(57)【要約】  本出願は、とりわけ、ジテルペンシンターゼ活性を有する新規ポリペプチド、それをコードする核酸分子、およびプロイロムチリンを産生する生合成経路に関与していると考えられているクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）由来の遺伝子クラスターに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、
配列番号２に対して少なくとも４０％の配列同一性を有する配列、ならびに
ｉ）配列番号７に対して少なくとも１５％の配列同一性を有する配列、
ｉｉ）配列番号４に対して少なくとも２５％の配列同一性を有する配列、
ｉｉｉ）配列番号５に対して少なくとも４５％の配列同一性を有する配列、および
ｉｖ）配列番号６に対して少なくとも４５％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、配列番号１〜２および４〜７がクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）由来であり、ポリペプチドがジテルペンシンターゼである、単離された該ポリペプチド。
【請求項２】
該アミノ酸配列が、配列番号３に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を更に含み、配列番号３がクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）由来である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドの分子量が９０ｋＤａ〜１４０ｋＤａの間、特に１００ｋＤａ〜１３０ｋＤａの間、特に１０５ｋＤａ〜１２０ｋＤａの間である、および／またはポリペプチドが、配列番号９に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、配列番号９に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えば、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドがゲラニルゲラニルピロホスファートからプロイロムチリン前駆体への、特に式（Ｉ）の化合物への変換を触媒しうる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
Ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドもしくは配列番号９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
Ｂ）ａ）配列番号８の配列、または
ａ’）配列番号１５の配列もしくはそれに相補的な配列、または
ｂ）ａ’）に記載の配列の部分配列（該部分配列はジテルペンシンターゼをコードするものである）、または
ｃ）ａ’）に記載の配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有し、もしくはａ）に記載の配列もしくはｂ）に記載の部分配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、ジテルペンシンターゼをコードする配列、または
ｄ）ジテルペンシンターゼをコードし、ａ）、ａ’）、ｂ）およびｃ）のいずれかに記載の配列に対する遺伝暗号の結果として縮重している配列、または
ｅ）ジテルペンシンターゼをコードし、ストリンジェントな条件下で配列番号８および／もしくは配列番号１３にハイブリダイズしうる配列
であるヌクレオチド配列、
Ｃ）Ｂ項に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１８個の連続的ヌクレオチド、および／または
Ｄ）ストリンジェントな条件下でＡ項もしくはＢ項に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズしうる少なくとも１８個の連続的ヌクレオチドを含む単離された核酸分子。
【請求項６】
ポリペプチドまたは核酸分子が、真菌宿主、特に担子菌門の真菌、より詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌から誘導可能である、特に、該ポリペプチドまたは核酸分子が、クリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）またはクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）から誘導可能である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドまたは請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項５のＡまたはＢに記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項８】
細胞、組織および非ヒト生物から選択される天然に存在しない宿主であって、該宿主が、請求項５のＡもしくはＢに記載のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子および／または請求項７に記載の少なくとも１つのベクターを含み、特に、ここで、該宿主が、真菌宿主、より詳しくは担子菌門の真菌、より詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌である、宿主。
【請求項９】
（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、請求項５のＡもしくはＢに記載の少なくとも１つの核酸分子および／または請求項７に記載の少なくとも１つのベクターを導入し、（ｉｉ）ポリペプチドの産生に適した条件下で該宿主を培養することを含み、特に、（ｉｉｉ）宿主からポリペプチドを回収するもう１つの工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、請求項５のＢａ’に記載の核酸分子および／または請求項５のＢａ’に記載の核酸分子を含むベクターを導入し、（ｉｉ）プロイロムチリンの産生に適した条件下で宿主を培養することを含む、プロイロムチリンの製造方法。
【請求項１１】
細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主におけるプロイロムチリンの産生の改変方法であって、該宿主がプロイロムチリンを産生することが可能であり、請求項５のＡまたはＢに記載のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子を含み、該方法が、前記の少なくとも１つの核酸分子のｉ）発現、ｉｉ）同一性、またはｉｉｉ）発現および同一性の両方を操作することを含み、特に、ここで、該方法が、
ａ）プロイロムチリンの産生を増加させる方法、または
ｂ）特に、前記の少なくとも１つの核酸分子を破壊またはダウンレギュレーションすることを含む、プロイロムチリンの産生を減少させる方法であり、特に、ここで、該宿主が真菌宿主、より詳しくは担子菌門の真菌、より一層詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌である、方法。
【請求項１２】
請求項５のＡまたはＢに記載の単離された核酸分子の使用であって、
ａ）該核酸分子の配列の２〜５０ヌクレオチドが、プロイロムチリンを産生しうる野生型生物により含まれるプロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する遺伝子クラスターの配列とは異なっている、プロイロムチリンの製造における、または
ｂ）該核酸分子の配列の２〜５０ヌクレオチドが、プロイロムチリンを産生しうる野生型生物により含まれるジテルペンシンターゼをコードする配列とは異なっている、プロイロムチリン前駆体（特に、該プロイロムチリン前駆体は式（Ｉ）の化合物である）の製造における、使用。
【請求項１３】
プロイロムチリン前駆体が式（Ｉ）の化合物である、プロイロムチリンまたはプロイロムチリン前駆体の製造における請求項８に記載の使用。
【請求項１４】
ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、特に、ジテルペンシンターゼをコードする、特に、プロイロムチリンシンターゼをコードする１以上の核酸を特定するための、請求項５に記載の単離された核酸分子の使用。
【請求項１５】
プロイロムチリン前駆体、特に式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、該方法が、
Ａ）該前駆体の発酵的製造方法であり、
（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、請求項５のＡもしくはＢに記載の少なくとも１つの核酸分子および／または請求項７に記載の少なくとも１つのベクターを導入し、
（ｉｉ）該前駆体の発酵的製造に適した条件下で宿主を培養する工程を含み、または
Ｂ）該前駆体の合成的製造方法であり、ゲラニルゲラニルピロホスファートを請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載の製造方法により入手可能なポリペプチドと反応させることを含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、とりわけ、ジテルペンシンターゼ活性を有する新規ポリペプチド、それをコードする核酸分子、およびクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）由来の遺伝子クラスター（該クラスターは、ジテルペン、より厳密にはプロイロムチリンを産生する生合成経路に関与していると考えられている）に関する。
【背景技術】
【０００２】
テルペンおよびテルペノイドは共に、多数の様態で合体し次いで修飾される５炭素イソプレン単位に由来する、大部分は天然に存在する有機化合物の、多様かつ非常に大きなクラスである。テルペンおよびテルペノイドは共に、それらの炭素骨格およびそれらの官能基において互いに異なりうる。テルペンおよびテルペノイドの大多数は１以上の環構造を含む。テルペノイドは一般に、イソプレノイドとも称される。テルペンおよびテルペノイドは、それらの骨格の一部であるテルペン単位（Ｃ５）の数に従い分類されうる。したがって、モノテルペンは２つのイソプレン単位（Ｃ１０；１０個の炭素原子の骨格）から構成され、セスキテルペンは３つのイソプレン単位（Ｃ１５；１５個の炭素原子の骨格）から構成され、ジテルペンは４つのイソプレン単位（Ｃ２０；２０個の炭素原子の骨格）から構成されるなどである。ジテルペンおよびジテルペノイドは一般にゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）から誘導される。
【０００３】
ジテルペンシターゼは、当業者によく知られている酵素であり、これは通常、それぞれジテルペンまたはジテルペノイドを形成するようにゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）を基質として利用する反応を触媒する。この場合、ＧＧＰＰは通常、１以上の炭素環を含む環状化合物に変換される。したがって、ジテルペンシンターゼはジテルペンシクラーゼと称されることが多い。ジテルペンシンターゼは一般に、ジテルペンまたはジテルペノイドを産生する生合成経路に関与している。
【０００４】
遺伝子クラスターは、例えば１つの特定の生合成経路（例えば、二次代謝産物を産生する経路）に関与するポリペプチドをコードすることにより機能性単位を形成する隣接遺伝子の一群として一般に公知である。二次代謝産物は、特定の条件下で特定生物により通常産生される物質である。一次代謝産物とは異なり、それは通常、それを産生する生物に必須ではない。広域スペクトル抗生物質プロイロムチリンはテルペノイド、より厳密にはジテルペノイドであり、真菌二次代謝産物の一例である。それはプロイロツス・ムチルス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｍｕｔｉｌｕｓ）（Ｆｒ．）Ｓａｃｃ．およびプロイロツス・パッセケリアヌス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）Ｐｉｌ．から１９５１年に最初に単離された。主として、プロイロムチリンはグラム陽性菌およびマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の増殖を抑制する。プロイロムチリンはリボソームの５０Ｓサブユニットのペプチジルトランスフェラーゼ成分に結合し、細菌におけるタンパク質合成を抑制する。プロイロムチリンはプロイロムチリン抗生物質のグループの唯一のメンバーであり、該グループは、ブタ赤痢および肺炎の治療に有効であると記載されているチアムリン、バルネムリンおよびレタパムリンを含む幾つかの半合成誘導体を更に含む（Ｙａｏ，２００７を参照されたい）。
【０００５】
【化１】
2013521006.tif 000002
【０００６】
プロイロムチリンのグループの他の典型的メンバーはアザムリンおよびＢＣ−３７８１である。他のプロイロムチリンはＨｕｎｔ，Ｅ．，２０００およびそれにおいて引用されている参考文献に開示されている。プロイロムチリンは元々は主に獣医学において使用されてきたものであるが、それはヒト用治療用物質としての関心を次第に獲得しつつある（Ｈｕら，２００９を参照されたい）。
【０００７】
プロイロムチリンを産生する一般的生合成経路は１９６０年代に同位体標識実験により明らかにされた。プロイロムチリンを産生する生合成経路における重要な反応はゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）から三環性プロイロムチリン前駆体への反応であり、この反応は、プロイロムチリンシンターゼと一般に称されている推定酵素である特定のジテルペンシンターゼ（ＤＳ）により触媒されると考えられている。該提示反応の詳細（Ｙａｏ，２００７を参照されたい）を図１に示す。プロイロムチリンを産生する経路の後続反応においては、シトクロムＰ−４５０酵素（Ｃ３およびＣ１１における機能）およびアシルトランスフェラーゼ（Ｃ１４ヒドロキシルにおける機能）の作用が、プロイロムチリンの形成を完了するのに必要だと考えられている（Ｙａｏ，２００７を参照されたい）。ＧＧＰＰからのプロイロムチリンの形成の、より後の提示段階を（Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉら，２００７を参照されたい）、図２に示す。
【０００８】
二次代謝産物の生合成をもたらす遺伝子のクラスター化は、ストレプトミセス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）（Ｉｋｅｄａら，２００３；Ｏｉｙｎｙｋら，２００７）および真菌（Ｋｅｌｌｅｒら，２００７）を含むほとんどの微生物における共通の特徴である。プロイロムチリンの形成のための生合成遺伝子クラスターを特定するための努力がなされている。例えば、Ｙａｏ（２００７）は、プロイロムチリンの形成のためのジテルペンシンターゼ遺伝子を特定するための３つの異なる試みを記載している。Ｙａｏは幾つかのＧＧＰＰシンターゼ遺伝子（ｇｇｓ遺伝子）を発見したが、ジテルペンシンターゼ遺伝子を特定することはできなかった。
【０００９】
したがって、ジテルペンシンターゼをコードする遺伝子クラスターおよび遺伝子のような核酸を特定すること、ならびにそれによりコードされるポリペプチドを特定することが当技術分野で必要とされている。なぜなら、プロイロムチリン遺伝子クラスターの特定はプロイロムチリン産生の論理的操作への道を開くであろうからである。抗生物質耐性の問題が増加しつつあるため、医学用途における可能な使用のためのプロイロムチリンまたはその前駆体もしくは変異体のような代替的抗生物質を製造するための手段を提供することが当技術分野で特に必要とされている。
【００１０】
本発明者らは、ジテルペノイド、より詳細にはプロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する遺伝子クラスターを含むと想定される核酸配列を特定することに成功した。該核酸配列はクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のゲノムに由来し、プロイロムチリンの生合成に関与すると考えられるポリペプチドをコードする少なくとも６つの転写的に共調節されるオープンリーディングフレームを含むと予想される。更に、本発明者らは更に、この遺伝子クラスターの一部として、新規ジテルペンシンターゼであるポリペプチドを特定することに成功している。それはクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のゲノムにおける唯一のジテルペンシンターゼであるらしく、したがって、長く追い求められていたプロイロムチリンシンターゼであると予想されている。該ジテルペンシンターゼ遺伝子は、推定ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ遺伝子、２以上のシトクロムｐ４５０酵素コード化遺伝子および推定アシルトランスフェラーゼコード化遺伝子に接近して位置しており、それらと共に実際に共調節されており、このことは、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のプロイロムチリンを産生する生合成経路にそれが関与していることを妥当かつ信頼しうるものにしている。プロイロムチリン合成のための生合成遺伝子クラスターの発見により、本発明は更に、ジテルペノイド、特にプロイロムチリンおよびプロイロムチリン前駆体を製造するための貴重な手段を提供し、本明細書に開示されているジテルペンシンターゼの産物から出発することにより、新規プロイロムチリン抗生物質またはプロイロムチリン類似体を合成するための基礎を提供すると考えられる。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、とりわけ、添付の特許請求の範囲において定義されている、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドに関する。
【００１２】
もう１つの態様においては、本発明は、添付の特許請求の範囲において定義されている対応核酸分子に関する。個々の核酸分子は、ジテルペン、より厳密にはプロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する遺伝子クラスターであると予想される核酸分子である。
【００１３】
更に詳細な態様においては、本発明は、特許請求の範囲において定められており後記に記載されている方法および使用のような主題に関する。
【００１４】
本発明の態様および個々の実施形態は特許請求の範囲および以下の開示に記載されている。
【００１５】
定義
後記で特に示されていない限り、本明細書中で用いる技術用語は一般に、当技術分野で理解されている一般的な意味を有する。
【００１６】
一般に、本明細書中で用いる「含む」なる語は、「有する」および「からなる」なる意味を含む。
【００１７】
ポリペプチドは通常、個々のアミノ酸がペプチド結合により互いに連結されている直鎖状アミノ酸重合体である。低い比率、例えば１０％未満、５％未満、３％未満または更には１％未満、例えば０％〜１％の修飾または非天然アミノ酸を含有するポリペプチドも想定される。しかし、好ましいポリペプチドは非天然アミノ酸を含有せず、修飾は専ら天然に生じる修飾、例えばグリコシル化、ユビキチン化などである。当業者によく知られているとおり、ポリペプチドは、例えば、セリン、トレオニンまたはチロシン残基のリン酸化により、あるいは例えばアスパラギン残基またはセリン残基のグリコシル化により修飾されうる。修飾ポリペプチドは同様に本発明においてポリペプチドに含まれると想定される。
【００１８】
ポリペプチドに関して本明細書中で用いる「野生型」なる語は、そのようなポリペプチドの、天然に存在する非突然変異形態を意味する。
【００１９】
本発明のポリペプチドは特に非天然ポリペプチドを含む。本明細書に記載されている「非天然ポリペプチド」自体は天然に存在しないが、実験的操作、例えば遺伝子工学技術、またはポリペプチドへの他の分子の化学的カップリングにより製造可能であり、個別的には既に製造されている。修飾ポリペプチドの例としては、特に、遺伝子工学技術により生じる付加、置換、欠失、トランケート化を含有するポリペプチドが挙げられる。好ましくは、「非天然ポリペプチド」は、天然に存在する種のゲノムによりそれ自体はコードされていないポリペプチド、特に、天然に存在する種がその起源として特定されている本出願の出願日における遺伝子バンクデータベースのポリペプチドのいずれとも同一でないポリペプチドである。ある好ましい一般的実施形態においては、本明細書に記載されているポリペプチドは非天然ポリペプチドである。
【００２０】
本明細書中で用いる「ポリペプチド」は、特に、３０個超、特に少なくとも３５、４０、４５個または少なくとも５０もしくは１００個であるが１０，０００個以下、特に９，０００、８，０００、７，０００、６，０００または５，０００個以下のアミノ酸を含む分子に関するものである。本発明の好ましいジテルペンシンターゼは、約５００〜約１，５００個のアミノ酸、特に約８００〜約１，２００個のアミノ酸、特に約９００〜約１，１００個のアミノ酸、より詳しくは約９００〜約１，０２０個のアミノ酸を含む。好ましくは、このポリペプチドの分子量は９０ｋＤａ〜１４０ｋＤａ、特に１００ｋＤａ〜１３０ｋＤａ、特に１０５ｋＤａ〜１２０ｋＤａである。
【００２１】
「単離（された）」ポリペプチドは、それが天然で存在する又はそれが産生された環境とは異なる環境中に存在するポリペプチドを意味する。好ましくは、単離ポリペプチドは、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）６．６（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に従い、不連続的ＳＤＳ  ＰＡＧＥを１２％  分解ゲルによる変性およびクーマシー染色により決定された場合に、少なくとも０．０１％、特に少なくとも０．１％、より詳しくは少なくとも１％、より詳しくは少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、より詳しくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％純粋である。好ましくは、単離ポリペプチドは生物または細胞内には含有されない。好ましい実施形態においては、該単離ポリペプチドは、その天然環境または産生環境のいずれのポリペプチド成分をも伴わない。
【００２２】
ポリペプチドの場合、好ましくは、参照配列に対して少なくともＸ％の同一性を有するポリペプチドを該参照配列と異ならせているアミノ酸残基変化の性質は、半保存的な、より好ましくは保存的なアミノ酸残基置換である。
【００２３】
【表１】
2013521006.tif 000003
【００２４】
Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、ＷまたはＹからＣへの変化は、新たなシステインが遊離チオールのままである場合、半保存的である。ＭからＥ、ＲまたはＫへの変化は、新たな側鎖基のイオン性先端部がタンパク質表面に達しうる一方でメチレン基が疎水性接触を引き起こす場合、半保存的である。ＰからＫ、Ｒ、ＥまたはＤの１つへの変化は、側鎖基がタンパク質の表面上に存在する場合、半保存的である。更に、立体的に厳しい位置におけるグリシンは置換されるべきではなく、アルファ−ヘリックスまたはベータシート構造を有するタンパク質部分にＰは導入されるべきではない、と当業者は理解するであろう。
【００２５】
核酸分子は当業者によく知られている。好ましくは、本明細書中で用いる「核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのような、ヌクレオチド単量体からなる核酸重合体を意味する。
【００２６】
「単離（された）」核酸分子は、それが天然で存在する又はそれが産生された環境とは異なる環境中に存在する核酸分子を意味する。特に、それは、それがそれぞれその天然環境または産生環境において通常伴っている少なくとも１つの核酸分子から分離されている。好ましくは、単離核酸分子は生物または細胞内には含有されない。好ましい実施形態においては、該単離核酸分子は、その天然環境または産生環境に伴ういずれの核酸分子をも伴わない。
【００２７】
核酸分子に関して本明細書中で用いる「野生型」なる語は、そのような核酸分子の天然に存在する非突然変異形態を意味する。
【００２８】
本発明の核酸分子は特に非天然核酸分子を含む。本明細書に記載されている「非天然核酸分子」自体は天然に存在しないが、実験的操作、例えば遺伝子工学技術、またはポリペプチドへの他の分子の化学的カップリングにより製造可能であり、個別的には既に製造されている。修飾核酸分子の例としては、特に、遺伝子工学技術により生じる付加、置換、欠失、トランケート化を含有する核酸分子が挙げられる。好ましくは、「非天然核酸分子」は、天然に存在する種がその起源として特定されている本出願の出願日における遺伝子バンクデータベースの核酸分子と同一でないポリペプチドである。ある好ましい一般的実施形態においては、本明細書に記載されている核酸分子は非天然核酸分子である。
【００２９】
「配列ｘの部分配列」は一般に、配列ｘの１以上の連続的断片を含む配列を意味する。ある好ましい実施形態においては、それは配列ｘの、１つの連続的断片を含む。好ましくは、ヌクレオチド配列の場合には、該部分配列は、１以上の、特に１つのオープンリーディングフレームを含む。より好ましくは、該部分配列は、ポリペプチドをコードする配列、特に、イントロンを含まないコード配列（ｃｄｓ）である。
【００３０】
本明細書中で用いるヌクレオチド配列が「種由来」と称されるのは、それが該種のゲノム内のどこかに含有されている場合である。該ヌクレオチド配列は遺伝子の一部分であってもそうでなくてもよい。
【００３１】
関連配列における対応位置の決定および同一性の割合（％）の計算は、よく知られたアライメントアルゴリズムおよび場合によってこれらのアルゴリズムを利用するコンピュータプログラムの助けにより行われうる。本特許出願における同一性は、デフォルトパラメータを用いるフリーウェアプログラムＣｌｕｓｔａｌＸ（バージョン１．８３）により配列を整列させ、ついで同一残基を手動で計数することにより計算した。ついで、同一物の数を最短配列の（全体の）長さで割り算することにより、同一性（％）（ＰＩＤ）を計算した。例えばペアワイズアライメント（遅−正確）のためのデフォルト設定は以下のとおりである：ギャップ・オープニング・パラメータ：１０．００；ギャップ伸長パラメータ０．１０；タンパク質重み行列：Ｇｏｎｎｅｔ  ２５０；ＤＮＡ重み行列ＩＵＢ。ＣｌｕｓｔａｌＸプログラムはＴｈｏｍｐｓｏｎら，１９９７に詳細に記載されている。
【００３２】
したがって、本明細書中で用いるヌクレオチドまたはアミノ酸配列が或る与えられた配列に対する「Ｘ％の配列同一性」を有すると称されるのは、デフォルトパラメータを用いるフリーウェアプログラムＣｌｕｓｔａｌＸ（バージョン１．８３）でのアライメント、後続の同一残基の決定［例えば、手動計算、およびそれに続く、同一物の数を最短配列の（全体の）長さで割り算することによる同一性の割合（％）（ＰＩＤ）の計算によるもの］が「Ｘ％の配列同一性」を示す場合である。
【００３３】
本明細書中で用いる「ベクター」は特に、外来ＤＮＡ配列を宿主内に移入し導入するために使用されうるＤＮＡ要素を意味する。ベクターには、プラスミド、ウイルス、ファージおよびコスミドが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態においては、該ベクターは「発現ベクター」である。当業者に公知のとおり、特定の部位に挿入されたコード配列が転写されポリペプチドに翻訳されるように、発現ベクターは設計される。
【００３４】
