(57)【要約】  本発明は、細胞内で細胞内物質の生理活性機能を調節する調節物質を検出する方法を提供する。本発明は、磁力線方向に磁化される磁性物質のパターンと、細胞内物質と結合した標識物質のパターンとをイメージ化して、細胞内でリファレンス物質と調節物質との間の競争反応可否を決定することによって、細胞内物質の生理活性機能を調節することができる調節物質を検出することができる。本発明は、薬物のような調節物質およびリファレンス物質に対する細胞内物質の反応が生きた細胞の中で起こるため、調節物質とリファレンス物質との間の競争反応が実際に細胞内の物質代謝を反映する利点がある。本発明は、少数のリファレンス物質を利用して多数の調節物質をスクリーニングすることができるという利点を提供し、リファレンス物質の導入によって調節物質の変形なしに調節物質の細胞内作用、すなわち、薬効などを探索できる利点を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁場により磁力線方向に磁化される磁性物質であって、ナノ単位で粒子化され、表面が改質された磁性物質を複数個準備する段階と、
細胞内物質の生理活性機能を調節すると知られているリファレンス物質を前記磁性物質と連関させる後、前記リファレンス物質と前記磁性物質を細胞内に提供し、かつ、一つの細胞を基準に前記リファレンス物質と連関された前記磁性物質を複数個提供する段階と、
前記リファレンス物質と結合する細胞内物質を、前記磁性物質のパターンをイメージ化する標識物質と連関させ、前記細胞内物質と前記標識物質を細胞内に提供する段階と、
前記リファレンス物質との競争反応可否の確認対象となる調節物質を細胞内に提供する段階と、
前記細胞に収束された磁場を印加し、磁力線束（ｂｕｎｄｌｅ）が前記細胞に対して一定方向に通過するようにする段階と、
前記細胞内で前記磁場の磁力線方向に複数個の磁性物質が配列になるようにする段階と、
前記磁性物質の配列パターンと前記標識物質のパターンをイメージ化して確認する段階とを含む、細胞内で細胞内物質の生理活性機能を調節する調節物質を検出する方法。
【請求項２】
前記磁性物質のパターンと、前記標識物質のイメージ化されたパターンを確認し、前記磁性物質のパターンと、前記標識物質のイメージ化されたパターンが重畳（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）するか否かを確認する段階とをさらに含む、請求項１に記載の細胞内で細胞内物質の生理活性機能を調節する調節物質を検出する方法。
【請求項３】
前記細胞内物質に対して前記調節物質が前記リファレンス物質と競争反応をする場合は、前記調節物質が前記細胞内物質と結合し、前記磁性物質のパターンと前記標識物質のイメージ化されたパターンが重畳しないことを特徴とする、請求項２に記載の細胞内で細胞内物質の生理活性機能を調節する調節物質を検出する方法。
【請求項４】
前記細胞内物質に対して前記調節物質が前記リファレンス物質と競争反応をしない場合は、前記リファレンス物質が前記細胞内物質と結合し、前記磁性物質のパターンと前記標識物質のイメージ化されたパターンが重畳することを特徴とする、請求項２に記載の細胞内で細胞内物質の生理活性機能を調節する調節物質を検出する方法。
【請求項５】
前記リファレンス物質と前記磁性物質とを生きた細胞内に提供した後、これらを生きた細胞の細胞質に露出させる段階とをさらに含む、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の細胞内で細胞内物質の生理活性機能を調節する調節物質を検出する方法。
【請求項６】
前記リファレンス物質と前記磁性物質とを生きた細胞の細胞質に露出させる前に、  前記調節物質を生きた細胞内に提供することを特徴とする、請求項５に記載の細胞内で細胞内物質の生理活性機能を調節する調節物質を検出する方法。
【請求項７】
前記細胞内物質が細胞膜に結合される特性を持つ場合には、前記細胞内物質の細胞膜結合特性を除去することを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の細胞内で細胞内物質の生理活性機能を調節する調節物質を検出する方法。
【請求項８】
前記細胞内物質がＢＬＫ、ＦＧＲ、ＬＹＮ、ＳＲＣまたはＹＥＳ１蛋白質である場合には、この蛋白質の２番目のアミノ酸であるグリシンをアラニンに置換して、前記細胞内物質の細胞膜結合特性を除去することを特徴とする、請求項７に記載の細胞内で細胞内物質の生理活性機能を調節する調節物質を検出する方法。
【請求項９】
前記細胞内物質がＫＩＴ蛋白質である場合には、ＫＩＴ蛋白質のアミノ酸５４５−９７６の部位だけを生きた細胞内に提供して、前記細胞内物質の細胞膜結合特性を除去することを特徴とする、請求項７に記載の細胞内で細胞内物質の生理活性機能を調節する調節物質を検出する方法。
【請求項１０】
前記細胞内物質がＡＢＬ１蛋白質である場合には、ＡＢＬ１の活性ドメイン（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）だけを生きた細胞内に提供して、前記細胞内物質の細胞膜結合特性を除去することを特徴とする、請求項７に記載の細胞内で細胞内物質の生理活性機能を調節する調節物質を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内で細胞内物質の生理活性機能を調節する調節物質を検出する方法  に関するものであって、さらに詳しくは、磁力線方向にパターンを示す標識物質をイメージ化して、細胞内でリファレンス物質と調節物質との間の、細胞内物質に対する競争反応可否を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の生理活性機能は、多様な細胞内物質（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）、例えば、蛋白質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、糖（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、脂質（ｌｉｐｉｄｓ）などの高分子化合物と、アミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ビタミン（ｖｉｔａｍｉｎｓ）、アミン（ａｍｉｎｅｓ）、その他、低分子有機化合物（ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）などの低分子化合物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）により調節され、維持される。細胞内物質の正常な生理活性機能が妨げられたまたは阻害された場合、病気が発生し、正常ではない機能を示す細胞内物質に起因する疾患を治療するために調節物質を用いて、細胞の生理活性機能を正常化するための多くの試みが製薬およびバイオテクノロジー業界で試みられてきた。
