(57)【要約】  いくつかの態様において、金属プロテアーゼのメトジンシンスーパーファミリーのメンバーに対する高選択的阻害抗体を生成するための一般的方法と、治療的および診断的使用のためのその適用とを提供する。この方法は、コンセンサスメトジンシン触媒のモチーフを包含する免疫原性ペプチドを用い、標的とするメトジンシンメタロエンドペプチダーゼに対して中和選択性を備える新規な触媒クレフト特異的抗体の生成を採用する。いくつかの態様において、方法は、治療目的のために、分析システムの阻害成分として、係る抗体の使用を含み、生物試料内の標的とするメトジンシンの活性と他の内因性メトジンシンの活性との区別を可能にする。係る分析は診断的または予後的目的のために使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メトジンシンプロテアーゼを特異的に不活性化する抗体またはその抗原結合フラグメントを生成する方法であって、
メトジンシンプロテアーゼ特異的エピトープを含む組成物に対する抗体を作成するステップを含む方法。
【請求項２】
前記抗体は、前記エピトープを含むペプチドで宿主動物に免疫性を与えることによって作成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体はインビトロトで作成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記エピトープは以下のペプチドからなる、請求項１に記載の方法：
ＨＸＢＧＢＸＨＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）または
ＨＸＢＧＢＸＤＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、
ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｂは可変のバルキーな非極性残基を表し、Ｚは保存アスパラギン酸塩、セリン／トレオニン、グルタミン酸塩、バリンまたはプロリンである。
【請求項５】
前記エピトープは以下のペプチドを含む、請求項１に記載の方法：
ＨＸＢＧＢＸＨＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）または
ＨＸＢＧＢＸＤＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、
ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｂは可変のバルキーな非極性残基を表し、Ｚは保存アスパラギン酸塩、セリン／トレオニン、グルタミン酸塩、バリンまたはプロリンである。
【請求項６】
前記エピトープはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜４０および４２〜７１から選択されるペプチドからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記エピトープはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜４０および４２〜７１から選択されるペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体はＡＤＡＭ１５エピトープに対して作成されなかった、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドは、対応するプロテアーゼ配列から前記エピトープの１〜５アミノ酸Ｃ末端を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記メトジンシンプロテアーゼファミリーのメンバーを特異的に不活性化する抗体であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法を使用して生成される、抗体。
【請求項１１】
この抗体は、ＡＤＡＭ１５プロテアーゼに特異的に結合せず、またＡＤＡＭ１５プロテアーゼを不活性化することもない、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
対象におけるメトジンシンプロテアーゼの活性を減少させる方法であって、
抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に投与するステップを含み、ここで、前記抗体は特異的にメトジンシンプロテアーゼの活性を減少させる、方法。
【請求項１３】
請求項１０または１２に記載の抗体が前記対象に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
対象において特異的な抗メトジンシン抗体反応を生成する方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載のエピトープで対象に免疫性を与えるステップを含む、方法。
【請求項１５】
生物試料におけるメトジンシンプロテアーゼの活性度を判定する方法であって、
生物試料をメトジンシン基質および特異的抗メトジンシン抗体に接触させるステップと、
前記特異的抗メトジンシン抗体の存在下において前記生物試料におけるプロテアーゼ活性レベルを、前記特異的抗メトジンシン抗体の不在下において前記生物試料におけるプロテアーゼ活性レベルと比較するステップと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２０１０年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６１／３８９，１７６号の利益を米国特許法１１９（ｅ）に基づき主張するものであり、その全体を本明細書に援用するものとする。
【０００２】
本発明の態様は、メトジンシンメタロエンドペプチダーゼ活性（度）を測定する方法、阻害抗体（抑制抗体）およびその抗原結合フラグメント、免疫原性ペプチドおよびその中のエピトープ、メタロエンドペプチダーゼのための合成ペプチド基質を生成する方法、ならびに触媒作用の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの荒廃した疾患の進行（例えば癌（腫瘍）、関節リウマチおよび心疾患）は、メタロエンドペプチダーゼスーパーファミリーと称されるメトジンシン（１、２）のいくつかのサブクラスを関与するという特徴がある。ＭＭＰ（マトリクス・メタロプロテイナーゼサブクラスのマトリキシン（ｍａｔｒｉｘｉｎ））およびＡＤＡＭ（ジスインテグリンおよび金属プロテアーゼサブクラスのレプロリシン（ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ））は、癌進行、網膜症および炎症（例えば炎症性腸疾患、関節炎およびクローン病）において確立した役割を有する。メプリンを含む他のメトジンシンは、腎臓および尿路の病状、ならびに妊娠に関係する高血圧障害を伴うパパリシン（ｐａｐｐａｌｙｓｉｎ）（下記参照）に関連する。従って、生物試料における異なるメトジンシンのレベルを判定する方法および組成物の必要性、ならびに上記の病状の進行に関連する特定のメトジンシンの触媒活性を治療的に阻害する方法および組成物の必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
いくつかの実施形態において、本発明の複数の態様は、プロテアーゼのメトジンシンファミリーの一または複数のメンバーを阻害する（例えば特異的に阻害する）ための方法および組成物に関する。例えば、一または複数のメトジンシンプロテアーゼを（例えば特異的に）阻害することは、（例えば、過剰発現による）一または複数のメトジンシンプロテアーゼの活性レベルが高い状態を治療するための治療において有用であり得る。一または複数のメトジンシンプロテアーゼを（例えば特異的に）阻害することは、一または複数のメトジンシンプロテアーゼの相対活性度を評価するための分析において有用であり得る。
【０００５】
いくつかの実施形態において、メトジンシンプロテアーゼの触媒クレフト（触媒溝）から少なくともエピトープを含むペプチドに対する抗体が作成される。いくつかの実施形態において、触媒クレフトのエピトープは、表３に示される任意のペプチドのＣ末端６、７、または８アミノ酸、または対応する共通配列のもの、または関連するプロテアーゼの対応配列のものからなるか、これらを含む。いくつかの実施形態において、これらのエピトープの一または複数のものがより長いペプチドの一部（例えば、約１０〜２０アミノ酸ペプチド、約１５アミノ酸ペプチド、または他の免疫原性ペプチド）として与えられる。従って、６〜８アミノ酸エピトープは、いくつかの（例えば、１〜５、１〜１０、またはこれら以上）Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸と共に与えられ得る。いくつかの実施形態において、これらは対応するプロテアーゼのＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸に対応し得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、これらは他の配列（例えば、異なるプロテアーゼからの配列、または一または複数の所望の構造特性および／または免疫原性特性を有するものとして知られる別の配列）であり得る。いくつかの実施形態において、アルファヘリックス特性を有するＮ末端ペプチドが加えられる。いくつかの実施形態において、エピトープと同一のプロテアーゼのＣ末端配列に対応するＣ末端ペプチドが使用される（例えば、更に特異性を提供するために）。いくつかの実施形態において、この付加的なＣ末端ペプチドは、１〜５アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、この付加的なＣ末端ペプチドは、Ｍｅｔ−ｔｕｒｎ（Ｍｅｔ−ターン）の保存Ｍｅｔを含まない。従って、いくつかの実施形態において、最小限のペプチドエピトープのみが免疫原として使用される。いくつかの実施形態において、この最小限のペプチドは、免疫原として使用されるようにそのＮ末端および／またはＣ末端の終端にて一または複数の付加的なアミノ酸（例えば、１〜５、５〜１０、またはこれ以上）を有することができる。いくつかの実施形態において、付加的なアミノ酸は、目的とするメトジンシンプロテアーゼの対応するアミノ酸である。いくつかの実施形態において、付加的なアミノ酸は、効果的な免疫化のためにペプチドを安定化するため、および／または構造を提供するために使用される、一般的なアミノ酸（例えば、プロテアーゼ特異性ではない）となることができる。
【０００６】
従って、いくつかの実施形態において、表３の任意の一または複数のペプチドは、抗体を生成するために使用され得、および／または対象に投与するために使用され得る。