(57)【要約】【課題】本発明は、ＦｃγＲＩＩｂを発現する標的細胞を有する患者を処置する方法であって、（ｉ）ＦｃγＲＩＩｂと結合することができるＦｃドメインを有する、前記標的細胞の表面抗原と特異的に結合する抗体分子と、組み合わせて（ｉｉ）前記抗体分子の前記Ｆｃドメインと、ＦｃγＲＩＩｂとの間における結合を妨げるか、または低減させる薬剤を投与することを含み、かつ、前記患者が、それらの標的細胞が上昇したレベルのＦｃγＲＩＩｂを発現することに基づいて選択されることを特徴とする方法を提供する。【選択図】図１
2013537547.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＦｃγＲＩＩｂと結合することができるＦｃドメインを有する、標的細胞の細胞表面抗原と特異的に結合する抗体分子
と、組み合わせて
（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩｂが前記抗体分子の前記Ｆｃドメインに結合することを妨げるか、または低減させる薬剤
を含む組成物であって、ＦｃγＲＩＩｂ発現の上昇したレベルを有する標的細胞を有する患者の処置において使用されるためのものであることを特徴とする組成物。
【請求項２】
抗体分子のＦｃドメインと、標的細胞上のＦｃγＲＩＩｂとの間における結合を妨げるか、または低減させる薬剤の使用であって、前記抗体分子は前記標的細胞の表面抗原と特異的に結合し、ＦｃγＲＩＩｂ発現の上昇したレベルを有する標的細胞を有する患者の処置において使用されるための医薬品の製造においてであることを特徴とする使用。
【請求項３】
ＦｃγＲＩＩｂを発現する標的細胞を有する患者を処置する方法であって、（ｉ）ＦｃγＲＩＩｂと結合することができるＦｃドメインを有する、前記標的細胞の表面抗原と特異的に結合する抗体分子と、組み合わせて（ｉｉ）前記抗体分子の前記Ｆｃドメインと、ＦｃγＲＩＩｂとの間における結合を妨げるか、または低減させる薬剤を投与することを含み、かつ、前記患者が、それらの標的細胞が上昇したレベルのＦｃγＲＩＩｂを発現することに基づいて選択されることを特徴とする方法。
【請求項４】
標的細胞におけるＦｃγＲＩＩｂ発現の使用であって、ＦｃγＲＩＩｂと結合することができるＦｃドメインを有する、前記標的細胞の表面抗原に特異的に結合する抗体分子による処置に対する前記標的細胞の応答についての予後マーカーとしての使用であり、それにより、ＦｃγＲＩＩｂの上昇したレベルが前記抗体分子による処置に対する応答における低下または前記抗体分子による処置に対する応答の非存在を示すものである、使用。
【請求項５】
標的細胞表面抗原と特異的に結合し、かつ、ＦｃγＲＩＩｂと結合することができるＦｃドメインを有する抗体分子による処置に対する患者の標的細胞の応答を予測するための方法であって、前記標的細胞におけるＦｃγＲＩＩｂの発現レベルを求めることを含み、それにより、ＦｃγＲＩＩｂの上昇したレベルが前記抗体分子による処置に対する応答における低下または前記抗体分子による処置に対する応答の非存在を予測するものであることを特徴とする方法。
【請求項６】
前記薬剤は、前記標的細胞上に存在するＦｃγＲＩＩｂが前記抗体分子の前記Ｆｃドメインに結合することを妨げるか、または低下させる、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項７】
ＦｃγＲＩＩｂと結合することができるＦｃドメインを有する、標的細胞の細胞表面抗原と特異的に結合する前記抗体分子はＦｃγＲＩＩｂ依存的様式で前記標的細胞内に内部移行されることが可能である、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項８】
ＦｃγＲＩＩｂが前記抗体分子の前記Ｆｃドメインに結合することを妨げるか、または低減させる前記薬剤はさらに、前記抗体分子の前記標的細胞内への内部移行を妨げるか、または低減させる、請求項１〜３および６〜７のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項９】
前記標的細胞がガン細胞である、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項１０】
前記標的細胞がＢ細胞である、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項１１】
処置される前記患者がガン患者であり、かつ、前記処置がガン処置である、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項１２】
前記ガンが、非ホジキンリンパ腫、例えば、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫または慢性リンパ性白血病などから選択される、請求項９〜１１のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項１３】
前記薬剤は、ポリペプチド；アンチカリン；ペプチド；抗体；キメラ抗体；単鎖抗体；アプタマー；ダルピン；Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント、ＳｃＦｖ抗体フラグメントまたはｄＡｂ抗体フラグメント；小分子；天然産物；アフィボディー；ペプチド模倣体；核酸；ペプチド核酸分子；脂質；炭水化物；アンキリン反復タンパク質、アルマジロ反復タンパク質、ロイシンリッチタンパク質、テトラリオペプチド反復タンパク質または設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を含むモジュール構成に基づくタンパク質のいずれかである、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項１４】
前記薬剤は、ＦｃγＲＩＩｂと特異的に結合する１つまたは複数の抗体分子である、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の抗体分子は、エフェクター細胞を動員することができるドメインを含まない、請求項１４に記載の組成物、使用または方法。
【請求項１６】
前記１つまたは複数の抗体分子がモノクローナル抗体分子である、請求項１５に記載の組成物、使用または方法。
【請求項１７】
前記薬剤は、下記のＣＤＲを含む可変性重鎖（ＶＨ）：
（ｉ）配列番号２９および配列番号３０および配列番号３１；または
（ｉｉ）配列番号３５および配列番号３６および配列番号３７；または
（ｉｉｉ）配列番号４１および配列番号４２および配列番号４３；または
（ｉｖ）配列番号４７および配列番号４８および配列番号４９；または
（ｖ）配列番号５３および配列番号５４および配列番号５５；または
（ｖｉ）配列番号５９および配列番号６０および配列番号６１；または
（ｖｉｉ）配列番号６５および配列番号６６および配列番号６７；または
（ｖｉｉｉ）配列番号７１および配列番号７２および配列番号７３；または
（ｉｘ）配列番号７７および配列番号７８および配列番号７９；または
（ｘ）配列番号８３および配列番号８４および配列番号８５；または
（ｘｉ）配列番号８９および配列番号９０および配列番号９１；または
（ｘｉｉ）配列番号９５および配列番号９６および配列番号９７；または
（ｘｉｉｉ）配列番号１０１および配列番号１０２および配列番号１０３
を含む、請求項１〜３および６〜１６のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項１８】
前記薬剤は、下記のＣＤＲを含む可変性軽鎖（ＶＬ）：
（ｉ）配列番号３２および配列番号３３および配列番号３４；または
（ｉｉ）配列番号３８および配列番号３９および配列番号４０；または
（ｉｉｉ）配列番号４４および配列番号４５および配列番号４６；または
（ｉｖ）配列番号５０および配列番号５１および配列番号５２；または
（ｖ）配列番号５６および配列番号５７および配列番号５８；または
（ｖｉ）配列番号６２および配列番号６３および配列番号６４；または
（ｖｉｉ）配列番号６８および配列番号６９および配列番号７０；または
（ｖｉｉｉ）配列番号７４および配列番号７５および配列番号７６；または
（ｉｘ）配列番号８０および配列番号８１および配列番号８２；または
（ｘ）配列番号８６および配列番号８７および配列番号８８；または
（ｘｉ）配列番号９２および配列番号９３および配列番号９４；または
（ｘｉｉ）配列番号９８および配列番号９９および配列番号１００；または
（ｘｉｉｉ）配列番号１０４および配列番号１０５および配列番号１０６
を含む、請求項１〜３および６〜１７のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項１９】
前記薬剤は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択される可変性重鎖（ＶＨ）アミノ酸配列を含む、請求項１〜３および６〜１８のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項２０】
前記薬剤は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択される可変性軽鎖（ＶＬ）アミノ酸配列を含む、請求項１〜３および６〜１９のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項２１】
前記薬剤は、下記のＣＤＲアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号２９および配列番号３０および配列番号３１および配列番号３２および配列番号３３および配列番号３４；または
（ｉｉ）配列番号３５および配列番号３６および配列番号３７および配列番号３８および配列番号３９および配列番号４０；または
（ｉｉｉ）配列番号４１および配列番号４２および配列番号４３および配列番号４４および配列番号４５および配列番号４６；または
（ｉｖ）配列番号４７および配列番号４８および配列番号４９および配列番号５０および配列番号５１および配列番号５２；または
（ｖ）配列番号５３および配列番号５４および配列番号５５および配列番号５６および配列番号５７および配列番号５８；または
（ｖｉ）配列番号５９および配列番号６０および配列番号６１および配列番号６２および配列番号６３および配列番号６４；または
（ｖｉｉ）配列番号６５および配列番号６６および配列番号６７および配列番号６８および配列番号６９および配列番号７０；または
（ｖｉｉｉ）配列番号７１および配列番号７２および配列番号７３および配列番号７４および配列番号７５および配列番号７６；または
（ｉｘ）配列番号７７および配列番号７８および配列番号７９および配列番号８０および配列番号８１および配列番号８２；または
（ｘ）配列番号８３および配列番号８４および配列番号８５および配列番号８６および配列番号８７および配列番号８８；または
（ｘｉ）配列番号８９および配列番号９０および配列番号９１および配列番号９２および配列番号９３および配列番号９４；または
（ｘｉｉ）配列番号９５および配列番号９６および配列番号９７および配列番号９８および配列番号９９および配列番号１００；または
（ｘｉｉｉ）配列番号１０１および配列番号１０２および配列番号１０３および配列番号１０４および配列番号１０５および配列番号１０６
を含む、請求項１〜３および６〜２０のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項２２】
前記薬剤は、下記のアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号３および配列番号１６；または
（ｉｉ）配列番号４および配列番号１７；または
（ｉｉｉ）配列番号５および配列番号１８；または
（ｉｖ）配列番号６および配列番号１９；または
（ｖ）配列番号７および配列番号２０；または
（ｖｉ）配列番号８および配列番号２１；または
（ｖｉｉ）配列番号９および配列番号２２；または
（ｖｉｉｉ）配列番号１０および配列番号２３；または
（ｉｘ）配列番号１１および配列番号２４；または
（ｘ）配列番号１２および配列番号２５；または
（ｘｉ）配列番号１３および配列番号２６；または
（ｘｉｉ）配列番号１４および配列番号２７；または
（ｘｉｉｉ）配列番号１５および配列番号２８
を含む、請求項１〜３および６〜２１のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項２３】
前記薬剤は、ＦｃγＲＩＩｂが前記抗体の前記Ｆｃドメインに結合することを妨げるか、または低減させるために請求項１７〜２２において定義されるような薬剤と競合することができる、請求項１〜３および６〜１６のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項２４】
前記薬剤はＦｃγＲＩＩｂのシグナル伝達を妨げるか、または低減させる、請求項１〜３および６〜２３のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項２５】
前記薬剤は前記標的細胞による前記抗体分子の内部移行を妨げるか、または低減させる、請求項１〜３および６〜２４のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項２６】
前記細胞表面抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ４０から選択される、請求項１〜２５のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項２７】
細胞表面抗原と特異的に結合する前記抗体分子がＣＤ２０抗体である、請求項１〜２６のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項２８】
前記ＣＤ２０抗体がＩ型ＣＤ２０抗体である、請求項２７に記載の組成物、使用または方法。
【請求項２９】
前記細胞表面抗原がＣＤ２０であり、かつ、細胞表面抗原に特異的に結合する前記抗体分子がＩ型抗体である、請求項１〜２８のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項３０】
前記標的細胞における上昇したＦｃγＲＩＩｂ発現がコントロールに対して求められ、かつ、好ましくは、前記コントロールは前記標的細胞と同じタイプの細胞におけるＦｃγＲＩＩｂ発現の正常なレベルである、請求項１〜２９のいずれかに記載の組成物、使用または方法。
【請求項３１】
明細書および添付図面を参照して実質的に本明細書中に記載される組成物。
【請求項３２】
明細書および添付図面を参照して実質的に本明細書中に記載される使用。
【請求項３３】
明細書および添付図面を参照して実質的に本明細書中に記載される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体のＦｃドメインと、細胞表面のＦｃγＲＩＩｂとの間における結合を妨げる薬剤に関連する。本発明はまた、抗体に基づく組成物により処置される標的細胞、例えば、ガン細胞などを有する患者を処置することにおいて使用されるためのそのような薬剤を含む組成物に関連する。
【０００２】
さらに、本発明は、抗体に基づく処置、特に、抗体リガンドがＦｃγＲＩＩｂ媒介の内部移行を受けやすい抗体に基づく処置に対する標的細胞の応答を予測するための方法、ならびに、とりわけ、そのような処置に対する標的細胞の応答についての予後マーカーとしてのＦｃγＲＩＩｂ発現レベルおよび／またはＦｃγＲＩＩｂを介する治療抗体媒介内部移行の使用に関連する。
【背景技術】
【０００３】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が治療効果を発揮し得る機構は、生来のエフェクターシステム、例えば、細胞傷害性細胞（例えば、マクロファージ）および酵素（例えば、補体）などを動員し、その後、これらが、ｍＡｂが結合する細胞を標的とすることにより、ガン細胞および他の望まれない細胞の除去を刺激することによってである。
【０００４】
例えば、Ｉ型抗ＣＤ２０ｍＡｂ（例えば、現在のマーケットリーダーであるリツキシマブなど）は、ｍＡｂの抗原結合ドメインを介してであるが、Ｂ細胞の表面のＣＤ２０分子に結合し、これらの標的Ｂ細胞を除くことによって働く。それらは、これらのエフェクター細胞の表面に発現するＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を介してｍＡｂのＦｃドメインと相互作用するエフェクター細胞を動員し、活性化することによってこのことを行う。
【０００５】
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のリツキシマブは、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の患者の全生存（ＯＳ）を改善している（１〜４）。マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）では、ほどほどの応答のみが認められ（５）、一方、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）では、最初の単剤リツキシマブ試験は他の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）対応物の場合に見られるほどの際立った応答をもたらさなかった（このことが（６）において総説される）。リンパ腫の一部はリツキシマブに対する元来的な抵抗性を示すか、または、最終的には、リツキシマブを含有する併用治療に対して抵抗性になる（７）。リツキシマブ処置に対する種々のＮＨＬサブタイプのこの処置抵抗性および認められた感受性の背後にある分子的基礎は現在不明であり、しかし、この分子的基礎には、ＣＤ２０発現のレベル（８〜１０）、補体防御分子（ＣＤ５５およびＣＤ５９）の高発現（１１、１２）、アポトーシス抵抗性の発達（１３）、および、低親和性対立因子の発現の結果としての最適でないＦｃ−ガンマ−受容体（ＦｃγＲ）相互作用（１４）が含まれるかもしれない。
【０００６】
処置が最適でないか、または、抵抗性が明らかである場合、そのような抗体の有効性を増大させることが非常に望ましい。
【０００７】
Ｆｃ：ＦｃγＲ相互作用が抗ＣＤ２０ｍＡｂの効力にとって非常に重要であることが一般に受け入れられている（１５〜１８）。このことと一致して、より大きい親和性の１５８Ｖ対立因子をＦｃγＲＩＩＩａにおいて有するリンパ腫患者は、低親和性の１５８Ｆアロタイプを有するリンパ腫患者と比較して、リツキシマブに対してより良好に応答する（１４）。このことは、多くの研究者に、ｍＡｂとＦｃγＲＩＩＩａとの相互作用を、例えば、脱フコシル化により増強することに集中するようにさせている（１９）。対照的に、ＩＴＡＭを有する受容体、例えば、抗原についてのＢ細胞受容体（ＢＣＲ）などによって受け取られる刺激性活性の負の調節因子として作用する阻害性ＦｃγＲＩＩｂおよび活性化ＦｃγＲの潜在的影響にはあまり関心が向けられてこなかった。Ｂ細胞において、この相互作用は、免疫複合体の結合の後におけるＢ細胞の増殖を制限するために役立ち、これに対して、マクロファージにおいては、ＦｃγＲＩＩｂの会合により、細胞障害活性の阻害がもたらされる（１５）。
【０００８】
Ｂ細胞悪性腫瘍の中には、ＦｃγＲＩＩｂが、ＣＬＬ／ＳＬＬ、ＭＣＬおよびＦＬの表面に発現され、後者は特に転換時においてである。ＤＬＢＣＬでは、ＦｃγＲＩＩｂの発現はより弱く、したがって、このことから、相関がなぜ、その発現と、リツキシマブ−ＣＨＯＰ（Ｒ−ＣＨＯＰ）化学療法に対する応答との間において何ら明らかにできなかったかが説明される（２０、２１）。活性化ＦｃγＲの場合と同様に、ＦｃγＲＩＩｂの活性に影響を与える多型もまた見出されており（２２、２３）、２３２Ｉ対立因子がＢＣＲ媒介のカルシウム流束を２３２Ｔ対立因子よりも効率的に阻害する。しかしながら、ＷｅｎｇおよびＬｅｖｙ（２４）は、これらの多型と、リツキシマブ治療に対する応答との間における相関をＦＬ患者において立証することができなかった。
【０００９】
増大する数の抗ＣＤ２０ｍＡｂが臨床研究のために利用可能になっている。これらの様々な抗ＣＤ２０ｍＡｂは、ＣＤ２０を原形質膜において再分布させるそれらの能力および様々なエフェクターアッセイにおけるそれらの活性に従って、Ｉ型（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ）またはＩＩ型（例えば、トシツモマブ（Ｂ１）、ＧＡ１０１、１１Ｂ８）として分類することができる（２５〜２７）。
【００１０】
本発明者らおよび他の研究者は、ＩＩ型ｍＡｂは、Ｂ細胞標的を多くののモデル系において除くことがより強力であることを示している（１８、１９）。例えば、リソソーム細胞死を誘発するＩＩ型ｍＡｂのより大きな能力が明白でない、正常なＢ細胞除去のヒトＣＤ２０遺伝子組換え（Ｔｇ）モデルにおいて（２５、２７）、本発明者らは、この効力が内部移行に対するそれらの抵抗性と相関したことを明らかにした（２８）。これは、リツキシマブのようなＩ型ｍＡｂとは対照的である。リツキシマブのようなＩ型ｍＡｂは、エネルギーおよび温度に依存し、かつ、アクチンの再分布を伴うプロセス（２８）でＣＤ２０と一緒に細胞表面から迅速に内部移行するからである。モジュレーションの速度が、種々の起源（原発性腫瘍対細胞株；ＣＬＬ対ＦＬ）に由来する細胞に関して顕著に異なった。だが、このことの分子的基礎は説明されないままであった。
【００１１】
国際公開ＷＯ２００８／００２９３３は、ＦｃガンマＲＩＩＢ（ＣＤ２３Ｂ）特異的抗体およびＣＤ２０特異的抗体、ならびに、Ｂ細胞関連の疾患または障害を、両抗体の組合せを使用して処置する方法を記載する。しかしながら、患者の一部、すなわち、その標的細胞が上昇したレベルのＦｃγＲＩＩｂを発現する患者を認識および／または処置するための教示または示唆、あるいは、抗体のどのタイプがＦｃγＲＩＩｂ抗体との併用処置のために好適であるかに対する教示または示唆が何ら認められない。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
予想外であったが、本発明者らは今回、モジュレーションが、細胞サブタイプにもかかわらず、ＦｃγＲＩＩｂの表面発現と強く相関し、過剰発現により、Ｒａｍｏｓ細胞が、遅いモジュレート体から迅速なモジュレート体に変換され得ることを示す。ＦｃγＲＩＩｂの内部移行がＣＤ２０と一緒に起こり、また、それに先立って、その活性化が生じた。まとめると、これらのデータは、種々のＮＨＬサブタイプのサブタイプ内およびサブタイプ間の両方におけるモジュレーション速度の以前に認められた不均一性についての明確な分子的根拠をもたらす。
【００１３】
すなわち、本発明者らは今回、驚くべきことに、抗原、例えば、ＣＤ２０などに対する抗体の有効性を決定する重要な要因が、同じ細胞の表面における阻害性ＦｃγＲＩＩｂ（これは、ＣＤ３２、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２Ｂ１、ＣＤ３２Ｂ２、ＦｃＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩｂまたはＦｃＲＩＩＢとしてもまた知られており、ＣＤ３２、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２Ｂ１、ＣＤ３２Ｂ２、ＦｃＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩｂまたはＦｃＲＩＩＢを包含する）との相互作用であることを示す。この相互作用は標的細胞による抗体の内部移行を引き起こし、したがって、この内部移行により、抗体はエフェクター細胞のＦｃ受容体と相互作用することができなくなる。本発明者らはさらに、薬剤、例えば、抗ＣＤ３２ｍＡｂなどがこの内部移行を阻止し得ることを明らかにする。本発明者らはまた、そのような薬剤が、細胞表面抗原を標的化するために様々な抗体（例えば、リツキシマブなど）との組合せで使用され得ること、また、それらの活性を、正常なＢ細胞または腫瘍細胞を除くためにインビボにおいて改善し得ることを明らかにする。
【００１４】
本発明によると、（ｉ）ＦｃγＲＩＩｂと結合することができるＦｃドメインを有する、標的細胞の細胞表面抗原と特異的に結合する抗体分子
と、組み合わせて
（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩｂが前記抗体分子の前記Ｆｃドメインに結合することを妨げるか、または低減させる薬剤
を含む組成物であって、ＦｃγＲＩＩｂ発現の上昇したレベルを有する標的細胞を有する患者の処置において使用されるためのものであることを特徴とする組成物を提供する。
【００１５】
別の側面によると、本発明は、抗体分子のＦｃドメインと、標的細胞上のＦｃγＲＩＩｂとの間における結合を妨げるか、または低減させる薬剤の使用であって、前記抗体分子は前記標的細胞の表面抗原と特異的に結合し、ＦｃγＲＩＩｂ発現の上昇したレベルを有する標的細胞を有する患者の処置において使用されるための医薬品の製造においてであることを特徴とする使用を提供する。
【００１６】
別の側面によると、本発明は、ＦｃγＲＩＩｂを発現する標的細胞を有する患者を処置する方法であって、（ｉ）ＦｃγＲＩＩｂと結合することができるＦｃドメインを有する、前記標的細胞の表面抗原と特異的に結合する抗体分子と、組み合わせて（ｉｉ）前記抗体分子の前記Ｆｃドメインと、ＦｃγＲＩＩｂとの間における結合を妨げるか、または低減させる薬剤を投与することを含み、かつ、前記患者が、それらの標的細胞が上昇したレベルのＦｃγＲＩＩｂを発現することに基づいて選択されることを特徴とする方法を提供する。
【００１７】
本発明の前記組成物、使用または方法の特定の実施形態において、前記薬剤は、前記標的細胞上に存在するＦｃγＲＩＩｂが前記抗体分子の前記Ｆｃドメインに結合することを妨げるか、または低下させる。
【００１８】
別の側面によると、本発明は、標的細胞におけるＦｃγＲＩＩｂ発現の使用であって、ＦｃγＲＩＩｂと結合することができるＦｃドメインを有する、前記標的細胞の表面抗原に特異的に結合する抗体分子による処置に対する前記標的細胞の応答についての予後マーカーとしての使用であり、それにより、ＦｃγＲＩＩｂの上昇したレベルが前記抗体分子による処置に対する応答における低下または前記抗体分子による処置に対する応答の非存在を示すものである、使用を提供する。
【００１９】
１つの実施形態において、標的細胞におけるＦｃγＲＩＩｂ発現の予後マーカーとしての使用は、標的細胞におけるＦｃγＲＩＩｃ発現の予後マーカーとしての使用を必要としない。
【００２０】
別の側面によると、本発明は、標的細胞表面抗原と特異的に結合し、かつ、ＦｃγＲＩＩｂと結合することができるＦｃドメインを有する抗体分子による処置に対する患者の標的細胞の応答を予測するための方法であって、前記標的細胞におけるＦｃγＲＩＩｂの発現レベルを求めることを含み、それにより、ＦｃγＲＩＩｂの上昇したレベルが前記抗体分子による処置に対する応答における低下または前記抗体分子による処置に対する応答の非存在を予測するものであることを特徴とする方法を提供する。
【００２１】
１つの実施形態において、患者の標的細胞の応答を予測するための方法は、標的細胞上のＦｃγＲＩＩｂの発現レベルを求めることを含み、かつ、標的細胞上のＦｃγＲＩＩｃの発現レベルを求めることをさらに含まない。
【００２２】
必ずしもすべての抗体が、それらの共通するＦｃ結合抗体定常ドメインおよび知られているＦｃガンマ受容体結合能にもかかわらず、ＦｃγＲＩＩｂ依存的様式で内部移行されず、このことにより、ＦｃγＲＩＩｂ機能調節試薬を含む併用治療による治療的成功のために、また、逆に、患者に利益をもたらさないことになる処置を回避するために非常に重要である好適な抗体の特定が行われることが明らかにされている。
【００２３】
本発明の前記組成物、使用または方法の特定の実施形態において、ＦｃγＲＩＩｂと結合することができるＦｃドメインを有する、標的細胞の細胞表面抗原と特異的に結合する前記抗体分子はＦｃγＲＩＩｂ依存的様式で前記標的細胞内に内部移行されることが可能である。
【００２４】
本発明の組成物、使用または方法のある特定の実施形態において、ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを妨げるか、または低減させる薬剤はさらに、その後での抗体分子の細胞内への内部移行を妨げるか、または低減させる。
【００２５】
本発明の組成物、使用または方法のある特定の実施形態において、標的細胞はガン細胞である。好都合には、標的細胞はＢ細胞である。
【００２６】
好都合なことではあるが、本発明によれば、標的細胞における上昇したＦｃγＲＩＩｂ発現がコントロールまたは参照物に対して求められる。好ましくは、コントロールは、標的細胞と同じタイプの細胞におけるＦｃγＲＩＩｂ発現の正常なレベルである。
【００２７】
「ＦｃγＲＩＩｂ発現の上昇したレベル」は下記において「定義」のもとで定義される。ＦｃγＲＩＩｂ発現レベルは、イソタイプコントロールに対するＦｃγＲＩＩｂの幾何平均蛍光強度（Ｇｅｏ  ＭＦＩ）の比率として測定することができる。代替において、ＦｃγＲＩＩｂ発現レベルは腫瘍生検物の免疫組織化学によって測定することができる。当業者は、ＦｃγＲＩＩｂ発現レベルを求めるための多数の技術および方法論が存在することを理解するであろう。
【００２８】
本発明はまた、ＦｃγＲＩＩｂ抗体との併用処置のために好適である抗体、すなわち、標的細胞表面からＦｃγＲＩＩｂ依存的様式で内部移行されるそのような抗体をどのようにして特定するかを教示する。本発明はさらに、ＦｃγＲＩＩｂ抗体との併用処置のために好適である患者サブセットを特定するための手段を提供する。
【００２９】
別の局面において、本発明は、標的細胞表面抗原に対する抗体のＦｃドメインと、標的細胞上のＦｃγＲＩＩｂとの間における結合を低減させるか、または妨げる薬剤を特定するためのアッセイであって、Ｆｃドメインと、ＦｃγＲＩＩｂとの間における結合の程度を試験剤の存在下および非存在下で求めることを含むアッセイを提供する。試験剤が、ＦｃドメインがＦｃγＲＩＩｂに結合することを低減させるか、または妨げるならば、有用な薬剤が特定される。そのようなアッセイはまた、どの薬剤（例えば、抗体分子）が抗ＦｃγＲＩＩｂ抗体との併用治療のために好適であるかを特定するためにも有用である。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、本発明の使用および方法の実施において有用である薬剤を特定するためのアッセイは、ウエスタンブロッティングによって検出されるような細胞内ＩＴＩＭモチーフにおけるチロシン−２９３のリン酸化によって示されるように、ＦｃγＲＩＩｂの刺激／シグナル伝達を阻止する薬剤についてスクリーニングすることを伴う。例えば、Ｒａｊｉ細胞が、リン酸化ＦｃγＲＩＩｂについての免疫ブロッティングの前に抗ＦｃγＲＩＩｂ試験剤の存在下または非存在下で細胞表面抗原に対する抗体、例えば、抗ＣＤ２０ｍＡｂのリツキシマブとともに培養される。リン酸化ＦｃγＲＩＩｂの量が、リツキシマブによって刺激された細胞では上昇するが、ＡＴ１０を阻止剤として使用する図４Ａに示されるのと同様な試験剤の添加によって阻害されるはずである。加えて、これらの薬剤は好ましくは、図１Ａに示されるクエンチングアッセイによるリツキシマブの内部移行もまた阻止するはずである。図２Ｂは、抗ＦｃγＲＩＩｂ阻止実体、この場合にはＡＴ１０による阻止の典型的な一例を示す。そのようなアッセイはまた、どの薬剤（例えば、抗体分子）が抗ＦｃγＲＩＩｂ抗体との併用治療のために好適であるかを特定するためにも有用である。
【００３１】
好ましい実施形態実施において、ＦｃγＲＩＩｂ抗体との併用治療のために好適である薬剤を特定するために使用されるアッセイは、薬剤（例えば、抗体分子）のＦｃγＲＩＩｂ発現細胞内への内部移行の割合を測定する。このアッセイは、この方法が、薬剤（例えば、抗体分子）標的発現細胞およびＦｃγＲＩＩｂ発現細胞とのインキュベーションの後で細胞表面に保持される薬剤（例えば、抗体分子）の割合を求めることを含み、それにより、細胞表面で利用可能な薬剤（例えば、抗体分子）の低下する割合（これは、増大する抗体分子の内部移行に相当する）が抗体分子による処置に対する応答を予測するものであるという点で特徴づけられる。
【００３２】
Neubig et al (2003) Pharmacol. Rev. 55, 597-606（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）は、ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを妨げるか、または低減させる薬剤を本発明に従って特定するためにスクリーニングされ得るリガンドの様々なクラスを記載する。
【００３３】
上述のリガンドは小さい有機実体または無機実体であってもよく、しかし、好ましくはペプチドまたはポリペプチドである。典型的には、リガンドが小さい有機実体または有機実体であるとき、リガンドはＭｒが５０〜２０００であり、例えば、１００〜１０００であり、例えば、１００〜５００である。
【００３４】
典型的には、リガンドは、ｍＭ〜ｐＭのＫｄにより、例えば、μＭ（マイクロモル濃度）〜ｎＭの範囲におけるＫｄによりＦｃγＲＩＩｂに結合する。一般には、最も低いＫｄを有するリガンドが好ましい。
【００３５】
リガンドは、ペプチド模倣体、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはアプタマーであってもよい。リガンドはまた、脂質または炭水化物であってもよい。
【００３６】
リガンドは、ＦｃγＲＩＩｂに結合するポリペプチドであってもよい。そのようなポリペプチド（ポリペプチドよって、オリゴペプチドが包含される）は典型的には、５００のＭｒから５０，０００のＭｒまでであり、しかし、より大きくてもよい。
【００３７】
ポリペプチドはまた、モジュール構成に基づく結合性タンパク質、例えば、アンキリン反復タンパク質、アルマジロ反復タンパク質、ロイシンリッチタンパク質、テトラトリオペプチド反復タンパク質または設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、あるいは、リポカリンまたはフィブロネクチンドメインまたはアフィリン足場に基づくタンパク質などあってもよい。
【００３８】
好都合には、試験剤は試験化合物のライブラリーであり、好ましくは、ライブラリーは、ペプチドライブラリー、タンパク質ライブラリー、抗体ライブラリー、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリー、あるいは、ｓｃＦＶファージディスプレーライブラリーまたはＦａｂファージディスプレーライブラリーのいずれかである。
【００３９】
好ましくは、本発明による組成物、使用または方法において、薬剤（ｉｉ）は、ＦｃγＲＩＩｂと特異的に結合する１つまたは複数の抗体分子である。好都合には、そのような１つまたは複数の抗体分子は、エフェクター細胞を動員することができるドメインを含まない。エフェクター細胞を動員すること。
【００４０】
好都合なことではあるが、そのような１つまたは複数の抗体分子は１つまたは複数のモノクローナル抗体である。
【００４１】
好ましくは、薬剤はＦｃγＲＩＩｂのシグナル伝達を妨げるか、または低減させる。一層より好ましくは、薬剤は、標的細胞による抗体分子の内部移行を妨げるか、または低減させる。
【００４２】
下記の実施形態において、配列番号は、下記のクローン１〜１３において示される配列を示す。
【００４３】
当業者は気づいているであろうように、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインには存在する。本明細書中に記載されるそれぞれのＣＤＲに対するアミノ酸の帰属は、Kabat EA et al. 1991, In "Sequences of Proteins of Immulogical Interest" Fifth Edition, NIH Publication No. 91-3242, pp xv-xvii.)による定義に従っている。
【００４４】
当業者は気づいているかもしれないように、他の方法もまた、アミノ酸をそれぞれのＣＤＲに帰属するために存在する。例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム(IMGT（登録商標）) (http://www.imgt.org/ and Lefranc and Lefranc “The Immunoglobulin FactsBook” published by Academic Press, 2001)。
【００４５】
１つの実施形態において、前記薬剤は、下記のＣＤＲを含む可変性重鎖（ＶＨ）：
（ｉ）配列番号２９および配列番号３０および配列番号３１；または
（ｉｉ）配列番号３５および配列番号３６および配列番号３７；または
（ｉｉｉ）配列番号４１および配列番号４２および配列番号４３；または
（ｉｖ）配列番号４７および配列番号４８および配列番号４９；または
（ｖ）配列番号５３および配列番号５４および配列番号５５；または
（ｖｉ）配列番号５９および配列番号６０および配列番号６１；または
（ｖｉｉ）配列番号６５および配列番号６６および配列番号６７；または
（ｖｉｉｉ）配列番号７１および配列番号７２および配列番号７３；または
（ｉｘ）配列番号７７および配列番号７８および配列番号７９；または
（ｘ）配列番号８３および配列番号８４および配列番号８５；または
（ｘｉ）配列番号８９および配列番号９０および配列番号９１；または
（ｘｉｉ）配列番号９５および配列番号９６および配列番号９７；または
（ｘｉｉｉ）配列番号１０１および配列番号１０２および配列番号１０３
を含む。
【００４６】
好ましくは、前記薬剤は、下記のＣＤＲを含む可変性軽鎖（ＶＬ）：
（ｉ）配列番号３２および配列番号３３および配列番号３４；または
（ｉｉ）配列番号３８および配列番号３９および配列番号４０；または
（ｉｉｉ）配列番号４４および配列番号４５および配列番号４６；または
（ｉｖ）配列番号５０および配列番号５１および配列番号５２；または
（ｖ）配列番号５６および配列番号５７および配列番号５８；または
（ｖｉ）配列番号６２および配列番号６３および配列番号６４；または
（ｖｉｉ）配列番号６８および配列番号６９および配列番号７０；または
（ｖｉｉｉ）配列番号７４および配列番号７５および配列番号７６；または
（ｉｘ）配列番号８０および配列番号８１および配列番号８２；または
（ｘ）配列番号８６および配列番号８７および配列番号８８；または
（ｘｉ）配列番号９２および配列番号９３および配列番号９４；または
（ｘｉｉ）配列番号９８および配列番号９９および配列番号１００；または
（ｘｉｉｉ）配列番号１０４および配列番号１０５および配列番号１０６
を含む。
【００４７】
選択的に、前記薬剤は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択される可変性重鎖（ＶＨ）アミノ酸配列を含む。
【００４８】
選択的に、前記薬剤は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択される可変性軽鎖（ＶＬ）アミノ酸配列を含む。
【００４９】
好ましくは、前記薬剤は、下記のＣＤＲアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号２９および配列番号３０および配列番号３１および配列番号３２および配列番号３３および配列番号３４；または
（ｉｉ）配列番号３５および配列番号３６および配列番号３７および配列番号３８および配列番号３９および配列番号４０；または
（ｉｉｉ）配列番号４１および配列番号４２および配列番号４３および配列番号４４および配列番号４５および配列番号４６；または
（ｉｖ）配列番号４７および配列番号４８および配列番号４９および配列番号５０および配列番号５１および配列番号５２；または
（ｖ）配列番号５３および配列番号５４および配列番号５５および配列番号５６および配列番号５７および配列番号５８；または
（ｖｉ）配列番号５９および配列番号６０および配列番号６１および配列番号６２および配列番号６３および配列番号６４；または
（ｖｉｉ）配列番号６５および配列番号６６および配列番号６７および配列番号６８および配列番号６９および配列番号７０；または
（ｖｉｉｉ）配列番号７１および配列番号７２および配列番号７３および配列番号７４および配列番号７５および配列番号７６；または
（ｉｘ）配列番号７７および配列番号７８および配列番号７９および配列番号８０および配列番号８１および配列番号８２；または
（ｘ）配列番号８３および配列番号８４および配列番号８５および配列番号８６および配列番号８７および配列番号８８；または
（ｘｉ）配列番号８９および配列番号９０および配列番号９１および配列番号９２および配列番号９３および配列番号９４；または
（ｘｉｉ）配列番号９５および配列番号９６および配列番号９７および配列番号９８および配列番号９９および配列番号１００；または
（ｘｉｉｉ）配列番号１０１および配列番号１０２および配列番号１０３および配列番号１０４および配列番号１０５および配列番号１０６
を含む。
【００５０】
よりさらに好ましくは、前記薬剤は、下記のアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号３および配列番号１６；または
（ｉｉ）配列番号４および配列番号１７；または
（ｉｉｉ）配列番号５および配列番号１８；または
（ｉｖ）配列番号６および配列番号１９；または
（ｖ）配列番号７および配列番号２０；または
（ｖｉ）配列番号８および配列番号２１；または
（ｖｉｉ）配列番号９および配列番号２２；または
（ｖｉｉｉ）配列番号１０および配列番号２３；または
（ｉｘ）配列番号１１および配列番号２４；または
（ｘ）配列番号１２および配列番号２５；または
（ｘｉ）配列番号１３および配列番号２６；または
（ｘｉｉ）配列番号１４および配列番号２７；または
（ｘｉｉｉ）配列番号１５および配列番号２８
を含む。
【００５１】
本発明の薬剤はまた、配列番号１および配列番号２の定常領域（ＣＨ）および（ＣＬ）を含む場合がある。
【００５２】
さらなる実施形態において、薬剤は、ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを妨げるか、または低減させるために、本明細書中に記載される本発明の薬剤と競合することができ、例えば、上記実施形態において述べられるアミノ酸配列（例えば、配列番号１〜配列番号１０６）を含む薬剤と競合することができる。
【００５３】
ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを妨げるか、または低減させるために、本明細書中で定義されるような薬剤（例えば、抗原分子など）と「競合することができる」によって、試験された薬剤が、少なくとも部分的には、本明細書中に定義されるような薬剤のＦｃγＲＩＩｂへの結合を阻害するか、または、そうでない場合には妨害し、ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを妨げることができること、または低減させることができることが意味される。
【００５４】
例えば、薬剤は、本明細書中に記載される薬剤の結合を少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％阻害するか、または、１００％さえ阻害すること、および／あるいは、ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを妨げるか、または低減させる薬剤の能力を少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％阻害するか、または、１００％させ阻害することが可能であるかもしれない。
【００５５】
競合的結合が、当業者には広く知られている方法によって、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などによって求められ得る。
【００５６】
ＥＬＩＳＡアッセイを、エピトープ改変抗体または阻止抗体を評価するために使用することができる。競合性抗体を特定するために好適なさらなる方法が、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に開示される（例えば、５６７頁〜５６９頁、５７４頁〜５７６頁、５８３頁および５９０頁〜６１２頁、１９８８、ＣＳＨＬ、ＮＹ、ＩＳＢＮ０−８７９６９−３１４−２を参照のこと）。
【００５７】
本発明の薬剤は下記の定常領域（ＣＨおよびＣＬ）を含むことができる：
IgG1-CH [配列番号１]
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
λ-CL [配列番号２]
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
【００５８】
本発明の薬剤はクローン１〜１４の１つまたは複数の配列を含むことができる：
クローン１
VH [配列番号3]
【表１】
2013537547.tif 000003
-VL [配列番号16]
【表２】
2013537547.tif 000004
ＣＤＲ領域

