(57)【要約】  本発明は、ａ）単離された血小板を含む血小板含有液体と、塩化カルシウムを含み、トロンビンを加えた、または加えない活性化剤と、から形成されたゲル足場と、ｂ）ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、レチノイン酸、およびこれらの組み合わせより選ばれる神経成長因子と、ｃ）少なくとも５万の前駆幹細胞の培養物と、の構成要素を含む、神経組織の再生のための、生体適合性で生分解性の移植片組成物と、その製造および使用法を提示する。
2013511314.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．単離した血小板を含む血小板含有液体と、塩化カルシウムを含み、トロンビンを加えた、または加えない活性化剤と、から形成したゲル足場と、
ｂ．ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、レチノイン酸、およびこれらの組み合わせより選ばれる神経成長因子と、
ｃ．少なくとも５万の前駆幹細胞の培養物と、
の構成要素を含むことを特徴とする、神経組織の再生のための、生体適合性で生分解性の移植片組成物。
【請求項２】
前記活性化剤は、その場で（in situ）前記ゲル足場を生成するため、前記血小板含有液体とは別個の形で供給できることを特徴とする、請求項１に記載の生体適合性で生分解性の移植片組成物。
【請求項３】
前記血小板含有液体は、多血小板血漿と乏血小板血漿とから選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の生体適合性で生分解性の移植片組成物。
【請求項４】
前記血小板含有液体は乏血小板血漿であることを特徴とする、請求項３に記載の生体適合性で生分解性の移植片組成物。
【請求項５】
外から加えられた血小板細胞因子を更に含むことを特徴とする、請求項４に記載の生体適合性で生分解性の移植片組成物。
【請求項６】
ａ）は、多血小板血漿液体と、２５〜５０μｍｏｌ／ｌの範囲の量の塩化カルシウムとから形成したゲル足場であることを特徴とする、請求項３に記載の生体適合性で生分解性の移植片組成物。
【請求項７】
ａ）は、０．０１〜５ＵＩ／ｍｌの範囲の量のトロンビンを更に含んでいることを特徴とする、請求項６に記載の生体適合性で生分解性の移植片組成物。
【請求項８】
ｂ）は、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、およびレチノイン酸の組み合わせであることを特徴とする、請求項６および請求項７のいずれか１項に記載の生体適合性で生分解性の移植片組成物。
【請求項９】
ＢＤＮＦは、５０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲の量であり、ＮＧＦは、５０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲の量であり、レチノイン酸は、０．５〜２μｇ／ｍｌの範囲の量であることを特徴とする、請求項８に記載の生体適合性で生分解性の移植片組成物。
【請求項１０】
請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の組成物を、それを必要とする対象に移植する工程を含むことを特徴とする、中枢神経系中の損傷の治療法。
【請求項１１】
前記活性化剤は、その場で（in situ）前記血小板含有液体に加えて前記ゲル足場を形成することを特徴とする、請求項１０に記載の治療法。
【請求項１２】
移植片とすることを特徴とする、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の組成物の使用法。
【請求項１３】
ＣＮＳ中の損傷を治療するための医薬組成物の製造であることを特徴とする、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の組成物の使用法。
【請求項１４】
ｉ．血小板を含む血小板含有液体を単離する工程と、
ｉｉ．前駆幹細胞を単離してex vivoで増殖（expansion）する工程と、
ｉｉｉ．ｉｉ）で得られた前駆幹細胞を、ｉ）で得られた血小板含有液体と、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、レチノイン酸、およびこれらの組み合わせより選ばれる少なくとも１つの成長因子と組み合わせる工程と、
ｉｖ．塩化カルシウムを含み、トロンビンを加えた、または加えない活性化剤を、ｉｉｉ）で得られた組み合わせに加える工程と、
ｖ．ｉｖ）で得られた混合物をゲル化する工程と、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）内の神経組織再生の分野に関する。特に、本発明は、神経組織の再生のための、生体適合性で生分解性のゲル移植片組成物と、その製造および使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
損傷後の中枢神経系（ＣＮＳ）の再生は、ミエリンとニューロンの修復を妨げる細胞外環境からの阻害的によって制限される。しばしば、脊髄または脳組織の損傷後、ネイティブ細胞が失われて空洞が生じる。この空洞は細胞外基質（ＥＣＭ）の隙間であり、一般にグリア性瘢痕によって組織と隔てられている。グリア性瘢痕は、当初、損傷後のＣＮＳ内の再生を妨げると考えられていた（Windleら, J Comp Neurol. 1950; 93:241-258）。最近になって、多くの様々な実験モデルで、ＣＮＳ軸索には少なくとも幾分かの再生能力があり、損傷部位の中で、また短い距離ならば成長することが研究者によって示された（Liu, CN. El Al., Arch. Neurol. Psychiat. 1958;79:46-61、Guthら, Exp Neurol. 1985;88:1-12、Freundら, Nat Med. 2006;12:790-792、Goshgarianら, J Appl Physiol. 2003;94:795-810、Li, Y.ら, J Neurosci. 1994;14:4050-4063、Taylorら, J Neurosci. 2006;26:9713-9721）。つまり、損傷のその部位だけなら、新たに形成された成長円錐が成長する。しかし、これらは損傷部位の側から離れることなく、自力で長い距離の再生は行えずに、すぐに栄養失調に陥ると思われる（Li, Y.ら, Exp Neurol. 1995;134:102-111、Misgeld, T.ら, Nat Rev Neurosci. 2006;7:449-463、Misgeld, T.ら, Nat Protoc. 2007;2:263-268)。
【０００３】
そこで、細胞療法による神経再生の戦略が立てられた。ヒトの神経疾病の移植治療のための候補として、造血幹細胞（Ａ．Ｋ．Ａ間葉幹細胞）、マクロファージ、樹状細胞、嗅覚鞘細胞（olfactory ensheathing cells）、シュヴァン細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞（ＮＳＣ）、および神経前駆細胞（ＮＰＣ）が提案された（Kawasakiら, Neuron. 2000. 28:31-40.1）。しかしこれらの細胞は、その採取と使用に関して倫理的、組織病理学的な課題に直面している。一方、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）は、ＥＣＭの特定の組成と因子に応じて、骨芽細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、またはニューロンに分化する能力を持つ（Engle AJ.ら, 2006. Cell 126(4): 677-689）。脳組織の細胞は、栄養因子（ＴＦ）とグリア細胞株由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ）で誘導した後に、ＢＭＳＣから特異的に発生させることができる。この誘導ＢＭＳＣは神経再生が可能と考えられる。自己由来ＢＭＳＣは更に、拒絶反応に関わる合併症も防ぐ（Dezawaら, J. Clin. Invest. 2004. 113(12): 1701-1710）。実際、単離してex vivoで増殖させた自己幹細胞は、ＣＮＳ内に加えた後に宿主組織に融合し、局所的なキュー（cues）に応じて分化することが分かっている。にもかかわらず、移植した細胞は新たな組織を作ることができず、細胞とＥＣＭとの不適切な相互作用に応じてアポトーシスに陥る。これはアノイキスとして知られ、別の種類のアポトーシスを開始する信号とは異なる信号によって開始される細胞死の種類であり、移植後に細胞数が臨界質量以下に減少してしまう（Modoら, Stroke 2002;33(9):2270-8、Okada, S.ら, FASEB J 2005;19:1839-41)。この見地から、培地および生物的マトリックスに栄養因子を加えると、アポトーシス性傷害から細胞を守ることができ（Koda M.ら, Neurosci Lett 2008;444:143-7、Jost, M.ら, Mol Biol Cell 2001;12:1519-27)、細胞分化の誘導に役立つ（Silva GA.ら, Science 2004;303:1352-5）ことが、多くの著者によって示された。しかし、栄養因子は、ＥＣＭ誘導物（guidance）の欠如の問題を解決しなかった。
