(57)【要約】  ウイルス粒子を含む、癌の処置のための標的指向遺伝子療法システムを提供する。癌転移部位など患部に治療または診断薬を特異的に送達するように前記ウイルス粒子を遺伝子操作する。癌などの疾患を処置するための限局投与レジメンを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的指向療法用レトロウイルス粒子での癌の処置を、それを必要とする被験者において行う方法であって、
ａ）少なくとも１×１０１１ｃｆｕ蓄積用量の標的指向療法用レトロウイルス粒子の第一の治療コースを全身投与する段階；
ｂ）前記被験者に、少なくとも１×１０１１ｃｆｕ蓄積用量の標的指向療法用レトロウイルス粒子の第二の治療コースを動脈内注入によって投与する段階；
ｃ）前記被験者を癌症状の改善についてモニターする段階
を含む方法。
【請求項２】
段階ｂ）に続いて、少なくとも１×１０１１ｃｆｕ蓄積用量の標的指向療法用レトロウイルス粒子の第三の治療コースをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１×１０１２ｃｆｕ蓄積用量が、第一および／または第二の治療コースとして投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１×１０１３ｃｆｕ蓄積用量が、第一および／または第二の治療コースとして投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記動脈内注入が、肝動脈、大脳動脈、冠動脈、肺動脈、腸骨動脈、腹腔動脈、胃動脈、脾動脈、腎動脈、生殖腺動脈、鎖骨下動脈、椎骨動脈、腋窩動脈（ａｘｉｌａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ）、上腕動脈、橈骨動脈、尺骨動脈、頚動脈、大腿動脈、下腸間膜動脈または上腸間膜動脈経由である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記動脈内注入が、肝動脈経由である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第一および第二の治療コースが、逐次的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第一および第二の治療コースが、同時に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第一および／または第二の治療コースが、少なくとも三日間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一および／または第二の治療コースが、少なくとも五日間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一および／または第二の治療コースが、少なくとも一週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一および／または第二の治療コースが、少なくとも二週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一および／または第二の治療コースが、少なくとも三週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一の治療コースが、少なくとも一週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含み、これに、少なくとも三日間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での第二の治療コースが続く、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一の治療コースが、少なくとも一週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含み、これに、少なくとも一週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での第二の治療コースが続く、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一の治療コースが、少なくとも二週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含み、これに、少なくとも一週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での第二の治療コースが続く、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験者を第一の治療コースと第二の治療コースの間に１から２日休薬させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第一の治療コースが、標的指向療法用レトロウイルス粒子の局所、静脈内、動脈内、結腸内、気管内、腹腔内、鼻腔内、血管内、髄腔内、頭蓋内、骨髄内、胸膜内、皮内、皮下、筋肉内、眼内、骨内および／または関節滑液嚢内投与を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記第一の治療コースが、標的指向療法用レトロウイルス粒子の静脈内または動脈内投与を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第二の治療コースが、標的指向療法用レトロウイルス粒子の局所、静脈内、動脈内、結腸内、気管内、腹腔内、鼻腔内、血管内、髄腔内、頭蓋内、骨髄内、胸膜内、皮内、皮下、筋肉内、眼内、骨内および／または関節滑液嚢内投与を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記第二の治療コースが、標的指向療法用レトロウイルス粒子の静脈内または動脈内投与を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験者が、哺乳動物である、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記被験者が、ヒトである、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、乳癌、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、脳癌、咽頭、胆嚢、膵臓、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、神経組織、頭頚部、結腸、胃、気管支、腎臓の癌、基底細胞癌腫、潰瘍性と乳頭状の両方のタイプの扁平上皮癌腫、転移性皮膚癌腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫、骨髄腫、巨細胞腫瘍、小細胞肺腫瘍、胆石、島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、急性および慢性リンパ球性および顆粒球性腫瘍、ヘアリーセル腫瘍、腺腫、過形成、髄様癌腫、褐色細胞腫、粘膜神経腫、腸神経節細胞腫、過形成性角膜神経腫瘍、マルファン様体型腫瘍、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、ライオマイオマター腫瘍、子宮頚部異形成および上皮内癌腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性および他の肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫瘍、真性赤血球増加症、腺癌、多形膠芽腫、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫、ならびに類表皮癌腫から成る群より選択される、請求項１〜２３のいずれに記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が、膵臓癌、肝臓癌、乳癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織肉腫、咽頭の癌、黒色腫、卵巣癌、脳癌、ユーイング肉腫または結腸癌である、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記標的指向療法用レトロウイルス粒子が、前記被験者における露出コラーゲンエリアに蓄積する、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記露出コラーゲンエリアが、新生物性病変、活性血管新生エリア、新生物性病変、血管損傷エリア、外科手術部位、炎症部位および組織破壊エリアを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的指向療法用レトロウイルス粒子が、コラーゲン結合ドメインを含有するように修飾されたおよび前記癌に対する治療薬をコードするエンベロープタンパク質を有する、レトロウイルスベクターである、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記レトロウイルスベクターが、両栄養性である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療薬が、サイクリンＧ１突然変異体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療薬が、サイクリンＧ１のＮ末端欠失突然変異体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記サイクリンＧ１のＮ末端欠失突然変異体が、ヒトサイクリンＧ１のアミノ酸約４１から２４９を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療薬が、インターロイキン−２（ＩＬ−２）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記治療薬が、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記治療薬が、チミジンキナーゼである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記レトロウイルスベクターが、
ａ）ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するヒト細胞である、プロデューサー細胞を、
第一のプラスミド（該プラスミドは、コラーゲン結合ドメインを含有するように修飾された４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含み、該核酸配列は、プロモータに作動可能に連結されている）；
第二のプラスミド（該プラスミドは、
プロモータに作動可能に連結されている核酸配列であって、ウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする配列、
プロモータに作動可能に連結されている核酸配列であって、前記プロデューサー細胞に薬物耐性を付与するポリペプチドをコードする配列、
ＳＶ４０複製起点
を含む）；
第三のプラスミド（該プラスミドは、
プロモータに作動可能に連結されている異種核酸配列であって、診断用または治療用ポリペプチドをコードする配列、
５’および３’長末端反復配列（ＬＴＲ）、
Ψレトロウイルスパッケージング配列、
５’ＬＴＲの上流のＣＭＶプロモータ、
プロモータに作動可能に連結されている核酸配列であって、前記プロデューサー細胞に薬物耐性を付与するポリペプチドをコードする配列、
ＳＶ４０複製起点
を含む）
で一過的にトランスフェクトする段階；
ｂ）標的指向送達ベクター生産および培養物の上清への放出を可能にする条件下でａ）のプロデューサー細胞を培養する段階；
ｃ）前記レトロウイルスベクターを収集する段階
を含む方法によって生産される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記第一のプラスミドが、Ｂｖ１／ｐＣＡＥＰプラスミドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第一のプラスミドが、ｐＢ−ＲＶＥプラスミドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記第二のプラスミドが、ｐＣｇｐｎプラスミドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記第三のプラスミドが、Ｇ１ＸＳｖＮａプラスミドに由来する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記第三のプラスミドが、ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸプラスミドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記第三のプラスミドが、ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸ  ＩＩプラスミドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記第三のプラスミドが、ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
前記療法用ウイルス粒子の投与の前に、該投与と同時に、または該投与の後に、前記被験者への化学療法薬、生物製剤または放射線療法の投与をさらに含む、請求項１〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記標的指向療法用レトロウイルス粒子が、フォン・ヴィレブランド因子のＤ２ドメインに由来するペプチドを含むコラーゲン結合ドメインを含む、請求項１〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記フォン・ヴィレブランド因子が、ウシ・フォン・ヴィレブランド因子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ペプチドが、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ  Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号：１）を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ペプチドが、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号：２）を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記ペプチドが、４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質のｇｐ７０部分に含有される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
腹部ＣＴスキャン、ＭＲＩ、腹部超音波、ＣＢＣ、血小板数、化学検査パネル（Ｃｈｅｍ  ｐａｎｅｌ）（ＢＵＮ、クレアチニン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、Ａｌｋ  Ｐｈｏｓ、ビリルビン）、電解質、ＰＴまたはＰＴＴ測定値を、被験者において癌症状の改善についてモニターする、請求項１〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
腫瘍病変（単数または複数）が、癌症状の改善についてモニターされる、請求項１〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記腫瘍病変（単数または複数）が、カリパスによってまたは放射線画像診断によって測定される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記放射線画像診断が、ＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴスキャンである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
１つ以上の追加の抗癌療法の投与をさらに含む、請求項１〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記追加の抗癌療法が、外科手術、放射線療法、化学療法薬および
それらの組み合わせから成る群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記化学療法薬が、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、インターカレーティング抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生体応答修飾物質、抗ホルモン薬、血管新生阻害剤、抗アンドロゲン薬およびそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
標的指向療法用レトロウイルス粒子での肝癌の処置を、それを必要とする被験者において行う方法であって、
ａ）少なくとも三日間、少なくとも１×１０１１ｃｆｕ蓄積用量の標的指向療法用レトロウイルス粒子の第一の治療コースを全身投与する段階；
ｂ）前記被験者に、少なくとも三日間、少なくとも１×１０１１ｃｆｕ蓄積用量の標的指向療法用レトロウイルス粒子の第二の治療コースを肝動脈注入によって投与する段階；
ｃ）前記被験者を癌症状の改善についてモニターする段階
を含む方法。
【請求項５８】
段階ｂ）に続いて、少なくとも１×１０１１ｃｆｕの標的指向療法用レトロウイルス粒子の第三の治療コースをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも１×１０１２ｃｆｕ蓄積用量が、第一および／または第二の治療コースとして投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも１×１０１３ｃｆｕ蓄積用量が、第一および／または第二の治療コースとして投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記第一および第二の治療コースが、逐次的に投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記第一および第二の治療コースが、同時に投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記被験者を第一の治療コースと第二の治療コースの間に１から２日休薬させる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記第一の治療コースが、標的指向療法用レトロウイルス粒子の局所、静脈内、動脈内、結腸内、気管内、腹腔内、鼻腔内、血管内、髄腔内、頭蓋内、骨髄内、胸膜内、皮内、皮下、筋肉内、眼内、骨内および／または関節滑液嚢内投与を含む、請求項５７〜６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記第一の治療コースが、標的指向療法用レトロウイルス粒子の静脈内投与を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記被験者が、哺乳動物である、請求項５７〜６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
前記被験者が、ヒトである、請求項５７〜６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
前記標的指向療法用レトロウイルス粒子が、前記被験者における露出コラーゲンエリアに蓄積する、請求項５７〜６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記露出コラーゲンエリアが、新生物性病変、活性血管新生エリア、新生物性病変、血管損傷エリア、外科手術部位、炎症部位および組織破壊エリアを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記標的指向療法用レトロウイルス粒子が、コラーゲン結合ドメインを含有するように修飾されたおよび前記癌に対する治療薬をコードするエンベロープタンパク質を有する、レトロウイルスベクターである、請求項５７〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
前記レトロウイルスベクターが、両栄養性である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記治療薬が、サイクリンＧ１突然変異体である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記治療薬が、サイクリンＧ１のＮ末端欠失突然変異体である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記サイクリンＧ１のＮ末端欠失突然変異体が、ヒトサイクリンＧ１のアミノ酸約４１から２４９を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記治療薬が、インターロイキン−２（ＩＬ−２）である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
前記治療薬が、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
前記治療薬が、チミジンキナーゼである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７８】
前記レトロウイルスベクターが、
ａ）ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するヒト細胞である、プロデューサー細胞を、
第一のプラスミド（該プラスミドは、コラーゲン結合ドメインを含有するように修飾された４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含み、該核酸配列は、プロモータに作動可能に連結されている）；
第二のプラスミド（該プラスミドは、
プロモータに作動可能に連結されている核酸配列であって、ウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする配列、
プロモータに作動可能に連結されている核酸配列であって、前記プロデューサー細胞に薬物耐性を付与するポリペプチドをコードする配列、
ＳＶ４０複製起点
を含む）；
第三のプラスミド（該プラスミドは、
プロモータに作動可能に連結されている異種核酸配列であって、診断用または治療用ポリペプチドをコードする配列、
５’および３’長末端反復配列（ＬＴＲ）、
Ψレトロウイルスパッケージング配列、
５’ＬＴＲの上流のＣＭＶプロモータ、
プロモータに作動可能に連結されている核酸配列であって、前記プロデューサー細胞に薬物耐性を付与するポリペプチドをコードする配列、
ＳＶ４０複製起点
を含む）
で一過的にトランスフェクトする段階；
ｂ）標的指向送達ベクター生産および培養物の上清への放出を可能にする条件下でａ）のプロデューサー細胞を培養する段階；
ｃ）前記レトロウイルスベクターを収集する段階
を含む方法によって生産される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７９】
前記第一のプラスミドが、Ｂｖ１／ｐＣＡＥＰプラスミドである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記第一のプラスミドが、ｐＢ−ＲＶＥプラスミドである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記第二のプラスミドが、ｐＣｇｐｎプラスミドである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記第三のプラスミドが、Ｇ１ＸＳｖＮａプラスミドに由来する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
前記第三のプラスミドが、ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸプラスミドである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８４】
前記第三のプラスミドが、ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸ  ＩＩプラスミドである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８５】
前記第三のプラスミドが、ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８６】
前記療法用ウイルス粒子の投与の前に、該投与と同時に、または該投与の後に、前記被験者への化学療法薬、生物製剤または放射線療法の投与をさらに含む、請求項５７〜８５のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
前記標的指向療法用レトロウイルス粒子が、フォン・ヴィレブランド因子のＤ２ドメインに由来するペプチドを含むコラーゲン結合ドメインを含む、請求項５７〜８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８８】
前記フォン・ヴィレブランド因子が、ウシ・フォン・ヴィレブランド因子である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ペプチドが、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ  Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号：１）を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記ペプチドが、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号：２）を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記ペプチドが、４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質のｇｐ７０部分に含有される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
腹部ＣＴスキャン、ＭＲＩ、腹部超音波、ＣＢＣ、血小板数、化学検査パネル（ＢＵＮ、クレアチニン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、Ａｌｋ  Ｐｈｏｓ、ビリルビン）、電解質、ＰＴまたはＰＴＴ測定値を、被験者において癌症状の改善についてモニターする、請求項５７〜９１のいずれかに記載の方法。
【請求項９３】
腫瘍病変（単数または複数）が、癌症状の改善についてモニターされる、請求項５７〜９２のいずれかに記載の方法。
【請求項９４】
前記腫瘍病変（単数または複数）が、カリパスによってまたは放射線画像診断によって測定される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記放射線画像診断が、ＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴスキャンである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
１つ以上の追加の抗癌療法の投与をさらに含む、請求項５７〜９５のいずれかに記載の方法。
【請求項９７】
前記追加の抗癌療法が、外科手術、放射線療法、化学療法薬およびそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記化学療法薬が、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、インターカレーティング抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生体応答修飾物質、抗ホルモン薬、血管新生阻害剤、抗アンドロゲン薬およびそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
新生物性障害を処置するためのキットであって、
ａ）医薬的に許容される担体中の請求項１〜９２のいずれかに記載の標的指向療法用レトロウイルス粒子が入っている容器と、
ｂ）請求項１〜９８のいずれかに記載の方法に従って被験者にａ）のベクターを投与するための指示書と
を具備するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１０年７月１６日出願の米国特許仮出願第６１／３６５，２４０号の恩典を請求するものであり、該仮出願は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
【０００２】
本開示は、一般に、癌を処置するための方法および組成物に関する。さらに、本開示は、治療に有効なベクターを投与するための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
癌などの増殖性疾患は、深刻な問題を社会に投げかけている。悪性癌性成長を含めて、癌性成長は、例えば悪性組織の無秩序な成長を生じさせる結果となる制御不能の細胞増殖、局部組織およびさらには遠隔組織に侵入する能力、分化の欠如、検出可能な症状の欠如ならびにもっとも有意には有効な治療および予防の欠如などの、独特な特徴を有する。
【０００４】
癌は、あらゆる年齢のあらゆる器官のあらゆる組織において発生し得る。癌の病因は、明確には定義されていないが、遺伝的感受性、染色体切断障害、ウイルス、環境要因および免疫障害などの機序、すべてが悪性細胞成長および形質転換と関連付けられている。癌は、世界中の何百万人もの人を罹患させる、広いカテゴリーの医学的状態である。癌細胞は、身体のほぼあらゆる器官および／または組織において発生し得る。世界中で、毎年１，０００万人を超える人々が癌と診断されており、この数は、２０２０年までに毎年１，５００万の新規症例に膨れ上がると予測される。癌は、毎年６００万件の死亡、すなわち世界中の死亡の１２％の原因となっている。
【０００５】
現在、利用できる主な処置のいくつかは、外科手術、放射線療法、化学療法および遺伝子療法である。膵臓癌および肝癌を処置するための外科手術手順は、結果として癌罹患器官自体を部分的にまたは完全に除去することができるが、有意なリスクを伴う。器官機能の喪失をはじめとする深刻な有害作用が、癌切除患者において発生する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、レトロウイルスベースのベクター粒子、アデノウイルスベクター粒子、アデノ関連ウイルスベクター粒子、ヘルペスウイルスベクター粒子、および水泡性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）などで偽型化されたウイルスをはじめとする、ウイルスベースおよび非ウイルスベースの標的指向粒子の投与に関し、ならびにビロゾームの一部としてウイルスタンパク質を含有する非ウイルスベクター、または他のプロテオリポソーム遺伝子導入ベクターに関する。標的指向療法用レトロウイルス粒子の生成のためのレトロウイルスベースの発現系、前記粒子を生産するための一過的にトランスフェクトされたヒトプロデューサー細胞の使用、前記ウイルス粒子の大規模生産のための製造プロセス、ならびに標的指向送達ベクターを収集および保管するための方法も提供する。加えて、腫瘍進行を停止させ、腫瘍成長を制御すること、寛解を誘導すること、外科的切除を可能にすること、または癌もしくは他の障害の再発を防止することをはじめとする、癌および他の障害の処置のための、標的指向療法用レトロウイルス粒子の投与方法を提供する。本明細書に記載する方法は、従来の療法に対して耐性である、例えば化学療法、抗体ベースの療法または他の標準的な療法に対して耐性である、癌または他の障害に特に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの実施形態において、標的指向療法用レトロウイルス粒子での癌の処置を、それを必要とする被験者において行う方法を提供し、この方法は、少なくとも１×１０１１ｃｆｕの標的指向療法用レトロウイルス粒子の第一の治療コースを全身投与する段階、その被験者に、少なくとも１×１０１１ｃｆｕの標的指向療法用レトロウイルス粒子の第二の治療コースを肝動脈注入によって投与する段階、およびその被験者を癌症状の改善についてモニターする段階を含む。
【０００８】
１つの実施形態において、前記方法は、前記被験者への少なくとも１×１０１１ｃｆｕの標的指向療法用レトロウイルス粒子の第二の治療コースの肝動脈注入による投与に続いて、少なくとも１×１０１２ｃｆｕの標的指向療法用レトロウイルス粒子の第三の治療コースをさらに含む。
【０００９】
一部の実施形態において、前記第一および／または第二の治療コースは、少なくとも三日間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含む。他の実施形態において、前記第一および／または第二の治療コースは、少なくとも五日間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含む。さらに他の実施形態において、前記第一および／または第二の治療コースは、少なくとも一週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含む。さらに他の実施形態において、前記第一および／または第二の治療コースは、少なくとも二週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含む。さらにもう１つの実施形態において、前記第一および／または第二の治療コースは、少なくとも三週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含む。１つの実施形態において、前記第一の治療コースは、少なくとも一週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含み、これに、少なくとも三日間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での第二の治療コースが続く。さらに１つの実施形態において、前記第一の治療コースは、少なくとも一週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含み、これに、少なくとも一週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での第二の治療コースが続く。さらに他の実施形態において、前記第一の治療コースは、少なくとも二週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での処置を含み、これに、少なくとも一週間の標的指向療法用レトロウイルス粒子での第二の治療コースが続く。
【００１０】
一部の実施形態では、前記第一および／または第二の治療コースを静脈内投与する。他の実施形態では、前記第一および／または第二の治療コースを動脈内注入によって投与し、該動脈内注入としては、肝動脈、大脳動脈、冠動脈、肺動脈、腸骨動脈、腹腔動脈、胃動脈、脾動脈、腎動脈、生殖腺動脈、鎖骨下動脈、椎骨動脈、腋窩動脈、上腕動脈、橈骨動脈、尺骨動脈、頚動脈、大腿動脈、下腸間膜動脈および／または上腸間膜動脈経由の注入が挙げられるが、これらに限定されない。動脈内注入は、血管内手順、経皮手順または直視下手術アプローチを用いて果たすことができる。一部の実施形態では、前記第一および第二の治療コースを逐次的に投与することができる。さらに他の実施形態では、前記第一および第二の治療コースを同時に投与することができる。さらに他の実施形態では、任意選択の第三の治療コースを、第一および第二の治療コースと逐次的にまたは同時に投与することができる。
【００１１】
１つの実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に１から２日休薬させる。一部の実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に２から４日休薬させる。他の実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に少なくとも２日休薬させる。さらに他の実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に少なくとも４日休薬させる。さらに他の実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に少なくとも６日休薬させる。一部の実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に少なくとも１週間休薬させる。さらに他の実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に少なくとも２週間休薬させる。１つの実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に少なくとも一ヶ月休薬させる。一部の実施形態では、前記被験者を、第二の治療コースと任意選択の第三の治療コースの間に少なくとも１〜７日休薬させる。さらに他の実施形態では、前記被験者を、第二の治療コースと任意選択の第三の治療コースの間に少なくとも１〜２週間休薬させる。
【００１２】
もう１つの実施形態において、前記第一および／または第二の治療コースは、標的指向療法用レトロウイルス粒子の局所、静脈内、動脈内、結腸内、気管内、腹腔内、鼻腔内、血管内、髄腔内、頭蓋内、骨髄内、胸膜内、皮内、皮下、筋肉内、眼内、骨内および／または関節滑液嚢内投与を含む。さらに他の実施形態において、前記第一および／または第二の治療コースは、標的指向療法用レトロウイルス粒子の静脈内投与を含む。さらに他の実施形態において、前記第一および／または第二の治療コースは、動脈内注入による投与を含む。一部の実施形態では、前記任意選択の第三の治療コースを、局所、静脈内、動脈内、結腸内、気管内、腹腔内、鼻腔内、血管内、髄腔内、頭蓋内、骨髄内、胸膜内、皮内、皮下、筋肉内、眼内、骨内および／または関節滑液嚢内投与することができる。
【００１３】
一部の実施形態において、処置される癌は、乳癌、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、脳癌、咽頭、胆嚢、膵臓、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、神経組織、頭頚部、結腸、胃、気管支、腎臓の癌、基底細胞癌腫、潰瘍性と乳頭状の両方のタイプの扁平上皮癌腫、転移性皮膚癌腫、黒色腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫、骨髄腫、巨細胞腫瘍、小細胞肺腫瘍、胆石、島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、急性および慢性リンパ球性および顆粒球性腫瘍、ヘアリーセル腫瘍、腺腫、過形成、髄様癌腫、褐色細胞腫、粘膜神経腫、腸神経節細胞腫、過形成性角膜神経腫瘍、マルファン様体型腫瘍、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、ライオマイオマター腫瘍、子宮頚部異形成および上皮内癌腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性および他の肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫瘍、真性赤血球増加症、腺癌、多形膠芽腫、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫、ならびに類表皮癌腫から成る群より選択される。他の実施形態において、処置される癌は、膵臓癌、肝臓癌、乳癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織肉腫、咽頭の癌、黒色腫、卵巣癌、脳癌、ユーイング肉腫または結腸癌である。
【００１４】
１つの実施形態において、前記標的指向療法用レトロウイルス粒子は、前記被験者における露出コラーゲンエリアに蓄積する。一部の実施形態において、前記露出コラーゲンエリアとしては、新生物性病変、活性血管新生エリア、新生物性病変、血管損傷エリア、外科手術部位、炎症部位および組織破壊エリアが挙げられる。さらに他の実施形態において、前記標的指向療法用レトロウイルス粒子は、コラーゲン結合ドメインを含有するように修飾されたおよび前記癌に対する治療薬をコードするエンベロープタンパク質を有する、レトロウイルスベクターである。さらにもう１つの実施形態において、前記レトロウイルスベクターは、両栄養性である。他の実施形態において、前記治療薬は、サイクリンＧ１突然変異体である。さらに他の実施形態において、前記治療薬は、サイクリンＧ１のＮ末端欠失突然変異体である。一部の実施形態において、前記サイクリンＧ１のＮ末端欠失突然変異体は、ヒトサイクリンＧ１のアミノ酸約４１から２４９を含む。他の実施形態において、前記治療薬は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）である。さらに他の実施形態において、前記治療薬は、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。さらに他の実施形態において、前記治療薬は、チミジンキナーゼである。
【００１５】
もう１つの実施形態では、標的指向療法用レトロウイルス粒子の生産方法を提供する。この方法は、プロデューサー細胞を、１）第一のプラスミド（該プラスミドは、コラーゲン結合ドメインを含有するように修飾された４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む、２）第二のプラスミド（該プラスミドは、ｉ）プロモータに作動可能に連結されている核酸配列であって、ウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする配列と、ｉｉ）プロモータに作動可能に連結されている核酸配列であって、前記プロデューサー細胞に薬物耐性を付与するポリペプチドをコードする第二の配列と、ｉｉｉ）ＳＶ４０複製起点とを含む、３）第三のプラスミド（該プラスミドは、ｉ）プロモータに作動可能に連結されている異種核酸配列であって、診断用または治療用ポリペプチドをコードする配列、ｉｉ）５’および３’長末端反復配列、ｉｉｉ）Ψレトロウイルスパッケージング配列、ｉｖ）前記５’ＬＴＲの上流のＣＭＶプロモータ、ｖ）プロモータに作動可能に連結されている核酸配列であって、前記プロデューサー細胞に薬物耐性を付与するポリペプチドをコードする配列、ｖｉ）ＳＶ４０複製起点を含むで、一過的にトランスフェクトする段階を含む。前記プロデューサー細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するヒト細胞である。１つの態様において、前記プロデューサー細胞は、２９３Ｔ細胞である。
【００１６】
一部の実施形態では、前記レトロウイルスベクターは、ａ）ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するヒト細胞である、プロデューサー細胞を、第一のプラスミド（該プラスミドは、コラーゲン結合ドメインを含有するように修飾された４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含み、該核酸配列は、プロモータに作動可能に連結されている）、第二のプラスミド（該プラスミドは、プロモータに作動可能に連結されている核酸配列であって、ウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする配列、プロモータに作動可能に連結されている核酸配列であって、前記プロデューサー細胞に薬物耐性を付与するポリペプチドをコードする配列、ＳＶ４０複製起点を含む）。第三のプラスミド（該プラスミドは、プロモータに作動可能に連結されている異種核酸配列であって、診断用または治療用ポリペプチドをコードする配列、５’および３’長末端反復配列（ＬＴＲ）、Ψレトロウイルスパッケージング配列、５’ＬＴＲの上流のＣＭＶプロモータ、プロモータに作動可能に連結されている核酸配列であって、前記プロデューサー細胞に薬物耐性を付与するポリペプチドをコードする配列、ＳＶ４０複製起点を含む）で一過的にトランスフェクトする段階、ｂ）標的指向送達ベクター生産および培養物の上清への放出を可能にする条件下でａ）のプロデューサー細胞を培養する段階、およびｃ）前記レトロウイルスベクターを収集する段階を含む方法によって生産される。
【００１７】
収集される粒子は、一般に、１ミリリットル当たり約１×１０７から１×１０１２、１×１０８から１×１０１１、１×１０９から１×１０１１、５×１０８から５×１０１０、または１×１０９から５×１０１１、少なくとも５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３または１×１０１４コロニー形成単位のウイルス力価を呈示する。加えて、前記ウイルス粒子は、一般に、直径が約１０ｎｍから１０００ｎｍ、２０ｎｍから５００ｎｍ、５０ｎｍから３００ｎｍ、５０ｎｍから２００ｎｍ、または５０ｎｍから１５０ｎｍである。
【００１８】
１つの実施形態において、前記第一のプラスミドは、Ｂｖ１／ｐＣＡＥＰプラスミドである。もう１つの実施形態において、前記第一のプラスミドは、ｐＢ−ＲＶＥプラスミドである。一部の実施形態において、前記第二のプラスミドは、ｐＣｇｐｎプラスミドである。１つの実施形態において、前記第三のプラスミドは、Ｇ１ＸＳｖＮａプラスミドに由来する。さらにもう１つの実施形態において、前記第三のプラスミドは、ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸプラスミドである。さらにもう１つの実施形態において、前記第三のプラスミドは、ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸ  ＩＩプラスミドである。さらにもう１つの実施形態において、前記第三のプラスミドは、ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドである。
