(57)【要約】本発明は、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子において同定された新規突然変異を提供するものであり、この突然変異は、嚢胞性線維症（ＣＦ）およびＣＦ関連障害のより正確な診断のために用いることができる。ＣＦＴＲ遺伝子における１つ以上の突然変異の存在を決定するために５人の被験体から得た試料を検査する方法を提供し、この場合、１つ以上の突然変異の存在は、その被験体がＣＦもしくはＣＦ関連障害を有する、またはＣＦＴＲ突然変異の保因者であることを示す。
2013521829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子またはタンパク質における表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異の存在を決定するために被験体から得た試料を検査する工程を含む方法であって、前記１つ以上の突然変異の存在が、前記被験体が嚢胞性線維症（ＣＦ）もしくはＣＦ関連障害を有するか、ＣＦもしくはＣＦ関連障害を発症する危険性があるか、またはＣＦＴＲ突然変異の保因者であることの指標となる、方法。
【請求項２】
前記１つ以上の突然変異が、表１、２または３から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の突然変異が、表１または２から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の突然変異が、表１から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上の突然変異が、ＣＦＴＲ突然変異パネルの一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、核酸を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記検査する工程が、核酸配列決定を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記検査する工程が、ハイブリダイゼーションを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ハイブリダイゼーションが、表１、表２、表３または表４から選択される前記１つ以上の突然変異に対応するＣＦＴＲ遺伝子（配列番号：１）内の領域に特異的な１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを使用し、かつ単一ヌクレオチドミスマッチを許容しないように、十分にストリンジェントな条件下で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハイブリダイゼーションが、マイクロアレイを用いて行われる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
前記検査する工程が、制限酵素消化を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記検査する工程が、ＰＣＲ増幅を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＣＲ増幅が、デジタルＰＣＲ増幅またはリアルタイムＰＣＲである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記検査する工程が、プライマー伸長を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマー伸長が、一塩基プライマー伸長である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記検査する工程が、マルチプレックス対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）を行うことを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が、タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記検査する工程が、アミノ酸配列決定を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記検査する工程が、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異に対応する１つ以上のエピトープを特異的に認識する１つ以上の抗体を使用してイムノアッセイを行うことを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記検査する工程が、プロテアーゼ消化を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記プロテアーゼ消化が、トリプシン消化である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記検査する工程が、２Ｄゲル電気泳動をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記検査する工程が、質量分析を用いて前記１つ以上の突然変異の存在を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記質量分析の形式が、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化、飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）、フーリエ変換、およびそれらの組み合わせの中から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が、細胞、組織、全血、口内洗浄液、血漿、血清、尿、糞便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、絨毛膜絨毛試料培養物、羊水、羊水培養物、頚部洗浄液、およびそれらの組み合わせから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ＣＦＴＲ突然変異についての追加の検査と共に用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
正常ＣＦＴＲ遺伝子には特異的に結合するが、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子には結合しない核酸プローブ。
【請求項２８】
正常ＣＦＴＲ遺伝子には特異的に結合するが、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子には結合しない１つ以上のプローブを含むアレイ。
【請求項２９】
表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子には特異的に結合するが、正常ＣＦＴＲ遺伝子には結合しない核酸プローブ。
【請求項３０】
表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子には特異的に結合するが、正常ＣＦＴＲ遺伝子には結合しない１つ以上のプローブを含むアレイ。
【請求項３１】
正常ＣＦＴＲタンパク質には特異的に結合するが、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲタンパク質には結合しない抗体。
【請求項３２】
表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲタンパク質には特異的に結合するが、正常ＣＦＴＲタンパク質には結合しない抗体。
【請求項３３】
正常ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質と表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質とを区別する１つ以上の試薬を含むキット。
【請求項３４】
前記１つ以上の試薬が、１つ以上の核酸プローブを含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
前記１つ以上の試薬が、１つ以上の抗体を含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３６】
前記１つ以上の試薬が、マイクロアレイの形態である、請求項３２に記載のキット。
【請求項３７】
プライマー伸長のための試薬をさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３８】
健常個体の指標となる対照をさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３９】
個体が、ＣＦもしくはＣＦ関連障害を有するかどうか、ＣＦもしくはＣＦ関連障害を発症する危険性があるかどうか、またはＣＦＴＲ突然変異の保因者であるかどうかを決定する方法についての指示をさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項４０】
表１、表２、表３および表４に示す１つ以上の突然変異に対応する情報をコードするコンピュータ可読媒体。
【請求項４１】
（ａ）被験体から得た試料を提供する工程；
（ｂ）ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質における、表１、表２、表３または表４から選択される所定の位置での突然変異の存在について、前記試料を検査する工程
を含む方法であって、
前記所定の位置での前記突然変異の存在が、前記被験体のＣＦもしくはＣＦ関連障害を発症する危険性が増大しているか、または前記被験体がＣＦＴＲ突然変異の保因者であることの指標となる、方法。
【請求項４２】
前記検査する工程が、表１、表２、表３または表４から選択される前記所定の位置でのヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の正体を決定することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記突然変異の存在が、前記所定の位置でのヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の正体を対照と比較することによって決定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記突然変異が表１、表２、表３または表４に載っているかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１０年３月２２日に出願された米国特許出願第６１／３１６，３２１号、および２０１０年６月２８日に出願された同第６１／３５９，０２９号に対する優先権を主張する。米国特許出願第６１／３１６，３２１号および同第６１／３５９，０２９号の各々の開示は、本明細書にそれらの全体が参考として明確に援用される。
【背景技術】
【０００２】
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、白人集団における最も一般的で重篤な常染色体劣性障害である。北米では２，５００人中おおよそ１人の白人生産児がＣＦに罹患する（非特許文献１）。この疾患発病率は、アフリカ系アメリカ人、ラテンアメリカ人およびアジア人におけるほうが低い。２５人中おおよそ１人の白人は、この疾患の保因者である。その原因遺伝子は、染色体７の長いアーム上に存在する２５０，０００塩基対ゲノム配列に局在定位されている。この配列は、「嚢胞性膜貫通調節因子」（すなわち「ＣＦＴＲ」）と呼ばれる膜結合タンパク質をコードする。ＣＦＴＲ遺伝子は、２７のエキソンを含有し、１４８０アミノ酸のタンパク質をコードする。幾つかの領域がＣＦＴＲタンパク質において機能的重要性を有すると考えられており、それらの領域としては、ヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＦ）と呼ばれるＡＴＰ結合のための２つの領域；プロテインキナーゼＡおよびＣによるリン酸化のための多数の潜在的部位を有する調節（Ｒ）領域；および細胞膜と相互作用すると考えられている２つの疎水性領域が挙げられる。
【０００３】
古典的嚢胞性線維症の主症状としては、慢性肺疾患、膵外分泌機能不全、男性先天性精管欠損症、および高い汗中電解質レベルが挙げられる。これらの症状は、外分泌障害であるＣＦと一致する。ＣＦ患者細胞の上皮の頂端膜を横断するイオン輸送の分析は最近進歩してきているが、クロライドチャネルの異常調節がこの疾患の唯一の欠陥に相当することは明確でない。ＣＦＴＲ遺伝子における突然変異は、非定型ＣＦならびに単一症候性疾患、例えば男性先天性精管欠損症、特発性慢性膵炎および慢性副鼻腔炎、にも関連している（非特許文献２；非特許文献３）。様々なＣＦＴＲ遺伝子突然変異が公知である。それらの１つは、第一の推定ＮＢＦドメイン内のフェニルアラニン残基５０８の欠落をもたらす。ΔＦ５０８と呼ばれるこの突然変異は、白人患者におけるＣＦＴＲ染色体の約７０％を占めており、白人ＣＦ患者の染色体において見出される主ハプロタイプに高度に関連していた（非特許文献４；非特許文献５）。しかし、あまり一般的ではないがΔＦ５０８を伴わない白人ＣＦ染色体に関連したハプロタイプも存在し、これは、対立遺伝子異質性がＣＦおよびＣＦ関連障害に存在することを裏付ける。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｏａｔら、Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、（１９８９）第６版、２６４９−２６８０頁、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、ＮＹ
【非特許文献２】ＮｏｏｎｅおよびＫｎｏｗｌｅｓ、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．、（２００１）第２巻、３２８頁
【非特許文献３】Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ、（２００７）第７４巻、２４１頁
【非特許文献４】Ｋｅｒｅｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（１９８９）第２４５巻、１０７３頁
【非特許文献５】Ｌｅｍｎａら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、（１９９０）第３２２巻、２９１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、白人ＣＦ患者の残りの３０％に存在する他のＣＦＴＲ突然変異体対立遺伝子、ならびに他の人種および民族群において見いだされる他の対立遺伝子についての、より有効な遺伝子スクリーニングが必要とされている。そのような対立遺伝子についての知識は、スクリーニングおよび／または検査用のプローブを設計するために、ならびに他のスクリーニングおよび／または検査法を考案するために、用いることができる。ＣＦＴＲ突然変異体対立遺伝子に利用可能なプローブセットが完全であるほど、診断は正確になる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＣＦおよびＣＦ関連障害のより正確な診断に用いることができる、ＣＦＴＲ遺伝子において同定された新規突然変異に関する方法、製品およびシステムを提供する。
【０００７】
１つの態様において、本発明は、ＣＦＴＲ遺伝子における突然変異について検査するための方法を提供し、この方法は、ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質における表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異の存在を決定するために被験体から得た試料を検査することを含み、この検査において、前記１つ以上の突然変異の存在は、前記被験体がＣＦもしくはＣＦＴＲ関連障害を有するか、ＣＦもしくはＣＦ関連障害を発症する危険性があるか、またはＣＦＴＲ突然変異の保因者であることを示す。一部の実施形態において、前記１つ以上の突然変異は、表１、２または３から選択される。一部の実施形態において、前記１つ以上の突然変異は、表１または２から選択される。一部の実施形態において、前記１つ以上の突然変異は、表１から選択される。一部の実施形態において、表１、表２、表３または表４から選択される前記１つ以上の突然変異は、ＣＦＴＲ突然変異のパネルの一部である。
【０００８】
本発明のさらに他の実施形態は、前記方法を行うためのシステムを含む。例えば、前記システムは、ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質における表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異の存在を決定するために被験体から得た試料を検査するためのステーションまたはデバイスを具備することができ、この検査において、前記１つ以上の突然変異の存在は、前記被験体がＣＦもしくはＣＦＴＲ関連障害を有するか、ＣＦもしくはＣＦ関連障害を発症する危険性があるか、またはＣＦＴＲ突然変異の保因者であることを示す。一部の実施形態において、前記１つ以上の突然変異は、表１、２または３から選択される。一部の実施形態において、前記１つ以上の突然変異は、表１または２から選択される。一部の実施形態において、前記１つ以上の突然変異は、表１から選択される。一部の実施形態において、表１、表２、表３または表４から選択される前記１つ以上の突然変異は、ＣＦＴＲ突然変異のパネルの一部である。また、前記システムは、データの分析および／または解釈のためのデバイスを具備することができる。例えば、本発明の突然変異のうちの１つの存在についてのデータを分析するためのソフトウェアを有するコンピュータを前記システムに含めることができる。
【０００９】
以下の実施形態を本発明の方法またはシステムのいずれかにおいて用いることができる。一部の実施形態において、前記試料は、単離された核酸を含有する。一部の実施形態において、前記検査する工程は、核酸配列決定を含む。一部の実施形態において、前記検査する工程は、ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態において、前記ハイブリダイゼーションは、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異に対応するＣＦＴＲ遺伝子（配列番号：１）（図１）内の領域に特異的な１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを使用して、および単一ヌクレオチドミスマッチを許容しないように、十分にストリンジェントな条件下で行われる。一部の実施形態において、前記ハイブリダイゼーションは、マイクロアレイを用いて行われる。一部の実施形態において、前記検査する工程は、制限酵素消化を含む。一部の実施形態において、前記検査する工程は、ＰＣＲ増幅を含む。一部の実施形態において、前記ＰＣＲ増幅は、デジタルＰＣＲ増幅である。一部の実施形態において、前記検査する工程は、プライマー伸長を含む。一部の実施形態において、前記プライマー伸長は、一塩基プライマー伸長である。一部の実施形態において、前記検査する工程は、マルチプレックス対立遺伝子特異的プライマー伸長（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）（ＡＳＰＥ）を行うことを含む。さらに他の実施形態において、前記検査する工程は、リアルタイムＰＣＲを行うことを含む場合がある。
