(57)【要約】ヒトのＤ１０Ｓ１２４８およびＤ１２Ｓ３９１遺伝子座における、まれな短縦列反復（ＳＴＲ）対立遺伝子が開示される。各遺伝子座についての代表的なアレリックラダー、これらの対立遺伝子を用いる方法およびアッセイ、および広い範囲の個人の正確な遺伝子型解析および同定のための、これらの対立遺伝子を含むアレリックラダーを含むキットが提供される。一実施形態において、１つ以上の多型短縦列反復遺伝子座の対立遺伝子変異体である、単離された複数の核酸分子を組み合わせて含むアレリックラダーが提供され、ここで、該多型短縦列反復遺伝子座は、対立遺伝子−７を含むＤ１０Ｓ１２４８および対立遺伝子−１３を含むＤ１２Ｓ３９１のうちの少なくとも１つである。
2013511989.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の多型短縦列反復遺伝子座の対立遺伝子変異体である、単離された複数の核酸分子を組み合わせて含むアレリックラダーであって、該多型短縦列反復遺伝子座は、対立遺伝子−７を含むＤ１０Ｓ１２４８および対立遺伝子−１３を含むＤ１２Ｓ３９１のうちの少なくとも１つである、アレリックラダー。
【請求項２】
前記短縦列反復遺伝子座がＤ１０Ｓ１２４８である、請求項１に記載のアレリックラダー。
【請求項３】
前記短縦列反復遺伝子座がＤ１２Ｓ３９１である、請求項１に記載のアレリックラダー。
【請求項４】
Ｄ１０Ｓ１２４８の前記アレリックラダーが、少なくとも１２個の対立遺伝子を含む、請求項２に記載のアレリックラダー。
【請求項５】
Ｄ１２Ｓ３９１の前記アレリックラダーが、少なくとも１４個の対立遺伝子を含む、請求項３に記載のアレリックラダー。
【請求項６】
以下に示される最小および最大の対立遺伝子の指定とともに、下記の遺伝子座：
【表４】
2013511989.tif 000006
のうちの１つ以上についてのアレリックラダーを含む、アレリックラダー混合物。
【請求項７】
前記混合物が、遺伝子座Ｄ１０Ｓ１２４８および遺伝子座Ｄ１２Ｓ３９１についてのアレリックラダーを含む、請求項６に記載のアレリックラダー混合物。
【請求項８】
Ｄ１０Ｓ１２４８の前記ラダーは、７８塩基対以上および／または１２２塩基対以下の範囲の対立遺伝子を含み、かつＤ１２Ｓ３９１の前記ラダーは、２０３塩基対以上および／または２５９塩基対以下の範囲の対立遺伝子を含む、請求項６に記載のアレリックラダー混合物。
【請求項９】
移動度修飾因子をさらに含む、請求項８に記載のアレリックラダー混合物。
【請求項１０】
前記移動度修飾因子がヘキサエチレンオキシド（ＨＥＯ）である、請求項９に記載のアレリックラダー混合物。
【請求項１１】
短縦列反復配列の対立遺伝子を検出および同定するための方法であって、該方法は：
（ａ）遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって標的核酸サンプルから少なくとも１つの短縦列反復配列を増幅する工程であって、少なくとも１つの該短縦列反復配列は、短縦列反復遺伝子座内に位置する、工程、および
（ｂ）増幅された少なくとも１つの該短縦列反復配列と、該短縦列反復遺伝子座に対応する、請求項１に記載のアレリックラダーとを比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記アレリックラダーがＰＣＲによって増幅される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）において、前記遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応によって前記アレリックラダーおよび前記標的核酸サンプルの両方を増幅する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
増幅された前記短縦列反復配列および増幅された前記アレリックラダーを電気泳動し、そして前記サンプルのバンド形成パターンと該アレリックラダーのバンド形成パターンとを比較することによって、増幅された少なくとも１つの該短縦列反復配列と、対応する増幅された該アレリックラダーとを比較する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的核酸サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの１つ以上に由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的核酸サンプルが、犯罪現場から取得されたサンプル、犯罪現場に関連するサンプル、容疑者から採取されたサンプル、参照サンプルまたは検討中のヒトから採取したサンプルのうちの１つ以上である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
核酸から異なる短縦列反復配列を検出するためのアッセイであって、該アッセイは：
ａ．遺伝子座特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって該核酸内から少なくとも２つの異なる短縦列反復配列を同時増幅する（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）工程；ならびに
ｂ．少なくとも２つの同時増幅された該短縦列反復配列と、対立遺伝子−７を含むＤ１０Ｓ１２４８遺伝子座および対立遺伝子−１３を含むＤ１２Ｓ３９１遺伝子座から選択される少なくとも１つのアレリックラダーとを比較する工程であって、少なくとも２つの異なる該短縦列反復配列の各々の対立遺伝子が検出される、工程、
を包含する、アッセイ。
【請求項１８】
前記遺伝子座特異的プライマーが、ＰＣＲで使用される、請求項１７に記載のアッセイ。
【請求項１９】
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも１つが、標識を含む、請求項１８に記載のアッセイ。
【請求項２０】
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも１つが、移動度修飾因子を含む、請求項１９に記載のアッセイ。
【請求項２１】
前記移動度修飾因子がＨＥＯである、請求項２０に記載のアッセイ。
【請求項２２】
サンプル中のＳＴＲを分析する方法であって、該方法は：
該サンプルが、Ｄ１０Ｓ１２４８の対立遺伝子−７を含むか否かを決定する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
前記サンプルと、Ｄ１０Ｓ１２４８の対立遺伝子−７についての標準とを比較する工程を包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記サンプルを核酸増幅反応に供する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記サンプルを、Ｄ１０Ｓ１２４８に対する遺伝子座特異的プライマーを用いて増幅する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも１つが、標識を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも１つが、移動度修飾因子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記移動度修飾因子がＨＥＯである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記標準がアレリックラダーを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記アレリックラダーを核酸増幅反応に供する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アレリックラダーを、Ｄ１０Ｓ１２４８に対する遺伝子座特異的プライマーを用いて増幅する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも１つが、標識を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも１つが、移動度修飾因子を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記移動度修飾因子がＨＥＯである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの１つ以上に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
サンプル中のＳＴＲを分析する方法であって、該方法は：
該サンプルが、Ｄ１２Ｓ３９１の対立遺伝子−１３を含むか否かを決定する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
前記サンプルと、Ｄ１２Ｓ３９１の対立遺伝子−１３についての標準とを比較する工程を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記サンプルを核酸増幅反応に供する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記サンプルを、Ｄ１２Ｓ３９１に対する遺伝子座特異的プライマーを用いて増幅する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも１つが、標識を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも１つが、移動度修飾因子を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記移動度修飾因子がＨＥＯである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記標準がアレリックラダーを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記アレリックラダーを核酸増幅反応に供する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記アレリックラダーを、Ｄ１２Ｓ３９１に対する遺伝子座特異的プライマーを用いて増幅する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも１つが、標識を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも１つが、移動度修飾因子を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記移動度修飾因子がＨＥＯである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの１つ以上に由来する、請求項３７に記載の方法。
