(57)【要約】  本発明は、感染症による死亡のより大きなリスクがある対象を特定し、および／または感染症発症のより大きなリスクがある対象を特定する、感染症をもつ対象の予後診断の方法であって、その対象からの試料における遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出することを含む方法であって、より高いＦＬＣの量が、感染症に起因する生存の減少、および／または感染症のリスクの増加、および／または感染症発症の増加したリスクを有することと関連する、方法を提供する。感染症を有する患者からの試料における遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出すること、およびその試料におけるＦＬＣの量を、その患者から以前に得た試料において検出されるＦＬＣの量と比較することを含む、感染症を監視する方法であって、以前の試料と比べて、ＦＬＣの検出量の増加が、患者における感染症の増加を示し、ＦＬＣの量の減少が、患者における感染症の減少を示す、方法。また、該方法に使用するためのアッセイキットも提供される。１つ以上の抗ＦＬＣ抗体および１つ以上の抗細菌性抗原抗体を含むアッセイキットもまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染症による死亡のより大きなリスクがある対象を特定し、および／または感染症発症のより大きなリスクがある対象を特定する、感染症をもつ対象の予後診断の方法であって、前記対象からの試料における遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出することを含む方法であって、より高いＦＬＣの量が、前記感染症に起因する生存の減少、および／または感染症のリスクの増加、および／または感染症発症の増加したリスクを有することと関連する、方法。
【請求項２】
感染症を有する患者からの試料における遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出すること、および前記試料における前記ＦＬＣの量を、前記患者から以前に得た試料において検出されるＦＬＣの量と比較することを含む、感染症を監視する方法であって、前記以前の試料と比べて、前記ＦＬＣの検出量の増加が、前記患者における前記感染症の増加を示し、前記ＦＬＣの量の減少が、前記患者における前記感染症の減少を示す、方法。
【請求項３】
前記感染症が、細菌感染症である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記感染症が、下部呼吸器感染症（例えば肺炎など）、尿路感染症、クロストリジウム・ディフィシル感染症、敗血症または腹膜炎である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記遊離軽鎖の量が、前記試料における総遊離軽鎖の量である、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＦＬＣが、前記対象の血清の試料において測定される、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記総ＦＬＣが、抗遊離軽鎖抗体を使用する免疫アッセイにより測定される、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、抗遊離κ軽鎖および抗遊離λ軽鎖抗体の混合物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＦＬＣの量を、比ろう法または比濁法によって検出することを含む、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、Ｂ細胞関連疾患症状を有さない、請求項１および３〜９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法において使用される取扱説明書を追加として含む、請求項１〜９に記載の前記方法に使用するためのアッセイキット。
【請求項１２】
前記アッセイキットを使用して得たＦＬＣの濃度が、対象の生存の増加を示す正常値を追加として含む、請求項１１に記載のアッセイキット。
【請求項１３】
１つ以上の抗ＦＬＣ抗体および１つ以上の抗細菌性抗原抗体を含む、請求項１〜１０に記載の方法に使用するためのアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染症のより大きなリスクを有する対象を特定し、および／または感染症発症のリスクがある対象を特定する、感染症をもつ対象の予後診断の方法に関する。典型的に、感染症は細菌感染症である。例えば、それは下部呼吸器感染症（例えば肺炎など）、尿路感染症、クロストリジウム・ディフィシル感染症、敗血症または腹膜炎でありうる。
【背景技術】
【０００２】