【００１０】
一部の実施形態において、前記試料は、精製または部分精製タンパク質を含有する。一部の実施形態において、前記検査する工程は、アミノ酸配列決定を含む。例えば、一定の実施形態において、前記システムは、アミノ酸配列決定用のデバイスを含む。一部の実施形態において、前記検査する工程は、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異に対応する１つ以上のエピトープを特異的に認識する１つ以上の抗体を使用してイムノアッセイを行うことを含む。一部の実施形態において、前記検査する工程は、プロテアーゼ消化（例えば、トリプシン消化）を含む。一部の実施形態において、前記検査する工程は、２Ｄゲル電気泳動を行うことを含む。
【００１１】
一部の実施形態において、前記検査する工程は、質量分析を用いて前記１つ以上の突然変異の存在を決定することを含む。一部の実施形態において、前記質量分析の形式は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化、飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）、フーリエ変換、およびそれらの組み合わせの中から選択される。
【００１２】
一部の実施形態において、前記試料は、細胞、組織、全血、口内洗浄液、血漿、血清、尿、糞便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、絨毛膜絨毛試料培養物、羊水、羊水培養物、頚部洗浄液（ｔｒａｎｓｃｅｒｖｉｃａｌ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ）、およびそれらの組み合わせから得られる。さらなる実施形態において、前記試料は、該試料が含有する胎児核酸における１つ以上のＣＦＴＲ突然変異の存在について該試料を検査するために、妊婦から得られる。例えば、一定の実施形態において、前記システムは、前記試料を処理するためのステーションを具備する。
【００１３】
さらにもう１つの態様において、本発明は、ＣＦＴＲ突然変異についてスクリーニングおよび／または検査するための方法を提供し、この方法は、（ａ）被験体から得た試料を提供する工程；（ｂ）ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質における、表１、表２、表３または表４から選択される所定の位置での突然変異の存在について、前記試料を検査する工程を含み、前記所定の位置での突然変異の存在は、前記被験体のＣＦもしくはＣＦ関連障害を発症する危険性が増大しているか、または前記被験体がＣＦＴＲ突然変異の保因者であることの指標となる。
【００１４】
本発明のさらに他の実施形態は、前記方法を行うためのシステムを含む。例えば、前記システムは、ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質における表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異の存在を決定するために被験体から得た試料を検査するためのステーションまたはデバイスを具備することができ、この検査において、前記１つ以上の突然変異の存在は、前記被験体がＣＦもしくはＣＦＴＲ関連障害を有するか、ＣＦもしくはＣＦ関連障害を発症する危険性があるか、またはＣＦＴＲ突然変異の保因者であることを示す。一部の実施形態において、前記１つ以上の突然変異は、表１、２または３から選択される。一部の実施形態において、前記１つ以上の突然変異は、表１または２から選択される。一部の実施形態において、前記１つ以上の突然変異は、表１から選択される。一部の実施形態において、表１、表２、表３または表４から選択される前記１つ以上の突然変異は、ＣＦＴＲ突然変異のパネルの一部である。また、前記システムは、データの分析および／または解釈のためのデバイスを具備することができる。例えば、本発明の突然変異のうちの１つの存在についてのデータを分析するためのソフトウェアを有するコンピュータを前記システムに含めることができる。
【００１５】
以下の実施形態を本発明の方法またはシステムのいずれかにおいて用いることができる。一部の実施形態において、前記検査する工程は、表１、表２、表３または表４から選択される所定の位置でのヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の正体を決定することを含む。
【００１６】
一部の実施形態において、前記突然変異の存在は、前記所定の位置でのヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の正体を対照と比較することによって決定される。
【００１７】
一部の実施形態において、前記方法は、前記突然変異が表１、表２、表３または表４に載っているかどうかを決定する工程をさらに含む。
【００１８】
もう１つの態様において、本発明は、本明細書に記載する新規ＣＦＴＲ突然変異を検出するための製品、例えば試薬、を提供する。そのような試薬を、タンパク質配列および／または核酸配列における本明細書に記載する突然変異の検出のために使用することができる。
【００１９】
一部の実施形態において、本発明は、正常なＣＦＴＲ遺伝子に特異的に結合するが、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子にはしない核酸プローブを提供する。一部の実施形態において、本発明は、多数のプローブ（例えば、リアルタイムＰＣＲもしくは配列決定のために使用することができるようなもの）、または１つ以上のプローブを含有するアレイを提供し、これらのプローブは、正常なＣＦＴＲ遺伝子に特異的に結合するが、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子にはしない。一部の実施形態において、本発明は、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子に特異的に結合するが、正常ＣＦＴＲ遺伝子にはしない核酸プローブを提供する。一部の実施形態において、前記アレイは、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子に特異的に結合するが、正常ＣＦＴＲ遺伝子にはしない１つ以上のプローブを含む。
【００２０】
一部の実施形態において、本発明は、正常なＣＦＴＲタンパク質に特異的に結合するが、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲタンパク質にはしない抗体を提供する。一部の実施形態において、本発明は、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲタンパク質には特異的に結合するが、正常ＣＦＴＲタンパク質には結合しない抗体を提供する。
【００２１】
一部の実施形態において、本発明は、正常ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質と表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質とを識別する１つ以上の試薬を含むキットを提供する。そのようなキットは、例えばＣＦＴＲ突然変異についてのスクリーニングおよび／または検査に、有用であり得る。一部の実施形態において、前記１つ以上の試薬は、１つ以上の核酸プローブを含む。一部の実施形態において、前記１つ以上の試薬は、１つ以上の抗体を含む。一部の実施形態において、前記１つ以上の試薬は、マイクロアレイの形態で備えられる。一部の実施形態において、前記キットは、プライマー伸長用の試薬をさらに含む。または、突然変異の検出用のプローブを備えさせることができる。一部の実施形態において、前記キットは、健常個体の指標となる対照をさらに含む。一部の実施形態において、前記キットは、個体が、ＣＦもしくはＣＦ関連障害を有するかどうか、ＣＦもしくはＣＦ関連障害を発症する危険性があるかどうか、またはＣＦＴＲ突然変異の保因者であるかどうかを決定する方法についての指示を含む。
【００２２】
さらにもう１つの態様において、本発明は、表１、表２、表３および表４に示す１つ以上の突然変異に対応する情報をコードするコンピュータ可読媒体を提供する。そのようなコンピュータ可読媒体は、本明細書に記載のシステムの一部であり得る。
【００２３】
本発明の他の特徴、目的および利点は、後続の詳細な説明およびクレームでわかる。しかし、詳細な説明、図面およびクレームは、本発明の実施形態を示すものであるが、限定としてではなく単に実例として与えるものである。本発明の範囲内の様々な変更および変形が当業者に明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−２】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−３】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−４】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−５】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−６】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−７】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−８】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−９】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−１０】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−１１】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−１２】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−１３】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−１４】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−１５】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−１６】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−１７】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−１８】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−１９】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−２０】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−２１】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−２２】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−２３】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−２４】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−２５】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−２６】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−２７】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−２８】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−２９】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−３０】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−３１】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−３２】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−３３】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−３４】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−３５】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−３６】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−３７】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−３８】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−３９】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−４０】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−４１】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−４２】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−４３】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−４４】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−４５】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−４６】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−４７】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−４８】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−４９】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−５０】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−５１】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−５２】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−５３】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−５４】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−５５】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図１−５６】図１は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子のゲノム配列である。
【図２−１】図２は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲのｃＤＮＡ配列である。
【図２−２】図２は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲのｃＤＮＡ配列である。
【図２−３】図２は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲのｃＤＮＡ配列である。
【図３】図３は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲのアミノ酸配列である。
【図４−１】図４は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子の５’末端のヌクレオチド配列である。
【図４−２】図４は、本発明の実施形態によるＣＦＴＲ遺伝子の５’末端のヌクレオチド配列である。
【図５】図５は、本発明の実施形態によるシステムの略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
本発明をより容易に理解するために、一定の用語を先ず定義する。以下の用語および他の用語についての追加の定義を本明細書中いたるところに示す。
【００２６】
本願において、「または」の使用は、別の言明がない限り、「および／または」を意味する。本願において用いる場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの用語の語尾変化形、例えば「含む（動名詞形：ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（三人称単数現在形：ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、他の添加物、成分、整数または工程を除外しないためのものである。本願において用いる場合、用語「約」および「おおよそ」は、同義語として用いる。約／おおよそを伴うまたは伴わない、本願において用いるいずれの数詞も、当業者によって理解されている任意の通常のゆらぎをカバーすることを意図したものである。一定の実施形態において、用語「おおよそ」または「約」は、別の言明がない限り、または別様に文脈から明白でない限り（そのような数値が、可能な値の１００％を超える場合を除き）、言明する参照値の両方向に（より大きいまたはより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内に入る値の範囲を指す。
