(57)【要約】  非還元条件下で１５ｋＤａの分子量を有するセクレトグロビンであり、一緒に連結した約５ｋＤａの分子量を有する第一のペプチド鎖と約１０ｋＤａの分子量を有する第二のペプチド鎖とを含む単離されたウマアレルゲン、ならびに該ウマアレルゲンと共通の抗体に対するエピトープを有するそれらの変異体およびフラグメントを開示する。さらに診断および治療におけるアレルゲンの使用、加えて該アレルゲンを含む診断キットおよび医薬組成物も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非還元条件下で１５ｋＤａの分子量を有するセクレトグロビンであり、一緒に連結した５ｋＤａの分子量を有する第一のペプチド鎖と１０ｋＤａの分子量を有する第二のペプチド鎖とを含む単離されたウマアレルゲン、ならびに抗体に対する該ウマアレルゲンと共通のエピトープを有するそれらの変異体およびフラグメント。
【請求項２】
ウマから精製された、または、組換え生産された、請求項１に記載のウマアレルゲン。
【請求項３】
第一のペプチド鎖が、Ｎ末端アミノ酸配列ＡＴＣＰＡＶＡＴＤＩＡＳＦＦＬＬＰＤＳＬ（配列番号１）を含む、請求項１または２に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。
【請求項４】
第二のペプチド鎖が、Ｎ末端アミノ酸配列ＧＳＧＣＱＬＬＥＤＶＶＥＫＴＩＴＡＥＬＳ（配列番号２）を含む、請求項１〜３請求項のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。
【請求項５】
第一のペプチド鎖が、アミノ酸配列ＱＣＩＮＥＩＳＡＧＤＲＹＩＩＴＥＴＬＧＫ（配列番号３）を有するセグメントを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。
【請求項６】
第一のペプチドセグメントが、アミノ酸配列ＡＴＣＰＡＶＡＴＤＩＡＳＦＦＬＬＰＤＳＬＦＫＬＱＬＩＫＹＱＡＰＰＥＡＫＤＡＴＭＱＶＫＱＣＩＮＥＩＳＡＧＤＲＹＩＩＴＥＴＬＧＫＩＶＬＱＣＧＡ（配列番号４）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。
【請求項７】
第二のペプチドセグメントが、アミノ酸配列ＧＳＧＣＱＬＬＥＤＶＶＥＫＴＩＴＡＥＬＳＰＡＥＹＶＥＡＶＱＥＦＩＰＤＥＡＴＥＫＡＡＩＱＬＫＱＣＹＬＫＱＳＮＥＴＬＮＤＦＲＴＭＭＮＳＭＹＮＳＡＹＣＡＬＦ（配列番号５）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のウマアレルゲンをコードする単離された核酸配列。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
インビトロでの１型アレルギーの診断に使用するための請求項１〜７のいずれか一項に記載のウマアレルゲン。
【請求項１２】
インビトロでの１型アレルギーの診断のための診断剤組成物を製造するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のウマアレルゲンの使用。
【請求項１３】
アレルゲン抽出物および／または少なくとも１種の精製したアレルゲン構成要素を含む組成物に、請求項１〜７のいずれか一項に記載のウマアレルゲンを添加する工程を含む、アレルゲン組成物の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法によって得られるアレルゲン組成物。
【請求項１５】
インビトロでの１型アレルギーの診断方法であって、該方法は：
１型アレルギーを有する疑いのある患者からの免疫グロブリンを含む体液サンプルを、請求項１〜７のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、または、請求項１４に記載のアレルゲン組成物と接触させる工程、および、
サンプル中の、前記ウマアレルゲンに特異的に結合するＩｇＥ抗体の存在を検出する工程、
を含み、ここで、このような前記ウマアレルゲンに特異的に結合するＩｇＥ抗体が存在することは、１型アレルギーであることを示す、上記方法。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、または、請求項１４に記載の組成物を含む、請求項１５に記載の方法を行うための診断キット。
【請求項１７】
１型アレルギーの予防的または治療的処置に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のウマアレルゲン。
【請求項１８】
１型アレルギーの予防的または治療的処置のための治療用組成物を製造するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のウマアレルゲンの使用。
【請求項１９】
１型アレルギーの治療に感受性を有する個体に、請求項１〜７のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、または、ＩｇＥ結合反応を排除するかまたは弱められるように改変された形態のウマアレルゲンを投与することを含む、１型アレルギーの治療方法。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、または、ＩｇＥ結合反応を排除するかまたは弱められるように改変された形態のウマアレルゲン、および、任意に医薬的に許容されるキャリアー、賦形剤、緩衝液および希釈剤の少なくとも１種を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギーの分野に関する。より具体的には、本発明は、哺乳動物からの新規のアレルゲンの同定、および、哺乳動物に対するアレルギーの診断および治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
先進工業国における人口のおよそ２０％が、様々な環境要因由来の抗原に曝露されると過剰反応（アレルギー性）を示すようになっている。このような即時的および／または遅延型の過敏症を誘発させる抗原は、アレルゲンとして知られている（Breiteneder et al. 1997）。このようなアレルゲンとしては、イネ科植物の産物、木、草類、動物の鱗屑、昆虫、食物、薬物および化学物質が挙げられる。アトピー性アレルギーに関与する抗体は、主として免疫グロブリンＥアイソタイプ（ＩｇＥ）に属する。ＩｇＥは、特異的な高親和性受容体ＦｃεＲＩを介して好塩基球、肥満細胞および樹状細胞に結合する。アレルゲンに曝露されると、細胞表面にアレルゲン特異的なＩｇＥ抗体と架橋を形成し、それによりヒスタミンやロイコトリエンなどの炎症性メディエータの放出が起こり、結果としてアレルギーの生理学的徴候が生じる（Akdis 2006）。
【０００３】
アレルギーの診断テストは、アレルゲン源由来のタンパク質に特異性を有する患者からのＩｇＥ抗体を検出することを含む。これらの試験には、典型的には、タンパク質の混合物を含むアレルゲン源からの水性抽出物が用いられる。ほとんどのアレルゲン源について、粗抽出物中に存在するアレルゲンタンパク質の一部しか同定および特徴付けがなされていない。患者における特異的なＩｇＥ抗体を検出するための診断テストの手順は、患者由来の血清を用いたインビトロでのイムノアッセイを利用するか、または、患者の皮膚に特異的な抽出物を局所的に塗布することによって行われる皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）（Wainstein et al. 2007）によって行うことができる。
【０００４】
近年、アレルゲン抽出物中の重要な様々なアレルゲンタンパク質が同定され特徴付けられている。これにより、これら個々のアレルギーを起こす構成要素それぞれに特異的なＩｇＥ抗体の定量が可能になり、これは、しばしば構成要素分解診断法（component resolved diagnostics ; CRD）（Valenta et al. 1999）（Hiller et al. 2002）と称され、多くの場合、それにより過敏症の診断を改善することができる（Stumvoll et al. 2003）。またＣＲＤの使用は、最適な免疫療法における処置の選択にも役立つことが示唆されている（Valenta et al. 2007）。さらに個々のアレルゲンは、抽出物にアレルゲン構成要素を加えることによって抽出物の診断感度を高めるのに用いられることもある。結論付けると、各アレルゲン源中の全ての重要なアレルゲンタンパク質を同定して特徴付けることは、上記の理由から非常に重要である。
【０００５】
例えば抗ヒスタミンによってアレルギーの症状を軽減することとは別に、特異的な免疫療法を用いてより長期にわたる治癒的なアレルギー治療を行うことができる。病気を引き起こすアレルゲン抽出物を、最も一般的には皮下または舌下のいずれかに塗布することにより、アレルゲンタンパク質に対する予防的な免疫反応の特異的な活性化が起る。正確なメカニズムは完全にはわかっていないが、このような免疫系の特異的な活性化は、その後同じアレルゲンに環境暴露された際のアレルギー症状を緩和する（Akdis et al. 2007）。一定の免疫療法のさらなる開発は、未精製の天然抽出物の代わりに、１種または数種の精製アレルゲンタンパク質を使用することである。このような免疫療法は、イネ科植物の花粉アレルギー患者には成功しており（Jutel et al. 2005）、さらに動物の鱗屑に対するアレルギーも治療することが示唆されている（Gronlund et al. 2009）。
【０００６】
ウマ鱗屑は、一般的な呼吸器のアレルギーの原因になりつつあり（Liccardi et al. 2011）、このアレルギーは鼻炎、結膜炎、気管支炎症および喘息などの症状を示す。アレルギー感作の決定的な危険因子は、職業的にウマアレルゲンに曝露されることであるが（Tutluoglu et al. 2002）、学校などその他の場所でもかなりの濃度のアレルゲンを検出することができる（Kim et al. 2005）。ある研究では、ウマ鱗屑に対するＩｇＥ感作は、喘息を発祥させる高い危険と関連することが示された（Ronmark et al. 2003）。
【０００７】
