(57)【要約】  １，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンと様々なコンジュゲーティングメンバーを含むコンジュゲートは、リン酸エステルと結合する二核金属錯体の形成に用いられる。それらのコンジュゲートを形成した形態により、錯体は、クロマトグラフィーメディア、アフィニティー結合試薬、及び染料に組み込まれ、それは、アッセイ、分離、及び精製の広い範囲において有用な錯体を形成する。加えて、コンジュゲートを形成していない１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンの二核金属錯体は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により、又は染料置換により生物学的種のリン酸エステルの検出に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有する化合物
【化１】
2013525270.tif 000015
［式中、
１又は２以上のＲ1〜Ｒ6が−Ｌ’であり、Ｌ’がアクリルアミド基、蛍光染料、アフィニティー型結合メンバー、及び固体クロマトグラフィー支持体からなる群から選択されるコンジュゲーティングメンバーと反応性を有する連結基であり、前記化合物と前記コンジュゲーティングメンバーとのコンジュゲートを形成し；
Ｒ1〜Ｒ6の残りが、独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択される］。
【請求項２】
Ｌ’が−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ2、−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ2、−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ−ＣＯ2Ｈ、−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ2、及び−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1〜Ｃ4）−ＮＨ2からなる群から選択されるメンバーである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｌ’が−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2−、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ2、−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ2Ｈ、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2、及び−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2からなる群から選択されるメンバーである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
以下の式を有する化合物
【化２】
2013525270.tif 000016
［式中、
１又は２以上のＲ1〜Ｒ6が−Ｌ−Ｒ7であり、Ｌが連結基であり、Ｒ7がアクリルアミド基、蛍光染料、アフィニティー型結合メンバー、及び固体クロマトグラフィー支持体からなる群から選択されるメンバーであり；
Ｒ1〜Ｒ6の残りが、独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択される］。
【請求項５】
Ｒ5が−Ｌ−Ｒ7であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ6が独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ5が−Ｌ−Ｒ7であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ6がＨである、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ2が−Ｌ−Ｒ7であり、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6が独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ2が−Ｌ−Ｒ7であり、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6がＨである、請求項４に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ6が−Ｌ−Ｒ7であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ6が−Ｌ−Ｒ7であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5がＨである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｌが、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ−、及び−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ−からなる群から選択されるメンバーである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｌが、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−、及び−Ｃ2Ｈ5−ＮＨ−からなる群から選択されるメンバーである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ7がアクリルアミド基である、請求項４に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ5が−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ2であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ6がＨである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ5が−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ2であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ6がＨである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ2が−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ2であり、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6がＨである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ6が−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ2であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5がＨである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ7が蛍光染料である、請求項４に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ7がビオチンである、請求項４に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ7が固体クロマトグラフィー支持体である、請求項４に記載の化合物。
【請求項２１】
以下の式を有する化合物
【化３】
2013525270.tif 000017
［式中、
Ｒ1〜Ｒ6のうちの一つが−Ｌ−Ｒ7であり、Ｌが連結基であり、Ｒ7がアクリルアミド基、蛍光染料、アフィニティー型結合メンバー、及び固体クロマトグラフィー支持体からなる群から選択されるメンバーであり；
Ｒ1〜Ｒ6の残りが、独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択され；
Ｍが二価金属である］。
【請求項２２】
ＭがＣａ、Ｚｎ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、及びＣｕからなる群から選択されるメンバーである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
ＭがＺｎ及びＭｎからなる群から選択されるメンバーである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ5が−Ｌ−Ｒ7であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ6が独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ5が−Ｌ−Ｒ7であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ6がＨである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ2が−Ｌ−Ｒ7であり、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6が独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ2が−Ｌ−Ｒ7であり、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6がＨである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ6が−Ｌ−Ｒ7であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ6が−Ｌ−Ｒ7であり、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ5がＨである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｌが、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ−、及び−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ−からなる群から選択されるメンバーである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｌが、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−、及び−Ｃ2Ｈ5−ＮＨ−からなる群から選択されるメンバーである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｒ7がアクリルアミド基である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｒ5が−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ2であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ6がＨである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｒ5が−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ2であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ6がＨである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｒ2が−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ2であり、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6がＨである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ6が−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ2であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5がＨである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３７】
Ｒ7が蛍光染料である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３８】
Ｒ7がビオチンである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３９】
Ｒ7が固体クロマトグラフィー支持体である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項４０】
リン酸化種の電気泳動に使用のための分離メディアの調製のための方法であって、アクリルアミド、架橋剤、開始剤、及び以下の式を有する化合物
【化４】
2013525270.tif 000018
［式中、
Ｒ1〜Ｒ6のうちの一つが−Ｌ−Ｒ7であり、Ｌは連結基であり、Ｒ7はアクリルアミド基である；
Ｒ1〜Ｒ6の残りが、独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択され；
Ｍが二価金属である］
を含むモノマー混合物をポリマー化することを含む、方法。
【請求項４１】
固体支持体上に固定化された、又はゲル中のリン酸化された化合物を蛍光染料で染色する方法であって、前記固体支持体又はゲルと、以下の式を有する化合物
【化５】
2013525270.tif 000019
［式中、
Ｒ1〜Ｒ6のうちの一つが−Ｌ−Ｒ7であり、Ｌは連結基であり、Ｒ7は蛍光染料である；
Ｒ1〜Ｒ6の残りが、独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択され；
Ｍが二価金属である］
とを接触させることを含む、方法。
【請求項４２】
固体支持体上に固定化された、又はゲル中のリン酸化された化合物を検出するための方法であって、
（Ａ）前記固体支持体又はゲルと、以下の式を有する化合物
【化６】
2013525270.tif 000020
［式中、
Ｒ1〜Ｒ6のうちの一つが−Ｌ−Ｒ7であり、Ｌは連結基であり、Ｒ7は第一の結合メンバーである；
Ｒ1〜Ｒ6の残りが、独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択され；
Ｍが二価金属である］
とを接触させ、
（Ｂ）（Ａ）に続いて、前記固体支持体又はゲルと、（ｉ）アフィニティー型結合を介して接触する場合、前記第一の結合メンバーと結合する第二の結合メンバーと（ｉｉ）レポーター基とのコンジュゲートとを接触させること
を含む、方法。
【請求項４３】
溶液からのリン酸化種の抽出のための方法であって、固体支持体とコンジュゲートを形成した以下の化合物
【化７】
2013525270.tif 000021
［式中、
Ｒ1〜Ｒ6のうちの一つが−Ｌ−*であり、Ｌは連結基であり、*は前記固体支持体との結合部位であり；
Ｒ1〜Ｒ6の残りが、独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択され；
Ｍが二価金属である］
を含む抽出媒体に前記溶液を通過させることを含む、方法。
【請求項４４】
サンプル中のリン酸エステルを検出する方法であって、
（Ａ）前記サンプルと以下の式の化合物：
【化８】
2013525270.tif 000022
［式中、
Ｒ1〜Ｒ6が独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択され、
Ｍが二価金属である］
の混合物を形成し、前記サンプル中に存在する任意の斯かるリン酸エステルと前記化合物の錯体を形成し、
（Ｂ）マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析により、前記混合物をスキャンし、前記錯体を検出し、及びそれにより、前記サンプル中の前記リン酸エステルをリン酸エステル以外の前記サンプル中の種と区別すること、
を含む、方法。
【請求項４５】
染料置換によりサンプル中のリン酸エステルを検出する方法であって、
（Ａ）前記サンプルと、金属帯電リガンドと色素体化合物の錯体との混合物を形成し、
ここで前記金属帯電リガンドは、以下の式：
【化９】
2013525270.tif 000023
［式中、
Ｒ1〜Ｒ6が独立してＨ及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から選択され、
Ｍが二価金属である］
を有し、前記色素体化合物は、前記金属帯電リガンドと第一の程度で結合親和性を有し、リン酸エステルは、前記金属帯電リガンドと第二の程度で結合親和性を有し、前記第一の程度は、前記第二の程度より低く、前記色素体化合物は、前記金属帯電リガンドと結合する場合に第一の発光スペクトル、結合していない場合に第二の発光スペクトルを有し、前記第一及び第二の発光スペクトルは互いと区別可能である、