【０００４】
移植した細胞のためのＥＣＭの支持体および誘導物の欠如の問題の解決法として、埋め込み可能な足場が考えられる。ＣＮＳの神経再生での有用性に関し、マトリゲル、コラーゲン、アルギン酸ヒドロゲル、フィブリン、およびポリ−α−ヒドロキシ酸に基づく細胞足場組成物が試験された。コラーゲンはＥＣＭの主成分のひとつであり、脊髄損傷（ＳＣＩ）のいくつかのモデルにおいて軸索再生を誘発できるようであることから、広く用いられている足場のひとつである（Liuら, Neurosurgery 2001;49:143-50、Goldsmithら, Neurol Res 2005;27:115-23)。しかし、コラーゲンは移植組織を密閉および隔離して宿主組織と相互作用できなくする応答を引き起こす。軸索伸長を促す能力を持つ他の足場は、アルギン酸ヒドロゲル（Kataokaら,J Biomed Mater Res 2001;54:373-84、Suzukiら, Neurosci Lett 2002;318:121-4)、ポリ−α−ヒドロキシ酸（Blacherら, Biomaterials 2003;24:1033-40、Patistら, Biomaterials 2004;25:1569-82)、合成ヒドロゲル類（Bakshiら, J Neurosurg Spine 2004;1:322-9)、またはポリエチレングリコール（Shi R J Neurotrauma 1999;16:727-3823）である。マトリゲルは、Engelbreth Holm Swarm肉腫由来の、ラミニン、フィブロンネクチン、およびプロテオグリカン類を含むＥＣＭである。様々な研究が、in vitroでの神経細胞の増殖を誘発し、様々なＳＣＩモデルにおいて軸索再生を誘発する、その有用性を示した（Novikova LN.ら, J Biomed Mater Res A 2006;77:242-52、Xiao M., Exp Neurol 2005;194:12-30、Facchiano Fら, J Neurosurg 2002; 97:161-8)。ＥＣＭ糖タンパク質であるフィブロネクチンもＣＮＳ再生の細胞足場としての使用に適していた（Ahmed Z, Tissue Eng 2003;9:219-31)。ＮＳＣを含んでいるポリグリコール酸（ＰＧＡ）系足場は、ドナーと移植細胞との相互干渉を強めることが分かった（Parkら, Nature Biotechnology 2002; 20(11):1111-7)。この方法の一歩進んだものでは、プラズマ重合アリルアミン（ｐｐＡＡｍ）処理ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）粒子を、ＮＳＣと共に播種し、損傷した脳の病変空洞に注入すると、初期の‘新脳'組織が生じて、宿主の脳組織と良好に融合した（Bibleら, 2009 Biomaterials 30:2985-2994)。しかし、ＰＬＧＡ粒子の分解生成物と長期に亘って存在する外部由来の材料は、細胞の生理機能に予想不可能な悪影響を及ぼすと考えられる。
【０００５】
フィブリノゲンとトロンビンから調製したフィブリンゲル（ＦＧ）は、もうひとつの良好な生体適合性足場である。細胞外マトリックスの成分とは異なり、ＦＧは、改良した重縮合反応によりフィブリノゲンからすぐに組み立てられる（Janmeyら, 1982. Biopolymers 21, 2253-2264)。これにより生理学的条件下でのゲル化時間とゲルの形態を制御することができる。近年、フィブリンの生化学的および機械的性質は多くの研究で利用されており、これらの研究は、医薬および生体工学におけるフィブリンの潜在的用途を示唆している。様々な著者が、組織再生におけるフィブリンの有用性を実証しており（Falangaら, Tissue Eng 2007;13:1299-1312）、時には、フィブリンを、成長因子（ａＦＧＦ、ＮＴ−３）と共に、あるいは他のマトリックスと組み合わせて使用する（Taylor SJら, J Control Release 2004;98:281-9431、Gille Jら, Tissue Cell 2005;37:339-4832）。ＦＧは生物的封止剤として外科的処置に用いられ、細胞の接着と成長を刺激する多孔性の足場と考えられている（Le Guehennec L, Eur Cell Mater 2004;8:1-10)。
【０００６】
多血小板血漿（ＰＲＰ）は、より高性能で先進的な埋め込み用材料であり、フィブリンも含んでいる。その主な利点は、ＰＲＰ足場が自己由来材料から製造されるため毒性や免疫応答が無いことである。ＰＲＰは、整形外科で（Wakitani S.ら, J Bone Joint Surg Br 1989;71:74-80）、また顎顔面外科手術で最もよく使われる自己由来足場であり、皮膚潰瘍の治療に、またマウスの植皮片として有益な効果を示している（Matrasら, Osterr Z Stomatol 1970;67:338-59）。更に、虚血または正常組織内の組織かん流を向上するための新血管形成の誘発にも用いられている（ＵＳ２００９０５３２０８）。しかし、現時点で、神経系疾患の分野におけるＰＲＰ足場の応用に関する研究はない。
【０００７】
組織の再生において足場が有用であるためには、支持される細胞が、意図されている組織の表現型を獲得できなければならない。これに関して、多くの文献データは、ＦＧおよびＰＲＰの足場上で培養したｈＢＭＳＣが硬骨または軟骨に分化できることを示している（３２、６３）。更に、様々なin vitro研究は、ＦＧ足場上でも（Willerthら,“Optimization of fibrin scaffolds for differenciation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials 2006; 27:5990-6003.）、神経ＢＭＳＣ分化転換が可能であることを支持しているが（６４〜６６）、現在、このプロセスがＰＲＰ足場上で起こり得るかは未知である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開２００９／０５３２０８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Windleら, J Comp Neurol. 1950; 93:241-258
【非特許文献２】Liu, CN. El Al., Arch. Neurol. Psychiat. 1958;79:46-61
【非特許文献３】Guthら, Exp Neurol. 1985;88:1-12
【非特許文献４】Freundら, Nat Med. 2006;12:790-792
【非特許文献５】Goshgarianら, J Appl Physiol. 2003;94:795-810
【非特許文献６】Li, Y.ら, J Neurosci. 1994;14:4050-4063
【非特許文献７】Taylorら, J Neurosci. 2006;26:9713-9721
【非特許文献８】Li, Y.ら, Exp Neurol. 1995;134:102-111
【非特許文献９】Misgeld, T.ら, Nat Rev Neurosci. 2006;7:449-463
【非特許文献１０】Misgeld, T.ら, Nat Protoc. 2007;2:263-268
【非特許文献１１】Kawasakiら, Neuron. 2000. 28:31-40.1
【非特許文献１２】Engle AJ.ら, 2006. Cell 126(4): 677-689
【非特許文献１３】Dezawaら, J. Clin. Invest. 2004. 113(12): 1701-1710
【非特許文献１４】Modoら, Stroke 2002;33(9):2270-8
【非特許文献１５】Okada, S.ら, FASEB J 2005;19:1839-41
【非特許文献１６】Koda M.ら, Neurosci Lett 2008;444:143-7
【非特許文献１７】Jost, M.ら, Mol Biol Cell 2001;12:1519-27
【非特許文献１８】Silva GA.ら, Science 2004;303:1352-5
【非特許文献１９】Liuら, Neurosurgery 2001;49:143-50
【非特許文献２０】Goldsmithら, Neurol Res 2005;27:115-23