【請求項５１】
前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
核酸サンプルに由来する短縦列反復配列を分析するためのキットであって、該キットは、請求項１に記載の１つ以上のアレリックラダーを含む、少なくとも１つの容器を備える、キット。
【請求項５３】
少なくとも１つの多型短縦列反復遺伝子座および前記核酸サンプルの対立遺伝子を増幅する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーペアをさらに備える、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記アレリックラダーが、短縦列反復遺伝子座Ｄ１０Ｓ１２４８のものである、請求項５２に記載のキット。
【請求項５５】
前記アレリックラダーが、短縦列反復遺伝子座Ｄ１２Ｓ３９１のものである、請求項５２に記載のキット。
【請求項５６】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが標識を含む、請求項５３に記載のキット。
【請求項５７】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが移動度修飾因子を含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記移動度修飾因子がＨＥＯである、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
ポリメラーゼ、検出可能なレポーターおよびプロトコールのうちの１つ以上をさらに備える、請求項５２に記載のキット。
【請求項６０】
前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの１つ以上に由来する、請求項５２に記載のキット。
【請求項６１】
前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
核酸サンプルに由来する短縦列反復配列を分析するためのキットであって、該キットは、Ｄ１０Ｓ１２４８の対立遺伝子−７を検出するためのアレリックラダー、および該Ｄ１０Ｓ１２４８遺伝子座から増幅産物を生成するための増幅プライマーの１つのペアを備える、キット。
【請求項６３】
少なくとも１つの増幅プライマーが標識を含む、請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
少なくとも１つの増幅プライマーが移動度修飾因子を含む、請求項６２に記載のキット。
【請求項６５】
前記移動度修飾因子がＨＥＯである、請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
ポリメラーゼ、検出可能なレポーターおよびプロトコールのうちの１つ以上をさらに備える、請求項６２に記載のキット。
【請求項６７】
前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの１つ以上に由来する、請求項６２に記載のキット。
【請求項６８】
前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
核酸サンプルに由来する短縦列反復配列を分析するためのキットであって、該キットは、Ｄ１２Ｓ３９１の対立遺伝子−１３を検出するためのアレリックラダー、および該Ｄ１２Ｓ３９１遺伝子座から増幅産物を生成するための増幅プライマーの１つのペアを備える、キット。
【請求項７０】
少なくとも１つの増幅プライマーが標識を含む、請求項６９に記載のキット。
【請求項７１】
少なくとも１つの増幅プライマーが移動度修飾因子を含む、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
前記移動度修飾因子がＨＥＯである、請求項７１に記載のキット。
【請求項７３】
ポリメラーゼ、検出可能なレポーターおよびプロトコールのうちの１つ以上をさらに備える、請求項６９に記載のキット。
【請求項７４】
前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの１つ以上に由来する、請求項６９に記載のキット。
【請求項７５】
前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、請求項７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一般的に、本開示された発明は、ヒトのＤ１０Ｓ１２４８遺伝子座およびＤ１２Ｓ３９１遺伝子座における新規の短縦列反復（ｓｈｏｒｔ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ）（ＳＴＲ）対立遺伝子の同定に関連する。新規対立遺伝子の発見は、各遺伝子座のより代表的なアレリックラダー（ａｌｌｅｌｉｃ  ｌａｄｄｅｒ）、およびより広い範囲の個人を正確に遺伝子型同定する能力を提供する。
【背景技術】
【０００２】
法医学、父系試験、組織型判定、および個別化医療の分野は、アイデンティティーの決定、遺伝子型解析、表現型予測のために、および疾患の予測および／または予防において、日常的にＤＮＡに基づく技術を使用する。ＤＮＡタイピングは、通常「マーカー」と呼ばれる、関心のある特徴を有するゲノムＤＮＡの対立遺伝子の分析を含む。今日使用されるほとんどのタイピング方法は、集団において少なくとも２つの異なる形態で現れることが公知であるＤＮＡマーカーの、１つ以上の領域の長さおよび／または配列の違いを検出および分析するために的確にデザインされる。そのような長さおよび／または配列の変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、「多型」と呼ばれる。そのような変異が起こるＤＮＡのあらゆる領域（すなわち「遺伝子座」）は、「多型遺伝子座」と呼ばれる。
【０００３】
近年、多型短縦列反復（ＳＴＲ）の、遺伝子マーカーとしての発見および発展が、ＤＮＡタイピングにおいて重要な役割を果たしている。ＳＴＲは、ヒトのアイデンティティーおよび法医学的ＤＮＡ試験の主な手段となった。Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎによって運営されるＣｏｍｂｉｎｅｄ  ＤＮＡ  Ｉｎｄｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＯＤＩＳ）ＤＮＡデータベースは、選択された個人のＤＮＡプロファイル情報を保存する。ＣＯＤＩＳプロファイルは、１３個のＳＴＲマーカー（ＳＴＲ反復を有する１３個の遺伝子座）、２つのさらなる対立遺伝子マーカーおよびＡＭＥＬ、性別決定対立遺伝子を含む。選択されたＤＮＡプロファイルは、多くの可能性のある供給源、例えば有罪判決を受けた犯罪者、逮捕者、行方不明者または身許不明者、および行方不明者参照ＤＮＡ（血縁者）由来であり得る。未同定サンプルのＤＮＡプロファイルを、ＣＯＤＩＳ  ＤＮＡプロファイルと比較することは、潜在的な身許確認照会（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍａｔｃｈ）または、可能性のある加害者の捜査の手掛かりを提供している。
【０００４】
既存の市販のＳＴＲアッセイから生じたＤＮＡプロファイルのマッチングおよび比較は、データベース内およびデータベース間のＤＮＡプロファイルの連続性および比較性、および改善されたＳＴＲアッセイを提供する。遺伝子座由来の増幅された対立遺伝子から構成されるサイズ標準、すなわちアレリックラダーの使用は、データベース、ＳＴＲアッセイ、実験室およびサンプル間の、その遺伝子座に関するＳＴＲ対立遺伝子の比較を可能にして、ＤＮＡプロファイリングシステムの力を増加させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、高度な識別力があり得る、まれな対立遺伝子の同定は、未同定サンプルにおける対立遺伝子の決定をさらに改善する。従って、ヒトＤＮＡ配列における新規ＳＴＲ対立遺伝子の発見に基づいて、ＤＮＡに基づく技術を改善するニーズが、当該分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの実施態様において、単離された複数の核酸分子を組み合わせて含むアレリックラダーが開示され、それは１つ以上の多型短縦列反復遺伝子座の対立遺伝子変異体であり、ここでその多型短縦列反復遺伝子座は、対立遺伝子−７を含むＤ１０Ｓ１２４８、および対立遺伝子−１３を含むＤ１２Ｓ３９１から成る群から選択される。アレリックラダーを用いる方法、アレリックラダーを採用するアッセイ、およびＤ１０Ｓ１２４８およびＤ１２Ｓ３９１  ＳＴＲマーカーに関するアレリックラダーを有するキットも想定される。
【０００７】