【００１９】
一部の実施形態において、前記標的指向療法用レトロウイルス粒子は、フォン・ヴィレブランド因子のＤ２ドメインに由来するペプチドを含むコラーゲン結合ドメインを含む。１つの実施形態において、前記フォン・ヴィレブランド因子は、ウシ・フォン・ヴィレブランド因子である。さらに他の実施形態において、前記ペプチドは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ  Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号：１）を含む。さらにもう１つの実施形態において、前記ペプチドは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号：２）を含む。一部の実施形態において、前記ペプチドは、４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質のｇｐ７０部分に含有される。
【００２０】
一部の実施形態において、前記方法は、前記療法用ウイルス粒子の投与の前に、該投与と同時に、または該投与の後に、前記被験者に化学療法薬、生物製剤または放射線療法を投与する段階をさらに含む。
【００２１】
一部の実施形態では、腹部ＣＴスキャン、ＭＲＩ、腹部超音波、ＣＢＣ、血小板数、化学検査パネル（ＢＵＮ、クレアチニン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、Ａｌｋ  Ｐｈｏｓ、ビリルビン）、電解質、ＰＴまたはＰＴＴ測定値のうちの少なくとも１つを、前記被験者において癌症状の改善についてモニターする。さらに他の実施形態では、腫瘍病変（単数または複数）を、癌症状の改善についてモニターする。１つの実施形態では、前記腫瘍病変（単数または複数）をカリパスによって、または放射線画像診断によって測定する。さらに他の実施形態において、前記放射線画像診断は、ＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴスキャンである。
【００２２】
標的指向療法用レトロウイルス粒子での癌の処置を、それを必要とする被験者において行う方法も提供し、この方法は、ａ）少なくとも三日間、少なくとも１×１０１１ｃｆｕの標的指向療法用レトロウイルス粒子の第一の治療コースを全身投与する段階、ｂ）その被験者に、少なくとも三日間、少なくとも１×１０１１ｃｆｕの標的指向療法用レトロウイルス粒子の第二の治療コースを肝動脈注入によって投与する段階、およびｃ）その被験者を癌症状の改善についてモニターする段階を含む。一部の実施形態において、提供する方法は、段階ｂ）に続いて、少なくとも１×１０１１ｃｆｕの標的指向療法用レトロウイルス粒子の第三の治療コースをさらに含む。
【００２３】
本明細書に開示する標的指向療法用レトロウイルス粒子は、一般に、診断用または治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する。本明細書の他の部分でより詳細に説明するように、本発明の例示的治療用タンパク質およびポリペプチドとしては、自殺タンパク質、アポトーシス誘導タンパク質、サイトカイン、インターロイキンおよびＴＮＦファミリータンパク質のクラスのものが挙げられるが、これらに決して限定されない。例示的診断用タンパク質またはペプチドとしては、例えば、緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼが挙げられる。
【００２４】
もう１つの実施形態では、プロモータに機能的に連結されている多重クローニング部位を含むプラスミドであって、該プロモータが、異種核酸配列；５’および３’長末端反復配列；Ψレトロウイルスパッケージング配列；前記５’ＬＴＲの上流に位置するＣＭＶプロモータ；プロモータに作動可能に連結されている核酸配列であって、該プラスミドを含有するプロデューサー細胞に薬物耐性を付与するポリペプチドをコードする配列；およびＳＶ４０複製起点の発現を支援するものであるプラスミド。例示的プラスミドとしては、ｐＣ−ＲＥＸ  ＩＩ、ｐＣ−ＲＥＸおよびｐＵＢＥＲ−ＲＥＸが挙げられる。前記例示のさらなる誘導体としては、治療用または診断用ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含有するものが挙げられる。
【００２５】
もう１つの実施形態では、癌を処置するためのキットを提供する。このキットは、医薬的に許容される担体中の本明細書に記載する方法によって生産されたウイルス粒子を収容している容器と、該ウイルス粒子を被験者に投与するための指示書とを具備する。前記投与は、本明細書に提供する例示的処置プロトコルにより得る。
【００２６】
もう１つの実施形態では、遺伝子療法事業の運営方法を提供する。この方法は、標的指向療法用レトロウイルス粒子を生成する段階、およびそれらの療法用レトロウイルス粒子を回収し、適する媒体の溶液に懸濁させ、その懸濁液を保管することによって、該標的指向療法用レトロウイルス粒子のバンクを確立する段階を含む。前記方法は、前記粒子および前記粒子の使用のための指示書を、それを必要とする被験者（患者）への投与のために医師または医療従事者に提供する段階をさらに含む。前記粒子の使用についてのそのような指示書は、表１に提供する例示的治療レジメンを含むことがある。前記方法は、患者または患者の保険業者に請求書を送る段階を、場合によっては含む。
【００２７】
さらにもう１つの実施形態では、本明細書に開示するキットを医師または医療従事者に提供する段階を含む、遺伝子療法事業の運営方法を提供する。
【００２８】
他の実施形態において、前記被験者は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００２９】
一部の実施形態において、前記療法用レトロウイルス粒子は、ここで開示する本発明のウイルスベクター、例えば、コラーゲン結合ドメインを含有するように修飾されたおよび癌に対する治療薬（例えば、サイクリンＧ１の細胞破壊性突然変異体）をコードするエンベロープタンパク質を有するレトロウイルス（好ましくは両栄養性）ベクターであるウイルスベクターである。
【００３０】
他の実施形態において、前記方法は、次の段階をさらに含むことがある：前記療法用レトロウイルス粒子の投与の前に、該投与と同時に、または該投与の後に、前記被験者に化学療法薬、生物製剤または放射線療法を投与する段階。
【００３１】
本発明のこれらのおよび他の態様、実施形態、目的および特徴、ならびにそれらを実施する最良の方式は、後続の「発明を実施するための形態」を添付の図面とともに読むと、より十分に分かるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】手術台エリア内の膵臓領域における大きな丸い再発腫瘍（Ｔ；括弧を付けたエリア）と、転移を示す肥大した傍大動脈リンパ節（Ｎ）とを示す、処置サイクル＃１の完了１日後の患者＃１からの代表ＭＲＩを表す図である。
【図１Ｂ】腫瘍塊の４０〜５０％を含む大きな中央壊死エリア（ｎｅｃ）を伴う再発腫瘍（Ｔ；括弧を付けたエリア）の形状の不規則さと、傍大動脈リンパ節転移（Ｎ）のサイズの有意な減少とを示す、処置サイクル＃２の完了４日後の患者＃１からのフォローアップＭＲＩを表す図である。
【図１Ｃ】ＲＥＸＩＮ−Ｇが患者＃１においてＣＡ１９−９血清レベルの低減を誘導することを示すグラフである。縦軸にプロットした血清ＣＡ１９−９レベル（Ｕ／ｍＬ）を、横軸にプロットした時間（日付）の関数として表す。各処置サイクルの開始を矢印によって示す。
【図２Ａ】上腸間膜静脈（ＳＭＶ）および上腸間膜動脈（ＳＭＡ）を侵害する膵頭部領域（Ｔ）内の６．０ｃｍ３の塊を示す、処置サイクル＃１の開始時に患者２から得た代表腹部ＣＴスキャンを提供する図である。
【図２Ｂ】膵臓腫瘍塊（Ｔ）のサイズが減少して上腸間膜脈管（ＳＭＶおよびＳＭＡ）から退縮したことを示す、処置サイクル＃２の完了２日後の患者＃２からのフォローアップ腹部ＣＴスキャンを提供する図である。各処置サイクルの開始を矢印によって示す。
【図２Ｃ】ＲＥＸＩＮ−Ｇが患者＃２において原発腫瘍成長を阻止することを示すグラフである。ＲＥＸＩＮ−Ｇでの連続的な処置に伴う腫瘍サイズの漸進的減少が認められた。式：幅２×長さ×０．５２（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ  ８８、２７７、１９９７年）を用いることによって導出し、縦軸にプロットした腫瘍容積（ｃｍ３）を、横軸にプロットした時間の関数として表す。各処置サイクルの開始を矢印によって示す。
【図３Ａ】ＲＥＸＩＮ−Ｇとゲムシタビンが、転移性膵臓癌を有する患者＃３において腫瘍退縮を誘導することを示すデータを表す図である。原発腫瘍の腫瘍容積（ｃｍ３）をＹ軸にプロットし、時間、日付、の関数として表す。ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入の開始を矢印によって示す。
【図３Ｂ】ＲＥＸＩＮ−Ｇとゲムシタビンが、転移性膵臓癌を有する患者＃３において腫瘍退縮を誘導することを示すデータを表す図である。門脈節の腫瘍容積をＹ軸にプロットし、時間、日付、の関数として表す。ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入の開始を矢印によって示す。
【図３Ｃ】ＲＥＸＩＮ−Ｇとゲムシタビンが、転移性膵臓癌を有する患者＃３において腫瘍退縮を誘導することを示すデータを表す図である。肝結節の数をＹ軸にプロットし、時間、日付、の関数として表す。ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入の開始を矢印によって示す。
【図４Ａ】患者＃１について、収縮期血圧をｍｍＨｇで表し、縦軸にプロットし、一方、ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入時を横軸にプロットした図である。
【図４Ｂ】患者＃１について、１分当たりの脈拍数を縦軸にプロットし、一方、ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入時を横軸にプロットした図である。
【図４Ｃ】患者＃１について、１分当たりの呼吸数を縦軸にプロットし、一方、ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入時を横軸にプロットした図である。
【図５Ａ】Ｙ軸にプロットし、Ｘ軸にプロットした処置日の関数として表した、患者＃１についてのヘモグロビン（ｇｍｓ％）、白血球数および血小板数を示すデータを表す図である。
【図５Ｂ】ＲＥＸＩＮ−Ｇが患者＃１について肝臓機能に有害作用を及ぼさないことを示すデータを表す図である。Ｙ軸にプロットしたＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）およびビリルビン（ｍｇ％）を、Ｘ軸にプロットした処置日の関数として表す。
【図５Ｃ】Ｙ軸にプロットし、Ｘ軸にプロットした処置日の関数として表した、患者＃１の血中尿素窒素（ｍｇ％）、クレアチニン（ｍｇ％）およびカリウム（ｍｍｏｌ／Ｌ）レベルを表す図である。用量レベルＩ（４．５×１０９ｃｆｕ／用量）を６日間連続して与え、２日間休薬し、その後、用量レベルＩＩ（９×１０９ｃｆｕ／用量）を２日間、次いで用量レベルＩＩＩ（１．４×１０１０ｃｆｕ／用量）を２日間与えた。
【図６】ＲＥＸＩＮ−Ｇの用量漸増が、患者２の血行動態機能に有害作用を及ぼさないことを示すデータを提供する図である。各用量レベルについて、収縮期血圧（ｍｍＨｇ）、脈拍数／分、および呼吸数／毎分を、横軸にプロットした注入時の関数として、縦軸にプロットする。
【図７Ａ】Ｙ軸にプロットし、Ｘ軸にプロットした処置日の関数として表した、患者＃２についてのヘモグロビン（ｇｍｓ％）、白血球数および血小板数を表す図である。
【図７Ｂ】ＲＥＸＩＮ−Ｇが患者＃２について肝臓機能に有害作用を及ぼさないことを示すデータを表す図である。Ｙ軸にプロットしたＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）およびビリルビン（ｍｇ％）を、Ｘ軸にプロットした処置日の関数として表す。
【図７Ｃ】Ｙ軸にプロットし、Ｘ軸にプロットした処置日の関数として表した、患者＃２についての血中尿素窒素（ｍｇ％）、クレアチニン（ｍｇ％）およびカリウム（ｍｍｏｌ／Ｌ）レベルを表す図である。用量レベルＩ（４．５×１０９ｃｆｕ／用量）を５日間連続して与え、その後、用量レベルＩＩ（９×１０９ｃｆｕ／用量）を３日間、次いで用量レベルＩＩＩ（１．４×１０９ｃｆｕ／用量）を２日間与えた。
【図８Ａ】Ｙ軸にプロットし、Ｘ軸にプロットした処置日の関数として表した、患者＃３についてのヘモグロビン（ｇｍｓ％）、白血球数および血小板数を表す図である。
【図８Ｂ】ＲＥＸＩＮ−Ｇが患者＃３について肝臓機能に有害作用を及ぼさないことを示すデータを表す図である。Ｙ軸にプロットしたＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）およびビリルビン（ｍｇ％）を、Ｘ軸にプロットした処置日の関数として表す。
【図８Ｃ】ＲＥＸＩＮ−Ｇが患者＃３について腎臓機能に有害作用を及ぼさないことを示すデータを表す図である。Ｙ軸にプロットした血中尿素窒素（ｍｇ％）、クレアチニン（ｍｇ％）およびカリウム（ｍｍｏｌ／Ｌ）のレベルを、Ｘ軸にプロットした処置日の関数として表す。用量レベルＩ（４．５×１０９ｃｆｕ／用量）を６日間連続して与えた。
【図９】ＲＥＸＩＮ−Ｇナノ粒子の粒径測定値を表す図である。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＭＡ  ０２０３８  Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用し、分子サイズを流体力学的半径（ｒｈ）として決定するためにバッチモードで動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて、ベクターサンプルを分析した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｖｅソフトウェアを使用して、ＤＬＳデータから様々なサイズの集団を数学的に決定した。３つのＲＥＸＩＮ−Ｇ臨床ロットの平均粒径は、それぞれ９５、１０５および９５ｎｍであり、検出可能なウイルス凝集はない。
【図１０】高感染力価（ＨＩＴ）バージョンのＧＴＩ発現ベクターＧｌｎＸＳｖＮａを表す図である。ｐＲＶ１０９プラスミドは、強力なＣＭＶプロモータを与える。結果として生ずるｐＲＥＸ発現ベクターは、ＳＶ４０ラージＴ抗原（２９３Ｔ）を発現するプロデューサー細胞系におけるエピソーム複製およびプラスミドレスキューのためのＳＶ４０  ｏｒｉと、大腸菌における選択および維持のためのアンピシリン耐性遺伝子と、ベクター力価を決定するためのＳＶ４０  ｅ．ｐ．によって駆動されるネオマイシン耐性遺伝子とを有する。対象となる遺伝子を、Ｎｏｔ  ＩおよびＳａｌ  Ｉオーバーハングを有するＰＣＲ産物として最初にクローニングする。増幅フラグメントをＤＮＡ配列分析によって検証し、それぞれのフラグメントのｐＧ１ＸｓｖＮａ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎｃ．）へのクローニング、次いでこのプラスミドのＫｐｎ  Ｉフラグメントの切除、その後の線形化（Ｋｐｎ  Ｉ消化）ｐＲＶ１０９プラスミドとのライゲーションによってレトロウイルス発現ベクターｐＲＥＸに挿入して、それぞれのＨＩＴ／ｐＲＥＸベクターを生じさせる。
【図１１】ｐＣ−ＲＥＸ  ＩＩ（すなわち、ＥＰＥＩＵＳ−ＲＥＸ）プラスミドのマップを表す図である。
【図１２】治療用サイトカイン遺伝子ＩＬ−２を挿入した新規ｐＣ−ＲＥＸ  ＩＩ（すなわち、ＥＰＥＩＵＳ−ＲＥＸ）プラスミドのマップを表す図である。
【図１３】治療用サイトカイン遺伝子ＧＭ−ＣＳＦを挿入した新規ｐＣ−ＲＥＸ  ＩＩ（すなわち、ＥＰＥＩＵＳ−ＲＥＸ）プラスミドのマップを表す図である。
【図１４Ａ】新規ｐＢ−ＲＶＥプラスミドのマップを表す図であり、この強化されたＣＭＶ発現プラスミドは、標的指向レトロウイルスベクターエンベロープ構築物（Ｅｐｅｉｕｓ−ＢＶ１：成熟タンパク質（ＣＡＥ−Ｐ）のＮ末端付近への一意的制限部位の付加により修飾された最小両栄養性ｅｎｖ（４０７０Ａ））を有し；コラーゲン結合モチーフ（ＧＨＶＧＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳＡＡ）（配列番号：１）を呈示するように遺伝子修飾され、およびＰＣＲによってすべての上流（５’）および下流（３’）ウイルス配列を削除するように再生成されたものである。このプラスミド主鎖（ｐｈＣＭＶｌ）は、ＳＶ４０ラージＴ抗原（２９３Ｔ）を発現するベクタープロデューサー細胞におけるエピソーム複製を可能にする、ＳＶ４０プロモータ／エンハンサーに加えて、ｅｎｖの発現を駆動するための最適化されたＣＭＶプロモータ／エンハンサー／イントロンを提供する。カナマイシン耐性遺伝子がポジティブ選択を生じさせる。
【図１４Ｂ】ｐＢ−ＲＶＥの制限消化を表す図である。
【図１５Ａ】新規ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドのマップを表す図である。このプラスミドは、２０９ａａ（６３０ｂｐ）ドミナントネガティブ突然変異体ｄｎＧ１（４７２−１０９８ｎｔ；４１−２４９ａａ；アクセッション＃Ｕ４７４１３）をコードする。このプラスミドは、５’ＬＴＲの上流の一意的ＳａｃＩＩ部位にＣＭＶ、すなわちプロモータエンハンサーがクローニングされたＧ１ＸＳｖＮａ（ＧＴＩ）に由来する。残基ｇａｇ配列の４８７ｂｐを除去（Ｄ）してＲＣＰの可能性を低下させ、９７ｂｐスプライスアクセプター部位（ＥＳＡ）をｄｎＧ１の上流に付加させた。ｄｎＧ１コーディング配列（ｎｔ４７２−１０９８と停止コドン＝１１０１）を、Ｎｏｔ  ＩおよびＳａｌ  Ｉオーバーハングを含めて、ＰＣＲによって調製した。ｎｅｏ遺伝子は、そのネストされたｏｒｉを有するＳＶ４０  ｅ．ｐ．によって、駆動される。２９３Ｔ細胞における高力価ベクター生産のために、このｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドを設計した。
【図１５Ｂ】ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸの制限消化を表す図である。
【図１６Ａ】Ｃ−ＲＥＸプラスミドの略図を示す図である。
【図１６Ｂ】ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドの略図を示す図である。
【図１７】ステージＩＶ膵臓癌を有する患者（患者Ａ３）から外科的に切除した肝臓切片において観察された、転移性腫瘍結節における静脈内ＲＥＸＩＮ−Ｇ誘導壊死および線維増多を表す図である。（Ａ）生検肝臓における腫瘍結節の代表ヘマトキシリン−エオシン染色組織切片；ｔ＝腫瘍細胞；ｎ＝壊死；ｆ＝線維増多。（Ｂ）同腫瘍結節の組織切片のトリクローム染色。青色染色物質は、線維増多エリアにおけるコラーゲン性タンパク質の存在を示す。
【図１８】膵臓癌を有する患者（患者Ａ３）で見られた、転移性腫瘍結節における静脈内ＲＥＸＩＮ−Ｇによって誘導された顕性アポトーシスを表す図である。（Ａ〜Ｄ）Ｔｕｎｅｌポジティブアポトーシス核（褐色染色物質）のはっきりと感知できる発生を示す、生検肝臓からの腫瘍結節の代表免疫染色組織切片。
【図１９】膵臓癌を有するＲＥＸＩＮ−Ｇ処置患者（患者Ａ３）から切除した転移性腫瘍結節における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の免疫組織化学的特性評価を表す図である。生検肝臓内の残留腫瘍結節の代表組織切片は、免疫反応性ＴおよびＢ細胞の機能的補足に伴う有意なＴＩＬ浸潤を示す。上方左から時計方向に：ヘルパーＴ細胞（ｃｄ４＋）、キラーＴ細胞（Ｃｄ８＋）、Ｂ細胞（ｃｄ２０＋）、単球／マクロファージ（ｃｄ４５＋）、樹状細胞（ｃｄ３５＋）、およびナチュラルキラー細胞（ｃｄ５６＋）。注記：細胞媒介免疫および体液性免疫に関連して機能するＴＩＬの中核メンバー（ｃａｄｒｅ）の存在（すなわち、移動）は、免疫能のある宿主における癌免疫化の可能性を示唆する。
【図２０】悪性黒色腫を有する患者（患者Ｂ４）の癌罹患リンパ節における静脈内ＲＥＸＩＮ−Ｇ誘導壊死、アポトーシスおよび線維増多を表す図である。Ａ）周囲に生腫瘍細胞の輪縁（ｔ）を有する癌細胞の広範囲の壊死（ｎ）、アポトーシス（矢印によって示す）および線維増多（ｆ）を示す、鼠蹊部リンパ節のＨ＆Ｅ染色組織切片；（Ｂ）濃縮またはフラグメント化された核を有する小細胞によって指摘されるアポトーシスを被っている非常に多数の細胞を示す、Ａの切片のより高倍率の拡大図（１００×）；（Ｃ）鮮黄色のヘモシデリン沈着マクロファージを示す、Ａのより高倍率の拡大図（１００Ｘ）；（Ｄ）免疫反応性ＣＤ３５＋樹状細胞での有意な浸潤を示す、鼠蹊部リンパ節の代表組織切片、（Ｅ）ＣＤ６８＋マクロファージおよび（Ｆ）ＣＤ８＋キラーＴ細胞。
【図２１】咽頭の扁平上皮癌腫を有する患者（患者Ｂ６）における腫瘍退縮の証拠を表す図である。ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置前（上方パネル）および後（下方パネル）に得た頚部領域のＭＲＩ画像。上気道の連続切片の直径の測定は、処置前に得た切片（白矢印によって指摘）と比較して、ＲＥＸＩＮ−Ｇの反復注入後の上気道径の劇的な（〜３００％）増加を示す。この気道の開存性増加は、周囲の腫瘍塊の退縮、および発声能力の回復に対応する。
【図２２】大量の腫瘍量を呈示する膵臓癌患者（患者Ｃ１）において観察された肝臓転移性病変の数および量に対するＲＥＸＩＮ−Ｇ注入の効果を表す図である。ＲＥＸＩＮ−Ｇの算出（パリティー計算）ドーズデンス注入での処置前（Ａ）および処置後（Ｂ）に得た腹部ＭＲＩ。画像の上方左四半分の非常に多数の小さな密集した腫瘍結節の完全根絶（括弧付）、ならびに樹立された肝結節の嚢胞転換（黒矢印）に注目のこと。肥大した肝臓嚢胞のその後の吸引（白矢印）、続いての細胞分析により、処置の結果として起こる吸引腋中の癌細胞の完全不在が確認された。
【図２３】心臓、肺および副腎転移性の難治性骨肉腫に対するＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置の効果を表す図である。放射線画像診断によって主要転移部位（Ａ）を特定して、ベースライン（Ｂ）からＲＥＸＩＮ−Ｇ処置一ヶ月（Ｃ）そして三ヶ月（Ｄ）へと劇的に変化する三つの肺標的病変（矢印）に焦点を当てている。注目に値することとして、これらの腫瘍の密度は有意に変化し、これは反応性石灰化および壊死を示すが、ＰＥＴスキャンによって機序の詳細が追加され、それによって腫瘍代謝活性の停止が確認される。
【図２４】ＲＥＸＩＮ−Ｇによる疾患の進行停止および安定化が、ここではネオアジュバントおよびアジュバント療法としての役割を果たし、２つの残留腫瘍結節の切除によって獲得される外科的寛解を可能にした、難治性転移性骨肉腫に対するＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置の効果を表す図である。切除した腫瘍の組織学的検査は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置後に一つの病変での石灰化（Ａ、およびより高倍率でＣ）ならびにもう１つの病変の嚢胞性転換および壊死（Ｂ、およびより高倍率でＤ）を確証する、明瞭な客観的反応を明示した。
【図２５】肺および脊椎転移性の難治性ユーイング肉腫に対するＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置の効果を表す図である。胸部領域における三つの大きな標的病変のＣＴスキャンとＰＥＴスキャンの比較（Ａ）は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置後の腫瘍代謝に対する腫瘍サイズに関する客観的臨床反応を評価する上で問題のある不一致を示す。同様に、ＰＥＴスキャンによって検出されたがＣＴスキャンではされなかった、腰部領域におけるびまん性転移性腫瘍浸潤（Ｂ）は、腫瘍サイズのみに基づく臨床的解釈が、非常に不十分な種類のものであることをさらに示唆している。
【図２６】腫瘍破壊、修復性線維増多、および反応性免疫細胞浸潤の組織学的態様（ＲＥＸＩＮ−Ｇ作用についての今では古典的な顕著な特徴）を示す、難治性転移性乳癌に対するＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置の効果を表す図である。この切除した腫瘍結節では、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置後に有意な免疫反応（ｉｍ）を伴う広範な線維増多（ｆｉｂ）に関連してわずかな数の腫瘍細胞（ｔｕ）しか見ることができない（細胞外マトリックスタンパク質の、Ａ、Ｈ＆Ｅ染色；Ｂ、トリクローム染色）。変性腫瘍細胞の残存ネスト（Ｆにおいて顕著）は、キラーＴ細胞（Ｅ）をはじめとする患者の免疫細胞（Ｃ、Ｈ＆Ｅ；Ｄ、ＬＣＡ免疫染色）によって浸潤され、「認識される」ように見える。
【図２７】患者が標準的なファーストライン療法の失敗後すぐにセカンドライン療法による処置としてＲＥＸＩＮ−Ｇを受けた、したがって、疾患進行の比較的早期に有効な腫瘍制御を獲得することの臨床的有用性の証拠となる、難治性転移性膵臓癌に対するＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置の効果を表す図である。原発性膵臓腫瘍の完全退縮（Ａ対Ｂ）が、転移性肝臓病変のサイズ（ＲＥＣＩＳＴ）と密度（ＣＨＯＩ）両方の変化（Ｃ対Ｄ）とともに実証され、結果として、疾患が安定化され、新たな病変が予防され、処置選択肢が増すこととなる。
【図２８】単独療法としてのＲＥＸＩＮ−Ｇでの継続処置によって獲得される完全な臨床的寛解を実証する、肝臓および腹部リンパ節への転移を有する再発性化学療法耐性膵臓癌に対するＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置の効果を表す図である。ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置の過程（Ｘ軸）で得られた肝臓における腫瘍量（Ａ、Ｙ軸）の放射線像の図形解析は、進行の停止とともに安定した疾患（ＳＤ）、そして新たな病変がないことを明示したが、肝臓病変のサイズのわずかな増加（ＲＥＣＩＳＴ基準によってのみ判定）は、進行性疾患（ＰＤ）を示すように「見えた」。ベースラインに向かって降下したＣＡ１９．９腫瘍マーカーのレベル（Ｃ）を含む、リンパ節における腫瘍量（Ｂ）の根絶のより総合的な分析は、腫瘍学者がこの標的指向療法コースを保持することを助長し、そのためこれらの条件を維持し、その後一ヶ月間の完全腫瘍反応（ＣＲ）に至った。全身毒性がない状態で、いずれの新たな病変もおよび／または検証可能な疾患進行もない状態で、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置コースを保持することの重要性は、結果として生ずる臨床的寛解持続によって明白である。
【図２９】肝臓からの残留腫瘍の外科的切除が、臨床的寛解持続ばかりでなく、ＲＥＸＩＮ−Ｇの分子的作用機序に対する重要な洞察を与える、難治性転移性膵臓癌に対するＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置の効果を表す図である。切除された肝臓結節の組織学的検査（Ａ）により、単純なＲＥＣＩＳＴ測定の限界が実証され、有意な量の修復性線維増多（Ｂ、ＥＣＭ株  青色）および免疫細胞浸潤（Ｃ、白血球）（ヘルパーＴ細胞（Ｆ）とキラーＴ細胞（Ｇ）の両方を含む）によって取り巻かれている、様々な変性段階の上皮様腫瘍細胞（ｔｕ）（挿入図）が明らかになる。ネオアジュバント療法としてのＲＥＸＩＮ−Ｇ処置後のこの結節の治療的外科的切除について、最も注目に値するのは、腫瘍細胞の円柱状／管状配列（Ｄ、ＴＵＮＥＬ染色；Ｅ、対照）で分かる大量のアポトーシス（活性細胞の死）によって証明されるＲＥＸＩＮ−Ｇの直接的抗腫瘍作用である。
【図３０】骨および軟部組織肉腫を有するＲＥＸＩＮ−Ｇ処置患者の無進行生存率（ＡおよびＢ）ならびに評価可能な患者の全生存データ（Ｃ）のカプラン・マイヤー分析を表す図である。
【図３１Ａ】評価可能な骨肉腫患者に関する全生存データを表す図である。カプラン・マイヤー分析は、少なくとも１サイクルの治療サイクルを完了し、腫瘍反応評価を有した、公知の療法に対して抗療性の再発性または転移性骨肉腫を有する１７名の評価可能な患者の全生存曲線を示す。
【図３１Ｂ】膵臓癌を有する患者の無進行生存率を表す図である。「治療企図」患者集団内の２０名の患者の生存率についてのカプラン・マイヤープロット。結果は、全生存率とＲＥＸＩＮ−Ｇ投薬量の間の用量−反応関係を示す（ｐ＝０．０３）。
【図３２】標的指向ベクター療法と放射線または化学療法とを併用する治療実施形態のフローチャートを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本明細書に開示する治療システムは、レトロウイルスベクターまたは任意の他のウイルスもしくは非ウイルスベクター、タンパク質または薬物を病態エリアに選択的に標的指向（すなわち、病態親和性標的指向）させ、それによって、高効率でインビボで脈管（Ｈａｌｌら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、８：２１８３−９２、１９９７年；Ｈａｌｌら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１１：９８３−９３、２０００年）または癌性病変（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １２：１９３−２０４、２００１年；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｃｕｒｉｅｌ  ＤＴ、Ｄｏｕｇｌａｓ  ＪＴ編集、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、２９３−３２０、２００２年）、活性血管新生エリア、および組織損傷または炎症エリアへの優先的遺伝子送達を可能にする。米国特許出願公開第２００４／０２５３２１５号、同第２００７／０１７８０６６号、同第２００９／０１２３４２８号および同第２０１０／００１６４１３号明細書も参照のこと（これらのそれぞれは、その全体が参照により援用されている）。
【００３４】
定義
別の定義がない限り、本明細書において用いるすべての専門および科学用語は、本発明（単数または複数）が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書における全開示を通して言及するすべての特許、特許出願、公開出願および公報、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、ウェブサイトならびに他の出版物は、別の注記がない限り、それら全体が参照により援用されている。本明細書中の用語について複数の定義がある場合、このセクションでの定義が優先する。ＵＲＬまたは他のそのような識別子もしくはアドレスに言及する場合、そのような識別子は変わることがあり、またインターネット上の特定の情報は移り変わることがあるが、等価の情報をインターネット検索によって見つけることができることは理解される。それらへの言及は、そのような情報の利用可能性および公開普及を明らかにするものである。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「核酸」は、少なくとも２つの共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体サブユニットを含有するポリヌクレオチドを指す。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体である場合がある。ヌクレオチド類似体は市販されており、そのようなヌクレオチド類似体を含有するポリヌクレオチドの調製方法は公知である（Ｌｉｎら（１９９４年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５２２０−５２３４；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９５年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１３６３−１１３７２；Ｐａｇｒａｔｉｓら（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８−７３）。核酸は、一本鎖、二本鎖、またはそれらの混合物である場合がある。本明細書における論点のために、別の指定がない限り核酸は二本鎖であり、またはそれは文脈から明らかである。
【００３６】
本明細書において用いる場合、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、プラスミド、ならびに修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むＤＮＡを含めて、すべてのタイプおよびサイズのＤＮＡ分子を含むことを意図したものである。
【００３７】
本明細書において用いる場合、ヌクレオチドは、ヌクレオシド一、二および三リン酸を含む。ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばホスホロチオエートヌクレオチドおよびデアザプリンヌクレオチドおよび他のヌクレオチド類似体（しかしこれらに限定されない）、もさらに含む。
【００３８】
本明細書において用いる場合、用語「被験者」は、大型ＤＮＡ分子を導入することができる動物、植物、昆虫および鳥類を指す。高等生物、例えば、ヒト、霊長類、げっ歯動物、ウシ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ネコ、イヌ、ウマ、ニワトリおよびその他を含む、哺乳類および鳥類が含まれる。
【００３９】
本明細書において用いる場合、「被験者に投与すること」は、１つ以上の送達薬剤および／または大型核酸分子を、一緒にまたは別々に、被験者に導入または印加して、最終的に、該被験者体内に存在する標的細胞を該薬剤および／または該大型核酸分子と接触させるようにする手順である。
【００４０】
本明細書において用いる場合、「標的指向送達ベクター」または「標的指向送達ビヒクル」または「標的指向療法用ベクター」または「標的指向療法用の系」は、異種核酸分子を持ち、それを細胞または組織に輸送する、ウイルス粒子と非ウイルス粒子の両方を指す。ウイルス標的としては、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。非ウイルスビヒクルとしては、ミクロ粒子、ナノ粒子、ビロゾームおよびリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。「標的指向（させた）」は、本明細書において用いる場合、送達ビヒクルと会合し、該ビヒクルを細胞または組織に標的指向させるリガンドの使用を指す。リガンドとしては、抗体、受容体およびコラーゲン結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書において用いる場合、「形質導入」と交換可能に用いる「送達」は、異種核酸分子を細胞に移入して、該分子が該細胞内に位置するようにするプロセスを指す。核酸の送達は、核酸の発現とは異質のプロセスである。
【００４２】
本明細書において用いる場合、「多重クローニング部位（ＭＣＳ）」は、多数の制限酵素部位を含有するプラスミド内の核酸領域であり、前記制限酵素部位のいずれかを標準的な組換え技術とともに用いてベクターを消化することができる。「制限酵素消化」は、核酸分子内の特定の位置でしか機能しない酵素での核酸分子の触媒性切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。そのような酵素の使用は、当業者に広く理解されている。多くの場合、ＭＣＳ内で切断する制限酵素を使用してベクターを線形化またはフラグメント化して、外因性配列を該ベクターにライゲートできるようにする。
【００４３】
本明細書において用いる場合、「複製起点」（「ｏｒｉ」と呼ばれることが多い）は、複製を開始させる特異的核酸配列である。あるいは、宿主細胞が酵母である場合には、自律複製配列（ＡＲＳ）を利用することができる。
【００４４】
本明細書において用いる場合、「選択可能またはスクリーニング可能マーカー」は、細胞に同定可能な変化を付与して、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定を可能にする。一般に、選択可能マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。ポジティブ選択可能マーカーは、該マーカーの存在がその選択を可能にするものであり、一方、ネガティブ選択可能マーカーは、その存在がその選択を妨げるものである。ポジティブ選択可能マーカーの一例は、薬物耐性マーカーである。
【００４５】
通常、薬物選択マーカーを含めることは、形質転換体のクローニングおよび同定の助けになり、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ヒグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択可能マーカーである。条件を満たすことに基づいて形質転換体の区別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、ベースが熱量分析であるＧＦＰなどのスクリーニング可能マーカーを含む他のタイプのマーカーも、考えられる。あるいは、スクリーニング可能酵素、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、を利用することができる。免疫学的マーカーを、ことによるとＦＡＣＳ分析とともに、利用する方法も、当業者に公知である。使用されるマーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限り、重要でないと考えられる。選択可能およびスクリーニング可能マーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【００４６】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために用いている。細胞は、外因性ＤＮＡがその細胞膜内に導入されているとき、「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が当技術分野において一般に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６（１９７３年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９年）；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６年）；Ｃｈｕら、Ｇｅｎｅ  １３：１９７（１９８１年）参照。そのような技術を用いて、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分、例えばヌクレオチド組み込みベクターおよび他の核酸分子、を適する宿主細胞に導入することができる。この用語は、化学的、電気的およびウイルス媒介トランスフェクション手順を捕捉する。
【００４７】
本明細書において用いる場合、「発現」は、核酸がペプチドに翻訳されるプロセス、または核酸が、例えばペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳され得るＲＮＡに、転写されるプロセスを指す。核酸が、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核宿主細胞または生物を選択すれば、ｍＲＮＡのスプライシングを含む。異種核酸が宿主細胞において発現されるために、それは、先ず細胞に送達されなければならず、そしてその後、細胞内に送達されたら、最終的にはその核内に存在しなければならない。
【００４８】
本明細書において用いる場合、「被験者に印加すること」は、被験者体内に存在する標的細胞を、最終的に、超音波または電気エネルギーなどのエネルギーと接触させる手順である。印加は、エネルギーを印加できる任意のプロセスである。
【００４９】
本明細書において用いる場合、「治療コース」は、被定義期間内の本明細書に開示する標的指向ベクターの定期的または時限投与を指す。そのような期間は、少なくとも一日、少なくとも二日、少なくとも三日、少なくとも五日、少なくとも一週間、少なくとも二週間、少なくとも三週間、少なくとも一ヶ月、少なくとも二ヶ月、または少なくとも六ヶ月である。投与を慢性的に、すなわち未定義期間にわたって、行ってもよい。前記定期的または時限投与は、一日一回、一日二回、一日三回、または他のセットの時限投与を含む。
【００５０】
本明細書において用いる場合、用語「共投与」、「と併用での投与」およびこれらの文法的同義語またはそれらに類するものは、選択された治療薬の単一患者への投与を包含することを意図したものであり、前記薬剤を同じもしくは異なる投与経路によってまたは同じもしくは異なる時点で投与する処置レジメンを含むと解釈される。一部の実施形態において、本願にて開示する治療薬は、他の薬剤と共投与されることとなる。これらの用語は、２つ以上の薬剤の動物への、両方の薬剤および／またはそれらの代謝産物が該動物体内に同時に存在するような、投与を包含する。それらは、別々の組成物での同時投与、別々の組成物での異なる時点での投与、および／または両方の薬剤が存在する組成物での投与を含む。したがって、一部の実施形態において、治療薬および他の薬剤（単数または複数）は、単一組成物で投与される。一部の実施形態において、治療薬および他の薬剤（単数または複数）は、前記組成物中で混合されている。さらなる実施形態において、治療薬および他の薬剤（単数または複数）は、別々の用量で別々の時点で投与される。
【００５１】
用語「宿主細胞」は、例えば、標的指向送達ベクターを生産するための多数の構築物のためにレシピエントとして使用され得る、または使用された、微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞を意味する。この用語は、トランスフェクトされた原細胞の後代を含む。したがって、本明細書において用いる場合の「宿主細胞」は、一般に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。同一親細胞の後代が、自然、偶発的または計画的突然変異のため、形態の点でまたはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体の点で原親と必ずしも完全に同一でないことがあることは理解される。
【００５２】
本明細書において用いる場合、「遺伝子療法」は、治療または診断が求められる障害または状態を有する哺乳類、特にヒトの、一定の細胞、標的細胞、への異種ＤＮＡの移入を含む。前記ＤＮＡは、選択された標的細胞に、その異種ＤＮＡが発現され、該ＤＮＡによってコードされた治療用産物が生産されるように、導入される。あるいは、前記異種ＤＮＡは、治療用産物をコードするＤＮＡの発現を何らかの様式で媒介することがあり、それは、治療用産物の発現を何らかの様式で直接または間接的に媒介する産物、例えばペプチドまたはＲＮＡ、をコードすることがある。遺伝子療法を用いて、遺伝子産物をコードする核酸を送達して、欠損遺伝子を補充すること、または哺乳類によって生産された遺伝子産物もしくはそれが導入される細胞を補足することもできる。導入される核酸は、哺乳類宿主において通常は生産されないまたは治療有効量でもしくは治療に有用な時点で生産されない治療化合物、例えば、その成長因子阻害剤、または腫瘍壊死因子もしくはその阻害剤、例えばその受容体、をコードすることがある。治療用産物をコードする異種ＤＮＡを、罹患宿主の細胞への導入前に修飾して、該産物またはその発現を強化するまたは別様に改変することができる。
【００５３】
本明細書において用いる場合、「異種核酸配列」は、概してＤＮＡであって、該ＤＮＡを発現する細胞によって通常はインビボで生産されないＲＮＡおよびタンパク質をコードするものであるＤＮＡ、または転写、翻訳もしくは他の調節可能な生化学プロセスに作用することにより内因性ＤＮＡの発現を改変するメディエーターを媒介もしくはコードするものであるＤＮＡである。異種核酸配列を外来ＤＮＡと呼ぶこともある。ＤＮＡであって、該ＤＮＡが発現される細胞に対して異種または外来のものであると当業者によって認識されるまたはみなされる任意のＤＮＡが、本明細書では異種ＤＮＡに包含される。異種ＤＮＡの例としては、追跡可能マーカータンパク質、例えば薬物耐性を付与するタンパク質、をコードするＤＮＡ、治療に有効な物質、例えば抗癌剤、酵素およびホルモン、をコードするＤＮＡ、ならびに他のタイプのタンパク質、例えば抗体、をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。異種ＤＮＡによってコードされる抗体は、該異種ＤＮＡが導入された細胞の表面で分泌または発現され得る。
【００５４】
プラスミド
本明細書に開示するプラスミドは、治療および診断手順において使用するための標的指向送達ベクターまたは標的指向療法用ベクターをトランスフェクトおよび生産するために使用される。一般に、そのようなプラスミドは、本明細書に開示する標的指向ベクターの、ウイルス性または非ウイルス性の、成分をコードする核酸配列を提供する。そのようなプラスミドは、例えばコラーゲン結合ドメインを含有するように修飾された４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質をコードする、核酸配列を含む。さらなるプラスミドは、プロモータに作動可能に連結されている核酸配列を含むことがある。前記配列は、一般に、ウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする。前記プラスミドは、さらに、プロモータに作動可能に連結されている核酸配列、およびプロデューサー細胞に薬物耐性を付与するポリペプチドをコードする配列を含む。複製起点も含まれる。さらなるプラスミドは、診断用または治療用ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、５’および３’長末端反復配列と、Ψレトロウイルスパッケージング配列と、前記５’ＬＴＲの上流のＣＭＶプロモータと、プロモータに作動可能に連結されている核酸配列と、ＳＶ４０複製起点とを含むことがある。
