(57)【要約】  本発明は、バイオマーカーとしてオリゴマー状態のアミロイドβの断片を使用する、アルツハイマー病の検出及び診断に関し、さらに生物学的試料中のオリゴマー状態のアミロイドβの断片を測定するための新規方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病及び軽度認知障害などの神経変性疾患を診断する又は監視する方法であって、被験対象由来の生物学的試料中のオリゴマー状態の標的アミロイドβペプチド(Aベータ又はAβ)を測定することを含み、以下の工程：
(a) 生物学的試料中の標的Aβペプチドの第1の濃度(ca)を測定すること；
(b) 工程(a)から得られた標的Aβペプチドを脱凝集すること；
(c) 該脱凝集したAβペプチドの第2の濃度(cd)を測定すること；及び
(d) 第2の濃度(cd)の値を第1の濃度(ca)の値で割った、cd/ca比を決定すること；
を含むことを特徴とし、
ここで、cd/ca比が1.5より低いことが、神経変性疾患の陽性診断を示す、前記方法。
【請求項２】
前記脱凝集工程(b)が、アルカリの使用を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程(b)の脱凝集に使用されるアルカリが、500mMの水酸化ナトリウムなどの水酸化ナトリウムである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記脱凝集工程(b)が、メタノール、特に50％(v/v)メタノールなどの適当な溶媒の使用をさらに含む、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記脱凝集工程(b)が、インキュベーション工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記脱凝集工程(b)が、室温で少なくとも2分間のインキュベーション工程を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記脱凝集工程(b)が、室温で少なくとも10分間のインキュベーション工程を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
1.3未満など、1.4よりも低いcd/ca比が、神経変性疾患の陽性診断を示す、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
1.1未満など、1.2よりも低いcd/ca比が、神経変性疾患の陽性診断を示す、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記標的Aβペプチドが、配列番号13のAβ(3-38)のアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記標的Aβペプチドが、配列番号19のAβ(11-38)のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記標的Aβペプチドが、その機能的等価物を含むAβ(x-y)であり、ここで、xが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び11から選択される整数と定義され、かつyが38、39、40、41、42及び43から選択される整数と定義される、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
xが1、特に11など、1、2、3及び11から選択される整数である、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
yが40、特に38など、38、40又は42から選択される整数である、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
前記標的Aβペプチドが、その機能的等価物を含む配列番号1〜24からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記標的Aβペプチドが、その機能的等価物を含む配列番号2のAβ(1-40)である、請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記標的Aβペプチドが、その機能的等価物を含む配列番号1のAβ(1-42)である、請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記標的Aβペプチドが、その機能的等価物を含む配列番号2のAβ(1-40)及び配列番号1のAβ(1-42)を含む、請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記標的Aβペプチドが、その機能的等価物を含む配列番号13〜24からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記標的Aβペプチドが、その機能的等価物を含む配列番号13のAβ(3-38)である、請求項１〜１５及び１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記標的Aβペプチドが、その機能的等価物を含む配列番号19のAβ(11-38)である、請求項１〜１５及び１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記標的AβペプチドのN-末端のグルタミン酸残基が、ピログルタミン酸に環化されている、請求項１９〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記標的Aβペプチドが、その機能的等価物を含む配列番号1〜6からなる群から選択され、アミノ酸位置1及び/又は7のアスパラギン酸残基が、イソアスパラートに変換されている、請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
前記標的Aβペプチドが、その機能的等価物を含む配列番号7〜12からなる群から選択され、アミノ酸位置6のアスパラギン酸残基が、イソアスパラートに変換されている、請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記標的Aβペプチドが、その機能的等価物を含む配列番号13〜18からなる群から選択され、アミノ酸位置5のアスパラギン酸残基が、イソアスパラートに変換されている、請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
前記生物学的試料が、血液、血清、尿、脳脊髄液(CSF)、血漿、リンパ液、唾液、汗、胸水、滑液、涙液、胆汁、及び膵分泌物からなる群から選択される、請求項１〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的試料が血漿である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
標的Aβペプチドの濃度を測定する工程が、以下の工程：
i) 生物学的試料を少なくとも2つの異なる捕捉抗体と接触させること；
ii) 得られた免疫複合体を検出すること；
iii) 該免疫複合体を破壊すること；及び
iv) 捕捉されたAβペプチドを定量すること
を含む、請求項１〜２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも2つの異なる捕捉抗体が、それぞれ前記Aβペプチドの異なるエピトープに特異的である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記捕捉抗体が、下記からなる群から選択される、請求項２８又は２９記載の方法：
3D6、エピトープ：1-5、
pAb-EL16、エピトープ：1-7、
2H4、エピトープ：1-8、
1E11、エピトープ：1-8、
20.1、エピトープ：1-10、
ウサギ抗Aβポリクローナル抗体、エピトープ：1-14(Abcam)、
AB10、エピトープ：1-16、
82E1、エピトープ：1-16、
pAb1-42、エピトープ：1-11、
NAB228、エピトープ：1-11、
DE2、エピトープ：1-16、
DE2B4、エピトープ：1-17、
6E10、エピトープ：1-17、
10D5、エピトープ：3-7、
WO-2、エピトープ：4-10、
1A3、エピトープ 5-9, 
pAb-EL21、エピトープ5-11、
310-03、エピトープ5-16、
ニワトリ抗ヒトAβポリクローナル抗体、エピトープ12-28(Abcam)、
ニワトリ抗ヒトAβポリクローナル抗体、エピトープ25-35(Abcam)、
ウサギ抗ヒトAβポリクローナル抗体、エピトープ:N-末端(ABR)、
ウサギ抗ヒトAβポリクローナル抗体(Anaspec)、
12C3、エピトープ10-16、
16C9、エピトープ10-16、
19B8、エピトープ9-10、
pAb-EL26、エピトープ:11-26、
BAM90.1、エピトープ:13-28、
ウサギ抗β-アミロイド(パン)ポリクローナル抗体、エピトープ:15-30(MBL)、
22D12、エピトープ:18-21、
266、エピトープ:16-24、
pAb-EL17;エピトープ:15-24、
4G8、エピトープ:17-24、
ウサギ抗Aβポリクローナル抗体、エピトープ:22-35(Abcam)
G2-10;エピトープ:31-40、
ウサギ抗Aβ、aa 32-40ポリクローナル抗体(GenScript Corporation)、
EP1876Y、エピトープ:x-40、
G2-11、エピトープ:33-42、
16C11、エピトープ:33-42、
21F12、エピトープ:34-42、
1A10、エピトープ:35-40、及び
D-17ヤギ抗Aβ抗体、エピトープ:C-末端、
pyro-Glu Aベータ抗体、Probiodrug AG、
Aβ5-5-6、
Aβ6-1-6、
Aβ17-4-3、
Aβ24-2-3、
Pyro-Glu Aベータ抗体クローン2-48(モノクローナル、マウス)；Synaptic Systems、
Pyro-Glu Aベータ抗体(ポリクローナル、ウサギ)；Synaptic Systems、
Pyro-Glu Aベータ抗体クローン8E1(モノクローナル、マウス)；Anawa、
Pyro-Glu Aベータ抗体クローン8E1(モノクローナル、マウス)；Biotrend、
抗-ヒトアミロイドβ(N3pE)ウサギIgG(ポリクローナル、ウサギ)；IBL、
抗-ヒトAβN3pE(8E1)マウスIgG Fab(モノクローナル、マウス)；IBL、
イソAsp抗体(T. Saidoのグループ)。
【請求項３１】
前記捕捉抗体が、3D6、BAN50、82E1、6E10、WO-2、266、BAM90.1、4G8、G2-10、1A10、BA27、11A5-B10、12F4、及び21F12からなる群から選択される、請求項２８〜３０のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
下記の抗体ペアが、捕捉抗体として使用される、請求項２８〜３１のいずれか一項記載の方法：
4G8及び11A5-B10、
3D6及び4G8、
6E10及び4G8、
82E1及び4G8、
4G8及び12F4、
4G8及び21F12、
3D6及び21F12、
6E10及び21F12、
BAN50及び4G8、
3D6及び11A5-B10、
3D6及び1A10、
3D6及びBA27、
6E10及び11A5-B10、
6E10及び1A10、
6E10及びBA27、
4G8及び11A5-B10、
4G8及び1A10、
4G8及びBA27、
4G8及び12F4、並びに
4G8及び21F12。
【請求項３３】
前記複合体の検出が、各捕捉抗体と特異的に反応する二次抗体を用いることによって実施される、請求項３０〜３２のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
前記二次抗体が、抗マウス抗体又は抗ウサギ抗体である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記二次抗体が標識されている、請求項３３又は３４記載の方法。
【請求項３６】
前記二次抗体が磁気ビーズ上に固定されている、請求項３３又は３４記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫複合体を担持する前記磁気ビーズが、磁気分離装置を用いて前記生物学的試料から分離される、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記免疫複合体の破壊が、50％(v/v)メタノール/0.5％(v/v)ギ酸の存在下で行なわれる、請求項３０〜３７のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
前記検出された免疫複合体が定量される、請求項３０〜３８のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
前記捕捉されたAβペプチドが、サンドイッチELISA、アミロイドβ1-40 HTRF(登録商標)アッセイ、Alphascreen(商標)アッセイ、マルチプレックスアッセイシステム、質量分析、及びウェスタンブロット解析からなる群から選択される定量手段によって定量される、請求項３０〜３９のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
前記捕捉されたAβペプチドが、定量手段としてのサンドイッチELISAによって定量される、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記サンドイッチELISAが、Aβ(x-y)の完全なN-末端に特異的である第1の抗体；及びAβ(x-y)のアミノ酸yで終わるC-末端に特異的である検出抗体を含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記サンドイッチELISAが、配列番号2のAβ(1-40)の完全なN-末端に特異的である第1の抗体；及び配列番号2のAβ(1-40)のアミノ酸40で終わるC-末端に特異的である検出抗体を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記サンドイッチELISAが、配列番号1のAβ(1-42)の完全なN-末端に特異的である第1の抗体；及び配列番号1のAβ(1-42)のアミノ酸42で終わるC-末端に特異的である検出抗体を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
前記サンドイッチELISAが、配列番号2のAβ(1-40)のC-末端に特異的である第1の抗体；及び配列番号2のAβ(1-40)のAsp-Ala-Gluで始まる完全なN-末端に特異的である検出抗体を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
前記サンドイッチELISAが、配列番号1のAβ(1-42)のC-末端に特異的である第1の抗体；及び配列番号1のAβ(1-42)のAsp-Ala-Gluで始まる完全なN-末端に特異的である検出抗体を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４７】
前記サンドイッチELISAが、配列番号13〜24からなる群から選択されるAβ標的ペプチドの完全なN-末端に特異的である第1の抗体；及び該配列番号13〜24からなる群から選択されるAβ標的ペプチドのC-末端に特異的である検出抗体を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４８】
前記サンドイッチELISAが、配列番号13のAβ(3-38)の完全なN-末端に特異的である第1の抗体；及び配列番号13のAβ(3-38)のアミノ酸38で終わるC-末端に特異的である検出抗体を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４９】
前記サンドイッチELISAが、配列番号19のAβ(11-38)の完全なN-末端に特異的である第1の抗体；及び配列番号19のAβ(11-38)のアミノ酸38で終わるC-末端に特異的である検出抗体を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項５０】
前記配列番号13〜24からなる群から選択されるAβ標的ペプチドのN-末端が、ピログルタミン酸に環化されており、前記第1の抗体が、該配列番号13〜24からなる群から選択される前記Aβ標的ペプチドのピログルタミン酸形態を特異的に検出する、請求項４７〜４９のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
前記第1の抗体が固定されている、請求項４２〜５０のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
前記検出抗体が標識されている、請求項４２〜５１のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
