(57)【要約】  本発明は、超分岐ポリエステルを含む眼科用組成物を提供する。該眼科用組成物は炭酸脱水素酵素阻害剤も含み得るものであり、該超分岐ポリエステルは炭酸脱水素酵素阻害剤の水溶解度を増加させ、有効薬剤の角膜透過性を増加させることを特徴とする。また、該眼科用組成物は、ＰＥＧ、ポリソルベート、ＨＰＭＣ又はＨＥＣなどの、非イオン性界面活性剤、及び、カルテオロール、レボブノロール、ベタキソロール、メチプラノロール、チモロール又はプロプラノロールなどの、ベータブロッカーも含み得る。ヒト角膜細胞へのいかなる細胞毒性効果、そして、それによる眼部刺激性を避けるために、眼科用製剤における超分岐ポリエステルの濃度は４％（ｗ／ｖ）以下であるべきである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミン基、ヒドロキシル基、脂肪酸基、及びＰＥＧからなる群から選択される末端官能基を含む超分岐ポリマーを含有する眼科用組成物。
【請求項２】
更に、炭酸脱水素酵素阻害剤を含む、請求項１に記載の眼科用組成物。
【請求項３】
更に、非イオン性界面活性剤を含む、請求項１に記載の眼科用組成物。
【請求項４】
更に、非イオン性界面活性剤を含む、請求項２に記載の眼科用組成物。
【請求項５】
該超分岐ポリマーの平均分子量が１，０００〜７５０，０００ダルトン（Ｍｗ）の範囲内である、請求項１に記載の眼科用組成物。
【請求項６】
該超分岐ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、及びポリエステルからなる群より選択されるコアを含む、請求項１又は２に記載の眼科用組成物。
【請求項７】
ｐＨが３．０〜８．０の範囲内である、請求項１に記載の眼科用組成物。
【請求項８】
該超分岐ポリマーの濃度が０．０１％〜５％（ｗ／ｖ）の範囲内である、請求項１に記載の眼科用組成物。
【請求項９】
更に、ベータブロッカーを含む、請求項２に記載の眼科用組成物。
【請求項１０】
該炭酸脱水素酵素阻害剤が、ドルゾラミド、ブリンゾラミド、及びアセタゾラミドからなる群より選択される、請求項２に記載の眼科用組成物。
【請求項１１】
該非イオン性界面活性剤が、ＰＥＧ、ポリソルベート、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群より選択される、請求項３に記載の眼科用組成物。
【請求項１２】
該非イオン性界面活性剤が、ＰＥＧ、ポリソルベート、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群より選択される、請求項４に記載の眼科用組成物。
【請求項１３】
該ベータブロッカーが、カルテオロール、レボブノロール、ベタキソロール、メチプラノロール、チモロール、及びプロプラノロールからなる群より選択される、請求項９に記載の眼科用組成物。
【請求項１４】
該超分岐ポリマーのコアがポリエステルであって、末端官能基として、ヒドロキシル基、脂肪酸基、及びＰＥＧを含む、請求項６に記載の眼科用組成物。
【請求項１５】
該超分岐ポリマーの平均分子量が、１，０００〜１２，０００ダルトン（Ｍｗ）の範囲内である、請求項１４に記載の眼科用組成物。
【請求項１６】
該超分岐ポリマーの濃度が、０．００１〜４％（ｗ／ｖ）の範囲内である、請求項１４に記載の眼科用組成物。
【請求項１７】
超分岐ポリエステル、チモロール、ドルゾラミド、及びポリソルベート８０を含有する眼科用組成物であって、該超分岐ポリエステルが、ポリエステルヒドロキシル基、脂肪酸基、及びＰＥＧからなる群より選択される末端官能基を含む、眼科用組成物。
【請求項１８】
超分岐ポリエステル、チモロール、ブリンゾラミド、及びポリソルベート８０を含有する眼科用組成物であって、該超分岐ポリエステルが、ポリエステルヒドロキシル基、脂肪酸基、及びＰＥＧからなる群より選択される末端官能基を含む、眼科用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は超分岐ポリマーを含む眼科用組成物に関する。本発明の超分岐ポリマーは、例えば、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン又はポリエステルを有する超分岐ポリマーなどの、医薬上許容されるいかなる超分岐ポリマーでもあり得る。
【背景技術】
【０００２】
ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）及びＴＲＵＳＯＰＴ（登録商標）は、緑内障と呼ばれる眼疾患の治療のために、メルク（Ｍｅｒｃｋ）によって開発された市販の局所的点眼液である。ＴＲＵＳＯＰＴ（登録商標）の場合、有効成分は専らドルゾラミド（Ｄｏｒｚｏｌａｍｉｄｅ）である。ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）の場合、有効成分はドルゾラミド及びチモロール（Ｔｉｍｏｌｏｌ）（ベータブロッカー）である。ドルゾラミドは、ｐＨ４．０〜５．５で４０ｍｇ／ｍＬの水溶解度を有する、炭酸脱水素酵素阻害剤であり、水には溶けるが、メタノールやエタノールには溶けにくい、白からオフホワイトの結晶性粉末である。
【０００３】
ただし、生理学的なｐＨでドルゾラミドの水溶解度が限定されるため、これらの製剤は２％（ｗ／ｖ）ドルゾラミドを含み、ｐＨ５．６５で調製される。その結果、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）及びＴＲＵＳＯＰＴ（登録商標）製剤は、低ｐＨに起因する局所的な刺激をもたらす可能性がある。ドルゾラミドは６．３５及び８．５の２つのｐＫａ値を有し、それぞれプロトン化第二アミノ基及びスルホンアミド基と一致する。ドルゾラミドは主に、ｐＨ６．４未満では親水性のカチオン性形態であり、ｐＨ８．５を超えると親水性のアニオン性形態となる。
【０００４】
上述のとおり、ドルゾラミドはｐＨ６．４から８．５の間では、溶液中で比較的低い水溶解度を有し、主に、該生理学的ｐＨの範囲でのドルゾラミドの非イオン性挙動に起因する。
【０００５】
ＡＺＯＰＴ（登録商標）（ブリンゾラミド（Ｂｒｉｎｚｏｌａｍｉｄｅ）眼懸濁液）１％は、ブリンゾラミドの無菌の水性懸濁液であり、振盪後に容易に懸濁され、ゆっくりと定常状態に戻るよう処方されている。ＡＺＯＰＴ（登録商標）はＡｌｃｏｎが開発し、有効成分としてブリンゾラミドを含む。該製剤はｐＨ約７．５及び浸透圧３００ｍＯｓｍ／ｋｇを有し、開放隅角緑内障又は高眼圧症の患者に、上昇した眼圧を下げるために滴下される。ブリンゾラミドのｐＫａ値は、５．９（アミン）及び８．４（第一スルホンアミド）であり、ブリンゾラミドが、ｐＨに依存して酸又は塩基（両性電解質）として作用するのを可能にし、主にｐＨ５．９未満では親水性のカチオン性形態であり、ｐＨ８．４を超えると親水性のアニオン性形態となる。ブリンゾラミドが生理学的なｐＨでは著しく低プロトン化状態（＜１０％）であることは明白である。従って、ｐＨ５．９から８．４の間の溶液中で、ブリンゾラミドは比較的低い水溶性を有し、主に該ｐＨの範囲でのブリンゾラミドの非イオン性（親油性）の挙動に起因する。
【０００６】
樹状ポリマーは木のような構造のポリマーであり、その枝分かれ構造に基づいて、「完全分岐」（デンドリマー）及び「不完全分岐」（超分岐ポリマー又はＨＰ）という２つの主要なタイプに分類することができる。超分岐ポリマーは、一般にコア周辺に枝分かれ構造を有する分子構成である。デンドリマーと異なり、超分岐ポリマーを構築するのに使用される基本単位又はモノマーは、多様な性質をもつ可能性があり、それらの分布は均一でないため、超分岐ポリマーの構造は一般に対称性を欠く。該ポリマーの分岐は異なる性質及び長さであり得る。異なる枝分かれに依存して、基本単位、又はモノマーの数は異なり得る。非対称であると同時に、超分岐ポリマーは以下：コアの周辺での極度な枝分かれ構造；連続した世代又は分岐の層；末端鎖の層、を有する可能性がある。超分岐ポリマーは一般的に、一以上のモノマーＡＢｘ（Ａ及びＢは共反応可能な反応基であり、ｘは２以上の整数である）の重縮合に由来するが、別の調製過程も可能である。超分岐ポリマーは、その重合の度合いＤＰ＝１００−ｂ（ｂは基Ａと反応していないＢにおける非末端官能性のパーセンテージである）によって特徴付けられる。縮合は体系的ではないため、重合の程度は１００％未満であり、末端基Ｔを超分岐ポリマーと反応させ、鎖の末端の特定官能性を得ることができる。
【０００７】
超分岐ポリマーは主に、そのコアの型と末端基によって同定される。超分岐ポリマーのコアの型の例として、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリグリコール、ポリエーテル、ポリエステル等が挙げられる。ポリエステルコアを有する超分岐ポリマーは、超分岐ポリエステルと呼ばれる場合がある。超分岐ポリマーの末端又は表面官能基の例として、アミン、ヒドロキシル、カルボン酸、脂肪酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエステル等が挙げられる。米国特許 6,432,423号明細書、米国特許7,097,856号明細書、及び米国特許 2006/0204472号公報を参照されたい（これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０００８】
【化１】
2013528589.tif 000002
【０００９】
ＡＢ２モノマーの重合からの超分岐ポリマーの形成を示す図
【００１０】
複数工程の合成によって調製される「構造的に完璧な」デンドリマーとは対照的に、幾分完璧性の低い超分岐ポリマーは、１工程の反応で合成することができる。従って、デンドリマーとは異なり、超分岐ポリマーは調製のための精製工程を必要とせず迅速に調製される。結果的に、超分岐ポリマーはデンドリマーよりもかなり安価であり、それ故、超分岐ポリマーのラージスケールｉｎ  ｖｉｖｏ試験への適用を可能にし、高度に分岐したポリマーを、イブプロフェンのようなごく一般的な薬のドラッグデリバリーのための候補としている（Kannan, R.M. et al., Biomedical Applications of Nanotechnology, 2007, John Wiley & Sons Inc., p. 105）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、有効成分の改善した水溶解度及び角膜透過性を有する、改善した眼科用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、超分岐ポリマーを含む眼科用組成物の研究を行い、超分岐ポリマーが強力な生体接着性を有する粘液接着性ポリマーであり、このことが、負に荷電した角膜ムチン膜と陽イオン性超分岐ポリマーとの間の強力な静電気的相互作用をもたらすことを見出した。
【００１３】
本発明者らは、超分岐ポリマーが、ドルゾラミド又はブリンゾラミド等の緑内障治療に用いられる、炭酸脱水素酵素阻害剤の水溶解度増加させること、更には、ドルゾラミド又はブリンゾラミドの水溶解度が、超分岐ポリマーの濃度の上昇に伴って直線的に増加することを見出した。加えて、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト角膜上皮細胞培養研究に基づいて、ヒドロキシル官能基を有するＢｉｓ−ＭＰＡ超分岐ポリエステル（第２世代）等の超分岐ポリマーが、細胞傷害性又は目に刺激を与えることなく最高４％（ｗ／ｖ）まで安全に使用することができること、更には、超分岐ポリマーが、ドルゾラミド及びチモロールの、インタクトな角膜への角膜透過及び分配を増加させ、ドルゾラミド及びチモロールの親油性角膜への分配を増加させることを見出した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下のとおりである：
（１）アミン基、ヒドロキシル基、脂肪酸基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択される末端官能基を含む超分岐ポリマーを含有する眼科用組成物、
（２）更に炭酸脱水素酵素阻害剤を含む、上記（１）に記載の眼科用組成物、
（３）更に非イオン性界面活性剤を含む、上記（１）又は（２）に記載の眼科用組成物、
（４）前記超分岐ポリマーの平均分子量が１，０００〜７５０，０００ダルトン（Ｍｗ）の範囲内である、上記（１）に記載の眼科用組成物、
（５）前記超分岐ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、及びポリエステルからなる群より選択されたコアを含む、上記（１）又は（２）に記載の眼科用組成物、
（６）ｐＨが３．０〜８．０の範囲内である、上記（１）に記載の眼科用組成物、
（７）超分岐ポリエステルの濃度が０．０１％〜５％（ｗ／ｖ）の範囲内である、上記（１）に記載の眼科用組成物、
（８）更にベータブロッカーを含む、上記（２）に記載の眼科用組成物、
（９）該炭酸脱水素酵素阻害剤が、ドルゾラミド、ブリンゾラミド、及びアセタゾラミドからなる群より選択される、上記（２）に記載の眼科用組成物、
（１０）該非イオン性界面活性剤が、ＰＥＧ、ポリソルベート、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、及びヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）からなる群より選択される、上記（３）に記載の眼科用組成物、
（１１）該ベータブロッカーが、カルテオロール、レボブノロール、ベタキソロール、メチプラノロール、チモロール、及びプロプラノロールからなる群より選択される、上記（８）に記載の眼科用組成物、
（１２）該超分岐ポリマーのコアがポリエステルであって、末端官能基として、ヒドロキシル基、脂肪酸基、及びＰＥＧを含む、上記（５）に記載の眼科用組成物、
（１３）該超分岐ポリマーの平均分子量が１，０００〜１２，０００ダルトン（Ｍｗ）の範囲内である、上記（１２）に記載の眼科用組成物、
（１４）該超分岐ポリマーの濃度が０．００１％〜４％（ｗ／ｖ）の範囲内である、上記（１２）に記載の眼科用組成物、
（１５）超分岐ポリエステル、チモロール、ドルゾラミド、及びポリソルベート８０を含有する眼科用組成物であって、該超分岐ポリエステルが、ポリエステルヒドロキシル基、脂肪酸基、及びＰＥＧからなる群より選択される末端官能基を含む、眼科用組成物、
（１６）超分岐ポリエステル、チモロール、ブリンゾラミド、及びポリソルベート８０を含有する眼科用組成物であって、該超分岐ポリエステルが、ポリエステルヒドロキシル基、脂肪酸基、及びＰＥＧからなる群より選択される末端官能基を含む、眼科用組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、０．１％（ｗ／ｖ）リン酸緩衝液中のドルゾラミドのｐＨ溶解特性を示す。