CDRH1:  NYGMH  [配列番号29]
CDRH2:  VISYDGSNKYYADSVKG  [配列番号30]
CDRH3:  EWRDAFDI  [配列番号31]

CDRL1:  TGSSSNIGAGYDVH  [配列番号32]
CDRL2:  SDNQRPS  [配列番号33]
CDRL3:  AAWDDSLSGSWV  [配列番号34]
【００５９】
クローン２

-VH [配列番号4]
【表３】
2013537547.tif 000005
-VL [配列番号17]
【表４】
2013537547.tif 000006
ＣＤＲ領域

CDRH1:  TYGMH  [配列番号35]
CDRH2:  VIAYDGSKKDYADSVKG  [配列番号36]
CDRH3:  EYRDAFDI  [配列番号37]

CDRL1:  TGSSSNIGAGYDVH  [配列番号38]
CDRL2:  GNSNRPS  [配列番号39]
CDRL3:  AAWDDSVSGWM  [配列番号40]

【００６０】
クローン３

-VH [配列番号5]
【表５】
2013537547.tif 000007
-VL [配列番号18]
【表６】
2013537547.tif 000008

ＣＤＲ領域

CDRH1:  NYGMH  [配列番号41]
CDRH2:  VISYDGSNRYYADSVKG  [SEQ ID NO: 42]
CDRH3:  DRWNGMDV  [配列番号43]

CDRL1:  SGSSSNIGAGYDVH  [配列番号44]
CDRL2: ANNQRPS  [配列番号45]
CDRL3: AAWDDSLNGPWV  [配列番号46]

【００６１】
クローン４

-VH [配列番号6]
【表７】
2013537547.tif 000009
-VL [配列番号19]
【表８】
2013537547.tif 000010
ＣＤＲ領域

CDRH1:  SYGMH  [配列番号47]
CDRH2:  VISYDGSDTAYADSVKG  [配列番号48]
CDRH3:  DHSVIGAFDI  [配列番号49]

CDRL1:  SGSSSNIGSNTVN  [配列番号50]
CDRL2:  DNNKRPS  [配列番号51]
CDRL3:  SSYAGSNNVV  [配列番号52]
【００６２】
クローン５
-VH [配列番号7]
【表９】
2013537547.tif 000011
-VL [配列番号20]
【表１０】
2013537547.tif 000012
ＣＤＲ領域

CDRH1:  NYGMH  [配列番号53]
CDRH2:  VISYDGSNKYYADSVKG  [配列番号54]
CDRH3:  DQLGEAFDI  [配列番号55]

CDRL1:  TGSSSNIGAGYDVH  [配列番号56]
CDRL2:  DNNKRPS  [配列番号57]
CDRL3:  ATWDDSLSGPV  [配列番号58]
【００６３】
クローン６
-VH [配列番号8]
【表１１】
2013537547.tif 000013
-VL [配列番号21]
【表１２】
2013537547.tif 000014
ＣＤＲ領域
CDRH1:  DYGMS  [配列番号59]
CDRH2:  AISGSGSSTYYADSVKG  [配列番号60]
CDRH3:  GDIDYFDY  [配列番号61]

CDRL1:  TGSSSNFGAGYDVH [配列番号62]
CDRL2:  ENNKRPS [配列番号63]
CDRL3:  AAWDDSLNGPV  [配列番号64]
【００６４】
クローン７
-VH [配列番号9]
【表１３】
2013537547.tif 000015
-VL [配列番号22]
【表１４】
2013537547.tif 000016
ＣＤＲ領域
CDRH1:  SYGMH  [配列番号65]
CDRH2:  VISYDGSNKYYADSVKG  [配列番号66]
CDRH3:  ERRDAFDI  [配列番号67]

CDRL1:  TGSSSNIGAGYDVH  [配列番号68]
CDRL2:  SDNQRPS  [配列番号69]
CDRL3:  ATWDSDTPV  [配列番号70]
【００６５】
クローン８
-VH [配列番号10]
【表１５】
2013537547.tif 000017
-VL [配列番号23]
【表１６】
2013537547.tif 000018
ＣＤＲ領域
CDRH1:  SYGMH  [配列番号71]
CDRH2:  VISYDGSNKYYADSVKG  [配列番号72]
CDRH3:  DHSAAGYFDY  [配列番号73]

CDRL1:  SGSSSNIGSNTVN  [配列番号74]
CDRL2:  GNSIRPS  [配列番号75]
CDRL3:  ASWDDSLSSPV  [配列番号76]

【００６６】
クローン９
-VH [配列番号11]
【表１７】
2013537547.tif 000019
-VL [配列番号24]
【表１８】
2013537547.tif 000020
ＣＤＲ領域
CDRH1:  SYGMH  [配列番号77]
CDRH2:  GISWDSAIIDYAGSVKG  [配列番号78]
CDRH3:  DEAAAGAFDI  [配列番号79]

CDRL1:  TGSSSNIGAGYDVH  [配列番号80]
CDRL2:  GNTDRPS  [配列番号81]
CDRL3:  AAWDDSLSGPVV  [配列番号82]

【００６７】
クローン１３
-VH [配列番号15]
【表１９】
2013537547.tif 000021
-VL [配列番号28]
【表２０】
2013537547.tif 000022

ＣＤＲ領域
CDRH1:  SYGIS  [配列番号101]
CDRH2:  GISGSGGNTYYADSVKG  [配列番号102]
CDRH3:  SVGAYANDAFDI  [配列番号103]