本教示のこれらの実施態様および他の特徴は、本明細書中の記載からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、Ｄ１２Ｓ３９１遺伝子座の対立遺伝子１４および２７のＳＴＲ領域を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、そして適当な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数も含み、そして逆もまた同じである。下記で述べるあらゆる定義が、本明細書中で参考として援用されるあらゆる文書を含む、あらゆる他の文書におけるその用語の使用と対立する場合には、反対の意味が明らかに意図されなければ（例えばその用語がもともと使用される文書において）、本明細書およびその関連する特許請求の範囲を解釈する目的のために、下記で述べる定義が常に統制する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、明白におよび明解に１つの指示対象に制限しなければ、複数の指示対象を含むことに注意する。「または」の使用は、他に述べなければ「および／または」を意味する。制限としてではなく例示の目的のために、「Ｘおよび／またはＹ」は、「Ｘ」または「Ｙ」または「ＸおよびＹ」を意味し得る。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、交換可能であり、そして制限することを意図しない。さらに、１つ以上の実施態様の記載が、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例において、その実施態様または複数の実施態様は、代わりに「実質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および／または「〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という言葉を用いて記載し得ることを理解する。「および／または」という用語は、１つまたは全ての列挙した要素または列挙した要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００１０】
本明細書中で使用されるその項の表題は、組織化の目的のためのみであり、そしていかなる方法においても記載された内容を制限するとは解釈されるべきでない。特許、特許出願、記事、書籍、および論文を含むがこれに限らない、本明細書中で引用される全ての文献は、あらゆる目的のためにその全体として明白に参考文献に組込まれる。組込まれた文献のいずれかが、本明細書中で定義されたいずれかの用語と矛盾する場合、本明細書が統制する。本教示は、様々な実施態様と組み合わせて記載されるが、本教示がそのような実施態様に限られることを意図しない。反対に、当業者によって認識されるように、本教示は様々な代替物、改変物、および同等物を包含する。
【００１１】
本発明の実施は、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術および説明を採用し得、それらは当該分野の技術の範囲内である。そのような従来の技術は、オリゴヌクレオチド合成、ハイブリダイゼーション、伸長反応、および標識を用いたハイブリダイゼーションの検出を含む。適当な技術の具体的な説明は、下記の本明細書中の実施例を参照し得る。しかし、他の等価な従来の手順ももちろん使用し得る。そのような従来の技術および説明を、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（第Ｉ−ＩＶ巻）、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌd  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９から）、Ｇａｉｔ、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」１９８４、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＮｅｌｓｏｎおよびＣｏｘ（２０００）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．およびＢｅｒｇら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．のような標準的な実験室マニュアルにおいて見出し得、それらは全て、全ての目的のためにその全体として本明細書中で参考として援用される。
【００１２】
本明細書中で使用される「対立遺伝子」という用語は、遺伝子またはＤＮＡのセグメントに関連する遺伝的変異、すなわち同じ遺伝子座を占めるＤＮＡ配列の、２つ以上の代替形態の１つを指す。
【００１３】
本明細書中で使用される「遺伝子座」という用語は、染色体または核酸分子上の特定の物理的位置を指す。遺伝子座の対立遺伝子は、相同染色体の同一の位置にある。本明細書中で使用される、「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」の複数形「遺伝子座（ｌｏｃｉ）」は、同じまたは異なる染色体のいずれかの特定の物理的位置、ならびにその核酸分子上の同じまたは異なるいずれかの特定の物理的位置を指す。
【００１４】
本明細書中で使用される「アレリックラダー」という用語は、特定のＳＴＲマーカーの、１つ以上の対立遺伝子に関するサイズ標準を含む、核酸サイズ標準を指す。アレリックラダーは、遺伝子座由来の増幅対立遺伝子についての、参照標準および核酸サイズマーカーとしてはたらく。いくつかの実施態様において、そのアレリックラダーは、異なるＳＴＲの対立遺伝子のサイズ標準を含み得る。いくつかの実施態様において、そのアレリックラダーは、ＤＮＡから成り得る。いくつかの実施態様において、そのアレリックラダーは、非天然核酸アナログから成り得る。アレリックラダー中の異なる個々のサイズ標準を、いくつかの実施態様において、検出可能な標識、例えばフルオロフォアで標識し得る。いくつかの実施態様において、そのアレリックラダー構成要素を、同じフルオロフォアで標識する。いくつかの実施態様において、そのアレリックラダー構成要素を、異なるフルオロフォアで標識する。そのサイズ標準を、オリゴヌクレオチドプライマーの特定のペア（または複数のペア）について働くよう選択し得る。例えば、もしマーカーＸのための第１のプライマーセットが、対立遺伝子７に対応する１５０塩基対のアンプリコンを産生するなら、その対応するマーカーは１５０塩基アンプリコンのためのサイズ標準としてはたらく；一方マーカーＸの第２のプライマーペアが、対立遺伝子７に対応する１７５塩基対のアンプリコンを産生するなら、その対応するマーカーは、１７５塩基アンプリコンのためのサイズ標準としてはたらく。従って、同じ対立遺伝子の、異なるサイズのアンプリコンについての異なるサイズ標準が企図される。所定の対立遺伝子由来の所定のアンプリコンのためのサイズ標準は、アンプリコンまたはそのアンプリコンが得られる対立遺伝子の核酸塩基配列と同じまたは異なる核酸塩基配列を有し得る。電気泳動システムにおける対立遺伝子分析のために、そのサイズ標準を、関心のあるアンプリコンと同じ電気泳動移動度を有するように選択し得る。あるいは、いくつかの実施態様において、そのサイズ標準を、関心のあるアンプリコンと異なる電気泳動移動度を有するように選択し得、その差異の性質が予測可能であるとの理解を考慮して、そのアンプリコンのアイデンティティーを決定し得る。質量分析システムにおける対立遺伝子分析のために、そのサイズ標準を（電気泳動移動度ではなく、重量／電荷比）、関心のあるアンプリコンと同じシグナルを有するように選択し得る。あるいは、いくつかの実施態様において、そのサイズ標準を（電気泳動移動度ではなく、重量／電荷比）、関心のあるアンプリコンと異なる分離性質を有するように選択し得、その差異の性質が予測可能であるとの理解を考慮して、そのアンプリコンのアイデンティティーを決定し得る。
【００１５】
本明細書中で使用される「対立遺伝子変異体」という用語は、遺伝子座における２つ以上の対立遺伝子間の変異を指す。対立遺伝子変異体はまた、多型とも呼ばれ得る。
【００１６】
本明細書中で使用する場合、「塩基対モチーフ」という用語は、反復配列、生物学的有意性を有する配列、縦列反復配列等を含むがこれに限らない、核酸塩基配列の構成を指す。
【００１７】
本明細書中で使用する場合、「比較する」という用語は、２つ以上の核酸配列間の違いを広く指す。類似性または差異を、核酸配列決定、配列決定の読み取りの整列、ゲル電気泳動、制限酵素消化、１本鎖コンフォメーション多型等を含むがこれに限らない、様々な方法によって決定し得る。
【００１８】
「検出する」および「検出」という用語は、本明細書中で広い意味で使用され、そして核酸配列の存在を決定し得る、または核酸配列を同定し得るあらゆる技術を包含する。いくつかの実施態様において、検出することは、制限無しに、定量的ＰＣＲ（「Ｑ−ＰＣＲ」）のようなリアルタイム検出方法を含む、核酸からの検出可能なシグナルを定量することを含む。いくつかの実施態様において、検出することは、鋳型として増幅産物を使用して産生した、配列決定産物または配列決定産物のファミリーの配列を決定することを含む；いくつかの実施態様において、そのような検出は、配列決定産物のファミリーの配列を得ることを含む。他の実施態様において、検出することを、核酸増幅産物のサイズを測定することによって達成し得る。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、単離核酸分子、ベクターＤＮＡ、および染色体ＤＮＡのような、当該分野で理解されるような様々な形態におけるデオキシリボ核酸を指す。「核酸」は、あらゆる形態におけるＤＮＡまたはＲＮＡを指す。単離核酸分子の例は、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子、異種性の宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子、部分的にまたは実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡ分子を含むがこれに限らない。典型的には、「単離」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて、天然にその核酸に隣接する配列（すなわち、その核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は一般的に、組換え技術によって産生される場合は実質的に他の細胞物質または培地を含まない、または化学合成される場合は化学的前駆体または他の化学物質を含まない。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「隣接配列」という用語は、短縦列反復配列を含むがこれに限らない、標的核酸配列の５’および／または３’の核酸配列を指す。