(57)【要約】本発明はa）油相を含むタンクに正圧をかけることによって混合装置に油相を導入する工程を含む水中油型エマルションを製造する方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）油相を含むタンク中に正圧をかけることによって、混合装置に油相を導入する工程を含む、水中油型エマルションを製造する方法。
【請求項２】
工程b）水相を含むタンク中に正圧をかけることによって、先の混合装置に水相を導入することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
油相および/または水相を、約2から6bar、例えば約4から約5bar、例えば4.5barの圧力に調整した混合装置に導入する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
工程a)およびb)を実質的に同時に行う、請求項2または3に記載の方法。
【請求項５】
水相および油相を、約90：10、95：5または98.75：1.25（パーセント v/v）の比率で導入する、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
混合装置が高せん断力ホモジナイザーまたは高圧ホモジナイザーである、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
工程c）水中油型エマルションを形成するために油相および水相を混合することを含む、請求項2から6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
d）水中サブミクロン油型エマルションを形成するために工程c）の水中油型エマルションを高圧均質化する工程を更に含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
工程d)を2、3、4、5または6回行う、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
高圧均質化を約10000psiから約20000psi、約12000psiから約18000psi、約14000psiから約16000psiまたは約15000±1000psiで行う、請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
工程d)が行われたそれぞれの回の後に、水中油型サブミクロンエマルションを、15℃から30℃、16℃から29℃、17℃から28℃、16℃から27℃または16℃から28℃に冷却する、請求項8から10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
e.水中油型エマルションをプレろ過し、
f.工程e）においてろ過された水中油型エマルションを減菌グレードフィルターに通してろ過する
工程を含む工程を更に含む、請求項8から11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
水中油型エマルションが2％から8％（v/v）の油を含む、前記請求項に記載の方法。
【請求項１４】
水中サブミクロン油型エマルションが4％から6％（v/v）の油を含む、請求項に記載の方法。
【請求項１５】
水中油型エマルションが8％から12％（v/v）の油を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
油相がスクアレンを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
油相が界面活性剤を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
界面活性剤がソルビタントリオレアート（SPAN85）である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
油相がトコールを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
トコールがα-トコフェロールである、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
水相が水溶液および界面活性剤を含む、請求項2から20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（TWEEN80、POLYSORBATE80）である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
請求項1から22のいずれか1項に記載の方法によって製造された水中油型エマルション。
【請求項２４】
請求項23による水中油型エマルションおよび抗原を含む免疫原性組成物。
【請求項２５】
医療において使用するための請求項23に記載の水中油型エマルションまたは請求項24に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
病気の予防および/または治療に使用するための請求項23に記載の水中油型エマルションまたは請求項24に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