【０００３】
細胞の生理活性機能を調節する調節物質の開発のために伝統的に試験管内の結合検証（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）、バクテリオファージディスプレイ技術（ｂａｃｔｅｒｉｏ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）（米国公開特許第ＵＳ２００５／０００９０９９Ａ１号（特許文献  １）；  米国公開特許第ＵＳ２００８／００５８２１９Ａ１号（特許文献  ２））、親和性クロマトグラフィー  技術（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ  ２００６／１３４０５６Ａ１号（特許文献３））等が使用されている。しかし、このような伝統的な方法は、人体由来の蛋白質を大腸菌でつくるために蛋白質の形態的変形を多く加えて蛋白質の大部分が元のサイズよりも小さく、人体由来の蛋白質を大腸菌で得たので本来の形と機能を持っていると断言することが難しい。または、蛋白質と薬物の反応が人為的な組成の溶液内で起こるので、細胞内で起きる現象とは異なる場合があり、特に蛋白質と薬物との反応結果を直接確認するのではなく２次的な実験を介して間接的に確認するため、偽陽性率（薬物と反応しなかったのに、まるで薬物と反応したような誤った結果を得る割合）が高くなるなどの問題がある。また、細胞破砕に使用される破砕緩衝溶液（Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）、薬物と蛋白質との結合の段階で使用される結合緩衝溶液（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）などをどんなものを使用するかによって、すなわち、実験を行う条件に応じてその結果が異なることができ、実験の段階が複雑で、実験外的な環境や機械的エラーによって繰り返し再現性が落ちることができる根本的な限界がある。
【０００４】
即ち、従来技術は、試験管の条件（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で実行され、新薬の開発段階で細胞内での効果と生体内での効果を予測するのに困難がある。したがって、本発明が属する技術分野では、細胞内物質と結合して細胞内物質の生理活性機能を調節する調節物質を細胞内で効率的にスクリーニングする方法の開発が切実に求められていると言える。
【０００５】
これに本発明者は、前述したような従来技術の問題点を解決するために、磁力線方向にパターンを示す標識物質をイメージ化して、細胞内でリファレンス物質（細胞内物質の生理活性機能を調節すると知られている物質）と調節物質との間の、細胞内物質に対する競争反応可否を決定することにより、細胞内物質の生理活性機能を調節することができる調節物質を発掘する技術を開発するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国公開特許第２００５／０００９０９９Ａ１号
【特許文献２】米国公開特許第２００８／００５８２１９Ａ１号
【特許文献３】ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ２００６／１３４０５６Ａ１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、磁力線方向に磁化される磁性物質のパターンと、細胞内物質と結合した標識物質のパターンとをイメージ化して、細胞内でリファレンス物質と調節物質との間の競争反応可否を決定する方法を提供することにその目的がある。
【０００８】
また、本発明は、磁力線方向に磁化される磁性物質のパターンと、細胞内物質と結合した標識物質のパターンとをイメージ化して、細胞内でリファレンス物質と調節物質との間の競争反応可否を決定することによって細胞内物質の生理活性機能を調節することができる調節物質を検出する方法を提供することにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
まず、本発明の明細書で使用される用語を説明すると、次のとおりである。
【００１０】
細胞内物質（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）とは、細胞内の生理活性機能を調節する物質を意味する。例えば、生体の生理代謝や病気と関連があると思われる蛋白質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、糖（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、脂質（ｌｉｐｉｄｓ）などの高分子化合物と、アミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ビタミン（ｖｉｔａｍｉｎｓ）、アミン（ａｍｉｎｅｓ）、その他、低分子有機化合物（ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）などの低分子化合物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）が挙げられる。
【００１１】
調節物質（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）とは、正常な生理活性機能が妨げられたまたは阻害された細胞内物質の異常な機能を正常化させることができる物質を意味する。一般的に生体の生理代謝を正常化させたり、病気を治すことができる物質を意味し、例えば、医薬のような低分子化合物、抗体、ホルモンや成長因子などの蛋白質、蛋白質ドメイン、蛋白質モチーフ、ペプチドなどが挙げられる。
