(57)【要約】  本発明は、高純度の、かつ、少量のフィブリノペプチドＡおよびフィブロネクチンの、ウィルスおよびプリオンセーブ（ｓａｖｅ）天然フィブリノーゲン濃縮物の製造のための方法またはプロセスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
陰イオン交換樹脂によるクロマトグラフィーを用いることによりフィブリノーゲン含有供給源からフィブリノーゲンを精製するための方法であって、前記陰イオン交換樹脂が、グラフトされた第三級または第四級アミノ基を有するヒドロキシル化ポリマーを含む担体材料から成る群より選択される、方法。
【請求項２】
前記担体材料が、セルロース、アガロース、シリカ、ポリマーまたはセラミック材料で構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記陰イオン交換樹脂が、連結基を介してヒドロキシル化メタクリル酸系ポリマーにグラフトされたトリメチル‐アミノ基、例えばＧｉｇａＣａｐ  Ｑ‐６５０Ｍ（登録商標）、である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記フィブリノーゲン含有供給源が、好ましくはおよそ中性のｐＨにて可溶化された、クリオプレシピテートである、先行する請求項の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項５】
前記溶液がＡｌ（ＯＨ）３で処理され、その結果として生じるゲルが除去される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ウィルス不活化が、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理を用いることによって行なわれる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
植物油を用いてＳ／Ｄ試薬を抽出すること、ならびに、６．９〜７．１のｐＨ値および５７０〜６１０ｍｏｓｍｏｌ／ｌのオスモル濃度にて水相をＴＭＡＥ樹脂と接触させること、が行なわれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
フィブリノーゲンを、グリシン、特には約１Ｍのグリシンによって沈殿させ、形成されるフィブリノーゲンペーストを分離する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記フィブリノーゲンペーストが、約８．０のｐＨにて、好ましくは約２０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液中に、再懸濁される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
濾過後、得られた分画を、連結基を介してヒドロキシル化メタクリル酸系ポリマー骨格にグラフトされたトリメチル‐アミノ基を含む強陰イオン交換樹脂上にロードし、緩く結合した物質を、好ましくは約１２．０ｍＳ／ｃｍの伝導度の洗浄緩衝液で洗い落とす、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
フィブリノーゲンを、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよびグリシン、好ましくは、特に約７．０のｐＨおよび１３．１〜１５ｍＳ／ｃｍの伝導度に調整された、約１．５ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、約７．０ｇ／ｌの塩化ナトリウムおよび約１０．０ｇ／ｌのグリシンを含有する溶出緩衝液で溶出する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記得られた分画を、濃縮し、製剤し、無菌濾過し、および／または、充填する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記得られた分画を凍結乾燥する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）  およそ中性のｐＨにて可溶化されるクリオプレシピテートの可溶化、
ｂ）  前記溶液を、Ａｌ（ＯＨ）３を用いた吸着に供すること、その結果として生じるゲルを除去すること、
ｃ）  工程ｂ）の結果として生じる溶液を、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理によってウィルス不活化すること、Ｓ／Ｄ試薬を植物油で抽出し、６．９〜７．１のｐＨ値および５７０〜６１０ｍｏｓｍｏｌ／ｌのオスモル濃度にて水相をＴＭＡＥ樹脂と接触させること、
ｄ）  工程ｃ）のフロースルーまたは脱離液に見出されるフィブリノーゲンの、約１Ｍのグリシンによる沈殿、および、そのフィブリノーゲンペーストの分離、
ｅ）  約８．０のｐＨでの、２０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液中での、前記フィブリノーゲンペーストの再懸濁、および、濾過、