CDRL1:  TGSSSNIGAGYDVH  [配列番号104]
CDRL2:  GDTNRPS  [配列番号105]
CDRL3:  AAWDDSLNGPV  [配列番号106]
【００６８】
クローン１０
-VH [配列番号12]
【表２１】
2013537547.tif 000023
-VL [配列番号25]
【表２２】
2013537547.tif 000024
ＣＤＲ領域
CDRH1:  SYGMH  [配列番号83]
CDRH2:  VISYDGSNKYYADSVKG  [配列番号84]
CDRH3:  ELYDAFDI  [配列番号85]

CDRL1:  TGSSSNIGAGYDVH  [配列番号86]
CDRL2:  ADDHRPS  [配列番号87]
CDRL3:  ASWDDSQRAVI   [配列番号88]
【００６９】
クローン１１
-VH [配列番号13]
【表２３】
2013537547.tif 000025
-VL [配列番号26]
【表２４】
2013537547.tif 000026
ＣＤＲ領域
CDRH1:  SYGMH  [配列番号89]
CDRH2:  VISYDGSNKYYADSVKG  [配列番号90]
CDRH3:  EFGYIILDY  [配列番号91]

CDRL1:  SGSSSNIGSNTVN  [配列番号92]
CDRL2:  RDYERPS  [配列番号93]
CDRL3:  MAWDDSLSGVV  [配列番号94]
【００７０】
クローン１２
-VH [配列番号14]
【表２５】
2013537547.tif 000027
-VL [配列番号27]
【表２６】
2013537547.tif 000028

ＣＤＲ領域
CDRH1:  NHGMH  [配列番号95]
CDRH2:  VISYDGTNKYYADSVRG  [配列番号96]
CDRH3:  ETWDAFDV  [配列番号97]