【図２】図２は、ｐＨ５．６５の０．１％（ｗ／ｖ）リン酸緩衝液中の、超分岐ポリマー濃度のドルゾラミド水溶解度への依存性を示す。
【図３】図３は、ｐＨ７の０．１％（ｗ／ｖ）リン酸緩衝液中の、超分岐ポリマー濃度のドルゾラミド水溶解度への依存性を示す。
【図４】図４は、ｐＨ７において、ＰＥＧ８０００及び超分岐ポリマー（Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳ）の様々な濃度の組み合わせが、ドルゾラミド水溶解度へ与える影響を示す。
【図５】図５は、０．１％（ｗ／ｖ）リン酸緩衝液中の、様々な溶液の２０℃でのせん断率に応じた粘性を示す。
【図６】図６は、ｐＨ７及びせん断率８０ｓ−１での生体接着力を示す。
【図７】図７は、全ての水溶液中に０．５％チモロールが存在する状況下、ｐＨ５．６５及びｐＨ７において、添加物を追加した場合のドルゾラミドの最大水溶解度を示す。
【図８】図８は、０．５％チモロール存在下、ｐＨ７で様々な組み合わせの添加物を加えた場合のドルゾラミドの最大溶解度を示す。
【図９】図９は、標準的な隣接拡散セルの図を示す。
【図１０】図１０は、Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳ超分岐ポリマーを含む製剤での、インタクトなラビット角膜を介したドルゾラミドの平均透過特性（ｎ＝２）を示す。
【図１１】図１１は、Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳ超分岐ポリマーを含む製剤での、インタクトなラビット角膜を介したチモロールの平均透過特性（ｎ＝２）を示す。
【図１２】図１２は、Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳ超分岐ポリマーを含む製剤での、ドルゾラミド及びチモロールの３時間後の総角膜透過率の平均パーセンテージを示す。
【図１３】図１３は、Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳ超分岐ポリマーを含む製剤での、ドルゾラミド及びチモロールの平均角膜透過係数を示す。
【図１４】図１４は、Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳ超分岐ポリマーを含む製剤での、インタクトなラビット角膜を介した透過についての、ドルゾラミド及びチモロールの平均拡散係数を示す。
【図１５】図１５は、Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳ超分岐ポリマーを含む製剤での、インタクトなラビット角膜を介した透過についての、ドルゾラミド及びチモロールの平均分配係数を示す。
【図１６】図１６は、１０ｍＭリン酸緩衝液中の様々なｐＨ値でのブリンゾラミドの水溶解度を示す。
【図１７】図１７は、水溶液中に０．５％チモロールが存在しない及び存在する状況で、ｐＨ７において添加物を追加した場合のブリンゾラミドの最大水溶解度を示す。
【図１８】図１８は、Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｈ２０超分岐ポリマーを含む製剤での、ラビット角膜を介したドルゾラミドの平均透過特性（ｎ＝２）を示す。
【図１９】図１９は、Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｈ２０超分岐ポリマーを含む製剤での、ラビット角膜を介したチモロールの平均透過特性（ｎ＝２）を示す。
【図２０】図２０は、Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｈ２０超分岐ポリマーを含む製剤での、ドルゾラミド及びチモロールの２時間後の総角膜透過率の平均パーセンテージを示す。
【図２１】図２１は、Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｈ２０超分岐ポリマーを含む製剤での、ドルゾラミド及びチモロールの平均角膜透過係数を示す。
【図２２】図２２は、Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｈ２０超分岐ポリマーを含む製剤での、インタクトなラビット角膜を介した透過についての、ドルゾラミド及びチモロールの平均拡散係数を示す。
【図２３】図２３は、Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｈ２０超分岐ポリマーを含む製剤での、インタクトなラビット角膜を介した透過についての、ドルゾラミド及びチモロールの平均分配係数を示す。
【図２４】図２４は、ｐＨ７．４の乳濁液中で０．５％（ｗ／ｖ）チモロール存在下において、Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｗ３０００（両親媒性ＨＰ）を添加した場合のブリンゾラミドの最大水溶解度を示す。
【図２５】図２５は、Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｗ３０００超分岐ポリマーを含む製剤での、インタクトなラビット角膜を介したドルゾラミドの平均透過特性（ｎ＝２）を示す。
【図２６】図２６は、Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｗ３０００超分岐ポリマーを含む製剤での、インタクトなラビット角膜を介したチモロールの平均透過特性（ｎ＝２）を示す。
【図２７】図２７は、Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｗ３０００超分岐ポリマーを含む製剤での、ドルゾラミド及びチモロールの３時間後の総角膜透過率の平均パーセンテージを示す。
【図２８】図２８は、Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｗ３０００超分岐ポリマーを含む製剤での、ドルゾラミド及びチモロールの平均角膜透過係数を示す。
【図２９】図２９は、Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｗ３０００超分岐ポリマーを含む製剤での、インタクトなラビット角膜を介した透過についての、ドルゾラミド及びチモロールの平均拡散係数を示す。
【図３０】図３０は、Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｗ３０００超分岐ポリマーを含む製剤での、インタクトなラビット角膜を介した透過についての、ドルゾラミド及びチモロールの平均分配係数を示す。
【図３１】図３１は、０．５％（ｗ／ｖ）チモロール存在下、ｐＨ７．４において、第２世代（２ｎｄ）Ｂｉｓ−ＭＰＡ超分岐ポリエステル又は第３世代（３ｒｄ）Ｂｉｓ−ＭＰＡ超分岐ポリエステルを添加した場合の、ブリンゾラミドの最大水溶解度を示す。
【図３２】図３２は、様々な濃度の超分岐ポリエステル（ヒドロキシル基第２世代及び第３世代）、及びＡＺＯＰＴ（登録商標）の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト角膜上皮細胞の生存率を示す。
【図３３】図３３は、様々な濃度のＢｉｓ−ＭＰＡ超分岐ポリエステルの細胞毒性を示す。
【図３４】図３４は、０．５％（ｗ／ｖ）チモロール存在下、ｐＨ７．４において、Ｂｉｓ−ＭＰＡ超分岐ポリエステル及び非イオン性界面活性剤を加えた場合の、ドルゾラミドの溶解度及び安定性を示す。
【図３５】図３５は、０．５％（ｗ／ｖ）チモロール存在下ｐＨ７．４において、様々な添加物を加えた場合の、ドルゾラミドの最大水溶解度を示す。
【図３６】図３６は、Ｂｉｓ  ＭＰＡ超分岐ポリエステル（第２世代）を含む製剤での、ドルゾラミドのインタクトな角膜透過特性を示す。
【図３７】図３７は、Ｂｉｓ  ＭＰＡ超分岐ポリエステル（第２世代）を含む製剤での、チモロールのインタクトな角膜透過特性を示す。
【図３８】図３８は、Ｂｉｓ  ＭＰＡ超分岐ポリエステル（第２世代）を含む製剤での、ドルゾラミド及びチモロールの３時間後の総角膜透過率の平均パーセンテージを示す。
【図３９】図３９は、Ｂｉｓ  ＭＰＡ超分岐ポリエステル（第２世代）を含む製剤での、ドルゾラミド及びチモロールの透過係数を示す。
【図４０】図４０は、Ｂｉｓ  ＭＰＡ超分岐ポリエステル（第２世代）を含む製剤での、ドルゾラミド及びチモロールの分配係数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の組成物は、眼の状態を治療するための、局所投与可能な治療用組成物である。当該眼の状態としては、緑内障、及び、例えば、白内障、結膜炎、感染症、炎症又は網膜症等の眼疾患が挙げられる。
【００１７】
本発明の詳細な説明は以下のとおりである。
【００１８】
本発明は超分岐ポリマーを含む眼科用組成物を包含する。
【００１９】
本発明に係る超分岐ポリマーは、例えば、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン又はポリエステルコアを有する超分岐ポリマーなどの、医薬上許容されるいかなる超分岐ポリマーでもあり得る。本発明の眼科用組成物における超分岐ポリマーの分子量は、１，０００〜７５０，０００ダルトンの範囲内であり、好ましくは、１，０００〜１２，０００ダルトンの範囲内である。分子量は、動的光散乱によって測定された平均分子量である。本発明の眼科用組成物における超分岐ポリマーの濃度は、０．００１％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲内であり、好ましくは０．００１％〜５％（ｗ／ｖ）の範囲内、より好ましくは０．００１％〜４％（ｗ／ｖ）の範囲内、より好ましくは０．０１％〜４％（ｗ／ｖ）の範囲内、より好ましくは０．０１％〜３％（ｗ／ｖ）の範囲内である。
【００２０】
上述の眼科用組成物は、炭酸脱水素酵素阻害剤も含み得る。炭酸脱水素酵素阻害剤は、炭酸脱水素酵素の活性を抑制する医薬品類で、抗緑内障剤として有用であることが既知である。本発明の眼科用組成物中に存在し得る炭酸脱水素酵素阻害剤の例としては、ドルゾラミド、ブリンゾラミド又はアセタゾラミドが挙げられる。
【００２１】
上述の眼科用組成物は、非イオン性界面活性剤も含み得る。非イオン性界面活性剤は、例えば、ポリソルベート８０、ＰＥＧ８０００、ＨＰＭＣ又はＨＥＣ等の、医薬上許容される添加物として知られる、いかなる非イオン性界面活性剤でもあり得る。
【００２２】
本発明の眼科用組成物は、眼への局所使用のために従来採用されるｐＨの範囲へ調節された後、有利に使用される。通常ｐＨ３〜８へ、好ましくはｐＨ５〜８へ調節された後、使用される。ｐＨ調節のために、塩酸、酢酸、水酸化ナトリウム等を用いることができる。
【００２３】
本発明の眼科用組成物は、ベータブロッカーも含み得る。ベータブロッカーは、眼内の圧力（眼圧）を減少させることが既知であり、緑内障患者の視神経への傷害及び失明のリスクを軽減させるのに使用される。本発明の眼科用組成物におけるベータブロッカーは、カルテオロール、レボブノロール、ベタキソロール、メチプラノロール、チモロール及びプロプラノロール等の、眼科用組成物内で使用可能であることが既知である、いかなるベータブロッカーでもあり得る。
【００２４】
本発明の第１の特定の実施形態は、超分岐ポリマー、チモロール、ドルゾラミド、ＰＥＧ８０００及びポリソルベート８０を含む眼科用組成物である。
【００２５】
当該組成物は、好ましくは、約０．００１％〜１０％（ｗ／ｖ）の超分岐ポリマー、最も好ましくは約１〜５％（ｗ／ｖ）、及び０．０５〜１％（ｗ／ｖ）のチモロール、最も好ましくは約０．５％（ｗ／ｖ）、及び約０．０５〜５％（ｗ／ｖ）のドルゾラミド、最も好ましくは約０．５〜２％（ｗ／ｖ）、及び約０．０５〜５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００、最も好ましくは約０．５〜４％（ｗ／ｖ）、及び約０．０５〜５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、最も好ましくは約０．５〜４％（ｗ／ｖ）、を含み、それぞれの患眼に対し１日１回又は２回投与し得る。
【００２６】
本発明の第２の特定の実施形態は、超分岐ポリマー、チモロール、ブリンゾラミド、ＰＥＧ８０００及びポリソルベート８０を含む眼科用組成物である。
【００２７】
当該組成物は、好ましくは、約０．００１％〜１０％（ｗ／ｖ）の超分岐ポリマー、最も好ましくは約１〜５％（ｗ／ｖ）、及び０．０５〜１％（ｗ／ｖ）のチモロール、最も好ましくは約０．５％（ｗ／ｖ）、及び約０．０５〜５％（ｗ／ｖ）のブリンゾラミド、最も好ましくは約０．５〜２％（ｗ／ｖ）、及び約０．０５〜５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００、最も好ましくは約０．５〜４％（ｗ／ｖ）、及び約０．０５〜５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、最も好ましくは約０．５〜４％（ｗ／ｖ）、を含み、それぞれの患眼に対し１日１回又は２回投与し得る。
【００２８】
本発明の第３の特定の実施形態は、超分岐ポリエステル、チモロール、ドルゾラミド、ＰＥＧ８０００及びポリソルベート８０を含む眼科用組成物である。
【００２９】
当該組成物は、好ましくは、約０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）の超分岐ポリエステル、最も好ましくは約１〜５％（ｗ／ｖ）、及び０．０５〜１％（ｗ／ｖ）のチモロール、最も好ましくは約０．５％（ｗ／ｖ）、及び約０．０５〜５％（ｗ／ｖ）のドルゾラミド、最も好ましくは約０．５〜２％（ｗ／ｖ）、及び約０．０５〜５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００、最も好ましくは約０．５〜４％（ｗ／ｖ）、及び約０．０５〜５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、最も好ましくは約０．５〜４％（ｗ／ｖ）、を含み、それぞれの患眼に対し１日１回又は２回投与し得る。
【００３０】
本発明の第４の特定の実施形態は、超分岐ポリエステル、チモロール、ブリンゾラミド、ＰＥＧ８０００及びＰＥＧ８０００を含む眼科用組成物である。
【００３１】