ウマの毛および鱗屑の抽出物はアレルゲンタンパク質の複雑な混合物を含んでおり、これまでに４種のウマアレルゲン：Ｅｑｕｃ１、Ｅｑｕｃ２、Ｅｑｕｃ３およびＥｑｕｃ４／５が同定されている。最初の２種はいずれもリポカリンタンパク質ファミリーに属するもので、それらの自然源から精製されているが（Dandeu et al. 1993; Goubran Botros et al. 1998）、Ｅｑｕｃ１のみが組換えタンパク質として発現されている（Gregoire et al. 1996）。Ｅｑｕｃ１のアミノ酸配列は、ネコアレルゲンＦｅｌｄ４と６７％類似している（Smith et al. 2004）。Ｅｑｕｃ３はウマ血清アルブミンであり、これは、比較的保存されたタンパク質であり、他の哺乳動物アルブミンに対して広範な交差反応性を示す（Goubran Botros et al. 1996）。Ｅｑｕｃ４／５は、最初に精製され、ウマ鱗屑におけるＩｇＥ結合タンパク質として報告されたものであるが（Goubran Botros et al. 1998; Goubran Botros et al. 2001）、ウマの汗のラセリン（latherin）と同定されたのは後になってからである（McDonald et al. 2009）。Ｅｑｕｃ１は、既知のウマアレルゲンのなかでも最も重要なものと言われており（Dandeu et al. 1993）、組換えタンパク質のＩｇＥ抗体認識は、研究対象のウマアレルギーの被験者の７６％で観察されている（Saarelainen et al. 2008）。精製した天然アレルゲンを用いた別の研究では、ウマアレルギー患者のうち３３％しかＥｑｕｃ２に感作されておらず、Ｅｑｕｃ４／５には２３％しか感作されていなかった（Goubran Botros et al. 1998）。いくつかの研究で、ウマ血清アルブミンへのＩｇＥ結合の頻度を検討したところ、ウマアレルギーの被験者の最大４０％において反応性が認められた（Spitzauer et al. 1993; Cabanas et al. 2000）。しかしながら、血清アルブミンに感作すると、それに伴い他のアレルゲン構成要素に対するＩｇＥ抗体がより高濃度になることが多いことから、その特異的な臨床的関連性は不明確である。
【０００８】
長い間、ウマ鱗屑アレルゲンのＥｑｕｃ１、Ｅｑｕｃ２、Ｅｑｕｃ３およびＥｑｕｃ４／５が知られていたにもかかわらず、ウマ鱗屑に対する全ＩｇＥ反応に対する各構成要素の寄与率の定量的な推定はなされていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Breiteneder, H., K. Hoffmann-Sommergruber, et al. (1997). “Recombinant allergens; basic and practical considerations.” Arbeiten aus dem Paul Ehrlich Institut - Bundesamt fur Sera und Impfstoffe - Zu Frankfurt Am(91): 80-86.
【非特許文献２】Akdis, C. A. (2006). “Allergy and hypersensitivity: mechanisms of allergic disease.” Curr Opin Immunol 18(6): 718-726
【非特許文献３】Wainstein, B. K., A. Yee, et al. (2007). “Combining skin prick, immediate skin application and specific-IgE testing in the diagnosis of peanut allergy in children.” Pediatr Allergy Immunol 18(3): 231-239
【非特許文献４】Valenta, R., J. Lidholm, et al. (1999). “The recombinant allergen-based concept of component-resolved diagnostics and immunotherapy (CRD and CRIT).” Clinical and Experimental Allergy 29(7): 896-904
【非特許文献５】Hiller, R., S. Laffer, et al. (2002). “Microarrayed allergen molecules: diagnostic gatekeepers for allergy treatment.” FASEB Journal16(3): 414-416
【非特許文献６】Stumvoll, S., K. Westritschnig, et al. (2003). “Identification of cross-reactive and genuine Parietaria judaica pollen allergens.” Journal of Allergy and Clinical Immunology 111(5): 974-979
【非特許文献７】Valenta, R. and V. Niederberger (2007). “Recombinant allergens for immunotherapy.” J Allergy Clin Immunol 119(4): 826-830
【非特許文献８】Akdis, M. and C. A. Akdis (2007). “Mechanisms of allergen-specific immunotherapy.” J Allergy Clin Immunol 119(4): 780-791
【非特許文献９】Jutel, M., L. Jaeger, et al. (2005). “Allergen-specific immunotherapy with recombinant grass pollen allergens.” J Allergy Clin Immunol 116(3): 608-613
【非特許文献１０】Gronlund, H., T. Saarne, et al. (2009). “The Major Cat Allergen, Fel d 1, in Diagnosis and Therapy.” Int Arch Allergy Immunol 151(4): 265-274
【非特許文献１１】Liccardi, G., G. D'Amato, et al. (2011). “Sensitization to Horse Allergens in Italy: A Multicentre Study in Urban Atopic Subjects without Occupational Exposure.” Int Arch Allergy Immunol 155(4): 412-417
【非特許文献１２】Tutluoglu, B., S. Atis, et al. (2002). “Sensitization to horse hair, symptoms and lung function in grooms.” Clin Exp Allergy 32(8): 1170-1173
【非特許文献１３】Kim, J. L., L. Elfman, et al. (2005). “Current asthma and respiratory symptoms among pupils in relation to dietary factors and allergens in the school environment.” Indoor Air 15(3): 170-182
【非特許文献１４】Ronmark, E., M. Perzanowski, et al. (2003). “Different sensitization profile for asthma, rhinitis, and eczema among 7-8-year-old children: report from the Obstructive Lung Disease in Northern Sweden studies.” Pediatr Allergy Immunol 14(2): 91-99
【非特許文献１５】Dandeu, J. P., J. Rabillon, et al. (1993). “Hydrophobic Interaction Chromatography for Isolation and Purification of Equ.Cl, the Horse Major Allergen.” Journal of Chromatography-Biomedical Applications 621(1): 23-31
【非特許文献１６】Goubran Botros, H., J. Rabillon, et al. (1998). “Thiophilic adsorption chromatography: purification of Equ c2 and Equ c3, two horse allergens from horse sweat.” Journal of Chromatography. B, Biomedical Sciences & Applications 710(1-2): 57-65.
【非特許文献１７】Gregoire, C., I. Rosinski-Chupin, et al. (1996). “cDNA cloning and sequencing reveal the major horse allergen Equ c1 to be a glycoprotein member of the lipocalin superfamily.” Journal of Biological Chemistry 271(51): 32951-32959
【非特許文献１８】Smith, W., A. J. Butler, et al. (2004). “Fel d 4, a cat lipocalin allergen.” Clinical & Experimental Allergy 34(11): 1732-1738
【非特許文献１９】Goubran Botros, H., C. Gregoire, et al. (1996). “Cross-antigenicity of horse serum albumin with dog and cat albumins: study of three short peptides with significant inhibitory activity towards specific human IgE and IgG antibodies.” Immunology 88(3): 340-347
【非特許文献２０】Goubran Botros, H., P. Poncet, et al. (2001). “Biochemical characterization and surfactant properties of horse allergens.” Eur J Biochem 268(10): 3126-3136.
