(57)【要約】本開示は、インフルエンザ感染の処置、検出、分析および／または特徴付けのための方法、試薬および系を提供する。具体的には、本開示は、アンブレラトポロジーグリカンとコーントポロジーグリカンとを識別する強い能力を示す、操作された血球凝集素（ＨＡ）ポリペプチドを提供する。より具体的には、操作されたＨＡポリペプチドは、ＨＡポリペプチドの１３７、１９３、２２６および２２８に対応する位置に、ある特定のアミノ酸残基を有する。本開示は、ヒトにおけるインフルエンザ感染を処置するための操作されたＨＡポリペプチドの使用方法をさらに提供する。
2013541528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作されたＨＡポリペプチドであって、該操作されたＨＡポリペプチドのアミノ酸配列が、
アルギニン、リシン、グルタミン、メチオニンおよびヒスチジンからなる群より選択される、配列番号１の１３７位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基１３７」）；
アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、セリン、スレオニン、システインおよびバリンからなる群より選択される、配列番号１の１９３位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基１９３」）；
アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンからなる群より選択される、配列番号１の２２６位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基２２６」）；ならびに
アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、セリン、グリシン、スレオニンおよびチロシンからなる群より選択される、配列番号１の２２８位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基２２８」）
を含むことを特徴とする、操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項２】
前記残基１３７がアルギニン、リシン、グルタミンおよびメチオニンから選択される、請求項１に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項３】
前記残基１９３がアラニン、グルタミン酸、スレオニン、システイン、メチオニン、バリンおよびセリンからなる群より選択される、請求項１に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項４】
前記残基２２６がロイシン、イソロイシンおよびバリンからなる群より選択される、請求項１に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項５】
前記残基２２８がアルギニン、アスパラギン、セリン、グリシンおよびスレオニンからなる群より選択される、請求項１に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項６】
操作されたＨＡポリペプチドであって、該操作されたＨＡポリペプチドのアミノ酸配列が、アルギニンであるアミノ酸残基１３７、スレオニンであるアミノ酸残基１９３、ロイシンであるアミノ酸残基２２６、およびセリンであるアミノ酸残基２２８を含むことを特徴とする、操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項７】
Ｈ２ポリペプチドである、前述の請求項のいずれか一項に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項８】
高親和性でアンブレラトポロジーグリカンに結合することを特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載の操作されたＨＡポリペプチドであって、ヒト伝染性の同じサブタイプの野生型ＨＡの親和性と同等の親和性で、前記アンブレラトポロジーグリカンに結合する、操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８に記載の操作されたＨＡポリペプチドであって、ヒト伝染性の同じサブタイプの野生型ＨＡの親和性の少なくとも５０％の親和性で、前記アンブレラトポロジーグリカンに結合する、操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項１１】
請求項８に記載の操作されたＨＡポリペプチドであって、ヒト伝染性の同じサブタイプの野生型ＨＡの親和性の少なくとも７０％の親和性で、前記アンブレラトポロジーグリカンに結合する、操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項１２】
請求項８に記載の操作されたＨＡポリペプチドであって、ヒト伝染性の同じサブタイプの野生型ＨＡの親和性の少なくとも９０％の親和性で、前記アンブレラトポロジーグリカンに結合する、操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項１３】
請求項８に記載の操作されたＨＡポリペプチドであって、ヒト伝染性の同じサブタイプの野生型ＨＡの親和性の少なくとも１００％の親和性で、前記アンブレラトポロジーグリカンに結合する、操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項１４】
コーントポロジーグリカンと比較してアンブレラトポロジーグリカンに優先的に結合する、請求項１から１３のいずれかに記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項１５】
コーントポロジーグリカンに対する少なくとも２の相対的親和性で、アンブレラトポロジーグリカンに結合する、請求項１から１３のいずれかに記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項１６】
コーントポロジーグリカンに対する少なくとも４の相対的親和性で、アンブレラトポロジーグリカンに結合する、請求項１から１３のいずれかに記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項１７】
コーントポロジーグリカンに対する少なくとも１０の相対的親和性で、アンブレラトポロジーグリカンに結合する、請求項１から１３のいずれかに記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項１８】
コーントポロジーグリカンに対する少なくとも２０の相対的親和性で、アンブレラトポロジーグリカンに結合する、請求項１から１３のいずれかに記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項１９】
低親和性でコーントポロジーグリカンに結合することを特徴とする、請求項１から１８のいずれかに記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項２０】
約２００ｐＭ以下のＫｄ’でアンブレラトポロジーグリカンに結合する、請求項１から１９のいずれかに記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項２１】
約１００ｐＭ以下のＫｄ’でアンブレラトポロジーグリカンに結合する、請求項１９に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項２２】
約５０ｐＭ以下のＫｄ’でアンブレラトポロジーグリカンに結合する、請求項１９に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項２３】
約２０ｐＭ以下のＫｄ’でアンブレラトポロジーグリカンに結合する、請求項１９に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項２４】
約１００ｐＭ以上のＫｄ’でコーントポロジーグリカンに結合する、請求項１から２３のいずれかに記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項２５】
約２００ｐＭ以上のＫｄ’でコーントポロジーグリカンに結合する、請求項２３に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項２６】
約５００ｐＭ以上のＫｄ’でコーントポロジーグリカンに結合する、請求項２３に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項２７】
約１ｎＭ以上のＫｄ’でコーントポロジーグリカンに結合する、請求項２３に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項２８】
高親和性でアンブレラトポロジーグリカンに結合し、低親和性でコーントポロジーグリカンに結合することを特徴とする、請求項１に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項２９】
約２００ｐＭ以下のＫｄ’でアンブレラトポロジーグリカンに結合し、約２００ｐＭ以上のＫｄ’でコーントポロジーグリカンに結合する、請求項２８に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１から２９のいずれかに記載の操作されたＨＡポリペプチドを含む組成物を投与することによる、インフルエンザ感染を処置する方法。
【請求項３１】
請求項１から２９のいずれかに記載の操作されたＨＡポリペプチドを含むワクチン組成物。
【請求項３２】
弱毒化生ウイルスを含む、請求項３１に記載のワクチン組成物。
【請求項３３】
ウイルス様粒子を含む、請求項３１に記載のワクチン組成物。
【請求項３４】
サブユニットワクチンである、請求項３１に記載のワクチン組成物。
【請求項３５】
アジュバントをさらに含む、請求項１から３４のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
請求項３１から３５のいずれかに記載のワクチン組成物を、インフルエンザウイルスに感染しているかまたは感染が疑われる個体に投与するステップを含む、方法。
【請求項３７】
操作されたＨＡポリペプチドであって、改善は、
アルギニン、リシン、グルタミン、メチオニンおよびヒスチジンからなる群より選択される、配列番号１の１３７位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基１３７」）；
アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、セリン、スレオニン、システインおよびバリンからなる群より選択される、配列番号１の１９３位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基１９３」）；
アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンからなる群より選択される、配列番号１の２２６位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基２２６」）；ならびに
アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、セリン、グリシン、スレオニンおよびチロシンからなる群より選択される、配列番号１の２２８位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基２２８」）
の存在を含む、操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項３８】
操作されたＨＡポリペプチドであって、改善は、残基１３７のアルギニン、残基１９３のスレオニン、残基２２６のロイシン、および残基２２８のセリンの存在を含む、操作されたＨＡポリペプチド。
【請求項３９】
インフルエンザ感染を処置する方法であって、改善は、操作されたＨＡポリペプチドの含有、調製および／または使用を含み、該操作されたＨＡポリペプチドは、該操作されたＨＡポリペプチドのアミノ酸配列が、
アルギニン、リシン、グルタミン、メチオニンおよびヒスチジンからなる群より選択される、配列番号１の１３７位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基１３７」）；
アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、セリン、スレオニン、システインおよびバリンからなる群より選択される、配列番号１の１９３位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基１９３」）；
アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンからなる群より選択される、配列番号１の２２６位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基２２６」）；ならびに
アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、セリン、グリシン、スレオニンおよびチロシンからなる群より選択される、配列番号１の２２８位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基２２８」）
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項４０】
インフルエンザ感染を処置する方法であって、改善は、操作されたＨＡポリペプチドの含有、調製および／または使用を含み、該操作されたＨＡポリペプチドは、該操作されたＨＡポリペプチドのアミノ酸配列が、残基１３７にアルギニン、残基１９３にスレオニン、残基２２６にロイシン、および残基２２８にセリンを含むことを特徴とする、方法。
【請求項４１】
望ましい結合剤を同定する方法であって、改善は、操作されたＨＡポリペプチドの使用を含み、該操作されたＨＡポリペプチドは、該操作されたＨＡポリペプチドのアミノ酸配列が、
アルギニン、リシン、グルタミン、メチオニンおよびヒスチジンからなる群より選択される、配列番号１の１３７位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基１３７」）；
アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、セリン、スレオニン、システインおよびバリンからなる群より選択される、配列番号１の１９３位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基１９３」）；
アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンからなる群より選択される、配列番号１の２２６位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基２２６」）；ならびに
アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、セリン、グリシン、スレオニン、グリシンおよびチロシンからなる群より選択される、配列番号１の２２８位に対応する位置のアミノ酸残基（「残基２２８」）
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項４２】
望ましい結合剤を同定する方法であって、請求項１から２９のいずれかに記載の操作されたＨＡポリペプチドの使用を含む、方法。
【請求項４３】
望ましい結合剤を同定する方法であって、改善は、操作されたＨＡポリペプチドの使用を含み、該操作されたＨＡポリペプチドは、該操作されたＨＡポリペプチドのアミノ酸配列が残基１３７にアルギニン、残基１９３にスレオニン、残基２２６にロイシン、および残基２２８にセリンを含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
インフルエンザの処置および／または特徴づけ；ヒト適応ＨＡポリペプチド；ワクチン
政府支援
本特許出願は、２０１０年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／３８４，７８０号への優先権を主張し、上記米国仮特許出願の開示は、その全容が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、汎発流行、蔓延、再流行および大発生の長い歴史を有する。インフルエンザ株のうちＨ２株は、Ｈ２血球凝集素に免疫を有する人口の激減に照らして特定の難題を提起している。インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患に対する有効な処置または発症遅延のためのワクチンおよび治療戦略に対する必要性があり、特に、Ｈ２インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患に対する有効な処置または発症遅延のためのワクチンおよび治療戦略に対する必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、アンブレラトポロジー（ｕｍｂｒｅｌｌａ−ｔｏｐｏｌｏｇｙ）グリカンとコーントポロジー（ｃｏｎｅ−ｔｏｐｏｌｏｇｙ）グリカンとを識別する高い能力を示す結合剤を提供する。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、操作されたＨＡポリペプチドである。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、操作されたＨ２  ＨＡポリペプチドである。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、本明細書に記載のＲＴＬＳ  ＨＡポリペプチド（例えばＲＴＬＳ  Ｈ２  ＨＡポリペプチド）によって示されるものと少なくとも同様に有効な、アンブレラトポロジーグリカンとコーントポロジーグリカンとを識別する能力を示す。
【０００４】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書において「ＲＴＬＳ」と称する配列エレメントを含む、操作された血球凝集素（ＨＡ）ポリペプチドを特に提供する。本明細書において記載の通り、ＲＴＬＳエレメントはＨＡポリペプチドの残基１３７、１９３、２２６および２２８に対応する位置での特定のアミノ酸の存在を表す。いくつかの実施形態では、本発明は、例えば改善された、操作されたＨＡポリペプチドが、１３７、１９３、２２６および２２８に対応する位置に、ある特定のアミノ酸残基を有する、操作されたＨＡポリペプチドに対する改善を提供する。本明細書に記載の通り、そのようなＨＡポリペプチドは、先行技術での操作されたＨＡポリペプチドを含む先行技術ＨＡポリペプチドと比較して種々の予測されない、有用な特徴を有する。
【０００５】
本発明は、例えば、提供される結合剤に関連する診断用および治療用の試薬および方法（ワクチンを含む）も提供する。提供される試薬および方法は、とりわけ医療活動において、例えばワクチンの送達において、および／または（例えばインフルエンザウイルスでの）感染の処置もしくは予防のために有用である。いくつかの実施形態では、提供される試薬および方法はヒトの処置において特に有用である。いくつかの実施形態では、本発明は、いくつかの診断および／または治療用の試薬および方法に対する改善であって、例えば本明細書に記載の操作されたＨＡポリペプチドおよび／または１３７、１９３、２２６および２２８に対応する位置に、ある特定のアミノ酸残基を有するＨＡポリペプチドの含有、調製および／または使用を含む、改善を提供する。
【０００６】
本発明は、例えば、アンブレラトポロジーグリカンとコーントポロジーグリカンとを有効に識別する結合剤を同定するための系および試薬も提供する。いくつかの実施形態では、そのような結合剤は、本明細書に記載のＲＴＬＳ  ＨＡポリペプチド（例えばＲＴＬＳ  Ｈ２  ＨＡポリペプチド）が行うのと少なくとも同様の強い識別能力を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、特定の基準と比較してアンブレラトポロジーグリカンへの増強された結合を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、特定の基準と比較してコーントポロジーグリカンへの低下した結合を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、特定の基準と比較してアンブレラトポロジーグリカンへの増強された結合およびコーントポロジーグリカンへの低下した能力の両方を示す。いくつかの実施形態では、特定の基準は、野生型ＨＡポリペプチドである。いくつかの実施形態では、特定の基準は、野生型Ｈ２  ＨＡポリペプチドである。いくつかの実施形態では、特定の基準は、ＲＴＬＳ  ＨＡポリペプチド（例えばＲＴＬＳ  Ｈ２ＨＡポリペプチド）である。いくつかの実施形態では、本発明は、望ましい結合剤を同定するための改善された系および／または方法であって、１３７、１９３、２２６および２２８に対応する位置に、ある特定のアミノ酸残基を有するＨＡポリペプチド（例えば操作されたポリペプチド）の使用（例えば比較）を含む、改善された系および／または方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、提供される結合剤（提供されるＨＡポリペプチド、例えば操作されたＨＡポリペプチドを含む）は、アンブレラトポロジーグリカンに対して約１．５ｎＭから約２ｐＭの範囲内の親和性（Ｋｄ’）を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、アンブレラトポロジーグリカンに対して約１．５ｎＭから約２００ｐＭの範囲内の親和性（Ｋｄ’）を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、アンブレラトポロジーグリカンに対して約２００ｐＭから約１０ｐＭの範囲内の親和性（Ｋｄ’）を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、アンブレラトポロジーグリカンに対して約１０ｐＭから約２ｐＭの範囲内の親和性（Ｋｄ’）を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤はコーントポロジーグリカンに対して２ｎＭ以上である親和性（Ｋｄ’）を示し；いくつかの実施形態では、提供される結合剤はコーントポロジーグリカンに対して約２００ｐＭから約２ｎＭの範囲内である親和性（Ｋｄ’）を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、アンブレラグリカン対コーングリカンについて、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１０，０００、約１００，０００までまたはそれ以上である相対的親和性を示す。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、コーントポロジーグリカンに対する親和性の約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１０００％、約２０００％、約３０００％、約４０００％、約５０００％、約６０００％、約７０００％、約８０００％、約９０００％、約１０，０００％またはそれを超えるアンブレラトポロジーグリカンに対する親和性を示す。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が下に記載のエレメント：
Ｘ１３７  Ｌ１  Ｘ１９３  Ｌ２  Ｘ２２６  Ｌ３  Ｘ２２８
を含むＨＡポリペプチド（例えば操作されたＨＡポリペプチド）を提供し、
Ｘ１３７はアルギニン、リシン、グルタミン、メチオニンおよびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸であり、いくつかの実施形態ではＸ１３７はアルギニンおよびリシンからなる群より選択され；いくつかの実施形態ではＸ１３７はアルギニンであり、
Ｌ１はおよそ４０〜７０アミノ酸を含むリンカーであり、
Ｘ１９３はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、セリン、スレオニン、システインおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸であり、いくつかの実施形態ではＸ１９３はアラニン、グルタミン酸およびスレオニンからなる群より選択され；いくつかの実施形態ではＸ１９３はスレオニンであり、
Ｌ２はおよそ２０〜５０アミノ酸を含むリンカーであり、
Ｘ２２６はアラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸であり、いくつかの実施形態ではＸ２２６はロイシン、イソロイシンおよびバリンからなる群より選択され；いくつかの実施形態ではＸ２２６はロイシンであり、
Ｌ２はおよそ１〜１５アミノ酸を含むリンカーであり、
Ｘ２２８はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、セリン、グリシン、スレオニンおよびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸であり、いくつかの実施形態ではＸ２２８はアルギニン、アスパラギン、セリンおよびスレオニンからなる群より選択され；いくつかの実施形態ではＸ２２８はセリンである。
【０００９】
いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３のそれぞれは、Ｘ１３７、Ｘ１９３、Ｘ２２６およびＸ２２８が、図１７および／もしくは１８において示されおり、かつ／または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６および配列番号７からなる群より選択されるＨＡポリペプチドにおけるような、残基１３７、１９３、２２６および２２８と実質的に同様に、三次元空間においてお互いに配置されるような長さおよびアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｌ１はおよそ４０〜７０アミノ酸を含み、いくつかの実施形態ではＬ１は５０〜６０アミノ酸を含み、いくつかの実施形態ではＬ１は５３〜５８アミノ酸を含む。いくつかの実施形態ではＬ１はおよそ５６アミノ酸長であり、配列番号２の残基１３８から１９２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態ではＬ２は、およそ２０〜５０アミノ酸を含み、いくつかの実施形態ではＬ２は３０〜４０アミノ酸を含み、いくつかの実施形態ではＬ２は３２〜３５アミノ酸を含む。いくつかの実施形態ではＬ２はおよそ３３アミノ酸長であり、配列番号２の残基１９４から２２５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態ではＬ３はおよそ１〜１５アミノ酸を含み、いくつかの実施形態ではＬ３は１〜１０アミノ酸を含み、いくつかの実施形態ではＬ３は１〜５アミノ酸を含む。いくつかの実施形態ではＬ３はおよそ１アミノ酸長であり、配列番号２の残基２２７と１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する。
【００１０】
一態様では、本発明は、アンブレラトポロジーグリカンへの高親和性結合だけではヒトへの有効な伝染性／感染力を付与するためには十分ではない可能性があるという特定の認識を提供する。むしろ本発明はコーントポロジーグリカンへの低下した結合も重要である場合があるという知見を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１は、野生型Ｈ２ＨＡの例示的な配列のアラインメントを示す図である。配列はＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースから得た（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）。
【図１Ｂ】図１は、野生型Ｈ２ＨＡの例示的な配列のアラインメントを示す図である。配列はＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースから得た（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）。
【図１Ｃ】図１は、野生型Ｈ２ＨＡの例示的な配列のアラインメントを示す図である。配列はＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースから得た（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）。
【図１Ｄ】図１は、野生型Ｈ２ＨＡの例示的な配列のアラインメントを示す図である。配列はＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースから得た（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）。
【図１Ｅ】図１は、野生型Ｈ２ＨＡの例示的な配列のアラインメントを示す図である。配列はＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースから得た（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）。
【図２Ａ】図２は、野生型Ｈ３の例示的な配列のアラインメントを示す図である。配列はＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースから得た（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）。
【図２Ｂ】図２は、野生型Ｈ３の例示的な配列のアラインメントを示す図である。配列はＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースから得た（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）。
【図２Ｃ】図２は、野生型Ｈ３の例示的な配列のアラインメントを示す図である。配列はＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースから得た（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）。
【図２Ｄ】図２は、野生型Ｈ３の例示的な配列のアラインメントを示す図である。配列はＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースから得た（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）。
【図２Ｅ】図２は、野生型Ｈ３の例示的な配列のアラインメントを示す図である。配列はＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースから得た（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）。
【図３】図３は、例示的なコーントポロジーを示す図である。この図は、コーントポロジーを採用する、ある例示的な（しかし網羅的ではない）グリカン構造を示す。
【図４−１】図４は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｏ連結グリカン構造。
【図４−２】図４は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｏ連結グリカン構造。
【図４−３】図４は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｏ連結グリカン構造。
【図４−４】図４は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｏ連結グリカン構造。
【図４−５】図４は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｏ連結グリカン構造。
【図４−６】図４は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｏ連結グリカン構造。
【図４−７】図４は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｏ連結グリカン構造。
【図４−８】図４は、例示的なアンブレラトポロジーを示す図である。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用することができる、ある例示的な（しかし網羅的ではない）Ｏ連結グリカン構造。
【図５】図５は、Ａｌｂ５８ＨＡの例示的なグリカン受容体結合特異性を示す図である。（Ａ）トリ受容体結合に比べて、ヒト受容体に対して高親和性の結合を示す、Ａｌｂ５８ＨＡの例示的な用量依存性の直接グリカンアレイ結合。（Ｂ）ヨウ化プロピジウム染色（暗色）に対して示した、Ａｌｂ５８ＨＡ（明色）による、ヒト気管上皮の頂端表面の例示的な広範な染色、および肺胞組織切片の観察可能な染色。
【図６】図６は、変異形態のＡｌｂ５８ＨＡの例示的なグリカン受容体結合特異性を示す図である。（Ａ〜Ｃ）に示すのは、それぞれＡｌｂ５８−ＬＧ、Ａｌｂ５８−ＱＧ、Ａｌｂ５８−ＱＳ変異体の、ある例示的な用量依存性のグリカンアレイ結合である。Ｓｅｒ２２８→Ｇｌｙの１つだけのアミノ酸変化（Ａｌｂ５８−ＬＧ変異体）により、Ａｌｂ５８ＨＡにおいて観察されるトリ受容体の結合の欠損がもたらされる。さらなるＬｅｕ２２６→Ｇｌｎ変異（Ａｌｂ５８−ＬＧ上）は、Ａｌｂ５８−ＱＧ変異体がトリ受容体に優先的に結合するようにすることによって、結合特異性を完全に変換する。Ａｌｂ５８−ＱＳ変異体はトリおよびヒトの受容体結合の両方の欠損を示す。（Ｄ）例示的なホモロジーベースの、ヒト受容体を伴ったＡｌｂ５８−ＱＳ変異体の構造モデル（ＲＢＳ部分を略画として示す）。Ｌｅｕ２２６およびＧｌｎ２２６両方の側鎖に印を付けてある。変異体におけるＧｌｎ２２６はＳｅｒ２２８と相互作用するように位置付けられており、そのため２２６位はヒトおよびトリ両方の受容体との接触にあまり好都合でなくなっている。
【図７】図７は、ＣｋＰＡ０４ＨＡの例示的なグリカン受容体結合特異性を示す図である。（Ａ）ヒト受容体と比べて、トリ受容体に対する高親和性の結合を示す、ＣｋＰＡ０４ＨＡの例示的な用量依存性の直接グリカンアレイ結合。（Ｂ）ヨウ化プロピジウム染色（暗色）に対して示した、ＣｋＰＡ０４ＨＡ（明色）による、例示的な広範な肺胞の染色およびヒト気管上皮の頂端表面の最小の染色。
【図８】図８は、例示的なＨＡ−グリカン受容体複合体のホモロジーベースの構造モデルを示す図である。（Ａ）テンプレートとしてＡ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／ＮＹ／９１−トリ受容体（ＰＲＢ  ＩＤ：２ＷＲ２）の共結晶構造を用いて構築した、ＣｋＰＡ０４ＨＡのＲＢＳ（略画として示す）−トリ受容体構造複合体の例示的な立体像。トリ受容体の解明された座標（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ）を、棒表現を用いて示す。（Ｂ）テンプレートとしてＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７−ヒト受容体（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＷＲ７）の共結晶構造を用いて構築した、Ａｌｂ５８ＨＡのＲＢＳ（略画として示す）−ヒト受容体複合体の例示的な立体像。ヒト受容体の解明された座標（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌ）を、棒表現を用いて示す。グリカン受容体との相互作用に関与する重要な残基の側鎖を示し、標識している。ＣｋＰＡ０４とＡｌｂ５８ＨＡとの間で異なる、ＲＢＳにおける残基に下線を付している。
【図９−１】図９は、変異形態のＣｋＰＡ０４ＨＡの例示的なグリカン受容体結合特異性を示す図である。それぞれ、ＣｋＰＡ０４−ＬＳ、ＣｋＰＡ０４−ＴＬＳ、およびＣｋＰＡ０４−ＲＴＬＳ変異体の、例示的な用量依存性のグリカン受容体結合（Ａ、Ｃ、Ｅ）および例示的なヒト組織結合（Ｂ、Ｄ、Ｆ）。変異体は全て、グリカンアレイ、組織結合実験の両方において観察されるように、ＷＴ  ＣｋＰＡ０４ＨＡに比べて、ヒト受容体結合における実質的な改善、およびトリ受容体結合における低減を示す。
【図９−２】図９は、変異形態のＣｋＰＡ０４ＨＡの例示的なグリカン受容体結合特異性を示す図である。それぞれ、ＣｋＰＡ０４−ＬＳ、ＣｋＰＡ０４−ＴＬＳ、およびＣｋＰＡ０４−ＲＴＬＳ変異体の、例示的な用量依存性のグリカン受容体結合（Ａ、Ｃ、Ｅ）および例示的なヒト組織結合（Ｂ、Ｄ、Ｆ）。変異体は全て、グリカンアレイ、組織結合実験の両方において観察されるように、ＷＴ  ＣｋＰＡ０４ＨＡに比べて、ヒト受容体結合における実質的な改善、およびトリ受容体結合における低減を示す。
【図９−３】図９は、変異形態のＣｋＰＡ０４ＨＡの例示的なグリカン受容体結合特異性を示す図である。それぞれ、ＣｋＰＡ０４−ＬＳ、ＣｋＰＡ０４−ＴＬＳ、およびＣｋＰＡ０４−ＲＴＬＳ変異体の、例示的な用量依存性のグリカン受容体結合（Ａ、Ｃ、Ｅ）および例示的なヒト組織結合（Ｂ、Ｄ、Ｆ）。変異体は全て、グリカンアレイ、組織結合実験の両方において観察されるように、ＷＴ  ＣｋＰＡ０４ＨＡに比べて、ヒト受容体結合における実質的な改善、およびトリ受容体結合における低減を示す。
【図１０】図１０は、変異形態のＣｋＰＡ０４ＨＡの例示的なグリカン受容体結合親和性を示す図である。（Ａ）代表的なトリ受容体（３’ＳＬＮ−ＬＮ）に対するＷＴおよび変異体のＨ２Ｎ２のＨＡの結合親和性における違いを示す、ある例示的な理論上の結合曲線（見かけの結合定数Ｋｄ’を付す）。（Ｂ）代表的なヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に対するＷＴおよび変異体のＨ２Ｎ２のＨＡの結合親和性における違いを示す、ある例示的な理論上の結合曲線。ＣｋＰＡ０４−ＴＬＳ、Ａｌｂ５８、およびＣｋＰＡ０４−ＲＴＬＳについては、Ｋｄ’値（３〜８ｐＭ）の範囲が示され、ＣｋＰＡ０４−ＬＳのＫｄ’値とは対照的である。結合曲線は、Ｈｉｌｌの等式に適合させ（方法を参照されたい）、理論的に計算した飽和度（ｙ軸）をＨＡ濃度（ｘ軸）に対してプロットすることによって生成した。結合イベント全てに対するｎ値は、およそ１．３である。
【図１１】図１１は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＧａｌモチーフおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフのコンフォメーションマップおよび溶媒の接近可能性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を示す図である。パネルＡは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ連結のコンフォメーションマップを示す。丸で囲んだ領域２は、ＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２３、ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２３共結晶構造において観察されるトランスコンフォメーションである。丸で囲んだ領域１は、ＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３共結晶構造において観察されるコンフォメーションである。パネルＢは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのコンフォメーションマップを示し、ここで、ＨＡ−α２−６シアリル化グリカンの共結晶構造全てにシス−コンフォメーション（丸で囲んだ領域３）が観察される。パネルＣは、それぞれのＨＡ−グリカン共結晶構造におけるＮｅｕ５Ａｃα２−３シアリル化オリゴ糖とＮｅｕ５Ａｃα２−６シアリル化オリゴ糖との間の、溶媒露出面積（（ｓｏｌｖｅｎｔ  ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ）ＳＡＳＡ）の違いを示す。バーはそれぞれ、α２−６（正の値）またはα２−３（負の値）のシアリル化グリカンにおけるＮｅｕ５Ａｃは、グリカン結合部位とより接触するようにすることを指摘している。パネルＤは、ブタおよびヒトのＨ１（Ｈ１α２−３）、トリおよびヒトのＨ３（Ｈ３α２−３）に結合しているα２−３シアリル化グリカンにおけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡと、ブタおよびヒトのＨ１（Ｈ１α２−６）に結合しているα２−６シアリル化グリカンにおけるＮｅｕＡｃのＳＡＳＡとの間の違いを示す。Ｈ３α２−３に対する負のバーは、ヒトＨ３のＨＡがトリＨ３のＨＡに比べて、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとあまり接触しないことを示す。ねじれ角−Φ：Ｃ２−Ｃ１−Ｏ−Ｃ３（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６連結に対して）；Ψ：Ｃ１−Ｏ−Ｃ３−Ｈ３（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌに対して）またはＣ１−Ｏ−Ｃ６−Ｃ５（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌに対して）；ω：Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌに対して）連結。
【００１２】
Φ、Ψマップは、Ｍａｒｔｉｎ  Ｆｒａｎｋ博士およびＣｌａｕｓ−Ｗｉｌｈｅｌｍ  ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｅｔｈ博士（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）が開発したＧｌｙｃｏＭａｐｓ  ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得た。高エネルギーから低エネルギーの色付けスキームはそれぞれ、暗色から明色である。
