(57)【要約】【課題】マデカッソシド及びテルミノロシドの混合物を含むセンテラアジアチカの精製抽出物を調製する方法を提供する。【解決手段】α）マデカッソシド、テルミノロシド、及びアシアチコシドの混合物を含む水溶液を、吸着性樹脂の上を通過させるステップと、β）少なくとも３０重量％のアルコール系溶媒、及び所望により水を含む溶離剤で前記吸着性樹脂を溶離するステップと、水及びアルコール系溶媒を含む溶媒混合物を用いて再結晶させるためのステップであって、前記アルコール系溶媒が、好ましくはエタノール、メタノール及びブタノールからなる群から選択されるステップとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マデカッソシド及びテルミノロシド（terminoloside）の混合物を含むセンテラアジアチカの純化された抽出物を調製するための方法であって、前記方法は、
α）マデカッソシド、テルミノロシド、及びアシアチコシドの混合物を含む水溶液を、吸着性樹脂の上を通過させるステップと、
β）少なくとも３０重量％のアルコール系溶媒、及び所望により水を含む溶離剤で前記吸着性樹脂を溶離するステップと、
水及びアルコール系溶媒を含む溶媒混合物を用いて再結晶させるためのステップであって、前記アルコール系溶媒が、好ましくはエタノール、メタノール及びブタノールからなる群から選択されるステップと、
を含み、それにより前記センテラアジアチカの純化された抽出物を得る、方法。
【請求項２】
ステップα）の前に、以下の、
ａ）水又は少なくとも１０重量％の水及び所望によりアルコール系溶媒を含む溶媒混合物を用いてセンテラアジアチカの空中部分を抽出するステップ、
が先に行われ、
それによりマデカッソシド、テルミノロシド及びアシアチコシドの混合物を含む水溶液が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップβ）の後に、以下の、
ｂ）ステップβ）の後に得られる溶離液を、変色する樹脂の上を通過させ、それにより変色した水相が得られるステップと、
ｃ）変色した水相を濃縮するステップと、
が続き、それによりマデカッソシド、テルミノロシド及びアシアチコシドの混合物を含むセンテラアジアチカの抽出物が得られる、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
再結晶ステップが、以下の、
ｄ）ステップｃ）の後に得られる抽出物を、４０℃から７０℃の間の温度に達した水及びアルコール系溶媒を含む溶媒混合物中で可溶化し、それにより溶液を得るステップと、
ｅ）ステップｄ）の後に得られる溶液の温度を−２０℃から３０℃の間の温度まで低下させ、それにより冷却された混合物を得るステップと、
ｆ）冷却された混合物をろ過し、それによりろ液を得るステップと、
ｇ）ろ液を濃縮するステップと、
を含み、それにより、抽出物の総重量に対して５０重量％よりも多いテルミノロシド及びマデカッソシドの混合物を含むセンテラアジアチカの純化された抽出物を得る、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
マデカッソシド及びテルミノロシドの混合物を含むセンテラアジアチカの精製抽出物を調製するための方法であって、前記方法が、水及びアルコール系溶媒を含む溶媒混合物を用いて請求項１から４のいずれか一項に記載の方法に従って得られる純化された抽出物を精製するためのステップを含む、方法。
【請求項６】
精製ステップが、以下の、
ｈ）請求項１から４のいずれか一項に記載の方法に従って得られる純化された抽出物に、２５℃から６５℃の間の温度に達したアルコール系溶媒、及び所望により水を含む溶媒混合物を添加し、それにより溶液を得るステップと、
ｉ）溶液の温度を−２０℃から３０℃の間の温度まで低下させ、それにより冷却された混合物を得るステップと、
ｊ）冷却された混合物をろ過し、それによりろ液を得るステップと、
ｋ）ろ液を濃縮するステップと、
を含み、それにより、抽出物の総重量に対して９０重量％よりも多いマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物を含むセンテラアジアチカの精製抽出物を得る、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マデカッソシド（madecassoside）、テルミノロシド（terminoloside）、及びアシアチコシド（asiaticoside）の混合物を含むセンテラアジアチカ（Centella asiatica）の抽出物を調製するための方法に関する。  
【背景技術】
【０００２】
センテラアジアチカは、セリ科（Apiaceae）、詳しくはチドメグサ亜科に属する。この植物は、３０００年以上にわたって知られており、伝統薬に用いられている。そのヒーリング作用、鎮静作用、鎮痛作用、抗うつ作用、及び抗菌作用は特に興味深い。
【０００３】
センテラアジアチカの活性物質は、五環トリテルペンであり、これはトリテルペンゲニン：アジアティック酸（asiatic acid）（式I）及びマデカシン酸（madecassic acid）（式II）のいずれかの形態、又はトリテルペンヘテロシド：アシアチコシド（式III）、マデカッソシド（式IV）及びテルミノロシド（式V）の形態をとる。
