(57)【要約】  本発明は、個体からの混合試料中の１つ以上の遺伝子座のコピー数変動の検出および１つ以上の遺伝子座の多型検出のためのアッセイシステムおよび方法を提供する。
2013532494.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合試料中における発生源寄与の算出および１つ以上のゲノム領域中のコピー数変動（ＣＮＶ）の存在または非存在の検出のための単一のアッセイシステムであって、
第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドがゲノム領域中の、または該ゲノム領域に関連した１つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程；
第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが２つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程；
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程；
第１および第２のユニバーサルプライマー領域を用いて前記連続的連結産物を増幅して、増幅産物を作製する工程；および
前記増幅産物の配列を検出する工程
を含む、アッセイシステム。。
【請求項２】
前記固定配列オリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー領域を含む、
請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項３】
前記ユニバーサルプライマー領域が、増幅産物の配列決定において用いられる、
請求項２に記載のアッセイシステム。
【請求項４】
ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドが、連続的連結産物の増幅の前に除去される、
請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項５】
固定配列オリゴヌクレオチドの一方または両方がプレサークルプローブを含む、
請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項６】
前記増幅産物が、検出の前に単離される、
請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項７】
前記増幅産物が、検出の前に個々の分子として単離される、
請求項５に記載のアッセイシステム。
【請求項８】
検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の前記増幅産物の全部または一部の同一のコピーが作製される、
請求項７に記載のアッセイシステム。
【請求項９】
検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の前記増幅産物の全部または一部に相補的な分子の同一のコピーが作製される、
請求項７に記載のアッセイシステム。
【請求項１０】
コピー数に関して調査される少なくとも１つの遺伝子座が、多型に関して調査される全ての遺伝子座と異なる、
請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１１】
コピー数に関して調査されるいくつかの遺伝子座が、多型に関して調査される遺伝子座と異なる、
請求項１０に記載のアッセイシステム。
【請求項１２】
前記混合試料が、母体および胎児のｃｆＤＮＡを含む母体試料である、
請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１３】
単一アッセイを用いた、混合試料中における発生源寄与の算出および染色体異常の存在または非存在の検出のためのアッセイシステムであって、
第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第１の染色体に対応する２つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程；
第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第２の染色体に対応する２つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程；
第３のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが２つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程；
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程；
前記連続的連結産物を増幅して、増幅産物を作製する工程；および
前記増幅産物を検出する工程
を含む、アッセイシステム。
【請求項１４】
前記固定配列オリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー領域を含む、
請求項１３に記載のアッセイシステム。
【請求項１５】
前記ユニバーサルプライマー領域が、増幅産物の配列決定において用いられる、
請求項１４に記載のアッセイシステム。
【請求項１６】
ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドが、前記連続的連結産物の増幅の前に除去される、
請求項１５に記載のアッセイシステム。
【請求項１７】
前記固定オリゴヌクレオチドのセットが同時に導入される、
請求項１３に記載のアッセイシステム。
【請求項１８】
前記増幅産物が、検出の前に単離される、
請求項１３に記載のアッセイシステム。
【請求項１９】
前記増幅産物が、検出の前に個々の分子として単離される、
請求項１８に記載のアッセイシステム。
【請求項２０】
検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の前記増幅産物の全部または一部の同一のコピーが作製される、
請求項１９に記載のアッセイシステム。
【請求項２１】
検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の前記増幅産物の全部または一部に相補的な分子の同一のコピーが作製される、
請求項１９に記載のアッセイシステム。
【請求項２２】
コピー数に関して調査される少なくとも１つの遺伝子座が、多型に関して調査される全
ての遺伝子座と異なる、
請求項１３に記載のアッセイシステム。
【請求項２３】
コピー数に関して調査されるいくつかの遺伝子座が、多型に関して調査される遺伝子座と異なる、
請求項２２に記載のアッセイシステム。
【請求項２４】
前記混合試料が、母体および胎児ｃｆＤＮＡを含む母体試料である、
請求項１３に記載のアッセイシステム。
【請求項２５】
胎児異数性の存在または非存在を検出するために前記アッセイシステムが用いられる、
請求項２４に記載のアッセイシステム。
【請求項２６】
単一アッセイを用いた、母体試料中の発生源寄与の算出および染色体異常の存在または非存在の検出のためのアッセイシステムであって、
第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第１の染色体に対応する２つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記母体試料に導入する工程；
第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第２の染色体に対応する２つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記母体試料に導入する工程；
第３のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが２つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記母体試料に導入する工程；
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程；
前記連続的連結産物を増幅して、増幅産物を作製する工程；および
前記増幅産物を検出する工程
を含む、アッセイシステム。
【請求項２７】
前記固定配列オリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー領域を含む、
請求項２６に記載のアッセイシステム。
【請求項２８】
前記ユニバーサルプライマー領域が、前記増幅産物の配列決定において用いられる、
請求項２７に記載のアッセイシステム。
【請求項２９】
ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドが、前記連続的連結産物の増幅の前に除去される、
請求項２７に記載のアッセイシステム。
【請求項３０】
前記固定オリゴヌクレオチドのセットが同時に導入される、
請求項２６に記載のアッセイシステム。
【請求項３１】
前記増幅産物が、検出の前に単離される、
請求項２６に記載のアッセイシステム。
【請求項３２】
前記増幅産物が、検出の前に個々の分子として単離される、
請求項３１に記載のアッセイシステム。
【請求項３３】
検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の前記増幅産物
の全部または一部の同一のコピーが作製される、
請求項３２に記載のアッセイシステム。
【請求項３４】
検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の前記増幅産物の全部または一部に相補的な分子の同一のコピーが作製される、
請求項３２に記載のアッセイシステム。
【請求項３５】
コピー数に関して調査される少なくとも１つの遺伝子座が、多型に関して調査される全ての遺伝子座と異なる、
請求項２６に記載のアッセイシステム。
【請求項３６】
コピー数に関して調査されるいくつかの遺伝子座が、多型に関して調査される遺伝子座と異なる、
請求項２６に記載のアッセイシステム。
【請求項３７】
前記母体試料が、母体および胎児ｃｆＤＮＡを含む、
請求項２６に記載のアッセイシステム。
【請求項３８】
混合試料内の１つ以上のゲノム領域中の発生源寄与の算出およびＣＮＶの存在または非存在の検出のためのアッセイシステムであって、
第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドがゲノム領域中の、または該ゲノム領域に関連した１つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程；
第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程；
それぞれのセットの前記固定配列オリゴヌクレオチドに相補的な領域の間の遺伝子座の領域に相補的な１つ以上の架橋オリゴヌクレオチドを、該架橋オリゴヌクレオチドが前記遺伝子座中の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で導入する工程；
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程；
前記連続的連結産物を増幅して、増幅産物を作製する工程；および
前記増幅産物を検出する工程
を含む、アッセイシステム。
【請求項３９】
前記固定配列オリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー領域を含む、
請求項３８に記載のアッセイシステム。
【請求項４０】
第１および第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドが、架橋オリゴヌクレオチドの導入の前に導入される、
請求項３９に記載のアッセイシステム。
【請求項４１】
ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドが、架橋オリゴヌクレオチドの導入の前に除去される、
請求項３８に記載のアッセイシステム。
【請求項４２】
前記架橋オリゴヌクレオチドが連結混合物と同時に導入される、
請求項３８に記載のアッセイシステム。
【請求項４３】
前記固定配列オリゴヌクレオチドと前記核酸領域とのハイブリダイゼーション産物が、前記架橋オリゴヌクレオチドの導入の前に単離される、
請求項３８に記載のアッセイシステム。
【請求項４４】
前記増幅産物が、検出の前に単離される、
請求項３８に記載のアッセイシステム。
【請求項４５】
前記増幅産物が、検出の前に個々の分子として単離される、
請求項４４に記載のアッセイシステム。
【請求項４６】
検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の前記増幅産物の全部または一部の同一のコピーが作製される、
請求項４５に記載のアッセイシステム。
【請求項４７】
検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の増幅産物の全部または一部に相補的な分子の同一のコピーが作製される、
請求項４５に記載のアッセイシステム。
【請求項４８】
前記第１または第２のオリゴヌクレオチドが試料指標を含む、
請求項３８に記載のアッセイシステム。
【請求項４９】
前記混合試料が、母体および胎児ｃｆＤＮＡを含む母体試料である、
請求項３８に記載のアッセイシステム。
【請求項５０】
個体由来混合試料中のＤＮＡの少ない発生源における１つ以上の染色体異常および１つ以上の多型を決定する能力を有する単一のアッセイシステム。
【請求項５１】
単一のアッセイを用いた、混合試料中の発生源寄与の算出および染色体異常の存在または非存在の検出のためのアッセイシステムであって、
第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第１の染色体に対応する２つ以上の遺伝子座に対応する２つ以上の核酸上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程；
第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第２の染色体に対応する２つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程；
第３のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが２つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程；
それぞれのセットの前記固定配列オリゴヌクレオチドに相補的な領域の間の遺伝子座の領域に相補的な１つ以上の架橋オリゴヌクレオチドを、該固定配列オリゴヌクレオチドが前記遺伝子座中の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で導入する工程；
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程；
前記連続的連結産物を増幅して、増幅産物を作製する工程；および
前記増幅産物を検出する工程
を含む、アッセイシステム。
【請求項５２】
前記固定配列オリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー領域を含む、
請求項５１に記載のアッセイシステム。
【請求項５３】
前記ユニバーサルプライマー領域が、前記増幅産物の配列決定において用いられる、
請求項５２に記載のアッセイシステム。
【請求項５４】
ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドが、前記連続的連結産物の増幅の前に除去される、
請求項５１に記載のアッセイシステム。
【請求項５５】
固定配列オリゴヌクレオチドの一方または両方のセットがプレサークルプローブを含む、
請求項５１に記載のアッセイシステム。
【請求項５６】
前記増幅産物が、検出の前に単離される、
請求項５１に記載のアッセイシステム。
【請求項５７】
前記増幅産物が、検出の前に個々の分子として単離される、
請求項５５に記載のアッセイシステム。
【請求項５８】
検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の増幅産物の全部または一部の同一のコピーが作製される、
請求項５７に記載のアッセイシステム。
【請求項５９】
検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の増幅産物の全部または一部に相補的な分子の同一のコピーが作製される、請求項５７に記載のアッセイシステム。
【請求項６０】
コピー数に関して調査される少なくとも１つの遺伝子座が、多型に関して調査される全ての遺伝子座と異なる、
請求項５１に記載のアッセイシステム。
【請求項６１】
コピー数に関して調査されるいくつかの遺伝子座が、多型に関して調査される遺伝子座と異なる、
請求項６０に記載のアッセイシステム。
【請求項６２】
前記混合試料が、母体および胎児ｃｆＤＮＡを含む母体試料である、
請求項５１に記載のアッセイシステム。
【請求項６３】
単一のアッセイを用いた、母体試料中の発生源寄与の算出および染色体異常の存在または非存在の検出のためのアッセイシステムであって、
第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第１の染色体に対応する２つ以上の遺伝子座に対応する２つ以上の核酸上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記母体試料に導入する工程；
第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第２の染色体に対応する２つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記母体試料に導入する工程；
第３のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが２つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記母体試料に導入する工程；
それぞれのセットの前記固定配列オリゴヌクレオチドに相補的な領域の間の遺伝子座の領域に相補的な１つ以上の架橋オリゴヌクレオチドを、該固定配列オリゴヌクレオチドが
前記遺伝子座中の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で導入する工程；
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程；
前記連続的連結産物を増幅して、増幅産物を作製する工程；および
前記増幅産物を検出する工程
を含む、アッセイシステム。
【請求項６４】
前記固定配列オリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー領域を含む、
請求項６３に記載のアッセイシステム。
【請求項６５】
前記ユニバーサルプライマー領域が、前記増幅産物の配列決定において用いられる、
請求項６４に記載のアッセイシステム。
【請求項６６】
ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドが、前記連続的連結産物の増幅の前に除去される、
請求項６３に記載のアッセイシステム。
【請求項６７】
固定配列オリゴヌクレオチドの一方または両方のセットがプレサークルプローブを含む、
請求項６３に記載のアッセイシステム。
【請求項６８】
前記増幅産物が、検出の前に単離される、
請求項６３に記載のアッセイシステム。
【請求項６９】
前記増幅産物が、検出の前に個々の分子として単離される、
請求項６８に記載のアッセイシステム。
【請求項７０】
検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の増幅産物の全部または一部の同一のコピーが作製される、
請求項６９に記載のアッセイシステム。
【請求項７１】
検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の増幅産物の全部または一部に相補的な分子の同一のコピーが作製される、
請求項６９に記載のアッセイシステム。
【請求項７２】
コピー数に関して調査される少なくとも１つの遺伝子座が、多型に関して調査される全ての遺伝子座と異なる、
請求項６３に記載のアッセイシステム。
【請求項７３】
コピー数に関して調査されるいくつかの遺伝子座が、多型に関して調査される遺伝子座と異なる、
請求項７２に記載のアッセイシステム。
【請求項７４】
前記母体試料が、母体および胎児ｃｆＤＮＡを含む、
請求項６３に記載のアッセイシステム。
【請求項７５】
胎児染色体異常の存在または非存在を検出するために前記アッセイシステムが用いられる、
請求項６３に記載のアッセイシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一のアッセイにおいて混合試料中のコピー数変動を同定するためのアッセイシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の考察においては、特定の物品および方法を背景および導入目的で説明する。本明細書に含まれるものは、先行技術の「自認」と解釈すべきではない。出願人は、必要に応じて、本明細書に記載の物品および方法が適用可能な法令の条項の下で先行技術を構成しないことを証明する権利を明示的に保持する。診断法における近年の進歩は、疾患のリスク、存在および予後を決定するための低侵襲機構に焦点を当ててきた。遺伝子異常を決定するための診断方法は、特定の疾患および障害を同定するだけでなく、疾患発生源および治療選択肢に関する価値ある情報を得るための標準的な技術になっている。
【０００３】
血液および血漿などの生体試料中の無細胞核酸の同定により、臨床決定を行うのに採血などの低侵襲技術を用いることが可能になる。例えば、癌患者の末梢血には悪性固形腫瘍に由来する無細胞ＤＮＡが見出されており、移植を受けた個体は移植された器官に由来する無細胞ＤＮＡがその血流中に存在し、妊娠女性の血液および血漿中には無細胞胎児ＤＮＡおよびＲＮＡが見出されている。さらに、ウイルス量の検出などの感染性生物に由来する核酸の検出または特定の株のウイルスもしくは細菌病原体の遺伝的同定は、重要な診断および予後の指標となる。したがって、患者自身の正常細胞とは別の発生源に由来する無細胞核酸によって、例えば、治療選択肢、診断、予後などに関する重要な医学的情報を得ることができる。
【０００４】
そのような試験の感度は、異なる発生源に由来する核酸の量の同定、特に、第２の発生源に由来するより高レベルの核酸のバックグラウンドのある発生源に由来する低レベルの核酸の同定に依存することが多い。生体試料中に存在する無細胞核酸に対する少量の核酸種の寄与の検出は、得られるデータの正確な統計的解釈を実現することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、試料中の核酸の寄与に関する情報を用いて生体試料中の１つ以上の（１または複数の）ゲノム領域中のコピー数変動（ＣＮＶ）を算出するための方法が必要である。本発明は、この必要性に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この概要は、以下の詳細な説明においてさらに説明される単純化された形態の概念の選択を導入するために示される。この概要は、特許請求される主題の鍵となるか、もしくは本質的な特徴を同定することを意図されるものではなく、特許請求される主題の範囲を制限するために用いられることを意図されるものでもない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、利用性、および利点は、添付の図面に例示され、添付の特許請求の範囲に定義される態様を含む以下の詳細な説明から明らかである。
【０００７】
本発明の方法は、個体に由来する試料内の多い発生源（より多い方の発生源）および／または少ない発生源（より少ない方の発生源）の寄与を決定し、混合試料中の遺伝子座の発生源の寄与と比較したゲノム領域の値の差異を決定するための単一の発生源内の１つ以上のゲノム領域に関するコピー数情報を決定する能力を有する単一アッセイシステムを含む。本発明は、混合試料内の単一の発生源からの発生源寄与およびコピー数変動（ＣＮＶ
）を決定するための非多型および多型検出の両方を用いる単一アッセイシステムを用いる。試料内の多いおよび／または少ない発生源の寄与の決定により、混合試料中のＣＮＶの決定のためのゲノム領域の十分な同定を可能にする両発生源に由来する十分な遺伝物質の存在に関する情報を得ることができる。
【０００８】
１態様においては、前記アッセイシステムは、個体に由来する混合試料中の選択遺伝子座（選択された遺伝子座）の増幅および検出を用いて、発生源寄与を算出し、１つ以上のゲノム領域のコピー数を同定する。１つの具体的な態様においては、本発明は、混合試料中の多いおよび／または少ない発生源に由来する核酸の寄与ならびに混合試料中の単一の発生源に由来する１つ以上の（１または複数の）ゲノム領域でのＣＮＶの存在または非存在を決定する能力を有する単一アッセイシステムを提供する。前記アッセイシステムは、混合試料内の２つ以上の発生源中に存在するゲノム領域のコピー数を特異的に検出することができる。寄与の決定のためには、ある発生源に由来する選択遺伝子座を、混合試料中の少なくとも１つの他の発生源の選択遺伝子座と区別する。しかし、コピー数変動を混合試料内の２つ以上のゲノム領域のレベルの比較によって検出することができるため、ゲノム領域のコピー数変動の決定のために、選択遺伝子座は発生源寄与に関して区別されても良いが、区別される必要はない。好ましくは、前記アッセイシステムにおいて分析される無細胞核酸は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である。
【０００９】
かくして、第１の実施において、本発明は、１）２つ以上の情報遺伝子座から誘導された頻度データを用いて混合試料中の多い発生源および／または少ない発生源の寄与を決定するため；２）多いおよび少ない発生源における１つ以上のゲノム領域の頻度を決定するため；ならびに３）多いおよび／または少ない発生源における１つ以上のゲノム領域に関してＣＮＶの存在または非存在を同定するための単一アッセイシステムを提供する。好ましくは、ＣＮＶの同定は、混合試料中の多いおよび／または少ない発生源に由来する２つ以上のゲノム領域のコピー数の比較に基づく。
【００１０】
好ましくは、本発明のシステムを用いて分析される核酸は、無細胞核酸である。より好ましくは、前記アッセイシステムにおいて分析される核酸は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む。
【００１１】
別の具体的な態様においては、本発明は、アッセイが、第１のセットの固定配列（固定された配列）オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、ゲノム領域中の、またはそれと関連する１つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程；第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、２つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程；ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、選択遺伝子座に相補的な連続的連結産物を作製する工程；連続的連結産物を増幅させて、増幅産物を作製する工程；および増幅産物を検出する工程を含む、混合試料内の発生源寄与の算出および１つ以上のゲノム領域におけるＣＮＶの存在または非存在の検出のためのアッセイシステムを提供する。増幅産物の検出は、混合試料中の発生源寄与および１つ以上のゲノム領域のコピー数を算出するために用いられる。
【００１２】
固定オリゴヌクレオチドのセットは、ゲノム領域または情報遺伝子座の連続的領域にハイブリダイズする２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの好ましい態様においては、遺伝子座のセットはＣＮＶについて調査され、より大きいゲノム領域（例えば、染色体の全部または一部）の増幅を示す。好ましくは、前記アッセイシステムは、混合試料内の多い発生源と少ない発生源との間でこれらの遺伝子座のコピー数を区別することができる。選択遺伝子座のレベルを、目的のゲノム領域について決定し、１つ以上の他の目的のゲノム領域および／または１つ以上の参照ゲノム領域の遺伝子座の量と比較して、混合
試料中の遺伝子座頻度に基づく潜在的なＣＮＶを検出することができる。
【００１３】
試料中の染色体異常の検出は、多いおよび／もしくは少ない発生源に由来する単一の染色体上に位置するかまたは該染色体と関連した複数の選択遺伝子座に関するＣＮＶの検出に基づくものであってよい。かくして、別の具体的な態様においては、本発明は、１）２つ以上の情報遺伝子座から誘導された頻度データを用いて、混合試料中の多い発生源および／または少ない発生源の寄与を決定し；２）多いおよび少ない発生源における１つ以上のゲノム領域の頻度を決定し；３）混合試料中の多いおよび／または少ない発生源における染色体異常の存在または非存在を同定するための単一アッセイシステムを提供する。
【００１４】