いくつかの実施形態において、表３の任意のペプチドのＣ末端８アミノ酸が使用され得る（例えば、ＨＮＬＧＭＤＨＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、ＨＮＦＧＭＮＨＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ＨＮＦＧＡＥＨＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ＨＮＦＧＳＰＨＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ＨＮＬＧＭＱＨＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ＨＮＬＧＭＮＨＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ＨＮＦＧＭＴＨＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ＨＮＦＧＭＦＨＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ＨＳＬＧＬＳＨＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ＨＶＬＧＭＥＨＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ＨＶＦＮＭＬＨＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ＨＬＬＧＬＳＨＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ＨＳＦＧＩＱＨＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ＨＶＬＧＭＥＨＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ＨＳＬＧＬＳＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ＨＡＬＧＩＤＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ＨＳＬＧＬＦＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ＨＡＭＧＩＥＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ＨＳＬＧＭＧＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ＨＳＬＧＬＦＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ＨＶＬＧＬＱＨＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ＨＳＬＧＬＧＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ＨＳＬＧＬＤＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ＨＡＬＧＬＧＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ＨＡＬＧＬＥＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ＨＡＬＧＬＧＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、ＨＡＬＧＦＷＨＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）、ＨＡＬＧＦＹＨＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ＨＶＶＧＦＷＨＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ＨＶＩＧＦＷＨＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、またはこれらの任意の組み合わせ）。いくつかの実施形態において、これらのペプチドの一または複数（例えば、表３のもの、またはこれらのペプチドのＣ末端６、７、または８アミノ酸）は、対応するプロテアーゼからの付加的な１〜５（例えば、１、２、３、４、または５）アミノ酸も有し得、かつ適切な場合には付加的な構造特性を提供するために任意には付加的なＮ末端および／またはＣ末端（例えば、プロテアーゼ特異性または非プロテアーゼ特異性）を有し得る。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されたペプチドは免疫原として使用することができ、（例えば、本明細書において記載されるような治療においておよび／または分析のために）有用である抗体（例えば、動物系において）を生成する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるペプチドは、過剰なレベルのプロテアーゼに関連する状態を患う対象において一または複数のプロテアーゼのレベルを減少するのに有用な対象抗体の生成を刺激するために、対象（例えば、ヒト対象）に投与することができる治療的免疫原として使用することができる。
【０００９】
これらのペプチドは、単体で投与されるか、一もしくは複数の適切なアジュバントおよび／または他の因子と組み合わせて投与されることができると理解されるべきである。いくつかの実施形態において、単クローン抗体組成物が生成され得る。いくつかの実施形態においては、多クローン性抗体組成物が生成され得る。いくつかの実施形態において、１種のペプチドが抗体を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態においては、複数のペプチドの混合物が使用され得る（例えば、複数の異なるメトジンシンプロテアーゼに対する抗体の多クローン性組成物を生成するために）。
【００１０】
任意の適切な技術が本明細書において記載された一または複数のペプチドおよび／または抗体を（例えば、隔離および／または合成によって）作るために使用され得ると理解されるべきである。
【００１１】
従って、いくつかの実施形態において本発明の態様は、特異的にメトジンシンプロテアーゼを不活性化し、メトジンシンプロテアーゼ特異的なエピトープを含む組成物に対する抗体を作成するステップを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを生成する方法に関する。いくつかの実施形態において、この抗体はエピトープで宿主動物に免疫を与えることによって作成される。いくつかの実施形態において、この抗体は生体外（インビトロ）で生成される（例えば、ファージディスプレイ、バクテリアディスプレイ、イーストディスプレイ、哺乳動物の細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイまたは他のライブラリーに基づく組替プラットフォーム（ｌｉｂｒａｒｙ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ）を用いて）。
【００１２】
いくつかの実施形態において、エピトープは以下のペプチドの一つからなるか、これを含む：
ＨＸＢＧＢＸＨＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
ＨＸＢＧＢＸＤＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｂは可変のバルキーな（巨大な）疎水性または非極性残基（例えばＩ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｙ、Ｖ等）を表し、Ｚは本明細書に記載するサブファミリーの特定の残基を表す。
【００１３】
いくつかの実施形態において、エピトープは、表３に示された完全なペプチドおよび／またはエピトープから選択されるペプチドからなるかこれを含む。いくつかの実施形態において、このエピトープはＡＤＡＭ１５ペプチドではない。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明の態様は、メトジンシンプロテアーゼファミリーのメンバーを特異的に不活性化する抗体に関する。いくつかの実施形態において、この抗体はプロテアーゼを完全に不活性化する。いくつかの実施形態において、この抗体は部分的に不活性化する（例えば、約１０％、約１０〜２５％、約２５〜５０％、約５０％、約５０〜７５％、約７５〜９０％、約９０％、約９５％、またはこれ以上もしくはこれ以下（例えば、抗体濃度とプロテアーゼ濃度の割合が約１０：１から約１：１の間である、細胞に基づいた分析においてもしくはインビトロトでの分析において、または、本明細書において記載されるか当該技術分野において公知の他の任意の適切な分析において）。いくつかの実施形態において、この抗体は、ＡＤＡＭ１５プロテアーゼと特異的に結合せず、またＡＤＡＭ１５プロテアーゼを不活性化しない。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明の複数の態様は、抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に投与することによってこの対象におけるメトジンシンプロテアーゼの活性を減少させる方法に関し、ここで、この抗体は、メトジンシンプロテアーゼの活性を特異的に減少させるものである。いくつかの実施形態において、本発明の態様は、抗体またはその抗原結合フラグメントを有する細胞または組織を対象に接触させることによって、この対象におけるメトジンシンプロテアーゼの活性を減少させる方法に関し、ここで、この抗体はメトジンシンプロテアーゼの活性を特異的に減少させるものである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明の態様は、対象において特異的な抗メトジンシン抗体反応を生成する方法であって、本明細書において記載されたエピトープでこの対象に免疫を与えるステップを含む方法に関する。いくつかの実施形態において、このエピトープはＡＤＡＭ１５ペプチドではない。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明の態様は、生物試料をメトジンシン基質（例えば、一または複数のメトジンシンプロテアーゼのための基質であるクエンチングされた蛍光性ペプチド、例えば、文献３０に記載された一または複数のペプチド（そのペプチドおよび分析条件は本明細書において参照により援用される）および特定の抗メトジンシン抗体に接触させることによって、生物試料においてメトジンシンプロテアーゼの活性度を判定し、この特異的な抗メトジンシン抗体の存在下で生物試料におけるプロテアーゼ活性レベルを特異的な抗メトジンシン抗体の不在下の生物試料におけるプロテアーゼ活性レベルと比較する、方法に関する。
【００１８】
従って、いくつかの実施形態において、本発明の複数の態様は、免疫原として本明細書において記載された領域を包含する触媒クレフトペプチドを用いる金属プロテアーゼのメトジンシンスーパーファミリーのメンバーに対して選択的触媒作用阻害抗体を生成する方法に関する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明の態様は、前記患者に単一のメトジンシン選択性触媒クレフト特異的抗体または複数のメトジンシン選択性触媒クレフト特異的抗体の組み合わせの治療量を投与することによって、単一のまたは複数の標的メトジンシンが疾患進行を促進する疾患を伴う患者を治療する方法に関する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本発明の態様は、標的メトジンシンの触媒クレフトに対する特異性を有する阻害抗体を加えることによって生物試料内のメトジンシンスーパーファミリーまたはそのサブファミリーの標的メタロエンドペプチダーゼの触媒活性度を測定する方法に関し、これにより、阻害されていない試料から差し引くことでこの標的メトジンシンの活性度を判定することを可能にする。いくつかの実施形態において、本発明の態様は、本明細書において記載されたメトジンシンのコンセンサス亜鉛結合モチーフに対応する配列を含む一または複数のペプチド免疫原（任意には５つのアミノ酸残基または前記配列を側面に置く結合群よりも少ない数を有するもの）（但しこれに限定されない）に関する。いくつかの実施形態において、本発明の態様は、メトジンシンプロテアーゼファミリーまたはサブファミリーのメンバーを選択的に阻害（抑制）する一または複数の抗体に関する。いくつかの実施形態において、この抗体は、プロテアーゼの触媒クレフト領域内のプロテアーゼ特異的エピトープに選択的に結合する。いくつかの実施形態において、本発明の態様は、メトジンシンプロテアーゼを選択的に阻害する抗体に試料を接触させることによって試料におけるメトジンシンプロテアーゼの量または活性度を判定し、対照試料に対してこの試料におけるプロテアーゼ活性レベルを判定し、これによりこの試料におけるメトジンシンプロテアーゼの活性の量を判定する方法に関する。いくつかの実施形態において、この対照試料は異なる抗体と接触される。いくつかの実施形態において、この対照試料は抗体と接触されない。いくつかの実施形態において、この試料は生物試料（例えば患者からまたは他のソースからの例えば生体細胞、組織、体液または他の試料）である。
【００２１】
本明細書において記載されるプロテアーゼ特異的エピトープは、他の（例えば、非抗体）特異的結合剤（例えば、他のタンパク質または核酸結合剤、例えばアプタマーおよび／またはダーピン）を生成するための標的としても使用され得ると理解されるべきである。係る結合剤は、抗体に対して本明細書において記載されたプロテアーゼ特異的状態を治療するための治療においても使用され得る。いくつかの実施形態において、一または複数の異なるタイプの特異的結合剤が単体または任意の適切な組み合わせにおいて共に使用され得る。
【００２２】