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【０００４】
テルミノロシドは、マデカッソシドの位置異性体であり、同じ糖鎖、すなわち、グルコースーグルコースーラムノース鎖をもつ。テルミノロシドのテルペン環の構造は、テルミノール酸のテルペン環と同じである。
【０００５】
本発明者が知る限りでは、アシアチコシドの異性体は現在まで検出されていない。しかしながら、マデカッソシド及びテルミノロシド間に存在するのと類似した異性をもつ、アシアチコシドの位置異性体は存在すると推定される。
【０００６】
センテラアジアチカのヘテロシド、アシアチコシド及びマデカッソシドは、それぞれ植物のアジアティック酸及びマデカシン酸の貯蔵形態を形成している糖複合体である。
【０００７】
トリテルペン分子は、コラーゲンの活性を調整し、活性化するコラーゲン合成の点から特に興味深い。センテラアジアチカから抽出されたゲニン及びヘテロシドは特にコラーゲン１及び３の合成を促進する。これらの活性物質は、基本的に静脈不全の治癒を促進させ、治療するために医薬品分野で用いられる。それらは、基本的に抗しわ剤やアンチセルライト剤として、化粧品分野で用いられる。従来技術において、より普通に用いられているセンテラアジアチカの活性化合物は、アジアティック酸とマデカシン酸及びアシアチコシドである。
【０００８】
マデカッソシドは、水に非常に溶けるので、従来の脂溶性活性物質の抽出方法において通常洗浄水で除去される。
【０００９】
国際出願である特許文献１は、マデカッソシド、テルミノロシド、及びアシアチコシドの混合物を含むセンテラアジアチカの抽出物を調製する方法を開示しており、該方法は、脂質／脂質抽出で選択的脱脂質し、その後、得られた水―アルコール相の濃縮と連続したろ過を行うステップを含んでおり、この順序は、マデカッソシド及びテルミノロシドの混合物からアシアチコシドを除去することを意図している。しかしながら、マデカッソシドはアシアチコシドの一部を可溶化し、このアシアチコシドの残りの部分は、工業的スケールにおいて一般的ではないコストのかかる精製技術であるシリカゲルクロマトグラフィーにより除去する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０６２６７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
驚くことに、本発明者は、マデカッソシド、テルミノロシド、及びアシアチコシドの混合物を含むセンテラアジアチカの抽出物を調製する新規な抽出方法を開発した。この方法においては、本発明者は、マデカッソシド、テルミノロシド、及びアシアチコシドの混合物を含む溶液を精製するための新規なステップを用いた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、マデカッソシド、テルミノロシド、及びアシアチコシドの混合物を含むセンテラアジアチカの抽出物を調製するための吸着性樹脂の上を通過させるステップの使用に関する。
【００１３】
本発明で用いる吸着性樹脂は、好ましくはセンテラアジアチカに含まれるトリテルペンヘテロシドを吸着するのに適した樹脂、例えば、スチレンージビニルベンゼン又はホルモ−フェノール型樹脂の吸着性樹脂である。
【００１４】
また、本発明は、マデカッソシド、テルミノロシド及びアシアチコシドの混合物を含むセンテラアジアチカの抽出物を調製するための方法であって、前記方法は、
α）マデカッソシド、テルミノロシド、及びアシアチコシドの混合物を含む水溶液を、吸着性樹脂の上を通過させるステップと、
β）少なくとも３０重量％のアルコール系溶媒、及び所望により水を含む溶離液で前記吸着性樹脂を溶離するステップを含む。
【００１５】
本願の明細書内において、用語“アルコール系溶媒”は、少なくとも１つのーＯＨアルコール基を含む溶媒、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、グリセロール、特には、メタノール、エタノールを意味する。
【００１６】
ステップα）においては、マデカッソシド、テルミノロシド、及びアシアチコシドの混合物を含む水溶液を、吸着性樹脂の上を通過させることにより、これらのトリテルペンヘテロシドを選択的に吸着することが可能となる。
【００１７】
ステップβ）において用いる溶離液は、所望により希釈していないアルコール系溶媒、有利にはアルコール系溶媒と水の混合物、好ましくは５０〜８０％のアルコール系溶媒を含む該混合物、優先的には６０〜７０％のアルコール系溶媒を含む該混合物である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明方法の１つの好ましい他の態様においては、ステップα）の前に、以下の、
ａ）水又は少なくとも１０重量％の水及び所望によりアルコール系溶媒を含む溶媒混合物を用いてセンテラアジアチカの空中部分を抽出するステップ、
が先に行われ、それによりマデカッソシド、テルミノロシド及びアシアチコシドの混合物を含む水溶液が得られる。
【００１９】
