(57)【要約】  カンピロバクター感染に対する耐性の強化又はカンピロバクターに対する免疫応答の増強のためのワクチンベクター及び方法が提供される。前記ワクチンベクターは、配列番号：7−9から選択される抗原性ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする第一のポリヌクレオチドを含む。前記ベクターはまた免疫刺激性ポリペプチドを含むことができる。本方法は、対象動物に前記ワクチンベクターを投与する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：7（cjaD；cj0113）、配列番号：8（cjaA；cj0982）若しくは配列番号：9（ACE 393；cj0420）の抗原性ポリペプチド、又は前記のフラグメントをコードする第一のポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、前記第一のポリヌクレオチド配列が前記ベクターに本来付随していない、前記ベクター。
【請求項２】
さらにベクターに本来付随していない免疫刺激性ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
抗原性ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列、及び、免疫刺激性ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、前記第一のポリヌクレオチド配列は前記ベクターに本来付随しておらず、前記抗原性ポリペプチドが配列番号：1（cjaD；cj0113）、配列番号：2（cjaA；cj0982）又は配列番号：3（ACE393；cj0420）のフラグメントである、前記ベクター。
【請求項４】
ベクターが細菌である、請求項１−３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
細菌がサルモネラ（Salmonella）、エシェリキア（Escherichia）、バシルス（Bacillus）又はラクトバシルス（Lactobacillus）から選択される属に由来する、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
第一のポリヌクレオチド配列及び第二のポリヌクレオチド配列が細菌のゲノムに組み込まれる、請求項４に記載のベクター。
【請求項７】
ベクターが、第一のポリヌクレオチド配列の2つ以上のコピー、第二のポリヌクレオチド配列の2つ以上のコピー、又は第一及び第二のポリヌクレオチド配列の2つ以上のコピー含む、請求項２−６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項８】
第一のポリヌクレオチド配列が第二のポリヌクレオチド配列とインフレームで連結される、請求項２−７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項９】
抗原性ポリペプチド及び免疫刺激性ポリペプチドがベクターの表面で発現される、請求項２−８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１０】
第一のポリヌクレオチド配列及び第二のポリヌクレオチド配列が、トランスメンブレンタンパク質の外部部分をコードする第三のポリヌクレオチド配列内に挿入される、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
免疫刺激性ポリペプチドがCD154ポリペプチド又はHMGB1ポリペプチドである、請求項２−１０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１２】
CD154ポリペプチドがCD40と結合することができ、CD154ポリペプチドが50より少ないアミノ酸を有し、さらに配列番号：13のアミノ酸140−149又はそのホモローグを含む、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
CD154ポリペプチドが配列番号：15−19から選択されるポリペプチドを含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
HMGB1ポリペプチドが、配列番号：20−28の少なくとも1つ又は配列番号：20−28の少なくとも1つのフラグメントから選択されるポリペプチドを含む、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１５】
第一のポリヌクレオチド配列が配列番号：7又はそのフラグメントである、請求項１−１４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１６】
第一のポリヌクレオチド配列が、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：8のフラグメント、配列番号：9のフラグメント又はそれらの組合せである、請求項１−１５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１７】
対象動物へのベクターの投与が抗体応答を誘引することができる、請求項１−１６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１８】
抗体応答がIgA応答である、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
ベクターが、ワクチン接種後のカンピロバクター種による感染からワクチン接種対象動物を防御することができる、請求項１−１８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１−１９のいずれか１項に記載のベクター及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項２１】
対象動物で免疫応答を増強する方法であって、前記方法が、請求項１−１９のいずれか１項に記載のベクターを対象動物の免疫応答の増強に有効な量で前記対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２２】
免疫応答が抗体応答増強を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
可溶性IgA抗体応答が増強される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ベクター投与後のIgA応答が、コントロールベクター投与対象動物のIgA応答に対して少なくとも3倍増加する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
さらにカンピロバクター種で対象動物をチャレンジする工程を含む、請求項２１−２３のいずれか１項の記載の方法であって、チャレンジ後の対象動物におけるカンピロバクターの増殖が、コントロールベクター投与対象動物と比較してベクター投与対象動物で2 log低下する、前記方法。
【請求項２６】
対象動物でカンピロバクター感染に対する耐性を強化する方法であって、カンピロバクター種への曝露の後のカンピロバクター感染に対する耐性の強化に有効な量で請求項１−１９のいずれか１項に記載のベクターを対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２７】
ベクターが弱毒化される、請求項２１−２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ベクターが投与前に死滅化される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
耐性が抗体産生増加によって強化される、請求項２６−２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
抗体応答増加がIgA応答増加を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
耐性増加が、続いて起こるカンピロバクター種による感染がコントロールと比較してカンピロバクターの増殖低下に終わることを特徴とする、請求項２６−３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
カンピロバクター増殖が、コントロールベクター投与後のカンピロバクター増殖と比較して少なくとも2 log低下する、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互引用
本特許出願は、米国仮特許出願61/353,039号（2010年6月9日出願）（前記は参照によりその全体が本明細書に含まれる）の優先権を主張する。
連邦政府支援研究に関する記述
本発明は、グラント番号208-35-201-04-683（USDA/NRIより授与）により政府の支援を受けて達成された。本発明に関して政府は一定の権利を有する。
配列リスト
配列表が本出願に添付されてあり、前記配列表は参照によりその全体が本明細書に含まれる。本配列表は、テキストファイルとして2011年6月9日に前記出願とともに提出された。
本発明は、カンピロバクター感染に対する耐性を強化するか、又はカンピロバクターに対する免疫応答を増強するベクター及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多様な因子に対して粘膜免疫を生じる安全で費用効率のよいワクチンの種類は限られている。世界的なヒトの胃腸管性疾患の主要な細菌性原因はカンピロバクター（Campylobacter）である。細菌性胃腸炎は、近い将来にわたって米国及び海外で一般の人々に重大な脅威を引き起こし続ける。カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）による感染は、より広く公表されているサルモネラ（Salmonella）種又は大腸菌（Eschericia coli）O157、H7による感染よりも頻繁に発生している。カンピロバクター胃腸炎の実際の全国的疾患負荷は500−850感染/100,000人/年である。