かくして、本発明は、アッセイが、第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定配列オリゴヌクレオチドが、第１の染色体に対応する２つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程；第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、第２の染色体に対応する２つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程；第３のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、２つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程；ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程；連続的連結産物を増幅させて、増幅産物を作製する工程；および増幅産物を検出する工程を含む、単一アッセイを用いる混合試料中の発生源寄与の算出および染色体異常の存在または非存在の検出のためのアッセイシステムを提供する。増幅産物の検出を、混合試料中の発生源寄与の算出ならびに染色体異常の同定のために用いることができる。
【００１５】
より具体的な態様においては、本発明のアッセイシステムは、母体試料中の胎児寄与率および染色体異常を同定するために用いられる。本発明は、第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、第１の染色体に対応する２つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で母体試料に導入する工程；第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、第２の染色体に対応する２つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で母体試料に導入する工程；第３のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、２以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で母体試料に導入する工程；ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程；連続的連結産物を増幅させて、増幅産物を作製する工程；および増幅産物を検出する工程を含む、アッセイシステムを提供する。増幅産物の検出を、母体試料における胎児寄与の算出ならびに胎児核酸中の染色体異常の同定のために用いることができる。
【００１６】
本発明の特定の態様においては、固定オリゴヌクレオチドがアッセイの連結工程の間に直接的に連結されるように、それらは連続的領域のすぐ近くでハイブリダイズされる。しかしながら、他の態様においては、連続的領域におけるハイブリダイゼーション後に固定オリゴヌクレオチドの末端の間に１つ以上のヌクレオチドのギャップが存在してもよい。例えば、ポリメラーゼを用いるプライマー伸長と連結との組合せにより、固定オリゴヌクレオチドを連結する。
【００１７】
それぞれのセットの固定配列核酸は、選択遺伝子座中の少なくとも２つの別々の領域にハイブリダイズするように設計される。好ましい態様においては、２つ以上の別々のオリゴをセットで用いてこれらの領域にハイブリダイズさせ、選択遺伝子座に相補的な隣接核酸を提供する。しかしながら、いくつかの態様においては、セットは、本明細書でより詳細に説明されるように、選択遺伝子座に相補的な２つ以上の異なる非隣接領域を有する単
一プローブ（例えば、パドロックプローブ）からなってもよい。固定配列オリゴのセットを、アッセイにおいて連続的に、またはアッセイにおいて同時に提供することができる。
【００１８】
特定の好ましい態様においては、架橋オリゴを用いて、オリゴセットの特異性を増加させる、および／または固定配列オリゴヌクレオチド間のギャップを埋める。従って、本発明の別の具体的な態様は、アッセイが、第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、ゲノム領域中またはそれと関連する１つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程；第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程；それぞれのセットの固定配列オリゴヌクレオチドに相補的な領域の間およびすぐ近くの遺伝子座の領域に相補的である、１つ以上の架橋オリゴヌクレオチドを、架橋オリゴヌクレオチドが、前記遺伝子座中の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で導入する工程；ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程；連続的連結産物を増幅させて、増幅産物を作製する工程；ならびに増幅産物を検出する工程を含む、混合試料内の発生源寄与の算出および１つ以上のゲノム領域中のＣＮＶの存在または非存在の検出のためのアッセイシステムを提供する。増幅産物の検出を用いて、混合試料中の発生源寄与および１つ以上のゲノム領域のコピー数を算出する。
【００１９】
本発明の別の具体的な態様は、混合試料中の発生源寄与を算出し、染色体異常を同定するための架橋オリゴヌクレオチドを用いるアッセイシステムを提供する。このアッセイは、第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、第１の染色体に対応する２つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程；第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、第２の染色体に対応する２つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程；第３のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、２つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程；それぞれのセットの固定配列オリゴヌクレオチドに相補的な領域の間およびすぐ近くの遺伝子座の領域に相補的である、１つ以上の架橋オリゴヌクレオチドを、架橋オリゴヌクレオチドが、前記遺伝子座中の相補的領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で導入する工程；それぞれのセットの固定配列オリゴヌクレオチドに相補的な領域の間およびすぐ近くの遺伝子座の領域に相補的である、１つ以上の架橋オリゴヌクレオチドを、架橋オリゴヌクレオチドが、前記遺伝子座中の相補的領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で導入する工程；ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続連結産物を作製する工程；連続連結産物を増幅させて、増幅産物を作製する工程；ならびに増幅産物を検出する工程を含む。増幅産物の検出を、混合試料中の発生源寄与（母体試料中の胎児寄与など）の算出、ならびに染色体異常の同定のために用いることができる。
【００２０】
本発明の特定の態様においては、固定オリゴヌクレオチドが全部、アッセイの連結工程の間に直接連結されるように、それらは架橋オリゴのすぐ近くでハイブリダイズされる。しかしながら、他の態様においては、架橋オリゴのハイブリダイゼーション後に固定オリゴヌクレオチドと架橋オリゴとの一方または両方の末端の間に１つ以上のヌクレオチドのギャップが存在してもよい。例えば、ポリメラーゼを用いるプライマー伸長と連結との組合せにより、固定オリゴヌクレオチドと、架橋オリゴとを連結する。
【００２１】
本発明の多重化されたアッセイが、５以上、好ましくは１０以上、好ましくは１６以上、好ましくは２０以上、好ましくは３０以上、好ましくは３２以上、好ましくは４０以上
、好ましくは４８以上、好ましくは５０以上、好ましくは６０以上、好ましくは７０以上、好ましくは８０以上、好ましくは９０以上、およびより好ましくは９６以上の選択遺伝子座を同時に分析することができることが重要な特徴である。これらの選択遺伝子座は、単一の試料に由来する異なる遺伝子座であってもよく、またはそれらは２つ以上の混合試料に由来する遺伝子座であってもよい。後者の場合、選択遺伝子座の分析に用いられる２つの固定配列オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、該遺伝子座を特定の試料と関連付けることができる試料識別子（例えば、「試料指標」）を含む。あるいは、試料指標は、試料指標を含むプライマーを用いることにより連結産物の増幅中に添加することができる。
【００２２】
好ましい態様においては、これらの遺伝子座の調査は、単一の増幅反応において複数の遺伝子座の増幅を可能にするユニバーサル増幅技術を用いる。本発明のアッセイシステムにおける寄与算出ならびにＣＮＶおよび／または染色体異常の検出のための選択核酸を、混合試料からの初期選択的増幅後にユニバーサル増幅方法を用いて増幅させることができる。ユニバーサル増幅の使用は、単一の、または限られた数の増幅プライマーを用いて、単一または複数の試料に由来する複数の核酸領域を増幅させることを可能にし、単一の反応において複数の選択領域を増幅させるのに特に有用である。好ましい態様においては、増幅産物の配列決定においてユニバーサルプライマー領域を用いる。別の好ましい態様においては、ゲノム領域の検出のために用いられる固定配列オリゴヌクレオチドおよび多型の検出のために用いられる固定配列オリゴヌクレオチドにおいて、同じユニバーサルプライマー領域を用いる。
【００２３】
かくして、本発明の具体的な態様においては、ユニバーサル増幅における使用のためのプライマーに相補的な配列を、選択的増幅の間またはその後に選択遺伝子座に導入する。好ましくは、そのような配列を、そのような選択核酸の末端に導入するが、それらをユニバーサル増幅手順からの増幅産物の同定を可能にする任意の位置に導入してもよい。
【００２４】
特定の好ましい態様においては、用いられるプライマーの一方または両方は、試料指標または他の識別子を含む。具体的な態様においては、試料指標は１つ以上のユニバーサルプライマーに含まれる。試料指標を増幅産物中に組込み、次いで、異なる試料に由来する増幅産物を組み合わせることができる。試料指標はＣＮＶおよび多型を元の試料に適切に割り当てることができるように、ＣＮＶまたは染色体異常の検出ならびに多型の検出と同時に検出される。
【００２５】
特定の態様においては、アッセイシステムは２つ以上の調査される遺伝子座中の領域に相補的である１以上の共通の架橋オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子座調査を多重化する、すなわち、２つ以上の固定オリゴヌクレオチドセットについて単一の架橋オリゴを用いることができる。これにより、多重化されたアッセイシステムにおいて用いられる架橋オリゴヌクレオチドの数を、アッセイにおいて調査される遺伝子座の数より小さくできる。特定の具体的な態様においては、アッセイシステムは、本発明のアッセイシステムを用いて調査される２つ以上の遺伝子座と適合するようにそれぞれ設計された架橋オリゴヌクレオチドのプールを用いる。
【００２６】
選択遺伝子座の頻度を、目的のゲノム領域について決定し、１つ以上の他の目的のゲノム領域および／または１つ以上の参照ゲノム領域の遺伝子座の頻度と比較して、混合試料中の遺伝子座頻度に基づいて潜在的なＣＮＶを検出することができる。
【００２７】
いくつかの例においては、用いて検出される染色体異常は、目的の染色体上での遺伝子増幅または遺伝子座伸長と関連する。他の例においては、染色体異常は、ゲノム中の染色体の余分な部分の存在をもたらす転座と関連する。さらに他の例においては、遺伝子異常
は欠失である。
【００２８】
特定の好ましい態様においては、染色体異常は、目的の染色体の異数性と関連する。例えば、胎児における最も一般的な染色体異常は、トリソミー２１、１８、１３、Ｘおよび／もしくはＹまたはモノソミーＸである。具体的な好ましい態様においては、本発明のアッセイシステムは、母体試料の胎児ＤＮＡにおけるそのような一般的な染色体異数性を検出するために用いられる。
【００２９】
本発明のアッセイシステムにおいては、必要に応じて、増幅産物を単離した後、検出する。単離される場合、好ましくはそれらを個々の分子として単離して、その後の検出を補助する。単離後、増幅産物をさらに増幅させて、個々の増幅産物の全部または一部の同一コピーを作製した後、検出することができる。あるいは、単離された増幅産物をさらに増幅させて、個々の増幅産物の全部または一部に相補的な分子の同一コピーを作製した後、検出することができる。
【００３０】
ＣＮＶの検出の様々な方法を、本発明のアッセイシステムにおける多型の検出と共に用いることができる。１つの一般的な態様においては、アッセイシステムは、混合試料中の目的の第１のゲノム領域から１つ以上の選択核酸を増幅する工程；混合試料中の目的の第２の遺伝子座から１つ以上の選択核酸を増幅する工程、選択遺伝子座の相対頻度を決定する工程、選択遺伝子座の相対頻度を比較する工程、ならびに第１および第２の遺伝子座に由来する選択核酸の比較された相対頻度に基づいてＣＮＶの存在または非存在を同定する工程を含む、混合試料中の１つ以上の遺伝子座におけるＣＮＶの決定のための方法を用いる。好ましくは、アッセイ方法は、異なるゲノム領域に由来する２つ以上の選択遺伝子座を増幅するが、該遺伝子座は、同一の一般的なゲノム領域中に位置してもよく、これは、単一の遺伝子座由来のＣＮＶよりもむしろ染色体異常から生じるＣＮＶの確認のためである。
【００３１】
より好ましくは、ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドを除去した後、架橋オリゴヌクレオチドを導入する。いくつかの態様においては、架橋オリゴヌクレオチドを連結混合物と同時に導入する。他の態様においては、固定配列オリゴヌクレオチドと遺伝子座とのハイブリダイゼーション産物を単離した後、架橋オリゴヌクレオチドを導入する。
【００３２】
特定の具体的な態様においては、アッセイシステムは、本発明のアッセイシステムを用いて調査される２つ以上の遺伝子座と適合するようにそれぞれ設計された架橋オリゴヌクレオチドのプールを用いる。これらの態様においては、多重化アッセイにおいて用いられる架橋オリゴヌクレオチドは、好ましくは±５℃の範囲、より好ましくは±２℃の範囲のＴｍを有するように設計される。
【００３３】
特定の態様においては、架橋オリゴヌクレオチドは、長さ２〜４５ヌクレオチドである。具体的な態様においては、架橋オリゴヌクレオチドは、長さ３〜９ヌクレオチドである。さらに別の具体的な態様においては、オリゴヌクレオチドは長さ１０〜３０ヌクレオチドである。
【００３４】
ＣＮＶについて調査される遺伝子座は、いくつかの例においては、より大きいゲノム領域、例えば、染色体の全部または一部の増幅を示すものであってよい。好ましくは、アッセイシステムは混合試料内の多い発生源と少ない発生源との間でこれらの遺伝子座のコピー数を区別することができる。
【００３５】
別の態様においては、本発明は、混合試料中のＣＮＶおよび感染性因子の両方の同定を
可能にする技術を用いる。これは特に、臨床結果が感染性因子の存在によって悪化し得る患者をモニターするのに役立ち得る。例えば、移植を受けた患者は、免疫抑制剤を服用する可能性が高く、したがって一般により感染しやすい。同様に、妊娠女性はその免疫系において変化を有し、かくして、母親および／または胎児に対して有害な効果を有し得る病原体による感染により罹りやすい。また、特定の型の癌は感染性因子と関連し（例えば、肝臓癌はＢ型肝炎およびＣ型肝炎感染と関連し、子宮頚癌はヒトパピローマウイルス感染と関連する）、感染性因子の同定は臨床結果を予測するか、または患者のための医学的処置の好ましい経過を決定するのに有益であってよい。
【００３６】
かくして、特定の態様においては、本発明は、アッセイが、第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、ゲノム領域中の、またはそれと関連する１つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で、混合試料に導入する工程；第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で、混合試料に導入する工程；第３のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定配列オリゴヌクレオチドが、感染性因子を示す遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で、混合試料に導入する工程；ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、遺伝子座に相補的な連続的連結産物を作製する工程；連続的連結産物を増幅させて、増幅産物を作製する工程；ならびに増幅産物を検出する工程を含む、単一のアッセイを用いて、混合試料中の発生源寄与の算出、ゲノム領域のＣＮＶの存在または非存在、ならびに感染性因子の存在または非存在の検出のためのアッセイシステムを提供する。増幅産物の検出は、混合試料中のゲノム領域のコピー数および感染性因子の存在または非存在と相関する。
【００３７】
別の一般的な態様においては、アッセイシステムは、混合試料中の第１の目的の染色体から１つ以上の選択遺伝子座を増幅する工程；混合試料中の第２の目的の染色体から１つ以上の選択遺伝子座を増幅する工程；第１および第２の目的の染色体に由来する選択領域の相対頻度を決定する工程、第１および第２の目的の染色体に由来する選択領域の相対頻度を比較する工程；ならびに選択領域の比較された相対頻度に基づいて異常の存在または非存在を同定する工程を含む、ゲノム領域中のＣＮＶと関連する染色体異常の存在または非存在を決定するための方法を用いる。好ましくは、それぞれの染色体から２つ以上の核酸領域を選択し、より好ましくは、それぞれの染色体から５つ以上の遺伝子座を選択する。
【００３８】
さらに別の一般的な態様においては、アッセイシステムは、混合試料中の第１の目的の染色体に対応するｃｆＤＮＡ中の２つ以上の選択遺伝子座を増幅する工程；混合試料中の第２の目的の染色体に対応するｃｆＤＮＡ中の２つ以上の選択遺伝子座を増幅する工程、第１および第２の目的の染色体に由来する選択領域の相対頻度を決定する工程、第１および第２の目的の染色体に由来する選択領域の相対頻度を比較する工程、ならびに選択領域の比較された相対頻度に基づいて異数性の存在または非存在を同定する工程を含む、個体から得た混合試料中の異数性の存在または非存在の決定のための方法を用いる。具体的な態様においては、第１および第２の染色体の遺伝子座を単一の反応中で、好ましくは単一の容器内に含まれる単一の反応中で増幅する。
【００３９】
好ましくは、アッセイシステムは、血液、血漿、血清などの被験体から容易に取得することができる試料中の遺伝子座の存在または非存在を検出する。１つの一般的な態様においては、アッセイシステムは、混合試料中のｃｆＤＮＡ中の選択領域の検出を用いる。１つのより具体的な態様においては、アッセイシステムは、ゲノム領域中のＣＮＶの存在または非存在および１つ以上の遺伝子座における多型の存在または非存在を同定するために個体から得た混合試料のｃｆＤＮＡ中の選択領域の検出を用いる。ゲノム領域内のコピー
数を、選択遺伝子座の量の検出ならびに別のゲノム領域に由来する選択遺伝子座の量および／または参照ゲノム領域に由来する選択遺伝子座の量との比較に基づいて決定することができる。特定の態様においては、核酸の頻度の比率を、遺伝的に「正常な」被験体、すなわち、アッセイシステムにおいて調査される特定の遺伝子座と関連するＣＮＶを有さない被験体の統計的に有意な集団について決定される参照平均比率と比較する。
【００４０】
本発明の好ましい態様においては、選択核酸に対応する増幅産物を、選択遺伝子座の分析のために個々の分子として単離する。これらの個々の増幅産物を、互いに単離する、および好ましくは物理的に単離する（例えば、基質上で、または個々の容器中で）。単離後に個々の分子をさらに増幅して、複数の同一コピーの増幅産物、その一部、または増幅産物もしくはその一部に相補的な核酸を作製することができる。
【００４１】
好ましい態様においては、個々の増幅産物は配列決定を通じて分析される。他の態様においては、個々の増幅産物はハイブリダイゼーション技術を用いて分析される。
選択遺伝子座のコピー数を、非多型検出方法、すなわち、選択核酸領域を同定するための特定の多型の存在または非存在に依存しない検出方法を用いて検出することができることが本発明の特徴である。好ましい態様においては、アッセイ検出システムは、混合試料中に存在する選択遺伝子座の相対数を「計測する」ための非多型検出方法を用いる。これらの数を用いて、統計的に、混合試料が混合試料内の多いおよび／または少ない発生源中のゲノム領域中にＣＮＶを有する可能性があるかどうかを決定することができる。同様に、これらの数を用いて、統計的に、多い発生源および／または少ない発生源に由来する核酸が１つ以上の多型を有するかどうかを決定することができる。そのような情報を用いて、特定の病状または遺伝的障害を同定する、疾患または障害の診断または再発を確認する、疾患または障害の予後を決定する、潜在的な治療選択肢を決定するのを補助することなどができる。
【００４２】
いくつかの態様においては、前記アッセイシステムにより用いられる異数性の決定のための方法は、試料中の２つ以上の染色体に由来する複数の選択遺伝子座のコピー数変動を測定する。特定の染色体に対応する異なる選択遺伝子座のレベルを個別に定量および比較して、混合試料中の１つ以上の細胞源中の染色体異数性の存在または非存在を決定することができる。個別に定量された領域は、正規化計算を受けてもよく、またはそのデータを外れ値除外にかけた後、比較して、混合試料中の異数性の存在または非存在を決定してもよい。
【００４３】
他の態様においては、選択遺伝子座の相対頻度を用いて、第１および第２の目的の染色体の染色体頻度を決定し、異数性の存在または非存在は第１および第２の目的の染色体の比較された染色体頻度に基づく。
【００４４】
さらに他の態様においては、選択遺伝子座の相対頻度を用いて、目的の染色体および参照染色体の染色体頻度を決定し、異数性の存在または非存在は目的の染色体および参照染色体の比較された染色体頻度に基づく。
【００４５】
本発明のアッセイシステムは好ましくは高度に多重化されたシステムとして配置されるため、個々の試料および／または複数の試料内の単一または複数の染色体に由来する複数の遺伝子座を同時に分析することができる。そのような多重化されたシステムにおいては、試料を別々に分析するか、またはより多数の試料の分析のためにそれらを２つ以上の群に最初にプールすることができる。プールされたデータが得られる場合、好ましくはそのようなデータを異なる試料について同定した後、異数性の分析を行う。しかしながら、いくつかの態様においては、プールされたデータを潜在的なＣＮＶについて分析し、最初の結果が、異数性の可能性がプールされた群内で検出されたことを示す場合、その群に由来
する個々の試料を続いて分析することができる。
【００４６】
特定の態様においては、アッセイシステムは、特定の試料に関する情報を提供する１つ以上の指標を用いる。例えば、指標は、核酸が増幅された試料を示唆する選択的または普遍的増幅において用いることができる。
【００４７】
１つの特定の態様においては、選択遺伝子座を単離した後、検出する。分析のために混合試料中に存在する特定の核酸を選択的に単離する任意の手段、例えば、ハイブリダイゼーション、増幅または混合試料からの核酸の他の形態の配列に基づく単離を用いて、選択遺伝子座を混合試料から単離することができる。単離後、選択核酸を、混合試料中のそれぞれの選択核酸の配列および／または相対量の決定のために、好適な検出形式に、例えば、マイクロアレイ上、またはフローセル中に個々に分配する。検出された核酸の相対量は、混合試料中に存在する選択核酸に対応する染色体のコピー数を指示する。
【００４８】
好適な形式での選択核酸の単離および分配後、選択配列を、例えば、選択配列の配列決定を通じて同定する。
１つの具体的な態様においては、本発明は、母体および胎児のｃｆＤＮＡを含む混合試料を提供する工程、混合試料中の第１および第２の目的の染色体に由来する２つ以上の選択遺伝子座を増幅する工程、混合試料中の第１および第２の目的の染色体に由来する２つ以上の選択遺伝子座を増幅する工程、目的の染色体に由来する選択領域の相対頻度を決定する工程、第１および第２の目的の染色体に由来する選択遺伝子座の相対頻度を比較する工程、ならびに選択遺伝子座の比較された相対頻度に基づいて胎児異数性の存在または非存在を同定する工程を含む、胎児異数性の存在または非存在の検出のためのアッセイシステムを提供する。
【００４９】
いくつかの具体的な態様においては、ゲノム領域に由来する遺伝子座の相対頻度を個々に算出し、個々の遺伝子座の相対頻度を比較して、染色体異常の存在または非存在を決定する。他の具体的な態様においては、選択遺伝子座の相対頻度を用いて、第１および第２の目的の染色体ならびに参照染色体の染色体頻度を決定し、染色体または染色体のゲノム領域に関するコピー数変動は、第１および第２の目的の染色体の比較された染色体頻度に基づく。
【００５０】
分析に用いられる混合試料は、本発明のアッセイシステムを用いて分析しようとする目的の核酸を含有する任意の試料から取得または誘導することができる。例えば、混合試料は、限定されるものではないが、母体血漿、母体血清、または母体血液を含む、母体および胎児の両方の無細胞核酸を含む任意の母体体液に由来するものであってよい。移植患者に由来する混合試料は、ドナー細胞および患者の細胞の両方に由来する無細胞核酸を含有する任意の液体または組織であってよい。悪性腫瘍を有する患者からの混合試料は、患者の正常な、健康な組織に由来する無細胞核酸ならびに癌細胞に由来する無細胞核酸を含む。
【００５１】
アッセイシステムは、混合試料中のｃｆＤＮＡを検出するために用いられることが好ましいが、特定の態様においては、本発明のアッセイシステムを用いて分析される目的のＤＮＡは、多い細胞種および少ない細胞種に由来するＤＮＡを含有する混合試料に由来するよりもむしろ、異なる細胞種に直接由来するＤＮＡを含む。そのような試料は、標的ＤＮＡに依存する様々な発生源から取得することができる。例えば、分析のための胎児細胞を、羊水、胎盤（例えば、絨毛膜）などの試料から誘導することができる。ドナー器官の試料は、生検により個体中で取得することができる。感染性生物は個体から直接単離し、単離後に分析することができる。ＤＮＡは癌細胞または組織から抽出し、分析に用いることができる。
【００５２】
混合試料から単離され、前記アッセイシステムにおいて検出される実質的な大部分の核酸が、混合試料中の特定の遺伝子座の存在、量および／または多型性に関連する情報を提供することが本発明の別の特徴である。これにより、本発明のアッセイシステムにおいて分析される大部分の核酸が情報を有することが確保される。
【００５３】
いくつかの態様においては、複数の選択遺伝子座のセットをそれぞれのゲノム領域について調査し、混合試料中に存在する選択領域のセットの量を個々に合計して、混合試料中のゲノム領域の相対頻度を決定する。これは、混合試料中に存在する組み合わせた母体および胎児のＤＮＡに関する遺伝子座の頻度の決定を含む。好ましくは、決定は別々の発生源に由来するＤＮＡ間の区別を必要としないが、特定の態様においては、この情報は、全体として試料中の相対頻度の情報に加えて取得することができる。
【００５４】
好ましい態様においては、情報遺伝子座に対応する選択核酸を検出、合計して、混合試料中のゲノム領域の相対頻度を決定する。混合試料中の第２の遺伝子座に由来する遺伝子座と比較した場合に第１のゲノム領域に由来する遺伝子座について予想されるものよりも高い頻度は、混合試料中の第１のゲノム領域のＣＮＶを指示する。
【００５５】
ゲノム領域の比較は、染色体の一部または全部の比較であってよい。例えば、ＣＮＶについて検出されたゲノム領域は、両方が異数性である可能性が最小である場合、胎児における全染色体（例えば、第１８および２１染色体）であってよい。これはまた、一方が異数性であると推定され（例えば、第２１染色体）、他方が参照染色体（例えば、第２染色体などの常染色体）として作用する染色体の比較であってもよい。さらに他の態様においては、比較は、異数性であると推定される２つ以上の染色体および１つ以上の参照染色体を用いることができる。
【００５６】
１態様においては、本発明のアッセイシステムは、目的の染色体上の選択遺伝子座を表す複数の核酸を分析し、試料に由来するそれぞれの選択遺伝子座の相対頻度を分析して、試料中のそれぞれの特定の目的の染色体に関する相対染色体頻度を決定する。次いで、２つ以上の染色体またはその一部の染色体頻度を比較して、染色体異常が存在するかどうかを統計的に決定する。
【００５７】
別の態様においては、本発明のアッセイシステムは目的の染色体上の選択遺伝子座の複数コピーのセットを分析し、試料に由来するそれぞれの選択遺伝子座の相対頻度を分析し、独立に定量して、試料中のそれぞれの選択遺伝子座に関する頻度を決定する。試料中の遺伝子座の合計を比較して、混合試料中の１つの発生源のゲノム領域中の１つ以上の遺伝子座についてＣＮＶが存在するかどうかを統計的に決定する。
【００５８】