【００２７】
抗体：本願において用いる場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされている１つ以上のポリペプチドから成るポリペプチドを指す。認知されている免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、典型的にカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、典型的にガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、そしてまたこれらが、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ規定する。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位が四量体を構成することは公知である。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアから成り、各ペアは、１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主として担当する約１００から１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語「可変軽鎖」（ＶＬ）および「可変重鎖」（ＶＨ）は、これらの軽および重鎖をそれぞれ指す。抗体は、特定の抗原に特異的であることができる。抗体またはその抗原は、分析物または結合パートナーのいずれかであり得る。抗体は、インタクト免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼでの消化によって生成される多数の十分に特性づけされたフラグメントとして、存在する。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域内のジスルフィドリンケージより下で抗体を消化してＦ（ａｂ’）２を生成し、このＦ（ａｂ’）２はＦａｂの二量体であり、このＦａｂは、それ自体、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に連結されている軽鎖である。Ｆ（ａｂ’）２を穏やかな条件下で還元して、ヒンジ領域内のジスルフィドリンケージを破壊し、それによってそのＦ（ａｂ’）２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は、本質的に、ヒンジ領域の一部を伴うＦａｂである（抗体フラグメントのより詳細な説明については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照のこと）。様々な抗体フラグメントが、インタクト抗体の消化の点から定義されているが、化学的にまたは組換えＤＮＡ方法論を利用することによってそのようなＦａｂ’フラグメントを新たに合成できることは当業者には理解されるであろう。従って、用語「抗体」は、本願において用いる場合、全長抗体の修飾によって生成された抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ方法論を用いて新たに合成された抗体フラグメントも含む。一部の実施形態において、抗体は、可変重および軽鎖が互いに（直接またはペプチドリンカーによって）連結されて連続ポリペプチドを形成する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体などの一本鎖抗体である。一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、直接連結されているまたはペプチドをコードするリンカーによって連結されているＶＨをコードする配列とＶＬをコードする配列とを含む核酸から発現され得る、共有結合型ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら（１��８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−５８８３を参照；この全内容は参照により本明細書に援用されている）。抗体Ｖ領域からの自然に凝集した、しかし化学的に分離された軽および重ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に同様の三次元構造にフォールディングすることとなるｓｃＦｖ分子に変換するために、多数の構造が存在する。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号および同第４，９５６，７７８号を参照のこと。
【００２８】
対立遺伝子：本願において用いる場合、用語「対立遺伝子」は、同じ遺伝子座（例えば遺伝子）のヌクレオチド配列の異なるバージョンを指す。
【００２９】
対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）：本願において用いる場合、用語「対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）」は、対応するＤＮＡ配列にハイブリダイズするプライマーであって、そのようなプライマーの３’末端ヌクレオチドのハイブリダイゼーション成功に依存して伸長されるものであるプライマーを利用する、突然変異検出方法を指す。典型的に、ターゲット配列との完全マッチを生じさせる３’末端ヌクレオチドを有する伸長プライマーを伸長させて、伸長生成物を形成する。修飾ヌクレオチドを伸長生成物に組み込むことができ、そのようなヌクレオチドは、検出のために伸長生成物を有効に標識する。あるいは、そうではなく、伸長プライマーは、ターゲット配列とのミスマッチを生じさせる３’末端ヌクレオチドを含むことがある。この場合、プライマー伸長は、伸長に用いられるポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ活性を偶発的に有さない限り起こらない。
【００３０】
増幅：本願において用いる場合、用語「増幅」は、ターゲット核酸をコピーするための方法であって、その結果、選択核酸配列のコピー数を増加させるものである当該技術分野において公知の任意のコピー方法を指す。増幅は、指数関数的であることもあり、または線形であることもある。ターゲット核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい。典型的に、このようにして増幅された配列は、「アンプリコン」を形成する。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、転写ベースの増幅、等温増幅、ローリングサークル増幅などをはじめとする（しかしこれらに限定されない）様々な方法で遂行することができる。プライマーペアの相対的に類似した量のそれぞれのプライマーを用いて増幅を行って、二本鎖アンプリコンを生じさせることができる。しかし、当該技術分野において周知であるように（例えば、Ｐｏｄｄａｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  １４：２５−３２（２０００））、非対称ＰＣＲを用いて、主としてまたは排他的に一本鎖生成物を増幅することができる。これは、それぞれのプライマーペアを、一方のプライマーの濃度をそのペアの他方のプライマーに対して有意に低減させること（例えば、１００倍の差）によって使用して、果たすことができる。非対称ＰＣＲによる増幅は、一般に線形である。加えて、リアルタイムＰＣＲなどの方法を利用することができる。当業者は、異なる増幅法を一緒に用いることができることがわかるであろう。
【００３１】
動物：本願において用いる場合、用語「動物」は、動物界の任意の構成員を指す。一部の実施形態において、「動物」は、任意の発育段階のヒトを指す。一部の実施形態において、「動物」は、任意の発育段階の非ヒト動物を指す。一定の実施形態において、前記非ヒト動物は、哺乳類（例えば、齧歯動物、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態において、動物としては、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または蠕虫が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子改変動物、および／またはクローンであり得る。
【００３２】
おおよそ：本願において用いる場合、用語「おおよそ」または「約」は、関心のある１つ以上の値に適用するとき、言明する参照値に類似している値を指す。一定の実施形態において、用語「おおよそ」または「約」は、別の言明がない限り、または別様に文脈から明白でない限り（そのような数値が、可能な値の１００％を超える場合を除き）、言明する参照値の両方向に（より大きいまたはより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内に入る値の範囲を指す。
【００３３】
生体試料：本願において用いる場合、用語「生体試料」は、生物源から得られる任意の試料を包含する。生体試料としては、非限定的例として、血液、羊水、血清、尿、糞便、表皮試料、皮膚試料、チークスワブ、精液、羊水、培養細胞、骨髄試料および／または絨毛膜絨毛を挙げることができる。適便な生体試料は、例えば口腔前庭の表面から細胞を擦過採取することによって、得ることができる。用語生体試料は、本明細書に記載の検出のために核酸またはタンパク質を遊離するように処理したまたは別様に利用可能にした試料を包含する。例えば、生体試料としては、生体試料中の細胞からＲＮＡの逆転写によって得たｃＤＮＡを挙げることができる。前記生体試料は、胎児、若年成人、成人およびこれらに類するものなどのライフステージから得ることができる。固定または凍結組織も使用することができる。
【００３４】
保因者：用語「保因者」は、ＣＦに関連して用いる場合、症状のない人であるが、彼の／彼女の子供に伝えられ得るＣＦＴＲ突然変異を保有する人を指す。典型的に、保因者は、病因性突然変異を含有する１つのＣＦＴＲ対立遺伝子と、正常であるまたは疾患に関連のない第二の対立遺伝子と保有する。ＣＦおよびＣＦ関連障害は、「常染色体劣性」疾患であり、これは、突然変異が、非疾患関連対立遺伝子を伴うヘテロ接合構造で存在するとき表現型効果を殆どまたはまったく生じさせないが、人が、ホモ接合性である、すなわち両方のＣＦＴＲ対立遺伝子が同じ病因性突然変異を含有する突然変異体対立遺伝子である、または複合ヘテロ接合性である、すなわち両方のＣＦＴＲ対立遺伝子が２つの異なる病因性突然変異を含有する突然変異体対立遺伝子である、とき「疾病状態」を生じさせることを意味する。保因者ステータスは、ある人が保因者であるか否かである。
【００３５】
コード配列対非コード配列：本願において用いる場合、用語「コード配列」は、転写および／または翻訳されて、ｍＲＮＡをおよび／またはそのポリペプチドもしくはそのポリペプチドのフラグメントについてのｍＲＮＡを生成させることができる、核酸もしくはその補体の配列、またはそれらの一部を指す。コード配列は、細胞の生化学的機構によって互いに連結されて成熟ｍＲＮＡを生じさせる、ゲノムＤＮＡまたは未成熟一次ＲＮＡ転写産物内のエキソンを含む。アンチセンス鎖は、そのような核酸の補体であり、コード配列をそこから推論することができる。本願において用いる場合、用語「非コード配列」は、インビボでアミノ酸に転写されない、またはｔＲＮＡがアミノ酸を配置するように相互作用しないもしくはアミノ酸を配置するように試みない、核酸もしくはその補体の配列、またはその一部を指す。非コード配列は、ゲノムＤＮＡまたは未成熟一次ＲＮＡ転写産物内のイントロン配列と、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどのような遺伝子付随配列の両方を含む。
【００３６】
補体：本願において用いる場合、用語「補体」、「相補的」および「相補性」は、ワトソン／クリック対合規則によるヌクレオチド配列の対合を指す。例えば、配列５’−ＧＣＧＧＴＣＣＣＡ−２’は、５’−ＴＧＧＧＡＣＣＧＣ−３’の相補的配列を有する。相補的配列は、ＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡの配列である場合もある。天然核酸において一般に見いだされない一定の塩基が、イノシン、７−デアザグアニン、ロックド核酸（ＬＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）をはじめとする（しかしこれらに限定されない）相補的核酸の中に含まれていることがある。補体は、完全である必要はない；安定したデュプレックスが、ミスマッチ塩基対、変性したまたはマッチしていない塩基を含有することもある。核酸技術分野の技術者は、例えばオリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、イオン強度ならびにミスマッチ塩基対の発生率を含む多数の変数を考慮して、経験的にデュプレックス安定性を決定することができる。
【００３７】
対照：本願において用いる場合、用語「対照」は、結果を比較する標準物質であるという、その技術分野で了解されている意味を有する。典型的に、対照は、変数を分離することによるそのような変数について推断するための実験において完全性を増大させるために用いられる。一部の実施形態において、対照は、比較対照を得るために検査反応またはアッセイと同時に行われる、反応またはアッセイである。１つの実験では、「検査」（すなわち、検査される変数）を適用する。第二の実験「対照」では、検査される変数を適用しない。一部の実施形態において、対照は、歴史的対照（すなわち、以前に行われた検査もしくはアッセイのもの、または既知である量もしくは結果）である。一部の実施形態において、対照は、印刷されたまたは別様に保存された記録である、または前記記録を含む。対照は、陽性対照であることもあり、または陰性対照であることもある。
【００３８】
粗製の：本願において用いる場合、用語「粗製の」は、生体試料に関連して用いるとき、実質的に未精製状態試料を指す。例えば、粗製試料は、細胞溶解産物または生検組織試料であり得る。粗製試料は、溶解状態で存在することもあり、または乾燥標本として存在することもある
欠失：本願において用いる場合、用語「欠失」は、天然に存在する核酸から１つ以上のヌクレオチドを除去する突然変異を包含する。
【００３９】
エピトープ：本願において用いる場合、用語「エピトープ」は、特定の抗体または抗体様タンパク質と接触する、分子または分子化合物（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質複合体）のフラグメントまたは一部分を指す。
【００４０】
家族歴：本願において用いる場合、用語「家族歴」は、親および兄弟を含む、個人の直近の血縁関係の家族（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｎｂｅｒ）に関係する事象（例えば、ＣＦ疾患、ＣＦ関連障害またはＣＦＴＲ突然変異保因者）の存在を概して指す。時として、家族歴は、祖父母も含むことがある。
【００４１】
隣接する：本願において用いる場合、「隣接する」は、プライマーが、ターゲット核酸にハイブリダイズして、該ターゲット上の増幅しようとする関心のある領域と隣り合うことを意味する。好ましいプライマーは、適するＤＮＡポリメラーゼによってヌクレオチドがプライマーの３’末端に付加され得るように、関心のある領域（ターゲット二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれの鎖に１つ）から３’にハイブリダイズするプライマーのペアであることは、当業者にはわかるであろう。例えば、突然変異体ＣＴＦＲ配列に隣接するプライマーは、実際には該突然変異体配列にアニールするのではなく、むしろ該突然変異体配列と隣り合う配列にアニールする。一部のケースでは、ＣＦＴＲエキソンに隣接するプライマーは、一般に、該エキソン配列にアニールするのではなく、むしろ該エキソンと隣り合う配列（例えば、イントロン配列）にアニールするように設計される。しかし、一部のケースでは、増幅プライマーがエキソン配列にアニールするように設計され得る。
【００４２】
遺伝子型：本願において用いる場合、用語「遺伝子型」は、生物の遺伝子構造を指す。より具体的には、この用語は、個体内に存在する対立遺伝子の同一性を指す。個体またはＤＮＡ試料の「遺伝子型決定」は、既知多型部位に個体が有する２つの対立遺伝子の、ヌクレオチド塩基の点からの、性質を同定することを指す。
【００４３】
ヘテロ接合性：本願において用いる場合、用語「ヘテロ接合性」または「ＨＥＴ」は、同じ遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有する個体を指す。本願において用いる場合、用語「ヘテロ接合性」は、「複合ヘテロ接合性」または「複合ヘテロ接合性突然変異体」を包含する。本願において用いる場合、用語「複合ヘテロ接合性」は、２つの異なる対立遺伝子を有する個体を指す。本願において用いる場合、用語「複合ヘテロ接合性突然変異体」は、対立遺伝子の２つの異なるコピーを有する個体を指し、このような対立遺伝子は、遺伝子の突然変異体形態として特徴づけられる。用語「突然変異体」は、本願において用いる場合、突然変異した、またはことによると非機能性の遺伝子形態を指す（「ＣＦＴＲ遺伝子の突然変異」を参照のこと）。
【００４４】
ホモ接合性：本願において用いる場合、用語「ホモ接合性」は、同じ対立遺伝子の２つのコピーを有する個体を指す。本願において用いる場合、用語「ホモ接合性突然変異体」は、同じ対立遺伝子の２つのコピーを有する個体を指し、このような対立遺伝子は、遺伝子の突然変異体形態として特徴づけられる。用語「突然変異体」は、本願において用いる場合、突然変異した、またはことによると非機能性の遺伝子形態を指す。
【００４５】
ハイブリダイズ：本願において用いる場合、用語「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイゼーション」は、２つの相補的核酸鎖が、適度にストリンジェントな条件下で互いにアニールするプロセスを指す。ハイブリダイゼーションに適するオリゴヌクレオチドまたはプローブは、典型的に、長さ１０〜１００ヌクレオチド（例えば、長さ１８〜５０、１２〜７０、１０〜３０、１０〜２４、１８〜３６ヌクレオチド）を有する。核酸ハイブリダイゼーション技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと。当業者は、少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列は安定的にハイブリダイズするが、より低い相補性を有するものはしないようにハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーをどのように推定または調整するか承知している。ハイブリダイゼーション条件およびパラメータの例については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｓｅｃａｕｃｕｓ、Ｎ．Ｊ．を参照のこと。
