(57)【要約】  本発明は、抗血清アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインDOM7h-14-10の改良された変異体、ならびにそのような変異体を含むリガンドおよび薬物コンジュゲート、組成物、核酸、ベクターおよび宿主に関するものである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
DOM7h-14-56 (配列番号72)、DOM7h-14-65 (配列番号73)、DOM7h-14-74 (配列番号74)、DOM7h-14-76 (配列番号75)、DOM7h-14-82 (配列番号76)、DOM7h-14-100 (配列番号77)、DOM7h-14-101 (配列番号78)、DOM7h-14-109 (配列番号79)、DOM7h-14-115 (配列番号80)、DOM7h-14-116 (配列番号81)、DOM7h-14-119 (配列番号82)、DOM7h-14-120 (配列番号83)、DOM7h-14-121 (配列番号84)、DOM7h-14-122 (配列番号85)、およびDOM7h-14-123 (配列番号86)から選択された抗血清アルブミン(SA)免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２】
請求項1記載の抗SA単一可変ドメインと、SA以外の標的抗原に特異的に結合する結合成分とを含んでなる多重特異性リガンド。
【請求項３】
前記可変ドメインが薬物(必要に応じてNCE薬物)にコンジュゲート化され、必要に応じて、前記ドメインまたは成分がDOM7h-14-100 (配列番号77)である、請求項1記載の抗SA単一可変ドメイン。
【請求項４】
請求項1記載の単一可変ドメインに融合されたポリペプチドまたはペプチド薬物を含んでなる融合タンパク質であって、必要に応じて、前記変異体または成分がDOM7h-14-100 (配列番号77)である、融合タンパク質。
【請求項５】
前記請求項のいずれか一項記載の可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドと、薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤またはビヒクルとを含む組成物。
【請求項６】
請求項1記載の単一可変ドメイン、または請求項2記載の多重特異性リガンド、または請求項4記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７】
配列番号87〜101から選択されたヌクレオチド配列、または選択された前記配列に対して少なくとも80％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８】
請求項6または7記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項8記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項１０】
少なくとも1回量の請求項1〜5のいずれか一項記載の可変ドメイン、リガンド、融合タンパク質、または組成物を患者に投与することを含んでなる、患者の疾患もしくは障害の治療または予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血清アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインDOM7h-14の改良された変異体、ならびにそのような変異体を含むリガンドおよび薬物コンジュゲート、組成物、核酸、ベクターおよび宿主に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
WO04003019およびWO2008/096158は、治療上有用な半減期を有する抗血清アルブミン(SA)結合成分、例えば抗SA免疫グロブリン単一可変ドメイン(dAb)を開示している。これらの公報は、単量体の抗SA dAbだけでなく、そのようなdAbを含む多重特異性リガンド、例えば抗SA dAbと標的抗原(TNFR1など)に特異的に結合するdAbとを含むリガンドを開示している。2種以上の動物種に由来する血清アルブミンに特異的に結合する結合成分、例えばヒト/マウス交差反応性抗SA dAbが開示されている。
【０００３】
WO05118642およびWO2006/059106は、薬物の半減期を増加するために、その薬物に抗SA結合成分、例えば抗SA免疫グロブリン単一可変ドメイン、をコンジュゲート化または会合させるという概念を開示している。タンパク質、ペプチドおよびNCE（新規化学物質）の薬物が開示され、かつ例示されている。WO2006/059106は、インスリン分泌増強薬、例えばグルカゴン様ペプチド(GLP)-1などのインクレチンホルモン、の半減期を高めるために、この概念を使用することを開示している。
【０００４】
Holt et al,“Anti-Serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs”, Protein Engineering, Design & Selection, vol 21, no 5, pp283-288, 2008をも参照されたい。
【０００５】
WO2008/096158には、優れた抗SA dAbであるDOM7h-14が開示されている。DOM7h-14の変異体であり、かつ血清アルブミン、好ましくはヒトおよび非ヒト種由来のアルブミンに特異的に結合する、改良されたdAbを提供することが望ましく、こうした改良型のdAbは、疾患の動物モデルにおいて、ならびにヒトの治療および/または診断において有用性があると考えられる。また、相対的に中程度の親和性から高度の親和性の抗SA結合成分(dAb)の選択肢を与えることも望ましいと考えられる。そのような成分は薬物に連結させることが可能であり、抗SA結合成分は意図された最終用途に応じて選択される。それによって、薬物は、抗SA結合成分の選択に応じて、慢性または急性の適応症を治療および/または予防するために、より良く調整することができるようになるだろう。いくつかの用途では、単量体状態であるか、または溶液中で実質的にそのような状態である抗SA dAbを提供することが望ましいと考えられる。このことは、抗SA dAbがTNFR1などの細胞表面受容体に特異的に結合する結合成分(例えば、dAb)と、その受容体に拮抗することを目的として、連結される場合に、特に有利であろう。抗SA dAbの単量体状態は、多量体を形成する可能性が低いので、受容体架橋の機会を減らすのに有用である。多量体は、細胞表面上の受容体(例えば、TNFR1)に結合してそれらを架橋し、したがって、受容体アゴニズムおよび有害な受容体シグナル伝達の可能性を高めると考えられる。
【発明の概要】
【０００６】
改良された抗SA dAbはPCT/EP2010/052008およびPCT/EP2010/052007に記載されている。
【０００７】
一態様において、本発明は、DOM7h-14-56 (配列番号72)、DOM7h-14-65 (配列番号73)、DOM7h-14-74 (配列番号74)、DOM7h-14-76 (配列番号75)、DOM7h-14-82 (配列番号76)、DOM7h-14-100 (配列番号77)、DOM7h-14-101 (配列番号78)、DOM7h-14-109 (配列番号79)、DOM7h-14-115 (配列番号80)、DOM7h-14-116 (配列番号81)、DOM7h-14-119 (配列番号82)、DOM7h-14-120 (配列番号83)、DOM7h-14-121 (配列番号84)、DOM7h-14-122 (配列番号85)、およびDOM7h-14-123 (配列番号86)から選択された抗血清アルブミン(SA)免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、1個、2個、3個、4個または5個のアミノ酸の相違を除いて上記の選択されたドメインと同一の、変異体単一可変ドメインが提供される。
【０００８】
本発明の任意の態様の実施形態では、抗血清アルブミン親和性が良好なDOM7h-14変異体が提供される。変異体の選択によって、所望の治療および／または予防の状況に従って半減期を調整することが可能である。例えば、一実施形態において、血清アルブミンに対する変異体の親和性は比較的高く、その場合変異体は慢性もしくは持続性の疾患、症状、毒性または他の慢性の適応症を治療および／または予防するのに有用な製品に含めるのに有用であろう。一実施形態において、血清アルブミンに対する変異体の親和性は比較的低く、その場合変異体は急性の疾患、症状、毒性または他の急性の適応症を治療および／または予防するのに有用な製品に含めるのに有用であろう。一実施形態において、血清アルブミンに対する変異体の親和性は中等度であり、その場合変異体は急性もしくは慢性の疾患、症状、毒性または他の急性もしくは慢性の適応症を治療および／または予防するのに有用な製品に含めるのに有用であろう。
【０００９】
血清アルブミンに対して適度に高い親和性および特異性を有する分子が所望の治療効果を有するのに十分長い時間循環中に留まることは想定される(Tomlinson, Nature Biotechnology 22, 521-522 (2004))。ここで、高親和性の抗SA変異体は、その種の血清アルブミンに合致して血清循環中に留まるであろう(WO20080096158)。一旦循環中に入れば、AlbudAb(商標)変異体(AlbudAbは抗血清アルブミンdAbまたは免疫グロブリン単一可変ドメインである)に対するいずれかの融合された治療剤は、NCE、ペプチドまたはタンパク質のいずれであれ、その標的に対してより長く作用し、より長期間持続する治療効果を発揮することができるであろう。これにより、頻繁に投与する必要なく、慢性または持続性の疾患を標的とすることが可能となるであろう。
【００１０】
中等度の親和性を有する(しかしSAに対する特異性を有する)変異体は血清循環中に短時間のみ留まり(例えば数時間または数日間)、融合された治療剤によって急性疾患に関わる治療標的を特異的に標的とすることを可能とするであろう。
【００１１】
このようにして、適切なアルブミン結合親和性および／または血清半減期を有する抗SA変異体を選択することによって、治療対象の疾患領域に抗SA含有産物を合わせることが可能である。
【００１２】
ドメイン抗体の特性の1つは、それらが単量体または二量体の形態で存在し、標的に結合し得ることである。本発明の任意の態様の他の実施形態は、単量体または二量体もしくは多量体の変異体を提供する。標的の架橋を抑制することが有利な場合(例えば標的が受容体チロシンキナーゼ等の細胞表面受容体、例えばTNFR1である場合)には、単量体dAbが特定の標的または適応症に好ましい場合がある。場合によっては、二量体または多量体としての結合が細胞表面上の受容体の架橋を生じさせ、それにより受容体の作動および有害な受容体シグナル伝達の可能性を増大させ得る。あるいはまた、標的の架橋を確実にするために、または例えば親和性の効果、安定性または溶解性によって結合を改善するために、二量体を形成するdAbが好ましい場合がある。
【００１３】
多重ドメイン(multidomain)構築物の関与する特定の標的化アプローチにおいては、dAbの二量体化は高分子量のタンパク質凝集物の形成に到ることがあるために、例えば上記のようなdAb-AlbudAb(商標)(AlbudAbが血清アルブミンに結合する)等の二価の標的化分子を生成させるべき場合に単量体のdAbを使用することが好ましい場合がある。
【００１４】
本発明の一態様は、上記の抗SA変異体と、SA以外の標的抗原に特異的に結合する結合成分とを含む、多重特異性リガンドを提供する。
【００１５】