【非特許文献２１】Kataokaら,J Biomed Mater Res 2001;54:373-84
【非特許文献２２】Suzukiら, Neurosci Lett 2002;318:121-4
【非特許文献２３】Blacherら, Biomaterials 2003;24:1033-40
【非特許文献２４】Patistら, Biomaterials 2004;25:1569-82
【非特許文献２５】Bakshiら, J Neurosurg Spine 2004;1:322-9
【非特許文献２６】Shi R J Neurotrauma 1999;16:727-3823
【非特許文献２７】Novikova LN.ら, J Biomed Mater Res A 2006;77:242-52
【非特許文献２８】Xiao M., Exp Neurol 2005;194:12-30
【非特許文献２９】Facchiano Fら, J Neurosurg 2002; 97:161-8
【非特許文献３０】Ahmed Z, Tissue Eng 2003;9:219-31
【非特許文献３１】Parkら, Nature Biotechnology 2002; 20(11):1111-7
【非特許文献３２】Bibleら, 2009 Biomaterials 30:2985-2994
【非特許文献３３】Janmeyら, 1982. Biopolymers 21, 2253-2264
【非特許文献３４】Falangaら, Tissue Eng 2007;13:1299-1312
【非特許文献３５】Taylor SJら, J Control Release 2004;98:281-9431
【非特許文献３６】Gille Jら, Tissue Cell 2005;37:339-4832
【非特許文献３７】Le Guehennec L, Eur Cell Mater 2004;8:1-10
【非特許文献３８】Wakitani S.ら, J Bone Joint Surg Br 1989;71:74-80
【非特許文献３９】Matrasら, Osterr Z Stomatol 1970;67:338-59
【非特許文献４０】Willerthら,“Optimization of fibrin scaffolds for differenciation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials 2006; 27:5990-6003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
要約すると、脊髄および脳の損傷修復における細胞治療のために現在用いられている材料および方法は完全に満足できるものではない。細胞の増殖、移動、および健康な神経細胞への分化を十分に促進できる組成物はまだない。この分野では、ＣＮＳ再生のための効果的なツールの開発が求められている。
【００１１】
この要求に応えるための試みにおいて、本出願の発明者らは長い実験的研究の末、新たに形成された神経組織の既存構造体への融合を促す、神経再生を誘導および支持することのできる、新たな生分解性で生体適合性の移植片組成物を開発した。
【００１２】
この新たな組成物は、成形が容易で、損傷した組織への適合が確実であり、また外傷後の空洞を埋めるため、脳または脊髄の修復に使用すると有益であることが分かった。幹細胞をこのＰＲＰ足場上に播種し、ＢＤＮＦ、ＮＦＧ、レチノイン酸などの成長因子で刺激すると神経表現型を獲得できることが初めて示された。つまり、幹細胞はこの生物的マトリックスに付着して間葉細胞の形を取り、高い生存率を示すことができる。
【００１３】
本発明の著者らは、幹細胞を脊髄損傷や中枢神経系の他の外傷性傷害に適用させた臨床試験計画で用いる場合、ＰＲＰ足場が幹細胞の支持体として理想的なマトリックスと考えられることを示すことができた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
まず、本発明は、ａ）単離した血小板を含む血小板含有液体と、塩化カルシウムを含み、トロンビンを加えた、または加えない活性化剤と、から形成したゲル足場と、ｂ）ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、レチノイン酸、およびこれらの組み合わせより選ばれる神経成長因子と、ｃ）少なくとも５万の前駆幹細胞の培養物と、を含む、神経組織の再生のための、生体適合性で生分解性の移植片組成物に関する。
【００１５】
更に、本発明の目的は、本発明の組成物をそれを必要とする対象に移植する工程を含む、中枢神経系の損傷の治療法である。
【００１６】
最後に、本発明の目的は、ｉ）血小板を含む血小板含有液体を単離する工程と、ｉｉ）前駆幹細胞を単離してex vivoで増殖する工程と、ｉｉｉ）ｉｉ）で得られた前駆幹細胞を、ｉ）で得られた血小板含有液体と、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、レチノイン酸、およびこれらの組み合わせより選ばれる少なくとも１つの成長因子と組み合わせる工程と、ｉｖ）塩化カルシウムを含み、トロンビンを加えた、または加えない活性化剤を、ｉｉｉ）で得られた組み合わせに加える工程と、ｖ）ｉｖ）で得られた混合物をゲル化する工程と、を含む、本発明の組成物の製造法である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】＜ＦＧ足場＞Ａ：本研究で使用する足場の調製。Ｂ：１００／５０ＦＧ足場（上）と２０／１００ＦＧ足場（下）の顕微鏡写真。いずれの足場も強いコンシステンシー（堅さ：consistency）を示す。Ｃ：１０／４ＦＧ足場の顕微鏡写真。１０／４および５／２ＧＦ足場は同様に中程度のコンシステンシーを示す。Ｄ：環境走査型電子顕微鏡で分析した２０／１００ＦＧ足場の表面。タンパク質の網目に付着したフィブリンのフィブリル構造と線維芽細胞様形態を持ついくつかのｈＢＭＳＣ（矢印）が見られる。Ｅ：１０／４ＦＧ足場上に播種したｈＢＭＳＣの様子。培養７日後、ｈＢＭＳＣは球形の形態を示す。Ｆ：２０／１００ＦＧ足場上に播種したｈＢＭＳＣの様子。丸い形の細胞が見られる（Ｈ＆Ｅ法）。Ｇ：典型的な線維芽細胞の態様を示す、２０／１００ＦＧ足場中の膨張したｈＢＭＳＣを示す画像（Ｈ＆Ｅ法）。Ｈ：１００／５００ＦＧ足場上に播種したｈＢＭＳＣ。フィブリンの網目に捕らえられた丸い細胞が見られる（Ｈ＆Ｅ法）。ＩおよびＪ：１００／５００ＦＧ足場上のアポトーシスｈＢＭＳＣ。典型的なクロマチン凝縮（Ｉ）と細胞質泡（cytoplasmic bubbles）（Ｊ）が見られる（Ｈ＆Ｅ法）。
【図２】＜ＰＲＰ足場＞Ａ：トロンビンを加えていないＰＲＰ足場。中程度のコンシステンシー。Ｂ：塩化カルシウムと４ＩＵのトロンビンとを加えたＰＲＰ足場。このＰＲＰ足場と、２ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場は、中程度のコンシステンシーを示した。Ｃ：塩化カルシウムと１００ＩＵのトロンビンとを加えたＰＲＰ足場。取り扱い易いゲルのコンシステンシーである。Ｄ：固体であるが、多孔性のコンシステンシーを示す、塩化カルシウムと５００ＩＵのトロンビンとを加えたＰＲＰ足場。ＥからＨ：環境走査型電子顕微鏡で観察したＰＲＰ足場の表面。Ｅ：塩化カルシウムのみ（０ＩＵのトロンビン）を加えたＰＲＰ足場。フィブリンの緩くて多孔性の網目のある粗い表面。ｈＢＭＳＣと血小板で完全に覆われている。Ｆ：２ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場。表面は滑らかであるがｈＢＭＳＣは良く結合している。Ｇ：１００ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場。Ｈ：５００ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場。両種類のＰＲＰ足場で、フィブリンの緩い網目があるが、多くの血小板と付着したｈＢＭＳＣのため表面は非常に粗い。ＩからＬ：倒立顕微鏡で観察した、我々のＰＲＰ足場上に播種したｈＢＭＳＣの様子。細胞は線維芽細胞の形状を示した。Ｉ：塩化カルシウムのみを加えたＰＲＰ足場。Ｊ：２０ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場。Ｋ：１００ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場。Ｌ：５００ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場。ＭからＰ：線維芽細胞の形態を示している、我々の様々なＰＲＰ足場上で培養したｈＢＭＳＣ。Ｍ：２０ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場。Ｏ：１００ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場。Ｐ：５００ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場。
