(57)【要約】  本発明は、腹膜組織に由来する足場および細胞を使用した、臓器または組織構造の再生、再構築、修復、増大、または置換に関する。【選択図】図１Ｂ
2013521882.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１の面を有し、必要としている被検体の天然の管腔臓器または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形される、マトリクスと、ｂ）前記マトリクスの前記第１の面の上または中に沈着される、腹膜由来の細胞集団と、を備え、前記マトリクスおよび前記細胞集団が移植可能な構築体を形成する、該移植可能な構築体。
【請求項２】
ａ）第１の面を有し、必要としている被検体の天然の脈管からの流体の通過を可能にするように成形される、管状マトリクスと、ｂ）前記マトリクスの前記第１の面の上または中に沈着される、腹膜由来の細胞集団と、を備え、前記マトリクスおよび前記細胞集団が移植可能な構築体を形成する、該移植可能な構築体。
【請求項３】
前記細胞集団は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）集団である、請求項１または２に記載の移植可能な構築体。
【請求項４】
前記管状マトリクスは、第１の端部を備える、請求項２に記載の移植可能な構築体。
【請求項５】
前記第１の端部は、前記被検体の腹壁に接触するように構成される、請求項４に記載の移植可能な構築体。
【請求項６】
前記第１の端部は、前記被検体の腹壁の開口部への吻合のために構成される、請求項５に記載の移植可能な構築体。
【請求項７】
前記第１の端部は、前記被検体の皮膚に露出するように構成される、請求項５または６に記載の移植可能な構築体。
【請求項８】
前記管状マトリクスは、前記天然の脈管への接続のための、第１の側部開口部をさらに備える、請求項４〜６のいずれか１項に記載の移植可能な構築体。
【請求項９】
前記天然の脈管は、第１の尿管である、請求項８に記載の移植可能な構築体。
【請求項１０】
前記管状マトリクスは、第２の尿管への接続のための、第２の端部をさらに備える、請求項９に記載の移植可能な構築体。
【請求項１１】
前記管状マトリクスは、第２の尿管への接続のための、第２の側部開口部をさらに備える、請求項９に記載の移植可能な構築体。
【請求項１２】
移植したときに、前記第１の尿管から前記管状マトリクスの内部への尿の通過を可能にする、請求項９に記載の移植可能な構築体。
【請求項１３】
移植したときに、前記第２の尿管から前記管状マトリクスの内部への尿の通過を可能にする、請求項１０または１１に記載の移植可能な構築体。
【請求項１４】
移植したときに、前記被検体からの尿の通過を可能にする、請求項１２に記載の移植可能な構築体。
【請求項１５】
移植したときに、前記被検体からの尿の通過を可能にする、請求項１３に記載の移植可能な構築体。
【請求項１６】
前記管状マトリクスの前記第１の端部は、移植したときに、前記被検体の外部にストーマを形成する、請求項７に記載の移植可能な構築体。
【請求項１７】
前記第１の端部は、前記被検体の腹壁を通って延在する、ストーマ端部を備える、請求項１６に記載の移植可能な構築体。
【請求項１８】
前記ストーマ端部は、前記被検体の皮膚に接続される、請求項１７に記載の移植可能な構築体。
【請求項１９】
移植したときに、前記ストーマ端部で上皮化した粘膜を形成する、請求項１７または１８に記載の移植可能な構築体。
【請求項２０】
前記上皮化した粘膜は、前記ストーマ端部に皮膚粘膜領域を備える、請求項１９に記載の移植可能な構築体。
【請求項２１】
前記上皮化した粘膜は、前記皮膚粘膜領域に隣接する前庭領域を備える、請求項２０に記載の移植可能な構築体。
【請求項２２】
前記上皮化した粘膜は、最初に前記前庭領域に現れて、前記ストーマ端部に向かって前記皮膚粘膜領域を通して徐々に増加する上皮を特徴とする、請求項２１に記載の移植可能な構築体。
【請求項２３】
前記上皮は、上皮細胞マーカーの発現を特徴とする、請求項２２に記載の移植可能な構築体。
【請求項２４】
前記上皮化した粘膜は、自然発生の皮膚粘膜領域と同等である、請求項１９に記載の移植可能な構築体。
【請求項２５】
前記構築体は、尿路上皮細胞を含まないか、またはいかなる他の細胞集団も含まない、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の移植可能な構築体。
【請求項２６】
層状に組織化された管腔臓器または組織構造の再構築、増大、または置換を必要としている被検体におけるそのような治療のための方法であって、前記層状に組織化された管腔臓器または組織構造の形成のために、請求項１に記載の構築体を前記被検体の前記治療部位に移植することを含む、前記方法。
【請求項２７】
層状に組織化された管腔臓器または組織構造の再構築、増大、または置換を必要としている被検体におけるそのような治療のための、移植可能な構築体を調製する方法であって、
ａ）第１の面を有し、前記被検体の天然の管腔臓器または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形される、マトリクスを提供することと、
ｂ）前記移植可能な構築体を形成するために、前記マトリクスの前記第１の面の上または中に腹膜由来の細胞集団を沈着させることと、
を含む、前記方法。
【請求項２８】
形成される前記移植可能な構築体は、請求項１に記載の構築体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
治療を必要としている被検体における障害のある膀胱のための移植可能な構築体を提供する方法であって、請求項２に記載の構築体を前記被検体に移植することを含む、前記方法。
【請求項３０】
治療を必要としている被検体における障害のある膀胱のための移植可能な構築体を調製する方法であって、
ａ）第１の面を有し、前記被検体の天然の脈管からの流体の通過を可能にするように形成される、マトリクスを提供することと、
ｂ）前記移植可能な構築体を形成するために、前記マトリクスの前記第１の面の上または中に腹膜由来の細胞集団を沈着させることと、
を含む、前記方法。
【請求項３１】
形成される前記移植可能な構築体は、請求項２に記載の構築体である、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腹膜組織源から得られた細胞を播種した足場（scaffolds）を使用した、層状に組織化された管腔臓器または組織構造の再生、再構築、増大、または置換に関する。
【背景技術】
【０００２】
異常の中には、膀胱を異常に発達させて、外科的増大を必要とする可能性があるものがある。後部尿道弁、両側異所性尿管、膀胱外反、総排泄腔外反、および二分脊椎（すなわち、脊髄髄膜瘤）等の状態は、膀胱の非順応性を引き起こす場合があり、高い圧力を発生させる小容量の膀胱をもたらす。臨床的に、これは、患者に失調症を引き起こす一方で、尿生殖器系の高い圧力のため、腎不全の危険性を高める。これらの小児科の患者のための現在の標準的治療は、腸膀胱形成術（Ｌｅｗｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．（１９９０）；６５：４８８−４９１）による膀胱の増大である。膀胱の増大は、順応性を増加させ、圧力を減少させ、かつ容量を高めるために、患者から大腸の一部を除去し、次いで、その組織を既存の膀胱に接続することを伴う。この手術は、比較的複雑であり、費用がかかる。良好な技術的結果を伴う患者であっても、この手技には、差し迫った危険性および慢性合併症が付随する。これらの手術の侵襲性、コスト、および合併症により、それらの使用が最も重篤な膀胱の不具合だけに限定される。多くが膀胱癌の結果として膀胱置換を必要とする成人に、類似した外科的手順が行われている。成人では、膀胱全体が切除されて、大腸と置換される。副作用の危険性にもかかわらず、米国では、これらの手技が１年に約１０，０００件行われており、約１０％が先天的な異常を有する子供で、９０％が膀胱癌等の後天的な障害を有する成人である。明らかに、現在の治療標準と関連付けられる副作用を排除するかまたは少なくとも実質的に低減する、改善された手法に対する切迫した医学的必要性がある。
【０００３】
ヒトの膀胱は、筋結織膜の嚢であり、骨盤腔の中にあり、尿管を通して受け取り、尿道を通して排出する尿の貯留部としての役割を果たす。ヒトにおいて、膀胱は、骨盤骨（恥骨結合）の背後の骨盤腔の中にあり、上側および後方で、尿道と呼ばれる、体外に出る排液管に接続される。膀胱は、多数の病気および損傷の影響を受けやすく、これらが患者の膀胱の悪化を引き起こす。例えば、膀胱の悪化は、感染性疾患、腫瘍および発達異常に起因し得る。さらに、膀胱の悪化はまた、自動車事故およびスポーツ損傷等の外傷の結果としても起こり得る。膀胱癌患者には、しばしば尿路変向が必要である。米国では、毎年５４，０００件の新しい膀胱癌の症例がある。大部分の膀胱癌は、上皮起源であり、世界的に、毎年約３３６，０００件の尿路上皮癌腫（移行上皮癌（ＴＣＣ））の新しい症例がある（Ｋａｋｉｚｏｅ（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９７（９）８２１）。
【０００４】
尿路変向は、泌尿器系が損傷を受けた、または機能しないために、個人が排尿不可能であるときに、経路を定めて、体内から尿を排出するための方法である。一般に、尿の流れを妨害して、尿管内および／または腎臓内の圧力を増加させる、任意の状態は、尿路変向が必要であり得る。変向術に対するいくつかの適用としては、膀胱切除を必要とする膀胱癌、神経因性膀胱、膀胱に対する放射線傷害、女性に起こる難治性失禁、慢性骨盤痛症候群が挙げられる。一般に、尿路変向には、２つの主な方策がある。すなわち、人工膀胱造設術および禁制型変向術である。人工膀胱造設術は、回腸、結腸、または空腸等の小腸粘膜下組織（ＳＩ）の短い切片等の体内の導管に接続される、腹部におけるストーマの作成を伴う。この手技において、短いＳＩの他端は、通常、腎臓から膀胱まで尿を運ぶ、尿管に接続される。尿は、尿管を通って短いＳＩの中に入り、ストーマから外部回収貯留部に流れる。この手技の代替案は、尿管を直接ストーマに取り付けることであり、尿管造瘻術とも呼ばれる。禁制型変向術は、胃または小腸もしくは大腸の一部から体内に小袋または貯留部を作成することを含む、ストーマの使用は、必要である場合もあり、または必要でない場合もある。例えば、腸の切片を得て、それをより球状に修正することによって、禁制型皮膚貯留部を作成してもよい。修正した部分の一端を尿管に接続し、他端を、外部回収貯留部に至るストーマに接続する。最後に、個人が、ストーマを通してではなく尿道を通して排尿できるように、一端を尿管に接続し、他端を尿道に接続して、再成形した切片を元の膀胱の位置に配置することによって、同所性変向術を作成してもよい。
【０００５】
小腸粘膜下組織（ＳＩ）は、尿路変向に使用され得るが、粘膜および粘膜下組織の除去が腸管切片退縮に至る場合があることが報告されている（例えば、Ａｔａｌａ，Ａ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５６：３３８（１９９６）を参照のこと）。石の形成、粘液産生の増加、新生組織形成、感染、代謝の乱れ、長期間の拘縮、および再吸収を含む、膀胱手術のための特定の胃腸切片の使用による他の問題が報告されている。尿路変向に対する天然材料の使用は、特定の筋肉の弾性的性質および尿路上皮の不透過性機能により、膀胱組織を容易に置換することができないことを示している。加えて、患者自身の腸切片を尿路変向に使用することは、少なくとも２回の異なる手術手技が必要であり、１回目の手術は、切片を取り出すために行い、２回目の手術では、尿路変向を導入する。複数の手術が必要であることは、手技の全体的なコスト、患者に対する危険性、および患者の全体的な快適性を増加させる。
【０００６】
したがって、尿路変向に対する胃腸切片の使用に関連付けられる複数の合併症、および複数の手術手技が必要であることにより、尿路変向システムをそのようなシステムを必要としている患者に提供するための方法およびデバイスに対する必要性が存在する。
【０００７】
尿失禁は、どちらも一般のコミュニティおよび健康管理の場において、あらゆる年代および物理的健康のレベルの人々に影響を及ぼす、一般的な問題である。医学的に、尿失禁は、患者の尿路感染、圧迫潰瘍、会陰発疹、および尿路性敗血症を起こし易くする。社会的および心理学的に、尿失禁は、羞恥、社会的非難、気分の落ち込み、および特に年輩者にとっては施設収容の危険性の増加と関連付けられる（Ｈｅｒｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ，９：７４（１９８９））。経済学的に言えば、コストは驚異的であり、米国単独では、１年あたり１００億ドルが、失禁を処理するために費やされている。
【０００８】
失禁は、真性腹圧性（膀胱および尿道過可動）、内因性括約筋不全（「ＩＳＤ」）、または両方に起因する可能性がある。特に女性において一般的であり、より少ない程度で小児に存在し（特に、ＩＳＤ）、また前立腺全摘出術を受けた男性に存在する。
【０００９】
緊張性失禁は、咳、くしゃみ、笑い、または運動等の、腹圧を増加させる物理的活動中に起こる、尿失禁である。個人は、一方または両方の種類の失禁を罹患する可能性があり、どちらも罹患したときには、混合型失禁と呼ばれる。全ての知識が失禁と関連付けられるが、切迫性失禁の大多数の症例は突発性であり、これは、特定の原因を識別することができないことを意味する。切迫性失禁は、あらゆる年齢で誰にでも起こり得、女性および年輩者においてより一般的である。
【００１０】
排尿筋は、尿を膀胱から排出するために収縮する、膀胱壁筋肉である。反射亢進等の排尿筋の機能不全の影響としては、不十分な膀胱順応性、高い膀胱内圧、および膀胱容量の減少が挙げられ、これらは全て、上部尿路の悪化をもたらし得る。
【００１１】
１つの切迫性失禁の現在の治療は、ボツリヌス毒素（例えば、ボトックス（登録商標））等の神経毒の注射である。ボツリヌス毒素は、膀胱壁の中の排尿筋を麻痺させることによって、あるいは膀胱の中の求心路に衝撃を与えて尿路上皮下神経の中の感覚受容器を減少させることによって、膀胱活動亢進に影響を及ぼす。大きいサイズのボツリヌス毒素分子は、その拡散を制限することができ、したがって、該分子が求心性神経線維および遠心性神経線維の双方に到達することを妨げる。その結果、過活動性膀胱（ＯＡＢ）に対する現在の投与方法は、例えば、膀胱の筋肉壁へのボツリヌス毒素の多数回注射（一般的に、２０〜５０回）を必要とし、したがって、医師の訪問回数および関連する治療コストが増加する。さらに、膀胱からの感覚神経伝達物質放出の阻害の慢性的な長期にわたる影響の安全性は、まだ判定されていない。
【００１２】
尿失禁の治療のためのさらなる手法は、膀胱弛緩性質を伴う薬物の投与を含み、抗コリン作用薬がそのような薬物の柱である。例えば、臭化プロパンテリン等の抗コリン作用薬、ならびにラセミオキシブチニンおよびジサイクロミン等の平滑筋弛緩薬／抗コリン作用薬の組み合わせが、切迫性失禁を治療するために使用されてきた。（例えば、Ａ．Ｊ．Ｗｅｉｎ，Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．，２２：５５７（１９９５）を参照のこと）。しかしながら、しばしば、そのような薬物治療は、全ての分類の失禁患者に関して完全な成功を達成せず、しばしば、患者がかなりの副作用を経験する結果となる。
【００１３】
薬物治療の他に、本発明より前に当業者によって使用されている他の選択肢としては、人工括約筋の使用（Ｌｉｍａ  Ｓ．Ｖ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１５６：６２２−６２４（１９９６）、Ｌｅｖｅｓｑｕｅ  Ｐ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１５６：６２５−６２８（１９９６））、膀胱頸部支持補綴（Ｋｏｎｄｏ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１５７：８２４−８２７（１９９６））、架橋コラーゲンの注射（Ｂｅｒｍａｎ  Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１５７：１２２−１２４（１９９７）、Ｐｅｒｅｚ  Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１５６：６３３−６３６（１９９６）、Ｌｅｏｎａｒｄｏ  Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１５６：６３７−６４０（１９９６））、およびポリテトラフルオロエチレンの注射（Ｐｅｒｅｚ  Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１５６：６３３−６３６（１９９６））が挙げられる。
【００１４】
ＩＳＤと関連付けられる尿失禁の治療のための最近の既知の手法は、患者に尿道周囲の内視鏡的なコラーゲン注射を受けさせることである。これは、膀胱漏出または緊張性失禁の可能性を軽減する目的で、膀胱の筋肉を増大させる。
【００１５】
失禁を回避するための既存の解決策は、既知の欠点を有する。内視鏡的に誘導される膀胱頸部周囲へのコラーゲンの注射は、いかなる著しい病的状態も伴わずに、括約筋不全において高い成功率を有するが、コラーゲンの使用は、平均して２年後に起こる不具合をもたらす可能性があり、およびそのコスト効果を考慮する必要がある（Ｋｈｕｌｌａｒ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ＆  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，１０４）：９６−９９（１９９６））。おそらくは移動現象（Ｐｅｒｅｚ  Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）による患者の禁制の悪化は、禁制を回復させるために、繰り返しの注射が必要になる場合がある（Ｈｅｒｓｃｈｏｒｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１５６：１３０５−１３０９（１９９６））。
【００１６】
腹圧性尿失禁の治療のための根治的前立腺全摘除術に伴うコラーゲンの使用による結果も、概して、期待を外れのものであった（Ｋｌｕｔｋｅ  Ｃ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１５６：１７０３−１７０６（１９９６））。さらに、１つの研究は、ウシ真皮コラーゲンの注射がＩｇＧおよびＩｇＡ分類の特異的抗体を産生したという証拠を提供している。（ＭｃＣｅｌｌ  ａｎｄ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｌｕｓｔｒｏ，Ｆ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ  １５５，２０６８−２０７３（１９９６））。したがって、コラーゲンに対する可能な患者の感作は、経時的になり得ると予想される。
【００１７】
限定的な成功率にもかかわらず、経尿道コラーゲン注射治療は、他の適切な代替案が不十分であるため、内因性括約筋不全のための許容される治療のままである。
【００１８】
現時点では、過活動性膀胱障害または切迫性失禁を罹患する個人は、医師によって、最初に、非侵襲性の薬学的医薬品で治療される。しかしながら、これらの非侵襲性の薬学的医薬品が失敗した場合、医師は、より侵襲的な解決策を提供する。
【００１９】
したがって、既存の層状に組織化された管腔臓器または組織構造（例えば、膀胱）を拡大する最小侵襲性の方法に対する必要性が存在する。
【００２０】
層状に組織化された管腔臓器または組織構造（膀胱、膀胱の一部、または膀胱の構成要素等）の再構築、修復、増大、または置換で使用するための、移植可能な細胞播種したマトリクスを成功裏に提供するために、組織工学の原則を適用している。Ａｔａｌａの米国特許第６，５７６，０１９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で説明されるように、細胞は、膀胱、尿道、尿管、および他の尿生殖器組織を含む、患者自身の組織に由来してもよい。しかしながら、新しく健康な人工組織を発達させるための基本ユニットとしての、一次臓器部位からの細胞培養システムの開発および保守への依存度と関連付けられる課題がある。例えば、障害のある膀胱からの膀胱細胞を培養することが、同じく障害のある培養細胞をもたらすことになるという当然の理由から、障害のある膀胱の治療は、細胞の供給源に関する特定の課題をもたらす。そのような細胞は、移植可能な新膀胱足場またはマトリクスをポピュレートするための賢明な選択肢でない。このように、移植可能な新臓器／組織構造体の足場またはマトリクス上に播種するのに適切である、代替の細胞源に対する必要性がある。
【００２１】
Ｊａｙｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．（２００８）３（５），６７１−６８２（以下、「ＪａｙｏＩ」と称する）によって説明されるように、臓器または組織を修復するという試みは、しばしばコラーゲン沈着を伴う不完全な組織置換、およびいくつかの場合では、瘢痕組織の形成を特徴とする。Ｊａｙｏ他はまた、組織工学のより望ましい結果とは、組織構造または臓器の元の構造および機能の再生であると述べている。Ｊａｙｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．（２００８）１８０；３９２−３９７（以下「ＪａｙｏＩＩ」と称する）も参照されたい。特定の分子は、インビボでの再生過程と関連付けられると考えられている。例えば、ケモカインＭＣＰ−１は、単核細胞を動員するその能力が最もよく知られている。しかしながら、それはまた、脈管平滑筋細胞の増殖のための強力な分裂促進因子であるとも思われる。ＭＣＰ−１は、循環単球を脈管損傷の領域に動員し、その結果、一般的に、サイトカインおよび成長因子のための貯留部としての役割を果たすことができる、マクロファージに形質転換される。マクロファージはまた、コレステロールを摂取して、脂質を酸化する。マクロファージおよび筋肉前駆細胞は、どちらも、ＭＣＰ−１シグナリングの標的であると考えられる。ＣＣＲ−２受容体は、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）のリガンドであり、ＣＣＲ−２欠損マウスは、高められた脂肪生成／線維症を伴う再生欠陥を示す。骨格筋に障害のあるＣＣＲ−２欠損マウスの断片は、正常なマウスと比較して、より多くの間質腔、多数の炎症細胞、大きい円形膨張した筋原線維、より多くの間質腔の中の線維芽細胞の蓄積、脂肪沈着の周囲にコラーゲンの分布を伴う脂肪湿潤、およびカルシウム沈着を伴う線維症を示した（Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９：４１３−４１５；Ｓｅｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８３（４）；Ｈ１４５５−Ｈ１４６１；Ｓｈａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ａｍ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９２：Ｃ９５３−Ｃ９６７；Ｓｈｉｒｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１３４（１）：１４５−５７．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｆｅｂ  ２０；Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．８２：１１８−１２１；Ｓｃｈｅｃｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．７５：１０７９−１０８５；Ｄｅｏｎａｒｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７），Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．５：１１；Ｌｕｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７（１）：１７５−１８４）。
【００２２】
本発明は、腹膜組織源に由来する細胞集団、そのような細胞を単離する方法、そのような細胞（構築体）を播種した新臓器／組織構造足場またはマトリクス、およびその作製方法、ならびにそのような新臓器／組織構造の構築体を使用することを必要としている患者の治療方法に関する。
【発明の概要】
【００２３】