【００４６】
挿入または付加：本願において用いる場合、用語「挿入」または「付加」は、天然に存在する分子と比較して、それぞれ、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドの付加を生じさせる結果となる、アミノ酸またはヌクレオチド配列の変化を指す。
【００４７】
インビトロ：本願において用いる場合、用語「インビトロ」は、多細胞生物の体内でではなく、人工的環境で、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養などで、発生する事象を指す。
【００４８】
インビボ：本願において用いる場合、用語「インビボ」は、非ヒト動物などの多細胞生物の体内で発生する事象を指す。
【００４９】
単離された：本願において用いる場合、用語「単離された」は、（１）（天然にであろうと、および／または実験環境でであろうと）最初に生産されたときに会合していた成分のうちの少なくとも一部から分離された、および／または（２）人の手によって生産、調製および／または製造された、物質および／またはエンティティーを指す。単離された物質および／またはエンティティーは、それらが当初会合していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、または１００％から分離され得る。一部の実施形態において、単離された薬剤は、約８０％より高く、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、または１００％純粋である。本願において用いる場合、物質は、他の成分が実質的にないとき、「純粋」である。本願において用いる場合、用語「単離された細胞」は、多細胞生物に含有されていない細胞を指す。
【００５０】
標識された：用語「標識された」および「検出可能薬剤または部分で標識された」は、エンティティー（例えば、核酸プローブ、抗体など）を、例えば別のエンティティー（例えば、核酸、ポリペプチドなど）への結合後に、可視化することができることを明記するために本明細書では交換可能に用いている。測定できるシグナルであって、その強度が結合されたエンティティーの量に関係づけられる（例えば比例する）ものであるシグナルを生じさせるような検出可能薬剤または部分を選択することができる。タンパク質およびペプチドを標識および／または検出するための多種多様なシステムが当該技術分野において公知である。標識されたタンパク質およびペプチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的または他の手段により検出可能である標識の組み込みまたは前記標識へのコンジュゲーションによって、調製することができる。標識または標識部分は、直接検出可能であることがある（すなわち、それは、検出可能であるためにいずれのさらなる反応もしくは操作を必要としない；例えば、蛍光体は直接検出可能である）、または間接的に検出可能であることがある（すなわち、検出可能である別のエンティティーとの反応もしくは結合によってそれを検出可能にする；例えば、ハプテンは、蛍光体などのレポーターを含む適切な抗体との反応後、免疫染色によって検出可能である）。適する検出可能薬剤としては、放射性核種、蛍光体、化学発光剤、マイクロ粒子、酵素、比色標識、磁性標識、ハプテン、分子ビーコン、アプタマービーコン、およびこれらに類するものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５１】
マルチプレックスＰＣＲ：本願において用いる場合、用語「マルチプレックスＰＣＲ」は、別個のプライマーペアを使用してそれぞれプライミングされる、２つ以上の領域の増幅を指す。
【００５２】
マルチプレックスＡＳＰＥ：本願において用いる場合、用語「マルチプレックスＡＳＰＥ」は、多型を検出するための、マルチプレックスＰＣＲと対立遺伝子特異的プライマー伸長を併用するアッセイを指す。典型的には、マルチプレックスＰＣＲを用いて、ＡＳＰＥプライマーのためのターゲット配列としての役割を果たすＤＮＡの領域を先ず増幅する。対立遺伝子特異的プライマー伸長の定義を参照のこと。
【００５３】
ＣＦＴＲ遺伝子の突然変異：本願において用いる場合、用語「ＣＦＴＲ遺伝子の突然変異」は、野生型ＣＦＴＲ遺伝子配列と比較して１つ以上の異常な核酸配列を指す。「ＣＦＴＲ遺伝子の突然変異」を「突然変異体ＣＦ配列」とも呼ぶ。ＣＦＴＲ遺伝子の突然変異は、置換（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ））、欠失、挿入、付加および／または重複を包含する。
【００５４】
プライマー：本願において用いる場合、用語「プライマー」は、核酸試料中の相補的配列にハイブリダイズすることができる短い一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。典型的に、プライマーは、テンプレート依存性ＤＮＡ合成のための開始点としての役割を果たす。デオキシリボヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによってプライマーに付加させることができる。一部の実施形態において、プライマーへのそのようなデオキシリボヌクレオチド付加は、プライマー伸長としても公知である。用語プライマーは、本願において用いる場合、ペプチド核酸プライマー、ロックド核酸プライマー、ホスホロチオアート修飾プライマー、標識プライマーおよびこれらに類するものを含めて、合成することができるすべての形態のプライマーを含む。ＰＣＲ反応のための「プライマーペア」または「プライマーセット」は、「フォワードプライマー」および「リバースプライマー」を概して含む１セットのプライマーを概して指す。本願において用いる場合、「フォワードプライマー」は、ｄｓＤＮＡのアンチセンス鎖にアニールするプライマーを指す。「リバースプライマー」は、ｄｓＤＮＡのセンス鎖にアニールする。
【００５５】
多型：本願において用いる場合、用語「多型」は、１つ以上の形態の遺伝子またはその一部分の共存を指す。
【００５６】
純粋なまたは実質的に純粋な：本願において用いる場合、用語「純粋なまたは実質的に純粋な」は、天然に随伴する成分から分離されている化合物、例えばタンパク質またはポリペプチド、を指す。典型的に、化合物は、試料中の全材料の（容量で、湿潤もしくは乾燥重量で、またはモルパーセントもしくはモル分率で）少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９９％が、関心のある化合物であるとき、実質的に純粋である。純度は、任意の適切な方法により、例えば、ポリペプチドの場合はカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析により、測定することができる。化合物、例えばタンパク質は、天然に会合している成分が本質的にないときも、またはその天然状態ではそれに随伴する生得の不純物から分離されているときも、実質的に精製されている。
【００５７】
リアルタイムＰＣＲ：本願において用いる場合、用語「リアルタイムＰＣＲ」は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ／ｑＰＣＲ／ｑｒｔ−ＰＣＲ）またはキネティックポリメラーゼ連鎖反応（ＫＰＣＲ）を指し、ＰＣＲに基づく実験室技術であって、ターゲットにしたＤＮＡ分子を増幅し、同時に定量するために用いられる。それは、ＤＮＡ試料中の１つ以上の特異的配列の検出と（コピーの絶対数、またはＤＮＡインプットもしくは追加の正規化用遺伝子に正規化したときの相対量としての）定量の両方を可能にする。
【００５８】
センス鎖対アンチセンス鎖：本願において用いる場合、用語「センス鎖」は、機能性タンパク質のコード配列の少なくとも一部分を含む、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の鎖を指す。本願において用いる場合、用語「アンチセンス鎖」は、センス鎖の逆補体である、ｄｓＤＮＡの鎖を指す。
【００５９】
特異的：本願において用いる場合、用語「特異的」は、オリゴヌクレオチドプライマーに関連して用いるとき、適切なハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下で、関心のあるターゲットにはハイブリダイズすることができ、関心のない核酸には実質的にハイブリダイズすることができない、オリゴヌクレオチドまたはプライマーを指す。高い配列同一性レベルが好ましく、それらとしては、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％配列同一性が挙げられる。一部の実施形態において、特異的オリゴヌクレオチドまたはプライマーは、ハイブリダイズまたは増幅される核酸の部分と配列同一性の少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０塩基またはより多くの塩基を、該オリゴヌクレオチドと該核酸をアラインしたとき、含有する。
【００６０】
被験体：本願において用いる場合、用語「被験体」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物を指す。被験体は患者であり得、患者は、疾患の診断または処置のために医療従事者に診察を受けに行くヒトを指す。ヒトは、出生前および出生後形態を含む。特に好ましい被験体は、ＣＦＴＲ保因者状態、ＣＦ疾患またはＣＦ関連障害状態の存在について検査を受けるヒトである。
【００６１】
実質的に：本願において用いる場合、用語「実質的に」は、関心のある特性または性質の全またはほぼ全程度または度合を呈示するという質的条件を指す。生物学的および化学的現象は、完了まで行くおよび／または完全まで進むまたは絶対的結果に達するまたは絶対的結果を回避することがあるにせよ滅多にないことは、生物技術分野の当業者にはわかるであろう。従って、用語「実質的に」は、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の潜在的欠如をとらえるために本明細書では用いている。
【００６２】
実質的に相補的：本願において用いる場合、用語「実質的に相補的」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる２つの配列を指す。実質的に相補的な配列が、それらの全長に沿ってハイブリダイズする必要がないことは、当業者にはわかるであろう。一部の実施形態において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、次のものと少なくとも同様にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を指す：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ  超音波処理サケ精子ＤＮＡおよび５×デンハルト溶液中、４２℃で一晩のハイブリダイゼーション；４５℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄；および４５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄。一部の実施形態において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、２０連続ヌクレオチドのストレッチに関して２塩基より多く異なる２つの核酸のハイブリダイゼーションを可能にしないはずである。
【００６３】
置換：本願において用いる場合、用語「置換」は、１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの、それぞれ、その天然に存在する分子と比較して異なるアミノ酸またはヌクレオチドによる置換を指す。
【００６４】
に罹患している：疾患、障害および／または病態「に罹患している」個体は、その疾患、障害および／または病態と診断されており、その疾患、障害および／または病態の１つ以上の症状を示す。
【００６５】
に罹患しやすい：疾患、障害および／または病態「に罹患しやすい」個体は、その疾患、障害および／または病態と診断されていない。一部の実施形態において、疾患、障害および／または病態に罹患しやすい個体は、その疾患、障害および／または病態の症状を呈示しないことがある。一部の実施形態において、疾患、障害および／または病態に罹患しやすい個体は、その疾患、障害および／または病態を発症するであろう。一部の実施形態において、疾患、障害および／または病態に罹患しやすい個体は、その疾患、障害および／または病態を発症しないであろう。
【００６６】
野生型：本願において用いる場合、用語「野生型」は、天然に存在する典型的なまたは最も一般的な形態を指す。例えば、野生型ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質は、天然集団中に存在するＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質の典型的なまたは最も一般的な形態を指す。本願において用いる場合、「野生型」を「天然に存在する」と交換可能に用いる。一部の実施形態において、野生型ＣＦＴＲ遺伝子またはその遺伝子座は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＩＤ  Ｍ５８４７８（ＨＵＭＣＦＴＣ）（配列番号：４）（図４）において見つけられるＣＦＴＲ遺伝子配列を指す。ＣＦＴＲ遺伝子は、染色体７上に位置し、これは、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＣ０００１１１およびＡＣ００００６１において見つけることができる；これらの内容はそれら全体が参照により本明細書に援用されている。ＣＦＴＲ遺伝子のｃＤＮＡは、Ａｕｄｒｅｚｅｔら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．（２００４）２３（４）、３４３−３５７において見つけられる。
【００６７】
詳細な説明
本発明は、数ある中でも、ＣＦおよびＣＦ関連疾患についてのスクリーニングおよび／または検査の際に嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）（ＣＦＴＲ）遺伝子における新規突然変異を使用する方法、製品およびシステムを提供する。例えば、本明細書において提供する新規突然変異は、ＣＦ疾患、ＣＦ関連疾患、障害もしくは病態、または保因者ステータスの臨床診断を支援するために、および遺伝子カウンセリングのために（例えば、ＣＦを発症することまたはＣＦＴＲ突然変異の保因者であることについての個体の危険度の評価のために）使用することができる。本明細書において提供する新規突然変異は、ＣＦＴＲ突然変異のパネルの一部として単独使用することまたは他の公知ＣＦＴＲ突然変異と併用することができる。
【００６８】
本発明の様々な態様を以下のセクションで詳細に説明する。セクションの使用は、本発明を限定することを意図したものではない。各セクションが本発明の任意の態様にあてはまり得る。本願において、「または」の使用は、別の言明がない限り、「および／または」を意味する。
【００６９】
ＣＦＴＲ遺伝子における新規突然変異
ＣＦＴＲ遺伝子は、染色体７にマッピングされており、例えば、米国特許第６，２０１，１０７号および同第５，７７６，６７７号に記載されている；これらの開示は、それら全体が参照により本明細書に援用されている。ＣＦＴＲゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＣ＿０００００７（範囲：１１７１２００１６．．１１７３０８７１８；この全内容が参照により本明細書に援用されている）に記載されている（配列番号：１）（図１）。ＣＦＴＲ遺伝子は、２７エキソンを含有する。これらのエキソンに１、２、３、４、５、６ａ、６ｂ、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ａ、１４ｂ、１５、１６、１７ａ、１７ｂ、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４という番号をつける。ＣＦＴＲ  ｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＲ０１６０３２．１に記載されている（配列番号：２）（図２）。
【００７０】
ＣＦＴＲタンパク質は、例えば米国特許第５，５４３，３９９号に記載されている；この開示は、その全体が参照により本明細書に援用されている。ＣＦＴＲタンパク質配列もＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ９０８４０．１に記載されている（配列番号：３）（図３）。
【００７１】
実施例１において説明するように、本願の発明者らは、ＣＦＴＲ遺伝子における様々な新規突然変異を同定した（表５）。ＣＦに罹患していることもしくは家族歴のため保因者である可能性が高いことがわかっていたまたは他のＣＦ検査に基づきＣＦに罹患している疑いがあった個体から得た、臨床検査のために提出された検体におけるＣＦＴＲの配列分析により、これらの突然変異を同定した（表５に載せる臨床適応を参照のこと）。患者試料からのＣＦＴＲ遺伝子配列を野生型ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質配列（配列番号：１〜３を参照）と比較することにより、突然変異を同定した。表５に示すように、これらの突然変異を保有する患者は、白人、アフリカ系アメリカ人、ラテンアメリカ人およびアジア人を含む異なる民族群からの者であった。従って、これらの突然変異は、非白人人種群からの患者についてのより有効な遺伝子検査の開発に特に有用であり得る。
【００７２】
本明細書に記載する新規突然変異は、イントロン（例えば、イントロン３、イントロン６ａ、イントロン１１、イントロン１４ａ、イントロン１９、イントロン２０、イントロン２１、およびイントロン２３）およびエキソン（例えば、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６ａ、エキソン６ｂ、エキソン７、エキソン９、エキソン１０、エキソン１１、エキソン１２、エキソン１３、エキソン１４ａ、エキソン１４ｂ、エキソン１５、エキソン１６、エキソン１７ａ、エキソン１７ｂ、エキソン１９、エキソン２０、エキソン２１、エキソン２２、およびエキソン２４）内に位置する。前記新規突然変異の一部は、ナンセンス突然変異、すなわち、停止コドンを生じさせる結果となる突然変異である。前記新規突然変異の一部は、ミスセンス突然変異、すなわちアミノ酸置換を生じさせる結果となる突然変異、である。前記新規突然変異の一部は、インフレーム挿入および／または欠失の原因となる。前記新規突然変異の一部は、リーディングフレーム内でのシフトをもたらすような様式で１つ以上のヌクレオチドを欠失させる。前記新規突然変異の一部は、スプライス接合部、例えばコンセンサススプライス部位ａｇ／ｇｔまたは他のスプライス部位、の配列を改変させる。従って、本明細書に記載する新規突然変異の大部分は、ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質発現または機能を破壊する可能性が高い。