【図３】＜ＦＧおよびＰＲＰ足場上でのｈＢＭＳＣの増殖能の測定＞Ａ：２０／１００ＦＧ足場上でＫｉ−６７陽性を示しているｈＢＭＳＣ。細胞は球状の形態を示しているが、増殖活性が見られる。挿入図（ａ）において、二重免疫染色は、ＣＤ７３陽性細胞（緑色）とＫｉ−６７発現（赤色）を示している。Ｂ：１００ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場上に支持したＫｉ−６７陽性ｈＢＭＳＣ。Ｋｉ−６７陽性を示す多数の細胞が見られる。矢印は有糸分裂中の細胞を示している。＜細胞死率の測定＞Ｃ：ＴＵＮＥＬ陽性（緑色）を示している、２０／１００ＦＧ足場上のｈＢＭＳＣ。Ｄ：１００ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場上のｈＢＭＳＣ。孤立した細胞（矢印）だけがＴＵＮＥＬ陽性を示している。
【図４】＜培養したｈＢＭＳＣのＲＴ−ＰＣＲ分析＞Ａ：ＦＧ足場上に播種したｈＢＭＳＣ中のニューロンおよび星状膠遺伝子発現。ＮＧＦを加えた２０／１００ＦＧ足場は、ネスティン発現はするが、β−ＩＩＩ−チューブリン（ニューロン）またはＧＦＡＰ（星状膠）遺伝子発現はしない。ＢＤＮＦを加えた１０／４足場は、ネスティンおよびβ −ＩＩＩ−チューブリン発現はするが、ＧＦＡＰ発現はしない。ＢＤＮＦを加えた２０／１００ＦＧ足場は、ネスティン、β−ＩＩＩ−チューブリン、およびＧＦＡＰ発現をする。（ａ）：ＢＤＮＦを加えた２０／１００足場上に播種したｈＢＭＳＣ（Ｈ＆Ｅ法）。（ｂ）：ＢＤＮＦを加えた２０／１００足場上に播種したｈＢＭＳＣ。免疫染色は強いネスティン陽性を示す。Ｂ：ＰＲＰ足場上に播種したｈＢＭＳＣ中のニューロンおよび星状膠遺伝子発現。これらの足場では、ネスティン、β−ＩＩＩ−チューブリン、およびＧＦＡＰが常に発現した。（ｃ）：ニューロン形態を示している、１００ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場上に播種したｈＢＭＳＣ（位相差顕微鏡法）。（ｄ）：ＰＲＰ上のｈＢＭＳＣ。
【図５】Ａ：脳損傷部位（＊）へのゲル移植片の配置。Ｂ：脳損傷上に置かれたゲル移植片。Ｃ：移植した細胞の１週間後の様子（ビスベンズアミド標識試験法）。Ｄ：ビスベンズアミドで標識した間質細胞（細胞核は緑色で示されている)と、脳損傷上のゲル足場内に閉じ込められた７日後の生存細胞の様子。免疫蛍光は、これらの細胞の神経分化を示しており（矢印）、これは、細胞質伸長（cytoplasmic extensions）の形成とネスティン発現（赤色）から分かる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ＣＮＳ損傷における神経組織再生のための、効果的な最新ツールが求められている。
【００１９】
本発明において、本発明の著者らは、ＣＮＳ再生のための有効なツールとして使用される、幹細胞の増殖、移動、および健康な神経細胞への分化を十分に促すことのできる移植片組成物を提示するものであり、この組成物は、神経再生を誘導および支持し、新たに形成された組織の既存構造体への融合を促す、生分解性で生体適合性の移植足場の形をしている。
【００２０】
主な実施の形態において、本発明は、ａ）単離した血小板を含む血小板含有液体と、塩化カルシウムを含み、トロンビンを加えた、または加えない活性化剤と、から形成したゲル足場と、ｂ）ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、レチノイン酸、およびこれらの組み合わせより選ばれる神経成長因子と、ｃ）少なくとも５万の前駆幹細胞の培養物と、の構成要素を含んでいる、神経組織の再生のための、生体適合性で生分解性のゲル移植片組成物（以後、‘本発明の組成物’と呼ぶ)に関する。
【００２１】
本発明の文脈において、以下の用語は次のように理解すべきである。
【００２２】
移植片：典型的に、交換、矯正、または別の方法で欠陥を克服するため、個体中に埋め込み可能な要素であり、足場と単離細胞とを含み、足場が細胞の付着と増殖に適した表面となっている。“埋め込み可能な”とは、これが身体組織に接合することを意味している。
【００２３】
生体適合性：無毒で、有害でなく、拒絶反応を起こさないことで、生体組織または生体系との適合性を示す配合物を指す。
【００２４】
生分解性：無害な生成物に分解し、身体に徐々に吸収および／または排出される物質を指す。
【００２５】
生物活性：生体、その部分、臓器、細胞、またはその代謝に影響を与える配合物を指す。
【００２６】
本発明の組成物中で用いられる、単離した前駆幹細胞の培養物は、単離した自己または異種前駆幹細胞から得ることができる。
【００２７】
更に、本発明の目的のため、用語“血小板を含む液体（血小板含有液体）”は、血小板成長因子のキャリアとして働く、少量の血漿中に懸濁させたある濃度の（a concentration of）血小板である。血小板成長因子は、血小板から盛んに分泌されるもので、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来上皮増殖因子（ＰＤＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、および血小板由来血管新生成長因子（ＰＤＡＦ）などである。
【００２８】
血小板含有液体は自己でも非自己でも良い。望ましい実施の形態において、血小板含有液体は自己である。自己血小板ゲルは、自己血小板含有液体と自己または非自己の活性化剤とから作られた組成物を指す。組成物に自己成分を使用する主な利点は、炎症反応や、感染性で異質な試剤に曝露する患者のリスクが少ないことである。
【００２９】
望ましい実施の形態において、血小板含有液体は多血小板血漿（ＰＲＰ）または乏血小板血漿（ＰＰＰ）から選ぶ。ＰＲＰ中の血小板濃度は９５％であり、ＰＰＰ中のその割合は５％以下である。
【００３０】
ある特定の実施の形態で乏血小板血漿（ＰＰＰ）を用いる場合、移植片組成物は、外から加えられた血小板細胞因子を更に含んでいる。この血小板細胞は自己でも異種でも良い。
【００３１】
トロンビンを加えて、または加えずに、血小板含有液体と塩化カルシウムとを反応させるとゲルが生成した。足場をゲル化する前に、ex vivoで細胞と活性化剤を混合しても良い。こうすると、組織内に移植する前に、細胞はゲル内に閉じ込められる。
【００３２】
しかし、ある特定の実施の形態では、損傷部位でゲル足場を形成するため、活性化剤を、その場で（in situ）血小板含有液体に加えられるよう別個の形で供給することができる。
【００３３】
望ましい実施の形態では、多血小板血漿液体と２５〜５０μｍｏｌ／ｌの範囲の量の塩化カルシウムとからゲル足場を形成する。必要に応じて、この組成物に、０．０１〜５ＵＩ／ｍｌの範囲の量のトロンビンを更に加えることができる。
【００３４】
より望ましくは、組成物に用いられる成長因子は、ＢＤＮＦとＮＧＦとレチノイン酸との組み合わせである。より望ましい実施の形態において、生体適合性で生分解性の移植片組成物は、５０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲の量のＢＤＮＦと、５０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲の量のＮＧＦと、０．５〜２μｇ／ｍｌの範囲の量のレチノイン酸とを含んでいる。
【００３５】
別の主な実施の形態において、本発明は、本発明の組成物を、それを必要としている対象の中枢神経系組織内の損傷部位に投与する工程を含む、ＣＮＳ中の損傷の治療法を意図している。
【００３６】
ある特定の実施の形態では、活性化剤（成分Ｂ）を、血小板含有液体と神経成長因子と細胞とを含む組成物（成分Ａ）とは別に損傷部位に加えて、ゲル足場を‘その場（in situ）’で形成することができる。損傷部位でゲルを形成するため、活性化剤（成分Ｂ）は、細胞と神経成長因子を含んでいる血小板含有液体（成分Ａ）と同時に配置しなければならない。この２つの成分を均一に混合するため、本発明では、二重注射器注入法（double syringe injection technique）を用いることが望ましい。
【００３７】
別の実施の形態において、本発明は、ＣＮＳ中の損傷を治療するための医薬組成物の製造における本発明の組成物の使用に関するものである。
【００３８】
医薬組成物の成分は一緒に投与して良く、あるいは、活性化剤を他の成分とは別個の形で投与しても良い。
【００３９】
医薬組成物には、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を加えても良い。文中で用いられているように、薬学的に許容される賦形剤とは、本発明の細胞および他の薬剤の生物活性の有効性を妨げない無毒の材料を意味する。