一態様において、本発明は、層状に組織化された管腔臓器または組織構造の再生、再構築、増大、または置換を必要とする被検体におけるそのような治療のための、移植可能な（implantable）構築体を提供する。一実施形態において、移植可能な構築体は、ａ）第１の面を有し、必要としている被検体の天然の管腔臓器または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形される、マトリクスと、ｂ）マトリクスの第１の面の上または中に沈着される、腹膜由来の細胞集団と、を含み、マトリクスおよび細胞集団が、移植可能な構築体を形成する。別の実施形態では、細胞集団は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）集団である。別の態様において、本発明は、層状に組織化された管腔臓器または組織構造の再構築、増大、または置換を必要とする被検体におけるそのような治療のための方法を提供する。一実施形態において、本方法は、層状に組織化された管腔臓器または組織構造の形成のために、構築体を被検体の治療部位に移植するステップを含む。他の一態様において、本発明は、層状に組織化された管腔臓器または組織構造の再構築、増大、または置換を必要としている被検体におけるそのような治療のための、移植可能な構築体を調製する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、被検体の天然の管腔臓器または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形される、マトリクス提供するステップを含む。別の実施形態において、本方法は、移植可能な構築体を形成するために、マトリクスの第１の面の上または中に腹膜由来の細胞集団を沈着させるステップを含む。他の一実施形態において、本方法は、移植可能な構築体を提供する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、新尿路導管として使用するための、移植可能な構築体を提供する。一実施形態において、構築体は、ａ）必要としている被検体の天然の脈管からの流体の通過を可能にするように適合される、第１の面を有する管状のマトリクスと、ｂ）マトリクスの第１の面の上または中に沈着される、腹膜由来の細胞集団と、を含み、マトリクスおよび細胞集団が、移植可能な構築体を形成する。別の実施形態において、細胞集団は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）集団である。管状マトリクスは、第１の端部を有してもよい。一実施形態において、第１の端部は、被検体の腹壁に接触するように構成または成形されてもよい。第１の端部は、被検体の腹壁の開口部への吻合のために構成または成形されてもよい。別の実施形態において、第１の端部は、被検体の皮膚に露出できるように構成されてもよい。他の一実施形態において、管状マトリクスの第１の端部は、移植したときに、被検体の外部にストーマを形成する。第１の端部は、被検体の腹壁を通って延在する、ストーマ端部を含む。一実施形態において、ストーマ端部は、被検体の皮膚に接続される。構築体は、移植したときに、ストーマ端部で上皮化した粘膜を形成する形成する。上皮化した粘膜は、ストーマ端部で皮膚粘膜領域を含んでもよい。一実施形態において、上皮化した粘膜は、皮膚粘膜領域に隣接する前庭領域を有してもよい。上皮化した粘膜は、最初に前庭領域の中に現れて、ストーマ端部に向かって皮膚粘膜領域を通して徐々に増加する上皮を特徴とし得る。別の実施形態において、上皮は、上皮細胞マーカーの発現を特徴とする。上皮化した粘膜は、自然発生の皮膚粘膜領域と同等である。
【００２５】
さらに別の実施形態において、管状マトリクスは、天然の脈管への接続のための、第１の側部開口部をさらに含む。天然の脈管は、第１の尿管であってもよい。一実施形態において、管状マトリクスは、第２の尿管への接続のために成形される、第２の端部をさらに含む。管状マトリクスは、第２の尿管への接続のために成形される、第２の側部開口部をさらに含んでもよい。別の実施形態において、構築体は、第１の側部開口部および／または第２の側部開口部から管状マトリクスの内部への流体の通過を可能にするように成形される。他の一実施形態において、構築体は、管状マトリクスの第１の端部を通しての、管状マトリクスの内部から、外部への流体の通過を可能にするようにさらに成形される。移植したときに、構築体は、移植したときに、第１の尿管および／または第２の尿管から管状マトリクスの内部への尿の通過を可能にする。加えて、構築体は、移植したときに、マトリクスの内部から被検体の外への尿の通過を可能にする。他の一態様において、本発明は、治療を必要としている障害のある膀胱のための、移植可能な構築体を提供するための方法を提供する。一実施形態において、本方法は、本明細書で説明される構築体を移植するステップを含む。別の態様において、本発明は、層状に組織化された管腔臓器または組織構造の再構築、増大、または置換を必要としている被検体におけるそのような治療のための、移植可能な構築体を調製する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、第１の面を有し、被検体の天然の管腔臓器または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形される、マトリクス提供するステップを含む。別の実施形態において、本方法は、該移植可能な構築体を形成するために、該マトリクスの第１の面の上または中に腹膜由来の細胞集団を沈着させるステップをさらに含む。
【００２６】
別の態様において、本明細書で説明される移植可能な構築体は、平滑筋細胞集団を含むが、付加的な細胞集団を含まない。一実施形態では、構築体は、尿路上皮細胞を含まない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】膀胱増大足場の実施例を示す図である。
【図１Ｂ】膀胱増大足場の実施例を示す図である。
【図１Ｃ】膀胱増大足場の実施例を示す図である。
【図１Ｄ】膀胱増大足場の実施例を示す図である。
【図２Ａ】膀胱置換足場の実施例を示す図である。
【図２Ｂ】膀胱置換足場の実施例を示す図である。
【図２Ｃ】膀胱置換足場の実施例を示す図である。
【図２Ｄ】膀胱置換足場の実施例を示す図である。
【図３Ａ】尿路変向または導管足場の実施例を示す図である。
【図３Ｂ】異なる種類の断面積、ならびに尿管に接続するように構成され得る開口部のための潜在的な位置を有する、尿路変向構築体の実施例を示す図である。
【図３Ｃ】尿路変向術の構築体（Ａ：開いた卵形状、Ｂ：開いた卵形状レセプタクル、Ｃ：閉じた卵形状レセプタクルおよび３つの管）
【図４】尿路変向または導管構築体の異なる応用例を示す図である。
【図５】筋肉等価足場の実施例を示す図である。
【図６】パッチまたは帯の形態の種々の筋肉等価足場の画像を表す図である。
【図７】異なる筋肉等価足場および代表的な移植方法を表す図である。Ａは足場の平面シートの形成を表す図である。Ｂは移植時に巻いて、腹腔鏡管を通して送り、腹腔の中で広げることができる、腹腔鏡的に適した足場を表す図である。Ｃは腹腔鏡管を通しての挿入を容易にし、その後に腹腔の中で広げるための、巻いた構成の腹腔鏡的に適した足場シートの形成を表す図である。Ｄは管を通しての挿入を容易にし、その後に腹腔の中で広げるために、折り畳み構成またはアコーディオン様式の腹腔鏡的に適した足場シートの形成を表す図である。
【図７Ｅ】筋肉等価足場の移植のための可能な手術方法を表す図である。
【図７Ｆ】空および満杯の膀胱上の移植場所を表す図である。
【図７Ｇ】表面を切断した際に作成される楕円面を示す手術スリットを伴う膀胱モデルを表す図である。
【図８】腹腔鏡ポートを通しての挿入を容易にするために、予め折り畳んだアコーディオン様式の足場シートを表す図である。
【図９Ａ】帯状に予め切断し、次いで、互いに縫合して積み重ね、腹腔鏡ポートの中に挿入し、そして腹腔の中の低位置に固定される、足場を表す図である。
【図９Ｂ】２つ折りで長さ１８．７ｃｍ×幅２．０ｃｍの１つの足場を表す図である。
【図９Ｃ】３つ折りで長さ１３．３ｃｍ×幅２．８ｃｍの１つの足場を表す図である。
【図９Ｄ】４つ折りで長さ９．７ｃｍ×幅４．０ｃｍの１つの足場を表す図である。
【図９Ｅ】２つの部品で構成され、それぞれ２つ折りで長さ９．７ｃｍ×幅２．０ｃｍの１つの足場を表す図である。
【図１０】移植型導管構築体のための構成の実施例を示す図である。
【図１１Ａ】新尿路導管足場のための例示的な構成を表す図である。
【図１１Ｂ】移植型新尿路導管足場のための２つの代替の構成（ＡおよびＢ）を表す図である。
【図１２】永続的な尿路変向構築体の移植型構成要素の実施例を示す図である。
【図１３】尿路変向構築体の他の応用例を表す図である。
【図１４】腹膜組織からの細胞単離のための代表的なプロトコルのステップを表す図である。
【図１５】イヌおよびブタ由来の細胞の細胞形態を示す図である。
【図１６Ａ】平滑筋アルファ−アクチンの発現およびイヌ由来の膀胱細胞の中のカルポニンを示す図である。
【図１６Ｂ】平滑筋アルファ−アクチンの発現およびイヌ由来の膀胱細胞の中のカルポニンを示す図である。
【図１６Ｃ】平滑筋アルファ−アクチンの発現およびイヌ由来の網細胞の中のカルポニンを示す図である。
【図１６Ｄ】平滑筋アルファ−アクチンの発現およびイヌ由来の網細胞の中のカルポニンを示す図である。
【図１７Ａ】イヌの網由来の細胞ＳＭＣのＦＡＣＳによる表現型（上皮性および内皮抗原性マーカー）を示す図である。
【図１７Ｂ】イヌの網由来の細胞ＳＭＣのＦＡＣＳによる表現型（上皮性および内皮抗原性マーカー）を示す図である。
【図１７Ｃ】イヌの網由来の細胞ＳＭＣのＦＡＣＳによる表現型（上皮性および内皮抗原性マーカー）を示す図である。
【図１８Ａ】イヌの網由来の細胞ＳＭＣのＦＡＣＳによる表現型（上皮性および内皮抗原性マーカー）を示す図である。
【図１８Ｂ】イヌの網由来の細胞ＳＭＣのＦＡＣＳによる表現型（上皮性および内皮抗原性マーカー）を示す図である。
【図１８Ｃ】イヌの網由来の細胞ＳＭＣのＦＡＣＳによる表現型（上皮性および内皮抗原性マーカー）を示す図である。
【図１９】網および膀胱由来のイヌＳＭＣからの平滑筋細胞関連のマーカーの免疫蛍光分析を示す図である。
【図２０Ａ】イヌの網由来の細胞の免疫蛍光分析（上皮、内皮、およびＳＭＣ抗原性マーカー）を示す図である。
【図２０Ｂ】イヌの網由来の細胞の免疫蛍光分析（上皮、内皮、およびＳＭＣ抗原性マーカー）を示す図である。
【図２１】網および膀胱由来のブタＳＭＣからの平滑筋細胞関連のマーカーの免疫蛍光分析を示す図である。
【図２２】ＰＣＲによる、イヌ由来の細胞によるＳＭＣ遺伝子発現を表す図である。
【図２３】ＰＣＲによる、イヌ由来の細胞によるＳＭＣ遺伝子発現を表す図である。
【図２４】ＰＣＲによる、ブタ由来の細胞によるＳＭＣ遺伝子発現を表す図である。
【図２５】イヌ由来の網細胞の収縮表現型を示す図である。
【図２６】足場内部のイヌの網由来の細胞ＳＭＣの免疫蛍光分析を示す図である。
【図２７】足場内部の網由来のＳＭＣからのＭＣＰ１タンパク質分泌を表す図である。
【図２８】足場の中の網由来の細胞によるＥＣＭ産生の免疫蛍光分析を示す図である。
【図２９】足場内部の網由来のＳＭＣの代謝を表す図である。
【図３０】移植に伴う新尿路導管の特性を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、腹膜組織源から得られた細胞を播種した足場を使用した、必要としている被検体における層状に組織化された管腔臓器または組織構造の再生、再構築、増大、または置換に関する。別の態様において、本発明は、腹膜組織源から得られた細胞を含有する新尿路導管として使用するための、移植可能な構築体を提供する。
【００２９】
本発明は、腹膜組織源に由来する細胞集団、そのような細胞を単離する方法、そのような細胞（構築体）を播種した新臓器／組織構造足場またはマトリクス、およびその作製方法、ならびにそのような新臓器／組織構造の構築体を使用することを必要としている患者の治療方法に関する。本発明の構築体は、本明細書で説明されるように、臓器または組織構造の再構築、修復、増大、置換、または再生に使用されてもよい。
【００３０】
１．定義
別に定義されない限り、本明細書で使用する技術および科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。（Ｒ  Ｌａｎｚａ、Ｒ  Ｌａｎｇｅｒ、＆  Ｊ  Ｖａｃａｎｔｉ編）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３ｒｄ  Ｅｄ．，２００７は、本出願で使用する多くの用語に対する一般的な指針を当業者へ提供する。
【００３１】
当業者は、本発明の実施に使用することができ得る、本明細書に記載する多くの方法および材料と同様または同等のものを理解するであろう。実際に、本発明は、記載する方法および材料に決して限定されない。本発明の目的を達成するために、以下の用語を下記に定義する。
【００３２】
本明細書で使用される「平滑筋細胞」または「ＳＭＣ」という用語は、本明細書で説明される再構築、修復、増大、または置換構築体および方法の対象である天然の臓器または組織とは異なる源に由来する、収縮細胞を指す。本発明によって提供される平滑筋細胞は、本明細書で説明される足場またはマトリクス上に播種されて培養されると、中空の臓器（例えば、膀胱、腹腔、胃腸管等）の壁に見られ、収縮および緩和する能力を特徴とする、非横紋筋を形成することが可能である。当業者は、平滑筋細胞の他の性状を理解するであろう。
【００３３】
本明細書で使用される「細胞集団」という用語は、適切な哺乳動物の組織源から単離して、その後にインビトロで培養することによって得られる、多数の細胞を指す。当業者は、本発明とともに使用するための細胞集団を単離および培養するための種々の方法、ならびに本発明で使用するのに適切である細胞集団の中の種々の数の細胞、および本発明で使用するのに適切である細胞集団の中の種々の数の細胞を理解するであろう。細胞集団は、腹膜組織に由来する平滑筋細胞（ＳＭＣ）集団であってもよい。腹膜組織は、網組織であってもよい。ＳＭＣ集団は、平滑筋細胞と関連付けられるマーカーの発現を特徴とし得る。ＳＭＣ集団はまた、精製された細胞集団であってもよい。ＳＭＣ集団は、自己源または非自己源に由来してもよい。
【００３４】
「自己」という用語は、同じ個人に由来すること、またはそこから移されることを指す。自己平滑筋細胞集団は、本明細書で説明される移植可能な構築体の受容体となる、被検体に由来する。
【００３５】
「非自己」という用語は、本明細書で説明される移植可能な構築体の受容体とならない、被検体に由来するか、またはそこから移されることを指す。そのような非自己源としては、同種異系、同系（自家、または同種）、およびそれらの任意の組み合わせである源が挙げられる。
【００３６】
「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、概して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、または糖脂質に基づく分子マーカーを指し、培養細胞集団におけるその発現または存在は、標準的な方法（または本明細書で開示される方法）によって検出することができ、特定の種類の細胞である培養細胞集団の中の１つ以上の細胞と一致する。概して、細胞「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、一般的に天然の細胞によって発現される、本明細書で説明される細胞集団の中で発現される分子を指す。マーカーは、細胞または遺伝子等の染色体上の識別可能な物理的場所によって発現されるポリペプチド、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、または天然の細胞によって発現されるポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）であってもよい。マーカーは、「遺伝子発現マーカー」と称される遺伝子の発現領域、またはいかなる既知のコード機能も伴わないＤＮＡの何らかの切片であってもよい。
【００３７】
「平滑筋細胞マーカー」という用語は、概して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、または糖脂質に基づく分子マーカーを指し、培養細胞集団におけるその発現または存在は、標準的な方法（または本明細書で開示される方法）によって検出することができ、平滑筋細胞である培養細胞集団の中の１つ以上の細胞と一致する。概して、平滑筋細胞（ＳＭＣ）「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、一般的に、天然の平滑筋細胞によって発現される分子を指す。マーカーは、細胞または遺伝子等の染色体上の識別可能な物理的場所によって発現されるポリペプチド、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、またはＳＭＣによって発現されるポリペプチドをコードする核酸であってもよい。マーカーは、「遺伝子発現マーカー」と称される遺伝子の発現領域、またはいかなる既知のコード機能も伴わないＤＮＡのいくつかの切片であってもよい。本発明によって企図されるそのようなマーカーとしては、ミオカルディン、アルファ−平滑筋アクチン、カルポニン、ミオシン重鎖、ＢＡＡＬＣ、デスミン、筋線維芽細胞抗原、ＳＭ２２、およびそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
「差別的に発現した遺伝子」、「差別的遺伝子発現」、およびそれらの同義語は、同じ意味で使用され、第１の細胞または細胞集団中のその発現が、第２の細胞または細胞集団中のその発現と比較して、より高いまたはより低いレベルに活性化される遺伝子を指す。この用語はまた、その発現が、第１または第２の培養細胞の継代中の経時的に異なる段階で、より高いまたはより低いレベルに活性化される遺伝子を指す。また、差別的に発現した遺伝子は、核酸レベルまたはタンパク質レベルで活性化または阻害され得るか、または代替のスプライシングを受けて異なるポリペプチド産物をもたらし得る。そのような差は、例えば、ポリペプチドのｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌、または他の分配の変化によって明示されてもよい。差別的遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子間の発現もしくはそれらの遺伝子産物の比較か、２つ以上の遺伝子間の発現もしくはそれらの遺伝子産物の比率の比較か、さらには第１の細胞と第２の細胞との間で異なる、２つの異なるように処理された同じ遺伝子の産物の比較を含んでもよい。差別的発現は、遺伝子の時間的もしくは細胞発現パターンの、または例えば第１の細胞と第２の細胞との間の、その発現産物の、定量的ならびに質的両方の差を含む。本発明では、第１の細胞と第２の細胞との所与の遺伝子の発現の間に、または培養細胞の継代中の経時的に異なる段階で、少なくとも約１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１４．５倍、または、少なくとも約１５倍の差があったときに、「差別的遺伝子発現」があるとみなされる。
【００３９】
「阻害する」、「下方制御する」、「過小発現させる」、および「低減する」という用語は、同じ意味で使用され、遺伝子の発現、１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル、または１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、例えば１つ以上の陽性対照および／または陰性対照等の、１つ以上の対照と比較して、減少していることを意味する。
【００４０】
「上方制御する」または「過剰発現させる」という用語は、遺伝子の発現、１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル、または１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、例えば１つ以上の陽性対照および／または陰性対照等の、１つ以上の対照と比較して、増加していることを意味する。
【００４１】
「収縮機能」という用語は、ミオシンのカルシウム活性化リン酸化によって開始され、したがって、細胞内のカルシウムレベルに依存して収縮させる、アクチンフィラメントおよびミオシンフィラメントの滑り運動の相互作用を伴う、平滑筋収縮機能を指す。
【００４２】
「腹膜組織」という用語は、概して、壁側腹膜、臓側腹膜、および網が挙げられるが、これらに限定されない、腹膜に由来する組織を意味するものとする。腹膜組織は、胃、肝臓、および／または腸が挙げられるが、これらに限定されない、内部臓器と密接に接触した状態であり得る。網組織は、大網および小網が上げられるが、これらに限定されない、異なる源から得てもよい。網組織は、切開および生検を介して得ることができる。
【００４３】
「構築体」という用語は、１つ以上の合成または自然発生の生体適合材料で構成される足場またはマトリクスの表面の上もしくは中に沈着される、少なくとも１つの細胞集団を指す。細胞集団は、インビトロもしくはインビボで、足場またはマトリクスと組み合わせてもよい。
【００４４】
「試料」、「患者試料」、または「生物学的試料」という用語は、概して、個人の体液、体組織、細胞株、組織培養物、または他の源から得られる、生物学的試料を意味するものとする。この用語は、例えば血液（末梢血または静脈血等）、尿、および他の生物学的起源の液体試料（吸引脂肪等）等の体液、ならびに生検標本等の固体組織生検材料（例えば、腹膜組織生検材料）、または組織培養物もしくはそれに由来する細胞、ならびにそれらの子孫を含む。この定義はまた、試料を源から得た後に、試薬による処理、可溶化、または特定の成分（タンパク質またはポリヌクレオチド等）の富化等の、任意の方法で操作された試料も含む。この定義はまた、臨床試料を包含し、さらに、細胞上清、細胞溶解物、血清、原形質、生物学的流体、および組織試料を含む。試料源は、固体組織（新鮮な、冷凍の、および／もしくは保存した、臓器もしくは組織試料、生検材料、または吸引物等からの）、血液または任意の血液成分、体液（脳髄液、羊水、腹水、または間質液）、被検体の発達における任意のときの細胞であってもよい。生物学的試料は、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質等の、実際は、組織とともに、またはその中に本質的に自然に存在しない化合物を含有してもよい。試料は、診断またはアッセイの監視のために使用することができる。哺乳動物から試料を得るための方法は、当技術分野でよく知られている。「試料」という用語が単独で使用された場合であっても、その「試料」が「生物学的試料」または「患者試料」であることを意味するものとする。すなわち、この用語は、同じ意味で使用される。試料はまた、試験試料であってもよい。
【００４５】
「試験試料」という用語は、本明細書で説明される構築体の移植に伴う、被検体からの試料を指す。試験試料は、血液、血清、尿、精液、骨髄、粘膜、組織等が挙げられるが、これらに限定されない、哺乳動物の被検体の種々の源に由来してもよい。
【００４６】
「対照」または「対照試料」という用語は、否定的結果が、試験試料における肯定的な結果を相関させるのに役立つことが予想される、陰性対照を指す。代替として、対照は、肯定的な結果が、試験試料における否定的な結果を相関させるのに役立つことが予想される、陽性対照であってもよい。本発明に適切である対照としては、サイトカインの正常なレベルを有することが分かっている試料、本明細書で説明される構築体が埋め込まれていないことが分かっている哺乳動物の被検体から得た試料、および正常であることが分かっている哺乳動物の被検体から得た試料が挙げられるが、これらに限定されない。対照はまた、本明細書で説明される構築体の移植前に被検体から得られる試料であってもよい。加えて、対照は、試験試料に含有される細胞と同じ起源を有する、正常な細胞を含有している試料であってもよい。当業者は、本発明で使用するための適切な他の対照を理解するであろう。
【００４７】
「患者」という用語は、処置が所望される、任意の単一の動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園動物、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、および非ヒト霊長類等の非ヒト動物を含む）を指す。より好ましくは、本明細書における患者はヒトである。
【００４８】
「被検体」という用語は、治療に適格であり、（不全な、損傷した、または機能しない泌尿器系を含む）臓器機能の不全もしくは故障の１つ以上の徴候、症状、または他の指標を経験している、または経験した患者を含む、任意の単一のヒトの被検体を意味するものとする。そのような被検体としては、新たに診断されたもしくは以前に診断されて現在再発もしくは再燃を経験している、またはその原因に関わらず臓器機能の不全もしくは故障の危険性がある被検体が挙げられるが、これらに限定されない。被検体は、以前に臓器機能の不全もしくは故障と関連付けられる状態を治療されていても、またはそのように治療されていなくてもよい。被検体は、膀胱切除を必要としている膀胱の癌を有する被検体、腎機能に衝撃を与える神経因性膀胱を有する被検体、膀胱に放射線傷害を有する被検体、および難治性失禁を有する被検体が挙げられるが、これらに限定されない、尿路変向の候補であってもよい。被検体は、尿路変向が必要であると新たに診断され得るか、以前に尿路変向が必要であると診断されて現在合併症を経験しているか、またはその原因に関わらず不全の、損傷した、もしくは機能しない泌尿器系の危険性があり得る。被検体は、以前に、不全の、損傷した、もしくは機能しない泌尿器系と関連付けられる状態を治療されていても、またはそのように治療されていなくてもよい。
【００４９】
「尿路変向」または「導管」という用語は、被検体の、尿路変向構築体、吻合された尿管、および随意に、隣接する心房との経時的な相互作用に起因する、結果として生じる臓器または組織構造を指す。心房は、腹壁を通しての尿の通過を可能にし、かつ構築体の尾側端（腹腔内空洞の中に位置する）を皮膚に接続する腹膜ラップの最前方の管状部分によって作製され得る、前方接続チャンバである。
【００５０】
「尾側」および「頭側」という用語は、尿の産生および流れに関連する記述用語である。「尾側」という用語は、移植したときにストーマに最も近い尿路変向構築体の端部を指し、一方で、「頭側」という用語は、移植したときに腎臓および尿管に最も近い尿路変向構築体の端部を指す。
【００５１】