【００１２】
リファレンス物質（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ）とは、細胞内物質の生理活性機能を調節すると知られている物質で、前記調節物質との競争反応をする物質を意味する。生体の生理代謝を正常化させたり、病気を治療する物質として知られている物質であり、例えば、医薬のような低分子化合物、抗体、ホルモンや成長因子などの蛋白質、蛋白質ドメイン、蛋白質モチーフ、ペプチドなどが挙げられる。  
標識物質とは、前記リファレンス物質と前記調節物質との間の競争反応可否をイメージ化する物質で、視覚的にそのパターンを確認することができる物質を意味する。たとえば、放射性物質、蛍光物質または発光物質などが挙げられており、細胞内物質の存在、位置、およびパターンを確認するためＥＧＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、またはＲＦＰなどの蛍光蛋白質を使用することができる。  
一方、本発明の明細書で使用される表面改質という用語は、改質対象となる物質の基本的物性には変化を与えず、他の物質との結合を容易にするために表面を変形または変更させることを意味する。たとえば、抗体と結合する抗原、またはリガンドと結合する受容体などが磁性物質のような粒子の表面に付着していることを含む。
【００１３】
また、本発明の明細書で使用される連関という用語は、対象となる二つの物質を直接または間接的に結合させることを意味する。たとえば、粒子の表面が抗原や受容体によって改質された場合、これに各々対応する抗体やリガンドを、粒子の表面に付着されている抗原や受容体に結合させることを含む。
【００１４】
以下では、前述したような本発明の明細書で使用される用語を使用して、本発明の構成を説明する。
【００１５】
本発明の細胞内で細胞内物質の生理活性機能を調節する調節物質を検出する方法は、磁場により磁力線方向に磁化される磁性物質であって、ナノ単位で粒子化され、表面が改質された磁性物質を複数個準備する段階と、細胞内物質の生理活性機能を調節すると知られているリファレンス物質を前記磁性物質と連関させる後、前記リファレンス物質と前記磁性物質を細胞内に提供し、かつ、一つの細胞を基準に前記リファレンス物質と連関された前記磁性物質を複数個提供する段階と、前記リファレンス物質と結合する細胞内物質を、前記磁性物質のパターンをイメージ化する標識物質と連関させ、前記細胞内物質と前記標識物質を細胞内に提供する段階と、前記リファレンス物質との競争反応可否の確認対象となる調節物質を細胞内に提供する段階と、前記細胞に収束された磁場を印加し、磁力線束（ｂｕｎｄｌｅ）が前記細胞に対して一定方向に通過するようにする段階と、前記細胞内で前記磁場の磁力線方向に複数個の磁性物質が配列になるようにする段階と、前記磁性物質の配列パターンと前記標識物質のパターンをイメージ化して確認する段階とを含む。
【００１６】
本発明の一実施例の方法において、前記磁性物質のパターンと、前記標識物質のイメージ化されたパターンを確認し、前記磁性物質のパターンと、前記標識物質のイメージ化されたパターンが重畳（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）するか否かを確認する段階とをさらに含む。
【００１７】
本発明の一実施例の方法において、前記細胞内物質に対して前記調節物質が前記リファレンス物質と競争反応をする場合は、前記調節物質が前記細胞内物質と結合し、前記磁性物質のパターンと前記標識物質のイメージ化されたパターンが重畳しない。従って、前記磁性物質のパターンと前記標識物質のイメージ化されたパターンが重畳しない場合は、前記調節物質が前記細胞内物質と結合するものと判断することができる。
【００１８】
また、本発明の一実施例の方法において、前記細胞内物質に対して前記調節物質が前記リファレンス物質と競争反応をしない場合は、前記リファレンス物質が前記細胞内物質と結合し、前記磁性物質のパターンと前記標識物質のイメージ化されたパターンが重畳する。従って、前記磁性物質のパターンと前記標識物質のイメージ化されたパターンが重畳する場合は、前記調節物質が前記細胞内物質と結合しないものと判断することができる。
【００１９】
本発明の好ましい一実施例の方法において、前記リファレンス物質と前記磁性物質とを生きた細胞内に提供した後、これらを生きた細胞の細胞質に露出させる段階とをさらに含む。
【００２０】
さらに好ましくは、前記リファレンス物質と前記磁性物質とを生きた細胞の細胞質に露出させる前に、前記調節物質を生きた細胞内に提供することである。
【００２１】
本発明の一実施例の方法において、  前記細胞内物質、前記リファレンス物質，及び前記調節物質は、蛋白質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、糖（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、脂質（ｌｉｐｉｄｓ）などの高分子化合物と、アミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ビタミン（ｖｉｔａｍｉｎｓ）、アミン（ａｍｉｎｅｓ）、その他の低分子有機化合物（ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）などの低分子化合物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）などを含む。
【００２２】
本発明の一実施例の方法において、前記細胞内物質が細胞膜に結合される特性を持つ場合には、前記細胞内物質の細胞膜結合特性を除去することができる。このような場合、前記標識物質で標識された前記細胞内物質が細胞膜に固定され、磁場を印加した後にも、前記標識物質が前記磁性物質のパターンをイメージ化しない問題を事前に防ぐことができる。
【００２３】
本発明の一実施例の方法において、前記細胞内物質がＢＬＫ、ＦＧＲ、ＬＹＮ、ＳＲＣまたはＹＥＳ１蛋白質である場合には、この蛋白質の２番目のアミノ酸であるグリシンをアラニンに置換して、前記細胞内物質の細胞膜結合特性を除去することができる。
