(57)【要約】本発明は一般的に、被験体における神経変性疾患のリスクの推移を検出およびプロファイリングする方法に関する。一実施形態では、本方法は、被験体の脳脊髄液から幹細胞を単離する工程、および幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを決定する工程を包含する。被験体は、Ｈ３Ｋ２７のメチル化のレベルが上昇している場合、神経変性疾患の発症リスクが増大していると決定される。種々の実施形態では、神経変性疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病または筋萎縮性側索硬化症である。
2013526705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における神経変性疾患を発症するリスクを決定する方法であって、該方法は：
該被験体の脳脊髄液から幹細胞を単離する工程；
該幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを決定する工程を包含し、ここで、
Ｈ３Ｋ２７のメチル化のレベルの上昇は、該神経変性疾患を発症するリスクの増大の指標である、
方法。
【請求項２】
前記幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを決定する工程が、Ｋ２７でジメチル化されたヒストンＨ３およびＫ２７でトリメチル化されたヒストンＨ３のうちの少なくとも１つに対する抗体と該幹細胞とを接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを決定する工程が、Ｋ２７でジメチル化されたヒストンＨ３およびＫ２７でトリメチル化されたヒストンＨ３のうちの少なくとも１つに特異的な抗体と該幹細胞とを接触させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇからなる群より選択される少なくとも１つの幹細胞マーカーが、前記幹細胞に存在するかまたは存在しないかを決定する工程をさらに包含し、該幹細胞マーカーの該決定する工程は、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇのうちの少なくとも１つに対する抗体と該幹細胞とを接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞が、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇからなる群より選択される少なくとも１つの幹細胞マーカーに関して陽性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｂｒｎ３ａ、ＴｕＪ１、ＧＦＡＰおよびＯ４からなる群より選択される少なくとも１つの分化マーカーが、前記幹細胞に存在するかまたは存在しないかを決定する工程をさらに包含し、該分化マーカーの該決定する工程は、Ｂｒｎ３ａ、ＴｕＪ１、ＧＦＡＰおよびＯ４のうちの少なくとも１つに対する抗体と該幹細胞とを接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記幹細胞が、Ｂｒｎ３ａ、ＴｕＪ１、ＧＦＡＰおよびＯ４からなる群より選択される少なくとも１つの分化マーカーに関して陰性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記幹細胞とβアミロイド抗体とを接触させることにより、該幹細胞におけるβアミロイドタンパク質の存在または量を決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記幹細胞とαシヌクレイン抗体とを接触させることにより、該幹細胞におけるαシヌクレインタンパク質の存在または量を決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞とインターロイキン−６抗体とを接触させることにより、該幹細胞におけるインターロイキン−６タンパク質の存在または量を決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験体は、前記神経変性疾患の任意の臨床症状を有する前に検査される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
神経変性疾患のリスクがある被験体を処置する方法であって、該方法は：
該被験体の脳脊髄液から幹細胞を単離する工程；
該幹細胞内のＨ３Ｋ２７ｍ２メチル化のレベルを決定する工程であって、ここで、Ｈ３Ｋ２７のメチル化のレベルが通常レベルよりも高い場合、該被験体は、該神経変性疾患のリスクが増大していると決定される、工程；ならびに
