(57)【要約】  支持体に固定化された少なくとも１つのメガリンポリペプチドおよび／または少なくとも１つのキュビリンポリペプチドを含む分離媒体を提供する。さらに分離媒体を含む装置と、複雑な生物学的液体から低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を体外に除去するために分離媒体を利用する方法および使用とを提供する。【選択図】図５
2013532031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体に固定化された
ａ．少なくとも１つのメガリンポリペプチド、および
ｂ．少なくとも１つのキュビリンポリペプチド、
を含む分離媒体。
【請求項２】
支持体に固定化された少なくとも１つのメガリンポリペプチドを含む分離媒体。
【請求項３】
支持体に固定化された少なくとも１つのキュビリンポリペプチドを含む分離媒体。
【請求項４】
請求項１乃至２のいずれか１項に記載の分離媒体において、前記メガリンポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２と、それらと少なくとも８０％、たとえば少なくとも８５％、たとえば少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列とからなる群から選択されることを特徴とする分離媒体。
【請求項５】
請求項１、３および４のいずれか１項に記載の分離媒体において、前記キュビリンポリペプチドは、存在する場合、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０と、それらと少なくとも８０％、たとえば少なくとも８５％、たとえば少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列とからなる群から選択されることを特徴とする分離媒体。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の分離媒体を含む、複雑な生物学的液体を体外処理するための医療装置。
【請求項７】
請求項６に記載の医療装置において、前記複雑な生物学的液体は血液であることを特徴とする医療装置。
【請求項８】
請求項６乃至７のいずれか１項に記載の医療装置において、前記複雑な生物学的液体は低分子量タンパク質を含むことを特徴とする医療装置。
【請求項９】
請求項８に記載の医療装置において、前記低分子量タンパク質はペプチドホルモン、酵素、免疫グロブリン軽鎖、ミオグロブリンおよびビタミン結合タンパク質からなる群から選択されることを特徴とする医療装置。
【請求項１０】
請求項６乃至９のいずれか１項に記載の医療装置において、前記装置はサイズフィルターを含むことを特徴とする医療装置。
【請求項１１】
請求項６乃至１０のいずれか１項に記載の医療装置において、前記装置は電荷フィルターを含むことを特徴とする医療装置。
【請求項１２】
請求項６乃至１１のいずれか１項に記載の医療装置を含む、複雑な生物学的液体を体外処理するための透析装置。
【請求項１３】
複雑な生物学的液体から低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を体外に除去する方法において、
ａ）メガリンおよび／またはキュビリンに対して結合親和性を有する、低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む複雑な生物学的液体のサンプルを用意するステップと、
ｂ）前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体が前記少なくとも１つのメガリンポリペプチドおよび／または前記少なくとも１つのキュビリンポリペプチドに結合できる条件下で、前記サンプルを請求項１乃至５のいずれか１項に記載の分離媒体、または請求項６乃至１２のいずれか１項に記載の装置と接触させるステップと、
ｃ）前記支持体から前記サンプルを分離して、前記サンプル中に最初に存在していた前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体の総量の少なくとも一部が前記支持体上に保持されるようにするステップと、
ｄ）量が減少した前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む前記サンプルを回収するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記サンプルにサイズ分離濾過ステップが施されることをさらに含み、それによりステップｂ）を実施する前に高分子量成分が前記サンプルから除去されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３乃至１４のいずれか１項に記載の方法において、前記サンプルに電荷濾過ステップが施されることをさらに含み、それによりステップｂ）を実施する前にｐＩが８以下の成分が前記サンプルから除去されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載の方法において、前記保持された低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体が溶出されるステップｅ）をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体により引き起こされた、または悪化した状態に罹患している哺乳動物の被検体を処置するための方法において
ａ）前記被検体から血液を抽出するステップと、
ｂ）請求項１３乃至１６のいずれか１項に記載の方法を用いて、前記抽出された血液から低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を除去して、前記血液中に最初に存在していた前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体の総量の少なくとも一部が前記支持体上に保持されるようにするステップと、
ｃ）量が減少した前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む前記血液を前記被検体に再導入するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
血液透析、血液濾過および／または血液透析濾過のための、請求項６乃至１２のいずれか１項に記載の医療または透析装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、支持体に固定化されたポリペプチドを含む分離媒体に関する。本発明はさらに、そうした分離媒体を含む医療装置、およびそうした医療装置を含む透析装置、ならびにそうした装置の、たとえば血液透析、血液濾過および／または血液透析濾過のための使用に関する。さらに、本発明は、複雑な生物学的液体から低分子量タンパク質を体外に除去する方法、および患者の血液から低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を除去することにより処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は、哺乳動物の血液中の望ましくないポリペプチドのクリアランスに最も重要な臓器であり（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＢＭ（２００３）Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＆  Ｒｅｃｔｏｒ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｋｉｄｎｅｙ（７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ））、腎機能が失われると、ポリペプチドの顕著な蓄積が起こる（Ｎａｓｅｅｂ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｂｌｏｏｄ  Ｐｕｒｉｆ．２６（６）：５６１−８）。腎臓の機能障害は、急性腎不全（数時間または数日間にわたる腎機能の低下を特徴とし、腎臓が窒素老廃物の排泄と、体液および電解質のホメオスタシスの維持とができなくなる）、および慢性腎疾患（ＣＫＤ）（程度の差はあるが、上記の機能の持続的な喪失を示す）に分けられる（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＢＭ（２００３），上掲）。急性腎不全は主に腎臓の濾過装置への血液供給の減少により起こり、血液量減少性ショックの患者に最も多く見られる（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＢＭ（２００３），上掲）のに対し、ＣＫＤには複数の原因があり、現在伝染病のように多発しており、欧米集団の１０〜１２％がＣＫＤの徴候を示す（Ｗｅｎ  ＣＰ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｌａｎｃｅｔ  ３７１（９６３１）：２１７３−８２）。ＣＫＤを引き起こす基礎疾患には幅があり、定量的に最も重要なのは糖尿病による糖尿病性ニューロパチー、高血圧による腎硬化症、および糸球体腎炎である（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＢＭ（２００３），上掲）。ＣＫＤ腎機能障害の表現型は、初期には異なるものの、後期には各病因の間で著しく類似しており、遅かれ早かれ糸球体濾過量の劇的な減少が起こり、生存のため定期的な透析または腎移植が必要となる。腎代替療法の進歩にもかかわらず、急性腎傷害または慢性腎疾患の患者はどちらも、尿細管クリアランスの低下に由来し（Ｍｏｅｓｔｒｕｐ  ＳＫ  ｅｔ  ａｌ（１９９５），Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．９６（３）：１４０４−１３；Ｖｉｎｇｅ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ（２０１０），Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，ａｄｖａｎｃｅ  ｅ−ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎｄｔ／ｇｆｑ０４４）、生活の質および生存に関連すると考えられる循環血中のポリペプチドの増加に悩まされる（Ｎａｓｅｅｂ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ（２００８），上掲）。この症状は、現在の治療法により対処されない。
【０００３】
低または中分子量の多くのポリペプチドのほか、高分子量のポリペプチドの一部は腎糸球体で濾過され、尿細管に入る。そこで、尿細管細胞の管腔表面のスカベンジャー受容体と結合し、エンドサイトーシスにより取り込まれる（Ｍｏｅｓｔｒｕｐ  ＳＫ  ｅｔ  ａｌ（１９９５），上掲）。その後これらのポリペプチドはトランスサイトーシスにより循環血液に戻るか、または管周囲細胞で分解され、新鮮なタンパク質合成のためアミノ酸として再利用される（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＥＩ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３（４）：２５６−６６；Ｒｕｓｓｏ  ＬＭ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，７１（６）：５０５−１３）。このため、これらの管周囲受容体は、正常な身体機能に必須なタンパク質およびポリペプチドの過剰な尿中排泄に対する生理的防御に不可欠である。
【０００４】
尿細管には、マルチリガンドなエンドサイトーシス受容体メガリンおよびキュビリンが共存する。どちらの受容体も、アルブミン尿におけるなど、糸球体で濾過されたタンパク質の尿細管の正常な再吸収にとって重要である（Ｒｕｓｓｏ  ＬＭ  ｅｔ  ａｌ（２００７），上掲；Ｖｉｎｇｅ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ（２０１０），上掲）。
【０００５】
腎機能障害に対する現在の処置法の選択肢は、特異的なバインダー（たとえばカリウム結合剤およびリン酸塩結合剤）による小分子、主に水および塩のホメオスタシス、または透析（たとえば血液透析および腹膜透析）によるそれらの非特異的除去に力点が置かれている。腹膜透析は、腹膜をフィルターとして利用する。血液透析のほか、血液濾過および血液透析濾過は、体外回路と、合成フィルター、通常プラスチックフィルターとを利用する。非特異的な腎機能の喪失を処置する現在の方法はすべて、不要、かつ有害になる可能性がある分子を除去する分子サイズフィルターによる。さらに、特定の状況において標的化合物を除去する、いくつかのより特異的な方法も存在する。そうしたものとして、移植の前に白血球を除去するように設計されたプロテインＡカラム（Ｗｅｉｓｓ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（２）：８７−９６）、免疫グロブリン軽鎖に対する抗体でコーティングし、骨髄腫患者のそうした軽鎖を除去するためのカラム（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ＣＡ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１８（３）：８８６−９５）、および炎症状態でヘパリン結合性サイトカインを除去する半特異的ヘパリンコーティング装置が挙げられる（Ａｘｅｌｓｓｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）ＡＳＡＩＯ  Ｊ．５６（１）：４８−５１）。
【０００６】