【非特許文献２１】McDonald, R. E., R. I. Fleming, et al. (2009). “Latherin: a surfactant protein of horse sweat and saliva.” PLoS One 4(5): e5726
【非特許文献２２】Saarelainen, S., M. Rytkonen-Nissinen, et al. (2008). “Animal-derived lipocalin allergens exhibit immunoglobulin E cross-reactivity.” Clin Exp Allergy 38(2): 374-381
【非特許文献２３】Spitzauer, S., C. Schweiger, et al. (1993). “Characterisation of dog allergens by means of immunoblotting.” International Archives of Allergy and Immunology 100: 60-67
【非特許文献２４】Cabanas, R., M. C. Lopez-Serrano, et al. (2000). “Importance of albumin in cross-reactivity among cat, dog and horse allergens.” Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology 10(2): 71-77
【発明の概要】
【００１０】
上述したように、うまく設計された特異的なＩｇＥ抗体のための実験用イムノアッセイを用いれば、天然ウマ鱗屑抽出物を用いてウマへの感作のほとんどのケースを検出することができる。しかしながら、小型化された、または、実験用ではないイムノアッセイ、例えばアレルゲンマイクロアレイ、または、医師の診察室で行われる試験の場合、分析条件があまり好適ではないこと、抗体結合アレルゲン試薬の能力が低いこと、さらに天然アレルゲン抽出物は限定的な効力しか有さないことが組み合わさって、不十分な診断感度しか得られない可能性がある。他の動物上皮に対する特異的なＩｇＥのイムノアッセイについても同様の状況が起こり得る。従って、動物上皮に対する特異的なＩｇＥ抗体のための診断テストにおいて十分な感受性を達成するために、場合によっては純粋なアレルゲンタンパク質を使用することが必要である。
【００１１】
このようなアレルゲンは、慣例的な診断テストにおいて感受性を高めるための試薬としてだけでなく、異なるタイプの構成要素分解診断法の適用においても有用であり得る（Valenta et al. 1999）（Hiller et al. 2002）。免疫療法における新規の試薬として、改善された非アナフィラキシー性を有する純粋なアレルゲンタンパク質またはフラグメントおよびそれらの変異体も使用される可能性がある（Valenta et al. 1999）（Cromwell et al. 2006）（Saarne et al. 2005）；（Jutel et al. 2005）；（Cromwell et al. 2006）。
【００１２】
全ての既知のウマアレルゲン構成要素の精製および解析から、ウマ鱗屑抽出物に対して、個々のウマアレルゲン構成要素に対する反応を全て合計した値よりも有意に高いＩｇＥ反応を示す数人の患者の血清が同定された。これらの血清は、これまで知られていなかったウマアレルゲン構成要素に対するＩｇＥ結合反応性を有することが見出された。
【００１３】
上述の血清を用いて、ウマ鱗屑から新しい主要アレルゲンを精製したところ、セクレトグロビンタンパク質ファミリーの一員と同定することができた。本明細書においてＥｑｕｃ１５ｋと称される新規のウマタンパク質は、ジスルフィド架橋で一緒に結合した１つの１５ｋＤａのアミノ酸鎖と１つの１０ｋＤａのアミノ酸鎖からなる。２種のポリペプチド鎖は別個の遺伝子によってコードされていることを考慮すると、この研究から、これまでウマゲノムの生物情報学的な研究では予測されなかったヘテロ二量体タンパク質の存在が示された。このアレルゲンは、あらゆる形態においてこれまでに知られていたウマアレルゲンとは異なっている。このアレルゲンは、既知のウマアレルゲンのパネルへの重要な追加となり、ウマアレルギーの診断において有用であると予想される。
【００１４】
一形態において、本発明は、非還元条件下でおよそ１５ｋＤａに相当する電気泳動移動度（見かけの分子量）を示し、１個またはそれより多くのジスルフィド結合で一緒に連結した約５ｋＤａの分子量を有する第一のペプチド鎖と約１０ｋＤａの分子量を有する第二のペプチド鎖とを含む、セクレトグロビンファミリーに属する単離されたウマアレルゲンのＥｑｕｃ１５ｋに関する。この本発明の形態はまた、Ｅｑｕｃ１５ｋと共通の抗体に関するエピトープを有するＥｑｕｃ１５ｋの変異体およびフラグメントも含み、ここでこのような変異体およびフラグメントは、このような抗体と少なくとも約５０％まで交差反応する。このような変異体およびフラグメントとしては、例えば、同じ種由来の関連アレルゲンが挙げられる。以下で説明されるその他の本発明の形態においても、用語「Ｅｑｕｃ１５ｋ」は、便宜上、このようなそれらの変異体およびフラグメントも含むものとして用いられる。
【００１５】
その他の形態において、本発明は、最初に述べられた形態に係るアレルゲンをコードする単離された核酸に関し、加えて、核酸分子を含むベクター、および、このようなベクターを含む宿主細胞にも関する。このようなベクターを含む宿主細胞によって生産された組換えタンパク質またはペプチドは、用いられる宿主細胞に応じてグリコシル化されていてもよいし、またはグリコシル化されていなくてもよい。
【００１６】
さらなる形態において、本発明は、Ｉ型アレルギーの診断のための組成物を製造するためのＥｑｕｃ１５ｋの使用に関する。
さらなる形態において、本発明は、Ｅｑｕｃ１５ｋで「スパイクされた」アレルゲン組成物に関する。このようなアレルゲン組成物は、Ｅｑｕｃ１５ｋ含量がゼロか低いアレルゲン抽出物または精製もしくは組換えアレルゲン構成要素の混合物であってもよく、ここでＥｑｕｃ１５ｋは、自身のＩｇＥが組成物中の他のアレルゲン構成要素と結合しないか、または不十分にしか結合しないと予想される患者由来のＩｇＥと結合させるために添加される。またこの本発明の形態は、このような組成物を生産する方法にも関し、本方法は、例えばアレルゲン抽出物などのアレルゲン組成物（任意に他の構成要素でスパイクされていてもよい）、または、精製した天然または組換えアレルゲン構成要素の混合物にＥｑｕｃ１５ｋを添加する工程を含む。
【００１７】
さらにその他のに形態において、本発明は、患者においてＩ型アレルギーを診断するインビトロでの診断方法に関し、ここで体液サンプル、例えば患者からの血液または血清サンプルと、Ｅｑｕｃ１５ｋまたは前述の形態に係る組成物とを接触させることにより、患者のサンプルがＥｑｕｃ１５ｋに特異的に結合するＩｇＥ抗体を含むかどうかを決定することができる。このような診断方法は、当業界でよく知られているあらゆる方法で行うことができる。Ｅｑｕｃ１５ｋは、例えば従来の実験室レベルのイムノアッセイ、マイクロアレイ、または、ラテラルフロー分析においては、例えば固体支持体に固定されていてもよいし、または、流体相試薬として用いてもよい。
【００１８】
その他の形態において、本発明は、前述の形態に係る方法を行うための診断キットに関する。
上述した形態において、野生型Ｅｑｕｃ１５ｋ分子は、上述したように、以下で定義されるような、野生型タンパク質と共通の抗体に対するエピトープを有するＥｑｕｃ１５ｋの天然または人工のフラグメントまたは変異体で置き換えることができる。
【００１９】
本発明はさらに、Ｉ型アレルギーの治療方法に関し、本方法は、以下で説明するように、このような治療が必要な患者に、Ｅｑｕｃ１５ｋまたは改変されたＥｑｕｃ１５ｋを投与することを含む。この本発明の形態はまた、例えば構成要素分解免疫療法（Valenta et al. 2007）などの免疫療法におけるＥｑｕｃ１５ｋの使用にも関する。この形態の一実施態様において、Ｅｑｕｃ１５ｋは、その天然の形態で用いてもよいし、または、天然分子と類似した生化学的および免疫学的な特性を示す組換えの形態で用いてもよい。その他の実施態様において、Ｅｑｕｃ１５ｋは、治療された個体においてそのＩｇＥ抗体結合能力を排除（abrogate）するかまたは弱める（attenuate）ために、同時に好ましくはＩｇＧ反応を惹起できるようにするために化学的または遺伝学的に生成した改変された形態で用いてもよい。改変例としては、これらに限定されないが、分子の断片化、トランケーション、タンデム化もしくは凝集、内部セグメントの欠失、アミノ酸残基の置換、他の高分子構造または他方の低分子量化合物へのジスルフィド架橋または結合を壊すことによるドメインの再構成もしくは少なくとも部分的な三次構造の破壊が挙げられる。この形態のさらにその他の実施態様において、改変されたＥｑｕｃ１５ｋとして、無傷の分子と比較して低いＩｇＥ結合活性を示すＥｑｕｃ１５ｋの個々の１０ｋＤａおよび／または５ｋＤａのサブユニットが用いられる。
