(57)【要約】  本発明は、アミノ酸側鎖の２つのヘテロ原子間に少なくとも１つの分子内環状結合を有するペプチドをディスプレイする複製可能遺伝子パッケージ、複製可能遺伝子パッケージを調製する方法、ライブラリーを産生する方法、および複製可能遺伝子パッケージのライブラリーに言及する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸側鎖の２つのヘテロ原子間に少なくとも１つの分子内環状結合を有するペプチドをディスプレイする、複製可能遺伝子パッケージ。
【請求項２】
ファージ粒子、細菌、酵母、真菌、微生物胞子およびリボソームからなる群より選択される、請求項１記載の複製可能遺伝子パッケージ。
【請求項３】
Ｍ１３、Ｔ４、Ｔ７、ｆｄおよびラムダファージからなる群より選択される、請求項１または２記載の複製可能遺伝子パッケージ。
【請求項４】
前記ペプチドがリーダーおよびコアペプチドを含む前駆体ペプチドである、請求項１〜３のいずれか記載の複製可能遺伝子パッケージ。
【請求項５】
前記コアペプチドが天然リボソームペプチド由来である、請求項１〜４のいずれか記載の複製可能遺伝子パッケージ。
【請求項６】
前記環状結合が、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される２つの原子を連結する、請求項１〜５のいずれか記載の複製可能遺伝子パッケージ。
【請求項７】
前記環状結合が２つの異なる原子を連結する、請求項６記載の複製可能遺伝子パッケージ。
【請求項８】
前記ペプチドが多環構造を含む、請求項１〜７のいずれか記載の複製可能遺伝子パッケージ。
【請求項９】
前記ペプチドがランダム化配列を含む、請求項１〜８のいずれか記載の複製可能遺伝子パッケージ。
【請求項１０】
アミノ酸側鎖内に少なくとも１つの分子内環状結合を有するペプチドをディスプレイする複製可能遺伝子パッケージを調製する方法であって
ａ）ペプチドをコードする核酸配列を提供し、
ｂ）複製可能遺伝子パッケージの遺伝子内に前記核酸配列を連結し、
ｃ）前記複製可能遺伝子パッケージの表面上に、対応する一次ペプチド配列をディスプレイして、一次パッケージを得て、そして
ｄ）翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素を用いて前記一次パッケージを酵素的にプロセシングして、前記ペプチドの多環構造をディスプレイする成熟パッケージを産生する
工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
分子内環状結合が、アミノ酸側鎖の２つのヘテロ原子間である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ペプチド切断を遮断するようにペプチドを操作する工程をさらに含む、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＴＭ酵素が、カルボキシレート−アミン・リガーゼ、シクラーゼ、デヒドロゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、エピメラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ペプチダーゼ、デヒドラターゼ、トランスフェラーゼ、エステラーゼ、オキシゲナーゼおよびイソメラーゼからなる群より選択される、請求項１０〜１２のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
前記プロセシングが、リーダーの存在下で行われる、請求項１０〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれか記載の方法によって得られうる複製可能遺伝子パッケージ。
【請求項１６】
アミノ酸側鎖内に少なくとも１つの分子内環状結合を有するペプチドをディスプレイする複製可能遺伝子パッケージのライブラリーを産生する方法であって、
ａ）ペプチド変異体をコードする核酸配列のレパートリーを提供し、
ｂ）前記レパートリーを複製可能遺伝子パッケージの遺伝子内に連結し、
ｃ）前記パッケージの表面上に、対応する一次ペプチド配列をディスプレイして、一次ライブラリーを得て、そして
ｄ）ＰＴＭ酵素を用いて前記一次ライブラリーを酵素的にプロセシングして、前記ペプチド変異体の環状構造をディスプレイする成熟ライブラリーを産生する
工程を含む、前記方法。
【請求項１７】
多様なペプチド配列をディスプレイする、請求項１〜９または１５のいずれか記載の複製可能遺伝子パッケージのライブラリー。
【請求項１８】
ＰＴＭ酵素でペプチドライブラリーを翻訳後修飾して、環状ペプチド構造をディスプレイする成熟ライブラリーを産生する方法。
【請求項１９】
Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される２つの原子間の共有結合を提供可能な酵素を用いる、請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、翻訳後修飾されたペプチドを提示するディスプレイ系に言及する。
【背景技術】
【０００２】
多くの場合、新規化合物に関する検索は、所望の活性または特性を有する化合物をスクリーンし、そして同定するため、化合物の巨大ライブラリーを利用する。コンビナトリアルペプチドライブラリー技術は、薬剤発見および開発の価値ある供給源である。ファージまたは他のウイルス粒子上にディスプレイされる組換えペプチドライブラリーは、こうしたスクリーンにおいて特に有用であることが立証されてきている。多くのヒト疾患および疾病のための新規治療の検索において、ペプチドライブラリーから得られる生物学的活性ペプチドの開発に向けて、多くのグループが取り組んでいる。
【０００３】
ファージディスプレイペプチドライブラリー技術は、多くのヒト疾患および疾病のための新規治療の検索において広く用いられている。繊維状ファージ上にディスプレイされたペプチドライブラリーは、任意の所定のターゲットに結合し、それによって薬理学的効果を示すペプチドを同定するためのスクリーニング供給源として用いられてきている。こうして同定されたペプチドは、続いて、慣用的合成化学法を用いて、大量に合成可能である。
【０００４】
バクテリオファージＭ１３は、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡゲノムを持つイノウイルス科の無エンベロープ繊維状大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ファージである。ヌクレオカプシドは、異なるコピー数の４つのバクテリオファージタンパク質からなり：ｐＶＩＩＩはおよそ２７００コピーであり、一方、ｐＩＩＩ、ｐＶＩおよびｐＩＸは５コピーで存在する。Ｔ４、Ｔ７、ｆｄおよびラムダのような他のバクテリオファージの中でも、Ｍ１３は、バイオテクノロジースクリーニング法で使用するためのファージディスプレイに成功裡に用いられてきている。こうしたスクリーニングアプローチにおいて、ペプチドのランダムライブラリーは、結合パートナー（タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ等）と異なるファージの相互作用を研究するため、ファージＭ１３のヌクレオカプシド表面上に提示されている。通常、合成オリゴヌクレオチドは、ヌクレオカプシドを構成するタンパク質をコードする遺伝子内にクローニングされ、そしてそれによって、関心対象のペプチド（または異なるペプチドのライブラリー）は、続く結合研究のため、ファージＭ１３ヌクレオカプシド表面上に提示される。
【０００５】
ファージディスプレイ法は、典型的には、ランダムオリゴヌクレオチドが、ファージコートタンパク質（例えば繊維状ファージｐＩＩＩ、ｐＶＩまたはｐＶＩＩＩ）に融合したペプチドライブラリーを細菌宿主に発現させるように、ファージゲノム内へのランダムオリゴヌクレオチドの挿入を含む。この技術の利点は、ファージの大きさが小さいため、最大１０１５の異なる個体を含むライブラリーを扱うことが可能になり、そしてペプチドをコードする遺伝情報とディスプレイされたペプチドの物理的関連があることである。
【０００６】
基本的なファージディスプレイ技術は、真核ウイルス、細菌および酵母細胞など、ファージ以外の複製可能遺伝子パッケージからディスプレイされるペプチドライブラリーを含むように拡大されてきている。原理および戦略は、ファージに関して使用されるものと非常に類似であり、すなわち、スクリーニングしようとするペプチドおよび細胞またはウイルス表面上に曝露される内因性タンパク質の間に融合タンパク質を生成するように、ディスプレイしようとするペプチドをコードする核酸が、パッケージのゲノム内に挿入される。融合タンパク質の発現および細胞表面への輸送は、細胞またはウイルス表面で、ペプチドのディスプレイを生じる。
【０００７】
二次ペプチド構造を通じてライブラリー多様性を増加させる試みの中で、いくつかのグループは、化学的反応を通じて、コンホメーション的に拘束されたペプチドを産生してきた。
【０００８】
ＥＰ１１８７９１４Ｂ１は、システイン残基間のジスルフィド架橋を通じて安定化された、複数の環状ペプチドを含む、構造的に拘束されたペプチドのライブラリーを開示する。
【０００９】
ＷＯ２００９／０９８４５０Ａ２は、コネクター化合物を通じて連結されたジスルフィド安定化二環ペプチドをディスプレイするファージ粒子を開示する。
ＵＳ２００９／０１３７４２４Ａ１は、アジド−アルキン［３＋２］シクロ付加反応およびシュタウディンガー修飾のためのターゲットを提供するため、非天然アミノ酸を含有する、ファージディスプレイポリペプチドの翻訳後修飾を開示する。
【００１０】
デプシペプチド天然化合物の生合成が、ＥＰ２０４８１５５Ａ１に記載される。５〜５０アミノ酸の間の前駆体ペプチド配列は、ＡＴＰ把握（ｇｒａｓｐ）様酵素によって修飾される。核酸分子は、例えば大腸菌内に導入されて、デプシペプチド天然化合物、例えばミクロビリジン（ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄｉｎ）を産生する。
【００１１】
いくつかのリボソームペプチドの天然産物合成は、Ｏｍａｎら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：９−１８（２０１０））によって概説される。前駆体ペプチドは、リーダーペプチドによって仲介され、翻訳後プロセシングされる。これらのリーダーペプチドは、前駆体ペプチドをフォールディングし、前駆体を分解に対して安定化し、そして宿主内部での生合成中、分泌およびタンパク質分解に適切な時が来るまで、前駆体を不活性に維持するのを補助する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＥＰ１１８７９１４Ｂ１
【特許文献２】ＷＯ２００９／０９８４５０Ａ２
【特許文献３】ＵＳ２００９／０１３７４２４Ａ１
【特許文献４】ＥＰ２０４８１５５Ａ１
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｏｍａｎら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：９−１８（２０１０））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ペプチドライブラリー技術を通じて開発される新規ターゲティングペプチドに関する差し迫った必要性がある。したがって、スクリーニング目的のため、構造的に拘束されたペプチドの改善されたライブラリーを提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この技術的問題に対する解決策は、請求項に特徴付けられる態様を提供することによって達成される。したがって、本発明は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素によって酵素的にプロセシングすることを通じて、多環ペプチドの巨大ライブラリーを容易に生成することを可能にする。
【００１６】
本発明にしたがって、アミノ酸側鎖の２つのヘテロ原子間に、分子内イソペプチド結合、エステル結合またはランチオニン結合を含む、少なくとも１つの分子内環状結合を有するペプチドをディスプレイする、複製可能遺伝子パッケージを提供する。
【００１７】
本発明記載の複製可能遺伝子パッケージは、好ましくは、ファージ粒子、細菌、酵母、真菌、微生物胞子およびリボソームからなる群より選択される。
特に、複製可能遺伝子パッケージは、Ｍ１３、Ｔ４、Ｔ７、ｆｄおよびラムダファージからなる群より選択される。