ｆ）  工程ｅ）の濾過溶液を、連結基を介してヒドロキシル化メタクリル酸系ポリマー骨格にグラフトされたトリメチル‐アミノ基を含む強陰イオン交換樹脂上にロードし、緩く結合した物質を、約１２．０ｍＳ／ｃｍの伝導度の洗浄緩衝液で洗い落とすこと、
ｇ）  特に約７．０のｐＨおよび１３．１〜１５ｍＳ／ｃｍの伝導度に調整された、約１．５ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、約７．０ｇ／ｌの塩化ナトリウムおよび約１０．０ｇ／ｌのグリシンを含有する溶出緩衝液を用いた、フィブリノーゲンの溶出、
ｈ）  濃縮し、製剤し、無菌濾過し、充填すること、
という工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に従って得ることができるフィブリノーゲン生成物。
【請求項１６】
ａ）  およそ中性のｐＨにて可溶化されるクリオプレシピテートの可溶化、
ｂ）  前記溶液を、Ａｌ（ＯＨ）３を用いた吸着に供すること、その結果として生じるゲルを除去すること、
ｃ）  工程ｂ）の結果として生じる溶液を、トリトンおよびＴｎＢＰを用いた溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理によってウィルス不活化すること、Ｓ／Ｄ試薬を植物油で抽出し、６．９〜７．１のｐＨ値および５７０〜６１０ｍｏｓｍｏｌ／ｌのオスモル濃度にて水相をＴＭＡＥ樹脂と接触させること、
ｄ）  工程ｃ）のフロースルーまたは脱離液に見出されるフィブリノーゲンの、１Ｍのグリシンによる沈殿、および、そのフィブリノーゲンペーストの分離、
ｅ）  約８．０のｐＨでの、２０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液中での、前記フィブリノーゲンペーストの再懸濁、および、濾過、
ｆ）  工程ｅ）の濾過溶液を、連結基を介してヒドロキシル化メタクリル酸系ポリマー骨格にグラフトされたトリメチル‐アミノ基を含む強陰イオン交換樹脂上にロードし、緩く結合した物質を、約１２．０ｍＳ／ｃｍの伝導度の洗浄緩衝液で洗い落とすこと、
ｇ）  特に約７．０のｐＨおよび１３．１〜１５ｍＳ／ｃｍの伝導度に調整された、約１．５ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、約７．０ｇ／ｌの塩化ナトリウムおよび約１０．０ｇ／ｌのグリシンを含有する溶出緩衝液を用いた、フィブリノーゲンの溶出、
ｈ）  濃縮し、製剤し、無菌濾過し、充填すること、
という工程を含む方法により得ることができる、フィブリノーゲンあたり０．０１〜１．００μｇ／ｍｇのフィブロネクチン含有量を有する、請求項１５に記載のフィブリノーゲン生成物。
【請求項１７】
フィブリノペプチドＡ含有量が０．０１〜９．０ｎｇ／ｍｇフィブリノーゲンであるか、ＶＷＦ：Ａｇ活性が０．１ＩＵ／ｍｇフィブリノーゲン未満であるか、第ＸＩＩＩ因子活性が０．０７〜１ＩＵ／ｍｇフィブリノーゲンであるか、または、トロンビン活性が０．００７ＩＵ／ｍｇフィブリノーゲン未満である、請求項１５または１６に記載のフィブリノーゲン生成物。
【請求項１８】
以下の特性を有する、請求項１５〜１７のうちの少なくとも一項に記載のフィブリノーゲン生成物：
【表１】
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【請求項１９】
凍結乾燥状態にあることを特徴とする、請求項１５〜１８のうちの少なくとも一項に記載のフィブリノーゲン。
【請求項２０】
請求項１〜１４のうちの少なくとも一項に記載の方法における、請求項１５〜１９のうちの少なくとも一項に記載のフィブリノーゲン生成物の精製または製造のための、グラフトされた第三級または第四級アミノ基を有するヒドロキシル化ポリマー骨格を含む担体材料から成る群より選択される陰イオン交換樹脂の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
凝固第Ｉ因子としても知られるフィブリノーゲンは、止血および創傷治癒において、鍵となる役割を果たしている。フィブリノーゲンは、３４０．０００Ｄａの見かけ上の分子量を有する、肝臓において合成される糖タンパク質であり、２つの二量体で構成され、それらのうちのそれぞれは、ジスルフィド架橋により結合したＡα、Ｂβおよびγと称される３対の同一でないポリペプチド鎖でできている。フィブリノーゲンは、血流中におよそ１５０〜４００μｇ／ｍｌの濃度で循環している。血管の損傷時には、血小板が活性化され、栓が形成される。フィブリノーゲンは、活性化された血小板の架橋結合を助けることにより、一次止血に関与している。
【０００２】
並行して、凝固カスケードの活性化が開始される。終点としては、フィブリノーゲンは、フィブリノペプチドＡのおよび―より遅い速度においては―フィブリノペプチドＢの、トロンビンによるタンパク質分解性放出によって、フィブリンへと変換される。可溶性フィブリンモノマーは、集まって、二本鎖のねじれた原線維となる。続いて、これらの原線維は横方式に配列され、その結果、より太い線維ができる。次いで、これらの線維はＦＸＩＩＩａにより架橋結合され、フィブリンと活性化された血小板との相互作用により血小板栓を安定化するフィブリン網となり、その結果、安定した凝固がもたらされる。