該被験体は前記神経変性疾患のリスクが増大していると決定される場合、ビタミンＢまたはその代謝産物を該被験体に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記ビタミンＢの代謝産物が、Ｌ−メチルフォレートである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇからなる群より選択される少なくとも１つの幹細胞マーカーが、前記幹細胞に存在するかまたは存在しないかを決定する工程をさらに包含し、該幹細胞マーカーの該決定する工程は、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇのうちの少なくとも１つに対する抗体と該幹細胞とを接触させることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
Ｂｒｎ３ａ、ＴｕＪ１、ＧＦＡＰおよびＯ４からなる群より選択される少なくとも１つの分化マーカーが、前記幹細胞に存在するかまたは存在しないかを決定する工程をさらに包含し、前記分化マーカーの該決定する工程は、Ｂｒｎ３ａ、ＴｕＪ１、ＧＦＡＰおよびＯ４のうちの少なくとも１つに対する抗体と該幹細胞とを接触させることを含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、神経変性疾患のリスクの推移を検出およびプロファイリングする方法、およびそのような疾患を予防および処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は、神経変性の過程の結果としてのニューロンの死などニューロンの構造または機能の漸進的な喪失を表す用語である。そのような疾患には、パーキンソン病、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）がある。
【０００３】
アルツハイマー病は、認知症の最も一般的な形態である。一般に、アルツハイマー病は６５歳を超える人に診断されるが、あまり見られないものの早期発症型アルツハイマー病はかなり早期に生じる場合がある。２００６年には罹患者が世界全体で２６６０万人にのぼった。アルツハイマー病は、臨床症状が出現する前の未確定の期間に進行し、何年間も診断されないままとなることもある。アルツハイマー病の経過は一人一人特有であるとはいえ、多くの共通の臨床症状がある。最も初期に観察できる症状は、加齢性の問題またはストレスの発現であると誤解されている場合が多い。初期の段階に最も一般的に認識される症状は、最近記憶した事柄を思い出すことが困難であるなどの記憶喪失である。疾患が進行したとき、症状としては、錯乱、被刺激性および攻撃性、気分変動、失語（ｌａｎｇｕａｇｅ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）、長期記憶の喪失、ならびに患者の一般的な引きこもり（ｇｅｎｅｒａｌ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）が挙げられる。いずれは身体の機能が失われ、最終的には死亡に至る。
【０００４】
パーキンソン病は、多くの場合、罹患者の運動機能（ｍｏｔｏｒ  ｓｋｉｌｌ）、言語および他の機能を障害する中枢神経系変性障害である。その臨床症状は、筋硬直、振戦、身体運動（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ）の緩慢化、および極端な場合、身体運動の喪失を特徴とする。主な症状は通常、脳のドーパミン作動性ニューロンで産生されるドーパミンの形成および作用が不十分であることによって引き起こされる、基底核による運動皮質の低下した刺激の結果である。二次的な臨床症状としては、高レベルの認知機能障害および軽い言語障害を挙げることができる。
【０００５】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）は、運動ニューロンが選択的に変性の標的となる疾患である。ＡＬＳの発症は非常に軽度であることがあるため、臨床症状が見過ごされることが多い。最も初期の臨床症状は、明らかな衰弱および／または筋萎縮である。これらの症状に、上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンが共に変性するにつれて、全身の筋肉の衰弱および萎縮が続く。筋肉は機能することができず、徐々に衰弱し、攣縮を起こし、最終的には萎縮症を発症する。患者は最終的に全ての随意運動を開始および制御する能力を失うことがある。
【０００６】