【００４０】
別の実施の形態において、本発明は、ＣＮＳの損傷を治療するための移植片としての、本発明の組成物の使用に関するものである。
【００４１】
別の実施の形態において、本発明は、本発明の組成物の製造法に関するものであり、この方法は、
ｉ）血小板含有液体を単離する工程と、
ｉｉ）前駆幹細胞を単離してex vivoで増殖する工程と、
ｉｉｉ）ｉｉ）で得られた前駆幹細胞を、ｉ）で得られた血小板含有液体と、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、レチノイン酸、およびこれらの組み合わせより選ばれる少なくとも１つの成長因子と組み合わせる工程と、
ｉｖ）塩化カルシウムを含み、トロンビンを加えた、または加えない活性化剤を、ｉｉｉ）で得られた組み合わせに加える工程と、
ｖ）ｉｖ）で得られた混合物をゲル化する工程と、
を含んでいる。
【００４２】
血小板含有液体のゲル化は、その場で（in situ）またはその場以外の場所で（ex situ）行うことができる。前者の場合、工程ｉｖ）と工程ｖ）は、損傷部位内の‘その場で’行う。
【実施例】
【００４３】
［材料および方法］
＜ＢＭＳＣの単離と特性解析＞
通常の全股関節置換手術（total hip replacement surgery）を受けた、血液学的に正常な成人の患者（５２〜６０歳）の小柱骨から骨髄試料を採取した。全てのケースで同意を得た。各患者の腸骨稜から単回の骨髄吸引物（３５〜５０ｍｌ）を採った。凝固を防ぐため、吸引針には無菌硫酸ヘパリン（１０００Ｕ／ｍｌ）を含ませておいた。採取後直ちに骨髄吸引物を分注した。それぞれ４ｍｌの吸引物を、１５ｍｌの円錐管に入れた３ｍｌの滅菌Ficoll-Hypaque TM Plus (カナダ国ブリティッシュコロンビア州バンクーバー、Stem Cell Technologies Inc.製)の上に層とした。得られた懸濁液を１５００ｒｐｍで３０分間、室温で遠心した。Ficoll-Hypaqueと血漿との界面の単核細胞層を取り、１０ｍｌのα−ＭＥＭ／２．５ＦＢＳ培地中に再懸濁して７０μｍの細胞濾過器に通した。１０００ｒｐｍで５分間、細胞を遠心分離し、α−ＭＥＭ／２．５ＦＢＳ培地中に再懸濁した。トリパンブルー試験法を用いて細胞数と生存率を求め、細胞を、１０％のウシ胎仔血清と、１０００単位／ｍｌのペニシリンと、１０００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンとを補ったα−ＭＥＭを入れたＴ−７５フラスコに、５０００細胞／ｃｍ２の密度でプレートアウト（plated out）した（０．２５μｇ／ｍｌ）。３７℃、５％ＣＯ２の気体供給培養器（gassed incubator）中で培養を行った。３日目に最初の細胞培地の交換を行い、付着していない細胞を除いた。その後の細胞培養液交換は２〜３日毎に行った。その後、１〜２代継代したＢＭＳＣを使用した。フローサイトメトリー分析を用いて、培養細胞の特異的マーカーを決定した。懸濁液中の細胞を、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６に対する蛍光色素結合抗体（米国ミネソタ州、R&D Systems SL, Inc.製）と混合した。適当な同形の抗体を用いて非特異的染色を調節した。製造者の勧告に従って染色を行った。免疫染色した細胞を得て、フローサイトメータ（Cytomic FC 500-MPL、米国カリフォルニア州フラートン、Beckman Coulter Inc.製）で分析した。
【００４４】
＜ＦＧ足場の調製＞
製造者の指示に従って、Tissucol（登録商標）Duoキット５ｍｌ（スペイン国バレンシア、Baxter SL製）を使用し、ＦＧ足場を調製した。２つの別個の液体を混合してフィブリンゲルを生成した。溶液Ａは、３０００ＩＵＫのウシアプロチニン、ヒトアルブミン、グリシン、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリソルベート８０、クレアチン、および水から成る溶液に溶解した、フィブリノゲン（１００ｍｇ／ｍｌ）、１０ＩＵの因子ＸＩＩＩ、９ｍｇのフィブロネクチン、および１２０ｍｇ／ｍｌのヒトプラスミノゲンから成る。溶液Ｂは、塩化ナトリウム溶液に溶解した、５００ＩＵのヒトトロンビンと４０μｍｏｌの塩化カルシウムを含んでいる。溶液Ａと溶液Ｂを１：１の比で混合した。滅菌蒸留水にフィブリノゲンを溶解させて、溶液を調製した。我々のこの研究では、４つの異なる濃度のフィブリノゲン（５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、および１００ｍｇ／ｍｌ）を試験し、また、塩化カルシウム（４０μｍｏｌ／ｍｌ）中の４つの異なる濃度のトロンビン（２ＩＵ／ｍｌ、４ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、および５００ＩＵ／ｍｌ）も試験した。
【００４５】
実験のため、溶液Ａおよび溶液Ｂの様々な希釈物を用いてＦＧ足場を調製し、それぞれのフィブリノゲンおよびトロンビンの濃度で識別した（表１）。Ｐ３５プレート上で、１００μｌの溶液Ａと１００μｌの溶液Ｂを用いて全てのＦＧ足場を重合させ、小さな２００μｌの外植片（約１０個の外植片／プレート）で行った。先に足場を重合させ、次に、３７℃、相対湿度９５％、５％ＣＯ２で１時間培養した。ＡとＢとの反応からゲルが生成した。各種類の足場について、合計６枚のＰ３５プレートを用いた。足場の重合の前に、合計５万細胞／外植片で、ｈＢＭＳＣをトロンビン成分と混合した。続いて、３ｍｌのα−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ完全培地を各プレートに加えた。７日間毎日、ゲル内に捕らえられた細胞の形態を倒立顕微鏡で観察した。
【００４６】
【表１】
2013511314.tif 000003
【００４７】
＜ＰＲＰ足場の調製＞
ＰＲＰ足場を調製するため、健康なドナー患者からの末梢血を採取し、３．８％のクエン酸ナトリウムを入れた試験管に集めた（全血０．５ｃｃ、クエン酸塩／４．５ｃｃ）。抗凝固処理した血液試料を２０００ｇで１５分間遠心し、赤血球を除いた。上澄み液を集め、２４００ｇで６分間、２回目の遠心を行った。それぞれ４．５ｃｃの血液を、抗凝固剤として５００μｌの３．８％クエン酸ナトリウムを入れた試験管に集めた。血液を２５００ｒｐｍで５分間遠心し、ＰＲＰ画分を含んでいる黄色の血漿を分けた。ゲルを形成するため、１００μｌの１０％塩化カルシウム（３４μｍｏｌ／ｍｌ）だけ、または５０μｌの１０％塩化カルシウムと５０μｌのトロンビン（２、４、１００、および５００ＩＵ）を、それぞれ１００μｌのＰＲＰに加えた。全ての血漿足場を、小さな２００μｌの外植片（約１０個の外植片／プレート）から成るＰ３５プレート中で重合させた。先に足場を重合させ、次に、３７℃、相対湿度９５％、５％ＣＯ２で１時間培養した。トロンビンを加えて、または加えずに、ＰＲＰと塩化カルシウムを反応させると、ゲルが生成した。各群で、６枚のＰ３５プレートを試験した。実験のため、様々な溶液を用いて血漿足場を調製した（表２）。ＰＲＰで調製した足場は、トロンビンの濃度で識別した。足場の重合の前に、合計５万細胞／外植片で、細胞をトロンビンまたは塩化カルシウムの成分と混合した。続いて、３ｍｌのα−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ完全培地を各プレートに加えた。７日間毎日、ゲル内に捕らえられた細胞の形態を倒立顕微鏡で観察した。
【００４８】
【表２】
2013511314.tif 000004
【００４９】
＜細胞学的研究＞
倒立顕微鏡で細胞形態を観察し、Willerthらの研究（“Optimization of fibrin scaffolds for differenciation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells.”Biomaterials 2006; 27:5990-6003）に基づいた尺度を用いて、細胞生存率を求めた。この尺度では、（−）：培地中に浮遊している死細胞が見られる（全細胞）。（＋）：少数の細胞が生きており、その形は丸い。（＋＋）：多くの細胞が生きているが、ほんの僅かの膨らんだものが細胞質性であり（only a few expansions are cytoplasmic）、残りは丸いままである。（＋＋＋）：細胞の多くが生きている様子で、多くが線維芽細胞の形態を示している。（＋＋＋＋）：全ての細胞が生きている様子で、その全てが明らかな線維芽細胞の形態を示している。
【００５０】