当該組成物は、好ましくは、約０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）の超分岐ポリエステル、最も好ましくは約１〜５％（ｗ／ｖ）、及び０．０５〜１％（ｗ／ｖ）のチモロール、最も好ましくは約０．５％（ｗ／ｖ）、及び約０．０５〜５％（ｗ／ｖ）のブリンゾラミド、最も好ましくは約０．５〜２％（ｗ／ｖ）、及び約０．０５〜５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００、最も好ましくは約０．５〜４％（ｗ／ｖ）、及び約０．０５〜５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、最も好ましくは約０．５〜４％（ｗ／ｖ）、を含み、それぞれの患眼に対し１日１回又は２回投与し得る。
【００３２】
本発明に係る眼科用組成物は、自体公知の薬理学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含むことができ、眼科用組成物調製の自体公知の方法によって処方し得る。本発明の眼科用組成物は、点眼、乳濁液、及び眼軟膏などの、眼科用製剤として従来使用されるいかなる医薬品剤形によっても提供され得る。
【００３３】
点眼剤は、例えば、透明な溶液、眼科用懸濁液、眼科用乳濁液である点眼液のような水溶性製剤であり得、同様に、非水溶性点眼液及び非水溶性眼科用懸濁液のような非水溶性製剤でもあり得る。
【００３４】
上記点眼液製剤は、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、アミノ酸、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等）、等張剤（例えば、ソルビトール、グルコース及びマンニトールなどの糖類、グリセリン、濃グリセリン、ＰＥＧ及びプロピレングリコールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムなどの塩）、保存剤又は防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、メチルｐ−オキシベンゾエート又はエチルｐ−オキシベンゾエートなどのＰ−オキシベンゾエート、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、ソルビン酸又はその塩、チメロサール、クロロブタノール等）、可溶化補助剤又は安定化剤（例えば、シクロデキストリン及びその派生物、ポリビニルピロリドンなどの水溶性ポリマー、チロキサポールなどの界面活性剤、ｐＨ修飾剤（例えば、塩酸、酢酸、リン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム等）、増粘剤（例えば、ＨＥＣ、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ＨＰＭＣ、カルボキシメチルセルロース及びそれらの塩）、キレート剤（例えば、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、濃リン酸ナトリウム）等の、通常組み入れられる様々な添加物を含み得る。
【００３５】
水溶性懸濁液形態の点眼剤は、上記添加剤に加え、懸濁剤（例えば、ポリビニルピロリドン、グリセリンモノステアレート）及び分散剤（例えば、チロキサポールなどの界面活性剤、アルギン酸ナトリウムなどのイオン性ポリマー）も含むことができ、これらは、点眼剤がより均一な微粒子であって、十分に拡散する水溶性懸濁液であることを保証する。
【００３６】
水溶性懸濁液形態の点眼剤は、好ましくは、緩衝剤としてクエン酸ナトリウム又は酢酸ナトリウム、等張剤として濃グリセリン及び／又はプロピレングリコール、並びに懸濁剤としてポリビニルピロリドンを含む。好ましい分散剤は、界面活性剤及び／又はアルギン酸ナトリウムである。該界面活性剤は、好ましくは、チロキサポールである。
【００３７】
本発明の眼科用組成物は、緑内障等の眼疾患に罹患している又は罹患の可能性のある哺乳動物（例えば、ヒト、ラビット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、サル）へ投与し得る。
【００３８】
投与経路及び用量は対象者の症状、年齢及び体重に依存して変わり得るが、成人に対して、好ましくは、１〜複数滴の一用量で１日１〜８回投与された場合、水溶性点眼剤に含まれる本発明の眼科用組成物中の活性剤の濃度は、約０．００１〜５（ｗ／ｖ）％、好ましくは約０．０１〜３（ｗ／ｖ）％である。使用の意図と反する悪影響が無いのであれば、本発明の眼科用組成物は、例えば、ステロイド性抗炎症剤（デキサメタゾン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、フルオロメトロン、フルオシノロン等）、非ステロイド性抗炎症剤（ジクロフェナクナトリウム、プラノプロフェン、ブロムフェナク、ケトロラクトロメタミン、ネパフェナク、フルルビプロフェンナトリウム等）、抗アレルギー剤（トラニラスト、フマル酸ケトチフェン、塩酸オロパタジン、クロモグリク酸ナトリウム、ペミロラストカリウム、ネドクロミルナトリウム等）、抗ヒスタミン剤（塩酸エピナスチン、塩酸アゼラスチン、Ａｚａｌａｓｔｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｒｉｌｉｄｅｍ、塩酸ジフェンヒドラミン等）、緑内障治療剤（塩酸ピロカルピン、サリチル酸フィゾスチグミン、チモロール、イソプロピルウノプロストン、ラタノプロスト、塩酸ベタキソロール、アプラクロニジン、酒石酸ブリモニジン、Ｃａｒｂａｃｏｌ、ジピベフリン、ビマトプロスト、トラボプロスト、酒石酸ブリモニジン等）、抗生物質（アジスロマイシン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸フラジオマイシン、トブラマイシン、スルベニシリン、セフメノキシム、エリスロマイシン、コリスチン、オキシテトラサイクリン、ポリミキシンＢ、クロラムフェニコール、ミクロノマイシン、ジベカシン、シソマイシン等）、抗菌剤（スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、オフロキサシン、ノルフロキサシン、塩酸ロメフロキサシン、塩酸モキシフロキサシン、エノキサシン、塩酸シプロフロキサシン、シノキサシン、スパルフロキサシン、トシル酸トスフロキサシン、ナリジクス酸、ピペミド酸三水和物、ピペミド酸、フレロキサシン、レボフロキサシン、ガチフロキサシン等）、及び抗ウイルス剤（イドクスウリジン、アシクロビル等）、並びに抗真菌剤（ピマリシン、フルコナゾール、ミコナゾール、アムホテリシンＢ、フルシトシン、イトラコナゾール等）、抗ＶＥＧＦ抗体（ペガプタニブ等）など、他の適切な薬理学的有効物質を含み得る、又はこれらの物質と併用し得る。
【００３９】
本発明の眼科用組成物は、等張剤、緩衝剤、保存剤、懸濁剤、増粘剤、安定化剤、ｐＨ調節剤等の、医薬上許容される添加物を適切に含む溶液中で、活性剤、超分岐ポリマー、及び任意で非イオン性界面活性剤を、溶解又は分散することで産生し得る。
【００４０】
本発明者らは、先の出願、米国特許出願 12/774,419の内容全体を本明細書に参照として組み入れる。以下の実施例により、更に本発明の詳細を説明するが、これらの実施例は単なる実例であり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００４１】
実施例１
様々な濃度の超分岐ポリマー（ＨＰ）（Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）Ｇ２０、Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）Ｇ３５、Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳ）及びＰＥＧを含む水溶液におけるドルゾラミドのｐＨ溶解度特性
方法
ｐＨ５．５、ｐＨ６、ｐＨ６．５、ｐＨ７、ｐＨ７、ｐＨ８及びｐＨ８．５の０．１％（ｗ／ｖ）リン酸緩衝溶液で、塩酸ドルゾラミド懸濁液を調製した。異なるＨＰと分子量８０００のＰＥＧを様々な濃度で含む水溶液中においても、同様の懸濁液を調製した。ポリソルベート８０とＰＥＧ８０００との組み合わせも試みた。ｐＨはｍｉｃｒｏ−ｐＨ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、正確に測定した。１Ｍ  ＮａＯＨ又は１Ｍ  ＨＣｌのいずれかを使用し、所望のｐＨに調節した。前記懸濁液を初めに、１０分間室温で攪拌した（６０℃までの５分間の加熱とともに）。懸濁液を更に３０分間室温に置いて平衡化した後、１０分間の超音波処理を行い、最終的に０．４５μｍのシリンジフィルターで濾過した。ＵＰＬＣを使用して、ドルゾラミド濃度について、該濾液を解析した。ドルゾラミドの検出は以下を使用して行った：水中での勾配１％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン（ＴＥＡ）：室温、流速０．７ｍＬ／ｍｉｎ、波長２５４ｎｍ及び注入体積１０μＬ、ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ、２．１ｘ５０ｍｍカラムでアセトニトリル法を行った。ドルゾラミドの濃度を見出すために、キャリブレーション曲線を作成した。使用したポリマーの特性は表１に記載した。
【００４２】
【表１】
2013528589.tif 000003
【００４３】
結果及び考察
図１は、ｐＨが５．６５から上昇するにつれ、ドルゾラミドの水溶解度が減少し、ｐＨ７で最低になることを明らかにしている。ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）はｐＨ５．６５で製剤化されているため、ｐＨ５．６５の０．１％（ｗ／ｖ）リン酸緩衝液中で、異なるＨＰが様々な濃度で存在する際の、ドルゾラミドの溶解度を定量した。結果を図２に示す。ｐＨ５．６５で、ドルゾラミドの溶解度は、ＨＰの濃度が０．１％から１％（ｗ／ｖ）へ上昇するに従って増加した。同様に、ｐＨ７において、図３の棒グラフに示されるように、ドルゾラミドの溶解度は、ＨＰの濃度が０．１％（ｗ／ｖ）から４％（ｗ／ｖ）へ上昇するのに伴って直線的に増加した。
【００４４】
図４で示されるように、ｐＨ７で、様々な濃度のＰＥＧ８０００、並びに、０．５％及び０．１％（ｗ／ｖ）のＨＰ（Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳ）の組み合わせを適用した。図４から明らかなように、約２０％  ＰＥＧ８０００及び０．５％  Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳ、又は、１７％  ＰＥＧ８０００及び１％  Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳを使用することで、ｐＨ７のリン酸緩衝液中で、２％（ｗ／ｖ）のドルゾラミド溶解度（ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）と同様）を達成し得る。
【００４５】
結論
本発明者らは、ドルゾラミドの水溶解度が、ＨＰ及びＰＥＧの濃度の上昇に伴って増加することを見出した。ＰＥＧの場合、ＰＥＧの分子量の増加に伴い、直線的に溶解度も上昇した。更に、ＰＥＧ存在下で、ポリソルベート８０はドルゾラミド分子の拡散を助け、水中での沈殿を阻害する。
【００４６】
これらの結果から、ＨＰはドルゾラミドの溶解性を有意に亢進すると結論づけた。更に、親水性ポリエチレングリコールがドルゾラミド溶解性促進剤であることを見出した。上記結果は、生理学的なｐＨ付近のｐＨ値で、超分岐ポリマー及びＰＥＧをドルゾラミド溶解性促進添加物として使用することの有用性を明示している。
【００４７】
実施例２
ムチン−超分岐ポリマーの生体接着結合強度のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定のための単純な流動学的方法
ムチン−ポリマーの生体接着結合強度を定量するため、単純な粘度測定法を採用した。Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳと呼ばれる市販のＨＰの粘接着特性を決定するため、ｐＨ７で、市販品のＣＯＳＯＰＴ（登録商標）と比較しながら、ブタ胃ムチンを有する様々な濃度のＨＰの生体接着力を計算した。ブタ胃ムチンはモデルムチンとして使用したが、全てのムチンは一般的な、物理学的、構造的、及び流動学的特性を共有していると思われるため、ブタ胃ムチンは生体接着性物質の第一の評価には十分なモデルであるとされている。
【００４８】
方法
全ての測定にブルックフィールド粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  Ｌ  ＶＤＶＥ粘度計）を用いた。全ての粘度測定にコードナンバー１８の軸を使用した。マニュアルにあるように、ｒｐｍのせん断率（ｓ−１）への変換には、ファクター１．３２を使用した。ｐＨ７の０．１％（ｗ／ｖ）リン酸緩衝液中で、１５％（ｗ／ｖ）胃ムチン溶液を調製した。リン酸緩衝液中で０．５％（ｗ／ｖ）及び１％（ｗ／ｖ）Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳの個別の粘度を測定した。リン酸緩衝液中の１５％ムチンの粘度も測定した。粘度は、２０℃で２．６〜８０ｓ−１の様々なせん断率Ｄにおいて測定した。（Hassan, E. et al., Pharm. Res., 5 (1990) 491）ｐＨ７の０．１％（ｗ／ｖ）リン酸緩衝液中で、様々な濃度のＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳ、ＰＥＧ、並びに、１５％（ｗ／ｖ）胃ムチン有り及び無しで、各１０ｍＬのサンプルを５サンプル調製した。
【００４９】
【表２】
2013528589.tif 000004
【００５０】
サンプル＃７はオリジナルのＣＯＳＯＰＴ（登録商標）市販品である。２０℃での粘度を様々なせん断率で測定した。上述のように、生体接着力は等式（１）及び（２）を使用して計算した。
【００５１】
生体接着力（Ｆ）は以下の等式（１）のように計算した：
【００５２】
【数１】
2013528589.tif 000005
【００５３】
σは１秒当りのせん断率であり、ηｂは以下の等式（２）による実験測定値に基づいている：
【００５４】
【数２】
2013528589.tif 000006
【００５５】
ηｔは系の粘度係数であり、ηｍ及びηｐはそれぞれムチン及び生体接着性ポリマー（例えば、ＨＰやＰＥＧ８０００）の個別の粘度係数である。
【００５６】
