(57)【要約】  この発明は、抗不整脈作用を有する化合物を特定する方法、並びに前記作用を有する化合物の特定のためのアデノシン−ジホスホ−リボースシクラーゼ（心臓ＡＤＰＲＣ）の使用に関する。【化１】2013532987.tif 000005
2013532987.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗不整脈作用を有する化合物を特定する方法であって、その方法が、
−心臓アデノシン−ジホスホ−リボースシクラーゼ（心臓ＡＤＰＲＣ）を提供することと、
−心臓ＡＤＰＲＣを化合物と接触させることと、及び
−化合物の存在下で、心臓ＡＤＰＲＣの活性を決定することを含んでなり、
上記方法において、コントロールと比較してＡＤＰＲＣの活性の低下が、化合物の抗不整脈作用を示すことを特徴とする、前記特定方法。
【請求項２】
心臓ＡＤＰＲＣが、細胞内膜結合性心臓ＡＤＰＲＣ、特に筋小胞体膜結合性心臓ＡＤＰＲＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
心臓ＡＤＰＲＣが、哺乳類起源、特にヒト、ブタ又はラット、殊にブタ、又はヒト心臓由来のものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
心臓ＡＤＰＲＣの活性が、心臓ＡＤＰＲＣの基質の生成物への変換を測定することによって決定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
基質が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドグアニジンジヌクレオチド（ＮＧＤ）又はニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（ＮＨＤ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
心臓ＡＤＰＲＣの活性が、蛍光によって決定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、化合物ライブラリーをスクリーニングするために使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、自動化フォーマット、特にハイスループットフォーマットで行なわれる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
抗不整脈作用を有する化合物の特定のための心臓ＡＤＰＲＣの使用。
【請求項１０】
心臓ＡＤＰＲＣが、更に請求項２又は３に記載のように定義される、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、抗不整脈作用を有する化合物を識別する方法、及び前記作用を有する化合物の識別のための心臓のアデノシン−ジホスホ−リボースシクラーゼ（心臓ＡＤＰＲＣ）（cardiac adenosine−diphospho−ribose cyclase(cardiac ADPRC)）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去数十年で、心臓血管疾患の処置は計り知れない経済的及び社会的重要性を増している。実際に、欧米世界では、心臓血管疾患はこれまで割合別に見た死亡率の原因のリストの１位の座を占めている。心臓血管疾患の最も脅かされる例の１つは、心律動異常とも呼ばれている心臓不整脈が代表的なものである。心臓不整脈は、心臓の異常な電気的活動が示されることを特徴とする対象における病態に関連する。結果として、心臓は不規則に、あるいは脈拍が遅延又は加速して鼓動しうる。過去数１０年にわたって、数多くの異なった種類及び度合いの不整脈が述べられてきている。多くの不整脈は対象集団内で正常な一類型と見なされうるが、一部は心停止及び突然死に繋がりうる重篤な疾患、又は生命を脅かす医学的な非常事態までになる。心臓の速いリズムは、心房細動、心房粗動、心室頻拍、及び心室細動の可能性がある。注目すべきことに、症状がない場合でさえ、心臓不整脈は、患者に生命を脅かす脳卒中または塞栓症の素因を与える可能性がありうる。不整脈を引き起こしうる種々の分子的要因があり、このことは、診断及び／又は治療目的のための新規な薬剤を特定することを間違いなくかなり困難にしている。
【０００３】
治療的に不整脈を制御し、あるいは診断的に不整脈を検出する関連で、心臓の速いリズムを抑制するいくつかの抗不整脈薬が開発されてきた。多くの場合、この抗不整脈薬はそれらの分子標的に関連する４つのグループに分類されている。クラスＩの薬剤は、ナトリウムチャネルを妨害し、それによって心臓活動電位の立ち上がりに対する作用を有し、クラスＩＩの薬剤は、βアドレナリン受容体を妨害し、それによって心臓の交感神経活動を減少させるカテコールアミンに拮抗し、クラスＩＩＩの薬剤は、カリウムチャネルを妨害し、それによって再分極を遅延し、そしてクラスＩＶの薬剤は、カルシウムチャネルを妨害する。これに加えて、他のいくつかの薬剤が抗不整脈作用を有しうる。アデノシンは、Ａ1−アデノシン受容体に相互作用し、それによってカリウムチャネルをモジュレートする。心臓グリコシドは心筋ナトリウム／カリウム−ＡＴＰアーゼを阻害する。副交感神経遮断薬は、ムスカリンＭ２及びＭ４受容体を遮断し、そして交感神経興奮様薬は、心筋のβ１受容体を活性化する。
【０００４】
要約すれば、当技術分野において知られている抗不整脈薬は、主として制限された選択性と関連する安全性問題を伴うイオンチャネル遮断薬である。これらは、受容体が完全に心臓特異的であるわけではないので、重篤な副作用を生み出し、そしてそれらは催不整脈作用（proarrhythmic effects）を引き起こすリスクを生み出しさえする可能性がありうる。これに加えて、他の薬剤に相互作用する薬剤が多い。それ故、知られている抗不整脈薬の代替物を開発するニーズが依然として存在する。こうした代替薬は知られている標的を標的とする薬剤を改良するだけではなく、他のイオンチャネル又は受容体などの他の分子標的構造を対象とすべきである。
【０００５】
驚くべきことに、我々は心臓のアデノシン−ジホスホ−リボースシクラーゼ（心臓のＡＤＰＲＣ）のアンタゴニストはまた、抗不整脈作用を有しうることを見出した。
【０００６】
ビスフェニル化合物が一般的に、アデノシン−ジホスホ−リボースシクラーゼ（ＡＤＰＲＣ）を阻害しうることが最近実証されている（特許文献１）が、ＡＤＰＲＣ全般の、特に心臓ＡＤＰＲＣの阻害剤の抗不整脈作用については当技術分野で未だ開示されていない。
【０００７】
それ故、この発明において、不整脈作用が心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤の場合に見出されたことは驚くべきことであった。ここにおいて、心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤が心臓ＡＤＰＲＣの酵素活性の測定に基づく方法によって特定された。可能性のある心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤を含むサンプルを阻害剤非添加のサンプルと比較した。更に、こうした結果は電気生理学的記録によって確認された。
【０００８】
心臓不整脈の適応以外に、心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤は、それを必要とする対象における心不全、虚血性心疾患及び突然心臓死を処置又は予防する方法、及び／又は罹患している、又は罹患している可能性のある、又はそのリスクにさらされている対象における心不全、虚血性心疾患及び／又は突然心臓死の診断をする方法の場合に使用されうる。心臓ＡＤＰＲＣが、心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤の更なる適応症になりうる肺動脈高血圧症の発症に関与している場合がありうるという追加の証拠が存在する。それ故、心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤は、それを必要とする対象における肺動脈高血圧症を処置又は予防する方法の場合に、及び／又は罹患している、又は罹患している可能性のある、又はそのリスクにさらされている対象における肺動脈高血圧症を診断する方法の場合に使用されうる。
【０００９】
これまで、ＡＤＰＲＣ一般の不整脈特性を試験すること、及び特に心臓ＡＤＰＲＣを標的とする抗不整脈性化合物を試験することは、適切な試験系及びスクリーニングアッセイが存在しないために依然として制限されているので、上述の使用のための有用なＡＤＰＲＣ阻害剤は、当技術分野では特定されておらず、そして開示されていなかった。
【００１０】
従って、アデノシン−ジホスホ−リボースシクラーゼ（ＡＤＰＲＣｓ）の生理学的、病態生理学的及び生化学的役割については、それらは極めて関心のある治療標的でありうるけれども、未だ十分には解明されているわけではなく、それ故、そうしたものに相互作用する、特にそれを活性化するか、又は不活性化する薬剤を開発し、特定し、及び／又は特徴付けることが望ましい。その結果、アデノシン−ジホスホ−リボースシクラーゼ（ＡＤＰＲＣ）、及びそれをモジュレートする物質の機能及び制御を検討する方法が必要であり、他の薬物の１つ又は複数のデメリットを避け、又は回避することが必要である。試験方法は、例えば、ライブラリーの試験を可能にし可能性のある治療薬でありうる新規な心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤またはアクティベーターを検出するためにハイスループットスクリーニングに適していることが望ましい。
【００１１】
これまで、当技術分野において知られている方法では、心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤の抗不整脈作用は、抗不整脈性心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤をスクリーニングし、そして特定するのに利用可能な適切な方法が存在していないために確認されていなかった。それ故、心臓筋小胞体膜中でのＡＤＰＲＣ活性を決定するための、そして化合物ライブラリーをスクリーニングするための、新規な方法の開発によって、予想外に抗不整脈性心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤を検出することが導かれた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ ０８／８２１６９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
驚くべきことに、活性な心臓ＡＤＰＲＣの存在下で化合物の抗不整脈活性及び基質の変換を決定する方法、並びに抗不整脈作用を有する化合物を特定する方法が見出された。
【００１４】
従って、この発明の第一の局面では、抗不整脈作用を有する化合物を特定する方法であって、その方法が、
−心臓のアデノシン−ジホスホ−リボースシクラーゼ（心臓ＡＤＰＲＣ）を提供することと、
−心臓ＡＤＰＲＣを化合物と接触させることと、及び
−化合物の存在下で、心臓ＡＤＰＲＣの活性を決定することを含んでなり、
上記方法において、コントロールと比較してＡＤＰＲＣの活性の低下が化合物の抗不整脈作用を示すことを特徴とする、前記特定方法に関する。
【００１５】
一般的に、アデノシン−ジホスホ−リボースシクラーゼ（心臓ＡＤＰＲＣ）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（nicotinamide adenine dinucleotide（ＮＡＤ））からサイクリックアデノシンジホスホリボース（cyclic adenosine diphosphoribose（ｃＡＤＰＲ））の生成を触媒する。更に、これらはまた、他の種々の反応、例えば、ｃＡＤＰＲ加水分解、又は塩基交換反応を介してニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からニコチン酸アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＡＤＰ）の生成を触媒することが示されてきた。哺乳類では、下記の２つの異なったＡＤＰＲＣが特定されている：ＣＤ３８及びＣＤ１５７。最近になって、これに加えて、ＡＤＰＲＣが脳、腎臓、血管及び心臓から単離されている。興味深いことに、それらの特性は、ＣＤ３８及びＣＤ１５７とは異なることが判明し、そしてそうした活性に対する分子相関は特定されていない。心臓ＡＤＰＲＣは、心臓、とりわけ脊椎動物、特に哺乳類の心臓において見出されたＡＤＰＲＣとして知られている。心臓ＡＤＰＲＣを単離する方法は、この明細書中に詳述されており、更に実施例中に説明されている。心臓ＡＤＰＲＣは、心臓細胞の筋小胞体からのカルシウム放出を調節することが判明している。
【００１６】
この発明の文脈では、用語“心臓アデノシン−ジホスホ−リボースシクラーゼ（cardiac adenosine-diphospho-ribose cyclase）”又は“心臓ＡＤＰＲＣ（cardiac ADPRC）”は、特に、哺乳類起源の心臓ＡＤＰＲＣに、より詳細には、ヒト、ブタ、ラット又はモルモット（guinea pig）の心臓ＡＤＰＲＣに、更により具体的には、ヒト又はブタの心臓ＡＤＰＲＣに、最も具体的には、ヒト又はブタの心臓の心臓ＡＤＰＲＣに関する。この発明の文脈では、呼称“心臓ＡＤＰＲＣ（cardiac ADPRC）”、“アデノシン−ジホスホ−リボースシクラーゼ（adenosine-diphospho-ribose cyclase）”、“アデノシンジホスホリボースシクラーゼ（adenosine diphospho ribose cyclase）”、“アデノシン−ジホスホ−リボシルシクラーゼ（adenosine-diphospho-ribosyl cyclase）”、“アデノシン−二リン酸−リボースシクラーゼ（adenosine-diphosphate-ribose cyclase）”、“アデノシン−二リン酸−リボシルシクラーゼ（adenosine-diphosphate-ribosyl cyclase）”、“ＡＤＰ−リボースシクラーゼ（ADP-ribosecyclase）”、“ＡＤＰリボースシクラーゼ（ADP ribose cyclase）”、“ＡＤＰリボシルシクラーゼ（ADP ribosyl cyclase）”及び“ＡＤＰ−リボシルシクラーゼ（ADP-ribosyl cyclase）”及び類似呼称は、互換性があるものと見なされるものとする。