【００１８】
特定の側面にしたがって、前記ペプチドはリーダーおよびコアペプチドを含む前駆体ペプチドである。
前記リーダーペプチドが天然リボソームペプチドのリーダーを含むことが好ましい。
【００１９】
前記コアペプチドが天然リボソームペプチド由来であることもまた好ましい。
特に、環状結合は、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される２つの原子を連結する。
【００２０】
好ましい態様において、環状結合は、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される２つの異なる原子を連結する。
好ましい態様にしたがって、ペプチドは多環構造を含む。
【００２１】
ペプチドがランダム化配列を含むことが好ましい。
本発明の別の側面にしたがって、アミノ酸側鎖内に少なくとも１つの分子内環状結合を有するペプチドをディスプレイする複製可能遺伝子パッケージ、例えば本発明記載の複製可能遺伝子パッケージを調製する方法であって
ａ）ペプチドをコードする核酸配列を提供し、
ｂ）複製可能遺伝子パッケージの遺伝子内に前記核酸配列を連結し、
ｃ）前記複製可能遺伝子パッケージの表面上に、対応する一次ペプチド配列をディスプレイして、一次パッケージを得て、そして
ｄ）翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素を用いて前記一次パッケージを酵素的にプロセシングして、前記ペプチドの環状構造をディスプレイする成熟パッケージを産生する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００２２】
特定の態様において、該方法は、アミノ酸側鎖の２つのヘテロ原子間の分子内環状結合を提供する。
本発明にしたがった好ましい方法は、ペプチド切断を遮断するようにペプチドを操作する工程をさらに含む。
【００２３】
好ましいＰＴＭ酵素は、カルボキシレート−アミン・リガーゼ、シクラーゼ、デヒドロゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、エピメラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ペプチダーゼ、デヒドラターゼ、トランスフェラーゼ、エステラーゼ、オキシゲナーゼおよびイソメラーゼ、特にランチオニン結合形成酵素、細胞溶解素形成酵素、シアノバクチン形成酵素、チオペプチド形成酵素、コノペプチド形成酵素、ミクロビリジン形成酵素、シクロチド形成酵素、バクテリオシン形成酵素およびサブチロシン形成酵素からなる群より選択される。
【００２４】
特定の態様にしたがって、プロセシングは、リーダー、好ましくはリーダーペプチドの存在下で行われる。
本発明にしたがって、本発明記載の方法によって得られうるまたは得られた複製可能遺伝子パッケージを提供する。
【００２５】
本発明のさらなる側面にしたがって、アミノ酸側鎖内に少なくとも１つの分子内環状結合を有するペプチドをディスプレイする複製可能遺伝子パッケージ、例えば本発明記載の複製可能遺伝子パッケージのライブラリーを産生する方法であって、
ａ）ペプチド変異体をコードする核酸配列のレパートリーを提供し、
ｂ）前記レパートリーを複製可能遺伝子パッケージの遺伝子内に連結し、
ｃ）前記パッケージの表面上に、対応する一次ペプチド配列をディスプレイして、一次ライブラリーを得て、そして
ｄ）ＰＴＭ酵素を用いて前記一次ライブラリーを酵素的にプロセシングして、前記ペプチド変異体の環状構造をディスプレイする成熟ライブラリーを産生する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００２６】
本発明のさらなる側面にしたがって、複製可能遺伝子パッケージを調製する方法および複製可能遺伝子パッケージのライブラリーを産生する方法を含む、本発明の方法にしたがって産生された、複製可能遺伝子パッケージのライブラリーを提供する。
【００２７】
本発明のさらなる側面にしたがって、パッケージが多様なペプチド配列をディスプレイする、本発明記載のものなどの、複製可能遺伝子パッケージのライブラリーを提供する。
さらに、本発明の別の側面にしたがって、ＰＴＭ酵素でペプチドライブラリーを翻訳後修飾して、多環ペプチド構造をディスプレイする成熟ライブラリーを産生する方法を提供する。
【００２８】
特に、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される、同じまたは異なる原子の２つの原子間の共有結合を提供可能な酵素を用いる。
したがって、本発明にしたがって、ペプチド変異体に多環構造を取り込むペプチドライブラリーをプロセシングするためのＰＴＭ酵素の使用をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】配列。ｍｖｄＥに融合したｐＩＩＩ遺伝子の配列（図１ａ、配列番号２）；翻訳されたアミノ酸配列（図１ｂ、配列番号３）：ファージタンパク質ｐＩＩＩ、太字はＭｖｄＥ前駆体ペプチドを指し、下線文字はコアペプチドを指す。
【図２】キモトリプシン処理した参照ペプチド、ミクロビリジンＫの高解像度質量スペクトル（ＦＴＭＳ）。８８５．８５３２Ｄａで示される質量は、ミクロビリジンＫの理論的質量（８８５．８５０１９Ｄａ）にマッチする。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたキモトリプシン消化した試料バンドの高解像度質量スペクトル（ＦＴＭＳ）。試料は、ＰＴＭ酵素処理したＭ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥファージを指す。検出された二重荷電質量ｍ／ｚ  ８８５．８５４０Ｄａは、ペプチド、ミクロビリジンＫの理論的質量および参照ペプチド、ミクロビリジンＫの測定された質量（図１）によく適合する。質量精度は５ｐｐｍであった。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
したがって、本発明は、特定の分子内環状構造を有するペプチドをディスプレイする複製可能遺伝子パッケージに基づくペプチドディスプレイ系に関する。ペプチドの代謝的操作は、例えばジスルフィド架橋を操作する化学架橋より好都合であり、これは、複素環の橋脚としてヘテロ原子を使用するためである。それによって、代謝的プロセシングを通じて、非常に望ましい結合モチーフを所持する適切なペプチドを特異的に選択するためのプールとして、多様なペプチド一次および二次構造が提供される。
【００３１】
用語「複製可能遺伝子パッケージ」は、本明細書において、原核または真核遺伝子パッケージを意味するものとし、そして細胞、胞子、酵母、細菌、ウイルス、バクテリオファージ、リボソームおよびポリソームを含む。好ましい複製可能遺伝子パッケージはファージである。ペプチドは、複製可能遺伝子パッケージ上にディスプレイされ、すなわち、これらは、複製可能遺伝子パッケージの外表面に位置する基または分子に付着している。複製可能遺伝子パッケージは、ペプチドをコードする核酸分子に連結されたスクリーニングされるペプチドを含む、スクリーン可能単位である。核酸分子は、通常、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えばベクターとして、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばＰＣＲ、転写および翻訳によってのいずれかで、複製可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏ複製は、細胞の場合のように自律的であってもよいし、ウイルスの場合のように宿主因子の補助を伴ってもよいし、またはファージミドの場合のように宿主およびヘルパーウイルス両方の補助を伴ってもよい。多様なペプチドをディスプレイする複製可能遺伝子パッケージは、ディスプレイしようとする、異種ペプチドをコードする核酸分子を、複製可能遺伝子パッケージのゲノム内に導入して、通常、複製可能遺伝子パッケージの外表面に発現される自己タンパク質を含む融合タンパク質を形成することによって、形成される。融合タンパク質の発現、外表面への輸送およびアセンブリは、複製可能遺伝子パッケージの外表面からのペプチドのディスプレイを生じる。本発明にしたがって用いられるようなディスプレイ系は、通常、所望の特性、例えば物理的、化学的または機能的特性に基づく選択のためにアクセス可能なペプチドコレクションを指し、その際、選択されたペプチドをコードする核酸を容易に単離または回収可能である。ディスプレイ系は、好ましくは、生物学的系において、ペプチドの適切なレパートリーを提供し、ときに生物学的ディスプレイ系と呼ばれ、特に、複製可能遺伝子パッケージを指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ系とは対照的に、生物学的系は、典型的には、ウイルスまたは細胞発現系を使用し、例えば形質転換、感染、トランスフェクションまたは形質導入された細胞において核酸ライブラリーを発現し、そして複製可能遺伝子パッケージ表面上に、コードされるペプチドをディスプレイする。
【００３２】
用語「ペプチド」は、本明細書において、５またはそれより多いアミノ酸、典型的には少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０または１００アミノ酸を含有するペプチドまたはポリペプチドを意味するものとする。該用語はまた、より高分子量のポリペプチド、例えばタンパク質も指す。
【００３３】
用語「分子内環状結合」は、本明細書において、ペプチド配列内のアミノ酸側鎖間で共有結合を使用する、例えば分子外（外因性）構造を取り込まない、分子内イソペプチド結合を通じて形成される二次構造を意味するものとする。該用語は、特に、翻訳後酵素プロセシングを通じて得られている環および多環を指し、これは好ましくは、化学的プロセシング、例えば還元反応を通じた、例えばジスルフィド架橋形成、付加環化またはシュタウディンガー反応を排除するであろう。特に、環は、本明細書において、「ヘテロ原子」と称される少なくとも２つの原子を含む複素環であり、「ヘテロ原子」は、Ｎ、ＯまたはＳなどのヘテロ原子、あるいはＣ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される２つの異なる原子間の共有結合を形成する原子である。これは特に、適切な化学的意味において、二重結合を含めて、Ｃ−Ｎ、Ｃ−Ｏ、Ｃ−Ｓ、Ｎ−Ｎ、Ｎ−Ｏ、Ｎ−Ｓ、Ｏ−Ｏ、Ｏ−ＳおよびＳ−Ｓ結合を含む。こうした結合の橋脚はいずれも「ヘテロ原子」と称され、そして「複素環」、特に翻訳後修飾または代謝的プロセシングによって産生されるヘテロ環の橋脚と見なされる。
【００３４】
用語「多環」または「多環構造」は、本明細書において、少なくとも二環構造、好ましくは少なくとも３、より好ましくは少なくとも４、さらにより好ましくは少なくとも５の環状結合を有する構造を指すものとする。本発明にしたがって用いられるようなペプチドの長さに応じて、より複雑な二次ペプチド構造が達成可能である。
【００３５】
用語「前駆体ペプチド」は、本明細書において、ペプチドの翻訳後酵素的プロセシング（成熟）を支持する要素、例えば操作的にコアペプチドに連結されるシグナルおよび／またはリーダー配列を含むペプチドを指すものとする。前駆体ペプチドのカルボキシル末端は、通常、酵素修飾された配列、「コア配列」をコードする。リーダーは、通常、修飾後に成熟カルボキシル末端から切断されて短いペプチド産物を生じるが、本発明にしたがってディスプレイされる好ましい前駆体ペプチドは、コアペプチドの成熟後であってさえ、なお前駆体要素、例えばシグナルまたはリーダー配列を含むであろう。したがって、好ましいディスプレイ系または構築物は、成熟プロセス前および／または後のいずれかの、コアペプチドの切断を遮断するよう操作される。これは、切断を防止する突然変異によって、または切断部位を横断する適切な架橋の確立を通じて、達成可能である。
【００３６】
用語「リーダー」または「リーダー配列」は、本明細書において、翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素のための認識モチーフを指すものとする。好ましい側面にしたがって、ペプチドは、複製可能遺伝子パッケージ上に組み込まれたリーダー配列とともに、例えば前駆体ペプチドの形でディスプレイされるか、あるいはリーダーは別個の実体として、例えば添加物として、またはＰＴＭ酵素作用を支持するよう作用するリーダー配列もしくは多様なリーダー配列突然変異体をディスプレイする生物学的もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ系に基づくヘルパーディスプレイ系によって、本発明にしたがった複製可能遺伝子パッケージとは独立の別個のペプチドとして、ディスプレイされる。
