(57)【要約】核酸製剤を送達するための粒子および複合体。粒子、複合体または両方を含有する組成物。粒子、複合体および組成物の使用方法。また本明細書では、複合体、例えば、核酸剤−ポリマーの複合体、この粒子または複合体を含む混合物、組成物および剤形、この粒子を用いる方法（例えば、障害を治療するため）、この核酸剤−ポリマーの複合体および粒子を備えているキット、核酸剤−ポリマーの複合体および粒子を作製する方法、この粒子を保管する方法、ならびにこの粒子を分析する方法も記載される。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子であって、
ａ）複数の疎水性部分；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；
ｃ）任意に、複数の陽イオン性部分；および
ｄ）複数の核酸製剤であって、前記複数の核酸製剤のうちの少なくとも一部分が、
（ｉ）
疎水性部分、例えばａ)の疎水性ポリマーまたは
ｂ)の親水性−疎水性ポリマー
のいずれかと共有結合されるか、あるいは
（ｉｉ）ａ)の疎水性部分またはｂ)の親水性−疎水性ポリマーのいずれかと共有結合される核酸と二重鎖を形成する複数の核酸製剤
を含む、粒子。
【請求項２】
複数の陽イオン性部分を含む請求項１記載の粒子。
【請求項３】
前記疎水性部分が疎水性ポリマーである請求項１記載の粒子。
【請求項４】
前記疎水性部分が疎水性ポリマーであり、そしてａ)の疎水性ポリマーの少なくとも一部分がｄ)の核酸製剤と、各々共有結合される請求項１記載の粒子。
【請求項５】
ｄ)の核酸製剤の少なくとも一部分が、リンカーを介して疎水性ポリマーと共有結合される請求項４記載の粒子。
【請求項６】
ａ)の疎水性ポリマーの少なくとも一部分が、核酸製剤の５’位置を介してｄ)の核酸製剤と各々共有結合される請求項４記載の粒子。
【請求項７】
粒子であって、
ａ）複数の核酸製剤−ポリマー複合体であって、その各々が、
（ｉ）疎水性ポリマーと結合されるか、あるいは
（ｉｉ）疎水性ポリマーと共有結合される核酸と二重鎖を形成する
核酸製剤を含む核酸製剤−ポリマー複合体；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；および
ｃ）任意に、複数の陽イオン性部分
を含む、粒子。
【請求項８】
複数の陽イオン性部分を含む請求項７記載の粒子。
【請求項９】
疎水性ポリマーをさらに含む請求項７記載の粒子であって、前記疎水性ポリマーが核酸製剤と結合されない粒子。
【請求項１０】
核酸製剤が、リンカーを介して疎水性ポリマーと共有結合される請求項７記載の粒子。
【請求項１１】
粒子であって、
ａ）複数の疎水性部分；
ｂ）複数の核酸製剤−親水性−疎水性ポリマー複合体であって、その各々の核酸製剤が、
（ｉ）前記親水性−疎水性ポリマーと共有結合されるか、または
（ｉｉ）親水性−疎水性ポリマーと共有結合される核酸と二重鎖を形成する
核酸製剤−親水性−疎水性ポリマー複合体；および
ｃ）任意に、複数の陽イオン性部分
を含む、粒子。
【請求項１２】
複数の陽イオン性部分を含む請求項１１記載の粒子。
【請求項１３】
粒子であって、
ａ）複数の疎水性ポリマー；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；
ｃ）複数の陽イオン性部分であって、その少なくとも一部分がａ)の疎水性ポリマーまたはｂ)の親水性−疎水性ポリマーのいずれかと結合される複数の陽イオン部分；および
ｄ）複数の核酸製剤
を含む、粒子。
【請求項１４】
ａ)の前記複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部分がｃ)の陽イオン部分またはｄ)の核酸製剤と共有結合されない請求項１３記載の粒子。
【請求項１５】
ａ)の前記複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部分がｃ)の陽イオン部分と各々共有結合される請求項１３記載の粒子。
【請求項１６】
前記陽イオン性部分がスペルミンまたはテトラメチル化スペルミンである請求項１３記載の粒子。
【請求項１７】
粒子であって、
ａ）複数の疎水性ポリマー；
ｂ）任意に、複数の親水性−疎水性ポリマー；
ｃ）複数の陽イオン性部分；および
ｄ）複数の核酸製剤であって、その少なくとも一部分が親水性ポリマーと共有結合されるか、または親水性ポリマーと共有結合される核酸と二重鎖を形成する複数の核酸製剤
を含む、粒子。
【請求項１８】
前記核酸製剤が親水性ポリマーと共有結合される請求項１７記載の粒子。
【請求項１９】
前記親水性ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項１７記載の粒子。
【請求項２０】
前記親水性ポリマーが脂質と共有結合される請求項１７記載の粒子。
【請求項２１】
疎水性−親水性ポリマーを実質的に有さない請求項１７記載の粒子。
【請求項２２】
粒子であって、
ａ）複数の疎水性ポリマー；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；および
ｃ）複数の核酸製剤−陽イオン性ポリマー複合体
を含む、粒子。
【請求項２３】
前記陽イオン性ポリマーがＰＶＡである請求項２２記載の粒子。
【請求項２４】
前記核酸製剤−陽イオン性ポリマー複合体がｓｉＲＮＡ−陽イオン性ＰＶＡ複合体である請求項２２記載の粒子。
【請求項２５】
粒子であって、
ａ）複数の疎水性ポリマー；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；
ｃ）任意に、複数の陽イオン性部分；および
ｄ）複数の核酸製剤
を含む粒子であって、ｃ)の陽イオン性部分の大部およびｄ)の核酸製剤の大部が疎水性ポリマーまたは親水性−疎水性ポリマーと共有結合されない、粒子。
【請求項２６】
前記核酸製剤または陽イオン性部分が粒子中に埋め込まれる請求項２５記載の粒子。
【請求項２７】
複数の陽イオン性部分を含む請求項２５記載の粒子。
【請求項２８】
前記陽イオン性部分が陽イオン性ポリマーである請求項２７記載の粒子。
【請求項２９】
前記疎水性部分または疎水性ポリマーがＰＬＧＡである請求項１〜２８のいずれかに記載の粒子。
【請求項３０】
前記ＰＬＧＡが反応性基によって末端で修飾される請求項２９記載の粒子。
【請求項３１】
前記親水性−疎水性ポリマーがＰＥＧ−ＰＬＧＡである請求項１〜２０および２２〜２９のいずれかに記載の粒子。
【請求項３２】
前記陽イオン性部分が少なくとも１つの第一級、第二級、第三級または第四級アミンを含む請求項１〜３１のいずれかに記載の粒子。
【請求項３３】
前記核酸製剤がｓｉＲＮＡである請求項１〜３２のいずれかに記載の粒子。
【請求項３４】
界面活性剤をさらに含む請求項１〜３３のいずれかに記載の粒子。
【請求項３５】
約−２０ｍＶ〜約＋２０ｍＶのゼータ電位を有する請求項１〜３４のいずれかに記載の粒子。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれかに記載の複数の粒子を含む組成物。
【請求項３７】
薬学的組成物である請求項３６記載の組成物。
【請求項３８】
前記粒子が２００ｎｍ未満のＤｖ９０を有する請求項３６記載の組成物。
【請求項３９】
請求項１〜３５のいずれかに記載の複数の粒子または請求項３６〜３９のいずれかに記載の組成物を含むキット。
【請求項４０】
請求項１〜３５のいずれかに記載の複数の粒子または請求項３６〜３９のいずれかに記載の組成物を含む単一投薬単位。
【請求項４１】
障害を有する対象の治療方法であって、有効量の請求項１〜３５のいずれかに記載の粒子または請求項３６〜３９のいずれかに記載の組成物を前記対象に投与し、それにより対象を治療することを包含する方法。
【請求項４２】
疎水性ポリマーと共有結合される核酸製剤を含む核酸製剤−疎水性ポリマー複合体であって、前記核酸製剤が、センス鎖の５’末端を介してポリマーに結合されるｓａＲＮＡである複合体。
【請求項４３】
前記核酸製剤が、リンカーを介して疎水性ポリマーと共有結合される請求項４２記載の複合体。
【請求項４４】
親水性−疎水性ポリマーと共有結合される核酸製剤を含む核酸製剤−親水性−疎水性ポリマー複合体。
【請求項４５】
前記核酸製剤が前記親水性−疎水性ポリマーの親水性部分と結合される請求項４４記載の複合体。
【請求項４６】
前記核酸製剤が前記親水性−疎水性ポリマーの疎水性部分と結合される請求項４４記載の複合体。
【請求項４７】
核酸製剤を含む粒子の製造方法であって、
（ａ）核酸製剤−疎水性ポリマー複合体（ここで、各核酸製剤−疎水性ポリマー複合体は、疎水性ポリマーと共有結合される核酸製剤を含み、前記核酸製剤−疎水性ポリマー複合体は陽イオン性部分と会合される）；
（ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；および
（ｃ）複数の疎水性ポリマー
を、粒子の形成を可能にする条件下で極性溶媒中で、合わせ、それにより粒子を形成することを包含する方法。
【請求項４８】
対象に投与される場合、（ａ）粒子または複合体以外の処方物中で対象に投与される核酸製剤を用いて観察される標的遺伝子の発現における低減より；あるいは（ｂ）核酸製剤または他の治療薬の投与の非存在下での標的遺伝子の発現より、少なくとも１０、２０、５０、７５、８０、９０、１００、２００または５００％大きい標的遺伝子の発現における低減を生じる請求項３６〜３９のいずれかに記載の組成物。
【請求項４９】
請求項４２〜４６のいずれかに記載の複合体、請求項１〜２９のいずれかに記載の粒子、あるいは請求項３６〜３９のいずれかに記載の組成物の保存方法であって、
（ａ）容器中に前記複合体、粒子または組成物を提供すること；
（ｂ）前記複合体、粒子または組成物を保存すること；および
（ｃ）前記容器を第二の場所に移動するかまたは前記複合体、粒子または組成物の全部またはアリコートを前記容器から取り出すこと
を包含する方法。
【請求項５０】
保存される前記複合体、粒子または組成物が再構成処方物である請求項４９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１０年８月２０日出願の米国特許出願第６１／３７５，７８３号；２０１０年９月２９日出願の米国特許出願第６１／３８７，８８２号；２０１１年２月１７日出願の米国特許出願第６１／４４３，９７２号；および２０１１年４月１５日出願の米国特許出願第６１／４７５，９２３号に対して優先権を主張し、その各々の内容は参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
治療標的に対する核酸剤の有効な送達は、その核酸剤の最適の用途および有効性を得るために望ましい。粒子送達系は、核酸剤の有効性または耐容性を増大し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の要旨
本発明に記載されるのは、例えば、核酸剤の送達において用いられ得る、粒子である。典型的には、この粒子は、核酸剤、および少なくともカチオン性部分、疎水性部分、例えば、ポリマー、または親水性−疎水性ポリマーのうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、核酸剤およびカチオン性部分、ならびに少なくとも疎水性部分、例えば、ポリマー、または親水性−疎水性ポリマーのうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、核酸剤、カチオン性部分、および疎水性部分、例えば、ポリマー、および親水性−疎水性ポリマーの両方を含む。他の実施形態では、この粒子は、核酸剤、カチオン性部分、およびｉ）疎水性部分、例えば、ポリマー、またはｉｉ）親水性−疎水性ポリマーのいずれかを含み、この一方が存在する場合、他方は実質的に存在しないか、または２つのうち一方が、例えば、粒子の量で決定した場合、または粒子を作製するために用いた材料の量で決定した場合、他方の５、２または１重量％未満で存在する。ある実施形態では、疎水性部分（例えば、疎水性ポリマー）、親水性−疎水性ポリマー、カチオン性部分、または核酸剤の１つ以上が、別の部分、例えば、上でまたは本明細書の他のいずれの部分にも列挙される別の部分に結合されてもよい。例えば、ある実施形態では、カチオン性部分および／または核酸剤は、疎水性部分（例えば、疎水性ポリマー）、および／または親水性−疎水性ポリマーに結合されてもよい。この粒子はまた、他の構成要素、例えば、界面活性剤または親水性ポリマー（例えば、親水性ポリマー、例えばＰＥＧであり、これは脂質とさらに結合され得る）を含んでもよい。また本明細書では、複合体、例えば、核酸剤−ポリマーの複合体、この粒子または複合体を含む混合物、組成物および剤形、この粒子を用いる方法（例えば、障害を治療するため）、この核酸剤−ポリマーの複合体および粒子を備えているキット、核酸剤−ポリマーの複合体および粒子を作製する方法、この粒子を保管する方法、ならびにこの粒子を分析する方法も記載される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書に開示される粒子は、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉを促進する剤の送達を提供する。
【０００５】
従って、一態様では、本開示は、以下を含む粒子を特徴とする粒子である：
ａ）複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマー；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；
ｃ）必要に応じて、複数のカチオン性部分；および
ｄ）複数の核酸剤であって、ここでこの複数の核酸剤の少なくとも一部が
（ｉ）疎水性部分、例えば、ａ）の疎水性ポリマーもしくはｂ）の親水性−疎水性ポリマーのいずれかに共有結合されるか、または
（ｉｉ）疎水性部分、例えば、ａ）の疎水性ポリマーもしくはｂ）の親水性−疎水性ポリマーのいずれかに対して共有結合される核酸との二重鎖（例えば、ヘテロ二重鎖）を形成する、核酸剤。
【０００６】
いくつかの実施形態では、この粒子は、カチオン性部分を含む。
【０００７】
ある実施形態では、この粒子は、ナノ粒子である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、この疎水性部分は、疎水性ポリマーである。いくつかの実施形態では、この疎水性部分は、ポリマーではない。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ａ）の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも一部は、核酸剤に対して共有結合されていない。いくつかの実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、カチオン性部分に対して共有結合されていない。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ｃ）のカチオン性部分の実質的に全ては、疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーに共有結合されておらず、ｂ）のポリマーに対する共有結合はない。
【００１１】
いくつかの実施形態では、複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｃ）のカチオン性部分またはｄ）の核酸剤のうち１つまたは両方への共有結合がない。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ａ）の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｄ）の核酸剤に対して各々共有結合される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ａ）の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｄ）の単一の核酸剤に対して各々共有結合される。いくつかの実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｄ）の複数の核酸剤に対して共有結合される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ａ）の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｄ）の核酸剤に対して（例えば、疎水性ポリマーのカルボキシ末端またはヒドロキシル末端で）直接共有結合される（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ｄ）の核酸剤の少なくとも一部は、リンカーを介して疎水性ポリマーに共有結合される。例示的なリンカーとしては、クリックケミストリーを用いて形成される結合を含むリンカー（例えば、ＷＯ２００６／１１５５４７に記載）、およびアミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、オキシム、カルバミン酸塩、炭酸塩、シリルエーテル、またはトリアゾールを含むリンカー（例えば、アミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、またはトリアゾール）が挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合のような官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合のような複数の官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、官能基、例えば、リンカーの末端でこのリンカーを通じて連結される第一または第二の部分のいずれに対しても直接結合されないが、リンカーに対して内部である、本明細書に記載の結合または官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で加水分解性であるか、このリンカーは、生理学的条件下で酵素的に切断可能であるか、またはこのリンカーは、生理学的条件下で還元され得るジフルフィドを含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下では切断されず、例えば、このリンカーは、核酸剤が活性であるために切断される必要のない十分な長さであり、例えば、このリンカーの長さは、少なくとも約２０Å（例えば、少なくとも約２４Å）である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、この核酸剤は、疎水性ポリマーに結合される核酸と二重鎖を形成する。例えば、この核酸剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉを促進する剤）は、疎水性ポリマーに結合されるＤＮＡと二重鎖（例えば、ヘテロ二重鎖）を形成し得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ａ）の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、核酸剤の３’および／または５’位置を通じてｄ）の核酸剤に共有結合される。いくつかの実施形態では、ａ）の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも一部は、各々が、ｄ）の核酸剤の２’位置を通じてその核酸剤に共有結合される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｄ）の核酸剤に対して共有結合される（例えば、その疎水性ポリマーのカルボキシ末端もしくはヒドロキシル末端で、または親水性ポリマーの末端で）。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｄ）の単一の核酸剤に対して共有結合される。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｄ）の複数の核酸剤に対して共有結合される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｄ）の核酸剤に対して（例えば、その疎水性ポリマーのカルボキシ末端もしくはヒドロキシル末端で、または親水性ポリマーの末端で）直接共有結合される（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしに）。いくつかの実施形態では、核酸剤の少なくとも一部は各々が、リンカーを介して親水性−疎水性ポリマーに対して共有結合される。
【００２０】
例示的なリンカーとしては、クリックケミストリーを用いて形成される結合を含むリンカー（例えば、ＷＯ２００６／１１５５４７に記載）およびアミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、オキシム、カルバミン酸塩、炭酸塩、シリルエーテル、またはトリアゾールを含むリンカー（例えば、アミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、またはトリアゾール）が挙げられる。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合などの官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合のような複数の官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーとしては、官能基、例えば、リンカーの末端でこのリンカーを通じて連結される第一または第二の部分のいずれに対しても直接結合されないが、リンカーに対して内部である、本明細書に記載の結合または官能基が挙げられる。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で加水分解性であるか、このリンカーは、生理学的条件下で酵素的に切断可能であるか、またはこのリンカーは、生理学的条件下で還元され得るジフルフィドを含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下では切断されず、例えば、このリンカーは、核酸剤が活性であるために切断される必要のない十分な長さであり、例えば、このリンカーの長さは、少なくとも約２０Å（例えば、少なくとも約２４Å）である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、核酸剤が疎水性ポリマーに結合される核酸と二重鎖を形成する。例えば、核酸剤（例えば、ＲＮＡｉ）が疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーに結合されるＤＮＡと二重鎖（例えば、ヘテロ二重鎖）を形成し得る。いくつかの実施形態では、核酸剤が親水性−疎水性ポリマーに結合される核酸と二重鎖を形成する。例えば、核酸剤（例えば、ＲＮＡｉ）は、疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーに結合されたＤＮＡと二重鎖（例えば、ヘテロ二重鎖）を形成し得る。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ｂ）の複数の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、核酸剤の３’および／または５’位置を通じてその核酸剤に共有結合される。いくつかの実施形態では、ｂ）の複数の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、核酸剤の２’位置を通じてこの核酸剤に対して共有結合される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ａ）の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｃ）のカチオン性部分、例えば、複数の疎水性部分の少なくとも一部に対して共有結合され、例えば、ａ）の疎水性ポリマーは各々が、ｃ）のカチオン性部分に対して直接共有結合される（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）。いくつかの実施形態では、ａ）の複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｃ）のカチオン性部分に対してアミド、エステル、チオエーテル、またはエーテルを介して（例えば、疎水性ポリマーのカルボキシ末端で）共有結合される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ａ）の複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｃ）のカチオン性部分に対してその疎水性ポリマーの末端で共有結合される。いくつかの実施形態では、ｃ）の単一のカチオン性部分は、ａ）の単一の疎水性ポリマーに対して（例えば、その疎水性ポリマーの末端で）共有結合される。いくつかの実施形態では、ａ）の単一の疎水性ポリマーは、ｃ）の複数のカチオン性部分に対して共有結合される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ｃ）の複数のカチオン性部分の少なくとも一部は各々が、ａ）の疎水性ポリマーの骨格に対して結合される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ａ）の複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｃ）のカチオン性部分に対して共有結合され、およびａ）の複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｄ）の核酸剤に対して共有結合される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、この粒子は、ｃ）のカチオン性部分を含み、かつさらに複数の追加のカチオン性部分を含み、ここでこの追加のカチオン性部分は、ｃ）のカチオン性部分とは異なる。この追加のカチオン性部分は、例えば、カチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ、カチオン性ＰＶＡ、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（リジン）、またはポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート）であってもよい。いくつかの実施形態では、複数の追加のカチオン性部分の少なくとも一部各々が、ａ）の複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも一部および／またはｂ）の複数の親水性−疎水性ポリマーに結合される。いくつかの実施形態では、複数の追加のカチオン性部分の少なくとも一部は、ａ）の複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも一部に結合される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、この粒子はさらに、複数の追加の核酸剤を含み、ここでこの追加の核酸剤は、ｄ）の複数の核酸剤とは、例えば、構造において、例えば、配列、長さ、オーバーハングの長さ、または核酸剤の誘導体化（例えば、糖または塩基の修飾）が異なる。いくつかの実施形態では、複数の追加の核酸剤の少なくとも一部は、ａ）の複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーおよび／またはｂ）の複数の親水性−疎水性ポリマーのいずれかの少なくとも一部に結合される。いくつかの実施形態では、複数の追加の核酸剤の少なくとも一部は、ａ）の複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーの少なくとも一部に結合される。
【００２９】
本明細書に開示される粒子は、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡのようなＲＮＡｉを促進する剤の送達を提供し、ここでこの核酸剤は、疎水性ポリマーに結合されるか、または疎水性ポリマーに結合される核酸と二重鎖を形成する。
【００３０】
従って、別の態様では、本開示は、粒子であって：
ａ）複数の核酸剤−ポリマーの複合体であって、その各々が核酸剤を含み、この核酸剤が、
（ｉ）疎水性ポリマーに結合されるか、または
（ｉｉ）疎水性ポリマーに共有結合される核酸と二重鎖（例えば、ヘテロ二重鎖）を形成する、複合体と；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマーと；
ｃ）必要に応じて、複数のカチオン性部分と；
を含む粒子を特徴とする。
【００３１】
いくつかの実施形態では、粒子は、カチオン性部分を含む。
【００３２】
ある実施形態では、この粒子は、ナノ粒子である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、この粒子はさらに、疎水性ポリマーを含み、例えば、ここで、この疎水性ポリマーは、核酸剤のような核酸に結合されていない。いくつかの実施形態では、この粒子はｃ）の複数のカチオン性部分を含み、その少なくとも一部は各々が、疎水性ポリマー（例えば、核酸剤のような核酸に結合されていない疎水性ポリマー）に共有結合されている。例示的なカチオン性部分−疎水性ポリマーの複合体としては、Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５、Ｎ１０、Ｎ１４−テトラメチル化−スペルミンが挙げられる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、この粒子は、ｃ）の複数のカチオン性部分を含み、かつｂ）の複数の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｃ）のカチオン性部分に共有結合されている。いくつかの実施形態では、ｃ）の複数のカチオン性部分の少なくとも一部は各々が、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの疎水性部分に共有結合される（例えば、アミド、エステルまたはエーテルのような本明細書に記載されるリンカーを通して）。いくつかの実施形態では、ｃ）の複数のカチオン性部分の少なくとも一部は各々が、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの親水性部分に対して共有結合される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、核酸剤は、リンカーを介して疎水性ポリマーに対して共有結合される。例示的なリンカーとしては、クリックケミストリーを用いて形成される結合を含むリンカー（例えば、ＷＯ２００６／１１５５４７に記載）およびアミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、オキシム、カルバミン酸塩、炭酸塩、シリルエーテル、またはトリアゾールを含むリンカー（例えば、アミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、またはトリアゾール）が挙げられる。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合などの官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合のような複数の官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーとしては、官能基、例えば、リンカーの末端でこのリンカーを通じて連結される第一または第二の部分のいずれに対しても直接結合されないが、リンカーに対して内部である、本明細書に記載の結合または官能基が挙げられる。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で加水分解性であるか、このリンカーは、生理学的条件下で酵素的に切断可能であるか、またはこのリンカーは、生理学的条件下で還元され得るジフルフィドを含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下では切断されず、例えば、このリンカーは、核酸剤が活性であるために切断される必要のない十分な長さであり、例えば、このリンカーの長さは、少なくとも約２０Å（例えば、少なくとも約２４Å）である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、この核酸剤は、疎水性ポリマーに結合される核酸と二重鎖を形成する。例えば、この核酸剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉを促進する剤）は、疎水性ポリマーに結合される核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）と二重鎖（例えば、ホモ二重鎖またはヘテロ二重鎖）を形成し得る。
【００３７】
いくつかの実施形態では、この粒子は、ｃ）のカチオン性部分を含み、かつさらに複数の追加のカチオン性部分を含み、ここでこの追加のカチオン性部分は、ｃ）の複数のカチオン性部分とは、例えば、分子量、粘度、荷電または構造が異なる。いくつかの実施形態では、複数の追加のカチオン性部分の少なくとも一部は、疎水性ポリマー、および／またはｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部に結合される。いくつかの実施形態では、複数の追加のカチオン性部分の少なくとも一部は、疎水性ポリマーに結合される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、この粒子はさらに、複数の追加の核酸剤を含み、ここでこの追加の核酸剤は、ａ）の複数の核酸剤とは、例えば、構造において、例えば、配列、長さ、オーバーハングの長さ、または核酸剤の誘導体化（例えば、糖または塩基の修飾）が異なる。いくつかの実施形態では、複数の追加の核酸剤の少なくとも一部は、疎水性ポリマーおよび／またはｂ）の複数の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部に結合される。いくつかの実施形態では、複数の追加の核酸剤の少なくとも一部は、疎水性ポリマーに結合される。
【００３９】
本発明の粒子は、親水性−疎水性ポリマーに対して、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉを促進する剤の結合を提供する。疎水性部分およびカチオン性部分もまた、例えば、下記のように含まれる。
【００４０】
従って、別の態様では、本発明は、粒子であって：
ａ）複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーと；
ｂ）複数の核酸剤−親水性−疎水性ポリマーの複合体であって、ここで、この複数の核酸剤−親水性−疎水性ポリマーの複合体の核酸剤が、
（ｉ）親水性−疎水性ポリマーに共有結合されるか、または
（ｉｉ）親水性−疎水性ポリマーに共有結合される核酸との二重鎖（例えば、ヘテロ二重鎖）を形成する、複合体と；
ｃ）必要に応じて、複数のカチオン性部分と；
を含む粒子を特徴とする。
【００４１】
いくつかの実施形態では、この粒子は、複数のカチオン性部分を含む。
【００４２】
ある実施形態では、この粒子は、ナノ粒子である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、この粒子はまた、複数の親水性−疎水性ポリマーを含み、ここでこの親水性−疎水性ポリマーは、核酸剤のような核酸に共有結合されない。
【００４４】
いくつかの実施形態では、この粒子は、ｃ）の複数のカチオン性部分を含み、そしてｃ）の複数のカチオン性部分の少なくとも一部は、親水性−疎水性ポリマーに対して共有結合され、例えば、ｃ）のカチオン性部分は、核酸剤に結合されていない親水性−疎水性ポリマーに対して共有結合される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、この粒子は、ｃ）の複数のカチオン性部分を含み、かつこの複数の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は、この親水性−疎水性ポリマーの疎水性部分を通じて（例えば、アミド、エステルまたはエーテルを通じて）ｃ）のカチオン性部分に共有結合される。いくつかの実施形態では、ａ）の複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｃ）のカチオン性部分に対して共有結合される（例えば、アミド、エステルまたはエーテルを通じて）。いくつかの実施形態では、ｂ）の複合体の疎水性−親水性ポリマーは、リンカーを介して核酸剤に共有結合される。例示的なリンカーとしては、クリックケミストリーを用いて形成される結合を含むリンカー（例えば、ＷＯ２００６／１１５５４７に記載）、およびアミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、オキシム、カルバミン酸塩、炭酸塩、シリルエーテル、またはトリアゾールを含むリンカー（例えば、アミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、またはトリアゾール）が挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合のような官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合のような複数の官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーとしては、官能基、例えば、リンカーの末端でこのリンカーを通じて連結される第一または第二の部分のいずれに対しても直接結合されないが、リンカーに対して内部である、本明細書に記載の結合または官能基が挙げられる。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で加水分解性であるか、このリンカーは、生理学的条件下で酵素的に切断可能であるか、またはこのリンカーは、生理学的条件下で還元され得るジフルフィドを含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下では切断されず、例えば、このリンカーは、核酸剤が活性であるために切断される必要のない十分な長さであり、例えば、このリンカーの長さは、少なくとも約２０Å（例えば、少なくとも約２４Å）である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、この粒子は、ｃ）のカチオン性部分を含み、かつさらに複数の追加のカチオン性部分を含み、ここでこの追加のカチオン性部分は、ｃ）のカチオン性部分とは、例えば、分子量、粘度、電荷、または構造が異なる。いくつかの実施形態では、複数の追加のカチオン性部分の少なくとも一部は、ａ）の複数の疎水性ポリマーおよび／または複数の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部に結合される。いくつかの実施形態では、複数の追加のカチオン性部分の少なくとも一部は、ａ）の複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部に結合される。    
【００４７】
いくつかの実施形態では、この粒子はさらに、複数の追加の核酸剤を含み、ここでこの追加の核酸剤は、ｂ）の複数の核酸剤とは、例えば、構造において、例えば、配列、長さ、オーバーハングの長さ、または核酸剤の誘導体化（例えば、糖または塩基の修飾）が異なる。いくつかの実施形態では、複数の追加の核酸剤の少なくとも一部は、ａ）の疎水性ポリマーおよび／またはｂ）複数の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部に結合される。いくつかの実施形態では、複数の追加の核酸剤の少なくとも一部は、ａ）の複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部に結合される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ａ）の複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部に結合される核酸と二重鎖を形成する。例えば、核酸剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉを促進する剤）は、疎水性ポリマーに結合された核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）と二重鎖（例えば、ホモ二重鎖またはヘテロ二重鎖）を形成し得る。
【００４９】
本発明の粒子は、本明細書に記載されるように、具体的には、ポリマーに結合されるカチオン性部分を含む、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉを促進する剤の送達を提供する。
【００５０】
従って、別の態様では、本発明は、粒子であって：
ａ）複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーと；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマーと；
ｃ）複数のカチオン性部分であって、ここで、この複数のカチオン性部分の少なくとも一部が、ａ）の疎水性ポリマー、またはｂ）の親水性−疎水性ポリマーのいずれかに結合される、カチオン性部分と；
ｄ）複数の核酸剤と；
を含む粒子を特徴とする。
【００５１】
いくつかの実施形態では、複数の疎水性部分の少なくとも一部、例えば、ａ）のポリマーは、ｃ）のカチオン性部分に共有結合されない。いくつかの実施形態では、ａ）の複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｄ）の核酸剤に共有結合されない。
【００５２】
ある実施形態では、この粒子はナノ粒子である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ｄ）の複数の核酸剤の実質的に全ては、ポリマー（例えば、ａ）またはｂ）のポリマー）に共有結合されない。いくつかの実施形態では、ａ）の複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｃ）のカチオン性部分またはｄ）の核酸剤に共有結合されない。
【００５４】
いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ＰＥＧポリマーのような親水性ポリマーに対して共有結合される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、脂質に結合されるかおよび／または末端においてメチル基で修飾される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ａ）の複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｃ）のカチオン性部分に対して共有結合され、例えば、複数の疎水性ポリマーは、テトラメチル化スペルミン（例えば、Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５、Ｎ１０、Ｎ１４テトラメチル化−スペルミン）に対して共有結合される。いくつかの実施形態では、ａ）の複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｃ）のカチオン性部分に対して、アミド、エステルまたはエーテルを通じて（例えば、疎水性ポリマーのカルボキシ末端で）共有結合される。いくつかの実施形態では、ａ）の複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｃ）のカチオン性部分に対して、疎水性ポリマーの末端で共有結合される。いくつかの実施形態では、ｃ）の複数のカチオン性部分の少なくとも一部は、ａ）の疎水性ポリマーに対して（例えば、その疎水性ポリマーのカルボキシ末端またはヒドロキシル末端で、直接共有結合される（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）。いくつかの実施形態では、ｃ）の複数のカチオン性部分の少なくとも一部は、ａ）の疎水性ポリマーに対してリンカーを介して（例えば、その疎水性ポリマーのカルボキシ末端またはヒドロキシル末端で）共有結合される。いくつかの実施形態では、このリンカーは、クリックケミストリーを用いて形成される結合を含む（例えば、ＷＯ２００６／１１５５４７に記載されるような）。いくつかの実施形態では、このリンカーは、アミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド（すなわち、チオエーテル結合）、ケタール、コハク酸塩、オキシム、カルバミン酸塩、炭酸塩、シリルエーテル、またはトリアゾールを含む。いくつかの実施形態では、ｃ）の単一のカチオン性部分は、ａ）の単一の疎水性ポリマーに対して（例えば、その疎水性ポリマーの末端で）共有結合される。いくつかの実施形態では、ｃ）の複数のカチオン性部分の少なくとも一部は、アミド、エステル、チオエーテル、またはエーテル結合を介して疎水性部分を通じてｂ）の親水性−疎水性ポリマーに共有結合される。いくつかの実施形態では、ａ）の単一の疎水性ポリマーは、ｃ）の複数のカチオン性部分に対して共有結合される。いくつかの実施形態では、ｃ）の複数のカチオン性部分の少なくとも一部は、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部の骨格に結合される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ｂ）の複数の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｃ）のカチオン性部分に共有結合される。いくつかの実施形態では、ｃ）の複数のカチオン性部分の少なくとも一部は、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーに対して（例えば、その疎水性ポリマーのカルボキシ末端またはヒドロキシル末端で）直接共有結合される（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）。いくつかの実施形態では、ｃ）の複数のカチオン性部分の少なくとも一部は、ａ）の親水性−疎水性ポリマーに対して、リンカーを介して（例えば、その疎水性ポリマーのカルボキシ末端またはヒドロキシル末端で）共有結合される。いくつかの実施形態では、このリンカーは、クリックケミストリーを用いて形成される結合を含む（例えば、ＷＯ２００６／１１５５４７に記載されるような）。いくつかの実施形態では、このリンカーは、アミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、オキシム、カルバミン酸塩、炭酸塩、シリルエーテル、またはトリアゾールを含む。いくつかの実施形態では、ｃ）の単一のカチオン性部分は、ｂ）の単一の親水性−疎水性ポリマーに対して（例えば、その親水性−疎水性ポリマーの末端で）共有結合される。いくつかの実施形態では、ｃ）の複数のカチオン性部分の少なくとも一部は、疎水性部分を通じてｂ）の親水性−疎水性ポリマーに共有結合される。いくつかの実施形態では、ｃ）の複数のカチオン性部分の少なくとも一部は、疎水性部分を通じてｂ）の親水性−疎水性ポリマーに共有結合される。いくつかの実施形態では、ｃ）の複数のカチオン性部分の少なくとも一部は、アミド、エステルまたはエーテル結合を介して、疎水性部分を通じてｂ）の親水性−疎水性ポリマーに対して共有結合される。いくつかの実施形態では、ｂ）の単一の親水性−疎水性ポリマーは、ｃ）の複数のカチオン性部分に対して共有結合される。いくつかの実施形態では、ｃ）の複数のカチオン性部分の少なくとも一部は、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部の骨格に対して結合される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ａ）の複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｄ）の核酸剤に共有結合される。いくつかの実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｄ）の単一の核酸剤に共有結合される。いくつかの実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｄ）の複数の核酸剤に共有結合される。いくつかの実施形態では、ｄ）の核酸剤は、ａ）の疎水性ポリマーに対して（例えば、親水性−疎水性ポリマーのヒドロキシル末端で）、直接共有結合される（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）。いくつかの実施形態では、核酸剤は、ａ）の疎水性ポリマーに対してリンカーを介して（例えば、親水性−疎水性ポリマーのヒドロキシル末端で）共有結合される。例示的なリンカーとしては、クリックケミストリーを用いて形成される結合を含むリンカー（例えば、ＷＯ２００６／１１５５４７に記載されるような）、およびアミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、オキシム、カルバミン酸塩、炭酸塩、シリルエーテル、またはトリアゾールを含むリンカー（例えば、アミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、またはトリアゾール）が挙げられる。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合のような官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合のような複数の官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーとしては、官能基、例えば、リンカーの末端でこのリンカーを通じて連結される第一または第二の部分のいずれに対しても直接結合されないが、リンカーに対して内部である、本明細書に記載の結合または官能基が挙げられる。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で加水分解性であるか、このリンカーは、生理学的条件下で酵素的に切断可能であるか、またはこのリンカーは、生理学的条件下で還元され得るジフルフィドを含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下では切断されず、例えば、このリンカーは、核酸剤が活性であるために切断される必要のない十分な長さであり、例えば、このリンカーの長さは、少なくとも約２０Å（例えば、少なくとも約２４Å）である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、核酸剤の３’および／または５’位置を通じてｄ）の核酸剤に共有結合される。いくつかの実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｄ）の核酸剤の２’位置を通じてその核酸剤に共有結合される。
【００５９】
いくつかの実施形態では、核酸剤は、ａ）の複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部に結合される核酸と二重鎖を形成する。例えば、核酸剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉを促進する剤）は、疎水性ポリマーに結合された核酸（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）と二重鎖（例えば、ホモ二重鎖またはヘテロ二重鎖）を形成し得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｄ）の核酸剤に対して共有結合される。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｄ）の単一の核酸剤に対して共有結合される。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、ｄ）の複数の核酸剤に対して共有結合される。いくつかの実施形態では、ｄ）の核酸剤の少なくとも一部は、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーに対して（例えば、親水性−疎水性ポリマーのヒドロキシル末端で）、直接共有結合される（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）。いくつかの実施形態では、ｄ）の核酸剤の少なくとも一部は各々が、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーに対して、リンカーを介して（例えば、親水性−疎水性ポリマーのヒドロキシル末端で）共有結合される。例示的なリンカーとしては、クリックケミストリーを用いて形成される結合を含むリンカー（例えば、ＷＯ２００６／１１５５４７に記載されるような）、およびアミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、オキシム、カルバミン酸塩、炭酸塩、シリルエーテル、またはトリアゾールを含むリンカー（例えば、アミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、またはトリアゾール）が挙げられる。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合のような官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合のような複数の官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーとしては、官能基、例えば、リンカーの末端でこのリンカーを通じて連結される第一または第二の部分のいずれに対しても直接結合されないが、リンカーに対して内部である、本明細書に記載の結合または官能基が挙げられる。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で加水分解性であるか、このリンカーは、生理学的条件下で酵素的に切断可能であるか、またはこのリンカーは、生理学的条件下で還元され得るジフルフィドを含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下では切断されず、例えば、このリンカーは、核酸剤が活性であるために切断される必要のない十分な長さであり、例えば、このリンカーの長さは、少なくとも約２０Å（例えば、少なくとも約２４Å）である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、核酸剤の３’および／または５’位置を通じてｄ）の核酸剤に共有結合される。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｄ）の核酸剤の２’位置を通じてその核酸剤に共有結合される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｃ）のカチオン性部分に対して共有結合され、そしてａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ｄ）の核酸剤に対して結合される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、この粒子はさらに、複数の追加のカチオン性部分を含み、ここで、追加のカチオン性部分は、ｃ）のカチオン性部分とは、例えば、分子量、粘度、電荷、または構造が異なる。いくつかの実施形態では、複数の追加のカチオン性部分の少なくとも一部は、ａ）の疎水性ポリマーおよび／またはｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部に結合される。いくつかの実施形態では、複数の追加のカチオン性部分の少なくとも一部は、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部に結合される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、この粒子はさらに、複数の追加の核酸剤を含み、ここでこの追加の核酸剤は、ｄ）の核酸剤とは、例えば、構造において、例えば、配列、長さ、オーバーハングの長さ、または核酸剤の誘導体化（例えば、糖または塩基の修飾）が異なる。いくつかの実施形態では、複数の追加の核酸剤の少なくとも一部は、ａ）の疎水性ポリマーおよび／またはｂ）複数の親水性−疎水性ポリマーのいずれかの少なくとも一部に結合される。いくつかの実施形態では、複数の追加の核酸剤の少なくとも一部は、ａ）の複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部に結合される。
【００６５】
本発明の粒子は、核酸剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉを促進する剤）の送達を提供し、ここでこの核酸剤は、疎水性ポリマーに共有結合されるか、または親水性ポリマーに共有結合された核酸と二重鎖を形成する。
【００６６】
従って、別の態様では、本発明は、粒子であって：
ａ）複数の疎水性部分（例えば、疎水性ポリマー）と；
ｂ）必要に応じて複数の親水性−疎水性ポリマーと；
ｃ）複数のカチオン性部分と；
ｄ）複数の核酸剤であって、ここでこの複数の核酸剤の少なくとも一部が、親水性ポリマーに共有結合されるか、または親水性ポリマーに共有結合される核酸と二重鎖（例えば、ヘテロ二重鎖）を形成する粒子を特徴とする。
【００６７】
ある実施形態では、この粒子はナノ粒子である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、この核酸剤は、親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧを含んでいる）に対して共有結合される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約２ｋＤａという分子量を有する。いくつかの実施形態では、このポリマー、（例えば、親水性ポリマー）は、脂質（例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ＰＤＰ（ポリエチレングリコール）−２ｋ］）に共有結合される。例示的な脂質は、ＤＳＰＥのように本明細書に記載される。一実施形態では、ポリマーは、脂質に共有結合されたＰＥＧ、例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ＰＤＰ（ポリエチレングリコール）−２ｋＤａ］に共有結合されたＰＥＧである。
【００６９】
ある実施形態では、この粒子は、実質的に疎水性−親水性ポリマーを含まない。ある実施形態では、疎水性−親水性ポリマーは、存在する場合、粒子を作製するための出発材料中で、または出発材料として用いられる、組成物、例えば、ポリマーの重量あたり５、２、または１重量％未満の量である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、この疎水性部分は、疎水性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡである。いくつかの実施形態では、親水性−疎水性ポリマーは、ＰＥＧ−ＰＬＧポリマーである。
【００７１】
本発明の粒子は、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉを促進する剤の送達をもたらし、ここでこの核酸剤は、ポリマーまたは親水性−疎水性ポリマーのような疎水性部分に対して結合（例えば、共有結合される）されず、かつポリマーまたは親水性−疎水性ポリマーのような疎水性部分に対して結合される（例えば、共有結合される）核酸と二重鎖を形成しない。代替的に、いくつかの粒子では、粒子を作製するための出発材料中で、または出発材料として用いられる、核酸剤の重量あたり５、２、または１重量％未満が、このようなポリマーに結合される。
【００７２】
従って、別の態様では、本発明は、粒子であって：
ａ）複数の疎水性部分（例えば、疎水性ポリマー）と；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマーと；
ｃ）複数の核酸剤−カチオン性ポリマーの複合体と；
を含む、粒子を特徴とする。
【００７３】
ある実施形態では、この粒子はナノ粒子である。
【００７４】
ある実施形態では、この核酸剤は、疎水性ポリマー、または親水性−疎水性ポリマーに対して、結合されず、例えば、共有結合されない。ある実施形態では、粒子を作製するための出発材料中で、または出発材料として用いられる、核酸剤の重量あたり５、２、または１重量％未満の量が、疎水性ポリマー、または親水性−疎水性ポリマーに結合される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、ＰＶＡであり、例えば、核酸剤−カチオン性ポリマーの複合体は、ｓｉＲＮＡ−カチオン性ＰＶＡ複合体である。いくつかの実施形態では、この疎水性部分は、ＰＬＧＡのような疎水性ポリマーである。いくつかの実施形態では、この親水性−疎水性ポリマーは、ＰＥＧ−ＰＬＧポリマーである。
【００７６】
本発明の粒子は、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉを促進する剤の送達をもたらし、ここで、核酸剤もカチオン性ポリマーも、疎水性ポリマーもしくは親水性−疎水性ポリマーに結合されず、例えば共有結合されないか、またはここで独立して、粒子を作製するための出発材料中で、または出発材料として用いられる、核酸剤およびカチオン性部分の重量あたり５、２、または１重量％未満が、このようなポリマーに結合される。このような粒子の核酸剤、およびカチオン性部分、例えば、この粒子の核酸剤およびカチオン性部分の実質に全てが、ポリマー成分に共有結合されるのとは対照的に、この粒子内に包含される。
【００７７】
従って、別の態様では、本発明は、粒子であって：
ａ）複数の疎水性部分（例えば、疎水性ポリマー）と；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマーと；
ｃ）必要に応じて、複数のカチオン性部分と；
ｄ）複数の核酸剤と；を含み、
ここで、ｃ）のカチオン性部分の実質的に一部、およびｄ）の核酸剤の実質的に一部が、疎水性ポリマーにも、親水性−疎水性ポリマーにも共有結合されない、粒子を特徴とする。例えば、核酸剤またはカチオン性部分は、この粒子中に封入される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、この粒子は、複数のカチオン性部分を含む。
【００７９】
ある実施形態では、この粒子はナノ粒子である。
【００８０】
ある実施形態では、独立して、この粒子を作製するための出発材料中で、または出発材料として用いられる核酸剤の重量あたり５、２または１％未満が、このようなポリマーに結合され、そして、この粒子を作製するための出発材料中で、または出発材料として用いられるカチオン部分の重量あたり５、２または１％未満が、このようなポリマーに結合される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、このカチオン性部分は、カチオン性ポリマーである。例示的なカチオン性ポリマーとしては、カチオン性ＰＶＡ、例えば、本明細書に記載されるカチオン性ＰＶＡまたはスペルミン、例としては、修飾スペルミン（例えば、テトラメチル化スペルミン）が挙げられる。核酸剤は、本明細書に記載されるカチオン性ポリマーのようなカチオン性部分と複合体を形成し得る。カチオン性部分と複合体化された核酸剤は、粒子中に封入され得る。いくつかの実施形態では、核酸剤の骨格の電荷に対するカチオン性部分の電荷の比は、約２：１〜約１：１（例えば、約１．５：１〜約１：１）である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、この疎水性部分は、疎水性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡである。いくつかの実施形態では、この親水性−疎水性ポリマーは、ＰＥＧ−ＰＬＧポリマーである。
【００８３】
本明細書に記載される粒子は、以下の特性のうちの１つ以上を有し得る。一実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、カルボキシ末端を有する。一実施形態では、カルボキシ末端のような末端は、修飾される（例えば、本明細書に記載される反応基を含む反応基による）。一実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ヒドロキシル末端を有する。一実施形態では、ヒドロキシル末端は、（例えば、反応基で）修飾される。一実施形態では、ヒドロキシル末端を有するａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ヒドロキシル末端キャップを有する（例えば、アシル部分でキャップされた）。一実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、カルボキシ末端およびヒドロキシル末端の両方を有する。一実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、乳酸および／またはグリコール酸のモノマーを含む。一実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、ＰＬＡまたはＰＧＡを含む。一実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は、乳酸およびグリコール酸のコポリマー（すなわち、ＰＬＧＡ）を含む。一実施形態では、ポリマー多分散性係数は、約２．５未満（例えば、約１．５未満）である。一実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの一部は、約２５：７５〜約７５：２５という乳酸対グリコール酸の比を有するＰＬＧＡを含む。一実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの一部は、約５０：５０という乳酸対グリコール酸の比を有するＰＬＧＡを含む。一実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーは、約４〜約６６ｋＤａ、例えば約４〜約１２ｋＤａ、約８〜約１２ｋＤａという分子量を有する。一実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーは、約４〜約１２ｋＤａ（例えば、約４〜約８ｋＤａ）という重量平均分子量を有する。一実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーは、この粒子を作製するための出発材料中で、または出発材料として用いられる重量あたり、約３５〜約９０重量％（例えば、約３５〜約８０重量％）を含む。一実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、単一のカチオン性部分に共有結合され、ａ）の疎水性ポリマーの一部が、複数のカチオン性部分に結合される。一実施形態では、ａ）の疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、単一の核酸剤に共有結合され、ａ）の疎水性ポリマーの一部は、複数の核酸剤に結合される。
【００８４】
本明細書に記載される粒子のさらなる特性としては以下が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーは、ブロックコポリマーである。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーは、ジブロックコポリマーである。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部の疎水性部分は、ヒドロキシル末端を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル末端を有するｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部の疎水性部分は、ヒドロキシル末端のエンドキャップを有する（例えば、アシル部分でキャップされた）。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル末端を有するｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部の疎水性部分は、アシル部分でキャップされたヒドロキシル末端を有する。
【００８５】
本明細書に記載される粒子のさらなる特性としては以下が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部の疎水性部分は、乳酸およびグリコール酸のコポリマー（すなわち、ＰＬＧＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部の疎水性部分は、約２５：７５〜約７５：２５という乳酸対グリコール酸の比を有するＰＬＧＡを含む。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部の疎水性部分は、約５０：５０という乳酸対グリコール酸の比を有するＰＬＧＡを含む。
【００８６】
本明細書に記載される粒子のさらなる特性としては、以下が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部の疎水性部分は、約４〜約２０ｋＤａ（例えば、約４〜約１２ｋＤａ、約６〜約２０ｋＤａまたは約８〜約１５ｋＤａ）という重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部の親水性部分は、約１〜約８ｋＤａ（例えば、約２〜約６ｋＤａ）という重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ｂ）の複数の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は、粒子を作製するための出発材料中で、または出発材料として用いられる重量あたり約２〜約３０重量％（例えば、約４〜約２５重量％）である。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの親水性部分の少なくとも一部は、ＰＥＧ、ポリオキサゾリン、ポリビニルピロリジン、ポリヒドロキシルプロピルメタクリルアミド、またはポリシアル酸（例えば、ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの親水性部分の少なくとも一部は、メトキシで終わる。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、単一のカチオン性部分に対して共有結合され、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの一部は、複数のカチオン性部分に結合される。いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーの少なくとも一部は各々が、単一の核酸剤に対して共有結合され、かつｂ）の親水性−疎水性ポリマーの一部は、複数の核酸剤に対して共有結合される。
【００８７】
本明細書に記載される粒子のさらなる特性としては以下が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｃ）のカチオン性部分の少なくとも一部は、少なくとも１つのアミン（例えば、一級、二級、三級または四級のアミン）を含む。いくつかの実施形態では、ｃ）のカチオン性部分の少なくとも一部は、複数のアミン（例えば、一級、二級、三級または四級のアミン）を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性部分の少なくとも１つのアミンは、二級または三級のアミンである。いくつかの実施形態では、ｃ）のカチオン性部分の少なくとも一部は、ポリマー、例えば、ポリエチレンイミンまたはポリリジンを含む。ポリマーのカチオン性部分は、種々の分子量を有する（例えば、約５００〜約５０００Ｄａ、例えば、約１〜約２ｋＤａまたは約２．５ｋＤａにおよぶ）。いくつかの実施形態では、ｃ）のカチオン性部分の少なくとも一部は、カチオン性のＰＶＡ（例えば、ＣＭ−３１８またはＣ−５０６のようにＫｕｒａｒａｙから提供される）を含む。他の例示的なカチオン性部分としては、ポリアミノ酸、ポリ（ヒスチジン）およびポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレートが挙げられる。いくつかの実施形態では、カチオン性部分は、５以上というｐＫａを有する。いくつかの実施形態では、アミンは、酸性のｐＨで正に荷電される。いくつかの実施形態では、アミンは、生理学的なｐＨで正に荷電される。いくつかの実施形態では、ｃ）のカチオン性部分の少なくとも一部は、硫酸プロタミン、臭化ヘキサジメトリン（ｈｅｘａｄｅｍｅｔｈｒｉｎｅ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム、スペルミン（例えば、テトラメチル化スペルミン）、およびスペルミジンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ｃ）のカチオン性部分の少なくとも一部は、テトラアルキルアンモニウム部分、トリアルキルアンモニウム部分、イミダゾリウム部分、アリールアンモニウム部分、イミニウム部分、アミジニウム部分、グアニジウム部分、チアゾリウム部分、ピラゾリリウム部分、ピラジニウム部分、ピリジニウム部分およびホスホニウム部分からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ｃ）のカチオン性部分の少なくとも一部は、カチオン性脂質である。いくつかの実施形態では、ｃ）のカチオン性部分の少なくとも一部は、非重合性の疎水性部分（例えば、コレステロールまたはビタミンＥ  ＴＰＧＳ）に対して複合体化される。いくつかの実施形態では、ｃ）の複数のカチオン性部分は、粒子を作製するための出発材料中で、または出発材料として用いられる重量あたり約０．１〜約６０重量％、例えば、粒子の重量あたり約１〜約６０重量％である。いくつかの実施形態では、複数のカチオン性部分の電荷、対、複数の核酸剤の電荷の比は、約１：１〜約５０：１（例えば、１：１〜約１０：１または１：１〜５：１、約１．５：１または約１：１）である。カチオン性部分が窒素含有部分である実施形態では、この比は、Ｎ／Ｐ比と呼ばれ得る。
【００８８】
本明細書に記載される粒子のさらなる特性としては以下が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸剤の少なくとも一部は、ＤＮＡ剤である。いくつかの実施形態では、核酸剤の少なくとも一部は、ＲＮＡ剤（例えば、ｓｉＲＮＡもしくはマイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉを促進する剤）である。いくつかの実施形態では、核酸剤の少なくとも一部は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、アプタマー、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびプラスミドからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、複数の核酸剤の少なくとも一部は、化学的に修飾され（例えば、１つ以上の骨格の修飾、塩基の修飾、および／または糖に対する修飾を含む）核酸剤の安定性が増大する。いくつかの実施形態では、複数の核酸剤は、粒子を作製するための出発材料中で、または出発材料として用いられる重量あたり約１〜約５０重量％（例えば、約１〜約２０％、約２〜約１５％、約３〜約１２％）である。
【００８９】
本明細書に記載される粒子のさらなる特性としては以下が挙げられる。いくつかの実施形態では、この粒子はまた、界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、この界面活性剤はポリマー、例えば、ＰＶＡである。いくつかの実施形態では、ＰＶＡは、約２〜約２７ｃＰの粘度を有する。いくつかの実施形態では、この界面活性剤は、粒子を作製するための出発材料中で、または出発材料として用いられる重量あたり約０〜約４０重量％（例えば、約１５〜約３５重量％）である。いくつかの実施形態では、この粒子の直径は、約２００ｎｍ未満（例えば、約２００〜約２０ｎｍ、約１５０〜約５０ｎｍ、または約１５０ｎｍ未満）である。いくつかの実施形態では、この粒子の表面は、実質的に、ＰＥＧ、ＰＶＡ、ポリオキサゾリン、ポリビニルピロリジン、ポリヒドロキシルプロピルメタクリルアミド、またはポリシアル酸（例えば、ＰＥＧ）でコーティングされる。いくつかの実施形態では、この粒子は、標的化剤を含む。いくつかの実施形態では、この粒子の表面は実質的に核酸剤を含まない。  
【００９０】
本明細書に記載される粒子のさらなる特性としては以下が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｄ）の複数の核酸剤は実質的に完全なままである。いくつかの実施形態では、この粒子のゼータ電位は、約−２０〜約５０ｍＶ（例えば、約−２０〜約２０ｍＶ、約−１０〜約１０ｍＶ、または中性）である。いくつかの実施形態では、この粒子は、摂氏２３度の温度でかつ６０％の湿度パーセントを含む、条件下で、少なくとも１日（例えば、少なくとも７日、少なくとも１４日、少なくとも２１日、少なくとも３０日）化学的に安定である。いくつかの実施形態では、この粒子は、凍結乾燥された粒子である。いくつかの実施形態では、この粒子は、薬学的組成物に処方される。いくつかの実施形態では、この粒子の表面は実質的に標的化剤を含まない。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子は、対象における標的とされる遺伝子の発現が、対象へのこの粒子の投与後ほぼ７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、１９２時間、２１６時間、２４０時間、２６４時間で、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上減少されるような核酸剤の有効量を送達し得る。一実施形態では、本明細書に記載される粒子は、対象における標的とする遺伝子の発現が、対象へのこの粒子の投与後ほぼ１２０時間で、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％まで減少されるような核酸剤の有効量を送達し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子または組成物を投与された対象における標的遺伝子発現のレベルが、この核酸剤が、粒子または複合体以外の処方物で（すなわち、粒子中でなく、例えば、粒子中に封入されることもなく、ポリマー、例えば、本明細書に記載される粒子に複合体化されることもなく）投与された場合に見られる標的遺伝子の発現のレベル、または核酸剤も他の治療剤の投与もなしで見られる標的遺伝子の発現と比較される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、この粒子は、疎水性ポリマーを含み、例えば、ここでは、核酸剤は、ａ）の疎水性ポリマーに結合され、ここで、この疎水性ポリマー、または核酸剤−疎水性ポリマーの複合体は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：
ｉ）核酸剤に結合された疎水性ポリマーは、ホモポリマーであっても、または２種以上のモノマーサブユニットからできているポリマーであってもよい；
ｉｉ）核酸剤に結合された疎水性ポリマーは、約４〜約２０ｋＤａという重量平均分子量を有する；
ｉｉｉ）疎水性ポリマーは、第一種および第二種のモノマーサブユニットからできており、かつこの剤に結合された疎水性ポリマー中の第一種のモノマーサブユニット対第二種のモノマーサブユニットの比は、約２５：７５〜約７５：２５、例えば、約５０：５０である；
ｉｖ）疎水性ポリマーは、ＰＬＧＡである；
ｖ）核酸剤は、粒子の重量あたり約１〜約２０重量％である；
ｖｉ）複数の核酸剤−疎水性ポリマーの複合体は、粒子の重量あたり約１０重量％である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、核酸剤に結合される疎水性ポリマーは、約４〜約１２ｋＤａ、例えば、約６〜約１２ｋＤａまたは約８〜約１２ｋＤａという重量平均分子量を有する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ｂ）の親水性−疎水性ポリマーは、以下の特性のうち１つ以上を有する：
ｉ）親水性部分は、約１〜約６ｋＤａ（例えば、約２〜約６ｋＤａ）という重量平均分子量を有する、
ｉｉ）疎水性ポリマーは、約４〜約１５ｋＤａという重量平均分子量を有する；
ｉｉｉ）複数の親水性−疎水性ポリマーは、この粒子の約２５重量％である；
ｉｖ）親水性ポリマーは、ＰＥＧである；
ｖ）疎水性ポリマーは、第一種および第二種のモノマーサブユニットからできており、かつこの剤に結合された疎水性ポリマー中の第一種のモノマーサブユニット対第二種のモノマーサブユニットの比は、約２５：７５〜約７５：２５、例えば、約５０：５０である；ならびに
ｖｉ）疎水性ポリマーは、ＰＬＧＡである。
【００９５】
いくつかの実施形態では、親水性部分の重量平均分子量は、約１〜約３ｋＤａ、例えば、約２ｋＤａであり、親水性部分の重量平均分子量の疎水性部分の重量平均分子量に対する比は、１：３〜１：７であり、かつ親水性部分の重量平均分子量が、約４〜約６ｋＤａ、例えば、約５ｋＤａである場合、親水性部分の重量平均分子量の疎水性部分に対する重量平均分子量の比は、１：１−１：４である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、親水性部分は、約２〜約６ｋＤａという重量平均分子量を有し、かつ疎水性部分は、約８〜約１３ｋＤａという重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、親水性−疎水性ポリマーの親水性部分は、メトキシで終わる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、核酸剤は、疎水性ポリマーに結合され、ここで、この核酸剤−疎水性ポリマーの複合体は、以下の特性のうち１つ以上を有する：
ｉ）核酸剤に結合される疎水性ポリマーは、ホモポリマーであっても、または２種以上のモノマーサブユニットからできているポリマーであってもよい；  
ｉｉ）核酸剤に結合される疎水性ポリマーは、約４〜約１５ｋＤａという重量平均分子量を有する；
ｉｉｉ）疎水性ポリマーは、第一種および第二種のモノマーサブユニットからできており、かつこの剤に結合された疎水性ポリマー中の第一種のモノマーサブユニット対第二種のモノマーサブユニットの比は、約２５：７５〜約７５：２５、例えば、約５０：５０である；
ｉｖ）この疎水性ポリマーは、ＰＬＧＡである；
ｖ）カチオン性部分の核酸剤に対する電荷比は、約１：１〜約４：１である；  
ｖｉ）複数の核酸剤−疎水性ポリマーの複合体は、粒子の重量あたり約１０重量％である。いくつかの実施形態では、この粒子はまた、界面活性剤（例えば、ＰＶＡ）を含む。