【００２０】
上述した全ての本発明の形態において、Ｅｑｕｃ１５ｋタンパク質は、例えば尿、唾液またはその他の体液などのその自然源から精製してもよいし、または、例えばウマの毛髪または鱗屑などの組織から精製してもよい。また、上述したように、当業者によく知られた方法によって組換えＤＮＡ技術によって生産してもよいし、または化学合成によって生産してもよい。
【００２１】
本発明はまた、１型アレルギーの予防的または治療的処置に使用するためのＥｑｕｃ１５ｋにも関し、加えて診断でも使用するためのＥｑｕｃ１５ｋにも関する。
定義
ここで述べられるアレルギーを起こすウマタンパク質であるＥｑｕｃ１５ｋは、セクレトグロビンタンパク質ファミリーに属しており、具体的には２個のヘテロ二量体サブユニットによって形成された四量体タンパク質を含む１つのサブファミリーに属する。ヘテロ二量体は、ジスルフィド架橋によって一緒に連結した異なる遺伝子から誘導された２つの鎖からなる（Klug et al. 2000）。ここで述べられるウマセクレトグロビンは、本明細書においてＥｑｕｃ１５ｋと称される１５ｋＤａのヘテロ二量体であって、これは、それぞれ５±２ｋＤａのサブユニットと１０±２ｋＤａのサブユニットとからなり、これらはそれぞれ、本発明の目的において５および１０ｋＤａサブユニットと称される。分子量の割り当ては、以下の実施例４で説明されてるＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察されたそれらの見かけの分子量に従う。当然ながら見かけの分子量は、例えば電気泳動による分離の媒体およびそれらの濃度、用いられる直線的または濃度勾配のある緩衝液などの分離条件に応じて変動すると予想される。また１０ｋＤａサブユニットにはＮ−グリコシル化部位が含まれるが、グリカン構造にこのような部位が含まれると、見かけの分子量に影響を与える可能性がある。
【００２２】
５ｋＤａ鎖のアミノ酸配列は、予測アミノ酸配列ＡＴＣＰＡＶＡＴＤＩＡＳＦＦＬＬＰＤＳＬＦＫＬＱＬＩＫＹＱＡＰＰＥＡＫＤＡＴＭＱＶＫＱＣＩＮＥＩＳＡＧＤＲＹＩＩＴＥＴＬＧＫＩＶＬＱＣＧＡ（配列番号４）を有し、理論上の分子量は、７．５ｋＤａである。
【００２３】
１０ｋＤａ鎖のアミノ酸配列は、予測アミノ酸配列ＧＳＧＣＱＬＬＥＤＶＶＥＫＴＩＴＡＥＬＳＰＡＥＹＶＥＡＶＱＥＦＩＰＤＥＡＴＥＫＡＡＩＱＬＫＱＣＹＬＫＱＳＮＥＴＬＮＤＦＲＴＭＭＮＳＭＹＮＳＡＹＣＡＬＦ（配列番号５）を有し、理論上の分子量は、８．４ｋＤａである。
【００２４】
特筆すべきことに、様々な哺乳動物種において構造的に関連するタンパク質が説明されているが、アレルゲンと定義されたタンパク質は、主要なネコアレルゲンＦｅｌｄ１のわずか１種である（登録番号Ｐ３０４３８およびＰ３０４４０）。
【００２５】
Ｅｑｕｃ１５ｋの変異体およびフラグメントは、ヘテロ二量体における各鎖が少なくとも１０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも４０個、さらにより好ましくは少なくとも５０個または６０個のアミノ酸残基の長さを有し、前記Ｅｑｕｃ１５ｋとの配列同一性が少なくとも５０％、好ましくは６０％より高い、７０％、８０％、９０％または９５％であるタンパク質またはペプチドを意味するものと解釈されるべきである。
【００２６】
本発明の環境において、改変されたＥｑｕｃ１５ｋは、例えば上記で本発明の免疫療法の形態に関して例示されたように、その免疫学的な特性を変えるために化学的に改変された、または、遺伝子組換えされたＥｑｕｃ１５ｋ変異体を意味するものとして解釈されるべきである。
【００２７】
Ｅｑｕｃ１５ｋと共通の抗体に対するエピトープを有するＥｑｕｃ１５ｋの変異体およびフラグメントは、代表的なＥｑｕｃ１５ｋに感作した患者の血清サンプルからの抗体（例えばＩｇＥまたはＩｇＧ抗体）との結合が、Ｅｑｕｃ１５ｋによって有意に阻害される可能性があるフラグメントおよび変異体と解釈されるべきである。このような阻害分析は、例えば、Mattsson et al. 2009（この開示は、参照により本明細書に組み入れられる）で説明されている方法に従って行ってもよい。
【００２８】
低アレルギー性の改変されたＥｑｕｃ１５ｋまたはＥｑｕｃ１５ｋの変異体もしくはフラグメントは、例えば以下に記載された実施例７に従ったプロトコールによって決定した場合に、代表的なＥｑｕｃ１５ｋに感作した患者の血清サンプルからのＥｑｕｃ１５ｋ反応性ＩｇＥ抗体と結合できない改変されたＥｑｕｃ１５ｋまたはＥｑｕｃ１５ｋの変異体もしくはフラグメントであるか、または、例えば好塩基球のヒスタミン放出分析（Demoly et al. 2003; Ebo et al. 2004）などの細胞活性化分析によって決定した場合に、生物学的なアレルゲン活性がないか、または極めて低い生物学的なアレルゲン活性しか示さない改変されたＥｑｕｃ１５ｋまたはＥｑｕｃ１５ｋの変異体もしくはフラグメントであると解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】図１Ａは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるウマ鱗屑タンパク質の分画化を示す。それに続く精製工程に用いられたピークＡおよびＢは矢印で指定した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｎＥｑｕｃ１の精製を示す。ピークＣおよびＤは、それに続く精製工程に用いられた。
【図１Ｃ】図１Ｃは、疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｎＥｑｕｃ２およびＥｑｕｃ４／５の精製を示す。ピークＥ、ＦおよびＧは、それに続く精製工程に用いられた。
【図１Ｄ】図１Ｄは、陰イオン交換クロマトグラフィーによるｎＥｑｕｃ２の精製を示す。ピークＨおよびＩは、それに続く解析に用いられた。
【図１Ｅ】図１Ｅは、精製したタンパク質のＥｑｕｃ１のＡおよびＢの形態、Ｅｑｕｃ２およびＥｑｕｃ４／５の１４ｋＤａおよび１９ｋＤａの形態のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーンＭは、分子量マーカータンパク質を含み、分子量は左側に示した。
【図２Ａ】図２Ａは、３５種のウマ鱗屑反応性血清を用いてｎＥｑｕｃ１の２つのＡ型およびＢ型のＩｇＥ結合（それぞれピークＣおよびピークＤ）を比較した図である。点線は、０．３５ｋＵＡ／Ｌのカットオフレベルを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、３８種のウマ鱗屑反応性血清を用いてｎＥｑｕｃ４／５の１９ｋＤａおよび１４ｋＤａの形態のＩｇＥ結合を比較した図である。点線は、０．３５ｋＵＡ／Ｌのカットオフレベルを示す。
【図３Ａ】図３は、新規のＩｇＥ結合タンパク質を検索するのに使用された分画の精製を示す。Ａ：陰イオン交換クロマトグラフィーによる分画Ａの精製。
【図３Ｂ】図３は、新規のＩｇＥ結合タンパク質を検索するのに使用された分画の精製を示す。Ｂ：疎水性相互作用クロマトグラフィーによる分画ＢおよびＣの精製。
【図４Ａ】図４は、１５ｋＤａのウマ鱗屑タンパク質の精製を示す。Ａ：サイズ排除クロマトグラフィーによるウマ鱗屑抽出物の分画化。ピークＡは、それに続く精製工程に用いられた。
【図４Ｂ】図４は、１５ｋＤａのウマ鱗屑タンパク質の精製を示す。Ｂ：疎水性相互作用クロマトグラフィーによるピークＡの分画化である。ピークＪは、図で指定された通りにプールされ、それに続く精製工程に用いられた。
【図４Ｃ】図４は、１５ｋＤａのウマ鱗屑タンパク質の精製を示す。Ｃ：陰イオン交換クロマトグラフィーによるピークＪの分画化。ピークＫおよびＬは、それに続く解析および／またはさらなる精製工程に用いられた。
【図４Ｄ】図４は、１５ｋＤａのウマ鱗屑タンパク質の精製を示す。Ｄ：精製した１５ｋＤａのウマ鱗屑タンパク質の還元（Ｒｅｄ）および非還元（Ｏｘ）サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーンＭは、分子量マーカータンパク質を含み、分子量は左側に示した。
【図４Ｅ】図４は、１５ｋＤａのウマ鱗屑タンパク質の精製を示す。Ｅ：逆相クロマトグラフィーによるピークＫの精製の精密化。ピークＭは、その後の免疫学的な解析に用いられた。
【図５】図５は、ｎＥｑｕｃ１５ｋの５ｋＤａおよび１０ｋＤａのアミノ酸鎖の予想された配列を示す。Ｎ末端の配列解析によって同定されたアミノ酸を下線で示し、ＭＳ／ＭＳ解析によって同定されたアミノ酸を太字で示す。
【図６】図６は、免疫ブロッティングによって検出された、ウマアレルギー患者のうち２名（番号３および１２）の血清中のｎＥｑｕｃ１５ｋに対するＩｇＥの反応性を示す。最初の２つのストリップは全てのタンパク質の染色を示し、５および１０ｋＤａサブユニットならびに１５ｋＤａのタンパク質それぞれの位置を矢印で示した。右の４つのストリップは、Ｅｑｕｃ１５ｋの還元（Ｒｅｄ）および非還元（Ｏｘ）サンプルへのＩｇＥ結合を示す。