米国特許出願公開第２００４／０２３５１６１号明細書は、表面にメガリンが発現した細胞を含むスポンジシートを有する体内人工腎臓の使用に着目している。腎尿細管細胞はすべて血液の浄化に利用される。
【０００７】
国際公開第２００３／１０２５９３号パンフレットは、外部から投与されたポリペプチドから保護するためのメガリンの使用に着目している。
【０００８】
透析処置中に有毒タンパク質、生理的タンパク質および異常ポリペプチドを複雑な生物学的液体、たとえば血液から特異的に除去する血液精製法が求められている。
【発明の概要】
【０００９】
本開示の目的は、従来技術に伴う問題の少なくとも一部を軽減することである。
【００１０】
特に、本開示の目的は、低分子量タンパク質および／またはそのフラグメントもしくは誘導体を体液から除去できる分離媒体を提供することである。
【００１１】
さらに本開示の目的は、低分子量タンパク質および／またはそのフラグメントもしくは誘導体を複雑な生物学的液体から選択的に除去できる医療装置を提供することである。
【００１２】
本開示のもう１つの目的は、複雑な生物学的液体の組成を回復できる医療装置を提供することである。
【００１３】
本開示のさらに別の目的は、低分子量タンパク質および／またはそのフラグメントもしくは誘導体を複雑な生物学的液体から体外に除去する方法を提供することである。
【００１４】
上記の目的、および本開示と共に提示されたとき、当業者に明らかになる他の目的は各々、本発明の様々な態様の少なくとも１つにより対応される。
【００１５】
本発明は、その第１の態様では、支持体に固定化されたａ）少なくとも１つのメガリンポリペプチド、および／またはｂ）少なくとも１つのキュビリンポリペプチドを含む分離媒体を提供する。
【００１６】
本発明の文脈では、「分離媒体」という用語は、分離用媒体、たとえばカラムまたはフィルターをいう。
【００１７】
本開示を通して、「メガリンポリペプチド」という用語は、メガリン受容体、またはメガリン受容体の少なくとも１つの機能を保持するその変異体、ドメイン、フラグメントもしくは誘導体をいう。たとえば、少なくとも１つの機能は、少なくとも１つのリガンドに対する結合機能であってもよい。メガリン受容体は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）と構造上の類似性を有する受容体ファミリーのメンバーであり、「低密度リポタンパク質関連タンパク質２」（ＬＲＰ２）とも呼ばれる（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＥＩ  ｅｔ  ａｌ（２００２），上掲；Ｃｕｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ａｍ  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９８（２）：３３５−３４５）。メガリン受容体は、多くの吸収上皮細胞の形質膜に見られるマルチリガンド結合受容体である。このタンパク質は、リガンドのエンドサイトーシスを仲介してリソソームにおける分解またはトランスサイトーシスを誘導する働きをする。このタンパク質は、ヒトでは、ＬＲＰ２遺伝子がコードする。ヒトメガリン受容体のアミノ酸配列の非限定的な例については、添付の配列表に配列番号１として開示されている。以下の実施例の項に例示されるように、メガリン受容体の様々なフラグメントは、メガリン受容体の少なくとも１つの機能を保持しており、それ自体で、あるいは、そうしたフラグメントを相互に任意に組み合わせると、全長受容体と任意に組み合わせると、または他のフラグメントと任意に組み合わせると本発明の様々な態様に有用である場合がある。本明細書でこうしたフラグメントまたはドメインの例は、ＭＥＧ１（配列番号２）、ＭＥＧ２（配列番号３）、ＭＥＧ３（配列番号４）、ＭＥＧ４（配列番号５）、ＭＥＧ５（配列番号６）、ＭＥＧ６（配列番号７）、ＭＥＧ７（配列番号８）、ＭＥＧ８（配列番号９）、ＭＥＧ９（配列番号１０）、ＭＥＧ１０（配列番号１１）およびＭＥＧ５−８（配列番号１２）と呼ぶ。ただし、「メガリンポリペプチド」は、メガリン受容体の機能の少なくとも１つを果たす類似のタンパク質、フラグメント、ドメインまたは誘導体をいうこともある。そうしたポリペプチドのアミノ酸配列は、たとえば１つまたは複数の保存的置換変異により、本明細書に具体的に開示されたアミノ酸配列に関連するものでもよい。この場合、開示された配列のアミノ酸残基が、物理化学的特性を共有する同じグループのアミノ酸残基の別のアミノ酸残基に置き換わっている。こうしたグループは、タンパク質工学の当業者によく知られている。言い換えれば、「メガリンポリペプチド」は、具体的に開示されたメガリンポリペプチド配列に少なくとも８０％、たとえば少なくとも８５％、たとえば少なくとも９０％、またはたとえば少なくとも９５％の程度の類似性または同一性で似ていればよい。
【００１８】
同様に、本発明の文脈では、「キュビリンポリペプチド」という用語は、キュビリン受容体の少なくとも１つの機能を保持するキュビリン受容体またはそのフラグメントをいう。たとえば、少なくとも１つの機能は、少なくとも１つのリガンドに対する結合機能であってもよい。キュビリン（キュブリン、腸内因子受容体、内因子−ビタミンＢ１２受容体および４６０ｋＤａ受容体とも呼ばれる）はインビボで、腸および腎臓の上皮内に位置する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＥＩ  ｅｔ  ａｌ（２００２），上掲；Ｋｏｚｙｒａｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９１（１０）：３５９３−３６００；米国特許第６５８６３８９号明細書）。このタンパク質は、ヒトでは、ＣＵＢＮ遺伝子がコードする。ヒトキュビリン受容体のアミノ酸配列の非限定的な例については、配列表に配列番号１３として開示されている。以下の実施例の項に例示するように、キュビリン受容体の様々なフラグメントは、キュビリン受容体の少なくとも１つの機能を保持しており、それ自体で、あるいはそうしたフラグメントを相互に任意に組み合わせると、全長受容体と任意に組み合わせると、または他のフラグメントと任意に組み合わせると本発明の様々な態様に有用である場合がある。本明細書でこうしたフラグメントまたはドメインの例は、ＣＵＢＥＧＦ（配列番号１４）、ＣＵＢ１−７（配列番号１５）、ＣＵＢ５−８（配列番号１６）、ＣＵＢ６−１２（配列番号１７）、ＣＵＢ１１−１７（配列番号１８）、ＣＵＢ１６−２２（配列番号１９）およびＣＵＢ２１−２７（配列番号２０）と呼ぶ。ただし、「キュビリンポリペプチド」は、キュビリン受容体の少なくとも１つの機能を果たす類似のタンパク質、フラグメント、ドメインまたは誘導体をいうこともある。そうしたポリペプチドのアミノ酸配列は、たとえば１つまたは複数の保存的置換変異により、本明細書に具体的に開示されたアミノ酸配列に関連するものでもよい。この場合、開示された配列のアミノ酸残基が、物理化学的特性を共有する同じグループのアミノ酸残基の別のアミノ酸残基に置き換わっている。こうしたグループは、タンパク質工学の当業者によく知られている。言い換えれば、「キュビリンポリペプチド」は、具体的に開示されたキュビリンポリペプチド配列に少なくとも８０％、たとえば少なくとも８５％、たとえば少なくとも９０％、またはたとえば少なくとも９５％の程度の類似性または同一性で似ていればよい。
【００１９】
本出願に開示される分離媒体では、同一でも異なっていてもよい１つまたは複数のメガリンポリペプチド、および／または同一でも異なっていてもよい１つまたは複数のキュビリンポリペプチドを使用してもよい。
【００２０】
本発明の文脈では、「支持体」という用語は、少なくとも１つのメガリンポリペプチドおよび／または少なくとも１つのキュビリンポリペプチドが固定化された表面をいう。たとえば、支持体は、ビーズまたは膜からなっていてもよい。存在する場合、ビーズをカラム内に使用してもよく、膜をフィルター内に使用してもよい。メガリンおよび／またはキュビリンポリペプチドが固定化されたカラムまたはフィルターを使用して、タンパク質、たとえば低分子量タンパク質および／またはそのフラグメントもしくは誘導体を分離してもよい。
【００２１】
また、本発明の文脈では、当業者であれば容易に理解されるように、「支持体に固定化された」という用語は、ある種が、やはり同じ支持体に固定化される他の種とは別にその支持体に意図的に固定化されていることを意味する。メガリンおよびキュビリンポリペプチドの両方が存在する本発明の実施形態では、これらのポリペプチドが「支持体に固定化された」ということは、支持体に各ポリペプチド種が別々に固定化されたことを意味する。固定化は、よく知られたアフィニティー系を使用するなど間接的なものであってもよい。例として、それぞれのポリペプチドのＨｉｓ−ｔａｇとＮｉ−ＮＴＡ基などのキレート部分を設けた支持体と（またはその逆）の相互作用、またはそれぞれのポリペプチドのビオチン基とストレプトアビジン基を設けた支持体と（またはその逆）の相互作用が挙げられる。固定化はまた、直接的なものであってもよい、すなわちポリペプチドを支持体に共有結合してもよい。これらおよび他の方法と各当該ポリペプチドの固定化の手段との任意の組み合わせを意図しており、当業者はこれを過度の負担なく実施することができる。
【００２２】
少なくとも１つのメガリンポリペプチドおよび／または少なくとも１つのキュビリンポリペプチドを含む分離媒体の利点は、本媒体が、メガリン、キュビリンもしくはその両方、場合によっては、および／またはそれらのフラグメントもしくは誘導体に結合できるタンパク質の結合を可能にすることである。メガリンおよび／またはキュビリンとの相互作用を利用することにより、これらのタンパク質の少なくとも一部を体液から除去することができる。たとえば、そうした分離媒体は、たとえば患者の血液の透析を目的として医療装置に利用しても、または透析装置に利用してもよい。この用途では、低分子量のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントもしくは誘導体の血液中の量が減少する可能性があり、血液中の低分子量分子の元の組成が回復し得る。各タンパク質の組成が回復した血液は、腎臓を通過した血液に似ており、腎臓により通常血液中に維持されるタンパク質の組成を有する。
【００２３】
媒体がメガリンポリペプチドおよびキュビリンポリペプチドの両方を含む分離媒体のいくつかの実施形態では、メガリンポリペプチドとキュビリンポリペプチドとのモル比は、１：１００〜１００：１の範囲、たとえば１：５０〜５０：１の範囲、たとえば１：１０〜１０：１の範囲、たとえば１：５〜５：１の範囲、たとえば１：２〜２：１の範囲、または、たとえば１：１の範囲であってもよい。本開示の文脈では、モル比は、キュビリンポリペプチドのモル濃度に対するメガリンポリペプチドのモル濃度の比率である。本発明者は、メガリンポリペプチドとキュビリンポリペプチドとの１０：１という特定のモル比から、本分離媒体により多くの低分子量タンパク質が捕捉され、複雑な生物学的液体から除去されるという良好な結果が示されることを見出した。しかしながら、他のモル比でもうまくいく。本明細書の教示内容を踏まえ、上記の比率をガイドラインとして用いれば、当業者は、本発明による分離媒体のこうした実施形態でメガリンポリペプチドとキュビリンポリペプチドとのモル比を最適化するのに必要な実験を行うことができる。
【００２４】
誤解を避けるため、本発明の態様はまた、場合によっては低分子量タンパク質および／またはそのフラグメントもしくは誘導体を捕捉するのに満足のいく作用を有することがある、固定化したメガリンポリペプチドのみを含む（すなわちキュビリンポリペプチドを含まない）、または固定化したキュビリンポリペプチドのみを含む（すなわちメガリンポリペプチドを含まない）分離媒体も提供する。たとえば、下記実施例１１に記載されているように、固定化したメガリンポリペプチド（ＭＥＧ５−８）を含む分離媒体は、複雑な生物学的液体のインスリンに結合する。さらに、下記実施例１２および１３に記載されているように、固定化した全長メガリンを含む分離媒体を用いて、部分腎摘出ラットの血液の処理に成功し得る。これらの例では、メガリンポリペプチドは、少なくとも１つの低分子量タンパク質の除去に有用な分離媒体を得るのに十分である。しかしながら、他の状況では、満足のいく結果を得るために少なくとも１つのメガリンポリペプチドと少なくとも１つのキュビリンポリペプチドとの組み合わせが必要となる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、固定化したメガリンの表面密度は、１〜１０００００メガリンポリペプチド分子／μｍ２、たとえば１００〜５００００分子／μｍ２、たとえば１０００〜２００００分子／μｍ２、または、たとえば３０００〜１００００分子／μｍ２であってもよい。
【００２６】
いくつかの実施形態では、固定化したキュビリンの表面密度は、１〜１０００００キュビリンポリペプチド分子／μｍ２、たとえば１００〜５００００分子／μｍ２、たとえば１０００〜２００００分子／μｍ２、または、たとえば３０００〜１００００分子／μｍ２であってもよい。
【００２７】
メガリンポリペプチドは、組換えにより製造しても、または化学合成により製造してもよい。同様に、キュビリンポリペプチドも組換えにより製造しても、または化学合成により製造してもよい。
【００２８】