病気の予防および/または治療の薬剤の製造における請求項23に記載の水中油型エマルションまたは請求項24に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項２８】
請求項23に記載の水中油型エマルションまたは請求項24に記載の免疫原性組成物を哺乳類、例えば人に投与する工程を含む治療方法。
【請求項２９】
i）請求項23に記載の水中油型エマルション；およびii）抗原を含むキット。
【請求項３０】
抗原がインフルエンザウイルス由来である請求項23に記載の免疫原性組成物または請求項29に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は水中油型エマルション、特にスクアレンを含むサブミクロンの水中油型エマルションを製造するための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は水中油型エマルションの製造方法に関する。製造方法は、Ott et al., 2000 (The Adjuvant MF59: A 10-year Perspective. Vaccine Adjuvants: Preparation methods and Research Protocols [Methods in Molecular medicine, Vol. 42, Chapter 12, p211-228]、Ott et al., 1995 (MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines: Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach [Pharmaceutical Biotechnology volume 6] eds. Powell & Newman、WO06/100110A1、及びLidgate et al., 1992 (Sterile Filtration of a Parenteral Emulsion. Pharmaceuticals Research 9(7): 860-863)に開示されている。
【０００３】
水中油型エマルションはしばしば、アジュバントとしてワクチン/免疫原性組成物に使用されている。これらのエマルションはヒトに投与されるので、エマルションは無菌である必要がある。アジュバントとして使用される水中油型エマルションはサブミクロンエマルションであり、油滴は0.2μmフィルターを通して細菌をろ過できるように十分に小さい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第06/100110号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ott et al., 2000 (The Adjuvant MF59: A 10-year Perspective. Vaccine Adjuvants: Preparation methods and Research Protocols [Methods in Molecular medicine, Vol. 42, Chapter 12, p211-228]
【非特許文献２】Ott et al., 1995 (MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines: Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach [Pharmaceutical Biotechnology volume 6] eds. Powell & Newman
【非特許文献３】Lidgate et al., 1992 (Sterile Filtration of a Parenteral Emulsion. Pharmaceuticals Research 9(7): 860-863)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、水中油型エマルションの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明はサブミクロン水中油型エマルション、特にスクアレンを含むサブミクロン水中油型エマルションの製造方法に関する。特に、本発明は、a）油相を含むタンクに正圧をかける事によって、混合装置に油相を導入する工程を含む、水中油型エマルションの製造方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】パス回数による、およびろ過後のエマルション液滴のZ-平均直径の変化。エラーバーは標準偏差である。
【図２】パス回数による、およびろ過後のエマルション液滴の多分散性の変化。エラーバーは標準偏差である。
【図３】150cm2膜または1300cm2膜で測定した、3回パス後のエマルションの、フィルターの容量として表わしたろ過性。エラーバーは標準偏差である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