（Ｂ）前記サンプル中の前記リン酸エステルの存在又は不存在の指標として前記混合物の発光スペクトルを検出すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１０年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／３１４，４３１号、及び２０１０年７月２７日に出願された同第６１／３６８，１０６号の利益を主張する。斯かる仮特許出願の双方の内容は、参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
リン酸化及び脱リン酸化は、生理学的システムにおいて代謝的に重要な反応である。これらの反応は、特定のタンパク質のヒドロキシル基において、特定の他のタンパク質の窒素原子において、及びさらに多くのタンパク質のカルボキシル基において生じ、いずれの場合にも、インビボで、これらのタンパク質の活性及び機能に影響を与える。特定のリン酸化／脱リン酸化反応は、タンパク質キナーゼ及びホスファターゼにより仲介され、それらの発生は、これらの酵素の活性の指示を与える。リン酸化／脱リン酸化反応における異常は、細胞発癌、アレルギー性疾患、及びアルツハイマー病に関与する。タンパク質リン酸化は、シグナル伝達、アポトーシス、増殖、分化、及び代謝のための、全ての生細胞における必須のプロセスである。タンパク質のリン酸化状態の測定のための方法は、従って、疾患の分子的起源の探索、及び新規薬物の設計において、価値がある。
【０００３】
二つの金属イオンを含む特定の金属酵素は、脱リン酸化反応、特にリン酸ジエステルの加水分解を触媒することが知られている。これらの反応により生じる機構の研究は、二金属錯体を形成し、同一の触媒機能を果たす合成有機リガンドの使用を伴う。これらの合成リガンドの多くは、水への溶解性が低いことが分かっており、しかしながら、実験室研究におけるそれらの有用性は限られる。この障害を取り除くために、水溶性リガンドである１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンは、開発されている。このリガンドのＺｎ（ＩＩ）錯体、及びＲＮＡの加水分解におけるその使用の開示は、Iranzo, O., et al., “Cooperativity between Metal Ions in the Cleavage of diester phosphate and RNA by Dinuclear Zn(II) Catalysts,” Inorganic Chemistry 42(24), 7737-7746 (2003)、及び Iranzo, O., et al., “Physical and Kinetic Analysis of the Cooperative Role of Metal Ions in Catalysis of Phosphodiester Cleavage by a Dinuclear Zn(II) Complex,” J. Am. Chem. Soc. 125(7), 1988-1993 (2003)により公開されている。この分子、及びそれがリン酸エステルと形成する遷移状態の更なる研究は、Yang, M.-Y., et al., “Substrate specificity for catalysis of phosphodiester cleavage by a dinuclear Zn(II) complex,” Chem. Commun. 2003, 2832-2833、及び Yang, M.-Y., et al., “A transition state analog for phosphate diester cleavage catalyzed by a small enzyme-like metal ion complex,” Bioorganic Chemistry 35, 366-374 (2007)により報告されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
一部においては、本発明は、様々なコンジュゲーティングメンバーを含む、置換された又は未置換の１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンのコンジュゲートに属し、それぞれのコンジュゲートは、上記の報告に開示される錯体と同様の様式で二金属錯体を形成することができる。本発明はまた、官能基化された、置換された又は未置換の１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンに属し、その官能基は、コンジュゲーティングメンバーと反応性を有する。置換された又は未置換の１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンは、便宜のために、「リガンド」と称され、コンジュゲートは、後述のように様々な更なる機能の一つを果たすコンジュゲーティングメンバーとコンジュゲートを形成するこれらのリガンドである。本発明は、更に、これらのコンジュゲートの二核金属錯体、及びリン酸ジエステルの加水分解以外におけるこれらの錯体の様々な使用に属する。これらの錯体の有用性は、二つの金属イオンのリン酸結合活性と共に、コンジュゲートの形成に用いられる特定のコンジュゲーティングメンバーに起因する。
【０００５】