本明細書中で用いる「宿主」は、好ましくは、細胞、組織および非ヒト生物から選択される。好ましい実施形態においては、該宿主は真菌宿主であり、より詳しくは担子菌門の真菌、より一層詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌である。好ましい実施形態においては、該宿主はクリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）属のものであり、特に、クリトピルス・シフォイデス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｓｃｙｐｈｏｉｄｅｓ）、クリトピルス・プルヌルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｒｕｎｕｌｕｓ）、クリトピルス・ホブソニイ（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｈｏｂｓｏｎｉｉ）、クリトピルス・プソイド−ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏ−ｐｉｎｓｉｔｕｓ）、クリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）およびクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からなる群から選択され、より詳しくは、クリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）およびクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）から選択される。もう１つの好ましい実施形態においては、該宿主はプロイロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属のものである。好ましくは、該宿主は、プロイロムチリンを産生しうることが公知である細胞、組織および非ヒト生物、例えば、オムファリナ・ムチナ（Ｏｍｐｈａｌｉｎａ  ｍｕｔｉｌａ）クリトピルス・シフォイデス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｓｃｙｐｈｏｉｄｅｓ）、クリトピルス・プルヌルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｒｕｎｕｌｕｓ）、クリトピルス・ホブソニイ（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｈｏｂｓｏｎｉｉ）、クリトピルス・プソイド−ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏ−ｐｉｎｓｉｔｕｓ）、クリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）およびクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からなる群から選択される。特に、該宿主はクリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）およびクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）である。
【００３５】
本明細書中で用いる「細胞」は特に限定されるものではない。好ましくは、該細胞は、本発明のベクターが複製可能な細胞である。好ましくは、該細胞は、ベクター内に挿入されたコード配列が転写されポリペプチドに翻訳される細胞である。好ましくは、該細胞は全能性幹細胞ではない。幾つかの実施形態においては、該組織は非動物細胞である。好ましい実施形態においては、該細胞は前記の真菌からのものである。
【００３６】
本明細書中で用いる「組織」は特に限定されるものではない。好ましくは、該組織は、本発明のベクターが複製可能な組織である。好ましくは、該組織は、ベクター内に挿入されたコード配列が転写されポリペプチドに翻訳される組織である。幾つかの実施形態においては、該組織は非動物組織である。好ましい実施形態においては、該組織は前記の真菌からのものである。組織は器官でありうる。１つの好ましい真菌組織は菌糸である。
【００３７】
本明細書中で用いる「非ヒト生物」は特に限定されるものではない。好ましくは、該非ヒト生物は、本発明のベクターが複製可能な非ヒト生物である。好ましくは、該非ヒト生物は、ベクター内に挿入されたコード配列が転写されポリペプチドに翻訳される非ヒト生物である。好ましい実施形態においては、該非ヒト生物は非動物生物である。好ましい実施形態においては、該非ヒト生物は真菌生物、より詳しくは担子菌門の真菌、より一層詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌である。好ましい実施形態においては、該真菌生物はクリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）属またはプロイロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属の真菌である。
【００３８】
本明細書中で用いる「野生型宿主」なる語および「天然に存在する宿主」なる語は共に、天然に存在する宿主を意味する。特に、そのような野生型宿主は、本出願の出願日現在のデータベースに含まれる天然に存在する種である又は該種の一部であるいずれかの細胞、組織または非ヒト生物である。
【００３９】
「天然に存在する宿主」なる語は、天然には存在しない宿主を意味する。好ましい実施形態においては、該宿主は、例えば本発明の核酸分子またはベクターがそれに導入されていることにより、天然に存在しないものである。好ましい実施形態においては、該宿主は、本明細書に記載されている核酸分子の配列を有する核酸分子がそれにおいて修飾されていることにより、天然に存在しないものである。
【００４０】
天然に存在しない宿主の「天然に存在する対応宿主」は、天然に存在しない対応宿主の非天然的特徴を示さない、天然に存在する対応宿主を意味する。一般に、天然に存在する対応宿主は、プロイロムチリンを産生しうる又は産生し得ない宿主でありうる。一般に、天然に存在する対応宿主は、プロイロムチリン前駆体、特に、式（Ｉ）の化合物を産生しうる又は産生し得ない宿主でありうる。本明細書中で用いる「プロイロムチリンを産生し得ない宿主」は、検出可能な量のプロイロムチリンを産生しない宿主を意味する。したがって、本明細書中で用いる「プロイロムチリンを産生しうる宿主」は、前記方法の１つにより、検出可能な量のプロイロムチリンを産生する宿主を意味する。
【００４１】
ある与えられた宿主が、検出可能な量のプロイロムチリンを産生するか否かは、該宿主の細胞の均一化サンプルを適当な溶媒で抽出し、例えば、ＨＰＬＣ（例えば、Ｈａｒｔｌｅｙら，２００９に記載されているとおり）、ＭＳ（例えば、Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉら，２００７）またはＮＭＲもしくはＭＳ（例えば、Ｙａｏ，２００７に記載されているとおり）を含む方法により、同時に陽性対照としてプロイロムチリンを含有するサンプルをも使用して、該抽出物中のプロイロムチリンの存在または非存在に関してアッセイすることにより、容易に決定されうる。
【００４２】
真菌宿主に関しては、「プロイロムチリンを産生し得ない宿主」は、好ましくは、Ｈａｒｔｌｅｙら，２００９の２６ページに記載されている「プロイロムチリン産生の評価」により判定された場合にプロイロムチリン産生に関する陰性結果を示す宿主を意味する。非真菌宿主に関しては、「プロイロムチリンを産生し得ない宿主」は、好ましくは、Ｈａｒｔｌｅｙら，２００９の２６ページに記載されている「プロイロムチリン産生の評価」に記載されているＨＰＬＣ分析に該宿主の細胞の均一化サンプルの抽出物を付した場合に、プロイロムチリン産生に関する陰性結果を示す宿主を意味する。
【００４３】
したがって、真菌の「プロイロムチリンを産生しうる宿主」は、好ましくは、Ｈａｒｔｌｅｙら，２００９の２６ページに記載されている「プロイロムチリン産生の評価」（すなわち、「プロイロムチリンピーク」の観察）により判定された場合にプロイロムチリン産生に関する陽性結果を示す宿主を意味する。非真菌宿主に関しては、「プロイロムチリンを産生しうる宿主」は、好ましくは、Ｈａｒｔｌｅｙら，２００９の２６ページに記載されている「プロイロムチリン産生の評価」に記載されているＨＰＬＣ分析に該宿主の細胞の均一化サンプルの抽出物を付した場合に、プロイロムチリン産生に関して陽性結果を示す宿主を意味する。
【００４４】
プロイロムチリンを産生しうる非限定的な典型的な真菌株は、例えば、Ｈａｒｔｌｅｙら，２００９に開示されている。これらには、オムファリナ・ムチラ（Ｏｍｐｈａｌｉｎａ  ｍｕｔｉｌａ）、クリトピルス・ホブソニイ（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｈｏｂｓｏｎｉｉ）、クリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）およびクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）の株が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
遺伝子クラスターは、一般に、機能性単位を構成する遺伝子の一群を意味しうる。本明細書中で用いる「遺伝子クラスター」は、一緒になって少なくとも１つの生合成経路、好ましくは１つの生合成経路に関与するポリペプチドをコードする配列を含む核酸である。特に、該配列は隣接している。好ましくは、該配列は互いに直に連続しており、この場合、それらは種々の量の非コードＤＮＡにより隔てられている。好ましくは、本発明の遺伝子クラスターは１０ｋｂ〜５０ｋｂ、より好ましくは１４ｋｂ〜４０ｋｂ、より一層好ましくは１５ｋｂ〜３５ｋｂ、より一層好ましくは２０ｋｂ〜３０ｋｂ、特に２３ｋｂ〜２８ｋｂのサイズを有する。
【００４６】
本明細書中の序論に既に記載されているとおり、テルペンおよびテルペノイドは当業者によく知られている。本明細書においては、「テルペン」と「テルペノイド」との間で区別はされていない。したがって、本明細書においては、「ジテルペン」と「ジテルペノイド」との間で区別はされていない。ジテルペンは１５個の炭素原子を含みうる。好ましくは、ジテルペンは１以上の環状構造要素を含む。ジテルペンはまた、１５個を超える又は１５個未満の炭素原子を含みうる。典型的なジテルペン／ジテルペノイドには、アコニチン、カフェストール、センブレン（ｃｅｍｂｒｅｎｅ）、カーベオール、フィタン、レチノール、ステビオシドおよびタキサジエンが含まれるが、これらに限定されるものではない。ジテルペン／ジテルペノイドの好ましい例には、限定的ではないが、プロイロムチリン、チアムリン、バルネムリン、レタパムリンが含まれ、プロイロムチリンが特に好ましい。
【００４７】
プロイロムチリンは縮合５−６−８三環性ジテルペノイドとして当業者によく知られている。それは図１においては「プロイロムチリン１」として示されうる。
【００４８】
本明細書中で用いる「プロイロムチリン抗生物質」は抗生物質のプロイロムチリンファミリーのいずれかの抗細菌物質を意味する。プロイロムチリン抗生物質には、プロイロムチリン、チアムリン、バルネムリン、レタパムリン、アザムリン、ＢＣ−３７８１およびＨｕｎｔ，Ｅ．，２０００に開示されているものが含まれるが、これらに限定されるものではない。ここにおいては、プロイロムチリン抗生物質は、好ましくは、プロイロムチリンまたはプロイロムチリン誘導体である。プロイロムチリン誘導体は特に限定されるものではなく、認識可能なあらゆるプロイロムチリン誘導体を包含する。
【００４９】
本明細書中で用いる「プロイロムチリン前駆体」は、プロイロムチリンを産生する生合成経路のいずれかの中間化合物を意味する。プロイロムチリン前駆体はゲラニルゲラニルピロホスファートシンターゼの産物であっても又はそうでなくてもよく、したがって、ゲラニルゲラニルピロホスファートであっても又はそうでなくてもよい。好ましくは、「プロイロムチリン前駆体」は、ゲラニルゲラニルピロホスファートの下流でプロイロムチリンを産生する生合成経路のいずれかの中間化合物を意味する。好ましい「プロイロムチリン前駆体」は、本明細書に開示されているとおり、ジテルペンシンターゼの産物、特にプロイロムチリンシンターゼの産物である。本発明における好ましいプロイロムチリン前駆体は、図１に示されているプロイロムチリン前駆体である。本発明における特に好ましいプロイロムチリン前駆体は、図１に示されている式（Ｉ）の化合物である。
【００５０】
「プロイロムチリン前駆体」はまた、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するポリペプチドにより触媒されるいずれかの他の反応の産物でありうる。他の好ましいプロイロムチリン前駆体には、特に、本出願における図２に示されている化合物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）が含まれる。
【００５１】
また、「ジテルペンシンターゼ」および「ジテルペノイドシンターゼ」は本明細書においては互換的に用いられている。また、「ジテルペンシンターゼ」は「ジテルペンシクラーゼ」とも称されうる。ジテルペンシンターゼは、前記にも記載されているとおり、当業者によく知られている。換言すれば、当業者は、例えば公知ジテルペンシンターゼに対するその相同性により、ジテルペンシンターゼを認識するのに容易な位置にあるであろう。この目的のために、当業者は、コンピュータによる方法、例えばアライメント、例えば本出願の図５に開示されているものに類似したアライメントを適切に用いることが可能である。本明細書においては、「ジテルペンシンターゼ」は、特に、１以上の環構造を含有する分子にゲラニルゲラニルピロホスファートを変換するのを触媒しうるポリペプチドを意味する。好ましくは、該分子はプロイロムチリン前駆体である。したがって、好ましい実施形態においては、ジテルペンシンターゼはプロイロムチリンシンターゼである。本明細書においては、「プロイロムチリンシンターゼ」は、特に、１以上の環構造を含有する分子［該分子はプロイロムチリン前駆体、特に、図１に示されているプロイロムチリン前駆体、特に、式（Ｉ）の化合物である］にゲラニルゲラニルピロホスファートを変換するのを触媒しうるポリペプチドを意味する。
【００５２】
本明細書中で用いる「ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチド」は、好ましくは、１以上の環構造を含有する分子にゲラニルゲラニルピロホスファートを変換するのを触媒しうるポリペプチドを意味する。該ポリペプチドは他の活性を有していても又は有していなくてもよく、ジテルペンシンターゼ活性は該ポリペプチドの主要活性でなくてもよい。ジテルペンシンターゼ活性は、例えば、該ポリペプチド、好ましくは該精製ポリペプチドを含有するサンプルをＧＧＤＰと共に適当なバッファー中でインキュベートし、場合によってはＧＧＤＰの消費に関連したジテルペンシンターゼの産物（例えば、１以上の環構造を含有するジテルペン分子）の産生を適当な方法（例えば、ＭＳまたはＧＣ／ＭＳを含む方法）により検出することにより検出および／または測定されうる。ジテルペンシンターゼの活性に関する１つの特定の典型的な酵素アッセイがＴｏｙｏｍａｓｕら，２０００に開示されている。該アッセイは、基本的に、ＧＣ−ＭＳによるジテルペンシンターゼの産物の検出を含む。ジテルペンシンターゼ活性に関する典型的アッセイはＫａｗａｉｄｅら，１９９７にも開示されており、１つの特定のアッセイは、［３Ｈ］ＧＧＤＰを用いることによる、ＧＧＤＰ消費および産物生成の検出を含み、もう１つのアッセイは、ＧＣ−ＭＳにより代謝産物を特定するのに適している。ある与えられたアッセイのために必要な場合には、ジテルペンシンターゼは、例えば真菌宿主または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現されることが可能であり、場合によっては、それから精製されうる。
【００５３】
本明細書中で用いる「プロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチド」は、好ましくは、プロイロムチリン前駆体、特に、図１に示されているプロイロムチリン前駆体、特に、式（Ｉ）の化合物にゲラニルゲラニルピロホスファートを変換するのを触媒しうるポリペプチドを意味する。該変換は１以上の工程を含みうる。該ポリペプチドは他の活性を有していても又は有していなくてもよく、プロイロムチリンシンターゼ活性は該ポリペプチドの主要活性でなくてもよい。プロイロムチリンシンターゼ活性は、例えば、該ポリペプチド、好ましくは該精製ポリペプチドを含有するサンプルをＧＧＤＰと共に適当なバッファー中でインキュベートし、プロイロムチリン前駆体、特に式（Ｉ）の化合物の産生に関してアッセイすることにより検出および／または測定されうる。プロイロムチリン前駆体、特に、図１に示されている化合物、特に、式（Ｉ）の化合物の産生の検出は、本明細書に開示されている参考文献の教示を含む本明細書の開示に基づいて、例えば、ＭＳまたはＮＭＲを含む方法により、当業者により容易に達成可能であろう。好ましい実施形態においては、本発明のプロイロムチリンシンターゼは、配列番号９のプロイロムチリンシンターゼの活性の少なくとも５％、１０％または２０％、好ましくは、少なくとも３０％または４０％、例えば、少なくとも５０％または少なくとも６０％、７０％、８０％、特に、少なくとも９０％または９５％、特に、少なくとも１００％、例えば、少なくとも１２５％、１５０％または１７５％、特に、配列番号９のプロイロムチリンの活性の少なくとも２倍または５倍、少なくとも１０倍または２５倍、例えば、５０〜１００倍の活性を有する。
【００５４】
ＧＧＰＰと略される「ゲラニルゲラニルピロホスファート」なる語およびＧＧＤＰと略される「ゲラニルゲラニルジホスファート」は本明細書においては互換的に用いられる。
【００５５】
本明細書中で用いる「ジテルペンを産生する生合成経路」は、プロイロムチリンのようなジテルペンにつながる生合成経路を意味する。該経路は少なくとも、ジテルペンまたはジテルペン前駆体にＧＧＰＰを変換する工程を含み、ＧＧＰＰの形成の工程、および／または該ジテルペンの合成の、１以上の後期工程を更に含みうる。
【００５６】
本明細書中で用いる「プロイロムチリンを産生する生合成経路」は、プロイロムチリンのようなプロイロムチリン抗生物質につながる生合成経路を意味する。好ましい実施形態においては、それは、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）［これは、好ましくは、ファルネシルピロホスファート（ＦＰＰ）から形成され、プロイロムチリンにつながる］の形成の工程から始まる生合成経路を意味する。他の好ましい実施形態においては、それは、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）からプロイロムチリンにつながる生合成経路を意味する。該経路は、ＧＧＰＰからプロイロムチリン前駆体、特に式（Ｉ）の化合物への反応、および更には、本明細書においては該生合成経路の後期工程とも称されうる、図２に記載されているような反応工程（Ｙａｏ，２００７を参照されたい）を含むと記載されている。ＧＧＰＰの共通前駆体はイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）およびジメチルアリルジホスファート（ＤＭＡＰＰ）である。当業者に公知のとおり、ゲラニルピロホスファート（ＧＰＰ）はＩＰＰおよびＤＭＡＰＰから合成されることが可能であり、ＦＰＰはＩＰＰおよびＧＰＰから合成されることが可能である。
【００５７】
真菌および動物においては、イソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）およびジメチルアリルジホスファート（ＤＭＡＰＰ）は、いわゆるメバロン酸（メバロナート）（ＭＶＡ）経路により合成されると記載されている（Ｄｅｗｉｃｋ，２００２を参照されたい）。後者の経路においては、アセチル−補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）の２つの分子が反応してアセトアセチル−ＣｏＡが生じる。アセトアセチル−ＣｏＡはアセチル−ＣｏＡのもう１つの分子と反応して３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を与える。この反応はＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼにより触媒される。ついでＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼがＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸（ＭＶＡ）へ変換する。ついで、６個の炭素原子を含有するメバロン酸は、２つのリン酸化反応により、５個の炭素原子を含有するイソペンテニル−５−ピロホスファート（ＩＰＰ）に変換されて、それぞれメバロナート−５−ホスファートおよびメバロナート−５−ピロホスファートを与え、ついで脱カルボキシル化反応によりＩＰＰを与える。イソペンテニルジホスファートはＩＰＰイソメラーゼにより異性化されて、ジメチルアリルジホスファート（ＤＭＡＰＰ）を与える。
【００５８】
イソペンテニルピロホスファート（ＩＰＰ）およびジメチルアリルピロホスファート（ＤＭＡＰＰ）の形成をもたらす代替的代謝経路は、いわゆる非メバロン酸経路またはメチルエリトリトールホスファート経路（ＭＥＰ経路）であり、これはピルバートおよびグリセリンアルデヒド−３−ホスファートから出発し、例えば、ほとんどの細菌および緑藻類により利用される（Ｋｕｚｕｙａｍａ，２００２を参照されたい）。高等植物および紅藻類はＭＶＡまたはＭＥＰ経路を利用しうる。
【００５９】
真菌においては、プロイロムチリンを産生する全生合成経路はＦＰＰからゲラニルゲラニルピロホスファートへの反応を含むと記載されており、該反応は、特定のプレニルトランスフェラーゼ、いわゆるＧＧＰＰシンターゼ（ｇｇｓ）（これはＦＰＰを１つのＩＰＰ分子で伸長させる）により触媒される。ついで、ＧＧＰＰは、プロイロムチリンシンターゼとも称される特定のジテルペンシンターゼにより反応して環状プロイロムチリン前駆体を与える。このようにして得られたプロイロムチリン前駆体は次いで、プロイロムチリン合成のいわゆる後期段階でプロイロムチリンに変換される。プロイロムチリン合成の後期段階はアシルトランスフェラーゼおよびシトクロムＰ−４５０酵素の作用を含むと考えられる。
【００６０】
本明細書中で用いる「プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する」ポリペプチドの発現は特に、プロイロムチリン抗生物質、特にプロイロムチリンを産生する生合成経路、特に前記の経路の反応の少なくとも１つを触媒しうるポリペプチドを意味する。好ましくは、該ポリペプチドはＦＰＰからプロイロムチリン抗生物質（例えば、プロイロムチリン）への変換における少なくとも１つの反応を触媒する。好ましくは、該ポリペプチドはＧＧＰＰからプロイロムチリン抗生物質（例えば、プロイロムチリン）への変換における少なくとも１つの反応を触媒する。好ましい実施形態においては、該発現は特に、図２に示されている反応の少なくとも１つを触媒しうるポリペプチドを意味する。最も好ましくは、該ポリペプチドはＧＧＰＰからプロイロムチリンへの全体的な変換における少なくとも１つの反応に必須である。
【００６１】
プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する好ましいポリペプチドはジテルペンシンターゼ、例えば本発明のものである。プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する特に好ましいポリペプチドはプロイロムチリンシンターゼであり、これは、ＧＧＰＰから式（Ｉ）の三環性中間体への変換を触媒しうる。最も好ましくは、該プロイロムチリンシンターゼはＧＧＰＰから式（Ｉ）の三環性中間体への変換に必須である。本明細書中で用いる「プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する」核酸、遺伝子または遺伝子クラスターの発現は特に、プロイロムチリン抗生物質、例えばプロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する１以上のポリペプチドをコードする核酸、遺伝子または遺伝子クラスターを意味する。後者の核酸、遺伝子または遺伝子クラスターは、プロイロムチリンを産生する生合成経路に直接的に関与するとも言われる。プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する核酸、遺伝子または遺伝子クラスターは、直接的に関与する核酸、遺伝子または遺伝子クラスターに作用することにより、プロイロムチリンを産生する生合成経路に間接的に関与する例えばプロモーターまたはエンハンサーのようなものをも含む。好ましくは、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する核酸、遺伝子または遺伝子クラスターは、本明細書に記載されているとおり、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する好ましいポリペプチドをコードしている。
【００６２】
本明細書中で用いる「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな条件」は、核酸分子がその標的および最小数の他の配列のみにハイブリダイズする条件を意味する。
【００６３】
本発明の意味におけるストリンジェントな条件は、２２℃で６×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳの溶液中の予備洗浄、６×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ中で６５℃で一晩のハイブリダイゼーション、およびそれに続く、６５℃でのそれぞれ３０分間の４回の洗浄（２回は１×ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳ中、および２回は０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中）を含む。
【００６４】
ポリペプチドの「発酵的製造方法」は当業者によく知られている。本明細書においては、それは、生きた系、例えば生物、例えば細菌もしくは真菌生物、または細胞（培養）、または組織（培養）を伴う方法である。そのような生きた系は、本明細書に開示されている宿主のいずれかでありうる。
【００６５】
「発酵的製造方法」は、生きた系を伴う製造工程を含むことのみにより特徴づけられうる。「発酵的製造方法」はまた、生きた系を伴う製造工程および生きた系を伴わない製造工程の両方を含むことにより特徴づけられうる。後者の方法は本明細書においては「半合成的製造方法」とも称されうる。
【００６６】
本明細書中で用いる「合成的製造方法」は生きた系、例えば生物、例えば細菌もしくは真菌生物、または細胞（培養）、または組織（培養）を伴わない。好ましくは、そのような方法は化学的手段、または単離されたポリペプチド、例えば、本明細書に開示されているポリペプチドを使用する。
【００６７】
本明細書中で用いる「ポリペプチドの製造方法」は特に限定されるものではない。それはポリペプチドの発酵的製造方法、ポリペプチドの合成的製造方法および後者の方法のいずれかの組合せを含む。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、ＧＧＤＰから式（Ｉ）の化合物につながる、プロイロムチリンシンターゼにより触媒される反応の、提示されている詳細を示す（Ｙａｏ，２００７参照）。
【図２】図２は、ＧＧＤＰからプロイロムチリンにつながる、プロイロムチリンを産生する生合成経路、すなわち、ジテルペンシンターゼにより触媒される反応の段階およびプロイロムチリン合成の後期段階を示す（Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉら，２００７から改変）。
【図３−１】図３は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するジテルペンシンターゼ（遺伝子）のポリペプチド（配列番号９）およびコード核酸配列（配列番号８）を示す。また、対応ゲノム核酸配列（配列番号１３）が示されており、ここにおいて、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からの推定遺伝子クラスターを含む配列およびイントロンが小文字で示されている（配列番号１５）。
【図３−２】図３は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するジテルペンシンターゼ（遺伝子）のポリペプチド（配列番号９）およびコード核酸配列（配列番号８）を示す。また、対応ゲノム核酸配列（配列番号１３）が示されており、ここにおいて、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からの推定遺伝子クラスターを含む配列およびイントロンが小文字で示されている（配列番号１５）。
【図３−３】図３は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するジテルペンシンターゼ（遺伝子）のポリペプチド（配列番号９）およびコード核酸配列（配列番号８）を示す。また、対応ゲノム核酸配列（配列番号１３）が示されており、ここにおいて、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からの推定遺伝子クラスターを含む配列およびイントロンが小文字で示されている（配列番号１５）。
【図３−４】図３は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するジテルペンシンターゼ（遺伝子）のポリペプチド（配列番号９）およびコード核酸配列（配列番号８）を示す。また、対応ゲノム核酸配列（配列番号１３）が示されており、ここにおいて、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からの推定遺伝子クラスターを含む配列およびイントロンが小文字で示されている（配列番号１５）。
【図３−５】図３は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するジテルペンシンターゼ（遺伝子）のポリペプチド（配列番号９）およびコード核酸配列（配列番号８）を示す。また、対応ゲノム核酸配列（配列番号１３）が示されており、ここにおいて、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からの推定遺伝子クラスターを含む配列およびイントロンが小文字で示されている（配列番号１５）。