水中油型エマルションは、油相（１またはそれ以上の油および場合により1またはそれ以上の界面活性剤）を、界面活性剤を含む水相と組み合わせて混合することにより作られる。界面活性剤および顕微溶液化（ミクロ流動化、microfluidisation）は、安定したエマルション、すなわち少なくとも3年間は油相と水相に分離しないエマルションを形成する事を可能とする。
【００１０】
本発明者は、油相を含む容器（例えば供給タンク）に正圧をかける事によって混合装置内に油相を導入することによって、油相を、例えば膜ポンプによって導入した水中油型エマルションと比較して、減少した多分散性、減少した液滴サイズおよび改善したろ過性を持つ水中油型エマルションが生成することを立証した。
【００１１】
したがって、本発明は、a）油相を含むタンクに正圧をかける事によって混合装置に油相を導入する工程を含む水中油型エマルションの製造方法を提供する。
【００１２】
油相および/または水相を導入するのに使用できる圧力は、当業者により容易に決定することができる。本発明方法の特定の実施形態として、油相および/または水相は、約2から6bar、例えば約4から約5bar、例えば4.5barの圧力に調整することによって混合装置に導入される。
【００１３】
水中油型組成物がヒトへの投与に適しているためには、油相は代謝可能な（すなわち生分解性の）油を含む必要がある。油は、受容者に対して毒性がなく代謝によって変換が可能なあらゆる植物油、魚油、動物油または合成油とすることができる。木の実、種子、および穀粒は植物油の一般的な原料である。合成油もまた適している。したがって、本発明の水中油型エマルションは代謝可能な油を含み、特定の実施形態としては本発明の水中油型エマルションはスクアレンを含む（例えば約4％から6％[v/v]）。
【００１４】
油相は１またはそれ以上の代謝可能な油を含む事ができる。特定の実施形態として、油相はスクアレンまたはスクアラン、特にスクアレンを含む。本発明の更なる実施形態として、油相はトコールを含み、本発明の特定の実施形態として、油相はα-トコフェロールを含む。本発明の更なる実施形態として、油相はスクアレンおよびα-トコフェロールを含む。
【００１５】
油相は更に界面活性剤を含む事ができる。適した界面活性剤は当業者によく知られており、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（TWEEN80、POLYSORBATE80）、ソルビタントリオレアート（SPAN85）、ホスファチジルコリン（レシチン）、ポリオキシエチレン（12）セトステアリルエーテルおよびオクトキシノール-9（TRITON X-100）を含むが、これに限定されない。特定の実施形態として、油相はソルビタントリオレアート（SPAN85）を含む。本発明の特定の実施形態として、油相はスクアレンおよびソルビタントリオレアート（SPAN85）を含む。
【００１６】
本発明の更なる実施形態として、更に、b）水相を含むタンクに正圧をかけることによって、前記混合装置に水相を導入する工程を含む本明細書に記載の方法を提供する。
【００１７】
本発明の方法で使用される水相は水、例えば、注射用水（WFI）であってもよい。しかしながら、好ましくは本発明の水相は緩衝液を含む。適した緩衝液は当業者によく知られており、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、コハク酸塩緩衝液、マレイン酸塩緩衝液またはホウ酸塩緩衝液を含むが、これに限定されない。特定の実施形態として、緩衝液は、リン酸塩緩衝食塩水（PBS）、改変PBS（PBS-mod）およびクエン酸塩緩衝液のグループから選択される。特定の実施形態として、水相は、油相と混合されたときに実質的に等張の水中油型エマルションを提供する緩衝液を含む。
【００１８】
本発明の特定の実施形態として、水相は本明細書に記載の1またはそれ以上の界面活性剤を含む。本発明の特定の実施形態として、水相は界面活性剤ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（TWEEN80、POLYSORBATE80）を含む。
【００１９】
本発明の特定の実施形態として、[工程b)]の水相および[工程a)]の油相の導入は実質的に同時に行われる。
【００２０】
本発明の更なる実施形態として、本明細書に記載の水相および油相は約90：10または約95：5または約97.5：2.5または約98.75：1.25（パーセントv/v）の比率で導入される。
【００２１】
本明細書で使用する用語「混合装置」は、エマルションを形成するのに油相および水相を混合するために適した装置を意味する。本発明の特定の実施形態として、混合装置は高せん断混合装置である。適した高せん断混合装置は当業者によって知られており、高速羽根ホモジナイザー、インラインホモジナイザー、コロイドミルまたはソノレーターを含むが、これに限定されない。本発明の特定の実施形態において、混合装置は高圧ホモジナイザーである。適した高圧ホモジナイザーは当業者によって知られており、固定形状マイクロフリューダイザーまたは可変式構造高圧ホモジナイザーを含むが、これに限定されない。
【００２２】
本発明の更なる実施形態として、更に工程c）水中油型エマルションを形成するために油相および水相を混合する工程を含む、本明細書に記載の方法を提供する。
【００２３】