別の態様においては、それぞれの染色体上の遺伝子座のサブセットを分析して、染色体異常が存在するかどうかを決定する。遺伝子座頻度を特定の染色体について合計し、遺伝子座の合計を用いて異数性を決定することができる。本発明のこの態様は、それぞれのゲノム領域中の個々の遺伝子座の頻度を合計した後、ある染色体のゲノム領域上の遺伝子座の合計を別の染色体のゲノム領域に対して比較して、染色体異常が存在するかどうかを決定する。遺伝子座のサブセットを無作為であるが、染色体異常が存在するかどうかを決定する際に統計的に有意な結果をもたらすのに十分な数の遺伝子座を用いて選択することができる。異なる遺伝子座のサブセットの複数の分析を混合試料内で実施して、より高い統計力を得ることができる。別の態様においては、試料間であまり変動しないことが知られるか、または染色体頻度の決定に用いられるデータを制限することにより、例えば、試料内の非常に高いか、もしくは非常に低い頻度を有する遺伝子座に由来するデータを無視することにより、特定の遺伝子座を選択することができる。
【００５９】
特定の態様においては、１つ以上の特定の遺伝子座の測定された量を正規化して、試料中の遺伝子座の量の差異を説明する。アッセイシステム（例えば、温度、試薬ロットの相違）、試料の基本的な生物学（例えば、核酸含量）、操作者の相違、または任意の他の変数などの発生源に由来する既知の変動を正規化することにより、これを行うことができる。
【００６０】
特定の具体的な態様においては、混合試料中の少ない発生源に由来する核酸の相対割合の決定が、その試料中の少ない発生源内のコピー数変動を示し得る遺伝子座の相対的な統計的存在に関する重要な情報を提供するため、アッセイシステムを実施するのに有益であり得る。少ない発生源に由来する混合試料に寄与した遺伝子座の決定は、目的のゲノム領域に関する頻度の統計的に有意な差異を算出するのに用いられる情報を提供することができる。かくして、そのような遺伝子座は、アッセイにおいて２つの形態の情報を提供することができる−対立遺伝子情報は混合試料中の少ない細胞の寄与率を決定するのに用いることができ、対立遺伝子情報の合計は混合試料中のその遺伝子座の相対的な全体の頻度を決定するのに用いることができる。対立遺伝子情報はその遺伝子座の相対的な全体の頻度を決定するのに必要とされない。
【００６１】
別の具体的な態様においては、本発明のアッセイシステムを用いて、細胞集団中の潜在的なモザイク現象、ならびに多いおよび／または少ない発生源におけるモザイク現象の同定を確認するためにさらなる確認試験を行うべきであるかどうかを決定することができる。特定の例においては、混合試料中の少ない発生源に由来する核酸のパーセントの決定は、モザイク現象の見積もられたレベルの定量を補助することができる。続いて、特定の細胞または組織におけるモザイクの完全または部分的な異数性を識別することができる他の試験法を用いて、モザイク現象を確認することができる。
【００６２】
さらに別の具体的な態様においては、本発明のアッセイシステムを用いて、少ない種が夾雑種である、試料中の夾雑を決定することができる。
別の態様においては、所与の選択核酸のオリゴヌクレオチドを、環状または単分子プローブがそれに結合することができるように、非配列特異的末端で接続することができる。この態様においては、環状プローブの３’末端および５’末端は、選択遺伝子座に結合し、少なくとも１つのユニバーサル増幅領域が環状プローブの選択されていない特異的配列中に存在する。
【００６３】
増幅産物を、初期混合試料から多型領域の富化を要することなく直接分析することができることがアッセイの重要な特徴である。かくして、本発明は、選択遺伝子座の配列決定の前に介入多型富化工程を行うことなく母体試料に由来するＣＮＶおよび多型の両方の検出を可能にする。
【００６４】
選択増幅および検出の標的化手法を用いてＣＮＶおよび発生源寄与の両方を決定することが、アッセイの別の重要な特徴である。これにより、アッセイにおいて集められた情報の大部分がＣＮＶおよび／または発生源寄与の決定にとって有用になり、参照配列と整列させなければならない配列リードを生成させる必要性を取り除くことができる。
【００６５】
これらのおよび他の態様、特徴および利点を本明細書に記載のようにより詳細に提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明のアッセイシステムにおいて用いられる全工程の単純化された流れ図。
【図２】本発明の連結に基づくアッセイシステムの第１の全体図。
【図３】本発明の連結に基づくアッセイシステムの第２の全体図。
【図４】本発明の連結に基づくアッセイシステムの第３の全体図。
【図５】本発明の１アッセイシステムを用いて得られた遺伝子型決定性能を例示する図。
【図６】本発明のアッセイを用いた胎児パーセントの決定の結果を例示するグラフ。
【図７】母体試料の２つのコホートに関する異数性および多型の検出に用いられる要素を示す図。
【図８−１】妊娠被験体の第２のコホートのサブセットに関する患者の概要および試料情報およびデータを示す図。
【図８−２】妊娠被験体の第２のコホートのサブセットに関する患者の概要および試料情報およびデータを示す図。
【図８−３】妊娠被験体の第２のコホートのサブセットに関する患者の概要および試料情報およびデータを示す図。
【図８−４】妊娠被験体の第２のコホートのサブセットに関する患者の概要および試料情報およびデータを示す図。
【図８−５】妊娠被験体の第２のコホートのサブセットに関する患者の概要および試料情報およびデータを示す図。
【図９】第１のコホートに関して本発明の１態様を用いて達成された第２１染色体の異数性検出を例示する図。
【図１０】第１のコホートに関して本発明の１態様を用いて達成された第１８染色体の異数性検出を例示する図。
【図１１】第２のコホートに関して本発明の１態様を用いて達成された第２１染色体の異数性検出を例示する図。
【図１２】第２のコホートに関して本発明の１態様を用いて達成された第１８染色体の異数性検出を例示する図。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
（定義）
本明細書で用いられる用語は、当業者によって理解されるような平易で通常の意味を有することが意図される。以下の定義は、読者が本発明を理解するのを助けることを意図されるものであって、具体的に指摘しない限りそのような用語の意味を変化させるか、またはさもなければ制限することを意図されるものではない。
【００６８】
用語「増幅された核酸」は、混合試料中のその出発量と比較して、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で実施された任意の核酸増幅法または複製方法によって量が少なくとも２倍増加した任意の核酸分子である。
【００６９】
本明細書で用いられる用語「増幅産物」とは、鋳型として連続的連結産物を用いる増幅反応から生じる産物、または鋳型として連続的連結産物に相補的な分子を用いる増幅反応から生じる産物を指す。
【００７０】
用語「染色体異常」とは、単一の遺伝子座よりも大きい染色体の全部または一部に影響する任意の遺伝的変化を指す。遺伝子変異体は、限定されるものではないが、増幅または欠失、転座、逆位、および突然変異などの任意のＣＮＶを含んでもよい。染色体異常の例としては、限定されるものではないが、ダウン症候群（トリソミー２１）、エドワード症候群（トリソミー１８）、パトー症候群（トリソミー１３）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）、トリプルＸ症候群、ＸＹＹ症候群、トリソミー８、トリソミー１６、ターナー症候群、ロバートソン転座、ディジョージ症候群およびヴォルフ・ヒルシュホルン症候群が挙げられる。
【００７１】
用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成規則により関連する核酸分子（すなわち、ヌクレオチドの配列）を参照して用いられる。相補的ヌクレオチドは、一般に、ＡとＴ（もしくはＡとＵ）、またはＣとＧである。２つの一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、最適に整列され、好適なヌクレオチド挿入または欠失を有する、一方の鎖のヌクレオチドが、少なくとも約９０％〜約９５％の相補性、およびより好ましくは約９８％〜約１００％の相補性、およびさらにより好ましくは１００％の相補性で対形成する場合、実質的に相補的であると言われる。あるいは、ＲＮＡまたはＤＮＡ鎖がその相補体に選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合、実質的な相補性が存在する。選択的ハイブリダイゼーション条件としては、限定されるものではないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約１Ｍ未満、より通常は約５００ｍＭ未満および好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は、一般に、融点（Ｔｍ）よりも少なくとも約２℃〜約６℃低い。
【００７２】
本明細書で互換的に用いられる用語「コピー数変動」または「ＣＮＶ」は、ＤＮＡ中の１つ以上の遺伝子座の異常な数のコピーを有する細胞をもたらすゲノムのＤＮＡの変化である。臨床的に関連するＣＮＶは、単一の遺伝子に限られるか、または遺伝子の連続するセットを含んでもよい。ＣＮＶはまた、完全な染色体の１つ以上のさらなるコピーを含むものまで、特定の染色体上で欠失、逆位または複製したゲノムの比較的大きい領域に一致してもよい。本明細書で用いられる用語「ＣＮＶ」は、任意の配列関連情報を指すものではなく、むしろ試料中に存在する遺伝子領域の量または「計数」を指すものである。
【００７３】
用語「補正指標」とは、増幅、配列決定または配列決定中の１つ以上の塩基の欠失、置換もしくは挿入ならびにオリゴ合成、増幅、およびアッセイの他の態様などの配列決定の外部で起こり得るヌクレオチド変化の検出を含む他の実験誤差の同定および補正を可能にするさらなるヌクレオチドを含んでもよい指標を指す。これらの補正指標は、別々の配列である独立指標であってよく、またはそれらを他の領域内に埋込んで、用いられる実験技術の正確度を確認するのを助けることができる、例えば、補正指標はユニバーサル増幅に用いられる配列のサブセットまたは試料遺伝子座のヌクレオチドのサブセットであってもよい。
【００７４】
本明細書で用いられる用語「診断ツール」とは、例えば、診断試験または患者試料に対するアッセイを実行するためのシステムにおいて組み合わせて用いられる本発明の任意の組成物またはアッセイを指す。
【００７５】
用語「疾患形質」とは、病理学的状態、例えば、疾患、障害、症候群または素因と関連する単一遺伝子または多遺伝子形質を指す。
本明細書で用いられる用語「ゲノム領域」とは、ゲノム中に連続的様式で通常認められる１つ以上の遺伝子座の任意の領域を指す。ゲノム領域は、最大で染色体全体を含むものまでサイズが変化してもよい。
【００７６】
用語「ハイブリダイゼーション」は一般に、核酸の相補鎖の対形成が起こる反応を意味する。ＤＮＡは通常二本鎖であり、鎖が分離された場合、それらは好適な条件下で再度ハイブリダイズする。ハイブリッドはＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡの間で形成することができる。それらは、短い鎖と、短い鎖に相補的な領域を含む長い鎖との間で形成することができる。不完全なハイブリッドも形成することができるが、それらがより不完全であるほど、それらはより不安定である（形成する可能性が低くなる）。
【００７７】
本明細書で用いられる用語「情報遺伝子座」とは、特定の染色体またはある染色体の全部もしくは一部のＣＮＶを決定する目的で調査されたその染色体の一部の上のある細胞源にとってホモ接合性であり、第２の細胞源にとってヘテロ接合性である遺伝子座を指す。本発明のアッセイシステムにおける使用のための情報遺伝子座としては、参照染色体の調査のために用いられる遺伝子座ならびに細胞源中で異数性であると推定される染色体の調査のために用いられる遺伝子座が挙げられる。情報遺伝子座はまた、単一の個体内の異なる個体に由来する細胞源中の遺伝子座のコピー数を識別することもできる（例えば、移植レシピエントにおける移植ドナー細胞の検出または母体混合試料内の胎児ＤＮＡの検出）。
【００７８】
本明細書で用いられる用語「遺伝子座」とは、ゲノム中の既知の位置の遺伝子座を指す。
用語「多い発生源」とは、ある個体由来の試料中の核酸（当該個体において支配的なゲノム材料を表す）の発生源を指す。
【００７９】
本明細書で用いられる用語「母体試料」とは、胎児および母体の両方の無細胞ゲノム材料（例えば、ＤＮＡ）を含む妊娠した哺乳動物から採った任意の試料を指す。好ましくは、本発明における使用のための母体試料は、比較的非侵襲的な手段、例えば、静脈切開術または被験体から末梢試料を抽出するための他の標準的な技術により得られる。
【００８０】
用語「融解温度」または「Ｔｍ」は、一般的に二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖に解離するようになる温度と定義される。核酸のＴｍを算出するための式は当業界で周知である。標準的な参考文献により示されるように、Ｔｍ値の単純な見積もりを、核酸が０．５Ｍ以下の陽イオン濃度を有する水溶液中にあり、（Ｇ＋Ｃ）含量が３０％〜７０％であり、ｎが塩基数であり、ｍが塩基対不一致の割合である場合、式：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）０．４１（％［Ｇ＋Ｃ］）−６７５／ｎ−１．０ｍにより算出することができる（例えば、サムブルック  ジェイら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ
ａｌ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）を参照されたい）。他の参考文献は、Ｔｍの算出のために構造ならびに配列の特徴を考慮に入れる、より洗練された計算を含む。
【００８１】
「マイクロアレイ」または「アレイ」とは、アレイのそれぞれの部位が、実質的に同一の、または同一のコピーのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドからなり、空間的に規定され、アレイの他のメンバーの部位と重複しない、すなわち、部位が空間的に別個のものであるような核酸を含有する部位のアレイを担持する、表面、好ましくは全く平面的ではなく、または実質的に平面的な表面を有する固相支持体を指す。アレイまたはマイクロアレイはまた、ビーズまたはウェルなどの表面を有する非平面的な調査可能な構造からなってもよい。アレイのオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを固相支持体に共有結合させるか、または非共有結合させることができる。従来のマイクロアレイ技術は、例えば、シーナ（Ｓｃｈｅｎａ），Ｅｄ．，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（２０００）に概説されている。「アレイ分析」、「アレイによる分析」または「マイクロアレイによる分析」とは、例えば、マイクロアレイを用いる１つ以上の生物分子の配列分析などの分析を指す。
【００８２】
用語「少ない発生源」とは、限られた量で存在し、そのゲノム構成および／または発現における差異に起因して多い発生源から識別可能である、個体内の核酸の発生源を指す。少ない発生源の例としては、限定されるものではないが、妊娠女性における胎児細胞、悪性腫瘍を有する患者における癌細胞、移植患者におけるドナー器官に由来する細胞、感染
した宿主における感染性生物に由来する核酸などが挙げられる。
【００８３】
本明細書で用いられる用語「混合試料」とは、一方が多い発生源であり、他方が単一の個体内の少ない発生源である、２つ以上の目的の細胞種（細胞タイプ）に由来する無細胞ゲノム材料（例えば、ＤＮＡ）を含む任意の試料を指す。混合試料の例としては、母体試料（例えば、母体および胎児の両方のＤＮＡを含む母体の血液、血清または血漿）、ならびに末梢由来体細胞試料（例えば、異なる細胞種、例えば、造血細胞、間葉細胞、および他の器官系に由来する循環細胞を含む血液、血清または血漿）が挙げられる。混合試料は、個体における多い発生源および少ない発生源の両方に由来するゲノム材料を含む試料を含み、例えば、正常な体細胞および非定型体細胞、または２つの異なる個体に由来するゲノムを含む細胞であってよく、２つの異なる個体に由来するとは、例えば、母体および胎児の両方のゲノム材料を含む試料、またはドナーおよびレシピエントの両方に由来する細胞を含む移植患者に由来する試料を含む。
【００８４】
本明細書で用いられる用語「単一遺伝子形質」とは、単一の遺伝子中の突然変異または多型と関連する、正常な、または病理学的な任意の形質を指す。そのような形質としては、単一の遺伝子における機能障害により引き起こされる疾患、障害、または素因と関連する形質が挙げられる。形質はまた、非病理学的特徴（例えば、特定の細胞種上の細胞表面分子の存在または非存在）も含む。
【００８５】
用語「非母体」対立遺伝子は、胎児対立遺伝子（ｄｅ  ｎｏｖｏでのＳＮＰもしくは突然変異を有する対立遺伝子）および／または親対立遺伝子中に認められるが、母体対立遺伝子中には認められない多型および／または突然変異を有する対立遺伝子を意味する。
【００８６】
選択遺伝子座の検出に関して用いられる場合、「非多型」とは、１つ以上の多型を含んでもよいが、検出が領域内の特定の多型の検出に依らない、そのような遺伝子座の検出を意味する。かくして、選択遺伝子座は多型を含んでもよいが、本発明のアッセイシステムを用いる領域の検出は、その領域中の特定の多型の存在または非存在よりもむしろ領域の発生に基づく。
【００８７】
本明細書で用いられる「ヌクレオチド」とは、塩基−糖−リン酸の組合せを指す。ヌクレオチドは、核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）のモノマー単位である。用語「ヌクレオチド」は、リボヌクレオシド三リン酸ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧ、ＧＴＰおよびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰなどのデオキシリボヌクレオシド三リン酸、またはその誘導体を含む。そのような誘導体としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰ、ならびにヌクレオチド誘導体を含有する核酸分子に対してヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体が挙げられる。本明細書で用いられる用語「ヌクレオチド」はまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびその誘導体をも指す。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例としては、限定されるものではないが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが挙げられる。
【００８８】
本発明によれば、「ヌクレオチド」は標識されていないか、または周知の技術により検出可能に標識されていてもよい。蛍光標識およびオリゴヌクレオチドへのその付着は、ハウグランド（Ｈａｕｇｌａｎｄ），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ（２００２）；ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）およびマナク（Ｍａｎａｋ），ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；エクステイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ），Ｅｄ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅ
ｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）；ウェットムール（Ｗｅｔｍｕｒ），Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７−２５９（１９９１）などの多くの概説に記載されている。本発明に適用可能な他の方法は、以下の参考文献：ファングら（Ｆｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第４，７５７，１４１号；ホブス  ジュニアら（Ｈｏｂｂｓ，Ｊｒ．，ｅｔ  ａｌ．），米国特許第５，１５１，５０７号；クルイクシャンク（Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ），米国特許第５，０９１，５１９号；メンチェンら（Ｍｅｎｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第５，１８８，９３４号；ベゴットら（Ｂｅｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第５，３６６，８６０号；リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第５，８４７，１６２号；カナら（Ｋｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第４，３１８，８４６号；リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第５，８００，９９６号；リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第５，０６６，５８０号；マチエスら（Ｍａｔｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第５，６８８，６４８号などに開示されている。以下の特許および特許公開：米国特許第６，３２２，９０１号；第６，５７６，２９１号；第６，４２３，５５１号；第６，２５１，３０３号；第６，３１９，４２６号；第６，４２６，５１３号；第６，４４４，１４３号；第５，９９０，４７９号；第６，２０７，３９２号；米国特許出願公開第２００２／００４５０４５号および第２００３／００１７２６４号に開示されたような、量子ドットを用いて標識を実行することもできる。検出可能な標識としては、例えば、放射性アイソトープ、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識が挙げられる。ヌクレオチドの蛍光標識は、限定されるものではないが、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、カスケードブルー、オレゴングリーン、テキサスレッド、シアニンおよび５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含んでもよい。蛍光標識されたヌクレオチドの具体例としては、パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）［米国カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）所在］から入手可能な［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、および［ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ；アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）［米国イリノイ州ア��リントンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ）所在］から入手可能なＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｄｅｏｘｙ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  ＦｌｕｏｒＸ−ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、およびＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ５−ｄＵＴＰ；ベーリンガーマンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）［米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）所在］から入手可能なフルオレセイン−１５−ｄＡＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、テトラメチル−ローダミン−６−ｄＵＴＰ、ＩＲ７７０−９−ｄＡＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、およびフルオレセイン−１５−２’−ｄＡＴＰ；ならびにモレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）［米国オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）所在］から入手可能なＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｅ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、カスケードブルー−７−ＵＴＰ、カスケードブルー−７−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄ
ＵＴＰ、オレゴングリーン４８８−５−ｄＵＴＰ、ローダミングリーン−５−ＵＴＰ、ローダミングリーン−５−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、テキサスレッド−５−ＵＴＰ、テキサスレッド−５−ｄＵＴＰ、およびテキサスレッド−１２−ｄＵＴＰが挙げられる。
【００８９】
本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」とは、ワトソン−クリック型の塩基対形成、塩基スタッキング、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型の塩基対形成などの規則的なパターンのモノマー間相互作用により一本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、そのアノマー形態、ペプチド核酸モノマー（ＰＮＡ）、ロックドヌクレオチド酸モノマー（ＬＮＡ）など、またはその組合せを含む天然または改変核酸モノマーの線状オリゴマーを指す。通常、モノマーはホスホジエステル結合またはその類似体により連結されて、数個のモノマー単位、例えば、８〜１２個から数十個のモノマー単位、例えば、１００〜２００個以上の大きさの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。好適な核酸分子を、ボーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびカルターズ（Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２（１９８１））により記載されたホスホルアミダイト法により、またはマテウッチら（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５（１９８１））によるトリエステル法により（両方とも本明細書に援用する）、または市販の自動化オリゴヌクレオチド合成装置を用いるなどの他の化学的方法により調製することができる。
【００９０】
本明細書で用いられる用語「多遺伝子形質」とは、２つ以上の遺伝子における突然変異または多型と関連する正常な、または病理学的な任意の形質を指す。そのような形質としては、２つ以上の遺伝子における機能障害により引き起こされる疾患、障害、症候群、または素因と関連する形質が挙げられる。形質はまた、２つ以上の遺伝子の相互作用と関連する非病理学的特徴をも含む。
【００９１】
本明細書で用いられる用語「ポリメラーゼ」とは、鋳型として別の鎖を用いて、個々のヌクレオチドを長い鎖に一緒に連結する酵素を指す。２つの一般的な種類のポリメラーゼ−ＤＮＡを合成するＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡを合成するＲＮＡポリメラーゼが存在する。これらの２つのクラスの中に、どの種類の核酸が鋳型として機能することができ、どの種類の核酸が形成されるかに応じて、いくつかのサブタイプのポリメラーゼが存在する。
【００９２】
本明細書で用いられる「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、過剰の非特異的ＤＮＡの存在下でも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択ＤＮＡの特定の小片を複製するための技術を指す。プライマーを選択ＤＮＡに添加すると、プライマーはヌクレオチドおよび典型的には、Ｔａｑポリメラーゼなどを用いて選択ＤＮＡのコピーを開始する。温度を循環させることにより、選択ＤＮＡは変性およびコピーを繰り返す。他の無作為のＤＮＡと混合した場合でも、１コピーの選択ＤＮＡを増幅して、数十億の複製物を得ることができる。ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、非常に少量のＤＮＡを検出および測定し、ＤＮＡの特製小片を作製することができる。いくつかの例においては、線状増幅法をＰＣＲの代替として用いることができる。