【０００３】
障害および欠乏症
先天性無フィブリノーゲン血症は稀な出血性障害であり、患者は、フィブリノーゲンの欠如または機能不全に起因する、血液の不十分な凝固に苦しむ。この医学的状態は、軽度外傷後またはインターベンショナルな術式中の、特発性出血の発現または過度の出血につながる可能性がある。
【０００４】
フィブリノーゲンの後天性欠乏症は、先天性無フィブリノーゲン血症よりはずっと一般的であり、血液希釈、または、例えば手術中の失血、外傷、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）もしくは敗血症などの他の事象により誘発され得る。
【０００５】
フィブリノーゲン欠乏症は、新鮮凍結血漿またはクリオプレシピテートの静脈内注入による置換療法により、約１．５〜３ｇ／ｌの正常な血漿中フィブリノーゲンレベルへと是正することができる。しかしながら、これらの治療は、例えばウィルスまたはプリオンなどの病原体の患者への導入の危険性に悩まされるものであり、また、それにより、さらなる障害を生じている。よって、安全な方法で生理学的レベルでフィブリノーゲンを回復させるために、ウィルス不活化フィブリノーゲン組成物を静脈内投与することが得策である。
【０００６】
フィブリン糊、フィブリノーゲン接着剤、組織糊および類似物と称される調製物中にはフィブリノーゲンが存在するが、これらの調製物は、粉末、ペースト、泡沫としての、または布地と組み合わせて創傷用プラスター剤としての、局所使用が意図されたものであり、それらは、注射されるとすぐにその粘稠度および組成が血栓性の事象を開始するであろうから、静脈内投与に使用可能ではない。これらの調製物は、トロンビン、カルシウム塩および比較的多い量の凝固第ＸＩＩＩ因子をさらに含有する。そのような調製物の例が、ＵＳ‐Ａ１‐２００８／００３２７２、ＷＯ‐Ａ‐９５／２２３１６またはＵＳ‐Ａ１‐２００８／１８１８７８である。
【０００７】
フィブリノーゲン生産のためのプロセスはＥＰ‐Ｂ１‐１  ２４０  ２００から公知であり、このＥＰ‐Ｂ１‐１  ２４０  ２００は、フィブリノーゲン含有溶液からフィブリノーゲンを精製する方法であって、フィブリノーゲン含有溶液を、イオン交換マトリックスに、フィブリノーゲンがそのマトリックスに結合するような条件下で適用すること、そのイオン交換マトリックスを、少なくとも１つのω‐アミノ酸を含む緩衝溶液で洗浄すること、そのマトリックスからフィブリノーゲンを、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのクエン酸塩、４５ｍＭのスクロース；および２００ｍＭ〜１．０Ｍの濃度のＮａＣｌ、から成る緩衝液で溶出すること、ならびに所望によりフィブリノーゲンをその溶出物から回収すること、を含む方法に関する。
【０００８】
ＥＰ‐Ｂ１‐０  ７７１  ３２４は、フィブリノーゲンを含有する可溶化血漿分画を、化学的ウィルス不活化処理、すなわちＳ／Ｄまたは溶媒／界面活性剤処理に供すること、得られたウィルス不活化分画を、酸性ｐＨの、アミノ酸を含有する溶液中で沈殿に供し、上清を得ること、上清を濾過し、精製フィブリノーゲン濃縮物を得ること、および、精製フィブリノーゲン濃縮物を回収すること、によって得られる、ウィルスを含まないフィブリノーゲン濃縮物の生産のためのプロセスに言及している。回収されたフィブリノーゲン濃縮物は、第二のウィルス不活化のために紫外線放射に供される。生成物は、第三のウィルス不活化より前に、安定化および凍結乾燥される。
【０００９】
ＥＰ‐Ｂ１‐１  ５１９  ９４４は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを、フィブリノーゲンおよびプラスミノーゲンがそのマトリックスに結合するような条件下で使用すること、ならびに、フィブリノーゲンと９３％のプラスミノーゲンとを、別々に、そのマトリックスから選択的に溶出すること、を教示している。
【００１０】
ＥＰ‐Ｂ１‐０  ５５５  １３５は、第四級アミン基を含む架橋結合アガロースをベースとする陰イオン交換ゲルによるでのフィブリノーゲン溶液の精製による、静脈内投与可能なフィブリノーゲンの生産のための方法を開示している。生産されるフィブリノーゲンは、第ＶＩＩＩｃ因子を含まないとされている。
【００１１】
ＥＰ‐Ｂ１‐１  ４５７  ４９７は、溶液の安定化および凍結ならびにその後の解凍を特徴とする、フィブリノーゲン溶液中のウィルスを除去するためのプロセスに言及している。溶解していない材料の分離は、タンパク質の希釈前に行なわれ、その後に、３５ｎｍよりも小さい孔径のフィルターを用い、得られた溶液のナノ濾過が続く。
【００１２】
ＵＳ‐Ａ１‐２００６／０００９３７６も、フィブリノーゲンを製造するための方法を開示している。第ＸＩＩＩ因子を除去するための、フィブリノーゲンの、繰り返される溶解および沈殿に続く。