【００５５】
前記異種核酸配列は、一般に、診断用または治療用ポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、前記治療用ポリペプチドまたはタンパク質は、単独でまたは他の化合物の存在下で細胞死を引き起こす「自殺タンパク質」である。そのような自殺タンパク質の代表例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼである。さらなる例としては、水痘−帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ、細菌遺伝子シトシンデアミナーゼ（５−フルオロシトシンを高毒性化合物５−フルオロウラシルに転化させる）、ｐ４５０オキシドレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、ベータ−グルクロニダーゼ、ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、リナマラーゼ（ベータ−グルコシダーゼとも呼ばれる）、大腸菌ｇｐｔ遺伝子、および大腸菌Ｄｅｏ遺伝子が挙げられるが、他のものも当技術分野において公知である。一部の実施形態において、前記自殺タンパク質は、プロドラッグを毒性化合物に転化させる。本明細書において用いる場合、「プロドラッグ」は、毒性産物に転化され得る、すなわち腫瘍細胞に対して毒性であり得る、本発明の方法において有用な任意の化合物を意味する。前記プロドラッグは、自殺タンパク質によって毒性産物に転化される。そのようなプロドラッグの代表例としては、チミジンキナーゼについてのガンシクロビル、アシクロビル、およびＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル）；オキシドレダクターゼについてのイホスファミド；ＶＺＶ−ＴＫについての６−メトキシプリンアラビノシド；シトシンデアミナーゼについての５−フルオロシトシン；ベータ−グルクロニダーゼについてのドキソルビシン；ニトロレダクターゼについてのＣＢ１９５４およびニトロフラゾン；ならびにカルボキシペプチダーゼＡについてのＮ−（シアノアセチル）−Ｌ−フェニルアラニンまたはＮ−（３−クロロプロピオニル）−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。前記プロドラッグを当業者は容易に投与することができる。当業者は、前記プロドラッグの最も適切な用量および投与経路を容易に決定するだろう。
【００５６】
一部の実施形態において、治療用タンパク質またはポリペプチドは、癌抑制因子、例えばｐ５３もしくはＲｂであり、またはそのようなタンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸である。勿論、当業者は、多種多様なそのような癌抑制因子を知っており、それらを得る方法および／またはそれらをコードする核酸を得る方法を知っている。
【００５７】
治療用タンパク質またはポリペプチドの他の例としては、アポトーシス促進性治療用タンパク質およびポリペプチド、例えばｐ１５、ｐ１６またはｐ２１／ＷＡＦ−１が挙げられる。
【００５８】
サイトカイン、およびそれらをコードする核酸も、治療用タンパク質およびポリペプチドとして使用することができる。例としては、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）；ＴＮＦ−アルファ（腫瘍壊死因子アルファ）；ＩＦＮ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマをはじめとする（しかしこれらに限定されない）、インターフェロン；ならびに；インターロイキン−１（ＩＬ１）、インターロイキン−ベータ（ＩＬ−ベータ）、インターロイキン−２（ＩＬ２）、インターロイキン−４（ＩＬ４）、インターロイキン−５（ＩＬ５）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキン−８（ＩＬ８）、インターロイキン−１０（ＩＬ１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ１５）、インターロイキン−１６（ＩＬ１６）、インターロイキン−１８（ＩＬ１８）、インターロイキン−２３（ＩＬ２３）、インターロイキン−２４（ＩＬ２４）をはじめとする（しかしこれらに限定されない）、インターロイキンが挙げられるが、他の実施形態も当技術分野において公知である。
【００５９】
細胞破壊性遺伝子のさらなる例としては、突然変異サイクリンＧ１遺伝子が挙げられるが、これに限定されない。例として、細胞破壊性遺伝子は、サイクリンＧ１タンパク質のドミナントネガティブ突然変異体（例えば、国際公開第０１／６４８７０号パンフレット）であり得る。
【００６０】
以前、レトロウイルスベクター（ＲＶ）構築物は、一方が、レトロウイルスＬＴＲとパッケージング配列と対象となるそれぞれの遺伝子（単数または複数）とを含有し、もう一方のレトロウイルスベクターが、強力なプロモータ（例えば、ＣＭＶ）と外来性機能性配列の宿主とを含有する、２つの別個のレトロウイルス（ＲＶ）プラスミドのクローニングおよび融合によって、一般に生産されていた。本明細書に開示するｐＣ−ＲＥＸ  ＩＩ（ｅ−ＲＥＸ）ベクターは、前記実験遺伝子（単数または複数）の定方向クローニングを助長するための固有のセットのクローニング部位の挿入物を一次プラスミド内に含有する、改善されたプラスミドを指す。前記強力なプロモータ（例えば、ＣＭＶ）は、プラスミド主鎖において、レシピエントプロデューサー細胞内で産生されるＲＮＡメッセージの量を増加させるために利用されるが、遺伝子隣接レトロウイルスＬＴＲの外側に位置するので、それ自体はレトロウイルス粒子にパッケージングされない。
【００６１】
したがって、ＦＤＡによりヒトへの使用が以前に承認されたＧ１ｘＳｖＮａベクター内の戦略的部位に（ＰＣＲによって得られる）強力なＣＭＶプロモータを含め、このようにして、以前に報告されたベクターのプラスミドサイズおよび配列の懸念を無くした、改善されたプラスミドを設計した。この最新式の構築物をｐＣ−ＲＥＸと呼んだ。ＰＣ−ＲＥＸを、定方向クローニングおよび／または多数の遺伝子の挿入を可能にする一連の一意的クローニング部位（ｐＣ−ＲＥＸ  ＩＩにおけるＭＣＳ、図１１参照）と補助的機能性ドメインとを組み込むように、さらに修飾した。それ故、これらの新規プラスミドをｐＣ−ＲＥＸおよびｐＣ−ＲＥＸ  ＩＩ（ＥＰＥＩＵＳ−ＲＥＸまたはｅＲＥＸ）と呼ぶ。前記ｐＣ−ＲＥＸプラスミド設計は、直接サイドバイサイド比較でｐＨＩＴ−１１２／ｐＲＥＸのものより性能が優れている。前記新規プラスミド設計を、様々な治療有効ポリペプチドのコーディング配列を含むようにさらに修飾した。一例では、ドミナントネガティブサイクリンＧ１（ｄｎＧ１）を治療用遺伝子として含めた。前記三分節ウイルス粒子（ｅｎｖ、ｇａｇ−ｐｏｌ、およびｄｎＧ１遺伝子ベクター構築物）は、臨床試験の報告書ではひとまとめにしてＲＥＸＩＮ−Ｇと呼ばれている。したがって、ＲＥＸＩＮ−Ｇは、標的指向させた注射用ウイルス粒子にパッケージされ、封入され、包まれている、標的指向送達ベクターｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸを表す。
【００６２】
ＲＥＸＩＮ−Ｇ生産に用いられる系などの一過性プラスミドコトランスフェクション系において複製能のあるレトロウイルスが発生する可能性は低い。なぜなら、マウスに基づくレトロウイルスエンベロープ構築物、パッケージング構築物ｇａｇ  ｐｏｌ、およびレトロウイルスベクターは、それら独自のプロモータによって駆動される別個のプラスミドにおいて発現されるからである。加えて、ヒトプロデューサー細胞は、ビリオンを産生させるために使用される。ヒト細胞は、ＲＥＸＩＮ−Ｇにおいて用いられるマウスに基づくレトロウイルスベクターと組換えることができる内因性マウス配列を有さない。複製能のあるレトロウイルスの産生の可能性をさらに低下させるようにＲＥＸＩＮ−Ｇの生産が最近改善された。そのプラスミドｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸは、それぞれのｇａｇ−ｐｏｌ構築物に含有される５’ＤＮＡ配列とオーバーラップする可能性がある、残留ｇａｇ−ｐｏｌ配列を含有する。したがって、４８７塩基対を親ｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸプラスミドから除去し、その後、９７塩基対スプライスアクセプター部位を挿入して、ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸを生じさせた（図１５Ａ）。
【００６３】
標的指向性リガンドを、本明細書に開示するプラスミドに含める。一般に、プラスミドの核酸配列によってコードされたレトロウイルスエンベロープの天然（すなわち、未修飾）受容体結合領域の２つの連続した番号のアミノ酸残基の間に標的指向性リガンドを挿入し、例えば、修飾両栄養性ＣＡＥエンベロープポリペプチドの場合、標的指向性ポリペプチドをアミノ酸残基６と７の間に挿入する。前記ポリペプチドは、モロニーマウス白血病ウイルスの両栄養性エンベロープに含まれている、ｇｐ７０として公知のタンパク質の一部分である。一般に、前記標的指向性ポリペプチドは、コラーゲン（Ｉ型コラーゲンおよびＩＶ型コラーゲンを含む）、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、およびフィブロネクチンに結合する配列、例えばアルギニン−グリシン−アスパラギン酸、すなわちＲＧＤ、配列、をはじめとする（しかしこれらに限定されない）、細胞外マトリックス成分に結合する結合領域を含む。前記標的指向性ポリペプチドに含めることができる結合領域としては、フォン・ヴィレブランド因子またはその誘導体の中の機能性ドメインであるポリペプチドドメインが挙げられるが、これらに限定されず、そのようなポリペプチドドメインは、コラーゲンに結合する。１つの実施形態において、前記結合領域は、次の構造式を有するポリペプチドである。Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号：３）。
【００６４】
標的指向ベクターを生産するための方法
本開示は、ウイルスおよび非ウイルスベクター粒子の生産に関し、該ベクター粒子としては、レトロウイルスベクター粒子、アデノウイルスベクター粒子、アデノ関連ウイルスベクター粒子、ヘルペスウイルスベクター粒子、偽型化ウイルス、および修飾もしくは標的指向ウイルス表面タンパク質を有する非ウイルスベクター、例えば標的指向ウイルスエンベロープポリペプチドなど、が挙げられ、前述の修飾ウイルス表面タンパク質、例えば修飾ウイルスエンベロープポリペプチドは、コラーゲンなどの細胞外マトリックス成分に結合する結合領域を含む標的指向性ポリペプチドを含む。前記標的指向性ポリペプチドを、前記ウイルス表面タンパク質の２つの連続するアミノ酸残基の間に置くことができ、または前記ウイルス表面タンパク質から除去したアミノ酸残基の代わりに置くことができる。
【００６５】
遺伝子療法を果たすために最もよく用いられる送達系の１つは、ウイルスベクターを含み、最も一般的にはアデノウイルスおよびレトロウイルスベクターを含む。例示的なウイルスベースのビヒクルとしては、組換えレトロウイルス（例えば、国際公開第９０／０７９３６号パンフレット；国際公開第９４／０３６２２号パンフレット；国際公開第９３／２５６９８号パンフレット；国際公開第９３／２５２３４号パンフレット；米国特許第５，２１９，７４０号明細書；国際公開第９３／１１２３０号パンフレット；国際公開第９３／１０２１８号パンフレット；米国特許第４，７７７，１２７号明細書；英国特許第２，２００，６５１号明細書；欧州特許第０  ３４５  ２４２号明細書；および国際公開第９１／０２８０５号パンフレット参照）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、国際公開第９４／１２６４９号パンフレット；国際公開第９３／０３７６９号パンフレット；国際公開第９３／１９１９１号パンフレット；国際公開第９４／２８９３８号パンフレット；国際公開第９５／１１９８４号パンフレットおよび国際公開第９５／００６５５号パンフレット参照）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２年）３：１４７に記載されているような不活化（ｋｉｌｌｅｄ）アデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与も、利用することができる。
【００６６】
遺伝子送達のために、ウイルス粒子を、標的細胞に対して天然であるウイルスから発生させてもよいし、標的細胞に対して非天然であるウイルスから発生させてもよい。一般に、天然ウイルスベクターではなく非天然ウイルスベクターを使用するほうが望ましい。天然ウイルスベクターは、標的細胞に対して天然の親和性を有することがあるが、そのようなウイルスは、標的細胞内で増殖するより大きな可能性を有するので、より大きな危険を呈する。これに関しては、動物ウイルスベクターは、それらがヒト細胞内で増殖するように自然に設計されていない場合、ヒト細胞への遺伝子送達に有用であり得る。しかし、遺伝子送達での使用のために十分な量のそのような動物ウイルスベクターを得るためには、天然動物パッケージング細胞において生産を行う必要がある。しかし、このようにして生産されたウイルスベクターには、エンベロープの一部としてのまたはヒト細胞に対する親和性をもたらすことができるカプシドの一部としての一切の成分が通常ない。例えば、非ヒトウイルスベクターの生産のための現行の実務、例えばＭＭＬＶのような環境栄養性マウス（ネズミ）レトロウイルスは、マウスパッケージング細胞系において生産される。ヒト細胞親和性に必要とされる別の成分を供給しなければならない。
【００６７】
一般に、ウイルスベクターの（ヘルパーウイルスなしでの）増殖は、パッケージング成分の核酸配列が細胞ゲノムに安定的に組み込まれているパッケージング細胞において行われ、ウイルス核酸をコードする核酸がそのような細胞系に導入される。現在利用できるパッケージング系は、遺伝子療法利用のためのヒト細胞を形質導入するために十分な力価のプロデューサークローンを生じさせるので、ヒト臨床試験の開始に至っている。しかし、これらの系統では不十分である分野が２つある。
【００６８】
第一に、特定の用途に適するレトロウイルスベクターの設計には、数種類のベクター構成の構築および試験が必要である。例えば、Ｂｅｌｍｏｎｔら、Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８（１２）：５１１６−５１２５（１９８８年）は、１６のレトロウイルスベクターから安定したプロデューサー系を構築して、最高力価プロデューサーを生産することもでき最適な発現を生じさせることもできるベクターを同定した。調査された構成の一部は、次のものを含んだ。（１）ＬＴＲ駆動発現対内部プロモータ；（２）ウイルスまたは細胞遺伝子から誘導される内部プロモータの選択；および（３）選択可能マーカーが構築物に組み込まれたかどうか。安定したプロデューサー系を生成する必要なく迅速な高力価ウイルス生産を可能にするパッケージング系は、数種類の構築物から誘導される高力価プロデューサークローンの同定に必要とされるおおよそ二ヶ月を節約することとなる点で、非常に有利であろう。
【００６９】
第二に、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞と比較して、高力価両栄養性レトロウイルスプロデューサーでの哺乳類体細胞の初代培養物の感染効率は、かなり変動する。マウス筋芽細胞（Ｄｈａｗａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１５０９−１５１２（１９９１年））またはラット毛細管内皮細胞（Ｙａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８１０１−８１０５（１９９１年））の形質導入効率は、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のものにほぼ等しいことが証明されたが、イヌ肝細胞（Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６１４１−６１４５（１９９０年））の形質導入効率は、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞において見出されたもののわずか２５％であった。原発性ヒト腫瘍浸潤リンパ球（「ＴＩＬ」）、末梢血リンパ球から単離されたヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに霊長類長期再構成造血幹細胞は、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞と比較して低い形質導入効率の極端な例の代表である。精製ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、安定したプロデューサークローンからの上清で６％〜９％のレベルまで感染されたと、かつて報告されている（Ｍｏｒｅｃｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３２：３４２−３５２（１９９１年））。レトロウイルスベクターが、ｎｅｏＲ遺伝子を含有する場合、形質導入細胞が高度に富化されている集団をＧ４１８における選択によって得ることができる。しかし、選択可能マーカー発現は、造血幹細胞におけるインビボでの長期遺伝子発現に対して有害な影響を及ぼすことが証明された（Ａｐｐｅｒｌｙら、Ｂｌｏｏｄ  ７８：３１０−３１７（１９９１年））。
【００７０】
これらの限界を克服するために、新規一過性トランスフェクションパッケージング系のための方法および組成物を提供する。このレトロウイルスベクター設計の改善は、次のことを可能にする。（１）先行技術を代表する厄介なプラスミドクローニングおよび融合手順の代替、（２）監督官庁（すなわち、ＦＤＡ）の承認を得る点から試薬を妥協することとなる、親構築物における過度な融合および突然変異を回避する、単一の簡単なプラスミド構築の提供、（３）結果として得られるレトロウイルスベクター内の余分な、効力のない、および／または望ましくない配列の削除、（４）選択のより大きな自由度、および治療用遺伝子構築物のレトロウイルスベクターへの定方向クローニング、（５）レトロウイルスベクター内の様々な補助ドメインの分子クローニングの助長、（６）ベクタープロデューサー細胞に関連して親プラスミドの性能を証明可能に増加させる、およびしたがってレトロウイルスベクター産物の結果として生ずる作用強度を増大させる、戦略的修飾の導入、（７）プラスミド生産を、生物発酵における「低コピー数、低収率」試薬から中間的収率のものに増加させる程度に、レトロウイルスベクター構築物の全サイズを有意に縮小すること。まとめると、これらの修飾は、現在使用されているレトロウイルスベクターの（ベクター安全性、遺伝子組み込みおよび遺伝子発現の点での）良さを保持しながら、ヒト遺伝子療法のための有望なレトロウイルスベクターの構築、検証、製造および性能の有意な改善をもたらす。これは、Ｃ−ＲＥＸベクターと呼ばれる高性能レトロウイルス発現ベクターを含むＴＤＳの第二の成分を象徴する。
【００７１】
一過性トランスフェクションは、パッケージング細胞法を超える非常に多くの利点を有する。これに関しては、一過性トランスフェクションは、安定したベクター生産細胞系を産生させるために必要とされるより長い時間を回避し、またベクターゲノムまたはレトロウイルスパッケージング成分が細胞に対して毒性である場合に使用される。ベクターゲノムが、毒性遺伝子、または宿主細胞の複製に干渉する遺伝子、例えば、細胞周期阻害剤、もしくはアポトーシスを誘導する遺伝子をコードする場合、安定したベクター生産細胞系を産生させることは困難であり得るが、一過性トランスフェクションを用いて、細胞死の前に該ベクターを生産することができる。また、安定したベクター生産細胞系から得られるレベルに匹敵するベクター力価レベルを生じさせる一過性感染を用いて細胞系が発生された（Ｐｅａｒら、１９９３年、ＰＮＡＳ  ９０：８３９２−８３９６）。
【００７２】
高いバルク力価および生物活性を有する細胞破壊性遺伝子構築物を保有するレトロウイルスベクターストックの大規模生産のための高効率製造プロセスを提供する。この製造プロセスは、一過的にトランスフェクトされた２９３Ｔプロデューサー細胞の使用；プロデューサー細胞の遺伝子操作法の規模拡大；および高忠実度で細胞破壊性遺伝子発現を保持するレトロウイルスベクターを産生させる一過性トランスフェクション手順を説明するものである。
【００７３】
もう１つの実施形態では、臨床用レトロウイルスベクター生産のための十分に検証された２９３Ｔ（ＳＶ４０ラージＴで形質転換されたヒト胚性腎細胞）マスター細胞バンクを提供する。２９３Ｔ細胞は、実験室用の少量の中力価から高力価ベクターストックを産生したが、これらのプロデューサー細胞は、臨床用ベクターストックの大規模生産に有用であると以前に証明されていない。他の実施形態において、前記製造プロセスは、レトロウイルス粒子の収集、続いてのレトロウイルス粒子の加工、ベクター回収および収集の最終段階、レトロウイルス粒子の濃縮中、治療用レトロウイルス粒子の保管前、および／またはレトロウイルス粒子の投与直前を含めて、治療用レトロウイルス産物の調製にＤＮＡ分解法を組み込み、結果としてベクター作用強度を一切喪失しない。ＤＮＡ分解段階は、ＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＴＵＲＢＯ（商標）Ｄｎａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）、Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｓａｆｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））での処理を含み得る。一部の実施形態では、０．１〜１０単位／ｍＬ；０．５〜５単位／ｍＬ；１〜４単位／ｍＬまたは１単位／ｍＬのＤＮａｓｅ  Ｉを添加して、治療用レトロウイルスベクター調製から無傷の発癌遺伝子を除去する。
【００７４】
もう１つの実施形態において、治療用途のためのレトロウイルスベクターストックの濃縮および１×１０９ｃｆｕ／ｍＬに迫る臨床用ベクター製品の一貫した産生のための方法を提供する。一部の実施形態において、前記臨床用ベクター製品の濃度は、少なくとも１×１０７ｃｆｕ／ｍＬである。他の実施形態において、前記臨床用ベクター製品の濃度は、少なくとも１×１０８ｃｆｕ／ｍＬである。さらに他の実施形態において、前記臨床用ベクター製品の濃度は、少なくとも１×１０９ｃｆｕ／ｍＬである。前記臨床用製品の最終調合物は、高力価臨床用ベクターストックの回収、収集および保管のための化学的に定義された無血清溶液から成る。
【００７５】
もう１つの実施形態において、無菌の維持、品質制御検体のサンプリングおよび最終充填の助長のためのシステムを用いる、臨床用ベクターまたは治療用レトロウイルスベクター粒子の収集方法を提供する。一例は、臨床用製品の収集に求められる規格、すなわちサンプリング中の無菌の維持、を満たすように設計された閉ループマニホールドアセンブリであり、市販品として入手できない。本明細書に開示するウイルス粒子の回収のための閉ループマニホールドアセンブリは、エチルビニルアセテート（ＥＶＡ）の流体接触層、エチルビニルアルコール（ＥＶＯＨ）の気体遮断層およびＥＶＡの外層から成る３層共押出フィルムを含むＳｔｅｄｉｍ  ７１フィルムで作られたフレックスボディーバッグおよびマニホールドシステムを含む。全フィルム厚は、３００ｍｍである。ＥＶＡは、不活性非ＰＶＣ系フィルムであって、可塑剤の添加を必要とせず、その結果、抽出物を最小に保つフィルムである。Ｓｔｅｄｉｍは、この製品について広範な生体適合性試験を実施し、ＦＤＡによるドラッグ・マスター・ファイルを確立した。前記フィルムおよびポートチューブは、ＵＳＰクラスＶＩ要件を満たしている。バッグのカスタマイズはすべてＳｔｅｄｉｍのクラス１０，０００管理製造環境で行われる。使用するフィルム、管材料およびすべての部品は４５ｋＧｙまでのガンマ線適合性である。ガンマ線照射は最低暴露２５ｋＧｙから最大４５ｋＧｙまでで実施される。Ｓｔｅｄｉｍからも、その契約滅菌業者からも、製品品質適合書が提供されている。前記閉ループマニホールドシステムを、前記治療用レトロウイルスベクター粒子の濃縮、最終充填ならびに／または保管にも使用することができる。さらに他の実施形態では、例えば、０．２２μｍ孔径を有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ遠心濾過機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、または利用可能な任意の他の濾過滅菌システムを使用して、前記レトロウイルス粒子を収集および濾過滅菌する。さらに他の実施形態では、遠心分離、フロキュレーション、試薬結合、カラム精製、および臨床用途のレトロウイルスベクター粒子を濃縮するために用いられる他の手段を用いて、前記レトロウイルスベクター粒子を濃縮する。
【００７６】
前記臨床用レトロウイルスベクターを低温、例えば−８０℃、で長期間にわたって保管することができる。前記臨床用レトロウイルスベクターを−８０℃で、１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬ、１００ｍＬ、１１０ｍＬ、１２０ｍＬ、１３０ｍＬ、１４０ｍＬまたは１５０ｍＬの体積で保管することもできる。前記臨床用レトロウイルスベクター製品を、ガラスバイアル、クリオバッグおよびこれらに類するものをはじめとする、長期間の低温保管条件の間、該製品を保護する任意の適する容器の中で保管することができる。
【００７７】
前記十分に検証された製品は、少なくとも１×１０７ｃｆｕ／ｍＬ、少なくとも３×１０７ｃｆｕ／ｍＬ、少なくとも５×１０７ｃｆｕ／ｍＬ、少なくとも８×１０７ｃｆｕ／ｍＬ、少なくとも１×１０８ｃｆｕ／ｍＬ、少なくとも５×１０８ｃｆｕ／ｍＬ、少なくとも１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ、少なくとも５×１０９ｃｆｕ／ｍＬ、少なくとも１×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ、少なくとも５×１０１０ｃｆｕ／ｍｌのウイルス力価を呈示する。前記十分に検証された製品はまた、ヒト乳、結腸および膵臓癌細胞において少なくとも６５〜７０％、少なくとも５０〜７５％、少なくとも４５〜７０％、少なくとも３５〜５０％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％または少なくとも１０％成長阻害活性の生体作用強度を有し得る。前記十分に検証された製品はまた、ウイルス凝集のない、〜１０ｎｍ、〜２０ｎｍ、〜５０ｎｍ、〜１００ｎｍ、〜２００ｎｍ、〜３００ｎｍ、〜４００ｎｍ、〜５００ｎｍ、〜６００ｎｍ、〜７００ｎｍ、〜８００ｎｍまたは〜１０００ｎｍの均一粒径を有し得る。前記十分に検証された産物はまた、５５０ｂｐ未満の残留ＤＮＡ、５００ｂｐ未満の残留ＤＮＡ、４００ｂｐ未満の残留ＤＮＡ、３００ｂｐ未満の残留ＤＮＡ、２００ｂｐ未満の残留ＤＮＡまたは１００ｂｐ未満の残留ＤＮＡを有し得、これは、無傷の発癌遺伝子の不在を示す。前記十分に検証されたものはまた、検出可能なＥ１ＡまたはＳＶ４０ラージＴ抗原を有さず、ｍｕｓ  Ｄｕｎｎｉおよびヒト２９３細胞での５継代の間、検出可能な複製能のあるレトロウイルス（ＲＣＲ）を有さない。前記十分に検証された製品は、＜０．３ＥＵ／ｍＬ、＜０．２ＥＵ／ｍＬ、＜０．１ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンレベルで無菌であり、生産終了時の細胞には、マイコプラズマおよび他の外来性ウイルスがない。
【００７８】
前記新規ｐＢ−ＲＶＥおよびｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドを使用して生産したＲＥＸＩＮ−Ｇを、２０〜４０ｍＬの体積で、１５０ｍＬプラスチッククリオバッグの中で、−７０±１０℃で保管した。前記臨床ロットの力価は、０．５から５．０×１０９単位（Ｕ）／ｍＬの範囲であり、各ロットは、複製能のあるレトロウイルス（ＲＣＲ）がないこと、ならびにヒトにおける全身使用のために必要な純度、生体作用強度、無菌性および全般的安全性がないことが検証された。
【００７９】
前記ウイルスエンベロープは、フィブロネクチンを結合するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸、すなわちＲＧＤ、配列、および同じくフィブロネクチンに結合する、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ（配列番号：４）を有するポリペプチドを含む（しかし、これらに限定されない）、標的指向性リガンドを含む。結合領域に加えて、前記標的指向性ポリペプチドは、結合領域のＮ末端および／またはＣ末端に位置するアミノ酸残基数１以上のリンカー配列をさらに含むことができ、それによって、そのようなリンカーが、該修飾エンベロープポリペプチドの回転自由度を増加させる、および／または立体障害を最小にする。前記ポリヌクレオチドは、当業者に公知の遺伝子操作技術によって構築することができる。
【００８０】
したがって、本発明に従って作られる標的指向送達ベクターは、標的部位での該ベクターの蓄積を助長するリガンド、すなわち標的特異的リガンド、を該ベクターと会合した状態で含有する。前記リガンドは、選ばれた標的と特異的反応性であるが、他の標的との反応性が低い化学的部分、したがって治療用または診断用ポリペプチドをコードする核酸を選ばれた標的の付近の細胞に選択的に移動させる利点を標的指向送達ベクターにもたらす化学的部分、例えば、分子、官能基またはそれらのフラグメントである。「反応性」であるとは、細胞もしくは組織への結合親和性を有すること、または細胞に内在化できることを意味し、この場合の結合親和性は、当技術分野において公知の任意の手段によって、例えば、任意の標準的なインビトロアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、表面プラズモン共鳴など、によって検出可能である。通常、リガンドは、特定の分子部分〜エピトープ、例えば分子、官能基、または細胞もしくは組織と会合した分子複合体、に結合して、２構成員の結合対を形成する。結合対におけるいずれの構成員がリガンドであってもよいが、他方はエピトープであることは理解される。そのような結合対は、当技術分野において公知である。例示的結合対は、抗体−抗原、ホルモン−受容体、酵素−基質、栄養素（例えば、ビタミン）−輸送タンパク質、成長因子−成長因子受容体、炭水化物−レクチン、および相補配列を有する２つのポリヌクレオチドである。前記リガンドのフラグメントをリガンドとみなすこともでき、そのフラグメントが適切な細胞表面エピトープに結合する能力を保持する限り、本発明に使用することができる。好ましくは、前記リガンドは、免疫グロブリンの抗原結合配列を含む、タンパク質およびペプチドである。さらに好ましくは、前記リガンドは、Ｆｃ配列を欠く抗原結合抗体フラグメントである。そのような好ましいリガンドは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメント、免疫グロブリンのＦ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント、または一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントである。これらのフラグメントを酵素的に誘導することができ、または組換え生産することができる。それらの機能性の態様に関して、前記リガンドは、好ましくは内在化可能リガンド、すなわち、選ばれた細胞によって、例えばエンドサイトーシスのプロセスによって、内在化されるリガンドである。同様に、置換または他の改変を有するが、エピトープ結合能力を保持するリガンドも使用することができる。有利には、病的細胞、例えば悪性細胞または感染性因子、を認識するリガンドを選択する。例えば露出したコラーゲンに結合するリガンドは、悪性組織を含む被験者のエリアにベクターを標的指向させることができる。一般に、身体の別のエリアに転移した細胞は、健常組織に侵入しそれを破壊することによって転移する。この侵入がコラーゲンを露出させる結果となり、本明細書に記載するベクターをそのコラーゲンに標的指向させることができる。
【００８１】
ベクターを標的指向させるために使用することができるリガンドのさらなる群は、多くの腫瘍において細胞表面で過発現されるチロシンキナーゼ成長因子受容体と結合対を形成するものである。例示的チロシンキナーゼ成長因子は、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＩＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、ＴＧＦ−アルファ受容体、ＴＧＦ−ベータ受容体、ＨＢ−ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ２受容体、ＥｒｂＢ３受容体およびＥｒｂＢ４受容体である。ＥＧＦ受容体ｖＩＩＩおよびＥｒｂＢ２（ＨＥｒ２）受容体は、ＩＮＳＥＲＴＳを使用する癌処置の状況では特に好ましい。これらの受容体は、悪性細胞に対してより特異的であるが、正常細胞上には稀であるからである。あるいは、有益な遺伝子の導入による遺伝子修正または遺伝子改変を必要とする細胞、例えば肝臓細胞、上皮細胞、遺伝的欠損を有する動物における内分泌細胞、インビトロ胚細胞、生殖細胞、幹細胞、生殖細胞、ハイブリッド細胞、植物細胞、または工業プロセスで使用される任意の細胞、を認識するリガンドを選択する。
【００８２】
前記リガンドを、当技術分野において利用できる任意の適する方法によって、ウイルス粒子の表面で発現させることができ、または非ウイルス粒子に連結させることができる。前記連結は、共有結合性であってもよいし、または非共有結合性、例えば吸着または複合体形成などによるもの、であってもよい。前記連結は、好ましくは共有結合または非共有結合を形成することによりリガンドにコンジュゲートすることができる、「アンカー」と呼ばれる、親油性分子部分を含む。アンカーは、親油性環境、例えば脂質ミセル、二重層および他の凝縮相、に対する親和性を有し、それによってリガンドを脂質−核酸ミクロ粒子に連結させる。親油性アンカーによるリガンド連結方法は、当技術分野において公知である。（例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、Ｊ．Ｒ．ＰｈｉｌｉｐｐｏｔおよびＦ．Ｓｃｈｕｂｅｒ編集、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９５、２１−３７頁におけるＦ．Ｓｃｈｕｂｅｒ、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ」参照）。
【００８３】
本明細書に開示する標的指向送達ベクターまたは標的指向療法用ベクターは、ウイルスおよび非ウイルス粒子を含むことは理解される。非ウイルス粒子は、脂質二重層に封入された核タンパク質（完全または部分集合ウイルス粒子を含む）を含む。脂質二重層へのウイルスの封入方法は、当技術分野において公知である。それらは、脂質二重層密閉粒子（リポソーム）への受動的捕捉、およびビリオンとリポソームのインキュベーションを含む（米国特許第５，９６２，４２９号明細書；Ｆａｓｂｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６４７９−６４８９；ＨｏｄｇｓｏｎおよびＳｏｌａｉｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３３９−３４２（１９９６年））。理論によって制限させることなく、本発明者らは、ビリオンの表面に露出した酸性タンパク質が、標的指向送達ベクターまたは標的指向療法用ベクターのカチオン性脂質／カチオン性ポリマー成分との複合体形成のための界面を提供し、天然脂質成分による二重層形成のための「足場」として役割を果たすと考える。ウイルスの例示的タイプは、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスおよびバクテリオファージである。
【００８４】
例えばカチオン性リポソームおよびポリカチオンを含む、ミクロ粒子またはナノ粒子などの、非ウイルス性送達系は、送達系のための代替法を提供し、本開示に包含される。
【００８５】
非ウイルス性送達系の例としては、例えば、Ｗｈｅｅｌｅｒら、米国特許第５，９７６，５６７号および同第５，９８１，５０１号明細書が挙げられる。これらの特許には、プラスミドの水溶液とカチオン性および非カチオン性脂質を含有する有機溶液とを接触させることによる血清安定性プラスミド−脂質粒子の調製が開示されている。Ｔｈｉｅｒｒｙら、米国特許第６，０９６，３３５号明細書には、全体的にアニオン性の生物活性物質とカチオン性構成要素とアニオン性構成要素とを含む複合体の調製が開示されている。ＡｌｌｅｎおよびＳｔｕａｒｔ、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２９３７（国際公開第９８／５８６３０号パンフレット）には、カチオン性脂質の可溶化に適する脂質溶媒中のポリヌクレオチド−カチオン性脂質粒子を形成すること、それらの粒子を含有する溶媒への中性小胞形成脂質に添加すること、およびその脂質溶媒を蒸発させて、ポリヌクレオチドが中に捕捉されているリポソームを形成することが開示されている。ＡｌｌｅｎおよびＳｔｕａｒｔ、米国特許第６，１２０，７９８号明細書には、第一の、例えば水性溶媒にポリヌクレオチドを溶解し、前記第一の溶媒と不混和性の第二の、例えば有機溶媒に脂質を溶解すること、第三の溶媒を添加して単一相の形成を果たすこと、そしてさらに一定量の第一および第二の溶媒を添加して２つの液相の形成を果たすことによる、ポリヌクレオチド−脂質ミクロ粒子の形成が開示されている。Ｂａｌｌｙら、米国特許第５，７０５，３８５号明細書およびＺｈａｎｇら、米国特許第６，１１０，７４５号明細書には、核酸と、非カチオン性脂質およびカチオン性脂質を含有する溶液とを接触させて、脂質−核酸混合物を形成することによる、脂質−核酸粒子の調製方法が開示されている。Ｍａｕｒｅｒら、ＰＣＴ／ＣＡ００／００８４３（国際公開第０１／０６５７４号パンプレット）には、荷電治療薬の完全脂質封入治療薬粒子の調製方法が開示されており、この方法は、小胞を不安定化するが破壊しない不安定化溶媒中で既成脂質小胞と荷電治療薬と不安定化剤とを併せて混合物を形成する段階、およびその後、前記不安定化剤を除去する段階を含む。
【００８６】
粒子形成成分（「ＰＦＣ」）は、典型的に、カチオン性脂質などの脂質を、場合によってはカチオン性脂質以外のＰＦＣとの組み合わせで、含む。カチオン性脂質は、脂質であって、その分子が、電離して約３から約１０のｐＨ範囲の、好ましくは約４から約９の生理ｐＨ範囲の、正味正イオン電荷を生じさせることができるものである脂質である。そのようなカチオン性脂質は、例えば、カチオン性洗剤、例えば、一本の炭化水素鎖を有するカチオン性両親媒性物質を含む。特許および科学文献には、核酸トランスフェクション増進特性を有する非常に多数のカチオン性脂質が記載されている。これらのトランスフェクション増進性カチオン性脂質としては、例えば、１，２−ジオレイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニオ）プロパンクロリド−、ＤＯＴＭＡ（米国特許第４，８９７，３５５号明細書）；ＤＯＳＰＡ（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら、Ｆｏｃｕｓ  １５（３）：７３（１９９３）参照）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アンモニウムブロミド、またはＤＤＡＢ（米国特許第５，２７９，８３３号明細書）；１，２−ジオレイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニオ）プロパンクロリド−ＤＯＴＡＰ（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：３９１７−３９２５（１９８８年））；グリセロール系脂質（Ｌｅｖｅｎｔｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０２３：１２４（１９９０年）参照）；アルギニル−ＰＥ（米国特許第５，９８０，９３５号明細書）；リシニル−ＰＥ（Ｐｕｙａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２８：６９７（１９９５年））、リポポリアミン（米国特許第５，１７１，６７８号明細書）およびコレステロール系脂質（国際公開第９３／０５１６２号パンフレット、米国特許第５，２８３，１８５号明細書）；ＣＨＩＭ（１−（３−コレステリル）−オキシカルボニル−アミノメチルイミダゾール）；およびこれらに類するものが挙げられる。トランスフェクションのためのカチオン性脂質は、例えば、Ｂｅｈｒ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５：３８２−３８９（１９９４年）において総説されている。好ましいカチオン性脂質は、ＤＤＡＢ、ＣＨＩＭ、またはそれらの組み合わせである。カチオン性洗剤であるカチオン性脂質の例としては、（Ｃ１２〜Ｃ１８）−アルキル−および（Ｃ１２〜Ｃ１８）−アルケニル−トリメチルアンモニウム塩、Ｎ−（Ｃ１２〜Ｃ１８）−アルキル−およびＮ−（Ｃ１２〜Ｃ１８）−アルケニル−ピリジニウム塩、ならびにこれらに類するものが挙げられる。
【００８７】
本発明に従って形成される標的指向送達ベクターまたは標的指向療法用ベクターのサイズは、約４０から約１５００ｎｍの範囲内、好ましくは約５０〜５００ｎｍの範囲、および最も好ましくは約２０〜１５０ｎｍの範囲である。有利には、このサイズ選択は、標的指向送達ベクターを身体に投与したとき、その標的指向送達ベクターが、血管から悪性腫瘍などの罹病組織に浸透し、そこに治療用核酸を移入することを助長する。例えば動的光散乱法によって測定して、そのサイズが細胞外生体液、例えばインビトロ細胞培養基または血漿、の存在下で実質的に増加しないことも、前記標的指向送達ベクターの特徴および有利な特性である。
【００８８】
あるいは、Ｃｕｌｖｅｒら（１９９２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６、１５５０−１５５２に記載されているように、レトロウイルスを生産する細胞を腫瘍に注射することができる。そのように導入されるレトロウイルス生産細胞は、ウイルスベクター粒子などの標的指向送達ベクターを能動的に生産するように遺伝子操作されるので、該ベクターの連続生産が腫瘍塊内でインサイチューで起こる。このように、レトロウイルスベクター生産細胞と混合すると、増殖性腫瘍細胞をインビボで首尾よく形質導入することができる。
【００８９】
処置方法
本発明の標的指向ベクターは、突然変異体サイクリン−Ｇポリペプチドなどの治療薬をコードする核酸を送達するための遺伝子療法プロトコルの一部として使用することもできる。したがって、本発明のもう１つの態様は、転移新生物障害に関係づけられる細胞タイプを含む被験者のエリアへの治療薬のインビボまたはインビトロトランスフェクションのための発現ベクターを特徴とする。本明細書に提供する標的指向ベクターは、遺伝子療法用のベクターとしての使用を意図したものである。突然変異体サイクリン−Ｇポリペプチドおよび核酸分子を使用して、他の標的指向ベクター内の対応する遺伝子を置換することができる。あるいは、本明細書に記載する標的指向ベクター（例えば、コラーゲン結合ドメインを含むもの）は、任意の治療薬（例えば、チミジンキナーゼ）をコードする核酸を含有することができる。新生物障害の処置に有用な治療薬が対象となる。
【００９０】
本研究は、インビボヒト臨床試験から生じたデータを提供する。それでもやはり、本明細書に開示する標的指向ベクターのさらなる毒性および治療有効性を、細胞培養または実験動物での標準的な薬学的手順、例えばＬＤＳ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を判定するためのもの、によって判定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、それを比ＬＤ５０／ＥＤ５０と表現することができる。大きな治療指数を呈示する用量が好ましい。本発明では、毒性副作用を通常は提示する用量を使用することができる。なぜなら、本治療用の系は、処置部位に標的指向させて、未処置細胞への障害を最小化するおよび副作用を低減させるように設計されているからである。
【００９１】
ヒト臨床試験（下記参照）から得たデータは、本発明の標的指向ベクターが、新生物障害の進行を阻害するようにインビボで機能することを立証する。表１のデータは、患者へのそのようなベクターの投与のための処置レジメンを提供するものである。加えて、前記標的指向ベクターの代替形態（例えば、代替標的指向化機序または代替治療薬）を使用する細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトにおいて使用するための投薬範囲の処方に用いることができる。投薬量は、好ましくは、ほとんどまたはまったく毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内に存する。前記投薬量は、利用する剤形および利用する投与経路に依存してこの範囲内で変動することがある。治療有効量を最初に細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、半最大感染または半最大阻害を果たす被験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を実現するような用量を動物モデルにおいて処方することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって、測定することができる。