【００２４】
また、本発明の一実施例の方法において、前記細胞内物質がＫＩＴ蛋白質である場合には、ＫＩＴ蛋白質のアミノ酸５４５−９７６の部位だけを生きた細胞内に提供して、前記細胞内物質の細胞膜結合特性を除去することができる。
【００２５】
また、本発明の一実施例の方法において、前記細胞内物質がＡＢＬ１蛋白質である場合には、ＡＢＬ１の活性ドメイン（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）だけを生きた細胞内に提供して、前記細胞内物質の細胞膜結合特性を除去することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、磁力線方向に磁化される磁性物質のパターンと、細胞内物質と結合した標識物質のパターンとをイメージ化して、細胞内でリファレンス物質と調節物質との間の競争反応可否を決定することができ、追加的にリファレンス物質と調節物質との間の競争反応可否を決定することによって、細胞内物質の生理活性機能を調節することができる調節物質を検出することができる。
【００２７】
即ち、本発明によれば、蛋白質のような細胞内物質の精製が不要であり、蛋白質のような細胞内物質の変形がなく細胞内での本来の形と機能を持っているので、分離精製された細胞内物質を対象に薬効探索をする既存のスクリーニング方法とは異なり、細胞内で調節物質に対する細胞内物質の選択性をモニタリングすることによって、薬物のような調節物質の人体内での反応をよく予測できるという利点がある。
【００２８】
また、本発明によれば、薬物のような調節物質およびリファレンス物質に対する細胞内物質の反応が生きた細胞の中で起こるため、調節物質とリファレンス物質との間の競争反応が実際に細胞内の物質代謝を反映する利点がある。そして、本発明の方法は、薬物のような調節物質と細胞内物質との反応の結果を、生きた細胞内で直接に確認することもできる。
【００２９】
さらに、本発明の方法は、リファレンス物質と調節物質との間の競争反応を利用するので、イメージ化された磁性物質のパターンが形成されると、細胞内物質と調節物質との反応が陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）であると判断し、イメージ化された磁性物質のパターンが形成されない場合は、細胞内物質と調節物質との反応が陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であると判断することができる長所がある。これは、少数のリファレンス物質を利用して多数の調節物質を選抜試験（スクリーニング）することができるという利点を提供し、リファレンス物質の導入によって調節物質の変形なしに調節物質の細胞内作用、すなわち、薬効などを探索できる利点を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】競争反応を利用して細胞内物質と結合する低分子化合物（競争反応物質）を確認する概念を模式化した概略図である。
【図２】蛍光標識された細胞内物質と、表面が改質された磁性物質に連関されたリファレンス物質とが結合して、磁性物質が磁場の方向に形成させた誘導磁化パターンと重畳される蛍光パターンを示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３】競争反応物質である、ビオチン化されていないダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）を処理したり、処理しないことにより、競争反応物質と細胞内物質との結合可否を確認した蛍光顕微鏡写真である。
【図４】競争反応物質である、ビオチン化されていないダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）を処理したり、処理しないことにより、競争反応物質と細胞内物質との結合可否を確認した蛍光顕微鏡写真である。図３及び図４において、競争反応物質を処理していない場合は、表面が改質された磁性物質に連関されたダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）−ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）と蛍光標識された細胞内物質とが結合して、磁性物質が磁場の方向に形成させた誘導磁化パターンと重畳される蛍光パターンを確認することができるものの、競争反応物質を処理した場合は、競争反応物質と細胞内物質とが結合して、磁性物質は磁場の方向に誘導磁化パターンを形成するが、この誘導磁化パターンと重畳される蛍光パターンは確認できないことがわかる。
【図５】競争反応によって細胞内物質と結合する調節物質（低分子化合物）をスクリーニングした結果を示す表である。異なる日に行われた、少なくとも２回以上の独立した実験で、細胞内物質と結合することで確認された調節物質である低分子化合物を“阻害”と示した。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく記述する。本発明の下記の実施例は本発明を具体化するだけのものであって、本発明の権利範囲を制限または限定するものでないことはもちろんである。本発明の詳細な説明および実施例から本発明が属する技術分野の専門家が容易に類推できるのは、本発明の権利範囲に属するものと解釈される。本発明にて引用された参考文献は、本発明に参考として統合される。
【００３２】
実施例１：リファレンス物質と細胞内物質との結合確認
本実施例では、磁力線方向に磁化される磁性物質（表面が改質され、リファレンス物質に連関される磁性物質）のパターンと、細胞内物質と結合した標識物質のパターンをイメージ化する上で、磁場の印加により形成された複数の磁性粒子の磁化パターンが、標識物質である蛍光物質によってイメージ化されるか否かを観察すると同時に、磁性物質が形成する磁力線方向のパターンと重畳する蛍光パターンが形成されるか否かも確認した。この時、細胞内物質は、例えば、リン酸化蛋白質であることができる。しかし、本発明の細胞内物質がこれに限定されないことはもちろんである。
【００３３】