【００９３】
本明細書で用いられる用語「多型」とは、限定されるものではないが、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、メチル化差異、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、単一遺伝子多型、点突然変異、トリヌクレオチドリピート、インデルを含む任意の遺伝子変化または遺伝子座の配列変異体を指す。
【００９４】
一般に、「プライマー」は、ポリメラーゼ連鎖反応の合成工程または特定の配列決定反
応において用いられるプライマー伸長技術などにおいて主ＤＮＡの伸長、連結および／または合成を準備するのに用いられるオリゴヌクレオチドである。プライマーはまた、特定の遺伝子座の検出のための捕捉オリゴヌクレオチドに遺伝子座の相補性を提供するための手段としてハイブリダイゼーション技術において用いることもできる。
【００９５】
本明細書で用いられる用語「研究ツール」とは、薬理学的および／または生物学的治療剤の開発を含む、科学的探求、事実上は学問的または商業的探求に用いられる本発明の任意の組成物またはアッセイを指す。本発明の研究ツールは、治療剤または規制認可にかけられることを意図するものではなく、むしろ、本発明の研究ツールは研究を容易にし、規制当局への提出を支援するための情報をもたらす意図をもって実施される任意の活動を含むそのような開発活動を補助することを意図されるものである。
【００９６】
用語「試料指標」とは、一般に、一連の独自のヌクレオチド（すなわち、それぞれの試料指標は複数の試料の分析のための多重化されたアッセイシステム中の試料にとって独自である）を指す。かくして、試料指標を用いて、それぞれの試料をその試料指標に基づいて同定することができるように、単一の反応容器中の異なる試料の多重化のための遺伝子座同定を補助することができる。好ましい態様においては、試料のセット中のそれぞれの試料について独自の試料指標が存在し、試料は配列決定の間にプールされる。例えば、１２の試料が単一の配列決定反応中にプールされる場合、それぞれの試料が独自に標識されるように少なくとも１２の独自の試料指標が存在する。
【００９７】
本明細書で用いられる用語「選択遺伝子座」とは、例えば、コピー数、１つ以上の多型の存在または非存在、感染性生物の存在または非存在などについて調査された遺伝子座に対応する遺伝子座を指す。そのような選択遺伝子座を、ハイブリダイゼーションおよび／または他の配列に基づく技術に基づいて直接単離し、検出のために試料から増幅させるか、またはそれらを配列の検出の前に鋳型として試料を用いて増幅させることができる。本発明のアッセイシステムにおける使用のための核酸領域を、個体間のＤＮＡレベルの変動に基づいて、特定の染色体に対する特異性に基づいて、選択遺伝子座のＣＧ含量および／もしくは必要とされる増幅条件に基づいて、または本開示を読む際に当業者に明らかである他の特徴に基づいて選択することができる。
【００９８】
本明細書で用いられる用語「配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」、「配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）」などは、一般に、核酸中のヌクレオチド塩基の順序を決定するのに用いることができる任意かつ全ての生化学的方法を指す。
【００９９】
本明細書で用いられる用語「発生源寄与」とは、個体内の核酸の２つ以上の発生源の相対的寄与を指す。単一からの寄与は、一般に、試料からの核酸のパーセントとして決定されるが、任意の相対的測定値を用いてもよい。
【０１００】
用語「特異的に結合する」、「特異的結合」などは、指定されたアッセイ条件下で統計的に有意な正のシグナルの生成をもたらす結合パートナー（例えば、核酸プローブまたはプライマー、抗体など）を指す場合に本明細書で用いられる。典型的には、続いて、相互作用は、望ましくない相互作用（バックグラウンド）の結果として生成された任意のシグナルの標準偏差の少なくとも２倍である検出可能なシグナルをもたらす。
【０１０１】
遺伝子との関係において本明細書で用いられる用語「状態」とは、特定の遺伝子からの翻訳および／またはタンパク質発現に影響するコード領域および非コード領域を含む、その遺伝子の対立遺伝子の配列の状態を指す。軟骨形成不全症（例えば、線維芽細胞増殖因子受容体をコードする遺伝子）もしくはハンチントン病（例えば、ハンチンチン遺伝子）、または男性胎児の場合のＸ連鎖疾患などの常染色体優性疾患と関連する遺伝子の状態を
、罹患、すなわち、ある対立遺伝子が疾患もしくは障害の原因である突然変異を有する、または非罹患、すなわち、両方の対立遺伝子がそのような突然変異を欠く、と分類することができる。常染色体劣性疾患と関連する遺伝子またはＸ連鎖劣性障害と関連する母体遺伝子の状態を、罹患、すなわち、両方の対立遺伝子が疾患もしくは障害の原因となる突然変異を有する；キャリア、すなわち、ある対立遺伝子が疾患もしくは障害の原因となる突然変異を有する；または非罹患、すなわち、両方の対立遺伝子がそのような突然変異を欠く、と分類することができる。遺伝子の状態は、多遺伝子病を発症する危険性と関連する特定の対立遺伝子、例えば、特定の疾患もしくは障害に対して保護的である多型または特定の疾患もしくは障害の危険性の増強と関連する多型の存在または非存在を示唆することもできる。
【０１０２】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載のアッセイシステムおよび方法は、別途指摘しない限り、当業者の技術の範囲内にある、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、マイクロアレイおよび配列決定技術の従来の技術および説明を用いてもよい。そのような従来の技術としては、ポリマーアレイ合成、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび連結、オリゴヌクレオチドの配列決定、ならびに標識を用いるハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。好適な技術の具体的な例示は、本明細書に記載の実施例を参照することにより有することができる。しかしながら、等価な従来の手順も、勿論、用いることができる。そのような従来の技術および説明は、グリーンら（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｅｄｓ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）（１９９９）；ワイナーら（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（２００７）；ディーフェンバッハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ），ドベクスラー（Ｄｖｅｋｓｌｅｒ），Ｅｄｓ．，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００３）；ボウテル（Ｂｏｗｔｅｌｌ）およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ（２００３）；マウント（Ｍｏｕｎｔ），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（２００４）；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ），Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００６）；ならびにサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００２）（全てＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから）；ストライヤー  エル（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ  Ｅｄ．）ダブルユー  エイチ  フリーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）；ゲイト（Ｇａｉｔ），“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８４）；ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）およびコックス（Ｃｏｘ），Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（２０００）；ならびにバーグら（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００２）（全てあらゆる目的でその全体を本明細書に援用する）などの標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。本発明の組成物、研究ツールおよび方法を説明する前に、本発明が記載される特定の方法、組成物、標的および使用に限定されず、そのようなものとして、勿論、変化してもよいことが理解されるべきである。また、本明細書で用いられる用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１０３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文が別途明確に述べない限り、複数の指示対象を含むことに留意すべきである。かくして、例えば、「遺伝子座（ａ  ｌｏｃｕｓ）」に対する参照は、１つの領域、１より多い領域、またはそのような領域の混合物を指し、「アッセイ（ａｎ  ａｓｓａｙ）」に対する参照は当業者には公知の等価な工程および方法に対する参照などを含む。
【０１０４】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間のそれぞれの途中の値およびその記述される範囲中の任意の他の記述されるか、または途中の値が本発明に包含される。記述された値が上限および下限を含む場合、これらの含まれる限界のいずれかを除く範囲も本発明に含まれる。
【０１０５】
明確に記述しない限り、本明細書で用いられる用語は当業者によって理解されるような平易かつ通常の意味を有することが意図される。以下の定義は、読者が本発明を理解するのを助けることを意図するものであるが、具体的に指摘しない限りそのような用語の意味を変化させるか、またはさもなければ限定することを意図するものではない。本明細書に記載の全ての刊行物は、その刊行物に記載され、本願で説明される発明と関連して用いることができる製剤および方法を説明および開示する目的で本明細書に援用される。
【０１０６】
以下の説明において、いくつかの具体的な詳細を、本発明のより完全な理解を提供するために記載する。しかしながら、本発明は１つまたは複数のこれらの具体的な詳細がなくても実施することができることが当業者には明らかである。他の例においては、本発明を不明確にするのを避けるために、周知の特徴および当業者には周知の手順は記載されていない。
【０１０７】
（一般的な本発明）
本発明は、単一の個体からの混合試料中の疾患状態と関連するコピー数変動、多型および核酸（例えば、病原体に由来する核酸、または癌、糖尿病、アルツハイマー病などと関連する核酸）を検出する能力を有する単一のアッセイシステムを提供する。前記アッセイは、試料中の選択遺伝子座のコピー数に関する情報ならびに試料中の多い発生源および１つ以上の少ない発生源に由来する核酸の寄与の割合に関する情報を用いる、混合試料中の１つ以上の少ない発生源における遺伝子変動の同定を可能にする。これらの方法は、単一の個体中に存在する多いおよび少ない発生源に由来するゲノム材料（例えば、ＤＮＡ）を含有する任意の混合試料にとって有用である。
【０１０８】
本発明のアッセイ方法における選択遺伝子座の使用は、混合試料内の１つ以上の発生源におけるコピー数変動の決定のための遺伝子座の直接検出を提供する。本発明の注目すべき利点は、コピー数変動および／または多型に対応する選択遺伝子座を、限定されるものではないが、ハイブリダイゼーション技術、デジタルＰＣＲおよび高効率配列決定技術を含む様々な検出および定量技術を用いてさらに分析できることである。任意の染色体に関する任意の数の選択遺伝子座に対してプローブを設計することができる。選択遺伝子座の同定および定量の前の増幅は義務ではないが、検出の前に混合試料の限定的な増幅を用いて、出発材料内の核酸の全体数を拡張することができる。
【０１０９】
図１は、本発明のアッセイシステムにおいて用いられる全工程の単純化された流れ図である。図１は方法１００を示し、第１の工程１１０において、混合された核酸試料が分析のために提供される。そのような技術は当業者には公知であるため、混合試料を実質的に任意の試料から調製することができる（例えば、ティエツ（Ｔｉｅｔｚ），Ｔｅｘｔｂｏｏｄ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，バーティス  シー（Ｂｕｒｔｉｓ，Ｃ．）アッシュウッド  イー（Ａｓｈｗｏｏｄ  Ｅ．）およびブランス  ディ
ー（Ｂｒｕｎｓ，Ｄ．）ｅｄｓ．（２００６）；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｗｅａｐｏｎｓ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ，メシラクソ  エム（Ｍｅｓｉｌａａｋｓｏ，Ｍ．），ｅｄ．，（２００５）；パウリスジン  ジェイ（Ｐａｗｌｉｓｚｙｎ，Ｊ．），Ｓａｍｐｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓａｍｐｌｅ
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（２００２）；ベンカテシュ  イエンガー  ジーら（Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ  Ｉｙｅｎｇａｒ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  （１９９８）；ドリエラック  エス（Ｄｒｉｅｌａｋ，Ｓ．），Ｈｏｔ  Ｚｏｎｅ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃｓ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（２００４）；ウェルズ  ディー（Ｗｅｌｌｓ，Ｄ．），Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（２００２）（それぞれ本明細書に援用する）を参照されたい）。選択された混合試料の種類に応じて、さらなるプロセッシングおよび／または精製工程を実施して、所望の純度またはサイズの核酸断片を取得することができる。超音波処理、噴霧化、ゲル精製、ＰＣＲ精製系、ヌクレアーゼ切断、またはこれらの方法の組合せを含むプロセッシング方法を用いることができるが、これらに限定されるものではない。好ましい態様においては、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む試料を用いる。
【０１１０】
工程１２０で、第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、混合核酸試料に、第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドが混合核酸試料にハイブリダイズすることができる条件下で導入する。第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドは、混合試料中の１つ以上の選択遺伝子座に相補的である核酸配列からなり、本明細書で詳細に説明されるように、コピー数変動および／または染色体異常を決定するのに有用である。コピー数変動および／または染色体異常を決定することができる核酸配列は、増幅または欠失、異数性、転座、または逆位などの染色体異常の同定を可能にする配列を含む。
【０１１１】
工程１３０では、第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、混合核酸試料および第１のセットの固定配列オリゴヌクレオチドに、第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドが混合核酸試料にハイブリダイズすることができる条件下で導入する。第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドは、多型を検出することができる、混合試料中の１つ以上の選択遺伝子座に相補的である核酸配列を含む。必要に応じて、洗浄工程を、工程１２０と１３０との間、および工程１３０と１４０との間に行ってもよい。
【０１１２】
工程１４０では、混合試料中の選択遺伝子座の隣接領域にハイブリダイズした第１および第２のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを連結し、工程１５０では、連結されたオリゴヌクレオチドを増幅させる。次いで、連結および増幅されたオリゴヌクレオチドを検出および分析し、工程１６０でのコピー数変動または染色体異常の決定および多型の同定を可能にする。
【０１１３】
固定配列核酸のセットは、選択遺伝子座中の少なくとも２つの別々の領域にハイブリダイズするように設計される。好ましい態様においては、２つ以上の別々のオリゴを用いてこれらの領域にハイブリダイズさせて、選択遺伝子座に相補的な隣接核酸を提供する。しかしながら、いくつかの態様においては、いわゆる「パドロックプローブ」または「分子反転プローブ（ＭＩＰ）」などのプレサーキュラ（ｐｒｅｃｉｒｃｕｌａｒ）プローブを含む選択遺伝子座に相補的である２つ以上の異なる非隣接領域を含む単一のプローブを用いることができる。
【０１１４】
本発明は、大規模並行配列決定、ショットガン配列決定、およびＣＮＶを検出ために他者により用いられた無作為デジタルＰＣＲの使用などのより無作為な技術と比較して改善されたシステムを提供する。これらの上記手法は、試料中の全ての、または統計的に有意な集団のＤＮＡ断片の配列決定、次いで、これらの断片のマッピングまたはさもなければその好適な染色体への前記断片の結合に依る。次いで、同定された断片を互いに、またはいくつかの他の参照（例えば、正常な染色体構成）に対して比較して、特定の染色体上のＣＮＶを決定する。目的の主要な染色体のみが、混合試料中のそのようなＤＮＡ断片の検出から生成される少数のデータを構成するため、これらの方法は、本発明と比較して本質的に不十分である。
【０１１５】
本発明のアッセイは、選択遺伝子座の標的化された検出を提供し、これは、選択遺伝子座の両含量に関する情報（すなわち、多型領域の存在）および試料中の選択遺伝子座の頻度に関する情報（その領域中の任意の推定される多型を検出するか、または検出しない）を提供する選択。この鍵となる特徴は、本発明の多重化されたアッセイの実施からの単一のデータセットとして、選択遺伝子座のコピー数および選択遺伝子座における多型の存在または非存在の両方を検出する能力を提供することである。
【０１１６】
試料中のＤＮＡの非常に広いサンプリングに依存する技術は、分析される非常に広範囲のＤＮＡを提供しているが、実際には、１Ｘ以下のベースで試料内に含まれるＤＮＡをサンプリングしている（すなわち、サブサンプリング）。対照的に、本発明のアッセイにおいて用いられる選択遺伝子座の増幅は、目的の特定の遺伝子座の範囲の深さを提供し、最初の混合試料中に存在する選択遺伝子座（１つ以上の、少ない発生源に由来するものを含む）の、好ましくは２Ｘ以上の平均配列範囲、より好ましくは１００Ｘ以上の配列範囲、さらにより好ましくは１０００Ｘ以上の配列範囲を有するそのような選択遺伝子座の「スーパーサンプリング」を提供する。
【０１１７】
本発明の注目すべき利点は、アッセイから生じる増幅産物を、限定されるものではないが、ハイブリダイゼーション技術、デジタルＰＣＲおよび高効率配列決定技術を含む様々な検出および定量技術を用いて分析することができることである。
【０１１８】
本発明の方法は、データのより効率的および経済的な使用を提供し、試料増幅後に分析される実質的に大部分の配列は混合試料中の選択遺伝子座の配列同一性および頻度に関する断定的な情報をもたらす。かくして、染色体領域の大規模並行配列決定または無作為デジタル「計数」およびそのような計数からの関連データのその後の同定に依る技術と違って、本発明のアッセイシステムは、当業界の他者により教示された無作為手法よりも非常に効率的なデータ収集の使用を提供する。
【０１１９】
（アッセイ方法）
本発明のアッセイシステムは、上記の一般的なスキームを用いるが、多くの異なる配置および変更を用いてもよく、そのいくつかは以下に記載され、その多くは２０１０年８月６日に出願された米国特許出願第６１／３７１６０５号（その全体を本明細書に援用する）に例示されている。
【０１２０】
図２は、本発明の連結に基づくアッセイシステムの第１の全体図を示す。固定配列オリゴヌクレオチド２０１、２０３は、それぞれ、ユニバーサルプライマー領域２０９および２１１ならびにそれぞれ選択遺伝子座２０５および２０７に相補的な領域を含む。しかしながら、さらに、図２に記載のアッセイシステムは、第１の固定配列オリゴヌクレオチド２０１上の試料指標領域２２１を用いる。特定の態様においては、選択遺伝子座の配列の全部または一部を、記載された技術を用いて、例えば、配列決定またはハイブリダイゼー
ション技術により直接検出する。図２の例では、試料指標を第１の固定配列オリゴヌクレオチド２０１と結合させる。指標の検出は、高度に多重化されたアッセイシステムにおいて特定の試料に由来する配列を同定することができる。
【０１２１】
工程２０２では、固定配列オリゴヌクレオチド２０１、２０３を工程２０２において混合試料２００に導入し、選択遺伝子座２１５に特異的に結合させる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドを残りの遺伝子試料から分離するのが好ましい（例えば、洗浄による（図示なし））。次いで、架橋オリゴを導入し、工程２０４において、第１（２０１）および第２（２０３）の固定配列オリゴヌクレオチドの間の遺伝子座の領域２１５にハイブリダイズさせる。結合したオリゴヌクレオチドを工程２０６において連結して、目的の遺伝子座に広がるそれに相補的な連続的核酸を作製する。本発明の特定の態様においては、架橋オリゴヌクレオチドは長さ２〜４５ヌクレオチドである。具体的な態様においては、架橋オリゴヌクレオチドは長さ３〜９ヌクレオチドである。さらに別の具体的な態様においては、オリゴヌクレオチドは長さ１０〜３０ヌクレオチドである。
【０１２２】
連結後、連結産物をｇＤＮＡ鋳型から溶出させる。ユニバーサルプライマー２１７、２１９を工程２０８において導入して、連結された第１および第２の固定配列オリゴヌクレオチドを増幅させて、目的の遺伝子座の配列を含む増幅産物２２３を作製する（２１０）。これらの産物２２３を単離、検出、同定および定量して、混合試料中の選択遺伝子座の存在および量に関する情報を提供する。好ましくは、増幅産物を、配列決定により検出および定量する。具体的な態様においては、試料指標と増幅産物との両方の配列を決定して、例えば、試料ならびに遺伝子座の同定を提供することが望ましい。本発明で想定される本明細書に示された試料指標などの指標を、第１の固定配列オリゴヌクレオチド、第２の固定配列オリゴヌクレオチドまたはその両方と結合させることができる。あるいは、またはさらに、指標を、連結された第１および第２の固定配列オリゴヌクレオチドを増幅させるのに用いられるプライマーであって、指標を増幅産物中に組込むのにも役立つプライマーと結合させてもよい。
【０１２３】
好ましい態様において、および図２に示されたように、核酸を単離することができる混合試料を代表する指標を用いて、多重化アッセイシステムにおいて選択遺伝子座の発生源を同定する。そのような態様においては、核酸を、試料指標を用いて独自に同定する。次いで、独自に同定されたオリゴヌクレオチドを単一の反応容器中で、他の混合試料に由来する核酸と組み合わせた後、配列決定することができる。そのような場合、配列決定データを独自の試料指標により分離して、それぞれの混合試料に関するそれぞれの標的遺伝子座の頻度を決定し、個々の試料中に染色体異常が存在するかどうかを決定する。
【０１２４】
試料指標を用いる本発明の態様においては、情報を同定することを含む試料指標が、ユニバーサルプライマー領域２０９および２１１と、試料中の選択遺伝子座に相補的な領域２０５および２０７との間に配置されるように、固定配列オリゴヌクレオチドを設計するのが好ましい。あるいは、指標およびユニバーサル増幅配列を、別々の試料について連結産物を増幅させるのに用いられるプライマー中にこれらの指標を含有させることにより、連結された第１および第２の固定配列オリゴ（および存在する場合、架橋オリゴ）に付加することができる。いずれの場合でも、好ましくは、前記指標は、それらが増幅時に保存されるように、遺伝子座特異的配列の上流であるが、ユニバーサルプライマーの下流でコードされる。
【０１２５】
図３は、１つ以上の架橋オリゴヌクレオチドが用いられ、どのように多型が検出および同定されるかを例示するアッセイシステムの方法を例示する。図３では、２つのセットの固定配列オリゴヌクレオチドが用いられる。これら２つのセットの固定配列オリゴヌクレ
オチドは、実質的に同じユニバーサルプライマー３０９、３１１および配列特異的領域３０５、３０７を含むが、異なる試料指標３２１、３２３を含み、その異なる指標は、特定の試料中に存在する単一ヌクレオチド多型の異なる塩基配列に対応するセットの固定配列オリゴヌクレオチド上にある。同じ混合試料３００に由来するが、異なる対立遺伝子特異的オリゴセットを含む個別のチューブ中の材料を用いて連結反応を実行する。選択遺伝子座３１３、３３３におけるこのＳＮＰの２つの可能なヌクレオチドに対応する架橋オリゴヌクレオチドを用いて、それぞれの連結反応において選択遺伝子座を検出する。連結された第１、第２の、および架橋オリゴヌクレオチドの実際の配列の配列決定は必ずしも必要ないが、連結産物全体の配列の多型を同定し、および／または確認を提供するために依然として決定することができるように、特定の多型対立遺伝子を示唆する２つの対立遺伝子指標３２１、３２３を増幅産物中に組込む。
【０１２６】
それぞれの固定配列オリゴヌクレオチドは、選択遺伝子座に相補的な領域３０５、３０７、および混合試料からの選択遺伝子座の最初の選択および／または単離後に、異なる選択遺伝子座を増幅させるのに用いられるユニバーサルプライマー領域３０９、３１１を含む。ユニバーサルプライマー領域は、前記指標および目的の核酸に相補的な領域にフランキングする固定配列オリゴヌクレオチド３０１、３０３および３２３の末端に位置し、かくして、任意のユニバーサル増幅法の産物中に核酸特異的配列および試料指標を保存する。固定配列オリゴヌクレオチド３０１、３０３、３２３を工程３０２で遺伝子試料３００のアリコートに導入し、選択遺伝子座３１５または３２５に特異的に結合させる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドを残りの遺伝子試料から、例えば、洗浄（示さず）により分離するのが好ましい。
【０１２７】
Ａ／Ｔ  ＳＮＰ  ３１３またはＧ／Ｃ  ＳＮＰ  ３３３に対応する架橋オリゴを導入し、工程３０４において、固定配列オリゴヌクレオチドの第１（３０５）および第２（３０７）の核酸相補領域の間の選択遺伝子座３１５または３２５の領域に結合させる。あるいは、架橋オリゴ３１３、３３３を、固定配列オリゴヌクレオチドと同時に試料に導入することができる。結合したオリゴヌクレオチドを工程３０６において、単一の反応混合物中で連結して、選択遺伝子座に広がるそれに相補的な連続的核酸を作製する。
【０１２８】
連結後、好ましくは、別々の反応をユニバーサル増幅および検出工程のために組み合わせることができる。ユニバーサルプライマー３１７、３１９を工程３０８で組合せ反応に導入して、連結された鋳型領域を増幅させ、工程３１０で、連結された第１および第２の固定配列オリゴならびに架橋オリゴの産物３２７、３２９を作製する。これらの連結産物３２７，３２９は、選択遺伝子座中の両方のＳＮＰを表す。これらの連結産物３２７、３２９を、試料指標および／または選択遺伝子座中にＳＮＰを含有する産物の領域を介して、連結産物の配列決定により検出および定量する。
【０１２９】
本発明のアッセイシステムの方法の代替的な配置においては、架橋オリゴは、固定配列オリゴの一方または両方に相補的な領域に直接隣接しない領域にハイブリダイズしてもよく、１つ以上のオリゴの伸長を必要とする中間工程が連結の前に必要である。例えば、図４に例示されるように、それぞれのセットのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、固定配列の２つのオリゴヌクレオチド４０１、４０３および１つ以上の架橋オリゴヌクレオチド４１３を含む。それぞれの固定配列オリゴヌクレオチドは、選択遺伝子座４０５、４０７に相補的な領域、およびプライマー配列を含み、プライマー配列は、好ましくは、ユニバーサルプライマー配列４０９、４１１、すなわち、ユニバーサルプライマーに相補的なオリゴ領域である。プライマー配列４０９、４１１は、固定オリゴヌクレオチド４０１、４０３の末端またはその近くに位置し、かくして、任意のユニバーサル増幅法の産物中に核酸特異的配列を保存する。固定配列オリゴヌクレオチド４０１、４０３を工程４０２で混合試料４００に導入し、目的の遺伝子座４１５の相補部分に特異的に結合させる。ハイブ