いくつかの実施形態では、支持体の材料は、ガラス、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、架橋デキストラン、架橋アガロース、寒天ゲル支持体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリウレタン、シリコーンおよびアミラーゼコーティング粒子からなる群から選択されてもよい。たとえば、ポリスチレンは、アニロスルホン酸ポリスチレンおよびトリエタノールアミンメチルポリスチレンから選択されてもよい。一例では、支持体は、架橋デキストラン、たとえばＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）からなる。支持体の他の例には、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）がある。当業者であれば、本明細書に示したガイドラインを踏まえて試行錯誤により支持体を選択することができることを理解する。安価で製造および取扱いが容易な支持体は都合がよく、支持体材料からの物質の漏出を最小限に維持する支持体も同様である。さらに、支持体は滅菌してもよい。
【００２９】
支持体は、様々な形態をとってもよい。たとえば、支持体は、微小粒子またはナノ粒子などのビーズまたは粒子を含んでもよい。他の例では、支持体は、１つまたは複数の中空繊維を含んでもよい。支持体は、カラム、たとえば多孔性カラムであってもよい。さらに、支持体はフィルターであってもよい。
【００３０】
少なくとも１つのメガリンポリペプチドおよび／または少なくとも１つのキュビリンポリペプチドは、支持体に共有結合していてもよい。共有結合は、共有結合によるポリマーグラフト、プラズマ処理、物理吸着、化学吸着および化学誘導体化からなる群から選択されてもよい。他の例では、少なくとも１つのポリペプチドをＣｎＢｒカップリングにより支持体に結合してもよい。なお他の例では、ビオチン−アビジンまたはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）カップリングを使用してもよい。
【００３１】
本発明は、その別の態様では、上記のような分離媒体を含む、複雑な生物学的液体の体外処理のための医療装置を提供する。
【００３２】
上記および本発明の他の態様の文脈では、「複雑な生物学的液体」という用語は、たとえば様々な溶質、懸濁された天然または製造されたポリペプチドおよび細胞を含む水性体液をいう。たとえば、複雑な生物学的液体は、タンパク質、塩および他の分子、たとえば細胞を含んでもよい。いくつかの例では、複雑な生物学的液体は血液、たとえば哺乳動物血液、たとえばヒト血液である。他の例では、複雑な生物学的液体は血漿、血清または尿である。本開示の文脈では、血漿は、通常全血中の血液細胞が浮遊している血液の黄色の液体成分である。血漿は血管内液であり、細胞外液の一部である。血漿は大部分が水であり、溶解したタンパク質、グルコース、凝固因子、ミネラルイオン、ホルモンおよび二酸化炭素を含む。血漿は、抗凝固薬を含む新鮮な血液のチューブを血液細胞がチューブの底に沈殿するまで遠心機で回転させることにより調製することができる。その後血漿を注ぐか、または取り除く。本開示の文脈では、血清は、フィブリノーゲンまたは他の凝固因子を含まない血漿である（すなわち全血から細胞と凝固因子との両方を取り除いたもの）。血清は、血液凝固に使用されないすべてのタンパク質、およびすべての電解質、抗体、抗原、ホルモン、ならびに任意の外因性物質（たとえば、薬剤および微生物）を含んでもよい。
【００３３】
本発明の文脈では、体外処理とは、体、たとえば人体外での処理をいう。たとえば、体外処理は、血液の透析を含んでもよい。血液などの複雑な生物学的液体の処理は、タンパク質などの分子の血液からの除去を含んでもよい。
【００３４】
いくつかの実施形態では、複雑な生物学的液体は、少なくとも１つの低分子量タンパク質、および／またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む。低分子量タンパク質は、より大きなタンパク質の一部であってもよい。いくつかの例では、低分子量タンパク質は、５０ｋＤａ以下の分子量を有する。他の例では、低分子量タンパク質は、３５ｋＤａ以下の分子量を有する。なお他の例では、低分子量タンパク質は、２０ｋＤａ以下の分子量を有する。たとえば、複雑な生物学的液体は、低分子量タンパク質および／またはそのフラグメントもしくは誘導体の混合物を含んでもよい。さらに、複雑な生物学的液体は、たとえば５０ｋＤａより大きなタンパク質、およびタンパク質以外の分子を含んでもよい。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態では、低分子量タンパク質を修飾してもよい。こうした修飾の例として、グリコシル化、たとえばマンノース−６−リン酸付加およびシアル酸付加、およびロイシンリッチ領域の修飾がある。他の例には、メタロプロテイナーゼまたはエンドプロテアーゼの作用がある。いくつかの例では、低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を分解してもよい。
【００３６】
低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体は、メガリン結合モチーフを有していてもよく、このタンパク質が本明細書で定義したメガリンポリペプチドに結合する能力を有することを意味する。他の例では、低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体は、キュビリン結合モチーフを有していてもよい、すなわち本明細書で定義したキュビリンポリペプチドに結合する能力を有していてもよい。低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体は、少なくとも１つのメガリン結合モチーフ、少なくとも１つのキュビリン結合モチーフ、またはそれらの組み合わせを有していてもよい。
【００３７】
いくつかの実施形態では、低分子量タンパク質は、ペプチドホルモン、酵素およびビタミン結合タンパク質からなる群から選択されてもよい。たとえば、低分子量タンパク質は、サイトカイン、インスリン、アルブミン、アポリポタンパク質、β２−およびα１−ミクログロブリン、ミオグロブリンおよび免疫グロブリン軽鎖、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体からなる群から選択されてもよい。一例では、アポリポタンパク質はアポリポタンパク質Ｈであってもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明による医療装置は、サイズフィルターをさらに含んでもよい。濾過は、液体のみが通過できる媒体を置いて液体から固体を分離するのに使用される機械的または物理的操作である。液体に懸濁された大きな粒子の除去にはメッシュフィルター、バッグフィルターおよびペーバーフィルターを使用してもよいのに対し、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、逆浸透および透析などの膜処理では合成膜が利用され、これをマイクロメートルサイズまたはより小さい種を分離するのに使用してもよい。本発明による医療装置に使用してもよいサイズフィルターは、カットオフが５０ｋＤａである。他の例では、カットオフは３５ｋＤａである。なお他の例では、カットオフは２０ｋＤａである。たとえば、サイズフィルターは、複雑な生物学的液体からアルブミンなどの大きなタンパク質を除去することができる。他の例では、サイズフィルターは、血液から血液細胞を除去することができる。
【００３９】
本発明による医療装置のいくつかの実施形態に使用されるサイズフィルターは、様々な形態をとってもよい。たとえば、サイズフィルターは繊維でも、穿孔処理したシートでも、またはメッシュタイプのフィルターでもよい。サイズフィルターは、天然材料で作られていてもよい。たとえば、天然材料はセルロースもしくはその誘導体でも、キトサンでも、カーボンでも、または酸化アルミニウムでもよい。他の例では、サイズフィルターは、たとえば、ナイロン６−６、フッ化ポリビニリデン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルスルホン、ガラスおよび金属からなる群から選択される人工材料で作られていてもよい。当業者であれば、サイズフィルターは、本明細書に示したガイドラインを踏まえて試行錯誤により選択してもよいことを理解する。サイズフィルターは、好ましくは安価かつ滅菌可能で製造および取扱いが容易であり、サイズフィルターの材料の漏出が少ないと好ましい。
【００４０】
いくつかの実施形態では、医療装置は電荷フィルターをさらに含んでもよい。いくつかの例では、電荷フィルターは、等電点、ｐＩが≦８の種のみを通過させる。他の例では、電荷フィルターは、ｐＩが≦７の種のみを通過させる。なお他の例では、電荷フィルターは、ｐＩが≦５．８の種のみを通過させる。
【００４１】
電荷フィルターは、様々な形態をとってもよい。たとえば、電荷フィルターは、繊維でも、穿孔処理したシートでも、またはメッシュタイプのフィルターでもよい。電荷フィルターは、天然材料で作られていてもよい。たとえば、天然材料はセルロースもしくはその誘導体でも、キトサンでも、カーボンでも、または酸化アルミニウムでもよい。他の例では、電荷フィルターは、たとえば、ナイロン６−６、フッ化ポリビニリデン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルスルホン、ガラスおよび金属からなる群から選択される人工材料で作られていてもよい。当業者であれば、電荷フィルターは、本明細書に示したガイドラインを踏まえて試行錯誤により選択してもよいことを理解する。電荷フィルターは、好ましくは安価かつ滅菌可能で製造および取扱いが容易であり、電荷フィルターの材料の漏出が少ないと好ましい。
【００４２】
いくつかの実施形態では、サイズフィルターおよび電荷フィルターは同じフィルターであってもよい。いくつかの例では、サイズフィルターおよび電荷フィルターは、２つの異なるフィルターであってもよい。たとえば、医療装置には、サイズフィルターを設置した後に電荷フィルターを設置してもよい。この例では、医療装置に加える複雑な生物学的液体は、サイズフィルターに達した後に電荷フィルターに達する。他の例では、医療装置に電荷フィルターを設置した後にサイズフィルターを設置する。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態では、医療装置を使用前に滅菌してもよい。滅菌とは、表面から伝染性病原体（たとえば真菌、細菌、ウイルス、芽胞体等）を効率的に死滅させるか、または除去する任意のプロセスをいう。滅菌は、加熱、化学物質、照射、高圧または濾過を用いて行うことができる。広く用いられている加熱滅菌の方法としてオートクレーブがある。オートクレーブは一般に１２１〜１３４℃に加熱された蒸気を使用する。他の例では、γ線で装置を滅菌してもよい。γ線は非常に透過性があり、シリンジなどの使い捨ての医療機器の滅菌に一般に使用される。他の代替手段には、エタノールなどの滅菌溶液の使用がある。本発明のいくつかの実施形態では、装置を全体として滅菌しなくてもよいが、代わりに予め滅菌した部品を用いて無菌環境で組み立てる。
【００４４】
本発明は、その別の態様では、複雑な生物学的液体を体外処理するための透析装置であって、本明細書に記載するような医療装置を含む透析装置を提供する。透析装置は、本明細書に記載するような医療装置以外の部品を含んでもよい。たとえば、本発明による透析装置は、２つ以上の医療装置を含んでもよい。２つ以上の医療装置は、並列に配置しても、または直列に配置してもよい。
【００４５】
本発明は、その別の態様では、複雑な生物学的液体から低分子量タンパク質を体外に除去する方法であって、
ａ）メガリンおよび／またはキュビリンに対して結合親和性を有する、低分子量タンパク質を含む複雑な生物学的液体のサンプルを用意するステップと、
ｂ）前記低分子量タンパク質が前記少なくとも１つのメガリンポリペプチドおよび／または少なくとも１つのキュビリンポリペプチドに結合できる条件下で、前記サンプルを上記に開示したような分離媒体、医療装置または透析装置と接触させるステップと、、
ｃ）前記支持体から前記サンプルを分離して、前記サンプル中に最初に存在していた前記低分子量タンパク質の総量の少なくとも一部が支持体上に保持されるようにするステップと、
ｄ）量が減少した前記低分子量タンパク質を含む前記サンプルを回収するステップと、
を含む方法を提供する。
【００４６】
複雑な生物学的液体から少なくとも１つの低分子量タンパク質を体外に除去する方法は、複雑な生物学的液体を体外処理するための方法として使用してもよい。体外処理のための方法では、本明細書に記載するような本発明による分離媒体は、本明細書に記載するような本発明による医療装置中で使用してもよい、たとえば本明細書に記載するような本発明による医療装置中に含まれていてもよい。
【００４７】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、複雑な生物学的液体は血液であってもよい。いくつかの例では、血液は哺乳動物の血液、たとえばヒト血液である。他の例では、複雑な生物学的液体は血漿でも、血清でも、または尿でもよい。
【００４８】
複雑な生物学的液体のサンプルは、たとえば血液透析回路を使用して得てもよい。血液透析回路は、腎疾患に罹患している患者に接続してもよい。
【００４９】
サンプルは、少なくとも１つのメガリンポリペプチドおよび／または少なくとも１つのキュビリンポリペプチドと接触させる。たとえば、サンプルは、メガリンポリペプチドおよびキュビリンポリペプチドのどちらかまたは両方を含む分離媒体と接触させても、あるいはそうした分離媒体を含む医療装置または透析装置と接触させてもよい。
【００５０】
分離の過程で、複雑な生物学的液体由来の少なくとも１つの低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体は、メガリンポリペプチドおよび／またはキュビリンポリペプチドに結合し、保持されることを意図している。この液体が分離媒体を通過する一方で、少なくとも１つの低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体は、分離媒体の支持体上に固定化したポリペプチドに結合する。分離の過程で、複雑な生物学的液体中の低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体の量の少なくとも一部が保持され、その後複雑な生物学的液体から除去することができる。
