(57)【要約】ＲＡＮＴＥＳならびにそのフラグメントおよび改変体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が開示される。さらに、ＲＡＮＴＥＳならびにそのフラグメントおよび改変体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子および組成物が、免疫原をコードする核酸配列と組み合わせて提供される。ＲＡＮＴＥＳならびにそのフラグメントおよび改変体をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えウイルスベクターであって、免疫原をコードする核酸配列の有無のベクターもまた、ＲＡＮＴＥＳならびにそのフラグメントおよび改変体をコードするヌクレオチド配列を含む弱毒化生病原体と同様に提供される。免疫原に対する免疫応答を調節する方法および免疫応答を誘導する方法もまた開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって：配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１に対して９５％相同である核酸配列、配列番号３に対して９５％相同である核酸配列、配列番号５に対して９５％相同である核酸配列、配列番号７に対して９５％相同である核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、および少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでいる、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号１を含んでいる、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記コード配列の５’末端で配列番号１に連結されたＩｇＥリーダーコード配列を含む、核酸配列を含んでいる、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号３を含んでいる、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記コード配列の５’末端で配列番号１に連結されたＩｇＥリーダーコード配列を含み、さらに、５’非翻訳領域にＫｏｚａｋ配列を含む、核酸配列を含んでいる、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号５を含んでいる、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
ヒト細胞中で機能的である調節性エレメントに対して作動可能に連結された請求項１の核酸配列を含んでいる、発現ベクター。
【請求項８】
前記発現ベクターがプラスミドである、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項９】
組成物であって
ａ）以下からなる群より選択される１つ以上の核酸配列を含んでいる複数の１つ以上の核酸分子：
１）以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列：配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１に対して９５％相同である核酸配列、配列番号３に対して９５％相同である核酸配列、配列番号５に対して９５％相同である核酸配列、配列番号７に対して９５％相同である核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、および少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列；ならびに
ｂ）１つ以上の免疫原をコードする１つ以上の追加の核酸配列、
を含んでいる、組成物。
【請求項１０】
前記ｂ）の１つ以上の追加の核酸配列が、ａ）のセクションに示される複数の核酸分子から複数の１つ以上の核酸分子が異なっている、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ａ）のセクションに示される前記複数の核酸分子が配列番号１を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
ａ）のセクションに示される前記複数の核酸分子が、前記コード配列の５’末端で配列番号１に連結されたＩｇＥリーダーコード配列を含む核酸配列を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
セクションに示される前記複数の核酸分子が、配列番号３を含む核酸配列を含んでいる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
ａ）のセクションに示される前記複数の核酸分子が、前記コード配列の５’末端で配列番号１に連結されたＩｇＥリーダーコード配列を含み、さらに、５’非翻訳領域にＫｏｚａｋ配列を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
ａ）のセクションに示される複数の核酸分子が配列番号５を含んでいる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ａ）およびｂ）に示される前記核酸配列が各々、ヒト細胞で機能的である調節性エレメントに対して作動可能に連結される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ａ）およびｂ）に示される前記核酸配列が、１つ以上の発現ベクターの一部である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１８】
前記１つ以上の発現ベクターがプラスミドである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記免疫原が、病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関与する細胞と会合する抗原である、請求項９に記載の組成物。
【請求項２０】
前記免疫原が、病原体抗原である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１の核酸配列を含む核酸分子を個体に投与する工程を包含する、免疫応答を調節する方法。
【請求項２２】
請求項９の組成物を個体に投与する工程を包含する、免疫原に対して免疫応答を誘導する方法。
【請求項２３】
請求項１のヌクレオチド配列を含んでいる組み換えウイルスベクター。
【請求項２４】
調節性エレメントに対して作動可能に連結される免疫原をコードする核酸配列をさらに含んでいる、請求項２３に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２５】
前記免疫原が病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関与する細胞と会合する抗原である、請求項２３に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２６】
前記免疫原が病原体抗原である、請求項２５に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載の組み換えウイルスベクターを前記個体に投与することを包含する、個体における免疫応答を調節する方法。
【請求項２８】
請求項１のヌクレオチド配列ヌクレオチド配列を含む弱毒化生病原体。
【請求項２９】
請求項２９の弱毒化生病原体を個体に投与することを包含する、前記病原体に対して前記個体を免疫する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＡＮＴＥＳをコードする核酸分子に関する。本発明は、ＲＡＮＴＥＳをコードするヌクレオチド配列を含むワクチン、ならびに免疫原に対して個体を予防的におよび／または治療的に免疫するための方法に、ならびにＲＡＮＴＥＳをコードするヌクレオチド配列を含む免疫治療組成物、および免疫治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許仮出願第６１／３０２，３２４号に対して優先権を主張する。
【０００３】
ＲＡＮＴＥＳとは、正常Ｔ細胞の発現と分泌の活性制御タンパク質（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）の略であって、走化性サイトカンまたはケモカインとして分類される８ｋＤａのタンパク質である。ＲＡＮＴＥＳは、Ｔ細胞活性化の数日後に発現される遺伝子として特定された。多くのヒトの疾患で発現されることが見いだされたＣＣケモカインであるＲＡＮＴＥＳは、クルッペル様因子１３（Ｋｒｕｐｐｅｌ  ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ  １３）（ＫＬＦ１３）によってＴリンパ球で調節される。
【０００４】
ケモカインレセプターＣＣＲ３、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１と相互作用するＲＡＮＴＥＳは、Ｔ細胞、好酸球、および好塩基球に走化性である。ＲＡＮＴＥＳは、炎症部位への白血球の補充に関与する。ＲＡＮＴＥＳとサイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−γ（Ｔ細胞によって放出される）との組み合わせは、特定のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖および活性化を誘導する。このような細胞は、ＣＨＡＫ（ＣＣ−ケモカイン活性化キラー（ＣＣ−Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ））細胞と呼ばれる。
【０００５】
参照によって本明細書に援用される米国特許出願第０９／６２２，４５２号は、免疫治療剤およびワクチン成分としてＲＡＮＴＥＳをコードする核酸分子を用いる組成物および方法を開示する。ＲＡＮＴＥＳの発現は免疫治療剤として用いられる場合、それが発現される個体における免疫系の特定の局面を改変する。同様に、ＲＡＮＴＥＳの発現は、ワクチンの一部として用いられる場合、そのワクチンの免疫原に対する免疫応答の特定の局面を増強する。
【０００６】
免疫療法とは、所望の治療効果を付与するためにヒトの免疫応答を調節することを指す。免疫治療剤とは、個体に投与された場合、その個体の免疫系を、所望されない免疫応答に伴う症状を最終的に低減するか、または所望の免疫応答を増大することによって症状を最終的に緩和するのに十分調節する組成物を指す。ある場合には、免疫療法は、ワクチン接種プロトコールの一部であり、ここでは個体は、ワクチンを投与され、そのワクチンはその個体が、このような場合、免疫応答を生じる免疫原に対してその個体を暴露し、免疫治療剤は、特定の病態、感染または疾患を処置または予防するために所望される免疫応答を増大するか、および／または免疫応答の一部（例えば、細胞性のアームまたは体液性のアーム）を選択的に増強する。
【０００７】
ワクチンのプロトコールは、改善された免疫応答を誘導するようにヒトの免疫応答を調節する因子の送達によって改善され得る。個体が免疫応答を生じる免疫原に対して個体を暴露するワクチンをその個体が投与されるいくつかのワクチン接種のプロトコールでは、特定の病態、感染または疾患を処置または予防するために所望される免疫応答を増大するか、および／または免疫応答の一部（例えば、細胞性のアームまたは体液性のアーム）を選択的に増強する因子が提供される。
【０００８】
ワクチンは、アレルゲン、病原体抗原、またはヒト疾患に関与する細胞に関連する抗原などの標的抗原に対して個体を免疫するのに有用である。ヒト疾患に関与する細胞に関連する抗原としては、癌関連の腫瘍抗原および自己免疫疾患に関与する細胞に関連する抗原が挙げられる。
【０００９】
このようなワクチンを設計するには、ワクチン接種された個体の細胞において標的抗原を生成するワクチンは、免疫系の細胞性アームを誘導するのに有効であることが認識された。詳細には、弱毒化生ワクチン、無毒のベクターを用いる組み換えワクチン、およびワクチン接種された個体の細胞で抗原の産生を各々がもたらすＤＮＡワクチンであって、これは、免疫系の細胞性アームの誘導を生じる。他方では、死滅ワクチンまたは不活化ワクチン、およびタンパク質のみを含むサブユニットワクチンは、良好な細胞性免疫応答を誘導しないが、それらは有効な体液性応答を誘導する。
【００１０】
細胞性免疫応答は、病原体感染に対して防御を提供するために、および病原体感染、癌または自己免疫疾患の処置のために有効な免疫媒介性の治療を提供するために必要である場合が多い。従って、ワクチン接種された個体の細胞において標的抗原を生成するワクチン、例えば、弱毒化生ワクチン、無毒のベクターを用いる組み換えワクチン、およびＤＮＡワクチンが好ましい場合が多い。
【００１１】
動物およびヒトの疾患に対してタンパク質またはワクチンを送達するための核酸配列の直接投与が研究されており、かなりの労力が、治療用／アジュバントのタンパク質および／または所望の抗原の必要な発現を生じるために核酸送達の有効かつ効率的な手段に集中していた。
【００１２】
ＤＮＡワクチンは、弱毒化生ウイルスおよび組み換えタンパク質ベースのワクチンなどの伝統的な遺伝子送達およびワクチン接種方法を上回る多くの概念的な利点を有する。ＤＮＡワクチンは、安全、安定であり、容易に産生され、かつヒトでよく耐容され、前臨床試験ではプラスミド組み込みの証拠をほとんど示さない［非特許文献１；非特許文献２］。さらに、ＤＮＡワクチンは、ワクチンの有効性がベクターに対する既存の抗体の力価によって影響されないという事実に起因して、反復投与によく適している［非特許文献３］。しかし、ＤＮＡワクチンの臨床採用に関する１つの主要な障害は、より大きい動物に移動する場合のプラットフォームの免疫原性の減少であった［非特許文献４］。ＤＮＡワクチン免疫原の操作における近年の技術的進歩は、コドン最適化、ＲＮＡ最適化であり、免疫グロブリンリーダー配列の付加がＤＮＡワクチンの発現および免疫原性を改善し［非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８］、同様に、近年では、エレクトロポレーションのようなプラスミド送達システムにおける技術を開発した［非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１］。さらに、コンセンサスな免疫原の使用では、天然の抗原単独に比較して細胞性免疫応答の幅を増大できることが研究によって示唆された［Ｙａｎ，Ｊ．ら、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ−１  ｓｕｂｔｙｐｅ  Ｂ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００７．１５（２）：ｐ．４１１〜２１；Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｍ．ら、Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｃｅｎｔｅｒ−ｏｆ−ｔｒｅｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１６）：ｐ．８５０７〜１４］。
【００１３】
プラスミドＤＮＡのような核酸配列を送達するための一方法は、エレクトロポレーション（ＥＰ）技術である。この技術は、ブレオマイシンのような抗癌薬を送達するためのヒト臨床試験において、および多数の動物種での多くの前臨床研究において用いられた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．ら、Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１９９９．１０（５）：ｐ．７５９〜６８
【非特許文献２】Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｗ．Ｗ．ら、Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｏｍｅ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１９９５．７７２：ｐ．３０〜９
【非特許文献３】Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｂｏｙｅｒ，およびＤ．Ｂ．Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ａ  ｎｅｗ  ｅｒａ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ，１９９７．１１（１０）：ｐ．７５３〜６３
【非特許文献４】Ｌｉｕ，Ｍ．Ａ．およびＪ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ａｄｖ  Ｇｅｎｅｔ，２００５．５５：ｐ．２５〜４０
【非特許文献５】Ａｎｄｒｅ，Ｓ．ら、Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｐ１２０  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，１９９８．７２（２）：ｐ．１４９７〜５０３
【非特許文献６】Ｄｅｍｌ，Ｌ．ら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｇａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００１．７５（２２）：ｐ．１０９９１〜１００１
【非特許文献７】Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７．２５（１６）：ｐ．２９８４〜９
【非特許文献８】Ｆｒｅｌｉｎ，Ｌ．ら、Ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ３／４Ａ  ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２００４．１１（６）：ｐ．５２２〜３３
【非特許文献９】Ｈｉｒａｏ，Ｌ．Ａ．ら、Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ／ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｐｉｇｓ  ａｎｄ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００８．２６（３）：ｐ．４４０〜８
【非特許文献１０】Ｌｕｃｋａｙ，Ａ．ら、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１０）：ｐ．５２５７〜６９
【非特許文献１１】Ａｈｌｅｎ，Ｇ．ら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ３／４Ａ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｏｃａｌ  ＤＮＡ  ｕｐｔａｋｅ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ３＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７．１７９（７）：ｐ．４７４１〜５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ワクチンは、病原体感染またはヒト疾患に対して個体を予防的にまたは治療的に免疫するために有効である場合が多いが、改良されたワクチンが必要である。増強された免疫応答を生じる組成物および方法が必要である。同様に、いくつかの免疫治療剤は、患者の免疫応答を調節するのに有用であるが、改良された免疫治療用の組成物および方法の必要性はまだ残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の要旨
本発明は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子に関する：配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１に対して９５％相同である核酸配列、配列番号３に対して９５％相同である核酸配列、配列番号５に対して９５％相同である核酸配列、配列番号７に対して９５％相同である核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、および少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列．
【００１７】
本発明は、組成物であって、以下からなる群より選択される１つ以上の核酸配列を含んでいる複数の１つ以上の核酸分子を含んでいる、組成物にも関する：１）以下からなる群より選択される核酸配列：配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１に対して９５％相同である核酸配列、配列番号３に対して９５％相同である核酸配列、配列番号５に対して９５％相同である核酸配列、配列番号７に対して９５％相同である核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、および少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列；ならびにｂ）１つ以上の免疫原をコードする１つ以上の追加の核酸配列。
【００１８】
本発明は、さらに、免疫応答を調節する方法であって、個体に対して、以下：配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１に対して９５％相同である核酸配列、配列番号３に対して９５％相同である核酸配列、配列番号５に対して９５％相同である核酸配列、配列番号７に対して９５％相同である核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、および少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子；または組成物であって、以下：１）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１に対して９５％相同である核酸配列、配列番号３に対して９５％相同である核酸配列、配列番号５に対して９５％相同である核酸配列、配列番号７に対して９５％相同である核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、および少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列からなる群より選択される１つ以上の核酸配列を含む複数の１つ以上の核酸分子；ならびにｂ）１つ以上の免疫原をコードする１つ以上の追加の核酸配列を含む組成物、を投与する工程を包含する方法に関する。
【００１９】
本発明は、さらに、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでいる組み換えウイルスベクターに関する：配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１に対して９５％相同である核酸配列、配列番号３に対して９５％相同である核酸配列、配列番号５に対して９５％相同である核酸配列、配列番号７に対して９５％相同である核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、および少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列。
【００２０】
本発明はまた、個体における免疫応答を調節する方法であって、この個体に対して、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む組み換えウイルスベクターを投与することを包含する、方法に関する：配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１に対して９５％相同である核酸配列、配列番号３に対して９５％相同である核酸配列、配列番号５に対して９５％相同である核酸配列、配列番号７に対して９５％相同である核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、および少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列。
【００２１】
本発明は、さらに、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでいる弱毒化生病原体に関する：配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１に対して９５％相同である核酸配列、配列番号３に対して９５％相同である核酸配列、配列番号５に対して９５％相同である核酸配列、配列番号７に対して９５％相同である核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、および少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列。