【図３−６】図３は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するジテルペンシンターゼ（遺伝子）のポリペプチド（配列番号９）およびコード核酸配列（配列番号８）を示す。また、対応ゲノム核酸配列（配列番号１３）が示されており、ここにおいて、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からの推定遺伝子クラスターを含む配列およびイントロンが小文字で示されている（配列番号１５）。
【図３−７】図３は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するジテルペンシンターゼ（遺伝子）のポリペプチド（配列番号９）およびコード核酸配列（配列番号８）を示す。また、対応ゲノム核酸配列（配列番号１３）が示されており、ここにおいて、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からの推定遺伝子クラスターを含む配列およびイントロンが小文字で示されている（配列番号１５）。
【図３−８】図３は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するジテルペンシンターゼ（遺伝子）のポリペプチド（配列番号９）およびコード核酸配列（配列番号８）を示す。また、対応ゲノム核酸配列（配列番号１３）が示されており、ここにおいて、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からの推定遺伝子クラスターを含む配列およびイントロンが小文字で示されている（配列番号１５）。
【図３−９】図３は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するジテルペンシンターゼ（遺伝子）のポリペプチド（配列番号９）およびコード核酸配列（配列番号８）を示す。また、対応ゲノム核酸配列（配列番号１３）が示されており、ここにおいて、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からの推定遺伝子クラスターを含む配列およびイントロンが小文字で示されている（配列番号１５）。
【図３−１０】図３は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するジテルペンシンターゼ（遺伝子）のポリペプチド（配列番号９）およびコード核酸配列（配列番号８）を示す。また、対応ゲノム核酸配列（配列番号１３）が示されており、ここにおいて、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からの推定遺伝子クラスターを含む配列およびイントロンが小文字で示されている（配列番号１５）。
【図３−１１】図３は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するジテルペンシンターゼ（遺伝子）のポリペプチド（配列番号９）およびコード核酸配列（配列番号８）を示す。また、対応ゲノム核酸配列（配列番号１３）が示されており、ここにおいて、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からの推定遺伝子クラスターを含む配列およびイントロンが小文字で示されている（配列番号１５）。
【図４】図４は、本発明者により特定された遺伝子クラスターの一部の、提示された概要を示す。
【図５−１】図５は、公知および推定ジテルペンシンターゼ配列［フォモプシス・アミグダリ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ａｍｙｇｄａｌｉ）コパリルジホスファートシンターゼ（ＢＡＧ３０９６２）、ホモプシス・アミグダリ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ａｍｙｇｄａｌｉ）フィロクラダン−１６ａ−オールシンターゼ（ＢＡＧ３０９６１）、フォーマ・ベタエ（Ｐｈｏｍａ  ｂｅｔａｅ）アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ（ＢＡＢ６２１０２）、フェオスフェリア種（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐ．）ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＢＡＡ２２４２６）、フザリウム・プロリフェラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＡＢＣ４６４１３）、ジベレラ・フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＢＡＡ８４９１７）、ミクロスポルム・カニス（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ）ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＥＥＱ２９６４４）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）仮想タンパク質Ａｎ１８ｇ０２７１０（ＸＰ ００１３９８７３０）、ネオサルトリア・フィスチェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）仮想タンパク質ＮＦＩＡ ００９７９０（ＸＰ ００１２６４１９６）］に対する本発明の好ましいジテルペンシンターゼ配列（「Ｃ．ｐ」と示されている）のアミノ酸アライメントを示す。
【図５−２】図５は、公知および推定ジテルペンシンターゼ配列［フォモプシス・アミグダリ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ａｍｙｇｄａｌｉ）コパリルジホスファートシンターゼ（ＢＡＧ３０９６２）、ホモプシス・アミグダリ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ａｍｙｇｄａｌｉ）フィロクラダン−１６ａ−オールシンターゼ（ＢＡＧ３０９６１）、フォーマ・ベタエ（Ｐｈｏｍａ  ｂｅｔａｅ）アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ（ＢＡＢ６２１０２）、フェオスフェリア種（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐ．）ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＢＡＡ２２４２６）、フザリウム・プロリフェラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＡＢＣ４６４１３）、ジベレラ・フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＢＡＡ８４９１７）、ミクロスポルム・カニス（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ）ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＥＥＱ２９６４４）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）仮想タンパク質Ａｎ１８ｇ０２７１０（ＸＰ ００１３９８７３０）、ネオサルトリア・フィスチェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）仮想タンパク質ＮＦＩＡ ００９７９０（ＸＰ ００１２６４１９６）］に対する本発明の好ましいジテルペンシンターゼ配列（「Ｃ．ｐ」と示されている）のアミノ酸アライメントを示す。
【図５−３】図５は、公知および推定ジテルペンシンターゼ配列［フォモプシス・アミグダリ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ａｍｙｇｄａｌｉ）コパリルジホスファートシンターゼ（ＢＡＧ３０９６２）、ホモプシス・アミグダリ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ａｍｙｇｄａｌｉ）フィロクラダン−１６ａ−オールシンターゼ（ＢＡＧ３０９６１）、フォーマ・ベタエ（Ｐｈｏｍａ  ｂｅｔａｅ）アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ（ＢＡＢ６２１０２）、フェオスフェリア種（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐ．）ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＢＡＡ２２４２６）、フザリウム・プロリフェラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＡＢＣ４６４１３）、ジベレラ・フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＢＡＡ８４９１７）、ミクロスポルム・カニス（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ）ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＥＥＱ２９６４４）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）仮想タンパク質Ａｎ１８ｇ０２７１０（ＸＰ ００１３９８７３０）、ネオサルトリア・フィスチェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）仮想タンパク質ＮＦＩＡ ００９７９０（ＸＰ ００１２６４１９６）］に対する本発明の好ましいジテルペンシンターゼ配列（「Ｃ．ｐ」と示されている）のアミノ酸アライメントを示す。
【図６】図６は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するＣＹＰ４５０−１（遺伝子）の推定アミノ酸配列およびコード核酸配列を示す。
【図７】図７は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するアシルトランスフェラーゼ（遺伝子）の推定アミノ酸配列およびコード核酸配列を示す。
【図８】図８は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ（遺伝子）の推定アミノ酸配列およびコード核酸配列を示す。
【図９】図９は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するＣＹＰ４５０−２（遺伝子）の推定アミノ酸配列およびコード核酸配列を示す。
【図１０】図１０は、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するＣＹＰ４５０−３（遺伝子）の推定アミノ酸配列およびコード核酸配列を示す。
【図１１−１】プロイロムチリン生産性の増加はプロイロムチリン生合成クラスター内の遺伝子の転写の増強と相関すると推定することが可能である。したがって、２つの株、すなわち、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）ＤＳＭ１６０２（ＡＴＣＣ３４６４６，ＮＲＬＬ３１００）および誘導体（Ｃｐ２４；プロイロムチリン生産性の増強に関して選択されたもの）の発現プロファイルを分析した（図１１Ａ参照）。全サンプルを三重に測定した。内因性対照としてのベータアクチン遺伝子の場合に対する標的遺伝子（検出手段）に関する計算された値の正規化の後、プロイロムチリン生合成遺伝子（Ｂ：ＣＹＰ４５０−１；Ｃ：アシルトランスフェラーゼ；Ｄ：ジテルペンシンターゼ；Ｅ：ＧＧＤＰＳ；Ｆ：ＣＹＰ４５０−２；Ｇ：ＣＹＰ４５０−３）に関する相対転写産物レベル値を得た。ＧＡＰＤＨ（図１１Ｈ）を陰性対照として使用した。
【図１１−２】プロイロムチリン生産性の増加はプロイロムチリン生合成クラスター内の遺伝子の転写の増強と相関すると推定することが可能である。したがって、２つの株、すなわち、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）ＤＳＭ１６０２（ＡＴＣＣ３４６４６，ＮＲＬＬ３１００）および誘導体（Ｃｐ２４；プロイロムチリン生産性の増強に関して選択されたもの）の発現プロファイルを分析した（図１１Ａ参照）。全サンプルを三重に測定した。内因性対照としてのベータアクチン遺伝子の場合に対する標的遺伝子（検出手段）に関する計算された値の正規化の後、プロイロムチリン生合成遺伝子（Ｂ：ＣＹＰ４５０−１；Ｃ：アシルトランスフェラーゼ；Ｄ：ジテルペンシンターゼ；Ｅ：ＧＧＤＰＳ；Ｆ：ＣＹＰ４５０−２；Ｇ：ＣＹＰ４５０−３）に関する相対転写産物レベル値を得た。ＧＡＰＤＨ（図１１Ｈ）を陰性対照として使用した。
【図１１−３】プロイロムチリン生産性の増加はプロイロムチリン生合成クラスター内の遺伝子の転写の増強と相関すると推定することが可能である。したがって、２つの株、すなわち、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）ＤＳＭ１６０２（ＡＴＣＣ３４６４６，ＮＲＬＬ３１００）および誘導体（Ｃｐ２４；プロイロムチリン生産性の増強に関して選択されたもの）の発現プロファイルを分析した（図１１Ａ参照）。全サンプルを三重に測定した。内因性対照としてのベータアクチン遺伝子の場合に対する標的遺伝子（検出手段）に関する計算された値の正規化の後、プロイロムチリン生合成遺伝子（Ｂ：ＣＹＰ４５０−１；Ｃ：アシルトランスフェラーゼ；Ｄ：ジテルペンシンターゼ；Ｅ：ＧＧＤＰＳ；Ｆ：ＣＹＰ４５０−２；Ｇ：ＣＹＰ４５０−３）に関する相対転写産物レベル値を得た。ＧＡＰＤＨ（図１１Ｈ）を陰性対照として使用した。
【図１１−４】プロイロムチリン生産性の増加はプロイロムチリン生合成クラスター内の遺伝子の転写の増強と相関すると推定することが可能である。したがって、２つの株、すなわち、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）ＤＳＭ１６０２（ＡＴＣＣ３４６４６，ＮＲＬＬ３１００）および誘導体（Ｃｐ２４；プロイロムチリン生産性の増強に関して選択されたもの）の発現プロファイルを分析した（図１１Ａ参照）。全サンプルを三重に測定した。内因性対照としてのベータアクチン遺伝子の場合に対する標的遺伝子（検出手段）に関する計算された値の正規化の後、プロイロムチリン生合成遺伝子（Ｂ：ＣＹＰ４５０−１；Ｃ：アシルトランスフェラーゼ；Ｄ：ジテルペンシンターゼ；Ｅ：ＧＧＤＰＳ；Ｆ：ＣＹＰ４５０−２；Ｇ：ＣＹＰ４５０−３）に関する相対転写産物レベル値を得た。ＧＡＰＤＨ（図１１Ｈ）を陰性対照として使用した。
【図１２】図１２は、プライマーペアＣｐ ｄｔｓ Ｕ１およびＣｐ ｄｔｓ Ｌ１での定量的ＰＣＲにより測定されたジテルペンシンターゼの発現レベルを示す。
【図１３】図１３は、プライマーペアＣｐ ｄｔｓ Ｕ２およびＣｐ ｄｔｓ Ｌ２での定量的ＰＣＲにより測定されたジテルペンシンターゼの発現レベルを示す。
【図１４】図１４は、プラスミドＰ２５５８を含有する形質転換体（Ｃ１〜Ｃ６）および親株ＤＳＭ１６０２と比較された場合の、プラスミドＰ２５４３を含有するＲＮＡ干渉形質転換体（Ｔ１〜Ｔ９）のプロイロムチリン生産性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
配列の説明
【００７０】
【化２】
2013521006.tif 000004
2013521006.tif 000005
2013521006.tif 000006
【００７１】
配列番号１〜３は、本発明の好ましいポリペプチド、より厳密には好ましいジテルペンシンターゼの保存領域のアミノ酸配列であり、一方、配列番号４〜７は該ポリペプチドの署名配列に関するものである。
【００７２】
配列番号９（配列番号１４も参照）は、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のプロイロムチリンの産生に関与するジテルペンシンターゼの推定ポリペプチド配列を示す。
【００７３】
配列番号８は、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のプロイロムチリンの産生に関与するジテルペンシンターゼｃＤＮＡの対応ヌクレオチド配列を示す。配列番号８はまた、配列番号１５の逆相補鎖（すなわち、（−）鎖）に含まれる。
【００７４】
配列番号１０〜１２は、配列番号１〜３の保存領域をコードする核酸配列である。
【００７５】
配列番号１３は、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のプロイロムチリンの産生に関与するジテルペンシンターゼの推定遺伝子配列を示す。
【００７６】
配列番号１５は、ジテルペノイド、より厳密にはプロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する遺伝子クラスターを含むと想定される核酸配列を示す。該核酸配列はクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のゲノムに由来する。
【００７７】
配列番号１６〜３９は、後記実施例３に記載されているＲＡＣＥにおいて使用したプライマーおよびネステッドプライマーである。
【００７８】
配列番号４０は、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のプロイロムチリンの産生に関与するＣＹＰ４５０−１の推定オープンリーディングフレームを示す。配列番号４１はＣＹＰ４５０−１の推定アミノ酸配列である。
【００７９】
配列番号４２は、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のプロイロムチリンの産生に関与するアシルトランスフェラーゼの推定オープンリーディングフレームを示す。配列番号４３はアシルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００８０】
配列番号４４は、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のプロイロムチリンの産生に関与するＧＧＤＰＳの推定オープンリーディングフレームを示す。配列番号４５はＧＧＤＰＳの推定アミノ酸配列である。
【００８１】
配列番号４６は、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のプロイロムチリンの産生に関与するＣＹＰ４５０−２の推定オープンリーディングフレームを示す。配列番号４７はＣＹＰ４５０−２の推定アミノ酸配列である。
【００８２】
配列番号４８は、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のプロイロムチリンの産生に関与するＣＹＰ４５０−３の推定オープンリーディングフレームを示す。配列番号４９はＣＹＰ４５０−３の推定アミノ酸配列である。
【００８３】
配列番号５０〜６３は、後記実施例３に記載されている定量的ＰＣＲ発現分析において使用したプライマーである。
【００８４】
配列番号６４〜６６はＰ２５４３ ヘアピンのＲＮＡｉカセットを定めている。
【００８５】
配列番号６７および６８は、該ヘアピンカセットの効率的転写のために使用されるプロモーターおよびターミネーターを示す。
【００８６】
配列番号６９は、後記実施例４に記載されているＰ２５５８を構築するために使用された。
【００８７】
配列番号７０および７１は、後記実施例４に記載されている定量的ＰＣＲ発現分析において使用したプライマーである。
【００８８】
好ましい態様および実施形態の詳細な説明
本発明は特に、特許請求の範囲に定義されているとおりのポリペプチドおよび核酸分子のような化合物ならびに方法および用途に関する。
【００８９】
一般に、第１の態様においては、本発明は、単離された新規ポリペプチド、特に新規ジテルペンシンターゼ、特にプロイロムチリンシンターゼに関する。
【００９０】
１つの実施形態においては、該ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、配列番号２に対して少なくとも４０％の配列同一性を有する配列、ならびにｉ）配列番号７に対して少なくとも１５％の配列同一性を有する配列、ｉｉ）配列番号４に対して少なくとも２５％の配列同一性を有する配列、ｉｉｉ）配列番号５に対して少なくとも４５％の配列同一性を有する配列、およびｉｖ）配列番号６に対して少なくとも４５％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１〜２および４〜７はクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）由来である。そのような単離されたポリペプチドのアミノ酸配列は更に、配列番号３に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含みうる。配列番号１〜７はクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）由来である。
【００９１】
もう１つの実施形態においては、該ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、配列番号２に対して少なくとも４０％の配列同一性を有する配列、および前記のｉ）〜ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むアミノ酸配列を含む。
【００９２】
もう１つの実施形態においては、該ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、配列番号３に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、および前記のｉ）〜ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むアミノ酸配列を含む。
【００９３】
もう１つの実施形態においては、該ポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、配列番号９に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えば、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列を含む。
【００９４】
本明細書中に定められている単離されたポリペプチドの分子量は、好ましくは９０ｋＤａ〜１４０ｋＤａの間、特に１００ｋＤａ〜１３０ｋＤａの間、特に１０５ｋＤａ〜１２０ｋＤａの間である。
【００９５】
特定の実施形態においては、該ポリペプチドは、配列番号１および配列番号２、ならびに前記のｉ）〜ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１つの配列、特に、ｉ’）配列番号７、ｉｉ’）配列番号４、ｉｉｉ’）配列番号５およびｉｖ’）配列番号６からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列は更に配列番号３を含みうる。
【００９６】
本発明の単離ポリペプチドは、好ましくは、ジテルペンシンターゼ活性、特に、プロイロムチリンシンターゼ活性を有する。したがって、該単離ポリペプチドは、好ましくは、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するものであり、好ましくは、ゲラニルゲラニルピロホスファートをプロイロムチリン前駆体、特に式（Ｉ）の化合物に変換するのを触媒しうる。より好ましくは、それはプロイロムチリンの産生のためにプロイロムチリン産生生物において必須である。
【００９７】
前記のとおり、本発明者らは、ジテルペノイド、より厳密にはプロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のゲノムに由来する遺伝子クラスターを含むと想定される核酸配列を特定することに成功した。該核酸配列は、プロイロムチリン生合成に関与すると考えられるポリペプチド、すなわち、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ（ＧＧＤＰＳ）および３つのシトクロムＰ４５０酵素をコードする少なくとも６つの転写的に共調節されているオープンリーディングフレームを含むと予想される。典型的に、ヒドロキシルまたは他の酸素官能基は、モノオキシゲナーゼ、例えばシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの作用により導入される。生じたヒドロキシル基はアシル化、アルキル化およびグリコシル化により更に修飾されうる。プロイロムチリンを産生する経路の後続反応においては、シトクロムＰ−４５０酵素（例えばＣ３およびＣ１１に作用する）およびアシルトランスフェラーゼ（例えばＣ１４ヒドロキシルに作用する）の作用は、プロイロムチリンの形成を完了するのに必要と考えられる（Ｙａｏ，２００７参照）。
【００９８】
したがって、もう１つの実施形態においては、該ポリペプチドは、配列番号４３に対して少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは配列番号４３に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えばより一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列を含む。この単離ポリペプチドは、好ましくは、アシルトランスフェラーゼ活性を有する。したがって、該単離ポリペプチドは、好ましくは、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するものであり、好ましくは、例えば、図２に示されている式（ＩＩＩ）の化合物から式（ＩＶ）への変換において、例えばＣ１４ヒドロキシルに作用する。より好ましくは、それはプロイロムチリンの産生のためにプロイロムチリン産生生物において必須である。好ましい実施形態においては、本発明のアシルトランスフェラーゼは、配列番号４３のアシルトランスフェラーゼの活性の少なくとも５％、１０％または２０％、好ましくは少なくとも３０％または４０％、例えば少なくとも５０％または少なくとも６０％、７０％、８０％、特に少なくとも９０％または９５％、特に少なくとも１００％、例えば少なくとも１２５％、１５０％または１７５％の活性、特に、配列番号４３のアシルトランスフェラーゼの活性の少なくとも２倍または５倍、少なくとも１０倍または２５倍、例えば５０〜１００倍の活性を有する。配列番号４５のアシルトランスフェラーゼと比較して変異体アシルトランスフェラーゼの活性を測定するためには、アシルトランスフェラーゼ活性を可能にする同一条件下でインキュベートした場合に、式（ＩＶ）の化合物の濃度の経時的な増加、または適当な基質、例えばアシル−ＣｏＡもしくは式（ＩＩＩ）の化合物の減少を測定することを含む、いずれかの適当な方法が用いられうる。典型的アッセイは、［３Ｈ］標識基質を使用することによる産物形成および／またはＧＣ−ＭＳによる検出を含みうる。しかし、用いられうる適当なアッセイは当技術分野において一般に公知である。
【００９９】
もう１つの実施形態においては、該ポリペプチドは、配列番号４５に対して少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは配列番号４５に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えばより一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列を含む。この単離ポリペプチドは、好ましくは、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ活性を有する。したがって、該単離ポリペプチドは、好ましくは、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するものであり、好ましくは、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）の形成に関与するものであり、これは、好ましくは、ファルネシルピロホスファート（ＦＰＰ）から形成される。より好ましくは、それはプロイロムチリンの産生のためにプロイロムチリン産生生物において必須である。好ましい実施形態においては、本発明のゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼは、配列番号４５のゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼの活性の少なくとも５％、１０％または２０％、好ましくは少なくとも３０％または４０％、例えば少なくとも５０％または少なくとも６０％、７０％、８０％、特に少なくとも９０％または９５％、特に少なくとも１００％、例えば少なくとも１２５％、１５０％または１７５％の活性、特に、配列番号４５のゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼの活性の少なくとも２倍または５倍、少なくとも１０倍または２５倍、例えば５０〜１００倍の活性を有する。配列番号４５のゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼと比較して変異体ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼの活性を測定するためには、ＧＧＰＰ形成を可能にする同一条件下で適当な基質、例えばＦＰＰと共にインキュベートした場合に、ＧＧＰＰの濃度の経時的な増加、または適当な基質、例えばＦＰＰの減少を測定することを含む、いずれかの適当な方法が用いられうる。典型的アッセイは、［３Ｈ］標識基質を使用することによる産物形成および／またはＧＣ−ＭＳによる検出を含みうる。ＧＧＤＰＳ活性を測定するための好適でありうる他のアッセイは、例えば、Ｃｈａｎｇら（２００６）Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ−ＩＩＩ  ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｃｈａｉｎ  ｌｅｎｇｔｈ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；２８１（２１）：１４９９１−１５０００；およびＳｉｎｇｋａｒａｖａｎｉｔ  Ｓ．ら，（２０１０）Ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｇｉ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ；８５（５）：１４６３−１４７２に記載されている。しかし、一般に用いられうる適当なアッセイは当技術分野において公知である。