【００５１】
複雑な生物学的液体は、分離媒体の通過後に回収することができる。回収された複雑な生物学的液体は、分離媒体に進入する複雑な生物学的液体のタンパク質の組成（および量）と比較してタンパク質の組成（および量）が変化する。
【００５２】
複雑な生物学的液体から低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を体外に除去する方法の１つの利点は、この方法が正常に機能している腎臓の機能に似ていることである。腎臓が機能不全を起こしている人は、血液中の低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体の量の増加に関連する問題を抱え、アミロイドーシス（血液中のβ−２ミクログロブリンの濃度上昇）または小胞体ストレス（メガリンおよび／またはキュビリン結合残留物の濃度上昇）などの深刻な問題を引き越す可能がある。血液などの複雑な生物学的液体から低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を体外に除去する方法を用いることにより、この液体のタンパク質の量およびタンパク質の組成を、正常に機能している腎臓を持つ人の血液の内容に似た状態に回復させることができる。
【００５３】
さらに、複雑な生物学的液体から低分子量タンパク質を体外に除去する方法は、血液中の低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体の量を減少させることにより、腎不全を予防するために使用してもよい。たとえば、血液から低分子量タンパク質を体外に除去する方法を用いて、筋肉損傷により起こり得る血液中のミオグロブリンの濃度上昇を抑制してもよい。血液中のミオグロブリンの濃度上昇は、腎不全を引き起こす恐れがある。別の例では、血液から低分子量タンパク質を体外に除去する方法を用いて、骨髄腫など血液の悪性腫瘍に関連する循環血中の免疫グロブリン軽鎖の量を減少させてもよい。
【００５４】
誤解を避けるため、本発明の態様はまた、分離媒体を用いて複雑な生物学的液体から、場合によっては低分子量タンパク質の捕捉に満足のいく作用を有することがある固定化したメガリンポリペプチドのみ（すなわちキュビリンではない）または固定化したキュビリンポリペプチドのみ（すなわちメガリンではない）を含む、低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を体外に除去する方法を提供する。しかしながら、他の状況では、満足のいく結果を得るには、少なくとも１つのメガリンポリペプチドと少なくとも１つのキュビリンポリペプチドとの組み合わせが必要である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体は、５０ｋＤａ以下の分子量を有していてもよい。他の例では、低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体は、３５ｋＤａ以下の分子量を有する。なお他の例では、低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体は、２０ｋＤａ以下の分子量を有する。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態では、低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を修飾することができる。どのような特定の科学理論にも拘泥するわけではないが、こうした修飾のいくつかの例には、グリコシル化、マンノース−６−リン酸付加、ロイシンリッチ領域の修飾、およびシアル酸付加がある。他の例としてメタロプロテイナーゼまたはエンドプロテアーゼが挙げられる。いくつかの例では、低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を分解してもよい。
【００５７】
本発明による方法の実施形態では、低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体は、少なくとも１つのメガリン結合モチーフ、少なくとも１つのキュビリン結合モチーフ、またはそれらの組み合わせを有していてもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、低分子量タンパク質は、ペプチドホルモン、酵素およびビタミン結合タンパク質からなる群から選択されてもよい。たとえば、低分子量タンパク質は、サイトカイン、インスリン、アルブミン、アポリポタンパク質、β２−およびα１−ミクログロブリンおよび免疫グロブリン軽鎖からなる群から選択されてもよい。一例では、アポリポタンパク質はアポリポタンパク質Ｈであってもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本方法は、サンプルにサイズ分離濾過ステップを施すステップをさらに含み、ステップｂ）を実施する前にサンプルから高分子量成分を除去することができる。本発明の文脈では、「成分」という用語は、複雑な生物学的液体中に存在するタンパク質または他の分子をいう。たとえば、高分子量成分は、５０ｋＤａ以上の分子量を有していてもよい。他の例では、高分子量成分は３５ｋＤａ以上の分子量を有する。なお他の例では、高分子量成分は２０ｋＤａ以上の分子量を有する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本方法は、サンプルに電荷濾過ステップを施し、ステップｂ）を実施する前にｐＩが８以下である成分をサンプルから除去することをさらに含む。他の例では、除去される成分は、ｐＩが７．０以下であってもよい。なお他の例では、除去される成分は、ｐＩが５．８以下であってもよい。
【００６１】
いくつかの実施形態では、サイズ分離濾過および電荷濾過を同時に実施する。サイズフィルターと電荷フィルターとは同じであってもよい。他の例では、サイズ分離濾過を電荷濾過の前に実施してもよい。なお他の例では、電荷濾過をサイズ分離濾過の前に実施する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本方法は、保持された低分子量タンパク質を溶出するステップｅ）をさらに含んでもよい。溶出されたタンパク質は、集めて解析してもよい。たとえば、タンパク質の量およびタンパク質の種類は、患者の疾患の状態を判定する、または腎疾患の患者の処置を決定するのに重要であり得る。医療装置または透析装置は、２回以上再利用してもよい。装置は、複雑な生物学的液体の２回の添加の間に溶出に供してもよい。
【００６３】
本発明はまた、低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体により引き起こされた、または悪化した状態に罹患している哺乳動物の被検体を処置する方法であって、
ａ）被検体から血液を抽出するステップと、
ｂ）上記のような体外に除去する方法を用いて、前記抽出された血液から低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を除去して、前記血液中に最初に存在していた前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体の総量の少なくとも一部が支持体上に保持されるようにするステップと、
ｃ）量が減少した前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む血液を被検体の血流に再導入するステップと、
を含む方法を提供する。
【００６４】
低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体により引き起こされた、または悪化した状態に罹患している被検体は、腎疾患に罹患している患者であってもよい。腎疾患に罹患している患者は、１つまたは２つの機能不全の腎臓を有していてもよい。機能不全の腎臓にあり得る結果は、血液中の低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体の量の増加であってもよい。
【００６５】
たとえば、血液の抽出および再導入は連続ループで行ってもよい。ループは、被検体の血流の一部を構成してもよい。他の例では、血液の抽出は外部血液回路を含む透析装置を用いて行ってもよい。
【００６６】
他の例では、処置の方法は、メガリンポリペプチドおよび／またはキュビリンポリペプチドを含む装置と血液が接触する人体内で行ってもよい。装置は人体に配置してもよい。装置から出た血液は、装置に入ったときと比較してタンパク質の量が減少し得る。
【００６７】
本発明は、その別の態様では、血液透析、血液濾過および／または血液透析濾過に使用することができる医療または透析装置を提供する。装置は、血液回路と直列および／または並列で使用してもよい。いくつかの例では、血液回路は透析器具であってもよい。
【００６８】
装置は、複雑な生物学的液体から低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を体外に除去するのに使用してもよい。複雑な生物学的液体は、本明細書に記載するような血液、血漿、血清または尿であってもよい。複雑な生物学的液体は、本明細書に記載するような少なくとも１つの低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を含んでもよい。
【００６９】
低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体は、ペプチドホルモンでも、酵素でも、またはビタミン結合タンパク質でもよい。たとえば、低分子量タンパク質は炎症性サイトカインであってもよい。別の例では、低分子量タンパク質は、免疫グロブリン軽鎖でもよい。たとえば、骨髄腫は腎臓において軽鎖の沈着を引き起こすため、本発明による装置を使用すると、血液中の免疫グロブリン軽鎖の量を減少させるのに有利である場合がある。
【００７０】
いくつかの例では、装置は、複雑な生物学的液体の組成を回復させるために使用してもよい。腎疾患に罹患している人は、血液中の修飾タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体の量が増加していることがある。修飾タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体の大部分は、腎臓の機能不全のため腎臓で血液から除去されない（少なくとも満足のいく程度まで除去されない）。血液の組成を回復させるために本開示による装置を使用してもよい。
【００７１】
本発明による装置は、腎不全に罹患するリスクがある被検体を処置または予防するための方法に使用してもよい。たとえば、装置は、腎不全の症状を示す被検体の血液中で凝集している低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体の量を減少させるために使用することができる。
【００７２】
本発明の一実施形態では、本発明による装置は、バイオリアクターから機能タンパク質を採取するために使用してもよい。たとえばアフィニティーカラムを使用してタンパク質を単離および分離した後、機能不全タンパク質と機能タンパク質とを識別するために本発明による装置を使用してもよい。本発明による装置は、バイオリアクターで作製後、単離されたタンパク質を採取する際の付加的ステップとしてとして使用してもよい。
【００７３】
他の例では、本発明による装置は敗血症の治療に使用してもよい。たとえば、装置は、敗血症の症状を示す被検体の血液中のサイトカイン量を減少させるために使用してもよい。
【００７４】
なお他の例では、本発明による装置を急性腎不全の処置に使用してもよい。急性腎不全は、たとえば筋肉損傷後のミオグロブリンの蓄積により引き起こされることがある。本発明による装置は、急性腎不全の症状を示す被検体のミオグロブリン量を減少させるために使用してもよい。
【００７５】
本開示による医療または透析装置は、体外の血液回路に連結された別の医療または透析装置と並列で使用しても、または直列で使用してもよい。たとえば、他の医療または透析装置は透析血液フィルターでも、または体外の血液酸素化装置でもよい。
【００７６】
実施形態の項目別のリスト
以下は、本発明により本発明のある種の態様で提供される様々な特徴および組み合わせを記載することを目的とした、本開示の実施形態の非限定的な項目別のリストである。
【００７７】
項目：
１．支持体に固定化された少なくとも１つのメガリンポリペプチドを含む分離媒体。
２．前記メガリンポリペプチドは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２と、それらと少なくとも８０％、たとえば少なくとも８５％、たとえば少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列とからなる群から選択される、項目１に記載の分離媒体。
３．前記メガリンポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択される、項目２に記載の分離媒体。
４．固定化したメガリンの表面密度が１〜１０００００メガリンポリペプチド分子／μｍ２である、先行する項目のいずれか１つに記載の分離媒体。
５．固定化したメガリンの前記表面密度が３０００〜１００００メガリンポリペプチド分子／μｍ２である、項目４に記載の分離媒体。
６．少なくとも１つのメガリンポリペプチドは組換えにより製造されるか、または化学合成により製造される、先行する項目のいずれか１つに記載の分離媒体。
７．支持体に固定化された少なくとも１つのキュビリンポリペプチドを含む分離媒体。