カンピロバクターは細菌性胃腸炎の主要原因であるだけでなく、C.ジェジュニは神経病理学的疾患ギャン・バレー症候群（GBS）と密接に関係している。死亡の危険性を有するこの疾患は、ある種のC.ジェジュニ株のガングリオシド様構造に対する免疫応答の可能性がある（神経細胞に対する自己免疫応答をもたらす）。GBSはもっとも重大な慢性後遺症であるが、カンピロバクター感染はまた反応性関節炎と密接に関係する（前記関節炎はライター症候群へ進むことがある）。
カンピロバクターに対するワクチン接種は、死滅化全細胞又はタンパク質系ワクチンを用いて限定的な成功をおさめている。さらにまた、死滅化全細胞ワクチン接種に起因するギャン・バレー症候群又は他の後遺症の発症の懸念が存在する。優れたワクチンは、費用効率がよく安全で経口投与が有効であること、及び非常に短期間で大量に製造されることが必要であろう。現時点ではそのようなワクチンは存在しない。
【発明の概要】
【０００３】
カンピロバクター感染に対する耐性を強化するか、又はカンピロバクターに対する免疫応答を増強するベクター及び方法が本明細書で提供される。
ある特徴では、前記ベクターに元々は本来付随していない抗原性ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列を含むベクターが提供される。前記抗原性ポリペプチドは、配列番号：7（cjaD；cj0113；GVSITVEGNCDEWGTDEYNQA）、配列番号：8（cjaA；cj0982；KDIVLDAEIGGVAKGKDGKEK）、若しくは配列番号：9（ACE 393；cj0420；KVALGVAVPKDSNITSVEDLKDKTLLLNKGTTADA）、又は前記のフラグメントであり得る。前記ベクターはまた、前記ベクターに本来付随していない免疫刺激性ポリペプチドを含むことができる。前記ワクチンベクターは、ワクチン接種対象動物からカンピロバクターに対するIgA抗体応答を含む免疫応答を誘引することができる。前記応答は、カンピロバクターによるチャレンジに対して防御性であり得る。
別の特徴では、前記ベクターに元々は本来付随していない抗原性ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列及び免疫刺激性ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を含むベクターが提供される。前記抗原性ポリペプチドは、配列番号：1（cjaD）、配列番号：2（cjaA）又は配列番号：3（ACE393）のフラグメントであり得る。前記ワクチンベクターは、ワクチン接種対象動物からカンピロバクターに対するIgA抗体応答を含む免疫応答を誘引することができる。前記応答は、カンピロバクターによるチャレンジに対して防御性であり得る。
さらに別の特徴では、医薬的に許容できる担体中に本明細書で提供されるベクターを含む医薬組成物が開示される。
さらに別の特徴では、対象動物でカンピロバクターに対して免疫応答を増強する方法が提供される。前記方法は、本明細書で提供されるベクターの有効量を対象動物に投与する工程を含む。ある実施態様では、増強される免疫応答にはIgA抗体応答が含まれ、前記応答は防御性であり得る。
さらにまた別の特徴では、カンピロバクター感染に対する耐性を強化する方法が本明細書で提供される。前記方法は、その後のカンピロバクターへの曝露の後の感染に対して対象動物を耐性にできるように、本明細書で開示されるベクターの有効量を対象動物に投与する工程を含む。ある実施態様では、増強される免疫応答にはIgA抗体応答が含まれ、前記応答は防御性であり得る。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】定量的PCRの標準曲線を示すグラフであり、通常培養及びコロニー形成単位（CFU）の測定によって決定した培養可能カンピロバクター・ジェジュニの数がｘ軸に示されている。定量的PCRで蛍光が閾値を超えたサイクル数がｙ軸に示されている。
【図２】食塩水、又はカンピロバクターペプチドcj0420（配列番号：9）、cj0113（配列番号：7）若しくはcj0982（配列番号：8）を発現するサルモネラベクター（108 cfu/ニワトリ）でワクチン接種し、C.ジェジュニ（5ｘ107 cfu/mL）でチャレンジして11日後のニワトリの回腸内容物1g当たりのlog cfuを示すグラフである。定量的PCRは、回腸の粘膜基底層から通常的方法により抽出した全DNAで実施した。結果は平均±SEMで表されている（n=10）。異なる小文字を有するグループは有意に相違する（p＜0.05）。
【図３】食塩水、抗原性ペプチド挿入物を含まないサルモネラベクター、又はcj0113挿入物（配列番号：7）を含むサルモネラベクター（108 cfu/ニワトリ）でワクチン接種し、C.ジェジュニ（1ｘ107 cfu/mL）でチャレンジして11日後のニワトリの回腸内容物1g当たりのlog cfuを示すグラフである。定量的PCRは、回腸の粘膜基底層から通常的な方法により抽出した全DNAで実施した。結果は平均±SEMで表され（n=10）、*は有意な相違を示す（P＜0.05）。
【図４】表示のベクター（108 cfu/ニワトリ）の投与後21日及び32日にELISAによって測定した、抗カンピロバクターIgGの相対的レベル（S/P比）を示すグラフである。異なる小文字を有するグループは有意に相違する（p＜0.05）。
【図５】表示のベクター（108 cfu/ニワトリ）によるワクチン接種後32日の回腸粘膜における抗カンピロバクターsIgAの相対的レベル（S/P比）を示すグラフである。異なる小文字を有するグループは有意に相違する（p＜0.05）。
【図６】食塩水、挿入物を含まないサルモネラベクター、又は抗原性ポリペプチドcj0113（配列番号：7）を含むベクターによるワクチン（108 cfu/ニワトリ）接種後21日及び31日の血清IgGレベル（S/P比）、並びに32日の回腸粘膜におけるsIgAレベル（S/P比）を示すグラフである。*はコントロールとの有意な相違を示す（P＜0.05）。
【図７】枯草菌（Bacillus subtilis）骨格株（BSBB）又はcj0113（配列番号：7）枯草菌ベクターワクチン候補物を用いて経口胃管栄養によりワクチン接種（108 cfu/ニワトリ）して10日後のC.ジェジュニ特異的血清IgG抗体レベルを示すグラフである。データは平均±SEMで表され、*は両コントロールとの有意な相違を示す（P＜0.05）。
【図８】枯草菌骨格株（BSBB）又はcj0113（配列番号：7）枯草菌ベクターワクチン候補物を用いて経口胃管栄養によりワクチン接種して10日後のC.ジェジュニ特異的分泌性IgA抗体レベルを示すグラフである。粘膜は回腸領域で収集した。データは平均±SEMで表され、*は両コントロールとの有意な相違を示す（P＜0.05）。
【図９】定量的PCRにより示された、回腸内容物１グラム当たりのC.ジェジュニのlog10 CFUを示すグラフである。枯草菌骨格株（BSBB）又はcj0113（配列番号：7）を発現する枯草菌ベクターでワクチン接種したトリをC.ジェジュニ（108 cfu/ニワトリ）でチャレンジし、続いて10日後にPCRにより調べた。qPCRは、回腸の粘膜基底層から通常的方法により抽出した全DNAで実施した。結果は、回腸内容物1グラム当たりの平均log10CFU±SEMとして表され（n=10）、*はコントロールとの有意な相違を示す（P＜0.05）。
【図１０】定量的PCRにより示された、シチメンチョウの回腸内容物１グラム当たりのC.ジェジュニのlog10 CFUを示すグラフである。骨格株又はcj0113（配列番号：7）サルモネラベクターワクチンを用いてワクチン接種したシチメンチョウをC.コリ（108 cfu/ニワトリ）でチャレンジし、続いて12日後にPCRにより調べた。qPCRは、回腸の粘膜基底層から通常的方法により抽出した全DNAで実施した。結果は、回腸内容物1グラム当たりの平均log10CFU±SEMとして表され（n=10）、*はコントロールとの有意な相違を示す（P＜0.05）。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
カンピロバクターの複数の血清型亜型に対して粘膜免疫、液性免疫及び細胞媒介性免疫応答を誘引するワクチンベクターは、カンピロバクター胃腸炎を制限する有望なアプローチを提供する。本プロジェクトは、本来のものではない線状エピトープ（抗原性ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列を挿入することによって、ワクチンの開発で新規なアプローチを利用する。前記抗原性ポリペプチドは、免疫刺激性ポリペプチド（例えばCD154（CD40L）又はHMGB1（高可動性グループボックス1））と組み合わせて前記ベクターワクチンで用いることができる。適切には、前記抗原性ポリペプチド及び免疫刺激性ポリペプチドは、前記ベクターに元々は付随して見出されるポリペプチドではない。エピトープ又は抗原性ポリペプチド及び免疫刺激性ポリペプチドは組換えベクターの表面で発現され得る。ベクターは細菌、ウイルス又はリポソームベクターですら可能である。ベクターは生であっても、生及び弱毒であっても、投与前に死滅化されてもよい。外来エピトープを発現するサルモネラ又はバシルス構築物が高力価のエピトープ特異的抗体をin vivoで迅速に誘発できることを、相当な量の予備的データ（例えば実施例で示したもの）が示している。さらにまた、表面CD154又はHMGB1の同時発現は外来エピトープに対する抗体応答を効率的に増強した。
【０００６】
組換えDNA技術は、多くの細菌種及びウイルス種の比較的容易な操作を可能にする。いくつかの細菌及びウイルスは病原性が低いか又は病原性をもたないが、強い免疫応答を生じることができる。これらの細菌及びウイルスは、異種抗原、非天然抗原又は外来抗原に対して免疫応答を誘引するための有力なワクチンベクターとなる。細菌性又はウイルス性ワクチンベクターは天然の感染を模倣し、強い長期間持続する免疫を生じることができる。ワクチンベクターはしばしば製造及び投与が相対的に安価である。さらにまた、そのようなベクターはしばしば2つ以上の抗原を保持することができ、複数の感染因子に対して防御を提供することができる。