即ち、リファレンス物質と細胞内物質とが細胞内で結合するか否かを確認するために、次のような実験を行った。まず、選択したリファレンス物質と結合すると知られている細胞内物質を蛍光蛋白質と結合された形で細胞内で発現させ、表面が改質され、リファレンス物質に連関された磁性物質を細胞内に伝達した後、磁場を印加したとき前記リファレンス物質と前記細胞内物質とが結合して、磁性物質が形成する磁力線方向のパターンと重畳する蛍光パターンが形成されるか否かを確認した。
（１）リファレンス物質
細胞内物質の生理活性機能を調節すると知られているリファレンス物質としては、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）の治療剤として使われているダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）［Ｌｏｍｂａｒｄｏ，  Ｌ．  Ｊ．，  Ｌｅｅ，  Ｆ．  Ｙ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｎ−（２−ｃｈｌｏｒｏ−６−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｈｅｎｙｌ）−２−（６−（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−ｙｌａｍｉｎｏ）ｔｈｉａｚｏｌｅ−５−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ（ＢＭＳ−３５４８２５），  ａ  ｄｕａｌ  Ｓｒｃ／Ａｂｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｓａｙｓ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４７，  ６６５８−６６６１（２００４）；  Ｓｈａｈ，  Ｎ．  Ｐ．，  Ｔｒａｎ，  Ｃ．，  Ｌｅｅ，  Ｆ．  Ｙ．  Ｃｈｅｎ，  Ｐ．，  Ｎｏｒｒｉｓ，  Ｄ．，  Ｓａｗｙｅｒｓ，  Ｃ．  Ｌ．  Ｏｅｒｒｉｄｉｎｇ  ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＡＢＬ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５，  ３９９−４０１（２００４）］を選択した。
【００３４】
そして、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で表面が改質された磁性粒子に、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）を結合させるために、ダサチニブ−ビオチン（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ−ｂｉｏｔｉｎ）を合成した。ダサチニブ−ビオチンの合成は、本発明者の先行特許出願である韓国特許出願第１０−２００８−０１１１３２６号（出願日：２００８．１１．１０）に記載の方法に応じて行った。
【００３５】
一方、本発明の一実施例では、リファレンス物質としてダサチニブが使用されたが、本発明はこれに限定されるものではなく磁性物質に付着が可能であり、細胞内に導入が可能な様々な低分子化合物、抗体、ホルモンや成長因子のような蛋白質、蛋白質ドメイン、蛋白質モチーフ、ペプチドなどが使われることを本発明の属する技術分野の当業者なら容易に理解できる。
（２）細胞内物質
細胞内の生理活性機能を調節する物質である細胞内物質としてダサチニブと結合する細胞内物質としては、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＢＬＫ、ＢＭＸ、ＢＴＫ、ＣＳＫ、ＦＧＲ、ＬＹＮ、ＳＲＣ、ＹＥＳ１、ＫＩＴ、ＭＡＰＫ１４、ＲＩＰＫ２、ＳＮＦ１ＬＫを使用した。ＰＣＲ増幅に必要な鋳型ＤＮＡは、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入したか、ｃＤＮＡライブラリーＤＮＡ（ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ＤＮＡ）を使用した。それぞれの遺伝子が暗号化する蛋白質を蛍光蛋白質と融合した形でヒト由来の細胞で発現させるために、それぞれの遺伝子についての停止コドンが除去されたＯＲＦをＰＣＲ増幅した後、前記韓国特許出願第１０−２００８−０１１１３２６号に記述された方法に応じて、発現ベクターにクローニングした。
【００３６】
一方、細胞内物質の中でＢＬＫ、ＦＧＲ、ＬＹＮ、ＳＲＣ、ＹＥＳ１などは蛋白質の２番目のアミノ酸であるグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）にミリストイル化され（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ）、細胞膜に結合されると知られている［ＭｃＣａｂｅ，  Ｊ．  Ｂ．  ＆  Ｂｅｒｔｈｉａｕｍｅ，  Ｌ．  Ｇ．（１９９９）  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｆａｔｔｙ  ａｃｙｌａｔｅｄ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １０，  ３７７１］。
【００３７】
したがって、本実施例では、これらの蛋白質のミリストイル化を防止するために２番目のアミノ酸をアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）に置換してクローニングした［ＭｃＣａｂｅ，  Ｊ．  Ｂ．  ＆  Ｂｅｒｔｈｉａｕｍｅ，  Ｌ．  Ｇ．（１９９９）  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｆａｔｔｙ  ａｃｙｌａｔｅｄ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １０，  ３７７１］。
【００３８】