等式（１）及び（２）が有効であるには、ηｔ、ηｍ及びηｐは、同一の濃度、温度、時間、及びせん断率で測定されるほうがよい。生体接着性現象は、前角膜領域において代替する涙液の接触時間に主要な役割を果たす。
【００５７】
結果及び考察
図５に示されるように、リン酸緩衝液中で低濃度のＨＰは、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）（サンプル＃７）及びムチン（サンプル＃１）に比べて、相対的に低い粘度を有している。ＨＰ（０．５％、サンプル＃２、及び、１％、サンプル＃４）の粘度は、高せん断率において比較的水に近く、高せん断率において、０．５％（ｗ／ｖ）ＨＰ及び１％（ｗ／ｖ）の粘度間の相違は無視できる。ＨＰの製剤への添加は、最終的な製剤の流動学的特性を変えないであろうから、上記結果は、局所的点眼液に非常に適合し得る、流動学的特性を有する添加物として、ＨＰを使用することの有用性を明確に示唆している。
【００５８】
生体接着力は、せん断率８０ｓ−ｌの図５から得られるデータに基づいて定量した。ポリマーは一般的に高せん断率（１００ｓ−１付近）で生体接着特性を示すため、高いせん断率を選択した。
【００５９】
図６で示されるように、低濃度（０．５％（ｗ／ｖ）及び１％（ｗ／ｖ））ＨＰ−ムチン系の生体接着結合強度は、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）−ムチン系のそれのほぼ２倍を上回る。２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧの添加により１％（ｗ／ｖ）ＨＰ−ムチン系の生体接着力が変化しなかったことは、２％ＰＥＧが、ｐＨ７で、ＨＰによって起きる生体接着力へ影響しないであろう、ということを示唆している。概して、図６に示される結果は、低濃度ＨＰの生体接着強度は、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）製剤中に存在するポリマーに比べ、相対的に有意であることを示している。生体接着現象は、薬剤の眼でのバイオアベイラビリティを増加するのに大きく寄与し得る。
【００６０】
結論
結論として、生体接着性の粘度判定法によって得られたデータは、超分岐ポリマーが、目のムチンと強く相互作用する可能性のある、生体接着性添加物質であることを示唆している。ムチンとＨＰ間の当該生体接着力は、最終的に薬剤の眼でのバイオアベイラビリティの亢進をもたらす可能性がある。
【００６１】
実施例３
ｐＨ５．６５及びｐＨ７での、ＨＰ（Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳ）並びに、ポリソルベート８０、又は、ＰＥＧ及びポリソルベート８０の組み合わせを含む新規製剤での、チモロール存在下におけるドルゾラミドの水溶解度
方法
ｐＨ５．６５のクエン酸緩衝液中で、塩酸ドルゾラミド及び０．５％（ｗ／ｖ）チモロールの懸濁液を調製した（コントロールサンプル）。同様の懸濁液も、ｐＨ３のクエン酸緩衝液中で、２％（ｗ／ｖ）ＨＰを含む水溶液として調製した。最終的なｐＨは、ＨＰ添加後に１Ｍ  ＮａＯＨを用いて５．６５に調節した（サンプル１）。表３にあるように、ｐＨ５．６５で様々な分子量のＰＥＧ及びポリソルベート８０の組み合わせも試みた。表３は、１０ｍＭクエン酸緩衝液で調製された、全ての異なる試験サンプル懸濁液を示している。
【００６２】
【表３】
2013528589.tif 000007
【００６３】
同様に、クエン酸緩衝液ではなく、ｐＨ７のリン酸緩衝液でのドルゾラミドの溶解度を試験する製剤として、１０ｍＭリン酸緩衝液中で再度製剤を調製した（表３）。最初に懸濁液を１０分間室温で攪拌した（６０℃までの５分間の加熱とともに）。前記懸濁液を更に３０分間室温で平衡化した後、１０分間の超音波処理を行い、最終的に０．４５μｍのシリンジフィルターで濾過した。実施例１と同じ条件で、ＵＰＬＣを使用して、ドルゾラミド及びチモロールの濃度について、濾液を解析した。
【００６４】
結果及び考察
本実験において、本発明者らは、ＨＰ、ＰＥＧ、及びポリソルベート８０を溶解度促進添加物として使用した。ｐＨ５．６５及びｐＨ７で、様々な組み合わせを試みた。図７に示されるように、ｐＨ５．６５及びｐＨ７でチモロール存在下において、ドルゾラミドの溶解度は、添加物無しのコントロールサンプルに比べ、添加物を加えた場合の方が増加することが示された。ｐＨ５．６５で、全ての場合において、ドルゾラミドの溶解度は２％を超えており、ＨＰ又はＰＥＧ及びポリソルベート８０の組み合わせの添加により、チモロール存在下で、ドルゾラミドの溶解度は増加した。
【００６５】
市販のＣＯＳＯＰＴ（登録商標）製品は、ｐＨ５．６５で２％（ｗ／ｖ）ドルゾラミドを有するが、ＨＰ又はＰＥＧの添加によるｐＨ５．６５での２％（ｗ／ｖ）を越えるドルゾラミド溶解度の亢進は、用量を増やすことによる、薬剤の有効性亢進について有用に寄与しないであろう。故に、１０ｍＭリン酸緩衝液中で難溶解性（０．５％  ｗ／ｖ溶解度未満）のドルゾラミドの、ｐＨ７での溶解度のデータはより重要である。上記製剤サンプル内のチモロールの溶解度（それぞれ正確に０．５％  ｗ／ｖチモロールを含む）は、ｐＨ５．６５及びｐＨ７で添加物を加えても変化しないことも判明した。ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）はｐＨ５．６５で調合されているため、製剤サンプルへのｐＨ５．６５での様々な濃度の異なるＨＰの添加により、チモロール存在下でのドルゾラミド溶解度を定量した。結果を図７に示す。棒グラフで示されるように、ｐＨ５．６５及びｐＨ７で、ＨＰの濃度を０．５％から２％（ｗ／ｖ）へ上昇させるに伴い、ドルゾラミド溶解度は直線的に増加する。しかしながら、ドルゾラミドの溶解度の亢進に対するＨＰの影響は、ｐＨ７よりもｐＨ５．６５での方がより明白である。図８で示されるように、ＨＰへのポリソルベート８０の添加はドルゾラミドの溶解度を増加する。
【００６６】
チモロール存在下でのドルゾラミドの水溶解度の改善は、ｐＨ５．６５で、ＨＰ、又は、ＰＥＧ及びポリソルベート８０を組み合わせて添加した場合に有意であった。この場合、ポリソルベート８０はドルゾラミド分子の拡散を助け、ＰＥＧ存在下で水中での沈殿を阻害した。ｐＨ７でチモロール存在下での、ＨＰとポリソルベート８０との組み合わせは、ドルゾラミド溶解度を亢進するのに最良の組み合わせであった。上記結果から、ｐＨ７でチモロール存在下において、ＨＰ及びポリソルベート８０は、ドルゾラミドの溶解度を有意に増加すると結論づけることができる。親水性ＰＥＧもドルゾラミド溶解度促進剤であることが判明した。更に、低濃度のポリソルベート８０とＰＥＧ８０００との組み合わせも、ドルゾラミドの溶解度を亢進する、非常に有用な添加物であることが証明された。概して、最適化濃度のＨＰ及びポリソルベートを有するｐＨ７の製剤が、眼でのバイオアベイラビリティを高めるのに非常に有用であろう。
【００６７】
結論
上記結果は、およそ１％（ｗ／ｖ）のドルゾラミドを角膜へ透過させるのに、より寄与するであろう生理学的なｐＨ付近のｐＨ値で、ドルゾラミド溶解度を促進する添加物として、ＨＰ及びポリソルベート８０を使用することの有用性を明示している。ポリソルベート８０も、ｐＨ７でＨＰ存在下難溶解性であるドルゾラミドの沈殿を抑制する、効果的な乳化剤であることが証明された。
【００６８】
実施例４
ＨＰ（Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳ）及びポリソルベート８０を含む新規局所的製剤のための、ドルゾラミド及びチモロールのｉｎ  ｖｉｔｒｏ角膜透過研究
【００６９】
ｐＨ５．６５のオリジナルの市販されている局所的製剤（有効成分のみ）と比べ、０．５％（ｗ／ｖ）ＨＰの添加、又は、０．５％（ｗ／ｖ）ＨＰ及び１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の添加の効果を検討するために、ドルゾラミド及びチモロール（ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）の有効成分）の角膜透過についてｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験を実施した。
【００７０】
材料及び方法
実験方法
１．製剤調製：ドルゾラミド及びチモロールのｉｎ  ｖｉｔｒｏ角膜透過性を検討する、及び角膜加水分解効果を決定するために、１０ｍＭクエン酸緩衝液中で、以下の３溶液を調合した。
【００７１】
【表４】
2013528589.tif 000008
【００７２】
上記サンプルは０．４５μｍシリンジフィルターで濾過した。双方のサンプルの初期濃度は、ＵＰＬＣ解析により決定した。実験結果から以下の推定を行った：
ａ）ＨＰ独占的に（HP exclusively）（試験１と試験２のデータの比較から）。
ｂ）角膜透過性へのポリソルベート８０（試験２及び試験３の比較）有意性。
ｃ）ＨＰ＋ポリソルベート８０組み合わせの有意性（試験１、試験２、試験３のデータの比較から）。
【００７３】
２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏラビット角膜透過実験
【００７４】
【表５】
2013528589.tif 000009
【００７５】
３〜４ポンド重量の３匹の雄ラビット（ニュージーランド）は、１１〜１２週齢であった。二酸化炭素ガスの過剰投与により屠殺した後、直ちに眼球を取り出し、生理食塩水で洗浄し、透過実験に使用する角膜を分離した。過剰な染色を除くために、新たに調製したレセプター溶液（表４）でそれぞれの角膜を洗浄した。６つのインタクトで新鮮な角膜を、ガラス製の隣接拡散セルのドナー区画とレセプター区画間の固定部に、上皮表面がドナー区画に面するように固定した。図９は本実験で使用した単純拡散セルの模式図を示している。
【００７６】
透過に使用できる角膜の面積は０．２１１ｃｍ２であった。レセプター区画は、表４に記載されている組成に従って、ｐＨ７．２で新たに調製したレセプター溶液で満たした。一定分量（５ｍＬ）のサンプル＃１を２つのインタクトな角膜上に置き、ドナーセルの開口部をカバーガラスで密封した。サンプル＃１を置いてから１０分後に、一定分量（５ｍＬ）のサンプル＃２を次の２つのインタクトな角膜上へ置いた。更に１０分後、一定分量（５ｍＬ）のサンプル＃３を残りの２つのインタクトな角膜へ置いた。レセプター溶液（それぞれのレセプターセルに５ｍＬ）は、６つ全ての場合において、ウォータージャケットを介して、攪拌しながら３４℃に一定に保たれた。既定の時間間隔（１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、及び１８０分）で、レセプター溶液から２００μＬのサンプルを回収した。その後、レセプターセルに等量のリン酸緩衝液を加えた。薬剤濃度はＵＰＬＣで解析した。
【００７７】
３．解析
ドルゾラミド及びマレイン酸チモロール検出条件は以下であった、水中での勾配１％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン（ＴＥＡ）：室温、流速０．７ｍＬ／ｍｉｎ、波長２５４ｎｍ及び２９８ｎｍ並びに注入体積１μＬ、ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ、２．１ｘ５０ｍｍカラムでアセトニトリル法を行った。
【００７８】
４．角膜透過パラメーターの計算
実験終了時に、それぞれの角膜（接着性強膜なし）を脱イオン水に浸した後、重さを量った。湿った角膜を一晩オーブンで乾燥させ、再び重量を量った。重さの違いから角膜の水和作用を計算した。薬剤透過の最終結果は累積透過量（Ｑ）と表した。パラメーターは以下のように計算した：
【００７９】
【数３】
2013528589.tif 000010
【００８０】
結果及び考察
ＵＰＬＣで決定したドルゾラミド及びチモロールの初期濃度を表５に示す。
【００８１】
【表６】
2013528589.tif 000011
【００８２】
角膜水和作用は、角膜の正味湿重量及び乾燥重量に基づいて測定した。通常、正常哺乳動物の角膜水和作用％（ｗ／ｗ）は、７５〜８０％の範囲にある。概して、全ての試験サンプルの水和作用％で有意な変化は無く、それらは全ての場合で望ましい範囲内にあった。故に、ＨＰ又はポリソルベート８０は、角膜の水和作用に影響を与えなかった。
【００８３】
【表７】
2013528589.tif 000012
【００８４】
図１０及び１１は、それぞれドルゾラミド及びチモロールの角膜透過特性を明らかにしている。ドルゾラミド及びチモロールの時間依存的な透過性は、単離したラビット角膜を通して３４℃で注意深く調べた。ドルゾラミドの角膜を介した総累積透過量、及び３時間後の総透過量は、添加物無しのコントロールサンプルと比べ、０．５％（ｗ／ｖ）ＨＰを含む試験製剤で相対的に高かった。更に、ＨＰと共にポリソルベート８０を添加した場合は、ＨＰのみを含む製剤よりも、より多量のドルゾラミドを透過し、角膜透過性を亢進した。概して、０．５％（ｗ／ｖ）ＨＰ及び１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の添加により、ドルゾラミド及びチモロールの角膜透過率は、約２５〜３０％亢進した。同様の傾向はチモロールについても見られた（図１１）。したがって、ＨＰとポリソルベート８０の組み合わせは、有効成分の角膜透過性を改善した。
【００８５】
図１２は、ドルゾラミド及びチモロールの総透過パーセンテージを示している。明らかに、ＨＰ及びポリソルベート８０の存在により、角膜を介し透過した有効成分（ドルゾラミド及びチモロール）のパーセンテージが増加した。ドルゾラミド及びチモロールの場合では、全ての試験製剤は同様の初期濃度を有していた（１０％未満の変化）ことは注目すべきであり、同様のｐＨ条件下で、各添加物の影響を決定することは容易であった。試験２と試験１とを比較することで、ＨＰを添加物として使用することの有意性が明確に証明される。
【００８６】
図１３は、ドルゾラミド及びチモロールの角膜透過係数を示す。透過係数は、ドナー溶液中の薬剤の初期濃度に反比例した。ドルゾラミドの場合、試験２及び試験３の透過係数はより高く、ＨＰを含まないｐＨ５．６５のコントロール製剤（試験１）と比べ、０．５％ＨＰ存在下でドルゾラミドの角膜透過率が亢進したことを示唆している。試験３は試験２よりも相対的に高い角膜透過性を有し、ポリソルベート８０の影響を示している。ポリソルベート８０は粘度促進剤として作用する可能性があるため、角膜透過についてのドルゾラミド及びチモロールのバイオアベイラビリティを増加させている。概して、図１３のデータは、ｐＨ５．６５でＨＰ無しのコントロール試験１（ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）の有効成分製剤と類似）と比べて、試験２及び３（それぞれＨＰ及びＨＰ＆ポリソルベート８０を含む）製剤では、チモロール及びドルゾラミドの透過係数が、より高いことを明示している。