【００９８】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される複数の粒子を含む組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、この組成物は薬学的組成物である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、組成物中の粒子の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または全てが、約２００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、この粒子は、２００ｎｍ未満（例えば、約２００〜約２０ｎｍ、約１５０〜約５０ｎｍ、または約１５０ｎｍ未満）というＤｖ９０を有する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、この組成物は、約１ｋＤａ未満の分子量（例えば、約５００Ｄａ未満）を有するポリマーを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、この組成物は、実質的に遊離の核酸剤（すなわち、粒子中に封入されることも、結合されることもない核酸剤）を含まない。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、標的化剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、実質的にカチオン性部分（すなわち、粒子中の成分に封入されることもなく、結合されることもないカチオン性部分）を含まない。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、組成物は、摂氏２３度の温度でかつ６０％の湿度パーセントを含む、条件下で、少なくとも１日（例えば、少なくとも７日、少なくとも１４日、少なくとも２１日、少なくとも３０日）化学的に安定である。いくつかの実施形態では、この組成物は、凍結乾燥された組成物である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、この粒子は、薬学的組成物中に処方される。
【０１０３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される複数の粒子または本明細書に記載される組成物を備えているキットを特徴とする。
【０１０４】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される複数の粒子、または本明細書に記載される組成物を含んでいる、単位剤形を特徴とする。
【０１０５】
別の態様では、本発明は、障害を有する対象を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載される粒子、または本明細書に記載される組成物を対象に投与して、それによって対象を治療することを包含する方法を特徴とする。
【０１０６】
一実施形態では、この障害は増殖性障害、例えば、進行の遅い増殖障害である。一実施形態では、増殖障害は癌、例えば、本明細書に記載される癌である。一実施形態では、この癌は、進行の遅い癌、例えば、固形腫瘍または白血病である。例えば、進行の遅い癌とは、ステージＩまたはステージＩＩの固形腫瘍であり得る。例示的な癌としては限定するものではないが、膀胱癌（加速型、および転移性膀胱癌を含む）、乳癌（例えば、エストロゲン受容体陽性乳癌；エストロゲン受容体陰性乳癌；ＨＥＲ−２陽性乳癌；ＨＥＲ−２陰性乳癌；プロゲステロン受容体陽性乳癌；プロゲステロン受容体陰性乳癌；エストロゲン受容体陰性、ＨＥＲ−２陰性、およびプロゲステロン受容体陰性乳癌（すなわち、三重陰性乳癌）；炎症性乳癌）、結腸癌（結腸直腸癌を含む）、腎癌、肝癌、肺癌（小細胞肺癌および非小細胞肺癌、肺腺癌、および扁平上皮癌を含む）、泌尿生殖器癌、例えば、卵巣癌（ファロピウス管癌および腹膜癌を含む）、子宮頚癌、前立腺癌および精巣癌、リンパ系癌、直腸癌、喉頭癌、膵癌（外分泌膵癌を含む）、食道癌、胃癌、胆嚢癌、甲状腺癌、皮膚癌（扁平上皮癌を含む）、脳癌（多形神経膠芽腫を含む）、および頭頚部癌が挙げられる。好ましい癌としては、乳癌（例えば、転移性乳癌または局所進行性乳癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺癌）、腎細胞癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺腺癌、および扁平上皮癌、例えば、進行性非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺腺癌、および扁平上皮癌）膵癌、胃癌（例えば、転移性胃腺癌）、直腸結腸癌、直腸癌、頭頚部の扁平上皮癌、リンパ腫（ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫）、腎細胞癌、尿路上皮癌、軟部組織肉腫、神経膠種、黒色腫（例えば、進行性または転移性の黒色腫）、胚細胞腫瘍、卵巣癌（例えば、進行性卵巣癌、例えば、進行性ファロピウス管癌または腹膜癌）および胃腸癌が挙げられる。
【０１０７】
別の態様では、本発明は、対象、例えば、標的とする遺伝子の発現を減少することによって処置され得る障害を有している対象における標的遺伝子発現を減少する方法を特徴とする。この方法は、有効量の本明細書に記載される粒子、または本明細書に記載される組成物を投与することを包含し、ここで、この粒子によって送達される核酸剤は、対象における標的とする遺伝子の発現を、その粒子の投与後、ほぼ７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、１９２時間、２１６時間、２４０時間、２６４時間後に少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上減少させる。一実施形態では、この粒子によって送達される核酸剤は、対象における標的とする遺伝子の発現を、この粒子の投与のほぼ１２０時間後、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子または組成物を投与された対象における標的遺伝子発現のレベルは、核酸剤が、粒子または複合体以外の処方物で（すなわち、粒子中でなく、例えば、粒子中に封入されることも、ポリマー、例えば、本明細書に記載の粒子に複合体化されることもなく）投与された場合に見られる標的遺伝子の発現のレベル、または核酸剤もしくは他の治療剤の投与なしで見られる標的遺伝子の発現と比較される。
【０１０８】
別の態様では、本発明は、核酸剤−疎水性ポリマーの複合体であって、疎水性ポリマーに共有結合された核酸剤、または疎水性ポリマーに共有結合される核酸と二重鎖（例えば、ヘテロ二重鎖）を形成する核酸剤を含んでいる、核酸剤−疎水性ポリマーの複合体を特徴とする。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、核酸剤は、核酸剤の２’、３’および／または５’末端を介して疎水性ポリマーに共有結合される。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ポリマーの末端でこの疎水性ポリマーに共有結合される。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、疎水性ポリマーの骨格上のポリマーに対して共有結合される。いくつかの実施形態では、単一の核酸剤が、単一の疎水性ポリマーに対して共有結合される。いくつかの実施形態では、複数の核酸剤は各々が、単一の疎水性ポリマーに対して共有結合される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、この核酸剤は、疎水性の疎水性ポリマーに対して（例えば、エステルを介して）、直接共有結合される（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、リンカーを介して、疎水性ポリマーに共有結合される。例示的なリンカーとしては、クリックケミストリーを用いて形成される結合を含むリンカー（例えば、ＷＯ２００６／１１５５４７に記載されるような）、およびアミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、オキシム、カルバミン酸塩、炭酸塩、シリルエーテル、またはトリアゾールを含むリンカー（例えば、アミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、またはトリアゾール）が挙げられる。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合のような官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合のような複数の官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーとしては、官能基、例えば、リンカーの末端でこのリンカーを通じて連結される第一または第二の部分のいずれに対しても直接結合されないが、リンカーに対して内部である、本明細書に記載の結合または官能基が挙げられる。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で加水分解性であるか、このリンカーは、生理学的条件下で酵素的に切断可能であるか、またはこのリンカーは、生理学的条件下で還元され得るジフルフィドを含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下では切断されず、例えば、このリンカーは、核酸剤が活性であるために切断される必要のない十分な長さであり、例えば、このリンカーの長さは、少なくとも約２０Å（例えば、少なくとも約２４Å）である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、この疎水性ポリマーは、末端のヒドロキシル部分を有する。いくつかの実施形態では、この疎水性ポリマーは、キャップされている（例えば、アシル部分で）末端のヒドロキシル部分を有する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、この疎水性ポリマーは、以下の特性のうち１つ以上を有する：
ｉ）核酸剤に結合される疎水性ポリマーは、ホモポリマー、または２種以上のモノマーサブユニットからできているポリマーである；
ｉｉ）核酸剤に結合される疎水性ポリマーは、約４〜約１５ｋＤａ（例えば、約４〜約１２ｋＤａ、約６〜約１２ｋＤａ、または約８〜約１２ｋＤａ）という重量平均分子量を有する；
ｉｉｉ）疎水性ポリマーは、第一種および第二種のモノマーサブユニットからできており、この剤に結合された疎水性ポリマー中の第一種のモノマーサブユニット対第二種のモノマーサブユニットの比は、約２５：７５〜約７５：２５、例えば、約５０：５０である；
ｉｖ）この疎水性ポリマーは、ＰＬＧＡである。
【０１１３】
ある実施形態では、この核酸剤は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの混合ポリマーである。ある実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである．ある実施形態では、ＤＮＡはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである。ある実施形態では、核酸剤は、一本鎖であり、かつ別の実施形態では、これは二本鎖を含む。ある実施形態では、核酸剤は、２つ以上の分子由来の鎖からできている、二重鎖の領域を有し得る。ある実施形態では、この核酸剤は、遺伝子発現を阻害する剤、例えば、ＲＮＡｉを促進する剤である。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）からなる群より選択される。ある実施形態では、この核酸剤は、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）またはアプタマーである。
【０１１４】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される複数の核酸剤−疎水性ポリマーの複合体を含んでいる組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、この組成物は、薬学的組成物である。いくつかの実施形態では、この組成物は反応混合物である。いくつかの実施形態では、この組成物は実質的に、非複合体型の核酸剤を含まない。いくつかの実施形態では、核酸剤−ポリマーの複合体上の核酸剤の少なくとも約５０％が完全なままである。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、この組成物は実質的に、約１ｋＤａ未満（例えば、約５００Ｄａ未満）という分子量を有する疎水性ポリマーを含まない。
【０１１６】
別の態様では、本発明は、核酸剤−疎水性ポリマーの複合体を作製する方法であって：
核酸剤およびポリマーを提供することと；
この核酸剤およびポリマーを、このポリマーに対する核酸剤の共有結合をもたらす条件に供することと、
を包含する方法を特徴とする。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、この方法は、反応混合物中で行われる。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、単一の溶媒を含む。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、複数の溶媒を含んでいる溶媒系を含む。いくつかの実施形態では、この複数の溶媒は、混和性である。いくつかの実施形態では、この溶媒系は、水および極性の溶媒、例えば、本明細書に記載される溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトン、ベンジルアルコール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、またはアセトニトリル）を含む。いくつかの実施形態では、この溶媒系は、水性の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ＴＥ緩衝液、または２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ））を含む。いくつかの実施形態では、この溶媒系は、二相性である（例えば、有機相および水相を含む）。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸剤またはポリマーのうちの少なくとも１つが、不溶性基質に結合される。いくつかの実施形態では、ポリマーが不溶性基質に結合される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、この方法は、クリックケミストリーを用いて形成される結合の形成を生じる（例えば、ＷＯ２００６／１１５５４７に記載されるような）。いくつかの実施形態では、この方法は、アミド、ジスルフィド、スルフィド、エステル、ケタール、コハク酸塩、オキシム、カルバミン酸塩、炭酸塩、シリルエーテル、および／またはトリアゾールの形成を生じる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、この疎水性ポリマーは、約１ｍｇ／ｍｌ未満の水溶性を有する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、この核酸剤は、この核酸剤の２’、３’および／または５’末端を介して疎水性ポリマーに共有結合される。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、このポリマーに対して、その疎水性ポリマーの末端で共有結合される。いくつかの実施形態では、この疎水性ポリマーは、ヒドロキシルおよび／またはカルボン酸末端を有する。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、このポリマーに対して疎水性ポリマーの骨格上で共有結合される。いくつかの実施形態では、単一の核酸剤が単一の疎水性ポリマーに対して共有結合される。いくつかの実施形態では、複数の核酸剤が、各々、単一の疎水性ポリマーに対して共有結合される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、この方法は、複数の少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）の純度を有する核酸剤−疎水性ポリマーの複合体を生じる。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも約１００ｍｇの核酸剤−疎水性ポリマーの複合体（例えば、少なくとも約１ｇ）を生成する。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法によって作製される核酸剤−疎水性ポリマーの複合体を特徴とする。
【０１２４】
別の態様では、本発明は、親水性−疎水性ポリマーに対して共有結合される核酸剤、または親水性−疎水性ポリマーに対して共有結合される核酸と二重鎖（例えば、ヘテロ二重鎖）を形成する核酸剤を含んでおり、ここでこの親水性−疎水性ポリマーは、疎水性部分に結合された親水性部分を含む、核酸剤−親水性−疎水性ポリマーの複合体を特徴とする。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、この核酸剤は、親水性−疎水性ポリマーの親水性部分に結合される。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、この親水性−疎水性ポリマーの疎水性部分結合される。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、この親水性−疎水性ポリマーに対して、この核酸剤の２’、３’および／または５’末端を介して共有結合される。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、この親水性−疎水性ポリマーに対して、そのポリマーの末端で共有結合される。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、このポリマーに対して、親水性−疎水性ポリマーの骨格上で共有結合される。いくつかの実施形態では、単一の核酸剤は、単一の親水性−疎水性ポリマーに対して共有結合される。いくつかの実施形態では、複数の核酸剤は各々が、単一の親水性−疎水性ポリマーに対して共有結合される。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、この核酸剤は、疎水性−疎水性ポリマーの疎水性部分に対して、（例えば、エステルを介して）直接共有結合される（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、親水性−疎水性ポリマーの親水性部分に対して（例えば、エステルを介して）直接共有結合される（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、親水性−疎水性ポリマーに対して、リンカー（例えば、このポリマーの親水性部分、またはこのポリマーの疎水性部分）を介して結合される。
【０１２７】
例示的なリンカーとしては、クリックケミストリーを用いて形成される結合を含むリンカー（例えば、ＷＯ２００６／１１５５４７に記載されるような）、およびアミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、オキシム、カルバミン酸塩、炭酸塩、シリルエーテル、またはトリアゾールを含むリンカー（例えば、アミド、エステル、ジスルフィド、スルフィド、ケタール、コハク酸塩、またはトリアゾール）が挙げられる。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合のような官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で切断可能な結合のような複数の官能基を含む。いくつかの実施形態では、このリンカーとしては、官能基、例えば、リンカーの末端でこのリンカーを通じて連結される第一または第二の部分のいずれに対しても直接結合されないが、リンカーに対して内部である、本明細書に記載の結合または官能基が挙げられる。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下で加水分解性であるか、このリンカーは、生理学的条件下で酵素的に切断可能であるか、またはこのリンカーは、生理学的条件下で還元され得るジフルフィドを含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下では切断されず、例えば、このリンカーは、核酸剤が活性であるために切断される必要のない十分な長さであり、例えば、このリンカーの長さは、少なくとも約２０Å（例えば、少なくとも約２４Å）である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、この親水性−疎水性ポリマーは、以下の特性のうち１つ以上を有する：
ｉ）この親水性部分は、約１〜約６ｋＤａ（例えば、約２〜約６ｋＤａ）という重量平均分子量を有する、
ｉｉ）この疎水性ポリマーは、約４〜約１５ｋＤａ（例えば、約４〜約１２ｋＤａ、約６〜約１２ｋＤａ、または約８〜約１２ｋＤａ）という重量平均分子量を有する；
ｉｉｉ）この親水性ポリマーは、ＰＥＧである；
ｉｖ）この疎水性ポリマーは、第一種および第二種のモノマーサブユニットからできており、かつ核酸剤に結合される疎水性ポリマーにおける第一種のモノマーサブユニット対第二種モノマーサブユニットの比は、約２５：７５〜約７５：２５、例えば、約５０：５０である；
ｖ）疎水性ポリマーは、ＰＬＧＡである。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、親水性−疎水性ポリマーの親水性部分の重量平均分子量が、約１〜約３ｋＤａ、例えば、約２ｋＤａである場合、親水性部分の重量平均分子量の疎水性部分に対する重量平均分子量の比は、１：３〜１：７であり、親水性部分の重量平均分子量が、約４〜約６ｋＤａ、例えば、約５ｋＤａである場合、親水性部分の重量平均分子量の疎水性部分に対する重量平均分子量の比は、１：１〜１：４である。いくつかの実施形態では、この親水性部分は、約２〜約６ｋＤａという重量平均分子量を有し、かつ疎水性部分は、約８〜約１３ｋＤａという重量平均分子量を有する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、親水性−疎水性ポリマーの親水性部分は、メトキシで終わる。
【０１３１】
ある実施形態では、この核酸剤は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの混合ポリマーである。ある実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。ある実施形態では、ＤＮＡは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである。ある実施形態では、この核酸剤は、一本鎖であり、かつ別の実施形態では、これは２つの鎖を含む。ある実施形態では、この核酸剤は、１つまたは２つの分子由来の鎖からできている、二重鎖の領域を有し得る。ある実施形態では、この核酸剤は、遺伝子発現を阻害する剤、例えば、ＲＮＡｉを促進する剤である。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）からなる群より選択される。ある実施形態では、この核酸剤は、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）またはアプタマーである。
【０１３２】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される複数の核酸剤−親水性−疎水性ポリマーの複合体を含む組成物を特徴とする。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、この組成物は、反応混合物である。いくつかの実施形態では、この組成物は、薬学的組成物である。いくつかの実施形態では、この組成物は、実質的に非複合体型の核酸剤を含まない。いくつかの実施形態では、核酸剤−ポリマーの複合体上でこの核酸剤の少なくとも約５０％は完全なままである。いくつかの実施形態では、この組成物は実質的に、約１ｋＤａ未満の分子量を有する親水性−疎水性ポリマーを含まない。
【０１３４】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される核酸剤−親水性−疎水性ポリマーの複合体を作製する方法であって：
核酸剤およびポリマーを提供することと；
この核酸剤およびポリマーを、核酸剤のポリマーへの共有結合をもたらす条件に供することと；
を包含する、方法を特徴とする。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、この方法は、ある反応混合物中で行われる。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、単一の溶媒を含む。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、複数の溶媒を含んでいる溶媒系を含む。いくつかの実施形態では、この複数の溶媒は、混和性である。いくつかの実施形態では、この溶媒系は、水および極性の溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトン、ベンジルアルコール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、またはアセトニトリル）を含む。いくつかの実施形態では、この溶媒系は、水性緩衝液（例えば、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ＴＥ緩衝液、または２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ））を含む。いくつかの実施形態では、この溶媒系は、二相性（例えば、有機相および水相）である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、核酸剤またはポリマーのうちの少なくとも１つは、不溶性基質に結合される。いくつかの実施形態では、ポリマーが不溶性基質に結合される。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、この方法は、クリックケミストリーを用いて結合を形成することを包含する（例えば、ＷＯ２００６／１１５５４７に記載されるような）。いくつかの実施形態では、この方法は、アミド、ジスルフィド、スルフィド、エステル、オキシム、炭酸塩、カルバミン酸塩、シリルエーテル、および／またはトリアゾールの形成を生じる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、この親水性−疎水性ポリマーは、約５０ｍｇ／ｍｌ未満の水溶性を有する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、この核酸剤は、この核酸剤の２’、３’および／または５’末端を介して疎水性−親水性ポリマーに共有結合される。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、疎水性−親水性ポリマーに対して、そのポリマーの末端で共有結合される。いくつかの実施形態では、核酸剤は、この疎水性−親水性ポリマーに対して、そのポリマーの疎水性部分で共有結合される。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、疎水性−親水性ポリマーに対して、そのポリマーの疎水性部分で共有結合される。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、疎水性−親水性ポリマーに対して、そのポリマーの骨格で共有結合される。いくつかの実施形態では、単一の核酸剤は、単一の疎水性−親水性ポリマーに対して（例えば、親水性部分または疎水性部分に対して）共有結合される。いくつかの実施形態では、複数の核酸剤は各々が、単一の疎水性−親水性ポリマーに対して共有結合される。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、この方法は、複数の少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）の純度を有する核酸剤−親水性−疎水性ポリマーの複合体を生じる。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも約１００ｍｇの核酸剤−疎水性ポリマーの複合体（例えば、少なくとも約１ｇ）を生成する。
【０１４１】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法によって作製される核酸剤−親水性−疎水性ポリマーの複合体を特徴とする。
【０１４２】
別の態様では、本発明は、粒子であって、
複数の核酸剤−ポリマーの複合体と；
複数のカチオン性ポリマーまたは脂質と；
複数のポリマーまたは脂質であって、実質的に、複数の核酸剤−ポリマーの複合体を囲む、ポリマーまたは脂質と、
を含む粒子を特徴とする。いくつかの実施形態では、この粒子は自己集合される。
【０１４３】
別の態様では、本発明は、粒子を作製する方法であって：
ａ）複数の核酸剤−ポリマーの複合体を含んでいる粒子を形成することと；
ｂ）この粒子と複数のカチオン性の多価ポリマーまたは脂質とを接触させることと；
ｃ）ｂ）の生成物と複数のポリマーまたは脂質とを接触させることであって、ここで、この複数のポリマーまたは脂質が実質的にｂ）の生成物を取り囲んで粒子を形成することと；
を包含する、方法を特徴とする。
【０１４４】
別の態様では、本発明は、核酸剤、例えばｓｉＲＮＡ部分を含む粒子、例えば、ナノ粒子を作製する方法であって、極性の溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトン、ベンジルアルコール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、またはアセトニトリル）中で、粒子の形成を可能にする条件下で、例えば、沈殿によって、
（ａ）核酸剤−疎水性ポリマーの複合体であって、各々の核酸剤−疎水性ポリマーの複合体が、疎水性ポリマーに共有結合された、核酸剤、例えばｓｉＲＮＡ部分を含んでおり、ここで、カチオン性部分と会合される、核酸剤−疎水性ポリマーの複合体と、
（ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー、例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡと、
（ｃ）複数の疎水性ポリマー（核酸剤に対して共有結合されない）と、
を合わせ、それによって粒子を形成する、方法を特徴とする。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、この合わせることは、アセトンを含んでいる溶媒系で行われる。いくつかの実施形態では、この溶媒は、混合された溶媒系（例えば、水性／有機の溶媒系、例えば、アセトニトリルおよび水性の緩衝液系）である。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、この方法は：
（ｉ）複数の核酸剤であって、各々の核酸剤、例えば、アセトニトリル／ＴＥ緩衝液（例えば、約９０／１０〜約５０／５０重量％、例えば、約９０／１０〜約７０／３０重量％、例えば、約８０／２０重量％）中で、疎水性ポリマーとカップリングして、カチオン性部分と会合している、ｓｉＲＮＡまたは他の核酸剤；と
（ｉｉ）複数の親水性−疎水性ポリマー、例えば、アセトニトリル／ＴＥ緩衝液（例えば、約９０／１０〜約５０／５０重量％、例えば、約９０／１０〜約７０／３０重量％、例えば、約８０／２０重量％）中の、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ、および複数の疎水性ポリマー（核酸剤とカップリングしていない）と；
を合わせることを包含する。
【０１４７】
別の態様では、本発明は、ステップａ）の反応混合物、またはその組成物もしくは薬学的調製物を特徴とする。
【０１４８】
別の態様では、本発明は、ステップ（ｉ）の反応混合物またはその組成物もしくは薬学的調製物を特徴とする。
【０１４９】
別の態様では、本発明は、ステップ（ｉｉ）の反応混合物またはその組成物もしくは薬学的調製物を特徴とする。
【０１５０】
別の態様では、本発明は、上記のプロセスによって作製される粒子を特徴とする。
【０１５１】
別の態様では、本発明は、上記のプロセスによって作製される粒子を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を特徴とする。
【０１５２】
別の態様では、本発明は、水溶性の核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡ部分、疎水性−親水性ポリマー、および疎水性ポリマーを含む、粒子、例えばナノ粒子を作製する方法であって、
ａ）例えば、水性溶媒中で、
ｉ）第一の複数の疎水性−親水性ポリマー、例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡと、
ｉｉ）第一の複数の疎水性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡであって、各々が、第一の反応性部分、例えば、スルフヒドリル部分を有するポリマーと；
を接触させて、水溶性の中間粒子を形成することと；
ｂ）例えば、水性溶媒中でこの中間粒子と、複数の水溶性の核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡ部分であって、各々が、第二の反応性部分、例えば、ＳＨ部分を有する核酸剤とを、中間複合体（例えば、約１００ｎｍ未満の直径を有する）、例えば、核酸剤にカップリングされた、親水性−疎水性ポリマーおよび疎水性ポリマーを含む中間構造の形成を可能にする条件下で接触させることと；
ｃ）例えば、非水性の溶媒、例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトン、ベンジルアルコール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、またはアセトニトリル中で、中間複合体と、第二の複数の親水性−疎水性ポリマー、例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ、および第二の複数の疎水性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡとを、粒子の形成を可能にする条件下で接触させることと；
を包含し、
これによって粒子を形成する方法を特徴とする。
【０１５３】
別の態様では、本発明は、粒子、例えば、ナノ粒子を形成する方法であって、
ａ）例えば、アセトニトリル／ＴＥ緩衝液（例えば、約９０／１０〜約５０／５０重量％、例えば、約９０／１０〜約７０／３０重量％、例えば、約８０／２０重量％）中で
ｉ）第一の複数の親水性−疎水性ポリマー、例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡと、
ｉｉ）第一の複数の疎水性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡ（各々が、第一の反応性部分、例えば、スルフヒドリル部分を有する）と；を接触させて、
中間粒子（例えば、約１００ｎｍ未満の直径を有する）を形成し、いくつかの実施形態では、この中間粒子が、例えば、水溶液中で可溶性であるように十分な親水性部分を有することに起因して、水溶液中で機能的に可溶性であることと；
ｂ）例えば、アセトニトリル／ＴＥ緩衝液（例えば、約９０／１０〜約５０／５０重量％、例えば、約９０／１０〜約７０／３０重量％、例えば、約８０／２０重量％）中で、中間粒子と、複数の薬物部分、例えば、ｓｉＲＮＡまたは他の核酸薬物部分（各々が、第二の反応性部分、例えば、ＳＨ部分を有する）とを、中間複合体（例えば、薬物部分にカップリングされた、親水性−疎水性ポリマーおよび疎水性ポリマーを含んでいる中間構造）の形成を可能にする条件下で接触させることと；
ｃ）例えば、アセトニトリル／ＴＥ緩衝液（例えば、約９０／１０〜約５０／５０重量％、例えば、約９０／１０〜約７０／３０重量％、例えば、約８０／２０重量％）中で、中間複合体と、第二の複数の親水性−疎水性ポリマー、例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ、および第二の複数の疎水性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡとを、粒子の形成を可能にする条件下で接触させることと、
を包含し、これによって粒子を形成する方法を特徴とする。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、この中間粒子ａ）の直径は、１００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、この粒子の直径は、１５０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、疎水性ポリマーに対して共有結合される複数のカチオン性部分が、ステップｂ）において加えられる。
【０１５５】
別の態様では、本発明は、ステップａ）の反応混合物、またはその組成物もしくは薬学的調製物を特徴とする。
【０１５６】
別の態様では、本発明は、ステップｂ）の反応混合物、またはその組成物もしくは薬学的調製物を特徴とする。
【０１５７】
別の態様では、本発明は、上記のプロセスによって作製される粒子を特徴とする。
【０１５８】
別の態様では、本発明は、上記のプロセスによって作製される粒子を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を特徴とする。
【０１５９】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される組成物（例えば、薬学的組成物）であって、対象に投与された場合、対象に対して、粒子または複合体以外の処方物（すなわち、粒子中でなく、例えば、粒子中に封入されることもなく、ポリマーに複合体されることもない、例えば、本明細書に記載される粒子）中で投与される核酸剤でみられる標的遺伝子の発現の減少、または核酸剤もしくは他の治療剤の投与もなしで見られる標的遺伝子の発現よりも、少なくとも１０、２０、５０、７５、８０、９０、１００、２００、または５００％大きい標的遺伝子の発現の減少を生じる組成物を特徴とする。
【０１６０】
ある実施形態では、この核酸剤は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの混合ポリマーである。ある実施形態ではＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。ある実施形態では、ＤＮＡは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである。ある実施形態では、この核酸剤は、一本鎖であって、別の実施形態では、この核酸剤は２つの鎖を含む。ある実施形態では、この核酸剤は、１つまたは２つの分子由来の鎖から構成される二重鎖の領域を有し得る。ある実施形態では、この核酸剤は、遺伝子発現を阻害する剤、例えば、ＲＮＡｉを促進する剤である。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）からなる群より選択される。ある実施形態では、この核酸剤は、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）またはアプタマーである。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、この減少とは、組成物または単独核酸剤で処理されていない対照試料に比べての減少である。いくつかの実施形態では、この組成物および核酸剤（単独投与）は、同じ条件下で投与される。いくつかの実施形態では、対象に投与されるこの粒子組成物中の核酸剤の量は、例えば、分子の重量または数に関して、単独投与の核酸剤の量と同じである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰまたはＲＦＰである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、標識、例えば、蛍光部分、例えば、ＧＦＰまたはＲＦＰを含む融合タンパク質をコードする融合遺伝子である。いくつかの実施形態では、この減少は、ある用量の組成物または単独の核酸剤投与の１分、１０分、６０分、２時間、１２時間、２４時間、２日または７日後に測定される。いくつかの実施形態では、この対象は、マウス、ラット、イヌまたはヒトのいずれかである。いくつかの実施形態では、この対象は、マウスであり、標的遺伝子はＧＦＰであり、このＧＦＰは、マウスに移植されたＨｅＬａ細胞中で発現される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、マウスに移植されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＧＦＰまたはＭＤＡ−ＭＢ−４６８  ＧＦＰ細胞中で発現される。
【０１６２】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される組成物（例えば、薬学的組成物）であって、培養細胞と接触された場合、対象に対して核酸剤（これは、ＤＮＡ剤、ＲＮＡ剤、例えば、ＲＮＡｉを促進する剤、またはマイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、アプタマー、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはプラスミドであり得る）を単独投与される場合にみられる減少よりも少なくとも１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、６０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００％大きい標的遺伝子の発現の減少を生じる、組成物を特徴とする。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、この減少とは、組成物または単独核酸剤で処理されていない対照試料に比べての減少である。いくつかの実施形態では、この組成物および核酸剤（単独投与）は、同様の条件下で投与される。いくつかの実施形態では、培養細胞と接触される粒子組成物中の核酸剤の量は、例えば、分子の重量または数に関して、単独で接触される量と同じである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰまたはＲＦＰである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、標識、例えば、蛍光部分、例えば、ＧＦＰまたはＲＦＰを含む融合タンパク質をコードする融合遺伝子である。いくつかの実施形態では、この減少は、培養された細胞との接触の１０分、６０分、２時間、１２時間、２４時間、２日または７日後に測定される。いくつかの実施形態では、この培養細胞は、ＨｅＬａ細胞である。いくつかの実施形態では、この培養された細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＧＦＰまたはＭＤＡ−ＭＢ−４６８  ＧＦＰ細胞である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、ＧＦＰであり、標的遺伝子発現の減少は、組成物のアリコートと、ＧＦＰでトランスフェクトされた培養されたＨｅＬＡ細胞とを接触させること、単独の核酸剤のアリコートとＧＦＰでトランスフェクトされた培養されたＨｅＬＡ細胞とを接触させること、および各々においてＧＦＰ活性のレベルを評価することによって決定される。
【０１６４】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される組成物（例えば、薬学的組成物）であって、血清、または細胞溶解液中でインキュベートされ、次いで培養された細胞と接触された場合、粒子の対照組成物、例えば、血清または細胞溶解液とインキュベートされていない、例えば、生理学的ｐＨの緩衝液中の条件でそれ以外は同様の条件下でインキュベートされた、培養細胞と接触された場合、標的遺伝子の発現を低下する組成物の能力の少なくとも１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、６０、８０、９０、または１００％を保持する組成物を特徴とする。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、この減少とは、組成物または単独の核酸剤で処理されていない対照試料に比較した減少である。いくつかの実施形態では、血清または細胞溶解液中のインキュベーションは、１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、５時間、２４時間、２日、３日、５日、または１０日である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰまたはＲＦＰである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、標識、例えば、蛍光部分、例えば、ＧＦＰまたはＲＦＰを含む融合タンパク質をコードする融合遺伝子である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、ＧＦＰであり、標的遺伝子発現の減少は、組成物のアリコートとＧＦＰでトランスフェクトされた培養されたＨｅＬＡ細胞とを接触すること、単独の核酸剤のアリコートと、ＧＦＰでトランスフェクトされた培養されたＨｅＬＡ細胞とを接触させること、および各々におけるＧＦＰ活性のレベルを評価することによって決定される。いくつかの実施形態では、組成物および核酸剤（これは、ＤＮＡ剤、ＲＮＡ剤、例えば、ａｎＲＮＡｉを促進する剤、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、アプタマー、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはプラスミドであってもよい）（単独投与）は、同様の条件下で細胞と接触される。いくつかの実施形態では、培養された細胞と接触された粒子組成物中の核酸剤の量は、例えば、分子の重量または数に関して、単独で接触される量と同じである。いくつかの実施形態では、この培養された細胞は、ＨｅＬａ細胞である。いくつかの実施形態では、この培養された細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＧＦＰまたはＭＤＡ−ＭＢ−４６８  ＧＦＰ細胞である。
【０１６６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される組成物（例えば、薬学的組成物）であって、血清中でインキュベートされ、次いで培養された細胞と接触される場合、以下の特性のうちの少なくとも１つを有する、組成物を特徴とする：
ａ）粒子の対照組成物、例えば、血清とインキュベートされていない、例えば、生理学的ｐＨの緩衝液中でそれ以外は同様の条件下でインキュベートされ、培養された細胞と接触された場合、標的遺伝子の発現を低下する、組成物の能力の少なくとも１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、６０、８０、９０もしくは１００％を保持するか；または
ｂ）粒子の対照組成物、例えば、血清とインキュベートされていない、例えば、生理学的ｐＨの緩衝液中でそれ以外は同様の条件下でインキュベートされ、完全なままの核酸剤を放出する、組成物の能力の少なくとも１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、６０、８０、９０もしくは１００％を保持する。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、血清中のインキュベーションは、１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、５時間、２４時間、２日、３日、５日または１０日である。いくつかの実施形態では、粒子または複合体（すなわち、粒子中でなく、例えば、粒子中に封入されることもなく、本明細書に記載される粒子中でポリマーに複合体されることもない）以外の処方物中で投与される組成物および核酸剤は、細胞と同様の条件下で接触される。いくつかの実施形態では、培養された細胞と接触された粒子組成物中の核酸剤の量は、例えば、分子の重量または数に関して、単独での接触の量と同じである。ある実施形態では、この核酸剤は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの混合ポリマーである。ある実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。ある実施形態では、ＤＮＡは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである。ある実施形態では、この核酸剤は、一本鎖であり、別の実施形態ではこの核酸剤は２つの鎖を含む。ある実施形態では、この核酸剤は、１つまたは２つの分子由来の鎖から構成される二重鎖の領域を有し得る。ある実施形態では、この核酸剤は、遺伝子発現を阻害する剤、例えば、ＲＮＡｉを促進する剤である。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）からなる群より選択される。ある実施形態では、この核酸剤は、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）またはアプタマーである。
【０１６８】
別の態様では、本発明は、複合体、粒子または組成物を保管する方法であって：
この複合体、粒子または組成物を、容器、例えば、気密または液密の容器、例えば、本明細書に記載される容器、例えば、不活性ガス、例えば、アルゴンまたは窒素を頭部空間に充填されている容器中に入れて提供することと；
この複合体、粒子または組成物を、例えば、事前に選択された条件下で、例えば、温度、例えば、本明細書に記載される温度で保管することと；
この容器を第二の位置に移動するか、またはこの容器から、この複合体、粒子または組成物の全てもしくはアリコートを取り出すことと；
を包含する、方法を特徴とする。
【０１６９】
ある実施形態では、この複合体、粒子または組成物は、例えば、核酸剤の安定性または活性、物理的特性、例えば、色、凝集、流れるかもしくは注がれる能力、または粒子のサイズもしくは電荷を評価される。この評価は、標準に対して比較されてもよく、必要に応じて、この標準の複合体、粒子または組成物に対する応答は、分類される。
【０１７０】
ある実施形態では、複合体、粒子または組成物は、再構成された処方物として保管される（例えば、液体中に、溶液または懸濁物として）。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｃは、本明細書に記載される部分に結合し得る例示的なリンカーを記載する。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｃは、本明細書に記載される部分に結合し得る例示的なリンカーを記載する。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｃは、本明細書に記載される部分に結合し得る例示的なリンカーを記載する。
【図２】消化アッセイの結果を示すゲルであって、ここでは、その中に封入される（非複合体型の）ｓｉＲＮＡを含有する粒子をＲＮＡｓｅで処理した。
【図３】消化アッセイの結果を示すゲルであって、ここでは、ポリマーに複合体されたｓｉＲＮＡを含有する粒子をＲＮＡｓｅで処理した。
【図４】異種マウスにおいて、ＥＧＦＰを発現するように操作したヒト乳房腫瘍細胞における標的（ＥＧＦＰ）ｍＲＮＡの特異的な切断を示すゲルであり、その異種マウスをインビボで、ｓｉＥＧＦＰ粒子を用いて処置した場合のものである。このゲルは、処置した異種マウス由来の腫瘍のＲＮＡ抽出物において５’ＲＬＭ  ＲＡＣＥ−ＰＣＲによって生成された切断特異的増幅生成物のレベルを示す。
【図５】実施例６１ａおよび実施例３２ａに従って調製した粒子に曝したヒトの全血試料中のＣ３ａおよびＢｂ濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１７２】
詳細な説明
本発明は、その適用において、以下の詳細な説明に示されるか、または図面に例示される、構築物および構成要素の配置の詳細に限定されない。本発明は、種々の方法で、他の実施形態であってもよく、かつ実施されるかまたは遂行されてもよい。本明細書で用いられる語法および用語はまた、説明目的のためであり、限定するとしてみなされるべきではない。本明細書における「〜を含むこと、〜を包含すること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含むこと、〜を備えること（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「〜を有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「〜を包含すること（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」およびそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目およびそれらの等価物、ならびに追加的な項目を包含することを意図する。
【０１７３】
粒子、複合体（例えば、核酸剤−ポリマーの複合体）および組成物が本明細書に記載される。また、複合体、粒子、および組成物を含む剤形；（例えば、障害を治療するために）この複合体、粒子、および組成物を用いる方法；この複合体、粒子、および組成物を備えるキット；この複合体、粒子、および組成物を製造する方法；この複合体、粒子、および組成物を保管する方法；ならびに粒子およびこの粒子を含む組成物を分析する方法も開示される。
【０１７４】
見出し、および他の識別子、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などは、単に本明細書および特許請求の範囲を読むことを容易にするために示す。本明細書または特許請求の範囲における見出しまたは他の識別子の使用は、このステップまたは要素が、アルファベット順、または数字順、または示される順序で行われることを必要とはしない。
【０１７５】
定義
本明細書で使用する場合、「大気条件」という用語は、別段示さない限り、約１大気圧、５０％の相対湿度、および約２５℃の周囲条件を指す。
【０１７６】
第一部分の第二部分に対する関係、例えば、ポリマーに対する薬剤の結合に関して本明細書で用いる場合、「結合する」という用語は、第一部分と第二部分の間の共有結合の形成を指す。同じ文脈で、「結合」という名詞は、第一部分と第二部分の間の共有結合を指す。例えば、ポリマーに結合された核酸剤は、ポリマー（例えば、本明細書に記載される疎水性ポリマー）に共有結合された治療剤、この場合は核酸剤である。結合は、例えば、第一部分の第二部分への直接的な結合を通じての直接的な結合であってもよく、またはリンカーを通じてであってもよい（例えば、第一部分と第二部分の間に配置される１つ以上の原子の共有結合鎖を通じて）。例えば、リンカーを通じて結合する場合、第一部分（例えば、薬剤）は、リンカーに共有結合し、次にこのリンカーが第二部分（例えば、本明細書に記載される疎水性ポリマー）に共有結合される。
【０１７７】
「生分解性」という用語は、使用中に分解することを意図している本明細書で記載のような、ポリマー、組成物、および処方物を包含する。生分解性ポリマーは典型的には、これが使用中に分解し得る点で、非性分解性ポリマーとは異なる。特定の実施形態において、このような使用は、インビボ治療法などのインビボでの用途を包含し、他のある実施形態において、このような用途はインビトロでの用途を包含する。一般に、生分解性に起因する分解は、生分解性ポリマーの、その構成要素サブユニットへの分解、またはポリマーのより小さな非ポリマーサブユニットへの、例えば生化学的プロセスによる消化を包含する。特定の実施形態において、２つの異なる種類の生分解が一般に特定され得る。例えば、１種類の生分解は、ポリマー骨格における結合（共有結合であろうと他の結合であろうと）の切断が関与し得る。このような生分解において、モノマーおよびオリゴマーが典型的には結果として生じ、さらにより典型的には、このような生分解は、ポリマーのサブユニットの１つ以上を結合する結合の切断によって生じる。対照的に、別の種類の生分解は、側鎖に対して内部の、または側鎖をポリマー骨格に結合する結合（共有結合であろうと他の結合であろうと）の切断と関与し得る。特定の実施形態では、その生分解の１つもしくは他方、またはその両方の一般的な種類が、ポリマーの使用の間に生じ得る。
【０１７８】
本明細書で使用する場合、「生分解」という用語は、上記の生分解の両方の一般的な種類を包含する。生分解ポリマーの分解速度は、任意の分解に寄与する連結の化学的性質が何であるか、このようなポリマーの分子量、結晶化度、生体安定性（ｂｉｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、および架橋度、ポリマーの物理的特徴（例えば、形状および大きさ）、ポリマーもしくは粒子の集合、ならびに投与の様式および位置を含む、種々の因子に一部は依存する場合が多い。例えば、より大きな分子量、より高い結晶化度、および／またはより大きな生体安定性は通常、より遅い生分解をもたらす。
【０１７９】
「カチオン性部分」という用語は、ｐＫａ５以上（例えば、５以上のｐＫａを有するルイス塩基）および／または以下の条件のうちの少なくとも１つの陽性電荷を有する部分を指す：本明細書に記載される粒子の生成の間、本明細書に記載される粒子に処方されたとき、またはその後の対象に対して本明細書に記載の粒子の投与、例えば、対象における循環の間、および／またはエンドソームにおける循環の間。例示的なカチオン性部分としては、アミン含有部分（例えば、荷電されたアミン部分、例えば、四級アミン）、グアニジン含有部分（例えば、荷電されたグアニジン、例えば、グアニジニウム部分）、および複素環式および／または複素環式芳香族部分（例えば、荷電部分、例えば、ピリジニウムまたはヒスチジン部分）が挙げられる。カチオン性部分としては、ポリマー種、例えば、２つ以上の電荷を有する部分（例えば、ある部分（例えば、カチオン性ＰＶＡおよび／またはポリアミン）の反復する存在によって寄与される）が挙げられる。カチオン性部分としてはまた、陽性荷電および陰性荷電の両方を有する化合物（例えば、アミノ酸、例えば、アルギニン、リジン、またはヒスチジン）を意味する双性イオンを包含する。
【０１８０】
「カチオン性ポリマー」という用語、例えば、ポリアミンは、本明細書に記載される粒子に処方された場合、複数の正の電荷（すなわち、少なくとも２）を有するポリマー（ポリマーという用語は、本明細書で下に記載される）を指す。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマー、例えば、ポリアミンは、少なくとも３、４、５、１０、１５、または２０の正の電荷を有する。
【０１８１】
「生理学的条件下で切断可能」という句は、生理学的な条件に供された場合、約５０または１００時間未満の半減期を有する結合を指す。例えば、酵素分解は、生理学的条件（例えば、約４〜約８のｐＨ、および約２５℃〜約３７℃の温度を有する水溶液）に対する暴露の際、約５年、１年、６カ月、３カ月、１カ月、１５日、５日、３日、または１日未満の期間にわたって生じ得る。
【０１８２】
「有効量」または「有効な量」とは、細胞を治療し、または障害の症状を治癒させ、緩和させ、軽減し、または改善する上での対象への単回または複数回の用量の投与の際に有効なポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物の量を指す。組成物の有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体における所望の応答を誘発させる化合物の能力などの要因に応じて変動し得る。有効量とはまた、組成物の任意の毒性のまたは有害な効果を、治療的に有益な効果が上回るものでもある。
【０１８３】
本明細書で使用する場合、用語「封入する」は、第一部分と第二部分との、例えば、核酸剤またはカチオン性部分とポリマーとの間の非共有結合性の相互作用の形成による、第二の部分とのまたは第二の部分内の第一部分の配置を指す。いくつかの実施形態では、粒子内に封入された部分を指す場合、その部分（例えば、核酸剤またはカチオン性部分）は、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、水素結合、双極子間相互作用、イオン相互作用、およびπスタッキング（ｐｉ  ｓｔａｃｋｉｎｇ）などの１つ以上の非共有結合性相互作用を通じてポリマーまたは粒子の他の成分と結合し、この部分とポリマーまたは粒子の他の成分との間の共有結合は、存在しない。封入された部分は、これが封入されるポリマーまたは粒子によって完全にまたは部分的に取り囲まれ得る。
【０１８４】
本明細書で用いる場合、「疎水性」という用語は、生理学的イオン強度で水溶液に約０．０５ｍｇ／ｍＬ未満（好ましくは約０．０１ｍｇ／ｍＬ以下）の程度までしか溶解することのできない部分を指す。
【０１８５】
本明細書で用いる場合、「親水性」という用語は、生理学的なイオン強度で水溶液において少なくとも約０．０５ｍｇ／ｍＬ以上の溶解度を有する部分を指す。
【０１８６】
本明細書で用いる場合、「親水性−疎水性ポリマー」という用語は、疎水性部分に対して結合された親水性部分を含むポリマーを指す。例示的な親水性−疎水性ポリマーとしては、例えば、親水性ポリマーおよび疎水性ポリマーのブロック−コポリマーが挙げられる。
【０１８７】
本明細書で用いる場合、「ヒドロキシ保護基」は、当該分野で周知であり、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，第３版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９において詳細に説明されたものを含む。好適なヒドロキシ保護基としては、例えば、アシル（例えば、アセチル）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）、およびカルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）が挙げられる。
【０１８８】
本明細書において用いる場合、「完全なまま」という用語は、核酸剤が、その標的遺伝子を効果的にサイレンシングするのに必要な構造の十分量を保持することを意味する。標的遺伝子は、その発現が、完全なままの核酸剤と接触された場合、少なくとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または少なくとも１０％まで減少される場合に、「効果的にサイレンシングされている」。典型的には、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡの完全なままの調製では、核酸剤分子のうち少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または全てが、完全なままの核酸剤分子の同じ分子量または長さを有する。
【０１８９】
本明細書で用いる場合、「不活性雰囲気」とは、本明細書に記載されるポリマー−薬剤の複合体、粒子、組成物、または混合物と化学的に反応しない不活性ガスから主として構成される雰囲気を指す。不活性ガスの例は、窒素（Ｎ２）、ヘリウム、およびアルゴンである。
【０１９０】
本明細書で用いる場合、「リンカー」とは、２つ以上の部分（例えば、核酸剤またはカチオン性部分およびポリマー、例えば、疎水性または親水性−疎水性または親水性のポリマー）を一緒に接続する部分である。リンカーは少なくとも２つの官能基を有する。例えば、２つの官能基を有するリンカーは、核酸剤、カチオン性部分、疎水性部分（例えば、本明細書に記載のポリマーまたは親水性−疎水性ポリマー）のような部分の上の官能基と反応し得る第一の官能基と、本明細書に記載の核酸剤のような第二の部分上の官能基と反応し得る第二の官能基とを有し得る。
【０１９１】
リンカーは、３つ以上の官能基（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの官能基）を有してもよく、この官能基は、例えば複数の剤をポリマーに連結するように、またはリンカー内の生体切断性（ｂｉｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）部分を提供するように、用いられ得る。いくつかの実施形態では、例えば、リンカーが、３つ以上の官能基を有し、例えば、このリンカーは、第一の部分を第二の部分に接続する２つの官能基に加えて、官能基を含み、この追加の官能基（例えば、第三の官能基）は、第一の基と第二の基との間に位置してもよく、いくつかの実施形態では、例えば、生理学的条件下で切断され得る。例えば、リンカーは、
【０１９２】
【化１−１】
2013541506.tif 000003
の形態であってもよく、式中、ｆ１は、第一の官能基、例えば、核酸剤、カチオン性部分、疎水性部分（例えば、本明細書に記載のポリマーまたは親水性−疎水性ポリマー）のような部分の上の官能基と反応し得る官能基であり、ｆ２は、第二の官能基、例えば、本明細書に記載の核酸剤のような第二の部分上の官能基と反応し得る官能基であり；ｆ３は、生体切断性官能基、例えば、本明細書に記載される生体切断性の結合であり、
【化１−２】
2013541506.tif 000004
は、官能基、例えば、アルキレン（二価のアルキル）基を接続するスペーサーであり、ここで必要に応じて、アルキレンリンカーの１つ以上の炭素原子が、１つ以上のヘテロ原子（例えば、以下の基のうちの１つ以上を生じる：チオエーテル、アミノ、エステル、エーテル、ケト、アミド、シリルエーテル、オキシム、カルバミン酸塩、炭酸塩、ジスルフィド、複素環式、または複素環式芳香族）で置換されている。文脈に応じて、リンカーとは、第一の部分もしくは第二の部分（例えば、核酸剤もしくはポリマー）のいずれかへの結合の前のリンカー部分、１つの部分へ結合した後だが、第二の部分への結合の前のリンカー部分、または第一および第二の部分の両方に結合した後に存在するリンカーの残基を指してもよい。
【０１９３】
本明細書で用いる場合、「凍結保護剤」という用語は、凍結乾燥した調製物中に存在する物質を指す。典型的には、凍結保護剤は、凍結乾燥加工前に存在し、結果として生じる凍結乾燥した調製物において持続する。典型的には、凍結保護剤は、粒子の形成後に添加される。例えば、粒子の形成と凍結乾燥との間に、濃縮ステップが存在する場合、凍結保護剤は、この濃縮ステップの前に添加されても後に添加されてもよい。凍結保護剤は、凍結乾燥中に、粒子を保護するために、例えば、凝集、粒子の崩壊、および／または他の種類の損傷を低減または防止するために、用いられてもよい。ある実施形態では、凍結保護剤は、抗凍結剤である。
【０１９４】
ある実施形態では、凍結保護剤は、炭水化物である。本明細書で用いる場合、「炭水化物」という用語は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類を指し、かつ包含する。
【０１９５】
ある実施形態では、凍結保護剤は単糖である。本明細書で用いる場合、「単糖」という用語は、より単純な炭水化物単位へと加水分解できない単一の炭水化物単位（例えば、単純な糖）を指す。例示的な単糖凍結保護剤としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、リボースなどが挙げられる。
【０１９６】
ある実施形態では、凍結保護剤は、二糖である。本明細書で用いる場合、「二糖」という用語は、グリコシド連鎖を通じて、例えば、１〜４の連鎖または１〜６の連鎖を通じて結合した２個の単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指す。二糖は、２つの単糖類へと加水分解され得る。例示的な二糖凍結保護剤としては、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトースなどが挙げられる。
【０１９７】
ある実施形態では、凍結保護剤は、オリゴ糖である。本明細書で用いる場合、「オリゴ糖」という用語は、グリコシド連鎖を通じて、例えば１〜４の連鎖または１〜６の連鎖を通じて互いに結合されて、直鎖の、分岐鎖の、または環状の構造を形成する３〜約１５の、好ましくは３〜約１０の単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指す。例示的なオリゴ糖凍結保護剤としては、シクロデキストリン、ラフィノース、メレチトース、マルトトリオース、スタキオースアカルボース、などが挙げられる。オリゴ糖は、酸化されてもよいし、または還元されてもよい。
【０１９８】
ある実施形態では、凍結保護剤は、環状オリゴ糖である。本明細書で用いる場合、「環状オリゴ糖」という用語は、グリコシド連鎖を通じて、例えば、１〜４の連鎖、または１〜６の連鎖を通じて、互いに結合されて環状構造を形成する３〜約１５、好ましくは６、７、８、９、または１０の単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指す。例示的な環状オリゴ糖凍結保護剤としては、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、またはγシクロデキストリンなどの別々の化合物である環状オリゴ糖類が挙げられる。
【０１９９】
他の例示的な環状オリゴ糖凍結保護剤としては、環状オリゴ糖部分を含むポリマーなど、より大きな分子構造におけるシクロデキストリン部分を含む化合物が挙げられる。環状オリゴ糖は、酸化されても、または還元されてもよく、例えば酸化されてジカルボニルの形態となってもよい。本明細書で用いる場合、「シクロデキストリン部分」という用語は、ポリマーなど、より大きな分子構造へと組み込まれた、またはその一部であるシクロデキストリン（例えば、α、β、またはγシクロデキストリン）基を指す。シクロデキストリン部分は、直接的にまたは任意のリンカーを通じて１つ以上の他の部分に結合することができる。シクロデキストリン部分は、酸化されてもまたは還元されてもよく、例えば、酸化されてジカルボニルの形態となってもよい。
【０２００】
炭水化物の凍結保護剤、例えば、環状オリゴ糖凍結保護剤は、誘導体化された炭水化物であってもよい。例えば、ある実施形態では、凍結保護剤は、誘導体化された環状オリゴ糖、例えば、誘導体化されたシクロデキストリン、例えば、２ヒドロキシプロピル−βシクロデキストリン、例えば、その内容が参照により本明細書に援用されている米国特許第６，４０７，０７９号において開示される、部分的にエーテル化したシクロデキストリン（例えば、部分的にエーテル化したβシクロデキストリン）である。誘導体化されたシクロデキストリンの別の例は、β−シクロデキストリンスルホブチルエーテルナトリウムである。
【０２０１】
例示的な凍結保護剤は、多糖である。本明細書で用いる場合、「多糖」という用語は、グリコシド連鎖を通じて、例えば、１〜４の連鎖、または１〜６の連鎖を通じて互いに結合されて、直鎖の、分岐鎖の、または環状の構造を形成し、その骨格構造の一部として多糖類を含むポリマーを包含する少なくとも１６の単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指す。骨格において、多糖は、直鎖であってもまたは環状であってもよい。例示的な多糖保護剤としては、グリコーゲン、アミラーゼ、セルロース、デキストラン、マルトデキストリンなどが挙げられる。
【０２０２】
「誘導体化された炭水化物」という用語は、該当の誘導体化していない炭水化物とは少なくとも１つの原子が異なる実体を指す。例えば、誘導体化していない炭水化物に存在する−ＯＨの替わりに、誘導体化された炭水化物は−ＯＸを有してもよく、この式中で、ＸはＨ以外である。誘導体は、化学的機能化および／または置換を通じて、あるいは新規合成を通じて得てもよく、「誘導体」という用語は、過程に基づく限定を意味することはない。
【０２０３】
「ナノ粒子」という用語は、任意の1つの寸法の大きさ（例えば、ｘ、ｙ、およびｚのデカルト寸法）が約１マイクロメーター（ミクロン）未満、例えば、約５００ｎｍ未満、または約２００ｎｍ未満、または約１００ｎｍ未満、かつ約５ｎｍ超である材料の構造を指すために本明細書で用いられる。ある実施形態では、この大きさは、７０ｎｍ未満であるが、約２０ｎｍよりは大きい。ナノ粒子は、種々の幾何学的形状、例えば、球状、楕円体などを有することができる。「ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」という用語は、「ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）」という用語の複数形として用いられる。
【０２０４】
「核酸剤」という用語は、２つ以上のヌクレオチド残基を含む、任意の合成または天然に存在する治療剤を指す。ある実施形態では、この核酸剤は、ＲＮＡ，ＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの混合ポリマーである。一実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。ある実施形態では、ＤＮＡはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである。ある実施形態では、この核酸剤は、一本鎖であり、別の実施形態ではこの核酸剤は２つの鎖を含む。ある実施形態では、この核酸剤は、１つまたは２つの分子由来の鎖から構成される二重鎖の領域を有し得る。ある実施形態では、この核酸剤は、遺伝子発現を阻害する剤、例えば、ＲＮＡｉを促進する剤である。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。ある実施形態では、この核酸剤は、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）またはアプタマーである。
【０２０５】
本明細書で用いる場合、「粒子多分散指数（ＰＤＩ）」または「粒子多分散性」とは、粒子の大きさの分布の幅を指す。粒子のＰＤＩは、ＰＤＩ＝２ａ２／ａ１２の等式から算出することができ、式中、ａ１は、強度により加重されたＺ平均サイズを算出するために用いられる第一の累積率またはモーメントであり、ａ２は、多分散指数（ＰｄＩ）として定義されるパラメータを算出するために用いられる第二のモーメントである。１の粒子ＰＤＩは、理論的最大値であり、完全に平らなサイズ分布プロットであろう。本明細書で説明される粒子の組成物は、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、または０．１未満という粒子ＰＤＩを有し得る。
【０２０６】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体またはアジュバント」とは、本明細書で説明されたポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物とともに患者に投与され得、その薬理学的活性を破壊せず、治療量の粒子を送達するのに十分な用量で投与される場合に非毒性である担体またはアジュバントを指す。薬学的に受容可能な担体として機能することのできる材料のいくつかの例としては、以下が挙げられる：（１）ラクトース、グルコース、マンニトール、およびスクロースなどの糖類；（２）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；（４）トラガカント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）滑石；（８）ココアバターおよび坐剤用ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質非含有水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；ならびに（２１）薬学的組成物において採用される他の非毒性適合性物質。
【０２０７】
本明細書で用いる場合、「ポリマー」という用語は、当該分野で使用される通常の意味、すなわち、共有結合によって接続される１つ以上の反復単位（モノマー）を特徴とする分子構造という意味を与えられる。反復ユニットは、すべて同一であり得、またはいくつかの場合、ポリマー内に存在する２種類以上の反復単位であり得る。ポリマーは、天然であっても、または天然でない（合成の）ポリマーであってもよい。ポリマーは、２つ以上のモノマーを含んでいるホモポリマーであっても、またはコポリマーであってもよい。ポリマーは直鎖であっても、または分岐されてもよい。
【０２０８】
２種以上の反復単位がポリマー内に存在するならば、このポリマーはいわば「コポリマー」である。ポリマーを使用する任意の実施形態において、採用されるポリマーはコポリマーであってもよいことが理解されるべきである。コポリマーを形成する反復単位は、任意の様式で配置され得る。例えば、反復単位は、無作為な順序で、交互の順序で、または「ブロック」コポリマーとして、すなわち、第一の反復単位（例えば、第一のブロック）を各々含む１つ以上の領域、および第二の反復単位（例えば第二のブロック）を各々含む１つ以上の領域、などを含んで配置されてもよい。ブロックコポリマーは、２個（ジブロックコポリマー）、３個（トリブロックコポリマー）、またはそれより多数の別個のブロックを有してもよい。配列の点で、コポリマーは、無作為、ブロックであってもよく、または無作為およびブロックの配列の組み合わせを含んでもよい。
【０２０９】
いくつかの場合、ポリマーは、生物から得られ、すなわち、生体高分子である。生体高分子に関する非限定的な例としては、ペプチドもしくはタンパク質（すなわち、種々のアミノ酸のポリマー）またはＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸が挙げられる。
【０２１０】
本明細書で用いる場合、「ポリマー多分散指数（ＰＤＩ）」または「ポリマー多分散性」とは、所与のポリマー試料における分子質量の分布を指す。算出されたポリマーＰＤＩは、重量平均分子量を数平均分子量で割ったものである。ポリマーＰＤＩは、ポリマーのバッチにおける個々の分子質量の分布を示す。ポリマーＰＤＩは、典型的には１より大きい値を有するが、ポリマー鎖が一律の鎖の長さに近づくと、ＰＤＩは均一（１）に近づく。
【０２１１】
本明細書で用いる場合、対象への薬剤の投与の文脈で用いられる「予防する」または「予防すること」という用語は、対象に投与計画、例えば、ポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物の投与を与えて、その結果、障害の少なくとも１つの症状の発症が、この投与計画の不在下でみられるであろうものと比較して遅延されることを指す。
【０２１２】
本明細書で用いる場合、「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図する。例示的なヒト対象は、障害、例えば、本明細書で説明される障害を有するヒト患者、または健常な対象を含む。「非ヒト動物」という用語には、すべての脊椎動物、例えば、非哺乳類（ニワトリ、両生類、爬虫類など）、ならびに非ヒト霊長類、飼うための動物、および／または農業的に有用な動物、例えばヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタなどの哺乳類を包含する。
【０２１３】
本明細書で用いる場合、障害を有する対象を「治療する」または「治療すること」という用語は、投与計画、例えば、ポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物を対象へ投与し、その結果、その障害の少なくとも１つの症状が治療され（ｃｕｒｅｄ）、治癒され（ｈｅａｌｅｄ）、軽減され、緩和され、変化され、治癒され（ｒｅｍｅｄｉｅｄ）、寛解され、または改善されることを指す。治療することは、障害または障害の症状を軽減するか、緩和するか、変化させるか、治癒するか、寛解するか、改善するか、または影響するのに有効な量を投与することを包含する。治療は、障害の症状の増悪または悪化を阻害し得る。
【０２１４】
「アシル」という用語は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指し、それらのうちのいずれもさらに置換されてもよい（例えば、１つ以上の置換基によって）。例示的なアシル基としては、アセチル（ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−）、ベンゾイル（Ｃ６Ｈ５Ｃ（Ｏ）−）、およびアセチルアミノ酸（例えば、アセチルグリシン、ＣＨ３Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）が挙げられる。
【０２１５】
「アルコキシ」という用語は、酸素ラジカルの結合した、以下に定義されるようなアルキル基を指す。代表的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、などが挙げられる。
【０２１６】
「カルボキシ」という用語は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨまたはその塩を指す。
【０２１７】
「ヒドロキシ」および「ヒドロキシル」は、交換可能に用いられて、−ＯＨを指す。
【０２１８】
「置換基」という用語は、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロシクリル基、ヘテロシクロアルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、またはヘテロアリール基において、その基の任意の原子において「置換された」基を指す。任意の原子を置換され得る。好適な置換基としては、限定するものではないが、アルキル（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２の直鎖または分岐鎖アルキル）、シクロアルキル、ハロアルキル（例えば、ＣＦ３などのペルフルオロアルキル）、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリル、アルケニル、アルキニル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、アルコキシ、ハロアルコキシ（例えば、ＯＣＦ３などのペルフルオロアルコキシ）、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、カルボキシラート、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ＳＯ３Ｈ、スルファート、ホスファート、メチレンジオキシ（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、この中で、酸素は近接する原子に結合している）、エチレンジオキシ、オキソ、チオキソ（例えば、Ｃ＝Ｓ）、イミノ（アルキル、アリール、アラルキル）、Ｓ（Ｏ）ｎアルキル（式中、ｎは０〜２である）、Ｓ（Ｏ）ｎアリール（式中、ｎは０〜２である）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロアリール（式中、ｎは０〜２である）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロシクリル（式中、ｎは０〜２である）、アミン（モノ−、ジ−、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、アリール、ヘテロアリール、およびこれらの組み合わせ）、エステル（アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、アリール、ヘテロアリール）、アミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、アリール、ヘテロアリール、およびこれらの組み合わせ）、スルホンアミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組み合わせ）が挙げられる。一態様において、１つの基における置換基は独立して、上記の置換基の任意の単一の置換基または任意のサブセットである。別の態様において、置換基はそれ自体、上記の置換基の任意の１つと置換されてもよい。
【０２１９】
粒子