これらのおよび他の本発明の態様は、本明細書においておよび添付の図面においてより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、メトジンシン触媒クレフトおよびＣ末端ドメインの一般的な特徴を非限定的に表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明の複数の態様は、生物試料において特定のメトジンシンを特異的に不活性化しおよび／または検出する方法および組成物に関する。現在、公知のメタロエンドペプチダーゼ阻害剤は非特異的であり、かつ、生物試料内の複数の異なるメトジンシンを区別しおよび／または特異的に不活性化するのに使用することができない。対照的に、出願人は、メトジンシンスーパーファミリーおよび／またはそのサブファミリーに属する個々の金属プロテアーゼをこのスーパーファミリーまたはサブファミリーの他のメンバーに影響を与えることなく特異的に結合し、および／または不活性化することができる結合剤（例えば抗体）を開発する方法および技術を特定した。
【００２５】
いくつかの実施形態において、特異的結合剤は、どのメトジンシンメタロエンドペプチダーゼが試料に存在し、および／または活性状態にあるかを判定するためにこの生物試料を評価するために使用することができる。いくつかの実施形態において、特異的メトジンシンの活性レベルを判定することができる。
【００２６】
いくつかの特定の実施形態において、特異的結合剤は、インビトロトおよび／またはインビボ（生体内）で一または複数のメトジンシンを特異的に不活性化するために使用することができる。いくつかの実施形態において、対象を、この対象内の特定のメトジンシンの活性レベルを減少させるために一または複数の特異的結合剤を投与することによって治療することができる。例えば、過剰なメトジンシン活性に関連する特定の状態は、メトジンシンファミリーの一または複数のメンバーを特異的に不活性化することによって治療することができる。いくつかの実施形態において以下のプロテアーゼの一または複数が、関連する疾患を治療するために特異的に不活性化され得る。例えば、癌進行においてＭＭＰおよびＡＤＡＭ／ＡＤＡＭ−ＴＳファミリーのメンバーの関与の強力な証拠がある（最も顕著なものはＭＭＰ−１、−２〜７、９、および１４およびＡＤＡＭ９、１０、１２、１５、１７、および１９（本明細書の記載、表１、ならびに文献３および４を参照））。
【００２７】
表１：メトジンシン治療標的および疾患分野
2013541534.tif 000003
【００２８】
更に、本発明の一または複数の結合剤は、単体で治療的に使用されるか、一または複数の他の治療薬と組み合わせて治療的に使用され得ると理解されるべきである。
【００２９】
本発明の複数の態様は、特異的不活性特性を有する抗体を作成するために使用することができるプロテアーゼのメトジンシンファミリーの特定のエピトープの特定に（少なくとも部分的に）基づく。注目すべきことは、触媒クレフト内のエピトープは、ｉ）メトジンシンスーパーファミリーの個々のプロテアーゼメンバーに特異的に結合し、および／またはｉｉ）メトジンシンスーパーファミリーの個々のプロテアーゼメンバーを特異的に不活性化する、抗体を作成するために使用することができることである。
【００３０】
従って、特定のメトジンシンプロテアーゼ（またはプロテアーゼ群）に対して特異的な抗体またはその抗原結合フラグメントを、（例えば、過剰発現および／または制御されていない発現によって）そのプロテアーゼ（またはプロテアーゼ群）が異常に高いレベルであることに関連する状態を治療するために使用することができる。
【００３１】
抗体親和性は、低いピコモルから高いナノモル（例えば、５０ｐＭ〜５００ｎＭのＫｄ）までの範囲に及ぶことができるが、本明細書において記載された抗体は０．１ｎＭ〜５０ｎＭの範囲にあると予想される。ＩＣ５０値は細胞に基づく分析において０．５〜５００ｎＭの範囲に及ぶことができ、かつ１０ｎＭ〜２００ｎＭの範囲に入る可能性が大きい。いくつかの実施形態において、この定義されたエピトープからのアミノ酸の単一置換が抗原認識の損失を引き起こすというＡＤＡＭ１５抗体の観察に基づき、メトジンシンサブファミリー間の交差反応がほとんどないか無有意（例えば、ほとんどまたは全く検出されない）であると予想される（例えば、ＡＤＡＭ抗体はＭＭＰ抗体と交差反応すべきでなく、その逆も然りである）。しかしながら、この定義されたエピトープ領域におけるアミノ酸バリエーションが保守的である非常に似たサブファミリーメンバー間にいくらかの交差反応があり得る。従って、いくつかの実施形態において、本明細書において記載されたエピトープに対して作成された抗体の約９０％は、同一のアミノ酸エピトープを伴うこれらのメトジンシン（ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰおよびＭＴ５−ＭＭＰ）を除き、単一特異性であると予想される。いくつかの実施形態において、抗体は、この定義されたエピトープと共にこの免疫原性ペプチドにおいて付加的なプロテアーゼ特異的配列を含むことによってこれらのメトジンシン間の区別をするために生成することができる（例えば、この定義されたエピトープに対するＮ末端および／またはＣ末端）。
【００３２】
メトジンシンの触媒ドメインは、共有の構造の骨組みおよび共有の活性部位環境の存在によって特徴付けられる（但し、各サブファミリーはユニークな構造要素を有する）。ねじれたｂシートを形成する３つのα螺旋（αＡ、αＢおよびαＣ）および５つのベータストランド（ｓＩ−ｓＶ）からなる触媒ドメインは、活性部位クレフト（触媒クレフト）によって分離されるＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインに空間的に組織化され、この活性部位クレフトは分子の幅全体に亘り、かつ触媒活性の亜鉛イオン（１、２）を収容する。更なる構造的特徴は、Ｃ末端亜鉛結合モチーフＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の存在であり、ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表し、このモチーフは、３つの亜鉛結合ヒスチジン（あるいはいくつかのメトジンシンにおいて第３のヒスチジンがアスパラギン酸塩と置換される）と、触媒作用中に一般塩基／酸として作用するグルタミン酸塩を含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（そのＣ末端にＨを備える）は、ヒトおよび哺乳動物のメトジンシンの特徴であり、一方、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（そのＣ末端にＤを備える）は特定の単細胞生物の特徴であることに留意されたい。このコンセンサス構造モチーフの第１の２つの亜鉛配位ヒスチジンは、α螺旋Ｂで表された活性部位α螺旋のＣ末端部分内に存在する（αＢ、文献１および２、ならびに図１）。図１において、触媒クレフトおよびＣ末端の複数の異なる領域が、阻害剤が接触すると信じられる場所を示すために図示される。本発明の触媒クレフト抗体は、ヒドロキサメート阻害剤およびＭＭＰ１３のより新しい世代の化学的阻害剤のものとは異なる領域と結合する。完全な触媒ドメインの３次元分子モデルは、文献３３、および３４において見ることができる。図１において、触媒クレフトの領域は、α螺旋ＢのＣ末端の終端からアミノ酸Ｚ全体に亘る線によって示される。アミノ酸Ｚは、サブファミリー選択残基を表し、この残基はこの抗体エピトープの重要な部分を形成する。アミノ酸ＭはＭｅｔ−ｔｕｒｎの保存メチオニンである。αＢの端部の特徴的な（Ｈａｌｌｍａｒｋ：ホールマーク）グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）残基は、ポリペプチド鎖をα螺旋から、第３の亜鉛キレートヒスチジンまたはアスパラギン酸塩を含む降鎖に鋭角に屈曲する。特徴的なグリシン（Ｇ）は、グルタミン酸塩基の次にも見られるバルキーな疎水性残基によって常に側面に位置する。これらの非極性残基は、触媒クレフト内のαＢの位置決めにおける構造的役割を担うと考えられる。αＢの更に下流の他の保存構造は、ポリペプチド鎖が、触媒亜鉛に空間的に近いが接触しない位置３（Ｍｅｔ−ｔｕｒｎ）にて厳密に保存されたメチオニンを伴い１、４β−ｔｕｒｎ（文献１および２、ならびに図１）を特徴的に形成するものである。そしてこのＭｅｔ−ｔｕｒｎには可変の領域およびＣ末端螺旋（αＣ）が続き、触媒ドメインを完全なものにする。レプロリシン（ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ）（ＡＤＡＭを含む）およびマトリキシン（ｍａｔｒｉｘｉｎ）（ＭＭＰ）サブファミリーにおいて、コンセンサス亜鉛結合モチーフは、第３の亜鉛配位ヒスチジン、例えば、ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ（ＳＥ���  ＩＤ  ＮＯ：１）を常に包含する。更に、第３のヒスチジンには、各メトジンシンサブファミリーのメンバー間にほとんど保存される残基がすぐに続く。いくつかの実施形態において、この残基（第３のヒスチジンのすぐ後の残基、第３のヒスチジンの代わりにアスパラギン酸塩を有するプロテアーゼのためのアスパラギン酸塩のすぐあとの残基）はサブファミリー特異性である。従って、このサブファミリー特異的残基を含有するペプチドは、サブファミリーの特定のプロテアーゼに対して（または、この位置での特定の種類のアミノ酸の存在によって特徴付けられる特定のサブファミリーに属する一または複数のプロテアーゼ群に対して）特異的結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）を生成するために使用することができる。この残基は、レプロリシンにおけるアスパラギン酸塩、マトリキシン（ｍａｔｒｉｘｉｎ）におけるセリン／トレオニン／バリン、アスタシンにおけるグルタミン酸塩、パパリシン（ｐａｐｐａｌｙｓｉｎ）におけるバリン、およびセラリシン（ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎ）におけるプロリンである（１〜４）。よって、より特異的なメトジンシン触媒のコンセンサスモチーフは、配列ＨＥＢＸＨＸＢＧＢＸＨＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）またはＨＥＢＸＨＸＢＧＢＸＤＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）によって表されることができ、ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｂは可変のバルキーな疎水性または非極性残基（例えばＩ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｙ、Ｖ等）を表し、Ｚは本明細書において記載したサブファミリー特定の残基を表す。注目すべきことは、いくつかの実施形態において、このメトジンシンコンセンサス領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３または４）を包含するペプチド免疫原に対する抗体は、このモチーフのＣ末端領域ＨＸＢＧＢＸＨＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）またはＨＸＢＧＢＸＤＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）内に包含されるエピトープに特異的に結合することである。この領域は、３つの高度に保存されたアミノ酸位置、第２の亜鉛配位ヒスチジン、特徴的なＧおよび第３の亜鉛配位残基（最も一般的にはヒスチジンであるが場合によってはアスパラギン酸塩も含む）を包含する。それは、特徴的なＧおよびサブファミリー特異的残基（Ｚ）を側面に置くバルキーな／非極性残基も含み、これは、高度に可変の残基（Ｘ）に結合した場合に抗原性選択性を付与するためにメトジンシン間で十分な配列バリエーションを生成する。この領域は、ＭＭＰ１３に対する選択性を備える小分子阻害剤を特定した研究において「特異性ループ」と最近名付けられた領域とは区別され、なぜなら「特異性ループ」が線状ポリペプチド配列（５）においてＭｅｔ−ｔｕｒｎの前ではなく後ろに位置するためである。空間的に、このＭＭＰ１３阻害剤のための結合ポケットは、触媒ドメイン内において深く、かつ触媒亜鉛および基質結合ポケット（ここで、本明細書において記載されたペプチド免疫原がその免疫原性のために特定された）から離れている（図１を参照）。従って、いくつかの実施形態において、αＢとＭｅｔ−ｔｕｒｎとの間にあるこの領域と結合する複数の抗体は、プロテアーゼ選択的である（例えば、これらの抗体は、この領域においてユニークなまたは類似するエピト��プを有するメトジンシンファミリーの限定された数のプロテアーゼまたは単一のプロテアーゼと選択的に結合し、および／またはこれを不活性化する）。従って、いくつかの抗体は、単一特異性であり得、一方、他のものは、この領域において非常に類似するエピトープを有する限られた数のプロテアーゼと交差反応し得る。