リダイゼーション後、ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドを、残りの遺伝子試料から分離するのが好ましい（図示なし）。
【０１３０】
次いで、架橋オリゴヌクレオチドを工程４０４で導入し、第１（４０１）および第２（４０３）の固定配列オリゴヌクレオチドの間の選択遺伝子座４１５の領域に結合させる。あるいは、架橋オリゴを、固定配列オリゴヌクレオチドと同時に導入することができる。この例示的態様においては、架橋オリゴは第１の固定配列オリゴ領域４０５に直接隣接する領域にハイブリダイズするが、第２の固定配列オリゴヌクレオチド４０７の相補領域から１つ以上のヌクレオチド離れている。固定配列および架橋オリゴのハイブリダイゼーション後、架橋オリゴ４１３を、工程４０６で、例えば、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて伸長させて、架橋オリゴ４１３と第２の固定配列オリゴ４０３との間のギャップを埋める。伸長後、結合したオリゴヌクレオチドを工程４０８で連結して、目的の遺伝子座４１５に広がるそれに相補的な連続的核酸を作製する。連結後、ユニバーサルプライマー４１７、４１９を工程４１０で導入して、連結された第１、第２の、および架橋オリゴを増幅させて、工程４１２で、目的の選択遺伝子座の配列を含む増幅産物４２３を作製する。必要に応じて、増幅産物４２３を単離、検出および定量して、混合試料中の選択遺伝子座の存在および量に関する情報を提供する。
【０１３１】
（コピー数変動の検出）
本発明は、１つ以上の遺伝子座のコピー数変動および１つ以上の多型の存在または非存在を同定するための方法を提供する。これを、単一の遺伝子配列に対応する目的の遺伝子座の特定の染色体に対応する遺伝子座の同定のための増幅方法を用いて実施することができる。
【０１３２】
前記アッセイシステムは、混合試料中の選択遺伝子座を同定し、好ましくは単離するために設計された核酸プローブを用いる。特定のプローブは、コピー数（すなわち、遺伝子座頻度）について調査される選択遺伝子座中の目的の配列を同定し、他のプローブは、混合試料中の多い発生源または少ない発生源に対応する核酸中の目的の多型（すなわち、遺伝子座含量）に対応する配列を同定する。
【０１３３】
具体的な態様においては、本発明のアッセイシステムは、分析される実質的に全ての選択遺伝子座を単離、増幅または分析するための１つ以上の選択的増幅工程（例えば、選択遺伝子座に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーを用いる）を用いる。そのような増幅技術は一般に、ゲノムの全部または実質的な部分の無作為の増幅を含むため、これは、例えば、大規模並行配列決定を用いる他者により用いられる無作為増幅手法とは正反対である。さらに、初期試料は必要に応じて、混合試料中の核酸のコピー数を増加させる一般的な増幅などの方法を用いて富化することができる。好ましくは、目的の遺伝子座を同定するのに用いられるハイブリダイゼーション、連結、および増幅工程を、混合試料上で直接実施する。
【０１３４】
一般的な態様においては、本発明の使用者は、異なる染色体上の複数の選択遺伝子座を分析する。試料について複数の遺伝子座を分析する場合、好ましい実施形態は、１つの反応容器中でそれぞれの試料について全ての選択遺伝子座を増幅させることである。複数の選択遺伝子座の頻度を用いて、染色体異常が存在するかどうかを決定し、必要に応じて、選択遺伝子座中の多型を同定する。
【０１３５】
好ましい態様においては、２つ以上の試料に由来する複数の選択遺伝子座を、単一の反応溶液中で増幅させ、例えば、配列決定により、単一のデータセット中で情報を同時に分析する。次いで、得られるデータを分析して、異なる試料に関する結果を分離し、個々の試料におけるＣＮＶの存在または非存在および発生源寄与を決定するために用いる。
【０１３６】
１態様においては、複数の染色体上の複数の選択遺伝子座を用いて本発明のアッセイシステムにおいて染色体異常を同定し、複数の染色体上の選択遺伝子座の頻度を比較して、染色体上の複数の遺伝子座の頻度比に基づいて異数性の可能性の増加を同定する。頻度の正規化または標準化を、１つ以上の選択遺伝子座について実施することができる。
【０１３７】
別の態様においては、前記アッセイシステムは、２つ以上の染色体上の選択遺伝子座の頻度を合計した後、別の染色体に対して、ある染色体上の選択遺伝子座の合計を比較して、染色体異数性が存在するかどうかを決定する。別の態様においては、前記アッセイシステムは、２つ以上の染色体上の選択遺伝子座頻度のサブセットを分析して、２つの染色体のうちの１つについて染色体異数性が存在するかどうかを決定する。この比較は、同じか、または異なる染色体内で行うことができる。
【０１３８】
特定の態様においては、選択遺伝子座の頻度を決定するのに用いられるデータは、実験誤差に起因すると考えられるか、または特定の試料内の特発的な遺伝的偏りに基づいてレベルが上昇もしくは抑制された外れ値データを排除することができる。１例においては、合計するのに用いられるデータは、１つ以上の試料中の特に上昇した頻度を有するＤＮＡ領域を排除することができる。別の例においては、合計するために用いられるデータは、１つ以上の試料中で特に少ない量で見出される選択遺伝子座を排除することができる。
【０１３９】
別の態様においては、選択遺伝子座のサブセットを選択して、染色体異常が存在するかどうかを決定する場合に統計的に有意な結果を得ることができる。選択遺伝子座の異なるサブセットの複数の分析を、混合試料内で実施して、より高い統計力を得ることができる。例えば、第２１染色体について１００の選択遺伝子座および第１８染色体について１００の選択遺伝子座が存在する場合、それぞれの染色体について１００より少ない領域を評価する一連の分析を実施することができる。この例では、選択遺伝子座は選択的に排除されない。
【０１４０】
特定の染色体上で検出可能な異なる核酸の量は、混合試料中の異なる細胞源における遺伝子座の一般的表示、混合試料中の異なる遺伝子座を表す異なる核酸の分解速度、試料調製方法を含むいくつかの因子に応じて変化してもよい。かくして、別の態様においては、染色体上の特定の遺伝子座の量を合計して、試料中の異なる染色体の遺伝子座の量を決定する。遺伝子座の頻度を特定の染色体について合計し、遺伝子座の合計を用いて、異数性を決定する。本発明のこの態様は、それぞれの染色体上の個々の遺伝子座の頻度を合計した後、ある染色体上の遺伝子座の合計を１つ以上の他の染色体に対して比較して、染色体異常が存在するかどうかを決定する。
【０１４１】
好ましくは、本発明のアッセイシステムを用いて分析される核酸を選択的に増幅し、必要に応じて、目的の遺伝子座（例えば、混合試料中の目的の遺伝子座に）に特異的なプライマーを用いて混合試料から単離する。選択的増幅のためのプライマーを、様々な理由のために選択することができるが、好ましくは、１）目的の染色体に由来する領域を効率的に増幅する；２）異なる混合試料中の母体および／または胎児発生源からの推定可能な範囲の発現を有する；ならびに３）特定の染色体にとって特徴的である、すなわち、他の染色体上の相同領域を増幅しないように設計する。以下は、本発明のアッセイシステムにおいて用いることができる例示的技術である。
【０１４２】
本発明のアッセイシステムは、目的の特定の遺伝子座の同定および定量により、異数性および特定の染色体異常の両方を検出する。そのような染色体異常としては、限定されるものではないが、欠失突然変異、挿入突然変異、コピー数多型、コピー数変異体、第２２染色体ｑ１１欠失症候群、第１１染色体上の１１ｑ欠失症候群、第８染色体上の８ｐ欠失
症候群などが挙げられる。一般に、同じか、または別々の染色体上に存在する少なくとも２つの選択遺伝子座を分析し、選択遺伝子座の少なくとも１つは胎児対立遺伝子異常と関連する。次いで、２つの選択遺伝子座の配列および２つの選択遺伝子座のコピー数を比較して、染色体異常が存在するかどうかを決定し、そうである場合、異常の性質を決定する。
【０１４３】
本明細書に含まれる説明の多くは、１つ以上の推定異数性染色体上の選択遺伝子座の量および１つ以上の正常な染色体上の選択遺伝子座の量を計数することにより異数性を検出することを記載するが、同じ技術を用いて、コピー数変動が染色体の一部にのみ起こるそのようなコピー数変動を検出することができる。コピー数変動の検出においては、推定コピー数変動位置内の複数の選択遺伝子座を、推定コピー数変動位置の外部の複数の選択遺伝子座と比較する。例えば、２２ｑ１１欠失内の２つ以上の遺伝子座および２２ｑ１１欠失の外側の２つ以上の遺伝子座を選択することにより、母体試料中で胎児における第２２染色体ｑ１１欠失症候群を検出することができる。２２ｑ１１欠失の外側の遺伝子座は、第２２染色体の別の領域上にあるか、または完全に異なる染色体上にあってもよい。それぞれの遺伝子座の量を、本出願に記載の方法により決定する。
【０１４４】
いくつかの態様においては、選択遺伝子座を増幅させるためにユニバーサル増幅を用いることができる。いくつかの態様においては、それぞれの試料に関する選択遺伝子座を単一の容器中の単一の反応においてアッセイする。他の態様においては、複数の試料に由来する遺伝子座を、単一の容器中の単一の反応においてアッセイすることができる。
【０１４５】
本発明の特定の態様は、そのような欠失の境界を含む欠失を検出することができる。いくつかの態様においては、少なくとも２４の選択遺伝子座を推定される欠失の領域内で用いることができ、少なくとも２４の選択遺伝子座を推定される欠失の領域の外側で用いることができる。別の態様においては、少なくとも４８の選択遺伝子座を推定される欠失の領域内で用いることができ、少なくとも４８の選択遺伝子座を推定される欠失の領域の外側で用いることができる。別の態様においては、少なくとも４８の選択遺伝子座を推定される欠失の領域内で用いることができ、少なくとも９６の選択遺伝子座を推定される欠失の領域の外側で用いることができる。別の態様においては、少なくとも４８の選択遺伝子座を推定される欠失の領域内で用いることができ、少なくとも１９２の選択遺伝子座を推定される欠失の領域の外側で用いることができる。好ましい態様においては、少なくとも３８４の選択遺伝子座を推定される欠失の領域内で用いることができ、少なくとも３８４の選択遺伝子座を推定される欠失の領域の外側で用いることができる。推定される領域内の選択遺伝子座と、推定される欠失の領域の外側の選択遺伝子座とを合計する。次いで、これらの合計を互いに比較して、欠失の存在または非存在を決定する。必要に応じて、合計の比率を計算し、その比率を正常な集団から作製された平均比率と比較することができる。１つ以上の選択遺伝子座の比率が期待される比率の統計的に外側にある場合、欠失が検出される。欠失を正に同定するための閾値は、正常な集団において算出される変動の２倍以上、好ましくは４倍以上であってよい。複数の選択遺伝子座が推定される欠失の領域の内部および外部に求められた場合、欠失の境界を同定することができる。
【０１４６】
（疾患または素因に関連する多型）
本発明のアッセイシステムを用いて、常染色体優性または劣性疾患または突然変異に関連する多型などの多型を検出することもできる。本発明のアッセイシステムの多重化された性質を考慮すると、検出は染色体異常の検出と同じアッセイで行う。かくして、単一のアッセイシステムは、異なるクラスの遺伝子突然変異に関する診断情報を提供することができる。従って、本発明の好ましいアッセイシステムは高度に多重化され、混合試料内の数百から数千もの選択遺伝子座を調査することができるため、特定の態様においては、混合試料内のマーカー遺伝子座、例えば、遺伝的危険性と関連する遺伝子座または感染性生
物の存在または非存在を同定する遺伝子座について試料を調査するのが望ましい。かくして、前記アッセイシステムは、混合試料中のコピー数決定のための選択遺伝子座の検出と共にそのようなマーカー遺伝子座の検出を提供する。
【０１４７】
かくして、本発明のアッセイシステムを用いて、混合試料中の多型を検出することができ、そのような多型は、常染色体劣性障害に関連する遺伝子、常染色体優性障害に関連する突然変異；疾患および／または疾患の進行（例えば、転移）を生じる危険性ならびに予後指示因子に関連する多型に関連する。
【０１４８】
他の具体的な態様においては、本発明のアッセイシステムを用いて、母体試料中で胎児突然変異または多型を検出することができ、そのような突然変異または多型は、冠動脈性心疾患、糖尿病、高血圧、鬱血性心不全、およびてんかんなどの多遺伝子障害と関連する。例としては、癌感受性遺伝子における突然変異（例えば、ＢＲＣＡＩもしくはＩＩまたはｐ５３における突然変異）などの素因に関連する遺伝子における突然変異；アルツハイマー病の危険性に関連するａｐｏＥ３遺伝子多型などの、後に疾患を開始する高い危険性に関連する多型が挙げられる。
【０１４９】
染色体異常および単一遺伝子突然変異または単一遺伝子もしくは多遺伝子疾患、障害、もしくは素因に関連する多型の検出に加えて、本発明のアッセイシステムは、混合試料中の感染性因子を同定することができる。
【０１５０】
（選択的増幅）
いくつかの選択的増幅方法を用いて、本発明のアッセイシステムにおいて分析される増幅された核酸を提供することができ、そのような方法を用いて、混合試料中の選択遺伝子座の初期含量に関する情報の保存を可能にする様式で混合試料中の選択遺伝子座のコピー数を増加させるのが好ましい。増幅および分析の全ての組合せが本明細書で詳細に説明されるわけではないが、本明細書と一致する領域の核酸を単離および／または分析するために様々な増幅方法および／または分析ツールを用いることは当業者の技術の範囲内にあり、そのような変更は本開示を読めば当業者には明らかである。
【０１５１】
そのような増幅方法としては、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号；および第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｄ．エイチ  エー  エルリッヒ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ），Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，１９９２）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ウー（Ｗｕ）およびウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０，１９８９；ランデグレンら（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７，１９８８）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（米国特許第５，２７０，１８４号；および第５，４２２，２５２号）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）（米国特許第５，３９９，４９１号）、連結線形増幅（ＬＬＡ）（米国特許第６，０２７，９２３号）など、自己持続型配列複製（グアテリら（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４（１９９０）およびＷＯ  ９０／０６９９５）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号、第５，８６１，２４５号）ならびに核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）（米国特許第５，４０９，８１８号、第５，５５４，５１７号および第６，０６３，６０３号（それぞれ本明細書に援用する）を参照されたい）が挙げられる。用いることができる他の増幅方法としては、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号に記載のＱｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ、ウォーカーら（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  
ａｌ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）：１６９１−６（１９９２）に記載のＳＤＡなどの等温増幅法、および米国特許第５，６４８，２４５号に記載のローリングサークル増幅が挙げられる。用いることができる他の増幅方法は、米国特許第５，２４２，７９４号、第５，４９４，８１０号、第４，９８８，６１７号および米国特許出願第０９／８５４，３１７号および米国特許出願公開第２００３０１４３５９９号（それぞれ本明細書に援用する）に記載されている。いくつかの態様においては、ＤＮＡを多重遺伝子座特異的ＰＣＲにより増幅する。好ましい態様においては、ＤＮＡをアダプター連結および単一プライマーＰＣＲを用いて増幅する。他の利用可能な増幅方法は、平衡化ＰＣＲ（マクリジオルゴスら（Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：９３６−９（２００２））ならびに核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および自己持続型配列複製（グアテリら（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．），ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：１８７４（１９９０））などの等温増幅方法などである。そのような方法に基づいて、当業者であれば、目的の遺伝子座の５’および３’側の任意の好適な領域中でプライマーを設計することができる。そのようなプライマーを用いて、ＤＮＡが目的の選択遺伝子座を含む限り、任意の長さのＤＮＡを増幅することができる。
【０１５２】
目的のゲノム領域に由来する増幅された選択遺伝子座の長さは、増幅および／または選択された他の遺伝子座から、増幅された遺伝子座を識別するための十分な配列情報を提供するのに十分な長さである。一般に、選択遺伝子座に対応する増幅された核酸は、少なくとも約１６ヌクレオチドの長さであり、より典型的には、選択遺伝子座に対応する増幅された核酸は、少なくとも約２０ヌクレオチドの長さである。本発明の好ましい態様においては、選択遺伝子座に対応する増幅された核酸は、少なくとも約３０ヌクレオチドの長さである。本発明のより好ましい態様においては、選択遺伝子座に対応する増幅された核酸は、少なくとも約３２、４０、４５、５０または６０ヌクレオチドの長さである。本発明の他の態様においては、選択遺伝子座に対応する増幅された核酸は、約１００、１５０または最大で２００の長さであってよい。
【０１５３】
特定の態様においては、選択的増幅は、混合試料に由来するＤＮＡの出発量が非常に限られる場合、例えば、試料中の無細胞ＤＮＡが限られた量で利用可能である場合に特に有用であり得る、初期線形増幅工程を含む。この機構は、元のＤＮＡ含量を代表するＤＮＡ分子の量を増加させ、ＤＮＡまたはＤＮＡの画分（例えば、母体試料中の胎児ＤＮＡ寄与）の正確な定量が必要とされるサンプリング誤差を低下させるのに役立つ。
【０１５４】
かくして、１態様においては、限られたサイクル数の配列特異的線形増幅を、ｃｆＤＮＡを含む出発混合試料に対して実施する。サイクル数は一般に、典型的なＰＣＲ増幅に用いられるものよりも少なく、例えば、５〜３０サイクル以下である。プライマーまたはプローブを設計して、選択遺伝子座を含む特異的ゲノム断片または領域を増幅させることができる。プライマーもしくはプローブを５’末端の末端標識を用いて（例えば、ビオチンを用いて）、または他に、増幅産物をさらなる単離もしくは分析のために精製するか、もしくは固体基質（例えば、ビーズもしくはアレイ）に結合させることができるようなプライマーもしくはプローブに沿って改変することができる。好ましい態様においては、単一の反応が、異なる領域に由来する複数のＤＮＡ断片をもたらすように、プライマーを多重化する。次いで、線形増幅に由来する増幅産物を、標準的なＰＣＲ方法またはさらなる線形増幅を用いて増幅させることができる。
【０１５５】
例えば、ｃｆＤＮＡを妊娠女性の血液、血漿または血清から単離し、目的の染色体に対応する設定数の選択遺伝子座に対するプライマーと共にインキュベートすることができる。好ましくは、初期線形増幅に用いられるプライマーの数は、１２以上、より好ましくは２４以上、より好ましくは３６以上、さらにより好ましくは４８以上、およびさらにより
好ましくは９６以上である。それぞれのプライマーは、単一の選択遺伝子座に対応し、必要に応じて、同定および／または単離のためにタグ付けされる。限られたサイクル数、好ましくは１０以下のサイクル数を線形増幅と共に実施する。続いて、増幅産物を単離する、例えば、プライマーをビオチン分子に連結する場合、増幅産物を固体基質上のアビジンまたはストレプトアビジンへの結合により単離することができる。次いで、増幅産物を、他のプライマーを用いるさらなる増幅などのさらなる生化学的方法ならびに／または配列決定およびハイブリダイゼーションなどの検出技術にかける。
【０１５６】
線形増幅の効率は、特定の系において、正規化を用いて線形増幅に由来する産物が混合試料中の核酸の頻度および配列を代表することを確保することができるように、部位間およびサイクル間で変化してもよい。本発明のアッセイシステムを実施する者であれば、試料の複数のアリコートに由来する情報を用いて、異なる選択遺伝子座における変動を含む選択遺伝子座を代表する異なる増幅産物の量における変動および／または限定的初期線形増幅後の選択遺伝子座間の変動を決定することができる。そのような情報を用いて、試料ＤＮＡ含量中の選択遺伝子座の初期レベルを決定し、選択遺伝子座の頻度の正規化を可能にすることができる。
【０１５７】
（ユニバーサル増幅）
本発明の好ましい態様においては、選択的に増幅された遺伝子座を、本発明のアッセイシステムを用いる様々な選択遺伝子座の全部または実質的に全部のユニバーサル増幅によりさらに増幅させるのが好ましい。選択的に増幅された遺伝子座を単一のユニバーサル増幅反応においてさらに増幅させることができるように、ユニバーサルプライマー領域を固定配列オリゴヌクレオチドに付加する。これらのユニバーサルプライマー配列を、選択的増幅方法の間に核酸領域に付加することができる、すなわち、選択的増幅のためのプライマーはユニバーサルプライマー配列を含む。あるいは、ユニバーサル増幅配列を含むアダプターを、初期増幅後および混合試料に由来する選択的に増幅された選択遺伝子座の単離後にアダプターとして選択的に増幅された選択遺伝子座の末端に付加することができる。
【０１５８】
１つの例示的な態様においては、選択遺伝子座を、目的の選択遺伝子座に相補的なプライマーを用いて混合試料から最初に増幅させた後、ユニバーサル増幅工程を行って、分析のための遺伝子座の数を増加させる。混合試料に由来する初期増幅産物へのプライマー領域の導入により、分析、例えば、配列決定の前、またはその間に選択核酸の全部または一部のその後の制御されたユニバーサル増幅が可能になる。
【０１５９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中に見られるように、ＤＮＡ増幅中には偏りおよび変動性が導入され得る。増幅反応が多重化される場合、異なる選択遺伝子座は異なる速度または効率で増幅する可能性がある。これは、より良好な効率（すなわち、より好ましいハイブリダイゼーション反応速度）を有する多重反応中のいくつかのプライマーに部分的に起因し得、これは、プライマーおよび鋳型ＤＮＡの配列含量、バッファー条件、および他の条件など、他のプライマーよりもいくつかのプライマーを好む実験条件に起因する。多重化されたアッセイシステムにおけるユニバーサルＤＮＡ増幅は一般に、増幅される遺伝子座の間に導入される偏りおよび変動性がより少ない。
【０１６０】
従って、１態様においては、遺伝子座特異的配列を用いる小さいサイクル数（例えば、１〜１０、好ましくは３〜５）の選択的増幅を実施した後、ユニバーサルプライマーを用いるユニバーサル増幅を行う。ユニバーサルプライマーを用いるサイクル数は変化するが、好ましくは、少なくとも１０サイクル、より好ましくは少なくとも５サイクル、さらにより好ましくは２０サイクル以上である。より少ない数の増幅サイクル後にユニバーサル増幅に移動することにより、特定の遺伝子座が他のものより大きい速度で増幅する偏りは低下する。
【０１６１】
必要に応じて、アッセイシステムは、選択的増幅反応において選択的に増幅されない任意の核酸を除去するために選択増幅方法とユニバーサル増幅方法との間に工程を含む。
選択的増幅に由来する全産物または産物のアリコートを、ユニバーサル増幅反応に用いることができる。同じか、または異なる条件（例えば、ポリメラーゼ、バッファーなど）を増幅工程において用いて、例えば、偏りおよび変動性が実験条件に起因して不注意に導入されないことを確保することができる。さらに、プライマー濃度における変動を用いて、他の選択遺伝子座と比較して、いくつかの選択遺伝子座について、配列特異的増幅サイクルの数を示差的に制限することができる。
【０１６２】
特定の態様においては、アッセイシステムにおいて用いられるプライマーまたはアダプターのユニバーサルプライマー領域は、１つの容器中の１つの反応において同時に多数の核酸を分析するための一般的なプライミング機構を用いる従来の多重化アッセイ方法と適合するように設計される。そのような「ユニバーサル」プライミング方法は、混合試料中に存在する選択遺伝子座の量の効率的な高容量の分析を可能にし、異数性の決定のためのそのような混合試料内の選択遺伝子座の存在の包括的定量を可能にする。
【０１６３】
そのようなアッセイ方法の例としては、限定されるものではないが、オリファントら（Ｏｌｉｐｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第７，５８２，４２０号に記載のものなどの、様々な試料を同時に増幅および／または遺伝子型決定するのに用いられる多重化方法が挙げられる。
【０１６４】
いくつかの態様は、それぞれの方法の初期段階に由来するオリゴヌクレオチドが、方法の後の段階に由来するオリゴヌクレオチドにより用いることができる配列を含む核酸配列の多重検出のための共役反応を用いる。限定されるものではないが、以下に記載の方法（それぞれその全体が本明細書に援用される）を含む試料中の核酸を増幅および／または検出するための例示的方法を、単独で、または組み合わせて用いることができる。
【０１６５】
特定の態様においては、本発明のアッセイシステムは、以下の組合せの選択的およびユニバーサル増幅技術の１つを用いる：（１）ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）と一緒のリガーゼ検出反応（「ＬＤＲ」）；（２）ＬＤＲと一緒の二次ＰＣＲと一緒の一次ＰＣＲ；および（３）二次ＰＣＲと一緒の一次ＰＣＲ。本発明のこれらの態様の各々は、特定の核酸特徴を検出する際に特定の適用性を有する。しかしながら、それぞれは、それぞれの方法の初期段階に由来するオリゴヌクレオチドが、方法の後の段階に由来するオリゴヌクレオチドにより用いることができる配列を含む核酸配列の差異の多重検出のための共役反応の使用を必要とする。
【０１６６】
バラニーら（Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第６，８５２，４８７号、第６，７９７，４７０号、第６，５７６，４５３号、第６，５３４，２９３号、第６，５０６，５９４号、第６，３１２，８９２号、第６，２６８，１４８号、第６，０５４，５６４号、第６，０２７，８８９号、第５，８３０，７１１号、第５，４９４，８１０号は、様々な核酸試料中の特異的ヌクレオチド配列の検出のためのリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）アッセイの使用を記載している。
【０１６７】
バラニーら（Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第７，８０７，４３１号、第７，４５５，９６５号、第７，４２９，４５３号、第７，３６４，８５８号、第７，３５８，０４８号、第７，３３２，２８５号、第７，３２０，８６５号、第７，３１２，０３９号、第７，２４４，８３１号、第７，１９８，８９４号、第７，１６６，４３４号、第７，０９７，９８０号、第７，０８３，９１７号、第７，０１４，９９４号、第６，９４９，３７０号、第６，８５２，４８７号、第６，７９７，４７０号、第６，５７６，４５３
号、第６，５３４，２９３号、第６，５０６，５９４号、第６，３１２，８９２号および第６，２６８，１４８号は、核酸検出のためのＬＤＲ共役ＰＣＲを記載している。
【０１６８】
バラニーら（Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第７，５５６，９２４号および第６，８５８，４１２号は、核酸検出のための共役したＬＤＲおよびポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を用いるプレサークルプローブ（「パドロックプローブ」または「多逆位プローブ」とも呼ばれる）の使用を記載している。
【０１６９】
バラニーら（Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第７，８０７，４３１号、第７，７０９，２０１号および第７，１９８，８１４号は、核酸配列の検出のためのエンドヌクレアーゼ切断および連結反応の組合せの使用を記載している。