CDRL1:  SGSSSNIGSNNAN  [配列番号98]
CDRL2:  DNNKRPS  [配列番号99]
CDRL3:  QAWDSSTVV  [配列番号100]
【００７１】
好ましい標的細胞表面抗原を下記から選択することができる：
CD20, Thy-1 (CD90, Cluster of Differentiation 90 (Biofactors. 2009 May-Jun;35(3):258-65)); Ly-6 (リンパ球抗原Lymphocyte Antigen 6 (Mol Biol Rep. 2009 Apr;36(4):697-703)); CD59 (補体調節タンパク質Complement regulatory protein (Mol Immunol. 2007 Jan;44(1-3):73-81)); Fas (FS7関連細胞表面抗原FS7-associated cell surface antigen, CD95, APO-1 or TNFRSF6 (Adv Exp Med Biol. 2009;647:64-93)); EGFR (上皮成長因子受容体Epidermal Growth Factor Receptor (FEBS J. 2010 Jan;277(2):301-8)); Her2 (ヒト上皮成長因子受容体Human epidermal growth factor receptor 2 (Clin Breast Cancer. 2008 Oct;8(5):392-401)); CXCR4 (ケモカイン受容体４Chemokine Receptor 4 (Biochim Biophys Acta. 2007 Apr;1768(4):952-63)); CD19 (Cluster of Differentiation 19 (Cell Immunol. 1989 Feb;118(2):368-81)); CD40 (Cluster of Differentiation 40 (Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2009 Feb;104(2):87-92)); HLA分子(ヒト白血球型抗原分子(Korean J Lab Med. 2010 Jun;30(3):203)); GM1 (ガングリオシドganglioside, monosialotetrahexosylganglioside (J Lipid Res. 2010 Sep;51(9):2731-8)); CD22 (Cheson (2008) NEJM 359(6): 613-26); CD23 (Cheson, 2008); CD80 (Cheson, 2008); CD74 (Cheson, 2008); DRD (Cheson, 2008).
【００７２】
好ましくは、本発明による組成物、使用または方法において、表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ４０から選択され、より好ましくは、それらのヒト形態から選択される。ＣＤ２０、とりわけ、ヒトＣＤ２０が最も好ましい。
【００７３】
好都合なことではあるが、細胞表面抗原と特異的に結合する抗体分子はモノクローナル抗体であり、好ましくは、標的細胞に結合したとき、細胞表面から除かれ、ＦｃγＲＩＩｂ依存的様式で標的細胞内に内部移行されるモノクローナル抗体である。好ましくは、そのようなモノクローナル抗体は、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体または抗ＣＤ４０抗体である。最も好ましくは、そのようなモノクローナル抗体は抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
【００７４】
好ましい実施形態実施において、細胞表面抗原に特異的に結合する抗体分子はＩ型抗ＣＤ２０抗体である。別の好ましい実施形態実施において、細胞表面抗原に特異的に結合する抗体分子はＩＩ型抗ＣＤ２０抗体ではない。
【００７５】
１つの実施形態において、細胞表面抗原はＣＤ２０であり、かつ、細胞表面抗原に特異的に結合する抗体分子はＩ型抗体である。
【００７６】
上述のように、２つのタイプの抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が存在する。抗ＣＤ２０ｍＡｂは、最初、２００３年に種々のグループ分けに分類されるとして本発明者らによって定義され（４３および２５）、その後、２００４年にＩ型ｍＡｂおよびＩＩ型ｍＡｂとして定義された（２６）。当初、このことについての根拠は、抗ＣＤ２０ｍＡｂが、リンパ腫の異種移植片を根絶するそれらの能力に基づく２つの異なったタイプの試薬に分類されることであった：すなわち、Ｉ型（例えば、リツキシマブおよび１Ｆ５）は補体を利用し、ＩＩ型（例えば、Ｂ１）は補体を利用しない。両方のタイプのｍＡｂは生存の優れた延長をもたらし、しかし、補体活性を枯渇させることは、ＣＶＦを投与することによる場合、リツキシマブおよび１Ｆ５の効力をかなり損なったが、Ｂ１の活性に対する影響は何らなかった。これらの結果から、種々のＣＤ２０ｍＡｂが、異なるエフェクター機構をインビボにおいて作動させることが明瞭に示された。そのうえ、これらの結果は、リツキシマブおよび１Ｆ５が、ＣＤ２０を標的細胞膜における脂質ラフトに転位置させることの結果として、補体を効率的に活性化し得ることを示す以前の研究、すなわち、Ｂ１型ｍＡｂは補体を活性化することができないことを示す何かの研究（４３）と完全に一致している。補体と会合し、かつ、ＣＤ２０を脂質ラフト内に移動するように誘導するｍＡｂの能力との優れた相関が認められる（４３、２６）。したがって、Ｉ型およびＩＩ型の性質は、ＣＤ２０を脂質ラフト内に移動させるそれらの能力によって定義することができる。このことが、下記に示されるように決定され得る。ＩＩ型ｍＡｂはより強力なホモタイプ接着を誘発することができ、かつ、細胞死を導くことができることとの相関もまた認められる。しかし、これらは、（Ｔｘ−１００ラフトアッセイ（下記参照）とは異なり）Ｉ型またはＩＩ型のｍＡｂを定義するために単独で使用することができなかった。
【００７７】
したがって、様々な抗ＣＤ２０ｍＡｂが、ＣＤ２０を原形質膜において再分布するそれらの能力および様々なエフェクターアッセイにおけるそれらの活性に従ってＩ型（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ）またはＩＩ型（例えば、トシツモマブ（Ｂ１）、ＧＡ１０１、１１Ｂ８）として分類され得る（２５〜２７）。Ｉ型（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ）の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、ＣＤ２０を大きい界面活性剤抵抗性のミクロドメイン（ラフト）の中に再分布するように誘導し、これに対して、ＩＩ型（トシツモマブ様）の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は誘導しない（５０）。
【００７８】
上記で議論されたように、抗ＣＤ２０ｍＡｂは、ＣＤ２０を脂質ラフト内に再分布させるかどうかによってＩ型またはＩＩ型と呼ぶことができる。これは、Ｔｘ−１００不溶性アッセイによって、または、スクロース密度勾配分離およびウエスタンブロッティングによって行われる。両方の方法が、下記のように、Ｃｒａｇｇ他、Ｂｌｏｏｄ、２００３（４３）に記載される：
【００７９】
１．Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性によるラフト会合抗原の評価
ラフトミクロドメインにおける抗原存在の迅速評価として、本発明者らは、低温におけるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性に基づくフローサイトメトリー法を利用した。簡単に記載すると、細胞をＲＰＭＩ／１％ＢＳＡにおいて洗浄し、２．５×１０６個／ｍｌで再懸濁した。その後、細胞を１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣコンジュゲート化ｍＡｂと３７℃で１５分間インキュベーションし、冷ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／２０ｍＭアジ化ナトリウムにおいて洗浄し、その後、サンプルを二分した。一方を、１００％の表面抗原レベルの計算を可能にするために氷上で維持し、一方で、もう一方を、不溶性ラフト画分に残留する抗原の割合を求めるために氷上で１５分間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により処理した。その後、細胞を、アッセイの残り部分を通して４℃で維持し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物において１回洗浄し、上記で詳述されるように再懸濁し、フローサイトメトリーによって評価した。類似した結果が、間接的な検出方法を使用して得られた。標的抗原のラフト会合の構成的レベルを求めるために、細胞を最初、ＦＩＴＣ標識されたｍＡｂの結合に先立って、氷上で１５分間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により処理し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物において洗浄した。より多くの抗原が、さらなる架橋によって、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性画分に移動し得るかを評価するために、細胞をＦＩＴＣ−ｍＡｂと以前のようにインキュベーションし、洗浄し、その後、４つに分けた。これらのサンプルのうちの２つをヤギ抗マウスＩｇＦ（ａｂ’）２フラグメントと氷上で１５分間インキュベーションした。洗浄後、架橋サンプルの１つと、非架橋サンプルの１つとを、フローサイトメトリーに先立って、上記で詳述されるようにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００において溶解し、洗浄した。
【００８０】
２．スクロース密度勾配分離およびウエスタンブロッティング−脂質ラフト画分の調製およびウエスタンブロッティング
モノクローナルＡｂ（１μｇ／１０６細胞）を３７℃で細胞に加えた。２０分間インキュベーションした後、細胞をペレット化し、ＭＥＳ緩衝化生理的食塩水（２５ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフッ化物、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、５μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）における氷冷１．０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００において溶解した。その後、脂質ラフト画分をスクロース密度勾配遠心分離によって調製した。簡単に記載すると、溶解物を等体積の８０％スクロース／溶解緩衝液と混合し、不連続な５％〜３０％のスクロース密度勾配を重層し、その後、遠心分離を２００，０００ｘｇで１６時間行った。分画物（０．５ｍｌ）を集め、ウエスタンブロッティングによって分析した。それぞれの分画物の１５ｍｌアリコートを２×負荷緩衝液において１：１で希釈し、９５℃に５分間加熱し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、その後、ＰＶＤＦメンブランに転写し、一次抗体（例えば、ＣＤ２０を検出するためのマウス抗ＣＤ２０であるクローン７Ｄ１、または、ラフト画分を特定するための抗Ｌｙｎウサギポリ血清（Ｓｅｒｏｔｅｃ、英国））とインキュベーションし、その後、ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体とインキュベーションした
(Amersham Biosciences UK株式会社)。ブロットを、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓ
(Amersham Biosciences UK株式会社)を使用して可視化した。
【００８１】
抗ＣＤ２０ｍＡｂはＣＤ２０のラージループにおけるＡｘＰモチーフを要求し得る（オファツムマブおよび他のＧｅｎｍａｂ抗体は要求しない）。しかしながら、Ｎｉｅｄｅｒｆｅｌｎｅｒ他（５１）は、ＩＩ型ｍＡｂが、Ｉ型と比較して、ＣＤ２０ループのわずかに異なる領域に結合することを示す。
【００８２】
好ましくは、本発明による組成物、使用または方法において、標的細胞はガン細胞である。より好ましくは、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫または慢性リンパ性白血病（これらに限定されない）を含む非ホジキンリンパ腫から選択されるガン。
【００８３】
１つの実施形態において、本発明は、ガンを処置するための組成物、使用および方法を提供し、具体的には、リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病および非ホジキン病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の領域を伴う濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ならびに、びまん性小切り込み型細胞リンパ腫、または、それらの組合せから好ましくは選択されるＢ細胞悪性腫瘍を処置するための組成物、使用および方法を提供する。ある特定の実施形態において、Ｂ細胞悪性腫瘍はリンパ腫であり、例えば、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などである。
【００８４】
別の実施形態において、本発明は、炎症性疾患を処置するための組成物、使用および方法を提供する。これは自己免疫性疾患であってもよく、例えば、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、エリテマトーデス、多発性硬化症、自己免疫性内耳疾患、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、自己免疫性肝炎、家族性腺腫性ポリポーシスおよび潰瘍性大腸炎またはそれらの組合せなどであり得る。具体的な実施形態において、自己免疫性疾患は関節リウマチまたは全身性エリテマトーデスである。
【００８５】
好ましい実施形態において、処置は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞悪性腫瘍、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、全身性硬化症および自己免疫性水疱性疾患を含む疾患の処置である。
【００８６】
好ましい実施形態において、本発明の使用によって強化される処置は、抗ＣＤ２０ｍＡｂ（例えば、リツキシマブなど）による処置である。
【００８７】
定義
「上昇した」によって、問題としている細胞が、低いレベルまたは中程度のレベルのＦｃγＲＩＩｂをその表面に発現するコントロール細胞または参照細胞よりも高いレベルのＦｃγＲＩＩｂをその表面に発現するという意味が包含される。例えば、問題としている細胞がＢ細胞のタイプである場合、発現レベルが、同じ細胞タイプのＢ細胞によるＦｃγＲＩＩｂの発現の正常なレベル（好ましくはメジアンレベル）よりも大きかったならば、ＦｃγＲＩＩｂ発現の「上昇した」レベルが認識されるであろう。代替において、問題としている細胞が、ＦｃγＲＩＩｂを低いレベルまたは中程度のレベルで発現する異なる細胞タイプよりも高いレベルでＦｃγＲＩＩｂを発現したならば、「上昇した」レベルが認識されるであろう。
【００８８】
本発明によれば、標的細胞のＦｃγＲＩＩｂ発現における上昇の程度が大きいほど、標的細胞の表面抗原に特異的に結合する抗体分子で、ＦｃγＲＩＩｂと結合することができるＦｃドメインを有する抗体分子による処置に対するそのような細胞の予測された応答が悪くなる。したがって、ＦｃγＲＩＩｂ発現における上昇が大きいほど、ＦｃドメインのＦｃγＲＩＩｂへの結合を妨げるか、または低減させる本発明による薬剤の使用から得られることになる利益が、図２Ｄおよび図３Ａにおいて明らかにされるように大きくなる。ＦｃγＲＩＩｂレベルをＩＨＣによって測定し（図１０ｂ）、ＭＣＬサンプルをＦｃγＲＩＩｂについて陽性および陰性に分けた後において、応答における明確な臨床的差異が、リツキシマブに基づく治療の後で認められた（図１０ｃおよび図１０ｄ）。
【００８９】
当業者は、細胞表面におけるＦｃγＲＩＩｂの発現レベルを、様々な知られている方法によって、例えば、添付された図面および実施例において記載されるフローサイトメトリー法および免疫組織化学的染色法などによって容易に求めることができる。
【００９０】
当業者は、ＦｃγＲＩＩｂの「正常な」発現レベルおよび「上昇した」発現レベルが種々の細胞タイプの間および種々の疾患状態の間で変化するはずであることを理解するであろうし、また、所与の標的細胞または疾患状態についてのＦｃγＲＩＩｂの「正常な」発現レベルおよび「上昇した」発現レベルを、この技術分野で広く知られている方法および本明細書中に記載される方法を使用して特定することができるであろう。ある種の細胞タイプにおけるＦｃγＲＩＩｂ発現の「正常な」レベル（またはメジアンレベル）および「上昇した」レベルの例示的レベルが図２Ｃに提供される。これらの特定の例において、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）では、「正常な」レベルがおよそ５０（イソタイプコントロールに対するＧｅｏ  ＭＦＩ  ＦｃγＲＩＩｂの比率）であり、「上昇した」レベルがおよそ１２５または４００またはそれ以上であり、一方で、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）では、「正常な」レベルがおよそ２０であり、「上昇した」レベルがおよそ８０またはそれ以上であり、一方で、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）では、「正常な」レベルがおよそ６０であり、「上昇した」レベルがおよそ１１０または１９０またはそれ以上であり、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）では、「正常な」レベルがおよそ１００であり、「上昇した」レベルがおよそ３００またはそれ以上である。
【００９１】
好ましくは、上昇したＦｃγＲＩＩｂ発現レベルは、同じ細胞タイプの細胞（または異なる細胞タイプの細胞）の正常な発現レベル（好ましくはメジアン発現レベル）と比較して少なくとも１．１倍増大するか、あるいは、同じ細胞タイプの細胞または異なる細胞タイプの細胞の正常な発現レベル（またはメジアン発現レベル）と比較して少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４．０倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５．０倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６．０倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７．０倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８．０倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９．０倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．９倍、１０．０倍、１０．５倍、１１．０倍、１１．５倍、１２．０倍、１２．５倍、１３．０倍、１３．５倍、１４．０倍、１４．５倍、１５．０倍、１５．５倍、１６．０倍、１６．５倍、１７．０倍、１７．５倍、１８．０倍、１８．５倍、１９．０倍、１９．５倍、２０．０倍、２１．０倍、２２．０倍、２３．０倍、２４．０倍または２５．０倍またはそれ以上増大する。好ましくは、上昇したＦｃγＲＩＩｂ発現レベルは、同じ細胞タイプの細胞または異なる細胞タイプの細胞の正常な発現レベル（またはメジアン発現レベル）と比較して少なくとも１．８倍増大する。
【００９２】
添付された実施例において示されるように、本発明者らは、ＦｃγＲＩＩｂ発現のレベルが細胞表面からのｍＡｂの増大したモジュレーションと相関することを明らかにしている。ＦｃγＲＩＩｂ発現の一層より高いレベルは一層より大きいモジュレーションを与える。すなわち、図２Ｄおよび図３Ａに示されるような、発現の上昇の程度と、モジュレーションとの間における相関が認められる。図２Ｄにおいて、ＦｃγＲＩＩｂの発現レベルが、観測されたモジュレーションのレベルに対してプロットされる。相関は、ＦｃγＲＩＩｂの最も高いレベル（例えば、４００を超えるレベル）が表面のＣＤ２０の最も低いレベル（２０％未満のレベル）をもたらし、すなわち、細胞表面からのｍＡｂをモジュレートすることに対する最も大きい影響をもたらすような相関である。図３Ａにおいては、ＦｃγＲＩＩｂの低いレベル（１８）、中程度のレベル（７０）および高いレベル（１２４）がＦｃγＲＩＩｂ陰性細胞株（Ｒａｍｏｓ）に導入され、このことが、ＦｃγＲＩＩｂの発現に比例して細胞表面のＣＤ２０の低下するレベルと直接に相関した（低、中程度および高について、６０％、４０％、３０％）。ＦｃγＲＩＩｂ発現レベルが、イソタイプコントロールに対するＦｃγＲＩＩｂの幾何平均蛍光強度（Ｇｅｏ  ＭＦＩ）の比率として与えられる。
【００９３】
モジュレーションは、細胞表面に残るｍＡｂの量を低下させる。ｍＡｂは、標的細胞を除去するための免疫エフェクター機構（ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ）と関わるためにＦｃを要求する。したがって、モジュレーションをＦｃγＲＩＩｂ阻止ｍＡｂにより低下させることは、Ｆｃ依存的なエフェクター機能を改善することになる。このことが、図８においてＡＤＣＰ（食作用）について示される。リツキシマブ単独による食作用は４０％であったが、ＦｃγＲＩＩｂがＡＴ１０によって阻止されたときには５５％に上がった。
【００９４】
「抗体分子」によって、モノクローナル抗体、合成抗体、組換え産生された抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、または、上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが包含される。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体であり、より好ましくはヒト化抗体またはヒト抗体である。
【００９５】
本発明の組成物、使用および方法において有用である抗体分子の調製および特徴づけのための様々な方法が当業者には広く知られている。例えば、国際公開ＷＯ２００８／００２９３３は、５．３節〜５．３．１節、７４頁〜９１頁において、標的細胞表面抗原、例えば、ＣＤ２０またはＦｃγＲＩＩｂなどに特異的に結合するモノクローナル抗体の調製および特徴づけを記載する。ＦｃγＲＩＩｂおよびＣＤ２０と特異的に結合する有用な抗体がまた、ブダペスト条約に従って寄託されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体を含めて、国際公開ＷＯ２００８／００２９３３の１５頁〜２１頁に開示される（その開示は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００９６】
「特異的に結合する」によって、標的抗原に結合するが、他の抗原には結合（交差反応）しないか、または、そのような抗原とはより弱く、すなわち、標的抗原よりも低い親和性により結合する薬剤、例えば、抗体分子などが包含される。例えば、ＦｃγＲＩＩＢに特異的に結合する抗体は、他のペプチドまたはポリペプチドに対しては、例えば、この技術分野で知られている免疫アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅまたは他のアッセイによって求められる場合、より低い親和性により結合し得る。好ましくは、ＦｃγＲＩＩＢまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体は他の抗原と交差反応しない。ＦｃγＲＩＩＢに特異的に結合する抗体は、例えば、当業者に知られている免疫アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅまたは他の技術によって特定することができる。抗体またはそのフラグメントは、この抗体またはそのフラグメントが、様々な実験技術、例えば、ウエスタンブロット、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などを使用して求められるように、どのような交差反応性抗原に対するよりも大きい親和性によりＦｃγＲＩＩＢに結合するとき、ＦｃγＲＩＩＢに特異的に結合し（抗体特異性に関する議論については、Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York 332-336頁 (1989)を参照のこと）、また、前記抗体またはそのフラグメントがＦｃγＲＩＩＡ、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＡ、より具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも大きい親和性によりＦｃγＲＩＩＢ、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢ、より具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩＩＢと結合する。代表的な抗体が、米国特許出願公開第２００４−０１８５０４５号、同第２００５−０２６０２１３号および同第２００６−００１３８１０号に開示される（これらはすべてが、それらの全体において参照によって本明細書中に特に組み込まれる）。
【００９７】
好ましくは、本発明の組成物および方法においてＣＤ２０抗体との組合せで使用されるある種のＦｃγＲＩＩＢ抗体は天然型ヒトＦｃγＲＩＩＢの細胞外ドメインと結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、前記抗体またはそのフラグメントがＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも少なくとも２倍大きい親和性によりＦｃγＲＩＩＢと結合する。
【００９８】
別の実施形態において、前記抗体またはそのフラグメントは、前記抗体またはそのフラグメントがＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１０４倍、少なくとも１０５倍、少なくとも１０６倍、少なくとも１０７倍、少なくとも１０８倍大きい親和性によりＦｃγＲＩＩＢと結合する。好ましい実施形態において、前記抗体またはそのフラグメントは、前記抗体またはそのフラグメントがＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１０４倍、少なくとも１０５倍、少なくとも１０６倍、少なくとも１０７倍、少なくとも１０８倍大きい親和性によりＦｃγＲＩＩＢと結合する。
【００９９】
本発明の局面を具体化する実施例が次に、添付された図面を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１−１】Ｉ型ｍＡｂは正常なヒトＢ細胞および悪性のヒトＢ細胞の細胞表面から内部移行する。  Ａ）原発性ＣＬＬ細胞を、Ｔｏｓｉｔ−４８８、ＧＡ１０１ｇｌｙ−４８８、Ｒｉｔｕｘ−４８８またはＯｆａｔｕｍ−４８８とともに（すべてが５μｇ／ｍｌで）２時間または６時間培養した。その後、細胞を集め、２回洗浄し、その後、内部移行したｍＡｂと、内部移行していないｍＡｂとを識別するために、抗Ａｌｅｘａ−４８８をサンプルの半分に４℃で３０分間加えた。表面の利用可能ＣＤ２０（％）を、下記の計算を使用して求めた：表面の利用可能ＣＤ２０＋（クエンチ前のＧｅｏ  ＭＦＩ−クエンチ後のＧＥＯ  ＭＦＩ）／（クエンチ前のＧｅｏ  ＭＦＩ）×１００。それぞれの点が、異なるＣＬＬ患者からのサンプルを表す。統計学的分析を、ウィルコクスン・ペアード検定を使用して行った（＊＊ｐ値＜０．００１）。メジアンが示される。Ｂ）その後、様々な原発性Ｂ細胞腫瘍と、健康な志願者からの正常なＢ細胞とを、Ｔｏｓｉｔ−４８８またはＲｉｔｕｘ−４８８を用いる同じアッセイで調べた。統計学的分析を、マン・ホィットニー検定を使用して行った。メジアンが示される。