Aβ(x-y)の定量のためのELISAキットが用いられる、請求項４２記載の方法。
【請求項５４】
前記ELISAキットが、アミロイド-β(1-40)(N)ELISA(IBL, JP27714)；Aβ[1-40]ヒトELISAキット(Invitrogen)；ヒトアミロイドベータ(アミロイド-b)、aa 1-40 ELISAキット(Wako Chemicals USA, Inc.)；及びアミロイドベータ1-40 ELISAキット(The Genetics Company)からなる群から選択される、配列番号2のAβ(1-40)の定量のためのELISAキットである、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記ELISAキットが、アミロイド-β(1-42)(N)ELISA(IBL, JP27712)；Aβ[1-42]ヒトELISAキット(Invitrogen)；ヒトアミロイドベータ(アミロイド-β)、aa 1-42 ELISAキット(Wako Chemicals USA, Inc.)；アミロイドベータ1-40 ELISAキット(The Genetics Company)；INNOTEST(登録商標)β-アミロイド(1-42)(Innogenetics)からなる群から選択される、配列番号1のAβ(1-42)の定量のためのELISAキットである、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
アルツハイマー病の鑑別診断のための、請求項１〜５５のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
アルツハイマー病の初期段階の診断のための、請求項１〜５５のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
軽度認知障害の診断のための、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
アルツハイマー病の診断のための、請求項１０〜２５のいずれかに定義される標的AβペプチドなどのオリゴマーAβペプチドの使用。
【請求項６０】
アルツハイマー病の鑑別診断のための、請求項５９記載の使用。
【請求項６１】
アルツハイマー病の初期段階の診断のための、請求項５９又は６０記載の使用。
【請求項６２】
軽度認知障害の診断のための、請求項６１記載の使用。
【請求項６３】
生物学的試料中のオリゴマー状態の標的アミロイドβペプチド(Aベータ又はAβ)を測定する方法であって、以下の工程：
(a) 生物学的試料中の標的Aβペプチドの第1の濃度(ca)を測定すること；
(b) 工程(a)から得られた標的Aβペプチドを脱凝集すること；
(c) 該脱凝集したAβペプチドの第2の濃度(cd)を測定すること；及び
(d) 第2の濃度(cd)の値を第1の濃度(ca)の値で割った、cd/ca比を決定すること；
を含み、
ここで、cd/ca比が1を上回ることが、オリゴマーAβの存在を示す、前記方法。
【請求項６４】
前記脱凝集工程(b)が、アルカリの使用を含む、請求項６５記載の方法。
【請求項６５】
請求項６３又は６４記載のオリゴマー状態のアミロイドβペプチドを測定する方法が使用される、インビトロでアルツハイマー病を診断する方法。
【請求項６６】
アルツハイマー病などの神経変性疾患を診断するキットであって、適当なアルカリ及び請求項１〜５５のいずれか一項記載の方法に従い該キットを使用するための指示書を含む、前記キット。
【請求項６７】
アルツハイマー病などの神経変性疾患を有する、有する疑いのある、又はそれに罹患しやすい対象における治療の効果を監視する方法であって、被験対象由来の生物学的試料中の請求項１〜５５のいずれか一項に記載のオリゴマー状態の標的アミロイドβペプチド(Aベータ又はAβ)を測定することを含む、前記方法。
【請求項６８】
被験対象から2回以上採取された生物学的試料中のオリゴマー状態の標的アミロイドβペプチドを測定することを含む、請求項１〜５５又は６７のいずれか一項記載の診断又は監視方法。
【請求項６９】
前記2回以上採取された生物学的試料中のオリゴマー状態の標的アミロイドβペプチドのレベルを比較することを含む、請求項６８記載の診断又は監視方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、オリゴマー状態のアミロイドβの断片のバイオマーカーとしての使用を伴うアルツハイマー病の検出及び診断に関し、さらに、生物学的試料中のオリゴマー状態のアミロイドβの断片を測定するための新規の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
アルツハイマー病は、認知症の最も一般的な形態であり、全認知症障害の中で約65〜70％の罹患率を有する(Blennowらの文献, 2006)。平均寿命の延長に起因して、この疾患は、日本及び中国のような高度先進工業国、並びに米国及び欧州で特別な問題になっている。アルツハイマー患者の数は、2001年の2400万人から2040年には8100万人に増加すると推定されている(Ferriらの文献, 2005)。現在、全世界のAD患者の治療及び介護の費用は、年間約2500億米ドルに達する。
【０００３】
散発型のアルツハイマー病の進行は比較的緩徐であり、この疾患は、最初の症状の発症後、通常約10〜12年間持続する。現在、信頼できる早期のAD診断を行ない、それを認知症の他の形態と区別することは極めて困難である。90％を上回る信頼度の正確な診断は、この疾患の後期にのみ可能となる。それ以前は、アルツハイマー病の可能性があるか又はその可能性が高いことを予測することしかできず、その場合の診断は、Knopmanらの文献, 2001；Waldemarらの文献, 2007、又はDuboisらの文献, 2007による特定の基準の使用に頼っている。しかしながら、神経変性は、最初の臨床症状が認められる20〜30年前に始まる(Blennowらの文献, 2006；Jellinger KAの文献, 2007)。臨床期の開始は、通常、いわゆる「軽度認知障害」(MCI)によって特徴付けられる。この場合、患者は、測定可能な認知欠陥を示すが、この欠陥は、明確な形での認知症疾患の診断を可能にするほど十分でない(Petersenらの文献, 1999；Chetkowらの文献, 2008)。MCIを有する多くの患者はADに典型的な神経病理学的変化を有するが、この変化は、ADの初期段階の可能性はあるが、確実ではないことを意味する(Scheffらの文献, 2006；Markesberyらの文献, 2006；Bouwmanらの文献, 2007)。しかしながら、アルツハイマー病に進行しないMCI症例が多数ある。こうした症例では、他の因子が認知欠陥の原因となっている(Saitoらの文献, 2007；Jichaらの文献, 2006、及びPetersenらの文献, 2006)。その状態の悪化を全く示さないか又はある種の改善すら示すMCI患者もいるが、ほとんどのMCI症例の場合、認知欠陥は臨床的認知症に進む。この転換の年率は、約10〜19％である(Gauthierらの文献, 2006；Fischerらの文献, 2007)。現在、軽度認知障害の様々な亜型を識別することができる臨床的過程、神経心理学的過程、及び画像診断過程の組合せがある(Devanandらの文献, 2007；Rossiらの文献, 2007；Whitwellらの文献, 2007；Panzaらの文献, 2007)。しかしながら、認知症のさらなる進行に関して、これらの亜型間に顕著な違いはない(Fischerらの文献, 2007)。したがって、初期段階で、好適には、その発症時に又はMCIの間に、アルツハイマー病の明確でかつ信頼できる診断を可能にする方法を開発することが最も重要である。
【０００４】
(先行技術のバイオマーカー)
アルツハイマー病のバイオマーカーは先行技術で既に記載されている。例えば、ADAS-cog、MMSE、DemTect、SKT、又は時計描画テストのような周知の心理テストとともに、バイオマーカーは、最初の診断の診断感度及び特異性を改善するだけでなく、疾患の進行を監視するとも考えられている。AD/MCIのバイオマーカーの開発の現状との関連で、将来の疾患を他の診断基準と関連付けることが提案された(Whitwellらの文献, 2007；Panzaらの文献, 2007；Hyman SEの文献, 2007)。バイオマーカーは、将来、古典的な神経-心理テストを支援するか又はそれに取って替わると考えられている。それらは、アルツハイマー病に対する薬剤の開発の代用マーカーとして非常に重要であるという共通の考えがある(Blennow Kの文献, 2004；Blennow Kの文献, 2005；Hampelらの文献, 2006；Lewczukらの文献, 2006；Irizarry MC, 2004)。
【０００５】
(構造バイオマーカー)
「磁気共鳴画像診断」(MRI)は、脳の変性萎縮の検出を可能にする画像診断法である(Barnes Jらの文献, 2007；Vemuriらの文献, 2008)。故に、内側側頭葉の萎縮(MTA)は、高齢患者の脳の海馬領域の変性による影響を受けやすく、これは、MRIによって非常に明確に可視化することができるが、アルツハイマー病に特異的ではない。軽度のMTAは、他の認知症でより高頻度に見られるわけではないが(Barkhofらの文献, 2007)、それは確かにMCIと相関する(Mevelらの文献, 2007)。このため、神経変性がアルツハイマー病であるのか又はアルツハイマー病の初期段階であるのかをMRIデータのみから判定するのは不可能である。さらなる画像診断法は、アミロイド沈着物上の検出分子(PIB)の蓄積を可視化する陽電子放出断層撮影法(PET)である。チオフラビンT-類似体(11C)PIBが、それぞれ、MCI又は軽度アルツハイマー病を有する患者の脳の特定の領域で次第に蓄積することが見出されている(Kemppainenらの文献, 2007；Klunkらの文献, 2004；Roweらの文献, 2007)。残念ながら、これは、認知症を有さない対象においても検出することができる(Pikeらの文献, 2007)。しかしながら、この現象がさらなる研究で確認されることになれば、これはおそらく、PETによるアミロイド沈着物の検出によってアルツハイマー病の前臨床段階の検出が可能になることを示すであろう。最もよく利用されるプロセスである、MRI及びPETの他に、アルツハイマー病のさらなる構造バイオマーカーが知られている:CBF-SPECT、CMRg1-PET(グルコース代謝プロトン分光法(H-1 MRS)、高磁場強度の機能的MRI、ボクセルに基づく形態計測法(voxel-based morphometry)、(fMRIによって検出される)内側基底側頭葉の増強された活性化、ミクログリア細胞の検出のための(R)-[(11)C]PK11195 PET(Huangらの文献, 2007；Kantarciらの文献, 2007；Petrellaらの文献, 2007；Hamalainenらの文献, 2007；Kircherらの文献, 2007；Krophollerらの文献, 2007)。
【０００６】
(CSFバイオマーカー)
老人斑は、アルツハイマー病の病理学的特徴の1つである。これらの斑は、主にAβ(1-42)ペプチドからなる(Attems J, 2005)。いくつかの研究では、MCI患者のCSFでの低レベルのAβ(1-42)がアルツハイマー病の進行において、その更なる進行と特異的に相関することを示した(Blennow及びHampelの文献, 2003；Hanssonらの文献, 2006及び2007)。CSFでの減少は、おそらく、脳におけるAβ(1-42)の凝集の増強によるものである(Faganらの文献, 2006；Princeらの文献, 2004；Strozykらの文献, 2003)。別の可能性としては、CSFでのより低いレベルの検出をもたらす半可溶性Aβ(1-42)オリゴマー(Walshらの文献, 2005)の出現である。特に、アルツハイマー病の初期段階では、Aβ(1-42)の濃度の減少が検出されると同時に、CSF中のタウタンパク質及びホスホ-タウタンパク質の量の増加がそれぞれ検出され得る(Ewersらの文献, 2007；Lewczukらの文献, 2004)。バイオマーカーのより良好な予測可能性を提供するために、通常、タウ/Aβ(1-42)比を用いて、それを認知症を有さない高齢者の認知欠陥の予測と関連付けることが試みられる(Faganらの文献, 2007；Gustafsonらの文献, 2007；Hanssonらの文献, 2007；Liらの文献, 2007；Stomrudらの文献, 2007)、及びMCI患者 (Hampelらの文献, 2004；Maccioniらの文献, 2006；Schonknechtらの文献, 2007)。Aβ(1-42)、タウ、ホスホ-タウ-Thr231の生前のCSFレベルと死後の脳の組織病理学的変化とのさらなる相関がAD患者で検出された(Clarkらの文献, 2003；Buergerらの文献, 2006)。しかしながら、他の研究では、CSFバイオマーカーと、Aβ(1-42)、APOE ε4-アレルの場合の総タウ及びホスホ-タウ、剖検後の斑及びもつれの量(tangle load)との間に相関を検出することはできなかった(Engelborghsらの文献, 2007；Buergerらの文献, 2007)。興味深い側面が多施設研究で見出された。総タウ及びホスホ-タウ(181)のレベルの増加は、Aβ(1-42)/Aβ(1-40)の比の低下と相関するが、Aβ(1-42)単独とは相関しないようである(Wiltfangらの文献, 2007)。しかしながら、CSFタウのレベルの増加は、どれもニューロンの喪失と関連するクロイツヘルト-ヤコブ病、脳梗塞、及び脳血管認知症のような他のCNS疾患でも検出された(Buergerらの文献, 2006(2)；Biblらの文献, 2008)。さらに可能性のあるバイオマーカーは、MCIの指標としてのCSF中のBACE 1活性の増加である(Zhongらの文献, 2007)。BACE 1活性の増加が、Aβ産生の増加、したがって、ペプチドの凝集の増加をもたらすことも論じられている。アルツハイマー病は、神経炎症過程を伴うと考えられる。したがって、CSFの抗ミクログリア細胞抗体は、ADにおけるこれらの炎症過程の可能性のあるバイオマーカーである(McReaらの文献, 2007)。
【０００７】
アルツハイマー病の早期診断を可能にすると考えられるバイオマーカーが多数あるにもかかわらず、信頼できる明確な診断を保証する単一のバイオマーカーは今のところない。これは、通常、ほとんどの研究が、それぞれのバイオマーカーと臨床診断との比較を使用するためである。より良いアプローチとは、バイオマーカーとアルツハイマー病の病理学的な原因との相関であろう。
【０００８】
可能性あるアプローチは、Aβ(1-40)及びAβ(1-42)が実際に好適な神経化学的認知症マーカーであるかどうかを明らかにするための、明確に特定され、定義された神経病理学的認知症疾患の免疫沈降されたCSF試料の反復解析であろう(Jellingerらの文献, 2008)。アルツハイマー病のこれまで知られていない新規のバイオマーカーを発見するために、通常、CSF試料を比較プロテオミクス解析で解析して感度が強化されたADの診断を行ない、他の変性認知症障害との識別も可能にする(Finehoutらの文献, 2007；Castanoらの文献, 2006；Zhangらの文献, 2005；Simonsenらの文献, 2007；Lescuyerらの文献, 2004；Abdiらの文献, 2006)。プロテオミクス解析の後、潜在的な新しいバイオマーカーは、その好適性及び病理学的原因との相関について詳細に解析しなければならない。プロテオミクス解析によって発見されたバイオマーカーの典型例は、多発性硬化症のバイオマーカーとしての切断されたシスタチンCである。このバイオマーカーは、後に、貯蔵アーティファクトであることが分かった(Iraniらの文献, 2006；Hanssonらの文献, 2007(2))。
【０００９】
(血漿バイオマーカー)
頻繁に用いられる血漿バイオマーカー、すなわち、Aβペプチドの他に、さらなる炎症血漿マーカーが、認知症(Ravagliaらの文献, 2007；Engelhartらの文献, 2004)、及び特にアルツハイマー病(Mottaらの文献, 2007)の早期診断に用いられる。これらのすべては今なお議論されている。さらに可能性のあるバイオマーカーは、AD患者及び健康対象由来の血漿の比較プロテオミクス解析によっても発見された (Germanらの文献, 2007；Rayらの文献, 2007)。その特徴は、これらの生体分子が実際にアルツハイマー病に特異的であり、バイオマーカーとして適当であるかを示すであろう。前述のどのバイオマーカーについても、その特異性又は安定性のいずれかを示す説得力のある又は好適なデータは得られていない。
【００１０】