【００１３】
Ｇｏｈｅｅｎ，  Ｓ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ．  ８１６（１９９８）８９‐９６において、血漿タンパク質であるアルブミン、フィブリノーゲンおよび免疫グロブリン（Ｇ）の、第四級アミン官能基またはスルホプロピル官能基のいずれかを含有する非多孔性カラム材料上でのＨＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーについて報告している。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の１つの目的は、病原体関連の病気の発症または有害反応を克服するために、生産プロセスにおいて専用の病原体排除および／または不活化工程を用いて製造される、フィブリノーゲン濃縮物を提供することである。前記病原体は、細菌、ウィルス、および、例えばプリオンタンパク質スクレイピー（ＰｒＰｓｃ）などのプリオン、の群から選択される。そのようなフィブリノーゲン生成物の、静注経路経由での全身投与により、先天性無フィブリノーゲン血症および後天性フィブリノーゲン欠乏症の治療が可能となる。この標準化されたフィブリノーゲン濃縮物の投与により、緊急の状況における、時間のかかる新鮮凍結血漿の解凍なしでの速い処理、および、量的に軽減された負荷、および、本質的に一定である組成に起因する信頼できる凝固特性が可能となる。
【００１５】
本願のさらなる目的は、小規模生産、すなわち１０分の数リットル〜数リットルも可能でありながら、工業的レベルで、すなわち数百から数千リットルの出発原料、例えば血液または血漿など、について、濃縮物を製造するためのプロセスを提供することである。
【００１６】
これらのおよびさらなる目的は、請求項１〜１４に記載の方法によって、および、請求項１５〜１９においてクレームされているような本発明の方法により得ることができる生成物によって、達成される。
【００１７】
フィブリノーゲン含有供給源からのフィブリノーゲンの精製または製造のための本発明のプロセスは、通常、以下の工程を含む：
―  少なくとも１つの沈殿剤を前記フィブリノーゲン含有供給源に加えることにより、フィブリノーゲンに富んだ沈殿物を形成する；
―  任意に、前記フィブリノーゲンに富んだ沈殿物を、例えば前記沈殿物の遠心分離により、単離する；
―  前記フィブリノーゲンに富んだ沈殿物を、フィブリノーゲン含有溶液を形成する水性媒体中に溶解し、続いて、任意に濾過および／または限外／透析濾過を行う；
―  前記フィブリノーゲン含有溶液を、フィブリノーゲンが固定相に結合するような条件下で前記溶液を固定相に接触させることにより、強陰イオン交換体基を有する固定相上でのクロマトグラフィーに供する；
―  その後に、前工程のイオン強度よりも高いイオン強度を有する水溶液を用いた、前記固定相からのフィブリノーゲンの溶出が続き、フィブリノーゲンに富んだ分画を得、それを回収する；
―  所望により、その後、引き続く前記フィブリノーゲンに富んだ分画の希釈および／または濃縮の工程が続く；
―  ならびに、所望により、前記フィブリノーゲンに富んだ分画を、適切なバイアル中へと充填する。
【００１８】
本発明の製造方法の１つの実施形態では、前記フィブリノーゲン含有供給源は、血漿、分画Ｉなどの血漿分画、もしくは、クリオプレシピテート、フィブリノーゲンを産生する細胞培養物、および／または、前記細胞培養物の上清、から成る群より選択される。クリオプレシピテートを出発原料として使用しない場合には、Ｃｏｈｎ、  Ｋｉｓｔｌｅｒ‐Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎにより開示されているような周知の方法やその変法により、出発原料としてのフィブリノーゲン含有中間体が生産される。
【００１９】
薬剤的使用が可能な生成物を得るためには、前記フィブリノーゲン含有供給源を、ウィルス不活化プロセス、例えば溶媒・界面活性剤プロセスに供することは有利である。
【００２０】
本発明のもう１つの実施形態によれば、ウィルス不活化は、フィブリノーゲンに富んだ沈殿物を形成することより前に行なわれる。しかしながら、ウィルス不活化を違う段階で行なうことも可能である。
【００２１】
本発明のさらにもう１つの実施形態によれば、ウィルス不活化物質の除去は、油抽出および／または強陰イオン交換体を用いたクロマトグラフィーによって行なわれる。
【００２２】
本発明の製造方法における使用のための典型的な沈殿剤は、グリシンなどのアミノ酸、高塩濃度（塩析）、または、ポリエチレングリコール、から成る群より選択される。
【００２３】
本発明のさらにもう１つの実施形態によれば、溶解は、７．５〜８．５のｐＨを有する緩衝液中での、ペーストの再懸濁である。
【００２４】
本発明のさらなる一実施形態によれば、前記固定相は第三級または第四級アミノ基を有する。
【００２５】
本発明の製造方法におけるクロマトグラフィー工程は、特に、カラム中で行なうことができる。
【００２６】