その隣接配列は、増幅産物内に存在し得るかまたはその外側、すなわち増幅産物に隣接して存在し得る。増幅プライマーを、ＳＴＲマーカーについて特異的な対立遺伝子の指標となるサイズのアンプリコンを産生するように、そのＳＴＲマーカーの変異部分（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ）に隣接する配列にハイブリダイズするよう選択し得る。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「短縦列反復（ＳＴＲ）遺伝子座」という用語は、２から７塩基対の長さの短い反復配列要素を含むゲノムの領域を指す。各配列要素は、ＳＴＲ内で少なくとも１回反復され、そして本明細書中で「反復ユニット」と呼ばれる。ＳＴＲという用語はまた、配列の少なくとも１つがタンデムで少なくとも２回反復される限り、１つ超の反復ユニットがタンデムで、または介在塩基と共に反復する、ゲノムＤＮＡの領域も包含する。ＳＴＲの例は、トリプレットリピート、例えばＡＴＣのタンデム、例えばＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣ（配列番号１）；４−ピート（ｐｅａｔ）（テトラリピート）、例えばＧＡＴＡのタンデム、例えばＧＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＡＣＡＴＡＧＡＴＡ（配列番号２）；および５−ピート（ペンタリピート）、例えばＡＴＴＧＣのタンデム、例えばＡＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＴＴＧＣ（配列番号３）等を含むがこれに限らない。遺伝子マーカーとして使用し得る特定のＳＴＲ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＳＴＲ）についての情報を、特にｗｗｗ．ｃｓｔｌ．ｎｉｓｔ．ｇｏｖ／ｓｔｒｂａｓｅのＳＴＲｂａｓｅにおいて見出し得る。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「不完全（ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ）反復」、「不完全（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ）反復」、および「変異体反復」という用語は、その反復ユニットが、タンデムであるが、１つ以上の反復ユニットの間に配列の妨害（付加または欠失）をその中に有する縦列反復、例えばＡＴＣＧＡＴＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧ（配列番号４）を指し、ここで３番目の反復ユニットが他の反復ユニットと同じではなく、そしてそれゆえ不完全（ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ）反復であり；不完全（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ）反復は、反復ユニット中の塩基対の数が、不完全（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ）な反復である縦列反復として見出され得る、例えばＴＨ０１遺伝子座の対立遺伝子９は、ＴＨ０１遺伝子座の完全反復「ＡＡＴＧ」に関して、９つの４−ピート反復ユニット（［ＡＡＴＧ］９）を含むが、９．３対立遺伝子は、９つの「ＡＡＴＧ」反復および３ヌクレオチドからなる「ＡＴＧ」である１つの不完全（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ）反復、すなわち［ＡＡＴＧ］６ＡＴＧ［ＡＡＴＧ］３という不完全（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ）反復を含む；一方変異体反復は、反復ユニット中に変異（複数可）、例えばＡＴＣＣＡＴＣＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＣＡＴＣＣ（配列番号５）を有し、ここで４−ピート反復ユニットは、反復ユニットの４番目の位置で変異塩基対、「Ｃ」または「Ｇ」ヌクレオチドのいずれかを有する。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「多型短縦列反復遺伝子座」という用語は、ゲノムＤＮＡの特定の領域における反復配列要素の数（および配列の正味の長さ）が、対立遺伝子ごとに、および個人ごとに変動するＳＴＲ遺伝子座を指す。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「縦列反復」という用語は、逐次的な連続物で存在する反復配列を指す。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「縦列反復遺伝子座」という用語は、縦列反復を含む遺伝子座を指す。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「Ｄ１０Ｓ１２４８、対立遺伝子−７」とは、第１０染色体の１０ｑ２６．３のＤ１０Ｓ１２４８遺伝子座に位置する、ＳＴＲマーカーＤ１０Ｓ１２４８を指す。対立遺伝子−７の反復構造は、［ＧＧＡＡ］７であると推定されるが、対立遺伝子−７に変異反復および不完全（ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ）反復を有することも可能である。Ｄ１０Ｓ１２４８、対立遺伝子−７に言及する場合、Ｄ１０Ｓ１２４８、対立遺伝子−７の可能性のある不完全（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ）反復、変異反復、および不完全（ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ）反復も想定される。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「Ｄ１２Ｓ３９１、対立遺伝子−１３」は、第１２染色体のＤ１２Ｓ３９１遺伝子座に位置する、ＳＴＲマーカーＤ１２Ｓ３９１を指す。対立遺伝子−１３の反復構造は、［ＡＧＡＴ］６［ＡＧＡＣ］６［ＡＧＡＴ］と推定される。Ｄ１２Ｓ３９１、対立遺伝子−１３に言及する場合、Ｄ１２Ｓ３９１、対立遺伝子−１３の不完全（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ）反復、変異反復、および不完全（ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ）反復も想定され、それはこのマーカー内の他の対立遺伝子、例えば対立遺伝子１７および１７．３、１９および１９．３、２０および２０’、２１および２１’、２２および２２’、２３および２３’、２４、２４’および２４”、２５および２５’、２６および２６’の間で一般的である。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「増幅する」は、特定のヌクレオチド配列の量を酵素的に増加させる過程を指す。この増幅は、制限されないが、一般的にはＰＣＲによって達成される。本明細書中で使用される場合、「変性」は、２つの相補的なヌクレオチド鎖の、アニーリングした状態からの分離を指す。変性を、例えば緩衝液のイオン強度、温度、または塩基対形成相互作用を破壊する化学物質のような、いくつかの因子によって誘導し得る。本明細書中で使用される場合、「アニーリング」は、ヌクレオチドの鎖間の特異的相互作用を指し、ここでその鎖は、実質的にワトソン−クリック塩基対形成によって決定される鎖間の相補性に基づいてお互いに結合する。アニーリングが起こるために、相補性が１００％である必要はない。本明細書中で使用される場合、「伸長」は、プライマーオリゴヌクレオチドおよび標的核酸がお互いにアニーリングした後の増幅サイクルを指し、ここでそのポリメラーゼ酵素はプライマーの伸長を触媒し、それによって標的核酸を複製鋳型として使用した増幅を可能にする。
【００２９】
「アンプリコン」、「増幅産物」および「増幅配列」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、そして直線的または指数関数的に、ポリヌクレオチド配列を増加させるための広い範囲の技術を指し、そして増幅反応の産物であり得る。アンプリコンは、２本鎖または１本鎖であり得、そして２本鎖増幅産物を変性させることによって得られる、分離した構成要素の鎖を含み得る。特定の実施態様において、１回の増幅サイクルのアンプリコンが、続く増幅サイクルにおける鋳型として作用し得る。代表的な増幅技術は、ＰＣＲまたはプライマー伸長工程を採用するあらゆる他の方法を含むがこれに限らない。増幅の他の制限しない例は、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含むがこれに限らない。増幅方法は、熱サイクリングを含み得る、または等温で行い得る。様々な実施態様において、「増幅産物」および「増幅配列」という用語は、増幅反応の任意のサイクル数に由来する産物を含む。
【００３０】