本願の明細書内において、用語“センテラアジアチカの空中部分”は、５ｃｍ未満の葉柄をもつ葉片からなるセンテラアジアチカの葉を意味する。
【００２０】
前記活性物質は、好ましくは植物の空中部分を用いて、センテラアジアチカから抽出される。その根を傷つけることなく、それによりこの多年生植物の自然な再生を可能にすることを主たる目的としている。
【００２１】
本発明方法の１つの好ましい他の態様においては、前記抽出ステップは、水中、又は、水及び所望によりアルコール系溶媒を含む溶媒混合物中で前記空中部分を、撹拌下で解離するステップを含む。
【００２２】
本願の明細書内において、用語“溶媒混合物分”は、少なくとも２つの溶媒の混合物、好ましくは２つの溶媒の混合物、例えば、水とアルコール系溶媒の混合物を特に意味する。
【００２３】
前記解離は水又は少なくとも１０重量％の水及び所望によりアルコール系溶媒を含む溶媒混合物を用いて、通常２０〜９０℃、好ましくは５０〜７０℃、優先的にはおよそ５０℃の温度で、通常２０〜１８０分間、１：２〜１：２０の間の［センテラアジアチカ］：［溶媒混合物］比で行うのが好ましい。
【００２４】
得られた前記解離混合物は、通常、ろ過し、それによりマデカッソシド、テルミノロシド及びアシアチコシドの混合物を含む水溶液を得る。このろ過は、普通６００μｍ、１００μｍ及び２５μｍの多孔性フィルタをもつ連続的なろ過手段によって通常行う。
【００２５】
本発明方法の１つの態様においては、上述した抽出ステップに続いて得られた水溶液は、処理する容量を減らして、２％から２５％の乾燥物を含む濃縮液を得るために、必要に応じて濃縮する。
【００２６】
得られた上記濃縮液は  所望により塩基性化し、好ましくは、固体又は水溶液形態の強アルカリ性水酸化物無機塩基（例えば、水酸化リチウムＬｉＯＨ、水酸化ナトリウムＮａＯＨ又は水酸化カリウムＫＯＨ）、又は生石灰ＣａＯ、又は消石灰Ｃａ（ＯＨ）２で塩基性化して、前記濃縮液のｐＨを好ましくは８〜１２に調整する。強無機塩基は好ましくはＮａＯＨ、ＫＯＨ及びＣａＯから選択される。
【００２７】
強塩基を添加すると、通常、強塩基と反応しやすい、存在する金属及び他の物質を沈殿させ、ろ過による除去が可能になる。通例、沈殿又は凝集したタンパク質及び樹脂性化合物は、その後、塩基性化した混合物から、ろ過により除去する。
【００２８】
前記ろ過ステップに続いて、得られたろ過物に対し、所望により、好ましくは、強鉱酸、例えばリン酸Ｈ３ＰＯ４、塩酸ＨＣｌ、硝酸ＨＮＯ３、硫酸Ｈ２ＳＯ４、過塩素酸ＨＣｌＯ４、臭化水素酸ＨＢｒ、又は１又は複数の−ＣＯＯＨカルボキシル基をもつ芳香族又は非芳香族有機化合物（ギ酸、エタノール酸、安息香酸、クエン酸又は炭酸など）等の有機酸を添加することにより、酸性化することができる。この酸性化のステップでは、ろ過物のｐＨを５〜７に調整するのが好適である。前記強鉱酸は、Ｈ３ＰＯ４とＨＣｌから選択するのが好ましい。前記有機酸は、クエン酸又は炭酸から選択するのが好ましい。
【００２９】
形成された塩及び沈殿化合物は通常、該酸性化した混合物からろ過により除去する。
【００３０】
本発明方法の１つの有利な態様においては、ステップβ）に引き続いて以下のステップ、
ｂ）ステップβ）の後に得られる溶離液を、変色する樹脂の上を通過させ、それにより変色した水相が得られるステップと、
ｃ）変色した水相を真空濃縮するステップを行い、
それによりマデカッソシド、テルミノロシド及びアシアチコシドの混合物を含むセンテラアジアチカの抽出物が得られる。
【００３１】
上記得られた混合物は、マデカッソシド、２５％〜６５％のテルミノロシド及び２０％〜４０％のアシアチコシドからなることが好ましい。
【００３２】
上記得られた抽出物は、該抽出物の総重量に対して、２５重量％〜６５重量％のテルミノロシドとマデカッソシドの混合物、及び２０重量％〜４０重量％のアシアチコシドを含むことが好ましい。
【００３３】
本発明方法の１つの有利な態様においては、ステップβ）の後に得られる溶離液は最初に活性炭で処理する。活性炭を添加することにより、通常、脂肪酸又は酸化生成物を固定することにより、溶離液を変色させることができる。
【００３４】
所望により活性炭で処理したこの溶離液は、次いでアルコール系溶媒を蒸留することにより濃縮することができる。濃縮した溶離液は、次いで例えば水相中の不溶化合物を除去するためにろ過する。アシアチコシドの一部は通常溶離液の濃縮において沈殿し、その後、ろ過により通常除去する。
【００３５】
ステップｂ）において、所望により活性炭で処理し、所望により濃縮し、ろ過するステップβ）で得られた溶離液は、例えば、強アニオン性スチレン−クロライド型の変色する樹脂の上を通過させて変色させる。
【００３６】
本発明方法の１つの有利な態様においては、変色した水相は、次いで所望によりカチオン性イオン交換樹脂の上、及び、アニオン性イオン交換樹脂の上に連続的に通過させることによって処理し、それにより不溶性塩及び不要な化合物を水相から除去する。使用する該カチオン性樹脂は、スルホネート型官能基を含む強カチオン性樹脂が好ましい。使用する該アニオン性樹脂は、第四級アンモニウム型官能基を含む強アニオン性樹脂が好ましい。本発明方法の範囲内においては、該イオン交換樹脂の順序は、残留する酸の分画の固定を増強させる上で重要である。