【００２２】
本発明はまた、病原体に対して個体を免疫する方法であって、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでいる弱毒化生病原体をこの個体に投与することを包含する方法に関する：配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１に対して９５％相同である核酸配列、配列番号３に対して９５％相同である核酸配列、配列番号５に対して９５％相同である核酸配列、配列番号７に対して９５％相同である核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメント、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号１の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号３の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号５の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列、および少なくとも６０個のヌクレオチドを含んでいる配列番号７の機能的なフラグメントに対して９５％相同である核酸配列。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１ａ】図１ａ〜図１ｅは、ＥＰによるＤＮＡワクチン接種後の堅調な細胞性免疫応答の誘導を示しているデータを示す。各々の免疫後のＳＩＶｇａｇ（白いバー）、ｅｎｖ（灰色のバー）およびｐｏｌ（黒のバー）に対する総応答を、累積群の平均応答±ＳＥＭとして示す。テューキー事後検定（Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）およびダネットＴ３事後検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ  Ｔ３  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ）を用いて、それぞれ第三および第四の免疫についての群の間の相違の有意差を決定した。
【図１ｂ】図１ａ〜図１ｅは、ＥＰによるＤＮＡワクチン接種後の堅調な細胞性免疫応答の誘導を示しているデータを示す。各々の免疫後のＳＩＶｇａｇ（白いバー）、ｅｎｖ（灰色のバー）およびｐｏｌ（黒のバー）に対する総応答を、累積群の平均応答±ＳＥＭとして示す。テューキー事後検定（Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）およびダネットＴ３事後検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ  Ｔ３  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ）を用いて、それぞれ第三および第四の免疫についての群の間の相違の有意差を決定した。
【図１ｃ】図１ａ〜図１ｅは、ＥＰによるＤＮＡワクチン接種後の堅調な細胞性免疫応答の誘導を示しているデータを示す。各々の免疫後のＳＩＶｇａｇ（白いバー）、ｅｎｖ（灰色のバー）およびｐｏｌ（黒のバー）に対する総応答を、累積群の平均応答±ＳＥＭとして示す。テューキー事後検定（Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）およびダネットＴ３事後検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ  Ｔ３  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ）を用いて、それぞれ第三および第四の免疫についての群の間の相違の有意差を決定した。
【図１ｄ】図１ａ〜図１ｅは、ＥＰによるＤＮＡワクチン接種後の堅調な細胞性免疫応答の誘導を示しているデータを示す。各々の免疫後のＳＩＶｇａｇ（白いバー）、ｅｎｖ（灰色のバー）およびｐｏｌ（黒のバー）に対する総応答を、累積群の平均応答±ＳＥＭとして示す。テューキー事後検定（Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）およびダネットＴ３事後検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ  Ｔ３  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ）を用いて、それぞれ第三および第四の免疫についての群の間の相違の有意差を決定した。
【図１ｅ】図１ａ〜図１ｅは、ＥＰによるＤＮＡワクチン接種後の堅調な細胞性免疫応答の誘導を示しているデータを示す。各々の免疫後のＳＩＶｇａｇ（白いバー）、ｅｎｖ（灰色のバー）およびｐｏｌ（黒のバー）に対する総応答を、累積群の平均応答±ＳＥＭとして示す。テューキー事後検定（Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）およびダネットＴ３事後検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ  Ｔ３  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ）を用いて、それぞれ第三および第四の免疫についての群の間の相違の有意差を決定した。
【図２ａ】図２ａ〜図２ｃは、ＤＮＡ免疫後のエキソビボの増殖能力を示す。第四回の免疫の２週後に単離された新鮮なＰＢＭＣをＣＦＳＥで染色し、ＳＩＶｇａｇ（白いバー）、ｅｎｖ（灰色のバー）およびｐｏｌ（黒のバー）のペプチドを用いてインビトロで５日間刺激して、抗原特異的細胞の増殖能力を決定した。図２ａでは、代表的な動物のドット・プロットを示す。総ＳＩＶの増殖応答をＣＤ４＋については図２ｂに、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞区画については図２ｃに、累積群の平均応答±ＳＥＭとして示す。群の間の統計学的相違は、ｐ値が０．０１７未満を有意としてボンフェローニの調整を用いてペアワイズのマンホイットニー検定を行うことによって決定した。
【図２ｂ】図２ａ〜図２ｃは、ＤＮＡ免疫後のエキソビボの増殖能力を示す。第四回の免疫の２週後に単離された新鮮なＰＢＭＣをＣＦＳＥで染色し、ＳＩＶｇａｇ（白いバー）、ｅｎｖ（灰色のバー）およびｐｏｌ（黒のバー）のペプチドを用いてインビトロで５日間刺激して、抗原特異的細胞の増殖能力を決定した。図２ａでは、代表的な動物のドット・プロットを示す。総ＳＩＶの増殖応答をＣＤ４＋については図２ｂに、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞区画については図２ｃに、累積群の平均応答±ＳＥＭとして示す。群の間の統計学的相違は、ｐ値が０．０１７未満を有意としてボンフェローニの調整を用いてペアワイズのマンホイットニー検定を行うことによって決定した。
【図２ｃ】図２ａ〜図２ｃは、ＤＮＡ免疫後のエキソビボの増殖能力を示す。第四回の免疫の２週後に単離された新鮮なＰＢＭＣをＣＦＳＥで染色し、ＳＩＶｇａｇ（白いバー）、ｅｎｖ（灰色のバー）およびｐｏｌ（黒のバー）のペプチドを用いてインビトロで５日間刺激して、抗原特異的細胞の増殖能力を決定した。図２ａでは、代表的な動物のドット・プロットを示す。総ＳＩＶの増殖応答をＣＤ４＋については図２ｂに、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞区画については図２ｃに、累積群の平均応答±ＳＥＭとして示す。群の間の統計学的相違は、ｐ値が０．０１７未満を有意としてボンフェローニの調整を用いてペアワイズのマンホイットニー検定を行うことによって決定した。
【図３ａ】図３ａ〜３ｄは、免疫後のＳＩＶｐｏｌの応答の多機能的なプロフィールを示す。第４回目の免疫２週後に単離されたＰＢＭＣを、インビトロでＳＩＶｐｏｌペプチドプール混合物を用いて５時間刺激した。細胞を、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２の細胞内産生ならびにＣＤ１０７ａによる脱顆粒について染色した。図３ａは、細胞内サイトカイン染色のための代表的なゲート分析を示す。一重項の集団を前方散乱高（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｈｅｉｇｈｔ）（ＦＳＣ−Ｈ）および前方散乱面積（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ  ａｒｅａ）（ＦＳＣ−Ａ）によって識別する。引き続いて、本発明者らは、ＦＳＣ−Ａによって側方散乱面積（ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ  ａｒｅａ）（ＳＳＣ−Ａ）を用いてリンパ球集団を単離した。生きたＴ細胞は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅダンプ・ゲート（ｄｕｍｐ  ｇａｔｅ）（これは、生存に関してＶｉｏｌｅｔ  Ｖｉｖｉｄ  Ｄｙｅを含む）ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ１９について陰性に染色され、ＣＤ３について陽性に染色されると特定した。この後、ＩＦＮ−γに対するＣＤ８＋およびＣＤ４＋事象に対して事象を連続してゲートして下方制御を説明する。この実施例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の特定のためのゲートを示す。第一にＣＤ３＋  ＣＤ８＋のＴ細胞を、陽性のＣＤ８染色および陰性のＣＤ４染色によって同定し、活性化後に上方制御されたＣＤ８を有し得るＣＤ４＋Ｔ細胞を除外する。ＣＤ２８およびＣＤ９５染色によって、ナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞を分析から除外した。次いで、この得られた抗原経験済みのＣＤ８＋Ｔ細胞を、我々のパネルにおいて４つの機能の各々についてゲートした：ＣＤ１０７ａ、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦα。図３ａおよび図３ｂにおける棒グラフは、１５個の機能的な組み合わせの各々の頻度を示す。図３ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を示す。図３ｃは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を示す。円グラフは、４つの機能（紫色または濃灰色）、３つの機能（黄色または淡灰色）、２つの機能（緑または中濃灰色）または１つの機能（淡青色または灰色）を有するＳＩＶｐｏｌ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。円グラフ上に重ね合わされた数は、ＳＩＶｐｏｌ応答の総頻度に相当する。図３ｄは、ＩＦＮγ＋単機能ＣＤ８＋Ｔ細胞の記憶表現型に関する。ＩＦＮγ＋単機能（濃灰色）のドットプロットをＣＤ９５密度プロットによってＣＤ２８上に重ねて、この集団の記憶表現型を決定した。ＤＮＡ＋１２群における代表的な動物からの染色を示す。
【図３ｂ】図３ａ〜３ｄは、免疫後のＳＩＶｐｏｌの応答の多機能的なプロフィールを示す。第４回目の免疫２週後に単離されたＰＢＭＣを、インビトロでＳＩＶｐｏｌペプチドプール混合物を用いて５時間刺激した。細胞を、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２の細胞内産生ならびにＣＤ１０７ａによる脱顆粒について染色した。図３ａは、細胞内サイトカイン染色のための代表的なゲート分析を示す。一重項の集団を前方散乱高（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｈｅｉｇｈｔ）（ＦＳＣ−Ｈ）および前方散乱面積（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ  ａｒｅａ）（ＦＳＣ−Ａ）によって識別する。引き続いて、本発明者らは、ＦＳＣ−Ａによって側方散乱面積（ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ  ａｒｅａ）（ＳＳＣ−Ａ）を用いてリンパ球集団を単離した。生きたＴ細胞は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅダンプ・ゲート（ｄｕｍｐ  ｇａｔｅ）（これは、生存に関してＶｉｏｌｅｔ  Ｖｉｖｉｄ  Ｄｙｅを含む）ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ１９について陰性に染色され、ＣＤ３について陽性に染色されると特定した。この後、ＩＦＮ−γに対するＣＤ８＋およびＣＤ４＋事象に対して事象を連続してゲートして下方制御を説明する。この実施例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の特定のためのゲートを示す。第一にＣＤ３＋  ＣＤ８＋のＴ細胞を、陽性のＣＤ８染色および陰性のＣＤ４染色によって同定し、活性化後に上方制御されたＣＤ８を有し得るＣＤ４＋Ｔ細胞を除外する。ＣＤ２８およびＣＤ９５染色によって、ナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞を分析から除外した。次いで、この得られた抗原経験済みのＣＤ８＋Ｔ細胞を、我々のパネルにおいて４つの機能の各々についてゲートした：ＣＤ１０７ａ、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦα。図３ａおよび図３ｂにおける棒グラフは、１５個の機能的な組み合わせの各々の頻度を示す。図３ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を示す。図３ｃは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を示す。円グラフは、４つの機能（紫色または濃灰色）、３つの機能（黄色または淡灰色）、２つの機能（緑または中濃灰色）または１つの機能（淡青色または灰色）を有するＳＩＶｐｏｌ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。円グラフ上に重ね合わされた数は、ＳＩＶｐｏｌ応答の総頻度に相当する。図３ｄは、ＩＦＮγ＋単機能ＣＤ８＋Ｔ細胞の記憶表現型に関する。ＩＦＮγ＋単機能（濃灰色）のドットプロットをＣＤ９５密度プロットによってＣＤ２８上に重ねて、この集団の記憶表現型を決定した。ＤＮＡ＋１２群における代表的な動物からの染色を示す。
【図３ｃ】図３ａ〜３ｄは、免疫後のＳＩＶｐｏｌの応答の多機能的なプロフィールを示す。第４回目の免疫２週後に単離されたＰＢＭＣを、インビトロでＳＩＶｐｏｌペプチドプール混合物を用いて５時間刺激した。細胞を、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２の細胞内産生ならびにＣＤ１０７ａによる脱顆粒について染色した。図３ａは、細胞内サイトカイン染色のための代表的なゲート分析を示す。一重項の集団を前方散乱高（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｈｅｉｇｈｔ）（ＦＳＣ−Ｈ）および前方散乱面積（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ  ａｒｅａ）（ＦＳＣ−Ａ）によって識別する。引き続いて、本発明者らは、ＦＳＣ−Ａによって側方散乱面積（ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ  ａｒｅａ）（ＳＳＣ−Ａ）を用いてリンパ球集団を単離した。生きたＴ細胞は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅダンプ・ゲート（ｄｕｍｐ  ｇａｔｅ）（これは、生存に関してＶｉｏｌｅｔ  Ｖｉｖｉｄ  Ｄｙｅを含む）ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ１９について陰性に染色され、ＣＤ３について陽性に染色されると特定した。この後、ＩＦＮ−γに対するＣＤ８＋およびＣＤ４＋事象に対して事象を連続してゲートして下方制御を説明する。この実施例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の特定のためのゲートを示す。第一にＣＤ３＋  ＣＤ８＋のＴ細胞を、陽性のＣＤ８染色および陰性のＣＤ４染色によって同定し、活性化後に上方制御されたＣＤ８を有し得るＣＤ４＋Ｔ細胞を除外する。ＣＤ２８およびＣＤ９５染色によって、ナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞を分析から除外した。次いで、この得られた抗原経験済みのＣＤ８＋Ｔ細胞を、我々のパネルにおいて４つの機能の各々についてゲートした：ＣＤ１０７ａ、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦα。図３ａおよび図３ｂにおける棒グラフは、１５個の機能的な組み合わせの各々の頻度を示す。図３ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を示す。図３ｃは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を示す。円グラフは、４つの機能（紫色または濃灰色）、３つの機能（黄色または淡灰色）、２つの機能（緑または中濃灰色）または１つの機能（淡青色または灰色）を有するＳＩＶｐｏｌ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。円グラフ上に重ね合わされた数は、ＳＩＶｐｏｌ応答の総頻度に相当する。図３ｄは、ＩＦＮγ＋単機能ＣＤ８＋Ｔ細胞の記憶表現型に関する。ＩＦＮγ＋単機能（濃灰色）のドットプロットをＣＤ９５密度プロットによってＣＤ２８上に重ねて、この集団の記憶表現型を決定した。ＤＮＡ＋１２群における代表的な動物からの染色を示す。
【図３ｄ】図３ａ〜３ｄは、免疫後のＳＩＶｐｏｌの応答の多機能的なプロフィールを示す。第４回目の免疫２週後に単離されたＰＢＭＣを、インビトロでＳＩＶｐｏｌペプチドプール混合物を用いて５時間刺激した。細胞を、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２の細胞内産生ならびにＣＤ１０７ａによる脱顆粒について染色した。図３ａは、細胞内サイトカイン染色のための代表的なゲート分析を示す。一重項の集団を前方散乱高（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｈｅｉｇｈｔ）（ＦＳＣ−Ｈ）および前方散乱面積（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ  ａｒｅａ）（ＦＳＣ−Ａ）によって識別する。引き続いて、本発明者らは、ＦＳＣ−Ａによって側方散乱面積（ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ  ａｒｅａ）（ＳＳＣ−Ａ）を用いてリンパ球集団を単離した。生きたＴ細胞は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅダンプ・ゲート（ｄｕｍｐ  ｇａｔｅ）（これは、生存に関してＶｉｏｌｅｔ  Ｖｉｖｉｄ  Ｄｙｅを含む）ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ１９について陰性に染色され、ＣＤ３について陽性に染色されると特定した。この後、ＩＦＮ−γに対するＣＤ８＋およびＣＤ４＋事象に対して事象を連続してゲートして下方制御を説明する。この実施例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の特定のためのゲートを示す。第一にＣＤ３＋  ＣＤ８＋のＴ細胞を、陽性のＣＤ８染色および陰性のＣＤ４染色によって同定し、活性化後に上方制御されたＣＤ８を有し得るＣＤ４＋Ｔ細胞を除外する。ＣＤ２８およびＣＤ９５染色によって、ナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞を分析から除外した。次いで、この得られた抗原経験済みのＣＤ８＋Ｔ細胞を、我々のパネルにおいて４つの機能の各々についてゲートした：ＣＤ１０７ａ、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦα。図３ａおよび図３ｂにおける棒グラフは、１５個の機能的な組み合わせの各々の頻度を示す。図３ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を示す。図３ｃは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を示す。円グラフは、４つの機能（紫色または濃灰色）、３つの機能（黄色または淡灰色）、２つの機能（緑または中濃灰色）または１つの機能（淡青色または灰色）を有するＳＩＶｐｏｌ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。円グラフ上に重ね合わされた数は、ＳＩＶｐｏｌ応答の総頻度に相当する。図３ｄは、ＩＦＮγ＋単機能ＣＤ８＋Ｔ細胞の記憶表現型に関する。ＩＦＮγ＋単機能（濃灰色）のドットプロットをＣＤ９５密度プロットによってＣＤ２８上に重ねて、この集団の記憶表現型を決定した。ＤＮＡ＋１２群における代表的な動物からの染色を示す。
【図４ａ】図４ａおよび４ｂは、多機能的な記憶Ｔ細胞集団の維持を示す。最終の免疫（ＳＩＶｍａｃ２５１のチャレンジの日）の８カ月後に単離されたＰＢＭＣを、インビトロでＳＩＶｐｏｌペプチドのプール混合物を用いて５時間刺激した。細胞を、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２の細胞内産生ならびにＣＤ１０７ａによる脱顆粒について染色した。図４ａおよび図４ｂにおける棒グラフは、１５の機能的な組み合わせの各々の頻度を示す。図４ａはＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す。図４ｂはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。円グラフは、４つの機能（紫色または濃灰色）、３つの機能（黄色または淡灰色）、２つの機能（緑中濃灰色）または１つの機能（淡青色または灰色）を有するＳＩＶｐｏｌ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。円グラフ上に重ね合わされた数は、ＳＩＶｐｏｌ応答の総頻度に相当する。
【図４ｂ】図４ａおよび４ｂは、多機能的な記憶Ｔ細胞集団の維持を示す。最終の免疫（ＳＩＶｍａｃ２５１のチャレンジの日）の８カ月後に単離されたＰＢＭＣを、インビトロでＳＩＶｐｏｌペプチドのプール混合物を用いて５時間刺激した。細胞を、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２の細胞内産生ならびにＣＤ１０７ａによる脱顆粒について染色した。図４ａおよび図４ｂにおける棒グラフは、１５の機能的な組み合わせの各々の頻度を示す。図４ａはＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す。図４ｂはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。円グラフは、４つの機能（紫色または濃灰色）、３つの機能（黄色または淡灰色）、２つの機能（緑中濃灰色）または１つの機能（淡青色または灰色）を有するＳＩＶｐｏｌ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。円グラフ上に重ね合わされた数は、ＳＩＶｐｏｌ応答の総頻度に相当する。
【図５ａ】図５ａ〜図５ｄは、ＳＩＶｍａｃ２５１粘膜変化からのデータを示す。図５ａは、ワクチン接種した（  または淡灰色）とワクチン接種していない（●または濃灰色）動物との間のウイルス負荷の比較を、チャレンジ前、チャレンジ後２週（ピーク）、１４週（設定ポイント）、および３５週（慢性）で示す。図５ｂは、チャレンジ前、ピーク、設定ポイント、および慢性のウイルス負荷量の比較を以下の群で示す：ナイーブ（●または濃灰色）、
【数１】
2013518599.tif 000002
、ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ
【化１】
2013518599.tif 000003
。図５ｃは、プロットの曲線下面積を示す。群の平均を示す。図５ｄは、防御的なクラスＩ対立遺伝子、Ｍａｍｕ−Ｂ＊０３およびＭａｍｕ−Ｂ＊０１７
【化２】
2013518599.tif 000004
とノンコントローラー対立遺伝子
【化３】
2013518599.tif 000005
