(57)【要約】システム及び方法は、核酸を約５ｋｂｐ〜約２０ｋｂｐの範囲の平均核酸サイズに断片化するために用いられる処理装置を含む。処理装置は、試料の大部分が剪断領域を通って流れる間、剪断領域の進入口に比較的一定の圧力（例えば、変動が約４０％未満である圧力）を確立して維持するように構成された、剪断領域より上流の流入部分とチャネルとを含み得る。一部の実施形態では、試料を剪断領域を通して１回流れさせた後、処理装置を遠心機から取り出し、反転させて遠心機に戻すことにより、試料を再び剪断領域に通してもよい。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる核酸を断片化する処理装置であって、
核酸を含む前記試料を受け入れる流入部分と、
前記流入部分と流体連通するチャネルであって、容積を有するチャネルと、
前記チャネルと流体連通する剪断領域であって、前記試料が前記剪断領域を通って流れると同時に前記試料中の前記核酸を断片化するように構成された剪断領域において、前記流入部分及び前記チャネルは、試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、前記チャネル容積の少なくとも２倍の試料容積を有する試料に対して、前記剪断領域の進入口で比較的一定の圧力を維持するように配置構成される、剪断領域と、
前記剪断領域と流体連通し、断片化された前記核酸を含む試料を前記剪断領域から受け取る回収部分であって、前記流入部分、前記チャネル、前記剪断領域及び当該回収部分は、核酸を含む前記試料を前記流入部分から前記チャネル及び前記剪断領域を通して当該回収部分へと移動させるために、フローアクチュエータと共に使用するように配置構成される、回収部分、とを備える装置。
【請求項２】
前記剪断領域は、前記試料が前記剪断領域を通って流れると同時に、４０ｋｂｐ〜１Ｇｂｐの平均核酸サイズから約５ｋｂｐ〜約２０ｋｂｐの平均核酸サイズへの前記試料中の核酸の断片化を生じさせるように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、前記剪断領域の前記進入口の圧力を初期圧力の約４０％以下の範囲内に維持するように配置構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記チャネルは約５ｍｍ〜約２０ｍｍの長さを有する、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、ほぼ一定の試料高さを維持するように配置構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、前記剪断領域の進入口で比較的一定の容積流量を維持するように配置構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、前記剪断領域の進入口の容積流量を初期容積流量の約５０％以内に維持するように配置構成される、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記流入部分の断面積は前記チャネルの断面積の５倍以上である、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、前記チャネル容積の少なくとも５倍の試料容積を有する試料に対して、前記剪断領域の進入口で比較的一定の圧力を維持するように配置構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記流入部分及び前記チャネルは、前記剪断領域を通って流れる試料の速度が、試料が前記剪断領域を通って流れる間に前記流入部分内を流れる試料の速度より大きくなるように配置構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記剪断領域は、前記試料が前記剪断領域を通って流れる方向と垂直な角度を形成する壁を有する進入口部分を備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記フローアクチュエータは遠心機を備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記流入部分、前記チャネル、前記剪断領域及び前記回収部分は、前記遠心機において第１の向き又は前記第１の向きに対して反転させた第２の向きのいずれかで使用されるように配置構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記剪断領域は、直列構成で配置された複数のオリフィスを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記複数のオリフィスは第１オリフィスと第２オリフィスとを含み、前記第１オリフィスは前記第２オリフィスより大きい断面積を有する、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記試料は細胞を含み、前記剪断領域は、前記試料が前記剪断領域を通って流れるときに前記細胞の溶解を生じさせるように配置構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
前記剪断領域のうち前記試料と接触する部分は、ガラス、サファイア、ルビー、金属又はセラミックのなかの少なくとも１つを含む材料から形成される、請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
前記剪断領域は、約１０ミクロン〜約１００ミクロンの幅及び約１００ミクロン〜約２０ｍｍの長さを有するオリフィスを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
前記流入部分は、核酸を含む前記試料を受け入れる漏斗形のリザーバを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項２０】
試料中に含まれる核酸を断片化する処理装置であって、
核酸を含む前記試料を受け入れる流入口と、
前記流入口と流体連通する剪断領域であって、試料が前記剪断領域を通って流れると同時に前記試料中の前記核酸を断片化するように構成された剪断領域と、
前記剪断領域と流体連通し、前記断片化された核酸を含む試料を前記剪断領域から受け取る回収部分であって、前記流入口、前記剪断領域及び当該回収部分は、遠心機において第１の向き又は前記第１の向きに対して反転させた第２の向きのいずれかで使用するように配置構成される回収部分と、を備える装置。
【請求項２１】
前記剪断領域は、前記試料が前記剪断領域を通って流れると同時に、４０ｋｂｐ〜１Ｇｂｐの平均核酸サイズから約５ｋｂｐ〜約２０ｋｂｐの平均核酸サイズへの前記試料中の核酸の断片化を生じさせるように構成される、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
前記第１の向きは、遠心機の回転中心から離れる方向を向く第１の端部と、前記遠心機の回転中心に向かう方向を向く第２の端部と、を含み、前記第２の向きは、前記遠心機の回転中心から離れる方向を向く前記第２端部と、前記遠心機の回転中心に向かう方向を向く前記第１端部と、を含む、請求項２０に記載の装置。
【請求項２３】
前記回収部分は、前記断片化された核酸を含む前記試料を前記剪断領域から受け取るための蓋を備える、請求項２０に記載の装置。
【請求項２４】
前記流入部分は、前記核酸を含む試料を受け入れる漏斗形のリザーバを含む、請求項２０に記載の装置。
【請求項２５】
前記試料は細胞を含み、前記剪断領域は、前記試料が前記剪断領域を通って流れるときに前記細胞の溶解を生じさせるように配置構成される、請求項２０に記載の装置。
【請求項２６】
前記剪断領域のうち前記試料と接触する部分は、ガラス、サファイア、ルビー、金属又はセラミックのなかの少なくとも１つを含む材料から形成される、請求項２０に記載の装置。
【請求項２７】
前記剪断領域は、約１０ミクロン〜約１００ミクロンの幅及び約１００ミクロン〜約２０ｍｍの長さを有するオリフィスを備える、請求項２０に記載の装置。
【請求項２８】
前記流入部分及び前記剪断領域と流体連通するチャネルをさらに備え、前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、前記剪断領域の進入口で比較的一定の圧力を維持するように配置構成される、請求項２０に記載の装置。
【請求項２９】
前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、一定の試料高さを維持するように配置構成される、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
前記チャネルは約５ｍｍ〜約２０ｍｍの長さを有する、請求項２８に記載の装置。
【請求項３１】
前記流入部分及び前記チャネルは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間、前記剪断領域の進入口で比較的一定の容積流量を維持するように配置構成される、請求項２８に記載の装置。
【請求項３２】
前記流入部分及び前記チャネルは、前記剪断領域を通って流れる試料の速度が、試料が前記剪断領域を通って流れる間に前記流入部分内を流れる試料の速度より大きくなるように配置構成される、請求項２０に記載の装置。
【請求項３３】
試料中に含まれる核酸を断片化する方法であって、
核酸を含む前記試料を少なくとも１つの処理装置の流入部分に提供するステップと、
前記少なくとも１つの処理装置の前記流入部分から剪断領域を通して第１の方向に前記試料を流れさせるステップと、
前記試料が前記剪断領域を流れる際に前記試料中の核酸に剪断力を加えて前記核酸を断片化するステップと、
前記試料が前記剪断領域を流れている処理時間の大部分にわたって、前記剪断領域に至る進入口で比較的一定の圧力を維持するステップと、
断片化された核酸を含む前記試料を回収領域に回収するステップと、を含む方法。
【請求項３４】
前記試料中の前記核酸に剪断力を加えるステップは、約４０ｋｂｐ〜１Ｇｂｐの初期平均核酸サイズを有する核酸を約５ｋｂｐ〜約２０ｋｂｐの平均核酸サイズに断片化するステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
核酸に剪断力を加えるステップは、前記試料中の前記核酸を、前記流入部分に提供される前記試料の初期平均核酸サイズの半分以下の最終平均核酸サイズに断片化するステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの処理装置の前記剪断領域を通して前記試料を少なくとも２回流れさせるステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの処理装置を第１の向きから第２の向きに反転させて、前記少なくとも１つの処理装置の前記剪断領域を通して前記第１の方向と逆の第２の方向に前記試料を流れさせるステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの処理装置の剪断領域を通して前記試料を流れさせるステップは、前記剪断力が核酸に加えられている処理時間の大部分にわたって、比較的一定の容積流量で剪断領域を通る前記試料の流れを引き起こすステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記剪断力が核酸に加えられている処理時間の大部分にわたって、比較的一定の容積流量で前記剪断領域を通る前記試料の流れを引き起こすステップは、初期容積流量の約５０％以内にとどまる速度で前記試料を前記剪断領域に通して流すステップを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの処理装置の剪断領域を通して前記試料を流れさせるステップは、前記剪断力が核酸に加えられている処理時間の大部分にわたって、前記剪断領域と流体連通している前記試料の一定の試料高さを維持するステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの処理装置の剪断領域を通して前記試料を流れさせるステップは、前記試料の大部分が前記剪断領域を通って流れる間に前記流入部分を流れる前記試料の速度より大きい速度で試料を前記剪断領域に通して流すステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
試料中に含まれる核酸を断片化する方法であって、
核酸を含む前記試料を少なくとも１つの処理装置の流入部分に提供するステップと、
遠心機が発生する力によって、前記少なくとも１つの処理装置の剪断領域を通して前記試料を流れさせるステップと、
前記試料が前記剪断領域を流れる際に前記試料中の核酸に剪断力を加えて前記核酸を約１０ｋｂｐ未満の平均核酸サイズに断片化するステップと、