【００３７】
本発明にしたがって用いられるような用語「天然リボソームペプチド」はまた、「リボソームペプチド天然産物」とも称され、生物学的に活性である、構造的に多様なリボソーム合成ペプチドを意味するものとし、最も一般的には長さ約１００アミノ酸であり、非常に多数の異なる化学的モチーフの形成を触媒する多様な酵素によって翻訳後修飾される。このクラス内では、高頻度可変性配列を含む多数の（前駆体）ペプチドがある。一次ペプチドは、プロセシング経路の基質として作用可能であり、そしてしたがって、各経路は、多くの異なる成熟ペプチドを導く。このクラスのメンバーは、微生物学、環境、医学および技術において重要でありうる、高い潜在能力を有する。一般的に、天然リボソームペプチドの前駆体ペプチドは、修飾酵素による、そして／または排出機構による認識に、少なくとも部分的に関与する、比較的保存されたリーダー配列を含有する。これらの生合成機構は、細菌リボソームペプチド天然産物に関してほぼ普遍的であり、そしてまた古細菌、真菌、植物および動物などの他の生物由来の類似のペプチドの生合成においても一般的に見られる。
【００３８】
本発明にしたがって用いられる好ましいリボソームペプチドには、ミクロビリジン、ラクチシン、チオペプチド、コノペプチド、ミクロシン、細胞溶解素、ランチビオティクス、シアノバクチン、アマトキシン／ファロトキシン、シクロチドおよび（環状）バクテリオシン、またはその機能的に同等な変異体が含まれる。
【００３９】
用語「ランダム化」または「ランダム化配列」は、あらかじめ決定された領域における特異的ヌクレオチドまたはアミノ酸配列修飾を指すものとし、例えば代謝的プロセシングに際して複素環の新規橋脚を形成するか、またはこうした橋脚間で、複素環の三次元構造を変化させる。修飾は、典型的には、アミノ酸のランダム挿入、交換または欠失を生じる。アミノ酸を置換するかまたは挿入するため、選択されたアミノ酸あるいは全範囲の天然または合成アミノ酸を、当該技術分野に知られる方法によって、そして本特許出願に開示するように、ランダムにまたは半ランダムに用いてもよい。ランダム化は、多様なペプチド配列をコードする核酸のレパートリーを生じるであろう。ランダム化目的には、天然アミノ酸の使用が好ましい。特定の態様において、非天然アミノ酸の使用を回避する。
【００４０】
用語「レパートリー」は、本明細書において、配列多様性によって特徴付けられる核酸またはアミノ酸配列のコレクションを指す。レパートリーの個々のメンバーは、共通の特徴、例えば足場内の共通のコア構造、および／または共通の機能、例えば特定の結合または生物学的活性を有する可能性もある。レパートリー内には、通常、核酸またはアミノ酸配列の「変異体」、例えば親配列から突然変異誘発法を通じて、例えばランダム化技術を通じて得られる、多様なペプチド配列がある。用語「ライブラリー」は、本明細書において、不均一ペプチドまたは核酸配列の混合物を指す。ライブラリーは、各々、単一のペプチドまたは核酸配列を有するメンバーで構成される。この範囲で、「ライブラリー」は、「レパートリー」と同義である。ライブラリーメンバー間の配列相違は、ライブラリーに存在する多様性に関与する。
【００４１】
用語、親分子の「機能的に同等な変異体」または「機能的に活性である変異体」は、本明細書において、配列内の、あるいは配列遠位端のいずれかまたは両方での１またはそれより多いアミノ酸またはヌクレオチドの挿入、欠失または置換による、この配列の修飾を生じ、そしてこの修飾がこの配列の活性に影響を及ぼさない（特に損なわない）、配列を意味する。選択されたリガンドに対する特異性を有するリガンド結合ペプチドの場合、本発明にしたがって用いられるような、機能的に活性であるペプチド変異体は、あらかじめ決定された結合特異性を有するものとするが、これは、例えば、特定のエピトープに対する細かい特異性、アフィニティ、アビディティ、ＫｏｎまたはＫｏｆｆ速度等を変化させるように変化させることも可能である。好ましい態様において、機能的に活性である変異体は、ａ）ペプチドの生物学的に活性である断片、ペプチドの配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％を含む機能的に活性である断片であり；ｂ）少なくとも１つのアミノ酸置換、付加および／または欠失によって、ペプチドから得られており、ペプチドに対して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。機能的に活性である変異体は、ペプチドまたはヌクレオチド配列中の配列改変によって得られる可能性もあり、ここで、本発明と組み合わせて用いた際、配列改変は、改変されていないペプチドまたはヌクレオチド配列の機能を保持する。こうした配列改変には、限定されるわけではないが、（保存的）置換、付加、欠失、突然変異および挿入が含まれてもよい。
【００４２】
ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の変異体は、本発明の背景において、変異体を含む（が元来のものを含まない）ペプチド調製の活性が、配列改変を含まないペプチドまたはヌクレオチド配列（すなわち元来のポリペプチドまたはヌクレオチド配列）を含む本発明にしたがって用いられるようなペプチドの生物学的活性の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％に達する場合、機能的に活性である。
【００４３】
保存的置換は、側鎖および化学的特性において関連しているアミノ酸ファミリー内で行われるものである。こうしたファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小さい側鎖、巨大側鎖などを持つアミノ酸である。
【００４４】
本発明の別の態様において、上に定義するようなペプチドまたはヌクレオチド配列を多様な化学的技術で修飾して、ペプチドと本質的に同じ活性（断片および変異体に関して上に定義するようなもの）を有し、そして場合によって他の所望の特性を有する、誘導体を産生してもよい。
【００４５】
本明細書において、「相同体」または「機能的相同体」は、親核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の変異体が、一次、二次または三次構造において、対応する位で同じかまたは保存された残基を有することを意味するものとする。該用語はまた、相同ペプチドをコードする２またはそれより多いヌクレオチド配列にも拡大適用される。特に、相同化合物は、通常、全長天然配列またはその任意の断片に関して，少なくとも約５０％のアミノ酸配列同一性を有する。好ましくは、相同化合物は、天然化合物、または全長化合物の任意の他の特に定義される断片に対して、少なくとも約５５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。生物学的に活性であるペプチドとしての機能がこうした相同体で証明された場合、相同体は「機能的相同体」と称される。
【００４６】
用語「相同ヌクレオチド配列」は、本明細書において、意図されるヌクレオチド配列とヌクレオチド配列が同一ではないが関連し、そして本質的に同じ機能を実行する、ヌクレオチド配列を指す。これらはまた、遺伝暗号の縮重による変動を含む、ヌクレオチド組成の変動を含み、それによって該ヌクレオチド配列は、本質的に同じ機能を実行する。
【００４７】
本明細書に同定するペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、そして必要であればギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した後、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさずに、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。当業者は、比較中の配列の全長に渡って、最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、整列を測定するための適切なパラメータを決定可能である。
【００４８】
用語「翻訳後修飾酵素」または「ＰＴＭ酵素」は、本明細書において、翻訳されたペプチドの構造変化を伴う、例えばプロセシング機構の一部として、生物学的に活性であるペプチドの生合成において、天然リボソームペプチドを特異的に修飾する酵素を指すものとする。このクラスには、カルボキシレート−アミン・リガーゼ、シクラーゼ、デヒドロゲナーゼ、シクロデヒドラターゼ、デカルボキシラーゼ、エピメラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ペプチダーゼ、デヒドラターゼ、トランスフェラーゼ、エステラーゼ、オキシゲナーゼおよびイソメラーゼ、特にランチオニン結合形成酵素、細胞溶解素形成酵素、シアノバクチン形成酵素、チオペプチド形成酵素、コノペプチド形成酵素、ミクロビリジン形成酵素、シクロチド形成酵素、バクテリオシン形成酵素およびサブチロシン形成酵素を含む、多数のタイプの酵素が含まれる。
【００４９】
酵素のさらなる説明を以下に提供する。
特に、ランチオニン結合形成酵素を使用する。ランチビオティクス（Ｗｉｌｌｅｙおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｎｋ  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００７．  ６１：４７７−５０１）は、ランチオニン含有抗生物質と定義される。分子内架橋は、ランチオニンまたはメチルランチオニン結合と称され、これは、異なるアミノ酸側鎖の翻訳後修飾から生じる。セリンおよびスレオニン・ヒドロキシル基を脱水して、それぞれ、２，３−ジデヒドロアラニン（Ｄｈａ）または（Ｚ）−２，３−ジデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）を得る。これに続いて、ＤｈａまたはＤｈｂ上にシステイン残基を立体特異的分子内付加して、ランチオニンまたはメチルランチオニン結合を形成する。現在、いくつかの翻訳後修飾酵素およびその遺伝子が知られる：ＬａｎＢ型デヒドラターゼは、セリンおよびスレオニンの脱水工程を触媒すると提唱される酵素のＣ末端を構成することが示されている。ＬａｎＣ型シクラーゼは、システイン・チオールの付加を触媒する。シクラーゼの構成要素であるＬａｎＣは、亜鉛金属タンパク質であり、その結合金属は、求核付加のため、チオール基質を活性化させると提唱されてきている。ＬａｎＭ型融合デヒドラターゼおよびシクラーゼ：これは、ランチビオティクス合成中の前駆体−ペプチドの脱水および環状化の両方に関与する。ＬａｎＤ酸化性デカルボキシラーゼ型酵素：この酵素は、エピデルミンのＣ末端メソランチオニンのシステイン残基からの２つの還元性同等物の除去を触媒して、−−Ｃ＝Ｃ−−二重結合を形成する。ＬａｎＰ型ペプチダーゼは、ランチビオティクスからリーダーペプチドを切断する。ＡＢＣトランスポーターに融合したＬａｎＴ型ペプチダーゼ；前駆体ペプチドの切断は、分泌プロセスの一部として、トランスポーターによって仲介される。デヒドラターゼおよびデヒドロゲナーゼのＬｔｎＭおよびＬｔｎＪ型は、Ｄ−アラニンの形成に関与する。ＣｉｎＸは、シンナマイシン生合成中、アスパラギンをヒドロキシル化する。
【００５０】
ミクロシン：（Ｄｕｑｕｅｓｎｅら［Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  Ｒｅｐ．  ２００７  Ａｕｇ；２４（４）：７０８−３４］）は大部分、腸内細菌によって産生され、そして３つの群：クラスＩ、ＩＩａおよびＩＩｂに分類される。関与するＰＴＭ酵素およびその遺伝子は：ＭｃｂＢ様セリンおよびシステイン・デヒドラターゼ（シクロデヒドラターゼ）、ＭｃｂＣ様フラビン依存性デヒドロゲナーゼ（オキシドレダクターゼ）、抗生物質ミクロシンＢ１７のタンパク質分解的プロセシングに関与するＴｌｄＥプロテアーゼ、ＰｍｂＡ（ＴｌｄＤ）ミクロシン・プロセシングペプチダーゼ２型、ミクロシンＭｃｃＣ７／Ｃ５１生合成に関与するＭｃｃＢ型修飾酵素、ｎ−アミノプロパノール基のＭｃｃＤ型トランスファー（ＭｃｃＣ７／Ｃ５１）、ミクロシンＪ２５プロセシングおよび成熟に関与するＭｃｊＢおよびＭｃｊＣ、ミクロシンＥ４９２修飾に関与するＭｃｅＣ型グリコシルトランスフェラーゼ、ＭｃｅＤエンテロバクチン・エステラーゼ、ＭｃｅＩアセチルトランスフェラーゼである。