CSF中のアミロイドβの解析とは対照的に、血漿中の好適なAβバイオマーカーに関して今までに得られている結果は、信頼性がないか、又は明確性がない。いくつかの研究では、血漿中のAβ(1-42)/Aβ(1-40)の比の減少と、認知健常者のそれぞれMCI又はアルツハイマー患者への転換の増加との間の相関が認められた(Graff-Radfordらの文献, 2007；van Oijenらの文献, 2006；Sundelofらの文献, 2008)。しかしながら、他の研究では、Aβ(1-42)血漿レベルの低下は、MCIからADへの転換のマーカーである可能性がより高く(Songらの文献, 2007)、アルツハイマー病の場合に直面する、神経変性目的のマーカーとしては適さない(Pesaresiらの文献, 2006)ことが見出された。しかしながら、これらの研究の大半は、健康対照と孤発性アルツハイマー病を有する患者とのAβ血漿レベルの違いを示していない(Fukumotoらの文献, 2003；Kosakaらの文献, 1997；Scheunerらの文献, 1996；Sobowらの文献, 2005；Tamaokaらの文献, 1996；Vandersticheleらの文献, 2000)。いくつかの研究は、血漿中のAβのレベルが、脳で見られるようなレベルと相関せず(Faganらの文献, 2006；Freemanらの文献, 2007)、また、それがCSFで見られるレベルとも相関しないことも示した(Mehtaらの文献, 2001；Vandersticheleらの文献, 2000)。最近の研究で、Aβ(1-40)及びAβ(1-42)についてCSFと血漿との間で相関が検出されたが、これは健康対照でしか見られなかった。この相関は、MCI及びADでは検出することができなかった。これは、脳内のAβ沈着物によるCSF Aβと血漿Aβの間のバランスの破壊によって説明される(Giedraitisらの文献, 2007)。一般に、血漿Aβ(1-42)レベルがMCI又はADの信頼できるバイオマーカーではないと考えられている(Blaskoらの文献, 2008；Mehtaらの文献, 2000；Brettschneiderらの文献, 2005)のに対し、血漿Aβ(1-38)/Aβ(1-40)比の減少は血管性認知症のバイオマーカーと考えられ、CSFマーカーの予測可能性に近づいている(Biblらの文献, 2007)。
【００１１】
これまで、Aβオリゴマーは、アルツハイマー病のバイオマーカーとして注目されてこなかった。しかし、これらは、神経変性過程の開始時において決定的役割を果たすと考えられている(Walsh及びSelkoeらの文献, 2007)。いくつかの研究において、神経毒性の影響は、8kDaのAβ二量体から100kDaを超える前原線維の時点まで見られた(Lambertらの文献, 1998；Walshらの文献, 2002；Keayedらの文献, 2004；Clearyらの文献, 2005)。さらに、そのようなAβオリゴマーは、ヒト体液(human liquor)に見い出されている(Pitschkeらの文献, 1998；Santosらの文献, 2007；Klyubinらの文献, 2008)。それらの神経毒性に加えて、オリゴマーはまた、ヒト試料中のAβ濃度の測定に影響を及ぼす。オリゴマー化は、AβペプチドのC末端エピトープの遮蔽をもたらし(Roherらの文献, 2000)、C末端特異的ELISAによって検出されるAβレベルの過小の見積もりを招く(Stenhらの文献, 2005)。したがって、試料中のAβオリゴマーの存在は、ELISAシグナルを低下させる。これは、正確なAβ濃度の測定において問題となり得るが、この事実は、生物学的試料中のオリゴマーの量及びオリゴマー化のレベルを測定する機会をも提供する。本明細書中に提示されるデータは、驚くべきことに、Aβオリゴマーの脱凝集の前及び後にELISAシグナルを測定することによって、Aβオリゴマーの含有量を間接的に測定することができることを示している。両値の比率は、それぞれヒト血漿における溶解性のAβオリゴマーの濃度及びオリゴマーレベルを反映する。出願人らの本発明とは別に、ごく最近、類似のアプローチが発表された(Englundらの文献, 2009)。彼らは、非変性条件下でELISAによって、及び変性条件下でSDS-PAGE続くウェスタンブロット分析を用いて、Aβ1-42濃度を測定することによって、ヒトCSF試料中のAβ1-42オリゴマー比を測定した。しかしながら、このオリゴマーレベルの間接的な測定方法は、いくつかの重大な問題を有する：
1. SDS-PAGEでは、Aβ1-42を十分に脱凝集することができない。出願人らの実験でも、SDSゲル上のバンドに反映されるAβ三量体及び四量体が見られた。
2. ELISAで測定されたAβ濃度とウェスタンブロットで測定されたAβ濃度との比較は不完全である。
【００１２】
別のより一般的なアプローチは、Aβオリゴマーの直接測定である。しかしながら、特にオリゴマーの血漿Aβをバイオマーカーとして用いるそのような方法は、Aβペプチドが非常に疎水性であるために、極めて確立するのが困難である。現在開示されているアッセイシステムは、ELISAシステムにおいて、Aβオリゴマー特異的抗体を使用している(Englundらの文献, 2007；Schupfらの文献, 2008)。しかしながら、そのようなオリゴマー特異的抗体に基づいたELISAの使用は、従来のAβELISAシステムと同様の問題を有する。該方法は、極めて不十分な分析感度しか達成せず、かつ検体とマトリックス、すなわち、血漿との間の極めて複雑な相互作用を伴う大きな問題と直面する。通常、Aβの定量化にはELISA又はELISA型システム(マルチプレックス)が使用され、近年では、血漿中のAβオリゴマーにも使用されている。このような検出システムの特異化は、通常、不十分に分析されるだけであるか、又は完全に無視される。例えば、回収率のような重要な項目は、刊行物において、分析されないか、又は記載されていない。しかしながら、回収率は、血漿において生じるAβペプチド又はオリゴマーの完全な描写の提供に決め手となるものである。該研究間の相違もこれら回収率の違いに起因し得る。ELISA又はマルチプレックスシステムのさらなる重要な特徴は、その線形性である。したがって、血漿中の検体の測定された濃度は、非常に低い程度か又は全くない程度まで、測定に使用された希釈法にのみ依存すべきである。しかしながら、これは、血漿中のAβの定量化について、ELISAとマルチプレックスシステムのいずれも可能ではない。したがって、1〜20倍の希釈についての計算された血漿Aβ(1-42)濃度間の相違は、同じ試料の1〜2倍希釈より3倍高いものであった(Hanssonらの文献, 2008)。この例は単独で、いくつかの研究における血漿試料の異なる希釈の使用が、同物の比較を不可能とさせることを示している。
【００１３】
したがって、特に、血漿中のオリゴマーのAβを高い信頼性で測定可能な新規方法を提供することが、本発明の目的である。本発明もまたAβオリゴマーの間接的な測定を使用するが、先行技術と対照的に、どちらの値(変性状態及び非変性状態下)も、比較可能性を保証するために、Aβ特異的ELISAで測定される。Aβペプチドを単量体及びオリゴマー形態に分離する最初の免疫沈降工程の後に、我々の新規脱凝集法が続くので、後続のELISAは、回収及び/又は線形性の問題による制限を受けない。
【００１４】
さらに、本発明は、信頼できる方法で測定することができ、かつアルツハイマー病の信頼できかつ明確な予測に使用することができる診断マーカーを提供することを目的とする。
【発明の概要】
【００１５】
本発明の第1の態様によると、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病及び軽度認知障害を診断する又は監視する方法が提供され、該方法は、被験対象由来の生物学的試料中のオリゴマー状態の標的アミロイドβペプチド(Aベータ又はAβ)を測定することを含み、以下の工程：
(a) 生物学的試料中の標的Aβペプチドの第1の濃度(ca)を測定すること；
(b) 工程(a)から得られた標的Aβペプチドを脱凝集すること；
(c) 該脱凝集したAβペプチドの第2の濃度(cd)を測定すること；及び
(d) 第2の濃度(cd)の値を第1の濃度(ca)の値で割った、cd/ca比を決定すること；
を含むことを特徴とし、
ここで、cd/ca比が1.5より低いことが、神経変性疾患の陽性診断を示す。
【００１６】
本発明の第2の態様によると、生物学的試料中のオリゴマー状態の標的アミロイドβペプチド(Aベータ又はAβ)を測定する方法が提供され、該方法は、以下の工程：
(a) 生物学的試料中の標的Aβペプチドの第1の濃度(ca)を測定すること；
(b) 工程(a)から得られた標的Aβペプチドを脱凝集すること；
(c) 該脱凝集したAβペプチドの第2の濃度(cd)を測定すること；及び
(d) 第2の濃度(cd)の値を第1の濃度(ca)の値で割った、cd/ca比を決定すること；
を含み、
ここで、cd/ca比が1を上回ることが、オリゴマーAβの存在を示す。
【００１７】
(定義)
本明細書中で使用される「オリゴマー」とは、限定された数の凝集されたAβペプチド単量体ユニットを指す。そのようなオリゴマーの例を挙げると、二量体、三量体及び四量体がある。用語「脱凝集」とは、オリゴマー形態のAβペプチドを単量体形態のAβペプチドに変換するプロセスを指す。
【００１８】
本願の意味における「捕捉抗体」は、標的Aβペプチドに結合する抗体を包含することが意図される。
【００１９】
好適には、捕捉抗体は、高親和性で標的Aβペプチドに結合する。好適には、捕捉抗体は、高親和性で標的Aβペプチドに結合する。本発明との関連で、高親和性は、10-7M以下のKD値、好ましくは10-8M以下のKD値、又はさらにより好ましくは10-9M〜10-12MのKD値を有する親和性を意味する。
【００２０】
用語「抗体」は、最も広範な意味で使用され、かつ具体的には、それらが所望の生物学的活性を示す限りは、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体断片を対象としている。抗体は、例えばIgM、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4)、IgD、IgA、又はIgEであることができる。しかしながら、好適には、本抗体はIgMではない。「所望の生物学的活性」は、標的Aβペプチドへの結合である。
【００２１】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、一般には無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片:ダイアボディ;単鎖抗体分子;並びに抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわちその集団を構成している個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然の突然変異以外は、同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対する高度な特異性がある。さらに、典型的には様々な抗原決定基(エピトープ)に対する様々な抗体を含む「ポリクローナル抗体」調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に対するものである。その特異性に加え、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが夾雑しないハイブリドーマ培養により合成される点で、それらは有利であり得ることが多い。「モノクローナル」とは、抗体の実質的に均質な集団から得られるものとしての抗体の特徴を示すものであり、かつ任意の特定の方法による抗体産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerらの文献(Nature, 256:495 (1975))で最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができるか、又は一般に周知の組換えDNA法によって作製することができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clacksonらの文献(Nature, 352:624-628 (1991))及びMarksらの文献(J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))に記載された技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００２３】
モノクローナル抗体は、本明細書では特に、重鎖及び/又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、この鎖(複数)の残りは、別の種に由来する抗体又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である、キメラ抗体(免疫グロブリン)、さらには所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を含む。
【００２４】
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖又は断片(例えば、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、又は抗体の他の抗原結合性部分配列)である。大部分に関して、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDR由来の残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が、対応する非ヒト残基により置き換えられている。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDR又はフレームワーク配列にも認められない残基を含むことができる。
【００２５】
これらの修飾は、抗体性能をさらに純化しかつ最適化するために行われる。概してヒト化抗体は、少なくとも1つの、及び典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、全て又は実質的に全てのCDR領域は、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、かつ全て又は実質的に全てのFR領域は、ヒト免疫グロブリン配列のFR領域である。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域(Fc)の、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含む。さらなる詳細に関しては、Jonesらの文献, Nature, 321:522-525(1986), Reichmannらの文献, Nature, 332:323-329(1988):及びPrestaの文献, Curr. Op. Struct. Biel., 2:593-596(1992)を参照されたい。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が関心対象の抗原によるマカクザルの免疫化により産生された抗体に由来するPrimatized(商標)抗体、又は「ラクダ化」抗体を含む。
【００２６】
「単鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のVHドメイン及びVLドメインを含み、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーによって、sFvは、抗原結合のための望ましい構造を形成することができる。sFvの総説については、Pluckthunの文献、「モノクローナル抗体の薬理学(The Pharmacology of Monoclonal Antibody)」, 第113巻, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, ニューヨーク, 269-315頁(1994)を参照されたい。
【００２７】
用語「ダイアボディ」は、その断片が、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン(VD)に接続された重鎖可変ドメイン(VH)を含む、2つの抗原結合部位を伴う小型の抗体断片(VH-VD)をいう。同じ鎖上の2つのドメインを対合させるには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは、別の鎖の相補ドメインと対合するように強制され、かつ2つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディは、Hollingerらの文献, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)でより十分に説明されている。
【００２８】