【０１００】
更にもう１つの実施形態においては、該ポリペプチドは、配列番号４１に対して少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは配列番号４１に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えばより一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
あるいは、該ポリペプチドは、配列番号４７に対して少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは配列番号４７に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えばより一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列を含む。あるいは、該ポリペプチドは、配列番号４９に対して少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは配列番号４９に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えばより一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
この単離ポリペプチドは、好ましくは、シトクロムＰ４５０活性、例えばモノオキシゲナーゼ活性を有する。したがって、該単離ポリペプチドは、好ましくは、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与し、好ましくは、例えばプロイロムチリン前駆体、例えば図２の式（Ｉ）または（ＩＩ）に示されているプロイロムチリン前駆体のＣ３およびＣ１１に作用する。したがって、シトクロムＰ４５０は、好ましくは、モノオキシゲナーゼである。好ましくは、該シトクロムＰ４５０は、図２に示されている式（Ｉ）の化合物から式（ＩＩ）の化合物への変換および／または式（ＩＩ）の化合物から式（ＩＩＩ）の化合物への変換に関与する。より好ましくは、それはプロイロムチリンの産生のためにプロイロムチリン産生生物において必須である。好ましい実施形態においては、該シトクロムＰ４５０酵素は、それぞれ配列番号４１、４７および４９によりコードされる対応シトクロムＰ４５０の活性の少なくとも５％、１０％または２０％、好ましくは少なくとも３０％または４０％、例えば少なくとも５０％または少なくとも６０％、７０％、８０％、特に少なくとも９０％または９５％、特に少なくとも１００％、例えば少なくとも１２５％、１５０％または１７５％、特に、それぞれ配列番号４１、４７および４９によりコードされる対応シトクロムＰ４５０の活性の少なくとも２倍または５倍、少なくとも１０倍または２５倍、例えば５０〜１００倍の活性を有する。それぞれ配列番号４１、４７または４９のシトクロムＰ４５０酵素と比較して変異体シトクロムＰ４５０酵素の活性を測定するためには、シトクロムＰ４５０活性を可能にする同一条件下でインキュベートした場合に、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物の濃度の経時的な増加、または適当な基質、例えば式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の減少を測定することを含む、いずれかの適当な方法が用いられうる。典型的アッセイは、［３Ｈ］標識基質を使用することによる産物形成および／またはＧＣ−ＭＳによる検出を含みうる。しかし、用いられうる適当なアッセイは当技術分野で公知である。
【０１０３】
ある好ましい実施形態においては、本発明のポリペプチドは非天然ポリペプチドである。
【０１０４】
第２の態様においては、
Ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは配列番号９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
Ｂ）ａ）配列番号８の配列、または
ａ’）配列番号１５の配列もしくはそれに相補的な配列、または
ｂ）ａ’）に記載の配列の部分配列（該部分配列はジテルペンシンターゼをコードするものである）、または
ｃ）ａ’）に記載の配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有する、もしくはａ）に記載の配列もしくはｂ）に記載の部分配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、ジテルペンシンターゼをコードする配列、または
ｄ）ジテルペンシンターゼをコードし、ａ）、ａ’）、ｂ）およびｃ）のいずれかに記載の配列に対する遺伝暗号の結果として縮重している配列、または
ｅ）ジテルペンシンターゼをコードし、ストリンジェントな条件下で配列番号８および／もしくは配列番号１３にハイブリダイズしうる配列
であるヌクレオチド配列、
Ｃ）Ｂ項に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１８個の連続的ヌクレオチド、および／または
Ｄ）ストリンジェントな条件下でＡ項もしくはＢ項に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズしうる少なくとも１８個の連続的ヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。
【０１０５】
１つの好ましい実施形態においては、該単離核酸分子は前記のＡ）を含む。もう１つの好ましい実施形態においては、該単離核酸分子は前記のＢ）のいずれか、例えばＢａ、Ｂａ’、Ｂｂ、Ｂｃ、Ｂｅを含む。
【０１０６】
一般に、本発明の好ましい核酸分子はジテルペンシンターゼ、より好ましくはプロイロムチリンシンターゼをコードしており、および／または、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチド、より好ましくは、プロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードしている。追加的または代替的に、該単離核酸分子は
Ａ）配列番号４３のポリペプチド、または前記のとおり配列番号４３に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みアシルトランスフェラーゼ活性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
Ｂ）ａ）配列番号４２の配列、または
ｂ）アシルトランスフェラーゼをコードする、配列番号１５の部分配列、もしくはそれに相補的な配列、または
ｃ）ａ）に記載の配列もしくはｂ）に記載の部分配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、アシルトランスフェラーゼをコードする配列、または
ｄ）アシルトランスフェラーゼをコードし、ａ）、ｂ）およびｃ）のいずれかに記載の配列に対する遺伝暗号の結果として縮重している配列、または
ｅ）アシルトランスフェラーゼをコードし、ストリンジェントな条件下で配列番号４２にハイブリダイズしうる配列であるヌクレオチド配列を（も）含みうる。
【０１０７】
好ましくは、該アシルトランスフェラーゼは、プロイロムチリンまたはプロイロムチリン前駆体、例えば図２に示されている式（ＩＶ）の化合物の産生に関与する。
【０１０８】
追加的または代替的に、該単離核酸分子は、
Ａ）配列番号４５のポリペプチド、または前記のとおり配列番号４５に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
Ｂ）ａ）配列番号４４の配列、または
ｂ）ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼをコードする、配列番号１５の部分配列、もしくはそれに相補的な配列、または
ｃ）ａ）に記載の配列もしくはｂ）に記載の部分配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼをコードする配列、または
ｄ）ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼをコードし、ａ）、ｂ）およびｃ）のいずれかに記載の配列に対する遺伝暗号の結果として縮重している配列、または
ｅ）ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼをコードし、ストリンジェントな条件下で配列番号４４にハイブリダイズしうる配列であるヌクレオチド配列を（も）含みうる。
【０１０９】
追加的または代替的に、該単離核酸分子は、
Ａ）配列番号４１のポリペプチド、または前記のとおり配列番号４１に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みシトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
Ｂ）ａ）配列番号４０の配列、または
ｂ）シトクロムＰ４５０をコードする、配列番号１５の部分配列、もしくはそれに相補的な配列、または
ｃ）ａ）に記載の配列もしくはｂ）に記載の部分配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、シトクロムＰ４５０をコードする配列、または
ｄ）シトクロムＰ４５０をコードし、ａ）、ｂ）およびｃ）のいずれかに記載の配列に対する遺伝暗号の結果として縮重している配列、または
ｅ）シトクロムＰ４５０をコードし、ストリンジェントな条件下で配列番号４０にハイブリダイズしうる配列であるヌクレオチド配列を（も）含みうる。
【０１１０】
追加的または代替的に、該単離核酸分子は、
Ａ）配列番号４７のポリペプチド、または前記のとおり配列番号４７に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みシトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
Ｂ）ａ）配列番号４６の配列、または
ｂ）シトクロムＰ４５０をコードする、配列番号１５の部分配列、もしくはそれに相補的な配列、または
ｃ）ａ）に記載の配列もしくはｂ）に記載の部分配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、シトクロムＰ４５０をコードする配列、または
ｄ）シトクロムＰ４５０をコードし、ａ）、ｂ）およびｃ）のいずれかに記載の配列に対する遺伝暗号の結果として縮重している配列、または
ｅ）シトクロムＰ４５０をコードし、ストリンジェントな条件下で配列番号４６にハイブリダイズしうる配列であるヌクレオチド配列を（も）含みうる。
【０１１１】
追加的または代替的に、該単離核酸分子は、
Ａ）配列番号４９のポリペプチド、または前記のとおり配列番号４９に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みシトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
Ｂ）ａ）配列番号４８の配列、または
ｂ）シトクロムＰ４５０をコードする、配列番号１５の部分配列、もしくはそれに相補的な配列、または
ｃ）ａ）に記載の配列もしくはｂ）に記載の部分配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、シトクロムＰ４５０をコードする配列、または
ｄ）シトクロムＰ４５０をコードし、ａ）、ｂ）およびｃ）のいずれかに記載の配列に対する遺伝暗号の結果として縮重している配列、または
ｅ）シトクロムＰ４５０をコードし、ストリンジェントな条件下で配列番号４８にハイブリダイズしうる配列であるヌクレオチド配列を（も）含みうる。
【０１１２】
好ましくは、該シトクロムＰ４５０活性はモノオキシゲナーゼ活性であり、より好ましくは、プロイロムチリン前駆体、例えば図２に示されている式（ＩＩ）の化合物および／または式（ＩＩＩ）の化合物の産生に関与する。
【０１１３】
本明細書中で用いる「ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列」は、好ましくは、ジテルペンシンターゼをコードする配列である。好ましくは、ジテルペンシンターゼをコードする配列は、プロイロムチリンシンターゼをコードする配列である。
【０１１４】
また、本明細書中で用いる「ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列」は、好ましくは、プロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列である。好ましくは、プロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列は、プロイロムチリンシンターゼをコードする配列である。
【０１１５】
１つの追加的実施形態においては、該単離核酸分子は前記のＣ）を含む。１つの追加的実施形態においては、該単離核酸分子は前記のＤ）を含む。Ｃ）またはＤ）の少なくとも１８個の連続的ヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１９、２０、２５個、特に少なくとも３０、３５、４０、４５個、特に少なくとも５０、５５、６０、６５個、特に少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５個、特に少なくとも１００、１５０、２００、２５０個、特に少なくとも３００、３５０、４００、４５０または５００個の連続的ヌクレオチドである。
【０１１６】
Ｂａ’の配列は、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のゲノムＤＮＡを単離し、配列決定することにより得られた。
【０１１７】
好ましい実施形態においては、本発明の核酸分子は、配列番号８に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、配列番号８に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には９０％、例えば、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【０１１８】
他の好ましい実施形態においては、本発明の核酸分子は、配列番号１５に対して少なくとも５０％、特に少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、配列番号１５に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には９０％、例えば、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列を含む。ある好ましい実施形態においては、本発明の核酸分子は、ジテルペンを産生する、特にプロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する遺伝子クラスターを含む。
【０１１９】
該単離ポリペプチドおよび該単離核酸分子は、好ましくは真菌宿主、特に担子菌門の真菌、より詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌、特にクリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）属の真菌、特に、クリトピルス・シフォイデス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｓｃｙｐｈｏｉｄｅｓ）、クリトピルス・プルヌルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｒｕｎｕｌｕｓ）、クリトピルス・ホブソニイ（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｈｏｂｓｏｎｉｉ）、クリトピルス・プソイド−ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏ−ｐｉｎｓｉｔｕｓ）、クリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）およびクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からなる群からの真菌、特に、クリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）またはクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）の真菌、あるいはプロイロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属の真菌に由来しうる。
【０１２０】
ある好ましい実施形態においては、本発明の核酸分子は非天然核酸分子である。
【０１２１】
本発明の核酸分子は更に、１以上の調節配列、例えばプロモーター、特に強力プロモーター、エンハンサー、リプレッサー結合部位、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびターミネーターから選択される調節配列を含むことが可能であり、あるいはそれらのあらゆる組合せを更に含むことが可能である。該核酸分子が、ジテルペン合成経路、例えばプロイロムチリン生合成経路に関与する本発明の２以上の核酸配列を含む場合、該核酸配列は縦列配向で位置することが可能であり、あるいはポリシストロン性であることが可能である。縦列発現またはポリシストロン発現のための調節配列は当技術分野で公知である。本発明の核酸分子は、プロイロムチリン生合成経路に関与する本発明のジテルペンシンターゼをコードしうる。あるいは、該核酸分子は、プロイロムチリン生合成経路に関与する本発明のアシルトランスフェラーゼをコードしうる。あるいは、該核酸分子は、プロイロムチリン生合成経路に関与する本発明のゲラニルゲラニルシンターゼをコードしうる。あるいは、該核酸分子は、プロイロムチリン生合成経路に関与する本発明の少なくともシトクロムＰ４５０酵素、例えばモノオキシゲナーゼをコードしうる。あるいは、該核酸分子は、プロイロムチリン生合成経路に関与する本発明のジテルペンシンターゼおよび本発明のアシルトランスフェラーゼの両方をコードしうる。あるいは、該核酸分子は、プロイロムチリン生合成経路に関与する本発明のジテルペンシンターゼおよび本発明のゲラニルゲラニルシンターゼの両方をコードしうる。あるいは、該核酸分子は、プロイロムチリン生合成経路に関与する本発明のジテルペンシンターゼおよび本発明の少なくとも１つのシトクロムＰ４５０酵素の両方をコードしうる。しかし、プロイロムチリン生合成経路に関与する本発明のアシルトランスフェラーゼおよび本発明の少なくとも１つのシトクロムＰ４５０酵素の両方をコードしうる核酸分子も想定される。また、プロイロムチリン生合成経路に関与する本発明のアシルトランスフェラーゼおよび本発明のゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼの両方をコードしうる核酸分子も想定される。また、プロイロムチリン生合成経路に関与する本発明の少なくとも１つのシトクロムＰ４５０酵素および本発明のゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼの両方をコードしうる核酸分子も想定される。該単離核酸分子は、プロイロムチリン生合成経路に関与する本発明のジテルペンシンターゼ、本発明の少なくとも１つのシトクロムＰ４５０酵素および本発明のゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼをもコードしうる。あるいは、該単離核酸分子は、プロイロムチリン生合成経路に関与する本発明のジテルペンシンターゼ、本発明のアシルトランスフェラーゼおよび本発明のゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼをもコードしうる。あるいは、該単離核酸分子は、プロイロムチリン生合成経路に関与する本発明のジテルペンシンターゼ、本発明のアシルトランスフェラーゼおよび本発明の少なくとも１つのシトクロムＰ４５０酵素をもコードしうる。最後に、該単離核酸分子は、プロイロムチリン生合成経路に関与する本発明のジテルペンシンターゼ、本発明のゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ、本発明のアシルトランスフェラーゼおよび本発明の少なくとも１つのシトクロムＰ４５０酵素をもコードしうる。１つの実施形態（ｉ）においては、前記の少なくとも１つのシトクロムＰ４５０酵素は、配列番号４１に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド、または前記のとおりに配列番号４１に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みシトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドである。もう１つの実施形態（ｉｉ）においては、前記の少なくとも１つのシトクロムＰ４５０酵素は、配列番号４７に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド、または前記のとおりに配列番号４７に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みシトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドである。更にもう１つの実施形態（ｉｉｉ）においては、前記の少なくとも１つのシトクロムＰ４５０酵素は、配列番号４９に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド、または前記のとおりに配列番号４９に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みシトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドである。この文脈における「少なくとも１つのシトクロムＰ４５０酵素」なる語は、前記実施形態（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）から選択される１、２または３個のシトクロムｐ４５０酵素を意味する。特に好ましいのは、（ｉ）および（ｉｉ）の組合せ、または（ｉ）および（ｉｉｉ）の組合せ、または（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の組合せ、および（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の組合せである。
【０１２２】
第３の態様は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。ベクターは当技術分野で一般に公知である。一般的なベクターには、表現型マーカー、好ましくは選択マーカーが含まれ、その非限定的な例には、抗生物質耐性または或るアミノ酸に関する原栄養性を付与するマーカーが含まれる。あるいは、該マーカーはスクリーニング可能なマーカーでありうる。特定の発現ベクター、例えば縦列発現ベクターまたはポリシストロン発現ベクターも想定される。
【０１２３】
第４の態様は、宿主、特に、細胞、組織および非ヒト生物から選択される天然に存在しない宿主に関するものであり、該宿主は、本発明の少なくとも１つの核酸分子および／または本発明の少なくとも１つのベクターを含む。特に、該宿主は真菌宿主、特に担子菌門の真菌、より詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌、特にクリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）属またはプロイロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属の真菌である。
【０１２４】
幾つかの好ましい実施形態においては、該宿主は、配列番号８に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、配列番号８に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えば、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【０１２５】
他の好ましい実施形態においては、該宿主は、配列番号４０に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、配列番号４０に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えば、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【０１２６】
他の好ましい実施形態においては、該宿主は、配列番号４２に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、配列番号４２に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えば、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【０１２７】
他の好ましい実施形態においては、該宿主は、配列番号４４に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、配列番号４４に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えば、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【０１２８】
他の好ましい実施形態においては、該宿主は、配列番号４６に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、配列番号４６に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えば、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【０１２９】
他の好ましい実施形態においては、該宿主は、配列番号４８に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、配列番号４８に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えば、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【０１３０】
他の好ましい実施形態においては、該宿主は、配列番号１３に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、配列番号１３に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えば、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【０１３１】
他の好ましい実施形態においては、該宿主は、配列番号１５に対して少なくとも５０％、特に少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、配列番号１５に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または更には少なくとも９０％、例えば、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【０１３２】