【０１７０】
ウィリスら（Ｗｉｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第７，７００，３２３号および第６，８５８，４１２号は、多重化された核酸増幅、検出および遺伝子型決定におけるプレサークルプローブの使用を記載している。
【０１７１】
ロナギら（Ｒｏｎａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第７，６２２，２８１号は、ユニークなプライマーおよびバーコードを含むアダプターを用いて核酸を標識および増幅するための増幅技術を記載している。
【０１７２】
好ましい態様においては、増幅産物を、以前に記載のように多重化する。好ましい態様においては、多重増幅産物を、増幅産物の分析によって定量する。好ましい態様においては、増幅方法に由来する個々の分子の代表的試料を、さらなる分析のために残りの試料から単離する。個々の分子の代表的試料を得るために、遺伝子座あたりの平均分子数は多重化反応により作られるサンプリングノイズを超えなければならない。１態様においては、遺伝子座あたりの平均数は１００より多い。別の態様においては、遺伝子座あたりの平均数は５００より多い。別の態様においては、遺伝子座あたりの平均数は１０００より多い。
【０１７３】
増幅産物に由来する個々の分子を、異なる増幅産物を分析において互いに識別することができる様式で他の分子から物理的に単離するのが好ましい。好ましい態様においては、この単離は、固体基質上で行う。それぞれの単離された分子を、分析の前に特定の同定可能な、もしくは物理的なアドレスと結合させることができるか、またはアドレスは分析の結果に基づいて特定の増幅産物について既知となってもよい。基質は平面的な表面であるか、またはビーズなどの三次元的な表面であってもよい。
【０１７４】
一度単離されたら、個々の増幅産物をさらに増幅して、同じ既知の、または同定可能な位置でその分子の複数の同一のコピーを作製することができる。増幅は、その位置が同定可能な、または物理的なアドレスになる前または後に行ってもよい。次いで、増幅産物および／またはそのコピー（増幅産物と同一であるか、または該増幅産物に相補的であってよい）を、増幅産物またはそのコピーの配列に基づいて分析して、特定の遺伝子座および／またはそれが代表する対立遺伝子を同定する。
【０１７５】
好ましい態様においては、増幅産物または増幅産物の一部の全長を、配列決定を用いて分析することができる。決定するのに必要な塩基数は、特定の遺伝子座および／または対立遺伝子に属するものとして増幅産物を独自に同定するのに十分なものでなければならない。１つの好ましい態様においては、増幅産物の配列決定により遺伝子座を分析する。
【０１７６】
配列決定のいくつかの方法は、本発明のアッセイシステムと適合する。配列決定のための例示的方法としては、限定されるものではないが、ドルマナク（Ｄｒｍａｎａｃ），米
国特許第６，８６４，０５２号；第６，３０９，８２４号；および第６，４０１，２６７号；ならびにドルマナクら（Ｄｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許出願公開第２００５／０１９１６５６号（本明細書に援用する）に開示されたものなどのハイブリダイゼーションに基づく方法、合成方法による配列決定、例えば、ナイレンら（Ｎｙｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第７，６４８，８２４号、第７，４５９，３１１号および第６，２１０，８９１号；バラスブラマニアン（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ），米国特許第７，２３２，６５６号および第６，８３３，２４６号；クエイク（Ｑｕａｋｅ），米国特許第６，９１１，３４５号；リら（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００：４１４−４１９（２００３）；ロナギら（Ｒｏｎａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第７，６４８，８２４号、第７，４５９，３１１号、第６，８２８，１００号および第６，２１０，８９１号に記載のピロリン酸配列決定；ならびに連結に基づく配列決定法、例えば、ドルマナクら（Ｄｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許出願第２０１００１０５０５２号およびチャーチら（Ｃｈｕｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許出願第２００７０２０７４８２号および第２００９００１８０２４号などが挙げられる。
【０１７７】
多くの配列が好ましくは高効率連続方法を用いて並行して読み取られる、本質的に並行様式で多くの（典型的には、数千から数十億）の核酸配列を決定する方法を用いて、配列情報を決定することができる。そのような方法としては、限定されるものではないが、ピロ配列決定（例えば、４５４ライフサイエンスインコーポレイティッド社（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）［米国コネチカット州ブランフォード（Ｂｒａｎｆｏｒｄ）所在］により市販）；連結による配列決定（例えば、ＳｏＬｉＤ（商標）技術、ライフテクノロジーインコーポレイティッド社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）［米国カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在］で市販）；改変ヌクレオチドを用いる合成による配列決定（イルミナインコーポレイティッド社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）［米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在］によるＴｒｕＳｅｑ（商標）およびＨｉＳｅｑ（商標）技術、ヘリコスバイオサイエンスコーポレーション社（Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）［米国マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）所在］によるＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）、ならびにパシフィックバイオサイエンスオブカリフォルニアインコーポレイティッド社（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．）［米国カリフォルニア州メンロパーク（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ）所在］によるＰａｃＢｉｏ  ＲＳなどで市販）、イオン検出技術による配列決定（イオントレントインコーポレイティッド社（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．）［米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）所在］）；ＤＮＡナノボールの配列決定（コンプリートジェノミックスインコーポレイティッド社（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．）［米国カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）所在］）；ナノ孔に基づく配列決定技術（例えば、オックスフォードナノポアテクノロジーズリミテッド社（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＴＤ）［英国オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）所在］により開発されたもの）、および同様に高度に並行化された配列決定法が挙げられる。
【０１７８】
あるいは、別の態様においては、増幅産物または増幅産物の一部の全長を、ハイブリダイゼーション技術を用いて分析することができる。検出のためのポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを行う方法は、当業界でよく開発されている。ハイブリダイゼーションアッセイ手順および条件は、用途に応じて変化し、マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）；ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）；ヤング（Ｙｏｕｎｇ）およびデイビス（Ｄａｖｉｓ），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，８０：１１９４（１９８３）に記載のものを含む公知の一般的結合方法に従って選択される。反復的および制御的ハイブリダイゼーション反応を実行するための方法および装置は、米国特許第５，８７１，９２８号、第５，８７４，２１９号、第６，０４５，９９６号および第６，３８６，７４９号、第６，３９１，６２３号（それぞれ本明細書に援用する）に記載されている。
【０１７９】
本発明はまた、特定の好ましい態様においては、リガンド間のハイブリダイゼーションのシグナル検出も想定する。米国特許第５，１４３，８５４号、第５，５７８，８３２号、第５，６３１，７３４号；第５，８３４，７５８号；第５，９３６，３２４号；第５，９８１，９５６号；第６，０２５，６０１号；第６，１４１，０９６号；第６，１８５，０３０号；第６，２０１，６３９号；第６，２１８，８０３号；および第６，２２５，６２５号、米国特許出願第６０／３６４，７３１号ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号（ＷＯ９９／４７９６４として公開）（それぞれあらゆる目的で全体を本明細書に援用する）を参照されたい。
【０１８０】
シグナル検出および強度データのプロセッシングのための方法および装置は、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、第５，５４７，８３９号、第５，５７８，８３２号、第５，６３１，７３４号、第５，８００，９９２号、第５，８３４，７５８号；第５，８５６，０９２号、第５，９０２，７２３号、第５，９３６，３２４号、第５，９８１，９５６号、第６，０２５，６０１号、第６，０９０，５５５号、第６，１４１，０９６号、第６，１８５，０３０号、第６，２０１，６３９号；第６，２１８，８０３号；および第６，２２５，６２５号、米国特許出願第６０／３６４，７３１号ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号（ＷＯ９９／４７９６４として公開）（それぞれあらゆる目的で全体を本明細書に援用する）に開示されている。
【０１８１】
（試料内および試料間の変動の最小化）
混合試料中での検出による染色体異常の検出に関する１つの課題は、少ない発生源に由来する核酸が、通常の多い発生源に由来する核酸よりも非常に少ない量で存在し得るということである。胎児および母体ｃｆＤＮＡを含有する母体試料の場合、全ｃｆＤＮＡの割合としての無細胞胎児ＤＮＡは１〜４０％未満で変化することがあり、最も一般的には、２０％以下で存在し、１０％以下で存在することが多い。そのような母体試料の胎児ＤＮＡにおけるトリソミー２１（ダウン症候群）などの異数性の検出においては、第２１染色体の相対的増加は胎児ＤＮＡにおいては５０％であり、かくして、母体試料中の全ＤＮＡの割合として、一例としては、胎児ＤＮＡは全部の５％であり、全部の割合としての第２１染色体の増加は２．５％である。本明細書に記載の方法によってこの差異を確実に検出しようとする場合、第２１染色体の測定値の変動は、胎児ＤＮＡに由来する第３の第２１染色体により寄与される第２１染色体の増加率よりも非常に小さいものでなければならない。
【０１８２】
試料間で認められる、および／または試料内の遺伝子座に関するレベル間の変動は、その多くが本出願に記載される分析方法の組合せを用いることにより最小化することができる。例えば、前記アッセイにおける内部参照を用いることにより、変動が少なくなる。内部参照の例は、同じ試料中の、異数性などの推定される異常な量で存在する染色体に対して比較するための「正常な」量で存在する染色体（例えば、常染色体のダイソミー）の使用である。参照染色体としての１つのそのような「正常な」染色体の使用で十分であり得るが、定量の統計力を増加させるための内部参照染色体として２つから多くの正常な染色体を使用することも可能である。
【０１８３】
内部参照を用いる１つの方法は、染色体比と呼ばれる、試料中の正常な染色体の量に対する推定される異常な染色体の量の比率を算出することである。染色体比の算出においては、それぞれの染色体のそれぞれの選択遺伝子座の量または計数を一緒に合計して、それぞれの染色体に関する全計数を算出する。次いで、１つの染色体に関する全計数を、異なる染色体に関する全計数で除算して、これらの２つの染色体に関する染色体比を作る。
【０１８４】
あるいは、それぞれの染色体に関する染色体比を、それぞれの染色体に関するそれぞれの選択遺伝子座の計数を最初に合計した後、１つの染色体に関する合計を、２つ以上の染色体に関する全合計で除算することにより算出することができる。一度算出されたら、染色体比を正常な集団に由来する平均染色体比と比較する。
【０１８５】
前記平均は、正規化および外れ値データの排除を用いるか、または用いない、平均値、中央値、最頻値または他の平均であってよい。好ましい態様においては、平均値を用いる。正常な集団に由来する染色体比に関するデータセットを生成させる際に、測定された染色体の正常な変動を算出する。この変動は、いくつかの方法で、最も典型的には、変動係数、またはＣＶと表すことができる。試料に由来する染色体比を、正常集団に由来する平均染色体比と比較する場合に、試料に関する染色体比が正常集団に関する平均染色体比の統計的に外側にある場合、試料は異数性を含む。異数性を宣言するための統計的閾値を設定するための基準は、染色体比の測定値における変動ならびにアッセイに関する許容可能な偽陽性率および偽陰性率に依存する。一般に、この閾値は、染色体比において観察される変動の倍数であってよい。１例においては、この閾値は、染色体比の変動の３倍以上である。別の例においては、それは染色体比の変動の４倍以上である。別の例においては、それは染色体比の変動の５倍以上である。別の例においては、それは染色体比の変動の６倍以上である。上記の例において、染色体比は、染色体による選択遺伝子座の計数を合計することにより決定される。典型的には、それぞれの染色体に関して同じ数の選択遺伝子座を用いる。染色体比を生成させる代替的な方法は、それぞれの染色体に関して遺伝子座の平均計数を算出することである。前記平均は、平均値、中央値または最頻値の任意の推定値であってよいが、典型的には、平均を用いる。平均は、トリム平均もしくは加重平均などの全計数またはいくつかの変動の平均値であってよい。それぞれの染色体に関する平均計数が算出されたら、それぞれの染色体に関する平均計数を、他のもので除算して２つの染色体の間の染色体比を得ることができ、それぞれの染色体に関する平均計数を、全ての測定された染色体に関する平均の合計で除算して、上記のようなそれぞれの染色体に関する染色体比を得ることができる。上記で強調されたように、推定ＤＮＡが少ない相対量にある母体試料において異数性を検出する能力は、アッセイにおける異なる選択遺伝子座の測定値の変動に大きく依存する。この変動を低下させ、かくして、異数性を検出するためのこの方法の感度を改善するいくつかの分析方法を用いることができる。アッセイの変動性を低下させるための１つの方法は、染色体の量を算出するのに用いられる選択遺伝子座の数を増加させることである。一般に、染色体の単一の選択遺伝子座の測定された変動がＸ％であり、Ｙ個の異なる選択遺伝子座が同じ染色体上で測定される場合、その染色体上のそれぞれの選択遺伝子座の量を合計するか、または平均することにより算出された染色体量の測定値の変動はＹ＾１／２で除算した約Ｘ％である。別の言い方をすれば、染色体量の測定値の変動は、遺伝子座の数の平方根で除算したそれぞれの選択遺伝子座の量の測定値のおおよその平均変動である。
【０１８６】
本発明の好ましい態様においては、それぞれの染色体に関して測定される選択遺伝子座の数は少なくとも２４である。本発明の別の好ましい態様においては、それぞれの染色体に関して測定される選択遺伝子座の数は少なくとも４８である。本発明の別の好ましい態様においては、それぞれの染色体に関して測定される選択遺伝子座の数は少なくとも１００である。本発明の別の好ましい態様においては、それぞれの染色体に関して測定される
選択遺伝子座の数は少なくとも２００である。それぞれの遺伝子座の測定に対する増分費用が存在し、かくして、選択遺伝子座の数を最小化することが重要である。本発明の好ましい態様においては、それぞれの染色体に関して測定される選択遺伝子座の数は２０００未満である。本発明の好ましい態様においては、それぞれの染色体に関して測定される選択遺伝子座の数は１０００未満である。本発明の最も好ましい態様においては、それぞれの染色体に関して測定される選択遺伝子座の数は少なくとも４８および１０００未満である。１態様においては、それぞれの選択遺伝子座の量を測定した後、選択遺伝子座のサブセットを用いて、異数性の存在または非存在を決定することができる。選択遺伝子座のサブセットを選択するための多くの標準的な方法が存在する。これらの方法は、特定のパーセンタイル値より下および／または上のレベルが検出された選択遺伝子座が分析から廃棄される、外れ値排除を含む。１態様においては、前記パーセンタイル値は、量により測定される最小および最高５％であってよい。別の態様においては、前記パーセンタイル値は、量により測定される最小および最高１０％であってよい。別の態様においては、前記パーセンタイル値は、量により測定される最小および最高２５％であってよい。
【０１８７】
選択遺伝子座のサブセットを選択するための別の方法は、いくつかの統計的限界の外側にある領域の消去を含む。例えば、平均量の１つ以上の標準偏差の外側にある選択遺伝子座を、分析から除去することができる。選択遺伝子座のサブセットを選択するための別の方法は、選択遺伝子座の相対量を、健康な集団中の同じ選択遺伝子座の期待量と比較し、期待値試験内にある選択遺伝子座を廃棄することであってよい。アッセイにおける変動をさらに最小化するために、それぞれの選択遺伝子座が測定される回数を増加させることができる。考察されたように、ゲノムが１回未満の平均で測定される異数性を検出する無作為の方法と対照的に、本発明のアッセイシステムはそれぞれの選択遺伝子座を複数回意図的に測定する。一般に、事象を計数する場合、計数における変動はポアソン統計により決定され、変動の計数は典型的には１を計数の平方根で除算したものに等しい。本発明の好ましい態様においては、選択遺伝子座をそれぞれ、平均で少なくとも１００回測定する。本発明の好ましい態様においては、選択遺伝子座をそれぞれ、平均で少なくとも５００回測定する。本発明の好ましい態様においては、選択遺伝子座をそれぞれ、平均で少なくとも１０００回測定する。本発明の好ましい態様においては、選択遺伝子座をそれぞれ、平均で少なくとも２０００回測定する。本発明の好ましい態様においては、選択遺伝子座をそれぞれ、平均で少なくとも５０００回測定する。
【０１８８】
別の態様においては、遺伝子座のサブセットを無作為であるが、十分な数の選択遺伝子座を用いて選択して、染色体異常が存在するかどうかを決定する際に統計的に有意な結果を得ることができる。異なる遺伝子のサブセットの複数の分析を混合試料内で実施して、より高い統計力を得ることができる。この例では、無作為分析の前に選択遺伝子座を除去または消去する必要があってもなくてもよい。例えば、第２１染色体に関して１００個の選択遺伝子座が存在し、第１８染色体に関して１００個の選択遺伝子座が存在する場合、それぞれの染色体に関して１００個未満の遺伝子座を評価する一連の分析を実施することができる。
【０１８９】
前記アッセイにおける変動を低下させるための上記方法に加えて、その多くが本出願中の以前に記載された他の分析技術を組み合わせて用いることができる。一般に、前記アッセイにおける変動を、それぞれの試料について全ての選択遺伝子座を単一の容器中の単一の反応において調査する場合に低下させることができる。同様に、アッセイにおける変動を、ユニバーサル増幅システムを用いる場合に低下させることができる。さらに、アッセイの変動を、増幅のサイクル数が限定される場合に低下させることができる。
【０１９０】
（癌患者からの混合試料における検出のためのアッセイシステムの使用）
前記アッセイシステムは、癌患者における診断、予後、およびモニタリングマーカーと
しての、ＤＮＡ鎖完全性、突然変異の頻度、マイクロサテライトの異常、および遺伝子のメチル化などのｃｆＤＮＡの定量的および定性的腫瘍特異的変化の検出を可能にする。単一の遺伝子変化（点突然変異、インデルおよびコピー数変動など）のそのような検出と、ＣＮＶ検出とを組み合わせる能力は、悪性腫瘍を有するか、または有すると疑われる患者における臨床診断、治療、結果予測および進行モニタリングを補助するための強力な方法を提供する。
【０１９１】
いくつかの態様においては、本発明のアッセイシステムを、診断目的で、例えば、患者における悪性腫瘍の存在および／もしくは性質を検出するため、または患者における腫瘍量の定量的見積もりを提供するために用いる。循環する腫瘍ＤＮＡおよびマイクロＲＮＡは、肺癌などの特定の癌と関連してきた（ロス  シーら（Ｒｏｔｈ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．），Ｍｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．２０１１  Ｊｕｎ；５（３）：２８１−９１  Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｆｅｂ  ２４）。コピー数変動はまた、乳癌患者におけるｃｆＤＮＡ中のＨＥＲ２およびエストロゲン受容体の増幅など、特定の癌において検出されてきた（ペイジ  ケイ（Ｐａｇｅ  Ｋ．），Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１１  Ａｐｒ  １２；１０４（８）：１３４２−８  Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｍａｒ  ２２）。
【０１９２】
本発明の他の態様においては、前記アッセイシステムを癌患者において用いて、治療に対する応答をモニターする、および／または疾患の進行を追跡する、例えば、化学放射線療法（ＣＲＴ）を受けている患者における単一遺伝子変化およびｃｆＤＮＡを測定する。特定の癌においては、ｃｆＤＮＡ完全性指標は治療に対する腫瘍応答と有意かつ独立に関係し得ることが示されている。アゴスティーニ  エムら（Ａｇｏｓｔｉｎｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．），Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．２０１１  Ｍａｒ  １７。また、特定の遺伝子変化および／またはコピー数変動の差異の存在または非存在も、化学療法に対する応答および／または疾患の進行と関連してきた。例えば、癌における治療応答および生存の決定のための有用な遺伝的変動を記載するサバス  エス（Ｓａｖａｓ  Ｓ．），Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌ．２０１０  Ｎｏｖ；４９（８）：１２１７−２６  Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｊｕｌ  ２９を参照されたい。例えば、Ｋ−ＲＡＳ遺伝子および／またはｐ５３遺伝子における突然変異の検出と組み合わせたｃｆＤＮＡレベルの検出は、卵巣癌、子宮内膜癌およびリンパ腫を含む様々な癌の進行を測定する際の強力な、比較的非侵襲的なツールを提供する。ドブリチカ  ビーら（Ｄｏｂｒｚｙｃｋａ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．），Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１１  Ｍａｙ；２２（５）：１１３３−４０  Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｎｏｖ  ２３；ドブリチカ  ビーら（Ｄｏｂｒｚｙｃｋａ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．），Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１０  Ａｕｇ  １；１２７（３）：６１２−２１；ホスニー  ジーら（Ｈｏｓｎｙ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００９  Ｍａｒ  １８；２７５（２）：２３４−９  Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｎｏｖ  ２８。そのような分析を、遺伝的変化ならびに治療結果および予後との関連の同定のための機能的データベースポータルであるＶａｒｉｅｔａｓなどのツールを用いてさらに補助することができる。パナネン
ジェイら（Ｐａａｎａｎｅｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．），Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｏｘｆｏｒｄ）．２０１０  Ｊｕｌ  ２９；２０１０；ｂａｑ０１６。
【０１９３】
（移植患者からの混合試料の検出のためのアッセイシステムの使用）
本発明のアッセイシステムを用いて、ｃｆＤＮＡの検出とＳＮＰまたは１つ以上の単一遺伝子における突然変異の検出との組合せを用いて移植患者における器官の健康をモニターすることができる。移植された器官は、レシピエント患者のゲノムとは異なるゲノムを有し、器官の健康はアッセイシステムを用いて検出することができる。例えば、急性細胞拒絶は、心臓移植レシピエントにおけるドナーゲノムに由来する無細胞ＤＮＡの有意に増加したレベルと関連することが示されている。スナイダー  ティーエムら（Ｓｎｙｄｅｒ
ＴＭ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１  Ａｐｒ  １２；１０８（１５）：６２２９−３４．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｍａｒ．２８。
さらに、ケモカインおよび接着分子は、白血球を同種移植片に補充することにより同種移植片拒絶を媒介し、インターロイキン（ＩＬ）−８、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２に位置するＳＮＰは同種移植の結果と相関することが示されている。ロー  エイチら（Ｒｏ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．），Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０１１  Ｊａｎ  １５；９１（１）：５７−６４。かくして、本発明のアッセイシステムは、固形器官移植レシピエントをモニターするための非侵襲的試験を提供し、器官生検または他のより面倒な診断もしくは予後技術を要することなく拒絶の初期兆候を同定するのを助けることができる。
【０１９４】
（母体試料における検出のためのアッセイシステムの使用）
特定の具体的態様においては、試料中の胎児ＤＮＡの割合は染色体の予想される統計的存在、および予想が胎児異数性を示唆し得る変動に関する重要な情報を提供するため、母体試料中の胎児ＤＮＡの相対割合の決定が増幅産物の分析において有益であり得る。胎児寄与率は母体試料中の同定された選択遺伝子座のレベルの変動における定量的統計的有意性を決定するのに用いることができるため、これは母体試料中の胎児ＤＮＡのレベルが低い環境において特に役立ち得る。他の態様においては、母体試料中の胎児ｃｆＤＮＡの相対パーセントの決定は、胎児異数性の検出における確実性のレベルまたは力を見積もるのに有益であり得る。
【０１９５】
いくつかの具体的な態様においては、目的の対立遺伝子での母体ＤＮＡの相対胎児寄与を、その対立遺伝子での父方の寄与と比較して、試料中のおおよその胎児ＤＮＡ濃度を決定することができる。他の具体的な態様においては、父方由来の配列（例えば、Ｙ染色体配列または父方特異的多型）のみの相対量を用いて、母体試料中の胎児ＤＮＡの相対濃度を決定することができる。
【０１９６】
母体試料における胎児寄与率を決定するための別の例示的な手法は、胎児および母体ＤＮＡの間で異なるパターンのＤＮＡメチル化を有するＤＮＡ断片の分析によるものである。好ましい態様においては、無細胞ＤＮＡからの増幅されたＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による。本開示を読む際に当業者に明らかであるように、本明細書でより詳細に説明されるものを含む増幅のための他の機構を同様に用いることができる。
【０１９７】