「単離された」抗体は、同定されかつその天然の環境の成分から分離及び/又は回収されたものである。その天然の環境の夾雑成分は、この抗体の診断的又は治療的使用を妨げる物質であり、かつこれは、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含むことができる。適当な実施態様では、抗体は、(1)Lowry法で決定したときに抗体の95重量％を上回るまで、及び最も好ましくは99重量％を上回るまで、(2)スピニングカップシーケネーター(spinning cup sequenator)の使用により、N-末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、又は(3)クマーシーブルーもしくは好適には銀染色を用いる還元もしくは非還元条件下のSDS-PAGEによって均質になるまで精製される。単離された抗体は組換え細胞内のインサイチュの抗体を含む。というのは、抗体の天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程によって調製される。
【００２９】
本明細書中で使用される表現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は、互換的に使用され、かつそのような表記は全て子孫を含む。したがって、語句「形質転換体」及び「形質転換された細胞」は、継代(transfer)された数とは関係なく、それらから派生した初代の対象細胞及び培養物を含む。全ての子孫は、故意の又は故意でない突然変異のために、DNA含有量が正確には同一でないことがあり得ることも理解される。最初に形質転換された細胞でスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体子孫が含まれる。はっきりと区別できる表記が意図される場合、これは文脈から明からになるであろう。
【００３０】
本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、互換性があり、かつペプチド結合により連結されたアミノ酸で構成された生体分子を意味すると定義される。
【００３１】
本明細書中で使用される用語「ある(a、an及びthe)」は、「1以上」を意味するように定義され、かつ文脈が不適切でない限りは、複数を含む。
【００３２】
「アミロイドβ、Aβ、又はβ-アミロイド」は、当技術分野で認識された用語であり、アミロイドβタンパク質及びペプチド、アミロイドβ前駆体タンパク質(APP)、ならびにそれらの修飾物、断片、及び任意の機能的等価物をいう。特に、本明細書中で使用されるアミロイドβとは、APPのタンパク質分解的切断によって産生される任意の断片を意味するが、とりわけ、アミロイド病理に関与又は関連する断片を意味し、これには、限定するものではないが、配列番号3のAβ(1-38)、配列番号2のAβ(1-40)、及び配列番号1のAβ(1-42)が含まれる。
【００３３】
本発明の文脈において、「アミロイドβの断片」とは、配列番号13のコアアミロイドβ断片Aβ(3-38)を含む全てのアミロイドβペプチドである。本発明の目的により好適なものは、配列番号19のコアアミロイドβ断片Aβ(11-38)を含む全てのアミロイドβペプチドである。そのような、配列番号19のAβ(11-38)のアミノ酸配列を含むAβ断片は、特にAβ(x-y)断片であり、これは、アルツハイマー病及び軽度認知障害などの神経変性疾患の結果として対象において蓄積することが示されている。
ここで、
xは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び11から選択される整数と定義される。
好ましくは、xは1、2、3及び11から選択される整数である。
より好ましくは、xは1である。
さらにより好ましくは、xは11である。
yは、38、39、40、41、42及び43から選択される整数と定義される。
好ましくは、yは38、40又は42、例えば、40又は42である。
より好ましくは、yは40である。
さらにより好ましくは、yは38である。
【００３４】
Aβ(x-y)断片に適当な例は、下記のものである：
Aβ(1-38)  (配列番号3)、
Aβ(1-39)  (配列番号4)、
Aβ(1-40)  (配列番号2)、
Aβ(1-41)  (配列番号5)、
Aβ(1-42)  (配列番号1)、
Aβ(1-43)  (配列番号6)、
Aβ(2-38)  (配列番号7)、
Aβ(2-39)  (配列番号8)、
Aβ(2-40)  (配列番号9)、
Aβ(2-41)  (配列番号10)、
Aβ(2-42)  (配列番号11)、
Aβ(2-43)  (配列番号12)、
Aβ(3-38)  (配列番号13)、
Aβ(3-39)  (配列番号14)、
Aβ(3-40)  (配列番号15)、
Aβ(3-41)  (配列番号16)、
Aβ(3-42)  (配列番号17)、
Aβ(3-43)  (配列番号18)、
Aβ(11-38)  (配列番号19)、
Aβ(11-39)  (配列番号20)、
Aβ(11-40)  (配列番号21)、
Aβ(11-41)  (配列番号22)、
Aβ(11-42)  (配列番号23)、及び
Aβ(11-43)  (配列番号24)。
【００３５】
「機能的等価物」は、本発明によって記載されているような検出のための方法又は診断のための方法を受けるよう選択された患者群で天然に生じ得るAβ(x-y)の全ての突然変異体又は変異体を包含する。より具体的には、本発明の文脈での「機能的等価物」は、Aβ(x-y)の機能的等価物がその突然変異体又は変異体であり、かつアルツハイマー病で蓄積することが示されていることを意味する。機能的等価物は、それぞれのAβ(x-y)ペプチドと比較して、30以下、例えば20、例えば10、特に5、及び特に2、又は1つだけの突然変異を有する。機能的等価物は突然変異した変異体も包含し、それには、例として、アミノ酸Asp-Ala-Gluで始まり、それぞれ、Gly-Val-Val及びVal-Ile-Alaで終わる全てのAβペプチドが含まれる。
【００３６】
本文脈での特に有用な等価物はAβ(1-40)(配列番号2)及びAβ(1-42)(配列番号1)のものであり、これらは、Irieらの文献, 2005によって記載されているもの、すなわち、Aβの鳥取型、フラマン型、オランダ型、イタリア型、北極型、及びアイオワ型突然変異である。機能的等価物は、スウェーデン型、オーストリア型、フランス型、ドイツ型、フロリダ型、ロンドン型、インディアナ型、及びオーストラリア型変異体のようなβ-又はγ-セクレターゼ切断部位に隣接する突然変異を有するアミロイド前駆体タンパク質に由来するAβペプチドも包含する(Irieらの文献, 2005)。
【００３７】
「修飾アミロイドβ、Aβ又はβ-アミロイド」とは、アミロイドβタンパク質及びペプチド、アミロイドβ前駆体タンパク質(APP)、断片並びにその機能的等価物の様々なアミノ酸部位における全ての修飾を包含する。本文脈で有用なものは、前記アミロイドβペプチド及びタンパク質、アミロイドβ前駆体タンパク質(APP)、断片、及び機能的等価物のN-末端及び/又はC-末端での修飾である。特に、グルタミン及びグルタミン酸残基での修飾、例えば、N末端のグルタミン又はグルタミン酸残基のピログルタミン酸への環化などが有用である。本発明の適当な例は、N末端がグルタミン酸残基で始まり、該N末端のグルタミン酸残基がピログルタミン酸に修飾される配列番号13〜24のアミロイドβペプチドである。例えば、アスパラギン酸のイソアスパラギン酸への変換のようなアスパラギン酸残基での修飾、も有用である。本発明の適当な例は、アミノ酸位置1及び/又は7のアスパラギン酸残基がイソアスパラート(isoasparate)に変換される配列番号1〜6のアミロイドβペプチドである。さらに適当な例は、アミノ酸位置6のアスパラギン酸残基がイソアスパラートに変換される配列番号7〜12のアミロイドβペプチドである。さらに適当な例は、アミノ酸位置5のアスパラギン酸残基がイソアスパラートに変換される配列番号13〜18のアミロイドβペプチドである。
【００３８】
「サンドイッチELISA」は、通常、検出しようとするタンパク質の異なる免疫原性部分、又はエピトープに各々結合することができる2つの抗体の使用を含む。サンドイッチアッセイでは、被験試料検体は、固体支持体に固定された第1の抗体によって結合させられ、その後、第2の抗体が検体に結合し、その結果、不溶性の3つの部分からなる複合体を形成する。第2の抗体それ自体は、検出可能部分で標識されていてもよいし(直接サンドイッチアッセイ)、又は検出可能部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定されてもよい(間接サンドイッチアッセイ)。例えば、サンドイッチアッセイの1つの適当なタイプは、ELISAアッセイであり、その場合、検出可能部分は酵素である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】二価免疫沈降システムは捕捉効率を改善する。(A)様々な抗体組合せの使用によるCyp18溶液及びヒト血漿からのAβ1-40の回収(B)二価捕捉システムの概略図(網掛け:4G8抗体, 灰色:x-40抗体、黒色:磁気ビーズにコンジュゲートされた抗マウス抗体)。
【図２】ヒト血漿由来のオリゴマー状態のAβペプチドの測定。脱凝集後に測定した濃度と脱凝集なしに測定した濃度との比は、オリゴマー状態のAβ(1-40/42)を反映する。
【図３】DemTectテスト。DemTectスケールによるAD患者及び健康対象(第I群：18〜30歳；第II群：31〜45歳；第III群：46〜65歳)の分類の違いの結果の平均値(平均±SD)。
【図４】ミニメンタルステートテスト(Mini-Mental-State Test)。ミニメンタルステートテストによるAD患者及び健康対象(第I群：18〜30歳；第II群：31〜45歳；第III群：46〜65歳)の分類の違いの結果の平均値(平均±SD)。
【図５】時計描画テスト。時計描画テストによるAD患者及び健康対象(第I群：18〜30歳；第II群：31〜45歳；第III群：46〜65歳)の分類の違いの結果の平均値(平均±SD)。
【図６】オリゴマー状態の平均値、AD群対対照群のT-検定。**T-検定、p＜0.01；***T-検定、p＜0.001
【図７】血漿中の全オリゴマー量の反映としてのオリゴマー状態のAβ(1-40)＋Aβ(1-42)。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
（発明の詳細な説明）
本発明の第1の態様によると、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病及び軽度認知障害を診断する又は監視する方法が提供され、該方法は、被験対象由来の生物学的試料中のオリゴマー状態の標的アミロイドβペプチド(Aベータ又はAβ)を測定することを含み、以下の工程：
(a) 生物学的試料中の標的Aβペプチドの第1の濃度(ca)を測定すること；
(b) 工程(a)から得られた標的Aβペプチドを脱凝集すること；
(c) 該脱凝集したAβペプチドの第2の濃度(cd)を測定すること；及び
(d) 第2の濃度(cd)の値を第1の濃度(ca)の値で割った、cd/ca比を決定すること；
を含むことを特徴とし、
ここで、cd/ca比が1.5より低いことが、神経変性疾患の陽性診断を示す。
【００４１】
驚くべきことに、本明細書に提示されたデータは、オリゴマー状態のAβが、対照患者と比較した場合に、アルツハイマー病患者で顕著に低下したことを示した。したがって、オリゴマー状態のAβは、アルツハイマー病の信頼でき、かつ明確な予測となると考えられる。(cd/ca)比1.0は、試料中にオリゴマーがないことを示す。より高いcd/ca比(すなわち、＞1.0の比率)は、試料中のより多くの量のオリゴマーを反映しているか、又はより密集したオリゴマー(エピトープの接触性が低い)を反映している。1.5よりも低いcd/ca比(すなわち、1.0と1.5の間の比率)、例えば、1.4未満、1.3未満、1.2未満、1.1未満又は1.05未満では、アルツハイマー病などの神経変性疾患の陽性診断を示すことが見出された。
【００４２】
本発明の別の実施態様によると、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病及び軽度認知障害を診断する又は監視する方法が提供され、該方法は、被験対象由来の生物学的試料中のオリゴマー状態の標的アミロイドβペプチド(Aベータ又はAβ)を測定することを含み、以下の工程：
(a) 生物学的試料中の標的Aβペプチドの第1の濃度(ca)を測定すること；
(b) 工程(a)から得られた標的Aβペプチドを脱凝集すること；
(c) 該脱凝集したAβペプチドの第2の濃度(cd)を測定すること；及び
(d) cdとcaの値を合計すること；
を含むことを特徴とし、
ここで、cdとcaの合計の値が3.0より低いことが、神経変性疾患の陽性診断を示す。
【００４３】
cdとcaの合計が、2.9未満、2.8未満、2.7未満、2.6未満、2.5未満、2.4未満又は2.3未満では、アルツハイマー病などの神経変性疾患の陽性診断を示すことが見出された。
【００４４】
大半の研究で、工程(a)及び(c)での標的Aβペプチドの濃度は、捕捉抗体及び検出抗体からなるサンドイッチELISAシステムで測定した。抗体(150kDa)のサイズと比較すると、単量体のAβペプチド(4.5kDa)は非常に小さい。ペプチドの凝集性のために、それらは、オリゴマー、原線維といえるほどの前原線維を形成する傾向がある。このような凝集体内部では、Aβ単量体は密集しており、結果として、立体障害又はエピトープの非接触性のために、全ての単量体に検出抗体を結合することはできない。検出されるオリゴマーのAβ濃度は、単量体のそれより低い。これは、血漿及びCSF中のAβレベルのそれぞれの過小の見積もりを招くであろう。測定濃度と実際の濃度との相違は、オリゴマーの量とその密集性に依存する。逆に、Aβ凝集の量、又はより正確には負荷を受けるエピトープは、オリゴマーの存在下で検出された濃度と、オリゴマーを単量体に完全に脱凝集した後の濃度とを比較することによって測定することができる。該方法の原理を図2に示す。
【００４５】
一実施態様において、脱凝集工程(b)は、アルカリの使用を含む。さらなる実施態様において、工程(b)の脱凝集に使用されるアルカリは、水酸化ナトリウム、例えば、500mMの水酸化ナトリウムである。アルカリ、特に水酸化ナトリウムなどの強アルカリを使用する利点は、より効果的な脱凝集が達成されることにある。例えば、観察可能な量の二量体、三量体又は四量体を含まない、高比率の単量体が得られる。
【００４６】
一実施態様において、脱凝集工程(b)は、メタノールなどの適当な溶媒、例えば、50%(v/v)のメタノールの使用をさらに含む。
【００４７】
一実施態様において、脱凝集工程(b)は、インキュベーション工程を含む。さらなる実施態様において、該インキュベーション工程は、室温で少なくとも2分間のインキュベーションを含む。さらなる実施態様において、該インキュベーション工程は、室温で少なくとも10分間のインキュベーションを含む。
【００４８】
Aβペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質(APP)から酵素β-及びγ-セクレターゼによる連続的な切断の後に遊離する。γ-セクレターゼによる切断は、主にAβ(1-40)及びAβ(1-42)ペプチドの生成をもたらすだけでなく、主に位置38又は43で終了する。これは、そのC-末端が異なり、かつ凝集、原線維形成、及び神経毒性の異なる効力を示す。また、β-セクレターゼによる切断は、異なるN-末端を生成する。ペプチド及び他の酵素による後続の修飾は、例えば、位置2、3、4及び11で始まるAβペプチドなどの主要な種をもたらし、一方、位置3及び11のグルタミン酸で始まる種は、ピログルタミン酸に変換することができ、これらのペプチドは特に疎水性であり、急速に凝集する傾向がある(Schillingらの文献, 2004；Picciniらの文献, 2005；Schillingらの文献, 2006；Schlenzigらの文献, 2009)。このようなAβのC-末端及びN-末端の異形は、Aβ(1-40)及びAβ(1-42)ペプチドの機能的等価物としての役割を果たす。
【００４９】
したがって、本発明は、オリゴマー状態のAβ(x-y)ペプチド(ここで、x及びyは上記に定義したものである)の測定方法を提供する。
【００５０】
したがって、上記方法の一実施態様によると、測定されるオリゴマー状態の標的Aβペプチドは、下記からなる群から選択される：
Aβ(1-38)  (配列番号3)、
Aβ(1-39)  (配列番号4)、
Aβ(1-40)  (配列番号2)、
Aβ(1-41)  (配列番号5)、
Aβ(1-42)  (配列番号1)、
Aβ(1-43)  (配列番号6)、
Aβ(2-38)  (配列番号7)、
Aβ(2-39)  (配列番号8)、
Aβ(2-40)  (配列番号9)、
Aβ(2-41)  (配列番号10)、
Aβ(2-42)  (配列番号11)、
Aβ(2-43)  (配列番号12)、