神経変性疾患の最初の臨床症状は、疾患の発症から何年も経過してから生じることがある。たとえば、パーキンソン病の場合、神経変性による細胞消失の大部分が、臨床症状が出現する前に起こる。臨床症状が出現する前に疾患を早期検出すれば、発症前処置および細胞喪失の予防、あるいは少なくともその低減が見込まれる。したがって、疾患の発症初期、好ましくは臨床症状の開始前に患者の神経変性疾患を検出する方法の開発が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、被験体における神経変性疾患を発症するリスクを決定する方法を提供する。本方法は、被験体の脳脊髄液から幹細胞を単離する工程、および幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを決定する工程を含む。Ｈ３Ｋ２７のメチル化のレベルの上昇は、神経変性疾患を発症するリスクの増大の指標である。一実施形態では、幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを決定する工程は、Ｋ２７でジメチル化されたヒストンＨ３およびＫ２７でトリメチル化されたヒストンＨ３の少なくとも１つに対する抗体と幹細胞とを接触させることを含む。別の実施形態では、幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを決定する工程は、Ｋ２７でジメチル化されたヒストンＨ３およびＫ２７でトリメチル化されたヒストンＨ３に特異的な抗体と幹細胞とを接触させることを含む。
【０００８】
種々の実施形態では、神経変性疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病または筋萎縮性側索硬化症である。ある種の実施形態では、神経変性疾患の任意の臨床症状を有する前に被験体を検査する。
【０００９】
他の実施形態では、本方法は、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇの各幹細胞マーカーのうちの少なくとも１つが、幹細胞に存在するかまたは存在しないかを決定する工程をさらに含む。なお他の実施形態では、本方法は、Ｂｒｎ３ａ、ＴｕＪ１、ＧＦＡＰおよびＯ４からなる群より選択される少なくとも１つの分化マーカーが、幹細胞に存在するかまたは存在しないかを決定する工程をさらに含む。
【００１０】
種々の実施形態では、本方法は、βアミロイド抗体と幹細胞とを接触させることによって幹細胞内のβアミロイドタンパク質の存在または量を決定する工程、あるいは、αシヌクレイン抗体と幹細胞とを接触させることによって幹細胞内のαシヌクレインタンパク質の存在または量を決定する工程、あるいは、インターロイキン−６抗体と幹細胞とを接触させることによって幹細胞内のインターロイキン−６タンパク質の存在または量を決定する工程をさらに含む。
【００１１】
本発明の別の態様は一般的に、神経変性疾患のリスクがある被験体の処置をモニタリングする方法に関する。一実施形態では、本方法は、被験体の脳脊髄液から幹細胞を単離する工程、および幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを決定する工程を含む。Ｈ３Ｋ２７のメチル化のレベルが通常より高い場合、被験体は、神経変性疾患のリスクが増大していると決定される。本方法は、被験体が神経変性疾患のリスクが増大していると決定された場合、ビタミンＢまたはその代謝産物を被験体に投与する工程をさらに含む。一実施形態では、ビタミンＢ代謝産物はＬ−メチルフォレートである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１（ａ）〜１（ｃ）は、葉酸塩−レスキューＳｐｌｏｔｃｈホモ接合胚におけるＨ３Ｋ２７のメチル化およびＫＤＭ６Ｂ発現の逆転を示す図である。付録１は、これらの図面のカラー図を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
神経変性疾患の早期検出
本発明の一態様は一般的に、被験体における神経変性疾患のリスクの推移を検出およびプロファイリングする方法に関する。一実施形態では、被験体はヒト被験体である。種々の実施形態では、神経変性疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病または筋萎縮性側索硬化症である。本発明の別の態様は、そのような被験体における神経変性疾患の処置をモニタリングする方法に関する。
【００１４】
成人の脳には、主に脳室下帯（ｓｕｂ−ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）および顆粒細胞下帯（ｓｕｂ−ｇｒａｎｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）の神経幹細胞に由来する神経修復能力がある。こうした幹細胞は増殖、移動、分化して脳の様々な部位に統合される。神経変性疾患では、この神経修復能力が低下し、ニューロンが徐々に失われる。
【００１５】