本明細書中の開示ならびに特に推定ＤＴＳコード配列（ｃｄｓ）および配列番号８、１３の遺伝子、またはコード配列配列番号４０、４２、４４、４６、４８および配列番号１５（ジテルペンを産生する生合成経路に関与する推定遺伝子クラスターを含む）に基づいて、ジテルペンシンターゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＧＧＤＰＳおよび／またはシトクロムＰ４５０酵素をコードする本発明の核酸分子が当業者により容易に得られうると予想される。すなわち、バイオインフォマティクス技術／計算技術、例えば遺伝子予測ソフトウェア、例えば「ＧｅｎｅＳｃａｎ」を用いて、真核生物ＤＮＡ配列からのタンパク質コード遺伝子の全ゲノム予測のための計算手段が、該核酸分子、およびジテルペンを産生する生合成経路に関与するタンパク質をコードする他の核酸配列（該配列は、本明細書に記載されている遺伝子クラスターの一部である）の同一性および位置を特定するために適切に用いられうる。
【０１３３】
また、ジテルペンを産生する生合成経路に関与する遺伝子クラスターをコードする予想される配列番号１５が、これに関して適切に使用されうる。該核酸分子は、例えば、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）から取り出されることが可能であり、および／または本発明の他のヌクレオチド配列を得るために、通常の技術、例えば部位特異的突然変異誘発により修飾されることが可能である。
【０１３４】
特に、本発明の好ましいポリペプチドの保存領域をコードする部分核酸配列配列番号１０〜１２、および特に、本発明の好ましいポリペプチドをコードする配列番号８、４０、４２、４４、４６、４８、および特に、ジテルペンを産生する生合成経路に関与する遺伝子クラスターをコードすると予想される配列番号１５に基づいて、当業者は本発明の核酸を容易に特定し入手すると考えられる。
【０１３５】
本明細書中の開示に基づいて、本発明の核酸分子および本発明のベクターは、以下に概説する方法によっても得られうると予想される。第１工程は、例えば、特定の細胞培養、例えばクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からの細胞培養、例えばクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からの菌糸から単離されたメッセンジャーＲＮＡ集団を調製し、所望のメッセンジャーＲＮＡの少なくとも一部にハイブリダイズさせるのに適したＤＮＡプローブを調製することである。この目的に適していると考えられる典型的なＤＮＡプローブは、ＤＮＡ配列、例えば配列番号８および１０〜１３に基づくものであることが可能であり、該ＤＮＡ配列のうち、配列番号８は、本発明の好ましいポリペプチドをコードする核酸配列であり、配列番号１０〜１２は本発明の好ましいポリペプチドの保存領域をコードしている。この目的に適していると考えられる他の有用なＤＮＡプローブは、配列番号４０、４２、４４、４６および４８（これらはそれぞれ、本発明の好ましいポリペプチドをコードする核酸配列である）に示されているＤＮＡ配列に基づくものでありうる。
【０１３６】
後続工程は、該ＤＮＡプローブにより該メッセンジャーＲＮＡ集団をスクリーニングし、逆転写酵素により該メッセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡ分子を調製し、該ｃＤＮＡ分子をベクター内にクローニングし、これらのベクターを例えば制限酵素またはＤＮＡ配列決定により分析し、該ｃＤＮＡ断片を含有する又は含有する可能性のあるベクターを選択することである。ついで該ｃＤＮＡ断片を、該ポリペプチドの発現を可能にする良く知られた遺伝的要素を備えた適当な発現ベクター内に移すことが可能である。該ｃＤＮＡ断片が所望の遺伝子を表さない場合には、異なるクローンのｃＤＮＡ断片を組合せ、ついで、該ポリペプチドの発現を可能にする良く知られた遺伝的要素を備えた適当な発現ベクター内に挿入することが可能である。更に、より大きな配列部分を含有するコスミドライブラリーをスクリーニングすることにより、または例えば相互重複ＤＮＡ領域を含む遺伝子バンク内のゲノムウォーキングのような技術により、関心のある領域の隣接領域を分析することが可能である。
【０１３７】
該核酸分子は、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）、またはジテルペン、特にプロイロムチリン抗生物質、特にプロイロムチリンを産生することが公知である若しくは疑われる別の生物から調製されうると予想される。好ましくは、該生物は真菌宿主、より詳しくは担子菌門の真菌、より一層詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌、特にクリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）属またはプロイロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属の真菌、特に、本明細書に開示されているプロイロムチリン産生体である。陽性クローンは、例えば制限酵素分析、配列決定、配列比較などにより分析されうる。
【０１３８】
ＲＮＡ転写産物の完全長配列を得るための１つの典型的な適当な技術は「ＲＡＣＥ」（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）として公知であり、これは、ｃＤＮＡコピーの逆転写により産生された関心のあるＲＮＡ配列のｃＤＮＡコピーを産生する。ついでＰＣＲ増幅ｃＤＮＡコピーは配列決定される。ＲＡＣＥは、ＲＮＡの５’末端（５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）または３’末端（３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）に該転写産物内の小さな既知配列からのＲＮＡ転写産物の配列を供与しうる。この方法は後記実施例３において更に詳しく例示される。
【０１３９】
該遺伝子クラスターの境界をより厳密に定め、該クラスターの調節を明らかにするための、当業者に公知の手段には、ｑＲＴ−ＰＣＲ（定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）による転写プロファイリングが含まれ、この場合、反応が進行するにつれて増幅ｃＤＮＡがリアルタイムで検出される。特に、この技術は、共調節を特定するのに、および遺伝子クラスターに属し機能的に関連した遺伝子の発現レベルを定量するのに適している。また、転写プロファイリングは、ゲノム内のどこかに位置する機能性関連遺伝子を特定するためにも適用されうる。この方法は後記実施例３において更に詳しく例示される。
【０１４０】
本開示に基づいて本発明の核酸配列を入手するのを補助するための適当な詳細は、例えば、Ｋａｗａｉｄｅら，１９９７またはＫｉｌａｒｕら，２００９ｂから得られうる。
【０１４１】
本発明のポリペプチドの配列は、このようにして得られた核酸配列から容易に推定されうる。更に、本発明のポリペプチドは、このようにして得られたｃＤＮＡ（核酸分子）または発現ベクターを適当な方法で使用してポリペプチドの発現を達成することにより、例えば、宿主内への導入により製造されうる。
【０１４２】
したがって、第５の態様は、（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、本発明の少なくとも１つの核酸分子および／または本発明の少なくとも１つのベクターを導入し、（ｉｉ）該ポリペプチドの産生に適した条件下で該宿主を培養することを含む、本発明のポリペプチドの製造方法に関する。個別的には、該方法は、（ｉｉｉ）該宿主から該ポリペプチドを回収する、もう１つの工程を含む。
【０１４３】
遺伝的物質を宿主内に導入するための方法は当業者によく知られており、好ましい方法はそれぞれの宿主に左右される。例えば、該宿主が真菌、例えばクリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）属の真菌である場合、非限定的な例は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換系およびＰＥＧ媒介形質転換系（Ｋｉｌａｒｕら，２００９ｂ参照）を含むと考えられる。
【０１４４】
宿主からポリペプチドをそれぞれ回収または精製する方法は当業者に公知である。これらの方法は、いずれかの公知クロマトグラフィー技術、例えばイオン交換クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣ、遠心分離技術、例えば超遠心分離、沈殿技術、例えば硫酸アンモニウム沈殿、差次的可溶化技術などを用いうる。簡便には、ポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端タグ、例えばＨｉｓタグの使用、および対応精製技術、例えばＮｉ２＋−アフィニティークロマトグラフィーの使用を含むいずれかの公知技術により精製されうる。また、該宿主からの該ポリペプチドの分泌を可能にする手段、例えばシグナルペプチドの使用による手段を用いる場合、工程（ｉｉｉ）は必須でないかもしれない。後者の場合、増殖培地がそのまま使用されることが可能であり、あるいは１以上の精製工程に付されることが可能である。
【０１４５】
第６の態様は、（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、本発明の遺伝子クラスター、例えば、前記Ｂａ’に記載の配列を有する核酸分子を導入し、（ｉｉ）プロイロムチリンの産生に適した条件下で該宿主を培養することを含む、プロイロムチリンの製造方法に関する。
【０１４６】
１つの実施形態においては、該方法は、前記Ｂａ’に記載の配列を有する核酸分子に加えて又はその代わりに、前記Ｂａ’に記載の配列を含むベクターを導入することを含む。
【０１４７】
該宿主は、プロイロムチリンを産生しうる又は産生し得ない宿主であることが可能であり、好ましくは、プロイロムチリンを産生し得ない宿主である。該宿主は、プロイロムチリンを産生するための全遺伝子クラスターが欠如しているため、またはその一部が欠如しているため、プロイロムチリンを産生し得ないことが可能である。したがって、該方法は、全クラスター、例えば前記Ｂａ’に記載の配列を提供することにより実施可能であると考えられる。あるいは、該クラスターを完全なものにし、プロイロムチリンの産生を可能にするために、該クラスターの（欠落している）一部のみが提供されうる。特に、該宿主は、プロイロムチリンシンターゼまたはプロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチド（本明細書に記載されているもの）をコードする核酸が存在しないため、プロイロムチリンを産生し得ないことが可能である。この場合、本発明の核酸分子またはポリペプチドが導入されうる。一般に、プロイロムチリンの産生を増加させるために、該核酸分子の２以上のコピーが導入されうる。該核酸分子はベクターの一部でありうる。導入に際して、該導入核酸分子は染色体内に組込まれても組込まれなくてもよい。
【０１４８】
第７の態様は、一般に、細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主におけるプロイロムチリンの産生の改変方法に関する。好ましい実施形態においては、それは、細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主におけるプロイロムチリンの産生の改変方法に関するものであり、ここで、該宿主はプロイロムチリンを産生することが可能であり、前記Ａ）またはＢ）に記載のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子を含み、該方法は、前記の少なくとも１つの核酸分子のｉ）発現、ｉｉ）同一性、またはｉｉｉ）発現および同一性の両方を操作することを含む。
【０１４９】
この方法は、プロイロムチリンの産生（製造）を増加させる方法であると想定される。プロイロムチリンの産生の増加は、前記の少なくとも１つの核酸分子の発現を直接的または間接的に操作することにより達成されうる。これに関する直接的操作は、例えば、前記の少なくとも１つの核酸分子の更なるコピーの供与により、例えば、本明細書に開示されているベクターの導入により、および／または染色体内への組込みにより達成されうる。好ましい実施形態においては、本発明の１以上の核酸分子の過剰発現は１以上のベクターにより達成される。１つの実施形態においては、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）から入手可能な配列番号１５の配列（該配列は、ジテルペンを産生する生合成経路に関与する遺伝子クラスターをコードすると予想され、本明細書に記載されている情報、特に核酸配列配列番号８および１０〜１２が当業者に与えられれば、該配列は当技術分野で公知の分子生物学的方法により入手可能である）が該宿主内に導入される。代替的または追加的に、核酸配列配列番号４０、４２、４４、４６および／または４８を含む本発明の核酸分子は該宿主内に導入されうる。適当なベクターおよび発現系が当技術分野で公知であり、これらには、担子菌に関する例としての以下の刊行物：Ｂｉｎｎｉｎｇｅｒら，１９８７；Ｋｉｌａｒｕら，２００９ａ；およびＫｉｌａｒｕら，２００９ｂ（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているベクター／選択系、ならびにストレプトミセテス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）に関する例としての以下の刊行物：Ｌａｃａｌｌｅら，１９９２；ＪｏｎｅｓおよびＨｏｐｗｏｏｄ，１９８４ならびにＭｏｔａｍｅｄｉおよびＨｕｔｃｈｉｓｏｎ，１９８７（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているベクター／選択系が含まれる。
【０１５０】
これに関する間接的操作は、例えば、適当なプロモーターまたはエンハンサーのような要素の提供により、あるいはリプレッサー結合部位またはターミネーターの除去により、あるいはそれらの組合せにより達成されうる。プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどは当業者に公知である。プロイロムチリンの産生は、前記の少なくとも１つの核酸分子の同一性を操作することによっても、例えば、その突然変異誘発およびプロイロムチリン産生の増加に関する選択によっても増加されうる。あるいは、プロイロムチリンの産生はそれらの組合せにより増加されうる。該発現は、生理的パラメーターおよび／または発酵条件の調節により該宿主の発酵中に少なくとも１つの核酸分子の発現および／または転写調節を最適化することによっても間接的に増加されうる。１つの実施形態においては、調節性遺伝子、および／または少なくとも１つの核酸分子の調節性タンパク質のＤＮＡ結合部位が影響される。
【０１５１】
第７の態様の方法がプロイロムチリンの産生（製造）の減少方法であることも想定される。特に、それは、前記の少なくとも１つの核酸分子を破壊またはダウンレギュレーションすることを含みうる。これに関する調節的操作のための方法は、当技術分野でよく知られている、遺伝子の標的化破壊を含む。したがって、例えば、突然変異宿主、例えば突然変異クリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）株、例えば突然変異クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）株が構築可能であり、それにおいては、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するポリペプチドをコードする１以上の天然核酸がゲノムから部分的または完全に欠失している。あるいは、前記の少なくとも１つの核酸分子の同一性は、例えば、その突然変異誘発およびプロイロムチリン産生の減少に関する選択により操作されうる。一般に、プロイロムチリンの産生を減少させるための他の適当なそのような方法はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の利用を含みうる。この方法は後記実施例４に更に詳しく例示されている。特定の遺伝子の発現をノックダウンする手段としてのＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングの実施可能性は、二核クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）において、Ｋｉｌａｒｕら（２００９ｂ）により、ごく最近実証されている。この場合、それは、この真菌の二核性により、標的化遺伝子破壊より簡便であると考えられている。この参考文献に記載されている方法は、他の担子菌類、特にクリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）属の他のメンバー、例えば、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）を含む本明細書に開示されている好ましいものにおいて、同様に適用可能であると想定される。代替的または追加的に、プロイロムチリンの産生は、適当なプロモーターまたはエンハンサーのような要素の除去により、あるいはリプレッサー結合部位またはターミネーターの供与により、あるいはそれらの組合せにより、発現を間接的に操作することにより減少されうる。
【０１５２】
一般に、プロイロムチリンの産生を改変するためには、例えばプロモーター領域またはコード配列におけるプロイロムチリン遺伝子クラスターの例えば（限定的）突然変異誘発が用いられうる。例えば、それは、プロイロムチリン前駆体を産生するプロイロムチリン産生生物の能力における有益な増強をもたらすことが可能であり、あるいは更にはプロイロムチリン生合成の最終産物を変化させうる。
【０１５３】
宿主におけるプロイロムチリンの産生は、前記の少なくとも１つの核酸分子における個々の断片を他の断片（例えば、他の遺伝子クラスターからの断片）により置換することによっても改変されうる。また、宿主におけるプロイロムチリンの産生は、プロイロムチリンを産生する生合成経路における個々の工程を不活性化することにより、例えば、該遺伝子クラスターの他のポリペプチドを欠失または破壊することにより改変されうる。また、この態様においては、該宿主は、好ましくは、前記のとおりである。
【０１５４】
細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主におけるプロイロムチリンの産生を改変する方法は特に、ａ）プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を過剰発現させるための、あるいはｂ）プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する１以上の遺伝子を不活性化または修飾するための、あるいはｃ）プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する１以上の遺伝子が欠失している、天然に存在しない宿主を構築するための、あるいはｃ）プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する１以上の遺伝子が欠失または破壊されている、突然変異宿主、例えばクリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）株を構築するための、本発明の単離核酸分子、ベクターまたは宿主細胞の使用を含みうる。
【０１５５】
細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主におけるプロイロムチリンの産生を改変する方法はまた、代謝流動をＭＶＡ経路の排出物、すなわち、アセチル−ＣｏＡへと向け直すこと、および／または例えば前駆体ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰに関して競合する非必須反応を遮断することにより、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼの基質の量を増加させることを含みうる。
【０１５６】
第８の態様は、プロイロムチリンの製造における、本発明の核酸分子の使用に関するものであり、ここで、該核酸分子の配列の２〜５０ヌクレオチドは、プロイロムチリンを産生しうる野生型生物に含まれるプロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する遺伝子クラスターの配列とは異なっている。好ましくは、前記の２〜５０ヌクレオチドは少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０または４５ヌクレオチド、好ましくは３〜１００、より好ましくは５〜８０ヌクレオチド、より一層好ましくは８〜６０ヌクレオチドである。例えばプロモーター領域またはコード配列におけるプロイロムチリン遺伝子クラスターのそのような限定的突然変異誘発は、プロイロムチリンを産生するプロイロムチリン産生生物の能力における有益な増強をもたらすことが可能であり、あるいは更にはプロイロムチリン生合成の最終産物を変化させ、それにより、プロイロムチリン前駆体の、より高い収率を与えうる。しかし、該核酸分子は、本出願の優先日において、プロイロムチリンを産生しうる野生型生物またはプロイロムチリン産生に関して選択された生物のいずれかに含まれるプロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する遺伝子クラスターの配列と同一でなくてもよい。該使用は特に限定されるものではなく、本明細書に開示されているプロイロムチリンの製造方法のいずれをも含みうる。該使用は、前記の完全遺伝子クラスター、またはそのいずれかの部分配列を含みうるが、使用される配列は、野生型生物、特にプロイロムチリンを産生しうる野生型生物に含まれるプロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する遺伝子クラスターの配列とは異なっている。該使用は、例えばインビボ、エクスビボもしくはインビトロの使用またはそれらの組合せでありうる。
【０１５７】
第９の態様は、プロイロムチリン前駆体の製造における、本発明の単離された核酸分子の使用に関するものであり、ここで、該核酸分子の配列の２〜５０ヌクレオチドは、プロイロムチリンを産生しうる野生型生物に含まれるジテルペンシンターゼをコードする配列とは異なっている。好ましくは、前記の２〜５０ヌクレオチドは少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０または４５ヌクレオチド、好ましくは３〜１００、より好ましくは５〜８０ヌクレオチド、より一層好ましくは８〜６０ヌクレオチドである。例えばプロモーター領域またはコード配列におけるプロイロムチリン遺伝子クラスターのそのような限定的突然変異誘発は、プロイロムチリン前駆体を産生するプロイロムチリン産生生物の能力における有益な増強をもたらすことが可能であり、あるいは更にはプロイロムチリン生合成の最終産物を変化させ、それは例えば、プロイロムチリン前駆体の、より高い収率を与えうる。特に、該プロイロムチリン前駆体は式（Ｉ）の化合物である。あるいは、該プロイロムチリン前駆体は式（ＩＩ）の化合物でありうる。もう１つの実施形態においては、該プロイロムチリン前駆体は式（ＩＩＩ）の化合物でありうる。更にもう１つの実施形態においては、該プロイロムチリン前駆体は式（ＩＶ）の化合物でありうる。該使用は特に限定されるものではなく、本明細書に開示されているプロイロムチリン前駆体の製造方法のいずれをも含みうる。該使用は、前記の完全遺伝子クラスター、またはそのいずれかの部分配列を含みうるが、使用される配列は、野生型生物、特にプロイロムチリンを産生しうる野生型生物に含まれるジテルペンシンターゼをコードする配列とは異なっている。該使用は、例えばインビボ、エクスビボもしくはインビトロの使用またはそれらの組合せでありうる。
【０１５８】
第１０の態様は、プロイロムチリンまたはプロイロムチリン前駆体の製造における、請求項８に記載の宿主の使用に関するものであり、特に、この場合、該プロイロムチリン前駆体は式（Ｉ）の化合物である。
【０１５９】
また、式（ＩＩ）のプロイロムチリン前駆体の製造における、本発明の宿主の使用も想定される。更に、式（ＩＩＩ）のプロイロムチリン前駆体の製造における、本発明の宿主の使用が想定される。最後に、式（ＩＶ）のプロイロムチリン前駆体の製造における、本発明の宿主の使用も想定される。
【０１６０】
該使用は特に限定されるものではない。それは、本明細書に開示されている宿主のいずれをも含むことが可能であり、例えばインビボ、エクスビボもしくはインビトロの使用またはそれらの組合せでありうる。
【０１６１】
同様に、本発明は、本発明の単離核酸分子、ベクターまたは宿主を使用する少なくとも１つの工程を含み第８〜第１０の態様の使用に対応する、プロイロムチリンまたはプロイロムチリン前駆体の製造方法に関する。
【０１６２】
同様に、例えば固体発酵法における、本発明のポリペプチドの使用を含む、プロイロムチリンまたはプロイロムチリン前駆体の製造方法も含まれる。
【０１６３】
第１１の態様は、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする１以上の核酸を特定するための、本発明の単離核酸分子の使用に関する。好ましくは、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするそのような核酸は、プロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードしている。
【０１６４】
同様に、本発明の単離核酸分子は、アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１以上の核酸を特定するために使用されうる。好ましくは、アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするそのような核酸は、プロイロムチリン生合成経路に関与するポリペプチドをコードしている。
【０１６５】
あるいは、本発明の単離核酸分子は、シトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドをコードする１以上の核酸を特定するために使用されうる。好ましくは、シトクロムＰ４５０活性、例えばモノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするそのような核酸は、プロイロムチリン生合成経路に関与するポリペプチドをコードしている。
【０１６６】
最後に、本発明の単離核酸分子は、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする１以上の核酸を特定するために使用されうる。好ましくは、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするそのような核酸は、プロイロムチリン生合成経路に関与するポリペプチドをコードしている。
【０１６７】
また、この態様は、ジテルペンシンターゼをコードする、好ましくはプロイロムチリンシンターゼをコードする１以上の核酸を特定するための、本発明の単離核酸分子の使用に関する。
【０１６８】
ある実施形態においては、該態様は、ジテルペンを産生する、特にプロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する本発明の遺伝子クラスターを特定するための、本発明の核酸分子の使用に関する。
【０１６９】
例えば、本発明の核酸分子は、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを確立し、本明細書に開示されている核酸分子を使用することにより該ライブラリーをスクリーニングし、陽性クローンを単離する工程により特徴づけられる方法において使用されうる。言い換えれば、本明細書に開示されている核酸分子またはその部分配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用されうる。陽性クローンを特定するためには種々の標準的な方法が利用可能である。幾つかの実施形態においては、検出可能性を改善するために、本明細書に記載されている単離核酸分子は、例えば公知の物理的または化学的方法により容易に同定可能ないずれかの標識のような検出可能標識で標識されうる。検出可能標識は当技術分野でよく知られており、限定的なものではないが、放射能標識、発色団、蛍光物質、酵素、補酵素、基質、酵素インヒビター、抗生物質などを包含する。
【０１７０】
該ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは、いずれかの候補生物から、特に、ジテルペン、特にプロイロムチリン抗生物質、特にプロイロムチリンを産生しうることが公知である又は疑われる生物から調製されうる。好ましくは、該生物は、真菌宿主、より詳しくは担子菌門の真菌、より一層詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌、特にクリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）属またはプロイロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属の真菌、例えば、クリトピルス・シフォイデス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｓｃｙｐｈｏｉｄｅｓ）、クリトピルス・プルヌルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｒｕｎｕｌｕｓ）、クリトピルス・ホブソニイ（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｈｏｂｓｏｎｉｉ）、クリトピルス・プソイド−ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏ−ｐｉｎｓｉｔｕｓ）、クリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）およびクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からなる群からの真菌であり、ここで、該生物はクリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）またはクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）である。陽性クローンは、例えば制限酵素分析、配列決定、配列比較などにより分析されうる。関心のある領域の隣接領域は、より大きな配列部分を含有するコスミドライブラリーをスクリーニングすることにより、または例えば相互重複ＤＮＡ領域を含むゲノムライブラリー内のゲノムウォーキングのような技術により更に分析されうる。
【０１７１】
ｉ）ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、ｉｉ）プロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、ｉｉｉ）ジテルペンシンターゼをコードする、および／またはｉｖ）プロイロムチリンシンターゼをコードする核酸を特定するための方法は、本明細書に開示されている核酸分子に対する相同性を有する核酸の存在を検出するために、候補生物の染色体ＤＮＡを使用してサザンブロットを行う工程を含みうる。
【０１７２】
所望により、ｉ）ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、ｉｉ）プロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、ｉｉｉ）ジテルペンシンターゼをコードする、および／またはｉｖ）プロイロムチリンシンターゼをコードする核酸を特定するための方法は、いずれかの公知方法によりプロイロムチリン産生に関してアッセイすることにより、該候補生物がプロイロムチリンを産生しうるかどうかを決定する先行工程を含みうる。
【０１７３】
同様に、本明細書に開示されている核酸分子に対する相同性を有する核酸の存在を検出するために、候補生物の染色体ＤＮＡを使用してサザンブロットを行う工程を含みうる、ｉ）アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、および／またはｉｉ）アシルトランスフェラーゼをコードする核酸を特定するための方法も想定される。
【０１７４】
更に、本明細書に開示されている核酸分子に対する相同性を有する核酸の存在を検出するために、候補生物の染色体ＤＮＡを使用してサザンブロットを行う工程を含みうる、ｉ）ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、および／またはｉｉ）ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼをコードする核酸を特定するための方法が想定される。
【０１７５】
また、本明細書に開示されている核酸分子に対する相同性を有する核酸の存在を検出するために、候補生物の染色体ＤＮＡを使用してサザンブロットを行う工程を含みうる、ｉ）シトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドをコードする、ｉｉ）モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、および／またはｉｉｉ）シトクロムＰ４５０酵素をコードする核酸を特定するための方法も想定される。
【０１７６】
所望により、前記方法は、いずれかの公知方法によりプロイロムチリン産生に関してアッセイすることにより、該候補生物がプロイロムチリンを産生しうるかどうかを決定する先行工程を含みうる。
【０１７７】
本発明は更に、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、および／またはプロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする１以上の核酸を生物（好ましくは、該生物は前記のとおりである）から単離するための、本発明の単離核酸分子の使用に関する。
【０１７８】
また、この態様は、ジテルペンシンターゼをコードする、好ましくは、プロイロムチリンシンターゼをコードする１以上の核酸を生物（好ましくは、該生物は前記のとおりである）から単離するための、本発明の単離核酸分子の使用に関する。
【０１７９】
更に、アシルトランスフェラーゼをコードする、好ましくは、生物（好ましくは、該生物は前記のとおりである）からのアシルトランスフェラーゼをコードする１以上の核酸を生物（好ましくは、該生物は前記のとおりである）単離するための、本発明の単離核酸分子の使用が想定される。
【０１８０】
また、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼをコードする、好ましくは、生物（好ましくは、該生物は前記のとおりである）からのゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼをコードする１以上の核酸を生物（好ましくは、該生物は前記のとおりである）単離するための、本発明の単離核酸分子の使用が想定される。
【０１８１】
最後に、シトクロムＰ４５０酵素、例えばモノオキシゲナーゼをコードする、好ましくは、生物（好ましくは、該生物は前記のとおりである）からのシトクロムＰ４５０酵素をコードする１以上の核酸を生物（好ましくは、該生物は前記のとおりである）単離するための、本発明の単離核酸分子の使用も想定される。
【０１８２】
第１２の態様は、プロイロムチリン前駆体、特に式（Ｉ）の化合物の製造方法に関するものであり、該方法は該前駆体の発酵的製造方法であり、（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、本発明の少なくとも１つの核酸分子および／または本発明の少なくとも１つのベクターを導入し、（ｉｉ）該前駆体の発酵的製造に適した条件下で該宿主を培養する工程を含む。
【０１８３】
プロイロムチリン前駆体、特に式（ＩＩ）および／または（ＩＩＩ）の化合物の製造方法も想定され、該方法は該前駆体の発酵的製造方法であり、（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、シトクロムＰ４５０酵素、例えばモノオキシゲナーゼをコードする核酸配列を含む本発明の少なくとも１つの核酸分子および／または本発明の少なくとも１つのベクターを導入し、（ｉｉ）該前駆体の発酵的製造に適した条件下で該宿主を培養する工程を含む。
【０１８４】
更に、プロイロムチリン前駆体、特に式（ＩＶ）の化合物の製造方法も想定され、該方法は該前駆体の発酵的製造方法であり、（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、アシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む本発明の少なくとも１つの核酸分子および／または本発明の少なくとも１つのベクターを導入し、（ｉｉ）該前駆体の発酵的製造に適した条件下で該宿主を培養する工程を含む。
【０１８５】
第１３の態様は、プロイロムチリン前駆体、特に式（Ｉ）の化合物の製造方法に関するものであり、該方法は該前駆体の合成製造方法であり、ゲラニルゲラニルピロホスファートを本発明のポリペプチドまたは前記方法により入手可能なポリペプチドと反応させることを含む。後者の２つの態様においては、該宿主は、好ましくは、前記で開示されているものである。
【０１８６】
更にもう１つの態様においては、本発明は、式（Ｉ）の単離化合物に関する。幾つかの実施形態においては、式（Ｉ）の単離化合物は、本明細書に開示されている方法により、特に、第１２または第１３の態様の方法により入手可能である。
【０１８７】
更に詳細な態様においては、本明細書は、本明細書に開示されている方法により入手可能な式（ＩＩ）の単離化合物、本明細書に開示されている方法により入手可能な式（ＩＩＩ）の単離化合物、および／または本明細書に開示されている方法により入手可能な式（ＩＶ）の単離化合物を主題とする。
【０１８８】
更にもう１つの態様においては、本発明に従い製造されたジテルペン、特にプロイロムチリン前駆体はプロイロムチリン抗生物質、例えば新規プロイロムチリン抗生物質に変換されうる。これは、合成有機化学により、例えば、プロイロムチリンがチアムリン（ＩＮ  ２００５ＣＨ００５２１に記載されている方法に類似している）、バルネムリン（ＣＮ  １０１３１８９２１に記載されている方法に類似している）、レタパムリン（ＷＯ  ２００９０７５７７６に記載されている方法に類似している）に変換される類似方法により行われうる。したがって、本発明はまた、プロイロムチリン抗生物質の半合成的製造における、中間体Ｉ（すなわち、式（Ｉ）の化合物）の使用に関する。「半合成的製造」は、プロイロムチリン前駆体の発酵的製造、およびそれに続く、該プロイロムチリン前駆体の共有結合的修飾をもたらす少なくとも１つの合成化学的工程の組合せに関する。
【０１８９】
したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチドまたは方法を用いて得られたジテルペンまたはプロイロムチリン前駆体を反応させる少なくとも１つの工程を含む、プロイロムチリン抗生物質の製造方法に関する。
【０１９０】
更にもう１つの態様においては、本発明により得られた新規プロイロムチリン抗生物質、特に該プロイロムチリンは中間体として使用される。１つの実施形態においては、それは細菌感染症の治療方法において使用される。また、本発明により得られたジテルペン、特に該新規プロイロムチリン抗生物質、特に該新規半合成プロイロムチリンを、それを要する対象、特に、細菌感染症または細菌を伴う障害もしくは疾患に罹患している対象に投与する工程を含む、細菌感染症の治療方法も予想される。
【０１９１】
該細菌（細菌感染症を引き起こす又は該障害もしくは疾患に関与するもの）は、グラム陽性菌、特にブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌および腸球菌；グラム陰性菌、特にナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属から選択されるもの；マイコプラズマ；クラミジア；グラム陽性嫌気性細菌およびグラム陰性嫌気性細菌からなる群から選択されうる。
【０１９２】
一般に、本明細書中で引用されている全ての文書の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。また、本発明の或る態様および実施形態が記載され例示されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾が施されうると当業者により理解されるであろう。
【実施例】
【０１９３】
以下の実施例は本発明を更に例示するものであり、本発明を限定するものではない。該実施例は技術的特徴を含み、本発明は、この例示の節に記載されている技術的特徴の組合せにも関連していることが理解されるであろう。
【０１９４】
実施例１：ジテルペンシンターゼ（ＤＳ）の特定
本発明者らはクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）におけるｄｓ遺伝子を特定した。ｄｓ遺伝子によりコードされるポリペプチドの部分タンパク質配列が特定され、それらは配列番号１〜７として本明細書に記載されている。ｄｓ遺伝子ジテルペンシンターゼの推定タンパク質配列は本明細書中に配列番号９として記載されており、コンピュータによる方法により得られた。公知テルペンシンターゼ配列に対する該配列のアライメントは多数の共有保存領域を示しており、このことは、該ポリペプチドがジテルペンシンターゼ活性を有する可能性があることを示している。特に、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）はプロイロムチリン産生株として本発明者らに公知であるため、およびこれがクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）における唯一のジテルペンシンターゼであることを考慮すると、特定されたジテルペンシンターゼはプロイロムチリンシンターゼ活性を有すると予想される。ｄｓ遺伝子によりコードされるジテルペンシンターゼの推定タンパク質配列（「Ｃ．ｐ」と表示されている）および幾つかの公知ジテルペンシンターゼ配列のアライメントが図５に示されている。
【０１９５】
実施例２：クリトピルス・パッセケリアヌスにおける推定プロイロムチリン遺伝子クラスターの特定
本発明に到達するために、本発明者らは、前記の推定ジテルペンシンターゼの周囲のゲノム領域を分析し、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のゲノム配列を使用するバイオインフォマティクス手段を用いた。
【０１９６】
本発明者らは、推定ｄｓ遺伝子の近傍において、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）の従来未知の推定ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ（ｇｇｓ）遺伝子を特定した。クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からの新規ｇｇｓ遺伝子は公知ｇｇｓ遺伝子に対する密接な関連性を示している。ホモプシス・アミグダリ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ａｍｙｇｄａｌｉ）（ＢＡＧ３０９５９）の公知ｇｇｓ遺伝子に対するアライメントは３１％の同一性を示している。該同一性は、フリーウェアプログラムＣｌｕｓｔａｌＸ（バージョン１．８３）をデフォルトパラメータで使用して配列を整列させ次いで同一残基を手動で計数することにより計算した。ついで、同一のものの数を最短配列の長さで割り算することにより、同一性（％）（ＰＩＤ）を計算した。例えばペアワイズアライメント（遅−正確）のためのデフォルト設定は以下のとおりである：ギャップ・オープニング・パラメータ：１０．００；ギャップ伸長パラメータ０．１０；タンパク質重み行列：Ｇｏｎｎｅｔ  ２５０；ＤＮＡ重み行列ＩＵＢ。ＣｌｕｓｔａｌＸプログラムはＴｈｏｍｐｓｏｎら，１９９７に詳細に記載されている。
【０１９７】
図４に示されているとおり、配列番号８を含み約２７ｋｂのサイズを有するゲノム領域の更なる分析は更に、３つの推定ＣＹＰ４５０遺伝子（推定アシルトランスフェラーゼ遺伝子ならびにｇｇｓおよびｄｓ遺伝子に近傍の他の推定遺伝子）を明らかにした。これは、このクラスターがプロイロムチリン生合成遺伝子クラスターであることを示唆している。更に、これらの酵素活性の存在は推定生合成経路に沿っている。更に、発現分析は、それらの遺伝子が、遺伝子発現パターンに影響を及ぼすことが知られている種々の条件下で共調節を示すことを明らかにしており、このことは前記結論を更に裏付けている。
【０１９８】
実施例３：クリトピルス・パッセケリアヌスにおけるプロイロムチリン候補遺伝子の特定
クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のプロイロムチリン候補遺伝子に関する推定遺伝子モデルを、配列番号１５由来の翻訳ヌクレオチド問合せ配列を使用するｂｌａｓｔｘ検索タンパク質データベース（例えば、ｎｒ＝非重複タンパク質配列）により手動で開発した。これらの推定遺伝子モデルに基づいて、５’−および３’−ｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）の迅速な増幅のための特異的プライマーを設計した。断片が重複し、それにより完全長ｃＤＮＡが得られるように、プライマー（以下の表を参照されたい）を設計した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該製造業者のプロトコールに従い使用して、ＲＡＣＥを行った。アンプリコンをアガロースゲルにより精製し、ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＣＲ（登録商標）４  ＢｌｕｎｔＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。
【０１９９】
【表２】
2013521006.tif 000007
2013521006.tif 000008
【０２００】
重複配列を合体させ、各ｃＤＮＡ（ＲＡＣＥから得られたもの）内の最大オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を翻訳して対応アミノ酸配列を推定した。
【０２０１】
該推定プロイロムチリンコアクラスターは、プロイロムチリン生合成に要求される生化学反応を行うのに必要な以下の全ての酵素をコードしている：（Ｉ）ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ（ＧＧＤＰＳ）に連結されたジテルペンシンターゼ（ＤＴＳ）（これらは同一プロモーター領域を共有しているが、それらの遺伝子は逆方向の相補的プロモーターから転写される）、（ＩＩ）三環式ジテルペン炭化水素中間体に酸素機能を加えるための３つのシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）酵素、（ＩＩＩ）Ｃ１４のアセチル化のためのアセチルトランスフェラーゼ（ＡＴ）。該ＯＲＦおよび推定アミノ酸配列は図３および６〜１０に示されている。該ＯＲＦは、以下の位置（終止コドンを含む）において、配列番号１５に示されている推定プロイロムチリン遺伝子クラスター上でコードされている。
ＣＹＰ４５０−１：（５０１．．６９９，７５９．．８６７，９１７．．９４３，９９８．．１１８６，１２４０．．１５０４，１５６０．．１６７７，１７３２．．１９０９，１９６６．．２０７０，２１２０．．２２５１，２３０３．．２４４６，２５０２．．２６０７）。
ＡＴ：（２８５６．．３２８１，３３３５．．３３６２，３４１６．．３４７４，３５３６．．４１５６）。
ＤＴＳ：（５０２９．．６７１４，６７６７．．７０５３，７１０９．．７２２９，７２８４．．８０６９）。
ＧＧＤＰＳ：（９０２１．．９１５８，９２１７．．９３８６，９４４６．．９７３５，９７９５．．１００４０，１０１０１．．１０３０９）。
ＣＹＰ４５０−２：（１０７２５．．１０８２３，１０８９４．．１０９９８，１１０５３．．１１０９１，１１１４３．．１１２５８，１１３１６．．１１３３６，１１３８８．．１１４３６，１１４９４．．１１５５６，１１６１３．．１１８１１，１１８６５．．１２２２９，１２２８７．．１２４１７，１２４７２．．１２５３７，１２５９４．．１２６８１，１２７３０．．１２７６９，１２８２０．．１３０１０）。
ＣＹＰ４５０−３：（１３９０１．．１３９９３，１４０４６．．１４１３５，１４１８７．．１４３４４，１４３９９．．１４４１９，１４４７５．．１４５２３，１４５７４．．１４６３６，１４６９３．．１４９００，１４９６０．．１５３３３，１５３８５．．１５５１５，１５５６８．．１５７２１，１５７７８．．１５８１７，１５８７０．．１６１２９）。
【０２０２】
定量的ＰＣＲ発現分析
プロイロムチリン生産性の増加はプロイロムチリン生合成クラスター内の遺伝子の転写の増強と相関すると考えられうる。したがって、２つの株、すなわち、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）ＤＳＭ１６０２（ＡＴＣＣ３４６４６，ＮＲＬＬ３１００）および誘導体（プロイロムチリン生産性の増加に関して選択されたＣｐ２４）を分析した。両方の株を、例えばＨａｒｔｌｅｙら（２００９）に記載されているのと実質的に同じ方法で、振とうフラスコ内で培養した。１つの前培養を使用して３つの並行主培養（生物学的重複体）に接種した。２つの培養のそれぞれをＲＮＡ分析のためにサンプル採取した。３つ目の培養をプロイロムチリン分析に使用した。サンプルは該主培養のｔ＝７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間および１６８時間の時点で採取した。
【０２０３】
無菌布での濾過により集めた菌糸から全ＲＮＡを単離した。湿潤菌糸を液体窒素中で急速冷凍し、乳鉢および乳棒を使用して粉末へと粉砕した。ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抽出プロトコールを使用して全ＲＮＡを抽出した。全ての方法は、該製造業者のプロトコールに従い行った。抽出後、該ＲＮＡサンプルをＲＮｅａｓｙ（登録商標）カラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、ＲＮアーゼ非含有ＤＮアーゼセットキット（Ｑｉａｇｅｎ）を該製造業者のプロトコールに従い使用して、カラム上でＤＮアーゼ消化を行った。ＲＮＡを、ＤＥＰＣで処理された無菌蒸留水に再懸濁させ、その濃度を分光測光法（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３１００  ｐｒｏ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）により測定した。ＲＮＡ６０００ナノアッセイ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ測定（Ａｇｉｌｅｎｔ）により該ＲＮＡの質を調べた。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を該製造業者のプロトコールに従い使用して、後続の逆転写を行った。該ＲＴ−ＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、全ての遺伝子特異的プライマーを設計した。逆転写全ＲＮＡの系列希釈を用いて、各プライマーペアに関する相対的標準曲線を作成した。プライマーは以下の基準に完全に適合しなければならない：−３．６０＜勾配＜３．１０および０．９６０＜Ｒ２。
【０２０４】
クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析に使用したプライマー：
【０２０５】
【表３】
2013521006.tif 000009
2013521006.tif 000010
【０２０６】
該反応は、５０ｎｇの鋳型ｃＤＮＡをそれぞれが含有する２０μｌの反応を用いて、該製造業者のプロトコールに従い行った。各鋳型用の試薬における混入物に関する対照としての添加鋳型ＲＮＡを伴わない無鋳型対照（ＮＴＣ）を含める。
【０２０７】
ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：変性の初期サイクル（９５℃で１０分）、それに続く４０サイクル（９５℃で１５秒および６０℃で１分）。９５℃で１５秒、６０℃で１５秒および９５℃で１５秒の追加的サイクルでの解離曲線決定により非特異的増幅に関してサンプルを試験した。競合的ＣＴ法を用いて一括販売ＳＤＳソフトウェアｖｅｒ．２．３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でデータ分析を行った。
【０２０８】
全てのサンプルは三重に測定した。プロイロムチリン生合成遺伝子に関する相対転写産物レベル値を、内在性対照としてのベータアクチン遺伝子の場合に対する標的遺伝子（検出体）に関して計算された値の正規化の後で得た。
【０２０９】
図１１に示されている結果から理解されうるとおり、コアプロイロムチリンクラスター遺伝子（ＣＹＰ４５０−１、ＡＴ、ＤＴＳ、ＧＧＤＰＳ、ＣＹＰ４５０−２、ＣＹＰ４５０−３）は、予想と全く同じプロファイル（Ｃｐ２４における構成的アップレギュレーション）を示している。これとは対照的に、陰性対照としてのＧＡＰＤＨは発現プロファイルにおける有意な相違を示していない。
【０２１０】
実施例４：クリトピルス・パッセケリアヌスのジテルペンシンターゼのＲＮＡｉノックダウン
ＲＮＡｉに使用したプラスミドの構築
ＲＮＡ干渉による標的遺伝子の転写抑制は、標的遺伝子のｍＲＮＡと部分的に同一である二本鎖ＲＮＡの断片を細胞に供給することにより実験的に誘導されうることが文献からよく知られている。真菌においてこれを達成するための効率的方法は、ヘアピンループ構造へと折り畳まれうるｍＲＮＡを転写するプラスミドで細胞を形質転換することからなる。ヘアピンループ一本鎖核酸は、塩基対形成したステム構造と、対形成していないスペーサー配列からなり、ループを形成する。
【０２１１】
厳密には、ＲＮＡｉの生成は、配列伸長およびその自己相補的対応物（短いスペーサー配列により隔てられた反復体としてのもの）をクローニングすることにより達成される。このＲＮＡｉカセットは、選択プラスミド上、プロモーターとターミネーターとの間に位置していて、ＲＮＡｉヘアピンベクターを与え、これは、ジテルペンシンターゼ遺伝子の発現に対して標的化されるＲＮＡｉベクターを構成する（例えば、Ｐ２５４３ ヘアピン）。
【０２１２】
Ｐ２５４３ ヘアピンのＲＮＡｉカセットは配列Ａ、ＢおよびＣの連続的伸長として定められる。
【０２１３】
【化３】
2013521006.tif 000011
【０２１４】
ＲＮＡｉカセットの転写に際して、生じるｍＲＮＡは、ステムを形成する配列Ａ）およびＣ）、ならびにループを形成するスペーサーＢ）とヘアピン構造を形成しうる。しばしば、文献においては、スペーサー配列はイントロン配列を含有する。ＲＮＡｉ誘導におけるイントロンの厳密な機能は理解されていないが、ＲＮＡｉ効率を増加させると考えられている。文献との合致の理由により、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）のクチナーゼ遺伝子のイントロン１はスペーサー領域の一部として用いられている。
【０２１５】
プロモーター（Ｄ）およびターミネーター（Ｅ）はヘアピンカセットの効率的転写のために用いられている。
【０２１６】
【化４】
2013521006.tif 000012
2013521006.tif 000013
2013521006.tif 000014
【０２１７】
プロモーター（Ｄ）、ＲＮＡｉカセット（Ａ、Ｂ、Ｃ）およびターミネーター（Ｅ）を連続的伸長として含有するＤＮＡ配列を遺伝子合成により作製し、選択プラスミドｐＰＨＴ１（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら，１９９９）内にクローニングした。生じたプラスミドＰ２５４３ ヘアピンはクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）をヒグロマイシン耐性へと形質転換し、ジテルペンシンターゼ遺伝子に対するＲＮＡｉ干渉を誘導しうる。
【０２１８】
ＲＮＡｉ誘導過程に関する陰性対照として、プラスミドＰ２５５８を案出した。ジテルペンシンターゼ配列Ｆ）に隣接するＡｓｃＩおよびＰａｃＩ制限部位を用いてＲＮＡｉカセット（ＡｓｃＩ  ８’１３３５位〜ＰａｃＩ  １位）を配列（Ｆ）で置換することにより、Ｐ２５４３ ヘアピンからＰ２５５８を構築した。
【０２１９】
【化５】
2013521006.tif 000015
【０２２０】
プラスミドＰ２５５８は、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）をヒグロマイシン耐性に形質転換することが可能であるが、ＲＮＡ干渉を誘導し得ない。
【０２２１】
クリトピルス・パッセケリアヌスＤＳＭ１６０２の形質転換
クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）ＤＳＭ１６０２をＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ＤＳＭＺ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇから得た。この株は、プラスミドｐＰＨＴ１（Ｋｉｌａｒｕら，２００９）を使用してヒグロマイシン耐性へと容易に形質転換されうる。プラスミドＰ２５５８およびＰ２５４３ ヘアピン（プラスミドｐＰＨＴ１由来）は以下のとおりにプロトプラストへと形質転換された。
【０２２２】
接種物の調製のためには、ＤＳＭ１６０２の良く成長したコロニーを平均５〜１０個の細胞の菌糸断片へと水中で機械的にせん断し、綿栓で閉じられたガラスフラスコ内の１００ｍｌの湿潤破壊トウモロコシへの接種に使用する。２５℃で１４日間のインキュベーションの後、５０ｍｌの水を加え、２３０ｒｐｍで２時間激しく振とうすることにより、該菌糸メッシュを集める。破壊菌糸断片を含有する懸濁液を、トウモロコシから分離するために濾過し、液体培養を調製するために接種物として使用した。
【０２２３】