【図７】図７は、天然および組換えＥｑｕｃ１５ｋのＩｇＥ反応性の相関を示す。０．３５ｋＵＡ／Ｌおよび０．１ｋＵＡ／Ｌレベルを点線で示した。
【図８】図８は、２５人のウマ鱗屑アレルギーの被験者の同齢集団における、ウマ鱗屑抽出物（ＨＤＥ）、Ｅｑｕｃ１、ｎＥｑｕｃ２、ｎＥｑｕｃ３、ｎＥｑｕｃ４／５およびｒＥｑｕｃ１５ｋに対するＩｇＥ抗体のレベルを示す。０．１ｋＵＡ／Ｌ未満の観察の数は、各構成要素ごとに括弧内に示した。点線は０．３５ｋＵＡ／Ｌレベルを示し、実線は０．１ｋＵＡ／Ｌレベルを示す。水平のバーは、ＩｇＥの中央値のレベルを示す。
【図９】図９は、ｎＥｑｕｃ１５ｋおよびｒＦｅｌｄ１に対するＩｇＥ抗体結合を比較した図である。０．３５ｋｌＵ／Ｌおよび０．１ｋＵＡ／Ｌレベルを点線で示した。
【図１０】図１０は、固定されたＥｑｕｃ１およびＦｅｌｄ１へのＩｇＥ結合を自己阻害および交差阻害する可溶性Ｅｑｕｃ１５ｋおよびＦｅｌｄ１の能力を示す。ウマ鱗屑アレルギー患者からの血清（表３に従って標識された）またはウマ鱗屑で感作された被験者からの血清（Ａ〜Ｅと標識された）を用いた。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
以下の実施例は、ウマからのセクレトグロビンの単離および使用によって本発明を説明するものである。これらの実施例は単なる説明であり、本発明を制限するものと解釈すべきではなく、本発明は添付の請求項の範囲によって定義される。
【００３１】
実施例１：ウマ鱗屑および血清からの既知のアレルゲンの精製および特徴付け
Ｅｑｕｃ１、Ｅｑｕｃ２およびＥｑｕｃ４／５を精製するための出発原料としてウマ鱗屑を用い、一方でウマ血清からＥｑｕｃ３を精製した。
【００３２】
２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．６）、０．５ＭのＮａＣｌ（ＭＢＳ＝ＭＯＰＳ−緩衝食塩水）中でウマ鱗屑（アレルゴン（Allergon），スウェーデン国バリング（Valinge））を抽出し、遠心分離で透明にし、０．４５μｍの混合型のセルロースエステルフィルター（ミリポア（Millipore），米国マサチューセッツ州ビレリカ）を通過させてろ過した。３種全てのウマ鱗屑アレルゲンにとって第一の精製工程として、透明化した抽出物を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のためにスーパーデックス（SuperdexTM）７５カラム（ＸＫ２６／１００，Ｖｔ＝５０５ｍＬ，ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス（GE Healthcare Life Sciences）、スウェーデン国ウプサラ）に適用し、ＭＢＳを用いて流速２ｍＬ／分で溶出した。
【００３３】
Ｅｑｕｃ１
Ｅｑｕｃ１を精製するために、図１ＡにおけるピークＡを２ＭのＮＨ４ＳＯ４に調整し、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中の２ＭのＮＨ４ＳＯ４で平衡化したフェニルセファロース（Phenyl SepharoseTM）ＨＰカラム（ＨＲ１０／１０，Ｖｔ＝９．０ｍＬ，ＧＥヘルスケアライフサイエンス）に適用した。２Ｍ〜０ＭのＮＨ４ＳＯ４の直線的なＮＨ４ＳＯ４濃度勾配で溶出させた。勾配の中央でＥｑｕｃ１を含む２つのピーク（図１ＢにおけるピークＣおよびＤ）が溶出した。２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．６）、０．５ＭのＮａＣｌで平衡化したセファデックス（SephadexTM）Ｇ２５ファインカラム（ＸＫ１６／２０，Ｖｔ＝３４ｍＬ，ＧＥヘルスケアライフサイエンス）で各ピークを脱塩した後、それぞれのｎＥｑｕｃ１調製物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で、サンプルと１００ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含むＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプル緩衝液（インビトロジェン）とを１：３で混合することによって製造された還元サンプルのＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ緩衝液系（１０％ＮｕＰＡＧＥゲル，インビトロジェン（Invitrogen），米国カリフォルニア州カールスバッド）を用いて処理した。見かけの分子量の指標として、マーク１２（Mark12TM）標準（インビトロジェン）を用いた。いずれのｎＥｑｕｃ１調製物もＳＤＳ−ＰＡＧＥでの判断から純粋であることがわかった（図１Ｅ）。
【００３４】
説明されている通りに、ブルカー・ダルトニクス・オートフレックス（Autoflex）２装置（ブルカー・ダルトニクス（Bruker Daltonics），ドイツ国ブレーメン）でペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）を行うことによってタンパク質調製物を明確にＥｑｕｃ１と同定した（Mattsson et al. 2009）。
【００３５】
説明されている通りに、上記タンパク質の両方の形態をイムノＣＡＰ（ImmunoCAPTM）固相に固定した（Marknell DeWitt et al. 2002）。
Ｅｑｕｃ２
Ｅｑｕｃ２を精製するために、ＳＥＣからの第二のピーク（図１ＡにおけるピークＢ）を１ＭのＮＨ４ＳＯ４に調整し、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）において２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中の１ＭのＮＨ４ＳＯ４で平衡化したフェニルセファロースＴＭＨＰカラム（ＨＲ１０／１０，Ｖｔ＝９．０ｍＬ，ＧＥヘルスケアライフサイエンス）で処理した。同じ緩衝液中の１Ｍ〜０ＭのＮＨ４ＳＯ４の直線的なＮＨ４ＳＯ４濃度勾配で溶出させた。分画（図１ＣにおけるピークＥ）を通過したフロー中にＥｑｕｃ２が含まれており、これをプールして、２０ｍＭのビストリスプロパン（ｐＨ８．５）で平衡化したセファデックスＴＭＧ２５ファインカラム（ＸＫ２６／２０，Ｖｔ＝９０ｍＬ，ＧＥヘルスケアライフサイエンス）で脱塩した。脱塩したＥｑｕｃ２プールを最終的に２０ｍＭのビストリスプロパン（ｐＨ８．５）で平衡化した陰イオン交換カラムソース（SourceTM）１５Ｑ（ＨＲ１６／１０，Ｖｔ＝９ｍＬ，ＧＥヘルスケアライフサイエンス）に適用した。同じ緩衝液中の０〜０．４０Ｍの直線的なＮａＣｌ濃度勾配で溶出させたところ、タンパク質は３つのピークに分解し、これらはいずれも、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析で純粋な１７ｋＤａのバンドを示した。最も大きい２つのピークをＮ末端の配列解析（プロサイス（ProciseTM）ＬＣ４５２、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems)，米国カリフォルニア州フォスターシティー）で解析し、これらはいずれも配列ＤＱＤＰＱＳＥＤＴＹを有しており、これらはＥｑｕｃ２．０２０１と同定された（図１ＤピークＨおよびＩ）。説明されている通りに、ＩｇＥ結合反応性を評価するために、これらのピークをプールし、イムノＣＡＰＴＭ固相に固定した（Marknell DeWitt et al. 2002）。
【００３６】
Ｅｑｕｃ４／５
ＳＥＣからの第二のピーク（図１ＡのピークＢ）を用いてＥｑｕｃ４／５の精製を行った。このプールを１ＭのＮＨ４ＳＯ４に調整し、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）において２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中の１ＭのＮＨ４ＳＯ４で平衡化したフェニルセファロースＴＭＨＰカラム（ＨＲ１０／１０，Ｖｔ＝９．０ｍＬ，ＧＥヘルスケアライフサイエンス）で処理した。同じ緩衝液中の１Ｍ〜０ＭのＮＨ４ＳＯ４の直線的なＮＨ４ＳＯ４濃度勾配で溶出させた。Ｅｑｕｃ４／５タンパク質は、勾配の中央で２つの別個のピーク（図１ＣにおけるピークＦおよびＧ）に溶出した。第一のピークのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析から１４ｋＤａのバンドとして移動するタンパク質が明らかになり、第二のピークは１９ｋＤａのバンドを含むことが明らかになった。その後、２０ｍＭのビストリスプロパン（ｐＨ８．５）で平衡化したセファデックスＴＭＧ２５ファインカラム（ＸＫ２６／２０，Ｖｔ＝９０ｍＬ，ＧＥヘルスケアライフサイエンス）で脱塩した。いずれのタンパク質もＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純粋であることがわかった（図１Ｅ）。これら２種の調製物はいずれもＮ末端配列ＶＧＰＬＬＧＰＳＤＡを示し、これは、ウマラセリンまたはＥｑｕｃ４／５と同定された。