Ｐａｘ遺伝子は、細胞発生のある種の局面を調節する。これらの遺伝子の突然変異は、胚形成期に明らかになる半優性欠損をもたらす。Ｐａｘ−３変異体マウスＳｐｌｏｔｃｈは、二分脊椎についての葉酸塩反応性のマウスモデルである。本出願人らは、Ｓｐｌｏｔｃｈマウスモデルを用いてＰａｘ３がＨｅｓ１遺伝子およびＮｅｕｒｏｇ２遺伝子を制御することを明らかにした［Ｎａｋａｚａｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３１６，ｐｐ．５１０〜５２３（２００８）］。Ｓｐｌｏｔｃｈのホモ接合胚は開放性の神経管閉鎖不全を示し、ヒストン３の２７位でのメチル化が増加し、かつヒストンデメチラーゼＫＤＭ６Ｂが減少する。
【００１６】
ヒストンは、ＤＮＡを一まとめにする真核細胞核に認められる強アルカリ性のタンパク質である。ヒストンは５つの主要なクラス：Ｈ１／Ｈ５、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４に分類することができる。これらのクラスは、コアヒストン−Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４と、リンカーヒストン−Ｈ１およびＨ５との２つのスーパークラスに体系づけられる。
【００１７】
ヒストンは、ＤＮＡおよび核タンパク質との相互作用を変化させる翻訳後修飾を受ける。ヒストンは、たとえばメチル化、アセチル化およびリン酸化により数か所で共有結合的に修飾されることがある。ヒストンの修飾は、有糸分裂の間の遺伝子制御、ＤＮＡ修復および染色体凝縮など多様な生物学的プロセスで作用する。ヒストン修飾の一般的な命名法は、ヒストン名の後に、修飾されたアミノ酸のアミノ酸の１文字略語、およびタンパク質中のそのアミノ酸の位置を表記し、最後に修飾の種類を表記する。たとえば、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２は、Ｈ３タンパク質のＮ末端から２７番目の残基（リジン）のジメチル化を示す。
【００１８】
Ｈｅｓ１遺伝子およびＮｅｕｒｏｇ２遺伝子は、幹細胞の維持および神経発生に関与している。これらの遺伝子の発現レベルの減少は、Ｈｅｓ１およびＮｅｕｒｏｇ２のプロモーター上のＨ３Ｋ２７ｍｅレベルの増加に起因し得ると考えられる。神経幹細胞のＨ３Ｋ２７ｍｅレベルの上昇は、幹細胞の増殖能の低下の指標であり、ニューロンが徐々に失われ、最終的に神経変性が起こると考えられる。
【００１９】
本発明の一態様は、被験体の脳脊髄液から単離された神経幹細胞のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを決定することにより、被験体において神経変性疾患が発症するリスクを検出する方法を提供する。Ｈ３Ｋ２７のメチル化のレベルの上昇は、神経変性疾患のリスクの増大の指標である。本発明の別の態様は、そのような神経幹細胞のＫＤＭ６Ｂのレベルを決定することにより、神経変性疾患のリスクを検出する方法を提供する。ＫＤＭ６Ｂの通常レベル未満のレベルは、神経変性疾患のリスクの増大の指標である。一実施形態では、神経変性疾患が発症するリスクを検出する方法は、免疫染色法である。
【００２０】
一実施形態では、被験体はヒト被験体である。ある種の実施形態では、神経変性疾患のリスクを、ヒト被験体が疾患の任意の臨床症状を示す前に検出する。種々の実施形態では、神経変性疾患のリスクを臨床症状の開始の少なくとも１５年前、１０年前、５年前または１年前に検出する。
【００２１】
ある種の実施形態では、幹細胞マーカー：ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２（ＨＭＧボックス転写因子）、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔａｍｅｒ−４）またはＮａｎｏｇ（ＮＡＮＯＧタンパク質）のうちの少なくとも１つに関して陽性の細胞として幹細胞を同定する。好ましくは、幹細胞は未分化の幹細胞である。ある種の実施形態では、未分化の幹細胞は、分化マーカー：Ｂｒｎ３ａ（脳特異的ホメオボックス／ＰＯＵドメインタンパク質３Ａ（Ｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ／ＰＯＵ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３Ａ））、ＴｕＪ１（ニューロン特異的クラスＩＩＩβチューブリン（Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  ｂｅｔａ−ｔｕｂｕｌｉｎ））、ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）およびＯ４（希突起膠細胞マーカー）のうちの少なくとも１つに関して陰性の幹細胞である。
【００２２】
一実施形態では、核染色剤４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を細胞と接触させる。ＤＡＰＩを細胞に加えると、ＤＮＡが青色に染色される。他の実施形態では、上述の他のマーカーの少なくとも１つに対する抗体を検出可能なプローブで標識し、細胞と接触させる。たとえば、これらのマーカーの少なくとも１つに対するマウスモノクローナル抗体を蛍光性化合物で標識する。