【００７３】
「ＡＣＭＧ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ：Ｒｅｖｉｓｉｏｎｓ  ２００７」（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ＳＣら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０：２９４−３００；これは参照により本明細書に援用されている）には、本明細書に記載する新規突然変異を以下のグループに分類するための追加の検査結果および臨床情報と共に、使用することができる配列変異の解釈上のカテゴリーおよび定義が提供されている。
【００７４】
グループＩ：患者は、ＡＣＭＧガイドラインに従ってカテゴリー２に分類することができる新規配列変化（すなわち、ナンセンス、フレームシフト（ＦＳ）、コンセンサススプライス部位ａｇ／ｇｔ）を有する。患者は、別の十分に確立されたＣＦ病因性突然変異（すなわち、Ｆ５０８、Ｗ１２８２Ｘなど）を有する。患者の適応症は、ＣＦを有する疑いがある、ＣＦに罹患していることがわかっている、または新生児スクリーニングによって同定される。特に関心があるグループＩ突然変異を表１に示す。これらの突然変異は、ＣＦまたはＣＦ関連疾患、障害もしくは病態を引き起こすと予想される。
【００７５】
グループＩＩＡ：患者は、ＡＣＭＧガイドラインに従ってカテゴリー３に分類することができる新規配列変化（すなわち、ミスセンス、インフレームｉｎｓ／ｄｅｌ、他のスプライス部位突然変異など）を有する。患者は、別の十分に確立されたＣＦ病因性突然変異（すなわち、Ｆ５０８、Ｗ１２８２Ｘなど）を有する。患者は、ＣＦを有する疑いがある、ＣＦに罹患していることがわかっている、または新生児スクリーニングで陽性であることによって同定される。グループＩＩＡ突然変異を表２に（サブセクション・グループＩＩＡに）示す。
【００７６】
グループＩＩＢ：患者（Ｐａｔｅｎｔ）は、ＡＣＭＧガイドラインに従ってカテゴリー３に分類することができる新規配列変化（すなわち、ミスセンス、インフレームｉｎｓ／ｄｅｌ、他のスプライス部位突然変異など）を有する。患者は、ＣＦを有する疑いがある、ＣＦに罹患していることがわかっている、または新生児スクリーニングで陽性であることによって同定される。グループＩＩＢ突然変異を表２に（サブセクション・グループＩＩＢに）示す。
【００７７】
グループＩＩＩ：患者は、ＡＣＭＧガイドラインに従ってカテゴリー３に分類することができる新規配列変化（すなわち、ミスセンス、インフレーム挿入／欠失、他のスプライス部位突然変異など）を有する。患者は、別の十分に確立されたＣＦ病因性突然変異（すなわち、Ｆ５０８、Ｗ１２８２Ｘなど）を有する。患者は、ＣＦを有する疑いがある、ＣＦに罹患していることがわかっている、または新生児スクリーニングによって同定される。患者は、臨床的有意性不明の追加の変化（単数または複数）を有する。グループＩＩＩ突然変異を表３に示す。
【００７８】
グループＩＶ：上で定義したグループＩ、ＩＩおよびＩＩＩ突然変異以外の突然変異。グループＩＶ突然変異を表４に示す。
【００７９】
しかし、本発明による新規ＣＦＴＲ突然変異は、表１〜４において確認される特異的ヌクレオチドまたはアミノ酸変異に限定されず、表１〜４において確認されるいずれかの位置に存在し得る、野生型ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質配列と比較して、異常な任意のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を包含する。
【００８０】
【表１−１】
2013521829.tif 000003
【００８１】
【表１−２】
2013521829.tif 000004
【００８２】
【表１−３】
2013521829.tif 000005
【００８３】
【表１−４】
2013521829.tif 000006
【００８４】
【表３】
2013521829.tif 000007
【００８５】
【表４−１】
2013521829.tif 000008
【００８６】
【表４−２】
2013521829.tif 000009
【００８７】
【表４−３】
2013521829.tif 000010
ＣＦＴＲ突然変異の検出
本発明にて開示するＣＦＴＲ遺伝子突然変異を検出するために当該技術分野において公知の様々な方法を用いることができる。例えば、以前に同定されたＣＦＴＲ遺伝子突然変異を検出するために用いられた方法は、記載されており、本発明との使用に適応可能である。例えば、Ａｕｄｒｅｚｅｔら、「Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＦＴＲ  ｇｅｎｅ：ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ」、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．、２００４  Ａｐｒｉｌ；２３（４）：３４３−５７；ＳｐｉｅｇｅｌｍａｎおよびＬｅｍによる「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ」と題する、ＰＣＴ国際公開第２００４／０４００１３号Ａ１および対応米国出願第２００４０１１０１３８号；Ｄｕｎｌｏｐらによる「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ」と題する、米国特許第出願公開第２００３／０２３５８３４号；およびＮ．Ｂｒｏｕｄｅによる「Ｎｏｖｅｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｏｕｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＰＣＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓａｍｐｌｅ」と題する米国特許出願公開第２００４／０１２６７６０号を参照のこと；これらの各々の内容全体は、参照により本明細書に援用されている。
【００８８】
核酸分析
一定の実施形態において、本明細書において開示するＣＦＴＲ遺伝子突然変異は、核酸レベルで検出される。例えば、配列決定、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、制限酵素消化、プライマー伸長、例えば一塩基プライマー伸長またはマルチプレックス対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）によって、核酸を分析することができる。
【００８９】
ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、および／またはｃＤＮＡを用いて核酸分析を行うことができる。多くの実施形態において、核酸は、生体試料から抽出される。一部の実施形態において、核酸は、増幅せずに分析される。一部の実施形態において、核酸は、当該技術分野において公知の技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を用いて増幅され、増幅された核酸は、その後の分析において使用される。プライマーペアの多数のセットを使用して幾つかのアンプリコン（例えば、異なるゲノム領域からのもの）が同時に増幅されるマルチプレックスＰＣＲを利用してもよい。加えて、当該技術分野において公知であるようなリアルタイムＰＣＲなどの方法を用いて核酸分析を行ってもよい。
【００９０】
一部の実施形態において、核酸は、野生型対立遺伝子についての増幅生成物が突然変異体対立遺伝子のものとサイズの点で異なるような様式で、増幅される。従って、増幅生成物のサイズの差を例えば電気泳動ゲルで検出することにより、特定の突然変異体対立遺伝子の存在または不在を決定することができる。例えば、ＣＦＴＲ遺伝子領域の欠失または挿入は、サイズに基づくアプローチの使用に特に適しているだろう。
【００９１】
一定の例示的核酸分析法を下で詳細に説明する。
【００９２】
対立遺伝子特異的増幅
一部の実施形態において、ＣＦＴＲ遺伝子突然変異は、対立遺伝子特異的増幅アッセイを用いて検出される。このアプローチは、特異的対立遺伝子のＰＣＲ増幅（ＰＡＳＡ）（Ｓａｒｋａｒら、１９９０  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６：６４−６８）、対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ）（Ｏｋａｙａｍａら、１９８９、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１１４：１０５−１１３）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳＰＣＲ）（Ｗｕら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、８６：２７５７−２７６０）、および増幅困難な突然変異系（ＡＲＭＳ）（Ｎｅｗｔｏｎら、１９８９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１７：２５０３−２５１６）と様々に呼ばれる。これらの参考文献のそれぞれの全内容は、本明細書に援用されている。この方法は、一塩基置換および微小欠失／挿入に適用可能である。
【００９３】
例えば、ＰＣＲベースの増幅法については、異なる対立遺伝子間の（例えば、野生型対立遺伝子と突然変異体対立遺伝子との）区別ができるように、増幅プライマーを設計することができる。従って、増幅生成物の存在不在を用いて、ＣＦＴＲ遺伝子突然変異が所与の核酸試料に存在するかどうかを決定することができる。一部の実施形態では、増幅生成物の存在がＣＦＴＲ遺伝子突然変異を示すように対立遺伝子特異的プライマーを設計することができる。一部の実施形態では、増幅生成物の不在がＣＦＴＲ遺伝子突然変異を示すように、対立遺伝子特異的プライマーを設計することができる。
一部の実施形態において、２つの相補的反応が用いられる。一方の反応は、野生型対立遺伝子に特異的なプライマーを利用し（「野生型特異的反応」）、他方の反応は、突然変異体対立遺伝子のためのプライマーを利用する（「対立遺伝子特異的反応」）。これら２つの反応は、共通の第二のプライマーを利用することができる。特定の対立遺伝子（例えば、野生型対立遺伝子または突然変異体対立遺伝子）に特異的なＰＣＲプライマーは、一般に、そのターゲットの一方の対立遺伝子変異体と完全にマッチするが、他方の対立遺伝子（例えば、突然変異体対立遺伝子または野生型対立遺伝子）にはミスマッチする。このミスマッチをプライマーの３’末端に／付近に配置して、完全マッチ対立遺伝子の優先的増幅をもたらすことができる。増幅生成物を一方の反応から検出できるのか、または両方の反応から検出できるのかが、突然変異体対立遺伝子の不在または存在を示す。野生型特異的反応のみからの増幅生成物の検出は、野生型対立遺伝子のみの存在（例えば、野生型対立遺伝子のホモ接合性）を示す。突然変異特異的反応のみからの増幅生成物の検出は、突然変異体対立遺伝子のみの存在（例えば、突然変異体対立遺伝子のホモ接合性）を示す。両方の反応からの増幅生成物の検出は、（例えば、ヘテロ接合体）を示す。本願において用いる場合、このアプローチを「対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ）」と呼ぶこととする。
【００９４】
その接合部を部分的に越えてハイブリダイズするプライマーを使用することにより、対立遺伝子特異的増幅を用いて重複、挿入または逆位を検出することができる。接合部オーバーラップの程度を変えて、特異的増幅を可能にすることができる。
【００９５】
サイズによって核酸を分離するために（例えば電気泳動によって）ゲルの中を泳動させた核酸のバンドを（例えば、１つ以上の色素で）可視化することによる方法を含めて、当該技術分野において公知の方法により、増幅生成物を調査することができる。
【００９６】
対立遺伝子特異的プライマー伸長
一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）アプローチが、ＣＦＴＲ遺伝子突然変異を検出するために用いられる。ＡＳＰＥは、対立遺伝子間の（例えば、突然変異体対立遺伝子と野生型対立遺伝子との）区別ができる対立遺伝子特異的プライマーを伸長反応に利用するので、伸長生成物は、特定の対立遺伝子（例えば、突然変異体対立遺伝子または野生型対立遺伝子）の存在下でのみ得られる。伸長生成物は、例えば、標識されたデオキシリボヌクレオチドを伸長反応に利用することにより、検出可能であり得、または検出可能にすることができる。放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識などをはじめとする（しかしこれらに限定されない）任意の様々な標識がこれらの方法での使用に対応できる。一部の実施形態において、ヌクレオチドは、後に検出可能標識を（直接または間接的に）結合させることができるエンティティー、例えば、ストレプトアビジンコンジュゲート型蛍光色素を結合させることができるビオチン分子、で標識される。一部の実施形態において、反応は、例えば同じ伸長反応において多くの対立遺伝子特異的プライマーを使用して、マルチプレックスで行われる。
【００９７】
一部の実施形態において、伸長生成物は、数ある中でもビーズ、マトリックス、ゲルなどの、固体または半固体支持体にハイブリダイズされる。例えば、伸長生成物に特定の核酸配列（例えば、対立遺伝子特異的プライマーの一部として含まれるもの）でタグ付けすることができ、および固体支持体を「抗タグ」（例えば、前記増幅生成物中のタグに相補的な核酸配列）を取り付けることができる。その固体支持体を用いて伸長生成物を捕捉および検出することができる。例えば、ビーズを選別し、検出することができる。このようにして用いることができる１つのそのようなシステムは、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによる嚢胞性繊維状突然変異検出に適応させることができるおよび汎用ビーズアレイ（ＴＡＧ−ＩＴ（商標））として市販されている、ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）ＭＡＰシステムである（例えば、実施例２を参照のこと）。
【００９８】
追加のＡＳＰＥ法および試薬は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１３８８０３号Ａ１に記載されている；この全内容が参照により本明細書に援用されている。
【００９９】
単一ヌクレオチドプライマー伸長
一部の実施形態では、１つだけのヌクレオチドが伸長されるようにプライマーを設計する、単一ヌクレオチド伸長（ＳＮｕＰＥ）アッセイが用いられる。このような方法において、プライマーの３’末端のすぐ下流（例えば３’）のヌクレオチドの同一性は既知であり、突然変異体対立遺伝子におけるものは野生型対立遺伝子と比較して異なる。１つの特定の種類のデオキシヌクレオチドだけが標識される（例えば、標識ｄＡＴＰ、標識ｄＣＴＰ、標識ｄＧＴＰ、または標識ｄＴＴＰ）伸長反応を用いて、ＳＮｕＰＥを実施することができる。従って、検出可能な伸長生成物の存在を、関心のある位置（例えば、プライマーの３’末端のすぐ下流の位置）でのヌクレオチドの同一性の指標として、および従って、その位置での突然変異の存在または不在の指標として、使用することができる。ＳＮｕＰＥは、米国特許第５，８８８，８１９号；米国特許第５，８４６，７１０号；米国特許第６，２８０，９４７号；米国特許第６，４８２，５９５号；米国特許第６，５０３，７１８号；米国特許第６，９１９，１７４号；Ｐｉｇｇｅｅ，Ｃら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  ７８１（１９９７）、３６７−３７５頁（「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｎｏｗｎ  Ｐｏｉｎｔ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｓｅｒ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」）；Ｈｏｏｇｅｎｄｏｏｍ，Ｂ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）１０４：８９−９３（「Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｂｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」）に記載されているように行うことができる；これらのそれぞれの全内容が参照により本明細書に援用されている。
【０１００】
一部の実施形態では、突然変異の存在または不在の正確で迅速な検出のためにプライマー伸長を質量分析と併用することができる。Ｈａｆｆらの米国特許第５，８８５，７７５号（一塩基多型分析の質量分析による分析）；Ｋｏｓｔｅｒの米国特許第７，５０１，２５１号（質量分析に基づくＤＮＡ診断）を参照のこと；これら両方の教示は参照により本明細書に援用されている。適する質量分析形式としては、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化、飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）、フーリエ変換、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ
一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ（「ＯＬＡ」または「ＯＬ」）が用いられる。ＯＬＡは、ターゲット分子の単一鎖の隣接配列にハイブリダイズすることができるように設計される２つのオリゴヌクレオチドを利用する。典型的に、前記オリゴヌクレオチドの一方はビオチン化され、他方は、例えばストレプトアビジンコンジュゲート型蛍光部分で、検出可能に標識される。的確な相補的配列がターゲット分子内で見つけられると、オリゴヌクレオチドは、それらの末端が隣接するようにハイブリダイズし、ライゲーション基質を作り、この基質を捕捉および検出することができる。例えば、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：８９２３−８９２７、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０、および米国特許第４，９９８，６１７号を参照のこと；これらの全内容は、それら全体が参照により本明細書に援用されている。