典型的には、前記充填されたフィブリノーゲンに富んだ分画の保存形態は、液体状態にあるか、凍結状態にあるか、好ましくは＜−１５℃にあるか、最も好ましくは−３０℃よりも低いか、または、凍結乾燥物としてある。
【００２７】
本発明の製造方法に従って得ることができるフィブリノーゲンに富んだ分画もまた本発明の主題である。本発明の、フィブリノーゲンに富んだ分画は、１ｍｇのフィブリノーゲンあたり例えば０．０１〜９．０ｎｇのフィブリノペプチドＡを含有する。さらに、本発明の、フィブリノーゲンに富んだ分画は、クラウス法により測定される、１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．８０〜１．１０ｍｇのフィブリノーゲン抗原；１ｍｇのフィブリノーゲンあたり＜０．１ＩＵのＶＷＦ：Ａｇ活性；１ｍｇのフィブリノーゲンあたり≧０．０７ＩＵの凝固第ＸＩＩＩ因子活性；１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．０１〜１．００μｇのフィブロネクチン、および、１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．０３ＩＵ未満のトロンビン、を含有する。
【００２８】
前記フィブリノーゲン濃縮物は、無菌濾過後に最終容器中へと充填され、液体形態、液体凍結形態または凍結乾燥形態で保存されてもよい。
【００２９】
本方法に従って生産されるフィブリノーゲンは、その生成物の天然性を確定する非常に少ない量の不純物を特徴とするものであり、必要としている人々の長期治療を可能にするものである。ＦＸＩＩＩは、含有される濃度で好ましいが、なぜならば、それが、形成されるフィブリンの安定化を支援し、その一方で、このトランスグルタミナーゼの過負荷が回避されるからである。
【００３０】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という語は、本明細書の開示を変えることなく「成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、「成る（ｃｏｎｓｉｓｔ）」または「成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ）」によって置き換えることもできる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
原則としては、すべてのフィブリノーゲン含有供給源が、本発明に従って使用可能であるが、クリオプレシピテートが好ましい供給源であり、以下では、本発明の製造プロセスのさらなる説明において、クリオプレシピテートを、フィブリノーゲンの典型的な供給源とする。
【００３２】
典型的には、クリオプレシピテートを、適切な緩衝液条件下で、特におよそ中性のｐＨ（例えばクエン酸ＮａおよびＮａＣｌを含有する溶液緩衝液においては６．９〜７．０）にて、再構成または可溶化し、特にＡｌ（ＯＨ）３を用いた吸着に供し、その結果として生じるゲルを、例えば遠心分離によって除去する。次いで、その上清は、例えば溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理によって、ウィルス不活化となってもよい。この方法は、当業者にとって周知のものであり、もともとはＥＰ‐Ａ‐１３１  ７４０に記載されたものである。Ｓ／Ｄ化合物、例えばトリトン（Ｏ‐［４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェノキシ］‐ポリエトキシエタノール）およびＴｎＢＰ（トリ‐ｎ‐ブチルホスフェート）など、をヒマシ油での抽出によって特に除去する。さらなる精製のために、水相をクロマトグラフィープロセスに供してもよい。典型的には、水相を、強陰イオン交換ゲル、マトリックス材料上にグラフトされたトリ‐メチル‐アミノ‐エチル（ＴＭＡＥ）、例えばフラクトゲル（登録商標）ＥＭＤ‐ＴＭＡＥなど、と接触させることによって行なってもよい。このクロマトグラフィーを、６．９〜７．１のｐＨ値および５７０〜６１０ｍｏｓｍｏｌ／ｌのオスモル濃度を有する緩衝液を用いて行なう場合に、良い結果が達成可能である。これらの条件下では、フィブリノーゲンは、固定相に結合せず、それ故、フロースルーまたは脱離液中に見出されるが、バッチクロマトグラフィープロセスを行なう場合には後者である。
【００３３】
約４０ｇ／ｌ（クラウスの比濁法）を典型的に含有する非結合フィブリノーゲン溶液を、ｐＨ＝７．０〜８．０、特にはｐＨ＝７．３〜７．５に、調整する。適切な沈殿剤、例えばグリシンを、０．８〜１．２Ｍ、特には０．９〜１．１Ｍの濃度まで加えた後に、その結果として生じる溶液を、６０〜１２０分間撹拌して、フィブリノーゲンを沈殿させてもよい。次いで、そのフィブリノーゲン含有沈殿物を、遠心分離によって分離してもよく、また、この中間体フィブリノーゲンペーストは、≦７０℃にて、好ましくは−１００℃〜−７０℃にて、最大１ヶ月間、保存してもよい。既に、例えばグリシンでの、一回の沈殿によって、さらなる処理のための十分に純粋なフィブリノーゲンペーストがもたらされる。