本発明の一態様は、上記の任意の変異体に融合された、または(NCEの場合は)コンジュゲート化された、ポリペプチド、タンパク質、ペプチドもしくはNCE薬物を含む融合産物、例えば融合タンパク質、またはペプチドもしくはNCE(新規化学物質)薬物との融合体を提供する。好適には、融合産物において有用となる結合パートナーに融合またはコンジュゲートした時に観察されるパートナーに対する変異体の親和性の低下はわずかである。一実施形態において、本発明は、本発明による単一可変ドメインに融合したポリペプチドまたはペプチド薬物を含む融合タンパク質を提供し、場合により、該変異体または成分はDOM7h-14-100(配列番号77)である。別の実施形態において、本発明は、可変ドメインが薬物(場合によりNCE薬物)にコンジュゲートした本発明の抗SA単一可変ドメインを提供し、場合により、該可変ドメインまたは成分はDOM7h-14-100(配列番号77)である。
【００１６】
本発明の一態様は、上記の任意の態様の変異体、融合産物、タンパク質またはリガンドと、薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤またはビヒクルとを含む組成物を提供する。
【００１７】
本発明の一態様は、本明細書に開示された抗血清アルブミンdAbと、インクレチンまたはインスリン分泌促進剤、例えばエキセンディン-4、GLP-1(7-37)、GLP-1(6-36)またはWO06/059106に開示された任意のインクレチンもしくはインスリン分泌促進剤（これらの剤は、本発明および請求の範囲に含めるために本明細書中に記載されているかのように、参照により本明細書に明示的に組み入れる）とを含む、ポリペプチド融合体またはコンジュゲートを提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、上記の更なる態様の抗SA単一可変ドメインと、SA以外の標的抗原に特異的に結合する結合成分とを含む多重特異的リガンドを提供する。
【００１９】
本発明は、本発明の任意の態様による上記の単一可変ドメイン、多重特異性リガンドもしくは融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００２０】
本発明は、配列番号87〜101から選択されるヌクレオチド配列、または該選択された配列に対して少なくとも80％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、該核酸を含むベクター、または該ベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。
【００２１】
本発明の一態様は、少なくとも1回量の本発明のいずれかの態様または実施形態に従う変異体、リガンド、融合産物、タンパク質または組成物を患者に投与することを含んでなる、患者の疾患もしくは障害の治療または予防方法を提供する。別の態様は、医薬として使用するための、本発明による変異体、リガンド、多重特異性リガンド、融合産物、融合タンパク質、タンパク質または組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】PCT/EP2010/052007に記載されたDOM7h-14変異体dAbのアミノ酸配列アライメント。特定の位置の「・」は、DOM7h-14でその位置に見られるのと同じアミノ酸を示す。CDRは下線と太字で示される(第1の下線配列がCDR1であり、第2の下線配列がCDR2であり、そして第3の下線配列がCDR3である)。
【図１Ｂ】PCT/EP2010/052007に記載されたDOM7h-14変異体dAbのアミノ酸配列アライメント。特定の位置の「・」は、DOM7h-14でその位置に見られるのと同じアミノ酸を示す。CDRは下線と太字で示される(第1の下線配列がCDR1であり、第2の下線配列がCDR2であり、そして第3の下線配列がCDR3である)。
【図２Ａ】DOM7h-14変異体の動態パラメータ。KD単位 = nM; Kd単位 = sec-1; Ka単位 = M-1 sec-1。表記A e-BはA×10-Bを意味し、C e DはC×10Dを意味する。下の例により支持される、さまざまな動物種における全体的な動態範囲が示される。また、選択範囲が特定の治療セッティング(急性または慢性の適応症、症状もしくは疾患、ならびに慢性期と急性期の両方に用いられる「中間」)で用いるために提供される。高度親和性のdAbおよびこれらを含む製品は慢性期に有用である。中等度の親和性のdAbおよびこれらを含む製品は中間期に有用である。低度親和性のdAbおよびこれらを含む製品は急性期に有用である。ここでの親和性は、血清アルブミンに対する親和性である。抗血清アルブミンdAbおよび融合タンパク質のさまざまな例が記載されており、これらは開示された範囲を支持する。こうした例の多くは、ヒトおよび1種以上の非ヒト動物(例えば、ヒトとカニクイザルおよび/またはマウス)で好ましい動態を有する。dAbまたはそれを含む製品の選択は、本発明によれば、治療処置されるセッティング(例えば、慢性または急性)に応じて、調整することができる。
【図２Ｂ】DOM7h-14変異体の動態パラメータ。KD単位 = nM; Kd単位 = sec-1; Ka単位 = M-1 sec-1。表記A e-BはA×10-Bを意味し、C e DはC×10Dを意味する。下の例により支持される、さまざまな動物種における全体的な動態範囲が示される。また、選択範囲が特定の治療セッティング(急性または慢性の適応症、症状もしくは疾患、ならびに慢性期と急性期の両方に用いられる「中間」)で用いるために提供される。高度親和性のdAbおよびこれらを含む製品は慢性期に有用である。中等度の親和性のdAbおよびこれらを含む製品は中間期に有用である。低度親和性のdAbおよびこれらを含む製品は急性期に有用である。ここでの親和性は、血清アルブミンに対する親和性である。抗血清アルブミンdAbおよび融合タンパク質のさまざまな例が記載されており、これらは開示された範囲を支持する。こうした例の多くは、ヒトおよび1種以上の非ヒト動物(例えば、ヒトとカニクイザルおよび/またはマウス)で好ましい動態を有する。dAbまたはそれを含む製品の選択は、本発明によれば、治療処置されるセッティング(例えば、慢性または急性)に応じて、調整することができる。
【図２Ｃ】DOM7h-14変異体の動態パラメータ。KD単位 = nM; Kd単位 = sec-1; Ka単位 = M-1 sec-1。表記A e-BはA×10-Bを意味し、C e DはC×10Dを意味する。下の例により支持される、さまざまな動物種における全体的な動態範囲が示される。また、選択範囲が特定の治療セッティング(急性または慢性の適応症、症状もしくは疾患、ならびに慢性期と急性期の両方に用いられる「中間」)で用いるために提供される。高度親和性のdAbおよびこれらを含む製品は慢性期に有用である。中等度の親和性のdAbおよびこれらを含む製品は中間期に有用である。低度親和性のdAbおよびこれらを含む製品は急性期に有用である。ここでの親和性は、血清アルブミンに対する親和性である。抗血清アルブミンdAbおよび融合タンパク質のさまざまな例が記載されており、これらは開示された範囲を支持する。こうした例の多くは、ヒトおよび1種以上の非ヒト動物(例えば、ヒトとカニクイザルおよび/またはマウス)で好ましい動態を有する。dAbまたはそれを含む製品の選択は、本発明によれば、治療処置されるセッティング(例えば、慢性または急性)に応じて、調整することができる。
【図２Ｄ】DOM7h-14変異体の動態パラメータ。KD単位 = nM; Kd単位 = sec-1; Ka単位 = M-1 sec-1。表記A e-BはA×10-Bを意味し、C e DはC×10Dを意味する。下の例により支持される、さまざまな動物種における全体的な動態範囲が示される。また、選択範囲が特定の治療セッティング(急性または慢性の適応症、症状もしくは疾患、ならびに慢性期と急性期の両方に用いられる「中間」)で用いるために提供される。高度親和性のdAbおよびこれらを含む製品は慢性期に有用である。中等度の親和性のdAbおよびこれらを含む製品は中間期に有用である。低度親和性のdAbおよびこれらを含む製品は急性期に有用である。ここでの親和性は、血清アルブミンに対する親和性である。抗血清アルブミンdAbおよび融合タンパク質のさまざまな例が記載されており、これらは開示された範囲を支持する。こうした例の多くは、ヒトおよび1種以上の非ヒト動物(例えば、ヒトとカニクイザルおよび/またはマウス)で好ましい動態を有する。dAbまたはそれを含む製品の選択は、本発明によれば、治療処置されるセッティング(例えば、慢性または急性)に応じて、調整することができる。
【図３−１】本明細書に記載のDOM7h-14-10変異体dAbのアミノ酸配列アライメント。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図３−３】図３−２の続きである。
【図３−４】図３−３の続きである。
【図３−５】図３−４の続きである。
【図３−６】図３−５の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書では、本発明は、明確かつ簡潔な明細書を記載することができるように、実施形態に関連して、説明されている。実施形態は、本発明から逸脱することなく、さまざまに組み合わせたり、分離したりできることが意図されており、また、そのように理解されるべきである。
【００２４】
他に定義がない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語は、当業者(例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学の分野の当業者)が一般に理解しているものと同じ意味を有する。分子遺伝学的および生化学的方法(一般的には、参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第4版, John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと)ならびに化学的方法については標準的な技術が使用される。
【００２５】
「患者」とは、任意の動物、例えば哺乳動物、例えば非ヒト霊長類(ヒヒ、アカゲザルもしくはカニクイザル)、マウス、ヒト、ウサギ、ラット、イヌ、ネコまたはブタである。一実施形態では、患者がヒトである。
【００２６】
本明細書中で用いる「抗体」とは、IgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE、またはフラグメント(Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合したFv、scFv、閉鎖立体配座の多重特異性抗体、ジスルフィド結合したscFv、ダイアボディなど)を指し、天然で抗体を産生するどの種に由来するか、または組換えDNA技術によって作製されるか、または血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母もしくは細菌から単離されるかどうかを問わない。
【００２７】
本明細書中で用いる「抗体フォーマット」とは、1つ以上の抗体可変ドメインが抗原に対する結合特異性をポリペプチド構造に付与するように組み込まれ得る、任意の適切なポリペプチド構造を指す。さまざまな適切な抗体フォーマットが当技術分野で知られており、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および/または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、前述のいずれかの抗原結合フラグメント(例えば、Fvフラグメント(例：一本鎖Fv (scFv)、ジスルフィド結合Fv)、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント)、単一抗体可変ドメイン(例えば、dAb、VH、VHH、VL)、および前述のいずれかの改変型(例えば、ポリエチレングリコールもしくは他の適切なポリマーの共有結合により改変されたもの、またはヒト化VHH)などである。
【００２８】