【００９２】
標的指向送達ベクターを含有する医薬組成物は、選択された量のベクターと１つ以上の生理的に許容される担体または賦形剤とを混合することによる任意の従来の手法で、調合することができる。例えば、標的指向送達ベクターをＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）などの担体に懸濁させてもよい。活性化合物を任意の適切な経路によって、例えば経口的に、非経口的に、静脈内に、皮内に、皮下にまたは局所的に、液体、半液体または固体形態で投与することができ、およびそれぞれの投与経路に適する手法で調合する。
【００９３】
標的指向送達ベクターを、該ベクターの局部濃度を増加させるように投与することもできる。例えば、標的指向送達ベクターを、特定の器官系への標的指向送達ベクトルの局部濃度を増加させる動脈内注入によって、投与することができる。標的病変の位置に依存して、肝動脈へのカテーテル留置、続いての膵十二指腸、右肝および中肝動脈への注入をそれぞれ行うことができ、これによって局部的に肝病変に標的指向させることができるだろう。標的指向送達ベクターの限局分布を、カテーテル留置または他の限局送達系により、肺、胃腸、脳、生殖、脾臓または他の被定義器官系をはじめとする他の器官系に指向させることができる。動脈内注入を、肝動脈、大脳動脈、冠動脈、肺動脈、腸骨動脈、腹腔動脈、胃動脈、脾動脈、腎動脈、生殖腺動脈、鎖骨下動脈、椎骨動脈、腋窩動脈、上腕動脈、橈骨動脈、尺骨動脈、頚動脈、大腿動脈、下腸間膜動脈および／または上腸間膜動脈経由の注入をはじめとする（しかしこれらに限定されない）、任意の他の利用可能な動脈源経由で、行うこともできる。動脈内注入は、血管内手順、経皮手順または直視下手術アプローチを用いて果たすことができる。
【００９４】
前記標的指向送達ベクターおよび生理的に許容される塩および溶媒和物を、吸入法もしくは通気法による（口もしくは鼻経由いずれかでの）投与用に、または経口、頬側、非経口もしくは直腸内投与用に調合することができる。吸入法による投与については、前記標的指向送達ベクターを、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適するガス、を使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエーロゾルスプレー提示の形態で送達することができる。加圧エーロゾルの場合は、計量された量を送達するようにバルブを設けることにより、投薬単位を決めることができる。治療用化合物と適する粉末基材、例えばラクトースまたはデンプン、との粉末混合物を収容している、吸入器または通気器で使用するための例えばゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジを、組み立ててもよい。
【００９５】
経口投与のための医薬組成物は、例えば、医薬的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、を用いて従来の手段により調製した錠剤またはカプセルの形態をとり得る。当技術分野において周知の方法によって錠剤をコーティングしてもよい。経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップもしくは懸濁液の形態をとることがあり、または使用前に水もしくは他の適するビヒクルで再構成するための乾燥製品としてそれらを提供することができる。そのような液体製剤は、医薬的に許容される添加剤、例えば懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）、非水性ビヒクル（例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）および保存薬（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）、を用いて従来の手段によって調製することができる。前記製剤は、緩衝塩、着香剤、着色剤および甘味剤も、適宜、含有し得る。
【００９６】
経口投与のための製剤は、活性化合物の制御放出をもたらすように適切に調合することができる。頬側投与のための組成物は、従来の手法で調合された錠剤またはロゼンジの形態をとり得る。
【００９７】
前記標的指向送達ベクターを、注射による、例えばボーラス注射または持続注入による、非経口投与用に調合することができる。注射用の調合物は、保存薬を添加した単位剤形で、例えば、アンプルまたは多回投与容器内に入れて提供することができる。前記組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとり得、調合剤、例えば懸濁化剤、安定剤および／または分散剤、を含有し得る。あるいは、前記活性成分は、使用前に適するビヒクル、例えば滅菌発熱物質不含水、で構成するための粉末凍結乾燥形態であり得る。
【００９８】
前に説明した調合物に加えて、前記標的指向送達ベクターをデポー製剤として調合することもできる。そのような長時間作用性調合物は、埋め込みによって（例えば、皮下的にもしくは筋肉内的に）、または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、前記治療用化合物を、適する高分子もしくは疎水性材料を用いて（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）もしくはイオン交換樹脂を用いて、またはやや溶けにくい誘導体として、例えばやや溶けにくい塩として、調合することができる。
【００９９】
前記活性薬剤を、局部または局所適用のために、例えば、皮膚および粘膜、例えば眼内の粘膜、への局所適用のために、ゲル、クリームおよびローションの形態で、ならびに眼への適用のために、または槽内もしくは髄腔内適用のために調合することができる。そのような溶液、特に眼科使用を意図したものは、適切な塩を用いて、０．０１％〜１０％等張溶液、ｐＨ約５〜７、として調合することができる。前記化合物を、例えば吸入法による、局所投与のためのエーロゾルとして調合することができる。
【０１００】
前記薬組成物中の活性化合物の濃度は、該活性化合物の吸収、不活化および排泄速度、投薬スケジュール、ならびに投与される量、ならびに当業者に公知の他の要因に依存するであろう。例えば、送達される量は、高血圧の症状の処置に十分な量である。
【０１０１】
前記組成物は、必要に応じて、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を収容することができるパックまたはディスペンサーデバイスに入れて提供することができる。前記パックは、例えば、金属またはプラスチックホイル、例えばブリスターパック、を含むことがある。前記パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための指示書を伴うことがある。
【０１０２】
前記活性薬剤を、包装材料と、本明細書において提供する薬剤と、該薬剤を与える障害を示すラベルとを含む製品として、包装することができる。
【０１０３】
サイトカイン遺伝子を含む標的指向レトロウイルス粒子を、単独で投与することができ、または他の治療薬もしくは活性薬剤とともに投与することができる。例えば、サイトカイン遺伝子を含む標的指向レトロウイルス粒子を、細胞破壊性遺伝子を含む標的指向レトロウイルス粒子とともに投与することができる。投与すべき細胞破壊性遺伝子を含む標的指向レトロウイルス粒子の量は、本明細書において上で説明したようなウイルス粒子の力価に基づく。例として、サイトカイン遺伝子を含む標的指向レトロウイルス粒子を、細胞破壊性遺伝子を含む標的指向レトロウイルス粒子とともに投与する場合、各ベクターについてのレトロウイルス粒子の力価は、各ベクターを単独で使用する場合より低くてよい。サイトカイン遺伝子を含む標的指向レトロウイルス粒子を、細胞破壊性遺伝子を含む標的指向レトロウイルス粒子と同時に投与することができ、または別々に投与することができる。
【０１０４】
本発明の方法は、標的指向レトロウイルス粒子（例えば、サイトカインを発現する標的指向レトロウイルスベクター、単独で、または細胞破壊性遺伝子を発現する標的指向レトロウイルスベクターとともに）を１つ以上の他の活性薬剤とともに投与することによる、癌の処置方法にも関する。使用することができる他の活性薬剤の例としては、化学療法薬、抗炎症薬、プロテアーゼ阻害剤、例えばＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体、例えばＡＺＴ、が挙げられるが、これらに限定されない。１つ以上の活性薬剤を、１つ以上の活性薬剤と同時に投与することができ、または別々に（例えば、標的指向レトロウイルス粒子の投与前にもしくは標的指向レトロウイルス粒子の投与後に）投与することができる。前記標的指向レトロウイルス粒子を前記１つ以上の薬剤と同じ経路で投与することができ（例えば、前記標的指向レトロウイルスベクターと前記薬剤を両方とも静脈内投与する）、または異なる経路によって投与することができる（例えば、前記標的指向レトロウイルスベクターを静脈内投与し、前記１つ以上の薬剤を経口投与する）ことは、当業者には理解されるであろう。
【０１０５】
処置を必要とする被験者に投与すべき有効量のまたは治療有効量の標的指向レトロウイルス粒子を、様々な方法で決定することができる。例として、前記量は、動物モデルでのウイルス力価または有効性に基づき得る。あるいは、臨床試験で用いた投薬レジメンを一般ガイドラインとして用いることができる。日用量を単回用量で投与することができ、またはその日の様々な時間に少しずつ投与することができる。最初に、より高い投薬量を必要とすることができ、最適な初期反応が得られたらその投薬量を継時的に低減させることができる。例として、処置は、数日、数週間もしくは数年継続することもあり、または休薬期間を間に挟んで時々であることもある。投薬量は、その個体が受け得る他の処置に従って変更することができる。しかし、前記処置方法は、前記標的指向レトロウイルス粒子の特定の濃度または範囲に決して限定されず、処置される個体ごとにおよび使用される誘導体ごとに変えることができる。
【０１０６】
所与の個体について最大効果を実現するために投薬量の個別化が必要とされ得ることは、当業者には理解されるであろう。さらに、当業者には、処置する個体に投与する投薬量が、その個体の年齢、疾患の重症度またはステージ、および処置コースに対する反応に依存して変動し得ることが分かる。本明細書に記載する方法によって処置される個体について適正な投薬量を決定するために評価する臨床パラメータは、当業者に公知であるだろう。投薬量を決定するために評定され得る臨床パラメータとしては、腫瘍サイズ、特定の悪性疾患について臨床試験をする際に使用される腫瘍マーカーのレベルの変化が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなパラメータに基づいて、処置する医師は、所与の個体について使用すべき治療有効量を決定することとなる。そのような治療を必要に応じた頻度でおよび処置する医師によって必要と判断された期間にわたって投与することができる。
【０１０７】
標的指向療法用レトロウイルス粒子を含む（しかしこれに限定されない）、標的指向療法用ベクトルを、処置を必要とする被験者に全身的にまたは局所的に（局部的に）送達することができる。例えば、前記標的指向療法用ベクターを全身、静脈内投与することができる。あるいは、前記標的指向療法用ベクターを動脈内投与することもできる。前記標的指向療法用ベクターを、局所、静脈内、動脈内、結腸内、気管内、腹腔内、鼻腔内、血管内、髄腔内、頭蓋内、骨髄内、胸膜内、皮内、皮下、筋肉内、眼内、骨内および／または関節滑液嚢内投与することもできる。送達方式の組み合わせを用いてもよく、例えば、患者は、標的指向療法用ベクターを全身にも局所的に（局部的に）も受けて、該標的指向療法用ベクターの処置に伴う腫瘍奏効を向上させることができる。
【０１０８】
一部の実施形態では、複数の治療コース（例えば、第一および第二の治療コース）を、処置を必要とする被験者に投与することができる。一部の実施形態では、前記第一および／または第二の治療コースを静脈内投与する。他の実施形態では、前記第一および／または第二の治療コースを動脈内注入によって投与し、該動脈内注入としては、肝動脈、大脳動脈、冠動脈、肺動脈、腸骨動脈、腹腔動脈、胃動脈、脾動脈、腎動脈、生殖腺動脈、鎖骨下動脈、椎骨動脈、腋窩動脈、上腕動脈、橈骨動脈、尺骨動脈、頚動脈、大腿動脈、下腸間膜動脈および／または上腸間膜動脈経由の注入が挙げられるが、これらに限定されない。動脈内注入は、血管内手順、経皮手順または直視下手術アプローチを用いて果たすことができる。一部の実施形態では、前記第一および第二の治療コースを逐次的に投与することができる。さらに他の実施形態では、前記第一および第二の治療コースを同時に投与することができる。さらに他の実施形態では、任意選択の第三の治療コースを、第一および第二の治療コースと逐次的にまたは同時に投与することができる。
【０１０９】
一部の実施形態では、本明細書に開示する標的指向送達ベクターを、累積ベースで高用量で逐次的にまたは同時に投与される治療コース（単数または複数）とともに投与することができる。例えば、一部の実施形態では、それを必要とする患者に、累積ベースで少なくとも１×１０９ｃｆｕ、少なくとも１×１０１０ｃｆｕ、少なくとも１×１０１１ｃｆｕ、少なくとも１×１０１２ｃｆｕ、少なくとも１×１０１３ｃｆｕ、少なくとも１×１０１４ｃｆｕまたは少なくとも１×１０１５ｃｆｕの標的指向送達ベクターの第一の治療コースを全身投与、例えば静脈内投与、することができる。前記第一の治療コースを全身投与することができる。あるいは、前記第一の治療コースを、限局的に投与すること、例えば動脈内投与することができ、例えばそれを必要とする患者に、累積ベースで少なくとも１×１０９ｃｆｕ、少なくとも１×１０１０ｃｆｕ、少なくとも１×１０１１ｃｆｕ、少なくとも１×１０１２ｃｆｕ、少なくとも１×１０１３ｃｆｕ、少なくとも１×１０１４ｃｆｕまたは少なくとも１×１０１５ｃｆｕの標的指向送達ベクターを動脈内注入によって投与することができる。
【０１１０】
さらに他の実施形態では、それを必要とする患者は、高用量の標的指向送達ベクターの全身投与と動脈内注入投与の組み合わせを、逐次的にまたは同時に受けることができる。例えば、それを必要とする患者に、累積ベースで少なくとも１×１０９ｃｆｕ、少なくとも１×１０１０ｃｆｕ、少なくとも１×１０１１ｃｆｕ、少なくとも１×１０１２ｃｆｕ、少なくとも１×１０１３ｃｆｕ、少なくとも１×１０１４ｃｆｕまたは少なくとも１×１０１５ｃｆｕの標的指向送達ベクターをまず全身投与し、その後、累積ベースで少なくとも１×１０９ｃｆｕ、少なくとも１×１０１０ｃｆｕ、少なくとも１×１０１１ｃｆｕ、少なくとも１×１０１２ｃｆｕ、少なくとも１×１０１３ｃｆｕ、少なくとも１×１０１４ｃｆｕまたは少なくとも１×１０１５ｃｆｕの標的指向送達ベクターを投与する動脈内注入、例えば肝動脈注入、の追加の治療コースを投与することができる。さらにもう１つの実施形態において、その必要がある患者は、高用量での標的指向送達ベクターの動脈内注入と全身投与の組み合わせを受けることができる。例えば、それを必要とする患者に、累積ベースで少なくとも１×１０９ｃｆｕ、少なくとも１×１０１０ｃｆｕ、少なくとも１×１０１１ｃｆｕ、少なくとも１×１０１２ｃｆｕ、少なくとも１×１０１３ｃｆｕ、少なくとも１×１０１４ｃｆｕまたは少なくとも１×１０１５ｃｆｕの標的指向送達ベクターを最初に動脈内注入によって投与し、その後、累積ベースで少なくとも１×１０９ｃｆｕ、少なくとも１×１０１０ｃｆｕ、少なくとも１×１０１１ｃｆｕ、少なくとも１×１０１２ｃｆｕ、少なくとも１×１０１３ｃｆｕ、少なくとも１×１０１４ｃｆｕまたは少なくとも１×１０１５ｃｆｕの標的指向送達ベクターを全身投与する追加の治療コースを投与することができる。前記治療コースを同時に投与することもでき、すなわち、高用量の標的指向送達ベクター、例えば累積ベースで少なくとも１×１０９ｃｆｕ、少なくとも１×１０１０ｃｆｕ、少なくとも１×１０１１ｃｆｕ、少なくとも１×１０１２ｃｆｕ、少なくとも１×１０１３ｃｆｕ、少なくとも１×１０１４ｃｆｕまたは少なくとも１×１０１５ｃｆｕの標的指向送達ベクター、の治療コースを、累積ベースで少なくとも１×１０９ｃｆｕ、少なくとも１×１０１０ｃｆｕ、少なくとも１×１０１１ｃｆｕ、少なくとも１×１０１２ｃｆｕ、少なくとも１×１０１３ｃｆｕ、少なくとも１×１０１４ｃｆｕまたは少なくとも１×１０１５ｃｆｕの標的指向送達ベクターを投与する動脈内注入、例えば肝動脈注入、の治療コースと一緒に投与することもできる。
【０１１１】
さらに他の実施形態では、それを必要とする患者は、前記第一および第二の治療コースとともに、累積用量の標的指向送達ベクター、例えば累積ベースで少なくとも１×１０９ｃｆｕ、少なくとも１×１０１０ｃｆｕ、少なくとも１×１０１１ｃｆｕ、少なくとも１×１０１２ｃｆｕ、少なくとも１×１０１３ｃｆｕ、少なくとも１×１０１４ｃｆｕまたは少なくとも１×１０１５ｃｆｕの標的指向送達ベクター、の追加の治療コース（例えば、第三の治療コース、第四の治療コース、第五の治療コース）を、逐次的にまたは同時に、さらに受けることができる。
【０１１２】
一部の実施形態では、処置を必要とする患者に累積用量の少なくとも１×１０１１ｃｆｕを全身（例えば、静脈内）投与し、その後、累積用量の少なくとも１×１０１１ｃｆｕを動脈内注入（例えば、肝動脈注入）によって投与することができる。他の実施形態では、処置を必要とする患者に累積用量の少なくとも１×１０１２ｃｆｕを全身（例えば、静脈内）投与し、その後、累積用量の少なくとも１×１０１２ｃｆｕを動脈内注入（例えば、肝動脈注入）によって投与することができる。１つの実施形態では、処置を必要とする患者に累積用量の少なくとも１×１０１３ｃｆｕを全身（例えば、静脈内）投与し、その後、累積用量の少なくとも１×１０１３ｃｆｕを動脈内注入（例えば、肝動脈注入）によって投与することができる。さらに他の実施形態では、処置を必要とする患者に、累積用量の少なくとも１×１０１１ｃｆｕを動脈内注入（例えば、肝動脈注入）による投与と同時に、累積用量の少なくとも１×１０１１ｃｆｕを全身（例えば、静脈内）投与することができる。さらに他の実施形態では、処置を必要とする患者に、累積用量の少なくとも１×１０１２ｃｆｕを動脈内注入（例えば、肝動脈注入）による投与と同時に、累積用量の少なくとも１×１０１２ｃｆｕを全身（例えば、静脈内）投与することができる。さらに他の実施形態では、処置を必要とする患者に、累積用量の少なくとも１×１０１３ｃｆｕを動脈内注入（例えば、肝動脈注入）による投与と一緒に、累積用量の少なくとも１×１０１３ｃｆｕを全身（例えば、静脈内）投与することができる。
【０１１３】
処置を必要とする患者に、標的指向送達ベクターの治療コースを被定義期間にわたって全身投与、または極限投与（例えば、動脈内注入、例えば肝動脈注入）することもできる。一部の実施形態において、前記期間は、少なくとも一日、少なくとも二日、少なくとも三日、少なくとも四日、少なくとも五日、少なくとも六日、少なくとも七日、少なくとも一週間、少なくとも二週間、少なくとも三週間、少なくとも四週間、少なくとも五週間、少なくとも六週間、少なくとも七週間、少なくとも八週間、少なくとも二ヶ月、少なくとも三ヶ月、少なくとも四ヶ月、少なくとも五ヶ月、少なくとも六ヶ月、少なくとも七ヶ月、少なくとも八ヶ月、少なくとも九ヶ月、少なくとも十ヶ月、少なくとも十一ヶ月、少なくとも一年、少なくとも二年、少なくとも三年、少なくとも四年または少なくとも五年であり得る。投与を慢性的に、すなわち未定義または不定期間にわたって、行ってもよい。
【０１１４】
前記標的指向送達ベクターの投与を定期的に、例えば、一日一回、一日二回、一日少なくとも三回、一日少なくとも四回、一日少なくとも五回、行うこともできる。前記標的指向送達ベクターの定期的投与は、標的指向送達ベクターの回数ならびに投与方式に依存し得る。例えば、非経口投与を長期間にわたって一日一回だけ行うことができ、これに対して標的指向送達ベクターの経口投与を一日一回より多く行うことができ、この場合、該標的指向送達ベクターの投与をより短期間にわたって行う。
【０１１５】
１つの実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に１から２日休薬させる。一部の実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に２から４日休薬させる。他の実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に少なくとも２日休薬させる。さらに他の実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に少なくとも４日休薬させる。さらに他の実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に少なくとも６日休薬させる。一部の実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に少なくとも１週間休薬させる。さらに他の実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に少なくとも２週間休薬させる。１つの実施形態では、前記被験者を、第一の治療コースと第二の治療コースの間に少なくとも一ヶ月休薬させる。一部の実施形態では、前記被験者を、第二の治療コースと任意選択の第三の治療コースの間に少なくとも１〜７日休薬させる。さらに他の実施形態では、前記被験者を、第二の治療コースと任意選択の第三の治療コースの間に少なくとも１〜２週間休薬させる。
【０１１６】
改善されたｐＢ−ＲＶＥおよびｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドの使用は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）の非常に高い作用強度の製剤（１〜５×１０９ｃｆｕ／ｍＬ）の生産を可能にした。これは、以前の製品の大きな注入量および結果として生ずる投薬制限の問題を克服し、パリティー計算として定義される戦略的ドーズデンスレジメンの開発を可能にする。癌治療において、治験薬の有効性に影響を及ぼす重要な要因は、腫瘍量の程度である。多くの場合、腫瘍制御を獲得する前に用量制限毒性に達するので、被験薬の安全域は狭い。したがって、用量制限副作用または器官損傷を惹起することなく実際に腫瘍量に対処することができる制癌剤の開発は、癌処置における有意な重要段階および進歩を意味する。もう１つの重要な問題は、適切な動力学的解決法を必要とする、癌成長の本来の動力学である。腫瘍成長の史上有名なモデルは、今では単純過ぎると考えられている（Ｈｅｉｔｊａｎ（１９９１年）Ｓｔａｔ．Ｍｅｄ．１０：１０７５−１０８８、Ｎｏｒｔｏｎ．（２００５年）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １０：３７０−３８１）が、これらのあまりにも単純なモデルは、今日でもなお実施されている癌処置の基準、すなわち、薬物を併用するためのおよび薬物を等しい強度の等間隔のサイクルで使用するための基準の開発に大きな影響を及ぼした。腫瘍収縮が予後改善と相関しているという予測は確かに真実であるが、従来の薬物を十分長期に投与することが腫瘍根絶につながるという予測は誤っていることが判明した（Ｎｏｒｔｏｎ（２００６年）Ｏｎｃｏｌ．４：３６−３７）。Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｇｏｍｐｅｒｔｚによって説明され、Ｎｏｒｔｏｎ−Ｓｉｍｏｎモデルによって明確な形にされた、より複雑な動力学の認識は、その予測の際に転移の動態および腫瘍量と転移の可能性の間の定量的関係を考慮に入れている。それ故、ドーズデンス化学療法の概念が出現し、これは、より短い時間間隔で腫瘍退縮を引き起こす薬物の最適用量を強調するものであり、コンビナトリアルアプローチよりむしろ逐次的アプローチに好都合であった（（Ｎｏｒｔｏｎ（２００６年）；Ｆｏｒｎｉｅｒ  ａｎｄ  Ｎｏｒｔｏｎ（２００５年）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：６４−６９）。その後、多数の臨床試験により、薬物のより高密度での投与が癌細胞死滅を最適化する点で有意な差を生じさせる裏付けになる証拠が得られた。
【０１１７】
本研究では、標的指向療法用ベクターの様々な例示的プロトコルを癌患者のために設計した。例えば、１つの研究では、ＲＥＸＩＮ−Ｇの静脈内注入による患者内用量漸増レジメンを８〜１０日間、毎日施した。このレジメンの完了後に毒性評定のための一週間の休薬期間が続き、その後、最大耐用量のＲＥＸＩＮ−Ｇをさらに８〜１０日間、ＩＶ投与した。患者が、処置期間の間にＲＥＸＩＮ−Ｇに関連してグレード３または４の有害事象を発現しなければ、ＲＥＸＩＮ−Ｇの用量を次のように漸増した：
【０１１８】
【表１】
2013541497.tif 000002
【０１１９】
最初の二名の患者において観察された安全性に基づき、非常に多数の肝臓転移を有するステージＩＶＢ膵臓癌を有する第三の患者に静脈内ＲＥＸＩＮ−Ｇでのフロントライン処置を六日間施し、その後、フィリピンＢＦＡＤによって承認された第二の臨床プロトコルで１０００ｍｇ／ｍ２の８週間用量のゲムシタビンを施した。
【０１２０】
標的指向遺伝子送達のための病態親和性ナノ粒子の導入は、独特で戦略的な様式で転移癌を処置する新たな定量的アプローチを可能にする。本明細書に記載するパリティー計算は、非常に短縮された期間で所与の腫瘍量に対処および適合しようとする新生パラダイム；言い換えれば、全腫瘍量の最良推定量に定量的に基づくドーズデンス誘導レジメンを意味する。パリティー計算は、最初から、（ｉ）生理学的性能係数（φ）または生理学的感染多重度（Ｐ−ＭＯＩ）を計算できるようにするために、希釈、乱流、流れ、拡散バリア、濾過、不活性化、およびクリアランスをはじめとする生理学的バリアが十分に相殺されるように、治療薬（この場合はＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標））が十分に標的指向されること、（ｉｉ）薬剤が制限的な用量制限毒性を付与しないレベルで有効であること、および（ｉｉｉ）薬剤が容量過負荷を誘発することなく個別化用量の静脈内投与を可能にする十分に高い濃度で利用可能であることを仮定している。細胞破壊性サイクリンＧ１構築物の生理学的性能係数は４から２５０まで様々であり、一つには薬物の力価に依存する（Ｇｏｒｄｏｎら（２０００年）Ｃａｎｓｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３３４３−３３４７）。各日に与える、ＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）をはじめとする治療用標的指向ベクターの最適投薬量を計算するために、次の因子を考慮に入れた：（１）放射線画像診断研究に基づく全腫瘍量、（２）標的癌細胞ごとに必要とされる誘導可能遺伝子導入単位の多重度を規定する、系の生理学的性能係数（φ）、および（３）１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（Ｕ）で表される、ベクター力価に関して定義された薬物の正確な作用強度。１遺伝子導入単位は、１コロニー形成単位に相当する。パリティー計算は、投与される標的指向ベクターの用量が、出現腫瘍量と等価である場合、腫瘍制御を達成できることを予測する；しかし、細網内皮系が生じた腫瘍残屑を排除する時間を与えている間に腫瘍成長が遅れを取り戻さないようにするために、全投薬量を安全に考えられるできる限り短い期間で投与すべきである（Ｇｏｒｄｏｎら（２０００年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３３４３−３３４７）。
【０１２１】
パリティー計算の式：
【０１２２】
初期腫瘍制御に必要な遺伝子療法薬の用量＝
腫瘍量×ｐＭＯＩ
薬物の作用強度
【０１２３】
治療用ベクター粒子での治療に適用したパリティー計算：
上記式中の腫瘍量は、式［標的病変の最長直径の和（ｃｍ）］×［１×１０９癌細胞／ｃｍ］から得られ、
この場合、φまたはｐＭＯＩが、前臨床試験および臨床試験から推定された経験的数であり、
ＲＥＸＩＮ−ＧについてのｐＭＯＩは、１００であり、
上記式中の作用強度は、薬物溶液１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（Ｕ）の数である。
【０１２４】
新規構築物、ｐＢ−ＲＶＥおよびｐｄｎＧ１／ＥＲＥＸ、を使用して生産したＲＥＸＩＮ−Ｇについての作用強度は、５×１０８〜５×１０９単位／ｍＬの範囲である。
【０１２５】
例：転移性膵臓癌を有する患者のためのＲＥＸＩＮ−Ｇ用量の計算
【０１２６】
患者が、２ｃｍ×２ｃｍの寸法の局部進行性腫瘍および４つの肝臓病変（このうち３つは１ｃｍ×１ｃｍの寸法であり、４つ目は、２ｃｍ×２ｃｍの寸法である）を有する場合、
腫瘍量（膵臓、肝臓）＝（４ｃｍ＋（２ｃｍ＋２ｃｍ＋２ｃｍ＋４ｃｍ））×１×１０９細胞／ｃｍ＝１４×１０９癌細胞
【０１２７】
ＲＥＸＩＮ−Ｇの特定のロットが、１×１０９Ｕ／ｍＬの作用強度を有する場合、
ＲＥＸＩＮ−Ｇ用量（ｍＬ）＝
４×１０９細胞×１００Ｕ／細胞＝１４×１０１１Ｕ＝１４００ｍＬ
１×１０９Ｕ／ｍＬ                １×１０９Ｕ／ｍＬ
【０１２８】
例：投与のためのＲＥＸＩＮ−Ｇ保管ユニットの数の計算
【０１２９】
注入に必要なＲＥＸＩＮ−Ｇ保管ユニット（例えば、ガラスバイアル、クリオバック）の数を決定するために、ＲＥＸＩＮ−Ｇ用量の全体積を使用したロットからの保管ユニットの中に収容されているＲＥＸＩＮ−Ｇの標準体積で割る。ＲＥＸＩＮ−Ｇを、例えばクリオバッグまたはガラスバイアルに、２０ｍＬまたは４０ｍＬいずれかのアリコートで供給することができる。
【０１３０】
必要なＲＥＸＩＮ−Ｇ保管ユニットの数＝
ＲＥＸＩＮ−Ｇ用量の体積
保管ユニット当たりの体積
【０１３１】
４０ｍＬアリコートとしてＲＥＸＩＮ−Ｇが供給された場合、必要とされる用量数は：
１４００ｍＬ＝３５保管ユニット（各４０ｍＬ）
【０１３２】
パリティー計算を用いて、異なる腫瘍量のための３つの投薬スケジュールを導出した（上記参照）。
【０１３３】
2013541497.tif 000003
【０１３４】
標的指向遺伝子療法をはじめとする標的化療法の出現により、制癌剤に対する腫瘍反応が評価されている方法は変わりつつある。本明細書に記載する方法は、従来の療法に対して耐性である、例えば化学療法、抗体ベースの療法または他の標準的な療法に対して耐性である、癌または他の障害の処置に特に有用である。標的指向送達ベクターの使用によって得られる客観的反応には、癌または他の障害の寛解の誘導、腫瘍の外科的切除を可能にすること、または再発の予防などがある。本明細書に記載する方法は、従来の療法に対して耐性である、例えば化学療法、抗体ベースの療法または他の標準的な療法に対して耐性である、癌または他の障害において特に有用である。したがって、すべての標準的な治療が失敗したまたは成功に至らなかった後でさえ、標的指向送達ベクターの投与を行うことができる。
【０１３５】
加えて、標的指向送達ベクターと標準的治療の組み合わせ（例えば、治療用ウイルス粒子の投与前に、投与と同時に、または投与後に、化学療法薬、生物製剤または放射線療法）を用いることもできる。したがって、標的指向送達ベクターと主なアジュバントまたはネオアジュバント抗癌療法の組み合わせが、本開示の実施形態として考えられる。本明細書において用いる場合、用語「癌処置」、「癌治療」、「抗癌療法」およびこれらに類する用語は、処置、例えば、外科手術、放射線療法、化学療法薬の投与、およびこれらの方法のいずれか二つまたはすべての組み合わせを包含する。併用処置は、逐次的に行ってもよいし、または同時に行ってもよい。外科手術前に投与される処置、例えば放射線療法および／または化学療法、をネオアジュバント療法と呼ぶ。外科手術後に投与される処置、例えば放射線療法および／または化学療法、を本明細書ではアジュバント療法と呼ぶ。癌処置に用いることができる外科手術の例としては、根治的前立腺全摘除術、凍結療法、乳房切除術、乳房腫瘤摘出術、経尿道的前立腺切除術およびこれらに類するものが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３６】
抗癌療法としては、ＤＮＡ傷害剤、トポイソメラーゼ阻害剤および有糸分裂阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。多くの化学療法が当技術分野において今では公知であり、本明細書に記載する標的指向送達ベクターとそれらを併用することができる。一部の実施形態において、前記化学療法薬は、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、インターカレーティング抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生体応答修飾物質、抗ホルモン薬、血管新生阻害剤、抗アンドロゲン薬から成る群より選択される。
【０１３７】
癌治療の原則は、有望な化学療法薬から得られる治療効果が、薬物候補によって誘導される重篤なまたは致死性の全身毒性のリスクを超えなければならいことであった。このために、固形癌に対する治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）が、米国メリーランド州ベセズダの国立癌研究所（ＮＣＩ）、によって明らかにされ、すべてではないにしても大半の学術機関によって、腫瘍反応評価のための世界基準として採用されている（Ｔｈｅｒａｓｓｅら、（２０００年）Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：２０５−２１６）。  具体的には、客観的腫瘍反応（ＯＴＲ）は、最近まで、固形腫瘍の癌治療の評価の成功の至適基準と見なされてきた。ＯＴＲは、標的病変のサイズの少なくとも３０％の縮小および／または転移病巣もしくは非標的病変の完全な消失から成る。しかし、癌の多くの生物応答修飾物質は、実際には腫瘍の縮小とは関連がなく、無進行生存期間（ＰＦＳ）、および全生存期間（ＯＳ）を延長させることが証明されている（Ａｂｅｌｏｆｆ、（２００６年）Ｏｎｃｏｌ．Ｎｅｗｓ  Ｉｎｔ’ｌ．１５：２−１６）。それ故、有効な生物製剤への反応は、生理的なことが多く、ＲＥＣＩＳＴは、もはや、生物療法に対する腫瘍反応の評価のための適切な基準ではないのかもしれない。こうした訳で、代替の代用エンドポイント、例えば瘍における腫瘍密度（壊死の指標）、血流およびグルコース利用率の測定値、ならびに腫瘍反応の機序を評価するために用いられる画像診断法の他の改良が求められている。
【０１３８】
したがって、提案された介入の所期の作用機序ばかりでなく、疾患過程を理解することは、所与の臨床エンドポイントに対する処置の効果を予測する上で不可欠である。主な作用機序が、増殖性腫瘍細胞および付随する新生血管系のアポトーシスの誘導である、標的指向療法用ベクターに対する腫瘍反応の場合、腫瘍内で壊死および嚢胞性変化が起きることが多い。これは、腫瘍を飢餓させる腫瘍の血液供給に対する標的指向妨害のためであり、その結果、その後の腫瘍内での壊死が生ずる。例えば、アポトーシスが顕著な特徴であるＲＥＸＩＮ−Ｇ治療患者の腫瘍の場合、腫瘍は、フォローアップ画像診断研究では簡単に収縮して消失する。しかし、壊死が顕著な特徴である腫瘍の場合、壊死性腫瘍および腫瘍の嚢胞性転換によって誘発される炎症反応のために、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置後に腫瘍のサイズが実際には大きくなることがある。この場合、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャンまたはＭＲＩでの腫瘍結節のサイズの増大は、必ずしも疾患進行を示すわけではない。したがって、処置された腫瘍の組織学的な質を反映するさらなる同時評価を用いて、処置によって誘導された壊死または嚢胞性変化の程度をより正確に判定することができ、したがって治療用レトロウイルスベクター粒子療法の過程をモニターすることができる。ＣＴスキャンについては、ハウンズフィールド単位（ＨＵ）での腫瘍密度測定値が、腫瘍の壊死の程度の正確かつ再現性のある指標である。標的病変密度の段階的縮小（ＨＵでの減少）は、ポジティブ処置効果を示す。ＰＥＴスキャンについては、標的病変における標準取り込み値（ＳＵＶ）の段階的低下が、腫瘍活性低下およびポジティブ処置効果を示す。生検腫瘍については、アポトーシス、壊死、反応性線維増多および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在が、ポジティブ処置効果を示す。加えて、ＰＥＴ基準（代謝活性）およびＣＨＯＩ基準（腫瘍密度）、ならびにＲＥＣＩＳＴ（サイズのみ）を用いて、標的指向療法用ベクター治療プログラムの進行を判定することもできる。
【０１３９】
レトロウイルスベクターの投与は、レシピエントにおけるベクター中和抗体の生産を惹起し、その結果、さらなる処置が妨げられることがある。（Ｈａｌｂｅｒｔら（２００６年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１７（４）：４４０−４４７）。しかし、当技術分野では、中和抗体産生の誘発を、ベクター投与時付近に施す免疫抑制処置によって阻止することができることが公知である。そのような免疫抑制処置としては、薬物（シクロホスファミド、ＦＫ５０６）、サイトカイン（インターフェロン−ガンマ、インターロイキン−１２）およびモノクローナル抗体（抗ＣＤ４、抗ｐｇｐ３９、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）（Ｐｏｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，（１９９９年）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７５：１５９−１７４）が挙げられる。さらに、中和抗体を体外免疫吸着によって除去することができる（Ｎｉｌｓｓｏｎら、（１９９０年）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８２（３）４４０−４４４）。より高用量のベクターの投与により、中和抗体をインビボで枯渇させることもできる。ＲＥＸＩＮ−Ｇベクターは低い免疫原性を有し、今までのところ、ベクター中和抗体は６ヶ月のフォローアップ期間にわたって患者の血清中で検出されていない。
【０１４０】
キット
本明細書に記載する方法において使用するための組成物を含むキットまたは薬物送達系も提供する。標的指向レトロウイルス粒子の投与に必要とされる不可欠な材料および試薬のすべてをキット内に集めることができる（例えば、パッケージング細胞構築物または細胞系、サイトカイン発現ベクター）。キットの構成要素を、上で説明したような様々な調合物で提供することができる。１つ以上の標的指向レトロウイルス粒子と、１つ以上の薬剤（例えば、化学療法薬）とを、単一の医薬的に許容される組成物に調合することができ、または別個の医薬的に許容される組成物に調合することができる。
【０１４１】
これらのキットまたは薬物送達系の成分を乾燥または凍結乾燥形で提供することもできる。試薬または成分が乾燥形態として提供されるとき、一般に、適する溶媒の添加によって再構成され、この溶媒は別の容器手段に提供されることもできる。本発明のキットは、標的指向レトロウイルス粒子の投薬量および／または投与情報に関する指示書も含むことがある。本発明のキットまたは薬物送達系は、市販用に厳重な梱包でバイアルを収容するための手段、例えば所望のバイアルが中に保持されている射出またはブロー成形プラスチック容器など、も概して含むであろう。容器の数またはタイプに関係なく、前記キットは、被験者の体内への最終複合組成物の注射／投与または配置を補助するための器具を含むこと、または該器具と共に包装することもできる。前述の器具は、アプリケータ、吸入器、注射器、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器、または任意のそのような医療用に承認された送達ビヒクルであり得る。
【０１４２】
もう１つの実施形態では、遺伝子療法事業の運営方法を提供する。この方法は、標的指向送達ベクターを生成する段階、およびそれらのベクター粒子を回収し、適する媒体の溶液に懸濁させ、その懸濁液を保管することによって、ベクターのバンクを確立する段階を含む。前記方法は、前記粒子および前記粒子の使用のための指示書を、それを必要とする被験者（患者）への投与のために医師または医療従事者に提供する段階をさらに含む。前記ベクターの使用についてのそのような指示書は、表１に提供する例示的治療レジメンを含むことがある。前記方法は、患者または患者の保険業者に請求書を送る段階を、場合によっては含む。
【０１４３】
さらにもう１つの実施形態では、本明細書に開示するキットを医師または医療従事者に提供する段階を含む、遺伝子療法事業の運営方法を提供する。
【実施例】
【０１４４】
以下の実施例は、単に例証のために含めるものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。例示する具体的な方法を他の種で実施することもできる。本実施例は、一般的なプロセスを例示するためのものである。
【０１４５】
実施例１：構築物
プラスミドｐＢｖ１／ＣＡＥＰは、コラーゲン結合機能の不可欠獲得量を組み込むように修飾された、４０７０Ａ両栄養性エンベロープタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ３３４６９）のコーディング配列を含有する（Ｈａｌｌら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、８：２１８３−２１９２、１９９７年）。親発現プラスミドｐＣＡＥ（Ｍｏｒｇａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６７：４７１２−４７２１、１９６７年）は、ＵＳＣ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから提供された。このｐＣＡＥプラスミドを、該成熟タンパク質のＮ末端付近、アミノ酸６および７のコーディング配列間へのＰｓｔ  Ｉ部位（アミノ酸ＡＡＧをコードする、ｇｃｔ  ｇｃａ  ｇｇａ）の挿入によって修飾した（ｐＣＡＥＰ）。ウシ・フォン・ヴィレブランド因子のＤ２ドメインに由来する最小コラーゲン結合デカペプチド（太字）であるアミノ酸ＧＨＶＧＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳＡＡ（配列番号：１）を（Ｈａｌｌら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１１：９８３−９９３、２０００年）コードしており、かつ戦略的リンカー（下線）が隣接している、合成オリゴヌクレオチド二本鎖（ｇｇａ  ｃａｔ  ｇｔａ  ｇｇａ  ｔｇｇ  ａｇａ  ｇａａ  ｃｃａ  ｔｃａ  ｔｔｃ  ａｔｇ  ｇｃｔ  ｃｔｇ  ｔｃａ  ｇｃｔ  ｇｃａ）（配列番号：５）をこの一意的Ｐｓｔ  Ｉ部位にクローニングして、ｐＢｖ１／ＣＡＥＰを生産した。
【０１４６】
２９３Ｔプロデューサー細胞におけるキメラエンベロープタンパク質の発現は、強力なＣＭＶ、すなわちプロモータ、によって駆動される。前記キメラエンベロープは、正しくプロセッシングされて、レトロウイルス粒子に安定的に組み込まれ、はっきりと感知できるほど感染力価を失うことなく機能獲得表現型を呈示する。ＤＮＡ配列分析によって、コラーゲン結合ドメインの正しい配向を確認し、プラスミドを線形化してコラーゲン結合ドメインを放出させる制限消化Ｐｓｔ  Ｉによって、プラスミド品質管理を確認した。
【０１４７】
原プラスミドｐＢｖ１／ＣＡＥＰのさらなる改善を行って、ＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）生産中に複製能のあるレトロウイルス（ＲＣＲ）を産生する可能性を低下させた。前記ベクターｐＢｖ１／ＣＡＥＰは、モロニーエンベロープＡＴＧ開始コドンの上流に３８塩基対の非翻訳配列を含有する。このベクターはまた、モロニーエンベロープ停止コドンの下流に７６塩基対の非翻訳配列を含有する。ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いることによりこれら両方の非翻訳配列（３８＋７６＝１１４塩基対）を削除して、ＡＴＧ開始コドンからＴＧＡ停止コドンまでのモロニー・エンベロープ・オープン・リーディング・フレーム配列のみを増幅した。以下のプライマーセットを使用した。
ＮｅｗＥｎｖＦ１  ５’  ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＴＴＣＡＡＣＧＣＴＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＣＴＣＡＡＧＡＴＡ  ３’（配列番号：６）
ＮｅｗＥｎｖＲ１  ５’  ＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＣＴＣＴＡＴＧＧＧＴＴＴＴＡＧＣＴＧＧ  ３’（配列番号：７）
【０１４８】
ｐＢＶ１／ＣＡＥＰをＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用して、一意的フォン・ヴィレブランド・コラーゲン結合部位（ＧＨＶＧＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳＡＡ）（配列番号：１）が、確実に、新たなオープン・リーディング・フレームのみのエンベロープＰＣＲ産物に正しくコピーされるようにした。適正な２０３７ｂｐ対ＰＣＲ製品を生産し、ｐＣＲ２クローニングベクターにライゲートし、シークエンシングして、予想配列との１００％配列一致を確実にした。このシークエンシングしたモロニー・エンベロープ・オープン・リーディング・フレームのみの遺伝子を、ｐＣＲ２プラスミド主鎖から切除し、Ｇｅｎｅｌａｎｔｉｓからの超高発現プラスミドｐＨＣＭＶにサブクローニングして、新たなプラスミド、ｐＢ−ＲＶＥ、を生産した。
【０１４９】
