(57)【要約】本発明は、ｄａｍにおける１つ又は複数の変異あるいはｄａｍ遺伝子の部分的欠失又は欠失と合わせた、ｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ遺伝子における欠失あるいは１つ又は複数の変異により特徴付けられる細胞の成長を増加させるための方法、得られた細胞、及びその使用に関する。
2013528048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥならびにｄａｍ配列を含む細胞が、ｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍヌクレオチド配列の部分的又は全体的欠失あるいは産生されたＴｌｄＤ及び／又はＴｌｄＥ、ならびにＤａｍタンパク質を不活化する１つ又は複数の変異に供される、原核細胞の成長を増加させるための方法。
【請求項２】
ｄａｍヌクレオチド配列の３’部分の欠失が、Ｄａｍ１−５９ポリペプチドをコードするヌクレオチド１から開始してヌクレオチド１７８までのｄａｍオープンリーディングフレームの５’領域を含むｄａｍ１−１７８配列をもたらす、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞による酢酸産生が、少なくとも１０%、好ましくは３０%低下されている、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
細胞中のグリコーゲン含量が、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも５０倍増加している、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ遺伝子を、ＴｌｄＤ及び／又はＴｌｄＥタンパク質を不活化する１つ又は複数の変異に供する工程を含む、細胞中のプラスミド量を増加させるための方法。
【請求項６】
原核細胞を、ｄａｍヌクレオチド配列の部分的又は全体的欠失あるいは産生されたＤａｍタンパク質の活性を不活化する１つ又は複数の変異に供する工程をさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ遺伝子あるいはｄａｍ遺伝子を、ＴｌｄＤ及び／又はＴｌｄＥ、ならびにＤａｍタンパク質を不活化させる１つ又は複数の変異に供する工程を含む、細胞による酢酸産生を低下させるための方法。
【請求項８】
ｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ遺伝子あるいはｄａｍ遺伝子を、ＴｌｄＤ及び／又はＴｌｄＥ、ならびにＤａｍタンパク質を不活化させる１つ又は複数の変異に供する工程を含む、細胞中のグリコーゲン含量を増加させるための方法。
【請求項９】
細胞を、炭素源を用いて添加した培地中で成長させる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
炭素源が、解糖系の炭素源からなる群より選択されるならびに／あるいはグリセロール、ピルビン酸、及び／又は解糖系サッカライドからなる群より選択される、より好ましくはグルコースである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
原核細胞を、ｃｓｒＡヌクレオチド配列の部分的又は全体的欠失あるいは産生されたＣｓｒＡタンパク質の活性を不活化する１つ又は複数の変異に供する工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
細胞が細菌細胞である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
細菌細胞がエシェリヒア コリ（Escherichia coli）である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
細菌細胞がクロストリジウム属（Clostridium sp.）である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
細菌細胞がスフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）である、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
ｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍヌクレオチド配列が、部分的に又は全体的に欠失される、あるいは、産生されたＴｌｄＤ及び／又はＴｌｄＥ、ならびにＤａｍタンパク質の活性を不活化させる１つ又は複数の変異を含む、組換え細胞。
【請求項１７】
目的の遺伝子産物をコードする外因性インサート又は外因性ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１６記載の組換え細胞。
【請求項１８】
ＣｓｒＡタンパク質の活性を低下させる１つ又は複数の変異にさらに供されている、請求項１６又は１７記載の組換え細胞。
【請求項１９】
原核細胞がエシェリヒア コリ（Escherichia coli）ではない、先行する請求項１６〜１８のいずれかに記載の細胞。
【請求項２０】
ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium sp.）、クロストリジウム属（Clostridium sp.）、スフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）、及びラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）からなる群より選択される、請求項１９記載の細胞。
【請求項２１】
内因性又は外因性化合物の産生のための先行する請求項１６〜２０のいずれかに記載の細胞の使用。
【請求項２２】
グリコーゲンの産生のための先行する請求項１６〜２０のいずれかに記載の細胞の使用。
【請求項２３】
プラスミド産生のための先行する請求項１６〜２０のいずれかに記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、過剰増殖性（組換え）細胞、その調製プロセス、及び、特に目的の分子の産生のためのその使用に関する。
【０００２】
発明の背景及び最先端技術
組換え微生物は、それ自体で（肥料、プロバイオティクス、ワクチンなどの形態で）、又は、安価でフレキシブルな方法での種々の分子（例えばＤＮＡコンストラクト、ポリペプチドなど）の産生のために使用される。
【０００３】
しかし、産生のより良い収率は、高密度での微生物、特に細菌細胞の培養を要求し、困難なままである。
【０００４】
さらに、発酵は、ブロス中での微生物培養の結果であり、酢酸の大規模産生をもたらし（特に解糖がクレブスサイクルをオーバーフローする場合）、今度は、それらの成長を阻害する。
【０００５】
いくつかの可能性が実施された（例えば透析、濾過、及び純酸素添加など）。透析又は濾過による微生物からの酢酸分離は、後者はさらなる成長を許容するが、例えば価格及び培地中の得られた産物の起こりうる希釈などの限定を伴う。酸素添加は、解糖の代わりに酸化的代謝、ならびに酢酸消費を好む。しかし、この方法は、より洗練されたデバイスをバイオリアクターに加えることを要求する。
【０００６】
欧州特許出願ＥＰ０３１６２２９は、低下した酢酸産生ならびに増加した細胞密度及び続く収率を提示する変異エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）株を記載する。しかし、本特許出願において、得られた変異及び影響される経路は、開示されていない。
【０００７】
ｔｌｄｄ及びｔｌｄＥ遺伝子がミクロシンＢ１７プロセシング及び成熟のために必要であるとして同定された（Allali, N., Afif, H., Couturier, M. and Van Melderen, L. (2002) The highly conserved TldD and TldE proteins of Escherichia coli are involved in microcin B17 processing and in CcdA degradation. J. Bacteriol, 184, 3224-3231）。ＴｌｄＤ及びＴｌｄＥタンパク質は多くの真正細菌及び古細菌において高度に保存されているため、これは、それらが他の中心的な役割を有することを示唆する。
【０００８】
ｄａｍ遺伝子（Ｄａｍメチラーゼ）によりコードされるメチラーゼは、Ｓアデノシルメチオニンからのメチル基を、配列ＧＡＴＣ中のアデニン残基のＮ６位置に移す。
【０００９】
Ｄａｍは、特定のエンドヌクレアーゼに対する耐性において、ＤＮＡの修復機構において及び遺伝子発現の制御において含まれる。
【００１０】
発明の概要
本発明は、最先端技術の欠点を提示しない、新たな組換え細胞及びそれらの調製プロセスを提供する。
【００１１】
好ましくは、本発明は、改善された特性（低下した酢酸産生及び酢酸に対する低下した感受性など）を提示するそのような細胞を提供し、細胞は、貴重な生物学的又は化学的な下流産物の産生を改善（増加）させるために、野生型株と比較して、延長した対数増殖期を提示しそしてより高い生存細胞数を生じ、それらは、これらの細胞から得られる内因性及び外因性分子（核酸コンストラクト、ポリペプチド、サッカライド、脂質、ビタミンなど）を意味する。
【００１２】
さらに、本発明は、増加したプラスミド量を有する細胞を提供する。
【００１３】
本発明の第１の局面は、（原核）細胞の成長を改善（増加）させるための方法に関し、それにおいて、（野生型及び／又は機能的）ｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥならびにｄａｍヌクレオチド配列を（天然で）含むこの細胞（野生型細胞）が、前記ｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍヌクレオチド配列の部分的又は全体的欠失あるいはＴｌｄＤ及び／又はＴｌｄＥ、ならびにＤａｍタンパク質（の機能）を不活化させる１つ又は複数の変異に供される。
【００１４】
これらの変異は、これらのｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍヌクレオチド配列における変異（好ましくは、ヌクレオチドの挿入又は欠失を起こす、及び／又は停止コドンを導入する、及び／又は１つのアミノ酸の別のものによる置換を有する翻訳ペプチドをもたらす）、しかし、また、（恐らくは）これらのｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍ配列の下流及び／又は上流で作用し、同じ表現型をもたらすヌクレオチド配列の変異を含む。