【００３７】
カチオン性樹脂及びアニオン性樹脂の上の連続的な通過は、好ましくは繰り返してもよいし、又は前記樹脂の混床上を変色させた水相を通過させて行ってもよい。
【００３８】
ステップｃ）においては、所望によりカチオン性樹脂及びアニオン性樹脂の上を通過させた、変色した水相を真空濃縮し、得られた濃縮物は、通常真空乾燥又は噴霧乾燥する。該濃縮は、好ましくは有機もしくは無機質膜でのタンジェンシャル（tangential）ろ過膜技術を用いて行うことができる。その場合、２００ｋＤａから１００ｋＤａのカットオフ閾値を有する媒体を用いる（すなわち、分子量２００〜１００，０００ｇ／ｍｏｌの分子を用いる）。
【００３９】
ステップｃ）の結果として、通例、抽出物の総重量に対して、２５重量％から６５重量％のマデカッソシドとテルミノロシドの混合物、及び２０重量％〜４０重量％のアシアチコシドを含むセンテラアジアチカの抽出物が得られる。
【００４０】
ステップｃ）の結果として、通例、抽出物の総重量に対して、２５重量％から６５重量％のマデカッソシドとテルミノロシドの混合物を含むセンテラアジアチカの抽出物が得られる。
【００４１】
ステップｃ）の結果として、通例、抽出物の総重量に対して、２０重量％から４０重量％のアシアチコシドを含むセンテラアジアチカの抽出物が得られる。
【００４２】
本発明の範囲内においては、用語“アシアチコシド”は式IIIの化学分子、場合により、そのオレアノール異性体（oleanic isomer）のいずれかとの混合物を意味する。
【００４３】
また、本発明は、マデカッソシド、テルミノロシド及びアシアチコシドの混合物を含むセンテラアジアチカの純化された抽出物を調製するための方法に関するものであり、該方法は、前記方法によって得られた抽出物を、水及びアルコール系溶媒を含む溶媒混合物を用いて再結晶するステップを含む。
【００４４】
前記再結晶のステップに適したアルコール系溶媒としては、エタノール、メタノール、及びブタノール、あるいはそれらの混合物が例示される。
【００４５】
本明細書において、用語“センテラアジアチカの純化された抽出物”は、抽出物の総重量に対して、５０重量％よりも多いマデカッソシドとテルミノロシドの混合物を含むセンテラアジアチカの抽出物を意味する。
【００４６】
該抽出物は、通例、抽出物の総重量に対して、１５重量％より少ないアシアチコシドを含む。
【００４７】
本発明方法の再結晶のステップは、アシアチコシドの大部分を除去し、それにより、得られる純化された抽出物中のマデカッソシドとテルミノロシドの混合物の含有量を増加させるのに適している。
【００４８】
再結晶精製の方法は、溶媒中の化合物の熱い時と冷たい時の溶解度の違いに基づいている。固形物の溶解度は通例温度と共に上昇する。それゆえ、温溶媒に溶解した場合、その再結晶は、その過飽和に溶液を冷却することにより行ってもよい。したがって、再結晶は、溶媒又は溶媒混合物中の精製すべき固形物を通常沸点に置き、続いて、該溶液の冷却、後にろ過によって分離される該固形物の再結晶の誘導からなる。また、その溶質は、溶媒を蒸発させることにより沈殿させて濃縮することができる。
【００４９】
より具体的には、再結晶のステップは、以下のステップ、
ｄ）前述した方法に係るステップｃ）の後に得られる抽出物を、４０℃から７０℃の間の温度に達した水及びアルコール系溶媒を含む溶媒混合物中で可溶化し、それにより溶液を得るステップと、
ｅ）ステップｄ）の後に得られる溶液の温度を−２０℃から３０℃の間の温度まで低下させ、それにより冷却された混合物を得るステップと、
ｆ）前記冷却された混合物をろ過し、それによりろ液を得るステップと、
ｇ）前記ろ液を濃縮するステップと、
を含み、それにより、マデカッソシド、テルミノロシド及びアシアチコシドの混合物を含むセンテラアジアチカの純化された抽出物を得る。
【００５０】
本発明の範囲内においては、前記再結晶の溶媒混合物は、水及びアルコール系溶媒を含む溶媒混合物である。特に好ましい再結晶溶媒混合物は、好ましくは５５℃から６５℃、優先的にはおよそ６０℃に達した７０％の水及び３０％のアルコール系溶媒（好ましくはエタノール又はメタノール）を含む。
【００５１】
前記再結晶の溶媒混合物は、所望により精製すべき抽出物の可溶化を可能にするために沸騰させる。
【００５２】
ステップｃ）の後に得られた抽出物の可溶化において、抽出物全体が可溶化したときに、溶媒の添加を停止するために、通常、該溶媒混合物は滴下して添加する。
【００５３】
次いで、得られた溶液は、アシアチコシドの結晶化を誘導するために冷却する。
温度の下降は一般にゆっくり徐々に行い、形成されたアシアチコシドの結晶の純度を上昇させて、それにより、この結晶中にテルミノロシド及びマデカッソシドを捕集しないようにするため、１から２５０時間の間の時間が好都合であり、好ましくは１００から２５０時間である。これにより母液中の該化合物の含有量が低下する。上記冷却した混合物の温度は通常−１０℃から１０℃の間であり、好ましくは−５℃から５℃の間である。
【００５４】
形成された結晶及び特にテルミノロシド及びマデカッソシドを含む母液を含む上記冷却した混合物はろ過して、達した温度で不溶性の結晶化した及び／又は沈殿した固形物を除去する。除去した結晶は通常７５％よりも多いアシアチコシドを含み、再使用しうる。