このプラスミドを多数の異なる力価アッセイで試験し、ｐＣｇｐｎおよびｐＥ−ＲＥＸと一緒に２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした場合、同様の力価を達成するために量でその５分の１〜３分の１の使用が今や最適であるほどにその強度が増加したことが判明した。これは、ｐＢ−ＲＶＥプラスミドが、機能性エンベロープタンパク質を生産する際に対応するｐＢＶ１／ＣＡＥＰプラスミドより３〜５倍強力であることを意味する。しかし、通常量ｐＢＶ１／ＣＡＥＰと同じ量のｐＢ−ＲＶＥプラスミドを使用した場合、はるかに低い力価が生成されることとなる。この結果は、最高力価のための最適比を得るために、プラスミド比研究一式を実施することの重要性を強調している。一部の状況では、３つのプラスミド成分遺伝子のいずれか１つの過発現が、組み立ておよびプロセッシング中のウイルス部分の繊細なバランスを乱し、より低い力価で認められるような阻害効果を引き起こすことがある。本発明者らは、ｐＢＶ１／ＣＡＥＰの５分の１〜３分の１のｐＢ−ＲＶＥを使用することを、ＧＭＰレトロウイルス生産中に同様の高い力価を達成するとともにこのプラスミドでのそのはるかに少ない使用の利点を得るために、選択した。この高レベル発現効果は、エンベロープ遺伝子が、ＣＭＶイントロンとの連携でＣＭＶプロモータエンハンサーにより発現されるためである可能性が最も高い。この組み合わせは、単にＣＭＶプロモータにより発現された場合よりも、ｐＢＶ１／ＣＡＥＰプラスミドの場合と同様、３〜５倍強いことが公表されている。
【０１５０】
プラスミドｐＣｇｐｎは、ＭｏＭｕＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌコーディング配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号３３１９３４）を含有し、該配列は、最初、プロウイルスクローン３ＰＯからｐＧａｇ−ｐｏｌ−ｇｐｔとして誘導されたものであり（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６２：１１２０−１１２４、１９８８年）、Ψパッケージングシグナルの１３４塩基対欠失およびｅｎｖコーディング配列のトランケーションを呈示する。この構築物を、その５’ＥｃｏＲＩ部位がＧａｇの上流のＸｍａＩＩＩ部位に対応するｐＣｇｐのＥｃｏＲＩフラグメントとして生じさせ、ｅｎｖのＳｃａＩ部位に隣接してその３’ＥｃｏＲＩ部位を付加させた。そのＥｃｏＲＩフラグメントをｐＣｇｐから切除し、ｐｃＤＮＡ３．１＋発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の一意的クローニング部位にライゲートした。
【０１５１】
ＳａｌＩでの制限消化によって正しい配向を確認し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によってその挿入物をさらに特性評価した。Ｔ７プロモータ結合部位プライマー（Ｓ１）およびｐｃＤＮＡ３．１／ＢＧＨリバースプライマー部位（ＡＳ１）をそれぞれ使用するＤＮＡ配列分析により、ｇａｇ−ｐｏｌ挿入物の５’配列と３’配列の両方を確認した。ｐＣｇｐｎと呼ばれるこの得られたプラスミドは、強力なＣＭＶプロモータによって駆動されるｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質と、ＳＶ４０初期プロモータによって駆動されるネオマイシン耐性遺伝子とをコードする。このプラスミド内のＳＶ４０  ｏｒｉの存在が、ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する細胞系（すなわち、２９３Ｔプロデューサー細胞）でのエピソーム複製を可能にする。
【０１５２】
ドミナントネガティブサイクリンＧ１構築物（ｄｎＧ１）を含有するｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸレトロウイルス発現ベクターを有するプラスミドの構築を次に説明する。高感染力価のベクターの生産のために、一過性トランスフェクションプロトコルによってプラスミドを強化する。ヒトサイクリンＧ１（ＣＹＣＧ１、Ｗｕら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、１：７０５−１１、１９９４；アクセッション番号Ｕ４７４１３）のａａ４１から２４９をコードするｃＤＮＡ配列（４７２−１０９８と停止コドン）を、ＰＣＲによって完全長サイクリンＧ１テンプレートから生成して、Ｎｏｔ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉオーバーハングを組み込んだ。そのＮ末端欠失突然変異体構築物を、先ず、ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、その後、Ｎｏｔ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉ消化に付し、精製された挿入物を、Ｎｏｔ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉ消化ｐＧ１ＸＳｖＮａレトロウイルス発現ベクター（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｎｃ．）にライゲートして、５’および３’長末端反復（ＬＴＲ）配列とΨレトロウイルスパッケージング配列とを完備したｐｄｎＧ１ＳｖＮａベクターを生産した。
【０１５３】
ＣＭＶ、すなわちプロモータ−エンハンサーを、ＰＣＲによりＣＭＶ駆動ｐＩＲＥＳテンプレート（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から調製してＳｃａ  ＩＩオーバーハングを組み込み、５’ＬＴＲの上流のｐｄｎＧ１ＳｖＮａの一意的Ｓａｃ  ＩＩ部位にクローニングした。ベクター力価の決定を助長するネオマイシン耐性遺伝子は、ｏｒｉがネストされているＳｖ４０  ｅ．ｐ．によって駆動される。Ｓｖ４０  ｏｒｉに加えて、強力なＣＭＶプロモータを含むことが、ラージＴ抗原を発現する２９３Ｔ細胞での高力価レトロウイルスベクター生産を助長する（Ｓｏｎｅｏｋａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３：６２８−６３３、１９９５年）。ＣＭＶプロモータの正しい配向および配列を、制限消化およびＤＮＡ配列分析によって確認し、ｄｎＧ１コーディング配列も同様に確認した。プラスミド同一性および品質管理を、（７５０ｂｐ  ＣＭＶプロモータを放出する）Ｓａｃ  ＩＩおよび（ｄｎＧ１構築物内の一意的部位で切断する）Ｂｇｌ  ＩＩでの消化によって確認した。
【０１５４】
ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸおよびｐＢＶ１−ＣＡＥＰを使用する多数のＧＭＰレトロウイルス生産は、安全であることおよびＲＣＲがないことが証明されている。第４および第５世代ＭＬＶベースのレトロウイルスベクターおよびベクター生産方法論、すなわち、スプリットゲノム設計は、標準ＧＭＰ条件下でＲＣＲを産生することなく一貫した生産品質を生じさせた（Ｓｈｅｒｉｄａｎら、２０００年；Ｍｅｒｔｅｎ、２００４年）。しかし、本発明者らは、他者同様、すべての利用可能なベクター構築物が、それぞれのｇａｇ−ｐｏｌプラスミド構築物に含有される５’ＤＮＡ配列とオーバーラップする可能性がある有意な数の残留ｇａｇ−ｐｏｌ配列を含有すること（Ｙｕら、２０００年）、およびベクター生産の規模を、より多くの細胞数および対応するプラスミド濃度を用いる商業量に最終的に拡大するとき、これらの有意なオーバーラップエリアが問題になり得ることを認識している。
【０１５５】
これらの問題点を念頭に置いて、本発明者らは、制限消化およびＰＣＲクローニングによって親ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸベクターから残存ｇａｇ−ｐｏｌ配列の４８７塩基対を除去すること（ｐｄｎＧ１／Ｃ−ΔＲＥＸ）、続いて、パッケージング（力価）および遺伝子発現（作用強度）の点から見て害になるものを相殺するのに役立つ合成９７ｂｐエンベロープスプライスアクセプター部位（ＥＳＡ）（Ｌａｚｏら、（１９８７年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（６）：２０３８−４１）を挿入することにした。これらの結果としてのｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸ安全性修飾は、ＧＡＧの４８７塩基対のない、まさに同じトランスジーン（ｄｎＧ１およびｎｅｏ）をコードし発現する、および今やＲＥＸＩＮ−Ｇの生産における以前のプラスミドに取って代わる、ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸの生成をもたらした。Ｃ−ＲＥＸプラスミドとＣ−ＲＥＸＩＩプラスミド間の比較の略図、およびＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドを図１６に示す。
【０１５６】
正確な比率でのならびに高度に制御および最適化された製造条件下でのｐＢ−ＲＶＥ、ｐＣｇｐｎ、ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲプラスミドの組み合わせは、ＲＣＲなしでの臨床用ベクター製品、およびこれまでに報告された最高の未濃縮ＧＭＰ最終製品レトロウイルス力価、＞５×１０９ｃｆｕ／ｍＬを生じさせる。
【０１５７】
実施例２：ＲＥＸＩＮ−Ｇ
最終製品、Ｍｘ−ｄｎＧ１（ＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標））は、ハイブリッドＬＴＲ／ＣＭＶプロモータの制御下でＮ末端欠失突然変異体ヒトサイクリンＧ１構築物をコードするマトリックス（コラーゲン）標的指向型レトロウイルスベクターである。このベクターは、ＳＶ４０初期プロモータによって駆動されるネオマイシン耐性遺伝子も含有する。
【０１５８】
Ｍｘ−ｄｎＧ１ベクターは、十分に検証されたマスター細胞バンクから得た２９３Ｔ（ＳＶ４０ラージＴ抗原細胞で形質転換されたヒト胚性腎２９３細胞）の３つのプラスミドでの一過性コトランスフェクションによって生産される。
【０１５９】
前記トランスフェクション系の成分としては、ＣＭＶ即時初期プロモータによって駆動されるａ．ａ．４１から２４９をコードするヒトサイクリンＧ１遺伝子の欠失突然変異体を含有するｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸ治療用プラスミド構築物、パッケージング配列、および内部ＳＶ４０初期プロモータの制御下の細菌ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。トランケートされたサイクリンＧ１遺伝子を、まず、ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、その後、Ｎｏｔ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉ消化に付し、精製された挿入物をＮｏｔ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉ消化ｐＧ１ＸＳｖＮａレトロウイルス発現ベクター（メリーランド州ゲーサーズバーグのＧｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｎｃ．によって提供されたもの）にライゲートして、５’および３’ＬＴＲ配列とΨ配列とを完備したｐｄｎＧ１ＳｖＮａベクターを生産した。ＣＭＶ、すなわちプロモータ−エンハンサーを、ＰＣＲによりＣＭＶ駆動ｐＩＲＥＳテンプレート（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から調製してＳａｃ  ＩＩオーバーハングを組み込み、５’ＬＴＲの上流のｐｄｎＧ１ＳｖＮａの一意的Ｓａｃ  ＩＩ部位にクローニングした。
【０１６０】
プラスミド、ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸの使用を、ｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸ（原ｐｄｎＧ１／Ｃ−ＲＥＸにおいて見出されるＧＡＧの４８７塩基対がない、まさに同じトランスジーン（ｄｎＧ１およびｎｅｏ）をコードし発現する次世代プラスミド）と置き換えた。
【０１６１】
この系は、４０７０ＡエンベロープのＮ末端領域のａ．ａ．６とａ．ａ．７の間の遺伝子操作されたＰｓｔ  Ｉ部位にコラーゲン結合ペプチドが挿入された、ＣＭＶによって駆動される修飾両栄養性４０７０Ａエンベロープタンパク質を含有するＭｘ（Ｂｖ１／ｐＣＡＥＰ）エンベローププラスミドをさらに含む。
【０１６２】
Ｍｘ（Ｂｖ１／ｐＣＡＥＰ）エンベローププラスミドの使用を、ｐＢ−ＲＶＥ（天然非翻訳（ＵＴＲ）配列とオーバーラップする可能性がある１１４ｂｐの外来性レトロウイルス配列を削除する改善されたプラスミド）と置き換えた。
【０１６３】
この系も、ＣＭＶ即時初期プロモータによって駆動されるＭＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ要素を含有するｐＣｇｐｎプラスミドを含む。これは、クローン３ＰＯからｐＧａｇ−ｐｏｌ−ｇｐｔとして誘導される。このベクター主鎖は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐｃＤＮＡ３．１＋である。ウシ成長ホルモンからのポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列がＲＮＡ安定性を強化する。ＳＶ４０  ｏｒｉは、ｅ．ｐ．とともに、ＳＶ４０標的Ｔ抗原を発現する細胞系におけるエピソーム複製およびベクターレスキューを特徴とする。
【０１６４】
前記プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析されたものであり、前記細胞系は、１リットル当たり４グラムのグルコースと、１リットル当たり３グラムの重炭酸ナトリウムと、１０％ガンマ線照射ウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）とを補足したＤＭＥＭ基体から成る。前記血清は、米国の供給業者から入手したものであり、ＵＳＤＡ規則に従ってウシウイルスがないことが検査されたものである。レトロウイルス粒子の分芽は、酪酸ナトリウムによる誘導によって増進される。得られたレトロウイルス粒子を、単にその上清を０．４５マイクロメートルフィルターに通すことによって処理するか、接線流／ダイアフィルトレーション法を用いて濃縮する。これらのレトロウイルス粒子は、外観的にはＣ型レトロウイルスである。レトロウイルス粒子を回収し、９５％ＤＭＥＭ培地および１．２％ヒト血清アルブミンの溶液に懸濁させることとなる。この製剤を５００ｍＬクリオバッグに１５０ｍＬのアリコートで保管し、使用するまで−７０から−８６℃で冷凍保存する。
【０１６５】
前記改善されたｐＢ−ＲＶＥおよびｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドを用いて生産されるＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）については、治療用ナノ粒子の生産、懸濁および収集を有標培地の最終製剤中、ウシ血清不在下で行い、無菌閉ループシステムを用いる逐次的な清澄化、濾過およびクリオバッグへの最終充填によって処理する。得られるＣ型レトロウイルス粒子は、１００ナノメートルの平均直径を有し、ウイルス遺伝子が一切なく、完全複製欠損である。これらの臨床用ロットの力価は、３×１０７から５×１０９コロニー形成単位（Ｕ）／ｍＬの範囲であり、各ロットは、必要純度および生体作用強度について検証される。
【０１６６】
患者投与用のＭｘ−ｄｎＧ１ベクターの調製は、３７℃  ８０％エタノール浴でベクターバッグ内のベクターを解凍することから成る。各ベクターバッグを患者への注入１時間前に解凍し、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（１０Ｕ／ｍＬ）で処理し、１〜３時間以内に直ちに注入するものとする。
【０１６７】
前記改善されたｐＢ−ＲＶＥおよびｐｄｎＧ１／ＵＢＥＲ−ＲＥＸプラスミドを用いて生産された処理済みの臨床グレードＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）をクリオバッグに密封し、出荷前は−７０℃±１０℃冷凍庫で保管する。ＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）ベクターを収容した各ロットの検証され発売されたクリオバッグは、ドライアイスを用いて臨床施設に出荷され、そこで該ベクターは、使用まで−７０±１０℃の冷凍庫で保管される。静脈内注入の１５分前、該ベクターは、３２〜３７℃の水浴で急速解凍して直ちに注入されるか、直ぐに使用するために専用トレーまたはクーラーを用いて氷上で患者の部屋または臨床施設に運ばれる。患者は、抹消静脈、中心静脈ラインまたは肝動脈経由でＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）の注入を受ける。臨床研究Ａ、ＢおよびＣ（下記）に関して説明するような様々な投薬レジメンを用いた。しかし、８ｍＬ／ｋｇ／用量の最大量を１日１回与える。ＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）の各バッグを４ｍＬ／分の速度で１０〜３０分かけて注入する。
【０１６８】
実施例３：Ｍｘ−ｄｎＧ１ベクターの治療有効性
インビトロで癌細胞増殖の阻害に関して、および肝臓転移のヌードマウスモデルにおいてインビボで腫瘍成長の阻止に関してＭｘ−ｄｎＧ１の有効性を試験した。膵臓起源のヒト未分化癌細胞系を、転移癌のプロトタイプとして選択した。これらの癌細胞でのレトロウイルス形質導入効率は非常によく、感染多重度（それぞれ４および２５０）に依存して２６％から８５％の範囲である。治療用遺伝子の選択のために、様々なサイクリンＧ１構築物を有するベクターを使用して形質導入細胞において細胞増殖研究を行った。標準条件下、Ｍｘ−ｄｎＧ１ベクターは、ｄｎＧ１タンパク質を表す２０ｋＤａの領域での免疫反応性サイクリンＧ１の出現と同時に、最大抗増殖効果を一貫して呈示した。これらの結果に基づき、Ｍｘ−ｄｎＧ１ベクターを後続のインビボ有効性研究のために選択した。
【０１６９】
インビボでのＭｘ−ｄｎＧ１のパフォーマンスを評定するために、１４日間の適所に保持された留置カテーテルによる門脈への７×１０５ヒト膵臓癌細胞の注入によって肝臓転移のヌードマウスモデルを確立した。合計９日間の２００ｍＬ／日のＭｘ−ｄｎＧ１（ＲＥＸＩＮ−Ｇ；力価：９．５×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）またはＰＢＳ食塩水対照から成るベクター注入を３日後に開始した。ベクター注入完了の１日後にマウスを屠殺した。
【０１７０】
ＰＢＳまたは低用量Ｍｘ−ｄｎＧ１のいずれかで処置したマウスからの転移腫瘍病巣の組織学的および免疫細胞化学的評価を行い、Ｏｐｔｉｍａｓ画像診断システムで評価した。ＰＢＳ処置動物におけるおよびＭｘ−ｄｎＧ１ベクター処置動物の残留腫瘍病巣におけるサイクリンＧ１核免疫反応性向上によって証明されるように（褐色染色物質）、ヒトサイクリンＧ１タンパク質は、転移腫瘍病巣において高度に発現された。対照動物からの肝臓切片の組織学的検査により、付随する血管新生および間質形成エリアと、サイトケラチンが陽性染色された上皮成分と、ビメンチンおよびＦＬＫ受容体が陽性染色された混在する腫瘍間質／内皮細胞とを有する、実質的な腫瘍病巣が明らかになった。対照的に、低用量Ｍｘ−ｄｎＧ１処置動物における腫瘍病巣の平均サイズは、ＰＢＳ対照と比較して有意に縮小され（ｐ＝０．００１）、同時に、ＰＢＳ対照群と比較してアポトーシス核の密度の病巣での増加が明らかになった。さらに、ＰＡＳ＋、ＣＤ６８＋およびヘモシデリン沈着マクロファージによる浸潤が、Ｍｘ−ｄｎＧ１処置動物の残留腫瘍病巣において観察された。これは、変性腫瘍細胞および腫瘍残屑の肝臓細網内皮系による能動クリアランスを示唆している。まとめると、これらの所見は、細胞破壊性細胞周期制御遺伝子を有する標的指向型注射用レトロウイルスベクターのインビボでの抗腫瘍効力の証拠となり、転移癌のための標的指向型注射用ベクターの開発の明確な進歩を表す。
【０１７１】
ヌードマウスでの皮下ヒト膵臓癌モデルにおいて、本発明者らは、Ｍｘ−ｄｎＧ１の静脈内（ＩＶ）注入が、非標的指向ＣＡＥ−ｄｎＧ１ベクター（ｐ＝０．０１４）、マーカー遺伝子を有するマトリックス標的指向型対照ベクター（Ｍｘ−ｎＢｇ；ｐ＝０．００４）およびＰＢＳ対照（ｐ＝０．００１）と比較して、遺伝子送達を向上させることおよび皮下腫瘍の成長を停止させることを実証した。腫瘍結節のベクター透過および形質導入の向上（３５．７＋標準偏差１．４％）は、随伴する全身毒性のない治療有効性と相関した。ＰＢＳプラセボ、非標的指向ＣＡＥ−ｄｎＧ１ベクターおよびＭｘ−ｄｎＧ１ベクターで処置したマウスにおいて、カプラン・マイヤー生存研究も行った。タローン・ログランク検定を用いると、三群すべての同時比較についての総合的ｐ値は、０．００３であり、０．００４のレベルに対して有意である傾向があった。これは、腫瘍成長の長期制御の確率が、非標的指向ＣＡＥ−ｄｎＧ１ベクターまたはＰＢＳプラセボでより、標的指向Ｍｘ−ｄｎＧ１ベクターでのほうが有意に大きいことを示す。まとめると、本研究は、末梢静脈注射によって分散されたＭｘ−ｄｎＧ１が、（ｉ）１時間以内に腫瘍新生血管系に蓄積し、（ｉｉ）腫瘍細胞を高レベル効率で形質導入し、（ｉｉｉ）はっきりと感知できる毒性を誘発することなく治療用遺伝子の送達および長期有効性を向上させたことを実証する。
【０１７２】
実施例４：薬理学／毒物学研究
細胞外マトリックス成分（例えば、コラーゲン）に標的指向するペプチドを組み入れているマトリックス標的指向型注射用レトロウイルスベクターが治療用遺伝子のインビボ送達を増進させることを実証した。２つの癌マウスモデルと、細胞破壊性／細胞増殖抑制性ドミナントネガティブサイクリンＧ１構築物を有する２つのマトリックス標的指向型ＭＬＶベースレトロウイルスベクター（Ｍｘ−ｄｎＧ１およびＭｘＶ−ｄｎＧ１と呼ぶ）を使用して、さらなるデータを提供する。Ｍｘ−ｄｎＧ１およびＭｘＶ−ｄｎＧ１は両方とも、病態エリアに標的指向するためのマトリックス（コラーゲン）標的指向性モチーフを提示する両栄養性４０７０Ａ  ＭＬＶベースレトロウイルスベクターである。これら２ベクター間の唯一の相違は、ＭｘＶ−ｄｎＧ１が水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質で偽型化されていることである。
【０１７３】
皮下ヒト癌異種移植モデルにおいて、１×１０７ヒトＭｉａＰａｃａ２膵臓癌細胞（転移性消化器癌のプロトタイプ）をヌードマウスの側腹部の皮下に埋め込んだ。６日後、２００μＬのＭｘ−ｄｎＧ１ベクターを、１または２サイクルの１０日処置サイクルの間、尾静脈に毎日、直接注射した（全ベクター用量：それぞれ、５．６×１０７［ｎ＝６］または１．６×１０８ｃｆｕ［ｎ＝４］）。肝蔵転移のヌードマウスモデルには、７×１０５ＭｉａＰａｃａ２細胞を、１０〜１４日間、適所に保持された留置カテーテルによって門脈経由で注射した。腫瘍細胞の注入の三日後から開始して、６または９日間、毎日、２００ｍＬのＭｘＶ−ｄｎＧ１ベクターを１０分間かけて注入した（全ベクター用量：それぞれ、４．８×１０６［ｎ＝３］または１．１×１０９ｃｆｕ用量［ｎ＝４］）。生体内分布研究のために、マウスゲノムＤＮＡバックグラウンドの中にＳＶ４０およびネオマイシン（Ｎｅｏ）遺伝子配列を含有するＧ１ＸＳｖＮａベースベクターを検出するためのＴａｑＭａｎ（商標）ベースのアッセイが開発された（Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）。このアッセイは、蛍光標識プローブがＳＶ４０遺伝子の３’部分およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性（Ｎｅｏｒ）遺伝子の５’部分とオーバーラップする、９５ｎｔアンプリコン（Ｇ１ＸＳｖＮａプラスミドベクターのｎｔｓ．１７７９−１８７４）を検出する。
【０１７４】
Ｍｘ−ｄｎＧ１ベクターででも、ＭｘＶ−ｄｎＧ１ベクターででも、ベクター関連死亡率または罹患率は観察されなかった。低レベルのポジティブシグナルが、低用量および高用量ベクター処置動物両方の肝臓、肺および脾臓において検出された。ベクター処置動物の精巣、脳および心臓においてＰＣＲシグナルは検出されなかった。病理組織学的検査により、カテーテルを留置したが抗生物質で予防していない２匹の動物において門脈静脈炎、限局性心筋炎を伴う腎盂腎炎が判明した。Ｍｘ−ｄｎＧ１処置マウスおよびＭｘＶ−ｄｎＧ１処置マウスの非標的臓器において他の病態は認められなかった。血清化学プロフィールにより、ＰＢＳ対照と比較してＡＬＴおよびＡＳＴの軽度の上昇が、Ｍｘ−ｄｎＧ１処置動物において判明した。しかし、それらのレベルは、マウスについての正常限度内であった。７週間のフォローアップ期間内にベクター処置動物の血清中でベクター中和抗体は検出されなかった。
【０１７５】
上述の前臨床所見は、ヒト膵臓癌の２つのヌードマウスモデルにおけるＭｘ−ｄｎＧ１の静脈内注入が、隣接する正常組織に対するはっきりと感知できる損傷も、全身的な副作用も示さなかったことを確証する。静脈内注入による本標的指向遺伝子送達法は、いくつかの臨床的に意義のある利点をもたらす。静脈系への注入は、腫瘍の処置を可能にすることはもちろん、腫瘍の潜在病巣の処置も可能にする。分裂している腫瘍細胞において観察されるより高い有糸分裂速度は、腫瘍にはより高い形質導入効率をもたらすが、肝細胞および他の正常組織には与えずにおくであろうと考えられる。そのため、本発明者らは、標準的な化学療法に対して抗療性である局部進行または転移性膵臓癌および他の固形腫瘍の処置のための静脈内投与Ｍｘ−ｄｎＧ１ベクターを使用するヒト臨床調査プロトコルを提案する。
【０１７６】
実施例５：臨床研究
本研究の目的は、（１）ＲＥＸＩＮ−Ｇの連続静脈内注入の用量制限毒性および最大耐用量（安全性）を決定すること、ならびに（２）潜在的抗腫瘍奏効を評定することであった。推定生存期間が少なくとも３ヶ月ある末期癌患者のためのプロトコルを設計した。腫瘍内科医により標準化学療法に対して抗療性であると見なされた３名のステージＩＶ膵臓癌患者に、フィリピン食品医薬品局によって承認された、ＲＥＸＩＮ−Ｇを使用する人道的使用プロトコルへの参加を勧めた。ＲＥＸＩＮ−Ｇの静脈内注入による患者内用量漸増レジメンを８〜１０日間、毎日、施した。このレジメンの完了後に、用量制限毒性についての１週間の評価期間が続き、その後、ＲＥＸＩＮ−Ｇの最大耐用量をさらに８〜１０日間投与した。患者が、観察期間中にＲＥＸＩＮ−Ｇに関連してグレード３または４の有害事象を発症しなければ、ＲＥＸＩＮ−Ｇの用量を表１（上）に示すように漸増させた。
【０１７７】
腫瘍奏効は、カリパスによって、または放射線画像診断（ＭＲＩまたはＣＴスキャン）によって測定して、式：幅２×長さ×０．５２を用いて腫瘍容積を順次決定することによって評価した。
【０１７８】
患者＃１（４７歳フィリピン人女性）は、生検腫瘍組織の組織学的検査および病期分類研究によって、膵頭部の限局性腺癌を有すると診断された。彼女は、原発性腫瘍の完全切除を含むＷｈｉｐｐｌｅ外科手技を受けた。この後に週１回の単剤ゲムシタビンを７用量分続けたが、許容不能な毒性のために化学療法を中止した。数ヶ月後、フォローアップＭＲＩは、鎖骨上リンパ節と腹部リンパ節の両方への転移拡散を伴う原発性腫瘍の再発を示した。臨床プロトコルに従って、この患者は、１週間の中間休薬期間のある２８日にわたる２サイクルのＲＥＸＩＮ−Ｇの１０日処置サイクルを２．１×１０１１単位の累積用量のために受けた。全身毒性不在の状態で、この患者は、３×１０１１単位の総累積用量のためにさらなる１０日治療サイクルを受けた。
【０１７９】
２つの表面鎖骨上リンパ節のサイズを、カリパスを使用して手作業で測定した。鎖骨上リンパ節の腫瘍容積の漸進的減少が観察され、第２８日の処置サイクル＃２の終りにはそれぞれ３３％および６２％腫瘍サイズ縮小に達した（表２）。
【０１８０】
【表２】
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【０１８１】
フォローアップ腹部ＭＲＩにより、（ｉ）新たな腫瘍転移エリアがないこと、（ｉｉ）４０〜５０％の原発性腫瘍を含む識別可能な中心壊死エリア、および（ｉｉｉ）傍大動脈腹部リンパ節のサイズの有意な減少が判明した（図１Ａ〜Ｂ）。第５４日におけるフォローアップＭＲＩは、原発性腫瘍のサイズに継時的変化がないことを示した。これらの所見と一致して、ＣＡ１９−９血清レベルの漸進的低下（１２００Ｕ／ｍＬのピークレベルから５８４Ｕ／ｍｌの低レベルへ）が認められ、第５４日にはＣＡ１９−９レベルの５０％低下に達した（図１Ｃ）。しかし、第１０１日におけるフォローアップＣＴスキャンは、原発性腫瘍および鎖骨上リンパ節のサイズの有意な増加を示した。この患者は、週１回のゲムシタビン、１０００ｍｇ／ｍ２、を受けることを承諾する第１７５日まで、さらなる化学療法を拒絶した。ＲＥＣＩＳＴ基準により、患者＃１は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入開始から６．７５ヶ月、腫瘍再発時から１１ヶ月および最初の診断時から２０ヶ月である、第１８９日フォローアップ時に、進行性疾患を伴って生存している。
【０１８２】
患者＃２（５６歳のフィリピン人女性）は、胆管擦過細胞診により、ステージＩＶＡの局部進行および切除不能膵頭部癌腫を有すると診断された。試験開腹により、腫瘍が門脈を包み込み、上腸間膜動脈および静脈の極めて近くに浸潤していることが判明した。彼女は、５−フルオロウラシルでの外部ビーム放射線療法を受けて、さらに、単剤ゲムシタビンを週１回、８用量分、その後、月１回の維持用量を受けていた。しかし、ＣＡ１９−９血清レベルの漸進的上昇が認められ、フォローアップＣＴスキャンにより腫瘍のサイズが増加したことが判明した（図２Ａ）。この患者は、１．８×１０１１単位の総累積用量のために毎日の静脈内注入として２サイクルのＲＥＸＩＮ−Ｇ処置サイクルを受けた。結果：連続腹部ＣＴスキャンは、ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入開始時の６．０ｃｍ３から処置終了時の３．２ｃｍ３への腫瘍容積の有意な減少を示し、第２８日には腫瘍サイズの４７％減少に達した（図２Ａ〜Ｃ）。第１０３日におけるフォローアップＣＴスキャンは、腫瘍サイズの継時的変化がないことを示し、その後、この患者を月１回のゲムシタビンで維持した。ＲＥＣＩＳＴ基準により、患者＃２は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入開始から５．５ヶ月および最初の診断の１４ヶ月後である、第１５４日フォローアップ時に、安定した疾患での無症候状態で生存している。
【０１８３】
患者＃３（４７歳の中国人糖尿病男性）は、膵体および尾部のステージＩＶＢ腺癌を有すると診断され、肝臓および門脈リンパ節への非常に多数の転移がＣＴガイド肝臓生検によって確認された。膵臓のステージＩＶＢ腺癌の急速な致死的転帰に基づき、この患者には、ＲＥＸＩＮ−Ｇフロントライン、続いて週１回のゲムシタビンを用いる、第２の臨床プロトコルへの参加を勧めた。より良好な細胞破壊効力のために、ＲＥＸＩＮ−Ｇのプライミング用量を投与して、腫瘍をゲムシタビンでの化学療法に対して増感させた。この患者は、２．７×１０１０単位の総累積用量のために６日間、４．５×１０９単位／用量でＲＥＸＩＮ−ＧのＩＶ注入を毎日受け、その後、ゲムシタビンの週間用量（１０００ｍｇ／ｍ２）を８回受けた。第６２日におけるフォローアップ腹部ＣＴスキャンは、原発性腫瘍のサイズが７．０×４．２ｃｍ（腫瘍容積：６４．２ｃｍ３）ベースライン測定値から６．０×３．８ｃｍ（腫瘍容積：４５ｃｍ３）へと減少したことを示した（図３Ａ）。さらに第６２日には、１８結節（ベースライン）から５結節への肝結節数の劇的な低減（図３Ｃ）とともに、ベースラインの２．２×２ｃｍ（腫瘍容積：４．６ｃｍ３）から１×１ｃｍ（腫瘍容積：０．５２ｃｍ３）への最大肝結節縮退が見られた（図３Ｂ）。ＲＥＣＩＳＴ基準により、患者＃３は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入開始から４．７ヶ月および診断時から〜５ヶ月である第１３３日フォローアップ時に、安定した疾患で生存している。
【０１８４】
表３は、前記３名の患者における全腫瘍奏効の比較評価を示すものである。ＲＥＣＩＳＴ基準を用いると、ＲＥＸＩＮ−Ｇは、３名すべての患者において腫瘍成長安定化を誘導した。
【０１８５】
【表３】
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【０１８６】
本研究では、ＲＥＸＩＮ−Ｇの静脈内注入に対する腫瘍奏効を評価するために２つの方法を用いた。２ｃｍより大きい標的病変の最長直径の和、および比較ポイントとしてすべての非標的病変の消失対持続を測定するＮＣＩ−ＲＥＣＩＳＴ基準を用いると、ＲＥＸＩＮ−Ｇで処置した患者３名中３名（１００％）が、１００日（３ヶ月）より長く腫瘍成長安定性を有した（表３）。画像診断研究（ＭＲＩまたはＣＴスキャン）およびカリパス測定によって立証されるように、腫瘍容積測定による奏効の評価（式：幅２×長さ×０．５２）（１６）により、ＲＥＸＩＮ−Ｇは、患者３名中３名（１００％）において腫瘍縮退、すなわち、患者＃１において転移性リンパ節腫脹の３３〜６２％縮退（表２）、患者＃２において原発性腫瘍の４７％縮退（図２Ｃ）、および患者＃３において原発性腫瘍の３０％縮退、転移肝臓病巣の７２％（１３／１８）の根絶および転移門脈節の８９％縮退（図３）を誘導したことが判明した。さらに、安全性の評価により、用量制限毒性が３×１０１１単位の累積ベクター用量までは発生しないことが明らかになった。これは、より大きい治療有効性を実現するためにより多くのベクターを投与できることを示す。ＲＥＸＩＮ−Ｇベクター注入は、悪心または嘔吐、下痢、ニューロパチー、脱毛、血行動態不安定、骨髄抑制、肝臓または腎臓損傷を随伴しなかった。
【０１８７】
実施例６：臨床試験Ａ。第Ｉ／ＩＩ相。局部進行または転移性膵臓癌におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ
臨床研究Ａは、フィリピン食品医薬品局（ＢＦＡＤ）によるまたは米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による承認、および治験審査委員会または病院倫理委員会に従って、局部進行または転移性膵臓癌のためのＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）の静脈内注入を調査する、第Ｉ／ＩＩ相または単回使用プロトコルを含む（Ｇｏｒｄｏｎら、（２００４年）Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２４：１７７−１８５）。本研究の目的は、（１）ＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）の毎日の静脈内注入の安全性／毒性を判定すること、および（２）ＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）の静脈内注入に対する潜在的抗腫瘍奏効を判定することであった。推定生存期間が少なくとも３ヶ月ある患者のためのプロトコルを設計した。インフォームドコンセントを得た後、局部進行切除不能または転移性膵臓癌を有する６名の患者をＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）の反復注入で処置した。６名の患者のうちの５名は、標準的な化学療法に失敗していた。これらの患者は、患者内用量漸増プロトコルをフィリピンのマニラおよび／または米国ニューヨーク州ブルックリンにおいて次のように完了した。第１〜２日：３．８×１０９単位；第３〜４日：７．５×１０９単位；第５〜６日：１．１×ｌ０１０単位；第７〜１０日：１．５×１０１０単位；１週間休薬；第１８〜２７日：１．５×１０１０単位。２名の患者は、さらに１サイクル受け、１名の患者は、さらに７サイクル受けた。切除不能ステージＩＶ膵臓癌を呈した６番目の患者は、６日のＩＶ  ＲＥＸＩＮ−Ｇ（３．８×１０９単位／日）、続いての８週間の週１回のゲムシタビン（１０００ｍｇ／ｍ２）から成る併用療法をファーストライン処置として受けた。臨床研究ＡについてのＲＥＸＩＮ−Ｇ製剤は、３×１０７単位／ｍＬの作用強度を有した。
【０１８８】
ＮＩＨ共通毒性基準（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ）（ＣＴＣＡＥバージョン２または３）（共通毒性基準バージョン２．０．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ．ＤＣＴＤ，ＮＣＩ，ＮＩＨ，ＤＨＨＳ，Ｍａｒｃｈ，１９９８年３月）に従って有害事象のグレード分類を行った。ＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）の臨床的有効性を評価するために、本発明者らは、該薬剤の一般的な細胞破壊および抗血管新生活性（Ｇｏｒｄｏｎら（２０００年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３３４３−３３４７、Ｇｏｒｄｏｎら（２００１年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９３−２０４）はもちろんのこと、処置コース中の標的指向ナノ粒子の生体内分布およびバイオアベイラビリティーに影響を及ぼす病態親和性ナノ粒子の転移病変中への動的隔離（Ｇｏｒｄｏｎら、（２００１年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９３−２０４）も考慮した。前記ベクターは、腫瘍の侵襲性および血管新生の程度に依存して、一定の癌性病変に、より容易に蓄積することとなるので、特に、腫瘍量が多い患者の場合、腫瘍結節の残部に均一に分散されるとは予想されない。これは、予想どおり、サイズが減少する腫瘍もあるが、より大きくなる腫瘍結節もある、および／または新たな病変が出現することもある、混合型腫瘍奏効を誘導するだろう。その後、全腫瘍量の正規化または減少に伴って、病態親和性監視機能が、循環ナノ粒子を、多少、より均一に分散させるだろう。加えて、処置病変は、壊死性腫瘍によって誘導される炎症反応または嚢胞性変化のため、最初、サイズが大きくなることがある。それ故、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置に対する客観的腫瘍奏効の評価には、標準の固形癌に対する治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ；Ｔｈｅｒａｓｓｅら（２０００年）Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：２０５−２１６）とは別に、２つのさらなる尺度、すなわち（１）腫瘍容積の推定のためのＯ’Ｒｅｉｌｌｙの式：Ｌ×Ｗ２×０．５２（２７  Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７年）Ｃｅｌｌ  ８８：２７７−２８５）、および（２）処置期間中の腫瘍における壊死または嚢胞性変化の誘導、を用いた。例えば、３０％以上の標的病変の腫瘍容積の減少、または腫瘍内での壊死または嚢胞性変化の誘導を、処置の部分奏効（ＰＲ）またはポジティブ効果と見なした。片側正確確率検定を用いて、ＲＥＸＩＮ−Ｇで処置した患者のＰＲと既存対照のＰＲとの差の有意性を予想５％ＰＲで決定した。
【０１８９】
本初期第Ｉ／ＩＩ相試験は、患者内用量漸増プロトコルの安全性および潜在的有効性を検査するものである。表４に示すように、様々な程度の部分奏効（ＰＲ）が、ＲＥＸＩＮ−Ｇで処置した６名の患者のうち５名において認められ、一方、残りの患者では安定した疾患が観察された。６名の患者のうちの３名（５０％）は、ＲＥＣＩＳＴまたは腫瘍容積測定により腫瘍サイズの３０％以上減少を有し、６名の患者のうち２名（３３％）は、生検および／またはフォローアップＭＲＩ／ＣＡＴスキャンにより原発性腫瘍または転移結節いずれかの壊死を有した。ＣＴスキャンにより８つの肝臓腫瘍結節のうち６つが消失した１名の特定の患者（Ａ３）についてのさらなる分析は、肝蔵生検によって助長され、その結果、生検肝臓の残留肝臓腫瘍中の非常の多数の腫瘍浸潤リンパ球の観察と共に、前臨床試験で観察されたものに類似した腫瘍結節内でのアポトーシス、壊死および線維増多の発生率上昇が判明した。残留肝臓腫瘍に浸潤する免疫反応性ＴおよびＢリンパ球の存在は、ＲＥＸＩＮ−Ｇが局部的免疫反応を抑制しないことを示す。無進行生存期間は、６名の患者のうち４名（６７％）において３ヶ月より長かった。化学療法抵抗性患者におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）処置後の生存期間中央値は１０ヶ月であり、診断後の生存期間中央値は２５ヶ月であった。対照的に、ファーストライン薬としてゲムシタビンまたは５−ＦＵ（標準処置）のいずれかを受けた膵臓癌を有する患者の報告されている生存期間中央値は、それぞれ、診断後５．６５ヶ月および４．４１ヶ月であった（Ｂｕｒｒｉｓら、（１９９７年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５：２４０３−２４１３）。片側正確確率検定を用いると、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置患者における部分奏効の有意性レベルは、既存対照のＰＲ率と比較したとき、＜０．０２５であった。これらの初期所見は、比較的少数の患者で立証されたにもかかわらず、ＲＥＸＩＮ−Ｇが、わずかな用量ででも臨床的に有効であること、医療処置をしないよりも明らかに優れていること、および進行または転移性膵臓癌を有する患者の処置のための単剤として使用したときにゲムシタビンよりも優れていることがあることを十分に示している。
【０１９０】
【表４】
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【０１９１】
６名すべての患者が、随伴する悪心または嘔吐、下痢、粘膜炎、脱毛ならびにニューロパチーなく、ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入に対して十分耐容性を示した。６名の患者のうちの３名（５０％）は、疼痛の症状寛解を有した。治験薬に関連した血行動態機能の有意な変化、骨髄抑制、肝臓、腎臓または任意の器官の機能不全はなかった。治験薬に明確に関連していると考えられる唯一の有害事象は、６名の患者のうちの２名における全身性発疹および蕁麻疹（グレード１〜２）であり、ことによると関連していると考えられる有害事象は、６名の患者のうちの２における悪寒および発熱であった（グレードＩ）。本研究において観察された処置中に発生した限られた数の有害事象は、これらの漸増用量で静脈内投与されるＲＥＸＩＮ−Ｇが、比較的安全な療法であることを示唆している。
【０１９２】
実施例７：臨床研究Ｂ：様々な進行または転移性固形腫瘍における第Ｉ／ＩＩ相ＲＥＸＩＮ−Ｇ
臨床研究Ｂは、臨床研究Ａの拡張に相当する。ＲＥＸＩＮ−Ｇによる初期臨床経験の有望な結果に基づいて、より高用量のＲＥＸＩＮ−Ｇの安全性および潜在的有効性をさらに判定するために、標準的な化学療法に対して抗療性であるすべての進行または転移性固形腫瘍に臨床適応を拡大するために、ならびに外来患者を処置できるように処置スケジュールおよびプロトコルを調整するために、前記第Ｉ／ＩＩ相研究を拡張した。本研究の目的は、（１）ＲＥＸＩＮ−Ｇの毎日の静脈内注入の安全性／毒性を判定すること、および（２）より高い用量レベルでのＲＥＸＩＮ−Ｇの静脈内注入に対する潜在的抗腫瘍奏効を判定することであった。推定生存期間が少なくとも３ヶ月ある患者のためのプロトコルを設計した。インフォームドコンセントを得た後、外胚葉（黒色腫、１；喉頭の扁平上細胞ＣＡ、１）、中胚葉（平滑筋肉腫、１）または内胚葉（膵臓、２；乳房、２；子宮、１；結腸、２）のいずれかを起源とする転移癌を有する１０名の患者、および化学療法を拒絶した、新たに診断された以前に未処置の転移性膵臓癌の患者（患者の総数＝１１）は、静脈内ＲＥＸＩＮ−Ｇを、単剤として、合計２０日間にわたって１日当たり３．０×１０１０単位の用量で、次の処置スケジュールに従って受けた。第１〜５、８〜１２、１５〜１９、および２２〜２６日；月曜から金曜までで週末は休薬期間。改善されたＧＭＰ製造およびバイオプロセッシングプロトコルにより、実質的により高い力価のＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）の製造が可能となったので、臨床研究Ｂに使用した製剤は、７×１０８単位／ｍＬのベクター作用強度を呈示した。
【０１９３】
ＮＩＨ共通毒性基準（ＣＴＣＡＥバージョン２または３）（共通毒性基準２．０．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ．ＤＣＴＤ，ＮＣＩ，ＮＩＨ，ＤＨＨＳ，Ｍａｒｃｈ，１９９８年３月）に従って有害事象のグレード分類を行った。ＲＥＸＩＮ−Ｇの臨床的有効性を評価するために、本発明者らは、該薬剤の一般的な細胞破壊および抗血管新生活性（Ｇｏｒｄｏｎら（２０００年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３３４３−３３４７、Ｇｏｒｄｏｎら（２００１年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９３−２０４）はもちろんのこと、処置コース中の標的指向ナノ粒子の生体内分布またはバイオアベイラビリティーに影響を及ぼす病態親和性ナノ粒子の転移病変中への動的隔離（Ｇｏｒｄｏｎら、（２００１年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９３−２０４）も考慮した。前記ベクターは、腫瘍の侵襲性および血管新生の程度に依存して、一定の癌性病変に、より容易に蓄積することとなるので、特に、腫瘍量が多い患者の場合、腫瘍結節の残部に均一に分散されるとは予想されない。これは、予想どおり、サイズが減少する腫瘍もあるが、より大きくなる腫瘍結節もある、および／または新たな病変が出現することもある、混合型腫瘍奏効を誘導するだろう。その後、全腫瘍量の正規化または減少に伴って、病態親和性監視機能が、循環ナノ粒子を、多少、より均一に分散させるだろう。加えて、処置病変は、壊死性腫瘍によって誘導される炎症反応または嚢胞性変化のため、最初、サイズが大きくなることがある。それ故、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置に対する客観的腫瘍奏効の評価には、標準の固形癌に対する治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ；Ｔｈｅｒａｓｓｅら（２０００年）Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：２０５−２１６）とは別に、２つのさらなる尺度、すなわち（１）腫瘍容積の推定のためのＯ’Ｒｅｉｌｌｙの式：Ｌ×Ｗ２×０．５２（２７  Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７年）Ｃｅｌｌ  ８８：２７７−２８５）、および（２）処置期間中の腫瘍における壊死または嚢胞性変化の誘導、を用いた。例えば、３０％以上の標的病変の腫瘍容積の減少、または腫瘍内での壊死または嚢胞性変化の誘導を、処置の部分奏効（ＰＲ）またはポジティブ効果と見なした。