断片化された核酸を含む前記試料を回収領域に回収するステップと、を含む方法。
【請求項４３】
前記試料中の前記核酸に剪断力を加えるステップは、約４０ｋｂｐ〜１Ｇｂｐの初期平均核酸サイズを有する核酸を約１０ｋｂｐ未満の平均核酸サイズに断片化するステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
核酸に剪断力を加えるステップは、前記試料中の前記核酸を、前記流入部分に提供される前記試料の初期平均核酸サイズの半分以下の最終平均核酸サイズに断片化するステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの処理装置を第１の向きから第２の向きに反転させ、前記少なくとも１つの処理装置の前記剪断領域を通して前記第１の方向と逆の第２の方向に前記試料を流れさせるステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記剪断力が核酸に加えられている処理時間の大部分にわたって、前記剪断領域に至る進入口で比較的一定の圧力を維持するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１０年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／３８６，３９２号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書に記載される態様は、核酸などの材料を断片化する処理装置及び方法に関する。ある場合には、処理装置は剪断領域を含んでもよく、この剪断領域を通って試料が好適に流れると、試料中の核酸又は他の巨大分子が断片化される。
【背景技術】
【０００３】
溶液をポンピングして小径の穴又は毛細管の中に通すと、溶液に大きい速度勾配が生じることが知られている。ＤＮＡを含む溶液では、かかる速度勾配は、溶液中のＤＮＡを断片化する剪断力をもたらす。数多くの用途において、ＤＮＡを有する溶液を小径の穴を通して押し込んだり引き込んだりするためにポンプが用いられる。しかしながら、そのような実施方法では多くの問題が生じ得る。ポンピングする方法を利用してＤＮＡの液体試料を小径の毛細管穴に押し込んだり引き込んだりする既存のシステムは、高価であるばかりでなく、ＤＮＡ試料の損失及び交差汚染を極めて起こしやすいものであり得る。さらに、ポンピングによって小径の穴にＤＮＡ試料を前進させたり後退させたりすることはまた、時間のかかる煩わしいプロセスでもあり得る。
【０００４】
例えば、システムによっては、ＤＮＡ溶液はシリンジによって流入口から剪断オリフィスの中へと押し込まれ、ここで溶液は、剪断オリフィス内で約２０回、繰り返し押し込まれたり引き込まれたりする。このプロセスは、最大２０分かかることもあり、一度に一つのＤＮＡ溶液に対してのみ実施される。さらに、シリンジを使用して剪断オリフィス内でＤＮＡ溶液を押し込んだり引き込んだりすると、ボイド容量が生じ、そこで元の溶液の一部が失われる。オリフィスの目詰まりが発生して、フロー管の圧力が原因となって漏出が起こることもまた知られ、この漏出もまた、一定量の損失溶液をもたらし得る。試料が順々に用いられる場合には剪断システムにおける交差汚染が問題となるため、このシステムでは洗浄工程が必要となることが多く、洗浄工程は時間を要し得るばかりでなく、確実な汚染の防止にはならない。剪断オリフィスを通るＤＮＡ試料の動きを生じさせる既存のシステムは、システムを通じた圧力及び流量を調節する（例えば、剪断オリフィスに至る進入口領域の圧力を確立して維持する）ことができず、望ましくない結果となる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、米国特許出願公開第２００６／０１３３９５７号明細書に記載されるものなどの従来の剪断装置の性能が比較的低くなるのは、少なくともある程度は、剪断領域で試料流体の適切な圧力及び／又は流量が確立されないためであり得ることを認識した。すなわち、本発明者らは、オリフィスにおける剪断の働きが、少なくともある程度は、オリフィスにおける流体の圧力及び流体の流量並びに剪断オリフィスのサイズなどの他のパラメータに依存することを見出した。剪断オリフィスの圧力及び／又は流量が不十分である及び／又は変動すると、剪断性能が低下し、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸分子の剪断に一貫性がなくなり、そのため核酸断片が所望のサイズより大きくなること又は望ましい分布の核酸断片が得られないことが見出された。従来の剪断装置では、所望の結果をもたらすために不完全に剪断された材料を剪断オリフィスに数回、例えば最大１０〜２０回通さなければならないため、非効率な剪断によって剪断プロセスは複雑化し得る。
【０００６】
本発明の態様は、分子の効率的な剪断を提供するため、剪断オリフィス（例えば進入口）に適切な圧力、流量及び／又は他のパラメータを確立して維持するように動作する核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）などの分子の剪断方法及び装置を提供する。例えば、本発明の態様における一部の実施形態は、当初のサイズが約４０ｋｂｐ〜ゲノムサイズの核酸（例えば、数Ｍｂｐ、最大１Ｇｂｐのサイズ）の範囲である核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を、ある場合には剪断装置を通る１回のパスから、得られる核酸断片のサイズが約５〜２０ｋｂｐとなるように剪断することを提供する。核酸分子の剪断は、適切な試料材料が入った剪断装置を遠心機に置き、続いて遠心機中の装置をスピンさせることにより実施され得る。遠心機により生じる力が、試料材料を装置の１以上の剪断領域を通して動かす駆動力を提供し得る。一部の実施形態では、剪断装置は２以上の剪断領域を備えてもよく、それにより例えば、剪断断片の９０％以上が１０ｋｂｐより小さいサイズ（例えば、約５ｋｂｐ）である完成試料など、均一なサイズの剪断断片を有する最終生成物が提供され得る。
【０００７】
一部の実施形態では、処理装置における剪断領域の進入口の圧力は、例えば処理装置の流入口及びチャネルの構造の結果として、試料の大部分が剪断領域を通って流れる間、比較的一定であるように確立されて維持される。ある場合には、剪断領域の進入口の圧力は、試料の大部分が剪断領域を通って流れる間、初期圧力の約４０％以内に維持され得る。一部の実施形態では、流入口の断面積は、チャネルの断面積より実質的に大きくてもよい。一部の実施形態では、流入口の容積は、チャネルの容積より実質的に大きくてもよい。チャネルと比較して流入口の断面積及び／又は容積が大きいため、流入口における剪断オリフィスに対する表面レベル高さが比較的変化しないまま、試料が剪断オリフィスを通って流れることが可能になり得る。このように表面レベル高さの変化が比較的小さいことは、剪断オリフィスにかかるヘッド圧を比較的一定に維持するのに役立ち、剪断作用の向上に役立ち得る。
【０００８】
一部の実施形態では、剪断装置に導入された核酸の剪断は、核酸を有する試料材料を剪断領域に通す動きを２回以上生じさせることにより、２回以上実施されてもよい。例えば、遠心機をアクチュエータとして使用して、試料材料を剪断領域に通して流してもよい。続いて、遠心機から剪断装置を取り出して反転させ、反転した配置で遠心機に戻してもよい。剪断装置を再度遠心力に供すると、試料材料が剪断領域を通って逆戻りし、それにより試料材料にさらなる剪断力が加わり得る。従って、好適な剪断装置は、遠心機で処理され、続いて反転され、次に再び遠心機で処理され得る。かかる処理スキームを必要に応じて何回でも用いることができる。
【０００９】
従って、本発明の態様はまた、核酸及び／又は他の材料を望ましいサイズ範囲及び分布の核酸サイズに断片化するために用いられる処理装置及び方法にも関する。処理装置は、核酸を含む試料を受け入れる流入口と、試料が流入口から剪断領域を通って好適に流れると同時に試料中の核酸を断片化する剪断領域と、を含む。剪断領域の幾可学的形状により、ある核酸濃度の試料が適切な速度及び／又は圧力で流入口から剪断領域を通って流れると、試料に剪断力が加わって核酸間の結合が破壊される。一部の実施形態では、流入口は、剪断領域の剪断オリフィスと流体連通するチャネルを有し得る。このチャネルは、オリフィスの試料をほぼ一定の又は他の望ましい流量又は圧力とするように構成され得る。例えば、チャネルの形状は、剪断領域に対するヘッド高さを比較的一定に維持しながら試料流体を剪断領域に誘導する働きをする好適な漏斗状であってもよい。チャネルより上側の流入口の部分は、チャネルと比べてサイズ、例えば断面積が大幅に大きくてよく、それにより比較的広範囲の試料容積について、オリフィスより上側の試料のヘッド高さが維持され得る。処理装置はまた、剪断領域から断片化された核酸を受け取る回収部分も含む。
【００１０】
流入口から剪断領域を通って回収部分に入る核酸を含む試料の流れを生じさせるため、１以上の処理装置がフローアクチュエータと組み合わされてもよく、フローアクチュエータが発生する力により、処理装置の剪断領域を好適な速度で通る試料の流れが生じる。一部の実施形態では、フローアクチュエータは、試料をポンプと接触させることなく処理装置を通る試料の流れを生じさせる力を生成する。例えば、フローアクチュエータは、剪断領域を通して試料を流れさせる圧力を流入口に作り出す遠心機又は空気（若しくは他の気体）ポンプであってもよい。従って、フローアクチュエータが遠心機である場合、処理装置の流入口、剪断部分及び回収部分は、遠心機の中に置かれてそこで用いられるように配置構成される。
【００１１】
本発明の別の態様では、試料中の核酸を断片化するシステム及び方法が記載され、ここでは試料の全容積が剪断領域を通して流される。例えば、処理装置を遠心機で用いるように適切に構成することにより、処理装置の流入口に提供される試料の全容積が剪断領域を通って回収領域へと送り込まれ得る。従って、試料中の核酸の断片化完了時に発生し得る試料の損失は、ごく僅かであるか又は全くない。これは、剪断オリフィスを通る試料の流れをシリンジポンプの動作によって生じさせるいくつかの剪断構成とは対照的である。かかる装置では、試料の一部がシリンジポンプの「デッドスポット」及び／又は剪断領域に捕捉され、なぜなら、単純に、シリンジ機構では全ての試料をシリンジから押し出して剪断領域に通すことができないためである。別の態様では、既存の剪断構成で必要であろう処理時間と比べて短い時間で試料中の核酸が所望の平均核酸サイズに処理され得る。例えば、ある初期平均核酸サイズを有する核酸を含む試料が、初期平均核酸サイズの半分以下の（例えば、５０ｋｂｐから５〜２０ｋｂｐに至るまでの）最終平均核酸サイズへと、１分未満又はさらには３０秒未満で断片化され得る。一部の実施形態では、処理装置の剪断領域を１回通って流れるだけの核酸を含む試料が、核酸の最終平均核酸サイズが試料の初期平均核酸サイズの半分以下となるように剪断され得る。
【００１２】
本発明の他の態様は、処理装置の幾可学的形状、例えば剪断領域又はその近傍における装置の幾可学的形状に関する。一部の実施形態では、処理装置の剪断領域は、試料が剪断領域を通って流れる方向に実質的に垂直な角度を形成する壁（例えば、内壁又は外壁）を有する進入口部分を含む。一部の実施形態では、処理装置の流入口の一部分が、試料の所望の圧力、流量又は他のパラメータを維持するように漏斗形である。例えば、処理装置の流入口は、流入口の遠位端領域の断面積より大きい断面積の進入口領域を有することができ、ここで流入口の遠位端は装置の剪断領域へと通じる。流入口の遠位端は、剪断オリフィスへと通じるチャネルを備え得る。チャネルは、オリフィスを通る試料の流れの大部分について、オリフィスを通る試料の流れが好適な流量範囲内にとどまるように構成された導管を提供し得る。一部の実施形態では、試料の大部分が処理装置を通って流れる間、流入口及びチャネルが剪断オリフィスに対して一定の試料高さを維持し得ることで、剪断オリフィスに比較的一定の所望の圧力が生じ、剪断オリフィスを通る好適な流量が促進される。
【００１３】
例示的な実施形態において、試料中に含まれる核酸を断片化する処理装置が提供される。この装置は、核酸を含む試料を受け入れる流入部分と、流入部分と流体連通するチャネル容積を有するチャネルと、チャネルと流体連通する剪断領域であって、試料が剪断領域を通って流れると同時に試料中の核酸を断片化するように構成された剪断領域において、流入部分及びチャネルは、試料の大部分が剪断領域を通って流れる間、その試料の容積がチャネル容積の少なくとも２倍である場合に、剪断領域の進入口に比較的一定の圧力を維持するように配置構成される、剪断領域と、剪断領域と流体連通し、剪断領域から断片化された核酸を含む試料を受け取る回収部分と、を含み、ここで流入部分、チャネル、剪断領域及び回収部分は、フローアクチュエータと共に使用することで、核酸を含む試料を流入部分からチャネル及び剪断領域を通して回収部分へと動かすように配置構成される。一部の実施形態では、流入部分及びチャネルは、試料の大部分が剪断領域を通って流れる間、その試料の容積がチャネル容積の少なくとも４、５、６、８、１０倍又はそれ以上である場合に、剪断領域に至る進入口に比較的一定の圧力を維持するように構成され得る。