【図１−２】ＣＤ２０モジュレーションとＣＬＬ表現型／予後マーカーとの間には相関がない。ａ）モジュレーションと、知られているＣＬＬ予後因子との間における相関：ＣＬＬ事例を、ＩｇＶＨ遺伝子の変異状態、Ｚａｐ−７０およびＣＤ３８の発現について表現型分類し、内部移行アッセイを、モジュレーションを図１ａ）でのように評価するためにこれらのサンプルに対して行った。それぞれの予後特徴とＣＤ２０モジュレーションとの間における相関をスピアマンの相関分析によって行った。相関がそれぞれの予後因子に関して何ら認められなかった（ｐ＞０．０５）。ｂ）同様に、ｓＩｇ状態、カルシウム流束を誘発する細胞の能力、および、ＣＬＬ細胞の生存性を評価し、ＣＤ２０モジュレーションと比較した。再度ではあるが、相関が何ら認められなかった。
【図１−３】ＣＤ２０モジュレーションとＣＬＬ表現型／予後マーカーとの間には相関がない。ｃ）ＣＬＬ細胞のＣＤ２０発現を、Ｒｉｔｕｘ−４８８を使用してＦＡＣＳによって評価し、ＣＤ２０モジュレーションと比較した。弱い相関が認められた（−０．３４のスピアマンｒ値、ｐ＝０．０３８）。ＣＤ２０モジュレーションに対するＣＤ２０発現およびＦｃγＲＩＩｂ発現の多変量回帰を使用するその後の分析では、ＣＤ２０との弱い相関が有意でなかったことが示された（ｐ＝０．６３８）。ｄ）ＩｇＭ陽性ＣＬＬ事例のｓＩｇ発現をＦＡＣＳによって求め、発現のレベルをＣＤ２０モジュレーションと比較した。相関が何ら見出されなかった（ｐ＞０．０５）。ｅ）ＣＬＬ事例を、Ｒｉｔ  ｍ２ａ−４８８とともに２時間培養し、内部移行アッセイを図１ａ）でのように行った。ただ１つのＣＬＬ事例の範囲において、ＣＤ３８発現における変動が認められた。ＦＡＣＳプロットはクエンチ前のサンプル（左）およびクエンチ後のサンプル（右）を示す。対応するヒストグラムでは、ただ１つのサンプルに含まれるＣＤ３８＋ｖｅ細胞およびＣＤ３８−ｖｅ細胞が同じ速度でモジュレートしたことが強調される。ＣＤ３８＋ｖｅ細胞およびＣＤ３８−ｖｅ細胞が黒塗りピークおよび白抜きピークによってそれぞれ表される。これらの結果は３つの異なる事例を表す。
【図２】モジュレーションはＦｃ依存的プロセスである。Ａ）１ａ）に記載される内部移行アッセイを、ＣＬＬ細胞をリツキシマブのＡｌｅｘａ−４８８標識フラグメント（Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＩｇＧ）とともに６時間培養した後で繰り返した。データは、３つの異なるＣＬＬサンプルについて、モジュレーションの平均レベル＋／−ＳＤを表す。Ｂ）ＣＬＬ細胞を、１ａ）の場合のようにＴｏｓｉｔ−４８８、Ｒｉｔｕｘ−４８８＋／−ＡＴ１０、および、Ｒｉｔ  ｍ２ａ−４８８とともに２時間および６時間培養した。平均＋／−モジュレーションが６つの異なるＣＬＬサンプルから示される。抗ＦｃγＲＩＩ  ｍＡｂであるＡＴ１０のリツキシマブへの添加は、ＣＤ２０モジュレーションを、Ｒｉｔ  ｍ２ａと同様なレベルにまで低下させ、これに対して、Ｒｉｔ  ｍ２ａへのＡＴ１０の添加は、モジュレーションに対する有意な差を何らもたらさなかった。Ｃ）様々な正常なＢ細胞サンプルおよび悪性のＢ細胞サンプルをＡＴ１０−ＰＥによりＦｃγＲＩＩｂ発現について染色した。ヒストグラムは３つの異なるＣＬＬ事例におけるＦｃγＲＩＩｂ発現の多様性を示し、これらの事例により、名目上の高い発現（黒色線）、中程度の発現（暗灰色線）および低い発現（明灰色線）が表される。散布図は、健康なＢ細胞、ＣＬＬ、ＳＬＬ、ＭＣＬ、ＦＬおよびＳＬＢＣＬにわたるＦｃγＲＩＩｂ発現における差を示す。ＦｃγＲＩＩｂ発現を、実験間の変動に起因する小さい差を抑制するために、ＦｃγＲＩＩｂ：イソタイプコントロールＧｅｏ  ＭＦＩの比率として表した。メジアン値が示される。Ｄ）ＦｃγＲＩＩｂ発現を、（Ｒｉｔｕｘ−４８８とともに６時間共培養されたすべてのＮＨＬサブタイプおよび正常なＢ細胞にわたる（１Ａ）に記載される内部移行アッセイから得られる）ＣＤ２０モジュレーションに対してプロットした。分析を、ノンパラメトリック分布を仮定してスピアマンの相関を使用して行った。強い相関が明らかにされた。スピアマンｒ値＝−０．７４、９５％信頼区間：−０．８３〜−０．６１、および、ｐ＜０．０００１。
【図３】ＦｃγＲＩＩｂ発現はＣＤ２０モジュレーションの主要な決定要因である。Ａ）ＦｃγＲＩＩｂによりトランスフェクションされたＲａｍｏｓ細胞を、ＦｃγＲＩＩｂの低いレベル、中程度のレベルおよび高いレベルを表すために分取し、模擬トランスフェクションされた細胞と一緒に、Ｔｏｓｉｔ−４８８およびＲｉｔｕｘ−４８８を使用する内部移行アッセイで６時間の時点で評価した。棒は、独立した実験からの平均値＋／−ＳＤを表す。分取された細胞のＦｃγＲＩＩｂ発現についてのＧｅｏ  ＭＦＩ値が右側に列挙される。Ｂ）内部移行アッセイを、６時間のインキュベーションの後、正常なＲａｍｏｓ細胞、Ｒｘ３細胞（これはＢＣＲ発現を有しない）、模擬トランスフェクションされたＲｘ３細胞、および、ＦｃγＲＩＩｂによりトランスフェクションされたＲｘ３細胞に対して、Ｔｏｓｉｔ−４８８およびＲｉｔｕｘ−４８８を使用して繰り返した。５つの独立した実験からのデータ点がメジアン値とともに示される。
【図４】ＣＤ２０およびＦｃγＲＩＩｂの共結合が主としてシス様式で生じ、ＦｃγＲＩＩｂの活性化を引き起こす。Ａ）Ｒａｊｉ細胞を、指定のｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）とともに３７℃で２時間培養し、その後、集め、溶解し、続いて、免疫ブロッティングをリン酸化ＦｃγＲＩＩｂについて行った。Ｂ）左側パネル；ＰＫＨ２６標識されたＲａｍｏｓ細胞（ＦｃγＲＩＩｂ−ＶＥ、Ｒ１）を、（図３Ａに記載される）分取された高ＦｃγＲＩＩｂ発現のＲａｍｏｓトラスフェクタント（Ｒ２）と１：１で混合した。右側パネル；Ｒｉｔｕｘ−４８８との６時間の培養の後でのＦｃγＲＩＩｂ＋ＶＥ細胞およびＦｃγＲＩＩｂ−ＶＥ細胞におけるＣＤ２０のモジュレーション。コントロールとして、両方の集団は単独でもまた培養された。データは、３つの独立した実験からのモジュレーションの平均レベル＋／−ＳＤを表す。Ｃ）類似した実験において、低ＦｃγＲＩＩｂ発現のＣＬＬをＰＫＨ２６標識し、その後、より高いＦｃγＲＩＩｂ発現のＣＬＬと１：１で混合した。実験を３回行った（それぞれで、異なる高ＦｃγＲＩＩｂ発現のＣＬＬを用いた）。ＦｃγＲＩＩｂレベル（Ｇｅｏ  ＭＦＩ）が４２（低）であり、これらの高発現体については２７５、３０６および１６５であった。その後、内部移行アッセイを４Ｂの場合のように行った。データはモジュレーションの平均レベル＋／−ＳＤを表す。Ｄ）種々のＣＬＬサンプルを、２０×１０５細胞／ｍｌ、４×１０５細胞／ｍｌおよび１×１０５細胞／ｍｌで６時間、Ｒｉｔｕｘ−４８８とともに培養し、内部移行アッセイを以前のように６時間において行った。Ｅ）Ｒａｊｉ細胞を、２０×１０５細胞／ｍｌ、４×１０５細胞／ｍｌおよび１×１０５細胞／ｍｌで、指定のｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）とともに３７℃で２時間培養した。画像を、細胞近傍における差を明らかにするために明視野顕微鏡を使用して取り込んだ。その後、細胞を集め、４Ａに記載されるようなリン酸化ＦｃγＲＩＩｂについての免疫ブロッティングによって評価した。
【図５】リツキシマブ、ＣＤ２０およびＦｃγＲＩＩｂがリポソーム内に一緒に内部移行する。Ａ）ＣＬＬ細胞をＴｏｓｉｔ−４８８またはＲｉｔｕｘ−４８８のどちらかと２時間インキュベーションし、その後、抗ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＡＴ１０−ＰＥにより染色した。データは、非処理物（ｎ＋６のＣＬＬサンプル）の％としてＦｃγＲＩＩｂ発現についての平均＋／１ＳＤを示す。Ｒｉｔｕｘ−４８８後のＦｃγＲＩＩｂ発現がＴｏｓｉｔ−４８８後よりも有意に低かった（＊ｐ＜０．０５）。ＣＬＬ細胞を洗浄し、固定処理および透過処理に供し、その後、ＡＴ１０−６４７により染色し（青色）、洗浄し、共焦点顕微鏡法により分析した。この画像は非刺激細胞におけるＦｃγＲＩＩｂ染色パターンを表す。Ｃ）同じＣＬＬサンプルをＲｉｔｕｘ−４８８とともに３０分間培養し、その後、５ｂ）に記載されるように処理した。この時点での細胞は、ＡＴ１０−６４７（青色）を伴うＲｉｔｕｘ−４８８（緑色）の間における明白な共局在化を呈した。Ｄ）ＣＬＬ細胞を、５Ｂでのような顕微鏡法のための調製の前にＴｏｓｉｔ−４８８と６時間インキュベーションした。加えて、細胞はまた、リソソームについて染色するためにビオチン化ＬＡＭＰ−１およびストレプトアビジン−５４６（赤色）により染色された。Ｔｏｓｉｔ−４８８は表面に均一に留まったままであり、ＡＴ１０−６４７染色は、５Ｂにおいて認められるベースラインから変化していなかった。ＬＡＭＰ−１との共局在化が何ら認められなかった。Ｅ）ＣＬＬ細胞を５Ｄ）でのようにＲｉｔｕｘ−４８８により６時間処理し、評価した。２つの代表的な細胞がここに示される。上側の細胞は、Ｒｉｔｕｘ−４８８と、ＡＴ１０−６４７との間における疑いのない共局在化を示し、しかし、ＬＡＭＰ−１との共局在化を何ら示していない。下側の細胞は、３つすべての蛍光団の共局在化を示す。それぞれの場合において、明視野（ＢＦ）像が同じ細胞から示される。スケールバーは５μｍを表す。
【図６】阻害性受容体の欠如は抗ＣＤ２０ｍＡｂの枯渇化能を増強する。ｈＣＤ２０Ｔｇマウス（ＷＴ）、または、ＣＤ３２を欠くｈＣＤ２０Ｔｇマウス（ＣＤ３２ＫＯ）を、マウスＩｇＧ１を有するリツキシマブ変化体（ｍ１）またはマウスＩｇＧ２ａを有するリツキシマブ変化体（ｍ２ａ）により処理し（２５０ｍｇ  ｉｖ）、その後、ｂ細胞の枯渇を、マウスの連続した採血により９０日間にわたるローサイトメトリー、ならびに、Ｂ２２０ｍＡｂおよびＣＤ１９ｍＡｂによる染色によってモニターした。
【図７】阻害性受容体ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）を阻止することはヒト異種移植片システムにおける抗ＣＤ２０ｍＡｂの効力を増強する。ＣＤ２０陽性のヒト腫瘍細胞（ＤａｕｄｉまたはＲａｊｉ）をＳＣＩＤマウスに接種し、その後、リツキシマブ、ＡＴ１０または両者のいずれかにより処理し、マウスの生存または腫瘍成長をモニターした。使用されたｍＡｂの用量が図の凡例に示される。Ａ）では、Ｄａｕｄｉ細胞が皮下に接種され、腫瘍が３０５日毎にカリパス測定によってモニターされた。Ｂ）およびＣ）では、Ｒａｊｉ細胞が静脈内に接種された。
【図８】ＦｃγＲＩＩ阻止ｍＡｂとの共インキュベーションによる、リツキシマブにより処理されたＣＬＬ細胞の高まった食作用。単球を健康な志願者から得て、使用前の少なくとも７日の期間、６ウエルプレートにおいてＭ−ＣＳＦによりマクロファージに分化させた。その後、マクロファージを集め、ＣＦＳＥ標識されたＣＬＬ細胞を加える前の少なくとも２時間にわたって５×１０５細胞／ウエルで９６ウエルプレートにおいて接着させた。ＣＦＳＥ標識されたＣＬＬ細胞は非処理であったか、あるいは、２回の洗浄およびマクロファージへの少なくとも３０分間の添加（１：１の比率）を行う前の１５分間または６時間のどちらかで１０μｇ／ｍｌのリツキシマブ（ｒｉｔｕｘ）およびＦｃγＲＩＩｂ阻止ｍＡｂ  ＡＴ１０（ｆａｂ’）２によりオプソニン化された。その後、抗ＣＤ１６ｆ（ａｂ’）２−ＡＰＣ（５μｇ／ｍｌ）を室温（ＲＴ）で１５分間、それぞれのウエルに加えて、マクロファージを染色し、その後、ウエルをＲＴでＦａｃｓ洗浄液（ＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物）により１回洗浄した。さらに、氷冷ＦＡＣＳ洗浄液を加え、プレートを、Ｆａｃｓによる分析のために集める前の１０分間、氷上でインキュベーションした。％二重陽性マクロファージは、％ＣＤ１６＋細胞の合計として表されるＣＤ１６＋ＣＦＳＥ＋陽性細胞の％を表す。Ｎ＝３の反復、線は平均を表す。データは、リツキシマブがほんの１５分間加えられたとき、６時間と比較して、ＣＬＬ細胞の食作用がより大きいことを明瞭に示す。効力におけるこの低下は細胞表面からのリツキシマブのモジュレーションを伴い、ＦｃγＲＩＩｂ阻止ｍＡｂのＡＴ１０による処理によって取り消され得る。重要なことに、ＦｃγＲＩＩｂ  ｍＡｂはＣＬＬ細胞に加えられるだけであり、したがって、マクロファージ自身に対する影響は何ら有していない。そのうえ、ＡＴ１０のＦａｂ２フラグメントのみが使用され、したがって、増大した食作用が、より多くのｍＡｂがＣＬＬ細胞表面に結合することの結果として生じる可能性はない。この結論はまた、食作用における増大がほんの１５分間（ほんの少しのリツキシマブのモジュレーションが生じていたであろう時間）のインキュベーションの後では全く認められないという観測結果によって裏付けられる。
【図９】ＩＨＣによるＦｃγＲＩＩｂ発現。パラフィン包埋組織を、抗ＣＤ３２ｂ特異的ｍＡｂのＥＰ８８８Ｙを使用してＦｃγＲＩＩｂ発現について染色した。４名の異なるＦＬ患者からの画像が示される（４０倍の総合倍率および１５０倍の拡大挿入図）。ＦｃγＲＩＩｂ発現はまた、一致する生細胞をＡＴ１０−ＰＥにより染色することによるフローサイトメトリーによって調べられた。フローサイトメトリーによって得られるＦｃγＲＩＩｂ発現がそれぞれの画像の左上隅に示される。
【図１０】ＦｃγＲＩＩｂレベルはリツキシマブ処置のＭＣＬ患者における臨床結果を予測する。本発明者らのインビトロ知見の概念実証として、本発明者らは、リツキシマブを受けていたＭＣＬ患者のコホートのＦｃγＲＩＩｂ発現を遡及的に調べた。診断用のパラフィン包埋組織を、ＦｃγＲＩＩｂ特異的ｍＡｂを使用して免疫組織化学によって染色した（図１１）。強い膜染色がＦｃγＲＩＩｂ＋ｖｅのリンパ腫サンプルにおいて認められたが、ＦｃγＲＩＩｂ−ｖｅのリンパ腫サンプルでは認められなかった。ＩＨＣによって図１０ａおよび図１０ｂに示されるＦｃγＲＩＩｂ染色は、図２Ｄに示されるようなフローサイトメトリーによって示されるＦｃγＲＩＩｂ発現と相関した（２Ｄにおけるフローサイトメトリーによって求められる値が図１０ａおよび図１０ｂにおいて数字の挿入として示される）。これらの結果は、フローサイトメトリーによって得られる対応するＤＭＳＯ凍結サンプルのＦｃγＲＩＩｂ発現（図２Ｃ、挿入値）と相関した。１６名のＭＣＬ患者からなるほんの小さいコホートを研究したにもかかわらず、ＦｃγＲＩＩｂ−ｖｅのリンパ腫の患者は、ＦｃγＲＩＩｂ＋ｖｅの細胞を有する患者よりも有意に良好なメジアン無進行生存を有した（メジアンがそれぞれ、８５２日および１８９日であった）。図１０ｃは、ＦｃγＲＩＩｂ＋サブセットおよびＦｃγＲＩＩｂ−サブセットにおける生存差を示す。これらの群は臨床的特徴の点で同程度であり（ＭＣＬ国際予後指標、データは示されず）、しかし、使用された化学療法タイプにおいて不均一性があった。このことを検討するために、本発明者らは、最初の治療についてリツキシマブまたはフルダラビンのどちらかの単剤、シクロホスファミドおよびリツキシマブ（ＦＣＲ）により処置されたそのような患者における結果を調べ、類似した結果が得られた。図１０ｄは、患者コホートが議論されるようにさらに管理された後のＦｃγＲＩＩｂ＋サブセットおよびＦｃγＲＩＩｂ−サブセットにおける生存差を示す。
【図１１】免疫組織化学で使用された抗ＦｃγＲＩＩｂ  ｍＡｂの特異性の確認。  ＦｃγＲＩＩａトランスフェクションおよびＦｃγＲＩＩｂトランスフェクションのＲａｍｏｓ細胞を遠心分離により集め、パラフィン包埋した。ヒトＦｃγＲＩＩｂに対するｍＡｂを使用する免疫組織化学では、ＦｃγＲＩＩｂによりトランスフェクションされたＲａｍｏｓ細胞における強い膜染色が明らかにされ、ＦｃγＲＩＩａによりトランスフェクションされた細胞では染色が全く認められなかった。
【図１２】ＣＤ３２Ｂ特異的クローンはリツキシマブの内部移行を阻害する。  抗ＣＤ３２ｂ  ｍＡｂはリツキシマブのモジュレーションを阻止することができる。Ｙ軸は表面の利用可能ＣＤ２０（％）を示す。リツキシマブ−ａｌｅｘａ４８８を、異なるＣＤ３２ｂ阻止ｍＡｂ（ＷＴまたは２９７Ｑ（ｎｑ）変異型）の存在下または非存在下、ＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＲａｍｏｓ細胞に加え、モジュレーションを、１時間後、２時間後、６時間後および２４時間後に評価した。ＣＤ３２ｍＡｂの阻止能についてのコントロールとして、本発明者らはまた、二重ＣＤ３２ａ／ｂ特異性ｍＡｂのＡＴ１０（ＩｇＧフラグメントおよびＦａｂ２フラグメント（Ｆａｂ））を陰性コントロール（イソタイプが一致した無関係なｍＡｂ（ｉｓｏ  ｗｔまたはｎｑ）とともに含めた。最後に、ＡＬＥＸａ４８８標識されたＢ１が、迅速にモジュレートしないコントロールｍＡｂとして含められた。データは、３つすべてのｎＣｏＤｅＲ（Ｃ）ｍＡｂ（Ｃ１、Ｃ１１およびＣ１３）がｗｔ形式または２９７ｑ形式のどちらにおいてでもリツキシマブのモジュレーションを阻止し得ることを明瞭に示している。特に、Ｃ１１ｍＡｂが極めて効果的であった。
【図１３】抗ＣＤ３２ｂ  ｍＡｂはリツキシマブのモジュレーションを阻止することができる。１３すべてのｍＡｂ（ｎｑ）、および、ｗｔとしてのＣ１１  リツキシマブ−ａｌｅｘａ４８８を、異なるＣＤ３２ｂ阻止ｍＡｂ（ＷＴまたは２９７Ｑ変異型）の存在下または非存在下、ＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＲａｍｏｓ細胞に加え、モジュレーションを、１時間後、２時間後、６時間後および２４時間後に評価した。Ｙ軸は表面の利用可能ＣＤ２０（％）を示す。ＣＤ３２ｍＡｂの阻止能についてのコントロールとして、本発明者らはまた、二重ＣＤ３２ａ／ｂ特異性ｍＡｂのＡＴ１０（ＩｇＧフラグメントおよびＦａｂ２フラグメント（Ｆａｂ））を陰性コントロール（イソタイプが一致した無関係なｍＡｂ（ｉｓｏ  ｗｔまたはｎｑ）とともに含めた。最後に、ＡＬＥＸａ４８８標識されたＢ１が、迅速にモジュレートしないコントロールｍＡｂとして含められた。加えて、コントロールのＣＤ３２陰性Ｒａｍｏｓ細胞が、ＣＤ３２阻止ｍＡｂの最大影響を推定することを可能にするために含められた。データは、ｎＣｏＤｅＲ（Ｃ）ｍＡｂの大部分のすべてがリツキシマブのモジュレーションを阻止できたことを明瞭に示している。特に、Ｃ１０ｍＡｂおよびＣ１１ｍＡｂが極めて効果的であり、これらは、モジュレーションを、２４時間においてさえ、ほぼ完全に阻止するようであった。
【図１４Ａ】抗ＣＤ３２ｂ阻止ｍＡｂの親和性と、リツキシマブ結合後においてＣＤ３２ｂのリン酸化を妨げる能力との相関。  ｍＡｂの相対的親和性を、ＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に対するｍＡｂ結合を測定する用量滴定実験によって求めた。簡単に記載すると、ＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた接着性ＣＨＯ  Ｋ１細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。ＩｇＧを３０ｎＭからおよそ０．０１５ｎＭまで１：２の希釈で力価測定し、室温で１時間にわたって結合させた。洗浄後、結合したＩｇＧを抗ヒトＩｇＧ−ＡＰＣにより検出した。最後に、プレートを洗浄し、ＦＭＡＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で読み取った。これは、標的発現細胞に対するｍＡｂ結合についてのＥＣ５０値を与え、相対的親和性に変換することができる。その後、この相対的親和性を、リツキシマブ結合後のＣＤ３２ｂのリン酸化を妨げる抗ＣＤ３２ｂ阻止ｍＡｂの能力と相関させた。これを、細胞を抗ＣＤ３２ｂ  ｍＡｂの存在下または非存在下においてリツキシマブにより刺激し、その後、ウエスタンブロッティングをホスホＣＤ３２ｂについて行うことによって求めた。その後、ＣＤ３２ｂ  ｍＡｂを、ＣＤ３２のリン酸化を阻止するその能力に従ってランク付けした（１が最も効果的である）。密接な相関が、ｍＡｂの親和性と、ＣＤ３２ｂのリン酸化を阻止する能力との間において明白に認められた。
【図１４Ｂ】抗ＣＤ３２ｂ阻止ｍＡｂの親和性と、リツキシマブのモジュレーションを妨げる能力との相関。  抗ＣＤ３２ｂ阻止ｍＡｂの親和性と、リツキシマブのモジュレーションを妨げるそれらの能力との相関。ｍＡｂの相対的親和性を、ＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に対するｍＡｂ結合を測定する用量滴定実験によって求めた。簡単に記載すると、ＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた接着性ＣＨＯ  Ｋ１細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。ＩｇＧを３０ｎＭからおよそ０．０１５ｎＭまで１：２の希釈で力価測定し、室温で１時間にわたって結合させた。洗浄後、結合したＩｇＧを抗ヒトＩｇＧ−ＡＰＣにより検出した。最後に、プレートを洗浄し、ＦＭＡＴ（Applied Biosystems）で読み取った。これは、標的発現細胞に対するｍＡｂ結合についてのＥＣ５０値を与え、相対的親和性に変換することができる。その後、この相対的親和性を、（前図に示される）ＣＤ３２ｂトランスフェクションされたＲａｍｏｓ細胞におけるリツキシマブのモジュレーションを妨げる抗ＣＤ３２ｂ阻止ｍＡｂの能力と相関させた。強い相関が、ｍＡｂの親和性と、リツキシマブのモジュレーションを阻止する能力との間において明白に認められた。このデータから、標的細胞表面からのリツキシマブのモジュレーションを促進させることにおけるＣＤ３２Ｂの中心的役割が確認される。
【図１５】クローン１によって媒介されるように。ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する用量依存的結合、ならびに、ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害。  ○（円、サークル）は、ｈＣＤ３２ＡによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示し、◆（黒菱形）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示す。×（クロス）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する免疫複合体の用量依存的阻害を示す。クローン１によって媒介される通りである。細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。免疫複合体を、ＦＩＴＣをＢＳＡにコーティングし、その後、これをＦＩＴＣ特異的ｈＩｇＧ１抗体と１０：１のモル比で混合することによって調製した。総強度が結合を反映し、強度が大きいほど、結合が大きい。結合は免疫複合体（ＩＣ）またはｍＡｂのいずれかである。
【図１６】クローン２によって媒介されるように。ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する用量依存的結合、ならびに、ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害。  ○（円、サークル）は、ｈＣＤ３２ＡによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示し、◆（黒菱形）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示す。×（クロス）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する免疫複合体の用量依存的阻害を示す。クローン２によって媒介される通りである。細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。免疫複合体を、ＦＩＴＣをＢＳＡにコーティングし、その後、これをＦＩＴＣ特異的ｈＩｇＧ１抗体と１０：１のモル比で混合することによって調製した。総強度が結合を反映し、強度が大きいほど、結合が大きい。結合は免疫複合体（ＩＣ）またはｍＡｂのいずれかである。
【図１７】クローン３によって媒介されるように。ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する用量依存的結合、ならびに、ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害。  ○（円、サークル）は、ｈＣＤ３２ＡによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示し、◆（黒菱形）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示す。×（クロス）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する免疫複合体の用量依存的阻害を示す。クローン３によって媒介される通りである。細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。免疫複合体を、ＦＩＴＣをＢＳＡにコーティングし、その後、これをＦＩＴＣ特異的ｈＩｇＧ１抗体と１０：１のモル比で混合することによって調製した。総強度が結合を反映し、強度が大きいほど、結合が大きい。結合は免疫複合体（ＩＣ）またはｍＡｂのいずれかである。
【図１８】クローン４によって媒介されるように。ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する用量依存的結合、ならびに、ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害。  ○（円、サークル）は、ｈＣＤ３２ＡによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示し、◆（黒菱形）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示す。×（クロス）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する免疫複合体の用量依存的阻害を示す。クローン４によって媒介される通りである。細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。免疫複合体を、ＦＩＴＣをＢＳＡにコーティングし、その後、これをＦＩＴＣ特異的ｈＩｇＧ１抗体と１０：１のモル比で混合することによって調製した。総強度が結合を反映し、強度が大きいほど、結合が大きい。結合は免疫複合体（ＩＣ）またはｍＡｂのいずれかである。
【図１９】クローン５によって媒介されるように。ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する用量依存的結合、ならびに、ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害。  ○（円、サークル）は、ｈＣＤ３２ＡによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示し、◆（黒菱形）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示す。×（クロス）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する免疫複合体の用量依存的阻害を示す。クローン５によって媒介される通りである。細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。免疫複合体を、ＦＩＴＣをＢＳＡにコーティングし、その後、これをＦＩＴＣ特異的ｈＩｇＧ１抗体と１０：１のモル比で混合することによって調製した。総強度が結合を反映し、強度が大きいほど、結合が大きい。結合は免疫複合体（ＩＣ）またはｍＡｂのいずれかである。
【図２０】クローン６によって媒介されるように。ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する用量依存的結合、ならびに、ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害。  ○（円、サークル）は、ｈＣＤ３２ＡによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示し、◆（黒菱形）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示す。×（クロス）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する免疫複合体の用量依存的阻害を示す。クローン６によって媒介される通りである。細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。免疫複合体を、ＦＩＴＣをＢＳＡにコーティングし、その後、これをＦＩＴＣ特異的ｈＩｇＧ１抗体と１０：１のモル比で混合することによって調製した。総強度が結合を反映し、強度が大きいほど、結合が大きい。結合は免疫複合体（ＩＣ）またはｍＡｂのいずれかである。