胎児が男性である環境では、試料中の胎児ＤＮＡのパーセントは、Ｙ特異的遺伝子座の検出および算出された母体ＤＮＡ含量との比較により決定することができる。Ｙ染色体上に位置し、かくして、胎児ＤＮＡのものである、性決定領域Ｙ遺伝子に由来する領域（ＳＲＹ）などの、増幅されたＹ特異的遺伝子座の量を、試料から決定し、母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡの両方に存在し、好ましくは、胎児において異数性である可能性があると考えられる染色体、例えば、第２１または１８染色体上にはない常染色体領域に由来するものではない１つ以上の増幅された選択遺伝子座と比較することができる。好ましくは、この増幅工程を、選択的増幅工程と並行して実施するが、多重化アッセイの性質に応じて、それを選択的増幅の前または後に実施してもよい。
【０１９８】
特定の態様においては、母体試料中の無細胞胎児ＤＮＡの割合を、母体試料から単離された連続希釈されたＤＮＡを用いるＰＣＲにより決定することができ、この方法は、増幅された遺伝子を含むゲノム数を正確に定量することができる。母体試料から単離された連続希釈されたＤＮＡを用いるＰＣＲは、男性胎児を含む胎児ＤＮＡのパーセントを決定する場合に好ましい。例えば、血液試料が１００％の男性胎児ＤＮＡを含み、１：２連続希釈を実施する場合、１コピーのＹ連鎖遺伝子および２コピーの常染色体遺伝子が存在するため、平均でＹ連鎖シグナルは常染色体シグナルの前に１倍希釈で消失する。
【０１９９】
具体的な態様においては、母体血漿中の遊離胎児ＤＮＡの割合は、以下の式：遊離胎児ＤＮＡの割合＝（Ｙ連鎖遺伝子のコピー数×２×１００）／（常染色体遺伝子のコピー数
）（式中、それぞれの遺伝子のコピー数はその遺伝子が検出された最も高い連続希釈率を観察することにより決定される）を用いて男性胎児について算出される。この式は、ゲノム、胎児または母体のぞれぞれの中の２コピーの常染色体遺伝子と比較して１コピーのみのＹ連鎖遺伝子が存在するという事実について正規化するために用いられる、２の増倍率を含む。
【０２００】
（混合試料中の少ない発生源のＤＮＡ含量の決定）
本発明の特定の態様においては、少ない発生源からのＤＮＡの寄与の決定は、これらの試料中の遺伝子座のコピー数変動の決定において有用であり得る。例えば、それぞれの母体由来試料中で、胎児に由来するＤＮＡは、母親から継承した遺伝子座の約５０％を継承し、父親に由来する遺伝子座の５０％を継承する。非母体発生源から胎児への遺伝子座寄与の決定は、母体試料中の胎児ＤＮＡの見積もりを可能にし、かくして、目的の染色体に関する染色体頻度の統計的に有意な差異を算出するのに用いられる情報を提供する。
【０２０１】
特定の態様においては、少ない発生源の多型の決定には、混合試料中の少ない発生源のＤＮＡの存在を同定するための標的化ＳＮＰおよび／または突然変異分析が必要である。この計算に必要とされる情報を、本発明のアッセイを用いて提供することができる。いくつかの態様においては、従来の遺伝子型決定、例えば、移植のドナーの遺伝子型決定、母体試料中の父親および母親の遺伝子型決定の使用が役立つ。しかし一般には、従来の遺伝子型決定に属するこの情報は、アッセイを実施する前には必要ではなく、混合試料内の選択遺伝子座のコピー数の決定と同時に遺伝子型決定を実施する。
【０２０２】
１つの好ましい態様においては、混合試料中の少ない発生源の核酸のパーセントを、従前の遺伝子型の知識を用いずに多重化されたＳＮＰ検出を用いて定量することができる。この態様においては、それぞれの領域中に既知のＳＮＰを含む２つ以上の選択多型遺伝子座を用いる。好ましい態様においては、選択多型遺伝子座は、遺伝子座増幅する。好ましい態様においては、増幅はユニバーサルである。好ましい実施形態においては、選択多型遺伝子座を、１つの容器中の１つの反応において増幅する。母体試料中の選択多型遺伝子座のそれぞれの対立遺伝子を決定および定量する。好ましい態様においては、高効率配列決定を、そのような決定および定量に用いる。多いおよび少ない発生源の遺伝子型が異なる遺伝子座が同定される、例えば、ドナー遺伝子型は同型であり、レシピエント遺伝子型は異型である。特定の選択遺伝子座について一方の対立遺伝子の高い相対頻度（＞８０％）および他方の対立遺伝子の低い相対頻度（＜２０％および＞０．１５％）を観察することにより、この同定を行う。複数の遺伝子座の使用は、対立遺伝子の量の測定における変動の量を低下させるため、特に有利である。この要件を満たす遺伝子座の全部またはサブセットを用いて、統計分析により少ない発生源の核酸濃度を決定する。１態様においては、２つ以上の遺伝子座に由来する低い頻度の対立遺伝子を一緒に合計し、高頻度の対立遺伝子の合計で除算し、２を掛けることにより、濃度を決定する。別の態様においては、少ない発生源の核酸のパーセントを、２つ以上の遺伝子座に由来する低頻度の対立遺伝子を平均し、高頻度の対立遺伝子の平均で除算し、２を掛けることにより決定する。
【０２０３】
多くの対立遺伝子について、多いおよび少ない発生源の核酸配列は同型および同一であることがあり、この情報は特徴的ではないため、混合試料中の少ない発生源の核酸の決定においてはそれは有用ではない。本発明は、少ない発生源の核酸の割合の算出において、細胞源（例えば、母体対立遺伝子とは異なる少なくとも１つの対立遺伝子を含有する胎児対立遺伝子）間の識別可能な差異が存在する対立遺伝子情報を用いる。かくして、多いおよび少ない発生源について同じである対立遺伝子領域に関するデータは分析のために選択されず、有用なデータを無力化しないように割合の決定の前に関連データから除去される。
【０２０４】
母体血漿中の胎児ＤＮＡを定量するための例示的方法は、例えば、本明細書に援用するチューら（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ  ２０１０；３０：１２２６−１２２９に見出すことができる。
【０２０５】
１態様においては、領域の量または頻度が実験誤差に起因する、または特定の試料内の特発的な遺伝的偏りに由来する外れ値であると考えられる場合、選択遺伝子座を排除してもよい。別の態様においては、選択遺伝子座は、総和または平均化の前に正規化、標準化、クラスター化、または変換などの統計的または数学的調整を受けてもよい。別の態様においては、選択核酸は、総和または平均化の前に、正規化およびデータ実験誤差排除の両方を受けてもよい。
【０２０６】
好ましい態様においては、１２以上の遺伝子座を、分析のために用いる。別の好ましい態様においては、２４以上の遺伝子座を分析のために用いる。別の好ましい態様においては、４８以上の遺伝子座を分析のために用いる。別の態様においては、１つ以上の指標を用いて試料を同定する。
【０２０７】
具体的な態様においては、少ない発生源の寄与を、タンデムＳＮＰ検出を用いて定量することができる。例えば、母体試料から抽出されたＤＮＡ中のタンデムＳＮＰを同定するための技術は、ミッチェルら（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許第７，７９９，５３１号ならびに米国特許出願第１２／５８１，０７０号、第１２／５８１，０８３号、第１２／６８９，９２４号および第１２／８５０，５８８号に開示されている。これらのものは、胎児ゲノムと母体ゲノムとの間で異なるハプロタイプを有する母体試料中での少なくとも１つのタンデム単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出による胎児および母体の遺伝子座の分化を記載している。これらのハプロタイプの同定および定量は、ミッチェルら（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）の開示に記載のように、母体試料上で直接実施し、母体試料中の胎児寄与率を決定するのに用いることができる。
【０２０８】
胎児の性別について以前に試験されていなかった試料は、胎児が男性であるおおよそ５０％の可能性を有するため、Ｙ特異的配列はそのような試料の半分においてのみ適用可能である。具体的な態様においては、胎児発生源寄与の決定に用いられる多型遺伝子座はＹ染色体上にはない。
【０２０９】
ｃｆＤＮＡのパーセントが少ない発生源について算出されたら、このデータを異数性検出のための方法と組み合わせて、混合試料が異数性を含む可能性を決定することができる。１態様においては、例えば、クエイク（Ｑｕａｋｅ），米国特許出願第１１／７０１，６８６号；シューメイカーら（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），米国特許出願第１２／２３０，６２８号に記載のものなどの、無作為ＤＮＡセグメントの分析を利用する異数性検出方法を用いる。好ましい態様においては、混合試料中の選択遺伝子座の分析を利用する異数性検出方法は、単一の反応において染色体異常を検出するための、少ない発生源のＤＮＡ含量の決定のための領域ならびに２つ以上の染色体に由来する非多型領域の両方を含む。単一の反応は、アッセイシステムにおける様々な工程の間に導入され得るか、さもなければ染色体異常の存在または非存在を決定するのに役立つ少ない発生源のＤＮＡ含量を利用する場合に結果を歪曲し得る、夾雑または偏りの危険性を最小化するのに役立つ。他の態様においては、選択遺伝子座または領域を、少ない発生源のＤＮＡ含量の決定ならびに少ない発生源の染色体異常の検出の両方のために用いることができる。ＤＮＡ含量と染色体異常の検出との両方について同じ領域を用いることは、実験誤差または夾雑に起因する任意の偏りを最小化するのに役立ち得る。
【０２１０】
（実施例）
以下の実施例は、本発明をどのように行い、使用するかの完全な開示および説明を当業
者に提供するために提示されるものであり、発明者がその発明と見なすものの範囲を制限することを意図するものでもなく、また、発明者が、以下の実験が実施される実験の全部であるか、または唯一の実験であることを表すか、または含蓄することを意図するものでもない。当業者であれば、広く記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的な態様に示されたように本発明に対して多くの変更および／または改変を行うことができることを理解する。従って、本発明の態様は、あらゆる点で、例示的であり、限定的ではないと考えられるべきである。
【０２１１】
用いられる数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するために努力が払われたが、いくらかの実験誤差および偏差が説明されるべきである。別途指摘しない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏で表され、および圧力は大気圧周辺のものである。
【０２１２】
（実施例１）
本発明のアッセイシステムの一般的態様
いくつかのアッセイ形式を試験して、多数（例えば、９６以上）の目的の遺伝子座の多重化された、連結に基づく検出を証明するための独立遺伝子座の選択的増幅および検出を実施する能力を証明した。これらの遺伝子座は、特定の染色体の存在または特定の対立遺伝子中の突然変異もしくは多型の存在もしくは非存在を示唆する遺伝子座を含んでいた。
【０２１３】
これらのアッセイを、ヒトゲノム配列に基づいて設計し、それぞれの調査は、アッセイにおいて調査される選択遺伝子座あたり２つの固定配列オリゴからなっていた。ゲノム領域の３’領域に相補的な第１のオリゴは、以下の配列（５’から３’に向かって）オリゴ要素：全アッセイに共通のユニバーサルＰＣＲプライミング配列：ＴＡＣＡＣＣＧＧＣＧＴＴＡＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡＣ（配列番号１）；選択遺伝子座に特異的な９ヌクレオチドの同定指標；第１のＳＮＰ独立セット中の遺伝子座指標としておよび多型特異的な第２のセット中の遺伝子座／対立遺伝子指標として作用する９塩基の遺伝子座−または遺伝子座／対立遺伝子特異的配列；ゲノム遺伝子座中の対応する塩基とは異なるハイブリダイゼーション破壊ヌクレオチド；ならびに選択ゲノム遺伝子座に相補的な２０〜２４ｂｐの配列を含んだ。選択ゲノム遺伝子座のこの部分においてＳＮＰまたは突然変異が検出される場合に備えて、対立遺伝子特異的調査セットは、２つの第１の固定配列タンデム連結プライマーからなっており、それぞれ、突然変異／ＳＮＰ位置に、異なる遺伝子座／対立遺伝子指標および異なる対立遺伝子特異的塩基を含んでいた。これらの第１のオリゴを、それぞれの選択核酸について、アッセイセットにおける全ての調査にわたって２℃の変動を含む予測された均一のＴｍを提供するように設計した。
【０２１４】
ゲノム遺伝子座の５’領域に相補的な、第２の固定配列オリゴは、以下の配列（５’から３’に向かって）要素：ゲノム遺伝子座中の５’領域に相補的な２０〜２４ｂの配列；ゲノム遺伝子座中の対応する塩基とは異なるハイブリダイゼーション破壊ヌクレオチド；およびアッセイセットにおいて全ての第３のオリゴに共通であるユニバーサルＰＣＲプライミング配列：ＡＴＴＧＣＧＧＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＧＣＧＴＣ（配列番号２）を含んだ。
【０２１５】
選択ゲノム遺伝子座においてＳＮＰまたは突然変異が検出される場合に備えて、対立遺伝子特異的調査セットは、２つのタンデム連結プライマーからなっており、それぞれ、突然変異／ＳＮＰ位置に、異なる遺伝子座／対立遺伝子座指標および異なる対立遺伝子特異的塩基を含んでいた。この第２の固定配列オリゴを、それぞれの選択核酸について、第１のオリゴセットと実質的に同じＴｍであるアッセイセットにおける全ての調査にわたって２℃の変動を含む予測された均一なＴｍを提供するように設計した。
【０２１６】
特定の試験された態様においては、それぞれの選択遺伝子座のために用いられる第１および第２の固定配列オリゴに相補的な領域間でゲノム遺伝子座配列に相補的である１つ以上の架橋オリゴを用いた。試験された具体的な態様においては、２つ以上の架橋オリゴを用いて、固定配列オリゴヌクレオチド間のギャップを測り、必要に応じて、１つ以上の架橋オリゴを、前記配列中の１つ以上の突然変異またはＳＮＰを同定するために設計することができる。前記アッセイシステムにおいて用いられる架橋オリゴヌクレオチドの長さは、５から３６塩基対まで変化した。
【０２１７】
タンデム連結形式で用いられた全てのオリゴヌクレオチドを、従来の固相化学を用いて合成した。第２の固定配列オリゴおよび架橋オリゴヌクレオチドを、隣接するオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシル末端への連結を可能にする５’リン酸部分を用いて合成した。
【０２１８】
（実施例２）
タンデム連結手順における使用のためのＤＮＡの調製
白人男性（ＮＡ１２８０１）または白人女性（ＮＡ１１９９５）に由来するゲノムＤＮＡを、コリエルセルレポジトリーズ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）［米国ニュージャージー州カムデン（Ｃａｍｄｅｎ）所在］から取得し、音響剪断（コバリス社（Ｃｏｖａｒｉｓ）［米国マサチューセッツ州ウォバーン（Ｗｏｂｕｒｎ）所在］）により、約２００ｂｐの平均断片サイズまで断片化した。
【０２１９】
コリエル（Ｃｏｒｉｅｌｌ）のＤＮＡを、標準的な手順を用いてビオチン化した。簡単に述べると、コバリス（Ｃｏｖａｒｉｓ）の断片化されたＤＮＡを、１．５ｍｌマイクロチューブ中に以下の反応液：５μｇのＤＮＡ、１２μｌの１０Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー（エンザイマティクス社（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）［米国マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）所在］）、５０ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（エンザイマティクス社（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）［米国マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）所在］）、およびＨ２Ｏで１２０μｌまで、を作製することにより末端修復した。これを３７℃で３０分間インキュベートした。約２ｎｇ／μｌの所望の最終濃度まで、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．５を用いてＤＮＡを希釈した。
【０２２０】
５μｌのＤＮＡを９６穴プレートの各ウェルに入れ、プレートを粘着プレートシーラを用いて密封し、２５０ｘｇで１０秒間遠心分離した。次いで、プレートを９５℃で３分間インキュベートし、２５℃に冷却し、２５０ｘｇで１０秒間、再度遠心分離した。ビオチン化マスターミックスを、１．５ｍｌマイクロチューブ中に、１Ｘ  ＴｄＴバッファー（エンザイマティクス社（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）［米国マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）所在］）、８Ｕ  ＴｄＴ（エンザイマティクス社（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）［米国マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）所在］）、２５０μＭ  ＣｏＣｌ２、０．０１  ｎｍｏｌ／μｌビオチン−１６−ｄＵＴＰ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）［米国ニュージャージー州ナットレー（Ｎｕｔｌｅｙ）所在］）およびＨ２Ｏで１．５ｍｌまでの最終濃度に調製した。１５μｌのマスターミックスを９６穴プレートの各ウェルに分注し、プレートを粘着プレートシーラを用いて密封した。プレートを２５０ｘｇで１０秒間遠心分離し、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを２５０ｘｇで１０秒間再度遠心分離し、７．５μｌの沈降ミックス（１μｇ／μｌのＤｅｘｔｒａｎ  Ｂｌｕｅ、３ｍＭ  ＮａＯＡｃ）を各ウェルに添加した。
【０２２１】
プレートを粘着プレートシーラを用いて密封し、３０００ｒｐｍで２分間、ＩＫＡプレートボルテクサを用いて混合した。２７．５μｌのイソプロパノールを各ウェルに添加し、プレートを粘着プレートシーラを用いて密封し、３０００  ｒｐｍで５分間ボルテックスした。プレートを３０００ｘｇで２０分間遠心分離し、上清をデカントし、プレートを
反転させ、１０ｘｇで１分間、吸収ワイプ上で遠心分離した。プレートを５分間空気乾燥し、ペレットを３０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁した。
【０２２２】
（実施例３）
タンデム連結を用いる例示的アッセイ形式
ビオチン化ＤＮＡを用いるいくつかのタンデム連結アッセイ形式を試験して、本発明のアッセイシステムに関する概念の証拠を示し、一連の異なるアッセイ形式を用いる多数の独立遺伝子座の高度に多重化された標的化された検出を実施する能力を証明した。本発明の例示的アッセイ形式を、遺伝子試料中の遺伝子座あたり９６以上の調査を含むように設計し、ＳＮＰが検出された場合、アッセイ形式は、それぞれ遺伝子試料中の９６の遺伝子座あたり異なる対立遺伝子の検出を用いる、１９２以上の別々の調査を用いた。それぞれのアッセイ形式について記載された例は、ＳＮＰが同定されたか否かに応じて、選択遺伝子座について合計９６または１９２の調査反応を含む、２つの異なるセットの固定配列オリゴヌクレオチドおよび／または架橋オリゴ（実施例１に記載）を用いた。
【０２２３】
第１の例示的アッセイ形式は、第１の固定配列オリゴと架橋オリゴとの間に１塩基のギャップが存在し、架橋オリゴと第２の固定配列オリゴとの間に第２の１塩基のギャップが存在する、遺伝子座特異的な固定配列オリゴおよび架橋オリゴを用いた。２つのギャップのそれぞれは、２つの異なるＳＮＰを包含した。この形式では、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、それぞれのＳＮＰ塩基を組込み、リガーゼを用いて、それによって形成されたニックを塞いだ。ＳＮＰ塩基識別は、ポリメラーゼによる塩基組込みの忠実性、および誤組込みの事象においては、不一致の塩基に隣接するニックを塞がないリガーゼの傾向に由来するものであった。
【０２２４】
第２の例示的アッセイ形式は、固定配列オリゴ間に約１５〜３５塩基のギャップが存在し、ギャップが１つ以上のＳＮＰに広がる、２つの遺伝子座特異的な固定された配列オリゴヌクレオチドを用い、架橋オリゴを用いなかった。この形式では、ポリメラーゼを用いてギャップの失われる塩基を組込み、リガーゼを用いてそれによって形成されたニックを塞いだ。ＳＮＰ塩基識別は、ポリメラーゼによる塩基組込みの忠実性、および誤組込みの事象においては、不一致の塩基に隣接するニックを塞がないリガーゼの傾向に由来するものであった。
【０２２５】
第３の例示的アッセイ形式は、第１および第２の固定配列オリゴの間に約１５〜３５塩基のギャップが存在し、ギャップが１つ以上のＳＮＰに広がる、対立遺伝子特異的な第１および第２の固定配列オリゴを用い、架橋オリゴを用いなかった。２つの別々の対立遺伝子特異的な第１の固定配列オリゴおよび２つの別々の対立遺伝子特異的な第２の固定配列オリゴを用いた。ポリメラーゼを用いて、失われる塩基を組込み、リガーゼを用いて、それによって形成されたニックを塞いだ。ＳＮＰ塩基識別は、ハイブリダイゼーション特異性、３’末端近くに不一致を含むアニーリングしたプライマーを伸長させない非校正ポリメラーゼの傾向、および不一致の塩基に隣接するニックを塞がないリガーゼの傾向に由来するものであった。
【０２２６】
第４の例示的形式は、対立遺伝子特異的な固定配列オリゴおよび遺伝子座特異的架橋オリゴを用いた。この形式では、第１は標的化ＳＮＰの一方の対立遺伝子に特異的な３’塩基を含み、第２は標的化ＳＮＰの他方の対立遺伝子に特異的な３’塩基を含む、目的の遺伝子座の３’末端に相補的な２つの別々の固定配列オリゴを用いた。同様に、第１は第２の標的化ＳＮＰの一方の対立遺伝子に特異的な５’塩基を含み、第２は第２の標的化ＳＮＰの他方の対立遺伝子に特異的な５’塩基を含む、２つの別々の第２の固定配列オリゴを用いた。架橋オリゴは、第１および第２の固定配列オリゴに相補的な遺伝子座領域に直接
隣接する領域に相補的であり、かくして、連結の前のポリメラーゼは必要なかった。リガーゼを用いて、固定配列オリゴと架橋オリゴとの間のニックを塞いだ。このアッセイ形式におけるＳＮＰ塩基識別は、ハイブリダイゼーションの特異性および不一致の塩基に隣接するニックを塞がないリガーゼの傾向に由来するものであった。この例示的形式を、連続的鋳型の作製のためにＴ４リガーゼまたはＴａｑリガーゼを用いて試験し、両方とも以下に記載のような反応において有効であることが証明された。
【０２２７】
第５の例示的形式は、目的の核酸上の隣接領域に相補的である遺伝子座特異的な固定配列オリゴを用い、かくして、これらのオリゴのハイブリダイゼーションによってギャップは作製されなかった。この形式では、ポリメラーゼは不要であり、リガーゼを用いてオリゴ間の単一のニックを塞いだ。
【０２２８】
第６の例示的形式は、固定配列オリゴに相補的な遺伝子座領域間に５塩基の短い塩基ギャップが存在する、対立遺伝子特異的な固定配列オリゴおよび遺伝子座特異的架橋オリゴを用いた。この例における遺伝子座特異的架橋オリゴは、第１および第２の固定配列オリゴに相補的な領域に直接隣接する領域に相補的な５マーであった。この形式では、ポリメラーゼは必要なく、リガーゼを用いてオリゴ間の２つのニックを塞いだ。
【０２２９】
第７の例示的形式は、架橋オリゴに相補的な領域中にＳＮＰを含有する５塩基のより短い塩基ギャップが存在する、遺伝子座特異的な固定配列オリゴおよび遺伝子座特異的架橋オリゴを用いた。可能なＳＮＰに対応する対立遺伝子特異的架橋オリゴをハイブリダイゼーションおよび連結反応に含有させた。この形式では、ポリメラーゼは必要なく、リガーゼを用いて、オリゴ間の２つのニックを塞いだ。このアッセイ形式におけるＳＮＰ塩基識別は、ハイブリダイゼーションの特異性および不一致の塩基に隣接するニックを塞がないリガーゼの傾向に由来するものであった。
【０２３０】
第８の例示的形式は、第１および第２の固定配列オリゴに相補的な領域の間に１０塩基のギャップが存在する、遺伝子座特異的な固定配列オリゴおよび２つの隣接する遺伝子座特異的架橋オリゴを用いた。遺伝子座特異的架橋オリゴを、ギャップを架橋するために２つの連続する５マーを要するギャップと共に、連結反応に含有させた。この形式では、ポリメラーゼは必要なく、リガーゼを用いてオリゴ間の３つのニックを塞いだ。
【０２３１】
上記アッセイ形式のそれぞれについて、実施例２に記載のように調製されたオリゴから、等モルプール（それぞれ４０ｎＭ）の第１および第２の遺伝子座または対立遺伝子座特異的な固定配列オリゴヌクレオチドのセットを作製した。別の等モルプール（それぞれ２０μＭ）の架橋オリゴヌクレオチドも同様に、選択ゲノム遺伝子座の配列に基づくアッセイ方法のために作製した。
【０２３２】
１００μｇのストレプトアビジンビーズを、９６穴プレートのウェルに移し、上清を除去した。６０μｌのＢＢ２バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．０、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ２、５８％ホルムアミド、０．１７％Ｔｗｅｅｎ−８０）、１０μＬの４０ｎＭの固定配列オリゴプールおよび実施例２で調製された３０μＬのビオチン化鋳型ＤＮＡを、ビーズに添加した。プレートを粘着プレートシーラを用いて密封し、ビーズが再懸濁されるまで３０００  ｒｐｍでボルテックスした。７０℃で５分間インキュベートした後、室温までゆっくりと冷却することにより、オリゴを鋳型ＤＮＡにアニーリングさせた。
【０２３３】
プレートを持ち上げた棒磁石プレート上に２分間置いて、磁気ビーズおよび結合したＤＮＡをウェル側に引き寄せた。ピペッティングにより上清を除去し、５０μｌの６０％ＢＢ２（水中でｖ／ｖ）と置換した。ボルテックスによりビーズを再懸濁し、再度磁石上に
置き、上清を除去した。このビーズ洗浄手順を、５０μｌの６０％ＢＢ２を用いて１回繰り返し、５０μｌの洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ２）を用いてさらに２回繰り返した。
【０２３４】
１Ｘ  Ｔａｑリガーゼバッファー（エンザイマティクス社（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）［米国マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）所在］）、１Ｕ  Ｔａｑリガーゼ、および２μＭ架橋オリゴプール（アッセイ形式に依存する）からなる３７μｌの連結反応ミックス中にビーズを再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。必要に応じて、およびアッセイ形式に応じて、非校正熱安定性ポリメラーゼ＋２００ｎＭの各ｄＮＴＰをこの混合物中に含有させた。プレートを持ち上げた棒磁石プレートの上に２分間置いて、磁気ビーズおよび結合したＤＮＡをウェル側に引き寄せた。ピペッティングにより上清を除去し、５０μＬの洗浄バッファーと置換した。ボルテックスによりビーズを再懸濁し、再度磁石上に置き、上清を除去した。洗浄手順を１回繰り返した。
【０２３５】
ストレプトアビジンビーズから生成物を溶出させるために、３０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  １ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０を９６穴プレートの各ウェルに添加した。プレートを密封し、ＩＫＡボルテクサを用いて３０００  ｒｐｍで２分間混合してビーズを再懸濁した。プレートを９５℃で１分間インキュベートし、８チャンネルのピペッタを用いて上清を吸引した。各ウェルから２５μｌの上清を、ユニバーサル増幅のために新鮮な９６穴プレート中に移した。
【０２３６】
（実施例４）
タンデム連結産物のユニバーサル増幅
目的の遺伝子座にハイブリダイズした第１および第２の固定配列オリゴ中に存在するユニバーサル配列に相補的なユニバーサルＰＣＲプライマーを用いて、重合した、および／または連結された核酸を増幅させた。２５μｌの実施例３のそれぞれの反応混合物を、それぞれの増幅反応において用いた。５０μｌのユニバーサルＰＣＲ反応は、２５μｌの溶出した連結産物＋１Ｘ  Ｐｆｕｓｉｏｎバッファー（フィンザイムス（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、フィンランド）、１Ｍのベタイン、４００ｎＭの各ｄＮＴＰ、１ＵのＰｆｕｓｉｏｎ誤差補正熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および以下のプライマー対：ＴＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＧＧＣＧＴＴＡＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡ（配列番号３）およびＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＸＡＡＡＣＧＡＣＧＣＧＡＴＣＡＴＣＧＧＴＣＣ  ＣＣＧＣＡＡ（配列番号４）（配列中、Ｘはプール化および配列決定の前に個々の試料を独自に同定するのに用いられた９６の異なる試料指標の１つである）からなる。ＰＣＲを、ＢｉｏＲａｄ  Ｔｅｔｒａｄ（商標）サーモサイクラーを用いてストリンジェントな条件下で行った。