【００１４】
別の例示的な実施形態において、試料中に含まれる核酸を断片化する処理装置が提供される。この装置は、核酸を含む試料を受け入れる流入部分と、流入部分と流体連通する剪断領域であって、試料が剪断領域を通って流れると同時に試料中の核酸を断片化するように構成された剪断領域と、剪断領域と流体連通し、剪断領域から断片化された核酸を含む試料を受け取る回収部分と、を含み、ここで流入部分、剪断領域及び回収部分は、遠心機において第１の向き又は第１の向きに対して反転させた第２の向きのいずれかで用いるように形成及び構成される。
【００１５】
さらなる例示的な実施形態において、試料中に含まれる核酸を断片化する方法が提供される。この方法は、核酸を含む試料を少なくとも１つの処理装置の流入部分に提供するステップと、試料を少なくとも１つの処理装置の剪断領域を通して第１の方向に流れさせるステップと、試料が剪断領域を流れるときに試料中の核酸に剪断力を加えて核酸を断片化するステップと、核酸に剪断力が加えられる処理時間の大部分にわたって、剪断領域に至る進入口で比較的一定の圧力を維持するステップと、断片化された核酸を含む試料を回収領域に回収するステップと、を含む。
【００１６】
さらに別の例示的な実施形態において、試料中に含まれる核酸を断片化する方法が提供される。この方法は、核酸を含む試料を少なくとも１つの処理装置の流入部分に提供するステップと、遠心機が発生する力により試料を少なくとも１つの処理装置の剪断領域を通して流れさせるステップと、試料が剪断領域を流れるときに試料中の核酸に剪断力を加えて核酸を約１０ｋｂｐ未満の平均核酸サイズに断片化するステップと、断片化された核酸を含む試料を回収領域に回収するステップと、を含む。
【００１７】
例示的な一実施形態において、核酸を断片化する処理装置が提供される。この装置は、核酸を含む試料を受け入れる流入部分と、流入部分と流体連通する剪断領域であって、試料が流入部分から剪断領域を通って流れると同時に、試料中の核酸を断片化するように構成された剪断領域と、剪断領域と流体連通し、剪断領域から断片化された核酸を含む試料を受け取る回収部分と、を含む。流入部分、剪断領域及び回収部分は、核酸を含む試料を流入部分から剪断領域を通して動かすために、遠心機において使用するように配置構成される。
【００１８】
別の例示的な実施形態において、核酸を剪断して断片化された核酸を生じさせるシステムが提供される。このシステムは、少なくとも１つの処理装置とフローアクチュエータとを含む。少なくとも１つの処理装置は、核酸を含む試料を受け入れる流入部分と、剪断領域であって、試料が剪断領域を通って流れると同時に試料中の核酸を断片化するように構成された剪断領域と、剪断領域から断片化された核酸を含む試料を回収するための回収部分と、を含む。フローアクチュエータは、少なくとも１つの処理装置と組み合わされ、試料をポンプと接触させることなしに、少なくとも１つの処理装置の流入部分から剪断領域を通って回収部分に入る試料の流れを生じさせる力を発生するように構成される。
【００１９】
別の例示的な実施形態において、核酸を断片化する方法が提供される。この方法は、核酸を含む試料を少なくとも１つの処理装置の流入部分に提供するステップと、試料をポンプと接触させることなく、試料を少なくとも１つの処理装置の剪断領域を通して流れさせるステップと、試料が剪断領域を流れるときに試料中の核酸に剪断力を加えて核酸を断片化するステップと、断片化された核酸を含む試料を回収領域に回収するステップと、を含む。
【００２０】
さらに別の例示的な実施形態において、核酸を剪断することにより所望の平均サイズを有する核酸断片を生じさせるシステムが提供される。このシステムは、少なくとも１つの処理装置とフローアクチュエータとを含む。少なくとも１つの処理装置は、核酸を含む試料を受け入れ、試料容積を有する流入部分と、剪断領域であって、試料が剪断領域を通って流れると同時に試料中の核酸を断片化するように構成された剪断領域と、断片化された核酸を含む試料を回収するための回収部分と、を含む。フローアクチュエータは、少なくとも１つの処理装置と組み合わされ、全試料容積が流入部分から剪断領域を通って回収部分まで流れるような、少なくとも１つの処理装置の流入部分から剪断領域を通って回収部分に入る試料の流れを生じさせるように構成される。
【００２１】
別の例示的な実施形態において、核酸を断片化する方法が提供される。この方法は、核酸を含み、試料容積を有する試料を少なくとも１つの処理装置の流入部分に提供するステップと、全試料容積を少なくとも１つの処理装置の剪断領域を通して流れさせるステップと、試料が剪断領域を流れるときに試料中の核酸に剪断力を加えて核酸を断片化するステップと、断片化された核酸を含む試料を回収領域に回収するステップと、を含む。
【００２２】
さらに別の例示的な実施形態において、核酸を断片化する方法が提供される。この方法は、初期平均核酸サイズを有する核酸を含む試料を少なくとも１つの処理装置の流入部分に提供するステップと、少なくとも１つの処理装置の剪断領域を通る試料の流れを生じさせることにより、剪断領域を通って流れた後の試料の最終平均核酸サイズが初期平均核酸サイズの半分以下となるように、１分以下の範囲内で試料中の核酸を断片化するステップと、を含む。
【００２３】
例示的な実施形態において、核酸を断片化する処理装置が提供される。この装置は、核酸を含む試料を受け入れる流入部分と、試料が剪断領域を通って流れる方向と垂直な角度をなす内壁を有する進入口部分を有する剪断領域であって、それにより試料が流入部分から剪断領域の進入口部分に流れ込むと同時に試料中の核酸を断片化する剪断領域と、剪断領域から断片化された核酸を含む試料を受け取る回収部分と、を含む。
【００２４】
別の例示的な実施形態において、核酸を断片化する方法が提供される。この方法は、初期平均核酸サイズを有する核酸を含む試料を少なくとも１つの処理装置の流入部分に提供するステップと、少なくとも１つの処理装置の剪断領域を通る試料の流れを１回生じさせることにより、剪断領域を通って流れた後の試料の最終平均核酸サイズが初期平均核酸サイズの半分以下となるように、試料中の核酸を断片化するステップと、を含む。
【００２５】
別の例示的な実施形態において、核酸を断片化する処理装置が提供される。この装置は、核酸を含む試料を受け入れる漏斗形流入部分であって、進入口領域と遠位端領域とを有する流入部分において、流入部分の進入口領域に規定される断面積が流入部分の遠位端領域に規定される断面積より大きい、流入部分と、流入部分の遠位端領域に隣接して配置される剪断領域であって、試料が流入部分から剪断領域を通って流れると同時に試料中の核酸を断片化するように構成された剪断領域と、剪断領域から断片化された核酸を含む試料を受け取る回収部分と、を含む。
【００２６】
上記は本発明の非限定的な概要であり、本発明は添付の特許請求の範囲によって定義される。他の態様、実施形態、特徴は、以下の説明から明らかとなるであろう。
【００２７】
添付の図面は一定の縮尺で描くことを意図したものではない。図面では、様々な図に示される同一の又はほぼ同一の構成要素のそれぞれが、同様の参照符号で表される。明確にするため、各図面の全ての構成要素に符号が付されるとは限らない。
【００２８】
本発明の利点及び特徴は、添付の図面と併せて考慮するとき、以下の詳細な説明からより明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】核酸を断片化する処理装置の内側部分の例示的な実施形態を示す。
【図１Ｂ】処理装置の外側部分の例示的な実施形態を示す。
【図２】核酸を断片化する処理装置の例示的な実施形態を示す。
【図３Ａ】様々な実施形態における処理装置を示す。
【図３Ｂ】図３Ａの処理装置を示す。
【図４Ａ】核酸を断片化する処理装置の実施形態を示す。
【図４Ｂ】核酸を断片化する処理装置の別の実施形態を示す。
【図４Ｃ】角度をなして配置された、装置を通る試料の流れの方向を図示する図４Ａに係る処理装置の実施形態を示す。
【図５】例示的な実施形態に係る処理装置及び遠心機を示す。
【図６】核酸を断片化するのに好適な処理装置の実施形態を示す。
【図７】核酸を断片化するのに好適な処理装置の別の例示的実施形態を示す。
【図８】核酸を断片化するのに好適な処理装置の別の例示的な実施形態を示す。
【図９】処理装置のオリフィスを含む剪断領域の実施形態の側面図を示す。
【図１０】図９に示される線に沿った剪断オリフィスの断面図を示す。
【図１１】図９に示される線に沿った剪断オリフィスの別の断面図を示す。
【図１２】ある実施形態に係る複数の剪断オリフィスの断面図を示す。
【図１３】ある実施形態に係る別の複数の剪断オリフィスの断面図を示す。
【図１４】例示的な実施形態に係る核酸を断片化するのに好適な処理装置の一部を示す。
【図１５】別の例示的実施形態に係る核酸を断片化するのに好適な処理装置の一部を示す。
【図１６】別の例示的な実施形態に係る核酸を断片化するのに好適な処理装置の一部を示す。
【図１７】核酸を断片化する処理装置の実施形態を示す。
【図１８】例示的な実施形態に係る回転軸の周りに配置された図１７の処理装置を示す。
【図１９】処理装置の別の例示的実施形態の斜視図を示す。
【図２０Ａ】核酸を断片化する処理装置のさらに別の実施形態を示す。
【図２０Ｂ】例示的な実施形態に係る図２０Ａの処理装置を使用した核酸の断片化方法を示す。
【図２１Ａ】ある実施形態に係る核酸を断片化する処理装置の斜視図を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ａの処理装置の断面図を示す。
【図２２】ある実施形態において様々な遠心速度の影響を試験する処理例の結果を示す。
【図２３】ある実施形態において試料の濃度を変化させるときの差を試験する処理例の結果を示す。
【図２４】ある実施形態において装置の一部分の残りの試料容積が変化するときの装置を通る流量の変動を示す処理例の結果を示す。
【図２５】処理時間に伴う流量の変化を示す図２４の処理例の結果を示す。
【図２６】ある実施形態において装置の一部分の残りの試料容積が変化するときの装置を通る流量の変化を示す別の処理例の結果を示す。
【図２７】ある実施形態における別の処理例の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書で考察される態様においては、図を参照しながら例示的な実施形態が記載されることが理解されなければならない。記載される実施形態は、必ずしも本発明のあらゆる態様を示すことを意図したものでなく、むしろいくつかの例示的な実施形態を記載するために用いられる。従って、本明細書で考察される態様が、それらの例示的な実施形態をふまえて狭義に解釈されることは意図されない。加えて、記載される態様は、単独で用いられても、又は同様に記載される他の態様との任意の好適な組み合わせで用いられてもよいことが理解されなければならない。
【００３１】
所望の平均核酸サイズ範囲を有する核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を断片化して回収するために用いられる処理装置を含むシステム及び方法が記載される。例えば、比較的大きいサイズの核酸（例えば、約４０〜５０ｋｂｐを始端とし、ゲノムサイズの核酸、数Ｍｂｐ、１Ｇｂｐ等の範囲にまで及ぶサイズの核酸）を含む溶液を、約５ｋｂｐ〜約２０ｋｂｐの範囲（例えば、約２０ｋｂｐ未満、約１０ｋｂｐ未満）の中程度のサイズの核酸に断片化することができる。ある場合には、核酸は、５ｋｂｐを下回る平均サイズまで断片化することができる。かかる結果が、核酸断片化に使用される従来のシステムで典型的に起こり得る多くの欠点を呈することなしに見出され得る。一部の実施形態では、核酸を含む試料（例えば、溶液、乳剤、懸濁液等）は、処理装置の流入部分に導入される。試料に力が加えられ、それにより、試料に剪断力を加えて核酸を望ましい形で断片化するのに好適な幾可学的形状を有する装置の流入部分から剪断領域を通る試料の流れが生じる。
【００３２】
一部の実施形態では、試料が剪断領域を通って流れると、初めに試料が処理装置に導入されたときに試料中に含まれた初期平均核酸サイズ（例えば、４８〜５０ｋｂｐ）のほぼ半分以下である最終平均核酸サイズ（例えば、５〜２０ｋｂｐ、１〜１０ｋｂｐ、５〜１０ｋｂｐ）に核酸が断片化される。一部の実施形態では、初期平均核酸サイズは、実質的であり、数Ｍｂｐ程度（例えば、ゲノム又は染色体サイズの核酸）であってよい。様々な実施形態において、かかる大きい核酸もまた好適に望ましい核酸サイズまで断片化され得る。一部の実施形態では、核酸を含む試料は遠心機が発生する力に供され、それにより処理装置の流入口から剪断領域を通る試料の流れが生じ、核酸の断片化が引き起こされる。