マトリックス中の細胞の浸潤の程度と、細胞質伸長（extensions）に基づく細胞分化の程度を決定するため、次の尺度を用いた（Willerthら）。（−）：細胞は未分化のままであり、殆どが丸い形をしている。（＋）：細胞は未分化のままであり、ほんの僅かに線維芽細胞の形態が見られる。（＋＋）：細胞は未分化のままであるが、大部分に線維芽細胞の形態が見られる。（＋＋＋)：僅かの細胞で細胞質の大きさに変化が見え始め、一部は神経突起様突起を延ばしている。（＋＋＋＋）：多くの細胞が細胞質の明らかな変化を示し、多くが神経突起様突起を延ばしている。（＋＋＋＋＋）：全ての細胞が細胞質の明らかな変化を示し、多くが神経突起様突起を延ばしている。
【００５１】
＜ＴＵＮＥＬアッセイおよびエチジウムブロマイド染色＞
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated）ｄＵＴＰニック末端ラベル化（ＴＵＮＥＬ）アッセイのため、培養物を室温で１５分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）緩衝液中で３回洗浄した。次に、細胞を、０．１％クエン酸ナトリウムを加えた１％のTriton X-100中で１５分間透過化し、ＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した。次に、アポトーシスを起こした細胞の存在を、製造者の指示に従って、ＴＵＮＥＬ標識混合物（TACS XL DAB、米国ミネアポリス、R&D Systems, Inc.製）を用いて評価した。一連の濯ぎを行った後、ジゴキシゲニンで標識したヌクレオチドを、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素（ＴｄＴ）により、酵素的にＤＮＡに付加した。６０分間培養を行った。３０分間結合させた抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼまたは抗ジオキシゲニン−ＦＩＴを用いて、標識ＤＮＡを検出した。色素原ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）は茶色の反応生成物を生じ、これを光学顕微鏡または蛍光顕微鏡で評価した。陽性および陰性対照は同じブロックからのスライド上で行った。ＴｄＴを加えない培養物を陰性対照とした。細胞計数を行うため、少なくとも１０個の顕微鏡視野を４０倍で観察し、免疫染色した細胞の割合を記録して平均した。我々の研究成果は、平均した結果（平均±ＳＤ）で示す。培養７日後、５０ｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド（P4170、スペイン国マドリッド、Sigma製）を用いてその赤色蛍光により死細胞を特定し、細胞生存率を測定した。
【００５２】
＜細胞分化＞
神経分化を調べるため、ｈＢＭＳＣをＦＧおよびＰＲＰ足場上で培養した。対応する成長因子（１００ｎｇ／ｍｌの組み換えヒト脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（米国カリフォルニア州テメキュラ、Chemicon International Inc.製）、１００ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＮＧＦ）−７Ｓ（スペイン国マドリッド、Sigma-Aldrich SL製）、および１μｇ／ｍｌのレチノイン酸（ＲＡ）（スペイン国マドリッド、Sigma-Aldrich SL製））をフィブリノゲン成分に加えて、フィブリノゲン／トロンビン（５／２、１０／４、２０／１００、および１００／５００）を含むＦＧ足場を調製した。対応する成長因子（１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、および１μｇ／ｍｌのＲＡ）を血漿成分に加えて、ＰＲＰ足場（２ＩＵ、４ＩＵ、１００ＩＵ、および５００ＩＵ）を調製した。各成長因子、各足場の種類に対し３連で試験するため合計３６個のプレートを使用し、小さな２００μｌの外植片を実行しているＰ３５プレート上（約３外植片／プレート）で全ての足場を重合させた。まず足場を重合させて、３７℃、相対湿度９５％、５％ＣＯ２で１時間培養した。重合前に、合計５万細胞／外植片で、細胞をトロンビン成分または塩化カルシウムと混合した。次に、３ｍｌのα−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ完全培地を各プレートに加えた。成長因子を初期濃度まで加えて、７日間毎日、培地を新しくした。培養７日後、形態学的、免疫細胞化学的、およびＲＴ−ＰＣＲ試験を行った。
【００５３】
＜免疫細胞化学的解析＞
ｈＢＭＳＣ分化を確認するため、フィブリンおよびＰＲＰ足場内で７日間培養したものの免疫細胞化学的解析を行った。それぞれの足場から培地を除き、各ウェルを１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で濯いだ。室温で１時間、４％のパラホルムアルデヒド溶液を用いて、足場内部の細胞を固定した。次に、試料を３０％のショ糖緩衝液に１時間漬け、ＯＣＴ中に含ませ、凍結下で２０μｍに切った。ヘマトキシリン−エオシンの通常の手法を用いて、それぞれの足場の２つの組織切片を染色した。ＰＢＳで希釈した０．１％のtriton-Xを加えて、４５分間、細胞を透過化した。ＰＢＳに希釈した５％のヤギ血清を用いて、１時間、細胞をブロックし、４℃で一晩、一次抗体に触れさせた。使用した一次抗体は、マウス抗β−ＩＩＩ−チューブリンタンパク質モノクローナル抗体（２μｇ／ｍｌ、米国カリフォルニア州テメキュラ、Chemicon International Inc.製）、マウス抗ネスティンモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、米国カリフォルニア州テメキュラ、Chemicon International Inc.製）、マウス抗ＭＡＢ１５８０モノクローナル抗体（１：２００、米国カリフォルニア州テメキュラ、Chemicon International Inc.製）、マウス抗グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、米国カリフォルニア州テメキュラ、Chemicon International Inc.製）、およびウサギ抗Ｋｉ−６７タンパク質モノクローナル抗体（１：２００、米国カリフォルニア州、LabVision Westinghouse, Dr. Fremont）に対向（directed against）するものであった。次に、切片をＰＢＳ中で洗い、アビジン−ビオチン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（米国カリフォルニア州、Vector Inc.製)と共に培養した。色素原として３’，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いた。一次または二次抗体の欠けている対照薄片をそれぞれの一連の試料と共に分析した。光学顕微鏡を用いて切片を調べた。いくつかの切片を、二次抗体（Ｃｙ（登録商標）２結合抗マウスＩｇＧ（１：２００、米国バルチモアパイク、Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.製）およびローダミン（ＴＲＩＣＴ）結合抗ウサギＩｇＧ（１：２００、Jackson製））と共に室温で１時間培養した。ＰＢＳで洗浄後、切片を４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）（ドイツ国ダルムシュタット、Merck KgaA製）で染色し、グリセロールと共に載せた。蛍光顕微鏡を用いて切片を調べた。一次抗体のない対照染色を陰性対照として用いた。それぞれの細胞マーカーについて、少なくとも１０個の顕微鏡視野を４０倍で調べ、免疫染色した細胞の割合を平均し、記録した。我々の研究成果は、記載の方法を用いた６個の連続的な実験の平均した結果（平均±ＳＤ）で示した。
【００５４】
＜微細構造研究＞
透過型電子顕微鏡のため、標本を、０．０６Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３５）に加えた２．５％のグルタルアルデヒドを用い、４℃で４８〜７２時間固定し、０．２Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液で濯ぎ、１％四酸化オスミウムを用い、室温で後固定した。次に、試料を２．４％塩化ナトリウム溶液で濯ぎ、０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で洗い、０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に加えた１％酢酸ウラニルを用いて、暗所中、室温で３０分間、ブロック染色した。通常の処理を行い、アルコール中で脱水してアラルダイト中に埋め込んだ。非常に薄い切片（５０〜７０ｎｍ）にクエン酸鉛と酢酸ウラニルでコントラストを付け、Philips EM-200電子顕微鏡で見た。更に、ＦＧおよびＰＲＰ足場の表面を環境走査型電子顕微鏡を用いて観察した。