【００８７】
ドルゾラミド及びチモロールの拡散係数（遅延時間に反比例する）は、ＨＰ及びポリソルベート８０の添加により有意に変化しなかった（図１４を参照）。故に、ＨＰ及びポリソルベート８０は角膜表面に影響しない。仮に、拡散係数が有意に増加又は減少したならば、それは角膜表面の性質の変化を示している。拡散係数は薬剤化合物の固有の性質であるため、添加物によって変化しないはずである。
【００８８】
ＨＰはチモロール及びドルゾラミドの被包を促進することで、チモロールの角膜上皮への分配を亢進する。この理論は図１５のデータによっても支持される。試験３のチモロール及びドルゾラミドの角膜表面への分配係数は試験１よりも高く、このことは、０．５％（ｗ／ｖ）の高機能性ＨＰ存在下で、チモロール及びドルゾラミドの親油性角膜への分配の改善を示している。従って、ＨＰ存在下での改善した透過性は、主に上皮への改善した分割（portioning）に起因している。分配は製剤溶液中のＨＰ濃度を上げることで、更に亢進する可能性がある。ＨＰは主に以下の理由ａ）高機能ポリエチレンイミンの枝分かれ構造内への分子被包、ｂ）薬剤分子とＨＰのイオン性機能性アミン基との間の静電気的相互作用、及び、ｃ）荷電ＨＰの粘液接着性挙動、により角膜透過性を亢進している。
【００８９】
０．５％（ｗ／ｖ）ＨＰ及び１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の添加により、ドルゾラミド及びチモロールの角膜透過率は約２５〜３０％近く亢進した。ＨＰが存在することで、ｐＨ５．６５でのドルゾラミド及びチモロールの角膜への分配が増加した。ＨＰ及びポリソルベート８０の添加により、角膜拡散率及び角膜水和率に有意な変化は認められないことは、これらの添加物が角膜表面へ有害な影響を有しないことを示唆している。ドルゾラミド及びチモロールの角膜透過係数が、ＨＰ存在下において相対的に高いことは、ＨＰの効果的な薬剤担体添加物としての有意性を示唆している。従って、本発明者らは、現在の市販品と比較して、増強された角膜透過性を有する新規製剤を見出した。角膜透過性はＨＰの濃度を上げることで更に亢進し得る。
【００９０】
結論
ｐＨ５．６５でＨＰなどの添加物存在下で、ドルゾラミド及びチモロールの累積透過量は、添加物無しのコントロール製剤（ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）有効成分製剤）と比べて相対的に高かった。０．５％（ｗ／ｖ）ＨＰ及び１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の製剤への添加により、ドルゾラミド及びチモロールの角膜透過率は、約２５〜３０％近く亢進した。ＨＰの存在下で、有効成分の角膜上皮への分配が増加する。従って、ＨＰとポリソルベート８０の組み合わせは、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）有効成分の眼でのバイオアベイラビリティを増加させるのに非常に有効である可能性がある。
【００９１】
実施例５
ｐＨ７のリン酸緩衝液で、ＨＰ（Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＳ）若しくはＨＰ及びポリソルベート８０の組み合わせ、又は、ＰＥＧ及びポリソルベート８０の組み合わせを含む水溶液中における、ブリンゾラミドの溶解度の亢進
ｐＨ７の１０ｍＭリン酸緩衝液中で、チモロール存在下における、ブリンゾラミドの水溶解度を検討した。
方法
【００９２】
【表８】
2013528589.tif 000013
【００９３】
リン酸緩衝液中に１％（ｗ／ｖ）ブリンゾラミドを含む懸濁液を、コントロールサンプルとして調製した。上記表７のように、ＨＰ、ＰＥＧ及びポリソルベート８０を様々な組み合わせで含有する水溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液）中において、過多のブリンゾラミド（＞１％（ｗ／ｖ））を含む同様の懸濁液も調製した。最終的なｐＨは１Ｍ  ＮａＯＨを用いて７に調節した。初めに懸濁液を１０分間室温で攪拌した（６０℃までの５分間の加熱とともに）。前記懸濁液を更に３０分間室温で平衡化した後、１０分間の超音波処理を行い、最終的に０．４５μｍのシリンジフィルターで濾過した。実施例１と同じ条件で、ＵＰＬＣを使用して、ブリンゾラミド濃度について、濾液を解析した。
【００９４】
結果及び考察
図１６は、様々なｐＨ値の１０ｍＭリン酸緩衝液におけるブリンゾラミドの溶解度を示している。ｐＨが４から７へ上昇するのに伴って、ブリンゾラミドの水溶解度は明らかに減少した。ブリンゾラミドの溶解度はｐＨ７で最低となったことは、ｐＨ７での完全な非イオン性の挙動と一致している。ブリンゾラミドのイオン化％は８．４から１０へのｐＨの上昇に伴って増加するため、溶解度も急に増加し、これは、当該ｐＨの範囲内でのブリンゾラミドのアニオン性の性質と一致する。前記溶解度の特性はドルゾラミドと非常に類似している。それ故、眼でのバイオアベイラビリティを亢進し、かつ、ブリンゾラミドの眼への刺激を減らすために、ｐＨ７．４付近（涙液のｐＨは７．４４）での亢進した溶解度を有する、親油性ブリンゾラミド薬の開発は重要である。
【００９５】
本研究において、本発明者らは、ＨＰ、ＰＥＧ、及びポリソルベート８０を溶解度促進添加物として使用し、ｐＨ７で様々な組み合わせを試みた。図１７では、ブリンゾラミドの溶解度が添加物を加えることで増加することを示している。
【００９６】
図１７に示されるように、双方の場合（チモロール有りと無し）において、ブリンゾラミドの溶解度は、ＨＰ濃度の上昇に伴って増加する。０．５％（ｗ／ｖ）ＨＰ及び１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を有し、チモロールが無い場合、ブリンゾラミドの溶解度は約１１ｍｇ／ｍＬである。ＰＥＧ８０００の添加は、ＰＥＧ４００以上に、ブリンゾラミドの溶解度を亢進するようである。しかしながら、コントロール溶液、及び０．５％（ｗ／ｖ）チモロールを含んでいる全ての添加物有りの製剤の溶解度は相対的に低かった。従って、チモロール（ｐＨ７の水中で、ブリンゾラミドよりも相対的により溶解性である）は、局所的製剤サンプル中に存在することで、ブリンゾラミドの水溶解度に影響を与える。これらの結果は、ドルゾラミドと称される他の炭酸脱水素酵素に関する結果（実施例１）と非常に類似している。ｐＨ７での高溶解性イオン性チモロールによる上記溶解度の減少は、チモロールの添加又は塩析効果による、溶液のイオン強度の変化に起因している可能性がある。市販品ＡＺＡＲＧＡ（登録商標）は、ｐＨ７．４で１０ｍｇ／ｍＬブリンゾラミド及び５ｍｇ／ｍＬチモロールを有する眼科用懸濁液であるが、ＨＰ又はＰＥＧの添加によるｐＨ７での溶解度の亢進は、１％を超える用量に増加させることによる薬剤の有効性亢進に有用に寄与するであろう。
【００９７】
ポリソルベート８０のＨＰへの添加は、沈殿を防ぐことによって、ブリンゾラミドの溶解度を増加させている。ポリソルベート８０は界面活性剤として作用する可能性があり、それにより、ＨＰ存在下における相分離後のブリンゾラミドの凝集を減らしている。０．５％（ｗ／ｖ）ＨＰ及び１％（ｗ／ｖ）ポリソルベートの組み合わせは、ｐＨ７の製剤で０．５％（ｗ／ｖ）チモロール存在下において非常に有効であろう。
【００９８】
チモロール存在下でのブリンゾラミド水溶解度の改善は、ｐＨ７において、ＨＰ又はＰＥＧとポリソルベート８０の組み合わせの添加により有意であった。ポリソルベート８０はブリンゾラミド分子の拡散を助け、ＰＥＧ存在下で水中での沈殿を阻害する。ＨＰとポリソルベート８０の組み合わせは、ｐＨ７でチモロール存在下において、ブリンゾラミドの溶解度を亢進する良い組み合わせであろう。上記結果より、ＨＰ及びポリソルベート８０は、ｐＨ７のチモロール存在下において、疎水性ブリンゾラミドの溶解度を有意に亢進すると結論づけることができる。親水性ＰＥＧもまた、ブリンゾラミド溶解度促進剤であること、更には、低濃度のポリソルベート８０及びＰＥＧ８０００の組み合わせも、疎水性ブリンゾラミドの溶解度の亢進のための非常に有用な添加物であることが証明された。概して、最適化濃度のＨＰ及びポリソルベート８０を有するｐＨ７の製剤が、眼でのバイオアベイラビリティを高めるのに非常に有用であろう。
【００９９】
結論
上記結果は、生理学的ｐＨに近いｐＨ値で、ＨＰ及びポリソルベート８０を疎水性ブリンゾラミドの溶解度促進添加物として使用することの有用性を明示している。ポリソルベート８０も、ｐＨ７のＨＰ存在下において、難溶解性のブリンゾラミドの沈殿を抑制する、効果的な乳化剤であることが証明された。チモロールは、溶液のイオン強度を変えることで、ブリンゾラミドの溶解度に影響を与え得る。
【０１００】
実施例６
末端ヒドロキシル基を有するＨＰを含む、ドルゾラミド及びチモロールのｉｎ  ｖｉｔｒｏ角膜透過研究
オリジナルの市販局所的製剤（有効成分のみ）と比較して、ヒドロキシル官能基を有する超分岐ポリエステルの添加の効果を検討するため、ドルゾラミド及びチモロール（ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）の有効成分）の角膜透過ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を実施した。
【０１０１】
Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｈ２０と称される市販のＨＰを含む新規製剤の一般的な定義は、ポリエステルコア及び１６の末端ヒドロキシル官能基を有するＨＰであり、ｐＨ７又はｐＨ７．４で調合した非イオン性（親油性）ドルゾラミドの溶解度を亢進する。
【０１０２】
【化２】
2013528589.tif 000014
【０１０３】
ヒドロキシル末端基を有する超分岐ポリエステルの一般的な構造
【０１０４】
本実験に使用したＨＰの特性を表８に記載する。当該ＨＰは、一分子あたり１６の第一ヒドロキシル基を有し、固形分は１００％（ｗ／ｖ）である。
【０１０５】
【表９】
2013528589.tif 000015
【０１０６】
２％（ｗ／ｖ）までのＨＰを含む新規製剤から、ドルゾラミド及びチモロールのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの角膜透過性を決定した。ＨＰ濃度の有効成分への効果も決定した。ｐＨ７．４でＣＯＳＯＰＴ（登録商標）の有効成分を含む、標準的な溶液をコントロールサンプルとして使用した。
【０１０７】
材料及び方法
製剤調製
ドルゾラミド及びチモロールのｉｎ  ｖｉｔｒｏ角膜透過性を調べるため、及び、角膜の加水分解効果を決定するために、以下の３つの溶液を０．１％（ｗ／ｖ）リン酸緩衝液中（表９）で調合した。
【０１０８】
【表１０】
2013528589.tif 000016
【０１０９】
まず、適切に測量した固形有効成分に１０ｍＭリン酸緩衝液を加え、１５分間完全に攪拌した。次に、５％（ｗ／ｖ）ＨＰ懸濁溶液の有効体積を試験サンプル２及び試験サンプル３へ加え、表９に記載の正確な濃度で作製した。
【０１１０】
その後、上記３つの試験溶液を室温で１０分間攪拌した（６０℃までの５分間の加熱とともに）。攪拌後、溶液を５分間超音波処理した。コントロール溶液（コントロールサンプル＃１）は別として、ＨＰを有する溶液はｐＨを合わせる前、白い泥状物の懸濁液となった。全ての有効及び非有効成分を完全に希釈した後、１Ｍ  ＮａＯＨ又は１Ｍ  ＨＣｌを使用してｐＨを７．４に調節し、表８のような正確な組成物を作製するため、追加の緩衝液を加えた。全ての場合において、懸濁溶液はｐＨの調製と共に作製し、それらを室温で更に１５時間又はそれ以上攪拌することにより平衡化した。最終的な所望のｐＨを確認するために、全てのサンプル溶液のｐＨを再度測定した。
【０１１１】
角膜透過を検討するために、これらの懸濁溶液を、直接サンプルドナー溶液として使用した。溶解度を決定するために、懸濁液を０．４５μｍシリンジフィルターで濾過した。それぞれのサンプルを超純水で希釈した後（希釈係数＝１０００）、ＵＰＬＣを使用して、ドルゾラミド及びチモロールの濃度について、その濾液を解析した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの角膜透過特性の結果と、実施例４のｐＨ５．６５で有効成分を含むコントロールサンプルで得られたデータとの比較も行った。
【０１１２】
２〜３ｋｇ重量の３匹の雄ラビット（ニュージーランド）を、イソフルランの過剰吸入によって屠殺した後、直ちに、眼球を取り出し、透過実験に使用する角膜を分離した。実験手順の詳細は先の実施例４に記載されている。
【０１１３】
算出したパラメーターは、実施例４に記載されている（Ｃｄ［ｎｇ／ｍＬ］はドナー溶液中の有効医薬成分の初期薬剤濃度とする（表１０））。
【０１１４】
結果及び考察
ＵＰＬＣによって決定したドルゾラミド及びチモロールの初期濃度を表１０に示す。角膜水和作用のパーセンテージ算定は表１０に示す。
【０１１５】
【表１１】
2013528589.tif 000017
【０１１６】
【表１２】
2013528589.tif 000018
【０１１７】
角膜水和作用は、角膜の正味湿重量及び乾燥重量に基づいて測定した。通常、正常哺乳類動物における角膜水和作用％は７５〜８０％の範囲内である。概して、全ての試験サンプルの水和作用％には有意な変化が無く、それらは全ての場合において望ましい範囲内にあった。従って、ＨＰは角膜水和作用に影響を与えなかった。
【０１１８】
図１８及び１９は、それぞれドルゾラミド及びチモロールの角膜透過特性を明らかにしている。試験サンプル１、２及び３で得られた透過特性と共に、実施例４のｐＨ５．６５でのコントロールサンプルの透過特性もプロットした。ドルゾラミド及びチモロールの時間に依存した透過性を、３４℃で、単離したラビット角膜を通し、注意深く調べた。ドルゾラミドの角膜を介した累積総透過量、及び２時間後の総透過量は、添加物無しのコントロールサンプルと比べ、０．５％（ｗ／ｖ）ＨＰ（試験２）及び２％（ｗ／ｖ）ＨＰ（試験３）を含む試験製剤で相対的に高かった。更に、０．５％  ＨＰから２％  ＨＰへの濃度の上昇により、両有効成分の角膜透過性が増加することが示された。２％（ｗ／ｖ）ＨＰを含む製剤（試験３）において、有効成分の角膜透過性はｐＨ５．６５の市場製品ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）（製剤中に有効成分のみ）よりも高い（図１９及び図２０を参照）。更に、２％（ｗ／ｖ）ＨＰを含む製剤は、２時間後の角膜透過において、高い透過率（傾きの変化）を有し、有意に亢進した。