Aβ(3-38)  (配列番号13)、
Aβ(3-39)  (配列番号14)、
Aβ(3-40)  (配列番号15)、
Aβ(3-41)  (配列番号16)、
Aβ(3-42)  (配列番号17)、
Aβ(3-43)  (配列番号18)、
Aβ(11-38)  (配列番号19)、
Aβ(11-39)  (配列番号20)、
Aβ(11-40)  (配列番号21)、
Aβ(11-41)  (配列番号22)、
Aβ(11-42)  (配列番号23)、及び
Aβ(11-43)  (配列番号24)。
【００５１】
特定の実施態様において、測定されるオリゴマー状態の標的Aβペプチドは、Aβ(1-40)(配列番号2)である。
【００５２】
特定の実施態様において、測定されるオリゴマー状態の標的Aβペプチドは、Aβ(1-42)(配列番号1)である。
【００５３】
特定の実施態様において、測定されるオリゴマー状態の標的Aβペプチドは、Aβ(1-40)(配列番号2)及びAβ(1-42)(配列番号1)である。本明細書中に提示したデータは、Aβ(1-40)ペプチドとAβ(1-42)ペプチドとの合計の適合性を示しており、ここで、両方のオリゴマー状態の合計が、診断の有意性を向上させることが示された。
【００５４】
特定の実施態様において、測定されるオリゴマー状態の標的Aβペプチドは、配列番号13〜24から選択される少なくとも1つのAβペプチドであり、N-末端がグルタミン酸残基で始まるものである。
【００５５】
特定の実施態様において、測定されるオリゴマー状態の標的Aβペプチドは、Aβ(3-38)(配列番号13)である。
【００５６】
特定の実施態様において、測定されるオリゴマー状態の標的Aβペプチドは、Aβ(11-38)(配列番号19)である。
【００５７】
さらなる特定の実施態様において、測定されるオリゴマー状態の標的Aβペプチドは、配列番号13〜24から選択される少なくとも1つのAβペプチドであり、これらのペプチドのN-末端のグルタミン酸残基が、ピログルタミン酸に環化される。
【００５８】
さらなる特定の実施態様において、測定されるオリゴマー状態の標的Aβペプチドは、配列番号1〜6から選択される少なくとも1つのAβペプチドであり、アミノ酸位置1及び/又は7のアスパラギン酸残基が、イソアスパラートに変換される。
【００５９】
より具体的には、測定されるオリゴマー状態の標的Aβペプチドは、配列番号7〜12から選択される少なくとも1つのAβペプチドであり、アミノ酸位置6のアスパラギン酸残基が、イソアスパラートに変換される。
【００６０】
より具体的には、測定されるオリゴマー状態の標的Aβペプチドは、配列番号13〜18から選択される少なくとも1つのAβペプチドであり、アミノ酸位置5のアスパラギン酸残基が、イソアスパラートに変換される。
【００６１】
オリゴマー状態のAβを測定する該方法は、必ずしもアルツハイマー病などの神経変性疾患の診断に限定されない新規かつ創意的なアッセイに関する本発明のさらなる態様を構成することが理解されるであろう。したがって、本発明の第2の態様によると、生物学的試料中のオリゴマー状態の標的アミロイドβペプチド(Aベータ又はAβ)を測定する方法が提供され、該方法は、以下の工程：
(a) 生物学的試料中の標的Aβペプチドの第1の濃度(ca)を測定すること；
(b) 工程(a)から得られた標的Aβペプチドを脱凝集すること；
(c) 該脱凝集したAβペプチドの第2の濃度(cd)を測定すること；及び
(d) 第2の濃度(cd)の値を第1の濃度(ca)の値で割った、cd/ca比を決定すること；
を含み、
ここで、cd/ca比が1を上回ることが、オリゴマーAβの存在を示す。
【００６２】
一実施態様において、脱凝集工程(b)は、上記に定義されるアルカリの使用を含む。
【００６３】
一実施態様において、工程(a)及び(c)における標的Aβペプチドの第1及び第2の濃度を測定する方法は、下記を含む：
i) 生物学的試料を少なくとも2つの異なる捕捉抗体と接触させること；
ii) 得られた免疫複合体を検出すること；
iii) 該免疫複合体を破壊すること；及び
iv) 捕捉されたAβペプチドを定量化すること。
【００６４】
一実施態様において、該定量化工程(iv)は、Aβ特異的ELISAにおける分析を含む。さらなる実施態様において、該Aβ特異的ELISAは、サンドイッチELISAである。一実施態様において、工程(a)及び(c)はどちらも、Aβ特異的ELISAでの分析を含む。この実施態様は、工程(a)及び(c)で得られた第1及び第2の濃度間の許容比較可能性の利点を提供する。
【００６５】
一実施態様において、生物学的試料は、血液、血清、尿、脳脊髄液(CSF)、血漿、リンパ液、唾液、汗、胸水、滑液、涙液、胆汁、及び膵分泌物からなる群から選択される。さらなる実施態様では、生物学的試料は血漿である。
【００６６】
生物学的試料は、当業者に周知の方法で患者から得ることができる。特に、血液試料は対象から得ることができ、該血液試料は、従来法によって、血清と血漿に分離することができる。生物学的試料が得られる対象は、アルツハイマー病に罹患している疑いがある、アルツハイマー病を発症するリスクがある、及び/又は任意の他の種類の認知症のリスクがあるか、もしくはそれを有することが疑われる。
【００６７】
特に、それは、軽度認知障害(MCI)を有する、及び/又はアルツハイマー病の初期段階にあることが疑われる対象である。
【００６８】
本方法は、当技術分野で公知の方法に優るいくつかの利点を有する。すなわち、本発明の方法は、初期段階のアルツハイマー病を検出するために、並びに疾患の発症及び進行の初期段階でアルツハイマー病と他のタイプの認知症とを識別するために用いることができる。1つの考えられる初期段階は軽度認知障害(MCI)である。当技術分野で現在知られている方法では、アルツハイマー病の初期段階の明確でかつ信頼できる診断を行なうことは不可能であり、特に、該初期段階においてアルツハイマー病の発症と他の形態の認知症とを識別することは不可能である。これは、特に、MCIに罹患した患者の場合に当てはまる。
【００６９】
対照的に、本発明によって提供される方法は、アルツハイマー病の鑑別診断に好適である。特に、本発明は、オリゴマー状態の標的Aβペプチドを、上記の対象のいずれかから得られる生物学的試料中で再現性高く検出することができる方法を提供する。本発明の方法の高い再現性は、工程(c)で後に使用される方法と同一である最初の免疫沈降工程(工程(a))において、少なくとも2つの異なる捕捉抗体を用いることによって達成される。一実施態様において、これらの少なくとも2つの異なる捕捉抗体は、Aβ標的ペプチドの異なるエピトープに関する。
【００７０】
一実施態様において、生物学的試料は血漿である。
【００７１】
上述の「Aβ標的ペプチド」は、上記で定義したAβ(x-y)を包含する。
【００７２】
本発明によって克服されなければならなかった具体的な問題は、使用しようとするバイオマーカーが、アルツハイマー病の初期段階、例えば、軽度認知障害の間に変化することである。本発明の発明者らは、オリゴマー状態の標的Aβペプチドを信頼できるやり方で測定することができることを示し、また、実際に、オリゴマー状態のAβ(x-y)が早期発症性アルツハイマー病の診断に特に好適であることも初めて明らかとなった。
【００７３】
工程(a)及び(c)での標的Aβペプチドの第1及び第2の濃度を測定する方法は、具体的に以下の工程を含む：
i) 生物学的試料を免疫沈降工程で少なくとも2つの異なる捕捉抗体と接触させること。
該生物学的試料を前述の少なくとも2つの異なる捕捉抗体と接触させた後、該少なくとも2つの異なる捕捉抗体と標的Aβペプチドとの間で免疫複合体が形成される。この工程は、全長Aβ(x-y)(式中、xは1である)を特異的に単離する役割を果たすのではなく、むしろ、特に、位置38、40及び/又は位置42で終わる、全てのAβ種を捕捉し、分離する役割を果たす。
ii)次に、この複合体を二次抗体によって検出する。好適には、該二次抗体は磁気ビーズに固定されている。該磁気ビーズとともに、該免疫複合体は、磁気分離装置を用いて、体液(血漿/血清、CSFなど)から容易に分離することができる。
iii) 該免疫複合体を該ビーズから溶出させる。好適には、該溶出工程は、該免疫複合体を担持する該ビーズを、50％メタノール/0.5％ギ酸を含む溶液中、室温で1時間インキュベートすることによって行なわれる。それによって、全ての分子間相互作用が破壊され、該生物学的試料から単離された全てのAβペプチド分子が、該溶液中の該ビーズから放出される。
iv) 放出され、単離されたAβペプチドを、次の工程で、例えば、全長Aβ(x-y)を特異的に検出するサンドイッチELISAによって定量化する。ここで、この工程における全長Aβ(x-y)とは、最も好適にはAβ(1-40)及びAβ(1-42)を意味する。
【００７４】
本文脈で好適な、考えられる免疫沈降用の抗体は下記であるが、本発明はその具体的な実施例によって制限されない：
3D6、エピトープ:1-5(Elan Pharmaceuticals, Innogenetics)
pAb-EL16、エピトープ:1-7
2H4、エピトープ:1-8(Covance)
1E11、エピトープ:1-8(Covance)
20.1、エピトープ:1-10(Covance, Santa Cruz Biotechnology)
ウサギ抗-Aβポリクローナル抗体、エピトープ:1-14(Abcam)
AB10、エピトープ:1-16(Chemicon/Upstate - Milliporeの1部門)
82E1、エピトープ:1-16(IBL)
pAb1-42、エピトープ:1-11
NAB228、エピトープ:1-11(Covance, Sigma-Aldrich, Cell Signaling, Santa Cruz Biotechnology, Zymed/Invitrogen)
DE2、エピトープ:1-16(Chemicon/Upstate - Milliporeの1部門)
DE2B4、エピトープ:1-17(Novus Biologicals, Abcam, Accurate, AbD Serotec)
6E10、エピトープ:1-17(Signet Covance, Sigma-Aldrich)
10D5、エピトープ:3-7(Elan Pharmaceuticals)
WO-2、エピトープ:4-10(The Genetics Company)
1A3、エピトープ5-9(Abbiotec)
pAb-EL21、エピトープ5-11
310-03、エピトープ5-16(Abcam, Santa Cruz Biotechnology)
ニワトリ抗ヒトAβポリクローナル抗体、エピトープ12-28(Abcam)
ニワトリ抗ヒトAβポリクローナル抗体、エピトープ25-35(Abcam)
ウサギ抗ヒトAβポリクローナル抗体、エピトープ:N-末端(ABR)
ウサギ抗ヒトAβポリクローナル抗体(Anaspec)
12C3、エピトープ10-16(Abbiotec, Santa Cruz Biotechnology)
16C9、エピトープ10-16(Abbiotec, Santa Cruz Biotechnology)
19B8、エピトープ9-10(Abbiotec, Santa Cruz Biotechnology)
pAb-EL26、エピトープ:11-26
BAM90.1、エピトープ:13-28(Sigma-Aldrich)
ウサギ抗β-アミロイド(パン)ポリクローナル抗体、エピトープ:15-30(MBL)
22D12、エピトープ:18-21(Santa Cruz Biotechnology)
266、エピトープ:16-24(Elan Pharmaceuticals)
pAb-EL17;エピトープ:15-24
4G8、エピトープ:17-24(Covance)
ウサギ抗Aβポリクローナル抗体, エピトープ:22-35(Abcam)
G2-10;エピトープ:31-40(The Genetics Company)
ウサギ抗-Aβ、aa 32-40ポリクローナル抗体(GenScript Corporation)
EP1876Y、エピトープ:x-40(Novus Biologicals)
G2-11、エピトープ:33-42(The Genetics Company)
16C11、エピトープ:33-42(Santa Cruz Biotechnology)
21F12、エピトープ:34-42(Elan Pharmaceuticals, Innogenetics)
1A10、エピトープ:35-40(IBL)
D-17ヤギ抗Aβ抗体、エピトープ:C-末端(Santa Cruz Biotechnology)。
【００７５】
免疫沈降用の特定の抗体は、下記のものである：
3D6(Elan)、BAN50(Takeda)、82E1(IBL)、6E10(Covance)、WO-2(The Genectics Company)、266(Elan)、BAM90.1(Sigma)、4G8(Covance)、G2-10(The Genetics Company)、1A10(IBL)、BA27(Takeda)、11A5-B10(Millipore)、12F4(Millipore)、21F12(Elan)。
【００７６】
AβN3pE特異的抗体の例は、下記のものである：
- PCT/EP2009/058803に記載されるPyro-Glu Aベータ抗体Aβ5-5-6(Deposit No. DSM ACC 2923)、Aβ6-1-6(Deposit No. DSM ACC 2924)、Aβ17-4-3(Deposit No. DSM ACC 2925)、及びAβ24-2-3(Deposit No. DSM ACC 2926)(モノクローナル、マウス)；Probiodrug AG
- Pyro-Glu Aベータ抗体クローン2-48(モノクローナル、マウス)；Synaptic Systems
- Pyro-Glu Aベータ抗体(ポリクローナル、ウサギ)；Synaptic Systems
- Pyro-Glu Aベータ抗体クローン8E1(モノクローナル、マウス)；Anawa
- Pyro-Glu Aベータ抗体クローン8E1(モノクローナル、マウス)；Biotrend
- 抗-ヒトアミロイドβ(N3pE)ウサギIgG(ポリクローナル、ウサギ)；IBL
- 抗-ヒトAβ N3pE(8E1) マウスIgG Fab(モノクローナル、マウス)；IBL。
【００７７】
AβイソAsp1特異的抗体の例は、下記のものである：
- 抗ヒトAβイソAsp1抗体(ポリクローナル、ウサギ)；Saido TCらの文献, Neurosci Lett. (1996) 13；215(3):173-6に開示。
【００７８】
免疫沈降用の特定の抗体ペアは、下記のものである：
4G8及び11A5-B10、3D6及び4G8、6E10及び4G8、82E1及び4G8、4G8及び12F4、4G8及び21F12、3D6及び21F12、6E10及び21F12、BAN50及び4G8、3D6及び11A5-B10、3D6及び1A10、3D6及びBA27、6E10及び11A5-B10、6E10及び1A10、6E10及びBA27、4G8及び11A5-B10、4G8及び1A10、4G8及びBA27、4G8及び12F4、4G8及び21F12。
【００７９】
AβN3pE特異的抗体の例は、下記のものである：
- PCT/EP2009/058803に記載されるPyro-Glu Aベータ抗体Aβ5-5-6(Deposit No. DSM ACC 2923)、Aβ6-1-6(Deposit No. DSM ACC 2924)、Aβ17-4-3(Deposit No. DSM ACC 2925)、及びAβ24-2-3(Deposit No. DSM ACC 2926)(モノクローナル、マウス)；Probiodrug AG
- Pyro-Glu Aベータ抗体クローン2-48(モノクローナル、マウス)；Synaptic Systems
- Pyro-Glu Aベータ抗体(ポリクローナル、ウサギ)；Synaptic Systems
- Pyro-Glu Aベータ抗体クローン8E1(モノクローナル、マウス)；Anawa
- Pyro-Glu Aベータ抗体クローン8E1(モノクローナル、マウス)；Biotrend
- 抗-ヒトアミロイドβ(N3pE)ウサギIgG(ポリクローナル、ウサギ)；IBL
- 抗-ヒトAβ N3pE(8E1) マウスIgG Fab(モノクローナル、マウス)；IBL。
【００８０】
AβイソAsp1特異的抗体の例は、下記のものである：
- 抗ヒトAβイソAsp1抗体(ポリクローナル、ウサギ)；Saidoらの文献, 1996。
【００８１】
上に示した抗体以外に、免疫沈降に好適な他の全てのアミロイドベータ特異的抗体(モノクローナル及びポリクローナル)を濃度測定法に用いることができる(さらなる好適な抗体は、例えば、www.alzforum.orgから取得することができる)。異なるエピトープを有する2つ、3つ、又はそれより多くの異なる抗体の使用は、良好な捕捉効率にとって決定的である。Aβペプチドの免疫沈降に対する2以上の抗体タイプの使用は、協調的でかつ驚くほど相乗的な結合効果(結合力)をもたらし、これにより、非常に高い捕捉効率を達成することが最終的に可能になる(図1参照)。
