(57)【要約】  本技術は、酵素組成物に関する。この酵素組成物は、グルテン不耐性患者を治療するために使用することができ、該不耐性は、非セリアック性グルテン不耐性及び／又は非セリアック性グルテン感受性を含む。この酵素組成物は、ある種の個体（患者）のグルテン曝露を低減させるために利用することもできる。例えば、この酵素組成物は、予防として、グルテンオリゴペプチドに曝露することを低減させるために使用することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的に、ＧＤＥＰ；ＧＤＥＰ−ＬＧＧ；ＧＤＥＰ−Ｍ；ＧＤＥＰ−ＬＮＡ；ＧＤＥＰ−２Ａ；ＧＤＥＰ−ＡＨ；パパイン；アオルシン；アオルシンに対して少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を有する酸性セリンプロテアーゼポリペプチド、又はその断片；ＣＰＹ；ＣＰＹに対して少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を有する酵素、又はその断片；セミアルカリプロテアーゼ；及びペニシリウム・シトリナムからの調製物、よりなる群から選択される組成物
を含む酵素カクテルであって、
該酵素カクテルは、グルテンオリゴペプチドを開裂させることができる、当該酵素カクテル。
【請求項２】
酵素カクテルが、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、パパイン、セミアルカリプロテアーゼ及びペニシリウム・シトリナムからの調製物を含む、請求項１に記載の酵素カクテル。
【請求項３】
セミアルカリプロテアーゼが、プロテアーゼＰである、請求項１に記載の酵素カクテル。
【請求項４】
パパインが、還元剤により活性化された、請求項１に記載の酵素カクテル。
【請求項５】
グルテンオリゴペプチドが、α−グリアジンの３３量体ペプチド断片である、請求項１に記載の酵素カクテル。
【請求項６】
３３量体ペプチド断片が、アミノ酸配列ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ(SEQ ID NO:１)を有する、請求項５に記載の酵素カクテル。
【請求項７】
酵素カクテルが、酸性条件において安定である、請求項１に記載の酵素カクテル。
【請求項８】
酵素カクテルが、製薬上許容しうる賦形剤中に配合された、請求項１に記載の酵素カクテル。
【請求項９】
ヒト患者においてグルテン不耐性を治療し又はグルテン曝露を低減する方法であって：
該方法は、その患者に治療上有効な量の酵素カクテルを与えることを含み、
該酵素カクテルが、酸性条件においてグルテンオリゴペプチドを開裂することができる、当該方法。
【請求項１０】
酵素カクテルが、本質的に、ＧＤＥＰ；ＧＤＥＰ−ＬＧＧ；ＧＤＥＰ−Ｍ；ＧＤＥＰ−ＬＮＡ；ＧＤＥＰ−２Ａ；ＧＤＥＰ−ＡＨ；パパイン；アオルシン；アオルシンに対して少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を有する酸性セリンプロテアーゼポリペプチド、又はその断片；ＣＰＹ；ＣＰＹに対して少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を有する酵素、又はその断片；セミアルカリプロテアーゼ；及びペニシリウム・シトリナムからの調製物、よりなる群から選択される組成物を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
酵素カクテルが、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ及びパパインを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
酵素カクテルが、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ；パパイン；セミアルカリプロテアーゼ；及びペニシリウム・シトリナムからの調製物を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
酵素カクテルが、製薬上許容しうる賦形剤に配合された、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
酵素カクテルが、経口送達のために配合された、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
グルテン不耐性の治療又はグルテン曝露の低減において使用するための配合物であって：
本質的に、ＧＤＥＰ；ＧＤＥＰ−ＬＧＧ；ＧＤＥＰ−Ｍ；ＧＤＥＰ−ＬＮＡ；ＧＤＥＰ−２Ａ；ＧＤＥＰ−ＡＨ；パパイン；アオルシン；アオルシンに対して少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を有する酸性セリンプロテアーゼポリペプチド、又はその断片；ＣＰＹ；ＣＰＹに対して少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を有する酵素、又はその断片；セミアルカリプロテアーゼ；及びペニシリウム・シトリナムからの調製物、よりなる群から選択される少なくとも２種の酵素組成物を含み、
ただし、該少なくとも２種の酵素組成物は、グルテンオリゴペプチドをインビトロ胃腸モデルにおいて消化する能力を有する。
【請求項１６】
少なくとも２種の酵素組成物が、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ及びパパインである、請求項１５に記載の配合物。
【請求項１７】
上記モデルが、少なくとも２種の酵素組成物を、グルテンオリゴペプチドと、模擬胃液中で、約３７℃で、約１２０分間インキュベートすることを含む、請求項１５に記載の配合物。
【請求項１８】
模擬胃液が、胃粘膜ムチン、ペプシン、ゼラチナーゼ、アミラーゼ、及びリパーゼを含む、請求項１７に記載の配合物。
【請求項１９】
上記モデルが、少なくとも２種の酵素組成物を、グルテンオリゴペプチドと、模擬腸液中で、約３７℃で、約６０分間インキュベートすることを含む、請求項１５に記載の配合物。
【請求項２０】
模擬腸液が、一種又はそれ以上の膵酵素及び胆汁酸塩を含む、請求項１９に記載の配合物。
【請求項２１】
一種又はそれ以上の膵酵素が、本質的に、トリプシン、キモトリプシン、アミラーゼ、及びリパーゼよりなる群から選択される、請求項２０に記載の配合物。
【請求項２２】
上記モデルが下記を含む、請求項１５に記載の配合物：
少なくとも２種の酵素組成物、グルテンオリゴペプチド、胃粘膜ムチン、ペプシン、ゼラチナーゼ、アミラーゼ、及びリパーゼを含む混合物を、酸性条件下で、約３７℃で、約６０〜１２０分間インキュベートすること；
酸中和物質をこの混合物に加えること；及び
この混合物を、トリプシン、アミラーゼ、及びリパーゼ、及び胆汁酸塩と、中性条件下で、約３７℃で、約６０分間インキュベートすること。
【請求項２３】
グルテンオリゴペプチドが、α−グリアジンの３３量体ペプチド断片である、請求項１５に記載の配合物。
【請求項２４】
３３量体ペプチド断片が、アミノ酸配列ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ(SEQ ID NO:１)を有する、請求項２３に記載の配合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この本願は、２０１０年２月２日に出願された米国暫定特許出願Ｎｏ．６１／３００，７２６(本明細書中に、参考として、そっくりそのまま援用する)に対する優先権及び当該特許出願からの利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
グルテンは、小麦、大麦及びライムギを含むある種の草に関係した細粒子中で見出される一般的なタンパク質複合体である。グルテンは、グリアジンとグルテニンを含むタンパク質の混合物である。ヒトの消化器系では消化されないα−２グリアジンに由来する３３量体ペプチド(残基５７〜８９)が、例えばセリアック病におけるグルテンに対する炎症応答の発動因子として同定されている。このα−２グリアジン由来の３３量体は、特に、プロリンとグルタミン残基に富んでいる。それは、影響を受けやすい患者においてＴ細胞免疫応答を刺激し、腸壁に損傷を生じる炎症を生じる。これは、更に、栄養を吸収する腸の能力を損ない、栄養失調及び他の様々な症状へと導く。
【０００３】
グルテン不耐性、又はグルテン過敏性（感受性）は、すべての種類のグルテンに対する感受性を含む集合的用語である。グルテン不耐性の人々の内の少しの割合の人々が、セリアック病について検査陽性となる。セリアック病についての標準的診断指標は、十二指腸生検で検出される絨毛萎縮である。加えて、組織トランスグルタミナーゼ(ｔＴＧ)及びグリアジンに対する抗体は、活性なセリアック病の患者の殆ど１００％において現れ、特にＩｇＡクラスのかかる抗体の存在は、この病気の診断に用いられてきた。セリアック病の患者の大部分は、ＨＬＡ−ＤＱ２［ＤＱＡ１＊０５０１、ＤＱＢ１＊０２］及び／又はＤＱ８［ＤＱＡ１＊０３０１、ＤＱＢ１＊０３０２］分子を発現する。セリアック病の臨床症状は、例えば、疲労、慢性下痢、栄養の吸収不良、体重喪失、腹部膨満、貧血症並びに骨粗鬆症及び腸の悪性腫瘍(リンパ腫及び癌腫)の発症のリスクの実質的な増大を含む。
【０００４】
しかしながら、殆どのグルテン不耐性、又はグルテン感受性（過敏性）の人々は、セリアック病について検査陰性である(又は、確定的でない)。最大で約１５％の集団(即ち、７人中１人)は、非セリアック性のグルテン過敏性であり、又は非セリアック性のグルテン不耐性である。これらの患者は、セリアック病の診断基準を満たさないでセリアック病患者に似た症状及び疾患を患う点において、非セリアック性のグルテン過敏性であるか又は非セリアック性のグルテン不耐性である。従って、非セリアック性のグルテン過敏性(「ＮＣＧＳ」)、非セリアック性のグルテン不耐性(「ＮＣＧＩ」)、又はグルテン関連疾患(「ＧＲＤ」)は、状態又は異常と呼ばれ、各患者はは、セリアック病の人々と非常に似た症状を患うが、セリアック病を同定し診断する診断検査(血液検査を含む)では、陰性又は確定的でない。従って、米国人口の１５％(７人に１人)は、ＮＣＧＳを有しうる。
【０００５】
その上、米国内の１５００〜３０００万人の人々は、様々な理由により、グルテンへの曝露を減じるために、グルテンを含まない製品を購入している。
【０００６】
米国特許第７，３２０，７８８号(「Shan」)は、「グルテナーゼ」と呼ばれるある種の酵素を、セリアック患者又は疱疹状皮膚炎の患者に投与することを提案している。Shanによれば、グルテナーゼは、小麦、大麦及びライムギで見出されるエンドプロテアーゼ、例えば、オオムギ (Hordeum vulgare) 由来のエンドプロテアーゼなど；プロリルエンドペプチダーゼ(「ＰＥＰ」)、特に、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム(Flavobacterium meningoscepticum) （Genbank ID# D10980）及び ミキソコッカス・ザンサス(Myxococcus xanthus) (Genbank ID# AF127082) 由来のＰＥＰ；及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ及びジペプチジルカルボキシペプチダーゼを含むジペプチドの除去を触媒する刷子縁酵素を含む。Shanは又、アスペルギルス・オリザエ (Aspergillus oryzae) (Genbank ID# BD191984)由来のＸ−Ｐｒｏジペプチダーゼ及びアアスペルギルス・サイトイ (Aspergillus saitoi) (Genbank ID# D25288)由来のカルボキシペプチダーゼがセリアック病の腸におけるグルテンの消化を改善しうることにも言及している。Shanは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ、及びＨｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕなどのオリゴペプチドが、候補の酵素が毒性のグルテンオリゴペプチドを消化するか否かを決定するために利用できることを教示している。事実、Shanは、ＰＥＰ酵素の使用量は、１マイクロモルのＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを加水分解するのに要する酵素の量によって決定されることを教示している。
【０００７】
米国特許第７，５３４，４２６号(「Piper」)は、候補のグルテナーゼ酵素の治療的効力を、一種以上の選択されたオリゴペプチドを消化する候補の酵素の能力を検出することによって決定する方法に関する。米国特許第２００８／０２１３２４５(「Hausch」)は、食糧の酵素処理に言及し、且つ活性なグルテナーゼを同定するために有毒なオリゴペプチドを用いるｍスクリーニング法にも言及している。Shanと同様に、PiperとHauschの両者は、セリアック病及び／又は疱疹状皮膚炎の治療のためにＰＥＰに言及しており、且つオリゴペプチドＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを用いて、候補の酵素が有毒なグルテンオリゴペプチドを消化するか否かを決定することができることを教示している。米国特許第７，４６２，６８８号(「Khosla」)は、セリアック病及び／又は疱疹状皮膚炎を、有毒なグルテンオリゴペプチド、又はＴ細胞及び／又はそれに反応性の抗体を検出することによって診断する方法に関する。Kholsaは、かかる患者を、有毒なグルテンオリゴペプチドがＴ細胞及び／又はＨＬＡ分子へ結合することに干渉するペプチドを投与することにより治療することを示唆している。
【０００８】
国際公開ＷＯ２００５／０２７９５３(「Edens」)は、ペプチド又はポリペプチドをタンパク質加水分解する方法に関し、プロリン特異的エンドペプチダーゼ、例えばアスペルギルス種由来のＰＥＰを使用して、セリアック関連エピトープのない食物を製造することに言及している。同様に、米国第７，５６３，８６４号(「Marti」)は、ペプシン、トリプシン／キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、ＰＥＰ、及びラット刷子縁膜酵素を用いて、グルテンを解毒する、イン・ビトロのタンパク質分解プロトコールに言及している。Rizello等(Applied and Environmental Microbiology, July 2007, p. 4499-4507)は、乳酸桿菌属とアスペルギルス・オリザエ由来のプロテアーゼ(BIO-CAT提供)の組合せを、食品処理中のグルテン濃度を低下させるために利用している。Doumas等(Applied and Environmental Microbiology, Dec. 1998, p. 4809-4815)は、アスペルギルス・オリザエ プロリルジペプチジルペプチダーゼ(ＤＰＰＩＶ)の配列を提示し、ＤＰＰＩＶ酵素が、小麦グルテンベースの基質の工業的加水分解において重要となることを示唆している。
【０００９】
Ehren等(PLoS ONE 4(7):e6313)は、中程度のグルテン解毒特性を有する食品等級酵素調製物を論じている。Ehren等は、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 由来のアスペルギロペプシンが顕著にグルテン消化を増進させることを記している。Ehren等は、アスペルギルス・オリザエ 由来のペプチダーゼＰを用いた。それは、エキソペプチダーゼＤＰＰＩＶを含み、ＡＳＰがグルテンを加水分解する程度を増大させる。Ehren等は、ＤＰＰＩＶ単独では、α２−グリアジン由来の合成３３量体又はγ５−グリアジン由来の２６量体を含むグルテンオリゴペプチドを解毒することはできず、ＤＰＰＩＶは、低ｐＨでは無効であり、それ故、インビボで制酸助剤の非存在下では効果がないであろうことを教示している。
【００１０】
「グルテン不耐性における経口パパイン(Oral Papain in Gluten Intolerance)」文献(「Messer等」)は、セリアック病と考えられる患者を、経口パパインで処置するとが、その患者がグルテンを含有する食事を更なるセリアック病の症状を伴わずに消費することができるという結果を生じたことに言及している。オーストラリアの特許出願Ｎｏ．２００８１００７１９(「Cornell 及び Stelmasiak」)は、セリアック病の予防と治療のための組成物及び方法に言及している。Cornelｌ等は、パパイヤ樹脂又はその機能的類似体の抽出物を含む組成物及び方法に言及している。「グリアジン解毒能を有するパパイヤラテックス酵素(Papaya latex enzymes capable of detoxification of gliadin)」(「Cornell等」)は、パパイヤの活性が、大いにカリカインによっており、キモパパイン及びグルタミンシクロトランスフェラーゼには低依存であることに言及している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本技術のある実施形態は、グルテン分解酵素調製物及びパパインを含む酵素カクテルを提供する。本技術の酵素カクテルは、グルテンオリゴペプチド例えばα−グリアジンの３３量体のペプチド断片を開裂させることができる。この酵素カクテルは、活性化パパインを含むことができる。例えば、パパインは、還元剤によって活性化することができる。この酵素カクテルは、経口送達用に配合（製剤）することができ且つ／又は腸溶コーティングを含む配合物（製剤）に含ませることができる。この酵素カクテルは、固体、カプセル又は液体などの製薬上許容されるキャリアー（担体）を含む配合物（製剤）に含ませることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本技術のある実施形態は、グルテン分解酵素調製物及びアオルシンに対して少なくとも約８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する酸性セリンプロテアーゼポリペプチド又はその断片を含む酵素カクテルを提供する。本技術の酵素カクテルは、グルテンオリゴペプチド例えばα−グリアジンの３３量体ペプチド断片を開裂することができる。この酵素カクテルは、更に、パパイン(活性化パパイン、キモパパイン及び／又は精製パパインを含む)、カルボキシペプチダーゼＹ(「ＣＰＹ」)及び／又はＣＰＹに対して少なくとも約８０％相同なアミノ酸配列を有する酵素又はその断片を含むことができる。このＣＰＹは、サッカロミセス・セレビシエＣＰＹ、アスペルギルス・ニガー ＣＰＹ、シゾサッカロミセス・ポンベＣＰＹ、又はアスペルギルス・フミガーツス (Aspergillus fumigatus) ＣＰＹであってよい。この酵素カクテルは、製薬上許容される賦形剤にて配合（製剤）することができる。この酵素カクテルは、経口送達用に配合（製剤）することができ且つ／又は腸溶コーティングを含む配合物（製剤）に含ませることができる。この酵素カクテルは、固体、カプセル又は液体などの製薬上許容されるキャリアー（担体）を含む配合物に含まれうる。
【００１３】
本技術のある実施形態は、グルテンへの曝露の減少又はグルテン不耐性の治療に使用するための配合物（製剤）であって、免疫原性グルテンオリゴペプチドをイン・ビトロで非毒性の断片に開裂することのできる酵素組成物を含む配合物（製剤）を提供する。この酵素組成物は、グルテン分解酵素調製物；パパイン(活性化パパイン、キモパパイン及び／又は精製パパインを含む)；アオルシン；アオルシンに対して少なくとも約８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する酸性セリンプロテアーゼポリペプチド；ＣＰＹ；ＣＰＹに対して少なくとも約８０％相同なアミノ酸配列を有する酵素、又はそれらの断片；アスペルギルス・メレウス(Aspergillus melleus) 由来のプロテアーゼ；及び／又はペニシリウム・シトリナム (Penicillium citrinum) 由来の調製物を含むことができる。この配合物は、免疫原性グルテンオリゴペプチドの少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％をイン・ビトロで開裂して、非毒性の断片にすることができる。この配合物（製剤）は、製薬上許容されるキャリアー例えば固体、カプセル又は液体を含むことができる。
【００１４】
本技術のある実施形態は、グルテンへの曝露の減少における使用又はグルテン不耐性の治療のための配合物（製剤）を提供する。この配合物（製剤）は、グルテンオリゴペプチドをイン・ビトロ胃腸管モデルにおいて消化することができ、少なくとも二種の酵素組成物を含む。これらの酵素組成物は、グルテン分解酵素調製物；パパイン(活性化パパイン、キモパパイン及び／又は精製パパインを含む)；アオルシン；アオルシンに対して少なくとも約８０％相同なアミノ酸配列を有する酸性セリンプロテアーゼポリペプチド、又はその断片；ＣＰＹ；ＣＰＹに対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する酵素；アスペルギルス・メレウス に由来するプロテアーゼ；及び／又はペニシリウム・シトリナム に由来する調製物であってよい。このイン・ビトロ胃腸管モデルは、これらの酵素組成物をグルテンオリゴペプチドと、模擬的胃液（人工胃液）中で約３７℃で、イン・ビボでの胃液との接触の典型的な時間にわたってインキュベートすること、及び／又はこれらの酵素組成物をグルテンオリゴペプチドと、模擬的腸液中で約３７℃で、イン・ビボでの腸液との接触の典型的な時間にわたってインキュベートすることを含むことができる。この模擬的胃液は、胃粘膜ムチン、ペプシン、ゼラチナーゼ、アミラーゼ及び／又はリパーゼを含むことができる。この模擬的腸液は、一種以上の膵酵素及び胆汁酸塩を含むことができる。これらの膵酵素は、トリプシン、キモトリプシン、アミラーゼ、及び／又はリパーゼであってよい。このグルテンオリゴペプチドは、α−グリアジンの３３量体ペプチド断片例えばアミノ酸配列ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ(SEQ ID NO:１)を有するペプチドであってよい。