【００１５】
好ましくは、Ｄａｍタンパク質を不活化する変異は、その活性を部分的に不活化している。
【００１６】
部分的不活化は、好ましくは、野生型タンパク質のＮ末端部分を保持し、恐らくは、野生型活性と比較してそれほど活性ではないタンパク質を生じるタンパク質の切断を意味する。
【００１７】
本発明に従い、Ｄａｍタンパク質を不活化させる１つの変異は、（好ましくは）ｄａｍ：：ｋａｎ変異である。
【００１８】
有利には、ｄａｍ配列の３’領域の欠失は、ｄａｍ天然配列の５’領域で構成される配列、より好ましくはヌクレオチド１から開始してヌクレオチド１７８までの、天然Ｄａｍタンパク質の５９アミノ末端アミノ酸（Ｅ．  ｃｏｌｉ；配列番号８）で構成されているＤａｍ１−５９と呼ばれるポリペプチドをコードする配列を生じる。
【００１９】
このヌクレオチド配列は、短いｄａｍ配列と呼ばれる。
【００２０】
短いｄａｍ配列（Ｅ．  ｃｏｌｉ；配列番号７）は、ヌクレオチド１７９からヌクレオチド８３７までのｄａｍ天然配列の３’末端を欠く。同じ変異が、ｄａｍ：：ｋａｎ変異体において得られる。
【００２１】
あるいは、ｄａｍ配列における変異は、その活性を完全に不活化させる完全欠失又は変異でありうる。
【００２２】
有利には、（原核）細胞の成長を改善（増加）させるための本方法は、さらに、（原核）細胞を、ｃｓｒＡヌクレオチド配列の３’部分の欠失あるいはこのＣｓｒＡタンパク質の活性を低下させる（部分的に不活化させる）１つ又は複数の変異に供する工程を含む。
【００２３】
好ましくは、ｃｓｒＡ配列の３’領域の欠失は、ｃｓｒＡ天然配列の５’領域で構成される配列、より好ましくはヌクレオチド１から開始してヌクレオチド１５０までの、天然ＣｓｒＡタンパク質の５０アミノ末端アミノ酸で構成されているＣｓｒＡ１−５０と呼ばれるポリペプチドをコードする配列を生じる。
【００２４】
このヌクレオチド配列は、短いｃｓｒＡ配列と呼ばれる。
【００２５】
短いｃｓｒＡ配列は、ヌクレオチド１５１からヌクレオチド１８６までのｃｓｒＡ天然配列の３’末端を欠く。
【００２６】
好ましくは、（原核）細胞の成長を改善（増加）させるためのこの方法において、この（原核）細胞を、炭素源（好ましくは、解糖系の炭素源であるならびに／あるいはグリセロール、ピルビン酸、及び／又は解糖系サッカライドからなる群より選択される、より好ましくはグルコース）を用いて添加した培地中で成長させる。
【００２７】
本発明の関連する局面は、（原核）細胞においてプラスミド量（相対存在量；μgプラスミドＤＮＡ：μg染色体ＤＮＡ）を増加させる方法に関し、（この（原核）細胞の）ｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ遺伝子を、ＴｌｄＤ及び／又はＴｌｄＥタンパク質を不活化する１つ又は複数の変異に供する工程を含む。
【００２８】
好ましくは、プラスミド量を増加させるための方法において、ＴｌｄＤ及び／又はＴｌｄＥを不活化させる１つ又は複数の変異に供した（組換え）細胞のプラスミド量を、コントロール細胞（参照又は野生型細胞）と比較して、少なくとも３倍、好ましくは少なくとも１０倍増加させる。
【００２９】
これらの変異は、ｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥヌクレオチド配列における変異（好ましくは、ヌクレオチドの挿入又は欠失を起こし、ならびに／あるいは停止コドンを導入し、ならびに／あるいは１つのアミノ酸の別のものによる置換を有する翻訳ペプチドをもたらす）、しかし、また、これらのｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ配列の下流及び／又は上流で作用し、同じ表現型をもたらすヌクレオチド配列の変異を含む。
【００３０】
ＴｌｄＤ及び／又はＴｌｄＥタンパク質を不活化させる好ましい変異は、これらのｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ遺伝子の完全欠失である。
【００３１】
好ましくは、プラスミド量を増加させるためのこの方法において、プラスミド量を少なくとも３倍増加させる。
【００３２】
有利には、プラスミド量を増加させるための方法において、プラスミドは低コピー数プラスミドである（即ち、通常の条件下で、５０コピー／細胞未満で、好ましくは、２０コピー／細胞未満で、より好ましくは、１５、１０、９、８、７、６未満、又はさらには５コピー／細胞未満で存在するプラスミド）。
【００３３】
好ましくは、プラスミド量を増加させるためのこの方法は、さらに、（原核）細胞を、ｄａｍ及び／又はｃｓｒＡヌクレオチド配列の部分的又は全体的欠失あるいは産生されたＤａｍ及び／又はＣｓｒＡタンパク質の活性を不活化する１つ又は複数の変異に供する工程を含む。
【００３４】
好ましくは、Ｄａｍ及び／又はＣｓｒＡタンパク質を不活化するこれらの変異は、ｄａｍヌクレオチド配列の３’部分の欠失及び／又はｃｓｒＡヌクレオチド配列の３’部分の欠失であり、切断された（短い）Ｄａｍ及び／又は切断された（短い）ＣｓｒＡタンパク質の産生をもたらす。
【００３５】