また、ＫＩＴは、単一の膜透過ドメインを持っている細胞膜受容体の蛋白質リン酸化酵素（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ）である［Ｙａｒｄｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｃ−ｋｉｔ：  ａ  ｎｅｗ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ａｎ  ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｌｉｇａｎｄ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６，  ３３４１］。
【００３９】
したがって、本実施例では、ＫＩＴ蛋白質の膜透過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）を除去するためにＫＩＴ蛋白質のアミノ酸５４５−９７６部位だけをＰＣＲ増幅して発現ベクターを作製した。
【００４０】
一方、ＡＢＬ１の場合には、ＡＢＬ１の活性ドメイン（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）だけをクローニングしてＡＢＬ１ｃａｔ発現ベクターを作製した。
【００４１】
そして、完成した発現ベクターは、両末端の塩基配列の分析（ｅｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって確認した。本実施例で使用される細胞内物質である蛋白質リン酸化酵素の遺伝子名、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｎｏ．と、本実施例で発現され、使用された蛋白質リン酸化酵素の特性を要約すると下記の表１の通りである。
【００４２】
一方、本発明で使用可能な細胞内物質は、下記の表１に示したリン酸化蛋白質に限定されるものではなく、細胞内の生理活性機能を調節する物質として、例えば、生体の生理代謝や病気と関連があるとされるさまざまな物質が使われることを本発明の属する技術分野の当業者なら容易に理解できる。
【００４３】
【表１】
2013518581.tif 000003
【００４４】
（３）リファレンス物質と細胞内物質との結合確認
ＨｅＬａ細胞を９６−ウェルプレートに５，０００〜１０，０００細胞／ウェルの濃度で継代培養した後、前述なように用意された発現ベクターＤＮＡを形質導入した。ＤＮＡの形質導入は、公知の方法、例えばリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）、またはヒュージーン  ６（Ｆｕｇｅｎｅ  ６）（Ｒｏｃｈｅから購入）を利用して行われる。
【００４５】
ＤＮＡが形質導入された細胞に、ダサチニブ−ビオチンがコーティングされた磁性物質（ダサチニブ−磁性物質）を、公知の方法によって伝達した［Ｊｏｓｅｐｔｈｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ−Ｔａｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  １０，  １８６；  Ｄｅｒｆｕｓ，  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ．  Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．  １６，  ９６１；  Ｆｒａｎｋ，  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ．  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２２８，  ４８０；  Ｋｉｍ，  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄａｓａｔｉｎｉｂ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３０，  １６４６６  参照］。
【００４６】
ダサチニブ−ビオチンをコーティングするために使用される磁性物質は、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）が接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）された超常磁性の磁性粒子（ストレプトアビジン−磁性粒子）で、公知の方法で直接製作したり、購入して使われる［Ｍｏｌｄａｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ−ｄｅｘｔｒａｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．（１９８２）  ５２，  ３５３−３６７；  Ｍａｒｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｙａｎｏｇｅｎ  ｂｒｏｍｉｄｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇａｒｏｓｅ  ｆｏｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７４）  ６０，  １４９−１５２；  Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，  Ｐ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９７０）  ２４５，  ３０５９−３０６５；米国特許第５，６６５，５８２号；米国特許公開第２００３／００９２０２９Ａ１号］。
【００４７】
次の日、ダサチニブ−磁性物質が処理された細胞でリファレンス物質（ダサチニブ）と細胞内物質との結合は、公知の方法に応じて、ダサチニブ−磁性物質を細胞質に露出させて行った［Ｋｉｍ，  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄａｓａｔｉｎｉｂ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３０，  １６４６６  参照］。
【００４８】