【００５５】
＜ＲＴ−ＰＣＲ研究＞
ＲＴ−ＰＣＲ分析のため、全てのＲＮＡ試料を、ＲＮＡ抽出キット（ドイツ国ハンブルグ、Eppendorf AG製）を用い、製造者の指示に従って培養ｈＢＭＳＣから精製した後、Dnase I（スペイン国マドリッド、Bionova製）を用いて処理し、ゲノムＤＮＡ汚染物質を除いた。２６０ｎｍで吸光度を測定してＲＮＡ濃度を求めた。キットＲＴ−ＰＣＲ（Eppendorf AG製）を製造者の指示に従って使用して相補鎖ＤＮＡを合成した。最初の変性を９４℃で５分間行い、次に、９４℃で４５秒間の変性と、５８℃で４５秒間のプライマアニーリングと、７２℃で４５秒間の伸長とから成るサイクルを３０回行い、７２℃で５分間の最後の伸張工程を行って、連続作業を完了した。ＰＣＲ生成物を１．２％アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイド（０．５μｇ／ｍｌ、スペイン国マドリッド、Bio-Rad製）を用いて可視化した。ニューロンおよびグリアの特異遺伝子の発現に用いたプライマ配列は、ネスティン上流  ５’−ＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＣＴＧＧ−３’（配列識別番号１）、ネスティン下流  ５’−ＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＧＡＧＧＴＴＴＧＴ−３’（配列識別番号２）、ＰＣＲ生成物の大きさ：４３１ｐｂｓ；β−ＩＩＩ−チューブリン上流  ５’−ＴＧＣＧＴＧＴＧＴＡＣＡＧＧＴＧＡＡＴＧＣ−３’（配列識別番号３）、β−ＩＩＩ−チューブリン下流  ５’−ＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＡＡＧ−３’（配列識別番号４）、ＰＣＲ生成物の大きさ  ２４０ｐｂｓ；ＧＦＡＰ上流  ５’−ＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＡＧＣＴＴＧＡＴＴＣＴ−３’（配列識別番号５）、ＧＦＡＰ下流  ５’−ＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＧＡＣＡ−３’（配列識別番号６）、生成物の大きさ  １４１ｐｂｓ；ＧＡＤＰＨ上流  ５’−ＣＣＣＡＣＧＧＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡ−３’（配列識別番号７）、ＧＡＤＰＨ下流  ５’−ＴＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＧＣ−３’（配列識別番号８）、生成物の大きさ  ４３０ｐｂｓであった。グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ）を用いて対照実験を行った。
【００５６】
［実施例１］細胞の増殖、移動および分化の促進における、フィブリンゲル移植片とＰＲＰゲル移植片との比較実験：
＜培養７日後の細胞形態＞
この実験において、ｈＢＭＳＣは、表現型フローサイトメトリー試験後、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−のプロフィールを示した。
【００５７】
ＦＧ足場は堅く（consistent）、非常に扱い易かったが、ｈＢＭＳＣは、フィブリン網目に良く付着せず、数時間培養すると丸い形の細胞が塊となるのが見られ、典型的な間葉の形をした細胞は時折見られるだけであった（表３）。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
図１は、ＦＧ足場とその上に播種したｈＢＭＳＣの様々な形態学的特徴を示している。５／２および１０／４ＦＧ足場は、同様に中程度の液状のコンシステンシーを示している（図１Ｃ）。これらは相対的に扱いにくく、培養７日後には容易に扱えなかった。１０／４ＦＧ足場上に播いたＨＢＭＳＣは、培養７日後に球状の形態を示している（図１Ｅ）。これらの足場上に播種した細胞は結合できず、このため膨張および増殖できなかった。あるいは、エチジウムブロマイドで染色後の生存率は５０％±９．３％を超えなかった。２０／１００ＦＧ足場は、より扱い易いコンシステンシーを持ち（図１Ｄ）、細胞生存率は６９．５％±１２．５％に上昇した。にもかかわらず、大部分の細胞は丸い形のままであり（図１Ｆ）（Ｈ＆Ｅ法）、膨張したごく少数のｈＢＭＳＣしか典型的な細胞質伸長を示さなかった（図１Ｇ）（Ｈ＆Ｅ法）。コンシステンシーが非常に密の１００／５００ＦＧ足場（図１Ｂ）は、細胞死の著しい上昇を示し（約９０％±７．８％：エチジウムブロマイド染色後の生存率１０％±２．５％）、これは、増殖が僅か、またはないことを示している。細胞は伸びず、殆どの場合、細胞はフィブリン網目構造の間に捕らえられ、球形を保っていた（図１Ｈ）（Ｈ＆Ｅ法）。形態学的に、ｈＢＭＳＣは、典型的に凝縮した核とアポトーシス小体の形成のある、アポトーシスの様子を呈していた（図１Ｉおよび図１Ｊ）（Ｈ＆Ｅ法）。これらの知見は、核膜周囲の凝縮した核クロマチンと、多数の小オルガネラと小胞のある収縮した細胞質が見られる、電子顕微鏡法で確認された。これらの細胞のほかに、膜で囲まれ、クロマチンが内側に凝縮したアポトーシス小体があった。環境走査型電子顕微鏡により、非常に厚いフィブリン網目が密集した構造体を形成し、培地の流通を妨げていることが分かった。
【００６０】
トロンビンを含むＰＲＰ足場は堅く、安定で、容易に扱うことができた。全てのゲルにおいて、観察したｈＢＭＳＣは、培養初日からマトリックスタンパク質に良く付着しており、培養数時間で、細胞はタンパク質の網目の間に均一に分散した様子が見られた（表４）。
【００６１】
【表４】
2013511314.tif 000006
【００６２】
図２は、ＰＲＰ足場とその上に播種したｈＢＭＳＣの様々な形態学的特徴を示している。
【００６３】
これらの細胞は、膨らんだ細胞質（an expanded cytoplasm）、細胞質膨張（cytoplasmic expansions）、および大きな増殖能力を持つ、典型的な間葉状形態を示し、試験の７日間の間に数が指数関数的に上昇したことが分かった。アポトーシス細胞に一致する画像は全く観察されなかった。エチジウムブロマイド染色で測定した生存率は、９９．５％の生存を示した。微細構造の研究において、ＰＲＰ足場上で培養したｈＢＭＳＣは、円または卵円形の核、多数の小胞体、ミトコンドリア、および非常に多くの細胞質性小胞を持つ、典型的な形態を示した。塩化カルシウム（３４μｍｏｌ／ｍｌ）を含むＰＲＰ足場では、この試剤の凝固剤としての有効性が示され、コンシステンシーが良好で取り扱い易いゲルが得られた。更に、細胞の挙動はトロンビンを用いた足場で観察されたものと非常に似ており、ｈＢＭＳＣは足場に良く付着し、非常に多くの伸長を持つ膨らんだ細胞質と盛んな有糸分裂像を示した。エチジウムブロマイド染色後の細胞生存率は９９．５％±７．５％であり、アポトーシスに一致する画像は見られなかった。２ＩＵおよび４ＩＵを加えて形成した足場は、中程度のコンシステンシーを示し、重合後、申し分なく取り扱えるというには液状でありすぎた（図２Ｂ）。しかし、１００ＩＵおよび５００ＩＵを加えて重合した足場は、容易に取り扱えた。詳細には、１００ＩＵを加えると、ゲルのコンシステンシーは取り扱いが容易となり（図２Ｃ）、５００ＩＵでは、ＰＲＰ足場は固体となったが、多孔性のコンシステンシーであった（図２Ｄ）。更に、ゲルのコンシステンシーは、細胞挙動にはあまり影響しないようで、全てのケースで細胞生存率は約９９％±６．４％に保たれ、２ＩＵおよび４ＩＵの足場では多少低く、培養の最初の４日間、細胞生存率は６８％±８．７％に低下したが後に回復し、培養の１週目の終わりには９９％±１２．６％の生存率に達した。これらの足場において、環境走査型電子顕微鏡で、ＦＧ足場中より直径の小さな、多くのタンパク質フィラメントから成り、培地が入り込める比較的緩い構造体を成している、緩くて粗い表面が見られた（図２Ｅ〜図２Ｈ）。ＰＲＰ足場の表面は線維芽細胞の形をしたｈＢＭＳＣで覆われ、付着したタンパク質網目構造と、この網目構造中に捕らえられた多数の血小板とが見られた（図２Ｉ〜図２Ｐ）。
【００６４】
＜細胞生存率および増殖＞
培養７日後、Ｋｉ−６７の発現に基づいて、ＦＧおよびＰＲＰ足場上のｈＢＭＳＣの増殖能力を測定し（図３Ａ〜図３Ｂ）、細胞死の割合をＴＵＮＥＬ染色で算定した（図３Ｃ〜図３Ｄ)。ＴＵＮＥＬ法によるｈＢＭＳＣの試験の他に、異なる足場でのアポトーシスにより細胞死した細胞の存在を電子顕微鏡で常に確認した。その結果、ＦＧ足場の場合、分析したＦＧ足場の種類に関係なく、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合は細胞増殖の割合よりもずっと高いことが分かった。細胞死／増殖のバランスのこの違いは、５／２および１００／５００ＦＧ足場の場合でより顕著であった（表５）。