【００３７】
説明されている通りに、ｎＥｑｕｃ４／５の２つの形態を別々にイムノＣＡＰＴＭ固相に固定した（Marknell DeWitt et al. 2002）。
Ｅｑｕｃ３
天然Ｅｑｕｃ３を、実質的に説明されている通りに、ブルー・セファロース（Blue Sepharose）ＦＦ、（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）を用いたアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＩＥＣ）およびＳＥＣによって、ウマ血清から精製した（van Eijk et al. 1999）。
【００３８】
実施例２：ウマに感作された個体からの血清のパネルにおける個々のウマ鱗屑アレルゲン構成要素へのＩｇＥ結合レベルの評価
Ａ型およびＢ型と名付けられたＥｑｕｃ１の２つの形態のＩｇＥ結合活性を、（社内の血清コレクションから得られた）ウマ鱗屑に感作された血清１セットを用いて評価した。図２Ａで示されるように、Ｅｑｕｃ１の２つの形態は、同等のＩｇＥ結合活性を示した。従って以下の分析にはｎＥｑｕｃ１Ａで得られた値のみを用いた。ウマ鱗屑反応性血清の類似のセットを用いて、Ｅｑｕｃ４／５の２つの形態へのＩｇＥ抗体結合を比較したところ、図２Ｂで示されるように、それらは極めて類似していることがわかった。
【００３９】
通常の実験用イムノＣＡＰＴＭ試験（ファディア（Phadia），スウェーデン国ウプサラ）を用いてウマ鱗屑抽出物および精製したウマアレルゲンへのＩｇＥ抗体結合を試験した。実験用イムノＣＡＰＴＭ試験を上述のようにして調製した。ウマ鱗屑で感作された個体からの２９種の血清のパネルを用いた。ウマ鱗屑抽出物、ｎＥｑｕｃ１、ｎＥｑｕｃ２、ｎＥｑｕｃ４／５に対するＩｇＥ反応の決定を行った。結果は表１に示したが、ここで患者Ａ１〜Ａ２９の血清中のＨＤＥおよび構成要素および３種の構成要素の合計に対するＩｇＥ抗体濃度はｋＵＡ／Ｌで表示した。構成要素の割合は、構成要素の合計とウマ鱗屑抽出物との比率であり、パーセンテージで示した。
【００４０】
ウマ鱗屑抽出物に対するＩｇＥ結合のレベルが、個々の構成要素、例えば血清番号Ａ１、Ａ２１およびＡ２２それぞれが占める可能性があるレベルよりも有意に高いレベルを有する多数の血清を同定した。この段階で評価されていないＥｑｕｃ３反応性の可能性を別にしても、同定した血清は、新規のウマ鱗屑由来ＩｇＥ結合タンパク質の検索に役立つ可能性がある。
【００４１】
実施例３：新規のＩｇＥ結合反応性を有するウマ鱗屑からの分画の同定
前もって特徴付けられているウマ鱗屑アレルゲンを精製するプロセスの間に、これまでに知られていたウマアレルゲン以外のタンパク質を含む数種の分画が同定された。上記の実施例２で同定された血清を用いてＩｇＥ結合活性を解析するために特に興味深い３種の分画を選択した。分画Ａには、矢印で示された（図３Ａ）Ｅｑｕｃ２の陰イオン交換による精製工程から得られた１０ｋＤａのバンド（還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が含まれていた。それぞれ１３ｋＤａおよび１０ｋＤａのバンド（還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を含む分画ＢおよびＣをＥｑｕｃ１のＨＩＣ精製工程から得て、これは図３Ｂにおいて矢印で示した。説明されている通りに、実験用イムノＣＡＰＴＭ（ファディア）試験を調製し（Marknell DeWitt et al. 2002）、これを血清解析に用いた。
【００４２】
表２に結果をまとめたが、表２はさらに、以前のウマ鱗屑抽出物の決定とｎＥｑｕｃ１、ｎＥｑｕｃ２およびｎＥｑｕｃ４／５の合計も含み、いずれもｋＵＡ／Ｌとして表示した。分画Ｃにおいて最大ＩｇＥ結合レベルが確認された。特筆すべきことに、血清Ａ１において、分画ＣへのＩｇＥ結合レベルが、ｎＥｑｕｃ１、ｎＥｑｕｃ２およびｎＥｑｕｃ４／５へのＩｇＥ結合の合計よりもかなり高かった。この血清において、アルブミンＩｇＥの反応性は１．５ｋＵＡ／Ｌしか示さなかった（示さず）ことから、分画Ｃには新規のウマ鱗屑アレルゲンが含まれることが示唆される。
【００４３】
実施例４：分画Ｃにおいて優勢なタンパク質成分の精製および同定
分画Ｃからのウマ鱗屑タンパク質の精製
分画Ｃに存在する１０ｋＤａのタンパク質をより高度に標的化した方法で精製するために、ウマ鱗屑抽出物を実施例１で説明されているようにしてＳＥＣで処理した。図で指定された通りに（図４ＡにおけるピークＡ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に従ってＥｑｕｃ１を含むピークをプールした。ピークＡの右側部分だけに１０ｋＤａバンドが含まれており、これをプールした。実施例１においてＥｑｕｃ１に関して説明されている通りに、このプールを２ＭのＮＨ４ＳＯ４に調整し、ＨＩＣで処理した（図４Ｂ）。図４ＢにおけるピークＪを２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）で１：３に希釈し、同じ緩衝液で平衡化したソースＴＭ１５Ｑカラム（ＰＥ４．６／１００，Ｖｔ＝１．７ｍＬ；ＧＥヘルスケアライフサイエンス）に適用した。０〜０．４ＭのＮａＣｌの直線的な濃度勾配で溶出させたところ、濃度勾配の中央において優勢なピーク、それに続いてより小さいピークが得られた（図４ＣにおけるピークＫおよびＬ）。実施例１で説明されているようにＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ緩衝液系を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行ったが、ここでサンプルは、それぞれ還元および非還元条件に応じた４％β−メルカプトエタノール含有または非含有のＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ緩衝液で１：３に希釈することによってサンプルを調製した。両方のピークのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（図４Ｄ）から、非還元条件下でおよそ１５ｋＤａのバンドが出現した。サンプルを還元した際に、１５ｋＤａのバンドが消失したが、同時におよそ５および１０ｋＤａの２つのバンドが現れたことから、非還元の１５ｋＤａのバンドは、１個またはそれより多くのジスルフィド架橋で互いに連結した５ｋＤａおよび１０ｋＤａのバンドを形成するポリペプチドで構成されていることが示唆される。両方のピークは同じタンパク質を含むようにみえるが、大きいピーク（Ｋ）のみをさらなる生化学的解析で処理した。ＩｇＥ結合を研究ために、ＲＰＣ精製工程でサンプルを０．０６５％ＴＦＡの水溶液で平衡化したソースＴＭ５ＲＰＣカラム（ＳＴ２．１／１５０，Ｖｔ＝０．５２ｍＬ；ＧＥヘルスケアライフサイエンス）に適用することにより精製を行った。０．０５％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリルからなる緩衝液Ｂの０〜７０％の直線的な濃度勾配で溶出させた。濃度勾配の終わり付近でタンパク質が単一のピークで溶出した（図４ＥにおけるピークＭ）。
【００４４】
セクレトグロビンとしての１５ｋＤａのウマ鱗屑タンパク質の同定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出し抽出した還元型５ｋＤａおよび１０ｋＤａのタンパク質バンドをＮ末端の配列解析によって解析した。５ｋＤａのバンドの解析から、アミノ酸配列ＡＴｘＰＡＶＡＴＤＩＡＳＦＦＬＬＰＤＳＬ（ｘ：未解析の残基）が明らかになり、これは、「ＬｐｐＡＢに類似」と表示されたエクウス・カバルス（Equus caballus)の予測配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＸＰ＿００１５０２５４４）（配列番号１）の残基２２〜４１とマッチした。１０ｋＤａのバンドの解析から、配列ＧＳＧｘＱＬＬＥＤＶＶＥＫＴＩＴＡＥＬＳ（ｘ：未解析の残基）が明らかになり、これは、「リポフィリンＣＬ２に類似」と表示されたエクウス・カバルス由来の予測配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿００１４９４５６４）（配列番号２）の残基１９〜３８とマッチした。
【００４５】