リファレンス物質が結合されている磁性粒子の誘導磁化パターンは、公知の方法に応じて、磁場をかけて形成させた［韓国特許第１０−０７９２５９４号；韓国特許第１０−０８６２３６８号；米国特許第４，２４７，３９８号；  Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，  Ｄ．，  Ｆ．  Ｐａｕｌ，  ＆  Ｓ．  Ｒｏａｔｈ（１９７５）  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２５５：  ７０６］。磁場をかけた状態で、公知の方法によって細胞を固定した後、顕微鏡観察を行った［韓国特許出願第１０−２００８−０１１１３２６号；  Ｋｉｍ，  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄａｓａｔｉｎｉｂ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３０，  １６４６６  参照］。
【００４９】
本実施例においては、対物レンズＵｐｌａｎ  Ａｐｏ  ４０Ｘ／０．８５が装着されたオリンパス社の蛍光顕微鏡ＦＶ１０００を利用して細胞の蛍光イメージと透過光イメージを得、その結果を図２に例示した。図２では、磁力線方向に磁化される磁性物質（リファレンス物質であるダサチニブが結合された磁性物質）のパターンと、細胞内物質であるリン酸化蛋白質と結合したＥＧＦＰ蛍光物質のパターンとをイメージ化する上で、磁化の方向（磁力線の方向）にＥＧＦＰの蛍光パターンが形成されることを確認した。
【００５０】
図２に図示されたように、リファレンス物質である“ダサチニブ”と細胞内物質であるリン酸化蛋白質とが細胞内で結合するか否かを確認した結果、細胞内で発現されたＡＢＬ１ｃａｔ−ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰ−ＡＢＬ２、ＢＬＫ−ＥＧＦＰ、ＢＭＸ−ＥＧＦＰ、ＢＴＫ−ＥＧＦＰ、ＣＳＫ−ＥＧＦＰ、ＦＧＲ−ＥＧＦＰ、ＬＹＮ−ＥＧＦＰ、ＳＲＣ−ＥＧＦＰ、ＹＥＳ１−ＥＧＦＰ、ＫＩＴ−ＥＧＦＰ、ＲＩＰＫ２−ＥＧＦＰなどのリン酸化蛋白質−ＥＧＦＰの融合蛋白質は、ダサチニブが結合された磁性粒子と結合して、磁化の方向（磁力線の方向）に蛍光パターンを形成することが確認できた。このような蛍光パターンは透過光イメージから観察された磁性物質のパターンと重畳して現れており、これは、蛍光物質であるＥＧＦＰがリン酸化蛋白質−ダサチニブが結合された磁性粒子を正確に標識させ、磁化パターンをイメージ化した結果であることが分かる。
【００５１】
つまり、本発明の方法に応じて、磁力線方向に磁化される磁性物質（リファレンス物質であるダサチニブが結合された磁性物質）のパターンと、細胞内物質であるリン酸化蛋白質と結合したＥＧＦＰ蛍光物質のパターンとをイメージ化することによって、リファレンス物質と細胞内物質とが細胞内で結合するか否かを確認することができる。したがって、本実施例に応じた実験結果である、図２の写真は、磁性物質にコーティングされたダサチニブがリン酸化蛋白質（ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＢＬＫ、ＢＭＸ、ＢＴＫ、ＣＳＫ、ＦＧＲ、ＬＹＮ、ＳＲＣ、ＹＥＳ１、ＫＩＴおよびＲＩＰＫ２）と結合した結果を示していることが分かる。
【００５２】
実施例２：競争反応による競争反応物質と細胞内物質との結合確認
実施例１の通り、蛍光標識された細胞内物質が、表面が改質された磁性物質に連関されたリファレンス物質と結合すると、外部の磁場によって誘導磁化（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ）された磁性物質のパターンと重畳される蛍光パターンを形成することになる。
【００５３】
さて、もしリファレンス物質が結合することになる細胞内物質の特定の部位に結合することができる調節物質（競争反応物質）が細胞内に一緒に存在すれば、前記調節物質（競争反応物質）と細胞内物質とが結合することになって、その結果、細胞内物質とリファレンス物質との結合は妨げられる。したがって、細胞内物質は、  表面が改質された磁性物質に連関されたリファレンス物質との結合がされなくなり、これによって磁性物質は磁化の方向に誘導磁化パターンを形成するが、細胞内物質に標識されている蛍光はもう磁化方向にパターンを形成できなくなる（図１の（ａ）  参照）。
【００５４】
反面、競争反応の候補物質が細胞内物質と結合しない場合は、細胞内物質とリファレンス物質との結合が維持され、磁化の方向に形成された誘導磁化のパターンと重畳される蛍光パターンが形成されることになる（図１の（ｂ）  参照）。つまり、磁化の方向に誘導磁化パターンを形成する磁性物質と重畳される蛍光パターンの形成可否によって、細胞内物質と競争反応の候補物質とが結合するか否かを確認することができる。
【００５５】
このように、競争反応の候補物質による競争反応を利用して、第３の物質と細胞内物質との結合を確認するために、次のような実験を行った。
【００５６】
まず、選択したリファレンス物質と結合すると知られている細胞内物質を蛍光蛋白質と結合された形で細胞内で発現させ、表面が改質された磁性物質に連関されたリファレンス物質を細胞内に伝達しながら競争反応物質を処理すると、前記競争反応物質と前記細胞内物質とが結合して、磁性物質が形成する磁力線方向のパターンと重畳される蛍光パターンが形成されない。反面、前記競争反応物質を処理しない場合は、前記細胞内物質が前記リファレンス物質と結合して、磁性物質が形成する磁力線方向のパターンと重畳される蛍光パターンが形成される。
【００５７】
表面が改質された磁性物質に連関されたリファレンス物質と、蛍光物質で標識された細胞内物質とが伝達された細胞は、実施例１の通り準備した。ダサチニブ−磁性物質を細胞質に露出させる前に競争反応物質であるビオチン化されていないダサチニブ（ｕｎｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｄａｓａｔｉｎｉｂ）を１０μＭの濃度で３０分乃至２時間の間、細胞に処理した。その後、ダサチニブ−磁性物質を細胞質に露出させ、磁場をかけた状態で実施例１の通り細胞を固定した後、顕微鏡観察を行った。
【００５８】
本実施例では対物レンズＵｐｌａｎ  Ａｐｏ  ４０Ｘ／０．８５が装着されたオリンパス社の蛍光顕微鏡ＦＶ１０００を利用して細胞の蛍光イメージと透過光イメージを得、その結果を図３と図４に例示した。