【００２３】
標識した抗体を細胞と接触させる。細胞内の検出可能なプローブの存在を検出することによって、標識抗体が細胞に結合するかどうかを観察することにより特定のマーカーの存在または不在を決定する。一実施形態では、異なる吸収または発光スペクトルを有する様々な蛍光性化合物で様々なマーカーに特異的な抗体を標識して、同じ細胞内で複数のマーカーの検出を可能にする。
【００２４】
本発明の一実施形態は、被験体の脳脊髄液から未分化神経幹細胞を単離する工程、および幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを決定する工程を含む方法を提供する。未分化神経幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルが上昇している場合、被験体は、神経変性疾患を発症するリスクが増大していると決定される。一実施形態では、Ｈ３Ｋ２７ジ−メチル化のレベルが上昇している場合、被験体は、神経変性疾患を発症するリスクが増大していると決定される。別の実施形態では、Ｈ３Ｋ２７トリ−メチル化のレベルが上昇している場合、被験体は、神経変性疾患を発症するリスクが増大していると決定される。なお別の実施形態では、Ｈ３Ｋ２７トリ−メチル化および／またはジ−メチル化のレベルが上昇している場合、被験体は、神経変性疾患を発症するリスクが増大していると決定される。
【００２５】
一実施形態では、Ｋ２７でジメチル化されたヒストンＨ３およびＫ２７でトリメチル化されたヒストンＨ３の少なくとも１つに特異的な抗体と幹細胞とを接触させる工程を含む方法により、幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを決定する。抗体はモノクローナル抗体でも、またはポリクローナル抗体でもよい。ある種の実施形態では、抗体を検出可能なプローブ、たとえば、放射性プローブ、蛍光プローブまたは化学発光プローブで標識する。他の実施形態では、抗体をプローブで標識しない。代わりに、そのような検出可能なプローブで標識した二次抗体と抗体を接触させることにより、抗体の存在を検出する。
【００２６】
別の実施形態では、脳脊髄液のホモシステインレベルの決定と組み合わせて幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを決定する。研究によれば、タンパク質合成に組み込まれないアミノ酸、ホモシステインのレベルの上昇は、神経変性疾患の病因における主要な危険因子である。Ｔｒｏｅｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０５（３４），ｐｐ．１２４７４−９（２００８）。一実施形態では、脳脊髄液の上昇したレベルのホモシステインと組み合わせた、上昇したレベルのＨ３Ｋ２７のメチル化は、神経変性疾患のリスクの増大の指標である。別の実施形態では、脳脊髄液の正常範囲内のレベルのホモシステインと組み合わせた、上昇したレベルのＨ３Ｋ２７のメチル化は、初期段階の病因の指標である。
【００２７】
他の実施形態では、Ｈ３Ｋ２７のメチル化のレベルの決定を二次検査と組み合わせて行い、被験体が発症するリスクがある神経変性疾患の種類を分類する。一実施形態では、たとえば、幹細胞のβアミロイドタンパク質またはトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）の存在または量を、βアミロイドまたはＴＧＦβ１抗体と幹細胞とを接触させる工程を含む方法により決定する。この実施形態では、βアミロイドタンパク質またはＴＧＦβ１の存在または増大した量は、アルツハイマー病を発症するリスクの増大の指標である。
【００２８】
別の実施形態では、たとえば、幹細胞のαシヌクレインタンパク質またはｐ−タウの存在または量を、αシヌクレイン抗体またはｐ−タウ抗体と幹細胞とを接触させる工程を含む方法により決定する。この実施形態では、βアミロイドタンパク質またはｐ−タウの存在または増大した量は、パーキンソン病を発症するリスクの増大の指標である。
【００２９】
なお別の実施形態では、たとえば、インターロイキン−６抗体または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）抗体と幹細胞とを接触させることにより幹細胞のインターロイキン−６またはＰＥＤＦの存在または量を決定する。この実施形態では、インターロイキン−６またはＰＥＤＦの存在または増大した量は、ＡＬＳを発症するリスクの増大の指標である。
【００３０】
別の実施形態では、ＫＤＭ６Ｂに対する抗体と神経幹細胞とを接触させる工程を含む方法により神経幹細胞内に存在するＫＤＭ６Ｂの存在または量を測定して神経変性疾患のリスクを決定する。一実施形態では、本方法は免疫染色法である。ＫＤＭ６Ｂの通常レベル未満のレベルは、神経変性疾患を発症するリスクの増大の指標である。