【００３３】
従って、本発明の一態様は、抗体の生成に関するものであり、これは、メトジンシンコンセンサス触媒のモチーフ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３または４）を包含する免疫原性ペプチドを用いて触媒クレフトを標的とすることによってメトジンシンの触媒活性を阻害し、かつ、同一の遺伝子サブファミリーの密接に関係するメンバー間を区別するための十分な特異性を維持するものである。触媒作用に不可欠な著しい数の残基、および亜鉛イオンの配位は、αＢのＣ末端部分と、触媒亜鉛イオンの配位において重要な役割を有しかつＭｅｔ−ｔｕｒｎを越える下記の降鎖とを含む共有の構造ユニットを採用するこの領域内で保存される（下記の表２を参照）。従って、本発明の複数の態様は、メトジンシンプロテアーゼファミリーの異なる複数のメンバーを特異的に不活性化するのに有用であり得る（例えば、抗体といった特異的結合剤を、一または数個の関連するプロテアーゼを他のいずれも阻害することなく阻害するために使用することができる）。
【００３４】
従って、いくつかの実施形態において、抗体は、一または複数の特異的プロテアーゼのための領域ＨＸＢＧＢＸＨＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）またはＨＸＢＧＢＸＤＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）からなるかこれを包含するペプチド免疫原に対して作成される（表３に挙げられた配列を参照）。例えば抗体は、興味のある特定のメトジンシンプロテアーゼまたは興味のある特定の群のメトジンシンプロテアーゼの配列ＨＸＢＧＢＸＨＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、またはＨＸＢＧＢＸＤＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を有する特異的ペプチドに対して作成され得る。いくつかの実施形態において、特異的メトジンシン配列を使用することもできる（例えば、表３から）。いくつかの実施形態において、複数（例えば、２〜５、５〜１０、またはこれ以上）のペプチドを使用することもでき、各々が、異なるメトジンシンプロテアーゼ配列に対応する異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、使用される複数の異なる配列は、特定の特徴（例えば、本明細書において記載されるような特定の種類のプロテアーゼのための同一の「Ｚ」アミノ酸）を共有し、かつ、その種類のプロテアーゼの複数の異なるメトジンシンプロテアーゼ配列に対応する複数の異なるＸおよび／またはＢ残基を有し得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、抗体は、ペプチドＨＸＢＧＢＸＨＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）またはＨＸＢＧＢＸＤＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の保存アミノ酸（特定の種類のプロテアーゼのＨ、Ｇ、ＨまたはＤ、Ｚ）からなるかこれを包含するペプチドに対して作成され得るが、Ｘおよび／もしくはＢ残基の一または複数、または複数の残基の組み合わせは、天然プロテアーゼ配列では見られないアミノ酸または複数のアミノ酸の組み合わせで置換する、と理解されるべきである。
【００３５】
これらの抗体は、ＨＸＢＧＢＸＨＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、またはＨＸＢＧＢＸＤＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）ペプチド自体に対して、またはこの配列を含むより長いペプチドに対して作成され得ると理解されるべきである。このより長いペプチドは、付加的なＮ末端および／またはＣ末端（例えば、１〜５、５〜１０またはこれ以上）残基を含み得る。この付加的な残基は、本明細書において記載された一または複数の自然発生のプロテアーゼ配列もしくは自然のプロテアーゼに見られる配列、またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、α螺旋ＢのＣ末端（図１を参照）およびＭｅｔ−ｔｕｒｎのＮ末端（図１を参照）である領域を含み得る。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α螺旋Ｂの一または複数のＣ末端残基（図１を参照）、例えばα螺旋Ｂの約１〜１０個のＣ末端残基を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるようなエピトープは、数個の付加的なＣ末端アミノ酸（例えば、１または２）と共に提供され得る。α螺旋ＢのＣ末端からＭｅｔ  ｔｕｒｎまで亘る領域の長さは異なるプロテアーゼでは異なると理解されるべきである。従って、いくつかの実施形態において、異なるペプチド長さが、異なるプロテアーゼに対して抗体を作成するために使用され得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、類似する（または同一の）長さのペプチドを、異なるプロテアーゼのために使用することができ、なぜなら、この領域に亘るペプチドの全長は、本明細書において記載されるようなものである必要はないからである。
【００３６】
いくつかの実施形態において、使用されるペプチドは、ＡＤＡＭ１５プロテアーゼの配列を含まない。従って、いくつかの実施形態において、本明細書において記載したように生成されたあるいは使用される抗体は、特異的にＡＤＡＭ１５と結合しない。
【００３７】
（例えば、哺乳類（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、または他の哺乳類）において、または合成スクリーンまたは他の実験方式において）抗体を作成するために有用であるとして本明細書において記載されるペプチドは、治療の免疫原としても使用され得ると理解されるべきである。例えば、本明細書において記載された一または複数のペプチドは、対象（例えば、ヒト患者）において過活性である特定のプロテアーゼまたは一群のプロテアーゼに対して抗体を作成するために、この対象に投与され得る。本発明の態様は、特異的抗体を生成するために、特異性レベルもしくは活性度を分析するため、および／または、メトジンシンファミリーまたはそのサブファミリーの任意の一または複数のプロテアーゼを対象においてインビボで、または細胞もしくは組織においてエクスビボもしくはインビトロトで選択的に阻害すると理解されるべきである。
【００３８】
本明細書において記載された結合剤（例えば、抗体）は、任意の対象において一または複数のメトジンシンプロテアーゼを阻害するために使用され得る。対象は、ヒト、または他の哺乳類、または他の脊椎動物、または他の生物であり得ると理解されるべきである。いくつかの実施形態において、１種からのペプチドに対して作成された抗体は、他の種からのプロテアーゼと交差反応し得、なぜなら共通配列が種に亘って（例えば、哺乳動物の種に亘って）高度に保存されているからである。
【００３９】
このヒトゲノムは、メトジンシンに属する約８０遺伝子を含有し、かつ特徴付けられたメンバーの大半を表２に示す。
【００４０】
表２  ヒトゲノムにおけるメトジンシン
2013541534.tif 000004
2013541534.tif 000005
＊は、サブクレード内の関連遺伝子がヒト遺伝子のパラロガス領域に位置することを表す。
出典：Ｈｕｘｌｅｙ−Ｊｏｎｅｓ他、ＢＭＣ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００７  ７：６３  ｄｏｉ：  １０．１  １８６／１４７１  −２１４８−７−６３  文献１８
【００４１】
メトジンシン、マトリキシン（ｍａｔｒｉｘｉｎ）およびレプロリシンの２つの重要なサブファミリーは、それぞれマトリクスメタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＰ）およびジスインテグリン・メタロエンドペプチダーゼ（ＡＤＡＭ／ＡＤＡＭ−ＴＳ）遺伝子ファミリーを表す（３、４）。ＭＭＰおよびＡＤＡＭ／ＡＤＡＭ−ＴＳファミリーは両方とも、健康および疾患の両方において重要な役割を演じることが現在知られている。他のメトジンシン同様、ＡＤＡＭおよびＭＭＰは、金属プロテアーゼドメインの活性が、システイン残基が金属プロテアーゼ触媒クレフト亜鉛イオンを配位結合させるプロドメインによって制御されるモジュール方式を共有する。よって、メトジンシンプロテアーゼは、構造的に表されるが、プロドメインを開裂するかシステイン結合を開放する酵素によって活性化されるまで潜伏状態を維持する。これらのメトジンシンは、（ＴＩＭＰが最も重要かつよく研究された）ＴＩＭＰ、ＲＥＣＫおよびαマクログロブリンを含む、内因性の阻害剤によっても制御される。
【００４２】
２４ヒト（表２）および２３マウス遺伝子によってコードされるＭＭＰは、それらのドメイン構造（コラゲナーゼ、ストロメライシン、ゼラチナーゼ、および膜型ＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）を含む）に従って４つのメインサブグループに区分される分泌性および膜結合性のメンバーを含む。その過半数は、可溶性の細胞外プロテアーゼであり、その主な役割は細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の分解および／またはリモデリングである（但し、いくつかのレポートは、ニューロンおよびグリア細胞の細胞核における、細胞内ＭＭＰ機能ならびにＭＭＰ−２、−９、および−１３の活性型を示す）（６）。ＭＭＰ１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）といった膜局限性メンバーは、細胞表面タンパク質および活性な潜伏性のＭＭＰもシェディングする、単スパン内在性膜タンパクである。ＭＭＰは、創傷治癒、血管形成および神経発達といった多くの生理的課程において重要な役割を担う（４、７）。それらは更に、多くの病状の進行において重要な役割を有する。顕著な例として癌を挙げると、ＭＭＰは腫瘍において上方制御されることが知られており、かつ、不良な予後に関連することが多い。例えば、ＭＭＰ−１１および／またはＭＭＰ−１４の発現は、小細胞肺癌のためのマイナスの予後指標である。加えて、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−９発現は、主にヒト乳癌のための不良な予後に関連する（６）。神経膠腫において、複数のＭＭＰが上方制御される（ＭＭＰ−１、−７、−１０、−１１、および−１９ならびによく研究されたゼラチナーゼ、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を含む）（６）。いくつかのＭＭＰは抗癌作用を発揮する（ＭＭＰ−３、−８、−９、−１１、−１２、−１９、および−２６を含む）（７）。例えば、結腸癌におけるＭＭＰ１２の発現は、患者生存率の上昇に関連する（７）。ＭＭＰ発現は、癌細胞（例えば、ＭＭＰ７）および間質細胞（例えばＭＭＰ２および９）の両方（線維芽細胞、筋線維芽細胞、炎症性の細胞および内皮細胞を含む）に関連する。ＭＭＰは、ＥＣＭ成分の分解およびリモデリングを通しての癌細胞増殖、癌細胞浸潤、転移および血管形成や、細胞表面およびＥＣＭからおよびシグナル伝達を介して発育因子の起動を高めることによって癌を促進する（４、７）。血管形成は、癌治療の標的であるが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４といったＭＭＰが血管形成を促進するために不可欠であり、一方、アンギオスタチン（プラズミノゲン製品）といった内因性血管造成阻害剤（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）は、インビトロトでＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１２の酵素作用によって生成される。別の内因性血管形成遮断剤、エンドスタチンは、インビトロトでＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３およびＭＭＰ２０処理によってタイプＸＶＩＩＩコラーゲンから生成される（７）。これらの例は、ＭＭＰの治療的な阻害のためのターゲットバリデーション（ｔａｒｇｅｔ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）の重要性を強調し、かつ、腫瘍進行を標的とする広域スペクトル阻害剤が、予測された不望の活性に加えて所望のＭＭＰ活性の阻害の結果としてなぜ失敗したのかの洞察を与える。更に、一般的に、ＴＩＭＰ（メタロエンドペプチダーゼの組織阻害剤）��伝子ファミリーメンバーの発現の上昇は、不良な予後に関連し、異なるＭＭＰファミリーメンバーのためのさまざまな役割を示す（３、７）。