【００１５】
本技術のある実施形態は、ヒト患者におけるグルテン不耐性を治療する方法であって、酸性条件下でグルテンオリゴペプチドを開裂することのできる酵素カクテルの治療上有効な量を、その患者に与えることを含む当該方法を提供する。この酵素カクテルは、グルテン分解酵素調製物；パパイン(活性化パパイン、キモパパイン及び／又は精製パパインを含む)；アオルシン；アオルシンに対して少なくとも約８０％相同なアミノ酸配列を有する酸性セリンプロテアーゼポリペプチド、又はその断片；ＣＰＹ；ＣＰＹに対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する酵素；アスペルギルス・メレウス に由来するプロテアーゼ；及び／又はペニシリウム・シトリナム に由来する調製物を含むことができる。この酵素カクテルは、アスペルギルス・オリザエ 由来の組成物を含むことができる。この酵素カクテルは、製薬上許容される賦形剤にて配合（製剤）することができる。この酵素カクテルは、経口送達用に配合することができ且つ／又は腸溶コーティングを含む配合物（製剤）に含ませることができる。この酵素カクテルは、製薬上許容されるキャリアー例えば固体、カプセル又は液体を含む配合物（製剤）に含ませることができる。
【００１６】
本技術のある実施形態は、患者におけるグルテンへの曝露を減じる方法であって、酸性条件下でグルテンオリゴペプチドを開裂することのできる酵素カクテルを、患者に与えることを含む当該方法を提供する。この酵素カクテルは、グルテン分解酵素調製物；パパイン(活性化パパイン、キモパパイン及び／又は精製パパインを含む)；アオルシン；アオルシンに対して少なくとも約８０％相同なアミノ酸配列を有する酸性セリンプロテアーゼポリペプチド、又はその断片；ＣＰＹ；ＣＰＹに対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する酵素；アスペルギルス・メレウス 由来のプロテアーゼ；及び／又はペニシリウム・シトリナム 由来の調製物を含ませることができる。この酵素カクテルは、アスペルギルス・オリザエ 由来の組成物を含ませることができる。この酵素カクテルは、製薬上許容される賦形剤にて配合（製剤）することができる。この酵素カクテルは、経口送達用に配合（製剤）することができ且つ／又は腸溶コーティングを含む配合物（製剤）に含ませることができる。この酵素カクテルは、製薬上許容されるキャリアー例えば固体、カプセル又は液体を含む配合物（製剤）に含ませることができる。
【００１７】
本技術のある実施形態は、酵素組成物の効力を評価する方法であって、(ｉ)候補の酵素組成物及びグルテンオリゴペプチドを含む混合物を模擬的胃液（人工胃液）中で、約３７℃で、イン・ビボで胃液と接触する典型的時間にわたってインキュベートし；(ii)酸中和物質を混合物に加え；(iii)この混合物を、模擬的腸液（人工腸液）中で、３７℃で、イン・ビボで腸液と接触する典型的時間にわたってインキュベートし、(iv)この混合物中のインタクトな（無傷の）グルテンオリゴペプチドの量を測定する、工程を含む当該方法を提供する。イン・ビボでの胃液との接触の典型的時間は、約１２０分とすることができる。イン・ビボでの腸液との接触の典型的時間は、約６０分とすることができる。模擬的胃液は、胃粘膜ムチン、ペプシン、ゼラチナーゼ、アミラーゼ及びリパーゼを含ませることができる。模擬的腸液は、一種以上の膵酵素及び胆汁酸塩を含む。これらの膵酵素は、トリプシン、キモトリプシン、アミラーゼ及び／又はリパーゼであってよい。グルテンオリゴペプチドは、α−グリアジンの３３量体ペプチド断片であってよく、例えば、アミノ酸配列ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ(SEQ ID NO:１)を有するペプチドとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、３３量体ペプチドの、様々な使用量及び時間でのＧＤＥＰ−ＬＧＧによる分解を示している図である(ＥＬＩＳＡによるインタクトな（無傷の）３３量体ペプチドのレベルの測定により評価した)。
【００１９】
【図２】図２は、３３量体ペプチドの、グルテン分解酵素調製物及びその個々の成分酵素、オリジン、ＮＰＩ及びＮＰIIによる分解を示している図である(ＥＬＩＳＡによるインタクトな（無傷の）３３量体ペプチドのレベルの測定により評価した)。
【００２０】
【図３】図３は、３３量体ペプチドの、グルテン分解酵素調製物及びその個々の成分酵素、オリジン、ＮＰＩ及びＮＰII、及びそれらの様々な組合せによる分解を示している図である(ＥＬＩＳＡによるインタクトな（無傷の）３３量体ペプチドのレベルの測定により評価)。
【００２１】
【図４】図４は、３３量体ペプチドの、ペプシン(図４Ａ)、プロテイナーゼＫ(図４Ｂ)及びＧＤＥＰ−ＬＧＧ(図４Ｃ)での処理後の、２８０ｎｍ及び２１０ｎｍでのＨＰＬＣ分析のクロマトグラフ(パネル１及び２)並びにマススペクトル分析(パネル３)を示している。
【００２２】
【図５】図５は、３３量体ペプチドの、グルテン分解酵素調製物(図５Ａ)及び他のアスペルギルス由来のプロテアーゼ、ＧＤＥＰ−２Ａ(図５Ｂ)、ＧＤＥＰ−ＬＮＡ(図５Ｃ)、ＧＤＥＰ−Ｍ(図５Ｄ)及びプロテアーゼＰ(図５Ｅ)での処理後の、２８０ｎｍ及び２１０ｎｍでのＨＰＬＣ分析のクロマトグラフ(パネル１及び２)並びにマススペクトル分析(パネル３)を示している。
【００２３】
【図６】図６は、３３量体ペプチドの、３．０〜６．０のｐＨ範囲でのＧＤＥＰ−Ｍ(図６Ａ〜６Ｄ、６Ｈ)での処理及び４．０〜６．０のｐＨ範囲でのＧＤＥＰ−ＬＧＧ(図６Ｅ〜６Ｇ)での処理後の、２８０ｎｍ及び２１０ｎｍでのＨＰＬＣ分析のクロマトフラフ(パネル１及び２)並びにマススペクトル分析(パネル３)を示している。
【００２４】
【図７】図７は、３３量体ペプチドの、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ単独(図７Ａ)及びＰＭＳＦ(図７Ｂ)、ペプスタチン(図７Ｃ)、及びＥＤＴＡ(図７Ｄ) の存在下でのＧＤＥＰ−ＬＧＧでの処理後の、２８０ｎｍ及び２１０ｎｍでのＨＰＬＣ分析のクロマトグラフ(パネル１及び２)並びにマススペクトル分析(パネル３)を示している。図７はさらに、３３量体ペプチドの、ＧＤＥＰ−Ｍ単独(図７Ｅ)及びＰＭＳＦ (図７Ｆ)、ペプスタチン(図７Ｇ)及びＥＤＴＡ(図７Ｈ) 存在下でのＧＤＥＰ−Ｍでの処理後の、ＨＰＬＣ分析のクロマトグラフ(パネル１及び２)並びにマススペクトル分析(パネル３)をも示している。
【００２５】
【図８】図８は、３３量体ペプチドの、様々な量のアオルシンＡ(図８Ａ〜８Ｄ)及びアオルシンＢ(図８Ｅ〜８Ｈ)での処理後の、２８０ｎｍ及び２１０ｎｍでのＨＰＬＣ分析のクロマトグラフ(パネル１及び２)並びにマススペクトル分析(パネル３)を示している。
【００２６】
【図９】図９は、３３量体ペプチドの、アオルシンによる分解を示している(ＥＬＩＳＡによるインタクトな（無傷の）３３量体ペプチドのレベルの測定により評価した)。
【００２７】
【図１０】図１０は、３３量体ペプチドの、ｐＨ範囲４．０〜７．０でのカルボキシペプチダーゼＹ(「ＣＰＹ」)での処理(図１０Ａ〜１０Ｄ)及びｐＨ範囲４．０〜７．０でのミキソコッカス・ザンサス プロリルエンドペプチダーゼ(「ＭＸ−ＰＥＰ」)での処理(図１０Ｅ〜１０Ｈ)後の、ＨＰＬＣ分析のクロマトグラフ(パネル１及び２)並びにマススペクトル分析(パネル３)を示している。
【００２８】
【図１１】図１１は、３３量体ペプチドの、様々な量のＣＰＹ(図１１Ａ〜１１Ｄ)、ＭＸ−ＰＥＰ(図１１Ｅ〜１１Ｈ)及びアスペルギルス・ニガー プロリルエンドペプチダーゼ(「ＡＮ−ＰＥＰ」)(図１１Ｉ〜１１Ｌ)での処理後の、ＨＰＬＣ分析のクロマトグラフ(パネル１及び２)並びにマススペクトル分析(パネル３)を示している。図１１はさらに、ＣＰＹ(図１１Ｍ〜１１Ｐ)、ＭＸ−ＰＥＰ(図１１Ｑ〜１１Ｔ)及びＡＮ−ＰＥＰ(図１１Ｕ〜１１Ｖ)での処理後の３３量体のＨＰＬＣ分析のクロマトグラフ(パネル１及び２)並びにマススペクトル分析(パネル３)をも示している。
【００２９】
【図１２】図１２は、３３量体ペプチドの、ＣＰＹ及びプロリルエンドペプチダーゼＭＸ−ＰＥＰ及びＡＮ−ＰＥＰによる分解(インタクトな（無傷の）３３量体ペプチドのレベルをＥＬＩＳＡによって測定することにより評価した)を示している(図１２Ａ)。図１２はさらに、３３量体ペプチドの、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ及びＣＰＹによる分解(インタクトな（無傷の）３３量体ペプチドのレベルをＥＬＩＳＡによって測定することにより評価した)をも示している(図１２Ｂ)。図１２はさらに、３３量体ペプチドの、ＡＮ−ＰＥＰによる分解(インタクトな（無傷の）３３量体ペプチドのレベルをＥＬＩＳＡによって測定することにより評価した)をも示している(図１２Ｃ)。
【００３０】
【図１３】図１３は、小麦グリアジン及び３３量体ペプチドの、イン・ビトロ胃腸管モデルにおけるＧＤＥＰ−ＬＧＧによる分解(インタクトな（無傷の）３３量体ペプチドのレベルをＥＬＩＳＡによって測定することにより評価した)を示している。
【００３１】
【図１４】図１４は、イン・ビトロ胃腸管モデルにおける、消化酵素単独(図１４Ａ)、ＣＰＹ(図１４Ｂ)、ＧＤＥＰ−Ｍ(図１４Ｃ)、及びＣＰＹとＧＤＥＰ−Ｍの組合せ(図１４Ｄ)での処理後の３３量体ペプチドの、ＨＰＬＣ分析のクロマトグラフ(パネル１及び２)並びにマススペクトル分析(パネル３)を示している。
【００３２】
【図１５】図１５は、小麦グリアジン及び３３量体ペプチドの、イン・ビトロ胃腸管モデルにおける、ＣＰＹ及びＧＤＥＰ−Ｍによる分解(インタクトな（無傷の）３３量体ペプチドのレベルをＥＬＩＳＡによって測定することにより評価した)を示している。
【００３３】
【図１６】図１６は、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ(図１６Ａ)、ＣＰＹ(図１６Ｂ)、及びＧＤＥＰ−ＬＧＧとＣＰＹの組合せ(図１６Ｃ)での処理後の、３３量体ペプチドの、ＨＰＬＣ分析のクロマトグラフ(パネル１及び２)並びにマススペクトル分析(パネル３)を示している。
【００３４】
【図１７】図１７は、タンパク質濃度(Ａ２８０)、３３量体ペプチド分解活性、プロリルエンドペプチダーゼ活性、及び分画されたＧＤＥＰ−ＬＧＧのプロテアーゼ活性を示している。
【００３５】
【図１８】図１８は、ＣＰＹ及びＡＮ−ＰＥＰ(図１８Ａ)、ＧＤＥＰ−Ｍ及びＧＤＥＰ−ＬＧＧ(図１８Ｂ)、アオルシンＡ及びアオルシンＢ(図１８Ｃ)、ＧＤＥＰ−Ｍ及び幾つかのペプチダーゼの組み合わせ(図１８Ｄ)、並びにＧＤＥＰ−ＬＧＧ及びＧＤＥＰ−Ｍの組み合わせ(図１８Ｅ)によるグルテンの消化についてのＥＬＩＳＡによる分析後の残存率の比較を示している(すべて、酵素の量を変えてある)。
【００３６】
【図１９】図１９は、３３量体ペプチドの分解(インタクトな（無傷の）３３量体ペプチドのレベルをＥＬＩＳＡによって測定することにより評価した)を示しており、市販の３３量体ペプチド調製物(図１９Ａ)、ラビオリ(図１９Ｂ)、チーズマカロニ(図１９Ｃ)、白パン(図１９Ｄ)及びロールパン(図１９Ｅ)からのものであり、ＧＤＥＰ−ＬＧＧの様々な投与量(５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、及び４００ｍｇ)によるものである。
【００３７】
【図２０】図２０は、ラビオリ(図２０Ａ)、マカロニ(図２０Ｂ)、白パン(図２０Ｃ)、ロールパン(図２０Ｄ)、ラザーニャ(図２０Ｅ)及びパスタ(図２０Ｆ)由来の３３量体ペプチドの分解(インタクトな（無傷の）３３量体ペプチドのレベルをＥＬＩＳＡによって測定することにより評価した)を示している(様々な投与量(５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、及び４００ｍｇ)のＧＤＥＰ−ＬＧＧ及びＧＤＥＰ−Ｍを使用した)。
【００３８】
【図２１】図２１は、３３量体ペプチドの、３ロットのＧＤＥＰ−ＬＧＧ及び３種類の既存の製品(「グルテン ゲスト」(Gluten Gest)、「グルテン−ザイム」(Gluten-zyme)及び「グルテンイーズ」(GlutenEase))による分解後の残留率（残存率）(インタクトな（無傷の）３３量体ペプチドのレベルのＥＬＩＳＡによる測定により評価)の比較、並びに、既存の製品(「グルテン ゲスト」、「スペクトラムザイム」(Spectrumzyme)、「グルテン−ザイム プラス」(Gluten-zyme plus)及び「グルテンイーズ」(GlutenEase))、ペプシン、３３量体対照及びグルテン分解酵素調製物についてのＨＰＬＣ−ＭＳによる分析後のクロマトグラフ(反応中の様々な時間による)を示している。
【００３９】
【図２２】図２２は、パパインでの処理後の、３３量体ペプチドの、ＨＰＬＣ分析のクロマトグラフ(パネル１及び２)並びにマススペクトル分析(パネル３)を示している。
【００４０】
【図２３】図２３は、パパインのカチオン交換分析のクロマトグラフ及び、カチオン交換クロマトグラフィーによって得られたパパイン画分による処理後の３３量体ペプチドのマススペクトル分析を示している。
【００４１】
【図２４】図２４は、カチオン交換クロマトグラフィーによる分画後のパパインのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。
【００４２】
【図２５】図２５は、カチオン交換クロマトグラフィーによる精製後のパパインからのピーク２(図２５Ａ)及びピーク３(図２５Ｂ)の画分についてのＨＰＬＣ分析のクロマトグラフを示している。
【００４３】
【図２６】図２６は、さらに、る疎水性相互作用クロマトグラフィー(図２６Ａ)及びＦＲＥＴＳ分析(図２６Ｂ)した後の、カチオン交換クロマトグラフィーによるパパイン精製のＥ９画分のＨＰＬＣ分析のクロマトグラフを示している。
【００４４】
【図２７】図２７は、得られた画分での処理後の３３量体ペプチドのマススペクトル分析のクロマトグラフ及びＦＲＥＴＳ分析を示している。
【００４５】
【図２８】図２８は、逆相クロマトグラフィーによるピーク３−１(図２８Ａ)、３−２(図２８Ｂ)及び３(図２８Ｃ)のＨＰＬＣ分析のクロマトグラフを示している。
【００４６】
【図２９】図２９は、パパインと他の酵素の、ＥＬＩＳＡによる分析後の残留率の比較を示している。
【００４７】
【図３０】図３０は、還元剤(グルタチオン、ジチオスレイトール、Ｌ−システイン、又はＮ−アセチル−Ｌ−システイン)と、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ及びパパインのプロテアーゼ活性及び加水分解活性を示している。
【００４８】
【図３１】図３１は、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ及びパパインを様々な濃度で含む酵素カクテル(図３１Ａ)の相対的活性並びに各濃度についてのＨＰＬＣ分析のクロマトフラフ(図３１Ｂ〜３１Ｇ)を示している。
【００４９】
【図３２】図３２は、様々な組成物について、６量体のセットを用いたＦＲＥＴＳアッセイスクリーニングの結果を示している。
【００５０】
【図３３】図３３は、ＦＲＥＴＳアッセイスクリーニング(図３２)から選択された組成物の加水分解活性についてのＨＰＬＣ分析のクロマトグラフを示している。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本技術は、一般に、酵素組成物に関する。この酵素組成物は、非セリアックグルテン過敏性(「ＮＣＧＳ」)及び／又は非セリアックグルテン不耐性(「ＮＣＧＩ」)の患者を含むグルテン不耐性及び／又はグルテン過敏性患者の治療に用いることができる。この酵素組成物は又、ある種の患者におけるグルテン曝露を減らすために用いることもできる。例えば、この酵素組成物は、グルテンオリゴペプチド例えばα−２グリアジンに由来する３３量体ペプチドへの曝露を減じ又は防止して、グルテン不耐性及び／又はグルテン不感受性の発症を制限し、減じ、防止し、又は制御するための予防剤として用いることもできる。α−グリアジンの３３量体断片、ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（SEQ ID NO:１）は、胃及び膵臓の酵素による消化によって普通に形成され、消化酵素による分解に抵抗性がある。
【００５２】
多くの食物及び飲料は、グルテンオリゴペプチド例えばα―２グリアジン由来の３３量体ペプチドを含んでいる。α−２グリアジン由来の３３量体ペプチドを含むグルテン関連ペプチドの消化は、生理的利益例えばグルテン及びグルテン関連ペプチドへの曝露を減少させる。これは、効果的に又は効率的にグルテンを加水分解しない集団又は特定の個体(ヒト又は動物の患者を含む)(例えば、その消化器系が、グルテン及び／又はグルテン関連ペプチドを効果的に又は効率的に加水分解するために必要とされる酵素活性を欠いている)にとって、及びグルテン及びグルテン関連ペプチドへの曝露を減じることが望ましい個体にとって特に利益とうる。
【００５３】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、機能性食品（栄養補助食品）である。用語「機能性食品」（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）は、摂取されることが意図され又は合理的に期待されて、ＮＣＧＳ及び／又はＮＣＧＩ及び／又は関連症状(腹痛、膨満感、腸不快感、下痢、鼓腸、及び栄養吸収不良を含むがこれらに限られない)の予防及び／又は治療を含む医学的又は健康的な利益を与えることのできる任意の食物製品又は物質を指すために用いられてきた。「機能性食品」という標示に該当する組成物は、単離された栄養素、栄養サプリメント（食事補充物）、及び酵素組成物から、遺伝子操作されたデザイナーフード、ハーブ製品、及び加工食品、例えばシリアル、スープ及び飲み物にまで及びうる。一層技術的な意味において、用語「機能性食品」は、一般に医薬的形態で販売され、例えば、急性又は慢性の病気、異常、又は他の総合的症状を、改善し、治療し、予防し、発生率を減じ、又は防護を与えることにより、生理的利益を有することが示されている、摂取可能な食品製品を指す。
【００５４】
ある実施形態において、本技術の一以上の酵素組成物は、例えばセリアック病、甲状腺疾患、例えば甲状腺機能低下症及び神経系疾患例えば自閉症、小脳性運動失調症、末梢神経障害、精神分裂病を含む、治療しやすい任意の病気を、グルテン曝露を防止し／又は減じることにより治療するために用いることができる。
【００５５】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、任意の酵素又は酵素の混合物を含むことができる。ある実施形態において、本技術の酵素組成物の酵素は、例えばプロテアーゼ及びペプチダーゼ例えばエキソプロテアーゼ、エンドプロテアーゼ、及び酸安定プロテアーゼなどのタンパク質を減少させる酵素である。ある実施形態において、この酵素組成物は、プロテアーゼを含むことができる。一般に、プロテアーゼは、タンパク質のアミノ酸の間のペプチド結合を切断する酵素である。酵素の好適なサブセットは、アスペルギルス・オリザエ に由来する酵素を含む。例えば、この酵素組成物は、グルテン分解酵素調製物、パパイン、精製されたパパイン、活性化されたパパイン、キモパパイン、又はこれらの組合せを含むことができる。この酵素組成物は、カルボキシペプチダーゼ例えばカルボキシペプチダーゼＹ(「ＣＰＹ」)を含むことができる。この酵素組成物は、セミアルカリプロテアーゼを含むことができる。この調製物は、ペニシリウム・シトリナム からの調製物をも含むことができる。本技術の酵素組成物は、例えば、グルテン不耐性の治療において、及びα−２グリアジン由来の３３量体を含むグルテンオリゴペプチドへの曝露の低減において有用である。
【００５６】
ここで用いる場合、用語「グルテン分解酵素調製物」(「ＧＤＥＰ」)は、少なくとも オリジン(Oryzin), ニュートラル(Neutral) プロテアーゼＩ(「ＮＰＩ」)及び ニュートラル プロテアーゼＩＩ(「ＮＰＩＩ」)を含む酵素調製物を指すために用いられる。
【００５７】
ロイシル−グリシル−グリシン(「ＬＧＧ」)法により中性のｐＨで約７０ユニット／ｇ以上のペプチダーゼ活性を有するＧＤＥＰを、ここでは、「ＧＤＥＰ−ＬＧＧ」と呼ぶ。ロイシルナフチルアミド(「ＬＮＡ」)法により中性のｐＨで約１，４００ｕ／ｇ以上のペプチダーゼ活性を有するＧＤＥＰを、ここでは、「ＧＤＥＰ−ＬＮＡ」と呼ぶ。酸性ｐＨで約５，５００ユニット／ｇ以上のプロテアーゼ活性を有するＧＤＥＰを、ここでは、「ＧＤＥＰ−Ｍ」と呼ぶ。中性のｐＨで約２０，０００ユニット／ｇ以上のプロテアーゼ活性を有するＧＤＥＰを、ここでは、「ＧＤＥＰ−２Ａ」と呼ぶ。中性のｐＨで約１０，０００ユニット／ｇ以上のプロテアーゼ活性を有するＧＤＥＰを、ここでは、「ＧＤＥＰ−ＡＨ」と呼ぶ。
【００５８】
