(57)【要約】  蛋白質試料における突然変異、修飾又は不純物の存在を定性的及び／又は定量的に検出する方法を提供する。前記方法は２個の蛋白質試料をボトムアップ液体クロマトグラフィーで比較できるようにするために、蛋白質消化前に蛋白質に組込んだアミノ酸の同位体標識物を利用する。本発明により実現される測定は蛋白質分解消化中に生成したペプチドの質量のみならず、得られた各ペプチドの存在量も考慮する。ＭＳによるペプチドの存在量の測定は蛋白質消化前に非標識蛋白質と混合するＳＩＴＲＳ試料を利用することにより可能になる。本願で使用する「ＳＩＴＲＳ試料」又は「ＳＩＴＲＳ標準」なる用語は既知配列の蛋白質（例えば抗体）をこの蛋白質に存在する少なくとも１種のアミノ酸の安定同位体標識物で標識したものを意味する。
2013528818.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質試料の性状決定方法であって、
（ｉ）既知アミノ酸配列をもつ第１の蛋白質の少なくとも１種のアミノ酸を同位体標識アミノ酸で置換した第１の蛋白質の試料を準備する段階と；
（ｉｉ）第１の蛋白質における同位体標識物に対応する非標識アミノ酸を含む第２の非標識蛋白質の試料を準備する段階と；
（ｉｉｉ）第１の試料と第２の試料を混合し、混合物を形成する段階と；
（ｉｖ）混合物を蛋白質消化に供し、第１の消化産物を形成する段階と；
（ｖ）第１の消化産物をボトムアップ液体クロマトグラフィー／質量分析法に供し、１個以上のダブレット又はシングレットピークを含む第１のスペクトルを形成し、ダブレットピークは第１の試料に由来する同位体標識ペプチドと第２の試料に由来する対応する非標識ペプチドの存在を示し、各シングレットピークは突然変異、修飾又は不純物を含むペプチドの存在を示す段階
を含み、それによって第２の蛋白質試料を性状決定する、前記方法。
【請求項２】
（ｖｉ）ダブレットのピークの相対強度を比較して各ペプチドの相対量を求め、ピーク比が１：１の場合には第１のペプチドと第２のペプチドが実質的に同一であると判定し、ピーク強度が相違する場合には化学的に別個のペプチドが存在すると判定する段階を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ピーク強度の相対低下に基づいて化学的に別個のペプチドの量を定量する段階を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｖｉｉ）消化産物をタンデム質量分析法に供し、スペクトル中のシングレットピークにより表されるペプチドの配列を決定する段階を更に含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第１の蛋白質における実質的に全ての等価アミノ酸を同位体標識する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
同位体標識アミノ酸が少なくとも１種の重同位体を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
蛋白質消化と同位体標識アミノ酸が、
（ａ）トリプシン消化と、１種以上の重アルギニン、重リジン及びその組合せ；
（ｂ）エンドプロテイナーゼＧｌｕＣ消化と重グルタミン酸；
（ｃ）エンテロキナーゼ軽鎖消化と、１種以上の重アスパラギン酸、重リジン及びその組合せから選択される、同位体標識物；
（ｄ）第Ｘａ因子消化と、１種以上の重イソロイシン、重グルタミン酸、重アスパラギン酸、重グリシン、重アルギニン及びその組合せ；
（ｅ）フリン消化と重アルギニン；
（ｆ）ｇｅｎｅａｓｅ  Ｉ消化と、１種以上の重ヒスチジン、重チロシン及びその組合せ；
（ｇ）キモトリプシン消化と重芳香族アミノ酸；
（ｈ）Ｌｙｓ−Ｃ又はＬｙｓ−Ｎ消化と重リジン；並びに
（ｉ）エンドプロテイナーゼＡｒｇＣ消化と重アルギニン
から構成される群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
標識蛋白質と非標識蛋白質を蛋白質消化前に精製する段階を更に含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
蛋白質が組換え蛋白質、バイオセラピー用蛋白質、抗体、モノクローナル抗体、抗体−薬物コンジュゲート、イメージング抗体、融合蛋白質及びペグ化蛋白質から構成される群から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
蛋白質が抗体である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
消化産物が蛋白質の全長アミノ酸配列の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上に相当する全体配列をもつペプチド集合を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
全体配列が蛋白質の全長アミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法であって、
（ｉ）第１の蛋白質における同位体標識物に対応する非標識アミノ酸を含む第３の非標識蛋白質の試料を準備する段階と；
（ｉｉ）第１の試料と第３の試料を混合し、第２の混合物を形成する段階と；
（ｉｉｉ）第２の混合物を第２の蛋白質消化に供し、第２の消化産物を形成する段階と；
（ｉｖ）第２の消化産物をボトムアップ液体クロマトグラフィー／質量分析法に供し、１個以上のダブレット又はシングレットピークを含む第２のスペクトルを形成し、各ダブレットピークは第１の試料に由来する同位体標識ペプチドと第３の試料に由来する対応する非標識ペプチドの存在を示し、各シングレットピークは突然変異、修飾又は不純物を含むペプチドの存在を示す段階、
を更に含み、それによって第３の蛋白質試料を性状決定する、前記方法。
【請求項１４】
（Ｖ）第２の消化産物に由来するスペクトル中のダブレットピークの相対強度を比較し、各ペプチドの相対量を求める段階を更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第１の消化産物と第２の消化産物の結果を比較し、第２の蛋白質試料と第３の蛋白質試料の相違を判定する段階を更に含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記比較が第１の消化産物に由来するスペクトルのピークシグナル比を第２の消化産物に由来するスペクトルの対応するピークシグナル比と比較する段階を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
第１の蛋白質試料が革新的生物製剤であり、第２の蛋白質試料が革新的生物製剤のバイオシミラーである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
第１の蛋白質試料が非コンジュゲート蛋白質であり、第２の蛋白質試料がコンジュゲート蛋白質である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
第１の蛋白質試料と第２の蛋白質試料が異なる細胞株、異なる細胞種又は異なる製造方法で作製される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
第１の蛋白質試料と第２の蛋白質試料が異なる保存条件で保存されている、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
第２の蛋白質試料における突然変異、修飾又は不純物を検出するために前記方法を利用する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
突然変異、修飾又は不純物がオリゴ糖含量変化、Ｎ末端グルタミン変換、Ｃ末端リジン除去、ピログルタミン酸含量変化、及び脱アミド化又は酸化の亢進から構成される群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第１の試料と第２の試料が実質的に均質な蛋白質調製物である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