【００４３】
ＭＭＰとは対照的に、ＡＤＡＭジスインテグリン・金属プロテアーゼは、主に内在性膜タンパクである（但し、いくつかの可溶性アイソフォーム（例えば、ｓＡＤＡＭ１２）は、それらのｍＲＮＡの交互のスプライシングによって生成される）（４、９）。ＡＤＡＭ−ＴＳと呼ばれるＡＤＡＭの異なる分岐は、もっぱら可溶性の分泌分子であり、一または複数のＣ末端トロンボスポンジンの繰り返しおよび膜貫通螺旋および細胞質ドメインを明確に包含する（４）。ＭＭＰと同様、ＡＤＡＭ遺伝子ファミリーは癌進行において重要な役割を演じる。ＡＤＡＭファミリーメンバーの約６０％のみが保存メトジンシン亜鉛結合モチーフの存在によって予測されるようにタンパク質分解活性を有するが、リサーチはＡＤＡＭタンパク質を重要な細胞のシェデース（ｓｈｅｄｄａｓｅ）として確立しており、標的とするタンパク質分解細胞過程（サイトカンの起動、増殖因子シグナル伝達および細胞間接着を含む）を通して制御する。重要なＡＤＡＭ細胞内標的は、ＴＮＦαといった炎症性のサイトカン、Ｅｒｂｂレセプターおよびそれらのリガンド（４、９〜１４）といった増殖因子リガンド・レセプターシステム、カドヘリンファミリーのメンバーといった活性化分子および接着分子のためのノッチ（Ｎｏｔｃｈ）レセプターを含む（４）。いくつかの触媒活性のＡＤＡＭファミリーメンバーの高度発現は、異なる複数の腫瘍に対して報告されている。例えば、ＡＤＡＭ１７、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）は、脳、乳房、腸、胃、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓および前立腺の癌腫において上昇し、一方、ＡＤＡＭ１９上昇は脳および腎臓の腫瘍に限定される（４）。乳癌でのＡＤＡＭ１７発現は、腫瘍進行の変化と相互に関連した（４）。ＩＮＣＢ３６１９、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７の部分的に選択的な、小分子タンパク質分解阻害剤は、乳癌腫瘍の増殖を遅らせることにおいてパクリタキセルと相乗作用を示した（１４）。ＩＮＣＢ３６１９は更に、マウスの非小細胞肺癌モデルにおいて腫瘍容積を減少させるためにパクリタキセルと相乗作用で作用することを示した（１０）。更に、患者の尿におけるＡＤＡＭ１２レベルは、乳癌進行と相関し、ＡＤＡＭ１２が乳癌のための診断マーカーとなり得ることを示唆する（１１）。ＡＤＡＭ１２は、膠芽腫で主に発現されることが報告されており、ここで、それはｐｒｏＨＢ−ＥＧＦを起動し、治療剤であるヒドロキサメート阻害剤ＫＢ−Ｒ７７８５（１１．１２）によって阻害された。元々血管細胞において特定されたＡＤＡＭ１５は、乳房、肺、胃および前立腺癌において上方制御され、かつ、その遺伝子（ｌｑ２１．３）を含む染色体領域は、いくつかのケースにおいて増幅される（４、１５、１６）。前立腺癌に関し、ＡＤＡＭ１５は疾患進行において、グリソンスコアによって分析されるように転移および高度な疾患／不良な予後と相関する患部組織における高ＡＤＡＭ１５発現としての役割を演じると考えられる（１５）。更に、細胞質ドメイン（ＡＤＡＭ１５−Ｂ）内のＳｒｃのために挿入された結合部位を包含するＡＤＡＭ１５のスプライス変異は、リンパ節転移陰性の乳癌において低い生存率に結びついた（１６）。この変異体は、細胞に基づいたシェッディ��グ分析（ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）において非Ｓｒｃ結合ＡＤＡＭ１５変異体と比較して、２〜３倍高い触媒活性を有することを示した（１７）。これらの研究はＡＤＡＭ触媒活性を腫瘍の攻撃性と結びつける初めてのものである。
【００４４】
更に、レプロリシンのＡＤＡＭ−ＴＳサブファミリーは、健康および疾患において重要なものとして浮上した。１９個のヒトタンパク質のうち、おそらく最もよく特徴付けられたメンバーは、止血中にフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）多量体化を中和する、ＡＤＡＭ−ＴＳ−１３、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）開裂酵素である。それらの血清における超大型のｖＷＦマルチマーの存在によって特徴付けられる血栓性血小板減少性紫斑病を保有する患者は、ｖＷＦのＡＤＡＭ−ＴＳ−１３媒介性の開裂を阻害する自己抗体を発現させる（１７）。重要なことには、これらの自己抗体のためのエピトープは、触媒ドメインの外側の領域に位置づけられた（１９）。ＡＤＡＭ−ＴＳメンバー（包括的にアグリカナーゼと称される）（ＡＤＡＭ−ＴＳ−１、−４、−５、−８、−９、１５および−２０）は、軟骨部ヒアレクタン（ｈｙａｌｅｃｔａｎ）のタンパク質分解を通して関節炎進行における重要な役割を担う（２０）。ＡＤＡＭ  ＴＳ−７および−１２の高度発現も疾患進行と相関し、かつ軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質（ＣＯＭＰ）（２０）の破壊を示した。面白いことには、最近の遺伝学研究は、ＡＤＡＭＴＳ−７をアテローム性動脈硬化のプロモーターとして特定した（２１）。
【００４５】
上記のＭＭＰおよびＡＤＡＭ／ＡＤＡＭ−ＴＳに加えて、アスタシンおよびパパリシン（ｐａｐｐａｌｙｓｉｎ）も疾患に関連する。アスタシン（例えばメプリンおよびＢＭＰ−ＴＬＬ（骨形成タンパク質およびトロイド様メタロプロテイナーゼ）も、いくつかの病状の進行との関連性が増加している（２２〜２４）。例えば、メプリンは、急性の腎臓の障害（ＡＲＦ）、尿路感染症（ＵＴＩ）および炎症性腸疾患に関連する炎症性のプロセスを促進する（２３）。メプリンの非特異性阻害剤、アクチノニンは、ＡＲＦのげっ歯類モデルにおいて腎障害の度合いを和らげることを示した（２２）。更に、ヒト尿におけるメプリン発現の研究は、高メプリンＡタンパク質レベルと活性のＵＴＩとの間の相関関係を特定した（２３）。まとめると、このデータは腎臓のおよび泌尿生殖器の病状においてメプリンの役割に関連する。ＢＭＰ−ＴＬＬは、コラーゲン線維形成およびＴＧＦベータ様「ケイロン」増殖分化因子８（ミオスタチンとしても知られるＧＤＦ８）、およびＧＤＦ１１（ＢＭＰｌ１としても知られる）のためのプロコラーゲンＩ〜ＩＩＩの処理を含む形態形成過程中のＥＣＭの生物発生およびその調整に関係し、筋組織および神経組織増殖の負のフィードバック阻害に関係することがそれぞれ知られている（２４）。ＩＧＦ結合タンパク質を開裂することで知られているパパリシンＡを含むパパリシンは、子癇前症進行に相関することを示した（２５）。
【００４６】
従って、本発明の一態様は、ＭＭＰおよびＡＤＡＭ遺伝子ファミリーの異なるメンバー、または疾患または障害（例えば、癌および／またはいくつかの付加的な病状）における治療的介入のための所望の標的である本明細書において記載されたような他のメトジンシンサブファミリーの複数の異なるメンバーを検出および／または標的とするための薬剤を提供する。本発明の薬剤は、既存のプロテアーゼインヒビター（阻害剤）に対して著しい利点を提供する。現在、概してメトジンシンのため、特にＭＭＰおよびＡＤＡＭ遺伝子ファミリーのメンバーのための特異的阻害剤の欠如は、異なるメトジンシンプロテアーゼ活性に関する疾患および状態の評価および／または治療における大きな障害であることが証明された。自然発生の阻害剤、ＴＩＭＰ（これらのうち４つがヒトにおいて見られる）は、概して、ヒトに見られる２３ＭＭＰの広域スペクトル性の阻害剤である（但し、特異性においていくつかの相違がそれらの間に存在する）。ＴＩＭＰ−１は、膜型ＭＭＰ、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１６、およびＭＭＰ−２４ならびにＭＭＰ−１９に対して比較的低い親和性を有する他の３つのＴＩＭＰよりもその阻害範囲においてより限定されている［４］。ＴＩＭＰ−３は、ＡＤＡＭおよびＡＤＡＭＴＳファミリーのいくつかのメンバーを含むより多くのメトジンシンを阻害することにおいて、哺乳動物のＴＩＭＰの中ではユニークなものである（４）。更に、自然発生のＴＩＭＰの研究は、これらの阻害剤がそれらのＭＭＰおよびＡＤＡＭブロック作用から独立して癌促進性特性を有し得ることを示唆し、かつ、これは合成活性部位阻害剤の開発に焦点を当てた（２７）。始め、合成阻害剤は、活性部位内の亜鉛イオンをキレート化する化学的グループに焦点を当てた（例えばヒドロキサメート）。このコンセプトに基づく阻害剤についての主な問題は、選択性の問題である。例えばＭＭＰに関し、選択性はペプチド模倣のバックボーンにおいて決定されるが、全選択性を授けず、他の無関係な金属キレート酵素およびサブファミリーに亘るメトジンシンの他のメンバーが通常阻害される（５、６、２７）。この選択性の欠如は、臨床的に使用される場合に、ＭＭＰ阻害剤の旧世代の不具合・失敗の主な理由であった。しかしながら、癌、心疾患および抗血管形成の治療のためのＭＭＰ阻害剤の後続する臨床試験もほぼ失敗した（３、８）。概して、ターゲットバリデーションは概して悪く、かつ阻害剤は、マトリキシン（ｍａｔｒｉｘｉｎ）の病的なメンバー、およびいくつかの場合においてメトジンシンの他のサブファミリー（ＡＤＡＭ等）を選択および標的とするために十分な特異性を欠如した。結果として、化学的阻害剤（特にヒドロキサメートおよびブタン酸の誘導体）を使用する手法は、ＭＭＰの所望の活性および不望の活性の両方を阻害したと考えられ、臨床的エンドポイントの非達成をもたらし、更には疾患進行が高まると考えられる。例えば、ＭＭＰ阻害剤マリマスタットの不具合は、ＡＤＡＭ９、１０、１７、および３３といったメトジンシンファミリーの多くのメンバーを含むその幅広い阻害プロファイルに部分的に帰し得る（４、８）。選択的ＡＤＡＭ阻害剤といわれるものに関し、今日まで最も印象的な化合物は、Ｉｎｃｙｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって開発されたＩＮＣＢ７８３９であった。この化合物はその先行物であるＩＮＣＢ３６１９に関連し、かつ、両方が亜鉛結合グループとしてヒドロキサメートを利用するが、ＡＤＡＭ８、９および３３といった他のファミリーメンバーに対してＡＤＡＭ１０および１７に対するいくらかの選択性を示す（１０）。しかしながら、ＩＮＣＢ３６１９は、ＡＤＡＭ１０および１７への作用のため、同様の服用量範囲にてＭＭＰ２、１２および１５を阻害し、前の世代のヒドロキサメート（ｈｙｄｏｘａｍａｔｅ）誘導体と同様、その選択性はメトジンシンサブファミリーまたはそれらの個々のメンバー間において限定されたことを示すことに留意されたい（１０）。
【００４７】
メトジンシンのメンバーおよび特にＭＭＰは病状において所望および不望の両方の役割を有するという高まりつつある認識は、疾患促進標的ひいては臨床標的として見なされる個々のファミリーメンバーに対するより大きな選択性を示す阻害剤を設計することに関して現在重要なファクターである（８）。この目的に関して、阻害効果が触媒のＺｎ２＋イオンとの相互作用に依る化合物からは明らかに離れてきている（５、６、８）。例えば、化学ライブラリーのスクリーニングは、基質結合クレフトから離れＭｅｔ−ｔｕｒｎとαＣとの間に位置するＳ１特異性ループにおいて結合する、選択的な非金属結合のＭＭＰ１３阻害剤を特定する。この非金属結合化合物は、亜鉛結合ヒドロキサメートとは構造的に異なり、かつ、Ｓ１「特異性」ループの融通性を制限することによって触媒作用を非競争的に阻害すると考えられる（５）。同様に、ＡＤＡＭに関し、構造・機能研究は、膜環境内の基質認識がジスインテグリンおよびシステインが豊富なドメイン（触媒ドメインの近位にある）を含む複数のドメインに対して分子接触を必要とすることを暗示している。従って、触媒活性の阻害剤のための所望の特異性を獲得する手段としてこれらの領域を標的とすることに著しい関心がある（４、６、８）。