【０１１９】
概して、ヒドロキシル官能基を有するＨＰの添加は、ＨＰの濃度の上昇に伴って、ドルゾラミド及びチモロールの角膜透過率を有意に亢進する。従って、ＨＰは、緑内障治療に使用されるＣＯＳＯＰＴ（登録商標）又はＴＲＵＳＯＰＴ（登録商標）又はＡＺＯＰＴ（登録商標）として知られる市販品と比べた場合、有効成分の角膜透過性を改善した。
【０１２０】
図２０は、２時間後のドルゾラミド及びチモロールの総透過パーセンテージを示す。明らかに、ＨＰの存在で、角膜を介して透過した有効成分（ドルゾラミド及びチモロール）のパーセンテージが増加した。ドルゾラミドの場合、全ての試験製剤は異なる初期濃度を有し、チモロールの場合は同様の濃度（１０％未満の変化）であったことは注目すべきである。ドルゾラミドの異なる初期濃度は、主にＨＰによる溶解度の上昇に起因する。試験１と比べ試験２及び試験３では、添加物としてＨＰを使用することの有意性が図２０から明らかである。角膜透過性、分配係数及び拡散係数を決定するために、図１９及び図２０の２時間後までの傾きを使用した。
【０１２１】
図２１は、ドルゾラミド及びチモロールの角膜透過係数を示す。透過係数は、ドナー溶液中の薬剤の初期濃度に反比例した。両有効成分において、試験２及び試験３の透過係数がより高いことは、ＨＰ存在下で、ドルゾラミド（ｄｏｒｏｚａｍｉｄｅ）が、ＨＰを含まないコントロール製剤（試験１）と比べ、亢進した角膜透過率を有することを示唆している。試験３は試験２よりも相対的に高い角膜透過性を有し、従って、ＨＰ濃度の上昇の影響を示している。概して、図２１のデータは、ＨＰを含む試験２及び試験３製剤のチモロール及びドルゾラミドの透過係数が、ｐＨ７．４でＨＰ無しのコントロール試験１、及び、ｐＨ５．６５のＣＯＳＯＰＴ（登録商標）コントロール製剤（ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）有効成分製剤と同様）と比較して、より高かったことを明示している。
【０１２２】
ドルゾラミド及びチモロールの拡散係数（遅延時間と反比例する）は、ＨＰの添加により有意に変化しなかった（図２２を参照）。従って、ＨＰは角膜の表面には影響しない。仮に、拡散係数が有意に増加又は減少したならば、それは、角膜表面の特性の変化を示しているであろう。拡散係数は薬剤化合物の固有の特性であるため、添加物の付加で変化しないはずである。
【０１２３】
ＨＰはチモロール及びドルゾラミドの被包を促進し、チモロール及びドルゾラミドの角膜上皮への分配を亢進する。この理論は図２３で示唆されたデータによっても支持される。試験２及び３の、チモロール及びドルゾラミドの角膜表面への分配係数が試験１よりも高いことは、高機能性（ヒドロキシル基）ＨＰの存在下で、チモロール及びドルゾラミドの親油性角膜への分配の改善を示している。従って、ＨＰ存在下での改善した透過性は、主に改善した上皮への分配に起因している。製剤溶液中のＨＰの濃度を０．５％から２％（ｗ／ｖ）へ上昇させることで、透過性は更に亢進した。しかしながら、分配係数及び透過係数は物質濃度の機能ではないであろうから、これらのパラメーターはＨＰ濃度の上昇によって有意に変化しなかった。
【０１２４】
ｐＨ７．４でＨＰ添加物（市販のヒドロキシル官能基を有するＢｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｈ２０等）の存在下で、ドルゾラミド及びチモロールの累積透過量は、添加物無しのコントロール製剤と比べ、相対的に高かった。製剤中におけるそのようなＨＰの濃度の上昇は、ドルゾラミド及びチモロールの角膜透過率を有意に亢進した。ドルゾラミド及びチモロールの角膜透過係数は、ＨＰ存在下で相対的に高かった。有効成分の角膜上皮への分配はＨＰ存在下で増加した。従って、ヒドロキシル官能基を有するＨＰは、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）有効成分の眼でのバイオアベイラビリティを高めるのに非常に有効であろう。
【０１２５】
実施例７
ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液中でＨＰ及びチモロールの存在下における、ドルゾラミド及びブリンゾラミド等の炭酸脱水素酵素阻害剤の水溶解度を検討した。Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｗ３０００と呼ばれるＨＰを使用した。このＨＰの末端官能基は、ＰＥＧ（親水性）及び不飽和長鎖脂肪酸である。本実験で使用した超分岐ポリエステルのモデルを以下に示す。
【０１２６】
【化３】
2013528589.tif 000019
【０１２７】
両親媒性末端基を有する超分岐ポリエステル
【０１２８】
本実験に使用したＨＰの特性を表１２に記載する。前記ＨＰは、一分子当り５０の第一ヒドロキシル基を有し、その固形分は５５％（ｗ／ｗ）である。
【０１２９】
【表１３】
2013528589.tif 000020
【０１３０】
表１３は、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液中で調製した、様々な試験サンプル製剤を示す。
【０１３１】
【表１４】
2013528589.tif 000021
【０１３２】
５％（ｗ／ｖ）乳濁液を調製するために、継続的な攪拌及び６０〜７０℃での加熱をしながら、少なくとも３０分間、測量したろうを塗られたＢｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｗ３０００にゆっくりと水を拡散させ、その後、更に１５時間継続的によく攪拌し、フラスコ内に均一な乳濁混合液を得た。
【０１３３】
適切に測量した固形有効成分に１０ｍＭリン酸緩衝液を加え、１５分間完全に攪拌した。次に、表１３に記載の正確な濃度で作製するために、５％（ｗ／ｖ）ＨＰ乳濁溶液の有効体積を適切に希釈した。その後、前記サンプル試験乳濁溶液を室温で１０分間攪拌した（６０℃までの５分間の加熱とともに）。攪拌後、乳濁液を５分間超音波処理した。全ての有効及び非有効成分を完全な乳濁液とした後、１Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨを７．４に調節し、表１３の正確な組成物を作製するために追加の緩衝液を加えた。ｐＨ調製とともに、乳濁溶液を室温で更に１５時間又はそれ以上攪拌することで平衡化した。最終的に所望のｐＨ７．４であることを確認するために、全てのサンプル乳濁溶液のｐＨを再び測定した。実施例１と同じ条件で、ＵＰＬＣを使用して、ＣＡＩ濃度について濾液を解析した。
【０１３４】
結果及び考察
本実験では、両親媒性の自己乳化ＨＰを、溶解度促進添加物として使用した。ｐＨ７．４で様々な濃度のＨＰを試みた。
【０１３５】
図２４において、ブリンゾラミド及びドルゾラミドの溶解度がＨＰ濃度の上昇に伴って増加することが示されている。５％（ｗ／ｖ）ＨＰと共に０．５％（ｗ／ｖ）チモロールが存在する場合、ドルゾラミド及びブリンゾラミドの溶解度はＣＡＩの約２％（ｗ／ｖ）である。２％（ｗ／ｖ）ＨＰにＨＰＭＣを添加しても溶解度は亢進しなかった。市販のＡＺＡＲＧＡ（登録商標）懸濁液は、ｐＨ７．４で１％（ｗ／ｖ）ブリンゾラミドを有し、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）はｐＨ５．６５で２％（ｗ／ｖ）ドルゾラミドを有するのに対し、ＨＰの添加によるｐＨ７．４での溶解度の亢進は、用量を１％（ｗ／ｖ）を超えるまで増やすことによる薬剤の有効性の亢進に対し、有用に寄与するであろう。従って、眼でのバイオアベイラビリティを亢進し、ＣＡＩの眼への刺激を減らすために、ｐＨ７．４付近（涙液のｐＨは７．４）での亢進した溶解度を有する、ブリンゾラミド又はドルゾラミドを開発することは重要である。
【０１３６】
実施例８
両親媒性官能基を有するＨＰ（Ｂｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｗ３０００）を含むドルゾラミド及びチモロールのｉｎ  ｖｉｔｒｏ角膜透過研究
オリジナルの市販局所的製剤（有効成分のみ）と比較して、両親媒性官能基を有するＨＰの添加による効果を検討するために、ドルゾラミド及びチモロール（ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）の有効成分）の角膜透過についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験を実施した。
【０１３７】
新たな局所的製剤は、親水性官能基として非イオン性ＰＥＧを、疎水性官能基として不飽和脂肪酸（市販されている）を有するが故、両親媒性となるＢｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｗ３０００（超分岐ポリエステル）を含む。ｐＨ７．４１でこのＨＰを２％（ｗ／ｖ）で加えることで、ドルゾラミドの溶解度は４．３から１５ｍｇ／ｍＬへ増加した。本実験において、ドルゾラミド及びチモロールのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの角膜透過性は、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）と同等の、２％（ｗ／ｖ）までのＨＰを含む、新規製剤により決定した。ＨＰ濃度の有効成分への効果も決定した。ｐＨ７．４でＣＯＳＯＰＴ（登録商標）有効成分を含む標準溶液をコントロールサンプルとして使用した。
【０１３８】
材料及び方法
１．製剤調製
ドルゾラミド及びチモロールのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの角膜透過を調べるため、並びに角膜の加水分解効果を決定するために、０．１％（ｗ／ｖ）リン酸緩衝液中で、以下の３つの溶液（表１４）を調合した。
【０１３９】
【表１５】
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【０１４０】
適切に測量した固形有効成分に１０ｍＭリン酸緩衝液を加え、１５分間完全に攪拌した。次に、５％（ｗ／ｖ）ＨＰ懸濁溶液の有効体積を試験２へ加え、表１４のように正確な濃度で作製した。その後、前記３つの試験溶液を室温で１０分間攪拌した（６０℃までの５分間の加熱とともに）。攪拌後、溶液を５分間超音波処理した。全ての有効及び非有効成分を完全に希釈した後、１Ｍ  ＮａＯＨ又は１Ｍ  ＨＣｌを使用して、ｐＨを７．４又は５．６５のいずれかに調節し、表１５の正確な組成物を作製するために追加の緩衝液を加えた。ｐＨの調節とともに（液の外観は表１４に記されている）、製剤を室温で更に１５時間又はそれ以上攪拌することで平衡化した。最終的に所望のｐＨであることを確認するために、全てのサンプル溶液のｐＨを再度測定した。角膜透過研究のために、これらの製剤を直接サンプルドナー溶液として使用した。溶解度を決定するために、懸濁液／乳濁液を０．４５μｍシリンジフィルターで濾過した。それぞれのサンプルを超純水で希釈した後（希釈係数＝１０００）、ＵＰＬＣを使用して、ドルゾラミド及びチモロールの濃度について濾液を解析した。
【０１４１】
２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏラビット角膜透過実験
実施した実験手順及び解析は、先の実施例４に詳細が記載されている。算出したパラメーターは実施例４に記載されている（Ｃｄ［ｎｇ／ｍＬ］はドナー溶液中の有効医薬成分の初期薬剤濃度とする（表１５から））。
【０１４２】
結果及び考察
ＵＰＬＣにより決定した、ドルゾラミド及びチモロールの初期濃度を表１５に示す。角膜水和作用パーセンテージの算定は表１６に示す。
【０１４３】
【表１６】
2013528589.tif 000023
【０１４４】
【表１７】
2013528589.tif 000024
【０１４５】
角膜水和作用は、角膜の正味湿重量及び乾燥重量に基づいて測定した。通常、正常な哺乳動物の角膜の水和作用％（ｗ／ｗ）は７５〜８０％の範囲内にある。試験１及び３は共に８０％を超えている。しかしながら、分配及び透過係数の計算値に違いはなく、このことは、高い水和作用％が原因のいかなる角膜損傷もないであろうことを示唆している。概して、全ての試験サンプルの水和作用％で有意な変化は認められず、全ての場合において望ましい範囲内であった。従って、ＨＰは角膜水和作用に影響を与えないと考えられる。
【０１４６】
図２５及び２６は、それぞれドルゾラミド及びチモロールの角膜透過特性を明らかにしている。ドルゾラミド及びチモロールの時間依存的な透過性を、単離したラビットの角膜を通して、３４℃で注意深く調べた。ドルゾラミドの角膜を介した累積総透過量、及び２時間後の総透過量は、ｐＨ７．４で添加物無しのコントロールサンプル（試験１）と比較して、２％（ｗ／ｖ）ＨＰを含む試験製剤（試験２）で相対的に高かった。試験２（新規製剤）のドルゾラミドの総透過は、試験３のドルゾラミドの透過特性と同等であった。しかしながら、市販品がｐＨ５．６５で調製されているのに対し、試験１はｐＨ７．４で調製されており、試験１は患者にとってより苦痛がないであろうことは注目すべきである。透過性はＨＰ濃度を上げることで更に増加する可能性がある。
【０１４７】
更に、ドルゾラミドとは異なり、同様の水溶解度を有する試験１及び３と比べて、試験２ではＨＰ存在下でチモロールの透過性が有意に増加した（図２６を参照）。２％（ｗ／ｖ）ＨＰを含む製剤（試験２）では、チモロールの角膜透過性は、ｐＨ５．６５の市販品ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）（製剤中に有効成分のみ）よりも、ほぼ２倍高い（図２７を参照）。この結果は、ドルゾラミド及びチモロール双方について、局所的製剤用の薬剤担体としてＨＰを使用することの重要性を明確に説明している。
【０１４８】
概して、両親媒性官能基を有するＨＰの添加は、ＨＰ濃度の上昇に伴って、ドルゾラミド及びチモロールの角膜透過率を有意に亢進する。従って、両親媒性官能基を有する樹状ポリエステルＨＰは、緑内障治療に使用される市販品（ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）又はＴＲＵＳＯＰＴ（登録商標）又はＡＺＯＰＴ（登録商標）として既知）と比較して、有効成分の角膜透過性を改善する。
【０１４９】