第１の試料と第２の試料が医薬組成物である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は安定同位体標識参照標準（Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ−Ｔａｇｇｅｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＳＩＴＲＳ））と共にボトムアップ液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）を使用して２個以上の蛋白質試料を比較する解析方法に関する。
【０００２】
本出願は、２０１０年６月１６日に出願された米国仮出願第６１/３５５，２６９号の優先権の利益を主張するものであり、その全部が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
質量分析法（ＭＳ）検出によるペプチドマッピングは一次配列の確認のために蛋白質解析法で使用されている。公知解析方法は予想されるペプチドの存在を主に定性的に確認している。
【発明の概要】
【０００４】
１側面において、本発明は蛋白質試料の性状決定方法に関し、前記方法は、（ｉ）既知アミノ酸配列をもつ第１の蛋白質の少なくとも１種のアミノ酸を同位体標識アミノ酸で置換した第１の蛋白質の試料を準備する段階と；（ｉｉ）第１の蛋白質における同位体標識物に対応する非標識アミノ酸を含む第２の非標識蛋白質の試料を準備する段階と；（ｉｉｉ）第１の試料と第２の試料を混合し、混合物を形成する段階と；（ｉｖ）混合物を蛋白質消化に供し、第１の消化産物を形成する段階と；（ｖ）第１の消化産物をボトムアップ液体クロマトグラフィー／質量分析法に供し、１個以上のダブレット又はシングレットピークを含む第１のスペクトルを形成する段階（なお、各ダブレットピークは第１の試料に由来する同位体標識ペプチドと第２の試料に由来する対応する非標識ペプチドの存在を示し、各シングレットピークは突然変異、修飾又は不純物を含むペプチドの存在を示す）を含む。所定態様において、前記方法は更に、（ｖｉ）ダブレットのピークの相対強度を比較して各ペプチドの相対量を求め、ピーク比が１：１の場合には第１のペプチドと第２のペプチドが実質的に同一であると判定し、ピーク強度が相違する場合には化学的に別個のペプチドが存在すると判定する段階を含む。別の態様において、前記方法は更に、ピーク強度の相対低下に基づいて化学的に別個のペプチドの量を定量する段階を含む。別の態様において、前記方法は更に、（ｖｉｉ）消化産物をタンデム質量分析法に供し、スペクトル中のシングレットピークにより表されるペプチドの配列を決定する段階を含む。
【０００５】
別の側面において、本発明は蛋白質試料における突然変異、修飾又は不純物の存在を定性的に検出する方法に関する。前記方法は各試料を安定同位体標識参照標準（Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ−Ｔａｇｇｅｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＳＩＴＲＳ））蛋白質と比較することにより２個以上の蛋白質試料を相互に比較することができる。前記方法は、既知アミノ酸配列をもつ第１の蛋白質（ＳＩＴＲＳ）の少なくとも１種のアミノ酸を同位体標識アミノ酸で置換した第１の蛋白質の試料を準備する段階と；第１の蛋白質における同位体標識アミノ酸に対応する非標識アミノ酸を含む非標識蛋白質の試料を準備する段階と；第１の蛋白質と非標識蛋白質標準を混合し、混合物を形成する段階と；混合物を消化とそれに続いてボトムアップ液体クロマトグラフィー／質量分析法による解析に供し、スペクトルが各蛋白質におけるこの特定ペプチドの存在を示すダブレットを含むか否かを判定する段階を含む。ダブレットピークが観測されない場合には、単一ピークは以下の可能性の１つに由来するペプチドに対応すると思われる。即ち（１）ペプチドが標識アミノ酸を含まない；（２）ペプチドが修飾を含む；（３）ペプチドが突然変異、挿入又は欠失を含む；（４）ペプチドが不純物に対応し、蛋白質試料に存在するアミノ酸配列を含まない。この場合には単一ピークをＭＳ／ＭＳにより解析してペプチドの配列を解明し、上記４種類の可能性のうちのどれが存在するかを判定することができる。
【０００６】
別の側面において、本発明は蛋白質試料における突然変異又は修飾の存在を定量的に測定する方法に関する。前記方法は、既知アミノ酸配列をもつ第１の蛋白質（ＳＩＴＲＳ）の少なくとも１種のアミノ酸を同位体標識アミノ酸で置換した第１の蛋白質の試料を準備する段階と；第１の蛋白質における同位体標識アミノ酸に対応する非標識アミノ酸を含む非標識蛋白質の試料を準備する段階と；第１の蛋白質と非標識蛋白質試料を混合し、混合物を形成する段階と；混合物を消化とそれに続いてボトムアップ液体クロマトグラフィー／質量分析法による解析に供し、スペクトルがＳＩＴＲＳと非標識蛋白質試料の両者におけるこの特定ペプチドの存在を示すダブレットを含むか否かを判定すると共に、ダブレットのピークの強度を比較し、各蛋白質におけるこの特定ペプチドの相対存在量を求める段階を含む。先ず上記のように同一ＳＩＴＲＳ抗体と比較した後に各非標識蛋白質試料の結果を比較することにより更に他の非標識蛋白質試料を相互に比較することもできる。
【０００７】
本発明のこれら及び他の側面は本明細書を精読することにより当業者に理解され、明白に認識されよう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明によるＳＩＴＲＳ実験の模式図である。
【図２】本発明に従い、そのＳＩＴＲＳ対照物の存在下でトリプシン消化により生成するＭＡｂ−１ペプチドの代表的な質量スペクトルである。
【図３】本発明に従い、突然変異体で２０％までスパイクしたｍＡｂ−１とｗｔ ｍＡｂ−１を比較したＳＩＴＲＳ実験の抽出質量スペクトルである（ｗｔ及び突然変異体ｍＡｂの両方に存在するｗｔ  ＨＣ（２５５−２７３）ペプチドを示す）。
【図４】本発明による図３からのＨＣ（２５５−２７３）のモノアイソトピックピーク強度の表である。
【図５】本発明に従い、突然変異体で２０％までスパイクしたｍＡｂ−１とｗｔ  ｍＡｂ−１を比較したＳＩＴＲＳ実験の抽出イオン質量スペクトルである（突然変異体ｍＡｂにおいて修飾されているｗｔ  ＨＣ（２１８−２４７）ペプチドを示す）。
【図６】本発明による図５からのＨＣ（２１８−２４７）のモノアイソトピックピーク強度の表である
【図７】本発明に従い、突然変異体で２０％までスパイクしたｍＡｂ−１とｗｔ  ｍＡｂ−１を比較したＳＩＴＲＳ実験の抽出イオン質量スペクトルである（突然変異体ｍＡｂのみに存在し、ＳＦＴＲＳ試料には存在しない突然変異ＨＣ（２１８−２４７）ペプチドを示す）。
【図８】本発明に従い、サイズ排除クロマトグラフィー／高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を利用した抗体脱塩を実証するＬＣクロマトグラムである。
【図９Ａ】（Ａ）純非標識ＭＡｂ−１と（Ｂ）１０％ＭＡｂ−２で汚染されたＭＡｂ−１に由来するペプチドの質量スペクトルの比較である。本発明に従い、トリプシン消化及び解析前にＳＩＴＲＳを各ペプチドと１：１比で混合した。
【図９Ｂ】（Ａ）純非標識ＭＡｂ−１と（Ｂ）１０％ＭＡｂ−２で汚染されたＭＡｂ−１に由来するペプチドの質量スペクトルの比較である。本発明に従い、トリプシン消化及び解析前にＳＩＴＲＳを各ペプチドと１：１比で混合した。
【図１０】本発明に従い、１０％ＭＡｂ−２で汚染されたＭＡｂ−１試料の定量で試験した６種類のペプチドのＳＩＴＲＳ値を示すグラフである。
【図１１】本発明に従い、ヒト胎児腎２９３細胞とチャイニーゼハムスター卵巣細胞に由来するＭＡｂ−１ペプチドからのＳＶを比較したものである。
【図１２】本発明に従い、突然変異体で２０％までスパイクしたｍＡｂ−１とｗｔ  ｍＡｂ−１を比較したＳＩＴＲＳ実験のＳＩＴＲＳ棒グラフである。
【図１３】本発明に従い、突然変異体で２．５％までスパイクしたｍＡｂ−１とｗｔ  ｍＡｂ−１を比較したＳＩＴＲＳ実験のＳＩＴＲＳ棒グラフである。
【図１４】本発明に従い、突然変異体でスパイクした各種ｍＡｂ−１試料のＳＩＴＲＳ解析により、突然変異体スパイク抗体におけるペプチドＨＣ（２１８−２４７）、ＨＣ（３４４−３５９）及びＨＣ（２８８−３００）の量を野生型抗体における量に対して比較測定したプロットである。