【００３４】
このように調製した中間体を、１０〜３０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ＝７．５〜８．５）中に、特にはｐＨ＝７．５〜８．５の１５〜２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液中に、再懸濁してもよい。次いで、得られた懸濁液を、濾別し、例えば前記懸濁液の体積の５倍の、同じまたは違う緩衝液に対する、限外／透析濾過に供してもよい。
【００３５】
次いで、その結果として生じるフィブリノーゲン含有溶液を、マトリックスにグラフトされる配位子として好ましくは第三級または第四級アミノ基の群から選択される強陰イオン交換ゲル上にロードする。前記官能基は、周知の、ジエチル‐アミノ‐エチル（ＤＥＡＥ）、トリ‐メチル‐アミノ、トリ‐メチル‐アミノ‐エチル（ＴＭＡＥ）および他の基から選択されるが、一方、キャリア材料は、セルロース、アガロース、シリカ、ポリマーまたはセラミック材料で構成されていてもよい。特にフィブロネクチンおよびビトロネクチンの低減においては、連結基を介してヒドロキシル化メタクリル酸系ポリマーにグラフトされたトリメチル‐アミノ基、例えばＧｉｇａＣａｐ  Ｑ‐６５０Ｍ（登録商標）などで、良い結果が達成可能である。このことは非常に驚くべきことである。なぜならば、トリメチル‐アミノ配位子も有するジエチレン‐グリコール‐ジメタクリレート／グリシジル‐メタクリレートで構成されるものの、そのポリマー骨格中にヒドロキシル官能価を欠いているメタクリル酸系コポリマーである、化学的に類似したＭａｒｃｏ‐Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ（登録商標）は、前記した２種類のタンパク質の低減において、より効果に乏しいからである。フィルターの寿命は目詰まりの低減によって延びるので、粘着性のフィブロネクチンの効果的な低減は、所望により実施される濾過、例えば限外／透析濾過またはナノ濾過などにとって非常に有利である。本方法が、ナノ濾過を含むよう意図されたものである場合には、希釈された溶液（約２ｇ／ｌのフィブリノーゲン濃度）を用いて、特にはナノフィルターのカスケードを用いて、本方法を行なうことが好ましい。クロマトグラフィーゲルまたは樹脂は、フィブリノーゲン溶液のアプライの前に、中間体フィブリノーゲンペーストの再懸濁に使用したのと同じ緩衝液で特に予め平衡化する。緩く結合した物質を、平衡化緩衝液で、その後、洗浄用緩衝液（１．５ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、６．０ｇ／ｌの塩化ナトリウム；ｐＨ＝６．８〜７．２、好ましくは６．９〜７．１に調整されており；および２０〜２５℃の室温で１１．０〜１３．０ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する）で洗い流した。
【００３６】
次いで、フィブリノーゲンを、そのクロマトグラフィーカラムから、例えばＨＣｌおよび／またはＮａＯＨによって特に前記洗浄用緩衝液と同じｐＨ範囲に調整され、かつ、約７．０ｇ／ｌのＮａＣｌで、２０〜２５℃の室温で１３．１〜１５ｍＳ／ｃｍの伝導度に調整された、１．５ｇ／ｌのクエン酸ナトリウムおよび１０．０ｇ／ｌのグリシンを含有する溶出緩衝液で溶出してもよい。前記カラムにアプライされたフィブリノーゲンのうちのおよそ７４％が、その溶出物中に回収され、一方、フィブロネクチンは、そのフィブリノーゲン含有溶出物からほぼ完全に除去される。
【００３７】
この濾過されたフィブリノーゲン溶液を、限外／透析濾過によって約２０〜２６ｇ／ｌへとさらに濃縮し、≦０．２μｍの公称孔径のメンブレンで無菌濾過してもよい。他の濃度、例えば１〜１９．９ｇ／ｌもしくは２６．０１〜３０ｇ／ｌまたはさらにより高い濃度も達成可能であることは当業者に公知である。本発明のフィブリノーゲン濃縮物は、当業者に公知の、炭水化物、例えばスクロース、トレハロース、アミノ酸、例えばグリシン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、および、界面活性剤、例えばポリオキシエチレン‐（２０）‐ソルビタン‐モノオレエート（ＴＷＥＥＮ８０（登録商標））などの補助剤および安定剤と共に、製剤されてもよい。この無菌濾過したバルクは、所望により二度目の無菌濾過の前に−７０℃以下にて、特には−７０℃〜−８０℃にて、最大５日間保存し、最終容器中へと充填し、所望により凍結乾燥させるか、または、二回目の無菌濾過をせずに、最終容器中へと直接充填し、所望により凍結乾燥させるか、のいずれかを行なう。
【００３８】
さらなる緩衝液、安定剤、補助剤、または、凝固第ＸＩＩＩ因子（Ｆ  ＸＩＩＩ）のような他の化合物を加えることは必要ではない。凝固第ＸＩＩＩ因子は、当該濃縮物中に、１ｍｇのフィブリノーゲンあたり≧０．０５ＩＵの活性（クラウス法）で、特には、１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．０７〜０．３ＩＵの活性、１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．０６〜０．５ＩＵの活性、または、１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．０５〜１ＩＵの活性で、存在する。