一実施形態において、ＧＤＥＰ−ＬＧＧは、コウジカビ(アスペルギルス・オリザエ)由来のペプチダーゼ調製物である。グルテン分解酵素調製物産生株は、アスペルギルス・オリザエを、ＵＶ変異誘発を含む変異誘発過程にかけることにより誘導される。例えば、黄色コウジカビは、アスペルギルス・オリザエを含むが、ＵＶ変異誘発にかけられて「Ａ菌株」を生成し、これをＵＶ変異誘発にかけて、約５００〜６００ｕ／ｇのタンパク質分解活性を有する９０−７６（菌株）を生成する。この９０−７６菌株は、更に、ＵＶ変異誘発にかけられて、約８００〜１０００ｕ／ｇのタンパク質分解活性を有する９０−５１菌株を生成する。ＵＶ変異誘発後に、単胞子分離(Mono Spore Isolation)(Ｍ.Ｓ.Ｉ.)を行って、培養プレート上に単一コロニーを得る。この手順は、グルテン分解酵素調製物産生菌株を産出する。このグルテン分解酵素調製物産生株のタンパク質分解活性は、親菌株の約２倍である。
【００５９】
典型的なＧＤＥＰ−ＬＧＧ組成物は、約７．０のｐＨで約７０ｕ／ｇ以上のペプチダーゼ活性を有する。ＧＤＥＰ−ＬＧＧは、アスペルギルス・オリザエから、当分野で公知の方法によって得ることができ、使用前に希釈又は濃縮することができる。ＧＤＥＰ−ＬＧＧを含む調製物は、ペプチダーゼの不活性化を回避するための噴霧乾燥法によって得ることができる。この産生過程は、例えば、固体発酵とその後の水での抽出、濾過、限外濾過、及び最終的には、噴霧乾燥を含む。
【００６０】
本技術の少なくとも幾つかの実施形態において、ＧＤＥＰ−ＬＧＧは、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、及びＬｅｕのカルボキシル側で切断する。基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡに対する活性を評価することにより測定すると、ＧＤＥＰ−ＬＧＧは、プロリル−エンドペプチダーゼ活性を有しない。それでも、ＧＤＥＰ−ＬＧＧは、３３量体ペプチドを部分的に加水分解し、酸性ｐＨでも効力が残っている。３３量体ペプチドを基質として用いると、グルテン分解酵素調製物は、その３３量体の約９０％を消化する。イン・ビトロ胃腸管モデルにおいて、２００ｍｇのグルテン分解酵素調製物は、１０ｇの小麦グルテンからの３３量体を、添加酵素なしの３３量体(対照)と比較して、約８０％消化する。
【００６１】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、パパインを含む。典型的なパパインの市販の調製物は、パパイン Ｗ−４０バルクとして購入可能である。この市販の調製物は、所定の濃度で用いることができるし、使用のために希釈又は濃縮することもできる。
【００６２】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、精製されたパパインを含む。精製方法には、カチオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれる。
【００６３】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、キモパパインを含む。
【００６４】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、活性化されたパパインを含む。例えば、パパインは、還元剤によって活性化されうる。本技術における使用に適した還元剤には、グルタチオン、ジチオスレイトール(「ＤＴＴ」)、Ｌ−システイン、及びＮ−アセチル−Ｌ−システインが含まれるが、これらに限られない。
【００６５】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、酵素又は酵素組成物の混合物である。ある実施形態において、混合物の成分には、添加物を有する。ある別の実施形態においては、混合物の成分は、相乗効果を有し、例えば、グルテン分解酵素調製物の混合物及びパパインを含む酵素組成物は、３３量体ペプチドの分解に対して予想外の相乗効果を有する。
【００６６】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、ＧＤＥＰ−Ｍを含む。ＧＤＥＰ−Ｍは、アスペルギルス・オリザエから、当分野で公知の方法によって得ることができ、使用前に希釈し又は濃縮することができる。ＧＤＥＰ−Ｍを含む調製物は、噴霧乾燥により又はエタノール沈澱により得ることができる。噴霧乾燥手順は、エタノール沈澱によるプロテアーゼ活性と比較してより一層高いペプチダーゼ活性を生成する。ある実施形態において、用いたＧＤＥＰ−Ｍは、約ｐＨ３．０で約５，５００ｕ／ｇ以上のプロテアーゼ活性を有する。この調製物は、所定の濃度で用いられうるし、その調製物は、使用のために、希釈し又は濃縮することができる。
【００６７】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、ＧＤＥＰ−２Ａを含む。ＧＤＥＰ−２Ａは、アスペルギルス・オリザエから、当分野で公知の方法により得ることができ、使用前に、希釈し又は濃縮することができる。ＧＤＥＰ−２Ａを含む調製物は、噴霧乾燥により又はエタノール沈澱により得ることができる。噴霧乾燥手順は、エタノール沈澱で得られるプロテアーゼ活性と比較して一層高いペプチダーゼ活性を生成する。ある実施形態において、用いたＧＤＥＰ−２Ａは、約ｐＨ７．０で約２０，０００ｕ／ｇ以上のプロテアーゼ活性を有する。この調製物は、所定濃度で用いることができ、又はその調製物は、使用のために希釈し又は濃縮することができる。
【００６８】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、ＧＤＥＰ−ＡＨを含む。ＧＤＥＰ−ＡＨは、アスペルギルス・オリザエから、当分野で公知の方法により得ることができ、使用のために、希釈し又は濃縮することができる。ＧＤＥＰ−ＡＨを含む調製物は、噴霧乾燥により得ることができる。ある実施形態において、用いたＧＤＥＰ−ＡＨは、約ｐＨ７．０で約１０，０００ｕ／ｇ以上のプロテアーゼ活性を有している。この調製物は、所定濃度で用いることができ、又はこの調製物は、使用のために、希釈又は濃縮することができる。
【００６９】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、ＧＤＥＰ−ＬＮＡを含む。ＧＤＥＰ−ＬＮＡは、アスペルギルス・オリザエから、当分野で公知の方法により得ることができ、使用前に希釈し又は濃縮することができる。ＧＤＥＰ−ＬＮＡを含む調製物は、噴霧乾燥により得ることができる。ある実施形態において、ＧＤＥＰ−ＬＮＡは、ロイシルナフチルアミド(「ＬＮＡ」)法により、約ｐＨ７．０で約１，４００ｕ／ｇ以上のペプチダーゼ活性を有する。この調製物は、所定の濃度で用いることができ、又はこの調製物は、使用のために希釈し又は濃縮することができる。
【００７０】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、ＧＤＥＰ−Ｍの特異的プロテアーゼ成分を含んでいる。例えば、アオルシンは、ＧＤＥＰ−Ｍから精製される酸性ｐＨでトリプシン様特異性を有するセリンプロテアーゼである。アオルシンＡ及びアオルシンＢは、日本国特許第４４０１５５５号及びＪＰ２００９−２３２８３５Ａにおいて特性表示されている(これらの各々を、参考として、そっくりそのまま、本明細書中に援用する)。アオルシンは、効率的に、３３量体ペプチドを酸性ｐＨで加水分解する。アオルシンのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、Lee等、Biochem. J. 371(PT 2), 541-548(2003)に公開されている。アオルシンＡのヌクレオチド配列は、GenBank受入れ（アクセッション）番号ＡＢ０８４８９９．１を有し、対応するアミノ酸配列は、GenBank受入れアクセッション）番号ＢＡＢ９７３８７を有している。アオルシンＢは、GenBank受入れアクセッション）番号ＸＭ００１８２０７８３．１を有し、対応するアミノ酸配列は、GenBank受入れアクセッション）番号ＸＰ＿００１８２０８３５．１を有する。
【００７１】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、アオルシンのアミノ酸配列又はアオルシンのアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素を含んでいる。ある実施形態において、このアミノ酸は、アオルシンのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％の、少なくとも約８１％の、少なくとも約８２％の、少なくとも約８３％の、少なくとも約８４％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約８６％の、少なくとも約８７％の、少なくとも約８８％の、少なくとも約８９％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９１％の、少なくとも約９２％の、少なくとも約９３％の、少なくとも約９４％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９６％の、少なくとも約９７％の、少なくとも約９８％の、少なくとも約９９％の同一性を有しうる。
【００７２】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、アオルシンと実質的に相同であるアミノ酸配列を有する。２つのアミノ酸配列は、それらのアミノ酸配の少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３の、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％が同一であるか；又はそれらのアミノ酸配の少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３の、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％が、それらが機能的に同じである点において類似している場合に、「実質的に相同である」。相同性配列は、アラインメント使用により、例えば、ＧＣＧ(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, ウィスコンシン)パイルアッププログラム、又は任意の配列比較アルゴリズム例えばＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡによって同定することができる。
【００７３】
本技術は又、ＧＤＥＰ−Ｍに類似した酵素活性プロフィルを示す酵素組成物をも含む。例えば、ある実施形態において、この酵素組成物は、約４，０００〜８，０００ｕ／ｇのプロテアーゼ活性を示す。ある非制限的な例として、かかる組成物は、約６，５００ｕ／ｇのプロテアーゼ活性を含む酵素活性プロフィルを有する。
【００７４】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、ＣＰＹを含み、これは、プロテイナーゼＣ又はｙｓｃＹとしても知られている。ＣＰＹは、タンパク質及びペプチドのカルボキシ末端からアミノ酸を除去する広い特異性の液胞エキソペプチダーゼである。それは、高度に保存され活性部位周辺にある触媒的に必須のセリン及びヒスチジン残基を特徴とする遍在性のタンパク質分解酵素であるセリンカルボキシペプチダーゼのファミリーに属する。本技術において重要なＣＰＹは、例えば、酵母又はカビ、例えばサッカロミセス、シゾサッカロミセス、アスペルギルス、カンジダ、及びピキア由来のＣＰＹである。例えば、本技術において用いられるＣＰＹは、アミノ酸レベルで、以下のＣＰＹの一つに対して少なくとも約２０％の配列同一性、或は、少なくとも約４０％の配列同一性、或は、少なくとも約５０％の配列同一性、或は、少なくとも約６０％の配列同一性、或は、少なくとも約７０％の配列同一性、或は、少なくとも約８０％の配列同一性、或は、少なくとも約９０％の配列同一性を有する：サッカロミセス・セレビシエ ＣＰＹ、アスペルギルス・ニガー ＣＰＹ、シゾサッカロミセス・ポンベ ＣＰＹ、アスペルギルス・フミガーツス ＣＰＹ。
【００７５】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、ＣＰＹのアミノ酸配列又はＣＰＹのアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素を含む。ある実施形態において、このアミノ酸は、ＣＰＹのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％の、少なくとも約８１％の、少なくとも約８２％の、少なくとも約８３％の、少なくとも約８４％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約８６％の、少なくとも約８７％の、少なくとも約８８％の、少なくとも約８９％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９１％の、少なくとも約９２％の、少なくとも約９３％の、少なくとも約９４％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９６％の、少なくとも約９７％の、少なくとも約９８％の、少なくとも約９９％の同一性を有することができる。ある実施形態において、この酵素組成物は、ＣＰＹと実質的に相同なアミノ酸配列を有する酵素を含む。
【００７６】
他の実施形態において、グルテン分解活性が、驚くべきことに、ペニシリウム・シトリナムからの酵素調製物において見出された。特に、ペニシリウム・シトリナムからの酵素調製物は、実施例２４で同定された１０の６量体基質の少なくとも４が、＞１０００ｕ／ｇで消化されるグルテン消化活性を有する(ここに、１ユニットは、ＦＲＥＴ基質消化の１μモル毎分に等しい)。この活性を有する調製物は、他のカビ例えばアスペルギルス・ニガー及びある種のアクチノミセス、例えばストレプトミセス・アウレウス(Streptomyces aureus)から得ることもできる。ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、グルテン分解活性並びに５’−ホスホジエステラーゼ(「５’−ＰＤＥ」)活性を有するペニシリウム・シトリナムからの調製物を含む。
【００７７】
他の実施形態において、グルテン分解活性は、驚くべきことに、セミアルカリプロテアーゼを含む調製物を含む酵素組成物において、見出された。ここで用いる場合、セミアルカリプロテアーゼは、カビ起源に由来し、タンパク質及びそれらの分解産物、ポリペプチド及びペプチドを加水分解により破壊することができ、ｐＨ６．０〜１１に及ぶ環境で活性である酵素を指す。セミアルカリプロテアーゼの起源には、ある種のカビ例えばアスペルギルス・メレウスが含まれる。セミアルカリプロテアーゼは、ある種の植物胚芽例えば大麦胚芽又はモロコシ胚芽から得ることもできる。
【００７８】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、幾つかの方法の何れかによって生成することができる。例えば、個々の酵素を組み合わせて、所望の酵素活性プロフィルを有する所望の酵素組成物を得ることができる。
【００７９】
更に又は別法として、この酵素組成物は、酵素を自然に産生する微生物から、又は当分野で周知の方法を用いて遺伝子操作により一種以上の酵素を産生するようにした微生物から得ることができる。例えば、本技術の酵素組成物は、次のものの少なくとも２つを含みうる：ＧＤＥＰ、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、ＧＤＥＰ−ＬＮＡ、ＧＤＥＰ−Ｍ、ＧＤＥＰ−２Ａ、ＧＤＥＰ−ＡＨ、オリジン、ＮＰＩ、ＮＰＩI，アオルシンＡ、アオルシンＢ、ＣＰＹ、パパイン、活性化パパイン、精製パパイン、又はキモパパイン。本技術の酵素組成物は、ペニシリウム・シトリナムからの調製物及び／又はセミアルキルプロテアーゼを更に含むことができる。ある実施形態において、この酵素組成物は、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ及びパパインを含むことができる。他の実施形態において、この酵素組成物は、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、パパイン、及びペニシリウム・シトリナムからの調製物を含むことができる。他の実施形態において、この酵素組成物は、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、パパイン、ペニシリウム・シトリナムからの調製物及びセミアルカリプロテアーゼを含むことができる。更に別の実施形態において、この酵素組成物は、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ及び活性化パパインを含むことができる。他の実施形態において、この酵素組成物は、ＧＤＥ−ＬＧＧ，活性化パパイン、及びペニシリウム・シトリナムからの調製物を含むことができる。他の実施形態において、この酵素組成物は、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ，活性化パパイン、ペニシリウム・シトリナムからの調製物及びセミアルカリプロテアーゼを含むことができる。更に別の実施形態において、この酵素組成物は、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ及びキモパパインを含むことができる。他の実施形態において、この酵素組成物は、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、キモパパイン、及びペニシリウム・シトリナムからの調製物を含むことができる。他の実施形態において、この酵素組成物は、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、キモパパイン、ペニシリウム・シトリナムからの調製物及びセミアルカリプロテアーゼを含むことができる。
【００８０】
上記のように、本技術の酵素及び酵素組成は、当分野で周知の方法によりトランスフォームされ又はトランスフェクトされた細胞から得ることもできる。例えば、所望の酵素をコードする核酸を、発現ベクターに挿入することができ、それを、所望の酵素の製造のために宿主細胞をトランスフォーム又はトランスフェクトするために用いることができる。次いで、その宿主細胞から、酵素又は酵素組成物を、当分野で周知の方法によって得ることができる。
【００８１】
組成物中の所定の酵素又は酵素活性の量は、その組成物の所望の効果によって変わり、当分野で公知の様々な方法によって測定あるいは決定することができる。組成物中に存在する酵素の量は、モル量又はモル比で(例えば、ナノモル又はマイクロモルの酵素)、重量又は重量比で(例えば、マイクログラムの又はナノグラムの酵素)、又は活性量又は活性比で(例えば、酵素の「ユニット」又は酵素の重量若しくはモル当たりの酵素活性で)記述することができる。特定の実施形態では、組成物は、プロテアーゼ及びペプチダーゼ活性を含むことができる。
【００８２】
本技術のある実施形態において、様々なプロテアーゼ組成物の効力が評価される。従って本技術は、これらのプロテアーゼ組成物を評価するためのイン・ビトロモデル含むことができる。イン・ビトロモデルは、例えば、胃モデル、腸モデル、又は胃腸モデルを含むことができる。
【００８３】
イン・ビトロ胃モデル。イン・ビトロ胃モデルは、例えば、模擬的胃液(「ＳＧＦ」)（人工胃液）を含むことができる。このＳＧＦは、血清アルブミン、胃粘膜ムチン、及び／又は緩衝液を含むことができる。この緩衝液は、酢酸緩衝液であってもよい。このＳＧＦは、例えば塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)及び塩化カルシウム(ＣａＣｌ2)生理的塩溶液を含むことができる。ＳＧＦを、模擬的胃状態に適したｐＨで、例えば、約１．０〜７．０の範囲のｐＨあるいは約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８又は約６．９を含む酸性ｐＨに維持することができる。酸、例えば塩酸をＳＧＦに、インキュベーション中、周期的間隔で加えてＳＧＦの酸性度を維持することができる。
【００８４】
ＳＧＦは又、一種以上の胃の酵素例えばペプシン、ゼラチナーゼ、アミラーゼ、及びリパーゼをも含むことができ、並びに、更に胃の状態を模倣するために他の酵素例えばラクターゼ及びアルファ−ガラクトシダーゼをも含むことができる。市販の消化酵素製品例えばＥＺ−ＧＥＳＴ(登録商標)(Shaklee)を用いて、模擬的胃混合物を補うことができる。
【００８５】
候補の酵素組成物の効力を評価するために、幾らかの酵素組成物及びペプチド含有物質をＳＧＦに加えることができる。このペプチド含有物質は、均質なペプチド調製物例えば天然若しくは合成のグルテンオリゴペプチドを含む調製物、又は例えば動物に摂取させることを意図し又は摂取されることを合理的に予想される食糧品を含む任意の物質を含む不均質な調製物であってよい。典型的なグルテンオリゴペプチドには、３３量体ペプチド：ＬＱＬＱＰＥＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ及びＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ (SEQ ID NO:1)、並びに例えば米国特許第７，５６３，８６４号で同定されたペプチドが含まれる。
【００８６】