本発明は、更に、リン酸エステルの正に帯電した二核金属錯体を形成する好適なマトリックスにおいてサンプルと斯かる錯体を混合することにより、リガンドの二核金属錯体、又はリガンドのコンジュゲートの二核金属錯体のいずれかを用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型）質量分析により、サンプル中のリン酸エステルを検出するための方法に属する。質量分析スキャンが、サンプル及びマトリックスに対して実行される場合、錯体を形成していない成分と、サンプル中のリン酸エステルの正に帯電した二核金属錯体との識別は、錯体中のリガンドにより与えられる付加質量、及び錯体の帯電における変化のために、増加する。コンジュゲートを形成していないリガンドは、本発明のこの態様において、特に対象となる。
【０００６】
本発明のなお更なる態様は、リガンドの二核金属錯体、又はリガンドのコンジュゲートの二核金属錯体のいずれかを再び用いて、色素置換によりサンプル中のリン酸エステルを検出するための方法に属する。本発明のこの態様では、二核金属錯体は、二つの主要な特徴−（１）色素体化合物は、金属帯電リガンド（又はリガンドのコンジュゲート）とリン酸エステルが有するよりも低い親和性を有する、即ちリン酸エステルは、リガンドとより強く結合し、接触した場合に錯体中の色素体化合物を置き換える；及び（２）色素体化合物は、結合の場合に、未結合の場合と異なる吸収又は蛍光スペクトルを有する、を有する色素体化合物との錯体を更に形成する。この記述を満たす色素体染料の一つの例は、ピロカテコール・バイオレットである。リン酸エステルによる錯体からの色素体化合物の置換の結果として生じるスペクトル変化は、従って、サンプル中のリン酸エステルの存在の指標として機能する。本発明のこの態様ではまた、コンジュゲートを形成していないリガンドの使用も、特に対象となる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の実施形態の詳細な説明
置換された又は未置換の１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンであるリガンドは、一般式（Ｉ）：
【０００８】
【化１】
2013525270.tif 000002
により表される。
【０００９】
式（Ｉ）では、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、同じ又は異なっており（同じものもあれば、異なるものもある）、Ｈ又は低級アルキル基のいずれかである。表現「低級アルキル」とは、６個以下の炭素原子のアルキル基として定義される。Ｒ1〜Ｒ6の好ましい基は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ3アルキルのいずれかである、又はＨ及びＣ1〜Ｃ3アルキルから選択される組み合わせであり、最も好ましくはＨである。本明細書において用語「置換された」とは、１又は２以上のＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ6がＨ原子ではなくアルキル基であることを表す。
【００１０】
コンジュゲートを形成していないとして本明細書で記述されるリガンドは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6が同じ又は異なっており、それぞれがＨ又は低級アルキル基のいずれかであるものである。リガンドのコンジュゲートは、コンジュゲーティングメンバーを残りの構造につなぐ連結基を介して、コンジュゲーティングメンバーが、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6により示される任意の位置を占める式（Ｉ）のこれらの化合物である。コンジュゲーティングメンバーを表さない任意の斯かるＲ基は、上述のように、Ｈ又は低級アルキル基である。コンジュゲートについては、１又は２以上のＲ1〜Ｒ6は、従って、−Ｌ−Ｒ7であり（Ｌは連結基を表し、Ｒ7はコンジュゲーティングメンバーである）、Ｒ1〜Ｒ6の残りの基（単数又は複数）は、同じ又は異なっており（同じものもあれば、異なるものもある）、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルのいずれかである。官能基化されたリガンドについては、１又は２以上のＲ1〜Ｒ6は、−Ｌ’である（Ｌ’は、コンジュゲーティングメンバーとの反応性を有する、未反応の連結基を表す）。コンジュゲートとして、官能基化されたリガンドでは、Ｒ1〜Ｒ6の残りの基（単数又は複数）は、同じ又は異なっており（同じものもあれば、異なるものもある）、それぞれＨ又はＣ1〜Ｃ6アルキルのいずれかである。好ましい官能基化されたリガンド又はコンジュゲートでは、Ｒ1〜Ｒ6の一つのみがそれぞれ−Ｌ’又は−Ｌ−Ｒ7であり、さらに好ましいリガンド又はコンジュゲートでは、Ｒ5のみ、Ｒ6のみ、又はＲ2のみが−Ｌ’又は−Ｌ−Ｒ7である。−Ｌ’又は−Ｌ−Ｒ7により置き換えられないＲ1〜Ｒ6基の中で、斯かる基は、好ましくはＨ、Ｃ1〜Ｃ3アルキル、又はＨ及びＣ1〜Ｃ3アルキルから選択される組み合わせであり、Ｈが最も好ましい。コンジュゲーティングメンバーＲ7は、アクリルアミド基、蛍光染料、アフィニティー型結合メンバー、又は固体クロマトグラフィー支持体のいずれかである。連結基Ｌ’又はＬは、二つの結合部位を有する任意の従来のリンカーであり、その一つは、コンジュゲーティングメンバーＲ7と共有結合を形成し、他方は、式（Ｉ）の残り上の隣接する炭素原子と共有結合を形成する。連結基は、一般的に、使用可能な価数を満たすＨ原子に加えてＣ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される３〜３０原子を有し、環式の、非環式の、芳香族の、又は環式、非環式及び芳香族部分の組み合わせのいずれかである。連結基の例としては、アミンアルキル連結、アルケニル連結、アミド又はアミドを含む連結、エステル又はエステルを含む連結、及びエーテル又はエーテルを含む連結が挙げられる。