【図１５Ａ】本発明に従い、２種類の異なる方法を使用して２種類の異なる細胞株により産生させたＭＡｂ−１試料のバッチ（ＣＨＯで産生させた試料（図１５Ａ）とＨＥＫで産生させた試料（図１５Ｂ））を比較するＳＩＴＲＳ棒グラフである。
【図１５Ｂ】本発明に従い、２種類の異なる方法を使用して２種類の異なる細胞株により産生させたＭＡｂ−１試料のバッチ（ＣＨＯで産生させた試料（図１５Ａ）とＨＥＫで産生させた試料（図１５Ｂ））を比較するＳＩＴＲＳ棒グラフである。
【図１６】図１５Ｂに示した本発明による安定同位体標識参照標準（ＳＩＴＲＳ）結果と従来の解析法による結果を対比した表である。バッチ２（ＣＨＯ産生）とバッチ３（ＨＥＫ産生）に由来するｍＡｂ−１のＳＩＴＲＳ解析の選択結果（ｎ＝６）を従来方法により得られた結果（ｎ＝３）と比較する。
【図１７】本発明に従い、組成の異なる２種類の緩衝液中で軽度ストレス下のｍＡｂ−１試料を比較するＳＩＴＲＳ棒グラフである。
【図１８】本発明に従い、ＤＴＰＡ−ＭＡｂ−１コンジュゲートを非修飾ＭＡｂ−１と比較したＳＩＴＲＳ棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の各種態様について詳細に記載し、その１例以上を以下に説明する。各例は本発明を限定する目的ではなく、本発明を説明する目的で記載する。実際に、当業者に自明の通り、本発明の範囲又は趣旨から離れずに本発明に種々の変更及び変形を加えることができる。例えば、ある態様の一部として例証又は記載する特徴を別の態様で使用し、更に別の態様を提供することができる。
【００１０】
従って、本発明は特許請求の範囲とその等価物の範囲に該当するような変更及び変形に対応するものである。本発明の他の目的、特徴及び側面も以下の詳細な説明に開示し、又は以下の詳細な説明から自明である。当業者に自明の通り、本願の記載は典型的な態様の説明に過ぎず、本発明のより広範な側面を限定するものではない。
【００１１】
本願で使用する「蛋白質」又は「ポリペプチド」なる用語は１０アミノ酸以上、例えば５０アミノ酸、１００アミノ酸、２００アミノ酸、３００アミノ酸、４００アミノ酸、５００アミノ酸又はそれ以上のアミノ酸のポリマーを意味する。本発明の典型的な蛋白質としては、限定されないが、組換え蛋白質、バイオセラピー用蛋白質、モノクローナル抗体及び他の抗体、抗体−薬物コンジュゲートもしくは他のバイオコンジュゲート、イメージング抗体、融合蛋白質又はペグ化蛋白質が挙げられる。
【００１２】
本願で使用する「モノクローナル抗体」なる用語は特定標的分子（抗原）と１カ所の特定部位（抗原部位）で結合する類の抗体蛋白質を意味する。
【００１３】
本発明により実現される測定は蛋白質分解消化中に生成したペプチドの質量のみならず、得られた各ペプチドの存在量も考慮する。ＭＳによるペプチドの存在量の測定は蛋白質消化前に非標識蛋白質と混合するＳＩＴＲＳ試料を利用することにより可能になる。本願で使用する「ＳＩＴＲＳ試料」又は「ＳＩＴＲＳ標準」なる用語は既知配列の蛋白質（例えば抗体）をこの蛋白質に存在する少なくとも１種のアミノ酸の安定同位体標識物で標識したものを意味する。
【００１４】
従って、１側面において、本発明は蛋白質（例えば抗体）の２個の試料を比較し、試料における突然変異、修飾又は不純物等の差異を定性的及び／又は定量的に同定する方法に関する。測定は蛋白質消化及びＬＣ−ＭＳ前に非標識蛋白質（例えば非標識抗体）と混合するＳＩＴＲＳ試料を利用することにより実施することができる。
【００１５】
安定同位体標識物を内部標準として導入し、定量に影響を与える可能性のある試料操作とＭＳ検出に起因する変動とアーチファクトを軽減する。本発明により軽減される潜在的変動の例としては、蛋白質消化の程度、試料操作によるアーチファクトの形成及び／又はＭＳ検出中のイオン化効率の変動が挙げられる。本発明の方法を利用することにより、このようなパラメーターをＳＩＴＲＳ試料に対して正規化することができる。
【００１６】
１側面において、本発明は標識蛋白質（ＳＩＴＲＳ試料）を調製する段階と、標識蛋白質を非標識蛋白質試料と混合する段階を含む。混合した試料を次にボトムアップＬＣ−ＭＳに供し、非標識試料中の低レベル突然変異、修飾又は不純物を定性的及び／又は定量的に測定することができる。発現細胞株の選択不良、増殖培地の不備、細胞培養条件の不備、精製段階の不備又は製剤化緩衝液の不足を判定するためにこの解析を使用してもよい。
【００１７】
典型的な１態様では、非標識抗体を実験増殖培地で形成するか又は実験細胞株／クローンにより産生させ、得られた非標識抗体をＳＩＴＲＳ試料と混合した後、混合した試料を蛋白質消化とボトムアップＬＣ−ＭＳに供し、これを使用して実験増殖培地／細胞株／クローンが目的抗体の産生に許容可能であるか否かを判定することができる。
【００１８】
標準逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）条件下において、標識ペプチドと非標識ペプチドは保持時間がほぼ等しいため、同時に泳動する。標識ペプチドと非標識ペプチドはクロマトグラフィーにより分離できないが、ＭＳ検出により区別可能であり、特定ペプチドにおける標識残基数に等しいダルトン（Ｄａ）の差を生じる。従って、ＳＩＴＲＳ試料を非標識抗体又は他の蛋白質と混合すると、Ｄａの差を示すダブレットが質量スペクトルに出現し、ＳＩＴＲＳ試料への標識アミノ酸の組込みと、同一アミノ酸配列をもつペプチドがＳＩＴＲＳ試料及び非標識抗体の両方に存在することを示す。（１：１混合物における）その非標識対照物との唯一の相違が標識アミノ酸の存在であるＳＩＴＲＳ試料は各ピークが同一強度であるダブレットを生じる。
【００１９】
ＳＩＴＲＳ試料は標準アミノ酸の代わりに重アミノ酸を使用する当分野で公知の方法を使用して作製することができる。例えば、アルギニン残基とリジン残基を含む蛋白質を作製する場合には、天然存在量の多い１２Ｃ原子の代わりに６個の１３Ｃ原子から構成されるアルギニン残基とリジン残基（アルギニン−６及びリジン−６）を増殖培地に添加すればよい。
【００２０】
当分野で公知の重同位体による標識物が本発明で有用であると考えられる。当業者に自明の通り、重同位体による標識物の選択は形成される蛋白質と、ＬＣ−ＭＳ検出に備えて蛋白質に実施される蛋白質消化に依存する。例えば、作製される蛋白質がアルギニン及び／又はリジンを含み、トリプシン消化を受ける場合には、重アルギニン及び／又はリジンが望ましいと思われる。同様に、作製される蛋白質がアスパラギン酸を含み、エンドプロテイナーゼＡｓｐＮ消化を受ける場合には、重アスパラギン酸が望ましいと思われる。作製される蛋白質がグルタミン酸を含み、エンドプロテイナーゼＧｌｕＣ消化を受ける場合には、重グルタミン酸が望ましいと思われる。作製される蛋白質がアスパラギン酸−アスパラギン酸−アスパラギン酸−アスパラギン酸−リジン鎖を含み、エンテロキナーゼ消化を受ける場合には、重アスパラギン酸及び／又は重リジンが望ましいと思われる。作製される蛋白質がイソロイシン−グルタミン酸又はアスパラギン酸−グリシン−アルギニン鎖を含み、第Ｘａ因子消化を受ける場合には、重イソロイシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン及び／又はアルギニンが望ましいと思われる。作製される蛋白質がアルギニン−Ｘ−Ｘ−アルギニン鎖を含み、フリン消化を受ける場合には、重アルギニンが望ましいと思われる。作製される蛋白質がヒスチジン−チロシン結合を含み、ｇｅｎｅａｓｅ  Ｉ消化を受ける場合には、重ヒスチジン及び／又はチロシンが望ましいと思われる。作製される蛋白質が芳香族側鎖をもつアミノ酸を含み、キモトリプシン消化を受ける場合には、芳香族側鎖をもつ重アミノ酸が望ましいと思われる。作製される蛋白質がリジンを含み、Ｌｙｓ−Ｃ又はＬｙｓ−Ｎ消化を受ける場合には、重リジンが望ましいと思われる。作製される蛋白質がメチオニンを含み、ＣＮＢｒ消化を受ける場合には、重メチオニンが望ましいと思われる。作製される蛋白質がアルギニンを含み、エンドプロテイナーゼＡｒｇＣ消化を受ける場合には、重アルギニンが望ましいと思われる。本発明は特定の同位体標識物又は特定の蛋白質消化方法に限定されず、蛋白質に応じて同位体標識物及び方法を変えることができる。
【００２１】
本発明は更に蛋白質精製段階を含むことができる。当分野で公知の蛋白質精製法が本発明で有用であると考えられ、利用することができる。蛋白質消化前に蛋白質精製段階を実施することができ、場合によっては、試料を混合する前に蛋白質精製段階を実施することが望ましいと思われる。他の態様では、試料混合後で蛋白質消化前に蛋白質精製段階を実施することが望ましいと思われる。