「遺伝子マーカー」は、一般的に、ＤＮＡタイピングのような分析にとって関心のある特徴を有する、ゲノムＤＮＡ遺伝子座の対立遺伝子であり、ここで個人は、そのＤＮＡにおける変異に基づいて区別される。ほとんどのＤＮＡタイピング方法は、集団において少なくとも２つの異なる形態、または対立遺伝子で現れることが公知であるＤＮＡマーカーの１つ以上の領域の長さおよび／または配列の差を検出および分析するようにデザインされる。そのような変異は、「多型」と呼ばれ、そしてそのような変異が起こるＤＮＡのあらゆる領域は「多型遺伝子座」と呼ばれる。ＤＮＡタイピングを行う１つの可能な方法は、ＰＣＲ増幅技術（Ｋ  Ｂ  Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，２０２号）を、長さ変異多型（ｌｅｎｇｔｈ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の分析と組み合わせることを含む。ＰＣＲは伝統的に、比較的小さいＤＮＡセグメントを信頼性高く増幅するためのみに使用することができる；すなわち長さが３，０００塩基未満のＤＮＡセグメントを増幅することのみに使用することができる（Ｍ．ＰｏｎｃｅおよびＬ．Ｍｉｃｏｌ（１９９２）、ＮＡＲ  ２０（３）：６２３；Ｒ．Ｄｅｃｏｒｔｅら（１９９０）、ＤＮＡ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬ．９（６）：４６１  ４６９）。短縦列反復（ＳＴＲ）、ミニサテライトおよび縦列反復数変異（ＶＮＴＲ）は、長さ変異多型のいくつかの例である。ミニサテライトまたはＶＮＴＲを含むＤＮＡセグメントは一般的に、長すぎてＰＣＲによって信頼性高く増幅できない。対照的に、増幅プロトコールを、ＤＮＡの他の、長さが変異する領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ｒｅｇｉｏｎ）から起こり得るよりも小さい産物を産生するようにデザインし得るので、約３から７個のヌクレオチドの反復ユニットを含むＳＴＲは、十分に短く、ＰＣＲ増幅における遺伝子マーカーとして有用である。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、そして制限無しにヌクレオチド間ホスホジエステル結合、またはヌクレオチド間アナログによって連結した、２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む、ヌクレオチドモノマーの１本鎖および２本鎖ポリマー、および会合対イオン、例えばＨ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋等を指す。ポリヌクレオチドは、全部デオキシリボヌクレオチドから、全部リボヌクレオチドから、またはそのキメラ混合物から成り得、そしてヌクレオチドアナログを含み得る。そのヌクレオチドモノマーユニットは、あらゆるヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。ポリヌクレオチドは、典型的にはサイズが数モノマーユニット、例えば当該分野においてオリゴヌクレオチドと呼ばれることがある５−４０個から、数千のモノマーヌクレオチドユニットまでの範囲である。他に述べなければ、ポリヌクレオチド配列が示される場合はいつでも、そのヌクレオチドは左から右へ５’から３’の順であること、および他に述べなければ、「Ａ」はデオキシアデノシンを意味し、「Ｃ」はデオキシシトシンを意味し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを意味し、「Ｔ」はチミジンを意味し、そして「Ｕ」はデオキシウリジンを意味することが理解される。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「標的ポリヌクレオチド」、「核酸標的」および「標的核酸」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、そして関心のある特定の核酸配列を指す。その「標的」は、増幅しようとするポリヌクレオチド配列であり得、そして他の核酸分子の存在下で、またはより大きな核酸分子中に存在し得る。その標的ポリヌクレオチドを、あらゆる供給源から得ることができ、そしてあらゆる数の異なる組成物の構成要素を含み得る。例えば、その標的は、核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。その標的は、メチル化、非メチル化、または両方であり得る。さらに、「標的ポリヌクレオチド」は、標的ポリヌクレオチド自体、ならびにその代用物、例えば増幅産物、および天然配列を指し得ることが認識される。いくつかの実施態様において、その標的ポリヌクレオチドは、例えば、法医学的サンプルにおいて見出し得るもののような、しかしこれに限らない、分解した供給源由来の短いＤＮＡ分子である（例えばＢｕｔｌｅｒ、２００１、Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  ＤＮＡ  Ｔｙｐｉｎｇ：  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｅｈｉｎｄ  ＳＴＲ  Ｍａｒｋｅｒｓを参照のこと）。本教示の標的ポリヌクレオチドは、多くの供給源のいずれか由来であり得る。これらの供給源は、全血、組織生検材料、リンパ、骨、骨髄、歯、羊水、毛髪、皮膚、精液、肛門分泌物、膣分泌物、汗、唾液、頬側スワブ（ｂｕｃｃａｌ  ｓｗａｂ）、様々な環境サンプル（例えば農業サンプル、水サンプル、および土サンプル）、研究サンプル一般、精製サンプル一般、および溶解した細胞を含み得るがこれに限らない。標的ポリヌクレオチドを、当該分野で公知の様々な手順のいずれか、例えばＰｒｅｐＳＥＱＴＭ  Ｋｉｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、Ｂｏｏｍら、および米国特許第５，２３４，８０９号等を用いて、サンプルから単離し得ることが認識される。標的ポリヌクレオチドを、機械力、超音波処理、制限エンドヌクレアーゼ切断、または当該分野で公知のあらゆる方法などの手順の使用を含んで、分析の前に切断または剪断し得ることが認識される。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」またはＰＣＲは、２本鎖核酸サンプルの鎖を分離する最初の変性工程、続く（ｉ）増幅プライマーが標的配列に隣接する位置に特異的にアニーリングすることを可能にするアニーリング工程；（ｉｉ）プライマーを５’から３’の方向へ伸長し、それによって標的配列に相補的なアンプリコンポリヌクレオチドを形成する伸長工程、および（ｉｉｉ）アンプリコンの標的配列からの分離を引き起こす変性工程の繰り返しから成る、核酸の増幅である（Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＢｉｒｋＨａｕｓｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．（１９９４））。上記の各工程を、好ましくは自動化サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＬＣ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの部門、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて、異なる温度で行い得る。所望の場合、ＲＮＡサンプルをＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖に、または二本鎖ｃＤＮＡに、当業者に公知の方法によって変換し得る。ＰＣＲ法はまた、逆転写酵素ＰＣＲおよびＰＣＲの原理に従う他の反応を含む。
【００３４】
「プライマー」という用語は、標的核酸または「鋳型」、標的領域隣接配列に、または増幅産物の対応するプライマー結合部位に選択的にハイブリダイズし得；そしてそのプライマーの３’末端から、対応するポリヌクレオチド鋳型、隣接配列または増幅産物に相補的な配列の合成を可能にする、ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）およびそのアナログを指す。典型的には、プライマーは長さが約１０から１００ヌクレオチドの間であり得、そして鋳型に相補的なポリヌクレオチドの、鋳型指向性合成の開始点を提供し得、それは適当な酵素（複数可）、補助因子、ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）等のような基質の存在下で起こり得る。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「増幅プライマー」および「オリゴヌクレオチドプライマー」という用語は、交換可能に使用され、そしてそれは、標的配列に隣接するＲＮＡまたはＤＮＡ領域にアニーリングし得、そして当該分野で周知の適当な条件下でＤＮＡ合成のための開始プライマーとして作用し得る、オリゴヌクレオチドを指す。典型的には、ＰＣＲ反応は、「上流」または「前向き」プライマー、および「下流」または「逆向き」プライマーを含む、「オリゴヌクレオチドプライマーペア」とも呼ばれる「増幅プライマーペア」を採用し、それは増幅するＲＮＡまたはＤＮＡの領域の範囲を定める。第１のプライマーおよび第２のプライマーは、前向きまたは逆向きプライマーのいずれかであり得、そして本明細書中で交換可能に使用され、そして制限しない。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「プライマー結合部位」という用語は、ポリヌクレオチド配列の領域、典型的には標的領域に隣接する配列および／またはアンプリコンの領域を指し、その領域は、当該分野で公知のあらゆる適当なプライマー伸長反応（例えばＰＣＲであるがこれに限らない）の場合に、プライマーがアニーリングし得る鋳型として、直接、またはその相補部分（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に基づき作用し得る。２つのプライマー結合部位が、２本鎖ポリヌクレオチドに存在する場合、２つのプライマー結合部位の方向は一般的に異なることが、当業者によって認識される。例えば、プライマーペアの１つのプライマーは、第１のプライマー結合部位と相補的であり、そしてそこにハイブリダイズし得、一方そのプライマーペアの対応するプライマーは、第２のプライマー結合部位の相補部分とハイブリダイズするようデザインされる。言い換えると、いくつかの実施態様において、第１のプライマー結合部位は、センス方向に存在し得、そして第２のプライマー結合部位は、アンチセンス方向に存在し得る。アンプリコンのプライマー結合部位は、標的隣接配列またはその相補部分と同じ配列または少なくともその配列のいくらかを含み得るが、必ずしもその必要はない。
【００３７】