この粒子は、一般には、核酸剤、および少なくとも１つのカチオン性部分、疎水性部分、例えば、ポリマー、または親水性−疎水性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、核酸剤およびカチオン性部分、ならびに疎水性部分、例えば、ポリマー、または親水性−疎水性ポリマーのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子は、疎水性部分、例えば、疎水性ポリマー、または脂質（例えば、疎水性ポリマー）、親水性部分および疎水性部分を含むポリマー、核酸剤、およびカチオン性部分を含む。いくつかの実施形態では、この核酸剤および／またはカチオン性部分は、ある部分に結合される。例えば、この核酸剤および／またはカチオン性部分は、ポリマー、（例えば、疎水性ポリマー、または親水性部分および疎水性部分を含んでいるポリマー）に結合されてもよいし、またはこの核酸剤は、ポリマーに結合される核酸と二重鎖を形成する。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ポリマー、（例えば、疎水性ポリマー、または親水性部分および疎水性部分を含んでいるポリマー）に結合され、およびカチオン性部分は、ポリマーに結合されない（例えば、このカチオン性部分は、粒子に封入される）。いくつかの実施形態では、この核酸剤およびカチオン性部分は、両方ともポリマー、（例えば、疎水性ポリマー、または親水性部分および疎水性部分を含んでいるポリマー）に結合されるか、またはこの核酸剤は、ポリマーに結合される核酸と二重鎖を形成し、カチオン性部分はポリマーに結合される。いくつかの実施形態では、このカチオン性部分はポリマー（例えば、疎水性ポリマーまたは親水性部分および疎水性部分を含んでいるポリマー）に結合され、およびこの核酸剤は、ポリマーに結合されない（例えば、この核酸剤は、この粒子中に封入される）。いくつかの実施形態では、核酸剤およびカチオン性部分のいずれもポリマーに結合されない。この核酸剤および／またはカチオン性部分はまた、他の部分に結合されてもよい。例えば、核酸剤は、カチオン性部分に結合されてもよいし、または親水性ポリマー、例えば、ＰＥＧに結合されてもよい。
【０２２０】
疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーまたは脂質（例えば、疎水性ポリマー）、親水性部分および疎水性部分を含んでいるポリマー、核酸剤、およびカチオン性部分に加えて、本明細書に記載される粒子は、１つ以上の追加の成分、例えば、追加の核酸剤または追加のカチオン性部分を包含し得る。本明細書に記載される粒子はまた、少なくとも１つの酸性部分、例えば、カルボン酸基を有する化合物を包含し得る。この化合物は、小分子であっても、または少なくとも１つの酸性部分を有するポリマーであってもよい。いくつかの実施形態では、この化合物は、ポリマー、例えば、ＰＬＧＡである。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、この粒子は、対象に投与された場合、予め選択された区画で、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡの優先的な遊離があるように構成される。この予め選択された区画は、標的部位、位置、組織型、細胞型、例えば、疾患特異的な細胞型、例えば、癌細胞、または細胞内区画、例えば、サイトゾルであってもよい。ある実施形態では、ある粒子は、他の区画、例えば、非腫瘍区画、例えば、末梢血液ではなく、腫瘍において優先的な遊離をもたらす。核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡがポリマーまたはカチオン性部分に結合される実施形態では、この核酸剤は、対象の非腫瘍区画、例えば、末梢血液において腫瘍より大きい程度まで放出される（例えば、リンカーの還元切断を通じて）。いくつかの実施形態では、この粒子は、対象に投与された場合、対象の区画、例えば、腫瘍に対して、核酸剤が単独に投与された場合よりも多くの核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡを送達するように構成される。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、この粒子は、賦形剤、例えば、炭水化物成分、または安定化剤もしくは凍結保護剤、例えば、本明細書に記載の炭水化物成分、安定化剤または凍結保護剤と会合される。理論によって束縛されるものではないが、炭水化物成分は、安定化剤または凍結保護剤として機能し得る。いくつかの実施形態では、炭水化物成分、安定化剤または凍結保護剤は、１つ以上の炭水化物（例えば、本明細書に記載される１つ以上の炭水化物、例えば、例えば、スクロース、シクロデキストリンまたはシクロデキストリンの誘導体（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、時にはＨＰ−β−ＣＤと呼ばれる））、塩、ＰＥＧ、ＰＶＰまたはクラウンエーテルを含む。いくつかの実施形態では、炭水化物成分、安定化剤または凍結保護剤は、２つ以上の炭水化物、例えば、本明細書に記載される２つ以上の炭水化物を含む。一実施形態では、この炭水化物成分、安定化剤または凍結保護剤としては、環状の炭水化物（例えば、シクロデキストリンまたはシクロデキストリンの誘導体、例えば、α−、β−、またはγ−、シクロデキストリン（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン））および非環状の炭水化物が挙げられる。例示的な非環状のオリゴ糖類としては、１０、８、６または４個の単糖類サブユニット（例えば、単糖類または二糖類（例えば、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース）またはそれらの組み合わせ）が挙げられる。
【０２２３】
ある実施形態では、炭水化物成分、安定化剤または凍結保護剤は、第一のおよび第二の構成要素、例えば、環状炭水化物および非環状炭水化物、例えば、単糖類、二糖類または四糖類を含む。
【０２２４】
一実施形態では、粒子と会合する環状炭水化物の非環状炭水化物に対する重量比は、本明細書に記載される重量比、例えば、０．５：１．５〜１．５：０．５である。
【０２２５】
ある実施形態では、炭水化物成分、安定化剤または凍結保護剤は、以下のような第一のおよび第二の構成要素（ここでは、ＡおよびＢと命名）を含む：
（Ａ）は環状炭水化物を含み、そして（Ｂ）は二糖類を含む；
（Ａ）は２つ以上の環状炭水化物、例えば、β−シクロデキストリン（本明細書では時には、β−ＣＤと呼ばれる）またはβ−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、そして（Ｂ）は二糖類を含む；
（Ａ）は環状炭水化物、例えば、β−ＣＤまたはβ−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、そして（Ｂ）は２つ以上の二糖類を含む；
（Ａ）は２つ以上の環状炭水化物、および（Ｂ）は２つ以上の二糖類を含む；
（Ａ）はシクロデキストリン、例えば、β−ＣＤまたはβ−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、そして（Ｂ）は二糖類を含む；
（Ａ）はβ−シクロデキストリン、例えば、β−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）は二糖類を含む；
（Ａ）はβ−シクロデキストリン、例えば、β−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）はスクロースを含む；
（Ａ）はβ−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）はスクロースを含む；
（Ａ）はβ−シクロデキストリン、例えば、β−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）はトレハロースを含む；
（Ａ）はβ−シクロデキストリン、例えば、β−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）はスクロースおよびトレハロースを含む。
（Ａ）はＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）はスクロースおよびトレハロースを含む。
【０２２６】
ある実施形態では、成分ＡおよびＢは、０．５：１．５〜１．５：０．５の比で存在する。ある実施形態では、構成要素ＡおよびＢは、以下の比で存在する：３−１：０．４−２；３−１：０．４−２．５；３−１：０．４−２；３−１：０．５−１．５；３−１：０．５−１；３−１：１；３−１：０．６−０．９；および３：１：０．７。ある実施形態では、構成要素ＡおよびＢは、以下の比で存在する：２−１：０．４−２；３−１：０．４−２．５；２−１：０．４−２；２−１：０．５−１．５；２−１：０．５−１；２−１：１；２−１：０．６−０．９；および２：１：０．７。ある実施形態では、構成要素ＡおよびＢは以下の比で存在する：２−１．５：０．４−２；２−１．５：０．４−２．５；２−１．５：０．４−２；２−１．５：０．５−１．５；２−１．５：０．５−１；２−１．５：１；２−１．５：０．６−０．９；２：１．５：０．７。ある実施形態では、構成要素ＡおよびＢは以下の比で存在する：２．５−１．５：０．５−１．５；２．２−１．６：０．７−１．３；２．０−１．７：０．８−１．２；１．８：１；１．８５：１および１．９：１。
【０２２７】
ある実施形態では構成要素Ａは、シクロデキストリン、例えば、β−シクロデキストリン、例えば、β−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）はスクロースを含み、ならびにそれらは以下の比で存在する：２．５−１．５：０．５−１．５；２．２−１．６：０．７−１．３；２．０−１．７：０．８−１．２；１．８：１；１．８５：１および１．９：１。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、この粒子はナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約２２０ｎｍ以下（例えば、約２１５ｎｍ、２１０ｎｍ、２０５ｎｍ、２００ｎｍ、１９５ｎｍ、１９０ｎｍ、１８５ｎｍ、１８０ｎｍ、１７５ｎｍ、１７０ｎｍ、１６５ｎｍ、１６０ｎｍ、１５５ｎｍ、１５０ｎｍ、１４５ｎｍ、１４０ｎｍ、１３５ｎｍ、１３０ｎｍ、１２５ｎｍ、１２０ｎｍ、１１５ｎｍ、１１０ｎｍ、１０５ｎｍ、１００ｎｍ、９５ｎｍ、９０ｎｍ、８５ｎｍ、８０ｎｍ、７５ｎｍ、７０ｎｍ、６５ｎｍ、６０ｎｍ、５５ｎｍまたは５０ｎｍ以下）の直径を有する。ある実施形態では、このナノ粒子は、少なくとも１０ｎｍ（例えば、少なくとも約２０ｎｍ）の直径を有する。
【０２２９】
本明細書に記載される粒子は、標的化剤または脂質（例えば、この粒子の表面上に）を含み得る。
【０２３０】
本明細書に記載される複数の粒子の組成物は、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ（例えば、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ）の平均直径を有し得る。複数の粒子の組成物粒子は、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ（例えば、約７５ｎｍ〜約２２０ｎｍ））から約５０ｎｍ〜約２２０ｎｍ（例えば、約７５ｎｍ〜約２００ｎｍ）という中央粒子サイズ（Ｄｖ５０（粒子の体積の５０％がそれ未満で存在する粒子サイズ）を有し得る。複数の粒子の組成物は、約５０ｎｍから約５００ｎｍ（例えば、約７５ｎｍ〜約２００ｎｍ）というＤｖ９０（粒子の体積の９０％がそれ未満で存在する粒子サイズ）を有し得る。いくつかの実施形態では、複数の粒子の組成物は、約１５０ｎｍ未満のＤｖ９０を有する。複数の粒子の組成物は、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、または０．１未満という粒子ＰＤＩを有し得る。
【０２３１】
本明細書に記載される粒子は、水中で測定した場合、約−２０ｍＶ〜約５０ｍＶにおよぶ表面ゼータ電位を有してもよい。ゼータ電位は、粒子の表面電位の測定値である。いくつかの実施形態では、粒子は、水中で測定した場合、約−２０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約１０ｍＶ、または中性におよぶ表面ゼータ電位を有してもよい。
【０２３２】
ある実施形態では、本明細書に記載される、粒子、または複数の粒子を含む組成物は、例えば、インビボのモデル系で投与した場合（例えば、物理的特性、例えば、分子量の関数によって測定した場合）、効果（例えば、ノックダウン）を観察するのに十分な量の核酸剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）を有する。
【０２３３】
ある実施形態では、本明細書に記載される、粒子、または複数の粒子を含む組成物は、その核酸剤、例えば、数量または重量で、ｓｉＲＮＡの少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％が完全なままである（例えば、物理的特性、例えば、分子量の関数によって測定した場合）組成物である。
【０２３４】
ある実施形態では、本明細書に記載される、粒子、または複数の粒子を含む組成物は、その核酸剤、例えば、数量または重量で、ｓｉＲＮＡの少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％が、その粒子の表面で曝されるのではなく内側である組成物である。
【０２３５】
ある実施形態では、本明細書に記載の粒子、または複数の粒子を含む組成物は、５０／５０のマウス／ヒト血清中でインキュベートされた場合、凝集をほとんど示さないか、または全く示さない。例えば、インキュベートされた場合、数量または重量で３０、２０、または１０％未満の粒子が凝集する。
【０２３６】
ある実施形態では、本明細書に記載の粒子、または複数の粒子を含む組成物は、２５℃±２℃／６０％（相対湿度）±５％（相対湿度）で、開放、または閉鎖された容器中で、２０、３０、４０、５０または６０日間保管された場合、例えば、インビボのモデル系（例えば、本明細書に記載される任意のモデル系のようなマウスモデル）で測定した場合、その活性の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５％を保持し得る。
【０２３７】
ある実施形態では、本明細書に記載の粒子、または複数の粒子を含む組成物は、インビボのモデル系（例えば、本明細書に記載される任意のモデル系のようなマウスモデル）で１または３ｍｇ／ｋｇの単回用量で投与した場合、少なくとも２０、３０、４０、５０または６０％のタンパク質減少および／またはｍＲＮＡノックダウンを生じ得る。
【０２３８】
ある実施形態では、本明細書に記載される粒子、または複数の粒子を含む組成物は、インビボのモデル系（例えば、本明細書に記載される任意のモデル系のようなマウスモデル）で投与された場合（例えば、１または３ｍｇ／ｋｇの単回用量として）、タンパク質またはｍＲＮＡで測定した場合、オフターゲット遺伝子の２０、１、５％未満、またはそのノックダウンを生じ得る。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子は、対象における標的とする遺伝子の発現を、対象に対するその粒子の投与後、ほぼ７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、１９２時間、２１６時間、２４０時間、２６４時間後に少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上減少させるのに有効な量の核酸剤を送達し得る。一実施形態では、本明細書に記載の粒子は、対象における標的とする遺伝子の発現を、対象に対するこの粒子の投与のほぼ１２０時間後、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％まで低下するのに有効な量の核酸剤を送達し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子または組成物を投与された対象における標的遺伝子発現のレベルが、核酸剤が、粒子または複合体以外の処方物（すなわち、粒子中でなく、例えば、粒子中に封入されることも、ポリマーに複合体されることもない、例えば、本明細書に記載の粒子）中で投与される場合に見られる標的遺伝子の発現のレベルまたは核酸剤もしくは他の治療剤の投与もなしで示される標的遺伝子の発現と比較される。
【０２４０】
ある実施形態では、本明細書に記載される、粒子、または複数の粒子を含む組成物は、標的遺伝子ｍＲＮＡと接触された場合、ｍＲＮＡの切断を生じる。
【０２４１】
ある実施形態では、本明細書に記載される、粒子、または複数の粒子を含む組成物は、インビボのモデル系（例えば、本明細書に記載される任意のモデル系のようなマウスモデル）で投与された場合（例えば、１または３ｍｇ／ｋｇの単回用量として）、２、５、または１０倍未満のサイトカイン誘導を生じる。例えば、投与は、以下：腫瘍壊死因子α、インターロイキン−１α、インターロイキン１β、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、ケラチノサイト由来サイトカインおよびインターフェロンγのうち１つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは７つまたは全ての２、５または１０倍未満の誘導を生じる。
【０２４２】
ある実施形態では、本明細書に記載される、粒子または複数の粒子を含んでいる組成物は、インビボのモデル系（例えば、本明細書に記載される任意のモデル系のようなマウスモデル）で投与された場合（例えば、１または３ｍｇ／ｋｇの単回用量として）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の２、５または１０倍未満の増大を生じる。
【０２４３】
ある実施形態では、本明細書に記載される、粒子または複数の粒子を含んでいる組成物は、インビボのモデル系（例えば、本明細書に記載されるようなマウスモデル）で、３ｍｇ／ｋｇの２用量の投与４８時間後に、血球の有意な変化を生じない。
【０２４４】
ある実施形態では、粒子は、非極性の有機溶媒（例えば、ヘキサン、クロロホルムまたはジクロロメタンのうちのいずれか）で安定である。例えば、この粒子は、実質的に不活性であり、例えば、存在する場合、外層は、内部移行しないか、またはかなりの量の表面構成要素が、水性溶媒中でそれらの構成に対して内部移行する。ある実施形態では、構成要素の分布は実質的に、非極性の有機溶媒中で、および水性溶媒中で同じである。
【０２４５】
ある実施形態では、粒子は、ミセルの少なくとも１つの構成要素を欠き、例えば、これはコアを欠き、親水性の構成要素を実質的に含まない。
【０２４６】
ある実施形態では、この粒子のコアは、かなりの量の親水性構成要素を含む。
【０２４７】
ある実施形態では、この粒子のコアは、この粒子のうちかなりの量、例えば、少なくとも（重量または数量で）１０、２０、３０、４０、５０、６０または７０％の核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡを含む。
【０２４８】
ある実施形態では、この粒子のコアは、この粒子のうちかなりの量、例えば、少なくとも（重量または数量で）１０、２０、３０、４０、５０、６０または７０％のカチオン性部分、例えば、ポリカチオン性部分を含む。
【０２４９】
本明細書に記載される粒子は、少量の残留溶媒、例えば、この粒子を調製するのに用いられる溶媒、例えば、アセトン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ベンジルアルコール、ジオキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、メチルエチルケトン、酢酸ブチル、または酢酸プロピル（例えば、イソプロピルアセテート）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この粒子は、５０００ｐｐｍ未満の溶媒（例えば、４５００ｐｐｍ未満、４０００ｐｐｍ未満、３５００ｐｐｍ未満、３０００ｐｐｍ未満、２５００ｐｐｍ未満、２０００ｐｐｍ未満、１５００ｐｐｍ未満、１０００ｐｐｍ未満、５００ｐｐｍ未満、２５０ｐｐｍ未満、１００ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、２５ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満、２ｐｐｍ、または１ｐｐｍ未満）を含んでもよい。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、この粒子は、実質的に、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ「Ｑ３ｃ  −Ｔａｂｌｅｓ  ａｎｄ  Ｌｉｓｔ」が定義するクラスＩＩまたはクラスＩＩＩの溶媒を含まない。いくつかの実施形態では、この粒子は、５０００ｐｐｍ未満のアセトンを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、５０００ｐｐｍ未満のｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、５０００ｐｐｍ未満のヘプタンを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、６００ｐｐｍ未満のジクロロメタンを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、８８０ｐｐｍ未満のジメチルホルムアミドを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、５０００ｐｐｍ未満の酢酸エチルを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、４１０ｐｐｍ未満のアセトニトリルを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、７２０ｐｐｍ未満のテトラヒドロフランを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、５０００ｐｐｍ未満のエタノールを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、３０００ｐｐｍ未満のメタノールを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、５０００ｐｐｍ未満のイソプロピルアルコールを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、５０００ｐｐｍ未満のメチルエチルケトンを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、５０００ｐｐｍ未満の酢酸ブチルを含む。いくつかの実施形態では、この粒子は、５０００ｐｐｍ未満の酢酸プロピルを含む。
【０２５１】
本明細書に記載される粒子は、粒子を作製するための出発材料の重量あたり、または出発材料として用いられて、約２０〜約９０重量％（例えば、約２０重量％〜約８０重量％、約２５重量％〜約７５重量％、または約３０重量％〜約７０重量％）などの種々の量の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマーを含んでもよい。
【０２５２】
本明細書に記載される粒子は、粒子を作製するための出発材料の重量あたり、または出発材料として用いられて、例えば、最大約５０重量％（例えば、約４から約５０重量％、約５重量％、約８重量％、約１０重量％、約１５重量％、約２０重量％、約２３重量％、約２５重量％、約３０重量％、約３５重量％、約４０重量％、約４５重量％または約５０重量％のいずれかまで）という、種々の量のポリマー（親水性部分および疎水性部分を含む）を含み得る。例えば、この粒子の疎水性−親水性ポリマーの重量パーセントは、約３％〜３０％、約５％〜２５％または約８％〜２３％である。
【０２５３】
本明細書に記載される粒子では、疎水性ポリマーの疎水性−親水性ポリマーに対する比は、疎水性部分および親水性部分を有する粒子を作製するための出発材料の重量あたり、または出発材料として用いられて、この粒子が少なくとも５重量％、８重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、１８重量％、２０重量％、２３重量％、２５重量％、または３０重量％のポリマーを含むような比である。
【０２５４】
本明細書に記載される粒子は、粒子を作製するための出発材料の重量あたり、または出発材料として用いられて、例えば、約０．１％〜約６０％（例えば、約１％〜約６０％、約２％〜約２０％、約３％〜約３０％、約５％〜約４０％、約または約１０％〜約３０％）という種々の量のカチオン性部分を含んでもよい。カチオン性部分が窒素含有部分である場合、粒子中の窒素部分の、粒子中の核酸剤骨格由来のリン酸塩に対する比（すなわち、Ｎ／Ｐ比）は、約１：１〜約５０：１（例えば、約１：１〜約２５：１、約１：１〜約１０：１、約１：１〜約５：１、または約１：１〜約１．５〜１：１）であり得る。
【０２５５】
本明細書に記載される粒子は、粒子を作製するための出発材料の重量あたり、または出発材料として用いられて、例えば、約０．１重量％〜約５０重量％（例えば、約１％〜約５０％、約０．５％〜約２０％、約２％〜約２０％、約または約５％〜約１５％）の種々の量の核酸剤を含んでもよい。
【０２５６】
この粒子が界面活性剤を含む場合、この粒子は、粒子を作製するための出発材料の重量あたり、または出発材料として用いられて、例えば、最大、約４０重量％、または約１５％〜約３５％または約３％〜約１０％の種々の量の界面活性剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この界面活性剤は、ＰＶＡであり、かつカチオン性部分は、カチオン性ＰＶＡである。いくつかの実施形態では、この粒子は、約２％〜約５％のＰＶＡ（例えば、約４％）、および約０．１％〜約３％のカチオン性ＰＶＡ（例えば、約１％）を含んでもよい。
【０２５７】
本明細書に記載される粒子は、実質的に、標的化剤を（例えば、粒子中の構成要素に共有結合された標的化剤、例えば、標的の生物学的実態（例えば、膜成分、細胞表面レセプター、前立腺特異的膜抗原など）に結合するかそうでなければ会合することができる標的化剤を）含まなくてもよい。本明細書に記載される粒子は、核酸アプタマー、成長因子、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、抗体、インテグリン、フィブロネクチンレセプター、ｐ−糖タンパク質レセプター、ペプチドおよび細胞結合配列から選択される標的化剤を実質的に含まなくてもよい。いくつかの実施形態では、粒子内に、標的化部分に複合体化されるポリマーはない。本明細書に記載される粒子は、例えば、対象における標的に高い親和性および比親和性を有する粒子上の部分の使用によって、対象中の部位に対して粒子を選択的に標的する目的のための部分を添加されないかもしれない。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、この粒子は、脂質を含まず、例えば、リン脂質を含まない。本明細書に記載される粒子は、ナノ粒子への水の浸透を軽減する両親媒性層を実質的に含まなくてもよい。本明細書に記載される粒子は、脂質、例えば、リン脂質を５％または１０％未満（例えば、ｗ／ｗ、ｖ／ｖとして決定）含んでもよい。本明細書に記載される粒子は、ナノ粒子への水の浸透を例えば軽減する、脂質層、例えば、リン脂質層を実質的に含まなくてもよい。本明細書に記載される粒子は、実質的に脂質を含まなくてもよく、例えば、リン脂質を実質的に含まない。
【０２５９】
本明細書に記載される粒子は実質的に、放射性医薬品、例えば、放射性治療薬、放射性診断薬、予防薬または他の放射性同位体を含まなくてもよい。本明細書に記載される粒子は実質的に、免疫調節薬、例えば、免疫調節剤または免疫抑制剤を含まなくてもよい。本明細書に記載される粒子は実質的に、ワクチンも免疫原も、例えば、ペプチド、糖、脂質ベースの免疫原、Ｂ細胞抗原またはＴ細胞抗原も含まなくてもよい。
【０２６０】
本明細書に記載される粒子は実質的に、水溶性の疎水性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡ、例えば、ＰＬＧＡ（約１ｋＤａ未満（例えば、約５００Ｄａ未満）の分子量を有する）を含まなくてもよい。
【０２６１】
例示的な粒子
１つの例示的な粒子としては、以下を含む粒子が挙げられる：
ａ）複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマー；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；
ｃ）必要に応じて、複数のカチオン性部分；および
ｄ）複数の核酸剤であって、ここで複数の核酸剤の少なくとも一部が
（ｉ）以下のいずれか
疎水性部分、例えば、ａ）の疎水性ポリマーもしくは
ｂ）の親水性−疎水性ポリマー
に対して共有結合されるか、または、
（ｉｉ）疎水性部分、例えば、ａ）の疎水性ポリマー、またはｂ）の親水性−疎水性ポリマーｂ）のいずれかに対して共有結合される核酸と二重鎖（例えば、ヘテロ二重鎖）を形成する、核酸剤。
【０２６２】
別の例示的な粒子としては、以下を含む粒子が挙げられる：
ａ）複数の核酸剤−ポリマーの複合体であって、各々が核酸剤を含み、この核酸剤が、
（ｉ）疎水性ポリマーに結合されるか、または
（ｉｉ）疎水性ポリマーに対して共有結合される核酸と二重鎖（例えば、ヘテロ二重鎖）を形成する、核酸剤；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；および
ｃ）必要に応じて、複数のカチオン性部分。
【０２６３】
別の例示的な粒子としては、以下を含む粒子が挙げられる：
ａ）複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマー；
ｂ）複数の核酸剤−親水性−疎水性ポリマーの複合体であって、この複数の核酸剤−親水性−疎水性ポリマーの複合体の各々の核酸剤が、
（ｉ）親水性−疎水性ポリマーに対して共有結合されるか、または
（ｉｉ）親水性−疎水性ポリマーに共有結合される核酸と二重鎖（例えば、ヘテロ二重鎖）を形成する、複数の核酸剤−親水性−疎水性ポリマーの複合体；および
ｃ）必要に応じて、複数のカチオン性部分。
【０２６４】
別の例示的な粒子としては、以下を含む粒子が挙げられる：
ａ）複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマー；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；
ｃ）複数のカチオン性部分であって、ここでこの複数のカチオン性部分の少なくとも一部が、ａ）の疎水性ポリマーまたはｂ）の親水性−疎水性ポリマーのいずれかに結合される、複数のカチオン性部分；および
ｄ）複数の核酸剤。
【０２６５】
別の例示的な粒子としては、以下を含む粒子が挙げられる：
ａ）複数の疎水性部分（例えば、疎水性ポリマー）；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；
ｃ）必要に応じて、複数のカチオン性部分；および
ｄ）複数の核酸剤；
ここでｃ）のカチオン性部分の実質的な部分、およびｄ）の核酸剤の実質的な部分は、疎水性ポリマーまたは親水性−疎水性ポリマーに対して共有結合されない。例えば、核酸剤またはカチオン性部分は、この粒子に封入される。
【０２６６】
別の例示的な粒子としては、以下を含む粒子が挙げられる：
ａ）複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマー；
ｂ）必要に応じて複数の親水性−疎水性ポリマー；
ｃ）複数のカチオン性部分；および
ｄ）複数の核酸剤であって、ここで複数の核酸剤の少なくとも一部が、親水性ポリマーに対して共有結合されるか、または親水性ポリマーに対して共有結合される核酸と二重鎖（例えば、ヘテロ二重鎖）を形成する、複数の核酸剤。
【０２６７】
別の例示的な粒子としては、以下を含む粒子が挙げられる：
ａ）複数の疎水性部分、例えば、疎水性ポリマー；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；および
ｃ）複数の核酸剤−カチオン性ポリマーの複合体。
【０２６８】
ある実施形態では、この核酸剤は、疎水性ポリマー、または親水性−疎水性ポリマーに対して、結合、例えば、共有結合されない。ある実施形態では、粒子を作製するための出発材料の重量あたり、または出発材料として用いられて、５、２、または１重量％未満の核酸剤が、疎水性ポリマーまたは親水性−疎水性ポリマーに結合される。
【０２６９】
別の例示的な粒子は、複数の核酸剤−ポリマーの複合体；複数のカチオン性ポリマーまたは脂質；および複数のポリマーまたは脂質を含み、ここで、このポリマーまたは脂質は実質的に、複数の核酸剤−ポリマーの複合体を囲み、例えば、このような核酸剤は、実質的に、粒子の内側であり、粒子の表面にはない。
【０２７０】
疎水性部分
疎水性ポリマー
本明細書に記載される粒子は、疎水性ポリマーを含み得る。疎水性ポリマーは、核酸剤および／またはカチオン性部分に結合して複合体（例えば、核酸剤−疎水性ポリマーの複合体またはカチオン性部分−疎水性ポリマーの複合体）を形成し得る。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、疎水性ポリマーに結合される核酸剤と二重鎖を形成する。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、この疎水性ポリマーは、別の部分に結合されない。粒子は、複数の疎水性ポリマーを含んでもよく、例えば、ここでは、いくつかが、核酸剤および／またはカチオン性部分のような別の部分に結合され、いくつかは結合されない。
【０２７２】
例示的な疎水性ポリマーとしては以下が挙げられる：アクリラート、例としては、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル（ＢＡ）、アクリル酸イソブチル、アクリル酸２−エチル、およびアクリル酸ｔ−ブチル；メタクリラート、例としては、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ−ブチルおよびメタクリル酸イソブチル；アクリロニトリル；メタクリロニトリル；ビニル、例としては、酢酸ビニル、ビニルベルサタート、ビニルプロピオナート、ビニルホルムアミド、ビニルアセトアミド、ビニルピリジン、およびビニルイミダゾール；アミノアルキル類、例としては、アミノアルキルアクリラート類、アミノアルキルメタクリラート、およびアミノアルキル（メタ）アクリルアミド；スチレン；セルロースアセタートフタラート；セルロースアセタートスクシナート；フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース；ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）；ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）；ポリ（グリコリド）；ポリ（ヒドロキシブチラート）；ポリ（アルキルカルボナート）；ポリ（オルトエステル）；ポリエステル類；ポリ（ヒドロキシ吉草酸）；ポリジオキサノン；ポリ（エチレンテレフタラート）；ポリ（リンゴ酸）；ポリ（タルトロン酸）；ポリ酸無水物類；ポリホスファゼン類；ポリ（アミノ酸類）およびそれらのコポリマー（一般的には、Ｓｖｅｎｓｏｎ，Ｓ（編），Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：第Ｉ巻：Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ．２００６；ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ；Ａｍｉｊｉ，Ｍ．Ｍ（編），Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２００７；Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ，ＬＬＰ；Ｎａｉｒら、Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．（２００７）３２：７６２−７９８参照）；疎水性ペプチドに基づくポリマーおよびポリ（Ｌ−アミノ酸）に基づくコポリマー；（Ｌａｖａｓａｎｉｆａｒ，Ａ．，ら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００２）５４：１６９−１９０）；ポリ（エチレン−酢酸ビニル）（「ＥＶＡ」）コポリマー；シリコーンゴム；ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリジエン（ポリブタジエン、ポリイソプレン、およびこれらポリマーの水素付加型）；ビニルメチルエーテルおよび他のビニルエーテル類のマレイン酸無水物コポリマー；ポリアミド類（ナイロン６，６）；ポリウレタン；ポリ（エステルウレタン類）；ポリ（エーテルウレタン類）；およびポリ（エステル−尿素）。
【０２７３】
本明細書に記載されるポリマー−薬剤の複合体または粒子を調製する上で有用な疎水性ポリマーとしてはまた、生分解性ポリマーが挙げられる。生分解性ポリマーの例としては、ポリラクチド類、ポリグリコリド類、カプロラクトンベースのポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリジオキサノン、ポリ酸無水物類、ポリアミン類、ポリエステルアミド類、ポリオルトエステル類、ポリジオキサノン類、ポリアセタール類、ポリケタール類、ポリカルボナート類、ポリホスホエステル類、ポリエステル類、ポリブチレンテレフタラート、ポリオルトカルボナート類、ポリホスファゼン類、スクシナート類、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（アミノ酸類）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシセルロース、多糖類、キチン、キトサン、およびヒアルロン酸、ならびにこれらのコポリマー、ターポリマーおよび混合物が挙げられる。生分解性ポリマーとしてはまた、カプロラクトン系のポリマー、ポリカプロラクトンおよびポリブチレンテレフタラートを含むコポリマーを含めたコポリマーが挙げられる。
【０２７４】
いくつかの実施形態において、ポリマーは、Ｄ，Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、Ｌ−ラクチド、Ｄ，Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸、グリコリド、グリコール酸、ε−カプロラクトン、ε−ヒドロキシヘキサン酸、γ−ブチロラクトン、γ−ヒドロキシ酪酸、δ−バレロラクトン、δ−ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシ酪酸、およびリンゴ酸からなる群より選択されるモノマーから合成されたポリエステルである。
【０２７５】
コポリマーはまた、本明細書に記載されるポリマー−薬剤の複合体または粒子においても用いられ得る。いくつかの実施形態において、ポリマーは、乳酸およびグリコール酸の生分解性のランダムコポリマーであるＰＬＧＡであり得る。ＰＬＧＡポリマーは、例えば、約０．１：９９．９〜約９９．９：０．１（例えば、約７５：２５〜約２５：７５、約６０：４０〜４０：６０、または約５５：４５〜４５：５５）の範囲で変動する比の乳酸：グリコール酸を有し得る。いくつかの実施形態において、例えば、ＰＬＧＡにおいて、乳酸モノマーのグリコール酸モノマーに対する比は、５０：５０、６０：４０、または７５：２５である。
【０２７６】
特定の実施形態において、ポリマー−薬剤の複合体または粒子のＰＬＧＡポリマーにおけるグリコール酸モノマーに対する乳酸の比を最適化することによって、水の取り込み、薬剤放出（例えば、「徐放」）、およびポリマー分解動態などのパラメーターが最適化され得る。さらに、比を調整することはまた、コポリマーの疎水性に影響するであろうし、このことが次には薬物負荷に影響し得る。
【０２７７】
生分解性ポリマーがまた、核酸剤または他の物質（例えば、それに結合するカチオン性部分、またはそれに結合して核酸と二重鎖を形成する核酸剤）を有する特定の実施形態において、このようなポリマーの生分解速度は、このような物質の放出速度によって特徴づけられ得る。このような状況において、生分解速度は、ポリマーが化学的に何であるかおよび物理的特徴だけでなく、結合する物質(単数または複数)が何であるかにも依存し得る。対象の組成物の分解は、例えば酸化および／または加水分解による分子内結合の切断だけでなく、外来封入宿主との競合的複合体形成による宿主／ゲスト複合体の解離など、分子内結合の撹乱も含む。いくつかの実施形態において、放出は、粒子における追加の成分、例えば、少なくとも１つの酸性部分（例えば、遊離酸ＰＬＧＡ）を有する化合物によって影響され得る。
【０２７８】
特定の実施形態において、疎水性ポリマーのような１つ以上のポリマーを含む粒子は、所望の適用において許容される期間内で生分解する。インビボ治療法などの特定の実施形態において、このような分解は、通常約５年未満、１年、６ヶ月、３ヶ月、１ヶ月、１５日、５日、３日、または１日の期間でさえ、２５℃〜３７℃の温度を有するｐＨ４〜８の生理学的溶液への曝露の際に生じる。他の実施形態において、ポリマーは、所望の適用に応じて、約１時間〜数週間の期間で分解する。
【０２７９】
ポリマーが、インビボで核酸剤の送達に用いられる場合、ポリマー自体が非毒性であること、これらが、体液によってポリマーが浸食される際に非毒性の分解産物へと分解することが重要である。しかしながら、多くの生分解性ポリマーは、インビボでの浸食の際に、周囲の組織と有害な相互作用をするオリゴマーおよびモノマーを生じる（Ｄ．Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．１２３３（１９８２））。完全なままのポリマー担体およびその分解産物の毒性を最小化するために、ポリマーは、天然に存在する代謝産物に基づいて設計されている。例示的なポリマーとしては、乳酸および／またはグリコール酸に由来するポリエステル類、ならびにアミノ酸に由来するポリアミド類が挙げられる。
【０２８０】
多数の生分解性ポリマーが公知であり、医薬製剤の徐放に用いられる。このようなポリマーは、例えば、各々が全体として参照により本明細書に援用される米国特許第４，２９１，０１３号；第４，３４７，２３４号；第４，５２５，４９５号；第４，５７０，６２９号；第４，５７２，８３２号；第４，５８７，２６８号；第４，６３８，０４５号；第４，６７５，３８１号；第４，７４５，１６０号；および第５，２１９，９８０号、ならびにＰＣＴ公報ＷＯ２００６／０１４６２６において記載されている。
【０２８１】
本明細書に記載される疎水性ポリマーは、種々の末端基を有し得る。いくつかの実施形態において、例えば、ポリマーの末端基がカルボン酸、ヒドロキシ基、またはアミノ基である場合、このポリマーの末端基はさらに修飾されない。いくつかの実施形態において、この末端基はさらに修飾されてもよい。例えば、ヒドロキシル末端基を有するポリマーは、アシル基で誘導体化されて、アシル−キャッピングポリマー（例えば、アセチル−キャッピングポリマーまたはベンゾイルキャッピングポリマー）を、アルキル基で誘導化されて、アルコキシキャッピングポリマー（例えば、メトキシキャッピングポリマー）を、またはベンジル基で誘導体化されて、ベンジルキャッピングポリマーを生じ得る。この末端基はまたさらに、官能基と反応されて、例えば、核酸剤、カチオン性部分、または不溶性基質などの別の部分に対する連結を提供し得る。いくつかの実施形態では、粒子は、官能化された疎水性ポリマー、例えば、疎水性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡ（例えば、５０：５０ＰＬＧＡ）、ある部分で官能化された、例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド、２−（２−ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ、またはスクシンイミジニル−Ｎ−メチルエステル（別の部分、例えば、核酸剤と反応されなかった）を含む。
【０２８２】
疎水性ポリマーは、約１ｋＤａ〜約７０ｋＤａ（例えば、約４ｋＤａ〜約６６ｋＤａ、約２ｋＤａ〜約１２ｋＤａ、約６ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約６ｋＤａ〜約１３ｋＤａ、約７ｋＤａ〜約１１ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａ、約７ｋＤａ〜約１０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約７ｋＤａ、約６ｋＤａ〜約８ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約１６ｋＤａ、または約１７ｋＤａ）の範囲の重量平均分子量を有し得る。
【０２８３】
本明細書に記載される疎水性ポリマーは、約２．５以下（例えば、約２．２以下、または約２．０以下、または約１．５以下）のポリマー多分散指数（ＰＤＩ）を有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される疎水性ポリマーは、約１．０〜約２．５、約１．０〜約２．０、約１．０〜約１．７、または約１．０〜約１．６のポリマーＰＤＩを有し得る。
【０２８４】
本明細書に記載される粒子は、粒子の例えば、約１０重量％〜約９０重量％（例えば、約２０％〜約８０％、約２５％〜約７５％、または約３０％〜約７０％）の様々な量の疎水性ポリマーを含み得る。
【０２８５】
本明細書に記載される疎水性ポリマーは、例えば、ＢＡＳＦ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｄｕｒｃｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｕｒａｃ  Ａｍｅｒｉｃａ、およびＳｕｒＭｏｄｉｃｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓなどの商業的供給元から市販され得る。本明細書に記載されるポリマーはまた合成されてもよい。ポリマーを合成する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＴｈｅｏｒｙおよびＰｒａｃｔｉｃｅ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｄ．Ｂｒａｕｎら、第４版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，２００５参照）。このような方法としては、例えば、重縮合、ラジカル重合、イオン重合（例えば、陽イオンまたは陰イオン重合）、または開環メタセシス重合が挙げられる。
【０２８６】
市販のまたは合成されたポリマー試料はさらに、ポリマー−薬剤の複合体の形成または本明細書に記載される粒子もしくは組成物への組み込みの前に精製されてもよい。いくつかの実施形態において、精製は、ポリマー試料の多分散を低下させ得る。ポリマーは、溶液からの沈殿、またはセライトなどの固形物上での沈殿によって精製され得る。ポリマーはまた、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに精製されてもよい。
【０２８７】
他の疎水性部分
本明細書に記載される粒子の他の適切な疎水性部分としては、例えば、リン脂質が挙げられる。例示的な脂質としては、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド類、リン酸ジセチル、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【０２８８】
他の例示的な疎水性部分としては、コレステロールおよびビタミンＥ  ＴＰＧＳが挙げられる。
【０２８９】
ある実施形態では、疎水性部分は、脂質ではない（例えば、リン脂質ではない）し、脂質を含むこともない。
【０２９０】
疎水性−親水性ポリマー
本明細書に記載される粒子は、親水性部分および疎水性部分を含むポリマー、例えば、疎水性−親水性ポリマーを含んでもよい。この親水性−疎水性ポリマーは、別の部分、例えば、核酸剤（例えば、親水性部分または疎水性部分を通じて）および／またはカチオン性部分に対して結合されてもよく、または核酸剤は、疎水性−親水性ポリマーに結合した核酸と二重鎖を形成し得る。いくつかの実施形態では、疎水性−親水性ポリマーは結合されない（すなわち、別の部分に結合されない）。粒子は、複数の疎水性−親水性ポリマーを含んでもよく、例えば、ここでいくつかは、別の部分、例えば、核酸剤および／またはカチオン性部分に結合され、いくつかは結合されない。
【０２９１】
親水性部分および疎水性部分を含むポリマーは、疎水性ブロックとカップリングされた親水性ブロックのコポリマーであり得る。これらのコポリマーは、約５ｋＤａ〜約３０ｋＤａ（例えば、約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２２ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約１２ｋＤａ〜約２２ｋＤａ、約７ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約１９ｋＤａ、または約１１ｋＤａ〜約１３ｋＤａ、例えば、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約１６ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約１８ｋＤａまたは約１９ｋＤａ）の重量平均分子量を有し得る。親水性部分および疎水性部分を含むポリマーは、薬剤へ結合し得る。
【０２９２】
ポリマーの好適な疎水性部分の例としては、上記の疎水性部分が挙げられる。コポリマーの疎水性部分は、約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａ（例えば、約８ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１８ｋＤａ、１７ｋＤａ、１６ｋＤａ、１５ｋＤａ、１４ｋＤａ、または１３ｋＤａ、約２ｋＤａ〜約１２ｋＤａ、約６ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１８ｋＤａ、約７ｋＤａ〜約１７ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約１３ｋＤａ、約９ｋＤａ〜約１１ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１４ｋＤａ、約６ｋＤａ〜約８ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約１６ｋＤａ、または約１７ｋＤａ）の重量平均分子量を有し得る。
【０２９３】
ポリマーの適切な親水性部分の例としては、以下が挙げられる：カルボン酸、例としては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、およびマレイン酸；ポリオキシエチレン類または酸化ポリエチレン（ＰＥＧ）；ポリアクリルアミド類（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ならびにそれらとジメチルアミノエチルメタクリラート、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ビニルベンジルトリメチル（ｔｈｒｉｍｅｔｈｙｌ）アンモニウムクロリド、アクリル酸、メタクリル酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびスルホン酸スチレンとのコポリマー、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリオキサゾリン、ポリシアル酸、デンプンおよびデンプン誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体類；ポリペプチド類、例えば、ポリリシン類、ポリアルギニン類、ポリグルタミン酸類；アルギン酸類、ポリラクチド類、ポリエチレンイミン類、ポリイオネン類、ポリアクリル酸類、およびポリイミノカルボン酸、ゼラチン、ならびに不飽和エチレン性のモノまたはジカルボン酸。好適な親水性ポリマーの列挙は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＧｕｍｓおよびＲｅｓｉｎｓ，Ｒ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９８０）に見ることができる。コポリマーの親水性部分は、約１ｋＤａ〜約２１ｋＤａ（例えば、約１ｋＤａ〜約３ｋＤａ、例えば、約２ｋＤａ、または約２ｋＤａ〜約６ｋＤａ、例えば、約３．５ｋＤａ、または約４ｋＤａ〜約６ｋＤａ、例えば、約５ｋＤａ）の重量平均分子量を有し得る。一実施形態では、親水性部分は、ＰＥＧであり、重量平均分子量は、約１ｋＤａ〜約２１ｋＤａ（例えば、約１ｋＤａ〜約８ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約３ｋＤａ、例えば、約２ｋＤａ、または約２ｋＤａ〜約６ｋＤａ、例えば、約３．５ｋＤａ、または約４ｋＤａ〜約６ｋＤａ、例えば、約５ｋＤａ）である。一実施形態では、親水性部分は、ＰＶＡであり、重量平均分子量は、約１ｋＤａ〜約２１ｋＤａ（例えば、約１ｋＤａ〜約８ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約３ｋＤａ、例えば、約２ｋＤａ、または約２ｋＤａ〜約６ｋＤａ、例えば、約３．５ｋＤａ、または約４ｋＤａ〜約６ｋＤａ、例えば、約５ｋＤａ）である。一実施形態では、親水性部分は、ポリオキサゾリンであり、重量平均分子量は、約１ｋＤａ〜約２１ｋＤａ（例えば、約１ｋＤａ〜約８ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約３ｋＤａ、例えば、約２ｋＤａ、または約２ｋＤａ〜約６ｋＤａ、例えば、約３．５ｋＤａ、または約４ｋＤａ〜約６ｋＤａ、例えば、約５ｋＤａ）である。一実施形態では、親水性部分は、ポリビニルピロリジンであり、重量平均分子量は、約１ｋＤａ〜約２１ｋＤａ（例えば、約１ｋＤａ〜約８ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約３ｋＤａ、例えば、約２ｋＤａ、または約２ｋＤａ〜約６ｋＤａ、例えば、約３．５ｋＤａ、または約４ｋＤａ〜約６ｋＤａ、例えば、約５ｋＤａ）である。一実施形態では、親水性部分は、ポリヒドロキシルプロピルメタクリルアミドであり、重量平均分子量は、約１ｋＤａ〜約２１ｋＤａ（例えば、約１ｋＤａ〜約８ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約３ｋＤａ、例えば、約２ｋＤａ、または約２ｋＤａ〜約６ｋＤａ、例えば、約３．５ｋＤａ、または約４ｋＤａ〜約６ｋＤａ、例えば、約５ｋＤａ）である。一実施形態では、親水性部分は、ポリシアル酸であり、重量平均分子量は、約１ｋＤａ〜約２１ｋＤａ（例えば、約１ｋＤａ〜約８ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約３ｋＤａ、例えば、約２ｋＤａ、または約２ｋＤａ〜約６ｋＤａ、例えば、約３．５ｋＤａ、または約４ｋＤａ〜約６ｋＤａ、例えば、約５ｋＤａ）である。
【０２９４】
親水性部分および疎水性部分を含むポリマーは、ブロックコポリマー、例えば、ジブロックまたはトリブロックコポリマーであってもよい。いくつかの実施形態において、このポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むジブロックコポリマーであり得る。いくつかの実施形態において、このポリマーは、疎水性ブロック、親水性ブロック、および別の疎水性ブロックを含むトリブロックコポリマーであり得る。２つの疎水性ブロックは、同じ疎水性ポリマーであっても、または異なる疎水性ポリマーであってもよい。本明細書で用いられるブロックコポリマーは、様々な親水性部分、対疎水性部分の比を有してもよく、例えば、重量で１：１〜１：４０の範囲に及ぶ（例えば、重量で約１：１〜約１：１０、重量で約１：１〜約１：２、または重量で約１：３〜約１：６）。
【０２９５】
親水性部分および疎水性部分を含むポリマーは、種々の末端基を有し得る。いくつかの実施形態において、末端基は、ヒドロキシ基またはアルコキシ基であり得る（例えば、メトキシ）。いくつかの実施形態において、ポリマーの末端基はさらに修飾されていない。いくつかの実施形態において、末端基はさらに修飾され得る。例えば、末端基は、アルキル基でキャッピングされて、アルコキシでキャッピングされたポリマー（例えば、メトキシでキャッピングされたポリマー）を生じてもよく、標的化剤（例えば、葉酸塩）もしくは色素（例えば、ローダミン）と誘導体化されてもよく、または官能基と反応されてもよい。
【０２９６】
親水性部分および疎水性部分を含むポリマーは、コポリマーの２つのブロック間にリンカーを含み得る。このようなリンカーは、例えば、アミド連結、エステル連結、エーテル連結、アミノ連結、カルバメート連結、またはカーボネート連結であってもよい。
【０２９７】
本明細書に記載される親水性部分および疎水性部分を含むポリマーは、約２．５以下のポリマー多分散指数（ＰＤＩ）を有し得る（例えば、約２．２以下、または約２．０以下、または約１．５以下）。いくつかの実施形態において、ポリマーＰＤＩは、約１．０〜約２．５、例えば、約１．０〜約２．０、約１．０〜約１．８、約１．０〜約１．７、または約１．０〜約１．６である。
【０２９８】
本明細書に記載される粒子は、親水性部分および疎水性部分を含む種々の量のポリマー、であって、例えば粒子の重量あたり最大約５０重量％を含み得る（例えば、約４〜約５０重量％、約５重量％、約１０重量％、約１５重量％、約２０重量％、約２５重量％、約３０重量％、約３５重量％、約４０重量％、約４５重量％、または約５０重量％）。例えば、粒子内の第二のポリマーの重量パーセントは約３％〜３０％、約５％〜２５％、または約８％〜２３％である。
【０２９９】
本明細書に記載される親水性部分および疎水性部分を含むポリマーは、市販されている場合があるし、または合成されてもよい。ポリマーを合成する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＴｈｅｏｒｙおよびＰｒａｃｔｉｃｅ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｄ．Ｂｒａｕｎら、，第４版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，２００５を参照のこと）。そのような方法としては、例えば、重縮合、ラジカル重合、イオン重合（例えば、陽イオンまたは陰イオン重合）、または開環メタセシス重合が挙げられる。ブロックコポリマーは、２つのポリマー単位を別個に合成した後、２つの部分を確立された方法を用いて複合体化することによって調製され得る。例えば、ブロックは、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド）などのカップリング剤を用いて連結され得る。複合体化の後、２つのブロックは、アミド連結、エステル連結、エーテル連結、アミノ連結、カルバメート連結、またはカーボネート連結を介して連結され得る。
【０３００】
市販のまたは合成されたポリマー試料はさらに、ポリマー−薬剤の複合体の形成または本明細書に記載される粒子もしくは組成物への組み込みの前に精製され得る。いくつかの実施形態において、精製は、濾過できないポリマー試料をもたらし得る、より低分子量のポリマーを除去し得る。ポリマーは、溶液からの沈殿またはセライトなどの固形物への沈殿によって精製され得る。ポリマーはまた、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに精製されてもよい。
【０３０１】
カチオン性部分
本明細書に記載される粒子および複合体における使用のための例示的なカチオン性部分としては、アミン類、例としては、例えば、一級、二級、三級および四級のアミン類、ならびにポリアミン類（例えば、分岐したおよび直鎖のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはその誘導体、例えば、ポリエチレンイミン−ＰＬＧＡ、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−トリＧＡＬ）誘導体）が挙げられる。いくつかの実施形態では、カチオン性部分は、カチオン性脂質（例えば、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド（ＤＯＴＩＭ），ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、１，２ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＥＤＭＰＣ）、エチル−ＰＣ、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、ＤＣ−コレステロール、およびＭＢＯＰ、ＣＬｉｎＤＭＡ、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、ｐＣＬｉｎＤＭＡ、ｅＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、およびＤＭＬＢＡ）を含む。例えば、カチオン性部分がポリアミンであるいくつかの実施形態では、ポリアミンは、ポリアミノ酸（例えば、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、およびポリ（アルギニン））および誘導体類（例えば、ポリ（リジン）−ＰＬＧＡ、イミダゾール修飾ポリ（リジン））またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む。例えば、カチオン性部分が、複数のアミンを含んでいるポリマーである、いくつかの実施形態では、アミン類は、このアミン類が約４〜約１０Å（例えば、約５〜約８または約６〜約７）離れるように、ポリマーにそって配置され得る。いくつかの実施形態では、このアミン類は、核酸剤上のリン酸塩と合致するようにポリマーにそって配置され得る。
【０３０２】
カチオン性部分は、５以上のｐＫａを有してもよく、および／または生理学的なｐＨで正に荷電されてもよい。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、このカチオン性部分は、少なくとも１つのアミン（例えば、一級、二級、三級または四級のアミン）、または複数のアミン類（各々が、独立して一級、二級、三級または四級のアミン）を含む。いくつかの実施形態では、このカチオン性部分は、ポリマー、例えば、１つ以上の二級または三級のアミン類を有し、例えばカチオン性ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（例えば、Ｋｕｒａｒａｙによって提供される、例えば、ＣＭ−３１８またはＣ−５０６）、キトサン、ポリアミン−分岐およびスター（ｓｔａｒ）ＰＥＧおよびポリエチレンイミンである。カチオン性ＰＶＡは、例えば、その内容が参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２００２／０１８９７７４号に記載のような、酢酸ビニル／Ｎ−ビニルホルムアミドコポリマーを重合することによって、例えば、作製され得る。カチオン性ＰＶＡの他の例としては、米国特許第６，３６８，４５６号およびＦａｔｅｈｉ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ７９（２０１０）４２３−４２８）（その内容が参照によって本明細書に援用される）が挙げられる。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、カチオン性部分は、窒素含有の複素環式部分または複素環式芳香族部分（例えば、ピリジニウム、イミダゾリウム、モルホリニウム、ピペリジニウムなど）を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、窒素含有複素環式部分または複素環式芳香族部分、例えば、ポリビニルピロリジンまたはポリビニルピロリジノンを含む。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、カチオン性部分は、グアナジニウム部分（例えば、アルギニン部分）を含む。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、カチオン性部分は、界面活性剤、例えば、カチオン性ＰＶＡ、例えば、本明細書に記載されるカチオン性ＰＶＡである。
【０３０７】
さらなる例示的なカチオン性部分としては、アガマチン、硫酸プロタミン、ヘキサデメチリンブロミド（ｈｅｘａｄｅｍｅｔｈｒｉｎｅ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、１−ヘキシルトリエチル−アンモニウムホスフェート、１−ドデシルトリエチル−アンモニウムホスフェート、スペルミン（例えば、スペルミンテトラヒドロクロライド）、スペルミジン、およびその誘導体（例えば、Ｎ１−ＰＬＧＡ−スペルミン、Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５、Ｎ１０、Ｎ１４−トリメチル化−スペルミン、（Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５、Ｎ１０、Ｎ１４、Ｎ１４−テトラメチル化−スペルミン）、ＰＬＧＡ−ｇｌｕ−ジ−トリＣｂｚ−スペルミン、トリＣｂｚ−スペルミン、アンフィポル（ａｍｉｐｈｉｐｏｌｅ）、ＰＭＡＬ−Ｃ８、およびアセチル−ＰＬＧＡ５０５０−ｇｌｕ−ジ（Ｎ１−アミノ−Ｎ５、Ｎ１０、Ｎ１４−スペルミン）、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート）、ヘキシルデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサジメチリンブロミド、およびアテロコラーゲンならびに例えば、ＷＯ２００５００７８５４、米国特許第７，６４１，９１５号、およびＷＯ２００９０５５４４５（その各々の内容が参照によって本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。
【０３０８】
ある実施形態では、カチオン性部分とは、その存在が、本明細書に記載される粒子において、粒子の外側上で、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡの５０、４０、３０、２０、または１０％未満（重量または数として）の存在を伴うものである。
【０３０９】
ある実施形態では、カチオン性部分は、脂質ではなく（例えば、リン脂質ではなく）、脂質を含むこともない。
【０３１０】
核酸剤
核酸剤は、本明細書に記載の粒子、複合体、または組成物を用いて送達され得る。適切な核酸剤の実施例としては、限定するものではないが、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）類、アプタマー類、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびプラスミドが挙げられる。核酸剤因子は、目的の種々の遺伝子、例えば、過剰発現が疾患または障害と伴う遺伝子を標的とし得る。
【０３１１】
本明細書に記載されるポリマー−核酸剤の複合体、粒子または組成物を用いて送達される核酸剤は、単独で投与されても、または組み合わせて投与されてもよい（例えば、同じ処方物または別々の処方物中で）。一実施形態では、複数の薬剤、例えば、ｓｉＲＮＡが、疾患または障害の処置のための同じ遺伝子上の異なる部位を標的するために投与される。別の実施形態では、複数の剤、例えば、ｓｉＲＮＡを、疾患または障害の治療のために２つ以上の異なる遺伝子を標的するために投与する。
【０３１２】
ｓｉＲＮＡ
本明細書に記載されるポリマー−核酸剤の複合体、粒子または組成物による送達に適切な治療剤核酸は、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」であってもよい。本明細書において用いる場合、ｓｉＲＮＡとは、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」または遺伝子サイレンシングを配列特異的方式で媒介することによって、遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方制御し得る任意の核酸分子を指す。例えば、ｓｉＲＮＡは、自己相補性のセンス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖核酸分子であってもよく、ここでこのアンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部におけるヌクレオチド配列に対して相補性であるヌクレオチド配列、および標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有するセンス領域を含む。
【０３１３】
一実施形態では、本明細書に記載される複合体、粒子または組成物とともに送達するために適切な治療用ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現の阻害を生じる方式で、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。
【０３１４】
ｓｉＲＮＡは、二本鎖構造を含み、これは典型的には、１５〜５０塩基対、例えば、１９〜２５、１９〜２３、２１〜２５、２１〜２３、または２４〜２９塩基対を含み、かつ細胞内で発現された標的遺伝子またはＲＮＡに対して同一またはほぼ同一のヌクレオチド配列を有している。ｓｉＲＮＡは、２つのアニーリングされたポリヌクレオチドまたヘアピン構造を形成するは単一のポリヌクレオチドから構成されてもよい。一実施形態では、治療用のｓｉＲＮＡは、本明細書に記載される複合体、粒子または組成物にパッケージングされている、発現ベクターの形態で提供され、ここでこのベクターは、対象に対する投与後、ｓｉＲＮＡを生成する１つ以上の転写生成物を生成するように転写されるコード配列を有する。
【０３１５】
ｓｉＲＮＡは、２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てられてもよく、ここでは、１つの鎖がセンス鎖であり、かつ他方がアンチセンス鎖であり、このアンチセンス鎖およびセンス鎖は、自己相補性であり（すなわち、各々の鎖が、他の鎖におけるヌクレオチド配列に対して相補性であるヌクレオチド配列を含む）；例えば、ここでこのアンチセンス鎖およびセンス鎖は、二重鎖または二本鎖構造を形成し、例えば、この二本鎖領域は、約１５〜約３０塩基対、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基対であり；このアンチセンス鎖は、標的核酸分子におけるヌクレオチド配列またはその一部に対して相補性であるヌクレオチド配列を含み、およびこのセンス鎖は、標的核酸分子に対応するヌクレオチド配列またはその一部を含む（例えば、ｓｉＲＮＡ分子の約１５〜約２５以上のヌクレオチドは、標的核酸またはその一部に相補性である）。あるいは、ｓｉＲＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、ここでこのｓｉＲＮＡの自己相補性のセンスおよびアンチセンス領域を、核酸ベースのリンカーまたは非核酸ベースのリンカー（単数または複数）によって連結する。
【０３１６】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖は、約１〜約６ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有するが、２〜４ヌクレオチド長であってもよい。典型的には、この３’オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、１つの鎖は、３’オーバーハングを有し、他の鎖は、平滑末端であるか、またはオーバーハングも有する。オーバーハングの長さは、お互いの鎖について同じであってもまたは異なってもよい。ｓｉＲＮＡの安定性をさらに向上するために、３’オーバーハングを、分解に対して安定化してもよい。
【０３１７】
ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに対して有意な配列類似性を有し、その結果、ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに対合して、ＲＮＡ干渉機構を通じて標的ＲＮＡの配列特異的な分解を生じ得る。必要に応じて、ｓｉＲＮＡ分子は、３’ヒドロキシル基を含む。一実施形態では、ＲＮＡは、プリンヌクレオチド、例えば、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドを含むことによって安定化される。あるいは、修飾アナログによるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’−デオキシチミジンによるウリジンヌクレオチド３’オーバーハングの置換は、耐容され、ＲＮＡｉの有効性に影響することはない。２’−ヒドロキシルの非存在は、組織培養培地におけるオーバーハングのヌクレアーゼ耐性を有意に増強し、かつインビボで有益であり得る。
【０３１８】
ｓｉＲＮＡは、二重鎖、非対称性二重鎖、ヘアピンまたは非対称性ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであってもよく、自己相補性センスおよびアンチセンス領域を有し、ここでこのアンチセンス領域は、別々の標的核酸分子におけるヌクレオチド配列またはその一部に対して相補性であるヌクレオチド配列を含み、そしてこのセンス領域は、標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を有している。ｓｉＲＮＡは、環状の一本鎖のポリヌクレオチドであってもよく、これは２つ以上のループ構造およびステムを有し、これは自己相補性センスおよびアンチセンス領域を含んでおり、ここでこのアンチセンス領域は、標的核酸分子におけるヌクレオチド配列またはその一部に対して相補性であるヌクレオチド配列を含み、およびこのセンス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有しており、およびここでこの環状ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介できる活性なｓｉＲＮＡ分子を生成するためにインビボまたはインビトロのいずれかで処理されてもよい。
【０３１９】
ｓｉＲＮＡはまた、標的核酸分子におけるヌクレオチド配列またはその一部に対して相補性のヌクレオチド配列を有する一本鎖のポリヌクレオチドを含んでもよく（例えば、ここでこのようなｓｉＲＮＡ分子は、標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部のｓｉＲＮＡ分子内に存在する必要はない）、ここでこの一本鎖のポリヌクレオチドはさらに、末端のリン酸基、例えば、５’−リン酸塩（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３−５７４およびＳｃｈｗａｒｚら、，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，１０，５３７−５６８を参照のこと）、または５’，３’−二リン酸塩を含んでもよい。特定の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、別々のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含み、ここで、このセンスおよびアンチセンス領域は、当該分野で公知であるヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合されるか、あるいは、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および／またはスタッキング相互作用によって非共有結合的に連結される。
【０３２０】
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介する能力を有する天然のＲＮＡと十分に同様であることだけを必要とする。従って、ｓｉＲＮＡは、遺伝子変異、株多様性または進化的分岐に起因して予期され得る配列の変動に耐容し得る。標的配列とＲＮＡｉ構築物の配列との間の耐容されるヌクレオチドミスマッチの数は、５塩基対中１以下、または１０塩基対中１以下、または２０塩基対中１以下、または５０塩基対中１以下である。いくつかの実施形態では、この剤は、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、または少なくとも１８または１９〜約２１〜２３または２４〜２９ヌクレオチド長の配列のような、１５〜２９ヌクレオチド長の間の評価のウインドウにわたって標的転写物と少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、８４％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の正確な配列相補性を有する鎖を含む。言い換えれば、約１９〜２５ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡでは、およそ４個以下のミスマッチを有するｓｉＲＮＡが一般に耐容され、３ミスマッチ、２ミスマッチおよび／または１ミスマッチ以下を有するｓｉＲＮＡも同様である。
【０３２１】
ｓｉＲＮＡ二重鎖の中心におけるミスマッチは、許容されにくく、本質的に標的ＲＮＡの切断を無効にし得る。対照的に、ｓｉＲＮＡの３’ヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖の３’ヌクレオチド）は典型的には、標的認識の特異性に対して有意に寄与しない。詳細には、標的ＲＮＡに対して相補的であるｓｉＲＮＡ配列の３’残基（例えば、ガイド配列）は一般には、標的ＲＮＡ切断にそれほど重要ではない。
【０３２２】
本明細書に記載される複合体、粒子または組成物による送達に適切なｓｉＲＮＡは、標的遺伝子転写物の一部とハイブリダイズできるヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）を含むと機能的に定義され得る（例えば、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃のハイブリダイゼーション１２〜１６時間；続いて洗浄）。追加の好ましいハイブリダイゼーション条件としては、７０℃で、１×ＳＳＣ中、または５０℃で１×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、５０％のホルムアミド、続いて、７０℃で０．３×ＳＳＣで洗浄、または７０℃で４×ＳＳＣ中で、または５０℃で４×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、５０％ホルムアミド、続いて６７℃で１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。５０塩基対長未満であると予想されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）よりも５〜１０℃下でなければならず、ここでＴｍは、以下の式によって決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。１８〜４９塩基対長のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％）（６００／Ｎ）であり、ここで、Ｎは、ハイブリッドの塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣのための［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）ついて）。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件のさらなる例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９および１１、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ら、編集，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．１０および６．３−６．４（参照によって本明細書に援用される）に提供される。同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも約１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３２、３５、３７、４０、４２、４５、４７または５０塩基であってもよい。
【０３２３】
本明細書に用いる場合、ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はなく、さらに、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを包含してもよい。特定の実施形態では、治療用のｓｉＲＮＡは、ヌクレオチドを含有する２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）を欠く。特定の実施形態では、治療用ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介するために２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要とせず、従って、ｓｉＲＮＡは、なんらリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まない。ＲＮＡｉを支持するためにリボヌクレオチドの存在を必要としない、このようなｓｉＲＮＡ分子は、しかし、結合したリンカー（単数または複数）、または他の結合するかもしくは会合した基、部分もしくは鎖（２’−ＯＨ基を有する１つ以上のヌクレオチドを含有する）を有してもよい。必要に応じて、ｓｉＲＮＡ分子は、ヌクレオチド位置の約５、１０、２０、３０、４０、または５０％でリボヌクレオチドを含んでもよい。
【０３２４】
他の有用な治療用ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチド、ならびに具体的には米国特許第５，４８９，６７７号に教示されるような、ＣＨ２ＮＨＯＣＨ２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＯＣＨ２、ＣＨ２ＯＮ（ＣＨ３）ＣＨ２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２、およびＯＮ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２（ここで天然のホスホジエステル骨格は、ＯＰＯＣＨ２として示される）、および米国特許第５，６０２，２４０号に開示されるアミド骨格を有してもよい。
【０３２５】
置換糖部分がまた、修飾されたオリゴヌクレオチドに含まれてもよい。本明細書に記載される複合体、粒子または組成物による送達のための治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’位置で以下のうち２つ以上を含んでもよい：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルキル；Ｏ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル。ここで、このアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。有用な修飾としてはまた、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（Ｃ２）ｎＣＨ３］２を挙げることができ、ここでｎおよびｍは、１〜約１０である。さらに、オリゴヌクレオチドは、２’位置で以下のうちの１つを含んでもよい：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インタカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態または薬理学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。他の有用な置換基としては、アルコキシアルコキシ基、例えば、２’−メトキシエトキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）、ジメチルアミノオキシエトキシ基（２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２）、またはジメチルアミノ−エトキシエトキシ基（２’−ＯＣＨ２ＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ２）２）が挙げられる。他の修飾としては、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、または２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の修飾がまた、オリゴヌクレオチド内の他の位置で、例えば、３’末端ヌクレオチド上の、または２’−５’連結オリゴヌクレオチド中の糖の３’位置、および５’末端ヌクレオチドの５’位置で行われ得る。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチル部分のような糖模倣物を有してもよい。このような置換糖部分の調製を教示する引用文献としては、米国特許第４，９８１，９５７号および同第５，３５９，０４４号が挙げられる。