ＳＧＦ、酵素組成物、及びペプチド含有物質を含む混合物は、約３７℃で、イン・ビボでの胃液との接触時間に相当する時間、例えば、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１０５分、約１１０分、約１１５分、又は約１２０分インキュベートすることができる。このＳＧＦ、酵素組成物、及びペプチド含有物質を含む混合物を、定期的間隔でサンプリングして、消化効率を評価することができる。消化効率は、例えば、混合物中に存在する３３量体の量を測定することにより又は遊離のチロシン産生の量をＦｏｌｉｎ法により測定することにより評価することができる。
【００８７】
イン・ビトロ腸モデル。イン・ビトロ腸モデルは、例えば、模擬腸液(「ＳＩＦ」)（人工腸液）を含むことができる。このＳＩＦは、例えば微酸性、中性、又は約６．０〜１４．０の範囲のｐＨ、あるいは約７．０、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８，７、約８．８、約８．９、約９．０、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、約９．８、約９．９、約１０．０、約１０．１、約１０．２、約１０．３、約１０．４、約１０．５、約１０．６、約１０．７、約１０．８、約１０．９、約１１．０、約１１．１、約１１．２、約１１．３、約１１．４、約１１．５、約１１．６、約１１．７、約１１．８、約１１．９、約１２．０、約１２．１、約１２．２、約１２．３、約１２．４、約１２．５、約１２．６、約１２．７、約１２．８、約１２．９、約１３．０、約１３．１、約１３．２、約１３．３、約１３．４、約１３．５、約１３．６、約１３．７、約１３．８、約１３．９のｐＨを含む塩基性ｐＨなどの、腸の条件を模倣するのに適当なｐＨで維持することができる。このＳＩＦは又、酸を中和するための物質例えば重炭酸ナトリウム(ＮａＨＣＯ3)又はリン酸水素二ナトリウム(Ｎａ2ＨＰＯ4)をも含むことができる。
【００８８】
このＳＩＦは、一種以上の膵酵素例えばトリプシン、キモトリプシン及びアミラーゼ、及び腸の酵素例えばスクラーゼ、マルターゼ、イソマルターゼ、及びラクターゼを含むことができる。例えば、ＳＩＦは、パンクレアチンを含むこともできる。パンクレアチンは、膵酵素トリプシン、アミラーゼ及びリパーゼを含む。パンクレアチンは、クレオン(Ｃｒｅｏｎ）(登録商標)(Solvay)、ニュートリザイム(Ｎｕｔｒｉｚｙｍ)１０(登録商標)(Merck)、パンクレアーゼ(登録商標)(Janssen-Ortho)及びパンクレックス(Ｐａｎｃｒｅｘ)(登録商標)(Paines & Byrne)として市販されている。
【００８９】
ＳＩＦは又、一種以上の胆汁酸塩、例えばコール酸塩例えばタウロデオキシコール酸塩(「ＴＤＣＡ」)及びデオキシコール酸塩(「ＤＣＡ」)、又は胆汁酸、例えばコール酸、グリオコール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、又はリトコール酸を含むこともできる。
【００９０】
候補の酵素組成物の効力を評価するために、幾らかの酵素組成物及びペプチド含有物質をＳＩＦに加えることができる。このペプチド含有物質は、均質なペプチド調製物例えば天然若しくは合成のグルテンオリゴペプチドであってもよいし、又は例えばヒト又は動物により摂取されることを意図し、あるいは摂取されることが合理的に予想される食糧品を含む不均質な調製物であってもよい。典型的なグルテンオリゴペプチドは、３３量体ペプチド：ＬＱＬＱＰＥＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ及びＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ (SEQ ID NO:1)、並びに、例えば、米国特許第７，５６３，８６４号で同定されたペプチドを含む。
【００９１】
ＳＩＦ、酵素組成物、及びペプチド含有物質を含む混合物を、約３７℃で、腸液とのイン・ビボ接触の典型的期間（時間）、例えば約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、約６０分間、約６５分間、約７０分間、約８０分間、約８５分間、約９０分間、約９５分間、約１００分間、約１０５分間、約１１０分間、約１１５分間、約１２０分間、約１２５分間、約１３０分間、約１３５分間、約１４０分間、約１４５分間、約１５０分間、約１５５分間、約１６０分間、約１６５分間、約１７０分間、約１７５分間、約１８０分間、約１８５分間、約１９０分間、約１９５分間、約２００分間、約２０５分間、約２１０分間、約２１５分間、約２２０分間、約２２５分間、約２３０分間、約２３５分間、又は約２４０分間にわたってインキュベートすることができる。このＳＩＦ、酵素組成物、及びペプチド含有物質を含む混合物は、消化効率を評価するために、一定の間隔でサンプリングすることができる。消化効率は、例えば、混合物中に存在する３３量体の量又はＦｏｌｉｎ法により産生された遊離のチロシンの量を測定することにより評価することができる。
【００９２】
イン・ビトロ胃腸管モデル。イン・ビトロの胃腸管モデルは、上記の胃モデル及び腸モデルにおける逐次的処理を含むことができる。例えば、候補の酵素組成物及びペプチド含有物質は、ＳＧＦ中で、約３７℃で、胃液とのイン・ビボ接触の典型的期間（時間）、例えば約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、約６０分間、約６５分間、約７０分間、約８０分間、約８５分間、約９０分間、約９５分間、約１００分間、約１０５分間、約１１０分間、約１１５分間、又は約１２０分間にわたってインキュベートすることができる。酸を中和するための物質例えば重炭酸ナトリウム(ＮａＨＣＯ3)又はリン酸ナトリウム(例えば、Ｎａ2ＨＰＯ4)を、この混合物に加えることができる。次いで、この混合物を、ＳＩＦ中で、約３７℃で、イン・ビボでの腸液との典型的接触期間（時間）、例えば約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、約６０分間、約６５分間、約７０分間、約８０分間、約８５分間、約９０分間、約９５分間、約１００分間、約１０５分間、約１１０分間、約１１５分間、約１２０分間、約１２５分間、約１３０分間、約１３５分間、約１４０分間、約１４５分間、約１５０分間、約１５５分間、約１６０分間、約１６５分間、約１７０分間、約１７５分間、約１８０分間、約分１８５間、約分１９０間、約１９５分間、約２００分間、約２０５分間、約２１０分間、約２１５分間、約２２０分間、約２２５分間、約２３０分間、約２３５分間、又は約２４０分間インキュベートすることができる。好ましくは、候補の酵素組成物及びペプチド含有物質を、ＳＧＦ中で約６０分間インキュベートし、ＳＩＦ中で約６０分間インキュベートすることができる。或は、候補の酵素組成物及びペプチド含有物質を、ＳＧＦ中で約１２０分間インキュベートし、ＳＩＦ中で約６０分間インキュベートする。適当な動物モデルからの胃腸管液及び／又は模擬的液例えば模擬的胃液及び腸液（人工胃液及び腸液）ＵＳＰを用いることができる。
【００９３】
「医薬組成物」は、ここに記載された本技術の酵素又は酵素組成物の一種以上の混合物に、下記の他の化学成分例えば生理的に許容しうるキャリアー及び賦形剤を伴うものを指す。医薬組成物の目的は、酵素又は酵素組成物の生物体への投与を容易にすることである。
【００９４】
酵素及び酵素組成物は、それらの本質的に純粋な形態で投与することができるが、それらの酵素を、投与前に、例えば酵素の嗜好性、治療摂取方法に対する患者のコンプライアンス、及び／又は一般的な投与の容易さを高めるために医薬組成物中に配合するのが望ましいであろう。こうして、ある実施形態では、本技術の酵素組成物は、グルテンオリゴペプチドに対する活性を有する一種以上の酵素に加えて、他の成分例えば一種以上の製薬上許容されるコーティング剤、結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、甘味料、着香料、防腐剤、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、発泡剤、及び他の賦形剤を含む。かかる賦形剤は、当分野で公知であり、当業者により容易に選択されうる。一種以上の酵素に加えて存在する追加の成分の量は、全組成物の、約０．１重量％〜約９９重量％で、好ましくは約５重量％〜約８０重量％で、一層好ましくは約１０重量％〜約７０重量％の範囲で変化させることができる。例えば、一種以上の酵素に加えて存在する追加の成分の量は、約１５重量％、約２０重量％、約２５重量％、約３０重量％、約３５重量、約４０重量％、約４５重量％、約５０重量％、約５５重量％、約６０重量％、又は約６５重量％であってよい。
【００９５】
本技術の幾つかの実施形態によれば、医薬組成物は、製薬上許容されるキャリアーを含むことができる。用語「製薬上許容されるキャリアー」は、例えばヒト患者への投与に適した、一種以上の相容性の固体又は液体の充填剤、希釈剤、又はカプセル物質を指す。用語「キャリアー」（担体）は、有機又は無機の、天然又は合成の成分を指し、これには、活性成分の使用を容易にするために組み合わされる。医薬組成物の成分は、通常、所望の医薬的効力を害する相互作用が生じないような性質である。ある実施の態様において、そのような組成物中で使用されるキャリアーは、生体適合性及び／又は生分解性である。ある実施形態において、キャリアーは、ＵＳ２００８／００２００３６に記載されたようなヒドロゲルを形成することのできる少なくとも一の粘着性ポリマーを含む組成物であってよい。
【００９６】
一実施形態において、この酵素組成物は、少なくとも一の製薬上許容される賦形剤とブレンドされ、賦形剤により希釈され又はキャリアー内に封入され、該キャリアーは、カプセル、サッシェ剤、錠剤、バッカル剤、トローチ剤（ロゼンジ）、口腔薄膜、紙、又は他の容器の形態であってよい。賦形剤が希釈剤として役立つ場合には、それは、ビヒクル、キャリアー、又はその組成物の残部のための媒質として作用する固体、半固体、懸濁液、スラリー、又は液体材料であってよい。従って、この組成物は、錠剤、ピル、トローチ（香錠）、粉末、エリキシル剤、懸濁液、乳濁液、シロップ、カプセル剤(例えば、軟質及び硬質ゼラチンカプセル)、坐薬、薬用キャンディー（ロゼンジ）、バッカル投薬形態、無菌注射溶液、及び無菌パッケージ化粉末を配合することができる。
【００９７】
ある実施形態において、医薬組成物は、塩、緩衝用物質、防腐剤、キャリアー、及び適宜、他の治療用有効成分を含むことができる。この塩は、医薬としての使用のために製薬上許容されるものでなければならない。しかし、他の塩を、製薬上許容される塩を製造するために用いることができ、本技術の一部として含まれる。かかる薬理学的及び製薬学的に許容しうる塩には、例えば、次の酸から製造されるものが含まれうる：臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸など。製薬上許容される塩は又、ナトリウム、カリウム又はカルシウム塩などのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩としても製造することができる。
【００９８】
ある実施形態において、医薬組成物は、緩衝用物質例えば酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、及びリン酸塩を含むことができる。
【００９９】
医薬組成物は、適宜、防腐剤例えばパラベン(ポリパラベン及びメチルパラベンを含む)、ソルビン酸カリウム、安息香酸及びその塩、パラヒドロキシ安息香酸の他のエステル例えばブチルパラベン、アルコール例えばエチル又はベンジルアルコール、フェノール化合物例えばフェノール、又は四級化合物例えば塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、及びチメロサールを含むこともできる。
【０１００】
これらの医薬組成物は、通常、標準的投与形態で提供され、当業者に公知の方法で製造することができる。医薬組成物は、例えば、カプセル、錠剤、トローチ、懸濁液、スラリー、シロップ、エリキシル剤又は乳濁液の形態であってよい。
【０１０１】
結合剤の例には、様々なセルロース及び架橋したポリビニルピロリドン、微晶質セルロース(例えば、アビセル(Ａｖｉｃｅｌ)  ＰＨ)、ケイ素化微晶質セルロース(ＳＭＣＣ)、及びマンニトールが含まれる。
【０１０２】
適当な潤滑剤には、圧縮される粉末配合物の流動性に作用する薬剤が含まれ、コロイド状二酸化ケイ素(例えば、アエロシル(Ａｅｒｏｓｉｌ)(登録商標)２００)、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、及びシリカゲルが含まれる。
【０１０３】
甘味料の例には、天然又は人工の甘味料、例えば、スクロース、キシリトール、ラクトース、サッカリン、シクラメート、アスパルテーム、及びアセサルフェーム並びにこれらの塩が含まれる。香味料の例は、マグナスウィート(Ｍａｇｎａｓｗｅｅｔ)(登録商標)(MAFCO)、アカシアシロップ、カルダモン、キャラウェー、バニラ、サッカリン、グルコース、グリセリン、甘草、バブルガム風味、ペパーミント、冬緑油、及び果実フレーバー例えば桜桃（チェリー）又はオレンジ香味料である。
【０１０４】
適当な希釈剤には、製薬上許容される不活性な充填剤例えばコロイド状二酸化ケイ素、微結晶性セルロース(例えば、アビセル ＰＨ)；リン酸水素カルシウム；マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、及びグルコースを含む糖類；及び／又は前記の何れかの混合物が含まれる。
【０１０５】
適当な崩壊剤には、軽度に架橋したポリビニルピロリドン、コーンスターチ、ポテトスターチ、トウモロコシ澱粉、及び加工澱粉、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ナトリウム澱粉グリコレート、並びにこれらの混合物が含まれる。
【０１０６】
発泡剤の例には、発泡対、例えば、有機酸と炭酸塩又は重炭酸塩が含まれる。適当な有機酸には、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸、コハク酸、及びアルギン酸並びに無水物及び酸性塩が含まれる。適当な炭酸塩及び重炭酸塩には、例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、ナトリウムグリシンカーボネート、Ｌ−リジンカーボネート、及びアルギニンカーボネートが含まれる。或は、発泡対の酸成分だけが存在してもよい。
【０１０７】
ある実施形態では、本技術の医薬組成物は、即時放出型組成物である。他の実施形態では、この医薬組成物は、放出制御型組成物（徐放性組成物）である。この医薬組成物は、ある活性成分を比較的一定レベルで放出することができる。しかしながら、他の実施形態では、投与してすぐにより急速な放出が求められうる。他の実施形態では、活性な化合物の事象トリガー放出とすることができる。活性成分のトリガーとなる事象は、水分、低ｐＨ又は温度閾値への曝露であってよい。かかる組成物の配合は、公知の技術を用いる当業者の技術的水準内にある。この点で有用な、例証となるキャリアーには、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、澱粉、セルロース、デキストランなどの微粒子が含まれる。例証となるその他の遅延放出キャリアーには、非液体親水性コア(例えば、架橋した多糖類又はオリゴ糖類)と、任意に両親媒性の化合物、例えばリン脂質、を含む外、層を含む超分子バイオベクターが含まれる。ある実施形態で、除放性配合物に含まれる活性化合物の量は、投与部位、放出の速度と予定される持続時間、及び治療すべき病状による。
【０１０８】
様々な他の物質が、コーティングとして或は投薬単位の物理的形態を改変するために存在してよい。例えば、錠剤、ピル、又はカプセルは、シェラック、糖、又は両方でコートすることができる。
【０１０９】
幾つかの実施形態において、本技術の酵素組成物は、経口投与に適した投薬単位に形成され、活性化合物は、賦形剤と組み合わせていてもよく、摂取可能な錠剤、薬用キャンディー（ロゼンジ）、頬側錠剤（バッカル剤）、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの形態で用いてもよい。
【０１１０】
例えば、酵素組成物を、固体の、粉末の(pulverant)、キャリアー、例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロース誘導体又はゼラチンと混合することができ、並びに、減摩剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、及びポリエチレングリコールワックス類と混合することができる。この混合物を、次いで、圧縮して錠剤にすることができる。コートされた錠剤を所望するのであれば、上記の製造された錠剤を例えば砂糖の濃縮溶液などでコートすることができ、これは、アラビアゴム、ゼラチン、タルク、二酸化チタンを含むものでもよく、あるいは揮発性有機溶媒若しくは溶媒混合物に溶解させたラッカーでコートしてもよい。このコーティングへ、錠剤を異なる酵素の錠剤又は異なる量の酵素を含む錠剤と区別するために、様々な染料を加えることができる。
【０１１１】
ある実施形態では、この投薬単位形態は、カプセルである。このカプセルは、液体キャリアーを含むことができる。例えば、この投薬単位形態は、経口投与に適した軟質カプセル、例えば、一種以上の酵素の混合物を、植物油、又は非水性の水混和性物質、例えばポリエチレングリコールなど、と共に含むカプセルであってよい。或は、こ(れら)の酵素は、酵素の顆粒を、固体、粉末キャリアー、例えばソルビトール、マンニトール、ポテトスターチ、コーンスターチ、アミロペクチン、セルロース誘導体、又はゼラチンと併せて含むことのできる硬質カプセルに入れて提供することができる。
【０１１２】
本技術の他の実施形態は、ここに記載の酵素組成物の顆粒化形態を含む。顆粒化形態は、経口用錠剤の製造に有用であり、当分野で周知の他の技術も使用できるが、典型的には、次の方法により製造される。固体物質(一種以上の酵素を含む)を穏やかに粉砕し又は篩にかけて、所望の粒度とし、その結果生成したマスを、所望のサイズのステンレス鋼の篩に穏やかに通す。この混合物の層を、次いで、制御された乾燥ユニット中で決められた時間乾燥させて、所望の粒度及び堅さを達成する。この乾燥した混合物の顆粒を穏やかに篩にかけて任意の粉末を除去する。この混合物に、随意の崩壊剤、減摩剤、及び/又は付着防止剤を加えることができる。最後に、この混合物を、所望の錠剤サイズを得るのに適当なパンチとダイを有する機械を用いて、圧縮して錠剤にする。この機械の運転パラメーターは、当業者が選択することができる。
【０１１３】
本技術の他の実施形態は、吸入用の粉末を含む。
【０１１４】
本技術の一種以上の酵素又は酵素組成物は、この酵素又は酵素組成物を長時間例えば約２〜１６時間にわたって放出する組成物中に配合（製剤）することもできる。幾つかの実施形態において、酵素又は酵素組成物は、約３〜約１２時間にわたって放出される。例えば、酵素又は酵素組成物を、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、又は約１１時間にわたって放出することができる。更に別の実施形態において、酵素又は酵素組成物は、約４〜約８時間にわたって放出される。当業者は、かかる徐放性配合物（徐放性製剤）を当分野で公知の方法により製造することができる。
【０１１５】
ある実施形態において、本技術の酵素組成物は、酸性の胃の条件下で、消化に抵抗するように安定化される。ある実施形態において、酵素組成物は、活性な薬剤を腸まで送達することを可能にする腸溶性コーティングを施すことができる。ある実施形態において、酵素組成物は、例えば、医薬製造業者に公知の保護用サブコーティングを有するか又は有しない腸溶性コーティング層を含む一以上の層に囲まれたコア中に存在していてもよい。サブコーティングを採用しない場合には、その腸溶性コーティングは、それが、コア中の活性成分が分解されないように選択することができる。
【０１１６】
この腸溶性層は、典型的には、腸溶性のポリマーを含む。代表的なポリマーには、メタクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート及びヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネートが含まれるが、これらに限定されるものではない。種々のタイプのメタクリル酸コポリマー、例えば、メタクリル酸コポリマーＡ型(オイドラギット(Ｅｕｄｒａｇｉｔ)(登録商標)Ｌ−１００)、メタクリル酸コポリマーＢ型(オイドラギット(登録商標)Ｓ１００)、メタクリル酸コポリマーＣ型(オイドラギット(登録商標)Ｌ１００−５５)、メタクリル酸コポリマー分散液(オイドラギット(登録商標)Ｌ３０Ｄ−５５)、メタクリル酸メチルメタクリレートとメチルメタクリレートのコポリマー(オイドラギット(登録商標)ＦＳ)及びこれらの混合物、例えば、オイドラギット(登録商標)Ｌ１００−５５とオイドラギット(登録商標)Ｓ１００の重量比約３：１〜約２：１の混合物又はオイドラギット(登録商標)Ｌ３０Ｄ−５５とオイドラギット(登録商標)ＦＳの重量比約３：１〜約５：１の混合物を使用することができる。
【０１１７】