ついで、炭素および窒素源としてコーンスティープリカーおよびグルコースを含有する１００ｍｌの培地に１０ｍｌのＤＳＭ１６０２接種物を接種することにより、プロトプラスト化のための菌糸を２７℃で３日間成長させた。２７℃および２３０ｒｐｍで３日間の培養の後、該菌糸を遠心分離により集めた。プロトプラスト化溶液（グルカネックス（ｇｌｕｃａｎｅｘ）を含有するＭｇＳＯ４／ＰＯ４バッファー（ｐＨ  ６．８））中、２７℃および２３０ｒｐｍで２時間、プロトプラスト化を行った。プロトプラストを遠心分離により２回洗浄するため、およびプロトプラストを１０８／ｍｌの密度まで濃縮するために、スクロース／ＣａＣｌ２／Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ  ７．５）を使用した。
【０２２４】
該形質転換法のために、５０μｌのプロトプラスト懸濁液を５〜１０μｇのプラスミドＤＮＡおよび２５μｌの３６％  ＰＥＧ混合物（ＣａＣｌ２／Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ  ７．５）中のポリエチレングリコール４，０００）と混合した。破砕氷上で２０分間インキュベートした後、２００μｌのＰＥＧ混合物を加え、該懸濁液を室温で５分間インキュベートした。プラスミドＰ２５４３ ヘアピンまたは対照Ｐ２５５８を含有する形質転換サンプルのほかに、ＤＮＡを含有しないサンプルも該選択過程の対照として調製した。１００μｇ／ｍｌ  ヒグロマイシンを含有するジャガイモデキストロース寒天上で形質転換体の選択を行った。増殖速度および形態学的特徴に関して正常表現型を示す選択された形質転換体を、振とうフラスコ発酵におけるプロイロムチリン生産性、およびプロイロムチリン生産性とジテルペンシンターゼ遺伝子の発現との間の相関性に関して試験するためのジテルペンシンターゼ遺伝子の転写の分析に使用した。
【０２２５】
クリトピルス・パッセケリアヌスのジテルペンシンターゼの定量的ＰＣＲ発現分析
ＲＮＡｉ構築物を含有する形質転換体およびこの構築物を含有しない対照株におけるジテルペンシンターゼ遺伝子の発現パターンを定量するために、実施例３に記載されているとおりに定量的ＰＣＲ分析を行った（ＡＢＩ７９００  ＨＴ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０２２６】
クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃ．ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）の菌糸からのＲＮＡを無菌布での濾過により集めた。該湿潤菌糸を液体窒素中で急速冷凍し、ボールミルを使用して粉末へと粉砕した。ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抽出プロトコールを使用して全ＲＮＡを抽出した。全ての方法は、該製造業者のプロトコールに従い行った。抽出後、該ＲＮＡサンプルをＲＮｅａｓｙ（登録商標）カラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、ＲＮアーゼ非含有ＤＮアーゼセットキット（Ｑｉａｇｅｎ）を該製造業者のプロトコールに従い使用して、カラム上でＤＮアーゼ消化を行った。ＲＮＡを、ＤＥＰＣで処理された無菌蒸留水に再懸濁させ、その濃度を分光測光法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００，Ｐｅｑｌａｂ）により測定した。ＲＮＡ６０００ナノアッセイ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ測定（Ａｇｉｌｅｎｔ）により該ＲＮＡの質を調べた。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を該製造業者のプロトコールに従い使用して、後続の逆転写を行った。
【０２２７】
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、該ジテルペンシンターゼ遺伝子の、２つの独立したプライマーセットを設計した。それぞれ９９７〜１０２１位および１０９６〜１０７７位を含むフォワードプライマーＣｐ ｄｔｓ Ｕ１（５’−ＧＴＴＡＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＣＣＴ−３’）（配列番号５６）およびリバースプライマーＣｐ ｄｔｓ Ｌ１（５’−ＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＧＡＣＡＴＡＡＧＧ−３’）（配列番号５７）、ならびにスプライス化ジテルペンシンターゼメッセンジャーＲＮＡ配列の１１２５〜１１４７位および１２１４〜１１８８位を含むＣｐ ＤＴＳ Ｕ２（５’−ＡＡＴＣＧＴＣＡＡＧＡＴＣＧＣＣＡＣＴＴＡＴＧ−３’（配列番号７０）およびリバースプライマーＣｐ ＤＴＳ Ｌ２（５’−ＧＡＧＴＡＣＣＡＴＴＣＴＧＡＴＡＣＡＴＴＣＣＡＴＴＴＧ−３’）（配列番号７１）を設計した。対照として、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃ．ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のａｃｔ遺伝子を以下のプライマーの設計のために使用した：Ｃｐ ａｃｔ Ｕ１（５’−ＴＧＡＴＧＧＴＣＡＡＧＴＴＡＴＣＡＣＧＡＴＴＧＧ−３’）（配列番号５０）およびリバースプライマーＣｐ ａｃｔ Ｌ１（５’−ＧＡＧＴＴＧＴＡＡＧＴＧＧＴＴＴＣＧＴＧＡＡＴＡＣＣ−３’）（配列番号５１）（これは１１９ｂｐのアンプリコンを与える）。ＰＣＲ反応のために、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。該反応は、１２ｎｇの鋳型ｃＤＮＡをそれぞれが含有する１２μｌの反応を用いて、該製造業者のプロトコールに従い行った。プライマーの各ペア用の試薬における混入物に関する対照としての添加鋳型ＲＮＡを伴わない無鋳型対照（ＮＴＣ）を含めた。使用した全てのプライマーセットの良好な効率が標準曲線により実証された。
【０２２８】
使用した両方のプライマーペアでの結果は、ＲＮＡｉ構築物で形質転換された全ての株におけるジテルペンシンターゼ転写の、より低いレベル（約４倍）を明らかに証明している（図１２；図１３参照）。プラスミドＰ２５４３ ヘアピンを含有する形質転換体（Ｔ１〜Ｔ９）は、プラスミドＰ２５５８（Ｃ１〜Ｃ６）を含有する形質転換体および親株ＤＳＭ１６０２と比較した場合にジテルペンシンターゼの有意な低下を明らかに示している。
【０２２９】
クリトピルス・パッセケリアヌスＤＳＭ１６０２形質転換体の生産性
選択された形質転換体のプロイロムチリン生産性を、コーンスティープリカー、グルコースおよびブチロールイート（ｂｕｔｙｌｏｌｅａｔ）を炭素および窒素源として含有する培地Ｍ２を使用する振とうフラスコ発酵において分析した。
【０２３０】
ＲＮＡ干渉の結果として、プラスミドＰ２５４３ ヘアピンを含有する形質転換体（Ｔ１〜Ｔ９）は、プラスミドＰ２５５８（Ｃ１〜Ｃ６）を含有する形質転換体および親株ＤＳＭ１６０２と比較した場合にプロイロムチリン生産性の有意な低下を明らかに示している（図１４参照）。
【０２３１】
このデータから、クリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のジテルペンシンターゼはプロイロムチリンシンターゼ活性を有すると結論づけられうる。
【０２３２】
特定の実施形態
以下の節においては、幾つかの実施形態により本発明を例示するが、それらは本発明の範囲を限定するものではない。
【０２３３】
１．ａ１）配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、
ａ２）配列番号２に対して少なくとも４０％の配列同一性を有する配列、および
ａ３）配列番号３に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される１つ、特に２つ、特に３つの配列を含む、ならびに、
ｂ１）配列番号４に対して少なくとも２５％の配列同一性を有する配列、
ｂ２）配列番号７に対して少なくとも１５％の配列同一性を有する配列、
ｂ３）配列番号５に対して少なくとも４５％の配列同一性を有する配列、および
ｂ４）配列番号６に対して少なくとも４５％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【０２３４】
２．該アミノ酸配列が、実施形態１において定義されている以下の配列群：
ａ１，ｂ１；ａ１，ｂ２；ａ１，ｂ３；ａ１，ｂ４；ａ１，ｂ１，ｂ２；ａ１，ｂ１，ｂ３；ａ１，ｂ１，ｂ４；ａ１，ｂ２，ｂ３；ａ１，ｂ２，ｂ４；ａ１，ｂ３，ｂ４；ａ１，ｂ１，ｂ２，ｂ３；ａ１，ｂ１，ｂ２，ｂ４；ａ１，ｂ１，ｂ３，ｂ４；ａ１，ｂ２，ｂ３，ｂ４；ａ１，ｂ１，ｂ２，ｂ３，ｂ４；
ａ２，ｂ１；ａ２，ｂ２；ａ２，ｂ３；ａ２，ｂ４；ａ２，ｂ１，ｂ２；ａ２，ｂ１，ｂ３；ａ２，ｂ１，ｂ４；ａ２，ｂ２，ｂ３；ａ２，ｂ２，ｂ４；ａ２，ｂ３，ｂ４；ａ２，ｂ１，ｂ２，ｂ３；ａ２，ｂ１，ｂ２，ｂ４；ａ２，ｂ１，ｂ３，ｂ４；ａ２，ｂ２，ｂ３，ｂ４；ａ２，ｂ１，ｂ２，ｂ３，ｂ４；ａ３，ｂ１；ａ３，ｂ２；ａ３，ｂ３；ａ３，ｂ４；ａ３，ｂ１，ｂ２；ａ３，ｂ１，ｂ３；ａ３，ｂ１，ｂ４；ａ３，ｂ２，ｂ３；ａ３，ｂ２，ｂ４；ａ３，ｂ３，ｂ４；ａ３，ｂ１，ｂ２，ｂ３；ａ３，ｂ１，ｂ２，ｂ４；ａ３，ｂ１，ｂ３，ｂ４；ａ３，ｂ２，ｂ３，ｂ４；ａ３，ｂ１，ｂ２，ｂ３，ｂ４から選択されるいずれかの配列群を含む、実施形態１に記載の単離されたポリペプチド。
【０２３５】
３．ａ１）配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列、
ａ２）配列番号２に対して少なくとも４０％の配列同一性を有する配列、および場合によっては、
ａ３）配列番号３に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む、ならびに、
ｂ１）配列番号４に対して少なくとも２５％の配列同一性を有する配列、
ｂ２）配列番号７に対して少なくとも１５％の配列同一性を有する配列、
ｂ３）配列番号５に対して少なくとも４５％の配列同一性を有する配列、および
ｂ４）配列番号６に対して少なくとも４５％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【０２３６】
４．該アミノ酸配列が、実施形態１において定義されている以下の配列群：
ａ１，ａ２，ｂ１；ａ１，ａ２，ｂ２；ａ１，ａ２，ｂ３；ａ１，ａ２，ｂ４；
ａ１，ａ２，ｂ１，ｂ２；ａ１，ａ２，ｂ１，ｂ３；ａ１，ａ２，ｂ１，ｂ４；ａ１，ａ２，ｂ２，ｂ３；ａ１，ａ２，ｂ２，ｂ４；ａ１，ａ２，ｂ３，ｂ４；
ａ１，ａ２，ｂ１，ｂ２，ｂ３；ａ１，ａ２，ｂ１，ｂ２，ｂ４；ａ１，ａ２，ｂ１，ｂ３，ｂ４；ａ１，ａ２，ｂ２，ｂ３，ｂ４；
ａ１，ａ２，ｂ１，ｂ２，ｂ３，ｂ４から選択されるいずれかの配列群を含む、実施形態１または３のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【０２３７】
５．該アミノ酸配列が、実施形態１において定義されている以下の配列群：
ａ１，ａ２，ａ３，ｂ１；ａ１，ａ２，ａ３，ｂ２；ａ１，ａ２，ａ３，ｂ３；ａ１，ａ２，ａ３，ｂ４；
ａ１，ａ２，ａ３，ｂ１，ｂ２；ａ１，ａ２，ａ３，ｂ１，ｂ３；ａ１，ａ２，ａ３，ｂ１，ｂ４；ａ１，ａ２，ａ３，ｂ２，ｂ３；ａ１，ａ２，ａ３，ｂ２，ｂ４；ａ１，ａ２，ａ３，ｂ３，ｂ４；
ａ１，ａ２，ａ３，ｂ１，ｂ２，ｂ３；ａ１，ａ２，ａ３，ｂ１，ｂ２，ｂ４；ａ１，ａ２，ａ３，ｂ１，ｂ３，ｂ４；ａ１，ａ２，ａ３，ｂ２，ｂ３，ｂ４；
ａ１，ａ２，ａ３，ｂ１，ｂ２，ｂ３，ｂ４から選択されるいずれかの配列群を含む、実施形態１または３に記載の単離されたポリペプチド。
【０２３８】
６．ｂ１、ｂ２、ｂ３およびｂ４の２つの配列、特に３つの配列、特に４つの配列を含む、実施形態１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０２３９】
７．ａ１で定義されている配列が、配列番号１に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％、特に１００％の配列同一性を有する、実施形態１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０２４０】
８．ａ２で定義されている配列が、配列番号２に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％、特に１００％の配列同一性を有する、実施形態１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０２４１】
９．ａ３で定義されている配列が、配列番号３に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％、特に１００％の配列同一性を有する、実施形態１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０２４２】
１０．ｂ１で定義されている配列が、配列番号４に対して少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％、特に１００％の配列同一性を有する、実施形態１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０２４３】
１１．ｂ２で定義されている配列が、配列番号７に対して少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％、特に１００％の配列同一性を有する、実施形態１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０２４４】
１２．ｂ３で定義されている配列が、配列番号５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％、特に１００％の配列同一性を有する、実施形態１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０２４５】
１３．ｂ４で定義されている配列が、配列番号６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％、特に１００％の配列同一性を有する、実施形態１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【０２４６】
１４．配列ａ１，ａ２，ａ３，ｂ１，ｂ２，ｂ３およびｂ４を含む、実施形態５に記載の単離されたポリペプチドであって、配列ａ１，ａ２，ａ３，ｂ１，ｂ２，ｂ３およびｂ４が以下の配列同一性を有する、すなわち、
ａ１が配列番号１に対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、ａ２が配列番号２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、ａ３が配列番号３に対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、ｂ１が配列番号４に対して少なくとも３５％の配列同一性を有し、ｂ２が配列番号７に対して少なくとも２５％の配列同一性を有し、ｂ３が配列番号５に対して少なくとも５５％の配列同一性を有し、ｂ４が配列番号６に対して少なくとも５５％の配列同一性を有する、より好ましくは、
ａ１が配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、ａ２が配列番号２に対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、ａ３が配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、ｂ１が配列番号４に対して少なくとも４５％の配列同一性を有し、ｂ２が配列番号７に対して少なくとも３５％の配列同一性を有し、ｂ３が配列番号５に対して少なくとも６５％の配列同一性を有し、ｂ４が配列番号６に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する、より一層好ましくは、
ａ１が配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、ａ２が配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、ａ３が配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、ｂ１が配列番号４に対して少なくとも５５％の配列同一性を有し、ｂ２が配列番号７に対して少なくとも４５％の配列同一性を有し、ｂ３が配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有し、ｂ４が配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する、実施形態５に記載の単離されたポリペプチド。
【０２４７】
１５．配列番号１〜７の少なくとも５つ、特に少なくとも６つ、特に７つ全てがクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）由来である、実施形態１〜１４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【０２４８】
１６．該ポリペプチドの分子量が９０ｋＤａ〜１４０ｋＤａの間、特に１００ｋＤａ〜１３０ｋＤａの間、特に１０５ｋＤａ〜１２０ｋＤａの間である、および／または
該ポリペプチドが、配列番号９に対して少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、配列番号９に対して少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％、または更には少なくとも９０％、例えば、より一層好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１５のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【０２４９】
１７．該ポリペプチドがジテルペンシンターゼ、特にプロイロムチリンシンターゼである、および／または該ポリペプチドがジテルペンシンターゼ活性、特にプロイロムチリンシンターゼ活性を有する、実施形態１〜１６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【０２５０】
１８．該ポリペプチドが、プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する、実施形態１〜１７のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【０２５１】
１９．該ポリペプチドが、ゲラニルゲラニルピロホスファートからプロイロムチリン前駆体への、特に式（Ｉ）の化合物への変換を触媒しうる、実施形態１〜１８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【０２５２】
２０．該ポリペプチドが、真菌宿主、特に担子菌門の真菌、より詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌から誘導可能であり、特に、ここで、該ポリペプチドが、クリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）属またはプロイロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属から誘導可能であり、特に、ここで、該ポリペプチドが、クリトピルス・シフォイデス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｓｃｙｐｈｏｉｄｅｓ）、クリトピルス・プルヌルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｒｕｎｕｌｕｓ）、クリトピルス・ホブソニイ（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｈｏｂｓｏｎｉｉ）、クリトピルス・プソイド−ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏ−ｐｉｎｓｉｔｕｓ）、クリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）およびクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のいずれかから、特にクリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）またはクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）から誘導可能である、実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【０２５３】
２１．Ａ）実施形態１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドもしくは配列番号９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
Ｂ）ａ）配列番号８の配列、または
ａ’）配列番号１５の配列もしくはそれに相補的な配列、または
ｂ）ａ’）に記載の配列の部分配列（該部分配列はジテルペンシンターゼをコードするものである）、または
ｃ）ａ’）に記載の配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有し、もしくはａ）に記載の配列もしくはｂ）に記載の部分配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、ジテルペンシンターゼをコードする配列、または
ｄ）ジテルペンシンターゼをコードし、ａ）、ａ’）、ｂ）およびｃ）のいずれかに記載の配列に対する遺伝暗号の結果として縮重している配列、または
ｅ）ジテルペンシンターゼをコードし、ストリンジェントな条件下で配列番号８および／もしくは配列番号１３にハイブリダイズしうる配列
であるヌクレオチド配列、
Ｃ）Ｂ項に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１８個の連続的ヌクレオチド、および／または
Ｄ）ストリンジェントな条件下でＡ項もしくはＢ項に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズしうる少なくとも１８個の連続的ヌクレオチドを含む単離された核酸分子。
【０２５４】
２２．実施形態１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは配列番号９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【０２５５】
２３．ａ）配列番号８の配列もしくはそれに相補的な配列、または
ａ’）配列番号１５の配列もしくはそれに相補的な配列、または
ｂ）ａ）もしくはａ’）に記載の配列の部分配列（該部分配列は、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするものである）、または
ｃ）ａ）もしくはａ’）に記載の配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有し、もしくはｂ）に記載の部分配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列、または
ｄ）ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ａ）、ａ’）、ｂ）およびｃ）のいずれかに記載の配列に対する遺伝暗号の結果として縮重している配列、または
ｅ）ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ストリンジェントな条件下でａ）、ａ’）、ｂ）およびｃ）のいずれかに記載の配列、特に配列番号８および／もしくは配列番号１３にハイブリダイズしうる配列であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【０２５６】
２４．ａ）配列番号１５の配列、または
ｂ）それに相補的な配列、または
ｃ）ａ）もしくはｂ）に記載の配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有し、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列、または
ｄ）ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ａ）、ｂ）およびｃ）のいずれかに記載の配列に対する遺伝暗号の結果として縮重している配列、または
ｅ）ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれかに記載の配列、特に配列番号１５にハイブリダイズしうる配列であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【０２５７】
２５．ａ）ジテルペンを産生する生合成経路に関与する遺伝子クラスターをコードする、配列番号１５の配列、または
ｂ）プロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する遺伝子クラスターをコードする、配列番号１５の配列、または
ｃ）ａ）もしくはｂ）に記載の配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有し、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列、または
ｄ）ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ａ）、ｂ）およびｃ）のいずれかに記載の配列に対する遺伝暗号の結果として縮重している配列、または
ｅ）ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号１５にハイブリダイズしうる配列であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【０２５８】
２６．該核酸分子が、ゲラニルゲラニルピロホスファートからプロイロムチリンへの変換を触媒しうる、特に、ファルネシルジホスファートからプロイロムチリンへの変換を触媒しうるポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子クラスターを含む、実施形態２４または２５に記載の単離された核酸分子。
【０２５９】
２７．ａ）配列番号８の配列、または
ｂ）配列番号１３の配列、または
ｃ）ａ）もしくはｂ）に記載の配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列、または
ｄ）ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ａ）、ｂ）およびｃ）のいずれかに記載の配列に対する遺伝暗号の結果として縮重している配列、または
ｅ）ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれかに記載の配列にハイブリダイズしうる配列であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【０２６０】
２８．ａ）ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１５の部分配列、または
ｂ）プロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１５の部分配列、または
ｃ）ａ）もしくはｂ）に記載の部分配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列、または
ｄ）ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ａ）、ｂ）およびｃ）のいずれかに記載の部分配列に対する遺伝暗号の結果として縮重している配列、または
ｅ）ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のいずれかに記載の配列にハイブリダイズしうる配列であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【０２６１】
２９．ｃ）項における少なくとも４０％の配列同一性が少なくとも４５％、５０％、５５％、特に少なくとも６０％、６５％、７０％、特に少なくとも７５％、８０％、８５％、より詳しくは少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、特に１００％の配列同一性である、および／または
ｃ）項における少なくとも６０％の配列同一性が少なくとも６５％、７０％、７５％、特に少なくとも８０％、８５％、特に少なくとも９０％、９２％、より詳しくは少なくとも９５％、９７％、９９％、特に１００％の配列同一性である、実施形態２１、２３、２４、２５、２７および２８のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【０２６２】