動物との間のウイルス負荷の比較を、ピーク、設定ポイント、および慢性の感染の間で示す。両側Ｔ検定を行って、図５ａと図５ｄの群の間の相違の有意差を決定し、両側ダネット事後検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）を用いるＡＮＯＶＡを図５ｂで用いた。
【図５ｂ】図５ａ〜図５ｄは、ＳＩＶｍａｃ２５１粘膜変化からのデータを示す。図５ａは、ワクチン接種した（  または淡灰色）とワクチン接種していない（●または濃灰色）動物との間のウイルス負荷の比較を、チャレンジ前、チャレンジ後２週（ピーク）、１４週（設定ポイント）、および３５週（慢性）で示す。図５ｂは、チャレンジ前、ピーク、設定ポイント、および慢性のウイルス負荷量の比較を以下の群で示す：ナイーブ（●または濃灰色）、
【数１】
2013518599.tif 000006
、ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ
【化１】
2013518599.tif 000007
。図５ｃは、プロットの曲線下面積を示す。群の平均を示す。図５ｄは、防御的なクラスＩ対立遺伝子、Ｍａｍｕ−Ｂ＊０３およびＭａｍｕ−Ｂ＊０１７
【化２】
2013518599.tif 000008
とノンコントローラー対立遺伝子
【化３】
2013518599.tif 000009
動物との間のウイルス負荷の比較を、ピーク、設定ポイント、および慢性の感染の間で示す。両側Ｔ検定を行って、図５ａと図５ｄの群の間の相違の有意差を決定し、両側ダネット事後検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）を用いるＡＮＯＶＡを図５ｂで用いた。
【図５ｃ】図５ａ〜図５ｄは、ＳＩＶｍａｃ２５１粘膜変化からのデータを示す。図５ａは、ワクチン接種した（  または淡灰色）とワクチン接種していない（●または濃灰色）動物との間のウイルス負荷の比較を、チャレンジ前、チャレンジ後２週（ピーク）、１４週（設定ポイント）、および３５週（慢性）で示す。図５ｂは、チャレンジ前、ピーク、設定ポイント、および慢性のウイルス負荷量の比較を以下の群で示す：ナイーブ（●または濃灰色）、
【数１】
2013518599.tif 000010
、ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ
【化１】
2013518599.tif 000011
。図５ｃは、プロットの曲線下面積を示す。群の平均を示す。図５ｄは、防御的なクラスＩ対立遺伝子、Ｍａｍｕ−Ｂ＊０３およびＭａｍｕ−Ｂ＊０１７
【化２】
2013518599.tif 000012
とノンコントローラー対立遺伝子
【化３】
2013518599.tif 000013
動物との間のウイルス負荷の比較を、ピーク、設定ポイント、および慢性の感染の間で示す。両側Ｔ検定を行って、図５ａと図５ｄの群の間の相違の有意差を決定し、両側ダネット事後検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）を用いるＡＮＯＶＡを図５ｂで用いた。
【図５ｄ】図５ａ〜図５ｄは、ＳＩＶｍａｃ２５１粘膜変化からのデータを示す。図５ａは、ワクチン接種した（  または淡灰色）とワクチン接種していない（●または濃灰色）動物との間のウイルス負荷の比較を、チャレンジ前、チャレンジ後２週（ピーク）、１４週（設定ポイント）、および３５週（慢性）で示す。図５ｂは、チャレンジ前、ピーク、設定ポイント、および慢性のウイルス負荷量の比較を以下の群で示す：ナイーブ（●または濃灰色）、
【数１】
2013518599.tif 000014
、ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ
【化１】
2013518599.tif 000015
。図５ｃは、プロットの曲線下面積を示す。群の平均を示す。図５ｄは、防御的なクラスＩ対立遺伝子、Ｍａｍｕ−Ｂ＊０３およびＭａｍｕ−Ｂ＊０１７
【化２】
2013518599.tif 000016
とノンコントローラー対立遺伝子
【化３】
2013518599.tif 000017
動物との間のウイルス負荷の比較を、ピーク、設定ポイント、および慢性の感染の間で示す。両側Ｔ検定を行って、図５ａと図５ｄの群の間の相違の有意差を決定し、両側ダネット事後検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）を用いるＡＮＯＶＡを図５ｂで用いた。
【図６ａ】図６ａ〜６ｅは、ＳＩＶｍａｃ２５１粘膜チャレンジ後のＣＤ４＋Ｔ細胞損失を示す。チャレンジ後の末梢のＣＤ４＋Ｔ細胞カウントにおける変化を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞カウントにおける相対変化は、ベースラインのカウントの割合として示し、群の平均±ＳＥＭを、
【化４】
2013518599.tif 000018
の群について示す。チャレンジ後の個々のＣＤ４＋Ｔ細胞損失の時間経過。防御と関連するハプロタイプを有する動物を、各々の群において強調している。Ｍａｍｕ−Ｂ＊０１７対立遺伝子を有したＤＮＡ＋１２群において４３９４以外は、全てがＭａｍｕ−Ｂ＊００３対立遺伝子を有した。
【図６ｂ】図６ａ〜６ｅは、ＳＩＶｍａｃ２５１粘膜チャレンジ後のＣＤ４＋Ｔ細胞損失を示す。チャレンジ後の末梢のＣＤ４＋Ｔ細胞カウントにおける変化を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞カウントにおける相対変化は、ベースラインのカウントの割合として示し、群の平均±ＳＥＭを、
【化４】
2013518599.tif 000019
の群について示す。チャレンジ後の個々のＣＤ４＋Ｔ細胞損失の時間経過。防御と関連するハプロタイプを有する動物を、各々の群において強調している。Ｍａｍｕ−Ｂ＊０１７対立遺伝子を有したＤＮＡ＋１２群において４３９４以外は、全てがＭａｍｕ−Ｂ＊００３対立遺伝子を有した。
【図６ｃ】図６ａ〜６ｅは、ＳＩＶｍａｃ２５１粘膜チャレンジ後のＣＤ４＋Ｔ細胞損失を示す。チャレンジ後の末梢のＣＤ４＋Ｔ細胞カウントにおける変化を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞カウントにおける相対変化は、ベースラインのカウントの割合として示し、群の平均±ＳＥＭを、
【化４】
2013518599.tif 000020
の群について示す。チャレンジ後の個々のＣＤ４＋Ｔ細胞損失の時間経過。防御と関連するハプロタイプを有する動物を、各々の群において強調している。Ｍａｍｕ−Ｂ＊０１７対立遺伝子を有したＤＮＡ＋１２群において４３９４以外は、全てがＭａｍｕ−Ｂ＊００３対立遺伝子を有した。
【図６ｄ】図６ａ〜６ｅは、ＳＩＶｍａｃ２５１粘膜チャレンジ後のＣＤ４＋Ｔ細胞損失を示す。チャレンジ後の末梢のＣＤ４＋Ｔ細胞カウントにおける変化を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞カウントにおける相対変化は、ベースラインのカウントの割合として示し、群の平均±ＳＥＭを、
【化４】
2013518599.tif 000021
の群について示す。チャレンジ後の個々のＣＤ４＋Ｔ細胞損失の時間経過。防御と関連するハプロタイプを有する動物を、各々の群において強調している。Ｍａｍｕ−Ｂ＊０１７対立遺伝子を有したＤＮＡ＋１２群において４３９４以外は、全てがＭａｍｕ−Ｂ＊００３対立遺伝子を有した。
【図６ｅ】図６ａ〜６ｅは、ＳＩＶｍａｃ２５１粘膜チャレンジ後のＣＤ４＋Ｔ細胞損失を示す。チャレンジ後の末梢のＣＤ４＋Ｔ細胞カウントにおける変化を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞カウントにおける相対変化は、ベースラインのカウントの割合として示し、群の平均±ＳＥＭを、
【化４】
2013518599.tif 000022
の群について示す。チャレンジ後の個々のＣＤ４＋Ｔ細胞損失の時間経過。防御と関連するハプロタイプを有する動物を、各々の群において強調している。Ｍａｍｕ−Ｂ＊０１７対立遺伝子を有したＤＮＡ＋１２群において４３９４以外は、全てがＭａｍｕ−Ｂ＊００３対立遺伝子を有した。
【図７ａ】図７ａおよび図７ｂは、免疫後のＣＣＲ５＋Ｔ細胞の誘導を示す。第三回の免疫（すなわち、分子アジュバントを含むような最終免疫）後に単離された凍結保存されたＰＢＭＣを、ＳＩＶｐｏｌペプチドで刺激して、抗原特異的な細胞を、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２の産生、またはＩＣＳによるＣＤ１０７ａの動員によって特定した。ＳＩＶｐｏｌ特異的な、ＣＣＲ５＋細胞の頻度は、ＣＤ８＋Ｔ細胞区画（図７ａに示すデータ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞区画（図７ｂに示すデータ）について決定した。このデータは、総ＣＤ８またはＣＤ４の集団における頻度として示される。ＩＦＮγおよびＴＮＦαは、このパネルにおける追加の染色を調整するための同じ発蛍光団上で組み合された。
【図７ｂ】図７ａおよび図７ｂは、免疫後のＣＣＲ５＋Ｔ細胞の誘導を示す。第三回の免疫（すなわち、分子アジュバントを含むような最終免疫）後に単離された凍結保存されたＰＢＭＣを、ＳＩＶｐｏｌペプチドで刺激して、抗原特異的な細胞を、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２の産生、またはＩＣＳによるＣＤ１０７ａの動員によって特定した。ＳＩＶｐｏｌ特異的な、ＣＣＲ５＋細胞の頻度は、ＣＤ８＋Ｔ細胞区画（図７ａに示すデータ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞区画（図７ｂに示すデータ）について決定した。このデータは、総ＣＤ８またはＣＤ４の集団における頻度として示される。ＩＦＮγおよびＴＮＦαは、このパネルにおける追加の染色を調整するための同じ発蛍光団上で組み合された。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
ヒト細胞で高レベルの発現を生じるように設計されたヌクレオチド配列（配列番号１）を有する、ヒトＲＡＮＴＥＳをコードする核酸分子を提供する。このヌクレオチド配列によってコードされるＲＡＮＴＥＳのアミノ酸配列は、配列番号２に示される。このヌクレオチド配列は、ヒト細胞における発現に必須の調節性エレメントに対して作動可能に連結され得る。発現レベルをさらに増強するために、追加のエレメントおよび配列が提供され得る。配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７を含むプラスミド、ウイルスベクターまたは細胞を、個体に対して投与して、その個体の細胞内で発現させて、機能的なＲＡＮＴＥＳタンパク質をその個体に対して送達してもよい。さらに、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７で形質転換された宿主細胞を、ＲＡＮＴＥＳタンパク質を生成するために培養してもよい。
【００２５】
免疫治療剤またはワクチンの一部として送達される場合、ＲＡＮＴＥＳおよびその機能的なフラグメントをコードする核酸分子は、免疫応答を調節する。従って、ＲＡＮＴＥＳおよびその機能的なフラグメントをコードする核酸分子は、免疫治療剤としておよび／またはワクチン（免疫応答が所望される免疫原性の標的をコードする核酸分子も含む）と組み合わせてもしくはワクチンの成分として送達されてもよい。
【００２６】
科学的な理論で束縛されることはないが、免疫応答を調節するために有用な免疫治療剤は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７を含んでいる核酸分子を含み得る。免疫原に対して増強された免疫応答を惹起するために用いられ得るワクチンは、以下のうちの１つ以上を含んでいてもよい：１）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７を含んでいる核酸分子、および標的の免疫原をコードするヌクレオチド配列；ならびに２）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７を含んでいる第一の核酸分子、および標的の免疫原をコードするヌクレオチド配列を含んでいる第二の核酸分子。
【００２７】
免疫治療剤および免疫化方法は、このような核酸分子を用いて行ってもよい。高レベルのＲＡＮＴＥＳの発現を達成するために、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に対して作動可能に連結された調節性エレメントを有する免疫治療剤およびワクチンが調製され得る。
【００２８】
個体に対するＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントをコードする核酸配列の送達は、その個体における免疫応答を調節する。免疫治療剤として送達される場合、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントをコードする核酸配列は、個体における免疫応答を調整して、免疫系に関与する種々の疾患、病態および障害の症状または原因を軽減する。ワクチンの成分として、免疫原をコードする核酸配列と一緒に個体に送達される場合、その免疫原に対する免疫応答を増強する。ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントをコードする核酸分子が個体に投与される場合、ＲＡＮＴＥＳは、細胞中に取り込まれて発現され、そしてＲＡＮＴＥＳタンパク質は、それによって個体に送達される。ワクチンの場合には、免疫原をコードする核酸配列も投与され、細胞によって取り込まれて、細胞によって発現され、それによって免疫原性タンパク質が産生される。タンパク質のコード配列を送達する方法は、複数の単一の核酸分子または複数の多重の異なる核酸分子の送達を包含し得る。タンパク質のコード配列は、例えば、プラスミド、組み換えワクチンまたは弱毒化ワクチンであってもよい。
【００２９】
病原体または異常な、疾患関連の細胞に対して個体を予防的におよび／または治療的に免疫する組成物および方法が提供される。ワクチンは、任意の種類のワクチン、例えば、弱毒化生ワクチン、組み換えワクチンまたは核酸もしくはＤＮＡのワクチンであってもよい。免疫原およびＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントをコードする核酸分子を送達することによって、ワクチンにより誘導される免疫応答が調整され得る。ＲＡＮＴＥＳは、例えば、プラスミドまたは組み換えベクターまたは弱毒化病原体もしくは細胞のゲノムの一部としてなど、発現可能な核酸分子を介して送達される場合、特に有用である。ＲＡＮＴＥＳは、非感染または疾患のない個体において防御免疫応答を誘導するために予防的に送達される場合、特に有用である。ＲＡＮＴＥＳをコードする核酸分子は、無細胞組成物中で送達されてもよい。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＴＥＳをコードする核酸分子は、なんら他のサイトカインなしで投与されてもよい。
【００３０】
標準的な技術および容易に利用可能な出発材料を用いて、ＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子が調製され得る。
【００３１】
ＲＡＮＴＥＳを送達するための組成物およびＲＡＮＴＥＳを用いる方法ならびにワクチンおよび免疫化の方法が提供される。組成物は、調節性エレメントに対して作動可能に連結されたＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。ワクチンの一部である場合、この組成物は、調節性エレメントに対して作動可能に連結された免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。このような組成物を含む注射可能な薬学的組成物は、個体に投与され得る。
【００３２】
１．定義
本明細書に用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、限定されるものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「１つの、ある（ａ、ａｎ）」および「この、その（ｔｈｅ）」は、その文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の言及を包含する。
【００３３】
本明細書における数値の範囲の記述に関しては、各々の介在する値が間にあり、ここで同じ程度の正確性が明確に考慮される。例えば、６〜９の範囲については、７および８という数が、６および９に加えて考慮され、そして６．０〜７．０の範囲については、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６、９および７．０という数が明確に考慮される。
【００３４】
ａ．アジュバント
「アジュバント」とは、本明細書において用いる場合、本明細書において以降に記載されるＤＮＡプラスミドおよびコード核酸配列によってコードされる抗原の免疫原性を増強するために本明細書に記載されるＤＮＡプラスミドワクチンに添加される任意の分子を意味する。
【００３５】
ｂ．抗体
「抗体」とは本明細書において用いる場合、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥのクラスの抗体またはそのフラグメント、そのフラグメントもしくは誘導体、例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄおよび一本鎖抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二機能性抗体およびそれらの誘導体を意味する。この抗体は、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対して十分な結合特異性を示す、哺乳動物の血清サンプルから単離された抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製抗体、またはそれらの混合物であってもよい。
【００３６】
ｃ．コード配列
「コード配列」または「コード核酸」とは、本明細書において用いる場合、あるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列はさらに、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞における発現を指向し得るプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節性エレメントに対して作動可能に連結された開始シグナルおよび終止シグナルを含んでもよい。
【００３７】
ｄ．補体
「補体」または「相補体」とは本明細書において用いる場合、核酸が、核酸分子のヌクレオチド（単数または複数）アナログの間のワトソン・クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を意味し得ることを意味する。
【００３８】
ｅ．定電流（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｃｕｒｒｅｎｔ）
本明細書において用いる場合、「定電流」とは、同じ組織に送達される電気的パルスの期間にわたって、組織またはその組織を規定する細胞によって受け取られるかまたは経験される電流を意味する。電気的パルスは、本明細書に記載されるエレクトロポレーションデバイスから送達される。この電流は、電気的パルスの寿命にわたってこの組織中で一定のアンペア数で残る。なぜなら、本明細書に提供されるエレクトロポレーションのデバイスは、フィードバックエレメントを有し、好ましくは瞬間的なフィードバックを有するからである。このフィードバックエレメントは、パルスの期間全体にわたって組織（または細胞）の抵抗を測定し得、エレクトロポレーションデバイスがその電気的なエネルギー出力を変更させ（例えば、電圧を増大し）、それで同じ組織中の電流は、電気的パルス全体にわたって（ミリ秒の大きさで）、およびパルスからパルスにわたって一定で残る。いくつかの実施形態では、このフィードバックエレメントはコントローラーを含む。
【００３９】
ｆ．電流フィードバックまたはフィードバック
「電流フィードバック」または「フィードバック」は、交換可能に用いられてもよく、提供されるエレクトロポレーションデバイスの能動的な応答を意味し、これは、電極の間の組織における電流を測定すること、および定常レベルで電流を維持するために適宜、ＥＰデバイスによって送達されるエネルギー出力を変更することを包含する。この一定レベルは、パルス配列または電気的処理の開始の前にユーザーによってプリセットされる。このフィードバックは、エレクトロポレーションの構成要素、例えば、コントローラー（エレクトロポレーションデバイスの）によって達成され得る。なぜなら、その中の電気的回路は、電極の間の組織における電流を連続してモニターし、そのモニターされた電流（または組織中の電流）をプリセット電流と比較して、モニターされた電流をプリセットレベルで維持するためのエネルギー出力調整を連続して行うことができるからである。このフィードバックループは、アナログの閉ループ式フィードバックであるので、即時的であり得る。
【００４０】
分散化された電流
「分散化された電流」とは本明細書において用いる場合、本明細書に記載されるエレクトロポレーションデバイスの種々のニードル電極アレイから送達される電流のパターンを意味し、このパターンは、エレクトロポレーションされている組織の任意の領域でエレクトロポレーション関連の熱ストレスの出現を最小化または好ましくは排除する。
【００４１】
ｈ．エレクトロポレーション
「エレクトロポレーション」、「電気的透過化（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」、または「動電学的増強（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（「ＥＰ」）とは、本明細書において交換可能に用いられる場合、生体膜中の顕微鏡的な経路（細孔）を誘導する膜貫通電場パルスの使用を意味する；それらの存在によって、生体分子、例えば、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオンおよび水が、細胞膜の一方の側から他方の側へ通過することが可能になる。
【００４２】
ｉ．フィードバック機構
「フィードバック機構」とは本明細書において用いる場合、ソフトウェアまたはハードウェア（またはフォームウェア）のいずれかによって行われるプロセスであって、所望の組織（エネルギーのパルスの送達の前、間、および／または後）のインピーダンスを受け取って現在値、好ましくは電流と比較して、プリセットの値を達成するように、送達されたエネルギーのパルスを調節するプロセスを意味する。フィードバック機構は、アナログの閉ループ式回路によって行われ得る。
【００４３】
ｊ．機能的なフラグメント
配列番号１に関して本明細書に用いられる「機能的なフラグメント」とは、１）完全な配列番号１よりも少ない（すなわち、その配列番号１の全長を除外する）配列番号１の一部に相当するヌクレオチド配列を有し、２）ＲＡＮＴＥＳ活性を有するポリペプチドをコードする（すなわちヒトで発現される場合、配列番号１がヒトで発現される時に生成されるＲＡＮＴＥＳとして機能する）核酸分子を指す。機能フラグメントの大きさは、９０以上の長さであっても、１２０以上の長さであっても、１５０以上の長さであっても、１８０以上の長さであっても、２１０以上の長さであっても、または２４０以上の長さであってもよい。ＤＮＡフラグメントは、１０ヌクレオチドより短くても、２０ヌクレオチドより短くても、３０ヌクレオチドより短くても、４０ヌクレオチドより短くても、５０ヌクレオチドより短くても、６０ヌクレオチドより短くても、７５ヌクレオチドより短くても、９０ヌクレオチドより短くても、１２０ヌクレオチドより短くても、１５０ヌクレオチドより短くても、１８０ヌクレオチドより短くても、２１０ヌクレオチドより短くても、または２４０ヌクレオチドより短くてもよい。本明細書に開示される目的に関しては、本明細書に示されるサイズはまた、ＤＮＡの機能フラグメントの大きさが２０〜９０、２０〜１２０、２０〜１５０、２０〜１８０、２０〜２１０、２０〜２４０、３０〜９０、３０〜１２０、３０〜１５０、３０〜１８０、３０〜２１０、３０〜２４０、４０〜９０、４０〜１２０、４０〜１５０、４０〜１８０、４０〜２１０、４０〜２４０、５０〜９０、５０〜１２０、５０〜１５０、５０〜１８０、５０〜２１０、５０〜２４０、６０〜９０、６０〜１２０、６０〜１５０、６０〜１８０、６０〜２１０、６０〜２４０、７５〜９０、７５〜１２０、７５〜１５０、７５〜１８０、７５〜２１０、７５〜２４０、９０〜１２０、９０〜１５０、９０〜１８０、９０〜２１０、９０〜２４０、２０〜９０、１２０〜１５０、１２０〜１８０、１２０〜２１０、１２０〜２４０、１５０〜１８０、１５０〜２１０、１５０〜２４０、１８０〜２１０、１８０〜２４０および２１０〜２４０の長さであり得るサイズの範囲を構成するものとする。
【００４４】