【０１０２】
ハイブリダイゼーションアプローチ
一部の実施形態において、核酸は、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異に対応するＣＦＴＲ遺伝子（配列番号：１）内の領域に特異的な１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを使用する、および単一オリゴヌクレオチドミスマッチを許さない十分にストリンジェントな条件下での、ハイブリダイゼーションによって分析される。一定の実施形態において、適する核酸プローブは、正常ＣＦＴＲ遺伝子と、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子とを区別することができる。例えば、適する核酸プローブは、正常ＣＦＴＲ遺伝子に特異的に結合するが、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子にはしない。あるいは、核酸プローブは、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子に特異的に結合するが、正常ＣＦＴＲ遺伝子にはしない。本発明のプローブは、表１、表２、表３または表４に載せた１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ対立遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるものを含む。本発明のプローブは、ＣＦＴＲ遺伝子の特定の領域内の正常対立遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができる、従って、正常対立遺伝子と表１、表２、表３または表４に載せた１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ対立遺伝子とを区別することができるものも含む。それ故、例えば、当業者は、個体が特定の対立遺伝子についてホモ接合性であるのか、またはヘテロ接合性であるのかを決定するために本発明のプローブを使用することができよう。
【０１０３】
核酸ハイブリダイゼーション技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと。当業者は、少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列は安定的にハイブリダイズするが、より低い相補性を有するものはしないようなハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーをどのように推定または調整するか承知している。ハイブリダイゼーション条件およびパラメータの例については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｓｅｃａｕｃｕｓ、Ｎ．Ｊ．を参照のこと。
【０１０４】
一部の実施形態において、突然変異体または野生型ＣＦＴＲ配列にハイブリダイズするプローブ分子は、増幅生成物中のそのような配列を液相または、さらに好ましくは、固相ハイブリダイゼーションにより検出するために使用することができる。固相ハイブリダイゼーションは、例えばマイクロチップにＣＦＴＲプローブを取り付けることによって、果たすことができる。
【０１０５】
核酸プローブは、リボ核酸および／またはデオキシリボ核酸を含むことがある。一部の実施形態において、提供される核酸プローブは、オリゴヌクレオチド（すなわち、「オリゴヌクレオチドプローブ」）である。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは、ＣＦＴＲ遺伝子の相同領域に特異的に結合するに足る長さであるが、該プローブと検査される試料との間の１ヌクレオチドの差がハイブリダイゼーションを中断させるに足る短さである。典型的に、オリゴヌクレオチドプローブのサイズは、おおよそ１０から１００ヌクレオチドまで様々である。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、長さが１５から９０、１５から８０、１５から７０、１５から６０、１５から５０、１５から４０、１５から３５、１５から３０、１８から３０、または１８から２６ヌクレオチドまで様々である。当業者には理解されるように、オリゴヌクレオチドプローブの最適な長さは、そのオリゴヌクレオチドプローブが利用され得る特定の方法および／または条件に依存し得る。
【０１０６】
一部の実施形態において、核酸プローブは、例えば核酸増幅および／または伸長反応のための、プライマーとして有用である。
【０１０７】
一部の実施形態において、核酸プローブは、本明細書に記載の検出可能部分で標識される。
【０１０８】
アレイ
本明細書において言及する様々な方法を、数セットの突然変異を１回の実験で分析および／または検出することを可能にするアレイとの使用に適応させることができる。例えば、本明細書（例えば、表１、表２、表３または表４）に記載する多数の新規ＣＦＴＲ突然変異を同時に分析することができる。加えてまたは代替的に、本明細書（例えば、表１、表２、表３または表４）に記載する１つ以上の新規ＣＦＴＲ突然変異を、当該技術分野において公知の他のＣＦＴＲ突然変異と一緒に、同時に分析することができる。詳細には、核酸試薬（例えば、プローブ、プライマー、オリゴヌクレオチドなど）の使用を伴う方法は、アレイベースのプラットホーム（例えば、マイクロアレイ）への適応に特に適している。一部の実施形態において、本明細書（例えば、表１、表２、表３または表４）に記載するＣＦＴＲ突然変異の検出に特異的な１つ以上のプローブを含有するアレイを設計し、本明細書に記載する様々な方法に適応させることができる。加えてまたは代替的に、本明細書（例えば、表１、表２、表３または表４）に記載するＣＦＴＲ突然変異の検出に特異的なプローブを、当該技術分野において公知のＣＦＴＲ突然変異に特異的なプローブと併用することができる。一部の実施形態において、多数のプローブを含有するアレイは、突然変異体パネルとして公知である。例えば、Ｗａｌｌら、「Ａ  ３１−ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ」、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ、１９９５；５（４）：３３３−８を参照のこと；この全内容が参照により本明細書に援用されている。他の方法としては、本明細書に記載のＣＦＴＲ突然変異を検出するためのプローブを用いるリアルタイムＰＣＲの使用を挙げることができる。
【０１０９】
タンパク質ベースの分析
一定の実施形態において、ＣＦＴＲ突然変異は、タンパク質（またはペプチドもしくはポリペプチドレベル）で検出される、すなわち、ＣＦＴＲ遺伝子突然変異からの遺伝子産物が分析される。例えば、ＣＦＴＲタンパク質またはそのフラグメントを、アミノ酸配列決定法によって、または本明細書（例えば、表１、２、３もしくは４）に記載する１つ以上の新規突然変異に対応する１つ以上のエピトープを特異的に認識する１つ以上の抗体を使用するイムノアッセイによって、分析することができる。ＣＦＴＲタンパク質をプロテアーゼ消化（例えば、トリプシン消化）によって分析することもでき、一部の実施形態では、それらの消化されたタンパク質生成物を２Ｄゲル電気泳動によってさらに分析することができる。
【０１１０】
突然変異体タンパク質の抗体検出
例えば、正常ＣＦＴＲタンパク質と突然変異体ＣＦＴＲタンパク質とを識別することができる特異的抗体を、当該技術分野において公知の任意の様々な方法で利用して、ＣＦＴＲ突然変異を検出することができる。一定の実施形態において、適する抗体は、正常ＣＦＴＲタンパク質と、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を含有する突然変異体ＣＦＴＲタンパク質とを区別することができる。例えば、適する抗体は、正常ＣＦＴＲタンパク質には特異的に結合するが、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲタンパク質には結合しない。あるいは、適する抗体は、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲタンパク質には特異的に結合するが、正常ＣＦＴＲタンパク質には結合しない。
【０１１１】
特定のエピトープに対する抗体、ポリペプチドおよび／またはタンパク質（例えば、突然変異体もしくは正常ＣＦＴＲタンパク質）を、当該技術分野における任意の様々な公知の方法を用いて生じさせることができる。例えば、抗体が望まれるエピトープ、ポリペプチドまたはタンパク質を生成し、動物、典型的には哺乳類（例えば、ロバ、マウス、ウサギ、ウマ、ニワトリなど）に注射し、その動物によって生産された抗体をその動物から回収することができる。不死細胞系を用いて関心のある抗体を発現するハイブリドーマを産生させることにより、モノクローナル抗体を生産することもできる。ＣＦＴＲ突然変異を検出するための抗体の生産方法および使用に関するさらなる詳細については、例えば、米国特許第５，７７６，６７７号を参照のこと；この全内容が参照により本明細書に援用されている。
【０１１２】
一部の実施形態において、抗体は、本明細書に記載の検出可能部分で標識される。
【０１１３】
抗体検出方法は当該技術分野において周知であり、それらとしては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびウエスタンブロットが挙げられるが、これらに限定されない。一部のそのような方法は、アレイ形式で行うことに適している。例えば、それぞれがＣＦＴＲタンパク質内の異なるエピトープに特異的である様々な異なる抗体をアレイに固定し、ＥＬＩＳＡなどのアッセイで使用することができる。
【０１１４】
検出可能部分
一定の実施形態において、本発明に従って使用されるおよび／または本発明によって提供される一定の分子（例えば、核酸プローブ、抗体など）は、１つ以上の検出可能エンティティーまたは部分を含む、すなわち、そのような分子は、そのようなエンティティーまたは分子で「標識」されている。
【０１１５】
任意の多種多様な検出可能薬剤を本発明の実施に使用することができる。適する検出可能薬剤としては、様々なリガンド、放射性核種；蛍光色素；化学発光剤（例えば；アクリジニウムエステル、安定化ジオキセタン、およびこれらに類するものなど）；生物発光剤；スペクトル分解可能な無機蛍光半導体ナノ結晶（すなわち、量子ドット）；マイクロ粒子；金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅、白金など）；ナノクラスタ；常磁性金属イオン；酵素；比色標識（例えば、色素、コロイド金、およびこれらに類するものなど）；ビオチン；ジオキシゲニン；ハプテン；および抗血清またはモノクローナル抗体を利用できるタンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１６】
一部の実施形態において、前記検出可能部分は、ビオチンである。ビオチンをアビジン（例えば、ストレプトアビジン）に結合させることができ、該アビジンは、概して、それら自体が検出可能である他の部分（例えば、蛍光部分）に（直接または間接的に）コンジュゲートしている。
【０１１７】
他の検出可能部分の一部の非限定的な例を下に記載する。
【０１１８】
蛍光色素
一定の実施形態において、検出可能部分は、蛍光色素である。多種多様な化学構造および物理的特性の非常に多数の公知蛍光色素が、本発明の実施の際の使用に適する。蛍光検出可能部分をレーザーによって刺激して、放射光を検出器によって捕獲することができる。前記検出器は、その強度を記録する、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）または共焦点顕微鏡であり得る。
【０１１９】
適する蛍光色素としては、フルオレセインおよびフルオレセイン色素（例えば、フルオレセインイソチオシアニン、すなわちＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、すなわちＦＡＭ、など）、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、フィコエリトリン、エリスロシン、エオシン、ローダミン色素（例えば、カルボキシテトラメチル−ローダミン、すなわちＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）など）、クマリンおよびクマリン色素（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）など）、オレゴングリーン色素（例えば、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４など）、テキサスレッド、テキサスレッド−Ｘ、ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＲＥＤ（商標）、ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＧＲＥＥＮ（商標）、シアニン色素（例えば、ＣＹ−３（商標）、ＣＹ−５（商標）、ＣＹ−３．５（商標）、ＣＹ−５．５（商標）など）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）色素（例えば、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）６８０など）、ＢＯＤＩＰＹ（商標）色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（商標）５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ（商標）５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ（商標）５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ（商標）５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ（商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（商標）６５０／６６５など）、ＩＲＤｙｅ（例えば、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ  ７００、ＩＲＤ  ８００など）、ならびにこれらに類するものが挙げられるが、それらに限定されない。適する蛍光色素のより多くの例、ならびに蛍光色素を他の化学エンティティー、例えばタンパク質およびペプチド、にカップリングさせるための方法については、例えば、「Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」、第９版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲを参照のこと。蛍光標識剤の好適な性質としては、高いモル吸光係数、高い蛍光量子収率、および光安定性が挙げられる。一部の実施形態において、標識用蛍光体は、スペクトルの紫外（すなわち、４００ｎｍより低い）領域ではなく可視（すなわち、４００ｎｍと７５０ｎｍの間の）領域での吸収および発光波長を呈示する。例えば、リアルタイムＰＣＲ手順での使用に適する色素としては、ＳＹＢＲグリーンを挙げることができる���
【０１２０】
検出可能部分は、１つより多くの化学エンティティー、例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）におけるもの、を含むことがある。共鳴移動は、発光強度の総合的強化をもたらす。例えば、Ｊｕら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：４３４７を参照のこと；この全内容は、参照により本明細書に援用されている。共鳴エネルギー移動を果たすために、第一の蛍光分子（「ドナー」蛍光体）は、光を吸収し、励起された電子の共鳴によってそれを第二の蛍光分子（「アクセプター」蛍光体）に移動させる。１つのアプローチでは、ドナー色素とアクセプター色素の両方を互いに連結させ、オリゴプライマーに取り付けることができる。ドナーおよびアクセプター色素を核酸に連結させる方法は、以前に、例えばＬｅｅらの米国特許第５，９４５，５２６号に記載されている；この全内容が参照により本明細書に援用されている。使用することができる色素のドナー／アクセプターペアとしては、例えば、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、およびフルオレセイン／ＱＳＹ  ７色素が挙げられる。例えば、Ｌｅｅらの米国特許第５，９４５，５２６号を参照のこと。これらの色素の多くが、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．（オレゴン州ユージーン）から、市販されている。適するドナー蛍光体としては、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）、およびこれらに類するものが挙げられる。
【０１２１】
酵素
一定の実施形態において、検出可能部分は、酵素である。適する酵素の例としては、ＥＬＩＳＡの際に使用されるもの、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、ベータ−グルクロニダーゼ、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。リンカー基、例えばカルボジイミド、ジイソシアナート、グルタルアルデヒドおよびこれらに類するもの、を使用して、酵素を分子にコンジュゲートさせることができる。
【０１２２】
放射性同位体
一定の実施形態において、検出可能部分は、放射性同位体である。例えば、分子を同位体標識することができ（すなわち、自然界で通常見出される原子質量もしくは質量数とは異なる原子質量もしくは質量数を有する原子によって置換されている１つ以上の原子を含有することができ）、または同位体を分子に取り付けることができる。分子に組み込むことができる同位体の非限定的な例としては、水素、炭素、フッ素、リン、銅、ガリウム、イットリウム、テクネチウム、インジウム、ヨウ素、レニウム、タリウム、ビスマス、アスタチン、サマリウムおよびルテチウムの同位体（すなわち、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２９Ｉ、１３１Ｉ、１３５Ｉ、１８６Ｒｅ、１８７Ｒｅ、２０１Ｔｌ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ）が挙げられる。
【０１２３】