【００５５】
通常、抽出物の総重量に対して、５０重量％よりも多い、又は６０％よりも多い、又は７０％よりも多いマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物を含む、センテラアジアチカの純化された抽出物が得られる。
【００５６】
さらに、この抽出物は、抽出物の総重量に対して、１５重量％より少ない、又は１０％より少ないアシアチコシドを含む。
【００５７】
また、本発明は、マデカッソシド及びテルミノロシドの混合物を含むセンテラアジアチカの精製された抽出物を調製する方法に関し、該方法は、前述した本方法に係るステップｇ）に従って得られた純化された抽出物を、水及びアルコール系溶媒を含む溶媒混合物を用いて精製するステップを含む。
【００５８】
本明細書において、用語“センテラアジアチカの精製された抽出物”とは、抽出物の総重量に対して、９０重量％よりも多いマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物を含むセンテラアジアチカの抽出物を意味する。この抽出物は抽出物の総重量に対して、通例６重量％より少ないアシアチコシドを含む。
【００５９】
本発明方法の精製ステップは、通常、センテラアジアチカの純化された抽出物に含まれるアシアチコシドの４０％よりも多い、又は５０％よりも多い割合を除去することを可能にする。
【００６０】
本発明方法の最初の他の態様においては、前記精製ステップは以下のステップ、
ｈ）前述した本方法のステップｇ）に従って得られる純化された抽出物に、２５℃から６５℃の間の温度に達したアルコール系溶媒、及び所望により水を含む溶媒混合物を添加し、それにより溶液を得るステップと、
ｉ）溶液の温度を−２０℃から３０℃の間の温度まで低下させ、それにより冷却された混合物を得るステップと、
ｊ）冷却された混合物をろ過し、それによりろ液を得るステップと、
ｋ）ろ液を濃縮するステップと、
を含み、それにより、マデカッソシド及びテルミノロシドの混合物を含むセンテラアジアチカの精製抽出物を得る、
【００６１】
前述した方法に係るステップｇ）に従って得られる純化された抽出物に、ステップｈ）で添加された溶媒混合物は、少なくとも８５重量％のアルコール系溶媒を含むことが好都合であり、好ましくは少なくとも９５重量％である。この溶媒混合物は３０℃から５０℃にするのが好都合であり、優先的にはおおよそ４５℃の温度である。
【００６２】
ステップｇ）に従って得られる抽出物の可溶化において、抽出物全体が可溶化したときに、溶媒の添加を停止するために、通常、該溶媒混合物は滴下して添加する。  
【００６３】
次いで、得られた溶液を一般にゆっくり徐々に、好ましくは１から２５０時間の時間で、好ましくは−１５℃と１５℃、好都合であるのは−１０℃と０℃、優先的には約−５℃の温度に冷却する。
【００６４】
形成された結晶と母液を含み、特にテルミノロシド及びマデカッソシドを含む前記冷却した混合物はろ過し、達した温度で不溶性の結晶化した及び／又は沈殿した固形物を除去する。母液とも称するろ過液は蒸留により濃縮し、通常真空乾燥する。
【００６５】
本発明方法の精製ステップにより、抽出物の総重量に対して９０重量％よりも多いマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物を含むセンテラアジアチカの精製抽出物を得る。さらに、この抽出物は抽出物の総重量に対して６重量％よりも少ないアシアチコシドを含む。
【００６６】
この精製ステップは、２から３回繰り返すことができ、それによりセンテラアジアチカの精製抽出物のマデカッソシド及びテルミノロシドの含有量を増加させることが好都合である。この精製ステップを繰り返すことにより、抽出物の総重量に対して９５重量％よりも多い、あるいはさらに９８重量％よりも多いマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物とすることが可能となり、かつ、抽出物の総重量に対してアシアチコシドを３重量％よりも少ない、あるいは１重量％よりも少なくすることができる。
【００６７】
ステップｇ）により得られたセンテラアジアチカの純化抽出物及びステップｋ）により得られたセンテラアジアチカの精製抽出物は、所望によりその後、シリカゲル分取クロマトグラフィーの手段により精製して、そのマデカッソシド及びテルミノロシドの各含有量を増加させることができる。このクロマトグラフィーのステップは、溶離液として、アルコール系溶媒と水を含む溶媒混合物を使用して行う。
【００６８】
本明細書においては、分取クロマトグラフィーで使用される溶離液は通例極性溶媒である。望ましくは、該溶媒は、水とエタノール等のアルコール系溶媒の混合物、好ましくは１：１の割合の水とエタノール（５０％水及び５０％エタノール）を含む混合物である。
【００６９】
本発明の範囲においては、分取クロマトグラフィーで使用される固定相は非極性固定相である。該固定相はグラフト化非極性シリカからなることが望ましい。非極性グラフト鎖は、２から１８の炭素原子が望ましく、より望ましくは、１２から１８の炭素原子である。
【００７０】