工程c)の混合の後の水中油型エマルションは、例えば高せん断力混合装置で混合した場合は、粗い水中油型エマルションであり得る。例えば減菌ろ過に適するように水中油型エマルションの油滴サイズを減少させるためには、工程c）からのエマルションを更に例えば高圧ホモジナイザーで処理することができる。
【００２４】
したがって、本発明の更なる実施形態として、更に工程d）サブミクロン水中油型エマルションを形成するために工程c）の水中油型エマルションを高圧均質化する工程を含む、本明細書に記載の方法を提供する。
【００２５】
熟練者はエマルションを高圧ホモジナイザーに通す回数を変更することで、望ましい油滴サイズを達成する事ができ、油滴サイズはそれぞれのサイクルを経ることで減少する。したがって、本発明の１つの実施形態として、エマルションを1、2、3、4、5、6、7、8またはそれ以上の回数高圧均質化する[工程f）]、本明細書に記載の方法を提供する。
【００２６】
本発明の更なる実施形態として、高圧均質化は約10000から約20000、約12000から約18000、約14000から約16000または約15000±1000psiの圧力で行われる。
【００２７】
高圧均質化の間、水中油型エマルションの温度は典型的に上昇するため、本発明の１つの実施形態として、水中油型エマルションは1回またはそれ以上の回数の後、しかし少なくともエマルションを高圧均質化した最後の回の後には、約15℃〜約30℃、約16℃〜約29℃、約17℃〜約28℃、約16℃〜約27℃または約16℃〜約28℃に冷却される。
【００２８】
更なる実施形態として、本発明の方法は、
e.水中油型エマルションをプレろ過し、
f.工程e）においてろ過された水中油型エマルションを減菌グレードフィルターに通してろ過する、工程を含む。
【００２９】
「減菌グレードフィルター」は、１cm2の有効ろ過面積当たり1×107以上の誘発レベルの微生物により誘発した後に無菌溶出液を生成するフィルターを意味する。減菌グレードフィルターは本発明の分野の当業者によく知られており、約0.2μmの孔サイズを持っており、約0.22μmの孔サイズをもつフィルターを含む。
【００３０】
プレフィルター（すなわち工程eで使用されるフィルター）で使用されるフィルターは減菌グレードフィルターの孔サイズ（すなわち約0.2μm）から約2μmの孔サイズまでの範囲の孔を持つことができる。特定の実施形態として、プレフィルターの孔サイズは減菌グレードフィルターの孔のサイズから約1μmのサイズの範囲である。例えば、工程e)で使用されるフィルターの孔のサイズは、約2μm、約2.5μm、約1μm、約0.9μm、約0.8μm、約0.9μm、約0.7μm、約0.6μm、約0.5μm、0.45μm、または減菌グレード例えば約0.2μm、例えば0.22μmである。
【００３１】
フィルターの膜は当業者によって知られている適した材料なら何からでも作製する事ができ、例えば、アセチルセルロース、ポリエーテルスルホン（PES）、ポリビニリデンフルオリド（PVDF）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）があるが、これに限定されない。本発明の特定の実施形態として、本発明の1つのまたはそれ以上のまたは全てのフィルター膜はポリエーテルスルホン、例えば親水性ポリエーテルスルホンを含む。
【００３２】
本発明の実施形態として、サブミクロン水中油型エマルションは、約2％から約15％、約4％から約12％、約5％から約10％、約4％から約6％、約8％から約12％、例えば約5％または約10％（v/v）の油を含む。
【００３３】
油相を膜ポンプのような手段により導入して製造された水中油型エマルションと比較して、本発明の方法では、より小さい油滴の水中油型エマルションが生成し、多分散性は減少し、および/または水中油型エマルションはより容易にろ過される。
【００３４】
したがって、本発明は本明細書に記載の方法により製造される水中油型エマルションを提供する。
【００３５】
本発明の水中油型エマルションはアジュバントとして有用であり得、免疫原性組成物を製造するために１以上の抗原と結合する事ができる。したがって、本発明は本明細書に記載の方法によって製造された水中油型エマルションおよび抗原を含む免疫原性組成物を提供する。
【００３６】
本発明の更なる実施形態として、i）本明細書に記載の方法により製造された水中油型エマルション、およびii）抗原を含むキットを提供する。
【００３７】
本発明の免疫原性組成物またはキットでの使用に適した抗原はインフルエンザウイルス由来の抗原を含むが、これに限定されない。特に、インフルエンザ抗原はサブユニットまたはスプリットインフルエンザウイルスである。インフルエンザ抗原は、卵由来または特に細胞培養由来のどちらかである。
【００３８】
本発明の水中油型エマルションはまたトコールを含む事ができる。トコールは当業者によってよく知られており、EP0382271に記載されている。特に、トコールはα-トコフェロールまたはその誘導体であり、例えばアルファ-トコフェロールコハク酸エステル（ビタミンEコハク酸エステルとしても知られている）がある。
【００３９】
本発明の特定の実施形態として、スクアレン（例えば約5％[v/v]）およびα-トコフェロール（例えば約5％[v/v]）を含む本発明の水中油型エマルションを提供する。
【００４０】