【０１９４】
本研究は、用量増大および臨床応用拡張によって初期第Ｉ／ＩＩ相膵臓癌プロトコルをすべての固形癌に拡大するものである。表５に示すように、様々な程度の原発性腫瘍または転移結節いずれかについての部分奏効が１１名の患者のうちの７名（６４％）に認められた。１１名の患者のうちの５名（４５％）は、生検またはＣＴスキャンのいずれかにより、原発性腫瘍および／または転移結節の壊死およびアポトーシスを発症し、ならびに１１名の患者のうちの５名（４５％）は、ＲＥＣＩＳＴまたは腫瘍容積測定により、原発性腫瘍または転移結節のサイズの３０％を超える縮小を有した。１１名の患者のうちの２名は、安定した疾患を有し、非常に大きい腫瘍量を有する１名の患者は、混合型腫瘍奏効を有し、および大きい腫瘍量（〜５０の肝結節）を有する１名の患者は、進行性疾患を有した。
【０１９５】
【表５】
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【０１９６】
ＲＥＸＩＮ−Ｇの反復注入での癌性リンパ節の漸進的縮小は、膵臓癌を有する患者において一貫して観察され、子宮癌、結腸癌、乳癌および悪性黒色腫を有する患者においても観察された。これは、関連する薬物動力学の理解の点から注目に値し、有意義である。センチネルリンパ節（複数を含む）、すなわち癌が原発性腫瘍から広がる可能性が高い最初のリンパ節（複数を含む）が、転移性疾患の病理発生、診断および前方視的処置の理解にとって非常に重要であることは周知であるが、局所リンパ節および遠位リンパ節両方へのＲＥＸＩＮ−Ｇの顕著な浸透度は、印象的でもあり、吉兆でもある（表４および５）。ＲＥＸＩＮ−Ｇ中の病態親和性ナノ粒子が、体内循環してもその生物活性を保持し、原発性および転移性病変に蓄積するばかりでなく、リンパ節中にも流入して治療的影響を及すという所見の臨床的有意性は、決して誇張ではない。図２０に示すように、悪性黒色腫を有する患者の鼠径部領域からの癌性リンパ節の外科生検は、実質的壊死（２０−Ａ）、大きな顕性アポトーシスエリア（２０−Ｂ）、およびヘモジデリン沈着マクロファージ（２０−Ｃ）が腫瘍残屑を排除しているゾーンを示した。さらに、免疫組織化学的染色により、ＣＤ３５＋樹状細胞（２０−Ｄ）、ＣＤ６８＋マクロファージ（２０−Ｅ）、ＣＤ８＋キラーＴ細胞（２０−Ｆ）およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（図示せず）での有意な単核浸潤が判明した。病態親和性ナノ粒子の遺伝子送達機能（すなわち、細胞破壊活性）が、センチネルリンパ節内の転移性疾患に浸透しても活性なままであり、免疫系を破壊せず、免疫系と協奏作用するように見えるという実状を知ることにより、サイトカイン遺伝子を有する本標的指向遺伝子送達系を使用する将来のインサイチューでの癌ワクチン接種の可能性が再び是認される。
【０１９７】
喉頭の扁平上皮細胞ＣＡを有する別の患者において、上気道の劇的な再開通が頸部ＭＲＩによって立証され（図２１）、この再開通は患者の声の回復と相関した。無進行生存期間は、１ヶ月から５ヶ月より長きに及んだ。生存期間中央値は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置開始から６ヶ月より長く、診断から２４ヶ月より長かった。１１名の患者のうち８名（７２％）が、ＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置後に６から１３ヶ月より長く生存した／している。まとめると、ＲＥＸＩＮ−Ｇは、広範囲の耐性腫瘍タイプにおいて単剤活性を有するように見える。さらに、処置の簡潔さにもかかわらず、治療効果の持続が患者の大多数において観察されたことが注目された。
【０１９８】
１１名すべての患者が、随伴する悪心または嘔吐、下痢、粘膜炎、脱毛ならびにニューロパチーなく、前記ベクター注入に対して十分耐容性を示した。１１名のうち８名（７３％）は、疼痛、鼓脹、拍動、嗄声および疲労の症状寛解を有した。治験薬に関連した血行動態機能の有意な変化、骨髄抑制、肝臓、腎臓および任意の器官の機能不全はなかった。治療に関連した有害事象がなかったことは、ベクター用量を増加させても、ＲＥＸＩＮ−Ｇが比較的安全な療法であることを、さらに示唆している。この時点で、用量制限毒性の不存在は、様々な異なる腫瘍タイプでの単剤有効性の強制適応、およびより高い作用強度のＲＥＸＩＮ−Ｇ製剤の最近の入手可能性と併せて、臨床的有効性の向上および処置プロトコルの最適化に焦点を合せて設計された臨床試験の進歩および監督官庁の承認を促した。
【０１９９】
実施例８：臨床研究Ｃ、移転性膵臓および結腸癌におけるＲＥＸＩＮ−Ｇの利用範囲拡大および「パリティー計算」
臨床研究Ｃは、フィリピンＢＦＡＤによって最近承認された暫定プログラムである、すべての固形癌へのＲＥＸＩＮ−Ｇの利用範囲拡大プログラムに参加した患者の小グループにかかわる。所与の患者の全腫瘍量にできる限り迅速に、しかし安全に対処して（すなわち、該腫瘍量を低減させて、または根絶して）、「キャッチアップ」腫瘍成長を防止しまたは未然に防ぎ、それによってこの交絡パラメータを最小にするために、この革新的プロトコルを設計した。利用した推定全投薬量は、「パリティー計算」と本明細書では呼ぶ（量の場合のように均等法、または機能等価性、と呼ぶ）経験的計算によって決定した。基本式は、画像診断研究から推定した全腫瘍量（１ｃｍ＝おおよそ１×１０９癌細胞）、標的指向ベクター系についての経験的パフォーマンス係数（φ）または生理学的感染多重度（Ｐ−ＭＯＩ、ウイルス学的表現で）（非標的指向ベクター系についてのＰ−ＭＯＩは本質的に無限である）、および臨床グレード製剤の作用強度（単位／ｍｌ）を考慮に入れている。腫瘍量を、センチメートルでの腫瘍結節の最長直径の和に１×１０９を掛けて示し、総癌細胞数として表現する。ＲＥＸＩＮ−Ｇについての１００の「操作上定義された」パフォーマンス係数（φ）または生理学的ＭＯＩ（Ｐ−ＭＯＩ）は、多種多様な前臨床研究において立証された標的指向遺伝子療法用の系の形質導入効率向上の定量的実証と、初期臨床試験の厳しい試練の中で観察されたＲＥＸＩＮ−Ｇの用量依存パフォーマンスとに基づいたものである。重要なこととして、高作用強度ＲＥＸＩＮ−Ｇ製品（〜１．０×１０９単位／ｍＬ）の生成によって、ＲＥＸＩＮ−Ｇの算出最適用量投与を容量過負荷のリスクなしに静脈内送達できるようになった。
【０２００】
先駆的研究：ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入の最初の２０日が完了した後、転移性膵臓癌を有する２名の患者および転移性結腸癌を有する１名の患者は、それぞれ、６週間（１名の患者）および１６週間（２名の患者）にわたって〜２．５×１０１２ｃｆｕの総用量まで、ＲＥＸＩＮ−Ｇ（商標）静脈内注入を受け続けることを（さらなるインフォームドコンセントを以て）選択した。これにより、ＣＴスキャンまたはＭＲＩに基づく患者の推定腫瘍量と大筋で匹敵するパリティー計算を得た。
【０２０１】
ＮＩＨ共通毒性基準（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ）（ＣＴＣＡＥバージョン２または３）（共通毒性基準バージョン２．０．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ．ＤＣＴＤ，ＮＣＩ，ＮＩＨ，ＤＨＨＳ，Ｍａｒｃｈ，１９９８年３月）に従って有害事象のグレード分類を行った。ＲＥＸＩＮ−Ｇの臨床的有効性を評価するために、本発明者らは、該薬剤の一般的な細胞破壊および抗血管新生活性（Ｇｏｒｄｏｎら（２０００年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３３４３−３３４７、Ｇｏｒｄｏｎら（２００１年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９３−２０４）はもちろんのこと、処置コース中の標的指向ナノ粒子の生体内分布またはバイオアベイラビリティーに影響を及ぼす病態親和性ナノ粒子の転移病変中への動的隔離（Ｇｏｒｄｏｎら、（２００１年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１９３−２０４）も考慮した。前記ベクターは、腫瘍の侵襲性および血管新生の程度に依存して、一定の癌性病変に、より容易に蓄積することとなるので、特に、腫瘍量が多い患者の場合、腫瘍結節の残部に均一に分散されるとは予想されない。これは、予想どおり、サイズが減少する腫瘍もあるが、より大きくなる腫瘍結節もある、および／または新たな病変が出現することもある、混合型腫瘍奏効を誘導するだろう。その後、全腫瘍量の正規化または減少に伴って、病態親和性監視機能が、循環ナノ粒子を、多少、より均一に分散させるだろう。加えて、処置病変は、壊死性腫瘍によって誘導される炎症反応または嚢胞性変化のため、最初、サイズが大きくなることがある。それ故、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置に対する客観的腫瘍奏効の評価には、標準の固形癌に対する治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ；Ｔｈｅｒａｓｓｅら（２０００年）Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：２０５−２１６）とは別に、２つのさらなる尺度、すなわち（１）腫瘍容積の推定のためのＯ’Ｒｅｉｌｌｙの式：Ｌ×Ｗ２×０．５２（２７  Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７年）Ｃｅｌｌ  ８８：２７７−２８５）、および（２）処置期間中の腫瘍における壊死または嚢胞性変化の誘導、を用いた。例えば、３０％以上の標的病変の腫瘍容積の減少、または腫瘍内での壊死または嚢胞性変化の誘導を、処置の部分奏効（ＰＲ）またはポジティブ効果と見なした。
【０２０２】
本研究は、パリティー計算と呼ばれる革新的な個別化ドーズデンスレジメンを採用する、すべての固形癌の処置のためのＲＥＸＩＮ−Ｇの利用範囲拡大プログラムでの最初の臨床経験報告に相当する。この予備的だが重要な中間解析において、それぞれが大量の腫瘍量を有する３名の患者すべてにおいて劇的な奏効が認められた。１名の患者（Ｃ１）において、パリティー計算（または機能等価性）は、フォローアップＭＲＩでの切除不能膵臓腫瘍の融解壊死および嚢胞性転換ならびにすべての転移肝結節の嚢胞性転換または消失いずれか（図２２）に至る累積投薬量を概算した。ある嚢胞性腫瘍結節の吸引は、悪性細胞についてネガティブであった。ステージＩＶ結腸癌に罹患している第二の患者（Ｃ２）において、所定のパリティー計算に近い累積投薬量は、転移性疾患の大部分を縮小させるのに有効であった。肝腫瘍結節で観察された８４％壊死を画像解析によって立証した。第三の患者（Ｃ３）では、原発性膵臓腫瘍の有意な減少、ならびに肺結節の数（肺結節２８から１２へ）およびサイズの有意な減少が、ＣＴスキャンによって認められた。無進行生存期間および全生存期間は、２名の患者では、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置後６ヶ月より長かった。これらの所見は、所与の患者の腫瘍量に対処するために必要とされるＲＥＸＩＮ−Ｇの総累積用量を決定するためにパリティー計算を用いることができるという仮説を裏付ける予備的証拠を提出するものであり、その結果、最適誘導レジメンを含む。
【０２０３】
３名すべての患者が、随伴する悪心または嘔吐、下痢、粘膜炎、脱毛ならびにニューロパチーなく、前記ベクター注入に対して十分耐容性を示した。治験薬に関連した血行動態機能の急性変化、骨髄抑制、肝臓、腎臓または任意の器官の機能不全はなかった。２名の患者は、赤血球輸血を必要とする貧血（グレード３）発症し、これは、壊死性腫瘍内へのその後の出血にことによると関連すると考えられた。１名の患者は、血小板減少症の散発性エピソード（グレード１〜２）を発症し、これは、治験薬にことによると関連すると考えられた。１名の患者は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置の３ヶ月後に、治験薬に起因しない急性劇症性表皮ブドウ球菌敗血症のために死亡した。この患者の剖検の結果は、残留膵臓腫瘍のほぼ完全な壊死、ならびに肝臓および腹腔腸間膜に残存する転移性腫瘍の７５〜９５％壊死を示し、骨髄、心臓および脳に関しては正常組織診が記録された。ＲＥＸＩＮ−Ｇ投与に随伴する全身毒性がないことは、転移癌の管理の有効性の点はもちろんのこと、他の生活の質の程度の点から見ても、標準的な化学療法に勝るＲＥＸＩＮ−Ｇの潜在的利点を強調する。各ケースにおいて、総合的な腫瘍崩壊の程度は印象的であった。患者の腫瘍量を克服するために特別に作られたＲＥＸＩＮ−Ｇのドーズデンスレジメンが、これらのレベルの効率を達成できるという確証は、最適な腫瘍根絶率を定義するために、および殺腫瘍後創傷治癒に耐えている患者のための最適な支持療法を識別するために、パリティー計算をさらに精緻化する必要性を強調する。
【０２０４】
本発明の実務は、別の指示がない限り、当分野の範囲内である従来の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学技術を利用するものとする。そのような技術は、文献に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、バージョン２、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７年）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第  １５４および１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．、Ｎ．Ｙ．、１９８６年）参照。
【０２０５】
実施例９：転移性骨肉腫患者におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ
図２３ＡにＸ線撮影によって示す、１７歳白人男性は、２００３年１２月に右脛骨の骨肉腫と診断された。彼は、シスプラチンおよびアドリアマイシンならびに高用量メトトレキサートでの術前化学療法受け、その後、四肢サルベージ手技を受けた。術後、彼は、シスプラチンおよびアドリアマイシン（×２）、そしてアドリアマイシンおよびイホスファミド（×２）のコースを受けて、アドリアマイシンの累積用量を４００ｍｇ／ｍ２にした。２００５年２月に化学療法を完了した。２００６年３月、フォローアップＣＴスキャンにより２つの左側肺転移が判明し、それらをＶＡＴＳ胸腔鏡下手術によって除去した。２００６年６月から１１月まで、彼は、高用量のメトトレキサートおよびイホスファミドを受け、その後、２００６年１１月に開胸術を受けた。２００６年１２月から２００７年４月までに彼の肺腫瘍のサイズおよび数は増し、１ｃｍを測定して１つだけの肺結節から１０を超える肺および胸膜ベース結節となり、最大病変は４．２ｃｍと測定された。この急速な疾患進行速度は、肺、心膜も、心臓の主要血管も含む、生命を危うくする転移病変位置と、副腎および脊椎への浸食によっていっそう増された。
【０２０６】
２００７年４月、この患者は、温情に基づきＲＥＸＩＮ−Ｇを受けた。患者に１×１０１１ｃｆｕのＲＥＸＩＮ−Ｇを週２回、４週間、静脈内投与し、その後、２週間の休薬期間を与えた。第一のサイクル完了の１週間後に得たＰＥＴ−ＣＴスキャンは、標的病変の合計の２８％増加、標的病変の合計腫瘍密度の６％低下、および４つの指定標的病変の合計ＳＵＶ  ｍａｘの３３％低下を示した（図２３Ｂ対２３Ｃ参照）。彼は、さらに４週間、ＲＥＸＩＮ−Ｇを受け続けた。第二の治療コース完了の２週間後に得たＰＥＴ−ＣＴスキャン（図２３Ｄ参照）は、新たな病変がないことと、４つの主要標的病変の合計ＳＵＶ  ｍａｘの４８％低下と、標的病変の全般的石灰化を示す合計腫瘍密度の５３９％増加とを示した。一つには、これらのポジティブ腫瘍奏効に基づき、ＦＤＡは、公知の療法に抗療性である転移性骨肉腫のためのＲＥＸＩＮ−Ｇの第ＩＩ相有効性研究を承認した。客観的腫瘍奏効を定量する際、腫瘍細胞増殖の停止に伴って収縮するのではなく石灰化する骨肉腫病変の傾向のため、腫瘍奏効基準のより包括的な分析（ＰＥＴ基準（代謝活性）およびＣＨＯＩ基準（腫瘍密度）ならびにＲＥＣＩＳＴ（サイズのみ）を含む）を行った。
【０２０７】
実施例１０：難治性転移性骨肉腫患者におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ
肺への腫瘍転移を伴う化学療法抵抗性骨肉腫を呈する、難治性転移性骨肉腫を有する３８歳黒人女性。ＲＥＸＩＮ−Ｇを単独療法として使用し、１〜２×１０１１ｃｆｕを週に３回与えた。客観的奏功は、外科的切除を十分正当化する、ＰＥＴ基準によって判定した腫瘍代謝活性の減弱を含む。承認用量漸増は、腫瘍制御およびその後の外科的寛解を可能にし、アジュバントＲＥＸＩＮ−Ｇ療法は、寛解を２年間より長く持続させる。
【０２０８】
化学療法抵抗性骨肉腫の処置のためのＲＥＸＩＮ−Ｇの本第ＩＩ相有効性研究は、ＲＥＸＩＮ−Ｇの実証された抗癌活性をネオアジュバント療法として役立てる、したがって、治癒の可能性を秘めた外科手術のための病期の設定に役立てる機会を生じさせた。このケースでの３８歳女性は、１９９５年９月に左腓骨の限局性骨肉腫を有すると診断された。彼女は、１９９６年１月に四肢サルベージ手技を受け、そのネオアジュバント／アジュバント療法は、メトトレキサート、イホスファミド、シスプラチンおよびアドリアマイシンから成った。数年にわたって、彼女は、肺腫瘍の外科的切除を必要とする多数の肺転移を発症し、その後、メトトレキサート、イホスファミド、アドリアマイシンおよびシスプラチンに加えてインターフェロンを再び開始した。２００８年１月、彼女は、化学療法抵抗性肺転移を呈し、骨肉腫のためのＲＥＸＩＮ−Ｇを使用する第ＩＩ相研究に登録された。該第ＩＩ相研究は、２週間の休薬期間を伴う、４週間、週３回投与される１〜２×１０１１ｃｆｕの用量のＲＥＸＩＮ−Ｇ  ｉ．ｖ．から成った。
【０２０９】
多数の積極的化学療法レジメンに失敗し、そして様々な外科的切除ラウンドの後、癌が再発して単一肺転移として現れた。腫瘍標的指向型ＲＥＸＩＮ−Ｇの反復静脈内注入は、このケースでは、進行中の臨床試験において妥当な安全性が決定され次第、米国ＦＤＡによって全面的に承認された、患者内用量漸増を含んだ。ＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置は、腫瘍の組織構造に有意な影響を及ぼし、腫瘍を外科的に切除することにより、１つの転移性標的病変の嚢胞性転換、および潜在病変の、すなわちＰＥＴ−ＣＴスキャンによって見られない、骨化を被っていることが判明した（図２４参照）。それ故、この患者は、３サイクルの処置サイクル、続いて残留肺腫瘍の外科的切除、およびその後、術後さらに５サイクルのＲＥＸＩＮ−Ｇを受けた。２年後の今日まで、彼女は、疾患の形跡なく、寛解持続を享受している。
【０２１０】
実施例１１：難治性ユーイング肉腫患者におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ
肺への化学療法−ＩＧＦＲ療法抵抗性転移を呈する、難治性ユーイング肉腫を有する３６歳白人男性。処置プロトコルは、単独療法として、ＲＥＸＩＮ−Ｇを含んだ；２×１０１１ｃｆｕ注入、毎日、週５回。客観的奏功は、ＰＥＴによる代謝活性の減弱；腫瘍成長の安定化を含んだ。確証的ＰＥＴ放射線学的研究が、腫瘍奏効分析をさらに精緻化する。
【０２１１】
ユーイング肉腫は、骨および軟部組織の比較的稀な悪性疾患であり、一般に、外科手術および／または放射線での局部疾患制御に加えて、多剤化学療法で積極的に処置される。転移性疾患への進行が明白であり、患者が標準的な療法に対して抗療性になるケースでは、予後が極めて不良である。このケースの３６歳男性は、２００４年７月に肺および肝臓に転移したユーイング肉腫と診断された。放射線療法および外科的切除に加えて、彼の多剤化学療法レジメンは、ドキソルビシン、ダカルバジンおよびイホスファミドから成った。標準的な療法に失敗した後、彼は、ＩＧＦ受容体に対するモノクローナル抗体、すなわち、Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅによるＲＧ１５０７抗体、の第Ｉ相臨床研究に登録された。この患者は、インスリン様成長因子−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）療法に一時的に反応し、この療法は、時が経つにつれて効果がなくなった。［追加の注記：２００９年１２月にＲｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈは、ＲＧ１５０７の臨床開発を中止する決定を発表した。同様に、Ｐｆｉｚｅｒは、重要な無益性解析後、その第ＩＩＩ相フィギツムマブＩＧＦ−１Ｒ試験を突然中断した］。
【０２１２】
この試験の失敗後、前記重度処置済患者は、単独サルベージ療法として先進誘導レジメンで週５日投与されるＲＥＸＩＮ−Ｇ、すなわち、注入１回当たり２×１０１１の用量で各日２回施されるＲＥＸＩＮ−Ｇ  ｉ．ｖ．を受けた。その後のＰＥＴ／ＣＴスキャンは、肺における大きな腫瘍塊の遺残を示したが、複合放射線画像の解析によって判定すると２つの最大肺結節の代謝活性が著しく減弱していた。図２５から分かるように、肺における進行性転移性疾患の位置および量は、このＲＥＸＩＮ−Ｇサルベージ療法の時点で相当なものであったが、ＰＥＴ／ＣＴキャンの注意深い解析に基づき、１日２回のＲＥＸＩＮ−Ｇ注入の抗腫瘍活性が、より明白になった。主要な肺動脈病変のサイズを単に示すＣＴスキャンと、ＰＥＴスキャンのオーバーレイ（ＰＥＴ／ＣＴスキャン）は、これらの腫瘍内の実際の代謝活性を明らかにし、腫瘍成長に対する真の影響度を暴露し、例えば、３つの主要標的病変のうちの２つは、有意に低下した代謝活性を示した（図２５Ａ）が、第三の代謝活性病変は、識別可能な壊死中心部を呈示した。さらに、腰部領域の棘筋系の類似した比較スキャン（図２５Ｂ参照）は、ＣＴスキャンだけでは記録されなかったＰＥＴ／ＣＴによる腫瘍転移の、問題となる証拠を明らかにする。これらの注目すべき観察は、ＣＴスキャンのみによって得る理解が非常に不十分なものであることを示しており、精密な標的指向分子療法となると、腫瘍代謝活性の評価を含む腫瘍奏効基準の精緻化を考慮することを促している。
【０２１３】
３サイクルのＲＥＸＩＮ−Ｇ処置サイクルの後、患者は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ単剤療法に好適に反応することにより、ＲＥＸＩＮ−ＧとＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ（すなわち、追加の抗腫瘍活性および長期にわたる抗腫瘍免疫性を原則としてもたらし得る、残留腫瘍内の局在免疫反応を刺激するための、腫瘍標的指向型ＧＭ−ＣＳＦワクチン（３））から成るＧｅｎｅＶｉｅｖｅプロトコルに登録する資格を得た。
【０２１４】
実施例１２：難治性転移性乳癌患者におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ
リンパ節および胸壁への化学療法およびホルモン抵抗性癌転移を呈する難治性乳癌を有する７４歳白人女性。ＲＥＸＩＮ−Ｇを単独療法として使用し、２×１０１１ｃｆｕを週に３回与えた。客観的奏功は、残留腫瘍結節の外科的切除を可能にする腫瘍収縮を含んだ。腫瘍組織診によって、好適な免疫反応；処置後３年より長い生存期間をはじめとする、より有意な細胞学的有効性が確認される。
【０２１５】
このケースは、腋窩リンパ節および胸壁組織に転移した乳癌の再発腺管癌腫を有する７４歳白人女性である。彼女は、２００１年９月に乳房の浸潤性腺管癌腫、Ｔ３Ｎ２ステージ、を有すると診断され、２００１年９月に右乳房切除術を受け、ドキソルビシンおよびシクロホスファミド、胸壁への照射、続いてドセタキセル、そしてその後、タモキシフェンを受け、これを２００２年１０月に開始した。乳癌は、ＥＲポジティブであると判定されたが、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポジティブ性には疑問があった。この患者は、胸壁、鎖骨上、腋窩および縦隔リンパ節およびことによると骨において再発した２００６年１１月まで、タモキシフェンを継続した。彼女は、２００６年１１月３０日から２００７年１月２５日までＦａｓｌｏｄｅｘを使用する臨床試験に参加させられた。この患者は、最初は反応したが、２００６年２月８日に反復ＣＴスキャンにより残留治療抵抗性疾患が確認された。
【０２１６】
化学療法抵抗性、ホルモン抵抗性乳癌のこのケースでは、再生疾患が、リンパ節においても前胸壁においても顕性であった。３週間、週３回施した１×１０１ｃｆｕのＲＥＸＩＮ−Ｇの反復注入は、結果として、胸壁腫瘍および腋窩リンパ節の退縮を生じさせ、孤立残留腫瘍の外科的切除を可能にした。図２６に示すように、残留腫瘍は、有意な腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に付随してわずかな、しかし識別できるアポトーシス腫瘍細胞を伴う、線維性の塊（マッソントリクローム染色で青色染色物質）のように主として見え、決して甚だしい増殖性腫瘍ではなかった。特定の免疫細胞化学的染色によるＴＩＬの補足のさらなる特性評価によって、一般により好適な予後と関連付けられる有意な割合のＣＤ８＋キラーＴ細胞が同定された。この好適な予後は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置後３年を超えて未だ生存しているこの患者の生存継続によって肯定される。
【０２１７】
実施例１３：難治性転移性卵巣癌患者におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ
大脳および脳幹に転移した化学療法抵抗性癌を呈する、難治性転移性卵巣癌を有する６１歳アジア人女性。ＲＥＸＩＮ−Ｇを単独療法として使用し、２×１０１１ｃｆｕを週に５日与えた。客観的奏功は、前頭葉および小脳における転移性脳病変の退縮を含んだ。これは、血液脳関門を越えての腫瘍制御の初めての臨床的実証である。
【０２１８】
この６０歳の患者は、２００６年５月に網に転移した左卵巣の腺癌を有すると診断された。彼女は、腹式子宮全摘術と両側卵管卵巣摘出術を受け、６サイクルのパクリタキセルおよびカルボプラチンと左骨盤に対する放射線療法を受けた。２００９年１１月、彼女は、重症うつ病および嗜眠を随伴する、左前頭葉および右小脳への転移を発症した。その後、彼女は、８週間、週に５日施される、１当量当たり２×１０１１ｃｆｕでの比較的集中的用量のＲＥＸＩＮ−Ｇ単剤療法ｉ．ｖ．を受けた。この集中的ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置は、大脳および小脳転移病巣の退縮と同時に、彼女のうつ病および認識を実質的に向上させる結果となった。
【０２１９】
これは、卵巣癌においてみられるＲＥＸＩＮ−Ｇ単剤有効性の初めての実証ではなく、客観的腫瘍奏効についてはＲＥＣＩＳＴによって以前に記録されている（データは示さない）。このケースは、血液脳関門を越えて達せられる、単純な静脈内注入によって達成される、臨床的有効性について初めて立証された実証の１つとして特に注目に値する。これらの治療用量の腫瘍標的指向型ＲＥＸＩＮ−Ｇナノ粒子の血液脳関門および／または脈絡叢を横断する輸送が、レトロベクター表面エンベロープタンパク質によって媒介されるにせよ、疾患組織病理に関連した毛細血管透過性の何らかの機序（単数または複数）によって媒介されるにせよ、ＲＥＸＩＮ−Ｇが、個々の脳腫瘍レベルに集中しこれらの病変の解剖学的退縮を生じさせるための十分な浸透度および治療的質量作用を呈示することは明白である。
【０２２０】
実施例１４：転移性前立腺癌患者におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ
原発性腫瘍と広範な有痛骨転移を呈する、転移性前立腺癌を有する９１歳。ＲＥＸＩＮ−Ｇを単独療法として使用し、２×１０１１ｃｆｕを週に３回与えた。客観的奏功は、原発性腫瘍の根絶および骨転移無進行を含み、結果として、骨痛の漸進的寛解および可動性増加が生じた。これは、進行転移性前立腺癌におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ単剤有効性の初めての臨床的実証である。
【０２２１】
この９１歳男性は、２００９年４月に転移性前立腺癌を有すると診断された。彼は、膀胱底（ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｆｌｏｏｒ）、精嚢がかかわる原発性前立腺悪性疾患、および両側水腎症を生じさせる結果となる閉塞性尿路疾患を呈し、高いＰＳＡレベル、および患者が寝たきりで確実に褥瘡性潰瘍になるほどの消耗性骨痛を随伴する広範な骨格への転移（頭骨、肩甲骨、胸骨、椎骨、肋骨、骨盤、腸骨翼、坐骨、恥骨および大腿骨）も明らかであった。この患者は高齢であるため、毒性化学療法および／または放射線療法でのファーストライン処置から除外した。その代り、この患者は、８週間、週に３回施される１用量あたり２×１０１１ｃｆｕのＲＥＸＩＮ−Ｇ  ｉ．ｖ．を受けた。和らぐ最初の痛ましい症状には、骨痛の重症度があり、続いて水腎の後遺症からの漸進的寛解があった。フォローアップ腹部ソノグラム、ＣＴスキャンおよび骨スキャンは、骨転移の進行のない正常な前立腺および腎臓を示し、疼痛の主観的寛解に加えて、血清ＰＳＡレベルが有意に低下した。この老人患者は、最終的には、歩行器を使って再び歩くことができ、日常活動に参加することができ、自分の仕事を再び始めることができた。
【０２２２】
実施例１５：難治性転移性膵臓癌患者におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ
肝蔵、腹部リンパ節および肺に転移した化学療法抵抗性切除不能膵臓癌を呈する、難治性転移性膵臓癌を有する５４歳アジア人女性。ＲＥＸＩＮ−Ｇを単独療法として施し、２×１０１１ｃｆｕを週に３回与えた。客観的奏功は、ＣＴスキャンによる、原発性腫瘍の融解および肝臓転移の退縮を含む。たった４週間のＲＥＸＩＮ−Ｇ処置の後、原発性腫瘍融解。
【０２２３】
この６０歳女性は、２００９年１月に腸間膜、肝蔵および肺に転移した膵臓腺癌を有すると診断された。この患者は、胆管バイパスを受け、標準的な化学療法、４週間のゲムシタビン１０００ｍｇ／ｍ２、での処置を受けたが、すぐに失敗し、疾患が進行する結果となった。２００９年４月、彼女は、４週間、週３回施される、１用量当たり２×１０１１ｃｆｕのＲＥＸＩＮ−Ｇ  ｉ．ｖ．での処置を開始した。４週終了時のフォローアップＣＴスキャンは、原発性腫瘍の完全退縮、および肝臓転移（標的病変）のサイズ縮小を示した。図２７から分かるように、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置後、組織密度（ＣＨＯＩ基準）はもちろん腫瘍サイズ（ＲＥＣＩＳＴ）にも迅速かつ識別可能な変化があった。セカンドライン療法として投与した顕著な１サイクルのＲＥＸＩＮ−Ｇの後、この好適反応患者は、ＲＥＸＩＮ−ＧとＲＥＸＩＭＭＵＮＥ−Ｃ（標的指向ＧＭ−ＣＳＦ）個別化ワクチン療法から成るＧｅｎｅＶｉｅｖｅプロトコルに登録された。彼女は、イベントなしに、新たな病変なしに、そして安定した残留疾患が確認されて、ＲＥＸＩＮ−Ｇ＋ＲＥＸＩＭＭＵＮＥ−Ｃでの６ヶ月の処置を完了し、さらに６ヶ月間の維持療法としてＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置を受けているところである。
【０２２４】
実施例１６：難治性転移性膵臓癌患者におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ
肝蔵および腹部リンパ節に転移した化学療法抵抗性膵臓癌を呈する、難治性転移性膵臓癌を有する７３歳白人女性。ＲＥＸＩＮ−Ｇを単独療法として使用し、３×１０１１ｃｆｕを週に３回与えた。客観的奏功は、９ヶ月間処置を維持することによって獲得された完全な臨床的寛解を含んだ。転移性化学療法抵抗性膵臓癌を呈する患者におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ誘導臨床的寛解の初めての実証。
【０２２５】
この７３歳女性は、２００６年６月に膵臓の腺癌を有すると診断された。この患者は、２００８年７月にＷｈｉｐｐｌｅ手技を受け、２００６年９月から２００６年１０月まで５−ＦＵでのアジュバント療法、続いて２００６年１１月から２００７年２月までゲムシタビンを受けた。彼女は、２００８年１０月に肝臓および腹部リンパ節における腫瘍再発を被り、その後、ゲムシタビン抵抗性膵臓癌のためのＲＥＸＩＮ−Ｇの第Ｉ／ＩＩ相研究に登録された。彼女は、４週間、週３回、注入１回当たり３×１０１１ｃｆｕでのＲＥＸＩＮ−Ｇ  ｉ．ｖ．を受け、これに２週間の休薬期間が続いた（これが１処置サイクルを構成する）。６ヶ月のＲＥＸＩＮ−Ｇ処置中に新たな病変は無く、これは安定した疾患（ＳＤ、図２８Ａ参照）を示すものであったが、残存肝臓病変の１つがやや大きく見え（ＲＥＣＩＳＴにより）、進行性疾患（ＰＤ）を連想させ得ることが、多少懸念された。標的リンパ節病変のサイズの漸進的縮小（図２８Ｂ）およびＣＡ１９．９レベルのほぼ正常レベルへの持続的降下（図２８Ｃ）をはじめとする、客観的腫瘍奏効のさらなる、より包括的な分析が、主任研究員にこのＲＥＸＩＮ−Ｇ処置コースを保持することを促し、その結果、最終的に、残存肝臓病変が迅速に解消するような完全な臨床的寛解（ＣＲ、図２８Ａ参照）が生じた。
【０２２６】
安定した疾患（ＳＤ）の達成とともに、反復ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置サイクル中に新たな病変の不在が観察されたことは、有意な臨床的有用性に相当した。このことは、予想できる膵臓癌挙動およびＲＥＸＩＮ−Ｇの分子的作用機序にかんがみて、過小評価すべきでない。９ヶ月のＲＥＸＩＮ−Ｇ処置後に臨床的に寛解した状態であることを宣告されたこの注目に値する膵臓癌患者の継続処置は、転移性肝臓病変の根絶が、アポトーシスおよび抗血管新生によって迅速に起こり得ること、または線維増多および腫瘍浸潤リンパ球（１０）の発現に伴って徐々に解決するものであることを思い出させるものとして役立ち、この場合、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置コースを保持し続けることは非常に有益である。この膵臓癌患者は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置の開始から１６ヶ月より長きにわたって寛解持続を教授している。
【０２２７】
実施例１７：難治性転移性膵臓癌患者におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ
肝蔵に転移した化学療法抵抗性のＷｈｉｐｐｌｅ後再発を呈する、難治性転移性膵臓癌を有する５０歳白人女性。ＲＥＸＩＮ−Ｇを単独療法として使用し、４×１０１１ｃｆｕを週に３回与えた。客観的奏功は、腫瘍進行の停止と肝臓転移の消失を含んだ。単一残留腫瘍をＲＥＸＩＮ−Ｇ療法の６ヶ月後に切除する。ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置により、外科的寛解が可能となり、その結果、分子的作用機序の直接的組織学的証拠が得られる。
【０２２８】
この５０歳女性は、２００７年８月に膵臓の腺癌を有すると診断された。この患者は、Ｗｈｉｐｐｌｅ手技、続いて、ゲムシタビンおよびカペチタビンから成るアジュバント化学療法コースを２００７年１１月から２００８年３月まで受けた。２００９年２月、フォローアップＣＴスキャンは、肝臓転移のいくつかの病巣を示した。その後、彼女は、２００９年３月にゲムシタビン抵抗性膵臓癌のためのＲＥＸＩＮ−Ｇの第Ｉ／ＩＩ相研究に参加させられ、週に３回投与される１用量当たり４×１０１１ｃｆｕでのＲＥＸＩＮ−Ｇ  ｉ．ｖ．を４サイクル受け、その結果、疾患進行が安定化し、新たな病変が予防され、２つの転移肝結節（標的病変）のうちの１つが根絶した。ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置期間中に発生する新たな病変の予防により、主任研究員は、その１つの孤立残留腫瘍の外科的切除を推奨することができ、該腫瘍を迅速に切除し、組織学的検査のために包埋した。
【０２２９】
外科手術手技直前のネオアジュバントとしてのＲＥＸＩＮ−Ｇでのこの患者の時宜を得た処置により、転移病変内での作用に関するＲＥＸＩＮ−Ｇの日和見検査が可能になった。図２９Ａに示すように、このＲＥＸＩＮ−Ｇ前処置腫瘍の容積の有意な割合は、線維増多および細胞外マトリックスタンパク質で構成され（２９Ｂ）、一方、残留腫瘍の残部は、様々な分化段階の円柱状／管状構造の相当ゆっくりと成長する比較的偽分化性配列であるように見える。この観察は、処置に対する客観的奏功がＲＥＣＩＳＴ測定値だけでは著しく過小評価されることがあるという主張を確証する。より顕著には、ＲＥＸＩＮ−Ｇは、残存癌細胞の大量のアポトーシス（図２９ＤにおけるＴＵＮＥＬ染色参照）はもちろん、すべて偽腺様構造の縁に沿ってはっきりとわかる明白な核崩壊も有するように見える。この患者の局部免疫反応は、決して強くはなく、ＣＤ４５＋白血球の散発性浸潤が病巣内で観察される（２９Ｃ）が、この細胞浸潤巣は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（２９Ｆ）およびＣＤ８＋キラーＴ細胞（２９Ｇ）から主として成った。
【０２３０】
単独療法としてＲＥＸＩＮ−Ｇを使用するステージＩＶ膵臓癌における転移性疾患の成長および拡大の制御に加えて、このケースは、有効なアジュバント療法として作用することによりこの致命的な癌形態からの最終的な外科的寛解を可能にしたＲＥＸＩＮ−Ｇについて特に注目すべきであり、これを考慮することは、臨床腫瘍医にとっても腫瘍外科医にとっても重要である。術後、この患者は、この手技からの回復後にＲＥＸＩＮ−Ｇ処置を再開し、処置開始から１１ヶ月より長きにわたって臨床的寛解持続を享受し続けている。
【０２３１】
実施例１８：難治性ユーイング肉腫患者におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ
原発性膵臓塊と広範な肝臓および腹部リンパ節転移を呈する、難治性転移性膵臓癌を有する４７歳白人男性。ＲＥＸＩＮ−Ｇをゲムシタビンとともにファーストライン処置として使用した。ＲＥＸＩＮ−Ｇ、２〜３×１０１１ｃｆｕを週５日、加えてゲムシタビン１０００ｍｇ／ｍ２を週１回、７週間与えた。客観的奏功は、ＣＡ１９．９レベルの４０％低下を伴う原発性腫瘍の迅速な退縮を含む。腫瘍破壊性代謝拮抗物質に対する腫瘍奏効を開始させるために考案された、ＲＥＸＩＮ−Ｇとゲムシタビンでのファーストライン併用療法の実証。
【０２３２】
発熱および黄疸の症状を呈し、この４８歳白人男性は、２００９年１１月、肝蔵および腹部リンパ節にかかわる広範な転移性腫瘍量を伴う膵臓の腺癌を有すると診断された。転移性疾患の存在によりＷｈｉｐｐｌｅ手技を除外したが、胆管バイパスを総胆管十二指腸吻合術および胆嚢摘出術で行った。ファーストライン療法としてのＲＥＸＩＮ−Ｇの人道的使用の急な要望に応えて、また国際監督官庁の承認のすべての認定および結果に従って、この患者を週に５日、１用量当たり２×１０１１ｃｆｕのｉ．ｖ．で施すＲＥＸＩＮ−Ｇと１０００ｍｇ／ｍ２の週間用量で投与するゲムシタビンの組み合わせで合計７週間にわたって処置した。このファーストライン併用療法の最初のコースの後、フォローアップＭＲＩは、膵腫瘤の有意な退縮、ならびに肝臓転移および腹部リンパ節腫脹の全般的安定化を示した。腫瘍制御のこれらの放射線医学的表示は、腫瘍マーカーＣＡ１９．９レベルの３０％低下を随伴した。このことは、ＣＡ１９．９の時宜を得た低下が、進行期間ばかりでなく全生存期間についての強力な指標として客観的放射線医学的反応と比べて勝ること、および代用エンドポイント（２４、２５）としてでさえ役立ち得ることを示唆する研究にかんがみて、さらに注目に値する。
【０２３３】
ゲムシタビンは、標準的な用量／処置修正プロトコルに従って、公知のゲムシタビン毒性に起因する肝臓酵素レベルの漸進的上昇（すなわち、ＬＦＴ上昇）のため、２週間の期間、中止したが、ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入は、この長期休薬期間の間も継続した。注目に値することとして、肝臓機能試験値は、迅速に正規化したが、ＣＡ１９．０は、初期値の４０％まで降下し続けた。この確立された併用療法の相対的安全性により、ＲＥＸＩＮ−Ｇの用量を、次の併用療法コースでは週に３回投与する１用量当たり３×１０１１ｃｆｕへと上昇させた。現在、この患者は、順調であり、追加のＲＥＸＩＮ−Ｇ／ゲムシタビン併用療法ラウンドを、明確に異なる分子的作用機序で動作するＲＥＸＩＮ−Ｇの標的指向された抗血管新生、抗腫瘍活性によって該代謝拮抗物質の制限された腫瘍破壊効果を強化することができることを期待して、継続している。
【０２３４】
実施例１９：ＲＥＸＩＮ−Ｇ第Ｉ／ＩＩ相および第Ｉ相臨床試験
膵臓癌、肉腫、乳癌についての第Ｉ相、Ｉ／ＩＩ相、および骨肉腫についてのＲＥＸＩＮ−Ｇの第ＩＩ相研究が完了している、または進行中である。投与スケジュールを表６および７に提供する。
【０２３５】
【表６】
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【０２３６】
【表７】
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【０２３７】
設計および方法−目的／研究設計／エンドポイント：本第Ｉ／ＩＩ研究の主要目的は、患者パフォーマンスステータス、毒性評定スコア、血液および代謝プロフィールによって定義される、漸増用量のＲＥＸＩＮ−Ｇの臨床的毒性の判定であった。副次的目的としては、（ｉ）ＲＥＸＩＮ−Ｇが免疫反応、組換え事象および／または非標的器官への望ましくないベクター組み込みを誘発する可能性の評価、および（ｉｉ）ＲＥＸＩＮ−Ｇに対する抗腫瘍奏効の同定が挙げられた。
【０２３８】
本研究は、標準コホート設計（Ｓｔｏｒｅｒ、１９８９）の変形を用いた。３つの各コホートを、毒性または生物活性に依存して患者６名に拡大することができた。最大耐用量を、１名以下の患者が用量制限毒性（ＤＬＴ）を経験する最大安全耐容用量と定義し、次に高い用量レベルは、ＤＬＴを経験した患者を少なくとも２名有した。ＤＬＴは、予期される事象、例えば、７２時間未満続くグレード３  ＡＮＣ、グレード３  脱毛、または任意のグレード３以上の悪心、嘔吐もしくは下痢（ＮＣＩ有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ  バージョン３））を除く、ことによると、多分または明確に治験薬に関連している考えられる任意のグレード３、４または５有害事象と定義した。
【０２３９】
患者がグレードＩ未満の毒性を有した場合には追加の処置サイクルを施すことを許容することにより、進行中の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験に第ＩＩ相有効性要素を組み込んだ。さらに、グレードＩ未満の毒性を有し、指定の用量レベルでの安全性が立証されたときには患者に用量レベルＩＩまでの全面的用量漸増を許容した。主任研究員は、残留疾患が組織学的検査またはＰＥＴ−ＣＴスキャンによって見つかった場合、外科的切除／減量術およびＲＥＸＩＮ−Ｇの継続を推奨することも許容された。
【０２４０】
統計解析（第Ｉ／ＩＩ相）−処置期間中のすべての有害事象に関して収集した情報を利用する安全性の主要評価。有効性情報を、用量ごとに、ＲＥＣＩＳＴ、国際ＰＥＴおよびＣＨＯＩ基準に基づくカテゴリーＣＲ、ＰＲ、ＳＤおよびＰＤ各々に関する数としてまとめた。任意の奏効（ＣＲ、ＰＲ、ＳＤおよびＰＤと定義）を達成した数を表にした。加えて、次のエンドポイントについての情報を報告する：腫瘍制御率（ＣＲ、ＰＲまたはＳＤ）、無進行生存期間および全生存期間。無進行生存期間および全生存期間をカプラン・マイヤープロットを用いてまとめる。腫瘍量、腫瘍奏効および用量レベルの程度間の相関関係も評価した。治験患者に関する人口統計およびベースライン情報（例えば、以前の治療の程度）を表にする。本研究において観察された有害事象について、次の情報を報告する：用量レベル、タイプ（罹患器官または検査室判定、例えば好中球絶対数）、重症度、および検査室判定についての最も極端な異常値、ならびに研究処置への関連性。用量ごとに、任意のグレード３、４または５有害事象を経験している患者数を報告し、特定のタイプの有害事象を経験した患者の数も報告する。安全性およびいくつかの薬物動態データ、ならびに抗腫瘍活性／有効性情報を、ＲＥＸＩＮ−Ｇの迅速承認のために提示する。
【０２４１】
第Ｉ／ＩＩ相肉腫（骨および軟部組織肉腫）：評価可能な患者３３名  表８は、第Ｉ／ＩＩ相肉腫研究（Ｃｈａｗｌａら、２００９）についての患者人口統計を示すものである。本肉腫研究は、次の１４タイプの肉腫を包含する：骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、平滑筋肉腫、滑膜細胞肉腫、線維肉腫、卵巣悪性ミューラー管混合腫瘍、悪性紡錘細胞肉腫、心臓血管肉腫、胞巣状軟部肉腫、横紋筋肉腫および無色素性シュワン腫。
【０２４２】
【表８】
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【０２４３】
【表９】
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【０２４４】