【００５９】
図３及び図４に示すように、競争反応物質であるビオチン化されていないダサチニブを処理しない場合には、蛍光標識された細胞内物質であるＥＧＦＰ−ＡＢＬ１、ＥＧＦＰ−ＡＢＬ２、ＢＬＫ−ＥＧＦＰ、ＢＭＸ−ＥＧＦＰ、ＢＴＫ−ＥＧＦＰ、ＣＳＫ−ＥＧＦＰ、ＦＧＲ−ＥＧＦＰ、ＬＹＮ−ＥＧＦＰ、ＳＲＣ−ＥＧＦＰ、ＹＥＳ１−ＥＧＦＰ、ＫＩＴ−ＥＧＦＰ、ＭＡＰＫ１４−ＥＧＦＰ、ＲＩＰＫ２−ＥＧＦＰ、ＳＮＦ１ＬＫ−ＥＧＦＰなどが、表面が改質された磁性物質に連関されたダサチニブと結合して、磁場の方向に誘導子化された磁性物質のパターンと重畳される蛍光パターンを形成した。しかしながら、競争反応物質であるビオチン化されていないダサチニブを処理した場合には、誘導子化された磁性物質のパターンと重畳される蛍光パターンが形成されなかった。このような結果は、競争反応物質として用いたビオチン化されていないダサチニブが、蛍光標識された細胞内物質と結合して、もう細胞内物質である蛍光標識された蛋白質と、表面が改質された磁性物質に連関されたリファレンス物質であるダサチニブとが結合しなかった結果であることが分かる。
【００６０】
実施例３：細胞内物質と結合する調節物質のスクリーニング
細胞内での競争反応を利用して細胞内物質と結合する調節物質（競争反応物質）、例えば、低分子化合物をスクリーニングするために、次のような実験を行った。
【００６１】
調節物質である低分子化合物としては、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）（ＣＡＳ  Ｎｏ．２２０１２７−５７−１）、  ロスコビチン（ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎ）（ＣＡＳ  Ｎｏ．１８６６９２−４６−６）、ＳＢ２０２１９０（ＣＡＳ  Ｎｏ．１５２１２１−３０−７）、ＳＢ２０３５８０（ＣＡＳ  Ｎｏ．１５２１２１−４７−６）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）（ＣＡＳ  Ｎｏ．６２９９６−７４−１）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）（ＣＡＳ  Ｎｏ．４４６−７２−０）、  ビスインドリルマレイミドＩ（ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｄｅ  Ｉ）（ＣＡＳ  Ｎｏ．１７６５０４−３６−２）、Ｈ−８９（ＣＡＳ  Ｎｏ．１２７２４３−８５−０）、ＬＹ２９４００２（ＣＡＳ  Ｎｏ．１５４４４７−３６−６）、ＰＤ９８０５９（ＣＡＳ  Ｎｏ．１６７８６９−２１−８）、チルホスチン  ＳＵ−１４９８（Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ  ＳＵ−１４９８）、チルホスチンＡＧ−１４７８（Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ  ＡＧ−１４７８）（ＣＡＳ  Ｎｏ．１７５１７８−８２−２）、チルホスチンＡＧ−４９０（Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ  ＡＧ−４９０）（ＣＡＳ  Ｎｏ．１３４０３６  −  ５２−５）、Ｕ−１２６（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０９５１１−５８−２）、ＨＡ−１０７７（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０３７４５−３９−７）を使用した。
【００６２】
しかし、本発明の方法で使用可能な調節物質としては、前述した低分子化合物だけでなく、細胞内に導入が可能な物質で、正常な生理活性機能が妨げられたまたは阻害された細胞内物質の異常な機能を正常化させることができる、さまざまな候補物質が使用できることを本発明の属する技術分野の当業者なら容易に理解できる。
【００６３】
一方、競争反応は、実施例２の通り行った。ダサチニブ−磁性物質を細胞質に露出させる前に調節物質（競争反応物質）である前記低分子化合物をそれぞれ１０μＭの濃度で３０分乃至２時間の間、細胞に処理した。その後、ダサチニブ−磁性物質を細胞質に露出させ、磁場をかけた状態で実施例１の通り細胞を固定した後、顕微鏡観察を実施例２の通り行った。
【００６４】
異なる日に行われた、独立した２回以上の実験で、ダサチニブ−磁性物質が磁力線方向に誘導磁化パターンを示すが、蛍光標識された細胞内物質の蛍光パターンが全く観察されていない低分子化合物（調節物質）を図５に“阻害”と表示した。一例として、図５で確認されるように、細胞内物質であるＫＩＴと調節物質である低分子化合物、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）とが細胞内で結合することがわかる。
【００６５】
従って、  本発明の方法は、薬物のような調節物質およびリファレンス物質に対する細胞内物質の反応が生きた細胞の中で起こるため、調節物質とリファレンス物質との間の競争反応が実際に細胞内の物質代謝を反映する利点があり、薬物のような調節物質と細胞内物質との反応の結果を、生きた細胞内で直接に確認することもできる。さらに、本発明の方法は、少数のリファレンス物質を利用して多数の調節物質をスクリーニングすることができるという利点を提供し、リファレンス物質の導入によって調節物質の変形なしに調節物質の細胞内作用、すなわち、薬効などを探索できる利点を提供する。
【００６６】
以上、本発明を前記実施例を挙げて説明したが、本発明はこれに制限されるものでない。当業者であれば本発明の趣旨および範囲を外れることなく修正、変更することができ、このような修正と変更もまた本発明に属するものであることを知ることができる。
【図１】
2013518581.tif 000004
【図２】
2013518581.tif 000005
【図３】
2013518581.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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