図２７は、３時間後のドルゾラミド及びチモロールの総透過パーセンテージを示す。明らかに、ＨＰが存在することで、角膜を介して透過した有効成分（ドルゾラミド及びチモロール）のパーセンテージが増加する（試験２を参照）。ｐＨ７．４で調製した試験２では、ｐＨ５．６５で調製した試験３よりも、ドルゾラミドの総透過％がわずかに高かった。ドルゾラミドの場合、全ての試験製剤は異なる初期濃度を有し、チモロールの場合は、全ての試験製剤で同様の濃度を有することは注目すべきである。ドルゾラミドの異なる初期溶解度は、主にＨＰによる溶解度上昇に起因する。試験３（ｐＨ５．６５）及び試験１（ｐＨ７．４）と比べ、試験２において、図２７でＨＰを添加物として使用することの有意性が説明されている。角膜透過性、分配係数及び拡散係数を決定するために、図２６及び２７の傾きを使用した。
【０１５０】
図２８は、ドルゾラミド及びチモロールの角膜透過係数を示す。透過係数は、ドナー溶液中の薬剤の初期濃度に反比例する。両有効成分について、ｐＨ７．４及びｐＨ５．６５のコントロールサンプルと比較して、試験２の透過係数は高く、従って、ＨＰを含まないコントロール製剤（試験１及び３）と比べて、ＨＰ存在下での有効医薬成分が亢進した角膜透過率を有することを示唆している。試験３は試験２よりも相対的に高い角膜透過性を有し、ｐＨの影響を示している。生理学的なｐＨでの有効医薬成分は、類似の溶解度についての透過性に、より貢献する。概して、図２８のデータは、ｐＨ７．４でＨＰ無しの試験１、及び、ｐＨ５．６５のＣＯＳＯＰＴ（登録商標）コントロール製剤（ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）有効成分製剤と類似）と比較して、ＨＰを含む試験２の製剤では、チモロール及びドルゾラミドの透過係数が高いことを明示している。
【０１５１】
ドルゾラミド及びチモロールの拡散係数（遅延時間に対し反比例する）は、ＨＰの添加により有意に変化しなかった（図２９を参照）。従って、ＨＰは角膜表面にいかなる影響も与えない。仮に、拡散係数が有意に増加又は減少したならば、それは角膜表面の特性の変化を示しているであろう。拡散係数は薬剤化合物の固有の特性であるため、添加物を加えることでは変化しないはずである。
【０１５２】
試験２の角膜表面へのチモロール及びドルゾラミドの分配係数が、試験１及び３よりも高いことは、高機能性（両親媒性）ＨＰの存在下で、親油性角膜へのチモロール及びドルゾラミドの分配の改善を示している。従って、ＨＰ存在下で亢進した透過性は、主に改善した上皮への分配に起因する。製剤溶液中のＨＰ濃度を２％から５％（ｗ／ｖ）へ上昇させることで、透過性が更に亢進する可能性がある。
【０１５３】
両親媒性官能基を有する市販のＢｏｌｔｏｒｎ（登録商標）Ｗ３０００（２％  ｗ／ｖ）などのＨＰ添加物の存在下で、ｐＨ７．４でのドルゾラミド及びチモロールの累積透過量は、添加物無しで同様のｐＨ値であるコントロール製剤と比較して、ほぼ２倍高かった。製剤中における、そのようなＨＰの２％（ｗ／ｖ）を超える濃度の上昇により、ｐＨ５．６５の市販品と比べて、ドルゾラミド及びチモロールの角膜透過率は更に亢進する可能性がある。新規局所的製剤はｐＨ７．４で調製されているため、患者にとってより助けとなり安心して利用できる。有効成分の角膜上皮への分配はＨＰ存在下で増加した。従って、両親媒性官能基を有するＨＰは、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）有効成分の眼でのバイオアベイラビリティを増加させるのに非常に効果的であろう。
【０１５４】
実施例９
Ｂｉｓ−ＭＰＡポリエステル超分岐ポリマー（ＢＭＰＡ−ＨＰ）、又は、ＰＥＧ及びＢＭＰＡ−ＨＰの組み合わせによる、炭酸脱水素酵素阻害剤（ＣＡＩ）の溶解度亢進
ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液で、チモロール存在下における、ドルゾラミド及びブリンゾラミド等のＣＡＩの水溶解度への、官能性超分岐ポリマーの影響を検討した。ＢＭＰＡ−ＨＰの一般的な定義は、ジメチロールプロピオン酸（Ｂｉｓ−ＭＰＡ）ポリエステルコア及び末端ヒドロキシル（ＯＨ）官能基を有する超分岐ポリマーである。末端ヒドロキシル官能基の数は、超分岐ポリエステルの世代に依存する。世代は、分岐層の数又はコアから末端官能基への分岐の広がりにより定義される。例えば、第２世代ＢＭＰＡ超分岐ポリエステルは、１６のヒドロキシル基を含み、一方で、第３世代は３２のヒドロキシル基を含む。ＢＭＰＡ−ＨＰの構造は以下に示す。
【０１５５】
【化４】
2013528589.tif 000025
【０１５６】
超分岐ｂｉｓ−ＭＰＡポリエステル第３世代（３ｒｄＢＭＰＡ−ＨＰ）
【０１５７】
本研究で使用した、異なる世代のポリエステルＨＰの特性を表１７に記載する。
【０１５８】
【表１８】
2013528589.tif 000026
【０１５９】
材料及び方法
表１８は、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液中で調製した、様々な試験サンプル乳濁液（コントロール溶液は除く）を示す。
【０１６０】
【表１９】
2013528589.tif 000027
【０１６１】
適切に測量した固形有効成分に１０ｍＭリン酸緩衝液を加え、１５分間完全に攪拌した。次に、５％（ｗ／ｖ）ＢＭＰＡ−ＨＰ溶液の有効体積を適切に希釈し、表１８に記載の正確な濃度で作製した。その後、サンプル試験溶液を室温で１０分間攪拌した（６０℃までの５分間の加熱とともに）。攪拌後、溶液を５分間超音波処理した。全ての有効及び非有効成分を完全に懸濁した後、１Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨを７．４に調節し、表１８記載の正確な組成物を作製するために追加の緩衝液を加えた。ｐＨ調製とともに、懸濁溶液を室温で更に１５時間又はそれ以上攪拌することで平衡化した。最終的に所望のｐＨ７．４であることを確認するため、全てのサンプル溶液のｐＨを再度測定した。実施例１と同じ条件で、ＵＰＬＣを使用して、ＣＡＩについて濾液を解析した。
【０１６２】
結果及び考察
本実験では、第２世代ＢＭＰＡ−ＨＰ又は第３世代ＢＭＰＡ−ＨＰを、溶解度促進添加物として用い、ｐＨ７．４で各々を様々な濃度で試験した。眼でのバイオアベイラビリティを亢進しＣＡＩによる眼への刺激を減らすために、ｐＨ７．４付近（涙液のｐＨは７．４）で、亢進した溶解度を有する親油性ブリンゾラミド又はドルゾラミド薬剤を開発することは重要である。０．５％チモロール存在下で、５％の第３世代ＢＭＰＡ−ＨＰを有するドルゾラミド及びブリンゾラミドの溶解度は、ＣＡＩのわずか約（slightly about）１％（ｗ／ｖ）である。下の世代である第２世代ＢＭＰＡ−ＨＰでは、ＣＡＩの溶解度は、第３世代ＢＭＰＡ−ＨＰ（全てのサンプルについて、添加物として使用した第２世代ＢＭＰＡ−ＨＰと同様の濃度で）と比較して、１０％未満近く減少した。
【０１６３】
２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００とＨＰとの組み合わせを使用した場合、ＣＡＩの溶解度は劇的に増加する（コントロールより４倍高い）。２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００を２％（ｗ／ｖ）ＢＭＰＡ−ＨＰへ加えることで、ＣＡＩの溶解度はほぼ倍加した（図３１を参照）。
【０１６４】
市販品ＡＺＡＲＧＡ（登録商標）懸濁液はｐＨ７．４で１％ブリンゾラミドを有し、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）はｐＨ５．６５で２％（ｗ／ｖ）ドルゾラミドを有するが、ＢＭＰＡ−ＨＰ添加によるｐＨ７．４での溶解度の亢進は、１％（ｗ／ｖ）を超える用量に増やすことによる、薬剤の有効性亢進に対し有用に寄与するであろう。
【０１６５】
上記結果は、生理学的ｐＨに近いｐＨ値で、疎水性ＣＡＩの溶解度促進剤としてＢＭＰＡ−ＨＰを使用することの有用性を明示している。ＢＭＰＡ−ＨＰを含む溶液にＰＥＧを加えることで、ＣＡＩの溶解度は更に改善した。
【０１６６】
実施例１０
Ｂｉｓ−ＭＰＡ超分岐ポリエステルの眼への刺激性を決定する、ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）組織培養研究、及び細胞毒性に基づいた、眼科研究のための最適化サンプル適用時間
方法及び材料
サンプルは、以下の表１９に従ってリン酸緩衝生理食塩水中（ＡＺＯＰＴ（登録商標）を除く）で調製し、０．２μｍ無菌シリンジフィルターを用いて無菌化した。０．０２％  ＢＡＫをポジティブコントロールとして使用した。再構築したヒト角膜上皮は、Ｓｋｉｎ  Ｅｔｈｉｃｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（フランス）から購入した。
【０１６７】
【表２０】
2013528589.tif 000028
【０１６８】
細胞培養方法を以下に記す：
上皮をアガロースから６−ｗｅｌｌプレート中の維持培地へ移す
↓
組織の順化：３７℃、５％  ＣＯ２、≧９５％湿度で少なくとも２時間
↓
組織を２４−ｗｅｌｌプレート中の新たな維持培地へ移す
↓
３つの組織それぞれ３０μＬ／３０ｍｇ試験物質
↓
室温で２０分間又は４０分間インキュベート
↓
ＰＢＳで洗浄
↓
組織を新たな維持培地へ移す
↓
３７℃、５％  ＣＯ２、≧９５％湿度で１６±１時間インキュベート
↓
組織を培養培地中のＭＴＴ溶液へ移す（ＭＴＴインキュベーション）
↓
組織を３時間インキュベート（３７℃、５％  ＣＯ２、≧９５％）
↓
挿入物をイソプロパノールに浸す（ホルマザン抽出）
↓
最低２時間ホルマザン抽出を行う（室温で）
↓
挿入物に穴を開けホモジェナイズ
↓
プレート分光光度計で５７０ｎｍのＯＤを測定
【０１６９】
処理した培養のそれぞれの生存率は、対応するネガティブコントロール（１００％生存）に対する、試験化学物質で処理した培養の、ＭＴＴ変換パーセンテージから算出した。
【０１７０】
以下の等式を使用した：
生存率＝［個別のＯＤ化学物質／平均ＯＤネガティブコントロール］×１００
【０１７１】
ＨＣＥ生存率分類予測モデル：ＮＩ（生存率≧６０％）、Ｉ（生存率＜６０％）、即ち、ネガティブコントロールと比べて、試験産物から得られた生存率が＜６０％である場合、その産物は刺激性であると分類される（ｉｎ  ｖｉｖｏでの分類に従う）。
【０１７２】
結果及び考察
図３２で示されるように、実験区分において、生存率のための上記等式を使用して、様々なサンプル（表１９に従う）の生存率を計算した。６０％未満の生存率であるサンプルは刺激性とみなした。トリプリケートに基づく、細胞生存率の標準偏差は、全てのサンプルで７％未満であった。細胞毒性研究の結果から、４％（ｗ／ｖ）までの第３世代ＢＭＰＡ−ＨＰを有する眼科用サンプルは、６０％を超える細胞生存率を有し、眼の刺激性はないであろうということが明らかとなった（図３２を参照）。図３２の結果は、角膜上皮細胞に対し、適用時間１時間で５０％未満の細胞生存率であるＡＺＯＰＴ（登録商標）が、細胞毒性を示す可能性があることも明らかにしている。５％（ｗ／ｖ）第２世代Ｂｉｓ−ＭＰＡを含むサンプルも、６０％未満の細胞生存率を有し、眼の刺激を起こした。
【０１７３】
先の検討結果を組み合わせることで、市販の超分岐ポリエステルＢｉｓ−ＭＰＡの様々な濃度での細胞毒性を図３３で明らかにする。点眼液中で同一濃度であるとき、第２世代ＢＭＰＡ−ＨＰにより起きる上皮細胞の傷害（故に眼部刺激）は、第３世代ＢＭＰＡ−ＨＰにより起きる眼部刺激より低いことが、前記の図より明らかとなった。分岐の広がり又は長さ（それ故分子量及び末端官能基の数）は、ＨＰの世代数の減少とともに減少する。図３３の結果は、世代数の減少に伴う細胞毒性の減少は、主に、末端官能基と上皮細胞との相互作用時間の減少に起因するであろうことを示している。
【０１７４】
結論
上皮細胞死の割合は、用量濃度及び世代（モル質量及び分岐の広がり）の増加に伴って増加した。市場製品ＡＺＯＰＴ（登録商標）の場合、５０％未満の細胞生存率で、眼部刺激を起こし、おそらくそれは、０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＡＫに１時間曝露したことに起因しているであろう。
【０１７５】
実施例１１
ＢＭＰＡ−ＨＰ又は非イオン性界面活性剤とＢＭＰＡ−ＨＰの組み合わせを含むＣＡＩの溶解度亢進
ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液中で、チモロール存在下での、ドルゾラミドの水溶解度及び安定性を検討した。
【０１７６】
方法及び材料
まず、適切に測量した固形有効成分に１０ｍＭリン酸緩衝液を加え、１５分間完全に攪拌した。有効医薬成分が完全に溶解した後、超分岐第２世代ＢＭＰＡ−ＨＰを溶液に加えた。ＨＰが溶解した後、必要な製剤濃度のＰＥＧ８０００を加えた。その後、サンプル試験溶液を室温で１０分間攪拌した（６０℃までの５分間の加熱とともに）。攪拌後、溶液を２０分間超音波処理した。全ての有効及び非有効成分を完全に溶解させた後、１Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨを７．４に調節し、表２０及び２１のような正確な組成物を作製するために、追加の緩衝液を加えた。ｐＨの調製とともに、製剤を室温で更に１５時間又はそれ以上攪拌することで平衡化した。サンプルを０．４５μｍシリンジフィルターで濾過した。最終製剤にポリソルベート８０を添加した。サンプル番号３については、ｐＨ調節後に、製剤を６０℃（２４時間）で平衡化し、それからポリソルベート８０を加えた。最終的に所望のｐＨ７．４であることを確認するために、全てのサンプル溶液のｐＨを再度測定した。全てのサンプルは１４日間２５及び６０℃で保存し、各サンプルを超純水で希釈した後（希釈係数＝１０００）、ＵＰＬＣを使用して、ドルゾラミド及びチモロールについて、濾液を解析した。
【０１７７】
結果及び考察
【０１７８】
【表２１】
2013528589.tif 000029
【０１７９】
【表２２】
2013528589.tif 000030
【０１８０】
本研究では、溶解度促進添加物として、第２世代ＢＭＰＡ−ＨＰを調べた。ｐＨ７．４で、非イオン性界面活性剤、例えば、ＰＥＧ及びポリソルベート８０、との様々な組み合わせを試みた。サンプル調製後、全ての製剤は室温で透明な溶液であった。図３４において、ドルゾラミドの溶解度が、４％（ｗ／ｖ）ＨＰ及び２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧの添加にともない、増加することが示されている。図３４に示されるように、４％（ｗ／ｖ）ＨＰ及び２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧを含む製剤では、初日から２週間後までにドルゾラミドの濃度は徐々に減少している。４％（ｗ／ｖ）ＨＰ及び２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧを含む製剤は、２週間後には懸濁液となった。本発明者らは、ドルゾラミド濃度の減少率が、１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の添加（サンプルＳ＃１）で減少することを見出した。ドルゾラミド濃度は２週間で９．６ｍｇ／ｍＬから８．４ｍｇ／ｍＬへ減少した。