【０３２６】
本明細書に記載されるポリマー−核酸剤の複合体、粒子または組成物で処方されたｓｉＲＮＡとしては、天然に存在するヌクレオシド類（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、インターカレート塩基、修飾された糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）を挙げることができる。適切な修飾された核酸塩基類としては、他の合成のおよび天然の核酸塩基類、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換のアデニン類およびグアニン類、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。他の有用な核酸塩基類としては、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるものが挙げられる。
【０３２７】
本明細書に記載されるポリマー−核酸剤の複合体、粒子または組成物への組み込みのための治療用ｓｉＲＮＡは、長い二本鎖ＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡから化学的に合成されても、またはそれに由来してもよい。ｓｉＲＮＡは、酵素的に、または部分的／全体的有機合成によって生成されてもよく、任意の修飾されたリボヌクレオチドを、インビトロの酵素的合成または有機合成によって導入してもよい。少なくとも一部はＲＮＡから構成される一本鎖の種は、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖として機能してもよいし、またはプラスミドベクターから発現されてもよい。
【０３２８】
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」とは、当該分野で概して公知であるように細胞中の遺伝子発現を阻害または下方制御するプロセスであって、低分子干渉核酸分子によって媒介されるプロセスを意味する。さらに、本明細書において用いる場合、ＲＮＡｉという用語は、配列特異的なＲＮＡ干渉、例えば、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、または後成的遺伝学を記載するために用いられる他の用語に等価的であることが意図される。例えば、本明細書に記載される複合体、粒子または組成物による送達のために適切な治療用ｓｉＲＮＡ分子は、転写後レベルまたは転写前レベルの両方で遺伝子を後成的にサイレンシングし得る。非限定的な実施例では、本発明のｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現の後成的な調節は、遺伝子発現を変更するためのクロマチン構造またはメチル化パターンのｓｉＲＮＡ媒介性の修飾から生じ得る。別の非限定的な実施例では、ｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、ＲＩＳＣを介したＲＮＡ（コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡのいずれか）のｓｉＲＮＡ媒介性切断、または当該分野で公知のような翻訳阻害から生じ得る。別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、転写阻害から生じ得る。ＲＮＡｉはまた、マイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡのように作用するｓｉＲＮＡによる翻訳抑制も含む。ＲＮＡｉは、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の誘導またはｓｉＲＮＡの細胞内の産生（例えば、プラスミドまたは導入遺伝子由来）によって開始されて、１つ以上の標的遺伝子の発現をサイレンシングし得る。あるいは、ＲＮＡｉは、細胞中に天然に存在して、外来のＲＮＡ類（例えば、ウイルスのＲＮＡ類）を除去する。天然のＲＮＡｉは、他の同族のＲＮＡ配列に対して分解機構を指向する、前駆体ｄｓＲＮＡのダイサー指向性（ｄｉｃｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）断片化を介して進行する。
【０３２９】
本明細書に用いる場合、ｓｉＲＮＡという用語は、配列特異的ＲＮＡｉを媒介し得る核酸分子を記載するために用いられる他の用語と等価であることを意味し、かつ例えば、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉性オリゴヌクレオチド、低分子干渉性核酸、低分子干渉性の修飾されたオリゴヌクレオチド、化学的に−修飾されたｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）などを包含する。
【０３３０】
ｍｉＲＮＡ
一実施形態では、本明細書に記載されるポリマー−核酸剤の複合体、粒子または組成物による送達に適切な治療用核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡ切断、翻訳抑制／阻害または異質染色質のサイレンシングのいずれかによる標的メッセンジャーＲＮＡの発現を調節する低分子二本鎖ＲＮＡを意味する（例えば、Ａｍｂｒｏｓ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３１，３５０−３５５；Ｂａｒｔｅｌ，２００４，Ｃｅｌｌ，１１６，２８１−２９７；Ｃｕｌｌｅｎ，２００４，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，１０２，３−９；Ｈｅら、，２００４，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，５，５２２−５３１；およびＹｉｎｇら、，２００４，Ｇｅｎｅ，３４２，２５−２８を参照のこと）。マイクロＲＮＡ類（ｍｉＲＮＡ類）は、約２２ヌクレオチド長の低分子非コードポリヌクレオチドであって、それらのｍＲＮＡ標的の直接破壊または翻訳抑制を指向する。
【０３３１】
一実施形態では、治療用マイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ分子のセンス鎖もしくはセンス領域と、アンチセンス鎖もしくはアンチセンス領域の間、またはｍｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖もしくはアンチセンス領域と、対応する標的核酸分子との間で部分的な相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有する。例えば、部分的な相補性は、二本鎖の核酸分子内に、種々のミスマッチまたは非塩基対のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５またはそれ以上のミスマッチまたは塩基対でないヌクレオチド、例えば、ヌクレオチドバルジ）を含んでもよく、その構造は、ｍｉＲＮＡ分子のセンス鎖もしくはセンス領域と、アンチセンス鎖もしくはアンチセンス領域の間、またはｍｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖もしくはアンチセンス領域と、対応する標的核酸分子との間で生じる、バルジ、ループ、またはオーバーハングを生じ得る。マイクロＲＮＡ翻訳抑制経路を介して作用する剤は、標的と形成された二重鎖中に少なくとも１つのバルジおよび／またはミスマッチを含む。特定の実施形態では、ガイド鎖および標的転写物によって形成される二重鎖中のＧＵまたはＵＧ塩基は、ＲＮＡｉ剤が、転写物に標的されるか否かを決定する目的に関してミスマッチとはみなされない。
【０３３２】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリマー−核酸剤の複合体、粒子または組成物による送達のために適切な治療用核酸は、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）であり、これは、例えば、それらの分解を促進することによって、相補的なｍｉＲＮＡの阻害をし得る化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドである（例えば、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔら、，Ｎａｔｕｒｅ，４３８：６８５−６８９，２００５を参照のこと）。
【０３３３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
治療用の「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本明細書に記載されるポリマー−核酸剤の複合体、粒子または組成物を介する送達に適切である。「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらのアナログ類のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、天然に存在する核酸塩基類、糖類および共有結合のヌクレオシド間（骨格）連結、ならびに、同様に機能する天然には存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドを包含する。このような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、所望の特性、例えば、細胞取り込みの向上、核酸標的に対するの親和性の向上、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増大のおかげで、天然型よりも好ましい場合が多い。
【０３３４】
治療用のアンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的には、約１０〜約５０ヌクレオチド長（例えば、１２〜４０、１４〜３０、または１５〜２５ヌクレオチド長）である。１５〜２３ヌクレオチド長であるアンチセンスオリゴヌクレオチドが特に有用である。しかし、１０ヌクレオチド未満しか含まないアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちの１つの一部）は、標的遺伝子の発現を阻害する所望の活性を示す限りは、本発明内に包含されると理解される。
【０３３５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸中の接近可能な領域と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列から本質的になり得る。しかし、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、いずれかの末端で５〜１０ヌクレオチドの追加の隣接する配列を含み得る。隣接配列としては、例えば、標的核酸の追加の配列、増幅プライマーに対して相補性の配列、または制限酵素部位に対応する配列を挙げることができる。
【０３３６】
有効性を最大化するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計にさらなる基準を適用してもよい。このような基準は、当該分野で周知であり、かつ例えば、オリゴヌクレオチドプライマーの設計に広く用いられる。これらの基準としては、潜在的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの予想の二次構造の欠失、適切なＧおよびＣヌクレオチドの含量（例えば、ほぼ５０％）、および、例えば、単一ヌクレオチドリピートのような配列モチーフ（例えば、ＧＧＧＧラン）がないことが挙げられる。
【０３３７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、限定するものではないが、下に記載されるようなオリゴヌクレオチドアナログを含む、他のオリゴマーのアンチセンス化合物を包含する。当該分野で公知のように、ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせであり、ここで塩基部分は通常は複素環式塩基である。このような複素環式塩基の２つの最も一般的な分類は、プリン類およびピリミジン類である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関しては、リン酸基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれかに連結され得る。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は、隣接するヌクレオシドをお互いに共有結合して、直鎖状ポリマー分子を形成する。この直鎖状ポリマー分子のそれぞれの末端は、環状分子を形成するようにさらに結合され得るが、直鎖状分子が一般には好ましい。オリゴヌクレオチド分子内では、リン酸基は通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するとされる。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常な連結または骨格は、３’〜５’ホスホジエステル連結である。
【０３３８】
本明細書に記載されるポリマー−核酸剤の複合体、粒子または組成物による送達のために適切な治療用のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、修飾された骨格または天然ではないヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書において用いる場合、修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドとしては、骨格中にリン原子を有するもの、および骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的に関して、および当該分野で時に言及されるとおり、それらのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチドであるとみなされ得る。
【０３３９】
修飾されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート類、鏡像異性のホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエステル類、アミノアルキルホスホトリエステル類、メチルおよび他のアルキルホスホネート類（例えば、３’−アルキレンホスホネート類および鏡像異性のホスホネート類）、ホスフィン酸塩類、ホスホロアミド酸類（例えば、３’−アミノホスホロアミド酸およびアミノアルキルホスホロアミド酸類）、チオノホスホロアミド酸類、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、およびボラノリン酸塩類（正常な３’−５’連結を有する）、ならびにこれらの２’−５’連結されたアナログ類、および逆の極性を有するもの（ここでヌクレオシド単位の隣接する対は、３’−５’から５’−３’に、または２’−５’から５’−２’に連結される）。種々の塩、混合塩および遊離の酸型もまた含まれる。このような骨格オリゴヌクレオチドの調製を教示する文献は、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号および同第５，７５０，６６６号に示される。
【０３４０】
その中にリン原子を含まない修飾されたオリゴヌクレオチド骨格を有する治療用のアンチセンス分子は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子のまたは複素環式ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有してもよい。これらとしては、モルホリノ連結を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から一部は形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸塩骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合のＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有するその他のものが挙げられる。このような修飾された骨格オリゴヌクレオチドの調製を教示する引用文献は、例えば、米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，５９６，０８６号に提供される。
【０３４１】
別の実施形態では、治療用のアンチセンス化合物は、オリゴヌクレオチドアナログであり、ここではヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間連結（すなわち、骨格）の両方が新規な基で置き換えられているが、塩基単位は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持されている。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたこのようなオリゴヌクレオチドアナログの１つは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖−骨格は、アミド含有骨格（例えば、アミノエチルグリシン骨格）で置き換えられている。核酸塩基類は、保持され、かつ骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。このような修飾された骨格オリゴヌクレオチドの調製を教示する引用文献は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００（１９９１）、および米国特許第５，５３９，０８２号に示される。
【０３４２】
他の有用な治療用のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド類、ならびに具体的には、米国特許第５，４８９，６７７号に教示されるようなＣＨ２ＮＨＯＣＨ２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＯＣＨ２、ＣＨ２ＯＮ（ＣＨ３）ＣＨ２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２、およびＯＮ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２（ここで天然のホスホジエステル骨格は、ＯＰＯＣＨ２として示される）、および米国特許第５，６０２，２４０号に開示されるアミド骨格を有し得る。
【０３４３】
置換された糖部分はまた、修飾されたオリゴヌクレオチドに含まれ得る。本明細書に記載されるポリマー−核酸剤の複合体、粒子または組成物による送達のための治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドは２’位置で以下のうちの１つ以上を含んでもよい：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルキル；Ｏ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル。ここで、このアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。有用な修飾としてはまた、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（Ｃ２）ｎＣＨ３］２を挙げることができ、ここでｎおよびｍは、１〜約１０である。さらに、オリゴヌクレオチドは、２’位置で以下のうちの１つを含んでもよい：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インタカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態または薬理学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。他の有用な置換基としては、アルコキシアルコキシ基、例えば、２’−メトキシエトキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）、ジメチルアミノオキシエトキシ基（２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２）、またはジメチルアミノ−エトキシエトキシ基（２’−ＯＣＨ２ＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ２）２）が挙げられる。他の修飾としては、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、または２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の修飾がまた、オリゴヌクレオチド内の他の位置で、例えば、３’末端ヌクレオチド上の、または２’−５’連結オリゴヌクレオチド中の糖の３’位置、および５’末端ヌクレオチドの５’位置で作製され得る。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチル部分のような糖模倣物を有してもよい。このような置換糖部分の調製を教示する引用文献としては、米国特許第４，９８１，９５７号および同第５，３５９，０４４号が挙げられる。
【０３４４】
治療用のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基修飾または置換を含んでもよい。本明細書に用いる場合、「修飾されていない」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基類としては、他の合成のおよび天然の核酸塩基類、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換のアデニン類およびグアニン類、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを挙げることができる。他の有用な核酸塩基類としては、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるものが挙げられる。
【０３４５】
特定の核酸塩基置換は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大するために特に有用であり得る。例えば、５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃で核酸二重鎖安定性を増大することが示されている（Ｓａｎｇｈｖｉら、編集、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．２７６−２７８，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９９３））。他の有用な核酸塩基置換としては、５−置換ピリミジン類、６−アザピリミジン類およびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン類、例えば、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが挙げられる。
【０３４６】
所定のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける全ての核酸塩基について均一に修飾されることは必須ではない。上述の修飾のうちの２つ以上が、単一のオリゴヌクレオチドに組み込まれても、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込まれてさえもよい。本明細書に記載される複合体、粒子または組成物による送達に適切な治療用の核酸はまた、キメラのオリゴヌクレオチドであるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。「キメラの」アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各々が少なくとも１つのモノマー単位からできている、２つ以上の化学的に別個の領域を含んでもよい（例えば、オリゴヌクレオチドの場合にはヌクレオチド）。キメラのオリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも１つの領域を含み、ここで、このオリゴヌクレオチドは、例えば、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取り込みの増大、および／または標的核酸に対する親和性の増大を付与するように修飾される。例えば、キメラのオリゴヌクレオチドの領域は、標的ｍＲＮＡとアンチセンスのオリゴヌクレオチドとの間で形成されるようなＲＮＡ：ＤＮＡのＲＮＡ鎖を切断し得る、ＲＮａｓｅＨのような酵素のための基質として機能し得る。従って、ＲＮａｓｅ  Ｈによるこのような二重鎖の切断は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を大きく向上し得る。
【０３４７】
治療用のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビトロで合成され得る。本発明によって用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、固相合成のような、公知の方法を通じて都合よく産生され得る。同様の技術がまた、修飾されたオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート類またはアルキル化誘導体を調製するために用いられ得る。
【０３４８】
アンチセンスポリヌクレオチドとしては、遺伝子またはｍＲＮＡに相補的である配列を含む。アンチセンスポリヌクレオチドとしては、限定するものではないが以下が挙げられる：モルホリノ類、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなど。ポリヌクレオチド−ベースの発現インヒビターは、インビトロで重合化された組み換え体であってもよく、キメラの配列を含んでもよく、またはこれらの基の誘導体であってもよい。このポリヌクレオチドベースの発現インヒビターは、標的のＲＮＡおよび／または遺伝子が阻害されるような、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成のヌクレオチド、または任意の適切な組み合わせを含んでもよい。
【０３４９】
本明細書において用いる場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、水素結合を意味し、これは、相補性ヌクレオシドとヌクレオチド塩基との間の、ワトソン−クリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合であり得る。例えば、アデニンとチミン、およびグアニンとシトシンは、それぞれ、水素結合の形成を通じて対合する、相補的な核酸塩基類（当該分野ではしばしば、単に「塩基」と呼ばれる）である。本明細書において用いる場合、「相補性の、相補的な」とは、２つのヌクレオチドの間の正確な対合の能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置でのヌクレオチドが、標的核酸分子中のヌクレオチドと水素結合し得るならば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸は、その位置でお互いに相補性であるとみなされる。オリゴヌクレオチドおよび標的核酸は、お互いの分子中の対応する位置の十分な数が、お互いと水素結合し得るヌクレオチドによって占有される場合、お互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズ可能」とは、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間で安定かつ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性または正確な対合を指すものである。
【０３５０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的核酸の配列に対して１００％相補性である必要はないことが当該分野では理解される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、（ａ）標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの結合が、標的核酸の正常な機能を妨害し、および（ｂ）特異的な結合が所望される条件下において、すなわち、インビトロアッセイが行われる条件下、またはインビボアッセイもしくは治療用途のための生理学的条件下で、非標的配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの非特異的な結合を回避するのに十分な相補性がある場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
【０３５１】
インビトロのストリンジェンシー条件は、温度、時間および塩濃度に依存する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９）を参照のこと）。典型的には、高度から中度のストリンジェンシーを、インビトロの特異的なハイブリダイゼーションに用い、その結果、実質的に同様の核酸の間でハイブリダイゼーションが生じるが、類似でない核酸の間では生じない。特異的なハイブリダイゼーション条件は、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍの塩化ナトリウム／０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）で１時間４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて、１×ＳＳＣ中で４０℃で１０回、および１×ＳＳＣ中で室温で５×の洗浄である。
【０３５２】
インビボのハイブリダイゼーションは、標的配列とのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを管理する細胞内条件（例えば、生理学的なｐＨおよび細胞内イオン条件）からなる。インビボ条件は、比較的低ストリンジェンシーの条件によってインビトロで模倣され得る。例えば、ハイブリダイゼーションは、インビトロで２×ＳＳＣ（０．３Ｍの塩化ナトリウム／０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ中で３７℃で行われ得る。４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する洗浄溶液は、１×ＳＳＣ中で４５℃での最終洗浄によって、３７℃で用いられ得る。
【０３５３】
アンチセンス分子とその標的核酸との特異的なハイブリダイゼーションは、標的核酸の正常な機能を妨害し得る。標的ＤＮＡ核酸については、アンチセンス技術は、複製および転写を中断し得る。標的ＤＮＡ核酸については、アンチセンス技術は、例えば、タンパク質翻訳の部位に対するＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の転位、１つ以上のｍＲＮＡ種を生じるＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡの触媒活性を混乱させ得る。標的核酸機能でのこのような干渉の全体的な効果は、標的遺伝子をコードする核酸の場合、標的遺伝子の発現の阻害である。本発明の状況では、「標的遺伝子の発現阻害」とは、標的ポリペプチドのレベルの減少、または標的ポリペプチドの完全な非存在を生じる標的核酸配列の転写および／または翻訳を撹乱することを意味する。
【０３５４】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は好ましくは、標的核酸分子内の特異的な標的で指向され得る。標的化プロセスは、アンチセンス相互作用が生じ得、その結果、所望の効果、例えば、標的遺伝子発現の阻害が生じる標的核酸分子内の部位（単数または複数）の特定を包含する。伝統的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドに好ましい標的部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始または終止コドンを包含する領域を含んだ。さらに、ＯＲＦは、アンチセンス技術で効果的に標的とされ、５’および３’非翻訳領域も同様である。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、イントロン領域およびイントロン−エキソン接合領域で首尾よく指向されている。
【０３５５】
しかし、標的核酸の配列およびドメイン構造（例えば、翻訳開始コドン、エキソンまたはイントロンの位置）の単純な知識では、一般には、特定の領域に指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的核酸の転写および／または翻訳に効率的に結合して阻害することを保証するのに十分ではない。その天然の状態では、ｍＲＮＡ分子は、複雑な二次構造および三次構造に折り畳まれ、このような構造の内部にある配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに接近できない。有効性を最大化するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、最も接近できる標的ｍＲＮＡの領域、すなわち、折り畳まれたｍＲＮＡ分子の表面または近位の領域に対して指向され得る。ｍＲＮＡ分子の接近可能な領域は、ＲｉｂｏＴＡＧ（商標）、またはｍＲＮＡ接近可能部位標的（Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  Ｓｉｔｅ  Ｔａｇｇｉｎｇ）（ＭＡＳＴ）、技術を用いることを含めて、当該分野で公知の方法によって特定され得る。ＲｉｂｏＴＡＧ（商標）技術は、ＰＣＴ出願番号ＳＥ０１／０２０５４で開示される。
【０３５６】
一旦、１つ以上の標的部位が特定されれば、標的に対して十分に相補性である（すなわち、所望の効果を得るために十分な強度および特異性でハイブリダイズする）アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成することができる。標的核酸の発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果は、例えば、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、または免疫組織化学染色を用いて、標的ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定することによって評価され得る。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、これは、標的核酸の複数の接近可能な領域を標的するために有用であり得る。このような実施形態では、お互いが特異的に、異なる接近可能領域にハイブリダイズする複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてもよい。複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを一緒にまたは順次用いてもよい。いくつかの実施形態では、これは、複数の標的核酸の複数の接近可能領域を標的するために有用であり得る。
【０３５８】
アプタマー
本明細書に記載されるポリマー−核酸剤の複合体、粒子または組成物による送達のために適切な治療用核酸は、アプタマー（これはまた、核酸リガンドまたは核酸アプタマーとも呼ばれる）であってもよく、アプタマーとは、標的分子に対して特異的に結合するポリヌクレオチドであり、ここで、その天然の設定で標的分子によって認識される配列とは別個である配列を核酸分子が有するポリヌクレオチドである。あるいは、アプタマーは、標的分子に結合する核酸分子（ここで標的分子は核酸に天然には結合しない）であってもよい。この標的分子は、目的の任意の分子であってもよい。この標的分子は、例えば、ポリペプチド、炭水化物、核酸分子または細胞であってもよい。アプタマーの標的は、このアプタマーに結合する三次元の化学構造である。例えば、核酸を標的するアプタマー（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、ヘアピンループのような他の構造で遮断される核酸標的に対して相補的なワトソンクリック塩基対合を介して結合する領域を含んでもよい。別の実施形態では、アプタマーは、リガンド−結合ドメインで標的タンパク質に結合し、それによって天然に存在するリガンドと標的タンパク質との相互作用を妨げる。
【０３５９】
一実施形態では、アプタマーは、特定の発達段階または特定の疾患状態にある細胞または組織に結合する。標的は、細胞の表面上の抗原、例えば、細胞表面受容体、インテグリン、膜貫通タンパク質、イオンチャネルまたは膜輸送タンパク質である。一実施形態では、標的は、腫瘍マーカーである。腫瘍マーカーは、正常組織に存在せず、腫瘍に存在する抗原であってもよいし、または正常組織よりも腫瘍に広く存在する抗原であってもよい。
【０３６０】
核酸リガンドを形成する核酸は、天然に存在するヌクレオシド類、修飾されたヌクレオシド類、１つ以上のヌクレオシド類の間に挿入された炭化水素リンカー（例えば、アルキレン）またはポリエーテルリンカー（例えば、ＰＥＧリンカー）を有する天然に存在するヌクレオシド類、１つ以上のヌクレオシド類の間に挿入された、炭化水素またはＰＥＧリンカーを有する修飾されたヌクレオシド類、あるいはそれらの組み合わせから構成され得る。一実施形態では、核酸リガンドのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドは、炭化水素リンカーまたはポリエーテルリンカーで置換されてもよく、ただし、この核酸リガンドの結合親和性および選択性は、置換によって実質的に低減されない（例えば、標的のためのアプタマーの解離定数は典型的には、約１×１０−６Ｍ以下である）ことを条件とする。
【０３６１】
アプタマーは、任意の方法、例えば、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）によって調製され得る。核酸リガンドを得るためのＳＥＬＥＸプロセスは、その教示全体が、参照によって本明細書に援用される、米国特許第５，５６７，５８８号に記載される。
【０３６２】
本明細書に記載される粒子内では、核酸剤は、別の部分、例えば、上記のポリマー、本明細書に記載されるカチオン性部分、または親水性ポリマー、例えば、ＰＥＧに結合されてもよい。核酸剤はまた、「結合されない」状態であってもよく、このことは、別の部分に結合されないことを意味する。粒子が複数の核酸剤を含む場合、いくつかの核酸剤は別の部分に結合されてもよく、いくつかは結合されなくてもよい。例えば、特定の実施形態では、粒子中の核酸剤因子は、粒子のポリマーに結合される、この核酸剤は、粒子中の任意のポリマー、例えば、疎水性ポリマー、または親水性部分および疎水性部分を含んでいるポリマーに結合されてもよい。
【０３６３】
特定の実施形態では、核酸は、粒子中で「結合されていない」。核酸剤は、１つ以上の非共有結合的な相互作用、例えば、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、水素結合、双極子−双極子相互作用、イオン性相互作用、およびπスタッキングを通じて粒子のポリマーまたは他の構成要素と会合され得る。
【０３６４】
核酸剤は、本明細書に記載されるポリマー−核酸剤の複合体、粒子または組成物の種々の量で存在し得る。粒子中に存在する場合、核酸剤は、ある量、例えば、この粒子の約０．１〜約５０重量％（例えば、この粒子の約１％〜約５０重量％、約１〜約３０重量％、この粒子の約１〜約２０重量％、この粒子の約４〜約２５重量％、またはこの粒子の約５〜約１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０重量％）で存在してもよい。
【０３６５】
追加の構成要素
いくつかの実施形態では、この粒子はさらに、界面活性剤または界面活性剤の混合物を含む。いくつかの実施形態では、この界面活性剤は、ＰＥＧ、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポロキサマー、ヘキシルデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ポリソルベート、ポリオキシエチレンエステル、ＰＥＧ−脂質（例えば、ＰＥＧ−セラミド、ｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコール１０００コハク酸塩）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］、レシチン、またはそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、この界面活性剤は、ＰＶＡであり、およびこのＰＶＡは、約３ｋＤａ〜約５０ｋＤａ（例えば、約５ｋＤａ〜約４５ｋＤａ、約７ｋＤａ〜約４２ｋＤａ、約９ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、または約１１〜約２８ｋＤａ）であり、最大で約９８％まで加水分解される（例えば、約７５〜９５％、約８０〜９０％加水分解され、または約８５％加水分解される）。いくつかの実施形態では、ＰＶＡは、約２〜約２７ｃＰの粘度を有する。いくつかの実施形態では、ＰＶＡは、カチオン性ＰＶＡ（例えば、上記のような）であり、例えば、カチオン性部分、例えば、カチオン性ＰＶＡはまた、界面活性剤としても機能し得る。いくつかの実施形態では、この界面活性剤は、ポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、この界面活性剤は、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ  １５である。いくつかの実施形態では、この界面活性剤は、脂質（例えば、リン脂質）ではなく、または脂質を含まない。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、この粒子の最大約３５重量％まで（例えば、最大で約２０重量％または最大で約２５重量％まで、約１５％〜約３５重量％、約２０％〜約３０重量％、または約２３％〜約２６重量％）の量で存在する。
【０３６６】
いくつかの実施形態では、この粒子は、賦形剤、例えば、炭水化物成分、または安定化剤または凍結保護剤、例えば、本明細書に記載される炭水化物成分、安定化剤または凍結保護剤を伴う。理論によって束縛されることは望まないが、炭水化物成分は、安定化剤または凍結保護剤として作用し得る。いくつかの実施形態では、炭水化物成分、安定化剤または凍結保護剤は、１つ以上の糖類、糖アルコール類、炭水化物類（例えば、スクロース、マンニトール、シクロデキストリンまたはシクロデキストリンの誘導体（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、時には、本明細書では、ＨＰ−β−ＣＤと呼ばれる、またはスルホブチル−ＣＤ、時にはＣＹＴＯＳＯＬと呼ばれる））、塩、ＰＥＧ、ＰＶＰまたはクラウンエーテルを含む。いくつかの実施形態では、炭水化物成分、安定化剤または凍結保護剤は、２つ以上の炭水化物、例えば、本明細書に記載される２つ以上の炭水化物を含む。一実施形態では、この炭水化物成分、安定化剤または凍結保護剤は、環状炭水化物（例えば、シクロデキストリンまたはシクロデキストリンの誘導体、例えば、α−、β−、またはγ−、シクロデキストリン（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン））および非環状炭水化物を含む。例示的な非環状オリゴ糖類は、１０、８、６または４個未満の単糖類サブユニット（例えば、単糖類または二糖類（例えば、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース）またはそれらの組み合わせ）のものを含む。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、単糖類、例えば、糖アルコール（例えば、マンニトール）である。
【０３６７】
ある実施形態では、炭水化物成分、安定化剤または凍結保護剤は、第一のおよび第二の構成要素、例えば、環状炭水化物および非環状炭水化物、例えば、単糖、二糖または四糖を含む。
【０３６８】
一実施形態では、粒子に会合する環状炭水化物の非環状炭水化物に対する重量比は、本明細書に記載される重量比、例えば、０．５：１．５〜１．５：０．５である。
【０３６９】
ある実施形態では、この炭水化物成分、安定化剤または凍結保護剤は、以下のように、第一のおよび第二の構成要素（ここでは、ＡおよびＢと命名）を含む：
（Ａ）は環状炭水化物を含み、かつ（Ｂ）は二糖類を含む；
（Ａ）は２つ以上の環状炭水化物、例えば、β−シクロデキストリン（時には、本明細書では、β−ＣＤと呼ばれる）またはβ−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）は二糖類を含む；
（Ａ）は環状炭水化物、例えば、β−ＣＤまたはβ−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）は２つ以上の二糖類を含む；
（Ａ）は２つ以上の環状炭水化物を含み、および（Ｂ）は２つ以上の二糖類を含む；
（Ａ）はシクロデキストリン、例えば、β−ＣＤまたはβ−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）は二糖類を含む；
（Ａ）はβ−シクロデキストリン、例えば、β−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）は二糖類を含む；
（Ａ）はβ−シクロデキストリン、例えば、β−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）はスクロースを含む；
（Ａ）はβ−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）はスクロースを含む；
（Ａ）はβ−シクロデキストリン、例えば、β−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）はトレハロースを含む；
（Ａ）はβ−シクロデキストリン、例えば、β−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）はスクロースおよびトレハロースを含む。
（Ａ）はＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）はスクロースおよびトレハロースを含む。
【０３７０】
ある実施形態では  構成要素ＡおよびＢ以下の比で存在する：
０．５：１．５〜１．５：０．５。ある実施形態では、構成要素ＡおよびＢは、以下の比で存在する：３−１：０．４−２；３−１：０．４−２．５；３−１：０．４−２；３−１：０．５−１．５；３−１：０．５−１；３−１：１；３−１：０．６−０．９；および３：１：０．７。ある実施形態では、構成要素ＡおよびＢは、以下の比で存在する：２−１：０．４−２；３−１：０．４−２．５；２−１：０．４−２；２−１：０．５−１．５；２−１：０．５−１；２−１：１；２−１：０．６−０．９；および２：１：０．７。ある実施形態では、構成要素ＡおよびＢは、以下の比で存在する：２−１．５：０．４−２；２−１．５：０．４−２．５；２−１．５：０．４−２；２−１．５：０．５−１．５；２−１．５：０．５−１；２−１．５：１；２−１．５：０．６−０．９；２：１．５：０．７。ある実施形態では、構成要素ＡおよびＢ以下の比で存在する：２．５−１．５：０．５−１．５；２．２−１．６：０．７−１．３；２．０−１．７：０．８−１．２；１．８：１；１．８５：１および１．９：１。
【０３７１】
ある実施形態では、構成要素Ａは、シクロデキストリン、例えば、β−シクロデキストリン、例えば、β−ＣＤ誘導体、例えば、ＨＰ−β−ＣＤを含み、および（Ｂ）は、スクロースを含み、それらは、以下の比で存在する：２．５−１．５：０．５−１．５；２．２−１．６：０．７−１．３；２．０−１．７：０．８−１．２；１．８：１；１．８５：１および１．９：１。
【０３７２】
いくつかの実施形態では、この粒子の表面は、実質的に、界面活性剤またはポリマー、例えば、ＰＶＡ、ポリオキサゾリン、ポリビニルピロリジン、ポリヒドロキシルプロピルメタクリルアミド、ポリシアル酸、またはＰＥＧで被覆されてもよい。
【０３７３】
複合体
粒子の構成要素のうちの１つ以上は、複合体の形態であってもよく、すなわち、別の部分に結合されてもよい。例示的な複合体としては、核酸剤−ポリマーの複合体（例えば、核酸剤−疎水性ポリマーの複合体、核酸剤−疎水性−親水性ポリマーの複合体、または核酸剤−親水性ポリマーの複合体）、カチオン性部分−ポリマーの複合体（例えば、カチオン性部分−疎水性ポリマーの複合体またはカチオン性部分−疎水性−親水性ポリマーの複合体）、核酸剤−カチオン性ポリマーの複合体、および核酸剤−疎水性部分複合体が挙げられる。
【０３７４】
本明細書に記載される核酸剤−ポリマーの複合体は、ポリマー、（例えば、疎水性ポリマー、親水性ポリマー、または親水性−疎水性ポリマー）、および核酸剤を含む。本明細書に記載される核酸剤は、例えば、直接（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）、またはリンカーを通じて、本明細書に記載されるポリマーに結合され得る。核酸剤は、疎水性ポリマー（例えば、ＰＬＧＡ）、親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）または親水性−疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）に結合され得る。核酸剤は、ポリマーの末端に結合されてもよく、ポリマーの両方の末端に結合されてもよく、またはポリマー鎖にそった点に結合されてもよい。いくつかの実施形態では、複数の核酸剤は、ポリマー鎖にそった点に結合されてもよく、または複数の核酸剤が、多機能性のリンカーを介してポリマーの末端に結合されてもよい。核酸剤は、この核酸剤の２’、３’、または５’位置を通じて本明細書に記載のポリマーに結合されてもよい。核酸剤が二重鎖である実施形態では（例えば、ｓｉＲＮＡ）、この核酸剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖を通じて結合され得る。
【０３７５】
本明細書に記載されるカチオン性部分−ポリマーの複合体は、ポリマー、（例えば、疎水性ポリマー、または親水性部分および疎水性部分を含んでいるポリマー）およびカチオン性部分を含む。本明細書に記載されるカチオン性部分は、本明細書に記載されるポリマーに対して、例えば、直接（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）、またはリンカーを通じて結合され得る。カチオン性部分は、疎水性ポリマー（例えば、ＰＬＧＡ）または疎水性部分および親水性部分を有するポリマー（例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）に結合され得る。カチオン性部分は、ポリマーの末端に、ポリマーの両方の末端に、またはポリマー鎖に沿った点に結合され得る。いくつかの実施形態では、複数のカチオン性部分は、ポリマー鎖に沿った点に結合されてもよく、または複数のカチオン性部分は、多機能性のリンカーを通じてポリマーの末端に結合されてもよい。
【０３７６】
本明細書に記載の核酸剤−カチオン性ポリマーの複合体は、カチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ、カチオン性ＰＶＡ、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（リジン）、またはポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート）および核酸剤を含む。本明細書に記載される核酸剤は、本明細書に記載されるポリマーに対して、例えば、直接（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）、またはリンカーを通じて結合され得る。核酸剤は、疎水性ポリマー（例えば、ＰＬＧＡ）、親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）または疎水性部分および親水性部分を有しているポリマー（例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）に対して結合され得る。核酸剤は、ポリマーの末端に結合されても、ポリマーの両方の末端に結合されても、またはポリマー鎖に沿った点に結合されてもよい。いくつかの実施形態では、複数の核酸剤は、ポリマー鎖に沿った点に結合されてもよいし、または複数の核酸剤は、多機能性のリンカーを介してポリマーの末端に結合されてもよい。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、複合体は、本明細書に記載されるポリマーに結合される核酸剤と二重鎖を形成する核酸剤を含んでもよい。例えば、本明細書に記載されるポリマーは、核酸オリゴマー（例えば、一本鎖ＤＮＡ）に結合され得、これが、核酸剤とハイブリダイズして、二重鎖を形成する。二重鎖は、切断されて、インビボで、例えば細胞のヌクレアーゼで核酸剤が遊離され得る。
【０３７８】
結合の方式
本明細書に記載される核酸剤またはカチオン性部分は、直接（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）、本明細書に記載されるポリマーまたは疎水性部分（例えば、ポリマー）に結合され得る。この結合は、ポリマーの末端であっても、またはポリマーの骨格にそってもよい。核酸剤は、例えば、この核酸剤が、二本鎖である場合、センス鎖またはアンチセンス鎖を通じてポリマーまたはカチオン性部分に結合され得る。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、このポリマーに対する結合点で修飾され；例えば、核酸剤の末端ヒドロキシ部分（例えば、５’または３’末端ヒドロキシル部分）は、ポリマーと反応される官能基に変換される（例えば、ヒドロキシル部分は、チオール部分に変換される）。核酸剤またはカチオン性部分の反応性官能基は、直接（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）、ポリマー上の官能基に結合され得る。核酸剤またはカチオン性部分は、種々の連結、例えば、アミド、エステル、スルフィド（例えば、マレイミドスルフィド）、ジスルフィド、スクシンイミド、オキシム、シリルエーテル、炭酸塩またはカルバミン酸塩連結を介してポリマーに結合され得る。例えば、一実施形態では、核酸剤またはカチオン性部分のヒドロキシ基は、ポリマーのカルボン酸基と反応されて、核酸剤またはカチオン性部分とポリマーとの間の直接エステル結合を形成し得る。別の実施形態では、核酸剤またはカチオン性部分のアミノ基は、ポリマーのカルボン酸基に連結されて、アミド結合を形成し得る。ある実施形態では、チオール修飾された核酸剤は、ポリマーの末端上の反応性部分（例えば、アクリレートＰＬＧＡ、またはピリジニル−ＳＳ−活性化ＰＬＧＡ、またはマレイミド活性化ＰＬＧＡ）と反応されて、スルフィドもしくはジスルフィドまたはチオエーテル結合（すなわち、スルフィド結合）を形成し得る。例示的な結合方式としては、クリックケミストリーから生じるもの（例えば、アミド結合、エステル結合、ケタール、コハク酸塩、またはトリアゾールおよびＷＯ２００６／１１５５４７に記載のもの）が挙げられる。
【０３７９】
いくつかの実施形態では、核酸剤またはカチオン性部分は、直接（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）、ポリマーの末端に結合されてもよい。例えば、その末端でカルボン酸部分を有しているポリマーは、核酸剤またはカチオン性部分のヒドロキシ、チオール、またはアミノ部分に共有結合されて、エステル、チオエステル、またはアミド結合を形成し得る。別の実施形態では、核酸剤またはカチオン性部分は、直接（例えば、介在するスペーサー部分由来の原子の存在なしで）、ポリマーの骨格に沿って結合され得る。核酸剤は、例えば、核酸剤が、二本鎖である場合、センス鎖またはアンチセンス鎖を通じてポリマーまたはカチオン性部分に結合され得る。
【０３８０】
特定の実施形態では、特定の所望の複合体の形成を容易にするために適切な保護基が、他のポリマー末端上で、または薬剤上の他の反応性置換基の上で必要であり得る。例えば、ヒドロキシ末端を有するポリマーは、例えば、シリル基の群（例えば、トリメチルシリル）またはアシル基（例えば、アセチル）で保護され得る。核酸剤またはカチオン性部分は、例えば、アセチル基または他の保護基で保護されてもよい。
【０３８１】
いくつかの実施形態では、ポリマーに対する核酸剤またはカチオン性部分の結合のプロセスは、同じポリマーおよび同じ核酸剤またはカチオン性部分を有する複合体の混合物を含む組成物を生じ得るが、これは、核酸剤またはカチオン性部分とポリマーとの間の連結の性質が異なる。例えば、核酸剤またはカチオン性部分が、ポリマーと反応し得る複数の反応性部分を有する場合、核酸剤またはカチオン性部分およびポリマーの反応の生成物は、複合体であって、ここで、この核酸剤またはカチオン性部分がこのポリマーに対して、１つの反応性部分を介して結合されている複合体、および複合体であって、ここで、この核酸剤またはカチオン性部分がこのポリマーに対して、別の反応性部分を介して結合されている複合体を含んでもよい。例えば、核酸剤が、ポリマーに結合される場合、この反応の生成物は、複合体であって、核酸剤のある程度が核酸剤の３’末端を通じてポリマーに結合されており、核酸剤のある程度は、核酸剤の５’末端を通じてポリマーに結合されている複合体を含み得る。例えば、二本鎖の領域を有する核酸剤が、ポリマーに結合される場合、この反応の生成物は、複合体であって、二本鎖領域を有する核酸剤のある程度がセンス末端を通じてポリマーに結合されており、および二本鎖領域を有する核酸剤のある程度がアンチセンス末端に結合されている複合体を含み得る。同様に、カチオン性部分が、複数のアミンのような複数の反応基を有する場合、この反応の生成物は、複合体であって、カチオン性部分のある程度がこのポリマーに対して、第一の反応基を通じて結合されており、カチオン性部分のある程度がこのポリマーに対して、第二の反応基を通じて結合されている複合体を含み得る。
【０３８２】
いくつかの実施形態において、核酸剤またはカチオン性部分をポリマーに結合させるプロセスは、保護基の使用を包含し得る。例えば、核酸剤またはカチオン性部分が、ポリマーと反応し得る複数の反応性部分を有する場合、この核酸剤またはカチオン性部分は、特定の反応性位置において保護され得、それによりポリマーは、特定された位置を介して結合される。一実施形態では、この核酸または核酸剤は、ポリマーに結合される場合、この核酸剤の３’または５’末端で保護され得る。一実施形態では、二本鎖領域を有する核酸剤は、ポリマーに結合されるとき、センスまたはアンチセンス末端上で保護され得る。
【０３８３】
いくつかの実施形態において、上で記載されたものなどの選択的にカップリングされた生成物を組み合わせて、ポリマー−薬剤の複合体の混合物を形成してもよい。例えば、核酸剤の３’末端を通じて核酸剤に結合されるＰＬＧＡ、および核酸剤の５’末端を通じて核酸剤に結合されるＰＬＧＡが組み合わされて、２つの複合体の混合物を形成し得、かつこの混合物は、粒子の調製物中で用いられ得る。別の実施形態では、センス末端（例えば、センス鎖の５’末端）を通じてｓｉＲＮＡに結合されるＰＬＧＡ、およびアンチセンス末端を通じてｓｉＲＮＡに結合されるＰＬＧＡが組み合わされて、２つの複合体の混合物を形成し得、かつこの混合物は、粒子の調製物中で用いられ得る。
【０３８４】
ポリマー−薬剤の複合体は、ポリマーに結合した単一の核酸剤またはカチオン性部分を含み得る。この核酸剤またはカチオン性部分は、ポリマーの末端に、またはポリマー鎖に沿ったポイントに結合され得る。
【０３８５】
いくつかの実施形態において、複合体は、ポリマーに結合した複数の核酸剤またはカチオン性部分を含み得る（例えば、２、３、４、５、６、またはそれ以上の薬剤が、ポリマーに結合され得る）。核酸剤またはカチオン性部分は、同じであってもまたは異なってもよい。いくつかの実施形態において、複数の核酸剤またはカチオン性部分は、多機能性リンカーに結合し得る（例えば、ポリグルタミン酸リンカー）。いくつかの実施形態において、複数の核酸剤またはカチオン性部分は、ポリマー鎖に沿ったポイントに結合され得る。
【０３８６】
リンカー
核酸剤またはカチオン性部分は、ある部分、例えば、ポリマー、または疎水性部分、例えば、脂質に対して、またはお互いに対して、本明細書に記載のリンカーのようなリンカーを介して結合され得る。例えば：疎水性ポリマーは、カチオン性部分に結合され得；疎水性ポリマーは、核酸剤に結合され得；親水性−疎水性ポリマーは核酸剤に対して結合され得；親水性ポリマーは、核酸剤に結合され得；親水性ポリマーは、カチオン性部分に結合され得；または疎水性部分は、カチオン性部分に結合され得、もしくは核酸剤はカチオン性部分に結合され得る。核酸剤は、ある部分、例えば、本明細書に記載されるポリマーに対して、核酸剤の２’、３’、または５’位置、例えば、核酸剤の末端の２’、３’、または５’位置に対して（例えば、本明細書に記載されるリンカーを通じて）結合され得る。核酸剤が、二本鎖（例えば、ｓｉＲＮＡ）である実施形態では、核酸剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖を通じて結合され得る。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ポリマー（例えば、ＰＬＧポリマー、ここでこの結合は、ヒドロキシル末端またはカルボキシ末端である）の末端を通じて結合される。
【０３８７】
ある特定の実施形態では、複数のこのリンカー部分がポリマーに結合されて、リンカーを通じたこのポリマーへの複数の核酸剤またはカチオン性部分の結合を可能にし、例えば、ここでは、このリンカーは、ポリマー骨格に沿うようなポリマー上の複数の位置で結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、複数の第一部分がリンカーを通じて第二の部分に連結されることを可能にするように構成され、例えば、複数の核酸剤が、分岐リンカーを介したＰＬＧＡポリマーのような単一のポリマーに連結され得、ここでこの分岐したリンカーは、これを通じて核酸が結合され得る複数の官能基を含む。いくつかの実施形態では、この核酸剤またはカチオン性部分は、生物学的条件下（すなわち、切断可能な生理学的条件下）でリンカーから遊離される。別の実施形態では、単一のリンカーがポリマーに、例えば、ポリマーの末端で結合される。
【０３８８】
リンカーは、例えば、アルキレン（二価アルキル）基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、アルキレニルリンカーの１つ以上の炭素原子が、１つ以上のヘテロ原子または官能基（例えば、チオエーテル、アミノ、エーテル、ケト、アミド、シリルエーテル、オキシム，カルバミン酸塩、炭酸塩、ジスルフィド、または複素環式または複素環式芳香族部分）で置換され得る。例えば、アクリレートポリマー（例えば、アクリレートＰＬＧＡ）は、チオール修飾された核酸剤（例えば、チオール修飾されたｓｉＲＮＡ）と反応して、スルフィド結合（例えば、チオプロピオン酸塩連結）を通じて結合された核酸剤−ポリマーの複合体を形成することができる。アクリレートは、塩化アクリルアシルとポリマーのヒドロキシル末端との反応によってポリマーの末端に結合され得る（例えば、ＰＬＧポリマーのヒドロキシル末端、例えば、５０：５０のＰＬＧポリマー）。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、リンカーは、第二の部分に対する第一の部分の結合を可能にする官能基に加えて、追加の官能基を有する。いくつかの実施形態では、追加の官能基は、生理学的条件下で切断され得る。そのようなリンカーは、例えば、第一の活性化部分、例えば、核酸剤またはカチオン性部分、例えば、本明細書に記載の核酸剤またはカチオン性部分と、第二の活性化部分、例えば、ポリマー、例えば、本明細書に記載されるポリマーとの反応によって、形成され得、ポリマーに対する核酸剤またはカチオン性部分を結合することによって形成される官能基を含むリンカーを生成し得る。任意で、追加の官能基は、追加の結合のための部位を提供するか、または生理学的条件下での切断を可能にし得る。例えば、この追加の官能基は、生理学的条件下で切断可能な、ジスルフィド、エステル、オキシム、炭酸塩、カルバミン酸塩、またはアミド結合を含み得る。いくつかの実施形態では、第一部分または第二部分に対してリンカーを結合する官能基の１つまたは両方が、エステル類、アミド類、またはジスルフィド類のような生理学的条件下で切断可能であり得る。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、追加の官能基は、複素環式または複素環式芳香族部分である。
【０３９１】
核酸剤は、リンカー（例えば、本明細書に記載されるリンカーのような２つまたは３つの官能基を含むリンカー）を通じて、本明細書に記載されるポリマーのような部分に対して、核酸剤の２’、３’、または５’位置、例えば、核酸剤の末端２’、３’、または５’位置を通じて結合され得る。核酸剤が二本鎖である実施形態では（例えば、ｓｉＲＮＡ）、核酸剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖を通じて結合され得る。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ポリマーの末端を通じて結合される（例えば、ＰＬＧポリマー、ここでは結合は、ヒドロキシル末端またはカルボキシ末端である）。
【０３９２】
いくつかの実施形態では、このリンカーとしては、リンカー中の官能基の反応性を調節し得る部分（例えば、生物学的な条件下で、例えば、官能基の反応性を増大または減少し得る、別の官能基または原子）を包含する。
【０３９３】
例えば、図１Ａ〜図１Ｃに示されるとおり、核酸剤（ＮＡ）、例えば、第一の反応基を有するＲＮＡは、ポリマーに対して核酸剤を結合するための第二の反応基を有しており、一方で生物切断可能な官能基を提供するポリマーと反応され得る。得られたリンカーは、第一のスペーサー、例えば、結合から（すなわち、共有結合の形成によって）生じる官能基に対して核酸剤を結合するアルキレンスペーサー、および第二のスペーサー、例えば、結合から生じる官能基にポリマーを結合するアルキレンスペーサー（例えば、約Ｃ１〜約Ｃ６）を含む。
【０３９４】
図１Ａ〜図１Ｃに示されるとおり、核酸剤（ＮＡ）は、やはり生分解性である、部分Ｙを介して第一のスペーサーに結合され得る。Ｙは、例えば、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−であってもよい。いくつかの実施形態では、第二のスペーサーは、脱離基Ｘ−、例えば、ハロ（例えば、クロロ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）に結合され得る。第二のスペーサーは、このポリマーに対して、ポリマー末端、例えば、ポリマーの末端の−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、または−ＳＨ、例えば、ＰＬＧＡの末端の−ＯＨまたは−ＣＯ２Ｈと連結する追加の官能基（Ｚ）を介して結合され得る。この追加の官能基（Ｚ）は、例えば、−Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ−、−ＮＲＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＲＣ（＝Ｏ）ＮＲ’−、−ＮＲＳ（＝Ｏ）２−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−であってもよく、反応性、例えば、結合または切断のための追加の部位を提供する。
【０３９５】
核酸剤は、核酸剤の２’、３’、または５’位置、例えば、核酸剤の末端２’、３’、または５’位置を通じて結合され得る。核酸剤が、二本鎖である実施形態では（例えば、ｓｉＲＮＡ）、この核酸剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖を通じて連結され得る。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ポリマーの末端に対してスペーサーを通じて結合される（例えば、ＰＬＧポリマー、ここで、この結合は、ヒドロキシル末端またはカルボキシ末端である）。
【０３９６】
ある実施形態では、例えば、図１Ａに示されるように、チオール修飾された核酸剤（例えば、チオール修飾されたｓｉＲＮＡ）が、ピリジニル−ＳＳ−活性化ポリマー（例えば、ピリジニル−ＳＳ−活性化ＰＬＧＡ、例えば、ピリジニル−ＳＳ−活性化５０５０  ＰＬＧＡ）と反応して、ジスルフィド結合を通じて結合された核酸剤−ポリマーの複合体を形成し得る。ある実施形態では、チオール修飾された核酸剤（例えば、チオール修飾されたｓｉＲＮＡ）は、マレイミド−活性化ポリマー（例えば、マレイミド−活性化ＰＬＧＡ、例えば、マレイミド−活性化５０５０  ＰＬＧＡ）と反応されて、マレイミドスルフィド結合を通じて結合された核酸剤−ポリマーの複合体を形成し得る。ある実施形態では、チオール修飾された核酸剤（例えば、チオール修飾されたｓｉＲＮＡ）は、アクリレート−活性化ポリマー（例えば、アクリレート−活性化ＰＬＧＡ、例えば、アクリレート−活性化  ５０５０  ＰＬＧＡ）と反応して、メルカプトプロピオン酸塩結合を通じて核酸剤−ポリマーの複合体を形成し得る。核酸剤は、核酸剤の２’、３’、または５’位置、例えば、核酸剤の末端の２’、３’、または５’を通じて結合され得る。核酸剤が、二本鎖である実施形態では（例えば、ｓｉＲＮＡ）、核酸剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖を通じて結合され得る。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ポリマーの末端に対してスペーサーを通じて結合される（例えば、ＰＬＧポリマー、ここでこの結合は、ヒドロキシル末端またはカルボキシ末端である）。ある実施形態では、例えば、図１Ｂに示されるように、アミン修飾された核酸剤（例えば、アミン修飾されたｓｉＲＮＡ）を、活性化カルボン酸またはエステル（例えば、活性化カルボン酸ＰＬＧＡ、例えば、活性化カルボン酸５０５０  ＰＬＧＡ、例えば、ＳＰＡ活性化カルボン酸ＰＬＧＡ、例えば、ＳＰＡ活性化カルボン酸５０５０  ＰＬＧＡ）を有するポリマーと反応させて、アミド結合を通じて結合された核酸剤−ポリマーの複合体を形成してもよい。ある実施形態では、アミン修飾された核酸剤（例えば、アミン修飾されたｓｉＲＮＡ）を、活性化ポリマー（例えば、活性化ＰＬＧＡ、例えば、−活性化５０５０  ＰＬＧＡ）と反応させて、カルバミン酸塩結合を通じて結合された核酸剤−ポリマーの複合体を形成してもよい。ある実施形態では、アミン修飾された核酸剤（例えば、アミン修飾されたｓｉＲＮＡ）は、活性化ポリマー（例えば、活性化ＰＬＧＡ、例えば、活性化５０５０  ＰＬＧＡ）と反応されて、カルバミド結合（尿素）を通じて結合された核酸剤−ポリマーの複合体を形成し得る。ある実施形態では、アミン修飾された核酸剤（例えば、アミン修飾されたｓｉＲＮＡ）は、活性化ポリマー（例えば、活性化ＰＬＧＡ、例えば、活性化５０５０  ＰＬＧＡ）と反応されて、アミノアルキルスルホンアミド結合を通じて結合された核酸剤−ポリマーの複合体を形成し得る。この核酸剤は、核酸剤の２’、３’、または５’位置、例えば、核酸剤の末端の２’、３’、または５’を通じて結合され得る。核酸剤が二本鎖である実施形態では（例えば、ｓｉＲＮＡ）、核酸剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖を通じて結合され得る。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ポリマーの末端に対してスペーサーを通じて結合される（例えば、ＰＬＧポリマー、ここでこの結合は、ヒドロキシル末端またはカルボキシ末端である）。
【０３９７】
ある実施形態では、例えば、図１Ｃに示されるとおり、ヒドロキシルアミン修飾された核酸剤（例えば、ヒドロキシルアミン修飾されたｓｉＲＮＡ）が、アルデヒド−活性化ポリマー（例えば、アルデヒド−活性化ＰＬＧＡ、例えば、アルデヒド−活性化５０５０  ＰＬＧＡ、例えば、ホルムアルデヒド−活性化ＰＬＧＡ、例えば、ホルムアルデヒド−活性化５０５０  ＰＬＧＡ）と反応されて、アルドキシム結合を通じて結合された核酸剤−ポリマーの複合体を形成し得る。この核酸剤は、核酸剤の２’、３’、または５’位置、例えば、核酸剤の末端の２’、３’、または５’を通じて結合され得る。核酸剤が二本鎖である実施形態では（例えば、ｓｉＲＮＡ）、この核酸剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖を通じて結合され得る。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ポリマーの末端に対してスペーサーを通じて結合される（例えば、ＰＬＧポリマー、ここで、この結合は、ヒドロキシル末端またはカルボキシ末端である）。
【０３９８】
ある実施形態では、例えば、図１Ｃに示されるとおり、アルキレン修飾された核酸剤（例えば、アルキレン修飾されたｓｉＲＮＡ、例えば、アセチレン修飾されたｓｉＲＮＡ）は、アジド−活性化ポリマー（例えば、アジド−活性化ＰＬＧＡ、例えば、アジド−活性化５０５０  ＰＬＧＡ）と反応されて、トリアゾール結合を通じて結合された核酸剤−ポリマーの複合体を形成し得る。この核酸剤は、、核酸剤の２’、３’、または５’位置、例えば、核酸剤の末端の２’、３’、または５’を通じて結合され得る。核酸剤が二本鎖である実施形態では（例えば、ｓｉＲＮＡ）、この核酸剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖を通じて結合され得る。いくつかの実施形態では、この核酸剤は、ポリマーの末端に対してスペーサーを通じて結合される（例えば、ＰＬＧポリマー、ここで、この結合は、ヒドロキシル末端またはカルボキシ末端である）。
【０３９９】
いくつかの実施形態において、薬剤およびポリマーに結合する前のリンカーは、以下の官能基の１つ以上を有し得る：アミン、アミド、ヒドロキシル、カルボン酸、エステル、ハロゲン、チオール、マレイミド、炭酸、またはカルバミン酸。いくつかの実施形態において、官能基は、リンカーを通じた第一および第二の部分の結合の後、リンカー配列中に残る。いくつかの実施形態では、このリンカーは、官能基の反応性を調節する１つ以上の原子または基を含む（例えば、この結果、この官能基は、加水分解によって、または生理学的条件下の還元によってなどで切断する）。
【０４００】
いくつかの実施形態では、このリンカーは、リンカー内にアミノ酸またはペプチドを含んでもよい。頻繁に、そのような実施形態では、ペプチドリンカーは、加水分解によって、還元条件下で、または特定の酵素によって（例えば、生理学的な条件下）で切断され得る。
【０４０１】
このリンカーが、二価の有機分子の残基である場合、リンカーの切断は、リンカー自体内にあってもよいし、または、リンカーを複合体の残りと、例えば、核酸剤またはポリマーのいずれかとカップリングする結合の１つにあってもよい。
【０４０２】
いくつかの実施形態では、リンカーは、以下の１つから選択されてもよく、またはリンカーは以下のうちの１つを含んでもよい：
【０４０３】
【化２−１】
2013541506.tif 000005
【化２−２】
2013541506.tif 000006
式中、ｍは１〜１０であり、ｎは１〜１０であり、ｐは１〜１０であり、かつＲはアミノ酸側鎖である。
【０４０４】
リンカーは、クリックケミストリー（例えば、アミド結合、エステル結合、ケタール、コハク酸塩、またはトリアゾールおよびＷＯ  ２００６／１１５５４７に記載されるもの）から生じる結合を含み得る。リンカーは、例えば、加水分解、減少反応、酸化的反応、ｐＨシフト、光分解、またはそれらの組み合わせによって；または酵素反応によって切断され得る。このリンカーはまた、酸化的または還元条件下で切断可能であるか、または酸に感受性であり得る結合を含んでもよい。
【０４０５】
いくつかの実施形態では、このリンカーは、生理学的条件下では切断されず、例えば、このリンカーは、核酸剤が活性であるために切断される必要のない十分な長さのものであり、例えば、このリンカーの長さは、少なくとも約２０Å（例えば、少なくとも約２４Å）である。
【０４０６】
複合体を作製する方法
複合体は、本明細書に記載されるものを含む、種々の方法を用いて調製され得る。いくつかの実施形態において、核酸剤またはカチオン性部分をポリマーに共有結合させるために、ポリマーまたは薬剤は、当該分野で公知の技術を用いて化学的に活性化され得る。次に、ポリマーと薬剤との間で共有結合を形成させるのに好適な条件下で、活性化されたポリマーを薬剤と混合するか、または活性化された薬剤をポリマーと混合する。いくつかの実施形態において、薬剤上のチオール、ヒドロキシル基、またはアミノ基などの求核試薬が、求電子試薬（例えば、活性化されたカルボニル基）を攻撃して、共有結合を形成する。核酸剤またはカチオン性部分は、種々の連結、例えば、アミド連結、エステル連結、スクシンイミド連結、炭酸連結、またはカルバミン酸連結を介してポリマーに結合され得る。
【０４０７】
いくつかの実施形態において、核酸剤またはカチオン性部分は、リンカーを介してポリマーに結合され得る。このような実施形態において、リンカーはまず、ポリマーに共有結合され得、次に、核酸剤またはカチオン性部分に結合され得る。他の実施形態において、リンカーはまず、核酸剤またはカチオン性部分に結合され得、次にポリマーに結合され得る。
【０４０８】
いくつかの実施形態では、この方法は、核酸剤−ポリマーの複合体、例えば、核酸剤−疎水性ポリマーの複合体または核酸剤−疎水性−親水性−ポリマーの複合体を形成することを包含し、ここでこの核酸剤およびポリマーの溶解度は、有意に異なる。例えば、この核酸剤は、高度に水溶性であり得、このポリマー（例えば、疎水性ポリマー）は、低い溶解度（例えば、約１ｍｇ／ｍＬ未満）を有し得る。このような反応は、単一の溶媒中で行われてもよく、または複数の溶媒（例えば、混和性溶媒）を含む溶媒系で行われてもよい。この溶媒系は、水（例えば、水性緩衝液系）および極性の溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミン（ＤＭＡ）、Ｎ−メチルピロリジン（ＮＭＰ）、ヘキサメチルホスホラミド（ＨＭＰＡ）、フルロイソプロパノール、トリフルオロエタノール、プロピレン  炭酸塩、アセトン、ベンジルアルコール、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、またはアセトニトリル（例えば、ＡＣＮ）を含んでもよい。例示的な水性緩衝液としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ＴＥ緩衝液、または２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ））が挙げられる。溶媒系は、二相性であってもよい（例えば、有機相および水相を有する）。いくつかの実施形態では、極性溶媒（例えば、「ｏｒｇ」）の水（例えば、水性緩衝液系）に対する比は、約９０／１０〜約４０／６０（例えば、約８０／１０〜約５０／５０、約８０／１０〜約６０／４０、約８０／２０、約６０／４０または約５０／５０）である。
【０４０９】
疎水性ポリマーに対して核酸剤を結合するために用いられ得る例示的な溶媒系としては、下の表１の溶媒系が挙げられる。
【０４１０】
【表１−１】
2013541506.tif 000007
【表１−２】
2013541506.tif 000008
上記の表は、１０ｍｇ／ｍＬポリマーの濃度についての表である。
＊Ｏｒｇとは、有機溶媒を指す。
＊＊ＴＥとは、緩衝液としてＴＥを有する水性緩衝液を指す（すなわち、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ＨＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡでｐＨ８．０にされる）
＊＊＊ＰＢＳとは、緩衝液としてＰＢＳを有する水性緩衝液を指す（すなわち、リン酸緩衝化生理食塩水）。
【０４１１】
疎水性−親水性ポリマーに対して核酸剤を結合するために用いられ得る例示的な溶媒系としては、以下の表２のものが挙げられる。
【０４１２】
【表２】
2013541506.tif 000009
上記の表は、１０ｍｇ／ｍＬポリマーの濃度についての表である。
＊Ｏｒｇとは、有機溶媒を指す。
＊＊ＴＥとは、緩衝液としてＴＥを有する水性緩衝液を指す（すなわち、１ｍＭのＴｒｉｓ、ＨＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡでｐＨ８．０に）
＊＊＊ＰＢＳとは、緩衝液としてＰＢＳを有する水性緩衝液を指す（すなわち、リン酸緩衝化生理食塩水）。
【０４１３】
本明細書に記載される方法は、過剰の１つ以上の試薬を用いて行われ得る。例えば、核酸剤ポリマーの複合体を形成する場合、この反応は、過剰のポリマー、または核酸剤のいずれかを用いて行われ得る。
【０４１４】
本明細書に記載される方法は、少なくとも１つの核酸剤またはポリマーが不溶性基質（例えば、ポリマー）に結合されて行われ得る。
【０４１５】
本明細書に記載される方法は、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）の純度を有する核酸剤−ポリマーの複合体を生じ得る。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも約１００ｍｇの核酸剤−ポリマーの複合体（例えば、少なくとも約１ｇ）を生じる。
【０４１６】
複合体の組成物
上記の複合体の組成物（例えば、核酸剤−ポリマーの複合体またはカチオン性部分−ポリマーの複合体）は、生成物の混合物を含み得る。例えば、ポリマーに対する核酸剤またはカチオン性部分の複合体化は、収率１００％未満であってもよく、従って、複合体を含む組成物はまた、非複合体型のポリマー、非複合体型の核酸剤、および／または非複合体型のカチオン性部分を含み得る。
【０４１７】
複合体の組成物（核酸剤−ポリマーの複合体またはカチオン性部分−ポリマーの複合体）はまた、同じポリマー、および同じ核酸剤および／またはカチオン性部分を有し、かつ核酸剤および／またはカチオン性部分とポリマーとの間の連結の性質が異なる複合体も含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、複合体が核酸剤−ポリマーの複合体である場合、この組成物は、核酸剤上に存在する異なるヒドロキシル基（例えば、２’、３’、または５’ヒドロキシル基、例えば、３’または５’）を介して核酸剤に結合されるポリマーを含んでもよい。複合体がカチオン性部分−ポリマーの複合体であり、かつカチオン性部分が複数の反応基を含む場合、この組成物は、カチオン性部分に存在する異なる反応性基を介してカチオン性部分に結合されるポリマーを含んでもよい（例えば、異なる反応性アミン）。