【図１２−１】図１２は、グリカン受容体特異性を理解するためのフレームワークを示す図である。α２−３および／またはα２−６連結したグリカンは異なるトポロジーを採用し得る。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドがこれらのある種のトポロジーに結合する能力により、ヒトなどの様々な宿主の感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡにおいて図示する通り、「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーの、特に関係のある２つのトポロジーが存在する。コーントポロジーはα２−３および／またはα２−６連結したグリカンが採用することができ、短いオリゴ糖またはコアに付着している分枝のオリゴ糖に典型的である（しかし、このトポロジーはある種の長いオリゴ糖が採用することもある）。アンブレラトポロジーは、α２−６連結したグリカンだけが採用することができ（おそらく、α２−６連結に存在する余分なＣ５−Ｃ６結合によって付与されるコンフォメーションの複数性の増大による）、特にＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−モチーフを含む、長いオリゴ糖または長いオリゴ糖の分枝を有する分枝のグリカンが優先的に採用する。本明細書に記載する通り、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力は、ヒト受容体に対する結合および／またはヒトの感染を媒介する能力を付与する。この図のパネルＢは、それぞれ−Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの三糖モチーフのグリコシドねじれ角によって支配される、α２−３およびα２−６のトポロジーを特に示す。パラメータ（θ）−これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子とその後のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度を定義し、トポロジーを特徴付けた。θ外形ならびにα２−３およびα２−６モチーフのコンフォメーションマップの重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用し、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方を抽出したことを示している（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によって抽出されたコーン様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖を、コーンをまたがる領域に沿って位置付ける。ＨＡの、コーン様トポロジーとの相互作用は、番号付けした位置のアミノ酸（Ｈ３ＨＡ番号付けに基づく）のＮｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖との接触を主に伴う。一方、α２−６に独特であるアンブレラ様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖はＨＡ結合部位に向かって折り曲がる（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される通り）。より長いα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）は、ＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の糖内ファンデルワールス接触によって安定化されるので、このコンフォメーションに都合がよい。ＨＡの、アンブレラ様トポロジーとの相互作用は、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖との接触の他に、番号付けした（Ｈ３ＨＡ番号付けに基づく）位置のアミノ酸の、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖との接触を伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのコンフォメーションの抽出を示す。セクション（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ連結のコンフォメーション（Φ、Ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ  ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得たこれらのマップは、ＭＭ３力場を用いてアブイニシオＭＤシミュレーションを用いて生成したものである。エネルギー分布を、暗色（高エネルギーを表す）から始まり、低エネルギーを表す明色まで色分けした。丸で囲んだ領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３およびα２−６オリゴ糖に対して観察された（Φ、Ψ）値を表す。Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランスコンフォメーション（丸で囲んだ領域１）は、ＨＡ結合ポケットにおいて顕著であり、このコンフォメーションがゴーシュである（丸で囲んだ領域２）α２−３を有するＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８Ｈ３Ｎ２のＨＡの共結晶構造は例外である。一方、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシスコンフォメーション（丸で囲んだ領域３）はＨＡ結合ポケットにおいて顕著である。丸で囲んだ領域１および２はコーン様トポロジーを抽出し、丸で囲んだ領域３はアンブレラ様トポロジーを抽出する。セクション（Ｅ）〜（Ｆ）はそれぞれα２−３モチーフおよびα２−６モチーフによるコーン様およびアンブレラ様トポロジーの抽出を示す。コンフォメーションマップにおける暗色領域を外側境界として用いて、所与の（Φ、Ψ）値のセットに対するθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子とその後のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度）を計算した。エネルギーのカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θ外形をコンフォメーションエネルギーマップと重ね合わせると、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを採用するのにエネルギー的に都合がよくなかったので、１００％コーン様トポロジーを採用することが示された。一方、α２−６モチーフはコーン様およびアンブレラ様両方のトポロジーを抽出し、この抽出を、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ連結のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。
【図１２−２】図１２は、グリカン受容体特異性を理解するためのフレームワークを示す図である。α２−３および／またはα２−６連結したグリカンは異なるトポロジーを採用し得る。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドがこれらのある種のトポロジーに結合する能力により、ヒトなどの様々な宿主の感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡにおいて図示する通り、「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーの、特に関係のある２つのトポロジーが存在する。コーントポロジーはα２−３および／またはα２−６連結したグリカンが採用することができ、短いオリゴ糖またはコアに付着している分枝のオリゴ糖に典型的である（しかし、このトポロジーはある種の長いオリゴ糖が採用することもある）。アンブレラトポロジーは、α２−６連結したグリカンだけが採用することができ（おそらく、α２−６連結に存在する余分なＣ５−Ｃ６結合によって付与されるコンフォメーションの複数性の増大による）、特にＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−モチーフを含む、長いオリゴ糖または長いオリゴ糖の分枝を有する分枝のグリカンが優先的に採用する。本明細書に記載する通り、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力は、ヒト受容体に対する結合および／またはヒトの感染を媒介する能力を付与する。この図のパネルＢは、それぞれ−Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの三糖モチーフのグリコシドねじれ角によって支配される、α２−３およびα２−６のトポロジーを特に示す。パラメータ（θ）−これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子とその後のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度を定義し、トポロジーを特徴付けた。θ外形ならびにα２−３およびα２−６モチーフのコンフォメーションマップの重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用し、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方を抽出したことを示している（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によって抽出されたコーン様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖を、コーンをまたがる領域に沿って位置付ける。ＨＡの、コーン様トポロジーとの相互作用は、番号付けした位置のアミノ酸（Ｈ３ＨＡ番号付けに基づく）のＮｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖との接触を主に伴う。一方、α２−６に独特であるアンブレラ様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖はＨＡ結合部位に向かって折り曲がる（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される通り）。より長いα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）は、ＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の糖内ファンデルワールス接触によって安定化されるので、このコンフォメーションに都合がよい。ＨＡの、アンブレラ様トポロジーとの相互作用は、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖との接触の他に、番号付けした（Ｈ３ＨＡ番号付けに基づく）位置のアミノ酸の、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖との接触を伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのコンフォメーションの抽出を示す。セクション（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ連結のコンフォメーション（Φ、Ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ  ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得たこれらのマップは、ＭＭ３力場を用いてアブイニシオＭＤシミュレーションを用いて生成したものである。エネルギー分布を、暗色（高エネルギーを表す）から始まり、低エネルギーを表す明色まで色分けした。丸で囲んだ領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３およびα２−６オリゴ糖に対して観察された（Φ、Ψ）値を表す。Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランスコンフォメーション（丸で囲んだ領域１）は、ＨＡ結合ポケットにおいて顕著であり、このコンフォメーションがゴーシュである（丸で囲んだ領域２）α２−３を有するＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８Ｈ３Ｎ２のＨＡの共結晶構造は例外である。一方、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシスコンフォメーション（丸で囲んだ領域３）はＨＡ結合ポケットにおいて顕著である。丸で囲んだ領域１および２はコーン様トポロジーを抽出し、丸で囲んだ領域３はアンブレラ様トポロジーを抽出する。セクション（Ｅ）〜（Ｆ）はそれぞれα２−３モチーフおよびα２−６モチーフによるコーン様およびアンブレラ様トポロジーの抽出を示す。コンフォメーションマップにおける暗色領域を外側境界として用いて、所与の（Φ、Ψ）値のセットに対するθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子とその後のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度）を計算した。エネルギーのカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θ外形をコンフォメーションエネルギーマップと重ね合わせると、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを採用するのにエネルギー的に都合がよくなかったので、１００％コーン様トポロジーを採用することが示された。一方、α２−６モチーフはコーン様およびアンブレラ様両方のトポロジーを抽出し、この抽出を、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ連結のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。
【図１２−３】図１２は、グリカン受容体特異性を理解するためのフレームワークを示す図である。α２−３および／またはα２−６連結したグリカンは異なるトポロジーを採用し得る。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドがこれらのある種のトポロジーに結合する能力により、ヒトなどの様々な宿主の感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡにおいて図示する通り、「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーの、特に関係のある２つのトポロジーが存在する。コーントポロジーはα２−３および／またはα２−６連結したグリカンが採用することができ、短いオリゴ糖またはコアに付着している分枝のオリゴ糖に典型的である（しかし、このトポロジーはある種の長いオリゴ糖が採用することもある）。アンブレラトポロジーは、α２−６連結したグリカンだけが採用することができ（おそらく、α２−６連結に存在する余分なＣ５−Ｃ６結合によって付与されるコンフォメーションの複数性の増大による）、特にＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−モチーフを含む、長いオリゴ糖または長いオリゴ糖の分枝を有する分枝のグリカンが優先的に採用する。本明細書に記載する通り、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力は、ヒト受容体に対する結合および／またはヒトの感染を媒介する能力を付与する。この図のパネルＢは、それぞれ−Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの三糖モチーフのグリコシドねじれ角によって支配される、α２−３およびα２−６のトポロジーを特に示す。パラメータ（θ）−これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子とその後のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度を定義し、トポロジーを特徴付けた。θ外形ならびにα２−３およびα２−６モチーフのコンフォメーションマップの重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用し、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方を抽出したことを示している（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によって抽出されたコーン様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖を、コーンをまたがる領域に沿って位置付ける。ＨＡの、コーン様トポロジーとの相互作用は、番号付けした位置のアミノ酸（Ｈ３ＨＡ番号付けに基づく）のＮｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖との接触を主に伴う。一方、α２−６に独特であるアンブレラ様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖はＨＡ結合部位に向かって折り曲がる（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される通り）。より長いα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）は、ＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の糖内ファンデルワールス接触によって安定化されるので、このコンフォメーションに都合がよい。ＨＡの、アンブレラ様トポロジーとの相互作用は、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖との接触の他に、番号付けした（Ｈ３ＨＡ番号付けに基づく）位置のアミノ酸の、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖との接触を伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのコンフォメーションの抽出を示す。セクション（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ連結のコンフォメーション（Φ、Ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ  ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得たこれらのマップは、ＭＭ３力場を用いてアブイニシオＭＤシミュレーションを用いて生成したものである。エネルギー分布を、暗色（高エネルギーを表す）から始まり、低エネルギーを表す明色まで色分けした。丸で囲んだ領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３およびα２−６オリゴ糖に対して観察された（Φ、Ψ）値を表す。Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランスコンフォメーション（丸で囲んだ領域１）は、ＨＡ結合ポケットにおいて顕著であり、このコンフォメーションがゴーシュである（丸で囲んだ領域２）α２−３を有するＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８Ｈ３Ｎ２のＨＡの共結晶構造は例外である。一方、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシスコンフォメーション（丸で囲んだ領域３）はＨＡ結合ポケットにおいて顕著である。丸で囲んだ領域１および２はコーン様トポロジーを抽出し、丸で囲んだ領域３はアンブレラ様トポロジーを抽出する。セクション（Ｅ）〜（Ｆ）はそれぞれα２−３モチーフおよびα２−６モチーフによるコーン様およびアンブレラ様トポロジーの抽出を示す。コンフォメーションマップにおける暗色領域を外側境界として用いて、所与の（Φ、Ψ）値のセットに対するθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子とその後のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度）を計算した。エネルギーのカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θ外形をコンフォメーションエネルギーマップと重ね合わせると、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを採用するのにエネルギー的に都合がよくなかったので、１００％コーン様トポロジーを採用することが示された。一方、α２−６モチーフはコーン様およびアンブレラ様両方のトポロジーを抽出し、この抽出を、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ連結のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。
【図１２−４】図１２は、グリカン受容体特異性を理解するためのフレームワークを示す図である。α２−３および／またはα２−６連結したグリカンは異なるトポロジーを採用し得る。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドがこれらのある種のトポロジーに結合する能力により、ヒトなどの様々な宿主の感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡにおいて図示する通り、「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーの、特に関係のある２つのトポロジーが存在する。コーントポロジーはα２−３および／またはα２−６連結したグリカンが採用することができ、短いオリゴ糖またはコアに付着している分枝のオリゴ糖に典型的である（しかし、このトポロジーはある種の長いオリゴ糖が採用することもある）。アンブレラトポロジーは、α２−６連結したグリカンだけが採用することができ（おそらく、α２−６連結に存在する余分なＣ５−Ｃ６結合によって付与されるコンフォメーションの複数性の増大による）、特にＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−モチーフを含む、長いオリゴ糖または長いオリゴ糖の分枝を有する分枝のグリカンが優先的に採用する。本明細書に記載する通り、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力は、ヒト受容体に対する結合および／またはヒトの感染を媒介する能力を付与する。この図のパネルＢは、それぞれ−Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの三糖モチーフのグリコシドねじれ角によって支配される、α２−３およびα２−６のトポロジーを特に示す。パラメータ（θ）−これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子とその後のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度を定義し、トポロジーを特徴付けた。θ外形ならびにα２−３およびα２−６モチーフのコンフォメーションマップの重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用し、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方を抽出したことを示している（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によって抽出されたコーン様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖を、コーンをまたがる領域に沿って位置付ける。ＨＡの、コーン様トポロジーとの相互作用は、番号付けした位置のアミノ酸（Ｈ３ＨＡ番号付けに基づく）のＮｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖との接触を主に伴う。一方、α２−６に独特であるアンブレラ様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖はＨＡ結合部位に向かって折り曲がる（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される通り）。より長いα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）は、ＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の糖内ファンデルワールス接触によって安定化されるので、このコンフォメーションに都合がよい。ＨＡの、アンブレラ様トポロジーとの相互作用は、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖との接触の他に、番号付けした（Ｈ３ＨＡ番号付けに基づく）位置のアミノ酸の、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖との接触を伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのコンフォメーションの抽出を示す。セクション（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ連結のコンフォメーション（Φ、Ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ  ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得たこれらのマップは、ＭＭ３力場を用いてアブイニシオＭＤシミュレーションを用いて生成したものである。エネルギー分布を、暗色（高エネルギーを表す）から始まり、低エネルギーを表す明色まで色分けした。丸で囲んだ領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３およびα２−６オリゴ糖に対して観察された（Φ、Ψ）値を表す。Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランスコンフォメーション（丸で囲んだ領域１）は、ＨＡ結合ポケットにおいて顕著であり、このコンフォメーションがゴーシュである（丸で囲んだ領域２）α２−３を有するＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８Ｈ３Ｎ２のＨＡの共結晶構造は例外である。一方、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシスコンフォメーション（丸で囲んだ領域３）はＨＡ結合ポケットにおいて顕著である。丸で囲んだ領域１および２はコーン様トポロジーを抽出し、丸で囲んだ領域３はアンブレラ様トポロジーを抽出する。セクション（Ｅ）〜（Ｆ）はそれぞれα２−３モチーフおよびα２−６モチーフによるコーン様およびアンブレラ様トポロジーの抽出を示す。コンフォメーションマップにおける暗色領域を外側境界として用いて、所与の（Φ、Ψ）値のセットに対するθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子とその後のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度）を計算した。エネルギーのカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θ外形をコンフォメーションエネルギーマップと重ね合わせると、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを採用するのにエネルギー的に都合がよくなかったので、１００％コーン様トポロジーを採用することが示された。一方、α２−６モチーフはコーン様およびアンブレラ様両方のトポロジーを抽出し、この抽出を、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ連結のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。
【図１２−５】図１２は、グリカン受容体特異性を理解するためのフレームワークを示す図である。α２−３および／またはα２−６連結したグリカンは異なるトポロジーを採用し得る。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドがこれらのある種のトポロジーに結合する能力により、ヒトなどの様々な宿主の感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡにおいて図示する通り、「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーの、特に関係のある２つのトポロジーが存在する。コーントポロジーはα２−３および／またはα２−６連結したグリカンが採用することができ、短いオリゴ糖またはコアに付着している分枝のオリゴ糖に典型的である（しかし、このトポロジーはある種の長いオリゴ糖が採用することもある）。アンブレラトポロジーは、α２−６連結したグリカンだけが採用することができ（おそらく、α２−６連結に存在する余分なＣ５−Ｃ６結合によって付与されるコンフォメーションの複数性の増大による）、特にＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−モチーフを含む、長いオリゴ糖または長いオリゴ糖の分枝を有する分枝のグリカンが優先的に採用する。本明細書に記載する通り、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力は、ヒト受容体に対する結合および／またはヒトの感染を媒介する能力を付与する。この図のパネルＢは、それぞれ−Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの三糖モチーフのグリコシドねじれ角によって支配される、α２−３およびα２−６のトポロジーを特に示す。パラメータ（θ）−これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子とその後のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度を定義し、トポロジーを特徴付けた。θ外形ならびにα２−３およびα２−６モチーフのコンフォメーションマップの重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用し、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方を抽出したことを示している（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によって抽出されたコーン様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖を、コーンをまたがる領域に沿って位置付ける。ＨＡの、コーン様トポロジーとの相互作用は、番号付けした位置のアミノ酸（Ｈ３ＨＡ番号付けに基づく）のＮｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖との接触を主に伴う。一方、α２−６に独特であるアンブレラ様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖はＨＡ結合部位に向かって折り曲がる（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される通り）。より長いα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）は、ＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の糖内ファンデルワールス接触によって安定化されるので、このコンフォメーションに都合がよい。ＨＡの、アンブレラ様トポロジーとの相互作用は、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖との接触の他に、番号付けした（Ｈ３ＨＡ番号付けに基づく）位置のアミノ酸の、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖との接触を伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのコンフォメーションの抽出を示す。セクション（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ連結のコンフォメーション（Φ、Ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ  ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得たこれらのマップは、ＭＭ３力場を用いてアブイニシオＭＤシミュレーションを用いて生成したものである。エネルギー分布を、暗色（高エネルギーを表す）から始まり、低エネルギーを表す明色まで色分けした。丸で囲んだ領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３およびα２−６オリゴ糖に対して観察された（Φ、Ψ）値を表す。Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランスコンフォメーション（丸で囲んだ領域１）は、ＨＡ結合ポケットにおいて顕著であり、このコンフォメーションがゴーシュである（丸で囲んだ領域２）α２−３を有するＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８Ｈ３Ｎ２のＨＡの共結晶構造は例外である。一方、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシスコンフォメーション（丸で囲んだ領域３）はＨＡ結合ポケットにおいて顕著である。丸で囲んだ領域１および２はコーン様トポロジーを抽出し、丸で囲んだ領域３はアンブレラ様トポロジーを抽出する。セクション（Ｅ）〜（Ｆ）はそれぞれα２−３モチーフおよびα２−６モチーフによるコーン様およびアンブレラ様トポロジーの抽出を示す。コンフォメーションマップにおける暗色領域を外側境界として用いて、所与の（Φ、Ψ）値のセットに対するθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子とその後のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度）を計算した。エネルギーのカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θ外形をコンフォメーションエネルギーマップと重ね合わせると、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを採用するのにエネルギー的に都合がよくなかったので、１００％コーン様トポロジーを採用することが示された。一方、α２−６モチーフはコーン様およびアンブレラ様両方のトポロジーを抽出し、この抽出を、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ連結のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。
【図１２−６】図１２は、グリカン受容体特異性を理解するためのフレームワークを示す図である。α２−３および／またはα２−６連結したグリカンは異なるトポロジーを採用し得る。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドがこれらのある種のトポロジーに結合する能力により、ヒトなどの様々な宿主の感染を媒介する能力が付与される。この図のパネルＡにおいて図示する通り、「コーン」トポロジーおよび「アンブレラ」トポロジーの、特に関係のある２つのトポロジーが存在する。コーントポロジーはα２−３および／またはα２−６連結したグリカンが採用することができ、短いオリゴ糖またはコアに付着している分枝のオリゴ糖に典型的である（しかし、このトポロジーはある種の長いオリゴ糖が採用することもある）。アンブレラトポロジーは、α２−６連結したグリカンだけが採用することができ（おそらく、α２−６連結に存在する余分なＣ５−Ｃ６結合によって付与されるコンフォメーションの複数性の増大による）、特にＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−モチーフを含む、長いオリゴ糖または長いオリゴ糖の分枝を有する分枝のグリカンが優先的に採用する。本明細書に記載する通り、ＨＡポリペプチドがアンブレラグリカントポロジーに結合する能力は、ヒト受容体に対する結合および／またはヒトの感染を媒介する能力を付与する。この図のパネルＢは、それぞれ−Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの三糖モチーフのグリコシドねじれ角によって支配される、α２−３およびα２−６のトポロジーを特に示す。パラメータ（θ）−これらの三糖モチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子とその後のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度を定義し、トポロジーを特徴付けた。θ外形ならびにα２−３およびα２−６モチーフのコンフォメーションマップの重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用し、α２−６モチーフはコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーの両方を抽出したことを示している（パネルＣ）。α２−３およびα２−６によって抽出されたコーン様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖を、コーンをまたがる領域に沿って位置付ける。ＨＡの、コーン様トポロジーとの相互作用は、番号付けした位置のアミノ酸（Ｈ３ＨＡ番号付けに基づく）のＮｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖との接触を主に伴う。一方、α２−６に独特であるアンブレラ様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖はＨＡ結合部位に向かって折り曲がる（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察される通り）。より長いα２−６オリゴ糖（例えば、少なくとも四糖）は、ＧｌｃＮＡｃのアセチル基とＮｅｕ５Ａｃのアセチル基との間の糖内ファンデルワールス接触によって安定化されるので、このコンフォメーションに都合がよい。ＨＡの、アンブレラ様トポロジーとの相互作用は、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖との接触の他に、番号付けした（Ｈ３ＨＡ番号付けに基づく）位置のアミノ酸の、ＧｌｃＮＡｃおよびその後の糖との接触を伴う。この図のパネルＣは、α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのコンフォメーションの抽出を示す。セクション（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ連結のコンフォメーション（Φ、Ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ  ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得たこれらのマップは、ＭＭ３力場を用いてアブイニシオＭＤシミュレーションを用いて生成したものである。エネルギー分布を、暗色（高エネルギーを表す）から始まり、低エネルギーを表す明色まで色分けした。丸で囲んだ領域１〜５は、ＨＡ−グリカン共結晶構造におけるα２−３およびα２−６オリゴ糖に対して観察された（Φ、Ψ）値を表す。Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランスコンフォメーション（丸で囲んだ領域１）は、ＨＡ結合ポケットにおいて顕著であり、このコンフォメーションがゴーシュである（丸で囲んだ領域２）α２−３を有するＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８Ｈ３Ｎ２のＨＡの共結晶構造は例外である。一方、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシスコンフォメーション（丸で囲んだ領域３）はＨＡ結合ポケットにおいて顕著である。丸で囲んだ領域１および２はコーン様トポロジーを抽出し、丸で囲んだ領域３はアンブレラ様トポロジーを抽出する。セクション（Ｅ）〜（Ｆ）はそれぞれα２−３モチーフおよびα２−６モチーフによるコーン様およびアンブレラ様トポロジーの抽出を示す。コンフォメーションマップにおける暗色領域を外側境界として用いて、所与の（Φ、Ψ）値のセットに対するθパラメータ（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子とその後のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度）を計算した。エネルギーのカットオフに基づき、θ＞１１０°の値を用いてコーン様トポロジーを特徴付け、θ＜１００°を用いてアンブレラ様トポロジーを特徴付けた。θ外形をコンフォメーションエネルギーマップと重ね合わせると、α２−３モチーフは、アンブレラ様トポロジーを採用するのにエネルギー的に都合がよくなかったので、１００％コーン様トポロジーを採用することが示された。一方、α２−６モチーフはコーン様およびアンブレラ様両方のトポロジーを抽出し、この抽出を、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ連結のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類した。