【００４８】
治療的な化合物に加えて、特定のＭＭＰおよびＡＤＡＭの触媒活性度の測定も、診断的および予後的適用のために望ましい。癌の進行（腫瘍増殖、癌の転移、および血管形成を含む）に関する過程における様々なＭＭＰおよびＡＤＡＭの既知の役割は、疾患進行の重要なバイオマーカーとして特定のＭＭＰおよびＡＤＡＭ分子を特定することである（３、４、６、８）。しかしながら、複合生物試料におけるＭＭＰ活性度の測定の方法は、ファミリーメンバーのための特定の生理学的基質または合成基質の欠如によって、およびタンパク性基質を組み込む分析の期間および複雑性によって複雑なものにされる。例えば、ザイモグラフィは、ゼラチナーゼ活性度の測定のための好適な方法であり、かつ、タンパク質の複合混合物を分離するのに使用される変成ポリアクリルアミドゲルにゼラチン基質を組み込むことを伴う。分離されたタンパク質試料の復元の後、ゼラチナーゼ活性度の視覚化が、調査中のＭＭＰに対応する見掛けの分子量にてリーシスの透明帯を示すゲルの染色によってなされる。かかる分析（同時に高感度かつ定量）は２４時間以上かかる可能性があり、かつ、ゼラチンに対する特異性を欠くＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ１、７および１３）にとって適切ではない（２７）。
【００４９】
より迅速な分析は、クエンチンググループに並置される蛍光性グループをより大きなタンパク性基質から得られた特定のペプチド内に組み込むように設計されたペプチド基質の使用を利用する。ペプチド結合の開裂は、蛍光検出（蛍光エネルギー移動クエンチング）における増加を可能にする２つのグループを分離する。これは、ペプチド開裂結合に対するアミノ酸Ｃ末端が蛍光性グループに置換されるセリン・プロテアーゼとは異なり、ペプチド開裂結合の両側面においてアミノ酸を認識する（２８〜２９）ため不可欠である。これらのラベル付けされたペプチド基質は感度が良く、かつ非常に優位な分析完了時間を供するが、特異性は、表面に固定された特定の抗体を使用して生物試料から検出されるべきＭＭＰの免疫捕獲によって導入される（２９）。これらの抗体は特定のプロテアーゼと選択的に結合するがそれらを不活性化しないことが知られている。従って、現在の分析は、試料中の一または複数の特異的プロテアーゼのほとんどまたは全てを捕獲するように設計され、そして広い範囲のプロテアーゼのための基質として作用することができる点でプロテアーゼ特異的ではないペプチド基質（例えば、ラベル付けされた基質）を用いてそれらの活性度を評価するように設計された技術に基づく。いくつかの実施形態において、係る分析は、ＭＭＰ活性を定量化するために特定の抗体による生物試料からの標的ＭＭＰの完全捕捉に依存する。対照的に、記載された選択的阻害抗体は、分析を行う前に異なるプロテアーゼを分離する必要はなく生物試料において一または複数の所定のメトジンシンの活性を評価するために使用することができる。いくつかの実施形態において、試料におけるプロテアーゼ活性は、本明細書において記載された一または複数の選択的抗体阻害剤の存在下および不在下において非特異性基質を使用して分析することができる。選択的抗体の存在下および不在下において活性度の測定レベルが比較され、差し引かれ、あるいは試料において全プロテアーゼ活性に対する各所定のプロテアーゼの寄与（例えば、相対的寄与）を決定するために評価され得る。これは生物試料における関心のある各所定のプロテアーゼの活性レベルを判定するために使用することができる。
【００５０】
ＡＤＡＭタンパク質に関して、触媒活性を評価するための特定の方法はＭＭＰの産業上の経験から利益を得た。ＭＭＰのために設計された、蛍光クエンチされたペプチド基質は、高率が減少してもＡＤＡＭメンバーによって加水分解されることが観察された（３０、３１）。ＡＤＡＭ触媒活性度の測定のために生成された第１の蛍光性ペプチド基質は、ＡＤＡＭ１７によって認識されるＴＮＦα開裂ペプチドを利用する（３０）。テンプレートとしてこれを用い、ＭｏｓｓおよびＲａｓｍｕｓｓｅｎはハイスループットスクリーニング検査のために有用なＡＤＡＭ１７、８、１０および１２によって効率的に開裂された誘導体を開発した（３０）。更に、Ｆｏｕｒｉｅ他（３２）は、ＡＤＡＭ１５、８およびＭＤＣ−Ｌ（ＡＤＡＭ２８）がペプチドライブラリーのスクリーン後に類似する基質特異性プロファイルを有し、かつ、全て細胞表面からＣＤ２３を開裂することができたことを突き止め、よって、蛍光性基質設計のための更なるテンプレートを提供する。これらの研究は、ＡＤＡＭおよびＭＭＰの触媒活性の評価のためのペプチド基質が利用可能であるが、これらの基質がいくつかのファミリーメンバーによって加水分解されるため、生物試料内の個々の標的メトジンシン活性度の測定のために必要な特異性をつかむことができないことを確認した。上記の分析は、可溶性の環境において機能するメトジンシンのために使用されることに留意すべきであり、すなわち、それらの効率的な触媒機能のために生体細胞膜を必要としないことに留意すべきである。ＡＤＡＭおよびＭＴ−ＭＭＰのための分析は、組み替えにより作られた隔離された触媒ドメインを必要とし、またはその膜アンカリングα螺旋および細胞内の領域に分子が無い細胞外部分全体を必要とする。組織試料におけるＡＤＡＭおよびＭＴ−ＭＭＰの触媒活性度の判定は、機械または酵素組織破壊および無細胞物質の分離といった確立された手続きによって組織から細胞懸濁液または細胞単層を作ることを必要とする。
【００５１】
この技術背景において、本発明の複数の態様は、組織生検試料および体液（例えば、患部組織からの試料（前癌性組織および癌組織の生検試料等、消化管または間接といった炎症性の組織の生検試料等、および／または任意の適切な生物試料（血液、血清、尿、ふん便、唾液、滑液、脳脊髄液、胸膜液、腹水、腹腔洗浄液、腹膜透析液、心嚢液、および一般的な漿液等、またはこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない））を含む複合生物試料内のＭＭＰまたはＡＤＡＭとった標的メトジンシンの触媒活性度の測定のための分析様式を明確にするのに有用である方法および組成物を提供する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本発明のユニークな態様は、本明細書において記載された所定のプロテアーゼに対する優れた特異性を備える抗体の生成および／または適用である。例えば、特定のＡＤＡＭ１５抗体は、細胞に基づいた分析において約６０ｎＭのＩＣ５０を有する。これは抗体が高度のピコモルから中度のナノモル範囲における結合定数を備える高親和性を有することを示す。更にこれらの抗体は、４アミノ酸が可変の残基であるコンセンサスメトジンシン触媒のモチーフ内の約６〜７残基、構造エピトープを認識する。この結合特異性によって、これらの抗体は試料内の標的メトジンシンファミリーメンバーの触媒活性を特異的に中和する。同様に、他のメトジンシンプロテアーゼに対する特異的な阻害抗体（例えば、各々が、特定の目標プロテアーゼのためにピコモル〜ナノモル結合定数、および／または約２０〜２００ｎＭ（例えば細胞に基づいた分析において約６０ｎＭ）の阻害性ΙＣ５０を備える）は、対応する触媒クレフトエピトープを組み込むペプチド免疫原を使用して生成することができる（表３）。従って、試料内の標的メタロエンドペプチダーゼ活性の正確な推定は、特定の触媒クレフト特異的抗体の不在下および存在下において生物試料内の標的メタロエンドペプチダーゼの活性に従いおよび／またはこれと比較することで、幅広い特異性の蛍光性ペプチド基質または均等物の使用によっても作ることができる。特異的触媒クレフト特異的抗体によって処理さていない同一の試料と比較して抗体によって処理された試料の活性度の減少は、抗体によって特異的に不活性化されるメトジンシン（またはメトジンシンのグループ）に帰する活性に対応する。いくつかの実施形態において、特定のメトジンシンを特異的に不活性化する２つ以上の異なる抗体を、ある試料をこの試料におけるそのメトジンシンの活性のために分析するために使用することができる（例えば、活性度の絶対的レベルまたは活性度の相対的レベル（例えば活性度への寄与率）を判定するために）と理解されるべきである。しかしながら、いくつかの実施形態において、２つ以上の異なる抗体を、ある試料において２つ以上のメトジンシンの活性度を評価するために使用することができることも理解されたい（例えば、活性度の絶対的レベルまたは活性度の相対的レベル（例えば活性度への寄与率）を判定するために）。
【００５３】
ＡＤＡＭ１５の生物学的役割を研究するために、アミノ酸３４６〜３５９を包含する触媒クレフト由来ペプチド（３４６ＩＡＨＥＬＧＨＳＬＧＬＤＨＤ３５９）に対する多クローン性抗体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）が生成され、位置１をＡＤＡＭ１５の開始メチオニンに帰する（表３（ならびに文献３３および３４）を参照）。本発明の複数の態様によると、この領域は、触媒／活性部位アルファヘリックス（αＢ、ならびに文献１および２）のＣ末端部分と、ならびにポリペプチド鎖の鋭角な屈曲を可能にする特徴的なＧ残基の存在によって特徴付けられる降鎖とに対応する。この領域は、コンセンサスメトジンシン触媒のモチーフＨＥＢＸＨＸＢＧＢＸＨＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（第３の亜鉛配位ヒスチジンの後には、触媒活性ＡＤＡＭにおけるサブファミリー特異的アスパラギン酸塩が続く）を包含する。２つの異なる抗体は、他のいくつかのＡＤＡＭまたはＭＭＰの対応する領域から得られる同等のペプチドと交差反応しないという、ＡＤＡＭ１５のために優れた特異性を示した（３３、３４）。エピトープ解析は、両方の抗体が３５２ＨＳＬＧＬＤＨＤ３５９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を含むペプチドのＣ末端部分内の領域を認識し、かつ、サブファミリー特異的残基Ｄ３５９が両方のエピトープの重要な残基だったことを明らかにした。これは、これらのＡＤＡＭ１５抗体がこの位置においてＳ／Ｔ／Ｖを有するＭＭＰとなぜ交差反応するのかを説明する蓋然性が高い。
【００５４】
従って、これらの抗体は、メトジンシンの個々のサブファミリーメンバー間（例えば個々のＡＤＡＭ間）だけではなく、密接に関係するサブファミリー間（例えばＡＤＡＭおよびＭＭＰ間）の区別もすることができないことを示し、これは、触媒亜鉛を標的とする初期または後期世代の化学的阻害剤には見られない特徴である。更にこれらの抗体は、ＡＤＡＭ触媒活性を分析するために広く使用される細胞に基づいた分析においてＡＤＡＭ１５シェッディング（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）活性を選択的に阻害し、同じ基質をシェディングする他のＡＤＡＭの活性を阻害しない。メトジンシンの触媒クレフトコンセンサス領域を標的とし、それらの触媒活性を中和するために抗体を使用することは、高選択的メトジンシン阻害剤の世代への新規なアプローチを表す。本明細書において記載されたペプチド免疫原が高抗原性であり、かつこれらの領域が種間で保存されるため抗原選択性を授けることができ、免疫抗原性が低いと見られ得ることは注目すべきことである。免疫グロブリンと同程度に大きい分子がαＢとＭｅｔ−ｔｕｒｎ間のこの触媒クレフト領域に対して高親和性を伴って結合することができることも注目すべきことである（図１）。触媒機能をブロックするＭＭＰ１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）の表面ループ領域に対する抗体が以前に報告されているが、この抗体は触媒クレフトに向けられず（３６）、かつ上記のようにＡＤＡＭ−ＴＳ−１３の活性を阻害する自己抗体はこの分子の金属プロテアーゼドメイン内に結合しない。従って、本発明の特定の実施形態は、この特定のメトジンシンに結合することなしに、または特定の病状／疾患試料によって、前立腺または乳癌患者から得られた組織試料においてＡＤＡＭ１５触媒活性度の測定のために分析を提供する。
【００５５】