出願人らは、患者の広範なモノクローナルガンマグロブリン血症についてアッセイをする方法として、遊離軽鎖を長年にわたって研究してきた。そのような遊離軽鎖を診断に使用することについては、書籍「血清遊離軽鎖分析（Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）第５版（２００８年）Ａ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌら、ＩＳＢＮ  ０７０４４２７０２８」に詳しく説明されている。
【０００３】
抗体は、重鎖および軽鎖からなる。それらは通常、二重対称（ｔｗｏ‐ｆｏｌｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）で、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖で構成され、各々、可変および定常領域を含有する。各々の軽鎖／重鎖対の可変領域は、組み合わさって抗原結合部位を形成し、両鎖が抗体分子の抗原結合特異性に寄与する。軽鎖には、κおよびλの２つのタイプがあり、どの抗体分子も、いずれか一方の軽鎖を用いて作られ、両方が用いられることはない。ヒトでは、λ分子より約２倍多くのκ分子が作られるが、これが異なる哺乳類もいる。通常は、軽鎖は重鎖に結合している。しかしながら、幾つかの結合していない「遊離軽鎖」が人々の血清または尿中で検出できる。遊離軽鎖は、通常、軽鎖が重鎖に結合することによって隠れている遊離軽鎖の表面に対する抗体を作ることによって特異的に識別しうる。遊離軽鎖（ＦＬＣ）では、この表面が露出され、それを免疫的に検出できる。κまたはλ遊離軽鎖検出用の市販のキットとしては、例えば、英国バーミンガム、バインディングサイトリミテッド（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）社製の「フリーライト（Ｆｒｅｅｌｉｔｅ）（商標）」が挙げられる。出願人らは、遊離κ／遊離λ比率の量を測定することが患者におけるモノクローナルガンマグロブリン血症の診断の一助となることを以前に見いだしている。それは、例えば、完全型免疫グロブリン多発性骨髄腫（ＭＭ）、軽鎖ＭＭ、非分泌ＭＭ、ＡＬアミロイドーシス、軽鎖沈着症、くすぶり型ＭＭ、形質細胞腫およびＭＧＵＳ（意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症）の診断における一助として使用されてきた。また、ＦＬＣの検出は、例えば他のＢ細胞疾患の診断の補助として、実際にモノクローナルガンマグロブリン血症一般の診断のために、尿ベンスジョーンズタンパク質分析の代替物として使用されてきた。
【０００４】
従来は、λまたはκ軽鎖の１つの増加およびその結果としての異常な比率を求めた。例えば、多発性骨髄腫は悪性形質細胞のモノクローナル増殖に起因し、単一のタイプの免疫グロブリンを産生する単一のタイプの細胞の増加をもたらす。これは、個体内で観察される、λまたはκいずれか遊離軽鎖の量の増加となる。この濃度の増加を測定し、通常は遊離κの遊離λに対する比率を求め、正常範囲と比較する。これはモノクローナル疾患の診断の一助となる。さらに、遊離軽鎖アッセイはまた患者の疾患の治療後にも使用しうる。例えば、ＡＬアミロイドーシスに対する治療後の患者の予後診断を実施しうる。
【０００５】
Ｋａｔｚｍａｎら（Clin. Chem. (2002); 48(9):1437‐1944）は、モノクローナルガンマグロブリン血症の診断における遊離κおよび遊離λ免疫グロブリンに関する血清基準範囲および診断範囲について考察している。２１〜９０才の人々を免疫アッセイによって調査し、免疫固定によって得た結果と比較し、Ｂ細胞疾患をもつ人々におけるモノクローナル遊離軽鎖（ＦＬＣ）を検出するための免疫アッセイを最適化した。
【０００６】
κおよびλＦＬＣの量およびκ／λ比率を記録し、Ｂ細胞疾患の検出を目的として基準範囲を確定することができた。
【０００７】
細菌感染症は、一般の集団および腎疾患をもつ人々の両方における主な死因である。腎疾患をもつ人々で感染症のリスクが増加するのには多くの理由があり、そのうちの１つは尿毒症毒素の滞留である。尿毒症毒素は、健康な状態では腎臓から除去される分子であり、腎機能障害ではその血清濃度が増加する。オーストリアの研究チームが、ＦＬＣが好中球の機能に悪影響を及ぼすことを報告する研究論文を発表している（概説については、Cohen & Horl "Free immunoglobulin light chains as a risk factor in renal and extrarenalcomplications" (2009) Seminars in Dialysis; 22: 369-372を参照されたい）。好中球は、免疫防御軽に一部を形成するにすぎず、発表されている研究はすべてインビトロであり、原因となる影響は生体内で示されていない。しかしながら、出願人は、ＦＬＣが好中球の機能に影響する可能性、およびＦＬＣの上昇と炎症プロセスとの公知の関連性に気付き、血清ＦＬＣを測定することによって感染に関連して死亡するリスクがある患者を特定できるかもしれないと仮定した。
【発明の概要】
【０００８】