【００３３】
好適な試料は核酸以外の材料を含み得る。一部の実施形態では、試料は細胞を含み、ここで細胞は、試料が処理装置の特定の領域、例えば剪断領域を通って流れるときに溶解される。試料中の細胞は、試料が処理装置の他の部分を通って流れるとき、例えば、試料が流入口からチャネルに流れる間、又はチャネルから回収部分に流れる間にも溶解され得る。試料は、他の化学的又は生物学的材料、例えばタンパク質、脂質、合成ポリマー、乳剤、懸濁液、又はその他の、巨大分子を含む好適な配合物を含み得る。
【００３４】
一態様において、核酸の試料は、初期平均核酸サイズから最終平均核酸サイズへと、既存の剪断機器で可能な処理と比べてより効率的に処理される。一部の実施形態では、試料を流入部分から剪断領域を通して動かして試料中の核酸を断片化する力が加えられるのは１分未満又は３０秒未満であり、所望の平均サイズに断片化された核酸を有する試料が取り出される。流入口から剪断領域を通る処理装置を通じた流れは複数回生じさせてもよいことは理解されなければならないが（例えば、剪断領域を通って戻る流れを生じさせるような往復作動又は処理装置の反転により）、しかしながら場合によっては、剪断領域を通る流れは１回のみ生じさせる。処理装置の流入口から剪断領域を通る試料の流れを１回のみ生じさせる場合、所望の平均核酸サイズ及び分布、例えば初期平均核酸サイズの半分以下である核酸サイズが回収され得る。
【００３５】
高速の核酸断片化を提供するシステム及び方法が記載されるのみならず、考察される態様は、試料損失のない核酸断片化方法を提供する。一部の実施形態では、処理装置の流入口に最初に導入される試料の全容積が処理装置の領域を通って流れ、断片化プロセスの終了時には、所望の平均核酸サイズを有する全容積が回収領域に回収される。
【００３６】
処理装置１１０の例示的な実施形態を図１Ａ〜図２に示す。この実施形態において、処理装置１１０は、図１Ａに示す内側部分１０と、図１Ｂに示す外側部分１００とを含み、ここで内側部分１０は、図２に示す処理装置１１０の組み立て時に外側部分１００内に置かれるように構成される。
【００３７】
図１Ａの実施形態に示されるとおり、処理装置１１０の内側部分１０は流入口と剪断領域とを含む。この実施形態において、流入口は、チャネル３０に連結された流入部分２０を含み、剪断領域は、チャネル３０に連結された剪断オリフィス４０を含む。流入部分２０、チャネル３０及び剪断オリフィス４０は、試料が流入部分のいかなる特定の領域にも留まることなく、流入部分からチャネルを通って剪断オリフィスに流れ込み得るような方法で接続されてもよい。例えば、図４Ａ及び図４Ｂに関連して後述するとおり、流入部分２０及びチャネル３０は、試料の一部が溜まったり、又は処理装置を通るその流れが他の形で妨げられたりする可能性が低減されるように構成され得る。流入部分２０は進入口領域２２を有し、この進入口領域２２は、例えばピペット又は他の液体操作装置を介して受け取った、核酸を含む試料を受け入れるのに好適である。一部の実施形態では、流入部分２０は、ピペット先端又はピペット先端と同様の構造である。
【００３８】
一部の実施形態では、チャネル３０は、剪断オリフィス４０の進入口に所望の圧力が生じるように構成される。剪断オリフィス４０の進入口の圧力は、チャネル３０内に置かれた試料の剪断オリフィス４０に対する高さに比例し得る。一部の実施形態では、装置の部分の寸法は、断片化プロセスの大半にわたりチャネル３０が満たされたままであるように決められる。従って、剪断オリフィス４０に対するチャネル３０及び流入部分２０の試料の高さは比較的一定のままであり、すなわち試料高さは大きくは（例えば、４０％未満しか）変化しない。試料が剪断オリフィスを通って流れるときの試料の剪断オリフィス４０に対する高さを比較的一定に維持することにより、剪断オリフィス４０の進入口に確立される圧力もまた比較的一定となり得る。結果として、剪断オリフィスに至る進入口の圧力の差は、流入部分２０及びチャネル３０が試料で完全に満たされている場合、チャネル３０のみが試料で満たされ、流入部分２０は空である場合と比較して、僅かな大きさであり得る。
【００３９】
図３Ａ及び図３Ｂが上記に記載される現象を示し、ここで処理装置は試料１２を含む。図３Ａに示されるとおり、試料１２の高さｈは、チャネル３０の長さＬをほんの距離ｄだけ越えて延在し、ここで距離ｄはチャネル３０の長さＬと比べてかなり小さい。例えば、チャネルの長さＬは、距離ｄ又は流入部分それ自体の高さより２倍超、３倍超、５倍超、又は１０倍超大きくてもよい。図を一定の縮尺で描く意図はないことが理解され得るとおり、流入部分２０の容積はチャネル３０の容積より実質的に大きくてもよい。同様に、流入部分の、例えば進入口２２並びに他の領域における断面積は、チャネルの断面積より実質的に大きくてもよい。従って、試料が処理装置を通って動くとき、高さｈは徐々に低下する。従って、チャネル３０が試料で満たされたままである一方、高さｈは引き続き距離ｄと比べてかなり大きく、チャネルを通って動く試料の量に比して、高さｈは比較的一定のままであり、すなわち高さが大幅に変化することはない。
【００４０】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるとおり試料の高さｈが比較的一定のままである場合、流入部分２０が空になる前の高さｈの変化は、初期試料高さの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、又は１０％未満である。試料高さｈが比較的一定のままであるため、剪断領域４０の進入口４２の圧力もまた比較的一定のままである。図３Ｂは、試料の実質的な量（例えば、最初に流入口に入れられた試料の大部分）が剪断領域を通って流れ去り、流入部分２０が本質的に空になった場合を示す。結果として、試料高さｈはチャネル３０の長さＬとほぼ等しい。従って、チャネルの断面積及び／又は容積は流入部分の断面積及び／又は容積と比べてかなり小さいため、少なくとも試料高さがチャネル長さＬに等しくなるまでは、試料高さｈは実質的に一定のままであり得る。
【００４１】
上記に示唆されるとおり、様々な実施形態において、流入部分の断面積（例えば、流入口の断面積のその高さにわたる平均としての及び／又は進入口近傍での、若しくはチャネル流入口近傍の流入部分における遠位領域での）は、チャネルの断面積より実質的に大きくてもよい。例えば、流入部分の断面積は、チャネルの断面積より５倍超、１０倍超、２０倍超、５０倍超、又は１００倍超大きくてもよい。一部の実施形態では、流入部分の容積（例えば、試料を受け取るように意図される容積）は、チャネルの容積より実質的に大きくてもよい。例えば、流入部分の容積は、チャネルにより囲まれる容積より２倍超、５倍超、１０倍超、２０倍超、５０倍超、又は１００倍超大きくてもよい。かかる構造により、試料の大部分が剪断領域を通って流れる間の試料高さの低下が極めて緩徐となり、比較的一定の試料高さ並びに剪断領域に至る進入口における比較的一定の圧力の双方がもたらされ得る。別様に考えれば、かかる構造により、流入部分での試料の表面の流速又は他の形での流入部分内における流速が、剪断領域又はチャネル内の試料の流速と比べて実質的に小さくなり得る。
【００４２】
一部の実施形態では、チャネルが満たされ且つ流入部分が満たされている場合、チャネルが満たされていて流入部分が空である場合と比較して剪断オリフィスの進入口に生じる圧力の差は、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、又は約１５％未満である。他の実施形態において、チャネルのみが試料で満たされている場合の剪断オリフィスの進入口の圧力は、装置がチャネルの容積の少なくとも２、４、５、６、８、１０倍又はそれ以上の容積の試料を保持しているときの剪断オリフィスにおける初期圧力の約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、又は約１５％未満だけ異なり得る。他の実施形態において、流入部分の断面積のチャネル長さに対する比が最小化され、それにより試料が流入部分から引き込まれることに伴う剪断オリフィス流入口における圧力変化が最小化され得る。ある場合には、流入部分の断面積の対チャネル長さ比は、約１．０又はそれ以上であってもよい。当然ながら、流入口断面積の対チャネル長さ比、異なる試料容積対チャネル容積比に基づく圧力差の比、流入部分の対チャネル断面積比等を、任意の好適な方法で単一の実施形態に共に組み合わせてもよい。従って、剪断領域の進入口の圧力は、試料の大部分が流入口から剪断領域を通って流れる間、比較的一定のままであり得る。
【００４３】
チャネル上流から剪断オリフィスまでが満たされている場合（すなわち、流入部分が満たされている状況又は空である状況を含む）、好適な圧力が剪断オリフィスの進入口領域で比較的一定となるように確立及び維持され得る。一部の実施形態では、剪断オリフィスに通じるチャネルが試料材料で満たされているとき、剪断オリフィスの進入口の圧力は、約１０ｐｓｉ〜約１５０ｐｓｉ、約１５ｐｓｉ〜約１００ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉ、又は約２５ｐｓｉ〜約４０ｐｓｉの範囲である。剪断オリフィスの進入口におけるこれらの範囲外の他の圧力もまた可能である。
【００４４】
本明細書に記載される装置の特定の領域が極めて小さい圧力変化しか示さないという能力を説明するため、高さが３ｍｍ、流入口直径が９ｍｍの、約２００マイクロリットルの容積を保持することが可能なシリンダ状の流入部分と、長さが１０ｍｍ、開口直径が１．５ｍｍの、約１７マイクロリットルの容積を保持することが可能なシリンダ状のチャネルと、を有する例示的な処理装置を考える。ここで流入部分及びチャネルは、４５００ｇの遠心機が発生する力に供される。この例では、流入部分が空で、チャネルが試料で満たされているとき、剪断領域の進入口の圧力は約２８ｐｓｉである。しかしながら、流入部分及びチャネルの両方が試料で満たされると、１８３マイクロリットルの試料容積の増加に相当するが、剪断領域の進入口の圧力は３５ｐｓｉまでしか増加しない。従って、処理装置がさらに１８３マイクロリットルの試料で満たされたことを考えれば、かかる７ｐｓｉの最小限の圧力増加は無視し得る程度と考えられる（すなわち、圧力は約２５％しか変化せず、比較的一定のままである）。従って、動作時、１８３マイクロリットルの試料が剪断領域を通って流れても、剪断領域の進入口の圧力は約３５ｐｓｉから約２８ｐｓｉまでを変化するに過ぎず、比較的一定のままである。しかしながら、流入部分の試料が空になると、試料がチャネルを通り、剪断領域を通って急速に流れるため、圧力は急速に降下し、しかしこの圧力変化を受けるのは約１７マイクロリットル未満の試料、全試料容積の約１０％未満、に過ぎない。従って、この実施形態では、処理装置は、試料の容積がチャネルの容積の約１２倍超大きい場合の試料の大部分について、剪断領域の圧力を約２５％以内の変動に維持するように構成される。また、流入部分の断面積の対チャネル長さ比は、この例では約６．４である。
【００４５】
他方で、流入部分２０はチャネル３０より大幅に大きいサイズ、容積又は他の形態を有してもよく、従って試料が流入部分２０から引き込まれても、チャネル３０における試料のヘッド高さは比較的一定のままである。例えば、流入部分２０は、進入口２２がより大きいサイズ、例えば断面積で（例えば、内径が約１０ｍｍ以下）、且つチャネル３０近傍がより小さいサイズ、例えば断面積である漏斗様の形状を有し得る。先述のとおり、従って流入部分２０は、試料が処理される間、流入部分２０における試料の高さが徐々に低下するように及び／又は比較的小さく変化するように構成され得る。例えば、チャネル３０における試料の高さが流入部分２０における試料の高さと比べてかなり大きくてもよく、次に流入部分２０がチャネル３０より大きい容積であってもよく、それにより、試料が剪断領域４０を通って動くとき、試料が流入部分２０から引き込まれることに伴うオリフィス４０に対する試料の全高ｈ（すなわち、チャネル３０及び流入部分２０における高さ）の変化が比較的小さくなる。従って、上記に考察したとおり、試料の処理中に流入部分２０における試料の高さが緩徐に低下する一方、チャネル３０内に置かれる試料の高さは比較的一定のままとなり、オリフィス４０にほぼ所望の圧力及び／又は流量が提供され得る。処理装置の流入部分の外径は約１５ｍｍ未満、約１１ｍｍ未満であってもよく、及び／又は装置を遠心機に嵌まり得るような外径であってもよい。流入部分の内径は、流入部分に沿った位置によって異なってもよく、例えば、流入部分の進入口の近傍は、流入部分がチャネルに連結される領域と対照的であってもよい。流入部分の内径は１０ｍｍ未満であってもよく、又は約９ｍｍ〜約１ｍｍの範囲であってもよく、若しくはそれ未満であってもよい。一部の実施形態では、流入部分の内径は、可能な限り多くの試料容積を保持する一方で、剪断領域におけるチャネルの圧力変動を最小限に抑えるように形成される。一部の実施形態では、流入部分の中に保持される試料の容積は約５０マイクロリットル〜約５００マイクロリットルの範囲である。