この腸溶性層は、更に、別の薬剤、例えば、セルロースアセテートフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、セルロースアセテートトリメリテート、セラック及び／又はゼインを含むことができる。随意に、この腸溶性層は、更に、抗粘着剤、例えば、タルク又はグリセリルモノステアレート；可塑剤、例えば、トリエチルシトレート又はポリエチレングリコール；及び／又は顔料、例えば、二酸化チタン又は酸化鉄を含む。この腸溶性層は、更に、アセチルトリエチルシトレート、アセチルトリブチルシトレート、アセチル化モノグリセリド、グリセリン、トリアセチン、プロピレングリコール、フタレートエステル(例えば、ジエチルフタレート、ジブチルフタレート)、ひまし油、ソルビトール及びジブチルセッケートを含む一種以上の可塑剤を含むことができるが、これらに限定されるものではない。ある実施形態は、腸溶性層がヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、トリアセチン、シリカ及びステアリン酸を含む腸溶性コートされた製剤（配合物）を提供する。
【０１１８】
直腸投与のための投薬単位も、企図されている。これらは、酵素及び中性脂肪基剤を含む座薬の形態で製造することができる。或は、それらは、酵素を、植物油又はパラフィン油との混合物として含む、ゼラチン直腸カプセルの形態で製造することができる。
【０１１９】
非経口投与に適した組成物は、通常、活性成分の、好ましくは受容者（レシピエント）の血液と等張である無菌の水性又は非水性調製物を含む。適当なキャリアー及び溶剤は、例えば、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液である。通常、溶解又は懸濁化剤として、追加的に用いられるのは、無菌の不揮発性油である。
【０１２０】
グルテン不耐性の患者又はグルテン曝露を減じることを希望する患者への、一種以上の酵素組成物の投与のための方法及び組成物が、ここに提供される。ある実施形態において、これらの方法及び組成物は、患者が、グルテン含有食物を、グルテン不耐性を患っていない個人と同じく、健康上の重大な結果を生じることなく摂取することを可能にする。ある実施形態において、セリアック病を患っていない患者（対象）が、グルテン非含有食品に固執するすることなく、グルテンへの曝露を減じ又は制限することを望むこともできる。別な例として、この酵素組成物は、患者に、グルテン曝露の低減によって治療可能な病気、例えば、甲状腺疾患、例えば甲状腺機能低下症並びに神経疾患、例えば自閉症、小脳性運動失調症、末梢神経障害及び精神分裂症、を治療するためにも投与することができる。
【０１２１】
ある実施形態において、酵素又は酵素組成物は、単独で投与することもできるし、又は互いに、又は他の活性あるいは比活性の成分と組み合わせて投与することもできる。酵素又は酵素組成物の組合せを用いる場合、少なくとも２種の異なる酵素又は酵素組成物の同時投与又は順次的投与が企図される。
【０１２２】
ある実施形態においては、同時投与が企図され、酵素又は酵素組成物の組合せが、経口投与に適した投薬単位形態である。この場合、活性化合物を賦形剤に組み込むことができ、摂食可能な錠剤、薬用キャンディー（ロゼンジ）、口腔錠（バッカル錠）、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの形態で使用することができる。この酵素又は酵素組成物の組合せは、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、ＧＤＥＰ−ＬＮＡ、ＧＤＥＰ−Ｍ、ＧＤＥＰ−２Ａ、ＧＤＥＰ−ＡＨ、オリジン、ＮＰＩ、ＮＰＩＩ、アオルシンＡ、アオルシンＢ、ＣＰＹ、パパイン、活性化パパイン、精製パパイン、又はキモパパインの少なくとも２つを含むことができる。本技術の酵素組成物は、更に、ペニシリウム・シトリナムからの調製物を含むことができる。
【０１２３】
ここで用いる場合、「治療上有効な量」という表現は、ＮＣＧＳ又はＮＣＧＩを含むグルテン不耐性を治療するのに有効な量を含む意味である。ある実施形態において、「治療上有効な量」という表現は、α−２グリアジン由来の３３量体を含むグルテンオリゴペプチドに対する患者の曝露を減じるのに有効な量、又はα−２グリアジン由来の３３量体を含むグルテンオリゴペプチドの抗原性を減じるのに有効な量を指すために用いることもできる。この量は、患者ごとに異なり、一般に、ヒト患者一人について、約２０〜約１０００ｍｇの範囲で変化しうる。他の実施形態においては、これらの量は、ヒト患者一人当たり、約１００〜約５００ｍｇに及ぶ。例えば、この量は、ヒト患者一人当たり、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、又は約４５０ｍｇであってよい。典型的投薬量は、ヒト患者一人につき、約２００ｍｇである。本技術の酵素組成物の治療上有効な量は、毎日、一回、投与することができる。或は、治療上有効な量を、毎日複数回に分けて、分けた量で投与することができる。投与計画としては、約２００ｍｇの酵素組成物を、日に２回与えることを例示できる。他のヒト患者用の投与計画としては、約２００ｍｇの酵素組成物を、グルテン含有食物を摂取した場合いつでも与えることを例示できる。あるいは別な適切な投与計画を、当業者は、決定することができる。
【０１２４】
当業者が認識するであろうように、活性成分の治療上有効な量は、例えば、用いた特定の化合物の活性；特定の患者又は患者集団の年齢、体重、一般的健康状態、性別、及び食事；投与の時間、吸収速度、及び排泄速度；別々に又は組み合わせて摂取した他の薬物との潜在的相互作用；及び治療効果が期待される特定の病気、症状（状態）又は異常の重症度を含む様々な因子によって変化する。投与量は、特定の化合物の投与に伴って起きうる副作用の存在、性質及び程度によっても決められる。特定の投薬量に影響を与える他の因子には、例えば、特定の患者に投与される特定の化合物に関するバイオアベイラビリティー、代謝プロフィル、及び薬力学が含まれる。例えば、治療上有効な量としては、必要な又は望ましい治療応答を引き出すのに十分な酵素組成物の量、例えば、患者に投与した場合に生物学的又は治療的応答を引き出すのに十分な量をあげることができる。
【０１２５】
ある実施形態において、「投与すること」という用語は、患者を、本発明によって提供される組成物と接触させることをいう。例えば、ある実施形態においては、ここに提供する組成物は、経口投与に適しており、それにより、患者を組成物と接触させることは、それらの組成物を摂取することを含む。他の実施形態においては、投与方法には、腸細胞などの細胞での、特定の酵素の発現のレベルを増大させるための遺伝子改変又は酵素組成物を発現する微生物を、患者の腸管への導入することを含む。かかる細胞(これらは、患者に由来しない細胞であるが、患者に投与された際に免疫により拒絶されない細胞を含む)及び微生物は、幾つかの実施形態においては、製薬上許容される賦形剤中に配合され、又は食品中に導入される。更に別の実施形態においては、食品を、グルテンの有毒なオリゴペプチドを減じ又は除去するために、予備処理し又は酵素組成物と合わせることができる。
【０１２６】
当業者が容易に認識するように、患者を、ここに提供する組成物と接触させる方法は、例えば、投与方法；年齢、既往歴、患者に投与される他の薬剤、症状の重さ、患者の体重又は太りやすさ、他の薬物療法への屈折作用など(ただし、これらに限定する意図はない)の多くの変数に依存する。そして、一実施形態において、、当業者が認める任意の適当な経路を通じて、本技術の化合物を患者に投与する具体的方法が提供される。
【０１２７】
ここで用いる場合、「治療すること」という用語は、病気、異常又は状態（症状）の、進行を、排除すること；予防すること；実質的に阻害すること、遅延させること又は逆行させること；その臨床的及び／又は非臨床的症状を実質的に改善（寛解）すること；又はその臨床的及び／又は非臨床的症状の出現を実質的に予防すること又は遅延させることを指す。
【０１２８】
一実施形態において、用語「患者」は、状態（症状）又は後遺症の治療を必要とし又はその影響を受けるヒトを含むほ乳類を指す。この患者には、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、及びマウス及びヒトが含まれる。用語「患者」は、すべての点で正常である個体を排除しない。
【０１２９】
前記の段落において、単数形の使用は、特に示さない限り、複数形を包含することができる。ここで用いる場合、単数形は、別途特定しない限り、「一以上」を意味する。加えて、本技術の態様が、代替可能な選択肢のリストに関連づけて記載されている場合には、本技術は、代替可能な選択肢のリストの各メンバー（要素）又は各サブグループのいずれか、及びこれら一以上の任意の組合せを包含する。
【０１３０】
すべての特許、公開公報(公開された特許出願を含む)、寄託受け入れ番号、及びデータベース受け入れ（アクセッション）番号の開示は、それにより、各特許、公開、寄託受け入れ番号、及びデータベース受け入れ番号が特定的及び個別的に参考として援用されるのと同程度に参考として援用される。
【０１３１】
本技術の範囲は、下記の特定の実施形態に限定されないということは理解されるべきである。本技術は、詳細に記載したもの以外で実施することができ、それも添付の特許請求の範囲に入る。
【０１３２】
同様に、下記の実施例は、本技術を一層完全に説明するために提示されるものである。それらは、決して、ここに開示した技術の広い範囲を限定するものと解するべきではない。
【実施例】
【０１３３】
実施例１：３３量体ペプチドのＧＤＥＰ−ＬＧＧによる分解。
３３量体ペプチド(ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ (SEQ ID NO:1))を、ＧＤＥＰ−ＬＧＧと、様々な濃度(０ｍｇ／ｍｌ；０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、及び１．０ｍｇ／ｍｌ)で、U.S. Pharmacopeiaの模擬的腸液(ＳＩＦ；ｐＨ約６．８)中でインキュベートした。３０μＬの反応体積には、１０μＬの３３量体ペプチド、１０μＬの酵素溶液、及び１０μＬの３×ＳＩＦ緩衝液を含ませた。約１５、３０、６０、１２０、及び２４０分間にわたって、約３７℃で反応させてから、５分間、９０℃にして酵素反応を終了させた。
【０１３４】
酵素処理した３３量体の試料を、３３量体ペプチドに対して作成されたＨＲＰ結合したポリクローナル抗体を用いる酵素結合免疫吸着検定法(「ＥＬＩＳＡ」)により分析した。
【０１３５】
３３量体ペプチドのＧＤＥＰ−ＬＧＧによる分解の時間経過及び投与量−応答分析の結果を、図１に示してある。ＧＤＥＰ−ＬＧＧとの(すべての濃度での)、約１２０分間にわたるインキュベーションは、３３量体の抗原性を少なくとも約７０％低下させた。
【０１３６】
実施例２：３３量体ペプチドのＧＤＥＰ−ＬＧＧの成分による分解。
ＧＤＥＰ−ＬＧＧの個々の成分(オリジン、ＮＰＩ及びＮＰＩＩを含む)を、３３量体に対する酵素活性について試験した。３３量体ペプチド(１ｍｇ／ｍｌ)を、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ；３×ＧＤＥＰ−ＬＧＧ(即ち、０．３ｍｇ／ｍｌ)；オリジン；ＮＰＩ；ＮＰＩＩ；又はオリジン、ＮＰＩ及びＮＰＩＩの組合せ(１：１：１及び２：１：４の比)を含む０．１ｍｇ／ｍｌ酵素溶液と、模擬的腸液(ＳＩＦ；ｐＨ約６．８)の存在下でインキュベートした。３０μＬの反応体積には、１０μＬの３３量体ペプチド、１０μＬの酵素溶液、及び１０μＬの３×ＳＩＦ緩衝液を含ませた。約２０、６０、１２０、及び２４０分間にわたって、約３７℃で反応させてから、５分間、９０℃にして、酵素反応を終了させた。
【０１３７】
酵素処理した３３量体の試料を、実施例１におけるように分析した。３３量体のＧＤＥＰ−ＬＧＧ及び個々の成分酵素による分解を図２に示してある。ＧＤＥＰ−ＬＧＧ(両方の濃度で試験した)との約６０分間のインキュベーションは、３３量体ペプチドの約９０％の分解を生じた。オリジン単独では、３３量体ペプチドを分解しなかった。ＮＰＩ及びＮＰＩIは、各々、限定的な３３量体ペプチド分解能力を示した。これら３種の精製酵素(オリジン、ＮＰＩ、及びＮＰＩＩ)を用いたＧＤＥＰ−ＬＧＧの再構成体は、１２０及び２４０分で、３３量体ペプチドの約５０％の分解を生じた。
【０１３８】
オリジン、ＮＰＩ、及び／又はＮＰＩＩを更に組み合わせて、それらが３３量体ペプチドを分解する能力について試験した。３３量体ペプチド(１ｍｇ／ｍｌ)を、グルテン分解酵素調製物；オリジン；ＮＰＩ；及び／又はＮＰＩIを含む、様々な濃度(０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ又は０．８ｍｇ／ｍｌ)の酵素溶液と，模擬的腸液(ＳＩＦ；ｐＨ約６．８)の存在下でインキュベートした。３０μＬの反応体積には、１０μＬの３３量体ペプチド、１０μＬの酵素溶液、及び１０μＬの３×ＳＩＦ緩衝液を含ませた。約６０分間、約３７℃で反応させてから、５分間９０℃にして酵素反応を停止させた。
【０１３９】
酵素処理した３３量体ペプチドの試料を、実施例１におけるように分析した。３３量体をＧＤＥＰ−ＬＧＧ及びその個々の成分酵素並びにそれらの様々な組合せによって分解して、図３に示した。ＮＰＩ単独では、３３量体ペプチドの約４０％を分解した(図３Ｂ)。ＮＰＩＩ単独では、３３量体ペプチドの約２０〜３０％を分解した(図３Ｂ)。オリジンは、最低濃度では、３３量体ペプチドを分解しなかった(図３Ｂ)。しかしながら、一層高濃度(０．４ｍｇ／ｍｌ及び０．８ｍｇ／ｍｌ)では、オリジンは、３３量体ペプチドの約１０〜２０％を分解した(図３Ｂ)。３種類の精製酵素(オリジン、ＮＰＩ，及びＮＰＩI)を用いたＧＤＥＰ−ＬＧＧの再構成体は、３３量体ペプチドを約３０〜約５０％分解した。しかしながら、この組合せは、３３量体の、ＧＤＥＰ−ＬＧＧと同じ分解パーセンテージを達成しなかった(図３Ｂ)。従って、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ中の他のプロテアーゼ又はペプチダーゼが、３３量体の分解に関与していることはありうる。オリジンとＮＰＩの組合せもＮＰＩとＮＰＩＩの組合せも、相乗効果を生じないようである(図３Ｃ及び３Ｅ)。しかしながら、オリジンとＮＰＩIの組合せは、相乗効果を達成することができる(図３Ｄ)。
【０１４０】
実施例３：ＧＤＥＰ−ＬＧＧと他の消化プロテアーゼの組合せ
３３量体ペプチド(１ｍｇ／ｍｌ)を、０．２５ｍｇ／ｍｌの酵素溶液(ペプシン、プロテイナーゼＫ、又はＧＤＥＰ−ＬＧＧを含む)と、模擬的腸液(ＳＩＦ；ｐＨ約６．８)又は模擬的胃液(ＳＧＦ；ｐＨ約２．０)の存在下でインキュベートした。４０μＬの反応体積には、１０μＬの３３量体ペプチド、１０μＬの酵素溶液、及び２０μＬの２×ＳＩＦ又はＳＧＦ緩衝液を含ませた。約１５時間にわたって、３７℃で反応させてから、５分間、９０℃にした。
【０１４１】
酵素処理した３３量体の試料を、アジレント(Ａｇｉｌｅｎｔ)１１００ＨＰＬＣシステムを用いる逆相高圧液体クロマトグラフィー(「ＨＰＬＣ」)により分析した。試料を、エクリプス(Ｅｃｌｉｐｓｅ)ＳＢ−Ｃ１８(内径２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、３．５ｕｍ)カラムに導入した。(Ａ)０．１％蟻酸を含む蒸留水と(Ｂ)０．１％蟻酸を含むアセトニトリルよりなる移動相を用いて、標的物質を、勾配モード(０分、２％Ｂ→１０分、２５％Ｂ→４０分、４０％Ｂ→４５分、１００％Ｂ→５０分、１００％Ｂ)にて溶出させた。流量は、０．２ｍＬ／分に設定し、注入体積は、５μＬであった。検出は、ダイオードアレイ検出器(２１０、２８０)及び質量分光計により行なった。
【０１４２】
質量分光計は、ＡＰＩ−ＥＳポジティブモードで、次の条件を用いて操作した：乾燥ガスフロー１３．０Ｌ／分；乾燥ガス温度２８０℃；ネブライザー圧６０ｐｓｉｇ；及びキャピラリー電圧２０００Ｖ。
【０１４３】
胃の条件(ｐＨ約２．０)において、ペプシンは、３３量体ペプチドを殆ど加水分解しなかった(図４Ａ)。同様に、腸条件(ｐＨ約６．８)においてプロテイナーゼＫは、３３量体ペプチドを殆ど加水分解しなかった(図４Ｂ)。腸条件において、ＧＤＥＰ−ＬＧＧは、３３量体ペプチドを加水分解したが、必ずしもすべてのペプチド断片を除去しなかった(図４Ｃ)。
【０１４４】
実施例４：グルテン分解酵素調製物と他のアスペルギルス由来のプロテアーゼの比較
３３量体ペプチド(１ｍｇ／ｍｌ)を、グルテンＧＤＥＰ−ＬＧＧ、ＧＤＥＰ−２Ａ、ＧＤＥＰ−ＬＮＡ、ＧＤＥＰ−Ｍ、又はプロテアーゼＰと、ＳＩＦ(ｐＨ約６．８)の存在下でインキュベートした。３０μＬの反応体積は、１０μＬの３３量体ペプチド、１０μＬの酵素溶液(０．１ｍｇ／ｍｌ)、及び１０μＬの３×ＳＩＦ緩衝液を含んだ。これらの反応を、約４時間にわたって、３７℃で行なってから、５分間、９０℃に加熱した。ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析を、実施例３に記載したように行なった。
【０１４５】
プロテアーゼＰは、セミアルカリプロテアーゼであり、タンパク質分解酵素調製物である。プロテアーゼＰは、小麦ふすま上で培養された選択されたアスペルギルス株を用いる独自の発酵過程により製造される。プロテアーゼＰ酵素は、水で抽出されて、エタノールによる分画により精製される。プロテアーゼＰは、高いタンパク質分解活性を有する。
【０１４６】
ＰＺＨ(ＳＤ)は、アスペルギルス・メレウスからのセミアルカリプロテアーゼである。これは又、この酵素の精製及び用途に応じて、プロテアーゼＰ、セアプローゼ又はプロテアーゼＤＳとも呼ばれる。プロテアーゼＰは、高度には精製されておらず；セアプローゼ(セミアルカリプロテアーゼ)は、日本では、肺関連疾患に対する薬物として使用されてきた；プロテアーゼＤＳは、アスペルギルス・メレウスにより産生される酵素調製物である。
【０１４７】
この３３量体ペプチドと、４時間にわたって、腸条件(ｐＨ約６．８)でインキュベートした場合、ＧＤＥＰ−ＬＧＧは、３３量体を加水分解した(図５Ａ)。しかしながら、３３量体のＧＤＥＰ−ＬＧＧによる加水分解は、反応時間を４時間に低減された場合、１５時間と比べて効率は低かった(実施例３参照)。他のアスペルギルスプロテアーゼは、３３量体ペプチドに対して、グルテン分解酵素調製物と類似の加水分解を示す(図５Ｂ−5Ｅ)。
【０１４８】
実施例５：ＧＤＥＰ−Ｍ及びＧＤＥＰ−ＬＧＧの、様々なｐＨにおける３３量体加水分解活性
３３量体ペプチド(１ｍｇ／ｍｌ)を、ＧＤＥＰ-ＬＧＧ又はＧＤＥＰ−Ｍと、様々なｐＨでインキュベートした。３０μＬの反応体積には、１０μＬの３３量体ペプチド、１０μＬの酵素溶液(０．１ｍｇ／ｍｌ)、及び１０μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液を含ませた。ＧＤＥＰ−Ｍのための緩衝液のｐＨは、３．０〜６．０の範囲とした(図６Ａ−6Ｄ)。グルテン分解酵素調製物のための緩衝液のｐＨは、４．０〜６．０にの範囲とした(図６Ｅ〜６Ｇ)。半量のＧＤＥＰ−Ｍも、ｐＨ４．０で試験した(図６Ｈ)。約４時間にわたって、３７℃で反応させてから、５分間、９０℃にした。ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は、実施例３に記載の通りとした。
【０１４９】
ＧＤＥＰ−ＬＧＧとＧＤＥＰ−Ｍの両者は、独立に、３３量体ペプチドを、酸性ｐＨで、高い効率で加水分解した。ＧＤＥＰ−Ｍは、酸性ｐＨで、ＧＤＥＰ−ＬＧＧより、一層高い効率での加水分解を示した。
【０１５０】
実施例６：プロテアーゼ阻害剤の分析
前記の実施例は、ＧＤＥＰ−ＭとＧＤＥＰ−ＬＧＧが、３３量体ペプチド、例えばα−２グリアジン由来のものを、酸性ｐＨで、効率よく加水分解することを示している。様々なプロテアーゼ阻害剤を、３３量体の分解に効果的なＧＤＥＰ−ＭとＧＤＥＰ−ＬＧＧの成分を評価するために使用した。
【０１５１】
３３量体ペプチド(１ｍｇ／ｍｌ)を、０．１ｍｇ／ｍｌの酵素溶液(ＧＤＥＰ−ＬＧＧ又はＧＤＥＰ−Ｍ)とインキュベートした。３３μＬの反応体積には、１０μＬの３３量体ペプチド、１０μＬの酵素溶液(０．１ｍｇ／ｍｌ)、１０μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液、及び３μＬのプロテアーゼ阻害剤−ＰＭＳＦ、ペプスタチン、又はＥＤＴＡを含ませた。この緩衝液のｐＨは、約４．０であった。約４時間にわたって、３７℃で反応させてから、５分間、９０℃にした。ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は、実施例３に記載の通りとした。
【０１５２】
３３量体ペプチドと約４時間にわたって酸性条件下(ｐＨ約４．０)でインキュベートすると、ＧＤＥＰ−ＬＧＧは、３３量体を加水分解した(図７Ａ)。しかしながら、ＧＤＥＰ−ＬＧＧによる３３量体の加水分解は、ＰＭＳＦの存在下では、効率が低かった(図７Ｂ)。ペプスタチンもＥＤＴＡも、ＧＤＥＰ−ＬＧＧによる３３量体ペプチドの加水分解を阻害しなかった(図７Ｃ及び７Ｄ)。
【０１５３】
３３量体ペプチドと４時間にわたって酸性条件(ｐＨ約４．０)でインキュベートした場合、ＧＤＥＰ−Ｍは、３３量体を加水分解した(図７Ｅ)。しかしながら、ＧＤＥＰ−Ｍによる３３量体の加水分解は、ＰＭＳＦの存在下では、効率が低かった(図７Ｆ)。ペプスタチンもＥＤＴＡも、ＧＤＥＰ−Ｍによる３３量体ペプチドの加水分解を阻害しなかった(図７Ｇ及び７Ｈ)。
【０１５４】
ペプスタチンもＥＤＴＡも、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ又はＧＤＥＰ−Ｍによる３３量体ペプチドの加水分解を阻害しなかった。ＰＭＳＦは、グルテン分解酵素調製物又はＧＤＥＰ−Ｍによる３３量体ペプチドの加水分解を阻害した。従って、酸性セリンプロテアーゼは、グルテン分解酵素調製物又はＧＤＥＰ−Ｍによる３３量体ペプチドの加水分解の主成分である。
【０１５５】
実施例７：アオルシン、ＧＤＥＰ−Ｍの成分による３３量体ペプチドの加水分解
上記の実験は、酸性セリンプロテアーゼが、３３量体に対するＧＤＥＰ−Ｍの加水分解活性に寄与することを示している。アオルシンは、ＧＤＥＰ−Ｍ中に存在する酸性セリンプロテアーゼである。