Ｌ’について好ましい連結基は、−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ2、−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ2、−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ−ＣＯ2Ｈ、−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ2、及び−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ4）−ＮＨ2であり、−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ2、−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ2Ｈ、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2、及び−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2は特に好ましい。Ｌについて好ましい基は、（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−Ｃ（��Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−、−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ−、及び−（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）−ＮＨ−であり、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−、及び−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−は特に好ましい。
【００１１】
Ｒ7はアクリルアミド基である場合、−Ｌ−Ｒ7は、好ましくは−ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ2、又は−（ＣＨ2）2−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）n−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ2（式中、ｎは１〜６である）であり、
−ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ2、及び
−（ＣＨ2）2−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）2−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ2
が最も好ましい。
【００１２】
特定にこの−Ｌ−Ｒ7がＲ5を置き換え、残りのＲが全てＨである場合、コンジュゲートは以下の式を有する。
【００１３】
【化２】
2013525270.tif 000003
【００１４】
コンジュゲーティングメンバーがアクリルアミドであるこの発明に従って、官能基化されたポリアクリルアミドゲルは、コンジュゲート及び二核金属錯体から形成され得る。これらのゲル中の官能基は、アクリルアミドを含むコンジュゲートの二金属錯体であり、得られたゲルは、タンパク質、ペプチド、又は核酸のリン酸モノエステルの、これらの種類の非リン酸化形態からとの電気泳動分離に用いられ得る。混合物中のタンパク質、ペプチド、又は核酸のリン酸モノエステルは、リン酸エステルとゲル上の二金属錯体官能基との相互作用のために、電気泳動の間、より遅く泳動される。混合物のリン酸化成分は、それにより、それらのリン酸化されていない同等物と区別され得る。官能基化されたゲルは、モノマー混合物中に二金属錯体を含むことにより形成され、それはまた、一般的に、官能基化されていないアクリルアミド、架橋剤、及び開始剤を含む。好適な架橋剤及び開始剤は、当該技術分野においてよく知られている。架橋剤の例としては、ビスアクリルアミド、及びエチレンジアクリレートが挙げられ、開始剤の例としては、リボフラビン、過硫酸アンモニウム、及びテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）が挙げられる。モノマーのポリマー化のための条件、及びモノマー混合物の様々な成分の濃度は、ポリアクリルアミドゲルの形成のための先行技術の手順に用いられるものと同様である。
【００１５】
この発明の実施において使用のための式（Ｉ）のリガンドの二核金属錯体は、式（ＩＩ）： 
【００１６】
【化３】
2013525270.tif 000004
を有するものである。
【００１７】
式（ＩＩ）では、Ｒ1〜Ｒ6は、上記に定義された通りであり、Ｍは、二価の金属である。二価の金属の好ましい群は、Ｃａ、Ｚｎ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、及びＣｕ（全て二価の形態）である。特に好ましい二価の金属は、Ｚｎ（ＩＩ）及びＭｎ（ＩＩ）である。
【００１８】
本発明の様々な方法において使用される場合、式（ＩＩ）の二核金属錯体は、式（ＩＩＩ）のリン酸結合錯体： 
【００１９】
【化４】
2013525270.tif 000005
を形成する。
【００２０】
式（ＩＩＩ）では、Ｘは、ペプチド、タンパク質、核酸の残基、又はこの発明の錯体が本明細書で述べられる任意の様々な目的に適用される一般的な任意の種類である。
【００２１】
Ｒ7が蛍光染料である場合、染料は、生物学的種の標識に用いられるために知られている任意の様々な蛍光染料でもよい。例としては、
【００２２】
フルオレセイン及びフルオレセイン誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネート、