好ましくは、プラスミド量を増加させるためのこの方法において、（原核）細胞を、炭素源（好ましくは、解糖系の炭素源からなる群より選択されるならびに／あるいはグリセロール、ピルビン酸、及び／又は解糖系サッカライドからなる群より選択される、より好ましくはグルコース）を添加した培地中で成長させる。
【００３６】
本発明の別の局面は、単離された（精製された）過剰増殖性（組換え）（原核）細胞に関し、それにおいて、ｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍヌクレオチド配列は部分的に又は全体的に欠失しており、あるいは、このｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍヌクレオチド配列を不活化する１つ又は複数の変異を含み（好ましくは、それにおいて、Ｄａｍを不活化するこの変異、例えばｄａｍヌクレオチド配列の３’部分の欠失などは、ヌクレオチド１から開始してヌクレオチド１７８までのｄａｍオープンリーディングフレームの５’領域を含む短いｄａｍ配列、あるいは、Ｄａｍタンパク質を不活化する１つ又は複数の変異、好ましくはｄａｍ：：ｋａｎ変異である）、及び、それにおいて、細胞は、恐らくはさらに、目的の遺伝子産物をコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
恐らくは、この原核細胞はＥ．  ｃｏｌｉではない。
【００３８】
これらの変異は、その発現を回避するためのこれらのｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍヌクレオチド配列における変異、しかし、また、これらのｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍ配列の上流及び／又は下流で作用し、同じ表現型をもたらすヌクレオチド配列の変異を含む。
【００３９】
好ましくは、この細胞は、クロストリジウム属（Clostridium sp.）、スフィンゴモナス属（Sphingomonas sp.）、バチルス属（Bacillus sp.）、及び、恐らくは、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium sp.）、ラクトコッカス属（Lactococcus sp.）の細胞からなる群より選択される。
【００４０】
本発明のさらなる局面は、単離された（精製された）過剰増殖性（組換え）Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞に関し、それにおいて、ｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍ配列（配列番号１、配列番号３、配列番号５）は欠失しており、あるいは、ＴｌｄＤ及び／又はＴｌｄＥ、ならびにＤａｍ活性を不活化する１つ又は複数の変異を含み（好ましくは、それにおいて、Ｄａｍを不活化するこの変異、例えばｄａｍヌクレオチド配列の３’部分の欠失などは、ヌクレオチド１から開始してヌクレオチド１７８までのｄａｍオープンリーディングフレームの５’領域を含む短いｄａｍ配列（配列番号７）、あるいは、Ｄａｍタンパク質を不活化する１つ又は複数の変異（及び／又はｄａｍ：：ｋａｎ変異）である）、及び、それにおいて、細胞は、さらに、目的の遺伝子産物をコードする外因性インサート又は外因性ヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
これらの変異は、その発現を低下又は回避させるためのｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍヌクレオチド配列における変異、しかし、また、これらのｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍ配列の下流及び／又は上流で作用し、同じ表現型をもたらすヌクレオチド配列の変異を含む。
【００４２】
「目的の遺伝子産物又はインサートをコードする外因性ヌクレオチド配列」は、これらの目的の遺伝子産物である生物学的又は化学的化合物（それらは（野生型）細胞において天然に存在しない）の産生に恐らくは含まれるヌクレオチド配列を指し、工業、医学、化粧品、化学、又は環境適用のための利益を提示する。これらの目的の遺伝子産物の非限定的な例は、ヌクレオチド配列（恐らくは、ベクター、例えばプラスミド、ウイルス、又はファージミドなどに含まれる）、サッカライド（ｓａｃｃｃｈａｒｉｄｅｓ）（オリゴ及びポリサッカライドを含む）、脂質（脂肪酸、例えばオメガ３脂肪酸などを含む）、バイオポリマー、酸（酪酸を含む）、ビタミン、炭化水素及び由来する産物（ポリマー、ヘム、酵素及び補酵素、バクテリオシン、抗体を含む）（又はそれらの部分、ナノボディを含む）、ヌクレオチドベースのワクチン組成物、ワクチン接種のための（ポリ）ペプチド（又はそれらの部分、例えばエピトープなど）、ならびに、任意の工業、医学、化粧品、化学、食品関連、又は環境適用のために回収されうる任意のタンパク質である。
【００４３】
有利には、目的の遺伝子産物は、免疫学的に活性な遺伝子産物（免疫抑制性化合物又は免疫刺激性化合物）であり、環境汚染物質の分解において効果的である化合物、好ましくは殺虫的に活性な産物にありうる。
【００４４】