【００６５】
【表５】
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【００６６】
一方、ＰＲＰ足場上に播種したｈＢＭＳＣの増殖／アポトーシスのバランスは、増殖の側に傾き、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数はずっと少なかった。ＰＲＰ足場上で培養したｈＢＭＳＣは高い増殖率を示し（８７．９％±１６．７％から９９％±１３．７％）、２ＩＵおよび４ＩＵのＰＲＰ足場（約８７％）に比べて、０ＩＵ、１００ＩＵ、および５００ＩＵの足場の場合に僅かに高かった（約９９％）。同様に、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数は非常に少なかった（２．１％±４．９％）（表６）。
【００６７】
【表６】
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【００６８】
＜細胞分化＞
形態学および免疫細胞化学を用いて、７日間に亘ってＦＧ足場中のｈＢＭＳＣの分化状態を評価した。ｈＢＭＳＣが神経表現型へ分化していることを確認するため、これらの細胞を、ネスティン、β−ＩＩＩ−チューブリン、およびＧＦＡＰについて染色した。
【００６９】
様々な成長因子の存在下で７日間培養した後、ＦＧ足場上に播種したｈＢＭＳＣは、これらの細胞の生存率が低いため、僅かな分化の徴候しか示さなかった（表７）。
【００７０】
【表７】
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【００７１】
ＦＧ足場をＮＧＦで処理した場合、播種したｈ−ＢＭＳＣの神経分化に一致する形態学的変化は一般的には観察されなかった。１０／４ＧＦ足場において、神経分化の形態学的変化は無かったが、ｈＢＭＳＣは通常の培養物ほどは丸くなく、より足場に付着し、膨張して、線維芽細胞の形態を獲得しているようであった。ＮＧＦで処理した２０／１００ＦＧ足場では、いくつかの細胞（生存細胞の１０％）が、その細胞質の僅かな変化と、神経突起様膨張と見られる、多少の細胞質膨張を示した。残りの細胞は典型的な線維芽細胞の形のままであった。５／２および１００／５００ＦＧ足場では、この時点で神経分化の徴候はなく、ｈＢＭＳＣは丸い形のままであった。やはりＢＤＮＦでの処理が、より良好な結果を示した。１０／４ＦＧ足場では、多少の割合の細胞（生細胞の１１．２％±３．４％) でその細胞質の大きさに変化が見え始め、また多少の神経突起様突起の存在が見られた。２０／１００ＦＧ足場では、大部分の細胞（生細胞の７０．６％±１５．６％）は、細胞質収縮や、多くの神経突起様突起の明らかな存在など、神経分化の徴候を示した。５／２および１００／５００ＦＧ足場では神経分化の徴候はなく、ｈＢＭＳＣは丸い形を保っていた。
【００７２】
ＦＧ足場をＲＡで処理した場合、ｈＢＭＳＣは、同じ培養時間後に、僅かしか神経分化の徴候を示さなかった。１０／４および２０／１００ＦＧ足場では、多少の割合の細胞（生細胞の５．６％±２．４％）が線維芽細胞の形を示したが、残りは、分化せずに丸い形を保っていた。５／２および１００／５００ＦＧ足場では、ｈＢＭＳＣは未分化細胞のままであり、その殆どは丸い形を示していた。免疫組織化学的研究で、神経分化の形態学的発見を確認した。表８に、ネスティン、β−ＩＩＩ−チューブリン、およびＧＦＡＰを発現している細胞の割合を示す。
【００７３】
【表８】
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【００７４】
ＭＡＢ  １５８０の免疫組織化学的発現は無く、希突起膠細胞分化がないことが示唆された。培養７日後、ＮＧＦで処理したＰＲＰ足場は、細胞質の僅かな収縮、神経突起様突起といった、神経分化の徴候を示す細胞の割合が全体的に高かった。この結果は、０ＩＵ、１００ＩＵ、および５００ＩＵのトロンビンを用いたＰＲＰ足場では関連がより強く、７８．２％±６．９％の細胞が神経分化の明らかな徴候を示した。２ＩＵおよび４ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場では、大部分の細胞が未分化のままであり、培養７日後、４ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場で、ごく少ない割合の細胞（４．９１％±１．５％）だけが、神経分化の僅かな徴候を示し始めた。この時点で、１００および５００ＩＵのトロンビンを加え、ＢＤＮＦで処理したＰＲＰ足場では、全てのｈＢＭＳＣが、神経分化の形態学的徴候を示し、０ＩＵおよび４ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場では７０．６％±４．９％のｈＢＭＳＣが神経分化を示し、２ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場では６．２１％±４．６％のｈＢＭＳＣが神経分化を示した。レチノイン酸で処理したＰＲＰ足場の群の結果は異なるものであった。１００および５００ＩＵのトロンビンを加えた足場では、神経分化の明らかな形態学的変化のあった細胞は６８．９％±７．８５％の割合で見られた。０ＩＵおよび４ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場では、神経分化に相当する変化は５．３％±２．３％の細胞で観察された。２ＩＵのトロンビンを加えたＰＲＰ足場では神経分化の徴候は僅かしか見られず、大部分の培養ｈＢＭＳＣは線維芽細胞の形のままであった（表９）。
【００７５】
【表９】
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【００７６】
神経表現型の獲得に一致する形態学的変化には、ネスティン、β−ＩＩＩ−チューブリン、ＧＦＡＰなどの免疫組織化学的マーカーの発現が伴った。ＭＡＢ  １５８０の免疫組織化学的発現は無く、希突起膠細胞分化がないことが示唆された。表１０は、使用した成長因子に応じて免疫染色したｈＢＭＳＣの割合を示している。
【００７７】
【表１０】
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【００７８】
これらの結果を確認するため、培養したｈＢＭＳＣのＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、その結果は、形態学的および免疫細胞化学的所見との強い相関を示した。処理１週間後、ネスティンｍＲＮＡの存在と、強いニューロン（β−ＩＩＩ−チューブリン）および星状膠細胞（ＧＦＡＰ）ｍＲＮＡ発現が見られた（図４）。
【００７９】
［実施例２］
全部で１０匹の成体ウィスター系ラットを用いた。その全てを開頭し、頭頂部の大脳皮質を切除して皮質に損傷を与えた。損傷直後、動物から採血し、プロトコルに従ってゲルを調製した。
成分Ａ：多血小板血漿（ＰＲＰ）＋細胞（５０万）＋ＢＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）
成分Ｂ：トロンビン（５ＵＩ）＋塩化カルシウム（３４μｍｏｌ／ｍｌ）
ふたつの成分を混合し、生成したゲルを６匹の動物の脳損傷部に置いた（図５Ａおよび図５Ｂ）。４匹の動物には、細胞を加えずに同じプロトコルを行った。
【００８０】
１週間後、組織学的検討を行った。図５Ｃに、移植した細胞の様子を示す（ビスベンズイミド標識分析で行った検討）。移植細胞は正常な外観を示し、その生存率は６０％以上であることが観察された。ゲル中に封入された細胞を埋め込まれたこれらの動物では、神経分化シグナルを持つ移植細胞の生存能力が観察された（ネスティン陽性）。図５Ｄで、免疫蛍光はこれらの細胞の神経分化を示し（矢印）、これは、細胞質伸張の形成とネスティン発現（赤色）によって分かる。ビスベンズアミドは核標識で、これにより幹細胞の生存能力を見るための標識幹細胞が認識できる。ネスティンは、初期の神経分化を示す細胞質標識である。
【００８１】
細胞を加えていないゲルを移植した動物において、組織学的な結果は、マクロファージとグリオーシスとを含む、脳挫傷部位の典型的な像を示した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
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【図２Ｏ】
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【図２Ｐ】
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【図３】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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