一部の実施形態において、シグナル増幅は、標識されたデンドリマーを検出可能部分として使用して果たされる（例えば、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３：９３−９９、２０００を参照；この全内容は、それら全体が参照により本明細書に援用されている）。蛍光標識されたデンドリマーは、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ（ニュージャージー州モントベール）から入手できる。これらを当該技術分野において公知の方法によってオリゴヌクレオチドプライマーに化学的にコンジュゲートさせることができる。
【０１２４】
キット
一定の実施形態において、本発明は、本発明に従って使用するためのキットを提供する。一般に、本発明のキットは、正常ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質と、表１、表２、表３または表４から選択される１つ以上の突然変異を含有する突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子またはタンパク質とを識別する１つ以上の試薬を含む。例えば、キットは、本明細書に記載の１つ以上の試薬（例えば、試薬の組み合わせ）、および場合により追加の成分を含むことができる。例えば、本発明によるキットは、当該技術分野において周知の他のＣＦＴＲ突然変異を検出することができる試薬も含むことができる。
【０１２５】
適する試薬としては、核酸プローブおよび／または抗体もしくはそれらのフラグメントを挙げることができる。一部の実施形態では、適する試薬は、アレイ、例えばマイクロアレイ、またはＣＦＴＲ突然変異パネルの形態で提供される。
【０１２６】
一部の実施形態において、提供されるキットは、本明細書に記載する様々な検出法（例えば、配列決定、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、マルチプレックスＡＳＰＥ、イムノアッセイなど）を行うための試薬をさらに含む。例えば、本発明によるキットは、本明細書に記載する方法において使用するための、例えば、プライマー誘導型増幅（ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）による核酸の増幅、ＥＬＩＳＡ実験の実施、などのための、緩衝液、酵素および／または試薬を場合により含有することがある。
【０１２７】
一部の実施形態において、提供されるキットは、健常個体の指標となる対照、例えば、ＣＦまたはＣＦ関連障害と関連づけられるＣＦＴＲ突然変異を保有しない個体からの核酸および／またはタンパク質試料、をさらに含む。一部の実施形態において、提供されるキットは、公知ＣＦＴＲ突然変異体対立遺伝子（例えば、ΔＦ５０８）を示す対照をさらに含む。キットは、個体が、ＣＦもしくはＣＦ関連障害を有するかどうか、ＣＦもしくはＣＦ関連障害を発症する危険性があるかどうか、またはＣＦＴＲ突然変異の保因者であるかどうかを決定する方法についての指示も含有することができる。
【０１２８】
一部の実施形態では、表１、表２、表３および表４に示す１つ以上の突然変異に対応する情報をコードするコンピュータ可読媒体を提供する。そのようなコンピュータ可読媒体を本発明のキットに含めることができる。
【０１２９】
システム
１つの実施形態において、本発明は、本発明の分析を行うためのシステムを提供する。従って、１つの実施形態において、本発明は、本明細書に記載する方法についてのプログラミングコードをコードしているコンピュータ可読媒体を含む。また、１つの実施形態において、本発明は、コンピュータ可読媒体と通信しているプロセッサであって、本明細書に記載する方法を行うように設定されたものであるプロセッサを具備するシステムを含むことができる。本発明の様々な実施形態に適するプロセッサおよびコンピュータ可読媒体を、より詳細に下で説明し、図５に図示する。
【０１３０】
従って、一定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの遺伝子の活性を予測するためのシステムを含み、このシステムは、コンピュータ可読媒体と、該コンピュータ可読媒体と通信しているプロセッサとを具備し、該プロセッサは、少なくとも１つの遺伝子における個々の突然変異の影響を推定するように設定されたものである。前記プロセッサは、一定の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子の一部分についての多数の配列に関するデータを含むデータベースとさらに通信していることがあり、この場合、前記プロセッサは、被験体から得た生体試料中の少なくとも１つの遺伝子の一部分に突然変異があるかどうかを決定するために前記少なくとも１つの遺伝子の一部分の核酸および／またはアミノ酸配列と前記少なくとも１つの遺伝子の一部分についての多数の配列に関するデータとを比較するように設定される。
【０１３１】
他の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの遺伝子の活性を予測するためのプログラムコードをコードしているコンピュータ可読媒体を含み、該プログラムコードは、該少なくとも１つの遺伝子における個々の突然変異の影響を推定するためにモデルを適用するためのコードを含む。一定の実施形態において、前記プログラミングコードは、被験体から得た生体試料中の少なくとも１つの遺伝子の一部分に突然変異があるかどうかを決定するために前記少なくとも１つの遺伝子の一部分のアミノ酸および／または核酸配列とデータベースに記憶された前記少なくとも１つの遺伝子の一部分についての多数の配列に関するデータとを比較するように設定されたコードを含む。
【０１３２】
本発明のシステムおよびコンピュータ可読媒体の一部の実施形態を様々な遺伝子に適用することができる。一定の実施形態において、前記少なくとも１つの遺伝子は、ＣＦＴＲ遺伝子を含む。
【０１３３】
本明細書において述べるように、特定の被験体について評定したときの少なくとも１つの遺伝子の一部分の配列および関心のある生物活性を、多数の被験体について評定したときのアミノ酸および／または核酸配列ならびに生物活性のデータベースと比較することができる。従って、前記システムおよびコンピュータ可読媒体の一定の実施形態において、前記データベースは、前記少なくとも１つの遺伝子の一部分の配列を決定した多数の試料に関して測定したときの生物活性についてのデータを含む。
【０１３４】
本主題の態様による実施形態をデジタル電子回路部品、コンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、または前述のものの組み合わせに実装することができる。１つの実施形態において、コンピュータは、プロセッサ（単数または複数）を具備することができる。前記プロセッサは、該プロセッサに連結されたランダム・アクセス・メモリなどのコンピュータ可読媒体を具備することができる、または該コンピュータ可読媒体にアクセスできる。前記プロセッサは、サンプリングルーチンを含む１つ以上のコンピュータプログラムの実行、および本明細書に詳細に記載する分析を生じさせるためのアウトプットの生成に適するプログラミングなどの、メモリに記憶されたコンピュータ実行可能プログラム命令を実行することができる。
【０１３５】
そのようなプロセッサは、マイクロプロセッサ、デジタル・シグナル・プロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラム可能ゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、およびステート・マシンを具備することができる。そのようなプロセッサは、プログラム可能電子デバイス、例えば、ＰＬＣ、プログラム可能割り込みコントローラ（ＰＩＣ）、プログラム可能論理デバイス（ＰＬＤ）、プログラム可能読み取り専用メモリ（ＰＲＯＭ）、電子的プログラム可能読み取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭもしくはＥＥＰＲＯＭ）、または他の同様のデバイスをさらに具備することができる。
【０１３６】
そのようなプロセッサは、媒体、例えば、そのプロセッサによって実行されたときに本明細書にプロセッサによって行われるまたは支援されると記載する工程をそのプロセッサに実施させることができる命令を記憶することができる有形コンピュータ可読媒体、を具備することができる、または前記媒体と通信状態にあることができる。コンピュータ可読媒体の実施形態は、ウェブサーバー内のプロセッサなどのプロセッサにコンピュータ可読命令を与えることができるすべての電子、光学、磁気または他の記憶デバイスを含むが、これらに限定されない。媒体の他の例は、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、磁気ディスク、メモリーチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＡＳＩＣ、設定されたプロセッサ、すべての光学媒体、すべての磁気テープもしくは他の磁気媒体、またはコンピュータプロセッサが読み取ることができる任意の他の媒体を含むが、これらに限定されない。また、様々な他のデバイスは、コンピュータ可読媒体、例えばルーター、私設もしくは公衆ネットワーク、または他の伝送装置を含むことができる。前記プロセッサおよびその処理は、１つ以上の構造のものである場合があり、および１つ以上の構造によって分散される場合がある。前記プロセッサは、本明細書に記載する方法（または方法の部分）のうちの１つ以上を行うためのコードを具備することができる。
【０１３７】
前記システムは、データ・コンパイリング・システム、および分析が進むにつれてユーザーが該システムと対話するための手段を含むことができる。従って、１つの実施形態において、本発明は、多数のアッセイ測定からのデータを読み込むおよび／またはコンパイルする、および／またはデータを順序づける、およびデータをコンピュータに送信するためのシステム、ならびに分析結果をユーザーに送信するためのシステムを含むことができる。本発明のシステムを、ＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列決定データの高スループット分析用に設計することができる。従って、１つの実施形態において、前記多数の測定シグナルは、少なくとも１つの細胞タイプから単離された多数の公知ＤＮＡ配列を含む。
【０１３８】
図５は、本発明のソフトウェアを具備するシステムにおける情報の流れの実施形態を示す。上で論じたように、コンピュータプロセッサまたはＣＰＵは、例えば、インプットを処理すること、アルゴリズムを実行すること、およびタッチセンシティブ・インプット・デバイスから受け取ったインプットに反応して必要に応じてアウトプットを生じさせることができる、デジタル論理プロセッサを含むことができる。本明細書において詳述するように、そのようなプロセッサは、マイクロプロセッサ、例えばＡＳＩＣ、およびステート・マシン、および／または他の構成要素を含むことができる。そのようなプロセッサは、そのプロセッサによって実行されたとき、そのプロセッサに本明細書に記載する工程を実施させる命令を記憶する媒体、例えばコンピュータ可読媒体、を含む、または前記媒体と通信状態にあることができる。
【０１３９】
従って、１つの実施形態において、起点は、正常ＣＦＴＲ遺伝子（１００Ａ）および突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子（１００Ｂ）を含むことができる、データ（１００）を含むことができる。前記データが読み込まれたら（１１０）、必要に応じて任意の標準的な表計算ソフトウェア、例えばＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ、ＦｏｘＰｒｏ、Ｌｏｔｕｓまたはこれらに類するもの、を使用してそれをコンパイルすること（１２０）および／または変換することができる。１つの実施形態において、前記データは、各実験のためのシステムに入力される。あるいは、前の試行からのデータがコンピュータメモリ（１５０）に記憶され、必要に応じて使用される。
【０１４０】
前記分析の各時点で、ユーザーは、キーボード（１８０）、フロッピー（登録商標）ディスク、リモートアクセス（例えば、インターネット経由）（１９０）、または他のアクセス手段によって命令をインプットすることができる。ユーザーは、試行のオプション、レポートをプリントアウトすべきかどうか、およびこれらに類することをはじめとする命令を入力することができる。また、各分析工程で、当該技術分野において一般的な記憶デバイス、例えばディスク、ドライブまたはメモリ（１５０）、を使用してコンピュータにデータを記憶させることができる。当該技術分野において承知されているように、プロセッサ（１６０）およびＩ／Ｏコントローラ（１７０）は、コンピュータ機能の多数の態様に必要とされる。また、１つの実施形態では、１つより多くのプロセッサが存在し得る。
【０１４１】
ノイズを除去するようにデータを処理することもできる（１３０）。一部のケースでは、ユーザーは、キーボード（１８０）、フロッピー（登録商標）ディスクまたはリモートアクセス（１９０）によって、分析のために変数または制約を、例えばノイズを決定するための閾値として、インプットすることを望むことがある。その後、分析結果を、ユーザーによる見直しのための形式でコンパイルし、提供することができる（１４０）。
【０１４２】
以下の実施例は、本発明の例証に役立つ。これらの実施例は、いかなる点においても、本発明の範囲を限定するためのものでない。
【実施例】
【０１４３】
実施例１
ＣＦＴＲ遺伝子における新規突然変異の同定
ＣＦ全配列決定アッセイを用いてＣＦＴＲ遺伝子における新規突然変異を同定した。典型的に、ＣＦ全配列決定アッセイのために提出された試料は、ＣＦ突然変異パネルにおける検査に情報価値がなかったまたは部分的に情報価値がなかった個体からのものであった。これらの個体としては、１）特発性慢性膵炎を有する患者；２）先天性両側精管欠損症（ＣＢＡＶＤ）を有する患者；３）突然変異分析により陽性／陰性の検査結果を示すカップル；４）１つの突然変異が同定されたまたは突然変異が同定されなかった、ＣＦに罹患しているまたはＣＦが疑われる患者；５）まれな家族性突然変異の絶対保因者；６）他の方法論による突然変異分析が陰性である、ＣＦの家族歴を有する患者；７）ＣＦ関連疾患または病態を有する患者が挙げられる。患者遺伝子配列を野生型遺伝子配列と比較することにより、ＣＦＴＲ遺伝子における配列変化を同定した。以前に報告されていないＣＦＴＲ遺伝子における新規突然変異を表５にまとめる。
【０１４４】
表５に示すように、これらの新規突然変異を保有する患者は、白人、アフリカ系アメリカ人、ラテンアメリカ人およびアジア人を含む、異なる民族群からの患者であった。前記突然変異の一部は、イントロン（例えば、イントロン３、イントロン６ａ、イントロン１１、イントロン１４ａ、イントロン１９、イントロン２０、イントロン２１、およびイントロン２３）内に位置する。前記突然変異の一部は、エキソン（例えば、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６ａ、エキソン６ｂ、エキソン７、エキソン９、エキソン１０、エキソン１１、エキソン１２、エキソン１３、エキソン１４ａ、エキソン１４ｂ、エキソン１５、エキソン１６、エキソン１７ａ、エキソン１７ｂ、エキソン１９、エキソン２０、エキソン２１、エキソン２２、およびエキソン２４）内に位置する。
【０１４５】
表５に示すように、同定された新規突然変異の大部分は、ＣＦＴＲ遺伝子発現および／またはタンパク質機能に影響を及ぼす可能性が高い、コドン変化または改変された遺伝子スプライシング部位を生じさせる結果となる。詳細には、前記突然変異の一部は、ナンセンス突然変異（すなわち、停止コドンの導入を生じさせる結果となると予想される突然変異）である。前記突然変異の一部は、コンセンサススプライス部位ａｇ／ｇｔに影響を及ぼす。これらの突然変異の一部は、少なくとも１ヌクレオチドの挿入または欠失である。これらの突然変異は、ＡＣＭＧガイドラインによるとカテゴリー２突然変異であり、ＣＦまたはＣＦ関連疾患、障害もしくは病態の原因となると予想されるタイプのものである。
【０１４６】
一部の突然変異は、ミスセンス突然変異である。一部は、インフレーム挿入および／または欠失の原因となると予測される。一部は、スプライス部位に影響を及ぼす可能性が高い。これらの突然変異は、ＡＣＭＧガイドラインによるとカテゴリー３突然変異である。
【０１４７】
従って、本明細書において提供する新規突然変異は、保因者検査を含むＣＦＴＲ検査アッセイにおいてＣＦまたはＣＦ関連障害を検出するために、単独で用いることができ、または他の公知ＣＦ突然変異と併用することができる。
【０１４８】
【表５−１】
2013521829.tif 000011
【０１４９】
【表５−２】
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【０１５０】
【表５−３】
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【０１５１】
【表５−４】
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【０１５２】
【表５−５】
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【０１５３】
【表５−６】
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実施例２
ＣＦＴＲ突然変異検出アッセイ
本実施例は、マルチプレックスＡＳＰＥアッセイを用いて、本明細書に記載する新規嚢胞性線維症突然変異を検出することができることを実証するものである。マルチプレックスＡＳＰＥは、マルチプレックスＰＣＲと対立遺伝子特異的プライマー伸長を兼ね備えている。マルチプレックスＰＣＲを行って、試料中のゲノムＤＮＡからの本明細書に記載する新規配列変異体を含有するＣＦＴＲ遺伝子内のターゲット領域を増幅する。次に、対立遺伝子特異的プライマーを使用してマルチプレックスプライマー伸長反応を行って、すなわち、前記ターゲット配列と完全補体を形成する３’末端ヌクレオチドを有する伸長プライマーを伸張して、伸長生成物を形成し、検出のために修飾ヌクレオチド（例えば、ビオチン化ｄＣＴＰ）をその伸長生成物に組み込む。あるいは、伸長プライマーは、その代りに、ターゲット配列とミスマッチを形成する３’末端ヌクレオチドを含有することがある。この場合、プライマー伸長は起こらない。次に、プライマー伸長生成物を、捕捉および検出のために、「抗タグ」配列（タグ配列に相補的な配列）を有する汎用アレイビーズにハイブリダイズさせる。
【０１５４】