本発明の複数の態様によると、他のメトジンシンファミリーメンバーに対する特異的抗体は、特異的触媒クレフトエピトープを使用して生成することができる。例えば、表３は、ＳＥＱ  ＩＤ：ＮＯ３のコンセンサスメトジンシン触媒モチーフの特異的メンバーに結合する特異的抗体を生成するために使用することができる触媒クレフトペプチドを示す。異なるメトジンシン（ＡＤＡＭおよびＭＭＰファミリーメンバーを含む）の対応する領域が比較のために示されている。これらの例の各々における第３の亜鉛配位ヒスチジンの後にはサブファミリー特異的残基が続く。これらの領域の各々は（または特定のエピトープを含むそのより小さなフラグメント、またはこれらの領域もしくはエピトープを含むより大きなフラグメント（但し、Ｍｅｔ−ｔｕｒｎのＣ末端を含まず、および／またはＭｅｔ−ｔｕｒｎのＭｅｔを含まない）本明細書において記載されるような一または複数の特定のメトジンシンプロテアーゼを（例えば、対象において）分析し、および／または治療的に阻害するために有用である選択的抗体を生成するために使用することができる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、メトジンシンプロテアーゼの異なるサブセットと交差反応するメトジンシン抗体を生成するために、配列を共有する触媒クレフトから最小限のエピトープを使用することができ、かつ、いくつかの一般的なペプチド（非プロテアーゼ特異的配列）をＮ末端および／またはＣ末端側に加えることができ、構造を提供する（例えば、Ｎ末端側にらせん構造）。対照的に、単一特異的な抗体を生成するために、特定のエピトープペプチド（任意には、プロテアーゼ特異的Ｎ末端および／またはＣ末端ペプチドを備える）を抗体を生成するために使用することができる。
【００５７】
同様に、所望の治療の標的であるヒトに見られる他のメトジンシンの同等の領域は、高選択的阻害抗体を生成するために使用することができる。例は、表３に示されるそれらの配列を含むが、これらに限定されない。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載された一または複数の抗体は、治療的適用のために提供される。当業者は、興味のある異なる抗体のための最適治療計画および／または適切な服用量を決定することができる。例えば、投与の適切なレベルおよびタイミングを、所望の治療の結果を出すように決定することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載された治療は治癒をもたらすことができる（例えば治療される疾患または状態の終止または完全な緩解・寛解）。しかしながら、いくつかの実施形態において、治療される疾患または状態の進行を遅くし、（例えば部分的に）減少させ、または阻害する治療である場合にこの治療は有用であり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態において、一または複数の抗体および／またはペプチド（例えば、エピトープおよび／または免疫原）が、治療的使用のために提供され得る（例えば、一または複数の付加的な安定剤もしくは賦形剤または他の治療薬（例えば消毒される）と共に薬剤的にもしくは生理学的に親和性の緩衝剤））。いくつかの実施形態において、投与の様式は非経口（例えば腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、腔内または経皮的）である（但し、任意の他の適切な様式（例えば経口投与）が用いられ得る）。いくつかの特定の実施形態において、静脈注射または静脈内注入が用いられ得る。投与の任意の適切な箇所が用いられ得る。例えば、それらは、処置が必要な箇所にて局所的かつ直接的に投与され、あるいは、体内の適切な位置への標的化を容易にする要素に貼り付けられるか、関連付けられ得る（例えば接合される）。
【００６０】
いくつかの特定の実施形態において、任意の生理学的に親和性の担体、賦形剤、希釈剤、緩衝剤または安定剤を、本発明の組成物において使用することができる。適切な担体、賦形剤、希釈剤、緩衝剤および安定剤の例は、水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびこれらの組み合わせの一または複数を含む。いくつかの場合において、等張剤（例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、または塩化ナトリウム）を含み得る。組成物は付加的に平滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、甘味剤、香味料等を含み得る。いくつかの特定の実施形態において、本発明の組成物は、当該技術分野において周知の手続きを用いて対象に投与した後に活性成分の急速な放出、持続放出または遅延放出を提供するように製剤され得る。本明細書において記載されるように、いくつかの特定の実施形態において、組成物は注射に適切な形態であり、かつ、適切な担体が任意の適切な濃度で存在し得るが、例示的な濃度は１％〜２０％または５％〜１０％である。治療的組成物は典型的には製造および保存状態において安定しており、無菌でなければならない。係る無菌および安定状態を達成する適切な方法は周知であり、先行技術文献において記載されている。
【００６１】
いくつかの特定の実施形態において、本明細書において記載された抗体、その抗原結合フラグメント、および／またはペプチドに加えて、この組成物は更に、特定の乳房、前立腺癌、神経膠腫、非肺細胞癌または結腸直腸癌において癌を治療するために有用である他の薬剤といった一または複数の他の活性成分を含む。しかしながら、本発明の態様はこの点において限定されないため他の癌を治療することもできる。哺乳類の治療において使用されるべき組成物に包含される適切な付加的な活性薬剤は、当業者に知られており、組成物によって治療されるべき疾患の特性に依って選択することができる。適切な付加的な薬剤は、他の標的に結合する抗体を含み、サイトカン、および化学薬品、例えば、標準的化学療法剤（小分子薬剤）、放射線療法または副作用を制御する薬剤を含む。乳癌治療のために、適切な付加的な薬剤は抗Ｈｅｒ２／ＥＧＦＲ標的剤（例えば、ハーセプチンまたはタイカーブ）、抗腫瘍薬（例えば、ドキシルまたはタキソテール）またはアバスチンを含み得る。いくつかの実施形態において、複合抗血管新生製剤が提供され、例えば、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを血管新生阻害剤（例えば、アンジオポイエチン、アンギオスタチンおよび／またはエンドスタチン）と組み合わされる。いくつかの実施形態において、前立腺癌治療のために、適切な付加的な薬剤は、抗アンドロゲン治療薬（例えば、Ｚｙｔｉｇａ）、抗腫瘍薬（例えば、タキソテールまたはジェブタナ（Ｊｅｖｔａｎａ））またはアバスチンを含み得る。いくつかの実施形態において、複合抗血管新生製剤が提供され、例えば、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを血管新生阻害剤（例えば、アンジオポイエチン、アンギオスタチンおよび／またはエンドスタチン）と組み合わせる。いくつかの実施形態において、神経膠腫治療のために、適切な付加的な薬剤は抗腫瘍薬（例えば、テモゾロマイド）またはアバスチンを含み得る。いくつかの実施形態において、複合抗血管新生製剤が提供され、例えば、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを血管新生阻害剤（例えば、アンジオポイエチン、アンギオスタチンおよび／またはエンドスタチン）と組み合わせる。いくつかの実施形態において、非肺細胞癌のために、適切な付加的な薬剤は抗腫瘍薬（例えば、シスプラチン）またはアバスチンを含み得る。いくつかの実施形態において、複合抗血管新生製剤が提供され、例えば、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを血管新生阻害剤（例えば、アンジオポイエチン、アンギオスタチンおよび／またはエンドスタチン）と組み合わせる。いくつかの実施形態において、結腸直腸癌のために、適切な付加的な薬剤は抗ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、セツキシマブ）、抗腫瘍薬（例えば、オキサリプラチンまたはイリノテカン）またはアバスチンを含み得る。いくつかの実施形態において、複合抗血管新生製剤が提供され、例えば本発明の抗体または抗原結合フラグメントを血管新生阻害剤（例えば、アンジオポイエチン、アンギオスタチンおよび／またはエンドスタチン）と組み合わせる。
【００６２】
抗体またはその抗原結合フラグメントの適切な服用量、および／または本発明のペプチド（単体または任意の他の活性成分と組み合わせて（含まれるのであれば））は、患者ごとに変わり、特定の疾患の性質にもよる。いくつかの実施形態において、前記服用量は治療的に有効な量または予防的に有効な量をなし、関係する治療の性質に依存する。適切な服用量は患者の体重、年齢および性別ならびに疾患の重症度によって当業者または医師によって決定され得る。個々における所望の反応を引き出す結合タンパク質の能力も一因である。例示的な一日量は活性成分の０．１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、または０．１〜２００または１００ｍｇ／ｋｇ、または１〜５０または１〜１０ｍｇ／ｋｇである。これは、１回量としてまたは一日に２回以上投与される複数回量として投与され得る。しかしながら、適切な服用量は患者に依って変わり得、任意の特定の対象にとって、特定の投薬計画は患者の個々のニーズによって経時的に調整されるべきであることに留意されたい。よって、本明細書において記載した投与量範囲は例示的なものとみなされるべきであり、特許請求の範囲に記載した組成物の範囲に限定されない。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ペプチド（例えば、本明細書において記載されるようなエピトープおよび／または免疫原性ペプチド）は、対象における免疫反応を引き出すためのワクチンとして使用することができる。典型的には、ワクチン投与量は約１〜５ｍｇのペプチドである。しかしながら、他の量も用いることができ、上記事項と同様の考えを用いることができる。いくつかの実施形態において、免疫原性ペプチド（例えば、ワクチンとして）を本明細書において記載されたような抗体に加えて、対象に投与することができる（例えば、同時にまたは複数の重複する投与計画において投与される）。
【００６４】
本発明の態様は、任意の適切な抗体組成物を作成するために使用することができ、これには、全抗体（ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＤ）、多クローン性抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体および完全に合成および／または組み換え抗体（バクテリア、イーストおよび／または他の組換発現系（異なるメトジンシンに対する選択性を備えるＦａｂ領域を包含するように組み替えられ得るもの）において生成されたもの）を含む（これらに限定されない）と理解されるべきである。
【００６５】
当業者は、任意の適切な技術（動物に免疫性を与えること、多クローン性抗体を得ること、または単クローン抗体生成細胞株（例えばハイブリドーマ）を隔離および生成すること、および／または組換抗体生成細胞を組み替えること、治療的なヒト化等、またはこれらの任意の組み合わせを含む（これらに限定されない））を用いて本明細書において記載されたエピトープ／免疫原に基づく適切な抗体を生成することができる。免疫処置は、メトジンシンペプチド免疫原（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））および公知の様々なアジュバント賦形剤に化学的に結合された担体抗原を組み込むことができる。
【００６６】
表３
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＊ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７  ＡＤＡＭ１５抗体を生成するために使用されるペプチド免疫原。
Ｘは任意のアミノ酸を表す。Ｂはバルキーな非極性アミノ酸を表し、ＺはＤ、Ｓ／Ｔ、Ｅ、ＶまたはＰのいずれかを表す。
注意：ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰおよびＭＴ５−ＭＭＰは同一のモチーフを共有する。
【００６７】
実施例
いくつかの非限定的な実施形態において、分析は以下の成分の一または複数からなるかこれを含む。
【００６８】