多数の病原性生物由来のポリペプチド抗原をコードするポリヌクレオチドをワクチンベクターに挿入して発現させ、抗原性ポリペプチドを生成することができる。抗原性ポリペプチドは、適応性を有する免疫系によって特異的に認識され得るポリペプチドである。抗原性ポリペプチドには免疫原性である任意のポリペプチドが含まれる。本抗原性ポリペプチドには、病原体関連、アレルゲン関連、腫瘍関連又は疾患関連抗原が含まれるが、ただしこれらに限定されない。病原体にはウイルス性、寄生虫性、真菌性及び細菌性病原体が、タンパク質病原体（例えばプリオン）と同様に含まれる。
【０００７】
抗原性ポリペプチドは完全長タンパク質でもその一部分でもよい。多くのタンパク質の免疫系による認識は比較的少数のアミノ酸（しばしばエピトープと称される）に依拠するということに議論の余地はない。エピトープはほんの8−10アミノ酸でもよい。したがって、本明細書に記載する抗原性ポリペプチドは、完全長タンパク質、8アミノ酸長エピトープ、又はこれら両極端の間の任意の部分であり得る。実際のところ、抗原性ポリペプチドは単一病原体又はタンパク質に由来する2つ以上のエピトープを含むことができる。適切には、抗原性ポリペプチドは、ベクターに本来は付随していないポリペプチドである。本来は付随していないものには、ベクターに天然にも存在し得るが組換えによりエピトープとして発現されるか、融合タンパク質として別個のタンパク質と結合して発現され、天然に発現されるポリペプチドと比較して弁別的提示及び免疫応答の弁別的増強を可能にする抗原性ポリペプチドが含まれる。
同一エピトープの複数のコピー又は別個のタンパク質に由来する複数のエピトープをワクチンベクターに挿入することができる。同一又は別個の病原体又は疾患に由来するいくつかのエピトープ又は抗原を単一ワクチンベクターに一緒に挿入して、複数の抗原に対して増強された免疫応答を発生させることも想定されている。組換えワクチンベクターは、複数の病原性微生物、ウイルス又は腫瘍関連抗原に由来する抗原をコードすることができる。複数の抗原を発現できるワクチンベクターの投与は、2つ以上の疾患に対する免疫を同時に誘発するという利点を有する。
【０００８】
ポリヌクレオチドは、ワクチンベクターの染色体に挿入されるか、またはプラスミド又は他の染色体外DNAでコードされてもよい。エピトープをコードするポリヌクレオチドは独立して発現させてもよいが（すなわち、当該ベクターで機能するプロモーターに作動できるように連結される）、ベクターで発現されるワクチンベクターポリヌクレオチド（すなわち本来のポリヌクレオチド又は本来のものではないポリヌクレオチド）に挿入してもよい。適切には、ワクチンベクターポリヌクレオチドは、ワクチンベクターの表面で発現されるポリペプチド（例えばトランスメンブレンタンパク質）をコードする。抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはワクチンベクターポリヌクレオチド配列にインフレームで挿入され、ベクターの表面での抗原性ポリペプチドの発現を可能にする。例えば、抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ベクターポリヌクレオチド配列がインフレームを維持できるように、トランスメンブレンタンパク質の外側ループ領域をコードする領域で細菌のポリヌクレオチドにインフレームで挿入される。下記実施例を参照されたい（前記実施例では、抗原性ポリペプチドはサルモネラ・エンテリチディス（Salmonella enteritidis）ベクターのlamB遺伝子の外側ループに挿入される）。
或いは、抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは分泌ポリペプチドに挿入できる。抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは極めて多様なワクチンベクターポリヌクレオチドに挿入され、抗原性ポリペプチドの発現及びワクチンベクター処置対象動物の免疫細胞への提示を提供できることは当業者には理解されるであろう。実施例では、いくつかのカンピロバクターポリヌクレオチドがサルモネラ・エンテリチディスのlamBコード配列に挿入された。得られた組換え細菌は、挿入された抗原性ポリペプチドを細菌の表面で発現させる。ポリヌクレオチドは、組換え細菌が挿入された抗原性ポリペプチドを芽胞中で発現できるように枯草菌のCotBに挿入されるか、又は栄養細菌での表面発現のためにslpに挿入される。
【０００９】
ベクターは、完全長のカンピロバクタータンパク質（cjaD（配列番号：1）、cjaA（配列番号：2）及びACE393（配列番号：3）を含む）又はこれらタンパク質の抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。実施例では、完全長タンパク質由来の抗原性ポリペプチドが以下のように用いられた：配列番号：7（cjaDポリペプチド（cj0113と称される））；配列番号：8（cjaAポリペプチド（cj0982と称される））；及び配列番号：9（ACE 393ポリペプチド（cj0420と称される））。実施例で用いられたポリヌクレオチドはそれぞれ配列番号：4−6として提供される。実施例で用いられたポリヌクレオチドは、セリンリンカーで分離された配列番号：7−9の抗原性ペプチドを有し、さらにCD154アミノ酸140−149に連結されていた（抗原性ポリペプチドと免疫刺激性ポリペプチドの前、後及びそれらの間に3アミノ酸）。
【００１０】
適切には、ワクチンベクターに挿入される抗原性ポリペプチドの部分は免疫原性又は抗原性である。免疫原性フラグメントは、細胞性又は液性免疫応答を誘引することができるペプチド又はポリペプチドである。適切には抗原性ポリペプチドは完全長タンパク質であるか、または、適切には完全長配列の20以上のアミノ酸、15以上のアミノ酸、10以上のアミノ酸又は8以上のアミノ酸であり得る。適切には、標的病原体に対して生じる免疫応答は防御性免疫応答である。防御性免疫応答は、標的病原体（すなわちカンピロバクター）のその後で発生する感染による有病率又は死亡率を阻止または低下させることができる応答である。
これらのポリヌクレオチド配列のいずれも他の任意の抗原性ポリペプチド（他の異種病原体又は生物由来のポリペプチドを含む）と一緒に用いることができ、さらにまた免疫刺激性ポリペプチド、例えばCD154又はHMGB1のポリペプチド（例えば国際出願PCT/US07/078785及びPCT/US2011/022062（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）に記載されたもの）をコードするポリヌクレオチドと一緒に用いることができることは、当業者には理解されるであろう。
【００１１】
対象動物のタンパク質と同種であり、さらに外来エピトープに応答するように免疫系を刺激できる免疫刺激性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまたベクターに挿入することができる。下記でさらに詳細に述べるように、ベクターはCD154ポリペプチドを含むことができ、前記CD154ポリペプチドは対象動物中のCD40と結合し、ベクター及びベクターに付随する外来抗原性ポリペプチドに応答するように対象動物を刺激することができる。さらにまた、ベクターはHMGB1ポリペプチド又はその機能的フラグメントを含むことができる。抗原性ポリペプチドに関連して上記に記載したように、これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはベクターの染色体に挿入するか、または染色体外で維持することができる。ベクターの種々の部分で発現させるために、又はポリペプチドを分泌させるために、多様なベクターポリヌクレオチドにこれらポリヌクレオチドを挿入できることは当業者には理解されるであろう。
【００１２】
抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を増強することができる免疫刺激性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、抗原性ポリペプチドをコードすることができる。免疫刺激性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ワクチンベクターで免疫刺激性ポリペプチド及び外来抗原性ポリペプチドが同じポリヌクレオチドに存在するように、抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに連結することができる。例えば、抗原性ポリペプチド及び免疫刺激性ポリペプチドは融合タンパク質の部分であり得る。実施例では、CD40と結合できるCD154のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、カンピロバクターのcjaD、cjaA又はACE393由来の抗原性ポリペプチドをコードする。あり得るポリペプチド配列のいくつかの例については添付の配列表の配列番号：10−12、並びに、抗原性ポリペプチド、免疫刺激性ポリペプチド及び宿主ポリペプチドの間でオプションのセリンリンカーをコードするポリヌクレオチド配列については配列番号：4−6を参照されたい。
実施例では、カンピロバクター抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び免疫刺激性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、両方ともトランスメンブレンlamB遺伝子の外側ループに挿入される。他のトランスメンブレンタンパク質をコードするベクターポリヌクレオチドもまた用いることができることは当業者には理解されるであろう。さらにまた、抗原性ポリヌクレオチドは染色体外性であってもベクターによって分泌されてもよい。実施例では、カンピロバクターcj0113抗原（配列番号：7）及び免疫刺激性ペプチドHMGB1（配列番号：20）をコードするポリヌクレオチドはバシルスベクターによって保持されるプラスミドから発現され、前記の細胞表面で発現される。
