(57)【要約】  本発明は、農業食物製品の１つまたはより多くの試料を特徴付けるための方法に関し、特にそのような製品の自然度、新鮮度、および信頼性、および／またはターゲット製品との適合性を決定することを意図している。本発明の方法は、試料の複数の自然蛍光スペクトルを取得する工程、前記スペクトルに多変量またはマルチパス分析方法を適用する工程であって、前記方法は、Ｆ次元の空間内の点（ＰＥ）によってその表示を可能とするために、前記または各試料を代表する変数の制限された数Ｆを提供する工程、前記または各試料を代表する前記点と、１つまたはより多くの参照試料を代表するターゲット（Ｃ１）との距離（Ｄ１）を計算する工程、並びに、前記距離（Ｄ）に従って前記または各試料の特徴を決定する工程、を含むことを特徴とする。
2013528814.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
農業食物製品の１つまたはより多くの試料（Ｅ）を特徴付けるための方法であって、
ａ）分析すべき前記または各試料（Ｅ）を、それぞれの波長を持つ複数の励起光放射で照らす工程と、
ｂ）前記または各試料の自然蛍光スペクトル（Ｆ２８０、Ｆ３４０、Ｆ４２９）を取得する工程であって、各々がそれぞれの励起光放射に対応している工程と、
ｃ）多方式の分析方法を前記スペクトルに適用する工程であって、前記または各試料がＦ次元を持つ空間内の点によって代表され得るように、前記または各試料の変数代表の数字Ｆを提供する工程と、
ｄ）Ｆ次元を持つ前記空間内の、前記または各試料を代表する点と、１つまたはより多くの参照試料を代表するターゲット（ＣＩ）との間の距離（Ｄ）を計算する工程と、
ｅ）前記または各試料の特徴を前記距離に従って決定する工程と、を備えた方法。
【請求項２】
前記特徴は、自然度インジケーター、新鮮度インジケーター、信頼性インジケーター、および適合性インジケーターから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記または各試料の変数代表の数字Ｆは、１と１０との間であり、好ましくは、１と５との間である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記多方式の分析方法は、ＰＡＲＡＦＡＣ分解である請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記距離は、ユークリッド距離、マハラノビス距離、および回帰モデルによって予測される距離から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記工程ｅ）は、スチューデントの検定のような統計的検定を適用することによって実施される請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程ｂ）は、前面蛍光スペクトルを取得する工程に存する請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、前記取得された蛍光スペクトルを励起光放射の１次レイリー散乱による寄与を減じることによって前処理する工程ｂ’）を、前記工程ｂ）とｃ）との間にさらに備え、
前記寄与は、一般化線形モデルを用いて計算される請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
励起光放射の数、および、各試料の対応する蛍光スペクトルの数は、２と６との間であり、好ましくは、３と５との間である請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記励起光放射間の平均スペクトルギャップは、少なくとも２０ｎｍであり、好ましくは、少なくとも５０ｎｍであり、少なくとも１００ｎｍのスペクトル範囲にわたる請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの試料の分光分析のための装置であって、
−  分析されるべき前記または各試料（Ｅ）を、異なる波長を持つ、それぞれの励起光放射によって照らすための光源の組（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３）と、
−  前記または各試料が前記励起光放射によって照らされたときに前記または各試料によって放出された前面蛍光スペクトルを取得するための手段（Ｍ、Ｄ）と、
−  請求項１乃至１０の１つに記載の方法を実行するために適した、取得した蛍光スペクトルを処理するための手段（ＭＴＤ）と、を備えた装置。
【請求項１２】
少なくとも１００ｎｍのスペクトル範囲にわたる少なくとも２０ｎｍの平均スペクトルギャップを持つ、２と６の間、好ましくは、３と５の間の前記光源を含む請求項１１に記載の光学分析のための装置。
【請求項１３】
−  ２７０と３００ｎｍとの間の波長を持つ放射を放出する第１光源（Ｓ１）と、
−  ３００と３６０ｎｍとの間の波長を持つ放射を放出する第２光源（Ｓ２）と、