また、本発明は、マデカッソシド及びテルミノロシドの混合物を含むセンテラアジアチカの精製された抽出物を調製するための方法であって、前記方法が、以下の、
ａ）水又は少なくとも１０重量％の水及び所望によりアルコール系溶媒を含む溶媒混合物を用いてセンテラアジアチカの空中部分を抽出し、それにより水溶液を得るステップ、
α）該水溶液を、吸着性樹脂の上を通過させるステップ、
β）少なくとも３０重量％のアルコール系溶媒、及び所望により水を含む溶離剤で前記吸着性樹脂を溶離し、それにより溶離液を得るステップ、
ｂ）該溶離液を、変色する樹脂の上を通過させ、それにより変色した水相を得るステップ、
ｃ）該変色した水相を濃縮し、それにより抽出物を得るステップ、
ｄ）ステップｃ）の後に得られる抽出物を、４０℃から７０℃の間の温度に達した水及びアルコール系溶媒を含む溶媒混合物中で可溶化し、それにより溶液を得るステップ、
ｅ）ステップｄ）の後に得られる溶液の温度を−２０℃から３０℃の間の温度まで低下させ、それにより冷却された混合物を得るステップ、
ｆ）冷却された混合物をろ過し、それによりろ液を得るステップ、
ｇ）該ろ液を濃縮し、それにより純化された抽出物を得るステップ、
ｈ）前記方法に係るステップｇ）に従って得られる純化された抽出物に、２５℃から６５℃の間の温度に達したアルコール系溶媒、及び所望により水を含む溶媒混合物を添加し、それにより溶液を得るステップ、
ｉ）該溶液の温度を−２０℃から３０℃の間の温度まで低下させ、それにより冷却された混合物を得るステップ、
ｊ）冷却された混合物をろ過し、それによりろ液を得るステップ、
ｋ）該ろ液を濃縮するステップ、を含み、それにより、マデカッソシド及びテルミノロシドの混合物を含むセンテラアジアチカの精製抽出物を得る方法である。
【実施例】
【００７１】
実施例１
センテラアジアチカの生抽出物の調製
１キロのセンテラアジアチカの葉（切断した葉）を７０℃に加熱した２０リットルの水に浸漬する。解離させるために該混合物を撹拌下で２時間放置し、次第に増加する多孔度（６００μｍ、その後１００μｍ、その後２５μｍ）のフィルタで連続的にろ過する。
これにより、１６．２リットルの生抽出物が得られ、該生抽出物には、総乾燥物重量に対して、１１．８重量％の値のマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物、及び１０．９重量％の値のアシアチコシドを含む２％の乾燥物を含む。
【００７２】
センテラアジアチカの半純化された抽出物の調製
前記液体生抽出物をＲＥＳ―００８２０（Burgundy）型の吸着性樹脂の上を通過させ、該樹脂は次いで７０％のエタノールと３０％の水（vol/vol）からなる溶離剤で溶離する。
【００７３】
回収されたエタノール系溶離液をＲＥＳ―０１５４１（Burgundy）型のアニオン性の変色する樹脂の上を通過させ、該変色された相を蒸留により脱アルコール化し、真空濃縮し、それにより、変色させた水性の濃縮物を得る。次いで、この濃縮物は凍結乾燥させる。
【００７４】
これにより、総抽出物重量に対して、４７．２重量％の値のマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物、及び３７．４重量％の値のアシアチコシドを含む７０ｇの半純化された抽出物が得られる。
【００７５】
センテラアジアチカの純化された抽出物の調製
半純化された抽出物は、７０％の水及び３０％のメタノールを含む溶液で可溶化し、６０℃の温度に達している。該抽出物を完全に可溶化した後、該溶液の温度を２４０時間にわたって５℃の温度に低下させる（低温装置の後、冷蔵庫で保管）。
【００７６】
得られた冷却混合物はろ過し、ろ過物は蒸留により脱アルコール化し、真空濃縮し、それにより、純化された水性の濃縮物が得られる。次いで、この濃縮物は凍結乾燥される。
【００７７】
これにより、総抽出物重量に関して、６７．２重量％の値のマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物、及び１０重量％未満の値（４．５％）のアシアチコシドを含む４５ｇの純化された抽出物が得られる。
【００７８】
センテラアジアチカの精製された抽出物の調製
前記純化された抽出物は５％の水と９５％のメタノールを含む溶液で可溶化し、４５℃の温度に達している。該抽出物を完全に溶解した後、該溶液の温度を１２０時間にわたって５℃の温度に低下させる。
【００７９】
得られた冷却混合物はろ過し、ろ過物は蒸留により脱アルコール化し、真空濃縮し、それにより、純化された水性の濃縮物が得られる。次いで、この濃縮物は凍結乾燥される。
【００８０】
これにより、総抽出物重量に関して、９０重量％より大きい値（９１．２％）のマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物、及び６重量％未満の値（３．１％）のアシアチコシドを含む２０ｇの精製された抽出物が産生される。
【００８１】
実施例２
センテラアジアチカの生抽出物の調製
１キロのセンテラアジアチカの葉（切断した葉）を５０℃に加熱した１５リットルの７０％のエタノールに浸漬する。解離させるために該混合物を撹拌下で２時間放置し、次第に増加する多孔度（６００μｍ、その後１００μｍ、その後２５μｍ）のフィルタで連続的にろ過する。