８．前記キュビリンポリペプチドは配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０と、それらと少なくとも８０％、たとえば少なくとも８５％、たとえば少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列とからなる群から選択される、項目７に記載の分離媒体。
９．前記キュビリンポリペプチドは配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択される、項目８に記載の分離媒体。
１０．支持体に固定化された少なくとも１つのメガリンポリペプチドおよび少なくとも１つのキュビリンポリペプチドを含む、先行する項目のいずれか１つに記載の分離媒体。
１１．前記メガリンポリペプチドと前記キュビリンポリペプチドとのモル比は１：１００〜１００：１の範囲である、項目１０に記載の分離媒体。
１２．前記メガリンポリペプチドと前記キュビリンポリペプチドとのモル比は１：１０〜１０：１の範囲など１：５０〜５０：１の範囲である、項目１１に記載の分離媒体。
１３．前記メガリンポリペプチドと前記キュビリンポリペプチドとのモル比は１０：１である、項目１２に記載の分離媒体。
１４．固定化したキュビリンの表面密度が１〜１０００００キュビリンポリペプチド分子／μｍ２である、項目７〜１３のいずれか１つに記載の分離媒体。
１５．固定化したキュビリンの前記表面密度が３０００〜１００００キュビリンポリペプチド分子／μｍ２である、項目１４に記載の分離媒体。
１６．少なくとも１つのキュビリンポリペプチドは組換えにより製造されるか、または化学合成により製造される、項目７〜１５のいずれか１つに記載の分離媒体。
１７．前記支持体の材料はガラス、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、架橋デキストラン、架橋アガロース、寒天ゲル支持体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリウレタン、シリコーンおよびアミロースコーティング粒子からなる群から選択される、先行する項目のいずれか１つに記載の分離媒体。
１８．前記材料はポリスチレンであり、前記ポリスチレンはアニロスルホン酸ポリスチレンおよびトリエタノールアミンメチルポリスチレンから選択される、項目１７に記載の分離媒体。
１９．前記材料は架橋デキストランである、項目１７に記載の分離媒体。
２０．前記支持体はビーズを含む、項目１７〜１９のいずれか１つに記載の分離媒体。
２１．前記ビーズは微小粒子である、項目２０に記載の分離媒体。
２２．前記ビーズはナノ粒子である、項目２０に記載の分離媒体。
２３．前記少なくとも１つのメガリンポリペプチドおよび／または前記少なくとも１つのキュビリンポリペプチドおよび／またはその両方は前記支持体に共有結合している、先行する項目のいずれか１つに記載の分離媒体。
２４．前記共有結合は共有結合によるポリマーグラフト、プラズマ処理、物理吸着、化学吸着および化学誘導体化からなる群から選択される、項目２３に記載の分離媒体。
２５．先行する項目のいずれか１つに記載の分離媒体を含む、複雑な生物学的液体を体外処理するための医療装置。
２６．前記複雑な生物学的液体は血液である、項目２５に記載の医療装置。
２７．前記複雑な生物学的液体は低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む、項目２５〜２６に記載の医療装置。
２８．前記低分子量は５０ｋＤａ以下の分子量を有することを意味する、項目２７に記載の医療装置。
２９．前記低分子量タンパク質は３５ｋＤａ以下の分子量を有することを意味する、項目２８に記載の医療装置。
３０．前記低分子量タンパク質は修飾される、項目２７〜２９のいずれか１つに記載の医療装置。
３１．前記低分子量タンパク質はメガリン結合モチーフを有する、項目２７〜３０のいずれか１つに記載の医療装置。
３２．前記低分子量タンパク質はキュビリン結合モチーフを有する、項目２７〜３１のいずれか１つに記載の医療装置。
３３．前記低分子量タンパク質はペプチドホルモン、酵素、免疫グロブリン軽鎖、ミオグロブリンおよびビタミン結合タンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体からなる群から選択される、項目２７〜３２のいずれか１つに記載の医療装置。
３４．前記低分子量タンパク質はサイトカイン、インスリン、アルブミン、アポリポタンパク質、β２−およびα１−ミクログロブリン、免疫グロブリン軽鎖、ミオグロブリンおよび酸素結合タンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体からなる群から選択される、項目３３に記載の医療装置。
３５．前記装置は使用前に滅菌される、項目２５〜３４のいずれか１つに記載の医療装置。
３６．前記装置はサイズフィルターを含む、項目２５〜３５のいずれか１つに記載の医療装置。
３７．前記サイズフィルターはカットオフが５０ｋＤａである、項目３６に記載の医療装置。
３８．前記カットオフは３５ｋＤａである、項目３７に記載の医療装置。
３９．前記サイズフィルターは繊維、穿孔処理したシートまたはメッシュタイプのフィルターである、項目３６〜３８のいずれか１つに記載の医療装置。
４０．前記サイズフィルターは、たとえばセルロースもしくはその誘導体、キトサン、カーボンまたは酸化アルミニウムからなる群から選択される天然材料で作られている、項目３６〜３９のいずれか１つに記載の医療装置。
４１．前記サイズフィルターはたとえばナイロン６−６、フッ化ポリビニリデン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルスルホン、ガラスおよび金属からなる群から選択される人工材料で作られている、項目３６〜３９のいずれか１つに記載の医療装置。
４２．前記装置は電荷フィルターを含む、項目２５〜４１のいずれか１つに記載の医療装置。
４３．前記電荷フィルターはｐＩが≦８の種のみを通過させる、項目４２に記載の医療装置。
４４．前記電荷フィルターはｐＩが≦５．８の種のみを通過させる、項目４３に記載の医療装置。
４５．前記電荷フィルターは、たとえばセルロースもしくはその誘導体、キトサン、カーボンおよび酸化アルミニウムからなる群から選択される天然材料で作られている、項目４２〜４４のいずれか１つに記載の医療装置。
４６．前記電荷フィルターは、たとえばナイロン６−６、フッ化ポリビニリデン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルスルホン、ガラスおよび金属からなる群から選択される人工材料で作られている、項目４２〜４４のいずれか１つに記載の医療装置。
４７．前記サイズフィルターおよび前記電荷フィルターは、両方が存在する場合、同じフィルターである、項目３６〜４６のいずれか１つに記載の医療装置。
４８．項目２５〜４７のいずれか１つに記載の医療装置を含む、複雑な生物学的液体を体外処理するための透析装置。
４９．複雑な生物学的液体から低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を体外に除去する方法であって、
ａ）メガリンおよび／またはキュビリンに対して結合親和性を有する、低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む複雑な生物学的液体のサンプルを用意するステップと、
ｂ）前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体が前記少なくとも１つのメガリンポリペプチドおよび／または前記少なくとも１つのキュビリンポリペプチドに結合できる条件下で、前記サンプルを項目１〜２４のいずれか１つに記載の分離媒体、または項目２５〜４８のいずれか１つに記載の装置と接触させるステップと、
ｃ）前記支持体から前記サンプルを分離して、前記サンプル中に最初に存在していた前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体の総量の少なくとも一部が支持体上に保持されるようにするステップと、
ｄ）量が減少した前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む前記サンプルを回収するステップと
を含む方法。
５０．前記複雑な生物学的液体は血液である、項目４９に記載の方法。
５１．前記血液は哺乳動物の血液である、項目５０に記載の方法。
５２．前記哺乳動物の血液はヒト血液である、項目５１に記載の方法。
５３．前記複雑な生物学的液体は血漿である、項目４９に記載の方法。
５４．前記複雑な生物学的液体は尿である、項目４９に記載の方法。
５５．前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体は５０ｋＤａ以下の分子量を有する、項目４９〜５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体は３５ｋＤａ以下の分子量を有する、項目５５に記載の方法。
５７．前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体は修飾される、項目４９〜５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体はメガリン結合モチーフを有する、項目４９〜５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体はキュビリン結合モチーフを有する、項目４９〜５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．前記低分子量タンパク質はペプチドホルモン、酵素、免疫グロブリン軽鎖、ミオグロブリンおよびビタミン結合タンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体からなる群から選択される、項目４９〜５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．前記低分子量タンパク質はサイトカイン、インスリン、アルブミン、アポリポタンパク質、β２−およびα１−ミクログロブリン、免疫グロブリン軽鎖、ミオグロブリンおよび酸素結合タンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体からなる群から選択される、項目６０に記載の方法。
６２．サンプルにサイズ分離濾過ステップを施すステップをさらに含み、それによりステップｂ）を実施する前にサンプルから高分子量成分を除去する、項目４９〜６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．前記高分子量成分は５０ｋＤａ以上の分子量を有する、項目６２に記載の方法。
６４．前記高分子量成分は３５ｋＤａ以上の分子量を有する、項目６３に記載の方法。
６５．サンプルに電荷濾過ステップを施すステップをさらに含み、それによりステップｂ）を実施する前にサンプルからｐＩが８以下の成分を除去する、項目４９〜６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．前記除去された成分はｐＩが５．８以下の成分である、項目６５に記載の方法。
６７．前記サイズ分離濾過および前記電荷濾過は、両方が存在する場合、同時に実施される、項目６２〜６６のいずれか１つに記載の方法。
６８．前記方法は、前記保持された低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を溶出するステップｅ）をさらに含む、項目４９〜６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体により引き起こされた、または悪化した状態に罹患している哺乳動物の被検体を処置する方法であって、
ａ）被検体から血液を抽出するステップと、
ｂ）項目４９〜６８のいずれか１つに記載の方法を用いて、前記抽出された血液から低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を除去して、前記血液中に最初に存在していた前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体の総量の少なくとも一部が支持体上に保持されるようにするステップと、
ｃ）量が減少した前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む血液を被検体に再導入するステップと、
を含む方法。
７０．血液の抽出および再導入が連続ループで実施され、ループは被検体の血流の一部を構成する、項目６９に記載の方法。
７１．血液透析、血液濾過および／または血液透析濾過のための、項目１〜２４のいずれか１つに記載の分離媒体の使用。
７２．血液透析、血液濾過および／または血液透析濾過のための、項目２５〜４８のいずれか１つに記載の医療または透析装置の使用。
７３．項目７２に記載の使用、前記装置は血液回路を含む直列および／または並列で使用される。
７４．前記血液回路は透析器具である、項目７３に記載の使用。
７５．複雑な生物学的液体から低分子量タンパク質を体外に除去するための、項目２５〜４８のいずれか１つに記載の医療または透析装置の使用。
７６．複雑な生物学的液体の組成を回復させるための、項目２５〜４８のいずれか１つに記載の医療または透析装置の使用。
７７．複雑な生物学的液体は血液である、項目７６に記載の使用。
７８．前記血液は少なくとも１つの低分子量タンパク質、またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む、項目７７に記載の使用。
７９．前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体は修飾される、項目６９〜７０のいずれか１つに記載の方法または項目７８に記載の使用。
８０．前記低分子量タンパク質は炎症性サイトカインである、項目６９〜７０のいずれか１つに記載の方法または項目７８〜７９のいずれか１つに記載の使用。