目的の遺伝子産物は、また、ポリペプチド（例えば抗原又は抗原の部分など）、酵素、抗血栓溶解化合物、ホルモン、神経伝達物質、抗体、抗体の部分、ナノボディ、サッカライドの合成に含まれるタンパク質、ビタミン、脂質、重金属の輸送に含まれるタンパク質、ワクチンに対するアジュバントなどを含みうる又はそれらからなりうる。
【００４５】
有利には、これらの過剰増殖性（原核）細胞（野生型及び／又は機能的ＣｓｒＡタンパク質をコードする；Ｅ．  ｃｏｌｉについての配列番号９）は、さらに、ｃｓｒＡヌクレオチド配列の３’部分の欠失あるいはこのＣｓｒＡタンパク質の活性を低下させる（部分的に不活化させる）１つ又は複数の変異に供されている。
【００４６】
好ましくは、ｃｓｒＡ配列の３’領域の欠失は、ｃｓｒＡ天然配列の５’領域で構成される配列、より好ましくはヌクレオチド１から開始してヌクレオチド１５０までの、天然ＣｓｒＡタンパク質の５０アミノ末端アミノ酸で構成されているＣｓｒＡ  １−５０と呼ばれるポリペプチドをコードする配列（Ｅ．  ｃｏｌｉについての配列番号１１）を生じる。
【００４７】
ヌクレオチド配列は、短いｃｓｒＡ配列と呼ばれる。
【００４８】
短いｃｓｒＡ配列は、ヌクレオチド１５１からヌクレオチド１８６までのｃｓｒＡ天然配列の３’末端を欠く。同じ変異がｃｓｒＡ：：ｋａｎにおいて得られる。
【００４９】
さらに、この組換え（原核）細胞は、また、さらに、１つ又は複数の選択マーカーを含みうる。
【００５０】
「選択マーカー」は、選択圧下で細胞に利点を与える遺伝子を指す。
【００５１】
本発明者らは、また、本発明の組換え細胞のグリコーゲン含量が、これらの遺伝子改変を含まないコントロール（野生型）細胞と比較して、１０倍、好ましくは少なくとも５０倍増加することを観察している。
【００５２】
さらに、本発明者らは、本発明の組換え（原核）細胞が、また、他の表現型（例えば低下した酢酸産生など）を提示することを観察している。好ましくは、本発明の組換え（原核）細胞において、酢酸産生は、コントロール（野生型）細胞（これらの遺伝子改変を提示しない細胞）の産生と比較して、好ましくは少なくとも１０%、好ましくは少なくとも１５%、より好ましくは少なくとも２０%低下する。
【００５３】
本発明者らは、本発明の過剰増殖性細胞が、延長した指数関数的成長を提示することを観察しており、それは、その成長が、これらの遺伝子改変を含まないコントロール（野生型）細胞と比較して、少なくとも２５%又は５０%、好ましくは少なくとも７５%、より好ましくは１００%増加することを意味する。
【００５４】
有利には、遅延期間及び世代時間は、本発明に従った過剰増殖性細胞において影響されないままである。
【００５５】
驚くべきことに、酢酸に対する本発明の過剰増殖性細胞の感受性は、また、これらの遺伝子改変を含まないコントロール（野生型）細胞と比較して、好ましくは少なくとも３０%、より好ましくは少なくとも５０%、有利には少なくとも７５%低下する。
【００５６】
従って、本発明の別の局面は、（組換え）細胞による酢酸産生の低下、好ましくは少なくとも１０%、好ましくは少なくとも１５%、より好ましくは少なくとも２０%の低下を得るための方法、及び／又は、酢酸に対するこの細胞の感受性を、天然でｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍヌクレオチド配列を含むコントロール（参照又は野生型）細胞と比較して、少なくとも３０%、より好ましくは少なくとも５０%、有利には少なくとも７５%低下させる方法に関し、それにおいて、この細胞は、このｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍヌクレオチド配列の部分的又は全体的欠失に、あるいは、これらのヌクレオチド配列を不活化させる（即ち、対応するコードタンパク質を不活化させる）１つ又は複数の変異に供される。
【００５７】
本発明は、また、天然でｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍヌクレオチド配列を含むコントロール（参照又は野生型）細胞と比較して、（組換え）細胞のグリコーゲン含量を増加させる（１０倍、好ましくは少なくとも５０倍増加させる）方法に関し、それにおいて、この細胞は、このｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍ配列の部分的又は全体的欠失に、あるいは、これらのヌクレオチド配列を不活化させる（即ち、対応するコードタンパク質を不活化させる）１つ又は複数の変異、例えばｄａｍヌクレオチド配列の３’部分の欠失あるいはＤａｍタンパク質の活性を低下させる（Ｄａｍタンパク質活性を部分的に不活化させる）１つ又は複数の変異などに供される。
【００５８】
逆に、本発明は、グリコーゲンの（増加した）産生のための（本発明の）組換え細胞の使用に関する。
【００５９】
これらの変異は、その発現を回避するためのｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍヌクレオチド配列における変異、しかし、また、これらのｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ、ならびにｄａｍ配列の下流及び／上流で作用し、同じ表現型をもたらすヌクレオチド配列の変異を含む。
【００６０】