【００８２】
工程ii)における二次抗体は、捕捉抗体の宿主抗体タイプに対して特異的である。適当な二次抗体は、抗マウス抗体及び抗ウサギ抗体である。
【００８３】
工程iii)における複合体と磁気ビーズとのインキュベーションの後、ビーズを洗浄バッファーで洗浄してもよい(本発明の実施例を参照されたい)。洗剤又は非特異的結合を防ぐ他の添加物を含む洗浄バッファーをこの工程に用いることができる。洗浄バッファーの非限定的な例は、下記のものである:
- 10mg/ml サイクロフィリン18(Cyp 18)及び0.05％ Tween-20を含むD-PBS、
- PBS + 0.05％ Tween-20、
- TBS + 0.05％ Tween-20、
- PBS + 1％(w/v) BSA + 0.05％ Tween-20、
- TBS + 1％(w/v) BSA + 0.05％ Tween-20、並びに
- Pierce ELISAブロッカー(Tween-20を含む)。
【００８４】
工程iv)におけるビーズからの免疫複合体の溶出後、溶液を希釈バッファーに希釈する。表面及び固定された第1のELISA抗体との非特異的相互作用を防ぐことができる任意の希釈バッファーをこの工程に用いることができる。希釈バッファーの非限定的な例は、下記のものである:
- EIAバッファー(IBL 1-40(N) ELISAキットの希釈バッファー)、
- PBS + 1％(w/v) BSA + 0.05％ Tween-20、
- TBS + 1％(w/v) BSA + 0.05％ Tween-20、及び
- Pierce ELISAブロッカー(Tween-20を含む)。
【００８５】
全長Aβ(1-40)を定量することができるELISAキットは市販されている。本発明の方法におけるAβ(1-40)の定量のための好適なELISAキットは、例えば、アミロイド-β(1-40)(N)ELISA(IBL, JP27714)；Aβ[1-40]ヒトELISAキット(Invitrogen);ヒトアミロイドベータ(アミロイド-β)、aa 1-40 ELISAキット(Wako Chemicals USA, Inc.);アミロイドベータ1-40 ELISAキット(The Genetics Company)である。
【００８６】
全長Aβ(1-42)を定量することができるELISAキットも市販されている。本発明の方法におけるAβ(1-42)の定量のための好適なELISAキットは、例えば、アミロイド-β(1-42)(N)ELISA(IBL, JP27712)；Aβ[1-42]ヒトELISAキット(Invitrogen)、ヒトアミロイドベータ(アミロイド-β)、aa 1-42 ELISAキット(Wako Chemicals USA, Inc.)、アミロイドベータ1-40 ELISAキット(The Genetics Company)、INNOTEST(登録商標)β-アミロイド(1-42)(Innogenetics)である。
【００８７】
濃度測定法は、Aβ(1-40)又はAβ(1-42)用の例示的な上述の市販ELISAキットに限定されない。全長Aβ(1-40)又はAβ(1-42)用の多くのさらなるサンドイッチELISAが先行技術で利用可能であり得るか、又は当業者によって開発され得る。これら全ての全長Aβ1-40又はAβ1-42サンドイッチELISAもまた、濃度測定法によって包含されるものとし、通常、Aβ(1-40)及び/又はAβ(1-42)の完全なN-末端、並びにアミノ酸40又は42で終わるC-末端にそれぞれ特異的な、捕捉抗体及び検出抗体の好適なペアを含むべきである。
【００８８】
そのような全長Aβ(1-40)サンドイッチELISAは、Aβ(1-40)のC-末端を特異的に認識する第1の固定された抗体、及びAβ(1-40)の完全なN-末端を特異的に認識する第2の標識された検出抗体を含むことができる。
【００８９】
全長Aβ(1-42)サンドイッチELISAは、Aβ(1-42)のC-末端を特異的に認識する第1の固定された抗体、及びAβ(1-42)の完全なN-末端を特異的に認識する第2の標識された検出抗体を含むことができる。
【００９０】
全長Aβ(1-40)サンドイッチELISAはまた、Aβ(1-40)の完全なN-末端を特異的に認識する第1の固定された抗体及びAβ(1-40)のC-末端を特異的に認識する第2の標識された検出抗体を含むことができる。
【００９１】
全長Aβ(1-42)サンドイッチELISAはまた、Aβ(1-42)の完全なN-末端を特異的に認識する第1の固定された抗体、及びAβ(1-42)のC-末端を特異的に認識する第2の標識された検出抗体を含むことができる。
【００９２】
濃度測定法における使用のための好適なAβ(1-40/42)N-末端特異的抗体は、例えば、3D6(Elan)、WO-2(The Genetics Company)、82E1(IBL)、BAN-50(Takeda)である。多くのさらなるAβ(1-40/42)N-末端特異的抗体が先行技術で利用可能であり得るか、又は当業者によって開発され得る。これら全てのAβ(1-40/42)N-末端特異的抗体もまた、濃度測定法によって包含される。
【００９３】
好適なAβ(1-40)C-末端特異的抗体は、例えば、G2-10(The Genetics Company)；11A5-B10(Millipore)；1A10(IBL)；BA27(Takeda)；EP1876Y(Novus Biologicals)である。多くのさらなるAβ(1-40)C-末端特異的抗体が先行技術で利用可能であり得るか、又は当業者によって開発され得る。これら全てのAβ(1-40)C-末端特異的抗体もまた、濃度測定法によって包含される。
【００９４】
好適なAβ(1-42)C-末端特異的抗体は、例えば、G2-11(The Genetics Company)；12F4(Millipore);抗ヒトAβ(38-42)ウサギIgG(IBL)；21F12(Elan)；BC05(Takeda)；16C11(Santa Cruz Biotechnology)である。多くのさらなるAβ(1-42)C-末端特異的抗体が先行技術で利用可能であり得るか、又は当業者によって開発され得る。これら全てのAβ(1-42)C-末端特異的抗体もまた、濃度測定法によって包含される。
【００９５】
一実施態様によると、検出抗体は標識されている。
診断用途のために、検出抗体は、通常、検出可能部分で標識されている。多くの標識が利用可能であり、それらは、通常、以下のカテゴリーに分類することができる:
(a) 放射性同位体、例えば、35S、14C、125I、3H、及び131I。抗体は、例えば、「免疫学最新プロトコル(Current Protocols in Immunology)」, 第1巻及び第2巻, Gutigenら編, Wiley-Interscience. New York, New York. Pubs.,(1991)に記載されている技術を用いて放射性同位体で標識することができ、放射能は、シンチレーションカウンティングを用いて測定することができる。
(b) 蛍光標識、例えば、希土類キレート(ユーロピウムキレート)又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリン、並びにテキサスレッドが利用可能である。蛍光標識は、例えば、「免疫学最新プロトコル(Current Protocols in Immunology)」(前掲)に開示されている技術を用いて、抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光光度計を用いて定量することができる。
(c) 様々な酵素-基質標識が利用可能である。酵素は一般に、様々な技術を用いて測定することができる発色基質の化学的変化を触媒する。例えば、酵素は、基質の色の変化を触媒することができ、この変化は、分光光度法によって測定することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変化させることができる。蛍光の変化を定量するための技術は上に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起されるようになり、その後 (例えば、化学発光計を用いて)測定可能な光を放出することができるか、又は蛍光受容体にエネルギーを供与することができる。酵素的標識の例は、ルシフェラーゼ(例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ;米国特許第4,737,456号)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRPO)などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、0-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ(例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ)、複素環オキシダーゼ(例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ)、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。酵素を抗体にコンジュゲートさせるための技術は、O'Sullivanらの文献,「酵素イムノアッセイにおける使用のための酵素-抗体コンジュゲートの調製方法(Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay)」，Methods in Enzym.(Langone & H. Van Vunakis編), Academic Press, New York, 73:147-166(1981)に記載されている。
【００９６】
酵素-基質の組合せの例は、例えば、下記のものを含む：
(i) セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRPO)と、基質としての水素ペルオキシダーゼ、ここで、この水素ペルオキシダーゼは、色素前駆体(例えば、オルトフェニレンジアミン(OPD)又は3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸塩(TMB))を酸化する；
(ii) アルカリホスファターゼ(AP)と、発色基質としてのパラ-ニトロフェニルホスフェート；及び
(iii) β-D-ガラクトシダーゼ(β-D-Gal)と、発色基質 (例えば、p-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ)又は蛍光基質4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼ。
【００９７】
他の多くの他の酵素-基質の組合せが、当業者に利用可能である。
(d) 検出抗体用の別の考えられる標識は、短いヌクレオチド配列である。その場合は、濃度をRT-PCRシステム(Imperacer(商標), Chimera Biotech)で測定する。
【００９８】
標識は、抗体と間接的にコンジュゲートされている場合もある。当業者であれば、これを達成するための様々な技術を知っているであろう。例えば、抗体をビオチンとコンジュゲートさせることができ、上述の3つの幅広いカテゴリーの標識のいずれかをアビジンとコンジュゲートさせることができるし、又はその逆も可能である。ビオチンはアビジンと選択的に結合し、そのため、この間接的な方法で、標識を抗体とコンジュゲートさせることができる。あるいは、標識と抗体との間接的コンジュゲーションを達成するために、抗体を小さいハプテン(例えば、ジゴキシン)とコンジュゲートさせ、上述の異なるタイプの標識のうちの1つを抗ハプテン抗体(例えば、抗ジゴキシン抗体)とコンジュゲートさせる。このようにして、標識と抗体との間接的コンジュゲーションを達成することができる。
【００９９】
本発明で使用される抗体を、任意の既知のアッセイ方法、例えば、競合結合アッセイ、直接的及び間接的サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイで利用することができる。Zolaの文献,「モノクローナル抗体 技術マニュアル(Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques)」, pp.147-158(CRC Press. Inc., 1987)。
【０１００】
競合結合アッセイは、限定された量の抗体との結合を被験試料検体と競合する標識された標準の能力に依存する。被験試料中のAβペプチドの量は、抗体に結合するようになる標準の量に反比例する。結合するようになる標準の量を決定しやすくするために、抗体は、通常、競合の前後に不溶化され、その結果、抗体に結合している標準及び検体を未結合のままの標準及び検体から好都合に分離することができる。
【０１０１】
ヒトにおけるAβ(1-40)濃度の解析のために、以下の全ての体液を用いることができる:血液、脳脊髄液(CSF)、尿、リンパ液、唾液、汗、胸水、滑液、房水、涙液、胆汁、膵分泌物。
【０１０２】
血液試料を用いて、本発明者らにより、新規の方法が確立された(本発明の実施例を参照されたい)。しかしながら、本方法は、血液試料に限定されるものとみなされるべきではない。本方法は、CSF、脳抽出物、及び尿試料、並びに他の全てのヒト体液、例えば、上で述べたものを同じように用いて、利用することもできる。特に好ましいのは、血漿試料である。
【０１０３】
免疫組織化学的解析のために、組織試料は、新鮮なものもしくは凍結されたものであってもよく、又はパラフィンに包埋され、例えば、ホルマリンなどの防腐剤を用いて固定されたものであってもよい。
【０１０４】
サンドイッチELISAシステムは、本発明の工程(a)及び(c)におけるAβ濃度測定のための1つの特定の実施態様であるが、他の濃度測定法を使用することができることは、理解されるであろう。
Aβの濃度測定のための好適な方法は、下記である。
【０１０５】
(1. アミロイドβ1-40 HTRF(登録商標)アッセイ(CisBio Bioassays))
このアッセイ原理はTR-FRETをベースにしている。これは、時間分解蛍光とフェルスター共鳴エネルギー転移を組み合わせたものである。通常のサンドイッチELISAと同様に、Aβ(1-40)は2つの抗体によって結合される。しかしながら、これらの抗体は、この場合は、表面に結合されず、相互作用は溶液中で生じる。両方の抗体は蛍光団で標識されている。これら2つの蛍光団が生体分子相互作用によって集合したとき、励起中に供与体蛍光団によって捕捉されたエネルギーの一部がFRETを介して受容体蛍光団に転移され、それが結果として励起される。この受容体蛍光団の蛍光が測定される。計測シグナルは、FRETの量、したがって、溶液中のAβ(1-40)の量と相関する。
同様に、同等の原理に基づいたLilly社のAlphascreen (商標)アッセイを使用することもできる。
【０１０６】
(2. マルチプレックスアッセイシステム)
マルチプレックスアッセイシステムはいくつかの製造業者から入手可能であり、かつ本分野において周知で、広く用いられている。本発明の方法における使用に好適な例は、INNO-BIA血漿Aβ形態アッセイ(Innogenetics)である。このアッセイは、xMAP(登録商標)技術(xMAPはLuminex社の登録商標である)を用いる、血漿中のヒトβ-アミロイド形態Aβ(1-42)及びAβ(1-40)、又はAβ(X-42)及びAβ(X-40)の同時定量のための多重パラメータビーズに基づく十分に標準化されたイムノアッセイである。
【０１０７】
このアッセイシステムは、最大100個の異なる検体を並行して定量することができる。この方法の基盤は、マイクロスフェア又はビーズと呼ばれる、小さな球状ポリスチロール粒子である。ELISA及びウェスタンブロットと同様に、これらのビーズは、生化学的検出のための固相としての役割を果たす。これらのビーズは色分けされており、そのため、100個の異なるビーズ種類を区別することができる。各ビーズ種類は、マイクロスフェア表面に固定された(例えば、Aβ(1-40)に対する)1つの特異的な抗体を有する。Aβ(1-40)濃度が増加する場合は、より多くのペプチド分子がこの種類のビーズによって結合される。検体の結合の検出は、緑色の光を発する別の蛍光色素で標識された第2の抗Aβ(1-40)抗体によって行なわれる。試料は、FACS解析と同じように操作される。マイクロスフェアは、流体力学的絞り込みによって単数化され、レーザーに基づく検出システムによって解析される。これにより、緑色蛍光に基づく定量を行ない、結合した検体をビーズの特異的な着色によって同定することができる。このようにして、1つの試料中で複数の検体の濃度を決定することができる。
【０１０８】
(3. 質量分析による定量)
- Aβ(1-40)の定量のために、SELDI-TOF質量分析も用いた(Simonsenらの文献, 2007(2))。
- 免疫沈降及びMALDI-TOF質量分析を用いたAβペプチドの定量的解析。15N標識標準Aβペプチドを較正に用いる(Gelfanovaらの文献, 2007)。