当業者は、標的領域が、特定の増幅手段によって増幅される場合、プライマー結合部位の相補部分は、相補的なアンプリコンまたはアンプリコンの相補鎖において合成されることを理解する。従って、プライマー結合部位の相補部分は、本明細書中で使用されるプライマー結合部位という用語の意図する意味に、明白に含まれるということを理解されたい。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「移動度修飾因子」という用語は、ＰＣＲプライマーの５’末端に結合した色素およびＰＣＲプライマーの５’末端の間の、非ヌクレオチドリンカーを指す。移動度修飾因子の例は、ヘキサエチレンオキシド（ＨＥＯ）のようなオリゴエチレンオキシド移動度修飾因子を含むがこれに限らない（本明細書中で参考として援用される、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、ＮＡＲ  ２２：２５２７−２５３４（１９９４）、米国特許第５，４７０，７０５；５，７０３，２２２および５，９８９，８７１号）。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「核酸サンプル」という用語は、例えば毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、例えば指紋に含まれる皮膚細胞、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液を含むがこれに限らない、本発明による生物学的サンプルにおいて見出される核酸を指す。サンプルを、侵襲的に、または非侵襲的に採取し得ることが企図される。サンプルは、線維、布、タバコ、チューインガム、接着性物質、土または無生物物体上に存在し得、その中に存在し得、その内部に存在し得、それ由来であり得る、またはそれに結合して見出し得る。本明細書中で使用される「サンプル」は、その最も広い意味で使用され、そして核酸を含むことが疑われるサンプルを指し、そして、それは、細胞、細胞から単離された染色体（例えば中期染色体の広がり）、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等を含み得る。サンプルは、細菌、ウイルス、植物、家畜、家内ペット、およびヒトのサンプルを含むがこれに限らない、核酸を含むあらゆる生物を包含する動物または植物起源であり得る。
【００４０】
本明細書中でまた、端点による数字の範囲の指定は、その範囲に包含される全ての数を含む（例えば、１から５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。
【００４１】
本教示の様々な実施態様は、ＳＴＲ、Ｄ１０Ｓ１２４８およびＤ１２Ｓ３９１の新規に発見された対立遺伝子に関連する。請求される発明の実施態様は、Ｄ１０Ｓ１２４８およびＤ１２Ｓ３９１のこれらの新規対立遺伝子の検出のためのアレリックラダーを含む。いくつかの実施態様において、各遺伝子座のアレリックラダーは、Ｄ１０Ｓ１２４８マーカーの対立遺伝子７またはＤ１２Ｓ３９１マーカーの対立遺伝子１３についてのサイズ標準として作用する、単離された複数の核酸分子を組み合わせて有する。遺伝子座内の対立遺伝子は、多型のタンデムに反復する塩基対モチーフを有する核酸分子を含む。遺伝子座内の対立遺伝子を区別するのは、タンデムの反復ユニットの数の変異である。
【００４２】
本明細書中で使用される特定のＳＴＲ遺伝子座に関する用語は、当該分野で公知であるようにこれらの遺伝子座につけられた名前を指す。その遺伝子座は、例えば様々な参考文献において、および以下のリストにおける様々な受託番号によって同定され、それらは全てその全体として本明細書中で参考として援用される。以下の参考文献のリストは、遺伝子座情報の供給源の単なる例として意図される。これらの遺伝子座を含むＤＮＡ領域に関する、およびアレリックラダーの構築のために企図される情報は、公的に入手可能であり、そして以下のまたは他の参考文献および／または受託番号を調べることによって、容易に見出される。適当な場合、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．）によって提供されるような、出願時点現在の受託番号が示される。例えば、遺伝子座Ｄ１０Ｓ１２４８に関して、Ｍ  Ｄ  ＣｏｂｌｅおよびＪ  Ｍ  Ｂｕｔｌｅｒ（２００５）、Ｊ．ＦＯＲＥＮＳＩＣ  Ｓｃｉ．５０（１）：４３−５３、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬ３９１８６９；およびＤ１２Ｓ３９１に関して、Ｍ  Ｖ  Ｌａｒｅｕら（１９９６）、ＧＥＮＥ  １８２：１５１−１５３、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｇ０８９２１を参照のこと。
【００４３】
現在まで、位置１０Ｑ２６．３において第１０染色体の長腕に位置するＤ１０Ｓ１２４８マーカーは、８縦列反復から１９縦列反復の範囲で「ＧＧＡＡ」テトラ−リピートの縦列反復を有する、１２個の対立遺伝子から成ることが報告された（ＮＩＳＴ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ＳＲＤ１３０、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。本教示は、７個の「ＧＧＡＡ」縦列反復を有すると推定される、新規に発見された対立遺伝子−７を包含する。全ての報告された場合において、Ｄ１０Ｓ１２４８の縦列反復は、完全反復である。すなわち、「ＧＧＡＡ」反復が、対立遺伝子−７に関しては７回タンデムで、対立遺伝子−８に関しては８回タンデムで現れる等である。
【００４４】
第１２染色体に位置するＤ１２Ｓ３９１マーカーは、以前１５個の対立遺伝子、および複合反復（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｒｅｐｅａｔ）として示される、さらなる８個のマイクロバリアント対立遺伝子を有することが報告された；［ＡＧＡＴ］８−１７［ＡＧＡＣ］６，８−１０［ＡＧＡＴ］０−１（ＮＩＳＴ、前出）。報告された縦列反復は、１５反復から２６反復の範囲であった。本教示は、Ｄ１２Ｓ３９１についての３つの新規対立遺伝子、それぞれ１３、１４および２７個の縦列反復を有する新規対立遺伝子−１３、−１４、および−２７を提供する。
【００４５】
各遺伝子座についての新規対立遺伝子を、表１にまとめることができる：
【００４６】
【表１】
2013511989.tif 000003
新規に開発されたアレリックラダー内の対立遺伝子を、表２にまとめる。アレリックラダーの構成のために、対立遺伝子型のあらゆる組み合わせが想定されるので、表２で示された対立遺伝子の数は、対立遺伝子反復を完全、不完全（ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ）、変異、または不完全（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ）であるとして区別しない。
【００４７】
【表２】
2013511989.tif 000004
ヒトゲノムＤＮＡの６２４個の集団サンプルの多重スクリーニングの間に、Ｄ１０Ｓ１２４８対立遺伝子−７およびＤ１２Ｓ３９１についての対立遺伝子−１３、−１４、および−２７を、それぞれサンプルＩＢＢ−８３、ＩＢＢ−７２５、ＩＢＢ−９２３およびＩＢＢ−４９６において同定した（Ｉｎｔｅｒｓｔａｔｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮ）。
【００４８】
ＩＢＢ−８３についての電気泳動図は、Ｄ１０Ｓ１２４８マーカーについてのヘテロ接合性（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｃｉｔｙ）を示した。２つのピークは、「トラッキングラダー」の外側にある新規対立遺伝子−７および対立遺伝子−１４のピークを示す。Ｄ１０Ｓ１２４８の対立遺伝子−７を同定するために使用したアレリックラダーは、対立遺伝子８−１８を示す、１１個のサイズ標準を含んでいた。
【００４９】
ＩＢＢ−７２５についての電気泳動図は、その個人はＤ１２Ｓ３９１マーカーに関してヘテロ接合体であることを示した。２つのピークが観察され、１つは新規対立遺伝子−１３を示し、そして「トラッキングラダー」の外側にあり、そして２番目のピークは対立遺伝子−１５を示した。ＩＢＢ−９２３についての電気泳動図は、その個人はＤ１２Ｓ３９１マーカーに関してヘテロ接合体であることを示した。２つのピークが観察され、１つは新規対立遺伝子−１４を示し、そして２番目のピークは対立遺伝子−１８を示した。ＩＢＢ−４９６についての電気泳動図は、その個人はＤ１２Ｓ３９１マーカーに関してヘテロ接合体であることを示した。２つのピークが観察され、１つは対立遺伝子−２３を示し、そして２番目のピークは新規対立遺伝子−２７のものであった。Ｄ１２Ｓ３９１についての対立遺伝子−１３、−１４、および−２７を同定するために使用したアレリックラダーは、対立遺伝子１５−２６を示す１２個のサイズ標準を含んでいた。
【００５０】
いくつかの実施態様において、そのアレリックラダーは、Ｄ１０Ｓ１２４８アレリックラダーおよびＤ１２Ｓ３９１アレリックラダーの少なくとも１つの混合物である。他の実施態様において、そのアレリックラダーは少なくともＤ１０Ｓ１２４８アレリックラダーおよびＤ１２Ｓ３９１アレリックラダーの混合物である。さらに他の実施態様において、そのアレリックラダーは、Ｄ１０Ｓ１２４８アレリックラダーおよびＤ１２Ｓ３９１アレリックラダーの混合物であり、そして表１で示したような本明細書中で開示された新規に同定された対立遺伝子を含む。Ｄ１０Ｓ１２４８ラダーは、７８塩基対（対立遺伝子−７）から１２２塩基対（対立遺伝子−１８）までの範囲の対立遺伝子を含み、そしてＤ１２Ｓ３９１アレリックラダーは、２０３塩基対（対立遺伝子−１３）から２６３塩基対（対立遺伝子−２７）までの範囲の対立遺伝子を含む。Ｄ１２Ｓ３９１の対立遺伝子−１４および対立遺伝子−２７の配列を、プラスミドベクターにクローニングし、そして配列決定した。図１は、対立遺伝子−１４および−２７の配列データを示す。
【００５１】