【００４６】
剪断オリフィス４０は、任意の好適な構成を有してもよく、例えば、ルビー、サファイア又は他の適切な材料で形成された宝石をちりばめた構造（ｊｅｗｅｌｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）であってもよい。剪断オリフィスは、好適なオリフィス内径、例えば、約１０ミクロン〜約１００ミクロン、約５０ミクロン〜約１００ミクロン、又は約１０ミクロン〜約５０ミクロンの直径を有し得る。剪断オリフィスはまた、約１ｍｍ〜約５０ｍｍ、又は約５ｍｍ〜約２０ｍｍの長さなどの、任意の好適な長さを有し得る。しかしながら、剪断オリフィス４０について他のサイズ又は構成が可能である。ある場合には、剪断オリフィスは、例えば１ｍｍ以下の外径の薄い剛性部材であってもよく、これは使用者が剪断オリフィスを操作するときに危害を及ぼす可能性がある。一部の実施形態（図に明確には示されない）では、かかる装置を操作し得る使用者の保護を高めるため、剪断オリフィスの周囲にスカート部分などの保護領域が提供されてもよい。
【００４７】
一部の実施形態では、オリフィスを組み込む剪断領域はルビーディスク及びガラス毛管を含み、これらは直列に配置され、ディスクの中心にシリンダ軸ｃに沿って延在する穴を有する。ルビーディスク及び／又はガラス毛管は、任意の好適な外側厚さｔ、例えば約５０ミクロン〜約５００ミクロンの外側厚さを有し得る。例えば、ある実施形態では、ルビーディスクは約２５０ミクロンの外側厚さを有し、ガラス毛管は約１００ミクロンの外側厚さを有する。ある実施形態では、ディスクの中心を通って延在する穴は、３０ミクロンの直径を有する。ルビーディスク及び／又はガラス毛管は、約１ｍｍ〜約５０ｍｍの長さなど、任意の好適な長さを有し得る。ある実施形態では、ガラス毛管は５〜２０ｍｍの長さである。再び図１Ａを参照すると、処理装置１１０の外側部分１００の実施形態が図示され、これは例えば管の形態であってよい。外側部分１００は、任意の好適な材料及び／又は物品、例えば内側部分１０を挿入するための進入口領域１０２を含む。外側部分１００はまた支持体１０４ａ及び１０４ｂも含み、これらは内側部分１０の設置に対応するのに好適な内幅Ｗ及び幾可学的形状を有する。回収領域５０が外側部分１００の底部に位置し、これは、試料が処理装置の他の領域を通って流れた後、試料（例えば、断片化されたＤＮＡの溶液）を蓄積するのに好適である。一部の実施形態では、外側部分１００は微量遠心管である。例えば、標準的な１．５ｍＬ又は２ｍＬ微量遠心管が、処理装置の外側部分として用いられてもよい。
【００４８】
図２は、図１Ａ及び図１Ｂの構造的な実施形態を図示し、ここでは内側部分１０が外側部分１００内に挿入されている。例えば、内側部分１０は、内側部分１０の流入部分２０の縁部が外側部分１００の支持体１０４ａ及び１０４ｂに当接して支えられるまで、進入口１０２から外側部分１００に入れられる。支持体１０４ａ及び１０４ｂはあくまでも例であり、内側部分１０の流入部分２０及び剪断領域を任意の好適な方法で処理装置の外側部分１００と関連付け得ることは理解され得る。例えば、内側部分１０が適切なサイズのリップを有し、そのリップが外側部分１００の好適な構造を有する進入口領域１０２と係合してもよい。或いは、内側部分１０と外側部分１００とは、接着剤、スナップ嵌め、ファスナ、ヒートシール／超音波シール又は他の好適な取り付け方法により共に連結されてもよい。一部の実施形態では、処理装置の内側及び外側部分は共に製造され、別個の挿入ステップを必要としない。例えば、フローアクチュエータ（例えば遠心機）と適切に組み合わせることのできる流入部分、チャネル、剪断領域及び回収部分を有する処理装置が、単一のモノリシック装置として提供されてもよい。従って、処理装置の内側及び外側部分は一体形成されてもよい。
【００４９】
処理装置の部分は、任意の適切な方法によって互いに取り付けられ得る。例えば、流入部分２０がチャネル３０に取り付けられてもよく、チャネル３０がさらに剪断領域に取り付けられてもよい。例えば、接着剤、スナップ嵌め、ファスナ、ヒートシール／超音波シール又は他の好適な方法など、任意の適切な取り付け方法を用いて処理装置の内側部分を共に取り付けることができる。ある場合には、流入部分２０の形状が、流入部分のチャネルとの及びチャネルの剪断領域との連結を促進し得る。例えば、流入部分が、スナップ嵌め又は締まり嵌めなどの構成用の、隣接するチャネルの進入口領域３２の対応する形状と係合するのに好適な遠位端領域２４の形状を有してもよい。或いは、遠位端領域２４は、例えば、単純に隣接するチャネルの進入口領域３２の断面積と同様の断面積を有することで、接着剤による取り付けを促進してもよい。同様に、チャネルと剪断領域とが任意の好適な方法で連結され得る。装置のなかで共に連結されて流体連通する部分は十分に封止され（例えば、ガスケット、Ｏリング、真空プレス等）、試料の漏出なしに試料が処理装置を通じて流れることが可能となり得る。
【００５０】
例示的実施形態において、核酸を含む試料は進入口２２から流入部分２０に導入される。場合によっては、図に示されるとおり、流入部分は漏斗形であり、試料の流入口への容易な進入、及び続く試料の流れの剪断領域への誘導が促進される。従って、装置をこのように限定するものではないが、漏斗形流入部分は流入部分の遠位端領域２４の断面積より大きい断面積の進入口領域２２を有してもよく、遠位端領域が剪断領域へとつながり得る。
【００５１】
図４Ａ〜図４Ｃに例示される実施形態において、流入部分２０は、試料が流入部分２０の様々な領域に捕捉される可能性を最小限に抑えるような方法でチャネル３０につながっている。すなわち、全試料が流入部分からチャネル３０を通って剪断オリフィス４０へと自由に流れる。図４Ａでは、チャネル３０は開口３４ａを有し、この開口３４ａは、試料材料が詰まって流入部分とチャネルとの間を容易に流れることができない「デッドスポット」範囲が生じないように、流入部分２０の遠位領域と好適に係合する。さらに、このチャネル３０の遠位部分は、剪断オリフィス４０により規定される断面積より大きい断面積を有する。図４Ｂでは、チャネル３０の開口３４ｂは、剪断オリフィス４０の直径と同様のサイズ及び形状の断面積を有する遠位部分を有する。従って、試料材料は、開口３４ｂと剪断オリフィス４０との間を、いかなる特定の箇所にも捕捉されることなく流れることができる。好適な実施形態は、流入部分とチャネルとの間、又はチャネルと剪断オリフィスとの間に滑らかな構造の移行部を有する必要はない。実際、ある場合には、チャネルと剪断オリフィスとの間など、様々な領域間における急激な移行部が、核酸及び／又は他の分子の剪断、ひいては断片化の向上をもたらす構造を提供する点で有利であり得る。
【００５２】
図４Ｃに示されるとおり、図４Ａの処理装置は、一般に遠心機に設置することに関連する所定の角度（例えば、４５度）で配置される。遠心機を作動させると、処理装置が回転軸Ａの周りに回転する。それに従い、試料が破線の方向付き矢印Ｆ１によって図示される流入部分２０を通り、破線の方向付き矢印Ｆ２によって示されるとおりチャネル３０へと流れ込む。チャネル３０の開口３４により、流入部分からチャネルを通って剪断オリフィス４０へと流れ易くなる。一部の実施形態では、チャネル３０の遠位端領域及び剪断オリフィス４０に至る進入口の幾可学的形状は、試料が剪断オリフィスを通って流れる方向（破線の方向付き矢印Ｆ４によって指示される）に実質的に垂直な角度を有する内壁を含む。従って、チャネルから剪断オリフィスへの試料の流れは急激に変化し、剪断効果の増強がもたらされる。場合によっては、剪断オリフィスに至る進入口のかかる壁がオリフィスの外部に位置決めされてもよい。試料が剪断オリフィス４０に至る進入口を通り、剪断領域の残りの部分を通って流れるとき、核酸を含む試料に対し、核酸を断片化する形で剪断力が加わる。
【００５３】
図４Ｃに示されるような構成の剪断オリフィス４０の圧力は、試料流体の密度（ρ）、遠心機の角速度（ω）、回転軸（Ａ）からの剪断オリフィスの半径（ｒ）、及び剪断オリフィスより上側の流体の高さ（ｈ）を含むいくつかのパラメータに依存し得る。一実施形態において、圧力（Ｐ）は以下の式により求められる。
【数１】
2013540439.tif 000003
【００５４】
オリフィス４０を通る流量は、オリフィスに至る進入口の圧力（Ｐ１）、オリフィスの出口の圧力（Ｐ２）、オリフィスの内径（Ｄ１）、オリフィスの外径（Ｄ２）、及び密度（ρ）を含むいくつかのパラメータに依存し得る。一実施形態において、流量Ｑは以下の式により求められる。
【数２】
2013540439.tif 000004
【００５５】
従って、遠心機適用における流量（及びオリフィスにおける分子の剪断）は、遠心機の角速度、オリフィスの直径、回転軸からのオリフィスの半径及びオリフィスに対する試料の高さに依存する。角速度、オリフィスの直径及びオリフィスの半径は、全て厳密に制御することができ、必要であれば一定にしてもよい。オリフィスに対する試料高さのみが変動し得ることから、従って剪断のより厳密な制御を維持するため、理想的には流入口（例えば、流入部分及びチャネル）は、処理中にオリフィスに対する試料ヘッド高さが可能な限り一定に維持されるように構成される。図１Ａに例示されるような構成では、チャネル３０の容積が比較的小さく、且つ試料が流入部分２０から引き込まれるときの試料高さの変化を最小限に抑えるように流入部分２０が構成される場合、オリフィスにおける高さ（ひいては試料圧力）は比較的一定となり得る。また、チャネル３０の容積が比較的小さいと、試料の他の部分より低い圧力で比較的少量の試料のみがオリフィスに押し通され得る。
【００５６】
試料中の核酸が処理前の元の核酸サイズの半分以下の平均核酸サイズに断片化されることは、概して短時間で起こり得る。一部の実施形態では、核酸を含む試料に対して力（例えば遠心機又はポンプなどのフローアクチュエータからの）が加えられることで、処理装置の剪断領域を通る試料の流れが１回のみ引き起こされ、ここで試料の最終平均核酸サイズは、力を加える前の試料における初期平均核酸サイズの約半分以下である。しかしながら、本明細書で意図される特定の処理装置を通る流れは、例えば洗練された核酸サイズ分布を提供することにおいて、複数回生じさせ得ることは理解されなければならない。一部の実施形態では、核酸を含む試料を処理装置の剪断領域を通って流れさせる力が加えられるのは１分以下（例えば３０秒以下）であり、試料の最終平均核酸サイズは、力を加える前の試料における初期平均核酸サイズの約半分以下である。
【００５７】
初期平均核酸サイズを有する核酸を含む任意の好適な試料が処理装置に供給され得る。例えば、試料は、溶液中に含まれる核酸がある適切な濃度である溶液を含み得る。処理装置で断片化する前、核酸の試料は任意の好適な初期平均核酸サイズ、例えば約４０ｋｂｐ〜約５０ｋｂｐ（例えば、約４８ｋｂｐ）、約４０ｋｂｐ〜１００Ｍｂｐ、約４０ｋｂｐ〜１Ｇｂｐ（例えば、ゲノムサイズの核酸程度）、約１Ｍｂｐ〜１００Ｍｂｐ、約４０ｋｂｐ〜１Ｍｂｐを有し得る。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの巨大分子、又は他の好適なヌクレオチドベースの化合物を含んでもよい。処理装置に導入される核酸を含む試料はまた、任意の好適な容積の試料であってよい。一部の実施形態では、試料容積は約５０マイクロリットル〜約５００マイクロリットルの範囲であり得る。
【００５８】
処理装置内に配置された、核酸を含んでいる試料に加えられる力は、流入口（例えば、チャネルを含む）から剪断領域を通って回収領域に入る処理装置を通じた試料の流れを生じさせ得る。ある場合には、かかる力は試料に対し、シリンジ装置などのポンプを使用して、試料を処理装置の流入口から剪断領域を通して押し込む方法で加えられ得る。しかしながら、一部の実施形態では、流入口から剪断領域を通る試料の流れを生じさせるために試料に加えられる力は、試料をポンプ又はシリンジ装置と接触させることなく引き起こされる。例えば、処理装置が遠心機の適切な領域内に置かれてもよく、ここで遠心機により発生する力が装置に加えられると、それにより試料が剪断領域を通って回収部分に流れ込む。一部の実施形態では、空気によって発生する圧力を加えることにより、試料が流入口から剪断領域を通して流される。例えば、処理装置にガス圧供給源が好適に連結され、それが発生する力により剪断領域を通る試料の流れを生じさせてもよい。或いは、真空の負圧を用いて試料を剪断領域に通すこともできる。さらに、一部の実施形態では、処理装置の適切な動き又は撹拌により、流入口から剪断領域を通る試料の流れを生じさせる。例えば、処理装置が振動する動き又は他の適切な加速に供されてもよく、それにより剪断領域を通る試料の流れを生じさせてもよい。