【００５１】
好ましくは、細胞溶解素形成酵素のさらなる群を使用する。ストレプトリジン（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００９  Ｍａｙ  ８；２８４（１９）：１３００４−１２）は、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）から翻訳後修飾されるペプチドである。特異的ＰＴＭ酵素は：ＳａｇＢデヒドロゲナーゼおよびＳａｇＣセリンおよびシステインデヒドラターゼ（シクロデヒドラターゼ）である。どちらの酵素も、チアゾール形成および（メチル）−オキサゾール形成に関与する。
【００５２】
シアノバクチン（Ｓｃｈｍｉｄｔら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００５  Ｍａｙ  １７；１０２（２０）：７３１５−２０）は、異なるシアノバクテリア属から単離される、複素環含有環状ペプチドである。好ましい態様にしたがって、シアノバクチン形成酵素、例えば前駆体ペプチドを切断するＰａｔＡスブチリシン（ｓｕｂｔｕｉｌｉｓｉｎ）様セリンプロテアーゼペプチダーゼ、ＰａｔＤセリンおよびシステインデヒドラターゼ（シクロデヒドラターゼ）およびＰａｔＧデヒドロゲナーゼ（オキシドレダクターゼ）を用いてもよい。
【００５３】
チオペプチド（Ｍｏｒｒｉｓら  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  ２００９  Ａｐｒ  ２９；１３１（１６）：５９４６−５５２００９）は、大環状分子の接合部で特徴的な三および四置換ピリジン環を有する複素環含有翻訳後修飾ペプチドクラスである。関与するＰＴＭ酵素は、ピリジン環形成に関与するＴｐｄＢデヒドラターゼ、ピリジン環形成に関与するＴｐｄＣデヒドラターゼ、チアゾリン形成に関与するＴｐｄＧシステインデヒドラターゼ（シクロデヒドラターゼ）、チアゾリンからのチアゾール形成に関与するＴｐｄＥデヒドロゲナーゼ（オキシドレダクターゼ）、ＴｐｄＨペプチダーゼ、ＴｐｄＩラジカルＳＡＭタンパク質、コプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ、ＴｐｄＪ１  Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ、ＴｐｄＪ２  Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ、Ｃ−メチル化に関与するＴｐｄＬラジカルＳＡＭタンパク質、ＴｐｄＭ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、ＴｐｄＮデアミンレダクターゼ、ＴｐｄＯシクロデヒドラターゼ、ＴｐｄＰデヒドラターゼ、ＴｐｄＱ  Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ、ＴｐｄＴ  Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびＴｐｄＵラジカルＳＡＭタンパク質である。
【００５４】
コノペプチド形成酵素もまた好ましい。コノペプチド（Ｂｕｃｚｅｋら  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ６２（２００５）３０６７−３０７９）は、イモガイ（ｃｏｎｅ  ｓｎａｉｌ）によって産生される翻訳後修飾ペプチドのクラスである。コノペプチドのクラスは、１００，０００の異なるペプチドの群を構成すると概算される。特異的ＰＴＭ酵素は、Ｔｅｘ３１基質特異的エンドプロテアーゼ、ＭｒＰＤＩ特異的タンパク質ジスルフィド・イソメラーゼ、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼ（寄託番号ＡＦ３８２８２３）である。生化学実験から、以下の酵素反応がコノトキシン形成に関与することを示すことが可能であった：プロリン、バリン、リジンヒドロキシル化、特異的モノオキシゲナーゼによるタンパク質アミド化反応、特異的ブロモペルオキシダーゼによる６−ブロモトリプトファンへのトリプトファンブロモ化、およびエピメラーゼによるＴｒｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌのエピマー化。さらに、コノトキシン生合成に関与する、グルタミニル・シクラーゼ、チロシルスルホトランスフェラーゼ、およびＯ−グリコシルトランスフェラーゼがある。
【００５５】
アマトキシン／ファロトキシン（Ｗａｌｔｏｎら  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．  ２０１０  Ｍａｙ  ２６．［印刷に先駆けた電子出版］，  Ｈａｌｌｅｎら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００７  Ｎｏｖ  ２７；１０４（４８）：１９０９７−１０１）は、テングダケ属（Ａｍａｎｉｔａ）担子菌類から単離された翻訳後修飾されたペプチドである。特に知られるＰＴＭ酵素は、Ｐｏｐ１セリンプロテアーゼである。生化学実験から、シクラーゼ、ヒドロキシラーゼ、およびトリプトファン−システイン・トリプタチオン（ｔｒｙｐｔａｔｈｉｏｎｅ）架橋に関与する酵素が、アマトキシン形成／ファロトキシン産生に関与すると推定される。
【００５６】
ミクロビリジン形成酵素が特に好ましい。ミクロビリジン（Ｐｈｉｌｍｕｓら，  ２００８  上記参照，  Ｚｉｅｍｅｒｔら，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．  ２００８；４７（４０）：７７５６−９）：ミクロビリジンは、三環ペプチドのクラスであり、異なるシアノバクテリア属から単離されてきている。ミクロビリジンの成熟に関与するＰＴＭ酵素は、生化学的に性質決定されてきている。特異的ＰＴＭ酵素は、ＭｖｄＢアセチルトランスフェラーゼ、ＲｉｍＫ  ＡＴＰ結合タンパク質に類似でアミド結合形成に関与するＭｖｄＣ環状化タンパク質、ＡＴＰ把握リガーゼ、ＲｉｍＫ  ＡＴＰ結合タンパク質に類似で２つのエステル結合形成に関与するＭｖｄＤ環状化タンパク質およびＡＴＰ把握リガーゼである。
【００５７】
シクロチド（Ｓａｓｋａら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００７  Ｏｃｔ  ５；２８２（４０）：２９７２１−８）は、スミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）およびウリ科（Ｃｕｒｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）の植物から単離される翻訳後修飾ペプチド群である。性質決定されたＰＴＭ酵素の中で、シクロチド形成に関与する２つのペプチダーゼがある：ＮｂＶｐｅ１ａおよびＮｂＶｐｅ１ｂ。
【００５８】
環状バクテリオシン（Ｍａｑｕｅｄａら  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００８  Ｊａｎ；３２（１）：２−２２）は、グラム陽性細菌から単離される翻訳後修飾ペプチド群に属する。環状（サイクリック）バクテリオシン形成に関与する酵素をコードする遺伝子オペロンが単離され、そして記載されてきているが、候補酵素によって触媒される生化学工程の同定は完了していない。生化学実験から、頭部から尾部への環状化を触媒するペプチダーゼが、環状バクテリオシン形成に関与していると推定されてきている。Ｄ−アラニンへのＬ−アラニンのエピマー化は、特異的エピメラーゼによって触媒される。やはり好ましいのは、ＡｌｂＡ、Ｆｅ−Ｓオキシドレダクターゼ、ＡｌｂＦ、Ｚｎ依存性ペプチダーゼおよびＡｌｂＥ、第二のＺｎ依存性ペプチダーゼのような、サブチロシン形成酵素である。
【００５９】
やはり好ましいのは、ＡｌｂＡ  ＡＰ０１１５４１．１、Ｆｅ−Ｓオキシドレダクターゼ、ＡｌｂＦ  ＡＰ０１１５４１．１、Ｚｎ依存性ペプチダーゼおよびＡｌｂＥ  ＡＰ０１１５４１．１、Ｚｎ依存性ペプチダーゼのようなサブチロシン形成酵素である。
【００６０】
好ましいＰＴＭ酵素の中には、リーダーペプチドからペプチド産物を切断するプロテアーゼがある。通常、ＰＴＭ酵素は、修飾酵素による、および／または搬出機構による認識に少なくとも部分的に関与するリーダー配列を含有する、前駆体ペプチドを修飾する。しかし、リーダーはまた、別個の実体、例えば添加物として、またはリーダー配列を含有する同時発現ベクターを使用した同時発現によって、提供されてもよい。ペプチドおよびリーダーは、次いで、同じ組換え宿主において同時発現されてもよく、そしてペプチドは翻訳後修飾される。あるいは、リーダーおよび酵素は、組換え宿主細胞培養に対する添加物として提供されてもよく、この宿主が次いで、成熟ペプチドを発現することが可能である。ＰＴＭ酵素は、典型的には、翻訳後プロセシングによって、システイン、セリンおよびスレオニン残基を修飾するが、アスパラギンまたはグルタミンのカルボキシル基も修飾して、例えば複素環部分、例えばチアゾールおよびオキサゾール部分を形成する。したがって、ＰＴＭ酵素は、単一タンパク質または単一サブユニット酵素として、ならびに少なくとも２、３または４つの異なる酵素を含むタンパク質酵素複合体として作用して、複素環化を支持することも可能である。特に、機能的に活性である変異体または相同体を含めて、複素環リボソームペプチドの生合成に関与する遺伝子または遺伝子クラスターが、本発明にしたがって使用可能である。好ましくは、天然酵素、例えば生物の溶解物由来の天然起源の酵素を用いてもよい。特に、好ましくは、細菌起源の酵素、例えば細菌溶解物由来のものが用いられる。あるいは、組換え酵素を用いてもよい。別の好ましい態様にしたがって、改変された基質特異性または酵素的活性を持つように操作された、改善された酵素または酵素変異体、好ましくは天然由来酵素の触媒断片を含むものが用いられる。
【００６１】
本発明にしたがって、生物学的またはｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイを含むディスプレイ系によってディスプレイされるペプチド、例えば天然リボソームペプチドあるいは機能的に活性である変異体または相同体の代謝的プロセシングを提供することが初めて可能となる。
【００６２】
代謝的、酵素的プロセシングの修飾プロセスを、ペプチドをディスプレイする複製可能遺伝子パッケージに、そしてペプチドライブラリー一般に適用可能であることがわかった。これは、ペプチドの（多）環構築を導く分子内架橋を生じる。直鎖ペプチドの多くの二次代謝産物は、最初のより大きな前駆体ペプチド由来の誘導体である。真核系の前駆体ペプチドはさらに、機能的に異なるセグメントに細分可能である：Ｎ末端には、シグナルペプチドおよびリーダーペプチドがあり、その後、成熟二次代謝産物にプロセシングされるコアペプチド、および前駆体ペプチドのＣ末端を特徴付ける場合による認識配列が続く。異なるセグメントの提唱される役割は以下の通りである：シグナルペプチドは、特定の細胞内区画への輸送を指示し、シグナルペプチドは翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素の認識モチーフである。コアペプチドは、プロセシングされて成熟二次代謝産物になるセグメントであり、そして認識配列は、コアペプチドセグメントに続くＣ末端の何らかの伸長部分である。一般的に、この群の二次代謝産物の産生に関与する５つの工程がある。まず、前駆体ペプチドをコードするメッセンジャーｍＲＮＡは、リボソームおよび輸送ｔＲＮＡを用いて翻訳される。上述のセグメントからなってもよい前駆体ペプチドは、次いで、コアセグメントを翻訳後修飾して分子架橋を生じ、（多）環構築を導く専用ＰＴＭ酵素によって認識される。プロテアーゼはリーダーペプチドを切断し、そしてしたがってコアペプチドセグメントからリーダーペプチドを分離する。最後に、輸送タンパク質は、成熟した二次代謝産物を膜上で移動させる。リーダーの切断を遮断する特異的突然変異は、本発明にしたがって前駆体ペプチドをディスプレイするのに好適でありうる。
【００６３】
本発明は、特に、アミノ酸側鎖内に、特にアミノ酸側鎖の２つのヘテロ原子間に、少なくとも１つの分子内環状結合を有するペプチドをディスプレイする複製可能遺伝子パッケージ、およびこうしたパッケージを産生する方法であって、例えば
ａ）ペプチドをコードする核酸配列を提供し、
ｂ）複製可能遺伝子パッケージの遺伝子内に前記核酸配列を連結し、