「デトリタス」という用語は、尿路変向構築体の移植後に起こる、治癒および再生過程中に形成される細片を指す。デトリタスは、はげ落ちた組織細胞、炎症性の滲出液、足場の生分解で構成される可能性がある。導管がそのような細片によって遮断された場合（不適当な流出）、停滞した細片は、導管の管腔内でデトリタスまたは半固体塊を形成する。
【００５２】
「創面切除」という用語は、感染を予防する、閉塞を予防する、および治癒過程を促進するために、異物、または切り裂かれた、失活した、汚染された、もしくは死亡した細胞の導管からの外科的もしくは非外科的除去を指す。創面切除は、破片の除去を伴ってもよい。
【００５３】
「ストーマ」という用語は、尿を尿路変向構築体の流出端から体外に流出させるために使用される、外科的に作成された開口部を指す。尿は、一般的に、体外の貯留部で採集される。
【００５４】
「ストーマポート」または「ストーマボタン」という用語は、ストーマ開口部の健全性を維持するために使用されるデバイス等の手段を指す。
【００５５】
本明細書で使用される「拡張」または「拡大」という用語は、既存の層状に組織化された管腔臓器または組織構造のサイズを増加させることを指す。例えば、本発明の一態様において、既存の層状に組織化された管腔臓器または組織構造は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９パーセント拡大され得る。本発明の他の態様において、既存の層状に組織化された管腔臓器または組織構造は、既存の層状に組織化された管腔臓器または組織構造の既存の容積を増加させるため等に、拡大され得る。
【００５６】
本明細書で使用される「容積」という用語は、規定の領域の中に含有することが可能な液体の量を指す。
【００５７】
「再生予後」または「再生の予後を示す」という用語は、概して、本明細書で説明される構築体の移植の推定される経過もしくは結果の予想または予測を指す。本明細書で使用される再生予後は、膀胱置換または増大後の機能的膀胱の発達または改善、導管の移植後の機能的尿路変向の発達、改善された膀胱容量の発達、および改善された膀胱順応性の発達のうちの任意の１つ以上の予想または予測を含む。本明細書で使用される「再生の予後」は、新しい臓器または組織構造の移植の推定される経過もしくは結果の予想または予測を指す。いくつかの実施形態において、「再生の予後を示す」は、膀胱置換または増大後の機能的膀胱の発達または改善、導管の移植後の機能的尿路変向の発達、膀胱容量または改善された膀胱容量の発達、および膀胱順応性または改善された膀胱順応性の発達のうちの任意の１つ以上（の予後）の予想または予測を提供することを含む。
【００５８】
「再生された組織」は、本明細書で説明される構築体の移植後に発達する、新しい臓器の組織または組織構造を指す。臓器または組織構造は、膀胱または膀胱の一部であってもよい。再生された組織は、その下に平滑筋を伴う連続する尿路上皮を含んでもよい。
【００５９】
２．細胞集団
本発明は、細胞集団が、収縮機能を有し、かつ１つ以上の平滑筋細胞マーカーに対して陽性である少なくとも１つの細胞を含む、層状に組織化された管腔臓器または組織構造の再構築、修復、増大、または置換で使用するための平滑筋細胞の集団を提供する。
【００６０】
一般的に尿路上皮および平滑筋層から成る、膀胱または膀胱構成要素等の、層状に組織化された管腔臓器および組織構造の再構築、修復、増大、または置換で使用するための、移植可能な細胞播種したマトリクスを提供するために、本明細書で論じられる組織工学の原則が成功裏に適用されている。（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．５１，１２１７−１２２８（２００７）、Ｆｒｉｍｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．１，４２５−４３５（２００６）、Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｕｒｏｌ．Ｒｅｐ．１０，１１９−１２５（２００９）、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｕｒｏｌ．１８，５６４−５６９）。平滑筋細胞は、膀胱、尿道、尿管、および他の尿生殖器組織を含む、患者自身の組織に由来してもよい。しかしながら、例えば癌の膀胱組織の治療中等に、新しく健康な人工組織を発達させるための、基本単位としての原発臓器部位からの細胞培養系の発達および保守への依存に関連付けられる課題がある。明らかに、そのような癌性細胞は、移植可能な新膀胱足場またはマトリクスをポピュレートするためには不適当である。
【００６１】
本発明は、再構築、修復、増大、または置換の対象である臓器または組織構造と異なる源に由来する、細胞集団を提供する。一実施形態において、源は、自己源である。別の実施形態において、源は、非自己源である。
【００６２】
別の態様において、細胞集団は、平滑筋細胞集団と一致する、またはそれに典型的であるマーカーを発現する。
【００６３】
他の一態様において、本発明は、再構築、修復、増大、または置換の対象である管腔臓器または組織構造と異なる源から単離される平滑筋細胞集団を提供する。好ましい実施形態において、管腔臓器または組織構造は、膀胱または膀胱の一部分である。
【００６４】
一態様において、源は、腹膜組織である。一実施形態において、腹膜組織由来の平滑筋細胞集団は、患者試料またはドナー試料に由来する。患者試料またはドナー試料は、生検中に取り出された腹膜組織であってもよい。腹膜組織は、網組織であってもよい
【００６５】
さらに他の一実施形態において、本発明の単離された細胞集団は、培養したときに、丘および谷形態、１つ以上の平滑筋細胞マーカーの発現、収縮機能、フィラメント形成、ならびにサイトカイン合成が挙げられるが、これらに限定されない、種々の平滑筋細胞特性を発達させることができる。
【００６６】
一態様において、培養された細胞集団は、その丘および谷形態を特徴とする。丘および谷形態を有する細胞は、紡錘形状、通過時の平坦で線維芽細胞様、細長い並列な配列、「回転状の」成長形態、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、種々の特徴を有してもよい。一実施形態において、細胞集団は、適切な媒体中で培養したときに、培養された平滑筋細胞で典型的である、「丘および谷形態」を発達させる。
【００６７】
別の態様において、培養された細胞集団は、１つ以上の平滑筋細胞マーカーの存在を特徴とする。一実施形態において、細胞集団は、適切な媒体中で培養したときに、デスミン、アルファ−平滑筋アクチン、ミオシン重鎖、カルポニン、ミオカルディン、ビメンチン、筋線維芽細胞、ＢＡＡＬＣ、ＳＭ２２、およびそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない、検出可能な平滑筋細胞マーカーを発達させる。
【００６８】
一態様において、培養された細胞集団は、１つ以上の上皮または内皮マーカーの不在を特徴とする。一実施形態において、細胞集団は、適切な媒体中で培養したときに、ハリエニシダ凝集素１（ＵＥＡ−１）、ＥｐＣａｍ、ＣＤＨ５、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＰＥＣＡＭ、ＴＥＫ、ｖＷＦ、サイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３、およびそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない、検出可能な上皮または内皮マーカーを発達させない。
【００６９】
他の一態様において、培養された細胞集団は、収縮機能を有する１つ以上の細胞の存在を特徴とする。一実施形態において、細胞集団は、適切な媒体中で培養したときに、収縮機能を発達させる。別の実施形態において、収縮機能は、カルシウムに依存する。他の一実施形態において、カルシウム依存性の収縮機能は、カルシウムキレート化剤による収縮の阻害によって実証される。別の実施形態において、カルシウムキレート化剤は、ＥＤＴＡである。当業者は、当技術分野で知られている他のキレート化剤が適切であり得ることを理解するであろう。
【００７０】
さらに別の態様において、培養された細胞集団は、フィラメント形成を特徴とする。一実施形態において、細胞集団は、適切な媒体中で培養したときに、フィラメント形成を受ける。
【００７１】
一態様において、細胞集団は、１つ以上のサイトカインを発現する、少なくとも１つの細胞を含む。一実施形態において、サイトカインは、ＭＣＰ−１である。
【００７２】
一態様において、本発明は、本明細書で説明される足場またはマトリクス上に沈着させて、必要としている被検体に移植したときに、本明細書で企図される再構築の被検体、修復、増大、または置換の対象である臓器または組織構造の再生効果を提供する少なくとも１つの再生細胞を含有する、再生細胞集団を提供する。再生細胞集団は、必要としている患者に移植したときに、層状に組織化された管腔臓器または組織構造の再生を刺激または開始する能力を有する。概して、臓器または組織構造の再生は、細胞成分、組織の機構および構造、機能、ならびに調節的発達の復元を特徴とする。加えて、再生細胞集団は、細胞播種した管腔臓器または組織構造構築体の移植部位で起こる傾向がある、不完全性または障害を最小化する。移植の部位の組織崩壊は、それ自体を、増加したコラーゲンの沈着および／または瘢痕組織の形成として表すことができ、それぞれ、再生細胞集団を使用することによって最小化することができる。加えて、特定の細胞的事象は、再生過程を示す。本明細書で説明される細胞集団および足場を使用して再生された膀胱または膀胱の一部の場合、再生臓器または組織構造は、管腔表面に向かって延在する多数の微小脈管の周辺で放射状に広がる線維脈管組織、ならびに粘膜表面に整合される十分に発達した血管を有するストローマ要素を伴う、平滑筋柔組織から成る（上記ＪａｙｏＩＩを参照のこと）。再生膀胱または膀胱の一部はまた、紡錘／間葉細胞およびαＳＭＡ陽性筋肉前駆細胞の存在を特徴とする。一実施形態において、αＳＭＡ陽性紡錘細胞は、新ストローマ組織の中で、および複数の新脈管（細動脈）の周辺で観察される。
【００７３】
一実施形態において、本発明は、本明細書で説明される足場またはマトリクス上に沈着させて、必要としている被検体に移植したときに、本明細書で企図される再構築、修復、増大、または置換の対象である臓器または組織構造の回復効果を提供する。他の実施態様において、回復効果は、瘢痕組織の形成および／またはコラーゲンの沈着を特徴とする。当業者は、当技術分野で知られている、修復の他の特性を理解するであろう。
【００７４】
別の態様において、再生細胞集団は、復元された層状に組織化された管腔臓器または組織構造のサイズの適応調節を特徴とする、再生効果を提供する。一実施形態において、再生細胞集団再生効果は、再生細胞集団を播種した足場またはマトリクスを受容する被検体に特異的である、適応調節の確立である。一実施形態において、適応調節は、新膀胱が成長して、被検体の体のサイズに比例するサイズまで発達するように、本明細書で説明される構築体を使用した、被検体における膀胱の置換または増大である。
【００７５】
一実施形態において、再生刺激が可能な細胞集団は、ＭＣＰ−１産生細胞集団であり、ケモカイン産物ＭＣＰ−１を発現する少なくとも１つの細胞を含有する。ＭＣＰ−１再生刺激は、移植の部位への特定の細胞型の動員を特徴とする。一実施形態において、ＭＣＰ−１は、新膀胱内で増殖させるために、筋肉前駆細胞を移植の部位に動員する。別の実施形態において、ＭＣＰ−１は、単球を移植部位に動員し、その結果、種々のサイトカインおよび／またはケモカインを産生して、再生過程を促進する。他の一実施形態において、ＭＣＰ−１は、網細胞を誘発して筋細胞に発達させる。
【００７６】
一態様において、本発明は、組織再生の代理マーカーとしての、ＭＣＰ−１等の特定のサイトカインの使用を提供する。そのようなマーカーは、機能が再構成されたかどうかに基づいた再生の評価と併せて使用することが可能である。また、再生の時間経過にわたって代理マーカーを監視することで、再生の予後指標としての役割を果たし得る。
【００７７】
別の実施形態において、細胞集団は、精製された細胞集団である。本明細書で説明される精製された細胞集団は、形態、マーカーの発現、および機能のうちの１つに基づいた表現型を特徴とする。表現型は、丘および谷形態、１つ以上の平滑筋細胞マーカーの発現、サイトカインの発現、培養液の有限増殖寿命、収縮機能、およびフィラメント形成を誘発する能力のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。表現型は、本明細書で説明される、または当業者に知られている他の特徴を含んでもよい。別の実施形態において、精製された集団は、本明細書で説明される平滑筋細胞集団について実質的に均一である。実質的に均一である精製された集団は、一般的に、形態、マーカーの発現、および機能のうちの１つ以上によって判定したときに、少なくとも約９０％均一である。他の実施態様において、精製された集団は、少なくとも約９５％均一であるか、少なくとも約９８％均一であるか、または少なくとも約９９．５％均一である。
【００７８】
全ての実施形態において、ＳＭＣ集団は、自己源または非自己源に由来する。
【００７９】
別の態様において、本発明は、本明細書で説明されるＳＭＣ集団の眼障害への適用を企図する。眼障害は、眼の筋肉の不適当な機能のため、被検体が不完全な眼を有するものである。平滑筋は、毛様体筋として眼の中に存在し、様々な距離で対象を概観するための眼の順応を制御し、かつシュレム管を通しての房水の流れを調節する。平滑筋はまた、眼の虹彩の中にも存在する。老眼および遠視等の眼障害を伴う個人は、これらのＳＭＣ集団から利益を得ることが可能である。一実施形態において、ＳＭＣ細胞集団は、必要としている被検体またはドナーの腹膜組織から単離することが可能である。細胞集団は、被検体の眼内のある部位での移植に適切な足場上に播種することが可能である。本発明の細胞集団の利点は、被検体が不完全な眼を有する場合、または眼組織の限定された入手可能性のため、被検体の眼から供給するために、適切なＳＭＣが利用できない場合があることである。ＳＭＣ集団は、生検材料から単離され、培養され、適切な足場上に播種され、そして被検体に埋め込まれて、新しい眼組織を提供することが可能である。腹膜組織は、網組織であってもよい。
【００８０】
別の実施形態において、本発明の平滑筋細胞集団は、移植等によって、足場の使用を伴わずに、眼障害を有する被検体に投与されてもよい。当業者は、移植の適切な方法を理解するであろう。
【００８１】
一態様において、本発明は、腹膜組織に由来する単離された平滑筋細胞集団に関する。一実施形態において、腹膜由来の細胞集団は、平滑筋細胞マーカーに対して陽性である、収縮機能を有する１つ以上の細胞を含有する。
【００８２】
全ての実施形態において、細胞集団は、ミオカルディン、アルファ−平滑筋アクチン、カルポニン、ミオシン重鎖、ＢＡＡＬＣ、デスミン、筋線維芽細胞抗原、ビメンチン、およびＳＭ２２から選択される、１つ以上の平滑筋細胞マーカーを特徴とし得る。いくつかの実施形態において、細胞集団は、ミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）を発現してもよい。全ての実施形態において、「ＭＹＯＣＤ」という用語は、ＭＹＯＣＤポリペプチドをコードする核酸、およびＭＹＯＣＤポリペプチドを含む。全ての実施形態において、細胞集団の収縮機能は、カルシウム依存性であってもよい。
【００８３】
３．細胞集団を単離する方法
自己細胞集団は、治療を必要としている被検体に直接由来する。非自己細胞集団は、ドナーに由来する。源組織は、概して、治療を必要としている臓器または組織構造と同じではない。細胞の集団は、患者自身の組織または例えば腹膜組織から等のドナー組織に由来してもよい。一実施形態において、源組織は、網組織である。細胞は、生検で単離されてもよい。加えて、細胞は、使用前に冷凍または拡張させてもよい。
【００８４】
細胞播種した足場の構造を調製するために、平滑筋細胞を含有する試料を、適切な細胞懸濁液中に解離させる。細胞の単離および培養のための方法は、発行済み米国特許第５，５６７，６１２号で論じられており、参照により特に組み込まれる。単一細胞懸濁液は、インビトロ培養の期間後になされてもよいので、単一細胞段階への細胞の解離は、初期一次培養に必須ではない。組織解離は、細胞外マトリックス、およびともに細胞を保持する細胞間接合部の機械的および酵素の破壊によって行われてもよい。細胞は、所望であれば、インビトロで培養して、足場上に播種するために利用可能な細胞の数を増加させることができる。
【００８５】
細胞は、遺伝物質を播種する前に形質移入されてもよい。平滑筋細胞は、ポリマー播種する前に特定の遺伝子を形質移入することが可能である。細胞ポリマー構築体は、宿主または組織工学によって作製された新臓器の長期生存のために必要とされる遺伝的情報を伝えることが可能である。
【００８６】
細胞培養は、細胞分画ステップの有無に関わらず調製されてもよい。細胞分画は、当業者に知られている手法を使用して行われてもよい。細胞分画は、細胞サイズ、ＤＮＡ含量、細胞表面抗原、および生存度に基づいて行われてもよい。例えば、平滑筋細胞は、腹膜組織から富化されてもよく、その一方で、内皮細胞は、平滑筋細胞回収のために低減させてもよい。細胞分画が使用され得るが、それは本発明の実践には不要である。腹膜組織は、網組織であってもよい。
【００８７】
本明細書で説明される方法における別の随意的な手技は、極低温保存である。極低温保存は、例えば複数の侵襲的手術手技の必要性を低減するために有用であり得る。生検材料から、または被検体由来の試料から採取した細胞は、増幅させてもよく、増幅させた細胞の一部を使用してもよく、また別の部分を極低温的に保存してもよい。細胞を増幅して保存する能力は、必要とされる手術手技の数を最小化し得る。極低温保存の有用性の別の例は、組織バンクである。細胞は、例えば、ドナー組織バンクに貯蔵してもよい。新しい臓器または組織構造のために細胞が必要とされたときに、必要に応じて、極低温保存された細胞の供給を使用してもよい。既存の臓器または組織構造を損ない得る、疾患を有する、または治療を受けている患者は、１つ以上の生検材料を低温的に維持してもよい。後に、患者自身の組織または組織構造が機能しなくなった場合に、低温的に保存された細胞を解凍して、治療に使用してもよい。例えば、治療後に新しい臓器または組織構造の中で癌が再発した場合に、付加的な生検材料を必要とすることなく臓器または組織構造を再構築するために、極低温的に保存された細胞を使用してもよい。
【００８８】
平滑筋細胞は、以下の一般プロトコルに基づいて腹膜組織から単離されてもよい。適切な重量（例えば、グラム）および／または面積（例えば、ｃｍ２）の生検標本を得ることができる。以下は、網組織から平滑筋細胞を単離するために適切なプロトコルの代表例である。適切なグラム重量（例えば、７〜２５ｇ）の網組織を、生検によって得て、ＰＢＳで洗浄し（例えば、３回）、外科用メスおよびはさみで細かく切り刻み、５０ｍＬの円錐管に移して、コラゲナーゼ（例えば、０．１〜０．３％）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）およびＤＭＥＭ−ＨＧ中１％のＢＳＡの溶液中で、３７℃で６０分間インキュベートする。管は、消化を促進するために、継続的に揺動させるか、または定期的に振盪させてもよい。消化された試料は、６００ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化し、ＤＭＥＭ−ＨＧ＋１０％のＦＢＳ中に再懸濁することができる。ペレットは、次いで、継代０を播種するために使用されてもよい。図１４は、腹膜組織から細胞を単離するための代表的なプロトコルを表す。
【００８９】
当業者は、平滑筋細胞を単離するための付加的な方法を理解するであろう。
【００９０】
一態様において、本発明は、平滑筋細胞集団を腹膜組織から単離する方法を提供する。別の態様において、本発明は、単離された平滑筋細胞集団を腹膜組織から単離する方法を提供する。腹膜組織は、網組織であってもよい。一実施形態において、本方法は、ａ）網組織を得ることと、ｂ）網組織を消化することと、ｃ）消化された網組織を遠心分離してＳＭＣ含有画分をペレット化することと、ｄ）ペレット化された画分を培養することと、ｅ）平滑筋細胞集団を画分から単離することと、を含む。一実施形態において、培養するステップは、ペレットを洗浄することと、ペレットを細胞培養媒体中に再懸濁することと、再懸濁されたペレットを平板培養することと、を含む。別の実施形態において、培養するステップは、平板またはコンテナ等の細胞培養支持体に接着する、細胞集団を提供することを含む。別の実施形態において、本方法は、培養された細胞集団を拡張することをさらに含む。他の実施態様において、本方法は、平滑筋細胞の特性について平滑筋細胞集団を分析することをさらに含む。一実施形態において、網組織は、自己源または非自己源に由来する。
【００９１】
他の一態様において、本発明は、収縮機能を有し、かつ１つ以上の平滑筋細胞マーカーに対して陽性である少なくとも１つの細胞を含有する、平滑筋細胞の集団を単離して、培養する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、層状に組織化された管腔臓器または組織構造の再構築、修復、増大、または置換を必要としている患者から試料を得るステップであって、該試料が、再構築、修復、増大、または置換を必要としている管腔臓器または組織構造から得られない、ステップを含む。別の実施形態において、平滑筋細胞は、患者試料に由来する。他の一実施形態において、管腔臓器または組織構造は、膀胱または膀胱の一部分である。一実施形態において、試料は、自己試料または非自己試料である。別の実施形態において、試料は、腹膜組織試料である。腹膜組織試料は、網組織試料であってもよい。
【００９２】
別の実施形態において、得るステップは、その後に分離ステップが続く。
【００９３】
網組織試料の場合、精製ステップは、コラゲナーゼによる試料の消化と、消化された試料を遠心分離することと、遠心分離された試料を混合してＳＭＣ含有画分を提供することと、混合された試料を遠心分離して以降に培養するために再懸濁することができる画分を得ることと、を含む。
【００９４】
一実施形態において、培養する方法は、当業者に知られている標準状態によって、最小限の必須媒体（例えば、ＤＭＥＭまたはα−ＭＥＭ）および胎児のウシ血清（例えば、１０％のＦＢＳ）を含有する、細胞培養媒体の使用を含む。
【００９５】
４．足場
Ａｔａｌａの米国特許第６，５７６，０１９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で説明されるように、足場またはポリマーマトリクスは、種々の異なる材料から成ってもよい。概して、生体適合材料および特に生分解性材料は、本明細書で説明される足場の構造に好ましい材料である。足場は、少なくとも２つの別個の表面を伴う、移植可能であるか、生体適合性であるか、合成であるか、または天然ポリマーマトリクスである。足場は、治療を必要としている管腔臓器または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形される。生体適合材料は、生分解性である。生体適合性とは、生物学的機能に対する中毒作用または有害作用を有しない材料を指す。生分解性とは、患者の体内で吸収または分解することができる材料を指す。生分解性材料の例としては、例えば、吸収性縫合糸が挙げられる。足場を形成するための代表的な材料としては、例えばコラーゲン、ポリ（乳酸）等のポリ（アルファヒドロキシエステル）、ポリ（グリコール酸）、ポリオルトエステル、およびポリ無水物、ならびに加水分解によって制御された速度で分解して再吸収されるそれらの共重合体等の、天然または合成ポリマーが挙げられる。これらの材料は、分解性、扱いやすさ、サイズ、および構成の最大制御を提供する。好ましい生分解性ポリマー材料としては、吸収性合成縫合糸材料として開発された、ポリグリコール酸およびポリグラクチンが挙げられる。ポリグリコール酸およびポリグラクチン繊維は、製造業者によって供給されるように使用されてもよい。他の足場材料としては、セルロースエーテル、セルロース、セルロースエステル、フッ素化ポリエチレン、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンゾオキサゾール、ポリカーボネート、ポリシアノアリールエーテル、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルサルホン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレンスルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、ポリフッ化ビニリデン、再生されたセルロース、シリコーン、尿素ホルムアルデヒド、またはこれらの材料の共重合体もしくは物理的混和物が挙げられる。材料は、適切な抗微生物剤を含浸させてもよく、また、可視性を向上させて手術手技を支援するために、着色添加剤によって着色してもよい。
【００９６】
生分解性である他の足場材料としては、ＭＯＮＯＣＲＹＬ（商標）（グリコリドおよびイプシロン−カプロラクトンの共重合体）、ＶＩＣＲＹＬ（商標）もしくはポリグラクチン９１０（ポリグラクチン３７０およびステアリン酸カルシウムで被覆される、ラクチドおよびグリコリドの共重合体）、およびＰＡＮＡＣＲＹＬ（商標）（カプロラクトンおよびグリコリドのポリマーで被覆される、ラクチドおよびグリコリドの共重合体）等の、Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｃｏ．（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｃｏ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ．）によって製造されている、合成縫合糸材料が挙げられる（Ｃｒａｉｇ  Ｐ．Ｈ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｊ．Ａ．，Ｄａｖｉｓ  Ｋ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．：Ａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ  ９１０  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｓｕｔｕｒｅｓ．Ｓｕｒｇ．１４１；１０１０，（１９７５））およびポリグリコール酸。これらの材料は、製造業者によって供給されるように使用することができる。