【図１３】図１３は、ＨＡ残基の、コーングリカン対アンブレラグリカンのトポロジーとの相互作用を示す図である。ＨＡ−グリカンの共結晶を分析すると、ＨＡ結合部位に対するＮｅｕ５Ａｃの位置がほとんど不変であることが明らかになる。Ｎｅｕ５Ａｃとの接触は、Ｆ９８、Ｓ／Ｔ１３６、Ｗ１５３、Ｈ１８３、およびＬ／Ｉ１９４などの高度に保存された残基を伴う。他の糖との接触は、糖の連結がα２−３であるか、またはα２−６であるか、およびグリカンのトポロジーがコーンであるか、またはアンブレラであるかに応じて異なる残基を伴う。例えば、コーントポロジーにおいて、主な接触は、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖とである。Ｅ１９０およびＱ２２６は、この結合において特に重要な役割を果たす。この図は、コーン構造に対する結合に関与することができる他の位置（例えば、１３７位、１４５位、１８６位、１８７位、１９３位、２２２位）も示す。いくつかの場合において、異なる残基は、異なるグリカン構造と異なる接触をすることがある。これらの位置におけるアミノ酸のタイプは、グリカン構造における異なる修飾および／または分枝パターンを有する受容体に結合するＨＡポリペプチドの能力に影響を及ぼし得る。アンブレラトポロジーにおいて、接触はＮｅｕ５ＡｃおよびＧａｌを超えた糖となされる。この図は、アンブレラ構造との結合に関与し得る残基（例えば、１３７位、１４５位、１５６位、１５９位、１８６位、１８７位、１８９位、１９０位、１９２位、１９３位、１９６位、２２２位、２２５位、２２６位）を示す。いくつかの場合では、異なる残基は、異なるグリカン構造と異なる接触をすることがある。これらの位置におけるアミノ酸のタイプは、グリカン構造における異なる修飾および／または分枝パターンを有する受容体に結合するＨＡポリペプチドの能力に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、１９０位のＤ残基および／または２２５位のＤ残基はアンブレラトポロジーに対する結合に寄与する。
【図１４Ａ】図１４は、ヒト気管支上皮細胞およびヒト結腸上皮細胞のグリカンプロファイルを示す図である。上気道組織におけるグリカン多様性をさらに調べるために、Ｎ連結グリカンをＨＢＥ（代表的な上気道細胞系）から単離し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて分析した。ＨＢＥにおけるａ２−６の優先的な発現を、試料をシアリダーゼＳ（ａ２−３特異的）およびシアリダーゼＡ（切断およびＳＡ）で前処理することによって確認した。長い分枝のトポロジーを有するグリカンの優先的な発現は、代表的な質量ピークのＴＯＦ−ＴＯＦフラグメンテーション分析によって支持される。上気道組織におけるグリカン多様性についての基準を提供するために、ヒト結腸上皮細胞（ＨＴ２９：代表的な腸細胞系）のＮ連結グリカンプロファイルを得た。この細胞系を選択したのは、現在のＨ５Ｎ１ウイルスが腸細胞に感染することが示されているからである。シアリダーゼＡおよびＳで前処理した対照は、ＨＴ−２９細胞におけるａ２−３グリカンの優先的な発現を示した。さらに、長い分枝グリカンのトポロジーは、ＨＢＥに観察されるほどは、見られなかった。したがって、Ｈ５Ｎ１のＨＡのヒトの適応は、ヒト上気道組織において発現される多様なグリカン（例えば、アンブレラグリカン）に対する高親和性の結合を可能にするＨＡ変異を伴う。
【図１４Ｂ】図１４は、ヒト気管支上皮細胞およびヒト結腸上皮細胞のグリカンプロファイルを示す図である。上気道組織におけるグリカン多様性をさらに調べるために、Ｎ連結グリカンをＨＢＥ（代表的な上気道細胞系）から単離し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて分析した。ＨＢＥにおけるａ２−６の優先的な発現を、試料をシアリダーゼＳ（ａ２−３特異的）およびシアリダーゼＡ（切断およびＳＡ）で前処理することによって確認した。長い分枝のトポロジーを有するグリカンの優先的な発現は、代表的な質量ピークのＴＯＦ−ＴＯＦフラグメンテーション分析によって支持される。上気道組織におけるグリカン多様性についての基準を提供するために、ヒト結腸上皮細胞（ＨＴ２９：代表的な腸細胞系）のＮ連結グリカンプロファイルを得た。この細胞系を選択したのは、現在のＨ５Ｎ１ウイルスが腸細胞に感染することが示されているからである。シアリダーゼＡおよびＳで前処理した対照は、ＨＴ−２９細胞におけるａ２−３グリカンの優先的な発現を示した。さらに、長い分枝グリカンのトポロジーは、ＨＢＥに観察されるほどは、見られなかった。したがって、Ｈ５Ｎ１のＨＡのヒトの適応は、ヒト上気道組織において発現される多様なグリカン（例えば、アンブレラグリカン）に対する高親和性の結合を可能にするＨＡ変異を伴う。
【図１５】図１５は、データマイニングプラットフォームを示す図である。（Ａ）において示すのは、データマイニングプラットフォームの主な成分である。特徴は、データベースから抽出するデータオブジェクトに由来する。上記特徴をパターンまたはルールを引き出すための分類方法によって用いられるデータセットについて準備する。（Ｂ）はユーザーがデータマイニングプロセスをグリカンアレイデータに適用できるようにする重要なソフトウエアモジュールを示す。
【図１６】図１６は、データマイニング分析において用いる特徴を示す図である。この図は、グリカンマイクロアレイ上のグリカンから抽出される、様々なタイプのペア、トリプレット、およびクアドルプレットを示す、代表的なモチーフとして本明細書で規定される特徴を示す。これらの特徴を選択した背後にある根拠は、二糖〜四糖の、ＨＡのグリカン結合部位に対する結合に基づく。最終のデータセットは、グリカンからの特徴、およびアレイ上でスクリーニングされる各ＨＡに対する結合シグナルを含む。分類のための様々な方法の中で、規則帰納分析を利用した。この方法の主な利点の１つは、これは他の統計学的方法または数学的方法と比べた場合、より容易に解釈することができるＩＦ−ＴＨＥＮルールを生成することである。分類の２つの主な目的は、（１）結合を増強する、一連の高親和性のグリカンリガンド上に存在する特徴を同定すること、および（２）結合に好ましくない低親和性グリカンリガンドにおける特徴を同定することであった。
【図１７】図１７は、例示的なＨ２ＨＡの結晶構造を示す図である。（ａ）α２，３およびα２，６連結グリカンの化学構造（末端のシアル酸およびガラクトースを伴う）をこの図に示す。（ｂ）１９５７年のＨ２三量体の全体像。５個の潜在的なグリコシル化部位が各モノマー上に見出される（標識した通り）。密度マップにおけるグリカンを示す。（ｃ）Ｈ２の受容体結合部位。Ｈ３構造によって示される、受容体結合に関与する残基を棒で示す。結合部位のベースを含む芳香族残基は、様々なＨＡサブタイプにおいて絶対的に保存されている。２２０ループからの残基および１９０位は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３における受容体特異性の切換えにとって不可欠である（Ｘｕ  Ｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８４巻（４号）、１７１５〜１７２１頁、２０１０年）。
【図１８−１】図１８は、トリＨ２ＨＡおよびヒトＨ２ＨＡの、トリおよびヒト受容体類似体との相互作用を示す図である。トリＨ２ＨＡ（上パネル）およびヒトＨ２ＨＡ（下パネル）の、トリおよびヒト受容体類似体との相互作用。棒表現において、いくつかの選択された側鎖と一緒に、結合部位の３つの２次構造エレメント、１３０−ループおよび２２０−ループならびに１９０−ヘリックスをこの骨格表示において標識する。破線は潜在的な水素結合相互作用を示す。４つ全てのパネルにおいて、シアロ糖における炭素、窒素、および酸素原子を示し、水分子を標識している。トリ受容体であるＬＳＴａ（Ａ）、およびヒト受容体であるＬＳＴｃ（Ｂ）との複合体におけるＡ／ｄｋ／Ｏｎｔａｒｉｏ／７７Ｈ２ＨＡ。ヒト受容体（Ｃ）およびトリ受容体（Ｄ）との複合体におけるＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７Ｈ２ＨＡ。Ａ、Ｂ、およびＣにおける黒矢印は、２つのヒト受容体複合体について、Ｓｉａ−１／Ｇａｌ−２連結はシスコンフォメーションを採用するが、トリ複合体について、トランスコンフォメーションを採用することを示す（参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉｕ  Ｊら、２００９年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１０６巻（４０号）、１７１７５〜１７１８０頁）。
【図１８−２】図１８は、トリＨ２ＨＡおよびヒトＨ２ＨＡの、トリおよびヒト受容体類似体との相互作用を示す図である。トリＨ２ＨＡ（上パネル）およびヒトＨ２ＨＡ（下パネル）の、トリおよびヒト受容体類似体との相互作用。棒表現において、いくつかの選択された側鎖と一緒に、結合部位の３つの２次構造エレメント、１３０−ループおよび２２０−ループならびに１９０−ヘリックスをこの骨格表示において標識する。破線は潜在的な水素結合相互作用を示す。４つ全てのパネルにおいて、シアロ糖における炭素、窒素、および酸素原子を示し、水分子を標識している。トリ受容体であるＬＳＴａ（Ａ）、およびヒト受容体であるＬＳＴｃ（Ｂ）との複合体におけるＡ／ｄｋ／Ｏｎｔａｒｉｏ／７７Ｈ２ＨＡ。ヒト受容体（Ｃ）およびトリ受容体（Ｄ）との複合体におけるＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７Ｈ２ＨＡ。Ａ、Ｂ、およびＣにおける黒矢印は、２つのヒト受容体複合体について、Ｓｉａ−１／Ｇａｌ−２連結はシスコンフォメーションを採用するが、トリ複合体について、トランスコンフォメーションを採用することを示す（参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉｕ  Ｊら、２００９年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１０６巻（４０号）、１７１７５〜１７１８０頁）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＨＡ配列エレメントの記載
ＨＡ配列エレメント１
ＨＡ配列エレメント１は、天然のインフルエンザ単離物において見出される多数のＨＡタンパク質の残基９７〜１８５（残基位置はＨ３  ＨＡを基準として用いて割り当てられている）付近に対応する配列エレメントである。この配列エレメントは基本構造：
Ｃ（Ｙ／Ｆ）ＰＸ１ＣＸ２ＷＸ３ＷＸ４ＨＨＰを有し、式中：
Ｘ１はおよそ３０〜４５アミノ酸長であり、
Ｘ２はおよそ５〜２０アミノ酸長であり、
Ｘ３はおよそ２５〜３０アミノ酸長であり、
Ｘ４はおよそ２アミノ酸長である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、Ｘ１は約３５〜４５または約３５〜４３または約３５、３６、３７、３８、３８、４０、４１、４２もしくは４３アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、Ｘ２は約９〜１５または約９〜１４または約９、１０、１１、１２、１３もしくは１４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、Ｘ３は約２６〜２８または約２６、２７もしくは２８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、Ｘ４は配列（Ｇ／Ａ）（Ｉ／Ｖ）を有する。いくつかの実施形態では、Ｘ４は配列ＧＩを有し；いくつかの実施形態では、Ｘ４は配列ＧＶを有し；いくつかの実施形態では、Ｘ４は配列ＡＩを有し；いくつかの実施形態では、Ｘ４は配列ＡＶを有する。いくつかの実施形態では、ＨＡ配列エレメント１は、ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、このジスルフィド結合は９７位と１３９位（本明細書において利用される標準的なＨ３番号付けシステムに基づく）とに対応する残基を架橋する。
【００１５】
ＨＡ配列エレメント２
ＨＡ配列エレメント２は、天然のインフルエンザ単離物において見出される多数のＨＡタンパク質の残基３２４〜３４０（Ｈ３  ＨＡに基づく番号付けシステムを再度用いる）付近に対応する配列エレメントである。この配列エレメントは基本構造：
ＧＡＩＡＧＦＩＥを有する。
いくつかの実施形態では、ＨＡ配列エレメント２は配列：
ＰＸ１ＧＡＩＡＧＦＩＥを有し、式中：
Ｘ１はおよそ４〜１４アミノ酸長または約８〜１２アミノ酸長、または約１２、１１、１０、９もしくは８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、この配列エレメントはＨＡ０切断部位を提供し、ＨＡ１およびＨＡ２の産生を可能にする。
【００１６】
定義
親和性：当技術分野において公知である通り、「親和性」は、特定のリガンド（例えばＨＡポリペプチド）の、そのパートナー（例えばＨＡ受容体）への結合の緊密さの尺度である。親和性は様々な方法で測定され得る。いくつかの実施形態では、親和性は、定量的アッセイ（例えばグリカン結合アッセイ）によって測定される。そのようないくつかの実施形態では、結合パートナー濃度（例えばＨＡ受容体、グリカンなど）は、生理学的条件（例えば細胞表面グリカンに結合するウイルス性ＨＡ）を模倣するために、リガンド（例えばＨＡポリペプチド）濃度過剰に設定され得る。代替的にまたは付加的にいくつかの実施形態では、結合パートナー（例えばＨＡ受容体、グリカンなど）濃度および／またはリガンド（ＨＡポリペプチド）濃度は変更され得る。いくつかのそのような実施形態では、親和性（例えば結合親和性）は、比較できる条件（例えば濃度）下で基準（例えばヒトの感染を媒介する野生型ＨＡ）と比較され得る。
【００１７】
結合：本明細書において用いられる用語「結合」は、薬剤間または薬剤における非共有結合を典型的には意味する。本明細書の多数の実施形態では、結合は、特定のグリカン（例えばアンブレラトポロジーグリカンまたはコーントポロジーグリカン）に関連して述べられる。そのような結合が任意の種々の状況において評価され得ることは当業者に理解される。いくつかの実施形態では、結合は遊離グリカンに関して評価される。いくつかの実施形態では、結合は、キャリアに付着した（例えば共有結合的に連結した）グリカンに関して評価される。いくつかのそのような実施形態では、キャリアはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、結合はＨＡ受容体に付着したグリカンに関して評価される。そのような実施形態では、基準は、受容体結合またはグリカン結合に対して作製され得る。
【００１８】
結合剤：一般に用語「結合剤」は、本明細書に記載のグリカン（例えばアンブレラトポロジーグリカン）に結合する任意の実体を意味して本明細書において用いられる。結合剤は、任意の化学型であってよい。いくつかの実施形態では、結合剤はポリペプチド（例えば抗体または抗体断片を含む）であり、いくつかのそのような実施形態では、結合剤はＨＡポリペプチドであり、他の実施形態では、結合剤はアミノ酸配列がＨＡの特徴的配列を含まないポリペプチド（すなわち「非ＨＡポリペプチド」）である。いくつかの実施形態では、結合剤は、小分子である。いくつかの実施形態では、結合剤は核酸である。いくつかの実施形態では、結合剤はアプタマーである。いくつかの実施形態では、結合剤はポリマーであり、いくつかの実施形態では、結合剤は非ポリマーである。いくつかの実施形態では、結合剤は炭水化物である。いくつかの実施形態では、結合剤はレクチンである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、アンブレラ様トポロジーを有するシアリル化グリカンに結合する。いくつかの実施形態では、結合剤は高い親和性および／または特異性でアンブレラトポロジーグリカンに結合する。いくつかの実施形態では、結合剤は、コーントポロジーグリカンと比較して、アンブレラトポロジーグリカンに対して結合優先性を示す。いくつかの実施形態では、結合剤は、血球凝集素受容体上のグリカンへの結合について血球凝集素と競合する。いくつかの実施形態では、結合剤は、アンブレラトポロジーグリカンへの結合について血球凝集素と競合する。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される結合剤は、アンブレラトポロジー遮断剤である。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される結合剤は、アンブレラトポロジー特異的遮断剤である。いくつかの実施形態では、結合剤はアンブレラトポロジーグリカン模倣物に結合する。
【００１９】
生物学的に活性：本明細書において用いられる語句「生物学的に活性」は、生物系、具体的には生物において活性を有する任意の薬剤の特徴を意味する。例えば（生物に投与される場合に）生物に生物学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性であると考えられる。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有する、そのタンパク質またはポリペプチドの部分は、典型的には「生物学的に活性」な部分と称される。
【００２０】
特徴的部分：本明細書において用いられる語句、タンパク質またはポリペプチドの「特徴的部分」は、アミノ酸の連続するストレッチまたはアミノ酸の連続するストレッチの集合物（一緒になってタンパク質またはポリペプチドの特徴を示す）を含有するものである。そのようなそれぞれの連続するストレッチは、少なくとも２個のアミノ酸を一般に含有する。さらに当業者は、典型的には少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個またはそれ以上のアミノ酸がタンパク質の特徴を示すために必要であることを理解する。一般に特徴的部分は、上に明記した配列同一性に加えて、少なくとも１つの機能的特徴を、関連するインタクトなタンパク質と共有する部分である。
【００２１】
特徴的配列：「特徴的配列」は、ポリペプチドまたは核酸のファミリーの全てのメンバーにおいて見出され、かつ／または免疫原性エピトープを含む配列であり、したがってファミリーのメンバーを定義するために当業者によって用いられ得る。
【００２２】
コーントポロジー：語句「コーントポロジー」は、あるグリカンによって、詳細にはＨＡ受容体上のグリカンによって採用される三次元配置を意味して本明細書において用いられる。図３に例示される通り、コーントポロジーは、α２−３シアリル化グリカンによって、またはα２−６シアリル化グリカンによって採用される場合があり、いくつかの長いオリゴヌクレオチドもこのコンフォメーションを採用する場合があるが、これは、短いオリゴヌクレオチド鎖の典型である。コーントポロジーはＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合のグリコシドのねじれ角によって特徴付けられ、これは、約−６０、約６０もしくは約１８０のΦ（Ｃ１−Ｃ２−Ｏ−Ｃ３／Ｃ６）値、および−６０から６０を抽出（ｓａｍｐｌｅ）しているΨ（Ｃ２−Ｏ−Ｃ３／Ｃ６−Ｈ３／Ｃ５）によって与えられる最小エネルギーコンフォメーションの３つの領域を抽出している（図１１）。図３は、コーントポロジーをとるグリカンのある代表的な（しかし網羅的ではない）例を示す。
【００２３】
「に対応する」：本明細書において用いられる用語「に対応する」は、ＨＡポリペプチドにおけるアミノ酸残基の位置／同一性を指定するためにしばしば用いられる。当業者は、簡潔さのために標準的な番号付けシステム（野生型Ｈ３  ＨＡに基づく）が本明細書において利用される（例えば図１〜２において例示される通り）ことを理解し、例えば１９０位の残基に「対応する」アミノ酸は、特定のアミノ酸鎖において実際に１９０番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ野生型Ｈ３  ＨＡにおいて１９０位に見出される残基に対応し；当業者は対応するアミノ酸をどのように同定するかを容易に理解する。
【００２４】
分離距離の程度：本明細書で用いられる、ある「分離距離の程度」であるアミノ酸は、グリカン結合に間接的な効果を有するＨＡアミノ酸である。例えば、分離距離の程度１（ｏｎｅ−ｄｅｇｒｅｅ−ｏｆ−ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ−ｒｅｍｏｖｅｄ）のアミノ酸は、（１）直接結合アミノ酸と相互作用する；および／または（２）そうでなければ、直接結合アミノ酸の宿主細胞ＨＡ受容体と関連しているグリカンと相互作用する能力に影響を与える、のいずれかであり得る；このような分離距離の程度１のアミノ酸は、それ自体がグリカンに直接的に結合してよく、またはしなくてもよい。分離距離の程度２のアミノ酸は、（１）分離距離の程度１のアミノ酸と相互作用する；および／または（２）そうでなければ、分離距離の程度１のアミノ酸の直接結合アミノ酸と相互作用する能力に影響を与える、のいずれかである、などである。
【００２５】
直接結合アミノ酸：本明細書で用いられる語句「直接結合アミノ酸」は、宿主細胞ＨＡ受容体と関連している１つまたは複数のグリカンと直接的に相互作用するＨＡポリペプチドアミノ酸を意味する。
【００２６】
操作された：本明細書において用いられる用語「操作された」は、アミノ酸配列が人によって選択されているポリペプチドを説明する。例えば、操作されたＨＡポリペプチドは、天然のインフルエンザ単離物において見出されるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、操作されたＨＡポリペプチドは、ＮＣＢＩデータベースに含まれるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。
【００２７】
Ｈ２ポリペプチド：本明細書において用いられる用語「Ｈ２ポリペプチド」は、アミノ酸配列が、Ｈ２の特徴を示し、Ｈ２を他のＨＡ亜型から識別する少なくとも１つの配列エレメントを含むＨＡポリペプチドである。代表的なそのような配列エレメントは、例えば図１に例示されるものなどのアラインメントによって決定されることができ、例えばＨＡ配列エレメントのＨ２特異的実施形態に関連して本明細書に記載されるものを含む。
【００２８】
血球凝集素（ＨＡ）ポリペプチド：本明細書において用いられる用語「血球凝集素ポリペプチド」（または「ＨＡポリペプチド」）は、アミノ酸配列がＨＡの少なくとも１つの特徴的配列を含むポリペプチドを意味する。インフルエンザ単離物由来の多種多様なＨＡ配列が当技術分野において公知であり、実際にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）は、データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ｆｌｕ．ｈｔｍｌ）を維持しており、本出願の出願時点で９７９６個のＨＡ配列を含んでいた。当業者はこのデータベースを参照することによって、一般的にＨＡポリペプチドに、および／または特定のＨＡポリペプチドに（例えばＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６ポリペプチド）特徴的である配列；または特定の宿主、例えばトリ、ラクダ、イヌ、ネコ、シベット、環境、ウマ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アザラシ、ムナジロテン（ｓｔｏｎｅ  ｍａｒｔｉｎ）、ブタ、トラ、クジラなどの感染を媒介するＨＡに特徴的である配列を容易に同定できる。例えばいくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドは、天然のインフルエンザウイルス単離物において見出されたＨＡタンパク質の残基９７付近から１８５付近、３２４付近から３４０付近、９６付近から１００付近および／または１３０付近から２３０付近に見出された１つまたは複数の特徴的配列エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドは、本明細書において定義のＨＡ配列エレメント１および２の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドは、ＨＡ配列エレメント１および２を含むアミノ酸配列を有し、いくつかの実施形態では、互いに約１００から約２００、もしくは約１２５から約１７５、もしくは約１２５から約１６０、もしくは約１２５から約１５０、もしくは約１２９から約１３９、または約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８または約１３９アミノ酸離れている。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドは、グリカン結合に関与する残基を領域９６〜１００および／または１３０〜２３０内の位置に含むアミノ酸配列を有する。例えば多数のＨＡポリペプチドは、１つまたは複数の次の残基：Ｔｙｒ９８、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｈｉｓ１８３およびＬｅｕ／Ｉｌｅ１９４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドはこれらの残基の少なくとも２個、３個、４個または５個全てを含む。
【００２９】
高親和性結合：本明細書において用いられる用語「高親和性結合」は、特定のリガンド（例えばＨＡポリペプチド）のそのパートナー（例えばＨＡ受容体）への結合の高い程度の緊密さを意味する。親和性は当技術分野において公知のものを含む任意の利用可能な方法によって測定され得る。いくつかの実施形態では、結合は、結合アッセイにおいてＫｄ’が約５００ｐＭ以下（例えば約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約４ｐＭ、約３ｐＭ、約２ｐＭ未満など）である場合に高親和性であると考えられる。いくつかの実施形態では、結合は、親和性が選択された基準ポリペプチドに対してよりも目的のポリペプチドに対して強い（例えばＫｄ’がより低い）場合に高親和性であると考えられる。いくつかの実施形態では、結合は、目的のポリペプチドについてのＫｄ’対選択された基準ポリペプチドについてのＫｄ’の比が１：１以下（例えば０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、０．１：１、０．０５：１、０．０１：１以下）である場合に高親和性であると考えられる。いくつかの実施形態では、結合は、目的のポリペプチドに対するＫｄ’が選択された基準ポリペプチドに対するＫｄ’の約１００％以下（例えば約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％以下）である場合に高親和性であると考えられる。
【００３０】
単離された：本明細書において用いられる用語「単離された」は、（ｉ）最初に産生された際に（天然においてであるかまたは実験的設定においてであるかにかかわらず）それが関連していた成分の少なくとも一部から分離されている；または（ｉｉ）ヒトの手によって産生された、のいずれかである薬剤または実体を意味する。単離された薬剤または実体は、最初にそれらが関連していた他の成分の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％またはそれ以上から分離されている場合がある。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超純粋である。
【００３１】
連結特異的遮断剤（ＬＳＢＡ）：本明細書において用いられる用語「連結特異的遮断剤」は、α２−６シアリル化グリカンを有するＨＡ受容体に結合する薬剤を意味する。いくつかの実施形態では、ＬＳＢＡは、α２−３シアリル化グリカンを有するＨＡ受容体に対する親和性の少なくとも約４０、５０または７５％の親和性でα２−６シアリル化グリカンを有するＨＡ受容体に、選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ＬＳＢＡは、α２−３シアリル化グリカンを有するＨＡ受容体に対する親和性よりも少なくとも約２、４、５または１０倍大きな親和性でα２−６シアリル化グリカンを有するＨＡ受容体に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ＬＳＢＡは、α２−３シアリル化グリカンに対する親和性の少なくとも５０、１００、１５０または２００％のα２−６シアリル化グリカンに対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＬＳＢＡは、ＨＡ受容体への結合について血球凝集素と競合する場合がある。例えばＬＳＢＡは、インフルエンザウイルス粒子（例えばヒトまたはトリインフルエンザウイルス）のＨＡ受容体への結合を、連結特徴（例えばα２−６シアリル化グリカンまたはα２−３シアリル化グリカン）に基づいて選択的に阻害できる。いくつかの実施形態では、ＬＳＢＡはポリペプチドである。いくつかのそのような実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一または実質的に相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドは、ＨＡポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドは、天然に存在するＨＡポリペプチドまたはこれらの断片である。いくつかの実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドは、ＨＡポリペプチドのアミノ酸配列に関連しないアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドは、抗体またはこれらの断片である。いくつかの実施形態では、ＬＳＢＡポリペプチドは、レクチン（例えばＳＮＡ−１）である。いくつかの実施形態では、ＬＳＢＡは、ポリペプチドではない。いくつかの実施形態では、ＬＳＢＡは小分子である。いくつかの実施形態では、ＬＳＢＡは核酸である。
【００３２】
長いオリゴ糖：本開示の目的のために、オリゴ糖は、少なくとも４つの糖残基を有する少なくとも１つの直鎖を含む場合に「長い」と典型的には考えられる。
【００３３】
低親和性結合：本明細書において用いられる用語「低親和性結合」は、特定のリガンド（例えばＨＡポリペプチド）のそのパートナー（例えばＨＡ受容体）への結合の低い程度の緊密さを意味する。本明細書に記載の通り、親和性は当技術分野において公知の方法を含む任意の利用可能な方法によって測定され得る。いくつかの実施形態では、結合は、Ｋｄ’が約１００ｐＭ以上（例えば約２００ｐＭ、３００ｐＭ、４００ｐＭ、５００ｐＭ、６００ｐＭ、７００ｐＭ、８００ｐＭ、９００ｐＭ、１ｎＭ、１．１ｎＭ、１．２ｎＭ、１．３ｎＭ、１．４ｎＭ、１．５ｎＭを超えるなど）である場合に低親和性であると考えられる。いくつかの実施形態では、結合は、親和性が選択された基準ポリペプチドと目的のポリペプチドとで同じか、または選択された基準ポリペプチドよりも目的のポリペプチドが低い（例えばＫｄ’がほとんど同じかまたは高い）場合に低親和性であると考えられる。いくつかの実施形態では、結合は、目的のポリペプチドに対するＫｄ’対選択された基準ポリペプチドに対するＫｄ’の比が１：１以上（例えば１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１以上）である場合に低親和性であると考えられる。いくつかの実施形態では、結合は、目的のポリペプチドに対するＫｄ’が選択された基準ポリペプチドに対するＫｄ’の１００％以上（例えば１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００以上）である場合に低親和性であると考えられる。
【００３４】
非天然アミノ酸：語句「非天然アミノ酸」は、アミノ酸、すなわち：
【００３５】
【化１】
2013541528.tif 000003
の化学構造を有し、したがって少なくとも２つのペプチド結合に関与できるが、天然において見出されるものとは異なるＲ基を有する実体を意味する。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は水素ではなく第２のＲ基を有することもでき、および／または１つまたは複数の他の置換基をアミノ部分またはカルボン酸部分に有し得る。
【００３６】
ポリペプチド：「ポリペプチド」は、一般的に言えば、ペプチド結合によってお互いに結びついた少なくとも２つのアミノ酸のストリングである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも３〜５個のアミノ酸を含んでよく、そのそれぞれは少なくとも１つのペプチド結合によって他と結びついている。当業者はポリペプチドが、「非天然」アミノ酸または他の実体（それにもかかわらず、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る）を任意選択で含む場合があることを理解する。
【００３７】
顕著に存在（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ  ｐｒｅｓｅｎｔ）：本明細書において用いられる用語「顕著に存在」は、集団全体における特定の位置での実体（例えばアミノ酸残基）の存在を意味する。例えばアミノ酸は、ポリペプチドの集団全体において特定のアミノがポリペプチド集団の少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％においてまたはそれを超えて統計的に存在する場合に、顕著に存在となり得る。
【００３８】
予防：本明細書において用いられる用語「予防」は、特定の疾患、障害または状態（例えばインフルエンザウイルスでの例えば感染）の１つまたは複数の症状の発症の遅延、ならびに／または頻度および／もしくは重症度における低減を意味する。いくつかの実施形態では、予防は、集団に基づいて評価され、ここで、疾患、障害または状態に罹りやすい集団において、疾患、障害または状態の１つまたは複数の症状の発症、頻度および／または強度における統計的に有意な減少が観察される場合に、特定の疾患、障害または状態を薬剤が「予防している」と考えられる。
【００３９】
純粋：本明細書において用いられる際に、実質的に他の成分を含有しない場合に、薬剤または実体は「純粋」である。例えば特定の薬剤または実体を約９０％を超えて含有する調製物は、純粋な調製物であると典型的には考えられる。いくつかの実施形態では、薬剤または実体は、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％純粋である。
【００４０】
短いオリゴ糖：本開示の目的のために、オリゴ糖は、任意の直鎖中に４より少ない、または確実には３より少ない残基を有する場合に「短い」と典型的には考えられる。
【００４１】
特異性：当技術分野において公知である通り「特異性」は、特定のリガンド（例えばＨＡポリペプチド）がその結合パートナー（例えばヒトＨＡ受容体および具体的にはヒト上気道管ＨＡ受容体）を他の潜在的結合パートナー（例えばトリＨＡ受容体）から識別する能力の尺度である。
【００４２】
実質的相同性：語句「実質的相同性」は、本明細書において、アミノ酸または核酸の配列間の比較を意味して用いられる。当業者に理解される通り、２つの配列は、対応する位置に相同残基を含有する場合に、一般に「実質的に相同」であると考えられる。相同残基は同一残基であってもよい。代替的に相同残基は、適切に類似した構造および／または機能的特徴を有する非同一残基であってもよい。例えば当業者に周知である通り、いくつかのアミノ酸は「疎水性」もしくは「親水性」アミノ酸に、および／または「極性」もしくは「非極性」側鎖を有するとして典型的には分類される。１つのアミノ酸の同じ種類の他のアミノ酸への置換は、しばしば「相同」置換と考えることができる。典型的アミノ酸分類は下に要約される：
【００４３】
【化２】
2013541528.tif 000004
【００４４】
【化３】
2013541528.tif 000005
当技術分野において周知である通りアミノ酸または核酸の配列は、ヌクレオチド配列についてのＢＬＡＳＴＮならびにアミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの商業的コンピュータープログラムにおいて利用可能なものを含む任意の種々のアルゴリズムを用いて比較され得る。例示的なそのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻（３号）：４０３〜４１０頁、１９９０年；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年；Ｂａｘｅｖａｎｉｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ、１９９８年；およびＭｉｓｅｎｅｒら、（編）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３２巻）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年；において記載されており、前述の全ては参照により本明細書に組み込まれる。相同配列を同定することに加えて、上に述べたプログラムは、相同性の程度の指標を典型的には提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上が、関連する残基のストレッチにわたって相同性である場合に、実質的に相同であると考えられる。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは、完全配列である。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００またはそれ以上の残基である。
【００４５】
実質的同一性；語句「実質的同一性」は、アミノ酸または核酸の配列間の比較を意味して本明細書において用いられる。当業者に理解される通り、２つの配列は、対応する位置に同一残基を含有する場合に一般に「実質的に同一」であると考えられる。当技術分野において周知である通り、アミノ酸または核酸の配列は、ヌクレオチド配列についてのＢＬＡＳＴＮならびにアミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの商業的コンピュータープログラムにおいて利用可能なものを含む任意の種々のアルゴリズムを用いて比較され得る。例示的なそのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻（３号）：４０３〜４１０頁、１９９０年；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年；Ｂａｘｅｖａｎｉｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ、１９９８年；およびＭｉｓｅｎｅｒら、（編）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３２巻）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年；において記載されており、前述の全ては参照により本明細書に組み込まれる。同一配列を同定することに加えて、上に述べたプログラムは、同一性の程度の指標を典型的には提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上が、関連する残基のストレッチにわたって同一である場合に、実質的に同一であると考えられる。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは完全配列である。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも��５０、少なくとも４７５、少なくとも５００またはそれ以上の残基である。
【００４６】
治療剤：本明細書において用いられる語句「治療剤」は、所望の生物学的または薬理学的効果を引き出す任意の薬剤を意味する。
【００４７】
処置：本明細書において用いられる用語「処置」は、疾患、障害または状態の１つまたは複数の症状または状況を緩和する、発症を遅延させる、重症度もしくは発生数を軽減する、または予防を得るために用いられる任意の方法を意味する。本発明の目的のために処置は、症状の発症の前、間および／または後に投与され得る。
【００４８】
アンブレラトポロジー：語句「アンブレラトポロジー」は、いくつかのグリカン、具体的にはＨＡ受容体上のグリカンによって採用される三次元配置を意味して本明細書において用いられる。本発明は、アンブレラトポロジーグリカンへの結合が、ヒト宿主への感染を媒介するＨＡタンパク質の特徴であるという認識を包含する。図１２に例示される通り、アンブレラトポロジーは、典型的にはα２−６シアリル化グリカンによってのみ採用され、長い（例えば四糖より大きい）オリゴ糖の典型である。いくつかの実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンは、図６（右パネル）に表す構造に実質的に類似する三次元構造を示すグリカンである。いくつかの実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンは、図６（右パネル）に示すアミノ酸残基を介してＨＡポリペプチドに接触するグリカンである。いくつかの実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンは、図６（右パネル）に示すアミノ酸結合ポケットに接触できる、および／または特異的に結合できるグリカンである。いくつかの実施形態では、グリカン構造のトポロジーは、ＳｉａのＣ２、ＧａｌのＣ１およびＧｌｃＮＡｃのＣ１の間の角度として定義されるパラメータθに基づいて分類される。θ値＜１００°は、α２−３および短いα２−６グリカンとによって採用されるコーン様トポロジーを表す。θ値＞１１０°は、長いα２−６グリカンによって採用されるトポロジーなどのアンブレラ様トポロジーを表す（図６）。アンブレラトポロジーの例は、およそ−６０のＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ連結のΦ角によって与えられる（例えば図１１を参照されたい）。図４は、アンブレラトポロジーをとり得るグリカンのある代表的な（しかし網羅的ではない）例を表す。図４に表される長いα２−６モチーフは、生物学的Ｎ連結グリカン、Ｏ連結グリカンおよび糖脂質の部分として見出される、長鎖（例えば少なくとも三糖）に非還元末端で連結しているＮｅｕ５Ａｃα２−６を含む。囲み挿入図は、ＨＡと高親和性で結合する生物学的グリカンの部分として見出される、アンブレラトポロジーの長いα２−６グリカン部分の例を示す。いくつかの実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンは（例えばある位置で）、短いα２−６（例えば単一のラクトサミン）分枝よりも長い（例えば複数のラクトサミン単位）α２−６オリゴ糖分枝を高い割合で含む。いくつかの実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンは（例えばある位置で）、短いα２−６（例えば単一のラクトサミン）分枝より約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍または約５０倍を超えて、長いα２−６オリゴ糖分枝を含む。いくつかの実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンおよび／またはグリカンデコイとのＨＡ相互作用の特有の特徴は、非還元末端にシアル酸（ＳＡ）および／またはＳＡ類似物を含むグリカンと接触しているＨＡである。いくつかの実施形態では、オリゴ糖の鎖長は、少なくとも三糖である（ＳＡまたはＳＡ類似物を除く）。いくつかの実施形態では、図１２の右側パネルに示される番号付けられた残基の組合せは、アンブレラ様トポロジーとの接触に関与する。いくつかの実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンは、次の形態：