【００１３】
適切には、CD154ポリペプチドは長さが50アミノ酸より短く、より適切には長さが40アミノ酸より短く、30アミノ酸より短く、又は20アミノ酸より短い。前記ポリペプチドは、長さが10から15アミノ酸、10から20アミノ酸、又は10から25アミノ酸であり得る。CD154配列及びCD40結合領域は多様な種で高度に保存されてはいない。ニワトリおよびヒトのCD154配列は配列番号：13及び14にそれぞれ提供されている。
CD154のCD40結合領域は多数の種（ヒト、ニワトリ、アヒル、マウス及びウシを含む）について決定されており、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18及び配列番号：19にそれぞれ示されている。種の間でCD40結合領域における配列の変動性が存在し、CD154とCD40との種を超えた結合が報告されている。例えば、ヒトCD154ポリペプチドはニワトリで免疫応答を増強することができた。したがって、種特異的CD154ポリペプチド又は異種CD154ポリペプチドを用いて本発明を実施することができる。
【００１４】
HMGB1（高移動性グループボックス1）タンパク質は、最初DNA構造及び安定性に極めて重要なDNA結合タンパク質として同定された。HMGB1は、配列特異性を示さずにDNAと結合する普遍的に発現される核タンパク質である。このタンパク質は高度に保存され、植物から哺乳動物で見出される。ゼブラフィッシュ、ニワトリ及びヒトHMGB1のアミノ酸配列は配列番号：28、配列番号：20及び配列番号：27にそれぞれ提供されている。哺乳動物全体を通して前記配列は98％アミノ酸同一性を有し高度に保存され、そのアミノ酸変化は保存的である。したがって1つの種に由来するHMGB1タンパク質は、別の種のHMGB1の代わりに機能的に同様に代用され得る。完全長のHMGB1タンパク質又はその部分を、本明細書に記載のワクチンベクターのHMGB1ポリペプチドとして用いることができる。HMGB1は2つのDNA結合領域を有し、これらの領域は、配列番号：21及び22に示されるAボックス並びに配列番号：23及び24に示されるBボックスと称される。以下を参照されたい：Andersson and Tracey, Annu. Rev. Immunol. 2011, 29:139-162（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
【００１５】
HMGB1は炎症の媒介物質であり、核損傷（例えば壊死細胞に由来する）のシグナルとしての機能を果たす。HMGB1はまた、タンパク質のアセチル化、核内転移及び分泌を必要とするプロセスで単球/マクロファージ系列の細胞によって活発に分泌され得る。細胞外HMGB1は、高度糖化最終生成物（RAGE）のレセプターを介するシグナリング及びToll様受容体ファミリー（TLR）のメンバー（特にTLR4）を介するシグナリングによって強力な炎症媒介物質として機能する。RAGE結合活性が同定されており、配列番号：25のポリペプチドを必要とする。TLR4結合には配列番号：20の106位にシステインが必要であり、これはHMGB1のBボックス領域で見出されている。
HMGB1の炎症性活性は完全長タンパク質を必要とせず、機能的フラグメントが同定されている。BボックスがHMGB1の前炎症性作用の媒介に十分であることが示され、したがって本発明の関係では配列番号：23及び24がHMGB1ポリペプチド又はその機能的フラグメントである。さらにまた、RAGE結合部位及び前炎症性サイトカイン活性は配列番号：25及び配列番号：26でそれぞれマッピングされている。したがって、これらのポリペプチドは本発明の関係ではHMGB1ポリペプチドの機能的フラグメントである。
【００１６】
当業者は、例えば国際特許出願公開公報WO02092004（参照によりその全体が本明細書に含まれる）に記載されている方法を用いて、前炎症性サイトカイン活性を刺激することができるHMGB1ポリペプチド及びそのフラグメントを同定することができる。適切には、HMGB1ポリペプチドは、配列番号：20のアミノ酸150−183位にRAGE結合ドメイン（配列番号：25又はそのホモローグ）を含み、配列番号：20のアミノ酸89−109位に前炎症性サイトカイン活性ドメイン（配列番号：26又はそのホモローグ）を含む。特に、HMGB1ポリペプチド及びその機能的フラグメント又はホモローグには、配列番号：20−28のHMGB1ポリペプチドと同一、又は少なくとも99％同一、少なくとも98％同一、少なくとも95％同一、少なくとも90％同一、少なくとも85％同一若しくは少なくとも80％同一のポリペプチドが含まれる。
HMGB1ポリペプチドを用いてベクターに存在する2つ以上の抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を増強できることは当業者には理解されるであろう。HMGB1由来のポリペプチドは樹状細胞及びマクロファージを活性化し、したがってIL-1、IL-6、IFN-γ及びTNF-αの産生を刺激することによって少なくとも部分的に免疫応答を刺激する。適切には、HMGB1はベクターの表面で発現され得る。
【００１７】
抗原性ポリペプチドの少なくとも一部分及びHMGB1ポリペプチド又は別の免疫刺激性ポリペプチドの少なくとも一部分がワクチンベクターの表面に存在し得る。ワクチンベクターの表面に存在するということには、ポリペプチドがトランスメンブレンタンパク質内に含まれていること、トランスメンブレンタンパク質、膜脂質又は膜結合炭水化物と相互作用しているか、それらと共有結合により若しくは化学的に架橋されていることが含まれる。ポリペプチドは、ペプチド結合を介して、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸をトランスメンブレンタンパク質のN-末端、C-末端又はトランスメンブレンタンパク質内の任意の場所に結合させることによってトランスメンブレンタンパク質内に含まれ得る（すなわちトランスメンブレンタンパク質の2つのアミノ酸の間に挿入されるか、又はトランスメンブレンタンパク質の1つ以上のアミノ酸の代わりに挿入される（すなわち欠失挿入））。適切には、ポリペプチドはトランスメンブレンタンパク質の外側ループに挿入できる。適切なトランスメンブレンタンパク質はcotB及びlamBであるが、当業者は多くの適切なトランスメンブレンタンパク質が利用可能であることを理解していよう。
或いは、ポリペプチドは、当業者が利用できる方法にしたがって、膜内のタンパク質、脂質若しくは炭水化物、又はキャプシド（ウイルスベクターが用いられる場合）と共有結合により又は化学的に結合させることができる。例えば、ジスルフィド結合又はビオチン‐アビジン架橋を用いて、抗原性ポリペプチド及びHMGB1ポリペプチドをワクチンベクターの表面に提示することができよう。適切には、抗原性ポリペプチド及びHMGB1ポリペプチドは融合タンパク質の部分である。2つのポリペプチドはペプチド結合を介して直に結合させてもよいが、リンカーによって又は2つのポリペプチドが挿入される第三のタンパク質の断片によって2つのポリペプチドが分離されてあってもよい。
【００１８】
実施例では、ベクターのいくつかは、カンピロバクターの抗原性ポリペプチド（cj0113、cj0420及びcj0982）及び免疫刺激性ポリペプチド（CD154アミノ酸140−149又はHMGB1又はその機能的フラグメント）を有し、それらポリペプチドは、互いに及び前記ポリペプチドが挿入されるサルモネラポリヌクレオチドとインフレームであるように同じポリヌクレオチド（lamB）上にコードされる。いくつかの実施態様では、発現されたポリペプチドがいくつかのアミノ酸により2つのポリペプチドに分離されるように、抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と免疫刺激性ポリペプチドをコードする配列の間にリンカーを付加してもよい。このリンカーは1つのアミノ酸をコードする3ヌクレオチドであっても、もっと長くてもよい（例えば10以上のアミノ酸をコードする30ヌクレオチド）。実施例では、9ヌクレオチドリンカーを用い、3つのセリン残基がコードされた。当業者は、用い得る多くの他のタイプのリンカーを容易に想定できるであろう。
さらにまた、ポリヌクレオチドはただ１つのコピー又は複数のコピーとして存在できる。例えば、3コピーの抗原性ポリペプチド及び3コピーの免疫刺激性ポリペプチドがトランスメンブレンタンパク質の同じ外側ループで見出し得るか、またはいくつかの異なるベクタータンパク質内で発現され得る。また別の実施態様では、免疫刺激性ポリペプチド及び抗原性ポリペプチドは別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００１９】
本方法で用いられる可能なワクチンベクターにはバシルス、サルモネラ（サルモネラ・エンテリチディス）、シゲラ（Shigella）、エシェリキア（大腸菌）、エルジニア（Yersinia）、ボルデテラ（Bordetella）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ラクトバシルス、ストレプトコッカス（Streptococcus）、ビブリオ（Vibrio）（コレラ菌（Vibrio cholerae））、リステリア（Listeria）、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス及びアデノ関連ウイルスが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切にはワクチンベクターはGRAS生物である。ワクチンベクターは、複製できないように不活化又は死滅化させることができる。細菌性又はウイルス性ワクチンベクターを不活化または死滅化する方法は当業者には周知であり、例えばホルマリン不活化、抗生物質による不活化、熱処理及びエタノール処理のような方法が含まれるが、ただしこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、ワクチンベクターはリポソーム系ベクターであり得る。