１．  標的メトジンシンを包含する処理される生物試料：  この試料は、可溶性ファミリーメンバーが溶液中で触媒活性であるときであって、一方、ＡＤＡＭといった膜結合性のメトジンシンは天然細胞膜の維持を必要とする場合に、問題のメトジンシンのために適切に育成される。従って、可溶性メトジンシンのために、この試料は体液から得ることができ、あるいは組織から加工することができ、可溶性画分を生成する。この試料は適切な賦形剤で処理することができ、特定のメトジンシンの触媒作用のために最適化された適切な可溶性分析試料を生成する。任意の特定の製剤によって結合されることなく、賦形剤は、洗剤を主とするリーシス溶液、適切な極性および非極性溶媒、金属イオンおよび緩衝剤を含むことができ、最適ｐＨを維持する。天然細胞膜を必要とするメトジンシンのために、組織試料は、細胞懸濁液または単分子層を得るために確立された方法を使用して処理される。
【００６９】
２．  測定可能な基質：  特定の基質製剤によって制約されることなく、幅広いメトジンシン特異性またはより限定された特異性のいずれかのタンパク質、ペプチド、細胞結合型または合成有機化合物を主とする基質が使用され、これは、いくつかの実施形態において触媒作用を開始するために処理される分析試料を上回って加えられ得る。いくつかの実施形態において、測定可能な基質は細胞に現れた特定のメトジンシンの既知の標的であり得、よって、細胞上清（例えば、シェッディングされた細胞表面タンパク質）で測定される。
【００７０】
３．  基質開裂検出機構：  任意の特定の基質開裂検出機構に制約されることなく、この分析は分析試料に存在する標的とするメトジンシンによってこの基質の加水分解を量的に判定するための機構を含む。この検出機構は、蛍光エネルギー移動クエンチング技術、測色技術、発光技術、ラジオアイソトープ技術または化学発光技術を使用することができる。この検出機構は、分離技術の適用によって、開裂された基質が、処理される生物試料を包含する残りの反応混合物から（測定目的のために）区別されることを必要とし得る。例えば、前記シェディングされたタンパク性基質に対して特異的なＥＬＩＳＡ分析の使用によるかまたは類似する方法による、細胞上清内のシェディングされたタンパク性基質の量の決定。
【００７１】
４．  ＡＤＡＭ、ＭＭＰおよび／または他のメトジンシンプロテアーゼファミリー（例えば、レプロリシン、マトリキシン（ｍａｔｒｉｘｉｎ）、またはメトジンシンの他のサブファミリー）に対する中和特異性を備える触媒クレフト特異的抗体：  本明細書において使用される用語「抗体」は、少なくとも一つの抗原結合領域を含む免疫グロブリン分子または他の分子を指す。本明細書において使用される用語「抗体」は、全抗体（ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＤ）、多クローン性抗体、モノクローナル抗体、ヒト化、キメラ抗体、ヒト抗体、完全成および組み換え抗体、一本鎖抗体、他の形態の抗体もしくは特異的エピトープ結合剤、またはこれらの任意の組み合わせを含むことを意図する。
【００７２】
いくつかの実施形態において、この分析は、標的メトジンシンに帰する生物試料における触媒活性度を判定するように調合されたいくつかの反応混合物において上記の鍵となる成分を含み得る。いくつかの態様において、この反応混合物は異なる量の処理される生物試料を含有し得る。いくつかの特定の実施形態において、阻害性の触媒クレフト特異的抗体の量は変わり得る。いくつかの実施形態において、この反応混合物は、過度の外来基質を含有する。いくつかの実施形態において、特異的メトジンシン活性を標的としかつ中和するために作られた触媒クレフト特異的抗体は、外来基質の添加を介する触媒反応の開始の前に、処理される試料に添加される。基質の加水分解は、阻害抗体の存在下における完成まで続き得、この反応プロファイルは同一の反応混合物（この中では阻害性の触媒クレフト特異的抗体が非抗原結合制御抗体によって置換される）と比較され得る。阻害されない試料に比べて抗体阻害された試料における速度の減少および触媒作用の進行度は、標的とするメトジンシンに帰する触媒活性度を判定するために使用することができる。分析設計のいくつかの態様において、生物試料に存在する標的メトジンシンの量の正確な定量化は、阻害抗体の存在下および不在下における酵素反応のための速度定数の変化を判定することによって得られる。標的メトジンシンの同質の物質の存在下におけるゼロ次速度過程において基質の開裂を用いる標準化反応スキームの使用によって、反応速度対メトジンシン濃度の標準曲線の形成が可能となり、よって試料における標的メトジンシンの量を推定することができる。
【００７３】
任意の適切な分析様式を用いることができ、これには、溶液に基づく分析、固定化基質、細胞に基づいた分析、インビトロ分析、ＥＬＩＳＡ、マルチウェル様式（ｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ  ｆｏｒｍａｔ）、マイクロ流体様式、任意の適切なハイスループット様式等、またはこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されないと理解されるべきである。更に、任意の適切な検出技術（例えば蛍光法、生物発光法、化学発光法、アイソトープ法等、またはこれらの任意の組み合わせ）を基質開裂のために使用することができると理解されるべきである。例えば、膜結合性のＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）およびＡＤＡＭは天然膜環境における触媒活性度を実証するのみであり、よって細胞／組織に基づく分析の使用が必要である。例えば、固定されていない良性および腫瘍組織試料が収集され、細胞が市販の細胞分離キットを用いて隔離される。簡潔に言うと、組織がさいの目に切られ、適切な細胞媒体内に埋め込められる。細胞は、必要な培養期間、コラゲナーゼおよびＤＮＡｓｅの組み合わせによる酵素消化法によって組織から断片化される。この懸濁液は、より大きな未消化物質を除去するように７０〜１００μｍの無菌のメッシュフィルターを用いて濾過され得る。この濾過された懸濁液は、ＦＡＣまたはイムノビード（ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ）技術によって選別される細胞を分離するために１２００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかけられる。これらの細胞は、必要な細胞数にて適切な細胞媒体において懸濁されるか、単分子層を形成するように板状にされる。これらの分離された細胞におけるメトジンシン活性度は、いくつかの方法で測定することができる。いくつかの可能な分析を例として以下に記載する。
【００７４】
ａ）細胞試料は、市販の蛍光広域スペクトルＭＭＰ基質（例えば、ＯｍｎｉＭＭＰＴＭ蛍光原基質（Ｍｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２・ＡｃＯＨ［Ｍｃａ＝（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル；Ｄｐａ＝Ｎ−３−（２、４−ジニトロフェニル）−Ｌ−ａ，β−ジアミノプロピオニル（ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）］）を含有する９６ウェル・ポリスチレンプレート（９６−ｗｅｌｌ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｐｌａｔｅ）において分析することができる。蛍光性は、励磁３２８ｎｍおよび放射電磁波３９３ｎｍ、ならびに異なる実験グループ間で比較される相対的蛍光単位となり得る。特定のメトジンシン活性度を判定するために、同等の試料がアイソタイプ特異的メトジンシン選択性の触媒活性中和抗体または制御抗体で前処理され、かつ、２つの処理される試料間の活性の違いが、調査中のメトジンシンサブタイプの特異的活性を生み出す。
【００７５】
ｂ）組織試料から隔離された細胞は、メトジンシン・シェディング活性度を判定するために使用することができる。例えば、公知の内在的に放出された基質は、公知の基質（例えばＡＤＡＭ１２のためのＨＢ−ＥＧＦ）に対して特異性のＥＬＩＳＡまたは類似する定量的検出システムを用いてこの隔離された細胞から得られる上清において測定することができる。あるいは、標的メトジンシンのための公知の基質は、酵素で標識した構成（例えばアルカリ性ホスファターゼ標識）として開発され得、この構成は、隔離された細胞に核酸を一時的に導入され、シェディングは上清における標識酵素活性の測定値として判定される。（シェディング分析、文献）。特定のメトジンシン活性度を判定するために、同等の試料がアイソタイプ特異的メトジンシン選択性の触媒活性中和抗体または制御抗体で前処理され、かつ、２つの試料におけるシェドタンパク質（ｓｈｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のレベルの違いが、調査中のメトジンシン金属プロテアーゼの比活性を生み出す。
【００７６】
標準的免疫方法が、触媒クレフト特異的抗体を生成するために使用され得る（例えば、Ｒａｈｍａｎ他（３３、３４）に記載されたように）。しかしながら、本発明の態様によると、免疫方法を明確にする特徴は、メトジンシン触媒クレフト共通配列および隣接残基（例えば、ＡＤＡＭ１５  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸Ｉｌｅ３４６−Ａｓｐ３５９、表３）を含む、ユニークな免疫原性ペプチド抗原の使用であり、これにより、標的メタロエンドペプチダーゼの触媒クレフトに向けられた抗体を引き出す。ＡＤＡＭ１５のために、得られた特異的な触媒作用中和抗体は、特徴的なグリシン（Ｈｉｓ３５２−Ａｓｐ３５９）を組み込む８つの残基のストレッチ内に定義されたエピトープに対する特異性を示した。従って、この領域は、重要な免疫原性領域を表し得（共通配列ＨＸＢＧＢＸＨＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）またはＨＸＢＧＢＸＤＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｂは可変のバルキーな非極性残基を表し、Ｚはサブファミリーに依って保存アスパラギン酸塩、セリン／トレオニン、グルタミン酸塩、バリンまたはプロリン）、この領域に対して優れた特異性の抗体が触媒活性の阻害を促進する標的メトジンシンの触媒クレフトに結合する。この特異性はＸ、ＢおよびＺで表されるアミノ酸の組み合わせによって授けられるように思われ、ここで、位置ＸおよびＢでのアミノ酸の特性は個々のメトジンシン特異性を授け、および位置Ｚでのアミノ酸はサブファミリー特異性を授け、または両方の態様の組み合わせである。従って、本明細書において記載された分析は、本明細書において記載された領域を包含する触媒クレフト免疫原性ペプチドまたは本明細書において記載された領域の一部を組み込む同一の近傍からのペプチドに対応するペプチド免疫原の使用を採用し、標的メタロエンドペプチダーゼの触媒クレフトに向けられる中和抗体の生成を必要とする。この分析設計に対する係る抗体の生成および適用は本技術の新規性および進歩性を有する特徴を表す。従って、例として、領域３４５ＬＡＨＥＬＧＨＮＦＧＭＮＨＤ３５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）（これに限定されない）に対応するヒトＡＤＡＭ１２のためのペプチド免疫原が、配列３５１ＨＮＦＧＭＮＨＤ３５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）（これに限定されない）内のエピトープを認識しやすい選択的抗体を生成すると予想される。同様に、領域４０３ＴＴＨＥＬＧＨＮＦＧＡＥＨＤ４１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を包含するヒトＡＤＡＭ１７のためのペプチド免疫原は、領域４０９ＨＮＦＧＡＥＨＤ４１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）（これに限定されない）内のエピトープを認識しやすい選択的抗体を生成し、その他も同様である。
【００７７】
本明細書において参照した特許および文献はそれらの全体をここに組み込む。争いがある場合、本明細書の教示内容が、明らかな誤記がある場合を除き、支配する。
【００７８】
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【国際調査報告】
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