好ましくは、ｄａｍ配列を不活化する変異はｄａｍ：：ｋａｎ変異であり、及び／又は、ｄａｍヌクレオチドの３’部分の欠失が、ヌクレオチド１から開始してヌクレオチド１７８までのｄａｍオープンリーディングフレームの５’領域を含むｄａｍ１−１７８配列をもたらす。
【００６１】
本発明に従った方法において、（原核）細胞は、好ましくは、炭素源、好ましくは、解糖系の炭素源からなる群より選択されるならびに／あるいはグリセロール、ピルビン酸、及び／又は解糖系サッカライド（例えばグルコース、フルクトース、スクロース、アラビノース、ガラクトース、又はラクトースなど、より好ましくはグルコース）からなる群より選択される源を添加した培地中で成長させ、より好ましくは、培地にグルコースを添加する。
【００６２】
本発明の別の局面は、目的の分子の合成のための本発明に従った過剰増殖性細胞の使用であり、好ましくは、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列、ポリペプチド（好ましくはインシュリン）、特に抗原又は抗原の部分、酵素（キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、エステラーゼなどを含む）、ホルモン、ビタミン、ヘム、脂質、アミノ酸、酸（例えば酪酸など）、サッカライド（オリゴ及び／又はポリサッカライド）、バイオポリマー、炭化水素、炭水化物（例えばグリコーゲンなど）、抗生物質分子、プラスミド、ウイルス、ファージミド、又はそれらの混合物からなる群より選択される。
【００６３】
本発明に従った過剰増殖性細胞は、また、プロバイオティクス又はバイオレメディエーターとして使用してもよく、本発明の最後の局面は、医薬品、化粧品、栄養補助食品、食品、飼料、又は飲料組成物あるいは本発明に従った細胞を含む廃棄物処理プラントに関する。
【００６４】
本発明に従った過剰増殖性細胞（重要なグリコーゲン貯蔵を提示する）を、生物学的（生分解性）プラスチックの合成のため、生物学的（生分解性）プラスチックバッグ又は「プラスチック」により作製された他のデバイスの製造のために、恐らくは、グリコーゲンを、この生物学的（生分解性）プラスチックの合成のための出発材料として使用することにより、しかし、また、紙（製紙、改善された特性（滑らかさ、白さなど）を伴う紙コーティング・・・）、食品産物（増粘剤及び安定剤として使用される食品添加物）、接着剤及び糊（好ましくは、段ボール接着剤）の製造において、石膏ボード製造プロセスにおいて、繊維化学薬品において（製織の間の糸の破壊を低下させるため、又は、繊維印刷増粘剤として）、印刷工業において（抗セットオフスプレー粉末の製造のため）、及び石油採掘（掘削液の粘度を調整するため）において使用することができる。
【００６５】
本発明の関連する局面は、ＴｌｄＤ及び／又はＴｌｄＥタンパク質をコードするｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥヌクレオチド配列における１つ又は複数の変異に供されている（原核）細胞（例えばＥ．  ｃｏｌｉなど）の使用に関し、これらの変異は、プラスミド量（相対存在量；即ち、μgプラスミドＤＮＡ：μg染色体ＤＮＡ）を増加させるためにこれらのＴｌｄＤ及び／又はＴｌｄＥタンパク質を不活化させる。
【００６６】
これらの変異は、これらのｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥヌクレオチド配列における変異（好ましくは、ヌクレオチドの挿入又は欠失を起こす、及び／又は停止コドンを導入する、及び／又は１つのアミノ酸の別のものによる置換を有する翻訳ペプチドをもたらす）、しかし、また、これらのｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ配列の下流及び／又は上流で作用し、同じ表現型をもたらすヌクレオチド配列の変異を含む。
【００６７】
ＴｌｄＤ及び／又はＴｌｄＥタンパク質を不活化する好ましい変異は、これらのｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ遺伝子の完全欠失である。
【００６８】
好ましくは、これらの変異（原核）細胞において、プラスミド量は少なくとも３倍増加している。
【００６９】
有利には、このプラスミドは低コピープラスミドである（即ち、通常の条件下で、５０コピー未満／細胞、好ましくは、２０コピー未満／細胞、より好ましくは、１５、１０、９、８、７、６未満、さらに５コピー未満／細胞で存在するプラスミド）。
【００７０】
恐らくは、プラスミド量を増加させるためのこの使用において、（原核）細胞は、さらに、Ｄａｍタンパク質を（部分的に）不活化させる１つ又は複数の変異ならびに／あるいはＣｓｒＡタンパク質を（部分的に）不活化させる１つ又は複数の変異に供されている。
【００７１】
好ましくは、Ｄａｍ及び／又はＣｓｒＡタンパク質を不活化させるこれらの変異は、ｄａｍヌクレオチド配列の３’部分の欠失及び／又はｃｓｒＡヌクレオチド配列の３’部分の欠失であり、切断Ｄａｍ及び／又はＣｓｒＡタンパク質の産生をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１である。
【００７３】
発明の詳細な説明
実施例１：本発明に従った株の樹立及び特徴付け