【００１７】
用語“心臓ＡＤＰＲＣ（cardiac ADPRC）”とは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）からサイクリックアデノシンジホスホリボース（ｃＡＤＰＲ）の生成を触媒する、心臓から単離された任意の酵素を意味しうる。
【００１８】
心臓ＡＤＰＲＣはまた、その官能性誘導体をすべて含みうる。心臓ＡＤＰＲＣの関連では、用語“官能性誘導体（functional derivative）”とは、ＡＣＰＲＣに対して、６０％を超える、好ましくは、８０％を超える、より好ましくは、８５％を超える、更により好ましくは、９０％を超える、更により好ましくは、９５％を超える配列同一性を有するタンパク質、最も好ましくは、心臓ＡＤＰＲＣに対して９７％を超える同一性を有するタンパク質、そして少なくとも５％を超える、少なくとも１０％を超える、少なくとも２０％を超える、少なくとも３０％を超える、少なくとも４０％を超える、少なくとも５０％を超える、少なくとも６０％を超える、少なくとも７０％を超える、少なくとも８０％を超える、少なくとも９０％を超える、少なくとも９５％を超える、少なくとも９７％を超える、又は少なくとも１００％を超える、それぞれの野生型タンパク質の酵素活性を有するタンパク質を意味する。
【００１９】
これに代えて、又はこれに加えて、この心臓ＡＤＰＲＣ又はその官能性を付与した誘導体（functionalized derivatives）は、他の１つ又は複数の分子とコンジュゲートし、結合し、又は融合することができる。心臓ＡＤＰＲＣとコンジュゲートし、結合し、又は融合したこうした分子はまた、“タグ（tags）”とも称される。心臓ＡＤＰＲＣの官能性誘導体には、好ましくは、以下のもの；
１つ又は複数のタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質、又はストレプトアビジン（ＳｔｐＡ）若しくはジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）などの結合タンパク質）、１つ又は複数の脂質若しくはリピドイド（lipidoids）、１つ又は複数の小分子色素（例えば、Ｃｙ色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５）、Ａｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５４６、Ａｌｅｘａ ６４７）、Ｓ色素（Ｓ０３８７）、そのフルオレセイン（fluorescein）及びその官能性誘導体（例えば、ＦＩＴＣ）、ローダミン、ＨＯＥＣＨＳＴ色素など、又はＵＶ／Ｖｉｓ色素、例えば、ｐ−ニトロフェニルモイエティ、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０（Coomassie Brilliant Blue G-250）のような蛍光色素）、１つ又は複数の量子ドット（quantumdots）、１つ又は複数の結合モイエティ（例えば、ビオチン、メトトレキサート、グリココルチコイド、又は例えば、１つ又は複数の活性エステル、イソチオシアネート、マレイミド（maleimids）又はその組み合わせを含むモイエティ）、１つ又は複数の可溶性及び／又は不溶解性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ））、官能性を付与した表面（functionalized surfaces）（例えば、アミノ反応性又はマレイミドミクロアレイスライド（amino reactive or maleimide microarray slides））、１つ又は複数の抗体若しくはその誘導体（例えば、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体、ダイアボディ（diabodies）、トリアボディ（triabodies）、フレキシボディ（flexibodies）、タンダブ（tandab：タンデムダイアボディ））、１つ又は複数のスピン標識（spin labels）、１つ又は複数の酵素標識（例えば、ペニシリナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、マイクロビーズ又はナノビーズ（例えば、官能性を付与したシリカビーズ（functionalized silica beads）、シュガーベースビーズ（sugar-based beads））、ポリマーソーム（polymersomes）及び／又はリポソーム；
とコンジュゲートし、結合し、又は融合している心臓ＡＤＰＲＣが言及されうるが、しかしこれらのものには限定されえない、他の分子とコンジュゲートし、又は結合している心臓ＡＤＰＲＣとして理解されうる。
【００２０】
更に、心臓ＡＤＰＲＣの官能性誘導体はまた、例えば、シンチレーションアッセイ、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）に適している、3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ又はランタノイド系元素（lanthonoids）で標識されているか、又は陽電子放出型断層撮影法（ＰＥＴ）に適している標識を用いている、放射活性物質で標識された心臓ＡＤＰＲＣを意味しうる。心臓ＡＤＰＲＣは、重同位体で、例えば、質量分析法（例えば、ＥＳＩ−ＭＳ又はＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって、又は核磁気共鳴法（ＮＭＲ）によって検出可能な2Ｈ、13Ｃで標識することができる。
【００２１】
更に、心臓ＡＤＰＲＣの官能性誘導体はまた、翻訳後修飾の官能性生成物（functional
products）、他の分子にコンジュゲートした心臓ＡＤＰＲＣの官能性誘導体又は心臓ＡＤＰＲＣの官能性コンジュゲート及び／又は放射活性標識心臓ＡＤＰＲＣでありうる。翻訳後修飾は、当技術分野で周知であり、いくつかのアミノ酸モイエティのリピド化、リン酸化、硫酸化、グルコシル化、トランケーション、環化、ポリペプチド連鎖の環化、酸化、還元、脱カルボキシル化、アセチル化、アミド化、脱アミド化、ジスルフィド結合生成、ピログルタミン酸生成、アミノ酸付加、コファクター付加（例えば、ビオチン化、ヘム付加）及び金属イオン、非金属イオン、ペプチド若しくは小分子体の複合体生成及び鉄−スルフィドクラスターの付加が含まれるが、これらに限定されない。ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＨ＋Ｈ+、ＮＡＤＰ+、ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+、イオンなどの結合のようなコファクターに非共有結合した心臓ＡＤＰＲＣはまた、こうしたコファクターの生物学的作用とは無関係に、心臓ＡＤＰＲＣの官能性誘導体として理解されうることが明白である。心臓ＡＤＰＲＣはまた、酵素活性に必要であるか、あるいは酵素活性を維持する、複合化したコファクター、及び／又は心臓ＡＤＰＲＣを維持するか、又は阻害するか、又は心臓ＡＤＰＲＣの酵素活性に影響を与えない、複合化するか、若しくは結合した塩、イオン及び非荷電性分子を含みうる。
【００２２】
更に、心臓ＡＤＰＲＣの官能性誘導体はまた、心臓ＡＤＰＲＣの変異形態にも関連しうる。心臓ＡＤＰＲＣのこうした変異形態又は変異心臓ＡＤＰＲＣは、変化したＤＮＡ又はＲＮＡ配列によってコードされた心臓ＡＤＰＲＣ、心臓ＡＤＰＲＣのスプライス変種（splice variant）又は別の種（例えば、ウイルスＡＤＰＲＣ、バクテリアＡＤＰＲＣ）に起源する心臓ＡＤＰＲＣを意味しうるが、それらに限定されることはない。心臓ＡＤＰＲＣをコードする変化したＤＮＡ又はＲＮＡ配列は、試験個体群の間で自然的に発生しうるか、あるいは人工的起源でありうる。個体群に自然的に発生する心臓ＡＤＰＲＣをコードする変化したＤＮＡ配列には、特に治療的関心がありえ、それ故、またこの発明の関連では関心がありうるところである。
【００２３】
心臓ＡＤＰＲＣ又はその官能性誘導体は、任意の手段によって提供されうる。本明細書において、用語“提供すること（providing）”とは、最も広い意味で理解することができ、心臓ＡＤＰＲＣを得るのに使用することができる当技術分野において知られているようないかなる生化学的又は生物工学的手段を含むが、それらには限定されることはない。あるいは、必要な量の心臓ＡＤＰＲＣは、凍結ストックから解凍することができるし、及び／又は商業上、又は非商業上の供給者を通して得ることができる。
【００２４】
心臓ＡＤＰＲＣは、ヒト以外の、犠死動物から直接的に抽出することにより、ヒトを含む動物からの生体又は死体からの生検サンプルにより、手術又は診断処置において使用されていない、ヒトを含む動物からの組織を用いることにより、又は細胞培養、組織培養により、及び／又は生物工学的手法を用いることにより得ることができる。
【００２５】
心臓ＡＤＰＲＣを、ヒト以外の犠死動物から、あるいは生検サンプルを通して得る場合には、所望の器官又は組織、好ましくは心臓又は心臓組織を外植し、そして心臓全体、その心室及び／又は乳頭筋又は組織などの所望の部分（複数を含む）を抽出する。このサンプルを活動電位に関する方法のために設置することができる。更に、メンブレン（membranes）、特に、筋小胞体メンブレンをKranias et al. （Biochim. Biophys. Acta, 709, 28-37, 1982）によって開示されているように、心臓から抽出することができる。抽出した生物材料から脂肪及び結合組織を除去することができ、そして適切なバッファー中で均質化することができ、このバッファーは冷却した水溶性バッファーが好ましく、中性ｐＨの冷却した水溶性バッファーがより好ましい。このバッファーは、心臓ＡＤＰＲＣをその活性な形態で維持しうることが好ましく、このバッファーの選択により、例えば、酵素の変性を回避し、そして好ましくは、化合物（複数を含む）及び／又は基質（複数を含む）の沈殿を回避する。これを遠心分離し、そして上清をろ過することができる。このサンプルは、数回遠心分離し、ろ過することが好ましい。この結果生じるペレットを、好ましくは、心臓ＡＤＰＲＣ活性を維持しながら、水溶性バッファー中、好ましくは、中性ｐＨの水溶性バッファー中で再懸濁することができる。こうした遠心分離及び再懸濁工程は、数回繰り返すことができる。最後に、意図した測定に適するタンパク質濃度を調整することができる。好ましくは、このタンパク質濃度は、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌでありえ、より好ましくは、０．５〜５０ｍｇ／ｍｌであり、更により好ましくは、０．５〜２５ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましくは、５〜１０ｍｇ／ｍｌでありうる。所望により、この懸濁液は凍結し、凍結状態で、好ましくは、−２０℃〜−８０℃の温度で貯蔵してもよい。
【００２６】
所望により、ＡＤＰＲＣタンパク質は、当技術分野で知られている任意の手段によって精製することができる。好ましくは、このＡＤＰＲＣタンパク質は、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ及び／又はＵＰＬＣ、あるいはその組み合わせを含む（但し、これらに限定されない）クロマトグラフィー方法によって精製する。より好ましくは、ＡＤＰＲＣタンパク質は、アフィニティクロマトグラフィー及び／又はＦＰＬＣによって精製される。更により好ましくは、使用するクロマトグラフィービーズは、タンパク質を選択的に結合させるのに適している表面官能性化（surface fuctionalization）がなされる。本明細書では、用語“選択的に（selectively）”は、密接に関連するタンパク質の結合を排除しておらず、それ故、他のタンパク質及び／又は他の分子構造とわずかに非特異的結合することを排除しておらず、但し、好ましくは、ＡＤＰＲＣタンパク質に結合するものと理解されうる。この文脈において、“結合させるのに適する表面官能性化（surface functionalization suitable for binding）”とは、ＡＤＰＲＣタンパク質の固定化リガンドから構成されうる。こうしたリガンドは、共有結合で、それとも非共有結合で表面にリンクすることができ、これらは共有結合でリンクするのが好ましい。この文脈では、用語“リンクされ（linked）”と“コンジュゲートされ（conjugated）”とは、互換性があるものと理解されうる。所望により、このリガンドは、当技術分野において知られているようなリンカー（例えば、ＰＥＧリンカー、アルキルリンカー、脂肪酸リンカー、又はペプチドリンカー）を介してクロマトグラフィービーズの表面にコンジュゲートする。このリガンドは、ＡＤＰＲＣの相互作用のパートナーとして知られていても、それとも知られていなくてもよい。好ましくは、このリガンドは、ＡＤＰＲＣの知られている相互作用のパートナーである。より好ましくは、このリガンドは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドグアニジンジヌクレオチド（ＮＧＤ）、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（ＮＨＤ）、Ａ００１１０２５８９又はＳＷ６４８２５である。ＡＤＰＲＣタンパク質を含む粗溶液を、上記に言及したビーズを含むカラムに加えることができ、その流速はＡＤＰＲＣタンパク質の結合が達成されるように調整される。次いでカラムを、ＡＤＰＲＣタンパク質がビーズに結合するのを妨害せず、しかしながら他のタンパク質及び／又は他の種類の分子の含有量を減少させる適切なバッファー溶液で洗浄する。最後に、ＡＤＰＲＣをＡＤＰＲＣタンパク質を溶離するのに適したバッファーで溶離する。
【００２７】
これに代えて、ＡＤＰＲＣタンパク質は、ゲル電気泳動、好ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、より好ましくは、タンパク質が分解及び／又は変性しない、ＰＡＧＥをベースとした電気泳動、例えば、当技術分野で知られているブルーネイティブ電気泳動（Blue Native Electrophoresis）によって精製することができる。更に、２Ｄ電気泳動（例えば、２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及び／又はアイソエレクトリックフォーカシング（isoelectric focusing）（ＥＦ）などの特殊な電気泳動法が、ＡＤＰＲＣタンパク質を精製するのに使用することができる。