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、異なるV領域またはドメインから独立して、抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン(VH、VHH、VL)を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域または可変ドメインと共にフォーマット(例えば、ホモまたはヘテロ多量体)で存在することができるが、その場合、他の領域またはドメインは単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合にとって必要とされない(すなわち、その場合、免疫グロブリン単一可変ドメインは追加の可変ドメインから独立して抗原に結合する)。「ドメイン抗体」または「dAb」は、本明細書中で用いる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語と同じである。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、本明細書中で用いる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語と同じである。「単一抗体可変ドメイン」または「抗体単一可変ドメイン」は、本明細書中で用いる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一実施形態では、ヒト抗体の可変ドメインであるが、げっ歯類(例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられるWO 00/29004に開示される)、テンジクザメおよびラクダ科動物のVHH dAbなど、他の種に由来する単一抗体可変ドメインをも包含する。ラクダ科動物VHHは、もともと軽鎖を欠いている重鎖抗体を産生するラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコなどの種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。VHHはヒト化することができる。
【００２９】
「ドメイン」とは、タンパク質の残りの部分から独立した三次構造を有する、折りたたまれたタンパク質構造のことである。一般的に、ドメインはタンパク質の個別の機能的特性に関与しており、多くの場合、そのタンパク質の残部の機能および/またはそのドメインの機能を失うことなく、他のタンパク質に付加、移動または転移することができる。「単一抗体可変ドメイン」とは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む、折りたたまれたポリペプチドドメインである。したがって、それには、完全な抗体可変ドメインおよび改変された可変ドメイン、例えば1つ以上のループが抗体可変ドメインに特徴的でない配列によって置換されたもの、あるいはトランケートされているかまたはN末端もしくはC末端の延長部を有する抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する折りたたまれた可変ドメインのフラグメントが含まれる。
【００３０】
本出願において、用語「予防」および「予防する」は、疾患または症状の誘導に先立って保護組成物を投与することを含む。「治療」および「治療する」は、疾患または症状の徴候が明らかになった後で保護組成物を投与することを含む。「抑制」または「抑制する」は、誘導事象の後で、しかし疾患または症状の臨床的出現の前に、該組成物を投与することを意味する。
【００３１】
本明細書中で用いる用語「用量」は、一度に全部(単位用量)、または特定の時間間隔で2回以上、被験者に投与されるリガンドの量を意味する。例えば、用量は、1日(24時間)(1日量)、2日間、1週間、2週間、3週間、または1ヶ月以上にわたって(例えば、単回投与により、または2回以上の投与により)被験者に投与されるリガンド(例えば、標的抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンド)の量を指すことができる。投与と投与の間隔は希望する任意の時間であり得る。用量に言及するときの用語「薬学的に有効な」とは、所望の効果を提供するのに十分な、リガンド、ドメインまたは医薬活性剤の量を意味する。「有効」である量は、個体の年齢および全身状態、特定の薬物または医薬活性剤などに応じて、被験者ごとに異なるだろう。したがって、すべての患者に適用できる正確な「有効」量を指定することが常に可能とは限らない。しかしながら、個々のケースにおける適切な「有効」用量は、ルーチンワーク的な実験を用いることにより、当業者が決定することができる。
【００３２】
薬物動態の解析方法およびリガンド(例えば、単一可変ドメイン、融合タンパク質、または多重特異性リガンド)の半減期の測定方法は当業者によく知られている。詳細は、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPeters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)に見いだすことができる。また、tαおよびtβ半減期、曲線下面積(AUC)などの薬物動態パラメータについて記載している“Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, 発行Marcel Dekker, 第2改訂版 (1982)をも参照されたい。必要に応じて、本明細書中に引用されたすべての薬物動態パラメータおよび値は、ヒトの値であると解釈されるべきである。必要に応じて、本明細書中に引用されたすべての薬物動態パラメータおよび値は、マウスまたはラットまたはカニクイザルの値であると解釈されるべきである。
【００３３】
半減期(t1/2αおよびt1/2β)とAUCは、時間に対するリガンドの血清濃度の曲線から求めることができる。例えば、その曲線をモデル化するために、WinNonlin解析パッケージ、例えばバージョン5.1 (Pharsight社(Mountain View, CA94040, 米国)から入手可能)を用いることができる。2コンパートメントモデルを使用する場合、第1相(α相)では、リガンドが、若干の排出を伴って、患者の体内に主に分布していく。第2相(β相)は、リガンドが全身にいきわたり、そしてリガンドが患者から消失されるにつれて血清濃度が低下していく時の相である。tα半減期は第1相の半減期であり、そしてtβ半減期は第2相の半減期である。かくして、一実施形態では、本発明との関連で、可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、(約)15分またはそれ以上の範囲のtα半減期を有する。一実施形態では、その範囲の下端は(約)30分、45分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間または12時間である。さらに、あるいはこれとは別に、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、最大12時間(または約12時間)までの範囲のtα半減期をもつだろう。一実施形態では、その範囲の上端は(約)11、10、9、8、7、6または5時間である。適切な範囲の例は(約)1〜6時間、2〜5時間または3〜4時間である。
【００３４】
一実施形態において、本発明は、(約)2.5時間またはそれ以上の範囲のtβ半減期を有する本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドを提供する。一実施形態では、その範囲の下端は(約)3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間もしくは12時間である。さらに、あるいはこれとは別に、tβ半減期は最大で(約)21または25日間である。一実施形態では、その範囲の上端は(約)12時間、24時間、2日間、3日間、5日間、10日間、15日間、19日間、20日間、21日間または22日間である。例えば、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは12〜60時間(または約12〜60時間)の範囲のtβ半減期をもつだろう。さらなる実施形態では、それは12〜48時間(または約12〜48時間)の範囲である。さらに別の実施形態では、それは12〜26時間(または約12〜26時間)の範囲である。
【００３５】
2コンパートメントモデルに代わる手段として、当業者はノンコンパートメントモデルの使用に精通しており、このモデルを用いて終末半減期を求めることができる(これに関連して、本明細書中で用いる用語「終末半減期」とは、ノンコンパートメントモデルを用いて測定された終末半減期を意味する)。例えば、この方法でその曲線をモデル化するために、WinNonlin解析パッケージ、例えばバージョン5.1 (Pharsight社(Mountain View, CA94040, 米国)から入手可能)を使用することができる。この場合、一実施形態では、単一可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、少なくとも(または少なくとも約)8時間、10時間、12時間、15時間、28時間、20時間、1日間、2日間、3日間、7日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間または25日間の終末半減期を有する。一実施形態では、この範囲の上端は(約)24時間、48時間、60時間、72時間または120時間である。例えば、終末半減期は、例えばヒトでは、(約)8〜60時間、8〜48時間または12〜120時間である。
【００３６】
さらに、あるいは上記の基準とは別に、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、(約)1mg.min/mlまたはそれ以上の範囲のAUC値(曲線下面積)を有する。一実施形態では、その範囲の下端は(約)5、10、15、20、30、100、200または300mg.min/mlである。さらに、あるいは別に、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、最大(約)600mg.min/mlまでの範囲のAUCを有する。一実施形態では、その範囲の上端は(約)500、400、300、200、150、100、75または50mg.min/mlである。有利には、可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、以下からなる群より選択される(およその)範囲のAUCをもつだろう：15〜150mg.min/ml、15〜100mg.min/ml、15〜75mg.min/ml、および15〜50mg.min/ml。
【００３７】
「表面プラズモン共鳴」：競合アッセイを用いて、ヒト血清アルブミンなどの特定の抗原またはエピトープが、本明細書に記載の血清アルブミン結合リガンド(特定のdAbなど)への結合について、カニクイザル血清アルブミンなどの別の抗原またはエピトープと競合するかどうかを調べることができる。同様に、競合アッセイを用いて、dAbなどの第1のリガンドが、標的抗原またはエピトープへの結合について、dAbなどの第2のリガンドと競合するかどうかを調べることができる。本明細書中で用いる用語「競合する」とは、2つ以上の分子間の特異的結合相互作用をいくらかでも妨げることができる分子、化合物、好ましくはタンパク質、などの物質を指す。語句「競合的に阻害しない」とは、物質、例えば分子、化合物、好ましくはタンパク質が、2つ以上の分子間の特異的結合相互作用を測定可能な程度または有意な程度には妨げないことを意味する。2つ以上の分子間の特異的結合相互作用には、好ましくは、単一可変ドメインとそのコグネイトのパートナーまたは標的との特異的結合相互作用が含まれる。妨害または競合する分子は、別の単一可変ドメインであってもよいし、それはコグネイトのパートナーまたは標的と構造的および/または機能的に類似する分子であってもよい。
【００３８】