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３
のオリゴ糖である。
式中：
（ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６は典型的には（しかし必要不可欠ではなく）非還元末端にある；
（ｂ）Ｓｕｇ１は：
（ｉ）αまたはβ立体配置（ＮおよびＯ連結伸長についてはしばしばβ−、糖タンパク質にＯ連結しているＧａｌＮＡｃα−の場合はα−）にあるヘキソース（しばしばＧａｌもしくはＧｌｃ）またはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃもしくはＧａｌＮＡｃ）である；
（ｉｉ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６以外の糖は、Ｓｕｇ１のいずれの非還元位置にも結合しない（Ｓｕｇ１が糖タンパク質にＯ連結しているＧａｌＮＡｃα−である場合を除く）；および／または
（ｉｉｉ）サルフェート、ホスフェート、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどの非糖部分はＳｕｇ１の非還元位置（典型的には６位）に結合し得る（例えばＨＡとの接触を改善するために）；
（ｃ）Ｓｕｇ２および／あるいはＳｕｇ３は：
（ｉ）αまたはβ立体配置（しばしばβ）にあるヘキソース（しばしばＧａｌもしくはＧｌｃ）またはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃもしくはＧａｌＮＡｃ）である；および／あるいは
（ｉｉ）糖（Ｆｕｃなど）または、サルフェート、ホスフェート、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどの非糖部分はＳｕｇ２、Ｓｕｇ３および／またはＳｕｇ４の非還元位置に結合し得る；
（ｄ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６連結とは別のオリゴ糖における任意の２つの糖の間の連結は、１−２、１−３、１−４および／または１−６（典型的には１−３または１−４）であってよく；ならびに／あるいは
（ｅ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６が、糖タンパク質にＯ連結しているＧａｌＮＡｃαに連結しており、付加糖がＧａｌＮＡｃαの非還元末端に連結している構造は、例えば
（ｉ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃα−
（ｉｉ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃα−
である。
【００４９】
アンブレラトポロジー遮断剤（ＵＴＢＡ）：本明細書において用いられる用語「アンブレラトポロジー遮断剤」は、アンブレラトポロジーグリカンを有するＨＡ受容体に結合する薬剤を意味する。いくつかの実施形態では、ＵＴＢＡは、ヒト上気道において見出されるアンブレラトポロジーグリカンを有するＨＡ受容体に結合する。ＵＢＴＡはアンブレラトポロジーグリカンおよび／またはコーントポロジーグリカンのいずれかに結合できる。いくつかの実施形態では、ＵＴＢＡは、コーントポロジーグリカンに対する親和性の５０、１００、１５０または２００％でアンブレラトポロジーグリカンに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ＵＴＢＡは、コーントポロジーグリカンに対する親和性の５０〜１５０％でアンブレラトポロジーグリカンに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態ではＵＴＢＡは、コーントポロジーグリカンに対してとほぼ同じ親和性でアンブレラトポロジーグリカンに結合する。例えばいくつかの実施形態では、ＵＴＢＡは、コーントポロジーグリカン（例えば３’ＳＬＮ−ＬＮ）への結合の親和性の約５０〜２００％、５０〜１５０％で、またはほぼ同じ親和性でアンブレラトポロジーグリカン（例えば６’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合する。いくつかの実施形態では、ＵＴＢＡは、インフルエンザウイルス粒子（例えば、ヒトまたはトリインフルエンザウイルス）のＨＡ受容体への結合を、受容体のグリカントポロジー（例えばアンブレラまたはコーン）に基づいて選択的に阻害する。いくつかの実施形態では、ＵＴＢＡは、ポリペプチドである。いくつかのそのような実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドと実質的に同一、または実質的に相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドは、ＨＡポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドは、天然に存在するＨＡポリペプチドまたはその断片である。いくつかの実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドは、ＨＡポリペプチドのアミノ酸配列に関係していないアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドは、抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、ＵＴＢＡポリペプチドは、レクチン（例えばＳＮＡ−１）である。いくつかの実施形態では、ＵＴＢＡはポリペプチドではない。いくつかの実施形態では、ＵＴＢＡは小分子である。いくつかの実施形態では、ＵＴＢＡは核酸である。
【００５０】
アンブレラトポロジーグリカン模倣物：「アンブレラトポロジーグリカン模倣物」は、本明細書に記載の結合剤に結合するアンブレラトポロジーグリカン以外の薬剤である。いくつかの実施形態では、アンブレラトポロジーグリカン模倣物は、ＨＡポリペプチドに結合する薬剤である。いくつかのそのような実施形態では、アンブレラトポロジーグリカン模倣物は、残基９５、９８、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３８、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８３、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、２１９、２２１、２２２、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８およびこれらの組合せからなる群より選択されるＨＡポリペプチド残基と相互作用する薬剤である。いくつかのそのような実施形態では、アンブレラトポロジーグリカン模倣物は、残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１５５、１８８、１９２、１９３、２２１、２２６、２２７、２２８およびこれらの組合せからなる群より選択されるＨＡポリペプチド残基と相互作用する薬剤である。いくつかのそのような実施形態では、アンブレラトポロジーグリカン模倣物は、残基１６０、１９２、１９３およびこれらの組合せからなる群より選択されるＨＡポリペプチド残基と相互作用する薬剤である。上に述べたアミノ酸位置がＨ３  ＨＡ番号付けに基づくことに注意されたい。いくつかの実施形態では、ＨＡトポロジーグリカン模倣物は、ＨＡポリペプチドとの相互作用についてアンブレラトポロジーグリカンと競合する薬剤である。
【００５１】
アンブレラトポロジー特異的遮断剤（ＵＴＳＢＡ）：本明細書において用いられる用語「アンブレラトポロジー特異的遮断剤」は、ヒト上気道において見出されるアンブレラトポロジーグリカンを有するＨＡ受容体に結合する薬剤を意味する。ＵＴＳＢＡは、アンブレラトポロジーグリカンＨＡに選択的に結合する。例えばＵＴＳＢＡは、コーントポロジーグリカン（例えば３’ＳＬＮ−ＬＮ）への結合の親和性より少なくとも約２、４、５または１０倍大きな親和性でアンブレラトポロジーグリカン（例えば６’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合する。典型的にはＵＴＳＢＡのアンブレラトポロジーグリカンに対する親和性は、１ｎＭより大きい。典型的にはコーントポロジーグリカンに対するＵＴＳＢＡの親和性は、アンブレラトポロジーグリカンのＳＣ１８、Ｍｏｓ９９、Ｔｘ９１などのヒト適応ＨＡおよび（ＳＮＡ−Ｉなどの）α２−６結合植物レクチンへの結合親和性より少なくとも２から３桁以内で低い。用量依存的直接結合アッセイ（図１９および２０）によって測定されるＵＴＳＢＡの結合親和性は、典型的には少なくとも１ｎＭである。典型的にはコーントポロジーグリカンに対するＵＴＳＢＡの親和性は、コーントポロジーグリカンのトリＨＡ（Ｖｉｅｔ０４０５、Ａｖ１８など）への結合親和性より最大で１から３桁低い。いくつかの実施形態では、ＵＴＳＢＡは、インフルエンザウイルス粒子（例えばヒトまたはトリインフルエンザウイルス）のＨＡ受容体（例えばＨ１、Ｈ２もしくはＨ３またはヒト適応Ｈ５、Ｈ７もしくはＨ９）への結合を、グリカントポロジー（例えばアンブレラまたはコーン）に基づいて選択的に阻害する。いくつかの実施形態では、ＵＴＳＢＡは、ポリペプチドである。いくつかのそのような実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一または実質的に相同性であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドは、ＨＡポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドは、天然に存在するＨＡポリペプチドまたはその断片である。いくつかの実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドは、ＨＡポリペプチドのアミノ酸配列に関係しないアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドは、抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、ＵＴＳＢＡポリペプチドは、レクチンである（例えばＳＮＡ−１）。いくつかの実施形態では、ＵＴＳＢＡは、ポリペプチドではない。いくつかの実施形態では、ＵＴＳＢＡは、小分子である。いくつかの実施形態では、ＵＴＳＢＡは核酸である。
【００５２】
ワクチン接種：本明細書において用いられる用語「ワクチン接種」は、免疫応答（例えば病原体（ｄｉｓｅａｓｅ−ｃａｕｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）に対する）を生じさせることを意図する組成物の投与を意味する。本発明の目的のために、ワクチン接種は、病原体への曝露、および／または１つまたは複数の症状の発症の前、間および／または後に、いくつかの実施形態では、病原体への曝露の前、間および／または直後に投与され得る。いくつかの実施形態では、ワクチン接種は、ワクチン組成物の、適切に時間を開けた複数回投与を含む。
【００５３】
バリアント：本明細書において用いられる用語「バリアント」は、目的の特定のポリペプチド（例えばＨＡポリペプチド）と（その配列が比較される）「親」ポリペプチドとの間の関係を説明する相対的な用語である。目的のポリペプチドが、特定の位置でのわずかな数の配列変化がなければ親のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する場合に、目的のポリペプチドは、親ポリペプチドの「バリアント」であると考えられる。典型的にはバリアントにおける残基の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満が親と比較して置換されている。いくつかの実施形態では、バリアントは、親と比較して１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個の置換された残基を有する。しばしばバリアントは、非常に少ない（例えば５、４、３、２または１個より少ない）数の置換された機能性残基（すなわち特定の生物活性に関与する残基）を有する。さらにバリアントは典型的には親と比較して５、４、３、２または１個以下の付加または欠失を有し、しばしば付加または欠失を有さない。さらに任意の付加または欠失は典型的には約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６より少なく、一般に約５、約４、約３または約２残基より少ない。いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは天然に認められるものである。例えば親ＨＡポリペプチドは、天然のインフルエンザウイルス（例えば野生型）単離物において見出されるものであってよい（例えば野生型ＨＡ）。
【００５４】
ベクター：本明細書において用いられる「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を意味する。いくつかの実施形態では、ベクターは、真核細胞または原核細胞などの宿主細胞における、連結されている核酸の染色体外複製および／または発現が可能である。作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することが可能であるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
【００５５】
野生型：当技術分野において理解される通り、語句「野生型」は、一般にタンパク質または核酸の、天然において見出される通常形態を意味する。例えば野生型ＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然単離物において見出される。様々な異なる野生型ＨＡ配列がＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌにおいて見出され得る。いくつかの例示的野生型Ｈ２  ＨＡポリペプチドは図１に示される。
【００５６】
本発明のある特定の実施形態の詳細な記載
本発明は、アンブレラトポロジーグリカンとコーントポロジーグリカンとを識別する強い能力を示す結合剤を提供する。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、操作されたＨＡポリペプチドである。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、操作されたＨ２  ＨＡポリペプチドである。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、本明細書に記載のＲＴＬＳ  ＨＡポリペプチド（例えばＲＴＬＳ  Ｈ２  ＨＡポリペプチド）によって示されるものと少なくとも同様に有効である、アンブレラトポロジーグリカンとコーントポロジーグリカンとを識別するための能力を示す。
【００５７】
本発明は、アンブレラトポロジーグリカンとコーントポロジーグリカンとを識別する強い能力を示す結合剤を同定するための系および試薬も提供する。本発明は、提供される結合剤に関連する種々の試薬および方法（例えばこれらを同定するための系、これらを調製するための戦略、これらに結合する抗体、ならびにこれらに関係する種々の診断方法および治療方法を含む）も提供する。本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態のさらなる記載などは、下に示される。
【００５８】
血球凝集素（ＨＡ）
インフルエンザウイルスは、ウイルス粒子の膜に埋め込まれた２つの糖タンパク質、血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含有する脂質膜エンベロープによって特徴付けられるＲＮＡウイルスである。１６個の公知のＨＡ亜型および９個のＮＡ亜型があり、異なるインフルエンザ株は、株のＨＡおよびＮＡ亜型の数字に基づいて命名される。アミノ酸配列同一性および結晶構造の比較に基づいて、ＨＡ亜型は２つの主な群および４つの小さなクレードに分けられている。異なるＨＡ亜型は強いアミノ酸配列同一性を共有する必要はないが、様々なＨＡ亜型の全体的な三次元構造は、分類目的に用いられ得る数個のわずかな差異を伴って、互いに類似している。例えば中央αヘリックスとの関係での膜遠位サブドメインの特定の向きは、ＨＡ亜型を決定するために一般に用いられる１つの構造的特徴である（Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００４年  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３２５巻：２８７頁、２００４年；参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５９】
ＨＡは、Ｈ１〜Ｈ１６と称される１６個の亜型の内の１個のホモ三量体として膜中に存在する。これらの亜型のうち３個（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）だけが、これまでのところヒト感染に適応するようになっている。ヒトに感染するように適応しているＨＡ（例えば、汎発流行Ｈ１Ｎ１（１９１８年）およびＨ３Ｎ２（１９６７〜６８年）インフルエンザ亜型由来のＨＡ）の報告された１つの特徴は、α２−３シアリル化グリカンに優先的に結合するそれらのトリ祖先と比較して、α２−６シアリル化グリカンに優先的に結合するそれらの能力である。（Ｓｋｅｈｅｌ  ＆  Ｗｉｌｅｙ、２０００年  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、６９巻：５３１頁；Ｒｏｇｅｒｓ，  ＆  Ｐａｕｌｓｏｎ、１９８３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１２７巻：３６１頁；Ｒｏｇｅｒｓら、１９８３年  Ｎａｔｕｒｅ、３０４巻：７６頁；Ｓａｕｔｅｒら、１９９２年  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻：９６０９頁；Ｃｏｎｎｏｒら、１９９４年Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０５巻：１７頁；Ｔｕｍｐｅｙら、２００５年  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１０巻：７７頁；これら全ては参照により本明細書に組み込まれる）。しかし本発明は、ヒト宿主に感染する能力が特定の連結のグリカンへの結合とあまり相関せず、特定のトポロジーのグリカンへの結合とより相関するという認識を包含する。したがって本発明は、（コーントポロジーグリカンがα２−６シアリル化グリカンである場合があるにもかかわらず）しばしばコーントポロジーグリカンよりもアンブレラトポロジーグリカンについての優先性を示して、ヒトへの感染を媒介するＨＡがアンブレラトポロジーグリカンに結合することを実証する。
【００６０】
シアリル化オリゴ糖（α２−３およびα２−６連結の両方の）に結合したＨ１（ヒトおよびブタ）、Ｈ３（トリ）ならびにＨ５（トリ）亜型由来のＨＡのいくつかの結晶構造は入手可能であり、これらのグリカンとＨＡとの別個の相互作用に関与する特定のアミノ酸についての分子的知見を提供する（Ｅｉｓｅｎら、１９９７年  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３２巻：１９頁；Ｈａら、２００１年Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９８巻：１１１８１頁；Ｈａら、２００３年  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３０９巻：２０９頁；Ｇａｍｂｌｉｎら、２００４年  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３巻：１８３８頁；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００４年  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３巻：１８６６頁；Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００６年  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ  ２３巻：８５頁；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６年Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：４０４頁；これら全ては参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６１】
例えば、単独またはα２−３もしくはα２−６シアリル化オリゴ糖に結合したＨ５（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／３／９７）の結晶構造は、結合したグリカンと直接相互作用するいくつかのアミノ酸、さらに１または複数の分離距離の程度であるアミノ酸を同定する（Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００１年  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８巻：１１１８１頁；参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの場合では、これらの残基のコンフォメーションは、非結合状態に対して結合状態において異なっている。例えばＧｌｕ１９０、Ｌｙｓ１９３およびＧｌｎ２２６は、全て直接結合相互作用に関与し、非結合状態に対して結合状態において異なるコンフォメーションを有する。Ｇｌｕ１９０の近位にあるＡｓｎ１８６のコンフォメーションも、非結合状態に対して結合状態において顕著に異なっている。
【００６２】
ヒトおよびトリＨＡ受容体の類似物と複合体化した例示的Ｈ２  ＨＡ（ヒトウイルスＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７およびＡ／Ｊａｐａｎ／３０５／５７、トリウイルスＡ／ｃｋ／Ｐｏｓｔｄａｍ／８４、Ａ／ｄｋ／Ｏｎｔａｒｉｏ／７７およびＡ／ｃｋ／ＮｅｗＹｏｒｋ／９１）の結晶構造は、結合したグリカンと直接相互作用するいくつかのアミノ酸、さらにＨＡの受容体結合ポケットを変化させる変異も同定する（Ｘｕ  Ｒら、２０１０年  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８４巻（４号）：１７１５頁；Ｌｉｕ  Ｊら、２００９年  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６巻（４０号）：１７１７５頁；それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。結合部位のいくつかの二次構造エレメント（例えば１３０および２２０ループならびに／または１９０ヘリックス）は、ヒトおよび／またはトリ受容体との相互作用に影響を与える場合がある。例えばヒトＨ２  ＨＡ残基２２２（Ｌｙｓ）は、Ｇａｌ−２の３’ＯＨと水素結合を形成し：ヒトＨ２  ＨＡ残基２２６（ロイシン）は（トリＨＡにおいては妨げられる）より疎水性の環境を導くことが報告されている（Ｌｉｕ  Ｊら、２００９年  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６巻（４０号）：１７１７５頁）。受容体結合部位が、１９０ヘリックス（残基１９０から１９８）、２２０ループ（残基２２１から２２８）、１３０ループ（残基１３４から１３８）からの残基およびＴｈｒ１５５によって取り囲まれる浅い空洞によって形成されることは報告されている（Ｘｕ  Ｒら、２０１０年  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８４巻（４号）：１７１５頁）。Ｔｙｒ９８、Ｔｒｐ１５３およびＨｉｓ１８３を含む数個の保存された芳香族残基が、受容体結合部位のくぼみの底を形成する場合があることが観察されている（Ｘｕ  Ｒら、２０１０年  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８４巻（４号）：１７１５頁）。いくつかの実施形態では、配列モチーフＶ／ＩＨＨＰは、Ｈ２  ＨＡ受容体結合部位に存在し、ここでは、最初のＨが残基１８３のヒスチジンに対応する。いくつかのそのような実施形態では、グリシンは残基１３４に存在する場合があり、トリプトファンは残基１５３に存在する場合があり、スレオニンは残基１５５に存在する場合があり、グルタミン酸は残基１９０に存在する場合があり、および／またはロイシンは残基１９４に存在する場合があり、これらの組合せである場合もある。いくつかの実施形態では、残基１３４、１５３、１５５、１９０および１９４は、シアル酸への結合に関わる。
【００６３】
結合剤
本明細書に記載の通り、アンブレラトポロジーグリカンへの結合は、例えばヒトを含む特定の宿主の感染を媒介する能力に相関する。したがって本発明は、アンブレラグリカン（および／またはアンブレラトポロジーグリカン模倣物）に結合する結合剤（例えばＨＡポリペプチド、具体的にはＨ２  ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、高親和性でアンブレラグリカン（および／またはアンブレラトポロジーグリカン模倣物）に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、複数の異なるアンブレラトポロジーグリカンに、しばしば高い親和性および／または特異性で結合する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、高親和性でアンブレラトポロジーグリカン（例えばＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−などの例えば長いα２−６シアリル化グリカン）に結合する。例えばいくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡについて観察されたものと同等の親和性で、アンブレラトポロジーグリカンに結合する。いくつかの実施形態では、ヒトにおける感染を媒介する（例えばヒト伝染性である）野生型ＨＡは、Ｈ１Ｎ１  ＨＡ、Ｈ２Ｎ２  ＨＡおよび／またはＨ３Ｎ２  ＨＡである。いくつかの実施形態では、ヒトにおける感染を媒介する（例えばヒト伝染性である）野生型ＨＡは、Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８由来のＨＡである。いくつかの実施形態では、ヒトにおける感染を媒介する（例えばヒト伝染性である）野生型ＨＡは、Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／５８由来のＨＡである。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡについての親和性の１０倍以下（例えば９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、２倍、１．５倍など）の範囲内でアンブレラグリカンに結合する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、ヒトの感染を媒介する（例えばヒト伝染性である）野生型ＨＡについて比較可能な条件下で観察されたものの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％である親和性でアンブレラグリカンに結合する。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、ヒトの感染を媒介する（例えばヒト伝染性である）野生型ＨＡについて比較可能な条件下で観察されたものよりも大きい親和性で、アンブレラグリカンに結合する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発明の結合剤の結合親和性は、ある範囲の濃度にわたって評価される。そのような戦略は、単一濃度分析よりも、特に多価結合アッセイにおいて顕著に多い情報を提供する。いくつかの実施形態において、例えば本発明の結合剤の結合親和性は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍またはそれを超える範囲の濃度にわたって評価される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、結合パートナー濃度（例えばＨＡ受容体、グリカンなど）は、生理学的条件（例えば細胞表面グリカンへのウイルス性ＨＡ結合）を模倣するためにリガンド（例えばＨＡポリペプチド）濃度過剰に設定され得る。代替的にまたは付加的にいくつかの実施形態では、結合パートナー（例えばＨＡ受容体、グリカンなど）濃度および／またはリガンド（例えばＨＡポリペプチド）濃度は、変更され得る。いくつかのそのような実施形態では、親和性（例えば結合親和性）は基準（例えばヒトの感染を媒介する野生型ＨＡ）と比較可能な条件下（例えば濃度）で比較され得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明の結合剤の結合親和性は、全ウイルスを用いて実施される。いくつかのそのような実施形態では、ウイルス力価はウイルス粒子の数に直接相関する単位で測定される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、それらが本明細書に記載のものなどの多価グリカンアレイ結合アッセイにおいて飽和シグナルを示す場合に高親和性を示す。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、それらがそのような研究において約４０００００超（例えば約５０００００、約６０００００、約７０００００、約８０００００超など）のシグナルを示す場合に高親和性を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍以上の濃度範囲にわたってアンブレラグリカンへの飽和結合を示し、いくつかの実施形態では、少なくとも２００倍以上の広い濃度範囲にわたる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、アンブレラトポロジーグリカン（および／またはアンブレラトポロジーグリカン模倣物）への高親和性結合を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、約１．５ｎＭから約２ｐＭの範囲内でアンブレラトポロジーグリカンに対する親和性（Ｋｄ’）を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、約１．５ｎＭから約２００ｐＭの範囲内でアンブレラトポロジーグリカンに対する親和性（Ｋｄ’）を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、約２００ｐＭから約１０ｐＭの範囲内でアンブレラトポロジーグリカンに対する親和性（Ｋｄ’）を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、約１０ｐＭから約２ｐＭの範囲内でアンブレラトポロジーグリカンに対する親和性（Ｋｄ’）を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、それらが結合アッセイにおいて約５００ｐＭ以下（例えば約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約４ｐＭ、約３ｐＭ、約２ｐＭより低いなど）のＫｄ’を示す場合にアンブレラトポロジーグリカン（および／またはアンブレラトポロジーグリカン模倣物）への高親和性結合を示す。
【００７１】
いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、コーントポロジーグリカン（および／またはコーントポロジーグリカン模倣物）への低親和性結合を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、それらが結合アッセイにおいて約１００ｐＭ以上（例えば約２００ｐＭ、約３００ｐＭ、約４００ｐＭ、約５００ｐＭ、約６００ｐＭ、約７００ｐＭ、約８００ｐＭ、約９００ｐＭ、約１ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．５ｎＭを超えるなど）のＫｄ’を示す場合にコーントポロジーグリカン（および／またはコーントポロジーグリカン模倣物）への低親和性結合を示す。
【００７２】
いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、アンブレラトポロジーグリカン（および／またはアンブレラトポロジーグリカン模倣物）への高親和性ならびにコーントポロジーグリカン（および／またはコーントポロジーグリカン模倣物）への低親和性の両方を示す。いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、結合アッセイにおいてアンブレラトポロジーグリカンに対して約５００ｐＭ以下（例えば約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約４ｐＭ、約３ｐＭ、約２ｐＭより低いなど）のＫｄ’、およびコーントポロジーグリカンに対して約１００ｐＭ以上（例えば約２００ｐＭ、約３００ｐＭ、約４００ｐＭ、約５００ｐＭ、約６００ｐＭ、約７００ｐＭ、約８００ｐＭ、約９００ｐＭ、約１ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．５ｎＭを超えるなど）のＫｄ’を示す。
【００７３】
一態様では、本発明は、アンブレラトポロジーグリカンに対する高い親和性だけではヒトへの伝染を効果的および／または効率的に媒介するためには十分でない可能性があるという驚くべき認識を提供する。むしろ本開示により、いくつかの実施形態では、提供される結合剤は、コーントポロジーグリカンへの低い結合、ならびに／またはアンブレラトポロジーグリカンに対する高親和性およびコーントポロジーグリカンへの低親和性の両方を示す。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明の結合剤はα２−６シアリル化グリカンに結合し、いくつかの実施形態では、本発明の結合剤はα２−６シアリル化グリカンに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は複数の異なるα２−６シアリル化グリカンに結合する。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤はα２−３シアリル化グリカンに結合できず、他の実施形態では、本発明の結合剤はα２−３シアリル化グリカンに結合できる。
【００７５】
さらにいくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、コーントポロジーグリカンに結合するよりも優先的にアンブレラトポロジーグリカン（および／またはアンブレラトポロジーグリカン模倣物）に結合する（例えばそれらはより強く結合する）。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、アンブレラグリカン対コーングリカンについて約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１０，０００、約１００，０００までまたはそれ以上である相対的親和性を示す。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、コーントポロジーグリカンについてのそれらの親和性の約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１０００％、約２０００％、約３０００％、約４０００％、約５０００％、約６０００％、約７０００％、約８０００％、約９０００％、約１０，０００％またはそれ以上である親和性をアンブレラトポロジーグリカンについて示す。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、ヒト上気道上皮細胞上に見出される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、気管支および／または気管におけるＨＡ受容体に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、肺深部における受容体には結合できず、他の実施形態では、本発明の結合剤は肺深部における受容体に結合できる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、ヒト上気道管組織（例えば上皮細胞）におけるＨＡ受容体で見出されるグリカンの少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上に結合する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、図４に例示される１つまたは複数のグリカンに結合する。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、図４に例示される複数のグリカンに結合する。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、図４に例示されるグリカンに高い親和性および／または特異性で結合する。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、図３に例示されるグリカンへのそれらの結合と比較して、図４に例示されるグリカンに優先的に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の結合剤は、次の形態：
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３
のオリゴ糖に結合する。
式中：
１．Ｎｅｕ５Ａｃ  α２−６は、常にまたはほとんど非還元末端にある；
２．Ｓｕｇ１は：
ａ．αまたはβ立体配置（ＮおよびＯ連結伸長についてはしばしばβ−、糖タンパク質にＯ連結しているＧａｌＮＡｃα−の場合はα−）にあるヘキソース（しばしばＧａｌもしくはＧｌｃ）またはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃもしくはＧａｌＮＡｃ）である；
ｂ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６以外の糖は、Ｓｕｇ１のいずれの非還元位置にも結合しない（Ｓｕｇ１が糖タンパク質にＯ連結しているＧａｌＮＡｃα−である場合を除く）；および／または
ｃ．サルフェート、ホスフェート、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどの非糖部分はＨＡとの接触を改善するためにＳｕｇ１の非還元位置（典型的には６位）に結合し得る；
３．Ｓｕｇ２および／またはＳｕｇ３は：
ａ．αまたはβ立体配置（しばしばβ）にあるヘキソース（しばしばＧａｌもしくはＧｌｃ）またはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃもしくはＧａｌＮＡｃ）である；ならびに／あるいは
ｂ．糖（Ｆｕｃなど）または、サルフェート、ホスフェート、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどの非糖部分はＳｕｇ２、Ｓｕｇ３および／またはＳｕｇ４の非還元位置に結合し得る；
４．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６連結とは別のオリゴ糖における任意の２つの糖の間の連結は、１−２、１−３、１−４および／または１−６（典型的には１−３または１−４）であってよく；ならびに／あるいは
５．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６が、糖タンパク質にＯ連結しているＧａｌＮＡｃαに連結しており、付加的糖がＧａｌＮＡｃαの非還元末端に連結している構造は、例えば
ｉ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃα−
ｉｉ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃα−
である。
【００７９】
本発明は、指定された結合特異性を有する結合剤を提供し、アンブレラグリカンに関して指定された結合特徴を有する結合剤も提供する。
【００８０】
本発明によって提供されるある特定の結合剤は、下にさらに詳細に記載される。
【００８１】
ＨＡポリペプチド