【００５９】
一部の実施形態では、処理装置の流入口に導入される全試料容積が剪断領域を通って流れ、及び回収部分で回収され得る。例えば試料を保持するシリンジを使用して試料を流入口から剪断領域を通してポンピングする従来の状況では、ごく一部の試料が少量の使用されない容積としてシリンジの試料との接触領域に残る。従って、シリンジを使用して試料を流入口から剪断領域を通してポンピングすると、最終的に処理後に回収できない部分的な試料損失が生じる。他方で、例えば、遠心機又は直接的な接触なしに好適な力を供給するポンプによるなど、試料のポンプとの接触が関与しない力を生じさせることにより、試料の全容積を流入口から剪断領域に通し、最終的には回収部分へと移動させて、処理済み試料を全て回収することが可能になる。
【００６０】
処理済みの試料中の断片化された核酸は、所望の最終平均核酸サイズ範囲を有し得る。一部の実施形態では、処理済みの試料の最終平均核酸サイズは、約５ｋｂｐ〜約２０ｋｂｐ、約５ｋｂｐ〜約１０ｋｂｐ、約１０ｋｂｐ未満、約８ｋｂｐ〜約２０ｋｂｐ又は約１０ｋｂｐ〜約２０ｋｂｐの範囲である。ある場合には、核酸サイズが断片化される程度は、剪断領域を通る試料の流れを生じさせる試料に加えられる力（例えば、遠心機の速度又は剪断領域から遠心機の回転中心までの距離を変えることにより生成される）など、様々な要因に依存し得る。例えば、試料に加える力を増加させると、試料中の核酸に加わる剪断力が増加し、より小さい核酸断片が得られる。溶液中の核酸の濃度もまた、最終平均核酸サイズに寄与し得る。従って、場合によっては、溶液中の核酸濃度を高くすると、核酸が低速で断片化されるようになり、核酸断片の平均値が大きくなり得る。試料中の核酸濃度は、例えば、約５マイクログラム／ミリリットル〜約２００マイクログラム／ミリリットルの間で異なり得るが、範囲又は分布がそのように限定されるものではない。一部の実施形態では、処理された核酸の断片サイズ分布は、約１４倍未満、約７倍未満又は約２倍未満である。ある例では、約１０．５ｋｂｐの平均核酸サイズについて、断片化された核酸のばらつきは約７倍〜約１４倍である。
【００６１】
処理装置を通る試料の流れは、任意の適切な速度で起こり得る。従って、試料に加えられる力が大きいほど、処理装置を通じて流れる試料の速度が高くなる可能性が高いが、速度は当然ながら、剪断領域におけるオリフィスサイズなどの他の要因に依存する。一部の実施形態では、処理中の所与の時点における処理装置を通じる試料の流量は、例えば、約３マイクロリットル／秒未満、約１マイクロリットル／秒〜約３マイクロリットル／秒、又は約１．５マイクロリットル／秒〜約２．５マイクロリットル／秒であり得る。一部の実施形態では、処理中の所与の時点における処理装置を通じる試料の流量は、例えば、約２０マイクロリットル／秒未満又は約１０マイクロリットル／秒〜約２０マイクロリットル／秒であり得る。処理装置を通じる試料の他の流量が可能である。
【００６２】
処理中の様々な時点における処理装置を通じる試料の流量は、任意の好適な程度に従い変化し得る。一部の実施形態では、試料の大部分が剪断領域を通って流れる間、処理装置を通じる試料の流量は比較的一定のままである。例えば、試料に対する処理時間の大部分にわたり、流量の変化が処理装置を通じる初期流量の約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、約１５％以下又は約１０％以下である場合、処理装置を通じる試料の流量は一定の流量であると見なされ得る。
【００６３】
処理装置は、使い捨てとして製造されてもよい。すなわち１回の使用で、試料が処理されて回収された後、装置は好適に取り除かれ得る。従って、使い捨ての処理装置が再利用される（又は洗浄して再利用される）ことがないため、試料間での交差汚染の可能性が大幅に低減される。
【００６４】
剪断オリフィスは任意の好適な材料を含み得る。一部の実施形態では、剪断オリフィスは、ルビー、サファイア、ガラス、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリイミド、ステンレス鋼、他の好適な材料又はそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、剪断オリフィスは、ポリイミドなどのコーティング材料を含む。例えば、コーティング材料を塗布すると、核酸が剪断オリフィスの表面に結合する可能性が特定のコーティングによって低くなり得るため、目詰まりする可能性が低下し得る。
【００６５】
図５は、個別の処理装置１１０ａ、１１０ｂ及び１１０ｃが適切に挿入される受け入れ領域２１０ａ、２１０ｂ及び２１０ｃを有する遠心機２００の例示的な実施形態を図示する。処理装置１１０ａ、１１０ｂ及び１１０ｃの各々の中には、核酸を含むそれぞれの試料が入れられる。処理装置は、破線矢印によって示されるとおり、遠心機２００の適切な受け入れ領域に挿入される。次に遠心機を作動させると力が発生し、その力により、装置のそれぞれの流入部分から剪断領域を通って回収部分に入る各処理装置中の試料の流れが生じる。
【００６６】
遠心機は、処理装置を中に配置し得る受け入れ領域を任意の好適な数だけ有し得る。遠心機を作動させると、核酸を有する試料がそれぞれの処理装置の各々の剪断領域を通る流れを同時に引き起こす力が生じる。一部の実施形態では、図５に示されるとおり、遠心機は１０個の受け入れ領域を備える。他の実施形態において、遠心機は１２個又はそれ以上の受け入れ領域を備える。従って、遠心機は、遠心機が有する受け入れ領域と同じ数の処理装置に対し、同時の核酸断片化をもたらす力を付与することが可能である。場合によっては、高速遠心機を使用して、記載される処理装置で核酸剪断を引き起こす力を発生させてもよい。例えば、好適な遠心機は、８０００ｒｐｍ以上、１００００ｒｐｍ以上、１２０００ｒｐｍ以上、又は１４０００ｒｐｍ以上の回転速度で力を発生し得る。
【００６７】
核酸断片化用の記載される処理装置を組み込むシステム及び方法から、例えば、望ましい範囲及び分布の核酸断片サイズが得られること、交差汚染が解消されること、様々な異なる試料容積及び濃度を処理する能力を有すること、試料を同時に処理すること、試料損失がないこと、及び短い処理時間など、いくつかの利益がもたらされる。ここで、上記の利益を提供する処理装置の様々な実施形態を、既に考察した実施形態に加えて説明する。
【００６８】
剪断領域は、試料が流れ得る剪断オリフィスを任意の好適な数だけ含むことができる。図６に示される例示的な実施形態では、処理装置１１０の剪断領域は、直列構成で配置された２つの剪断オリフィス４０ａと４０ｂとを含む。図に明確には示されないが、処理装置にさらに多くのチャネル及び／又は剪断オリフィスが含まれてもよいことは理解され得る。例えば、剪断オリフィス４０ａと４０ｂとの間、又はそれらの下流に、１つ又は複数のチャネルが含まれてもよい。
【００６９】
一部の実施形態では、処理装置はフィルタを含む。図７は、処理装置１１０の流入部分２０の中にフィルタ６０が配置される例示的な実施形態を図示する。従って、フィルタ６０は、試料が流入部分２０から剪断領域へと流れるときの材料の汚染又は目詰まりを防止する働きをする。特定の材料はフィルタを通り抜けて流れることができないが、好適な流体試料はフィルタを通過して剪断領域に入り得る。遠心機を使用して流入口から剪断領域を通る試料の流れを引き起こす力を発生させる実施形態において、フィルタは、剪断領域の進入口近傍における試料の初期の流れを減速させる働きをし得る。従って、場合によっては、遠心機が定常状態の角速度に達していない時点では、流入口内に置かれた試料の大部分は剪断領域にまだ入っていない。場合によっては、フィルタ６０はチャネル３０より上側に配置され、又は核酸が効率的に剪断されるように、流入部分２０内において、処理中に試料によって剪断オリフィス４０の進入口に確立される圧力を妨害しない十分な高さに位置決めされる。一部の実施形態では、フィルタ６０と剪断オリフィス４０との間の距離は約５ｍｍ〜約２０ｍｍである。
【００７０】
フィルタは任意の好適な方法によって流入口内に適切に位置決めされ得ることは理解され得る。一部の非限定的な例では、フィルタは、流入部分の遠位端領域に、剪断領域の進入口に隣接して、取り付けることなしに単純に置かれてもよく、又はフィルタは、接着剤又は取付け点により流入口又は剪断領域の一部分に取り付けられてもよい。
【００７１】
一部の実施形態では、材料が流入部分の進入口領域から出たり、又はそこに入り込んだりすることを防ぐため、処理装置は蓋を含む。図８は、処理装置１１０の流入部分２０を覆って蓋１０６が置かれる例示的な実施形態を示す。蓋１０６は、任意の好適な方法、例えば、接着剤、スナップ嵌め、ねじ嵌め又は別の適切な取り付け具により、流入部分２０に連結され得る。蓋１０６が流入部分２０の進入口に適切に連結されると、蓋１０６は外部の材料が流入部分に入り込んで処理装置内の内容物が汚染されることを阻止する。蓋１０６はまた、装置が突然動くことにより液がはね散るなどして流入部分内の材料が取り除かれることを阻止する働きもする。
【００７２】
上記に考察したとおり、剪断領域は１つ以上のチャネル及び／又は剪断オリフィスを有し得る。図９〜図１１は、直列構成で互いに隣接して配置されたチャネル３０及び剪断オリフィス４０の例示的な実施形態を図示する。この実施形態において、装置に好適な力が加えられると、試料はチャネル３０の進入口へと流れ込んで開口を通り、続いて断片化用の剪断オリフィス４０を通って流れる。必須ではないが、チャネル及び剪断オリフィスは、双方ともシリンダ状の形である。
【００７３】
図９は、チャネル３０及び剪断オリフィス４０の側面図を示す。チャネル３０は第１の長さＬ１を有し、剪断オリフィス４０は第２の長さＬ２を有する。本明細書に提示されるチャネル及び剪断オリフィスは、任意の好適な長さを有し得る。一部の実施形態では、チャネルの長さは約５ｍｍ〜約２０ｍｍ、約１０ｍｍ〜約１５ｍｍ、約１００ミクロン〜約２０ｍｍ又は約１００ミクロン〜約５ｍｍの範囲である。一部の実施形態では、剪断オリフィスの長さは、約１００ミクロン〜約２０ｍｍ、約１００ミクロン〜約５ｍｍ、約５ｍｍ〜約２０ｍｍ、約２００ミクロン〜約５００ミクロン又は約２５０ミクロン超である。
【００７４】
図１０は、図９に示される対応する線に沿ったチャネル３０の断面図を示し、ここでチャネル３０は、試料が処理装置の流入口から流れ込み得るオリフィスの内表面３６を有する。チャネル３０はまた外表面３８も含む。図１０に示されるとおり、内表面３６は内幅Ｗ１を有し、外表面３８は外幅Ｗ２を有する。
【００７５】
図１１は、図９に示される対応する線に沿った剪断オリフィス４０の断面図を示す。剪断オリフィス４０は、試料がチャネル３０から流れ込み得るオリフィスの内表面４６を含む。剪断オリフィス４０はまた外表面４８も含む。図１１に示されるが、内表面４６は内幅Ｗ３を有し、外表面４８は外幅Ｗ４を有する。
【００７６】
チャネル及び剪断オリフィスの内幅及び外幅は、任意の好適なサイズであってよいことは理解され得る。しかしながら、図９〜図１１に示される実施形態では、あらゆる実施形態に必須なわけではないが、チャネル３０の内幅Ｗ１は剪断オリフィス４０の外幅Ｗ４に等しい。一部の実施形態では、試料が流れ込み得る剪断オリフィスの内幅は、約１０ミクロン〜約１００ミクロン、約１０ミクロン〜約５０ミクロン又は約１０ミクロン〜約７０ミクロンの範囲である。一部の実施形態では、チャネルの内幅は約３００ミクロン〜約２ｍｍの範囲である。一部の実施形態では、剪断オリフィスの外幅は、約５０ミクロン超、約５０ミクロン〜約１ｍｍ、約１００ミクロン〜約１ｍｍ又は約１ｍｍ超である。例えば、剪断オリフィスの外幅は約３００ミクロン〜約１．５ｍｍの範囲であり得る。
【００７７】
剪断オリフィスの幅は、試料中の核酸に加えられる剪断力の程度に影響し得る。例えば、オリフィス幅が小さいと、試料がオリフィス内へとそこを通って流れるときの核酸に加わる剪断力の程度が大きくなり、ひいては核酸断片化の程度が高まり得る。
【００７８】
ある例では、剪断オリフィスは、約３０ミクロンの内径、約１．５ｍｍの外径及び約２５０ミクロンの長さを有する。チャネルは、約１．５ｍｍの内径及び約１０ｍｍの長さを有する。
【００７９】
核酸を含む試料が流れ得る剪断領域には、複数の剪断オリフィスが含まれてもよい。図１２は、表面４６ａ、４６ｂ、４６ｃ及び４６ｄにより規定される４つのオリフィスを有する剪断領域４１の例示的な実施形態を図示する。従って、適切な力が加わると、試料は流入口から、剪断領域で並列のオリフィスの各々へと流れ込み、そこを通過する。一実施形態において、約４０ミクロン径の複数の穴が約２５０ミクロン厚のポリイミドフィルムに開けられ、ここでそれらの穴は、約２００ミクロンより大きい中心間距離（例えば、約２５０ミクロンの中心間距離）だけ離間される。
【００８０】