【００２２】
所定態様では、混合した試料を蛋白質消化前に変性、還元及び／又はアルキル化することが望ましいと思われる。変性、還元及びアルキル化段階は当分野で公知の方法により実施することができる。例えば、変性段階は透析法、オフライン固相抽出法（ＳＰＥ）、オンラインＳＰＥ又は液体クロマトグラフィー（ＬＣ）（例えばサイズ排除クロマトグラフィー／高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）又は逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ））を使用して実施することができる。オンラインＳＰＥ又はＬＣ法では、流速を制御することができ、紫外線（ＵＶ）シグナルをモニターすることができ、精製蛋白質のみを採取し、増殖段階又は試料処理に起因する残留緩衝液又は他の汚染物質を採取しないように分画採取のタイミングを調節することができる。
【００２３】
図１はＳＩＴＲＳ解析の模式図である。図３及び５は非標識ＭＡｂとその対応するＳＩＴＲＳ標準（修飾又は突然変異なし）を含む２個の混合試料のＳＩＴＲＳ解析からの質量スペクトルを示す。図に示すように、ＳＩＴＲＳ標準と非標識ＭＡｂを１：１比で混合し、蛋白質（トリプシン）消化後、ボトムアップＬＣ−ＭＳに供した。非標識試料とＳＩＴＲＳ標準の両方に共通のペプチドに得られた質量スペクトルはＳＩＴＲＳ標準における標識アミノ酸の存在により質量対電荷比（ｍ／ｚ）ピークがダブレットとして出現するという特徴がある。従って、化学的組成がそのＳＩＴＲＳ対照物と同一であり、そのＳＩＴＲＳ対照物と同一量で存在するペプチドは強度が（１：１混合物における）標準の強度と等しくなる（例えば図３参照）。
【００２４】
図５に示すように、ペプチド集団の一部が点突然変異体又は部位特異的修飾分子（例えば脱アミド化、Ｎ末端ピログルタミン酸又はグリコシル化の差異）から構成されるペプチドは非標識試料に由来するピークの強度がＳＩＴＲＳ標準に比較して化学的に別個のペプチドの存在量に相当する量だけ低下した質量スペクトルとなる。従って、ＳＩＴＲＳ標準を非標識蛋白質調製物と混合し、混合した試料を蛋白質消化とボトムアップＬＣ−ＭＳに供することにより、非標識蛋白質調製物における突然変異、修飾及び／又は部位特異的修飾分子の存在を同定及び定量することができる。
【００２５】
上記ストラテジーを利用して異なる細胞株に由来する抗体調製物を比較することができる。例えば、本発明の方法は実験増殖培地で増殖させるか又は実験クローン／細胞株により産生させた非標識抗体における突然変異及び／又は修飾の存在を定性的に同定するために利用することができる。この態様では、少なくとも１種の同位体標識アミノ酸（「ＳＩＴＲＳ標準」）を含む標準試料を実験細胞株により産生させた非標識抗体と混合する。混合した試料を次に蛋白質消化とボトムアップＬＣ−ＭＳに供し、実験細胞株が目的抗体の産生に許容可能であるか否かを判定することができる。
【００２６】
上記態様と同様に、非標識抗体とＳＩＴＲＳ標準の唯一の相違がＳＩＴＲＳ標準における標識アミノ酸の存在である場合には、２個の試料はＭＳで同時に泳動し、質量スペクトルの唯一の顕著な相違はＳＩＴＲＳ標準における標識アミノ酸の存在を示すダブレットとして出現する。
【００２７】
ダブレットピークが観測されない場合には、単一ピークは以下の可能性の１つに由来するペプチドに対応すると思われる。即ち（１）ペプチドが標識アミノ酸を含まない；（２）ペプチドが修飾を含む；（３）ペプチドが突然変異、挿入又は欠失を含む；（４）ペプチドが不純物に対応し、蛋白質試料に存在するアミノ酸配列を含まない。この場合には単一ピークをＭＳ／ＭＳにより解析してペプチドの配列を解明し、上記４種類の可能性のうちのどれが存在するかを判定することができる。例えば、図７は姉妹ダブレットをもたない突然変異体ペプチドの存在を示す。従って、ＳＩＴＲＳ標準を非標識抗体と混合し、混合した試料を蛋白質消化とボトムアップＬＣ−ＭＳに供することにより、非標識抗体における突然変異、修飾及び／又は部位特異的修飾分子の存在を同定することができる。最良のクローンを選択するために上記同一ストラテジーを利用して異なる細胞株により産生させた数個の非標識ＭＡｂを比較することができる。
【００２８】
本発明の別の側面において、標識ＳＩＴＲＳ標準は各標識ＳＩＴＲＳ標準ペプチドのｍ／ｚピークの強度を各ダブレットにおける非標識試料のその対応する非標識ペプチドの強度と比較することにより、質量分析法による蛋白質の定量を可能にする。この結果、全長蛋白質配列にほぼ相当する全ペプチドの比較が可能になる。この場合には上記ストラテジーを利用して数種の非標識蛋白質を相互に比較することができる。
【００２９】
本発明のこの側面では、非標識蛋白質を作製する。更に、非標識ＭＡｂに対応するＳＩＴＲＳ標準を取得する。非標識蛋白質とＳＩＴＲＳ標準は実質的に同一であるはずであり、混合すると、図１に示すような１：１ダブレットをＭＳに示すはずである。非標識蛋白質における突然変異又は修飾の存在を定量するために、対応するＳＩＴＲＳ標準を非標識試料と混合する。対応するＳＩＴＲＳ標準と非標識試料の混合物を次に蛋白質消化とボトムアップＬＣ−ＭＳに供することができる。得られたスペクトルを次に解析し、ダブレットピークの強度が同一であるか否かを判定することができる。
【００３０】
更に、ＳＩＴＲＳ標準における同位体標識物以外は非標識ＭＡｂとＳＩＴＲＳ標準が同一であることを検証するために、非標識ＭＡｂとＳＩＴＲＳ標準を混合し、蛋白質消化とボトムアップＬＣ−ＭＳに供することができる。得られた質量スペクトルパターンは図１に示すように実質的に１：１ピークを生じるはずである。しかし、ペプチド集団の一部が点突然変異体又は部位特異的修飾分子（例えば脱アミド化、Ｎ末端ピログルタミン酸又はグリコシル化の差異）から構成されるペプチドは非標識標準試料に由来するピークの強度がＳＩＴＲＳ標準に比較して化学的に別個のペプチドの存在量に相当する量だけ低下した質量スペクトルとなる（図１）。
【００３１】
２個の非標識蛋白質試料を相互に（例えば非標識試料Ａを非標識試料Ｂと）比較する場合には、ピペッティングエラーとＭＳ検出に起因し得る変動を更に最小限にすることが必要になる場合がある。これらの変動を最小限にするためには、式１に示すようにＳＩＴＲＳ標準に対する非標識試料Ａの比をＳＩＴＲＳ標準に対する非標識試料Ｂの比に比較すればよい。得られた値をＳＩＴＲＳ値（ＳＶ）と言う。
【００３２】
【数１】
2013528818.tif 000003
【００３３】
式１において、ＩＡは非標識試料Ａのピーク強度であり、ＩＳＩＴＲＳ−Ａは非標識試料Ａと混合したＳＩＴＲＳ標準のピーク強度であり、ＩＢは非標識標準試料Ｂのピーク強度であり、ＩＳＩＴＲＳ−Ｂは非標識標準試料Ｂと混合したＳＩＴＲＳ標準のピーク強度である。式２に従って［（ＩＡ／ＩＳＩＴＲＳ−Ａ）／（ＩＢ／ＩＳＩＴＲＳ−Ｂ）］の最近似比の平均を得ることにより実験により決定される定数であるｃを掛けることにより、非標識標準試料Ｂに対する非標識試料Ａのピーク強度比を予想シグナルの百分率に変換する。２個の試料間で共通のペプチドは比が同等となり、相違するペプチドは異なる比となる。
【００３４】
【数２】
2013528818.tif 000004
【００３５】
あるいは、式３に示すように、ＳＩＴＲＳ標準に対する非標識試料Ａの比をＳＩＴＲＳ標準に対する非標識試料Ｂの比と比較してもよい。
【００３６】
【数３】
2013528818.tif 000005
【００３７】
式３において、Ａ及びＢは夫々試料Ａにおけるペプチドと試料Ｂにおける同一ペプチドの相対量である。ＩＡ、ＩＢ、ＩＳＩＴＲＳ−Ａ及びＩＳＩＴＲＳ−Ｂは夫々試料Ａ、Ｂ、試料Ａと混合したＳＩＴＲＳ標準及び試料Ｂと混合したＳＩＴＲＳ標準における同一ペプチドのｍ／ｚイオンピークの強度である。定数ｃは試料Ａと試料ＢへのＳＩＴＲＳ標準の添加量が等しくない可能性を考慮した正規化係数である。具体的には、ｃは通常では翻訳後修飾を受けない１組のペプチドのＢ／Ａ値の９５％信頼区間の外側の外れ値を除くＢ／Ａ値のトリム平均である。従って、ＩＡ／ＩＳＩＴＲＳ−Ａにｃを掛けると、定量したペプチドの大半でＩＢ／ＩＳＩＴＲＳ−Ｂの比に等しい積となる。
【００３８】