【００２８】
あるいは、このＡＤＰＲＣタンパク質は、沈殿によって精製することができる。これは、溶解されたＡＤＰＲＣタンパク質を含むバッファー溶液に、徐々に添加剤の濃度を増加させることによって達成することができる。こうした添加剤には、無機及び有機塩、エタノール、メタノール又はアセトン、あるいはその混合物が含まれるが、それらに限定されない。これに代えて、沈殿は塩濃度を減少させること（例えば、サンプルを透析することによる）によって、この溶液を加熱するか、又は冷却するかによって、あるいはせん断応力（shear stress）を使用することによって達成することができる。
【００２９】
あるいは、ＡＤＰＲＣタンパク質は、ビーズ沈殿によって精製することができる。この場合、このタンパク質を選択的に結合させるのに適する表面官能性化されているビーズが使用される。本明細書中では、用語“選択的に（selectively）”は、密接に関連するタンパク質の結合を排除しておらず、それ故、他のタンパク質及び／又は他の分子構造とわずかに非特異的結合することを排除しておらず、但し、好ましくは、ＡＤＰＲＣタンパク質に結合する活性と理解されうる。この文脈において、“結合させるのに適する表面官能性化（surface functionalization suitable for binding）”とは、ＡＤＰＲＣタンパク質の固定化リガンドから構成されうる。こうしたリガンドは、共有結合で、それとも非共有結合で表面にリンクすることができ、これらは共有結合でリンクするのが好ましい。この文脈では、用語“リンクされ（linked）”と“コンジュゲートされ（conjugated）”とは、互換性があるものと理解されうる。所望により、このリガンドは、当技術分野において知られているようなリンカー（例えば、ＰＥＧリンカー、アルキルリンカー、脂肪酸リンカー、又はペプチドリンカー）を介してクロマトグラフィービーズの表面にコンジュゲートする。このリガンドは、ＡＤＰＲＣの相互作用のパートナーとして知られていても、それとも知られていなくてもよい。好ましくは、このリガンドは、ＡＤＰＲＣの知られている相互作用のパートナーである。より好ましくは、このリガンドは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドグアニジンジヌクレオチド（ＮＧＤ）、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（ＮＨＤ）、Ａ００１１０２５８９又はＳＷ６４８２５である。このビーズを、ＡＤＰＲＣタンパク質を含む粗溶液に加えることができる。このビーズ及びタンパク質溶液を、ＡＤＰＲＣタンパク質をビーズに結合することを可能にする条件下にてインキュベートする。次にこのビーズを１回又はそれより多い回数、洗浄する。好ましくは、洗浄は遠心分離によって行なわれる。最後に、ＡＤＰＲＣタンパク質を、当技術分野で知られている適切なバッファーを用いることによってビーズから分離する。
【００３０】
所望により、上記に述べられている精製方法を、互いに組み合わせてもよいし、それとも当技術分野で知られている他の精製方法と共に組み合わせてもよい。精製したタンパク質を含む溶液は、所望により、当技術分野において知られている任意の手段によって、脱塩してもよいし、それともバッファーを変更してもよい（例えば、透析、スピンカラム、クロスフローシステム、イオン交換クロマトグラフィーなど）。更に、このタンパク質は、当技術分野の当業者に知られている方法（例えば、スピンカラム、クロスフローシステムなど）によって濃縮されてもよい。この溶液の塩の含有量及びタンパク質含有量が意図する更なる使用のために調整することができる。
【００３１】
精製されたＡＤＰＲＣタンパク質は、アッセイにおいて使用することができ、そして／又は本出願において具体的にしたような官能性アッセイ（functional assay）において解析することができる。更に、この精製ＡＤＰＲＣタンパク質は、アミノ酸シークエンシングの場合に使用することができる。アミノ酸シークエンシングのための数多くの方法は、当技術分野の当業者に周知であり、これには、化学シークエンシング方法（例えば、エドマン分解、バーグマン分解（Bergmann degradation））、マスフィンガープリンティング（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、又は質量分析法によるシークエンシング（mass spectrometric sequencing）（ＥＳＩ−ＭＳ，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）が含まれるが、これらに限定されない。所望により、質量分析法によるシークエンシングは、当技術分野の当業者に知られているＭＳ−ＭＳ又はＭＳn試験によって行なわれる。この場合、このタンパク質又はそのフラグメントはイオン化される（好ましくは、ＥＳＩ又はＭＡＬＤＩイオン源による）。所定の質量範囲のイオンが選択され、分離される。次いでイオン化されたペプチドフラグメントは、一部は分解され、そし分解物が分析される。このことは１回（ＭＳ−ＭＳ）又はｎ回（ＭＳn）行うことができる。通例、ＭＳnシークエンシングは、イオントラップ（ion trap（ＩＴ））又はＦＴＩＣＲシステムを用いることによって行なわれる。タンパク質又はそのペプチドフラグメントのアミノ酸配列が特定される。
【００３２】
ＡＤＰＲＣタンパク質のアミノ酸配列又はそのペプチドフラグメントの配列は、それぞれのアミノ酸配列及び／又は核酸配列（すなわち、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列）を、タンパク質中、及び／又は当技術分野の当業者に知られているゲノムデータバンク（例えば、PubMed, SwissProtなど）中で見出すのに使用することができる。
【００３３】
あるいは、この心臓ＡＤＰＲＣは、細胞又は組織培養から得ることができる。この細胞培養では、関心のある有機体、好ましくは、この有機体からの関心のある組織が起源でありうる。同様に、組織培養では、関心のある有機体、好ましくは、この有機体からの関心のある組織が起源でありうる。細胞又は組織はまた、関心のあるタンパク質、すなわち、官能性心臓ＡＤＰＲＣタンパク質（functional cardiac ADPRC protein）を発現させる能力を持ちうる。細胞は増殖することが可能であってもよいし、それとも増殖することが不可能であってもよい。この発明の文脈では、用語“細胞培養（cell culture）”とは、エキソビボで細胞を培養する、当技術分野で開示されている方法のすべてを意味する。すなわち、細胞は、培地で、適切な温度で培養することができる。培地は、栄養素（例えば、シュガー、塩、アミノ酸及び脂質）、バッファー系（しばしば、１つ又は複数の化学バッファー物質（例えば、毒性が低いか、または毒性のない、リン酸塩類（phosphates）、リン酸水素類（hydrogen phosphates）、及び／又はトリス（Tris）及び／又は炭酸ガス（carbon dioxide（ＣＯ2）gassing）を含む）、及び／又は所望により１つ又は複数の抗生物質を含むことができる。数多くの適切な細胞培地が商業上入手可能である。
【００３４】
十分な量の栄養素を提供するために、及び／又は代謝産物を除去するために、必要な場合には、好ましくは、定期的に培地を交換することができる。細胞は通例、およそ５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2及び比較的高い相対湿度（例えば、９０％容量（capacity））及び細胞に適した温度を含んでなる適切な雰囲気で培養される。温度は細胞に依存して変化しうる（例えば、哺乳類及び昆虫細胞：約３７℃、イースト：約２８℃、大部分のバクテリア：２０〜３７℃）。
【００３５】
また、この心臓ＡＤＰＲＣは、関心のある細胞で発現させてもよいし、又は過剰発現させてもよいし、及び／又は非相同発現させてもよい。この文脈では、用語“細胞（cell）”とは、バクテリア細胞又は真核細胞を意味しうる。用語“過剰発現した（overexpressed）”とは、官能性ＡＤＰＲＣの発現レベルが関連のある細胞で自然的発現レベルと比較してより高い状態を意味する。過剰発現は、心臓ＡＤＰＲＣ又はその前駆体の発現を刺激する化学化合物を添加するか、あるいは、当技術分野において知られている１つ又は複数の生物工学的方法によって達成させることができる。用語“非相同的に発現した（heterologously expressed）”とは、それぞれの種類の心臓ＡＤＰＲＣ又はその前駆体（複数を含む）が、自然的に発現しない有機体における発現を意味する。
【００３６】
この発明の文脈では、生物工学的方法は、遺伝情報をコードする１つ又は複数の分子の使用に依存している任意の方法に関連しうる。好ましくは、遺伝情報をコードする分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）でありうる。この発明の文脈では、用語“ＤＮＡ”はまた、ＤＮＡの官能性誘導体又は置換体［例えば、メチル化ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ（morpholinos）又はロックト核酸（locked nucleic acids）（ＬＮＡ）、色素、タンパク質、ペプチド、脂質又は小分子などにコンジュゲートしたＤＮＡ］を含む。同様に、この発明の文脈では、用語“ＲＮＡ”はまた、その官能性誘導体又は置換体［例えば、メチル化ＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ（morpholinos）又はロックト核酸（locked nucleic acids）（ＬＮＡ）、色素、タンパク質、ペプチド、脂質又は小分子などにコンジュゲートしたＲＮＡ］を含む。最も好ましくは、遺伝情報をコードしている分子はＤＮＡである。関心のあるＤＮＡは、自然的な起源から得ることができ、特に関心のある細胞、より詳細には、心筋細胞から抽出することができ、あるいは化学的に合成することができる。これは、当技術分野において開示されており、かつ当技術分野の当業者に周知である、ゲノムから、又はｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。得られたＤＮＡは、当技術分野において周知の１つ又は複数の生物工学的方法によって増幅してもよいし、あるいはしなくてもよい（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、バクテリア中の増幅、好ましくは、増殖バクテリア、逆転写酵素、又は真核細胞内増幅、好ましくは増殖真核細胞）。
【００３７】
心臓ＡＤＰＲＣ又はその前駆体をコードする核酸、特にＤＮＡを、下記を含んでなる当技術分野において知られている任意の手段によって関心のある細胞に導入することができる（但し、下記に限定されない）：エレクトロポレーション、摂取を容易にする分子（例えば、リポフェクタミン、カチオン性脂質又はリピドイド（lipidoids）、疎水性脂質又はリピドイド（hydrophobe lipids or lipidoids）、カチオン性合成ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、疎水性ポリマー、細胞透過性ペプチド（cell-penetrating peptides）（ＣＰＰ）、抗菌性ペプチド、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ポリサッカライド（例えば、キトサン）、ウイルス様粒子、ＤＮＡ−又はＲＮＡ−相互作用タンパク質との複合体化、摂取を容易にする分子（例えば、リポフェクタミン、カチオン性脂質、疎水性脂質又はリピドイド（hydrophobe lipids or lipidoids）、カチオン性合成ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、抗菌性ペプチド、タンパク質トランスダクションドメイン（ＰＴＤ）、他のトランスフェクション剤又はその組み合わせ）とのコンジュゲーション、関心のある細胞を感染させることができるウイルス及び／又はウイルスのファージゲノム及び／又はファージ内挿入（例えば、バキュロウイルス、アデノウイルス又はワクシニアウイルス）、マイクロビーズ又はナノビーズ、ポリマーソーム、リポソーム、凍結−解凍サイクル及び／又は遺伝子銃（gene gun）方式（例えば、金ビーズに基づく）。核酸、特にＤＮＡ又はその官能性誘導体は、直線状であっても、それとも環状であってもよい（例えば、プラスミド、バクテリアゲノム又はウイルスゲノム）。
【００３８】
所望の遺伝子情報をコードする分子、特にＤＮＡは、宿主細胞のゲノム中に挿入してもよいし、それとも染色体外であってもよい（例えば、プラスミドのような）。用語“宿主細胞（host cell）”とは、それがバクテリア細胞であるか、それとも真核細胞であるかどうかにかかわらず、そしてその細胞が自然的に心臓ＡＤＰＲＣを発現しようと、心臓ＡＤＰＲＣを発現しないかどうかにかかわらず、遺伝子を発現する細胞を意味する。好ましくは、外来の宿主細胞は、バクテリア細胞であってもよいし、それとも細胞株の細胞であってもよい。適切な細胞株の例には、ＨＥＫ ２９３、７４５−Ａ、Ａ−４３１、ＢｘＰＣ３、Ｃ５Ｎ、Ｃａｃｏ−２、Ｃａｐａｎ−１、ＣＣ５３１、ＣＦＰＡＣ、ＣＨＯ、ＣＨＯ Ｋ１、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＣＶ−１、ＥＡＨＹ、ＥＡＨＹ ９２６、Ｆ９８、ＧＨ３、Ｈ−２９５Ｒ、Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ、ＨＡＣＡＴ、ＨＡＣＡＴ Ａ１３１、ＨＥＫ、ＨＥＬ、ＨｅＬａ、Ｈｅｐ Ｇ２、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｈｓ ７６６Ｔ、ＨＴ２９、ＨＵＶ−ＥＣ Ｒ２４、ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ、ＩＥＣ １７、ＩＥＣ １８、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ ５６２、ＫＡＲＰＡＳ−２９９、Ｌ ９２９、ＬＩＮ １７５、ＭＡｔ−ＬＹＬＵ、ＭＣＦ−７、ＭＮＥＬ、ＭＲＣ−５、ＭＴ４、Ｎ６４、ＮＣＴＣ ２５４４、ＮＤＣＫ ＩＩ、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＮＴ２／Ｄ１、Ｐ１９、ＳＦ９、ＳＫ−ＵＴ−１、ＳＴ、ＳＷ ４８０、ＳＷＵ−２ ＯＳ、Ｕ−３７３、Ｕ−９３７、及びＹ−１が含まれるが、これらに限定されない。他の適切な細胞は、当技術分野における当業者に知られているものである。