【０４１８】
この複合体は、種々の量で組成物に存在し得る。例えば、複数の利用可能な結合ポイントを有する核酸剤および／またはカチオン性部分がポリマーと反応されるとき、得られる組成物は、より多くの反応性基（例えば、第一のヒドロキシル基またはアミノ基）を介して複合体された生成物を多く含み得、かつ少ない反応性基（例えば、第二のヒドロキシル基またはアミノ基）を介して結合される生成物を少なく含み得る。
【０４１９】
さらに、複合体の組成物は、２つ以上のポリマー鎖に結合される核酸剤および／またはカチオン性部分を含んでもよい。例えば、核酸剤−ポリマーの複合体の場合、核酸剤は、３’ヒドロキシルを通じて第一のポリマー鎖、および、５’ヒドロキシルを通じて第二のポリマー鎖に結合され得る。例えば、カチオン性部分が複数の反応性基を含む、カチオン性部分−ポリマーの複合体の場合、カチオン性部分は、第一の反応性基（例えば、第一のアミン）を通じて第一のポリマー鎖に、および第二の反応性基（例えば、第二のアミン）を通じて第二のポリマー鎖に結合され得る。
【０４２０】
粒子および組成物を作製する方法
本明細書に記載される粒子は、粒子、例えば、ナノ粒子を調製するための、当該分野で公知の任意の方法を用いて調製され得る。例示的な方法としては、噴霧乾燥、エマルジョン（例えば、エマルジョン−溶媒蒸発または二重エマルジョン）、沈殿（例えば、ナノ沈殿）および位相反転が挙げられる。
【０４２１】
一実施形態では、本明細書に記載の粒子は、沈殿（例えば、ナノ沈殿）によって調製され得る。この方法は、粒子の組成物（すなわち、１つ以上のポリマー、任意の追加の構成要素（単数または複数）、カチオン性部分および核酸剤）を、個々に、または組み合わせて、１つ以上の溶媒中に溶解して、１つ以上の溶液を形成することを包含する。例えば、１つ以上の構成要素を含有する第一の溶液は、１つ以上の構成要素を含有する第二の溶液中に（適切な速度またはスピードで）注いでもよい。この溶液は、例えば、シリンジポンプ、ＭｉｃｒｏＭｉｘｅｒ、または活発な制御された混合を可能にする任意のデバイスを用いて組合され得る。いくつかの場合には、ナノ粒子は、第一の溶液が第二の溶液と接触するにつれて形成され得、例えば、接触の際のポリマーの沈殿によってポリマーがナノ粒子を形成する。このような粒子形成の制御は、容易に最適化され得る。
【０４２２】
１組の実施形態では、この粒子は、１つ以上のポリマーおよび追加の構成要素を含有する１つ以上の溶液を提供すること、ならびにこの溶液を特定の溶媒と接触させて粒子を生成することによって形成される。非限定的な実施例では、疎水性ポリマー（例えば、ＰＬＧＡ）を、核酸剤またはカチオン性部分に複合体して、複合体を形成する。このポリマーの複合体、親水性部分および疎水性部分を含んでいるポリマー（例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、核酸剤および／またはカチオン性部分、および必要に応じて第三のポリマー（例えば、生分解性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡ）は、部分的に水混和性の有機溶媒（例えば、アセトン）に溶解される。この溶液は、界面活性剤を含有する水溶液に添加され、所望の粒子が形成される。これらの２つの溶液は、混合／沈殿の前に個々に濾過滅菌され得る。
【０４２３】
形成されたナノ粒子は、溶媒の除去のため、またはナノ粒子の精製のためにさらなる処理技術に曝されてもよい（例えば、透析）。上述のプロセスの目的のために、水混和性の溶媒としては、アセトン、エタノール、メタノール、およびイソプロピルアルコールが挙げられ；および部分的に水混和性の有機溶媒としては、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、イソプロピルアルコール、イソ酢酸プロピルまたはジメチルホルムアミドが挙げられる。
【０４２４】
本明細書に記載される粒子を生成するために用いられ得る別の方法は、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ｋ．ら，ＡｌＣｈＥ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００３）４９：２２６４−２２８２および米国特許出願公開第２００４／００９１５４６号（各々がその全体として参照によって本明細書に援用される）で記載されるように「ナノ粒子急速沈殿（ｆｌａｓｈ  ｎａｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）」と呼ばれるプロセスである。このプロセスは、制御されたサイズの、ポリマー安定化および保護されたナノ粒子の疎水性有機物を高い負荷でかつ収率で生成し得る。このナノ粒子急速沈殿技術は、両親媒性ジブロックコポリマー停止核生成および疎水性有機物の成長に基づく。適切な溶媒に溶解される両親媒性ジブロックコポリマーは、ブロックの溶媒の質が低下されるとき、ミセルを形成し得る。このような溶媒の質の変化を達成するために、接線方向流混合セル（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｍｉｘｉｎｇ  ｃｅｌｌ）（ボルテックスミキサー）を用いる。ボルテックスミキサーは、封じ込め容積チャンバ（ｃｏｎｆｉｎｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ｃｈａｍｂｅｒ）から構成され、ここでは、水−混和性溶媒中に溶解されるジブロックコポリマーおよび核酸剤を含有する１つのジェットストリームを、水を含有する別のジェットストリーム、核酸剤およびコポリマーの疎水性ブロックについては抗溶媒と高速度で混合する。このプロセスに関与する高速の混合、および高エネルギーの散逸は、核生成および粒子の成長よりも短いタイムスケールを提供し、これが他の技術では提供されない核酸剤負荷含量およびサイズ分布を伴うナノ粒子の形成をもたらすナノ粒子急速沈殿を介するナノ粒子の形成の際、混合は、凝集の発生の前に、全ての構成要素の高い過飽和が達成されることを可能にするのに十分速く生じる。従って、核酸剤（単数または複数）およびポリマーは同時に沈殿し、かつ遅い溶媒変化（例えば、透析）に基づく広範に用いられる技術で見いだされる低い活性剤の組み込みおよび凝集の限界を克服する。このナノ粒子急速沈殿のプロセスは、構成要素の化学的特異性に対して非感受性であり、これによって普遍的なナノ粒子形成技術となる。
【０４２５】
本明細書に記載される粒子はまた、ミキサー技術、例えば、スタティックミキサーまたはマイクロミキサー（例えば、分離−再結合（ｓｐｌｉｔ−ｒｅｃｏｍｂｉｎｅ）マイクロ−ミキサー、スリット−インターデジタル（ｓｌｉｔ−ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ）マイクロ−ミキサー、スター・ラミネーター・インターデジタル（ｓｔａｒ  ｌａｍｉｎａｔｏｒ  ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ）マイクロ−ミキサー、スーパーフォーカス・インターデジタル（ｓｕｐｅｒｆｏｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ）マイクロ−ミキサー、液−液マイクロ−ミキサー、またはインピンジング・ジェット（ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ  ｊｅｔ）マイクロ−ミキサー）を用いて調製され得る。
【０４２６】
分離−再結合マイクロミキサーは、ストリームを分けること、お互いの上に折り畳み／ガイドすること、およびそれらをお互いの混合ステップについて組み合すことを包含する混合原理を用い、これはこのような８〜１２のステップからなる。最終的に混合することは、多段階の流路の残留時間を除いて、ミリ秒内の拡散を介して生じる。さらに高速での流速では、乱流がこの混合効果に加わり、全体の混合の質がさらに改善される。
【０４２７】
スリット・インターデジタルマイクロミキサーは、液体の混合を高速にさせる幾何学的焦点を有する多重の積層によって創出される規則的な流動パターンを組み合わせる。この二重ステップの混合に起因して、スリットミキサーは、広範な種々のプロセスに適切である。
【０４２８】
本明細書に記載される粒子はまた、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＲＴ）を用いて調製され得る。ＭＲＴの中心部は、少なくとも５０ｌｉｔ／分まで拡張可能な、連続の、インピンジングジェットマイクロリアクターである。このリアクターでは、高速液体反応物を、マイクロリットルスケールの体積内で相互作用するように強制する。この反応物は、高い剪断応力および乱流に曝されるのでナノメートルのレベルで混合する。ＭＲＴは、供給速度の正確な制御および反応物の混合位置を提供する。これは、核の生成および成長の過程の制御を確実にし、均一な結晶成長および安定化速度を生じる。
【０４２９】
本明細書に記載される粒子はまた、エマルジョンによって調製されてもよい。例示的な乳化方法は、参照によって本明細書に援用される、米国特許第５，４０７，６０９号に開示される。この方法は、溶解された壁形成剤を含有する溶媒中に、薬剤、液体または固体を溶解するかそうでなければ分散すること、処理培地中に核酸剤／ポリマー溶媒混合物を分散して、エマルジョンを形成すること、および全てのエマルジョンを、より大きい体積の処理媒体または他の適切な抽出媒体に直ちに移して、エマルジョン中の微小液滴から溶媒を直ちに抽出し、マイクロカプセルまたはマイクロスフェアのような微小カプセル化生成物を形成することを包含する。ポリマー送達ビヒクル処方物を調製するために用いられる最も一般的な方法は、溶媒乳化蒸発方法である。この方法は、ポリマーおよび薬物を、水と完全に非混和性である有機溶媒（例えば、ジクロロメタン）中に溶解することを包含する。この有機混合物は、安定化剤、最もよくあるのはポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）を含有する水に添加し、次いで典型的には超音波処理する。
【０４３０】
この粒子の調製後、それらを、濾過、ふるい、押し出しまたは超遠心分離によって分画して、特定のサイズ範囲内の粒子を回収してもよい。１つのサイジング法は、選択した均一な細孔サイズを有する一連のポリカーボネート膜を通じて粒子の水性懸濁物を押し出すことを包含する；膜の細孔サイズは、その膜を通じた押し出しによって産生される粒子の最大サイズにほぼ対応する。例えば、参照によって本明細書に援用される、米国特許第４，７３７，３２３号を参照のこと。別の方法は、規定のサイズの画分を単離するための、規定の速度の連続的な超遠心分離（例えば、８，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、２２，０００、および２５，０００ｒｐｍ）である。別の方法は、接線流濾過であり、ここでは、粒子を含有する溶液を、膜の表面に接線方向に沿ってポンピングする。適用される圧力は、膜を通じて液体の一部を濾液側へ強制するように働く。膜の細孔を通過するには大きすぎる粒子は、上流側で保持される。保持される成分は、正常な流量濾過でのように膜の表面では蓄積されず、代わりに接線流によって掃引される。従って、接線流濾過を用いて、水溶液に存在する過剰の界面活性剤を除去しても、または透析濾過によって溶液を濃縮してもよい。
【０４３１】
本明細書に記載される粒子を作製する例示的な方法は、極性の溶媒（例えば、ＤＭＦ，ＤＭＳＯ、アセトン、ベンジルアルコール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、またはアセトニトリル）を、例えば、沈殿によって、粒子の形成を可能にする条件下で、（ａ）核酸剤−疎水性ポリマーの複合体であって、各々の核酸剤−疎水性ポリマーの複合体が、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡ部分（疎水性ポリマーに対して共有結合される）を含み、ここで、この核酸剤−疎水性ポリマーの複合体が、カチオン性部分と会合される、複合体、（ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー、例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ、および（ｃ）複数の疎水性ポリマー（核酸剤に対して共有結合されない）と合わせて、それによって粒子を形成することを包含する。合わせることは、極性の溶媒中で、例えば、アセトン、または混合溶媒系（例えば、組み合わせの水性／有機の溶媒系、例えば、アセトニトリルおよび水性の緩衝液系）中で行ってもよい。この方法はまた以下を含み得る：（ｉ）複数の核酸剤であって、各々の核酸剤が、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたは他の核酸剤（疎水性ポリマーにカップリングされ、カチオン性部分に会合される）を、アセトニトリル／ＴＥ緩衝液（例えば、８０／２０重量％）中に含んでいる、核酸剤と；（ｉｉ）アセトニトリル／ＴＥ緩衝液（例えば、８０／２０重量％）中の複数の親水性−疎水性ポリマー、例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ、および複数の疎水性ポリマー（核酸剤とカップリングしていない）。
【０４３２】
本明細書に記載される粒子を作製する別の例示的な方法は以下を包含する：ａ）例えば、水性溶媒中で、ｉ）第一の複数の疎水性−親水性ポリマー、例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡと、ｉｉ）第一の複数の疎水性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡ（各々が、第一の反応性部分、例えば、スルフヒドリル部分を有する）とを接触させて；水溶性の中間粒子（例えば、約１００ｎｍ未満の直径を有する）を形成することと；ｂ）例えば、水性溶媒中で、中間粒子と、複数の水溶性の核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡ部分（各々が、第二の反応性部分、例えば、ＳＨ部分を有する）とを、中間複合体、例えば、薬物部分にカップリングされた、親水性−疎水性ポリマーおよび疎水性ポリマーを含む中間構造の形成を可能にする条件下で接触させることと；ｃ）例えば、非水性溶媒、例えば、ＤＭＦ，ＤＭＳＯ、アセトン、ベンジルアルコール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、またはアセトニトリル中で、中間複合体と第二の複数の親水性−疎水性ポリマー、例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ、および第二の複数の疎水性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡとを、粒子の形成を可能にする条件下で接触させて、これによって粒子（ここで形成された粒子は、中間粒子よりも大きい）を形成すること。
【０４３３】
本明細書に記載の粒子を作製する別の例示的な方法は以下を包含する：ａ）例えば、アセトニトリル／ＴＥ緩衝液（例えば、８０／２０重量％）中で、ｉ）第一の複数の親水性−疎水性ポリマー、例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡと、ｉｉ）第一の複数の疎水性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡ（各々が、第一の反応性部分、例えば、スルフヒドリル部分を有する）とを接触させて、中間粒子（例えば、約１００ｎｍ未満の直径を有する）を形成することと（ここで、いくつかの実施形態では、この中間粒子は、例えば、これが水溶液中で可溶性であるのに十分な親水性部分を有することに起因して、水溶液中で機能的に可溶性である）；ｂ）この中間粒子と複数の核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたは他の核酸剤（各々が、第二の反応性部分、例えば、ＳＨ部分を有する）とを、中間複合体、例えば、核酸剤にカップリングされた親水性−疎水性ポリマーおよび疎水性ポリマーを有する中間構造の形成を可能にする条件下で接触させることと、ｃ）この中間複合体と第二の複数の親水性−疎水性ポリマー、例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ、および第二の複数の疎水性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡとを、粒子の形成を可能にする条件下で接触させて、それによって粒子（例えば、ここでこの粒子の直径は、１５０ｎｍ未満である）を形成すること。複数のカチオン性部分は、ｂ由来の疎水性ポリマーに対して共有結合され得る。
【０４３４】
本明細書に記載の粒子を作製する別の例示的な方法は、カチオン性−ＰＬＧＡおよび核酸−複合体された５０５０−Ｏ−アセチル−ＰＬＧＡを溶液中に溶解することを包含する。得られた溶液を水に添加して、ナノ粒子懸濁物を形成する。脂質混合物（例えば、ＤＯＴＡＰ、コレステロールおよびＤＯＰＥ−ＰＥＧ２ｋを含む）は、この脂質混合物が粒子を被覆することを可能にする条件下で、粒子懸濁物に添加される。
【０４３５】
本明細書に記載される粒子を作製する別の例示的な方法は、核酸−複合体された５０５０−Ｏ−アセチル−ＰＬＧＡ（Ｍｗ約２３．７ｋＤａ）を溶液中に溶解することを包含する。得られた溶液を、水に添加して、ナノ粒子懸濁物を形成する。カチオン性ポリマー（例えば、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、およびキトサンの６０重量％）をアセトン中に溶解して、１％のポリマー溶液を形成し、ポリマー混合物が粒子を被覆することを可能にする条件下で粒子懸濁物に添加する。
【０４３６】
本明細書に記載される粒子を作製する別の例示的方法は、複数の核酸剤−ポリマーの複合体を含む粒子を形成し、この粒子と複数のカチオン性多価ポリマーまたは脂質とを接触することと、ｂ）の生成物と複数のポリマーまたは脂質とを接触することとを包含し、ここでこの複数のポリマーまたは脂質は実質的に、ｂ）の生成物を囲んで粒子を形成する。
【０４３７】
いくつかの実施形態では、この粒子ははさらに処理、例えば、精製される。精製の例示的な方法は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ゲル浸透クロマトグラフィー、透析、接線流濾過（例えば、３００ｋＤａフィルターを用いる）、およびサイズ排除クロマトグラフィーを包含する。
【０４３８】
粒子の精製後、それらは、溶液中にある間に、濾過滅菌されてもよい（例えば、０．２２ミクロンのフィルターを用いる）。
【０４３９】
特定の実施形態では、この粒子は、選択されたサイズ範囲内で、サイズが実質的に均一であるように調製される。この粒子は好ましくは、その最大直径で３０ｎｍ〜３００ｎｍ（例えば、約３０ｎｍ〜約２５０ｎｍ）の範囲である。この粒子は、動的光散乱および／または電子顕微鏡（例えば、透過電子顕微鏡または走査電子顕微鏡）のような当該分野で公知の技術によって分析されてこの粒子のサイズが決定され得る。この粒子はまた、核酸剤負荷および／または不純物（例えば、残留溶媒）の有無について試験され得る。
【０４４０】
凍結乾燥
本明細書に記載される粒子は、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）として一般的に公知の凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を介して、乾燥保存のために調製され得る。凍結乾燥は、溶液から水を抽出して顆粒状の固形物または粉末を形成する過程である。この過程は、溶液を凍結することおよびその後、真空下での昇華によってすべての水または湿気を抽出することによって行われる。凍結乾燥の利点としては、物質の品質の維持、および治療用化合物の分解の最小化が挙げられる。凍結乾燥は、再構成され注射によって患者に投与される医薬製剤、例えば非経口薬剤生成物を開発するの特に有用であり得る。あるいは、凍結乾燥は、経口薬剤製剤、特に迅速に融解するかまたは急速に溶解する処方物を開発するのに有用である。
【０４４１】
凍結乾燥は、凍結保護剤、例えば、本明細書に記載される凍結保護剤の存在下で行ってもよい。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、炭水化物（例えば、スクロース、シクロデキストリン、またはシクロデキストリンの誘導体（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）のような本明細書に記載される炭水化物）、塩、ＰＥＧ、ＰＶＰ、またはクラウンエーテルである。
【０４４２】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥の間のＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）粒子の凝集は、環状オリゴ糖を含む凍結保護剤の使用によって減少または最小化され得る。適切な凍結保護剤を用いることで、保管期間が延長した凍結乾燥調製物が得られる。
【０４４３】
本開示は、環状オリゴ糖を含む液体の処方物および凍結乾燥調製物を特徴とする。いくつかの実施形態では、この液体処方物または凍結乾燥調製物は、少なくとも２つの炭水化物、例えば、環状オリゴ糖（例えば、シクロデキストリンまたはその誘導体）および非環状のオリゴ糖（例えば、１０、８、６または４個の単糖の長さ未満の非環状オリゴ糖、例えば、単糖類または二糖類を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この液体処方物はまた、再構成の試薬も含む。
【０４４４】
適切な環状オリゴ糖の例としては、限定するものではないが、α−シクロデキストリン類、β−シクロデキストリン類、例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン類、β−シクロデキストリンスルホブチルエーテルナトリウム類、γ−シクロデキストリン類、その任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０４４５】
特定の実施形態では、環状炭水化物、例えば、環状オリゴ糖は、ポリマーのようなより大きい分子構造に含まれ得る。適切なポリマーは、この粒子のポリマー組成物に関して本明細書に開示される。このような実施形態では、環状オリゴ糖は、ポリマーの骨格内に組み込まれてもよい。例えば、米国特許第７，２７０，８０８号および米国特許第７，０９１，１９２号を参照のこと、これは、本発明に従って用いられ得るポリマー骨格にシクロデキストリン部分を含む例示的なポリマーを開示する。米国特許第７，２７０，８０８号および米国特許第７，０９１，１９２号の全体的な教示は、参照によって本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、この環状オリゴ糖は、少なくとも１つの酸化された存在を含み得る。
【０４４６】
環状オリゴ糖を含んでいる凍結保護剤は、それらの凍結乾燥および／または保管の間ＰＥＧのような親水性ポリマーを含む粒子の分子間凝集の速度を阻害し得、従って延長した保管期間が得られる。理論によって束縛されることは望まないが、粒子凝集を妨げる環状オリゴ糖の機構は、環状オリゴ糖が、凍結乾燥の間の粒子中に存在するＰＥＧのような親水性ポリマーの結晶化を減少する、または防止することに起因し得る。これは、環状オリゴ糖と親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）との間の封入複合体の形成を通じて起こり得る。このような複合体は、シクロデキストリンと例えば、ポリエチレングリコールの鎖との間で形成され得る。シクロデキストリンの内腔は親油性であるが、シクロデキストリンの外側は、親水性である。これらの特性は、本明細書に記載の粒子の他の構成要素と封入複合体の形成を可能にし得る。凍結乾燥の間の処方物の安定化の目的のために、ポリ（エチレングリコール）鎖は、シクロデキストリンの腔内に適合し得る。環状オリゴ糖が粒子分解を減少、最小化、防止することを可能にし得る追加の機構は、凍結乾燥の間の環状オリゴ糖と親水性ポリマー（ＰＥＧ）との間の水素結合の形成に関連する。例えば、シクロデキストリンとポリ（エチレングリコール）鎖との間の水素結合は、結晶のような秩序的なポリエチレングリコール構造を妨げ得る。
【０４４７】
環状オリゴ糖は、本明細書に記載される処方物中に種々の量で存在し得る。ある特定の実施形態では、環状オリゴ糖の液体処方物に対する比は、重量として約０．７５：１〜約３：１の範囲である。好ましい実施形態では、この環状オリゴ糖の総ポリマーに対する比は、重量として約０．７５：１〜約３：１の範囲である。
【０４４８】
好ましい態様では、この処方物は、２つ以上の炭水化物類、例えば、環状オリゴ糖および非環状炭水化物、例えば、非環状オリゴ糖、例えば、非環状オリゴ糖（１０、８、６、４以下の単糖類単位を有する）を含む。本明細書に記載のとおり凍結乾燥されるべき液体処方物中に、非環状炭水化物、例えば、非環状オリゴ糖を含むことで、得られた凍結乾燥された調製物による水の取り込みが促進され、かつ凍結乾燥された調製物の分解が促進され得る。  
【０４４９】
好ましい態様では、凍結乾燥された処方物または液体処方物は、環状オリゴ糖、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせ、および非環状オリゴ糖、例えば、本明細書に記載の非環状オリゴ糖を含む。いくつかの好ましい実施形態では、凍結保護剤は、環状オリゴ糖、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、それらの任意の誘導体、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む、この非環状オリゴ糖は、二糖類、例えば、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、およびそれらの誘導体、および単糖類、例えば、グルコースを含む。１つの好ましい実施形態では、この凍結保護剤は、β−シクロデキストリンまたはそれらの誘導体、例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンまたはβ−シクロデキストリンスルホブチルエーテルを含み；およびこの非環状オリゴ糖は、二糖類、例えば、スクロースである。β−シクロデキストリンまたはそれらの誘導体および非環状オリゴ糖は、任意の適切な関連の量で存在し得る。好ましくは、環状オリゴ糖の非環状オリゴ糖に対する比（ｗ／ｗ）は、約０．５：１．５〜約１．５：０．５、およびさらに好ましくは０．７：１．３〜１．３：０．７である。いくつかの例では、環状オリゴ糖の非環状オリゴ糖に対する比（ｗ／ｗ）は、０．７：１．３、１：０．７、１：１、１．３：１または１．３：０．７である。液体または凍結乾燥された処方物が本明細書に記載される粒子を含む場合、環状オリゴ糖に加えて非環状オリゴ糖のポリマーに対する比（ｗ／ｗ）は、約１：１〜約１０：１、および好ましくは、約１．１〜約３：１である。
【０４５０】
ある特定の実施形態では、凍結乾燥された調製物は、再構成試薬で再構成され得る。いくつかの実施形態では、適切な再構成試薬は、任意の生理学的に許容される液体であってもよい。適切な再構成試薬としては、限定するものではないが、水、５％デキストロース注射液（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、乳酸リンゲル（Ｌａｃｔａｔｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）およびデキストロース注射液（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、または無水アルコール（Ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ  Ａｌｃｏｈｏｌ，米国薬局方）および非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチル化キャスターオイル界面活性剤（ＧＡＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，Ｎ．Ｊ．，から、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ．の商標で入手可能）の体積で等部の混合物が挙げられる。再構成された溶液中の界面活性剤の量を最小化するために、十分な量のビヒクルのみを提供して、凍結乾燥された調製物の溶液を形成し得る。一旦、凍結乾燥された調製物の溶解が得られれば、得られた溶液をさらに、適切な非経口的希釈物で注射の前に希釈してもよい。このような希釈液は、当業者に周知である。これらの希釈液は一般には、臨床施設で利用可能である。代表的な希釈物の例としては、限定するものではないが、乳酸リンゲル注射液（Ｌａｃｔａｔｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、５％デキストロース注射液（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、滅菌注射用水（Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）などが挙げられる。しかし、そのｐＨ範囲が狭い（ｐＨ６．０〜７．５）ために、乳酸リンゲル注射液が最も典型的である。１００ｍＬあたり、乳酸リンゲル注射液は、塩化ナトリウム（米国薬局方）０．６ｇ、乳酸ナトリウム０．３１ｇ、塩化カリウム（米国薬局方）０．０３ｇおよび塩化カルシウム２Ｈ２Ｏ（米国薬局方）０．０２ｇを含む。浸透圧は、２７５ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、これは等張性に極めて近い。
【０４５１】
従って、液体処方物は、再懸濁されても、または再水和され凍結乾燥された調製物であってもよい（適切な再構成試薬中で）。適切な再構成の試薬としては、生理学的に許容される担体、例えば、本明細書に記載のような生理学的に許容される液体が挙げられる。好ましくは、凍結乾燥された調製物の再懸濁または再水和は、凍結乾燥の前に、実質的に同じ特性（例えば、平均粒子径（Ｚａｖｅ）、サイズ分布（ＤＶ９０、Ｄｖ５０）、多分散性、薬物濃度）および本発明の液体処方物中のもとの粒子の形態を有する粒子の溶液または懸濁物を形成し、さらに凍結乾燥の前にもとの液体の治療剤対ポリマー比を維持する。ある特定の実施形態では、再懸濁または再水和された凍結乾燥調製物中の、約５０％〜約１００％、好ましくは約８０％〜約１００％の粒子が、もとの液体処方物中で、粒子のサイズ分布、および／または薬物対ポリマー比を維持する。好ましくは、凍結乾燥された調製物を再懸濁することによって生成される処方物中の粒子のＺａｖｅ、Ｄｖ９０、および多分散性は、凍結乾燥前のもとの溶液または懸濁物における粒子のＺａｖｅ、Ｄｖ９０、および多分散性とは、約５％を超えて、約１０％を超えて、約１５％を超えて、約２０％を超えて、約１５％を超えて、約３０％を超えて、約３５％を超えて、約４０％を超えて、約４５％を超えて、または約５０％を超えて異なることはない。
【０４５２】
好ましくは、この態様の液体処方物は、粒子を含み、かつ、１つ以上の炭水化物類（例えば、環状オリゴ糖および／または非環状オリゴ糖）を含む凍結保護剤のいずれかを用いて、凍結乾燥され、再懸濁できるのよりも、より高いポリマー濃度（粒子を形成するポリマー（単数または複数）の濃度）で特徴づけられる。例えば、このポリマー濃度は、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約６０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約６５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約７５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約８０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約８５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約９０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約９５ｍｇ／ｍＬであってもよく、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬである。例えば、この液体処方物は、再構成され、凍結乾燥された調製物であり得る。
【０４５３】
粒子および組成物の保管の方法
別の態様では、本発明は、複合体、粒子または組成物、例えば、薬学的組成物を保管する方法を特徴とする。
【０４５４】
ある実施形態では、本明細書に記載される複合体、粒子、または組成物を保管する方法は、例えば、以下のステップを包含する：（ａ）容器中に複合体、粒子または組成物を配置するステップ；（ｂ）そのような複合体、粒子または組成物を保管するステップ；および必要に応じて、（ｃ）このような容器を、第二の位置に移動するステップ、またはこのような複合体、粒子または組成物の全てもしくはアリコートを、このような容器から取り出すステップ。
【０４５５】
この複合体、粒子または組成物は、液体でも、乾燥でも、凍結乾燥されても、または再構成された（例えば、溶液または懸濁液として液体中）処方物または形態であってもよい。この複合体、粒子または組成物は、単一用量であっても、または複数回用量で保管されてもよく、例えば、これは、少なくとも２、５、１０、または１００回の投薬に十分な量で保管されてもよい。ある実施形態では、この方法は、この複合体、粒子または組成物を、透析、希釈、濃縮、乾燥、凍結乾燥、またはパッケージングすること（例えば、容器中に物質を配置すること）を包含する。ある実施形態では、この方法は、この複合体、粒子または組成物と別の構成要素、例えば、賦形剤，凍結保護剤、または不活性物質、例えば、不活性ガスと組み合わせることを包含する。ある実施形態では、この方法は、複合体、粒子または組成物の調製物を、アリコートに分けること、および必要に応じて複数のアリコートを複数の容器にいれることを包含する。ある実施形態では、複合体、粒子または組成物、例えば、薬学的組成物は、本明細書に開示される期間保管される。ある実施形態では、保管の期間後、保管された複合体、粒子または組成物は、例えば、凝集、色、または他のパラメーターについて評価される。
【０４５６】
ある実施形態では、本明細書に記載される複合体、粒子または組成物は、例えば、容器中に、少なくとも約１時間（例えば、少なくとも約２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、２日、１週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、または３年）保管され得る。従って、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載される複合体、粒子、または組成物を含む容器である。
【０４５７】
ある実施形態では、複合体、粒子、または組成物は、大気条件、または本明細書に記載の他の条件を含めて種々の条件下で保管され得る。ある実施形態では、複合体、粒子、または組成物は、低温、例えば、約５℃以下の温度（例えば、約４℃以下または約０℃以下）で保管される。複合体、粒子、または組成物はまた、約０℃未満の温度（例えば、−８０℃〜−２０℃）で凍結および保管され得る。複合体、粒子、または組成物はまた、不活性雰囲気、例えば、窒素またはアルゴンなどの不活性ガスを含む雰囲気の下で保管され得る。そのような雰囲気は、大気酸素および／または他の反応性ガスを実質的に含まないものであり得、ならびに／あるいは湿気を実質的に含まないものであり得る。
【０４５８】
いくつかの実施形態では、複合体、粒子、または組成物は、再構成された処方物として保管され得る（例えば、液体中で、溶液または懸濁液中で）。
【０４５９】
ある実施形態では、本明細書に記載の複合体、粒子、または組成物は、琥珀色（ａｍｂｅｒ）バイアルなどの遮光性容器を含む種々の容器に保管され得る。容器は、バイアル、例えばゴムまたはシリコーン封鎖（例えば、ポリブタジエンまたはポリイソプレンでできた封鎖）を有する密封バイアルであってもよい。容器は、大気酸素および／または他の反応性ガスを実質的に含まないものであり得、ならびに／あるいは湿気を実質的に含まないものであり得る。
【０４６０】
別の態様では、本発明は、容器、例えば、本明細書に記載の容器中に、例えば、本明細書に記載の量、形態または処方物中で入れられた、複合体、粒子または組成物を特徴とする。
【０４６１】
粒子および組成物を評価する方法
別の態様では、本発明は、例えば、本明細書に記載される特性について、粒子または粒子の調製を評価する方法を特徴とする。ある実施形態では、この特性は、物理的特性、例えば、平均直径である。別の実施形態では、この特性は、機能的な特性、例えば、本明細書に記載されるアッセイで測定されるような、例えば、標的遺伝子のノックダウンを媒介する能力である。この方法は：
１つ以上のこのような粒子を含む試料を、例えば、組成物、例えば、薬学的組成物として提供することと；
例えば、物理的試験によって、本明細書に記載される特性を評価して、その特性について測定した値を得ることと、を包含し、
これによって粒子または粒子の調製物を評価する。
【０４６２】
ある実施形態では、この方法は、以下のうちの１つまたは両方を含む：
ａ）測定した値と参照値または標準値、例えば、ある範囲の値（例えば、本明細書に開示されるか、または規制当局、製造業者もしくは有識者が設定する値）とを比較することと、あるいは
ｂ）このような決定または比較に対応して、このような粒子を分類することと。
【０４６３】
ある実施形態では、このような決定または比較に対応して、決定またはステップを行い、例えば、粒子を作製するためのプロセスでの産生パラメーターが変更されるか、試料が分類され、選択され、受け入れられるかもしくは廃棄され、発売されるかもしくは差し控えられ、医薬品へ加工され、運搬され、異なる位置へ移動され、処方され、例えば、別の物質（例えば、賦形剤）で処方され、ラベルが付され、パッケージングされ、上市されるか、または販売されるかもしくは販売に付される。
【０４６４】
ある実施形態では、特性に関する決定された値を、参照値と比較して、この比較に対応して、この粒子または粒子の調製物を、例えば、ヒト対象での使用に適切であるか、ヒト対象での使用に適切でないか、販売に適切であるか、発売の仕様に合致するか、または発売の仕様に合致しないかに分類する。
【０４６５】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、測定して、不純物または残留溶媒が存在するか否かを決定するか（例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を介する）、１つ以上の成分の相対的な量を決定するか（例えば、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を介する）、粒子の大きさを測定するか（例えば、動的光散乱および／または走査型電子顕微鏡を介する）、または表面成分の有無を決定する。
【０４６６】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、組成物中の粒子の平均直径について評価する。ある実施形態では、物理的測定を含む実験を行って、平均値を決定する。次いで、組成物の平均直径を、参照値と比較してもよい。ある実施形態では、粒子の平均直径は、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ（例えば、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ）である。複数の粒子の組成物粒子は、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ（例えば、約７５ｎｍ〜約２２０ｎｍ））から、約５０ｎｍ〜約２２０ｎｍ（例えば、約７５ｎｍ〜約２００ｎｍ）という中央粒子粒子サイズ（Ｄｖ５０（粒子の体積の５０％がそれ未満で存在する粒子サイズ））を有し得る。複数の粒子の組成物は、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ（例えば、約７５ｎｍ〜約２２０ｎｍ）というＤｖ９０（粒子の体積の９０％がそれ未満で存在する粒子サイズ）を有し得る。いくつかの実施形態では、複数の粒子の組成物は、約１５０ｎｍ未満というＤｖ９０を有する。複数の粒子の組成物は、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、または０．１未満という粒子ＰＤＩを有し得る。
【０４６７】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、動的光散乱に供して、例えば、サイズまたは直径を決定する。粒子は、レーザーを用いて照明され得、散乱した光の強度は、より小さな粒子が溶媒分子によってさらに「キックされ、蹴られ（ｋｉｃｋｅｄ）」ることにより迅速に動くので、粒子の大きさに応じた速度で変動する。これらの強度の揺らぎの分析によって、ブラウン運動の速度が得られ、それゆえ、ストークス−アインシュタイン関係を用いて粒子の大きさが得られる。動的光散乱において測定された直径は、水力学的直径と呼ばれ、粒子が流体内でどのように拡散するかを指す。この技術によって得られた直径は、測定されている粒子と同じ移動拡散係数を有する球の直径である。
【０４６８】
ある実施形態において、粒子または粒子の調製物は、クリオ走査電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ−ＳＥＭ）を用いて評価されて、例えば、構造または組成物が決定される。ＳＥＭは、ラスター走査パターンで電子の高エネルギービームを用いて走査することによって試料表面が撮像される１種の電子顕微鏡である。電子は、試料を構成する原子と相互作用して、試料表面の形状、組成、および導電性などの他の特性についての情報を含む信号を生じる。クリオ−ＳＥＭについて、ＳＥＭは、クリオ顕微鏡についての冷却ステージが装備されている。凍結固定を用いてもよく、低温走査電子顕微鏡を低温保管固定された検体に関して実施してもよい。凍結固定された検体は、特殊な装置において真空下で凍結破砕して、内部構造を明らかにして、スパッターコーティングしてもよく、なおも凍結したままで、ＳＥＭ凍結ステージへと移動してもよい。
【０４６９】
ある実施形態において、粒子または粒子の調製物は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて評価して、例えば、構造または組成物を決定する。この技術において、電子ビームは、極薄の検体を通じて透過され、ビームが通過する際に検体と相互作用する。画像は、検体を通じて伝達された電子の相互作用から形成され；この画像は、写真フィルムの層において、蛍光スクリーンなど、撮像装置へと拡大および焦点合わせされるか、または電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラなどのセンサーによって検出される。
【０４７０】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、表面ゼータ電位について評価する。ある実施形態では、物理的測定を含む実験を行って、平均値の表面ゼータ電位を決定する。次いで、この表面ゼータ電位を、参照値と比較することができる。ある実施形態では、この表面ゼータ電位は、水中で測定した場合、約−２０ｍＶ〜約５０ｍＶである。ゼータ電位とは、粒子の表面電位の測定である。いくつかの実施形態では、粒子は、水中で測定した場合、約−２０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約１０ｍＶ、または中性におよぶ表面ゼータ電位を有し得る。
【０４７１】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、それが含む核酸剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）の有効量について評価する。ある実施形態では、粒子は、例えば、インビボのモデル系（例えば、本明細書に記載の任意のモデルのようなマウスモデル）において投与され、効果のレベル（例えば、ノックダウン）が観察される。ある実施形態では、レベルを、参照標準と比較する。
【０４７２】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物は、その表面上での核酸剤の存在について評価される。例えば、インターカレート剤、例えば、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ、またはＨＰＬＣを用いて、粒子の表面上の二本鎖核酸剤の存在または量（例えば、ｓｉＲＮＡの存在または量）を決定することができる。
【０４７３】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、粒子の表面に露出されるのではなく、内部にある核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡの量について評価する。ある実施形態では、レベルを参照標準と比較する。ある実施形態では、粒子中の、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡの数または重量あたり、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％がこの粒子の内部にある。
【０４７４】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、核酸剤の構造または機能について情報を提供するアッセイ（例えば、消化アッセイ）を用いて評価する。例えば、この粒子は、核酸剤が標的の発現を調節する能力（例えば、ノックダウン）を評価する実験で評価することができる。この粒子はまた、それが障害を治療する、例えば、腫瘍増殖を調節する能力について評価され得る。いくつかの実施形態では、この評価は、インビトロまたはインビボのアッセイ（例えば、異種移植片モデル）である。この評価は、標準と比較し、および必要に応じてこの標準に対応し得、この粒子が分類される。
【０４７５】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡ（インビトロで、例えば、実験動物、例えば、マウスで標的遺伝子をノックダウンする）を送達する能力について評価する。組成物の活性は、等しい量の単独の核酸剤の活性と比較され得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子はＧＦＰであり、このＧＦＰはＨｅＬＡ細胞で発現される。例えば、アッセイは、参照によって本明細書に援用される、Ｂｅｒｔｒａｎｄら、，２００２，ＢＢＲＣ  ２９６：１０００−１００４に記載の、抗−ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ、ＧＦＰプラスミド、ＨｅＬＡ−ＧＦＰ細胞、マウスおよびＧＦＰ発現アッセイを用いることができる。複合体、粒子、および組成物を評価するための他の例示的な細胞としては、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８ＧＦＰの細胞が挙げられる。
【０４７６】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物は、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡ（標的遺伝子をインビトロで、例えば、培養された細胞中でノックダウンする）を送達する能力について評価する。組成物の活性は、等しい量の単独の核酸剤のものと比較し得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子はＧＦＰであり、およびこの培養された細胞は、ＧＦＰでトランスフェクトされたＨｅＬＡ細胞である。例えば、このアッセイは、参照によって本明細書に援用される、Ｂｅｒｔｒａｎｄら、，２００２，ＢＢＲＣ  ２９６：１０００−１００４に記載の、抗−ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ、ＧＦＰプラスミド、ＨｅＬＡ−ＧＦＰ細胞、細胞培養条件、およびＧＦＰ発現アッセイを用いることができる。本明細書に記載される粒子および組成物を評価するための他の零時的な細胞としては、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８ＧＦＰの細胞が挙げられる。
【０４７７】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物は、血清または細胞溶解液中でのインキュベーション後、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡ（標的遺伝子をインビトロで、例えば、培養された細胞中でノックダウンする）を送達する能力について評価する。処理された組成物の活性を、等しい量の単独の核酸剤のものと比較され得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子はＧＦＰであり、およびこの培養された細胞は、ＧＦＰでトランスフェクトされたＨｅＬＡ細胞である。例えば、このアッセイは、参照によって本明細書に援用される、Ｂｅｒｔｒａｎｄら、，２００２，ＢＢＲＣ  ２９６：１０００−１００４に記載の、抗−ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ、ＧＦＰプラスミド、ＨｅＬＡ−ＧＦＰ細胞、細胞培養条件、ＧＦＰ発現アッセイ、および細胞溶解液を用いるアッセイの場合には、ＨｅＬａ細胞溶解液を用いることができる。あるいは、参照によって本明細書に援用される、Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎら、，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：８９８４−８９９２に記載のマウス発現系を用いて、組成物の能力を評価することができる。Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎらの標的遺伝子および構築物、または他の標的遺伝子および構築物を、Ｈｕ−ｌｉｅｓｋｏｖａｎらに記載のマウス系で用いることができる。本明細書に記載される粒子および組成物を評価するための他の例示的な細胞としては、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８  ＧＦＰの細胞が挙げられる。
【０４７８】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ  Ａ）のような消化因子から核酸剤を防御する能力について評価する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、未処理の核酸剤（例えば、遊離のｓｉＲＮＡ）に対してｓｉＲＮＡのような核酸剤に対する防御を付与し得る。この評価は、組成物および／または単独の核酸剤がＲＮａｓｅのような消化因子とインキュベートされ、組成物および単独の核酸が、種々の時点にわたって、例えば、ゲルクロマトグラフィーを用いて評価されるアッセイを包含し得る。
【０４７９】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、それが含む完全なままの核酸剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）のレベルについて評価する。ある実施形態では、この完全性（ｉｎｔａｃｔｎｅｓｓ）は、物理的特性の存在、例えば、分子量によって、または、例えば、インビボのモデル系（例えば、本明細書に記載の任意のモデルのようなマウスモデル）で、機能性によって決定され得る。一実施形態では、このレベルは、参照の標準と比較される。ある実施形態では、粒子中で、数または重量で、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡの少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％が完全なままであり得る。
【０４８０】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物は、それが凝集する傾向に関して評価される。例えば、凝集は、予め選択された媒体、例えば、５０／５０のマウス／ヒト血清中で測定され得る。５０／５０のマウスヒト血清をインキュベートする場合の実施形態では、粒子は、凝集をわずかにしか示さないか、または全く示さない。例えば、粒子の数または重量の３０％、２０％または１０％未満が凝集する。ある実施形態では、このレベルは、参照標準と比較される。
【０４８１】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、安定性、例えば、選択された条件での安定性、例えば、２５℃±２℃／６０％の相対湿度±５％の相対湿度で、例えば、開口容器または閉鎖容器中での安定性について評価する。ある実施形態では、２５℃±２℃／６０％相対湿度±５％相対湿度で、開口容器または閉鎖容器中で、２０、３０、４０、５０または６０日間保管した場合、この粒子は、インビボでモデル系、（例えば、マウスモデル、例えば、本明細書に記載されるような）で決定した場合、その活性の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５％を保持する。ある実施形態では、保持された活性のレベルを、参照標準と比較する。
【０４８２】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、例えば、予め選択された投薬量で、タンパク質および／またはｍＲＮＡを減少する能力について評価する。例えば、粒子は、インビボでモデル系、（例えば、本明細書に記載されるモデルの１つのようなマウスモデル）で１または３ｍｇ／ｋｇの単回用量としての投与によって評価してもよい。本明細書に記載される粒子は、タンパク質またはｍＲＮＡのノックダウンにおいて、少なくとも２０、３０、４０、５０、または６０％の減少を生じ得る。ある実施形態では、このレベルを参照標準と比較する。
【０４８３】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、例えば、予め選択した投与量で、標的遺伝子のタンパク質および／またはｍＲＮＡを減少する能力について評価する。例えば、粒子は、インビボでモデル系（例えば、本明細書に記載される任意のモデルのようなマウスモデル）で１または３ｍｇ／ｋｇの単回用量として投与によって評価され得る。本明細書に記載される粒子は、タンパク質および／またはｍＲＮＡのノックダウンにおいて少なくとも２０、３０、４０、５０または６０％の減少を生じ得る。ある実施形態では、このレベルを参照標準と比較する。
【０４８４】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、例えば、予め選択した投薬量で、オフターゲット遺伝子のタンパク質および／またはｍＲＮＡの減少について評価する。例えば、粒子は、インビボのモデル系（例えば、本明細書に記載される任意のモデルのようなマウスモデル）で、１または３ｍｇ／ｋｇの単回用量として、投与によって評価され得る。本明細書に記載される粒子または調製物は、インビボでモデル系，（例えば、本明細書に記載される任意のモデルのようなマウスモデル）で投与された場合（例えば、１または３ｍｇ／ｋｇの単回用量として）、タンパク質またはｍＲＮＡによって測定して、結果として２０、１０、５％未満のノックダウンを生じ得るかまたはノックダウンを生じない場合がある。
【０４８５】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、ｍＲＮＡを切断する能力について評価する。
【０４８６】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、サイトカインを誘導する能力について評価する。本明細書に記載される粒子または調製物は、インビボのモデル系（例えば、本明細書に記載される任意のモデルのようなマウスモデル）で投与された場合（例えば、１または３ｍｇ／ｋｇの単回用量として）、２、５または１０倍未満のサイトカイン誘導を生じ得る。例えば、投与によって、以下のうちの１つ以上、例えば、２、３、４、５、６または７つまたは全ての２、５または１０倍未満の誘導が生じる：腫瘍壊死因子−α、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、ケラチノサイト由来サイトカインおよびインターフェロン−γ。
【０４８７】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物は、アラニンアミノトランスフェラーゼまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、インビボのモデル系（例えば、本明細書に記載される任意のモデルのようなマウスモデル）で（例えば、１または３ｍｇ／ｋｇの単回用量として）投与した場合、増大する能力について評価される。ある実施形態では、粒子または調製物は、２、５または１０倍未満の増大を生じる。
【０４８８】
ある実施形態では、粒子または粒子の調製物を、血球数を変更する能力について評価する。ある実施形態では、粒子または調製物は、血球数の変化を生じず、例えば、インビボのモデル系（例えば、本明細書に記載される任意のモデルのようなマウスモデル）では３ｍｇ／ｋｇの２回投与の４８時間後に変化を生じない。
【０４８９】
本明細書に記載される粒子は、いくつかの分析方法に供することができる。例えば、本明細書に記載される粒子は、不純物または残留溶媒が存在するか否かを決定するため（例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による）、１つ以上の成分の相対量を決定するため（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を介して）、粒子サイズを測定するため（例えば、動的光散乱および／または走査電子顕微鏡を介して）、または表面構成要素の有無を決定するための測定に供され得る。
【０４９０】
本明細書に開示される組成物は、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡ（インビボで、例えば、実験動物、例えば、マウスで標的遺伝子をノックダウンする）を送達する能力について評価され得る。組成物の活性を、等しい量の単独の核酸剤の活性と比較してもよい。いくつかの実施形態では、標的遺伝子はＧＦＰ（例えば、ＥＧＦＰ）であり、このＧＦＰは、ＨｅＬＡ細胞で発現され。例えば、このアッセイは、参照によって本明細書に援用される、Ｂｅｒｔｒａｎｄら、２００２，ＢＢＲＣ  ２９６：１０００−１００４に記載の、抗−ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ、ＧＦＰプラスミド、ＨｅＬＡ−ＧＦＰ細胞、マウス、およびＧＦＰ発現アッセイを用いてもよい。本明細書に記載される粒子および組成物を評価するための他の例示的な細胞としては、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭ４Ａ４  ＧＦＰの細胞が挙げられる。
【０４９１】
本明細書に開示される組成物は、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡ，（標的遺伝子をインビトロで、例えば、培養された細胞中でノックダウンする）を送達する能力について評価され得る。この組成物の活性を、等しい量の単独の核酸剤の活性と比較してもよい。いくつかの実施形態では、標的遺伝子はＧＦＰであり、この培養される細胞は、ＧＦＰでトランスフェクトされたＨｅＬＡ細胞である。例えば、このアッセイは、参照によって本明細書に援用される、Ｂｅｒｔｒａｎｄら、２００２，ＢＢＲＣ  ２９６：１０００−１００４に記載の、抗−ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ、ＧＦＰプラスミド、ＨｅＬＡ−ＧＦＰ細胞、細胞培養条件、およびＧＦＰ発現アッセイを用いてもよい。本明細書に記載される粒子および組成物を評価するための他の例示的な細胞としては、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭ４Ａ４  ＧＦＰの細胞が挙げられる。
【０４９２】
本明細書に開示される組成物は、血清または細胞溶解液中でのインキュベーション後、核酸剤、例えば、ｓｉＲＮＡ（標的遺伝子をインビトロで、例えば、培養された細胞中でノックダウンする）を送達する能力について評価され得る。処理された組成物の活性は、等しい量の単独の核酸剤の活性と比較され得る。いくつかの実施形態では、この標的遺伝子はＧＦＰであり、この培養される細胞は、ＧＦＰでトランスフェクトされたＨｅＬＡ細胞である。例えば、このアッセイは、参照によって本明細書に援用される、Ｂｅｒｔｒａｎｄら、２００２，ＢＢＲＣ  ２９６：１０００−１００４に記載の、抗−ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ、ＧＦＰプラスミド、ＨｅＬＡ−ＧＦＰ細胞、細胞培養条件、ＧＦＰ発現アッセイを用いても、細胞溶解液を用いるアッセイの場合は、ＨｅＬａ細胞溶解液を用いてもよい。あるいは、参照によって本明細書に援用される、Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎら、，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：８９８４−８９９２に記載のマウス発現系を用いて、組成物の能力を評価してもよい。Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎらの標的遺伝子および構築物、または他の標的遺伝子および構築物を、Ｈｕ−ｌｉｅｓｋｏｖａｎらに記載のマウス系で用いてもよい。本明細書に記載される粒子および組成物を評価するための他の例示的な細胞としては、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭ４Ａ４  ＧＦＰの細胞が挙げられる。
【０４９３】
本明細書に開示される組成物を、ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ  Ａ）のような消化因子から核酸剤を防御する能力について評価してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、未処理の核酸剤（例えば、単独のｓｉＲＮＡ）に対してｓｉＲＮＡのような核酸剤に対する防御を付与し得る。この評価は、組成物および／または遊離の核酸剤がＲＮａｓｅのような消化因子とインキュベートされ、組成物および単独の核酸が、種々の時点にわたって、例えば、ゲルクロマトグラフィーを用いて評価されるアッセイを包含し得る。
【０４９４】
薬学的組成物
本明細書で、本明細書に記載される複数の粒子および薬学的に許容される担体またはアジュバントを含む組成物、例えば、薬学的組成物を提供する。
【０４９５】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載される化合物、例えば、複合体の薬学的に許容される塩を含んでもよい。本明細書に記載される化合物の薬学的に許容される塩としては、薬学的に許容される無機および有機の酸および塩基由来の塩が挙げられる。適切な酸塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パルモアート（ｐａｌｍｏａｔｅ）、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、およびウンデカン酸塩が挙げられる。適切な塩基に由来する塩としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）、アンモニウム、およびＮ−（アルキル）４＋塩が挙げられる。本発明はまた、本明細書に記載される化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化も想定する。水溶性もしくは油溶性または分散性生成物は、このような四級化によって得られてもよい。
【０４９６】
ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤、および滑沢剤、ならびに着色料、放出剤、コーティング剤、甘味料、調味料および香料、保存料、ならびに抗酸化剤も組成物中に存在し得る。
【０４９７】
薬学的に許容される抗酸化剤の例としては以下が挙げられる：（１）水溶性の抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性の抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；ならびに（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など。
【０４９８】
組成物は、複合体、粒子、または組成物を懸濁するのに用いられる液体を含んでもよく、この液体は、複合体、粒子、または組成物に適応する任意の液体溶液であってもよく、また、薬学的に許容される非毒性液体のような、薬学的組成物において用いられるのに適切である。適切な懸濁液体としては、水、水性スクロースシロップ、トウモロコシシロップ、ソルビトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ５Ｗ、およびこれらの混合物からなる群より選択される懸濁液を含むが、これらに限定されない。
【０４９９】
本明細書に記載される組成物としてはまた、抗酸化剤、抗菌剤、緩衝液、増量剤、キレート剤、不活性ガス、等張剤、および／または粘性剤など、別の成分を含んでもよい。
【０５００】
一実施形態において、ポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物は、凍結乾燥された形態で提供され、対象への投与の前に再構成される。凍結乾燥されたポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物は、塩または生理食塩水溶液など、例えば、ｐＨ６〜９を有する塩化ナトリウム溶液、乳酸リンゲル注射溶液、またはＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｐＨ７．４（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ，  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）などの市販の希釈剤などの希釈溶液によって再構成されてもよい。
【０５０１】
一実施形態において、凍結乾燥された処方物は、凍結保護剤または安定剤を含み、凍結乾燥の間の結晶形成および融合過程に由来する損傷から、粒子および活性を保護することによって物理的および化学的安定性を維持する。凍結保護剤または安定剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ液体複合体（例えば、ＰＥＧ−セラミドまたはＤ−α−トコフェリルポリエチレングリコール１０００スクシナート）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリオキシエチレンエステル、ポリオキサマー、ポリソルベート、ポリオキシエチレンエステル、レシチン、糖類、オリゴ糖類、多糖類、炭水化物、シクロデキストリン（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）およびポリオール（例えば、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、グルコース、およびデキストラン）、塩、ならびにクラウンエーテルのうちの１つ以上であり得る。
【０５０２】
いくつかの実施形態において、凍結乾燥したポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物は、水、５％デキストロース注射液、乳酸リンゲルおよびデキストロース注射液、または無水アルコール（米国薬局方）および、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬの商標の下でＧＡＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，  Ｎ．Ｊ．から入手可能なポリオキシエチレン化したヒマシ油界面活性剤などの非イオン界面活性剤の体積での等量部の混合物で再構成される。凍結乾燥した生成物および再構成用のビヒクルは、適切に遮光されたバイアル中に別個にパッケージングしてもよい。再構成された溶液における界面活性剤の量を最小化するために、十分量のビヒクルのみを提供して、ポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物の溶液を形成してもよい。一旦薬剤の溶解を達成すると、得られる溶液はさらに、好適な非経口希釈剤によって注射の前に希釈される。このような希釈剤は、当業者に周知である。これらの希釈剤は一般的に、臨床施設において入手可能である。しかしながら、対象のポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物を、十分な非経口希釈剤を含む第三のバイアルでパッケージングして、投与のための最終濃度を調製することは本発明の範囲内である。代表的な希釈剤は、乳酸リンゲル注射液である。
【０５０３】
再構成されたポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物の最終的な希釈は、類似の有用性を有する他の調製物、例えば、５％デキストロース注射液、乳酸リンゲルおよびデキストロース注射液、注射用滅菌水などを用いて行ってもよい。しかしながら、その狭いｐＨ範囲（ｐＨ６．０〜７．５）に起因して、乳酸リンゲル注射液が最も代表的である。１００ｍＬあたり、乳酸リンゲル注射液は、塩化ナトリウム（米国薬局方）０．６ｇ、乳酸ナトリウム０．３１ｇ、塩化カリウム（米国薬局方）０．０３ｇ、および塩化カルシウム２Ｈ２Ｏ（米国薬局方）０．０２ｇを含む。モル浸透圧濃度は、２７５ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、等張に非常に近い。
【０５０４】
組成物は、単位剤形で簡便に与えられてもよく、医薬の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。薬学的に許容される担体と組み合わされて単一の剤形を生じ得る核酸剤の量は、治療されている宿主、特定の投与様式に応じて変動する。薬学的に許容される担体と組み合わせて単一剤形を生じることのできる活性薬の量とは一般的に、治療効果を生じる化合物の量である。
【０５０５】
投与の経路
本明細書に記載される薬学的組成物は、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内、眼内または頭蓋内注射）、局所的に、粘膜に（例えば、直腸にまたは膣に）、鼻腔内に、頬側に、眼に、吸入スプレーを介して投与されてもよく（例えば、噴霧、噴霧剤、または乾燥粉末装置を介して送達される）、またはインプラントのリザーバーを介して投与されてもよい。
【０５０６】
非経口投与に適切な薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容される滅菌等張性水性または非水性の溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルジョン、または使用直前に滅菌注射溶液または分散液中に再構成され得る滅菌粉末と組み合わせて、１つ以上のポリマー−薬剤の複合体（単数または複数）、粒子（単数または複数）、または組成物（単数または複数）を含み、これは、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、意図されるレシピエントの血液で製剤が等張となる溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含んでもよい。
【０５０７】
薬学的組成物において採用され得る適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、および適切なそれらの混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合、必要な粒子の大きさの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０５０８】
これらの組成物はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの封入によって確実にされ得る。糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物に含むこともまた望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬形態の長期吸収が、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど、吸収を遅延させる薬剤の封入によってもたらされ得る。
【０５０９】
いくつかの場合、核酸剤の効果を長期化するために、皮下または筋肉内注射からの薬剤の吸収を遅延させることが望ましい。このことは、水溶性に乏しい結晶または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。次に、複合体、粒子、または組成物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、溶解速度は次に、結晶の大きさおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与される剤形の遅延した吸収は、油性ビヒクルに複合体、粒子、または組成物を溶解または懸濁することによって達成される。
【０５１０】
経口投与に適切な薬学的組成物は、カプセル、サシェ（ｃａｃｈｅｔ）、丸剤、錠剤、ガム、トローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅ）（香味基剤、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを用いる）、散剤、顆粒剤の形態であっても、または水性もしくは非水性液体における溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはトローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅｓ）として（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を用いる）、および／または口腔洗浄薬などの形態であってもよく、各々が既定の量の薬剤を活性成分として含む。組成物はまた、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）、舐剤、ペーストとしても投与されてもよい。
【０５１１】
錠剤は、圧縮または成形によって、必要に応じて１つ以上の付属成分とともに製造され得る。圧縮された錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、または架橋されたカルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤、または分散剤を用いて調製されてもよい。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤された粉末状ペプチドまたはペプチド模倣薬の混合物を適切な機械において成形することによって製造されてもよい。
【０５１２】
錠剤、ならびに糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤などの他の固形剤形は必要に応じて、切れ目を入れられてもよいし、または腸溶性コーティングおよび医薬製剤分野で周知の他のコーティングのような、コーティングおよびシェルを用いて調製されてもよい。錠剤および他の固形剤形はまた、例えば、所望の放出特性を提供するために、様々な比のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いて、その内部にある活性成分の緩徐な放出または徐放を提供するよう製剤されてもよい。これらは、例えば、細菌保持フィルターを通じた濾過によって、または滅菌水、もしくはいくつかの他の滅菌注射可能媒体において使用直前に溶解することのできる滅菌固形組成物の形態で滅菌薬を組み込むことによって滅菌されてもよい。これらの組成物はまた、必要に応じて不透明化薬を含んでもよく、活性成分（単数または複数）のみを、または優先的に、胃腸管の特定の部分において、必要に応じて遅延された様式で放出する組成物であってもよい。使用することのできる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。活性成分はまた、適宜、上記の賦形剤の１つ以上とともにマイクロ封入された形態であってもよい。
【０５１３】
経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられる。ポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物に加えて、液体剤形は、例えば、水または、他の溶媒、安定化剤、および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油類（特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物など、当該分野で通常用いられる不活性希釈剤を含んでもよい。
【０５１４】
不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味料、調味料、着色料、香料、および保存料などのアジュバントも含んでもよい。
【０５１５】
懸濁液は、ポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、およびトラガカント、ならびにこれらの混合物のような懸濁剤を含んでもよい。
【０５１６】
局所投与に適切な薬学的組成物は、所望の処置が局所適用によって容易に接近可能な領域または臓器に関与する場合に有用である。皮膚へ局所的に適用するために、薬学的組成物は、担体に懸濁または溶解された活性成分を含む適切な軟膏を用いて処方されるべきである。本明細書に記載される粒子の局所投与のための担体としては、限定するものではないが、鉱油、液化石油、白色石油、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、および水が挙げられる。あるいは、薬学的組成物は、適切な乳化剤とともに担体において懸濁または溶解される活性粒子を含む適切なローションまたはクリームを用いて製剤してもよい。適切な担体としては、限定するものではないが、鉱油、ソルビタンモノステアラート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水が挙げられる。また、本明細書に記載される薬学的組成物は、直腸坐剤処方物によってまたは適切な浣腸処方物において下位腸管に局所的に適用され得る。局所性経皮パッチもまた本明細書に含まれる。
【０５１７】
本明細書に記載される薬学的組成物は、鼻内エアロゾルまたは吸入によって投与され得る。このような組成物は、医薬製剤の分野において周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールもしくは他の適切な保存料、バイオアベイラビリティを向上する吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当該分野で公知の他の可溶化剤もしくは分散剤を使用して、生理食塩水の溶液として調製され得る。
【０５１８】
本明細書に記載される薬学的組成物はまた、直腸または膣内投与のための坐剤の形態で投与されてもよい。坐剤は、本明細書に記載される１つ以上のポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物を、室温で固形物だが体温で液体である１つ以上の適切な非刺激性賦形剤と混合することによって調製され得る。従って、組成物は、直腸腔または膣腔において融解し、ポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物を放出する。このような材料としては、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤用ワックス、またはサリチル酸塩が挙げられる。膣内投与に適切な本発明の組成物としてはまた、当該分野で適切であることが公知のこのような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、泡状物、またはスプレー処方物が挙げられる。
【０５１９】
眼科用の処方物、眼の軟膏、散剤、溶液などもまた、本発明の範囲内であると意図される。眼の組織（例えば、眼の深部皮質領域、核上性（ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ）領域、または水性体液領域）は、眼科用処方物と接触されてもよく、この眼科用処方物はレンズへと分布させられる。本発明の眼科用処方物の投与または適用の任意の適切な方法（単数または複数）（例えば、局所、注射、非経口、風媒性など）が使用されてもよい。例えば、接触することは、局所投与を介して行われても、または注射を介して行われてもよい。
【０５２０】
薬用量および薬用量投与計画
複合体、粒子および組成物は、当業者に公知の従来法によって薬学的に許容される剤形へと処方することができる。
【０５２１】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の対象、組成物、および投与様式について、対象に対して毒性であることなく、所望の治療応答を達成するのに有効な量の活性成分を得るために変動されてもよい。
【０５２２】
一実施形態において、複合体、粒子、または組成物は、例えば０．００１〜３００ｍｇ／ｍ２、約０．００２〜２００ｍｇ／ｍ２、約０．００５〜１００ｍｇ／ｍ２、約０．０１〜１００ｍｇ／ｍ２、約０．１〜１００ｍｇ／ｍ２、約５〜２７５ｍｇ／ｍ２、約１０〜２５０ｍｇ／ｍ２、例えば、０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０ｍｇ／ｍ２の投薬量で対象に投与される。投与は、例えば、１、２、３、４もしくは５日ごと、または毎週、または２、３、４、５、６もしくは７もしく８週毎に一定間隔であってもよい。この投与は、約１０分〜約６時間、例えば、約３０分〜約２時間、約４５分〜９０分、例えば、約３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、またはそれより長い期間にわたってであり得る。一実施形態において、ポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物は、例えば１５分、１０分、５分、またはそれより短い期間にわたってボーラス注入または静脈内注入として投与される。一実施形態において、複合体、粒子、または組成物は、このような所望の用量の薬剤が投与されるような量で投与される。好ましくは、複合体、粒子、または組成物の用量は、本明細書に記載される用量である。
【０５２３】
一実施形態において、対象は、１、２、３、最大１０、最大１２、最大１５回、もしくはそれより多くの処置を、または障害もしくは障害の症状が治癒（ｃｕｒｅｄ）、治癒（ｈｅａｌｅｄ）、軽減、緩和（ｒｅｌｉｅｖｅｄ）、変化、治療、寛解、緩和（ｐａｌｌｉａｔｅｄ）、改善、または影響されるまで受ける。例えば、対象は、障害もしくは障害の症状が治癒（ｃｕｒｅｄ）、治癒（ｈｅａｌｅｄ）、軽減、緩和（ｒｅｌｉｅｖｅｄ）、変化、救済、寛解、緩和（ｐａｌｌｉａｔｅｄ）、改善、または影響されるまで、１、２、３、または４週ごとに１回注入を受ける。好ましくは、投薬スケジュールは、本明細書に記載される投薬スケジュールである。
【０５２４】
複合体、粒子、または組成物は、一次療法として、例えば単独でまたは追加の薬剤（単数または複数）との併用で投与されてもよい。他の実施形態において、複合体、粒子、または組成物は、対象が、一次療法に対して耐性を発現するか、この治療法に応答することができないか、またはこの治療法の後に再発した後に投与される。この複合体、粒子、または組成物は、第二の薬剤との併用で投与され得る。好ましくは、この複合体、粒子、または組成物は、本明細書に記載される第二の薬剤との併用で投与される。第二の薬剤は、粒子中の核酸剤と同じであっても、または異なってもよい。