「機能的なフラグメント」とは、ポリペプチド配列に関して、不完全な配列番号２の一部である（すなわち、配列番号２は除外される）機能的なフラグメントの核酸分子によってコードされるポリペプチドを意味する。このポリペプチドフラグメントは、３０以上のアミノ酸長であっても、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７５以上、８０以上、８５以上、または９０以上の長さであってもよい。ポリペプチドフラグメントは、１０アミノ酸長未満でも、１５アミノ酸長未満でも、２０アミノ酸長未満でも、２５アミノ酸長未満でも、３０アミノ酸長未満でも、３５アミノ酸長未満でも、４０アミノ酸長未満でも、４５アミノ酸長未満でも、５０アミノ酸長未満でも、５５アミノ酸長未満でも、６０アミノ酸長未満でも、６５アミノ酸長未満でも、７０アミノ酸長未満でも、７５アミノ酸長未満でも、８０アミノ酸長未満でも、８５アミノ酸長未満でも、９０アミノ酸長未満でもよい。本明細書に開示される目的に関して、本明細書に示される大きさはまた、タンパク質の機能的なフラグメントの大きさが、３０〜３５、３０〜４０、３０〜４５、３０〜５０、３０〜５５、３０〜６０、３０〜６５、３０〜７０、３０〜７５、３０〜８０、３０〜８５、３０〜９０、３５〜４０、３５〜４５、３５〜５０、３５〜５５、３５〜６０、３５〜６５、３５〜７０、３５〜７５、３５〜８０、３５〜８５、３５〜９０、４０〜４５、４０〜５０、４０〜５５、４０〜６０、４０〜６５、４０〜７０、４０〜７５、４０〜８０、４０〜８５、４０〜９０、４５〜５０、４５〜５５、４５〜６０、４５〜６５、４５〜７０、４５〜７５、４５〜８０、４５〜８５、４５〜９０、５０〜５５、５０〜６０、５０〜６５、５０〜７０、５０〜７５、５０〜８０、５０〜８５、５０〜９０、５５〜６０、５５〜６５、５５〜７０、５５〜７５、５５〜８０、５５〜８５、５５〜９０、６０〜６５、６０〜７０、６０〜７５、６０〜８０、６０〜８５、６０〜９０、６５〜７０、６５〜７５、６５〜８０、６５〜８５、６５〜９０、７０〜７５、７０〜８０、７０〜８５、７０〜９０、７５〜８０、７５〜８５、７５〜９０、８０〜８５、８５〜９０および８５〜９０の長さであり得るサイズの範囲を構成するものとする。
【００４５】
ｋ．遺伝的構築物
本明細書において用いる場合、「遺伝的構築物」という用語は、あるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。このコード配列は、この核酸分子が投与される個体の細胞における発現を指向し得るプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節性エレメントに対して作動可能に連結された開始シグナルおよび終止シグナルを含む。本明細書において用いる場合、「発現可能形態（ｅｘｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  ｆｏｒｍ）」という用語は、個体の細胞に存在する場合、コード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に対して作動可能に連結された必須の調節性エレメントを含む遺伝子構築物を指す。
【００４６】
Ｉ．同一性
「同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは本明細書において用いる場合、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況では、その配列が、特定の領域にわたって同じである、ある特定の割合の残基を有することを意味する。この割合は、２つの配列を最適に配列すること、特定の領域にわたってこの２つの配列を比較すること、同一の残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を求めること、このマッチした位置の数をその特定の領域の位置の総数で割ること、およびこの結果に１００を掛けて配列同一性の割合を求めることによって算出され得る。２つの配列が異なる長さであるか、または整列によって１つ以上の互い違いの末端が生じて、比較の特定の領域が単一の配列しか含まない場合は、この単一の配列の残基は、分母に含まれるが、計算の分子ではない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較した場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、等価とみなされ得る。同一性は、手技的に、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ  ２．０のようなコンピューター配列アルゴリズムを用いることによって行われ得る。
【００４７】
ｍ．インピーダンス
「インピーダンス」は、フィードバック機構を考察する場合に用いられ得、そしてオームの法則に従う電流値に変換され得てもよく、これによって、現在の電流との比較が可能になる。
【００４８】
ｎ．免疫応答
「免疫応答」とは本明細書において用いる場合、インフルエンザ血球凝集素コンセンサス抗原などの抗原の誘導に応答した、宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性応答もしくは体液性応答、またはその両方の形態であってもよい。
【００４９】
０．核酸
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは本明細書において用いる場合、一緒に共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列を規定する。従って、核酸とはまた、描写した一本鎖の相補鎖を包含する。核酸の多くの改変体が、所定の核酸と同じ目的で用いられ得る。従って、核酸とはまた、実質的に同一の核酸およびその相補体を包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。従って、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを包含する。
【００５０】
核酸は、一本鎖であってももしくは二本鎖であってもよく、または二本鎖および一本鎖の配列の両方の一部を含んでもよい。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッドの両方であってもよく、ここで核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含んでもよい。核酸は、化学的合成法によって得ても、または組み換え法によって得てもよい。
【００５１】
ｐ．作動可能に連結される
「作動可能に連結される」とは、本明細書において用いる場合、遺伝子の発現が、空間的に接続されているプロモーターの制御下であることを意味する。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’側（上流）に位置してもまたは３’側（下流）に位置してもよい。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターと、そのプロモーターが由来する遺伝子中でプロモーターが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該分野で公知のとおり、この距離の変化は、プロモーター機能の損失なしに適合され得る。
【００５２】
ｑ．プロモーター
「プロモーター」とは本明細書において用いる場合、細胞中の核酸の発現をもたらし、活性化しまたは増強し得る合成または天然に由来する分子を意味する。プロモーターは、１つ以上の特異的な転写調節性配列を、さらにその発現を増強するか、および／または空間的発現および／または一時的な発現を変更するために含んでもよい。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対程度離れて位置し得る、遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含んでもよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫および動物を含めた供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織もしくは器官に対して、または発現が生じる発生段階に対して、構成的にまたは示差的に、あるいは生理学的ストレス、病原体、金属イオンもしくは誘導性因子のような外部刺激に応答して、遺伝子構成要素の発現を調節し得る。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーターおよびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００５３】
ｒ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、本明細書において用いる場合、核酸の複雑な混合物中などで、第一の核酸配列（例えば、プローブ）が第二の核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件とは、配列依存的であり、異なる環境においては様々である。ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨにおける特異的配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低く選択され得る。Ｔｍとは、標的と相補的なプローブの５０％が、平衡状態でこの標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下での）温度であり得る（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍで、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェント条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオンである条件、例えば、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）でｐＨ７．０〜８．３であり得、この温度は、短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、および長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチド超）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定剤の付加によっても達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについては、正のシグナルは、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、以下が挙げられる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳ、インキュベーションは４２℃、または５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ、インキュベーションは、６５℃で、洗浄を０．２×ＳＳＣ、および０．１％のＳＤＳ中で６５℃。
【００５４】
ｓ．実質的に相補的な
「実質的に相補的な」とは本明細書において用いる場合、第一の配列が、第二の配列の相補体に対して、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０もしくはそれ以上のヌクレオチド、または８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５もしくは９０もしくはそれ以上のアミノ酸の領域にまたがって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であること、あるいはその２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００５５】
ｔ．実質的に同一な
「実質的に同一な」とは本明細書において用いる場合、第一および第二の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０もしくはそれ以上のヌクレオチド、または８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５もしくは９０もしくはそれ以上のアミノ酸の領域にまたがって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であること、あるいは核酸に対して、その第一の配列が第二の配列の相補体に対して実質的に相補的である場合、を意味する。
【００５６】
ｕ．改変体
「改変体」とは核酸に対して本明細書で用いて、（ｉ）言及されるヌクレオチド配列の一部またはフラグメント；（ｉｉ）言及されるヌクレオチド配列またはその一部の相補体；（ｉｉｉ）言及される核酸またはその相補体に対して実質的に同一である核酸；あるいは（ｉｖ）言及される核酸、その相補体、またはそれらに実質的に同一な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、を意味する。
【００５７】
「改変体」とは、アミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によって、アミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を残しているペプチドまたはポリペプチドに関する。改変体とはまた、言及されるタンパク質に対して、少なくとも１つの生物学的活性を保有するアミノ酸配列を有して実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。アミノ酸の保存的置換、すなわち、同様の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸によるアミノ酸の置換は、当該分野で、典型的にはマイナーな変化と理解されている。これらのマイナーな変化は、部分的には、当該分野で理解されるとおり、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって特定され得る。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５〜１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性および荷電の考慮に基づく。同様の疎水性親水性指標のアミノ酸が、置換されてもよく、タンパク質の機能を依然として保持し得ることは当該分野で公知である。一局面では、±２という疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生物学的機能を維持しているタンパク質を生じる置換を明らかにするために用いられ得る。ペプチドの状況におけるアミノ酸の親水性の考慮によって、抗原性および免疫原性とよく関連することが報告された有用な指標である、そのペプチドの最大局所平均親水性の算出が可能になる。米国特許第４，５５４，１０１号は参照によって本明細書に詳細に援用される。同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該分野で理解されるとおり、生物学的活性、例えば、免疫原性を保持しているペプチドを生じ得る。置換は、お互いの±２内の親水性値を有するアミノ酸で行われ得る。アミノ酸の疎水性指数および親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。その観察と一致して、生物学的機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、荷電、大きさおよび他の特性によって明らかであるとおり、アミノ酸の相対的な類似性、および特にそれらのアミノ酸の側鎖に依存することが理解される。
【００５８】
ベクター
「ベクター」とは本明細書において用いる場合、複製起点を含む核酸配列を意味する。ベクターとは、ベクター、バクテリオファージ、細菌、人工染色体または酵母人工染色体であり得る。ベクターとは、ＤＮＡであっても、またはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製する染色体外ベクターであってもよく、好ましくはＤＮＡプラスミドである。
【００５９】
ＲＡＮＴＥＳ
ＲＡＮＴＥＳは、配列番号１によってコードされる。この配列は、さらに、１つ以上の追加のアミノ酸配列エレメントを含み得る。例えば、核酸配列によってコードされるＲＡＮＴＥＳはさらに、そのＮ末端上にＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列を含み得る。ＩｇＥリーダーアミノ酸配列は、配列番号３であってもよい。同様に、ＩｇＥまたはＩｇＧリーダー配列をコードするコード配列は、免疫原をコードするコード配列に対して連結され得る。
【００６０】
配列番号１は、高レベルの発現について最適化される。この核酸配列は、５’非翻訳領域でコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含み得る。この核酸配列はさらに、リーダー配列をコードする核酸配列を含み得る。Ｎ末端リーダー配列のコード配列は、ＲＡＮＴＥＳコード配列の５’である。Ｎ末端リーダーは、分泌を容易にし得る。このＮ末端リーダーは、ＩｇＥリーダーであってもまたはＩｇＧリーダーであってもよい。配列番号３は、配列番号１に開示されるのと同じＲＡＮＴＥＳコード配列であって、さらにＩｇＥのコード配列；Ｎ末端でＲＡＮＴＥＳタンパク質に対して連結されたリーダー配列を含む。核酸配列は、５’非翻訳領域においてＫｏｚａｋ配列を含んでもよい。配列番号５は、配列番号３に開示されるのと同じＩｇＥリーダー−ＲＡＮＴＥＳコード配列であり、さらに５’非翻訳領域においてＫｏｚａｋ配列を含む。
【００６１】
３．遺伝子構築およびプラスミド
本明細書に提供されるのは、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントをコードする核酸配列を含み得る遺伝子構築物である。この遺伝子構築物は、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントをコードする核酸を含む機能性の染色体外分子として細胞中に存在し得る。ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントをコードする核酸を含む遺伝子構築物は、セントロメア、テロマーまたはプラスミドもしくはコスミドを含めて線形のミニ染色体であり得る。
【００６２】
遺伝子構築物はまた、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス随伴ウイルスおよび組み換えワクシニアを含めて、組み換えウイルスベクターのゲノムの一部であってもよい。この遺伝子構築物は、弱毒化した生きた微生物中の遺伝物質または細胞中で生きている組み換えの微生物ベクターの一部であってもよい。
【００６３】
遺伝子構築物は、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントの遺伝子発現のための調節性エレメントを含み得る。この調節性エレメントは、プロモーター、エンハンサー  開始コドン、終止コドンまたはポリアデニル化シグナルであってもよい。
【００６４】
組成物は、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントをコードする第一の核酸配列を含んでもよく、そしてさらに、１つ以上の免疫原をコードする１つ以上の追加の核酸配列（単数または複数）を含んでもよい。第一のおよび追加の核酸配列は、同じ核酸分子上に存在しても、または異なる核酸分子上に存在してもよい。第一のおよび追加の核酸配列は、ヒト細胞中で機能する調節性エレメントの制御下であり得る。
【００６５】
核酸配列は、ベクターであり得る遺伝子構築物を作成し得る。ベクターは、個体中で免疫応答を惹起するのに有効な量で個体の細胞中でＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントを発現し得る。このベクターは組み換え体であってもよい。このベクターは、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントをコードする異種核酸を含み得る。ベクターはプラスミドであってもよい。このベクターは、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントをコードする核酸で細胞をトランスフェクトするために有用であり得、ここで形質転換された宿主細胞は、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントの発現が生じる条件下で培養されて維持される。
【００６６】
ベクターは、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントをコードする異種核酸を含み得、さらに開始コドン（これはＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントのコード配列の上流であってもよい）、および終止コドン（これはＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントのコード配列の下流であってもよい）を含んでもよい。この開始コドンおよび終止コドンは、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントコード配列とインフレームであってもよい。このベクターはまた、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントコード配列に対して作動可能に連結されるプロモーターを含んでもよい。ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントコード配列に対して作動可能に連結されるこのプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ早初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであってもよい。このプロモーターはまた、ヒト遺伝子、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンまたはヒトメタロチオネイン由来のプロモーターであってもよい。このプロモーターはまた、組織特異的プロモーター、例えば、筋肉または皮膚特異的プロモーター、天然または合成であってもよい。このようなプロモーターの例は、その内容が全体として参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号に記載される。
【００６７】
このベクターはまた、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントコード配列の下流であり得る、ポリアデニル化シグナルを含んでもよい。このポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロブリンポリアデニル化シグナルであってもよい。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルであってもよい。
【００６８】
このベクターはまた、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントコード配列の上流のエンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、ＤＮＡ発現に必須であり得る。このエンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンまたはウイルスエンハンサー、例えば、ＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶまたはＥＢＶのうちの１つであってもよい。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、各々の内容が参照によって詳細に援用される、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、およびＷＯ９４／０１６７３７に記載される。
【００６９】
このベクターはまた、このベクターを染色体外で維持し、細胞中でこのベクターの複数のコピーを産生するための哺乳動物複製起点を備えてもよい。このベクターは、組み込みなしに高コピー数のエピソーム複製を生じ得る、エプスタイン・バーウイルスの複製起点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み得る、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４またはｐＲＥＰ４であってもよい。ベクターの骨格は、ｐＡＶ０２４２であってもよい。このベクターは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクターであってもよい。