ベクター及び医薬的に許容できる担体を含む組成物もまた提供される。医薬的に許容できる担体はin vivo投与に適切な任意の担体である。医薬的に許容できる担体には水、緩衝溶液、グルコース溶液又は細菌培養液が含まれ得る。前記組成物に追加される成分には、適切には賦形剤、例えば安定化剤、保存料、希釈剤、乳化剤及び滑沢剤が含まれ得る。医薬的に許容できる担体又は希釈剤の例には、安定化剤、例えば炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、デンプン、シュクロース、グルコース、デキストラン）、タンパク質（例えばアルブミン又はカゼイン）、タンパク質含有物質（例えばウシ血清又は脱脂乳）及び緩衝液（例えばリン酸緩衝液）が含まれる。特にそのような安定化剤が組成物に添加されるときには、組成物は凍結乾燥又は噴霧乾燥に適している。
【００２０】
本明細書に記載したベクターを投与することによって対象動物でカンピロバクターに対する免疫応答を増強する方法もまた提供される。ベクターは、ベクターに対する免疫応答を刺激することができるHMGB1ポリペプチド又はCD154ポリペプチド及び上記に記載の抗原性ポリペプチドを含むことができる。ベクターは、生来のものではない抗原性ポリペプチドに対する対象動物の免疫応答を増強するために有効な量で対象動物に投与される。適切には、カンピロバクターによるチャレンジに対する免疫応答が増強される。
免疫応答の増強には抗体応答の増強が含まれるが、ただし前記に限定されない。適切にはベクターの投与後にコントロールと比較してIgA応答が増強され、より適切には分泌性IgA応答が増強される。コントロールは、ベクターの投与前の同一対象動物、ベクターのみ又は無関係若しくは非カンピロバクター性抗原性ポリペプチドを発現するベクターを投与した比較可能な対象動物であり得る。抗体応答、コントロール対象動物の応答と比較して、適切にはIgA応答が、2倍、3倍、4倍、5倍又はそれ以上増加し得る。免疫の増強はまた、本明細書に記載のベクターの投与後のカンピロバクターの増殖又は複製能力及びコロニー形成能力の低下をもたらし得る。そのような低下は、ベクター投与対象動物をカンピロバクター感染でチャレンジし、当該細菌のコロニー形成および複製能力（すなわち感染能力）をモニターすることによって試験できる。対象動物におけるカンピロバクターの増殖は1log、2log、3log、4log、5log、又はそれ以上すら低下させ得る。ベクター投与対象動物におけるカンピロバクターの増殖は検出レベル以下であり得る。
【００２１】
さらにまた、カンピロバクター感染に対する耐性を強化する方法も開示される。簡単に記せば、前記方法は、カンピロバクターの抗原性ポリペプチドを含む上記に記載のベクターを対象動物に免疫応答を誘引するために有効な量で投与する工程を含む。カンピロバクター感染に対する耐性の強化には、カンピロバクター感染の発生率の低下、１宿主から別の宿主へのカンピロバクター感染の拡散の制限、対象動物でのカンピロバクター複製の低下、単一宿主内での侵入および拡散の低下、カンピロバクター感染に関連する有病率の低下、及びカンピロバクター感染の期間の短縮が含まれる。
ベクターの投与は、対象動物におけるカンピロバクター感染又は疾患によるいずれの身体的徴候（例えば胃腸炎又はGBS）の出現も予防し得る。カンピロバクターに対する耐性の増加にはまた抗体産生（適切にはIgA産生）の増加が含まれ得る。抗体応答（適切にはIgA応答）は、コントロール対象動物の応答と比較して、2倍、3倍、4倍、5倍又はそれ以上増加し得る。免疫応答の増強はまた、本明細書に記載のベクターの投与後のカンピロバクターの増殖又は複製能力及びコロニー形成能力の低下をもたらし得る。そのような低下は、ベクター投与対象動物をカンピロバクター感染でチャレンジし、当該細菌のコロニー形成および複製能力（すなわち感染能力）をコントロール対象動物と比較してモニターすることによって試験できる。対象動物におけるカンピロバクターの増殖は1log、2log、3log、4log、5log、又はそれ以上すら低下させ得る。ベクター投与対象動物におけるカンピロバクターの増殖は検出レベル以下であり得る。
【００２２】
本明細書に記載の全ての方法で使用される抗原性ポリペプチドは、上記で考察したcjaD、cjaA又はACE 393に由来し得る。抗原性ポリペプチドのベクターへの挿入は、当業者に公知の多様な方法で達成できる。前記方法には、国際特許出願公開公報WO2008/036675（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）に記載されている無痕跡（scarless）位置特異的変異導入系が含まれるが、ただし前記に限定されない。ベクターは、上記考察の免疫応答増強能力を有するポリヌクレオチドと一緒にカンピロバクターの抗原性ポリペプチドを発現するように操作された細菌であり得る。特にCD154又はHMBG1のポリペプチドが、抗原性ポリペプチドに対する対象動物の免疫応答を増強するためにベクターによって発現され得る。これらの方法で用いられるベクターは、投与前又は当該方法での使用前に弱毒化する又は死滅させることができる。
投与されるべき有用な用量は、対象動物の年齢、体重及び種、投与の態様及びルート、並びに免疫応答が希求される病原体のタイプに応じて変動するであろう。組成物は、免疫応答を惹起させるために十分な任意のベクター用量で投与できる。細菌ベクターについては、103から1010細菌、104から109細菌、105から107細菌の範囲の用量が適切であると考えられる。組成物はただ1回投与してもよいし、2回以上投与して免疫応答を高めてもよい。例えば、組成物は、1週間、2週間又は3週間以上離して2回以上投与してもよい。細菌ベクターは、適切には投与前には生命活性を有するが、いくつかの実施態様では細菌ベクターは投与前に死滅させることができる。いくつかの実施態様では、細菌ベクターは対象動物で複製できるが、一方、他の実施態様では、細菌ベクターは弱毒化されるか及び／又は対象動物で複製することができない。
【００２３】
動物またはヒトへの投与については、組成物は多様な手段で投与できる。前記手段には鼻内、粘膜、噴霧、皮内、非経口、皮下、経口、エーロゾル又は筋肉内投与が含まれるが、ただし前記に限定されない。点眼投与又は飲料水若しくは食物への添加はさらに別の適切な投与手段である。ニワトリについては、組成物はin ovoで投与できる。
本方法に関して、対象動物には脊椎動物、適切には哺乳動物（適切にはヒト）、又は鳥類（適切には家禽、例えばニワトリ又はシチメンチョウ）が含まれるが、ただし前記に限定されない。他の感染動物モデルもまた用いることができる。免疫応答の増強には、対象動物の免疫系によって媒介される治療的または予防的効果の誘導が含まれるが、ただし前記に限定されない。例えば、対象動物でその後に起きるカンピロバクターによる感染が予防されるならば、免疫応答は増強されている。具体的には、免疫応答の増強には、抗体産生の増強（例えば図4−8に明示）、抗体重鎖のクラス切り替えの増強、抗体提示細胞の成熟、ヘルパーT細胞の刺激、細胞溶解性T細胞の刺激、又はT及びB細胞メモリーの誘発が含まれ得る。実施例では、分泌性IgAの量の増加がベクター投与後に観察され、その後に起きるカンピロバクター感染の防御と相関性を示した。
【００２４】
同じ又は異なる病原体に由来するいくつかのエピトープ又は抗原を1つのベクターに一緒にして投与し、複数の抗原及びそれらと関連する病原体に対する増強された免疫応答を発生させることができると考えられる。組換えワクチンベクターは、複数の病原性微生物、ウイルス又は腫瘍関連抗原に由来する抗原をコードすることができる。複数の抗原を発現できるワクチンベクターの投与は、2つ以上の疾患に対して同時に免疫を誘導するという利点を有する。
複数の抗原をコードする異種ポリヌクレオチドをワクチンベクターの任意の非必須部位に挿入するか、或いは前記を当分野で周知の方法を用いてプラスミドで保持させることができる。ポリヌクレオチドの挿入に適切な1つの部位は、トランスメンブレンタンパク質の外側部分内に存在するか、又は分泌経路のために前記異種ポリヌクレオチドを標的とする配列と対を形成する。ポリヌクレオチドの挿入に適切なトランスメンブレンタンパク質の一例はサルモネラのlamB遺伝子である。異種ポリヌクレオチドには、ワクチンベクター以外の病原性微生物又はウイルスから選択される抗原をコードするポリヌクレオチド（すなわちワクチンベクター本来のものではないポリペプチドをコードするベクター本来のものではないポリヌクレオチド）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
以下の実施例は単に例示を意図し、本発明又は添付の請求の範囲の制限を意図するものではない。本明細書に引用した全ての参考文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
【実施例】
【００２５】
サルモネラワクチン候補株の弱毒化
サルモネラ・エンテリチディスファージ型13A（S. enteritidis）を、以前に記載されたようにS.エンテリチディスゲノムのaroA及び／又はhtrA遺伝子に規定の不可逆的欠失変異を導入することによって弱毒化した（ATCC寄託番号PTA-7871、PTA-7872及びPTA-7873として入手できる）。簡単に記せば、S.エンテリチディスの細菌ゲノム中の標的遺伝子配列をカナマイシン耐性（KmR）遺伝子配列で置き換えた。これは、3S-PCR及び3S-PCR生成物のエレクトロコンピテントなpKD46含有サルモネラ細胞へのエレクトロポレーションにより実施した。得られた細胞混合物をKm補充LB寒天培地にプレートして、KmR遺伝子を含む陽性クローンを選別した。KmR遺伝子は、問題の遺伝子（aroA又はhtrA）を含むゲノム領域に、前記問題の遺伝子に相同な配列をKmR遺伝子にフランキングさせることによって挿入した。KmR変異体が得られたら、欠失変異はPCR及びDNAシークェンシングによって確認した。エピトープ挿入を開始する前に全てのKmR遺伝子を除去した。
組換えワクチン候補の構築