用語「結合成分」とは、異なるエピトープまたは抗原結合ドメインから独立して、ある抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを指す。結合成分はドメイン抗体(dAb)であってもよいし、天然のリガンド以外のリガンドに結合する非免疫グロブリンタンパク質スカフォールド、例えば、CTLA-4、リポカリン、SpA、アフィボディ、アビマー(avimer)、GroE1、トランスフェリン、GroESおよびフィブロネクチンからなる群より選択されるスカフォールド、の誘導体であるドメインであってもよい(本発明の場合には、その成分は血清アルブミンに結合する)。タンパク質スカフォールドの例、およびレパートリーから抗原またはエピトープに特異的な結合ドメインを選択するための方法を開示する、WO2008/096158を参照されたい(実施例17〜25参照)。WO2008/096158のこれらの具体的な開示は、本発明で使用するために本明細書中に明確に記載されているかのように、参照により本明細書に明示的に組み入れられ、そしてそのような開示のどの部分も本明細書中の1つ以上の請求項に組み入れることができるものとする。
【００３９】
一実施形態において、本発明の任意の態様もしくは実施形態に係る前記変異体または結合成分は次の動態特性の1つ以上を含む：
(a)  変異体または結合成分は、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)0.1〜(約)10000nM、必要に応じて(約)1〜(約)6000nMの解離定数(KD)で、ヒトSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(b)  変異体または結合成分は、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)1.5×10-4〜(約)0.1sec-1、必要に応じて(約)3×10-4〜(約)0.1sec-1のオフ速度定数(Kd)で、ヒトSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(c)  変異体または結合成分は、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)2×106〜(約)1×104M-1sec-1、必要に応じて(約)1×106〜(約)2×104M-1sec-1のオン速度定数(Ka)で、ヒトSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(d)  変異体または結合成分は、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)0.1〜(約)10000nM、必要に応じて(約)1〜(約)6000nMの解離定数(KD)で、カニクイザルSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(e)  変異体または結合成分は、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)1.5×10-4〜(約)0.1sec-1、必要に応じて(約)3×10-4〜(約)0.1sec-1のオフ速度定数(Kd)で、カニクイザルSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(f)  変異体または結合成分は、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)2×106〜(約)1×104M-1sec-1、必要に応じて(約)1×106〜(約)5×103M-1sec-1のオン速度定数(Ka)で、カニクイザルSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(g)  変異体または結合成分は、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)1〜(約)10000nM、必要に応じて(約)20〜(約)6000nMの解離定数(KD)で、ラットSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(h)  変異体または結合成分は、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)2×10-3〜(約)0.15sec-1、必要に応じて(約)9×10-3〜(約)0.14sec-1のオフ速度定数(Kd)で、ラットSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(i)  変異体または結合成分は、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)2×106〜(約)1×104M-1sec-1、必要に応じて(約)1×106〜(約)3×104M-1sec-1のオン速度定数(Ka)で、ラットSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(j)  変異体または結合成分は、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)1〜(約)10000nMの解離定数(KD)で、マウスSAに特異的に結合する結合部位を含む；
(k)  変異体または結合成分は、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)2×10-3〜(約)0.15sec-1のオフ速度定数(Kd)で、マウスSAに特異的に結合する結合部位を含む；および/または
(l)  変異体または結合成分は、表面プラズモン共鳴で測定して、(約)2×106〜(約)1×104M-1sec-1、必要に応じて(約)2×106〜(約)1.5×104M-1sec-1のオン速度定数(Ka)で、マウスSAに特異的に結合する結合部位を含む。
【００４０】
必要に応じて、変異体または結合成分は以下を有する：
I:  (a)と(d)に記載のKD、(b)と(e)に記載のKd、および(c)と(f)に記載のKa；または
II: (a)と(g)に記載のKD、(b)と(h)に記載のKd、および(c)と(i)に記載のKa；または
III:(a)と(j)に記載のKD、(b)と(k)に記載のKd、および(c)と(l)に記載のKa；または
IV:  IおよびIIに記載の動態；または
V:   IおよびIIIに記載の動態；または
VI:  I、IIおよびIIIに記載の動態。
【００４１】
本発明はまた、本発明の上記態様または実施形態のいずれかの変異体または結合成分を含むリガンドを提供する。例えば、リガンドは二重特異性リガンドであり得る(二重特異性リガンドの例についてはWO04003019を参照されたい)。一態様では、本発明は、本発明の上記態様または実施形態のいずれかの抗SA変異体または結合成分と、SA以外の標的抗原に特異的に結合する更なる結合成分とを含む、多重特異性リガンドを提供する。各結合成分は標的に特異的に結合するどのような結合成分であってもよく、例えば、その成分は抗体、抗体フラグメント、scFv、Fab、dAb、または非免疫グロブリンタンパク質スカフォールドを含む結合成分である。そのような成分はWO2008/096158に詳しく開示されている(実施例17〜25参照、その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。非免疫グロブリンスカフォールドの例は、CTLA-4、リポカリン、ブドウ球菌プロテインA(spA)、アフィボディ(Affibody(商標))、アビマー(Avimer(商標))、アドネクチン、GroELおよびフィブロネクチンである。
【００４２】
一実施形態では、抗標的結合成分と抗SA単一変異体または結合成分との間にリンカーが配置され、そのリンカーはアミノ酸配列AST、必要に応じてASTSGPS（例えば抗SAおよび抗標的dAbを使用する場合）を含む。代替リンカーはWO2007085814に記載されており(参照により本明細書に組み入れられる)、また、WO2008/096158 (135頁12行〜140頁14行の文脈を参照されたい；その開示内容およびリンカーのすべての配列は、本発明で使用するために本明細書中に明確に記載されているかのように、参照により本明細書に明示的に組み入れられ、そしてそのような開示内容のどの部分も本明細書中の1つ以上の請求項に組み入れることができるものとする)およびWO2009/068649に記載されている。
【００４３】
多重特異性リガンドの一実施形態において、標的抗原はポリペプチド、タンパク質もしくは核酸、またはその一部とすることができ、天然に存在しても合成のものでもよい。これに関して、本発明のリガンドは、その標的抗原に結合してアンタゴニストまたはアゴニスト(例えば、EPO受容体アゴニスト)として作用することができる。当業者であれば、その選択肢が大規模で多様であることを理解するであろう。それらは、例えば、ヒトもしくは動物のタンパク質、サイトカインもしくは増殖因子、サイトカインもしくは増殖因子の受容体(ここでサイトカイン受容体はサイトカインのための受容体を含む)、酵素、酵素の補因子、またはDNA結合タンパク質であり得る。本明細書で使用する用語「腫瘍壊死因子受容体１(TNFR1)のアンタゴニスト」または「抗TNFR1アンタゴニスト」等は、TNFR1に結合し、TNFR1のある(すなわち1以上の)機能を阻害し得る物質(例えば分子、化合物)をいう。例えば、TNFR1のアンタゴニストはTNFαのTNFR1への結合を阻害し、および／またはTNFR1が介在するシグナル伝達を阻害し得る。従って、TNFR1-介在性のプロセスおよび細胞応答(例えば標準的なL929細胞毒性アッセイにおけるTNFα誘導性の細胞死)は、TNFR1のアンタゴニストによって阻害され得る。
【００４４】
一実施形態において、多重特異性リガンドは本発明の抗SA dAb変異体または成分と抗TNFR1結合成分(例えば、抗TNFR1 dAb)を含む。場合により、前記リガンドは、受容体の架橋の可能性を減らすために、ただ1つの抗TNFR1結合成分(例えば、dAb)を有する。抗TNFR1 dAbは、例えばWO2006/038027、WO2007/049017、WO2008/149148およびWO2010/081787に記載されている(これらのPCT出願に開示される、そのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、本発明で使用するために本明細書中に明確に記載されているかのように、参照により本明細書に明示的に組み入れられ、そしてそのような開示内容のどの部分も本明細書中の1つ以上の請求項に組み入れることができるものとする)。
【００４５】
一実施形態において、本発明のリガンドは、1つ以上のポリペプチドに直接または間接的に融合された本発明の変異体または成分を含む融合タンパク質である。例えば、その融合タンパク質は、WO2005/118642(その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)に開示されるような「薬物融合体」であってよく、それは本発明の変異体または成分とそのPCT出願に明示されるポリペプチド薬物とを含む。
【００４６】
本明細書中で用いる「薬物」とは、個体の生物学的標的分子に結合するおよび/または該標的分子の機能を変更することによって有益な、治療上のまたは診断上の効果を生み出すために、個体に投与することができる任意の化合物(例えば、有機小分子、核酸、ポリペプチド)を指す。標的分子は個体のゲノムによってコードされる内因性の標的分子(例えば、個体のゲノムによってコードされる酵素、受容体、増殖因子、サイトカイン)であってもよいし、病原体のゲノムによってコードされる外因性の標的分子(例えば、ウイルス、細菌、真菌、線虫または他の病原体のゲノムによってコードされる酵素)であってもよい。本発明の抗SA dAb変異体を含む融合タンパク質およびコンジュゲートで使用するための適切な薬物は、WO2005/118642およびWO2006/059106に開示されている(これらの全開示内容は、具体的な薬物の全リストを含めて、そのリストが本明細書中に明確に記載されているかのように、参照により本明細書に組み入れられ、そしてそのように組み入れることは本明細書の請求項に含めるための具体的な薬物の開示を提供するものとする)。例えば、その薬物はグルカゴン様ペプチド1(GLP-1)もしくはその変異体、インターフェロンα2bもしくはその変異体、またはエキセンディン-4もしくはその変異体であり得る。