今回、出願人らは、ＦＬＣ、特に総ＦＬＣについてアッセイすることを、感染症のより大きなリスクがある対象を特定し、および／または感染症発症のリスクがある対象を特定する、感染症をもつ対象の予後診断の方法に使用できることを見いだした。彼らは、ＦＬＣ濃度が、対象におけるそのような感染症による死亡のリスクと統計的に有意に関連し、そのような感染症の有無の指標であることを見いだした。
【０００９】
明らかに健康な人からの血清中のＦＬＣの濃度は、ある程度、個人の腎臓のＦＬＣを濾過および排出する能力に影響される。ＦＬＣクリアランスが限られる人では、血清に見られるＦＬＣレベルに増加がある。結果として、今日、ＦＬＣは腎機能の良いマーカーと考えられている。単量体ＦＬＣカッパ分子（２５ｋＤａ）は、二量体のラムダ分子（５０ｋＤａ）と異なるサイズであるので、それらは共に、例えばクレアチニン１１３ｋＤａと比べて、糸球体濾過のより良いマーカーである。しかしながら、クレアチニンと対照的に、ＦＬＣの産生は多くの疾患の結果として起こりうるため、血清ＦＬＣは典型的には単独で腎機能マーカーとして使用されないことになる。
【００１０】
しかしながら、Ｂ細胞増殖／活性のマーカーは重要であり、Ｂ細胞はＦＬＣの生成に関与するので、これは臨床的に有用である。ＦＬＣ産生は、Ｂ細胞アップレギュレーションの初期指標である。この点において、それはＴ細胞によって媒介される炎症反応のマーカーであるＣＲＰの使用を補完することができる。
【００１１】
高いＦＬＣ濃度は、おそらく、慢性の腎臓もしくは炎症性の障害またはＢ細胞疾患の指標でありうる。つまり、異常なＦＬＣアッセイ結果は、現在のところ幾つかのテストを組合せることを必要とする、さまざまな障害のマーカーでありうる。これとは逆に、ＦＬＣアッセイ結果が正常な場合、良好な腎機能、炎症性の状態が無い状態およびＢ細胞疾患の証拠がないことを示す。
【００１２】
出願人は、さまざまな程度の腎機能障害を有する患者からの血清試料を詳しく調べた。患者の死因をＦＬＣ濃度と比較して調査した。ＦＬＣレベル、特に総ＦＬＣレベルが、感染症による死亡するリスクと明らかに関連することが観察された。
【００１３】
本発明は、感染症による死亡のより大きなリスクがある対象を特定し、および／または感染症発症のより大きなリスクがある対象を特定する、感染症をもつ対象の予後診断の方
法であって、その対象からの試料における遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出することを含む方法であって、より高いＦＬＣの量が、感染症に起因する生存の減少、および／または感染症のリスクの増加、および／または感染症発症の増加したリスクを有することと関連する方法を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、対象からの試料中のＦＬＣの量を検出することを含む、感染症をもつ対象の予後診断の方法であって、ＦＬＣのより高い量が、感染症に起因する生存の減少と関連する方法を提供する。
【００１５】
対象は、これまでに感染症と診断されたことがなくともよい。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、感染症を有する患者からの試料における遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出すること、およびその試料におけるＦＬＣの量を、その患者から以前に得た試料において検出されるＦＬＣの量と比較することを含む、感染症を監視する方法であって、以前の試料と比べて、ＦＬＣの検出量の増加が、患者における感染症の増加を示し、ＦＬＣの量の減少が、患者における感染症の減少を示す方法を提供する。例えば、これを使用して、感染症における抗生物質などの治療の有効性を監視しうる。
【００１７】
典型的に、感染症は細菌感染症であるが、ウィルス感染症でもありうる。例えば、それは下部呼吸器感染症（例えば肺炎など）、尿路感染症、クロストリジウム・ディフィシル感染症、敗血症または腹膜炎でありうる。
【００１８】
ＦＬＣは、カッパまたはラムダＦＬＣでありうる。しかしながら、カッパＦＬＣまたはラムダＦＬＣを単独で検出することは、患者における例えばモノクローナル産生されたどちらか一方のＦＬＣの、例えば異常な高レベルを見逃しうるので、好ましくは総ＦＬＣ濃度を測定する。
【００１９】
総遊離軽鎖とは、試料中の遊離カッパ軽鎖と遊離ラムダ軽鎖の総量を意味する。
【００２０】
好ましくは、対象は必ずしもＢ細胞関連疾患の症状を有することはない。症状としては、再発性感染、骨痛および疲労を挙げられうる。そのようなＢ細胞関連疾患は、好ましくは、骨髄腫（完全型免疫グロブリン骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫など）、ＭＧＵＳ、ＡＬアミロイドーシス、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ホジキンリンパ腫、濾胞中心細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、プレＢ細胞白血病でも急性リンパ性白血病でもない。さらに、典型的に、個人は骨髄機能が低下していない。典型的に、個人は、多くのそのような疾患で典型的に見られる異常なλ：κのＦＬＣ比率を有さない。