【００３９】
提示されている方法に従って生産されるフィブリノーゲン濃縮物は、０．８０〜１．１０の、特には、０．８５〜１．０５または０．９０〜１．００の、フィブリノーゲン抗原／フィブリノーゲンクラウス関係；１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．０１〜９．０ｎｇ（クラウス法）の、特には、１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．０５〜８．０ｎｇまたは１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．０８〜６．０ｎｇの、フィブリノペプチドＡ含有量；１ｍｇのフィブリノーゲンあたり＜０．１ＩＵ（クラウス法）の、特には、１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．００１〜０．０９ＩＵ、１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．００２〜０．０７ＩＵまたは１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．００２〜０．０４ＩＵの、ＶＷＦ：Ａｇ活性；１ｍｇのフィブリノーゲンあたり≧０．０７ＩＵ（クラウス法）の、特には、１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．０７〜０．３ＩＵ、１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．０８〜０．５ＩＵまたは１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．０７〜１ＩＵの、第ＸＩＩＩ因子活性；１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．０１〜１．００μｇ（クラウス法）の、特には、１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．０３〜０．７０μｇまたは１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．０５〜０．４０μｇの、フィブロネクチン含有量；および１ｍｇのフィブリノーゲンあたり１〜１１ｍＩＵのプラスミノーゲン活性、を通じて、その天然性を現わす。トロンビン活性は、すべてのランについて、および、表１に提示されているのと同じフィブリノーゲン濃度において、検出可能限度である０．１５ＩＵ／ｍｌよりも低いと測定されたが、それは、１ｍｇのフィブリノーゲンあたり０．００７ＩＵ未満または０．００６９〜０．０００１ＩＵ／ｍｇに相当する。
【００４０】
以下の非限定的な例により、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００４１】
確立された方法により血漿から生産されたクリオプレシピテートを、およそ中性のｐＨにて再構成または可溶化し、Ａｌ（ＯＨ）３を用いた吸着に供し、その結果として生じたゲルを、遠心分離によって除去した。次いで、その上清を、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理によってウィルス不活化した。Ｓ／Ｄ化合物であるトリトンおよびＴｎＢＰを植物油で抽出し、水相をフラクトゲル（登録商標）ＥＭＤ‐ＴＭＡＥと接触させた。クロマトグラフィー条件（６．９〜７．１のｐＨ値および５７０〜６１０ｍｏｓｍｏｌ／ｌのオスモル濃度）を用いたが、これらの条件下では、フィブリノーゲンは、前記ゲルに結合せず、それ故、フロースルーまたは脱離液に見出された。
【００４２】
非結合フィブリノーゲンの溶液を、グリシン（１ｍｏｌ／ｌ終濃度およびｐＨ＝７．４）の添加後、約９０分間撹拌して、フィブリノーゲンを沈殿させた。次いで、そのフィブリノーゲン含有沈殿物を、遠心分離によって分離し、中間体フィブリノーゲンペーストを得た。
【００４３】
このように調製した中間体を、２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ＝約８．０）中に再懸濁した。次いで、得られた懸濁液を、濾過し、限外／透析濾過に供した。
【００４４】