抗原性ポリペプチドの3つの可能な候補を選択した：Omp18/cjaD（cj0113）、cjaA（cj0982）及びACE393（cj0420）。選択したポリペプチドは以下の通り：cj0113 （GVSITVEGNCDEWGTDEYNQAWMTTSYAPTS；配列番号：10）、cj0982c（KDIVLDAEIGGVAKGKDGKEKWMTTSYAPTS；配列番号：11）及びcj0420（KVALGVAVPKDSNITSVEDLKDKTLLLNKGTTADAWMTTSYAPTS；配列番号：12）（全ての挿入物はさらに別にCD154のアミノ酸140−149の配列を含んでいる）。
安定的に組み込まれたcj0113-CD154（cj0113）、cj0420-CD154（cj0420）又はcj0982c-CD154（cj0982）のコピーを含む組換えS.エンテリチディスを、Coxらの方法（Cox et al. Scarless and site-directed mutagenesis in Salmonella enteritidis chromosome. BMC Biotechnol 2007;7:59）を用いて構築した。簡単に記せば、KmR遺伝子と一緒にI-SceI酵素部位をlamB遺伝子のループ9に導入した。前記導入は、ループ9の上流域及び下流域に相同なPCR生成物（I-SceI酵素部位及び各側に約200−300塩基対のDNAがフランキングしたKmR遺伝子を有していた）を設計することによって達成した。使用したプライマーは下記の表Iに示す。前記PCR生成物をエレクトロコンピテントなpKD46プラスミド含有弱毒化サルモネラ細胞にエレクトロポレーションによって導入し、得られた細胞混合物をKm補充LB寒天プレートにプレートして、KmR遺伝子を含む陽性クローンを選別した。Sce-I/Km変異をループ9に導入した後、この領域をコドン最適化外来エピトープDNA配列に置き換えた（Burns DM, Beacham IR. Rare codons in E. coli and S. typhimurium signal sequences. FEBS Lett 1985;189(2):318-24）。この第二の3S-PCR反応は、ループ9の上流及び下流域にフランキングされた外来エピトープ挿入物を生成し、得られたPCR生成物を上記記載のSce-I/Km変異を含むエレクトロコンピテントなSE13Aにエレクトロポレーションによって導入した。プラスミドpBC-I-SceIもまた前記挿入物と一緒に前記細胞にエレクトロポレーションによって導入した。なぜならば、前記プラスミドは、LamB遺伝子のループ9領域（ここで外来エピトープ配列がSE13Aゲノムに挿入された）のI-SceI酵素部位でギャップを生じる配列を認識しこれを切断するI-SceI酵素を生成するからである。前記プラスミドはまた一緒にクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子（CmR）をKmR遺伝子の代替となる挿入物として保持する（前記変異は以前のI-Sce/Km変異に対する対抗選別のために新規な選別マーカーを有する必要がある）。エレクトロポレーション後に、陽性変異体の選別のために25μg/mLのCmを含むLB寒天培地に細胞をプレートした。
【００２６】
表I：PCRプライマー
2013537401.tif 000002
2013537401.tif 000003
【００２７】
いったん陽性変異/挿入が推測されたら、PCR及びDNAシークェンシングを実施して挿入配列の存在および正確さを確認した。
カンピロバクター・ジェジュニによるチャレンジ
以前に記載されたように、ブロイラー鶏由来のC.ジェジュニの3つの野生型単離株をlog増殖期まで個々に増殖させて混合し、連続希釈して通常的な培養計数のためにプレートに広げた（Cole et al. Effect of aeration and storage temperature on Campylobacter concentrations in poultry semen. Poult Sci 2004;83:1734-8）。
分光光度計による濃度及び以前に作成した標準曲線との比較を用いて、前記培養を経口胃管栄養によるチャレンジ用に約107から108 cfu/mLに希釈した。経験的に決定した投与cfuはチャレンジを含む各実験について報告する（下記参照）。
【００２８】
ワクチン接種実験1
第1の免疫実験では、孵化210日目のブロイラーの雛を地元の孵化業者から入手し、以下のように4つの処置グループの1つにランダムに割り当てた：食塩水のみ（陰性コントロール）、3つのワクチン候補グループ：cj0113、cj0420又はcj0982；ｎ＝50/囲い。
各処置グループを床に新しい松材敷きわらを施した個々の囲いに収容し、水及び飼料は常時供給した。孵化日に各処置グループの全雛に適切に処置した約108 cfu/mLを含む溶液（0.25ｍＬ）を経口胃管栄養により接種した。孵化後21日目に、各処置グループの全てのトリを経口胃管栄養により107 cfu/mL を含むC.ジェジュニの溶液（0.25mL）でチャレンジした。孵化後3、11、21（ブースター接種前）及び32日目に、各処置グループから10−15羽のトリを安楽死させ、サルモネラワクチンベクター株の器官侵襲、コロニー形成及びクリアランスの決定のためにそれらの肝臓、脾臓及び盲腸扁桃を無菌的に取り出した。さらにまた、孵化後21日及び32日目に回腸の切片を取り出してqRT-PCRでの使用のために処理し、さらに32日目に別の回腸サンプルを取り出し、食塩水中で1：5に希釈し、分泌性免疫グロブリンA（sIgA）の試験に使用した。さらにまた、各処置グループにつき10羽のトリから血液サンプルを収集し、ワクチン接種後21日目及び32日目の抗体応答の測定に使用した。
ワクチン接種実験2
実験2では、孵化110日目のブロイラーの雛を地元の孵化業者から入手し、以下のように2つの処置グループの1つにランダムに割り当てた：食塩水のみ（ビヒクルコントロール）又はサルモネラワクチン候補、cj0113、ｎ＝55/囲い。各処置グループを床に新しい松材敷きわらを施した個々の囲いに収容し、水及び飼料は常時供給した。孵化日に各処置グループの全雛に適切に処置した約108 cfu/mLを含む溶液（0.25ｍＬ）を経口胃管栄養により接種した。孵化後21日目に、各処置グループの全てのトリを経口胃管栄養により107 cfu/mL を含むC.ジェジュニの溶液（0.25mL）でチャレンジした。孵化後3、11、21（ブースター接種前）及び32日目に、各処置グループから10−15羽のトリを安楽死させ、サルモネラワクチンベクター株の器官侵襲、コロニー形成及びクリアランスの決定のためにそれらの肝臓、脾臓及び盲腸扁桃を無菌的に取り出した。さらにまた、孵化後21日及び32日目に回腸の切片を取り出してqRT-PCRでの使用のために処理した。さらに、各処置グループにつき10羽のトリから血液サンプルを収集し、ワクチン接種後21日目及び32日目の抗体応答の測定に使用した。
ワクチン接種実験3
第三の実験はワクチン接種実験2（上記に記載）と同様であったが、ただし、ベクター自体の経口接種のコントロールとしてカンピロバクターエピトープ（SE13A）を含まないS.エンテリチディス13A aroA/htrAの第三のグループを加えた。全てのサンプルの収集はワクチン接種実験2と同じであったが、ただし孵化後32日目にさらに別の回腸切片を用いて、実験1のようにsIgAのための粘膜層を採集した。
【００２９】
カンピロバクター抗体応答の測定
両免疫実験でトリから収集した血清をELISAで使用し相対的な抗体応答を測定した。簡単に記せば、96ウェルプレートの個々のウェルをC.ジェジュニで被覆した。抗原付着は4℃で一晩進行させ、続いてこのプレートを洗浄し、スーパーブロック（Superblock, Pierce）で室温にて1時間ブロックした。続いて以前に収集した血清の1：50希釈とともに前記プレートを2時間インキュベートした。再びプレートを洗浄し、続いてペルオキシダーゼ標識抗ニワトリIgG二次抗体（Jackson Immunolaboratories）を用いさらに1時間インキュベートした。続いて洗浄した後で、前記プレートをペルオキシダーゼ基質キット（BD OptEIA, Fisher Scienfic）を用いて反応させ、吸収を450nmにて分光光度計で読み取った。各プレートは陽性コントロール及び陰性コントロールを含み、この場合それぞれワクチン接種雛及び免疫前のニワトリの血清に由来するプール血清で処置グループの血清を置き換えた。陽性コントロール、陰性コントロール及び実験サンプルについて得られた吸収を用い、以下の計算によりサンプル対陽性コントロール比（S/P比）を算出した：（サンプル平均−陰性コントロール平均）／（陽性コントロール平均−陰性コントロール平均）（Brown et al. Detection of antibodies to Mycoplasma gallisepticum in egg yolk versus serum samples. J Clin Microbiol 1991;29(12):2901-3 and Davies et al. Evaluation of the use of pooled serum, pooled muscle tissue fluid (meat juice) and pooled faeces for monitoring pig herds for Salmonella. J Appl Microbiol 2003;95(5):1016-25）。sIgAの検出に用いたELISAの方法は、上記記載の血清免疫グロブリンのアッセイと同様であったが、ただし我々は、抗ニワトリIgG抗体結合物の代わりにセイヨウワサビペルオキシダーゼ（GenTex）を結合させたヤギ抗ニワトリIgAを用いた。
C.ジェジュニに関するDNA単離及び定量的PCR
回腸サンプルの全DNA抽出はQIAmp DNAスツールミニキット（QIAmp DNA Stool Mini Kit, Qiagen）を用いて達成した。製造業者が提供したプロトコルを以下のようにわずかに改変した：粘膜層を含むように回腸の内容物を取り出し、氷冷PBS＋0.05％Tween20で1：5（w/v）に希釈し、前記スラリーの1mLを2.0mLのマイクロ遠心管に入れた1mLのASL緩衝液に加え渦流ミキサーで処理し、さらに70℃で5分間加熱した。その後、最終工程まで製造業者の推奨にしたがいDNAを50μLの最終体積に溶出させた。