本発明の水中油型エマルションは1またはそれ以上の界面活性剤を含む。適した界面活性剤は当業者によく知られており、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（TWEEN80、POLYSORBATE80）、ソルビタントリオレアート（SPAN85）、ホスファチジルコリン（レシチン）、ポリオキシエチレン（12）セトステアリルエーテルおよびオクトキシノール-9（TRITON X-100）を含むが、これに限定されない。本発明の特定の実施形態として、水中油型エマルションはポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（TWEEN80、POLYSORBATE80）を含む。更なる実施形態として、本発明の水中油型エマルションはポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（TWEEN80、POLYSORBATE80）および更に別の活性剤、特にソルビタントリオレアート（SPAN85）を含む。
【００４１】
本発明の特定の実施形態として、水中油型エマルションは代謝可能な油（例えばスクアレン）、トコール（例えばα-トコフェロール）および界面活性剤（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート[TWEEN80、POLYSORBATE80]）を含む。
【００４２】
本発明の更なる実施形態として、本発明の水中油型エマルションは代謝可能な油（例えばスクアレン）、界面活性剤（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート[TWEEN80、POLYSORBATE80]）、および場合により第2の界面活性剤（例えばソルビタントリオレアート[SPAN85]）を含む。
【００４３】
本発明の更なる実施形態として、本発明の水中油型エマルションは代謝可能な油（例えばスクアレン）、非イオン性親水性ポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（12）セトステアリルエーテル）および非イオン性疎水性界面活性剤（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート[TWEEN80、POLYSORBATE80]またはソルビタントリオレアート[SPAN85]）を含む。
【００４４】
本明細書に記載の水中油型エマルションおよび免疫原性組成物は、医療における使用、特に病気の予防および/または治療に適している。
【００４５】
したがって、医療において使用するための、本明細書に記載のいずれかの方法によって製造された水中油型エマルションまたは本明細書に記載の免疫原性組成物を提供する。
【００４６】
更なる実施形態として、哺乳類、特に人の病気の予防および/または治療に使用するための、本明細書に記載のいずれかの方法によって製造された水中油型エマルションまたは本明細書に記載の免疫原性組成物を提供する。
【００４７】
更なる実施形態として、哺乳類、特に人の病気の予防および/または治療のための薬剤の製造における本明細書に記載のいずれかの方法によって製造された水中油型エマルションまたは本明細書に記載の免疫原性組成物の使用を提供する。
【００４８】
更なる実施形態として、本明細書に記載のいずれかの方法によって製造された水中油型エマルションまたは本明細書に記載の免疫原性組成物を哺乳類、特に人に投与する工程を含む治療方法を提供する。
【００４９】
本発明の「ワクチン組成物」に関する本明細書の実施形態はまた、本発明の「免疫原性組成物」に関する実施形態に適用可能であり、逆もまた同じである。
【００５０】
本明細書の用語「含む」は、発明者により場合によりあらゆる場合において用語「からなる」に代用可能であると意図されている。
【００５１】
数値xに関する用語「約」は、 x±5％または10％を意味する。
【実施例】
【００５２】
方法
水相を、注射用水、リン酸塩緩衝食塩水およびTweenを混合することでタンク2に準備した。油相を、トコフェロールおよびスクアレンを混合することでタンク1に準備した。両相を均質性が得られるまで撹拌した。トコフェロールの酸化を避ける為に装置全体に窒素を流した。
【００５３】
高圧ホモジナイザーには膜ポンプを使用して送り込んだ。両相を所要の流量割合で一緒に送り込んだ。初めは両相を高せん断ホモジナイザーに通し、そこで粗いエマルションを得た。さらに、高せん断ホモジナイザーに続いて、製造品を高圧ホモジナイザーに入れ、細かいエマルションを得た。
【００５４】
混合装置の出口において、製造品をタンク3（初回パス）に回収した。タンク2およびタンク1が空になってから、タンク3からのエマルションを混合装置の注入口に向け、2回目のパスを行った。2回目のパスの終わりには、製造品をタンク2に回収した。タンク3が空になってから、タンク2からのエマルションを混合装置の注入口に向け、3回目のパスを行った。エマルションをタンク3に回収し、ろ過をするまで窒素雰囲気下で貯蔵した。
【００５５】
供給方法の影響を評価する為に、方法をまた、装置全体に正の供給圧力をかけて行った。このようにする為に、タンクを窒素または空気で加圧した。
【００５６】
結果