【００７０】
このベクターはまた、ベクターが投与されるヒト細胞中の遺伝子発現に十分適切であり得る、調節性配列を含み得る。ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントのコード配列は、宿主細胞中でコード配列のより効率的な転写を可能にする。このベクターは、参照によって詳細に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）を含めて、慣用的な技術および容易に入手可能な出発材料によってタンパク質を生成するための発現ベクターまたはシステムであり得る。
【００７１】
ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントに関して、本明細書に開示される遺伝子構築物および構成要素はまた、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントではない免疫原をコードするコード配列で設計され得、それによってこのような構築物は、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントをコードする核酸配列と一緒になって、その免疫原に対して免疫応答を誘導する改善されたワクチンを提供する。
【００７２】
薬学的組成物
本明細書に提供されるのは、約１ナノグラム〜約１０ｍｇのＤＮＡを含む本発明による薬学的組成物である。いくつかの実施形態では、本発明による薬学的組成物は、：１）少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ナノグラム、または少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５もしくは１０００マイクログラム、または少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５もしくは１０ｍｇもしくはそれ以上；ならびに２）最大で１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ナノグラムまで、または最大で１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５．９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、もしくは１０００マイクログラムまで、または最大で１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５もしくは１０ｍｇまで含む。いくつかの実施形態では、本発明による薬学的組成物は、約５ナノグラム〜約１０ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本発明による薬学的組成物は、約２５ナノグラム〜約５ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約５０ナノグラム〜約１ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約１０〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約１５〜約１５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約２０〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約２５〜約７５マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約３０〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約３５〜約４０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約１０マイクログラム〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約２０マイクログラム〜約８０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約２５マイクログラム〜約６０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約３０ナノグラム〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、約３５ナノグラム〜約４５マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、この薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、この薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、この薬学的組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、この薬学的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。
【００７３】
本発明による薬学的組成物は用いられるべき投与方式によって処方される。薬学的組成物が注射用の薬学的組成物である場合は、それらは、無菌で、発熱物質を含まず（パイロジェンフリーで）、粒子状物質も含まない。等張性の処方物を用いることが好ましい。一般には、等張化のための添加物としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。ある場合には、リン酸緩衝化生理食塩水のような等張性溶液が好ましい。安定化剤としてはゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤をこの処方物に添加する。
【００７４】
本明細書に提供されるのは、ヒトにおける免疫応答を調節し得る免疫治療剤である。この免疫治療剤は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７またはそれらの機能的なフラグメントを含む上記で考察されるような遺伝子構築物を含み得る。
【００７５】
本明細書に提供されるのは、１つ以上の免疫原に対する免疫応答をヒトにおいて生じ得るワクチンである。このワクチンは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７またはそれらの機能的なフラグメントを含む上記で考察されるような遺伝子構築物を、免疫原をコードする核酸配列を含む上記で考察されるような遺伝子構築物と組み合わせて含んでもよい。ＲＡＮＴＥＳまたはそのフラグメントをコードする遺伝子構築物は、免疫原をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物と同じかまたは異なる核酸分子であってもよい。
【００７６】
免疫治療剤またはワクチンは、プラスミドＤＮＡ組成物であってもよい。このプラスミドＤＮＡ組成物は、１つ以上の遺伝子構築物を含んでいる複数の同じまたは異なるプラスミドを含んでもよい。このプラスミドＤＮＡ組成物は、ＲＡＮＴＥＳまたはその機能的なフラグメントをコードする核酸配列を含んでもよい。これが、ワクチンである場合、これはさらに、免疫原をコードする核酸配列を、同じまたは異なるプラスミド上に含んでもよい。
【００７７】
免疫治療剤またはワクチンとして有用なＤＮＡプラスミド組成物を生成するために用いられ得るＤＮＡワクチン技術は、参照によって本明細書に詳細に援用される、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および同第５，６７６，５９４号に開示される。ＤＮＡワクチンは、それが染色体へ組み込まれることを阻害する要素または試薬をさらに含んでもよい。
【００７８】
上記の遺伝子構築物を含む組み換えウイルスベクターもまた産生され得る。この組み換えウイルスベクターはまた、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７またはその機能的なフラグメントを含んでもよく、ここで免疫原をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物はある場合と無い場合がある。配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７またはその機能的なフラグメントは、弱毒化ワクチン、例えば、弱毒化生ワクチン、死菌（ｋｉｌｌｅｄ）ワクチンおよび外来遺伝子を送達するために組み換えベクターを用いるワクチン中に組み込まれ得る。弱毒化生ワクチン、外来抗原を送達するために組み換えベクターを用いるワクチン、サブユニットワクチンおよび糖タンパク質ワクチンの例は、その各々が参照によって本明細書に援用される、米国特許第４，５１０，２４５号；同第４，７９７，３６８号；同第４，７２２，８４８号：同第４，７９０，９８７号：同第４，９２０，２０９号：同第５，０１７，４８７号：同第５，０７７，０４４号：同第５，１１０，５８７号：同第５，１１２，７４９号：同第５，１７４，９９３号：同第５，２２３，４２４号：同第５，２２５，３３６号：同第５，２４０，７０３号：同第５，２４２，８２９号：同第５，２９４，４４１号：同第５，２９４，５４８号：同第５，３１０，６６８号：同第５，３８７，７４４号：同第５，３８９，３６８号：同第５，４２４，０６５号：同第５，４５１，４９９号：同第５，４５３，３６４号：同第５，４６２，７３４号：同第５，４７０，７３４号：同第５，４７４，９３５号：同第５，４８２，７１３号：同第５，５９１，４３９号：同第５，６４３，５７９号：同第５，６５０，３０９号：同第５，６９８，２０２号：同第５，９５５，０８８号：同第６，０３４，２９８号：同第６，０４２，８３６号：同第６，１５６，３１９号および同第６，５８９，５２９号に記載される。
【００７９】
ワクチンはさらに、薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤として機能的な分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクションを容易にする因子であってもよくこれには、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイントの不完全アジュバント、ＬＰＳアナログ、例としてはモノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、小胞、例えば、スクアレンおよびスクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、多価陰イオン、多価陽イオンもしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクションを容易にする因子を挙げることができる。
【００８０】
トランスフェクションを容易にする因子は、多価陰イオン、多価陽イオン、例としては、ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）、または脂質である。トランスフェクションを容易にする因子は、ポリ−Ｌ−グルタメートであり、およびさらに好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタメートは、ワクチン中に６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。トランスフェクションを容易にする因子としてはまた、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイントの不完全アジュバント、ＬＰＳアナログ、例としてはモノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、および小胞、例えば、スクアレンおよびスクアレンを挙げることが可能で、ヒアルロン酸もまた、遺伝子構築物と組み合わせて投与され得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミド組成物としてはまた、トランスフェクションを容易にする因子、例えば、脂質、リポソーム、例としては、レシチンリポソームまたは当該分野で公知の他のリポソームを、ＤＮＡ−リポソーム混合物（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照のこと）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、多価陰イオン、多価陽イオンもしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクションを容易にする因子を挙げることができる。好ましくは、トランスフェクションを容易にする因子とは、多価陰イオン、多価陽イオン、例としては、ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション因子の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【００８１】
薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントであってもよい。アジュバントは、別のプラスミド中で発現される他の遺伝子であってもよいし、または上記のプラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される。アジュバントは、以下からなる群より選択され得る：α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞遊走ケモカイン（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ａｔｔｒａｃｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（ＣＴＡＣＫ）、上皮性胸腺発現ケモカイン（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｈｙｍｕｓ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ｍｕｃｏｓａｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、例としては、ＩＬ−１５（シグナル配列を欠いており、ＩｇＥ由来のシグナルペプチドを必要に応じて含む）。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００８２】
有用なアジュバントであり得る他の遺伝子としては、以下をコードする遺伝子が挙げられる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、変異型のＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびそれらの機能的なフラグメント。
【００８３】
プラスミド組成物はさらに、参照によって本発明に詳細に援用される、１９９４年４月１日出願の米国特許出願第０２１，５７９号に記載されるような遺伝子ワクチン促進剤を含んでもよい。
【００８４】
送達の方法
本明細書に提供されるのは、ＲＡＮＴＥＳまたはそのフラグメントをコードする遺伝子構築物を提供するための薬学的組成物であって、免疫応答が所望される免疫原のコード配列を含む遺伝子構築物は有無の場合がある、薬学的組成物の送達方法である。薬学的処方物を送達する方法は、特定の免疫原に対して、個体の免疫系を調節するため、または治療的および／もしくは予防的な免疫応答を誘導するために提供され得る。
【００８５】
組成物は、参照によって両方とも詳細に援用される、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載のような形態で送達され得る。
【００８６】
ａ．投与の経路
この組成物は、経口的、非経口的、舌下、経皮的、直腸的、経粘膜的、局所的、吸入を介して、口腔内投与、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内  気管内、および関節内またはそれらの組み合わせを含む種々の経路によって投与され得る。この組成物は、伝統的な注射器、ニードルレスの注射デバイス、「微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｇｏｎｅ  ｇｕｎｓ）」または他の物理的方法、例えば、エレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」または超音波によって投与され得る。
【００８７】
組成物のベクターは、いくつかの周知の技術、例としては、ＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種としても公知）でインビトロのエレクトロポレーションは有無、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性の、組み換えベクター、例えば、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス随伴ウイルスおよび組み換えワクシニアによって哺乳動物に送達され得る。
【００８８】
ｂ．エレクトロポレーション
ワクチンのプラスミドのエレクトロポレーションを介したＤＮＡの投与は、細胞膜中で可逆性の細孔を形成させるのに有効なエネルギーのパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するために構成され得、好ましくは、エネルギーのパルスは、ユーザーによる現在の電流入力と同様の定電流であるエレクトロポレーションデバイスを用いて達成され得る。エレクトロポレーションデバイスは、エレクトロポレーションの構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを備え得る。このエレクトロポレーション構成要素は、エレクトロポレーションデバイスの種々の要素のうちの１つ以上を備えて組み込んでもよい：コントローラー、電流波形発生器、インピーダンステスター、波形自動記録装置（ｌｏｇｇｅｒ）、入力要素、状況報告要素、連絡ポート、記憶構成要素、電源および電源スイッチ。エレクトロポレーションは、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にするため、インビボのエレクトロポレーションデバイス、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰシステム（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて達成され得る。
【００８９】
エレクトロポレーションの構成要素は、エレクトロポレーションデバイスの１つの要素として機能し得、他の要素は、エレクトロポレーションの構成要素と連絡した別の要素（または構成要素）である。エレクトロポレーションの構成要素は、エレクトロポレーションデバイスの２つ以上の要素として機能し得、この要素は、エレクトロポレーション構成要素から隔てられたエレクトロポレーションデバイスのさらに他の要素と連絡されてもよい。１つの電気化学的または機械的なデバイスの一部として存在するエレクトロポレーションデバイスの要素は、その要素が１つのデバイスとして、またはお互いと連絡して別の要素として機能し得ると限定され得るものではない。このエレクトロポレーション構成要素は、所望の組織において定電流を生じるエネルギーのパルスを送達し得、フィードバック機構を備える。電極集合体は、空間的配置に複数の電極を有する電極アレイを備えてもよく、ここでこの電極集合体は、電極構成要素からのエネルギーのパルスを受け、それを、電極を通じて所望の組織に送達する。複数の電極のうち少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送達の間ニュートラルであり、所望の組織中でインピーダンスを測定して、そのインピーダンスをエレクトロポレーションの構成要素に連絡する。このフィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受け取り、エレクトロポレーション構成要素によって送達されるエネルギーのパルスを調節して、定電流を維持し得る。
【００９０】
複数の電極は、分散化されたパターンでエネルギーのパルスを送達し得る。複数の電極は、プログラムされた順序のもとで電極の制御を通じて分散化されたパターンでエネルギーのパルスを送達し得、このプログラムされた順序は、ユーザーによってエレクトロポレーション構成要素に入力される。このプログラムされた順序は、送達される複数のパルスを順番に含んでもよく、ここでこの複数のパルスの各々のパルスが、少なくとも２つの活性電極によって送達され、ここで１つは、中性極であって、インピーダンスを測定し、ここでこの複数のパルスの引き続くパルスは、少なくとも２つの活性電極のうちの異なる１つによって送達され、ここで１つは中性極であって、インピーダンスを測定する。
【００９１】
フィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれによって行われてもよい。このフィードバック機構は、アナログの閉ループ回路によって行われてもよい。このフィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓごとに出現するが、好ましくはリアルタイムのフィードバックまたは即時性である（すなわち、応答時間を決定するために利用可能な技術によって決定した場合、実質的に即時）。中性極は、所望の組織中でインピーダンスを測定し得、そのインピーダンスをフィードバック機構に連絡し、そのフィードバック機構がそのインピーダンスに応答して、現在の電流と同様の値で定電流を維持するようにエネルギーのパルスを調節する。このフィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達の間、定電流を連続してかつ即時的に維持し得る。
【００９２】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を容易にし得るエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション方法の例としては、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる、米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらによって出願された米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号（その内容が、その全体が参照によって本明細書に援用される）に記載の方法が挙げられる。ＤＮＡワクチンの送達を容易にするために用いられ得る他のエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション方法は、その全てが全体として本明細書に参照によって援用される、２００６年１０月１７日出願の米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号、および２００７年１０月１０日出願の同第６０／９７８，９８２号に対して、米国特許法第１１９条（ｅ）項のもとで恩典を請求する、２００７年１０月１７日出願の、同時係属かつ共有に係る米国特許出願第１１／８７４０７２に提供される方法が挙げられる。
【００９３】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる、米国特許第７，２４５，９６３号は、身体または植物中の選択された組織の細胞への生体分子の導入を容易にするためのモジュラー電極系およびそれらの使用を記載する。このモジュラー電極系は、複数のニードル電極と；皮下注射針と；プログラム可能な定電流のパルスコントローラーから複数のニードル電極への伝導性リンクをもたらす電極コネクターと；電源とを備え得る。オペレーターは、支持構造上に装着されている複数のニードル電極を保持して、それらを身体または植物中の選択された組織にしっかりと挿入し得る。次いでこの生体分子を、選択された組織中へ皮下注射針を介して送達する。プログラム可能な定電流パルスコントローラーを作動させて、定電流電気パルスを、複数のニードル電極に与える。この与えられた定電流電気パルスによって複数の電極の間の細胞への生体分子の導入が容易になる。米国特許第７，２４５，９６３号の全内容は、参照によって本明細書に援用される。
【００９４】
Ｓｍｉｔｈらによって提出された米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物の選択組織の細胞への生体分子の導入を効率的に容易にするために用いられ得るエレクトロポレーションデバイスを記載する。このエレクトロポレーションデバイスは、その操作がソフトウェアまたはファームウェアによって明記される、動電学的なデバイス（「ＥＫＤデバイス」）を備える。このＥＫＤデバイスは、ユーザーコントロールに基づくアレイ中の電極とパルスパラメーターの入力との間で一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生じ、電流波形データの蓄積および獲得を可能にする。このエレクトロポレーションデバイスはまた、ニードル電極のアレイを有する交換式の電極ディスクと、注射針のための中央の注射チャネルと、取り外し可能なガイドディスクとを備える。米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号の開示全体が、参照によって本明細書に援用される。