【００２１】
「総遊離軽鎖」という用語は、対象からの試料中のκおよびλ遊離軽鎖の量を意味する。
【００２２】
試料は、典型的に、対象からの血清の試料である。しかしながら、全血、血漿、尿、または組織、または体液のその他試料もまた、場合により利用しうる。
【００２３】
典型的に、総ＦＬＣなどのＦＬＣは、ＥＬＩＳＡアッセイなどの免疫アッセイ、血清タンパク質電気泳動またはルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）（商標）ビーズなどの蛍光標識されたビーズを利用することによって測定する。
【００２４】
例えば、サンドイッチアッセイは、抗体を使用して特異的抗原を検出する。アッセイに使用する１つ以上の抗体を、検出可能な検体に基質を変換できる酵素を用いて標識しうる
。そのような酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび当該技術分野において公知の他の酵素が挙げられる。代替的に、他の検出可能なタグまたは標識を、酵素の代わりに、または酵素と一緒に使用しうる。これらとしては、放射性同位元素、当該技術分野において公知の、広範な着色および蛍光標識、例えばフルオレセイン、アレクサフルオル、オレゴングリーン、ボディピー、ローダミンレッド、カスケードブルー、マリーナブルー、パシフィックブルー、カスケードイエロー、金；およびビオチンなどの複合体（例えば、英国インビトロジェン社から入手可能）が挙げられる。また、染料ゾル、化学発光ラベル、金属ゾルまたは着色ラテックスも使用しうる。１つ以上のこれら標識を、本明細書において記載されているさまざまな発明に従ってＥＬＩＳＡアッセイに使用するか、または代替的に、本明細書において記載されている他のアッセイ、標識された抗体もしくはキットに使用しうる。
【００２５】
サンドイッチ型アッセイの構造はそれ自体、当該技術分野において周知である。例えば、ＦＬＣに対して特異的な「捕捉抗体」を基質に固定する。「捕捉抗体」は、当該技術分野において周知である方法によって基質に固定しうる。試料中のＦＬＣは、「捕捉抗体」を介してＦＬＣを基質に結合する「捕捉抗体」によって結合される。
【００２６】
結合していない免疫グロブリンは洗い流しうる。
【００２７】
ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチアッセイでは、結合している免疫グロブリンの有無は、目的のＦＬＣの結合抗体とは異なる部分に対して特異的な、標識された「検出抗体」を使用することによって測定しうる。
【００２８】
フローサイトメトリーを使用して、目的のＦＬＣの結合を検出しうる。本技法は、例えば細胞選別など当該技術分野において周知である。しかしながら、それを使用して、ビーズなどの標識された粒子を検出し、それらのサイズを測定することもできる。実用フローサイトメトリー（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、第３版（１９９４年）、Ｈ．Ｓｈａｐｉｒｏ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、ニューヨーク、およびフローサイトメトリー第一原則（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｆｉｒｓｔ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）（第２版）２００１年、Ａ．Ｌ．Ｇｉｖｅｎ、Ｗｉｌｅｙ  Ｌｉｓｓなどの多数のテキストブックが、フローサイトメトリーについて説明している。
【００２９】
ＦＬＣに対して特異的な抗体などの結合抗体の１つを、ポリスチレンまたはラテックスビーズなどのビーズに結合させる。ビーズを、試料および第２の検出抗体と共に混合する。検出抗体は、好ましくは、検出可能な標識で標識し、試料中で検出されるＦＬＣに結合させる。これにより、アッセイされるＦＬＣが存在する場合、標識されたビーズがもたらされる。
【００３０】
また、本明細書において記載されている他の検体に特異的な他の抗体を使用して、それら検体の検出を可能にしうる。
【００３１】
次いで、標識されたビーズを、フローサイトメトリーを介して検出しうる。異なる蛍光標識などの異なる標識を、例えば抗遊離λおよび抗遊離κ抗体に対して使用しうる。また、本明細書において記載されている細菌特異的な抗原などの他の検体に対して特異的な他の抗体を、このアッセイまたは本明細書において記載されている他のアッセイに使用して、それら検体の検出を可能にしうる。これにより、結合したＦＬＣ各種の量を同時に測定でき、その他の検体の有無を決定できる。
【００３２】
代替的にまたは付加的に、異なる大きさのビーズを、異なる抗体、例えば異なるマーカーに特異的な抗体に対して使用しうる。フローサイトメトリーは異なる大きさのビーズを