【００３１】
神経変性疾患の処置のモニタリング
本発明の別の態様は、神経変性疾患の発症を予防する、または神経変性疾患の処置をモニタリングする方法を提供する。一実施形態では、神経幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルが上昇した被験体をビタミンＢまたはその代謝産物、たとえば、生物学的に活性な葉酸塩の形態である、Ｌ−メチルフォレートで処置する。Ｈ３Ｋ２７のメチル化のレベルは、処置の過程で間隔を置いて測定する。処置が進行するにつれてのＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルの減少は、神経変性疾患を発症するリスクの低下の指標である。
【００３２】
二分脊椎のＰａｘ３変異体Ｓｐｌｏｔｃｈ−葉酸反応性マウスモデルにおいて、ｓｐｌｏｔｃｈ胚での葉酸によるマーカーＨ３Ｋ２７ｍｅ２の逆転および神経管閉鎖不全のレスキューを示す。Ｓｐｌｏｔｃｈホモ接合胚は開放性の神経管閉鎖不全を示し、Ｈ３Ｋ２７のメチル化が増加し、かつＫＤＭ６Ｂが減少する。図１は、葉酸塩−レスキューＳｐｌｏｔｃｈホモ接合胚におけるＨ３Ｋ２７のメチル化およびＫＤＭ６Ｂの発現の逆転を示す。図１（Ａ）は、増殖因子ＥＧＦおよびｂＦＧＦの存在下で最初に増殖させたＥ１０．０（３０体節）の野生型胚、Ｓｐ−／−胚、および葉酸塩−レスキューＳｐ−／−胚との下部腰椎神経管領域由来の神経管の外植片を示す。１４０時間後、神経堤細胞を、増殖因子の非存在下で２日間分化させた。分化後、野生型およびＳｐ−／−胚の外植片培養物に由来する神経堤細胞をＤＡＰＩ、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびＫＤＭ６Ｂの抗体（Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ  ０２１３９−１５１７）で染色した。５つの異なる外植片培養物からのＤＡＰＩ、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびＫＤＭ６Ｂの陽性細胞をカウントし、ＤＡＰＩ陽性細胞に対する比率として表した。スチューデントのＴ検定によって決定した場合、Ｓｐ−／−胚の神経管外植片のＨ３Ｋ２７ｍｅ２（ｐ＜０．００１）およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３（ｐ＜０．０５）の陽性染色は有意に増加し、ＫＤＭ６Ｂ染色は有意に減少した（ｐ＜０．００１）。
【００３３】
葉酸−レスキューＳｐ−／−胚は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびＫＤＭ６Ｂの野生型での発現近くまでの逆転を示した。図１（Ｂ）は、野生型胚の尾側の閉鎖性神経管、Ｓｐ−／−胚の尾側の開放性神経管、および葉酸塩−レスキューＳｐ−／−胚の尾側の閉鎖性神経管から酸抽出したヒストンのＨ３Ｋ２７ｍｅ２のイムノブロットを示す（Ｅ１０．０；３０体節）。タンパク質のローディングコントロールは、Ｐｏｎｓｅａｕ  Ｓ染色で確認した。
【００３４】
図１（Ｃ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅサーマルサイクラーを使用してＲＴ−ＰＣＲによって分析したマウスのＫＤＭ６Ｂ発現を示す。データ（ｎ＝４；平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍ）は、野生型同腹仔と比較した、Ｓｐ−／−胚、葉酸塩−レスキューＳｐ−／−胚におけるＫＤＭ６Ｂの転写物レベルについてのΔΔＣｔ値を示す。陽性対照としてβアクチンを使用した。データは、β−アクチンレベルに対して正規化している。ΔΔＣｔ値は、βアクチンでの正規化後のＳｐ−／−または葉酸塩−レスキューＳｐ−／−から野生型ＫＤＭ６ＢのＣｔ値を引くことによって得られる。ΔΔＣｔ値がゼロに近いと、野生型の遺伝子発現により近い。ΔΔＣｔ値がゼロより大きいと、遺伝子発現が野生型より増加したことを示し、値がゼロより小さいと、野生型より遺伝子発現が減少したことを示す。ΔΔＣｔ値の１サイクルの変化は、遺伝子発現における２倍の変化であることを示す。実験は、各データポイントで二連、４回行った。
【００３５】
神経変性疾患のリスクの推移を検出およびプロファイリングするためのキットおよび試薬
本発明はまた、神経変性疾患のリスクの推移を検出およびプロファイリングするためのキットおよび試薬を提供する。一実施形態では、キットはパッケージまたは容器に少なくとも、緩衝液と組み合わせて、Ｋ２７でジメチル化されたヒストンＨ３およびＫ２７でトリメチル化されたヒストンＨ３のうちの少なくとも１つに特異的な抗体を含む試薬を含む。抗体はモノクローナル抗体でも、またはポリクローナル抗体でもよい。ある種の実施形態では、抗体を検出可能なプローブ、たとえば、放射性プローブ、蛍光プローブまたは化学発光プローブで標識する。他の実施形態では、抗体をプローブで標識しない。代わりに、キットは、そのような検出可能なプローブで標識した二次抗体をさらに含む。これらの実施形態、および下記の実施形態では、緩衝液は液体形態でも、凍結形態でも、または凍結乾燥形態でもよい。