３０．該核酸分子が、真菌宿主、特に担子菌門の真菌、より詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌から誘導可能であり、特に、ここで、該核酸分子が、クリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）属またはプロイロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属から誘導可能であり、特に、ここで、該核酸分子が、クリトピルス・シフォイデス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｓｃｙｐｈｏｉｄｅｓ）、クリトピルス・プルヌルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｒｕｎｕｌｕｓ）、クリトピルス・ホブソニイ（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｈｏｂｓｏｎｉｉ）、クリトピルス・プソイド−ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏ−ｐｉｎｓｉｔｕｓ）、クリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）およびクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）のいずれかから、特にクリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）またはクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）から誘導可能である、実施形態２１〜２９のいずれか１項に記載の核酸分子。
【０２６３】
３１．プロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列が、
ｉ）ジテルペンシンターゼをコードする配列、および／または
ｉｉ）プロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列、および／または
ｉｉ）プロイロムチリンシンターゼをコードする配列であり、
特に、ここで、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドが、ゲラニルゲラニルピロホスファートからプロイロムチリン前駆体への、特に式（Ｉ）の化合物への変換を触媒しうる、実施形態２１〜３０のいずれか１項に記載の核酸分子。
【０２６４】
３２．少なくとも１８、１９、２０、２５個、特に少なくとも３０、３５、４０、４５個、特に少なくとも５０、５５、６０、６５個、特に少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５個、特に少なくとも１００、１５０、２００、２５０個、特に少なくとも３００、３５０、４００、４５０または５００個の、実施形態２２〜３１のいずれか１項に記載の配列の連続的ヌクレオチドを含む、特に、検出可能標識を更に含む単離された核酸分子。
【０２６５】
３３．少なくとも１８、１９、２０、２５個、特に少なくとも３０、３５、４０、４５個、特に少なくとも５０、５５、６０、６５個、特に少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５個、特に少なくとも１００、１５０、２００、２５０個、特に少なくとも３００、３５０、４００、４５０または５００個の連続的ヌクレオチドを含む単離された核酸分子であって、該核酸分子が、ストリンジェントな条件下で実施形態２２〜３１のいずれか１項に記載の核酸分子にハイブリダイズしうる、特に、該核酸分子が検出可能標識を更に含む、単離された核酸分子。
【０２６６】
３４．実施形態２１および２３〜３１のいずれか１項に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド。
【０２６７】
３５．実施形態１〜２０のいずれか１項において更に定義されている、実施形態３４に記載のポリペプチド。
【０２６８】
３６．実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター、または実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載の核酸配列を含むベクター。
【０２６９】
３７．細胞、組織および非ヒト生物から選択される天然に存在しない宿主であって、該宿主が、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸を含み、特に、ここで、該ヌクレオチド配列が、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチド、特にジテルペンシンターゼまたはプロイロムチリンシンターゼをコードしており、特に、ここで、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドがゲラニルゲラニルピロホスファートからプロイロムチリン前駆体への、特に式（Ｉ）の化合物への変換を触媒しうる、宿主。
【０２７０】
３８．細胞、組織および非ヒト生物から選択される天然に存在しない宿主であって、実施形態３６に記載の少なくとも１つのベクターを含む、宿主。
【０２７１】
３９．細胞、組織および非ヒト生物から選択される天然に存在しない宿主であって、該宿主が、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子を含み、特に、ここで、該ヌクレオチド配列が、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチド、特にジテルペンシンターゼまたはプロイロムチリンシンターゼをコードしており、特に、ここで、ジテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドがゲラニルゲラニルピロホスファートからプロイロムチリン前駆体への、特に式（Ｉ）の化合物への変換を触媒することが可能であり、該宿主が、実施形態３６に記載の少なくとも１つのベクターを含む、宿主。
【０２７２】
４０．該宿主がプロイロムチリン前駆体、特に式（Ｉ）の化合物を産生しうる、実施形態３７〜３９のいずれか１項に記載の宿主。
【０２７３】
４１．該宿主がジテルペンまたはジテルペノイド、特にプロイロムチリンを産生しうる、実施形態３７〜４０のいずれか１項に記載の宿主。
【０２７４】
４２．細胞、組織および非ヒト生物から選択される、前記の少なくとも１つの核酸分子および／またはベクターを含まない対応する天然に存在しない宿主が、
（ｉ）式（Ｉ）の化合物を産生しうる、および／または
（ｉｉ）プロイロムチリンを産生しうる、実施形態３７〜４１のいずれか１項に記載の宿主。
【０２７５】
４３．細胞、組織および非ヒト生物から選択される、前記の少なくとも１つの核酸分子および／またはベクターを含まない対応する天然に存在しない宿主が、
（ｉ）式（Ｉ）の化合物を産生し得ない、および／または
（ｉｉ）プロイロムチリンを産生し得ない、実施形態３７〜４１のいずれか１項に記載の宿主。
【０２７６】
４４．該宿主が真菌宿主、より詳しくは担子菌門の真菌、より一層詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌であり、特に、ここで、該宿主がクリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）属またはプロイロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属のものであり、特に、ここで、該宿主が、クリトピルス・シフォイデス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｓｃｙｐｈｏｉｄｅｓ）、クリトピルス・プルヌルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｒｕｎｕｌｕｓ）、クリトピルス・ホブソニイ（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｈｏｂｓｏｎｉｉ）、クリトピルス・プソイド−ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏ−ｐｉｎｓｉｔｕｓ）、クリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）およびクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）、特にクリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）またはクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からなる群から選択される、前記実施形態のいずれか１項に記載の宿主。
【０２７７】
４５．（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸分子および／または実施形態３６に記載の少なくとも１つのベクターを導入し、（ｉｉ）該ポリペプチドの産生に適した条件下で該宿主を培養することを含み、特に、（ｉｉｉ）該宿主から該ポリペプチドを回収するもう１つの工程を含む、実施形態１〜２０、３４および３５のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【０２７８】
４６．（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸分子を導入し、（ｉｉ）該ポリペプチドの産生に適した条件下で該宿主を培養することを含み、特に、（ｉｉｉ）該宿主から該ポリペプチドを回収するもう１つの工程を含む、実施形態１〜２０、３４および３５のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【０２７９】
４７．（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、実施形態３６に記載の少なくとも１つのベクターを導入し、（ｉｉ）該ポリペプチドの産生に適した条件下で該宿主を培養することを含み、特に、（ｉｉｉ）該宿主から該ポリペプチドを回収するもう１つの工程を含む、実施形態１〜２０、３４および３５のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【０２８０】
４８．（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸分子および実施形態３６に記載の少なくとも１つのベクターを導入し、（ｉｉ）該ポリペプチドの産生に適した条件下で該宿主を培養することを含み、特に、（ｉｉｉ）該宿主から該ポリペプチドを回収するもう１つの工程を含む、実施形態１〜２０、３４および３５のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【０２８１】
４９．（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、実施形態２１Ｂａ’、２３、２４および２５のいずれか１項に記載の核酸分子ならびに／または実施形態２１Ｂａ’、２３、２４、２５および２６のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクターを導入し、（ｉｉ）プロイロムチリンの産生に適した条件下で該宿主を培養することを含む、プロイロムチリンの製造方法。
【０２８２】
５０．（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、実施形態２１Ｂａ’、２３、２４、２５および２６のいずれか１項に記載の核酸分子を導入し、（ｉｉ）プロイロムチリンの産生に適した条件下で該宿主を培養することを含む、プロイロムチリンの製造方法。
【０２８３】
５１．（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、実施形態２１Ｂａ’、２３、２４、２５および２６のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクターを導入し、（ｉｉ）プロイロムチリンの産生に適した条件下で該宿主を培養することを含む、プロイロムチリンの製造方法。
【０２８４】
５２．（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、実施形態２１Ｂａ’、２３、２４および２５のいずれか１項に記載の核酸分子ならびに実施形態２１Ｂａ’、２３、２４、２５および２６のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクターを導入し、（ｉｉ）プロイロムチリンの産生に適した条件下で該宿主を培養することを含む、プロイロムチリンの製造方法。
【０２８５】
５３．（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載の核酸分子および／または実施形態３６に記載のベクターを導入し、（ｉｉ）該プロイロムチリン前駆体の産生に適した条件下で該宿主を培養することを含む、プロイロムチリン前駆体、特に式（Ｉ）の化合物の製造方法。
【０２８６】
５４．（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載の核酸分子を導入し、（ｉｉ）該プロイロムチリン前駆体の産生に適した条件下で該宿主を培養することを含む、プロイロムチリン前駆体、特に式（Ｉ）の化合物の製造方法。
【０２８７】
５５．（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、実施形態３６に記載のベクターを導入し、（ｉｉ）該プロイロムチリン前駆体の産生に適した条件下で該宿主を培養することを含む、プロイロムチリン前駆体、特に式（Ｉ）の化合物の製造方法。
【０２８８】
５６．（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載の核酸分子および実施形態３６に記載のベクターを導入し、（ｉｉ）該プロイロムチリン前駆体の産生に適した条件下で該宿主を培養することを含む、プロイロムチリン前駆体、特に式（Ｉ）の化合物の製造方法。
【０２８９】
５７．細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主におけるプロイロムチリンの産生の改変方法であって、該宿主がプロイロムチリンを産生することが可能であり、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子を含み、該方法が、前記の少なくとも１つの核酸分子のｉ）発現、ｉｉ）同一性、またはｉｉｉ）発現および同一性の両方を操作することを含み、特に、ここで、該方法が、
ａ）プロイロムチリンの産生を増加させる方法、または
ｂ）特に、前記の少なくとも１つの核酸分子を破壊またはダウンレギュレーションすることを含む、プロイロムチリンの産生を減少させる方法であり、特に、ここで、該宿主が真菌宿主、より詳しくは担子菌門の真菌、より一層詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌である、方法。
【０２９０】
５８．細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主におけるプロイロムチリンの産生の改変方法であって、該宿主がプロイロムチリンを産生することが可能であり、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子を含み、該方法が、前記の少なくとも１つの核酸分子の同一性を操作することを含む、方法。
【０２９１】
５９．細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主におけるプロイロムチリンの産生の改変方法であって、該宿主がプロイロムチリンを産生することが可能であり、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子を含み、該方法が、前記の少なくとも１つの核酸分子の発現を操作することを含む、方法。
【０２９２】
６０．該方法が、プロイロムチリンの産生を増加させる方法である、実施形態５７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【０２９３】
６１．該方法が、プロイロムチリンの産生を減少させる方法であり、特に、前記の少なくとも１つの核酸分子を破壊またはダウンレギュレーションすることを含む、実施形態５７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【０２９４】
６２．該宿主が真菌宿主、より詳しくは担子菌門の真菌、より一層詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌であり、特に、ここで、該宿主がクリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）属またはプロイロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属のものであり、特に、ここで、該宿主が、クリトピルス・シフォイデス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｓｃｙｐｈｏｉｄｅｓ）、クリトピルス・プルヌルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｒｕｎｕｌｕｓ）、クリトピルス・ホブソニイ（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｈｏｂｓｏｎｉｉ）、クリトピルス・プソイド−ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏ−ｐｉｎｓｉｔｕｓ）、クリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）およびクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）、特にクリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）またはクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からなる群から選択される、実施形態５７〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【０２９５】
６３．プロイロムチリンの製造における、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載の単離された核酸分子の使用であって、該核酸分子の配列の２〜５０ヌクレオチドが、プロイロムチリンを産生しうる野生型生物に含まれるプロイロムチリンを産生する生合成経路に関与する遺伝子クラスターの配列とは異なっており、または該核酸分子が非天然核酸分子である、使用。
【０２９６】
６４．プロイロムチリン前駆体の製造における、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載の単離された核酸分子の使用であって、該核酸分子の配列の２〜５０ヌクレオチドが、プロイロムチリンを産生しうる野生型生物に含まれるジテルペンシンターゼをコードする配列とは異なっており、また該核酸分子が非天然核酸分子であり、特に、ここで、該プロイロムチリン前駆体が式（Ｉ）の化合物である、使用。
【０２９７】
６５．２〜５０ヌクレオチドが、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０または４５ヌクレオチドであり、特に３〜１００、より詳しくは５〜８０ヌクレオチド、より一層詳しくは８〜６０ヌクレオチドである、実施形態６３または６４記載の使用。
【０２９８】
６６．プロイロムチリンまたはプロイロムチリン前駆体の製造における、実施形態３７〜４４のいずれか１項に記載の宿主の使用であって、特に、ここで、該プロイロムチリン前駆体が式（Ｉ）の化合物である、使用。
【０２９９】
６７．ジテルペンシンターゼ活性、特にプロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、および／またはジテルペンシンターゼ、特にプロイロムチリンシンターゼをコードする１以上の核酸を特定するための、実施形態２１〜３３のいずれか１項、特に実施形態３２または３３に記載の単離された核酸分子の使用。
【０３００】
６８．ジテルペンシンターゼ活性、特にプロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、および／またはジテルペンシンターゼ、特にプロイロムチリンシンターゼをコードする１以上の核酸を単離するための、実施形態２１〜３３のいずれか１項、特に実施形態３２または３３に記載の単離された核酸分子の使用。
【０３０１】
６９．ジテルペンシンターゼ活性、特にプロイロムチリンシンターゼ活性を有するポリペプチドを単離する、および／またはジテルペンシンターゼ、特にプロイロムチリンシンターゼを単離する方法における、実施形態２１〜３３のいずれか１項、特に実施形態３２または３３記載の単離された核酸分子の使用。
【０３０２】
７０．ジテルペンシンターゼ活性を有する該ポリペプチドまたはジテルペンシンターゼが、実施形態１〜２０のいずれか１項のポリペプチドと同様に更に定義される、実施形態６７〜６９のいずれか１項に記載の使用。
【０３０３】
７１．前記の１以上の核酸が、実施形態２１〜３３のいずれか１項の核酸と同様に更に定義される、実施形態６７〜６８のいずれか１項に記載の使用。
【０３０４】
７２．プロイロムチリン前駆体、特に式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、該方法が、
Ａ）該前駆体の発酵的製造方法であり、特に、
（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸分子および／または実施形態３６に記載の少なくとも１つのベクターを導入し、
（ｉｉ）該前駆体の発酵的製造に適した条件下で該宿主を培養する工程を含み、または
Ｂ）該前駆体の合成的製造方法であり、ゲラニルゲラニルピロホスファートを請求項１〜２０、３４および３５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは実施形態４５〜４８のいずれか１項に記載の方法により入手可能なポリペプチドと反応させることを含む、製造方法。
【０３０５】
７３．プロイロムチリン前駆体、特に式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、該方法が該前駆体の発酵的製造方法であり、特に、
（ｉ）細胞、組織および非ヒト生物から選択される宿主内に、実施形態２１〜３１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸分子および／または実施形態３６に記載の少なくとも１つのベクターを導入し、
（ｉｉ）該前駆体の発酵的製造に適した条件下で該宿主を培養する工程を含み、特に、ここで、該方法が、（ｉｉｉ）該宿主から該前駆体を回収するもう１つの工程を含む、製造方法。
【０３０６】
７４．該宿主が真菌宿主、より詳しくは担子菌門の真菌、より一層詳しくはハラタケ目の真菌、より一層詳しくはイッポンシメジ科の真菌であり、特に、ここで、該宿主がクリトピルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ）属またはプロイロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属のものであり、特に、ここで、該宿主が、クリトピルス・シフォイデス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｓｃｙｐｈｏｉｄｅｓ）、クリトピルス・プルヌルス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｒｕｎｕｌｕｓ）、クリトピルス・ホブソニイ（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｈｏｂｓｏｎｉｉ）、クリトピルス・プソイド−ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏ−ｐｉｎｓｉｔｕｓ）、クリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）およびクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）、特にクリトピルス・ピンシツス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ）またはクリトピルス・パッセケリアヌス（Ｃｌｉｔｏｐｉｌｕｓ  ｐａｓｓｅｃｋｅｒｉａｎｕｓ）からなる群から選択される、実施形態７２または７３記載の製造方法。
【０３０７】
７５．プロイロムチリン前駆体、特に式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、該方法が該前駆体の合成的製造方法であり、ゲラニルゲラニルピロホスファートを請求項１〜２０、３４および３５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは実施形態４５〜４８のいずれか１項に記載の方法により入手可能なポリペプチドと反応させることを含む、製造方法。
【０３０８】
７６．式（Ｉ）の単離された化合物。
【０３０９】
７７．実施形態５３〜５６または７２〜７５のいずれか１項に記載の製造方法により入手可能である式（Ｉ）の単離された化合物。
【０３１０】
７８．ｉ）実施形態５３〜５６および７２〜７５のいずれか１項に記載の製造方法により得られるプロイロムチリン前駆体、
ｉｉ）実施形態６４の使用により得られるプロイロムチリン前駆体、または
ｉｉｉ）実施形態７６または７７記載の単離された化合物を反応させる工程を含み、場合によっては、プロイロムチリン抗生物質を製造するための更なる反応工程を含む、プロイロムチリン抗生物質の製造方法。
【０３１１】
７９．プロイロムチリン抗生物質、特にプロイロムチリン誘導体の製造における、
ｉ）実施形態５３〜５６および７２〜７５のいずれか１項に記載の製造方法により得られるプロイロムチリン前駆体、
ｉｉ）実施形態６４の使用により得られるプロイロムチリン前駆体、または
ｉｉｉ）実施形態７６または７７記載の単離された化合物の使用。
【０３１２】
８０．ｉ）医薬としての使用のための、または
ｉｉ）細菌感染症、特に、グラム陽性菌、特にブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌および腸球菌から選択されるグラム陽性菌；グラム陰性菌、特にナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属から選択されるグラム陰性菌；マイコプラズマ；クラミジア；グラム陽性嫌気性細菌およびグラム陰性嫌気性細菌からなる群から選択される細菌により引き起こされる感染症の治療方法における使用のための、または
ｉｉｉ）グラム陽性菌、特にブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌および腸球菌から選択されるグラム陽性菌；グラム陰性菌、特にナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属から選択されるグラム陰性菌；マイコプラズマ；クラミジア；グラム陽性嫌気性細菌およびグラム陰性嫌気性細菌からなる群から選択される細菌が関与する障害もしくは疾患の治療における使用のための、実施形態４９〜５２，６３および６６のいずれか１項に従い得られるプロイロムチリン。
【０３１３】
８１．ｉ）医薬としての使用のための、または
ｉｉ）細菌感染症、特に、グラム陽性菌、特にブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌および腸球菌から選択されるグラム陽性菌；グラム陰性菌、特にナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属から選択されるグラム陰性菌；マイコプラズマ；クラミジア；グラム陽性嫌気性細菌およびグラム陰性嫌気性細菌からなる群から選択される細菌により引き起こされる感染症の治療方法における使用のための、または
ｉｉｉ）グラム陽性菌、特にブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌および腸球菌から選択されるグラム陽性菌；グラム陰性菌、特にナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属から選択されるグラム陰性菌；マイコプラズマ；クラミジア；グラム陽性嫌気性細菌およびグラム陰性嫌気性細菌からなる群から選択される細菌が関与する障害もしくは疾患の治療における使用のための、実施形態７８に記載の製造方法により得られるプロイロムチリン抗生物質。
【０３１４】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図３−１１】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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