次いで、前記ろ過物は蒸留により脱アルコール化し、濃縮されたろ過物をろ過する。
これにより、３．７リットルの液体の生抽出物が得られ、該生抽出物には、総乾燥物重量に対して、１１．２重量％の値のマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物、及び８．６重量％の値のアシアチコシドを含む９％の乾燥物を含む。
【００８２】
センテラアジアチカの半純化された抽出物の調製
前記液体生抽出物をＲＥＳ―００４０８（Burgundy）型の吸着性樹脂の上を通過させ、該樹脂は次いで６０％のエタノールと４０％の水（vol/vol）からなる溶離剤で溶離する。
【００８３】
回収されたエタノール系溶離液をＲＥＳ―０１９５３（Burgundy）型のアニオン性の変色する樹脂の上を通過させ、次いでＲＥＳ―０１７４７（Burgundy）型のアニオン性のイオン交換樹脂、次いでＲＥＳ―０２０５６（Burgundy）型のアニオン性のイオン交換樹脂の上を通過させる。該変色かつ脱イオン化された相を真空濃縮し、それにより、変色かつ脱イオン化させた水性の濃縮物を得る。次いで、この濃縮物は凍結乾燥（あるいは所望により噴霧乾燥）させる。
【００８４】
これにより、総抽出物重量に対して、４７．２重量％の値のマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物、及び２７．４重量％の値のアシアチコシドをもつ６０ｇの半純化された抽出物が得られる。
【００８５】
センテラアジアチカの純化された抽出物の調製
半純化された抽出物は、７０％の水及び３０％のメタノールを含む溶液で可溶化し、６０℃の温度に達している。該抽出物を完全に可溶化した後、該溶液の温度を２４０時間にわたって５℃の温度に低下させる（低温装置の後、冷蔵庫で保管）。
【００８６】
得られた冷却混合物はろ過し、ろ過物は蒸留により脱アルコール化し、真空濃縮し、それにより、純化された水性の濃縮物が得られる。次いで、この濃縮物は凍結乾燥される。
【００８７】
これにより、総抽出物重量に対して、６７．５重量％の値のマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物、及び１３．２重量％の値のアシアチコシドを含む３５ｇの純化された抽出物が得られる。
【００８８】
センテラアジアチカの精製された抽出物の調製
前記純化された抽出物は５％の水と９５％のメタノールを含む溶液で可溶化し、４５℃の温度に達している。該抽出物を完全に溶解した後、該溶液の温度を１２０時間にわたって５℃の温度に低下させる。
【００８９】
得られた冷却混合物はろ過し、ろ過物は蒸留により脱アルコール化し、真空濃縮し、それにより、純化された水性の濃縮物が得られる。次いで、この濃縮物は凍結乾燥される。
【００９０】
これにより、総抽出物重量に対して、９０重量％より大きい値（９１．５％）のマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物、及び６重量％未満（４．６％）の値のアシアチコシドを含む２０ｇの精製された抽出物が得られる。
【手続補正書】
【提出日】平成25年1月9日(2013.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抽出物の総重量に対して５０重量％よりも多いマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物を含むセンテラアジアチカの純化された抽出物を調製するための方法であって、前記方法が、以下の、
ａ．水中、又は、少なくとも水及び所望によりアルコール系溶媒を含む溶媒混合物中のセンテラアジアチカ植物の葉の空中部分を、２０から９０℃の温度で、２０から１８０分間、１：２〜１：２０の間の［センテラアジアチカ］：［溶媒混合物］比で、撹拌下で解離するステップと、それに続いて、
解離混合物をろ過し、それにより水溶液を得るステップと、
α．得られた水溶液を、トリペルテンヘテロシドを吸着するのに適した吸着性樹脂の上を通過させるステップと、
β．前記吸着性樹脂を、少なくとも３０重量％のアルコール系溶媒、及び所望により水を含む溶離液で溶離し、それにより溶離液を得るステップと、それに続いて、
得られた溶離液を活性炭素で処理するステップと、
ｂ．処理した溶離液を、強アニオン性スチレン−クロライド型の変色する樹脂の上を通過させ、その後にスルホネート型官能基を含む強カチオン性イオン交換樹脂の上、及び、第四級アンモニウム型官能基を含む強アニオン性イオン樹脂の上に連続的に通過させることによって処理するか、あるいは溶離液を前記混合樹脂の上に通過させ、それにより変色した水相を得るステップと、
ｃ．２００ｋＤａから１００ｋＤａのカットオフ閾値を有する媒体を用いる、有機もしくは無機質膜でのタンジェンシャルろ過膜技術を用いて、変色した水相を真空濃縮し、それにより抽出物を得るステップと、それに続いて
以下により得られる抽出物を再結晶するステップと、
ｄ．得られた抽出物を、４０℃から７０℃の間の温度に達した水及びアルコール系溶媒を含む溶媒混合物中で可溶化し、それにより溶液を得るステップと、