識別することができ、よって試料中の各ＦＬＣまたはその他の検体の量を迅速に測定することができる。
【００３３】
代替的な方法は、例えば、市販のルミネックス（商標）ビーズなどの蛍光標識されたビーズに結合する抗体を使用する。異なるビーズを異なる抗体とともに使用する。異なるビーズを、異なるフルオロフォア混合物で標識し、それ故に異なる検体を蛍光波長によって測定できる。ルミネックスビーズは、アメリカ合衆国、テキサス州オースチン、ルミネックスコーポレーション（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）社より入手可能である。
【００３４】
好ましくは、アッセイは、比ろう法または比濁法を使用する。λ‐またはκ‐ＦＬＣの検出に関する比ろう法および比濁法のアッセイは、一般に当該技術分野において公知であるが、総ＦＬＣアッセイに関してはそうではない。それらは、アッセイとして最も良い感度のレベルを有し、λおよびκＦＬＣ濃度は別々に測定されうるか、総ＦＬＣ用の単一のアッセイに到達する。そのようなアッセイでは、抗κおよび抗λＦＬＣ抗体を典型的に６０：４０の比率で含有するが、５０：５０などの他の比率も使用されうる。
【００３５】
また、抗体は、遊離λおよび遊離κ軽鎖の混合物に対して作られうる。
【００３６】
総ＦＬＣなどのＦＬＣの量は、標準の所定値と比較され、ＦＬＣの正常範囲より高いか低いかを決定されうる。
【００３７】
以下で詳細に論じるように、出願人らは、血清ＦＬＣのより高い濃度が、感染症をもつ患者における生存が減少する可能性の著しい増加に関連することを見いだしている。例えば、低い血清ＦＬＣレベルをもつ人々よりもその関連性がある。
【００３８】
単位ＧＦＲ当たり１．７ｍｇ／Ｌを超えるＦＬＣレベルは、感染症による死亡リスクの増加に関連した。第９０パーセンタイル（単位ＧＦＲ当たり６．１２ｍｇ／ＬのＦＬＣ）を超えるレベルを持つ患者は、非常に著しく増加したリスクを有した。
【００３９】
ＩＣＤ１０レベルは、ＳＰＥによって測定した際、５０ｍｇ／ｍＬおよび６０ｍｇ／ｍＬにて死亡率の増加を示している。
【００４０】
歴史的に見て、アッセイキットは、カッパおよびラムダＦＬＣを別々に測定し、比率を計算できるように作製されてきた。それらは、従来、疾患症状をすでに呈する個人に使用されている。
【００４１】
好ましくは、アッセイでは、例えば約１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌまたは１ｍｇ／Ｌ〜８０ｍｇ／Ｌの試料中のＦＬＣ、例えば総ＦＬＣを測定することができる。これは、圧倒的多数の人々において、異なる希釈にて試料を再アッセイすることを必要とせずに、血清ＦＬＣ濃度を検出することが期待されている。
【００４２】
好ましくは、その方法は、例えば抗遊離κ軽鎖および抗遊離λ軽鎖抗体またはその断片の混合物を利用することによる、免疫アッセイを利用して試料中の総遊離軽鎖の量を検出することを含む。そのような抗体は、５０：５０の抗κ：抗λ抗体の比率でありうる。ＦＬＣに結合する抗体または断片は、標識された抗体または断片を使用することによって直接的に、または抗遊離λもしくは抗遊離κ抗体に対する標識された抗体を使用して間接的に検出しうる。
【００４３】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。ポリクローナルは同一鎖の
異なる部分に対して作られるので同一タイプの軽鎖間の若干の変動を許容するため使用されうる。ポリクローナル抗体の作製については、例えば国際公開第９７／１７３７２号に記載されている。
【００４４】
好ましくは、全生存の可能性の増加を示すのに有意であることが特定および判明した総ＦＬＣなどの血清ＦＬＣの量は、５０ｍｇ／Ｌ未満である。４７．４ｍｇ／Ｌ未満のレベルで、Ｐ＜０．００１を示した。
【００４５】
中央値（単位ＧＦＲ−糸球体濾過率当たり１．７ｍｇ／ＬのＦＬＣ）を超える修正ＦＬＣレベルをもつ個人は、顕著により短い生存を有した。第９０パーセンタイル（単位ＧＦＲ当たり６．１２ｍｇ／ＬのＦＬＣ）を超えるレベルを持つ患者は、非常に著しく増加したリスクを有した。
【００４６】
また、ＦＬＣ用の、例えば本発明の方法で使用するためのアッセイキットも提供される。該キットは、試料中の総ＦＬＣ量を検出しうる。それらは、本発明の方法に使用するための取扱説明書と組み合せて提供されうる。
【００４７】
また、アッセイキットは、１つ以上の抗ＦＬＣ抗体および１つ以上の抗細菌性抗原抗体を含む本発明の方法、または感染アッセイで使用される。一般に、マーカーである抗原は、多くの感染病原体について知られている。抗体は、そのようなマーカーに対して提供され、さらに感染症を特徴付ける。
【００４８】