溶液中でトリプシン消化した１５ｋＤａの精製タンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によるペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）解析を行ったところ、既知のデータベースエントリーとの有意な（ｐ＜０．０５）マッチングはまったく得られなかった。しかしながら、ペプチドのＭＳ−ＭＳ解析ｍ／ｚ＝２２８１およびｍ／ｚ＝１２６２．５によって、「ＬｐｐＡＢに類似」の予想された配列（エクウス・カバルス）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿００１５０２５４４）から配列ＱＣＩＮＥＩＳＡＧＤＲＹＩＩＴＥＴＬＧＫ（配列番号３）が同定された。
【００４６】
ゲル中でトリプシン消化した５ｋＤａフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によるペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）解析を行ったところ、既知のデータベースエントリーとの有意な（ｐ＜０．０５）マッチングはまったく得られなかった。しかしながら、検出された５種の優勢なペプチドはいずれも、配列番号４の予想されたトリプシンフラグメントに相当するものであり、ここでｍ／ｚ＝９０３．４７（残基２８〜３５に相当）、ｍ／ｚ＝１０３７．６（残基４３〜５３に相当）、ｍ／ｚ＝１２６２．６（残基４３〜５３に相当）、ｍ／ｚ＝２２８１．１（残基４３〜６２に相当）およびｍ／ｚ＝２３８４．２（残基１〜２２に相当）であり、これらは合計で、配列番号４の予測のアミノ酸残基のうち５０残基（７２％）にあたる。
【００４７】
ゲル中でトリプシン消化した１０ｋＤａのバンドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によるペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）解析を行ったところ、既知のデータベースエントリーとの有意な（ｐ＜０．０５）マッチングはまったく得られなかった。しかしながら、検出された２種の優勢なペプチドは、ｍ／ｚ＝１４３３．６およびｍ／ｚ＝２８８０．４を示し、これは、それぞれ配列番号５の残基１〜１３および１４〜３９に相当するペプチドＧＳＧＣＱＬＬＥＤＶＶＥＫおよびＴＩＴＡＥＬＳＰＡＥＹＶＥＡＶＱＥＦＩＰＤＥＡＴＥＫの質量と一致した。
【００４８】
同定されたデータベースエントリー、ＸＰ＿００１５０２５４４（配列番号６）およびＸＰ＿００１４９４５６４（配列番号７）両方のアミノ酸配列は、セクレトグロビンタンパク質ファミリーに特有の特徴を示した。従って、総合すると、これらの結果から、１５ｋＤａのウマ鱗屑タンパク質はセクレトグロビンであると同定された。以降、このタンパク質はＥｑｕｃ１５ｋと称する。図５に、Ｅｑｕｃ１５ｋの２種の鎖の前駆体配列の予測される全長配列を示し（５ｋＤａフラグメント−配列番号６；１０ｋＤａフラグメント−配列番号７）、ここでＮ末端の配列解析によって同定されたアミノ酸を下線で示し、ＭＳ−ＭＳ解析によって同定されたアミノ酸を太字で示す。５ｋＤａフラグメントの前駆体配列は、２１個のアミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを含み、１０ｋＤａフラグメントの前駆体配列は、１８個のアミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを含む。特筆すべきすることに、シグナルＰ（signalP）（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）を用いた前駆体配列のシグナルペプチド予想から、５ｋＤａおよび１０ｋＤａ鎖の両方について実験的に得られた配列と同じ成熟配列が得られた。
【００４９】
図４Ｄに記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、非還元条件下において、５および１０ｋＤａのアミノ酸鎖は１個またはそれより多くのジスルフィド架橋で一緒に保持されており、それによりヘテロ二量体タンパク質が形成されることを示す証拠となる。従って、この解析は、配列番号４をコードする遺伝子を、これまで知られていなかったヘテロ二量体のセクレトグロビンタンパク質を共に構成する配列番号５をコードする異なる遺伝子と結びつけるものである。
【００５０】
実施例５：免疫ブロット解析を用いたＥｑｕｃ１５ｋへのＩｇＥ結合の評価
ＩｇＥのタンパク質への反応性がＥｑｕｃ１５ｋのどのサブユニットに対するものなのかを決定するために、還元および非還元条件の両方を用いた免疫ブロット解析を行った。
【００５１】
４〜２０％ＮｕＰＡＧＥゲル（インビトロジェン）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した精製Ｅｑｕｃ１５ｋの還元および非還元サンプルで免疫ブロット解析を行い、ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）にエレクトロブロッティングした。ブロッキング緩衝液（５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．４）、０．１％（体積／体積）トゥイーン（TweenTM）２０、０．９％（質量／体積）ＮａＣｌ、０．３％（質量／体積）デキストランＴ１０）を用いてタンパク質ブロットを室温で１時間ブロッキングし、それぞれブロッキング緩衝液で１：４．８および１：１３．５に希釈した患者３および１２の血清と共に一晩インキュベートした。０．５％（体積／体積）トゥイーン−２０を含む０．１５ＭのＮａＣｌ溶液で洗浄した後に、メンブレンをブロッキング緩衝液中でＨＲＰで標識した抗ヒトＩｇＥ抗体と共に３時間インキュベートし、洗浄した後、結合したＩｇＥを、ＥＣＬアドバンス（ECL Advance）ウェスタンブロッティング検出キット（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）およびＬＡＳ４０００ミニＣＣＤカメラ（フジフィルム（Fujifilm），日本国東京）を用いて蛍光分析によって検出した。
【００５２】
イムノＣＡＰＴＭ解析によれば、解析（患者番号３および１２）で用いられた２種の血清はいずれもＥｑｕｃ１５ｋに対して優勢な反応性を示した（以下の実施例７を参照）。いずれの血清も、還元型５ｋＤａおよび１０ｋＤａサブユニットに相当する弱いバンドとして観察された、還元条件下で解離したＥｑｕｃ１５ｋのサブユニットとは、弱い反応しか示さなかった（図６）。Ｅｑｕｃ１５ｋの非還元型１５ｋＤａバンドに相当するバンドとは、非還元条件下でそれよりかなり強い反応性が観察された。この解析において、他のバンドに対して有意な反応性は観察されなかった。この免疫ブロット解析から、ＩｇＥ結合反応性は、実際には、Ｅｑｕｃ１５ｋ標品の主要なタンパク質バンドに向けられることが実証された。
【００５３】
実施例６：組換えＥｑｕｃ１５ｋの生産および免疫学的な特徴付け
組換えＥｑｕｃ１５ｋのクローニングおよび精製
５ｋＤａおよび１０ｋＤａサブユニットのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を３回含むリンカーペプチドをコードする配列とを組み合わせることによってＥｑｕｃ１５ｋ一本鎖の合成遺伝子を設計した。この合成遺伝子全長を、固定した金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によるタンパク質精製ができるようにＣ末端にヘキサヒスチジンタグを添加したベクターｐＥＴ２３ａ（＋）（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ），米国ウィスコンシン州マディソン）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。
【００５４】
配列番号８に、組換えタンパク質全体のアミノ酸配列を示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，米国カリフォルニア州メンローパーク）において最適なコドンを使用するために、ヌクレオチド配列を設計した。配列番号９に、組換えタンパク質全体をコードする核酸配列を示す。
【００５５】
大腸菌株ＢＬ２１−ＡＩ（インビトロジェン）にプラスミドＤＮＡコンストラクトを形質転換し、３リットルのバイオリアクター（ベラーチ・バイオテクニーク（Belach Bioteknik），スウェーデン国ソルナ）を用いて組換えＥｑｕｃ１５ｋ一本鎖タンパク質を生産した。
【００５６】