剪断領域のオリフィスは任意の好適な形を有し得ることもまた理解され得る。図１３は、様々な形の表面４６ｅ、４６ｆ、４６ｇ及び４６ｄにより規定される４つのオリフィスを有する剪断領域４１の非限定的な実施形態を例示する。例えば、表面４６ｅは矩形／正方形を規定し、表面４６ｆは三角形を規定し、表面４６ｇは楕円形を規定し、及び表面４６ｈは六角形を規定する。好適な力が加わると、核酸を含む試料が剪断領域４１に配置されたオリフィスの各々を通って流れる。
【００８１】
チャネルもまた、核酸を含む試料が流れ得る開口を任意の好適な数だけ有し得ることは理解されなければならない。かかるチャネル開口もまた、任意の好適な形を有し得る。
【００８２】
剪断オリフィスは、任意の好適な方法で処理装置の流入口と連結されてもよい。例えば、図１４は、処理装置の流入部分２０の壁の間に配置された剪断オリフィス４０の実施形態を例示する（外側部分及び回収領域は図示せず）。使用時、試料が流入部分２０に加えられ、処理装置が遠心機に置かれる。遠心機を作動させると、試料が剪断オリフィス４０の進入口４２を通過する。次に試料は、剪断オリフィス４０を出て流入部分２０の遠位端部分に入り込み、別の剪断オリフィス又は回収領域（図１４には図示せず）に入る。一部の実施形態では、剪断オリフィス４０及び流入部分２０は、試料が処理されたときに試料の一部が流入部分内に残るように構成される。
【００８３】
図１５は、流入部分２０の壁の下に配置された剪断オリフィス４０の実施形態を図示し、ここで遠心機に置くための外側部分及び回収領域は図示しない。図１４について説明したとおり、試料が流入部分２０から処理装置に導入され、処理装置が遠心機に置かれ、遠心機が作動される。遠心機から力が加わると、試料は流入口の本体を通って流入口の遠位端部分まで動き、そこで試料は次に剪断オリフィス４０の進入口４２を通って流れる。剪断オリフィス４０から出ると、続いて試料は別の剪断オリフィス又は回収領域（図１５には図示せず）に流れ込む。チャネルは明確に示されないが、この実施形態では１以上のチャネルを好適な方法で組み込むことができる。
【００８４】
図１６は処理装置の実施形態を示し、ここでは処理装置の対応する剪断オリフィス４０ａを有する第１の流入部分２０ａの一部分が、対応する剪断オリフィス４０ｂを有する第２の流入部分２０ｂの内部に配置されている。使用時、試料を第１の流入部分２０ａの進入口に導入した後、処理する力が（例えば遠心機から）装置に加えられる。試料は、剪断オリフィス４０ａの進入口４２ａを通って流れ、次に剪断オリフィス４０ａから出る。続いて試料は、第２の流入部分２０ｂに達し、そこで試料は最終的に、対応する進入口４２ｂ及び場合により好適なチャネルを経て、剪断オリフィス４０ｂを通って流れる。剪断オリフィス４０ｂから、試料は後続の剪断オリフィス又は回収領域（図１６には図示せず）へと流れ込む。ある場合には、処理する力を加えたとき、処理装置に複数の流入部分があることで、試料が装置を通じて流れるときの試料が受ける核酸断片化が増し、完成した試料において概してより小さい平均断片サイズ及び／又は均一性が増した断片サイズの核酸を有する処理済み試料が生じ得る。１つ以上のチャネルが剪断オリフィスと共に好適に組み込まれ得る。
【００８５】
図１７は、核酸の断片化に用いられ得る処理装置２００の例示的な実施形態を示す。処理装置２００は、核酸の溶液が流れ得る内側部分２１０と、遠心機の受け入れ範囲内に置くための構造を有する外側部分２６０と、を含む。内側部分２１０は、流入リザーバ２２０と、第１の剪断オリフィス２３０及び第２の剪断オリフィス２４０を含む剪断領域と、回収領域２５０と、を含む。核酸を含む試料（例えば、ＤＮＡを含む溶液）が流入リザーバ２２０の進入口２１２に導入され、装置２００が処理のため遠心機に好適に置かれる。
【００８６】
遠心機が作動して、処理装置を通じた試料の動きを引き起こす力が発生すると、試料は第１の剪断オリフィス２３０の進入口２３２を通って流れ、剪断オリフィス２３０に関連した剪断力により断片化される。続いて試料は剪断オリフィス２３０から流れ出て、流入リザーバ２２０を通って進み続け、第２の剪断オリフィス２４０に達する。次に試料は第２の剪断オリフィス２４０の進入口２４２に流れ込み、試料中の核酸が、第２の剪断オリフィス２４０によって生じる剪断力により断片化される。次に試料は流入リザーバ２２０の遠位端領域２１４に向かって流れ出す。遠心機が回転し続けることに伴い、断片化された核酸を含む試料は回収領域２５０に蓄積する。或いは、代替的には遠位端領域２１４を閉鎖して、試料が回収領域２５０へと通過することなく流入リザーバ２２０の底に集まるようにしてもよい。従って、遠位端領域２１４が回収領域として機能し得る。剪断オリフィス２３０及び／又は２４０は、流入リザーバ２２０に沿った任意の好適な位置に配置され得るが、一部の実施形態では、オリフィス２３０と２４０との間に好適に長い距離が提供され、下流オリフィス２４０における所望の試料圧力の確立が促進され得る。すなわち、上流オリフィス２３０の圧力が下流オリフィス２４０の圧力に影響を及ぼさないように、オリフィス２３０と２４０との間での流体の有効な分断が確立されてもよい。一部の実施形態では、剪断オリフィスは互いから約５ｍｍ〜約２０ｍｍに配置される。明確には示されないが、流入リザーバ２２０と外側部分２６０とは任意の好適な方法により共に取り付けられ、又は連結され得ることもまた理解されなければならない。一部の実施形態では、流入リザーバ２２０と外側部分２６０とは、単一のモノリシック装置として共に一体形成されてよい。
【００８７】
処理装置の流入リザーバ２２０は、図１７では円錐形を有するものとして例示されるが、流入リザーバは任意の適切な形状を有し得ることは理解されなければならない。例えば、記載される実施形態における好適な流入リザーバは、直線状であってもよく又は適切な曲率を含んでもよい。
【００８８】
一部の実施形態では、剪断オリフィス間にチャネルが配置される。例えば、図に明確には示されない処理装置が、直列構成で配置された、流入リザーバ２２０と、第１のチャネルと、第１の剪断オリフィス２３０と、第２のチャネルと、第２の剪断オリフィス２４０と、を含んでもよく、ここでチャネルと剪断オリフィスとは流体連通している。かかる例では、遠心機が作動すると、試料は、第１のチャネルを通って第１の剪断オリフィス２３０の進入口２３２に流れ込み、剪断オリフィス２３０に対応する剪断力により断片化される。続いて試料は、剪断オリフィス２３０から流れ出て第２のチャネルを通り、第２の剪断オリフィス２４０に達する。次に試料は第２の剪断オリフィス２４０の進入口２４２に流れ込み、試料中の核酸が適切に断片化される。剪断オリフィス間のチャネルは、先述したとおりの長さ、内幅及び外幅の範囲などの、任意の好適な寸法を有し得る。一部の実施形態では、２以上の剪断オリフィスを有する処理装置が、試料の大部分が処理装置を通って流れる間、各剪断オリフィスより上側の試料高さ、ひいては対応する剪断領域の進入口の圧力及び装置を通る流量も同様に比較的一定のまま維持するような構造を有する流入部分と１以上のチャネルとを含み得る。
【００８９】
図１８は、遠心機に好適に置かれたときに向きが付く処理装置２００を示し、ここでこの装置は、第１の剪断オリフィス２３０の中心が遠心機の回転軸Ａから径方向距離Ｒ１だけ離れて置かれるような傾いた構成にある。同様に、第２の剪断オリフィス２４０の中心は、遠心機の回転軸Ａから径方向距離Ｒ２だけ離れて置かれる。処理装置の構成が傾いているため、径方向距離Ｒ１は径方向距離Ｒ２より小さい。
【００９０】
場合によっては、処理装置及び遠心機システムの様々な特徴が、剪断オリフィスを通る試料流量、ひいては試料中の核酸が断片化される能力に影響を及ぼし得る。かかる特徴としては、例えば、遠心機の回転速度、剪断オリフィスの直径、及び回転軸からの剪断オリフィスの径方向距離を挙げることができる。一部の実施形態では、流入リザーバに沿った剪断オリフィスの位置が、核酸の断片化の程度にいくらかの影響を有し得る。例えば、流入リザーバの進入口のより近く（従って遠心機の回転軸Ａからより小さい半径、例えば径方向距離Ｒ１）に位置決めされた、且つ所与の直径を有する第１の剪断オリフィスは、同じ直径の、且つ流入リザーバの遠位端のより近く（従って第１の剪断オリフィスと比べて遠心機の回転軸Ａからより大きい半径Ｒ、例えば径方向距離Ｒ２）に位置決めされた第２の剪断オリフィスと比べ、オリフィスを通ってより低速の流量を示し得る。
【００９１】
場合によっては、剪断オリフィスを通る試料流量がより低速であることにより、剪断力の低下、ひいては核酸断片化の減少がもたらされる。実際、所与の遠心機システムについて、処理後の最終平均核酸サイズ及び分布は、処理装置の詳細な幾何学的設計上の考慮事項に依存し得る。従って、具体的な目標範囲の核酸サイズは、特定の処理システムで使用される処理装置の特定の属性に基づき回収され得る。一部の実施形態では、処理装置は、処理後に特定の核酸サイズ範囲が得られるように調節自在に設計される。例えば、オリフィスサイズ、回転軸Ａからの半径Ｒ、及び／又は各オリフィスそれぞれに対する試料ヘッド高さが、図１８にある装置と同様に、装置におけるオリフィス２３０及び２４０の双方に同一の又はほぼ同じ剪断影響を提供するように設計されてもよい。図示されないが、各オリフィス２３０及び２４０が、関連するオリフィスに対する試料のヘッド高さを定義するのに役立つそれぞれの流入部分／チャネルを有してもよい。一部の実施形態では、剪断オリフィス２３０と２４０とは同じ回収領域を共有してもよく、ここで試料材料は両方のオリフィスを通ってその回収領域に流れ込む。図に示されない他の実施形態では、別個の独立した剪断オリフィスがそれぞれの回収領域を有してもよく、ここで試料材料は別々に各オリフィスを通って流れ、独立に回収される。
【００９２】
再び図１７及び図１８を参照すると、一部の実施形態では、試料が回収されたときの核酸サイズのばらつきが比較的小さくなるように、第２の剪断オリフィス２４０を通る試料の流量がほぼ一定に保たれる。これを達成するため、処理時間のほとんどにおいて、第１の剪断オリフィス２３０と第２の剪断オリフィス２４０との間に置かれる試料の容積がほぼ一定に維持される。従って、ある実施形態では、試料は、第２の剪断オリフィス２４０を通る試料の流れと比べ、第１の剪断オリフィス２３０を通ってより容易に流れる。さらに、第２の剪断オリフィス２４０の径方向距離Ｒ２より小さい第１の剪断オリフィス２３０の径方向距離Ｒ１に適合させて、第１の剪断オリフィス２３０の直径を第２の剪断オリフィス２４０の直径より大きくしてもよい。従って、遠心機が作動すると、試料を第２の剪断オリフィス２４０に通す流れの力が試料を第１の剪断オリフィス２３０に通す流れの力より大きい可能性があるにもかかわらず、第１の剪断オリフィス２３０の直径がより大きいため、試料材料が装置を通じて動く間、第１の剪断オリフィス２３０と第２の剪断オリフィス２４０との間に置かれた試料の容積をほぼ一定のままとすることが可能となる。
【００９３】
図１９〜図２０Ｂは、処理装置３００の例示的な実施形態を図示する。装置３００は、チャネル３１０と、剪断オリフィス３２０と、第１のチャンバ３３０と、第１の蓋３３２と、第２のチャンバ３４０と、第２の蓋３４２と、を含む。処理装置３００について記載される構成要素の各々が、流体連通している。すなわち、流体は第１の蓋３３２から第１のチャンバ３３０に流れ込み、チャネル３１０を通り、剪断オリフィス３２０を通り、第２のチャンバ３４０に入り、第２の蓋３４２に入って戻り得る。第１の蓋３３２及び第２の蓋３４２は、任意の好適な方法によって第１のチャンバ３３０及び第２のチャンバ３４０に取り付けることができる。一部の実施形態では、蓋３３２及び３４２は、ねじ嵌めの構成によってチャンバ３３０及び３４０に取り付けられ得る。他の実施形態では、蓋３３２及び３４２は、接着剤、スナップ嵌め又は締まり嵌めによってチャンバ３３０及び３４０に連結される。
【００９４】
図１９は処理装置３００の斜視図を示し、蓋３３２及び３４２は図示しない。図２０Ａは、気密シールを形成するよう蓋３３２及び３４２がそれぞれのチャンバ３３０及び３４０に取り付けられているとき、及び取り付けられていないときの処理装置３００を例示する。一部の実施形態では、蓋３３２及び３４２は、処理装置３００に導入される試料の全容積を保持するのに十分な大きさである。処理装置３００が両端に２つの蓋を有しなくてもよいことは理解されなければならない。実際に、一部の実施形態については、処理装置３００は第１のチャンバ用の第１の蓋のみを含み、一方で第２のチャンバは、そこに永久的に取り付けられた、又はそこに成形された覆いを有する。処理装置３００は、チャンバ３３０と３４０との間にチャネル３１０及び剪断オリフィス３２０を通る試料材料の流れを生じさせるため、遠心機又はポンプなどのフローアクチュエータと好適に組み合わされ得る。一部の実施形態では、処理装置３００は、試料を処理するため、遠心機の受け入れ範囲に直接置かれ得る。或いは、処理装置３００は、内側部分１０及び外側部分１００に関して上記に記載する形状と同様の、遠心機の受け入れ範囲に置かれるような好適な形状の外部構造を有するホルダと組み合わされてもよい。従って、処理装置とホルダとの組み合わせが、遠心機によって加えられる力に共に供され得る。