いくつかの実施形態では、本発明の結合剤はＨＡポリペプチドである。例えば本発明は、指定された結合特異性を有する単離されたＨＡポリペプチドを提供し、アンブレラグリカンに関して指定された結合特徴を有する操作されたＨＡポリペプチドも提供する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する提供されるＨＡポリペプチドは、Ｈ１ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ２ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ４ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ５ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ６ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ７ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ８ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ９ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ１０ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ１１ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ１２ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ１３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ１４ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ１５ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ１６ポリペプチドである。
【００８３】
いくつかの実施形態では、指定された結合特徴を有する本発明によるＨＡポリペプチドは、Ｈ１ポリペプチドではなく、Ｈ２ポリペプチドではなく、および／またはＨ３ポリペプチドではない。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドは、株：
【００８５】
【化４】
2013541528.tif 000006
のいずれかに由来するＨ１タンパク質を含まない。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドは、１９５７〜５８年のアジアでのインフルエンザ蔓延株のいずれかに由来するＨ２タンパク質ではない。いくつかの実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドは、株：Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５＋／１９５７；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９６４；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９６７のいずれかに由来するＨ２タンパク質を含まない。いくつかの実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドは、Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／２００４由来のＨ２タンパク質を含まない。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドは、株：
【００８８】
【化５】
2013541528.tif 000007
のいずれかに由来するＨ３タンパク質を含まない。
【００８９】
操作されたおよび／またはバリアントＨＡポリペプチド
いくつかの実施形態では、提供されるＨＡポリペプチドは、そのアミノ酸配列が、わずかな数の特定の配列変更を除いて、親ＨＡのアミノ酸配列と同一である親ＨＡポリペプチドのバリアントである。いくつかの実施形態では、親ＨＡは、インフルエンザウイルスの天然単離物において見出されるＨＡポリペプチドである（例えば野生型ＨＡポリペプチド）。いくつかの実施形態では、親ＨＡは、Ｈ２  ＨＡポリペプチドである。いくつかの実施形態では、親ＨＡは、野生型Ｈ２  ＨＡポリペプチドである。いくつかの実施形態では、親ＨＡは、図１に列挙される群から選択されるＨ２  ＨＡである。いくつかの実施形態では、親ＨＡは、ＣｋＰＡ０４である。いくつかの実施形態では、親ＨＡは、Ａｌｂ５８である。いくつかの実施形態では、親ＨＡは、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７またはＡ／Ｊａｐａｎ／３０５／５７である。いくつかの実施形態では、親ＨＡは、Ａ／ｃｋ／ＮｅｗＹｏｒｋ／２９８７８／９１、Ａ／ｄｋ／Ｏｎｔａｒｉｏ／７７またはＡ／ｃｋ／ｐｏｓｔｄａｍ／４７０５／８４である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＡポリペプチドバリアントは、それらの対応する親ＨＡポリペプチドとは異なるグリカン結合特徴を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＨＡバリアントポリペプチドは、それらの同族の親ＨＡポリペプチドよりも大きな親和性および／または特異性をアンブレラグリカンに対して（例えばコーングリカンに対してと比較して）有する。いくつかの実施形態では、そのようなＨＡポリペプチドバリアントは、操作されたバリアントである。
【００９１】
いくつかの実施形態では、変更されたグリカン結合特徴を有するＨＡポリペプチドバリアントは、グリカン結合部位における、またはそれに影響を与える残基において配列変更を有する。いくつかの実施形態では、そのような置換は結合グリカンと直接相互作用するアミノ酸の置換であり、他の実施形態では、そのような置換は結合グリカンと相互作用するものから分離距離の程度１であるアミノ酸の置換であり、分離距離の程度１においてアミノ酸は（１）直接結合アミノ酸と相互作用する；（２）そうでなければ、直接結合アミノ酸がグリカンと相互作用する能力に影響するが、グリカンとは直接相互作用しない；または（３）そうでなければ、直接結合アミノ酸がグリカンと相互作用する能力に影響し、グリカンとも直接相互作用する、のいずれかである。本発明のＨＡポリペプチドバリアントは、１つもしくは複数の直接結合アミノ酸、１つもしくは複数の分離の程度１のアミノ酸、１つもしくは複数の分離の程度２のアミノ酸、またはこれらの任意の組合せの置換を含有する。いくつかの実施形態では、本発明のＨＡポリペプチドバリアントは、より高い分離の程度を有する１つまたは複数のアミノ酸の置換を含有する場合もある。
【００９２】
いくつかの実施形態では、変更されたグリカン結合特徴を有するＨＡポリペプチドバリアントは、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ以外の糖（例えば図１３を参照されたい）と接触する残基に配列変更を有する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントは、野生型親ＨＡと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＨＡポリペプチドバリアントは、同族の野生型親ＨＡと比較して少なくとも２個、３個、４個、５個またはそれ以上のアミノ酸置換を有し；いくつかの実施形態では、本発明のＨＡポリペプチドバリアントは、２個、３個または４個のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、そのような全てのアミノ酸置換は、グリカン結合部位内に位置する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアント、具体的にはＨ２ポリペプチドバリアントは、野生型親ＨＡと比較して、結合グリカンと相互作用するアミノ酸から分離距離の程度１であるアミノ酸から選択される残基に１つまたは複数のアミノ酸置換を有し、分離距離の程度１においてアミノ酸は（１）直接結合アミノ酸と相互作用する；（２）そうでなければ、直接結合アミノ酸がグリカンと相互作用する能力に影響するが、グリカンとは直接相互作用しない；または（３）そうでなければ、直接結合アミノ酸がグリカンと相互作用する能力に影響し、グリカンと直接相互作用もする、のいずれかであり、これだけに限らないが、残基１３７、１４５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９６、２２２、２２５、２２６および２２８を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアント、具体的にはＨ２ポリペプチドバリアントは、残基１３７、１９３、２２６および２２８の１つまたは複数に対応する位置に配列置換を有する。代替的にまたは付加的に、いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントは、残基１４５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９６、２２２および２２５の１つまたは複数に対応する位置に配列置換を有する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、１３７に対応する位置（「残基１３７」）にアルギニン、リシン、グルタミン、メチオニンおよびヒスチジンから選択されるアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、１３７に対応する位置（「残基１３７」）にアルギニン、リシン、グルタミンおよびメチオニンから選択されるアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、１３７に対応する位置（「残基１３７」）にアルギニンおよびリシンから選択されるアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態では、提供されるＨＡポリペプチドおよび／またはポリペプチドバリアント（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアント）は、残基１３７としてアルギニン残基を有する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、１９３に対応する位置（「残基１９３」）にアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、セリン、スレオニン、システインおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、アラニン、グルタミン酸、スレオニン、システイン、メチオニン、バリンおよびセリンからなる群より選択される残基１９３を有する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、アラニン、グルタミン酸およびスレオニンからなる群より選択される残基１９３を有する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、スレオニンである残基１９３を有する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、残基２２６に対応する残基（「残基２２６」）として非極性アミノ酸であるアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンからなる群より選択される残基２２６を有する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、ロイシン、イソロイシンおよびバリンからなる群より選択される残基２２６を有する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、ロイシンである残基２２６を有する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、２２８に対応する位置（「残基２２８」）に極性アミノ酸であるアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、セリン、グリシン、スレオニンおよびチロシンからなる群より選択される残基２２８を有する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、アルギニン、アスパラギン、セリン、グリシンおよびスレオニンからなる群より選択される残基２２８を有する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、セリンである残基２２８を有する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、提供されるＨＡポリペプチドバリアントは、特定の基準ＨＡポリペプチドと（例えば（例えば本明細書に記載の）野生型Ｈ２  ＨＡポリペプチドなどの野生型ＨＡポリペプチドと）比較して、１３７、１９３、２２６および／または２２８以外の位置に少なくとも１つの置換を有する。いくつかのそのような実施形態では、アンブレラトポロジーグリカンに対するバリアントの親和性および／または特異性は増大している。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、対応するヒト適応ＨＡ（例えば図１に示すものなどのヒト適応Ｈ２  ＨＡ）において顕著に存在するアミノ酸を特定の残基（例えば１３７、１４５、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、２２２、２２５、２２６、２２８）に有する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供されるＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２  ＨＡポリペプチド）は、対応するヒト適応ＨＡ（例えばヒト適応Ｈ２  ＨＡ）において見出される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＡポリペプチドバリアントは、基準または親ＨＡと、具体的には親野生型ＨＡと比較して、開いた結合部位を有する。
【０１０３】
ＨＡポリペプチドの部分または断片
本発明は、本発明によるＨＡポリペプチド（および／またはポリペプチドバリアント）の特徴的部分（結合剤であってもなくてもよい）ならびにそれらをコードする核酸をさらに提供する。一般に特徴的部分は、アミノ酸の連続するストレッチまたはアミノ酸の連続するストレッチの集合物（一緒になってＨＡポリペプチドの特徴を示す）を含有するものである。そのような連続するストレッチそれぞれは、一般に少なくとも２つのアミノ酸を含有する。さらに当業者は、典型的にはＨＡポリペプチド（例えばＨ２  ＨＡポリペプチド）の特徴となるために少なくとも５個、１０個、１５個、２０個またはそれ以上のアミノ酸が必要であること理解する。一般に特徴的部分は、上に記載の配列同一性に加えて、少なくとも１つの機能的特徴を関連するインタクトなＨＡポリペプチドと共有するものである。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドの本発明の特徴的部分は、グリカン結合特徴を関連する全長ＨＡポリペプチドと共有する。
【０１０４】
非ＨＡポリペプチド
いくつかの実施形態では、本発明により提供される結合剤は、アミノ酸配列が特徴的ＨＡ配列を含まないポリペプチドである。そのようなポリペプチドは、本明細書において「非ＨＡポリペプチド」と称される。いくつかの実施形態では、非ＨＡポリペプチドは予め選択されたアミノ酸配列を有する（例えば、基準配列と比較した戦略的アミノ酸変更の導入［付加、欠失および／または置換］を例えば含む、合理的設計を介して）。いくつかの実施形態では、非ＨＡポリペプチドは、確率的に決定され、例えば本明細書において定義の望ましい結合特徴に基づいて同定されるアミノ酸配列を有する。
【０１０５】
抗体
いくつかの実施形態では、本発明により提供される結合剤は、（例えばアンブレラトポロジーグリカンにおよび／またはアンブレラトポロジーグリカン模倣物に結合する）抗体である。本発明に適切である抗体は、任意のアンブレラトポロジーグリカンエピトープに免疫特異的に結合する抗体または抗体の断片を含む。本明細書において用いられる用語「抗体」は、指定されたタンパク質もしくはペプチドまたはこれらの断片に特異的に反応性である免疫グロブリンおよびこの断片を含むことを意図する。適切な抗体は、これだけに限らないがヒト抗体、霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、結合体化抗体（すなわち他のタンパク質、放射標識、細胞毒に結合体化または融合した抗体）、Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰｓ（商標）」）、１本鎖抗体、ラクダ化（ｃａｍｅｌｏｉｄ）抗体および抗体断片を含む。本明細書において用いられる用語「抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一ドメイン抗体（例えばサメ単一ドメイン抗体（例えばＩｇＮＡＲまたはその断片））、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）および所望の生物学的活性を呈する限りでの抗体断片も含む。本明細書における使用のための抗体ポリペプチドは、任意の型（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）であってよい。
【０１０６】
本明細書において用いられる「抗体断片」は、例えば抗体の抗原結合領域または可変領域などのインタクトな抗体の部分を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；トリアボディー；テトラボディー；直鎖抗体；１本鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。用語「抗体断片」は、複合体を形成するように特定の抗原に結合することによって、抗体のように作用する任意の合成または遺伝的に操作されたタンパク質も含む。例えば抗体断片は、単離された断片、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって繋がれている組換え１本鎖ポリペプチド分子（「ＳｃＦｖタンパク質」）、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位を含む。
【０１０７】
抗体は、当技術分野において周知の方法を使用して生成され得る。例えば抗体産生のためのプロトコールは、参照により本明細書に組み込まれるＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌによって記載されている。典型的には抗体は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラクダ、ラマ、サメまたは他の適切な宿主において生成され得る。代替的に抗体は、ＩｇＹ分子を産生するニワトリにおいて作製され得る（Ｓｃｈａｄｅら、１９９６年  ＡＬＴＥＸ  １３巻（５号）：８０頁；参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、本発明に適する抗体は、ヒトに近い霊長類抗体である。例えば治療用に有用な抗体をヒヒにおいて生じさせる一般的技術は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、例えばＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、国際特許出願公開第ＷＯ９１／１１４６５号（１９９１年）およびＬｏｓｍａｎら、１９９０年  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６巻：３１０頁において見出され得る。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ、１９８３年  Ｎａｔｕｒｅ  ３０５巻（５９３４号）：５３７頁；参照により本明細書に組み込まれる）を使用して調製され得る。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、組換え法によっても作製され得る（米国特許第４，１６６，４５２号、１９７９年；参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明に適する抗体は、ヒト化またはヒト抗体を含み得る。非ヒト抗体のヒト化形態は、非ヒトＩｇ由来の最小配列を含有するキメラＩｇ、Ｉｇ鎖または断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＡｂの他の抗原結合サブ配列など）である。一般にヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入される１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称され、典型的には「インポート」可変ドメインから得られる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯類相補性決定領域（ＣＤＲ）またはＣＤＲ配列に置換することによって達成される（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻（６１６２号）：３２３頁；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３９巻（４８４７号）：１５３４頁；それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。そのような「ヒト化」抗体は、キメラＡｂ（米国特許第４，８１６，５６７号、１９８９年；参照により本明細書に組み込まれる）であり、ここで、実質的にインタクトなヒト可変ドメイン未満のものが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかのＣＤＲ残基および場合によりいくつかのＦＲ残基がげっ歯類Ａｂの類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、などの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置き換えられているヒトＩｇ（レシピエント抗体）を含む。いくつかの場合では、対応する非ヒト残基がヒトＩｇのＦｖフレームワーク残基を置き換える。ヒト化抗体は、レシピエント抗体およびインポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含んでもよい。一般にヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、非ヒトＩｇのＣＤＲ領域に対応する全てではなくともほとんどのＣＤＲ領域、および全てではなくともほとんどのＦＲ領域がヒトＩｇコンセンサス配列のものである。最適にはヒト化抗体はまた、Ｉｇ定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒトＩｇの）の少なくとも部分を含む（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻（６１６２号）：３２３頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３９巻（４８４７号）：１５３４頁；それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０９】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１年  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８巻（９号）：１０２７〜３７頁；Ｍａｒｋｓら、１９９１年  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２２巻（３号）：５８１〜９７頁；それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）およびヒトモノクローナル抗体の調製（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ａｎｄ  Ｓｅｌｌ、１９８５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖ．４巻（１号）：２７１〜９０頁；それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）を含む種々の技術を使用しても産生され得る。同様に、内在性Ｉｇ遺伝子が部分的または完全に不活性化されているトランスジェニック動物へのヒトＩｇ遺伝子の導入は、ヒト抗体を合成するために利用され得る。挑戦において、遺伝子再配列、アッセンブリ、抗体レパートリーを含む全ての観点についてヒトにおいて見られるものと酷似しているヒト抗体産生が認められる（Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｈｉｇｈ−ａｖｉｄｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｋａｐｐａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６年７月；１４巻（７号）：８４５〜５１頁；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｆｏｕｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ  １９９４年４月２８日；３６８巻（６４７４号）：８５６〜９頁；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ、Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５年；１３巻（１号）：６５〜９３頁；Ｍａｒｋｓら、Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ  Ｙ）．１９９２年７月；１０巻（７号）：７７９〜８３頁；それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１０】
レクチン
いくつかの実施形態では、本発明に従って提供される結合剤はレクチンである。レクチンは、可溶性炭水化物、または複合糖質（例えば、糖ペプチドもしくは糖脂質）の一部分である炭水化物部分に結合することができる糖結合タンパク質である。レクチンは、典型的に、特定の糖部分を認識することによって、ある種の動物細胞を凝集させ、かつ／または複合糖質を沈澱させる。例えば、ＳＮＡ−１は、α２−６シアル酸に対して高親和性を有するレクチンである。さらに別の一例として、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｓｑｕａｍｏｓｕｓレクチン（ＰＳＬ１ａおよびＰＳＬ１ｂ）は、アスパラギン連結糖タンパク質のＮｅｕ５Ａｃα２，６Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ／ＧｌｃＮＡｃの三糖配列を含む、シアリル化した複合糖質の結合について高親和性を有する。結合剤として働くことができる非限定的な例示的なレクチンは、ＳＮＡ−１、ＳＮＡ−１’、ＰＳＬ１ａ、ＰＳＬ１ｂ、およびこれらに由来するポリペプチドを含む。
【０１１１】
例示的なレクチンのアミノ酸配列を、以下の表１〜４において提供する。
【０１１２】
【表１】
2013541528.tif 000008
【０１１３】
【表２】
2013541528.tif 000009
【０１１４】
【表３】
2013541528.tif 000010
【０１１５】
【表４】
2013541528.tif 000011
アプタマー
いくつかの実施形態では、本発明に従って提供する結合剤はアプタマーである。アプタマーは、特定の分子標的（例えば、アンブレラトポロジーグリカン）に対して緊密に結合する核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）からなる巨大分子である。特定のアプタマーは、直鎖状ヌクレオチド配列によって記載することができ、典型的に長さ約１５から約６０ヌクレオチドである。いかなる理論によっても拘束しようとするものではないが、アプタマーにおけるヌクレオチド鎖は分子を複雑な三次元の形状にフォールディングする分子内相互作用を形成し、この三次元の形状により、アプタマーはその標的分子の表面に緊密に結合できるようになると考えられる。全ての可能なヌクレオチド配列の領域内に存在する、分子の形状の極めて高い多様性を考慮すると、アプタマーを、タンパク質および小分子を含めた広範囲の分子標的について得ることができる。アプタマーは特異性が高いことに加えて、その標的に対して非常に高い親和性を有する（例えば、タンパク質に対してピコモルから低ナノモル範囲の親和性）。アプタマーは化学的に安定であり、活性を失わずに煮沸または冷凍することができる。アプタマーは合成分子であるので、種々の修飾を受け入れることができ、種々の修飾はこれらの機能を特定の適用に対して最適化することができる。例えば、アプタマーを修飾して、ｉｎ  ｖｉｖｏの適用における使用について、血液中の酵素による分解に対してこれらの感受性を劇的に低減することができる。さらに、アプタマーを、アプタマーの体内分布または血漿滞留時間を変更するように修飾することができる。
【０１１６】
アンブレラトポロジーグリカン（および／またはアンブレラトポロジーグリカン模倣体）に結合することができるアプタマーの選択は、当技術分野において公知の方法によって実現することができる。例えば、アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））法を用いて選択することができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｅｒｋ，  Ｃ．およびＧｏｌｄ，  Ｌ．、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻、５０５頁）。ＳＥＬＥＸ法では、核酸分子の大型のライブラリ（例えば、１０１５個の異なる分子）が生成され、かつ／または標的分子（例えば、アンブレラトポロジーグリカンエピトープのアンブレラトポロジーグリカン）でスクリーニングされる。標的分子を、ある期間、ヌクレオチド配列のライブラリとインキュベートする。次いで、当技術分野において公知のいくつかの方法を用いて、混合物中の非結合の分子からアプタマー標的分子を物理的に単離することができ、非結合の分子は捨てることができる。次いで、標的分子に対して最高の親和性を有するアプタマーを、標的分子から精製し、酵素的に増幅して、標的分子に結合することができるアプタマーについて実質的に濃縮されている分子の新たなライブラリを生成することができる。次いで、濃縮されたライブラリを用いて、新たなサイクルの選択、分割、および増幅を開始することができる。この反復性の選択、分割、および増幅プロセス、５〜１５サイクルの後、ライブラリは、標的分子に対して緊密に結合する少数のアプタマーに低減する。混合物中の個々の分子を次いで単離し、これらのヌクレオチド配列を決定し、結合親和性および特異性に関してこれらの性質を測定し、比較することができる。単離したアプタマーを、次いでさらに洗練させ、標的の結合および／またはアプタマーの構造に寄与しないあらゆるヌクレオチドを排除し、それによって、これらのコア結合ドメインに切断されたアプタマーを生成することができる。アプタマー技術の再考には、その教示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊａｙａｓｅｎａ，  Ｓ．  Ｄ．、１９９９年、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．、４５巻、１６２８〜１６５０頁を参照されたい。
【０１１７】
ポリペプチドの生成
本発明のポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチドおよび／または非ＨＡポリペプチド）、ならびに／あるいはこれらの特徴的部分、あるいはこれらをコードする核酸は、あらゆる利用可能な手段によって生成することができる。
【０１１８】
本発明のポリペプチド（または特徴的部分）は、例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸を発現するように操作された宿主細胞系を利用することによって生成することができる。
【０１１９】
卵、バキュロウイルス、植物、イースト、メイディンダービーイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、またはベロ（アフリカミドリザル腎）細胞など、あらゆる系を用いて、ポリペプチド（もしくは特徴的部分）を生成することができる。あるいは、またはさらに、ポリペプチド（もしくは特徴的部分）を、発現ベクターの使用によるなど、組換え技術を用いて、細胞において発現させることができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０１２０】
あるいは、またはさらに、本発明のポリペプチド（またはこれらの特徴的部分）は、合成の手段によって生成することができる。
【０１２１】
あるいは、またはさらに、本発明のポリペプチド（またはこれらの特徴的部分）、特にＨＡポリペプチドは、インタクトなウイルスの状況において（そうでなければ野生型、弱毒、死滅ウイルスなどでも）生成することができる。本発明のポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）、またはこれらの特徴的部分は、ウイルス様粒子の状況においても生成することができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチド（またはこれらの特徴的部分）は、インフルエンザウイルスから単離および／または精製することができる。例えば、ウイルスは、孵化鶏卵などの卵中で増殖させることができ、この場合、収集される材料は尿膜腔液であるのが典型的である。あるいは、またはさらに、インフルエンザウイルスは、ウイルスを増殖させるための組織培養物を用いるあらゆる方法に由来してよい。ウイルスを増殖させるのに適する細胞基材は、例えば、市販の供給源（例えば、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）から容易に入手できる、ＭＤＣＫなどのイヌ腎細胞、またはＭＤＣＫのクローンからの細胞、ＭＤＣＫ様細胞、ベロ細胞を含めたＡＧＭＫ細胞などのサル腎細胞、連続細胞系として培養された上皮細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＫ−２１細胞、ＣＶ−１細胞、またはワクチン目的のインフルエンザウイルスの生成に適するあらゆる他の哺乳動物細胞型を含む。適切な細胞基材は、ＭＲＣ−５細胞などのヒト細胞も含む。適切な細胞基材は細胞系に限定されず、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞などの初代細胞も含まれる。
【０１２３】
また、当業者であれば、ポリペプチド、特に本明細書に記載するバリアントＨＡポリペプチドは、アンブレラトポロジーグリカンに結合することができるポリペプチドを容易にスクリーニングおよび／または選択できる条件下で、ポリペプチド（単独でも、またはウイルス粒子もしくはウイルスの部分を含めた複合体の部分として）を生成する細胞あるいは生物体を培養することによって、産生し、同定し、単離し、かつ／または生成することができることを理解されよう。例を１つだけ挙げると、いくつかの実施形態では、（例えば、特定の特異性および／もしくは親和性で）アンブレラトポロジーグリカンに結合するこれらのバリアントを明らかにし、かつ／またはこれらのバリアントに都合がよい条件下で、ポリペプチド（例えば、ＨＡバリアントポリペプチド）の集合物を生成および／または研究することは有用であり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのこのような集合物（例えば、ＨＡバリアントポリペプチド）は、自然界における進化に起因する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのこのような集合物（例えば、ＨＡバリアントポリペプチド）は、操作に起因する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのこのような集合物（例えば、ＨＡバリアントポリペプチド）は、操作および自然界の進化の組合せに起因する。
【０１２４】
ＨＡ受容体
ＨＡは、糖タンパク質受容体に結合することによって細胞の表面と相互作用する。ＨＡのＨＡ受容体に対する結合は、ＨＡ受容体上のＮ連結グリカンによって主に媒介される。特に、インフルエンザウイルス粒子の表面上のＨＡは、細胞宿主の表面上のＨＡ受容体と関連しているシアリル化グリカンを認識する。認識し、結合した後、宿主細胞はウイルス細胞を貪食し、ウイルスは隣接する細胞に分配するための多くのさらなるウイルス粒子を複製し、生成することができる。例示的なＨＡ−グリカン相互作用のいくつかの結晶構造は同定されており、表５に示す：
【０１２５】
【表５】
2013541528.tif 000012
ＨＡ受容体は、受容体のＨＡ結合部位付近でα２−３またはα２−６いずれかのシアリル化グリカンによって修飾されており、受容体結合グリカンの連結のタイプは受容体のＨＡ結合部位のコンフォメーションに影響を及ぼすことがあり、このため、異なるＨＡに対する受容体の特異性に影響を及ぼすことがある。
【０１２６】
例えば、トリＨＡのグリカン結合ポケットは狭い。本発明によると、このポケットは、トランスコンフォメーションのα２−３シアリル化グリカンに、および／またはα２−３連結であれα２−６連結であれコーントポロジーグリカンに結合する。
【０１２７】
トリ組織、ならびにヒト肺深部、さらに胃腸（ＧＩ）管組織におけるＨＡ受容体は、α２−３シアリル化グリカン連結を特徴とし、さらに（本発明に従って）、コーントポロジーを主に採用する、α２−３シアリル化および／またはα２−６シアリル化グリカンを含めたグリカンによって特徴付けられる。このようなコーントポロジーグリカンを有するＨＡ受容体を、本明細書においてＣＴＨＡｒと呼ぶことができる。
【０１２８】
対照的に、上気道の気管支および気管におけるヒトＨＡ受容体は、α２−６シアリル化グリカンによって修飾されている。α２−３モチーフと異なり、α２−６モチーフは、Ｃ６−Ｃ５結合によるコンフォメーションのさらなる自由度を有する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００６年、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ、２３巻、８５頁）。このようなα２−６シアリル化グリカンに結合するＨＡは、このコンフォメーションの自由度に起因する構造の多様性に適応する、より開かれた結合ポケットを有する。さらに、本発明によると、ＨＡは、ヒト上気道組織の感染を効果的に媒介するために、アンブレラトポロジーにおけるグリカン（例えば、α２−６シアリル化グリカン）に結合する必要がある場合があり、特に強い親和性および／または特異性でこのようなアンブレラトポロジーグリカンに結合する必要がある場合がある。アンブレラトポロジーグリカンを有するＨＡ受容体を、本明細書においてＵＴＨＡｒと呼ぶことができる。
【０１２９】
これらの空間的に制限されたグリコシル化プロファイルの結果、ヒトは、多くの野生型トリＨＡ（例えば、トリＨ２）を含むウイルスに通常感染しない。特に、ウイルスに最も遭遇する可能性のあるヒト気道の部分（すなわち、気管および気管支）にはコーングリカン（例えば、α２−３シアリル化グリカン、および／または短いグリカン）との受容体がなく、野生型トリＨＡは典型的にコーングリカン（例えば、α２−３シアリル化グリカン、および／または短いグリカン）に関連する受容体に、主にまたは独占的に結合するため、ヒトがトリのウイルスに感染することは滅多にない。アンブレラグリカン（例えば、長いα２−６シアリル化グリカン）を有する肺深部および／または胃腸管の受容体に接近することができるほどウイルスと十分密接して接触する場合にのみ、ヒトは感染する。
【０１３０】
グリカンアレイ
公知の特異的なグリカン−グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）の相互作用の現在の知識を速やかに広げるために、国際共同研究の主導であるＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（ＣＦＧ；ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ）は、新規なグリカンリガンドの特異性についてのＧＢＰのハイスループットスクリーニングを可能にした、いくつかのグリカン構造を含むグリカンアレイを開発した。グリカンアレイは、１価および多価両方のグリカンモチーフを含み（すなわち、ポリアクリルアミド骨格に付着しており）、各アレイは低濃度（１０μＭ）および高濃度（１００μＭ）の２６４のグリカン、ならびに各濃度に対して６個のスポットを含む（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｃｏｒｅｈ５．ｓｈｔｍｌを参照されたい）。
【０１３１】
アレイは、Ｎ連結およびＯ連結グリカンの生理学的多様性を捉える合成のグリカンを主に含む。合成のグリカンの他に、様々な哺乳動物の糖タンパク質に由来するＮ連結グリカンの混合物も、アレイ上に提示される。
【０１３２】