【０１５６】
アオルシンＡ及びアオルシンＢを含むＧＤＥＰ−Ｍの個々の成分を、３３量体に対する酵素活性について試験した。３３量体ペプチド(１ｍｇ／ｍｌ)を、アオルシンＡ又はアオルシンＢを含む１．０ｍｇ／ｍｌの酵素溶液と、クエン酸緩衝液(ｐＨ約４．０)の存在下でインキュベートした。３０μＬの反応体積には、１０μＬの３３量体ペプチド、１０μＬのアオルシン溶液、及び１０μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液を含ませた。約１５分、３０分、６０分、及び２４０分間わたって約３７℃で反応させてから、５分間、９０℃にして、酵素反応を停止させた。
【０１５７】
ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析を、実施例３に記載の通りとした。３３量体ペプチドと酸性条件(ｐＨ約４．０)下でインキュベートした場合、アオルシンＡは、３３量体を加水分解した(図８Ａ−８Ｄ)。同様に、３３量体ペプチドと酸性条件(ｐＨ約４．０)下でインキュベートした場合、アオルシンＢは、３３量体を加水分解した(図８Ｅ−８Ｈ)。
【０１５８】
アオルシンで約２４０分間処理した３３量体の試料は実施例１に記載のようにも分析した。３３量体のアオルシンによる分解は、図９に示した。アオルシンＡ又はＢとの約２４０分間のインキュベーションは、３３量体ペプチドを完全分解した。
【０１５９】
実施例８：カルボキシペプチダーゼＹとミキソコッカス・ザンサスプロリルエンドペプチダーゼの様々なｐＨでの３３量体加水分解活性
３３量体ペプチド(１ｍｇ／ｍｌ)を、サッカロミセス・セレビシエ由来のＣＰＹ又はミキソコッカス・ザンサスのプロリルエンドペプチダーゼ(「ＭＸ−ＰＥＰ」)と様々なｐＨでインキュベートした。３０μＬの反応体積には、１０μＬの３３量体ペプチド、１０μＬの酵素溶液(０．１ｍｇ／ｍｌ)、及び１０μＬの緩衝液を含ませた。この緩衝液のｐＨは、４．０から７．０の範囲とした(ＣＰＹについては、図１０Ａ−１０Ｄ、及びＭＸ−ＰＥＰについては、図１０Ｅ−１０Ｈ)。約４時間にわたって、３７℃で反応させてから、５分間、９０℃にした。ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は、実施例３に記載の通りとした。
【０１６０】
ＭＸ−ＰＥＰは、３３量体ペプチドを酸性ｐＨで加水分解しなかった。ＣＰＹは、３３量体ペプチドを酸性ｐＨで完全に加水分解した。この結果は、ＣＰＹは、中性の至適ｐＨを有するエキソペプチダーゼとして知られているので、驚くべきことである。しかしながら、ここに示したデータは、ＣＰＹが、３３量体ペプチドに対しては酸性の至適ｐＨを有することを示している。
【０１６１】
実施例９：カルボキシペプチダーゼＹとプロリルエンドペプチダーゼの比較
３３量体ペプチド(１ｍｇ／ｍｌ)を、酵素溶液(ＣＰＹ、ＭＸ−ＰＥＰ、又はアスペルギルス・ニガープロリルエンドペプチダーゼ(「ＡＮ−ＰＥＰ」)を含む)とインキュベートした。ＡＮ−ＰＥＰは、例えば、ブリュワーズ・クラレックス(商標)(DSM)として市販されている。ＣＰＹとＡＮ−ＰＥＰを酸性ｐＨ(ｐＨ約５．０)でインキュベートした。ＭＸ−ＰＥＰを、ＳＩＦ(ｐＨ約６．８)の存在下でインキュベートした。３０μＬの反応体積には、１０μＬの３３量体ペプチド、１０μＬの酵素溶液、及び１０μＬの緩衝液を含ませた。
【０１６２】
各酵素を、４通りの濃度：０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ；０．０２５ｍｇ／ｍｌ、及び０．０１２５ｍｇ／ｍｌで試験した。約４時間にわたって、約３７℃で反応させてから、５分間、９０℃にして酵素反応を停止させた。ＣＰＹ、ＭＸ−ＰＥＰ、及びＡＮ−ＰＥＰについての投与量応答の結果は、図１１Ａ−１１Ｄ(ＣＰＹ)、図１１Ｅ−１１Ｈ(ＭＸ−ＰＥＰ)、及び図１１Ｉ−１１Ｌ(ＡＮ−ＰＥＰ)に示した。
【０１６３】
各酵素(０．１ｍｇ／ｍｌの濃度)は、４つの時点：約１５分、３０分、６０分、及び２４０分でも試験した。ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析を、実施例３に記載の通りとし、ＣＰＹ、ＭＸ−ＰＥＰ、及びＡＮ−ＰＥＰについてのこの分析の結果を、図１１Ｍ−１１Ｐ(ＣＰＹ)、図１１Ｑ−１１Ｔ(ＭＸ−ＰＥＰ)、及び図１１Ｕ−１１Ｖ(ＡＮ−ＰＥＰ)に示す。ＥＬＩＳＡによる分析も、実施例１に記載されたように行ない、この分析の結果は、図１２に示す。
【０１６４】
ＣＰＹ、ＭＸ−ＰＥＰ、及びＡＮ−ＰＥＰは、３３量体ペプチドを加水分解する。ＡＮ−ＰＥＰは、３３量体ペプチドに対する最強の活性を有し、その次がＣＰＹで、その次がＭＸ−ＰＥＰである。
【０１６５】
実施例１０：イン・ビトロ胃腸管モデル
イン・ビトロ胃腸モデルを用いて、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、ＧＤＥＰ−Ｍ及びＣＰＹを含む様々な酵素の消化効率を評価した。
【０１６６】
動物により摂取されることが意図され又は合理的に予想される、小麦グルテン及び市販の食品に対するＧＤＥＰ−ＬＧＧの消化効率を試験するために、下記のモデルを用いた：
【０１６７】
１３５ｍｌの溶液を、１００ｍｌの２．７％ウシ血清アルブミン；５ｍｌの３％胃粘膜ムチン；１０ｍｌのＮａＣｌ １３．２ｇ＋ＣａＣｌ2２Ｈ2Ｏ ０．２２ｇ／１００ｍｌ；及び２０ｍｌのｐＨ４．０の酢酸緩衝液を用いて調製した。この溶液を、３７℃で、約２０分間にわたってインキュベートした。この予備処理後に、５ｍｌの０．２％ペプシン及び１０ｍｌの１．４７％ＥＺ−ＧＥＳＴ(登録商標)(Shaklee)を、この溶液に加えた。ｔ＝０分に、ペプチド含有物質(例えば、小麦グルテン又は市販の食料品)を、この溶液に加えて、約１２０分間インキュベートした。このインキュベーションの期間中に(ｔ＝５分、ｔ＝２０分、ｔ＝３５分、ｔ＝５０分、ｔ＝６５分)、４ｍｌの０．２Ｎ ＨＣｌをこの混合物に加えて、その酸性度を維持した。
【０１６８】
ｔ＝１２０分に、３．０ｇ 重炭酸ナトリウム(ＮａＨＣＯ3)、０．３１ｇ ＴＤＣＡ、及び１５０ｍｇ パンクレアチンを、この混合物に加えて、腸条件を模倣した。この混合物を、次いで、約３７℃で約６０分間にわたってインキュベートした(ｔ＝１８０分まで)。この混合物を、ｔ＝０分、ｔ＝３０分、ｔ＝６０分、ｔ＝９０分、ｔ＝１２０分、ｔ＝１３０分、ｔ＝１４０分、ｔ＝１５０分、及びｔ＝１８０分において、１ｍｌ取り出すことによりサンプリングした。
【０１６９】
ＧＤＥＰ−ＬＧＧの、３３量体に対する消化効率を、３３量体ペプチド源として様々な市販の食料品を用いて、表１及び２に示した。表１のデータは、示した３３量体源の、２００ｍｇのＧＤＥＰ−ＬＧＧとの１８０分間のインキュベーションを反映している。表２に示したデータは、示した３３量体源の、示した量のＧＤＥＰ−ＬＧＧとの１８０分間のインキュベーションを反映している。
【表１】
2013518589.tif 000002
【表２】
2013518589.tif 000003
【０１７０】
更に、０〜２００ｍｇの範囲の様々な投与量のＧＤＥＰ−ＬＧＧを、１０ｇ小麦グルテンに対して、上記の胃腸管モデルで試験した。図１３は、小麦グルテンと３３量体ペプチドのＧＤＥＰ−ＬＧＧによる消化を示している。上記の２００ｍｇＧＤＥＰ−ＬＧＧの投与量は、グリアジンの約８０％及び３３量体の約８０％を消化した。
【０１７１】
３３量体に対するＣＰＹとＧＤＥＰ−Ｍの消化効率を調べるために、別のイン・ビトロ胃腸管モデルを採用した。
【０１７２】
この３３量体(３００μｇ)とペプシン(３０μｇ)を、１００μＬの２０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ４．５)に加えた。ＣＰＹ単独、ＧＤＥＰ−Ｍ単独、又はＣＰＹとＧＤＥＰ−Ｍの組合せも加えた。この溶液を、これらの胃条件下で３７℃で約６０分間にわたってインキュベートした。次いで、ｐＨを、５００ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4の添加により６．８に調節した。腸内酵素、トリプシン(２０μｇ)及びキモトリプシン(２０μｇ)も又、この時点で加えた。この溶液を、更に、腸条件下で３７℃で約６０分間インキュベートしてから、５分間、９０℃にして、酵素反応を停止させた。ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は、実施例３に記載の通りとした。
【０１７３】
ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は、実施例３に記載した。消化酵素単独(ペプシン、トリプシン及びキモトリプシン)は、３３量体ペプチドを消化することができなかった(図１４Ａ)。ＧＤＥＰ−Ｍ、ＣＰＹ、及びＧＤＥＰ−ＭとＣＰＹの組合せは、３３量体ペプチドを、人工的胃腸条件下で効率的に消化した(図１４Ｂ−１４Ｄ)。実施例１に記載したようにＥＬＩＳＡによる分析も行った。ＧＤＥＰ−Ｍ単独は、３３量体ペプチドの約８７％を消化し、ＣＰＹ単独は、３３量体ペプチドの約９５％を消化し、ＧＤＥＰ−ＭとＣＰＹの組合せは、３３量体ペプチドの約９９〜１００％を消化した(図１５)。
【０１７４】
実施例１１：３３量体ペプチドのＣＰＹ及びＧＤＥＰ−ＬＧＧによる加水分解
この３３量体(１ｍｇ／ｍｌ)を、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、ＣＰＹ、又はＧＤＥＰ−ＬＧＧとＣＰＹの組合せと、ＳＩＦ(ｐＨ約６．８)の存在下でインキュベートした。３０μＬの反応体積に、１０μＬの３３量体ペプチド、１０μＬの酵素溶液(０．１ｍｇ／ｍｌ)、及び１０μＬの３×ＳＩＦ緩衝液を含ませた。約４時間にわたって、３７℃で反応させてから、５分間、９０℃にした。ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は、実施例３に記載の通りとした。
【０１７５】
ＧＤＥＰ−ＬＧＧは、３３量体ペプチドを加水分解して、残留ペプチド、例えば１−３０、６−３３及び４−３３を生成した(図１６Ａ)。ＣＰＹは、効率的に、３３量体ペプチドを加水分解して、残留ペプチドは、約２０アミノ酸長であった(図１６Ｂ)。ＧＤＥＰ−ＬＧＧとＣＰＹでの処理は、３３量体ペプチドを加水分解し；残留ペプチドは、何れかの酵素組成物単独で用いた場合より遥かに少なかった(図１６Ｃ)。
【０１７６】
実施例１２：ＧＤＥＰ−ＬＧＧプロテアーゼ活性
ＧＤＥＰ−ＬＧＧを、ＤＥＡＥクロマトグラフィーを用いて分画した。各画分を、タンパク質濃度、３３量体ペプチド分解活性、プロリルエンドペプチダーゼ活性、及びプロテアーゼ活性について分析した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍで評価した。プロリルエンドペプチダーゼ活性を、基質のＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを用いて評価した。プロテアーゼ活性を、アゾカゼイン及び市販の蛍光共鳴エネルギー転移基質−２５Ｘａａ(「ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａ」)シリーズを用いて分析した。
【０１７７】
ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａ製品は、下記の一般的構造を有する：
【化１】
2013518589.tif 000004
【０１７８】
ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａシリーズ中の各基質(コード３７０１−ｖ−コード３７１９−ｖ)は、アミノ末端Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸(Ｄ−Ａ２ｐｒ)残基の側鎖に結合された高度に蛍光性の２−(Ｎ−メチルアミノ)ベンゾイル(Ｎｍａ)基を含み、これは、Ｌｙｓの官能基に結合された２，４−ジニトロフェニル(Ｄｎｐ)基により効率的に消光される。Ｘａａは、Ｃｙｓを除く１９の天然アミノ酸のいずれかの固定位置を表している(製品名コード３７０１−ｖ−コード３７１９−ｖで記されている)。各固定されたＸａａにつき、５種のアミノ酸残基(Ｐ、Ｙ、Ｋ、Ｉ、及びＤ)の混合物がＹａａ位置にあり、さらにＺａａ位置に５種のアミノ酸残基(Ｆ、Ａ、Ｖ、Ｅ、及びＲ)の混合物がある。これは、各Ｘａａシリーズに２５の組合せのペプチド混合物を提供し、総計で４７５ペプチド基質のコンビナトリアルライブラリーとなる。ＮｍａとＤｎｐの両基は、個々の残基の側鎖に結合されており、これは、酵素特異的な質量分析法及びエドマン分解などにより開裂部位の決定を可能にする。関心ある酵素が基質中のＤ−Ａ２ｐｒ(Ｎｍａ)とＬｙｓ(Ｄｎｐ)の間のペプチド結合を開裂した場合には、λex＝３４０ｎｍ及びλem＝４４０ｎｍの蛍光が、Ｎｍａフルオロフォアの内部Ｄｎｐクエンチャーからの放出に比例して、増大する。
【０１７９】
ＧＤＥＰ−ＬＧＧは、アゾカゼイン及びＦＲＥＴＳ−２５Ｐｒｏの分解により評価されているように、有意なプロテアーゼ活性を有している(図１７Ａ)。プロテアーゼ活性は、２つの主要な画分であるＤＥＡＥ透過性画分とＤＥＡＥ吸着画分に分割された(図１７Ａ)。ＧＤＥＰ−ＬＧＧは、基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡで測定されたように、極僅かなプロリルエンドペプチダーゼ活性を有している(図１７Ｂ)。それにもかかわらず、ＧＤＥＰ−ＬＧＧは、驚くべきことに、３３量体ペプチドに対して有意な活性を有しており、これは、２つの主要な画分であるＤＥＡＥ透過画分とＤＥＡＥ吸着画分に分割された(図１７Ｂ)。
【０１８０】
実施例１３：イン・ビトロ胃腸管モデル(１２．５ｍｇ、２５ｍｇ、３７．５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ及び４００ｍｇの投与量の酵素)
イン・ビトロ胃腸管モデルを用いて、様々な酵素の、投与量１２．５ｍｇ、２５ｍｇ、３７．５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ及び４００ｍｇの場合の消化効率を評価した。
【０１８１】
動物に摂取されることが意図され又は合理的に予想されるグルテンに対する様々な酵素の消化効率を調べるために、下記のモデルを採用した。
【０１８２】
１３５ｍｌの溶液を、１００ｍｌの２．７％ウシ血清アルブミン；５ｍｌの３％胃粘膜ムチン；１０ｍｌのＮａＣｌ １３．２ｇ＋ＣａＣｌ2２Ｈ2Ｏ ０．２２ｇ／１００ｍｌ；及び２０ｍｌのｐＨ４．０の酢酸緩衝液を用いて調製した。この溶液を、３７℃で、約２０分間にわたってインキュベートした。この予備インキュベーションの後に、５ｍｌの０．２％ペプシン及び１０ｍｌの様々な投与量の酵素(１２．５ｍｇ、２５ｍｇ、３７．５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ及び４００ｍｇ)を、この溶液に加えた。ｔ＝０で、グルテンを、この溶液に加えて、約１２０分間にわたってインキュベートした。このインキュベーション期間中に、４ｍｌの０．２Ｎ ＨＣｌアリコートを、この混合物に加えて、混合物の酸性を維持した(ｔ＝５分、ｔ＝２０分、ｔ＝３５分、ｔ＝５０分、ｔ＝６５分)。
【０１８３】
ｔ＝１２０分の時点で、３．０ｇ 重炭酸ナトリウム(ＮａＨＣＯ3)、０．８１ｇ デオキシコール酸塩、及び１５０ｍｇ パンクレアチンを、この混合物に加えて、腸条件を模倣した。この混合物を、次いで、約３７℃で、約６０分間にわたって(ｔ＝１８０分まで)インキュベートした。この混合物を、ｔ＝０分、ｔ＝３０分、ｔ＝６０分、ｔ＝９０分、ｔ＝１２０分、ｔ＝１３０分、ｔ＝１４０分、ｔ＝１５０分、及びｔ＝１８０分の時点で、１ｍｌを取り出すことにより、サンプリングした。
【０１８４】
グルテンを３３量体ペプチドの起源として用いて、３３量体ペプチドに対する酵素の残留率を図１８Ａ−１８Ｅに示した。これらの数値は、グルテンを、表示された各酵素（単数及び複数）の１２．５ｍｇ、２５ｍｇ、３７．５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ又は４００ｍｇとの１８０分間にわたるインキュベーションを反映している。ＥＬＩＳＡによる分析は、実施例１に記載の通りとした。
【０１８５】
ＧＤＥＰ−ＬＧＧは、３３量体を３３量体ペプチドのグルテン起源から、大きく減少させ又は排除するのに有効であった(図１８Ｂ、１８Ｅ)。
【０１８６】
実施例１４：イン・ビトロ胃腸管モデル(投与量５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ及び４００ｍｇのグルテン分解酵素調製物)
イン・ビトロ胃腸管モデルを用いて、投与量５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ及び４００ｍｇのＧＤＥＰ−ＬＧＧの消化効率を評価した。
【０１８７】
動物により摂取されることが意図され又は合理的に予想される市販の食品に対するグルテン分解酵素調製物の消化効率を調べるために、下記のモデルを採用した。
【０１８８】
１３５ｍｌの溶液を、１００ｍｌの２．７％ ウシ血清アルブミン；５ｍｌの３％胃粘膜ムチン；１０ｍｌ ＮａＣｌ １３．２ｇ＋ＣａＣｌ2２Ｈ2Ｏ ０．２２ｇ／１００ｍｌ；及び２０ｍｌのｐＨ４．０のアセテート緩衝液を用いて調製した。この溶液を、３７℃で、約２０分間インキュベートした。この予備インキュベーション後に、５ｍｌの０．２％ ペプシン及び１０ｍｌの様々な投与量のＧＤＥＰ−ＬＧＧ(５０、１００、２００又は４００ｍｇ)をこの溶液に加えた。ｔ＝０分で、ペプチド含有物質(例えば、市販の食品)を、この溶液に加えて、約１２０分間インキュベートした。このインキュベーション期間中、４ｍｌの０．２Ｎ ＨＣｌアリコートを、この混合物に加えて、混合物の酸性度を維持した(ｔ＝５分、ｔ＝２０分、ｔ＝３５分、ｔ＝５０、分、ｔ＝６５分)。
【０１８９】
ｔ＝１２０分で、３．０ｇ 重炭酸ナトリウム(ＮａＨＣＯ3)、０．８１ｇデオキシコール酸塩、及び１５０ｍｇパンクレアチンを、この混合物に加えて、腸条件を模倣した。次いで、この混合物を、約３７℃で、約６０分間(ｔ＝１８０分まで)インキュベートした。この混合物を、ｔ＝０分、ｔ＝３０分、ｔ＝６０分、ｔ＝９０分、ｔ＝１２０分、ｔ＝１３０分、ｔ＝１４０分、ｔ＝１５０分、及びｔ＝１８０分の時点で、１ｍｌ取り出すことにより、サンプリングした。
【０１９０】
３３量体ペプチド起源としての市販の食品の、ＧＤＥＰ−ＬＧＧでの処理後の３３量体ペプチドの残留率を、図１９Ａ−１９Ｅに示し、表３にまとめた。表３中のデータは、３３量体の示された起源の、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ又は４００ｍｇのＧＤＥＰ−ＬＧＧとの１８０分間にわたるインキュベーションを反映している。ＥＬＩＳＡによる分析は、実施例１に記載の通りとした。
【表３】
2013518589.tif 000005
【０１９１】
ＧＤＥＯＰ−ＬＧＧは、様々な市販の３３量体ペプチド起源から、該３３量体を大きく低減させ又は排除するのに有効であった。３３量体の残留率は、一般に、すべての起源を通して、ＧＤＥＰ−ＬＧＧの投与量が高いほど減少した（図１９Ａ〜１９Ｅ）。
【０１９２】
実施例１５：イン・ビトロ胃腸管モデル：５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ及び４００ｍｇの投与量における、ＧＤＥＰ−ＬＧＧとＧＤＥＰ−Ｍの比較
【０１９３】
イン・ビトロ胃腸管モデルを用いて、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ及び４００ｍｇの投与量における、ＧＤＥＰ−ＬＧＧとＧＤＥＰ−Ｍの各々の消化効率を比較した。
【０１９４】
動物により摂取されることが意図され又は合理的に予想される市販の食品に対するＧＤＥＰ−ＬＧＧとＧＤＥＰ−Ｍの消化効率を調べるために、下記のモデルを採用した。
【０１９５】
１３５ｍｌの溶液を、１００ｍｌの２．７％ウシ血清アルブミン；５ｍｌの３％胃粘膜ムチン；１０ｍｌ ＮａＣｌ １３．２ｇ＋ＣａＣｌ2２Ｈ2Ｏ ０．２２ｇ／１００ｍｌ；及び２０ｍｌのｐＨ４．０のアセテート緩衝液を用いて調製した。この溶液を、３７℃で、約２０分間インキュベートした。この予備インキュベート後に、５ｍｌの０．２％ペプシン及び１０ｍｌの様々な量のＧＤＥＰ−ＬＧＧ又はＧＤＥＰ−Ｍ(５０、１００、２００又は４００ｍｇ)をこの溶液に加えた。ｔ＝０において、ペプチド含有物質(例えば、市販の食品)をこの溶液に加えて、約１２０分間にわたってインキュベートした。このインキュベーション期間中、４ｍｌの０．２Ｎ ＨＣｌアリコートを、この混合物に加えて、混合物の酸性度を維持した(ｔ＝５分、ｔ＝２０分、ｔ＝３５分、ｔ＝５０分、ｔ＝６５分)。
【０１９６】
ｔ＝１２０分では、３．０ｇ 重炭酸ナトリウム(ＮａＨＣＯ3)、０．８１ｇデオキシコール酸塩、及び１５０ｍｇパンクレアチンを、この混合物に添加して、腸条件を模倣した。次いで、この混合物を、約３７℃で、約６０分間(ｔ＝１８０分まで)インキュベートした。この混合物を、ｔ＝０分、ｔ＝３０分、ｔ＝６０分、ｔ＝９０分、ｔ＝１２０分、ｔ＝１３０分、ｔ＝１４０分、ｔ＝１５０分、及びｔ＝１８０分の時点で、１ｍｌ取り出すことにより、サンプリングした。
【０１９７】
３３量体ペプチドの起源としての市販の食品のＧＤＥＰ−ＬＧＧ又はＧＤＥＰ−Ｍでの処理後の３３量体ペプチドの残留率を、図２０Ａ−２０Ｈに示し、表４にまとめた。表４のデータは、示された起源の３３量体の、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ又は４００ｍｇのＧＤＥＰ−ＬＧＧ又はＧＤＥＰ−Ｍとの１８０分間にわたるインキュベーションを反映している。ＥＬＩＳＡによる分析は、実施例１に記載の通りとした。