アッセイキットは、２５ｍｇ／Ｌ未満、最も好ましくは２０ｍｇ／Ｌ未満または約、１０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌもしくは４ｍｇ／Ｌ未満の試料中の総遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出するように構成されうる。検量用の材料は、典型的に、１〜ｌ００ｍｇ／Ｌの範囲を測定する。アッセイキットは、例えば比ろう法アッセイキットでありうる。好ましくは、キットは、ＦＬＣに対する１つ以上の抗体含む免疫アッセイキットである。典型的に、キットは、抗κおよび抗λＦＬＣ抗体の混合物を含む。典型的に、抗遊離κと抗遊離λ抗体が５０：５０の混合物が使用される。キットは、試料中の１〜１００ｍｇ／Ｌまたは、好ましくは１〜８０ｍｇ／Ｌの総遊離軽鎖の量を検出するように構成されうる。
【００４９】
また、（Ｆａｂ）２またはＦａｂ抗体などのＦＬＣに結合することができる抗体断片も使用されうる。
【００５０】
抗体または断片は、例えば前述のような標識を用いて標識されうる。標識された抗免疫グロブリン結合抗体またはその断片が提供され、ＦＬＣに結合する抗遊離λまたは抗遊離κが検出されうる。
【００５１】
キットは、示された範囲でアッセイを検量できるように検量用の液を含みうる。検量用の液は、好ましくは、例えば、１００ｍｇ／Ｌ〜１ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、１０ｍｇ／Ｌ未満、５ｍｇ／Ｌ未満または１ｍｇ／Ｌまでの所定の濃度のＦＬＣを含有する。キットはまた、抗体の量、およびラテックス粒子上にコーティングした「ブロッキング」タンパク質の量を最適化することによって、ならびに、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）濃度などの、補助試薬の濃度を最適化することによって構成されうる。
【００５２】
キットは、例えばＦＬＣについて複数の標準対照を含みうる。標準対照を使用して、ＦＬＣまたは生じる他の構成要素の濃度に関する標準曲線を有効にしうる。そのような標準対照は、先に検量された標準曲線が使用される試薬および状態に対して妥当であることを確認する。典型的に、それらは対象からの試料のアッセイと実質的に同時に使用される。
標準は、アッセイがより低い濃度の遊離軽鎖を検量できるように、ＦＬＣについて２０ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは１５ｍｇ／Ｌ未満、約１０ｍｇ／Ｌ未満、または５ｍｇ／Ｌ未満の、１つ以上の標準を含みうる。
【００５３】
アッセイキットは、比ろう法または比濁法キットでありうる。それは、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、蛍光、化学発光もしくはビーズタイプアッセイまたはディップスティックでありうる。一般に、そのようなアッセイは当該技術分野において公知である。
【００５４】
アッセイキットはまた、本発明の方法で使用される取扱説明書を含みうる。取扱説明書は、正常値であると考えられている総遊離軽鎖の濃度の指標を含み、例えば、それ未満または実際にそれを超えると、個人の生存の確率の増加または減少のどちらか、または感染症が存在する可能性の増加の指標を示しうる。そのような濃度は、上記で定義された通りでありうる。
【００５５】
本発明を、実施例を単なる例示として、以下の図を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、その総ＦＬＣ濃度を基にして五分位に分けられた試験集団についての生存の確率を示す。五分位レベルは、＜３３．３、３３．４〜４７．３、４７．４〜７６．８、６７．９〜１０６．３および＞１０６．５ｍｇ／Ｌである。
【図２】図２は、総ＦＬＣをＧＦＲに対して修正し、そのあと五分位に分けたことを示す。高い総修正ＦＬＣ五分位（４および５＝下の線）は、重篤な感染症による死亡を予測した（Ｐ＜０．００１）。
【図３】図３は、感染症による死亡に関するリスクマーカーとしての上位２つの五分位についてのＲＯＣ曲線である（単位ＧＦＲあたり１．７  ｍｇ／Ｌを超える総ＦＬＣ修正レベルを異常と見なした）。
【図４】図４は、混合した抗λおよび抗κ遊離軽鎖抗体を使用する総ＦＬＣアッセキットと比較しての、市販の別々の抗遊離κおよび抗遊離λアッセイキットを使用して得られた総ＦＬＣ濃度の比較である。
【図５】図５は、予後診断カットオフポイントとしての２つの異なるＦＬＣ濃度についての、４．５年の調査での患者の死亡の比較を示し、表は死因を示している。
【実施例】
【００５７】
感染症予後診断
方法
さまざまな程度の腎機能障害をもつ１３００人の患者から、血清試料を採集し（「基準」）、その後、最長６３カ月の期間にわたって追跡調査した。
【００５８】
より詳細には、患者は、バーミンガム大学病院の腎臓クリニックから募った。患者は、例えば蛋白尿、血尿、慢性腎臓疾患（すべての病期）、末期腎不全（血液透析および腹膜透析）および腎移植レシピエントを含む、腎臓にさまざまな問題を有する患者であった。
【００５９】
行われたテストおよび評価は以下の通り：
血清クレアチニンおよび推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）