C.ジェジュニの定量的測定は、以前に公表された方法をわずかに改変して使用し達成した（Skanseng et al. Comparison of chicken gut colonisation by the pathogens Campylobacter jejuni and Clostridium perfringens by real-time quantitative PCR. Mol Cell Probes 2006;20(5):269-79）。アッセイは、MX3005P（Agilent Technology）及びブリリアントII QPCRマスターミックス（Agilent Technologies）で使用するために最適化し、他の全ての混合物成分、プライマー、プローブ及びサイクリング条件は公表のとおりであった。
標準曲線（図1）は、10倍連続希釈し回腸内容物の定常的バックグラウンドに添加したC.ジェジュニの純粋培養を用いて作成した。全DNAの単離は以前に記載されたように実施した。
統計解析
データは、グループとコントロールの相違を比較するために不均等な分散を想定するスチューデント（Student）の2−テールｔ検定を用いJMPTM統計ソフトにより解析した。P＜0.05の値は有意と考えた。
結果
通常の微生物計数技術を用いるC.ジェジュニの定量とqPCRとの間に優れた相関性が見出され（図1）、2つの方法には99％を超える相関性があった。実験1では、ワクチン接種後3日目までに盲腸扁桃内で3つの候補ベクターワクチンによる有意なレベルのコロニー形成が観察され、同じ時点でcj0113発現ベクターにより内部器官の顕著な侵襲が同様に観察された（表II）。しかしながら、ワクチン接種後11目までに3つ全てのベクターのコロニー形成量は減少し、ワクチン接種後21日目までにベクターは内部器官と同様に盲腸扁桃から完全に除去された（表II）。同じ傾向が、ワクチン接種追跡実験（実験2）で我々のワクチン候補としてベクター発現cj0113を用いたとき表IIに提示したデータが示すように観察された。
【００３０】
表II：3つのサルモネラベクターワクチン候補の1つ又は食塩水の経口胃管栄養によるワクチン接種後のサルモネラによる肝臓、脾臓又は盲腸扁桃のコロニー形成、侵襲及びクリアランスのパーセンテージ
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実験1及び2では、弱毒化組換えサルモネラワクチンベクターの影響の程度が、10羽のトリにおける陽性肝、脾、又は盲腸扁桃のパーセンテージとして表されている。ニワトリは適切に処置した約108 cfuを孵化日に経口胃管栄養で与えられた。孵化後3、11、21及び32日目に、各処置グループの10羽のトリを安楽死させ、弱毒化組換えサルモネラワクチンベクターの測定（+/-）のために肝臓、脾臓及び盲腸扁桃を収集した。各トリの肝臓及び脾臓をプールし1つのサンプルとしてアッセイした。
【００３１】
ワクチン接種後21日目にニワトリをC.ジェジュニでチャレンジした。回腸粘膜サンプルをワクチン接種後21及び32日目（チャレンジ後0及び11日目）に入手し、DNAサンプル調製に用い、上記に記載したように腸内のC.ジェジュニを計数した。ベクター候補cj0420及びcj0982によるワクチン接種は、回腸サンプルに存在するC.ジェジュニレベルでそれぞれ約1 log及び2 logの減少（P＜0.05）をもたらした。cj0113ワクチン候補を用いたとき、コントロールのトリと比較して回腸で4.8 logのC.ジェジュニの顕著な減少（P＜0.05）が認められた（図2）。
実験2では、cj0113を発現するワクチン候補のみを用いて一次免疫実験を繰り返した。この実験では、qPCRデータは、食塩水のみを投与したトリと比較して、cj0113 SEベクターワクチンを投与したトリでは約5 logのC.ジェジュニの減少を示した（表III）。さらにまた実験3では、cj0113によるワクチン接種は、食塩水又はサルモネラ親株（エピトープ挿入物を含まない）と比較して、C.ジェジュニの約4 log減少（検出可能レベル未満）をもたらした（図3）。
【００３２】
表III：カンピロバクターチャレンジ後11日のニワトリにおける定量的PCRによるカンピロバクター・ジェジュニの計数（実験2、ｎ＝10）
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実験2では、食塩水又は108 cfu/雛のサルモネラベクターワクチン候補cj0113を投与したニワトリでカンピロバクター・ジェジュニの定量が実施された。前記は約107 cfu/mLのC.ジェジュニチャレンジ用量の投与11日後に定量的PCRによって決定された。qPCRは通常的な方法により回腸の粘膜基底層から抽出した全DNAで実施された。結果は、標準偏差a及び標準誤差bとともに、回腸内容物1グラム当たりの平均log10 cfuとして表されている（ｎ＝10）。
【００３３】
ワクチン接種後21及び32日後に各実験で収集した血清サンプルを用いて、C.ジェジュニ特異的IgG抗体を測定した。第一の実験では、3つのワクチン候補の全て（cj0420、cj0113、cj0982）が、食塩水のみを投与したグループと比較したとき両時点で有意に高い抗体レベルをもたらした（図4）。第一の実験ではまた、cj0113でワクチン接種したグループはcj0420及びcj0982と比較したとき有意に高い抗体力価を示した（図4）。ELISAはカンピロバクターに特異的な粘膜sIgA抗体レベルの決定にも用いた。これらのデータは、食塩水グループ及びcj0420又はcj0982のどちらかを投与した2つのグループと比較したとき、ワクチンベクターcj0113はsIgAレベルで有意な増加を引き起こすことを示した（図5）。cj0113のみをワクチン候補として用いた第二及び第三の実験の結果は実験1と同様な結果を示し、ワクチンを接種したトリは、食塩水のみを投与したトリと比較したとき、C.ジェジュニに対して有意に高いレベルの抗原特異的IgG及びIgA抗体を有していた（実験3のデータは図6に示されている）。さらにまた、第三の実験では、骨格株（SE13）に対する抗体レベルは食塩水コントロールと同様であった（図6）。
【００３４】
バシルスベクターによるワクチン接種実験
増殖性細胞による発現のための異種タンパク質の生成
業者（MoBioTec/Boca Scientific, Boca Raton, FL）から購入したプラスミドpHT10(Nguyen et al., 2007)をcj0113及びHMGB1の枯草菌コドン最適化挿入配列（それぞれ配列番号：4及び20）の付加によってマルチクローニング部位で形質転換した。DNAシークェンシングを実施して正確な配列挿入を確認した。続いてこの新規改変プラスミドでバシルスを形質転換させた。簡単に記せば、バシルス培養をHS培養液（0.5% グルコース、50μg/mL DL-トリプトファン、50μg/mLウラシル、0.02% カゼイン水解物、0.1% 酵母抽出物、8μg/mL アルギニン、0.4μg/mL ヒスチジン、1mM MgSO4を補充したスピジゼン（Spizizen）培養液）中で37℃にて一晩増殖させた。20mLのLS培養液（0.5% グルコース、5μg/mL DL-トリプトファン、5μg/mL ウラシル、0.01% カゼイン水解物、0.1% 酵母抽出物、1mM MgSO4、2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2を補充したスピジゼン培養液）に1mLの一晩培養を接種し、震盪しながら3−4時間30℃でインキュベートする。LS培養の1mLを取り出し、10μLの0.1M EGTAを添加して室温で5分間インキュベートする。1−2μgのプラスミドDNAを添加し、37℃で2時間震盪し、選別抗生物質を含むLBプレートにプレートする。これらの形質転換バシルス種は、1mMのIPTGで誘発すればカンピロバクター由来の異種エピトープ配列（cj0113）及びHMGB1を生成するようになる。
ワクチン接種実験
ワクチン接種チャレンジでは、孵化100日のブロイラー雛を地元の孵化業者から入手し、以下の4つの処置グループの1つにランダムに割り当てた：食塩水のみ、バシルスベクターのみ（BSBB）又は106 又は 108 のバシルスワクチン候補（ｎ＝25/囲い）。各処置グループを床に新しい松材敷きわらを施した個々の囲いに収容し、水及び飼料は常時供給した。孵化日に各処置グループの全雛に骨格ベクター株又はcj0113バシルスベクターの約106 cfu/mLを含む溶液（0.25ｍＬ）を経口胃管栄養により接種した。10日目にトリにブースターワクチン接種を施した。前記ブースターワクチン接種はそれらのトリが孵化日に受けた処置と同じであった。孵化後21日目に、各処置グループの全てのトリを経口胃管栄養により上記に記載したように調製した107 cfu/mL を含む溶液（0.25mL）でチャレンジした。孵化後3、11、21（ブースター接種前）及び32日目に、各処置グループから10−15羽のトリを安楽死させ、ワクチンベクター株の器官侵襲、コロニー形成及びクリアランスの決定のためにそれらの肝臓、脾臓及び盲腸扁桃を無菌的に取り出した。さらにまた、孵化後21日及び36日目に回腸の切片を取り出してqRT-PCRでの使用のために処理した。さらに、各処置グループに付き15羽のトリから血液サンプルを収集し、孵化後21日目及び36日目の抗体応答の測定に使用した。
結果
ワクチン接種後36日目に収集した血清サンプルを用いてC.ジェジュニ特異的IgG抗体を測定した。cj0113ポリペプチドを発現するバシルスベクターによるワクチン接種は、食塩水のみまたは空ベクターを投与されたグループと比較したとき有意に高い抗体レベルをもたらした（図7）。ELISAもまたワクチン接種後36日目のカンピロバクターに特異的な粘膜sIgA抗体の測定に用いた。これらのデータは、cj0113発現ワクチンベクターは、空ベクターと比較したときsIgAレベルで有意な増加をもたらしたことを示している（図8）。