本明細書で用いられる、グリカンの「アレイ」は、任意選択で固体支持体上に固定されている一連の１つまたは複数のグリカンを意味する。いくつかの実施形態では、「アレイ」は、空間において物理的に分離されている２つまたはそれを超える位置で、組織化された配置またはパターンとして存在するグリカンの集合物である。典型的に、グリカンアレイは、少なくとも４個、少なくとも８個、少なくとも１６個、少なくとも２４個、少なくとも４８個、少なくとも９６個、または数百もしくは数千の別々の位置を有する。一般的に、本発明のグリカンアレイは、あらゆる様々な型式を有することができる。生体分子に適用できる様々な異なるアレイの型式は当技術分野において公知である。例えば、多数のタンパク質および／または核酸のアレイが周知である。当業者であれば、本発明のグリカンアレイに好適な標準のアレイ型式を即座に理解されよう。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本発明のグリカンアレイは、「マイクロアレイ」の型式において存在する。マイクロアレイは、典型的に、約５０ミクロンから約２００ミクロンまたはそれ未満の距離によって分離されている試料位置、およびナノからマイクロモル範囲またはナノからピコグラム範囲の固定された試料を有することができる。当技術分野において公知のアレイ型式は、例えば、別々の各試料の位置が、例えば１０ミクロンの規模を有するものを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本発明のグリカンアレイは、支持体上に空間的に固定されている複数のグリカンを含む。本発明は、支持体上に整列しているグリカン分子を提供する。本明細書で用いられる「支持体」は、グリカン分子を整列するのに用いるのに適するあらゆる材料を意味する。当業者であれば理解される通り、あらゆる広範囲の材料を用いることができる。例を少数だけ挙げると、本発明において用いることができる支持体材料は、疎水性メンブレン、例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、またはナイロンのメンブレンを含む。このようなメンブレンは当技術分野において周知であり、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ、ＵＫから得ることができる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、その上にグリカンが整列している支持体は金属酸化物を含むことができる。適切な金属酸化物は、それだけには限定されないが、酸化チタン、酸化タンタル、および酸化アルミニウムを含む。このような材料の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ、Ｆａｎｃｙ  Ｒｏａｄ、Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＢＨ１２  ４ＱＨ  ＵＫから得ることができる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、このような支持体は、金属酸化物ゲルであり、または金属酸化物ゲルを含む。金属酸化物ゲルは、炭水化物含有分子の固定を助けるために、所与の巨視的領域内に大きな表面積を提供すると考えられている。
【０１３７】
本発明に従って用いることができるさらなるまたは代替の支持体材料は、シリカゲルまたは酸化アルミニウムゲルなどのゲルを含む。このような材料の例は、例えば、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツから得ることができる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、グリカンアレイは、通常の使用の間、サイズまたは形状における変化に抵抗することができる支持体上に固定されている。例えば、支持体は、グリカンを整列させるのに用いるのに適する成分材料でコーティングされているスライドガラスであってよい。また、いくつかの複合性材料が支持体に望ましい堅固性をもたらすことがある。
【０１３９】
本明細書において実証する通り、本発明のアレイは、様々なＨＡポリペプチドおよびその結合特性を、同定および／または特徴付けするのに有用である。いくつかの実施形態では、本発明によるＨＡポリペプチドをこのようなアレイ上で試験して、アンブレラトポロジーグリカンに対して（例えば、α２−６シアリル化グリカンに対して、特にアンブレラトポロジーにおいて配置される長いα２−６シアリル化グリカンに対して）結合する能力を評価する。
【０１４０】
実際、本発明は、ＨＡポリペプチド結合能力を特徴付けるために、かつ／またはヒト結合ＨＡポリペプチドなどを検出するための診断薬として用いることができる、α２−６シアリル化グリカンのアレイ、および任意選択でα２−３シアリル化グリカンのアレイを提供する。いくつかの実施形態では、本発明のアレイは、アンブレラトポロジーにおけるグリカン（例えば、α２−６シアリル化グリカン、特に、長いα２−６シアリル化グリカン）を含む。当業者であれば明らかである通り、このようなアレイは、例えば、研究者がデザインおよび／または調製したものの他に、天然のインフルエンザ単離物において見出されるものを含めた、あらゆるＨＡポリペプチドを特徴付けまたは検出するのに有用である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、このようなアレイは、ヒトＨＡ受容体上に、特にヒト上気道ＨＡ受容体上に見出されるグリカン（例えば、しばしばα２−６シアリル化グリカン、特に長いα２−６シアリル化グリカンであるアンブレラグリカン）の、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上を代表するグリカンを含む。いくつかの実施形態では、本発明のアレイは、図１４に示すグリカン構造のいくつかまたは全てを含む。いくつかの実施形態では、アレイは、これら示すグリカンの、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上を含む。
【０１４２】
本発明は、グリカンアレイを用いてＨＡポリペプチドを同定または特徴付けをする方法を提供する。いくつかの実施形態では、例えば、このような方法は、（１）ＨＡポリペプチドを含む試料を提供するステップと、（２）グリカンを含むアレイと試料を接触させるステップと、（３）ＨＡポリペプチドの、アレイ上の１つまたは複数のグリカンに対する結合を検出するステップとを含む。
【０１４３】
本発明によるグリカンアレイと接触させるＨＡポリペプチドを含む試料の適切な供給源は、それだけには限定されないが、病理学的試料、例えば、血液、血清／血漿、末梢血単核細胞／末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ）、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、皮膚病変スワブ、脳脊髄液、子宮頚部スミア、膿汁試料、食品マトリックス、ならびに脳、脾臓、および肝臓などの身体の様々な部分からの組織を含む。あるいは、またはさらに、ＨＡポリペプチドを含む試料の他の適切な供給源は、それだけには限定されないが、環境試料、例えば、土壌、水、および微生物叢を含む。さらに他の試料は、試験室試料、例えば研究者らがデザインおよび／または調製した操作されたＨＡポリペプチドの試料を含む。列挙されていない他の試料も適用することができる。
【０１４４】
本発明のグリカンアレイに結合するＨＡポリペプチドをアッセイするのに適する、広範囲の検出系が当技術分野において公知である。例えば、ＨＡポリペプチドを、アレイと接触させる前または後に検出可能に（直接的もしくは間接的に）標識することができ、次いで、結合を、局在化標識を検出することによって検出することができる。いくつかの実施形態では、スキャンデバイスを利用して、アレイ上の特定の位置を調べることができる。
【０１４５】
あるいは、またはさらに、整列したグリカンに対する結合を、例えば、熱量測定、蛍光、もしくは放射性の検出系、または他の標識化方法、または標識化を必要としない他の方法を用いて測定することができる。一般的に蛍光の検出は、蛍光分子でアレイを直接プローブし、蛍光シグナルをモニタリングすることを伴うのが典型的である。あるいは、またはさらに、アレイを、間接的な蛍光検出のために、（例えば、ビオチンで）タグ付けされている分子でプローブすることができる（この場合、蛍光標識されたストレプトアビジンの結合について試験することによる）。あるいは、またはさらに、整列したグリカンを蛍光標識し、試験分子（異なるフルオロフォアで標識されていてもよく、またはされていなくてもよい）でプローブする蛍光クエンチング法を利用することができる。このような実施形態では、アレイに対する結合は、整列したグリカンから放出される蛍光を抑制（ｓｑｕｅｌｃｈ）するように働き、したがって蛍光の放出の減少によって結合が検出される。あるいは、またはさらに、整列したグリカンを、放射性物質の存在下で増殖させた生の組織試料（放射標識したプローブを産生）でプローブすることができる。このような実施形態における結合は、放射性の放出を測定することによって検出することができる。
【０１４６】
このような方法は、ＨＡポリペプチドの本発明のグリカンアレイに対する結合の事実および／または結合の程度を決定するのに有用である。本発明のいくつかの実施形態では、このような方法をさらに用いて、グリカン−ＨＡポリペプチド相互作用に干渉し、またはそうでなければそれを変更する薬剤を同定および／または特徴付けすることができる。
【０１４７】
以下に記載する方法は、例えば、炭水化物と相互作用することができると考えられている分子が実際に相互作用することができるか否かを同定する上で、または分子が炭水化物と相互作用する能力を予想外に有するか否かを同定するのに、特に有用であり得る。
【０１４８】
本発明はまた、例えば、試験試料中の特定の薬剤を検出するための、本発明のアレイを用いる方法を提供する。例えば、このような方法は、（１）グリカンアレイを試験試料と（例えば、ＨＡポリペプチドを含むと思われる試料と）接触させるステップと、（２）試験試料中の任意の薬剤のアレイに対する結合を検出するステップとを含むことができる。
【０１４９】
またさらに、本発明のアレイに対する結合を利用して、例えば、結合剤とグリカンとの間の相互作用の動態を決定することができる。例えば、相互作用の動態を決定するための本発明の方法は、（１）グリカンアレイを試験する分子と接触させるステップと、（２）結合剤と、整列したグリカン（複数可）との間の相互作用の動態を測定するステップとを含むことができる。
【０１５０】
結合剤の、本発明のアレイにおける任意のグリカンとの相互作用の動態は、例えば、上記に記載した通り、比色または蛍光のシグナルにおけるリアルタイムの変化によって測定することができる。このような方法は、例えば、特定の結合剤が特定の炭水化物と、同じ炭水化物と相互作用する異なる結合剤よりも高度の結合で相互作用することができるか否かを決定する上で、特に有用であり得る。
【０１５１】
もちろん、本発明によるＨＡポリペプチドによるグリカンの結合は、本質的にアレイ型式において存在しないグリカンの試料または供給源において評価することができることが理解されよう。例えば、本発明によるＨＡポリペプチドを、組織試料および／または細胞系に結合させてこれらのグリカン結合特性を評価することができる。好適な細胞系は、例えば、任意の様々な哺乳動物細胞系、特に、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、少なくともそのいくつかはα２−６シアリル化グリカン、特に長いα２−６シアリル化グリカンであってよい）を含むＨＡ受容体を発現する哺乳動物細胞系を含む。いくつかの実施形態では、利用する細胞系は、アンブレラトポロジーを有する個々のグリカンを発現する。いくつかの実施形態では、利用する細胞系は多様なグリカンを発現する。いくつかの実施形態では、細胞系は臨床分離株から得られ、いくつかの実施形態では、これらは所望のグリカンの分布および／または保有率を有するように維持され、または操作される。いくつかの実施形態では、組織試料および／または細胞系は、哺乳動物上気道上皮細胞に特徴的なグリカンを発現する。
【０１５２】
データマイニングプラットフォーム
ここで論じる通り、本発明に従って、ＨＡポリペプチドは、グリカン結合の研究、構造の情報（例えば、ＨＡ結晶構造）、および／またはタンパク質構造予測プログラムからのマイニングデータによって同定および／または特徴付けをすることができる。
【０１５３】
本発明者らが利用した（そして本明細書に例示した）特定のデータマイニングプロセスに関与する主なステップを図１５に示す。これらのステップは、データオブジェクト、特徴、および分類指標の３つのエレメント上の操作を伴うものであった。「データオブジェクト」は、データベース中に蓄えられた生データであった。グリカンアレイデータの場合では、単糖および連結の点でのグリカン構造、ならびにスクリーニングした様々なＧＢＰとの結合シグナルの化学的記載がデータオブジェクトを構成していた。データオブジェクトの性質は、「特徴」であった。特徴に基づいて得られたルールまたはパターンを選択して、データオブジェクトを記載した。「分類指標」は、データオブジェクトを特定のクラスにクラスタリング（ｃｌｕｓｔｅｒ）するか、または特徴間もしくは特徴中の関係を決定する、のいずれかに用いられるルールまたはパターンであった。分類指標は、ＧＢＰに対して高親和性で結合するグリカンによって満たされる特定の特徴を提供した。これらのルールは、（１）結合を増強するとみなすことができる、一連の高親和性のグリカンリガンド上に存在する特徴、および（２）結合に都合がよくないとみなすことができる、高親和性のグリカンリガンド中に存在してはならない特徴の２種類であった。
【０１５４】
本明細書で利用するデータマイニングプラットフォームは、上記に記載した操作を行うためにお互いに相互作用するソフトウエアモジュール（図１５）を含んでいた。特徴抽出装置（ｅｘｔｒａｃｔｏｒ）は、ＣＦＧデータベースに接続して特徴を抽出し、ＣＦＧによって用いられるオブジェクトベースのリレーショナルデータベースは、特徴の柔軟な定義（ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）を促進する。
【０１５５】
特徴抽出およびデータ準備
グリカンアレイ上のグリカンから抽出される代表的な特徴を表６に列挙する。
【０１５６】
【表６−１】
2013541528.tif 000013
【０１５７】
【表６−２】
2013541528.tif 000014
示したこれらの特定の特徴を選択した背後にある根拠は、ＧＢＰ上のグリカン結合部位は、典型的に二糖〜四糖に適応するということであった。ツリーベースの表現を用いてグリカン構造における単糖および連結に対する情報を捉えた（還元性末端のツリーの根）。この表現により、接続したセットの単糖のトリプレットなど、より高次の特徴を含めた様々な特徴の抽出が促進された（図１６）。データ準備は、各グリカンに対する抽出した特徴（表６）とともにグリカンアレイにおける全てのグリカンのカラム状の（ｃｏｌｕｍｎ−ｗｉｓｅ）リストの生成を伴うものであった。グリカンおよびグリカンの特徴のこの基本表から、特定のＧＢＰまたはセットのＧＢＰに対する結合を支配する特定のパターンを決定するために、ルールベースの分類（以下を参照されたい）についてサブセットを選択する。
【０１５８】
分類指標
様々なタイプの分類指標が開発されており、多くの適用において用いられる。これらは、数学的方法、間隔法、および論理法の３つの主なカテゴリーに主に分類される。これらの異なる方法ならびにこれらの利点および短所は、ＷｅｉｓｓおよびＩｎｄｒｕｋｈｙａ（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｄａｔａ  ｍｉｎｉｎｇ  −  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ、Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９９８年）において詳しく論じられている。この特定の適用に対して、本発明者らは、論理法に該当する、規則帰納分析と呼ばれる方法を選択する。規則帰納分析の分類指標は、ＩＦ−ＴＨＥＮルールの形態のパターンを生成する。
【０１５９】
論理法、特にＩＦ−ＴＨＥＮルールを生成する規則帰納分析法などの分類指標の主な利点の１つは、他の統計学的方法または数学的方法に比較した場合、分類指標の結果をより簡単に説明することができることである。これにより、発見されたルールまたはパターンの構造的および生物学的な重要性を探求できる。先（表６）に記載した特徴を用いて生成した一例のルールは：グリカンが「Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃｂ３Ｇａｌ［Ｂ］」を含み、かつ「Ｆｕｃａ３ＧｌｃＮＡｃ［Ｂ］」を含まなければ、グリカンはＧａｌｅｃｔｉｎ３に対してより高い親和性で結合するということである。この場合に用いた特定の規則帰納分析アルゴリズムは、ＷｅｉｓｓおよびＩｎｄｕｒｋｙａ（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｄａｔａ  ｍｉｎｉｎｇ  −  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ、Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９９８年）によって開発されたものである。
【０１６０】
結合レベル
低親和性の結合と高親和性の結合とを区別する閾値を、グリカンアレイスクリーニングデータセットの各々に対して規定した。
【０１６１】
核酸
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸を提供する。他の実施形態では、本発明は、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸に対して相補的である核酸を提供する。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸に対してハイブリダイズする核酸分子を提供する。このような核酸は、例えば、プライマーとして、またはプローブとして用いることができる。例を少数だけ挙げると、このような核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして、ハイブリダイゼーション（ｉｎ  ｓｉｔｕチューハイブリダイゼーションを含む）のためのプローブとして、および／または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のためのプライマーとして用いることができる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、１本鎖または２本鎖であってよい。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は１つまたは複数の非天然のヌクレオチドを含むことができ、他の実施形態では、本発明による核酸は天然のヌクレオチドだけを含む。
【０１６４】
ポリペプチドに対する抗体
本発明は、本発明による結合剤ポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）に対する抗体を提供する。これらはモノクローナルまたはポリクローナルであってよく、当業者には公知の任意の様々な技術によって調製することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい）。例えば、抗体は、組換え抗体を生成させるために、モノクローナル抗体の産生を含めた細胞培養技術によって、または抗体遺伝子を適切な細菌もしくは哺乳動物の細胞宿主中にトランスフェクトすることによって生成することができる。
【０１６５】
動物モデルにおける結合剤の試験
本発明は、本発明による結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＳＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を、動物宿主において試験するための方法を提供する。本明細書で用いられる「動物宿主」は、インフルエンザの調査に適するあらゆる動物モデルを含む。例えば、本発明に適する動物宿主は、霊長類、フェレット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、げっ歯動物（例えば、マウス、ハムスター、ウサギ、およびラット）を含めたあらゆる哺乳動物宿主であってよい。いくつかの実施形態では、本発明に用いる動物宿主はフェレットである。特に、いくつかの実施形態では、動物宿主は、本発明の結合剤（任意選択で本発明の組成物中の）の投与前のウイルスの曝露または感染に対してナイーブである。いくつかの実施形態では、動物宿主に、本発明の結合剤の投与前に、または投与と同時に、ウイルスを接種し、ウイルスを感染させ、またはそうでなければ、ウイルスに対して曝露する。本発明の実施において用いられる動物宿主に、当技術分野において公知のあらゆる方法によってウイルスを接種し、ウイルスを感染させ、またはそうでなければ、ウイルスに対して曝露することができる。いくつかの実施形態では、動物宿主に、経鼻的にウイルスを接種し、ウイルスを感染させ、またはウイルスに対して曝露してもよい。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、適切な動物宿主は、ヒト気道において見出される分布に対して、アンブレラトポロジーグリカン対コーントポロジーグリカン、および／またはα２−６グリカン対α２−３グリカンの同様の分布を有することがある。例えば、動物宿主としてのフェレットは、ヒトにおけるインフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患のモデルとして用いられる場合、マウスよりも代表的であることがある（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｍｐｅｙら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１５巻、６５５〜６５９頁）ことが考慮される。いかなる理論にも拘束しようとするものではないが、本発明は、フェレットは、マウスよりも、ヒト気道におけるグリカンの分布により類似した気道におけるグリカンの分布を有することがあるという考えを包含するものである。
【０１６７】
ナイーブの動物および／または接種した動物を、あらゆる様々な試験に用いることができる。例えば、このような動物モデルは、当技術分野において公知のウイルス伝染試験に用いることができる。ウイルス伝染試験においてフェレットを使用すると、ヒトにおけるウイルス伝染に対する信頼できる予測因子として働き得ることが企図される。例えば、接種した動物（例えば、フェレット）からナイーブの動物へのウイルスのインフルエンザの空気伝染は当技術分野において公知である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｍｐｅｙら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１５巻、６５５〜６５９頁）。ウイルス伝染試験を、本発明の結合剤ポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）を試験するのに用いることができる。例えば、ウイルスの結合を遮断する上での結合剤の効力、および／または動物宿主における感染力を決定するために、本発明の結合剤をウイルス伝染試験の前、間、または後に適切な動物宿主に投与することができる。動物宿主におけるウイルス伝染試験から集めた情報を用いて、ウイルスの結合を遮断する上での結合剤の効力、および／またはヒト宿主における感染力を予測することができる。
【０１６８】
処置
本発明は、インフルエンザ感染を処置（例えば、インフルエンザ感染の１つまたは複数の症状または特徴を、軽減し、寛解し、緩和し、発症を遅らせ、進行を阻害し、重症度を低減し、かつ／または発生率を低減する）、および／または防止するための系、組成物、および方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するものなどの本発明の結合剤を、インフルエンザ感染の処置および／またはインフルエンザ感染に対して被験体を免疫化するためのワクチンの開発など、様々な治療目的に用いることができる。
【０１６９】
Ａ．ワクチン接種
いくつかの実施形態では、本発明による本発明の結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、および／またはこれらの断片、バリアント、および／または特徴的部分に結合する実体；アンブレラトポロジーグリカンに結合する実体）を、予防的適用に利用することができる。いくつかの実施形態では、予防的適用は、インフルエンザ感染を防ぎ、進行を阻害し、かつ／または発症を遅らせるための系および方法を伴う。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、インフルエンザワクチンは、インフルエンザによる感染を防ぎ、かつ／または発症を遅らせるのに用いられる。いくつかの実施形態では、ワクチン接種は、特定のＨＡポリペプチドに対して調整される。例えば、ワクチン組成物は、Ｈ２ＨＡポリペプチドおよび／またはこれらのバリアント、断片、および／または特徴的部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、天然のコンフォメーションを有し、保護的応答（例えば、補体活性化、ウイルス中和など）を媒介し、かつ／または強い抗体応答を誘発することができる抗原を含むことが望ましい。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、受動免疫（すなわち、抗体が被験体に投与される免疫化）に干渉剤を利用することができる。いくつかの実施形態では、受動免疫のためのインフルエンザワクチンは、本明細書に記載するものなどの抗体干渉剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、妊娠の間に抗体が母親から胎児に伝達されるときに受動免疫が生じる。いくつかの実施形態では、抗体を直接個体に投与する（例えば、注射による、経口的など）。
【０１７２】
本発明は、能動免疫（すなわち、微生物、タンパク質、ペプチド、エピトープ、ミモトープなどが被験体に投与される免疫化）のためのインフルエンザワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、インフルエンザワクチンは、本明細書に記載する、１つまたは複数の干渉剤および／または結合剤を含むことができる。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ワクチンは少なくとも１つのＨＡポリペプチド（および／またはこれらのバリアント、断片、および／または特徴的部分）、例えば、本明細書に記載する任意のＨＡポリペプチド、これらのバリアント、断片、特徴的部分、および／または組合せを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンはＨ２ＨＡポリペプチド（および／またはこれらのバリアント、断片、および／または特徴的部分）を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは以下：残基１３７位のアルギニン、残基１９３位のスレオニン、残基２２６位のロイシン、および／または残基２２８位のセリンの１つまたは複数を有するＨＡポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは以下：残基１３７位のアルギニン、残基１９３位のスレオニン、残基２２６位のロイシン、および／または残基２２８位のセリンの各々を有するＨＡポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、本明細書に記載する１つもしくは複数の任意のＨＡポリペプチドを含む生の活動性のウイルス粒子、本明細書に記載する１つもしくは複数の任意のＨＡポリペプチドを含む弱毒化生ウイルス粒子、本明細書に記載する１つもしくは複数の任意のＨＡポリペプチドを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）、本明細書に記載する１つもしくは複数の任意のＨＡポリペプチドを含むサブユニットワクチン、および／またはこれらの組合せを含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は少なくとも１つのアジュバントを含む。あらゆるアジュバントを本発明に従って用いることができる。多数のアジュバントが公知であり、多くのこのような化合物の有用な概論は、アメリカ国立衛生研究所によって準備されており、インターネット上に見出すことができる（ｗｗｗ．ｎｉａｉｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄａｉｄｓ／ｖａｃｃｉｎｅ／ｐｄｆ／ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ．ｐｄｆ）。Ａｌｌｉｓｏｎ（参照により本明細書に組み込まれる、１９９８年、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｔａｎｄ．、９２巻、３〜１１頁）、Ｕｎｋｅｌｅｓｓら、（参照により本明細書に組み込まれる、１９９８年、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻、２５１〜２８１頁）、およびＰｈｉｌｌｉｐｓら、（参照により本明細書に組み込まれる、１９９２年、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０巻、１５１〜１５８頁）も参照されたい。何百もの様々なアジュバントが当技術分野において公知であり、本発明の実施において用いられ得る。本発明に従って利用することができる例示的なアジュバントは、それだけには限定されないが、サイトカイン、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｙｌｏｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０巻、Ｓ１８頁、２００２年）、ゲルタイプのアジュバント（例えば、リン酸カルシウムなど）；微生物のアジュバント（例えば、ＣｐＧモチーフを含む免疫調節性ＤＮＡ配列）；モノホスホリル脂質Ａなどの内毒素（参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｂｉら、１９８６年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏｒｐ．、ＮＹ、４０７頁、１９８６年）；コレラ毒素、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性毒素、および百日咳毒素などの外毒素；ムラミルジペプチドなど；油−エマルジョンおよび乳化剤ベースのアジュバント（例えば、フロイントのアジュバント、ＭＦ５９［Ｎｏｖａｒｔｉｓ］、ＳＡＦなど）；粒子性のアジュバント（例えば、リポソーム、生物分解性のミクロスフェアなど）；合成のアジュバント（例えば、非イオン性ブロック共重合体、ムラミルペプチド類似体、ポリホスファゼン、合成のポリヌクレオチドなど）；ならびに／またはこれらの組合せを含む。他の例示的なアジュバントは、いくつかのポリマー（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５００，１６１号に記載されているポリホスファゼン）、Ｑ５７、サポニン（例えば、ＱＳ２１、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｈｏｃｈｉｋｙａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４巻、２２７５頁、２００６年）、スクアレン、テトラクロロデカオキシド、ＣＰＧ７９０９（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｏｐｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２２巻、３１３６頁、２００４年）、ポリ［ジ（カルボキシラートフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＣＰ、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｙｎｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１６巻、９２頁、１９９８年）、インターフェロン−γ（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０巻、２３８頁、１９９２年）、ブロック共重合体Ｐ１２０５（ＣＲＬ１００５、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｔｚら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８巻、２１７７頁、２０００年）、インターロイキン−２（ＩＬ−２、参照により本明細書に組み込まれるＭｂｗｕｉｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ、８巻、３４７頁、１９９０年）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｒｅｕｔｅｒら、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．、７０巻、３６７頁、１９８１年）などを含む。
【０１７５】
Ｂ．治療法
本発明は、インフルエンザに感染している、感染を生じることが多い、かつ／または症状を表す患者を処置するための系および方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、インフルエンザに感染している、感染を生じることが多い、かつ／または症状を表す患者を層別化するのに有用な系および方法を提供する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本発明による本発明の結合剤を、治療的な適用に利用することができる。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、治療的な適用は、本発明による少なくとも１つの結合剤の治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、結合剤の被験体への投与は、インフルエンザ感染の１つまたは複数の徴候、症状、および／または特徴を軽減し、寛解し、緩和し、発症を遅らせ、進行を阻害し、重症度を低減し、かつ／または発生率を低減することができる。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、結合剤の投与は、被験体中を循環するインフルエンザビリオン（例えば、新たな細胞に感染することができるインフルエンザビリオン）のレベルを低減する。いくつかの実施形態では、結合剤の投与は、被験体中を循環するインフルエンザビリオンのレベルを、無処置の対照に比べて、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％低減する。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、結合剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いて、被験体におけるウイルス負荷を低減することができる。身体成分、特にインフルエンザに感染している患者の身体成分のウイルス負荷を低減するために、患者の血液を、インフルエンザビリオンを捉えるための表面または固体支持体に結合している結合剤を含むデバイスを通過させる（例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６９８，３９０号および第４，６９２，４１１号を参照されたい）。文献において見出される様々な他のデバイスを、対象の抗体と一緒に用いて同様の結果を達成することができる。身体成分は、生体液（例えば、血液、血清など）、組織、器官、例えば、肝臓などであってよい。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、「被験体中を循環するインフルエンザビリオンのレベル」は、被験体中を循環するビリオンの絶対数を意味する。いくつかの実施形態では、「被験体中を循環するインフルエンザビリオンのレベル」は、被験体の血液の単位容積（例えば、ミリリットル、リットルなど）あたりのビリオンの数を意味する。いくつかの実施形態では、「被験体中を循環するインフルエンザビリオンのレベル」は、ウイルス負荷を意味する。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、結合剤の投与は、ＨＡ受容体に対するウイルスの結合を阻害する。いくつかの実施形態では、結合剤の投与は、無処置の対照に比べて、少なくとも１つのＨＡ受容体に対するウイルスの結合を約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約１０，０００倍、または約１０，０００倍を超えて阻害する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、結合剤の投与は、被験体におけるインフルエンザビリオンを死滅させ、かつ／または不活化する。いくつかの実施形態では、インフルエンザ抗体の投与は、無処置の被験体に比べて、被験体におけるインフルエンザビリオンの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％を死滅させ、かつ／または不活化する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、結合剤の投与は、標的細胞とのウイルス媒介性の融合を阻害する。いくつかの実施形態では、結合剤の投与は、無処置の対照に比べて、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約１０，０００倍、または約１０，０００倍を超えて標的細胞とのウイルス媒介性の融合を阻害する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、結合剤の投与は、ウイルス侵入に関連する１つまたは複数のタンパク質のコンフォメーションの変化を阻害する。いくつかの実施形態では、結合剤の投与は、無処置の対照に比べて、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約１０，０００倍、または約１０，０００倍を超えて、ウイルス侵入に関連する１つまたは複数のタンパク質のコンフォメーションの変化を阻害する。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、結合剤の投与は、ＨＡポリペプチドおよび／またはＨＡ受容体におけるコンフォメーションの変化をもたらす。例えば、投与した干渉剤および／または結合剤は、ＨＡポリペプチドおよび／またはＨＡ受容体に結合し、それによってＨＡポリペプチドおよび／またはＨＡ受容体がお互いに認識および／または相互作用する能力を立体的に阻害することができる。いくつかの実施形態では、投与した結合剤は、ＨＡポリペプチドおよび／またはＨＡ受容体に結合し、それによってＨＡポリペプチドおよび／またはＨＡ受容体がお互いに認識できなくするようなやり方で、ＨＡポリペプチドおよび／またはＨＡ受容体の三次元コンフォメーションを変化させることができる。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、処置および／またはワクチン接種のレジメンは、処置および／またはワクチン接種される個体に対して特に調整される。本発明は、患者がＨ２ＨＡインフルエンザに感染しているか、または非Ｈ２ＨＡインフルエンザに感染しているかを決定するのに有用な系、組成物、および方法を提供する。このような方法を利用して、患者を処置および／またはワクチン接種のカテゴリーに層別化することができる。いくつかの実施形態では、このような方法は、処置および／またはワクチン接種が、処置および／またはワクチン接種される特定の個体に調整されるので有利であり得る。特定の一例だけを挙げると、患者がＨ２ＨＡインフルエンザに感染していると分類された場合、Ｈ２ＨＡインフルエンザの処置に有用である治療法を患者に施すことができ、Ｈ２ＨＡインフルエンザの処置に有用ではない治療法は施されない。これにより、必要とされない治療薬の投与からの有害反応の危険性が回避または低減される。このような方法により、このような処置および／またはワクチン接種の恩恵を受けない患者を処置および／またはワクチン接種する出費が排除される。
【０１８７】
Ｃ．医薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＢＳＡなど）および／または関連する実体を含む医薬組成物を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、結合剤のポリペプチド（複数可）（例えば、ＨＡポリペプチド）、このようなポリペプチドをコードする核酸、このようなポリペプチドまたは核酸の特徴的な断片または生物学的に活性な断片、このようなポリペプチドまたは断片に結合および／または競合する抗体、このようなポリペプチドまたはこれらに結合するグリカンと相互作用または競合する小分子などが、本発明の医薬組成物中に含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドではない（例えば、小分子、アンブレラトポロジーグリカンおよびその模倣体、炭水化物、アプタマー、ポリマー、核酸など）本発明の結合剤が、医薬組成物中に含まれる。
【０１８８】
本発明は、このような本発明の医薬組成物を投与することによるインフルエンザ感染の処置を包含する。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物を、インフルエンザに感染している、または感染を生じることが多い被験体に投与する。いくつかの実施形態では、被験体はインフルエンザに感染しているとみなされ、被験体はインフルエンザ感染に通常関連する１つもしくは複数の症状を表している。いくつかの実施形態では、被験体はインフルエンザウイルスに曝露されていたことが知られているか、または考えられている。いくつかの実施形態では、被験体がインフルエンザウイルスに曝露されていたことが知られているか、または考えられている場合、被験体はインフルエンザ感染を生じることが多いとみなされる。いくつかの実施形態では、被験体が、インフルエンザウイルスに感染していたことが知られているか、または感染が疑われる他の個体と接触していた場合、ならびに／あるいは被験体が、インフルエンザ感染が蔓延していることが知られているか、または考えられている場所に存在しているか、または存在していた場合、被験体はインフルエンザウイルスに曝露されていたことが知られているか、または考えられる。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、インフルエンザに感染しているか、または感染を生じることが多い被験体を、本発明の医薬組成物の投与前、間、または後に、本発明の結合剤に対する抗体について試験する。いくつかの実施形態では、このような抗体を有する被験体に、本発明の結合剤を含む医薬組成物を投与しない。いくつかの実施形態では、医薬組成物および／または結合剤の好適な投与量は、このような抗体の検出（またはその欠乏）に基づいて選択される。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、処置に対する特定の被験体の選択、投与に対する特定の結合剤もしくは組成物の選択、および／または投与に対する特定の投与量もしくはレジメンの選択は、書面の、印刷された、または電子の記憶形態などにおいて記憶される。