【００９５】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載の電極アレイおよび方法を、筋肉のような組織だけでなく、他の組織または器官への深い浸透について適合させてもよい。電極のアレイの構成のおかげで、注射針（選り抜きの生体分子を送達する）も標的器官中に完全に挿入され、そしてその注入物は、電極によって事前に描写される領域内で、標的組織へ垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許出願公開第２００５／００５２６３号に記載の電極は好ましくは、２０ｍｍ長および２１ゲージである。
【００９６】
さらに、エレクトロポレーションデバイスを組み込みそれを使用するいくつかの実施形態を考慮すれば、以下の特許に記載されるデバイスである、エレクトロポレーションデバイスがある：１９９３年１２月２８日発行の米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日発行の米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日発行の同第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日発行の同第６，９５８，０６０号、および２００５年９月６日発行の６，９３９，８６２号。さらに、任意の種々のデバイスを用いるＤＮＡの送達に関与する、２００４年２月２４日発行の米国特許第６，６９７，６６９号に提供される主題をカバーする特許、およびＤＮＡの注入方法に引用される２００８年２月５日発行の米国特許第７，３２８，０６４号が本明細書において考慮される。上記の特許は、その全体が参照によって援用される。
【００９７】
ｃ．プラスミドを調製する方法
本明細書に提供されるのは、本明細書に考察される配列番号１を含むＤＮＡプラスミドを調製するための方法である。ＤＮＡプラスミドは、哺乳動物発現プラスミド中への最終のサブクローニング工程の後に、当該分野で公知の方法を用いて、大規模ファーメンテーションタンク中の細胞培養物に接種され得る。
【００９８】
本発明のＥＰデバイスで用いるためのＤＮＡプラスミドは、公知のデバイスおよび技術の組み合わせを用いて処方または製造され得るが、好ましくはそれらは、２００７年５月２３日出願の、認可された、同時係属の米国特許仮出願第６０／９３９，７９２号に記載される最適化プラスミド製造技術を用いて製造される。いくつかの実施例では、これらの研究で用いられるＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で処方され得る。この製造技術はまた、２００７年７月３日発行の、認可された特許米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるデバイスおよびプロトコールを含めて、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載のデバイスおよびプロトコールに加えて、当業者に共通して公知の種々のデバイスおよびプロトコールを含むか、または組み込む。上記の出願および特許、米国特許出願第６０／９３９７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、その全体が本明細書に援用される。
【００９９】
６．免疫原
本発明は、病原体、例えば、ウイルス、原核生物、ならびに単細胞の病原性生物および多細胞の寄生生物などの病原性真核生物に対して個体を免疫するために用いられ得る。本発明は特に、細胞に感染し、ウイルスのようにカプセルに包まれていない病原体、ならびに淋病、リステリアおよび赤痢菌などの原核生物に対して個体を免疫するために有用である。さらに、本発明はまた、原生動物病原体が細胞内病原体であるライフサイクルにおいて、ある段階を含む原生動物病原体に対して個体を免疫するために有用である。表１は、本発明によるワクチンが作製され得る、ウイルスの科および属のいくつかの列挙を示す。表に列挙される抗原などの病原性抗原に対して提示されたエピトープと同一であるかまたは実質的に類似の少なくともエピトープを含むペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物がワクチンに有用である。さらに、本発明はまた、原核生物および真核生物の原生動物病原体を含む他の病原体ならびに多細胞の寄生生物、例えば、表２に列挙されるものに対して個体を免疫するためにも有用である。
【０１００】
表１−ウイルス
ピコルナウイルス科
属：
ライノウイルス：（医学）感冒（風邪）のうち５０％の症例の原因
エンテロウイルス：（医学）ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスおよびヒトエンテロウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルスを含む。
アフトウイルス：（獣医学）これらは口蹄疫のウイルスである。
標的抗原：ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰＧ
カリチウイルス科
属：
ノーウォーク群のウイルス：（医学）これらのウイルスは、流行性胃腸炎の重要な原因因子である。  
トガウイルス科
属：
アルファウイルス：（医学および獣医学）例としては、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルスおよびベネズエラ東部＆西部ウマ脳脊髄炎ウイルスが挙げられる。
レオウイルス（医学）風疹ウイルス。
フラビウイルス科
例としては以下が挙げられる：（医学）デング、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎、およびダニ媒介脳炎ウイルス、西ナイルウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＣ００１５６３、ＡＦ５３３５４０、ＡＦ４０４７５７、ＡＦ４０４７５６、ＡＦ４０４７５５、ＡＦ４０４７５４、ＡＦ４０４７５３、ＡＦ４８１８６４、Ｍ１２２９４、ＡＦ３１７２０３、ＡＦ１９６８３５、ＡＦ２６０９６９、ＡＦ２６０９６８、ＡＦ２６０９６７、ＡＦ２０６５１８およびＡＦ２０２５４１）
代表的な標的抗原：Ｅ  ＮＳ５  Ｃ
Ｃ型肝炎ウイルス：（医学）これらのウイルスは、あるファミリーには位置せず、ただしトガウイルスまたはフラビウイルスのいずれかであると考えられる。最も類似なのはトガウイルスの科とである。
コロナウイルスのファミリー：（医学および獣医学）
感染性の気管支炎ウイルス（家禽類）
ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）
ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）
ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）
ネコ腸内コロナウイルス（ネコ）
イヌコロナウイルス（イヌ）
ＳＡＲＳ関連コロナウイルス
ヒト呼吸器コロナウイルスは、感冒の症例の約４０％の原因を生じる。ＥＸ．２２４Ｅ、ＯＣ４３。コロナウイルスは、非Ａ、ＢまたはＣ型の肝炎を生じ得ることに注意のこと。
標的抗原：Ｅ１（Ｍまたはマトリクスタンパク質とも呼ばれる）Ｅ２（Ｓまたはスパイクタンパク質とも呼ばれる）Ｅ３（またＢＥもしくはヘマグルチンエルロース糖タンパク質とも呼ばれる）（全てのコロナウイルスには存在しない）Ｎ−ヌクレオカプシド
ラブドウイルスファミリー
属：
ベシクロウイルス、リッサウイルス：（医学および獣医学）狂犬病
標的抗原：Ｇタンパク質、Ｎタンパク質
フィロウイルス科：（医学）
出血熱ウイルス、例えば、マーブルグおよびエボラウイルス
パラミクソウイルス科：
属：
パラミクソウイルス科：（医学および獣医学）ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリにおける重要な病原体）
モルビリウイルス：（医学および獣医学）はしか、イヌジステンパー
肺炎ウイルス：（医学および獣医学）呼吸器合胞体ウイルス  
オルトミクソウイルス科（医学）インフルエンザウイルス
ブニアウイルス科
属：
ブニアウイルス：（医学）カリフォルニア脳炎、ラクロス（Ｌａ  Ｃｒｏｓｓｅ）
フレボウイルス：（医学）リフトバレー熱
ハンタウイルス：プレマラはヘマハギン熱ウイルスである
ナイルウイルス（獣医学）ナイロビヒツジ病
また多くは未分類のブンガウイルス
アレナウイルス科（医学）ＬＣＭ、ラッサ熱ウイルス
レオウイルス科
属：
レオウイルス：潜在的なヒト病原体
ロタウイルス：小児の急性胃腸炎
オルビウイルス：（医学および獣医学）コロラドダニ熱
レボンボ（ヒト）ウマ脳炎、ブルータング
レトロウイルス科
亜科：
オンコリビリナル：（獣医学）（医学）猫の白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩ
レンチビリナル：（医学および獣医学）ＨＩＶ、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス
スプマビリナルパポバウイルス科
亜科：
ポリオーマウイルス：（医学）ＢＫＵおよびＪＣＵウイルス
亜科：
パピローマウイルス：（医学）癌または乳頭腫の悪性の進行に関連する多くのウイルス種
アデノウイルス（医学）ＥＸ  ＡＤ７、ＡＲＤ．、Ｏ．Ｂ．（呼吸器疾患を生じる）いくつかのアデノウイルス、例えば、２７５は、腸炎を生じる。
パルボウイルス科（獣医学）
ネコパルボウイルス：ネコ脳炎を生じる
ネコ汎白血球減少症ウイルス
イヌパルボウイルス
ブタパルボウイルス
ヘルペスウイルス科
亜科：
アルファヘルペスウイルス亜科
属：
単純ウイルス（医学）
ＨＳＶＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｘ１４１１２、ＮＣ００１８０６）、
ＨＳＶＩＩ（ＮＣ００１７９８）
水痘帯状ヘルペス：（医学  獣医学）
仮性狂犬病
水痘帯状ヘルペス
亜科
ベータヘルペスウイルス亜科
属：
サイトメガロウイルス（医学）
ＨＣＭＶ
ムロメガロウイルス
亜科
ガンマヘルペスウイルス亜科
属：
リンホクリプトウイルス（医学）
ＥＢＶ−（バーキットリンパ腫）
ポックスウイルス科
亜科：
コードポックスウイルス亜科（医学−獣医学）
属：
天然痘（スモールポックス）
ワクシニア（牛痘）
パラポックスウイルス−獣医学
トリポックスウイルス−獣医学
カプリポックスウイルス
レポリポックスウイルス
スイポックスウイルス
亜科：
エントモポックスウイルス亜科
ヘパドナウイルス科
Ｂ型肝炎ウイルス
未分類のデルタ型肝炎ウイルス
【０１０１】
表２
細菌病原体
病原性グラム陽性球菌としては以下が挙げられる：肺炎球菌；ブドウ球菌；および連鎖球菌。
病原性グラム陰性球菌としては以下が挙げられる：髄膜炎菌性；およ淋菌性。
病原性腸内グラム陰性桿菌としては以下が挙げられる：腸内細菌科；シュードモナス菌、アシネトバクテリアおよびエイケネラ、類鼻疽；サルモネラ；細菌性赤痢；ヘモフィルス；軟性下疳；ブルセラ病；野兎病；エルシニア（パスツレラ）；ストレプトバシラス・モルチリホルミス（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｒｔｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）およびらせん菌；リステリア菌（ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；豚丹毒菌（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア、コレラ、炭疽菌；ドノバン症（鼠径部肉芽腫）；およびバルトネラ症。
病原性嫌気性細菌としては以下が挙げられる：破傷風；ボツリヌス中毒；他のクロストリジウム；結核；ハンセン病；および他の放線菌。
病原性スピロヘータ疾患としては以下が挙げられる：梅毒；−トレポネーマ症；イチゴ腫、ピンタおよび地方病性梅毒；およびレプトスピラ症。
より高度の病原性細菌および病原性真菌によって生じる他の感染としては以下が挙げられる：放線菌症；ノカルジア症；クリプトコッカス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症およびコクシジウム症；カンジダ症、アスペルギルス症および菌腫；スポロトリクム症；パラコクシジオイドミコーシス、ペトリエリジア症、トルロプシス症、菌腫およびクロモミコーシス；および皮膚糸状菌症。
リケッチア感染としては、リケッチアおよびリケッチア症が挙げられる。
マイコプラズマおよびクラミジアの感染の例としては以下が挙げられる：マイコプラズマ肺炎；鼠径性病性リンパ肉芽腫症；オウム病；および周産期クラミジア感染。
病原性真核生物
病原性原生動物および寄生蠕虫ならびにそれらによる感染としては以下が挙げられる：アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノソーマ症；トキソプラズマ症；ニューモシスチス・カリニ（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）；バベシア症；ランブル鞭毛虫症；旋毛虫病；フィラリア症；住血吸虫症；線虫類；吸虫類（ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ）または吸虫類（ｆｌｕｋｅｓ）；ならびに条虫（ｃｅｓｔｏｄｅ）（サナダムシ（ｔａｐｅｗｏｒｍ））感染。
【０１０２】
本発明の別の局面は、過剰増殖性疾患において特徴的である過剰増殖性細胞に対する防御免疫応答を付与する方法、および過剰増殖性疾患に罹患している個体を処置する方法を提供する。過剰増殖性疾患の例としては癌および乾癬の全ての形態が挙げられる。
【０１０３】
免疫原性の「過剰増殖性細胞」関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物の個体の細胞への導入は、個体のワクチン接種細胞においてそれらのタンパク質の産生を生じることが発見された。過剰増殖性疾患に対して免疫するためには、過剰増殖性疾患に関連するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が個体に投与される。
【０１０４】
過剰増殖性関連のタンパク質が有効な免疫原性標的であるためには、正常な細胞に比較した場合、過剰増殖性細胞において排他的にまたはより高レベルで産生されるタンパク質でなければならない。標的抗原としては、このようなタンパク質、そのフラグメントおよびペプチドが挙げられ；これは、このようなタンパク質上で見出されるエピトープを少なくとも含む。いくつかの場合には、過剰増殖性関連のタンパク質は、タンパク質をコードする遺伝子の変異の生成物である。この変異された遺伝子は、正常なタンパク質で見出されない異なるエピトープを生じる、わずかに異なるアミノ酸配列を有することを除いて、正常なタンパク質とほぼ同一のタンパク質をコードする。このような標的タンパク質としては、癌遺伝子、例えば、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎ、ならびに転位遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦによってコードされるタンパク質であるものが挙げられる。標的抗原として癌遺伝子産物に加えて、抗癌処置および防御計画のための標的タンパク質としては、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞レセプターの可変領域によって作成される抗体の可変領域が挙げられ、これはまた、いくつかの実施形態では、自己免疫疾患のために用いられる標的抗原でもある。他の腫瘍関連タンパク質は、モノクローナル抗体１７−ＩＡによって認識されるタンパク質および葉酸塩結合タンパク質またはＰＳＡを含めて、腫瘍細胞中でより高レベルで見出されるタンパク質のような標的タンパク質として用いられ得る。
【０１０５】
本発明は、癌のいくつかの形態のうちの１つ以上に対して個体を免疫するために用いられ得るが、本発明は特に、特定の癌を発症する素因があるか、または癌を有しており、従って、再発を受け易い個体を予防的に免疫するために有用である。遺伝学および技術における開発、ならびに疫学によって、個体における癌の発症について確立およびリスクアセスメントの決定が可能になる。遺伝子スクリーニングおよび／または家族の既往歴を用いて、特定の個体がいくつかの種類の癌のうちのいずれか１つを発症する可能性を予測することが可能である。
【０１０６】
同様に、癌を既に発症した個体および癌を除去するために処置されたか、そうでなければ寛解状態にある個体は、特にぶり返しおよび再発を受け易い。処置計画の一部として、このような個体は、再発と戦うために彼が有すると診断された癌に対して免疫され得る。従って、個体がある種の癌を有し、再発のリスクにあることが一旦知られれば、それらの個体は、癌の任意の特徴的な状況と戦う免疫系を準備するように免疫され得る。
【０１０７】
本発明は、過剰増殖性疾患に罹患している個体を処置する方法を提供する。このような方法では、遺伝子構築物の導入は、免疫治療剤として機能し、個体の免疫系が標的タンパク質を産生する過剰増殖性細胞と戦うことを指向および促進する。
【０１０８】
癌を処置することまたは予防することにおいて、細胞なしの実施形態が特に有用である。
【０１０９】
本発明は、自己免疫疾患および障害に罹患している個体を、「自己」指向性の抗体を生じる細胞レセプターおよび細胞を含めて自己免疫に関連する標的に対して広範なベースの防御免疫応答を付与することによって、処置する方法を提供する。
【０１１０】
Ｔ細胞媒介性の自己免疫疾患としては、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸炎が挙げられる。これらの疾患の各々は、内因性抗原に結合して、自己免疫疾患に関連する炎症性のカスケードを開始するＴ細胞レセプターによって特徴付けられる。Ｔ細胞の可変領域に対するワクチン接種は、それらのＴ細胞を排除するためのＣＴＬを含む免疫応答を惹起する。
【０１１１】
ＲＡでは、疾患に関与するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）のいくつかの特異的な可変領域が特徴付けられた。これらのＴＣＲとしては、Ｖ．β−３、Ｖ．β．−１４、２０Ｖ．β．−１７およびＶａ−１７が挙げられる。従って、これらのタンパク質のうち少なくとも１つをコードするＤＮＡ構築物でのワクチン接種が、ＲＡに関与するＴ細胞を標的する免疫応答を惹起する。以下を参照のこと：Ｈｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｄ．ら、１９９１  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０９２１〜１０９２５；Ｐｉｌｉａｒｄ，Ｘ．，ら，１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３２５〜３２９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｗ．Ｖ．ら、１９９２  Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：３２６〜３３３；その各々が参照によって本明細書に援用される。ＭＳでは、疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特異的な可変領域が特徴付けられた。これらのＴＣＲは、ＶｆＰおよびＶａ−１０を包含する。従って、これらのタンパク質のうちの少なくとも１つをコードするＤＮＡ構築物でのワクチン接種は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的する免疫応答を惹起する。以下を参照のこと：Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ，Ｋ．Ｗ．ら、１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１０１６〜１０１９；Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｒ．，ら、１９９０  Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：３４４〜３４６；その各々が参照によって本明細書に援用される。
【０１１２】
強皮症では、疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特異的な可変領域が特徴付けられた。これらのＴＣＲ類としては、Ｖ．β．−６、Ｖ．β．−８、Ｖ．β．−１４およびＶａ−１６、Ｖａ−３Ｃ、Ｖａ−７、Ｖａ−１４、Ｖａ−１５、Ｖａ−１６、Ｖａ−２８およびＶａ−１２が挙げられる。従って、これらのタンパク質のうちの少なくとも１つをコードするＤＮＡ構築物でのワクチン接種は、強皮症に関与するＴ細胞を標的する免疫応答を惹起する。
【０１１３】
Ｔ細胞媒介性の自己免疫疾患、特にＴＣＲの可変領域がさらに特徴付けされなければならない疾患に罹患している患者を処置するために、滑膜生検を行ってもよい。存在するＴ細胞のサンプルを採取して、それらのＴＣＲの可変領域を標準的な技術を用いて特定した。遺伝子ワクチンはこの情報を用いて調製してもよい。
【０１１４】
Ｂ細胞媒介性の自己免疫疾患としては、ループス（ＳＬＥ）、グレーブス病、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発性胆汁性硬化症および悪性貧血が挙げられる。これらの疾患の各々は、内因性抗原に結合して、自己免疫疾患に関連する炎症性カスケードを開始する抗体によって特徴付けられる。抗体の可変領域に対するワクチン接種は、ＣＴＬを含む免疫応答を惹起して抗体を生じるＢ細胞を排除する。
【０１１５】
Ｂ細胞媒介性の自己免疫疾患に罹患している患者を処置するために、自己免疫活性に関与する抗体の可変領域が特定されなければならない。生検を行ってもよく、炎症の部位に存在する抗体のサンプルを採取してもよい。それらの抗体の可変領域は、標準的な技術を用いて特定され得る。遺伝子ワクチンは、この情報を用いて調製され得る。
【０１１６】
ＳＬＥの場合、１つの抗原は、ＤＮＡであると考えられる。従って、ＳＬＥに対して免疫されるべき患者では、それらの血清を、抗−ＤＮＡ抗体についてスクリーニングしてもよく、血清で見出されるこのような抗ＤＮＡ抗体の可変領域をコードするＤＮＡ構築物を含むワクチンを調製してもよい。
【０１１７】
ＴＣＲと抗体の両方の可変領域の間の共通の構造的特徴が周知である。特定のＴＣＲまたは抗体をコードするＤＮＡ配列は一般には、参照によって本明細書に援用される、Ｋａｂａｔら、１９８７  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．に記載される方法のような周知の方法に従って見出され得る。さらに、抗体から機能的な可変領域をクローニングするための一般的方法は、参照によって本明細書に援用される、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．，ら、１９９０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１０６６に見出され得る。
【０１１８】
遺伝子ワクチンを改善するための免疫調節性タンパク質コード配列の発現可能な形態を用いることに加えて、本発明は、改善された弱毒化生ワクチンおよび抗原をコードする外来遺伝子を送達するために組み換えベクターを用いる改善されたワクチンに関する。弱毒化生ワクチンおよび外来抗原を送達するための組み換えベクターを用いるワクチンの例は、以下の米国特許番号に記載される：米国特許第４，７２２，８４８号；同第５，０１７，４８７号；同第５，０７７，０４４号；同第５，１１０，５８７号；同第５，１１２，７４９号；同第５，１７４，９９３号；同第５，２２３，４２４号；同第５，２２５，３３６号；同第５，２４０，７０３号；同第５，２４２，８２９号；同第５，２９４，４４１号；同第５，２９４，５４８号；同第５，３１０，６６８号；同第５，３８７，７４４号；同第５，３８９，３６８号；同第５，４２４，０６５号；同第５，４５１，４９９号；同第５，４５３，３６４号；同第５，４６２，７３４号；同第５，４７０，７３４号；および同第５，４８２，７１３号（その各々が参照によって本明細書に援用される）。ＩＬ−２８またはその機能的なフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が提供され、ここでこのヌクレオチド配列は発現を達成するためにワクチン中で機能し得る調節性配列に対して作動可能に連結される。この遺伝子構築物は、弱毒化中ワクチンおよび組み換えワクチン中に組み込まれて、本発明による改善されたワクチンを産生する。