【０１８１】
従って、高濃度のポリソルベート８０は沈殿を防ぎ、新規製剤の安定化を助ける。２週間に渡って、全ての製剤のｐＨはほとんど変化しなかった（表２０及び表２１を参照）。２週間に渡り、チモロール濃度は有意に変化しなかった。市販品ＡＺＡＲＧＡ（登録商標）懸濁液はｐＨ７．４で１％（ｗ／ｖ）ブリンゾラミドを有し、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）はｐＨ５．６５で２％ドルゾラミド有するが、ＨＰ及び非イオン性界面活性剤の添加による、ｐＨ７．４での溶解度の亢進は、用量を１％（ｗ／ｖ）以上に増やすことによる、薬剤の有効性の亢進に有用に寄与するであろう。
【０１８２】
結論
上記結果は、生理学的ｐＨ付近のｐＨ値で、ＣＡＩ溶解度促進剤として、第２世代ＢＭＰＡ−ＨＰをＰＥＧ８０００及びポリソルベート８０との組み合わせで使用することの有用性を明確に証明している。
【０１８３】
実施例１２
リン酸緩衝液中で、超分岐ｂｉｓ−ＭＰＡポリエステル−１６−ヒドロキシル、第２世代（第２世代ＢＭＰＡ−ＨＰ）、ＰＥＧ８０００及びポリソルベート８０を、様々な組み合わせで含む水溶液で、チモロール存在下における、炭酸脱水素酵素阻害剤（ドルゾラミド及びブリンゾラミド）の溶解度及び安定性に基づく、ｐＨ７．４の局所的製剤を決定する研究を行った。
【０１８４】
方法及び材料
表２２は、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液中で調製した、全ての異なる試験サンプルを示す。
【０１８５】
【表２３】
2013528589.tif 000031
【０１８６】
まず、適切に測量した固形有効成分に１０ｍＭリン酸緩衝液を加え、有効医薬剤が溶解するまで完全に攪拌した。次に、固形ＢＭＰＡ−ＨＰ粉末をサンプル製剤１、２及び３へ加えた。ＨＰの溶解後、外観は透明溶液であった。適量の非イオン性界面活性剤（ＰＥＧ８０００等）を製剤に加え、上記表２２に記載の製剤含有量になるように正確な濃度で作製した。その後、全ての試験溶液を室温で１０分間攪拌した（６０℃までの５分間の加熱とともに）。攪拌後、溶液を５分間超音波処理した。全ての有効及び非有効成分を完全に溶解させた後、１Ｍ  ＮａＯＨ又は１Ｍ  ＨＣｌを使用して、ｐＨを７．４又は５．６５に合わせ、表２２のサンプル組成に従う正確な組成物を作製するために追加の緩衝液を加えた。ｐＨの調節とともに、室温で更に２４時間又はそれ以上攪拌することで平衡化し、試験溶液を作製した。ポリソルベート８０及び超分岐ポリエステルを含むサンプルについては（表２）、ポリソルベート８０だけは、最終製剤を２４時間、６０℃で平衡化した後に加えられた。最終的な所望のｐＨを確認するために、全てのサンプル溶液のｐＨを再度調節した。
【０１８７】
各サンプルを超純水で希釈した後（希釈係数＝１０００）、ＵＰＬＣを使用して、炭酸脱水素酵素阻害剤、チモロール及びＨＰの濃度について濾液を解析した。ＣＡＩ及びチモロール検出について、実施例１から得られた最適条件を使用した。それぞれの製剤の外観及びｐＨを、室温及び６０℃で１ヶ月間記録した。
【０１８８】
結果及び考察
本研究では、ヒドロキシル末端基を有するＨＰ、ＰＥＧ、及びポリソルベート８０を、溶解度促進添加物として使用した。先の結果に基づいて、最良の製剤を決定するために、ｐＨ７．４で様々な組み合わせを試みた。図３５は、４％（ｗ／ｖ）ＨＰ及び、２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ又は４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０存在下において、ドルゾラミドの溶解度が有意に増加することを示す（サンプル１、２及び３）。しかしながら、ドルゾラミドの溶解度は、ＰＥＧ８０００（サンプル５）若しくはポリソルベート８０（サンプル６）単独、又はそれらの組み合わせ（サンプル４）の存在下では、有意に増加しなかったことから、超分岐ポリエステルの製剤への添加は、溶解度促進剤として明らかに有益であることを示している。しかしながら、ヒドロキシル基を有するＨＰをポリソルベート８０との組み合わせで含む製剤（サンプル２）は、ＨＰ、ポリソルベート８０及びＰＥＧ８０００を含む製剤（サンプル１）と比較して、同等の溶解度を有することから、ＰＥＧ８０００の添加は避けることが可能である。概して、ドルゾラミド及びチモロール溶解度のデータに基づいて、サンプル２が最良の製剤であることを見出した。ポリソルベート８０などの界面活性剤をＨＰへ添加することでも、ドルゾラミドをＨＰ内に被包し沈殿を防ぐことにより、ドルゾラミドの溶解度を増加する。
【０１８９】
【表２４】
2013528589.tif 000032
【０１９０】
【表２５】
2013528589.tif 000033
【０１９１】
表２３及び２４は、全ての製剤サンプルについて、４週間に渡るドルゾラミド及びチモロールの安定性試験の結果を示す。表から明らかなように、サンプル＃１及びサンプル＃２は比較的安定で、１ヵ月後も透明な溶液である。ＰＥＧを含まないサンプル＃２がサンプル＃１と同等の結果であるため、サンプル＃１のＰＥＧは無くても良いであろう。
【０１９２】
結論
上記結果は、ヒドロキシル末端官能基を有するＨＰを、界面活性剤（ポリソルベート８０及びＰＥＧ８０００等）と組み合わせて使用することの利点を明確に示している。界面活性剤ポリソルベート８０の挙動は、沈殿を防ぐことにより、ＣＡＩの溶解度を増加するのに非常に有益である。溶解度及び１ヶ月間の安定性の結果に基づく好ましい製剤は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中に、４％（ｗ／ｖ）第２世代ＢＭＰＡ−ＨＰ及び４％ポリソルベート８０のみの組み合わせとともに、有効成分を含む製剤である。
【０１９３】
実施例１３
Ｂｉｓ  ＭＰＡ超分岐ポリエステル及びポリソルベート８０を含む、新規局所的製剤についての、ドルゾラミド及びチモロールのｉｎ  ｖｉｔｒｏ角膜透過研究
方法及び材料
ドルゾラミド及びチモロールのｉｎ  ｖｉｔｒｏ角膜透過性を調べるため、並びに角膜加水分解効果を決定するために、０．１％（ｗ／ｖ）リン酸緩衝液中で以下の３つの溶液（表２７）を調合した。
【０１９４】
【表２６】
2013528589.tif 000034
【０１９５】
まず、適切に測量した固形有効成分に１０ｍＭリン酸緩衝液を加え、１５分間完全に攪拌した。サンプルナンバー２及び３の場合、表２５の組成になるよう第２世代ＢＭＰＡ−ＨＰ粉末を溶液に添加した。その後、３つの試験溶液を室温で１０分間攪拌した（６０℃までの５分間の加熱とともに）。攪拌後、溶液を５分間超音波処理した。全ての有効及び非有効成分を完全に溶解させた後、１Ｍ  ＮａＯＨ又は１Ｍ  ＨＣｌを使用してｐＨを７．４又は５．６５に調節し、表のサンプル組成のような正確な組成物を作製するために、追加の緩衝液を添加した。ｐＨの調製とともに、サンプル１及び２については、室温で更に２４時間又はそれ以上攪拌することにより平衡化し、試験溶液を作製した。サンプルナンバー２及び３については、２４時間、６０℃で平衡化を実施した。その後、ポリソルベート８０（４％（ｗ／ｖ））を添加し、再度ｐＨを調節した。最終的な所望のｐＨを確認するために、全てのサンプル溶液のｐＨを再度測定した。
【０１９６】
これらの透明な溶液を、直接サンプルドナー溶液として角膜透過研究に使用した。溶解度を決定するために、試験溶液を０．４５μｍシリンジフィルターで濾過した。各サンプルを超純水で希釈した後（希釈係数＝１０００）、ＵＰＬＣを使用して、ドルゾラミド及びチモロールの濃度について、濾液を解析した。使用した材料及び機器、並びにラビット角膜研究手順の詳細は、実施例４に示されている。
【０１９７】
結果及び考察
【０１９８】
【表２７】
2013528589.tif 000035
【０１９９】
ＵＰＬＣで決定したドルゾラミド及びチモロールの初期濃度を表２６に示す。
【０２００】
【表２８】
2013528589.tif 000036
【０２０１】
角膜の正味湿重量及び乾燥重量に基づいて、角膜水和作用を測定した。通常、正常哺乳動物の角膜水和作用％（ｗ／ｗ）は、７５〜８５％の範囲内にある。概して、表２７に示されるように、全ての試験サンプルの水和作用％に有意な変化は無く、全てが望ましい範囲内にあった。従って、ＨＰ及びポリソルベート８０は角膜水和作用に影響を与えなかった。
【０２０２】
図３６及び図３７は、それぞれドルゾラミド及びチモロールの角膜透過特性を明らかにしている。単離したラビット角膜を通して、３４℃で、ドルゾラミド及びチモロールの時間依存的な透過性を注意深く調べた。図３６から、角膜を介したドルゾラミドの累積総透過量及び３時間後の総透過量は、ｐＨ７．４で、４％（ｗ／ｖ）ＨＰ及びポリソルベート８０を含む試験製剤（試験３）では、ｐＨ５．６５で、同じ製剤（試験２）と比べて、相対的に高かった。明らかに、ドルゾラミドの透過はｐＨ７．４で増強され、これは親油性の角膜上皮に対し非常に良い結果をもたらすであろう、ドルゾラミドの非イオン性の挙動に起因している。試験３のドルゾラミド角膜透過性は、ｐＨ５．６５で添加物無しのコントロール溶液（試験１）と同等である。試験１が２％（ｗ／ｖ）ドルゾラミドを含むのに対し、試験３が１％（ｗ／ｖ）ドルゾラミドを含むことは留意すべきである。試験３は試験１の半分の濃度のドルゾラミドを含むが、角膜透過特性は類似している。眼への刺激をもたらす可能性のある、ｐＨ５．６５の市販品と比べて、試験３はｐＨ７．４で調製されているため、試験３は患者にはより苦痛が無いであろう。図３７のチモロール透過特性は、試験３が、試験１（コントロール溶液）と比べ、有意に高い角膜透過性を有することを示唆している。ｐＨ７．４の試験３においては、同様の水溶解度をもつ試験１と比べて、超分岐ポリエステル及びポリソルベート８０の存在により、チモロールの透過性は明らかに亢進している。概して、市販品に対し亢進したチモロールの透過性及び同等のドルゾラミド透過性は、ＨＰ及びポリソルベート８０を含む新規製剤の主要な利点である。図３８より、試験３（新規製剤）における、３時間後のドルゾラミド及びチモロールの総透過パーセンテージは、試験１（市販品の有効成分）よりも少なくとも２倍高かった。ＨＰ及びポリソルベート８０の存在によって、角膜を介して透過した有効成分（ドルゾラミド及びチモロール）のパーセンテージが明らかに増加する。
【０２０３】
角膜透過係数及び分配係数を決定するために、図３６及び３７の傾きを使用した。透過係数は、ドナー溶液の薬剤初期濃度に反比例する。試験２の透過係数（図３９を参照）及び分配係数（図４０を参照）は、試験１よりも相対的に高い。試験１及び試験２溶液は共にｐＨ５．６５であることは留意すべきである。上記結果は、ＨＰ及びポリソルベート８０の影響で、有効成分の分配及び透過が亢進することを示唆している。ｐＨの効果により、試験３の透過係数及び分配係数は試験２よりも高い。試験３製剤は、非イオン性のドルゾラミド及びチモロールの透過性により貢献するであろう、ｐＨ７．４で調製されている。概して、上記結果は、ドルゾラミド及びチモロール双方についての、局所的製剤の薬剤担体として、ＨＰ及びポリソルベート８０を使用することの重要性を明確に示している。
【０２０４】
概して、図３９のデータは、ｐＨ７．４でＨＰ無しの試験１及びｐＨ５．６５のＣＯＳＯＰＴ（登録商標）コントロール製剤（ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）有効成分製剤と同様）と比較して、ＨＰ及びポリソルベート８０を含む試験２の製剤で、チモロール及びドルゾラミドの透過係数が高いことを明確に示している。
【０２０５】
ＨＰ及びポリソルベート８０は、チモロール及びドルゾラミドの被包を促進するため、チモロールの角膜上皮への分配を亢進する。この理論は図４０のデータによっても支持される。チモロール及びドルゾラミドの角膜表面への分配係数が、試験１及び試験２よりも、ｐＨ７．４の試験３で最も高いことは、ｐＨ５．６５ではなく、ｐＨ７．４で、高機能性ＨＰの存在下で、親油性の角膜へのチモロール及びドルゾラミドの分配が改善することを示している。従って、ＨＰ存在下での改善した透過性は、主に上皮への分配の改善に起因する。
【０２０６】
結論
市販の樹枝状Ｂｉｓ−ＭＰＡ  ＨＰ及びポリソルベート８０などの、ＨＰ添加物存在下で、ｐＨ７．４における有効医薬剤の累積透過量は、ドルゾラミドの場合は市販品とほぼ同等、チモロールについては２倍を超える透過性であった。当該新規局所的製剤はｐＨ７．４で調製されるため、親油性角膜上皮への透過に、より寄与し、患者にとって満足のいくものである。従って、ヒドロキシル末端基を有するＨＰ及びポリソルベート８０は、ＣＯＳＯＰＴ（登録商標）有効成分の眼でのバイオアベイラビリティを増加するのに非常に有効であろう。
【産業上の利用可能性】
【０２０７】
本発明によれば、ドルゾラミド又はブリンゾラミドなどの炭酸脱水素酵素阻害剤の水溶解度を増加させる、ＨＰを含む眼科用組成物を提供することが可能である。該眼科用組成物は、非イオン性界面活性剤及び／又はベータブロッカーも含み得る。本発明の眼科用組成物は、角膜への有効薬剤の透過性の増加をもたらす。従って、現在利用可能な関連する眼科市販品と比べ、炭酸脱水素酵素阻害剤及びベータブロッカー（有効成分）を含む、局所的点眼液の全体的な眼でのバイオアベイラビリティ及び治療活性を増加させることが可能である。本発明で提示される局所的眼科用組成物は、眼でのバイオアベイラビリティを増加することで、患者の服薬遵守を高め得る、より効果的な抗緑内障組成物を提供する。
【０２０８】
本発明のいくつかの実施形態についての詳細は上記されているが、当業者は、本発明の新たな知識及び利益から実質的にかけ離れない範囲で、上記特定の実施形態に対し、様々な修飾及び変更を適用することができる。そのような修飾及び変更は、特許請求の範囲に記載の、本発明の趣旨及び範囲に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【国際調査報告】
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