【０１０９】
(4. ウェスタンブロット解析)
ウェスタンブロット解析を伴う2D-ゲル電気泳動法は、Aβペプチドを定量するための好適な方法であり得る(Sergeantらの文献, 2003；Casasらの文献, 2004)。
【０１１０】
(診断キット)
便宜上、本発明の方法で使用される抗体を、キット、すなわち、所定の量の試薬と診断アッセイを実施するための指示書とを包装して組み合わせたものとして提供することができる。
【０１１１】
したがって、本発明のさらなる態様によると、適当なアルカリ及び本明細書中で定義された方法に従い前記キットを使用するための指示書を含む、アルツハイマー病などの神経変性疾患を診断するためのキットが提供される。
【０１１２】
一実施態様において、該キットは、本明細書中で定義される少なくとも2つの異なる捕捉抗体をさらに含む。
【０１１３】
抗体が酵素で標識されている場合、キットは、その酵素が必要とする基質及び補因子 (例えば、検出可能な発色団又は蛍光団を提供する基質前駆体)を含む。さらに、他の添加剤、例えば、安定化剤、バッファー(例えば、ブロックバッファー又は溶解バッファー)などが含まれていてもよい。アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中濃度を提供するために、様々な試薬の相対量を幅広く変化させることができる。特に、試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができる。
【０１１４】
本発明の診断キットは、アミロイド関連の疾患及び状態、例えば、アルツハイマー病の検出及び診断に特に有用である。
【０１１５】
(使用)
本発明の方法は、オリゴマーの標的Aβペプチド、特に、Aβ(1-40)、Aβ(1-42)、Aβ(3-38)及び/又はAβ(11-38)、又はその機能的等価物を信頼できる形で検出し、定量することを初めて可能にする。特に、本発明は、特に疾患の初期段階でのアルツハイマー病の鑑別診断に好適な血漿バイオマーカーとしてのオリゴマーのAβ(1-40)、Aβ(1-42)、Aβ(3-38)及び/又はAβ(11-38)を提供する。
【０１１６】
したがって、一実施態様において、本発明は、特に、疾患の初期段階でのアルツハイマー病の鑑別診断などのアルツハイマー病の診断のための、オリゴマー状態のアミロイドβペプチドの測定方法の使用に関する。好適には、アルツハイマー病の初期段階は、軽度認知障害である。
【０１１７】
さらなる実施態様において、本発明は、特に、疾患の初期段階でのアルツハイマー病の鑑別診断などのアルツハイマー病の診断のための、オリゴマーのAβ標的ペプチドの使用に関する。好適には、アルツハイマー病の初期段階は、軽度認知障害である。
【０１１８】
特に、アルツハイマー病の診断に用いるオリゴマーのAβ標的ペプチドは、本発明による方法を用いて検出され、定量される。
【０１１９】
さらなる実施態様において、Aβ標的ペプチドは、上記で定義されるAβ(x-y)、又はその機能的等価物である。
【０１２０】
本発明の方法はまた、アルツハイマー病などの神経変性疾患の所与の治療の効果を監視するための工業的用途を有する。したがって、本発明のさらなる態様によると、被験対象由来の生物学的試料中の本明細書で定義されるオリゴマー状態の標的アミロイドβペプチド(Aベータ又はAβ)を測定することを含む、アルツハイマー病などの神経変性疾患を有する、有する疑いのある、又はそれに罹患しやすい対象における治療の効果を監視する方法が提供される。
【０１２１】
一実施態様において、生物学的試料は、被験対象から2回以上採取される。さらなる実施態様において、該方法は、被験対象から2回以上採取された生物学的試料中に存在するオリゴマー状態の標的アミロイドβペプチド(Aベータ又はAβ)のレベルを比較することをさらに含む。一実施態様において、該方法は、被験試料中に存在するオリゴマー状態の標的アミロイドβペプチド(Aベータ又はAβ)のレベルを、治療に先立って前記対象から採取した1つ以上の試料、及び/又は治療の初期段階の前記対象から採取した1つ以上の試料中に存在する量と比較することをさらに含む。一実施態様において、該方法は、オリゴマー状態の標的アミロイドβペプチド(Aベータ又はAβ)のレベルを、1つ以上の対照と比較することをさらに含む。
【０１２２】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これは、いかなる点においても決して本発明を限定するものとみなされるべきではなく、本発明は、本明細書とともに添付される特許請求の範囲によってのみ、その範囲が定義される。
【実施例】
【０１２３】
(本発明の実施例)
(1. 材料及び方法)
(1.1 患者及び健康対照)
ADの臨床診断を有する患者及び健康対照をCRO(GALMED GmbH)を介して採用した。研究前の検査で、研究の参加者全員の神経心理学的機能をいくつかの心理テスト(DemTect、ミニメンタルステートテスト、時計描画テスト)で試験した。
【０１２４】
(DemTectテスト)
DemTectスケールは、5つの短い下位テスト(10単語のリストの反復、数字の変換、意味的単語の流暢性課題、逆方向数唱、単語リストの遅延再生)を含む認知症についての簡易スクリーニングテストである(Kesslerらの文献, 2000)。素点を変換して年齢及び教育に依存しない得点を出し、「認知症が疑われる」(8点以下)、「軽度認知障害」(9〜12点)、及び「年齢相応」(13〜18点)に分類する。
【０１２５】
(MMSE)
ミニメンタルステート検査(MMSE)又はFolsteinテストは、認知を評価するために用いられる30点の簡易アンケートテストである(表1参照)。それは、認知症についてスクリーニングするために医療で一般に用いられる。約10分間で、それは、計算力、記憶、及び見当識を含む様々な機能を試験する。それは、Folsteinらの文献, 1975によって紹介され、少しの修正を施され広く用いられている。
【０１２６】
MMSEは、以下のいくつかの領域の簡単な質問及び問題を含む：試験の時間及び場所、単語リストの反復、計算力、言語使用及び理解、並びに基本的な運動能力。例えば、ある質問では、2つの5角形の図を書き写すことが求められる(次表参照)。(30点中)27点以上の得点はいずれも事実上正常である。これ未満では、20〜26点は軽度の認知症を示し、10〜19点は中等度の認知症を示し、10点未満は重度の認知症を示す。正常値も教育の程度及び年齢について補正される。低い得点から極めて低い得点は、認知症の存在と密接に相関するが、他の精神障害もMMST検査での異常所見をもたらすことがある。
【０１２７】
【表１】
2013511734.tif 000002
【０１２８】
(時計描画テスト)
時計の採点は、Shulmannらの文献, 1986が用いた尺度の変法をベースにした。円は全て予め描かれており、対象に対する指示は、「11時10分を正しい位置に配置する」ことであった。採点システム(表2参照)の範囲は1点〜6点であり、より高い得点は、より多くの間違いとより多くの障害を反映する。この採点システムは、経験的に導かれ、臨床診療に基づいて修正される。必然的に、このシステムには個々の判断に任される余地がかなり残されるが、高水準の評価者間の信頼度を有するのに十分な簡易さがある。本発明者らの研究は、3つの主要な要素の分析に役立つ。これらは、時計描画テストと認知機能の他の評価基準との横断的比較;時計描画テストの経時的な長期的記載、及び時計描画テストの悪化と施設への収容決定との関係性を含む。  
【０１２９】
研究前の検査後、全ての参加者からの採血を用いて、2週間後に研究を開始した。3ヵ月間隔の1年間に渡って、全ての参加者は、センターを訪れ、心理試験を行い、血液試料を採取した。該研究は、「Arztekammer Sachsen-Anhalt」の倫理委員会で認可されている。全ての患者又はその近親者及び対照者から該研究の参加についてインフォームドコンセントを得た。
【０１３０】
【表２】
2013511734.tif 000003
【０１３１】
(1.2 血液試料)
ヒトのAβ1-40及び/又はAβ1-42濃度の分析に関して、以下の体液の全てを使用できる：血液、脳脊髄液、尿、リンパ液、唾液、汗、胸水、滑液、房水、涙液、胆汁、及び膵分泌物。
【０１３２】
血液試料を使用して新規方法を確立した。これは、さらにCSF、脳抽出物、及び尿試料、続いて他のヒト体液に使用することができる。
【０１３３】
ADバイオマーカーの決定用の血液試料を、下記の3本のポリプロピレンチューブに回収した：
1. EDTA血漿用のカリウム-EDTAを含むもの(Sarstedt Monovette, 02.1066.001)
2. ヘパリン血漿用のLi-ヘパリンを含むもの(Sartstedt Monovette, 02.1065.001)
3. 血清用のブランク(Sarstedt Monovette, 02.1063.001)。
【０１３４】
静脈穿刺によるか、又は挿入された前腕静脈留置カニューレからの反復採血によって、全試料を回収した。(上の第1.1章に記載したような)時間スケジュールに従って血液を回収した。それを1550g(3000rpm)にて4℃で10分間遠心分離して、血漿を得た。血漿又は血清をピペッティングして除去し、1本の5mlポリプロピレンクライオチューブ(Carl-Roth, E295.1)に充填し、-80℃で凍結保存した。試料は採血後1時間以内に遠心分離した。研究プロトコルに従い血漿又は血清のチューブに、適切なラベル付けをすることが、CROの義務であった。
【０１３５】
(1.3実験室的方法)
野生型Aβ1-40突然変異体もこの方法によって定量することができる。該突然変異体は、アミノ酸Asp-Ala-Gluで始まり、Gly-Val-Valで終わる全てのアミロイドβペプチドを含む。突然変異Aβ1-40の例は、鳥取型、フラマン型、オランダ型、イタリア型、北極型、及びアイオワ型である(Irieらの文献, 2005)。
【０１３６】
該Aβ1-40アッセイはまた、野生型Aβ1-40を産生するAβ1-40配列以外の突然変異を示す別の家族性アルツハイマー病にも使用することができる。下記の家族性アルツハイマー病の例も該アッセイに適している：スウェーデン型、オーストリア型、フランス型、ドイツ型、フロリダ型、ロンドン型、インディアナ型、及びオーストラリア型(Irieらの文献, 2005)。
【０１３７】
野生型Aβ1-42の突然変異体もまた、この方法で定量することができる。該突然変異体は、アミノ酸Asp-Ala-Gluで始まり、Val-Ile-Alaで終わる全てのアミロイドβペプチドを含む。突然変異Aβ1-42の例は、鳥取型、フラマン型、オランダ型、イタリア型、北極型、及びアイオワ型である(Irieらの文献, 2005)。
【０１３８】
該Aβ1-42アッセイはまた、野生型Aβ1-42を産生するAβ1-42配列以外の突然変異を示す別の家族性アルツハイマー病にも使用することができる。下記の家族性アルツハイマー病の例も該アッセイに適している：スウェーデン型、オーストリア型、フランス型、ドイツ型、フロリダ型、ロンドン型、インディアナ型、及びオーストラリア型(Irieらの文献, 2005)。
【０１３９】
(免疫沈降)
(4mlの血漿を含む)EDTA血漿試料(ヘパリン血漿、血清でもよい)を融解し、2mlポリプロピレンチューブ(Eppendorf, 0030120.094)に1mlずつ分注した。1錠のプロテアーゼ阻害剤(Roche, コンプリートミニプロテアーゼ阻害剤カクテル, 11836153001)を1mlのD-PBS(Invitrogen, 14190-094)に溶解させた。25μlのプロテアーゼ阻害剤溶液を1mlのEDTA血漿に添加した。各試料の1本のチューブを除く、全てのアリコートを凍結させ、-80℃で再び保存した。これら血漿のチューブに10μlの10％ Tween-20を添加した(spiked)。各チューブに、2.5μgの抗アミロイドβ(17-24)抗体4G8(Millipore, MAB1561)、2.5μgの抗アミロイドβ(x-42)抗体12F4(Millipore, 05-831)、及び2.5μgの抗アミロイドβ(x-40)抗体11A5-B10(Millipore, 05-799)を添加した。
【０１４０】
免疫沈降用の他の考え得る抗体は、上記に定義される。これら記載した抗体に加え、免疫沈降に適した全ての他のアミロイドβ特異的抗体(モノクローナル及びポリクローナル)をこの方法に使用することができる(www.alzforum.org参照)。異なるエピトープを有する2つ、3つ、又はそれより多くの異なる抗体の使用は、良好な捕捉効率にとって決定的である。Aβペプチドの免疫沈降に対する2以上の抗体タイプの使用は、協調的な結合効果(結合力)をもたらし、これにより、非常に高い捕捉効率を達成する(図1参照)。
【０１４１】
全ての血漿チューブをオーバーヘッドシェーカーにて4℃で一晩インキュベートした。アミロイドβ-抗体複合体の固定のために、100μlの抗マウス磁気ビーズ(Invitrogen, 112-02D)を各1mlの血漿試料に用いた。磁気ビーズ上にコンジュゲートされたこれらの特殊な抗マウス抗体の代わりに、他の全ての抗マウス抗体又は抗宿主抗体(宿主:上に記載した一次抗体の起源)を用いることができる。これらの抗体は、例えば、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用、トシル活性化表面、エポキシ活性化表面、アミン表面、又はカルボキシル表面などの様々なコンジュゲーション戦略によっていくつかのマトリックス(カラムマトリックス及びビーズマトリックス)上に固定することができる。使用前に、100μlのビーズをもとのボトルから2mlチューブに移し、1mlのPBSで3回洗浄した。洗浄後、ビーズを200μlのPBSに再懸濁した。血漿チューブを2000×gで30秒間遠心分離した。上清を抗マウス磁気ビーズを含むチューブに移した。チューブをオーバーヘッドシェーカーにて4℃で一晩インキュベートした。
【０１４２】
翌日、チューブを磁気分離装置内に置き、ビーズをチューブ壁に引き付けさせた。約1分後、上清を慎重に除去し、ビーズを10mg/mlのサイクロフィリン18及び0.05％のTween-20を含む500μlのD-PBSで2回洗浄した。
【０１４３】
洗剤又は非特異的結合を防ぐ他の添加物を含む他の洗浄バッファーをこの工程に用いることができる。洗浄バッファーの例は、下記のものである:
- PBS + 0.05％ Tween-20、
- TBS + 0.05％ Tween-20、
- Pierce ELISAブロッカー(Tween-20を含む)。
【０１４４】
(捕捉されたアミロイドβの溶出及び脱凝集)
最後の洗浄工程の後、溶液を取り除き、チューブを磁気分離装置から取り外し、100μlの50％(v/v)メタノール/0.5％(v/v)ギ酸を各チューブに添加し、軽く振ってビーズを再懸濁させた。全てのチューブを室温で1時間インキュベートした。その後、チューブを再び磁気分離装置内に置き、各チューブからの溶出液40μlを440μlのEIA緩衝液(IBL 1-40/42(N)ELISAキットの希釈緩衝液)と混合した。希釈した試料のpHを、16μlの400mM Na2HPO4、400mM KH2PO4 pH 8.0を用いて、EIA緩衝液のpHに合わせた。これらの試料から、脱凝集なしの濃度を測定した。脱凝集のために、各チューブから溶出液50μlを新しいチューブに移し、20μlの50％(v/v)メタノール/500mMのNaOHを各チューブに混合した。脱凝集を室温で10分間行った。その後、各脱凝集チューブからの40μlを440μlのEIA緩衝液(IBL 1-40/42(N)ELISAキットの希釈緩衝液)と混合した。希釈した試料のpHを、10μlの0.85％(v/v)H3PO4を用いて調整した。これらの試料から、脱凝集後の濃度を測定した。
製造元IBLの特殊なELISA希釈緩衝液の代わりに、表面及び捕捉抗体と非特異的相互作用を起こさない全ての別の希釈緩衝液を、この工程に使用することができる。希釈緩衝液の例は、下記のものである:
- PBS + 1％(w/v) BSA + 0.05％ Tween-20、
- TBS + 1％(w/v) BSA + 0.05％ Tween-20、
- Pierce ELISAブロッカー(Tween-20を含む)。
【０１４５】
(溶出したアミロイドβペプチドの定量)
ペプチド濃度(それぞれ脱凝集を伴うもの、及び伴わないもの)の測定は、IBL 1-40(N)ELISAキット(IBL, JP27714)及びIBL 1-42(N) ELISAキット(IBL, JP27712)を用いて実施した。
この特殊なAβ1-40ELISAの代わりに、全長Aβ1-40を検出することができる他の全ての市販品を用いることができる。
【０１４６】
市販のELISAキットの例は、下記のものである：
ヒトAベータ、aa1-40 ELISAキット  Invitrogen
ヒトアミロイドベータ(アミロイド-b)、(aa1-40 ELISAキット)   Wako Chemicals USA, Inc.