【０１９１】
本発明の組成物は、インフルエンザ感染の１つまたは複数の症状の発症の前または後に投与することができる。
【０１９２】
本発明は、本明細書に記載する薬剤および／または組成物の投与による、インフルエンザ感染の処置および／または防止（例えば、ワクチン接種）を包含する。いくつかの実施形態では、本発明によるインフルエンザ感染の処置は、ワクチンの投与によって達成される。現在まで、インフルエンザワクチンの開発において著しい業績が得られているが、さらなる改善の余地がある。本発明は、本発明の結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、特にＨ２ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＢＳＡなど）を含む、特にアンブレラグリカン（例えば、α２−６連結したアンブレラグリカン、例えば、長いα２−６シアリル化グリカン）に結合する結合剤を含むワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、非アンブレラトポロジーグリカンに優先的に結合する薬剤を実質的に含まない。このようないくつかの実施形態では、医薬組成物は、アンブレラトポロジーグリカン以外のＨＡ受容体グリカンに結合する薬剤を、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％以下含む。
【０１９３】
例を１つだけ挙げると、Ｈ２Ｎ２インフルエンザサブタイプは１９６８年までにヒトにおける循環を停止したが、Ｈ２サブタイプウイルスはブタおよびトリの種から時折単離される。家畜のトリおよびブタにおけるトリＨ２系統の循環により、ヒトがこれらのウイルスに曝露され、ヒト集団にウイルスが再導入される危険性が高まっている。このような再導入により、１９６８年以後に生まれたヒト集団の巨大なサブセットに既存の免疫がないものとすると、重大な地球規模の健康上の脅威がもたらされ得る。本発明は、とりわけ、インフルエンザ感染を処置および／または防止するための、Ｈ２ＨＡポリペプチドを含むワクチンを提供する。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本発明は、ワクチン、およびこれらのワクチンのヒト被験体への（例えば、インフルエンザに感染している、または感染を生じることが多い個体への）投与を提供する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、以下の１つまたは複数を含む組成物である：（１）不活化ウイルス、（２）弱毒化生インフルエンザウイルス、例えば、複製欠損ウイルス、（３）本発明の結合剤（例えば、ＨＡポリペプチドおよび／またはポリペプチドバリアント、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＢＳＡなど）、（４）結合剤ポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）またはその特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸、（５）本発明の結合剤ポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）またはその特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードするＤＮＡベクター、ならびに／あるいは（６）発現系、例えば、抗原として用いられる１つまたは複数のインフルエンザタンパク質を発現する細胞、および／またはウイルス様粒子。
【０１９５】
このように、いくつかの実施形態では、本発明は、不活化インフルエンザワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、不活化インフルエンザワクチンは３タイプの抗原調製物：不活化ウイルス全体、精製されたウイルス粒子が洗剤もしくは脂質のエンベロープを可溶化するための他の試薬で破壊されているサブビリオン（「スプリット」ワクチン）、または精製されたＨＡポリペプチド（「サブユニット」ワクチン）のうちの１タイプを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エーテル、洗剤とエーテル（例えば、ＴＷＥＥＮ−８０）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、デオキシコール酸ナトリウムおよびトリ（ｎ−ブチル）ホスフェートとの処理によって不活化することができる。不活化は、尿膜腔液の清澄化の後または前に生じてよく（卵において生成されたウイルスから）、ビリオンは遠心分離によって単離および精製される（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら編集、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｌｄｅｎ、ＭＡ、１９９８年）。ワクチンの効力を評価するために一元放射免疫拡散（ＳＲＤ）試験を用いることができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｉｌｄら、Ｂｕｌｌ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．、５２巻、４３〜５０頁および２２３〜３１頁、１９７５年；Ｍｏｓｔｏｗら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２巻、５３１頁、１９７５年）。いくつかの実施形態では、本発明はワクチンに有用であるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。一般に、ＶＬＰは、一緒にアッセンブルした場合に天然のウイルスのコンフォメーションを模倣するタンパク質抗原の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、強いＴ細胞および／またはＢ細胞の免疫応答を誘発することができるコンフォメーションエピトープを提示する、インフルエンザウイルス表面タンパク質（例えば、本発明によるＨＡポリペプチド）の反復性の高密度ディスプレイを含む。ＶＬＰは任意のウイルス遺伝物質を含まないので、ＶＬＰはワクチン組成物において弱毒化ウイルスよりも安全であり得る。ＶＬＰは、哺乳動物細胞系、昆虫細胞系、イースト、植物細胞などを含めた様々な細胞培養系において生成することができる。ＶＬＰの一般的な考察には、例えば、これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、公開されているＰＣＴ出願である、ＷＯ０２／０００８８５、ＷＯ０５／０２０８８９、ＷＯ０６／１０８２２６、ＷＯ０７／１３０３２７、ＷＯ０７／１３０３３０、ＷＯ０８／００５７７７、ＷＯ０８／０４００６０、ＷＯ０８／０５４５３５、ＷＯ０８／０６１２４３、ＷＯ０８／０９４１９７、ＷＯ０８／０９４２００、ＷＯ０８／１４８１０４、ＷＯ０９／００９８７６、ＷＯ０９／０１２４８９、ＷＯ１０／００６４５２、および米国特許出願公開第２００５／０００９００８号を参照されたい。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本発明によるＶＬＰは、脂質粒子と呼ばれる特殊化されたＶＬＰである。一般的に、脂質粒子は、コンフォメーションがインタクトな対象の膜タンパク質を高濃度含むように操作されている、安定で、高度に精製された、均一なＶＬＰである。いくつかの実施形態では、本発明による脂質粒子は、インフルエンザエンベロープタンパク質および／または他のインフルエンザ抗原を含んでいる。
【０１９７】
本発明は、生の、弱毒化インフルエンザワクチンも提供し、弱毒化のための方法は当技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、弱毒化は、部位特異的変異誘発などの逆遺伝学の使用によって実現される。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ワクチンにおいて用いるためのインフルエンザウイルスは、孵化鶏卵などの卵中で増殖され、この場合、収集される材料は尿膜腔液である。あるいは、またはさらに、インフルエンザウイルスは、ウイルスを増殖させるための組織培養を用いたあらゆる方法に由来してよい。ウイルスを増殖させるのに適する細胞基材は、例えば、市販の供給源（例えば、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ）から容易に入手できる、ＭＤＣＫなどのイヌ腎細胞またはＭＤＣＫのクローンからの細胞、ＭＤＣＫ様細胞、ベロ細胞を含めたＡＧＭＫ細胞などのサル腎細胞、連続細胞系としての培養上皮細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＫ−２１細胞、ＣＶ−１細胞、またはワクチン目的のインフルエンザウイルスの生成に適するあらゆる他の哺乳動物細胞型（上気道上皮細胞を含む）を含む。適切な細胞基材は、ＭＲＣ−５細胞などのヒト細胞も含む。適切な細胞基材は細胞系に限定されず、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞などの初代細胞も含まれる。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、ワクチンは１つまたは複数のアジュバントをさらに含む。あらゆるアジュバントを本発明に従って用いることができる。多数のアジュバントが公知であり、このような多くの化合物の有用な概論は、アメリカ国立衛生研究所によって準備されており、インターネット上に見出すことができる（ｗｗｗ．ｎｉａｉｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄａｉｄｓ／ｖａｃｃｉｎｅ／ｐｄｆ／ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ．ｐｄｆ）。Ａｌｌｉｓｏｎ（１９９８年、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｔａｎｄ．、９２巻、３〜１１頁；参照により本明細書に組み込まれる）、Ｕｎｋｅｌｅｓｓら、（１９９８年、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻、２５１〜２８１頁；参照により本明細書に組み込まれる）、およびＰｈｉｌｌｉｐｓら、（１９９２年、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０巻、１５１〜１５８頁；参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。何百もの様々なアジュバントが当技術分野において公知であり、本発明の実施において用いることができる。例えば、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど、Ｂａｙｌｏｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０巻、Ｓ１８頁、２００２年）、およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ、Ｒｉｂｉら、１９８６年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏｒｐ．、ＮＹ、４０７頁、１９８６年）を、ヒトワクチンにおけるアジュバントとして用いることができる。あるいは、またはさらに、本発明に従って利用することができる例示的なアジュバントは、サイトカイン、リン酸カルシウム、微生物のアジュバント（例えば、ＣｐＧモチーフを含む免疫調節性ＤＮＡ配列）；モノホスホリル脂質Ａなどの内毒素（参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｂｉら、１９８６年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏｒｐ．、ＮＹ、４０７頁、１９８６年）；コレラ毒素、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性毒素、および百日咳毒素などの外毒素；ムラミルジペプチドなど；油−エマルジョンおよび乳化剤ベースのアジュバント（例えば、フロイントのアジュバント、ＳＡＦなど）；粒子性のアジュバント（例えば、リポソーム、生物分解性のミクロスフェアなど）；合成のアジュバント（例えば、非イオン性ブロック共重合体、ムラミルペプチド類似体、ポリホスファゼン、合成のポリヌクレオチドなど）；ポリマー（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５００，１６１号に記載されている、ポリホスファゼン）、Ｑ５７、スクアレン、および／またはテトラクロロデカオキシドを含む。
【０２００】
あるいは、またはさらに、ＭＦ５９（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｉｒｏｎ．ｃｏｍ／ｉｎｖｅｓｔｏｒｓ／ｐｒｅｓｓｒｅｌｅａｓｅｓ／２００５／０５１０２８．ｈｔｍｌ）、ＣＰＧ７９０９（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｏｐｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２２巻、３１３６頁、２００４年）、およびＱＳ２１などのサポニン（参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｈｏｃｈｉｋｙａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４巻、２２７５頁、２００６年）などの新たな化合物が、ヒトワクチンにおけるアジュバントとして現在試験中である。
【０２０１】
さらに、ポリ［ジ（カルボキシラートフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＣＰ；参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｙｎｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１６巻、９２頁、１９９８年）、インターフェロン−γ（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０巻、２３８頁、１９９２年）、ブロック共重合体Ｐ１２０５（ＣＲＬ１００５；参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｔｚら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８巻、２１７７頁、２０００年）、インターロイキン−２（ＩＬ−２；参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｂｗｕｉｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ、８巻、３４７頁、１９９０年）、およびポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ；参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｒｅｕｔｅｒら、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．、７０巻、３６７頁、１９８１年）など、インフルエンザワクチンの免疫原性を増強するために、いくつかのアジュバントが当技術分野において公知である。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物はアジュバントを含まない（例えば、提供する組成物はアジュバントを本質的に含まない）。いくつかの実施形態では、医薬組成物はアラム（ａｌｕｍ）アジュバントを含まない（例えば、提供する組成物はアラムを本質的に含まない）。
【０２０３】
ワクチンの他に、本発明は、ウイルス感染の処置および／またはワクチン接種において有用な他の治療用組成物を提供する。いくつかの実施形態では、処置および／またはワクチン接種は、ＨＡポリペプチドの発現または活性に干渉する薬剤の投与によって実現される。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本発明は、提供するポリペプチドに関連する抗体または他の薬剤を含む医薬組成物を提供する。例えば、本発明は、特定のＨＡポリペプチド（例えば、アンブレラグリカンに結合するＨＡポリペプチド）を含むウイルス粒子を認識する抗体、核酸（ＲＮＡｉに用いることができる、ＨＡ配列に相補的である核酸配列など）、ＨＡ受容体に対する結合を競合するグリカン、グリカン−ＨＡポリペプチド相互作用に競合する小分子もしくはグリコミメティックス（ｇｌｙｃｏｍｏｍｅｔｉｃｓ）、またはこれらのあらゆる組合せを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、多様な構造を有する様々な薬剤の集合物が利用される。いくつかの実施形態では、治療用組成物は１つまたは複数の多価の薬剤を含む。いくつかの実施形態では、処置は曝露または曝露の疑いの直後に緊急投与することを含む。
【０２０５】
一般に、医薬組成物は、それだけには限定されないが無菌の水、食塩水、緩衝食塩水、またはデキストロース溶液を含めた無菌の、生体適合性のキャリアなどの１つまたは複数の不活性な薬剤に加えて、治療剤を含む。あるいは、またはさらに、組成物は、所望の特定の投薬形態に適する、本明細書で用いられる、あらゆる全ての溶媒、分散媒体、希釈液、または他の液体のビヒクル、分散補助剤もしくは懸濁補助剤、崩壊剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存剤、緩衝化剤、固体の結合剤、顆粒化剤、潤滑剤、着色剤、甘味剤、矯味矯臭剤、芳香剤などを含む薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６年；参照により本明細書に組み込まれる）は、医薬組成物を処方する上で用いられる様々な賦形剤、およびこれらを調製するのに公知の技術を公開している。任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的効果を生じさせるか、またはそうでなければ、医薬組成物の任意の他の成分と有害な方法で相互作用することなどにより、ある物質またはその誘導体と不適合性である場合以外は、賦形剤媒体の使用は本発明の範囲内であることが企図される。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物中に存在する治療剤は、本明細書に記載する１つまたは複数の結合剤からなる。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、アンブレラトポロジーグリカンに（および／またはアンブレラトポロジーグリカン類似体に）結合する結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を含んでいる。このようないくつかの実施形態では、本発明の組成物は、アンブレラトポロジーグリカンに結合しない関連の薬剤（例えば、他のＨＡポリペプチドなど）を実質的に含まない。このようないくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、アンブレラトポロジーグリカン以外のＨＡ受容体グリカンに結合する薬剤を５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％以下含む。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、脂質小胞、生物学的に利用可能な、および／または生体適合性の、および／または生物分解性のマトリックス、あるいは他の微粒子内に被包され、捕捉され、または結合されている治療剤を含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、提供する医薬組成物は、凝集していない結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、乾燥重量または数で、１％、２％、５％、１０％、２０％、または３０％未満の結合剤が、凝集物中に存在する。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、提供する医薬組成物は、変性していない結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、投与するＵＴＳＢＡの、乾燥重量または数で、１％、２％、５％、１０％、２０％、または３０％未満が変性している。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、提供する医薬組成物は、不活性ではない結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、投与するＵＴＳＢＡの、乾燥重量または数で、１％、２％、５％、１０％、２０％、または３０％未満が不活性である。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、提供する結合剤の免疫原性を低減するように処方される。例えば、いくつかの実施形態では、提供する結合剤は、その免疫原性をマスクする、ポリエチレングリコールおよび／またはカルボキシメチルセルロースなどの薬剤と関連（例えば、結合）させている。いくつかの実施形態では、提供する結合剤は、免疫原性を低減するさらなるグリコシル化を有する。
【０２１２】
本発明の医薬組成物は、単独で、あるいはそれだけには限定されないがワクチンおよび／または抗体を含めた１つまたは複数の他の治療剤と組み合わせてのいずれかで、投与することができる。「と組み合わせて」は、薬剤を同時に投与しなければならないことも、一緒に送達するように処方しなければならないことも含意しないものとされるが、これらの送達方法は本発明の範囲内である。一般的に、各薬剤が、その薬剤に対して決定された投与量および時間スケジュールで投与される。さらに、本発明は、医薬組成物の生物学的利用能を改善し、その代謝を低減または修飾し、その排泄を阻害し、または身体内のその分布を修飾し得る薬剤と組み合わせた、本発明の医薬組成物の送達を包含する。本発明の医薬組成物を、それを必要とする任意の被験体（例えば、任意の動物）の処置に用いることができるが、ヒトの処置において用いるのが最も好ましい。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物および／または結合剤は、１つもしくは複数の抗ウイルス薬（例えば、オセルタミビル［タミフル］、ザナミビル［リレンザ］など）および／またはシアリダーゼと組み合わせて投与される。
【０２１３】
医薬組成物は、処置および／またはワクチン接種に効果的なあらゆる量およびあらゆる投与経路を用いて投与することができる。必要とされる正確な量は、被験体の種、年齢、および全身状態、感染の重症度、特定の組成、その投与様式、その活性の様式などに応じて、被験体ごとに変化する。医薬組成物は、投与を容易にし、投与量を均一にするための投与量単位形態において処方されるのが典型的である。しかし、本発明の組成物の合計の一日使用量は、担当の医師によって正常な医学的判断の範囲内で決定されることが理解されよう。あらゆる特定の被験体または生物体に対する特定の治療有効投与量レベルは、処置および／またはワクチン接種される障害、障害の重症度、使用される特定のワクチン組成物の活性、投与後の組成物の半減期、被験体の年齢、体重、全身の健康、性別、および食事、投与時間、投与経路、使用される特定の化合物の排泄速度、処置の期間、使用する特定の化合物と組み合わせてまたは同時に用いられる薬物、ならびに医学の技術分野において周知の同様の因子を含めた様々な因子に依存する。
【０２１４】
本発明の医薬組成物は、あらゆる経路によって投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、経口（ＰＯ）、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、動脈内、髄内、くも膜下腔内、皮下（ＳＱ）、脳室内、経皮、皮中（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）、皮内、直腸内（ＰＲ）、膣内、腹腔内（ＩＰ）、胃内（ＩＧ）、局所（例えば、散剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、および／または滴剤によって）、粘膜、経鼻、頬側、経腸、硝子体、舌下を含めた様々な経路によって；気管内滴下、気管支滴下、および／または吸入によって；経口噴射、経鼻噴射、および／またはエアロゾルとして、ならびに／あるいは門脈カテーテルによって投与される。
【０２１５】
一般的に、最も好適な投与経路は、投与される薬剤の性質（例えば、投与時の安定性）、被験体の状態（例えば、被験体が特定の投与様式に耐えることができるか否か）などを含めた様々な因子に依存する。特定の実施形態では、医薬組成物は経鼻投与することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は気管内滴下によって投与することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は気管支滴下によって投与することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は吸入によって投与することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は経鼻噴射として投与することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は粘膜投与することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は経口投与することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は静脈注射によって投与することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は筋肉内注射によって投与することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は皮下注射によって投与することができる。現在、経口もしくは経鼻噴射、またはエアロゾルの経路（例えば、吸入による）が、治療剤を肺および呼吸器系に直接送達するのに最も一般的に用いられている。しかし、本発明は、薬物送達の科学における可能性のある進歩を考慮に入れた、あらゆる好適な経路による本発明の組成物の送達を包含するものである。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、吸入またはエアロゾルの送達のための調製物は複数の粒子を含む。いくつかの実施形態では、このような調製物は、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、または約１３ミクロンの平均粒子サイズを有する。いくつかの実施形態では、吸入またはエアロゾルの送達のための調製物は、乾燥粉末として処方される。いくつかの実施形態では、吸入またはエアロゾルの送達のための調製物は、例えば、湿潤剤を含めることによって、湿潤粉末として処方される。いくつかの実施形態では、湿潤剤は、水、食塩水、または生理学的ｐＨの他の液体からなる群より選択される。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、滴剤として鼻腔または頬側口腔に投与される。いくつかの実施形態では、投与量は複数の液滴（例えば、１〜１００滴、１〜５０滴、１〜２０滴、１〜１０滴、１〜５滴など）を含むことができる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物を、定量の投与量の組成物（例えば、結合剤）を送達するデバイスを用いて投与する。
【０２１９】
本明細書に記載する皮内の医薬組成物の送達において用いるのに適するデバイスは、これら全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８８６，４９９号、米国特許第５，１９０，５２１号、米国特許第５，３２８，４８３号、米国特許第５，５２７，２８８号、米国特許第４，２７０，５３７号、米国特許第５，０１５，２３５号、米国特許第５，１４１，４９６号、米国特許第５，４１７，６６２号において記載されているものなどの短針デバイスを含む。皮内組成物は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９９／３４８５０において記載されているもの、およびこれらの機能上の等価物など、皮膚中への針の効果的な貫入の長さを制限するデバイスによっても投与することができる。液体のワクチンを液体ジェット式注射器によって、または角質層を貫通し、真皮に到達する噴出を生成する針によって、真皮に送達するジェット式注射デバイスも適切である。ジェット式注射デバイスは、例えば、これら全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４８０，３８１号、米国特許第５，５９９，３０２号、米国特許第５，３３４，１４４号、米国特許第５，９９３，４１２号、米国特許第５，６４９，９１２号、米国特許第５，５６９，１８９号、米国特許第５，７０４，９１１号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，８９３，３９７号、米国特許第５，４６６，２２０号、米国特許第５，３３９，１６３号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，５０３，６２７号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第５，５２０，６３９号、米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第４，７９０，８２４号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，９４０，４６０号、ＷＯ９７／３７７０５、およびＷＯ９７／１３５３７に記載されている。圧縮ガスを用いて粉末形態のワクチンを皮膚の外側層を介して真皮へと加速する、弾道的な粉末／粒子の送達デバイスも適する。さらに、従来の注射器を、皮内投与の古典的なマントー法において用いることができる。
【０２２０】
医薬品の処方および製造における全般的な考察は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５年において見出すことができる。
【０２２１】
本発明の医薬組成物を、所望の結果を達成するのに好適な任意の投与量において投与することができる。いくつかの実施形態では、所望の結果は、インフルエンザ感染の１つまたは複数の症状の強度、重症度、および／または頻度における低減、ならびに／あるいは発症の遅延である。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、アンブレラトポロジーグリカンに結合するためのインフルエンザＨＡと競合するのに効果的なある投与量の結合剤を投与するように処方される。いくつかの実施形態では、インフルエンザＨＡによるこのような結合は、このような投与が無いときのレベルと比較して、本発明の組成物の１つまたは複数の投与量を投与した後に低減する。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、組成物を投与する被験体において（例えば、被験体の気道において）存在する少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％超、またはそれを超えるＨＡ結合部位（例えば、アンブレラトポロジーグリカンを含むＨＡ結合部位）を飽和するのに有効なある投与量の結合剤を投与するように処方される。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、所望の治療効果を得るために、１日あたり被験体の体重あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの治療剤を送達するのに十分な投与量レベルを投与することができる。所望の投与量を１回だけ被験体に送達してもよい。所望の投与量を、１日あたり３回を超えて、１日あたり３回、１日あたり２回、１日あたり１回、１日おき、２日おき、毎週、２週ごと、３週ごと、４週ごと、２ヶ月ごと、６ヶ月ごと、１２ヶ月ごと、２年ごと、３年ごと、４年ごと、５年ごと、１０年ごと、または２０年ごとに送達してもよい。いくつかの実施形態では、所望の投与量を、複数の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、またはそれを超えた投与）を用いて送達することができる。
【０２２４】
本発明による組成物を組み合わせ療法において用いることができることが理解されよう。組み合わせレジメンにおいて用いるための特定の組合せの治療法（例えば、治療薬もしくは手順）は、所望の治療薬および／または手順の適合性、ならびに達成すべき望ましい治療効果を考慮に入れる。使用する治療法は同じ目的について所望の効果を達成することがあり（例えば、インフルエンザ感染を処置し、防止し、かつ／または発症を遅らせるのに有用な薬剤を、インフルエンザ感染を処置し、防止し、かつ／または発症を遅らせるのに有用な別の薬剤と同時に投与することがある）、あるいは使用する治療法は異なる効果（例えば、任意の有害効果のコントロール）を達成することがあることが理解されよう。本発明は、医薬組成物の生物学的利用能を改善し、その代謝を低減および／もしくは修飾し、その排泄を阻害し、かつ／または身体内のその分布を修飾し得る薬剤と組み合わせた医薬組成物の送達を包含する。
【０２２５】
本発明による医薬組成物は、単独で、または１つもしくは複数の他の治療剤と組み合わせて投与することができる。「と組み合わせて」は、薬剤を同時に投与しなければならないことも、かつ／または一緒に送達するように処方しなければならないことも含意しないものとされるが、これらの送達方法は本発明の範囲内である。組成物を、１つまたは複数の他の望ましい治療薬または医学的手順と同時に、その前に、またはそれに引き続き投与することができる。組み合わせて利用される治療的に有効な薬剤は、単一の組成物において一緒に投与してもよく、または異なる組成物において別々に投与してもよいことが理解されよう。一般的に、各薬剤は、その薬剤に対して決定された投与量および／または時間スケジュールで投与される。
【０２２６】
一般的に、組み合わせて利用される薬剤は、これらが個々に利用されるレベルを超えないレベルで利用されることが予期される。いくつかの実施形態では、組み合わせて利用されるレベルは、個々に利用されるレベルよりも低い。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数の抗ウイルス薬（例えば、オセルタミビル［タミフル］、ザナミビル［リレンザ］など）および／またはシアリダーゼと組み合わせて投与される。
【０２２８】
診断／キット
本発明は、それだけには限定されないが、血液、血清／血漿、末梢血単核細胞／末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ）、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、皮膚病変スワブ、脳脊髄液、子宮頚部スミア、膿汁試料、食品マトリックス、ならびに脳、脾臓、および肝臓などの身体の様々な部分からの組織を含めた病理学的試料における、結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を検出するための、特に特定のグリカン結合の特徴（例えば、アンブレラグリカンに対する、α２−６シアリル化グリカンに対する、長いα２−６シアリル化グリカンに対する結合など）を有する結合剤を検出するためのキットを提供する。本発明は、それだけには限定されないが、土壌、水、および微生物叢を含めた環境試料における、対象の結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を検出するためのキットも提供する。列挙していない他の試料も適用することができる。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載するＨＡポリペプチド（このようなポリペプチドが結合剤であっても、またはなくても）を検出するためのキットを提供する。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、特定のグリカン結合性の性質を有する結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、ＬＳＢＡ、ＵＴＢＡ、ＵＴＳＢＡなど）を特異的に検出する１つまたは複数の薬剤を含むことができる。このような検出剤は、例えば、ある種の結合剤（例えば、アンブレラグリカンに、および／またはα２−６シアリル化グリカンに、および／または長いα２−６シアリル化グリカンに結合する結合剤）を特異的に認識する抗体を含むことができ、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、および／または免疫ブロット法によってこれらの結合剤を特異的に検出するのに用いることができる。
【０２３１】
ＨＡポリペプチドに対して（例えば、ＨＡポリペプチドバリアントなどの、提供されるＨＡポリペプチドに対して）結合する抗体もウイルス中和試験において用いることができ、ウイルス中和試験では、試料を対象のＨＡポリペプチドに特異的な抗体で処理し、無処理の試料と比べて、培養細胞に感染するその能力について試験する。その試料中のウイルスがこのようなＨＡポリペプチドを含んでいる場合、抗体はウイルスを中和し、ウイルスが培養細胞に感染するのを防ぐ。あるいは、またはさらに、このような抗体をＨＡ阻害試験において用いることもでき、ＨＡ阻害試験ではＨＡタンパク質を所与の試料から単離し、特定のＨＡポリペプチドまたはＨＡポリペプチドのセットに特異的な抗体で処理し、無処理の試料と比べて、赤血球を凝集するその能力について試験する。試料中のウイルスがこのようなＨＡポリペプチドを含んでいる場合、抗体はＨＡポリペプチドの活性を中和し、ＨＡポリペプチドが赤血球を凝集するのを防ぐ。
【０２３２】
【化６】
2013541528.tif 000015
他の実施形態では、このような薬剤は、特定のＨＡポリペプチドをコードし、ＲＴ−ＰＣＲまたはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってこのようなＨＡポリペプチドを特異的に検出するのに用いることができるヌクレオチドに特異的に結合する核酸を含むことがある。
【０２３３】
【化７】
2013541528.tif 000016
いくつかの実施形態では、試料から単離した核酸を増幅した後、検出する。いくつかの実施形態では、診断試薬を検出可能に標識することができる。
【０２３４】
本発明は、インフルエンザウイルスおよびワクチンを産生するための、本発明による試薬を含むキットも提供する。キットの内容は、それだけには限定されないが、対象のＨＡポリペプチド（または特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分）をコードするＨＡヌクレオチド（または特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分）を含む発現プラスミドを含む。あるいは、またはさらに、キットは、対象のＨＡポリペプチド（または特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分）を発現する発現プラスミドを含むことができる。使用者が、対象の任意のインフルエンザウイルスからのＨＡヌクレオチドを組み込むことができるように、ウイルス遺伝子を含まない発現プラスミドも含まれてよい。それだけには限定されないが、ベロおよびＭＤＣＫ細胞系を含む哺乳動物細胞系もキットに含まれてよい。いくつかの実施形態では、診断試薬を検出可能に標識することができる。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、本発明に従って用いるためのキットは、基準の試料、試料を処理加工し、試験を行うための指示書、結果を解釈するための指示書、試験を行うのに必要なバッファーおよび／または他の試薬を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは抗体のパネルを含むことができる。
【０２３６】
本発明のいくつかの実施形態では、上記で論じたグリカンアレイを、診断法および／またはキットとして利用してもよい。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、本発明のグリカンアレイおよび／またはキットを用いて、複数の投与量（例えば、本明細書で論じた通り）において、アンブレラグリカンに対するＨＡポリペプチドの結合を評価するための用量応答試験を行う。このような試験は、試験するＨＡポリペプチドの結合特性についての特に価値ある見識をもたらし、特異的な結合を評価するのに特に有用である。このタイプの用量応答結合試験は多くの有用な適用を見出す。例を１つだけ挙げると、これらの試験は、関連する一連のＨＡポリペプチドバリアントにおける結合特性の進化を追跡する上で、この一連のものが天然の進化によって産生されたものでも、意図的な操作によって産生されたものでも、２つの組合せによって産生されたものでも、役立つことがある。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本発明のグリカンアレイおよび／またはキットを用いて、所望の結合特性を有する結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド、および／またはＨＡポリペプチドバリアントなどのＨＡポリペプチド）を誘導し、同定し、かつ／または選択する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のグリカンアレイおよび／またはキットを用いて、ポリペプチド結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド）の集団に対して進化的な（例えば、スクリーニングおよび／または選択の）圧力をかける。