【００９７】
さらに別の実施形態において、マトリクスまたは足場は、天然の脱細胞化された臓器の各部を使用して作成することができる。生体構造または臓器の各部は、臓器から細胞および組織含量全体を取り除くことによって、脱細胞化することができる。脱細胞化過程は、一連の順次抽出を含む。この抽出過程の１つの重要な事柄は、生体構造の錯体の基礎構造を阻害または破壊し得る、過酷な抽出が回避されることである。第１のステップは、細胞細片の除去および細胞膜の可溶化を伴う。この後には、核細胞質成分および核成分の可溶化が続く。
【００９８】
好ましくは、生体構造（例えば、臓器の一部）は、穏やかな機械的破壊方法を使用して、臓器の一部を囲繞する細胞膜および細胞細片を取り除くことによって脱細胞化される。穏やかな機械的破壊方法は、細胞膜を破壊するのに十分でなければならない。しかしながら、脱細胞化の過程は、生体構造の錯体の基礎構造の損傷または障害を回避するべきである。穏やかな機械的破壊方法は、臓器部の表面をこすり取るか、臓器部をかき混ぜるか、または適切な容積の流体（例えば、蒸留水）中で臓器を撹拌することを含む。好ましい一実施形態では、穏やかな機械的破壊方法は、細胞膜が破壊されて細胞細片が臓器から取り除かれるまで、適切な容積の蒸留水中で攪拌することを含む。
【００９９】
細胞膜を取り除いた後に、生体構造の核および細胞質成分を取り除く。これは、基礎構造を破壊せずに、細胞および核成分を可溶化することによって行うことができる。核成分を可溶化するために、非イオン性界面活性剤または界面活性剤を使用してもよい。非イオン洗浄剤または界面活性剤の例としては、Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）から入手可能なＴｒｉｔｏｎシリーズ（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＮ−１０１、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５、ＴｒｉｔｏｎＸ−７０５、およびＴｒｉｔｏｎＤＦ−１６を含む、多数の販売業者から商業的に入手可能である）、Ｔｗｅｅｎシリーズ（モノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、モノパルミタート（Ｔｗｅｅｎ４０）、モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）、およびポリオキシエチレン−２３ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ．３５）、ポリオキシエチレンエーテルＷ−１（Ｐｏｌｙｏｘ）等）、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸、ＣＨＡＰＳ、サポニン、ｎ−デシル−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−Ｄ−グルコピラノシド、およびＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
当業者は、前述の分類および販売業者に属する合物の説明が、商業的に入手可能であり得、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ」、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ，Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，１９８６，Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＭＣ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．ａｎｄ  Ｊｕｄｉｔｈ  Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒ．，Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｃｅｌａｎｅｓｅ  Ｃｏｒｐ．，１９８７に見出され得ることを理解するであろう。好ましい一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎシリーズ、好ましくは、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。
【０１０１】
非イオン性界面活性剤の濃度は、脱細胞化されている生体構造の種類に応じて変更され得る。例えば、繊細な組織（例えば、血管）に対しては、洗浄剤の濃度を下げるべきである。非イオン性界面活性剤の好ましい濃度範囲は、約０．００１〜約２．０％（ｗ／ｖ）とすることができる。より好ましくは、約０．０５〜約１．０％（ｗ／ｖ）である。さらに好ましくは、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約０．８％（ｗ／ｖ）である。これらの好ましい濃度は、約０．００１〜約０．２％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは、約０．０５〜約０．１％（ｗ／ｖ）の範囲である。
【０１０２】
高密度な細胞質フィラメントネットワーク、細胞間錯体、および頂端微小細胞構造を含む、細胞骨格成分は、水酸化アンモニウム等のアルカリ性溶液を使用して可溶化してもよい。細胞骨格成分を可溶化するために、アンモニウム塩またはそれらの誘導体から成る他のアルカリ性溶液が使用されてもよい。他の適切なアンモニウム溶液の例としては、硫酸アンモニウム、アンモニウム酢酸塩、および水酸化アンモニウムが挙げられる。好ましい実施形態では、水酸化アンモニウムが使用される。
【０１０３】
アルカリ性溶液（例えば、水酸化アンモニウム）の濃度は、脱細胞化されている生体構造の種類に応じて変更され得る。例えば、繊細な組織（例えば、血管）に対しては、洗浄剤の濃度を下げるべきである。好ましい濃度範囲は、約０．００１〜約２．０％（ｗ／ｖ）とすることができる。より好ましくは、約０．００５〜約０．１％（ｗ／ｖ）である。さらにより好ましくは、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．０８％（ｗ／ｖ）である。
【０１０４】
脱細胞化し、凍結乾燥した構造は、使用に必要とされるまで適切な温度で貯蔵してもよい。使用前に、脱細胞化した構造は、適切な等張性緩衝剤または細胞培養媒体中で平衡させることができる。適切な緩衝剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋの平衡塩溶液等が挙げられるが、これらに限定されない。適切な細胞培養媒体は、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆｉｓｈｅｒ媒体、Ｉｓｃｏｖｅ媒体、ＭｃＣｏｙ媒体、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ媒体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
使用してもよいさらに他の生体適合性材料としては、ステンレス鋼、チタン、シリコーン、金、およびサイラスティックが挙げられる。
【０１０６】
ポリマーマトリクスまたは足場は、強化することができる。例えば、強化材料を、合成マトリクスまたは足場の形成中に追加するか、もしくは移植前に天然または合成マトリクスに取り付けてもよい。強化を形成するための代表的な材料としては、例えばコラーゲン、ポリ（乳酸）等のポリ（アルファヒドロキシエステル）、ポリ（グリコール酸）、ポリオルトエステル、およびポリ無水物、ならびに加水分解によって制御された速度で分解して再吸収されるそれらの共重合体等の、天然または合成ポリマーが挙げられる。ここれらの材料は、分解性、扱いやすさ、サイズ、および構成の最大制御を提供する。
【０１０７】
生分解性ポリマーは、インストロン試験機を使用した引張強度等の、機械的性質に関して、 ゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）によるポリマー分子量、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によるガラス転位温度、および赤外線（ＩＲ）分光法による結合構造について、ならびにＡｍｅｓアッセイおよびインビトロの催奇形性アッセイを伴う初期スクリーニング試験、および免疫原性、炎症、放出および分解研究のための動物における移植研究に関して、特徴付けることができる。インビトロの細胞付着性および生存度は、走査電子顕微鏡法、組織学、および放射性同位元素による定量的評価を使用して評価することができる。生分解性材料はまた、患者に移植したときに材料が分解するのに必要な時間量に関して特徴付けられ得る。例えば厚さおよびメッシュサイズ等の構造を変動させることによって、生分解性材料は、約２年または約２ヵ月の間に、好ましくは約１８ヵ月〜約４ヵ月の間、より好ましくは約１５ヵ月〜約８ヵ月の間、最も好ましくは約１２ヵ月〜約１０ヵ月の間に、実質的に生分解し得る。必要であれば、生分解性材料は、約３年もしくは約４年以内、または約５年以上実質的に分解しないように構築されてもよい。
【０１０８】
ポリマーマトリクスまたは足場は、前述のように、制御された孔構造を伴って製作されてもよい。孔のサイズは、細胞分布を決定するために使用されてもよい。例えば、ポリマーマトリクスまたは足場上の孔は、細胞が一方の面から反対の面に移動することを可能にする大きさであってもよい。代替として、孔は、ポリマーマトリクスまたは足場の両側の間で流体連通があるが、細胞は通過できない程度に小さくてもよい。この目的を達成するための適切な細孔寸法は、直径約０．０４ミクロン〜約１０ミクロンの間、好ましくは直径約０．４ミクロン〜約４ミクロンの間であってもよい。いくつかの実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場の表面は、細胞集団の孔への付着および移動を可能にするのに十分な大きさの孔を備えてもよい。孔サイズは、細胞がポリマーマトリクスまたは足場の一方から反対側に移動することを防止するために、ポリマーマトリクスまたは足場の内部で低減されてもよい。減少した孔サイズを伴うポリマーマトリクスまたは足場の一実施形態は、２つの大きい孔材料の間に挟まれる、小さい孔材料の積層構造である。ポリカーボネート膜が特に適切であるが、その理由は、この膜を、例えば、約０．０１ミクロン、約０．０５ミクロン、約０．１ミクロン、約０．２ミクロン、約０．４５ミクロン、約０．６ミクロン、約１．０ミクロン、約２．０ミクロン、および約４．０ミクロン等の、非常に制御された孔サイズで製作することができるからである。サブミクロンレベルで、ポリマーマトリクスまたは足場は、細菌、ウイルス、および他の微生物に対して不透過性であってもよい。
【０１０９】
とりわけ、以下の特性または基準が、各離散的マトリクスまたはその一部の設計において考慮される。（ｉ）形状、（ｉｉ）強度、（ｉｉｉ）硬さおよび剛性、ならびに（ｉｖ）縫合性（マトリクスまたはその一部が容易に縫合されるか、別様には隣接する組織に取り付けられる程度）。本明細書で使用される所与のマトリクスまたは足場の硬さは、弾性係数、すなわち、足場を変形させるように作用する単位面積当たりの応力と、それに起因する変形量との間の比率を表す係数によって定義される。（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａｎｄｒｅａｓ  Ｆ．  ｖｏｎ  Ｒｅｃｕｍ，（１９９９）、Ｒａｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）を参照されたい）。足場の剛性は、所与の足場が呈する柔軟度（またはその欠如）を指す。
【０１１０】
これらの基準のそれぞれは、マトリクスまたはその一部が最良に配置されて、意図される医学的適用および生理学的機能に対処することを可能にするように、（とりわけ、材料および製造工程の選択を通して）変更することができる、変数である。例えば、膀胱の置換、再構築、および／または増大のためのマトリクスまたは足場を備える材料は、破れることなく縫合糸を支持するための十分な強さがある一方で、変動する尿量を収容するように十分に順応性がなければならない。
【０１１１】
最適には、マトリクスまたは足場は、その生分解の後に、結果として生じる再構築された膀胱が、空のときに天然の膀胱に類似した様式で折り畳み可能であり、かつ尿路カテーテルが、漏出点を残さずに、新しい臓器または組織構造から取り除かれている間、尿が遮断されないように成形されるべきである。生体工学によって作られた膀胱構築体は、１つの部品として製作することができ、もしくは各部分を個々に製作することができ、または断片を特定の部分として製作することができる。各特定のマトリクスまたは足場部分は、特定の機能を有するように製作されてもよい。他の特定の部分は、製造を容易にするように製作されてもよい。特定の部分は、特定の材料から構築されてもよく、特定の性質を提供するように設計されてもよい。特定の部分の性質としては、０．５〜１．５ＭＰａ２の天然組織（例えば、尿管）に類似した引張強度、および３０〜１００％の極限伸びが挙げられ、または引張強度は、０．５〜２８ＭＰａ２であってもよく、極限伸びは、１０〜２００％の範囲であってもよく、また、圧縮強度は、１２未満であってもよい。
【０１１２】
円形、波形、平坦形、星形であってもよい、繊維単独で、または他の繊維が巻き付いて形成される、メッシュ構造が好ましい。分岐繊維の使用は、容積の増加に比例する表面積の増加の問題を解決するために生理的に使用される、同じ原理に基づいている。全ての多細胞生物は、この繰り返し分岐構造を利用する。分岐系は、臓器間の通信ネットワーク、ならびに個々の臓器の機能ユニットを表す。この構成に細胞を播種して、移植することで、それぞれが宿主の環境に露出する多数の細胞の移植を可能にし、栄養素および老廃物の自由な交換を提供する一方で、新脈管化が達成される。ポリマーマトリクスまたは足場は、所望される最終的な形態、構造、および機能に応じて、柔軟または剛体に作製されてもよい。
【０１１３】
好ましい一実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、１５μｍの平均繊維直径を伴うポリグリコール酸で形成されて、４−０のポリグラクチン９１０縫合糸を使用して膀胱形状の金型に構成される。結果として生じる構造は、十分な機械的特性を達成し、かつその形状を設定するために、例えばポリ−ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（５０：５０）、１ミリリットルあたり８０ミリグラムの塩化メチレン等の、液化共重合体で被覆される。
【０１１４】
さらなる実施形態では、本発明の足場は、生体適合性および生分解性形状設定材料で被覆される。一実施形態において、形状設定材料は、ポリ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド共重合体を含有する。別の実施形態において、形状設定材料は、液化される。
【０１１５】
他の一態様において、本発明の足場は、例えば移植後の新しい組織の再生を促進するために、移植前（ポリマーマトリクスまたは足場に細胞を播種する前、またはその後）に、添加剤または薬物で処理してもよい。したがって、移植片の治癒および新しい組織の再生を促進するために、例えば、成長因子、サイトカイン、細胞外マトリックスまたは足場成分、および他の生物活性材料を、ポリマーマトリクスまたは足場に加えることができる。そのような添加剤は、概して、適切な新しい組織が、移植された臓器または組織の中に形成されることを確実にするために、再構築、置換、または増大されている組織または臓器に従って選択される（骨の治癒の促進で使用するためのそのような添加剤の例については、Ｋｉｒｋｅｒ−Ｈｅａｄ，Ｃ．Ａ．Ｖｅｔ．Ｓｕｒｇ．２４（５）：４０８−１９（１９９５）を参照されたい）。例えば、脈管組織を増大させるために、ポリマーマトリクス（随意に、内皮細胞が播種される）を使用するときには、新しい脈管組織の再生を促進するために、脈管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（例えば、米国特許第５，６５４，２７３号を参照のこと）を用いることができる。成長因子および他の添加剤（例えば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン−結合表皮状成長因子（ＨＢＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、サイトカイン、遺伝子、タンパク質等）を、加えられた細胞が用いられた場合に、ポリマーマトリクス上に播種された細胞によって産生され得る、（該当する場合）そのような成長因子の任意の量を超える量で加えることができる。そのような添加物は、好ましくは、（例えば、宿主細胞の移植片の中への浸潤を引き起こす、または加速することによって）修復、置換、または増大される組織または器官に適切な種類の新しい組織の再生を促進するのに十分な量で提供される。他の有用な添加剤としては、抗生物質等の抗菌剤が挙げられる。
【０１１６】
１つの好ましい支持マトリクスまたは足場は、細胞支持体を移植したときに、短い距離にわたる栄養素の拡散によって細胞生存を可能にすることができる、交差フィラメントから成る。細胞支持マトリクスまたは足場は、移植に伴う細胞塊の拡大と協調して脈管化した状態になる。
【０１１７】
移植前の、インビトロでの３次元構造構築体の組み立ては、インビボでの移植後の細胞の最終的な最終分化を促進し、かつマトリクスに対する炎症応答の危険性を最小化し、したがって、移植片の拘縮および収縮を回避する。
【０１１８】
ポリマーマトリクスまたは足場は、使用前に、任意の既知の方法を使用して殺菌してもよい。使用される方法は、ポリマーマトリクスで使用される材料に依存する。殺菌方法の例としては、蒸気、乾式加熱、放射線、ガス（酸化エチレン等）、ガス、および沸騰が挙げられる。
【０１１９】
足場を構成する合成材料は、例えば、溶液流延、圧縮成形、フィラメント引、メッシング、溶脱、製織、および被覆を使用して成形されてもよい。溶液流延では、塩化メチレン等の適切な溶媒中の１つ以上のポリマーの溶液が、分岐パターンの凸凹構造として鋳造される。溶媒の蒸発後に、薄い膜が得られる。圧縮成形では、１平方インチ（約６．４５ｃｍ２）あたり最高３０，０００ポンド（約１３．６トン）の圧力でポリマーを適切なパターンに圧縮する。フィラメント引は、融解したポリマーからの引き抜きを伴い、メッシングは、繊維をフェルト状の材料に圧縮することによってメッシュを形成することを伴う。溶脱では、２つの材料を含有する溶液を、構築体の最終的な形態に近い形状に広げる。次に、溶媒は、成分のうちのいずれか１つを溶解するために使用されて、孔の形成をもたらす。（Ｍｉｋｏｓの米国特許第５，５１４，３７８号を参照のこと。参照により本明細書に組み込まれる）。核形成では、足場の形状の薄い膜が、放射線損傷を受けた材料のトラックを作成する、放射性核分裂生成物に曝露される。次に、ポリカーボネートシートが、酸または塩基でエッチングされ、放射線損傷を受けた材料のトラックを孔にする。最後に、多数の材料を通して個々の孔を成形および焼いて、均一な孔サイズを伴う構造を形成するために、レーザを使用してもよい。被覆は、その機械的性質を変えるために、例えば液化共重合体（ポリ−ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（５０：５０）、８０ｍｇ／ｍｌの塩化メチレン）等の材料でポリマー構造を被覆すること、またはその材料をポリマー構造に浸透させることを指す。被覆は、１つの層で行われてもよく、または所望の機械的性質が達成されるまで複数の層で行われてもよい。これらの成形手法は、組み合わせて用いられてもよく、例えば、ポリマーマトリクスまたは足場を織り、圧縮整形し、そしてともに接着してもよい。さらに、異なる過程によって成形される異なるポリマー材料をともに接合して、複合形状を形成してもよい。複合形状は、層構造であってもよい。例えば、ポリマーマトリクスまたは足場を、１つ以上のポリマーマトリクスに取り付けて、多層ポリマーマトリクスまたは足場構造を形成してもよい。取り付けは、液体ポリマーによる接着によって、または縫合によって行われてもよい。加えて、ポリマーマトリクスまたは足場は、固体ブロックとして形成して、レーザまたは他の標準的な機械加工技術によって、その所望の最終形態に成形されてもよい。レーザ成形は、レーザを使用して材料を取り除く過程を指す。
【０１２０】
好ましい実施形態において、足場は、不織ポリグリコール酸（ＰＧＡ）フェルトおよびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）ポリマー（ＰＬＧＡ）から形成される。別の好ましい実施形態において、足場は、尿路変向足場である。
【０１２１】
Ｂｅｒｔｒａｍ他の米国特許出願公開第２００７０２７６５０７号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で説明されるように、ポリマーマトリクスまたは足場は、任意の数の系、幾何学形状、または空間制限を満足するように、任意の数の所望の構成に成形されてもよい。マトリクスは、層状に組織化された管腔臓器または組織構造の寸法および形状に一致するように成形される、３次元マトリクスであってもよい。例えば、膀胱再構築に対するポリマーマトリクスの使用では、膀胱の全体または一部の寸法および形状に一致するように成形された、３次元マトリクスが使用されてもよい。必然的に、ポリマーマトリクスは、異なるようにサイズ決定された患者の膀胱に一致するように、異なるサイズおよび形状に成形されてもよい。随意に、ポリマーマトリクスは、その生分解後に、天然の膀胱に類似した様式で空になったときに、結果として生じる再構築された膀胱が折り畳み可能であり得るように成形されるべきである。ポリマーマトリクスはまた、患者の特別な必要性に適応するために、他の様式で成形されてもよい。例えば、以前に負傷した、または障害を持った患者は、異なる腹腔を有し得、また、合致するように適合された膀胱置換足場、膀胱増大足場、膀胱導管足場、および排尿筋等価足場が必要になり得る。
【０１２２】
一態様において、本発明は、本明細書で説明される平滑筋細胞集団とともに使用するのに適切な、付加的な足場を企図する。例えば、肺への移植に適切な足場が提供されてもよい。
【０１２３】
Ａ．増大または置換足場
他の一態様において、ポリマーマトリクスまたは足場は、膀胱の一部に一致するように成形される。一実施形態において、成形されたマトリクスは、受容体の既存の膀胱の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を置換するように一致される。他の一態様において、ポリマーマトリクスまたは足場は、膀胱の１００％、すなわち全てに一致するように成形される。
【０１２４】
一実施形態において、ポリマーマトリクスは、少なくとも２つの別個の表面を有する、第１の移植可能で、生体適合性である、合成もしくは天然のポリマーマトリクスまたは足場と、少なくとも２つの別個の表面を有する、第２の移植可能で、生体適合性であり、合成もしくは天然のポリマーマトリクスまたは足場とを備え、これらは、互いに噛合するように適合され、かつ噛合したときに、治療を必要としている管腔臓器または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形される。第１および第２のポリマーマトリクスは、噛合するように適合された、２つ以上の異なる部分に再分割される１つの一体型ユニットから、または２つ以上の異なる部分から形成されてもよい。いくつかの実施形態において、第１および第２のポリマーマトリクスは、噛合すると、管腔臓器または組織構造の再構築、修復、増大、または置換に使用されてもよい。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、第１および第２のポリマーマトリクスは、対称である一方で、他の実施形態において、第１および第２のポリマーマトリクスは、非対称である。一実施形態において、第１のポリマーマトリクスまたは足場は、閉じたドーム形の端部および開いた赤道境界を有する、半球状または準半球状の形状を有し、第２のポリマーマトリクスまたは足場は、第１のポリマーマトリクスの赤道境界と噛合するように適合されたカラーである。別の実施形態において、第１および第２のポリマーマトリクスは、それぞれ、閉じたドーム形の端部および開いた赤道境界を有する、半球形状または準半球形状である。さらに別の実施形態において、第１および第２のポリマーマトリクスは、それぞれ、円形または半円形基部、および各基部から半径方向に延在する少なくとも２つの花弁から成る。この実施形態において、第１および第２のポリマーマトリクスの基部および花弁形状の部分は、中空の球状または準球状のマトリクスまたは足場を作成するように噛合し、よって、フランジ付きの縦楕円開口部が、噛合したポリマーマトリクスの一方に作成され、かつ円形の開口部が、縦開口部の反対側に作成される。別の実施形態において、第１および第２のポリマーマトリクスは、噛合するように適合された頂部、前部、および側面部から成る３つの部分から作製される。この実施形態において、３つの異なる部分は、少なくとも３つの、好ましくは４つの垂直の縫い目を使用して噛合され、それによって、冠状の新膀胱構築体を形成する。この冠状の構築体は、好ましくは、管腔臓器の再構築、修復、増大、または置換のためのデバイスとして、単独で使用される。一実施形態において、構築体は、膀胱増大足場である。膀胱増大足場の１つの実施例は、図１Ａ〜Ｄで表される。