【００３６】
ある種の実施形態では、キットはパッケージまたは容器に、緩衝液と組み合わせて幹細胞マーカーを含む試薬をさらに含む。そのようなマーカーの例には、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、キットはパッケージまたは容器に、緩衝液と組み合わせて幹細胞分化のマーカーを含む試薬をさらに含む。そのようなマーカーの例には、Ｂｒｎ３ａ（感覚ニューロンマーカー）、ＴｕＪ１（神経細胞マーカー）、ＧＦＡＰ（星状細胞マーカー）およびＯ４（希突起膠細胞マーカー）が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、キットはパッケージまたは容器に、緩衝液と組み合わせてＤＡＰＩなどの核染色剤を含む試薬をさらに含む。
【００３７】
他の実施形態では、キットはパッケージまたは容器に１種または複数種の洗浄用緩衝液（たとえば、リン酸緩衝化生理食塩水）および／またはブロッキング緩衝液（たとえば、ＰＢＳ中、５％正常ロバ血清／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／０．０１％アジ化ナトリウム）を含む。なお他の実施形態では、キットは、シグナルを発する部分（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）から検出可能なシグナルが発生されるように、シグナル発生試薬を含んでもよい。キットは、１つまたは複数のサンプル採取デバイス、たとえば腰椎穿刺を行うのに好適なシリンジまたは針をさらに含んでもよい。他の実施形態では、キットは好適なパッケージまたは容器に陽性および／または陰性対照サンプルをさらに含む。
【００３８】
キットを供給する場合、様々な成分を別々の容器に包装し、使用直前に混合してもよい。そのように成分を別々に包装すると、活性成分の機能を失うことなく長期間の保存を可能にする。また、キットは、指示資料と共に供給してもよい。指示は、紙または他の支持体に印刷したものでもよいし、および／または、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープおよび録音テープなどの電子読み取り可能な媒体として供給してもよい。詳細な指示は、キットに物理的に付随していなくてもよい。代わりに、キットの製造者または販売業者が指定するインターネットウェブサイトに利用者を誘導しても、または電子メールとして供給してもよい。
【実施例】
【００３９】
（予測）
実施例１  −  神経幹細胞におけるＨ３Ｋ２７のメチル化の免疫化学的検出
腰椎穿刺を使用して、被験体から脳脊髄液のサンプルを得る。サンプル内の細胞を分離し、リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．５（ＰＢＳ）で３回洗浄する。細胞をスライドガラスに塗抹し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で１０分間インキュベートすることによって固定する。次いで細胞をＰＢＳで再び３回洗浄する。
【００４０】
ブロッキング溶液（ＰＢＳ中、５％正常ロバ血清／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／０．０１％アジ化ナトリウム）を少なくとも１時間加える。ブロッキング溶液を除去し、製造者の指示通りブロッキング溶液で希釈したＨ３Ｋ２７メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）に対するウサギ一次抗体（Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ  ０２１３９−１５１７）を加える。細胞を抗体溶液と４℃で一晩インキュベートする。抗体溶液を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄する。西洋わさびペルオキシダーゼに結合体化させ、ブロッキング溶液で製造者の指示通り希釈したロバ−抗ウサギ二次抗体の溶液を加え、細胞を１時間インキュベートする。二次抗体溶液を除去し、細胞を再びＰＢＳで３回洗浄する。基質溶液を加え、発色量を測定することによりＨ３Ｋ２７のメチル化の存在または量を決定する。
【００４１】
実施例２  −  未分化神経幹細胞におけるＨ３Ｋ２７のメチル化の免疫化学的検出