ｃ）前記複製可能遺伝子パッケージの表面上に、対応する一次ペプチド配列をディスプレイして、一次パッケージを得て、そして
ｄ）翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素を用いて前記一次パッケージを酵素的にプロセシングして、前記ペプチドの環状構造をディスプレイする成熟パッケージを産生する
工程を含む、前記方法に関する。
【００６４】
本発明にしたがった複製可能遺伝子パッケージは、好ましくは、ライブラリーのメンバーとして提供され、こうしたライブラリーメンバーは、多様なペプチドをディスプレイし、ペプチドライブラリーとも称される。したがって、本発明はまた、多様なペプチド構造をディスプレイする複製可能遺伝子パッケージのレパートリーを含むそれぞれのペプチドライブラリーを調製するプロセスも提供する。
【００６５】
こうしたライブラリーを産生する好ましい方法は
ａ）ペプチド変異体をコードする核酸配列のレパートリーを提供し、
ｂ）前記レパートリーを複製可能遺伝子パッケージの遺伝子内に連結し、
ｃ）前記パッケージの表面上に、対応する一次ペプチド配列をディスプレイして、一次ライブラリーを得て、そして
ｄ）ＰＴＭ酵素を用いて前記一次ライブラリーを酵素的にプロセシングして、前記ペプチド変異体の環状構造をディスプレイする成熟ライブラリーを産生する
工程を含む。
【００６６】
したがって、多様なペプチドをコードする核酸配列のレパートリーを複製可能遺伝子パッケージの遺伝子内に連結してもよい。
繊維状バクテリオファージ表面にペプチドを係留するため、大部分は、ファージコートタンパク質への遺伝子融合を使用する。好ましいのは、遺伝子ＩＩＩ、遺伝子ＶＩＩＩ、遺伝子ＶＩ、遺伝子ＶＩＩおよび遺伝子ＩＸ、ならびにその断片への融合である。さらに、ファージディスプレイはまた、ファージラムダ上でも達成されてきている。その場合、遺伝子Ｖタンパク質、遺伝子Ｊタンパク質および遺伝子Ｄタンパク質が、本発明の目的によく適合する。遺伝子融合を用いることに加えて、非共有ディスプレイを達成するため、外来の（ｆｏｒｅｉｇｎ）ペプチドまたはタンパク質が、ファージ上にディスプレイされるタグおよびディスプレイしようとするペプチドに融合したリガンドに結合するタグを含む会合ドメインを通じてファージ表面に付着されてきているが、また共有ディスプレイ用のコネクター化合物を含むディスプレイ系もある。
【００６７】
好ましくは、特定の部位で異なる修飾を含む変異体のレパートリーを調製するための足場として、天然リボソームペプチドが用いられる。親構造、例えばリボソームペプチド足場の変異体は、好ましくはあらかじめ決定された機能を持つライブラリーのメンバーを選択するために使用可能なペプチドライブラリーを形成するようグループ分けされる。これと一致して、足場配列は、好ましくは、例えば突然変異誘発法を通じてランダム化される。好ましい戦略にしたがって、ペプチド配列内の特定の位を突然変異させて、複素環のヘテロ原子架橋の新規橋脚を提供する。あるいは、突然変異位は、存在する橋脚とは別であり、したがって、（多）環ペプチド構造を維持しつつ、多様性を生じる。
【００６８】
好ましい態様にしたがって、潜在的にリガンド結合部位に寄与する、結合剤のループ領域または末端領域、例えば１またはそれより多いループ内あるいは末端部位の位を含む親ペプチド配列は、好ましくはライブラリーを生じるよう突然変異するかまたは修飾される。突然変異誘発法は、好ましくは、ランダム、半ランダム、または特に部位特異的ランダム突然変異誘発を使用し、したがって、ランダム化配列を生じて、特に欠失させるか、交換するかまたはランダムに生成された挿入物を導入する。あるいは、好ましくは、コンビナトリアルアプローチを使用する。既知の任意の突然変異誘発法を使用してもよく、その中にカセット突然変異誘発がある。いくつかの場合、位およびアミノ酸を、例えば任意の可能なアミノ酸または好ましいアミノ酸のセレクションをランダムに選択して、配列をランダム化するか、あるいは単純化した規則を用いて、アミノ酸変化を作製する。例えば、すべての残基を好ましくは特定のアミノ酸、例えばアラニンに突然変異させてもよく、これはアミノ酸またはアラニンスキャニングと称される。こうした方法を、より高次のレベルの配列多様性をスクリーニングする選択法を使用する、より洗練された操作アプローチと組み合わせてもよい。
【００６９】
任意の種類のペプチドライブラリーを、ＰＴＭ酵素を使用した代謝性プロセシングおよび成熟に供してもよい。それによって、ライブラリーは、ペプチドの三次元の拘束された構造を通じて改善される。これは、高アフィニティおよび／または高特異性結合剤の可能性を増加させる。
【００７０】
一次ライブラリーは、特に、足場として用いられる天然リボソームペプチドに由来してもよい。しかし、別の好ましい態様にしたがって、ＰＴＭ酵素によって、任意の慣用的なペプチドライブラリーをプロセシングしてもよい。特に、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ技術を用いて、任意のランダムペプチドライブラリーの二次代謝産物を調製してもよい。
【００７１】
本発明にしたがった、ＰＴＭ酵素を通じたペプチドライブラリーの成熟は、特に、核酸のコード機能、ならびにペプチドの物理的、化学的および／または機能的特性を連結させる、多くのディスプレイ系、例えばウイルス、例えばバクテリオファージ、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスディスプレイ、酵母ディスプレイ、真菌ディスプレイ、胞子ディスプレイ、細菌ディスプレイまたはリボソームディスプレイを含む生物学的ディスプレイ系に適用可能であるが、また固定ペプチドディスプレイ、エマルジョン区画化およびディスプレイ、プラスミドディスプレイ、共有ディスプレイ、固相ディスプレイ、マイクロアレイディスプレイ等を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ系にも適用可能である。
【００７２】
通常、本発明記載のペプチドライブラリーは、少なくとも１０６ライブラリーメンバー、より好ましくは少なくとも１０７、より好ましくは少なくとも１０８、より好ましくは少なくとも１０９、より好ましくは少なくとも１０１０、より好ましくは少なくとも１０１１、最大１０１２、さらにより多数のものも可能である。
【００７３】
８量体ランダムペプチド配列を含有するライブラリーは、理論的には２．６ｘ１０１０メンバーの多様性を有する。このライブラリーを構築するため、遺伝子多様性において、１．１ｘ１０１２のメンバーを含む形質転換体が必要である。完全ライブラリーの構築において、実験的限界を回避するため、ランダム化のために制限されたアミノ酸セットを用いるか、または構造的足場内のランダム化を使用するか、いずれでもよい。ループ構造は、典型的には、タンパク質−タンパク質またはタンパク質−ペプチド相互作用の分子認識において重要な役割を果たし、したがって、本発明にしたがって調製されるペプチドライブラリーの好ましい足場候補である可能性もあり、好ましくは複素環のループ構造が用いられる。好ましいライブラリー設計は、酵素環状化の１またはそれより多いあらかじめ決定された橋脚からはずれて、ランダム化を提供する。例えば、好ましく用いられるミクロビリジンＫ内で、ランダム化のための好ましい位置は、Ｔ４、Ｋ６、Ｓ９、Ｄ１０、Ｅ１２およびＥ１３である１またはそれより多い橋脚位とは別である。他のアミノ酸が本質的と見なされる可能性もあり、そしてしたがって、適切なように、突然変異しないように選択される。
【００７４】
特定の態様にしたがって、二次ペプチド構造、例えばジスルフィド架橋を取り込むように化学的にプロセシングされた、拘束されたペプチドライブラリーを、本発明にしたがってＰＴＭ酵素によってプロセシングされる一次ペプチドライブラリーとして用いる。したがって、ＰＴＭ酵素によるペプチドライブラリーの酵素的成熟をトポグラフィック特性およびペプチドライブラリーの多様性に加えることも可能である。
【００７５】
ペプチドのライブラリーまたはレパートリーは、典型的には、酵素活性に適した条件下で、１またはそれより多いＰＴＭ酵素と組み合わされる。ＰＴＭ酵素の酵素活性に適した条件は、当該技術分野に周知であるか、または一般の当業者によって容易に決定可能である。望ましい場合、例えばある範囲のｐＨ条件、酵素濃度、温度の下での酵素活性を評価することによって、そして／またはライブラリーまたはレパートリーおよび酵素が反応を許される時間の長さを変化させることによって、適切な条件を同定するかまたは最適化することも可能である。例えば、いくつかの態様において、ペプチドに対する、例えば突然変異体プランクトスリックス・アガーディー（Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ  ａｇａｒｄｈｉｉ）ＮＩＶＡ  ＣＹＡ  １２６／８（Ｐｈｉｌｍｕｓら  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ（２００８）３０６６−３０７２）の溶解物から得られる酵素の比（モル／モルに基づく）は、少なくとも１：１００，０００、好ましくは少なくとも１：１０，０００、より好ましくは少なくとも１：１，０００、または少なくとも１：１００、または少なくとも１：１０、最大１：１（酵素：ペプチド、ｍｏｌ／ｍｏｌ）である。好ましい範囲は、約０．０１％〜約５％（酵素対ペプチド、ｗ／ｗ）である。１つの態様において、酵素は、少なくとも０．０１、好ましくは少なくとも０．１または少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。混合物を酵素活性に適した温度、例えば２０℃〜約４０℃の範囲、または室温で、好ましくは３０分間から２４時間の期間、特に好ましくは１時間、インキュベーションしてもよい。
【００７６】
例えば、単一の酵素、異なる酵素の任意の所望の組み合わせ、あるいは酵素活性を含有する任意の生物学的調製物、生物学的抽出物、または生物学的ホモジネートを用いてもよい。用いる酵素の同一性が知られている必要はない。単独でまたは任意の望ましい組み合わせで使用可能な適切な酵素の例には、カルボキシレート−アミン・リガーゼ、シクラーゼ、デヒドロゲナーゼ、シクロデヒドラターゼ、ランチオニン結合形成酵素、デカルボキシラーゼ、エピメラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ペプチダーゼ、デヒドラターゼ、トランスフェラーゼ、エステラーゼ、オキシゲナーゼおよびイソメラーゼが含まれる。好ましいＰＴＭ酵素は、生物から、または精製された酵素調製物として入手可能である。好ましい態様において、細胞溶解物または細胞溶解物由来の酵素、例えばｍｖｄＥ遺伝子の欠失により、ミクロビリジンを産生不能である突然変異体プランクトスリックス・アガーディーＮＩＶＡ  ＣＹＡ  １２６／８  ｍｖｄＥ株（ＤＳＭＺに２０１０年７月２８日に寄託された株、プランクトスリックス・アガーディーＣＹＡ  １２６／８、ＤＳＭ２３８７２など）の溶解物を用い、またはＰＴＭ酵素を提供する任意の他の適切な株が使用可能である。
【００７７】
本発明にしたがって用いられるような好ましい例は、ＭｖｄＢ（寄託番号ＡＣＣ５４５４８．１）、ＭｖｄＣ（寄託番号ＡＣＣ５４５４９．１）およびＭｖｄＤ（寄託番号ＡＣＣ５４５５０．１）またはＭｄｎＢ（寄託番号ＣＡＱ１６１２２．１）およびＭｄｎＣ（寄託番号ＣＡＱ１６１２３．１）のようなその相同体である。
【００７８】
酵素活性を含有する適切な生物学的抽出物、ホモジネートおよび調製物には、水性有機溶媒を含む抽出物、溶解物等が含まれる。
本発明の特定の例にしたがって、シアノバクテリア・エラスターゼ阻害剤ミクロビリジンの前駆体ペプチドをコードするｍｖｄＥ遺伝子を、バクテリオファージＭ１３遺伝子ｐＩＩＩ内にクローニングした。次いで、この突然変異体ファージを宿主大腸菌において増殖させ、そしてＭ１３突然変異体ゲノムを配列決定し、そして遺伝子ｐＩＩＩに融合したｍｖｄＥの存在を検査した。続く免疫化学分析によって、突然変異体タンパク質ｐＩＩＩは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動速度を示し、野生型ｐＩＩＩに比較して物理的伸長があることが示された。どちらの実験も、ミクロビリジンの前駆体ペプチドＭｖｄＥがファージＭ１３表面上にディスプレイされていることを検査した。ミクロビリジンは生物活性二次代謝産物であり、プランクトスリックス属種のような異なるシアノバクテリアによって産生される。これはＮ末端でアセチル化された三環ペプチド（１４量体）であり、そしてアミノ酸配列アセテート−ＹＧＮＴＭＫＹＰＳＤＷＥＥＹ（配列番号１）（前駆体ペプチドＭｖｄＥ寄託番号ＥＵ４３８８９５．１）を示す。