【０１２６】
別の実施形態において、構築体は、膀胱置換足場である。
膀胱置換足場の１つの実施例は、図２Ｄで表される。
【０１２７】
加えて、第１のポリマーマトリクス、第２のポリマーマトリクス、またはどちらも、天然の脈管または管への構築体の接続が必要である場合に、管状脈管またはインサートを受容するように適合される、少なくとも１つのレセプタクルまたはポートを含んでもよい。
この脈管またはインサートは、それら自体が、例えば円筒状または管状のポリマーマトリクスであり、それぞれ、円筒ポリマーの第１の端部に位置する少なくとも１つのフランジを有する。この脈管またはインサートは、好ましくは、前述した第１または第２のポリマーマトリクスと同じ生体適合材料から成る。いくつかの実施形態において、この脈管またはインサートはまた、円筒もしくは管状の脈管またはインサートのポリマーマトリクス周辺に合致するように適合される、ワッシャを含む。例えば、ワッシャは、ヒドロゲルである。円筒もしくは管状の脈管またはインサートは、随意にワッシャを含んでもよい。ワッシャは、ヒドロゲルであってもよい。加えて、円筒または管状のインサートは、自己安定式でもよい。
【０１２８】
別の実施形態において、天然の脈管または管への（細胞を播種した）足場またはマトリクスの接続が必要である場合に、管状の脈管またはインサートを受容するように適合される、レセプタクルまたはポートはまた、下記で論じられるマトリクスにも適用する。
【０１２９】
一態様において、足場は、少なくとも２つのマトリクスを含む、臓器または組織構造置換足場である。一実施形態において、足場は、第１の面を有する第１のマトリクスと、第１の面を有する第２のマトリクスとを備える。第１のマトリクスおよび第２のマトリクスは、噛合するように構成または適合されてもよい。別の実施形態において、第１のマトリクスおよび第２のマトリクスは、噛合したときに、少なくとも管腔臓器の一部に一致するように成形されてもよい。第１および第２のマトリクスは、生体適合材料から成ってもよい。この生体適合材料は、生分解性材料から成ってもよい。
【０１３０】
一実施形態において、第１のマトリクスは、閉口端および開いた赤道境界を伴う半球形状を有してもよく、第２のマトリクスは、第１のマトリクスの赤道境界と噛合するように構成または適合される、カラーを有してもよい。閉口端は、ドーム形であってもよい。別の実施形態において、第１のマトリクスおよび第２のマトリクスは、それぞれ、閉口端および開いた赤道境界を有する半球形状を有してもよい。閉口端は、ドーム形であってもよい。さらに別の実施形態において、第１のマトリクスは、第１のマトリクスの少なくとも１つの境界に沿った、フランジ付き領域をさらに備える。第２のマトリクスは、第２のマトリクスの少なくとも１つの境界に沿った、フランジ付き領域をさらに備えてもよく、第２のマトリクスのフランジ付き領域は、第１のマトリクスのフランジ付き領域と噛合するように適合される。
【０１３１】
一実施形態において、足場は、第１の生体適合性マトリクスと、第２の生体適合性マトリクスとを備え、第１および第２のマトリクスは、それぞれ、基部を備えてもよく、また噛合するように構成または適合されてもよい。一実施形態において、第１および第２のマトリクスは、噛合したときに、管腔臓器の少なくとも一部に一致するように成形されてもよい。別の実施形態において、第１および第２のマトリクスは、各基部から半径方向に延在する少なくとも２つの花弁をさらに備えてもよい。
【０１３２】
他の一実施形態において、第１および第２のマトリクスのそれぞれは、本来、基部および少なくとも４つの花弁を備えるテンプレートに由来してもよい。１つの構成において、一対の対向する花弁は、他の花弁よりも長さが短くてもよい。別の実施形態において、第１および第２のマトリクスは、噛合するように適合される２つの異なるユニットであってもよい。
【０１３３】
一実施形態において、第１および第２のマトリクスの基部は、噛合するように適合される。いくつかの実施形態において、第１および第２のマトリクスは、第１および第２のマトリクスの花弁形状部分を介して噛合される。
【０１３４】
他の実施態様において、第１および第２のマトリクスは、第１のマトリクスと第２のマトリクスとの間の第１の噛合点に縦開口部を伴い、縦開口部の反対側にある、第１のマトリクスと第２のマトリクスとの間の第１の噛合点に円形開口部を伴う、中空の半球または準半球形状を形成するように構成または適合されてもよい。足場は、第１または第２のマトリクスの基部の中に組み込まれる、少なくとも１つのフラップをさらに含んでもよい。別の実施形態において、縦開口部は、リップを有し、少なくとも１つのフラップが縦開口部のリップに配置される。
【０１３５】
別の態様において、１つもしくは複数のマトリクスは、天然の脈管に接続可能であってもよい。一実施形態において、第１のマトリクス、第２のマトリクス、またはどちらも、それぞれ、天然の脈管を受容するように構成または適合される。別の実施形態において、第１のマトリクス、第２のマトリクス、またはどちらも、少なくとも１つのレセプタクルをさらに備える。少なくとも１つのレセプタクルは、管状インサートを受容するように構成または適合されてもよい。管状インサートは、レセプタクル内に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、管状インサートは、端部を有する。インサートは、この端部に位置する、少なくとも１つのフランジを有してもよい。別の実施形態において、管状インサートは、天然の脈管に接続するように構成または適合されてもよい。さらなる実施形態において、足場は、表面と、管状インサートの周囲に配置されるワッシャとを有する。ワッシャは、フランジと構築体の表面との間に防水シールを形成するように構成または適合されてもよい。いくつかの実施形態において、ワッシャは、ヒドロゲルを含む。
【０１３６】
図１および図２は、少なくとも２つのマトリクスを含む、足場構成の代表的な描写を提供する。
【０１３７】
一態様において、足場は、１つ以上のマトリクスを含む、臓器または組織構造増大足場である。一実施形態において、足場は、基部および複数の切り欠きを有する第１のマトリクスを含み、第１のマトリクスは、組み立てたときに管腔臓器の少なくとも一部に一致する半形状を形成するように適合される。別の実施形態において、足場は、第２および第３のマトリクスを含み、第１、第２、および第３のマトリクスは、噛合するように構成または適合されてもよく、かつ噛合したときに、管腔臓器の少なくとも一部に一致するように成形される。第１、第２、および第３のポリマーマトリクスは、３つの再分割された部分を備えるテンプレートに由来してもよい。別の実施形態において、第１、第２、および第３のマトリクスは、３つの異なるテンプレートに由来し、かつ噛合するように構成または適合されてもよい。他の一実施形態において、第１、第２、および／または第３のマトリクスは、生体適合材料を含む。生体適合材料は、生分解性材料を含んでもよい。
【０１３８】
他の一態様において、足場は、異なる形状または構成を有する部分で構成される。一実施形態において、足場は、ともに噛合したときに第１の第１の冠形状を形成する、それぞれ、頂部部品、前部部品、および側部部品に対応する、第１、第２、および第３のポリマーマトリクスを含んでもよい。別の実施形態において、前部部品および側部部品は、それぞれ、第１の縁と、第２の縁とを備えてもよい。前部部品の第１の縁は、側部部品の第１の縁に接合されてもよい。前部部品の第２の縁は、側部部品の第２の縁に接合されてもよい。他の一実施形態において、第１の縁は縫い目によって接合されてもよく、および／または第２の縁は、縫い目によって接合されてもよい。他の実施態様において、前部部品は、第１の縁と、第２の縁とを有する、切り欠きを含んでもよい。第１および第２の縁は、例えば縫い目によって接合されてもよい。別の実施形態において、頂部部品は、第１の縁を有してもよく、側部部品は、第３の縁を有し、前部部品は、第３の縁を有する。頂部部品の第１の第１の縁は、側部部品の第３の縁に接合されてもよく、および／または頂部部品の第１の縁は、前部部品の第３の縁に接合されてもよい。第１および第３の縁は、縫い目によって接合されてもよい。別の実施形態において、各切り欠きは、第１の縁および第２の縁を有してもよい。これらの縁は、例えば縫い目によって接合されてもよい。他の実施態様において、側部部品は、少なくとも１つのフラップを含んでもよい。
【０１３９】
全ての実施形態において、足場の個々のマトリクスまたは全てのマトリクスは、生分解性材料を含んでもよい。材料は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ならびにグリコール酸および乳酸の共重合体から成る群から選択されてもよい。他の実施態様において、１つもしくは複数のマトリクスは、ポリグリコール酸と、グリコール酸および乳酸の共重合体とを含む。
【０１４０】
一実施形態において、管腔臓器は、管状または中空の臓器である。臓器は、尿生殖器であってもよい。別の実施形態において、尿生殖器は、膀胱、尿管、および尿道から成る群から選択される。他の一実施形態において、尿生殖器は、膀胱または膀胱切片である。いくつかの実施形態において、使用される足場は、天然膀胱組織の順応性を呈する、再生された膀胱組織をインビボで形成するように構成または適合される。
【０１４１】
一実施形態において、沈着された細胞を伴う噛合したマトリクスは、移植可能な構築体を形成する。別の実施形態において、少なくとも第１の細胞集団は、本明細書で説明される筋肉細胞集団を備える。筋肉集団は、平滑筋細胞集団であってもよい。
【０１４２】
別の実施形態において、足場は、第１のマトリクスの第１の表面、第２のマトリクスの第１の表面、または双方の上もしくは中に沈着される、少なくとも第１の細胞集団を有してもよい。他の一実施形態において、足場は、第１のマトリクスの第２の表面、第２のマトリクスの第２の表面、または双方の上もしくは中に沈着される、第２の細胞集団をさらに含んでもよい。細胞の第２の集団は、尿路上皮細胞を含む。
【０１４３】
本明細書で説明される増大および置換足場、ならびにその作製および使用方法は、Ｂｅｒｔｒａｍ他の米国特許出願公開第２００７０２７６５０７号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）でさらに説明される。
【０１４４】
Ｂ．尿路導管足場
本発明は、細胞を播種することができ、かつ被検体の尿路変向の構築における胃腸組織の置換として使用することができる、新尿路変向または導管足場を提供する。例えば、本明細書で説明される新尿路変向は、別の場合であれば回腸ループ変向を受ける患者の治療のための根治的膀胱切除の後に、適用してもよい。
【０１４５】
一態様において、本発明は、本明細書で説明される方法によって形成される、必要としている被検体における尿路変向として使用するのに適切である、導管足場またはマトリクスを企図する。導管足場の一端は、１つ以上の尿管に接続されてもよく、他端は、被検体の体外にある尿貯留部に接続されてもよい。一実施形態において、導管は、ストーマを介して患者の体外に出る。別の実施形態において、ポリマーマトリクスは、管状形で提供される、第１の移植可能で、生体適合性である、合成ポリマーマトリクスまたは足場を備える。いくつかの実施形態において、管状の足場は、被検体の尿管に接続するように構成される、第１の端部を備える。別の実施形態において、第１の足場は、被検体のストーマまたは括約筋を形成するように構成される、第２の端部をさらに含む。別の実施形態において、第１の足場は、少なくとも１つの尿管に接続するように構成される、少なくとも１つの側部開口部をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１の足場は、第１の尿管に取り付けるように構成される、第１の側部開口部と、第２の尿管に取り付けるように構成される第２の側部開口部とを含む。
【０１４６】
一態様において、足場は、被検体における尿管の一方または両方の取り付けに関して柔軟であるように設計される。一実施形態において、足場は、管状構造の側部上に尿管を取り付けるための、１つ以上の開口部を有してもよい。別の実施形態において、足場は、尿管を取り付けるための、開口部を管状構造の一端に有してもよい。取り付けられる尿管の端部と足場の端部との間の距離が、尿管の端部と足場の側部との距離よりも短い場合、側部ではなく構造の一端への尿管の取り付けは、尿管に対してより少ない張力を提示し得る。
【０１４７】
一態様において、管状導管足場は、一方または両方の尿管から管状の足場を通って最後に受容体の外に出る尿の流出端としての役割を果たす、管の一端を備える。一実施形態において、足場の流出端は、受容体の腹部空洞の壁で終了するように構成される。図１１Ｂ（パネルＡ）は、足場のための例示的な構成を例証する。
【０１４８】
別の実施形態において、足場の流出端は、腹壁を通って延在して（すなわち、経腹腔的であり）、皮膚の皮下層に直接接続する（すなわち、経皮的である）ように構成される。図１１Ｂ（パネルＢ）は、足場のための例示的な構成を例証する。
【０１４９】
当業者は、異なる構成が、受容体の腹腔の特定の寸法に依存することを理解するであろう。
【０１５０】
他の一実施形態において、管状構造は、均一な縁を備える第１の端部と、不均一または不均等な縁を備える第２の端部とを備える。不均一な縁は、基部から半径方向に延在する多数の花弁を伴う円形の基部を含んでもよい。花弁の数は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つであってもよい。不均等な縁は、例えば図３に示されているもの等の、一連の花弁を備えてもよい。一実施形態において、管状構造は、必要としている患者の尿路変向系または導管として使用するのに適切な形態を有する。別の実施形態において、この系は、例えば尿管造瘻術等の場合に、尿を１つ以上の尿管から腹壁断片に分流する。他の実施態様において、この系は、例えば膀胱造瘻術等の場合に、尿を膀胱から腹壁断片まで分流する。他の一実施形態において、この系は、膀胱を尿道に接続する。さらに別の実施形態において、第１の系は、１つ以上の尿管から腹壁断片に尿を分流してもよく、第２の系は、膀胱から腹壁断片に尿を分流してもよい。全ての実施形態において、この系は、例えばストーマの形成時等に、１つ以上の尿管から腹壁断片に尿を分流してもよい。
【０１５１】
別の実施形態において、管状マトリクスまたは足場は、尿路変向または導管足場である。
【０１５２】
一実施形態において、尿路変向系の管状構造は、長方形、円形、または三角形の断面である。図３Ａは、本明細書で企図される、異なる断面構成の一部を例証する。
【０１５３】
別の実施形態において、管状構造は、移植後に開存したままにするのに十分な剛性を保持する。他の一実施形態において、管状構造の剛性は、その管腔におけるカテーテルの使用を伴って、または伴わずに保持される。カテーテルが使用される場合に、それは、付加的な開存性を提供するために、管状構造の管腔空間の中に配置することができる。
【０１５４】
他の一実施形態において、導管足場は、第１の足場の第１の端部を尿管に接続するように構成される、円形または卵形接続具の形態の第２の足場をさらに含んでもよい。さらに別の実施形態において、導管足場は、ストーマを被検体に作成するために、第１の管状の足場の第２の端部を伴うストーマまたは括約筋を形成するように構成される、ワッシャリングの形態の第３の足場をさらに含んでもよい。図３Ｂは、尿路変向構築体の変形例を例証する（Ａ：開いた卵形状、Ｂ：開いた卵形状レセプタクル、Ｃ：閉じた卵形状レセプタクルおよび３つの管）。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、管状構造は、禁制ストーマまたは括約筋を作成するための吻合を達成するために、組織、臓器、または体の部分に接続するためのワッシャ構造を含んでもよい。別の実施形態において、ワッシャは、約１ｍｍ未満、約１．５ｍｍ未満、約２ｍｍ未満、約２．５ｍｍ未満、約３ｍｍ未満、約３．５ｍｍ未満、約４ｍｍ未満、約４．５ｍｍ未満、または約５ｍｍ未満の厚さで提供される。
【０１５６】
一実施形態において、尿路変向または導管足場は、図３に示される構成に成形される。
【０１５７】
他の一実施形態において、管状構造は、均一な縁を備える第１の端部と、不均一または不均等な縁を備える第２の端部とを備える。不均一な縁は、例えば被検体への外部ストーマの形成時等に、被検体の外部領域に取り付けるために構成される、１つ以上の締結具を含んでもよい。一実施形態において、管状構造の第１および第２の端部は、図３で例証される形態であってもよい。締結具の数は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つであってもよい。
【０１５８】
別の実施形態において、管状の足場は、図２７で表される形態である。
【０１５９】
図４Ａは、ヒト尿路系の通常の解剖学的構造の一部を表す。
【０１６０】
一実施形態において、管状構造は、必要としている患者における尿路変向または導管として使用するのに適切な形態を有する。別の実施形態において、導管は、例えば尿管造瘻術等の場合に、１つ以上の尿管から腹壁断片に尿を分流する（図４Ｄ）。他の実施態様において、導管は、例えば 膀胱造瘻術等の場合に、膀胱から腹壁断片に尿を分流する（図４Ｂ）。他の一実施形態において、導管は、膀胱を尿道に接続する（図４Ｄ）。さらに別の実施形態において、第１の導管は、１つ以上の尿管から腹壁断片に尿を分流してもよく、第２の導管は、尿を膀胱から腹壁断片まで分流してもよい。全ての実施形態において、導管は、１つ以上の尿管から腹壁断片に尿を分流してもよい（図４Ｂ）。全ての実施形態において、導管は、ストーマを形成するように構成されてもよい。
【０１６１】
一実施形態において、尿路変向または導管足場の管状構造は、長方形、円形、または三角形の断面である。別の実施形態において、管状構造は、移植後に開存したままにするのに十分な剛性を保持する。他の一実施形態において、管状構造の剛性は、その管腔におけるカテーテルの使用を伴って、または伴わずに保持される。いくつかの実施形態において、尿路変向足場は、移植したときに管状構造の管腔空間の中に配置するように構成される、カテーテルをさらに含む。一実施形態において、カテーテルは、フォーリー様のバルーンカテーテルである。カテーテルを使用する場合は、それを管状構造の管腔空間の中に配置して、付加的な開存性を提供することができる。当業者は、当技術分野で知られている他のカテーテルが、本発明とともに使用するのに適切であり得ることを理解するであろう。
【０１６２】
別の実施形態において、足場の管状壁の厚さは、約２ｍｍ未満、約２．５ｍｍ未満、約３．５ｍｍ未満、約４ｍｍ未満、約４．５ｍｍ未満、約５ｍｍ未満、約５．５ｍｍ未満、または約６ｍｍ未満である。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、足場は、可変の外径および内径を有してもよい。一実施形態において、足場の端部は、広がっていても、広がっていなくても、密閉されていても、または丸くてもよい。
【０１６４】
他の実施態様において、足場は、尿に対して透過性である。一実施形態において、足場の孔サイズは、約０ミクロン超〜約５００ミクロンである。別の実施形態において、孔サイズは、約１００ミクロン〜約２００ミクロンである。別の実施形態において、孔サイズは、約１５０ミクロン〜約２００ミクロンである。他の実施態様において、孔サイズは、約１００ミクロン、約１１０ミクロン、約１２０ミクロン、約１３０ミクロン、約１４０ミクロン、約１５０ミクロン、約１６０ミクロン、約１７０ミクロン、約１８０ミクロン、約１９０ミクロン、または約２００ミクロンである。いくつかの実施形態において、孔サイズは、約１００ミクロン、約２００ミクロン、約３００ミクロン、約４００ミクロン、約５００ミクロン、または約６００ミクロンである。他の実施態様において、足場は、単一の孔サイズ分布、複数の孔サイズ分布、または孔勾配分布である、孔構造を含む。
【０１６５】
別の実施形態において、足場材料は、縫合可能であり、漏出に対して耐性を示す組織で接続を形成してもよい。
【０１６６】
他の実施態様において、管状の足場材料は、移植使用の期間の全体を通して開存性を維持し、細胞付着性および宿主組織の内方成長を支持し、かつ柔軟性を保持するように選択される。別の実施形態において、材料は、正常なインビボの流体循環中に晒される圧力を超える、破裂強度を有する。他の実施態様において、材料は、宿主組織の内方成長に相応する分解時間を有する。
【０１６７】
本明細書で説明される導管足場、ならびにその作製および使用方法は、Ｌｕｄｌｏｗ他の米国特許出願公開第２０１００１３１０７５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）でさらに説明されている。
【０１６８】
Ｃ．筋肉等価物
一態様において、本発明のポリマーマトリクスまたは足場は、筋肉等価足場である。一実施形態において、筋肉等価足場は、排尿筋等価足場である。別の実施形態において、足場は、腹腔鏡の移植に適切である。
【０１６９】
一態様において、ポリマーマトリクスは、治療を必要としている組織または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形され、かつ腹腔鏡的に移植するのに十分なサイズのポリマーマトリクスまたは足場を備える。特定の実施形態において、本発明のポリマーマトリクスまたは足場は、長さが約３〜約２０ｃｍの間である。一実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、最大長さが約２０ｃｍである。別の実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、最大長さが約１５ｃｍである。別の実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、最大長さが約１０ｃｍである。別の実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、最大長さが約８ｃｍである。別の実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、最大長さが約４ｃｍである。さらに別の実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、最大長さが約３ｃｍである。特定の実施形態において、本発明のポリマーマトリクスまたは足場は、幅が約１〜約８ｃｍの間である。いくつかの実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、最大幅が約４ｃｍである。他の実施態様において、ポリマーマトリクスまたは足場は、最大幅が約３ｃｍである。さらに他の実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、最大幅が約５ｃｍである。
【０１７０】
一実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、３次元（３Ｄ）形状を有する。別の実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、平坦形状を有する。一実施形態において、平坦形状のポリマーマトリクスまたは足場は、より高い柔軟性を可能にするために、前処理領域を備える。特定の実施形態において、前処理領域は、折り目が付く領域が被覆される。一実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、腹腔鏡管および／またはポートを通して移植するために、丸め、折り畳み、別様には成形に対して十分に順応性がある。そのような実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、腹腔鏡管および／またはポートを通して移植した後に、広げる、展開する、別様には形状に戻すことに対して十分に順応性がある。一実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、腹腔鏡管および／またはポートを通して移植する前に、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の帯に切断される。特定の実施形態において、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の帯は、腹腔鏡管および／またはポートを通して移植する前に噛合される。２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の帯は、接着剤、留め金、縫合糸、または当業者に知られている他の手法を使用して噛合されてもよい。このような実施形態において、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の噛合した帯は、腹腔鏡管および／またはポートを通過するように折り畳まれ、および／または積み重ねられる。このような実施形態において、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の帯は、腹腔鏡管および／またはポートを通して挿入した後に開かれる、および／または積み重ね解除される。いくつかの実施形態において、以前に配置した噛合手段は、腹腔鏡管および／またはポートを通して挿入した後に、必要に応じて締める。
【０１７１】