アミロイドベータELISAキット  The Genetics Company。
【０１４７】
独自のAβ1-40 ELISAは、Aβ1-40の完全なN-末端及びアミノ酸40位で終わるC-末端に特異的な、一対の捕捉抗体及び検出抗体からなる。
【０１４８】
考え得るN-末端特異的抗体は、下記のものである：
3D6(Elan Pharmaceuticals)
WO-2(The Genetics Company)
1-40(N)検出抗体(IBL)
BAN50(Takeda Chemicals Industries)。
【０１４９】
考え得るC-末端特異的抗体は、下記のものである：
G2-10(The Genetics Company)
11A5-B10(Millipore)
1A10(IBL)
ウサギ抗-ベータ-アミロイド、aa32-40ポリクローナル抗体(GenScript Corporation)
EP1876Y、エピトープ：x-40(Novus Biologicals)
【０１５０】
そのような独自の全長Aβ1-40サンドイッチELISAは、Aβ1-40のC-末端を特異的に認識する固定化された一次抗体、及びAβ1-40の完全なN-末端を特異的に認識する標識された二次検出抗体を含み得る。また、全長Aβ1-40サンドイッチELISAは、Aβ1-40の完全なN-末端を特異的に認識する固定化された一時抗体、及びAβ1-40のC-末端を特異的に認識する標識された二次検出抗体を含むことができ、特にこのタイプのAβ1-40サンドイッチELISAが想定される。
【０１５１】
この特殊なAβ1-42ELISAの代わりに、全長Aβ1-42を検出することができる他の全ての市販品を用いることができる。
【０１５２】
市販のELISAキットの例は、下記のものである：
ヒトAベータ、aa1-40 ELISAキット  Invitrogen
ヒトアミロイドベータ(アミロイド-b)、(aa1-42 ELISAキット)  Wako Chemicals USA, Inc.
アミロイドベータ1-42 ELISAキット  The Genetics Company
ベータ-アミロイド1-42 ELISAキット(SIGNET)  Covance
INNOTEST(登録商標)β-アミロイド(1-42)  Innogenetics
【０１５３】
独自のAβ1-40ELISAは、Aβ1-42の完全なN-末端及びアミノ酸40位で終わるC-末端に特異的な、一対の捕捉抗体及び検出抗体からなる。
【０１５４】
考え得るN-末端特異的抗体は、下記のものである：
3D6(Elan Pharmaceuticals)
WO-2(The Genetics Company)
1-40(N)検出抗体(IBL)
BAN50(Takeda Chemicals Industries)。
【０１５５】
考え得るC-末端特異的抗体は、下記のものである：
G2-11(The Genetics Company)
16C11(Santa Cruz Biotechnology)
21F12(Elan Pharmaceuticals, Innogenetics)
BC05(Takeda Chemicals Industries)。
【０１５６】
そのような独自の全長Aβ1-42サンドイッチELISAは、Aβ1-42のC-末端を特異的に認識する固定化された一次抗体、及びAβ1-42の完全なN-末端を特異的に認識する標識された二次検出抗体を含み得る。また、全長Aβ1-42サンドイッチELISAは、Aβ1-42の完全なN-末端を特異的に認識する固定化された一時抗体、及びAβ1-42のC-末端を特異的に認識する標識された二次検出抗体を含むことができ、特にこのタイプのAβ1-42サンドイッチELISAが想定される。
【０１５７】
希釈した試料(それぞれ脱凝集を伴うもの、及び伴わないもの)をELISAプレートに適用した(ウェル当たり100μl、反復測定)。ELISA標準をキットから取り出し、製造元の指示プロトコルに従って溶解させ、希釈した。全ての試料及び濃度標準の適用後、ELISAプレートを4℃で18時間インキュベートした。翌日、ELISAを製造元の指示プロトコルに従って発色させた。
【０１５８】
比色反応を停止させた後、各ウェル中の吸光度をプレートリーダー(TECAN Sunrise)を用いて450nmで測定し、550nmの吸光度で補正した。
【０１５９】
補正された450nmでの吸光度を、対応する標準ペプチド濃度に対してプロットすることによって、標準曲線の決定を行なった。この曲線を、Origin 7.0(Microcal)を用いて、4-パラメータ方程式(式1)を用いて、フィッティングした。
【数１】
2013511734.tif 000004
ここで、yは測定された吸光度を、xは対応する濃度を表す。
【０１６０】
各試料のELISAに対するAβ(1-40)及びAβ(1-42)濃度の計算は、式2を用いて、応分吸光度値に基づいて行った。
【数２】
2013511734.tif 000005
【０１６１】
脱凝集を伴わず測定した血漿試料中の濃度を測定するために、算出した濃度を、12.4倍のEIA緩衝液希釈(pH調整を含む)、及び免疫沈降の(1mlから100μlへの)0.1倍の濃度効果によって補正した。脱凝集を伴い測定した血漿試料中の濃度を測定するために、算出した濃度を、12.25倍のEIA緩衝液希釈(pH調整を含む)、溶出試料に20μlの50％(v/v)メタノール/500mMのNaOHを添加することによる1.4倍の希釈、及び免疫沈降の(1mlから100μlへの)0.1倍の濃度効果によって補正した。測定された血漿Aβ(1-40/42)濃度(それぞれ脱凝集を伴うもの、及び伴わないもの)をpg/mlで表した。
【０１６２】
(算出及び統計解析)
各血漿試料について、下記の4つのパラメータを測定した：
1. Aβ(1-40)濃度(脱凝集を伴う)
2. Aβ(1-40)濃度(脱凝集を伴わない)
3. Aβ(1-42)濃度(脱凝集を伴う)
4. Aβ(1-42)濃度(脱凝集を伴わない)。
【０１６３】
これらのデータから、下記の比率を算出した：
オリゴマー状態のAβ(1-40)＝Aβ1-40(脱凝集を伴う)/Aβ1-40(脱凝集を伴わない)
オリゴマー状態のAβ(1-42)＝Aβ1-42(脱凝集を伴う)/Aβ1-42(脱凝集を伴わない)。
【０１６４】
血漿のオリゴマー状態のAβ(1-40)及びAβ(1-42)の、アルツハイマー病の陽性の臨床診断の存在との関連を、スチューデントのt-検定を用いて検討した。
【０１６５】
(2. 結果)
(2.1 人口統計学的特徴)
全体で、30名の健康対照及び15名のAD患者の、45名の人が本研究に参加した。血漿Aβに対する年齢の影響の可能性を観察するために、対照の人を幅広い年齢にわたって選択し、3つの群に亜分類した。第I群は、18〜30歳の対象を含み、第II群は、31〜45歳の対象を含み、第III群は、46〜65歳の対象を含む。人口統計学的特徴を表3に示す。
【０１６６】
【表３】
2013511734.tif 000006
【０１６７】
(2.2 心理テスト)
神経心理学的機能の評価のために、参加者全員が、DemTect、ミニメンタルステートテスト、及び時計描画テストを実施した。これらのテストは、研究前、並びに研究の開始から3カ月後、6カ月後、9カ月後、及び12カ月後に行なわれた。
【０１６８】
(DemTectテスト)
素点を変換して年齢及び教育に依存しない得点を出し、「認知症が疑われる」(8点以下)、「軽度認知障害」(9〜12点)、及び「年齢相応」(13〜18点)に分類する。全往診についてのテスト結果を図3に示す。図3の結果は、患者と比較すると健康対象の3つの群との間に明確な違いがあることを示している。
【０１６９】
(ミニメンタルステートテスト)
27点以上(30点中)の得点はいずれも事実上正常である。これ未満では、20〜26点は軽度の認知症を示し、10〜19点は中等度の認知症を示し、10点未満は重度の認知症を示す。正常値も教育の程度及び年齢について補正される。低い得点から極めて低い得点は、認知症の存在と密接に相関するが、他の精神障害もMMST検査での異常所見をもたらすことがある。テスト結果を図4に示す。図4の結果は、患者と比較すると健康対象の3つの群との間に明確な違いがあることを示している。
【０１７０】
(時計描画テスト)
採点システムの範囲は1点〜6点であり、より高い得点は、より多くの間違いとより多くの障害を反映する。この採点システムは、経験的に導かれ、臨床診療に基づいて修正される。必然的に、このシステムには個々の判断に任される余地がかなり残されるが、高水準の評価者間の信頼度を有するのに十分な簡易さがある。
【０１７１】
本研究は、3つの主要な要素の分析に役立つ。これらは、時計描画テストと認知機能の他の評価基準との横断的比較、時計描画テストの経時的な長期的記載、及び時計描画テストの悪化と施設への収容決定との関係性を含む。該テストの結果を図5に示す。図5の結果は、患者と比較すると健康対象の３つの群との間に明確な違いがあることを示している。
【０１７２】
(2.3 血漿オリゴマー状態のAβ(1-40)及びAβ(1-42))
Aβ(1-40/42)濃度(それぞれ脱凝集を伴う及び伴わない)を、T0＋9カ月シリーズのEDTA血漿中で測定した。2つの重大な有害事象、AD患者番号34及び35が亡くなったため、13のAD試料のみがCROにより研究に手渡された。T0＋9シリーズのさらなる試料を用いて、新しい免疫沈降法を最適化し、確立した。全体では、最適化された最終的な方法を11個のAD試料及び26個の対照試料を用いて試験した。測定された濃度を表4に示す。
【０１７３】
【表４】
2013511734.tif 000007
【０１７４】
全ての対照群についてのオリゴマー状態のAβ(1-42)に関して、AD群との比較から有意な値の増加が得られた。オリゴマー状態のAβ(1-40)の比較により、同様の結果が得られた。18〜30の群だけは、あえなくその有意性を外れた。
【０１７５】
AD群の全試料に対する全対照試料のオリゴマー状態Aβ(1-40)及びAβ(1-42)を評価した(図6)。オリゴマー状態Aβ(1-40)及びAβ(1-42)はそれぞれ、健常対照と比較すると、AD患者では顕著に減少した。オリゴマー状態Aβ(1-40)及びAβ(1-42)のp値について、それぞれ0.0074及び0.00067が得られた。
【０１７６】
使用した方法は、試料中のAβ(1-40)又はAβ(1-42)ホモオリゴマーの量を測定することはできず、試料中の単量体のAβ(1-40)及びAβ(1-42)と比較した、溶解性の凝集体内のAβ(1-40)及びAβ(1-42)ペプチドの量を提示する。この事実のために、Aβ(1-40)とAβ(1-42)との値の合計は、AD患者及び健康対照の血漿中のAβオリゴマーの全体量を反映する(図7)。
【０１７７】
オリゴマー状態の値の合計は、T-検定のp値をさらに改善したが、試料の量は、Aβ(1-40)及びAβ(1-42)のそれぞれの単回の評価と比較して低下した。
【０１７８】
(3. 考察)
本明細書中に示した結果は、オリゴマー状態のAβ1-40及びAβ1-42の減少が、アルツハイマー病の陽性の臨床診断と関連することを示している。両方のオリゴマー状態の合計(Aβ1-40＋Aβ1-42)は、有意性を向上させる(p＝1.41e-4)。これまで、文献において少数の同等の研究だけが存在する。1つの研究では、軽度ADが発症した者における経過観察の間に、原線維Aβ42の血漿レベルが低下することが第2の評価によって示され(Schupfらの文献, 2008)、このことは、出願人らのデータを支持する。しかしながら、前原線維Aβ42の血漿レベルは、全参加者(1125人の高齢者)の34％で検出可能なだけであった。この事実は、繊維形態のAβ42を用いたマウスの免疫化によって産生されたモノクローナル抗体(クローン13C3)を使用するこのアッセイの有用性を制限する。13C3抗体の特性化は、前原線維Aβ42への良好な親和性をもたらすが、単量体のAβ42にも親和性を与え(Schupfらの文献, 2008；支持情報)、これは、測定された前原線維Aβ42レベルを事実とは異なるものにし得る。したがって、オリゴマー又は前原線維特異的抗体に基づいたこれらアッセイシステムの用法は、検出抗体が、アミロイドβのより大きな分子の凝集体に専ら特異的でない場合は、妨害される。別の研究(Xiaらの文献, 2009)では、サンドイッチELISAにおいて、オリゴマーのAβの検出のために、捕捉及び検出用に同じ抗体を使用した。したがって、検出は、Aβ構体が、同一の捕捉及び検出抗体が利用可能な少なくとも2つの露出した同じエピトープのコピーを含む場合にのみ可能である（El-Agnatらの文献、2000；Howlettらの文献, 1999)。Xia及び共同研究者らは、オリゴマーのAβの血漿レベルが、p値＜0.05で増加することを見出した。これは、本明細書で示される知見とは相反することである。しかしながら、この研究において、健常対照の30％及びAD患者の52％においてのみ、オリゴマーのAβが検出可能であり、これは、このアッセイの有用性を制限している。
【０１７９】
どちらの研究も同じ問題を示している。凝集したアミロイドβは、全試料で検出できないということである。該問題は、単純なサンドイッチELISAによる非効率的で、信頼性のないアミロイドベータの回収率に起因している可能性がある。本発明において、二価の捕捉システムが、試料からの全てのAβ分子の完全な回収を保証し、これが、本アッセイをより信頼性のあるものにさせる。ごく最近の出版物は、オリゴマーのアミロイドβの間接的な定量化を使用する方法を示している(Englundらの文献, 2009)。この研究では、CSF試料を分析し、変性及び非変性条件下でAβ(1-42)レベルを定量化し、CSF試料におけるAβ42オリゴマー比を算出した。健康対照と比較してAD及びMCI試料において、比率が増加することが見出された。しかしながら、このアッセイは、変性及び非変性Aβ42の異なる定量化方法の使用によって制限される。非変性条件では、Aβ42濃度は通常のサンドイッチELISAで測定される。上記のように、そのような単純なサンドイッチELISAは、回収率に関する問題を有し得る。変性条件では、Aβ42濃度はSDS-PAGE、続くウェスタンブロット分析で測定される。この方法の決定的問題は、Aβ(1-42)構体は2％SDSでは完全に脱凝集することはできないという事実である。本出願人らの実験でも、SDS-PAGEにおいてAβ(1-42)の三量体及び四量体種が見られる。このバックグラウンドに対して、補正されたAβ(1-42)単量体の定量化は非常に疑わしいものである。さらに、この事実は、ELISAで測定された濃度との比較、及び後続の両値の比率の算出を非常に不完全なものにさせる。
【０１８０】
これまで、アミロイドβのオリゴマー又は前原線維の定量化のための発表された全ての方法は、重大な問題を示していた。それらは、ヒト血漿及びCSFのそれぞれの分析に適用可能なもののみに制限される。本発明は、これら問題を克服し、ヒト血漿におけるAβ凝集体の信頼できる検出を示している。
【０１８１】
(参考文献)
【化１】
2013511734.tif 000008
2013511734.tif 000009
2013511734.tif 000010
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2013511734.tif 000019
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2013511734.tif 000021
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2013511734.tif 000023
2013511734.tif 000024
2013511734.tif 000025
【図１】
2013511734.tif 000026
【図２】
2013511734.tif 000027
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2013511734.tif 000032
【配列表】
2013511734000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月21日(2012.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013511734000001.app
【国際調査報告】
2013511734.tif 000040
2013511734.tif 000041
2013511734.tif 000042