【００４７】
一実施形態において、本発明は、WO2005/118642およびWO2006/059106に定義されかつ開示された薬物コンジュゲートを提供し、該コンジュゲートは本発明の変異体または成分を含む。一例では、薬物が変異体または成分に共有結合で結合される(例えば、変異体または成分と薬物は単一のポリペプチドの部分として発現される)。これとは別に、一例では、薬物が変異体または成分に非共有結合で結合または会合される。薬物は変異体または成分と直接または間接的に(例えば、適切なリンカーを介しておよび/または相補的結合パートナー(例：ビオチンとアビジン)の非共有結合を介して)共有結合または非共有結合で結合され得る。相補的結合パートナーを用いる場合には、結合パートナーの一方を薬物に直接または適切なリンカー成分を介して共有結合で結合させることができ、また、その相補的結合パートナーを変異体または成分に直接または適切なリンカー成分を介して共有結合で結合させることができる。薬物がポリペプチドまたはペプチドである場合、その薬物成分を融合タンパク質とすることができ、その場合にポリペプチドまたはペプチド薬物およびポリペプチド結合成分は連続したポリペプチド鎖の個別の部分(成分)である。本明細書に記載されるように、ポリペプチド結合成分とポリペプチド薬物成分はペプチド結合を介して相互に直接結合されてもよいし、あるいは適切なアミノ酸またはペプチドもしくはポリペプチドリンカーを介して連結されてもよい。
【００４８】
血清アルブミンに特異的に結合する、本発明の1つの単一可変ドメイン変異体または成分を含むリガンド(単量体)、または2つ以上の単一可変ドメインまたは成分を含むリガンド(本明細書中で定義される多量体、融合タンパク質、コンジュゲート、および二重特異性リガンド)は、以下から選択される1つ以上の成分をさらに含むことができるが、好ましくはそれらに限定されるものではない：標識、タグ、追加の単一可変ドメイン、dAb、抗体、抗体フラグメント、マーカーおよび薬物。これらの成分の1つ以上は、単一可変ドメインまたは成分(免疫グロブリンまたは非免疫グロブリンのいずれかの単一可変ドメイン)を含むリガンドのCOOH末端もしくはN末端に、またはN末端とCOOH末端の両方に位置づけることができる。これらの成分の1つ以上は、1つの単一可変ドメインまたは成分を含むリガンド(単量体)または2つ以上の単一可変ドメインまたは成分を含むリガンド(本明細書中で定義される多量体、融合タンパク質、コンジュゲート、および二重特異性リガンド)の、血清アルブミンに特異的に結合する単一可変ドメインまたは成分のCOOH末端もしくはN末端、またはN末端とCOOH末端の両方に位置づけることができる。これらの末端の一方または両方に位置づけられるタグの非限定的な例としては、HA、hisまたはmycタグが挙げられる。1つ以上のタグ、標識および薬物を含めて、これらの成分は、血清アルブミンに結合する、1つの単一可変ドメインを含むリガンド(単量体)または2つ以上の単一可変ドメインまたは成分を含むリガンド(本明細書中で定義される多量体、融合タンパク質、コンジュゲート、および二重特異性リガンド)に、上で説明したように直接またはリンカーを介して、結合させることができる。
【００４９】
本明細書にはまた、本明細書に記載の変異体、成分、融合タンパク質、コンジュゲートまたはリガンドのいずれかをコードする単離された核酸、例えば、血清アルブミンに特異的に結合する、またはヒト血清アルブミンと少なくとも1種の非ヒト血清アルブミンの両方に特異的に結合する、本発明の1つの単一可変ドメイン変異体を含むリガンド(単量体)もしくは2つ以上の単一可変ドメイン変異体を含むリガンド(本明細書中で定義される多量体、融合タンパク質、コンジュゲート、および二重特異性リガンド)またはその機能的に活性なフラグメントをコードする単離された核酸が包含される。さらに、本明細書には、ベクターおよび/または発現ベクター、該ベクターを含む宿主細胞、例えば、ベクターで形質転換された植物もしくは動物細胞および/または細胞株、前記ベクターによってコードされる、血清アルブミンに特異的に結合する、1つの単一可変ドメイン変異体もしくは成分(単量体)または2つ以上の単一可変ドメイン変異体もしくは成分(例えば、本明細書中で定義される多量体、融合タンパク質、コンジュゲート、および二重特異性リガンド)を含む1つ以上の変異体、成分、融合タンパク質もしくはリガンド、またはそのフラグメントを発現および/または産生させる方法を包含し、その方法は、場合によって、1つ以上の変異体、成分、融合タンパク質もしくはリガンド、またはそのフラグメントが発現されるように宿主細胞を培養し、任意で、血清アルブミンに特異的に結合する、1つの単一可変ドメイン変異体もしくは成分(単量体)または2つ以上の単一可変ドメイン変異体もしくは成分(本明細書中で定義される多量体、融合タンパク質、コンジュゲート、および二重特異性リガンド)を含むリガンドを宿主細胞の培養培地から回収することを含む。また、本明細書に記載のリガンドを、血清アルブミン(血清アルブミンおよび/または非ヒト血清アルブミンを含む)、および/または血清アルブミン以外の1つ以上の標的(ここで、その標的は生物学的活性分子を含み、先に挙げた動物タンパク質、サイトカインを含む)と接触させる方法が包含され、そして前記接触がin vitroである方法だけでなく、本明細書に記載の変異体、成分、融合タンパク質またはリガンドのいずれかを個々の宿主動物または細胞にin vivoおよび/またはex vivoで投与する方法も包含される。好ましくは、血清アルブミンおよび/または非ヒト血清アルブミンに対する単一可変ドメイン(免疫グロブリンまたは非免疫グロブリン)と、血清アルブミン以外の1つ以上の標的に対する1つ以上のドメインとを含む、本明細書に記載のリガンドを投与することは、その抗標的リガンドの半減期(Tβおよび/または終末半減期を含む)を高めるだろう。前記変異体、融合タンパク質もしくは単一ドメイン含有リガンドまたはそのフラグメント(その機能性フラグメントを含む)をコードする核酸分子は、本明細書において企図される。前記核酸分子をコードするベクター(発現ベクターを含むが、好ましくはそれに限定されない)は本明細書中で企図され、これらの発現ベクターの1つ以上を含む細胞株または生物に由来する宿主細胞も同様に企図される。また、上記の核酸、べクターおよび宿主細胞のいずれかを含むが、好ましくはそれらに限定されない、任意の変異体、融合タンパク質��たはリガンドの生産方法も企図される。
【００５０】
本発明の一態様は、本発明による変異体、または本発明の多重特異性リガンド、または本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００５１】
または選択された前記配列に対して少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％同一であるヌクレオチド配列。
【００５２】
本発明の一態様は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。本発明の一態様は、該ベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。
【００５３】
ライブラリーベクター系、単一可変ドメインの組み合わせ、二重特異性リガンドの特性解析、二重特異性リガンドの構造、二重特異性リガンドの構築に用いるスカフォールド、抗血清アルブミンdAbおよび多重特異性リガンドおよび半減期増強リガンドの使用、ならびに抗血清アルブミンdAbを含む組成物および製剤の詳細については、WO2008/096158を参照されたい。これらの開示内容は、本発明の変異体、成分、リガンド、融合タンパク質、コンジュゲート、核酸、ベクター、宿主および組成物に関する指針を含めて、本発明で使用するための指針を与えるために、参照により本明細書に組み入れられる。
【００５４】
配列
【表１】
2013537421.tif 000002
【表２】
2013537421.tif 000003
【表３】
2013537421.tif 000004
2013537421.tif 000005
2013537421.tif 000006
2013537421.tif 000007
【００５５】
上記表中でmyc-tag分子が示されている場合、これは実施例におけるPK研究で用いたものである。myc-tagのない配列が示されている場合は、実施例におけるPK研究はmyc-tagを付けた物質では行っていない。すなわち、記載したタグ付けされていない構築物で研究を行った。
【００５６】
例証
実験の項でのすべての番号付けはKabatに従うものである(Kabat, E.A. National Institutes of Health (US) & Columbia University. Sequences of proteins of immunological interest, edn 5 (US Dept. Of Health and Human Services Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991))。
【実施例１】
【００５７】
Vk親和性成熟
選択：
HSA(ヒト血清アルブミン)およびRSA(ラット血清アルブミン)抗原はSigma社から入手した(本質的に脂肪酸不含、約99％(アガロースゲル電気泳動)、凍結乾燥粉末、カタログ番号はそれぞれA3782およびA6414)。
【００５８】
上記2種の抗原のビオチン化産物は、EZ Link Sulfo-NHS-SS-Biotin (Pierce社、カタログ番号21331)を用いることにより作製した。遊離のビオチン試薬の除去は、サンプルをPD10脱塩カラムに2回通過させ、その後1000倍過剰量のPBSに対して4℃で一晩透析することによって行った。得られた産物を質量分析で検査したところ、分子あたり1〜2個のビオチンが観察された。
【００５９】
親和性成熟ライブラリー：
エラープローン・ライブラリーとCDRライブラリーは両方とも、DOM7h-14親dAbを用いて作製した(DOM7h-14の配列についてはWO2008/096158を参照されたい)。CDRライブラリーをpDOM4ベクター中に作製し、そしてエラープローン・ライブラリーをpDOM33ベクター中に作製した(プロテアーゼ処理の有無にかかわらず選択を可能にするため)。ベクターpDOM4は、遺伝子IIIシグナルペプチド配列が酵母糖脂質アンカー型表面タンパク質(GAS)シグナルペプチドに置換されている、Fdファージベクターの誘導体である。また、それはリーダー配列と遺伝子IIIの間にc-mycタグをも含み、これにより遺伝子IIIがインフレームに戻される。このリーダー配列はファージディスプレイベクター内でも他の原核生物発現ベクター内でもよく機能し、広く一般的に使用することができる。pDOM33は、dAb-ファージ融合体をタンパク質分解酵素トリプシンに対して耐性にする、c-mycタグが除去されたpDOM4ベクターの改変型である。これは、タンパク質分解酵素に比較的安定しているdAbを選択するためのファージ選択におけるトリプシンの使用を可能にする(WO2008149143を参照されたい)。
【００６０】
エラープローン成熟ライブラリーの場合は、成熟させるdAbをコードするプラスミドDNAを、GENEMORPH(登録商標)II RANDOM MUTAGENESIS KIT(ランダムでユニークな突然変異誘発キット、Stratagene社)を用いて、PCRにより増幅した。その産物をSal IとNot Iで消化して、切断したファージベクターpDOM33とのライゲーション反応に使用した。
【００６１】