【０５２５】
キット
本明細書に記載される複合体、粒子、または組成物は、キットにおいて提供され得る。このキットには、本明細書に記載される複合体、粒子、または組成物、ならびに必要に応じて、容器、薬学的に許容される担体、および／または資料を備える。この資料は、説明資料、指示資料、販売資料、または本明細書に記載される方法および／もしくは本明細書に記載される方法に関して粒子の使用と関連する他の資料であってもよい。
【０５２６】
キットの資料は、その形態で制限されることはない。一実施形態において、資料は、この複合体、粒子、または組成物の製造、この複合体、粒子、または組成物の物理的特性、濃度、使用期限、バッチまたは製造場所情報などについての情報を含んでもよい。一実施形態において、資料は、複合体、粒子、または組成物を投与する方法に関する。
【０５２７】
一実施形態において、資料は、本明細書に記載される複合体、粒子、組成物を、本明細書に記載される方法を実施するのに適切な様式で、例えば、適切な用量、剤形、または投与様式（例えば、本明細書に記載される用量、剤形、または投与様式）で投与するための説明書を含んでもよい。別の実施形態において、資料は、本明細書に記載される複合体、粒子、または組成物を、適切な対象、例えば、ヒト、例えば、本明細書に記載される障害を罹患しているかまたはその危険にあるヒトに投与するための説明書を含んでもよい。別の実施形態において、資料は、本明細書に記載される複合体または粒子を薬学的に許容される組成物へ再構成するための説明書を含んでもよい。
【０５２８】
一実施形態において、キットは、対象の治療などのための複合体、粒子、または組成物を使用するための説明書を備える。この説明書は、複合体、粒子、または組成物を、特定の対象を用いてまたは特定の化学治療薬との併用で使用するために再構成または希釈する方法を含んでもよい。説明書はまた、ポリマーの複合体組成物を、静脈内注入などによる特定の投与手段を用いて使用するために再構成または希釈する方法も含んでもよい。
【０５２９】
別の実施形態において、このキットは、特定の適応症を有する対象を処置するための説明書を備える。このキットの資料は、その形態で限定されることはない。多くの場合、資料、例えば説明書は、印刷物、例えば、印刷されたテキスト、図、および／または写真、例えば、ラベルまたは印刷されたシートにおいて提供される。しかしながら、資料はまた、点字、コンピュータ可読材料、ビデオ録画、またはオーディオ録音など、他の形式で提供されてもよい。別の実施形態において、キットの資料は、連絡先、例えば、実際の住所、電子メールアドレス、ウェブサイト、または電話番号であり、そこでキットのユーザーは、本明細書に記載される粒子および／または本明細書に記載される方法におけるその使用についての実質的な情報を得ることができる。この資料はまた、任意の組み合わせの形態で提供されてもよい。
【０５３０】
本明細書に記載される複合体、粒子、または組成物に加えて、キットの組成物は、他の成分、例えば、界面活性剤、凍結保護剤もしくは安定剤、抗酸化剤、抗菌薬、増量剤、キレート剤、不活性ガス、等張化剤および／もしくは粘性剤、溶媒もしくは緩衝液、安定剤、保存料、香味料（例えば、苦味アンタゴニストもしくは甘味料）、香料、例えば、キットにおける１つ以上の成分を染色または着色するための色素もしくは着色料、または他の見かけを良くする成分、薬学的に許容される担体、ならびに／あるいは、本明細書に記載される病態または障害を治療するための第二の薬剤などを含んでもよい。あるいは、他の成分が、キットに含まれてもよいが、ただし本明細書に記載される粒子とは異なる組成物または容器においてである。このような実施形態において、キットは、本明細書に記載される複合体、粒子、もしくは組成物および他の成分を混合するための、または本明細書に記載される複合体、粒子、もしくは組成物を他の成分とともに用いるための説明書を備えてもよい。
【０５３１】
別の実施形態において、キットには、第二の化学治療薬を備える。一実施形態において、この第二の剤は、凍結乾燥型または液体型である。一実施形態において、複合体、粒子、または組成物および第二の治療薬は別個の容器にあり、別の実施形態においては、複合体、粒子、または組成物および第二の治療薬は、同じ容器にパッケージングされる。
【０５３２】
いくつかの実施形態において、キットの成分は、例えばゴムまたはシリコーン封鎖（例えば、ポリブタジエンまたはポリイソプレン封鎖）によって密封されたバイアル中に保存される。いくつかの実施形態において、キットの成分は、不活性条件下で保存される（例えば、窒素またはアルゴンなど別の不活性ガスの下）。いくつかの実施形態において、キットの成分は、無水条件下（例えば、乾燥剤を用いる）で保存される。いくつかの実施形態において、キットの成分は、コハク色のバイアルなどの遮光容器に保存される。
【０５３３】
本明細書に記載される複合体、粒子、または組成物は、任意の形態、例えば、液体、凍結、乾燥、または凍結乾燥した形態において提供されてもよい。本明細書に記載される複合体、粒子、または組成物は、実質的に純粋であるか、および／または無菌であることが好ましい。いくつかの実施形態では、複合体、粒子、または組成物は無菌である。本明細書に記載される複合体、粒子、または組成物が液体溶液で提供される場合、この液体溶液は好ましくは水溶液であり、無菌の水溶液が好ましい。一実施形態において、複合体、粒子、または組成物は、凍結乾燥型で提供され、必要に応じて希釈溶液は、凍結乾燥した薬剤を再構成するために提供される。希釈剤としては例えば、塩、または生理食塩水溶液、例えば、ｐＨ６〜９を有する塩化ナトリウム溶液、乳酸リンゲル注射溶液、Ｄ５Ｗ、またはＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｐＨ７．４（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ，  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，  ＩＬ）を含んでもよい。
【０５３４】
このキットは、本明細書に記載される複合体、粒子、または組成物を含む組成物のための１つ以上の容器を備えてもよい。いくつかの実施形態において、キットは、組成物および資料のための別個の容器、分割器、または区画を備える。例えば、組成物は、ボトル、バイアル、静脈用混合バッグ、静脈用注入セット、ピギーバックセット、またはシリンジに含まれてもよく、資料は、プラスチックスリーブまたはパケットに含まれてもよい。他の実施形態において、キット別個の要素が、単一の分割されていない容器内に含まれる。例えば、組成物は、ラベルの形態で資料が添付されたボトル、バイアル、またはシリンジに含まれる。いくつかの実施形態において、キットは、複数（例えば、パック）の個々の容器を含み、各々が、本明細書に記載されるポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物のうち１つ以上の単位剤形（例えば、本明細書に記載される剤形）を含む。例えば、キットは、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、またはブリスターパックを備え、各々が本明細書に記載される粒子の単一の単位用量を含んでいる。キットの容器は、気密性、防水性（例えば、湿気または蒸発における変化に不透過性である）であっても、および／または遮光性であってもよい。
【０５３５】
キットには必要に応じて、組成物の投与に適切な器具、例えば、シリンジ、吸入装置、ピペット、ピンセット、計量スプーン、滴下装置（例えば、点眼装置）、スワブ（例えば、綿スワブまたは木製スワブ）、または任意のそのような送達デバイスを備える。一実施形態において、このデバイスは、例えば、外科的挿入のためにパッケージングされた医用インプラントデバイスである。
【０５３６】
粒子および組成物を用いる方法
本明細書に記載されるポリマー−薬剤の複合体、粒子、および組成物は、培養物中の細胞へ、例えばインビトロもしくはエクスビボで、または対象へ、例えばインビボで投与して、種々の疾患または障害（例えば、癌（例えば、固形腫瘍）、自己免疫障害、心血管系障害、炎症性障害、代謝性障害、感染性疾患など）を治療または予防することができる。
【０５３７】
従って、別の態様では、本発明は、対象における疾患または障害を治療または予防する方法であって、この疾患または障害が、癌（例えば、固形腫瘍）、自己免疫障害、心血管系障害、炎症性障害、代謝性障害、または感染性疾患である方法、を特徴とする。この方法は、本明細書に記載される有効量の複合体、粒子、または組成物を投与して、これによって疾患または障害を治療することを包含する。ある実施形態では、この複合体、粒子、および組成物は、第一選択、第二選択、または補助療法の一部として用いられてもよく、また単独でまたは１つ以上の追加の処置投与計画と併用して用いられてもよい。
【０５３８】
ある実施形態では、本明細書に開示される複合体（例えば、ポリマー−核酸剤の複合体）、粒子または組成物は、広範な種々の疾患または障害を処置または予防するために用いてもよいし、核酸剤を、例えば、その必要な対象に、例えば、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡを送達するために用いられても；以下の表Ａ、ＢもしくはＣに列挙されるものを含む、癌、炎症性疾患もしくは自己免疫性疾患、または心血管系疾患のような本明細書に記載される疾患または障害を治療するために用いられてもよい。実施形態では、ポリマー−核酸剤の複合体、粒子および組成物は、第一選択、第二選択、または補助療法の一部として用いられてもよく、また単独でまたは１つ以上の追加の処置投与計画と併用して用いられてもよい。
【０５３９】
癌
従って、別の態様では、本発明は、対象における疾患または障害を治療または予防する方法であって、この疾患または障害が、癌（例えば、固形腫瘍）である方法、を特徴とする。この方法は、本明細書に記載される有効量の複合体、粒子、または組成物を投与して、これによってこの疾患または障害を治療することを包含する。ある実施形態では、この複合体、粒子、および組成物は、第一選択、第二選択、または補助療法の一部として用いられてもよく、また単独でまたは１つ以上の追加の処置投与計画と併用して用いられてもよい。
【０５４０】
ある実施形態では、この開示されたポリマー−薬剤の複合体、粒子、および組成物は、増殖性障害を治療または予防するために、例えば、腫瘍およびその転移を治療するために用いられ、ここでは、この腫瘍またはその転移は、本明細書に記載される癌である。いくつかの実施形態において、ここでは薬剤は、本明細書に記載される診断薬、ポリマー−薬剤の複合体、粒子、および組成物を用いて、癌を評価または診断するために用いられてもよい。
【０５４１】
ある実施形態では、増殖性障害は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、または液体腫瘍である。例示的な固形腫瘍としては、脳、肺、乳房、リンパ系、胃腸管（例えば、結腸）、および尿生殖器（例えば、腎臓、尿路上皮性、または精巣の腫瘍）管、咽頭、前立腺、および卵巣のものなど、種々の臓器系の悪性腫瘍（例えば、肉腫および細胞腫（例えば、腺癌または有棘細胞癌））が挙げられる。例示的な腺癌としては、結腸直腸癌、腎細胞癌、肝癌、肺の非小細胞癌、および小腸の癌が挙げられる。ある実施形態では、この方法は、腱、筋肉または脂肪、および液体腫瘍のものなど、軟部腫瘍を評価または治療することを包含する。
【０５４２】
ある実施形態では、癌とは、任意の癌、例えば、米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）が記載するものである。癌は、癌腫、肉腫、骨髄腫（ミエローマ）、白血病、リンパ腫、または混合型であり得る。米国国立癌研究所によって記載される例示的な癌としては以下が挙げられる：
消化性／胃腸管系癌、例えば、肛門癌；胆管癌；肝外胆管癌；虫垂癌；カルチノイド腫瘍；胃腸癌；結腸癌；小児期結腸直腸癌を含む結腸直腸癌；小児期胃食道癌を含む胃食道癌；胆嚢癌；小児期胃癌を含む胃癌；成人性（原発性）肝細胞（肝）癌および小児期（原発性）肝細胞（肝）癌を含む肝細胞（肝）癌；小児期膵癌を含む膵癌；肉腫、横紋筋肉腫；島細胞膵癌；直腸癌；および小腸癌；
内分泌癌、例えば、島細胞癌（内分泌膵臓）；小児期副腎皮質癌を含む副腎皮質癌；胃腸細胞腫瘍；副甲状腺癌；クロム親和性細胞腫；下垂体腫瘍；小児期甲状腺癌を含む甲状腺癌；小児期多発性内分泌腫瘍症候群；および小児期細胞腫瘍；
眼癌、例えば、眼内黒色腫；および網膜芽細胞腫；
筋骨格癌、例えば、ユーイングファミリーの腫瘍；骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫；小児期横紋筋肉腫；成人期および小児期軟部組織肉腫を含む軟部組織肉腫；腱鞘の透明細胞肉腫；および子宮肉腫；
乳癌、例えば、小児期および男性乳癌を含む乳癌ならびに妊娠；
神経癌、例えば、小児期脳幹神経膠腫；脳腫瘍；小児期脳星状細胞腫；小児期脳星状細胞腫／悪性神経膠腫；小児期上衣腫；小児期髄芽腫；小児期松果体およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍；小児期視覚路および視床下部神経膠腫；他の小児期脳癌；副腎皮質細胞腫；原発性中枢神経系リンパ腫；小児期脳星状細胞腫；神経芽腫；頭蓋咽頭腫；脊髄腫瘍；中枢神経系非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；ならびに小児期テント上原始神経外胚葉性腫瘍および下垂体腫瘍；
尿生殖器癌、例えば、小児期膀胱癌を含む膀胱癌；腎細胞（腎）癌；小児期卵巣癌を含む卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣低悪性潜在的腫瘍；陰茎癌；前立腺癌；小児期腎細胞癌を含む腎細胞癌；腎盂および尿管の移行細胞癌；精巣癌；尿道癌；膣癌；外陰癌；子宮頚癌；ウイルムス腫瘍および他の小児期腎腫瘍；子宮内膜癌；ならびに妊娠性絨毛性腫瘍；
胚細胞性癌、例えば、小児期頭蓋外胚細胞性腫瘍；性腺外胚細胞性腫瘍；卵巣胚細胞性腫瘍；および精巣癌；
頭頸部癌、例えば、口唇および口腔の癌；小児期口腔癌を含む口腔癌（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ）；下咽頭癌；小児期喉頭癌を含む喉頭癌；潜在性原発性の転移性扁平上皮頚部癌；口腔癌；鼻腔および副鼻腔癌；小児期鼻咽頭癌を含む鼻咽頭癌；口腔咽頭癌；副甲状腺癌；咽頭癌；小児期唾液腺癌を含む唾液腺癌；咽喉癌；ならびに甲状腺癌；
血液／血液細胞癌、例えば、白血病（例えば、成人期および小児期急性リンパ性白血病を含む急性リンパ性白血病；成人期および小児期急性骨髄性白血病を含む急性骨髄性白血病；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；およびヘアリーセル白血病）；リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；成人期および小児期ホジキンリンパ腫ならびに妊娠中のホジキンリンパ腫を含むホジキンリンパ腫；成人期および小児期非ホジキンリンパ腫ならびに妊娠中の非ホジキンリンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫；菌状息肉症；セザリー症候群；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；ならびに原発性中枢神経系リンパ腫）；および他の血液癌（例えば、慢性骨髄増殖性疾患；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；骨髄異形成症候群；ならびに骨髄異形成／骨髄増殖性障害）；
肺癌、例えば、非小細胞肺癌；および小細胞肺癌；
呼吸器系癌、例えば、成人期悪性中皮腫；小児期悪性中皮腫；悪性胸腺腫；小児期胸腺腫；胸腺癌；小児期気管支腺腫／カルチノイドを含む気管支腺腫／カルチノイド；胸膜肺芽細胞腫；非小細胞肺癌；および小細胞肺癌；
皮膚癌、例えば、カポジ肉腫；メルケル細胞癌；黒色腫；および小児期皮膚癌；
ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍；
他の小児期癌、小児期の通常ではない癌、および未知の原発性部位の癌；
ならびに、上記の癌の転移もまた、本明細書に記載される方法に従って治療または予防することができる。
【０５４３】
本明細書に記載されるポリマー−薬剤の複合体、化合物、または組成物は、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、黒色腫、結腸直腸癌、および乳癌の加速性または転移性の癌を治療するのに特に適切である。
一実施形態において、ポリマー−薬剤の複合体、化合物、または組成物および第二の治療薬を用いた治療などによる癌の併用療法のための方法が提供される。種々の組み合わせが、本明細書に記載される。この組み合わせは、腫瘍の発達を低減するか、腫瘍の負荷を低減するか、または哺乳類宿主における腫瘍の退縮を生じることができる。
【０５４４】
ある実施形態では、核酸剤−ポリマーの複合体、粒子または組成物（例えば、表Ａに列挙される遺伝子を標的するｓｉＲＮＡを含む）を投与して、例えば、表Ａに列挙される関連の疾患を治療または予防する。
【０５４５】
【表３−１】
2013541506.tif 000010
【表３−２】
2013541506.tif 000011
【表３−３】
2013541506.tif 000012
【０５４６】
炎症および自己免疫疾患
別の態様では、本発明は、対象における疾患または障害を治療または予防する方法であって、ここでこの疾患または障害が炎症性または自己免疫性の疾患である方法を特徴とする。この方法は、本明細書に記載される複合体、粒子または組成物の有効量を投与し、それによってその疾患または障害を治療することを包含する。ある実施形態では、この複合体、粒子および組成物は、第一選択、第二選択、または補助療法の一部として用いられてもよく、また単独でまたは１つ以上の追加の治療投与計画と併用して用いられてもよい。
【０５４７】
ある実施形態では、本明細書に記載されるポリマー−薬剤の複合体、粒子、組成物および方法は、炎症と関連した疾患または障害を治療または予防するために用いられ得る。ある実施形態では、本明細書に説明されるポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物は、炎症の開始の前に投与されても、開始時に投与されても、開始後に投与されてもよい。ある実施形態では、予防的に用いられる場合、ポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物は、任意の炎症性の応答または症状に先立って提供される。ある実施形態では、ポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物の投与は、炎症性の応答または症状を予防または減弱させ得る。例示的な炎症性の病態としては、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、変性関節疾患、脊椎関節症（ｓｐｏｎｄｏｕｌｏａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）、痛風性関節症、全身性エリテマトーデス、若年性関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症、糖尿病（例えば、インスリン依存性糖尿病または若年発症糖尿病）、月経性痙攣、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、クローン病、粘液結腸炎、潰瘍性大腸炎、胃炎、食道炎、膵炎、腹膜炎、アルツハイマー病、ショック、強直性脊椎炎、胃炎、結膜炎、膵炎（急性および慢性）、多発性臓器不全症候群（例えば、敗血症または外傷に対して二次性）、心筋梗塞、アテローム動脈硬化症、脳卒中、再灌漑流障害（例えば、心臓肺バイパスまたは腎臓透析による）、急性糸球体腎炎、血管炎、温熱損傷（すなわち、日焼け）、壊死性腸炎、顆粒球輸液関連症候群、および／またはシェーグレン症候群が挙げられる。皮膚の例示的な炎症性の病態としては、例えば、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、じんましん、強皮症、乾癬、および急性の炎症成分を有する皮膚炎が挙げられる。
【０５４８】
別の実施態様において、本明細書に記載されるポリマー−薬剤の複合体、粒子、組成物、または方法を用いて、喘息、気管支炎、肺線維症、アレルギー性鼻炎、酸素毒性、肺気腫、慢性気管支炎、急性呼吸促迫症候群、および任意の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含むアレルギーおよび呼吸器系の病態を治療または予防し得る。このポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物を用いて、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を含む慢性肝炎感染を治療してもよい。
【０５４９】
ある実施形態では、本明細書に記載されるポリマー−薬剤の複合体、粒子、組成物、または方法を用いて、臓器−組織自己免疫疾患（例えば、レイノー症候群）、強皮症、重症筋無力症、移植片拒絶、エンドトキシンショック、敗血症、乾癬、湿疹、皮膚炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、ぶどう膜炎、全身性エリテマトーデス、アジソン病、自己免疫性多腺性疾患（自己免疫性多腺性症候群としても公知）、およびグレーブス病などの自己免疫疾患および／または自己免疫疾患と関連した炎症を治療してもよい。
【０５５０】
ある実施形態では、核酸剤−ポリマーの複合体、粒子または組成物（例えば、表Ｂに列挙される遺伝子を標的するｓｉＲＮＡを含む）を投与して、例えば、表Ｂに列挙される関連の疾患を治療または予防する。
【０５５１】
【表４−１】
2013541506.tif 000013
【表４−２】
2013541506.tif 000014
【表４−３】
2013541506.tif 000015
【０５５２】
心血管系疾患
別の態様では、本発明は、対象における疾患または障害を治療または予防する方法であって、ここでこの障害が心血管系疾患である方法を特徴とする。この方法は、本明細書に記載される複合体、粒子または組成物の有効量を投与して、これによってこの疾患または障害を治療することを包含する。ある実施形態では、この複合体、粒子および組成物は、第一選択、第二選択、または補助療法の一部として用いられてもよく、また単独でまたは１つ以上の追加の処置投与計画と併用して用いられてもよい。
【０５５３】
ある実施形態では、この開示された方法は、心血管系疾患の予防および治療に有用であり得る。本明細書に記載されるポリマー−薬剤の複合体、粒子、組成物および方法を用いて治療または予防され得る心血管系疾患としては、心筋症または心筋炎：例えば、特発性心筋症、代謝性心筋症、アルコール性心筋症、薬剤誘発性心筋症、虚血性心筋症、および高血圧性心筋症が挙げられる。本明細書に記載されるポリマー−薬剤の複合体、粒子、組成物、および方法を用いて治療可能または予防可能な疾患はまた、大動脈、冠動脈、頚動脈、脳血管性動脈、腎動脈、腸骨動脈、大腿動脈、および膝窩動脈などの主要血管のアテローム性障害（大血管性疾患）でもある。ある実施形態では、治療または予防することのできる他の脈管系疾患としては、血小板凝集、網膜細動脈、糸球体細動脈、神経栄養血管、心細動脈に関連したもの、ならびに眼の毛細血管床、腎臓、心臓、ならびに中枢および末梢神経系と関連したものが挙げられる。本明細書に記載されるポリマー−薬剤の複合体、粒子、組成物、および方法はまた、個体の血漿におけるＨＤＬレベルの上昇に用いられ得る。
【０５５４】
本明細書に記載されるポリマー−薬剤の複合体、粒子、組成物、および方法を用いて治療され得るさらに他の障害としては、例えば、冠動脈介入後の再狭窄、ならびに高密度および低密度コレステロールの異常なレベルと関連した障害が挙げられる。
【０５５５】
ある実施形態では、ポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物は、血管形成術を受けているかまたは受けたことのある対象に投与されてもよい。一実施態様において、ポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物は、ステント設置を用いる血管形成術を受けているか、または受けた対象に投与される。いくつかの実施態様において、ポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物は、ステントのコーティングとして用いられてもよい。
【０５５６】
ある実施形態では、ポリマー−薬剤の複合体、粒子、または組成物は、ステントのインプラントの間に、例えば別個の静脈内投与として、ステントのためのコーティングとして用いてもよい。
【０５５７】
ある実施形態では、核酸剤−ポリマーの複合体、粒子または組成物、（例えば、表Ｃに列挙される遺伝子を標的するｓｉＲＮＡを含む）を投与して、例えば、表Ｃに列挙される関連の疾患を治療または予防する。
【０５５８】
【表５−１】
2013541506.tif 000016
【表５−２】
2013541506.tif 000017
【０５５９】
本発明の少なくとも1つの実施態様に関するいくつかの態様を記載してきたが、当業者には、種々の変更、改変、および改良が容易に行われることが、認められるべきである。そのような変更、改変、および改良は、本開示の一部であることが意図され、本発明の精神および範囲内であることが意図される。従って、上記の説明および図は、単なる例に過ぎない。
【０５６０】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、そのすべての内容が全体として参照によって援用される。矛盾がある場合、定義を含めた本明細書が支配するものとする。加えて、材料、方法、および実施例は、説明のために過ぎず、限定と意図されるものではない。
【実施例】
【０５６１】
実施例
実施例１：５０５０  ＰＬＧＡの精製および特徴付け
ステップＡ：  機械的撹拌器を装備した３Ｌ丸底フラスコに、５０５０ＰＬＧＡ（３００ｇ、Ｍｗ：７．８ｋＤａ；Ｍｎ：２．７ｋＤａ）およびアセトン（９００ｍＬ）を投入した。混合物を室温で１時間撹拌して、透明黄色溶液を生成した。
【０５６２】
ステップＢ：機械的撹拌器を装備した底に出口を有する２２Ｌジャケット反応器に、ＭＴＢＥ（９．０Ｌ、５０５０ＰＬＧＡの質量に対して３０体積）を投入した。セライト（登録商標）（７９５ｇ）を、約２００ｒｐｍでオーバーヘッド撹拌しながら溶液に付加して、懸濁液を生成した。この懸濁液に、ステップＡからの溶液を１時間に亘って徐々に付加した。ポリマー溶液の付加後、混合物をさらに１時間掻き混ぜて、ポリプロピレンフィルターを通して濾過した。濾過ケーキをＭＴＢＥ（３×３００ｍＬ）で洗浄し、０．５時間状態調節して、残留ＭＴＢＥが５重量％以下（１Ｈ  ＮＭＲ解析により測定）になるまで、周囲温度で風乾した（典型的には１２時間）。
【０５６３】
ステップＣ：機械的撹拌器を装備した底に出口を有する１２Ｌジャケット反応器に、アセトン（２．１Ｌ、５０５０ＰＬＧＡの質量に対して７体積）を投入した。ステップＢからのポリマー／セライト（登録商標）複合体を、約２００ｒｐｍでオーバーヘッド撹拌しながら反応器に投入して、懸濁液を生成した。懸濁液を周囲温度でさらに１時間撹拌し、ポリプロピレンフィルターを通して濾過した。濾過ケーキをアセトン（３×３００ｍＬ）で洗浄し、併合濾液を０．４５ｍＭ直列フィルターを通して清澄化して、透明溶液を生成した。この溶液を、約１０００ｍＬに濃縮した。
【０５６４】
ステップＤ：機械的撹拌器を装備した底に出口を有する２２Ｌジャケット反応器に、水（９．０Ｌ、３０体積）を投入し、冷却装置を用いて０〜５℃に温度を下げた。ステップＣからの溶液を、約２００ｒｐｍでオーバーヘッド撹拌しながら２時間掛けて徐々に付加した。溶液の付加後、混合物をさらに１時間撹拌して、ポリプロピレンフィルターを通して濾過した。濾過ケーキを１時間状態調節して、周囲温度で１日風乾し、次いで、３日間真空乾燥して、精製５０５０ＰＬＧＡを白色粉末として生成した（２５８ｇ、収率８６％）。１Ｈ  ＮＭＲ解析は所望の生成物のものと一致し、そしてカール・フィッシャー分析は、０．５２重量％の水を示した。ＨＰＬＣ（ＡＵＣ、２３０ｎｍ）およびＧＰＣ（ＡＵＣ、２３０ｎｍ）により、生成物を分析した。当該プロセスは、より狭い多分散性、すなわちＭｗ：８．８ｋＤａおよびＭｎ：５．８ｋＤａを生じた。
実施例２．  ５０５０ＰＬＧＡラウリルエステルの精製および特徴付け
【０５６５】
機械的撹拌器を装備した１２Ｌ丸底フラスコに、ＭＴＢＥ（４Ｌ）およびヘプタン（０．８Ｌ）を投入した。混合物を約３００ｒｐｍで掻き混ぜて、これに、アセトン（３００ｍＬ）中の５０５０  ＰＬＧＡラウリルエステル（６５ｇ）の溶液を滴下した。ゴム状固体が時間経過とともに生成され、最後に、フラスコの底に固まった。上清をデカントして除去し、固体を、２５℃で２４時間、真空乾燥して、４０ｇの精製５０５０  ＰＬＧＡラウリルエステルを白色粉末として得た（収率：６１．５％）。  １Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ  5.25-5.16  (m,  53H),  4.86  -  4.68  (m,  93H),  4.18  (m,  7H),  1.69  -  1.50  (m,  179H),  1.26  (bs,  37H),  0.88  (t,  J  =  6.9  Hz,  6H)。１Ｈ  ＮＭＲ解析は、所望の生成物のものと一致した。ＧＰＣ（ＡＵＣ、２３０ｎｍ）：６．０２〜９．９分、ｔＲ＝７．９１分。
実施例３．  ７５２５ＰＬＧＡの精製および特徴付け
【０５６６】
機械的撹拌器を装備した２２Ｌ丸底フラスコに、１２ＬのＭＴＢＥを投入し、これに、ジクロロメタン（ＤＣＭ、７５０ｍＬ）中の７５２５  ＰＬＧＡ（１５０ｇ、約６．６ｋＤ）の溶液を約３００ｒｐｍで撹拌して１時間かけて滴下して、ゴム状固体を得た。上清をデカントして除去し、ゴム状固体をＤＣＭ（３Ｌ）中に溶解した。溶液を丸底フラスコに移して、濃縮して残渣を得て、これを２５℃で４０時間真空乾燥して、９４ｇの精製７５２５ＰＬＧＡを白色発泡体として得た（収率６２．７％）。1H  NMR  (CDCl3,  300  MHz):  δ  5.24-5.15  (m,  68H),  4.91  -  4.68  (m,  56H),  3.22  (s,  2.3H,  MTBE),  1.60  -  1.55  (m,  206H),  1.19  (s,  6.6H,  MTBE)。１Ｈ  ＮＭＲ解析は、所望の生成物のものと一致した。ＧＰＣ（ＡＵＣ、２３０ｎｍ）：６．０２〜９．９分、ｔＲ＝７．３７分。
実施例４．  Ｏ−アセチル−５０５０−ＰＬＧＡの合成、精製および特徴付け
【０５６７】
オーバーヘッド撹拌器を装備した２０００ｍＬ丸底フラスコに、精製５０５０  ＰＬＧＡ（２２０ｇ、Ｍｎ：５７００）およびＤＣＭ（６６０ｍＬ）を投入した。混合物を１０分間撹拌して、透明溶液を得た。Ａｃ２Ｏ（１１．０ｍＬ、１１６ｍｍｏｌ）およびピリジン（９．４ｍＬ、１１６ｍｍｏｌ）を溶液に付加すると、約０．５°Ｃの小発熱を生じた。反応を周囲温度で３時間撹拌し、約６００ｍＬに濃縮した。溶液を、約２００ｒｐｍでオーバーヘッド撹拌しながら１時間掛けて、ＭＴＢＥ（６．６Ｌ、３０体積）中のセライト（登録商標）（６６０ｇ）の懸濁液に付加した。懸濁液をポリプロプレンフィルターに通して濾過し、濾過ケーキを周囲温度で１日風乾した。それを、１時間オーバーヘッド撹拌しながら、アセトン（１．６Ｌ、約８体積）中に懸濁した。スラリーをフリットガラス漏斗（粗目）に通して濾過し、濾過ケーキをアセトン（３×３００ｍＬ）で洗浄した。併合濾液をセライト（登録商標）パッドに通して清澄化して、透明溶液を得た。それを約７００ｍＬに濃縮して、２００ｒｐｍで２時間に亘ってオーバーヘッド撹拌しながら、冷水（７．０Ｌ、０〜５°Ｃ）に付加した。懸濁液を、ポリプロピレンフィルターに通して濾過した。濾過ケーキを水（３×５００ｍＬ）で洗浄し、１時間状態調節して、５４３ｇの湿潤ケーキを得た。それを２つのガラストレーに移して、周囲温度で一晩風乾して、３３８ｇの湿潤性生物を得て、これを次に、２５℃で２日間、一定重量に真空乾燥して、２０１ｇの生成物を白色粉末として得た（収率：９１％）。１Ｈ  ＮＭＲ解析は、所望の生成物のものと一致した。生成物をＨＰＬＣにより分析した（ＡＵＣ、２３０ｎｍ）ならびにＧＰＣ（Ｍｗ：９．０ｋＤａおよびＭｎ：６．３ｋＤａ））。
実施例５．  フォレート−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ラウリルエステルの合成、精製および特徴付け
【０５６８】
葉酸−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ラウリルエステルの合成は、葉酸とＰＥＧビスアミン（Sigma-Aldrich、ｎ＝７５、ＭＷ  ３３５０Ｄａ）との直接的カップリングを伴う。低分子量アミンが生成物中に存在する、という可能性のため、ＰＥＧビスアミンを精製した。４．９ｇのＰＥＧビスアミンをＤＣＭ（２５ｍＬ、５体積）中に溶解し、次いで、激しく掻き混ぜながらＭＴＢＥ（２５０ｍＬ、５０体積）中に移した。ポリマーが白色粉末として沈澱した。次に、混合物を濾過し、固体を真空下で乾燥して、４．５ｇの生成物を得た（９２％）。固体の１Ｈ  ＮＭＲ分析は、きれいなスペクトルを提供した；しかしながら、アミン基へのα−メチレンの統合に基づいて、すべてのアルコール基がアミンに変換されるというわけではなかった（６３％ビスアミン、３７％モノアミン）。
【０５６９】
精製ＰＥＧビスアミンを用いて、フォレート−（γ）ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２を合成した。葉酸（１００ｍｇ、１．０当量）を熱ＤＭＳＯ（４．５ｍＬ、ＰＥＧビスアミンに対して３体積）中に溶解した。溶液を周囲温度に冷却し、（２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）（ＨＡＴＵ、１０４ｍｇ、１．２当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、８０μＬ、２．０当量）を付加した。その結果生じた黄色溶液を３０分間撹拌し、ＤＭＳＯ（３ｍＬ、２体積）中のＰＥＧビスアミン（１．５ｇ、２当量）を付加した。過剰量のＰＥＧビスアミンを用いて、ＰＥＧビスアミンの二付加物の考え得る生成を回避し、葉酸の変換を改良した。反応物を２０℃で１６時間撹拌し、Ｃ１８カラム（ＲｅｄｉＳｅｐ、４３ｇ、Ｃ１８）を用いてＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）により直接精製した。生成物を含有する分画を併合し、ＣＨ３ＣＮを真空下で除去した。残留水溶液（約２００ｍＬ）をクロロホルム（２００ｍＬ×２）で抽出した。合わせたクロロホルム相を約１０ｍＬに濃縮し、ＭＴＢＥ中に移して、生成物を黄色粉末として沈澱させた。物質中のあらゆる非反応ＰＥＧビスアミンを完全に除去するために、黄色粉末をアセトン（２００ｍＬ）で３回洗浄した。残りの固体を真空下で乾燥して、黄色半固体生成物（１２０ｍｇ）を得た。ＨＰＬＣ分析は純度９７％を示し、そして１Ｈ  ＮＭＲ解析は、生成物が不純物を含有しないことを示した。
【０５７０】
葉酸−（γ）ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２を、ｐ−ニトロフェニル−ＣＯＯ−ＰＬＧＡ−ＣＯ２−ラウリルと反応させて、葉酸−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ラウリルエステルを得た。ｐ−ニトロフェニル−ＣＯＯ−ＰＬＧＡ−ＣＯ２−ラウリルを調製するために、ＰＬＧＡ  ５０５０（ラウリルエステル）（１０．０ｇ、１．０当量）およびｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（０．７９ｇ、２．０当量）をＤＣＭ中に溶解した。溶解ポリマー溶液に、１部のＴＥＡ（３．０当量）を付加した。その結果生じた溶液を、２０℃で２時間撹拌した。１Ｈ  ＮＭＲ解析は、完全変換を示した。次に、反応溶液を４：１  ＭＴＢＥ／ヘプタン（５０体積）の溶媒混合物中に移した。生成物は沈澱し、ゴム状になった。上清をデカントして除去し、固体をアセトン（２０体積）中に溶解した。その結果生じたアセトン懸濁液を濾過し、濾液を濃縮、乾燥して、生成物を白色発泡体として得た（７．７５ｇ、７８％、Ｍｎ＝４６４８（ＧＰＣを基礎にして））。１Ｈ  ＮＭＲ解析は、精製物質を示し、検出可能なｐ−ニトロフェノールは認められなかった。
【０５７１】
葉酸−（γ）ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２（１２０ｍｇ、１．０当量）を、ＤＭＳＯ（５ｍＬ）中に溶解し、ＴＥＡ（３．０当量）を付加した。反応混合物のｐＨは、８〜９であった。ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中のｐ−ニトロフェニル−ＣＯＯ−ＰＬＧＡ−ＣＯ２−ラウリル（１５８ｍｇ、１．０当量）を付加し、反応をＨＰＬＣによりモニタリングした。１６．１分での新規のピーク（約４０％、ＡＵＣ、２８０ｎｍ）が、１時間でＨＰＬＣクロマトグラムから観察された。反応混合物の小試料を過剰量の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）で処理すると、色が直ぐに暗黄色に変わった。この試料のＨＰＬＣ分析は、ｐ−ニトロフェニル−ＣＯＯ−ＰＬＧＡ−ＣＯ２−ラウリルおよび１６．１分ピークの完全消失を示した。その代わりに、葉酸−（γ）ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２の右側におけるピークが出現した。ｐ−ニトロフェニル−ＣＯＯ−ＰＬＧＡ−ＣＯ２−ラウリルおよび考え得る生成物は強塩基性条件下では安定でなかった、と結論づけられ得る。１６．１分での新規のピークを特定するために、反応混合物の約１／３をＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）により精製した。当該物質を、最終的に、１：４  ＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮの溶媒混合物で溶離した。この物質は黄色であることが観察されたが、これが葉酸含量を示し得る。大量のＤＭＳＯが存在したため、この物質は溶液から単離されなかった。非反応の葉酸−（γ）ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２を含有する分画を合わせ、濃縮して、残渣を得た。この残渣のニンヒドリン試験は陰性結果を生じたが、これは、ＰＥＧの末端でのアミン基の欠如を暗示し得る。この観察は、反応の不完全な変換も説明し得る。
【０５７２】
残りの反応溶液を、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）により精製した。前の精製と同様に、推測された黄色生成物がカラムに保持された。０．５％ＴＦＡを含有するＭｅＯＨを用いて、当該物質を溶離した。考え得る生成物を含有する分画を合わせ、濃縮乾燥した。この試料の１Ｈ  ＮＭＲ分析は、葉酸塩、ＰＥＧおよびラウリル−ＰＬＧＡの存在を示し、そしてこれらのセグメントの統合は、３つの構成成分すべての１：１：１比という所望の値に近かった。高純度が、ＨＰＬＣおよびＧＰＣ分析の両方から観察された。ＧＰＣに基づいたＭｎは、８．７ｋＤａであった。ＤＭＳＯ中の試料を、ＭＴＢＥ中の沈降により回収した。
実施例６．  ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−核酸製剤複合体の合成
【０５７３】
トリブロックコポリマー  ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡは、Zentner  et  al.,  Journal  of  Controlled  Release,  72,  2001,  203-215により開発された方法を用いて合成される。この方法を用いて得られるＰＬＧＡの分子量は、約３ｋＤａである。Chen  et  al.,  International  Journal  of  Pharmaceutics,  288,  2005,  207-218により報告された同様の方法が、１〜７ｋＤａの範囲のＰＬＧＡ分子量を合成するために用いられる。ＬＡ／ＧＡ比は、典型的には、１：１の比であるが、これに限定されない。最小ＰＥＧ分子量は２ｋＤａで、上限は３０ｋＤａである。ＰＥＧの好ましい範囲は、３〜１２ｋＤａである。ＰＬＧＡの分子量は、最小値  ４ｋＤａおよび最大値  ３０ｋＤａである。ＰＬＧＡの好ましい範囲は、７〜２０ｋＤａである。核酸製剤、例えばＲＮＡ製剤は、適切なリンカー（すなわち、実施例で列挙されるようなもの）を介してＰＬＧＡと複合体化されて、ポリマー核酸製剤複合体を形成する。さらに、同一の核酸製剤または異なる核酸製剤が、もう一方のＰＬＧＡと結合されて、２つの同一核酸製剤または２つの異なる核酸製剤を有する二元性核酸製剤−ポリマー複合体を形成し得る。粒子は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ単独から、あるいはこのトリブロックコポリマーからなる単一核酸製剤−または二元性核酸製剤−ポリマー複合体から形成され得る。
実施例７．  ポリカプロラクトン−ポリ（エチレングリコール）−ポリカプロラクトン（ＰＣＬ−ＰＥＧ−ＰＣＬ）−核酸製剤複合体の合成
【０５７４】
トリブロック  ＰＣＬ−ＰＥＧ−ＰＣＬは、Hu  et  al.,  Journal  of  Controlled  Release,  118,  2007,  7-17で報告されたような、触媒（すなわち、第一スズオクトアート）の存在下での開環重合法を用いて合成される。この合成から得られるＰＣＬの分子量は、２〜２２ｋＤａの範囲である。Ge  et  al.  Journal  of  Pharmaceutical  Sciences,  91,  2002,  1463-1473による論文で示された非触媒法も、ＰＣＬ−ＰＥＧ−ＰＣＬを合成するために用いられる。この特定の合成から得られるＰＣＬの分子量は、９〜４８ｋＤａの範囲である。同様に、Cerrai  et  al.,  Polymer,  30,  1989,  338-343により開発された別の無触媒法は、１〜９ｋＤａの範囲のＰＣＬの分子量を有するトリブロックコポリマーを合成するために用いられる。最小ＰＥＧ分子量は２ｋＤａで、上限は３０ｋＤａである。ＰＥＧの好ましい範囲は、３〜１２ｋＤａである。ＰＣＬ分子量は、最小値  ４ｋＤａおよび最大値  ３０ｋＤａである。ＰＣＬの好ましい範囲は、７〜２０ｋＤａである。核酸製剤、例えばＲＮＡ製剤は、適切なリンカー（すなわち、実施例で列挙されるようなもの）を介してＰＣＬと複合体化されて、核酸製剤−ポリマー複合体を形成する。さらに、同一核酸製剤または異なる核酸製剤が、もう一方のＰＣＬと結合されて、２つの同一核酸製剤または２つの異なる核酸製剤を有する二元性核酸製剤−ポリマー複合体を形成し得る。粒子は、ＰＣＬ−ＰＥＧ−ＰＣＬ単独から、あるいはこのトリブロックコポリマーからなる単一核酸製剤−または二元性核酸製剤−ポリマー複合体から形成され得る。
実施例８．  ポリラクチド−ポリ（エチレングリコール）−ポリラクチド（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡ）−核酸製剤複合体の合成
【０５７５】
トリブロック  ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＣＬコポリマーは、Chen  et  al.,  Polymers  for  Advanced  Technologies,  14,  2003,  245-253で報告された触媒（すなわち、第一スズオクトアート）を用いる開環重合法を用いて合成される。生成され得るＰＬＡの分子量は、６〜４６ｋＤａの範囲である。低分子量範囲（すなわち、１〜８ｋＤａ）は、Zhu  et  al.,  Journal  of  Applied  Polymer  Science,  39,  1990,  1-9により示された方法を用いることにより達成され得る。最小ＰＥＧ分子量は２ｋＤａで、上限は３０ｋＤａである。ＰＥＧの好ましい範囲は、３〜１２ｋＤａである。ＰＬＡ分子量は、最小値  ４ｋＤａおよび最大値  ３０ｋＤａである。ＰＬＡの好ましい範囲は、７〜２０ｋＤａである。核酸製剤、例えばＲＮＡ製剤は、適切なリンカー（すなわち、実施例で列挙されるようなもの）を介してＰＬＡと複合体化されて、核酸製剤−ポリマー複合体を形成する。さらに、同一核酸製剤または異なる核酸製剤が、もう一方のＰＬＡと結合されて、２つの同一核酸製剤または２つの異なる核酸製剤を有する二元性核酸製剤−ポリマー複合体を形成し得る。粒子は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡ単独から、あるいはこのトリブロックコポリマーからなる単一核酸製剤−または二元性核酸製剤−ポリマー複合体から形成され得る。
実施例９．  ｐ−ジオキサノン−コ−ラクチド−ポリ（エチレングリコール）−ｐ−ジオキサノン−コ−ラクチド（ＰＤＯ−ＰＥＧ−ＰＤＯ）−核酸製剤複合体の合成
【０５７６】
トリブロック  ＰＤＯ−ＰＥＧ−ＰＤＯは、Bhattari  et  al.,  Polymer  International,  52,  2003,  6-14により開発された方法を用いて、触媒（第一スズ２−エチルヘキサノエート）の存在下で合成される。この合成から得られるＰＤＯの分子量は、２〜１９ｋＤａの範囲である。最小ＰＥＧ分子量は２ｋＤａで、上限は３０ｋＤａである。ＰＥＧの好ましい範囲は、３〜１２ｋＤａである。ＰＤＯ分子量は、最小値  ４ｋＤａおよび最大値  ３０ｋＤａである。ＰＤＯの好ましい範囲は、７〜２０ｋＤａである。核酸製剤、例えばＲＮＡ製剤は、適切なリンカー（すなわち、実施例で列挙されるようなもの）を介してＰＤＯと複合体化されて、核酸製剤−ポリマー複合体を形成する。さらに、同一核酸製剤または異なる核酸製剤が、もう一方のＰＤＯと結合されて、２つの同一核酸製剤または２つの異なる核酸製剤を有する二元性核酸製剤−ポリマー複合体を形成し得る。粒子は、ＰＤＯ−ＰＥＧ−ＰＤＯ単独から、あるいはこのトリブロックコポリマーからなる単一核酸製剤−または二元性核酸製剤−ポリマー複合体から形成され得る。
実施例１０．  多官能性ＰＬＧＡ／ＰＬＡベースのポリマーの合成
【０５７７】
容易に生分解可能であり、その構成成分がすべて生体許容可能構成成分である（すなわちヒトにおいて安全であることが知られている）ポリマー鎖全体を通して分散される官能基を有するＰＬＧＡ／ＰＬＡ関連ポリマーを合成し得る。具体的には、３−Ｓ−［（ベンキシルオキシカルボニル）メチル］−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ＢＭＤ）から得られるＰＬＧＡ／ＰＬＡ関連ポリマーが合成され得る（下記の構造参照）（下記の構造は、カッコ内に示されたモノマー単位のランダムコポリマーを表すよう意図される）。Ｒ基の例としては、負電荷、Ｈ、アルキルおよびアリールアルキルが挙げられる。
１．  ＢＭＤから得られるＰＬＧＡ／ＰＬＡ関連ポリマー
【化３】
2013541506.tif 000018
２．  ＢＭＤおよび３，５−ジメチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ビス−ＤＬ−乳酸環状ジエステル）を有するＰＬＧＡ／ＰＬＡ関連ポリマー
【化４】
2013541506.tif 000019
３．  ＢＭＤおよび１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ビス−グリコール酸環状ジエステル）を有するＰＬＧＡ／ＰＬＡ関連ポリマー
【化５】
2013541506.tif 000020
【０５７８】
好ましい一実施形態では、ＢＭＤおよびビス−ＤＬ−乳酸環状ジエステルから得られるＰＬＧＡ／ＰＬＡポリマーは、ＢＭＤおよびラクチドの割合を変えることにより、多数の異なるペンダント官能基を有して調製される。参照のために、各ポリマーが８ｋＤａという数平均分子量（Ｍｎ）を有するとされる場合には、ＢＭＤから得られる１００重量％であるポリマーは、約４６個のペンダントカルボン酸基を有する（１個の酸基／０．１７４ｋＤａ）。同様に、ＢＭＤから得られる２５重量％および３，５−ジメチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ビス−ＤＬ−乳酸環状ジエステル）から得られる７５重量％であるポリマーは、約１１個のペンダントカルボン酸基を有する（１個の酸基／０．３５ｋＤａ）。これは、官能化されない８ｋＤａ  ＰＬＧＡポリマーに関するちょうど１個の酸基と、線状ＰＬＧＡ／ＰＬＡポリマーの末端基の官能化中に付加される４部位が存在する場合の１個の酸基／２ｋＤａ、あるいは４ｋＤａ分子が結合される４個の官能基を有する場合の１個の酸基／１ｋＤａに匹敵する。
【０５７９】
具体的には、ＢＭＤから得られるＰＬＧＡ／ＰＬＡ関連ポリマーは、Kimura  et  al.,  Macromolecules,  21,  1988,  3338-3340による方法を用いて開発される。このポリマーは、各単位上にペンダントカルボン酸基を伴うグリコール酸とリンゴ酸の反復単位を有する（ＲＯ（ＣＯＣＨ２ＯＣＯＣＨＲ１Ｏ）ｎＨ：ここで、ＲはＨであるか、あるいはアルキルまたはＰＥＧ単位等であり、Ｒ１はＣＯ２Ｈである）。各１７４質量単位に関して１個のペンダントカルボン酸基が存在する。ポリマーの分子量およびポリマー多分散性は、異なる反応条件（すなわち、開始剤の種類、温度、加工処理条件）に伴って変わり得る。Ｍｎは、２〜２１ｋＤａの範囲であり得る。さらにまた、ポリマー中の２つのモノマー構成成分すべてに関してペンダントカルボン酸基が存在し得る。前に引用された参考文献に基づいて、ＮＭＲ解析は、エステル交換または他の機序により検出可能量のβ−マレートポリマーは生成されない、ということを示した。
【０５８０】
ＢＭＤおよび３，５−ジメチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ビス−ＤＬ−乳酸環状ジエステル）から得られる別の型のＰＬＧＡ／ＰＬＡ関連ポリマーは、Kimura  et  al.,  Polymer,  1993,  34,  1741-1748により開発された方法を用いて合成される。彼等は、利用された最高ＢＭＤ比率は１５ｍｏｌ％であり、これは、１４ｍｏｌ％（１６．７重量％）のＢＭＤ由来単位を含有するポリマーということになることを示した。ＢＭＤ組入れのこのレベルは、約８個のカルボン酸残基／８ｋＤａ  ポリマー（１個のカルボン酸残基／ポリマー１ｋＤａ）を表す。ＢＭＤ単独の使用と同様に、β−マレート由来ポリマーは検出されなかった。さらにまた、  Kimura等は、高ポリマー分子量（３６〜６７ｋＤａ）の使用にもかかわらず、ガラス転移温度（Ｔｇ）は低２０℃台である、と報告した。Ｔｇ’は、カルボン酸が遊離していてもまたは依然としてベンジル基であっても、これらのポリマーに関して２０〜２３°Ｃであった。より堅くなる要素（すなわち、強力な水素結合を形成し得るカルボン酸）の含有は、Ｔｇを増大するはずである。この具体的ポリマーから得られるポリマー薬剤複合体から形成される任意の粒子の凝集の考え得る防止は、考え得るより低いＴｇ値のため、評価されなければならない。
【０５８１】
種々の量のグリコール酸リンゴ酸ベンジルエステルを含有するＰＬＡ−ＰＥＧポリマーを合成するための別の方法は、Lee  et  al.,  Journal  of  Controlled  Release,  94,  2004,  323-335により報告された３，５−ジメチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ビス−ＤＬ−乳酸環状ジエステル）の存在下でのＢＭＤの重合を包含する。彼等は、重合に用いられるＢＭＤの重量によって、合成ポリマーが、約５〜８ｋＤａのＰＬＡ鎖中に１．３〜３．７カルボン酸単位を含有する（総ポリマー重量は約１１〜１３ｋＤａで、ＰＥＧは５ｋＤａである）、ということを報告した。一ポリマー中には、３．７カルボン酸単位／疎水性ブロックが存在し、この場合、ＢＭＤは疎水性ブロックの重量の約１９重量％を表す。ＢＭＤのラクチドに対する比は、Kimura  et  al.,  Polymer,  1993,  34,  1741-1748により観察されたものと同様であり、酸残基は、その結果生じるポリマーにおいて類似していた（約１酸単位／疎水性ポリマー１ｋＤａ）。
【０５８２】
より容易に加水分解可能であるＢＭＤで官能化されるポリマーは、Kimura  et  al.,  International  Journal  of  Biological  Macromolecules,  25,  1999,  265-271により開発された方法を用いて調製される。彼等は、加水分解の速度が存在する遊離酸基の数に関係した（ポリマーがより多くの酸基を有するほど、加水分解は速い）、ということを報告した。ポリマーは、約５または１０ｍｏｌ％のＢＭＤ含量を有した。さらにまた、Lee  et  al.,  Journal  of  Controlled  Release,  94,  2004,  323-335による参考文献では、ポリマーの加水分解速度は、最高濃度のペンダント酸基で最速であった（１９．５重量％のＢＭＤを含有するポリマーに関しては６日、０重量％のＢＭＤを含有するポリマーに関しては２０日）。
【０５８３】
核酸製剤、例えばＤＮＡ製剤またはＲＮＡ製剤は、ＰＬＧＡ／ＰＬＡ関連ポリマー（ＢＭＤ含有）と共役され得た（上記実施例を参照）。同様に、粒子は、このような核酸製剤−ポリマー複合体から調製され得た。
実施例１１．  リンゴ酸ベンジルエステルのβ−ラクトンを用いて調製されるポリマーの合成
【０５８４】
Wang  et  al.,  Colloid  Polymer  Sci.,  2006,  285,  273-281により開発されたように、ＭｅＰＥＧＯＨを、ＤＬ−ラクチド（乳酸の環状ジエステル）を有するＲＳ−β−ベンジルマロラクトネート（β−ラクトン）と重合して、ＭｅＰＥＧ（乳酸）（リンゴ酸）  Ｍｅ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）［ＯＣＣＣＨ（ＣＨ３）Ｏ］ｍ［ＣＯＣＨ２ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）Ｏ］を含有するポリマーを得ることにより、ポリマーを調製し得る。これらのポリマーは、抗レベルの酸性基を含有するためより速く分解する可能性がある。β−ラクトンの使用は、３−［（ベンジルオキシカルボニル）メチル］−１，４−ジオキサン−２，５−ジオンを用いて得られるものとは異なるポリマーを生成する、ということに留意すべきである。これらのポリマーにおいて、カルボン酸基は、メチレンスペーサーを伴わずに、ポリマー鎖に直接的に結合される。
【０５８５】
β−ラクトンから直接的に調製され得る別のポリマーは、Ouhib  et  al.,  Ch.  Des.  Monoeres.  Polym,  2005,  1,  25により報告された。その結果生じるポリマー（すなわち、ポリ−３，３−ジメチルリンゴ酸）は、遊離酸として水溶性であり、ポリマー鎖の各単位上にペンダントカルボン酸基を有しており、その上、３，３−ジメチルリンゴ酸は非毒性分子である、と報告されている。
【０５８６】
Coulembier  et  al.,  Macromolecules,  2006,  39,  4001-4008により示されたように、３，５−ジメチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ＤＤＤ）およびβ−ブチロラクトンの存在下で、４−ベンジルオキシカルボニル−，３，３−ジメチル−２−オキセタノンを重合して、ペンダントカルボン酸基を有するブロックコポリマーを生成し得る。この重合反応を、エチレングリコールの存在下で、カルベン触媒を用いて実行した。用いた触媒は、トリアゾールカルベン触媒であったが、これは、狭い多分散性を有するポリマーをもたらす。
実施例１２．  ２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミンの合成、精製および特徴付け
【化６】
2013541506.tif 000021
【０５８７】
２５ｍＬ丸底フラスコ中で、２，２’−ジチオジピリジン（２．０ｇ、９．１ｍｍｏｌ）を、酢酸（０．３ｍＬ）を有するメタノール（８ｍＬ）中に溶解した。システアミン塩酸塩（５２０ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）中に溶解し、1/2時間掛けて混合物中に滴下した。混合物を一晩撹拌した。次いで、それを真空下で濃縮して、黄色油を得た。その油をメタノール（５ｍＬ）中に溶解し戻して、次に、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）中に沈澱させた。沈殿物を濾し取り、乾燥した。次いでそれをメタノール（５ｍＬ）中に再溶解して、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）中で再沈澱させた。この手順をさらに２回反復した。淡黄色固体を濾し取り、乾燥して、最終生成物を得て（０．７４ｇ、収率７４％）、これをさらに精製することなく用いた。１Ｈ  ＮＭＲ解析は、所望の生成物のものと一致した。
実施例１３．  ３−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）プロピオン酸の合成、精製および特徴付け
【化７】
2013541506.tif 000022
【０５８８】
２５０ｍＬ丸底フラスコ中で、２，２’−ジピリジルジスルフィド（８．３ｇ、３８ｍｍｏｌ）を、酢酸（１．５ｍＬ）を有するメタノール（１００ｍＬ）中に溶解した。３−メルカプトプロピオン酸（２．０ｇ、１９ｍｍｏｌ）をその溶液に付加し、周囲温度で１８時間撹拌した。溶媒を真空下で除去して、黄色油および固体混合物を得た。反応混合物を、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（３０：１）を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。次に、それを再結晶化によりさらに精製して、白色結晶を得た（１．２ｇ、２９％）。１Ｈ  ＮＭＲ解析は、所望の生成物のものと一致した。
実施例１４．  スクシネート−５０５０  ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ２ｋの合成、精製および特徴付け
【化８】
2013541506.tif 000023
【０５８９】
５０ｍＬ丸底フラスコ中で、ｍＰＥＧ２ｋ−５０５０  ＰＬＧＡ９ｋ（ＭＷ＝１１ｋ、５．０ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（９１ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（５６ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍＬ）中に溶解し、周囲温度で１８時間撹拌した。ジエチルエーテル（１００ｍＬ）中のセライト（登録商標）（１５ｇ）の懸濁液中で、ポリマーを沈澱させた。セライト（登録商標）を濾し取り、一晩乾燥させた。アセトン（５０ｍＬ）をセライト（登録商標）に付加し、1/2時間撹拌した。次にそれを濾過し、アセトンで洗浄して、約５ｍＬに真空濃縮した。それを、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）中で析出させて、褐色脂性固体を褐色ゴムとともに得た。そのゴムを、固化するまで（約１５分）冷凍庫（−２０ｏＣ）中に保持した。次いで、真空下で乾燥して、薄褐色固体を得た（３．２ｇ、収率５８％）。１Ｈ  ＮＭＲ解析は、所望の生成物のものと一致した。
実施例１５．  Ｎ，Ｎ−ジエチルジエチレントリアミン−スクシンアミド−５０５０  ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ２ｋの合成、精製および特徴付け
【化９】
2013541506.tif 000024
【０５９０】
５０ｍＬ丸底フラスコ中で、ｍＰＥＧ２ｋ−５０５０  ＰＬＧＡ９ｋ−スクシネート（２．０ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解した。反応混合物に、Ｎ，Ｎ−ジエチルジエチレントリアミン（２１０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（６１ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（８２ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を付加した。次にそれを、室温で４時間撹拌した。反応混合物にＥｔ２Ｏ（１００ｍＬ）を付加して、ポリマーを析出させた。次いで、それをＥｔ２Ｏ（２０ｍＬ）ですすぎ、真空乾燥して、薄褐色固体を得た（１．９ｇ、収率９５％）。１Ｈ  ＮＭＲ解析は、所望の生成物のものと一致した。
実施例１６．  ２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−５０５０−ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
【化１０】
2013541506.tif 000025
【０５９１】
５０ｍＬ丸底フラスコ中で、５０５０  ＰＬＧＡ６．３ｋ−Ｏ−アセチル（２．０ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（６６ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（１２２ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１２ｍＬ）中に溶解した。反応混合物に、ＤＭＦ（６ｍＬ）中の２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミン（１２７ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（８２ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を付加した。次に、反応混合物を室温で４時間撹拌した。水（４０ｍＬ）を反応混合物に付加して、ゴム状固体を得た。ゴム状固体をＤＣＭ（１５ｍＬ）中に溶解し、０．１％ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ×２）で２回、その後ブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥して、さらに、冷エーテル（１００ｍＬ）中での沈澱により精製した。溶媒を除去し、物質を真空下で乾燥して、白色固体を得た（１．４ｇ、収率６８％）。１Ｈ  ＮＭＲ解析は、所望の生成物のものと一致した。
実施例１７．  Ｎ，Ｎ−ジエチルジエチレントリアミン５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
【化１１】
2013541506.tif 000026
【０５９２】
５０ｍＬ丸底フラスコ中で、５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（Ｍｗ：１６ｋＤａ、２．０ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解した。反応混合物に、Ｎ，Ｎ−ジエチルジエチレントリアミン（１００ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（２９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（３９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を付加した。次に、それを室温で４時間撹拌した。冷Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）を反応混合物に付加して、ポリマーを沈澱させた。沈澱ポリマーを真空下で乾燥して、白色発泡体を得た。１Ｈ  ＮＭＲ解析は、所望の生成物のものと一致した。
実施例１８．  スクシニミジル−Ｎ−ヒドロキシエステル５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
【化１２】
2013541506.tif 000027
【０５９３】
５０ｍＬ丸底フラスコ中で、５０５０  ＰＬＧＡ９ｋ−Ｏ−アセチル（２．０ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１２ｍＬ）中に溶解した後、ＮＨＳ（７８ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（１００ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）を付加した。反応混合物を、室温で４時間撹拌した。ポリマーをＤＣＭ中で溶媒和化して、冷エーテル中で３回沈澱させることにより（５０×３ｍＬ）、精製した。固体を真空下で乾燥して、１Ｈ  ＮＭＲにより解析した。
実施例１９．  ２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−ｍＰＥＧ１０ｋの合成、精製および特徴付け
【化１３】
2013541506.tif 000028
【０５９４】
アミン基末端化ｍＰＥＧ１０ｋ（５．５ｍｇ、０．００５３ｍｍｏｌ）を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で３時間、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（１．１２ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）と反応させて、透析（膜分子量カットオフ：３５００）により精製する。精製物質を凍結乾燥して、１Ｈ  ＮＭＲにより解析する。
実施例２０．  ２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）プロパノエート−５０５０−ＰＬＧＡ−ｍＰＬＧＡ２ｋの合成、精製および特徴付け
【化１４】
2013541506.tif 000029
【０５９５】
５０ｍＬ丸底フラスコ中で、５０５０  ＰＬＧＡ９ｋ−Ｏ−ｍＰＥＧ２ｋ（Ｍｗ：１１ｋＤａ、１．０ｇ、０．０９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（８ｍＬ）中に溶解した。反応混合物に、３−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）プロピオン酸（３０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（２０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（２２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を付加した。次に、それを室温で４時間撹拌した。冷Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）を反応混合物に付加して、ポリマーを析出させた。沈澱ポリマーを真空下で乾燥して、白色発泡体を得た。１Ｈ  ＮＭＲ解析は、所望の生成物のものと一致した。
実施例２１．  アジド末端化−ＰＥＧリンカー−５０５０−ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
【化１５】
2013541506.tif 000030
【０５９６】
５０ｍＬ丸底フラスコ中で、５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（２．０ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解する。反応混合物に、アジド−ＰＥＧ８−ＯＨ（４０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（２９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（３９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を付加する。次いでそれを、室温で４時間撹拌する。次に冷Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）を反応混合物に付加して、ポリマーを析出させる。沈澱ポリマーを真空下で乾燥して、白色発泡体を得る。１Ｈ  ＮＭＲ解析を実行して、所望の生成物の同一性を確定する。
実施例２１ａ．  グルタミン酸−ＰＬＧＡ５０５０−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
【化１６】
2013541506.tif 000031
【０５９７】
５００ｍＬ丸底フラスコに、５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（４０ｇ、５．８８ｍｍｏｌ）、ジベンジルグルタメート（３．７４ｇ、７．３５ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１２０ｍＬ、３体積）を投入し、１０分間混合させて透明溶液を得た。ＣＭＰＩ（２．１ｇ、８．２３ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（２．５２ｍＬ）を付加し、溶液を周囲温度で３時間撹拌した。黄色っぽい溶液を、０．５時間に亘ってオーバーヘッド撹拌しながら、ＭＴＢＥ（２．０Ｌ）中のセライト（登録商標（１２０ｇ）の懸濁液に付加した。固体を濾過し、ＭＴＢＥ（３００ｍＬ）で洗浄して、２５℃で１６時間、真空乾燥した。次に、固体をアセトン（４００ｍＬ、１０体積）中に懸濁して、０．５時間撹拌し、濾過して、濾過ケーキをアセトン（３×１００ｍＬ）で洗浄した。合わせた濾液を１５０ｍＬに濃縮して、０．５時間に亘ってオーバーヘッド撹拌しながら、冷水（３．０Ｌ、０〜５ｏＣ）に付加した。その結果生じた懸濁液を２時間撹拌し、ＰＰフィルターを通して濾過した。濾過ケーキを３時間風乾し、次いで、２８℃で１６時間真空乾燥して、生成物  ジベンジルグルタメート  ５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルを得た（４０ｇ、収率：９５％）。１Ｈ  ＮＭＲ解析は、ベンジル芳香族陽子のラクチドのメタン陽子に対する比が１０：４６であることを示した。ＨＰＬＣ分析は純度  ９６％（ＡＵＣ、２２７ｎｍ）を示し、そしてＧＰＣ分析はＭｗ  ８．９ｋＤａおよびＭｎ  ６．５ｋＤａを示した。
【０５９８】
ジベンジルグルタメート  ５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（４０ｇ）を酢酸エチル（４００ｍＬ）中に溶解して、黄色っぽい溶液を得た。木炭（１０ｇ）を混合物に付加し、周囲温度で１時間撹拌した。溶液をセライト（登録商標）（６０ｍＬ）のパッドを通して濾過して、無色濾液を得た。濾過ケーキを酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で洗浄して、合わせた濾液を４００ｍＬに濃縮した。活性炭上パラジウム（Ｐｄ／Ｃ、５重量％、４．０ｇ）を付加し、混合物を１分間真空除去して、バルーンを用いてＨ２で満たし、反応を周囲温度で３時間撹拌した。溶液をセライト（登録商標）パッドを通して濾過し（１００ｍＬ）、濾過ケーキをアセトン（３×５０ｍＬ）で洗浄した。併合濾液は灰色を有し、これを２００ｍＬに濃縮した。溶液を、０．５時間に亘ってオーバーヘッド撹拌しながら、ＭＴＢＥ（２．０Ｌ）中のセライト（登録商標）（１２０ｇ）の懸濁液に付加した。懸濁液を周囲温度で１時間撹拌し、ＰＰフィルターを通して濾過した。濾過ケーキを、周囲温度で１６時間乾燥し、アセトン（４００ｍＬ）中に懸濁して、０．５時間撹拌した。溶液をＰＰフィルターを通して濾過し、濾過ケーキをアセトン（３×５０ｍＬ）で洗浄した。あらゆる残留Ｐｄを除去するために、マクロ多孔性ポリスチレン−２，４，６−トリメルカプトトリアジン樹脂（ＭＰ−ＴＭＴ、２．０ｇ、Ｂｉｏｔａｇｅ、能力：０．６８ｍｍｏｌ／ｇ）を、オーバーヘッド撹拌しながら周囲温度で１６時間、付加した。溶液を、セライト（登録商標）パッドを通して濾過して、薄灰色溶液を得た。溶液を２００ｍＬに濃縮し、０．５時間に亘ってオーバーヘッド撹拌しながら、冷水（３．０Ｌ、０〜５ｏＣ）に付加した。その結果生じた懸濁液を５℃未満で１時間撹拌し、ＰＰフィルターを通して濾過した。濾過ケーキを１２時間風乾し、２日間真空乾燥して、半ガラス質固体を得た（グルタミン酸−ＰＬＧＡ５０５０−Ｏ−アセチル、３８ｇ、収率：９５％）。ＨＰＬＣ分析は９９．６％の純度を示し（ＡＵＣ、２２７ｎｍ）、そしてＧＰＣ分析はＭｗ  ８．８ｋＤａおよびＭｎ  ６．６ｋＤａを示した。
実施例２１ｂ．  ビス−（Ｎ１−スペルミン）グルタミド−５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成および精製
【化１７】
2013541506.tif 000032
【０５９９】
グルタミン酸−ＰＬＧＡ５０５０−Ｏ−アセチル（１．４ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、（Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−トリ−Ｃｂｚ）−スペルミン（６３０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１６０ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（８９ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１６０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）中に溶解し、室温で一晩撹拌した。ＤＣＭを真空除去した。ＤＭＦ溶液をジエチルエーテル（５０ｍＬ）に付加して、黄色物質を単離した。次いで、それをＭｅＯＨ（２５ｍＬ）で２回洗浄し、その後、水（２５ｍＬ）で洗浄した。次にそれを凍結乾燥して、白色固体  ビス−（Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−トリ−Ｃｂｚ）−スペルミングルタミド−５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（１．３ｇ、収率９３％）を得た。
【０６００】
ビス−（Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−トリ−Ｃｂｚ）−スペルミングルタミド−５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（１．０ｇ、０．１５ｍｍｏｌ、ＭＷ６，６００）を、酢酸（５ｍＬ）中の３３％ＨＢｒ中に溶解して、透明褐色溶液を得て、反応混合物を室温で２時間撹拌した。次にそれを、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）に付加した。固体をＭｅＯＨ（３０ｍＬ）ですすいだ。それをデカントし、水（３０ｍＬ）で再洗浄した。次いでそれを凍結し、凍結乾燥して、淡黄色固体を得た（０．７９ｇ、収率７９％）。
実施例２２．  オリゴヌクレオチド−Ｃ６−ＳＳ−５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
【０６０１】
Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、０．２ｍｇ、１４．７ｎｍｏｌ）を、９５：５  ＤＭＳＯ：ＴＥ緩衝液（１ｍＬ）の溶媒混合物中の実施例１６で調製したような２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−５０５０−ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（１０ｍｇ、１．５８μｍｏｌ）と複合体化させた。反応混合物を、６５℃で２時間、撹拌した。オリゴヌクレオチド−５０５０−ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル複合体を、逆相ＨＰＬＣおよびゲル電気泳動により分析した。
【化１８】
2013541506.tif 000033
実施例２２ａ．  オリゴヌクレオチド−Ｃ６−ＳＳ−５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
【０６０２】
ＥＧＦＰ配列の一部分と実質的に同一のヌクレオチド配列を有し、ＵＵオーバーハングを有する１９塩基対長であり、そして相補的アンチセンス鎖を有するセンス鎖を伴う１３．２ｋＤａのＭｗを有するＥＧＦＰ（増強化緑色蛍光タンパク質）に対するＣ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、２０ｍｇ、１．５１μｍｏｌ）を、９５：５  ＤＭＳＯ：ＴＥ緩衝液（１０ｍＬ）の溶媒混合物中の実施例１６で調製したような２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−５０５０−ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（８５ｍｇ、１１μｍｏｌ）と複合体化させた。反応混合物を６５℃で３時間撹拌した。オリゴヌクレオチド−５０５０−ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル複合体を逆相ＨＰＬＣおよびゲル電気泳動により分析した。
【化１９】
2013541506.tif 000034
実施例２２ｂ．  オリゴヌクレオチド−Ｃ６−ＳＳ−５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
【０６０３】
ルシフェラーゼ配列の一部分と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する、ＵＵオーバーハングを有する１９塩基対長である、そして相補的アンチセンス鎖を有するセンス鎖を伴うルシフェラーゼに対するＣ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、２０ｍｇ、１．５１μｍｏｌ、Ｍｗ  １３．６ｋＤａ）を、９５：５  ＤＭＳＯ：ＴＥ緩衝液（１０ｍＬ）の溶媒混合物中の実施例１６で調製したような２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−５０５０−ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（８５ｍｇ、１１μｍｏｌ）と複合体化させた。反応混合物を６５℃で３時間撹拌した。オリゴヌクレオチド−５０５０−ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル複合体を逆相ＨＰＬＣおよびゲル電気泳動により分析した。
【化２０】
2013541506.tif 000035
実施例２３．  オリゴヌクレオチド−Ｃ６−ＳＳ−５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−ｍＰＥＧ２ｋの合成、精製および特徴付け
【０６０４】
Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ、２ｍｇ、０．１３μｍｏｌ）（実施例２２で使用）を、溶媒混合物（２０：８０、ＰＢＳ：ＡＣＮ、ｐＨ８、０．６ｍＬ）中の２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−５０５０ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ２ｋ（６．９ｍｇ、０．６２５μｍｏｌ）と複合体化させる。反応混合物を、室温で４８時間、アルゴン下で撹拌する。オリゴヌクレオチド−５０５０−ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ２ｋ複合体を、分取陰イオン交換および逆相ＨＰＬＣにより分析し、精製する。
実施例２４．  粒子形成を介したオリゴヌクレオチド−Ｃ６−ＳＳ−５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
【０６０５】
Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ、２ｍｇ、０．１３μｍｏｌ）（実施例２２で使用）を、緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ８、０．４ｍＬ）中の２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−５０５０−ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（４ｍｇ、０．６２５μｍｏｌ）を含有する予成形粒子と複合体化させる。反応混合物を、室温で４８時間、アルゴン下で撹拌する。オリゴヌクレオチド−５０５０−ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ２ｋ複合体を、分取陰イオン交換および逆相ＨＰＬＣにより分析し、精製する。
実施例２５．  オリゴヌクレオチド−Ｃ１２−アミド−５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
【０６０６】
Ｃ１２−アミノ修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ、２ｍｇ、０．１３μｍｏｌ）を、溶媒混合物（２０：８０、ＰＢＳ：ＡＣＮ、ｐＨ８、０．４ｍＬ）中のスクシニミジル−Ｎ−ヒドロキシエステル５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（４ｍｇ、０．６２５μｍｏｌ）と複合体化させる。反応混合物を、室温で４８時間、アルゴン下で撹拌する。オリゴヌクレオチド−Ｃ１２アミド５０５０−ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル複合体を、分取陰イオン交換および逆相ＨＰＬＣにより分析し、精製する。
【化２１】
2013541506.tif 000036
実施例２６．  オリゴヌクレオチド−ＰＥＧ−エステル−５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
【０６０７】
ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ、２ｍｇ、０．１３μｍｏｌ）を、ＤＭＡＰ（０．６２５ｍｍｏｌ）を有するＤＭＳＯ（０．４ｍＬ）中のスクシニミジル−Ｎ−ヒドロキシエステル５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（４ｍｇ、０．６２５μｍｏｌ）と複合体化させる。反応混合物を、室温で４８時間、アルゴン下で撹拌する。オリゴヌクレオチド−Ｃ１８ＰＥＧ５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル複合体を、分取陰イオン交換および逆相ＨＰＬＣにより分析し、精製する。
【化２２】
2013541506.tif 000037
実施例２７．  オリゴヌクレオチド−ＳＳ−ｍＰＥＧの合成および精製
【０６０８】
Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ、２ｍｇ、０．１３μｍｏｌ）（実施例２２で使用）を、緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ８、０．４ｍＬ）中の２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−ｍＰＥＧ１０ｋ（６．５ｍｇ、０．６２５μｍｏｌ）と複合体化させる。反応混合物を、室温で４８時間、アルゴン下で撹拌する。反応混合物を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）カラムを用いてＨＰＬＣにより分析し、精製する。