組換えＥｑｕｃ１５ｋを精製するために、回収した細胞を２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁し、懸濁液をエマルシフレックス（Emulsiflex）Ｃ５ホモジナイザー（アベスチン（Avestin），カナダ国オンタリオ州オタワ）に１００００〜１５０００ｋＰａで通過させて溶解させた。懸濁液を遠心分離した後、ペレット化した封入体を６Ｍ塩酸グアニジン、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾールに溶解させ、０．４５μｍの混合型のセルロースフィルター（ミリポア）を通過させてろ過した。ろ過した上清をＮｉＳＯ４を充填したキレート化セファロースＦＦカラム（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）に入れた。６Ｍ尿素を含む２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾールを用いてカラムを洗浄し、続いて同じ緩衝液中の６Ｍ〜２Ｍ尿素の直線的な濃度勾配でその場で復元した。復元させた後、同じ緩衝液中の２０〜５００ｍＭのイミダゾールの直線的な濃度勾配によって組換えタンパク質を溶出させた。ＱセファロースＴＭＦＦカラム（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）を用いた２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でのＡＩＥＣによってさらなる組換えタンパク質の精製を行った。０〜０．５ＭのＮａＣｌの直線的な濃度勾配を用いてタンパク質を溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果に従って分画をプールした。２８０ｎｍにおける吸光度から１ｍｇ／ｍＬあたり０．４４の吸光係数により計算して最終的な調製物のタンパク質濃度を決定した。
【００５７】
組換えＥｑｕｃ１５ｋへのＩｇＥ結合の評価
組換えＥｑｕｃ１５ｋを実験用イムノＣＡＰＴＭに固定し、説明されている通りに、３６人のウマ鱗屑に感作された被験者の血清に対するＩｇＥの反応性を決定した（Marknell DeWitt et al. 2002）。
【００５８】
精製した天然Ｅｑｕｃ１５ｋへのＩｇＥ結合と組換えＥｑｕｃ１５ｋへのＩｇＥ結合との間に優れた一致がみられたことから（ｒ＝０．９８）（図７）、組換えタンパク質は免疫学的に活性であり、天然型タンパク質に構造的に類似していることが実証される。これらのデータから、同定されたゲノム配列情報から予測されたＥｑｕｃ１５ｋの５ｋＤａ（配列番号４）および１０ｋＤａ（配列番号５）フラグメントのアミノ酸配列は正しく、精製したウマ鱗屑アレルゲンＥｑｕｃ１５ｋのアミノ酸配列を示すという強い証拠が示される。
【００５９】
実施例７：ウマアレルギー患者の同齢集団におけるｎＥｑｕｃ１、ｎＥｑｕｃ２、ｎＥｑｕｃ３、ｎＥｑｕｃ４／５およびＥｑｕｃ１５ｋへのＩｇＥ結合活性の評価
この研究には、スペイン（ｎ＝２０）およびスウェーデン（ｎ＝５）からの２５人のウマアレルギーの被験者の血清が用いられた。全ての患者は、喘息、鼻結膜炎およびじんましんなどの症状、ならびにウマ鱗屑抽出物に対する皮膚プリックテスト陽性を有するウマアレルギーという医者の診断を受けていた。サンプルおよびデータが寄託されているバイオバンクに寄与する各センターにおける地域倫理委員会の承認の元に、全てのサンプルおよび臨床データを回収した。
【００６０】
イムノＣＡＰＴＭを用いて、２５人のウマアレルギーの被験者における、ウマ鱗屑抽出物、ｎＥｑｕｃ１、ｎＥｑｕｃ２、ｎＥｑｕｃ３およびｎＥｑｕｃ４／５およびｒＥｑｕｃ１５ｋに特異的なＩｇＥ抗体のレベルを決定した（図８，表３）。表３に、全てのイムノＣＡＰＴＭレベルをｋＵＡ／Ｌで示し、各患者の出身国はＥＳ（スペイン）またはＳＥ（スウェーデン）のように表示した。ウマに曝露された際に記録されたアレルギー症状は、鼻炎（ｒｈｉｎ）、喘息（ａｓｔｍ）、じんましん（ｕｒｔ）またはアナフィラキシー（ａｎａｐｈ）である。
【００６１】
試験した２５人の血清のなかでも、１２人（４８％）がｒＥｑｕｃ１５ｋに対して、１６人（６４％）がｎＥｑｕｃ２に対して、１９人（７６％）がｎＥｑｕｃ１に対して０．３５ｋＵＡ／Ｌ以上のＩｇＥ反応を示した。ｎＥｑｕｃ３およびｎＥｑｕｃ４／５はいずれも、調査した被験者のなかでも、調査された血清のそれぞれわずか５人（２０％）および７人（２８％）しかＩｇＥ抗体との結合を示さなかったことから、主要ではないアレルゲンのようである。２５人の血清（１６％）のうち４種が、もっぱらＥｑｕｃ１５ｋのみと反応した。全てのＥｑｕｃ１５ｋ反応性を示す血清を平均すると、Ｅｑｕｃ１５ｋに対するＩｇＥ抗体の濃度は、ウマ鱗屑に対するＩｇＥ抗体の濃度の３７％になった。それに相当するｎＥｑｕｃ１に対するＩｇＥ抗体の相対濃度は、これらのアレルゲンに特異的な反応性を示す血清において５２％であり、それに対してｎＥｑｕｃ２、ｎＥｑｕｃ３およびｎＥｑｕｃ４／５については、相対濃度はそれぞれ３５％、６９％および９％であった。２５人の血清中２４種がウマ鱗屑抽出物に対するＩｇＥ抗体結合を示した。これら血清はいずれも、試験された５種それぞれのウマアレルゲンのうち少なくとも１種への結合を示した。個々の構成要素に対するＩｇＥ結合レベルの合計は、ウマ鱗屑抽出物に対するＩｇＥ結合レベルと一致するか、または、それよりも高かった。
【００６２】
実施例８：Ｅｑｕｃ１５ｋ、および、ネコ由来のセクレトグロビン、主要なネコアレルゲンＦｅｌｄ１への個別の感作
Ｅｑｕｃ１５ｋはセクレトグロビンタンパク質ファミリーに属することから、同じタンパク質ファミリーに属する主要なネコアレルゲンであるＦｅｌｄ１との免疫学的な関係を調査した。３６人のウマ鱗屑に感作された被験者（実施例７で説明した２５人のウマアレルギー患者を含む）の血清におけるＦｅｌｄ１に対するＩｇＥ結合のレベルを評価した。組換えＥｑｕｃ１５に対するＩｇＥレベルとｒＦｅｌｄ１に対するＩｇＥレベルとの間に有意な相関（ｒ＝０．３６）は観察されず（図９）、これは、Ｅｑｕｃ１５ｋに対するＩｇＥ抗体反応は、主としてＥｑｕｃ１５ｋおよびＦｅｌｄ１間の交差反応性の結果によるものではない（逆もまた同様）ことを示唆している。
【００６３】
Ｅｑｕｃ１５ｋとＦｅｌｄ１との交差反応性の可能性をさらに調査するために、Ｆｅｌｄ１とＥｑｕｃ１５ｋの両方に対して有意なＩｇＥ抗体結合反応性を示す８人の血清を、固相上のｒＥｑｕｃ１５ｋおよびｒＦｅｌｄ１の両方、阻害剤として最終濃度１００μｇ／ｍｌの加えてｎＥｑｕｃ１５ｋおよびｒＦｅｌｄ１を用いて交差阻害に関して試験した（図１０）。阻害コントロールとして、ＩｇＥ希釈剤（ファディア）を用いた。二連での各阻害の測定値の平均を計算し、阻害の比率を、各阻害剤で抑制することができる希釈阻害剤を用いた結合の比率として計算した。これらの選択した血清において、Ｆｅｌｄ１による阻害は、固相上のＦｅｌｄ１に結合したときだけ達成が可能であった。同様に、Ｅｑｕｃ１５ｋを用いた阻害は固相上のＥｑｕｃ１５ｋにおいてのみ可能であったが、これは、これらの被験者において、これらの分子に対する感作は互いに独立して起こっており、交差反応性の結果ではないことを示す。しかしながら、これら２種のタンパク質間に弱い交差反応性の存在を完全に除外することはできない。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
【表２】
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【００６６】
【表３】
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【００６７】
配列表
【００６８】
【表４】
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【００６９】
【表５】
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【００７０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
2013528364.tif 000011
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
2013528364.tif 000013
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図７】
2013528364.tif 000020
【図８】
2013528364.tif 000021
【図９】
2013528364.tif 000022
【図１０】
2013528364.tif 000023
【図１Ｅ】
2013528364.tif 000024
【図４Ｄ】
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【図６】
2013528364.tif 000026
【配列表】
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【国際調査報告】
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2013528364.tif 000030
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