８１．前記低分子量タンパク質は免疫グロブリン軽鎖である、項目６９〜７０のいずれか１つに記載の方法または項目７８〜７９のいずれか１つに記載の使用。
８２．体外の血液回路に連結された別の医療または透析装置と並列および／または直列された、項目２５〜４８のいずれか１つに記載の医療または透析装置の使用。
８３．前記他の医療または透析装置は透析血液フィルターまたは体外の血液酸素化装置である、項目８２に記載の使用。
【００７８】
次に、本発明に記載の低分子量タンパク質を結合するための、少なくとも１つのメガリンポリペプチドおよび／または少なくとも１つのキュビリンポリペプチドの使用について、以下の図および実施例により非限定的に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、３つの異なる個体の腎生検よりｍＲＮＡをノーザンブロット解析した結果を示すゲルの写真である。凡例は、左から右に「ラダー」、「生検標本１」、「生検標本２」および「生検標本３」である。
【図２】図２は、２つのポリペプチド、すなわちＭＥＧ１（配列番号２）およびＣＵＢ５−８（配列番号１６）をウエスタンブロット解析した結果を示すゲルの写真である。ＭＥＧ１およびＣＵＢ５−８の大きさはどちらもほぼ４０ｋＤａである。
【図３】図３は、メガリンポリペプチドおよびキュビリンポリペプチドを固定化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を含むカラム（ＨＥＰ）、またはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）のみを含むカラム（ＣＴＲ）を通す前後の、健常被験者（健常）、および維持血液透析により処置した慢性腎疾患の患者（尿毒症）の濾過（＜３０ｋＤａ）血液をイムノブロット解析したゲルの写真である。
【図４】図４は、ポリペプチドＭＥＧ３（配列番号４）およびＣＵＢ１−７（配列番号１５）を固定化したビーズを含むカラムを通す前（「ＣＯＬ−」）、および通した後（「ＣＯＬ＋」）に、サイズ排除カラムを通した（「サイズ＋」）、および通さない（「サイズ−」）４つの異なるサンプルの結果を示す逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【図５】図５は、様々な比率のメガリンおよびキュビリンでメガリンポリペプチドおよびキュビリンポリペプチドを固定化したカラムを通した前後のサンプル中の総タンパク質含有量（ＴＰＣ）（ｇ／ｌ）の図である。
【図６Ａ】図６Ａは、固定化したメガリンポリペプチドＭＥＧ５−８（配列番号１２）を含むカラムを通した後のインスリン量（ｐｇ／ｍｌ）の変化を示す、ＥＬＩＳＡアッセイの結果の図を示す。３つの異なるカラムの結果は、対照カラム（抗体を加えていない）、抗インスリン抗体を加えたカラム、および抗メガリン抗体を加えたカラムを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ウエスタンブロット解析したゲルの写真を示す。第１のレーンは、抗体を加えていない複雑な生物学的液体の通過を示す。第２のレーンは、抗インスリン抗体を加えた複雑な生物学的液体の通過を示す。第３のレーンは、抗メガリン抗体を加えた複雑な生物学的液体の通過を示す。第４のレーンは、抗インスリン抗体および抗メガリン抗体の両方を加えた複雑な生物学的液体の通過を示す。各通過について、ＴＰＣの値を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、＜３０ｋＤａのプールされたラット血漿のプロテオームに対するＭＥＧカラムの作用を示す２−Ｄゲルの写真である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、＜３０ｋＤａのプールされたラット血漿のプロテオームに対するＣＴＲＬカラムの作用を示す２−Ｄゲルの写真である。
【図８】図８は、プールされた血液サンプルを、結合したメガリンを含むカラム（ＭＥＧ）、および結合したメガリンを含まないカラム（ＣＴＲＬおよびＳＨＡＭ）に通した後の腎摘出（ＭＥＧおよびＣＴＲＬ）ラット、および非腎摘出（ＳＨＡＭ）ラットの３日間の記録における典型的な行動の頻度を示す図である。ＳＨＡＭはｎ＝４；ＭＥＧはｎ＝３；およびＣＴＲＬはｎ＝３。
【実施例】
【００８０】
以下の非限定的な実施例１〜１０では、複雑な生物学的液体から少なくとも１つの低分子量タンパク質を除去するための、メガリンポリペプチドおよびキュビリンポリペプチドの使用の原理を示す。さらに、非限定的な実施例１１〜１３は、ある種の環境において複雑な生物学的液体から少なくとも１つの低分子量タンパク質を除去する場合、メガリンポリペプチドは、満足のいく結果を得るのに十分であることを示す。
【００８１】
実施例１
メガリンおよびキュビリンのｃＤＮＡの作製
Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＣＢ  ｅｔ  ａｌ，（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：４４５−４４８に記載された手順に従った。手短に言えば、製造者の指示通りＡｌｌＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ヒト腎皮質（３個体の腎生検標本）から全ＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡは、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。
【００８２】
ｃＤＮＡを得るため、表１および２に示したプライマーを用いＱｉａｇｅｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してＲＡＣＥを行い、表記のメガリンポリペプチドおよびキュビリンポリペプチド（その全アミノ酸配列を添付の配列表に示す）と、表記の制限酵素の切断部位とをコードするＤＮＡを作製した。品質を保証するため１％ホルムアルデヒドゲルおよび１μｇのｍＲＮＡを用いて１００Ｖで１時間ノーザンブロッティングを行い、西洋わさびペルオキシダーゼ標識リボプローブで可視化して品質を点検した（図１）。
2013532031.tif 000003
2013532031.tif 000004
【００８３】
実施例２
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いたＧＳＴ結合メガリンポリペプチドおよびキュビリンポリペプチドの発現
実施例１に記載されているように作製されたｃＤＮＡ産物をｐＧＥＸ−４Ｔ−３ベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にライゲートし、エレクトロポレーションを用いてエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）に形質転換した。ｃＤＮＡ産物の再利用をＤＮＡ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により行った。形質転換細胞は、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベーションを行うことにより同定した。単一コロニーを３ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地に接種し、オービタルシェーカーにて２５０ｒｐｍで一定の振盪を行いながら、３７℃にて一晩増殖させた。次いで、培養液を１：１００で２００ｍｌの新鮮なＬＢ−アンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）培地に希釈し、２５０ｒｐｍで一定の振盪を行いながら、ＯＤ６００がほぼ０．５になるまで（２〜３時間）３７℃でインキュベートした。次いでＩＰＴＧを０．５ｍＭの最終濃度になるように培養液に添加してタンパク質を誘導し、２５０ｒｐｍで一定の振盪を行いながら培養液を１５℃で一晩再びインキュベートした。翌日、培養液を６０００ｇ、４℃で１０分間遠心して細胞ペレットを形成させた。さらに４℃でペレットを１０ｍｌの冷やした溶解緩衝液に再懸濁し、氷上で超音波処理し（３０％振幅、５回の１０秒バースト、各バースト間に３０秒の冷却間隔）、タンパク質の遊離をＢｒａｄｆｏｒｄ反応によりモニターした（１０μｌの画分＋９０μｌの水＋１ｍｌのＢｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）；５９０ｎｍおよび４５０ｎｍで吸光度を測定し、それらの間の比率を使用してタンパク質濃度を算出した）。ライセートを２００００ｇ、４℃で３０分間遠心分離により清澄にし、その後上清をアリコートに分割し、氷上で保存した。品質管理のため、ＩｌｌｕｓｔｒａＰｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐ  ＭｉｎｉＳｐｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、製造者の指示に従い組換えプラスミドを抽出し、表記のポリペプチドの表１に示す制限酵素を用いて切断し、キットに用意されたゲルを用いて評価した。
【００８４】
発現したコンストラクトの精製を、Ｈｏｄｎｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，（２００２），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９１（２１）：９７２５−９に記載されているようにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）アフィニティークロマトグラフィーにより行った。簡単に説明すると、２ｍｌのグルタチオン−セファロース（Ｓｉｇｍａ）樹脂をガラスカラム中で細胞ライセートおよび０．２５ＭのＮａＣｌ  １ｍｌと混合し、穏やかに１時間撹拌した。洗浄は、３カラム体積、各回１５ｍｌの洗浄用緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５＋０．２５ＭのＮａＣｌ＋２ｍＭのＥＤＴＡ＋２ｍＭのＥＧＴＡ＋０．０３％Ｂｒｉｊ−３５（Ｓｉｇｍａ））を用いて行った。次いで、ｐＨ８．０になるように２０ｍＭのグルタチオン（Ｓｉｇｍａ）およびＮａＯＨを加えて予め混合した洗浄用緩衝液を用いてタンパク質の溶出を行った。各溶出後、Ｂｒａｄｆｏｒｄ反応を用いてタンパク質の収量を調べた。次に純粋なタンパク質（典型的な収量：ＭＥＧ１で９〜１２ｍｇ／ｌ培養液、およびＣＵＢ５−８で１８〜２１ｍｇ／ｌ培養液）をＰＢＳで溶出し、４℃、３０００ｇでＶｉｖａＳｐｉｎ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）限外濾過スピンカラムを用いて濃縮し、最後に−８０℃で保存した。得られた産物のウエスタンブロットのゲルの代表的なサンプルを図２に示す。
【００８５】
実施例３
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いたビオチン結合メガリンポリペプチドおよびキュビリンポリペプチドの発現
以前に記載されているようにシステイン−ビオチンを合成した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，（２００８），Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９（２）：１４１−５３）。簡単に説明すると、２．６ｍｍｏｌのＮ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン、３．１ｍｍｏｌのテトラメチル−Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）および３．９ｍｍｏｌの１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを５０ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に加えた。この混合物を室温で２０分間撹拌した。次に、７．８ｍｍｏｌのＮ−メチルモルホリンおよび２．６ｍｍｏｌのビオチニルエチレンジアミン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。穏やかに撹拌しながら反応を３時間継続させ、その後オイルポンプを備えたロータリーエバポレーターを用いて、溶媒を真空蒸発させた。この粗反応混合物を２００ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解させ、有機層を水で抽出し（３×１００ｍｌ）、次いで無水ＭｇＳＯ４（２５ｇ）を加えて周期的に撹拌しながら５分間乾燥させた。得られた溶液（１８０ｍｌ）を清浄なフラスコにデカントし、エバポレーターを用いて真空濃縮した。システイン−ビオチンの精製は、ガラスカラムに充填したシリカゲルシリカゲル（２００ｇ）を用いたフラッシュクロマトグラフィー（４〜８％ｖ／ｖのＭｅＯＨを含むＤＣＭ溶液）により行った。
【００８６】