一実施形態において、ポリマーマトリクスは、パッチの形態または帯の形態で提供される、第１の移植可能な、生体適合性である、合成もしくは天然のポリマーマトリクスまたは足場を備える。一実施形態において、パッチは、必要としている患者の膀胱に相当する排尿筋として使用するのに適切な形態を有する。他の一実施形態において、パッチは、必要としている患者の既存の膀胱の容積容量を増加させるのに適切な形態を有する。特定の実施形態において、パッチは、膀胱サイズを約５０ｍＬ〜約５００ｍＬの間で増加させる。いくつかの実施形態において、パッチは、膀胱サイズを５０ｍＬ単位で増加させる。いくつかの実施形態において、パッチは、膀胱サイズを約４５０ｍＬに増加させる。一実施形態において、３０ｃｍ２の表面積の増加は、２００ｍＬの膀胱の容積を２５０ｍＬまで増加させる。別の実施形態において、２５ｃｍ２の増加は、３５０ｍＬの膀胱の容積を４００ｍＬまで増加させる。一実施形態において、足場は、約３０ｃｍ２の２次元表面積を有する。別の実施形態において、足場は、約２５ｃｍ２の２次元表面積を有する。一実施形態において、パッチは、帯、円盤、正方形、楕円面、または任意の他の適切な構成の形態である。他の実施態様において、パッチは、例えばアコーディオンのような、予め折り畳んだ形態で提供される。
【０１７２】
図５Ａ〜Ｂは、筋肉等価足場またはポリマーマトリクスの実施例を示す。一実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、二重ウェッジ形状（例えば、図５Ａに示される形状）である。別の実施形態において、ポリマーマトリクスは、図６〜９に示される構成のうちの１つに成形される。図９Ｄにおいて、折り目は、インプラントが１２ｍｍの管を通過することを可能にする。
【０１７３】
全ての実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、膀胱およびマトリクスまたは足場への張力を最小化するように成形される。
【０１７４】
別の実施形態において、ポリマーマトリクスは、パッチの形態または帯の形態で提供される、第１の移植可能な、生体適合性である、合成もしくは天然のポリマーマトリクスまたは足場を備える。一実施形態において、パッチは、必要としている患者の膀胱に相当する排尿筋として使用するのに適切な形態を有する。他の一実施形態において、パッチは、必要としている患者の既存の膀胱の容積容量を増加させるのに適切な形態を有する。いくつかの実施形態において、パッチは、５０ｍＬ単位で膀胱サイズを増加させる。一実施形態において、パッチは、帯、円盤、正方形、楕円面、または任意の他の適切な構成の形態である。他の実施態様において、パッチは、例えばアコーディオンのような、予め折り畳んだ形態で提供される。
【０１７５】
一実施形態において、ポリマーマトリクスは、図１〜９に示される構成のうちの１つに成形される。
【０１７６】
別の実施形態において、ポリマーマトリクスは、図１０〜１３に示される構成のうちの１つに従って、必要としている被検体に埋め込まれる。
【０１７７】
全ての実施形態において、これらのマトリクスまたは足場に使用される生体適合材料は、例えば、生分解性である。全ての実施形態において、生体適合材料は、ポリグリコール酸であってもよい。全ての実施形態において、ポリマーマトリクスまたは足場は、生体適合性および生分解性の形状設定材料で被覆される。一実施形態において、形状設定材料は、液体共重合体を含んでもよい。別の実施形態において、液体コポリマーは、液化ラクチド／グリコリド共重合体を含んでもよい。一実施形態において、液体コポリマーは、ポリ−ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリドを含んでもよい。
【０１７８】
本明細書で説明される筋肉等価足場は、ならびにその作製および使用方法は、Ｌｕｄｌｏｗ他の米国特許出願公開第２０１００１３１０７５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）でさらに説明されている。
【０１７９】
５．構築体
一態様において、本発明は、少なくとも１つの細胞集団が播種される、１つ以上のポリマー足場またはマトリクスを提供する。細胞集団を播種したそのような足場は、本明細書において「構築体」と称される場合がある。一実施形態において、細胞播種した１つもしくは複数のポリマーマトリクスは、膀胱置換構築体、膀胱増大構築体、膀胱導管構築体、および排尿筋等価構築体から成る群から選択される、新膀胱構築体を形成する。
【０１８０】
当業者は、本明細書で説明される１つ以上の細胞集団の播種または沈着が、当技術分野で知られている種々の方法によって達成されてもよいことを理解するであろう。例えば、生物反応器によるインキュベーションおよび培養（Ｂｅｒｔｒａｍ他の米国特許出願公開第２００７０２７６５０７号、ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ他の米国特許第７，１１２，２１８号、Ａｕｇｅｒ他の米国特許第５，６１８，７１８号、Ｎｉｋｌａｓｏｎ他の米国特許第６，５３７，５６７号）、圧力誘発播種（Ｔｏｒｉｇｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１６（７）：７２９−３９、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｍａｙ，２７（１３）：２７３８−４６）、および静電播種（Ｂｏｗｌｉｎ他の米国特許第５，７２３，３２４号）を使用してもよい。加えて、電気紡糸繊維を細胞のエアロゾルと同時に被覆する最近の手法は、播種または沈着（Ｓｔａｎｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２８：２７３８−２７４６）に適切であり得る。
【０１８１】
一実施形態において、細胞の沈着は、足場を、細胞付着性強化タンパク質と接触させるステップを含む。別の実施形態において、強化タンパク質は、フィブロネクチン、コラーゲン、およびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）のうちの１つ以上である。他の一実施形態において、足場は、細胞付着性強化タンパク質を含まない。別の実施形態において、細胞の沈着は、足場を細胞集団と接触させた後に培養するステップを含む。さらに別の実施形態において、培養は、生物反応器の拍動流および／または定常流による調整を含んでもよい。
【０１８２】
本明細書で説明されるように腹膜組織から単離した平滑筋細胞集団は、次いで、本明細書で説明される足場に播種してもよい。腹膜組織は、網組織であってもよい。
【０１８３】
以下は、網由来の平滑筋細胞を足場に播種するためのプロトコルの代表例である。網由来の平滑筋細胞は、足場に播種するために必要な細胞の数を発生させるために、数週間（例えば、最高で７週間）にわたって拡大させてもよい。足場に播種するのに適切な細胞の密度を下記で説明する。網由来の平滑筋細胞は、構築体を産生するように足場に播種するための細胞を収穫する前に、多数の継代にわたって拡大されてもよい。細胞播種のための足場を調製するために、適切な材料（例えば、ＰＧＡフェルト）を、あるサイズに切断し、適切な形状に縫合し、材料（例えば、ＰＬＧＡ）で被覆してもよい。足場は、次いで、適切な方法（例えば、酸化エチレン）を使用して殺菌してもよい。細胞播種の前日に、殺菌した足場を、６０％のエタノール／４０％のＤＰＢ、１００％のＤＰＢ、Ｄ−ＭＥＭ／１０％のＦＢＳもしくはα−ＭＥＭ／１０％のＦＢＳでの飽和によって連続的に予湿潤し、その後に、一晩室温で、Ｄ−ＭＥＭ／１０％のＦＢＳもしくはα−ＭＥＭ／１０％のＦＢＳでのインキュベーションを続けてもよい。足場は、次いで、網由来の平滑筋細胞を播種し、播種した構築体を、被検体に移植する（例えば、７日目）まで、５％のＣＯ２で、加湿した３７℃の恒温器の中で成熟させることができる。当業者は、足場への細胞の播種および細胞の播種のための足場を調製するためのさらなる方法を理解するであろう。
【０１８４】
一態様において、本発明は、腹膜由来の平滑筋細胞を有する構築体を調製する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、ａ）ヒトの腹膜組織試料を得るステップと、ｂ）平滑筋細胞集団を試料から単離するステップと、ｃ）細胞集団を培養するステップと、ｄ）細胞集団を成形したポリマーマトリクス細胞構築体と接触させるステップとを含む。ヒトの腹膜組織試料は、自己源または非自己源から得てもよい。ヒトの腹膜組織試料は、網組織であってもよい。他の一実施形態において、本方法は、平滑筋細胞マーカーの発現を検出するステップをさらに含む。別の実施形態において、発現は、ｍＲＮＡ発現である。さらなる実施形態において、発現は、ポリペプチド発現である。一実施形態において、ポリペプチド発現は、細胞内免疫蛍光によって検出される。
【０１８５】
一実施形態において、足場は、本明細書で説明される細胞集団を含む。別の実施形態において、足場は、本質的に、本明細書で説明される細胞集団から成る。他の一実施形態において、足場は、本明細書で説明される細胞集団から成る。
【０１８６】
第１のポリマーマトリクスもしくは第２のポリマーマトリクスは、またはどちらも（該当する場合）、マトリクスまたは足場および細胞の構築体を構成するために、第１のポリマーマトリクスの第１の表面、第２のポリマーマトリクスの第１の表面、または双方の上もしくは中に沈着される、少なくとも１つの細胞集団を含み、少なくとも１つの細胞集団は、実質的に、筋肉細胞集団を含む。筋肉細胞集団は、例えば、平滑筋細胞集団である。好ましい実施形態において、第１の表面および第２の表面は、それぞれ、第１および第２のポリマーマトリクスの外面である。
【０１８７】
別の実施形態において、マトリクスおよび細胞を含む構築体は、いかなる他の細胞集団も含まない。好ましい実施形態において、構築体は、尿路上皮細胞を含まない。
【０１８８】
これらの構築体は、必要としている被検体に膀胱、尿管、および尿道を含む尿生殖器等の管腔臓器または組織構造を提供するために使用される。被検体は、そのような臓器または組織の再構築、修復、増大、または置換を必要とし得る。一実施形態において、管腔臓器または組織構造は、膀胱またはその一部分であり、ポリマーマトリクスまたは足場は、マトリクスの表面に沈着される平滑筋細胞を有する。構築体は、尿路変向もしくは導管、または排尿筋等価物を提供するために使用されてもよい。
【０１８９】
一態様において、本発明は、本明細書で説明される細胞集団を播種した、尿路変向または導管の足場またはマトリクスを提供する。細胞集団を播種した、そのような足場は、本明細書で「構築体」と称される場合がある。一実施形態において、尿路変向または膀胱導管構築体は、本明細書で説明される１つ以上の足場、および本明細書で説明される１つ以上の足場の上に沈着される細胞集団で構成される。
【０１９０】
一態様において、本発明は、尿路変向構築体、ならびにその作製および使用方法を提供する。一実施形態において、尿路変向は、被検体における障害のある膀胱のためのものであり、（ａ）腹壁断片に接続するように構成される第１の端部、第２の閉じた端部、および第１の尿管に接続するように構成される少なくとも第１の側部開口部を有する管状の足場を備える、第１の移植可能な生体適合性構築体と、（ｂ）足場の表面の上または中に沈着される、腹膜由来の細胞集団とを含む。別の実施形態において、尿路変向は、被検体における障害のある膀胱のためのものであり、（ａ）被検体の腹壁の開口部に接続するように構成される第１の端部、第２の閉じた端部、および第１の尿管に接続して、第１の尿管から管状の足場の内部への尿の通過を可能にするように適合される少なくとも第１の側部開口部を備える、尿の一時的貯蔵および通過のために適合される、移植可能な生体適合性の管状の足場と、（ｂ）足場の表面の上または中に沈着される、腹膜由来の細胞集団とを含む。
【０１９１】
一実施形態において、本発明は、必要としている被検体における障害のある膀胱のための尿路変向構築体を調製する方法を提供し、ａ）腹壁断片に接触するように構成される第１の端部、第２の閉じた端部、および第１の尿管に接続するように構成される少なくとも第１の側部開口部を有する管状の足場を備える、第１の移植可能な生体適合性足場を提供するステップと、ｂ）尿路変向構築体を形成するために、足場の第１の領域の上または中に腹膜由来の細胞集団を沈着させるステップとを含む。別の実施形態において、本方法は、ａ）被検体の腹壁の開口部に接続するように構成される第１の端部、第２の閉じた端部、および第１の尿管に接続して、第１の尿管から管状の足場の内部への尿の通過を可能にするように適合される少なくとも第１の側部開口部を備える、尿の一時的貯蔵および通過のために適合される、移植可能な生体適合性の管状の足場を提供するステップと、ｂ）尿路変向構築体を形成するために、足場の表面の上または中に腹膜由来の細胞集団を沈着させるステップとを含む。
【０１９２】
一態様において、本発明は、例えば膀胱を含む尿生殖器等の既存の管腔臓器または組織構造を高めるために使用されてもよい筋肉等価構築体を、必要としている被検体に提供する。被検体は、そのような臓器または組織の拡張または治療を必要とし得る。一実施形態において、管腔臓器または組織構造は、膀胱またはその一部分であり、ポリマーマトリクスまたは足場は、マトリクスの表面に沈着される平滑筋細胞を有する。一実施形態において、構築体は、排尿筋等価物を提供するために使用される。
【０１９３】
当業者は、細胞集団をマトリクスまたは足場に沈着するための複数の適切な方法がことを理解するであろう。
【０１９４】
一態様において、構築体は、新しい臓器または組織構造を必要とする被検体への移植に適切である。一実施形態において、構築体は、サイトカインＭＣＰ−１を産生する、細胞の集団を含む。別の実施形態において、ＭＣＰ−１は、被検体または受容体の天然の間葉系幹細胞の移植部位への移動を誘発する。一実施形態において、移動する受容体の天然の間葉系幹細胞は、新しい臓器または組織構造の再生を援助する。
【０１９５】
他の一態様において、本発明は、特定の細胞密度で細胞を播種した足場を提供する。一実施形態において、足場には、約２０×１０６〜約３０×１０６個の細胞の細胞密度で、平滑筋細胞集団を播種する。別の実施形態において、細胞密度は、約１×１０６〜約４０×１０６個、約１×１０６〜約３０×１０６個、約１×１０６〜約２０×１０６個、約１×１０６〜約１０×１０６個、または約１×１０６〜約５×１０６個である。
【０１９６】
さらなる実施形態において、細胞密度は、約２０×１０６〜約９８×１０６個の細胞である。さらなる実施形態において、細胞密度は、約２１×１０６〜約９７×１０６個、約２２×１０６〜約９５×１０６個、約２３×１０６〜約９３×１０６個、約２４×１０６〜約９１×１０６個、約２５×１０６〜約８９×１０６個、約２６×１０６〜約８７×１０６個、約２８×１０６〜約８５×１０６個、約２９×１０６〜約８３×１０６個、約３０×１０６〜約８０×１０６個、約３５×１０６〜約７５×１０６個、約４０×１０６〜約７０×１０６個、約４５×１０６〜約６５×１０６個、または約５０×１０６〜約６０×１０６個である。好ましい実施形態において、細胞密度は、約２４×１０６〜約９１×１０６個の細胞である。
【０１９７】
別の実施形態において、細胞密度は、約２．５×１０６〜約４０×１０６個、約５×１０６〜約４０×１０６個、約７．５×１０６〜約３５×１０６個、約１０×１０６〜約３０×１０６個、約１５×１０６〜約２５×１０６個、および約１７．５×１０６〜約２２．５×１０６個である。別の実施形態において、細胞密度は、約１×１０６個、約２×１０６個、約３×１０６個、約４×１０６個、約５×１０６個、約６×１０６個、約７×１０６個、約８×１０６個、約９×１０６個、約１０×１０６個、約１１×１０６個、約１２×１０６個、約１３×１０６個、約１４×１０６個、約１５×１０６個、約１６×１０６個、約１７×１０６個、約１８×１０６個、約１９×１０６個、約２０×１０６個、約２１×１０６個、約２２×１０６個、約２３×１０６個、約２４×１０６個、約２５×１０６個、約２６×１０６個、約２７×１０６個、約２８×１０６個、約２９×１０６個、約３０×１０６個、約３１×１０６個、約３２×１０６個、約３３×１０６個、約３４×１０６個、約３５×１０６個、約３６×１０６個、約３７×１０６個、約３８×１０６個、約３９×１０６個、約４０×１０６個、約４１×１０６個、約４２×１０６個、約４３×１０６個、約４４×１０６個、約４５×１０６個、約４６×１０６個、約４７×１０６個、約４８×１０６個、約４９×１０６個、約５０×１０６個、約５１×１０６個、約５２×１０６個、約５３×１０６個、約５４×１０６個、約５５×１０６個、約５６×１０６個、約５７×１０６個、約５８×１０６個、約５９×１０６個、約６０×１０６個、約６１×１０６個、約６２×１０６個、約６３×１０６個、約６４×１０６個、約６５×１０６個、約６６×１０６個、約６７×１０６個、約６８×１０６個、約６９×１０６個、約７０×１０６個、約７１×１０６個、約７２×１０６個、約７３×１０６個、約７４×１０６個、約７５×１０６個、約７６×１０６個、約７７×１０６個、約７８×１０６個、約７９×１０６個、約８０×１０６個、約８１×１０６個、約８２×１０６個、約８３×１０６個、約８４×１０６個、約８５×１０６個、約８６×１０６個、約８７×１０６個、約８８×１０６個、約８９×１０６個、約９０×１０６個、約９１×１０６個、約９２×１０６個、約９３×１０６個、約９４×１０６個、約９５×１０６個、約９６×１０６個、約９７×１０６個、約９８×１０６個、または約９９×１０６個である。
【０１９８】
さらなる態様において、本発明は、足場１ｃｍ２あたり特定の細胞密度で細胞を播種した足場を提供する。一実施形態において、密度は、約３，０００細胞／ｃｍ２〜約１５，０００細胞／ｃｍ２、約３，５００細胞／ｃｍ２〜約１４，５００細胞／ｃｍ２、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１４，０００細胞／ｃｍ２、約４，５００細胞／ｃｍ２〜約１３，５００細胞／ｃｍ２、約５，０００細胞／ｃｍ２〜約１３，０００細胞／ｃｍ２、約４，５００細胞／ｃｍ２〜約１３，５００細胞／ｃｍ２、約５，０００細胞／ｃｍ２〜約１３，０００細胞／ｃｍ２、約５，５００細胞／ｃｍ２〜約１２，５００細胞／ｃｍ２、約６，０００細胞／ｃｍ２〜約１２，０００細胞／ｃｍ２、約６，５００細胞／ｃｍ２〜約１１，５００細胞／ｃｍ２、約７，０００細胞／ｃｍ２〜約１１，０００細胞／ｃｍ２、約７，５００細胞／ｃｍ２〜約１０，５００細胞／ｃｍ２、約８，０００細胞／ｃｍ２〜約１０，０００細胞／ｃｍ２、約７，５００細胞／ｃｍ２〜約９，５００細胞／ｃｍ２、または約８，０００細胞／ｃｍ２〜約９，０００細胞／ｃｍ２である。好ましい実施形態において、密度は、約３，０００細胞／ｃｍ２〜約７，０００細胞／ｃｍ２、または約９，０００細胞／ｃｍ２〜約１５，０００細胞／ｃｍ２である。
【０１９９】
一態様において、本発明の構築体は、移植後に、特定の特徴を被検体に提供するように適合される。一実施形態において、構築体は、移植後に、再生を被検体に提供するように適合される。別の実施形態において、構築体は、移植部位での被検体における再生を促進するように適合される。例えば、移植後に、再生された組織は、移植部位で構築体自体から形成され得る。別の実施形態において、構築体は、移植後に被検体に機能的属性を与え得る。例えば、尿路変向構築体は、第１の尿管（例えば、第１の側部開口部）から管状の足場への被検体の尿の通過を可能にするように適合され得、ならびに／または尿の一時的貯蔵および被検体の外への通過（例えば、管状の足場）を提供するように適合され得る。一実施形態において、尿路変向構築体は、移植したときに上皮化した粘膜を提供するように適合されてもよい。別の実施形態において、構築体は、被検体における新しい臓器または組織構造の恒常的、調節的発達を提供するように適合されてもよい。
【０２００】
６．使用方法
一態様において、本発明は、治療を必要とする被検体に、層状に組織化された管腔臓器または組織構造を提供するための方法を企図する。一実施形態において、被検体は、臓器または組織の再生、再構築、修復、増大、または置換を必要とし得る。一実施形態において、本方法は、臓器または組織構造を必要としている臓器または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形される、生体適合性で合成または天然のポリマーマトリクスを提供するステップを含む。提供するステップの後には、再構築、修復、増大、または置換の対象である臓器または組織構造に由来しない、少なくとも１つの細胞集団を沈着させることが続いてもよい。沈着させるステップは、ポリマーマトリクス上で細胞集団を培養することを含んでもよい。細胞集団をマトリクス上に沈着させた構築体を提供した後に、所望の層状に組織化された管腔臓器または組織構造を形成するために、この構築体を患者の治療部位に移植することができる。一実施形態において、層状に組織化された管腔臓器または組織構造は、膀胱または膀胱の一部である。
【０２０１】
他の一態様において、本発明は、必要としている被検体に層状に、組織化された管腔臓器または組織構造を提供するための方法を提供する。一実施形態において、本方法は、ａ）治療を必要としている臓器または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形される、生体適合性で合成または天然のポリマーマトリクスを提供するステップと、ｂ）新しい臓器または組織構造に対応する天然の臓器または組織に由来しない細胞集団を、ポリマーマトリクスの第１の領域の上または中に沈着させるステップと、ｃ）層状に組織化された管腔臓器または組織構造の形成のために、成形したポリマーマトリクス細胞構築体を該被検体に移植するステップとを含む。他の一態様において、本発明は、必要としている被検体に新膀胱またはその一部分を提供するための方法を提供する。一実施形態において、本方法は、ａ）膀胱またはその一部分に一致するように成形される、生体適合性で合成または天然のポリマーマトリクスを提供することと、ｂ）被検体の膀胱に由来しない細胞集団をポリマーマトリクスの第１の領域の上または中に沈着させることと、ｃ）新膀胱またはその一部分の形成のために、成形したポリマーマトリクス細胞構築体を被検体に移植することとを含む。別の実施形態において、本明細書で説明される方法のステップｂ）の細胞集団は、平滑筋細胞マーカーに対して陽性である、収縮機能を有する１つ以上の腹膜由来の平滑筋細胞を含む。他の一実施形態において、細胞集団の収縮機能は、カルシウム依存性である。ＳＭＣは、網に由来してもよい。
【０２０２】
一実施形態において、本発明の方法は、脈管化を可能にするために、移植した導管構築体を、被検体の網、腸間膜、筋肉筋膜、および／または腹膜で包むステップをさらに含む。
【０２０３】
他の一態様において、本発明は、必要としている被検体における障害のある膀胱のための、尿路変向または導管を提供するための方法を提供する。一実施形態において、必要としている被検体に尿路変向を提供するための方法は、（ａ）生体適合性の導管足場を提供するステップと、（ｂ）実質的に筋肉細胞集団である第１の細胞集団を、該足場の第１の領域の上または中に沈着させるステップと、（ｃ）被検体から尿が出ることを可能にする導管を形成するために、ステップ（ｂ）の足場を該被検体に移植するステップとを含む。別の実施形態において、生体適合材料は、生分解性である。他の実施態様において、生体適合材料は、ポリグリコール酸である。さらに別の実施形態において、第１の細胞集団は、実質的に平滑筋細胞集団である。
【０２０４】
一実施形態において、本方法は、本明細書で説明される尿路変向または導管足場を提供するステップを含む。他の付加的な実施形態において、尿路変向または導管足場は、本明細書で説明されるように、第１、第２、および第３の足場等の複数の部分が提供される。別の実施形態において、本方法は、尿路変向または導管構築体を形成するために、障害のある膀胱に由来しない細胞集団を沈着させるステップをさらに含む。他の一実施形態において、沈着させるステップは、足場上で細胞集団を培養することを含んでもよい。いくつかの実施形態において、本方法は、必要としている患者に尿路変向構築体を移植するステップをさらに含む。別の実施形態において、移植は、障害のある膀胱の部位である。
【０２０５】
一実施形態において、構築体の開口端部（例えば、腹壁に接続するように構成される、第１の端部）は、ストーマまたは括約筋を形成するために、腹部または恥骨上壁を通して皮膚に吻合される（造瘻術）。別の実施形態において、カテーテルは、尿の流出を提供するために、ストーマ開口部を通して構築体の管腔に挿入される。
【０２０６】
図１０は、移植した導管構築体の構成を例証する。
【０２０７】
他の一実施形態において、本発明は、必要としている被検体における障害のある膀胱のための尿路変向を提供する方法を提供し、ａ）腹壁断片に接続するように構成される第１の端部、第２の閉じた端部、および第１の尿管に接続するように構成される少なくとも第１の側部開口部を有する管状の足場を備える、第１の移植可能な生体適合性足場を提供するステップと、ｂ）尿路変向構築体を形成するために、足場の第１の領域の上または中に腹膜由来の細胞集団を沈着させるステップと、ｃ）尿路変向の形成のために、構築体を被検体に移植するステップとを含む。別の実施形態において、本方法は、ａ）被検体の腹壁の開口部に接続するように構成される第１の端部、第２の閉じた端部、および第１の尿管に接続して、第１の尿管から管状の足場の内部への尿の通過を可能にするように適合される少なくとも第１の側部開口部を備える、尿の一時的貯蔵および通過のために適合される、移植可能な生体適合性の管状の足場を提供するステップと、ｂ）尿路変向構築体を形成するために、足場の表面の上または中に腹膜由来の細胞集団を沈着させるステップと、ｃ）尿路変向の形成のために、構築体を被検体に移植するステップとを含む。他の一実施形態において、本方法は、尿路変向構築体を被検体に移植するステップを含み、（ａ）腹壁断片に接触するように構成される第１の端部、第２の閉じた端部、および第１の尿管に接続するように構成される少なくとも第１の側部開口部を有する管状の足場を備える、第１の移植可能な生体適合性構築体と、（ｂ）尿路変向の形成のために、足場の表面の上または中に沈着される、腹膜由来の細胞集団とを含む。