実施例１と同様に被験体の脳脊髄液から細胞を単離する。単離した細胞を、幹細胞マーカーＣＤ１３３、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇに対して生じた第１のモノクローナル抗体と接触させる。第１のモノクローナル抗体を、第１の発光周波数範囲を有する第１の蛍光プローブで標識する。単離した細胞を、分化マーカーＢｒｎ３ａ、ＴｕＪ１、ＧＦＡＰまたはＯ４に対して生じた第２のモノクローナル抗体とも接触させる。第２のモノクローナル抗体を、第１の蛍光プローブの存在下で検出可能な第２の発光周波数範囲を有する第２の蛍光プローブで標識する。さらに、細胞を、第１および第２の蛍光プローブの存在下で検出可能な第３の蛍光プローブで標識した、Ｈ３Ｋ２７メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）に対して生じた抗体と接触させる。
【００４２】
第１のモノクローナル抗体に結合するが、第２のモノクローナル抗体に結合しない細胞として未分化の幹細胞を同定する。第３の蛍光プローブの量を測定することにより、これらの細胞に存在するＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを決定する。
【００４３】
実施例３  −  アルツハイマー病のリスクについての早期検出検査
被験体から脳脊髄液のサンプルを得、サンプルに含まれる細胞を洗浄し、実施例１に記載したプロトコルを用いて固定する。細胞をさらに室温で１０〜２０分間ギ酸／ｐＨ１．６〜２．０中でインキュベートして抗原賦活化（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を促進してもよい。
【００４４】
ヒトβアミロイドタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体を室温で６０分間加える。（クローン：６Ｆ／３Ｄ、マウス抗ヒト、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｓ、カタログ番号：ＮＣＬ−Ｂ−Ａｍｙｌｏｉｄ）。ＩＨＣ−Ｔｅｋ（商標）抗体希釈液（カタログ番号ＩＷ−１０００またはＩＷ−１００１）を用いて抗体を１：１００に希釈してバックグラウンドおよび非特異的染色を低減する。正常ロバ血清を用いた別個の血清ブロッキング工程は必要ない。次いで細胞を０．３％Ｈ２Ｏ２とインキュベートして内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックする。
【００４５】
ブロッキング後、細胞を、ビオチン化二次抗体を含むＰＢＳ中で３０分間室温にてインキュベートする。結合していない抗体を洗い流した後、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＡＢＣ  Ｓｔａｉｎｉｎｇキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ  ６１１０５）を用いて、結合したビオチン化抗体の存在を検出する。アルツハイマー病のリスクの増大は、老人斑のコア、斑の周辺およびびまん性斑におけるβアミロイドタンパク質の過剰な存在により示される。
【００４６】
実施例４  −  パーキンソン病のリスクについての早期検出検査
基本的な手順は、一次抗体マウス抗αシヌクレインモノクローナル抗体、クローン：ＫＭ５１（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅ  ＮＥ１２  ８ＥＷ  ＵＫ）以外は実施例３と同様である。パーキンソン病のリスクの増大は、レビー小体および神経網の染色の過剰な存在により示される。
【００４７】
実施例５  −  ＡＬＳのリスクについての早期検出検査
基本的な手順は、一次抗体ウサギＩＬ−６ポリクローナル抗体、カタログ番号：ａｂ６６７２（Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ  ０２１３９−１５１７）以外は実施例３と同様である。ＩＬ−６のレベルの上昇は、ＡＬＳのリスクの増大の指標である。
【００４８】
本発明についてその特定の例示的実施形態を参照しながら記載および図示してきたが、本発明をそのような例示的実施形態に限定することを意図するものではない。当業者であれば、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の真の範囲および精神を逸脱することなく変形および修正が可能であることを理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲に包含されるものとしてそのような変形および修正をすべて本発明に含むことを意図している。
【図１】
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【国際調査報告】
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