【００２３】
ローダミン誘導体、例えばテトラメチルローダミン、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、スルホローダミンＢ、ローダミン１０１（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、及びローダミン１１０、
【００２４】
４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ＢＯＤＩＰＹ）、及びそれらの誘導体、
【００２５】
ピレン及びピレン誘導体、例えば８−メトキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸、
【００２６】
ピリジルオキサゾール誘導体、
【００２７】
ダポキシル誘導体、
【００２８】
ウンベリフェロン、
【００２９】
１−アニリノ−８−ナフタリンスルホン酸、
【００３０】
３，６−ジスルホネート−４−アミノ−ナフタルイミド、
【００３１】
トリ−、ペンタ−、及びヘプタメチンシアニン染料、並びに
【００３２】
発光性遷移金属錯体、例えばトリス（２，２’−ビピリジンン）ルテニウム（ＩＩ）又はＩｒ（ＩＩＩ）のシクロメタル化された錯体が挙げられる。
【００３３】
Ｒ7がテトラメチルローダミンである場合、例えば、−Ｌ−Ｒ7は、好ましくは、
【００３４】
【化５】
2013525270.tif 000006
【００３５】
［式中、アスタリスクは、１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンと結合する部位を表す。］
である。このリンカー及び染料が、Ｒ5と置き換わり、Ｒ1〜Ｒ4が全てＨである場合、得られるコンジュゲートは、式
【００３６】
【化６】
2013525270.tif 000007
を有する。
【００３７】
蛍光染料を含むコンジュゲートから形成されるこの発明に従って、二核金属錯体は、例えば、生体液のサンプル中、及び一般的なアッセイメディア中のリン酸エステル、例えばリンタンパク質を同定及び定量するためのゲル又はブロットの染色のために、用いられ得る。
【００３８】
Ｒ7がアフィニティー型結合メンバーである場合、斯かる結合メンバーの例としては、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗体、及び抗体フラグメントが挙げられる。Ｒ7がビオチンである場合、−Ｌ−Ｒ7は、好ましくは、
【００３９】
【化７】
2013525270.tif 000008
［式中、アスタリスクは、１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル）−２−ヒドロキシプロパンとの結合の部位を表す。］
である。この官能基が、Ｒ5と置き換わり、Ｒ1〜Ｒ4が全てＨである場合、得られるコンジュゲートは、式
【００４０】
【化８】
2013525270.tif 000009
を有する。
【００４１】
Ｒ6がアフィニティー結合メンバーであるこの発明に従って、二核金属錯体は、固体支持体と結合した、さもなければ固体支持体上に固定化されたリンタンパク質、及び他のリン酸エステルの検出に有用である。アフィニティー結合対を形成する第二のアフィニティー結合メンバーと特異性的に結合するアフィニティー結合メンバーの能力は、錯体がリン酸エステルと結合する前又は後に、結合対を介してレポーター基と錯体との結合を可能にする。これは、アフィニティー結合メンバーとコンジュゲートを形成し得る任意の種類のレポーター基による検出を可能にする。アフィニティー結合対は、よく知られており；例としては、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、及び任意の様々な抗体又は抗体フラグメントと抗原が挙げられる。レポーター基の例としては、放射性標識、化学発光標識、及び酵素が挙げられる。酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びルシフェラーゼが挙げられる。アフィニティー結合メンバーを含む二核金属錯体の使用を説明するために、固体支持体、例えばその上にリン酸エステルが捕捉されるブロッティング膜は、錯体と最初に接触する。例えば、錯体上のコンジュゲーティングメンバーがビオチンである場合、支持体は、ストレプトアビジン−酵素コンジュゲートと接触する。続いて、支持体は酵素基質とインキュベーションされ、変化、ほとんどの場合、酵素により媒介される基質における変色は検出される。接触及びインキュベーションのための最適条件は、当業者に容易に理解される。
【００４２】
Ｒ7が固体クロマトグラフィー支持体である場合、用語「固体」は、半固体（例えばゲル）、可撓性固体（例えば膜及びフィルム）、並びに硬い固体（例えば非圧縮性のビーズ、顆粒、及びカラムの形成に用いられるもの又はチューブ壁）を含むものとして本明細書で用いられる。斯かる固体の例としては、ポリアクリルアミド、架橋されたシリコンポリマー、シリカゲル、アガロース、ポリビニルアルコール、セルロース、及びニトロセルロースが挙げられる。この発明の二核金属錯体を含むクロマトグラフィー支持体は、精製又は濃縮の目的のために、液体、例えば生体液、アッセイメディア、又はリン酸化化合物を含む任意の液体から、リン酸化化合物（リン酸エステル）を抽出するために用いられ得る。
【００４３】