こうして、一方には非標識試料Ａ（例えば十分に性状決定された参照抗体）とＳＩＴＲＳ標準を含み、他方には非標識試料Ｂ（例えば被験抗体試料）とＳＩＴＲＳ標準を含む少なくとも２個の蛋白質消化産物を１回の定量実験で試験することができる。
【００３９】
以下の実施例は本発明の典型的な態様について記載する。本願の特許請求の範囲内の他の態様も本願に開示する本発明の詳細な説明又は実施例に鑑みて当業者に明白に認識されよう。詳細な説明と実施例は例示に過ぎず、本発明の範囲と趣旨は実施例の後に記載する特許請求の範囲に指定する通りである。
【実施例】
【００４０】
特に指定しない限り、本実施例では以下の材料及び装置を利用した。しかし、本願に記載する方法はこれらの材料及び／又は装置のみを利用する方法に限定されない。
【００４１】
チャイニーゼハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培地とアミノ酸に使用した材料を以下に挙げる：
・Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの製品であるＬｙｓ／Ａｒｇドロップアウト培地；
・Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡの製品であるＬ−アルギニン（Ａｒｇ−６）一塩酸塩、カタログ番号ＣＬＭ−２２６５−０．２５（ＭＷ２１６．６２）；
・Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの製品であるＬ−リジン（Ｌｙｓ−６）二塩酸塩、カタログ番号ＣＬＭ−２２４７−０．２５（ＭＷ２２５．０７）；
・Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩの製品であるＬ−アルギニン一塩酸塩、カタログ番号Ａ５１３１−１Ｇ（ＭＷ２１０．６６）；及び
・Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩの製品であるＬ−リジン一塩酸塩、カタログ番号Ｌ５６２６−１Ｇ，（ＭＷ１８２．６５）。
・ミリＱ水又は同等物。
【００４２】
プロテインＡ精製に使用した材料を以下に挙げる：
・ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗａｕｗａｔｏｓａ，ＷＩの製品であるｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、カタログ番号１７−１２７９−０３；
・１Ｍトリス緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓ），ｐＨ８．５；
・１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ），ｐＨ７．４；
・酢酸；
・塩化ナトリウム；
・Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡの製品であるＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム、カタログ番号７３１−１５５０；
・真空マニホールド；
・Ｖａｒｉａｎ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡの製品である紫外・可視分光光度計、モデルＣａｒｙ  ５０；及び
・Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡの製品であるＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０、カタログ番号４２４１０。
【００４３】
ペプチドマッピングにおけるトリプシン消化に使用した材料を以下に挙げる：
・Ｓｉｇｍａの製品であるヨード酢酸（ＩＡＡ）；カタログ番号１４３８６−１０Ｇ；
・Ｓｉｇｍａの製品であるジチオスレイトール（ＤＴＴ）；カタログ番号Ｄ−９１６３；
・Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪの製品であるトリプシン、カタログ番号ＴＲＳＥＱＺ，４．６１ｕ／ｍｇＰ；
・１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０；
・１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；
・Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪの製品である塩酸グアニジン（Ｇｕａ−ＨＣｌ）；カタログ番号３６９０７５；
・ＪＴ  Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪの製品である５Ｎ塩酸（ＨＣｌ）；カタログ番号５６１８−０２；及び
・Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの製品である０．２２μｍ（ＣＡ）使い捨て滅菌フィルターユニット；カタログ番号４３００１５。
【００４４】
変性剤及び他の不純物を除去するためにゲル濾過に使用したＳＥＣ−ＨＰＬＣシステム：
・Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡの製品であるＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ＨＰＬＣシステム；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるＡｇｉｌｅｎｔリザーバトレイ；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３１１Ａクォータナリポンプ；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３２２Ａ脱ガス装置（インライン）；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３６７Ｂ  ＨｉＰ−ＡＬＳ高性能オートサンプラー；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品である温度制御機能付きＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３１６Ａ  ＴＣＣカラムコンパートメント；
・Ｔｏｓｏｈ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎの製品であるＴｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  ＳＷ３０００ＸＬガードカラム，内径６．０ｍｍ×長さ４０ｍｍ，粒子径７μｍ，カタログ番号０８５４３；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３６４Ｃ分析用フラクションコレクター；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるフラクションコレクター用Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３３０Ｂ温度制御器；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３６５Ｄ  ＭＷＤ（紫外・可視検出器）；及び
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるコンピュータ付きＡｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎデータ取得システム。
【００４５】
ＲＰ−ＨＰＬＣとＭＳ検出によるペプチドマッピングに使用した材料を以下に挙げる：
・ＪＴ  Ｂａｋｅｒの製品であるトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；カタログ番号９４７０−００；
・ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの製品であるギ酸（ＦＡ）；カタログ番号ＦＸ０４４０−５；及び
・Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ  Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍｏｒｒｉｓ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，ＮＪの製品であるＨＰＬＣグレードアセトニトリル（ＡＣＮ）、カタログ番号ＡＨ０１５−４。
【００４６】
ＲＰ−ＨＰＬＣとＭＳ検出によるペプチドマッピングに使用したＬＣ−ＭＳシステム；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるＡｇｉｌｅｎｔリザーバトレイ；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３７６Ａキャピラリバイナリポンプ；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３７９Ｂマイクロ真空脱ガス装置（インライン）；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３７７Ａ  Ｍｉｃｒｏ  ＷＰＳオートサンプラー；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３３０Ｂ  ＦＣ／ＡＬＳ  Ｔｈｅｒｍオートサンプラーサーモセット；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品である温度制御機能付きＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３１６Ｂ  ＴＣＣ  ＳＬカラムコンパートメント；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ６５１０Ａ−６５１０Ｑ−ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳシステム；
・Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡの製品であるＨｉｇｇｉｎｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏ  ２００  Ｃ１８，５μｍ，２５０×１．０ｍｍ，カタログ番号ＲＳ−２５０１−Ｄ１８５，シリアル番号１５７３３７；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるコンピュータ付きＡｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒデータ取得システム；
・Ａｇｉｌｅｎｔの製品であるＡｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｂ．０３．００  ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｃｏｎｆｉｒｍ；及び
・Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔの製品であるＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３ソフトウェア。
【００４７】
［実施例１］
本実施例では、アルギニンとリジンのアミノ酸を欠失する化学的に規定された培地で非標識及び標識モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生させた。次に培地に非標識又は標識Ｌ−アルギニン（Ａｒｇ）及びＬ−リジン（Ｌｙｓ）を夫々３．９７ｍＭ及び５．９５ｍＭまで添加した。当分野で公知の標準方法を使用して抗体の非標識物と標識物を作製し、必要時まで−８０℃で保存した。
【００４８】
標識ＭＡｂ−１（ＳＩＴＲＳ）及び非標識ＭＡｂ−１のプロテインＡ精製：
カラム充填
ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを使用してＭＡｂ−１（標識及び非標識）を精製した。激しく振盪することにより樹脂を再懸濁させた。１×ＰＢＳ  １０ｍＬを加えたＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｏｌｙ  ＰｒｅｐカラムにＳｅｐｈａｒｏｓｅ（１．６５ｍＬ，樹脂約１．２ｍＬ）を移した（カラムの底のキャップを閉めた）。
【００４９】
樹脂を底まで沈降させた。次にキャップを外し、緩衝液が流れるのに任せ、樹脂のベッドに到達する直前に停止させた。
【００５０】
プロテインＡ精製
１×ＰＢＳ  ２０ｍＬ（約２カラム容量）を〜３〜５ｍＬ／分の速度で流すことにより樹脂を平衡化させた。試料（１０ｍＬ〜１０ｍｇ）を〜１ｍＬ／分の速度でカラムにアプライした。１０ｍｇの標識ＭＡｂ−１と１０ｍｇの非標識ＭＡｂ−１を処理した。
【００５１】
次に１×ＰＢＳ  ４×１０ｍＬ（約２カラム容量）を〜３〜５ｍＬ／分の速度で流してカラムをリンスし、試料を０．１Ｍ酢酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ３．５）５ｍＬで重力流により溶出させた。
【００５２】
試料再構成
溶出したＭＡｂ−１のＡ２８０を溶出液の１０倍希釈液で測定した。具体的には、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０緩衝液１８０μＬを加えることにより蛋白質２０μＬを２００μＬまで希釈した。ＭＡｂ−１の消光係数は１．４３ｍＬ／ｍｇ＊ＡＵであった。
【００５３】
溶出したＭＡｂ−１（５ｍＬ）を１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）０．５ｍＬで中和させ、ｐＨを７〜８の範囲にし、試料中のＴｒｉｓの最終濃度を１００ｍＭまで上げた。
【００５４】
精製したＭＡｂ−１をＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０遠心フィルターで更に濃縮した。フィルターの容積は０．５ｍＬであったので、濃縮は２段階で実施した。試料を１０〜１５分間１０，０００ｇで遠心し、容量を約０．２５ｍＬ（４倍濃度）まで減らした。最終試料濃度は非標識ＭＡｂ−１が６．０７ｍｇ／ｍＬ、標識ＭＡｂ−１が５．６３ｍｇ／ｍＬであった。次に試料を−８０℃で凍結した。
【００５５】
ＳＩＴＲＳ実験用試料調製：
以下の手順に従って試料を調製した：
・非標識ＭＡｂ−１、ＭＡｂ−２（ＭＡｂ−１の二重点突然変異体）、ＨＥＫ由来ＭＡｂ−１及び標識ＭＡｂ−１の各試料をミリＱ水で４ｍｇ／ｍＬまで希釈した。
・ＭＡｂ−１（４ｍｇ／ｍＬ）をその二重点突然変異体ＭＡｂ−２（４ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ＭＡｂ−１を２０％、１０％、５％、２．５％、１．２５％及び０．６２５％のＭＡｂ−２突然変異体でスパイクした試料を得た。
・ＭＡｂ−１試料と突然変異体でスパイクしたＭＡｂ−１試料（２５μＬ，４ｍｇ／ｍＬ）を２５μＬの４ｍｇ／ｍＬ標識ＭＡｂ−１と混合した。
・ＭＡｂ−１（ＨＥＫ由来，２５μＬ，４ｍｇ／ｍＬ）を２５μＬの４ｍｇ／ｍＬ標識ＭＡｂ−１と混合した。
【００５６】
試料の変性、還元及びアルキル化
各ＳＩＴＲＳスパイク試料（２５μＬ）を８Ｍグアニジン−ＨＣｌ，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）７５μＬに加えた。試料を室温で１５分間インキュベーションした。
【００５７】
１Ｍ  ＤＴＴ  １μＬを各試料に加えた後、３７℃で３０分間インキュベーションすることにより還元を実施した。
【００５８】
０．５Ｍ  ＩＡＡ  ５μＬを加えた後、ホイルカバー下に３７℃で３０分間インキュベーションすることにより試料をアルキル化した。インキュベーション後、１Ｍ  ＤＴＴ  １．５μＬを各試料に加えることにより過剰のＩＡＡを不活性化した。
【００５９】
変性、還元及びアルキル化試料のＳＥＣ−ＨＰＬＣによるゲル濾過
以下の条件及び材料をＳＥＣ−ＨＰＬＣに使用した：
・カラム：Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  ＳＷ３０００ＸＬガードカラム，内径６．０ｍｍ×長さ４０ｍｍ，粒子径７μｍ
・移動相Ａ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５
・グラジエント：アイソクラチック
・流速：０．２５ｍＬ／分，一定