単位ＧＦＲ当たりＦＬＣの修正レベルは次のように計算した：総血清ＦＬＣ濃度（ｍｇ／Ｌ）を、コッククロフト・ゴールト式（ＲＥＦ）によりｍｌｓ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２で計算した推定糸球体濾過率で除した。このようにして、腎機能に依存しない単位ＧＦＲ当たりｍｇ／Ｌでの、患者の血清総ＦＬＣレベルを得た。
参照文献：Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ  ＤＷ，  Ｇａｕｌｔ  ＭＨ：血清クレアチニンからのクレアチニンクリアランスの予測（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  
ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｓｅｒｕｍ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）Ｎｅｐｈｒｏｎ  １６：３１‐４１、１９７６
尿アルブミン／クレアチニン比率
カッパおよびラムダの両方の血清ＦＬＣ濃度（フリーライト、バインディングサイトリミテッド社、英国バーミンガム）
総血清ＦＬＣ濃度は、カッパＦＬＣおよびラムダＦＬＣの値を合計することによって計算した。
【００６０】
追跡調査：
患者を、死亡するまでの期間および死因について追跡調査した。
【００６１】
結果
患者生存のカプランマイヤー分析は、より高いＦＬＣレベルをもつ患者は、減少した生存を有したことを示した（Ｐ＜０．００１）。図１を参照されたい。
【００６２】
死因を調査したとき、感染症に続いて死亡する可能性は、より高い総ＦＬＣ濃度をもつ患者で著しくより高かった。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
また、感染症による死亡のリスクは、腎機能（慢性腎臓病１〜５病期）にも関連したが、これは、リスク群を明確に描出しなかった。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
総ＦＬＣと腎機能（ｅＧＦＲ）は密接に相関した（Ｒ−０．６４５、Ｐ＜０．００１）。従って、総ＦＬＣを感染症の予測に利用する上で腎機能の影響を除外するために、総ＦＬＣをＧＦＲに対して修正し、そのあと五分位に分けた。高い総修正ＦＬＣ五分位（４および５＝下の線、図２）は、重篤な感染症による死亡を予測した（Ｐ＜０．００１）。
【００６７】
感染症による死亡に関するリスクマーカーとしてこれらの上位２つの五分位を使用し（単位ＧＦＲあたり１．７ｍｇ／Ｌを超える総ＦＬＣ修正レベルを異常と見なした）、ＲＯＣ曲線を使用して分析したとき、検査は有意に予測能があった（Ｐ＜０．０００１）。
【００６８】
特定された主な感染症は、下部呼吸器感染症（肺炎）、尿路感染症、クロストリジウム・ディフィシル、敗血症または腹膜炎であった。
【００６９】
考察
何らかの形の腎機能障害をもつ患者で結果を集めた。しかし、総ＦＬＣの上昇と感染症との間の関係が腎機能と独立であることを考えれば、一般に集団において、総ＦＬＣは感染症を同じように予測しうると思われる。検査（複数含む）は、低下した腎機能によるＦＬＣ濃度のバックグラウンドの上昇がない一般の集団ではより感度が良いであろうと推測されうる。前述のように、ＦＬＣによって媒介される好中球の機能の抑制を報告する研究論文が、これまでに発表されている。好中球は、免疫防御系の一部を形成するにすぎず、我々の知る限りでは、血清ＦＬＣ濃度を測定することが細菌感染症に起因する死亡のより大きなリスクがある患者を予測しうることは提案されていない。Ｃｏｈｅｎと同僚は、１９９５年に、インビトロにおけるＦＬＣの白血球への影響について最初に報告したが、それ以降、生体内におけるＦＬＣ濃度を測定する研究を１報も発表していない。我々が観察した予測効果の程度は、特に血清ＦＬＣ濃度を腎機能に対して修正した後、予想外であった。
【００７０】
アッセイキット
本発明の方法は、以下のアッセイキットを利用しうる。アッセイキットは、患者試料内の、例えば血清中に存在する総遊離κと遊離λ軽鎖を定量する。これは、抗遊離κおよび抗遊離λ軽鎖ヒツジ抗体の５０：５０混合物を用いて、１００ｎｍカルボキシル修飾ラテックス粒子をコーティングすることによって達成しうる。以下に例示されたアッセイでは、総遊離軽鎖に関する測定範囲は、１〜８０ｍｇ／Ｌである。しかしながら、他の測定範囲も同じように考慮されうる。
【００７１】
抗遊離κおよび抗遊離λ抗血清は、一般に当該技術分野において公知の技術を使用して、この特定の場合ではヒツジで作製した。一般的な免疫化プロセスは、国際公開第９７／１７３７２号に記載されている。
【００７２】
抗κおよび抗λ抗血清を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して等しい濃度まで希釈した。それら抗体を混ぜ合わせ、５０％の抗κ抗体および５０％の抗λ抗体を含む抗血清を作成した。
【００７３】