一部のケースでは、本明細書に記載する新規突然変異を、他の公知ＣＦ突然変異、例えば、米国遺伝子学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）および米国産婦人科学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｒｉｃｉａｎｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙｉｓｔ）によって推奨されている突然変異、ならびに他の一般的で臨床的に意義のある突然変異、例えばΔＦ５０８（エキソン１０）、Ｇ５４２Ｘ（エキソン１１）、Ｇ５５１Ｄ（エキソン１１）、Ｒ１１７Ｈ（エキソン４）、Ｗ１２８２Ｘ（エキソン２０）、Ｎ１３０３Ｋ（エキソン２１）、３９０５ｉｎｓＴ（エキソン２０）、３８４９＋１０ＫｂＣ＞Ｔ（イントロン１９）、Ｇ８５Ｅ（エキソン３）、Ｒ３３４Ｗ（エキソン７）、Ａ４５５Ｅ（エキソン９）、１８９８＋１Ｇ＞Ａ（エキソン１２）および／または２１８４ｄｅｌＡ（エキソン１３）など、と併せて検出することができる。
【０１５５】
様々なＡＳＰＥキットを使用して、本明細書に記載する検出方法を行うことができる。例えば、ＬｕｍｉｎｅｘのＴＡＧ−ＩＴ（商標）キットおよびＤａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを修正して、本明細書に記載する１つ以上の新規突然変異を含むＣＦ突然変異のパネルを検出することができる。突然変異検出キットは、非同位体蛍光技術、および結果分析と遺伝子型呼び出しとを自動化するような自動化に対応できる９６ウエルアッセイ形式を用いることができる。
【０１５６】
対立遺伝子特異的プライマー
当該技術分野において公知の様々な方法およびソフトウェアを用いて、表５に示す配列変異体およびＣＦＴＲゲノム配列（エキソンおよびイントロン配列を含む）に基づき、対立遺伝子特異的プライマーを設計することができる。汎用タグ配列を対立遺伝子特異的プライマーに付加させることができる。
【０１５７】
検体およびアッセイ形式
分析すべきゲノムＤＮＡを含有する検体は、次の源（しかしこれらに限定されない）から得ることができる：全血（例えば、ＥＤＴＡ、ＡＣＤ−Ａ、ＡＣＤ−Ｂ中の全血）、新鮮または凍結組織、羊水、ＣＶＳ（絨毛膜絨毛試料採取）組織、培養細胞（例えば、ＣＶＳ、羊水、線維芽細胞、ＰＯＣ（妊娠産物））、血斑、臍帯血、口内洗浄液、外部研究所によって抽出されたゲノムＤＮＡ。血液および血斑ＤＮＡ試料を、典型的には、未希釈で５μＬインプット容量で試行する。５から２００ｎｇの量のＤＮＡをインプットとして使用する。出生前試料および口内洗浄液試料を検査するために、一般に、２０ｎｇと１５０ｎｇの間、例えば、約２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、４５ｎｇ、５０ｎｇ、５５ｎｇ、６０ｎｇ、６５ｎｇ、７０ｎｇ、７５ｎｇ、８０ｎｇ、８５ｎｇ、９０ｎｇ、９５ｎｇ、１００ｎｇ、１１０ｎｇ、１２０ｎｇ、１３０ｎｇ、１４０ｎｇまたは１５０ｎｇをインプットとして使用する。
【０１５８】
９６ウエル・アッセイ・プレートを使用する。２つのゲノムＤＮＡ対照を各アッセイプレートに含める。特異的対照をアッセイプレートを通して順次交替させる。各アッセイプレートは、２つのカクテルブランクおよびＡＳＰＥ（対立遺伝子特異的プライマー伸長）対照も含む。較正用９６ウエルフィルタープレートもデータ獲得中に使用する。
【０１５９】
単一ウエルマルチプレックスＰＣＲ
コンセンサス隣接イントロン配列を使用して、マルチプレックスＰＣＲを行って、本明細書に記載する突然変異を含有するエキソンを増幅する。一般に、アンプリコンは、サイズが約１５０ｂｐと６００ｂｐの間（両終点を含む）の範囲である。
【０１６０】
典型的に、当該技術分野において公知のＰＣＲ増幅条件または常例的な実験を用いて最適化／修正されたＰＣＲ増幅条件を用いて、５ｎｇ〜２００ｎｇのＤＮＡを増幅して、多数のアンプリコンを含有する生成物を生成する。
【０１６１】
ＰＣＲ後の酵素的クリーンアップ
ＰＣＲ生成物をエキソヌクレアーゼＩおよびエビのアルカリホスファターゼで処理して、対立遺伝子特異的プライマー伸長反応に干渉するであろう残留プライマーを除去する。標準的なプロトコル、または当業者によって容易に発展させられる修正プロトコルに従って、ＰＣＲ生成物を酵素と共にインキュベートし、その後、酵素を熱不活性化する。
【０１６２】
単一ウエル対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）反応
Ｌｕｍｉｎｅｘビーズセットを使用して、典型的に１００以下の配列変異体を単一ウエル反応において区別することができる。例えば、タグ配列を有する１セットの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プライマー（野生型対照ＡＳＯを含む）を使用する。
【０１６３】
当該技術分野において公知のまたは当業者によって容易に修正されるＰＣＲ反応条件を用いて、Ｅｘｏ−ＳＡＰ処理ＰＣＲ生成物を、タグ付きプライマーとビオチン化ｄＣＰＴとを含有する対立遺伝子特異的プライマー伸長反応に付す。
【０１６４】
汎用アレイ選別および検出
各ビーズをタグ配列ＡＳＰＥプライマーに相補的な抗タグ配列とカップリングさせる。従って、存在する場合には任意のＡＳＰＥ生成物を遺伝子型分析のために捕捉することができる。各アンプリコンについての野生型対照を含める。野生型対立遺伝子からのシグナルは、各アンプリコンについての対照として役立ち、および検出された突然変異についての対立遺伝子比計算（典型的に、野生型対立遺伝子のシグナルに対する突然変異体対立遺伝子のシグナルの比を計算することによって得られる）のための情報を提供する。
【０１６５】
ＡＳＰＥプライマーに対する抗タグを含有する汎用ビーズアレイにＡＳＰＥ生成物を添加し、ハイブリダイゼーションのためにインキュベートする。その後、ビーズを捕捉し、ビオチンを含有する一切のハイブリダイズしていないＡＳＰＥ生成物を除去するフィルターを用いて、ハイブリダイゼーション反応物を洗浄する。ビーズハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において公知であり、当業者によって容易に適応され得る。
【０１６６】
ストレプトアビジンＲ−フィコエリトリンコンジュゲートをそのフィルタープレート上のハイブリダイズした生成物に添加し、室温でインキュベートし、その後、ビーズを選別し、検出する。例えば、修正したＬＵＭＩＮＥＸ（商標）１００ＩＳ（商標）または２００ＩＳ（商標）を使用することができる。ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）１００ＩＳ（商標）をテキストファイルまたはバーコードからサンプルシートにアップロードすることができる。検出時間は、１ウエルにつき平均２０〜１００秒である。
【０１６７】
結果
ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）システムにおいて、結果を＜．ｃｓｖ＞ファイルとして生じさせ、バッチでエクスポートする。ＴＡＧ−ＩＴ（商標）Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＴＤＡＳ）バージョン６．０におけるバッチ・アウトプット・ファイル（．ｃｓｖ）を開き、一定の個々に検査された突然変異に関しては対立遺伝子比についての所定のアルゴリズムに基づいて、および残りの突然変異に関してはシグナルの存在または不在に基づいて、結果を自動的に生じさせる。
【０１６８】
突然変異確認
本明細書に記載する任意の突然変異について陽性の試料を第二のアッセイ試行によって確認することができる。陽性試料を直接ＤＮＡ配列決定によって確認することもできる。
【０１６９】
実施例３
嚢胞性線維症配列決定アッセイ
嚢胞性線維症全配列決定アッセイおよび単一エキソン配列アッセイを用いて、直接、患者試料中のＣＦＴＲ遺伝子における突然変異を検出することができる。嚢胞性線維症全配列決定アッセイおよび単一エキソン配列アッセイは、ＣＦスクリーニングパネルを補足するために用いることもでき、および／または多重突然変異について陽性である試料もしくはＣＦ突然変異検出アッセイにおいて正常な対応物のない試料についての確認アッセイとして役立つように用いることもできる。
【０１７０】
ＣＦ全配列決定アッセイは、ＣＦＴＲ遺伝子の全コード領域に加えて各イントロンの３’末端の１５ｂｐ（ｅｌ７ｂについては公知突然変異をカバーするために３０ｂｐ）および各イントロンの５’の初めの６ｂｐを配列決定する。
【０１７１】
加えて、前記アッセイは、エキソン２、３欠失、１８１１＋１．６ｋｂでのＡ＞Ｇ突然変異、および３８４９＋１０ｋｂでのＣ＞Ｔ突然変異の同定に有用なイントロン１、３、１１および１９の部分を含む。典型的に、前記アッセイは、３１のアンプリコン：ｅｌ、ｉｌ、ｅ２、ｅ３、ｉ３、ｅ４、ｅ５、ｅ６ａ、ｅ６ｂ、ｅ７、ｅ８、ｅ９、ｅ１０、ｅ１１、ｅ１２、ｅ１３ａ、ｅ１３ｂ、ｅ１４ａ、ｅ１４ｂ、ｅ１５、ｅ１６、ｅ１７ａ、ｅ１７ｂ、ｅ１８、ｅ１９、ｉ１９、ｅ２０、ｅ２１、ｅ２２、ｅ２３およびｅ２４、の分析を含む。各アンプリコンは、エキソンの大きなサイズのためアンプリコンが２つのフラグメントに分割される１３．１および１３．２を除き、エキソンの完全コード領域を含む。ＣＦシグナル・エキソン・配列決定・アッセイは、必要に応じて、個々の塩基でだが、同じプライマーを使用する。
【０１７２】
この実施例におけるＣＦ単一エキソン・配列決定・アッセイで検査した試料としては、１）ＣＦ突然変異アッセイ（例えば、実施例２において説明したようなマルチプレックスＡＳＰＥアッセイ）において陽性の検査結果を有したが、確認を必要とする個体；２）ＣＦ全配列決定アッセイにおいて陽性の検査結果を有したので反復検査を必要とする個体；３）既知家族性突然変異（単数もしくは複数）について検査を受けている個体；および／または４）実施例２のＣＦ突然変異検出アッセイにおいて検出可能でない突然変異について検査を受けている個体からのものが挙げられる。
【０１７３】
検体およびアッセイ形式
分析すべき検体は、次の源（しかしこれらに限定されない）から抽出されるゲノムＤＮＡであり得る：全血（例えば、ＥＤＴＡ、ＡＣＤ−Ａ、ＡＣＤ−Ｂ中の全血）、血斑、羊水、絨毛膜絨毛試料（ＣＶＳ）（単一エキソン配列決定のためのみ）、培養細胞（例えば、ＣＶＳ、羊水、線維芽細胞、ＰＯＣ）、口内洗浄液（単一エキソン配列決定のためのみ）。
【０１７４】
９６ウエル形式を用いる。カクテルブランクを各アッセイ時にすべてのアプリコンについて試行する。
【０１７５】
ＰＣＲ増幅
本明細書に記載する突然変異を含有するターゲット領域を、先ず、ＰＣＲ増幅によって増幅する。典型的に、５ｎｇ〜２００ｎｇのＤＮＡを２５μＬ容量の反応で増幅する。ＰＣＲプライマーは、５’ＵＰＳタグ−フォワードプライマーのためのＵＰＳ１およびリバースプライマーのためのＵＰＳ２を含む。表６は、一定の例示的ターゲットエキソンまたはイントロン領域の増幅に使用した例示的プライマーの配列を提示するものである。
【０１７６】
【表６−１】
2013521829.tif 000017
【０１７７】
【表６−２】
2013521829.tif 000018
【０１７８】
【表６−３】
2013521829.tif 000019
【０１７９】
【表６−４】
2013521829.tif 000020
ＰＣＲ条件は表７に示すとおりである。
【０１８０】
【表７】
2013521829.tif 000021
ＰＣＲ後の酵素的クリーンアップ
ＰＣＲ生成物をエキソヌクレアーゼＩ（Ｅｘｏ）およびエビのアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）で処理して、配列決定に干渉し得る残留プライマーを除去する。以下のインキュベーション条件を用いる：
３０分間３７℃（酵素消化）
１５分間９９℃（酵素不活性化）
保管まで８℃で保持
生成物を、例えば−８０℃または−２０℃で、保管することができる。
【０１８１】
配列決定
Ｅｘｏ−ＳＡＰ処理生成物を水で１：２希釈し、３μＬを、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  ｖ３．１（ＡＢＩ）を含有する７μＬのフォワードおよびリバース配列カクテルそれぞれに添加する。二方向配列決定結果を得るために、ＵＰＳ１プライマーとＵＰＳ２プライマーの両方を使用して、各アンプリコンにつき２配列決定反応を行う。遺伝子特異的プライマーを使用する追加のフォワード配列決定反応をエキソン６ｂおよび９について行って、繰り返し領域を超えて読み取り可能な配列を得る。表８に示す条件を用いてサーモサイクラーでサイクル配列決定を行う。
【０１８２】
【表８】
2013521829.tif 000022
アッセイプレートを、例えば−８０℃で２週間まで、分析されるまたはさらに操作されるまで、保管することができる。
【０１８３】
配列決定後の精製
Ｐｅｒｆｏｒｍａ  ＤＴＲ  Ｕｌｔｒａ  ９６  Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してシークエンス生成物を精製する。配列決定反応物を１：２希釈し、１０μＬをＥｄｇｅ  Ｐｌａｔｅによって精製する。
【０１８４】
配列決定試行：ＡＢＩ  ３７３０遺伝子分析装置およびデータ分析
３７３０ｘ１遺伝子分析装置を用いて１ｋＶ／１４秒注入を行う。ＰＯＰ７ポリマーおよび５０ｃｍアレイを最適分解のために使用する。典型的な配列決定試行についてのパラメータを表９に示す。
【０１８５】
【表９】
2013521829.tif 000023
ＳＥＱＳＣＡＰＥ（商標）ソフトウェア（ＡＢＩ）を使用してシークエンスデータ分析を行う。
【０１８６】
等価物
当業者は、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態の多くの等価物を思い出すだろう、または常例的な実験以上のものを用いずにそれらを突きとめることができるだろう。本発明の範囲を上の説明に限定することを意図せず、むしろ本発明の範囲は添付のクレームに示すとおりである。冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本願において本明細書およびクレームにて用いる場合、相反する明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むと解釈すべきである。グループの１つ以上の構成員間に「または」を含むクレームまたは説明は、相反する指示がない限り、または別様に文脈から明らかでない限り、前記グループ構成員の１つ、１つより多く、またはすべてが、所与の生成物またはプロセスに存在する、利用される、または別様に関連している場合、履行されると考えられる。本発明は、前記グループのまさに１つの構成員が、所与の生成物またはプロセスに存在する、利用される、または別様に関連している実施形態を含む。本発明は、前記グループ構成員の１つより多く、またはすべてが、所与の生成物またはプロセスに存在する、利用される、または別様に関連している実施形態も含む。さらに、本発明は、別の指示がない限り、または矛盾もしくは不一致が生ずることが当業者に明らかでない限り、１つ以上のクレームからの１つ以上の制限、要素、節、記述的用語などが同じ基本クレーム（または、関連性がある場合には、任意の他のクレーム）に従属する別のクレームに導入される変型、組み合わせおよび順列を包含すると解釈しなければならない。要素がリストとして、例えばマーカッシュグループまたは類似の形式で、提示されている場合、前記要素の各サブグループも開示されていると、および任意の要素（単数または複数）が前記グループから除去され得ると解釈しなければならない。一般に、本発明、または本発明の態様、が特定の要素、特徴などを含むと言われている場合、本発明の一定の実施形態または本発明の態様は、そのような要素、特徴などから成る、または本質的に成る。明快さのために、それらの実施形態は、あらゆるケースに関して、本明細書に具体的に示されてはいない。本発明のいずれの実施形態も、例えば先行技術の中で見つけられるいずれの実施形態も、具体的な除外が本明細書において述べられているかどうかにかかわらず、本請求項から明示的に除外される場合があることも理解すべきである。
【０１８７】
相反する明確な指示がない限り、１つより多くの行為を含む本願において特許請求するいずれの方法においても、前記方法の行為の順序は、前記方法の行為が列挙されている順序に必ずしも限定されず、本発明は、前記順序がそのように限定されない実施形態を含むことも理解すべきである。さらに、本クレームが組成物を述べるものである場合、本発明は、該組成物の使用方法および該組成物の作製方法を包含する。本クレームが組成物を述べるものである場合、本発明は、該組成物の使用方法および該組成物の作製方法を包含すると解釈すべきである。
【０１８８】
参考文献の援用
本願に引用されるすべての出版物および特許文献は、個々の出版物または特許文献それぞれの内容が本願に援用されているのと同程度に、それら全体が参照により援用される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−３０】
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【図１−４０】
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【図１−４２】
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【図１−４３】
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【図１−４５】
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【図１−４６】
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【図１−４７】
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【図１−４８】
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【図１−４９】
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【図１−５０】
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【図１−５１】
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【図１−５２】
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【図１−５３】
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【図１−５４】
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【図１−５５】
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【図１−５６】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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