【図２１】クローン７によって媒介されるように。ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する用量依存的結合、ならびに、ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害。  ○（円、サークル）は、ｈＣＤ３２ＡによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示し、◆（黒菱形）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示す。×（クロス）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する免疫複合体の用量依存的阻害を示す。クローン７によって媒介される通りである。細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。免疫複合体を、ＦＩＴＣをＢＳＡにコーティングし、その後、これをＦＩＴＣ特異的ｈＩｇＧ１抗体と１０：１のモル比で混合することによって調製した。総強度が結合を反映し、強度が大きいほど、結合が大きい。結合は免疫複合体（ＩＣ）またはｍＡｂのいずれかである。
【図２２】クローン８によって媒介されるように。ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する用量依存的結合、ならびに、ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害。  ○（円、サークル）は、ｈＣＤ３２ＡによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示し、◆（黒菱形）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示す。×（クロス）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する免疫複合体の用量依存的阻害を示す。クローン８によって媒介される通りである。細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。免疫複合体を、ＦＩＴＣをＢＳＡにコーティングし、その後、これをＦＩＴＣ特異的ｈＩｇＧ１抗体と１０：１のモル比で混合することによって調製した。総強度が結合を反映し、強度が大きいほど、結合が大きい。結合は免疫複合体（ＩＣ）またはｍＡｂのいずれかである。
【図２３】クローン９によって媒介されるように。ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する用量依存的結合、ならびに、ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害。  ○（円、サークル）は、ｈＣＤ３２ＡによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示し、◆（黒菱形）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示す。×（クロス）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する免疫複合体の用量依存的阻害を示す。クローン９によって媒介される通りである。細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。免疫複合体を、ＦＩＴＣをＢＳＡにコーティングし、その後、これをＦＩＴＣ特異的ｈＩｇＧ１抗体と１０：１のモル比で混合することによって調製した。総強度が結合を反映し、強度が大きいほど、結合が大きい。結合は免疫複合体（ＩＣ）またはｍＡｂのいずれかである。
【図２４】クローン１０によって媒介されるように。ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する用量依存的結合、ならびに、ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害。  ○（円、サークル）は、ｈＣＤ３２ＡによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示し、◆（黒菱形）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示す。×（クロス）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する免疫複合体の用量依存的阻害を示す。クローン１０によって媒介される通りである。細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。免疫複合体を、ＦＩＴＣをＢＳＡにコーティングし、その後、これをＦＩＴＣ特異的ｈＩｇＧ１抗体と１０：１のモル比で混合することによって調製した。総強度が結合を反映し、強度が大きいほど、結合が大きい。結合は免疫複合体（ＩＣ）またはｍＡｂのいずれかである。
【図２５】クローン１１によって媒介されるように。ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する用量依存的結合、ならびに、ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害。  ○（円、サークル）は、ｈＣＤ３２ＡによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示し、◆（黒菱形）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示す。×（クロス）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する免疫複合体の用量依存的阻害を示す。クローン１１によって媒介される通りである。細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。免疫複合体を、ＦＩＴＣをＢＳＡにコーティングし、その後、これをＦＩＴＣ特異的ｈＩｇＧ１抗体と１０：１のモル比で混合することによって調製した。総強度が結合を反映し、強度が大きいほど、結合が大きい。結合は免疫複合体（ＩＣ）またはｍＡｂのいずれかである。
【図２６】クローン１２によって媒介されるように。ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する用量依存的結合、ならびに、ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害。  ○（円、サークル）は、ｈＣＤ３２ＡによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示し、◆（黒菱形）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示す。×（クロス）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する免疫複合体の用量依存的阻害を示す。クローン１２によって媒介される通りである。細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。免疫複合体を、ＦＩＴＣをＢＳＡにコーティングし、その後、これをＦＩＴＣ特異的ｈＩｇＧ１抗体と１０：１のモル比で混合することによって調製した。総強度が結合を反映し、強度が大きいほど、結合が大きい。結合は免疫複合体（ＩＣ）またはｍＡｂのいずれかである。
【図２７】クローン１３によって媒介されるように。ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する用量依存的結合、ならびに、ｈＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害。  ○（円、サークル）は、ｈＣＤ３２ＡによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示し、◆（黒菱形）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示す。×（クロス）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する免疫複合体の用量依存的阻害を示す。クローン１３によって媒介される通りである。細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。免疫複合体を、ＦＩＴＣをＢＳＡにコーティングし、その後、これをＦＩＴＣ特異的ｈＩｇＧ１抗体と１０：１のモル比で混合することによって調製した。総強度が結合を反映し、強度が大きいほど、結合が大きい。結合は免疫複合体（ＩＣ）またはｍＡｂのいずれかである。
【図２８】抗ＣＤ３２Ｂ抗体の細胞特異性を示す。  抹消血から単離されたＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配を使用して調製した。細胞を細胞特異的マーカーにより染色し、ＣＤ３２Ｂ特異的抗体の結合について評価した。図に示されるように、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋細胞）のみがクローン１〜１３により陽性に染まった。
【図２９】クローン１〜１３によるＢ細胞の用量依存的染色。  抹消血から単離されたＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配を使用して調製した。細胞をＣＤ１９により染色し、その後で、１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌまたは０．１ｍｇ／ｍｌの示されるようなＣＤ３２Ｂ特異的抗体により染色した。この図では、Ｂ細胞（これは、ＣＤ３２Ｂを発現することが知られている）が、ＣＤ１９特異的ｍＡｂを使用してゲートアウトされている。このゲートは「Ｍ１」と呼ばれる。ＣＤ３２Ｂ  ｍＡｂの濃度が低下するとき、染色されたＢ細胞の数が、ほぼ１００％から、はるかにより低い値にまで低下する。このことは、ＣＤ３２Ｂ特異的ｍＡｂから予想されるように、Ｂ細胞の特異的かつ用量依存的な染色を示す。
【図３０】Ｆｃ媒介のＣＤ３２Ｂリン酸化を阻害するそれぞれのｍＡｂの能力。Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ３２Ｂ陽性）をリツキシマブ（Ｒｉｔ）により処理し、これにより、ＣＤ３２Ｂのリン酸化を生じさせた。これをＣＤ３２Ｂ特異的ｍＡｂ（１〜１３）の非存在下または存在下で行った。図は、Ｆｃ媒介のＣＤ３２Ｂリン酸化を阻害するそれぞれのｍＡｂの能力を明らかにする。「ＴＵＢ」＝チューブリンコントロール。
【図３１】Ｉ型抗ＣＤ２０ｍＡｂのモジュレーションの速度に対するＣＤ３２ｂの影響。  ＣＤ３２ｂは他のＩ型抗ＣＤ２０ｍＡｂの内部移行に関与することができる。それぞれのｍＡｂのＡｌｅｘａ−４８８標識されたものをｐＣＤＮＡ３トランスフェクションＲａｍｏｓ細胞またはＣＤ３２ＢトランスフェクションＲａｍｏｓ細胞と１時間または６時間インキュベーションし、モジュレーションの程度を以前のように求めた。使用されたｍＡｂは、リツキシマブ（ＲＴＸ）、研究室で作製されたオファツムマブ（ＯＦＡ）およびトシツムモマブ（Ｔｏｓ）であった。データは、ＯＦＡの内部移行速度がＲＴＸの内部移行速度と類似しており、ＣＤ３２ｂの存在によって促進されることを明瞭に示す。
【図３２】抗ＣＤ１９ｍＡｂもまた、部分的にはＣＤ３２Ｂに依存する様式で、悪性のヒトＢ細胞の細胞表面から内部移行する。  Ｒａｍｏｓ  ｈｕＣＤ３２ｂトランスフェクタント。他の表面抗原との内部移行もまたＣＤ３２ｂ発現によって達成され得る。モジュレーションアッセイを、ＡＴ１０によるＣＤ３２阻止の存在下（＋）または非存在下（−）、異なるｍＡｂを用いて以前のように行った。Ｒａｍｏｓ  ＣＤ３２Ｂトランスフェクタントをこの６時間アッセイにおいて使用した。＊ｐ＜０．０５。ｆ３．３＝ＭＨＣクラスＩＩ；ＲＦＢ９＝ＣＤ１９；ＲＴＸ＝リツキシマブ。ｍＡｂが細胞表面に留まるならば、ｍＡｂをクエンチすることができる。ｍＡｂが内部移行されるならば、ｍＡｂをクエンチすることができない。クエンチされた％が低いほど、内部移行のレベルが高くなる。データは、ＣＤ３２阻止とのインキュベーションの後で、ＲＴＸおよびＲＦＢ９のｍＡｂについては表面モジュレーションにおける有意な低下を、また、Ｆ３．３  ｍＡｂについては低下がほとんどないことを明瞭に示す。これらのデータは、標的抗原、例えば、ＣＤ１９などもまた、部分的にはＣＤ３２Ｂに依存し、かつ、抗ＣＤ３２ｂ  ｍＡｂによって阻止され得る様式で、悪性のヒトＢ細胞の細胞表面から内部移行し得ることを示している。
【図３３】他の表面抗原との内部移行もまたＣＤ３２ｂ発現によって達成され得る。それぞれのｍＡｂのＡｌｅｘａ−４８８標識されたものをｐＣＤＮＡ３トランスフェクションＲａｍｏｓ細胞またはＣＤ３２ＢトランスフェクションＲａｍｏｓ細胞と２４時間インキュベーションし、モジュレーションの程度を以前のように求めた。＊＝ｐ＜０．０５。ｙ軸はモジュレーション／内部移行または表面の利用可能な抗原（％）を示す。図は、内部移行／モジュレーションの量がｈｕＣＤ３２ｂの存在下で増大するので、このことを示す。抗ＣＤ１９ｍＡｂおよび抗ＣＤ４０ｍＡｂの両方については、ＣＤ３２ｂの存在下での細胞表面抗原における統計学的に有意な（＊、ｐ＜０．０５）低下が認められることに留意すること。
【図３４】ＩｇＧ１−λ形式におけるヒトＣＤ３２Ｂに対する１４個の抗体クローンの定常領域のアミノ酸配列。ＩｇＧ１−ＣＨ領域およびλ−ＣＬ領域のアミノ酸配列が示される。
【図３５】ヒトＣＤ３２Ｂに対する抗体クローン１の可変領域のアミノ酸配列。アミノ酸配列がＶＨ領域およびＶＬ領域について示される。標識されたＣＤＲ配列が、標識されたフレームワーク領域によって隔てられる四角で囲まれた配列として示される。
【図３６】ヒトＣＤ３２Ｂに対する抗体クローン２の可変領域のアミノ酸配列。アミノ酸配列がＶＨ領域およびＶＬ領域について示される。標識されたＣＤＲ配列が、標識されたフレームワーク領域によって隔てられる四角で囲まれた配列として示される。
【図３７】ヒトＣＤ３２Ｂに対する抗体クローン３の可変領域のアミノ酸配列。アミノ酸配列がＶＨ領域およびＶＬ領域について示される。標識されたＣＤＲ配列が、標識されたフレームワーク領域によって隔てられる四角で囲まれた配列として示される。
【図３８】ヒトＣＤ３２Ｂに対する抗体クローン４の可変領域のアミノ酸配列。アミノ酸配列がＶＨ領域およびＶＬ領域について示される。標識されたＣＤＲ配列が、標識されたフレームワーク領域によって隔てられる四角で囲まれた配列として示される。
【図３９】ヒトＣＤ３２Ｂに対する抗体クローン５の可変領域のアミノ酸配列。アミノ酸配列がＶＨ領域およびＶＬ領域について示される。標識されたＣＤＲ配列が、標識されたフレームワーク領域によって隔てられる四角で囲まれた配列として示される。
【図４０】ヒトＣＤ３２Ｂに対する抗体クローン６の可変領域のアミノ酸配列。アミノ酸配列がＶＨ領域およびＶＬ領域について示される。標識されたＣＤＲ配列が、標識されたフレームワーク領域によって隔てられる四角で囲まれた配列として示される。
【図４１】ヒトＣＤ３２Ｂに対する抗体クローン７の可変領域のアミノ酸配列。アミノ酸配列がＶＨ領域およびＶＬ領域について示される。標識されたＣＤＲ配列が、標識されたフレームワーク領域によって隔てられる四角で囲まれた配列として示される。
【図４２】ヒトＣＤ３２Ｂに対する抗体クローン８の可変領域のアミノ酸配列。アミノ酸配列がＶＨ領域およびＶＬ領域について示される。標識されたＣＤＲ配列が、標識されたフレームワーク領域によって隔てられる四角で囲まれた配列として示される。
【図４３】ヒトＣＤ３２Ｂに対する抗体クローン９の可変領域のアミノ酸配列。アミノ酸配列がＶＨ領域およびＶＬ領域について示される。標識されたＣＤＲ配列が、標識されたフレームワーク領域によって隔てられる四角で囲まれた配列として示される。
【図４４】ヒトＣＤ３２Ｂに対する抗体クローン１０の可変領域のアミノ酸配列。アミノ酸配列がＶＨ領域およびＶＬ領域について示される。標識されたＣＤＲ配列が、標識されたフレームワーク領域によって隔てられる四角で囲まれた配列として示される。
【図４５】ヒトＣＤ３２Ｂに対する抗体クローン１１の可変領域のアミノ酸配列。アミノ酸配列がＶＨ領域およびＶＬ領域について示される。標識されたＣＤＲ配列が、標識されたフレームワーク領域によって隔てられる四角で囲まれた配列として示される。
【図４６】ヒトＣＤ３２Ｂに対する抗体クローン１２の可変領域のアミノ酸配列。アミノ酸配列がＶＨ領域およびＶＬ領域について示される。標識されたＣＤＲ配列が、標識されたフレームワーク領域によって隔てられる四角で囲まれた配列として示される。
【図４７】ヒトＣＤ３２Ｂに対する抗体クローン１３の可変領域のアミノ酸配列。アミノ酸配列がＶＨ領域およびＶＬ領域について示される。標識されたＣＤＲ配列が、標識されたフレームワーク領域によって隔てられる四角で囲まれた配列として示される。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：原発性ＣＬＬサンプルおよび他のＮＨＬサンプルにおけるＣＤ２０モジュレーション。
本発明者らは以前に、ＣＬＬサンプルのコホートにおけるリツキシマブのモジュレーションの速度および程度における不均一性を認めた（２８）。これらの発見を立証し、拡張するために、本発明者らはこのコホートを合計で４８例のＣＬＬサンプルに増やしている（図１Ａ）。以前のように、本発明者らは、表面の利用可能なＣＤ２０の量を低下させるリツキシマブおよびトシツモマブ（それぞれ、Ｉ型ｍＡｂおよびＩＩ型ｍＡｂの臨床的に関連のあるプロトタイプ）の能力を、２時間、６時間および２４時間にわたって比較した（図１Ａ、および、データは示されず）。加えて、本発明者らはまた、再発したＣＬＬにおける使用について先ごろＦＤＡ承認されている研究室作製のオファツムマブ（ｏｆａｔｕｍ；Ｉ型）、および、様々なＮＨＬのために現在、臨床開発中であるＧＡ１０１の糖非改変体（ＧＡ１０１ｇｌｙ；ＩＩ型）（１９）を試験した。本発明者らの以前の観測結果と一致して、かなりの不均一性が、ＩＩ型ｍＡｂよりも有意に多いモジュレーションをもたらすＩ型ｍＡｂとの場合を除くサンプル間に認められた。６時間において、リツキシマブの存在下におけるモジュレーションは最大に近く、ｍＡｂの１８％〜６５％（メジアンで３７％）がクエンチングアッセイにおいて利用可能なままであった（図１Ａ）。そのＩ型性質と一致して、オファツムマブもまた、大きい程度のモジュレーションをもたらした（６時間において２６％メジアン利用可能）。対照的に、トシツモマブおよびＧＡ１０１ｇｌｙははるかに少ないモジュレーションを示し、メジアンで、結合したｍＡｂの８０％（６１％〜８９％の範囲）および７０％（５７％〜８１％の範囲）がをそれぞれ６時間において利用可能であった。
【０１０２】
このＣＬＬコホートの範囲内において、本発明者らは、ＣＬＬの予後において重要であることが知られているいくつかの要因を調べた。そのような要因には、ＺＡＰ−７０発現（２９、３０）、ＣＤ３８陽性（３１、３２）およびＩｇＶＨ遺伝子の変異状態（３１、３３、３４）が含まれた。結果（追加の図１Ａ）は、これらの疾患マーカーのいずれとも相関がないことを示した。
【０１０３】
本発明者らは以前に、異なったモジュレーションパターンを有するそれぞれのＮＨＬサブタイプにもかかわらず、それらがかなりのＣＤ２０モジュレーション不均一性を呈したことを明らかにした（２８）。このことをさらに詳しく調べるために、本発明者らは、分析される原発性サンプルの数を、８名の健康な志願者を含むように拡大した（７例のＳＬＬ、７例のＭＣＬ、１１例のＦＬおよび７例のＤＬＢＣＬ）（図１Ｂ）。Ｉ型およびＩＩ型のｍＡｂがモジュレーションを誘導し得ることにおける差が、すべての組織学的サブタイプにわたって持続した。本発明者らはまた、健康な志願者に由来するＢ細胞におけるＣＤ２０がリツキシマブの存在下で迅速にモジュレートし、しかも、悪性Ｂ細胞の場合よりも均一にモジュレートしたことを認めた。このことは、悪性に関連する要因が、認められた不均一性の一因であることを示唆する。ＳＬＬ細胞およびＭＣＬ細胞に関するリツキシマブ誘導モジュレーションの速度はＣＬＬの場合と類似し（図１Ａ）、一方で、ＤＬＢＣＬおよびＦＬについては、速度が幾分か遅くなっていた（図１ＡからのＣＬＬと比較したとき、それぞれ、ｐ＜０．０００１および０．００２７）。しかしながら、ＦＬにおいて、本発明者らは、１１例中２例の患者サンプルがリツキシマブを非常に迅速にモジュレートし、これにより、かろうじて検出可能なレベルのｍＡｂまたはＣＤ２０が６時間の培養の後で残ったことを認めた。
【０１０４】
実施例２：Ｂ−ＮＨＬにおけるＣＤ２０のモジュレーションはＦｃ依存的プロセスである。
本発明者らおよび他の研究者は、インビボにおける抗ＣＤ２０ｍＡｂの効力がＦｃ依存的であることを以前に示している（２８）。本発明者らは、モジュレーションが、エフェクター細胞の非存在下でさえ、同様にＦｃ依存的であるかもしれないと仮定し、このことを、リツキシマブのＦａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを用いた内部移行アッセイを繰り返すことによって検証した（図２Ａ）。リツキシマブＦａｂ’は、細胞結合アッセイ（データは示されず）によって確認されるように、ＣＤ２０の二価架橋を必要とすることによって、または、その低親和性の一価結合によって、そのどちらかで説明され得るであろうほんの低いレベルのモジュレーションを示した。対照的に、Ｆ（ａｂ’）２およびＩｇＧは類似した結合プロフィルを示し（結果は示されず）、しかし、６時間の培養の後において、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、無傷のＩｇＧ（２０％の表面利用可能ＣＤ２０）よりも有意に少ないモジュレーションを有していた（４０％の表面利用可能ＣＤ２０）。アッセイが、高度に濃縮されたＢ細胞（９５％超の純度）を用いて行われたので、多量に存在する唯一のＦｃＲは阻害性ＦｃγＲＩＩｂであろう。阻止する抗ＦｃγＲＩＩ  ｍＡｂであるＡＴ１０の存在下では、リツキシマブによるモジュレーションが低下し、ヒトＩｇＧ１を有するリツキシマブよりも低い親和性によりＦｃγＲＩＩｂに結合するリツキシマブＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはＲｉｔ  ｍ２ａと同程度であった（図２Ｂ）。予想されるように、ＡＴ１０との共インキュベーションは、Ｒｉｔ  ｍ２ａのモジュレーションに対する影響をほとんどもたらさなかった。
【０１０５】
実施例３：正常なＢ細胞およびＢ細胞腫瘍におけるＦｃγＲＩＩｂの発現。
ＦｃγＲＩＩｂ：Ｆｃの相互作用がＣＤ２０モジュレーションの速度に影響を与え得るであろうという可能性を仮定して、本発明者らは、正常なＢ細胞および本発明者らの一群の原発性Ｂ細胞腫瘍におけるＦｃγＲＩＩｂの発現を調べた。図２Ｃに示されるように、ＦｃγＲＩＩｂ発現の顕著な不均一性がそれぞれの群の中において認められた。ＣＬＬ細胞における発現は比較的高く、イソタイプコントロールと比較して２０倍から３００倍に及んだ。ＤＬＢＣＬと、ＦＬの大部分とは、低いＦｃγＲＩＩｂ発現を呈した。２つのＦＬ事例は非常に高いＦｃγＲＩＩｂ発現を呈し、驚くべきことに、これらは、極めて迅速にモジュレートすることを本発明者らが以前に認めていた同じ２つの事例であった。ＭＣＬおよびＳＬＬは、不均一にもかかわらず、中間レベルのＦｃγＲＩＩｂを発現した（図２Ｃ）。再度ではあるが、これは以前の発見（２１）と一致している。
【０１０６】
実施例４：ＦｃγＲＩＩｂ発現はＣＤ２０モジュレーションを調節する。
まとめると、これらの発見により、ＦｃγＲＩＩｂ発現が、Ｂ細胞標的からのＣＤ２０モジュレーションの主要な決定要因であるかもしれないことが示唆された。この仮説を検証するために、本発明者らは、本発明者らの利用可能な健康なＢ細胞サンプルおよび原発性ＮＨＬサンプルのすべてのＦｃγＲＩＩｂ発現およびＣＤ２０モジュレーション速度を比較した（図２Ｄ）。スピアマンの相関分析により、これらのパラメーターの間における強い関係が明らかにされた（スピアマンｒ値：−０．７４、９５％信頼区間：−０．８３〜−０．６１、および、ｐ＜０．０００１）。データは、ＦＬおよびＤＬＢＣＬの事例の大部分が、広範な分布を示すＣＬＬサンプルおよびＭＣＬサンプルとともに上部に位置する逆指数関数的な曲線を示した。このグラフはまた、低い発現レベルでは、ＦｃγＲＩＩｂ発現における小さい差がＣＤ２０モジュレーションにおける比較的大きい変化の原因であり得るであろうことを明らかにしており、それにより、抗ＣＤ２０：ＣＤ２０複合体の細胞表面からのクリアランスを調節することにおけるこの受容体の能力を強調する。
【０１０７】
ＣＤ２０モジュレーションにおけるＦｃγＲＩＩｂの役割を直接に検討するために、ＦｃγＲＩＩｂ−ｖｅのＲａｍｏｓ細胞を、ＦｃγＲＩＩｂをコードするプラスミドによりトランスフェクションした。得られたＦｃγＲＩＩｂ＋ｖｅ細胞は一定しないＦｃγＲＩＩｂ発現レベルを呈したので、続いて、これらのＦｃγＲＩＩｂ＋ｖｅ細胞を、低いＦｃγＲＩＩｂ、中程度のＦｃγＲＩＩｂおよび高いＦｃγＲＩＩｂを発現する各サブクローンに分けた。その後、元のＦｃγＲＩＩｂ−のＲａｍｏｓ細胞と一緒に、これらの細胞を内部移行アッセイにおいて評価した。リツキシマブの存在下において、６時間でのＣＤ２０モジュレーション速度がＦｃγＲＩＩｂ発現と相関し、モジュレーションが下記の順で増大した：ＦｃγＲＩＩｂ−ｖｅ＞ＦｃγＲＩＩｂ＋ｖｅ  低＞ＦｃγＲＩＩｂ＋ｖｅ  中程度＞ＦｃγＲＩＩｂ＋ｖｅ  高（図３Ａ）。同様に、野生型マウス、および、遺伝子組換えヒトＣＤ２０を発現するＦｃγＲＩＩノックアウト（ＫＯ）マウスから得られるＢ細胞を使用した場合、ＦｃγＲＩＩｂ−／−のマウスの細胞におけるモジュレーションが野生型対応体よりも少なかった（データは示されず）。だが、感知できるほどのモジュレーションがＦｃγＲＩＩの非存在下において認められたことには留意しなければならない。このことは、この遺伝子組換えモデルでは、ＦｃγＲＩＩ以外の要因もまた、ＣＤ２０モジュレーションを調節することに関与することを示している。
【０１０８】
ＦｃγＲＩＩｂはＢ細胞上のＢＣＲ活性化の負の調節因子であり（これは（３５）において総説される）、また、ＣＤ２０はＣＤ２０ｍＡｂによる会合の後でＢＣＲと物理的に会合する（３６、３７）ので、本発明者らは、ＢＣＲの発現またはシグナル伝達活性がモジュレーションに影響し得るであろうと仮定した。したがって、これらの発見の原因としてのＢＣＲ発現における差を除外するために、ＢＣＲ欠損Ｒａｍｏｓ細胞（Ｒｘ３）をＦｃγＲＩＩｂによりトランスフェクションし、ＣＤ２０のモジュレーションを非操作のＲａｍｏｓ細胞および模擬のＲｘ３トランスフェクション細胞と比較した（図３Ｂ）。これらのデータは、ＢＣＲ発現を欠くＲｘ３細胞がＲａｍｏｓ細胞よりも遅くモジュレートすること、しかし、この欠陥が、高レベルのＦｃγＲＩＩｂを発現すること（ＦｃγＲＩＩｂ＋ｖｅのＲｘ３細胞）によって克服され得ることを明瞭に示している。ＣＤ２０モジュレーションを調節することにおけるＢＣＲに対するＦｃγＲＩＩｂのこの支配的役割が下記によって裏付けられる：１）本発明者らは、高いレベルのモジュレーションを、低いレベルのＢＣＲを特徴的に発現するＣＬＬ細胞において認めていること（３８）；および２）本発明者らは、何らかの相関を、ＣＬＬ細胞における表面免疫グロブリン（ｓＩｇ）発現と、ＣＤ２０モジュレーションとの間において示すことができなかったこと（追加図１）。
【０１０９】
実施例５：ＣＤ２０およびＦｃγＲＩＩｂのモジュレーションに先立って、ＦｃγＲＩＩｂの活性化が生じる。
抗ＣＤ２０ｍＡｂと、ＦｃγＲＩＩｂとの間における相互作用をさらに探るために、本発明者らは、細胞内ＩＴＩＭモチーフにおけるチロシン−２９３のリン酸化によって示されるようなＦｃγＲＩＩｂの抗体媒介される刺激を調べた。Ｒａｊｉ細胞を、リン酸化ＦｃγＲＩＩｂについての免疫ブロッティングの前に、抗ＦｃγＲＩＩｂ阻止ｍＡｂ（ＡＴ１０）の存在下または非存在下においてトシツモマブまたはリツキシマブとともに培養した。リン酸化ＦｃγＲＩＩｂを、トシツモマブではなく、リツキシマブによって刺激された細胞において評価し、リン酸化ＦｃγＲＩＩｂがＡＴ１０の添加によって阻害された（図４Ａ）。類似した結果がＤａｕｄｉ細胞に関して認められた（データは示されず）。
【０１１０】
実施例６：ＣＤ２０およびＦｃγＲＩＩｂの架橋が主にシス様式で生じる。
リツキシマブは、同じ細胞（シス）または隣接細胞（トランス）のどちらかの表面においてＣＤ２０およびＦｃγＲＩＩｂによって共結合され得る。このことを調べるために、本発明者らは、ＰＨＫ２６標識されたＦｃγＲＩＩｂ−のＲａｍｏｓ細胞を高ＦｃγＲＩＩｂ発現Ｒａｍｏｓトランスフェクタント（図４Ｂ）とともに共培養し、その後、それぞれの細胞タイプにおけるモジュレーションのレベルを比較した（単独で培養された両方の細胞タイプをコントロールとした）。以前に示されたように、単独で培養されたとき、ＦｃγＲＩＩｂ＋ｖｅ細胞は、ＦｃγＲＩＩｂを欠く細胞よりも大きいモジュレーションを示した（図４Ｂ）。共培養では、ＦｃγＲＩＩｂ−ｖｅにおけるモジュレーションのレベルがわずかに増大し、しかし、ＦｃγＲＩＩｂ＋ｖｅ細胞において見られるレベルには達しなかった。この結果は、トランス相互作用が生じているかもしれないが、ＦｃγＲＩＩｂによるＣＤ２０ｍＡｂのモジュレーションが主にシス様式で行われることを示唆する。