エシェリヒア コリ細胞を操作し、ｔｌｄＤ遺伝子（配列番号１）及び／又はｔｌｄＥ遺伝子（配列番号３）の欠失を有し、さらに、ｄａｍ１−１７８ヌクレオチド配列によるｄａｍ配列（配列番号５）の置換を伴い、ｄａｍ天然配列の３’部分が欠失し、Ｄａｍポリペプチド１−５９（配列番号７及び８）をコードした。この短いｄａｍ１−１７８の配列は
【化１】
2013528048.tif 000003
である。
【００７４】
同様の改変を、対応するヌクレオチド配列を有する他の原核細胞において操作することができる。
【００７５】
ＭＧ１６５５（野生型、実験室Ｋ−１２株）細胞を、ｔｌｄＤ及びｔｌｄＥオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（それぞれデルタｔｌｄＤ変異体及びデルタｔｌｄＥ変異体）を、開始コドンから最後のコドンまで（停止コドンを残す）を、Datsenko及びWannerの方法（Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. Jun 6; 97(12): 6640-5）を使用して除去することにより操作した。
【００７６】
これらの３つの得られた単一変異体は、グルコース又は他の炭素源を添加したＬＢ中又は最少培地中で、対応する野生型細胞株と同じ成長特性を有する。
【００７７】
短い（切断）ｄａｍ配列及びデルタｔｌｄＤ又はデルタｔｌｄＥのいずれかの変異体の組み合わせは、以降、「二重変異体」として言及され、ＬＢ培地中で、野生型株と同程度の成長を、しかし、非常に驚くべきことに、グルコース強化培地中で２倍増加の成長をもたらす。
【００７８】
ｄａｍヌクレオチド配列の３’部分の欠失を提示し、この短い（切断）Ｄａｍポリペプチドをコードする配列ならびにｔｌｄＤ及びｔｌｄＥの両方の配列（遺伝子）欠失を提示する変異体の特徴は、以降、「三重変異体」として言及される。
【００７９】
解糖を通して通過する他の炭素源（即ち、解糖系の炭素源）、例えばアラビノース（フルクトース−６−リン酸を介して）など、及び／又は、他の炭素源、例えばグリセロール及びピルビン酸などの添加は、増加した成長を誘発するが、しかし、解糖系のサッカライド、例えばグルコースなどよりもより小さい程度である。
【００８０】
また、変異株のグリコーゲン貯蔵は、有利には、参照（上に記載するコントロール又は野生型細胞）と比較して、約５０倍増加する。
【００８１】
グリコーゲンの合成は、また、派生するサッカライド（例えば食品工業における一部の有利な適用を見出すマルトデキストリンなど）の産生のための基質として使用することができうる。
【００８２】
非常に驚くべきことは、同じグルコース消費のために、本発明のこれらの二重及び三重（及びさらなる）変異体は、より少ない酢酸、即ち、野生型株（コントロール又は参照）についての０．９g/lに対して０．６g/lを産生するという事実である。
【００８３】
酢酸産生は、K-Acetキット（Megazyme）を使用して測定する。当業者は、他の方法を簡単に見出し、それらを本発明に適応するであろう。
【００８４】
また、非常に驚くことは、野生型株（コントロール又は参照）（成長が０．５g/lで阻害される）との比較において、二重及び三重（及びさらなる）変異体による成長の酢酸阻害に対する増加した耐性（０．９g/lまで）である。
【００８５】
好ましくは、本発明の過剰増殖性細胞（細菌）は、さらに、選択マーカーを含みうる。
【００８６】
実施例２：本発明に従った改変細胞株の使用
本発明に従い、組換え細胞（エシェリヒア コリ株を含む細菌）をさらに開発し、目的のタンパク質を発現するための外因性（細胞中に天然で存在しない外因性配列又はインサート）ヌクレオチド配列を取り込んでいる。有利には、本発明者らは、対応するタンパク質の増加した産生を測定した。
【００８７】
本発明者らは、本発明に従った組換え細菌、好ましくはエシェリヒア コリ株を、ポリペプチド、好ましくはインシュリン、及び酵素（キシログルカナーゼ、リパーゼ、及びエステラーゼを含む）の産生のために使用してきた。
【００８８】
本発明者らは、本発明に従った組換え細菌、好ましくはエシェリヒア コリ株を、アミノ酸（例えばフェニルアラニンなど）の産生のために使用してきた。
【００８９】
本発明者らは、本発明に従った改変細菌を、ペプチド及び非ペプチドホルモンの産生のために使用してきた。
【００９０】
さらに、本発明者らは、本発明に従った組換え細菌を、ビタミン及び補酵素、例えばメナキノン（ビタミンＫ２）など、ビタミンＢ１２、補酵素Ｑ１０及びヘム基の産生のために使用してきた。
【００９１】
本発明者らは、本発明に従った改変細菌を、脂質（特にオメガ３脂肪酸を含むもの）の産生のために使用してきた。
【００９２】
本発明者らは、組換え細菌（例えばクロストリジウム株など）を、ＷＯ２００７／０９５２１５に記載する通りに、酸（例えば酪酸など）の産生のために使用してきた。驚くべきことに、本発明者らは、この組換え細菌の酢酸合成の低下が、増加した成長と合わせて、協力して、酪酸の収量を増加させることを測定した。有利には、本発明者らは、酪酸が、電気分解後にヘキサンに変換されうることに気付いた。
【００９３】
本発明者らは、本発明に従った組換え細菌を、ザントモナス‐カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）によるオリゴ及び／又はポリサッカライド（例えばキサンタンガムなど）のならびに／あるいは他のバイオポリマーの産生のために使用してきた。