【表４】
2013518589.tif 000006
【０１９８】
ＧＤＥＰ−ＬＧＧは、様々な市販の３３量体ペプチド源からの３３量体を大きく低減させ又は排除するのに効果的であり、様々な市販の３３量体ペプチド源からの３３量体を低減させ又は排除するのにＧＤＥＰ−Ｍよりも一層効果的であった。３３量体の残留率は、一般に、すべての起源について、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ又はＧＤＥＰ−Ｍの量を増やすことによって低減した(図２０Ａ-２０Ｈ)。
【０１９９】
実施例１６：ＧＤＥＰ−ＬＧＧの既存の製品との比較
ＧＤＥＰ−ＬＧＧの既存の製品と比較しての消化効率を評価するために、下記のイン・ビトロモデルを採用した。
【０２００】
１３５ｍｌの溶液を、１００ｍｌの２．７％ウシ血清アルブミン；５ｍｌの３％胃粘膜ムチン；１０ｍｌ ＮａＣｌ １３．２ｇ＋ＣａＣｌ2２Ｈ2Ｏ ０．２２ｇ／１００ｍｌ；及び２０ｍｌのｐＨ４．０のアセテート緩衝液を用いて調製した。この溶液を、３７℃で、約２０分間インキュベートした。この予備インキュベーション後に、５ｍｌの０．２％ペプシンと１０ｍｌの酵素組成物(１００ｍｇ ＧＤＥＰ−ＬＧＧ；２カプセルの「グルテン ゲスト」(Allergy Research Groupより入手可能)；２カプセルの「グルテン−ザイム」(BioCareより入手可能)；又は１カプセルの「グルテンイーズ」(Enzymedicaより入手可能)；２カプセルの「グルテン−ザイム プラス」(BioCareより入手可能)；又は２カプセルの「スペクトラムザイム」(BioCareより入手可能))を、この溶液に加えた。ｔ＝０分で、市販の３３量体ペプチドをこの溶液に加えて、約１２０分間インキュベートした。このインキュベーション期間中、４ｍｌの０．２Ｎ ＨＣｌアリコートをこの混合物に加えて、混合物の酸性度を維持した(ｔ＝５分、ｔ＝２０分、ｔ＝３５分、ｔ＝５０分、ｔ＝６５分)。
【０２０１】
ｔ＝１２０分において、３．０ｇの重炭酸ナトリウム(ＮａＨＣＯ3)、０．８１ｇデオキシコレート、及び１５０ｍｇ パンクレアチンを、この混合物に加えて、腸状態を模倣した。次いで、この混合物を、約３７℃で、約６０分間(ｔ＝１８０分まで)インキュベートした。この混合物を、ｔ＝０分、ｔ＝３０分、ｔ＝６０分、ｔ＝９０分、ｔ＝１２０分、ｔ＝１３０分、ｔ＝１４０分、ｔ＝１５０分、及びｔ＝１８０分の時点で、１ｍｌ取り出すことにより、サンプリングした。
【０２０２】
分析を、実施例１に記載のようにＥＬＩＳＡによって、実施例３に記載のようにＨＰＬＣ−ＭＳによって、行なった。これらの結果は、図２１Ａに示し、表４にまとめた。
【表５】
2013518589.tif 000007
ＧＤＥＰ−ＬＧＧの３つのロットは、すべて、３３量体ペプチドを大きく低減させ又は排除した。３つのグルテン分解酵素調製物のロットは、すべて、３つの試験した既存の製品より有意に低い残留率を有し、ロット３は、最低残留率６．２％を示した。各市販製品の個々のクロマトグラフは、図２１Ｂ−２1Ｏに示した。
【０２０３】
実施例１７：３３量体ペプチドのパパインによる分解
この３３量体ペプチド(１ｍｇ／ｍｌ)を、約４．５のｐＨのパパインとインキュベートした。３０μＬの反応体積には、１０μＬ ３３量体ペプチド、１０μＬ 酵素溶液(０．１ｍｇ／ｍｌ)及び１０μＬ 緩衝液を含ませた。この緩衝液のｐＨは、約４．５であった。約１時間にわたって、３７℃で反応させてから、５分間、９０℃にして、酵素反応を停止させた。ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は、実施例３に記載の通りとした。
【０２０４】
この分析の結果は、図２２に示した。パパインは、３３量体ペプチドを、約４．５のｐＨで、完全に加水分解した。
【０２０５】
実施例１８：カチオン交換クロマトグラフィーによるパパインの精製
パパインを、GE Health Care製のＡＫＴＡ精製装置を用いてカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。ｐＨ約５．０の５０ｍＭアセテート緩衝液中のパパインＷ−４０バルクの２０％酵素溶液を、ｐＨ約５．０の５０ｍＭアセテート緩衝液によるＰＤ１０カラムを用いて脱塩した。試料は約１．４倍に希釈された。試料を、４０ｍＭＳＰセファロースＦＦカラムに導入した。(Ａ)５０ｍＭビス−トリスＨＣｌ緩衝液(ｐＨ約５．０)と(Ｂ)１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭビス−トリスＨＣｌ緩衝液(ｐＨ約５．０)よりなる移動相を用いて、標的物質を、勾配モード(４０ｍＬでのアプライ；８０ｍＬでのフロースルー；６００ｍＬでの溶出１、  ０→６００ｍＭ ＮａＣｌ；６００ｍＭ ＮａＣｌを含む１２０ｍＬでの溶出２；１Ｍ ＮａＣｌを用いる１２０ｍＬでの洗浄)にて溶出させた。流量は、５．０ｍＬ／分に設定し、注入体積は、１０ｍＬであり、画分サイズは１０ｍＬであった。検出を、２８０ｎｍの光学密度（吸光度）で行なった。
【０２０６】
この精製の結果を、図２３に示した。各画分を、３３量体ペプチドと約ｐＨ４.５でインキュベートした。３０μＬの反応体積には、１０μＬの３３量体ペプチド、１０μＬの酵素溶液(０．１ｍｇ／ｍｌ)及び１０μＬの緩衝液を含ませた。この緩衝液のｐＨは、約４．５であった。約１時間にわたって３７℃で反応させて、次いで、５分間、９０℃にして、酵素反応を停止させた。ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は、実施例３に記載の通りとした。
【０２０７】
この分析の結果は、図２３に示した。ピーク３からの画分は、３３量体ペプチドをｐＨ約４．５で、完全に加水分解した。
【０２０８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、カチオン交換クロマトグラフィー分析の各画分につき調製した。これらのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果は、図２４に示した。各ピーク(タンパクは、一致する分子量を示した。
【０２０９】
カチオン交換クロマトグラフィー精製によって得られたピーク２及び３を、更に、逆相クロマトグラフィーにより精製して、Ｎ末端配列分析により同定した。この分析の結果は、図２５Ａ及び２５Ｂに示した。
【０２１０】
実施例１９：疎水性相互作用クロマトグラフィーによるパパイン精製
実施例１８で行なったカチオン交換クロマトグラフィー分析でのＥ９画分を、更に、GE health care製のＡＫＴＡ精製装置を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製した。Ｅ９画分の酵素溶液を、同体積の２．４Ｍ硫酸アンモニウム(５０ｍＭピペス (Pipes)緩衝液(ｐＨ約６．５)中)に加えて、ｐＨ約６．５の２５ｍＭピペス緩衝液中の１．２Ｍ硫酸アンモニウムの中の最終試料とした。試料を５ｍＬのハイトラップブチルＦＦ(Hitrap Butyl FF)カラムに導入した。(Ａ)ｐＨ約６．５の２５ｍＭピペス緩衝液中の１．２Ｍ硫酸アンモニウムと(Ｂ)ｐＨ約６．５の２５ｍＭピペス緩衝液よりなる移動相を用いて、標的物質を、勾配モード(２０ｍＬのアプライ；５ｍＬのフロースルー；１００ｍＬの溶出１  １．２Ｍ→０ｍＭ硫酸アンモニウム；２５ｍＬの溶出２、０ｍＭ硫酸アンモニウム)にて溶出した。流量を４．０ｍＬ／分に設定し、注入体積は１０ｍＬであり、画分サイズは２．５ｍＬであった。検出を、２８０ｎｍの光学密度（吸光度）で行なった。
【０２１１】
この精製の結果は、図２６に示した。実施例１８のカチオン交換クロマトグラフィーの結果と異なり、ピーク３は、２つの分離したピークとして現れている。これらのピークは、図において、ピーク３−１及びピーク３−２と表示した(図２６Ａ−２６Ｂ)。
【０２１２】
これらの画分を、実施例１８に記載したように、ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａ法を用いて加水分解した。１０μＬの酵素溶液を、１００μＬの１０μＭの基質(５０ｍＭアセテート緩衝液中)に加えて、３７℃で、約１時間インキュベートしてから、５分間、９０℃にして、酵素反応を停止させた。
【０２１３】
このＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａ分析の結果は、図２７に示す。ピーク３−１で表された画分は、３３量体ペプチドを完全に加水分解した。
【０２１４】
実施例２０：逆相クロマトグラフィーによるパパインの精製
実施例１９でピーク３−１及び３−２として示された酵素溶液を、更に、逆相クロマトグラフィーを用いて精製した。
【０２１５】
この逆相クロマトグラフィーの結果は、図２８に示す。
【０２１６】
実施例２１：パパインと他の酵素の比較
イン・ビトロ胃腸管モデルを用いて、パパインと他の酵素の消化効率を様々な量で評価した。
【０２１７】
１３５ｍｌの溶液を、１００ｍｌの２．７％ウシ血清アルブミン；５ｍｌの３％胃粘膜ムチン；１０ｍｌ ＮａＣｌ １３．２ｇ＋ＣａＣｌ2２Ｈ2Ｏ ０．２２ｇ／１００ｍｌ；及び２０ｍｌのｐＨ４．０のアセテート緩衝液を用いて調製した。この溶液を、３７℃で、約２０分間インキュベートした。この予備インキュベーション後に、５ｍｌの０．２％ペプシンと１０ｍｌの様々な量の酵素(５、１０、４０、５０、１００及び４００ｍｇ)をこの溶液に加えた。ｔ＝０分で、市販の３３量体ペプチドを、この溶液に加えて、約１２０分間インキュベートした。このインキュベーション期間中に、４ｍｌの０．２Ｎ ＨＣｌアリコートを、この混合物に加えて、酸性度を維持した(ｔ＝５分、ｔ＝２０分、ｔ＝３５分、ｔ＝５０分、ｔ＝６５分)。
【０２１８】
ｔ＝１２０分で、３．０ｇの重炭酸ナトリウム(ＮａＨＣＯ3)、０．８１ｇデオキシコレート、及び１５０ｍｇパンクレアチンを、この混合物に加えて、腸条件を模倣した。次いで、この混合物を約３７℃で約６０分間(ｔ＝１８０分まで)インキュベートした。この混合物を、ｔ＝０分、ｔ＝３０分、ｔ＝６０分、ｔ＝９０分、ｔ＝１２０分、ｔ＝１３０分、ｔ＝１４０分、ｔ＝１５０分、及びｔ＝１８０分において、１ｍｌ取り出すことにより、サンプリングした。
【０２１９】
酵素の３３量体ペプチドに対する残留率を、図２９に示した。ＥＬＩＳＡによる分析は、実施例１に記載の通りとした。
【０２２０】
パパインのすべての形態は、３３量体を大きく低減し又は排除するのに有効であった。３３量体の残留率は、概して、酵素量を増大させると低減した(図２９)。
【０２２１】
実施例２２：パパインの還元剤による活性化
還元剤の存在下でのパパインの活性を試験するために、下記の試験法を採用した。
【０２２２】
パパインとＧＤＥＰ−ＬＧＧを、還元剤(グルタチオン、ジチオスレイトール(「ＤＴＴ」)、Ｌ−システイン、又はＮ−アセチル−Ｌ−システイン)の存在下及び非存在下で、プロテアーゼ活性について、ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａ法を用いて、実施例１６に記載のように分析した。１０μＬの酵素溶液を、１００μＬの１０μＭ Ｎｍａ−ＹＰＱＰＱＬＰＹＰＫ(Ｄｎｐ)−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＮＨ２ペプチド(ｐＨ４．５の５０ｍＭアセテート緩衝液又は１ｍＭの還元剤を加えた５０ｍＭアセテート緩衝液中)に加えた。この溶液を、約１時間、３７℃でインキュベートしてから、５分間、９０℃にして、酵素反応を停止させた。
【０２２３】
ＤＴＴとグルタチオン還元剤は、パパインのＦＲＥＴＳ活性を活性化したが、ＧＤＥＰ−ＬＧＧのＦＲＥＴＳ活性を有意に活性化しなかった(図３０Ａ)。すべての還元剤は、パパインを活性化した(図３０Ｂ)。
【０２２４】
これらの還元剤を含む酵素溶液の３３量体加水分解活性を、更に、試験した。３０μＬの反応体積には、１０μＬの１ｍｇ／ｍｌの３３量体ペプチド、１０μＬの酵素溶液(パパイン又はＧＤＥＰ−ＬＧＧ)及び１０μＬの５０ｍＭアセテート緩衝液(ｐＨ４．５)又は１ｍＭの還元剤を含む５０ｍＭアセテート緩衝液を含有させて、約１時間、３７℃でインキュベートして、次いで、酵素反応を停止させるために、５分間、９０℃にした。ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は、実施例３に記載の通りとした。すべての還元剤は、パパインの３３量体加水分解活性を活性化した(図３０Ｃ)。
【０２２５】
実施例２３：ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、様々なパパインＧＤＥＰ−ＬＧＧ組合せ、及びパパインの比較
様々な濃度の酵素溶液(１００％ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、２０％パパインを含む８０％ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、４０％パパインを含む６０％ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、６０％パパインを含む４０％ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、８０％パパインを含む２０％ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、及び１００％パパイン)のＦＲＥＴＳ活性を、ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａ法を用いて、実施例１６に記載されたように測定した。ＧＤＥＰ−ＬＧＧの濃度は０．０５７ユニット／ｍＬであり、パパイン濃度は０．０６０ユニット／ｍＬであった。
【０２２６】
１０μＬの酵素溶液を、１００μＬの１０μＭ Ｎｍａ−ＹＰＱＰＱＬＰＹＰＫ(Ｄｎｐ)−ＤＡｒｇ−ＤＡｒｇ−ＮＨ２ペプチド(ｐＨ４．５の５０ｍＭアセテート緩衝液中)に加えた。この溶液を、１時間３７℃でインキュベートしてから、５分間、９０℃にして、酵素反応を停止させた。
【０２２７】
様々な濃度のＧＤＥＰ−ＬＧＧ及びパパインの相対的活性(％)を、図３１Ａに示す。ＧＤＥＰ−ＬＧＧ及びパパインは、単独で、約１００％の相対的活性を示した。ＧＤＥＰ−ＬＧＧとパパインの組合せは、相乗的効果を生じ（図３１Ａ）、該組合せは、１００％を超える活性を有した。６０％ＧＤＥＰ−ＬＧＧと４０％パパインを含む試料は、約１５０〜約１７０％の最高相対的活性を生じた。
【０２２８】
酵素溶液の３３量体加水分解活性を、更に、試験した。６０μＬの反応体積は、２０μＬの１ｍｇ／ｍｌ ３３量体ペプチド、２０μＬの酵素溶液(１００％ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、２０％パパインを含む８０％ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、４０％パパインを含む６０％ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、６０％パパインを含む４０％ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、８０％パパインを含む２０％ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、及び１００％パパイン)及び２０μＬの１５０ｍＭアセテート緩衝液(ｐＨ４．５)よりなり、１時間、３７℃でインキュベートしてから、５分間、９０℃にして、酵素反応を停止させた。ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析は、実施例３に記載の通りとした。この加水分解実験の結果は、図３１Ｂ−３１Ｇに示した。６０％ＧＤＥＰ−ＬＧＧと４０％パパインを含む試料は、最高の３３量体加水分解活性を生じた。
【０２２９】
実施例２４：様々な酵素調製物の比較
様々な酵素調製物の、３３量体加水分解活性を、実施例２３に記載された方法によって、試験した。６量体のセットを、様々な組成物を３３量体に対する活性についてスクリーニングするためにＦＲＥＴＳアッセイにおいて用いた。図３２は、このスクリーニングの結果をまとめてある。最大活性を有する酵素が選択されている。驚くべきことには、ペニシリウム・シトリナムからの調製物が３３量体に対する活性を有するということが見出された。表６は、これらの反応ブレンド及び見出された最大残留ペプチドをまとめてある。
【表６】
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加水分解実験の結果を示すクロマトグラフを、図３３に示した。ＨＰＬＣ／ＭＣによる分析は、実施例３に記載の通りとした。これらの加水分解実験の生成物は、ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、パパイン、プロテアーゼＰ及びペニシリウム・シトリナムからの調製物を含むブレンドについて、最小である。
【０２３０】
特定の実施形態
ここに記載された酵素カクテルは、下記の番号を付けたセンテンス中に列挙された実施形態により、例証することができる：
１．下記を含む酵素カクテル：
(ａ)ＧＤＥＰ−ＬＧＧ；及び
(ｂ)パパイン；
(ただし、この酵素カクテルは、グルテンオリゴペプチドを開裂させることができる)。
２．セミアルカリプロテアーゼ、及び／又はペニシリウム・シトリナムからの調製物、を更に含む、センテンス１に記載の酵素カクテル。
３．パパインが活性化パパイン又はキモパパインである、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
４．活性化パパインが還元剤により活性化された、センテンス３に記載の酵素カクテル。
５．還元剤を更に含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
６．上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテルを含む医薬組成物。
７．酵素カクテルが更にＧＤＥＰ−Ｍを含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
８．酵素カクテルが、更に、ＣＰＹに対して少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を有する酵素又はその断片を含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
９．酵素カクテルが、更に、ＣＰＹに対して少なくとも約９０％相同であるアミノ酸配列を有する酵素又はその断片を含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
１０．酵素カクテルが更にＣＰＹを含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
１１．ＣＰＹが、本質的に、サッカロミセス・セレビシエＣＰＹ、アスペルギルス・ニガーＣＰＹ、シゾサッカロミセス・ポンベＣＰＹ、アスペルギルス・フミガーツスＣＰＹよりなる群から選択される、センテンス１０に記載の酵素カクテル。
１２．グルテンオリゴペプチドがα−グリアジンの３３量体ペプチド断片である、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
１３．３３量体ペプチド断片が、アミノ酸配列ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ(SEQ ID NO:１)を有する、センテンス１２に記載の酵素カクテル。
１４．酵素カクテルが酸性条件下で安定である、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
１５．酵素カクテルが、製薬上許容される賦形剤に配合される、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
１６．酵素カクテルが、経口送達用に配合される、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
１７．酵素カクテルが、腸溶性コーティングされた配合物に含まれる、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
１８．酵素カクテルが、製薬上許容されるキャリアーを含む配合物に含まれる、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
１９．製薬上許容されるキャリアーが固体である、センテンス１８に記載の酵素カクテル。
２０．製薬上許容されるキャリアーがカプセルである、センテンス１８に記載の酵素カクテル。
２１．製薬上許容されるキャリアーが液体である、センテンス１８に記載の酵素カクテル。
【０２３１】
ここに記載された酵素カクテルは、下記の番号を付けたセンテンス中に列挙された実施形態により、例証することができる：
１．下記を含む酵素カクテル：
(ａ)ＧＤＥＰ−ＬＧＧ；及び
(ｂ)アオルシンに対して少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を有する酸性セリンプロテアーゼポリペプチド又はその断片；
(ただし、この酵素カクテルは、グルテンオリゴペプチドを開裂させることができる)。
２．酸性セリンプロテアーゼポリペプチドがアオルシンに対して少なくとも約９０％相同であるアミノ酸配列を有し又はその断片である、センテンス１に記載の酵素カクテル。