【０１１９】
本発明は、ＤＮＡワクチン、弱毒化生ワクチンおよび組み換えワクチンを含むワクチン組成物の一部として個体の細胞に対して遺伝子構築物を送達する工程を包含する、個体を免疫する改善された方法を提供する。この遺伝子構築物は、ＩＬ−２８またはその機能的なフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は発現を達成するためにワクチン中で機能し得る調節性配列に対して作動可能に連結される。改善されたワクチンによって、増強された細胞性免疫応答が生じる。
【実施例】
【０１２０】
実施例１
本発明は、以下の実施例でさらに例示される。本実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示として示されるに過ぎないことが理解されるべきである。上記の考察および本実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認し得、そして本発明の趣旨および精神から逸脱することなく、本発明の種々の変化および改変を種々の用法および条件に対して適応させ得る。従って、本発明の種々の改変は、本明細書に示されかつ記載されるものに加えて、前述の説明から当業者に明白になる。このような改変はまた、添付の特許請求の範囲内におさまるものとする。
【０１２１】
導入
ＳＩＶｇａｇ、ｅｎｖ、およびｐｏｌを発現する最適化されたコンセンサスＳＩＶｍａｃプラスミド構築物のエレクトロポレーション（ＥＰ）によって誘導される細胞性免疫応答を評価して、プラスミド発現アカゲザルＩＬ−１２のＥＰと組み合わせた最適化されたコンセンサスＳＩＶｍａｃプラスミド構築物のエレクトロポレーション（ＥＰ）によって誘導される細胞性免疫応答と比較するか、またはＲＡＮＴＥＳは、細胞性免疫応答の大きさおよび質を変更し得る。ＥＬＩＳｐｏｔ多機能性フロー分析によって測定されるＴ細胞免疫応答においては顕著な改善、エキソビボの増幅およびエピトープの幅が観察された。不適合のＳＩＶｍａｃ２５１直腸内チャレンジにおけるウイルス負荷に対するこれらのワクチン接種アプローチの影響のアセスメントも行った。ＤＮＡワクチン接種単独で、この研究におけるウイルスチャレンジに影響することおよびＣＤ４Ｔ細胞損失に対する防御が見出された。プラスミドＩＬ−１２およびＲＡＮＴＥＳの同時送達は、ウイルス複製の制御の増強を生じた。従って、プラスミドワクチンカセットの送達および設計の両方を操作することは、ＨＩＶモデルシステムに関係する高頻度の細胞性免疫応答の生成について重要であると思われる。
【０１２２】
材料および方法
動物。中国由来のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅの標準に従って、ＢＩＯＱＵＡＬ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で飼育した。動物を任意の実験の前に、検疫所で少なくとも３０日間順応させた。
【０１２３】
免疫化。６匹の群のアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）（ＤＮＡ）を、各々１．５ｍｇのＳＩＶｇａｇ、ＳＩＶｅｎｖ、ＳＩＶｐｏｌを用いて０週、８週、１２週および２４週で免疫した。ＤＮＡを各々の免疫時点で、大腿四頭筋の単一部位に続いてインビボのＥＰに送達した。６匹のマカク（ｍａｃａｑｕｅ）の別の２群を、各々１．５ｍｇのＳＩＶｇａｇ、ＳＩＶｅｎｖ、ＳＩＶｐｏｌおよびアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＩＬ−１２（ＤＮＡ＋１２）またはＲＡＮＴＥＳ（ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ）を用いて０週、８週、および１２週で免疫した。プラスミドアジュバントは、ＤＮＡ＋１２およびＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群において第四回目の免疫（２４週）から排除した。６匹のマカク（ｍａｃａｑｕｅｓ）を陰性コントロール（ナイーブ）として注射用滅菌水で免疫した。全てのＥＰ手順は、定電流ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）デバイス（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を用いて行った。ＥＰ条件は、０．５Ａｍｐ、３パルス、５２ミリパルス秒長であって、パルス間は１秒であった。
【０１２４】
血液収集。動物を研究の期間中、２週間ごとに採血した。１０ｍｌの血液をＥＤＴＡチューブに採取した。末梢血細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的なＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離によって単離して、完全培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０であって、２ｍＭのＬ−グルタミンを含み、これには１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および５５μＭのβ−メルカプトエタノールを補充した）の中で再懸濁した。ＲＢＣを、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）で溶解した。
【０１２５】
プラスミドおよびプラスミド生成物。この研究で用いられるプラスミドは、ＳＩＶｇａｇ（ｐＳＩＶｇａｇ）、ＳＩＶｐｏｌ（ｐＳＩＶｐｏｌ）またはＳＩＶｅｎｖ（ｐＳＩＶｅｎｖ）について改変コンセンサス抗原を発現する。発現を改善するために、効果的なＩｇＥリーダー配列を含んだ。さらに、ＳＩＶ  ｅｎｖ  Ｖ１およびＶ２領域は、Ｎ−連結グリコシル化部位を取り除くことによって短くして、細胞質のテールを短縮してエンベロープがリサイクルすることを妨げた。ＳＩＶ  ｐｏｌについては、３つの変異を導入して、プロテアーゼ、逆転写酵素およびＲＮＡｓｅＨを不活性化した。得られた最適化されたＳＩＶ  ＤＮＡ免疫原をコドン最適化およびＲＮＡ最適化し、合成して、ｐＶＡＸ１発現ベクター中にクローニングして、ＳＩＶｇａｇ（ｐＳＩＶｇａｇ）、ＳＩＶｅｎｖ（ｐＳＩＶｅｎｖ）、およびＳＩＶｐｏｌ（ｐＳＩＶｐｏｌ）のための最適化発現構築物を作成した。次いで、これらのプラスミド構築物を、１０Ｌ規模で製造し（ＶＧＸＩ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）、本明細書に記載される研究での使用のために処方した。精製されたプラスミドＤＮＡを、水中に０．２５％のブピバカインを有する０．１５Ｍのクエン酸緩衝液ｐＨ６．７中に処方した。
【０１２６】
ペプチド。試薬は、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨを通じて入手した：ＳＩＶｍａｃ２３９  ｇａｇペプチド（＃６２０４）、ＳＩＶｍａｃ２３９  ｅｎｖペプチド（＃６８８３）、およびＳＩＶｍａｃ２３９  ｐｏｌペプチド（＃６４４３）。
【０１２７】
カルボキシフルオレシンスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）のコンジュゲーションおよびＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析。ＣＦＳＥは、前に記載される第四免疫の２週後に単離された新鮮なＰＢＭＣで行った。
【０１２８】
酵素連結イムノスポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）。ＥＬＩＳｐｏｔｓは、サルのＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔキット（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を用いて、前に記載のとおり行った。最初の２回の免疫のための入力細胞数は、２×１０５個の細胞であった。３回目および４回目の免疫時点については、入力細胞数は、過剰なスポット数に起因して１×１０５細胞まで減少された。三連のウェルからのスポットの平均数は、１０６個のＰＢＭＣあたりのスポットの数を反映するように調節した。ＳＩＶ特異的応答は、培養培地単独に対する応答において形成されたスポットを、刺激に用いられたＳＩＶペプチドプールの各々に応答して形成されたスポットの値から差引きした後に算出した。５０以上のＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣであり、かつ培養培地単独の応答の２×より大きい応答を、陽性とみなし、次いで正味の値を追加した。
【０１２９】
ＳＩＶｐｏｌエピトープマトリクスマッピング。ＳＩＶｐｏｌペプチドライブラリーを、前に記載されたような、マトリクスフォーマットを用いて３３個のプールに分け、第四免疫後に単離された凍結保存されたＰＢＭＣを刺激するために用いた。応答の幅は、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて評価した。エピトープの最大数の推定は、認識されたペプチドの総数に基づいた。エピトープの最小数の推定は、一連の２つ以上の連続陽性ペプチドである陽性のペプチドランの数を３で割って、最近似値の整数に切り上げることによって算出した。
【０１３０】
細胞内サイトカイン染色。多機能性Ｔ細胞分析を、前に記載のように、第四免疫の２週後および最終免疫の８ケ月後に単離した新鮮なＰＢＭＣで行った。データは、バックグラウンドの補正後に報告する。陽性の応答は、０．０５％より大きい場合と規定した。
【０１３１】
凍結保存したＰＢＭＣを、急速解凍して、刺激前に完全培地中で３７℃で一晩休息させた。ＣＣＲ５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，）発現は、各々の機能について抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞および総機能応答で測定した。ＩＦＮγおよびＴＮＦα抗体の両方とも、このパネル中でさらに染色に適応するためにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００上とした。データは、バックグラウンド補正後に報告しており、総ＣＤ８集団の割合として示す。
【０１３２】
ＳＩＶｍａｃ２５１チャレンジ。動物を、直腸内経路によって、ＳＩＶｍａｃ２５１の２５サル感染用量（ｍｏｎｋｅｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅｓ）（ＭＩＤ）での４回の免疫の８カ月後にチャレンジした。ウイルスストックは、Ｒｏｎａｌｄ  Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓによって調製し、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（ＡＢＬ，Ｉｎｃ．）（Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ，ＭＤ）によって提供され、ＢＩＯＱＵＡＬ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によって滴定された。
【０１３３】
血漿ウイルス負荷に関する定量的核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）アッセイ。血漿ウイルス負荷は、前に記載のとおり、ＡＢＬ  Ｉｎｃ．によりＳＩＶｇａｇについて定量的ＮＡＳＢＡアッセイによって決定した。
【０１３４】
ＭＨＣクラスＩ遺伝子型決定。包括的な配列に基づくＭＨＣ−Ｉ遺伝子型決定は、以前に記載のように、Ｓａｎｇｅｒ配列決定およびピロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法の組み合わせを用いて行った。要するに、総細胞ＲＮＡを、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてＰＢＭＣから単離した。ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてＲＮＡから生成し、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＭＨＣ−Ｉ特異的プライマーでのＰＣＲ増幅のためにテンプレートとして用いた。ＰＣＲ産物は、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製した。Ｓａｎｇｅｒ配列決定については、これらの生成物を、ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を備える、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて細菌中にクローニングした。１匹の動物あたり９６〜１９２個の形質転換された細菌のコロニーを、ＬＢ＋５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシン中で一晩増殖させ；プラスミドＤＮＡを引き続きＰｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ９６  Ｖａｃ  Ｂｉｎｄ  Ｋｉｔ（５  ＰＲＩＭＥ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて単離した。ＭＨＣ−Ｉエキソン２＆３によってコードされる高度可変ペプチド結合ドメインをカバーするサンガーの配列決定反応を、配列特異的なＰＣＲプライマーとＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）とを用いて行い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて分析した。５匹の動物のサブセットをまた、ＭＨＣ−Ｉエキソン２において普遍的な診断用の１９０ｂｐのＰＣＲアンプリコンのＲｏｃｈｅ／４５４−ピロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いて遺伝子型決定した。このアンプリコンは、ｃＤＮＡから増幅し、ゲル精製し、定量して、正規化し、プールして、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ装置上で４５４  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）  で、またはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓで、Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｉｇｎ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ）で流した。配列分析は、ＣｏｄｏｎＣｏｄｅアライナー（ａｌｉｇｎｅｒ）（ＣｏｄｏｎＣｏｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｅｈａｍ，ＭＡ）およびＬａｓｅｒｇｅｎｅ  ８（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて行った。アセンブルされたコンティグを、ＢＬＡＳＴＮを用いて公知のアカゲザルＭＨＣ−Ｉ対立遺伝子の社内データベースと比較した。
【０１３５】
統計学的。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔｓの比較のために、Ｔ細胞増殖、およびサイトカイン産生の両側マンホイットニー検定または一元ＡＮＯＶＡとテューキーまたはダネットのＴ３事後検定を、適宜、ＳＰＳＳ  １７．０統計学的ソフトウェアを用いて行った。ウイルス負荷を、対数変換して、統計学的分析の前にデータを正規化した。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
【０１３６】
結果
研究のデザイン。２４匹のチャイニーズアカゲザルを、４つの免疫群に分けた（表３）。第一群（ＤＮＡ）には、ＳＩＶｇａｇ、ＳＩＶｅｎｖおよびＳＩＶｐｏｌをコードする最適化プラスミドを与えた。第二群（ＤＮＡ＋１２）には、ｒｈＩＬ−１２をコードするプラスミドを、そして第３群（ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ）には、ＳＩＶプラスミドに加えてＲＡＮＴＥＳをコードするプラスミドを与えた。第四群（ナイーブ）には、生理食塩水注射を与えた。プラスミドは、０、８、１２および２４週で１．５ｍｇ／構築物／免疫という用量で投与した。サルは、筋肉内注射、続いてインビボのＥＰによって免疫した。
【０１３７】
エレクトロポレーションによるＤＮＡプラスミド送達は、堅調で、高度に増殖性の細胞性免疫応答を誘導する。第一に、各々の動物における細胞性免疫応答の誘導を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。各々の免疫の２週後に単離したＰＢＭＣを、ＳＩＶ特異的なＩＦＮγ産生についてアッセイした。プラスミドｒｈＩＬ−１２の同時免疫によって、初回のワクチン接種後、ＤＮＡ単独に比較してＥＬＩＳｐｏｔ数の９倍の増大が生じた（それぞれ、６０±４９および５６９±２４８ＳＦＵ／１０６個のＰＢＭＣ）。この早期の増強によって、さらなる免疫化は減少された。細胞応答の追加免疫は、４回の免疫の各々の後に観察し、これは堅調な抗ＳＩＶ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔｓ中で頂点に達し、平均で１６，０００ＳＦＵ／１０６個のＰＢＭＣ、または１．６％のＰＢＭＣ集団であった（図１ａ〜１ｅ）。ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群は、それらが、ＤＮＡ（ｐ＜０．００１）およびＤＮＡ＋１２（ｐ＝０．００１）群よりも有意に低い場合、特に第三回の免疫の後一貫して低いＥＬＩＳｐｏｔ応答を示した。第四回の免疫後ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群は、９，２１７±２１１１のＳＦＵ／１０６個のＰＢＭＣという総ＩＦＮγ応答を有した。
【０１３８】
第四回の免疫の後ＳＩＶｐｏｌ特異的  ＩＦＮγ応答の検査によって、全ての３つの群が、全体的な免疫原をカバーする広い範囲の応答を有したことが明らかになった（表４）。１つのエピトープが１１個のアミノ酸の重複に基づいて３つのペプチド中で可能性として提示され得るならば、エピトープの数は、陽性プール中に示されるペプチドの総数のほぼ１／３である。興味深いことに、ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群は、他のワクチン接種群よりもＳＩＶｐｏｌの応答の程度が低いにもかかわらず、推定で６８±３．６７のエピトープを認識する最も多様な応答を有した。
【０１３９】
次に、ワクチン誘導性のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の応答の増殖能力を、ＣＦＳＥ増殖アッセイを用いて評価した（図２ａ）。ＤＮＡ群は、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖性応答を有し、これは、ＤＮＡ＋１２およびＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群（それぞれ、４．５６±２．７２％および１．７３±０．７６％および０．４６±０．３９％、図２ｂ）より高かった。ワクチン誘導性のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞区画に比較してかなり高い増殖能力を有した。ＣＤ４＋Ｔ細胞応答と同様に、ＤＮＡ群は、最高の応答を有し、ここではＤＮＡ＋１２の群における１８．７±５．０２％、およびＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群における１７．９±５．３３％に比較して４１．３±９．２％の細胞増殖であった（図２ｃ）。ＤＮＡ群は、より高い増殖性応答を有したが、その相違は統計学的に有意ではなかった。
【０１４０】
プラスミドｒｈＩＬ−１２の同時免疫は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生を増強する。ワクチン誘導性の応答の質を決定するために、ＳＩＶｐｏｌ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦα、およびＣＤ１０７ａの産生について評価した（図３ａ）。個体の細胞が複数のサイトカインを生じる能力をゲートするブール（Ｂｏｏｌｅａｎ）を用いて、すなわちワクチン誘導性のＣＤ４＋Ｔ細胞応答の多官能性を評価した。ＤＮＡ単独での免疫では、０．５２±０．２９％という平均のＳＩＶｐｏｌ応答が生じた（図３ｂ）。免疫化に対するＩＬ−１２の追加によって、ＣＤ４＋Ｔ機能的応答のほぼ２倍の増大が生じた（０．９７±０．２６％）。興味深いことに、ＲＡＮＴＥＳの添加は、コントロール群よりも高い応答を誘導しなかった（それぞれ、０．０７±．０３％および０．１２±０．１２％）。全てのワクチン接種群におけるほとんどの応答は、単機能性であるが、ＤＮＡ＋１２群は、２つ以上の機能を果たし得る細胞の最大割合を有し、ここでは優勢な二重機能集団は、ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋産生細胞である。
【０１４１】
プラスミドｒｈＩＬ−１２の同時免疫は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を助ける。ＣＤ４＋Ｔ細胞区画中の別個の表現型の相違をみて、ＣＤ８＋Ｔ細胞区画の表現型を次に評価した。ＳＩＶｐｏｌ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生を評価した。機能的応答の大きさは、ＣＤ４＋Ｔ細胞区画において何が観察されるかを反映した。ＤＮＡ＋１２群は、少なくとも１つの機能を産生する２．３４±０．６２％のＣＤ８＋Ｔ細胞との最高の応答を有した（図３ｃ）。ＤＮＡ群は、１．６９±０．６３％というわずかに低い応答を有したが、ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群は、０．４４±０．１６％というＣＤ８＋Ｔ細胞応答で四分の一の応答であった。
【０１４２】
最高の大きさでの応答を有することに加えて、ＤＮＡ＋１２群における６匹の動物のうち４匹は、ＤＮＡ群での２匹の動物およびＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群での１匹の動物に比較して、４つ全ての機能を果たし得る細胞の集団を有した。４つの全ての機能を果たし得る応答をより大きい割合で有するにもかかわらず、ＤＮＡ＋１２群における優勢な応答は、ＩＦＮγ単機能集団である。これによって、分子アジュバントとしてのＩＬ−１２の追加は、ＩＦＮγを除いて、サイトカインを産生する能力を失った、高頻度の末端分化したエフェクター様細胞を誘導することが示唆され得る。しかし、これらの細胞の記憶表現型によって、これらの細胞は、ＣＤ２８およびＣＤ９５染色によって規定されるように（図３ｄ）、エフェクター記憶および中央記憶Ｔ細胞区画の両方に分布されることが示され、このことはこれらのＴ細胞の機能的な性質を支持している。
【０１４３】
ワクチン誘導性の応答の維持。ＥＰによって送達されるこのプラスミドワクチンによる細胞性免疫応答の劇的な誘導を観察して、実験を行って、これらの集団が免疫応答の記憶相で維持され得るか否かを決定した。動物を８か月間休息させて、サイトカイン産生をエキソビボのＳＩＶｐｏｌ刺激に応答して検査した。ＣＤ４＋Ｔ細胞区画では、ＤＮＡおよびＤＮＡ＋１２群は、免疫した後の免疫応答の大きさの半分またはそれより小さいレベルを担うＳＩＶｐｏｌ応答を有した（それぞれ、０．１５±０．１１％および０．４２±０．０９％）（図４ａ）。１つの例外は、０．４７±０．３７％という平均応答を有したＲＡＮＴＥＳ群であった。しかし、この群の１匹の動物は、大きい記憶応答を占める異常に高いＩＦＮγ応答を有した。第四回の免疫後に観察されたとおり、ＩＦＮγ単機能細胞は、全ての群で優勢な集団であった。
【０１４４】
記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞区画における免疫応答の同じ収縮を観察した（図４ｂ）。４つの機能的な細胞は検出されなかったが、３つの全ての群が、検出可能なＣＤ１０７ａ＋ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋応答および大きいＩＦＮγ＋単機能集団（４回目の免疫後に観察された）を維持した。これらのデータによって、増強されたＤＮＡワクチン接種（分子アジュバントは有無）は、長寿命の多機能性記憶応答を誘導し得ることが示唆される。
【０１４５】