CDRライブラリーの場合は、NNKまたはNNSコドンを含む縮重オリゴヌクレオチドを用いてPCR反応を行い、親和性成熟させるdAb中の必要な位置を多様化した。次にアセンブリPCRを用いて、多様化された完全長のインサートを作製した。そのインサートをSal IとNot Iで消化して、複数残基の変異導入のためのpDOM4および単一残基の変異導入のためのpDOM5とのライゲーション反応に使用した。pDOM5ベクターは、タンパク質の発現がLacZプロモーターによって駆動される、pUC119ベースの発現ベクターである。GAS1リーダー配列(WO 2005/093074参照)が、分離された可溶性dAbを大腸菌のペリプラズムおよび培養上清に確実に分泌させる。dAbはこのベクター内のSalI/NotIにクローニングされ、それによりdAbのC末端にmycタグが付加される。Sal IとNot Iを用いるこのプロトコルは、結果的にN末端にSTアミノ酸配列を含めることになる。
【００６２】
その後、いずれかの方法により生成されたライゲーション産物を用いて、大腸菌TB1株をエレクトロポレーションにより形質転換し、形質転換された細胞を15μg/mlテトラサイクリン含有2×TY寒天上にプレートすると、5×107クローンを上回るライブラリーサイズが得られた。
【００６３】
エラープローン・ライブラリーは次の平均変異率およびサイズを有していた：DOM7h-14 (dAbあたり2.9変異)、サイズ：5.4×108。
【００６４】
各CDRライブラリーは4アミノ酸の多様性を有する。2つのライブラリーがCDR1とCDR3のそれぞれのために作製され、そして1つのライブラリーがCDR2のために作製された。各ライブラリー内で多様化された位置は次のとおりである(アミノ酸はVKダミーDPK9配列に基づく)：
2013537421.tif 000008
【実施例２】
【００６５】
選択戦略
3つのファージ選択戦略がVκ AlbudAb(商標)(抗血清アルブミンdAb)の親和性成熟のために採用された。
【００６６】
1)  HSAのみに対する選択：
HSAに対する選択を3ラウンド実施した。エラープローン・ライブラリーと各CDRライブラリーはすべてのラウンドで個々のプールとして選択された。第1ラウンドの選択は、1mg/mlでイムノチューブ(immunotube)に受動的にコーティングしたHSAに対して行った。ラウンド2は100nM HSAに対して実施し、ラウンド3は10nM (CDR選択)または20もしくは100nM (エラープローン選択)のHSAに対して、両方とも可溶性選択として実施し、続いて第4ラウンドの選択をエラープローン・ライブラリーで1.5nM HSAに対して可溶性選択として実施した。エラープローン・ライブラリーは0.1MグリシンpH2.0を用いて溶出してから、1M Tris pH8.0で中和した。CDRライブラリーは1mg/mlトリプシンで溶出してから、対数期TG1細胞に感染させた。第3ラウンドの各選択物はスクリーニングのためにpDOM5にサブクローニングした。可溶性選択ではビオチン化HSAを使用した。
【００６７】
2)  HSAに対するトリプシン選択：
親クローンと比べて増加したプロテアーゼ耐性をもち、かつ潜在的に改善された生物物理学的特性をもつdAbを選択するために、ファージ選択においてトリプシンを使用した(WO2008149143を参照されたい)。4ラウンドの選択をHSAに対して実施した。エラープローン・ライブラリーの第1ラウンドの選択は、トリプシンを用いることなく、1mg/mlで受動的にコーティングされたHSAに対して実施した；第2ラウンドは、20μg/mlトリプシンを用いて、1mg/mlで受動的にコーティングされたHSAに対して37℃で1時間実施した；第3ラウンドの選択は、20μg/mlまたは100μg/mlトリプシンを用いて、100nM HSAに対して、ビオチン化HSAを用いる可溶性選択として、37℃で1時間実施した。最終ラウンドの選択は、100μg/mlトリプシンを用いて、100nM HSAに対して、ビオチン化HSAを用いる可溶性選択として、37℃で一晩実施した。
【００６８】
3)  HSA(ラウンド1)およびRSA(ラウンド2〜4)に対するクロスオーバー選択：
第1ラウンドの選択は、1mg/mlで受動的にコーティングされたHSAまたは1μM HSA(可溶性選択)に対して実施し、その後さらに3ラウンドの可溶性選択を、ビオチン化RSAに対して、ラウンド1では1μM、ラウンド2では100nM、そしてラウンド3では20nM、10nMまたは1nMの濃度で実施した。
【００６９】
スクリーニング戦略および親和性判別：
それぞれの場合に選択後、適切なラウンドの選択から得られたファージDNAのプールをQIAfilter midiprepキット(Qiagen社)により調製し、そのDNAを制限酵素Sal1およびNot1で消化し、そして濃縮されたV遺伝子を、mycタグ付きdAbを発現する可溶性発現ベクターpDOM5の対応する部位にライゲートする(PCT/EP2008/067789を参照されたい)。ライゲートされたDNAを用いて大腸菌HB 2151細胞を電気的に形質転換し、続いて抗生物質カルベニシリンを含む寒天プレート上で一晩増殖させる。得られたコロニーを抗原結合について個別に評価する。それぞれの場合に、少なくとも96のクローンをHSA、CSA(カニクイザル血清アルブミン)、MSA(マウス血清アルブミン)およびRSAへの結合についてBIAcore(商標)(表面プラズモン共鳴)で試験した。MSA抗原はSigma社から入手し(本質的に脂肪酸不含、約99％(アガロースゲル電気泳動)、凍結乾燥粉末、カタログ番号A3559)、CSAはprometic blue樹脂(Amersham社)を用いてカニクイザル血清アルブミンから精製した。可溶性dAbフラグメントは96ウェルプレートでONEX培養培地(Novagen社)中の細菌培養により37℃で一晩産生させた。可溶性dAbを含む培養上清を遠心分離して、高密度HSA、CSA、MSAおよびRSA CM5チップへの結合についてBIAcoreで分析した。クローンは、オフ速度スクリーニングにより、これらすべての動物種の血清アルブミンに結合することが判明した。これらのクローンの配列を決定して、ユニークなdAb配列を明らかにした。
【００７０】
選択されたクローンの(アミノ酸レベルでの)親に対する最低の同一性は96.3％であった(DOM7h-14-10: 96.3％、DOM7h-14-18: 96.3％、DOM7h-14-19: 98.2％、DOM7h-14-28: 99.1％、DOM7h-14-36: 97.2％)。
【００７１】
ユニークなdAbは、2.5L振とうフラスコ内でOnex培地にて30℃、250rpmで48時間にわたり細菌上清として発現させた。dAbは、プロテインLアガロースへの吸着とその後の10mMグリシンpH2.0を用いた溶出によって培養培地から精製した。BIAcoreによるHSA、CSA、MSAおよびRSAへの結合は、1μM、500nMおよび50nMの3つの濃度の精製タンパク質を用いて確認した。各血清アルブミンへのAlbudAbの結合親和性(KD)を調べるために、精製dAbを5000nM〜39nMのアルブミン濃度範囲(5000nM、2500nM、1250nM、625nM、312nM、156nM、78nM、39nM)にわたってBIAcoreで分析した。
【表４】
2013537421.tif 000009
【００７２】
DOM7h-14から誘導されたすべての変異体は、マウス、ラット、ヒトおよびカニクイザルの血清アルブミンに対して交差反応性である。DOM7h-14-10は、親に比較して、ラット、カニクイザルおよびヒト血清アルブミンに対する親和性が改善している。DOM7h-14-28は、RSAに対する親和性が改善している。DOM7h-14-36は、RSA、CSAおよびMSAに対する親和性が改善している。
【実施例３】
【００７３】
主要なDOM7h-14系統クローンの起源
DOM7h-14-19：エラープローン・ライブラリーを用いてHSAに対して実施された親和性成熟から、100μg/mlトリプシン存在下にラウンド3出力(100nM HSA)で得られた。 
DOM7h-14-10、DOM7h-14-18、DOM7h-14-28、DOM7h-14-36：CDR3ライブラリー(Y92、Y93、T94、N96)を用いてHSAに対して実施された親和性成熟から、ラウンド3の出力で得られた。
【表５】
2013537421.tif 000010
【実施例４】
【００７４】
発現および生物物理学的特性解析
2.5L振とうフラスコ内でのルーチンの細菌発現レベルは、Onex培地で30℃、250rpmにて48時間培養した後に測定された。生物物理学的特性はSEC MALLSおよびDSCにより測定された。
【００７５】
SEC MALLS(多角度レーザー光散乱を装備したサイズ排除クロマトグラフィー)は、溶液中の高分子を特性解析するための非侵襲的な手法である。簡単に説明すると、タンパク質(ダルベッコPBSバッファー中の濃度1mg/mL)を0.5ml/分で、その流体力学的特性に従って、サイズ排除クロマトグラフィー(カラム：TOSOH Biosciences社製のTSK3000；Pharmacia社製のS200)により分離する。分離後、そのタンパク質が光を散乱させる傾向を、多角度レーザー光散乱(MALLS)検出器を用いて測定する。タンパク質が検出器を通過している間の散乱光の強度を角度の関数として測定する。この測定を、屈折率(RI)検出器を用いて測定したタンパク質濃度と組み合わせると、適切な式(解析ソフトウェアAstra v.5.3.4.12の必須部分)を用いるモル質量の計算が可能となる。
【００７６】
DSC(示差走査熱量測定)：簡単に説明すると、タンパク質(PBS中1mg/mL)を180℃/時の一定速度で加熱し、熱変性に伴う検出可能な熱変化を測定する。転移中間点(appTm)が測定されるが、これはタンパク質の50％がその天然のコンフォメーションをとり、残りの50％が変性されるときの温度として説明される。ここでは、検査したタンパク質のほとんどが完全にはリフォールディングしないため、見かけの転移中間点(appTm)をDSCにより測定した。Tmが高ければ高いほど、その分子は安定している。アンフォールディング曲線を非2状態方程式によって解析した。用いたソフトウェアパッケージはOrigin(登録商標)v7.0383であった。
【表６】
2013537421.tif 000011
【００７７】
表６に示したすべてのクローンの発現レベルは、大腸菌において15〜119mg/Lの範囲で観察された。
【００７８】
DOM7h-14変異体に関しては、親和性成熟の間中、有益な生物物理学的パラメータ(SEC MALLSで測定された溶液中での単量体状態、およびDSCで測定された55℃を超えるappTm)と発現レベルが維持された。単量体状態は、それが二量体化を回避し、かつ細胞表面受容体のような標的を架橋しうる製品のリスクを回避するので、有利である。
【実施例５】
【００７９】
ラット、マウスおよびカニクイザルにおける血清半減期の測定
AlbudAbであるDOM7h-14-10、DOM7h-14-18およびDOM7h-14-19をpDOM5ベクターにクローニングした。各AlbudAb(商標)について、20〜50mg量を大腸菌において発現させ、細菌の培養上清からプロテインLアフィニティ樹脂を用いて精製し、100mMグリシンpH2により溶出した。そのタンパク質を1mg/mLより高濃度へと濃縮し、PBSにバッファー交換し、Qスピンカラム(Vivascience社)を使ってエンドトキシンを枯渇させた。ラットの薬物動態(PK)解析のために、化合物あたり3匹のラットを用いて、AlbudAbを2.5mg/kgで単回静脈注射として投与した。血清サンプルを0.16、1、4、12、24、48、72、120、168時間で採取した。血清レベルの分析は、以下に記載した方法に従って抗myc ELISAにより行った。
【００８０】
マウスのPKのために、dAbを3匹の被験体の用量群につき2.5mg/kgで単回静脈注射として投与し、血清サンプルを10分; 1h; 8h; 24h; 48h; 72h; 96hで採取した。血清レベルの分析は、以下に記載した方法に従って抗myc ELISAにより行った。