【００９４】
本発明者らは、スフィンガニンの増加した産生のための組換えスフィンゴモナス株及び／又はサクシノグリカンポリサッカライドの合成のためのリゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）株を得ている。
【００９５】
本発明者らは、リグノセルロース系バイオマスからのエタノールの増加した産生のために、ＷＯ２００８／０２１１４１に記載するヌクレオチド配列を伴う組換えエシェリヒア コリ株を得ている。
【００９６】
本発明者らは、本発明に従ったエシェリヒア コリ株を得ており、さらに、イソプレノイド脂質の増加した産生のために、ＷＯ２００８／００３０７８に記載するヌクレオチド配列を用いて形質転換している。それらは、これらの方法を他の原核生物（光合成種を含む）に適応する。
【００９７】
本発明者らは、本発明に従ったエシェリヒア コリ株を、さらに、ヌクレオチド配列を用いて、Klocke et al.(Applied Genetics and Molecular Biotechnology, 67, 532-538 (2005)）に記載される通りに、バクテリオシン（エンテロシンＡ及びＢ）の産生のために改変している。
【００９８】
本発明者らは、本発明に従ったエシェリヒア コリ株を、組換えヌクレオチド配列を含みうるプラスミド又はそのフラグメントの増加した産生のために改変している。
【００９９】
当業者は、また、プロバイオティクス（適当な量で投与された場合、宿主、特に、ヒトを含む哺乳動物に対する健康利益を付与する生きた微生物）又はバイオレメディエーターとして使用される細菌株を改変しうる。
【０１００】
当業者は、本発明に従った改変細菌を、免疫刺激特性を持つＤＮＡフラグメント配列（例えばＣｐＧリッチ配列など）及び恐らくはサッカライド誘導体をさらに単離することにより、ワクチンに対するアジュバントの増加した産生のために使用しうる。
【０１０１】
工業的プロセスにおいて有用な増加した成長の他、本発明者らは、インビボでのプロバイオティクス微生物の増加した成長に気付いた。
【０１０２】
実施例３：本発明に従った改変細胞株と他の過剰増殖性細胞との比較及び別の過剰増殖性細胞の開発
本発明者らは、さらに、ｔｌｄＤ及びｔｌｄＥ欠失ならびにＤａｍ切断に供されている本発明の過剰増殖性細胞と、本発明者らが以前に開発している、ｔｌｄＤ及びｔｌｄＥ欠失ならびにＣｓｒＡ切断に供されている別の過剰増殖性細胞との比較を実施している。本発明者らは、さらに、全てのこれらのｔｌｄＤ、ｔｌｄＥ、Ｄａｍ、ＣｓｒＡ変異を組み合わせている。
【０１０３】
本発明者らは、本発明の過剰増殖性細胞が、本発明者らが以前に開発した細胞より優れていることを見出した。実際に、測定されたＯＤ６００は、本発明の過剰増殖性細胞について約２０%高かった（図１も参照のこと）。
【０１０４】
本発明者らは、さらに、変異の組み合わせが、変異の追加により悪影響を及ぼされる代わりに、さらに１０〜２０%の追加のＯＤ６００値を有することに気付いた。
【０１０５】
実施例４：細胞中でのプラスミド量を増加させるための方法
本発明者らは、ｔｌｄＤとｔｌｄＥ遺伝子における変異及び／又はＤａｍ遺伝子における変異が、細胞当たりの低下したプラスミドのコピー数をもたらしうるか否かをチェックしている。本発明者らは、対応する野生型細胞との比較により、変異細胞におけるプラスミド含量について探索した。
【０１０６】
Ｄａｍ変異（例えば本発明の切断Ｄａｍなど）と組み合わせたＴｌｄＤ及び／又はＴｌｄＥ変異を有し、グルコース（０４%；ｗ：ｖ）含有ＬＢ培地中で成長させた（過剰増殖性）細胞における低下したプラスミド含量の代わりに、本発明者らは、細胞（染色体）ＤＮＡに対して標準化されたプラスミド量（即ち、相対存在量）の３から２０倍増加を測定した。
【０１０７】
本発明者らは、さらに、低コピー数プラスミド（例えば５０、２０、１５、１０、又はさらに５コピー未満／細胞を伴うプラスミドなど）について、より高い値（２０%から１００%の追加増加）に向かう傾向に気付いた。
【０１０８】
本発明者らは、次に、これらの結果を、ｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥ変異（例えばｔｌｄＤ及び／又はｔｌｄＥの完全欠失など）に供された、しかし、Ｄａｍ又はＣｓｒＡタンパク質における変異に供されていない細胞を使用して得られた結果と比較した。本発明者らは、このＴｌｄＤ及びＴｌｄＥ変異細胞でさえ、増加したプラスミド量の同じ表現型を有することを見出したが、増加した量は、計算を、細胞ＤＮＡを用いて標準化した場合、野生型細胞の量のわずか３から５倍の量であった。
【０１０９】
当業者は、本発明を、他の微生物に、及び、他の工業的適用に簡単に適応しうる。
【図１】
2013528048.tif 000004
【配列表】
2013528048000001.app
【国際調査報告】
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2013528048.tif 000006
2013528048.tif 000007
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