次いで、その結果として生じたフィブリノーゲン含有溶液を、ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ‐６５０Ｍ（登録商標）上にロードし、また、フィブリノーゲン溶液のアプライの前に、クロマトグラフィーゲルまたは樹脂を、再懸濁に使用したのと同じＴｒｉｓ緩衝液で予め平衡化した。平衡化緩衝液、続いて、洗浄緩衝液（１．５ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、６．０ｇ／ｌの塩化ナトリウム；およそｐＨ＝７．０に調整されており；および約１２．０ｍＳ／ｃｍの伝導度）による洗浄によって、緩く結合した物質を洗い流した。次いで、溶出緩衝液（前記洗浄用緩衝液と同じｐＨに調整され、かつ、約７．０ｇ／ｌのＮａＣｌで、１３．１〜１５ｍＳ／ｃｍの伝導度に調整された、１．５ｇ／ｌのクエン酸ナトリウムおよび１０．０ｇ／ｌのグリシン）で、フィブリノーゲンをクロマトグラフィーカラムから溶出した。
【００４５】
その結果として生じたフィブリノーゲン溶液を、濃縮し、製剤し、無菌濾過した。この無菌濾過したバルクは、二度目の無菌濾過の前に−８０℃にて５日間保存し、最終容器中へと充填した。一部の最終容器は凍結乾燥させ、他は液体製剤として保持した。
【００４６】
四種類の異なる生産ランの生成物を、凍結乾燥した生成物の再構成の後に分析した。凍結乾燥物の再構成は、注射用水（ＷＦＩ）を凍結乾燥前の濃度まで加えることによってなされた。すべての生産ランは、実質的に、実施例に提示されているのと同じ方法で行なった。結果を、表１に提示する。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
表２は、クラウス法により測定される、１ｍｇのフィブリノーゲンあたりの含有量または活性の算出による、測定値の正規化を示すものである。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
市販製品との比較。
表３は、市販のフィブリノーゲン濃縮物の測定値を示すものである。すべての製品は、凍結乾燥した製品であり、製造業者のガイドラインに従って再構成された。表１に既に示した、本発明に従ったラン１〜４の値の範囲も示されている。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
表４は、クラウス法により決定される、１ｍｇのフィブリノーゲンあたりの含有量または活性の算出による、市販の生成物の測定値の正規化を提示するものである。表２に既に示した本発明に従ったラン１〜４の値の範囲も示されている。
【００５３】
【表４】
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【００５４】
ＷＯ０１／４８０１６の好ましい一実施形態との比較。
１ｇの分画Ｉペーストを、８．３３ｇの抽出緩衝液（０．８ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのε‐ＡＣＡ（イプシロン‐アミノカプロン酸）、２０ｍＭのクエン酸Ｎａ、６０ＩＵ／ｍｌのヘパリンおよびｐＨ＝７．３、すなわち、第１．１．１９項の改良緩衝液）で、３７℃にて２時間抽出した。５０ｇの２％水酸化アルミニウム（アルハイドロゲル）溶液を、当該抽出の上清に加えた。この混合物を、室温で１５分撹拌し、５０００ｇで１０分間遠心し、ペレットを捨てた。そのアルハイドロゲル上清およびグリシン／ＮａＣｌ緩衝液（２．１Ｍのグリシン、２０ｍＭのクエン酸Ｎａ、３．６ＭのＮａＣｌおよび２．４ｍＭのＣａＣｌ２）を、それぞれ、３０．２℃、２９．７℃にし、当該上清を、当該緩衝液に、４．５分以内に加えた。１部の上清と２．０５部の緩衝液との混合物を、３０．２〜３１．１℃にて２０分間撹拌し、その後、５０００ｇで１０分間遠心した。Ｇｌｙ／ＮａＣｌ‐沈殿物を、分画１ペースト抽出の上清の体積の１／３にあたる緩衝液Ｄ中に、約２１℃で、連続撹拌にて、２時間、再可溶化した。この再可溶化された沈殿物を、その後、ポリソルベート８０およびＴｎＢＰを用いて、１％（ポリソルベート８０）および０．３％（ＴｎＢＰ）の濃度で、１時間、約２３℃にてＳ／Ｄ処理した。陰イオン交換クロマトグラフィーは、約１００ｍｌカラム体積にあたる、約２０ｃｍのベッド高で、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ（登録商標）ＨＱ樹脂を用いてＸＫ２６カラムにおいて、１０ｍｌ／分の流速で行なった。平衡化は、２カラム容量の改良ＭＱ緩衝液（５０ｍＭのＴＲＩＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのε‐ＡＣＡ、ｐＨ＝８．０、第２．２．３項）とＭＱ緩衝液の伝導度＋−１０％という所定の境界線に達する伝導度（ポストカラム）とを用いて行なわれた。６カラム容量のＭＱ緩衝液で洗浄後、フィブリノーゲンは、改良緩衝液ＭＥ（５００ｍＭのＮａＣｌ、１．１ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのクエン酸Ｎａ、１０ｍＭのＴｒｉｓおよび４５ｍＭのスクロース、ｐＨ＝７．０、すなわち、緩衝液Ｄ＋２×２００ｍＭのＮａＣｌ）で、単一のピークで溶出された。分析結果を、表５に提示する。
【００５５】
【表５】
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【国際調査報告】
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