【００８１】
カニクイザルのPKのために、DOM7h-14-10を用量群あたり3匹の雌カニクイザルに2.5mg/kgで単回静脈注射として投与し、血清サンプルを0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、96、144、192、288、336、504時間で採取した。血清レベルの分析は、以下に記載した方法に従って抗myc ELISAにより行った。
【００８２】
抗myc ELISA法：
血清中のAlbudAb濃度を抗myc ELISA法で測定した。簡単に説明すると、ヤギ抗mycポリクローナル抗体(1：500；Abcam社、カタログ番号ab9132)をNunc 96ウェルMaxisorpプレートに一晩コーティングして、5％ BSA/PBS＋1％ Tweenを用いてブロッキングした。血清サンプルを既知濃度の標準と共に希釈範囲で添加した。次に、結合されたmycタグ付きAlbudAbを、ウサギポリクローナル抗Vk(1：1000；社内試薬、血液をプールして使用前にプロテインAで精製した)とその後に抗ウサギIgG HRP抗体(1：10,000; Sigma社、カタログ番号A2074)を用いて検出した。アッセイの各段階の間に3×PBS＋0.1％ Tween20、続いて3×PBSを用いてプレートを洗浄した。最終洗浄後にTMB (SureBlue TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate、KPL社、カタログ番号52-00-00)を添加して発色させた。これを1M HClで停止させてから、そのシグナルを450nmでの吸光度により測定した。
【００８３】
生のELISAデータから、未知サンプルの濃度を標準曲線に対する内挿によって、希釈係数を考慮に入れて確定した。各時点からの平均濃度結果を反復値から求めて、WinNonLin解析パッケージ(例えば、バージョン5.1、Pharsight社(Mountain View, CA94040, 米国)から入手可能)に入力した。ノンコンパートメントモデルを用いてデータをフィットさせ、そこでPKパラメータをそのソフトウェアで概算して終末半減期を得た。投薬情報および時点は、各PKプロファイルの終末相を反映するように選択された。
【表７】
2013537421.tif 000012
【００８４】
ラット、マウスおよびカニクイザルの実験から得られた薬物動態パラメータはノンコンパートメントモデルを用いてフィットさせた。注釈：AUC：投薬時から無限大に外挿される曲線下面積；CL：クリアランス；t1/2：血中濃度が半分になる時間；Vz：終末相に基づいた分布容積。
【実施例６】
【００８５】
AlbudAb(商標) IFN融合体
クローニングおよび発現：
単一AlbudAbと同様に、親和性成熟させたVk AlbudAbをインターフェロンα2b(IFNα2b)に連結して、AlbudAbの有用なPKが融合タンパク質として維持されるかどうかを調べた。
【００８６】
インターフェロンα2bのアミノ酸配列：
2013537421.tif 000013
インターフェロンα2bのヌクレオチド配列：
2013537421.tif 000014
IFNα2bはTVAAPSリンカー領域を介してAlbudAbに連結させた(WO2007085814を参照されたい)。その構築物をSOE-PCR (Horton et al. Gene, 77, p61 (1989)の方法によるシングルオーバーラップエクステンション)によりクローニングした。AlbudAbおよびIFN配列のPCR増幅は、TVAAPSリンカー領域で約15塩基対のオーバーラップをもつプライマーを用いて別々に実施した。用いたプライマーは次のとおりである：
2013537421.tif 000015
これらの断片を別々に精製し、続いてフランキングプライマーのみを用いてSOE(シングルオーバーラップエクステンションPCR伸長)反応でアセンブリした。
【００８７】
2013537421.tif 000016
アセンブリしたPCR産物は制限酵素BamHIおよびHindIIIを用いて消化し、その遺伝子を哺乳動物発現ベクターpDOM50内の対応する部位にライゲートさせた。このベクターは、細胞培地への発現を促進するためのN末端V-J2-CマウスIgG分泌リーダー配列を有するpTT5誘導体である。
【００８８】
リーダー配列(アミノ酸)：
2013537421.tif 000017
リーダー配列(ヌクレオチド)：
2013537421.tif 000018
プラスミドDNAはQIAfilter megaprep (Qiagen社)を用いて調製した。1μg DNA/mlを293-FectinでHEK293E細胞にトランスフェクトし、無血清培地中で増殖させた。タンパク質を5日間の培養で発現させ、プロテインLアフィニティ樹脂を用いて培養上清から精製して、100mMグリシンpH2で溶出した。そのタンパク質を1mg/mlより高濃度に濃縮し、PBSにバッファー交換し、そしてQスピンカラム(Vivascience社)を用いてエンドトキシンを枯渇させた。
【表８】
2013537421.tif 000019
2013537421.tif 000020
2013537421.tif 000021
2013537421.tif 000022
2013537421.tif 000023
2013537421.tif 000024
2013537421.tif 000025
2013537421.tif 000026
2013537421.tif 000027
【００８９】
親和性判別および生物物理学的特性解析：
AlbudAb-IFNα2b融合タンパク質の各血清アルブミンへの結合親和性(KD)を判別するために、精製された融合タンパク質を、HBS-EP BIAcoreバッファー中5000nM〜39nM (5000nM、2500nM、1250nM、625nM、312nM、156nM、78nM、39nM)の融合タンパク質濃度を用いて、アルブミン(一級アミンカップリングによりCM5チップに固定化した；BIAcore社)に対してBIAcoreで解析した。
【表９】
2013537421.tif 000028
【００９０】
IFNα2bをAlbudAb変異体に連結させると、すべての場合に、血清アルブミンに結合するAlbudAbの親和性は減少する。DOM7h-14-10は、親に比べて、種を越えて血清アルブミンに対し改善された結合親和性を保持する。
【表１０】
2013537421.tif 000029
【００９１】
表10に示したすべてのクローンの発現は、HEK293において17.5〜54mg/Lの範囲で観察された。
【００９２】
IFNα2b-DOM7h-14変異体に関しては、有益な生物物理学的パラメータおよび発現レベルが親和性成熟の間ずっと維持された。
【００９３】
AlbudAb-IFNα2b融合体のPK判別
AlbudAb IFNα2b融合体であるDMS7321 (IFNα2b-DOM7h-14)、DMS7322 (IFNα2b-DOM7h-14-10)、DMS7323 (IFNα2b-DOM7h-14-18)、DMS7324 (IFNα2b-DOM7h-14-19)をHEK293細胞において20〜50mg量でmycタグ付きで発現させ、プロテインLアフィニティ樹脂を用いて培養上清から精製して、100mMグリシンpH2で溶出した。タンパク質を1mg/mLより高濃度へと濃縮し、ダルベッコPBSにバッファー交換し、Qスピンカラム(Vivascience社)を使ってエンドトキシンを枯渇させた。
【００９４】
ラットのPKについては、化合物あたり3匹のラットを用いて、IFN-AlbudAbを2.0mg/kgで単回静脈注射として投与した。血清サンプルを0.16、1、4、8、24、48、72、120、168時間で採取した。血清レベルの分析は、EASY ELISAを用いてメーカーの指示に従って行った(GE Healthcare社、カタログ番号RPN5960)。
【００９５】
マウスのPKについては、DMS7322 (IFN2b-DOM7h-14-10) (mycタグ付き)を3匹の被験体の用量群につき2.0mg/kgで単回静脈注射として投与し、血清サンプルを10分; 1h; 8h; 24h; 48h; 72h; 96hで採取した。血清レベルの分析は、EASY ELISAを用いてメーカーの指示に従って行った(GE Healthcare社、カタログ番号RPN5960)。
【表１１】
2013537421.tif 000030
【００９６】
ラットおよびマウスの実験から得られた薬物動態パラメータはノンコンパートメントモデルを用いてフィットさせた。注釈：AUC：投薬時から無限大に外挿される曲線下面積；CL：クリアランス；t1/2：血中濃度が半分になる時間；Vz：終末相に基づいた分布容積。
【００９７】
IFNα2b-AlbudAbをラットとマウスで試験した。t1/2の改善は、血清アルブミンに対するin vitro KDの改善と相関する。IFNα2b-DOM7h-14-10変異体に関しては、血清アルブミンに対するin vitro KDの改善はまた、ラットにおいてt1/2の改善に相関していた。
【００９８】
すべてのIFNα2b-AlbudAb融合タンパク質は、単一AlbudAbに比べて、RSAへの結合が5〜10倍減少する。
【実施例７】
【００９９】
AlbudAbとタンパク質、ペプチドおよびNCEとのさらなる融合体
他の化学物質、すなわちドメイン抗体(dAb)、ペプチドおよびNCEに融合させた各種AlbudAbについて試験した。結果を表12に示す。
【表１２】
2013537421.tif 000031
【０１００】
注釈：DOM1m-21-23は抗TNFR1 dAbであり、エキセンディン-4は39アミノ酸長のペプチド(GLP-1アゴニスト)である。NCE、NCE-GGGGSCおよびNCE-TVAAPSCについては以下で説明する。
【０１０１】
以前に、抗TNFR1 dAbのPK半減期をin vivoで引き延ばすためにアルブミン結合dAb (AlbudAb)との遺伝子融合体を使用することを記載した(例えば、WO04003019、WO2006038027、WO2008149148を参照されたい)。これらのPCT出願に記載されるプロトコルを参照されたい。上記の表において、DOM1m-21-23は抗マウスTNFR1 dAbである。
【０１０２】
エキセンディン-4と血清アルブミンに結合するDOM7h-14(または他のAlbudAb)との遺伝子融合体を作製するために、エキセンディン-4-リンカー- AlbudAb配列をpTT-5ベクター(CNRC社(カナダ)から入手可能)にクローニングした。いずれの場合にも、エキセンディン-4はその構築物の5'末端側にあって、dAbは3'末端側にあった。リンカーは(G4S)3リンカーとした。エンドトキシンフリーのDNAをアルカリ溶菌法(Qiagen CA社から入手可能な、エンドトキシンフリーのプラスミドGigaキットを使用する)により大腸菌で調製し、HEK293E細胞(CNRC社(カナダ)から入手可能)をトランスフェクトするために使用した。フラスコあたり250mlのHEK293E細胞(1.75×106個/ml)に、フラスコあたり333μlの293fectin (Invitrogen社)と250μgのDNAを用いてトランスフェクションを行い、30℃で5日間発現させた。上清を遠心分離によって回収し、プロテインLでのアフィニティ精製によって精製した。タンパク質を樹脂にバッチ結合させ、カラムに充填して、10倍カラム容量のPBSで洗浄した。タンパク質を50mlの0.1MグリシンpH2で溶出し、Tris pH8により中和した。予測されたサイズのタンパク質がSDS-PAGEゲル上に同定された。
【０１０３】
NCE Albudab融合体：