アレリックラダーの１つの実施態様を、特定のＳＴＲマーカーについてのＳＴＲ変異を代表する対立遺伝子を有する、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの社内ＤＮＡコレクション内の個人を同定することによって構築した。Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＤＮＡコレクションは、１２５１人のＤＮＡサンプルから成る（３９５人のラテンアメリカ人、３５０人の白人、３５０人のアフリカ系アメリカ人、および１５６人のアジア人）。そのＤＮＡを、以前にＡｍｐＦｌＳＴＲ（登録商標）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ（登録商標）キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のような、他の商業的に入手可能なＳＴＲｍｕｌｔｉｐｌｅｘキットによって遺伝子型を同定した。各遺伝子座についての対立遺伝子をまずＰＣＲによって増幅し、そして次いでＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡアプローチ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて細菌にクローニングした。正しい対立遺伝子がクローニングされたことを確認するために、新規に同定された対立遺伝子それぞれの少数のクローンについてのＤＮＡ配列決定を行い得る。Ｄ１２Ｓ３９１対立遺伝子−１４および対立遺伝子−２７の配列決定の結果を、図１に示す。
【００５２】
いくつかの実施態様において、本教示は、標的核酸において、短縦列反復（ＳＴＲ）配列の対立遺伝子を検出および同定するための方法に関連する。いくつかの実施態様において、ＳＴＲ配列の対立遺伝子を検出および同定するための方法は、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、標的核酸から少なくとも１つの短縦列反復配列を増幅することを含む。同じ遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、サンプルおよびマーカーのためのアレリックラダーの両方について使用し、そしてそのプライマーは、Ｄ１０Ｓ１２４８またはＤ１２Ｓ３９１マーカーのいずれかに特異的である。そのＳＴＲ配列は、Ｄ１０Ｓ１２４８またはＤ１２Ｓ３９１いずれかの短縦列反復遺伝子座内に位置する。増幅後、増幅産物の結果として生ずる増幅短縦列反復配列を、増幅したアレリックラダーと比較して、サンプルの増幅産物とアレリックラダー中で見出された対立遺伝子標準とのマッチングに基づいて、対立遺伝子を予想する。いくつかの実施態様において、短縦列反復配列の対立遺伝子を検出および同定するための方法は、標的核酸のＰＣＲ増幅を使用し、そしてオリゴヌクレオチドプライマーペアを採用する。Ｄ１０Ｓ１２４８およびＤ１２Ｓ３９１についてのＰＣＲプライマーペアは、ＳＴＲｂａｓｅから容易に入手可能である、または当業者に日常的な方法によってデザインし得る。
【００５３】
いくつかの実施態様において、増幅産物、すなわち所定の遺伝子座についてのＳＴＲを含むアンプリコンの電気泳動移動度を、別の異なるＳＴＲ遺伝子座アンプリコンの電気泳動移動度の範囲と重複することを避けるために調整し得る。これを、単独で、またはお互いに組み合わせて使用し得る、少なくとも２つの異なるアプローチで行い得る。１つのアプローチにおいて、電気泳動の間、別の遺伝子座の分子量サイズと重複することを避けるために、そのプライマーの位置を、より小さいまたはより大きい増幅産物を生じるように調整する。別のアプローチにおいて、例えばヘキサエチレンオキシド（ＨＥＯ）を含むがこれに限らない移動度修飾因子を、プライマーの５’末端の蛍光色素およびプライマー配列の間の非ヌクレオチドリンカーとして採用し得る。例えば、本明細書中でその全体として参考文献に組込まれる、米国特許第６，３９５，４８６および６，７３４，２９６号を参照のこと。同様に、その増幅プライマーは、その遺伝子座にハイブリダイズしないが、採用される検出方法、例えば電気泳動または質量分析のために、アンプリコンの望ましい移動度を生じるように加えられた、さらなるヌクレオチドを（５’末端に）含み得る。（２つのＰＣＲ産物のうち大きい方の）結果として生ずるＰＣＲ増幅産物は、移動度修飾分子を含み、ＰＣＲ産物の分子量を増加させ、そして従ってより大きなＰＣＲ産物の分子量のより大きなサイズへの認識されたシフトを増加させる。
【００５４】
核酸を分析するための方法は、ＰＣＲによる増幅についての方法と同様、当業者に周知である。ＰＣＲ増幅産物、すなわちアンプリコンの分析は、増幅産物の検出、同定、およびある場合には配列決定、良く確立され、そして当業者に公知である方法を含むがこれに限らない。いくつかの実施態様において、短縦列反復配列の対立遺伝子を検出および同定するための方法は、増幅した短縦列反復増幅配列を、電気泳動によって対応するアレリックラダーと比較することを含む。対立遺伝子の分離のための多くの電気泳動法が当業者に公知であり、そして、それには、変性および非変性ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等が含まれるがこれに限らない。いくつかの実施態様において、対象のアレリックラダーは、電気泳動の間に、増幅した短縦列反復増幅配列と同時に泳動するために利用可能であり、そしてアレリックラダーおよび増幅サンプルのバンド形成パターンを比較する利点を提供する。増幅産物を配列決定するための方法、例えばサンガー配列決定法がよく確立され、そして当業者に公知である。
【００５５】
本教示のいくつかの実施態様において、サンプル中に存在するＳＴＲ対立遺伝子の決定のために１つ以上のサンプルを分析する方法が提供される。いくつかの実施態様において、サンプルがＤ１０Ｓ１２４８の対立遺伝子−７またはＤ１２Ｓ３９１の対立遺伝子−１３を含むかどうかを調べるために、そのサンプルを試験する。いくつかの実施態様において、その方法は、サンプルから核酸を単離すること、およびその核酸をＰＣＲ増幅して増幅産物を産生する事を含む。その増幅産物を次いで１つ以上のアレリックラダーを含むアレリックラダー混合物と比較する。遺伝子座Ｄ１０Ｓ１２４８のために選択されたアレリックラダーは、対立遺伝子−７から−１８、または対立遺伝子−７から−１９までを有し得る。遺伝子座Ｄ１２Ｓ３９１のためのアレリックラダーは、対立遺伝子−１３から−２７を有し得る。
【００５６】
いくつかの実施態様において、分析する標的核酸を含むサンプルは、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液の１つ以上に由来する。いくつかの実施態様において、そのサンプルは、犯罪現場、犯罪現場に関連するサンプル、容疑者から採取したサンプル、参照サンプル、または検討中の（ｕｎｄｅｒ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ）ヒトから採取したサンプル由来であり得る。他の実施態様において、そのサンプルは、考古学的サンプル、母系サンプル、父系サンプル、行方不明者サンプルであり得る。
【００５７】
いくつかの実施態様において、本教示は、上に記載した方法を利用する、核酸サンプル由来の短縦列反復配列を分析するためのキットに関する。いくつかの実施態様において、核酸サンプル中の短縦列反復配列を分析するためのキットは、対立遺伝子−７を含むＤ１０Ｓ１２４８アレリックラダーおよび対立遺伝子−１３を含むＤ１２Ｓ３９１アレリックラダーから成る群から選択される、アレリックラダーを含む少なくとも１つの容器を含む。いくつかの実施態様において、基本的なキットは、少なくとも１つのアレリックラダーを有し得る。そのアレリックラダーは、Ｄ１０Ｓ１２４８またはＤ１２Ｓ３９１に関し得る、またはそのアレリックラダーは、少なくともＤ１０Ｓ１２４８およびＤ１２Ｓ３９１アレリックラダーのアレリックラダー混合物を含み得る。そのキットはまた、例えば１つ以上の以下の構成要素のような、他の任意選択のキット構成要素を有し得る：キットに含まれるアレリックラダー中の少なくとも（ａｔ  ｅａｓｔ）１つの個々のサイズ標準に対応するサイズのアンプリコンを産生するようにマーカーＤ１０Ｓ１２４８を増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマーペア、および標的核酸サンプル、キットに含まれるアレリックラダー中の少なくとも１つの個々のサイズ標準に対応するサイズのアンプリコンを産生するようにマーカーＤ１０Ｓ１２４８を増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマーペア、マーカーＤ１２Ｓ３９１および標的核酸サンプル、増幅のために十分な量の酵素、増幅を促進するための増幅バッファー、酵素活性を促進するための二価の陽イオン溶液、増幅中の鎖伸長のためのｄＮＴＰ、電気泳動のために増幅した物質を調製するための添加溶液（ｌｏａｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、鋳型コントロールとしてのゲノムＤＮＡ、分離媒体において予測されたように物質が移動することを確認するサイズマーカー、および使用者を教育し、そして誤使用を制限するためのプロトコールおよびマニュアル。キット中の様々な試薬の量はまた、そのプロセスの最適な感受性のような多くの因子に依存して変動し得る。手動の適用において使用するための試験キット、または自動化されたサンプル調製、反応設定、検出器または分析器で使用するための試験キットを提供することは、本教示の範囲内である。
【００５８】
当業者は、採用される検出技術は一般的に制限しないことを理解する。むしろ、広く様々な検出手段が、決定すべきアンプリコンの存在または欠如を可能にする限り、それらは、開示された方法およびキットの範囲内である。
【００５９】
本発明の原理を、特定の実施態様に関連して記載したが、これらの記載は、例としてのみなされたものであり、本発明の範囲を制限することを意図していないことが明らかに理解されるべきである。本明細書中で開示されたものは、図解および説明の目的のために提供された。網羅的であること、または開示されたものを、記載された正確な形態に制限することは意図されない。多くの修飾および変化が、当業者に明らかである。開示されたものは、記載された技術の開示された実施態様の原理および実用的な適用を最も良く説明するために選択および記載され、それによって他の当業者が、様々な実施態様および企図される特定の使用のために適当である様々な修飾を理解することを可能にする。開示されたものの範囲は、以下の特許請求の範囲およびその同等のもの（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ）によって規定されることが意図される。