実施例２８．  オリゴヌクレオチド−Ｃ１２−アミド−５０５０  ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ２ｋの合成、精製および特徴付け
【０６０９】
Ｃ１２−アミノ修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ、２ｍｇ、０．１３μｍｏｌ）（実施例２５で使用）を、溶媒混合物（５０：５０、ＰＢＳ：ＡＣＮ、ｐＨ８、０．４ｍＬ）中のｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ−スクシネート（４ｍｇ、０．６２５μｍｏｌ）と複合体化させる。反応混合物を、室温で４８時間、アルゴン下で撹拌する。オリゴヌクレオチド−Ｃ１２アミド５０５０−ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ２ｋ複合体を、分取陰イオン交換および逆相ＨＰＬＣにより分析し、精製する。
実施例２９．  オリゴヌクレオチド−ＰＥＧ−エステル−５０５０  ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ２ｋの合成、精製および特徴付け
【０６１０】
ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ、２ｍｇ、０．１３μｍｏｌ））（実施例２６で使用）を、ＤＭＡＰ（０．６２５ｍｍｏｌ）を有する溶媒混合物（５０：５０、ＰＢＳ：ＡＣＮ、ｐＨ８、０．４ｍＬ）中のｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ−スクシネート（４ｍｇ、０．６２５μｍｏｌ）と複合体化させる。反応混合物を、室温で４８時間、アルゴン下で撹拌する。オリゴヌクレオチド−Ｃ１８ＰＥＧ５０５０ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ２ｋ複合体を、分取陰イオン交換および逆相ＨＰＬＣにより分析し、精製する。
実施例３０．  オリゴヌクレオチド−Ｃ６−トリアゾール−ＰＥＧ−５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
【０６１１】
１０μＬの予錯化Ｃｕ（Ｉ）を、Ｃ６−アルキン修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ）（１〜４ｐｍｏｌ  ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ、１０ｍＭトリス）およびアジド末端化−ＰＥＧ−５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル溶液（１０μＬ；５ｍＭ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓで希釈）：ＤＭＳＯ中０．１Ｎのストックからの５％ｔＢｕＯＨを有する）（実施例２１）の反応混合物に付加する（１０ｍＭ；１ｍｇ  ＣｕＢｒ（９９．９９％）を、ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ：ＤＭＳＯ  １：３中の１０ｍＭ  ＴＢＴＡトリス（ベンジルトリアゾリルメチル）アミンリガンド７００μＬ中に溶解）。試料を、室温で２時間撹拌する。反応混合物を、陰イオン交換および逆相ＨＰＬＣにより分析し、精製する。
【化２３】
2013541506.tif 000038
実施例３１．  オリゴヌクレオチド−ＰＥＧ−トリアゾール−ＰＥＧ−５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
【０６１２】
１０μＬの予錯化Ｃｕ（Ｉ）を、アルキン−ＰＥＧ−修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ）（１〜４ｐｍｏｌ  ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ、１０ｍＭトリス）およびアジド末端化−ＰＥＧ−５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル溶液（１０μＬ；５ｍＭ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓで希釈）：ＤＭＳＯ中０．１Ｎのストックからの５％ｔＢｕＯＨを有する）（実施例２１）の反応混合物に付加する（１０ｍＭ；１ｍｇ  ＣｕＢｒ（９９．９９％）を、ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ：ＤＭＳＯ  １：３中の１０ｍＭ  ＴＢＴＡトリス（ベンジルトリアゾリルメチル）アミンリガンド７００μＬ中に溶解）。試料を、室温で２時間撹拌する。反応混合物を、陰イオン交換および逆相ＨＰＬＣにより分析し、精製する。
【化２４】
2013541506.tif 000039
実施例  ３１ａ．  トリメチルプロパンアミニウムＰＶＡ（陽イオン性ＰＶＡ）の合成、精製および特徴付け
【０６１３】
ＰＶＡ（０．０５６ｍｍｏｌ、８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）を６５℃でＤＭＳＯ（５ｍＬ）中に溶解し、その後、水素化ナトリウム（１２．５ｍｍｏｌ）を付加した。反応混合物を１時間撹拌し、その後、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（１３ｍｍｏｌ）を付加した（以下のスキーム参照）。反応混合物を、６５℃で一晩撹拌した。反応混合物を５日間透析し、凍結乾燥して、薄褐色生成物を得た。その生成物を、１Ｈ  ＮＭＲにより解析した。
【化２５】
2013541506.tif 000040
（陽イオン性ＰＶＡ、例えば陽イオン性ＰＶＡ  ＣＭ−３１８（Kuraray）（Ｃ１０Ｈ２１Ｎ２Ｏ．Ｃ４Ｈ６Ｏ２．Ｃ２Ｈ４Ｏ．Ｃｌ）×１−プロパンアミニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−ｓ−［（２−メチル−１−オキソ−２−プロペン−１−イル）アミノ］−クロライド（１：１）、エタノールおよび酢酸エテニルを有するポリマーも、Kurarayから購入し得る。）
実施例３２．  陽イオン性ＰＶＡを含む、ナノ沈澱を介したｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方および特徴付け
【０６１４】
Ｏ−アセチル５０５０  ＰＬＧＡ（６０ｍｇ、５４．５重量％）（実施例４）、コポリマーｍＰＥＧ（２ｋ）−ＰＬＧＡ（４０ｍｇ、３６．４重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）およびｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ、Ｍｗ  １４，９２９）を、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液：アセトニトリルの溶媒混合物中に、１：４の比で溶解した。ポリマーの総濃度は、１．０重量％であった。別個の溶液で、０．３％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ）および０．２％ｗ／ｖ  陽イオン性ＰＶＡ（Kuraray）（実施例６５のコメント参照）（８６〜９１％加水分解化、粘度１７〜２７ｃＰｓ）を水に溶解した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。有機溶媒を、溶液を２〜３時間撹拌することにより除去した。次に、粒子を１０体積の緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）蛍光検定を用いて、ｓｉＲＮＡの負荷を定量した（実施例７０ｂ参照）。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）試薬に関する較正曲線を作成するための標準として、ＲＮＡを用いた。励起波長  ４８０ｎｍおよび発光波長  ５２０ｎｍで、ｓｉＲＮＡの蛍光を測定した。
【０６１５】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝１１９ｎｍ
ＰＤＩ＝０．１４２
Ｄｖ５０＝９４．９ｎｍ
Ｄｖ９０＝１９１ｎｍ
ｓｉＲＮＡ負荷：１％ｗ／ｗ
実施例３２ａ．  陽イオン性ＰＶＡを含む、ナノ沈澱を介したｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方および特徴付け
【０６１６】
ポリマーＯ−アセチルＰＬＧＡ５０５０（１２０ｍｇ、５７．１重量％）（実施例４）、コポリマーｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（８０ｍｇ、３８．１重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）およびｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ、４．８重量％、Ｍｗ  １３．０ｋＤａ）（ＥＧＦＰ配列の一部分と実質的に同一のヌクレオチド配列を有し、ＵＵオーバーハングを伴う１９塩基対長であり、そして相補的アンチセンス鎖を有するセンス鎖を伴う）を、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液：アセトニトリルの溶媒混合物中に、１：４の比で溶解した。ポリマーの総濃度は、１．０重量％であった。別個の溶液で、０．３％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ）および０．２％ｗ／ｖ  陽イオン性ＰＶＡ（８６〜９１％加水分解化、粘度１７〜２７ｃＰｓ）を水に溶解した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次に、粒子を１０体積の緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）蛍光検定を用いて、ｓｉＲＮＡの負荷を定量し、標準としてＲＮＡを用いた。励起波長  ４８０ｎｍおよび発光波長  ５２０ｎｍで、ｓｉＲＮＡの蛍光を測定した。
【０６１７】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：
Ｚａｖｇ＝１３１．５ｎｍ
ＰＤＩ＝０．１５６
Ｄｖ５０＝１２３ｎｍ
Ｄｖ９０＝２０２ｎｍ
ｓｉＲＮＡ負荷：１．１％ｗ／ｗ
実施例３２ｂ．  陽イオン性ＰＶＡを含む、ナノ沈澱を介したｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方物および特徴付け
【０６１８】
ｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子を、実施例３２ａに記載されたように調製した。実施例３２で用いられるＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡの代わりに、ルシフェラーゼ配列の一部分と実質的に同一のヌクレオチド配列を有し、ＵＵオーバーハングを伴う１９塩基対長であり、そして相補的アンチセンス鎖を有するセンス鎖を伴うルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（Ｍｗ＝１３６１７Ｄａ）を用いた。
【０６１９】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：
Ｚａｖｇ＝１１４．１ｎｍ
ＰＤＩ＝０．１６３
Ｄｖ５０＝１０３ｎｍ
Ｄｖ９０＝１８２ｎｍ
ｓｉＲＮＡ負荷：１．４％ｗｔ／ｗｔ
実施例３２ｃ．  陽イオン性種を伴わないＤＮＡ含有ペギル化粒子の生成および特徴付け
【０６２０】
Ｏ−アセチルＰＬＧＡ５０５０（５７重量％、Ｍｗ  １０ｋＤａ）およびｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（３８重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）を溶解して、アセトン中の総濃度を１．０％ポリマーとした。別個の溶液で、２１塩基対を有するＤＮＡ（５重量％、Ｍｗ  １２８３５）を、水中の０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）の溶液中に溶解した。ポリマーアセトン溶液を、２３９ｍＬ／分の総流量でナノ沈澱を介して、撹拌しながら付加した（有機対水性相のｖ／ｖ比＝１：８）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、アセトンを除去した。次に、粒子を１０体積の水で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。
【０６２１】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝２１７ｎｍ
ＰＤＩ＝０．１２
Ｄｖ５０＝２３３ｎｍ
Ｄｖ９０＝４１３ｎｍ
ゼータ電位：−２２ｍＶ
薬剤濃度＝０．２２ｍｇ／ｍＬ
実施例３３．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した陽イオン性ＰＬＧＡを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の生成
【０６２２】
陽イオン性ＰＬＧＡ（６０ｍｇ、５４．５％）（実施例１７）、ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（４０ｍｇ、３６．４重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）およびｄＴｄＴオーバーハングを伴う２２塩基対を有するｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ、Ｍｗ  １４９２９．０６）を溶解して、溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ緩衝液：アセトニトリル（２：８）中の総濃度１．０％のポリマーを生成した。別個の溶液で、水中の０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）を調製した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、有機溶媒を除去した。次に、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。
実施例３４．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、硫酸プロタミンを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の生成および特徴付け
【０６２３】
５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（６０ｍｇ、５４．５％）、ｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ９ｋ（４０ｍｇ、３６．４重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）およびｓｉＲＮＡ（実施例３１）（１０ｍｇ、Ｍｗ  １４９２９．０６）を溶解して、溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ緩衝液：アセトニトリル（２：８）中の総濃度１．０％のポリマーを生成した。別個の溶液で、水中に０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）および１％ｗ／ｖ硫酸プロタミンを調製した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、有機溶媒を除去した。粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。
【０６２４】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝１１６．９ｎｍ
ＰＤＩ＝０．２２０
Ｄｖ５０＝９８．１ｎｍ
Ｄｖ９０＝１４４ｎｍ
実施例３５．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０,Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の生成および特徴付け
【０６２５】
Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミン（６０ｍｇ、５７．１重量％、Ｍｗ  ５．３ｋＤａ）、ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（４０ｍｇ、３８．１重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）およびｄＴｄＴオーバーハングを伴う２２塩基対を有するｓｉＲＮＡ（５ｍｇ、４．８重量％、Ｍｗ  １４９２９．０６）を溶解して、溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ緩衝液：アセトニトリル（２：８）中の総濃度１．０％のポリマーを生成した。別個の溶液で、水中の０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）を調製した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次に、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。
【０６２６】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝１１８．５ｎｍ
ＰＤＩ＝０．１３
Ｄｖ５０＝１０２ｎｍ
Ｄｖ９０＝１６２ｎｍ
ゼータ電位＝−１８．４ｍＶ
実施例３６．  二段階法を用いた、Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンを含むＤＮＡ含有ペギル化粒子の処方物および特徴付け
【０６２７】
ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（２０重量％、Ｍｗ  １０ｋＤａ）、ｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ９ｋ（３９重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）およびＮ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミン（３９重量％、Ｍｗ  ８．３ｋＤａ）を溶解して、アセトン中の総濃度を１．０％ポリマーとした。別個の溶液で、２１塩基対を有するＤＮＡ（２重量％、Ｍｗ  １２８３５）を、水中に溶解した。ポリマーアセトン溶液を、３３５ｍＬ／分の総流量でナノ沈澱を介して、撹拌しながら付加した（有機対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、アセトンを除去した。次に、粒子を１０体積の水で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。ＰＶＡ（粘度２．５〜３．５ｃｐ、Sigma-Aldrich）を粒子に付加して、２〜３時間撹拌させた。
【０６２８】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝１０８ｎｍ
ＰＤＩ＝０．２４
Ｄｖ５０＝８４ｎｍ
Ｄｖ９０＝１６３ｎｍ
ゼータ電位：１０．８ｍＶ
実施例３７．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、ｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の生成および特徴付け
【０６２９】
ｄＴｄＴオーバーハングを伴う２２塩基対を有するｓｉＲＮＡ（５ｍｇ、４．５重量％、Ｍｗ  １４．９ｋＤａ）、５０５０−Ｏ−アセチル−ＰＬＧＡ（６０ｍｇ、５４．５重量％、Ｍｗ  １０ｋＤａ）、ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（４０ｍｇ、３６．４重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）およびスペルミン四塩酸塩（５ｍｇ、４．５重量％、Ｍｗ  ３４８Ｄａ）を溶解して、溶媒混合物  水：アセトニトリル（２：８）中の総濃度１．０％のポリマーを生成した。別個の溶液で、水中の０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）を調製した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次に、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。
【０６３０】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝２１０．６ｎｍ
ＰＤＩ＝０．２７
Ｄｖ５０＝１９３ｎｍ
Ｄｖ９０＝３２３ｎｍ
ゼータ電位＝−２３．３ｍＶ
実施例３８．  ナノ沈澱を介した、スペルミンを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の生成および特徴付け
【０６３１】
Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（実施例２２で使用）（ｓｉＲＮＡ、５ｍｇ、０．３７μｍｏｌ、２．９重量％、Ｍｗ  １３．６ｋＤａ）を、ｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ９ｋ（６７ｍｇ、３９重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）を伴う溶媒混合物（９５：５、ＤＭＳＯ：ＴＥ、１０ｍＬ）中の２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（１００ｍｇ、１５．８μｍｏｌ、５８．１重量％、Ｍｗ  ６．３ｋＤａ）と複合体化させた。別個の溶液で、水中の０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）および０．３％ｗ／ｖのスペルミン四塩酸塩を調製した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次に、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。
【０６３２】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝１４３．２ｎｍ
ＰＤＩ＝０．２１
Ｄｖ５０＝１１９ｎｍ
Ｄｖ９０＝２００ｎｍ
ゼータ電位＝−１１．５ｍＶ
実施例３９．  ナノ沈澱を介した、Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の生成および特徴付け
【０６３３】
Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（実施例２２で使用）（ｓｉＲＮＡ、２ｍｇ、０．３７μｍｏｌ、０．８重量％、Ｍｗ  １３．６ｋＤａ）を、ｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ９ｋ（１００ｍｇ、３９．７重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）およびＮ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミン（１００ｍｇ、３９．７重量％、Ｍｗ  ５．３ｋＤａ）を伴う溶媒混合物（９５：５、ＤＭＳＯ：ＴＥ、１０ｍＬ）中の２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（５０ｍｇ、１５．８μｍｏｌ、１９．８重量％、Ｍｗ  ６．３ｋＤａ）と複合体化させた。別個の溶液で、水中の０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）を調製した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次に、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。
【０６３４】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝１３５．４ｎｍ
ＰＤＩ＝０．１２
Ｄｖ５０＝１２０ｎｍ
Ｄｖ９０＝２０８ｎｍ
ゼータ電位＝−８．３９ｍＶ
実施例３９ａ．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、ビス−（Ｎ１−スペルミン）グルタミド−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方および特徴付け
【０６３５】
ビス−（Ｎ１−スペルミン）グルタミド−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（６７重量％）およびｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（２８重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）を溶解して、アセトン中で総濃度１．０％のポリマーを生成した。別個の溶液で、ｄＴｄＴオーバーハングを伴う２２塩基対を有するｓｉＲＮＡ（２重量％、Ｍｗ  １４９２９．０６）を、水中の０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）の溶液に溶解した。陽イオン性アミノ基のｓｉＲＮＡリン酸基に対するモル比（Ｎ／Ｐ比）は、４．４：１で、例えば、それぞれビス−（Ｎ１−スペルミン）グルタミド−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルおよびｓｉＲＮＡの比であった。ポリマーアセトン溶液を、３３５ｍＬ／分の総流量で、ナノ沈澱を介して、撹拌しながら付加した（有機対水性相のｖ／ｖ比＝１：８）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、アセトンを除去した。次いで、粒子を１０体積の水で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。
【０６３６】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝６１ｎｍ
ＰＤＩ＝０．１６
Ｄｖ５０＝４３ｎｍ
Ｄｖ９０＝７２ｎｍ
ゼータ電位＝−２．６ｍＶ
薬剤濃度：３．１重量％
実施例３９ｂ．  二段階法を用いた、ビス−（Ｎ１−スペルミン）グルタミド−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方および特徴付け
【０６３７】
ビス−（Ｎ１−スペルミン）グルタミド−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（６８重量％）およびｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ９ｋ（２９重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）を溶解して、アセトン中で総濃度１．０％のポリマーを生成した。別個の溶液で、ｄＴｄＴオーバーハングを伴う２２塩基対を有するｓｉＲＮＡ（２重量％、Ｍｗ  １４９２９．０６）を、水中に溶解した。陽イオン性アミノ基のｓｉＲＮＡリン酸基に対するモル比（Ｎ／Ｐ比）は、１１：１で、例えば、それぞれビス−（Ｎ１−スペルミン）グルタミド−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルおよびｓｉＲＮＡの比であった。ポリマーアセトン溶液を、３３５ｍＬ／分の総流量で、ナノ沈澱を介して、撹拌しながら付加した（有機対水性相のｖ／ｖ比＝１：８）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、アセトンを除去した。次いで、粒子を１０体積の水で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。ＰＶＡ（粘度２．５〜３．５ｃｐ、Sigma-Aldrich）を粒子に付加して、２〜３時間撹拌させた。
【０６３８】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：
Ｚａｖｇ＝１３２ｎｍ
ＰＤＩ＝０．１８
Ｄｖ５０＝１０１ｎｍ
Ｄｖ９０＝２２６ｎｍ
ゼータ電位＝−１．６ｍＶ
薬剤濃度：４．６重量％
実施例３９ｃ．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、ビス−（Ｎ１−スペルミン）グルタミド−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方および特徴付け
【０６３９】
実施例２２ｂに示したようなＣ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、１０ｍｇ、０．７５５μｍｏｌ、４．２重量％、Ｍｗ  １３．２ｋＤａ）を、ｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ９ｋ（１００ｍｇ、４２．１重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）およびビス−（Ｎ１−スペルミン）グルタミド−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（８５ｍｇ、３５．８重量％）を伴う溶媒混合物（９５：５、ＤＭＳＯ：ＴＥ、１０ｍＬ）中の、実施例１６に示したような２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（４２．５ｍｇ、６μｍｏｌ、１７．９重量％、Ｍｗ  ６．９ｋＤａ）と複合体化させた。別個の溶液で、水中の０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ）を調製した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次に、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。ＲＮＡを標準としてRiboGreen（登録商標）蛍光検定を用いて、ｓｉＲＮＡの負荷を定量した。励起波長４８０ｎｍおよび発光波長５２０で、ｓｉＲＮＡの蛍光を測定した。
【０６４０】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝１３０．１ｎｍ
ＰＤＩ＝０．２０５
Ｄｖ５０＝９６．５ｎｍ
Ｄｖ９０＝１６５ｎｍ
ゼータ電位＝−１４．７ｍＶ
薬剤濃度：１．８重量％
実施例３９ｄ．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、ビス−（Ｎ１−スペルミン）グルタミド−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方および特徴付け
【０６４１】
ビス−（Ｎ１−スペルミン）グルタミド−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（６０ｍｇ、５７．１重量％）、ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（４０ｍｇ、３８．１重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）およびｓｉＲＮＡ（５ｍｇ、４．８重量％、Ｍｗ  １３０２９．２）を、１：４の比率のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液：アセトニトリルの溶媒混合物中に溶解した。ポリマーの総濃度は、１．０重量％であった。別個の溶液で、０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ）を水に溶解した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で、注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら水溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次いで、粒子を１０体積の緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。ＲＮＡを標準としてRiboGreen（登録商標）蛍光検定を用いて、ｓｉＲＮＡの負荷を定量した。励起波長４８０ｎｍおよび発光波長５２０で、ｓｉＲＮＡの蛍光を測定した。
【０６４２】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝６７．３５ｎｍ
ＰＤＩ＝０．３６６
Ｄｖ５０＝４３．４ｎｍ
Ｄｖ９０＝７５．１ｎｍ
ゼータ電位＝＋１７．６ｍＶ
ｓｉＲＮＡ負荷：１．８重量％
実施例３９ｅ．  界面活性剤を用いずに、ナノ沈澱を介した、ビス−（Ｎ１−スペルミン）グルタミド−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方および特徴付け
【０６４３】
ビス−（Ｎ１−スペルミン）グルタミド−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（６０ｍｇ、５７．１重量％）、ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（４０ｍｇ、３８．１重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）およびｓｉＲＮＡ（５ｍｇ、４．８重量％、Ｍｗ  １３０２９．２）を、１：４の比率のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液：アセトニトリルの溶媒混合物中に溶解した。ポリマーの総濃度は、１．０重量％であった。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で、注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら水に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次いで、粒子を１０体積の緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。ＲＮＡを標準としてRiboGreen（登録商標）蛍光検定を用いて、ｓｉＲＮＡの負荷を定量した。励起波長４８０ｎｍおよび発光波長５２０で、ｓｉＲＮＡの蛍光を測定した。
【０６４４】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝７４．７５ｎｍ
ＰＤＩ＝０．２３３
Ｄｖ５０＝５３ｎｍ
Ｄｖ９０＝８５．６ｎｍ
ゼータ電位＝＋２０ｍＶ
ｓｉＲＮＡ負荷：２．４重量％
実施例４０．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、陽イオン性ポリマーを含む核酸製剤含有ペギル化粒子の生成
【０６４５】
５０５０−Ｏ−アセチル−ＰＬＧＡ（６０ｍｇ、６０重量％）および核酸複合体化ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（実施例２３）（４０ｍｇ、４０重量％、Ｍｗ  約２５．７ｋＤａ）を溶解して、溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ：ＤＭＳＯ（５：９５）または代替的にはトリス−ＥＤＴＡ：アセトニトリル中の総濃度１．０％のポリマーを生成する。別個の溶液で、水中に０．３％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）および０．２％ｗ／ｖ陽イオン性ＰＶＡ（８６〜９１％加水分解化、粘度１７〜２７ｃＰｓ、Kuraray）を調製する。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加する（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次いで、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮する。いくつかの場合には、粒子は凍結乾燥して、粉末形態にする。
実施例４１．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、陽イオン性部分を含む核酸製剤含有ペギル化粒子の生成
【０６４６】
５０５０ＰＬＧＡ（６０ｍｇ、５４．５％）、ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（４０ｍｇ、３６．４重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）および核酸複合体化ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（実施例２３）（１０ｍｇ、Ｍｗ  約２５．７ｋＤａ）を溶解して、溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ：アセトニトリル（２：８）中の総濃度１．０％のポリマーを生成する。別個の溶液で、０．１ｍＭ〜５０ｍＭの陽イオン性部分（例えば、スペルミン四塩酸塩、ヘキシルデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ヘキサジメトリンブロミド、硫酸プロタミンおよび陽イオン性ポリマー、例えばポリヒスチジン、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミンおよびキトサン）を含有する水中に０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）を調製し得る。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加する（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、有機溶媒を除去し得る。次いで、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮する。いくつかの場合には、粒子は凍結乾燥して、粉末形態にする。
実施例４２．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、陽イオン性ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡを含む核酸製剤含有ペギル化粒子の生成
【０６４７】
５０５０ＰＬＧＡ（６０ｍｇ、６０重量％）、陽イオン性ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（実施例１５）（３０ｍｇ、３０重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）および核酸複合体化ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（実施例２３）（１０ｍｇ、Ｍｗ  約２５．７ｋＤａ）を溶解して、溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ：アセトニトリル（２：８）中の総濃度１．０％のポリマーを生成する。別個の溶液で、水中に０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）を調製する。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加する（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、有機溶媒を除去する。次いで、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮する。いくつかの場合には、粒子は凍結乾燥して、粉末形態にする。
実施例４３．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、陽イオン性ＰＬＧＡを含む核酸製剤含有ペギル化粒子の生成
【０６４８】
陽イオン性ＰＬＧＡ（６０ｍｇ、６０％）および核酸複合体化ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（実施例２３）（４０ｍｇ、４０重量％、Ｍｗ  約２５．７ｋＤａ）を溶解して、溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ：アセトニトリル（２：８）中の総濃度１．０％のポリマーを生成する。別個の溶液で、水中に０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）を調製する。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加する（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、有機溶媒を除去する。次いで、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮する。いくつかの場合には、粒子は凍結乾燥して、粉末形態にする。
実施例４４．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、核酸製剤含有ペギル化粒子の生成
【０６４９】
陽イオン性ＰＬＧＡ（６０ｍｇ、６０％、Ｍｗ）（実施例６８）および核酸複合体化ｍＰＥＧ１０ｋ（実施例２７）（４０ｍｇ、４０重量％、Ｍｗ  約２６．７ｋＤａ）を溶解して、溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ：アセトニトリル（２：８）中の総濃度１．０％のポリマーを生成する。別個の溶液で、水中に０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）を調製する。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加する（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、有機溶媒を除去する。次いで、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮する。いくつかの場合には、粒子は凍結乾燥して、粉末形態にする。
実施例４５．  陽イオン性部分を有する予備処方中間体粒子の表面生体共役化を介した核酸製剤含有ペギル化粒子の生成
【０６５０】
２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−５０５０−ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（９０ｍｇ、９０重量％）およびｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（１０ｍｇ、１０重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）を溶解して、アセトン中の総濃度１．０％のポリマーを生成する。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加する（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、有機溶媒を除去する。Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（実施例２２で使用）（ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ、２ｍｇ、０．１３μｍｏｌ）を、緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ８、０．４ｍＬ）中の２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−５０５０−ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル予備成形粒子（４ｍｇ、０．６２５μｍｏｌ）と複合体化させる（これは、非ペギル化であるかまたは≦１０重量％ペギル化され得る）。反応混合物を、室温で４８時間、アルゴン下で撹拌する。反応混合物を、陰イオン交換および逆相ＨＰＬＣにより分析する。粒子（６０ｍｇ、６０重量％）を、凍結乾燥して粉末形態にする。粒子（６０ｍｇ、６０重量％）およびｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（４０ｍｇ、４０重量％）を、アセトンまたは適切な水性／有機溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ緩衝液：アセトニトリル（２：８）中に溶解して、１％ポリマー濃度とする。別個の溶液で、０．１ｍＭ〜５０ｍＭの陽イオン性部分（例えば、スペルミン四塩酸塩、ヘキシルデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ヘキサジメトリンブロミド、硫酸プロタミン、あるいは陽イオン性ポリマー、例えばポリヒスチジン、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミンまたはキトサン）を含有する水中に０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）を調製する。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加する（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、有機溶媒を除去し得る。次いで、核酸製剤官能化粒子を１０体積の水で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮する。いくつかの場合には、粒子は凍結乾燥して、粉末形態にする。
実施例４６．  脂質被覆核酸製剤含有ペギル化粒子の生成
【０６５１】
陽イオン性ＰＬＧＡ（６０ｍｇ、６０％）（実施例６８）および核酸複合体化５０５０−Ｏ−アセチル−ＰＬＧＡ（４０ｍｇ、４０重量％、Ｍｗ  約２３．７ｋＤａ）を溶解して、アセトンまたは溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ緩衝液：アセトニトリル（２：８）中の総濃度１．０％のポリマーを生成する。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水に付加して（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）、粒子懸濁液を生成する。溶液を２〜３時間撹拌することにより、有機溶媒を除去する。エタノール中のＤＯＴＡＰ、コレステロールおよびＤＯＰＥ−ＰＥＧ２ｋの脂質混合物を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを介して粒子懸濁液に付加して、最終濃度を７０％エタノールとする。最終処方物を水で１０倍に希釈して、５体積の水で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮する。いくつかの場合には、粒子は凍結乾燥して、粉末形態にする。
実施例４７．  核酸製剤含有ペギル化粒子の生成
【０６５２】
核酸複合体化５０５０−Ｏ−アセチル−ＰＬＧＡ（Ｍｗ  約２３．７ｋＤａ）を溶解して、アセトンまたは溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ緩衝液：アセトニトリル（２：８）中の総濃度１．０％のポリマーを生成する。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水に付加して（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）、粒子懸濁液を生成する。溶液を２〜３時間撹拌することにより、有機溶媒を除去する。陽イオン性ポリマー（例えば、ポリヒスチジン、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミンまたはキトサン、６０重量％）およびｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（４０重量％）を、水混和溶媒、例えばアセトン中に溶解して、１％ポリマー溶液を生成し、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを介して粒子懸濁液に付加する。最終処方物を水で１０倍に希釈して、５体積の水で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮する。いくつかの場合には、粒子は凍結乾燥して、粉末形態にする。
実施例４８．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、陽イオン性部分を含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方
【０６５３】
５０５０ＰＬＧＡ（６０ｍｇ、５４．５％）、ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ９ｋ（４０ｍｇ、３６．４重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）、ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ、Ｍｗ  １４．９ｋＤａ）および陽イオン性部分（例えば、スペルミン四塩酸塩、ヘキシルデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ヘキサジメトリンブロミド、アガマチンまたは陽イオン性脂質、例えばＤＯＴＡＰ）を溶解して、溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ緩衝液：アセトニトリル（２：８）中の総濃度１．０％のポリマーを生成する。別個の溶液で、水中で０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）を調製する。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加する（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、有機溶媒を除去する。次いで、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮する。いくつかの場合には、粒子は凍結乾燥して、粉末形態にする。
実施例４９．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、陽イオン性部分を含む核酸製剤含有ペギル化粒子の処方
【０６５４】
５０５０ＰＬＧＡ（６０ｍｇ、５４．５％）、ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ９ｋ（４０ｍｇ、３６．４重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）および核酸複合体化５０５０ＰＬＧＡ（１０ｍｇ、Ｍｗ  約２３．７ｋＤａ）を溶解して、溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ緩衝液：アセトニトリル（２：８）中の総濃度１．０％のポリマーを生成する。別個の溶液で、０．１％ｗ／ｖの陽イオン性部分（例えば、スペルミン四塩酸塩、ヘキシルデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ヘキサジメトリンブロミド、アガマチン、あるいは陽イオン性ポリマー、例えばポリヒスチジン、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミンまたはキトサン）を含有する水中で０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）を調製する。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加する（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、有機溶媒を除去し得る。次いで、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮する。いくつかの場合には、粒子は凍結乾燥して、粉末形態にする。
実施例５０．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、陽イオン性部分を含む核酸製剤含有ペギル化粒子の生成
【０６５５】
５０５０ＰＬＧＡ（６０ｍｇ、５４．５％）、ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ９ｋ（４０ｍｇ、３６．４重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）、核酸複合体化５０５０ＰＬＧＡ（１０ｍｇ、Ｍｗ  約２３．７ｋＤａ）および陽イオン性部分（例えば、アガマチン、スペルミン四塩酸塩、ヘキシルデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ヘキサジメトリンブロミド、または陽イオン性脂質、例えばＤＯＴＡＰ）を溶解して、溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ緩衝液：アセトニトリル（２：８）中の総濃度１．０％のポリマーを生成する。別個の溶液で、水中で０．５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）を調製する。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加する（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、有機溶媒を除去し得る。次いで、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮する。いくつかの場合には、粒子は凍結乾燥して、粉末形態にする。
実施例５１．  アクリレート５０５０  ＰＬＧＡの合成、精製および特徴付け
【０６５６】
５０５０  ＰＬＧＡ（５．０ｇ、０．９４ｍｍｏｌ、ＭＷ  ５．３ｋＤａ）およびピリジン（２００ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ、２０ｍＬ）中に溶解した。塩化アクリロイル（２３０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を1/2時間に亘って滴下し、さらに３時間撹拌した。次にそれをジエチルエーテル（５０ｍＬ）中に注ぎ入れて、ポリマーを析出した。ポリマーをジエチルエーテル（２５ｍＬ）ですすぎ、真空下で乾燥して、白色粉末を得た。アセトン（２０ｍＬ）中に固体を溶解し、1/2時間に亘って５℃の冷水（４００ｍＬ）中で沈澱させることにより、さらに精製した。次に、混合物をさらに２時間撹拌した。濾過によりポリマーを取り出して、凍結乾燥して、白色固体を得た（３．８ｇ、収率７６％）。１Ｈ  ＮＭＲにより、生成物を確証した。
【化２６】
2013541506.tif 000041
実施例５２．  ２−（２−アミノエトキシ）エタノールアクリレート５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
Ｂｏｃ−２−（２−アミノエトキシ）エタノールの合成
【０６５７】
２−（２−アミノエトキシ）エタノール（５．０ｇ、４８ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、５０ｍＬ）中に溶解した。混合物に、２Ｎ水酸化ナトリウム（２４ｍＬ）を付加し、全溶液を氷浴中で冷却した。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（１０ｇ、４８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中に溶解し、それを、氷浴中で１時間に亘って混合物に滴下した。反応を室温にして、２．５日間撹拌した。ＴＨＦを、真空除去した。水溶液を、濃硫酸でｐＨ３に調整した。次にそれを、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、７５ｍＬ）で２回抽出した。有機層を水（２５ｍＬ）で２回、そしてブライン（２５ｍＬ）で１回、洗浄した。次に、それを硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）上で乾燥した。ＥｔＯＡｃを真空下で除去して、透明油を得た（４．１ｇ、収率４２％）。１Ｈ  ＮＭＲにより、生成物を確証した。
【化２７】
2013541506.tif 000042
２−（２−アミノエトキシ）エタノールアクリレートＴＦＡの合成
【０６５８】
２−（２−アミノエトキシ）エタノール（１．０ｇ、４．９ｍｍｏｌ）およびトリエタノールアミン（ＴＥＡ、０．５４ｇ、５．４ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（５０ｍＬ）中に溶解した。混合物を氷浴中で冷却した。塩化アクリロイル（０．４９ｇ、５．４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解し、それを、1/2時間に亘って氷浴中の混合物に滴下した。反応を室温にして、一晩撹拌した。反応混合物は、黄色に変わった。次にそれを、０．１Ｎ塩酸（１５ｍＬ）で２回、そしてブライン（１５ｍＬ）で２回、洗浄して、ＭｇＳＯ４上で乾燥した。次にそれをポンプダウンして、黄色油を得た（０．５４ｇ、収率４３％）。黄色油を、さらに精製することなく用いた。それをＤＣＭ：ＴＦＡ（１：１、１０ｍＬ）の混合物中に溶解し、室温で１時間撹拌した。溶媒を真空下で除去して、黄色油を得た（０．５０ｇ、収率９４％）。１Ｈ  ＮＭＲにより、生成物を確証した。
【化２８】
2013541506.tif 000043
２−（２−アミノエトキシ）エタノールアクリレート５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成
【０６５９】
５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（２．０ｇ、０．３７ｍｍｏｌ、ＭＷ  ５．３ｋＤａ）および２−（２−アミノエトキシ）エタノールアクリレートＴＦＡ（１９０ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１２０ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（８７ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（７６ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解し、室温で３時間撹拌した。その工程中、溶媒ＤＣＭを除去した。ポリマーをアセトン（１０ｍＬ）中に溶解し、次いで、５℃の冷水（４００ｍＬ）に付加して、沈殿物を得た。ポリマーを凍結乾燥して、白色固体を得た（１．２ｇ、収率６０％）。１Ｈ  ＮＭＲにより、生成物を確証した。
【化２９】
2013541506.tif 000044
実施例５３．  Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成、精製および特徴付け
【０６６０】
５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（３．０ｇ、０．５７ｍｍｏｌ、ＭＷ  ５．３ｋＤａ）、ＮＨＳ（１００ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（１９０ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１５ｍＬ）中に付加した。１時間撹拌後、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロアセテート（２３０ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１８０ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）を付加し、さらに３時間撹拌した。沈殿物を濾過により取り出し、ＤＣＭを真空下で除去した。次にそれをアセトン（３０ｍＬ）中に再溶解して、５℃で水（４００ｍＬ）中で析出させた。沈殿物を凍結乾燥して、白色固体を得た（２．３ｇ、収率７７％）。１Ｈ  ＮＭＲにより、生成物を確証した。
【化３０】
2013541506.tif 000045
実施例５４．  オリゴヌクレオチド−Ｃ６−Ｓ−Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成
【０６６１】
Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（実施例２２で使用）（ｓｉＲＮＡ、５．０ｍｇ、０．３７μｍｏｌ、３重量％、Ｍｗ  １３．６ｋＤａ）（ルシフェラーゼ配列の一部分と実質的に同一のヌクレオチド配列を有し、ＵＵオーバーハングを伴う１９塩基対長であり、そして相補的アンチセンス鎖を有するセンス鎖を伴う）を、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（１００ｍｇ、１８．９μｍｏｌ、５７重量％、Ｍｗ  ５．３ｋＤａ）と、ＤＭＳＯ：ＴＥ緩衝液（９５：５、１０ｍＬ）の溶媒混合物中で、複合体化させた。反応混合物を、６５℃で３時間、アルゴン下で撹拌した。この混合物を室温に冷却させた。
【化３１】
2013541506.tif 000046
実施例５４ａ．  オリゴヌクレオチド−Ｃ６−Ｓ−Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド５０５０  ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチルの合成
【０６６２】
Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、２０ｍｇ、１．５１μｍｏｌ、Ｍｗ  １３．２ｋＤａ）（ＥＧＦＰ配列の一部分と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有し、ＵＵオーバーハングを伴う１９塩基対長であり、そして相補的アンチセンス鎖を有するセンス鎖を伴う）を、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（８５ｍｇ、１６．１μｍｏｌ、Ｍｗ  ５．３ｋＤａ）と、ＤＭＳＯ：ＴＥ緩衝液（９５：５、１０ｍＬ）の溶媒混合物中で、複合体化させた。反応混合物を、６５℃で３時間、アルゴン下で撹拌した。この混合物を室温に冷却させた。
実施例５５．  ナノ沈澱を介した、界面活性剤としてＰＶＡおよび陽イオン性ＰＶＡの配合物を用いたｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方および特徴付け
【０６６３】
Ｓｉ−ＲＮＡ−Ｃ６−Ｓ−Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（実施例５４）を、ＤＭＳＯ（６．７ｍＬ）中のｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ９ｋ（６７ｍｇ、４０重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）と混合した。別個の溶液で、０．３％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）および０．２％ｗ／ｖ陽イオン性ＰＶＡ  ＣＭ−３１８（８６〜９１％加水分解化、粘度１７〜２７ｃＰｓ、Kuraray）を水（１６７ｍＬ）中で調製した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で、注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながらＰＶＡ／陽イオン性ＰＶＡ溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次いで、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。負荷は、０．９２％  ｓｉＲＮＡ  ｗ／ｗであると確定された。粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝１０３．３ｎｍ
ＰＤＩ＝０．２２９
Ｄｖ５０＝８３．３ｎｍ
Ｄｖ９０＝１５７ｎｍ
ゼータ電位＝＋１６．６ｍＶ
実施例５５ａ．  ナノ沈澱を介した、界面活性剤としてＰＶＡおよび陽イオン性ＰＶＡの配合物を用いたｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方物および特徴付け
【０６６４】
Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（実施例５４ａ）と複合体化されたＣ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、２０ｍｇ、１．５１μｍｏｌ、Ｍｗ  １３．２ｋＤａ）を、ＤＭＳＯ（６．７ｍＬ）中のｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ９ｋ（６７ｍｇ、４０重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）と混合した。別個の溶液で、０．３％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）および０．２％ｗ／ｖ陽イオン性ＰＶＡ  ＣＭ−３１８（８６〜９１％加水分解化、粘度１７〜２７ｃＰｓ、Kuraray）を水（１６７ｍＬ）中で調製した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で、注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、Ｃ６−Ｓ−Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（実施例５４）の溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次いで、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。負荷は、３％  ｓｉＲＮＡ  ｗ／ｗであると確定された。粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝１２７ｎｍ
ＰＤＩ＝０．２４４
Ｄｖ５０＝７６．５ｎｍ
Ｄｖ９０＝２２２ｎｍ
ゼータ電位＝＋１０．７ｍＶ
実施例５６．  オリゴヌクレオチド−Ｃ６−ＳＳ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋの合成、精製および特徴付け
【０６６５】
Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（実施例２２で使用）（ｓｉＲＮＡ、０．２ｍｇ、１４．７μｍｏｌ）を、ＴＥ緩衝液（１ｍＬ）中で、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ＰＤＰ（ポリエチレングリコール）−２ｋ］（４ｍｇ、１．３６μｍｏｌ）と複合体化させた。反応混合物を、６５℃で２時間、撹拌した。オリゴヌクレオチド−Ｃ６−ＳＳ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋ複合体を、逆相ＨＰＬＣおよびゲル電気泳動により分析した。
【化３２】
2013541506.tif 000047
実施例５７．  オリゴヌクレオチド−Ｃ６−チオエーテル−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋの合成、精製および特徴付け
【０６６６】
Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（実施例２２で使用）（ｓｉＲＮＡ、０．２ｍｇ、１４．７μｍｏｌ）（ルシフェラーゼ配列の一部分と実質的に同一のヌクレオチド配列を有し、ＵＵオーバーハングを伴う１９塩基対長であり、そして相補的アンチセンス鎖を有するセンス鎖を伴う）を、ＰＢＳ緩衝液（１ｍＬ）中で、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２ｋ］（４ｍｇ、１．３６μｍｏｌ）と複合体化させた。反応混合物を、６５℃で２時間、撹拌した。オリゴヌクレオチド−Ｃ６−チオエーテル−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）複合体を、逆相ＨＰＬＣおよびゲル電気泳動により分析した。
【化３３】
2013541506.tif 000048
実施例５８．  陽イオン性ＰＶＡを含むペギル化粒子中のｓｉＲＮＡで処理される細胞の生存度
【０６６７】
陽イオン性ＰＶＡを含むペギル化粒子中のｓｉＲＮＡ（実施例３２参照）が細胞死を引き起こすか否かを確定するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存度検定（ＣＴＧ）を用いた。検定は、存在するＡＴＰの量子化に基づいているが、これは、代謝的に活性ナ細胞の存在を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＥＧＦＰ細胞を、５％ＣＯ２で３７℃で、完全培地（ＤＭＥＭ、高グルコース、１０％ＨＩ−ＦＢＳ、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％抗生物質／抗真菌剤溶液）中で、７５ｃｍ２フラスコ中で８５〜９０％集密に増殖させた（継代数＜２０）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＥＧＦＰ細胞を、２００μＬ／ウェルで、１５００細胞／ウェルの濃度で、９６−ウェル不透明−透明底プレートに付加した。細胞を、３７°Ｃで５％ＣＯ２で２４時間、インキュベートした。翌日、陽イオン性ＰＶＡを含むペギル化粒子中の２倍濃縮ｓｉＲＮＡの連続希釈液を、完全培地を有する１２−ウェルレザバー中に作って、最終濃度を５０００ｎＭ〜０．０５ｎＭ  ｓｉＲＮＡとした。プレート中の培地を、二重反復実験で、１００μＬの新鮮な完全培地および１００μＬのそれぞれの連続希釈処理に取り替えた。二重反復実験処理を用いて、３組のプレートを調製した。３７℃で５％ＣＯ２でのインキュベーションの２４、４８および７２時間後、プレート中の培地を１００μＬの新鮮な完全培地および１００μＬのＣＴＧ溶液に取り替えて、次に、４５０ｒｐｍに設定した室温でのプレート振盪器上で５分間インキュベートして、１５分間休止させた。ルミネッセンスに設定された微量滴定プレート読取器で、生存可能細胞を測定した。以下に示すように、データを、生存度％対濃度としてプロットして、非処理細胞に対して正規化した。
【表６】
2013541506.tif 000049
実施例５９．  陽イオン性ＰＶＡを含むペギル化ＰＶＡ粒子中のｓｉＲＮＡのノックダウン活性
【０６６８】
陽イオン性ＰＶＩを含むペギル化粒子（実施例３２）中のｓｉＲＮＡのノックダウン活性を測定するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＥＧＦＰ細胞を、５％ＣＯ２で３７℃で、完全培地（ＤＭＥＭ、高グルコース、１０％ＨＩ−ＦＢＳ、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％抗生物質／抗真菌剤溶液）中で、７５ｃｍ２フラスコ中で８５〜９０％集密に増殖させた（継代数＜２０）。３０００細胞／ウェルを、１００μＬ／ウェルで、９６−ウェル不透明−透明底プレートに付加し、３７°Ｃで５％ＣＯ２で２４時間、増殖させた。翌日、１０００〜０．１ｎＭ  ｓｉＲＮＡの濃度を用いて、陽イオン性ＰＶＡを含む粒子中の連続希釈ｓｉＲＮＡの、二重反復実験での、１００μＬに、培地を取り替えた。処理細胞を、３７℃で５％ＣＯ２で４８時間、インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで１回洗浄して、氷上で２０分間、６０μＬ／ウェルのＭ−Ｐｅｒ哺乳動物タンパク質抽出物試薬（完全プロテアーゼ阻害剤カクテルを補足）で溶解した。細胞溶解物を、４〜５分間、ピペッティングした後、励起４８８ｎｍおよび発光５３５ｎｍに設定した蛍光計で測定した。処理細胞のＥＧＦＰノックダウン％を、以下に示すように、非処理対照と比較した。
【表７】
2013541506.tif 000050
実施例６０．  ｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子によるルシフェラーゼ活性のノックダウン
【０６６９】
ルシフェラーゼを発現するＢ１６Ｆ１０−ｌｕｃ２細胞を、５％ＣＯ２で３７℃で、完全培地（ＲＰＭＩ、１０％ＨＩ−ＦＢＳおよび１％抗生物質／抗真菌剤溶液）中で、増殖させた。５０００細胞／ウェルを、１００μＬ／ｗｅｌｌで、９６ウェルプレートに付加し、３７℃で５％ＣＯ２で２４時間、増殖させた。別個の反応物において、細胞を、ペギル化粒子中に埋め込まれたｓｉＲＮＡで、またはｓｉＲＮＡ−ＰＬＧＡ（０．０１μＭ〜７．５μＭ）複合体ペギル化粒子で、各々４８時間、処理した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ検定系（Promega）を用いて、ルシフェラーゼ活性に関して細胞を分析した。ルシフェラーゼノックダウン活性を有する細胞のパーセンテージを、非処理細胞のルシフェラーゼ活性と比較した。ルシフェラーゼノックダウン活性を、細胞の生存度に適合させた。
【０６７０】
実施例６０で用いた粒子は、以下のとおりである：
【表８】
2013541506.tif 000051
１    これらの粒子は、本質的には実施例３２に記載されるとおりに調製されたが、但し、核酸製剤はルシフェラーゼを標的にする（ＥＧＦＰではない）（本明細書中に記載されるように測定された粒子特性：Ｚａｖｇ＝１３１、Ｄｖ９０＝２３２、ゼータ＝＋１５．１）。
２    これらの粒子は、本質的には実施例３３に記載されるとおりに調製された（本明細書中に記載されるように測定された粒子特性：Ｚａｖｇ＝１３０、Ｄｖ９０＝２３１、ゼータ＝＋１５．９）。
３    これらの粒子は、実施例５５に記載されるとおりに調製された。
４    これらの粒子は、実施例６２に記載されるとおりに調製された（１：１  Ｎ／Ｐ比に対応する）。
５    これらの粒子は、実施例６２に記載されるとおりに調製された（１．５：１  Ｎ／Ｐ比に対応する）。
６    実施例６８に記載されるとおり。
【０６７１】
本明細書中に記載される粒子に関するノックダウン実験の結果を、以下に示す。
【表９−１】
2013541506.tif 000052
【表９−２】
2013541506.tif 000053
実施例６１．  ナノ沈澱を介した、界面活性剤としてのＰＶＡおよび陽イオン性ＰＶＡの配合物を含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方および特徴付け
【０６７２】
Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（実施例２２で使用）（ｓｉＲＮＡ、５ｍｇ、０．３７μｍｏｌ、３重量％、Ｍｗ  １３．６ｋＤａ）を、ｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ９ｋ（７０ｍｇ、４０重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）を伴う９５：５  ＤＭＳＯ：ＴＥ（１０ｍＬ）の溶媒混合物中の２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（１００ｍｇ、１５．８μｍｏｌ、５７重量％、Ｍｗ  ６．３ｋＤａ）（実施例１６）と複合体化させた。別個の溶液で、水中の０．３％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ）および０．２％ｗ／ｖの陽イオン性ＰＶＡ（８６〜９１％加水分解化、粘度１７〜２７ｃＰｓ）を調製した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次に、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。
【０６７３】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝９４．０ｎｍ
ＰＤＩ＝０．１７
Ｄｖ５０＝７９．８ｎｍ
Ｄｖ９０＝１３９ｎｍ
ゼータ電位＝＋９ｍＶ
実施例６１ａ．  ナノ沈澱を介した、界面活性剤としてのＰＶＡおよび陽イオン性ＰＶＡの配合物を含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方物および特徴付け
【０６７４】
Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、２０ｍｇ、１．５１μｍｏｌ、１１．６重量％、Ｍｗ  １３．２ｋＤａ）（実施例２２ａで使用）を、ｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ９ｋ（６７ｍｇ、３９重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）を伴う９５：５  ＤＭＳＯ：ＴＥ（１０ｍＬ）の溶媒混合物中の２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（８５ｍｇ、１２μｍｏｌ、４９．４重量％、Ｍｗ  ６．９ｋＤａ）（実施例１６）と複合体化させた。別個の溶液で、水中の０．３％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ）および０．２％ｗ／ｖの陽イオン性ＰＶＡ（８６〜９１％加水分解化、粘度１７〜２７ｃＰｓ）を調製した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次に、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。標準としてＲＮＡを用いたＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）蛍光検定を用いて、ｓｉＲＮＡの負荷を定量した。励起波長  ４８０ｎｍおよび発光波長  ５２０ｎｍで、ｓｉＲＮＡの蛍光を測定した。
【０６７５】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝８４．０９ｎｍ
ＰＤＩ＝０．２３
Ｄｖ５０＝６４．３ｎｍ
Ｄｖ９０＝９６．８ｎｍ
ゼータ電位＝＋７．７８ｍＶ
ｓｉＲＮＡ負荷：４．２重量％
実施例６１ｂ．  ナノ沈澱を介した、界面活性剤としてのＰＶＡおよび陽イオン性ＰＶＡの配合物を含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方および特徴付け
【０６７６】
Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、２０ｍｇ、１．５１μｍｏｌ、１１．６重量％、Ｍｗ  １３６１７Ｄａ）（実施例２２ｂで使用）を、ｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ９ｋ（６７ｍｇ、３９重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）を伴う９５：５  ＤＭＳＯ：ＴＥ（１０ｍＬ）の溶媒混合物中の２−（２−（ピリジン−２−イル）ジスルファニル）エチルアミノ−５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（８５ｍｇ、１２μｍｏｌ、４９．４重量％、Ｍｗ  ６．９ｋＤａ）（実施例１６）と複合体化させた。別個の溶液で、水中の０．３％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ）および０．２％ｗ／ｖの陽イオン性ＰＶＡ（８６〜９１％加水分解化、粘度１７〜２７ｃＰｓ）を調製した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次に、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。標準としてＲＮＡを用いたＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）蛍光検定を用いて、ｓｉＲＮＡの負荷を定量した。励起波長  ４８０ｎｍおよび発光波長  ５２０ｎｍで、ｓｉＲＮＡの蛍光を測定した。
【０６７７】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝８４．４２ｎｍ
ＰＤＩ＝０．１６７
Ｄｖ５０＝６２．８ｎｍ
Ｄｖ９０＝１１２ｎｍ
ゼータ電位＝＋１０．５ｍＶ
ｓｉＲＮＡ負荷：２．９７重量％
実施例６２．  二段階法を用いた、Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方および特徴付け
【０６７８】
ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（１１〜１９重量％、Ｍｗ  １０ｋＤａ）、ｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ９ｋ（３８〜４８重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）およびＮ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミン（３７〜３８重量％、Ｍｗ  ８．３ｋＤａ）（実施例６８に記載）を溶解して、アセトン中の総濃度を１．０％ポリマーとした。別個の溶液で、ｄＴｄＴオーバーハングを伴う２２塩基対を有するｓｉＲＮＡ（５〜６重量％、Ｍｗ  １４９２９．０６）を、水中に溶解した。用いられるＮ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５、Ｎ１０、Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンおよびｓｉＲＮＡの量を変えることにより、陽イオンアミノ基のｓｉＲＮＡリン酸基に対するモル比（Ｎ／Ｐ比）を１：１から１．５：１まで調整した。ポリマーアセトン溶液を、３３５ｍＬ／分の総流量でナノ沈澱を介して、撹拌しながら付加した（有機対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、アセトンを除去した。次に、粒子を１０体積の水で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。ＰＶＡ（粘度２．５〜３．５ｃｐ、Sigma-Aldrich）を粒子に付加して、２〜３時間撹拌させた。
【０６７９】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
【表１０】
2013541506.tif 000054
実施例６２ａ．  Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンを含むペギル化粒子中のｓｉＲＮＡで処理した細胞の生存度
【０６８０】
Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の細胞生存度を測定するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ細胞を、（２）９６−ウェル白色不透明−透明底プレート中で、１０，０００細胞／ウェルの密度で培養した。粒子で処理する前に、変法完全培地；ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリンストレプトマイシン（すべて、Life  Technologiesから）中で、３７°Ｃで５％ＣＯ２で、細胞を一晩培養した。次に、三重反復実験で、Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンを含む５〜０．０１μＭの封入ｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子で、細胞を処理し、それぞれ、３７°Ｃ、５％ＣＯ２で、２４および４８時間、インキュベートした。インキュベーション後、２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ（商標）生存度試薬（Promega）を、１００μＬの培地±封入ＣＰＸ１３１０／ＰＬＧＡ／ＰＥＧを含有する各ウェルに付加した。次いで、プレートを３７°Ｃで２時間、インキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５（Molecular  Devices）プレート読取器を用いて、４９０ｎＭで吸光度を測定することにより、生存度を確定した。以下に示すように、処理された生存可能細胞のパーセントを、同様の時点で処理されなかった細胞と直接比較した。
【表１１】
2013541506.tif 000055
実施例６２ｂ．  Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンを含むペギル化粒子中のｓｉＲＮＡによるｓｉＲＮＡのノックダウン活性
【０６８１】
Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子によるｓｉＲＮＡのＥＧＦＰノックダウン活性を測定するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＥＧＦＰ細胞を、（２）９６−ウェル白色不透明−透明底プレート中で、１０，０００細胞／ウェルの密度で培養した。変法完全培地；ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリンストレプトマイシン（すべて、Life  Technologiesから）中で、３７°Ｃで５％ＣＯ２で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＥＧＦＰ細胞を一晩増殖させた。翌日、処方物の体積に対応する培地の体積を、各ウェルから取り出した。次いで、三重反復実験で、Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンを含む５〜０．０１μＭのｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子で、細胞を処理した。処理細胞を、それぞれ、３７℃で５％ＣＯ２で２４および４８時間、インキュベートした。指示時点（２４時間および４８時間）で、細胞をＰＢＳで１回洗浄して、氷上で１５分間、Ｍ−ＰＥＲ（哺乳動物タンパク質抽出物試薬、Thermo  Fisher）（ＨＡＬＴ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Thermo  Fisher）を補足）で溶解した後、軌道平板振盪器（２００ｒｐｍ）上で室温で１０分間、インキュベートした。励起４８８ｎｍおよび発光５３５ｎｍに設定され、カットオフを５３５ｎｍで指示されたＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５(Molecular  Devices)蛍光プレート読取器を用いて、ＥＧＦＰ測定を完了した。処理細胞のノックダウン％を、以下に示すように、同様の時点からの非処理対照と比較した場合のＥＧＦＰシグナルの減少から得た。
【表１２】
2013541506.tif 000056
実施例６２ｃ．  Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンおよびＯ−アセチルＰＬＧＡを含むペギル化粒子中のｓｉＲＮＡで処理した細胞の生存度
【０６８２】
Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンおよびＯ−アセチルＰＬＧＡを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子によるｓｉＲＮＡの細胞生存度を測定するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＥＧＦＰ細胞を、（２）９６−ウェル白色不透明−透明底プレート中で、１０，０００細胞／ウェルの密度で培養した。粒子で処理する前に、変法完全培地；ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリンストレプトマイシン（すべて、Life  Technologiesから）中で、３７°Ｃで５％ＣＯ２で、細胞を一晩培養した。次に、三重反復実験で、Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンおよびＯ−アセチルＰＬＧＡを含む５〜０．０１μＭのｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子で、細胞を処理し、それぞれ、３７°Ｃ、５％ＣＯ２で、２４および４８時間、インキュベートした。インキュベーション後、２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ（商標）生存度試薬（Promega）を、１００μＬの培地±封入ＣＰＸ１３１０／ＣＰＸ１０２５／ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧを含有する各ウェルに付加した。次いで、プレートを３７°Ｃで２時間、インキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５（Molecular  Devices）プレート読取器を用いて、４９０ｎｍで吸光度を測定することにより、生存度を確定した。以下に示すように、処理された生存可能細胞のパーセントを、同様の時点に処理されなかった細胞と直接比較した。
【表１３】
2013541506.tif 000057
実施例６２ｄ．  Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンおよびＯ−アセチルＰＬＧＡを含むペギル化粒子中のｓｉＲＮＡによるｓｉＲＮＡのノックダウン活性
【０６８３】
Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンおよびＯ−アセチルＰＬＧＡを含むペギル化粒子中のｓｉＲＮＡのＥＧＦＰノックダウン活性を測定するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＥＧＦＰ細胞を、（２）９６−ウェル白色不透明−透明底プレート中で、１０，０００細胞／ウェルの密度で培養した。変法完全培地；ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリンストレプトマイシン（すべて、Life  Technologiesから）中で、３７°Ｃで５％ＣＯ２で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＥＧＦＰ細胞を一晩増殖させた。翌日、処方物の体積に対応する培地の体積を、各ウェルから取り出した。次いで、三重反復実験で、Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンおよびＯ−アセチルＰＬＧＡを含むペギル化粒子中の５〜０．０１μＭのｓｉＲＮＡで、細胞を処理した。処理細胞を、それぞれ、３７℃で５％ＣＯ２で２４および４８時間、インキュベートした。指示時点（２４時間および４８時間）で、細胞をＰＢＳで１回洗浄して、氷上で１５分間、Ｍ−ＰＥＲ（哺乳動物タンパク質抽出物試薬、Thermo  Fisher）（ＨＡＬＴ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Thermo  Fisher）を補足）で溶解した後、軌道平板振盪器（２００ｒｐｍ）上で室温で１０分間、インキュベートした。励起４８８ｎｍおよび発光５３５ｎｍに設定され、カットオフを５３５ｎｍで指示されたＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５(Molecular  Devices)蛍光プレート読取器を用いて、ＥＧＦＰ測定を完了した。処理細胞のノックダウン％を、以下に示すように、同様の時点からの非処理対照と比較した場合のＥＧＦＰシグナルの減少から得た。
【表１４】
2013541506.tif 000058
実施例６３．  ナノ沈澱を介した、界面活性剤としてのＰＶＡおよび陽イオン性ＰＶＡの配合物を含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の処方および特徴付け
【０６８４】
Ｃ６−チオール修飾オリゴヌクレオチド（実施例２２で使用）（ｓｉＲＮＡ、５ｍｇ、０．３７μｍｏｌ、３重量％、Ｍｗ  １３．６ｋＤａ）を、８：２  アセトニトリル：ＴＥ（１４ｍＬ）の溶媒混合物中のｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ９ｋ（６０ｍｇ、２８重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）および５０５０ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（４０ｍｇ、４１重量％）の付加を伴うトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ＰＤＰ（ポリエチレングリコール）−２ｋ］（４０ｍｇ、１３．４μｍｏｌ、２８重量％、Ｍｗ  ２．９８ｋＤａ）（実施例５６）と複合体化させた。別個の溶液で、水中の０．３％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ）および０．２％ｗ／ｖの陽イオン性ＰＶＡ  ＣＭ−３１８（８６〜９１％加水分解化、粘度１７〜２７ｃＰｓ）を調製した。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加した（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、有機溶媒を除去した。次いで、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。
【０６８５】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝１２４．９ｎｍ
ＰＤＩ＝０．１１８
Ｄｖ５０＝１１２ｎｍ
Ｄｖ９０＝１９６ｎｍ
ゼータ電位＝＋８ｍＶ
実施例６４．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、陽イオン性ポリマーを含む核酸製剤含有ペギル化粒子の生成
【０６８６】
５０５０−Ｏ−アセチル−ＰＬＧＡ（６０ｍｇ、６０重量％）および核酸複合体化ｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（実施例２３）（４０ｍｇ、４０重量％、Ｍｗ  約２５．７ｋＤａ）を溶解して、溶媒混合物トリス−ＥＤＴＡ：ＤＭＳＯ（５：９５）または代替的にはトリス−ＥＤＴＡ：アセトニトリル中の総濃度１．０％のポリマーを生成する。別個の溶液で、水中に０．３％ｗ／ｖ  ＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ、Sigma-Aldrich）および０．２％ｗ／ｖ陽イオン性ＰＶＡ（８６〜９１％加水分解化、粘度１７〜２７ｃＰｓ、Kuraray）を調製する。ポリマー溶液を、１ｍＬ／分の流量で注射器ポンプを用いて、５００ｒｐｍで撹拌しながら、水溶液に付加する（ポリマー溶液対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。次いで、粒子を１０体積のＴＥ緩衝液で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝１５０ｃｍ２）を用いて濃縮する。
実施例６５．  ナノ沈澱を介した、１−ヘキシルトリエチル−アンモニウムホスフェート（Ｑ６）および界面活性剤としてのＰＶＡを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の生成
【０６８７】
ＰＬＧＡ−Ｏ−アセチル（１１〜１９重量％、Ｍｗ  １０ｋＤａ）、ｍＰＥＧ２ｋ−５０５０ＰＬＧＡ９ｋ（３８〜４８重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）および１−ヘキシルトリエチル−アンモニウムホスフェート（３７〜３８重量％、Ｍｗ  ８．３ｋＤａ）を溶解して、アセトン中の総濃度１．０％のポリマーを生成した。別個の溶液で、ｄＴｄＴオーバーハングを伴う２２塩基対を有するｓｉＲＮＡ（５〜６重量％、Ｍｗ  １４９２９．０６）を、水に溶解した。陽イオン性アミノ基のｓｉＲＮＡリン酸基に対するモル比（Ｎ／Ｐ比）は、１５：１であった（具体的には、用いられる１−ヘキシルトリエチル−アンモニウムホスフェートおよびｓｉＲＮＡの量）。ポリマーアセトン溶液を、３３５ｍＬ／分の総流量で、ナノ沈澱を介して、撹拌しながら付加した（有機対水性相のｖ／ｖ比＝１：１０）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、アセトンを除去した。次いで、粒子を１０体積の水で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。ＰＶＡ（粘度２．５〜３．５ｃｐ、Sigma-Aldrich）を粒子に付加し、２〜３時間撹拌させた。
【０６８８】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝９８ｎｍ
ＰＤＩ＝０．４１
Ｄｖ５０＝３４ｎｍ
Ｄｖ９０＝６８ｎｍ
ゼータ電位＝−１１．５ｍＶ
ｓｉＲＮＡ薬剤負荷＝１．５１重量％
実施例６６．  酵素消化検定を用いた陽イオン性ＰＶＡを伴うペギル化粒子（非共役化）中に埋め込まれたｓｉＲＮＡの特徴付け
【０６８９】
０．５μｇのｓｉＲＮＡを含有するペギル化粒子（実施例３２）のアリコートを、４つの時間（３０分、１時間、４時間および１８時間）の各々に関してＲＮアーゼＡ（１μｇ）とともに、３７℃でインキュベートした。各反応を、プロテイナーゼＫ（０．０７ｍｇ）およびＳＤＳ（０．２ｍｇ）でクエンチして、さらに、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、試料を凍結し、臭化エチジウム染色で２０％ＰＡＧＥにより分析した。遊離ｓｉＲＮＡを用いて、同一プロトコールを反復した。結果を、図２に示す。
【０６９０】
レーン２〜５では、ＲＮアーゼによりｓｉＲＮＡが消化されて、より短い生成物になったため、物質のかすかな帯域が観察された。より短い種へのｓｉＲＮＡの完全消化はｓｉＲＮＡをＲＮアーゼとともにインキュベートした３０分後に観察された（レーン２参照）。
【０６９１】
レーン７〜１０では、レーン１の非消化ｓｉＲＮＡのものと同様の移動を有するより強い強度の帯域が、レーン２〜５における消化生成物のものと同様の移動を有するかすかな拡散性の帯域の上に観察された。非消化ｓｉＲＮＡ（レーン１）のものと同様の移動を有する高分子量帯域が、粒子に含有されるｓｉＲＮＡに関して全ての時間で観察された（レーン７〜１０）。ＲＮアーゼＡによる消化の１８時間後に、抗分子量帯域が依然として観察された（レーン７〜１０）。
実施例６７．  酵素消化検定を用いた陽イオン性ＰＶＡを伴うｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体粒子の特徴付け
【０６９２】
２６μｇのｓｉＲＮＡ−Ｓ−Ｓ−ＰＬＧＡを含有するペギル化粒子（実施例５８）のアリコートを、４つの時間（３０分、１時間、４時間および１８時間）の各々に関してＲＮアーゼＡ（５０μｇ）とともに、３７℃でインキュベートした。各反応を、プロテイナーゼＫ（０．２８ｍｇ）およびＳＤＳ（０．８ｍｇ）でクエンチして、さらに、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、試料を凍結し、臭化エチジウム染色を伴って２０％ＰＡＧＥにより分析した。単独ｓｉＲＮＡを用いて、同一プロトコールを反復した。結果を、図３に示す。
【０６９３】
単独ｓｉＲＮＡをＲＮアーゼとともにインキュベートすると（レーン３〜６）、ｓｉＲＮＡはすべて、各インキュベーション時間で消化される、ということが示された。ｓｉＲＮＡ−ＳＳ−ＰＬＧＡ粒子（レーン７〜１０）に関しては、ｓｉＲＮＡに対応するかすかな帯域が依然として可視的であったが、これは、粒子がＲＮアーゼＡによるｓｉＲＮＡの消化を遅くしたことを示している。
実施例６８．  Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンの合成、精製および特徴付け
【化３４】
2013541506.tif 000059
【０６９４】
内部温度プローブ、機械的撹拌器および添加漏斗を装備した３Ｌ三首丸底フラスコを窒素でフラッシュ洗浄して、スペルミン（９．６０ｇ、４７．４４ｍｍｏｌ）およびＭｅＯＨ（６７０ｍＬ）を投入した。溶液を、−２０℃に冷却した。その後、ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中のエチルトリフルオロアセテート（６．７４ｇ，４７．４４ｍｍｏｌ）の溶液を、添加漏斗を用いて９０分間、滴下した。混合物を１４時間撹拌して、温度を室温に上げさせた。ＭＳ［直接注射ＥＳＩ（＋）］により、反応の進行をモニタリングした。混合物は、スペルミン、Ｎ１−トリフルオロアセテート−スペルミンおよび化合物１を含有した。Ｎ１−トリフルオロアセテート−スペルミンが主要ピークであった。
【０６９５】
その後、有機溶媒を真空下で除去して、油残渣を得て、これを、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ、９５０ｍＬ）中の溶液として、内部温度プローブ、機械的撹拌器および添加漏斗を装備した３Ｌ三首丸底フラスコ中に付加した。混合物を０℃に冷却し、ホルムアミド（１９．２ｇ、２３７．３ｍｍｏｌ）の３７重量％水溶液を１５分で付加した。混合物を０℃で３０分撹拌し、次いで、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（６０．３ｇ、２８１．５ｍｍｏｌ）を、固体として１５分に亘って３回に分けて付加した。混合物を１４時間撹拌して、温度を室温に上げさせた。ＭＳ［直接注射ＥＳＩ（＋）］により、反応の進行をモニタリングした。混合物は、Ｎ１−トリフルオロアセテート−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化−スペルミン、化合物２、３を含有したが、前ステップからの物質は含有しなかった。
【０６９６】
反応混合物を１−Ｌ分液漏斗に移して、飽和重炭酸ナトリウム（１５０ｍＬ）で洗浄した。層を分離し、水性層を塩化メチレン（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過して、真空濃縮した。水性層を、５００ｍＬ丸底フラスコ中に投入し、一晩凍結乾燥した。残渣を、塩化メチレン（２５０ｍＬ）およびトリエチルアミン（２５ｍＬ）の溶液で希釈し、それを機械的撹拌器で３０分間撹拌した。その後、混合物を濾過し、濾過ケーキをフラスコに戻して、塩化メチレン（２５０ｍＬ）およびトリエチルアミン（２５ｍＬ）の溶液で希釈した。記載された方法を、２回反復した。
【０６９７】
塩化メチレン／ＴＥＡ抽出物を、分離からの塩化メチレン抽出物と合わせて、硫酸ナトリウム上で乾燥して、濾過し、真空濃縮して、残渣約１５ｇを得た。溶離液としてＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＴＥＡ（６／３／１（ｖ／ｖ／ｖ））の混合物（用いられる総溶媒  ２Ｌ）を用いて、残渣を、シリカゲル（３５０ｇ）上のカラムクロマトグラフィーにより精製した。画分を、ホスホモリブデン酸染料により可視化した。生成物を含有する画分（Ｒｆ＝０．４１）を取り出し、真空濃縮して、Ｎ１−トリフルオロアセテート−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化−スペルミン（約７ｇ)を得た。磁気撹拌器を装備した５００ｍＬ一首丸底フラスコに、Ｎ１−トリフルオロアセテート−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化−スペルミン（７．００ｇ、１９．７ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（７０ｍＬ）およびＮＨ４ＯＨ（濃縮、２１０ｍＬ）を投入した。混合物を、室温で１４時間撹拌した。その後、［直接注射ＥＳＩ（＋）］は、反応の完了を示した。混合物を真空濃縮して、シリカカラム（３５０ｇ  シリカ）上で乾燥負荷した。
【０６９８】
カラムを、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／濃ＮＨ４ＯＨ（７／２／１の比）（１．５Ｌ）で溶離した。エタノール中２％ニンヒドリン染料で、画分を可視化した。生成物を含有する画分（Ｒｆ＝０．６）を取り出し、真空濃縮して、Ｎ１−アミノ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミン（７４０ｍｇ）を得て、その構造を、１Ｈ  ＮＭＲおよびＭＳ（ＥＳＩ＋）により確証した。合わせた混合画分を濃縮し、シリカカラム（３５０ｇシリカ）上に負荷し、乾燥−負荷した。カラムを、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／濃度ＮＨ４ＯＨ（３／１／１の比）（１．５Ｌ）で溶離した。
【０６９９】
５００ｍＬ丸底フラスコに、アセチル−ＰＬＧＡ  ５０５０−７Ｋ（１５．００ｇ、２．８３ｍｍｏｌ：Ｍｎ  ５３００Ｄａを基礎にして）、ＤＣＭ（４０ｍＬ）およびトルエン（１００ｍＬ）を投入した。内容物を真空濃縮して、残留水を除去した。その後、同一フラスコに、ＤＣＣ（８７７ｍｇ、４．２５ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＤＭＡＰ（６９ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ、０．２当量）、Ｎ１−アミノ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化−スペルミン（１．１０ｇ、４．２５ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＤＣＭ（１２５ｍＬ）を投入した。混合物は、徐々に混濁した。７時間撹拌後、混合物をＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、濾過した。濾過ケーキを、新鮮なＤＣＭ（３０ｍＬ）で洗浄した。ＤＣＭ溶液を合わせ、５００ｍＬ分液漏斗中に移して、０．０００１Ｎ  ＮａＯＨ溶液（１００ｍＬ、ｐＨ＝１０）で静かに洗浄した。多少の乳濁液形成を観察した。乳濁液を３０分間静置して、層を分離させた。有機層を分離し、水性層をＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を併合し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥して、セライト（登録商標）パッドを通して濾過し、真空下で濃縮した。
【０７００】
残渣をアセトン（１００ｍＬ）中に溶解し、真空濃縮した。残渣をアセトン（１００ｍＬ）中に再溶解し、０．２μｍ  ＰＴＦＥフィルターを通して濾過し、機械的撹拌器を装備し、０℃に冷却された２Ｌ三首丸底フラスコを用いて、ＭＴＢＥ中に沈澱させた。アセトン中の粗製Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンの溶液を、絶えず撹拌しながらフラスコ中に滴下した。ポリマーが、粘着性物質として直ぐに沈澱し始めた。その結果生じた懸濁液を０℃で３０分間、次いで室温で３０分間撹拌した。液体をデカントして除去し、残渣をアセトン中に再溶解して、固体物質の移動を可能にし、次に、真空濃縮して、所望の生成物を得た（１２．０ｇ、８０％）。  １Ｈ  ＮＭＲ解析は、Ｎ１−アミノ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化スペルミンとポリマーとの複合体化、ならびにＤＭＡＰの非存在を示した。Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−テトラメチル化−スペルミンの負荷は、１Ｈ  ＮＭＲ解析により概算した場合、４．３重量％（理論的負荷の９２％：ＭＷ  ５．３ｋＤａを基礎にして）であった。ＨＰＬＣ分析は、純度９６．９％（ＡＵＣ、２３０ｎｍ）を示した。
実施例６９．  Ｎ１−アミノ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−トリ−Ｃｂｚ−スペルミンの合成、精製および特徴付け
【化３５】
2013541506.tif 000060
【０７０１】
アセチル−ＰＬＧＡ  ５０５０−７Ｋ（８．７ｇ、１．６５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２２ｍＬ、２．５体積）中に溶解し、トルエン（６１ｍＬ、７．０体積）で希釈した。粘性混合物を、回転蒸発器を用いて、４０℃の浴温度で、濃縮、乾燥して、白色固体物質を得た。固体をＤＣＭ（７０ｍＬ、８．０体積）およびＤＣＣ（０．５１ｇ、２．４８ｍｍｏｌ）中に溶解し、その後、ＤＭＡＰ（４０ｍｇ、０．３３）を付加した。次いで、ＤＣＭ（９ｍＬ）中のＮ１−アミノ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−トリ−Ｃｂｚ−スペルミン（１．５ｇ、２．４８ｍｍｏｌ）を付加し、その時点で、沈澱の形成が観察された。そのバッチを、２０〜２５℃で１６．５時間、撹拌した。不均質反応混合物を、ＨＰＬＣによりモニタリングしたが、これは、調製した前のバッチのものと同様であった。バッチをＤＣＭ（６１ｍＬ）で希釈し、０．３μｍ直列フィルターを通して濾過して、ＤＣＵを除去した。フィルターを、ＤＣＭ（１５ｍＬ）ですすいだ。濾液を、冷却２Ｍ  ＨＣｌ溶液（０〜５℃、２×６１．０ｍＬ）で洗浄した（水性廃液流のＨＰＬＣ分析は、Ｎ１−アミノ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−トリ−Ｃｂｚ−スペルミンが除去されなかったことを示した）。混合物をＤＣＭ（６１ｍＬ）で希釈し、活性化Ｄｏｗｅｘ（商標）５０ＷＸ８（２０ｇ湿重量）とともに３時間撹拌した。バッチを濾過し、ＨＰＬＣにより分析したが、これは、Ｎ１−アミノ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−トリ−Ｃｂｚ−スペルミンの濃度が有意に低減された、ということを示した。Ｎ１−アミノ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−トリ−Ｃｂｚ−スペルミンは３５．８％  ＡＵＣで存在したが、一方、生成物は、２０５ｎｍで６４．１％  ＡＵＣで存在した。
【０７０２】
濾液を濃縮、乾燥して、粗製物をオフホワイト色発泡体として得た（１０．０ｇ）。粗製物を、アセトン（１５０ｍＬ）中に溶解した。セライト（登録商標）（４０ｇ、４体積）をバッチに付加した。次いで、オーバーヘッド撹拌器でバッチを掻き混ぜながら、ＭＴＢＥ（４００ｍＬ）を付加した。スラリーを２時間撹拌して、濾過した。濾液を取り出して置き、生成物をセライト（登録商標）と混合して、ＤＣＭ（３５０ｍＬ）ですすいだ。濾液をＨＰＬＣにより分析したが、これは、微量のＮ１−アミノ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−トリ−Ｃｂｚ−スペルミンを示した。濾液を濃縮、乾燥して、セライト（登録商標）の存在下でのアセトン／ＭＴＢＥ混合物中での沈降により、Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−トリ−Ｃｂｚ−スペルミンを二次精製した。二次沈降は、Ｎ１−アミノ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−トリ−Ｃｂｚ−スペルミンを完全に除去した。バッチを濾過し、濾液を廃棄した。セライト（登録商標）をＤＣＭ（３５０ｍＬ）ですすぎ、次いで濾液を濃縮、乾燥して、高真空下で一晩乾燥して、生成物を白色発泡体として得た（５．４ｇ）。バッチのＨＰＬＣ分析は、Ｎ１−アミノ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−トリ−Ｃｂｚ−スペルミンが完全に除去された、ということを示した。１Ｈ  ＮＭＲに基づいて、負荷は８４％（８．５重量％負荷）であった。そのバッチのＧＰＣ分析は、１１．９ＤａのＭＰ（分子量ピーク）を示した。
実施例７０．  Ｎ１４−アセチルＰＬＧＡ−スペルミンの合成、精製および特徴付け
【化３６】
2013541506.tif 000061
【０７０３】
２５０ｍＬオートクレーブ中に、Ｎ１−ＰＬＧＡ−Ｎ５，Ｎ１０，Ｎ１４−トリ−Ｃｂｚ−スペルミン（５．１ｇ）、ＤＣＭ（７６．５ｍＬ、１５体積）、ＭｅＯＨ（３８ｍＬ、２Ｍ  ＨＣｌ（１．７ｍＬ）および１０％Ｐｄ／Ｃ（１．０ｇ）を付加した。反応混合物を、Ｎ２（３×１５ｐｓｉｇ）で、その後Ｈ２（２５ｐｓｉｇ）で浄化した。次いで、水素添加が、２０〜２５℃で、２５ｐｓｉｇ  Ｈ２圧で、始まった。反応を４および６．５時間後にモニタリングしたが、しかし残存する出発物質は少量であった。８．５時間後、残存する出発物質は微量であった。次に、混合物をセライト（登録商標）床を通して濾過し、ＤＣＭ（２×２０ｍＬ）ですすいだ。濾液を濃縮、乾燥して、粗生成物をオフホワイト色発泡体として得た（５．０８ｇ）。粗製物のＧＰＣ分析は、ＭＰ（分子量ピーク）が１０．６Ｄａであるということを示した。Ｎ１４−アセチルＰＬＧＡ−スペルミンを、ＤＣＭ／ＭＴＢＥ中での沈降により精製した。
実施例７０ａ．  界面活性剤としてＰＶＡを用いた、ナノ沈澱を介した、Ｎ１４−アセチルＰＬＧＡ−スペルミンを含むｓｉＲＮＡ含有ペギル化粒子の生成および特徴付け
【０７０４】
Ｎ１４−アセチルＰＬＧＡ−スペルミン（６８重量％、Ｍｗ  １０．７ｋＤａ）およびｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡ（２９重量％、Ｍｗ  １１ｋＤａ）を溶解して、アセトン中の総濃度１．０％のポリマーを生成した。別個の溶液で、ｄＴｄＴオーバーハングを伴う２２塩基対を有するｓｉＲＮＡ（３重量％、Ｍｗ  １４９２９．０６）を、水中の０．５％ｗ／ｖＰＶＡ（８０％加水分解化、粘度２．５〜３．５ｃＰｓ）の溶液に溶解した。陽イオン性アミノ基のｓｉＲＮＡリン酸基に対するモル比（Ｎ／Ｐ比）は、１．８：１であった（例えば、それぞれ、Ｎ１４−アセチルＰＬＧＡ−スペルミンおよびｓｉＲＮＡの比）。ポリマーアセトン溶液を、３３５ｍＬ／分の総流量で、ナノ沈澱を介して、撹拌しながら付加した（有機対水性相のｖ／ｖ比＝１：８）。溶液を２〜３時間撹拌することにより、アセトンを除去した。次いで、粒子を１０体積の水で洗浄して、接線流濾過系（３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ、膜面積＝５０ｃｍ２）を用いて濃縮した。
【０７０５】
粒子特性（上記の方法で製造される結果的に生じる複数の粒子を用いて評価）：  
Ｚａｖｇ＝６９ｎｍ
ＰＤＩ＝０．２４
Ｄｖ５０＝４３ｎｍ
Ｄｖ９０＝７８ｎｍ
ゼータ電位＝−７．８ｍＶ
薬剤負荷＝１．２７重量％
実施例７０ｂ．  ｍＰＥＧ−ＰＬＧＡ／ＰＶＡ粒子におけるｓｉＲＮＡ負荷を特徴付けする方法
【０７０６】
ｍＰＥＧ−ＰＬＧＡ分析：  標準としてのｍＰＥＧ２ｋ−ＰＬＧＡおよび凍結乾燥試料を、９０℃で２．５時間、水酸化ナトリウム（１Ｎ）で温浸して、次に、それらを、ＨＰＬＣ分析のために蟻酸（１Ｎ）で中和した。ＥＬＳＤ検出器を、すべての分析のために用いた。この分析方法に基づいて、ｓｉＲＮＡ粒子におけるｍＰＥＧ−ＰＬＧＡの範囲は、８〜１５重量％の範囲である。
【０７０７】
ＰＶＡ検定：粒子処方物およびＰＶＡ標準を、比色検定（ヨウ素検定）を用いて分析した。試料を、６０℃で２０分間、２ｍｌの水酸化ナトリウム（０．５Ｎ）で温浸した。次いで、それらを、０．９ｍｌの塩酸（１Ｎ）で中和した。３ｍｌのホウ酸（０．６５Ｍ）および０．５ｍｌのヨウ素／ヨウ化カリウム（０．０５Ｍ／０．１５Ｍ）を中和試料に付加した。分析物を水で希釈し、次に、ＵＶ分光光度計で６９０ｎｍで測定した。この分析方法に基づいて、ｓｉＲＮＡ粒子におけるｍＰＥＧ−ＰＬＧＡの範囲は、３５〜５５重量％の範囲である。
【０７０８】
ｓｉＲＮＡ負荷に関するＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）検定：  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）検定を用いて、ＲＮＡ−陽イオン性ＰＶＡ粒子のＲＮＡ含量を、標準としてＲＮＡを用いて定量した。ＲＮＡ標準を、異なる濃度（２μｇ／ｍｌ〜０．０１μｇ／ｍｌ）でのＴＥ緩衝液中に希釈した。試料を４８０ｎｍで励起して、蛍光発光強度を５２０ｎｍで測定した。蛍光分析のために、粒子試料を緩衝液で希釈した。
【表１５】
2013541506.tif 000062
実施例７１．  ＥＧＦＰのin  vivo  ｓｉＲＮＡノックダウン
【０７０９】
ＥＧＦＰを発現するよう遺伝子工学処理された培養ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を、ヌードマウスの乳房脂肪パッド中に移植した。移植後８日目に、６つの群（群１〜６、９匹／群）の各々におけるマウスに、表ＡＡに記載するように、対照またはｓｉＥＧＳＰを投与した。群１のマウスに、ビヒクル（１０％スクロース）の処方物を投与したが、これは、無ノックダウンの「陽性」対照を提供した。群２のマウスには、実施例３２ｂに従って調製した粒子を投与したが、これは、非標的化ルシフェラーゼ遺伝子に対する対照ｓｉＲＮＡ粒子を提供した。群６におけるマウスには、リポ多糖（ＬＰＳ  ０１１１：Ｂ４、Sigma-Aldrich）の処方物を投与したが、これは、追加の対照群としてサイトカイン放出を刺激した。群３、４および５におけるマウスには、尾静脈中に１０ｍＬ／ｋｇボーラスとしてｓｉＥＧＦＰ粒子の処方物を投与した。
【０７１０】
処方物を、１日おきに静脈内投与した（各マウスに関する２回の投与の合計）。投与量（ｍｇ／ｋｇで）および投与される処方物の体積を、表ＡＡに示す。群１〜６の各々において、２回目（最終）投与後２４時間、７２時間および１６８時間の各々で、３匹のマウスから腫瘍試料を収集した。収集腫瘍物質を、分析のために３つの個々の小片に切断した。切片を直接ドライアイス上に置くか、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Life  Technologies）に入れるか、またはリン酸塩緩衝生理食塩水（５％ウシ胎仔血清および０．１％アジ化ナトリウムを補足）で単一細胞に解離した。
【表１６−１】
2013541506.tif 000063
【表１６−２】
2013541506.tif 000064
【０７１１】
腫瘍細胞におけるＥＧＦＰノックダウンに及ぼす処理の影響を、ＦＡＣＳ解析、ＥＧＦＰ蛍光およびＥＧＦＰ  ＲＮＡレベルにより分析した。
【０７１２】
ＦＡＣＳｃａｎ（商標）血球計算を用いて、収集腫瘍試料から単離された個々の細胞における蛍光を測定した。ＦＡＣＳｃａｎ（商標）フローサイトメーターは、データ収集ソフトウェアとしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）を利用し、１０，０００で設定された所望数の事象を有する。収集データ内の細胞の特定集団を考慮するために、２つのゲートを作成した。非経口ゲートを非ＥＧＦＰ細胞株を用いて確定し、同時に、蛍光ゲートをビヒクル対照単離細胞を用いて選択した。ゲートの性質は、処理後にもはや蛍光性でないか、または処理による影響を受けないとして、細胞をスコアした。
【０７１３】
ＥＧＦＰ蛍光分析では、最初に、収集腫瘍の試料中のＥＧＦＰ蛍光のレベルを総タンパク質に関して正規化した。ＢＣＡ検定キット（ThermoFisher）を用いて、総タンパク質を確定した。総タンパク質の算定後、蛍光プレート読取器により５０μｇのタンパク質を蛍光に関して測定した（励起波長＝４８８、発光波長＝５３５）。ビヒクル対照と比較した場合の蛍光出力における減少パーセントを確定することにより、ＥＧＦＰ蛍光に関するノックダウン％値を算定した。
【０７１４】
ＲＮＡ解析では、ＥＧＦＰ特異的プローブとのハイブリダイゼーションならびに分枝プローブとのサンドイッチ核酸ハイブリダイゼーションを用いた検出により、収集腫瘍からの抽出ＲＮＡの試料において、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡのレベルを確定した。標識プローブとのハイブリダイゼーションにより作り出される発光の減少％を決定することにより、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡに関するノックダウン％値を算定した。この前に、試料を、ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）に対して正規化したが、これは、ＥＧＦＰハイブリダイゼーション段階と並行して完了した。ヒト遺伝子は、注入腫瘍細胞の比較を可能にし、マウスからのあらゆる夾雑を防止した。結果を、表ＢＢに示す。
【表１７−１】
2013541506.tif 000065
【表１７−２】
2013541506.tif 000066
【０７１５】
５’−ＲＬＭ−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを用いて、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡにおける低減が、部位特異的ｓｉＲＮＡ−特異的切断のためであることを確証した。ｓｉＥＧＦＰによるｓｉＲＮＡ−特異的切断は、ＲＮアーゼを活性化し、ＲＮＡを切断する多重タンパク質複合体による遺伝子のヌクレオチド４１４および４１５間の特異的切断を生じる。次に、腫瘍試料から抽出された精製ＲＮＡ（２４時間時点）を、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＡＣＥキット（Invitrogen，Ｌ１５０２−０１）で用いた。遺伝子特異的プライマー  （５’  ＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧ  ＧＧＡＧＧＴＧＴＧＧ−３’）を用いて、試料を逆転写して、順方向ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）５’プライマー（特異的結紮化ＲＮＡオリゴのために設計された）（５’  ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’）および逆方向遺伝子特異的プライマー（５’  ＣＧＣＣＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣ−３’）を用いて、ＰＣＲ増幅を起こさせた。標準ＰＣＲ条件を用いて、２５サイクルの増幅を完了した。
【０７１６】
増幅生成物を図４に示すが、これは、ＰＣＥ生成物の４％アガロースゲルを表しており、そして２４時間試料に関する５’ＲＬＭ  ＲＡＣＥ−ＰＣＲによるノックダウンの確証を示している。予測プライマー長は、３３３塩基対であった。レーンは、以下の通りである：１、  マーカー（１００ｂｐ  ＤＮＡラダー；Promega）；  ２、  ビヒクル；  ３、ＬＰＳ；  ４、  ｓｉＬＵＣ；  ５、  実施例６１ａに従って調製された粒子；  ６、実施例５５ａに従って調製された粒子；および７、  実施例３２ａに従って調製された粒子。レーン５、６および７は、レーン１、  マーカーレーンにおける３００塩基対帯域と同一移動度を有する顕著な帯域を示す。したがって、３００ｂｐに関する予測長の帯域を有するレーン５、６および７における大帯域のアラインメントは、それぞれ実施例６１ａ、５５ａおよび３２ａに記載されたような粒子形状におけるＲＮＡｉ切断部位の存在を確証する。
実施例７１で用いた方法
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ細胞
【０７１７】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰヒト乳癌細胞株（Cell  Biolabs,  Inc.）を、レンチウイルスベクター（プラスミド上でない）を用いて、増強ＥＧＦＰ遺伝子を伴うゲノム中に安定的にトランスフェクトした。
細胞培養
【０７１８】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＥＧＦＰ細胞を、完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン）中で、３７°Ｃ、５％ＣＯ２で、増殖させた。第７継代（すなわち、フラスコが集密になったら、細胞培養フラスコから新しいフラスコ中に取り出すための細胞の第７次トリプシン処理細胞）を、ヌードマウスにおける乳房脂肪パッド中に移植した。
フローサイトメトリー
【０７１９】
腫瘍を切断後、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および０．１％アジ化ナトリウムからなる解離緩衝液を利用して、組織解離を完了した。手でもてる大きさの乳棒と乳鉢を用いて組織を解離して、無傷細胞が通過するのに十分な隙間を作った。等体積の氷冷２％パラホルムアルデヒド溶液を、単離細胞を固定するために付加し、ＦＡＣＳ分析まで４°Ｃで保存した。Becton  Dickinson  ＦＡＣＳｃａｎ（商標）フローサイトメーターを利用して、２×１０６細胞を分析した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１親細胞（非ＥＧＦＰ）を用いて、ＥＧＦＰ細胞と比較した非ＥＧＦＰ細胞の適正なゲート開閉を確定した。
蛍光タンパク質分析
【０７２０】
ドライアイス上で即時凍結された腫瘍試料を、Ｔ−ＰＥＲ（Thermo  Fisher）の存在下で解凍させて、ＨＡＬＴ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤（Thermo  Fisher）を補足した。次に、２ｍＬのＴ−ＰＥＲ中でＴｉｓｓｕｅｍｉｓｅｒ（Thermo  Fisher）を利用して、試料を均質化した。メーカーの記載どおりにＢＣＡタンパク質検定（Thermo  Fisher）を用いて、総タンパク質濃度を測定して、マイクロプレート手順を用いて完了させた。２ｍｇ／ｍＬのストック濃度からアルブミン標準曲線を調製することにより、タンパク質濃度を決定した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５（Molecular  Devices）を用いて、５０μｇの総タンパク質／ウェルを付加して、ＥＧＦＰ蛍光を検出した。
ＲＮＡ抽出および定量
【０７２１】
腫瘍試料を、加工処理するまで−２０℃で１．５ｍＬのＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Life  Technologies）中に保存した。手でもてる大きさの微量遠心分離管乳棒を用いて溶解緩衝液を均質化して、その後、１２，０００ｇで１分間、遠心分離して、あらゆる破砕屑を除去した。次いで、上清を微量遠心分離管に移した。次に、メーカーの記載どおりに示唆されたプロトコールを用いて、ＲＮＡを溶解物から抽出した。その後、精製ＲＮＡ試料を、さらなる定量および下流解析まで、−８０℃で保存した。
【０７２２】
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡ定量化キット（Life  Technologies）を用いて定量を完了したが、これは、９６−ウェルプレート蛍光ベースのＲＮＡ定量検定である。ＲＮＡ確定は、標準曲線を作成するために提供されたＲＮＡ標準に基づいている。蛍光シグナルを、バックグラウンドを差し引いたＲＮＡ濃度に対してプロットした。
【０７２３】
試料はすべて、三重反復実験で完了した。示唆されたプロトコールに対する変法は、総体積低減に限定され、メーカーの記載どおりに、高範囲標準曲線を調製した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５を利用して、蛍光を測定した。
ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）２．０
【０７２４】
ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）２．０試薬系および検定キット（Affymetrix）を用いて、標的特異的ＲＮＡ、特にＥＧＦＰおよびＧＡＰＤＨを定量した。次いで、ハウスキーピング遺伝子からのシグナルを用いて、収集された全データ試料全体の遺伝子発現を正規化する。それぞれ、ＥＧＦＰのＧＡＰＤＨに対する比を用いて、各試料を正規化した。その時点と比較した場合の、各試料の変化パーセントから、ノックダウン％を算定した。
５’ＲＬＭ  ＲＡＣＥ−ＰＣＲ
【０７２５】
ｃＤＮＡ末端ポリメラーゼ連鎖反応の５’ＲＮＡ−リガンド媒介性迅速増幅（５’ＲＬＭ  ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）を、Invitrogen  ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）マニュアルに記載されたとおりに（わずかな修正を加えて）、実施した。簡潔に述べると、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（５Ｕ）を用いて、３７℃で１時間、１００ｎｇの総単離ＲＮＡを、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）ＲＮＡアダプター（５’−ＣＧＡＣＵＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＵＧＡＣＡＵＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＵＡＧＡＡＡ−３’）と直接ライゲーションを行った。ウシ腸ホスファターゼによるＲＮＡの脱リン酸化、ならびにｍＲＮＡキャップ構造の除去とを省いた。フェノール抽出および沈澱後、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）キットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩモジュールおよびＥＧＦＰ遺伝子特異的逆プライマー（５’−ＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＧＧ−３’）を用いて、試料を逆転写した。切断生成物を検出するために、ＲＮＡアダプター（ＧＲ５’：５’−ＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧ−３’）と相補的なプライマーを、ＥＧＦＰプライマー（ＥＧＦＰ  ＃１：  ５’−ＡＧＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＣＧＧＣ−３’）（ＥＧＦＰ＃２：５’−  ＣＧＣＣＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣ−３’）（ＥＧＦＰ＃３：  ５’−ＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴＧＴＣＧＣＣ−３’）とともに用いて、ＰＣＲを実施した。４％Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）ＥＸ（Life  Technologies）電気泳動により増幅生成物を分解して、Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）試料負荷緩衝液（Life  Technologies）で可視化した。
実施例７２．  ＥＧＦＰのin  vivo  ｓｉＲＮＡノックダウン
【０７２６】
ＥＧＦＰを発現するよう遺伝子工学処理された培養ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ、  Cell  Biolabs,  Inc.）を、ヌードマウスの乳房脂肪パッド中に移植した。１３の群（９匹／群）の各々におけるマウスに、表ＷＷＷに記載するように、対照またはｓｉＥＧＳＰ処方物を投与した。群１のマウスに、ビヒクル（１０％スクロース）の処方物を投与したが、これは、無ノックダウンの対照を提供した。群２のマウスには、実施例６１ｂに従って調製した粒子を投与したが、これは、非標的化ルシフェラーゼ遺伝子に対する対照ｓｉＲＮＡ粒子を提供した。群３〜１３におけるマウスには、尾静脈中に１０ｍＬ／ｋｇボーラスとして表ＷＷＷで参照される実施例に記載したように調製したｓｉＥＧＦＰ粒子の処方物を投与した。
【０７２７】
粒子の特性を、下記の表ＶＶＶに示す。実施例６１ａによる粒子の２つのバッチを、同一構成成分および方法を用いて調製したが、但し、ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰに対する）は、綿花亜空の２つの異なるバッチから得た。
【表１８−１】
2013541506.tif 000067
【表１８−２】
2013541506.tif 000068
【０７２８】
投与後２４時間、７２時間および１２０時間の各々で、３匹のマウスから腫瘍試料を収集した。次いで、収集した腫瘍物質を、分析のために３つの個々の小片に切断した。切片を、１．５ｍＬのＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Life  Technologies）に入れるか、直接ドライアイス上に置くか、またはリン酸塩緩衝生理食塩水（５％ウシ胎仔血清および０．１％アジ化ナトリウムを補足）で細胞に解離した。
【表１９−１】
2013541506.tif 000069
【表１９−２】
2013541506.tif 000070
【０７２９】
ＥＧＦＰノックダウンに及ぼす処理の影響を、ＥＧＦＰ蛍光の分析により確定した。ＥＧＦＰ蛍光分析では、Ｔ−ＰＥＲ(組織タンパク質抽出物試薬、ThermoFisher)（完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ThermoFisher）を補足）を利用して、腫瘍試料から総タンパク質を抽出した。均質化の前に、１．５ｍＬのＴ−ＰＥＲの存在下で、凍結腫瘍を解凍した。ＢＣＡ検定キット（ThermoFisher）を用いて、総タンパク質を確定した。総タンパク質の算定後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５（Molecular  Devices）蛍光プレート読取器を用いて、５０μｇのタンパク質をＥＧＦＰ蛍光に関して測定した（フィルターを励起波長＝４８８、発光波長＝５３５に設定。指示カットオフ：５３５ｎｍ）。下記の表ＸＸＸに示すように、同一時点からの非処理（ビヒクル）タンパク質試料と直接比較した場合のＥＧＦＰシグナルの減少から、腫瘍タンパク質のノックダウン％値を算定した。
【表２０−１】
2013541506.tif 000071
【表２０−２】
2013541506.tif 000072
【０７３０】
対照粒子で処理された群２のマウスと比較すると、群３〜１３の粒子のすべてが、ノックダウンの増大を示した（例えば、７２時間目に、ビヒクル対照群および群２の対照粒子と比較した場合）。実施例６１ａに従って調製された粒子は、最大ノックダウンパーセンテージを示した。
実施例７２ａ．  ＥＧＦＰのin  vivo  ｓｉＲＮＡノックダウン
【０７３１】
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８／ＧＦＰ細胞（Cell  Biolabs,  Inc.）を、継代１０まで、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ／１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質（すべてInvitrogenから）中で増殖させた。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８／ＧＦＰモデルは、緩徐増殖腫瘍モデル（すなわち、実施例７２で用いた迅速増殖腫瘍モデルであるＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰと比較した場合）である。
【０７３２】
同型接合雌ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕ  ヌードマウス（Taconic  Farms）に関して、以下のin  vivo試験を実施した：１日目に、５×１０６細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８／ＧＦＰ−継代１０、上記参照）を、１００μＬの５０％ＲＰＭＩ−１６４０／５０％マトリゲル（BD  Biosciences,  Inc.）中に混合し、各マウスの乳房脂肪パッド中に移植した。１３日目に、体重２０．４〜２６．４ｇ、平均腫瘍体積５７〜６９ｍｍ３のマウスを、２つの群（ビヒクルおよび粒子）に分け、各群は、測定される３つの時点、すなわち２４、７２および１２０時間の各々に関するマウスを有した。各腫瘍保有マウスに、ビヒクル（トリスＥＤＴＡ緩衝液中１０％スクロース）または実施例６１ａに従って調製された粒子（２．２ｍｇ／ｋｇ）の単一回処置を施し、１０ｍＬ／ｋｇの用量体積で尾静脈中に静脈内投与した。２４時間（１４日目）、７２時間（１６日目）および１２０時間（１８日目）時点で、各処理群から腫瘍を取り出した。次いで、収集した腫瘍物質を、分析のために３つの個々の小片に切断した。切片を、１．５ｍＬのＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Life  Technologies）に入れるか、直接ドライアイス上に置くか、またはリン酸塩緩衝生理食塩水（５％ウシ胎仔血清および０．１％アジ化ナトリウムを補足）で細胞に解離した。タンパク質およびＥＧＦＰ確定のために加工処理するまで、−８０℃で凍結試料を保存した。
【０７３３】
ＥＧＦＰ蛍光を分析することにより、実施例６１ａに従って調製した粒子による処置の影響を確定した。Ｔ−ＰＥＲ（ThermoFisher）の存在下で、凍結腫瘍を解凍し、ＨＡＬＴ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（ThermoFisher）を補足した。次に、補足Ｔ−ＰＥＲ  ４００μＬ中で、手で持てる大きさの乳鉢および乳棒を用いて試料を均質化した。ＢＣＡ検定キット（ThermoFisher）を用いて、総タンパク質を確定したが、この場合、タンパク質濃度は、２ｍｇ／ｍＬのストックからアルブミン標準曲線を調製することにより確定した。総タンパク質の算定後、５０μｇのタンパク質を１００μＬのＰＢＳ中に希釈し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５（Molecular  Devices）蛍光プレート読取器を用いて、蛍光に関して測定した（励起波長＝４８８、発光波長＝５３５）。下記の表ＹＹＹに示すように、同一時点からのビヒクル対照と直接比較した場合のＥＧＦＰシグナルの減少％を確定することにより、ＥＧＦＰ蛍光に関するノックダウン％値を算定した。
【表２１】
2013541506.tif 000073
【０７３４】
表ＹＹＹで分かるように、実施例６１ａに従って調製された粒子で処理されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８／ＧＦＰマウスは、同一時点でＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ腫瘍（対比して、実施例７２参照）で観察されたノックダウンレベルよりはるかに大きいレベルで、ＥＧＦＰノックダウン延長を示した(例えば、投与後１２０時間まで)。
【０７３５】
この結果は、実施例６１ａに従って調製された粒子への曝露後の、細胞のin  vitro生存度試験においてＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰおよびＭＤＡ−ＭＢ−４６８／ＧＦＰ細胞株間に測定可能な変動は認められなかったため、生理学的基礎を有すると思われる。さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８／ＧＦＰモデルにおける全体的腫瘍体積は、処理とは無関係であると思われた。すなわち、ビヒクル処理および粒子処理腫瘍はともに、０〜７２時間で体積を増大し、次いで、１２０時間時点までに体積を低減した。ＥＧＦＰノックダウンは腫瘍増殖とは関連しないため、ビヒクルおよび粒子群は、同様の腫瘍増殖特質を有すると予期された。
実施例７３．  マウスにおけるｓｉＲＮＡ粒子の耐容性
【０７３６】
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、遊離ｓｉＥＧＦＰ溶液、実施例６１ｂに記載したようなｓｉＬＵＣジスルフィド粒子、実施例３２ａに記載したようなｓｉＥＧＦＰ粒子、実施例５５ａに記載したようなｓｉＥＧＦＰ粒子、または実施例６１ａに記載したようなｓｉＥＧＦＰ粒子を投与した（表ＶＶＶ参照）。投与は、３ｍｇ／ｋｇの用量で、ｑ２ｄ×２の肩に、静脈内投与であった（すなわち、試験初日および試験３日目に、すなわち１日目および３日目に、すなわち２日置いて２回処置）。
【０７３７】
２回目（最終）の処理後４８時間に、血液を採取した。白血球数、赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均血球体積、平均血球ヘモグロビン濃度、好中球％（ＷＢＣ数の）、リンパ球％、単球％、好酸球％、好塩基球％、血小板概算値、多染性、赤血球不同症、絶対好中球数、絶対リンパ球数、絶対単球数、絶対好酸球数、絶対好塩基球数に関して、血液を分析した。遊離ｓｉＥＧＦＰ溶液またはｓｉＥＧＦＰ粒子処方物のいずれを摂取しているマウスにおいても、これらのパラメーターにおける有意の変化は認められなかった。
【０７３８】
血液から血清を分離し、アルカリ性ホスファターゼ、ＳＧＰＴ、ＳＧＯＴ、ＣＰＫ、アルブミン、総タンパク質、グロブリン、総ビリルビン、直接的ビリルビン、間接的ビリルビン、ＢＵＮ、クレアチニン、コレステロール、グルコース、カルシウム、リンおよび重炭酸塩に関して分析した。遊離ｓｉＥＧＦＰ溶液またはｓｉＥＧＦＰ粒子処方物のいずれかを摂取しているマウスにおいて、これらのパラメーターにおける有意の変化は認められなかった。処理動物の血清において普通に分析される追加のパラメーターは、塩化物、カリウムおよびナトリウムであるが、しかし分析されるべきこれらのパラメーターにのために、マウスから採取された血清は十分でなかった。血清化学における変化がないという見地から、ｓｉＥＧＦＰ粒子処方物による塩化物、カリウムおよびナトリウムに及ぼす任意の作用が存在したとは考えられない。
実施例７４．  マウスにおける循環サイトカイン濃度
【０７３９】
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３２ａに記載したようなｓｉＥＧＦＰ粒子；実施例５５ａに記載したようなｓｉＥＧＦＰ粒子；または実施例６１ａに記載したようなｓｉＥＧＦＰ粒子を投与した（表ＶＶＶ参照）。処理は、３ｍｇ／ｋｇの用量での単一回静脈内投与であった。
【０７４０】
陽性対照であるリポ多糖（ＬＰＳ  ０１１１：Ｂ４、Sigma-Aldrich）を、０．１  ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。粒子対照は、結合されていない（非ポリマー結合）ｓｉＥＧＦＰ溶液およびｓｉＬＵＣ粒子（実施例６１ｂ記載）で、各々、３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。
【０７４１】
処理後２時間および６時間に、血液を採取した。
【０７４２】
２時間時点からの血清を、腫瘍壊死因子−アルファ、インターロイキン−ラムダ、インターロイキン−１ベータ、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、ケラチノサイト誘導性サイトカインおよびインターフェロン−ガンマに関して分析した。この試験の結果を、表ＥＥＥに示す。陽性対照リポ多糖処理は、測定したサイトカインのすべてにおいて、有意の増大を伴った。粒子対照（遊離（非ポリマー結合）ｓｉＥＧＦＰ溶液およびｓｉＬＵＣ粒子（実施例６１ｂ記載）、ならびに粒子処方物、すなわち実施例３２ａに記載したようなｓｉＥＧＦＰ粒子、実施例５５ａに記載したようなｓｉＥＧＦＰ粒子、または６１ａに記載したようなｓｉＥＧＦＰ粒子は、測定したサイトカインのいずれにおける増大も刺激しなかった。
【０７４３】
６時間時点からの血清を、同一サイトカインに関して分析した。陽性対照リポ多糖処理は、６時間時点で測定したサイトカインのすべてにおいて有意の増大を伴ったが、しかしその濃度は２時間時点より低かった。遊離（非粒子結合）ｓｉＥＧＦＰ溶液、実施例３２ａに記載したようなｓｉＥＧＦＰ粒子、実施例５５ａに記載したようなｓｉＥＧＦＰ粒子、または６１ａに記載したようなｓｉＥＧＦＰ粒子は、測定したサイトカインのいずれにおける増大も刺激しなかった。実施例６１ｂに記載したようなｓｉＬＵＣ粒子は、６時間時点でのインターフェロン−ガンマにおいてのみ有意の増大を刺激したが、測定した他のサイトカインのいずれにおいても刺激しなかった。実施例６１ｂに記載したようなｓｉＬＵＣ粒子により刺激される循環インターフェロン−ガンマにおける増大は、ｓｉＬＵＣのオフターゲット効果であり得る。
【表２２】
2013541506.tif 000074
実施例７５．  マウスにおけるｓｉＲＮＡ粒子処方物の耐容性
【０７４４】
非腫瘍保有雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（体重２２．５〜２６．５ｇ）に、表ＦＦＦにおける処方物を尾静脈を介して静脈内注射した。注射後１日目、３日目および５日目に、体重における変化に関してマウスを査定した。表ＦＦＦは、群、投与処方物、用量、レジメンおよび群当たりのマウス数を記載する。
【表２３】
2013541506.tif 000075
【０７４５】
表ＧＧＧに示すように、３ｍｇ／ｋｇの用量で、ｑ２ｄ×２（１日目および３日目に投与）でのｓｉＥＧＦＰ粒子処方物の投与は、マウスにおいて体重損失を引き起こさなかった。
【表２４−１】
2013541506.tif 000076
【表２４−２】
2013541506.tif 000077
実施例７６．  ｓｉＲＮＡ粒子処方物によるヒト血液における補体活性化に関する検定
【０７４６】
ヒト全血を、実施例６１ａおよび実施例３２ａに従って調製された粒子に曝露して、粒子が血液中の補体（Ｃ３ａまたはＢｂ）を活性化したか否かを確定した。ヘパリン処理非と全血の３つの試料を、Bioreclamation  LLC  (Westbury,  NY)から入手して、入手後約１日で分析した。被験者は、３６、４９および５２歳男性であった。血液を１２ウェル細胞培養プレート上のプレート中に、各個体血液に関して１プレートで入れた。２ｍＬの血液を８ウェル／プレートの各々に入れた（すなわち、すべてのプレートウェルを用いたわけではない）。各々２ｍＬの血液アリコートを、以下の表ＨＨＨに従って処理した。したがって、各処理群は、ｎ＝３を有した。リポ多糖（ＬＰＳ）を、陽性対照として用いた。
【表２５】
2013541506.tif 000078
【０７４７】
各対応ウェルに処理を加えた後、プレートを覆い、卓上型インキュベーター／振盪器中に入れて、３７℃で中等度にゆっくり（１５０ｒｐｍ）振盪した。１時間後、各ウェルからの１ｍＬの血液を、１．５ｍＬエッペンドルフ管に移して、１０，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。ＭｉｃｒｏＶｕｅ（商標）補体ＥＩＡキット（Quidel  Corp.,  San  Diego,  CA）で、補体活性化の古典的および代替的経路のマーカーとしてのＣ３ａに関して、ならびに補体活性化の代替的経路のマーカーとしてのＢｂに関して、血漿を直ちに分析した。それぞれのＭｉｃｒｏＶｕｅ（商標）補体ＥＩＡキットに含まれた使用説明書に従って、Ｃ３ａおよびＢｂを測定した。
【０７４８】
図５に示すように、Ｃ３ａおよびＢｂのレベルは変化せず、正常の生理学的範囲内のままであった。粒子処方物は何れも補体（Ｃ３ａまたはＢｂ）を活性化しなかったが、これは、ｓｉＥＧＦＰ粒子がヒト全血中の補体を活性化しないことを示唆している。
【０７４９】
他の実施形態は、特許請求の範囲に示される。
【図１Ａ】
2013541506.tif 000079
【図１Ｂ】
2013541506.tif 000080
【図１Ｃ】
2013541506.tif 000081
【図５】
2013541506.tif 000082
【図２】
2013541506.tif 000083
【図３】
2013541506.tif 000084
【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月27日(2013.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子であって、
ａ）複数の疎水性ポリマー；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；
ｃ）複数の陽イオン性部分；および
ｄ）複数の核酸製剤、
を含み、
前記複数の核酸製剤のうちの少なくとも一部分が、（ｉ）ａ)の疎水性ポリマーもしくはｂ)の親水性−疎水性ポリマーのいずれかと共有結合されるか、または（ｉｉ）ａ)の疎水性ポリマーもしくはｂ)の親水性−疎水性ポリマーのいずれかと共有結合される核酸と二重鎖を形成するか、あるいは、
前記複数の陽イオン性部分の少なくとも一部が、ａ)の疎水性ポリマーもしくはｂ)の親水性−疎水性ポリマーのいずれかと結合する、
粒子。
【請求項２】
前記複数の核酸製剤の少なくとも一部が、（ｉ）ａ)の疎水性ポリマーまたはｂ)の親水性−疎水性ポリマーのいずれかと共有結合されるか、あるいは、（ｉｉ）ａ)の疎水性ポリマーまたはｂ)の親水性−疎水性ポリマーのいずれかと共有結合される核酸と二重鎖を形成する、請求項１記載の粒子。
【請求項３】
前記ａ)の疎水性ポリマーの少なくとも一部分がｄ）の核酸製剤と、各々共有結合される、請求項２記載の粒子。
【請求項４】
ｄ)の核酸製剤の少なくとも一部分が、リンカーを介してａ)の疎水性ポリマーと共有結合される、請求項３記載の粒子。
【請求項５】
前記ａ)の疎水性ポリマーの少なくとも一部分が、前記核酸製剤の５’位置を介してｄ)の核酸製剤と各々共有結合される、請求項３記載の粒子。
【請求項６】
前記粒子が、複数の核酸製剤−ポリマー複合体を含むものであって、前記複数の核酸製剤−ポリマー複合体が、それぞれ（ｉ）ａ)の疎水性ポリマーに結合されるか、または（ｉｉ）ａ)の疎水性ポリマーに共有結合される核酸製剤と二重鎖を形成する、ｄ）の核酸製剤を含む、請求項２に記載の粒子。
【請求項７】
前記粒子が、核酸製剤に結合していない疎水性ポリマーをさらに含む、請求項６記載の粒子。
【請求項８】
各核酸製剤が、リンカーを介して疎水性ポリマーと共有結合される、請求項６記載の粒子。
【請求項９】
前記粒子が、複数の核酸製剤−疎水性ポリマー複合体を含むものであって、各核酸製剤−疎水性ポリマー複合体が、それぞれ（ｉ）ｂ）の親水性−疎水性ポリマーに共有結合され、または（ｉｉ）ｂ）の親水性−疎水性ポリマーに共有結合される核酸製剤と二重鎖を形成する、ｄ）の核酸製剤を含む、請求項２記載の粒子。
【請求項１０】
前記複数の陽イオン性部分の少なくとも一部分がａ)の疎水性ポリマーまたはｂ)の親水性−疎水性ポリマーのいずれかと結合される請求項１記載の粒子。
【請求項１１】
ａ)の前記複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部分がｃ)の陽イオン部分またはｄ)の核酸製剤と共有結合されない請求項１０記載の粒子。
【請求項１２】
ａ)の前記複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部分が、それぞれｃ)の陽イオン部分と各々共有結合される請求項１０記載の粒子。
【請求項１３】
前記疎水性ポリマーがＰＬＧＡを含む請求項１〜１２のいずれかに記載の粒子。
【請求項１４】
前記親水性−疎水性ポリマーが、ＰＥＧ−ＰＬＧＡを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の粒子。
【請求項１５】
前記陽イオン性部分が、少なくとも１つの第一級、第二級、第三級または第四級アミンを含む請求項１〜１４のいずれかに記載の粒子。
【請求項１６】
前記陽イオン性部分が、スペルミン、ポリ（リジン）、カチオン性ポリビニルアルコールを含む請求項１〜１４のいずれかに記載の粒子。
【請求項１７】
前記陽イオン性部分が、ポリ（リジン）−ＰＬＧＡを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の粒子。
【請求項１８】
前記核酸製剤が、ｓｉＲＮＡを含む請求項１〜１７のいずれかに記載の粒子。
【請求項１９】
前記核酸製剤が、ｍＲＮＡを含む請求項１〜１７のいずれかに記載の粒子。
【請求項２０】
前記粒子が、界面活性剤をさらに含む請求項１〜１９のいずれかに記載の粒子。
【請求項２１】
約−２０ｍＶ〜約＋２０ｍＶのゼータ電位を有する請求項１〜２０のいずれかに記載の粒子。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の複数の粒子を含む組成物。
【請求項２３】
薬学的組成物である請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
前記粒子が２００ｎｍ未満のＤｖ９０を有する請求項２２記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２１のいずれかに記載の複数の粒子または請求項２２〜２４のいずれかに記載の組成物を含むキット。
【請求項２６】
請求項１〜２１のいずれかに記載の複数の粒子または請求項２２〜２４のいずれかに記載の組成物を含む単一投薬単位。
【請求項２７】
対象を治療または予防する方法において使用する請求項１〜２１のいずれかに記載の複数の粒子または請求項２２〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
対象の癌、自己免疫障害、心血管系障害、炎症性障害、代謝性障害または感染性疾患を治療または予防する方法において使用する、請求項１〜２１のいずれかに記載の複数の粒子または請求項２２〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２９】
疎水性ポリマーと共有結合される核酸製剤を含む核酸製剤−疎水性ポリマー複合体であって、前記核酸製剤が、センス鎖の５’末端を介してポリマーに結合されるｓｉＲＮＡである複合体。
【請求項３０】
前記核酸製剤が、リンカーを介して疎水性ポリマーと共有結合される請求項２９記載の複合体。
【請求項３１】
前記疎水性ポリマーが１ｋＤａから７０ｋＤａの範囲の重量平均分子量を有する請求項２９または３０に記載の複合体。
【請求項３２】
前記疎水性ポリマーが、アクリラート；アクリル酸メチル；アクリロニトリル；メタクリロニトリル；ビニル；アミノアルキル；セルロースアセタートフタラート；セルロースアセタートスクシナート；フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース；ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）；ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）；ポリ（グリコリド）；ポリ（ヒドロキシブチラート）；ポリ（アルキルカルボナート）；ポリ（オルトエステル）；ポリエステル類；ポリ（ヒドロキシ吉草酸）；ポリジオキサノン；ポリ（エチレンテレフタラート）；ポリ（リンゴ酸）；ポリ（タルトロン酸）；ポリ酸無水物類；ポリホスファゼン類；ポリ（アミノ酸類）およびそれらのコポリマー；疎水性ペプチドに基づくポリマーおよびポリ（Ｌ−アミノ酸）に基づくポリマー；ポリ（エチレン−酢酸ビニル）コポリマー；シリコーンゴム；ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリジエン；ビニルメチルエーテルおよび他のビニルエーテル類のマレイン酸無水物コポリマー；ポリアミド類；ポリウレタン；ポリ（エステルウレタン類）；ポリ（エーテルウレタン類）；およびポリ（エステル−尿素）からなる群から選択される請求項２９〜３１のいずれかに記載の複合体。
【請求項３３】
前記疎水性ポリマーが、ポリエステルであり、前記ポリエステルが、例えば、Ｄ，Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、Ｌ−ラクチド、Ｄ，Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸、グリコリド、グリコール酸、ε−カプロラクトン、ε−ヒドロキシヘキサン酸、γ−ブチロラクトン、γ−ヒドロキシ酪酸、δ−バレロラクトン、δ−ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシ酪酸、およびリンゴ酸からなる群より選択されるモノマーから合成されたポリエステルである請求項２９〜３９のいずれかに記載の複合体。
【請求項３４】
前記疎水性ポリマーがＰＬＧＡである請求項２９〜３１のいずれかに記載の複合体。
【請求項３５】
親水性−疎水性ポリマーと共有結合される核酸製剤を含む核酸製剤−親水性−疎水性ポリマー複合体。
【請求項３６】
前記核酸製剤が前記親水性−疎水性ポリマーの親水性部分と結合される請求項３５記載の複合体。
【請求項３７】
前記核酸製剤が前記親水性−疎水性ポリマーの疎水性部分と結合される請求項３５記載の複合体。
【請求項３８】
核酸製剤を含む粒子の製造方法であって、
（ａ）複数の核酸製剤−疎水性ポリマー複合体（ここで、各核酸製剤−疎水性ポリマー複合体は、疎水性ポリマーと共有結合される核酸製剤を含み、前記核酸製剤−疎水性ポリマー複合体は陽イオン性部分と会合される）；
（ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；および
（ｃ）複数の疎水性ポリマー
を、粒子の形成を可能にする条件下で極性溶媒中で、併合し、それにより粒子を形成することを包含する方法。
【請求項３９】
請求項２９〜３７のいずれかに記載の複合体、請求項１〜２１のいずれかに記載の粒子、あるいは請求項２２〜２４のいずれかに記載の組成物の保存方法であって、
（ａ）容器中に、処理される前記複合体、粒子または組成物を提供すること；
（ｂ）前記複合体、粒子または組成物を保存すること；そして
（ｃ）前記容器を第二の場所に移動するかまたは前記複合体、粒子または組成物の全部またはアリコートを前記容器から取り出すこと
を包含する方法。
【請求項４０】
保存される前記複合体、粒子または組成物が凍結乾燥された処方物または再構成処方物として形成される、請求項３９記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
ある実施形態では、複合体、粒子または組成物は、再構成された処方物として保管される（例えば、液体中に、溶液または懸濁物として）。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
粒子であって、
ａ）複数の疎水性部分；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；
ｃ）任意に、複数の陽イオン性部分；および
ｄ）複数の核酸製剤であって、前記複数の核酸製剤のうちの少なくとも一部分が、
（ｉ）
疎水性部分、例えばａ)の疎水性ポリマーまたは
ｂ)の親水性−疎水性ポリマー
のいずれかと共有結合されるか、あるいは
（ｉｉ）ａ)の疎水性部分またはｂ)の親水性−疎水性ポリマーのいずれかと共有結合される核酸と二重鎖を形成する複数の核酸製剤
を含む、粒子。
（項目２）
複数の陽イオン性部分を含む項目１記載の粒子。
（項目３）
前記疎水性部分が疎水性ポリマーである項目１記載の粒子。
（項目４）
前記疎水性部分が疎水性ポリマーであり、そしてａ)の疎水性ポリマーの少なくとも一部分がｄ)の核酸製剤と、各々共有結合される項目１記載の粒子。
（項目５）
ｄ)の核酸製剤の少なくとも一部分が、リンカーを介して疎水性ポリマーと共有結合される項目４記載の粒子。
（項目６）
ａ)の疎水性ポリマーの少なくとも一部分が、核酸製剤の５’位置を介してｄ)の核酸製剤と各々共有結合される項目４記載の粒子。
（項目７）
粒子であって、
ａ）複数の核酸製剤−ポリマー複合体であって、その各々が、
（ｉ）疎水性ポリマーと結合されるか、あるいは
（ｉｉ）疎水性ポリマーと共有結合される核酸と二重鎖を形成する
核酸製剤を含む核酸製剤−ポリマー複合体；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；および
ｃ）任意に、複数の陽イオン性部分
を含む、粒子。
（項目８）
複数の陽イオン性部分を含む項目７記載の粒子。
（項目９）
疎水性ポリマーをさらに含む項目７記載の粒子であって、前記疎水性ポリマーが核酸製剤と結合されない粒子。
（項目１０）
核酸製剤が、リンカーを介して疎水性ポリマーと共有結合される項目７記載の粒子。
（項目１１）
粒子であって、
ａ）複数の疎水性部分；
ｂ）複数の核酸製剤−親水性−疎水性ポリマー複合体であって、その各々の核酸製剤が、
（ｉ）前記親水性−疎水性ポリマーと共有結合されるか、または
（ｉｉ）親水性−疎水性ポリマーと共有結合される核酸と二重鎖を形成する
核酸製剤−親水性−疎水性ポリマー複合体；および
ｃ）任意に、複数の陽イオン性部分
を含む、粒子。
（項目１２）
複数の陽イオン性部分を含む項目１１記載の粒子。
（項目１３）
粒子であって、
ａ）複数の疎水性ポリマー；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；
ｃ）複数の陽イオン性部分であって、その少なくとも一部分がａ)の疎水性ポリマーまたはｂ)の親水性−疎水性ポリマーのいずれかと結合される複数の陽イオン部分；および
ｄ）複数の核酸製剤
を含む、粒子。
（項目１４）
ａ)の前記複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部分がｃ)の陽イオン部分またはｄ)の核酸製剤と共有結合されない項目１３記載の粒子。
（項目１５）
ａ)の前記複数の疎水性ポリマーの少なくとも一部分がｃ)の陽イオン部分と各々共有結合される項目１３記載の粒子。
（項目１６）
前記陽イオン性部分がスペルミンまたはテトラメチル化スペルミンである項目１３記載の粒子。
（項目１７）
粒子であって、
ａ）複数の疎水性ポリマー；
ｂ）任意に、複数の親水性−疎水性ポリマー；
ｃ）複数の陽イオン性部分；および
ｄ）複数の核酸製剤であって、その少なくとも一部分が親水性ポリマーと共有結合されるか、または親水性ポリマーと共有結合される核酸と二重鎖を形成する複数の核酸製剤
を含む、粒子。
（項目１８）
前記核酸製剤が親水性ポリマーと共有結合される項目１７記載の粒子。
（項目１９）
前記親水性ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である項目１７記載の粒子。
（項目２０）
前記親水性ポリマーが脂質と共有結合される項目１７記載の粒子。
（項目２１）
疎水性−親水性ポリマーを実質的に有さない項目１７記載の粒子。
（項目２２）
粒子であって、
ａ）複数の疎水性ポリマー；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；および
ｃ）複数の核酸製剤−陽イオン性ポリマー複合体
を含む、粒子。
（項目２３）
前記陽イオン性ポリマーがＰＶＡである項目２２記載の粒子。
（項目２４）
前記核酸製剤−陽イオン性ポリマー複合体がｓｉＲＮＡ−陽イオン性ＰＶＡ複合体である項目２２記載の粒子。
（項目２５）
粒子であって、
ａ）複数の疎水性ポリマー；
ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；
ｃ）任意に、複数の陽イオン性部分；および
ｄ）複数の核酸製剤
を含む粒子であって、ｃ)の陽イオン性部分の大部およびｄ)の核酸製剤の大部が疎水性ポリマーまたは親水性−疎水性ポリマーと共有結合されない、粒子。
（項目２６）
前記核酸製剤または陽イオン性部分が粒子中に埋め込まれる項目２５記載の粒子。
（項目２７）
複数の陽イオン性部分を含む項目２５記載の粒子。
（項目２８）
前記陽イオン性部分が陽イオン性ポリマーである項目２７記載の粒子。
（項目２９）
前記疎水性部分または疎水性ポリマーがＰＬＧＡである項目１〜２８のいずれかに記載の粒子。
（項目３０）
前記ＰＬＧＡが反応性基によって末端で修飾される項目２９記載の粒子。
（項目３１）
前記親水性−疎水性ポリマーがＰＥＧ−ＰＬＧＡである項目１〜２０および２２〜２９のいずれかに記載の粒子。
（項目３２）
前記陽イオン性部分が少なくとも１つの第一級、第二級、第三級または第四級アミンを含む項目１〜３１のいずれかに記載の粒子。
（項目３３）
前記核酸製剤がｓｉＲＮＡである項目１〜３２のいずれかに記載の粒子。
（項目３４）
界面活性剤をさらに含む項目１〜３３のいずれかに記載の粒子。
（項目３５）
約−２０ｍＶ〜約＋２０ｍＶのゼータ電位を有する項目１〜３４のいずれかに記載の粒子。
（項目３６）
項目１〜３５のいずれかに記載の複数の粒子を含む組成物。
（項目３７）
薬学的組成物である項目３６記載の組成物。
（項目３８）
前記粒子が２００ｎｍ未満のＤｖ９０を有する項目３６記載の組成物。
（項目３９）
項目１〜３５のいずれかに記載の複数の粒子または項目３６〜３９のいずれかに記載の組成物を含むキット。
（項目４０）
項目１〜３５のいずれかに記載の複数の粒子または項目３６〜３９のいずれかに記載の組成物を含む単一投薬単位。
（項目４１）
障害を有する対象の治療方法であって、有効量の項目１〜３５のいずれかに記載の粒子または項目３６〜３９のいずれかに記載の組成物を前記対象に投与し、それにより対象を治療することを包含する方法。
（項目４２）
疎水性ポリマーと共有結合される核酸製剤を含む核酸製剤−疎水性ポリマー複合体であって、前記核酸製剤が、センス鎖の５’末端を介してポリマーに結合されるｓａＲＮＡである複合体。
（項目４３）
前記核酸製剤が、リンカーを介して疎水性ポリマーと共有結合される項目４２記載の複合体。
（項目４４）
親水性−疎水性ポリマーと共有結合される核酸製剤を含む核酸製剤−親水性−疎水性ポリマー複合体。
（項目４５）
前記核酸製剤が前記親水性−疎水性ポリマーの親水性部分と結合される項目４４記載の複合体。
（項目４６）
前記核酸製剤が前記親水性−疎水性ポリマーの疎水性部分と結合される項目４４記載の複合体。
（項目４７）
核酸製剤を含む粒子の製造方法であって、
（ａ）核酸製剤−疎水性ポリマー複合体（ここで、各核酸製剤−疎水性ポリマー複合体は、疎水性ポリマーと共有結合される核酸製剤を含み、前記核酸製剤−疎水性ポリマー複合体は陽イオン性部分と会合される）；
（ｂ）複数の親水性−疎水性ポリマー；および
（ｃ）複数の疎水性ポリマー
を、粒子の形成を可能にする条件下で極性溶媒中で、合わせ、それにより粒子を形成することを包含する方法。
（項目４８）
対象に投与される場合、（ａ）粒子または複合体以外の処方物中で対象に投与される核酸製剤を用いて観察される標的遺伝子の発現における低減より；あるいは（ｂ）核酸製剤または他の治療薬の投与の非存在下での標的遺伝子の発現より、少なくとも１０、２０、５０、７５、８０、９０、１００、２００または５００％大きい標的遺伝子の発現における低減を生じる項目３６〜３９のいずれかに記載の組成物。
（項目４９）
項目４２〜４６のいずれかに記載の複合体、項目１〜２９のいずれかに記載の粒子、あるいは項目３６〜３９のいずれかに記載の組成物の保存方法であって、
（ａ）容器中に前記複合体、粒子または組成物を提供すること；
（ｂ）前記複合体、粒子または組成物を保存すること；および
（ｃ）前記容器を第二の場所に移動するかまたは前記複合体、粒子または組成物の全部またはアリコートを前記容器から取り出すこと
を包含する方法。
（項目５０）
保存される前記複合体、粒子または組成物が再構成処方物である項目４９記載の方法。
【国際調査報告】
2013541506.tif 000086
2013541506.tif 000087
2013541506.tif 000088
2013541506.tif 000089