サイズは、光の拡散に基づく方法である動的光散乱法によって測定した。Z-平均直径は装置全体に正圧をかけた方法と比較して供給に膜ポンプを使用した方法の方がより小さかった。この違いは方法の初め（パス1）では大きかったが、方法の最後（ろ過した製造品）では減少する傾向であった。加えて、システム全体が正圧下の状態で供給を行ったとき、サイズの変動性はまた、パスを加えると減少した。これは膜ポンプを使用した場合には起こらない。図1を参照。
【００５７】
多分散性は供給方法が何であれ同じ範囲であったが、再現性は装置全体に正圧をかけて行った方法の方がずっと良好であった。図2を参照。
【００５８】
ろ過性は増加し、最も重要なことは、再現性が、供給が膜ポンプで行われた方法と比較して装置全体に正圧をかけて行った方法の方が改善されていた。図3を参照。
【００５９】
結論
装置全体に正圧をかけることによる混合装置への供給は、より小さな液滴サイズおよび改善されたろ過性を得ることを可能とする。さらに、ZAD、PDIおよびろ過性で得られた標準偏差が供給を膜ポンプにより行った方法と比較してより小さかったことから、装置全体に正圧をかけることによる混合装置への供給はまた、方法の再現性も改善している。
【図１】
2013528195.tif 000002
【図２】
2013528195.tif 000003
【図３】
2013528195.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月8日(2013.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病気の予防および/または治療での使用に適している水中油型エマルションの製造方法であって、
a.スクアレンを含む油相を収容したタンクに正圧をかけることによって混合装置に油相を導入し、
b. 水相を含むタンクに正圧をかけることによって前記混合装置に水相を導入し、
c. 油相と水相を混合して水中油型エマルションを形成し、
d. 工程c）の水中油型エマルションを高圧均質化に付してサブミクロンの水中油型エマルションを形成し、
e.水中油型エマルションをプレろ過し、
f.工程e）においてろ過された水中油型エマルションを減菌グレードフィルターに通してろ過する
工程を含み、圧力を約2〜6barに調節することによって油相および/または水相を混合装置に導入する、前記方法。
【請求項２】
工程a)およびb)を実質的に同時に行う、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
水相および油相を、約90：10、95：5または98.75：1.25（パーセント v/v）の比率で導入する、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４】
混合装置が高せん断力ホモジナイザーまたは高圧ホモジナイザーである、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
工程d)を2、3、4、5または6回行う、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
高圧均質化を約10000psi〜約20000psi、約12000psi〜約18000psi、約14000psi〜約16000psiまたは約15000±1000psiで行う、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
工程d)を行った各回の後に、水中油型サブミクロンエマルションを、15℃〜30℃、16℃〜29℃、17℃〜28℃、16℃〜27℃または16℃〜28℃に冷却する、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
水中油型エマルションが2％〜8％（v/v）の油を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
水中油型サブミクロンエマルションが4％〜6％（v/v）の油を含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
水中油型エマルションが8％〜12％（v/v）の油を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
油相が界面活性剤を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
界面活性剤がソルビタントリオレアート（SPAN85）である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
油相がトコール、例えばα-トコフェロールを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
水相が水溶液および界面活性剤を含む、請求項1から13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（TWEEN80、POLYSORBATE80）である、請求項14に記載の方法。
【国際調査報告】
2013528195.tif 000005
2013528195.tif 000006
2013528195.tif 000007