【０２３９】
本発明は、本発明の医薬組成物を投与するためのキットを提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１投与量の結合剤を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、結合剤の開始の単位投与量およびその後の単位投与量を含むキットを提供する。このようないくつかの実施形態では、開始の単位投与量はその後の単位投与量よりも多く、または２つの投与量は等しい。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、本発明のキット（特に本発明の医薬組成物を投与するためのもの）は、吸入器など、送達デバイスの少なくとも１つの成分を含む。このようないくつかの実施形態では、本発明は、吸入器など、送達デバイスの少なくとも１つの成分、および１投与量の結合剤を含むキットを提供する。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、提供するキットは使用のための指示書を含む。
【実施例】
【０２４２】
（実施例１）
Ｈ２Ｎ２ＨＡバリアント
２０世紀は、１９１８年のスペイン風邪（Ｈ１Ｎ１）、１９５７年〜５８年のアジア風邪（Ｈ２Ｎ２）、および１９６７年〜６８年の香港風邪（Ｈ３Ｎ２）という３つのインフルエンザの汎発流行を目撃した。これらのサブタイプのうち、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２はヒト集団において依然として循環し、毎年の流行、大発生をもたらし、Ｈ１Ｎ１サブタイプは２００９年の「豚インフルエンザ」汎発流行（２００９年Ｈ１Ｎ１）に関与した。Ｈ２Ｎ２サブタイプは１９６８年までにヒトにおける循環を停止したが、Ｈ２サブタイプウイルスは時折ブタおよびトリの種から単離されている。家畜のトリおよびブタにおけるトリＨ２系統の循環により、ヒトがこれらのウイルスに曝露され、ヒト集団にウイルスが再導入される危険性は高まっている。このような再導入により、１９６８年以後に生まれたヒト集団の巨大なサブセットに既存の免疫がないとすると、重大な地球規模の健康上の脅威がもたらされ得る。
【０２４３】
汎発流行インフルエンザウイルスの進化における主なステップの１つは、効率的に複製し、速やかに伝染するために、ウイルスがヒト宿主に適応することを可能にする遺伝子変化を獲得することであり、このことは、ヒトにおける広範で持続的な疾患をもたらす。ウイルスによる宿主の感染における重要な第１のステップは、ウイルス表面の糖タンパク質である血球凝集素（ＨＡ）の、宿主細胞の表面上に発現されたＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を末端とする複雑なグリカンである、シアリル化グリカン受容体に対する結合である。末端から２番目の糖に対してα２→６連結しているＮｅｕ５Ａｃを末端とするグリカンがヒト上気道上皮において優先的に発現され、ヒト適応インフルエンザＡウイルスに対する受容体（以後ヒト受容体と呼ぶ）として働く。一方、末端から２番目の糖残基に対してα２→３連結しているＮｅｕ５Ａｃを末端とするグリカンは、トリ適応インフルエンザウイルスに対する受容体（以後トリ受容体と呼ぶ）として働く。
【０２４４】
ＨＡの、トリ受容体およびヒト受容体との分子相互作用は、グリカン受容体のトポロジーベースの定義を用いて捉えられている。代表的なトリ受容体およびヒト受容体から構成されるグリカンアレイプラットフォームが、ＨＡおよびウイルス全体のグリカン受容体の結合を研究するのに広く用いられている。トリ適応ウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１）、ならびにヒト適応ウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）から組換え発現されたＨＡの、トリおよびヒトの受容体に対する相対的な結合親和性は、これらのＨＡ（またはウイルス全体）を用量依存性の様式においてグリカンアレイプラットフォーム上で分析することによって定量化されている。さらに、ＨＡのグリカンアレイ結合の性質は、ヒト呼吸器組織における生理学的なグリカン受容体に対する結合と相関することが示されている。ヒトにおけるウイルス伝染性を評価するための確立されたモデルであるフェレット動物モデルにおいて、Ｈ１Ｎ１ＨＡのヒト受容体結合親和性は、空気伝搬性のウイルス伝染の効率と相関することが示されている。このような関係はＨ２Ｎ２サブタイプに対しては、未だ示されていない。
【０２４５】
構造および生化学に関する以前の研究により、１９５７〜５８年Ｈ２Ｎ２汎発流行系統に由来する野生型（ＷＴ）および変異型両方のＨＡについての、トリおよびヒトの受容体と、ＨＡの受容体結合部位（ＲＢＳ）との相互作用についての見識がもたらされている。しかし、抗原ドリフトまたは再集合による置換に起因する、ＲＢＳ内およびＲＢＳ近位のアミノ酸間の相互作用における変化は、ＨＡ−グリカン相互作用に対して深刻な効果を有し、この相互作用は次にＨＡのグリカン結合親和性に影響を及ぼすことが最近実証された。この知見は、汎発流行Ｈ２Ｎ２系統のＨＡ配列と比べて配列がかなり異なっている最近のトリ−Ｈ２系統からのＨＡに特に関係がある。したがって、ヒト適応をもたらす可能性がある最近のトリＨ２サブタイプウイルスにおける変化をモニタリングするために、１９５７〜５８年のヒト適応Ｈ２Ｎ２汎発流行ウイルスからのＨＡの親和性と定量的に同じ範囲にあるヒト受容体結合親和性を付与する、トリＨ２サブタイプウイルスのＨＡにおける変異を理解することが重要である。
【０２４６】
本実施例において、本発明者らは、汎発流行および最近のトリＨ２Ｎ２のＨＡのグリカンＲＢＳにおける変異の、それぞれのグリカン結合特異性に対する効果を系統的に分析した。代表的な１９５７〜５８年汎発流行のＨ２Ｎ２系統である、Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／５８（Ａｌｂ５８）からのＨＡを、基準のヒト適応ＨＡとして選択した。代表的なトリＨ２Ｎ２ウイルスであり、トリから単離した最も新しい系統の１つであるＡ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／２００４（ＣｋＰＡ０４）からのＨＡも、この研究において評価した。本発明者らは最初に、これらのトリ適応およびヒト適応Ｈ２Ｎ２ＨＡのグリカン受容体結合親和性およびヒト呼吸器組織結合性質を特徴付けた。ＨＡのグリカン受容体結合親和性を、先に記載した通り、多価ＨＡ−グリカン相互作用における協同性および結合活性を考慮に入れる、見かけの結合定数Ｋｄ’を用いて定量的に定義する。次に、Ａｌｂ５８ＨＡ−ヒト受容体およびＣｋＰＡ０４ＨＡ−トリ受容体の複合体のホモロジーベースの構造モデルを用いて、本発明者らはこれらＨＡのＲＢＳを分析し、ヒト受容体結合親和性をＡｌｂ５８ＨＡの結合親和性と同じ範囲にする、ＣｋＰＡ０４ＨＡにおける変異をデザインし、評価した。
【０２４７】
Ａｌｂ５８ＨＡのグリカン受容体結合特異性の特徴付け
本発明者らは、以前に、見かけの結合定数Ｋｄ’を計算することによって、ＨＡのグリカン受容体結合親和性を定量的に特徴付けるための用量依存性グリカンアレイ結合アッセイを開発している。Ａｌｂ５８ＨＡを組換え発現し、このアッセイを用いて分析した。Ａｌｂ５８ＨＡは、代表的なヒト受容体である６’ＳＬＮ（Ｋｄ’約３５ｐＭ）および６’ＳＬＮ−ＬＮ（Ｋｄ’約５ｐＭ）に高親和性で結合した（図５Ａ）。とりわけ、Ａｌｂ５８ＨＡの６’ＳＬＮ−ＬＮに対する結合親和性は、汎発流行Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８またはＳＣ１８）のＨＡの結合親和性と同じ範囲にある。しかしＳＣ１８ＨＡとは異なり、驚くべきことに、Ａｌｂ５８ＨＡは、代表的なトリ受容体である、グリカンアレイ上の３’ＳＬＮ−ＬＮ（Ｋｄ’約１．５ｎＭ）および３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮ（Ｋｄ’約１ｎＭ）に対しても実質的な結合を示した（図５Ａ）。ヒト上気道気管組織切片上のＡｌｂ５８ＨＡの染色により、タンパク質の、頂端側に対する広範囲な結合（図５Ｂ）が明らかになり、このように、ヒト受容体に対する高親和性の結合と相関していた。さらに、グリカンアレイアッセイにおいて観察されたＡｌｂ５８の実質的なα２→３シアリル化グリカンへの結合は、これらのグリカンを優先的に発現するヒト肺深部肺胞組織に対するＡｌｂ５８の結合にも反映されていた（図５Ｂ）。
【０２４８】
以前の研究は、グリカン受容体結合特異性を決定する上での、Ｈ２Ｎ２ＨＡのＲＢＳにおける２２６位および２２８位のアミノ酸が果たす役割を指摘していた。この知見は、ほとんどのヒトＨ２Ｎ２単離物からのＨＡはそのＲＢＳ内にＬｅｕ２２６およびＳｅｒ２２８を有し、ほとんどのトリＨ２単離物からのＨＡはＧｌｎ２２６およびＧｌｙ２２８を有するという事実を含む。これらの残基の、Ａｌｂ５８ＨＡの定量的なグリカン受容体結合親和性における役割を理解するために、Ａｌｂ５８の変異形態を３つデザインした。これら変異体の２つは、Ｌｅｕ２２６→Ｇｌｎ（Ａｌｂ５８−ＱＳ変異体）およびＳｅｒ２２８→Ｇｌｙ（Ａｌｂ５８−ＬＧ）のアミノ酸変化を１つだけ有していた。第３の変異体は、Ｌｅｕ２２６→Ｇｌｎ／Ｓｅｒ２２８→Ｇｌｙ（Ａｌｂ５８−ＱＧ）の２つのアミノ酸変化を保有していた。
【０２４９】
Ａｌｂ５８−ＬＧ変異体は、ＷＴ  Ａｌｂ５８ＨＡのヒト受容体結合特異性を保持していたが、用量依存性の直接結合アッセイにおいてトリ受容体結合における完全な欠損を示した（図６Ａ）。一方、Ａｌｂ５８−ＱＧ変異体は、ヒト受容体結合における完全な欠損を示したが、Ａｌｂ５８ＨＡとは対照的にトリ受容体に対する実質的な結合を示した（図６Ｂ）。驚くべきことに、Ａｌｂ５８−ＱＳ変異体は、トリおよびヒトのグリカン受容体に対して結合をほとんどまたは全く示さなかった（図６Ｃ）。Ａｌｂ５８−ＱＳの円偏光二色性分析により、Ａｌｂ５８−ＱＳがミスフォールディングされている可能性は除外された。Ａｌｂ５８−ＱＳ変異体のホモロジーベースの構造モデルを構築して、観察された生化学的な結合性質の分子的基礎を調べた。この変異体のグリカン受容体結合部位をモデルにおいて分析すると、Ｓｅｒ２２８が、Ｇｌｎ２２６と水素結合を形成するように配置されていることが示された（図６Ｄ）。Ｇｌｎ２２６とＳｅｒ２２８との間の相互作用が、Ｇｌｎ２２６の、トリ受容体と最適に接触するのに好ましい位置付けを潜在的に破壊している。この知見により、Ａｌｂ５８−ＱＳ変異体におけるトリ受容体結合の欠損に対する説明がもたらされる。さらに、Ｇｌｎ２２６とヒト受容体との間に接触が無いことが、ヒト受容体結合の欠損の説明となり得る。
【０２５０】
ＣｋＰＡ０４のＲＢＳにおける変異およびグリカン受容体結合特異性に対する変異の影響
ＣｋＰＡ０４ＨＡの用量依存性のグリカンアレイ結合は、代表的なトリ受容体である３’ＳＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ、および３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮに対する高親和性の結合を示し、ヒト受容体に対しては最小の結合であった（図７Ａ）。さらに、ＣｋＰＡ０４のグリカンアレイ結合性質は、ヒト肺胞組織に対する広範囲な結合および気管組織の頂端側に対する最小の結合と相関した（図７Ｂ）。
【０２５１】
Ｈ２ＨＡ−グリカン受容体相互作用の分子的局面を理解するために、本発明者らは、ＣｋＰＡ０４−トリ受容体複合体（図８Ａ）およびＡｌｂ５８−ヒト受容体複合体（図８Ｂ）のホモロジーベースの構造モデルを構築した。ＣｋＰＡ０４ＨＡおよびＡｌｂ５８ＨＡのこれらの構造モデルに基づいて、グリカン受容体と相互作用するように位置付けられたアミノ酸を比較した（表７）。
【０２５２】
【表７】
2013541528.tif 000017
２２６位および２２８位における違いの他に、１３７位および１９３位を含めた他の位置において違いが存在した。１３７位および１９３位のアミノ酸は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→６Ｇａｌモチーフおよびヒト受容体の状況ではこのモチーフを超えて糖と相互作用するように（また、Ｈ２ウイルスの現在の系統間での抗原性の変動において潜在的に役割を果たすように；考察を参照されたい）配向される。これらの違いは、Ｈ２Ｎ２ＨＡのヒト受容体結合に潜在的に影響を及ぼす。とりわけ、ＣｋＰＡ０４ＨＡは、初期のトリ適応Ｈ２Ｎ２ＨＡと１３７位および１９３位において異なる。したがって、Ｇｌｎ２２６→ＬｅｕおよびＧｌｙ２２８→Ｓｅｒの置換により、初期のトリ適応Ｈ２Ｎ２ＨＡのＲＢＳは汎発流行のＡｌｂ５８ＨＡのＲＢＳとほとんど同一になっているが、ＣｋＰＡ０４を含めたより最近のトリ適応ＨＡにおいて、さらなるアミノ酸変化が必要とされる。
【０２５３】
上記の分析に基づいて、３セットの変異をＣｋＰＡ０４上で進行的に作製して、ヒト受容体との接触を改善した。第１の変異体はＧｌｎ２２６→Ｌｅｕ／Ｇｌｙ２２８→Ｓｅｒの２つのアミノ酸変化を含む（ＣｋＰＡ０４−ＬＳ）。第２の変異体であるＣｋＰＡ０４−ＴＬＳは、ＣｋＰＡ０４−ＬＳＨＡにおけるさらなるＡｌａ１９３→Ｔｈｒアミノ酸変化を含んでいた。第３の変異体であるＣｋＰＡ０４−ＲＴＬＳは、ＣｋＰＡ０４−ＴＬＳＨＡにおいてさらなるＧｌｎ１３７→Ａｒｇ変異を導入することによって産生した。これらのＨＡ変異体を組換え発現させ、これらの定量的なグリカン受容体結合親和性およびヒト組織結合性質の点で特徴付けた。
【０２５４】
ＣｋＰＡ０４−ＬＳは、ＣｋＰＡ０４と比較して、トリ受容体に対する結合の低下およびヒト受容体に対する実質的な結合を示した（図９Ａ）。ＣｋＰＡ０４−ＴＬＳは、ＣｋＰＡ０４−ＬＳと比較した場合、ヒトおよびトリ両方の受容体に対して実質的に高い結合シグナルを示した（図９Ｃ）。一方、ＣｋＰＡ０４−ＲＴＬＳは、ＣｋＰＡ０４−ＬＳと比較して、ヒト受容体に対する結合シグナルの増大を示し、トリ受容体に対する同様の結合シグナルを示した（図９Ｅ）。ヒト呼吸器組織でのこれらの変異体Ｈ２ＨＡの結合は、これらに観察されるグリカンアレイの結合と一致していた（図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ）。記載したＨＡの用量依存性のグリカン結合データを用いて、結合データをＨｉｌｌの等式に適合させる（多価の結合に対して）ことによってＫｄ’およびｎ値を計算し（全てのＨＡに対してｎは約１．３）、次いでこれを用いて、理論上の結合曲線を生成して、代表的なトリおよびヒトの受容体に対するＷＴおよび変異体のＨ２ＨＡの相対的な結合親和性を明確に区別した（図１０）。ＣｋＰＡ０４−ＬＳのヒト受容体結合親和性（Ｋｄ’約５０ｐＭ）は、Ａｌｂ５８ＨＡの結合親和性（Ｋｄ’約５ｐＭ）の１／１０であった。一方、ＣｋＰＡ０４−ＴＬＳ（Ｋｄ’約３ｐＭ）およびＣｋＰＡ０４−ＲＴＬＳ（Ｋｄ’約８ｐＭ）両方のヒト受容体結合親和性は、ＣｋＰＡ０４−ＬＳの結合親和性より数倍高く、Ａｌｂ５８ＨＡの結合親和性と同じ範囲にあった。ＣｋＰＡ０４−ＴＬＳ（Ｋｄ’約５０ｐＭ）のトリ受容体結合親和性は、ＷＴ  ＣｋＰＡ０４ＨＡ（Ｋｄ’約２０ｐＭ）の結合親和性と同じ範囲であり、ＣｋＰＡ０４−ＬＳ（Ｋｄ’約２２０ｐＭ）およびＣｋＰＡ０４−ＲＴＬＳ（Ｋｄ’約２２０ｐＭ）の結合親和性より数倍高かった。したがって、様々な変異体の中で、ＣｋＰＡ０４−ＲＴＬＳは、相対的なヒト対トリの受容体結合親和性の点で、Ａｌｂ５８ＨＡに最も近かった。本発明者らの構造の理解に基づくと、この知見は、Ｎｅｕ５Ａｃ連結を超えたグリカン受容体との広範囲の接触を含めて、ＣｋＰＡ０４−ＲＴＬＳおよびＡｌｂ５８のＲＢＳは互いに非常に似ているという事実と一致する。
【０２５５】
本発明者らの研究は、ＨＡ−グリカン分子の相互作用の配列および構造の系統的な分析、ならびに、これら相互作用の、ＨＡの生化学的グリカン受容体結合親和性に対する影響を試験するための定量的結合アッセイを統合する価値を強調するものである。
【０２５６】
以前の研究は、汎発流行Ｈ２Ｎ２ＨＡのＲＢＳにおける２２６位および２２８位におけるアミノ酸置換に注目していた。最近、Ａｌｂ５８ウイルス、ならびにＷＴおよび変異型（ＨＡにおける２２６位および２２８位における置換を有する）の関連の汎発流行Ｈ２Ｎ２ウイルスであるＡ／Ｅｌ  Ｓａｌｖａｄｏｒ／２／５７（すなわちＥｌＳａｌｖ５７）のグリカン受容体結合の性質が、グリカンアレイプラットフォーム上で用量依存性の様式においてこれらウイルス全体を分析することによって特徴付けられた。現在の研究において報告された、組換えのＡｌｂ５８ＨＡのグリカン受容体結合の性質は、ウイルス全体を用いて得られた結合の性質と良好に一致する。本発明者らの結果は、２２６位および２２８位における置換の、Ａｌｂ５８ＨＡの定量的なグリカン受容体結合親和性に対する影響を特徴付けることによって、これらの知見をさらに増強するものである。
【０２５７】
以前に留意した２２６位および２２８位の他に、本発明者らのＨ２ＨＡ−グリカン複合体の配列および構造の系統的な分析により、１３７位および１９３位などの他の位置におけるＣｋＰＡ０４ＨＡとＡｌｂ５８ＨＡとの間の違いが明らかになった。ＣｋＰＡ０４における変異を進行的にデザインすることによって、本発明者らは、１３７位および１９３位の置換は（２２６位および２２８位における置換に加えて）、グリカン受容体の結合親和性を相当変えることを実証している。実際、これらのさらなるアミノ酸変化を導入することで（ＣｋＰＡ０４−ＴＬＳおよびＣｋＰＡ０４−ＲＴＬＳ変異体）、ヒト受容体結合親和性において、ＣｋＰＡ０４−ＬＳ変異体の結合親和性に比べて、１０倍の増大がもたらされ、親和性を汎発流行Ｈ２Ｎ２のＨＡ（Ａｌｂ５８）について観察される親和性の範囲にしている。したがって、ＲＢＳにおけるこれらのさらなる位置における変異をモニタリングすることは、Ｈ２ＨＡのグリカン受容体結合親和性における変化を理解するのに役立つ。さらに、これらのさらなる位置は、抗原ループの一部分でもあり、したがって、抗体の中和を回避するためのＨ２ウイルスにおける抗原ドリフトの結果として、一定の置換を受ける可能性がある。これらの変異をモニタリングすることはまた、ワクチン開発において重要な意味があり、最近のトリまたはブタのＨ２ウイルスがヒト集団において足がかりを得ることができるというシナリオが生じるだろう。
【０２５８】
本発明者らの研究において計算した見かけの結合定数Ｋｄ’を主に用いて、グリカンに対するＨＡの定義した空間的配置（全てのＨＡについて固定されている）を考慮に入れることによって、様々な組換えＨＡの相対的な結合親和性を比較する。ヒトにおける効果的なウイルスの伝染性に影響を及ぼす様々な因子の中で、本発明者らは１９１８年の汎発流行Ｈ１Ｎ１および最近公表された２００９年の汎発流行Ｈ１Ｎ１の両方において、ヒト受容体に対する結合親和性（Ｋｄ’を用いて定量化した）は、フェレットにおける呼吸器の液滴によるウイルスの伝染性と相関することを示した。Ａｌｂ５８ＨＡのヒト受容体結合親和性がＳＣ１８ＨＡの結合親和性と同じ範囲にあることは、Ａｌｂ５８ウイルスの効果的な呼吸器の液滴による伝染と併せると、Ｈ２Ｎ２ウイルスに対し、この相関を拡大するものである。さらに、Ａｌｂ５８ウイルスはフェレットにおいて呼吸器の液滴によって効果的に伝染することを考えると、本発明者らの結果は、トリ受容体からヒト受容体の結合への完全な切換えは、インフルエンザＡウイルスＨＡのヒト適応の決定的な決定要因ではないという事実を強調する。Ａｌｂ５８ＨＡの定量的なグリカンアレイ結合およびヒト組織結合両方の結果は、実質的なトリ受容体結合を示す。そうではなく、ヒト受容体に対する高親和性の結合は、Ｈ２ＨＡが他のヒト適応ウイルスのサブタイプ（Ｈ１およびＨ３）と共有する共通因子であると思われ、したがって、この性質は効果的なヒト適応および伝染についての重要な決定要因であると思われる。要約すると、本発明者らの研究は、現在循環しているトリＨ２インフルエンザＡウイルスのＨＡにおけるヒト適応変異の進化をモニタリングするための価値ある戦略を提供する。
【０２５９】
本開示は、本明細書で報告する絶対的および／または相対的な結合親和性を特徴とする、Ｈ２ＨＡポリペプチドの最初の記載を報告する。本開示は、このようなＨ２ＨＡポリペプチドを提供することが可能であることを確立しているので、当業者であれば、このような絶対的および／または相対的な結合親和性を同様に特徴とする他のＨ２ＨＡポリペプチド（例えば、本明細書において明確に試験されたＨ２ＨＡポリペプチドの特異的な配列と比較して１つまたは複数の配列の変動を含む）を調製することができることを理解されよう。本発明はしたがって、高親和性でアンブレラトポロジーグリカンに対する結合を示すことを特徴とするＨ２ＨＡポリペプチドを提供する。
【０２６０】
例えば、いくつかの実施形態では、Ｈ２ＨＡポリペプチドのアンブレラグリカンに対する結合は、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡについての親和性の、１０倍またはそれ未満の範囲内（例えば、９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、２倍、１．５倍など）である。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、Ｈ２ＨＡポリペプチドの、アンブレラグリカンに対する結合は、ヒトの感染を媒介する（例えば、ヒト伝染性である）野生型ＨＡについて比較可能な条件下で観察されるものの、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の親和性を有する。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、Ｈ２ＨＡポリペプチドは、多価グリカンアレイ結合アッセイにおいて、約４０００００超（例えば、約５０００００、約６０００００、約７０００００、約８０００００などを超える）の、アンブレラトポロジーグリカンに対する結合についてのシグナルを示す。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、Ｈ２ＨＡポリペプチドは、約１．５ｎＭから約２ｐＭの範囲内の、アンブレラトポロジーグリカンに対する親和性（Ｋｄ’）を示す。いくつかの実施形態では、Ｈ２ＨＡポリペプチドは、結合アッセイにおいて、約１００ｐＭまたはそれを超える（例えば、約２００ｐＭ、約３００ｐＭ、約４００ｐＭ、約５００ｐＭ、約６００ｐＭ、約７００ｐＭ、約８００ｐＭ、約９００ｐＭ、約１ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．５ｎＭを超えるなど）、コーントポロジーグリカンに対する結合についてのＫｄ’を示す。いくつかの実施形態では、Ｈ２ＨＡポリペプチドは、結合アッセイにおいて、アンブレラトポロジーグリカンに対して、約５００ｐＭまたはそれ未満（例えば、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約４ｐＭ、約３ｐＭ、約２ｐＭ未満など）のＫｄ’を示し、コーントポロジーグリカンに対して約１００ｐＭまたはそれを超える（例えば、約２００ｐＭ、約３００ｐＭ、約４００ｐＭ、約５００ｐＭ、約６００ｐＭ、約７００ｐＭ、約８００ｐＭ、約９００ｐＭ、約１ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．５ｎＭを超えるなど）Ｋｄ’を示す。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、Ｈ２ＨＡポリペプチドは、アンブレラグリカン対コーングリカンについて、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１０，０００、約１００，０００まで、またはそれを超える、相対的親和性を示す。いくつかの実施形態では、Ｈ２ＨＡポリペプチドは、コーントポロジーグリカンに対するそれらの親和性の約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１０００％、約２０００％、約３０００％、約４０００％、約５０００％、約６０００％、約７０００％、約８０００％、約９０００％、約１０，０００％または約１０，０００％超の、アンブレラトポロジーグリカンに対する親和性を示す。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、Ｈ２ＨＡポリペプチドは、ヒト上気道組織（例えば、上皮細胞）におけるＨＡ受容体上に見出されるグリカンの、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９５％超に対して結合する。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、Ｈ２ＨＡポリペプチドは、対応するヒト適応ＨＡ（例えば、ヒト適応Ｈ２ＨＡ、例えば、図１に示すものなど）に顕著に存在する特定の残基（例えば、１３７位、１４５位、１８６位、１８７位、１８９位、１９０位、１９２位、１９３位、２２２位、２２５位、２２６位、２２８位）のアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、ＨＡポリペプチドバリアントなどの提供するＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ２ＨＡポリペプチドバリアントなどのＨ２ＨＡポリペプチド）は、対応するヒト適応ＨＡ（例えば、ヒト適応Ｈ２ＨＡ）において見出される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、Ｈ２ＨＡポリペプチドは、野生型Ｈ２ＨＡ配列と異なる配列を有する。
【０２６７】
材料と方法
ＣｋＰＡ０４ＨＡ−およびＡｌｂ５８ＨＡ−グリカン構造複合体のホモロジーベースのモデリング
共結晶構造のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７Ｈ２Ｎ２ＨＡ−ヒト受容体（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＷＲ７）およびＡ／ｃｋ／ＮｅｗＹｏｒｋ／９１−トリ受容体（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＷＲ２）を、それぞれＡｌｂ５８−ヒト受容体およびＣｋＰＡ０４−トリ受容体の構造複合体をモデリングするためのテンプレートとして用いた。ホモロジーモデリングを、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬウェブベースのプログラム（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ．ｈｔｍｌ）を用いて行った。
【０２６８】
ＨＡのクローニング、変異誘発、および発現
Ａｌｂ５８およびＣｋＰＡ０４のプラスミドは、それぞれＴｅｒｒｅｎｃｅ  Ｔｕｍｐｅｙ博士およびＡｄｏｌｆｏ  Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ博士からもたらされた。ヒトおよびトリのＷＴのＨ２Ｎ２のＨＡ遺伝子をｐＡｃＧＰ６７Ａベクター中にサブクローニングして、昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現用に、それぞれｐＡｃＧｐ６７−Ａｌｂ５８−ＨＡおよびｐＡｃＧｐ６７−ＣｋＰＡ０４−ＨＡを産生した。テンプレートとしてｐＡｃＧｐ６７−ＣｋＰＡ０４−ＨＡを用いて、遺伝子を変異させて、ｐＡｃＧｐ６７−ＬＳ−ＨＡ［Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ］、ｐＡｃＧｐ６７−ＴＬＳ−ＨＡ［Ａｌａ１９３Ｔｈｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ］、およびｐＡｃＧｐ６７−ＲＴＬＳ−ＨＡ［Ｇｌｎ１３７Ａｒｇ、Ａｌａ１９３Ｔｈｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ］を産生した。変異誘発用のプライマーを、ＰｒｉｍｅｒＸ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｐｒｉｍｅｒｘ／）を用いてデザインし、ＩＤＴ  ＤＮＡテクノロジー（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成した。変異誘発反応を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ）を用いて行い、Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）を用いて製造元の指示に従って、Ａｌｂ５８、ＣｋＰＡ０４、ＣｋＰＡ０４−ＬＳ、ＣｋＰＡ０４−ＴＬＳ、およびＣｋＰＡ０４−ＲＴＬＳバキュロウイルスをそれぞれのプラスミドから作り出した。バキュロウイルスを用いて、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で培養したＳｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の３００ｍｌ懸濁培養物に感染させた。感染させた培養物をモニタリングし、感染４〜５日後に収集した。可溶性の三量体形態のＨＡを、先に記載したプロトコールの改変を用いて、感染させた細胞の上清から精製した。簡潔に述べると、上清を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて濃縮し、三量体のＨＡを、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を充填したカラムでのアフィニティークロマトグラフィーを用いて濃縮した細胞上清から収集した。ＨＡを含む画分を一緒にプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１００Ｋ  ＮＭＷＬメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて限外ろ過にかけた。タンパク質をＰＢＳ中で再構成し、濃縮した。精製したタンパク質の濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄのプロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ）を用いて決定した。
【０２６９】
用量依存性の直接グリカンアレイ結合アッセイ
多価ＨＡ−グリカン相互作用を調べるために、先に記載した通り、ストレプトアビジンプレートアレイは、代表的なビオチン化α２→３およびα２→６シアリル化グリカンを含んだ。グリカン、３’ＳＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮは代表的なトリ受容体である。６’ＳＬＮおよび６’ＳＬＮ−ＬＮは代表的なヒト受容体である。ＬＮはラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）に相当し、３’ＳＬＮおよび６’ＳＬＮはそれぞれ、ＬＮに連結しているＮｅｕ５Ａｃα２−３およびＮｅｕ５Ａｃα２−６に対応する。ビオチン化グリカンはＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓから、これらのリソースリクエストプログラム（ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｒｅｑｕｅｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍ）によって入手した。ストレプトアビジンコーティングした高結合能力３８４ウエルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を、２．４μＭのビオチン化グリカン５０μｌを有するウエルを４℃で一夜インキュベートすることによって、各ウエルの全容量までローディングした。過剰のグリカンを、ＰＢＳで広範囲に洗浄することによって除去した。
【０２７０】
三量体のＨＡ単位は、ＨＡモノマー３個（したがって各モノマーに対して１個ずつの、ＲＢＳ３個）で構成される。ストレプトアビジンプレートアレイのウエルにおけるビオチン化したグリカンの空間的配置は、三量体ＨＡ単位における３個のＨＡモノマーのうちの１個だけに結合するのに都合がよい。したがって、ＨＡ−グリカン相互作用における多価性を特に増強するために、組換えＨＡタンパク質を４：２：１（ＨＡ：１次：２次）の比率で１次抗体および２次抗体と予め複合体を形成した。全てのＨＡについてのプレ複合体における三量体のＨＡ単位４個の同一の配置により、これらのグリカン結合親和性間の比較が可能になる。
【０２７１】
好適な量の、４：２：１の比率における、ヒスチジンでタグ付けしたＨＡタンパク質、１次抗体（マウス抗６Ｘ  ＨｉｓタグＩｇＧ）、および２次抗体（ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ）（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含むストック溶液を、氷上で２０分間インキュベートした。予め複合体を形成したストックＨＡの好適な量を、ＰＢＳ中１％ＢＳＡで２５０μｌに希釈した。この予め複合体を形成したＨＡ５０μｌをグリカンコーティングした各ウエルに加え、室温で２時間インキュベートし、その後上記の洗浄ステップを続けた。結合シグナルを、ＨＲＰ活性に基づいて、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を用いて製造元の指示に従って決定した。実験を３回行った。グリカンなしのウエルに対する予め複合体を形成した単位の結合、およびグリカン有りのウエルに対する抗体単独の結合を含めた陰性対照において、最小の結合シグナルが観察された。Ｈ２ＨＡ−グリカン結合について、結合のパラメータである協同性（ｎ）および見かけの結合定数（Ｋｄ’）を、直線化した形態のＨｉｌｌの等式：
【０２７２】
【数１】
2013541528.tif 000018
［式中、ｙは飽和度（平均の結合シグナル／観察された最大の結合シグナル）である］
に対して、シグナル平均値（３回の分析からの）およびＨＡ濃度を適合させることによって計算した。Ｈｉｌｌの等式：
【０２７３】
【数２】
2013541528.tif 000019
（ｎおよびＫｄ’のセットのパラメータに対して）
を用いて計算した理論上のｙ値を、ＨＡの変化する濃度に対してプロットして、図１０に示す、代表的なヒト（６’ＳＬＮ−ＬＮ）およびトリ（３’ＳＬＮ−ＬＮ）の受容体に対する結合曲線を得た。
【０２７４】
ヒト呼吸器組織結合アッセイ
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した、正常ヒト気管および肺胞の組織切片を、それぞれＵＳ  ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌおよびＵＳ  Ｂｉｏｍａｘから購入した。組織切片を６０℃のハイブリダイゼーションオーブン中で３０分間インキュベートしてパラフィンを溶かした。過剰のパラフィンを、キシレン中で複数回洗浄することによって除去した。切片を引き続き、一連のエタノール洗浄中で再水和した。非特異的な結合を防ぐために、切片を、室温（ＲＴ）で３０分間、ＰＢＳ中１％ＢＳＡで予めブロックした。ＨＡ−抗体プレ複合体を産生するために、ヒスチジンタグ付けして精製した組換えＨＡ（Ａｌｂ５８、ＣｋＰＡ０４、ＬＳ、およびＴＬＳ）を、ｈｉｓタグに対する１次抗体（マウス抗６Ｘ  Ｈｉｓタグ、Ａｂｃａｍ）、および２次（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体と（それぞれ４：２：１の比率）、氷上で２０分間インキュベートした。組織切片を、ＨＡ−抗体の予め複合体を形成した単位（１％ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて様々な最終濃度に希釈した）とＲＴで３時間インキュベートした。次いで、切片をヨウ化プロピジウムとＲＴで２０分間インキュベートして核を対比染色した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＴＢＳＴ中１：１００）。徹底的に洗浄した後、切片をマウントし、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて分析した。
【０２７５】
【数３】
2013541528.tif 000020
【０２７６】
【数４】
2013541528.tif 000021
【０２７７】
【数５】
2013541528.tif 000022
【０２７８】
【数６】
2013541528.tif 000023
（実施例２）
本発明の結合剤の動物宿主における試験
本明細書に記載する通り、本発明は、ウイルス伝染試験のために動物宿主（例えば、フェレット）を用いることで、ヒトのウイルス伝染の信頼できる指標を提供することができるという認識を包含する。同様に、本発明は、ウイルスの伝染試験のために本発明の結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド）で処置した動物宿主（例えば、フェレット）を用いることで、ヒト宿主におけるウイルスの防止および処置のためのこのような本発明の結合剤の効力の信頼できる指標を提供することができるという認識を包含する。
【０２７９】
本実施例は、本発明の結合剤の存在下または非存在下で、適切な動物モデルにおけるウイルス伝染を決定するのに用いることができるウイルス伝染アッセイを記載する。フェレットなどの動物宿主は、動物間の直接的および間接的な接触を防ぐ、隣接するケージ中に収容することができる。しかし、これらの収容条件では、インフルエンザウイルスが空気を介して拡散される。第１の部分の動物に、有効量のウイルスを、鼻腔内などの当技術分野において公知の方法によって接種する（「接種動物」）。次いで、ナイーブの動物を、１、２、３日後またはそれ以降、接種動物に隣接するケージ内に導入することができる。
【０２８０】
本試験において用いる動物は、分析のために接種または伝染の１、２、３日後またはそれを超える日にちの任意の時間に屠殺することができる。ウイルス伝染試験に適する分析は、それだけには限定されないが、数ある中で、感染性ウイルスの力価の決定（例えば、鼻洗浄液による）、動物における身体的症状の観察（例えば、嗜眠、食欲不振、鼻漏、くしゃみ、高熱、および／または死亡）、呼吸器組織の免疫組織化学的分析を含むことができる。
【０２８１】
上記に記載したウイルス伝染アッセイは、ウイルスの接種または伝染の前、間、または後の、動物宿主の、本明細書に記載した本発明の結合剤での処置も組み込むことができる。次いで本明細書に記載する分析方法を用いて、動物宿主のウイルスによる伝染および／または感染の阻害における結合剤（複数可）の効力を決定する。
【０２８２】
等価物
当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的実施形態の多数の等価物を認識することも、日常的な実験だけを用いて確認することもできる。本発明の範囲が上の記載に限定されることは意図されず、次の特許請求の範囲において記載の通りである。
【図１Ａ】
2013541528.tif 000024
【図１Ｂ】
2013541528.tif 000025
【図１Ｃ】
2013541528.tif 000026
【図１Ｄ】
2013541528.tif 000027
【図１Ｅ】
2013541528.tif 000028
【図２Ａ】
2013541528.tif 000029
【図２Ｂ】
2013541528.tif 000030
【図２Ｃ】
2013541528.tif 000031
【図２Ｄ】
2013541528.tif 000032
【図２Ｅ】
2013541528.tif 000033
【図３】
2013541528.tif 000034
【図４−１】
2013541528.tif 000035
【図４−２】
2013541528.tif 000036
【図４−３】
2013541528.tif 000037
【図４−４】
2013541528.tif 000038
【図４−５】
2013541528.tif 000039
【図４−６】
2013541528.tif 000040
【図４−７】
2013541528.tif 000041
【図４−８】
2013541528.tif 000042
【図５】
2013541528.tif 000043
【図６】
2013541528.tif 000044
【図７】
2013541528.tif 000045
【図８Ａ】
2013541528.tif 000046
【図８Ｂ】
2013541528.tif 000047
【図９−１】
2013541528.tif 000048
【図９−２】
2013541528.tif 000049
【図９−３】
2013541528.tif 000050
【図１０】
2013541528.tif 000051
【図１１】
2013541528.tif 000052
【図１２−１】
2013541528.tif 000053
【図１２−２】
2013541528.tif 000054
【図１２−３】
2013541528.tif 000055
【図１２−４】
2013541528.tif 000056
【図１２−５】
2013541528.tif 000057
【図１２−６】
2013541528.tif 000058
【図１３】
2013541528.tif 000059
【図１４Ａ】
2013541528.tif 000060
【図１４Ｂ】
2013541528.tif 000061
【図１５】
2013541528.tif 000062
【図１６】
2013541528.tif 000063
【図１７】
2013541528.tif 000064
【図１８−１】
2013541528.tif 000065
【図１８−２】
2013541528.tif 000066
【配列表】
2013541528000001.app
【国際調査報告】
2013541528.tif 000067
2013541528.tif 000068
2013541528.tif 000069