実施例１に記載されているように作製されたｃＤＮＡ産物（１バッチ当たり１つのプライマー対）をｐＭＤ−１８−ＴＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲートし、エレクトロポレーションを用いてエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６に形質転換した。形質転換細胞は、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを３ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地に接種し、オービタルシェーカーにて２５０ｒｐｍで一定の振盪を行いながら、３７℃にて一晩増殖させた。次いで、培養液を１：１００で２００ｍｌの新鮮なＬＢ−アンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）培地に希釈し、２５０ｒｐｍで一定の振盪を行いながら、ＯＤ６００がほぼ０．５になるまで（２〜３時間）３７℃でインキュベートした。次いで０．５ｍＭの最終濃度になるように培養液に添加したイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によりタンパク質を誘導し、２５０ｒｐｍで一定の振盪を行いながら培養液を１５℃で一晩再びインキュベートした。翌日、培養液を６０００ｇ、４℃で１０分間遠心して細胞ペレットを形成させた。さらに４℃でペレットを１０ｍｌの冷やした溶解緩衝液に再懸濁し、氷上で超音波処理し（３０％振幅、５回の１０秒バースト、各バースト間に３０秒の冷却間隔）、タンパク質の遊離をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによりモニターした。ライセートを２００００ｇ、４℃で３０分間遠心分離により清澄にし、その後上清をアリコートに分割し、氷上で保存した。カラム中に培養液１リットル当たり２０ｍｌのキチンビーズを用い０．５〜１ｍｌ／分の流量でＨＰＬＣクロマトグラフィーによりタンパク質を単離し、３０ｍＭの２−メルカプトエタンスルホン酸（Ｓｉｇｍａ）および１ｍＭのシステイン−ビオチンを用いてカラムでビオチン化した。最後に、ビオチン化タンパク質を１０ｍｌのＰＢＳで溶出し、−８０℃で保存した。
【００８７】
実施例４
ＨＥＫ２９３細胞を用いた全長Ｈｉｓ１０タグ付きメガリンおよびキュビリンの発現
ベクターｐｃＤＮＡ（商標）４／ＨｉｓＭａｘ  Ａ，Ｂ，＆Ｃと共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号Ｋ９０００−１０）を用いて発現を行い、Ｎ末端にＨｉｓ１０−タグを付加したＣＭＶプロモーターの制御下で組換えタンパク質を発現させた。表２に示すプライマーを用いて実施例１に従いｃＤＮＡを得た。
【００８８】
実験の開始前に、細胞を少なくとも５回継代して樹立した。実験には初期継代細胞を使用した（１０継代未満）。１×１０６〜３×１０６生細胞／ｍｌの細胞密度になった時点で（一般に４８〜７２時間毎に）培養液を分割した。トリパンブルー排除を用いて細胞生存率を判定した（下記を参照）。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍを記載されているように使用した。懸濁したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞のトランスフェクションでは、キットに含まれていたカチオン性脂質ベースのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬を導入した。陽性対照ｐＣＭＶ  ＳＰＯＲＴ−βｇａｌをトランスフェクションおよび発現の陽性対照ベクターとして用意した。３０ｍｌ量の懸濁液のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞にトランスフェクトするため、３７．５μｇのプラスミドＤＮＡを加えた。トランスフェクションのほぼ２４時間前、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞を６〜７×１０５細胞／ｍｌで継代した。フラスコをオービタルシェーカーのプラットフォーム上に置き、１３５ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２で回転させた。トランスフェクションの当日、細胞密度を調べ、１．２×１０６細胞／ｍｌ未満を含むコロニーを捨てた。次に、細胞を１×１０６細胞／ｍｌに希釈した。次いで１２５ｍｌの振盪フラスコにそれぞれ３０ｍｌの細胞を加えた。次いでＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔのチューブを数回反転させ、全量０．６ｍｌとなるように３７．５μｇのプラスミドＤＮＡを含む、キットに用意されたＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈した。別のチューブで、３７．５μｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬を含むＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭを全量０．６ｍｌになるように希釈し、揺動により穏やかに混合した。混合物を室温で１０分間穏やかにインキュベートして複合体を形成させた。次いで、細胞を含む１２５ｍｌのフラスコにそれぞれ１．２ｍｌのＤＮＡ−脂質混合物を加えた。次に、トランスフェクトした細胞培養液をオービタルシェーカープラットフォーム上で３７℃、８％ＣＯ２にてインキュベートし、１３５ｒｐｍで５日間回転させた。タンパク質発現は、トランスフェクションから４〜８時間以内で検出可能であり、タンパク質の収率は、発現したコンストラクトによってトランスフェクションから２〜７日後に最大となった。
【００８９】
発現したコンストラクトの精製は、Ｓｍｉｔｈ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ（２０００），Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３７５（１）：１９５−２００に記載されているようにＮｉ−親和性およびイオン交換ＦＰＬＣクロマトグラフィーにより行った。次に純粋なタンパク質を緩衝液で溶出し、４℃、３０００ｇでＶｉｖａＳｐｉｎ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）限外濾過スピンカラムを用いて濃縮し、最後に−８０℃で保存した。
【００９０】
発現タンパク質は、遅延引き出しおよびリフレクターを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｂｉｆｌｅｘ  ＩＩＩ機器（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いてマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法（ＭＳ）により解析した。ペプチドのスペクトルは、トリプシン自己消化ペプチド内部標準を使用して校正した。タンパク質を同定するため、ＰｒｏＦｏｕｎｄ検索エンジンを用いてＮＣＢＩｎｒ配列データベースの検索を行った。１つのミスカット、アルキル化、およびメチオニンの部分酸化を許容した。同定の重要性は、確率値である「Ｚ」値、およびシーケンスカバー率により評価した。ペプチドの予想ｍ／ｚはすべて、質量スペクトルの主要なピークとして出現した。
【００９１】
実施例５
ＧＳＴを用いた、ＭＥＧ１およびＣＵＢ５−８のビーズへの末端結合
実施例２に記載されているように発現させたＭＥＧ１およびＣＵＢ５−８を、Ｈｏｄｎｅｌａｎｄ  ＣＤ  ｅｔ  ａｌ，上掲に記載されているようにグルタチオン−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ビーズに結合させた。簡単に説明すると、２ｍｇのグルタチオン−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｓｉｇｍａ）を、ガラスカラム中で２０μｇの精製されたＭＥＧ１、２０μｇのＣＵＢ５−８および２ｍｌの０．２５ＭのＮａＣｌと混合し、穏やかに１時間撹拌した。洗浄は、緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５＋０．２５ＭのＮａＣｌ＋２ｍＭのＥＤＴＡ＋２ｍＭのＥＧＴＡ＋０．０３％Ｂｒｉｊ−３５（Ｓｉｇｍａ））で行った。
【００９２】
成功した結合の検出は、最初にカラムをＰＢＳで５回（合計５カラム体積）洗浄し、次いで１ｍｇのビーズを０．５ｍｌの洗浄用緩衝液（２０ｍＭのトリス＋０．２５ＭのＮａＣｌ＋２ｍＭのＥＤＴＡ＋２ｍＭのＥＧＴＡ＋０．０３％Ｂｒｉｊ−３５＋２０ｍＭのグルタチオン）およびＮａＯＨとｐＨ８．０まで混合し、上清のウエスタンブロット解析を行い、ＭＥＧ１およびＣＵＢ５−８を検出することにより行った。
【００９３】
実施例６
ビオチン−アビジン結合を用いた、ＭＥＧ３およびＣＵＢ１−７のビーズへの末端結合
ビオチン化タンパク質を実施例３に記載されているように合成した。結合には、製造者の指示に従いＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）ストレプトアビジンＣ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。簡単に説明すると、ＰＢＳに再懸濁し、３回洗浄した後、ビーズ１ｍｇに対して１０μｇの精製されたＭＥＧ３タンパク質および１０μｇの精製されたＣＵＢ１−７タンパク質を加えた。混合液を穏やかに回転させながら室温で３０分間インキュベートした。コーティングされたビーズを磁石を使用して分離し、次いでＰＢＳで６回洗浄し、これに０．１％ＢＳＡおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えた。カラムは、使用時まで湿保存した。
【００９４】
成功した結合の検出は、最初にカラムをＰＢＳで１５回（合計１５カラム体積）洗浄し、次いで１ｍｇのビーズを１０ｍｌの１，８ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ  ｐＨ８．２および９５％ホルムアミドと混合することにより行った。室温で４時間穏やかに撹拌した後、上清のウエスタンブロット解析を行い、ＭＥＧ３およびＣＵＢ１−７を検出した。
【００９５】
実施例７
Ｈｉｓ１０−ｔａｇを用いた、全長メガリンおよびキュビリンのビーズへの末端結合
ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を、５ｍＭのＣａＣｌ２および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むトリス−緩衝食塩水（ＴＢＳ）（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌおよび３ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０）で平衡化し、実施例４に記載されているように発現させて同じ緩衝液で調製した１０μｇの組換えＨｉｓタグ付きメガリンタンパク質およびキュビリンタンパク質を室温で１時間インキュベートした。結合が飽和するまで（残った上清中の過剰なタンパク質を検出して判定）さらにタンパク質を加えた。１ｍｌのニッケルアガロースビーズでは、約１２μｇのキュビリンおよびメガリンがそれぞれ結合した。次いで、タンパク質コーティングされたビーズを１ｍｌのＴＢＳ＋２０ｍＭのイミダゾールで４回（それぞれ５分間）洗浄し、ＴＢＳに５０％スラリーとして懸濁した。
【００９６】
成功した結合の検出は、最初にカラムを１５回（合計１５カラム体積）洗浄し、次いで１ｍｇのビーズを１５０ｍＭのイミダゾール１ｍｌと混合し、室温で５分間穏やかに振盪することにより行った。次いで上清をウエスタンブロットにより解析して結合したメガリンおよびキュビリンを検出した。
【００９７】
実施例８
メガリンポリペプチドおよびキュビリンポリペプチドでコーティングされたビーズを用いた、循環血中のペプチドホルモンの結合
実施例２に記載されているように作製されたＧＳＴとＭＥＧ１およびＣＵＢ５−８、またはＭＥＧ３およびＣＵＢ１−７との融合タンパク質を、実施例５に記載されているようにグルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂビーズ上にタンパク質のモル比１：１で固定化した。次いでビーズを５ｍｌのカラム（「ＨＥＰ」と呼ぶ；４ｍｌのビーズ、デッドスペース１ｍｌ）に詰めた。対照カラムは、セファロース４Ｂビーズのみで調製した（「ＣＴＲ」と呼ぶ；４ｍｌのビーズ、デッドスペース１ｍｌ）。静脈血（各１０ｍｌ）を健常ヒトドナーおよび維持血液透析患者１例から採取し、ダルテパリン（Ｐｆｉｚｅｒ；１ＩＥ／ｍｌの血液）と混合し、回転させて細胞を除去した。得られた血漿のうち、各個体の１つのアリコートを１ｇで各カラム（ＨＥＰおよびＣＴＲ）に通した。次いで非結合の画分を二次元ゲル電気泳動に直接使用し、続いてカラムをＰＢＳで１０回洗浄し、その後結合した画分を、１５ｍｌの溶出緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌのｐＨ８および１０ｍＭのＲｅｄｕｃｅｄ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、Ｓｉｇｍａ）を使用し、栓をしたカラムにそれぞれ溶出し、これを室温で２０分間揺動し、次いで５００ｇで５分間遠心し、排出し、液体を集めた。カラム毎にこの溶出手順を合計３回繰り返し、各カラムの全溶出液を二次元ゲル電気泳動用にプールした。
【００９８】