プラスミドＩＬ−１２およびＲＡＮＴＥＳでの同時免疫は、設定ポイントでウイルス負荷における有意な減少を生じる。次に、実験を行って、免疫の８か月後に維持される、これらのワクチン特異的な細胞応答が、ＳＩＶｍａｃ２５１粘膜チャレンジ後のウイルス負荷に影響し得るか否かを確認した。この動物を直腸内経路によってＳＩＶｍａｃ２５１の２５サル感染用量（ｍｏｎｋｅｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅｓ）（ＭＩＤ）でチャレンジした。ウイルス負荷を２か月間毎週、および毎月、その後チャレンジ後最大９か月まで評価した。累積的に考慮して、ワクチン接種した動物は全体として（ＩＬ−１２またはＲＡＮＴＥＳにかかわらず）、非ワクチン接種コントロールに対して有意に低いピークウイルス血症（ｐ＝０．０２７）および低いウイルス設定ポイント（ｐ＝０．０１）を示した（図５ａ）。各々の群についての平均のウイルス負荷のさらなる検査によって、経時的にＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群におけるウイルス複製のコントロールの増強が明らかになった（図５ｂ）。ウイルス血症のピークでは、ＤＮＡおよびＤＮＡ＋１２の群は、ナイーブな群に比較して、ウイルス負荷が減少していた（それぞれ、１．１２および０．８２対数）。免疫化に対するＲＡＮＴＥＳの追加は、ピークウイルス血症での有意な２．０対数の減少を生じた（ｐ＝０．０１６）。設定ポイントでは、ＤＮＡ群は平均で、ナイーブな群に比較してウイルス負荷のわずか０．６２対数の減少しか示さなかった。ＤＮＡ＋１２およびＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群は、ナイーブな群に比較して設定ポイントのウイルス負荷で有意な１．５（ｐ＝０．０２９）および２．２（ｐ＝０．００３）対数の減少を有した。しかし、研究の終わりに、ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群のみは、曲線下面積の分析によって決定した場合、ウイルス複製の有意な減少を有した（ｐ＝０．００８）（図５ｃ）。
【０１４６】
以前のＳＩＶチャレンジ研究では、ウイルス複製の自然な制御に関連するいくつかのＭＨＣ−Ｉ対立遺伝子を特定した。この研究における宿主ＭＨＣ−Ｉ遺伝子の潜在的な貢献を評価するために、全ての動物の包括的な配列ベースの分類をレトロスペクティブに行った（表５）。事後分析によって、防御的Ｍａｍｕ−Ｂ＊００３対立遺伝子を発現する４匹の動物がおり、２匹はＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群であり、１匹はそれぞれＤＮＡ群およびＤＮＡ＋１２群であったことが明らかになった。本発明者らはまた、ＤＮＡ＋１２群におけるＭａｍｕ−Ｂ＊０１７動物を特定した。ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群における別の動物は、Ｍａｍｕ−Ｂ＊０１７０２に対して極めて類似の新規なクラスＩ対立遺伝子を有することが見いだされた。有意に低いウイルス負荷を、研究の終わりに防御的ハプロタイプを有する動物で観察した（ｐ＝０．０３３）（図５ｄ）が、ピーク（ｐ＝０．９６８）および設定ポイント（ｐ＝０．１６１）のウイルス負荷に統計学的な差はなかった。従って、これらの防御的対立遺伝子は、慢性感染の間のウイルス複製の制御に寄与し得るが、それらは、感染後早期に観察されるウイルス複製の制御に対するワクチン効果とは関連しない。
【０１４７】
ＤＮＡワクチン接種は、ＳＩＶｍａｃ２５１粘膜チャレンジ後のＣＤ４＋Ｔ細胞損失を妨げる。ワクチン接種群における設定ポイントでのウイルス複製の減少レベルを観察して、別の免疫パラメーターによる防御を評価した。この目的を達成するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞カウントを２か月間２週間ごとに、次いで、その後４週ごとにモニターした。ナイーブな群は、チャレンジ後９か月にわたって持続的にＣＤ４＋Ｔ細胞損失を受け、その結果、ベースラインのカウントに比較して５０％の損失が生じた（図６ａ〜図６ｅ）。対照的に、ワクチン接種した群は、ＣＤ４＋Ｔ細胞カウントにおいてなんら持続的な減少を示さなかった。従ってＤＮＡワクチン接種（免疫アジュバントは有無）は、ＳＩＶｍａｃ２５１での感染後、９か月にわたって、ＣＤ４＋Ｔ細胞損失から動物を防御した。
【０１４８】
ＲＡＮＴＥＳ同時免疫後の末梢血中の抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞に対してＣＣＲ５発現の増強はない。ＲＡＮＴＥＳでの同時免疫が、感染の部位で動員され得る抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルに影響し、チャレンジ後のウイルス複製に影響し得るか否かを決定するために実験を行った。ＩＣＳは、第三回の免疫後に単離された凍結保存細胞に対してＣＤ１０７ａ、ＩＬ−２、ＩＦＮｇおよびＴＮＦａについて行った。ＳＩＶｐｏｌ特異的応答を最初に、各々の機能について決定し、それらの細胞上でのＣＣＲ５の発現を測定した。ＣＣＲ５を発現する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が低いことは、ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群では末梢において（０．２６±０．０９％）、ＤＮＡおよびＤＮＡ＋１２群に比較して観察された（それぞれ、０．６２±０．２８％および０．３３±０．１４％）（図７ａ）。しかし、この相違は、統計学的に有意ではなかった（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ，ｐ＝０．０５６）。同様の傾向がＣＤ４＋Ｔ細胞区画で見られ、ここではＤＮＡ群は、高頻度（０．２７±０．０９％）のＳＩＶｐｏｌ特異的ＣＣＲ５＋細胞を有し、ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群は、末梢血中で最低の頻度を有した（０．１３±０．０４％）（図７ｂ）。このデータによって、ＲＡＮＴＥＳが、抗原特異的Ｔ細胞上でのＣＣＲ５発現のレベルを調節するか、あるいはこれらの細胞を他の免疫部位に動員するかのいずれかが支持される。
【０１４９】
考察
ＥＰおよびプラスミドＩＬ−１２がＨＩＶプラスミド抗原の免疫原性を劇的に増強する能力は、霊長類のパイロット研究で以前に報告された。ＲＡＮＴＥＳはまた、マウスの研究で極めて有効なアジュバントであることが観察された。本明細書に記載される実験は、これらのストラテジーがプラスミドＳＩＶワクチンの免疫原性を増強し得るか否かを確認するために、およびウイルス複製の制御に寄与し得る細胞性応答の任意の小集団を特定する試みにおいてこれらの応答を特徴づけるためにデザインした。コンセンサスＳＩＶ抗原を試験して、増強された応答が不適合の粘膜ＳＩＶｍａｃ２５１ウイルスチャレンジに影響し得るか否かを検査した。
【０１５０】
以前の研究と一致して、ＥＰは、ワクチン特異的ＩＦＮγの応答を極めて高レベルまで劇的に増強できた。早期の研究とは対照的に、この研究における応答の大きさは、この研究で用いられる構築最適化ストラテジーの追加と一致して３倍を超えていた。しかし、ＥＬＩＳｐｏｔカウントにおけるさらなる増強は、プラスミドＩＬ−１２をアジュバントとして用いた場合、研究の初期を除いて、観察されなかった。これは、用いたＤＮＡのさらに高い用量またはＤＮＡの濃度に起因し得；ワクチンは、パイロット研究では２ｍｇ／ｍＬに比較して１０ｍｇ／ｍＬで処方した。極めて最適化したＤＮＡ構築物をより高い用量および濃度で使用することで、処方されたワクチンがより低く、より薄い用量で送達される場合に観察される免疫原性の相違が克服されるようである。このような処方物は、ＤＮＡプラットフォームに重要な結果を有し得る。
【０１５１】
印象的なＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔカウントが観察されたが、多くの研究ではＥＬＩＳｐｏｔ応答がウイルス複製の制御と直接関連しないことが示されているので、このパラメーター単独でワクチン候補の有効性を決定する唯一の要因ではないはずということが重要である。この目的を達成するために、有効なＨＩＶワクチンを評価するために所望されるべき多数のパラメーターが示唆された。第一に、近年のＭｅｒｃｋ  ＳＴＥＰトライアルの結果では、広範な免疫応答の誘導が首尾よいワクチンに重要であることが示唆された。平均して、Ｍｅｒｃｋの組み換えＡｄ５ベクターでワクチン接種された被験体は、３〜５つのエピトープに限定された広い応答を有した。マトリクスペプチドマッピングによるＳＩＶｐｏｌ抗原に対する応答を評価するのにおいて、前例のない陽性の応答が、免疫群の全てにおいて広いエピトープカバーを示す大部分のペプチドプールについて観察された。最も多様なエピトープ応答を誘導したＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳワクチンは、ウイルス複製の最高の制御を有したことも興味深い。
【０１５２】
長期の非進行者における研究では、非進行者は、進行者よりも多機能的なＣＤ８＋Ｔ細胞を有することが示され、このことはこれらの多機能的な集団が、ウイルスの制御において重要であり得ることを示唆している。多機能的な応答の誘導は、ＤＮＡおよびＤＮＡ＋１２群の両方で、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞区画の両方について観察された。しかし、興味深い観察は少なかった。第一に、ＣＤ４＋Ｔ細胞区画では、ＤＮＡ群におけるＳＩＶｐｏｌに対する応答速度および応答の大きさは、ＤＮＡ＋１２群のものよりも低かった。第二に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞区画の両方で、ＤＮＡ＋１２群は、ＩＦＮγ単機能細胞からなるそれらの応答の割合が高かった。Ｔ細胞記憶分化のモデルでは、このようなＩＦＮγ単機能細胞は、最終のエフェクターに相当すると考えられる。この可能性に取り組むため、これらの単機能細胞の記憶の表現型を、ＣＤ２８およびＣＤ９５染色によって検査した。この状況では、これらの応答は、ＣＤ２８＋ＣＤ９５＋中央記憶集団およびＣＤ２８−ＣＤ９５＋エフェクター集団の両方に由来する細胞から構成されることが見いだされた。ＣＤ２８＋ＣＤ９５＋細胞は、正確には単機能ではなく、また本発明者らの多機能的なパネルで評価されなかったいくつかの他の機能も保有することが可能である。この仮説は、将来の研究において注目となる。
【０１５３】
多数のＤＮＡプライム／ウイルスベクターのブースト研究は、ＳＨＩＶ８９．６Ｐのチャレンジモデルでのウイルス負荷減少においてある程度の有効性を示した。しかし、ワクチン有効性を予測するのにおけるこのモデルの有用性を討論した。従って、よりストリンジェントな高用量ＳＩＶｍａｃ２５１粘膜チャレンジモデルにおけるＤＮＡワクチン誘導性の免疫応答の有効性を評価した。このチャレンジモデルを用いる他の研究では、ウイルス複製に対して軽度の効果が報告された。
【０１５４】
全てのワクチン接種された動物とコントロールの動物との間で観察されたＣＤ４Ｔ細胞損失の防御において劇的な相違があった。ワクチン接種した動物は、研究の全経過についてアジュバントにかかわらず、ＣＤ４Ｔ細胞損失から防御された。さらに、ワクチン接種群の間の相違が、チャレンジ後のウイルス複製の制御で見られた。ＤＮＡおよびＤＮＡ＋１２群の両方とも、非ワクチン接種コントロールに対して、ピークのウイルス血症のほぼ１対数の減少を示したが、ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群は、ナイーブ群に比較してピークウイルス負荷の有意な２．２対数の減少を示した。ＤＮＡ群は、設定ポイントでウイルス負荷の有意な減少を有さなかったが、ＩＬ−１２およびＲＡＮＴＥＳでアジュバントされた群は、有意に低いウイルス負荷を有した。３５週では、ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群のみが、ナイーブコントロールに比較してウイルス負荷に対して持続的な有意な影響を示した。
【０１５５】
ヒトおよびマカクにおける多数の研究で、特定のＭＨＣハプロタイプは、ウイルスの天然の制御に関連することが示された。ほとんどの以前の研究では、インド由来のアカゲザルにおけるＭＨＣ−Ｉ／疾患関連を試験したが、ＳＩＶワクチン研究について中国由来のアカゲザルの使用の増大によって、現在までに行われた補完物に対してこの研究中の集団における同様の研究の必要性が強化された。この問題に取り組むため、全ての動物の包括的なクラスＩ遺伝子型決定を、チャレンジ研究が開始された後に行った。事後解析によって、ＳＩＶ複製に対する強力な防御と関連するＭａｍｕ−Ｂ＊００３対立遺伝子を発現した４匹の動物が明らかになった：２匹は、ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群であり、ＤＮＡおよびＤＮＡ＋１２群で各々１匹。Ｍａｍｕ−Ｂ＊０１７動物もＤＮＡ＋１２群で特定した。興味深いことに、潜在的に防御的なＭａｍｕ−Ｂ＊０１７−様の新規な対立遺伝子が、チャレンジ後に検出可能な血漿ウイルスＲＮＡを決して示さないＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ動物で検出された。有意に低いウイルス負荷が、このようなクラスＩ対立遺伝子の重要性と一致して、これらの防御対立遺伝子を有する動物で研究の終わりに観察された（ｐ＝０．０３５）。しかし、対照的に、防御的ハロタイプ動物のピーク（ｐ＝０．５６１）および設定点（ｐ＝０．０５６）のウイルス負荷に統計学的な差はなかった。従って、防御的ハロタイプは、慢性感染の間のウイルス制御と関連したが、ワクチン効果も感染の早期のウイルス複製の制御で観察された。さらに、ワクチン接種群におけるチャレンジ後のＣＤ４＋Ｔ細胞の欠失は、Ｍａｍｕ−Ｂ＊００３またはＭａｍｕ−Ｂ＊０１７対立遺伝子を有する動物対ワクチン接種した動物の休止の間で有意に相違しなかった。これらのデータを一緒にすれば、ＤＮＡワクチン接種は、ＳＩＶｍａｃ２５１粘膜チャレンジにおける防御に寄与し得ることがさらに示される。
【０１５６】
ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群で観察されたウイルス抑制の増強についての機構は未知である。これは、ＩＦＮγ応答の大きさに起因しないことが本発明者らのアッセイから明らかである。１つの仮説は、免疫の間のＲＡＮＴＥＳの存在が、ＣＣＲ５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を調節するということである。次いで、これらの細胞は、ＣＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞について報告されたとおり、感染の部位に存在し、感染したＣＤ４＋Ｔ細胞を標的して、改善された結果をもたらすことができる。この仮説に取り組むために、予備的な方法で、ＣＣＲ５を発現した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を免疫後に末梢血中で測定した。これらの細胞は低い頻度であることが、ＤＮＡ＋ＲＡＮＴＥＳ群において末梢血中で観察された。この結果は、他のアッセイで観察された抗原特異的細胞の低い頻度とともに、他のワクチン接種群に比較してＲＡＮＴＥＳアジュバント応答の示差的なホーミングパターン（例えば、粘膜区画）を反映し得る。任意の事象では、誘導性Ｔ細胞の免疫生物学のＲＡＮＴＥＳ調節性の局面およびこの調節は、ウイルスチャレンジの状況では宿主に利点をもたらすらしいことが明らかである。この重要な領域をさらに探索するためには将来研究を行う必要がある。
【０１５７】
多数の免疫パラメーターを検査したが、単独のアッセイでウイルスチャレンジの結果を予測できたものはなかった。本研究で観察されたウイルス複製の制御は、中和抗体の発達とは関連しなかった。なぜなら免疫後になにも検出されなかったからである。近年の研究では、細胞毒性のような他の細胞機能が、防御的免疫応答の良好な指標であり得ることが示唆された。しかし、ワクチン誘発性の免疫応答においてパーフォリンは、アカゲザル特異的な抗体の欠失のせいで評価されなかった。チャレンジの結果に基づいて、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ応答は、重要ではあるが、ウイルス制御のさらに良好な指標であり得る他の機能とは別々に分離されていることは明らかであると思われる。ＩＬ−１２およびＲＡＮＴＥＳ誘導性の応答の免疫表現型のさらなる研究は、本研究で観察されるウイルス複製の減少について細胞機構を決定するのに重要である。
【０１５８】
Ｍｅｒｃｋ  ＳＴＥＰトライアルの近年の結果によって、次世代のＴ細胞ベースのワクチン候補物が取り組む必要がある多数の問題が強調され、これには以下が挙げられる：既存のワクチンベクターの血清学の懸念、Ａｄ５プラットフォームを上回る免疫応答の大きさおよび幅における有意な改善の必要性、ならびに異種ＳＩＶ粘膜チャレンジモデルにおけるウイルス制御の改善。この点に関して、本明細書に示される集合的データによって、本明細書に記載される併用ＤＮＡワクチンアプローチが、既存の血清学に起因する問題を回避しながら、ＳＩＶ感染に関連する堅調な免疫応答を誘導し得ることが支持される。これらのワクチンとベクターアプローチとを組み合わせて、このような血清学に基づく問題を部分的に迂回することが興味深い場合もある。さらに、これらの応答の大きさ、ならびに分子アジュバントを用いてこの誘導された免疫応答の指向および表現型を調節する能力は、ＳＩＶモデルに関係するワクチン関連の研究のための特に有用なツールであり得る。
【０１５９】
【表３】
2013518599.tif 000023
【０１６０】
【表４】
2013518599.tif 000024
【０１６１】
【表５】
2013518599.tif 000025
サンガーベースおよびＲｏｃｈｅ／４５４ピロシーケンシングベースの分類によって決定した、中国由来のアカゲザルの包括的なＭＨＣクラスＩ遺伝子型決定。各々の動物由来のＭＨＣクラスＩ配列を、ＢＬＡＳＴＮを用いて全ての公知のＭａｍｕ配列の社内データベースに比較した。ピロシーケンシングは、有意に深い深度の範囲を提供したが、評価された短いテンプレートに起因して高度に類似の対立遺伝子の間であいまい性は増大した。各々の動物における所定の対立遺伝子に対応する配列読み取りの割合は、５．０％を超える（ブルゴーニュ色）。ＭＨＣ−Ｉ対立遺伝子またはＳＩＶ複製の制御に関連するハプロタイプで観察された動物（Ｍａｍｕ−Ｂ＊００３およびＭａｍｕ−Ｂ＊０１７）は緑色で示す。１匹の動物（＃４４２４）が、これもまたＳＩＶコントロールに関連し得る、Ｍａｍｕ−Ｂ＊０１７と高度に類似の新規なＭａｍｕ−Ｂ対立遺伝子を発現した。コントロールに関連する他の対立遺伝子、例えば、インド由来のアカゲザル対立遺伝子Ｍａｍｕ−Ａ＊００１、Ｍａｍｕ−Ｂ＊００８またはＭａｍｕ−Ｂ＊０４７は、中国由来のアカゲザルのこのコホートでは観察されなかった。
【０１６２】
実施例２
ヒトＲＡＮＴＥＳ（ｐＣＣＬ５ＥＣＲＯ−ＥＣＲＯ＝ＩｇＥ，コドン（Ｃｏｄｏｎ／ＲＮＡ最適化（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ））の合成およびクローニング
最適化されたヒトＣＣＬ５（ｐＨｕＣＣＬ５ＥＣＲＯ）の３４８ｂｐの遺伝子を設計し、合成して以下の方式でクローニングした。コドン用法は、高ＣＡＩ値（非最適化：０．８１；最適化：０．９７）を生じるヒト遺伝子のコドンバイアスに適合した。デザインおよび合成のために、可能な場合、極めて高い（＞８０％）または極めて低い（＜３０％）のＧＣ含量の領域が回避されるようにコドンを選択した。これに関して、野生型ヒトＣＣＬ５遺伝子は、まれなコドンを高頻度で用い、ＧＣ含量は急速なｍＲＮＡ代謝回転のわずかなレベルを容易にし得る平均（５７％）であったことが確認された。従って、ＧＣ含量をわずかに増大して（６２％）ｍＲＮＡの半減期を改善した。最適化プロセスの間、以下のシス−作用性配列モチーフを回避した：内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位およびリボソーム進入部位、ＡＴ−リッチまたはＧＣ−リッチ配列のストレッチ、ＡＲＥ、ＩＮＳ、ＣＲＳ配列エレメント、リピート配列およびＲＮＡ二次構造、（潜在性（ｃｒｙｐｔｉｃ））スプライスドナーおよびアクセプター部位および分岐点。分析後、１つだけの陰性のシス作用性モチーフを特定して除去した。最適化ヒトＣＣＬ５の遺伝子合成は、Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって行った。合成の高度にコドン／ＲＮＡ最適化されたヒトＣＣＬ５遺伝子は、合成のオリゴヌクレオチドからアセンブルされた。コザック（Ｋｏｚａｋ）配列（ＧＣＣＡＣＣ）を導入して、翻訳開始を増大し、ＩｇＥリーダー配列を導入して、２つの終止コドンを追加して効率的な終結を保証した。このフラグメントを、ｐＶＡＸ１中に、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いてクローニングした。プラスミドＤＮＡを、ＶＧＸ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ，Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、形質転換された細菌から精製して、ＵＶ分光法によって濃度を決定した。ヒトＣＣＬ５（ｐｈｕｍＣＣＬ５ＥＣＲＯ）の最終ＤＮＡ配列を、配列決定によって確認して、１００％一致であることを見出した。
【０１６３】
実施例３
添付された配列表は、配列番号１〜８を含む。配列番号１は、ヒトＲＡＮＴＥＳをコードするコドン／ＲＮＡ最適化核酸配列である。配列番号２は、配列番号１によってコードされるヒトＲＡＮＴＥＳのアミノ酸配列である。配列番号３は、ヒトＲＡＮＴＥＳのＮ末端に連結されるＩｇＥリーダー配列を有するＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードするコドン／ＲＮＡ最適化核酸配列である。配列番号４は、配列番号３によってコードされるヒトＲＡＮＴＥＳのＮ末端に連結されるＩｇＥリーダー配列を有するＲＡＮＴＥＳタンパク質である。配列番号５は、配列番号３に開示されるようなヒトＲＡＮＴＥＳのＮ末端に連結されるＩｇＥリーダー配列を有するＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする同じコドン／ＲＮＡ最適化核酸配列を含むが、ここで追加のＫｏｚａｋ配列をその構築物の５’非翻訳領域に有する。配列番号４とおなじ配列である配列番号６は、配列番号３によってコードされるヒトＲＡＮＴＥＳのＮ末端に連結されるＩｇＥリーダー配列を有するＲＡＮＴＥＳタンパク質である。配列番号７は、配列番号３および配列番号５に開示されるようなヒトＲＡＮＴＥＳのＮ末端に連結されるＩｇＥリーダー配列を有するＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする同じコドン／ＲＮＡ最適化核酸配列を含むが、ここで追加のＫｏｚａｋ配列を配列番号５の構築物の５’非翻訳領域に、ならびに制限酵素部位を５’および３’末端に有し、これらは、プラスミド中の構築物の挿入およびクローニングに関与する有用な手順である。配列番号４および配列番号６と同じ配列である配列番号８は、配列番号３および配列番号５によってコードされるヒトＲＡＮＴＥＳのＮ末端に連結されるＩｇＥリーダー配列を有するＲＡＮＴＥＳタンパク質である。
【図２ａ】
2013518599.tif 000026
【図３ｄ】
2013518599.tif 000027
【図１ａ】
2013518599.tif 000028
【図１ｂ】
2013518599.tif 000029
【図１ｃ】
2013518599.tif 000030
【図１ｄ】
2013518599.tif 000031
【図１ｅ】
2013518599.tif 000032
【図２ｂ】
2013518599.tif 000033
【図２ｃ】
2013518599.tif 000034
【図３ａ】
2013518599.tif 000035
【図３ｂ】
2013518599.tif 000036
【図３ｃ】
2013518599.tif 000037
【図４ａ】
2013518599.tif 000038
【図４ｂ】
2013518599.tif 000039
【図５ａ】
2013518599.tif 000040
【図５ｂ】
2013518599.tif 000041
【図５ｃ】
2013518599.tif 000042
【図５ｄ】
2013518599.tif 000043
【図６ａ】
2013518599.tif 000044
【図６ｂ】
2013518599.tif 000045
【図６ｃ】
2013518599.tif 000046
【図６ｄ】
2013518599.tif 000047
【図６ｅ】
2013518599.tif 000048
【図７ａ】
2013518599.tif 000049
【図７ｂ】
2013518599.tif 000050
【配列表】
2013518599000001.app
【国際調査報告】
2013518599.tif 000051