【００９５】
図２０Ｂは、核酸を含む試料４５０が処理され得る一連のステップ４００〜４１０を例示する。ステップ４００では、試料４５０が第１のチャンバ３３０に装入される。ある場合には、試料の粘度とチャネルの小さい進入口直径との要因が複合して、試料４５０はチャネル３１０に容易には流れ込まない。ステップ４０２では、蓋３３２がチャンバ３３０に取り付けられ、気密シールが形成される。ステップ４０４は、例えば遠心機が発生する力に供されている処理装置を示す。従って、試料４５０は、第１のチャンバ３３０からチャネル３１０を通り、チャネルの中央に配置された剪断オリフィス３２０を通って第２の蓋３４２に流れ込む。一部の実施形態では、第２の蓋３４２が試料材料の回収領域として機能する。ステップ４０４から、剪断オリフィス３２０を通る試料の流れからの剪断力によって、試料中に含まれる核酸が断片化されることが理解されなければならない。
【００９６】
試料４５０が蓋３４２に回収されると、続いて装置は、ステップ４０６に示される反転した位置に置かれる。反転させると、重力によって試料４５０が第２のチャンバ３４０に入り、しかしながら試料４５０は、試料の粘度及びチャネルの小さい進入口直径に起因して、容易にはチャネル３１０に流れ込まない。ステップ４０８では、処理装置が、例えば遠心機により生じる力に供され、第２のチャンバ３４０からチャネル３１０を通り、剪断オリフィス３２０を通って第１の蓋３３２に入る試料４５０の流れが生じる。一部の実施形態では、第１の蓋３３２が試料材料の回収領域として機能してもよい。従って、試料中に含まれる核酸は、剪断オリフィス３２０を通る試料の流れからの剪断力によって再び断片化される。ステップ４１０では、第１の蓋３３２が処理装置３００から取り外され、試料４５０の処理が終わって完全に回収されている。
【００９７】
上記の方法、特にステップ４０４〜４０８は、目標の核酸サイズ分布に達するまで、必要に応じて何度でも繰り返されることが可能である。従って、ステップ４０８の後、装置を再度反転させてその元の位置にし、好適なフローアクチュエータ（例えば遠心機）によって加えられる力に供してもよい。従って、試料４５０は、第１のチャンバ３３０から流れ出て、チャネル３１０を通り、剪断オリフィス３２０を通って第２の蓋３４２に戻り得る。実際、一部の実施形態について装置３００は、所望の断片化された核酸のサイズ範囲及び分布に達するまで、必要に応じて何回でも反転させて処理されることができる。
【００９８】
図２１Ａは、本体５０２と、第１の蓋５３２と、第２の蓋５４２と、を含む処理装置５００の別の実施形態の斜視図を示す。第１の蓋５３２は、本体の一端でねじ装置を介してねじって本体に取り付けられ、第２の蓋５４２は、装置の他端で締まり嵌めによって本体に固着されている。他の取り付け構成が可能であることが理解され得る。第１の蓋５３２及び第２の蓋５４２は装置の対向する端部に取り付けられ、それぞれのチャンバ５３０、５４０を封鎖して気密シールを形成する。この装置はまた、第１のチャンバ５３０と剪断領域５２０との間に配置された第１のチャネル５１０、及び剪断領域５２０と第２のチャンバ５４０との間に配置された第２のチャネル５１２も含む。図示される実施形態において、第１のチャネル５１０の内幅は第２のチャネル５１２の内幅より小さい。装置について構造及び寸法の他の組み合わせが可能である。
【００９９】
一部の実施形態では、チャンバ５３０、５４０は、処理装置５００に導入された試料の全容積を保持するのに十分な大きさである。上記に考察したとおり、本明細書に記載される実施形態において好適な処理装置の両端部に２つの蓋を有することは、要件ではない。本発明における処理装置が、処理の主要な本体に任意の好適な方法で取り付け得る蓋を有してもよいことが理解され得る。さらに、他の好適な蓋又は取り付け具が、記載される本発明の特徴における様々な処理装置に対して使用されてもよく又は使用されなくてもよい。
【０１００】
図２１Ｂに示される実施形態において、核酸を有する試料材料は、処理装置５００の剪断領域５２０を１回又は複数回通過するように流され得る。使用時、第１の蓋５３２は、最初は本体５０２の第１のチャンバ５３０がある領域にねじ付けられていない。その一方で、第２の蓋５４２は、第２のチャンバ５４０で締まり嵌めによって本体に取り付けられている。第１のチャンバ５３０に提供される開口において、試料材料が装置に導入される。装置内に十分な量の試料材料が入ると、次に第１の蓋５３２が装置の本体にきつくねじ付けられ、試料材料が中に封入される。次に装置が、アクチュエータ（例えば、遠心機、ポンプ、撹拌等）によって生じる力に供され、試料材料がチャネル５１０を経由して剪断領域５２０を通り、チャネル５１２を経由して第２のチャンバ５４０へと動かされる。次に、装置に力を加えることで、試料材料が、チャネル５１０、５１２を経由して剪断領域５２０を通り、第１のチャンバ５３０の中へと戻る動きを生じさせてもよい。図２１Ｂに図示される実施形態に示されるとおり、チャネル５１０の断面積はチャネル５１２の断面積より大きい。一部の実施形態では、装置５００が適切に反転され、試料を逆方向に第１のチャンバ進入口範囲に向かって戻す力に供される。試料は、第１のチャンバの蓋に収集されてもよく又は剪断領域を戻る動きの繰り返しに供されてもよい。従って、試料材料は、剪断領域を通る好適な動きからの剪断力に必要に応じた回数だけ供され得る。
【実施例】
【０１０１】
実施例１
流入口として使用するピペットチューブにチャネル及び剪断オリフィスを装着し、微量遠心管内に置いて、上記に記載される実施形態に係る処理装置を形成した。濃度５０マイクログラム／ミリリットルの４８ｋｂｐの出発核酸サイズを有するラムダＤＮＡの試料を、処理装置のピペットチューブに導入した。装置を遠心機に挿入し、次に遠心機を、７，０００ｒｐｍ、８，０００ｒｐｍ、９，０００ｒｐｍ、１０，０００ｒｐｍ、１１，０００ｒｐｍ、１２，０００ｒｐｍ、１３，０００ｒｐｍ及び１４，５００ｒｐｍの種々の速度で動作させた。図２２に示されるとおり、断片化されたＤＮＡの結果をゲル電気泳動分析によって未処理の試料ＤＮＡと比較した。このＤＮＡ試料に対して遠心機を約１１，０００ｒｐｍ〜約１４，５００ｒｐｍの速度で動作させると、平均核酸サイズが約１０ｋｂｐのＤＮＡが得られたことが観察された。また、この処理装置に対して遠心機を高速で動作させるほど、ＤＮＡ断片化の増加がもたらされたことも観察された。
【０１０２】
実施例２
実施例１に記載されるものと同じ処理装置を使用して、様々な濃度の２００マイクロリットルのラムダＤＮＡ及び大腸菌(E.Coli)ＤＮＡを、１３，０００ｒｐｍで動作する遠心機を用いて処理した。ラムダＤＮＡの濃度は、５０マイクログラム／ミリリットル、１００マイクログラム／ミリリットル、及び２００マイクログラム／ミリリットルであった。大腸菌(E.Coli)ＤＮＡの濃度は、２５マイクログラム／ミリリットル、１００マイクログラム／ミリリットル、及び２００マイクログラム／ミリリットルであった。図２３に示されるとおり、処理後のラムダ及び大腸菌(E.Coli)試料の断片化されたＤＮＡは、約１０ｋｂｐの平均核酸サイズとなった。
【０１０３】
実施例３
実施例１に記載されるものと同様の、但し剪断オリフィスの直径が異なる４つの処理装置を作成した。すなわち、直径は１０ミクロン、２０ミクロン、３０ミクロン及び５０ミクロンであった。処理装置にラムダＤＮＡを充填して遠心機に置き、次に遠心機を１０，０００ｒｐｍ及び１４，０００ｒｐｍで動作させた。１０，０００ｒｐｍでは、２０ミクロン径及び３０ミクロン径の剪断オリフィスについての処理後の平均核酸サイズは、それぞれ約６．４ｋｂｐ及び約７．０ｋｂｐであった。１４，０００ｒｐｍでは、１０ミクロン径、２０ミクロン径、３０ミクロン径及び５０ミクロン径の剪断オリフィスについての処理後の平均核酸サイズは、それぞれ約５．２ｋｂｐ、約５．２ｋｂｐ、約６．０ｋｂｐ及び約９．０ｋｂｐであった。この処理装置に使用する剪断オリフィスの直径が小さいほど、ＤＮＡ断片化が増加したことが観察された。また、遠心機を高速で動作させるほど、同様にＤＮＡが断片化される量が増加したことも観察された。
【０１０４】
実施例４
１０ミクロン径による剪断を備える実施例３の処理装置を使用して、１２，０００ｒｐｍの定常遠心速度で処理する間の液体試料の流量を計測した。図２４及び図２５に示されるとおり、断片化プロセスの大半において処理装置を通じる流量に認められる低下は僅かであり、概して比較的一定の流量であると見なされた。流入リザーバに残る液体試料が１０マイクロリットル未満になると、流量は大幅に低下したが、１０マイクロリットルを超える液体試料の容積については、流量は約１．０マイクロリットル／秒〜約３．０マイクロリットル／秒の範囲でほぼ一貫していた。
【０１０５】
実施例５
図１７及び図１８に記載した実施形態に係る２つの剪断オリフィスを有する処理装置を使用し、これらは剪断オリフィス間で径方向距離及び試料高さが異なった。直径が５０ミクロン、４０ミクロン、３５ミクロン及び３０ミクロンの剪断オリフィスもまた評価した。以下の表は、処理装置において２つの異なる位置に位置決めした剪断オリフィスに対応する最小流量を、剪断オリフィスのそれぞれの直径と共に示す。剪断オリフィスの位置が変わると、遠心機の回転軸からの径方向距離が変化し、剪断オリフィスを通る流量に影響が及び得る。加えて、剪断オリフィスを通る流量は、概してオリフィスの直径が大きいほど高くなることが観察された。
【０１０６】
【表１】
2013540439.tif 000005
【０１０７】
図２６に示されるとおり、ＤＮＡ断片化プロセス全体を通じて流量はほぼ一定のままである。流入リザーバに残る液体試料が１０マイクロリットル未満になると、流量は大幅に低下したが、しかしながら１０マイクロリットルを上回る液体試料容積については、流量は約１０．０マイクロリットル／秒〜約２０．０マイクロリットル／秒の範囲で比較的一定していた。
【０１０８】
実施例６
図１９〜図２０Ｂにおいて記載した実施形態に係る処理装置を製造した。すなわち、この装置は、第１の位置で処理した後、装置が反転して底側が上を向き、且つ上側が下に向いた第２の位置で処理することが可能である。ＭＧ  ＤＮＡ及びラムダＤＮＡを１回、２回、及び４回処理し、ここで装置は、連続する処理ステップ毎に向きを反転させた。すなわち、４回処理した場合、装置は向きを３回反転させ、２回処理した場合、装置は１回反転させ、及び１回処理した場合、装置の向きは反転させなかった。加えて、各処理ステップの間、遠心機は７，０００ｒｐｍで動作させた。図２７に示されるとおり、ＭＧ  ＤＮＡ及びラムダＤＮＡを含む試料を４回処理すると、平均核酸サイズが約１０ｋｂｐの狭い分布が生じたことが観察された。
【０１０９】
このように、本発明の少なくとも一つの実施形態の態様をいくつか記載したが、当業者には様々な代替例、変形例、及び改良例が容易に想起され得ることが理解されなければならない。かかる代替例、変形例、及び改良例は、本開示の一部であることが意図され、且つ本発明の趣旨及び範囲に含まれることが意図される。従って、前述の説明及び図面は単に例に過ぎない。本発明の範囲から逸脱することなく本発明に対して他の実施形態及び様々な変形が行われ得ることは明らかであろう。本発明の前述の説明は、単に本発明を例示することを意図したものに過ぎず、本発明を限定する意図はない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物により定義される。 
【図１Ａ】
2013540439.tif 000006
【図１Ｂ】
2013540439.tif 000007
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2013540439.tif 000012
【図４Ｃ】
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【図５】
2013540439.tif 000014
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
2013540439.tif 000032
【図２４】
2013540439.tif 000033
【図２５】
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【図２６】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２７】
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【国際調査報告】
2013540439.tif 000039
2013540439.tif 000040