３．酵素カクテルがＧＤＥＰ−Ｍを含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
４．酵素カクテルが、更に、ＣＰＹに対して少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を有する酵素又はその断片を含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
５．酵素カクテルが、更に、ＣＰＹに対して少なくとも約９０％相同であるアミノ酸配列を有する酵素又はその断片を含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
６．酵素カクテルが、更に、ＣＰＹを含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
７．ＣＰＹが、本質的に、サッカロミセス・セレビシエＣＰＹ、アスペルギルス・ニガーＣＰＹ、シゾサッカロミセス・ポンベＣＰＹ、アスペルギルス・フミガーツスＣＰＹよりなる群から選択される、センテンス６に記載の酵素カクテル。
８．グルテンオリゴペプチドがα−グリアジンの３３量体断片である、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
９．３３量体ペプチド断片がアミノ酸配列ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ(SEQ ID NO:１)を有する、センテンス８に記載の酵素カクテル。
１０．酵素カクテルが酸性条件下で安定である、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
１１．酵素カクテルが製薬上許容される賦形剤に配合される、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
１２．酵素カクテルが経口送達用に配合される、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
１３．酵素カクテルが、腸溶性コーティングを含む配合物に含まれる、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
１４．酵素カクテルが、製薬上許容されるキャリアーを含む配合物に含まれる、上記のセンテンスの何れか一つに記載の酵素カクテル。
１５．製薬上許容されるキャリアーが固体である、センテンス１４に記載の酵素カクテル。
１６．製薬上許容されるキャリアーがカプセルである、センテンス１４に記載の酵素カクテル。
１７．製薬上許容されるキャリアーが液体である、センテンス１４に記載の酵素カクテル。
【０２３２】
ここに記載された配合物は、下記の番号を付けたセンテンス中に列挙された実施形態により、例証されうる：
１．下記を含む、グルテン曝露の低減又はグルテン不耐性の治療における使用のための配合物：
ＧＤＥＰ−ＬＧＧ、パパイン、活性化パパイン、精製パパイン、キモパパイン、ＧＤＥＰ−Ｍ、アオルシン、ＣＰＹ、セミアルカリプロテアーゼ、及びペニシリウム・シトリナムからの調製物よりなる群から選択される酵素組成物；
(この酵素組成物は、免疫原性グルテンオリゴペプチドを非毒性の断片へとイン・ビトロで開裂させることができる)。
２．酵素組成物が免疫原性グルテンオリゴペプチドの少なくとも約７０％を非毒性の断片へとイン・ビトロで開裂させることができる、センテンス１に記載の配合物。
３．酵素組成物が免疫原性グルテンオリゴペプチドの少なくとも約８０％を非毒性の断片へとイン・ビトロで開裂させることができる、上記のセンテンスの何れか一つに記載の配合物。
４．酵素組成物が免疫原性グルテンオリゴペプチドの少なくとも約９０％を非毒性の断片へとイン・ビトロで開裂させることができる、上記のセンテンスの何れか一つに記載の配合物。
５．配合物が経口投与に適している、上記のセンテンスの何れか一つに記載の配合物。
６．配合物が製薬上許容されるキャリアーを含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の配合物。
７．製薬上許容されるキャリアーが固体である、センテンス６に記載の配合物。
８．製薬上許容されるキャリアーがカプセルである、センテンス６に記載の配合物。
９．製薬上許容されるキャリアーが液体である、センテンス６に記載の配合物。
【０２３３】
ここに記載された配合物は、下記の番号を付けたセンテンス中に列挙された実施形態により、例証することができる：
１．下記を含む、グルテン曝露の低減又はグルテン不耐性の治療における使用のための配合物：
本質的に、ＧＤＥＰ；ＧＤＥＰ−ＬＧＧ；ＧＤＥＰ−Ｍ；ＧＤＥＰ−ＬＮＡ；ＧＤＥＰ−２Ａ；ＧＤＥＰ−ＡＨ；パパイン；アオルシン；アオルシンに対して少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を有する酸性セリンプロテアーゼポリペプチド又はその断片；ＣＰＹ；ＣＰＹに対して少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を有する酵素；セミアルカリプロテアーゼ；及びペニシリウム・シトリナムからの調製物よりなる群から選択される少なくとも２種の酵素組成物；
(ただし、これらの少なくとも２種の酵素組成物は、グルテンオリゴペプチドを、イン・ビトロ胃腸モデルにおいて消化することができる)。
２．少なくとも２種の酵素組成物がＧＤＥＰ−ＬＧＧ及びパパインである、センテンス１に記載の配合物。
３．少なくとも２種の酵素組成物がカルボキシペプチダーゼＹ及びアオルシンである、センテンス１に記載の配合物。
４．上記モデルが、少なくとも２種の酵素組成物をグルテンオリゴペプチドと模擬的胃液中で、約３７℃で、イン・ビボでの胃液との典型的接触期間にわたってインキュベートすることを含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の配合物。
５．イン・ビボでの胃液との典型的接触期間が約１２０分である、センテンス４に記載の配合物。
６．模擬的胃液が、胃粘膜ムチン、ペプシン、ゼラチナーゼ、アミラーゼ、及びリパーゼを含む、センテンス４又は５の何れか一つに記載の配合物。
７．上記モデルが、少なくとも２種の酵素組成物をグルテンオリゴペプチドと模擬的腸液中で、約３７℃で、イン・ビボでの腸液との典型的接触期間にわたってインキュベートすることを含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の配合物。
８．イン・ビボでの腸液との典型的接触期間が約６０分である、センテンス７に記載の配合物。
９．模擬的腸液が一種以上の膵酵素及び胆汁酸塩を含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の配合物。
１０．一種以上の膵酵素が、本質的に、トリプシン、キモトリプシン、アミラーゼ、及びリパーゼよりなる群から選択される、センテンス９に記載の配合物。
１１．上記モデルが、少なくとも２種の酵素組成物、グルテンオリゴペプチド、胃粘膜ムチン、ペプシン、ゼラチナーゼ、アミラーゼ、及びリパーゼを含む混合物を、酸性条件下で、約３７℃で、約１２０分間インキュベートすること；
酸中和用物質をその混合物に加えること；及び
この混合物をトリプシン、アミラーゼ、及びリパーゼ、及び胆汁酸塩と、中性条件下で、約３７℃で、約６０分間インキュベートすること
を含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の配合物。
１２、上記モデルが、少なくとも２種の酵素組成物、グルテンオリゴペプチド、及びペプシンを含む混合物を、酸性条件下で、約３７℃で、約６０分間インキュベートすること；
酸中和用物質をこの混合物に加えること；及び
この混合物を、トリプシン及びキモトリプシンと、中性条件下で、約３７℃で、約６０分間インキュベートすること
を含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の配合物。
１３．グルテンオリゴペプチドがα−グリアジンの３３量体ペプチド断片である、上記のセンテンスの何れか一つに記載の配合物。
１４．３３量体ペプチド断片が、アミノ酸配列ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ(SEQ ID NO:１)を有する、センテンス１３に記載の配合物。
【０２３４】
ここに記載された方法は、下記の番号を付けたセンテンス中に列挙された実施形態により、例証することができる：
１．ヒト患者において、グルテン不耐性を治療し又はグルテン曝露を低減させる方法であって、下記を含む当該方法：
その患者に、治療上有効な量の酵素カクテルを与えること、
ただし、、この酵素カクテルは、グルテンオリゴペプチドを酸性条件下で開裂させることができる。
２．酵素カクテルが、本質的に、ＧＤＥＰ；ＧＤＥＰ−ＬＧＧ；ＧＤＥＰ−Ｍ；ＧＤＥＰ−ＬＮＡ；ＧＤＥＰ−２Ａ；ＧＤＥＰ−ＡＨ；パパイン；アオルシン；アオルシンに対して少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を有する酸性セリンプロテアーゼポリペプチド又はその断片；ＣＰＹ；ＣＰＹに対して少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を有する酵素又はその断片；セミアルカリプロテアーゼ；及びペニシリウム・シトリナムからの調製物よりなる群から選択される少なくとも２種の酵素組成物よりなる群から選択される組成物を含む、センテンス１に記載の方法。
３．酵素カクテルが、アスペルギルス・オリザエ由来の組成物を含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の方法。
４．酵素カクテルが、製薬上許容される賦形剤に配合される、上記のセンテンスの何れか一つに記載の方法。
５．酵素カクテルが、経口送達用に配合される、上記のセンテンスの何れか一つに記載の方法。
６．酵素カクテルが、腸溶性コーティングを含む配合物に含まれる、上記のセンテンスの何れか一つに記載の方法。
７．酵素カクテルが、製薬上許容されるキャリアーを含む配合物に含まれる、上記のセンテンスの何れか一つに記載の方法。
８．製薬上許容されるキャリアーが固体である、センテンス７に記載の方法。
９．製薬上許容されるキャリアーがカプセルである、センテンス７に記載の方法。
１０．製薬上許容されるキャリアーが液体である、センテンス７に記載の方法。
【０２３５】
ここに記載された方法は、下記の番号を付けたセンテンス中に列挙された実施形態により、例証することができる：
１．酵素組成物の効力を評価する方法であって、下記の工程を含む当該方法：
(ｉ)酵素組成物及びグルテンオリゴペプチドを含む混合物を、模擬的胃液中で、約３７℃で、イン・ビボでの胃液との典型的接触期間にわたってインキュベートすること；
(ii)酸中和用物質をこの混合物に加えること；
(iii)この混合物を、模擬的腸液中で、約３７℃で、イン・ビボでの腸液との典型的接触期間にわたってインキュベートすること；及び
(iv)この混合物中の、インタクトなグルテンオリゴペプチドの量を測定すること。
２．イン・ビボでの胃液との典型的接触期間が約１２０分間である、センテンス１に記載の方法。
３．模擬的胃液が胃粘膜ムチン、ペプシン、ゼラチナーゼ、アミラーゼ、及びリパーゼを含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の方法。
４．イン・ビボでの腸液との典型的接触期間が約６０分間である、上記のセンテンスの何れか一つに記載の方法。
５．模擬的腸液が一種以上の膵酵素及び胆汁酸塩を含む、上記のセンテンスの何れか一つに記載の方法。
６．一種以上の膵酵素が、本質的に、トリプシン、キモトリプシン、アミラーゼ、及びリパーゼよりなる群から選択される、センテンス５に記載の方法。
７．グルテンオリゴペプチドがα−グリアジンの３３量体ペプチド断片である、上記のセンテンスの何れか一つに記載の方法。
８．３３量体ペプチド断片が、アミノ酸配列ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ (SEQ ID NO:1)を有する、センテンス７に記載の方法。
【０２３６】
現在記載されている技術は、今、当業者がそれを実施することを可能にする、完全な、明確な、簡潔なそして正確な用語にて記載されている。前述したものは、この技術の好適な実施形態を記載するものであること、及び添付の特許請求の範囲に示したこの発明の精神（意図）又は範囲から離れずに改変が為されうることは、理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７Ａ】
2013518589.tif 000032
【図７Ｂ】
2013518589.tif 000033
【図７Ｃ】
2013518589.tif 000034
【図７Ｄ】
2013518589.tif 000035
【図７Ｅ】
2013518589.tif 000036
【図７Ｆ】
2013518589.tif 000037
【図７Ｇ】
2013518589.tif 000038
【図７Ｈ】
2013518589.tif 000039
【図８Ａ】
2013518589.tif 000040
【図８Ｂ】
2013518589.tif 000041
【図８Ｃ】
2013518589.tif 000042
【図８Ｄ】
2013518589.tif 000043
【図８Ｅ】
2013518589.tif 000044
【図８Ｆ】
2013518589.tif 000045
【図８Ｇ】
2013518589.tif 000046
【図８Ｈ】
2013518589.tif 000047
【図９】
2013518589.tif 000048
【図１０Ａ】
2013518589.tif 000049
【図１０Ｂ】
2013518589.tif 000050
【図１０Ｃ】
2013518589.tif 000051
【図１０Ｄ】
2013518589.tif 000052
【図１０Ｅ】
2013518589.tif 000053
【図１０Ｆ】
2013518589.tif 000054
【図１０Ｇ】
2013518589.tif 000055
【図１０Ｈ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2013518589.tif 000058
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
2013518589.tif 000060
【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
2013518589.tif 000062
【図１１Ｇ】
2013518589.tif 000063
【図１１Ｈ】
2013518589.tif 000064
【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
2013518589.tif 000067
【図１１Ｌ】
2013518589.tif 000068
【図１１Ｍ】
2013518589.tif 000069
【図１１Ｎ】
2013518589.tif 000070
【図１１Ｏ】
2013518589.tif 000071
【図１１Ｐ】
2013518589.tif 000072
【図１１Ｑ】
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【図１１Ｒ】
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【図１１Ｓ】
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【図１１Ｔ】
2013518589.tif 000076
【図１１Ｕ】
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【図１１Ｖ】
2013518589.tif 000078
【図１２Ａ】
2013518589.tif 000079
【図１２Ｂ】
2013518589.tif 000080
【図１２Ｃ】
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【図１３】
2013518589.tif 000082
【図１４Ａ】
2013518589.tif 000083
【図１４Ｂ】
2013518589.tif 000084
【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
2013518589.tif 000087
【図１６Ａ】
2013518589.tif 000088
【図１６Ｂ】
2013518589.tif 000089
【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
2013518589.tif 000091
【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
2013518589.tif 000096
【図１８Ｅ】
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【図１９Ａ】
2013518589.tif 000098
【図１９Ｂ】
2013518589.tif 000099
【図１９Ｃ】
2013518589.tif 000100
【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０Ａ】
2013518589.tif 000103
【図２０Ｂ】
2013518589.tif 000104
【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
2013518589.tif 000106
【図２０Ｅ】
2013518589.tif 000107
【図２０Ｆ】
2013518589.tif 000108
【図２０Ｇ】
2013518589.tif 000109
【図２０Ｈ】
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【図２１Ａ】
2013518589.tif 000111
【図２１Ｂ】
2013518589.tif 000112
【図２１Ｃ】
2013518589.tif 000113
【図２１Ｄ】
2013518589.tif 000114
【図２１Ｅ】
2013518589.tif 000115
【図２１Ｆ】
2013518589.tif 000116
【図２１Ｇ】
2013518589.tif 000117
【図２１Ｈ】
2013518589.tif 000118
【図２１Ｉ】
2013518589.tif 000119
【図２１Ｊ】
2013518589.tif 000120
【図２１Ｋ】
2013518589.tif 000121
【図２１Ｌ】
2013518589.tif 000122
【図２１Ｍ】
2013518589.tif 000123
【図２１Ｎ】
2013518589.tif 000124
【図２１Ｏ】
2013518589.tif 000125
【図２２】
2013518589.tif 000126
【図２３Ａ】
2013518589.tif 000127
【図２３Ｂ】
2013518589.tif 000128
【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
2013518589.tif 000130
【図２３Ｅ】
2013518589.tif 000131
【図２３Ｆ】
2013518589.tif 000132
【図２３Ｇ】
2013518589.tif 000133
【図２５】
2013518589.tif 000134
【図２６Ａ】
2013518589.tif 000135
【図２６Ｂ】
2013518589.tif 000136
【図２７Ａ】
2013518589.tif 000137
【図２７Ｂ】
2013518589.tif 000138
【図２７Ｃ】
2013518589.tif 000139
【図２７Ｄ】
2013518589.tif 000140
【図２７Ｅ】
2013518589.tif 000141
【図２７Ｆ】
2013518589.tif 000142
【図２８】
2013518589.tif 000143
【図２９】
2013518589.tif 000144
【図３０Ａ】
2013518589.tif 000145
【図３０Ｂ】
2013518589.tif 000146
【図３０Ｃ１】
2013518589.tif 000147
【図３０Ｃ２】
2013518589.tif 000148
【図３１Ａ】
2013518589.tif 000149
【図３１Ｂ】
2013518589.tif 000150
【図３１Ｃ】
2013518589.tif 000151
【図３１Ｄ】
2013518589.tif 000152
【図３１Ｅ】
2013518589.tif 000153
【図３１Ｆ】
2013518589.tif 000154
【図３１Ｇ】
2013518589.tif 000155
【図３２Ａ】
2013518589.tif 000156
【図３２Ｂ】
2013518589.tif 000157
【図３３】
2013518589.tif 000158
【図２４】
2013518589.tif 000159
【配列表】
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【国際調査報告】
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