【０２３７】
それぞれの試料に由来する１０μｌのユニバーサルＰＣＲ産物をプールし、プールされたＰＣＲ産物を、ＡＭＰｕｒｅＸＰ（商標）ＳＰＲＩビーズ（ベックマン−カウルター社（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）［米国マサチューセッツ州ダンバーズ（Ｄａｎｖｅｒｓ）所在］）を用いて精製し、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在］）を用いて定量した。
【０２３８】
（実施例５）
選択遺伝子座の検出および分析
各アッセイ形式の精製されたＰＣＲ産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（商標）２０００（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ）所在］）上でスライドの単一レーン上で配列決定した。配列決定の実行は、典型的には、約１００Ｍの生の読み取り値を生じさせ、そのうちの約８５Ｍ（８５％）
は予想されたアッセイ構造にマッピングされた。これは、実験にわたって平均で約８８５Ｋの読み取り値／試料、および（９６の遺伝子座を用いる実験の場合）９６の遺伝子座にわたって９．２Ｋの読み取り値／複製／遺伝子座に換算された。このマッピングされた読み取り値を複製／遺伝子座／対立遺伝子計数中で解析し、様々な測定基準を、以下のように、それぞれの条件について計算した。
【０２３９】
収率：遺伝子座あたりの独自の読み取り値の平均数（複製／遺伝子座あたりの独自の同定指標読み取り値のみを計数する）を入力ＤＮＡ中に含まれるゲノム当量の総数で除算したものとして計算された、配列決定において調査された入力ＤＮＡの割合の  測定基準。
【０２４０】
８０パーセンタイル遺伝子座頻度範囲：遺伝子座の８０％を包含する倍数範囲として解釈された、配列決定データにおける遺伝子座頻度の変動性の測定基準。それは、遺伝子座あたりの全読み取り値の９０パーセンタイルを、遺伝子座あたりの全読み取り値の１０パーセンタイルで除算したものとして、全ての遺伝子座にわたって、遺伝子座あたりの全読み取り値の分布上で計算されたものであった。
【０２４１】
ＳＮＰ誤差率：ＳＮＰ位置での誤差率の測定基準であり、ＳＮＰ位置に不一致塩基を含有する読み取り値の割合として計算されたものである。
これらの結果を、テーブル１にまとめる。
【０２４２】
テーブル１：タンデム連結アッセイ形式の結果のまとめ
【０２４３】
【表１】
2013532494.tif 000003
【０２４４】
テーブル１は、架橋オリゴを用いる遺伝子座特異的タンデム連結アッセイが、高収率（約１０％）、高割合の標的遺伝子座に由来する産物（１５％の読み取り値は予想されたアッセイ構造を含まなかった）、遺伝子座の限定された偏り（８０％の遺伝子座が約５倍の濃度範囲内にある）、および高いＳＮＰ正確度（０．２％のＳＮＰ誤差率）で、鋳型ＤＮＡを標的化産物に変換したことを示す。架橋オリゴを用いない遺伝子座特異的タンデム連結アッセイは、収率および実質的な遺伝子座の偏りの低下をもたらしたが、依然として高
い正確度のＳＮＰ遺伝子型決定データをもたらした。架橋オリゴを用いる対立遺伝子特異的タンデム連結アッセイはＴ４およびＴａｑリガーゼの両方を用いる遺伝子座特異的アッセイと比較して中間の収率をもたらしたが、遺伝子座の限定された偏りおよび高い正確度のＳＮＰ遺伝子型決定データを依然としてもたらした。架橋を用いない対立遺伝子特異的タンデム連結アッセイは収率および実質的な遺伝子座の偏りの低下をもたらしたが、高い正確度のＳＮＰ遺伝子型決定データを依然としてもたらした。
【０２４５】
アッセイ形式６から８は、鋳型ＤＮＡを高い収率（１２〜１８％）、標的遺伝子座に由来する高い割合の産物（約７６％の読み取り値が予想されたアッセイ構造を含んでいた）および遺伝子座の限られた偏り（８０％の遺伝子座が２〜３倍の濃度範囲にある）で標的産物に変換することができることを示した。図５は、単一の試料中で観察された全ての多型アッセイの２つの対立遺伝子に関する配列計数を比較する、アッセイ形式７を用いて得られた遺伝子型決定性能を例示する。同型および異型クラスターの明確な分離、ならびに同型クラスター間で観察された低いバックグラウンド計数に留意されたい。
【０２４６】
（実施例６）
タンデム連結を用いる胎児ＤＮＡパーセントの決定
１つの例示的な本発明のアッセイシステムを設計して、遺伝子試料中の胎児ＤＮＡ濃度パーセントを決定し、ならびに試料内の選択遺伝子座に関する計数を提供した。この例示的アッセイは、それぞれ母体試料中での異なる遺伝子座の検出を用いる、４８０の個別の調査を含んだ。最初の例は、男性胎児を担持する被験者における胎児ＤＮＡパーセントの決定を使用し、従って、Ｙ染色体上の遺伝子座ならびに母体配列とは異なる父方から継承された胎児ＳＮＰを含有する遺伝子座を使用した。
【０２４７】
具体的には、４８０の選択核酸を、前記アッセイシステムを用いて調査した。４８０の選択核酸は、Ｙ染色体上の遺伝子座に対応する核酸の４８の配列特異的調査、第２１染色体上の遺伝子座に対応する核酸の１９２の配列特異的調査、第１８染色体上の遺伝子座に対応する選択核酸の１９２の配列特異的調査、および第１〜１６染色体上の多型遺伝子座に対応する選択核酸の１４４の配列特異的調査を含んだ。これらのアッセイは、ヒトゲノム配列に基づいて設計されたものであり、それぞれの調査は、アッセイにおいて調査された選択核酸あたり３つのオリゴを用いた。
【０２４８】
それぞれの調査に用いられた第１のオリゴは、選択ゲノム領域の３’領域に相補的であり、以下の配列（５’から３’に向かって）オリゴ要素：全アッセイに共通のユニバーサルＰＣＲプライミング配列：ＴＡＣＡＣＣＧＧＣＧＴＴＡＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡＣ（配列番号１）；９ヌクレオチドを含む選択遺伝子座に特異的な同定指標；および選択ゲノム遺伝子座に相補的な２０〜２４ｂｐの配列を含んだ。この第１のオリゴは、それぞれの選択核酸について、４８０のアッセイセットにおける全ての調査にわたって２℃の変動を含む予測された均一のＴｍを提供するように設計した。
【０２４９】
それぞれの調査に用いられた第２のオリゴは、第１のオリゴヌクレオチドに相補的なゲノム領域に直接隣接するゲノム遺伝子座配列に相補的な架橋オリゴであった。目的の選択核酸に基づいて、架橋オリゴを、アッセイセットにおいて４８０の調査の全部のために架橋オリゴとして役立ち得る合計１２のオリゴヌクレオチド配列の利用を可能にするように設計した。
【０２５０】
それぞれの調査に用いられた第３のオリゴは、選択ゲノム遺伝子座の５’領域に相補的であり、以下の配列（５’から３’に向かって）要素：ゲノム遺伝子座中の５’領域に相補的な２０〜２４ｂの配列；ゲノム遺伝子座中の対応する塩基とは異なるハイブリダイゼーション破壊ヌクレオチド；およびアッセイセットにおいて全ての第３のオリゴに共通で
あるユニバーサルＰＣＲプライミング配列：ＡＴＴＧＣＧＧＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＧＣＧＴＣ（配列番号２）を含んだ。この第３のオリゴは、それぞれの選択核酸について、４８０のアッセイセットにおいて全ての調査にわたって２℃の変動を含む予測された均一なＴｍを提供するように設計され、そのＴｍ範囲は、第１のオリゴセットと実質的に同じＴｍ範囲であった。
【０２５１】
全てのオリゴヌクレオチドを、従来の固相化学を用いて合成した。第１のオリゴヌクレオチドおよび架橋オリゴヌクレオチドを、隣接するオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシル末端への連結を可能にする５’リン酸部分を用いて合成した。多重化アッセイにおいて全ての調査に用いられた第１および第３のオリゴヌクレオチドのセットの等モルプールを作製し、全ての架橋オリゴヌクレオチドの別の等モルプールを作製して、別々のハイブリダイゼーション反応を可能にした。
【０２５２】
Ｄｙｎａｌ  Ｓｉｌａｎｅ  ｖｉｒａｌ  ＮＡキット（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在］）を用いて、５ｍＬの血漿からゲノムＤＮＡを単離した。７人の非妊娠女性被験者、男を妊娠している１０人の女性被験者、および女を妊娠している２２人の女性被験者を含む、３７人の女性から、それぞれ約１２ｎｇのＤＮＡを調製した。標準的な手順を用いてＤＮＡをビオチン化し、ビオチン化されたＤＮＡをストレプトアビジンで被覆された固相表面上に固定化して、その後のアッセイ工程においてゲノムＤＮＡの保持を可能にした。
【０２５３】
固定化ＤＮＡを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、それぞれの調査される配列のための第１および第３のオリゴを含む第１のプールにハイブリダイズさせた。次いで、プール中のハイブリダイズしなかったオリゴを、固相支持体の表面から洗浄し、固定化ＤＮＡを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で架橋オリゴヌクレオチドを含むプールにハイブリダイズさせた。架橋オリゴヌクレオチドを、固定化ＤＮＡにハイブリダイズさせたら、残りの未結合のオリゴを表面から洗浄し、選択遺伝子座に結合した３つのハイブリダイズしたオリゴを、Ｔ４リガーゼを用いて連結して、増幅のための連続ＤＮＡ鋳型を提供した。
【０２５４】
連結されたＤＮＡを、誤差補正熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、第１のユニバーサルＰＣＲプライマーＴＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＧＧＣＧＴＴＡＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡ（配列番号３）および第２のユニバーサルＰＣＲプライマーＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＸＡＡＡＣＧＡＣＧＣＧＡＴＣＡＴＣＧＧＴＣＣＣＣＧＣＡＡ（配列番号４）（配列中、Ｘはプール化および配列決定の前に個々の試料を独自に同定するのに用いられた９６の異なる試料指標の１つである）を用いて固体基質から増幅させた。上記の３７の試料のそれぞれに由来する１０μＬのユニバーサルＰＣＲ産物およびプールされたＰＣＲ産物を、ＡＭＰｕｒｅ（商標）ＳＰＲＩビーズ（ベックマン−カウルター社（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）［米国マサチューセッツ州ダンバーズ（Ｄａｎｖｅｒｓ）所在］）を用いて精製し、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在］）を用いて定量した。
【０２５５】
精製されたＰＣＲ産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（商標）２０００上の６レーンの単一スライド上で配列決定した。配列決定の実行は、３８４Ｍの生の読み取り値を生じさせ、そのうちの３４３Ｍ（８９％）が予想されたゲノム遺伝子座にマッピングされ、３７の試料にわたって試料あたり平均３．８Ｍの読み取り値、および４８０の遺伝子座にわたって遺伝子座あたり試料あたり８Ｋの読み取り値が得られた。マッピングされた読み取り値を試料および遺伝子座計数で解析し、胎児ＤＮＡパーセントの２つの別々の測定基準を以下のように計算した。
【０２５６】
Ｙ染色体遺伝子座により検出された男性ＤＮＡパーセントは、Ｙ染色体遺伝子座調査から誘導された読み取り値の相対割合と、常染色体遺伝子座調査から誘導された読み取り値の相対割合とに対応し、（試験被験者におけるＹ染色体の読み取り値の数／試験被験者における常染色体の読み取り値の数）／（男性対照被験者における読み取り値の数／男性対照被験者における常染色体読み取り値の数）として計算した。この測定基準を、Ｙ染色体の相対読み取り値を用いる男性胎児の場合、胎児ＤＮＡパーセントの尺度として用いた。
【０２５７】
多型遺伝子座により検出された胎児ＤＮＡパーセントは、そのような区別を行うことができる遺伝子座での母体対立遺伝子に対する非母体から誘導された読み取り値の割合に対応する。第１に、それぞれの同定された遺伝子座について、最も少ない計数を有する対立遺伝子（低頻度の対立遺伝子）の読み取り値の数を、読み取り値の総数で除算して、それぞれの遺伝子座に関する少ない対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を提供した。次いで、０．０７５％〜１５％のＭＡＦを有する遺伝子座を、情報遺伝子座として同定した。試料に関する見積もられた胎児ＤＮＡパーセントを、情報遺伝子座の少ない対立遺伝子頻度の平均を２で割ったものとして算出した、すなわち、０．０７５％＜ＭＡＦ＜１５％の場合、２Ｘ平均（ＭＡＦ）出現率として計算した。
【０２５８】
図６は、これらの計算の結果を示す。図６に示されるように、上記のＹ染色体測定基準を用いて決定された男性遺伝子座パーセント（灰色の円）は、男性胎児を含む妊娠を、女性胎児（灰色の菱形）および非妊娠試料（黒色の円）を含む妊娠から分離することができる。さらに、多型遺伝子座測定基準による試料中の胎児量パーセントの計算は、妊娠試料を非妊娠試料から識別することができる。最後に、Ｙ染色体から得られた試料に関する胎児ＤＮＡパーセント見積もり値と、男性胎児を含む妊娠における多型遺伝子座との間には相関があった。この相関は、非常に低い胎児パーセント値まで持続する。
【０２５９】
（実施例７）
母体試料中の異数性の検出
本発明のアッセイシステムを、妊娠女性の２つの別々のコホートにおける多型および染色体異常の検出において用いた。１９０の正常、３６のＴ２１、および８のＴ１８妊娠の第１のコホートならびに１２６の正常、３６のＴ２１および８のＴ１８妊娠の第２のコホートを、胎児異数性について試験した。染色体異数性を、５７６の第２１染色体および５７６の第１８染色体アッセイを用いて検出し、一緒にプールして、以下に記載のように単一の反応においてアッセイした。
【０２６０】
異数性検出アッセイにおいて用いられた要素を図７に例示する。母体試料から単離されたｃｆＤＮＡ（７０１）を、各母体試料中の第２１染色体および第１８染色体の両方に由来する複数の選択遺伝子座のハイブリダイゼーション、連結および増幅のための鋳型として用いた。３つのオリゴヌクレオチドをそれぞれの選択遺伝子座にハイブリダイズさせて、増幅および検出のための連結産物を作製した。左側（または第１の）固定配列オリゴヌクレオチドは、選択遺伝子座に相補的な領域（７０９）および第１のユニバーサルプライマー領域（７１１）を含んだ。右側（または第２の）固定配列オリゴヌクレオチド（７０５）は、選択遺伝子座に相補的な第２の領域（７１３）および第２のユニバーサルプライマー領域（７１５）を含んだ。用いた架橋オリゴヌクレオチド（７０７）は、それぞれ、異数性検出アッセイにおいて用いられた２つ以上の選択遺伝子座の架橋領域にハイブリダイズするように設計された。固定配列オリゴヌクレオチド（７０３、７０５）および架橋オリゴヌクレオチド（７０７）がｃｆＤＮＡ（７０１）の相補的領域にハイブリダイズした場合、その末端は２つのニックを形成した。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのｃｆＤＮＡへの連結の際に、それぞれの選択遺伝子座について、７０３、７０５および７０７を含む連結産物を作製し、これを増幅プライマー（７１９、７２１）のための鋳型と
して用いた。
【０２６１】
次いで、それぞれ、第１および第２のユニバーサルプライマー領域に相補的な領域を含む２つの増幅プライマー（７１９、７２１）を用いて、連結産物を増幅させた。この増幅産物は、選択遺伝子座の配列を含んでいた。右側の増幅プライマーはまた、遺伝子座が多重化アッセイにおいて得られた特定の試料を同定するための試料指標（７１７）を含んだ。９６の異なる右側の増幅プライマー（７２９）を用いる増幅は、単一のレーン上での９６の異なる増幅産物のプール化および同時的配列決定を可能にした。
【０２６２】
増幅プライマー（７１９、７２１）はまた、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（商標）２０００システム（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在］）を用いる配列決定のためのクラスター増幅を支援する左側のクラスター配列（７２３）（ＴＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ）（配列番号７）および右側のクラスター配列（７２５）（ＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡ）（配列番号８）も含んでいた。第１のユニバーサルプライマー配列を含む配列決定プライマー（７２７）を用いて、増幅産物の配列を決定し、第２の配列決定プライマー（７２９）を用いて、増副産物の試料指標（７１７）を決定した。
【０２６３】
簡単に述べると、約１０ｍＬの末梢血を各患者からＢＣＴチューブ（ストレック社（Ｓｔｒｅｃｋ）［米国ネブラスカ州オマハ（Ｏｍａｈａ）所在］）中に採取し、翌日配達便でタンデムダイアグノスティクス社（Ｔａｎｄｅｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に出荷した。１６００ｇで１０ｍの遠心分離により血液採取の７２ｈ以内にＢＣＴチューブから血漿を単離した。血漿を第２のチューブに移し、１６０００ｇで１０ｍ遠心分離して、残存する細胞を除去した。患者１人あたり４〜５ｍＬの血漿から、ｃｆＤＮＡを単離した。それぞれの患者試料から約１５ｎｇのｃｆＤＮＡを単離し、９６穴プレートの個々のウェルに配置した。その後のプロセッシングは全て、アレイシステム方法あたり最大で９６のｃｆＤＮＡ患者試料の多重化バッチ上で行った。
【０２６４】
各ウェル中の母体試料から単離されたｃｆＤＮＡをビオチン沈降させ、上記の実施例３に記載のように３０μＬのＴＥ中に再懸濁した。ビオチン化された鋳型ＤＮＡを、１００μｇのＭｙＯｎｅＣ１ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）［米国カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在］）、６０μｌのＢＢ２バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ２、５８％ホルムアミド、０．１７％Ｔｗｅｅｎ−８０）、ならびに１０μＬのプールされた４０ｎＭの左側（７０３）および右側（７０５）の固定配列オリゴヌクレオチドと混合した。混合物を７０℃に加熱し、２時間冷却した。次いで、ビーズをウェルの側に磁気的に固定し、５０μＬの６０％ＢＢ２（Ｈ２Ｏでｖ／ｖ）で２回洗浄し、５０μｌの洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ２）でさらに２回洗浄した後、１ＵのＴａｑリガーゼ（エンザイマティクス社（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）［米国マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）所在］）、１Ｘ  Ｔａｑリガーゼバッファー（エンザイマティクス社（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ））、および１０μＭの５’−リン酸化された５マーの架橋オリゴヌクレオチド（７０７）を含有する５０μＬの反応液中に再懸濁した。混合物を３７℃で１時間インキュベートした。ビーズを再度ウェルの側に磁気的に固定し、５０μＬの洗浄バッファーで２回洗浄した後、３０μＬのＴＥ中に再懸濁した。
【０２６５】
９５℃で３分間インキュベートすることにより、連結産物を固定化ビーズから溶出させた。溶出した連結産物を、１ＵのＰｆｕｓｉｏｎポリメラーゼ（サーモフィッシャー社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）［米国マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）所在］）、１Ｍのベタイン、１Ｘ  Ｐｆｕｓｉｏｎバッファー、ならびに４００ｎＭの左
側および右側の増幅プライマー（それぞれ、７１９、７２１）を含有する５０μＬの反応液中での２６サイクルのＰＣＲによって増幅した。右側プライマーは、ＨｉＳｅｑ２０００（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在］）上での９６の試料の多重化配列決定を可能にする７塩基の試料指標（７１７）を含んでいた。左側の固定配列オリゴの配列は、ＴＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＧＧＣＧＴＴＡＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡＣ（配列番号５）であった。
【０２６６】
そして、右側の固定配列オリゴの配列は、ＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＮＮＮＮＮＮＮＡＡＡＣＧＡＣＧＣＧＡＴＣＡＴＣＧＧＴＣＣＣＣＧＣＡＡＴ（配列番号６）であった。
【０２６７】
単一の９６穴プレートに由来する増幅産物を等量でプールし、プールされた増幅産物を、製造業者の説明書に従ってＡＭＰｕｒｅＸＰ（商標）ＳＰＲＩビーズ（ベックマン−カウルター社（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）［米国マサチューセッツ州ダンバーズ（Ｄａｎｖｅｒｓ）所在］）を用いて精製した。それぞれの精製されたプールされたライブラリーを、製造業者のプロトコルに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ｖ２  ＳＲクラスターキットフローセル（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在］）上でのクラスター増幅のための鋳型として用いた。スライドをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（商標）２０００（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在］）上でプロセッシングして、左側の配列プライマー（７２３）から５６塩基の遺伝子座特異的配列を生成させ、８塩基の試料特異的配列の別々の読み取り値を、第２の配列プライマー（７２５）から得た。試料あたり平均で９０３Ｋの生の読み取り値を収集した。平均で８７６Ｋ（９７％）の読み取り値を予想されたアッセイ構造に割り当てた。
【０２６８】
図８は、配列決定実行の単一レーン上での１つの多重化アッセイにおいて全て分析された、第２のコホートからの患者試料のサブセットに関する例示的データを示す。最初に９６の異なる試料をこの特定の実行において実行したが、試料品質対照閾値を満たさないものとして６つの試料をこの分析セットから後に排除した。アッセイにおいて生成された読み取り値に基づく試料について第１８染色体および第２１染色体のそれぞれについてトリム平均を算出した。試料による各染色体の高いおよび低い計数の１０％を除去することにより、トリム平均を計算した。様々な選択遺伝子座に対応する検出された増幅産物を用いて、各サンプルに関する第２１染色体の割合の測定基準および第１８染色体の割合の測定基準を計算した。第２１染色体割合については、各試料について、３８４の第２１染色体の選択遺伝子座における計数のトリム平均を、全部で５７６の第２１染色体の遺伝子座と５７６の第１８染色体の遺伝子座の計数のトリム平均の合計で除算したものとしてこれを算出した。
【０２６９】
第１のコホートの母体試料中では選択遺伝子座あたり平均で８３４の読み取り値計数が観察され、第２のコホートに由来する選択遺伝子座あたり６６４の読み取り値計数が観察された。これらの計数を用いて、第２１染色体および第１８染色体に関する染色体割合のｚスコアを計算した。
【０２７０】
簡単に述べると、各試料につき、遺伝子座計数あたりの中央値を一般値（例えば、１０００）にスケーリングすることによりｚスコアを算出し、スケーリングされた計数をｌｏｇ基数２により変換した。ＲＭＡ  ｌｏｇ線形モデリングおよび中央値分散分析を実施して（ボルスタッド  ビー  エムら（Ｂｏｌｓｔａｄ，Ｂ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）（２００３）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９（２）：１８５−１９３；ラファエル  エー（Ｒａｆａｅｌ．Ａ．）（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１
（４）：ｅ１５；イリザリー  アールエーら（Ｉｒｉｚａｒｒｙ，ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．）（２００３）Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ４（２）：２４９−６４）、染色体効果、遺伝子座効果、試料効果、および残差を見積もった。見積もられた染色体効果を一般値、例えば、０に設定し、２＾（染色体効果＋試料効果＋残差）を各遺伝子座について算出して正規化された計数を作製した。ｚスコアが０の平均を有し、１の標準偏差を有するように反復打ち切りを用いてｚスコアをスケーリングした。
【０２７１】
第１のコホートの試料から得られたデータを用いて、第２１染色体および第１８染色体に関する第１のコホートのｚスコアを決定し、それぞれ、図９および図１０に示した。正常な試料は暗灰色の菱形で示され、トリソミーを有する試料は明灰色の菱形で示される。１７９／１８０（９９．４％）の正常な試料（暗灰色の菱形）は３未満のｚスコアを有した；１つの正常な試料は第２１染色体の３．４のｚスコアおよび第１８染色体の３．０のｚスコアを有していた。３５／３５（１００％）のＴ２１および７／７（１００％）のＴ１８試料が、染色体割合の３を超えるｚスコアを有していた。Ｔ１８の平均ｚスコアは８．５であり、その範囲は５．８〜１０．９であった。Ｔ２１の平均ｚスコアは１１．５であり、その範囲は６．１〜１９．８であった。
【０２７２】
図８に提供されたデータを、第２のコホートの残りの試料からのデータと組み合わせて、第２１染色体および第１８染色体に関するｚスコアを決定し、それぞれ、図１１および図１２に示した。正常な試料は暗灰色の菱形で示され、トリソミーを有する試料は明灰色の菱形で示される。１２５／１２５の正常な試料は、３未満のｚスコアを有し、３６／３６（１００％）のＴ２１および８／８（１００％）のＴ１８試料が３を超えるｚスコアを有していた。Ｔ１８の平均ｚスコアは９．５であり、その範囲は５．１〜１９．８であった。Ｔ２１の平均ｚスコアは１１．４であり、その範囲は３．４〜２１．８であった。
【０２７３】
これらのコホートにおける異数性の検出に加えて、特定の多型を用いて、母体試料への胎児寄与率も決定した。これらの胎児寄与率の決定のために用いられた一般的方法は、全体が本明細書に援用される２０１１年７月１９日に出願された米国特許出願第６１／５０９，１８８号に記載されている。
【０２７４】
簡単に述べると、検出可能な多型を有する特定の遺伝子座の配列決定は、情報遺伝子座としてこれらの遺伝子座を同定した。母体多型領域とは異なる胎児多型領域を有する同定された遺伝子座の計数を用いて、母体試料に関するおおよその胎児寄与を算出した。母体試料への胎児寄与率の算出において用いられたそれぞれの遺伝子座は、最小で２５６の計数を有していた。この算出のための例示的ＳＮＰデータセットを、以下のテーブル２およびテーブル３に例示する。これらのセットに由来する同定された情報遺伝子座に対応するデータを、寄与率の算出において用いた。情報遺伝子座を、それぞれの表において太字で示す。
テーブル２：母体試料１に関するＳＮＰ検出および算出された胎児率（％）
【０２７５】
【表２】
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【０２７６】
2013532494.tif 000005
【０２７７】
2013532494.tif 000006
【０２７８】
2013532494.tif 000007
【０２７９】
テーブル３：試料２のＳＮＰ検出および算出された胎児率（％）
【０２８０】
【表３】
2013532494.tif 000008
【０２８１】
2013532494.tif 000009
【０２８２】
2013532494.tif 000010
【０２８３】
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【０２８４】
これらの多型に関するデータは、図１１および図１２に示された異数性データと同じデータセットにおいて得られたものである。かくして、単一のアッセイが、胎児異数性を同
定する能力を証明し、胎児遺伝子座と母体遺伝子座との多型の差異は、情報遺伝子座の同定および情報遺伝子座に基づく試料中の胎児ｃｆＤＮＡパーセントの見積もり値の算出を可能にした。
【図１】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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