【００７９】
その生合成は、ＰＴＭ酵素による翻訳後修飾を含めてリボソームに由来する。ミクロビリジン生合成に関連する遺伝子クラスターは、Ｐｈｉｌｍｕｓら（２００８、上記参考文献）によって同定された。Ｐｈｉｌｍｕｓら（上記参考文献）によって提供される突然変異体プランクトスリックス・アガーディーＣＹＡ  １２６／８デルタｍｖｄＥ株は、ｍｖｄＥ遺伝子の欠失によって、ミクロビリジンを産生不能である。細胞溶解物をミクロビリジン欠損株から産生し、そしてＭ１３突然変異体ファージ粒子とインキュベーションした。溶解物処理突然変異体ファージ粒子の続く免疫化学分析によって、溶解物処理ｐＩＩＩタンパク質に関して、異なる移動速度が示され、ディスプレイされたＭｖｄＥ前駆体ペプチドが一部切除されていることが示された。これは、リーダーセグメントがコアペプチドから遊離する際の、リボソーム由来二次代謝産物の成熟工程と一致する。したがって、ファージのヌクレオカプシド上にディスプレイされるＭｖｄＥ前駆体ペプチドの成功した成熟の証拠が得られた。ファージ表面上にディスプレイされたＭｖｄＥ前駆体ペプチドからプロセシングされた、アセチル化三環ミクロビリジンの存在に関する物理的証拠は、質量分析の方法を適用することによって得られた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、溶解物で処理されそして一部切除されたｐＩＩＩ−ＭｖｄＥタンパク質を分離し、そして同定した。対応するバンドをゲルから単離した後、タンパク質を抽出し、そしてキモトリプシンで消化して、質量分析によって分析可能なペプチド断片を得た。単離されたタンパク質から得られた質量の分析の後、質量を検出し、これは、アセチル化三環ミクロビリジンの質量と同一であった。これらの実験は、リボソーム的に得られた翻訳後修飾二次代謝産物をファージ表面上でプロセシングする可能性に関する特定の証拠を提供する。
【００８０】
代謝プロセシングに際して、適切なペプチド構造を持つライブラリーメンバーを分析してもよい。選択のさらなるラウンドのため、またはさらなるレパートリーを調製するため、例えばさらなる特異的ランダム化に向けたさらなる酵素的プロセシングのため、例えば特異性またはアフィニティ成熟目的を改善するため、核酸またはペプチドの十分な量を得るために、選択されるペプチドをコードする核酸コピー数を増幅するかまたは増加させることが好ましい可能性もある。例えば、ファージ増幅、細胞増殖またはＰＣＲ技術を使用してもよい。好ましい態様において、ディスプレイ系は、バクテリオファージディスプレイであり、そして増幅は、大腸菌における発現を通じる。
【００８１】
本発明にしたがって、所望の活性を有するペプチドが所望の活性を持たないペプチドとは区別され、そしてこれらよりも選択されることを可能にする、所望の結合または生物学的活性選択法を用いて、リガンド結合ペプチドをペプチドライブラリーから選択してもよい。一般的に、非常に過剰な非結合パッケージから関心対象の複製可能遺伝子パッケージを分離するには、１またはそれより多い選択ラウンドが必要である。ペプチド活性に関する適切なアッセイを用いて、さらなる性質決定のため、ライブラリーメンバーを選択してもよい。例えば、適切な結合アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、パニングを用いて、一般的なリガンド結合機能を評価してもよい。例えば、パニングによって、ターゲットリガンドに結合するペプチドを選択し、そして回収してもよい。当該技術分野に周知の技術によって、パニングを達成してもよい。
【００８２】
好ましくは、ファージディスプレイペプチドライブラリーのスクリーニングは、バイオパニングと称されるアフィニティ選択プロセスを通じて達成される。バイオパニングは、典型的には、ターゲットとペプチドライブラリーをインキュベーションし、未結合ファージを洗い流し、残った結合ファージを溶出し、そして続くスクリーニングラウンドのため、溶出したファージを増幅する工程を含む。バイオパニングの多数のラウンドの後、ターゲット結合ファージを濃縮することが可能であり、そして個々のファージを単離し、そして配列決定して、濃縮された結合モチーフをいずれも明らかにする。
【００８３】
ファージディスプレイ系を用いる場合、好ましくは、ファージＥＬＩＳＡにおいて結合を試験する。任意の適切な方法にしたがって、ファージＥＬＩＳＡを行ってもよい。１つの例において、選択の各ラウンドで産生されるファージ集団を、選択されたリガンドに対するＥＬＩＳＡによって、結合に関してスクリーニングして、リガンド結合ペプチドをディスプレイするファージを同定してもよい。一般的に用いられる方法にしたがって、例えばＣまたはＮ末端タグに対する試薬を用いたＥＬＩＳＡによって、リガンドへの結合に関して、可溶性ペプチドを試験してもよい。また、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動によって、またはベクターＤＮＡの配列決定によって、選択されたファージの多様性を評価してもよい。
【００８４】
また、ターゲット適用に応じて、触媒または酵素阻害活性に基づいて特異的ペプチドを選択してもよく、こうした活性は酵素活性アッセイを用いて測定可能である。適切なペプチドをスクリーニングするためのさらなる生物学的試験は、適切な細胞に基づくアッセイを使用した、所望の抗生物質、抗真菌、または他の生物活性、例えば阻害剤または補因子活性、例えば酵素阻害剤または増進剤活性に基づく。
【００８５】
適切なリガンドターゲットは、好ましくは、微生物、例えば細菌、真菌、寄生虫またはウイルスだけでなく、また、ヒトまたは動物細胞の構造またはエピトープより選択され、これにはタンパク質、特に酵素、酵素の補因子、受容体、増殖因子、ＤＮＡ結合タンパク質、核酸、脂質および炭水化物が含まれる。
【００８６】
結合ペプチドまたは該ペプチドをコードするＤＮＡを複製可能遺伝子パッケージより単離して、そして性質決定してもよい。適用型に応じて、次いで、リードペプチドを合成するかまたは標準的分子生物学的技術と組み合わせて、ペプチド融合物をコードする構築物を作製してもよい。ペプチドまたはペプチド融合構築物を調製する適切な方法は、例えば、組換え発現技術、例えば組換え細菌または酵母細胞による発現を使用する。
【００８７】
本発明にしたがって同定され、そして提供されるペプチドを、療法または診断試薬に発展させるためのリードとして利用してもよいし、あるいは特異的でそして差別的な薬剤送達のために、ユニークな分子実体をターゲットとするように操作してもよい。特に好ましい適用は、生物学的ターゲットのミモトープの分野にあり、例えば阻害剤、例えば抗細菌、抗真菌、抗寄生虫、抗ウイルス、酵素阻害剤および抗生物質として使用するため、またはワクチンを開発するためのものである。さらなる適用は、リガンド結合部分を使用する、産業、分析または環境適用のために実行可能である。
【００８８】
本発明にしたがって得られるペプチドを含む薬学的組成物は、典型的には、当業者に周知の少なくとも１つの薬学的に許容されうる賦形剤をさらに含む。薬学的組成物は、少なくとも１つの他の生物学的活性剤をさらに含んでもよい。適切な剤はまた、当業者に周知である。本発明にしたがって得られるような好ましいペプチド組成物は、安定化分子、例えばアルブミンまたはポリエチレングリコール、あるいは塩を含んでもよい。好ましくは、用いられる添加物は、ペプチドの所望の生物学的活性を保持し、そしていかなる望ましくない毒性学的影響も与えないものである。
【００８９】
本明細書記載の実施例は、本発明を例示し、そして限定となることは意図されない。本発明の異なる態様が、本発明にしたがって記載されてきている。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載し、そして例示する技術に対して、多くの修飾および変動を行ってもよい。したがって、実施例は例示のみであり、そして本発明の範囲を限定しないことを理解すべきである。
【実施例】
【００９０】
実施例１：ミクロビリジンのファージディスプレイ
ファージＭ１３のゲノム内へのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のクローニング
ファージＭ１３のゲノムＤＮＡをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  ＧｍｂＨより購入した。１μｇのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ）と３７℃で１時間インキュベーションした。製造者の推奨にしたがって、消化したＤＮＡをＫｌｅｎｏｗ断片（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ）と３７℃で２０分間インキュベーションした。インキュベーション後、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨのＰＣＲ精製キットを用いることによって、試料を精製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．のＮＤ−１０００分光光度計を用いて、精製したＤＮＡを定量化した。
【００９１】
製造者の推奨にしたがって、ＭＷＧ  Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＧｍｂＨより購入した特異的オリゴヌクレオチドＣＡＴ＋およびＣＡＴ−、ならびにＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｏｙ）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、ＣＡＴ遺伝子の増幅用のテンプレートＤＮＡとして、プラスミドＤＮＡ  ｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＧｍｂＨ）を用いた。ＰＣＲ終結後、エチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＧｍｂＨ）で染色したアガロースゲル（０．８％）上に試料を装填し、そして分離した。終結後、アンプリコン・バンドをＵＶ光で視覚化し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）で、ゲルから単離し、そして精製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．のＮＤ−１０００分光光度計を用いて、精製ＤＮＡを定量化した。
【００９２】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ）を用いて、等モル量の増幅ＣＡＴ  ＤＮＡおよびファージＭ１３  ＤＮＡを連結した。デバイス上にあらかじめインストールされた大腸菌用の標準的エレクトロポレーション・プログラムでＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ  ＧｍｂＨ）を用いた大腸菌Ｋ１２株２７３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のエレクトロポレーションのために、試料アリコットを用いた。１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＧｍｂＨ）を補充したＬＢ寒天プレート上に全試料をプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、１つの単一コロニーを用いて、１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した５０ｍｌの液体ＬＢに接種し、そして勢いよく振盪しながら、３７℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ遠心分離装置、Ｄｕｐｏｎｔ，  Ｉｎｃ．中で懸濁物を遠心分離した。ＧｅｎｅＪｅｔプラスミド・ミニプレップキット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ）を用いて、ペレットからＤＮＡを単離した。特異的オリゴヌクレオチドＭ１３Ｃｍ＋およびＭＷＧ  Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＧｍｂＨによって適用されるビッグ・ダイ・ターミネーター技術を用いたＤＮＡ配列決定によって、ファージＭ１３ゲノム内へのＣＡＴ遺伝子の組込み成功を確認した。
【００９３】