・オートサンプラー及びＦＣクーラー温度：４℃
・カラムオーブン温度：周囲温度
・波長：２８０ｎｍ
・合計試験時間：６分
・注入容量：１００μＬ（約１００μｇ）
・分画採取：時間基準で室温にて２〜３分に１分画を採取。
【００６０】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるゲル濾過
洗浄段階を挟んで各試料１００μＬをＳＥＣ−ＨＰＬＣに注入した。典型的なクロマトグラムを図８に示す。分画採取により精製試料２５０μＬを回収し、従って、精製中に試料損失が生じなかったと仮定すると、最終濃度は約０．４ｍｇ／ｍＬであった。
【００６１】
洗浄溶液（７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０中６Ｍ  Ｇｕａ−ＨＣＬ）１００μＬを注入することにより各試料試験間にカラム洗浄を実施した。流速を６分間０．４ｍＬ／分とし、分画を採取しなかった点を除き、カラム洗浄法は上記と同一とした。
【００６２】
トリプシン消化
０．２５ｍｇ／ｍＬトリプシン（１ｍＭ  ＨＣｌに再懸濁）８μＬをＳＥＣ−ＨＰＬＣ精製試料２００μＬ（８０μｇ）に加えた（酵素対試料重量比１：４０）。次に、混合物を３０分間３７℃でインキュベーションした。インキュベーション後に、１Ｍ  ＨＣｌ  ４μＬを最終濃度２０ｍＭまで加えることにより反応をクエンチした。試料２０μＬ（ないし約８μｇ）をＭＳ解析のためにＨＰＬＣにロードした。
【００６３】
トリプシン消化した抗体のＬＣ−ＭＳ解析
以下の条件及び材料をＬＣ−ＭＳに使用した：
・カラム：Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏ  ２００  Ｃ１８  ＲＰカラム（５μｍ，２００Å，１×２５０ｍｍ）
・移動相Ａ：０．０２％ＴＦＡ，０．０８％ギ酸水溶液
・移動相Ｂ：０．０２％ＴＦＡ，０．０８％ギ酸ＡＣＮ溶液
・グラジエント：バイナリ
・流速：５０μＬ／分，一定
・初期条件：２％Ｂ
・オートサンプラークーラー温度：４℃
・カラムオーブン温度：６０℃
・合計試験時間：１２０分
・注入容量：２０μＬ（試料８μｇ）
・バイナリグラジエントプログラム：
【００６４】
【表１】
2013528818.tif 000006
【００６５】
この方法では溶離液を先ず４分間廃棄した後に質量分析計に導入した。結果の定量を改善するために試験中にはＭＳ／ＭＳ情報を収集しなかった。
【００６６】
各ダブレットのピーク強度の定量を行い、抗体のほぼ全長配列に相当するペプチドの配列集合に対応させた。データを図１０、１１、１２及び１３に示すような「ＳＩＴＲＳ棒グラフ」として表した。
【００６７】
上記実施例から明らかなように、ＳＩＴＲＳを使用すると、ＭＳで生成されたデータを蛋白質試料の定性的及び定量的両者の比較に利用することが可能になる。
【００６８】
上記実施例では変性剤及び他の不純物を除去するために従来記載されているＳＥＣ−ＨＰＬＣによるゲル濾過を利用した。図８から明らかなように、溶離液をモニターした処、従来の脱塩法で得られるよりも高純度で低希釈度の抗体試料という最終結果が得られた。更に、グアニジン塩が試料からほぼ完全に除去されるため、トリプシン消化時間を著しく短縮することができ、従って、長時間のインキュベーションにより混入する可能性のある試料操作アーチファクトが最小限になった。
【００６９】
ＭＡｂ−１をＳＥＣ−ＨＰＬＣカラムに３回注入し、グアニジン及び他の汚染物質を除去した。試験段階を通して２８０ｎｍの吸光度をモニターした。図８の矢印は試料採取の開始と終了を示す。抗体はグアニジン及び他の汚染物質から分離した基線であった。
【００７０】
グアニジン及び他の汚染物質の除去後に等モル量のＳＩＴＲＳ標準の存在下でＭＡｂ−１試料を消化すると、適切なシグナル強度の予想ダブレットを特徴とするペプチドの質量スペクトルが得られた。図２は等モル比でＳＩＴＲＳ標準と混合したＭＡｂ−１のトリプシン消化産物に由来するピークの典型的な質量スペクトルを示す。８９９．９４１８の予想ｍ／ｚピーク（ＬＣのペプチド１２７−１４２に対応する［Ｍ＋２Ｈ］＋２ピーク）と非標識ペプチドの天然に存在する１３Ｃ含有ペプチドに由来するモノアイソトピックピークに加え、更にＳＩＴＲＳに由来する１組のピークが存在する。ＭＡｂ−１：ＳＩＴＲＳのピーク強度の予想される比は１である。全該当ピークのピーク高さを合計することにより得られた実測比は０．８１１である。クロマトグラムの軽鎖に由来する１１個のピークの比を計算すると、平均比は０．８２３±０．０１４となる。この数値は試験した全４２個のペプチドで一致し、標準偏差は２％である。理論に結び付けるものではないが、予想比１からのずれは初期蛋白質濃縮におけるピペッティングエラー等の系統的要因に起因する可能性が高いと考えられる。
【００７１】
図３は等モル比でＳＩＴＲＳ標準と混合したＭＡｂ−１のトリプシン消化産物に由来するピークの別の典型的な質量スペクトルを示す。１０７０．５０８５の予想ｍ／ｚ（重鎖のペプチド２５５−２７３の［Ｍ＋２Ｈ］２＋）と非標識ペプチドの天然に存在する１３Ｃ含有ペプチドに由来するモノアイソトピックピークに加え、更にＳＩＴＲＳに由来する１組のピークが存在する（１０７３．５１８４（［Ｍ＋２Ｈ］２＋）のｍ／ｚと天然に存在する１３Ｃ含有ペプチドに由来するモノアイソトピックピーク）。（試料を１：１比で混合し、この特定ペプチドの修飾が生じなかったならば）ＭＡｂ−１：ＳＩＴＲＳのピーク強度の予想比は１である。全該当ピークのピーク高さを合計することにより得られた実測比は１．０７である（図４）。２０％突然変異体スパイクＭＡｂ−１における同一ペプチドＨＣ（２５５−２７３）でも同一比が得られた。この数値は試験したペプチドの大半で一致した。一方、ペプチドＨＣ（２１８−２４７）を試験した処（ｍ／ｚ８３５．１５）、２０％突然変異体スパイクＭＡｂ−１における非標識ペプチドに対応するピーク強度の相対量はＳＩＴＲＳ標準における同一配列の標識ペプチドに対して低下した（図５）。ピーク強度比の見掛けの変化を定量し、図６に示した。野生型ＭＡｂ試料（０％突然変異体）における全該当ピークのピーク高さを合計することにより得られた実測比は１．１１であり、２０％突然変異体スパイクＭＡｂ−１の同一測定値は０．８７である。２０％突然変異体スパイクＭＡｂ−１に由来する非標識ペプチドＨＣ（２１８−２４７）の相対強度のこの低下はＭＡｂ−１の突然変異体（ＭＡｂ−２試料）において修飾されたこのペプチドに一致する。
【００７２】
上記ＳＩＴＲＳ実験から得られる定量的データに加え、試料に関する定性的情報も得ることができる。図７はダブレットを含まない１組のモノアイソトピックピークを示す。このピークは野生型ＭＡｂ−１には存在しないＭＡｂ−２（ＭＡｂ−１の二重点突然変異体）に由来するペプチドＨＣ（２１８−２４７）に対応する。
【００７３】
［実施例２］
ＳＩＴＲＳ標準に由来するｍ／ｚピークの存在は所与ペプチドの存在量の差の定量を可能にする。本実施例はＭＡｂ−１以外の抗体（例えばＭＡｂ−１の配列と完全には一致しないアミノ酸配列をもつＭＡｂ−２抗体）によるＭＡｂ−１の試料の汚染レベルの定量について詳述する。
【００７４】
１実験では、ＭＡｂ−１の試料をＭＡｂ−２で最終濃度１０％までスパイクした（９０％ＭＡｂ−１＋１０％ＭＡｂ−２）。この実験は偶発的に発生するか又は製造中の自然な生物学的プロセスにより発生する可能性のある有望なシナリオとして、点突然変異をもつ抗体を種々の量で含有する試料をシミュレートすることを目的とした。トリプシン消化により得られる大半のペプチドは相同度が高いため、２個の抗体間で共通であり、ＳＴＩＲＳ値（ＳＶ）が１００％になると予想された。６種類のこのようなペプチドを試験に選択した。しかし、１アミノ酸以上が相違するものは少なく、ＳＶは９０％であると予想された。図９は１種のこのような「突然変異体」ペプチドに由来する２種類の質量スペクトルを示す。第１のスペクトルはＳＩＴＲＳと混合した非標識抗体標準（汚染性ＭＡｂ−２を添加しなかった）に由来し（図９Ａ）、第２のスペクトルはＳＩＴＲＳと混合した１０％ＭＡｂ−２を含有する非標識汚染試料に由来する（図９Ｂ）。この突然変異をもつペプチドで観測されたＳＶは約９３．３％である。より大まかに言うと、ＭＡｂ−１とＭＡｂ−２で相違するペプチドは平均ＳＶが９３％であるが、共通するペプチドは約１００％の予測値であった（図１０）。ずれについては考慮しなかったが、理論に結び付けるものではないが、ピペッティングエラー又は濃縮により説明できる。従って、総蛋白質の１０％のレベルの分子中の点突然変異を同定するためにＳＩＴＲＳ法を使用するのに成功した。