【０２０８】
全ての実施形態において、尿路変向足場は、第２の尿管に接続するように構成される、第２の側部開口部をさらに備えてもよい。全ての実施形態において、第１の端部は、腹壁と同一平面に位置付けられるように構成されてもよい。全ての実施形態において、第１の端部は、被検体の皮膚に縫合されるように構成されてもよい。全ての実施形態において、第１の端部は、ストーマを形成するように構成されてもよい。全ての実施形態において、ストーマは、ストーマボタンをさらに備えてもよい。全ての実施形態において、足場は、ストーマを形成するように構成される、ワッシャリングをさらに備える。全ての実施形態において、生体適合性足場は、生分解性である。全ての実施形態において、足場は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ならびにポリグリコール酸およびポリ乳酸の共重合体から成る群から選択される材料を含んでもよい。全ての実施形態において、細胞集団は、平滑筋細胞集団である。全ての実施形態において、尿路変向は、障害のある膀胱のための置換であってもよい。全ての実施形態において、尿路変向は、一時的であってもよい。全ての実施形態において、尿路変向は、永続的であってもよい。全ての実施形態において、管状の足場は、長方形の断面構成、三角形の断面構成、または円形の断面構成を有してもよい。全ての実施形態において、尿路変向は、尿路上皮細胞を含まなくてもよい。全ての実施形態において、本発明の方法は、尿路状の組織再生を特徴とする、新尿路導管を提供してもよい。全ての実施形態において、再生された組織は、尿路上皮、固有層、および平滑筋束のうちの１つ以上の存在を特徴としてもよい。全ての実施形態において、再生された組織は、尿管−導管接合部（ＵＣＪ）、導管の頭側部分、および導管の中央心房部分のうちの１つ以上で観察することができる。全ての実施形態において、再生された組織は、粘膜、粘膜下組織、および線維血管性ストローマを伴う平滑筋のうちの１つ以上存在下を特徴としてもよい。全ての実施形態において、再生された組織は、その下に平滑筋を伴う連続する尿路上皮である。全ての実施形態において、尿路導管は、移植したときに上皮化した粘膜を形成する。
【０２０９】
別の実施形態において、本発明の方法は、尿路変向構築体の移植に伴う閉塞の存在について導管を監視するステップをさらに含む。閉塞は、デトリタスの蓄積によって引き起こされ得る。本方法は、閉塞が検出された場合に、導管の管腔からデトリタスを取り除くステップをさらに含んでもよい。
【０２１０】
一態様において、本発明は、臨時的に、必要としている被検体に尿路変向を提供する。一実施形態では、一時的な尿路変向または導管構築体を被検体に埋め込んでストーマの開口部を形成し、カテーテルまたは他のデバイスをストーマを通して導管構築体の管腔に一時的に挿入する。一時的な導管は、尿が被検体を出ることを可能にする一方で、永続的な解決策を障害のある膀胱に試みるといった利点を提供する。例えば、導管構築体の移植は、細胞集団を播種した新膀胱構築体の移植前、移植後、または移植と同時に行うことが可能である（例えば、上記のＢｅｒｔｒａｍ他の特許を参照のこと）。図１１は、一時的な尿路変向構築体の移植した構成要素の実施例を示す。
【０２１１】
一実施形態において、本発明の方法は、脈管化を可能にするために、移植した尿路変向または導管構築体を、被検体の網、腸間膜、筋肉筋膜、および／または腹膜で包むステップをさらに含む。
【０２１２】
一態様において、本発明は、永続的に、必要としている被検体に尿路変向を提供する。図１２は、永続的な尿路変向構築体の移植した構成要素の実施例を示す。
【０２１３】
一実施形態において、本明細書で説明される構築体は、尿道前立腺部の置換および尿路変向に使用されてもよい。そのような手技は、根治的前立腺摘除術が必要な被検体の尿道前立腺部を取り除くために必要である。他の実施態様において、構築体は、経皮変向管が弁のようなよじれを伴う禁制管を形成するために使用されてもよい。さらなる実施態様では、構築体は、禁制チャネルまたはカテーテル挿入可能な開口部を伴う膀胱頸部手術および尿路出口で使用される、膀胱頸部のスリングおよびラッピング材料として使用されてもよい。そのような実施形態の実施例を図１３に表す。
【０２１４】
尿は、尿道口（開口部を局所的および／または上行性感染から守る特徴を組み込んだ異なる構造）を介して体を出て、女性の膣前庭および男性の舟状窩を空にする。具体的には、この領域の中の皮膚粘膜は、保護内在性ラクトバクテリアフローラのための基質を提供するグリコーゲンの豊富な細胞から成る、非角化重層扁平上皮である。また、上皮が皮膚に近づくにつれて、殺菌性化合物を分泌するマクロファージの存在を示す、酸性ホスファターゼ活性およびリゾチーム様免疫反応性と関連付けられる（Ｈｏｌｓｔｅｉｎ  ＡＦ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  ２６４：２３）。
【０２１５】
一態様において、本明細書で説明される尿路変向または新尿路導管（ＮＵＣ）構築体は、天然の尿道で観察される皮膚粘膜領域の構造的特徴を有する、尿路粘膜と皮膚上皮との間の天然様転移の形成につながり得る。転移領域は、上皮化した粘膜と称される場合がある。一実施形態において、構築体は、移植したときに上皮化した粘膜を形成するように適合される。一実施形態において、上皮化した粘膜は、前庭領域と、皮膚粘膜領域とを備える。別の実施形態において、前庭領域は、皮膚粘膜領域に隣接する。別の実施形態において、皮膚粘膜領域は、被検体の腹壁および皮膚に接続される構築体のストローマ端部に位置する。概して、自然発生する皮膚粘膜領域は、粘膜および皮膚の存在を特徴とし、一般的に、外側の皮膚が終わり、体の内部を覆う粘膜が始まる、体のオリフィスの近くに存在する。本発明の構築体および方法によって提供される上皮化した粘膜は、被検体への移植後に、尿路変向の第１の端部で発達する。さらなる実施形態において、上皮化した粘膜は、最初に前庭領域に現れて、構築体のストーマ端部に向かって、皮膚粘膜領域を通して徐々に拡大または増加する、上皮の存在を特徴とする。別の実施形態において、上皮は、上皮細胞マーカーの発現を特徴とする。さらなる実施形態において、上皮細胞マーカーは、サイトケラチンである。サイトケラチンは、サイトケラチン１〜１９が挙げられるが、これに限定されない、当技術分野で知られているサイトケラチンのうちの１つ以上であってもよい。他の一実施形態において、サイトケラチンは、ＡＥ−１／ＡＥ３抗体で検出可能である。
【０２１６】
本明細書で説明される上皮化した粘膜を形成する構築体の能力は、腹部ストーマを介して尿路変向を達成するといった主要な課題の解決策を提供する。経皮的デバイスの寿命の長さが、しばしば、出口部位感染によって妨げられることが認められている（Ｋｎａｂｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０：５０３）。カテーテル、カニューレ、プロテーゼ取り付け具、およびグルコースセンサ等の経皮デバイスは、皮膚を貫通し、その保護バリアを破壊して、細菌侵襲のための洞管を作成する（Ｉｓｅｎｈａｔｈ  ＳＮ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  ８３：９１５）。不適切な表皮治癒による産物−皮膚界面の破損、生体適合性の不足、または機械的ストレスは、さらなる障害の危険性を引き起こす可能性がある（ｖｏｎ  Ｒｅｃｕｍ  ＡＦ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ  ＪＢ．（１９８１）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｅｎｇ  ５：３７）。
【０２１７】
別の態様において、受容体の組織との相互作用を通しての尿路変向構築体は、管状の小器官を再生する。一実施形態において、構築体の受容体組織との相互作用は、経腹腔的−経皮的配置によるものである。他の一実施形態において、管状の小器官は、尿管から受容体の外部への尿の流れを可能にする。尿は、膀胱、尿道、およびストーマ（すなわち、道または開口部）に見られる天然様の機能的性質を維持しながら、受容体から流出する。皮膚粘膜接合部は、前方尿道の開口部、すなわち、ヒトの女性および男性のそれぞれ膣前庭および舟状窩で見られる接合部に似ている。これらの天然の接合部は、上行性感染に対して保護を提供し得る、湿潤−乾燥表面に重要な粘膜区域によって覆われる。これらの粘膜区域の扁平上皮は、１）グリコーゲンが豊富であり、２）分泌腺（酵素および殺菌剤を放出することが可能）であり、３）食細胞であり、また、傷ついた表面に迅速に移動することができる。
【０２１８】
拡大すべき臓器または組織への足場の移植は、実施例で説明される方法に従って、または技術的に認識された方法に従って行うことができる。マトリクスまたは足場は、標的臓器にグラフト材料を縫合することによって、被検体の臓器または組織に移植することができる。
【０２１９】
説明される手法は、治療を必要としている患者の既存の層状に組織化された管腔臓器または組織構造を拡大するために使用されてもよい。例えば、必要としている臓器または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形され、かつ治療および腹腔鏡的に移植するのに十分なサイズであるポリマーマトリクスまたは足場を提供し、該臓器または組織構造に由来しない細胞集団を該ポリマーマトリクスの第１の領域の上または中に沈着させ、そして、既存の層状に組織化された管腔臓器または組織構造が拡大されるように、該患者の該治療部位に、成形したポリマーマトリクス構築体を腹腔鏡的に移植することによって、既存の層状に組織化された管腔臓器または組織構造を拡大させてもよい。
【０２２０】
図７Ｅは、本明細書で説明した筋肉等価足場の移植のための可能な手術方法を表す。図７Ｆは、空および満杯の膀胱上の移植部位を表す。図７Ｇは、表面を切断した際に作成される楕円面を示す手術スリットを伴う膀胱モデルを表す。折り畳んだ、または巻いたポリマーマトリクスまたは足場を通過させるために、プラスチック製の管を、利用可能な限定空間のモデルとして使用してもよい。
【０２２１】
説明される手法はまた、治療を必要としている患者の膀胱の容積を増加させるために使用してもよい。例えば、必要としている臓器または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形され、かつ治療および腹腔鏡的に移植するのに十分なサイズである、生体適合性で、合成または天然のポリマーマトリクスまたは足場を提供し、該臓器または組織構造に由来しない細胞集団を該ポリマーマトリクスの第１の領域の上または中に沈着させ、そして、膀胱の容積容量が増加するように、該患者の該治療部位に、成形したポリマーマトリクス構築体を腹腔鏡的に移植することによって、膀胱の容積を増加させてもよい。一実施形態において、本発明のマトリクスまたは足場は、約５０ｍＬの膀胱の容積容量を増加させるのに適切である。他の実施態様において、本発明のマトリクスまたは足場は、約１００ｍＬの膀胱の容積容量を増加させるのに適切である。他の実施態様において、本発明のマトリクスまたは足場は、約６０、約７０、約８０、または約９０ｍＬの膀胱の容積容量を増加させるのに適切である。
【０２２２】
説明される手法はさらに、治療を必要としている患者の膀胱の切開部位を拡大するために使用されてもよい。例えば、必要としている臓器または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形され、かつ治療および腹腔鏡的に移植するのに十分なサイズである、生体適合性で、合成または天然のポリマーマトリクスまたは足場を提供し、ｂ）該臓器または組織構造に由来しない細胞集団を該ポリマーマトリクスの第１の領域の上または中に沈着させ、そして、ｃ）膀胱の切開部位が拡大するように、該患者の該治療部位に、成形したポリマーマトリクス構築体を腹腔鏡的に移植することによって、膀胱の切開部位を拡大させてもよい。
【０２２３】
本発明の別の限定的でない使用は、尿失禁の治療を必要としている患者におけるそのような治療のための方法を含む。例えば、必要としている臓器または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形され、かつ治療および腹腔鏡的に移植するのに十分なサイズである、生体適合性で、合成または天然のポリマーマトリクスまたは足場を提供し、該臓器または組織構造に由来しない細胞集団を該ポリマーマトリクスの第１の領域の上または中に沈着させ、そして、膀胱の容積容量が増加するように、該患者の該治療部位に、成形したポリマーマトリクス構築体を腹腔鏡的に移植することによって、尿失禁を治療してもよい。
【０２２４】
一実施形態において、本明細書で説明される足場、細胞集団、および方法はさらに、本明細書で説明される障害の治療における有用な薬剤の調製のために使用されてもよい。障害は、層状に組織化された管腔臓器または組織構造の再生、再構築、修復、増大、または置換を必要とする被検体のあらゆる状態を含む。別の実施形態において、臓器または組織構造は、膀胱または膀胱の一部である。
【０２２５】
別の実施形態において、移植した構築体上に沈着させた細胞は、ＭＣＰ−１を産生し、それを移植部位で放出し、天然の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を刺激して移植部位に移動する。他の一実施形態において、天然のＭＳＣは、移植部位で、移植した構築体の再生を促進および／または高める。
【０２２６】
一実施形態において、沈着させた細胞集団は、本明細書で説明される腹膜組織に由来する平滑筋細胞（ＳＭＣ）集団である。腹膜組織は、網であってもよい。別の実施形態において、ＳＭＣ集団は、収縮機能を有し、かつミオカルディン、アルファ−平滑筋アクチン、カルポニン、ミオシン重鎖、ＢＡＡＬＣ、デスミン、筋線維芽細胞抗原、ＳＭ２２、ビメンチン、およびその任意の組み合わせ等の平滑筋細胞マーカーに対して陽性である、少なくとも１つの細胞を含む。他の実施態様において、ＳＭＣ集団は、ミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）の発現を示す、少なくとも１つの細胞を含む。ＭＹＯＣＤの発現は、ＭＹＣＯＤポリペプチドまたはＭＹＯＣＤポリペプチドをコードする核酸の発現であり得る。別の実施形態において、ＳＭＣの収縮機能は、カルシウム依存性である。一実施形態において、再構築、修復、増大、または置換の対象である、層状に組織化された管腔臓器または組織構造は、膀胱または一部の膀胱である。別の実施形態において、ポリマーマトリクスは、尿路上皮細胞を含まない。
【０２２７】
全ての実施形態において、本発明の方法は、本明細書で説明されるように細胞集団を播種した、膀胱置換足場、膀胱増大足場、膀胱導管足場、または細胞集団に基づく移植のために、構築体を利用する。
【０２２８】
別の実施形態において、本明細書で説明される、層状に組織化された管腔臓器または組織構造の再生、再構築、修復、増大、または置換のための方法は、ａ）治療を必要としている管腔臓器または組織構造の少なくとも一部に一致するように成形される、生体適合性で、合成または天然のポリマーマトリクスを提供するステップと、ｂ）実質的に筋肉細胞集団である第１の細胞集団を、本明細書で説明される細胞密度で、該ポリマーマトリクスの第１の領域の上または中に沈着させるステップと、ｃ）層状に組織化された管腔臓器または組織構造の形成のために、成形したポリマーマトリクス細胞集団を被検体の治療部位に移植するステップとを含む。他の一実施形態において、インビボで形成される層状に組織化された管腔臓器または組織構造は、天然の膀胱組織の順応性を呈する。
【０２２９】
他の一態様において、本発明は、生体力学的刺激または循環に基づいて、必要としている被検体への移植後に新膀胱を再生するための方法を提供する。一態様において、本方法は、膀胱または膀胱の一部の増大または置換のために移植した、移植した新膀胱構築体の再生を促進する際に使用するのに適切である。一実施形態において、新膀胱構築体は、細胞を新膀胱マトリクスまたは足場に播種することにより形成される。別の実施形態において、新膀胱足場は、膀胱置換足場、膀胱増大足場、膀胱導管足場、または排尿筋等価足場である。
【０２３０】
一態様において、本発明の方法は、少なくとも１つの細胞集団を新膀胱足場に播種することにより形成される、移植した新膀胱に適用する。一実施形態において、細胞播種した１つもしくは複数のポリマーマトリクスは、膀胱置換足場、膀胱増大足場、膀胱導管足場、または排尿筋等価足場である。一実施形態において、少なくとも１つの細胞集団は、実質的に筋肉細胞集団を含む。別の実施形態において、筋細胞集団は、平滑筋細胞集団であってもよい。播種のための細胞の異なる密度は、本明細書で説明されるように適切であり得る。
【０２３１】
一態様において、本発明の方法は、新膀胱の移植後の異なる時間に、異なる継続期間にわたって行われる。一実施形態において、循環は、ある期間にわたって毎日、ある期間にわたって毎週、または１週間おきに行われる。別の実施形態において、毎日の循環療法の継続期間は、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間であるか、または１４週間を超える。
【０２３２】
一実施形態において、被検体のための毎日の循環プロトコルは、約１時間にわたって新膀胱を満たすステップと、満たした新膀胱を約１時間にわたって排出するステップと、新膀胱を自由に（一般的に、一晩）排出させるステップとを含んでもよい。このプロトコルは、被検体の循環療法の１日目に行うことができる。この１日の順序は、第１日目の後に連続する複数日にわたって行うことができる。一実施形態において、循環プロトコルは、１日目の後の日に行ってもよく、満たすステップの継続期間を、約２時間、約３時間、約４時間まで、または約４時間を超えて増加させる。別の実施形態において、満たすステップおよび排出するステップは、新膀胱が自由に排出することを可能にする前に、１日に１回を超えて繰り返してもよい。
【０２３３】
別の実施形態において、被検体は、移植後にカテーテルが挿入され、循環時間は、被検体のカテーテルを締め付けたり、緩めたりすることによって制御される。
【０２３４】
当業者は、付加的な循環療法が本明細書で企図されていることを理解するであろう。
【０２３５】
循環プロトコルの実施例は、以下の通りである。本明細書で説明される細胞を新膀胱マトリクスまたは足場に播種することによって形成される新膀胱構築体の移植後に、循環を、移植後約１ヶ月に開始し、約９０日まで継続して、２週間おきに（１４±２日間隔で）行う。循環は、移植した新膀胱の順応性測定等の特定の種類の評価の後だが、蛍光透視撮像等の他の種類の評価の前に完了する。循環は、順応性測定の完了後に、１０〜２５ｍＬ／分の速度で、滅菌生理食塩水（恒温器によって加温する）で膀胱を再膨張させることによって行う。循環は、少なくとも５〜１０回、繰り返される。０〜１０ｍｍＨｇの初期圧力を達成して、開始時間とともに記録する。時間、送達される等張溶液の容積、および得られる圧力は、カテーテルの周囲で漏出が観察されたとき（別称、漏出点）か、または観察された容積がちょうど行われた順応性測定の容積に等しくなったときのどちらかが先に起こったときに、各サイクルについて記録される。
【０２３６】
一実施形態において、本発明は、被検体に移植した新膀胱の再生を促進する方法を提供し、（ａ）移植した新膀胱を流体で満たすステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の満たした新膀胱を空にするステップとを含む。別の実施形態において、本方法は、ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返す、ステップ（ｃ）を含む。他の一実施形態において、本方法は、移植後の最初の２週間以内に開始される。一実施形態において、ステップ（ａ）および（ｂ）は、１日１回、週１回、または隔週に１回行われる。いくつかの他の実施態様では、満たすステップ（ａ）は、約１時間行われ、空にするステップ（ｂ）は、約１時間行われる。さらに別の実施形態において、ステップａ）およびｂ）は、少なくとも移植後約６週間までに行われる。他の一実施形態において、ステップａ）およびｂ）は、移植後約１０週間を超えて行われない。別の実施形態において、ステップａ）およびｂ）は、移植後約１０週間を超えて行われる。他の実施態様において、満たすことは、新膀胱を拡大することを含む。別の実施形態において、再生は、循環を受けなかった被検体の新膀胱と比較して、新膀胱の容量の増加を含む。他の一実施形態において、再生は、循環を受けなかった被検体の新膀胱と比較して、新膀胱の順応性の増加を含む。他の実施態様において、再生は、循環を受けなかった被検体の新膀胱と比較して、新膀胱における細胞外マトリックス発達の増加を含む。一実施形態において、細胞外マトリックス発達の増加は、エラスチン繊維の発達を含む。
【０２３７】
他の一態様において、本発明は、移植した新膀胱が受容体の要求に応答するように、哺乳動物の新膀胱の恒常的、調節的発達を提供するための方法に関する。一実施形態において、移植した新膀胱は、受容体に比例するサイズまで成長する。別の実施形態において、被検体における新膀胱の恒常的、調節的発達を提供するための方法は、（ａ）生体適合性ポリマーの足場を提供するステップと、（ｂ）実質的に筋肉細胞集団である第１の細胞集団を、該足場の第１の領域の上または中に沈着させるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の足場を該被検体に埋め込んで、恒常的、調節的発達を確立するステップとを含む。他の一実施形態において、恒常的、調節的発達は、臓器のサイズおよび構造の復元を含む。別の実施形態において、恒常的、調節的発達は、体重に比例する新膀胱容量を含む。一実施形態において、比例する新膀胱容量は、移植後約４ヵ月で達成される。別の実施形態において、被検体における新膀胱の恒常的、調節的発達を提供するための方法は、移植した新膀胱の恒常的、調節的発達または進展の状態を監視するステップを含む。監視は、移植した新膀胱の位置および形状、ならびに／または尿力学的順応性および容量を示すために、膀胱造影手技を含んでもよい。
【０２３８】
別の態様において、本発明は、新しい臓器または組織構造を移植した後の患者の予後評価のための方法を提供する。一実施形態において、本方法は、該被検体から得られる試験試料中のＭＣＰ−１の発現レベルを検出するステップと、（ｂ）対照試料（または対照基準値）と相対的なＭＣＰ−１の発現レベルに対する、試験試料中の発現レベルを判定するステップと、（ｃ）ＭＣＰ−１の発現レベルの判定に基づいて、患者の再生予後を予測するステップとを含み、試験試料中のより高いＭＣＰ−１の発現レベルは、対照試料（または対照基準値）と比較したときの、被検体における再生の予後を示す。
【０２３９】
別の態様において、本発明は、新しい臓器または組織構造を患者に移植した後の患者の予後評価のための方法を提供し、本方法は、（ａ）患者の生物学的試料を得ることと、生物学的試料中のＭＣＰ−１の発現を検出することとを含み、ＭＣＰ−１の発現は、被検体における再生の予後を示す。いくつかの実施形態において、対照試料（または対照基準値）と相対的な患者の生物学的試料中の増加したＭＣＰ−１の発現は、被検体における再生の予後を示す。いくつかの実施形態において、対照試料（または対照基準値）と相対的な患者の生物学的試料中の減少したＭＣＰ−１の発現は、被検体における再生の予後を示さない。患者試料は、血液または尿等の体液を含む試験試料であってもよい。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、判定ステップは、（ｉ）試験試料および対照中のＭＣＰ−１の発現レベルの差を測定すること、および／または（ｉｉ）試験試料および対照中のＭＣＰ−１の発現レベル差の測定から得られるデータを分析すること、といった目的に適切なプロセッサによって実行されるソフトウェアプログラムの使用を含む。適切なソフトウェアおよびプロセッサは、当技術分野でよく知られており、市販されている。プログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピーディスク、ハードドライブ、ＤＶＤ、またはプロセッサに関連付けられたメモリ等の有形媒体に記憶させたソフトウェアで具現化されても良いが、当業者は、プログラムの全体またはその一部を、代替として、プロセッサ以外のデバイスによって実行すること、ならびに／または既知の様式でファームウェアおよび／もしくは専用ハードウェアで具現化することが可能であることを容易に理解するであろう。
【０２４１】
判定ステップの後には、一般的に、例えば、測定結果、所見、診断、予測、および／または治療の推奨が記録されて、技術者、医師、および／または患者に通信される。特定の実施形態では、そのような情報を患者および／または主治医等の当事者に通信するために、コンピュータを使用する。いくつかの実施形態では、結果もしくは診断が通信される国または管轄区域と異なる国または管轄区域でアッセイが行われるか、またはアッセイの結果が分析される。
【０２４２】