【０１１１】
この発見がＲａｍｏｓ細胞株に特異的でなかったことを明らかにするために、本発明者らは、低いＦｃγＲＩＩｂを発現するＣＬＬサンプル（これは、ＰＫＨ２６標識することによって区別される）を、高レベルのＦｃγＲＩＩｂを発現する３つの異なるＣＬＬ事例に由来する細胞とともに共培養した（図４Ｃ）。Ｒａｍｏｓ細胞を用いた以前のアッセイにおいて認められるように、混合集団において、ＦｃγＲＩＩｂが低いＢ細胞におけるモジュレーションは、ＦｃγＲＩＩｂが高い集団において見られるモジュレーションに達しなかった。このことは、再度ではあるが、ＦｃγＲＩＩｂによるＣＤ２０ｍＡｂのモジュレーションが主にシス様式で行われることを示唆する。しかしながら、最も早くモジュレートするＣＬＬ細胞との共培養が、低ＦｃγＲＩＩｂ発現ＣＬＬのモジュレーションにおける最も大きい増大をもたらし、しかし、その増大はほどほどにすぎなかった（およそ１８％；データは示されず）ことに留意することは興味深いことである。
【０１１２】
このタイプのさらなる実験において、ＣＬＬ細胞を、細胞：細胞相互作用の可能性を低下させるために、低下する濃度で培養し、その結果、細胞濃度を低下させることにより、モジュレーションが少なくなるという弱い傾向が得られた（図４Ｄ）。同じ実験を、種々の濃度のＲａｊｉ細胞を用いて繰り返した。再度ではあるが、モジュレーションの程度または範囲における変化がほとんど認められなかった（データは示されず）。重要なことに、この実験の期間中に撮影された明視野顕微鏡法画像は、細胞間（トランス）相互作用の可能性が、２×１０６細胞／ｍｌと比較して、１×１０５細胞／ｍｌでははるかに少なかったことを明らかにする。そのうえ、本発明者らは、リン酸化ＦｃγＲＩＩｂのレベルにおける顕著な差が種々の細胞密度で全く存在しなかったことを認めた（図４Ｅ）。まとめると、これらのデータは、ＦｃγＲＩＩｂが、ＣＤ２０ｍＡｂのモジュレーションに対するその影響を、隣り合うＦｃγＲＩＩｂ発現細胞からのほんの小さい寄与を伴って、主には同じ細胞上での事象を介して媒介することを示している。
【０１１３】
実施例７：ＦｃγＲＩＩｂはエンドサイトーシスによりリポソームにＣＤ２０とともに取り込まれる。
細胞表面でのリツキシマブの会合の後におけるＦｃγＲＩＩｂの運命を突き止めるために、本発明者らはその発現および場所をフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡法によってモニターした。フローサイトメトリーを使用して、本発明者らは、ＣＬＬの６つの異なる事例に由来するＢ細胞におけるＦｃγＲＩＩｂの表面発現を評価し、ＦｃγＲＩＩｂの表面発現が、トシツモマブではなく、リツキシマブとの２時間のインキュベーションのうちに低下したことを見出した（図５Ａ）。これらの発見は、ＦｃγＲＩＩｂが三成分複合体の一部としてＣＤ２０およびリツキシマブ（トシツモマブではない）と一緒に内部移行されるかもしれないことを示唆する。
【０１１４】
本発明者らおよび他の研究者は、初期エンドソームへのその輸送をもたらすリツキシマブのエンドサイトーシスと、リソソームにおけるその後の分解とを以前に報告している（９、２８）。同じプロセスがＣＬＬ細胞において抗ＣＤ２０：ＣＤ２０：ＦｃγＲＩＩｂ複合体の一部としてのＦｃγＲＩＩｂに関して生じたかどうかを検討するために、本発明者らはＣＬＬ細胞をＴｏｓｉｔ−４８８またはＲｉｔｕｘ−４８８とともに培養し、その後、固定処理し、（ＡＴ１０に由来するＡｌｅｘａ６４７標識のＦ（ａｂ’）２を使用する）ＦｃγＲＩＩｂについての染色およびリソソームマーカーＬＡＭＰ−１についての染色を行った。ｍＡｂによる刺激の前では、ＦｃγＲＩＩｂ染色が原形質膜において拡散しており、非局在化していた（図５Ｂ）。抗ＣＤ２０ｍＡｂとの３０分間のインキュベーションの後において、本発明者らは、染色における明確な差を、Ｒｉｔｕｘ−４８８と、Ｔｏｓｉｔ−４８８との間において認めた。それによれば、Ｔｏｓｉｔ−４８８は表面にもっぱら留まり、Ｒｉｔｕｘ−４８８は細胞内の点状染色を明らかにし、このことは本発明者らの以前の観測結果と一致していた（図５Ｃ、データは示されず。および（２８））。６時間の刺激の後では、Ｔｏｓｉｔ−４８８は細胞表面全域にわたって一様に分布したままであり、一方、ＡＴ１０−６４７は３０分においてそのベースライン外観から変化しておらず、ＬＡＭＰ−１との共局在化が全く認められなかった（図５Ｄ）。対照的に、同じ時間経過にわたって、Ｒｉｔｕｘ−４８８は異なった点状パターンを示し、細胞の大部分（５８％）がＡＴ１０−６４７およびＲｉｔｕｘ−４８８の間での共局在化を明らかにした（図５Ｅ）。ＬＡＭＰ１およびＡＴ１０−６４７の両方とのＲｉｔｕｘ−４８８の共局在化もまた、３３％の細胞において認められた。推定では、３つすべての染色の間において認められたこのより低い程度の共局在化は、Ｒｉｔｕｘ−４８８およびＦｃγＲＩＩｂが一緒に内部移行し、そして、リソソームにおけるそれらの出現の前に、おそらくは他の細胞内区画を占めるという事実を反映する。
【０１１５】
実施例８：ＦｃγＲＩＩｂはＩ型抗ＣＤ２０ｍＡｂをインビボにおいて阻害する。
ＦｃγＲＩＩｂがＩ型抗ＣＤ２０ｍＡｂの効力をインビボにおいて阻害しているかもしれないかどうかを検討するために、本発明者らは、Ｂ細胞枯渇化実験を、ｈＣＤ２０Ｔｇ野生型マウスにおいて、また、ＦｃγＲＩＩｂを欠くｈＣＤ２０Ｔｇマウス（ＣＤ３２ＫＯ）においても行った。これらの実験において、マウスを、マウスＩｇＧ１を有するリツキシマブ変化体（ｍ１）またはマウスＩｇＧ２ａを有するリツキシマブ変化体（ｍ２ａ）により処理し（２５０μｇ、ｉｖ）、その後、Ｂ細胞の枯渇を、マウスの連続した採血により９０日間にわたるフローサイトメトリー、ならびに、Ｂ２２０ｍＡｂおよびＣＤ１９ｍＡｂによる染色によってモニターした（図６）。これらの変化体はＣＤ３２ｂに強く結合し（ｍ１）、または、弱く結合する（ｍ２ａ）。データは、ｍ１イソタイプが使用されたとき、枯渇が（ｍ２ａと比較して）最適でないこと、および、ＣＤ３２の喪失が枯渇効力における実質的な改善をもたらすことを明瞭に示す。対照的に、ｍ２ａはＣＤ３２の存在下または非存在下において概ね類似している。
【０１１６】
実施例９：ＦｃγＲＩＩｂはヒト腫瘍に対する抗ＣＤ２０ｍＡｂの活性をインビボにおいて高め、増強する。
ヒト腫瘍細胞に対するＣＤ３２の影響、および、現行の治療用ｍＡｂ、例えば、リツキシマブなどを増強する可能性を調べるために、本発明者らは異種移植片システムを用いた。このシステムでは、ヒト腫瘍細胞のみがｈＣＤ３２を発現し、したがって、どのような治療効果であれ、治療効果は、宿主エフェクター細胞に対する何らかの影響を介してではなく、モジュレーションを阻止することによってであると最も考えられる腫瘍細胞に対する影響に由来する。これらの実験において、ＣＤ２０陽性かつＣＤ３２陽性のヒト腫瘍細胞（ＤａｕｄｉまたはＲａｊｉ）をＳＣＩＤマウスに接種し、その後、リツキシマブ、ＡＴ１０または両方のいずれかにより処理し、マウスの生存または腫瘍成長をモニターした（図７）。使用されたｍＡｂの用量が図の凡例に示される。Ａ）では、Ｄａｕｄｉ細胞が皮下に接種され、腫瘍が３日〜５日毎にカリパス測定によってモニターされた。ＢおよびＣでは、Ｒａｊｉ腫瘍細胞が静脈内に注入され、動物が生存についてモニターされた。両方のモデルにおいて、ＡＴ１０は、リツキシマブの活性を高め、増強することが示された。このことはインビボにおけるこの組合せの可能性を明らかにする。
【０１１７】
実施例１０：ＦｃγＲＩＩｂレベルはリツキシマブ処置のＭＣＬ患者における臨床結果を予測する。
本発明者らのインビトロ知見の概念実証として、本発明者らは、リツキシマブを受けていたＭＣＬのコホートのＦｃγＲＩＩｂ発現を遡及的に調べた。診断用のパラフィン包埋組織を、ＦｃγＲＩＩｂ特異的ｍＡｂを使用して免疫組織化学によって染色した（図１１）。強い膜染色がＦｃγＲＩＩｂ＋ｖｅのリンパ腫サンプルにおいて認められたが、ＦｃγＲＩＩｂ−ｖｅのリンパ腫サンプルでは認められなかった。これらの結果は、フローサイトメトリーによって得られる対応するＤＭＳＯ凍結サンプルのＦｃγＲＩＩｂ発現と相関した。ＩＨＣによって図１０ａおよび図１０ｂに示されるＦｃγＲＩＩｂ染色は、図２Ｄに示されるようなフローサイトメトリーによって示されるＦｃγＲＩＩｂ発現と相関した（２Ｄにおけるフローサイトメトリーによって求められる値が図１０ａおよび図１０ｂにおいて数字の挿入として示される）。１６名のＭＣＬ患者からなるほんの小さいコホートを研究したにもかかわらず、ＦｃγＲＩＩｂ−ｖｅのリンパ腫の患者は、ＦｃγＲＩＩｂ＋ｖｅの細胞を有する患者よりも有意に良好なメジアン無進行生存を有した（メジアンがそれぞれ、８５２日および１８９日であった）。図１０ｃは、ＦｃγＲＩＩｂ＋サブセットおよびＦｃγＲＩＩｂ−サブセットにおける生存差を示す。これらの群は臨床的特徴の点で同程度であり（ＭＣＬ国際予後指標、データは示されず）、しかし、使用された化学療法タイプにおいて不均一性があった。このことを検討するために、本発明者らは、最初の治療についてリツキシマブまたはフルダラビンのどちらかの単剤、シクロホスファミドおよびリツキシマブ（ＦＣＲ）により処置されたそのような患者における結果を調べ、類似した結果が認められた。図１０ｄは、患者コホートが議論されるようにさらに管理された後のＦｃγＲＩＩｂ＋サブセットおよびＦｃγＲＩＩｂ−サブセットにおける生存差を示す。
【０１１８】
実施例１０および実施例１１における実験のための理論的根拠は下記の通りである。細胞が高レベルのＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）を発現するならば、そのような細胞はリツキシマブをより迅速に内部移行することになる（これは、低下した％表面利用可能ＣＤ２０として示される）。リツキシマブが細胞表面にほとんど存在しないならば、Ｆｃ依存的なエフェクター活性（例えば、食作用またはＡＤＣＣなど）がより少なくなることになり、したがって、腫瘍細胞殺傷がより小さくなり、したがって、それほど広範囲でない治療結果が生じることになる。したがって、本発明者らは、ＭＣＬを有する処置患者のコホートにおけるＦｃγＲＩＩｂ発現を調べ、患者がＣＤ３２ｂの高発現者または低発現者であったかどうかを求めた。臨床データがこのコホートについては既に入手可能であり、したがって、その後、臨床結果を、患者が高ＦｃγＲＩＩｂ発現腫瘍または低ＦｃγＲＩＩｂ発現腫瘍であったかどうかに従って階層化した。仮説は、低レベルのＦｃγＲＩＩｂを発現する腫瘍がリツキシマブにより首尾よく処置されると考えられ、高レベルのＦｃγＲＩＩｂを発現する腫瘍はそれほど十分には処置されないと考えられるということであった。このことはまさに、臨床データにおいて示されたことである。図１１は、ＦｃγＲＩＩｂ染色のために使用されたｍＡｂの特異性を示す。使用されたｍＡｂは、近縁のＦｃγＲＩＩａではなく、ＦｃγＲＩＩｂを発現する細胞のみを染色する。
【０１１９】
ＦｃγＲＩＩｂレベルをＩＨＣによって測定し（図１０ｂ）、ＭＣＬサンプルをＦｃγＲＩＩｂについて陽性および陰性に分けた後、本発明者らは、リツキシマブに基づく治療の後での応答における明確な臨床差を認めた（図１０ｃおよび図１０ｄ）。
【０１２０】
実施例１１−抗ＣＤ３２ｂモノクローナル抗体の選択。
１４個の抗体クローンの可変領域（ＶＨおよびＶＬ）のアミノ酸配列ならびにＣＤＲ領域のアミノ酸配列が図３７〜図５０に示される。それぞれの場合において、定常領域（ＣＨおよびＣＬ）は同じである。定常領域が図３６に示される。
【０１２１】
ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）に対する選択を、ｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｓｃＦｖファージディスプレーライブラリーを使用して行った。ヒトＣＤ３２Ａを非標的として使用した。ｍＩｇＧ３−Ｆｃに融合されたＣＤ３２ＡおよびＣＤ３２Ｂの細胞外ドメインをＨＥＫ２９３Ｅにおいて産生させ、プロテインＡで精製した。３回の連続するタンパク質選択を行った。非標的をすべての選択において競合剤として使用した。得られたファージを個々のクローンのスクリーニングのためにｓｃＦｖ／Ｆａｂ産生形式に変換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０細菌に形質転換した。スクリーニングでは、ヒトのＣＤ３２ＢおよびＣＤ３２Ａに対する特異性が決定され、また、スクリーニングを、コーティングされたタンパク質をＥＬＩＳＡで使用して分析し、同様にまた、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞によりＦＭＡＴで分析した。ＩＣ阻害特性を求めるために、ＩｇＧをＣＤ３２ＢトランスフェクションＣＨＯ細胞と結合させ、その後、ＩＣをＩｇＧ１コーティングのウシ血清アルブミンの形態で加えた。その後、結合したＩＣを検出した。ＩｇＧの阻害特性が評価され得るでろう。
【０１２２】
実施例１２−抗ＣＤ３２ｂ  ｍＡｂはリツキシマブのモジュレーションを阻止することができる。
リツキシマブ−ａｌｅｘａ４８８を、異なるＣＤ３２ｂ阻止ｍＡｂ（ＷＴまたは２９７Ｑ変異型）の存在下または非存在下、ＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＲａｍｏｓ細胞に加え、モジュレーションを、１時間後、２時間後、６時間後および２４時間後に評価した。ＣＤ３２  ｍＡｂの阻止能についてのコントロールとして、本発明者らはまた、二重ＣＤ３２ａ／ｂ特異性ｍＡｂのＡＴ１０（ＩｇＧフラグメントおよびＦａｂ２フラグメント（Ｆａｂ））を陰性コントロール（イソタイプが一致した無関係なｍＡｂ（ｉｓｏ  ｗｔまたはｎｑ）とともに含めた。図１２におけるデータは、３つすべてのｎＣｏｄｅｒ  ｍＡｂ（Ｃ１、Ｃ１１およびＣ１３）がｗｔ形式または２９７ｑ形式のどちらにおいてでもリツキシマブのモジュレーションを阻止し得ることを明瞭に示している。
【０１２３】
図１３は、抗ＣＤ３２ｂ  ｍＡｂがリツキシマブのモジュレーションを阻止し得ることを、１３個すべてのｍＡｂを使用して示す。加えて、コントロールのＣＤ３２陰性Ｒａｍｏｓ細胞が、ＣＤ３２阻止ｍＡｂの最大影響を推定することを可能にするために含められた。図１２におけるデータは、ｎＣｏｄｅｒ  ｍＡｂのすべてがリツキシマブのモジュレーションを阻止できたことを明瞭に示している。
【０１２４】
前記一組の実験は、ＦｃγＲＩＩｂがリツキシマブの内部移行を調節することを明らかにしていた。したがって、これらの実験は、抗ＦｃγＲＩＩｂ  ｍＡｂによりＦｃγＲＩＩｂを阻止することによって、リツキシマブが内部移行される量が低下するであろうかどうかを調べようとするものであった。
【０１２５】
実施例１３。抗ＣＤ３２阻止ｍＡｂの親和性と、リツキシマブ結合後のＣＤ３２ｂのリン酸化を妨げる能力、および、リツキシマブのモジュレーションを妨げる能力との間における相関。
ｍＡｂの相対的親和性を、ＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に対するｍＡｂ結合を測定する用量滴定実験によって求めた。簡単に記載すると、ＣＤ３２Ｂによりトランスフェクションされた接着性ＣＨＯ  Ｋ１細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。ＩｇＧを３０ｎＭからおよそ０．０１５ｎＭまで１：２の希釈で力価測定し、室温で１時間にわたって結合させた。洗浄後、結合したＩｇＧを抗ヒトＩｇＧ−ＡＰＣにより検出した。最後に、プレートを洗浄し、ＦＭＡＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で読み取った。これは、標的発現細胞に対するｍＡｂ結合についてのＥＣ５０値を与え、相対的親和性に変換することができる。その後、この相対的親和性を、リツキシマブ結合後のＣＤ３２ｂのリン酸化を妨げる抗ＣＤ３２ｂ阻止ｍＡｂの能力と相関させた。これを、細胞を、抗ＣＤ３２ｂ  ｍＡｂの存在下または非存在下においてリツキシマブにより刺激し、その後、ウエスタンブロッティングをホスホＣＤ３２ｂについて行うことによって求めた。その後、ＣＤ３２ｂ  ｍＡｂを、ＣＤ３２のリン酸化を阻止するその能力に従ってランク付けした（１が最も効果的である）。図１４Ａは、密接な相関が、ｍＡｂの親和性と、ＣＤ３２ｂのリン酸化を阻止する能力との間において明白に認められたことを示す。図１４Ｂは、強い相関が、ｍＡｂの親和性と、リツキシマブのモジュレーションを阻止する能力との間において明白に認められたことを示す。このデータから、標的細胞表面からのリツキシマブのモジュレーションを促進させることにおけるＣＤ３２Ｂの中心的役割が確認される。
【０１２６】
理論的根拠が、ｍＡｂのより大きい親和性により、ＦｃγＲＩＩｂがより良好に阻止されるであろうということであった。続いて、ｍＡｂがＦｃγＲＩＩｂをより良好に阻止するほど、ｍＡｂはリツキシマブのモジュレーション／内部移行をより良好に阻止するであろう。このことはまさに、図１４に示されたことである。親和性が大きいほど、ｍＡｂは、リツキシマブが結合することによって誘導されるＦｃγＲＩＩｂ活性化（これは、ウエスタンブロッティングによるホスホＦｃγＲＩＩｂ染色の量に測定された）をより良好に阻止し、また、同様に、モジュレーションをより良好に阻止した。
【０１２７】
実施例１４。ｈＣＤ３２Ｂトランスフェクション細胞に対する用量依存的結合、ならびに、ｈＣＤ３２Ｂトランスフェクション細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害。
細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。免疫複合体を、ＦＩＴＣをＢＳＡにコーティングし、その後、これをＦＩＴＣ特異的ｈＩｇＧ１抗体と１０：１のモル比で混合することによって調製した。図１５〜図２７は、ｈＣＤ３２Ｂトランスフェクション細胞に対する用量依存的結合、ならびに、クローン１〜１３によってそれぞれ媒介されるｈＣＤ３２Ｂトランスフェクション細胞に対する免疫複合体の用量依存的な結合および阻害を示す。○（円、サークル）は、ｈＣＤ３２ＡによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する用量依存的結合を示し、◆（黒菱形）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する依存的結合を示す。×（クロス）は、ｈＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＣＨＯ  Ｋ１細胞に対する免疫複合体の用量依存的阻害を示す。
【０１２８】
これらの実験は、１）ｍＡｂの特異性を求めるために設計される。ＣＤ３２ＢおよびＣＤ３２Ａは非常に近縁の分子である。しかしながら、ＣＤ３２Ｂは阻害シグナルを伝えるが、ＣＤ３２Ａは正のシグナルを伝え、したがって、所望される効果のためには、抗体がＣＤ３２Ｂと結合するだけであることが不可欠である。２）さらには、ＣＤ３２Ｂを介するシグナルを効果的に阻止するために、抗体はＣＤ３２Ｂと結合しなければならないだけでなく、その天然リガンドの結合、すなわち、免疫複合体（ＩＣ）を阻止しなければならない。したがって、図は、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂに対する結合、および、ＩＣ結合の阻害を示す。図は、すべてのｍＡｂがＣＤ３２について特異的であり、かつ、ＣＤ３２Ａと結合しないこと、および、すべてのｍＡｂがＩＣ結合を阻害することを明らかにする。
【０１２９】
実施例１５。抗ＣＤ３２Ｂ抗体の細胞特異性。
抹消血から単離されたＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配を使用して調製した。細胞を細胞特異的マーカーにより染色し、ＣＤ３２Ｂ特異的抗体の結合について評価した。図２８に示されるように、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋細胞）のみがクローン１〜１３により陽性に染まった。
【０１３０】
休止ＰＢＭＣでは、ＣＤ３２ＢがＢ細胞の表面に発現されるだけであり、一方、密接に関連するＣＤ３２Ａが単球および好中球の表面に発現される。前図は、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞における特異性を示す。図２８は、抗体がまた、ＣＤ３２ＢをＢ細胞上にその真に天然型の形態で発現するＢ細胞と結合し、一方で、抗体は、ＣＤ３２Ａを発現する好中球または単球を染色しないことを示す。したがって、この図は、正常な非トランスフェクションＰＢＭＣにおいて抗原が発現されるときの抗体特異性を明らかにするものである。
【０１３１】
実施例１６。抗ＦｃγＲＩＩｂ  ｍＡｂクローン１〜１３によるＢ細胞の用量依存的染色。
抹消血から単離されたＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配を使用して調製した。細胞をＣＤ１９により染色し、その後で、１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌまたは０．１ｍｇ／ｍｌの示されるようなＣＤ３２Ｂ特異的抗体により染色した。図２９は、それぞれのクローンによるＢ細胞の細胞染色がどのように用量依存的であるかを示す。
【０１３２】
図２９では、Ｂ細胞（これは、ＣＤ３２Ｂを発現することが知られている）が、ＣＤ１９特異的ｍＡｂを使用してゲートアウトされている。このゲートは「Ｍ１」と呼ばれる。ＣＤ３２Ｂ  ｍＡｂの濃度が低下するとき、染色されたＢ細胞の数が、ほぼ１００％から、はるかにより低い値にまで低下する。このことは、ＣＤ３２Ｂ特異的ｍＡｂから予想されるように、Ｂ細胞の特異的かつ用量依存的な染色を示す。
【０１３３】
このことは、再度ではあるが、抗体の特異性を明らかにするものである。既に述べられたように、ＣＤ３２ＡおよびＣＤ３２Ｂは極めて近い関係にあり、特異的な抗体を得ることは些末なことではない。特異的な抗体はどれも用量依存的な結合を示すはずであり、このことが、図２９において明らかにされることであり、すなわち、抗体用量を減らすと、染色されたＢ細胞の量が、最大用量において認められるようなほぼ１００％から低下する。したがって、この図は、正常な非トランスフェクションＢ細胞において抗原が発現されるときの抗体特異性を明らかにするもうひとつのものである。
【０１３４】
実施例１７。Ｆｃ媒介のＣＤ３２Ｂリン酸化を阻害するそれぞれのｍＡｂの能力。
Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ３２Ｂ陽性）をリツキシマブにより処理し、これにより、ＣＤ３２Ｂのリン酸化を生じさせた。これをＣＤ３２Ｂ特異的ｍＡｂ（１〜１３）の非存在下または存在下で行った。図３０は、Ｆｃ媒介のＣＤ３２Ｂリン酸化を阻害するそれぞれのｍＡｂの能力を明らかにする。
【０１３５】
実施例１７および実施例１８の背後にある仮説は、リツキシマブのＦｃ領域がＦｃγＲＩＩｂと結合すること、および、これにより、ＦｃγＲＩＩｂの活性化が引き起こされることである。このことがＦｃγＲＩＩｂのＩＴＩＭ領域のリン酸化によって測定される。この反応を抗ＦｃγＲＩＩｂ  ｍＡｂにより阻止することは、リン酸化の阻止（図３０）およびモジュレーションの阻止（図３１および図３２）を生じさせるにちがいない。ｗｔ型ＦｃγＲＩＩｂ  ＩｇＧ１は、そのＦｃ領域を介してＦｃγＲＩＩｂと結合することもできるので、本発明者らは、Ｎ２９７Ｑ変異体（これは、ＦｃγＲＩＩｂと結合しないＦｃを有する）もまた、類似する活性を有したかどうかを調べた。Ｎ２９７Ｑ変異体は同一の活性を有した。
【０１３６】
実施例１８。Ｉ型抗ＣＤ２０ｍＡｂのモジュレーションの速度に対するＣＤ３２ｂの影響。
ＣＤ３２ｂが他のＩ型抗ＣＤ２０ｍＡｂの内部移行に関与し得ることが図３１に示される。それぞれのｍＡｂのＡｌｅｘａ−４８８標識されたものをｐＣＤＮＡ３によりトランスフェクションされたＲａｍｏｓ細胞またはＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＲａｍｏｓ細胞と１時間または６時間インキュベーションし、モジュレーションの程度を以前のように求めた。使用されたｍＡｂは、リツキシマブ（ＲＴＸ）、研究室で作製されたオファツムマブ（ＯＦＡ）およびトシツムモマブ（Ｔｏｓ）であった。データは、ＯＦＡの内部移行速度がＲＴＸの内部移行速度と類似しており、ＣＤ３２ｂの存在によって促進されることを明瞭に示す。
【０１３７】
これらのモジュレーション影響がリツキシマブ（Ｉ型抗ＣＤ２０）に関して認められ、しかし、トシツモマブ（ＩＩ型抗ＣＤ２０ｍＡｂ）に関してはそれほど明白でなかった。したがって、本発明者らは、このことが他の抗ＣＤ２０ｍＡｂにまで及んだかどうかを検討することを望み、そこで、オファツムマブ、すなわち、別の臨床的に関連のあるＩ型ｍＡｂ（Ｔｅｅｌｉｎｇ、２００４（５２））を調べた。オファツムマブは、リツキシマブと同様に、予想された通り迅速に内部移行された。
【０１３８】
実施例１９。抗ＣＤ１９  ｍＡｂもまた、部分的にはＣＤ３２Ｂに依存する様式で、悪性のヒトＢ細胞の細胞表面から内部移行する。
Ｒａｍｏｓ  ｈｕＣＤ３２ｂトランスフェクタント。他の表面抗原との内部移行もまたＣＤ３２ｂ発現によって達成され得る。モジュレーションアッセイを、ＡＴ１０によるＣＤ３２阻止の存在下（＋）または非存在下（−）、異なるｍＡｂを用いて以前のように行った。Ｒａｍｏｓ  ＣＤ３２Ｂトランスフェクタントをこの６時間アッセイにおいて使用した。＊ｐ＜０．０５。ｆ３．３＝ＭＨＣクラスＩＩ；ＲＦＢＰ＝ＣＤ１９；ＲＴＸ＝リツキシマブ。図３２は、ＣＤ３２阻止とのインキュベーションの後、ＲＴＸおよびＲＦＢ９のｍＡｂについては表面モジュレーションにおける有意な低下を、また、Ｆ３．３については低下がほとんどないことを明瞭に示す。これらのデータは、標的抗原、例えば、ＣＤ１９などもまた、部分的にはＣＤ３２Ｂに依存し、かつ、抗ＣＤ３２ｂ  ｍＡｂによって阻止され得る様式で、悪性のヒトＢ細胞の細胞表面から内部移行し得ることを示している。
【０１３９】
本発明者らは、ＣＤ２０以外の標的抗原もまたＦｃγＲＩＩｂ発現によって影響されるかどうかを明らかにすることを望んだ。したがって、本発明者らは、他の標的抗原（ＣＤ１９およびＭＨＣＩＩ）に向けられたｍＡｂを調べ、また、ＦｃγＲＩＩｂを阻止するｍＡｂがそれらの内部移行を低下させるであろうかどうかを調べた。データは、ＣＤ１９  ｍＡｂのモジュレーションもまた、ＦｃγＲＩＩｂを阻止することによって低下することを示す。
【０１４０】
実施例２０。他の表面抗原との内部移行もまたＣＤ３２ｂ発現によって達成され得る。
Ｒａｍｏｓ細胞はＣＤ３２ｂを全く有しておらず、したがって、ＣＤ３２Ｂの非存在下における内部移行のレベルを明らかにする。抗原がＣＤ３２ｂによって内部移行され得るならば、（Ｒａｍｏｓ−ＣＤ３２Ｂ細胞上での）その発現は内部移行のレベルを増大させることになる。
【０１４１】
それぞれのｍＡｂのＡｌｅｘａ−４８８標識されたものをｐＣＤＮＡ３によりトランスフェクションされたＲａｍｏｓ細胞またはＣＤ３２ＢによりトランスフェクションされたＲａｍｏｓ細胞と２４時間インキュベーションし、モジュレーションの程度を以前のように求めた。＊＝ｐ＜０．０５。図３３は、他の抗原との内部移行もまたＣＤ３２ｂ発現によって達成されることを示す。
【０１４２】
材料および方法
細胞
ヒト細胞株（Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ）をＥＣＡＣＣから得て、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｌｏｎｚａ、英国）ならびにグルタミンおよびピルビン酸塩（ともにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国）において維持し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＢＣＲ発現を欠くＲｘ３  Ｒａｍｏｓ細胞は以前に作製されたものである（３６）。Ｒａｍｏｓ  ＦｃγＲＩＩｂトランスフェクタント、および、空のベクターによりトランスフェクションされたコントロール細胞（ＦｃγＲＩＩｂ陰性）は、以前に記載されたものであり（３６）、ジェネテシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国）を添加した上記のような補充されたＲＰＭＩにおいて維持された。ＦｃγＲＩＩｂおよび空のベクターによりトランスフェクションされたＲｘ３細胞が同じように作製され、維持された。ＦｃγＲＩＩｂの表面発現を、（下記に記載される）ＰＥ標識されたＡＴ１０を使用してフローサイトメトリーによって求めた。低いレベル、中程度のレベルまたは高いレベルのＦｃγＲＩＩｂを発現するＲａｍｏｓ  ＦｃγＲＩＩｂトランスフェクタントを、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を使用して分取した。
【０１４３】
血液提供者