【００３９】
好ましくは、所望の遺伝子情報をコードする分子、好ましくはＤＮＡは、関心のある遺伝子、プロモーター領域、開始コドン及び終止コドンを含んでなる。遺伝子情報は、持続的に発現されてもよいし、それともレプレッサー及び／又はプロモーター領域の制御下にて発現されてもよい。得られた細胞は、直接使用してもよいし、又は組織培養のために使用されてもよく、又は細胞を回収し、そして心臓ＡＤＰＲＣを含むサンプルを、細胞を破壊することによって得ることができる。細胞は、当技術分野において知られている任意の手段によって破壊することができ、その手段は以下を含むがそれらに限定されない：音波破砕、低張緩衝液、洗剤、ウルトラタラックス（UltraTurrax）、フレンチプレス（French press）、凍結−解凍サイクル、機械的ホモジナイゼーション及びスクラッチング（mechanical homogenization and scratching）。
【００４０】
あるいは、ＤＮＡ又はＲＮＡは、細胞内で使用してもよいし、無細胞発現系で使用してもよく、これには、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡを固定化し、そして翻訳し、及び／又は、転写及び／又は翻訳に必要な因子（酵素、リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ヌクレオチド、ＡＴＰなど）を含んでいる官能性細胞溶解物（functional cell lysate）を添加することによって転写するマイクロアレイシステムがある。
【００４１】
または、この心臓ＡＤＰＲＣはまた、組織培養で発現させることができる。用語“組織培養（tissue culture）”とは、三次元ネットワークを生成する細胞群が培養される方法を意味する。この組織は、細胞自体によって培養物中に生成されてもよいし、あるいは細胞によって作成される細胞外マトリクスを生成してもよく、この培養物は自然的、又は人工的な細胞外マトリクス（例えば、コラーゲン、エラスチン、ポリスチレン、ナイロン、ポリリシン）によって培養することができ、あるいはこの組織は、ヒトを含む動物から得ることができる。この組織培養は、培地で、適切な温度で培養することができる。培地は、栄養素（例えば、シュガー、塩、アミノ酸及び脂質）、バッファー系（しばしば、１つ又は複数の化学バッファー物質（例えば、毒性が低いか、または毒性のない、リン酸塩類（phosphates）、リン酸水素類（hydrogen phosphates）を含む）、及び／又はトリス（Tris）及び／又は炭酸ガス（carbon dioxide(CO2)gassing）、及び／又は所望により１つ又は複数の抗生物質を含むことができる。十分な量の栄養素を提供するために、及び／又は代謝産物を除去するために、必要な場合には、培地を交換することができる。所望により、この組織培養は、培地で灌流することができる。この灌流は、持続的でも、又はパルス灌流（permanent or pulsed perfusion）でもよい。
【００４２】
要約すると、必要な量の心臓ＡＤＰＲＣは、任意の手段によって提供することができ、例えば、（ｉ）心臓ＡＤＰＲＣを自然的起源から得ることによって、又は（ｉｉ）当技術分野において周知の生物工学的な方法による。この心臓ＡＤＰＲＣは、溶液中、例えば、バッファー中、又はメンブレン中、若しくはメンブレンで、又は細胞中、組織中、器官中、又は有機体中にあってもよい。心臓ＡＤＰＲＣの例示的な源に関する更なる詳細は、本発明の実施例中に与えられている。当業者であれば、現行の方法に関連して、必要な生物学的及び化学的材料のソーシングを意図する具体的な試験設計に適合させることが可能であろう。
【００４３】
本発明を通して、用語“化合物（compound）”とは、あらゆる化学特質をもつ任意の試験物質を意味しうる。表示“化合物（compound）”は、“薬剤（agent）”、“物質（substance）”又は“化学物質（chemical substance）”と互換性があるものと理解されうる。これは、サイズが５００ダルトン未満の分子量を有する小分子又はその塩、タンパク質、ポリペプチド、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、合成ポリマー、抗体及び／又は抗体誘導体（例えば、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体、ダイアボディ（diabodies）、トリアボディ（triabodies）、フレキシボディ（flexibodies）、タンダブ（ｔａｎｄａｂｓ：タンデムダイアボディ））などの高分子量化合物を意味しうる。この化合物は、荷電されていても、あるいは荷電されていなくてもよい。更に、この化合物は、親水性であっても、疎水性であっても、あるいは両親媒性であってもよい。この化合物は、１つ又は複数の無機塩、１つ又は複数の塩イオン（salt ions）、１つ又は複数の金属、１つ又は複数の無機塩又はイオンの１つ又は複数の複合体（complexes）及び／又は１つ又は複数の金属の複合体（好ましくは、１つ又は複数の有機分子と複合体化している）でありうる。あるいは、この化合物はガスであってもよい。好ましくは、この化合物は、水溶性バッファー又は水溶性溶媒に可溶性でありうる。この化合物は、既に薬物又は薬剤として使用されていてもよい。あるいは、この化合物はまた、治療的使用が知られていない化学物質であっても、それとも更にアッセイでは使用されている知られていない化学特性を有する物質でもよい。更に、用語“化合物（compound）”はまた、この方法中で使用されている分子の前駆体として機能しうる物質を含んでいてもよい。具体的には、これは測定の直前に合成することが必要である不安定な物質の場合に当てはまる場合がありうる。こうした場合には、当技術分野において周知であるような共役酵素反応（coupled enzyme assay）が当てはまる場合がある。これに加えて、これは、薬理学においてしばしば使用されるようなプロドラッグ、すなわち、それらの作用を示す前に代謝される必要がある分子に当てはまる場合がありうる（例えば、活性化合物のアセチル化された、脂質付加された（lapidated）又は酸化された前駆体）。
【００４４】
これに代えて、又はこれに加えて、この化合物は、小分子、ペプチド、タンパク質、ポリサッカライド又は合成ポリマーなどの１つ又は複数の他の分子とコンジュゲート又は結合することができる。好ましくは、これは、１つ又は複数の小分子色素（例えば、Ｃｙ色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５）、Ａｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５４６、Ａｌｅｘａ ６４７）、Ｓ色素（例えば、Ｓ０３８７）、フルオレセイン（fluorescein）及びその官能性誘導体（例えば、ＦＩＴＣ）、ローダミン、HOECHSＴ色素などのような蛍光色素、又はＵＶ／Ｖｉｓ色素）、１つ又は複数の量子ドット（quantumdots）、１つ又は複数の結合モイエティ（例えば、ビオチン、グリココルチコイド、又は例えば、１つ又は複数の活性エステル、イソチオシアネート、マレイミド（maleimids）又はその組み合わせを含むモイエティ）、１つ又は複数の可溶性及び／又は不溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ））、１つ又は複数のスピン標識（spin labels）、１つ又は複数の、及び／又はマイクロビーズ又はナノビーズ（例えば、官能性を付与したシリカビーズ（functionalized silica beads）、シュガーベースビーズ（sugar-based beads）、ポリマーソーム（polymersomes））にコンジュゲートすることができる。更に、この化合物は、シンチレーションアッセイ、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）に適している、例えば、3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ又はランタノイド系元素（lanthonoids）で、又は陽電子放出型断層撮影法（ＰＥＴ）に適している標識で、放射性標識することができる。心臓ＡＤＰＲＣは、重同位体で、例えば、質量分析法（例えば、ＥＳＩ−ＭＳ又はＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって、又は核磁気共鳴法（ＮＭＲ）によって検出可能な2Ｈ、13Ｃで標識することができる。
【００４５】
本明細書中で使用される際には、用語“方法（method）”とは、実験活性又は手順として最も広い意味で理解されうる。これは、好ましくは、化学的、生化学的、生物学的、薬理学的、生理学的、電気生理学的、病理生理学的、毒物学的、医薬的及び／又は治療的手順を意味しうる。
【００４６】
本明細書中で使用される際には、用語“アッセイ（assay）”とは、“アッセイ（assay）”、“試験システム（test system）”、“試験（test）”、“スクリーニング（screening）”、“スクリーニング手順（screening procedure）”、“スクリーニング方法（screening method）”、“スクリーニングアッセイ（screening assay）”、“スクリーニング手法（screening technique）”、“実験手順（experimental proceeding）”、“実験手順（experimental procedure）”などのような表示にかかわらず、最も広い意味で理解されうる。これは、いくつかの特性を有する化合物を特定するのに、又はある種の化合物を特徴付けるのに使用することができるすべての手段として理解されるであろう。これは１つ又は複数のサンプルを試験すること、並びに数多くのサンプルを含むライブラリーをスクリーニングすることを含みうる。
【００４７】
この方法を行なうときには、提供された心臓ＡＤＰＲＣを、化合物に接触させうる。この発明の文脈では、用語“接触させること（contacting）”は、心臓ＡＤＰＲＣを、試験されうる１つ又は複数の化合物と相互作用することを可能にする任意の手段として最も広い意味で理解されうる。好ましくは、これは、心臓ＡＤＰＲＣを含む１つ又は複数の溶液と、心臓ＡＤＰＲＣの酵素活性に適しているバッファー溶液中の１つ又は複数の化合物と混和することによって達成される。混和するには、好ましくは、そのうちの一方が心臓ＡＤＰＲＣを含み、他方が化合物を含んでいる２つ又はそれより多い溶液をピペッティングすること、より好ましくは、混和することによって達成しうる。好ましい実施態様では、接触させることは、自動ピペッティングすることによって達成されうる。
【００４８】
好ましくは、この方法は、抗不整脈作用を有する化合物を特定するのに使用しうる。この文脈では、用語“化合物を特定すること（identifying a compound）”とは、最も広い意味で、それと接触したときに、心臓ＡＤＰＲＣの酵素活性に対する作用を示す化合物、特にそれと接触したときに、心臓ＡＤＰＲＣの酵素活性に対する阻害作用を示す化合物を、抗不整脈作用を有するものと判定することを見出すことを意図している。
【００４９】
用語“阻害剤（inhibitor）”とは、“アンタゴニスト（antagonist）”、“不活性化因子（inactivator）”、“不活性化剤（inactivating agent）”、“相互作用薬（interacting drug）”、“阻害作用を有する化合物（compound with inhibitory effect）”及び“不活性化化合物（inactivating compound）”及び当技術分野において知られている酵素活性を不活性化する物質の他の表示と互換性があるものと理解されうる。これに加えて、試験システムは、官能性心臓ＡＤＰＲＣ酵素を用いるか、又は官能性心臓ＡＤＰＲＣを含んでなる分子組成物を用いるべきである。この酵素は、組織からでも、又は細胞からでも抽出してもよいし、又は真核細胞若しくはバクテリア細胞中で非相同的に発現させてもよい。
【００５０】
阻害剤の結合は、阻害剤が結合する酵素の活性を低下させる。阻害剤結合は、可逆的か、あるいは不可逆的である。不可逆的阻害剤は通例、生体分子と反応し、それを化学的に変化させる。こうした阻害剤は、例えば、活性に必要なキーとなるアミノ酸残基を修飾することができる。対照的に、可逆的阻害剤は、非共有結合で結合し、そしてこうした阻害剤が生体分子に結合するか否かに応じて、異なる種類の阻害が引き起こされる。
【００５１】
化合物が、心臓ＡＤＰＲＣに対して特異的で、かつ有意な低下作用を有する場合には、その化合物は、ＡＤＰＲＣの阻害剤として、それ故、抗不整脈作用を有する化合物として特定される。この発明の文脈においてＡＤＰＲＣの阻害剤は、コントロールと比較して心臓ＡＤＰＲＣ酵素活性を低下させる化合物を意味する。当技術分野における当業者であれば、２つの値が互いに有意に異なっているかどうかを評価する統計的手順（例えば、スチューデントのｔ検定又はカイ二乗検定）を知っている。
【００５２】
好ましい実施態様では、酵素活性は、コントロールの、多くて９０％に、好ましくは、多くて７５％、より好ましくは、多くて５０％又は４０％、更により好ましくは、多くて３０％、そして最も好ましくは、多くて２０％に相当する。
【００５３】