通過の前および後の血漿について、Ｂｒａｄｆｏｒｄ反応を用いて総タンパク質含有量を試験した（１０μｌの画分＋９０μｌの水＋１ｍｌのＢｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）；５９０ｎｍおよび４５０ｎｍで吸光度を測定し、これらの間の比率を使用してタンパク質濃度を算出した）。次いで同じアリコートを、β−メルカプトエタノールを含む等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーと混合し、１００℃で５分間煮沸した。次いで変性したタンパク質を個別に１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、その後銀溶液およびクーマシーブリリアントブルー溶液で染色した。精製されたタンパク質をニトロセルロース膜にトランスファーし（定電流２０ｍＡ、４℃で一晩）、５％粉乳を含むＰＢＳでブロッキングした（室温２時間）。ゲルを乾燥させ、露出させてＦｕｊｉＸ２０００ホスホイメージャー（Ｆｕｊｉ）でスキャンした。次いで銀染色したゲルを、ＭａｇｉｃＳｃａｎ３２（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＡＩＤＡ（ＩＭＧ）ソフトウェアを含むＩｍａｇｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でスキャンし、Ｉｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒ  ２Ｄ  Ｅｌｉｔｅソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で解析した。得られた画像を図３に示す。
【００９９】
実施例９
タンパク質結合に対するサイズ排除の影響
維持血液透析を必要とする慢性腎疾患の７例の患者から静脈血（各５ｍｌ）を採取し、プールし、ダルテパリン（Ｐｆｉｚｅｒ；１ＩＥ／ｍｌの血液）と混合した。次いで混合物を遠沈させて細胞を除去した。得られた血漿のうち１ｍｌのアリコート１つを、実施例６によりＭＥＧ３およびＣＵＢ１−７にビオチン化し、調製した２ｍｇのＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）を含むカラムに通した。１ｍｌの血漿の別のアリコートをサイズ排除フィルター（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎｅ  ３０Ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；５０００ｇで１０分間回転）に通し、次いで実施例６により調製したＭＥＧ３およびＣＵＢ１−７を含む別のカラムに通した。
【０１００】
４群のそれぞれのサンプル（サイズ排除を用いたものおよび用いないものと、カラムの前のものおよび後のもの）を、ｒｐＨＰＬＣを用いて別々に解析した。３００μｇの血漿をｍＲＰ−Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードした。各サンプルに、尿素ペレット（２２ｍｇ）を６μｌの純氷酢酸と共に加え、最終濃度を６Ｍの尿素および０．１％酢酸とした。逆相ＨＰＬＣを０．７５ｍｌ／分の流量、および８０℃のカラム温度で行った。緩衝液Ａ（水／０．１％ＴＦＡ）およびＢ（アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の直線マルチセグメントグラジエントは、以下の通りである：時間０分３％Ｂ；１分３％Ｂ；６分３０％Ｂ；３９分５５％Ｂ；４９分１００％Ｂ；５３分１００％Ｂ；５８分３％Ｂ。予想通り、サイズ排除により、比較的高分子量のタンパク質のかなりの量が除去されたが、全部が除去されるわけではなかった。この除去の結果、おそらく競合的結合が減少したため、残りのペプチドがカラムに非常に結合しやすくなった。得られたクロマトグラムの代表的なサンプルを図４として示す。
【０１０１】
実施例１０
総タンパク質結合に対する通過量およびメガリン：キュビリン比の影響
精製されたメガリンドメインおよびキュビリンドメインの比（ｗ／ｗ）を１：１０（１μｇのＭＥＧ１および１０μｇのＣＵＢ５−８／ｍｌのビーズ）〜１０：１（１０μｇのＭＥＧ１および１μｇのＣＵＢ５−８／ｍｌのビーズ）に変更したこと以外は、実施例５に記載されているようにカラムを作製した。次に、静脈血漿を実施例９に記載されているように採取した。１ｍｌの血漿のアリコート１つを、メガリンおよびキュビリンを表面固定化した２ｍｇのビーズを含むガラスカラムに通す一方、１ｍｌの血漿を直ちに解析した。実施例８に記載されているようにＢｒａｄｆｏｒｄ反応を用いて総タンパク質含有量（ＴＰＣ）を判定した。実験は３回繰り返し、タンパク質濃度の変化の平均差（アリコートの前後）を図５に示す。このように、２ｍｏｌのメガリンと１ｍｏｌのキュビリンとの比率では、１ｍｏｌのメガリンと２ｍｏｌのキュビリンと同様にタンパク質が減少した。しかしながら、１０ｍｏｌのメガリンと１ｍｏｌのキュビリンでは、カラムを通過する過程で著しく高レベルのタンパク質が除去された。
【０１０２】
実施例１１
アフィニティーカラム中のＭＥＧ５−８に対するインスリンの結合
ＧＳＴ融合タンパク質ＭＥＧ５−８を実施例２に記載されているように作製し、実施例５に記載されているようにグルタチオン−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）４Ｂビーズ上に固定化した（２ｍｇのマトリックスをそれぞれ２０μｇの精製されたＭＥＧ５−８と混合）。次いでビーズを３つの同等の５ｍｌカラムに詰めた（４ｍｌのビーズ、デッドスペース１ｍｌ）。
【０１０３】
リガンドに対するメガリンの結合の特異性を試験するため、５ｍｌの最終容量になるように５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）およびＰＢＳと混合した６０ｐｇ／ｍｌの精製されたヒトインスリン（ヒューマリン１００ＩＥ／ｍｌ；Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）を使用した。この混合物をそのまま（ブランク）で、抗メガリン抗体（Ａｂｃａｍ；２０ｎｇ）と混合して、抗インスリン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；２０ｎｇ）と混合して、または両方の抗体（２０＋２０ｎｇ）と共にカラムに加えた。通過画分を集め、ウエスタンブロットを行った。その代表的なサンプルを図６Ｂに示す。さらに市販のＥＬＩＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、通過したサンプル中のインスリン濃度を評価した（図６Ａを参照）。図６Ｂに示すように、抗メガリンは、インスリンのカラムへの結合を著しく低下させたが、抗インスリンはそうではなかったことから、我々の装置によりメガリン特異的にインスリンが捕捉されることが証明された。
【０１０４】
実施例１２
全長メガリンカラムの調製
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ  ＨＥＫ−２９３細胞（カタログ番号Ｒ７９０−０７）を用いて既に調製したｐｃＤＮＡ（商標）４ベクターを使用して、実施例４と同様に全長Ｈｉｓ１０タグ付きメガリンを調製した。発現は、Ｐｒｏｆ．Ｒｅｎａｔａ  Ｋｏｚｙｒａｋｉ，ＩＮＳＥＲＭ，Ｐａｒｉｓから好意により提供された抗体を用いて、以前に記載されているようにウエスタンブロット解析により確認した（Ｌｅ  Ｐａｎｓｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６７（２）：１２０−１２９；Ｍｏｅｓｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：１６５６４−１６５７０）。
【０１０５】
５ｍＭのＣａＣｌ２および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むトリス−緩衝食塩水（ＴＢＳ）（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌおよび３ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０）でニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を平衡化し、同じ緩衝液で調製した２μｇの組換えＨｉｓ１０タグ付きタンパク質を室温で１時間インキュベートした。結合が飽和するまで（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて残った上清中の過剰なタンパク質を検出して判定）さらにタンパク質を加えた。１ｍｌのニッケルアガロースビーズでは、約１０μｇのメガリンが結合した。次いで、タンパク質コーティングされたビーズを１ｍｌのＴＢＳ＋２０ｍＭのイミダゾールで４回洗浄し（それぞれ５分間）、５０％スラリーとしてＴＢＳに懸濁した。
【０１０６】
成功した結合の検出は、最初にカラムを１５回（合計１５カラム体積）洗浄し、次いで１ｍｇのビーズを１５０ｍＭのイミダゾール１ｍｌと混合し、室温で５分間穏やかに振盪することにより行った。次いで上記のように上清をウエスタンブロットにより解析して結合メガリンを検出した。
【０１０７】
最後に、８μＭのフリット（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）Ｇｒａｄｅ  ４０ディスクフィルター）を備えた、１．５ｍｌのオートクレーブ処理したガラスカラムを、ビーズを用いて調製し、室温で乾燥させ、穏やかに振盪しながら２０％エタノールを一杯となるまで充填した。最終カラムにキャップし、シールし、使用時まで８℃で保存した（８日以内）。
【０１０８】
実施例１３
全長メガリンカラムを用いた５／６腎摘出したラットの処置。
動物：雌雄の８週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓから取得した。この動物をメガリン（ＭＥＧ）カラムもしくはプラセボ（ＣＴＲＬ）カラム、またはシャム手術（ＳＨＡＭ）に１：１：１の比で無作為に割り付けた。
【０１０９】
カラム：全長メガリンカラムを実施例１２と同様に調製した。プラセボカラムは、まったく同じように調製したが、結合メガリンタンパク質を含まないニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。
【０１１０】
動物の取扱い：１週間の馴化期間後、以前に記載されているように８匹の雄ラットに５／６腎亜全摘出を施行した（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９７５）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ７９：９５−１０６）。４匹の他の雄ラットには、腎実質の除去を行わずに偽腹壁切除術を施行した。各腎摘出群の動物１匹が手術中に死亡した。種々後、ラットに２週間の回復期間を与え、実験ストレスを低下させるように毎日面倒を見た。全試験期間中、水および標準的な固形飼料を自由に与えた。ラットは、標準的なケージにそれぞれ雄１匹および雌２匹を収容して飼育した。環境エンリッチメントを実施した。
【０１１１】
試験のサンプリング：本試験は、手術から１５日後に開始した。セボフロウランガス吸入によりラットを１日１回朝麻酔し、全手順中Ｏ２を補給した。以前の麻酔軟膏を用いて各アフェレーシス後に除去した尾静脈カテーテルを使用して、２ｍｌの血液を、抗凝固薬として１．１ｍｇのクエン酸一水和物を含むチューブに移した。血液を混合し、直ちに３０ｋＤａカットオフＣｅｎｔｒｉＣｏｎｅ（登録商標）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して回転させ、ずっと３９℃の加熱フードで保管した。次いでフィルターを後方から、３８℃に予め加熱した０．５ｍｌの等張食塩水で慎重に洗浄した。次にサイズフィルター通過画分を予め洗浄したビーズカラムを通過させ（試験群に従い決定されたＭＥＧまたはＣＴＲＬ）、０．１ｍｌを集め、その後のプール解析のため−８０℃で保存した。処理した残りの血漿は、サイズフィルター溶出液／非通過画分と混合した。得られた処理血液を直ちにカテーテルにより再注入し、この手順を３回繰り返した。偽手術動物は、プラセボカラム（すなわち結合メガリンを含まない）に流した。
【０１１２】
行動のモニタリング：試験の２０日目から３日間の期間、ラットを１日２４時間記録した。記録は、ＰＣ接続されたデジタルビデオカメラ（Ｓｏｎｙ  ＨＤＲ−ＣＸ５５０）でＩＲを用いて行った。保存された画像を検討し、ラットの摂食頻度および性行動（Ｓｉｓｋ  ａｎｄ  Ｍｅｅｋ（２００１）、「Ｓｅｘｕａｌ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒｓ」  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ８．２．１−８．２．１５に記載されている）を、ソフトウェアＳＢＲを用いて定量した（Ｃｌａｒｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｅｈａｖ  ４８（３）：４８９−４９３）。
【０１１３】
結果：８日にわたる２４回のカラム通過で処理された、プール画分のゲルおよびタンパク質含有量を図７に示す。正常な腎機能を持つＳＨＡＭ群と比較して、腎摘出ラットは、血清クレアチニン（ＳＨＡＭ０．８±０．１ｍｇ／ｄｌとＭＥＧ１．８±０．４ｍｇ／ｄｌおよびＣＴＲＬ１．５±０．４ｍｇ／ｄｌ；ＳＨＡＭとそれ以外の群のｐ＜０．０５）、および尿素（２２．７±６．１ｍｇ／ｄｌと４５．０±５．７ｍｇ／ｄｌおよび５７．８±８．２ｍｇ／ｄｌ；ｐ＜０．０５）のレベルが有意に高かった。さらに、図８に示すように、腎摘出していないＳＨＡＭラットと比較して、ＣＴＲＬラットでは性行動および摂食行動がどちらも有意に抑制されたのに対して、ＭＥＧラットではそうではなかった。ＳＨＡＭとＣＴＲＬとの差はすべて有意であったのに対し、ＳＨＡＭとＭＥＧとの差は有意ではなかった。摂食、勃起行動およびｑｕｉｃｋｆｌｉｐ行動は、ＣＴＲＬラットよりＭＥＧラットで有意に（ｐ＜０．０５）よく認められるのに対し、ｌｏｎｇｆｌｉｐ行動の差はこれらの２群間で統計学的に有意ではなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2013532031.tif 000016
2013532031.tif 000017
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