【００７５】
図１１及び表１はＣＨＯ細胞株と２９３細胞株に由来する材料を使用したＳＩＴＲＳ実験からのデータを示す。２９３に由来する材料はＣＨＯに由来するＭＡｂ−１よりも重鎖における非グリコシル糖鎖（ＮＧＡ２Ｆ）グリコシル化が２０％低い。更に、２個のバッチは重鎖上のＣ末端リジンの量とＮ末端ピログルタミン酸形成量も相違する。これらの修飾を含むペプチドはＳＶのその劇的な相違によりＳＩＴＲＳ実験で容易に識別できた（図１１に星印を付けた柱）。更に、存在量のレベルに差がないと予測されたペプチド（即ち全共通ペプチド）はそのＳＩＴＲＳ比が同等であり、非修飾ペプチドの平均標準偏差は１．４％であった（０．２２〜６．３１％の範囲）。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
従って、以上から明らかなように、所与蛋白質のバッチ間の相違を定量するために安定同位体標識蛋白質を内部参照標準として使用する新規方法が考案された。リジンとアルギニンを欠失する化学的に規定された培地に標識アミノ酸を添加し、細胞培養でＭＡｂ−１を産生させることによりリジン−６とアルギニン−６をＭＡｂ−１に均一に組込むことができた。質量分析法により非標識ＭＡｂ−１をそのＳＩＴＲＳ標準対照物に比較すると、この方法により生成されたデータは２％の標準偏差で一致することが実証された。ＨＥＫ２９３細胞株により産生させたＭＡｂ−１にこの方法を適用すると、Ｎ末端ピログルタミン酸、Ｃ末端リジン及びＮＧＡ２Ｆレベル等の修飾レベルが相違するペプチドが正確に同定された。更に、約１０％のレベルでＭＡｂ−２とＭＡｂ−１が１アミノ酸相違するペプチドを同定するためにこの方法を使用するのに成功した。
【００７８】
［実施例３］
別の実験で、２カ所の点突然変異を含む突然変異体ＭＡｂ−１（ＭＡｂ−２）でＭＡｂ−１の試料をスパイクした。具体的には、一方の突然変異はペプチドＨＣ（２１８−２４７）に位置し、他方はＨＣ（３４４−３４９）に位置する。突然変異体を２０％（９０％ＭＡｂ−１＋２０％突然変異体ＭＡｂ−１，図１２）から２％（９８％ＭＡｂ−１，２％突然変異体ＭＡｂ−１，図１３）の最終濃度となるように加えた。図１２及び１３に示すように、野生型及び突然変異体ＭＡｂ−１の両方に共通するペプチドは予測値が約１００％である。２種類の突然変異体ペプチドは予測値が約８０％（図１２）又は９８％（図１３）である。糖ペプチドＨＣ（Ｇ０Ｆ−２８８−３００）とＨＣ（４３９−４４６）も２試料間で相違する。２試料における糖ペプチドとＣ末端ペプチドは夫々そのオリゴ糖組成とＣ末端リジン含量が相違することが分かっていたので、これは予想通りであった。図１４は野生型ＭＡｂに種々の量の突然変異体ＭＡｂ−１をスパイクし、ＳＩＴＲＳにより測定した場合の野生型ペプチドＨＣ（２１８−２４７）、ＨＣ（３４４−３４９）及びＨＣ（Ｇ０Ｆ−２８８−３００）のレベルの百分率の差を示す。この方法は突然変異体の存在量に線形応答し、方法検出限界は２．４％である。
【００７９】
［実施例４］
ＳＩＴＲＳ法が試料を区別する能力を更に試験するために、ＨＥＫ細胞株でｍＡｂ−１を産生させることにより製造方法の変更をシミュレートした。ＣＨＯとＨＥＫに由来するｍＡｂのＳＩＴＲＳ解析を夫々図１５Ａ及び図１５Ｂに示す。この解析から３種類のペプチドが即座に着目される。先ず、Ｎ末端ピログルタミン酸残基をもつＨＣ（１−３９）はＨＥＫ試料のほうが７．１％多い。この結果と一致し、Ｎ末端非環化グルタミン残基をもつＨＣ（１−３９）はＣＨＯに由来するｍＡｂのほうが７４％多い。第２の相違位置はＣ末端重鎖ペプチドＨＣ（４３９−４４６）である。これはｍＡｂにおける共通の翻訳後イベントであるＬｙｓ４４６の蛋白質分解プロセシングの僅かな相違が原因であった。第３の顕著な相違は各種糖ペプチドの相対存在量である。
【００８０】
これらの相違を検証するために、ＭＡｂをＰＮＧａｓｅ  Ｆで脱グリコシル化し、２−アミノ安息香酸で標識後にＨＰＬＣによりオリゴ糖を定量した。ＳＩＴＲＳ法と酵素消化により測定したオリゴ糖含量の相違を図１６にまとめる。Ａｇｉｌｅｎｔ製品であるＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｃｏｎｆｉｒｍソフトウェアパッケージを使用して脱電荷脱同位体ピークの強度の比較によりＳＩＴＲＳ解析法とラベルフリーＭＳ解析法で測定したＮ末端グルタミン変換レベルとＣ末端リジン除去レベルの比較も図１６に示す。これらの２種類の異なる方法の結果は特に存在量の多いペプチドでかなりよく一致する。
【００８１】
他方、同一製造方法によりＣＨＯ細胞で産生させたｍＡｂの２個のバッチは非常によく似ていることが分かった（図１５Ａ）。ペプチドＨＣ（１−３９）におけるＮ末端ピログルタミン酸の量は３％未満の差しか観測されなかった。同様に、ＨＣ（３９２−４４５）における相対差も僅か３．３％であった。ＨＥＫ細胞で産生させたバッチとは異なり、ＣＨＯに由来する２個のバッチはグリコシル化パターンも同等であり、この結果はオリゴ糖プロファイリングにより裏付けられる。
【００８２】
［実施例５］
抗体に及ぼすストレスの影響を評価するためにＳＩＴＲＳ法を使用するのにも成功した。２種類の異なる緩衝液中で６カ月間又は１２カ月間４℃で保存したｍＡｂに由来するペプチドを比較すると、２個の試料間の差はごく僅かであると思われた（図１７）。しかし、これらの僅かな差は定量可能であった。例えば、ＨＣ（１−３９）におけるピログルタミン酸の量は１２カ月試料では６．２％増加した。この結果はＮ末端Ｇｌｎを含有するＨＣ（１−３９）が６カ月試料の２６．８％まで低下することに相関した。更に、ＨＣ（３７０−３９１）は４．７％低下した。１２カ月試料では脱アミド化ペプチドが２３１％も多いので、この低下は脱アミド化の亢進に起因すると考えられた。部分消化ペプチドＨＣ（６０−７２）（図１７）は１２カ月試料では６カ月試料で観測された存在量よりも９１１％高い存在量で観測された。この結果はＨＣ（６０−６５）、ＨＣ（６６−７２）及びＨＣ（６８−７２）の同時低下に相関した。
【００８３】
［実施例６］
低分子、薬物又は造影剤と蛋白質のバイオコンジュゲーション実験をモニターするためにもＳＩＴＲＳ法を使用した。例えば、図１８は金属キレート造影剤であるＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡを抗体のリジン残基にコンジュゲートしたＳＩＴＲＳ実験からのデータを示す。原理的には、ｍＡｂには９２カ所の可能な反応部位が存在する。しかし、ＳＩＴＲＳ実験によると、＞２０％の程度まで反応するのは３部位（矢印で示したペプチド）に過ぎないことが分かる。これらの反応部位は隣接するＣ末端ペプチドもその相対存在量が修飾されたＮ末端ペプチドとほぼ等量だけ減少するという事実により確認される。この現象はＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡとのコンジュゲーションによりトリプシン開裂部位が失われるという事実に起因する。
【００８４】
限定されないが、全研究論文、刊行物、特許、特許出願、口頭発表、教科書、報告、原稿、パンフレット、成書、インターネット投稿、雑誌論文及び／又は定期刊行物を含め、本明細書に引用する全文献はその開示内容全体を本明細書に援用する。文献に関する本願の記載はその著者により行われた主張を要約することのみを目的とし、如何なる文献も従来技術を構成すると認めるものではない。出願人は引用文献の正確さと妥当性に異議を申し立てる権利を留保する。
【００８５】
当業者は以下の特許請求の範囲により詳細に記載する本発明の趣旨と範囲から離れずに本発明のこれら及び他の変更及び変形を実施することができる。更に、当然のことながら、各種態様の各種側面は全面的又は部分的に相互に交換可能である。更に、当業者に自明の通り、以上の記載は例示の目的に過ぎず、以下の特許請求の範囲に更に記載するように本発明を限定する意図はない。従って、以下の特許請求の範囲の趣旨と範囲は特許請求の範囲に含まれる具体的な記載に限定すべきでない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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