好ましくは、１つ又は複数の化合物は、化合物群から、好ましくは、化合物ライブラリーから特定される。本明細書中で使用される際には、用語“化合物を特定すること（identifying a compound）”は、“化合物の検出（detection of a compound）”又は“化合物を見出すこと（finding a compound）”と互換性があるものと理解されうる。本明細書中の、用語“特定すること（identifying）”は、当技術分野の当業者にとって明白に、不整脈及び／又は心臓ＡＤＰＲＣの酵素活性に対する抗阻害作用が、“特定された（identified）”化合物と呼ぶのに十分強いと見なされる一定の閾値が適用される必要があるときに、関連する用語として理解されうる。この閾値は、実験の組み立てにかなり左右される場合もあり、そしてその方法の目的又は特定される抗不整脈化合物の使用意図に応じて調整されうることが理解されるであろう。
【００５４】
この発明の文脈では、抗不整脈作用は、好ましくは、心臓ＡＤＰＲＣの酵素活性に対する化合物の阻害効果として測定されるので、この閾値は、一定のＩＣ50値として付与されることが好ましい。当技術分野において通例知られているように、このＩＣ50値は、酵素活性の最大阻害の半分に必要な化合物濃度を意味する。明らかに、ＩＣ50値は、酵素の量、酵素の活性状態、コアクティベーター又はコレプレッサーなどのコファクターの存在、アクティベーター及びインヒビター（阻害剤）の存在、並びに塩濃度、温度、ｐＨなどの周囲条件を含む一連のファクターに依存する、相対的な値である。この発明の文脈では、化合物は、好ましくは、ＩＣ50値が、５０μΜ未満、２０μＭ未満、１０μＭ未満、５μＭ未満、４μＭ未満、３μＭ未満、２μＭ未満、１μＭ未満、０．５μＭ未満、０．４μＭ未満、０．３μＭ未満、０．２μＭ未満、０．１μＭ未満、０．０５μＭ未満、０．０２μＭ未満又は０．０１μＭ未満であるときに、抗不整脈作用を有する化合物として特定しうる。
【００５５】
用語“抗不整脈作用（antiarrhythmic effect）”は、当技術分野において知られているものと同様に使用される。特に、これにより、心臓不整脈と呼ばれる心臓のリズムの頻度又は規則性、又は心臓の異常な電気的活性から生じる他の作用に関する不全の抑制が述べられている。心臓不整脈は、例えば、心室性頻拍、心室細動、心房細動、及び心房粗動などのいくつかの疾患において重要な役割を果たしている。
【００５６】
化合物の抗不整脈作用は、心臓アデノシン−ジホスホ−リボースシクラーゼ（心臓ＡＤＰＲＣ）の活性を決定することによって測定することができる。この結果は、心臓細胞、心臓組織又は心臓の電気生理学的記録によって確認することができる。
【００５７】
本発明を通して、用語“活性を決定すること（determining the activity）”は、心臓ＡＤＰＲＣの官能性（functionality）を特徴付けるのに使用することができる任意の手段として、最も広い意味で理解されうる。好ましくは、これは、心臓ＡＤＰＲＣの酵素活性のキャラクタリゼーションに関連する。この酵素活性は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）からサイクリックアデノシンジホスホリボース（ｃＡＤＰＲ）の生成に関する触媒活性、又は、それぞれ、ＮＡＤ及び／又はｃＡＤＰＲなどのサロゲートの代謝に関する触媒活性に関連しうる。好ましくは、このＡＤＰＲＣは、阻害化合物と共にインキュベーションすると、酵素活性の減少を示す。例示的には、酵素活性の決定が本発明の実施例中に示されている。用語“サロゲート（surrogate）”は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）などの自然的な基質（複数を含む）の代わりに、代謝され、及び／又は酵素的に変換されうる分子として、最も広い意味で理解されうる。
【００５８】
化合物の抗不整脈作用を検出するために、心臓ＡＤＰＲＣの活性をコントロールと比較して化合物の存在下で決定することができる。本明細書中の用語“コントロール（対照：control）”は、ポジティブコントロール（positive control）、すなわち、基質の比較的高い変換率をもたらすことになる化合物が存在しない完全なサンプルを意味する。阻害作用を持っている化合物を添加すると、化合物を含むサンプルは、コントロールと比較してより低い変換率を示しうる。これに加えて、バックグラウンド、それ故、ＡＤＰＲＣ活性に依存していない基質の変換は、酵素を欠いているそれぞれのバッファー中の基質を含むサンプルによって測定することができる。このバックグラウンドサンプル（background
sample）では、基質の変化はないか、ほとんどないであろう。コントロール及びバックグラウンドサンプルの組成物は、それぞれ、実験の組み立てに応じて変換しうることは、当技術分野における当業者によって理解されるところである。その上、この発明において開示されている実験の組み立ては、例示的な組み立てとして理解することができ、本発明の範囲を限定するものであってはならない。
【００５９】
更に、本発明の方法は、心臓アデノシン−ジホスホ−リボースシクラーゼ（心臓ＡＤＰＲＣ）の、具体的には、これと相互作用する化合物の存在下で、より具体的には、酵素活性を阻害する化合物の存在下で、この心臓ＡＤＰＲＣの機能及び活性を解明するために使用することができる。これは、酵素反応速度論試験（enzyme kinetic studies）の場合に使用することができる。酵素活性を阻害する化合物は、それ単独で、心臓ＡＤＰＲＣと相互作用することによって直接作用することができるか、あるいは、心臓ＡＤＰＲＣの分子コファクターと相互作用することによるか、又は薬理作用の部位で心臓ＡＤＰＲＣのレベルを改変することによって間接的に作用することができる。化合物とその分子標的又はその複数の分子標的、特に心臓ＡＤＰＲＣの間の相互作用は、共有結合的であってもよいし、あるいは非共有結合的であってもよいし、あるいは複合体結合（complex bond）であってもよく、これは不競合的（uncompetitive）であってもよく、競合的であってもよく、非競合的（non-competitive）又はアロステリックであってもよい。この文脈では、薬理作用の部位は、組織又は細胞、特に心臓の細胞又は組織、より具体的には、心筋の細胞又は組織、あるいは前記細胞の細胞内コンパートメント、具体的には、カルシウムを貯蔵する細胞内コンパートメント、より具体的には、筋小胞体（sarcoplasmic reticulum）又は膜、特に筋小胞体膜（sarcoplasmic reticulum membrane）でありうる。化合物は、薬理作用の部位で豊富化していてもよく、あるいは枯渇していてもよい。更に、この方法は、そうしたものと相互作用する、具体的には、それを活性化するか、又は不活性化する、より具体的には、それを不活性化する化合物を開発し、特定し、及び／又は特徴付けるのに使用することができる。更に、この方法は、組織内の心臓ＡＤＰＲＣ濃度、又は心臓ＡＤＰＲＣの酵素活性を測定するのに使用することができる。更に、この方法は、心臓ＡＤＰＲＣの変異形態を決定するのに使用することができる。更に、この方法は、心臓ＡＤＰＲＣ及び／又は心臓ＡＤＰＲＣの変異形態の特性を特徴付けるのに使用することができる。
【００６０】
好ましい実施態様では、この心臓ＡＤＰＲＣは、細胞内膜結合性心臓ＡＤＰＲＣ、特に筋小胞体膜結合性心臓ＡＤＰＲＣである。
【００６１】
この発明の文脈では、用語“膜結合性（membrane-bound）”とは、心臓ＡＤＰＲＣが生体膜内に組み込まれているか、あるいは生体膜に結合していることを意味する。生体膜は、当技術分野における当業者によって知られている脂質二重層である。あるいは、心臓ＡＤＰＲＣはまた、脂質、リン脂質、ステロイド又は有機化合物又はその組み合わせから構成される人工膜に組み込まれているか、あるいはこうした人工膜に結合していてもよく、あるいは、この心臓ＡＤＰＲＣはまた、ミセル内に組み込まれているか、又はミセルに、リポソーム又はポリマーソーム膜若しくは表面に結合していてもよい。
【００６２】
用語“筋小胞体（sarcoplasmatic reticulum）”とは、当技術分野において一般的に知られているものと同様に理解されうる。すなわち、これは通例、筋細胞内に見出され、カルシウムイオンの貯蔵を促進し、それによって筋収縮における重要な役割を果たしている細胞小器官として理解されうる。
【００６３】
好ましい実施態様では、この心臓ＡＤＰＲＣは、哺乳類起源、特にヒト、ブタ、モルモット又はラット、特にブタ又はヒトの心臓に起源するものである。
【００６４】
この文脈では、用語“起源（origin）”は、心臓ＡＤＰＲＣが起源する、すなわち、使用ポリペプチドの配列が由来するもっぱら自然的起源に関する。これによって、この心臓ＡＤＰＲＣが実質的、かつ実体のある起源に限定されるものとして理解されてはならない。更に、この心臓ＡＤＰＲＣはまた、これに代えて、哺乳類細胞及び／又は他の種の組織から単離することができるが、またバクテリア又は真核細胞培養又は真核組織培養で発現させることもできる。
【００６５】
一連の試験設計はこの発明方法が適合しうる当技術分野において知られている。例示的な試験に関する更なる詳細は、実施例中に付与されている。この試験は、ヘテロジニアスアッセイであっても、あるいはホモジニアスアッセイであってもよい。本明細書中で使用される際には、ヘテロジニアスアッセイは、１つ又は複数の洗浄工程を含むアッセイであり、一方ホモジニアスアッセイは、こうした洗浄工程は必要なく、試薬及び化合物を、単に混和し、測定するアッセイである。当業者であれば、例えば、一般に行なわれている方法に関連して必要である更なる薬剤を添加することによって、この試験システムを意図する具体的な試験設計に適合させることが可能であろう。
【００６６】
この発明に従って、アッセイを設計し、心臓ＡＤＰＲＣ又はその誘導体の酵素活性を測定する。上記に述べられているように、心臓ＡＤＰＲＣは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）からサイクリックアデノシンジホスホリボース（ｃＡＤＰＲ）の生成、あるいはニコチンアミドグアニジンジヌクレオチド（ＮＧＤ）からサイクリックグアニジンジホスホリボース（ｃＧＤＰＲ）の生成、あるいはニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（ＮＨＤ）からサイクリックイノシンジホスホリボース（ｃＩＤＰＲ）の生成を触媒する酵素である。従って、この酵素活性は、心臓ＡＤＰＲＣによって触媒される反応の基質量の減少及び／又は生成物の量の増加として測定することができる。
【００６７】
この酵素活性が、酵素の量、酵素の活性状態、コアクティベーター又はコレプレッサーなどのコファクターの存在、アクティベーター及びインヒビター（阻害剤）の存在、並びに塩濃度、温度、ｐＨなどの周囲条件を含む一連のファクターによって影響されることは明白である。通例、この酵素活性は、標準的な実験室条件で測定され、そして当該試験システムの最適条件に適合させることができる。従って、有用な治療薬でありうるアクティベーター及びインヒビターなどの酵素の活性状態を変化させる分子を検出又は特定するために、この試験システムを使用することができる。
【００６８】
所望の酵素活性を得るために、心臓ＡＤＰＲＣ酵素の活性に適した分子環境で測定を行うことができる。好ましくは、この方法は、中性ｐＨの水溶性バッファー中で、より好ましくは、約ｐＨ７のｐＨのバッファー中で、更により好ましくは、Ｔｒｉｓ−Ｍａｌａｔ、塩化カリウム（ＫＣｌ）、スクロース、コンプリートプロテアーゼインヒビター及び／又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むｐＨ７のバッファー中で行なわれる。好ましくは、この心臓ＡＤＰＲＣは、使用するバッファー中でその活性を維持し、そして好ましくは、化合物又は酵素の沈殿をさせないようにする。所望により、サンプルを酵素活性に適する温度で、好ましくは、０〜５０℃の温度で、より好ましくは、１０〜４０℃の温度で、更により好ましくは、２０〜４０℃の温度で、最も好ましくは、３７℃でインキュベートすることができる。適用された方法は、方法セクションにより詳細に記載されている。適用される方法は、方法セクション中により詳細に述べられている。しかしながら、こうしたものは例示的なものであり、そして他の方法もまた適切である場合のありうることが理解されるべきである。
【００６９】
この酵素を、所望の濃度に希釈することが必要であり、そしてこの濃度は、酵素の量によって酵素活性が変化するため、様々なバッチによって異なりうることは、当技術分野における当業者にとって自明でありうる。
【００７０】
上記に言及したように、このアッセイの場合に使用される心臓ＡＤＰＲＣは、膜結合性であってもよいし、表面に固定化（マイクロアレイ、ビーズなど）されていてもよいし、あるいはバッファー中に溶解されていてもよい。好ましくは、この心臓ＡＤＰＲＣは、膜結合性であり、より好ましくは、この心臓ＡＤＰＲＣは、筋小胞体膜に結合している。
【００７１】
このテストシステムでは、基質、アデノシンジホスホリボース（ＮＡＤ）の検出可能なサロゲートを、この心臓ＡＤＰＲＣの酵素活性の検出が可能になるように使用することができる。好ましくは、こうした検出可能なサロゲートは、物理化学的な手段によって、より好ましくは、蛍光検出又は吸光度の測定などの光学的手段によって検出可能でありうる。
【００７２】
更により好ましくは、光学的方法により検出可能な分子は、（ｉ）酵素による変換によってそれらの蛍光スペクトルを変化させる分子、（ｉｉ）酵素による変換によって蛍光剤の蛍光生成物を生成する非蛍光前駆体、（ｉｉｉ）それらの光化学的特性（例えば、それらの特徴的な吸光度ＵＶ、ＩＲ又は可視的スペクトル、あるいはそれらの蛍光性によって）により検出可能なサロゲート又は分子複合体、（ｉｖ）酵素による変換によって、吸光度スペクトルの変化を有する生成物に切断されうるサロゲート（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル）、（ｖ）酵素による変換によって光ルミネセンスを放出する前駆体、あるいは（ｉｖ）１つ又は複数の色素（例えば、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度法によって検出可能である色素、Ｃｙ色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５）などの蛍光色素、Ａｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５４６、Ａｌｅｘａ ６４７）、Ｓ色素（例えば、Ｓ０３８７）、フルオレセイン（fluorescein）及びその官能性誘導体（例えば、ＦＩＴＣ）、ローダミン、HOECHST色素））で標識された分子でありうる。