国際ＰＥＴ基準およびＣＨＯＩ基準は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置に対する初期奏効についてのより感度の高い指標であるようである。図３０は、無進行生存期間とＲＥＸＩＮ−Ｇ用量の直接的関係を示す。無進行生存期間とＲＥＸＩＮ−Ｇ投薬量の間の有意な用量−反応関係を、ログランク検定により５％統計レベルで実証した。横軸にプロットした処置開始からの時間の関数として、縦軸に患者生存率をプロットする。評価可能患者は、処置サイクルを少なくとも１サイクル完了し、腫瘍奏効評価を有した患者である。図３０Ｃは、全生存率（ＯＳ）とＲＥＸＩＮ−Ｇ投薬量の間の用量−反応関係を明らかにする、全生存率についてのカプラン・マイヤー分析を示す（ｎ＝３３；処置群においてｐ＝０．００２）。治療企図群における有意性は、ｐ＝０．０１６であった。臨床データは、化学療法抵抗性骨および軟部組織肉腫に関して、ＲＥＸＩＮ−Ｇが、有意な抗腫瘍活性を呈示できること、および腫瘍成長の制御にならびに無進行生存および全生存の改善に役立ち得ることを示唆している。
【０２４５】
骨肉腫についてのＲＥＸＩＮ−Ｇの第ＩＩ相有効性研究：本研究の目標は、公知の療法に対して抗療性である再発または転移性骨肉腫を有する２０〜３０名の患者における検証的単群試験の完了に基づき、骨肉腫についてのサルベージ療法としてＲＥＸＩＮ−Ｇの迅速承認を獲得することである。主要エンドポイントは、国際ＰＥＴ基準による全奏効率（ＣＲ、ＰＲまたはＳＤのいずれか）によって測定される臨床的有効性である。副次的エンドポイントは、次のとおりである。（１）１ヶ月より長い無進行生存期間および６ヶ月以上の全生存期間によって測定される臨床的有効性、および（２）患者パフォーマンスステータス、毒性評定スコア、血液および代謝プロフィール、免疫反応、ＰＢＬへのベクター組み込みならびに組換え事象によって定義される臨床的毒性。
【０２４６】
各処置サイクルは、４週間の処置および２週間の休薬で、６週間とする。グレードＩ以下の毒性を有する患者には、安全性データおよび客観的腫瘍奏効を記録した後、反復サイクルを行うことができる。最初に、患者は、ＰＥＴ−ＣＴ画像診断研究によって測定された推定腫瘍量に基づいた指定された用量レベルでＲＥＸＩＮ−Ｇ  ｉ．ｖ．を受けた。その後、疾患進行または疾患関連有害事象があった場合、患者内用量漸増選択肢を含めるようにプロトコルを修正した。継続ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置は、疾患安定化および全生存期間の延長はもちろんのこと、蓄積毒性の不在の確認の点でも、累積用量のＲＥＸＩＮ−Ｇの有益な抗腫瘍効果の確認を可能にし、これらの両方を、標準的な化学療法に失敗した転移性骨および軟部組織肉腫に関するＲＥＸＩＮ−Ｇの第Ｉ／ＩＩ相研究において明確に実証した。
【０２４７】
主任研究員は、１サイクル以上の処置サイクルの後、外科的減量術または切除を推奨することができ、それによって、処置腫瘍の組織学的特性評価、および以前の前臨床および臨床研究において実証されたＲＥＸＩＮ−Ｇ処置腫瘍の既知特徴と比較が可能になる。これらの特徴としては、アポトーシス腫瘍細胞および内皮細胞の存在（ＲＥＸＩＮ−Ｇの主要作用機序）、ならびに反応性炎症反応での様々な程度の中心壊死、限局性微小出血（増殖性腫瘍内皮細胞の選択的破壊の結果として生ずるＲＥＸＩＮ−Ｇの抗血管新生作用）、修復性線維増多、ならびに腫瘍浸潤リンパ球の特徴的補足が挙げられる。
【０２４８】
術後に、病理組織学的検査またはＰＥＴ−ＣＴスキャンのいずれかによって残留疾患が存在した場合、および患者がグレードＩ未満の毒性を有する場合、反復サイクルを施することができる。この特別なアプローチは、ＲＥＸＩＮ−Ｇがネオアジュバント／アジュバント設定で投与される将来のプロトコルの設計の助けになるだろう。
【０２４９】
適格性（第ＩＩ相研究）−患者には、標準的な化学療法に失敗した再発または転移性骨肉腫を有することが要求された。診断または再発時に組織学的または細胞学的確認が要求された。患者には、０〜１のＥＣＯＧパフォーマンススコアならびに妥当な血液学的、肝および腎機能を有することが要求された。
【０２５０】
除外基準としては、ＨＩＶ、ＨＢＶまたはＨＣＶポジティブ；臨床的に有意な腹水；本プロトコルの遵守成功を危うくする健康または精神状態；ならびにＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置中および処置完了後４週間、有効な避妊法を用いることへの不賛成が挙げられた。Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄは、本プロトコルを承認し、すべての治験参加者からインフォームドコンセントを得た。
【０２５１】
処置前評価およびフォローアップ研究（第ＩＩ相研究）−処置前評価は、病歴；身体検査；血液学グループ；化学グループ；プロトロンビン時間（ＰＴ）、ＩＮＲおよび活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）をはじめとする凝固の評定；ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶについての検査；ＦＤＧ／ＰＥＴ−ＣＴスキャン、ＥＫＧおよび胸部Ｘ線を含む画像診断評価が挙げられた。すべての患者に、週１回、全血球算定および血清化学検査を行った。加えて、各ベクター注入前、および追加の処置サイクル開始前に、毒性を評定した。６週終了時または追加の処置サイクルの開始前に、画像診断研究での有効性評定も行った。６週の時点および各処置サイクル前に、患者の血清をベクター抗体の存在について検査した。６週終了時および各処置サイクルの前に、ベクターＤＮＡ組み込みの評定のために、患者から末梢血単核細胞を採取した。加えて、末梢血単核細胞中の複製能のあるレトロウイルス（ＲＣＲ）の存在を検出するためのリアルタイムＰＣＲを６週終了時および各処置サイクル前に行った。
【０２５２】
適応設計（第ＩＩ相研究）−各処置サイクルは、４週間の処置および２週間の休薬期間から成る、６週間であった。次の３つのベクター用量レベルを用いた。用量レベルＩ＝４週間、週に２回の１×１０１１ｃｆｕ  ＩＶ；用量レベルＩＩ＝４週間、週に３回の１×１０１１ｃｆｕ  ＩＶ；用量レベルＩＩＩ＝４週間、週に３回の２×１０１１ｃｆｕ  ＩＶ。患者が、グレードＩ以下の毒性を有した場合、画像診断結果にかかわらず、処置サイクルを反復した。腫瘍成長のより良好な制御を達成するために、疾患進行または疾患関連有害事象が発生した場合には（ＦＤＡとの論議の後）用量レベルＩＩＩへの患者内用量漸増を許容した。前投薬としてジフェンヒドラミンを１２〜５０ｍｇの用量で静脈内投与するか、経口投与した。過敏症反応が発生した場合には、タイレノール５００ｍｇ  ｐ．ｏ．、ヒドロコルチゾン５０〜１００ｍｇ  ＩＶ、およびメペリジン２５〜５０ｍｇ  ＩＶを処方した。すべての患者は、５×１０９ｃｆｕ／ｍＬの作用強度を有する臨床ロットを受けた。１サイクル以上の処置サイクルの後、主任研究員は、外科的減量術または完全外科的除去を推奨することができる。病理組織学的検査またはＰＥＴ−ＣＴスキャンのいずれかによって残留疾患が存在した場合、外科手術４週間後、その外科的切開が治癒していたら、および患者がグレードＩ未満の毒性を有していたら、反復処置サイクルを施することができる。
【０２５３】
統計法（第ＩＩ相研究）−有効性情報を、用量ごとに、国際ＰＥＴ基準に基づくカテゴリーＣＲ、ＰＲ、ＳＤおよびＰＤ各々に関する数および百分率としてまとめた。６および１２週の時点および各フォローアップＰＥＴ−ＣＴスキャン時点で（ＣＲ、ＰＲまたはＳＤとして定義され、全奏効またはＯＲと呼ばれる）任意の好適な奏効を達成する数および百分率を表にした。加えて、次のエンドポイントについての情報を報告する。全奏効率（ＣＲ、ＰＲまたはＳＤ）、無進行生存期間および全生存期間。患者は、生存期間については、１年の評価期間を超えている。すべての奏効を報告する。奏効率を、本研究に登録された適格患者の百分率（ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ解析）としても、評価可能な患者の百分率（すなわち、処置コースを完了する適格患者）（「ａｓ  ｔｒｅａｔｅｄ」解析）としても報告する。奏効率についての９５％信頼区画を推定することとする。カプラン・マイヤープロットを用いて、生存率、および失敗までの時間をまとめることとする。腫瘍量、腫瘍奏効および用量レベルの程度間の相関関係も評価した。
【０２５４】
ＦＤＡ承認第ＩＩ相研究に関して、本発明者らは、公知の療法に対して抗療性である再発または転移性骨肉腫を有する２０〜３０名の患者での本単群試験の完了に基づき、迅速承認を求めた。本第ＩＩ相試験のエンドポイントは、過去の情報との比較での単一試験群における全ポジティブ奏効のパーセントとなる。進行疾病状態の患者について迅速な腫瘍進行および限られた患者生存率を立証することとする。必要な患者数は、全奏効率（ＣＲ、ＰＲまたはＳＤとして定義されるＯＲ）の関数である。標準的な処置での失敗後にＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置を受けた患者における実測ＯＲ率と、標準的な処置に失敗してさらなる処置を受けていない患者における想定ＯＲ率、５％との比較についてのサンプルサイズを下の表に示す。本発明者らは、有意性レベル０．０２５、検出力８０％、および治験患者における一定範囲のＯＲ率での片側正確確率検定を想定した。全ポジティブ奏効の継続期間および程度は、単群試験に基づく薬剤の承認可能性を熟考する上で重要となる。１ヶ月より長い無進行生存期間中央値、６ヶ月より長い全生存期間中央値、および細胞傷害性化学療法の回避も熟慮中である。患者の特徴および転帰データを説明するために度数分布表、グラフおよび簡易統計を用いた。加えて、全生存期間の分布を説明するためにカプラン・マイヤー方法論（ＫａｐｌａｎおよびＭｅｉｅｒ、１９５８年）を用いた。
【０２５５】
奏効／毒性基準（第ＩＩ相試験）−国際ＰＥＴ基準ならびにまたＦＤＡ承認プロトコルによるＲＥＣＩＳＴおよびＣＨＯＩ基準を用いて、奏効を評価した。さらに、外科的切除／減量術手技から得た腫瘍検体の病理組織学的検査によって、奏効を評価した。ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置に対するポジティブ奏効を、（ｉ）ＲＥＣＩＳＴおよび／または国際ＰＥＴ基準による完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）または安定した疾患（ＳＤ）、（ｉｉ）１ヶ月より長い無進行生存期間（ＰＦＳ）、（ｉｉｉ）６ヶ月以上の全生存期間、および（ｉｖ）５０％より高い腫瘍壊死の組織学的所見、ならびに腫瘍内の石灰化および／または線維増多の存在によって示す。
【０２５６】
米国国立癌研究所共通用語基準バージョン３．０を用いて毒性のグレード分類を行った。ベースラインでおよび各処置サイクル後にＦＤＧ／ＰＥＴ／ＣＴスキャンによって奏効を評価した。ＮＣＩ  ＲＥＣＩＳＴ基準（Ｔｈｅｒａｓｓｅら、２０００年）および国際ＰＥＴ基準を用いて腫瘍奏効を評価した。奏効／毒性基準の総合評価は主任研究員が行った。
【０２５７】
結果：骨肉腫に関する単剤有効性研究
【表１０】
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ＣＲ＝完全奏効；ＰＲ＝部分奏効；ＳＤ＝安定した疾患；ＰＤ＝進行性疾患；ＮＤ＝決定できない；病変が小さすぎてＣＨＯＩによって決定できない；ＢＩＷ＝週に２回；ＴＩＷ＝週に３回
【０２５８】
合計２２名の患者にＲＥＸＩＮ−Ｇを開始させた。そのうち５名は、１サイクル未満の処置サイクルを経験し、評価のために戻ってこなかった。この治療企図集団において、ＯＳ中央値は、６．５ヶ月であり、１年生存率は、２７％であり、および２年生存率は、２３％であった。図３１Ａは、１７名の評価可能患者での有効性データを示す図である。標準ＲＥＣＩＳＴを用いて、１０／１７名（５９％）の評価可能患者は、外科的完全奏効または安定した疾患を有したが、国際ＰＥＴ基準を用いると、４／１７名の患者は、完全奏効または部分奏効を有し、８／１７名の患者は、安定した疾患を有し、総計すると、患者の７１％が部分奏効または安定した疾患を有した。ＣＨＯＩ基準を用いると、４／１７名は、完全または部分奏効を有し、１１／１７名は、安定した疾患を有し、総計すると、患者の８８％が、完全もしくは部分奏効または安定した疾患を有した。したがって、腫瘍奏効は、既存対照について予想されたもの（未処置の場合には５％以下がポジティブ奏効を有する；ｐ＜０．０２５）と比較してＲＥＸＩＮ−Ｇ処置群でのほうが有意に高かった。無進行生存期間中央値は、４ヶ月であり、全生存期間は、８ヶ月（２２名の登録患者すべてについて６．５ヶ月）であった。
【０２５９】
骨肉腫に関するＲＥＸＩＮ−Ｇの第ＩＩ相研究の結論：骨肉腫についての検証的第ＩＩ相研究の目的は満たされた。少なくとも１サイクルのＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置を受けた患者において、ＲＥＣＩＳＴにより１７名の評価可能患者のうち１名ＣＲ／９名ＳＤの腫瘍奏効（５９％；９５％信頼区画、３３〜８２％）、４ヶ月のＰＦＳ中央値、および８ヶ月の全生存期間中央値。すべての登録患者についての全生存期間中央値は、６．５ヶ月であった。まとめると、肉腫についての２つの独立した明確に規定された第Ｉ／ＩＩ相研究（このうち３名は、骨肉腫患者であった）および骨肉腫についての第ＩＩ相研究の結果は、ＲＥＸＩＮ−Ｇが、化学療法抵抗性肉腫および骨肉腫に関して腫瘍成長の制御を助長でき、ことによると無進行および全生存時間を改善することができることを示唆しており、したがって、希望的観測によれば、骨肉腫についての迅速承認のための必須要素を提供するものである。
【０２６０】
第Ｉ／ＩＩ相膵臓ＣＡ：有効性の分析は、表１１に示すとおり用量レベルＩＩＩまでの評価可能患者を含む。
【表１１】
2013541497.tif 000013
ＣＲ＝完全奏効；ＰＲ＝部分奏効；ＳＤ＝安定した疾患；ＰＤ＝進行性疾患；ＮＤ＝決定できない；病変が小さすぎてＣＨＯＩによって決定できない；ＢＩＷ＝週に２回；ＴＩＷ＝週に３回
＊２０名の患者にＲＥＸＩＮ−Ｇを開始させ、そのうち５名は、１サイクル未満の処置サイクルを経験し、または評価のために戻ってこなかった；ＯＳ中央値は、用量レベル０〜Ｉでの６名の患者については２．６ヶ月であり、用量レベルＩＩでの７名の患者については９．３ヶ月であり、および用量レベルＩＩＩでの７名の患者については７．５ヶ月であり、用量レベルＩＩおよびＩＩＩの両方について２９％の１年生存率であった。
【０２６１】
合計２０名の患者にＲＥＸＩＮ−Ｇを開始させ、そのうち５名は、１サイクル未満の処置サイクルを経験し、または評価のために戻ってこなかった；ＯＳ中央値は、用量レベル０〜Ｉでの６名の患者については２．６ヶ月であり、用量レベルＩＩでの７名の患者については９．３ヶ月であり、および用量レベルＩＩＩでの７名の患者については７．５ヶ月であった。国際ＰＥＴ基準およびＣＨＯＩ基準は、部分奏効の検出に関して、ＲＥＸＩＮ−Ｇに対する奏効のより感度の高い指標であるように見える。
【０２６２】
片側フィッシャー検定を用いて、本発明者らは、本先進第Ｉ／ＩＩ相研究における（ＲＥＣＩＳＴによる）腫瘍制御奏効（ｎ＝１５、奏効：１ＣＲ、２ＰＲ、１２ＳＤ）と先行第Ｉ相研究（１ＳＤ、１１ＰＤ；Ｇａｌａｎｉｓら、２００８年）とを比較した。ＣＲ、ＰＲまたはＳＤと呼ばれる「腫瘍制御奏効」に関して、割合は、現行研究については１５／１５および先行研究については１／１２であり、片側フィッシャー検定によりｐ＜０．０００１であった。これらのデータは、腫瘍制御奏効とＲＥＸＩＮ−Ｇ投薬量の間の用量反応関係を示している。
【０２６３】
図３１Ｂに示すように、カプラン・マイヤー分析は、無進行生存期間（ＰＦＳ）とＲＥＸＩＮ−Ｇ投薬量の間の用量−反応関係に向かう傾向を示唆する。先行第Ｉ相（Ｃ０３−１０１）および第Ｉ／ＩＩ相研究（Ｃ０７−１０５）からの無進行生存期間データをカプラン・マイヤープロットで表示する。横軸にプロットした処置開始からの時間の関数として、無進行で生存している患者の割合を縦軸にプロットする。注記：青色矢印は、より低用量のＲＥＸＩＮ−Ｇを使用する先行第Ｉ相安全性研究で処置された患者の〜１ヶ月（３２日）のＰＦＳ中央値を指摘している。先行第Ｉ相研究は、０．７５〜１．５×１０１０ｃｆｕの用量を１４〜２０用量分使用し、先進第Ｉ／ＩＩ相：用量０〜Ｉ＝１×１０１１ｃｆｕを週に２または３回；用量ＩＩ〜ＩＩＩ：２〜３×１０１１ｃｆｕ、週に３回、１２用量分で、この処置サイクルを、毒性がグレード１以下の場合、反復した。膵臓癌を有する患者の無進行生存率、治療企図集団についての全生存データをカプラン・マイヤープロットで表示する。横軸にプロットした処置開始からの時間の関数として、生存している患者の割合を縦軸にプロットする。同様に、コックス回帰分析およびカプラン・マイヤー分析は、全生存期間とＲＥＸＩＮ−Ｇ投薬量の間の用量−反応関係を示す（ｐ＝０．０３；ｎ＝２０）。
【０２６４】
膵臓癌におけるＲＥＸＩＮ−Ｇ有効性の分析−臨床データは、ＲＥＸＩＮ−Ｇが、化学療法抵抗性膵臓癌を有する患者において、有意な抗腫瘍活性を呈示すること、ならびに腫瘍成長の制御および全生存期間の改善に役立ち得ることを示唆している。
【０２６５】
第Ｉ／ＩＩ相乳癌（有効性の分析）Ｎ＝２０
【表１２】
2013541497.tif 000014
【０２６６】
乳癌に関する有効性の分析：臨床データは、ＲＥＸＩＮ−Ｇが、化学療法抵抗性乳癌に関して、腫瘍成長の制御に役立ち得ること、およびことによると全生存期間の延長に役立ち得ることを示している。
【０２６７】
第Ｉ／ＩＩ相および第ＩＩ相プロトコルについてのベクター安全性研究−これらの臨床プロトコルで使用したベクターは、ＲＥＸＩＮ−Ｇレトロベクターである。レトロウイルス遺伝子送達の潜在的リスク、危険および不安としては、複製能のあるレトロウイルスの発生、ＲＥＸＩＮ−Ｇベクターの散在、癌の挿入突然変異／リスク、およびベクター中和抗体の発生が挙げられる。これらのリスクは、以下の理由のため、ＲＥＸＩＮ−Ｇ製品では低い：１）複製能のあるレトロウイルス（ＲＣＲ）の発生：複製能のあるレトロウイルスの発生率は、マウス系のレトロウイルスエンベロープ構築物、パッケージング構築物ｇａｇ  ｐｏｌおよびレトロウイルスベクターがそれら固有のプロモータによって駆動される別々のプラスミドにおいて発現される一過性プラスミドコトランスフェクション系では見込めないであろう。さらに、前記臨床用ベクターは、米国ＦＤＡガイダンス／規則に従って検証されたＲＣＲアッセイを用いて、ＲＣＲについてネガティブと検定された。２）ＲＥＸＩＮ−Ｇベクターの散在：ヒト細胞系から産生されたレトロウイルスベクターは、ヒト補体による不活化に対して比較的耐性である。したがって、全身循環へのＲＥＸＩＮ−Ｇの注入は、即時不活化を生じさせる結果にはならないだろう。しかし、ＲＥＸＩＮ−Ｇベクター粒子は、癌性病変を探し出してそこに蓄積するので、標的癌細胞付近の露出したコラーゲンに直ぐ結合すると予想される。レトロウイルスベクターが本質的に備えている安全性特徴は、活発に分裂する細胞にしか組み入れられないものであるので、分裂していない正常な細胞に結合するベクターは、十中八九失われるであろう。またコラーゲンは通常は循環中に露出されないので、非標的器官内の増殖細胞が損傷されるリスクは、ほんのわずかであろう。３）癌の挿入突然変異／リスク：本質的に、修正遺伝子がエクスビボで回収細胞に挿入され、その後、該細胞が選択され、拡大され、移植によって患者に戻されて、表面上、長時間にわたる生化学的修正を生じさせる、遺伝子療法の利用の場合、必然的にベクターへの懸念が尾を引く。対照的に、癌のための遺伝医学の利用の場合、遺伝子送達系は、選択的であるようにおよび切除されやすいように設計されている。例えば、ベクターを遺伝子操作して、「細胞不活化性」にする（ＣＩＮ）。［注記：今までに開発されたＳＩＮ（自己不活化性）ＭＬＶ系ベクターは、低い力価、ＳＩＮ欠失の修復、および遺伝子輸送効率を欠点として持ち（Ａｎｓｏｎ、２００４）、これらの欠点はすべて、前方視的癌処置の有効性を台無しにする傾向がある。さらに、Ｅｐｅｉｕｓ「病態親和性」エンベロープ、成長関連細胞周期制御ノックアウト遺伝子の選択、およびＭＬＶベクター組み込みのための細胞増殖の基本要件をはじめとする、腫瘍標的指向化の機能的態様が協力して作用して、挿入突然変異誘発のリスクを最小にするように遺伝子送達系の安全性プロフィールを改善する。４）ベクター中和抗体の発生：ＲＥＸＩＮ−Ｇレトロベクターのステルス性および低い免疫原性は、ベクターに対する抗体の発生についての懸念がほとんどない反復静脈内注入を可能にする。
【０２６８】
これらのベクター安全性の懸念にさらに対処するために、ＲＥＸＩＮ−Ｇベクターを使用して、末梢静脈または中心ラインのいずれかを通して該ベクターを静脈内注入する、臨床的毒性およびベクター関連安全性の研究を行った。優良実験室規範に従って標準的な操作手順を用いて、Ｅｐｅｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｕｎｉｔにおいて相関的実験室分析を行った。このセクションにて、本発明者らは、患者の臨床的毒性、血液、代謝および化学プロフィール、患者血清中の抗ベクター抗体についての試験結果、ならびに複製能のあるレトロウイルス（ＲＣＲ）の存在および末梢血リンパ球へのベクターＤＮＡの組み込みについての試験結果をを報告する。
【０２６９】
臨床的毒性−患者の臨床的毒性、血液、代謝および化学プロフィールを、ＮＣＩ有害事象共通用語基準、ＣＴＣＡＥバージョンに従って報告する。３）．安全性／毒性研究の結果を表１３〜１７に列挙する。 
【０２７０】
【表１３】
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注記：グレードＩＩＩ有害事象は、１０００ｍｇのアセトアミノフェンを毎日摂取した１名の患者において発生した。アセトアミノフェンの中止により、有害事象の再発なく、ＲＥＸＩＮ−Ｇを再開することができた。これは、前記グレードＩＩＩ事象が、大用量のアセトアミノフェンの摂取に起因したことを示している。
【０２７１】
【表１４】
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＊後に、進行性疾患に帰する
【０２７２】
【表１５】
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【０２７３】
【表１６】
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【０２７４】
【表１７】
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＊後に、進行性疾患に帰する
【０２７５】
市場経験−ＲＥＸＩＮ−Ｇは、２００７年１２月にフィリピンＦＤＡからの迅速承認を獲得しており、フィリピンでは標準的な化学療法に失敗したあらゆる固形悪性疾患のための抗癌剤としての登録製品である。市販後モニタリングは、重篤な薬物関連有害事象の報告がないことを示している。ＲＥＸＩＮ−Ｇは、日本、スペイン、インドおよび中国において温情的理由で使用されており、これらの国において薬物関連有害事象の報告はない。ＲＥＸＩＮ−Ｇは、米国、ＥＭＥＡおよびその他の地域（フィリピン以外）では承認されておらず、これらの国での市販後経験はない。
【０２７６】
データの要約および調査員のためのガイダンス−転移性膵臓癌、肉腫、乳癌および骨肉腫に関するＲＥＸＩＮ−Ｇの安全性および有効性をそれぞれ評価する、４つの並行した先進第Ｉ／ＩＩ相および第ＩＩ相研究の結果は、標準的な化学療法に失敗した患者におけるＲＥＸＩＮ−Ｇの総合的安全性および潜在的用量依存有効性を支持する証拠を提出する。漸進的段階的用量漸増は、反復静脈内注入が用量制限毒性を生じさせなかった初期低用量第１相安全性研究（Ｇａｌａｎｉｓら、２００８年）のものを超えて、より高い、より有効なレベルへと進み、そのレベルで単剤有効性の証拠を得た（Ｃｈａｗｌａら、２００９年）。
【０２７７】
転移性ゲムシタビン抵抗性膵臓癌に関する静脈内ＲＥＸＩＮ−Ｇの先進第Ｉ／ＩＩ相研究は、治療企図集団において、ログランク検定により０．０３のレベルまでの全生存期間とＲＥＸＩＮ−Ｇ投薬量との有意な用量反応関係を示した。注目に値することとして、高用量コホートにおいて９．２ヶ月の生存期間中央値および２９％の１年生存率が示された（Ｃｈａｗｌａら、２００９年）。同様に、骨および軟部組織肉腫に関する静脈内ＲＥＸＩＮ−Ｇの適応第Ｉ／ＩＩ相研究は、ログランク検定を用いて、無進行生存期間／全生存期間とＲＥＸＩＮ−Ｇ投薬量との有意な用量反応関係を実証した（それぞれｐ＝０．０２および０．００５；Ｃｈａｗｌａら、２００９年）。ＰＥＴ−ＣＴスキャンによって示される好適な腫瘍奏効、およびＲＥＸＩＮ−Ｇの潜在的生存率向上も、公知の療法に失敗した骨肉腫を有する患者の第ＩＩ相研究において観察された（Ｃｈａｗｌａら、２００９年）。国際ＰＥＴ基準およびＣＨＯＩ基準と標準的ＲＥＣＩＳＴを用いる確証的分析の重要性がこれらの研究において強調された。
【０２７８】
アントラサイクリンおよびタキサン療法に失敗した転移性乳癌に関するＲＥＸＩＮ−Ｇの第Ｉ／ＩＩ相研究では、２０名の患者において７０％の腫瘍制御率および６５％の１年生存率が観察された。これらのデータは、有望である。同様の１年生存時間が、転移性乳癌のためのファーストライン処置として施されたときのパクリタキセルについて報告されているからである。
【０２７９】
〜１００人の患者にかかわる４つの臨床試験すべてにおける用量制限毒性の不在は、ＲＥＸＩＮ−Ｇの特有の安全性を裏付ける証拠を提出する。継続ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置１年以下のＲＥＸＩＮ−Ｇ処置患者の血清、および末梢血リンパ球からのＤＮＡにおいて、ベクター中和抗体、ベクターＤＮＡ組み込み、および複製能のあるレトロウイルスは検出されなかった（Ｃｈａｗｌａら、２００９年）。これらの結果は、監督官庁によるレトロベクター安全性の懸念を鎮めることとなろう。最後に、ＲＥＸＩＮ−Ｇが、アンメットメディカルニーズを代表するこれらの重篤で生命を脅かす疾病のための有効な処置としての安全性および有効性の真実味のある実証に基づき、膵臓癌、軟部組織肉腫および骨肉腫について希少疾病用医薬品指定を受けていることを述べておいたほうがいいだろう。
【０２８０】
実施例２０：再発または転移性肉腫のための介入としてのドミナントネガティブサイクリンＧ１構築物を有する病態親和性ナノ粒子（ＲＥＸＩＮ−Ｇ）の安全性および有効性の第Ｉ／ＩＩ相評価
本研究の主要目的は、静脈内注入として投与されるＲＥＸＩＮ−Ｇの用量制限毒性（ＤＬＴ）および最大耐用量（ＭＴＤ）を決定することであった。本研究の副次的目的は、ＲＥＸＩＮ−Ｇが非標的器官において免疫応答、組換え事象および望ましくないベクター組み込みを誘発する可能性を評価すること、ならびに静脈内ＲＥＸＩＮ−Ｇに対する客観的腫瘍奏効を特定することであった。
【０２８１】
これは、第ＩＩ相有効性相と組み合わせた３種類の設計の標準コホートの変形を組み入れた、非盲検、単群、用量探索研究であった。ＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置は、４週間の処置、続いての２週間の休薬を包含する、６週サイクルを含んだ。週に２回、静脈内（ｉ．ｖ．）注入によって施される、１．０×１０１１ｃｆｕで始まる、５つの用量レベルを計画した。各用量レベルごとに３名の患者を処置し、各用量レベルで最初の３名の患者のうちのいずれか１名にＤＬＴが観察されたら、１コホート当たり患者６名に拡大した。
【０２８２】
ＭＴＤは、患者３名のうちの０名または６名のうちの１名以下がＤＬＴを経験した最高用量と定義し、次に高い用量レベルは、ＤＬＴを経験した患者を少なくとも２名有した。
【０２８３】
ＤＬＴは、ことによると、多分または明確に治験薬に関連していると考えられる任意の米国国立癌研究所有害事象共通毒性基準（ＣＴＣＡＥ）グレード３、４または５有害事象（ＡＥ）であって、次のものを除くＡＥと定義した。最も効果的な支持療法を受けなかった患者における、７２時間未満続くグレード３  好中球絶対数；グレード３  脱毛；または悪心、嘔吐もしくは下痢の任意のグレード３以上のインシデント。
【０２８４】
本研究の第ＩＩ相部分については、毒性がなかった患者、または毒性がグレード１以下に解消された患者は、追加の治療サイクルを受けることができた。プロトコル修正案ＩおよびＩＩにより、毒性がなかった患者または毒性がグレード１以下に解消された患者については、より高い用量レベルでの安全性が確立され次第、用量レベルＩＩまでの患者内用量漸増が可能になった。加えて、各用量レベルで有意な生物活性が認められた場合には、各コホートを患者６または７名に拡大することもできた。主任研究員は、少なくとも１サイクルの処置サイクルが完了したのち、外科的切除／減量術を推奨することを許容された。先ずはＲＥＣＩＳＴを用いて奏効を評価した（Ｔｈｅｒａｓｓｅら、２０００年）。追加の評価は、国際ＰＥＴ基準（Ｙｏｕｎｇら、（１９９９年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３５：１７７３−１７８２）およびＣｈｏｉら、（２００７年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：１７５３−１７５９．によって記載された修正ＲＥＣＩＳＴを用いた。安全性および有効性分析を主任研究員が行った。
【０２８５】
３６名の患者が登録された（プロトコル適用免除および早期中止を含む）。Ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−Ｔｒｅａｔ（ＩＴＴ）安全性集団は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入を少なくとも１回受けたすべての患者と定義し３６名の患者を含んだ（安全性および全生存期間について用いた）。修正Ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−Ｔｒｅａｔ（ｍＩＴＴ）有効性集団は、少なくとも１サイクル（４週間）のＲＥＸＩＮ−Ｇを受け、かつフォローアップＰＥＴ  ＣＴスキャンをしたすべての患者と定義し、３３名の患者を含んだ（奏効、無進行生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）について用いた）。登録された被験者の性別および人種を表１８に示す。
【０２８６】
【表１８】
2013541497.tif 000020
【０２８７】
用量レベル０＝１×１０１１ｃｆｕ  週に２回（ＢＩＷ）；用量レベルＩ＝１×１０１１ｃｆｕ  週に３回（ＴＩＷ）；用量レベルＩＩ＝２×１０１１ｃｆｕ  ＴＩＷ；用量レベルＩＩＩ＝３×１０１１ｃｆｕ  ＴＩＷ；用量レベルＩＶ＝４×１０１１ｃｆｕ  ＴＩＷ。
【０２８８】
登録され、処置を受けた患者３６名のうち、６名は、用量レベル０〜Ｉでの処置を受け、７名は、用量レベルＩ〜ＩＩでの処置を受け、７名は、用量レベルＩＩでの処置を受け、８名は、用量レベルＩＩＩでの処置を受け、および８名は、用量レベルＩＶでの処置を受けた。３３名の患者は、少なくとも１サイクルの全処置サイクル（４週間）を受け、フォローアップＰＥＴ−ＣＴスキャンをし、有効性について評価可能と見なされた。ＲＥＣＩＳＴにより、２２名の患者はＳＤを有し、および１１名はＰＤを有した。国際ＰＥＴ基準により、９名の患者はＰＲを達成し、２１名はＳＤを有し、および３名はＰＤを有した。Ｃｈｏｉらの修正ＲＥＣＩＳＴ基準により、８名の患者はＰＲを達成し、２３名はＳＤを有し、および２名はＰＤを有した。腫瘍制御率（ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤ）は、ＲＥＣＩＳＴにより６７％（２２／３３名の患者）；ＰＥＴ基準により９１％（３０／３３）およびＣｈｏｉ修正ＲＥＣＩＳＴにより９４％（３１／３３）であった。ＰＥＴおよびＣｈｏｉ修正ＲＥＣＩＳＴを用いた方が、ＰＲが大きくなった。これは、これらのツールが、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置に対する腫瘍奏効のより感度の高い指標であることを示している。
【０２８９】
用量−反応効果は、腫瘍奏効についてもＰＦＳについても明らかでなかった。しかし、全生存期間とＲＥＸＩＮ−Ｇ用量の間の用量−反応関係は明らかであった。
【０２９０】
特に、最低用量のＲＥＸＩＮ−Ｇを受けた患者は、いずれも１年生存しなかった。対照的に、用量レベルＩ〜ＩＩを受けた患者の２８．５％が、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置開始の１年後に生存していたが、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置開始の２年後に生存した患者は居なかった。最良生存データは、最高用量（用量レベルＩＩＩ〜ＩＶ）のＲＥＸＩＮ−Ｇを受けた患者において観察され、全生存率推定値は、ＩＴＴ集団での１年で３１．２％および２年で２５％％と比較して、ｍＩＴＴ集団では１年で３８．５％および２年で３１％であった。
【０２９１】
２０１１年２月２５日の最後のフォローアップ現在で、３名の患者は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置開始より３２から３７ヶ月の範囲の期間、生存し続けていた。これらの３名の患者のうちの２名を用量レベルＩＩＩで処置し、１名を用量レベルＩＶで処置した。奏効を表１９にまとめる。
【０２９２】
【表１９】
2013541497.tif 000021
＊細胞数＝示す数×１０９
＋ｃｆｕの数＝示す数×１０１１
【０２９３】
いずれの用量レベルにおいても用量制限毒性はなかった。無関係有害事象をすべての患者について報告したが、事象数は少なく（最も多い場合で、１有害事象当たり発生１または２）、ほとんどがグレード１または２であった。８名の患者は、関連有害事象を経験した；すべてが軽度または中等度の重症度であった。２０名の患者は、重篤有害事象（ＳＡＥ）を経験し、これらのすべてが、治験薬には関係ないと考えられた。
【０２９４】
３６名すべての患者が、治験薬に関係のない非重篤ＡＥを１つ以上経験した。これらの無関係ＡＥの大多数は、グレード１または２であった。ＡＥとＲＥＸＩＮ−Ｇ用量の間に関係がないことは明らかであった。実際、低い用量のＲＥＸＩＮ−Ｇを受けた患者にほど、多くの無関係グレード３有害事象があった。これは、有害事象が癌に関連したものであることを示している。最高頻度のグレート３、非重篤、無関係有害事象は、貧血（患者１０名）、低カリウム血症（患者５名）および低ナトリウム血症（患者５名）であった。腹痛、血中アルカリホスファターゼ増加、低アルブミン血症および低カルシウム血症がそれぞれ３名の患者において報告された。高ビリルビン血症、筋骨格系胸痛、呼吸性アシドーシスおよび呼吸不全がそれぞれ２名の患者において報告された。他のすべてのグレード３  ＡＥは、それぞれ１名の患者でしか報告されず、すべてが疾患進行によるものであった。
【０２９５】
３６名の処置患者のうちの８名は、それぞれ、治験薬関連有害事象を１つ経験した。これらの８事象は、悪寒（患者２名）、疲労（患者５名）および過敏症（患者１名）を含んだ。すべての治験薬関連ＡＥは、非重篤であり、グレード１または２の重症度であった。これらの関連ＡＥについて用量の傾向は明らかでなかった。
【０２９６】
３６名の処置患者のうちの２０名は、ＳＡＥを有したと報告された。これらのＳＡＥは、いずれも、治験薬とは関係がなかった。
【０２９７】
２０１１年２月２５日現在、３３／３６名の患者は、死亡している。ＲＥＸＩＮ−Ｇに関連があると考えられる死亡はなかった。死亡した３３名のうちの３０名に関する死亡原因は、進行性疾患であった。死亡した他の３名の患者に関する死亡原因は、ステント手技からの医原性食道および大動脈出血、播種性血管内凝固を伴う敗血症、および術後合併症（不整脈および脱水症）であった。
【０２９８】
ベクター関連安全性パラメータもＲＥＸＩＮ−Ｇの有害効果を示さなかった。３名の患者は、ｇｐ７０に対する抗体について弱ポジティブであると検定された。各ケースにおいて、反応は一時的であり、これは、ベクター中和抗体の検出を伴わなかった、次のいずれについてもポジティブと検定された患者はいなかった。ベクター中和抗体、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中の複製能のあるレトロウイルス、またはＰＢＬのゲノムＤＮＡへのベクター組み込み。
【０２９９】
本研究は、ＲＥＸＩＮ−Ｇが、安全であり、十分に耐容され、処方用量で最小の毒性を有することを実証するものである。高い腫瘍制御率（ＲＥＣＩＳＴにより６７％、ＰＥＴにより９１％、およびＣｈｏｉにより９４％）は、ＲＥＸＩＮ−Ｇが、標準的な化学療法に失敗した再発または転移性肉腫を有する患者において実質的活性を有することを示している。８〜９名（２４〜２７％）の患者が、ＰＥＴまたはＣｈｏｉ腫瘍評定基準を用いてＰＲと評定されたが、ＲＥＣＩＳＴによってはされなかったという観察結果は、ＰＥＴおよびＣｈｏｉのほうが、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置に対する腫瘍奏効についての感度の高い指標であること、およびＲＥＣＩＳＴが、ＲＥＸＩＮ−Ｇを使用する試験にとって最適な評定ツールでない可能性があることを示唆している。最後に、全生存期間とＲＥＸＩＮ−Ｇ用量の間の用量−反応関係は、ＲＥＸＩＮ−Ｇが、骨および軟部組織肉腫を有する化学療法抵抗性患者において全生存期間を延長できることを示している。
【０３００】
実施例２１：再発または転移性乳癌のための介入としてのドミナントネガティブサイクリンＧ１構築物を有する病態親和性ナノ粒子（ＲＥＸＩＮ−Ｇ）の安全性および有効性の第Ｉ／ＩＩ相評価
本研究の主要目的は、静脈内注入として投与されるＲＥＸＩＮ−Ｇの用量制限毒性（ＤＬＴ）および最大耐用量（ＭＴＤ）を決定することであった。本研究の副次的目的は、ＲＥＸＩＮ−Ｇが非標的器官において免疫応答、組換え事象および望ましくないベクター組み込みを誘発する可能性を評価すること、ならびに静脈内ＲＥＸＩＮ−Ｇに対する客観的腫瘍奏効を特定することであった。
【０３０１】
これは、第ＩＩ相有効性相と組み合わせた３種類の設計の標準コホートの変形を組み入れた、非盲検、単群、用量探索研究であった。ＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置は、４週間の処置、続いての２週間の休薬を包含する、６週サイクルを含んだ。週に２回、静脈内（ｉ．ｖ．）注入によって施される、１．０×１０１１ｃｆｕで始まる、５つの用量レベルを計画した。各用量レベルごとに３名の患者を処置し、各用量レベルで最初の３名の患者のうちのいずれか１名にＤＬＴが観察されたら、１コホート当たり患者６名に拡大した。
【０３０２】
ＭＴＤは、患者３名のうちの０名または６名のうちの１名以下がＤＬＴを経験した最高用量と定義し、次に高い用量レベルは、ＤＬＴを経験した患者を少なくとも２名有した。
【０３０３】
ＤＬＴは、ことによると、多分または明確に治験薬に関連していると考えられる任意の米国国立癌研究所有害事象共通毒性基準（ＣＴＣＡＥ）グレード３、４または５有害事象（ＡＥ）であって、次のものを除くＡＥと定義した。最も効果的な支持療法を受けなかった患者における、７２時間未満続くグレード３  好中球絶対数；グレード３  脱毛；または悪心、嘔吐もしくは下痢の任意のグレード３以上のインシデント。
【０３０４】
本研究の第ＩＩ相部分については、毒性がなかった患者、または毒性がグレード１以下に解消された患者は、追加の治療サイクルを受けることができた。プロトコル修正案ＩおよびＩＩにより、毒性がなかった患者または毒性がグレード１以下に解消された患者については、より高い用量レベルでの安全性が確立され次第、用量レベルＩＩまでの患者内用量漸増が可能になった。加えて、各用量レベルで有意な生物活性が認められた場合には、各コホートを患者６または７名に拡大することもできた。主任研究員は、少なくとも１サイクルの処置サイクルが完了したのち、外科的切除／減量術を推奨することを許容された。先ずはＲＥＣＩＳＴを用いて奏効を評価した（Ｔｈｅｒａｓｓｅら、２０００年）。追加の評価は、国際ＰＥＴ基準（Ｙｏｕｎｇら、（１９９９年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３５：１７７３−１７８２）およびＣｈｏｉら、（２００７年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：１７５３−１７５９．によって記載された修正ＲＥＣＩＳＴを用いた。安全性および有効性分析を主任研究員が行った。
【０３０５】
２０名の患者が登録された。Ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−Ｔｒｅａｔ（ＩＴＴ）安全性集団は、少なくとも１用量のＲＥＸＩＮ−Ｇを受けたすべての患者と定義し２０名の患者を含んだ（安全性および全生存期間について用いた）。修正Ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−Ｔｒｅａｔ（ｍＩＴＴ）有効性集団は、少なくとも１サイクルを受け、かつフォローアップＰＥＴ−ＣＴスキャンをしたすべての患者と定義し、１８名の患者を含んだ（奏効、無進行生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）について用いた）。登録された被験者の性別および人種を表２０に示す。
【０３０６】
【表２０】
2013541497.tif 000022
【０３０７】
用量レベル０＝１×１０１１ｃｆｕ  週に２回（ＢＩＷ）；用量レベルＩ＝１×１０１１ｃｆｕ  週に３回（ＴＩＷ）；用量レベルＩＩ＝２×１０１１ｃｆｕ  ＴＩＷ；用量レベルＩＩＩ＝３×１０１１ｃｆｕ  ＴＩＷ；用量レベルＩＶ＝４×１０１１ｃｆｕ  ＴＩＷ。
【０３０８】
登録され、処置を受けた患者２０名のうち、７名は、用量レベル０〜ＩＩでの処置を受け、７名は、用量レベルＩＩＩでの処置を受け、および６名は、用量レベルＩＶでの処置を受けた。１７名の患者は、少なくとも１サイクルの全処置サイクル（４週間）を受け、フォローアップＰＥＴ  ＣＴスキャンをし、有効性について評価可能と見なされた。ＲＥＣＩＳＴにより、１３名の患者は、ＳＤを有し、４名の患者は、ＰＤを有した。各用量レベルで同様の数の患者がＳＤまたはＰＤを有したので、明らかな用量−反応関係はなかった。ＲＥＣＩＳＴによる腫瘍制御率（ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤ）は、７６％（１３／１７名の患者）であった。
【０３０９】
ＲＥＣＩＳＴによるＰＦＳは、用量レベル０〜Ｉでの３．５ヶ月から、用量レベルＩＩでの１．２５ヶ月、および用量レベルＩＩＩでの３ヶ月にわたり、したがって、用量−反応関係は明らかでなかった。より多い腫瘍量が、用量レベルＩＩＩでの患者について観察された。これは、より短いＰＦＳの説明になり得る。注目されることとして、広範な骨転移のみを有し、内臓での併発のない２名の患者（用量レベルＩＩＩでの患者１名および用量レベルＩＶでの１名）は、１年より長いＰＦＳを有し、処置開始後１年より長く生きている。
【０３１０】
ＯＳをＩＴＴおよびｍＩＴＴ集団において調査した。１年のＯＳ推定値は、ＩＴＴおよびｍＩＴＴ集団において、すべての用量レベルで６０％（ｍＩＴＴ集団では６６％）であり、用量レベルＩＶでは８３％であった。２０名の患者のうちの８名は、２０１１年６月２４日のフォローアップ現在、処置開始より１９から４３ヶ月間生存している。生存している者のうち、１名は、用量レベル０〜ＩＩでの処置を受け、２名は、用量レベルＩＩＩでの処置を受け、５名は、用量レベルＩＶでの処置を受けた。奏効を表２１にまとめる。
【０３１１】
【表２１】
2013541497.tif 000023
＊細胞数＝示す数×１０９
＋ｃｆｕの数＝示す数×１０１１
【０３１２】
いずれの用量レベルにおいても用量制限毒性はなかった。無関係有害事象をすべての患者について報告したが、事象数は少なく（最も多い場合で、１有害事象当たり発生１または２）、ほとんどがグレード１または２であった。関連有害事象が、５名の患者において発生し、１名以外のすべてが、グレード１または２であった。３名の患者は、重篤有害事象を経験し、これらのすべてが、治験薬には関係ないと考えられた。
【０３１３】
２０名すべての患者が、１つ以上の非重篤ＡＥを経験し、調査員は、これらのＡＥを治験薬には関係ないと考えた。無関係事象の大多数は、グレード１または２であった。
【０３１４】
最高頻度の非重篤、無関係グレード３ＡＥは、嘔吐であった（患者３名）。２名の患者において報告された他のグレード３ＡＥは、貧血、悪心、ＡＳＴ増加、アルカリホスファターゼ増加、およびリン増加であった。すべての他のグレード３  ＡＥは、それぞれ１名の患者でしか報告されなかった。用量の傾向は明らかでなかった。
【０３１５】
２０名の処置患者のうちの５名は、それぞれ、合計８の治験薬関連有害事象を経験した。５名の患者のうちの３名は、それぞれ、１つの治験薬関連ＡＥを有し、１名の患者は、２つの治験薬関連ＡＥを有し、および１名の患者は、３つの治験薬関連ＡＥを有した。これらの８事象は、それぞれ１名の患者における悪寒、そう痒、そう痒性皮疹、乾燥肌および顔面潮紅、ならびに３名の患者における味覚障害を含んだ。すべての治験薬関連ＡＥは、非重篤であり、グレート３そう痒性皮疹の１事象を除いてグレード１または２の重症度であった。すべての治験薬関連ＡＥは、用量レベルＩＩ以上での処置を受けた患者において発生し、８事象のうちの６事象が、用量レベルＩＩＩまたはＩＶでの処置を受けた患者において発生し、過敏症反応であった。
【０３１６】
１２名の患者のうちの３名は、治験薬と関係がないと考えられる重篤有害事象を有したと報告された。これらは、１名の患者におけるグレード２  悪性胸水、および１名の患者におけるグレード２  病的骨折を含んだ。１名の患者は、次の６つのＳＡＥを有した：グレード４  肺塞栓症、グレード４  好中球減少症、グレード４  発熱、グレード４  呼吸困難（ｄｙｓｐｎｏｅａ）、グレード４  呼吸器うっ血、およびグレード４  緑膿菌感染症。いずれも治験薬とは関係がなかった。用量の傾向は、明らかでなかった。
【０３１７】
２０１１年２月２５日現在、１２／２０名の患者は、死亡している。ＲＥＸＩＮ−Ｇに関連があると考えられる死亡はなかった。すべての死亡は、疾患進行の結果としてであった。
【０３１８】
ベクター関連安全性パラメータもＲＥＸＩＮ−Ｇの有害効果を示さなかった。次のいずれについてもポジティブと検定された患者はいなかった。ベクター中和抗体、ｇｐ７０に対する抗体、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中の複製能のあるレトロウイルス、ＰＢＬのゲノムＤＮＡへのベクター組み込み。