【００６０】
本教示の局面を、以下の実施例を考慮してさらに理解し得、それらはいかなる方法においても本教示の範囲を制限すると解釈されるべきでない。
【実施例】
【００６１】
当業者は、多くの改変物、代替物、および同等物が可能であることを理解する。全てのそのような改変物、代替物、および同等物は、本明細書中に含まれることが意図される。
【００６２】
以下の手順は、サンプル中の標的核酸の単離および増幅、および多型遺伝子座Ｄ１０Ｓ１２４８およびＤ１２Ｓ３９１の短縦列反復配列、およびそれから作製したアレリックラダーの検出、同定、および分析のために採用し得る、試薬および手順の代表である。
【００６３】
サンプルの増幅
実施例Ａ．アレリックラダーの構築
特定のＳＴＲマーカーについての変異の代表である対立遺伝子を有すると同定された個人から血液サンプルを採取し、そして当業者に公知の方法によって、ＤＮＡをその血液サンプルから単離する。関心のある遺伝子座のためのＰＣＲプライマーによって、関心のある対立遺伝子についてのＤＮＡを増幅する。
【００６４】
１．  ２５μｌのＰＣＲ反応物を調製する：
ＤＮＡ鋳型（＞１ｎｇ）  １０．０μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液  ２．５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２．０μｌ
５０ｍＭ  ｄＮＴＰ（０．２ｍＭの各ヌクレオチド３リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ））  ０．１０μｌの各ｄＮＴＰ
プライマー（各１００〜２００ｎｇ）各１μＭ  ０．７５μｌ
ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（１ユニット／μｌ）  １．２５μｌ
水  ８．４μｌ  。
【００６５】
プラスミドＤＮＡを鋳型として用いるなら、より少ないＤＮＡを使用し、そしてゲノムＤＮＡを鋳型として用いるなら、より多いＤＮＡを使用する。
【００６６】
熱サイクリング条件：
９４℃／１１分→３０サイクル［９４℃／１５秒、６０℃／３０秒、７２℃／４５秒］→７２℃／３０分→４℃／維持。全てのＰＣＲ産物が全長であり、そして３’アデニル化されていることを保証するために、最後のサイクル後に７２℃における７から３０分の伸長を含める。そのＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって確認し、そして次いで製造業者の指示に従って、Ｔｏｐｏ（登録商標）ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてプラスミドにクローニングする。
【００６７】
２．  クローニング反応：
【００６８】
【表３】
2013511989.tif 000005
＊終了したら全ての試薬を−２０℃で保存する。塩溶液および水は、室温または＋４℃で保存し得る。
【００６９】
反応物をおだやかに混合し、そして室温（２２〜２３℃）で５分間インキュベートした。そのクローニング反応は、３０秒から３０分まで変動し得る。ＰＣＲ産物の日常的なサブクローニングのために、３０秒が十分であり得るが、大きなＰＣＲ産物（＞１ｋｂ）またはＰＣＲ産物のプールの場合、反応時間の増加は、より多くのコロニーを生じる。インキュベーション後、その反応物を氷上に置いた、または−２０℃で保存した。
【００７０】
３．  コンピテント細胞を形質転換する
Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）  Ｍａｃｈ１ＴＭＴ１ＲケミカリーコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｔｏｇｅｎ）を、ケミカリーコンピテントＥ．ｃｏｌｉのためのクローニング反応を用いて形質転換した。選択プレートは、アンピシリンまたはカナマイシン選択性のいずれかであった。後者は、コロニーを視覚化するために一晩インキュベートすることが必要であった。
【００７１】
Ｓ．Ｏ．Ｃ．培地のバイアルを室温に温め、そして選択プレートを少なくとも３０分間３７℃に温めた。４０μｌの４０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌを、各ＬＢプレートに広げ、そして使用するまで３７℃でインキュベートした。各形質転換のためにＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）細胞の１本のバイアルを解凍し、そして使用するまで氷上に維持した。
【００７２】
Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎのための方法を、販売業者の指示に従って行った。
【００７３】
１．  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）  ケミカリーコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞のバイアルに、２μｌのＴＯＰＯ（登録商標）クローニング反応物を加え、そしておだやかに混合するが、ピペッティングで混合することは避け、そして氷上で５から３０分間インキュベートする。
【００７４】
２．  振とうせずに４２℃で３０秒間細胞に熱ショックを与え、そしてすぐに氷に移す。
【００７５】
３．  ２５０μｌの室温Ｓ．Ｏ．Ｃ．培地を加える。
【００７６】
４．  チューブにふたを固くしめ、そして３７℃で１時間、水平にチューブを振とうする（２００ｒｐｍ）。
【００７７】
５．  水平に振とうした後、各形質転換物からの１０〜５０μｌを、前もって温めた選択プレートに広げる。さらに室温で２０μｌのＳ．Ｏ．Ｃ．を加えて、拡散を促進し得る。２つの異なる容積をプレーティングすることは、２つの選択プレートのうち少なくとも１つで、よく広がったコロニーを有することを助ける。
【００７８】
６．  プレートを３７℃でインキュベートする。アンピシリン選択に関して、青／白スクリーニングによって目に見えるコロニーが８時間後に現れ得、１２時間後に青／白スクリーニングを行う。カナマイシン選択のために、プレートを一晩インキュベートする。
【００７９】
７．  分析のために、濃青色のコロニーは避けて、約１０個の白色または淡青色のコロニーを取る。
【００８０】
選択したコロニーを、大量のＤＮＡが必要である場合には一晩培地で増殖させた、そして／または正しい対立遺伝子がクローニングされたことを確認するために、ＤＮＡ配列決定のために使用した。各対立遺伝子についての高品質のＤＮＡを、プラスミドクローンから単離し、そして増幅した。そのクローン調製（ｃｌｏｎａｌ  ｐｒｅｐ）を、遺伝子座の各対立遺伝子に関して繰り返した。その対立遺伝子調製物を定量化し、典型的な濃度は５０から３５０ｎｇ／μＬの範囲であった。その結果生じた増幅対立遺伝子は、各遺伝子座についてのアレリックラダーの「シード」を形成した。
【００８１】
遺伝子座についてのアレリックラダーの合成は、対立遺伝子シードストックからの希釈物のＰＣＲ増幅の反復プロセス、各対立遺伝子についてのその結果生じたピークの高さを比較すること、ラダーのために最適なピークの高さを決定すること、および最終的にラダー中の各対立遺伝子に関して等しいピークの高さを得るために希釈度を調整することを含む。アレリックラダーの構築は、当業者に公知であり、そして代表的な方法は、米国特許第５，７８３，４０６および７，０８７，３８０号において見出し得、それらはそれぞれアレリックラダーの構築に関して本明細書中で参考として援用される。
【００８２】
熱サイクル条件：９５℃／１１分、３２サイクル（９４℃／２０秒、６１℃／２分、７２℃／２分）、６０℃／７５分、続いて４℃／維持。熱サイクリングを、反応容積を１００μＬに設定し、ＭＡＸ熱サイクリングモードに設定したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ９７００サーマルサイクラ−（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で行った。
【００８３】
試薬の供給業者：
ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、１２×２５０ユニット、Ｇｏｌd  ＢｕｆｆｅｒおよびＭｇＣｌ２溶液付き（Ｐ／Ｎ４３１１８２０、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）
ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ｄＮＴＰブレンド、１００ｍＭ（Ｎ８０８０２６１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
グリコーゲン、イガイ由来、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｐ／Ｎ１０９０１３９３００１）
ＧｅｎＳｃａｎＴＭ６００ＬＩＺＴＭサイズ標準（Ｐ／Ｎ４３６６５８９、Ａｐｐｌｉｅｄ    Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
Ｈｉ−ＤｉＴＭホルムアミド（Ｐ／Ｎ４３１１３２０、Ａｐｐｌｉｅｄ    Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）  。
【図１】
2013511989.tif 000007
【配列表】
2013511989000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年8月9日(2012.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013511989000001.app
【国際調査報告】
2013511989.tif 000008
2013511989.tif 000009
2013511989.tif 000010