好ましい実施形態において、異なるＭＣＰ−１の発現レベルを有する試験被検体で測定したＭＣＰ−１の発現レベルに基づいた予後、予測、および／または治療の推奨は、アッセイが完了した後、ならびに予後または予測が発生した後にできる限り早く被検体に通信される。結果または関連の情報は、被検体を治療する医師によって被検体に通信されてもよい。代替として、結果は、電子メールまたは電話等の書き込みの電子的通信形態を含む、任意の通信手段によって、試験被検体に直接通信されてもよい。通信は、電子メール通信等の場合には、コンピュータの使用によって容易になり得る。特定の実施形態において、予後試験の結果、ならびに／または試験から引き出される結論および／もしくは試験に基づく治療の推奨は、電気通信の分野の当業者によく知られているコンピュータハードウェアおよびソフトウェアの組み合わせを使用して、自動的に発生されて、被検体に自動的に送達されてもよい。健康管理指向の通信システムの１つの例は、米国特許第６，２８３，７６１号で説明されている。しかしながら、本発明は、この特定の通信システムを利用する方法に限定されない。本発明の方法の特定の実施形態において、試料をアッセイするステップ、再生の予後および／または予測ステップ、およびアッセイ結果もしくは診断を通信するステップを含む、本方法の全てのもしくはいくつかの工程は、種々の管轄区域（例えば、外国）で行われてもよい。
【０２４３】
別の態様において、本明細書で説明される予後方法は、移植の成功、および再生のためのリハビリテーション／治療プロトコルに関する情報を当事者に提供する。一実施形態において、本方法は、被検体から得られる試験試料中のＭＣＰ−１の発現レベルを検出するステップと、（ｂ）対照試料（または対照基準値）と相対的なＭＣＰ−１の発現レベルに対する、試験試料中の発現レベルを判定するステップと、（ｃ）ＭＣＰ−１の発現レベルの判定に基づいて、患者の再生予後を予測するステップとを含み、試験試料中のより高いＭＣＰ−１の発現レベルは、対照試料（または対照基準値）と比較したときに、新しい臓器または組織構造の再生の徴候を示す。
【０２４４】
概して、本明細書で使用される、再生予後は、本明細書で説明される構築体の移植を通した膀胱の置換または増大後の機能的膀胱の発達もしくは改善、本明細書で説明される構築体の移植後の機能的尿路変向の発達、本明細書で説明される構築体の移植後の膀胱容量の発達もしくは改善された膀胱容量、または本明細書で説明される構築体の移植後の膀胱順応性の発達もしくは改善された膀胱順応性のうちのいずれか１つの予想または予測を包含する。
【０２４５】
全ての実施形態において、本明細書で説明される、治療を必要としている被検体に、層状に組織化された管腔臓器または組織構造を提供する方法は、前述した再生の予後評価といった、移植後のステップを含んでもよい。
【０２４６】
全ての実施形態において、本発明は、必要としている被検体に、新しい臓器または組織構造を提供するための、特定の移植後の監視ステップを含む方法に関する。一実施形態において、移植した構築体の効果および性能は、移植後の異なる時間点での超音波撮像、腎盂像、ならびに尿および血液分析等を通して監視される。
【０２４７】
７．キット
本発明は、本発明のポリマーマトリクスおよび足場、および関連する材料、ならびに／または細胞培養媒体および使用説明書を備える、キットをさらに含む。使用説明書は、例えば、細胞の培養ならびに細胞および／または細胞産物の投与のための指示を含んでいてもよい。使用説明書はまた、腹腔鏡的移植のために、本発明のポリマーマトリクスおよび足場を前処理する、折り畳む、または調製するための説明を含んでもよい。
【０２４８】
一実施形態において、本発明は、本明細書で説明される足場を備えるキットおよび使用説明書を提供する。別の実施形態において、キットの足場は、膀胱増大足場、膀胱置換足場、尿路導管足場、または筋肉等価足場のうちの１つ以上である。
【０２４９】
８．報告書
本発明の方法は、市販目的で実践したときに、概して、再生予後の報告書または要約を作成する。本発明の方法は、本明細書で説明される構築体を提供するために、任意の手術手技の前後の再生の、起こり得る経過または結果の予測を含む報告書を作成する。報告書は、予後に関連する任意の指標に関する情報を含んでもよい。本発明の方法および報告書は、報告書をデータベースに記憶することをさらに含むことができる。代替として、本方法はさらに、被検体のデータベースの記録を作成することができて、データを伴う記録をポピュレートすることができる。一実施形態において、報告書は、紙の報告書であり、別の実施形態において、報告書は、聴覚的な報告書であり、別の実施形態において、報告書は、電子的な記録である。本報告書は、医師および／または患者に提供することが想定される。報告書の受信は、データおよび報告書を含むサーバコンピュータへのネットワーク接続を確立することと、サーバコンピュータからのデータおよび報告書を要求することとをさらに含むことができる。本発明によって提供される方法はまた、全体的または部分的に自動化されてもよい。
【実施例】
【０２５０】
以下の実施例は、例示目的のみのために提示されるのであって、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０２５１】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および文献の参照は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２５２】
実施例１−ＳＭＣ源としての網
平滑筋細胞は、イヌおよびブタの網から、成功裏に単離した。最初に、網由来の平滑筋細胞を、緩衝生理食塩水中で組織を洗浄することによって表面の汚染物質を取り除いて、イヌのまたはブタ網組織から単離した。次いで、図１４の図式で示すように、一連の酵素消化ステップおよび遠心分離ステップを網に受けさせて、さらに培養および特徴付けするための分離した網由来の細胞を得た。簡潔には、洗浄した網組織を、３７℃で１時間、０．１％のコラゲナーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）、およびＤＭＥＭ−ＨＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中の１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の溶液で消化させた。組織消化を補助するために、溶液を、３７℃で１時間のインキュベーション中に、速度５０および傾斜１５で、プラットフォームシェーカー上に配置した５０ｍｌの管の中で攪拌した。消化させた後に、溶液を、５分間３００×ｇで遠心分離し、次いで、網由来の細胞を含有する結果として生じるペレット化した材料を、脂肪プラグおよび他の非必須組織細片を取り除くために、ＰＢＳ１％のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁すること、および５分間３００×ｇで遠心分離してペレット化することを含む、一連のステップによって洗浄した。洗浄後、細胞を、培養地を含むＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中に再懸濁して、Ｔフラスコ上で平板培養した。培養は、生体外での拡張のためにサイトカインおよび成長因子を補充した、市販の媒体中で行った。以降の細胞通過によって適切な細胞数に到達した時に、細胞形態の観察を行い、平滑筋細胞タンパク質の免疫検出のために、アリコートを固定して処理した。比較分析のために、細胞は、Ａｔａｌａ他（Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：６０８，１９９３）、Ｃｉｌｅｎｔｏ他（Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５２：６５５，１９９４）、およびＡｔａｌａの米国特許第６，５７６，０１９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で説明されるプロトコルを使用して組織外植片を培養することによって、膀胱の平滑筋層から単離した。当業者は、細胞を単離する他の適切な方法を理解するであろう。
【０２５３】
実施例２−ＳＭＣの特徴付け
形態学。図１５は、イヌ由来およびブタ由来の網細胞の細胞形態の、イヌ由来およびブタ由来の膀胱細胞との比較を示す。イヌおよびブタの膀胱の平滑筋および網由来の細胞の細胞形態は、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中で成長させたときに、全く同じではないにしても、類似した形態が認められる。細胞は、紡錘に成形されて、伸長され、渦巻状の丘および谷形成の形跡を示す。したがって、網由来のものは、それらの形態が平滑筋細胞様であると思われる。
【０２５４】
細胞表面マーカーの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析。図１６Ａ〜Ｄは、ＦＡＣＳ分析による細胞表現型の特徴付けを例証し、イヌ由来の網細胞が、平滑筋細胞マーカーであるアルファ−アクチンおよびカルポニンに対して陽性であることを示す。簡潔には、データ点あたり０．５×１０６〜１×１０６個の細胞を、２％のパラホルムアルデヒドに付着させ、非特異的結合を防止するためにＦｃレセプタを遮断した。次いで、細胞を、製造業者によって推奨される平滑筋細胞アルファ−アクチン（ＳＭＡ）およびカルポニンに対する抗体でインキュベートした。イソタイプ対照抗体（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ）を、陰性対照として使用した。最終的な洗浄（ＰＢＳ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の後に、適切な蛍光チャネルを使用して、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  １またはＧｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｍｉｎｉ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｓｓａｙシステムを利用して、抗原検出を行った。各試料から、最小で５，０００〜１０，０００の事象が得られた。膀胱平滑筋細胞に類似して（図１６ＡおよびＢ）、網から単離した９８％を超える細胞は（図１６ＣおよびＤ）、平滑筋細胞マーカーであるアルファ−アクチンおよびカルポニンを発現する。したがって、網由来の細胞は、細胞表面マーカーに関して、膀胱から単離した平滑筋細胞と同じ表現型を有する。
【０２５５】
図１７および図１８は、平滑筋細胞マーカー、ならびに上皮および内皮抗原マーカーの双方を考察することによる、２頭の異なる動物からのイヌの網由来の細胞さらなるＦＡＣＳ光源発現分析を表す。１μｇ／ｍｌの一次および二次抗体で、網由来の細胞への染色を行った。下記表２．１で要約されるように、イヌの網由来の細胞は、平滑筋細胞マーカーに対して陽性であり、上皮および内皮細胞マーカーに対して陰性である。
【０２５６】
2013521882.tif 000003
【０２５７】
免疫蛍光分析。図１９〜図２１は、種々の平滑筋細胞マーカーの免疫蛍光分析、ならびに内皮および上皮細胞マーカーとの比較による、網および膀胱由来の平滑筋細胞の平滑筋細胞様表現型をさらに実証する。簡潔には、細胞を、２％のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で固定し、１０％のウマ血清（Ｇｉｂｃｏ）／０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）／ＤＰＢ（Ｇｉｂｃｏ）で遮断した。一次抗体を加えて、プレートを４℃で一晩インキュベートした。細胞は、２％のウマ血清／０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＤＰＢで３回洗浄し、次いで、室温で１〜３時間、１：５００希釈の二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ１およびヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ）でインキュベートした。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で対比染色した。マウスＩｇＧ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびマウスＩｇＧ２ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のイソタイプ対照を、陰性対照とした（図示せず）。画像は、Ｓｉｍｐｌｅ  ＰＣＩソフトウェアを実行して、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ４０００Ｂエピ蛍光顕微鏡で取り込んだ。
【０２５８】
図１９は、イヌの網および膀胱由来の細胞中の、カルポニン、平滑筋（ＳＭ）アルファ−アクチン、およびトランスゲリン（ＳＭ２２）の発現の免疫染色を表す。緑色の蛍光は、網由来の細胞が、膀胱平滑筋細胞が発現するのと同等のレベルで、これら３つの平滑筋特異的タンパク質を発現することを裏付ける。
【０２５９】
図２０Ａおよび図２０Ｂは、イヌの網由来の細胞が、平滑筋細胞マーカー（平滑筋アクチン、ビメンチン、ミオカルディン、およびｂａａｌｃ（脳および急性白血病細胞質タンパク質））に対して陽性であり、上皮および内皮細胞マーカー（ＵＥＡ−１およびＥｐＣａｍ）に対して陰性であることを示す、これらの細胞の免疫蛍光分析を表す。各パネルの左側は、画像領域の細胞含量を検証する対照画像である。緑色の蛍光を示す、各パネルの右側の画像は、網由来の細胞が平滑筋特定のタンパク質を発現することを裏付けている。
【０２６０】
図２１は、ブタ網由来の細胞もまた、免疫蛍光による平滑筋細胞マーカーに対して陽性であり、膀胱由来の細胞に類似していることを示す免疫染色分析を表す。この付加的な免疫蛍光データは、ブタの網およびブタの膀胱に由来するＳＭＣの中の、平滑筋アクチン、ｂａａｌｃ、ミオカルディン、およびミオシン重鎖の発現を示す。
【０２６１】
抗原マーカーの発現による細胞表現型分析の概要を下記表２．２で提供し、イヌおよびブタの網由来の細胞と、ヒトの膀胱平滑筋細胞との比較を示す。まとめると、これらのデータは、イヌの網由来の細胞（３頭の異なるイヌから抽出し、継代２代目および３代目で、３つの異なる種類の媒体中で培養した）およびブタの網由来の細胞（ＰＯＤＳ、最終継代５代目で、２つの異なる種類の媒体中で培養した）が、６つの異なる平滑筋マーカーに対して陽性であり、上皮および筋線維芽細胞マーカーに対して陰性であることを実証している。これらの同じマーカーは、対照として使用したヒトの膀胱平滑筋細胞（Ｈｕ１０２２  ＳＭＣ、継代５代目）上で発現する。さらに、網がＳＭＣの代替の源であってもよいという考えを支持する。故に、これらの免疫組織化学的なデータは、平滑筋細胞が網組織から単離されているという発見をさらに支持する。
【０２６２】
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【０２６３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく遺伝子発現分析。内皮および平滑筋細胞の遺伝子発現分析を、ＰＣＲによって評価した。試料ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で単離した。ｃＤＮＡは、製造業者の命令に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２μｇのＲＮＡから発生させた。ｃＤＮＡ合成の後に、各試料を、蒸留水で１：１０に希釈した。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、表２．２に列記されるＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ならびに１０μｌのＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２倍濃度）、１μｌプライマー／プローブ、および９μｌのｃＤＮＡ（希釈１：１０）を含む反応混合物を使用して設定した。反応物は、デフォルトの循環パラメータを使用して、ＡＢＩ７３００リアルタイムサーマルサイクラーで行った。ＰＣＲデータの分析は、比較Ｃｔによる相対定量（ＲＱ）法を使用して行った。相対定量は、内在性基準に正規化され、かつ校正器と相対的な標的の量であり、次の方程式によって与えられる。２−ΔΔＣＴを、ΔΔＣＴ＝ΔＣＴＴｅｓｔ−ΔＣＴＣａｌｉｂｒａｔｏｒとした。内在性参照（内部対照）を、１８Ｓ  ｒＲＮＡとした。ヒトの大動脈内皮細胞（ヒトのＡＥＣ）を、これらの遺伝子の発現に対する陽性対照として使用した。表２．３は、ＰＣＲ実験における発現に対して試験した遺伝子を列記する。
【０２６４】
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【０２６５】
図２２は、イヌの網由来の細胞と、イヌの膀胱由来の平滑筋細胞と、対照としてのヒトの膀胱細胞との間の、平滑筋細胞マーカーであるアクチン（継代１代目の細胞）、ＳＭ２２、ミオシン重鎖、およびカルポニンの遺伝子発現レベルを例証する。網および膀胱由来の平滑筋細胞は、ヒトの膀胱対照と比較したときに、平滑筋細胞遺伝子の高い発現を示す。
【０２６６】
図２３は、イヌの網由来の細胞と、イヌの膀胱由来の平滑筋細胞と、対照としてのヒトの膀胱細胞との間の、内皮細胞マーカーであるＣＤＨ５、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＰＥＣＡＭ、ＴＥＫ、およびｖＷＦの遺伝子発現レベルを例証する。ＦＬＴ１およびかなり少ないＫＤＲを除いて、残りの内皮遺伝子は、膀胱平滑筋細胞または網由来の細胞によって発現されなかった。存在する場合、網平滑筋細胞および膀胱平滑筋細胞は、内皮細胞マーカーの同じ限定的な発現を示した。
【０２６７】
図２４は、ブタ由来の細胞に対する平滑筋細胞マーカー（ＭＹＯＣＤ、ＳＭＡ、ＳＭ２２、ＳＭ−ＭＨＣ、ＣＮＮ、Ｂ−アクチン）の遺伝子発現レベルを示す。ゲル電気泳動によって質的に分析したｑＲＴ−ＰＣＲの結果は、ブタの網由来の平滑筋細胞の遺伝子発現が、ブタの膀胱由来の平滑筋細胞のそれに類似していることを示している。
【０２６８】
ゲル収縮機能アッセイ。従来技術で一般的に使用される平滑筋細胞のための機能アッセイは、コラーゲンゲルの中に移植したときに収縮する能力である。イヌの膀胱またはイヌの網由来の平滑筋細胞は、２〜３ｍｇ／ｍｌのラット尾コラーゲンＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ．，ＵＳＡ）を含有する溶液中の５００，０００細胞／ｍＬで懸濁した。１．８ｍｇ／ｍｌのＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を補充した濃縮ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．，ＵＳＡ）、および２．３ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を希釈剤として使用し、３．７ｍｇ／ｍｌのＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でｐＨ調製して、コラーゲン重合を可能にした。陰性対照ヒドロゲルは、Ｃａ２＋依存的な細胞収縮を抑えるために、５μＭのＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した。各複製について、２５０μＬの細胞懸濁液を、４８ウェルプレートの単一のウェルに分配した。重合すると、完全な収縮を妨げる可能性のある摩擦および付着を低減するために、コラーゲンゲルをウェルプレートから徐々に緩和した。無血清ＤＭＥＭ（２５０μＬ）を、ウェルプレートの中の各ゲルの頂部に加えて、加湿した５％のＣＯ２を含有する雰囲気中で、３７℃でインキュベートした。全てのゲルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、０時間、２４時間、および４８時間の時間点で撮像した。画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアバージョン１．４０ｇで測定し、画素単位で表した。ウェルプレートのコラーゲンゲルの直径は、精度を向上させるために、表面積から計算した。ゲルの直径の減少は、ゲルが収縮したことを示す。
【０２６９】
図２５は、網および膀胱由来の平滑筋細胞が、実証された収縮能力（平滑筋細胞の特徴的機能である）を有することを示す。
【０２７０】
実施例３−新尿路導管足場に播種される網由来の平滑筋細胞
本明細書で説明される新尿路導管は、管（導管）の形態で成形される生分解性足場、および足場に播種される平滑筋細胞から成る。この研究について、網組織に由来する平滑筋細胞は、新尿路導管に関するものと同じ過程を使用して調製した足場材料上に播種した。足場内部の細胞は、抗原発現による細胞表現型、タンパク質発現、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の産生、および代謝の活性プロファイルを含む、平滑筋細胞の特性について評価した。
【０２７１】
免疫組織化学的染色。図２６は、足場材料上に播種した後の、膀胱および網由来の平滑筋細胞の免疫組織化学的染色を示す。細胞播種した足場は、前述のように、固定して、平滑筋アルファ−アクチンに対する抗体で着色した。足場内部の網由来の平滑筋細胞表現型の免疫染色分析は、平滑筋アルファ−アクチンの発現を示した。したがって、網由来の細胞は、足場上に播種したときに、足場内部で平滑筋細胞表現型を保持し、膀胱由来の平滑筋細胞と同様に振舞うと思われる。
【０２７２】
ＭＣＰ１タンパク質分泌。ＭＣＰ−１は、膀胱平滑筋細胞の正常な産物であり、効力、同一性、および機能のマーカーとして使用されてもよい。Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓによるイヌのＭＣＰ−１に特異的なＥＬＩＳＡに基づくアッセイ系を用いた。試料は、２回アッセイし、標準曲線と比較して、構築体媒体の中の推定したＭＣＰ−１レベルを提供した。図２７で例証されるように、足場に播種した網由来の平滑筋細胞は、ＭＣＰ１タンパク質を産生した。
【０２７３】
ＥＣＭの産生。ＥＣＭタンパク質を産生する網由来の細胞の能力を評価するために、足場材料上に播種した後に、膀胱および網由来の平滑筋細胞の免疫組織化学的染色を行った。細胞播種した足場は、前述のように、固定して、フィブロネクチンに対する抗体で着色した。図２８で描写されるように、網由来の平滑筋細胞は、細胞外マトリクス材料であるフィブロネクチンを合成するが、これは、細胞の接着、移動、成長、および分化に重要である。さらに、網平滑筋細胞は、ここでも、足場上に播種したときに、膀胱平滑筋細胞と同様に振舞う。
【０２７４】
代謝のプロファイリング。足場に播種したときに、イヌの膀胱由来の平滑筋細胞および網由来の細胞の代謝のプロファイルをさらに分析した。媒体試料は、６日間の時間経過にわたって採取した。試料は、自動システム（Ｂｉｏｌｙｚｅｒ）を使用して分析した。簡潔には、媒体を、試料チャンバに加え、機械に注入して種々の代謝物質のレベルを測定した。図２９で描写されるように、イヌの膀胱平滑筋細胞および網由来の細胞の代謝プロファイルは、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｕｃ、Ｌａｃ、およびＮＨ４＋のレベルに関して類似している。したがって、網由来の細胞が、足場上に播種したときに、代謝的に活性であることを実証する。
【０２７５】
これらの研究は、網組織から平滑筋細胞を効果的に単離できることを示す。網由来の細胞は、膀胱から単離した平滑筋細胞と同じ特性を有する。網由来の細胞は、単離および拡張時に平滑筋細胞の形態を示した。抗原マーカーによる表現型分析は、膀胱平滑筋細胞に見られたものと同じであった。遺伝子発現は、網および膀胱由来の細胞について類似していた。内皮細胞マーカーの発現は、膀胱平滑筋細胞で検出されたものと同じであった。また、脂肪質マーカーは、細胞培養では検出されず（データ記載せず）、膀胱平滑筋細胞に対するものと同じであった。最後に、網由来の細胞もまた、膀胱由来の細胞に類似する収縮表現型を示した。したがって、これらの観察に基づいて、平滑筋細胞が、イヌおよびブタの網から成功裏に単離されたことが分かった。
【０２７６】
また、網由来の平滑筋細胞が、新尿路導管足場上に播種したときに、抗原マーカーの発現（平滑筋アルファ−アクチン）、タンパク質の発現（ＭＣＰ−１）、ＥＣＭの産生（フィブロネクチン）、代謝（グルコース摂取、乳酸産生等）といった特性で示されるように、膀胱組織から単離した平滑筋細胞と同様に振舞うことを実証した。
【０２７７】
図３０は、移植した後に、代替として供給した別の種類の平滑筋細胞（脂肪質由来の平滑筋細胞）を播種した新尿路導管の特性を表す。天然様の再生は、免疫応答を伴わずに、３ヵ月で観察することができる（Ａ）。加えて、尿管および皮膚接合部の粘膜裏打ちは、水密な尿の流れを可能にする（Ｂ）。いかなる異常な細胞成長もしくは組織発達、尿吸収、粘液分泌、または免疫拒絶反応の形跡も見られなかった。
【０２７８】
これらの発見は、新尿路導管の産生のために、平滑筋細胞の代替源として、網を使用できることを示唆する。
【図１Ｂ】
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【図２Ｂ】
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【図６】
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【図７Ｅ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２８】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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