【０３１９】
７６％の腫瘍制御率は、ＲＥＸＩＮ−Ｇが、以前の化学療法に失敗した再発または転移性乳癌を有する患者において抗腫瘍活性を有し得ることを示している。用量レベルＩＶについての１年のＯＳ率８３％は有望であり、またパクリタキセルでのファーストライン療法を受けた既存対照における７０％ＯＳ（Ｌｅｏら、２００９年）に勝る生存率向上を示唆している。注目されることとして、広範な骨転移のみを有し、内臓での併発のない２名の患者は、最長ＰＦＳを有し、ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置開始から１年より長く生きている。ＲＥＸＩＮ−Ｇに関する安全性の問題は、明らかでなかった。
【０３２０】
実施例２２：再発または転移性膵臓癌のための介入としてのドミナントネガティブサイクリンＧ１構築物を有する病態親和性ナノ粒子（ＲＥＸＩＮ−Ｇ）の安全性および有効性の第Ｉ／ＩＩ相評価
本研究の主要目的は、静脈内注入として投与されるＲＥＸＩＮ−Ｇの用量制限毒性（ＤＬＴ）および最大耐用量（ＭＴＤ）を決定することであった。本研究の副次的目的は、ＲＥＸＩＮ−Ｇが非標的器官において免疫応答、組換え事象および望ましくないベクター組み込みを誘発する可能性を評価すること、ならびに静脈内ＲＥＸＩＮ−Ｇに対する客観的腫瘍奏効を特定することであった。
【０３２１】
これは、第ＩＩ相有効性相と組み合わせた３種類の設計の標準コホートの変形を組み入れた、非盲検、単群、用量探索研究であった。ＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置は、４週間の処置、続いての２週間の休薬を包含する、６週サイクルを含んだ。週に２回、静脈内（ｉ．ｖ．）注入によって施される、１．０×１０１１ｃｆｕで始まる、５つの用量レベルを計画した。用量レベルごとに３名の患者を処置し、各用量レベルで最初の３名の患者のうちのいずれか１名にＤＬＴが観察されたら、１コホート当たり患者６名に拡大した。
【０３２２】
ＭＴＤは、患者３名のうちの０名または６名のうちの１名以下がＤＬＴを経験した最高用量と定義し、次に高い用量レベルは、ＤＬＴを経験した患者を少なくとも２名有した。
【０３２３】
ＤＬＴは、ことによると、多分または明確に治験薬に関連していると考えられる任意の米国国立癌研究所有害事象共通毒性基準（ＣＴＣＡＥ）グレード３、４または５有害事象（ＡＥ）であって、次のものを除くＡＥと定義した。最も効果的な支持療法を受けなかった患者における、７２時間未満続くグレード３  好中球絶対数；グレード３  脱毛；または悪心、嘔吐もしくは下痢の任意のグレード３以上のインシデント。
【０３２４】
本研究の第ＩＩ相部分については、毒性がなかった患者、または毒性がグレード１以下に解消された患者は、追加の治療サイクルを受けることができた。プロトコル修正案ＩおよびＩＩにより、毒性がなかった患者または毒性がグレード１以下に解消された患者については、より高い用量レベルでの安全性が確立され次第、用量レベルＩＩまでの患者内用量漸増が可能になった。加えて、各用量レベルで有意な生物活性が認められた場合には、各コホートを患者６または７名に拡大することもできた。主任研究員は、少なくとも１サイクルの処置サイクルが完了したのち、外科的切除／減量術を推奨することを許容された。先ずはＲＥＣＩＳＴを用いて奏効を評価した（Ｔｈｅｒａｓｓｅら、２０００年）。追加の評価は、国際ＰＥＴ基準（Ｙｏｕｎｇら、（１９９９年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３５：１７７３−１７８２）およびＣｈｏｉら、（２００７年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：１７５３−１７５９．によって記載された修正ＲＥＣＩＳＴを用いた。安全性および有効性分析を主任研究員が行った。
【０３２５】
２０名の患者が登録された。Ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−Ｔｒｅａｔ（ＩＴＴ）安全性集団は、少なくとも１用量のＲＥＸＩＮ−Ｇを受けたすべての患者と定義し２０名の患者を含んだ（安全性および全生存期間について用いた）。修正Ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−Ｔｒｅａｔ（ｍＩＴＴ）有効性集団は、少なくとも１サイクルを受け、かつフォローアップＰＥＴ−ＣＴスキャンをしたすべての患者と定義し、１５名の患者を含んだ（奏効、無進行生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）について用いた）。登録された被験者の性別および人種を表２２に示す。
【０３２６】
【表２２】
2013541497.tif 000024
【０３２７】
用量レベル０＝１×１０１１ｃｆｕ  週に２回（ＢＩＷ）；用量レベルＩ＝１×１０１１ｃｆｕ  週に３回（ＴＩＷ）；用量レベルＩＩ＝２×１０１１ｃｆｕ  ＴＩＷ；用量レベルＩＩＩ＝３×１０１１ｃｆｕ  ＴＩＷ。
【０３２８】
登録され、処置を受けた患者２０名のうち、６名は用量レベル０〜Ｉでの処置を受け、７名は用量レベルＩＩでの処置を受け、および７名は用量レベルＩＩＩでの処置を受けた。１５名の患者は、少なくとも１サイクルの全処置サイクル（４週間）を受け、フォローアップＰＥＴ−ＣＴスキャンをし、奏効、無進行性生存期間、および全生存期間に関して（修正Ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ＴｒｅａｔまたはｍＩＴＴ集団として公知の）有効性について評価可能と見なされた。
【０３２９】
ＲＥＣＩＳＴにより、１名の患者はＣＲを達成し、２名の患者はＲＲを有し、および１２名はＳＤを有した。用量レベル０〜Ｉでと比較して、用量レベルＩＩおよびＩＩＩにおける患者について、より多い腫瘍量が観察された。ＲＥＣＩＳＴによる腫瘍制御率（ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤ）は、１００％（１５／１５名の患者）であった。ＰＥＴ基準またはＣｈｏｉ修正ＲＥＣＩＳＴを用いて評定したときのほうが、奏効は良好であった。ＰＥＴにより、１名の患者は、ＣＲを達成し、４名の患者は、ＰＲを有し、および１０名の患者は、ＳＤを有した。Ｃｈｏｉにより、１名の患者はＣＲを有し、５名はＰＲを有し、および９名は、ＳＤを有した。ＲＥＣＩＳＴにより、ＰＲおよびＣＲは、用量レベルＩＩおよびＩＩＩでしか発生しなかった。これは、ＲＥＸＩＮ−Ｇ用量と奏効の間の用量依存関係を示唆している。
【０３３０】
ＲＥＣＩＳＴによるＰＦＳは、用量レベル０〜Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩで３、７．６および６．８ヶ月であった。これは、ＲＥＸＩＮ−Ｇ用量とＰＦＳの間の用量依存関係を示唆している。
【０３３１】
用量レベル０〜Ｉを併せた群の中で有効性評価可能なｍＩＴＴ集団におけるＯＳ推定値は、１年では０％であった。対照的に、用量レベルＩＩ〜ＩＩＩを併せた群でのＯＳ推定値は、１年では３３．３％および２年では２５％であった。これらの所見は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ用量と全生存率の間の用量依存関係を示している。
【０３３２】
用量レベル０〜Ｉを併せた群の中のＩｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ＴｒｅａｔまたはＩＴＴ集団（少なくとも１用量のＲＥＸＩＮ−Ｇを受けたすべての患者と定義）におけるＯＳ推定値は、１年では０％であった。対照的に、用量レベルＩＩ〜ＩＩＩを併せた群の中でのＯＳ推定値は、１年では２８．５％および２年では２１．４％であった。まとめると、これらの所見は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ用量と全生存率の間の用量依存関係を示している。奏効を表２３にまとめる。
【０３３３】
【表２３】
2013541497.tif 000025
＊細胞数＝示す数×１０９
＋ｃｆｕの数＝示す数×１０１１
【０３３４】
いずれの用量レベルにおいても用量制限毒性はなかった。無関係有害事象をすべての患者について報告したが、事象数は少なく（最も多い場合で、１つの好ましい項につき発生１または２）、ほとんどがグレード１または２であった。関連非重篤有害事象が、７名の患者において発生し、すべてが、グレード１であった。１３名の患者は、重篤有害事象を経験し、これらのすべてが、治験薬には関係ないと考えられた。
【０３３５】
２０名すべての患者が、無関係の非重篤有害事象を１つ以上経験した。無関係有害事象の大多数は、グレード１または２の重症度であった。いくつかのタイプの有害事象は、用量が高いほど頻度が高いように見えた。貧血：用量レベル０では６名の患者のうち２名、用量レベルＩでは３名の患者のうち２名、用量レベルＩＩでは７名の患者のうち７名、および用量レベルＩＩＩで処置された７名のうち５名；高ビリルビン血症：用量レベル０では６名の患者のうち１名、用量レベルＩでは３名の患者のうち１名、用量レベルＩＩでは７名の患者のうち３名、および用量レベルＩＩＩでは７名のうち４名；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ：用量レベル０では６名のうち２名、用量レベルＩでは３名のうち１名、用量レベルＩＩでは７名のうち４名、および用量レベルＩＩＩでは７名のうち３名；ならびに食欲減少：用量レベル０では６名のうち１名、用量レベルＩでは３名のうち２名、用量レベルＩＩでは７名のうち４名、および用量レベルＩＩＩでは７名のうち４名。
【０３３６】
最高頻度の非重篤、無関係グレード３ＡＥは、低アルブミン血症（患者４名）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ増加（患者３名）であった。貧血、高血糖、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ増加、および低カルシウム血症は、それぞれ２名の患者において報告された。他の非重篤無関係グレード３ＡＥは、それぞれ１名の患者でしか報告されなかった。グレード３  ＡＥは、用量レベルＩＩＩで、より高頻度であるように見えた。
【０３３７】
関連有害事象は、７名の患者において発生し（表４）、用量レベル２での悪寒（患者１名）、疲労（患者２名）および頭痛（患者１名）、ならびに用量レベル３での疲労（患者４名）を含んだ。すべてがグレード１であり、非重篤であった。重篤な治験薬関連ＡＥはなかった。
【０３３８】
２６の重篤有害事象が１３名の患者において報告された。いずれも治験薬とは関係がなかった。
【０３３９】
２０１１年２月２５日現在、１９／２０名の患者は、死亡している。ＲＥＸＩＮ−Ｇに関連があると考えられる死亡はなかった。死亡原因は、１名を除くすべての患者において進行性疾患であり、この患者についての死亡原因は、敗血症であった。
【０３４０】
ベクター関連安全性パラメータもＲＥＸＩＮ−Ｇの有害効果を示さなかった。次のいずれについてもポジティブと検定された患者はいなかった。ベクター中和抗体、ｇｐ７０に対する抗体、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中の複製能のあるレトロウイルス、ＰＢＬのゲノムＤＮＡへのベクター組み込み。
【０３４１】
１００％の腫瘍制御率は、ＲＥＸＩＮ−Ｇが、ゲムシタビンまたはゲムシタビン含有化学療法薬に失敗した再発または転移性膵臓癌を有する患者において実質的抗腫瘍活性を有することを示している。用量レベル０〜ＩＩと比較して用量レベルＩＩおよびＩＩＩでのほうが長いＰＦＳおよびＯＳは、この集団について有意である。ＰＥＴおよびＣｈｏｉ修正ＲＥＣＩＳＴを用いて観察された、より良好な奏効は、これらの代替評価法が、進行した膵臓癌を有する患者の場合、腫瘍奏効についてのＲＥＣＩＳＴより感度の高い指標であり得ることを示唆している。
【０３４２】
実施例２３：再発または転移性骨肉腫のための介入としてのドミナントネガティブサイクリンＧ１構築物を有する病態親和性ナノ粒子（ＲＥＸＩＮ−Ｇ）の安全性および有効性の第ＩＩ相評価
本研究の主要目的は、腫瘍奏効率、無進行生存期間および全生存期間に関して静脈内（ＩＶ）ＲＥＸＩＮ−Ｇの臨床的有効性を評定することであった。副次的目的は、パフォーマンスステータス、毒性評定スコア、血液、代謝プロフィール、免疫反応、ＰＢＬへのベクター組み込み、および組換え事象によって評価して、静脈内投与したＲＥＸＩＮ−Ｇの総合的安全性を評価することであった。
【０３４３】
公知の療法に対して抗療性と考えられる再発または転移性骨肉腫を有する患者は、本研究に適格であった。患者は、４週間、週に２または３回、ＲＥＸＩＮ−Ｇの静脈内注入を受け、それに２週間の休薬期間が続いた。腫瘍量が１０×１０９細胞未満であった場合には１×１０１１ｃｆｕ  ＢＩＷの用量、または腫瘍量が１０×１０９細胞より多かった場合には１×１０１１ｃｆｕ  ＴＩＷの用量に患者を割り当てた。毒性を有さないまたは毒性がグレードＩ以下に解消された患者は、追加のサイクルを受けることができた。
【０３４４】
プロトコル修正案ＩおよびＩＩにより、毒性がなかった患者または毒性がグレードＩ以下に解消された患者については、より高い用量レベルでの安全性が確立され次第、２×１０９ｃｆｕ  ＴＩＷまでの患者内用量漸増が可能になった。主任研究員は、少なくとも１サイクルの処置サイクルが完了したのち、外科的切除／減量術を推奨することを許容された。先ずはＲＥＣＩＳＴを用いて奏効を評価した（Ｔｈｅｒａｓｓｅら、２０００年）。追加の評価は、国際ＰＥＴ基準（Ｙｏｕｎｇら、（１９９９年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３５：１７７３−１７８２）およびＣｈｏｉら、（２００７年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：１７５３−１７５９．によって記載された修正ＲＥＣＩＳＴを用いた。安全性および有効性分析を主任研究員が行った。
【０３４５】
２２名の患者が登録された。Ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−Ｔｒｅａｔ（ＩＴＴ）安全性集団は、少なくとも１用量のＲＥＸＩＮ−Ｇを受けたすべての患者と定義し２２名の患者を含んだ（安全性および全生存期間について用いた）。修正Ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−Ｔｒｅａｔ（ｍＩＴＴ）有効性集団は、少なくとも１サイクルを受け、かつフォローアップＰＥＴ−ＣＴスキャンをしたすべての患者と定義し、１７名の患者を含んだ（奏効、無進行生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）について用いた）。登録された被験者の性別および人種を表２４に示す。
【０３４６】
【表２４】
2013541497.tif 000026
【０３４７】
登録され、処置を受けた患者２２名のうち１４名は、先ず、１×１０１１ＢＩＷまたは１×１０１１  ＴＩＷのいずれかでの処置を受け、その後、２×１０１１ｃｆｕ  ＴＩＷに漸増され、および８名は、２×１０１１ｃｆｕ  ＴＩＷでの処置だけを受けた。１７名の患者は、少なくとも１サイクルの全処置サイクル（４週間）を受け、フォローアップＰＥＴ−ＣＴスキャンをし、有効性について評価可能と見なされた。ＲＥＣＩＳＴにより、１０名の患者はＳＤを達成し、および７名はＰＤを有した。ＲＥＣＩＳＴによる腫瘍制御率（ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤ）は、５９％（１０／１７名の患者）であった。奏効は、ＰＥＴ基準またはＣｈｏｉ修正ＲＥＣＩＳＴを用いて評定したときのほうが良好であった（表２）。ＰＥＴにより、４名の患者がＰＲを達成し、８名の患者がＳＤを有し、および５名がＰＤを有し、ならびにＣｈｏｉ法により、３名がＰＲを有し、１２名がＳＤを有し、および２名がＰＤを有した。ＲＥＣＩＳＴによるＰＦＳ中央値は、有効性評価可能サブセットについては全体的に３．０ヶ月であり、ＯＳ中央値は、有効性評価可能（ｍＩＴＴ）患者については８．７ヶ月であり、本ＲＥＸＩＮ−Ｇ：群におけるＯＳ推定値は、１年では３５．３％、２年では２９．４％および３年では１７．６％であった。ＩＴＴ集団についてのＯＳは、６．０ヶ月であり、ＩＴＴ集団におけるＯＳ推定値は、１年では２７．３％、２年では２２．７％および３年では１３．６％であった。２０１１年２月２５日のフォローアップ現在で、３人の患者は、２５ヶ月から３８ヶ月の範囲の期間、生存し続けていた。奏効を表２５にまとめる。
【０３４８】
【表２５】
2013541497.tif 000027
＊細胞数＝示す数×１０９
＋ｃｆｕの数＝示す数×１０１１
【０３４９】
２２名すべての患者が、無関係の非重篤有害事象を１つ以上経験した。無関係事象の大多数は、グレード１または２であった。最高頻度の非重篤、無関係ＡＥは、貧血（患者１６名）、アルカリホスファターゼ増加（患者１２名）、高血糖（患者１１名）、低アルブミン血症、低血糖および低カリウム血症（各患者９名）であった。
【０３５０】
最高頻度の非重篤、無関係グレード３  ＡＥは、貧血（患者８名）、高血糖、低アルブミン血症およびアルカリホスファターゼ増加（各患者５名）、ならびに低カルシウム血症（患者４名）であった。頻脈、敗血症、低カリウム血症、低リン酸血症、および胸痛が、それぞれ３名の患者について報告された。無力症、疲労、脱水症および低カリウム血症が、それぞれ２名の患者について報告された。
【０３５１】
関連有害事象は、４名の患者（すべて用量レベルＩＩでの処置を受けた患者）において発生した。
【０３５２】
９名の患者は、１６の重篤有害事象を有したと報告された。大部分がグレード２または３であった（１つのＳＡＥは、グレード４であった）。いずれも治験薬とは関係がなかった。
【０３５３】
２０１１年２月２５日現在、１９／２２名の患者は、死亡している。ＲＥＸＩＮ−Ｇに関連があると考えられる死亡はなかった。１名の患者は、報告期間中に死亡した。死亡原因は、すべての患者において進行性疾患であった。
【０３５４】
ベクター関連安全性パラメータもＲＥＸＩＮ−Ｇの有害事象を示さなかった。次のいずれについてもポジティブと検定された患者はいなかった。ベクター中和抗体、ｇｐ７０に対する抗体、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中の複製能のあるレトロウイルス、ＰＢＬのゲノムＤＮＡへのベクター組み込み。
【０３５５】
５９％の腫瘍制御率は、ＲＥＸＩＮ−Ｇが、すべての公知療法に失敗した再発または転移性骨肉腫を有する患者において実質的な抗腫瘍活性を有することを示している。ＰＥＴおよびＣｈｏｉ修正ＲＥＣＩＳＴを用いて観察された、より良好な奏効は、これらの代替評価法が、化学療法抵抗性骨肉腫を有する患者における、より感度の高い初期腫瘍奏効指標であり得ることを示唆している。
【０３５６】
実施例２４：標準的な療法に対して抗療性の膵臓癌、乳癌、肉腫、骨肉腫および他の固形悪性疾患のためのＲＥＸＩＮ−Ｇの人道的使用
患者は、４週間、週に５日、１用量当たり２×１０１１ｃｆｕの用量でＲＥＸＩＮ−Ｇを静脈内に受けるものとする。毒性がグレードＩ未満であった場合、さらに８週間、週に３日、２×１０１１ｃｆｕの用量でＲＥＸＩＮ−Ｇを継続してもよい。患者が、ＲＥＸＩＮ−Ｇに関連したものまたはことによると関連したものであるように見えるグレード３以上の有害事象（ＣＴＣＡＥ  Ｖｓ３．０）を発症した場合、その注入を保持することとし、毒性が解消されるまで、または患者が安定するまで、その患者をモニターするものとする。毒性がグレード３であり、２４時間以内にグレード１以下に解消された場合、注入を再開することを考えることができる。有害事象が７２時間以内に解消されない場合、データが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）と論議され、研究を継続するのか、停止するのかが決定されるまで、研究を保留するものとする。
【０３５７】
患者にとって臨床的有用性があり、かつ患者がグレード１未満の毒性を有する場合、患者は、追加の処置サイクルを受けることができる。主任研究員は、１２週の処置の完了後、外科的切除／減量術／生検を推奨することができる。患者は、外科手術後にさらに６ヶ月間のＲＥＸＩＮ−Ｇでの処置を再開することができる。主任研究員は、１２週の処置が完了したら、放射線療法、姑息的化学療法再開、または別の臨床研究への登録を推奨することができる（図３２参照）。
【０３５８】
前記ベクターを使用まで−８０±１０℃の冷凍庫で保管する。注入の１５分前に、その製品を３２〜３６℃の水浴で解凍し、解凍し次第、速やかに注入する。
【０３５９】
患者は、末梢静脈または中心ＩＶライン経由で１分に４ｍＬの遅いＩＶ注射によりＲＥＸＩＮ−Ｇベクター注射を受ける。
【０３６０】
ベクター注入の３０分前：急性反応予防療法は、ベナドリル（１２．５〜２５ｍｇ）ＩＶプッシュまたはｐ．ｏ．と、デキサメタゾン  ２ｍｇ  ｐ．ｏ．と、ラニチジン  ３００ｂ．ｉ．ｄ．（ステロイド療法からのストレス性潰瘍を予防するため）と、アレルギー反応が発症した場合にはヒドロコルチゾン  ５０〜１００ｍｇ  ＩＶプッシュと、発熱用のアセトアミノフェン  ５００ｍｇ  ｐ．ｏ．とから成る。注入後、非ステロイド系抗炎症薬、例えばイブプロフェンを、疼痛および／または発熱のために必要に応じて使用することができる。
【０３６１】
計画的評価およびモニタリング
第０日ベースライン試験（ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入前２週間以内）
【０３６２】
Ａ．病歴、ならびにバイタルサイン、身長および体重を含む身体検査。パフォーマンスステータス。白血球百分率および血小板数を含めて、全血球算定（ＣＢＣ）。血清化学成分：トランスアミナーゼ（ＡＳＴ、ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ、総および直接ビリルビン、クレアチニン、アルブミン、血清クレアチニン。第０日に、および処置期間中に週１回、実施する。
【０３６３】
Ｂ．登録１４日以内（ベースラインおよび必要に応じて）のＥＫＧ。
【０３６４】
Ｃ．１２週ごとのＣＴスキャン、ＭＲＩおよび／またはＰＥＴ／ＣＴスキャン。
【０３６５】
フローアップならびに介入中および後の評価
【０３６６】
ベクター注入およびフォローアップ中、患者を有害事象または臨床状態の変化について綿密にモニターするものとする。患者を入院患者および外来患者として全研究期間中および定期的に親身にフォローする。
【０３６７】
停止規則
【０３６８】
Ａ．ＮＣＩ共通毒性基準（ＣＴ−ＣＡＥ  バージョン３．０）を用いて、治験薬／介入毒性に対する反応に一貫性を持たせるものとする。１から５のグレード分類尺度で毒性のグレード分類を行うものとする。
【０３６９】
患者は、４週間、週に５日、１用量当たり２×１０１１ｃｆｕの用量でＲＥＸＩＮ−Ｇを静脈内に受けるものとする。毒性がグレードＩ未満であった場合、さらに８週間、週に３日、２×１０１１ｃｆｕの用量でＲＥＸＩＮ−Ｇを継続してもよい。患者が、ＲＥＸＩＮ−Ｇに関連したものまたはことによると関連したものであるように見えるグレード３以上の有害事象（ＣＴＣＡＥ  Ｖｓ３．０）を発症した場合、その注入を保持することとし、毒性が解消されるまで、または患者が安定するまで、その患者をモニターするものとする。毒性がグレード３であり、２４時間以内にグレード１以下に解消された場合、注入を再開することを考えることができる。有害事象が７２時間以内に解消されない場合、データが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）と論議され、研究を継続するのか、停止するのかが決定されるまで、研究を保留するものとする。
【０３７０】
すべての治験薬関連重篤または不測の有害事象を、２４時間以内に速やかにスポンサーおよびＩＲＢに、ならびにインシデントの７日以内にＦＤＡに報告するものとする。すべての他の有害事象は、ＦＤＡおよびＩＲＢに年次報告形式でおよび最終研究報告で報告するものとする。
【０３７１】
ベクター注入と関係のないグレードＩＩＩ有害事象については、調査員が、利用できる様々な選択肢を論議するものとする。グレードＩＩＩ有害事象を有する患者に対する適切な行為を評価するものとする。患者がベクター注入を継続すべきかどうかの決定を、適宜、行うものとする。死亡事象の場合は、剖検を行う許可を申請するものとする。
【０３７２】
レトロウイルスベクター注入に付随するリスクとしては、複製能のあるレトロウイルス、ベクター中和抗体、非標的器官におけるベクターの組み込みの発生が挙げられる。共通毒性基準の中で概説されているような急性毒性が、細胞破壊性ＲＥＸＩＮ−Ｇベクターによる腫瘍の破壊から、または未知のベクター毒性から、発生することがある。すべてのグレードＩＩＩまたはＩＶ毒性は、治験薬に起因しようと、しなかろうと、報告するものとする。死亡事象の場合、検死を行ったら、剖検報告書を提出するものとする。
【０３７３】
実施例２５：肝動脈注入でのＲＥＸＩＮ−Ｇの強化
患者は、膵尾の腺癌、Ｓ／Ｐ膵体尾部切除術、膵管−空腸吻合術、空腸−空腸下流Ｒｏｕ−Ｙ吻合術および脾摘出術を有する、６７歳のアジア人男性である（２００８年１０月３０日）。このＴ３ＮＩ疾患の組織病理学的所見は、上皮成長因子ネガティブだがＫｒａｓポジティブである管内（膵管）乳頭状腺癌と一致した。術後の経過は、膵管−空腸離解、横隔膜下膿瘍およびフィステル形成によって複雑化された。これらの合併症は、経皮的横隔膜下カテーテルドレナージ、および広域ｉ．ｖ．抗生物質でゆっくりと改善した。アジュバント化学療法は、６サイクルのゲムシタビンおよびカペシタビンから成った。
【０３７４】
ＲＥＸＩＮ−Ｇ単剤療法：２０１０年２月２４日に、フォローアップＣＴスキャンは、外科手術部位での悪性腫瘍の再発と肝蔵への転移を示した。そこで、ＲＥＸＩＮ−Ｇ単剤療法の考慮のために、この患者が紹介された。膵臓癌のための標準的な療法に失敗して、この患者は、２０１０年３月１０日に、１２週間、週に５日の２×１０１１ｃｆｕ／用量ｉ．ｖ．でのＲＥＸＩＮ−Ｇ療法を開始した。２０１０年４月７日のフォローアップＰＥＴ−ＣＴスキャンによって、以前の小さな疑陽性肝臓病変が明確な代謝亢進性病変であることが確認された。２０１０年６月８日、第３のＲＥＸＩＮ−Ｇサイクルが完了した後、ＰＥＴスキャンは、（ｉ）左横隔膜下エリア（原発部位再発）に関するサイズおよび代謝活性の劇的減少、（ｉｉ）２つの肝臓病変に関するサイズおよび代謝活性増加、および（ｉｉｉ）ＲＥＸＩＮ−Ｇ処置中の新たな病変の完全不在を伴う、混合型腫瘍奏効を示した。
【０３７５】
ＲＥＸＩＮ−Ｇの強化：肝臓におけるＲＥＸＩＮ−Ｇの局所濃度を増加させるために、ＲＥＸＩＮ−Ｇの肝動脈注入（ＨＡＩ）の可能性を調べる評価のために、この患者を肝臓インターベンション専門医に紹介した。この時、上腹部の手順前ベースライン超音波を行った。
【０３７６】
局部２％リドカイン麻酔下で、５Ｆ大腿動脈シースを右大腿動脈に経皮挿入し、５Ｆ  Ｔｅｒｕｍｏ  Ｙａｓｈｉｒｏを同心３Ｆ  Ｔｅｒｕｍｏ  Ｐｒｏｇｒｅａｔカテーテルとともに使用して、上腸間膜、腹腔、総肝、固有肝、胃十二指腸、右肝、中肝および膵十二指腸循環の選択的および超選択的造影検査を行った。前面および斜投影像を撮影し、総量１１０ｍＬの非イオン性造影剤（Ｕｌｔｒａｖｉｓｔ−Ｉｏｐｒｏｍｉｄｅ）を点滴した。
【０３７７】
Ｘ線所見：門脈区のブリスク求肝性描出は、側副血管形成の痕跡を示さなかった。右肝、中肝および膵十二指腸動脈からの血液供給を示す軽度の新生血管および斑状腫瘍染色ともに、乏血管性腫瘍結節が肝右葉の内側区に見られた。
【０３７８】
ＨＡＩによるＲＥＸＩＮ−Ｇでのドーズデンス処置：各血管の寄与の視覚的推定量に比例して、それぞれ、標的病変の膵十二指腸（１０ｍＬ）、右肝（１０ｍＬ）および中肝（２０ｍＬ）動脈供給への４ｍＬ／分での４０ｍＬのＲＥＸＩＮ−Ｇ（５×１０９ｃｆｕ／ｍＬ）の連続注入を、巧みな選択的カテーテル留置により促進した。同じ注入を、同じ血管を再び利用して、さらに２日間繰り返した。
【０３７９】
安全性分析：有害事象は、ＨＡＩ手順中に発生せず、ＲＥＸＩＮ−Ｇでの後続の３日のＨＡＩの間にも発生しなかった。ＲＥＸＩＮ−ＧでのＨＡＩ中にも、後にも、悪心または嘔吐、発熱、骨髄抑制、肝または腎機能不全はなかった。
【０３８０】
下の表は、ＲＥＸＩＮ−Ｇ（２×１０１１ｃｆｕ／用量）×３日（累積用量：６×１０１１ｃｆｕ）のＨＡＩ前および後に得た血清化学および血液学研究の結果を示すものである。
【０３８１】
【表２６】
2013541497.tif 000028
【０３８２】
【表２７】
2013541497.tif 000029
【０３８３】
有効性分析：ＲＥＸＩＮ−ＧでのＨＡＩの前（第１日）および後（第７日）に腹部超音波により、次の２つの肝病変のサイズの減少が判明した。
【０３８４】
セグメント４：腫瘍容積の４１％減少
前  −  ２．６×２．１×２．５（腫瘍容積  １３．６５ｃｃ）
後  −  ２．１４×１．８×２．１（腫瘍容積＝８．０９ｃｃ）
【０３８５】
セグメント５：腫瘍容積の８％減少
前  −  ３．６×３．３×３．６（腫瘍容積＝４２．８ｃｃ）
後  −  ３．３×３．２４×３．６９（腫瘍容積＝３９．４５ｃｃ）
【０３８６】
結論：これらの所見は、ＲＥＸＩＮ−Ｇを、全身的転移性腫瘍制御のために静脈内注入により全身的にも、肝臓転移に対する向上したおよび好都合の制御のために肝動脈経由で局所的にも、安全にかつ効果的に送達できることを示唆している。進行しているこの患者のための計画は、ＲＥＸＩＮ−Ｇの連続全身（静脈内）注入を受けることに加えて、肝動脈注入によるＲＥＸＩＮ−Ｇの反復ドーズ・デンス・サイクルを助長する経腋窩アプローチを用いる経皮的「ｐｏｒｔａ  ｃａｔｈ」の留置である。
【０３８７】
実施例２６：原発性または続発性（転移性）肝臓悪性疾患のための肝動脈注入と静脈内注入によるＲＥＸＩＮ−Ｇ処置の強化
患者、調査員および施設の数：２０から４０名の患者を登録するものとする。これは、非盲検、単群、多施設研究とする。
【０３８８】
ＲＥＸＩＮ−Ｇは、潜在的抗新生物活性を有する、サイクリンＧ１遺伝子のＮ末端欠失突然変異体をコードする、複製能のない、病態親和性（疾患親和性）、腫瘍マトリックス（コラーゲン）標的指向型レトロベクターである（ＮＣＩシソーラスＣ４９０８２）。ＲＥＸＩＮ−Ｇナノ粒子は、該レトロウイルスベクターの表面へのフォン・ヴィレブランド凝固因子（ｖＷＦ）に由来するコラーゲン結合モチーフの分子工学的作製に基づいて癌性病変内で見出される新規露出細胞外マトリックスタンパク質に固有の親和性で結合する生理学的監視機能を呈示する。ｖＷＦの天然コラーゲン標的指向性機序の活用により、血管新生およびコラーゲンマトリックス露出が特徴的に発生する原発性腫瘍および転移部位への前記レトロベクターの選択的送達が可能になる。前記病態親和性ナノ粒子は、腫瘍細胞サイクリンＧ１活性の分解により腫瘍細胞を破壊するまたは腫瘍細胞の成長を遅らせる能力、したがって腫瘍細胞および増殖性腫瘍付随血管系のアポトーシスを誘導する能力を有する遺伝的ペイロードとして、細胞破壊性「ドミナントネガティブ」サイクリンＧＩ構築物を有する。
【０３８９】
前臨床概念実証研究において、静脈内投与したＲＥＸＩＮ−Ｇは、癌性病変内に選択的に濃縮すること、および転移癌のヒト異種移植モデルにおいて腫瘍成長を減弱することが証明された。臨床研究において、ＲＥＸＩＮ−Ｇは、膵臓癌ばかりでなく乳、結腸、肺、皮膚、筋肉および骨癌を含む多数の固形腫瘍組織において有意な抗腫瘍活性を有することが実証された。初期第Ｉ相安全性研究および第Ｉ／ＩＩ相適応研究からの結果として、ＲＥＸＩＮ−Ｇは、２００３年での膵臓癌に加えて、２００８年には軟部組織肉腫および骨肉腫について米国ＦＤＡにより希少疾病用医薬品のステータスを与えられた。膵臓癌についてのＲＥＸＩＮ−Ｇの先進第Ｉ／ＩＩ相臨床研究により、ＲＥＸＩＮ−Ｇは、優れた安全性／毒性プロフィールで十分耐容されること、ならびに有意な腫瘍退縮および無進行生存期間延長（ＲＥＣＩＳＴ基準による）と関連付けられることが証明され、ＲＥＸＩＮ−Ｇ単剤療法が全生存期間を向上させることも一応示された（Ｃｈａｗｌａら、２００９年）。原発性および続発性（転移性）肝臓悪性疾患のためにＲＥＸＩＮ−Ｇの（局部制御のために肝動脈注入による）局所送達と（全身制御のために）静脈内注入を併用することにより、ＲＥＸＩＮ−Ｇの安全性を損なうことなく、客観的腫瘍奏効を改善するための第４相研究を設計する。
【０３９０】
目的：主要  −  客観的腫瘍奏効に関してＲＥＸＩＮ−Ｇの肝動脈注入と静脈内注入併用の有効性を評価すること。副次的  −  ＲＥＸＩＮ−Ｇの肝動脈注入と静脈内注入併用の安全性／毒性を評価すること。
【０３９１】
研究設計  −  提案された第４相研究を、原発性または続発性（転移性）肝臓悪性疾患のためのＲＥＸＩＮ−Ｇ処置の（局部制御のための）肝動脈注入と（全身制御のための）静脈内注入併用処置の非盲検、単群、多施設研究として設計する。
【０３９２】
投薬および研究の実施：２０から４０名の患者は、第１〜３日および第１１〜１３日に肝動脈注入によりＲＥＸＩＮ−Ｇを、ならびに第４〜１０日および第１４〜２０日に静脈内的にＲＥＸＩＮ−Ｇを受けるものとする。１０名以上の患者が、治験薬への暴露の全サイクルを経験した後、サイクルの途中で患者の３分の１超が、（ＣＡＣＡＥｖｓ３を用いて）グレード３〜５の治験薬関連（ことによると、多分または明確に関連した）毒性を有した場合はいつでも停止規則に応ずるものとする。Ｅｐｅｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、研究の停止または継続に関するすべての最終決定を、ＦＤＡと協議して行うものとする。
【０３９３】
患者数：２０〜４０；ベクター用量：２×１０１１ｃｆｕ；最大量：４０ｍＬ
【０３９４】
主要エンドポイント：ＣＴスキャン、ＭＲＩまたは超音波による完全もしくは部分奏効または疾患の安定化に関する好適な客観的腫瘍奏効。
【０３９５】
副次的エンドポイント：ＮＩＨ−ＣＴ−ＣＡＥ  ｖｓ．３による許容可能な臨床的毒性プロフィール。
【０３９６】
組み入れ基準：患者が、１８歳以上の男性または女性のいずれかである；患者が、原発性または続発性（転移性）肝臓悪性疾患の証明された病歴を有する；患者が、いずれかの他の実験薬プログラムの構成員でない；ＥＣＯＧステータス０〜１で３ヶ月の余命がある；患者に、活動性感染症の所見が見られない；患者が、本プロトコルへの遵守成功を危うくする既存の慢性病態（すなわち、重症アテローム性動脈硬化症、膠原血管病、多発性硬化症、最近のＭＩまたは凝固障害、心筋症など）を有さない；患者が、血液および血清の検査室試験（詳細なプロトコルの中でさらに説明するとおり）によって判定して妥当な血液学的および器官機能を有する；患者が、敗血症、胸水または心嚢液貯留を有さない；患者が、インフォームドコンセントを理解し、快くサインすることができる；測定可能な疾患、すなわち、スパイラルＣＴスキャン、ＭＲＩまたは超音波によって直径が少なくとも１ｃｍ、を有する患者；患者が、ベクター注入期間中および注入後６週間、バリア避妊法を用いることに同意する。
【０３９７】
除外基準：患者が、研究の実施に干渉する何らかの健康状態を有する；患者が、正式なインフォームドコンセントを提供できない、または提供することに不賛成である；妊婦、または看護婦、または妥当な避妊手段の使用に不賛成であるいずれかの性別の個人；研究期間中の他の化学療法または免疫療法薬の同時使用。
【０３９８】
安全性についてのモニタリング：ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入中および注入後最初の１時間、観察およびバイタルサインにより注入関連毒性を医学的にモニターするものとする。他の点では、研究期間中のすべての有害事象（ＡＥ）データを毎週の来院時に報告／収集し、共通毒性基準（ＣＴＣＡＥ  ｖ．３．０）を用いてグレード分類するものとする。
【０３９９】
担当調査員は、すべてのＳＡＥを、ＳＡＥの発生に気づいた２４時間以内に、スポンサーまたはスポンサーが指定する代理人に報告するものとする。ＳＡＥは、緊急報告または特別報告についての既存の規則と矛盾なく、ＦＤＡおよびＩＲＢにタイミングよく報告するものとする。関連のあるＡＥに関する情報をタイミングよく施設間に広めるものとする。
【０４００】
有効性についてのモニタリング：腫瘍をベースライン、第７日および第２１日にＣＴスキャン、ＭＲＩまたは超音波によって放射線評価するものとする。治療による患者の（ＲＥＣＩＳＴ基準または腫瘍容積に基づいて）最良の奏効を収集するものとする。非リスポンダー（ＰＤ）に対するリスポンダー（ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤ）の数（割合）を決定するものとする。同じ統計法を、Ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−Ｔｒｅａｔ（ＩＴＴ）集団と修正治療企図（ｍＩＴＴ）集団の両方について行うものとする。ＩＴＴ集団は、実際に受けた処置または処置の量に関係なく、すべての被験者から成るものとする。ｍＩＴＴ集団は、ＲＥＸＩＮ−Ｇでの少なくとも２０日の処置を完了し、かつ第２１日でのＣＴスキャン、ＭＲＩまたは超音波による腫瘍奏効評価を有する、すべての患者から成るものとする。腫瘍奏効評価は、施設の調査員が行うこととし、独立した中心施設が指定された時点で盲検下の評価者（単数または複数）を用いて検証できる。
【０４０１】
エンドポイント：主要エンドポイントは、処置患者の大多数における好適な客観的腫瘍奏効（完全奏効、部分奏効または安定した疾患）とする。副次的エンドポイントは、グレード３以上の治験薬関連毒性を経験する患者が３分の１以下である、許容される臨床的毒性とする。
【０４０２】
探索的エンドポイント：腫瘍マーカーレベル、腫瘍量、および疾患診断からの時間と上に列挙した転帰／エンドポイントとの関連付け。同じ統計法を、Ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−Ｔｒｅａｔ（ＩＴＴ）集団と修正治療企図（ｍＩＴＴ）集団の両方について行う。
【０４０３】
治験来院：スクリーニング時、およびＲＥＸＩＮ−Ｇ処置開始から２１日までの間、週に１回、来院の予定を組むものとする。注入来院は、定期外の来院と考え、このときにバイタルサインだけは常に記録するものとする。腫瘍奏効評価を第７および２１日に得るものとする。治験終了訪問は、第２１日とする。治験終了訪問時に少なくとも１つのグレード２以上のＡＥまたはＳＡＥを有するすべての患者は、３０日より長きにわたりフォローするものとする。２１日の治験期間を完了した患者は、フォローアップ群に入れ、治験開始後１５年までの間、３ヶ月ごとに接触して、予想外の安全性事象および癌疾患進行歴を収集し、生存を確認するものとする。
【０４０４】
統計解析：本第４相研究には、２０〜４０名の患者を集めることが期待される。本試験を完了するためにおおよそ１２ヶ月かかるはずであり、ＲＥＸＩＮ−Ｇのｉ．ｖ．注入に付加したＨＡＩでの強化処置の潜在的有効性を洞察するための本質的に探索的なものである。本研究は、安全性または有効性についての確固たる結論を得られるほど大きくはないが、将来の研究の計画に有用である安全性および有効性に関する予備データを提供するだろう。治験患者に関する人口統計およびベースライン情報（例えば、以前の治療の程度）を表にすることとする。本研究において観察された有害事象について、以下の情報を報告するものする：タイプ（罹患器官または検査室判定、例えば好中球絶対数）、重症度（ＮＣＩ有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）バージョン３．０、および検査室判定についての最も極端な異常値）、および研究処置への関連性。
【０４０５】
有効性情報を、用量ごとに、カテゴリーＰＤ、ＳＤ、ＰＲ、およびＣＲ各々に関する数および百分率としてまとめるものとする。加えて、次の事象についての情報を報告するものとする。任意の原因からの死亡、任意の原因からの疾患進行または死亡、および基礎となる癌に起因する疾患進行または死亡。患者を１５年間にわたって生存についてフォローすることとする。奏効率を、本研究に登録された適格患者の百分率（「ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ」またはＩＴＴ解析）としても、評価可能な患者の百分率（すなわち、処置コースを完了する適格患者）（「修正ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ」またはｍＩＴＴ解析）としても報告するものとする；奏効率についての９５％信頼区画を推定するものとする。カプラン・マイヤープロットを用いて、生存率および失敗までの時間を要約するものとする。
【０４０６】
実施例２７：ＲＥＸＩＮ−Ｇの肝動脈注入のためのプロトコル
下記は、転移性肝癌の処置のための臨床プロトコルである。
【０４０７】
第１〜３日患者入院：インフォームドコンセントおよび病院責任免除を得る。
【０４０８】
前処置研究：腹部ＣＴスキャンもしくはＭＲＩまたは腹部超音波（ＨＡＩの１日前）；胸部Ｘ線およびＥＫＧ（１４日以内）；ＣＢＣ、血小板数、化学検査パネル（ＢＵＮ、クレアチニン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、Ａｌｋ  Ｐｈｏｓ、ビリルビン）；電解質、ＰＴ、ＰＴＴ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＥＡ；毎日のＣＢＣ、血小板数、化学検査パネル（ＢＵＮ、クレアチニン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、Ａｌｋ  Ｐｈｏｓ、ビリルビン）電解質、ＰＴ、ＰＴＴ
【０４０９】
肝動脈注入についての患者適格性の証拠書類を提供する。
【０４１０】
放射線インターベンション専門医による肝動脈カテーテル留置の予定を組む。
【０４１１】
抗生物質予防：手技前１５〜３０分（および６時間ごと×７２時間）にわたってＩｍｉｐｅｎｉｍ（５００ｍｇ）ＩＶ。注記：ペニシリン感受性歴を有する患者は、８時間ごとにセフタジジム（２グラム）ＩＶおよび６時間ごとにメトロニダゾール（５００ｍｇ）ＩＶを受けることとする。
【０４１２】
肝動脈カテーテル留置：手順に従って放射線インターベンション専門医により肝動脈カテーテル留置
【０４１３】
肝カテーテル留置のために放射線インターベンション専門医のヘパリンプロトコルをフォローする。
【０４１４】
肝動脈カテーテルによるＲＥＸＩＮ−Ｇ注入：
【０４１５】
前投薬：注入３０分前：ベナドリル  ２５〜５０ｍｇ  ｐ．ｏ．またはｉ．ｖ．；ヒドロコルチゾン  ５０〜１００ｍｇ  ＩＶ。ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入中は肝動脈カテーテルによるヘパリンを中止する。３日間、肝動脈カテーテルにより１日１回、４ｍＬ／分の速度で４０ｍＬ（２×１０１１ｃｆｕ）のＲＥＸＩＮ−Ｇを注入する。肝動脈カテーテルを除去する。
【０４１６】
肝動脈カテーテルを３日間、適所に保持する場合：絶対安静×７２時間（この間、肝動脈カテーテルは適所に存在する）；頭を４５°上昇させてもよい。Ｆｏｌｅｙカテーテルを挿入し、ＩおよびＯ×７２時間（この間、肝動脈カテーテルは適所に存在する）。
【０４１７】
肝動脈カテーテルによるヘパリン処置：ヘパリン  ２，０００単位／正常食塩液  ５００ｍＬを８０単位または２０ｍＬ／時で肝動脈カテーテルにより、×７２時間注入して、動脈ライン開存を保持する。
【０４１８】
バイタルサイン、下肢神経および血管をｑ１５分×４、次いで３０分×４、次いでｑ１時間  ×７２時間チェックし、ＰＴおよびＰＴＴをｑ１２時間×７２時間チェックし、鼠蹊部エリアからの出血または腹部疼痛についてチェックする。
【０４１９】
末梢ＩＶラインによるヘパリン処置：ヘパリン２５，０００単位／２５０ｍＬ  Ｄ５Ｗを８００単位／時で、末梢ＩＶにより、×７２時間。ＰＴＴを、１．５Ｘ正常値の範囲内に維持するように用量を調整する。出血についてチェックする。
【０４２０】
各ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入完了後、肝動脈カテーテルによりヘパリンを再開する。
【０４２１】
第３日：ＲＥＸＩＮ−Ｇ注入完了後、ヘパリン処置を中止する。放射線インターベンション専門医が肝動脈カテーテルを除去する。
【０４２２】
第４〜７日：４日間、１日１回、４ｍＬ／分でＲＥＸＩＮ−Ｇ、２×１０１１ｃｆｕをｉ．ｖ．注入する。フォローアップ腹部ＣＴスキャンまたはＭＲＩまたは腹部超音波、ＣＢＣ、血小板数、化学検査パネル（ＢＵＮ、クレアチニン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、Ａｌｋ  Ｐｈｏｓ、ビリルビン）電解質、ＰＴ、ＰＴＴ
【０４２３】
安定している場合、およびＰＴおよびＰＴＴが正常値に回復し、出血の形跡がない場合、患者を退院させる。
【０４２４】
本発明の範囲は、本明細書に記載する特定の実施形態によって限定されない。本発明の好ましい実施形態を本明細書に記載するが、そのような実施形態を単に例として提供していることは当業者には明白であろう。実際、記載するものに加えて本発明の様々な変形が、上述の説明および添付の図面から当業者に明らかになることだろう。後続の請求項が本発明の範囲を定義すると解釈し、これらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物は本発明に包含されると解釈する。
【０４２５】
様々な出版物が本明細書に引用されており、それらの開示は、それら全体が参照により援用されている。
【図１Ａ】
2013541497.tif 000030
【図１Ｂ】
2013541497.tif 000031
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
2013541497.tif 000037
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2013541497.tif 000041
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2013541497.tif 000078
【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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