以降、ファージをＭ１３ＫＥＣｍと称した。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ５２ＩおよびＡｃｃ６５Ｉ（どちらもＦｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ）によって、ＤＮＡを二重消化した。終結後、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）を用いて試料を精製し、そして分光光度測定によってＤＮＡを定量化した。
【００９４】
製造者の推奨にしたがったＰＣＲによって、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｏｙ）およびシアノバクテリウム、プランクトスリックス・アガーディーＣＹＡ  １２６／８（プランクトスリックス・アガーディーＮＩＶＡ  ＣＹＡ  １２６／８、ＤＳＭＺ寄託日２０１０年７月２８日、ＤＳＭ２３８７２）由来のテンプレートＤＮＡとともに、ｍｖｄＥ遺伝子の増幅のため、オリゴヌクレオチドｍｖｄＥ＋およびｍｖｄＥ−を用いた。オリゴヌクレオチドｍｖｄＥ＋は、Ａｃｃ６５Ｉのインフレーム制限認識配列を生じる６ｂｐ伸長を５’端に所持し、そしてオリゴヌクレオチドｍｖｄＥ−は、Ｅｃｏ５２Ｉのインフレーム制限認識配列を生じる６ｂｐ伸長を５’端に所持した。したがって、オリゴヌクレオチドｍｖｄＥ＋およびｍｖｄＥ−を伴うＰＣＲから生じたアンプリコンは、Ｅｃｏ５２ＩおよびＡｃｃ６５Ｉの両方の導入制限認識配列を所持した。ＰＣＲ終結後、エチジウムブロミドで染色したアガロースゲル（３％）上に試料を装填し、そして分離した。終結後、アンプリコン・バンドをＵＶ光で視覚化し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）で、ゲルから単離し、そして精製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．のＮＤ−１０００分光光度計を用いて、精製ＤＮＡを定量化した。１μｇのＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＡｃｃ６５ＩおよびＥｃｏ５２Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ）での二重消化に用いた。インキュベーション後、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）を用いて、試料を精製した。ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて、精製したＤＮＡを定量化した。
【００９５】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ）を用いて、等モル量の二重消化ｍｖｄＥ  ＤＮＡおよびファージＭ１３ＫＥＣｍ  ＤＮＡを連結した。デバイス上にあらかじめインストールされた大腸菌用の標準的エレクトロポレーション・プログラムでＢｉｏｒａｄ  ＧｍｂＨのＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒを用いた大腸菌Ｋ１２株２７３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＧｍｂＨ）のエレクトロポレーションのために、試料アリコットを用いた。１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＧｍｂＨ）を補充したＬＢ寒天プレート上に全試料をプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、１つの単一コロニーを用いて、１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した５０ｍｌの液体ＬＢに接種し、そして勢いよく振盪しながら、３７℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ遠心分離装置、Ｄｕｐｏｎｔ，  Ｉｎｃ．中、１０，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間、懸濁物を遠心分離した。ＧｅｎｅＪｅｔプラスミド・ミニプレップキット、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨを用いて、ペレットからＤＮＡを単離した。
【００９６】
特異的オリゴヌクレオチドＭ１３ＫＥ＋およびＭＷＧ  Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＧｍｂＨによって適用されるビッグ・ダイ・ターミネーター技術を用いたＤＮＡ配列決定によって、ファージＭ１３ＫＥＣｍのｐＩＩＩ遺伝子内へのｍｖｄＥ遺伝子のインフレーム組込み成功を確認した。
【００９７】
配列を図１に提供する：ｍｖｄＥに融合したｐＩＩＩ遺伝子の配列（図１ａ）；ファージタンパク質ｐＩＩＩの翻訳されたアミノ酸配列（図１ｂ）：太字はＭｖｄＥ前駆体ペプチドを指し、下線文字はコアペプチドを指す。
【００９８】
ファージＭ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥ大量増幅
以降、ファージをＭ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥと称した。デバイス上にあらかじめインストールされた大腸菌用の標準的エレクトロポレーション・プログラムでＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ  ＧｍｂＨ）を用いた大腸菌Ｋ１２株２７３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＧｍｂＨ）のエレクトロポレーションのために、１００ｎｇ  ＤＮＡを用いた。１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充したＬＢ寒天プレート上に全試料をプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、１つの単一コロニーを用いて、１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した３ｍｌの液体ＬＢに接種し、そして勢いよく振盪しながら、３７℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、３００μｌの懸濁物を用いて、１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した３００ｍｌの液体ＬＢに接種し、そして勢いよく振盪しながら、３７℃で４．５時間インキュベーションした。インキュベーション後、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ遠心分離装置、Ｄｕｐｏｎｔ，  Ｉｎｃ．中、４℃で１０分間、懸濁物を遠心分離し、そして上清を新鮮なバケットに移し、そして同じ条件下で再遠心分離した。次いで、上清（２８０ｍｌ）を新鮮なバケットに移し、そして４５ｍｌのＰＥＧ−ＮａＣｌ緩衝液（２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール−８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＧｍｂＨ））を添加し、勢いよく混合して、そして４℃で一晩インキュベーションした。Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ遠心分離装置（Ｄｕｐｏｎｔ，  Ｉｎｃ．）中、１０，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間、試料を遠心分離した。遠心分離後、上清を完全に取り除き、そして白色ペレットを２ｍｌのＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＧｍｂＨ）中に再懸濁し、そして４℃で保存した。
【００９９】
同様に、ファージＭ１３ＫＥＣｍを大量に産生し、そして４℃で保存した。
ファージ粒子のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ  Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏｒａｄ  ＧｍｂＨ）を用いて、６％のゲル強度で、すべてのＰＡＧＥ分析を行った。全部で１０μｌのファージ試料Ｍ１３ＫＥＣｍ（陰性対照）およびＭ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥをゲル上に装填し、そして製造者のガイドラインにしたがって分離した。終結後、製造者によって推奨される半乾燥ブロッティング法によって、ゲルをＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏｒａｄ  ＧｍｂＨ）上にブロッティングした。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＧｍｂＨから得たファージＭ１３のｐＩＩＩタンパク質に対する一次抗体を用いた免疫化学分析に、膜を用いた。膜の現像後、ファージＭ１３ＫＥＣｍのｐＩＩＩバンドおよびファージＭ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥのｐＩＩＩの間の明らかなサイズ相違が見られ、Ｍ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥファージにおけるｐＩＩＩのサイズ伸長が示された。
【０１００】
ファージＭ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥの溶解物処理
シアノバクテリウム、プランクトスリックス・アガーディーＣＹＡ  １２６／８  ＤｅｌＭｖｄＥ（Ｐｈｉｌｍｕｓら（２００８）  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．  ９（１８）：３０６６−７３）の突然変異体株１５０ｍｌを遠心分離し、そしてＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８  １ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＧｍｂＨ）で３回洗浄した。最後の遠心分離後、細胞ペレットを１ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３に再懸濁し、そして最終濃度１０ｍＭまで、ベータ−メルカプトエタノールを新鮮に添加する。これらはどちらもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＧｍｂＨから得られた。すべての続く工程を氷上で行った。懸濁物を細胞破壊容器（Ｐａｒｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＧｍｂＨ）に移し、そして１１０バールの圧を適用した後、懸濁物をバルブに通過させた。これらのサイクルを３回実行し、そして完了後、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ遠心分離装置、Ｄｕｐｏｎｔ，  Ｉｎｃ．中、１０，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間、懸濁物を遠心分離した。上清を新鮮な試験管に移し、そしてさらなる使用まで氷上に維持した。
【０１０１】