抗体を、１０ｍｇ／ｌｏｔのコーティング量（ｃｏａｔ  ｌｏａｄ）でカルボキシル修飾ラテックスにコーティングした。これは、標準的な手順を使用して達成した。例えば、「微粒子試薬最適化：微粒子の専門家からの実験室参照マニュアル（Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｎｕａｌ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」編者Ｃａｒｙｌ  Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｊｉｍ  Ｓｕｔｏｒ、Ｂｒｕｃｅ  Ｓｈｕｌｌ、著作権  Ｓｅｒａｄｙｎ  Ｉｎｃ、１９９４年（Ｐ／Ｎ０３４７８３５（１２９４）を参照されたい。
【００７４】
この参照文献はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用したアッセイキットの詳細も提供する。
【００７５】
混合した抗体を市販のκおよびλフリーライト（商標）キット（英国バーミンガム、バインディングサイトグループリミテッド（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）社から入手）を使用して得られた結果と比較した。そのようなフリーライト（商標）キットは、κ遊離軽鎖の量およびλ遊離軽鎖の量を、別々のアッセイにて特定する。総ＦＬＣキットを使用して曲線を作成し、対照濃度を使用して確認した。校正曲線は、１〜８０ｍｇ／Ｌの間の総遊離軽鎖について得ることができた。下記の結果の表において、κフリーライト（商標）、λフリーライト（商標）および総遊離軽鎖のアッセイを使用して、κ遊離軽鎖（κＦＬＣ）、λ遊離軽鎖（λＦＬＣ）および総ＦＬＣについて結果を得た。これらの結果を１５の異なる正常血清試料について示す。比濁法により測定した結果を下表および図４に示す。
【００７６】
予備結果は、抗κおよび抗λ遊離軽鎖抗体に基づく総遊離軽鎖アッセイを使用する原理は実行可能であることを示す。
【００７７】
結果
【００７８】
【表３】
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【００７９】
追加補助データ
調査集団
２００５年１１月８日から２００６年１月１０日の間、病院研究室は、血清タンパク質電気泳動（ＳＰＥ）を依頼された７２３の血清試料血清を受け取った。小児患者、免疫グロブリン補充を受けた患者からの試料、同一患者の２次およびそれに続く試料は、分析から除外した。また、異常なκ／λ遊離軽鎖（ＦＬＣ）比率（０．２５未満もしくは１．６５を超える；Ｋａｔｚｍａｎｎ）または異常なＳＰＥ結果（免疫固定によって確認した場合）によって示された、モノクローナルガンマグロブリン血症の証拠をもつ患者もすべて除外した。これにより、最終のデータ分析に５２８患者が残った。
【００８０】
研究室分析
すべての血清について、血清タンパク質電気泳動（ＳＰＥ；セビア（Ｓｅｂｉａ）社、英国）によって血清タンパク質異常について分析した。異常なＳＰＥバンドが存在する、または疑いの高い指数をもつ人のすべての試料（原因不明の低ガンマグロブリン血症、幅広β領域、または支持する臨床上の詳細を伴う低免疫グロブリン）に関して、血清免疫固定（ＩＦＥ；セビア社）を行った。診断の設定における血清の遊離軽鎖（ｓＦＬＣ）分析の評価の一部として、シーメンス  デイドベーリング  プロスペック（Ｐｒｏｓｐｅｃ）濁度計を使用して製造業者の取扱説明書に従い、ＦＬＣ測定（フリーライト、バインディングサイト社、英国バーミンガム）をすべての血清について行った。
【００８１】
患者追跡調査
２０１０年７月、最初の研究の終わりから４年６カ月後、患者の記録を検討した。全患者について、最後の追跡調査の日付または死亡の日付を記録し、死亡診断書を入手した。死亡診断書に記載されている主要な死因を世界保健機関疾病および関連保健問題の国際統計分類第１０改訂版（ＩＣＤ‐１０）に従って分類した。
【００８２】
データ分析
高い混合（κ＋λ）ＦＬＣ濃度と死亡の確率の増加との関連性を、カプランマイヤー生存分析、コックス回帰分析およびカイ二乗分析を使用して調査した。５０ｍｇ／Ｌ未満またはこれを超える、および、６５ｍｇ／Ｌ未満またはこれを超える、両方のカテゴリー別カットオフについて調査した。
【００８３】
結果
４．５年の追跡調査で、死亡は９９名であった（＝１８．８％死亡率）。ポリクローナル血清遊離軽鎖（カッパとラムダ）のより高い濃度は、死亡率の増加と関連することが判明した。これは、利用された予後診断のカットオフが５０ｍｇ／Ｌまたは６５ｍｇ／Ｌであった場合であり、すべての統計の分析で見られた。主な死因は「循環器系」（心血管疾患）および「感染症／呼吸器系」であった。
【００８４】
図（図５）は、異なるカテゴリーにおける感染症／呼吸器系の原因による死亡の割合（％）を表わす。統計的有意性は、カイ二乗分析によって決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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