新規化学物質(NCE) AlbudAb融合体について試験した。NCEである小分子ADAMTS-4阻害剤は、AlbudAbへのコンジュゲーションのためにPEGリンカー(PEG 4リンカー(すなわち、マレイミドの前の4個のPEG分子))とマレイミド基をもつように合成した。AlbudAbへのNCEのコンジュゲーションは、アミノ酸位置R108Cの人工的に導入されたシスチン残基を介して、またはAlbudAbの末端に導入された5アミノ酸(GGGGSC)もしくは6アミノ酸(TVAAPSC)スペーサーの後に行った。簡単に説明すると、AlbudAbをTCEP (Pierce社、カタログ番号77720)で還元し、PD10カラム(GE healthcare社)を用いて25mM Bis-Tris、5mM EDTA、10％(v/v)グリセロールpH6.5中に脱塩した。5倍モル過剰のマレイミド活性化NCEを、最終濃度が10％(v/v)を超えないようにDMSOに添加した。この反応を室温で一晩インキュベートし、20mM Tris pH7.4中に十分に透析した。
【０１０４】
PEGリンカー：
【化１】
2013537421.tif 000032
【０１０５】
配列：
DOM7h-14 R108C：
2013537421.tif 000033
【０１０６】
ヌクレオチド：
2013537421.tif 000034
【０１０７】
DOM7h-14-10/TVAAPSCおよびDOM7h-14-10/GGGGSC(すなわち、DOM7h-14-10/G4SC)の配列については表3を参照されたい。
【０１０８】
NCE-AlbudAbのDOM7h-14-10 GGGGSCおよびDOM7h14-10 TVAAPSCは、化学物質に融合させたとき、BIAcoreで測定して、RSAに対するin vitro親和性(KD)が5〜10倍減少する。これらの分子に関するPKデータはまだ得られていない。
【０１０９】
エキセンディン4-AlbudAb融合体：
AlbudAbのペプチドへの融合がRSA結合能に及ぼす効果は、結合が4倍しか減少しないDOM7h-14-10は別として、約10倍である。
【０１１０】
上記のすべてのデータに関して、融合体のt1/2は、動物種のSAに対する親和性の改善とともに増加した。
【０１１１】
一般的に、AlbudAb-治療薬は、AlbudAb-薬物融合体が血清アルブミンへの結合について0.1nM〜10mMの親和性範囲(KD)を示すとき、(疾患、症状もしくは徴候の治療および/または予防に)治療上適していると分類する。
【０１１２】
AlbudAbおよびAlbudAb融合体(タンパク質-AlbudAb、例えばIFNα2b-DOM7h-14-10；ペプチド-AlbudAb、例えばエキセンディン-4-DOM7h-14-10；dAb-AlbudAb、例えばDOM1m21-23-DOM7h11-15；NCE-AlbudAb、例えばADAMTS-4-DOM7h-14-10)の治療範囲は次のように規定する：慢性または急性の疾患、症状もしくは徴候の治療に有用な親和性(KD)範囲が示される。また、「中間」と区分された親和性範囲も示される。この範囲内に入るAlbudAbおよび融合体は、慢性または急性の疾患、症状もしくは徴候に対して有用である。このように、血清アルブミンに対するAlbudAbまたは融合体の親和性は、対処すべき疾患、症状もしくは徴候に応じて調整または選択することができる。上述したように、本発明は、さまざまな親和性をもつAlbudAbを提供し、各AlbudAbを「高度親和性」、「中等度親和性」または「低度親和性」と分類することを可能にするので、当業者は目下の治療に応じて本発明の適切なAlbudAbを選択できるようになる。図2を参照されたい。
【実施例８】
【０１１３】
改良された単一可変ドメイン
DOM7h-14-10の親和性成熟を実施し、様々な種（ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウス）由来の血清アルブミンへの特異的結合に基いて新規変異体を選択した。
【０１１４】
選択：
HSA(ヒト血清アルブミン)およびRSA(ラット血清アルブミン)抗原、ならびにビオチン化産物は実施例1に記載したとおりに入手した。
【０１１５】
親和性成熟ライブラリー：
エラープローン・ライブラリーとドープ・ライブラリーはどちらも、テンプレートとしてDOM7h-14-15親dAb(配列番号2参照)を用いて作製したが、その際、位置108のアルギニンをトリプトファンに変異させて(DOM7h-14-10 R108W)、ファージ選択のためにトリプシンを用いることができるようにした。ライブラリーはpDOM33ベクター内に作製した。
【０１１６】
ドープCDRライブラリーの場合、一次PCR反応は、dAbの必要な位置を多様化するために、偏りのある縮重コドンを含むドープ・オリゴヌクレオチドを用いて実施した。ドープ・ライブラリーの作製は、例えば、BalintおよびLarrick, Gene, 137, 109-118 (1993)に記載される。プライマーは、各縮重コドンから最初の2個のヌクレオチドのみを変化させるように設計して、親ヌクレオチドが85％のケースに存在し、5％のケースに他のすべての可能なヌクレオチドが存在するようにした。CDRあたり6つのコドンが、親ヌクレオチドと異なるように、そのコドンのヌクレオチドあたり15％の確率で同時に変異させるための標的となった。
【０１１７】
次に、アセンブリPCRを用いて、多様化された完全長のインサートを作製した。そのインサートをSal IおよびNot Iで消化し、pDOM33とのライゲーション反応に使用した。その後、ライブラリーのライゲーション産物を用いてエレクトロポレーションにより大腸菌TB1株を形質転換し、形質転換された細胞を、15μg/mlのテトラサイクリンを含む2×TY寒天上にプレートした。
【０１１８】
i)  選択戦略
HSAに対する選択：
HSAに対する選択を2ラウンド実施した。各CDRライブラリーはすべてのラウンドで個別のプールとして選択した。両ラウンドの選択とも濃度10nMのビオチン化HSAに対して溶液中で行った。ライブラリーを0.1MグリシンpH2.0で溶出し、その後1M Tris pH8.0で中和してから、対数期TG1細胞に感染させた。第2ラウンドの各選択物をスクリーニングのためにpDOM5にサブクローニングした。
【０１１９】
クロスオーバー選択：
溶液中のビオチン化SAに対する選択を2ラウンド実施した。2ラウンドの選択は、トリプシン処理と共に、または処理なしで、HSA (10nM、1nM)およびRSA (25nM、10nM、1nM)を種々の順序で用いて行った。各CDRライブラリーはすべてのラウンドで個別のプールとして選択した。ライブラリーを0.1MグリシンpH2.0で溶出し、その後1M Tris pH8.0で中和してから、対数期TG1細胞に感染させた。第2ラウンドの各選択物をスクリーニングのためにpDOM5にサブクローニングした。
【０１２０】
ii)  スクリーニング戦略および親和性判別
それぞれの場合に選択後、適切なラウンドの選択から得られたファージDNAのプールをQIAfilter midiprepキット(Qiagen社)により調製し、そのDNAを制限酵素Sal1およびNot1で消化し、そして濃縮されたV遺伝子を、mycタグ付きdAbを発現する可溶性発現ベクターpDOM5の対応する部位にライゲートする(PCT/EP2008/067789を参照されたい)。ライゲートされたDNAを用いて、ケミカルコンピテント大腸菌HB 2151細胞を形質転換し、その後抗生物質カルベニシリンを含む寒天プレート上で一晩増殖させる。得られたコロニーを抗原結合について個別に評価する。各選択出力につき、93のクローンをHSAおよびRSAへの結合についてBIAcore(商標)(表面プラズモン共鳴)で試験した。可溶性dAbフラグメントは96ウェルプレートでONEX培養培地(Novagen社)中の細菌培養により37℃で一晩産生させた。可溶性dAbを含む培養上清を遠心分離して、高密度HSAおよびRSA CM5チップへの結合についてBIAcoreで分析した。オフ速度スクリーニングでこれら両方の動物種の血清アルブミンに親クローンと同等にまたはそれ以上に結合することが判明したクローンについて、その配列を決定し、ユニークなdAb配列を明らかにした。
【０１２１】
親配列に対する配列相同性を下記の表13に示す。
【表１３】
2013537421.tif 000035
【０１２２】
ユニークなdAbは、0.5L振とうフラスコ内でOnex培地にて30℃、250rpmで48時間にわたり細菌上清として発現させた。dAbを培養培地からプロテインLストリームラインへの吸着とその後の100mMグリシンpH2.0での溶出によって精製した。ヒト、ラット、マウスおよびカニクイザル血清アルブミンへのAlbudAbの結合親和性(KD)を調べるために、精製dAbを500nM〜3.9nMのアルブミン濃度範囲(500nM、250nM、125nM、31.25nM、15.625nM、7.8125nM、3.90625nM)にわたってBIAcoreで分析した。
【０１２３】
MSA抗原はSigma社から入手し(本質的に脂肪酸不含、約99％(アガロースゲル電気泳動)、凍結乾燥粉末、カタログ番号A3559)、CSAはprometic blue樹脂(Amersham社)を用いてカニクイザル血清アルブミンから精製した。
【０１２４】
試験したすべての血清アルブミン種に対する主要なクローンの親和性を表14に示す。
【０１２５】
iii)  発現および生物物理学的特性解析
細菌発現、ならびにSECMALLSおよびDSCによる解析は、先に実施例4で記載したように実施した。
【０１２６】
T/DおよびD/Mは、SEC-MALLSで検出した、三量体と二量体、または二量体と単量体の平衡をそれぞれ示す。
【表１４】
2013537421.tif 000036
【０１２７】
DOM7h-14-100は、試験した種において一桁のnM KDを有していた。DOM7h-14-100はまた、有利なことに溶液中で単量体である。
【０１２８】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列を以下に列挙する。ほとんどのクローンで位置108のアルギニンがトリプトファンに変異している。これは必要に応じてトリプシンによる選択を可能とするために行われたものであり(トリプシン認識部位のノックアウト)、この変異は血清アルブミンへのAlbudAb結合に重要なものではなかった。
【０１２９】
他のクローン(DOM7h-14-119、DOM7h-14-120、DOM7h-14-121、DOM7h-14-122、DOM7h-14-123)が誘導されたが、これらは位置108がアルギニンへの復帰変異(W108R)を起こしており、また、場合により、位置106がイソロイシンへの復帰変異を起こしていた。これらのクローンの配列を以下に記載する。
【０１３０】
配列アライメントは図3に示す。
【表１５】
2013537421.tif 000037
2013537421.tif 000038
【表１６】
2013537421.tif 000039
2013537421.tif 000040
2013537421.tif 000041
【０１３１】
2013537421.tif 000042
2013537421.tif 000043
【図１Ａ】
2013537421.tif 000044
【図１Ｂ】
2013537421.tif 000045
【図２Ａ】
2013537421.tif 000046
【図２Ｂ】
2013537421.tif 000047
【図２Ｃ】
2013537421.tif 000048
【図２Ｄ】
2013537421.tif 000049
【図３−１】
2013537421.tif 000050
【図３−２】
2013537421.tif 000051
【図３−３】
2013537421.tif 000052
【図３−４】
2013537421.tif 000053
【図３−５】
2013537421.tif 000054
【図３−６】
2013537421.tif 000055
【配列表】
2013537421000001.app
【国際調査報告】
2013537421.tif 000056
2013537421.tif 000057
2013537421.tif 000058
2013537421.tif 000059
2013537421.tif 000060
2013537421.tif 000061
2013537421.tif 000062