ニワトリをワクチン接種後24日目にC.ジェジュニでチャレンジした。ワクチン接種後24及び36日目（チャレンジ後0及び11日目）に回腸粘膜サンプルを入手し、DNAサンプル調製に用い上記に記載したように腸内のC.ジェジュニを計数した。バシルスcj0113ベクターによるワクチン接種は、回腸サンプルに存在するC.ジェジュニのレベルにおいて約3logの減少（P＜0.05）をもたらした（図9）。
【００３５】
シチメンチョウ雛のワクチン接種実験
サルモネラベクターCj0113ワクチンはニワトリのチャレンジ後におけるカンピロバクター回収の減少で有効であったので、我々は、前記ワクチンは雛でも有効であり得ると仮説をたてた。したがって、このエピトープデリバリー系の使用をさらに評価するために、シチメンチョウの雛でC.コリチャレンジに対するワクチンの有効性を試験する実験を設計した。
ΔSE-cj0113ワクチンを上記のように構築した。このワクチン候補のための骨格株としてサルモネラ・エンテリチディスファージ型13A（SE13A）を用いた。この単離株は、以前に記載したようにaroA及びhtrAにおける不可逆的欠失によって二重に弱毒化された。続いて、これらの欠失を含む組換え株をさらに改変して、cj0113挿入物及び免疫刺激性分子CD154を挿入した（ΔSE-cj0113）。これらの配列を以前に記載されたように組み込んだ。
本実験では、70羽の雛を地元の孵化場から入手した。それらを2つの処置グループの1つにランダムに割り当てタグを付けた。30羽の雛に108 cfu/雛のΔSE-cj0113を経口胃管栄養で投与し、残りの雛を食塩水で偽似処理した。21日目に経口胃管栄養により雛をC.コリ（1.5ｘ108 cfu/雛）でチャレンジした。3日目（N=10）、21日目（N=10）及び35日目（N=10）に肝臓、脾臓及び盲腸扁桃を無菌的に取り出し、テトラチオネートブロス中で濃縮しさらにブリリアントグリーン寒天にプレートすることによってベクターの回収を検出した。21及び35日目に、摂取物（N=10）及び組織（N=5）サンプルを更なる解析のために収集した。培養した雛の回腸の摂取物をC.コリの計数のためにqPCRを用いて解析した。同じ領域の組織サンプルを収集し、全RNAを抽出した。インターフェロン-ガンマ及びTNF-アルファ様ワクチン応答を評価した。
結果
ニワトリで以前に示したように、これらの雛はサルモネラベクターCj0113ワクチンによるワクチン接種の後顕著な免疫応答を生じた。チャレンジ後にベクターのみのコントロールと比較して回腸でカンピロバクター・コリが約5log減少した（図10）。サルモネラベクターCj0113ワクチンによるワクチン接種は、ニワトリと同様に確かにシチメンチョウで機能したようにみえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年2月21日(2013.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：7（cjaD；cj0113）、配列番号：8（cjaA；cj0982）若しくは配列番号：9（ACE 393；cj0420）の抗原性ポリペプチド、又は前記のフラグメントをコードする第一のポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、前記第一のポリヌクレオチド配列が前記ベクターに本来付随していない、前記ベクター。
【請求項２】
さらにベクターに本来付随していない免疫刺激性ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
抗原性ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列、及び、免疫刺激性ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、前記第一のポリヌクレオチド配列は前記ベクターに本来付随しておらず、前記抗原性ポリペプチドが、配列番号：1（cjaD；cj0113）、配列番号：2（cjaA；cj0982）、配列番号：3（ACE393；cj0420）、配列番号：７、配列番号：８若しくは配列番号９のフラグメントである、または、配列番号：７、配列番号：８若しくは配列番号９である、前記ベクター。
【請求項４】
ベクターが細菌である、請求項１−３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
細菌がサルモネラ（Salmonella）、エシェリキア（Escherichia）、バシルス（Bacillus）又はラクトバシルス（Lactobacillus）から選択される属に由来する、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
第一のポリヌクレオチド配列及び第二のポリヌクレオチド配列が細菌のゲノムに組み込まれる、請求項４に記載のベクター。
【請求項７】
ベクターが、第一のポリヌクレオチド配列の2つ以上のコピー、第二のポリヌクレオチド配列の2つ以上のコピー、又は第一及び第二のポリヌクレオチド配列の2つ以上のコピー含む、請求項２−６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項８】
第一のポリヌクレオチド配列が第二のポリヌクレオチド配列とインフレームで連結される、請求項２−７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項９】
抗原性ポリペプチド及び免疫刺激性ポリペプチドがベクターの表面で発現される、請求項２−８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１０】
第一のポリヌクレオチド配列及び第二のポリヌクレオチド配列が、トランスメンブレンタンパク質の外部部分をコードする第三のポリヌクレオチド配列内に挿入される、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
免疫刺激性ポリペプチドがCD154ポリペプチド又はHMGB1ポリペプチドである、請求項２−１０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１２】
CD154ポリペプチドがCD40と結合することができ、CD154ポリペプチドが50より少ないアミノ酸を有し、さらに配列番号：13のアミノ酸140−149又はそのホモローグを含む、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
CD154ポリペプチドが配列番号：15−19から選択されるポリペプチドを含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
HMGB1ポリペプチドが、配列番号：20−28の少なくとも1つ又は配列番号：20−28の少なくとも1つのフラグメントから選択されるポリペプチドを含む、請求項11に記載のベクター。
【請求項１５】
抗原性ポリペプチド配列が配列番号：7であり、免疫刺激性ポリペプチドが配列番号：１３−２８から選ばれる、または、抗原性ポリペプチド配列および免疫刺激性配列が配列番号：１０である、請求項２−１４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１６】
対象動物へのベクターの投与が抗体応答を誘引することができる、請求項１−１５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１７】
抗体応答がIgA応答である、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
ベクターが、ワクチン接種後のカンピロバクター種による感染からワクチン接種対象動物を防御することができる、請求項１−１７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１９】
さらに第2の抗原性ポリペプチドをコードする第４のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１−１８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１−１９のいずれか１項に記載のベクター及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項２１】
対象動物で免疫応答を増強する方法であって、前記方法が、請求項１−１９のいずれか１項に記載のベクターを対象動物の抗原性ポリペプチドに対する免疫応答の増強に有効な量で前記対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２２】
対象動物でカンピロバクター感染に対する耐性を強化する方法であって、カンピロバクター種への曝露の後のカンピロバクター感染に対する耐性の強化に有効な量で請求項１−１９のいずれか１項に記載のベクターを対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２３】
ベクターが投与に先立って弱毒化される、または死滅される、請求項２１−２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
免疫応答が抗体応答増加を含む、または、耐性が抗体産生増加によって強化される、請求項２１−２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
抗体応答増加がIgA応答増加を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
免疫応答増強または耐性増加が、続いて起こるカンピロバクター種による感染がコントロールと比較してカンピロバクターの増殖低下に終わることを特徴とする、請求項２１−２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
カンピロバクター増殖が、コントロールベクター投与後のカンピロバクター増殖と比較して少なくとも2 log低下する、請求項２６に記載の方法。
【国際調査報告】
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