【００７３】
好ましくは、この検出可能なサロゲートは、酵素による変換によってそれらの蛍光スペクトル又は強度を変化させる分子、酵素による変換によって蛍光剤の蛍光生成物を生成する非蛍光前駆体、あるいは、吸光度スペクトルの変化又は吸光度の強度の変化を有する生成物に切断されうるサロゲートでありえ、より好ましくは、酵素による変換によってそれらの蛍光スペクトル又は強度を変化させる分子、酵素による変換によって蛍光剤の蛍光生成物を生成する非蛍光前駆体、更により好ましくは、ニコチンプリンヌクレオチド誘導体、最も好ましくは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドグアニジンジヌクレオチド（ＮＧＤ）、又はニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（ＮＨＤ）でありうる。このＮＡＤ、ＮＧＤ及び／又はＮＨＤ（複数を含む）は、それぞれ、例えば、それらの蛍光発光を介して検出できるサイクリックアデノシンジホスホリボース（ｃＡＤＰＲ）、サイクリックグアノシンジホスホリボース（ｃＧＤＰＲ）及びサイクリックイノシンジホスホリボース（ｃＩＤＰＲ）に変換される。
【００７４】
あるいは、この検出可能なサロゲートはまた、高親和性結合の結合パートナー（こうした結合パートナーは、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン、メトトレキサート−ジヒドロ葉酸（methotrexate-dihydropholate）などである）で標識された分子、又は放射活性物質で標識されたサロゲートでありうる。
【００７５】
この心臓ＡＤＰＲＣの酵素活性は、上記に言及したサロゲートを用いて、具体的には、検出可能な分子から生じる経時的なシグナルの変化、より具体的には、経時的な蛍光シグナルの変化を測定することによって、測定することができる。好ましくは、この経時的な蛍光シグナルは、一定の時間間隔後に測定され、より好ましくは、こうした時間間隔は数分の範囲である。測定の間、サンプルは所望の条件でインキュベートすることができる。
【００７６】
好ましい実施態様では、この心臓ＡＤＰＲＣの活性は、心臓ＡＤＰＲＣの基質の生成物への変換を測定することによって決定される。基質の変換は、酵素作用（enzymatic）に関連し、すなわち、心臓ＡＤＰＲＣによって触媒される変化、あるいは化学化合物の代謝に関連する。本発明を通して、用語“基質（substrate）”は、心臓ＡＤＰＲＣによって代謝されうる任意の化学物質に関連する。
【００７７】
好ましくは、この基質は、５００ダルトン未満の分子量である小分子である。
【００７８】
好ましい実施態様では、この基質は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドグアニジンジヌクレオチド（ＮＧＤ）又はニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（ＮＨＤ）である。この結果、基質の変換は、好ましくは、効果的に読み取ることができる方法（例えば、酵素アッセイを介して、好ましくは、蛍光検出を介して読み取る）によって測定される。この基質、特にＮＡＤのサロゲートを、（ｉ）生体材料が得られる対象、すなわち、ヒトを除外した動物に、組織に、又は細胞（複数を含む）に、（ｉｉ）実験開始前に反応混合物に、（ｉｉｉ）サンプルのインキュベーションの間に、（ｉｖ）サンプルのインキュベーションの後で、ただし測定の前に、又は（ｖ）サンプルのインキュベーションの後で、かつ測定の間に、加えることができる。
【００７９】
これに加えて、関心のある１つ又は複数の化合物を、反応混合物に加えることができる。この化合物（複数を含む）を、（ｉ）生体材料が得られる対象、すなわち、ヒトを除外した動物に、組織に、又は細胞（複数を含む）に、（ｉｉ）実験開始前に反応混合物に、（ｉｉｉ）サンプルのインキュベーションの間に、（ｉｖ）サンプルのインキュベーションの後で、ただし測定の前に、又は（ｖ）サンプルのインキュベーションの後で、かつ測定の間に、加えることができる。
【００８０】
好ましくは、この心臓ＡＤＰＲＣの酵素活性は、酵素アッセイによって決定される。より好ましくは、この心臓ＡＤＰＲＣの活性は、蛍光発光によって決定される。
【００８１】
用語“蛍光発光（fluorescence）”は、当技術分野において知られているものと同様に、本明細書中では使用される。好ましくは、用語“蛍光発光（fluorescence）”とは、より短い波長の光によって励起される分子又は分子群によってより長い波長の光を発光することを意味する。あるいは、用語「蛍光発光（fluorescence）」はまた、２つの光子の効果（two-photon effects）、すなわち、より長い波長の２つの光子で励起される分子による１つの光子の発光を含むことができる。更に、リン光などの三重項状態（triplet）に依存する効果のような他の光物理効果も含まれうる。
【００８２】
上記に述べられているように、用語“蛍光発光によって決定された（determined by fluorescence）”とは、好ましくは、蛍光シグナルの経時的な変化の検出が、（ｉ）蛍光分光光度計で、又は顕微鏡デバイスで蛍光強度の変化を検出すること、（ｉｉ）蛍光分光光度計で、又は顕微鏡デバイスで蛍光スペクトルの変化を検出すること、（ｉｉｉ）適切なデバイス［例えば、顕微鏡デバイスを介して、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を介して、蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）を介して、又は蛍光脱分極アッセイ（fluorescence depolarization assay）を介して、蛍光共鳴エネルギー移動ベース法（fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based methods）を介して、又は増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ（ＡＬＰＨＡ）を介して］の蛍光分子の移動度の変化（alterations of the mobility of the fluorescent molecule）を検出することによって測定することができることを意味する。こうした検出手法は当技術分野における当業者に知られうる。好ましくは、経時的な蛍光シグナルの変化の検出は、蛍光強度の変化を検出することによって測定することができる。より好ましくは、このシグナルは、蛍光分光光度計、更により好ましくは、マイクロタイタープレートに適している蛍光分光光度計で測定される。好ましくは、この蛍光は、ＵＶ範囲における励起によって検出され、そして放出した光は、より長い波長で検出され、より好ましくは、この励起は２５０〜３００ｎｍにて、そして検出は３８０〜４５０ｎｍにて、更により好ましくは、励起は２７５ｎｍにて、そして検出は４００〜４２０ｎｍにて、最も好ましくは、励起は、２７５ｎｍにて、そして検出は、４１０ｎｍにて行なわれる。適用される方法は方法セクションでより詳細に述べられている。しかしながら、こうしたものは、例示的なものであり、他の方法もまた適切でありうることが理解されるべきである。当業者は、励起及び検出条件を使用する分子及び測定方法に適合させることが可能でありうる。
【００８３】
それぞれのサンプルの心臓ＡＤＰＲＣ活性は、経時的な蛍光発光の変化、すなわち、蛍光対時間の線の傾きによって定義することができる。こうした結果は、実施例中に示されている線型回帰から得ることができる。阻害作用を持つ化合物を添加すると、観察される基質のより遅い変換が、そして生成物のより遅い生成、それ故、より平らな反応速度曲線（kinetic curve）がもたらされるであろう。活性化作用を持つ化合物を添加すると、観察される基質のより速い変換が、そして生成物のより速い生成、それ故、より急勾配の反応速度曲線がもたらされるであろう。作用を持たない化合物を添加すると、基質の酵素変換、及び生成物の生成に影響を与えず、それ故、反応速度曲線の峻度（steepness）を変化させないであろう。
【００８４】
従って、濃度−反応曲線は、こうした結果から得ることができる。こうした結果は、用量−反応曲線として示すことができ、異なったモデル、具体的には、薬理学的検討に使用されるモデル、より具体的には、当技術分野における当業者に周知のヒルの式（Hill equation）にフィットする。最後に、１／２−最大有効濃度（ＥＣ50値）及び／又は１／２−最大阻害濃度（ＩＣ50値）を算出することができる。好ましくは、ＩＣ50値が算出される。
【００８５】
関心のある化合物が、インヒビター又はアクティベーターとしての活性を示す場合には、このことによって、心臓ＡＤＰＲＣの酵素活性の変化がもたらされうる。こうした化合物の効力は、酵素活性の変化を測定することによって得ることができる。試験化合物が、試験システムに対して特異的で、かつ有意な作用を有する場合には、そうした化合物は、心臓ＡＤＰＲＣのモジュレーターとして特定される。この発明の文脈では、そうした化合物は、抗不整脈作用を有する。それ故、こうしたものは、好ましくは、心臓ＡＤＰＲＣの阻害剤である。いくつかの測定結果を、統計的手段などの数学的手段、例えば、スチューデントのｔ検定又はカイ二乗検定によって比較・解析することができる。
【００８６】
蛍光偏光（ＦＰ）−ベースアッセイ（Fluorescence polarization(FP)-based assays）は、溶液中の蛍光性基質又は化合物を励起させる偏光を用いるアッセイである。こうした基質又は化合物は、溶液中で遊離し、そして回転し（tumble）、放出した光を脱分極させる。基質化合物がより大きな分子に結合するか、あるいはそのサイズが開裂により顕著に減少するときには、その回転速度は、大幅に減少し、そして放出した光は高度に偏光したままである。
【００８７】
蛍光相関分光法（ＦＣＳ）は、溶液中の蛍光性化合物の速度を測定する共焦点光学系に基づく広範囲に使用されている方法である。高分子の標的に結合している化合物は、それらのより大きなストークス半径（Stokes radius）のためより遅いので、蛍光分子の結合及び／又はそれらの切断を検出することができる。蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）は、ＦＣＳに類似した方法であるが、２つ又はそれより多い異なったフルオロフォア（fluorophores）を検出する方法である。これは、ＦＣＳによって得られる全ての結果を提供し、これに加えて、一体となって拡散する（diffusing conjointly）、２つの別に標識した蛍光粒子の比率に関する情報が得られる。その結果、ＦＣＣＳによって、２つの別に標識した結合パートナーの結合、又は２つの異なる結合フルオロフォア間の化合物の切断に関する情報が提供される。
【００８８】
ＡＬＰＨＡは、当初はPackard BioScienceによって開発された溶液ベースアッセイである。ＡＬＰＨＡは、ルミネッセンス近接アッセイ（この方法では、一方の相互作用パートナーがドナービーズに結合し、一方では、他方はアクセプタービーズに結合し、両者とも、ほんの約２５０ｎｍの直径を有しているにすぎない）である。フォトセンシタイザー化合物がドナービーズ中に埋め込まれている。この化合物がレーザー光で約６８０ｎｍの波長にて照射されると、周囲の酸素がエネルギーリッチの、短寿命の一重項酸素に変換される。いかなるアクセプタービーズも近接していないときには、この一重項酸素は減衰し、シグナルを生成しない。ドナー及びアクセプタービーズが、結合した生体分子の生物学的相互作用によって引き合わされた（約２５０ｎｍ）場合には、ドナービーズによって放出される一重項酸素は、隣接するアクセプタービーズにおける発光（luminescence）／蛍光（fluorescence）カスケードを開始し、５２０ｎｍ〜６２０ｎｍの範囲で高度に増幅したシグナルが発生する。発光シグナルは適切な読み取り機で検出される。ＡＬＰＨＡ手法に関するより詳細については、Ullman et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91, 5426-5430を参照されたい。
【００８９】
これに代えて、酵素活性はまた、免疫化学的方法によって測定することができ、この方法には、サンドイッチＥＬＩＳＡを含む酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれるが、これに限定されない。この場合、酵素反応の変換生成物の基質は、抗原として、あるいは、当技術分野において知られているハプテンとして機能しうる。変換及び非変換サンプルは異なるシグナル強度を誘発することができる。ＥＬＩＳＡベースアッセイは、種々の会社によって提供されている。これはサンプル中の抗体又は抗原の存在を検出するために使用される生化学的手法である。抗原はまた、基質又は心臓ＡＤＰＲＣの基質のコンジュゲート又は心臓ＡＤＰＲＣによって触媒される反応の変換生成物などの小分子でありうる。更に、基質又は変換生成物はまた、ハプテンとして機能することができる。ＥＬＩＳＡを行なうには、１つの特定のものに特異性を持つ少なくとも１つの抗体が必要となる。一般的には、サンプル中の未知の量の抗原が表面に固定化される。特定の抗体を表面上で洗浄する。この抗体を発色又は蛍光などの検出可能なシグナルを生成する酵素にリンクさせる。例えば、未知の量の抗原を含むサンプルを、非特異的に（表面への吸着を介して）、あるいは特異的に（“サンドイッチ（sandwich）”ＥＬＩＳＡにおいて、同じ抗原に特異的な別の抗体による捕獲を介して）、固体支持体（通例、マイクロタイタープレート）上に固定化する。抗原を固定化した後、検出抗体を加え、抗原を含む複合体を形成する。検出抗体は、酵素に共有結合的にリンクしてもよいし、あるいはそれ自体、バイオコンジュゲーションを介して酵素にリンクする二次抗体によって検出してもよい。それぞれの工程の間に、プレートを通例、マイルドなデタージェント溶液（mild detergent solution）で洗浄して、特異的に結合していないタンパク質又は抗体を除去する。最終洗浄工程の後、プレートを、酵素基質を加えることによって展開して、サンプル中の抗原の量を示す可視的シグナルを生成する。より最近のアッセイでは非常に高い感受性をもつ蛍光性基質が用いられるが、昔からのＥＬＩＳＡでは発色性基質が利用される。