ｅ．温度を１から２５０時間ゆっくり徐々に低下させて、−２０℃から３０℃の間の冷却混合物温度とし、それにより冷却混合物を得るステップと、
ｆ．冷却混合物をろ過し、それによりろ液を得るステップと
ｇ．蒸留によってろ液を濃縮し、それにより抽出物の総重量に対して１５重量％未満のアシアチコシドを含む純化された抽出物を得るステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
ステップａ）の溶媒混合物が、少なくとも１０重量％の水及びアルコール系溶媒を含む少なくとも２つの溶媒の混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
センテラアジアチカの空中部分が、５０℃から７０℃の間の温度で解離する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
センテラアジアチカの空中部分が、５０℃の領域の温度で解離する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
解離混合物が、６００μｍ、１００μｍ及び２５μｍの多孔性フィルタによる連続ろ過によってろ過される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップα）の前に、以下の、
ステップａ）に従って得られるろ液を濃縮するステップと、それに続いて
固体又は水溶液形態の強アルカリ性水酸化物無機塩基（水酸化リチウムＬｉＯＨ、水酸化ナトリウムＮａＯＨ又は水酸化カリウムＫＯＨ）、又は生石灰ＣａＯ、又は消石灰Ｃａ（ＯＨ）２で塩基性化するステップと、それに続いて
強鉱酸、例えばリン酸Ｈ３ＰＯ４、塩酸ＨＣｌ、硝酸ＨＮＯ３、硫酸Ｈ２ＳＯ４、過塩素酸ＨＣｌＯ４、臭化水素酸ＨＢｒ、又は有機酸などで酸性化するステップと、
酸性化した混合物をろ過するステップと、
が先に行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップαの吸着性樹脂がスチレン−ジビニルベンゼン又はホルモ−フェノール型の樹脂であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップβの溶離剤が、６０から７０重量％のアルコール系溶媒、より具体的には６０から７０重量％のエタノール、及び水を含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）の前に、以下の、
アルコール系溶媒を蒸留することにより得られる溶離液を濃縮するステップと、
蒸留した溶離液を濃縮するステップと、
が先に行われる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｄ）の前に、真空乾燥又は噴霧乾燥ステップが先に行われる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｄ）で添加された溶媒混合物が、７０％の水及び３０％のメタノールを含み、６０℃の領域の温度に達していることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｅ）で温度を１００から２５０時間にわたって低下させて、−５℃から５℃の間の冷却混合物温度とすることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
抽出物の総重量に対して９０重量％よりも多いマデカッソシド及びテルミノロシドの混合物を含むセンテラアジアチカの精製抽出物を調製するための方法であって、前記方法が、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法に従って得られた純化された抽出物を精製するためのステップを含み、前記精製ステップが、以下の、
ｈ．請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法に従って得られた純化された抽出物に、３０℃から５０℃の間の温度に達した、アルコール系溶媒及び所望により水を添加し、それにより溶液を得るステップと、
ｉ．溶液の温度を１から２５０時間ゆっくり徐々に低下させて、−１５℃から１５℃の間の温度とし、それにより冷却混合物を得るステップと、
ｊ．冷却混合物をろ過し、それによりろ液を得るステップと、
ｋ．ろ液を蒸留により濃縮し、それにより抽出物の総重量に対して６重量％未満、又は１重量％未満のアシアチコシドを含む精製抽出物を得るステップと、
を含む、方法。
【請求項１４】
ステップｈ）の溶媒混合物が、４５℃の領域の温度に達していることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｉ）で温度を１００から２５０時間にわたって低下させて、−５℃前後の冷却混合物温度とすることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の方法。
【国際調査報告】
2013537888.tif 000005
2013537888.tif 000006
2013537888.tif 000007
2013537888.tif 000008
2013537888.tif 000009
2013537888.tif 000010