正常なヒトＢ細胞をインフォームドコンセントとともに健康な志願者から得た。抹消血をＫ２ＥまたはＬｉＨのいずれかで採取し、リンパ球を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ、英国）を製造者のプロトコルに従って使用して分離し、Ｂ細胞をヒトＢ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）による負の選択によって単離した。
【０１４４】
臨床サンプル
ＣＬＬ／ＳＬＬ、ＦＬ、ＤＬＢＣＬおよびＭＣＬの各サンプルをヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントとともに得た。血液サンプルをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐによりＫ２ＥまたはＬｉＨで集め、固体組織を無菌のストレーナーに通してばらばらにし、遠心分離した。細胞を、５０％ヒトＡＢ血清および１０％ＤＭＳＯが補充されたＲＰＭＩにおいて凍結保存し、ヒト組織局の許諾のもと、サウサンプトン大学ガン科学部門腫瘍バンクにおいて保存した。臨床サンプルの使用のための倫理承認をサウサンプトン・サウスウエストハンプシャー研究倫理委員会からのサウサンプトン大学病院ＮＨＳ  Ｔｒｕｓｔによって得た。ＣＬＬ細胞については、ＩｇＶＨ遺伝子の変異状態（３３）およびＣＤ３８の陽性（４４）を以前に詳述されるように求めた。簡単に記載すると、ＩｇＶＨ分析のために、ＶＨリーダープライマーミックスおよびＣμ１００プライマーを使用して、重鎖遺伝子をｃＤＮＡから増幅した。すべてのヌクレオチド配列をＶ塩基ディレクトリーに対してアラインメントし、変異状態を、９８％カットオフを使用して求めた。ＣＤ３８分析のために、抗ＣＤ３８  ＰＥ（クローンＨＢ７；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。ＺＡＰ−７０状態の決定をＣｒｅｓｐｏ他（３０）によって記載されるように行った。ＣＬＬ細胞の表面Ｉｇ発現を以前の記載（４５、４６）ようにフローサイトメトリーによって求めた。
【０１４５】
生存性アッセイ
細胞を、以前に詳述されるように（２５）、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶおよびＰＩにより染色した後、フローサイトメトリーによって生存性について評価した。
【０１４６】
抗体および試薬
リツキシマブは、サウサンプトン総合病院、腫瘍薬学科によって譲渡されたものである。Ｒｉｔ  ｍ２ａ（マウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域を有するリツキシマブ）およびＷＲ１７（抗ＣＤ３７）（すべてがマウスＩｇＧ２ａ）を以前の記載（１８）のように作製した。抗ＦｃγＲＩＩ  ｍＡｂ（ＡＴ１０）は、実験室で作製されたものであり、以前に記載されている（４７）。トシツモマブは、Ｔｉｍ  Ｉｌｌｉｄｇｅ教授（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国）によって譲渡されたものである。オファツムマブおよびＧＡ１０１ｇｌｙ（Ｆｃ領域が改変されていないグリコシル化ＧＡ１０１）を、特許公開された配列から実験室で作製した。これらのｍＡｂは、ＣＨＯ細胞または２９３Ｆ細胞において作製されたものであり、したがって、臨床使用のために製造されるｍＡｂとは（例えば、それらの炭水化物構造において）異なるかもしれないことに留意すること。Ａｌｅｘａ−４８８および抗Ａｌｅｘａ４８８試薬をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの製造は以前に記載されている（４８）。Ｆａｂ’フラグメントを、２０ｍＭの２−メルカプトエタノールとのインキュベーションを２５℃で３０分間行い、その後、過剰のヨードアセトアミドを添加することによって作製した。使用されたウエスタンブロッティング抗体は抗アクチン（ＡＣ７４、Ｓｉｇｍａ、英国）および抗ホスホＦｃγＲＩＩｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、英国）であった。
【０１４７】
フローサイトメトリー
蛍光団により標識されたｍＡｂをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得たか、または、実験室で作製した。ｍＡｂを製造者のプロトコルに従ってＡｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）とコンジュゲートした。フローサイトメトリーは以前に記載されている（４９）。サンプルをＦＡＣＳｃａｎまたはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒのどちらかで評価し、データを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏ（すべてが、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、または、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＤｅＮｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国）により分析した。Ｂ細胞をＡＰＣ標識された抗ヒトＣＤ１９（実験室）により特定し、ＦｃγＲＩＩｂ発現を、ＰＥ標識されたＡＴ１０（実験室）を使用して求めた。実験間の変動を考慮するために、ＦｃγＲＩＩｂ発現をＦｃγＲＩＩｂ：イソタイプコントロールのＧｅｏ平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比率として表した。
【０１４８】
内部移行アッセイ
内部移行アッセイを以前に詳述されるように行った（２８）。簡単に記載すると、２〜４×１０５細胞／ウエルを５μｇ／ｍｌの最終濃度でのＡｌｅｘａ−４８８標識されたｍＡｂとインキュベーションした。サンプルを、１時間後、２時間後、６時間後および／または２４時間後に集め、２回洗浄し、再懸濁し、クエンチング抗体の抗Ａｌｅｘａ−４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下または非存在下、ＡＰＣ標識された抗ＣＤ１９と４℃で３０分間インキュベーションした。その後、サンプルを１回洗浄し、フローサイトメーターで分析した。
【０１４９】
細胞と結合した抗ＣＤ２０ｍＡｂのＦｃ領域の、隣接細胞上のＦｃγＲＩＩｂとの相互作用を調べるために、Ｒａｍｏｓ細胞（これはＦｃγＲＩＩｂ−ｖｅである）を製造者の説明書に従ってＰＨＫ２６（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）により標識した。その後、ＰＫＨ２６標識された細胞を、ＦｃγＲＩＩｂによりトランスフェクションされたＲａｍｏｓ細胞の等しい数（２．５×１０５細胞）とともに共培養した。両方の細胞タイプをコントロールとして単独で培養した。その後、内部移行アッセイを上記のように行い、モジュレーションをＰＫＨ２６標識集団およびＰＫＨ２６非標識集団で比較した。この共培養アッセイのさらなる変形が図の凡例に記載される。
【０１５０】
ウエスタンブロッティング
プロトコルは以前に記載されている（３６）。簡単に記載すると、約２×１０６細胞／ウエルをｍＡｂ（５〜１０μｇ／ｍｌ）とインキュベーションした。その後、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、タンパク質を直ちにＰＶＤＦメンブラン転写した。メンブランを５％（ｗ／ｖ）脱脂乾燥乳によりブロッキング処理し、適切に希釈された一次抗体とインキュベーションし、洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートされた抗ウサギＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベーションし、強化化学発光（ＥＣＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国、または、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、英国）、および、感光性フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）またはＢｉｏｓｐｅｃｔｒｕｍ  ＡＣ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＵＶＰ、英国）への露光によって可視化した。
【０１５１】
光学顕微鏡観察および共焦点顕微鏡観察
抗ＣＤ２０ｍＡｂおよびＦｃγＲＩＩｂの細胞内輸送を明らかにするために、ＣＬＬ細胞を、図の凡例に記載されるような様々な時間にわたって、適切なＡｌｅｘａ４８８標識されたｍＡｂとインキュベーションし、その後、集め、洗浄し、２％パラホルムアルデヒドにより固定処理した。ＦｃγＲＩＩｂおよびＬＡＭＰ−１をそれぞれ検出するために、その後、細胞を０．３％サポニンにより透過処理し、Ａｌｅｘａ−６４７標識されたＡＴ１０  Ｆ（ａｂ’）２（標識化が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４６７標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って用いて行われた）、および／または、ビオチンコンジュゲート化抗ヒトＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ−１）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、英国）とインキュベーションした。その後、細胞を洗浄し、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、その後、さらに洗浄した。その後、細胞をスライドの上に移し、画像を、ＴＣＳ−ＳＰ５レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、英国）（１０ｘの接眼レンズ、１０ｘの対物レンズ）においてＬＡＳ−ＡＦ  ｖ２ソフトウエアを使用して取り込んだ。
【０１５２】
種々の細胞希釈度での細胞近傍を明らかにするために、細胞を１〜２０×１０５個／ｍｌで播種し、様々なｍＡｂにより２時間および／または６時間刺激し、その後、それらの比較的近傍を光学顕微鏡観察によって評価した。細胞を、１０ｘまたは２０ｘ／０．２５のＰＨレンズを使用するＯｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ２１倒立型顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、英国）により調べた。画像を、ＣＣＬ２デジタル冷却カメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して取得し、Ｃｅｌｌ  Ｂソフトウエア（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｓｏｆｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）およびＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（バージョンＣＳ２）ソフトウエア（Ａｄｏｂｅ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により処理した。
【０１５３】
統計学的分析
統計学的分析を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国）を使用して行った。対になったノンパラメトリックデータを、ウィルコクスンのペアード検定を使用して分析し、一方で、対になっていないデータはマン・ホィットニー検定を使用して分析した。
【０１５４】
例示的な組成物、配合物および投与様式
本発明は、疾患、障害または感染に伴う１つまたは複数の症状を、効果的な量の本発明の医薬組成物を対象または患者に投与することによって処置、予防または改善する方法を提供する。
【０１５５】
具体的な実施形態において、対象または患者は動物であり、好ましくは哺乳動物であり、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えば、サル（例えば、カニクイサルなど）およびヒト）である。好ましい実施形態において、対象はヒトである。
【０１５６】
様々な送達システムが知られており、それらを、本発明の組成物を投与するために使用することができる（例えば、リポソームにおける封入、マイクロ粒子、マイクロカプセル、抗体を発現することができる組換え細胞など）。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、本発明の抗体の標的化された送達のためにリポソームに配合される。リポソームは、水相を包み込む同心状に整列したリン脂質二重層から構成される小胞である。リポソームは典型的には、様々なタイプの脂質、リン脂質および／または表面活性剤を含む。リポソームの構成成分が、生物学的膜の脂質配置と類似する二重層形態で配置される。リポソームは、部分的にはその生体適合性、低い免疫原性および低い毒性のために特に好ましい送達ビヒクルである。リポソームを調製するための様々な方法がこの技術分野では知られており、本発明において包含される。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ他、1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688; Hwang et al, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4;米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号を参照のこと（これらのすべてがそれらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１５８】
本発明の組成物を投与する方法には、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外投与および粘膜投与（例えば、鼻腔内経路および経口経路）が含まれるが、これらに限定されない。具体的な実施形態において、本発明の組成物は、筋肉内、静脈内または皮下に投与される。組成物は、どのような経路であれ、好都合な経路によって投与することができ、例えば、注入またはボーラス注射によって、あるいは、上皮または粘膜皮膚の内張り（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を介した吸収によって投与することができ、また、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身的または局所的であることが可能である。加えて、肺投与もまた、例えば、吸入器またはネブライザーの使用およびエアロゾル化剤との配合によって用いることができる。米国特許第６，０１９，９６８号；同第５，９８５，３０９号；同第５，９３４，２７２号；同第５，８７４，０６４号；同第５，８５５，９１３号；同第５，２９０，５４０号；および同第４，８８０，０７８号；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１９２４４号；同ＷＯ９７／３２５７２号；同ＷＯ９７／４４０１３号；同ＷＯ９８／３１３４６号；および同ＷＯ９９／６６９０３号を参照のこと（これらのそれぞれがその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１５９】
障害に伴う１つまたは複数の症状の処置、予防または改善において効果的であろう本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。配合において用いられるための正確な用量はまた、投与経路および状態の重症度に依存することになり、医師の判断および各患者の状況に従って決定されなければならない。効果的な用量は、インビトロ試験システムまたは動物モデル試験システムに由来する用量応答曲線から推定される場合がある。
【０１６０】
本発明によって包含される抗体について、患者に投与される投薬量は典型的には、組合せにおけるそれぞれの抗体について独立して０．０００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重である。好ましくは、患者に投与されるそれぞれの抗体の投薬量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜２０ｍｇ／ｋｇ患者体重、０．０００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜１０ｍｇ／ｋｇ患者体重、０．０００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜５ｍｇ／ｋｇ患者体重、０．０００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜２ｍｇ／ｋｇ患者体重、０．０００１ｍｇ／ｋｈ患者体重〜１ｍｇ／ｋｈ患者体重、０．０００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜０．７５ｍｇ／ｋｇ患者体重、０．０００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜０．５ｍｇ／ｋｇ患者体重、０．０００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜０．２５ｍｇ／ｋｇ患者体重、０．０００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜０．１５ｍｇ／ｋｇ患者体重、０．０００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜０．１０ｍｇ／ｋｇ患者体重、０．００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜０．５ｍｇ／ｋｇ患者体重〜０２．５ｍｇ／ｋｇ患者体重、または、０．０１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜０．１０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。一般に、ヒト抗体は、異物ポリペプチドに対する免疫応答のために、他の生物種に由来する抗体よりも長いヒト体内における半減期を有する。したがって、ヒト抗体のより少ない投薬量およびより少ない投与頻度が多くの場合、可能である。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントの投薬量および投与頻度は、抗体の取り込みおよび組織浸透を修飾（例えば、脂質化など）により高めることによって減らすことができる。
【０１６１】
１つの実施形態において、患者に投与される本発明の組成物の抗体のそれぞれの投薬量が０．０１ｍｇ／日〜１０００ｍｇ／日である。
【０１６２】
本発明の組成物は、予防的または治療的に効果的な量の本明細書中に開示されるような薬剤および抗体と、医薬的に許容されるキャリアとを含む。
【０１６３】
具体的な実施形態において、用語「医薬的に許容される」は、規制当局によって承認されていること、あるいは、動物における使用、より具体的にはヒトにおける使用のために米国薬局方または他の一般に承認された薬局方に収載されていることを意味する。用語「キャリア」は、治療剤が一緒に投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全および不完全））、賦形剤またはビヒクルを示す。そのような医薬用キャリアは無菌の液体が可能であり、例えば、水およびオイルなどが可能であり、オイルには、石油起源、動物起源、植物起源または合成起源のものが含まれ、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油およびゴマ油などなどが含まれる。医薬組成物が静脈内投与されるときには、水が、好ましいキャリアである。生理的食塩水溶液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液はまた、特に注射可能な溶液のための液体キャリアとして用いることができる。好適な医薬用賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノールなどが含まれる。組成物はまた、所望されるならば、少量の湿潤化剤または乳化剤、あるいは、ｐＨ緩衝化剤を含有することができる。それらの組成物は、溶液、懸濁物、乳化物、錠剤、ピル、カプセル、粉末および持続放出配合物などの形態を取ることができる。
【０１６４】
様々な実施形態において、抗体および薬剤は同時に投与することができ、あるいは、１時間未満の間隔を置いて、約１時間の間隔を置いて、約１時間〜約２時間の間隔を置いて、約２時間〜約３時間の間隔を置いて、約３時間〜約４時間の間隔を置いて、約４時間〜約５時間の間隔を置いて、約５時間〜約６時間の間隔を置いて、約６時間〜約７時間の間隔を置いて、約７時間〜約８時間の間隔を置いて、約８時間〜約９時間の間隔を置いて、約９時間〜約１０時間の間隔を置いて、約１０時間〜約１００時間の間隔を置いて、約１１時間〜約１２時間の間隔を置いて、２４時間を超えない間隔を置いて、または、４８時間を超えない間隔を置いて投与することができる。好ましい実施形態において、２つ以上の成分が、同一の患者診療の際に投与される。
【０１６５】
本明細書中に示される投薬量および投与頻度は、治療効果的および予防効果的の用語によって包含される。投薬量および頻度はさらに、典型的には、投与される具体的な治療剤または予防剤、疾患の重篤度およびタイプ、投与経路、同様にまた、患者の年齢、体重、応答および過去の病歴に依存して、それぞれの患者について特異的な要因に従って変化するであろう。好適な療法が、そのような要因を考慮することによって、また、例えば、文献に報告される投薬量、および、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（第５６版、２００２）において推奨される投薬量に従うことによって当業者により選択され得る。
【０１６６】
概要
近年、本発明者らは、リツキシマブのようなＩ型ｍＡｂが、ヒトＣＤ２０ＴｇマウスのＢ細胞の表面から（インビトロおよびインビボで）、また、ＮＨＬ患者に由来するある種の原発性腫瘍細胞からモジュレートし、それにより、エフェクターを動員し、標的細胞を枯渇させるそれらの能力を制約することを見出した（２８）。本発明者らは、リツキシマブおよび他のＩ型ＣＤ２０ｍＡｂの治療活性の制約を説明するための、また、重要なことであるが、このプロセスの阻止または回避のための可能性を提供し、それにより、より強力な試薬を開発するための起こり得る機構を検討している。本研究は、リツキシマブおよびオファツムマブによって誘導されるＣＤ２０モジュレーションについての分子的根拠を提供する。ＦｃγＲＩＩｂ発現が、Ｉ型抗ＣＤ２０ｍＡｂに対する応答についての重要な予後マーカーを提供するにちがいない。原発性ＣＬＬ／ＳＬＬ細胞がＩ型抗ＣＤ２０ｍＡｂとともに培養されたとき、ＣＤ２０の有意な、しかし、不均一なモジュレーションが認められたが、この不均一性はＣＬＬにおける知られている予後因子に関連づけることができないであろう。他のＢ−ＮＨＬサブタイプの分析では、ＭＣＬが、ＣＬＬと類似する不均一なモジュレーションを呈したこと、しかし、ＦＬおよび特にＤＬＢＣＬは有意に少ないモジュレーションを示したことが示された。これらの結果に基づいて、本発明者らは今回、これらの悪性腫瘍におけるＦｃγＲＩＩｂ発現のレベルと、これらの悪性腫瘍が６時間の培養においてモジュレートする程度との間における密接な相関を報告する。そのうえ、本発明者らは、このモジュレーションにより、これらの疾患において見られるリツキシマブに対する応答における不均一性のいくらかが説明され得ることを示唆する。リツキシマブは、化学療法との併用でＤＬＢＣＬおよびＦＬ（これらにおいて、リツキシマブが第一選択の治療として確立している）において最も有効であることが証明されているものである。それに反して、リツキシマブによるＣＬＬにおけるＯＳでの改善を実証することはより困難であることが判明しており（３９）、ＭＣＬおけるその利益は一層ほどほどである（５）。したがって、一般的な知見として、ＦｃγＲＩＩｂを発現するＢ細胞悪性腫瘍は、ＣＤ２０をモジュレートし、かつ、リツキシマブ処置からの利益をそれほど受けない可能性がより大きいと考えられた。しかしながら、ＤＬＢＣＬおよびＦＬの範囲内でさえ、一部の事例はリツキシマブに対して応答しない。一例として、形質転換したＦＬ事例は一般に、治療に対する応答が不良であり、かつ、ＦｃγＲＩＩｂを発現する（２１）。これは、高ＦｃγＲＩＩｂ発現サンプルの１つ（図２Ｃ）がＦＬとして特定され、それに対応してモジュレーションの大きい速度を明らかにしたという本発明者ら自身の発見と一致する観察結果である。ただ１つだけの事例に基づくが、本発明者らは、このことが潜在的には、リツキシマブに対する抵抗性の重要な手段をもたらし得るであろうと思っている。
【０１６７】
ＣＤ２０モジュレーションは、Ｂ−ＮＨＬ疾患サブタイプにもかかわらず、ＦｃγＲＩＩｂ発現レベルとの強い相関を示した。ＦｃγＲＩＩｂが、エフェクター細胞上の活性化Ｆｃ受容体と競合し、それにより、細胞毒性のシグナル伝達を阻害することによって治療でのｍＡｂの効力を阻害している可能性があることが以前に示唆された（４０）。本発明者らのインビトロ研究では、リツキシマブが、主に同じ細胞においてＣＤ２０およびＦｃγＲＩＩｂを共架橋し、それにより、ＦｃγＲＩＩｂの活性化、および、分解のためのリソソーム内への、結合したｍＡｂと一緒での両方の表面抗原の迅速な対になった内部移行を生じさせることが示唆される。ＦｃγＲＩＩｂの発現は、低下したエフェクター細胞動員を、標的細胞上のｍＡｂの表面発現をダウンレギュレーションするその能力を介して生じさせるようである。
【０１６８】
本発明者らはまた、阻止する抗ＦｃγＲＩＩｂ  ｍＡｂとの共インキュベーションにより、ＦｃγＲＩＩｂの活性化およびリツキシマブの迅速な内部移行の両方を妨げることが可能であったことを示した。まとめると、これらのデータから、ＦｃγＲＩＩｂの活性化と、細胞表面からのｍＡｂの迅速な内部移行との間における直接的な連係が確認される。
【０１６９】
種々のＢ−ＮＨＬサブタイプにわたるＩ型抗ＣＤ２０ｍＡｂによって誘導されるＣＤ２０モジュレーションと、ＦｃγＲＩＩｂ発現との間における強い相関は、本発明者らのトランスフェクション研究と同様に、ＦｃγＲＩＩｂがＣＤ２０モジュレーションの重要な調節因子であることを示唆する。
【０１７０】
他のグループがリンパ腫におけるＦｃγＲＩＩｂの役割を調べている。Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ−Ｂｒｏｅｔ他（２０）は、Ｒ−ＣＨＯＰに対する応答と、ＦｃγＲＩＩｂ発現との間における有意な関係をＤＬＢＣＬにおいて何ら示すことができず、しかしながら、１８％（２３４事例中４２）のみが、より早期の系列において免疫組織化学によってＦｃγＲＩＩｂ陽性であると思われた（２１）。陽性の頻度が比較的低いことを考慮すると、陽性事例の数が、差を検出するためには不十分であったかもしれないことが考えられる。過剰発現の代わりに、ＷｅｎｇおよびＬｅｖｙ（２４）は、ＦｃγＲＩＩｂの２つの対立因子（２３２Ｉ対立因子、これは自己免疫疾患において２３２Ｔ対立因子よりもＢＣＲ媒介のカルシウム調節において効率的である（２２、２３））がリツキシマブの効力と関連づけられるかどうかを調べたが、この多型と、単剤リツキシマブ治療に対する応答との間における相関をＦＬ患者において何ら明らかにすることができなかった。主な関心事は、著者ら自身によって提起されたものであるが、１７名の患者のみが２３２Ｔ対立因子を有したということであった（再度ではあるが、このことが研究の検出力を制限している）。加えて、研究された多型は、自己免疫疾患におけるＢＣＲ阻害の効率を反映したものであり、これらの多型がリンパ腫において関連があること、または、ヒトＩｇＧ１のＦｃ結合に影響することを示す観測結果は何ら発表されていない。ＦｃγＲＩＩｂ発現は、内部移行の速度を調節するその能力により、Ｉ型ｍＡｂ（リツキシマブおよびオファツムマブを含む）による免疫治療の成功に関する重要な予後指標となるであろう。ＦｃγＲＩＩｂ発現はＩＩ型ｍＡｂ治療に対してはそれほど顕著な影響を有しないかもしれない。
【０１７１】
そのうえ、２つの異なるインビボモデルにおいて、本発明者らは、ＣＤ３２がｍＡｂの効力を制約し得ること、および、抗ＣＤ３２ｂ  ｍＡｂはこの制約を克服し、かつ、リツキシマブ治療を増強し得ることを明らかにしている。
【０１７２】
参考文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【国際調査報告】
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