【００９０】
更なる代替手段として、この酵素活性はまた、クロマトグラフィー方法（例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ及び／又はＵＰＬＣ）における保持時間の変化の測定に基づく手法によって測定することができる。具体的には、基質及び変換生成物の保持時間によって識別可能であるか、あるいは結合していない基質及び心臓ＡＤＰＲＣの保持時間が識別可能である場合には、好ましくは、クロマトグラフィー方法を使用することができる。
【００９１】
好ましい実施態様では、この方法を使用して化合物のライブラリーをスクリーニングする。この文脈では、化合物のライブラリーは、集めることが可能な複数の起源の複数の化学物質から構成されうる。ライブラリーは、化学的に合成された物質、生物工学的な方法の生成物、自然的に存在する物質、又はコンビナトリアルケミストリー手法に由来する生成物又はその組み合わせを含むことができる。この発明の文脈では、このライブラリーは、好ましくは、小分子化合物、より好ましくは、化学的に合成された小分子化合物を含む。
【００９２】
この発明の文脈では、用語“スクリーニングする（screen）”は、分子標的への結合又は生物活性、具体的には、酵素活性に対する影響、より具体的には、酵素活性の阻害などの関心のあるそれらの特性を決定するために、標準化されている分子アッセイ、又はいくつかの分子アッセイの複合が複数の化合物に適用される方法に関する。スクリーニングは、溶液中（例えば、フラスコ中、反応チューブ、キュベット、マイクロタイタープレート中など）、表面で（例えば、マイクロアレイフォーマット中、又はビーズベースフォーマット上、ヒトを除く生きている動物中、又は生きている細胞中）行うことができる。好ましくは、スクリーニングは、溶液中で行うことができる。このスクリーニングは、好ましくは、ほとんど化合物の消費がない状態で、及び／又は少量で行うことができる。それ故、マイクロタイターフォーマットを使用することが好ましい。こうしたマイクロタイタープレート上では、数マイクロリットルのような少ない量で、スクリーニングには十分でありうる。
【００９３】
好ましい実施態様では、この方法は、自動化フォーマット、特にハイスループットフォーマットの形で行なわれる。この発明の文脈では、用語“自動化フォーマット（automated format）”とは、完全に、又は部分的に制御されている方法、及び／又は１つ又は複数の技術的デバイス、好ましくは、ピペットロボットによって行なわれる方法を意味する。この文脈では、用語“ハイスループットフォーマット（high throughput format）”は、短時間内に複数の化合物を迅速に試験する（すなわち、試験化合物についてのアッセイ時間を最小にする）ためのアッセイシステムに関する。このアッセイは、好ましくは、マルチウェルプレート、より好ましくは、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレート、更により好ましくは、９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレート中で行なわれる。
【００９４】
本発明の第二の局面は、抗不整脈作用を有する化合物を特定するための心臓ＡＤＰＲＣの使用に関する。
【００９５】
好ましい実施態様では、この心臓ＡＤＰＲＣは、細胞内膜結合性心臓ＡＤＰＲＣ、特に筋小胞体膜結合性心臓ＡＤＰＲＣであり、あるいは哺乳類起源、具体的には、ヒト、ブタ、モルモット若しくはラット由来、特にブタ又はヒト心臓由来の心臓ＡＤＰＲＣとしての心臓ＡＤＰＲＣである。
【００９６】
上記に述べられている方法によって決定される抗不整脈作用を確認するために、この心臓ＡＤＰＲＣ活性、又は心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤の抗不整脈特性は、細胞内、組織内、又は器官内で決定することができる。その場合において、好ましくは、心臓からの細胞又は組織であるか、又は器官は心臓であり、より好ましくは、心臓からの筋肉細胞若しくは筋肉組織であり、更により好ましくは、乳頭筋肉細胞若しくは乳頭筋肉組織であり、最も好ましくは、乳頭筋肉組織である。この細胞又は組織は、ヒトを除く動物から新鮮に調製することができ、あるいは上記に述べられている細胞培養から、及び／又は組織培養手法から得ることができる。別の好ましい実施態様では、筋肉、好ましくは、心筋、更により好ましくは、乳頭筋肉が測定のために使用される。更なる好ましい実施態様では、新鮮に調製した、又は抽出した心臓が使用される。
【００９７】
好ましくは、活動電位は、器官、具体的には、心臓、組織で、具体的には、心筋組織又は細胞、具体的には、心筋細胞で測定される。この文脈では、活動電位は、乳頭筋肉などの細胞、組織又は器官へのイオンの流出入、心電図（ＥＣＧ）としてしばしば測定される、その結果生じる電圧変化及び／又は心臓のスカラーポテンシャル（scalar potential）として理解されうる。好ましくは、このシグナルは、カルシウムの流出入を変化させること、及び／又は細胞若しくは組織の形質膜（plasma membrane）における電圧を変化させることに付随して起こる。この場合には、この活動電位は、好ましくは、電気的検出方法、より好ましくは、電界又はその変化を測定する方法、更により好ましくは、電気生理学的記録を用いて決定されうる。マウントされた（mounted）乳頭筋肉、乳頭筋肉細胞又は乳頭筋組織の活動電位に関して試験されうる化合物の作用を試験することができる。それ故、それぞれのサンプルは、化合物と共にプレインキュベートしてもよいし、又は化合物を含まずにインキュベートしてもよく、この化合物は、この実験手順を行う前に、この方法の実験手順の間に、又はこの実験手順の終期に加えることができる。
【００９８】
好ましい実施態様では、乳頭筋肉、乳頭筋肉細胞又は乳頭筋肉組織の収縮が測定される。この目的の場合には、乳頭筋肉又はその細胞若しくは組織は、収縮を検出するのに適しているデバイスにマウントされうる。次いでマウントされた乳頭筋肉、乳頭筋肉細胞又は乳頭筋肉組織を電気パルスで刺激することができる。好ましくは、この電気パルスは、数ボルトの矩形パルス、より好ましくは、０〜２０ボルトの矩形パルス、更により好ましくは、０〜１０ボルトの矩形パルス、最も好ましくは、１〜４ボルトの矩形パルスである。パルスの持続時間は、数ミリ秒（ｍｓ）でありえ、好ましくは、０〜２０ｍｓの持続時間でありえ、より好ましくは、パルスの持続時間は０〜１０ｍｓの持続時間でありえ、更により好ましくは、パルスの持続時間は１〜３ｍｓでありうる。このサンプルは、数秒の間に数Ｈｚ、好ましくは、０〜６０秒の間に０〜１０Ｈｚ、より好ましくは、３０秒の間に０〜１０Ｈｚ、そして更により好ましくは、３０秒の間に４Ｈｚのペースでありうる。実験手順の間、観察する筋肉、組織又は細胞は、バッファー溶液中であってよいし、及び／又はバッファー溶液によって灌流されていてもよい。このバッファー溶液は、心臓細胞活性測定に適切でありうる。好ましくは、このバッファーは、商業的に入手可能なバッファーであるか、あるいは塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）を含むバッファーである。ＣａＣｌ2の濃度は変化しえ、最高５．５ｍＭ又は更にそれより高い濃度まで増加させることができる。好ましくは、このバッファーは、心臓細胞、組織又は筋肉活性に適している温度、より好ましくは、４０℃未満の温度、更により好ましくは、１０〜４０℃の温度、最も好ましくは、約３７℃の温度を有する。活動電位は、異なった時間において記録することができる。それらは、数秒後、及び／又は数分後に、直接記録することができる。
【００９９】
上記に言及したアレインジメントでは、この活動電位は、活動電位を検出するために当技術分野において知られている任意のデバイス（例えば、分子イメージング方法又は電気生理学的方法）によって記録することができる。好ましくは、電気生理学的方法が使用することができ、より好ましくは、活動電位の検出は、電極を介して行なわれる。この電極は、金属などの導電性材料又は導電性溶液で満たされた非導電性材料に属しうる。好ましくは、この電極は、水溶性バッファーで満たされたガラス電極であり、より好ましくは、この電極は、塩化カリウム（ＫＣｌ）水溶液、更により好ましくは、３Ｍ ＫＣｌ溶液で満たされたガラス電極である。活動電位から発生する電気シグナルは、必要ならば増幅することができ、そしてコンピューターベースシステムによって検出することができ、及び／又はコンピューターベースシステム中に保存することができる。好ましくは、測定データはコンピューターベースシステムによって解析される。
【０１００】
これに代えて、又はこれに加えて、この活動電位は、分子イメージング方法及び／又はフローサイトメトリーを介して間接的に検出することができる。この文脈では、例えば、電位感受性色素を使用することができるか、あるいはカルシウム流入及び／又は流出をカルシウム感受性色素によって記録することができる。こうした色素は、当技術分野における当業者に周知である。活動電位から発生する検出されたイメージ、シグナル又はプロットなどのシグナル、具体的には、蛍光イメージ又はシグナルは、必要により増幅することができ、そしてコンピューターベースシステムによって検出することができ、及び／又はコンピューターベースシステム中に保存することができる。この細胞は、より高い処理量の解析細胞数（higher throughput of the number of analyzes cells）及び／又は自動化顕微鏡を可能にするために、マルチチャンバープレート中で、それともマイクロアレイスライド上で増殖させることができる。好ましくは、細胞の輝度（cellular brightness）及び／又はいくつかの細胞コンパートメントにおける輝度を定量化し、比較するために、得られた顕微鏡イメージを自動化又は半自動化イメージ処理によって解析する。
【０１０１】
試験化合物が試験システムに対する特異的で、かつ有意な作用を有する場合には、その化合物を心臓ＡＤＰＲＣのモジュレーターとして特定する。この発明の文脈では、その化合物は、抗不整脈作用を有する。それ故、これは、好ましくは、心臓ＡＤＰＲＣの阻害剤である。いくつかの測定結果を、統計的手段などの数学的手段、例えば、スチューデントのｔ検定又はカイ二乗検定によって比較・解析することができる。
【０１０２】
器官、組織及び細胞の使用のほかに、この抗不整脈作用は、それぞれ、インビトロ及びエキソビボであると考えられる生物系に基づくインビトロ試験で検出可能でありうる。こうした試験では、観察される細胞、組織又は器官の収縮は、自動化イマージ処理によって、又は収縮から生じる物理的な力（physical force）の測定によって、又は電気生理学的記録によって、可視的に観察される。用語“インビトロ及びエキソビボであると考えられる生物系（living systems that are considered to be in vitro and ex vivo）”とは、活動電位及び／又は筋肉の収縮性を決定するモデルシステムとして広く使用されている心臓、又は蛙の脚などの抽出器官を意味するか、あるいはこれは、具体的には、胚内試験（in ovo studies）で、より具体的には、医薬開発において広く使用されているめんどりの卵子での胚内試験に基づく卵子ベース系（egg-based systems）を意味しうる。
【０１０３】
これに代えて、又はこれに加えて、この抗不整脈作用は、ヒトを除く動物を用いるインビボ試験で検出可能でありうる。化合物は、注入、吸入、及び皮膚又は粘膜を介する、また経口摂取による投与を含む（これらには限定されない）任意の手段によって動物に投与することができる。この発明の文脈では、動物モデルにおける方法は、処置方法として、又は診断方法として見なされるのではなく、単に化合物又は試験化合物の１つ又は複数の抗不整脈作用を特定する検出方法として機能する。これは治療及び／又は診断方法において心臓ＡＤＰＲＣの活性を阻害するか、あるいは強化するある種の化合物の可能性のある有用性を排除することはない。動物の心臓の鼓動及び／又は心電図（ＥＣＧ）シグナルが、記録・解析することができる。あるいは、基質の変換を、全身的に検出することができ、すなわち、基質及び／又はその代謝基質を、血液中、又は他の体液中で検出することができ、あるいはその変換は、例えば、当技術分野において知られているインビボの蛍光検出などのインビボイメージング手法によってインサイチュで検出される。
【０１０４】
本発明を、下記の実施例及び図面によって更に説明するが、こうしたものは説明することを意図しているものであり、この発明の範囲を限定することはない。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】ブタ心臓の筋小胞体膜によって触媒される、ＮＨＤのｃＩＤＰＲへの変換の時間依存性を示す。ｃＩＤＰＲの生成は、それぞれ、２７５及び４１０ｎｍの励起及び発光波長での蛍光発光の変化に従ってモニタリングされた。データはポジティブコントロール（“高い（high）”）、バックグラウンドサンプル（“低い（low）”）及び４７％阻害を示している試験化合物（“化合物（ｃｐｄ）”）に対して示されている。複数の点にフィットする線の傾き（slope）は、酵素活性の尺度と見なされる。
【図２】心臓ＡＤＰＲＣの阻害剤として特定されたＡ００１１０２５８９の構造を図解している。
【図３】阻害剤化合物Ａ００１１０２５８９及びＳＷ６４８２５の濃度反応曲線を示す。このＩＣ50値は、それぞれ、０．２１μＭ及び０．０４μＭであると決定された。
【図４】心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤Ａ００１１０２５８９は、モルモット乳頭筋肉の高周波ペーシング（high-frequency pacing）の後、６秒以内に観察された遅延後脱分極（delayed after-depolarizations）の数が有意に減少したことを証明している。
【図５】モルモットの乳頭筋肉の高周波ペーシングの後、６秒以内に観察された遅延後脱分極の数を減少させることを、Ａ００１１０２５８９（Ａ）とは異なった構造分類の心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤、ＳＷ６４８２５（Ｂ）から更に証明している。化合物の濃度は３μＭであり、そしてＤＭＳＯサンプルは、０．０３％ＤＭＳＯに相当する。化合物ＳＷ６４８２５は、遅延後脱分極の数を有意に減少させている。