１００μｌのファージ懸濁物Ｍ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥを５００μｌの上記溶解物と混合し、そして２２℃で１時間インキュベーションした。終結後、懸濁物を１／６体積のＰＥＧ／ＮａＣｌ緩衝液で処理し、そして４℃で一晩インキュベーションした。Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ遠心分離装置、Ｄｕｐｏｎｔ，  Ｉｎｃ．中、１０，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間、試料を遠心分離した。遠心分離後、上清を完全に取り除き、そして緑がかったペレットを、１ｍｌのＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中に再懸濁し、そして４℃で保存した。上記方法にしたがって、第二の洗浄工程を適用した。最後に、ペレットを４０μｌ  ＴＢＳ中に再懸濁した。総量３０μｌの溶解物処理を伴わないファージ試料Ｍ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥ（陰性対照）および溶解物処理後のＭ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥをゲル上に装填し、そして製造者のガイドラインにしたがって分離した。終結後、製造者によって推奨される半乾燥ブロッティング技術によって、ゲルをＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏｒａｄ  ＧｍｂＨ）にブロッティングした。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＧｍｂＨから得たファージＭ１３のｐＩＩＩタンパク質に対する一次抗体を用いた免疫化学分析に、膜を用いた。膜の現像後、溶解物処理を伴わないファージＭ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥのｐＩＩＩバンドおよび溶解物処理を伴うファージＭ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥのｐＩＩＩの間の明らかなサイズ相違が見られ、Ｍ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥファージにおけるｐＩＩＩのサイズ一部切除が示された。このサイズ相違は、ファージヌクレオカプシド上にディスプレイされた前駆体ペプチドの翻訳後修飾が成功した後、該ペプチドは３５アミノ酸短くなるはずであると解釈された。
【０１０２】
上述のようなＳＤＳ  ＰＡＧＥを反復し、そしてゲルをクーマシー染色（Ｂｉｏｒａｄ  ＧｍｂＨ）に用いた。溶解物で処理したファージＭ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥのｐＩＩＩのタンパク質バンドを単離して、そして質量分析に用いた。Ｐｒｏｔｅｏｍ  Ｆａｃｔｏｒｙ  ＧｍｂＨによって質量分析を行った。１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を２０分間、その後、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、８０％アセトニトリル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（ｖ／ｖ）、ｐＨ８．０を２０分間、添加し、そして除去することによって、タンパク質バンドを洗浄した。洗浄工程を２回反復した後、上清を取り除き、そして消化するため、２００ｎｇキモトリプシンを２０μｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５％ＡＣＮ（ｖ／ｖ）、ｐＨ８．０中でタンパク質バンドに２５℃で一晩添加した。溶液を１Ｖｏｌの２％ギ酸で酸性化し、そして３０分間インキュベーションした。Ｋｏｓｏｌら（２００９  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．  ４４：４９−６２）に記載される勾配を用いたＨＰＬＣ（Ｈｅｗｌｅｔｔ＆Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｃ．）によって、株、プランクトスリックス・アガーディーＣＹＡ  １２６／８から、ミクロビリジンＫ純粋物質（Ｐｈｉｌｍｕｓら  ２００８、上記参考文献）を単離した。
【０１０３】
２０μｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、ｐＨ８．０中、およそ１０ｎｇの純粋ペプチドを２００ｎｇのキモトリプシンと２５℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、溶液を１Ｖｏｌの２％ギ酸で酸性化し、そして３０分間インキュベーションした。２０μｌの両試料を、溶媒Ａ（０．１％ギ酸／５％アセトニトリル／９４．９％ｄｄＨ２Ｏ）および溶媒Ｂ（０．１％ギ酸／９９．９％アセトニトリル）で、５％Ｂから始まり４０％Ｂまで、５０分間のｎａｎｏＬＣ勾配（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｎａｎｏＬＣ系）を用いて、高解像度ｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＦＴ−ＩＣＲ  ＭＳ）分析に適用した。質量精度は、ＭＳに関しては５ｐｐｍでよりよく、ＭＳＭＳに関しては０．５Ｄａでよりよかった。分析されるタンパク質のアミノ酸配列を含むカスタム・データベースを用いて、Ｍａｓｃｏｔサーバーによって、ＭＳデータを分析した。
【０１０４】
理論的質量計算：ミクロビリジンＫの単一同位体質量は、１７７１．７００３８Ｄａ（Ｐｈｉｌｍｕｓら  ２００８）であり、これは、二重荷電質量ｍ／ｚに関しては、８８５．８５０１９Ｄａを生じる。
【０１０５】
結果を図２（参照）および３（Ｍ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥ）に提供する。
解釈：
アセチル化三環ペプチド、ミクロビリジンＫを、ＨＰＬＣによって単離し、そしてＦＴＭＳでの測定の前に、およそ１０ｎｇの純粋ペプチドをキモトリプシンで処理した。８８５．８５３２Ｄａの質量が検出可能であり、これは、ミクロビリジンＫの８８５．８５０１９Ｄａの理論的に計算された質量によく適合する。したがって、純粋ミクロビリジンのキモトリプシン処理は、ペプチドの切断を生じず、これはミクロビリジンＫの環状の性質に一致する。
【０１０６】
第二のＦＴＭＳ測定で用いる試料は、ファージＭ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥの単離ｐＩＩＩタンパク質に相当する。ファージＭ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥは、ＭｖｄＥの前駆体タンパク質にＮ末端融合しているｐＩＩＩタンパク質をディスプレイし、そしてこのファージをプランクトスリックス・アガーディーＮＩＶＡ  ＣＹＡ  １２６/８  ＤｅｌＭｖｄＥの細胞溶解物で処理した。こうして処理されたファージＭ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥをＳＤＳ  ＰＡＧＥ分離に用い、そして修飾ｐＩＩＩ−ＭｖｄＥタンパク質に相当するタンパク質バンドを単離し、そしてゲルから抽出した。溶解物由来のＰＴＭ酵素で、ディスプレイされたｐＩＩＩ−ＭｖｄＥのプロセシングに成功した後、生成された三環ミクロビリジンＫは、ｐＩＩＩタンパク質にＮ末端で付着していると推定される。ミクロビリジンＫのＣ末端アミノ酸はチロシンである。キモトリプシンは、アミド結合のカルボキシル側がチロシンであるアミド結合を優先的に切断するタンパク質分解酵素であるため、これを用いて、ミクロビリジンＫの後を正確に切断し、そしてファージタンパク質ｐＩＩＩから遊離させる。実際、図３に示す質量スペクトルは、図２に示すような参照質量に対して５ｐｐｍの質量精度内で同一の質量を示す。これは、プランクトスリックス・アガーディーＮＩＶＡ  ＣＹＡ  １２６/８  ＤｅｌＭｖｄＥの溶解物中に含有されるＰＴＭ酵素を用いると、ディスプレイされた前駆体ペプチドＭｖｄＥが、ファージＭ１３ＫＥＣｍＭｖｄＥ上に付着し、そしてディスプレイされたままでＰＴＭ酵素によって完全に翻訳後修飾されることの証拠である。
【０１０７】
本明細書記載のデータは、ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質に物理的に連結されたままで、翻訳後修飾ペプチド（ミクロビリジン）のメンバーを生成可能であることを明らかにする。
【０１０８】
実施例２：ペプチドライブラリーの生成
ミクロビリジンＫは、アミノ酸配列Ｙ１Ｇ２Ｎ３Ｔ４Ｍ５Ｋ６Ｙ７Ｐ８Ｓ９Ｄ１０Ｗ１１Ｅ１２Ｅ１３Ｙ１４（配列番号１を参照されたい）を含む三環ペプチドであり、ここで、分子内架橋に関与するアミノ酸残基は、Ｔ４、Ｋ６、Ｓ９、Ｄ１０、Ｅ１２およびＥ１３である。したがって、１、２、３、５、７、８、１１、１４位は、可変と見なされ、そして好ましくは架橋の数および架橋パターンに干渉しないランダム化のために用いられる。１、２、３、５、７、８、１１、１４位のアミノ酸残基のランダム化は、固相合成（ＭＷＧ  Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＧｍｂＨ）から得られるオリゴヌクレオチド混合物の同化作用によって行われる。
【０１０９】
オリゴヌクレオチド配列は、以下の通りである：
（ＮＮＫ）ｎ．ＡＣＴ．ＮＮＫ．ＡＡＧ．ＮＮＫ．ＮＮＫ．ＴＣＣ．ＧＡＴ．ＮＮＫ．ＧＡＡ．ＧＡＡ．（ＮＮＫ）ｎ（配列番号４）。典型的には、縮重した（ｒｅｄｕｃｅｄ）遺伝暗号の使用を通じて、ライブラリーオリゴヌクレオチドＤＮＡをランダム化することによって、ファージディスプレイペプチドライブラリー内に多様性を導入する。例えば、縮重コドンＮＮＫ（ここで、Ｎは、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンヌクレオチドの各２５％の混合物を示し；そしてＫはチミンおよびグアニンヌクレオチドの各５０％の混合物を示す）を、ライブラリーＤＮＡ構築に用いる。Ｔ４をコードするトリプレットもまた、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＡであってもよい。トリプレットＡＡＡのさらなる可能性を伴って、同じ戦略をＫ６に、そして他の９、１０、１２および１３位に使用してもよい。また、５’端および３’端の異なるトリプレット数の伸長は、（ＮＮＫ）ｎトリプレット（Ｎ＝ＧＡＴＣおよびＫ＝ＧＴ、ｎは０〜１００の整数である）の付加によって産生される。ｐＩＩＩをコードする遺伝子内へのオリゴヌクレオチドの組込みは、確立されたプロトコル（例えば、ＳａｍｂｒｏｃｋおよびＲｕｓｓｅｌ  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  第３版  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ）にしたがって行われる。ファージ上にディスプレイされた前駆体ＭｖｄＥペプチドの翻訳後修飾はまた、精製酵素、とりわけ、ＭｖｄＢ（寄託番号ＡＣＣ５４５４８．１）、ＭｖｄＣ（寄託番号ＡＣＣ５４５４９．１）およびＭｖｄＤ（寄託番号ＡＣＣ５４５５０．１）、またはＭｄｎＢ（寄託番号ＣＡＱ１６１２２．１）およびＭｄｎＣ（寄託番号ＣＡＱ１６１２３．１）のようなその相同体を用いて行われる。
【０１１０】
Ｏｍａｎおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｎｋ（２０１０）（Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ２０１０  Ｊａｎ；６（１）：９−１８）にも記載される翻訳後修飾ペプチドは、２つの原理的に異なるクラスに細分されうる：１つのクラスは、とりわけミクロビリジン、ラクチシン、チオストレプトン、コノペプチドのようなメンバーによって構成され、これらは、前駆体ペプチドのＣ末端アミノ酸がまた、完全にプロセシングされたコアペプチドのＣ末端アミノ酸であるという共通の特徴を有する。とりわけパテルアミド（ｐａｔｅｌｌａｍｉｄｅ）、アマニチンのような第二のクラスのメンバーは、前駆体ペプチドからタンパク質分解的に切除される共通の特徴を示す。最初に言及したクラスに関して、その前駆体ペプチドを、ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質と連結して、そしてこれらが産生生物由来の溶解物とともに、または専用の精製ＰＴＭ酵素とともにディスプレイされ、そしてその生合成が、前駆体ペプチドのＣ末端アミノ酸からコアペプチドが分離される工程を伴わないため、ウイルスに連結されたまま維持されてディスプレイされるようにプロセシングすることが可能である。したがって、遺伝情報およびウイルス表面上にディスプレイされる構造の間の物理的連結は、その生合成のすべての工程の間、クラス１  ＰＴＭペプチドのすべての代表に関して維持される。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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