この発明に従って、コンジュゲートは、１又は２以上の保護された二級アミン基、又は好適な保護基を含む１，４，７−トリアザシクロノナン誘導体で開始する従来の方法により、又は１，４，７−トリアザシクロノナン三環式オルトアミドの形成により、調製され得る。適切な官能基は、選択的に、１又は２以上の未保護のＲ1〜Ｒ4位置に置かれ得る。適切な官能基はまた、三つの炭素鎖を含む各大員環からの一つの環窒素を連結することにより、二つの１，４，７−トリアザシクロノナン基と結合する適切な合成中間体の選択により、Ｒ5位置に置かれ得る。官能基の選択は、連結基の選択、及び連結基が結合する様式により変更され得、斯かる結合は、当該技術分野において知られている連結反応の任意の広い範囲で達成可能である。官能基の顕著な例は、コンジュゲーティングメンバーに結合しているアミン官能基と反応し得るカルボン酸又はカルボン酸のエステル、活性カルボン酸エステル又は酸塩化物と反応し得るアミン基であり、双方ともにアミド結合の形成をもたらす。カルボン酸で官能基化されたリガンドと、アミンを含むコンジュゲーションパートナーとの反応は、当該技術分野で知られているように、直接的に、又は活性化酸、例えば酸塩化物、酸無水物、又はスクシンイミジルエステルの存在下で、容易に達成される。アミン官能基化されたリガンドと、活性化エステル又は酸塩化物を含むコンジュゲーションパートナーとの反応は、当該技術分野で知られているように、容易に達成される。
【００４４】
官能基化されたリガンドの調製は、メチルエステルが、Ｒ5を占め、他の全てのＲ基がＨであるリガンドにより説明される。斯かる調製の例としては、１，４，７−トリアザシクロノナンで開始され、ジメチルホルムアミドジメチルアセタールと反応し、１，４，７−トリアザシクロノナン三環式オルトアミドを形成し、それはその後メチル３，５−ジブロモレブリネートと反応し、メチル３，５−ビス（４−ホルミル−１，４，７−トリアゾナン−１−イル）−４−オキソペンタノアートを形成するものが挙げられる。後者は、その後水素化ホウ素ナトリウムと反応し、メチル３，５−ビス（４−ホルミル−１，４，７−トリアゾナン−１−イル）−４−ヒドロキシペンタノアートを形成し、それはその後、塩酸と反応し、メチル４−ヒドロキシ−３，５−ジ（１，４，７−トリアゾナン−１−イル）ペンタノアートを生成する。この一連の反応は、いかに示される：
【００４５】
【化９】
2013525270.tif 000010
【００４６】
分子上の他の位置においてメチルエステル基を置き、更なる置換基と共に官能基化されたリガンドを得るための手順のバリエーションは、有機化学合成分野における当業者に明らかである。一つの例は下記に示され、それは、アミン基を置き、二つのＮ原子においてブトキシカルボニル基で保護された１，４，７−トリアザシクロノナンで開始し、１，３−ジブロモ−２−プロパノールと反応し、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル７−（３−ブロモ−２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７−トリアゾナン−１，４−ジカルボキシレートを形成する（ステップ１）。独立して、未保護の１，４，７−トリアザシクロノナンは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタールと反応し、対応する三環式構造を形成し、それはその後、ｔｅｒｔ−ブチル（２−ブロモエチル）カルボマートと反応し、加水分解され、ｔｅｒｔ−ブチル（２−（４−ホルミル−１，４，７−トリアザノン−１−イル）−３−）１，４，７−トリアゾナン−１−イル）エチルカルボマートを得る。二つの生成物は、その後反応し、１−（４−（２−アミノエチル）−１，４，７−トリアゾナン−１−イル）−３−（１，４，７−トリアゾナン−２−イル）プロパン−２−オールを形成し、続いて脱保護される（ステップ３）。
【００４７】
【化１０】
2013525270.tif 000011
【００４８】
【化１１】
2013525270.tif 000012
【００４９】
【化１２】
2013525270.tif 000013
【００５０】
更なる例は、下記に示され、Ｎ−（３−ブチニル）フタルアミドのＮ−（３−オキソブチル）フタルアミドへの水和で開始する。これに続き、臭素、その後ウィッティヒ試薬、その後ペルオキシ酢酸、その後二つのＮ原子において保護されている１，４，７−トリアザシクロノナンと反応し、続いて脱保護され、２−（１，４，７−トラゾナン−１−イル）メチル）−４−１−（１，４，７−トリアゾナン−１−イル）ブタン−２−オールを形成する。
【００５１】
【化１３】
2013525270.tif 000014
【００５２】
本発明に使用のためのリガンド又はコンジュゲートのいずれかの錯体形成は、リガンドで、コンジュゲーションの前の官能基化されたリガンドで、又はコンジュゲート自身上で行なわれ得る。いずれにしても、錯体形成は、金属の適切な塩、例えばＺｎ（ＮＯ3）2（Ｚｎ錯体は形成される）と、適切なモル比において、リガンドの臭化水素酸又は塩酸塩と結合し、ｐＨを６．５〜７．０に調整することにより、達成され得る。
【００５３】
本明細書に添付の特許請求の範囲において、用語「一つの（ａ）」又は「一つの（ａｎ）」は、「１又は２以上」を意味することを意図する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びそれらのバリエーション、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、ステップ又は要素の列挙に先立つ場合、更なるステップ又は要素の付加が任意であり、排除されないことを意味することを意図する。全ての特許、特許出願、及びこの明細書において引用される他の公開されている参照材料は、これによりそれらの全体において参照により本明細書に援用される。本明細書で引用される任意の参照材料又は一般的な任意の先行技術と、この明細書の明示的な教示との間の任意の矛盾は、この明細書の教示を尊重して解決されることを意図する。これは、語又は語句の当該技術分野で理解されている定義と、同一の語又は語句の明細書で明示的に提供される定義との間の任意の矛盾を含む。
【国際調査報告】
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