【図６】ウアバイン（ouabain）注入後、化合物を、それぞれ、３ｍｇ／ｋｇの静脈（i.v.）注入した場合の、心停止（Ａ）までの時間、及び心室細動までの時間（Ｂ）に対する試験化合物ＳＷ６４８２５の作用を示す。コントロールは化合物で処置をしていない動物を表す。
【図７】心臓ＡＤＰＲＣの阻害剤として特定されたＳＷ６４８２５の構造を図解する。
【実施例】
【０１０６】
実施例１：ヌクレオシドジホスホリボシルシクラーゼ（nucleoside diphosphoribosyl cyclase）活性の測定
実験プロトコル：
ブタ心臓からの筋小胞体膜を、わずかに変更して、Kranias et al. （Biochim. Biophys. Acta 709, 28-37, 1982）によって記載されている通り調製した。新鮮なうちに外植された子ブタの心臓の左心室から、脂肪及び結合組織を除去し、そして小片（およそ、１ｃｍ3）に切り分けた。この小片を手短に氷冷培地Ｉ（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｍａｌａｔ，ｐＨ ７．０，０．３Ｍ スクロース，５ｍｇ／ｍｌ ロイペプチン，０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）でリンスし、そしてワーリングブレンダー（Waring blender）（フルスピードで６０秒，中間に３０秒の冷却間隔を持って、４回（１５秒間）に分けた）を用いて氷冷培地Ｉ（５ｍｌ／ｇ（組織））中でホモジナイズした。このホモジネートを５，５００ｇで１０分間遠心分離した。上清を４層のミラクロス（Miracloth）（Merck Biosciences, Darmstadt, Germany）に通し、そして１２，０００ｇで２５分間遠心分離した。上清を再度４層のミラクロスに通してろ過し、次いで１４３，０００ｇで６０分間遠心分離した。この結果生じたペレットを培地ＩＩ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｍａｌａｔ，ｐＨ ７．０，０．６Ｍ ＫＣｌ，０．３Ｍ スクロース，５ｍｇ／ｍｌ ロイペプチン，０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）中でウルトラタラックスデバイス（Ultra-Turrax device）を用いて再懸濁し、そしてこの懸濁液を再度１４３，０００ｇで６０分間遠心分離した。このペレットを培地Ｉ中で再懸濁し、そして再び１４３，０００ｇで６０分間遠心分離した。この最後の遠心分離工程からのペレットを、培地ＩＩＩ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｍａｌａｔ，ｐＨ ７．０，０．１Ｍ ＫＣｌ，０．３Ｍ スクロース，コンプリートプロテアーゼインヒビター（Complete protease inhibitors）（Roche, Penzberg, Germany）w/o EDTA）中で再度懸濁すると、５〜１０ｍｇ／ｍｌの最終的なタンパク質濃度が得られた。この懸濁液をアリコートし、液体窒素中で衝撃冷凍（shock-frozen）し、そして−８０℃で貯蔵した。
【０１０７】
ニコチンアミドグアニジンジヌクレオチド（ＮＧＤ）及びニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（ＮＨＤ）を、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のためのサロゲートとし、Graeff et al. (Biochemistry 35, 379-386, 1996）によって述べられているように心臓ＡＤＰＲＣ活性を測定した。シクラーゼによって触媒される反応において、ＮＧＤ及びＮＨＤは、それぞれ、サイクリックグアノシンジホスホリボース（ｃＧＤＰＲ）及びサイクリックイノシンジホスホリボース（ｃＩＤＰＲ）に変換され、これにより可視的スペクトルでそれらの蛍光を介して検出することが可能となる。この方法は、以下のように行なわれた：
【０１０８】
試験化合物（１μｌ ストック溶液，３ｍＭ（ＤＭＳＯ中））を２％ ＤＭＳＯを含む９９μｌの反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｍａｌａｔ，ｐＨ ７．０，０．１Ｍ ＫＣｌ，０．３Ｍ スクロース，コンプリートプロテアーゼインヒビター w/o EDTA）中に希釈して、３％ ＤＭＳＯを含む反応バッファー中の３０μＭの試験化合物を得た。上記の記載の通りに調製された心臓筋小胞体膜を反応バッファー中に、観察時間内に十分な基質のターンオーバーが与えられる濃度に希釈した。適切な希釈は、各バッチの心臓ＳＲ膜に対して個々に決定することが必要である。次に、この基質（ＮＧＤ又はＮＨＤ，１０ｍＭ ストック溶液（水中））を、反応バッファー中、７５０μＭの濃度に希釈した。２μｌの化合物溶液を３８４ウェルの少量マイクロタイタープレート（Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany）に移した。２μｌの希釈ＳＲ膜を加え、そして反応を２μｌの基質溶液を添加することによって開始させた。ポジティブコントロール（化合物溶液の代わりに３％ ＤＭＳＯを含む反応バッファー）及びバックグラウンドサンプル（化合物溶液の代わりに３％ ＤＭＳＯを含む反応バッファー、反応バッファー中の心臓ＳＲ膜の代わりに反応バッファー）を、各プレートに含有させた。次いで、反応混合物の蛍光（励起波長 ２７５ｎｍ、発光波長 ４１０ｎｍ）を、基質を添加した（ｔ0測定）後、及びいくつかのインキュベーション期間（例えば、３０、６０、９０分）の後、直接測定した。測定の間に、プレートを３７℃でインキュベートした。
【０１０９】
解析：
各反応混合物のシクラーゼ活性を、経時的な蛍光の変化、すなわち、図１に示されているように線形回帰によって得られた時間プロットに対する蛍光の線の傾き（スロープ：slope）によって明確にした。阻害パーセント値（Ｉ％）は、下記の式を用いることによって得られた。
【０１１０】
【数１】
2013532987.tif 000003
【０１１１】
濃度反応曲線を、異なった濃度の範囲にわたって化合物を試験することによって得た。ＩＣ50値は、試験化合物の有効性の尺度として使用され、これはデータの点を下記の式（パラメーターＣ）にフィットさせることによって算出された。パラメーターＡは、低い化合物濃度におけるＩ％の下限（lower limit）である。これはゼロにセットした。パラメーターＢは、高い化合物濃度におけるＩ％の上限である。パラメーターＤは、いわゆる、ヒル係数であり、これは、その変曲点における濃度反応曲線の傾きを定義している。
【０１１２】
【数２】
2013532987.tif 000004
【０１１３】
結果：
およそ１６，０００化合物のライブラリーを、スクリーニングし、そして心臓ＡＤＰＲＣによって触媒される基質変換の速度論曲線の傾きの有意な減少を示している（図１において示されている例）いくつかの心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤を特定した。例示的に、２つの異なった心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤の場合の結果がここに示されている。この酵素速度論値は、ＩＣ50値が導かれる用量反応曲線（図３）に示されている。化合物Ａ００１１０２５８９のＩＣ50値は、およそ、０．２１μＭであった。化合物ＳＷ６４８２５のＩＣ50値は、およそ、０．０４μＭであった。驚くべきことに、こうした結果は、下記に述べられている化合物の抗不整脈特性に非常によく相関している。
【０１１４】
実施例２：インビトロにおける心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤の抗不整脈特性の決定
上記に述べられているアッセイで特定された心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤の抗不整脈特性が、高周波電気刺激（high frequency electrical stimulation）の後、モルモットの乳頭筋肉細胞における遅延後脱分極の発生を防止するそれらの能力を決定することによって精査された。この実験プロトコルは以下の通りであった：
【０１１５】
組織調製：
およそ４００ｇの重さのモルモット（Dunkin Hardley Pirbright）を、震盪、引き続いて放血することによって犠死させた。開胸直後に、心臓を除去し、室温でタイロード溶液（ｍｍｏｌ／ｌ単位）：１３６ ＮａＣｌ，３．３ ＫＣｌ，１．２ ＫＨ2ＰＯ4，１．１ ＭｇＳＯ4，２．５ ＣａＣｌ2，５ グルコース，１０ ＨＥＰＥＳ，そしてｐＨ＝７．４，酸素ガスを通じる）中に入れた。最後に、左乳頭筋肉を除去し３７℃に過熱したタイロード溶液を含む測定チャンバーにマウントした。心臓除去からのチャンバーにおける乳頭筋肉マウンティングまでの時間は、およそ３分であった。
【０１１６】
電気生理学的記録：
乳頭筋肉のマウンティング直後に、これを１〜４ボルトの矩形パルスで、及び１〜３ミリ秒（ｍｓ）の持続時間、１Ｈｚの周波数にて、コンピュータープログラム（MFK, Niedernhausen, Germany）によって刺激した。この浴（bath）は、ローラーポンプ（TL, Meredos GmbH, Bovenden, Germany）によって、１分あたり４ｍｌの割合にてタイロード溶液で連続的に灌流した。この溶液は３７℃に予熱した。活動電位（ＡＰＳ）を、３Ｍ ＫＣｌ溶液で満たされたガラス微小電極によって記録した。この電極は、微小電極プラー（microelectrode puller）（DMZ-Universal Puller, Zeitz Instruments, Martinsried, Germany）によって、ホウケイ酸ガラス（品目番号：１Ｂ１５０Ｆ−４，World Precision Instruments, Sarasota, USA）から作製した。この電極は、５〜１０メガオーム（megaohms）の電気抵抗を有していた。電気シグナルを増幅器（Model 309, Harvard Apparatus GmbH, March-Hugstetten, Germany）を用いて記録し、コンピューターシステムに保存した。
【０１１７】
実験プロトコル：
３０分の平衡期間の後、ＡＰを記録し、そして化合物又はコントロールを灌流溶液に加えた。１５分後、ＡＰを記録し、そして灌流溶液を変更した：ＫＣｌ及びＫＨ2ＰＯ4を除外し、そしてＣａＣｌ2を５．５ｍＭに増加した。１５分後、ＡＰを記録し、組織を４Ｈｚで３０秒間ペーシングした。次いでこのペーシングを停止すると、頻繁に自発的なＡＰが発生した。ペーシング停止の６秒後に発生する自発的なＡＰの数をカウントした。バックグラウンドサンプルのみの存在下では、６秒の時間内の自発的ＡＰの数は、およそ１３であった。コントロール及び化合物の測定の数は、それぞれごとに、１０であった。各群の自発的ＡＰの数は、スチューデントのｔ検定によって比較した。
【０１１８】
結果：
脱分極実験の結果が図４及び図５にまとめられている。１０μＭで、心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤Ａ００１１０２５８９は、６秒に平均４．４の脱分極に急速ぺーシングした後６秒以内に遅延後脱分極の数を有意に減少させ、一方、ＤＭＳＯコントロールは、６秒でおよそ１４の脱分極を示した（図４）。別の実験において、心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤ＳＷ６４８２５の作用がアッセイされた。３μＭで、心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤ＳＷ６４８２５は、急速ペーシングした後６秒以内に、遅延後脱分極の数を有意に減少させた。一方、ＤＭＳＯコントロールでは、６秒以内で平均１３．１の脱分極があり、効果を発揮する心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤ＳＷ６４８２５は、６秒で平均２．９の脱分極まで脱分極の数を減少させた。
【０１１９】
驚くべきことに、こうした結果は、全体的に、上記に示されているように、心臓ＡＤＰＲＣの酵素活性阻害の場合に見出された結果と非常によく相関関係がある。
【０１２０】
実施例３：インビボにおける心臓ＡＤＰＲシクラーゼ阻害剤の抗不整脈特性の決定
実験プロトコル：
ＡＤＰＲシクラーゼ阻害剤の抗不整脈特性を、麻酔モルモットにおいてインビボで測定した。この目的のために、モルモットをペントバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ i.p.）で麻酔し、そして４０％（ｖ／ｖ） 酸素（Ｏ2）で通気を行なった。３０分後、化合物を、ボーラスインジェクションとして用いた。５分後、ウアバインを１分当たり、３０μｇ／ｋｇの速度で注入すると、収縮の強い連続的な増加が生じた。バックグラウンドサンプルの存在下では、心室細動が、ウアバイン注入のおよそ１２分後に生じ、そして心停止がおよそ１５分後に起こった。
【０１２１】
結果：
心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤の存在下では、心室細動（ＶＦ）及び心停止までの時間が有意に延長された。この結果について、図６に図解されている。心臓ＡＤＰＲＣ阻害剤ＳＷ６４８２５は、麻酔モルモットへのウアバイン注入による心室細動及び心停止までの時間を有意に延長した。
【０１２２】
参照資料：
1. Graeff et al., Biochemistry 35, 379-386, 1996
2. Kranias et al., Biochim. Biophys. Acta 709, 28-37, 1982
3. WO 08/82169, Chonbuk University, S. Korea
4. Ullman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91, 5426-5430, 199。
【図１】
2013532987.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2013532987.tif 000014
2013532987.tif 000015