−  ４００と５００ｎｍとの間の波長を持つ放射を放出する第３光源（Ｓ３）と、を備えた請求項１２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業食物製品を特徴付けるための分光学的方法に係わり、特に、そのような製品の自然度、新鮮度、および信頼性、或いは、該農業食物製品とターゲット製品との適合性をも決定することを意図した方法に関する。本発明は、また、そのような方法を実施するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
本方法は、計量化学的方法に基づいており、特に、多変量の、または、好ましくは、自然蛍光スペクトルの多方式の統計的分析に基づいている。多方式の分析は、データが３つまたはより多くの方式で表に配列されているときの、多変量分析の自然拡張である。この点に関して、Ｒ．Ｂｒｏによる関連の業績「食物産業モデル、アルゴリズム、および応用における多方式分析」（博士論文、アムステルダム大学、１９９８）が参考になるかもしれない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
貯蔵され、または変換された農業食物製品の「自然度」および「新鮮度」、すなわち、初期新鮮製品に関するそれらの近接度は、顧客と生産者の両方にとって重要なパラメータである。残念ながら、これらのパラメータは正確に定義することが困難であり、定量化することは、より一層困難である。本発明は、実際、そのような定量化を可能とすることを目指したものである。
【０００４】
本発明の方法は、また、参照製品（原産地、国、製造方法等）または「標準」製品との比較において、農業食物製品の「信頼性」または「標準化」を評価することを可能とする。
【０００５】
一般に、（ａ）自然度、（ｂ）新鮮度、（ｃ）信頼性または（ｃ’）標準化の概念は、製品の品質の改変を意味し、（ａ）変換されておらず、（ｂ）貯蔵無しで新鮮であり、（ｃ）正確かつ承認された仕様に従って信頼性があり、および、（ｃ’）製品を製造する会社の内部の仕様に従って標準化されている、自然製品との比較における、物理化学的特性の変化によって明らかとなる。
【０００６】
物理化学的特性における変化は、それら自身、自然の、または新しく形成された蛍光体、或いは吸光度（色に関連する）および散乱（高分子組織に関連する）のような光学特性を介して、化学組成改変を明らかにする、蛍光の変化によって明確とされる。
【０００７】
Ｆ変数を持つ、スペクトルの被約表現間の距離の計算は、（ａ）技術的変換の際に、（ｂ）特定の条件下での貯蔵の際に、または（ｃ、ｃ’）各種の製造モードの間に実施される、多かれ少なかれ標準の、または信頼性のある変化を定量化するための手段を構成する。
【０００８】
いずれにしても、参照製品の試料の代表集団を考慮して、前記製品における不可避の変動性を考慮することができる。実際、特徴付けられるべき製品と参照製品との間のスペクトルサインにおける差異は、参照製品の試料間の変動性に帰され得る程度を超えたときにのみ重要である。
【０００９】
この方法は、食物加工産業の事業における標準化ツールを構成し得るものであり、目的試料との間の如何なる工業製品との比較も可能とし、最適であると判断される。それはまた、貯蔵、変換、または製造方法を特徴付けるためのツールを構成し得るものであり、この場合、孤立した試料に焦点は当てられず、特徴付けられるべき方法から生じる、そのような試料の代表集団に焦点が当てられる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
農業食物製品の１つまたはより多くの試料、或いは、より概括的には、製造の方法を受けるあらゆる製品（化粧品、薬等）、変換、または貯蔵を特徴付けるための、本発明による方法は、以下の特徴を備えている。
ａ）分析すべき前記または各試料をそれぞれの波長での複数の励起光放射で照らす工程、
ｂ）前記または各試料の自然蛍光スペクトルを取得する工程であって、各々がそれぞれの励起光放射に対応している、工程、
ｃ）多変量または多方式の分析方法を前記スペクトルに適用する工程であって、前記または各試料がＦ次元を持つ空間内の点によって代表され得るように、前記または各試料の変数代表の数字Ｆを提供する、工程、
ｄ）Ｆ次元を持つ前記空間内の、前記または各試料を代表する点と、１つまたはより多くの参照試料を代表するターゲットとの間の距離を計算する工程、および
ｅ）前記または各試料の特徴を前記距離に従って決定する工程。
【００１１】
特に１つの簡単なケースにおいては、計算された距離それ自身が、所望の特徴を表示するために使用され、このケースにおいては、工程ｄ）とｅ）とが一緒に実施される。
【００１２】
単独で、または組み合わせて取り入れられる、本発明の各種の有利な特徴によれば、
−  前記特徴は、自然度インジケーター、新鮮度インジケーター、信頼性インジケーター、および適合性インジケーターから選択され得る。
−  前記または各試料の変数代表の数字Ｆは、１と１０との間であり得るものであり、好ましくは、１と５との間である。
−  前記多変数または多方式の分析方法は、主成分分析またはＰＣＡ、主成分回帰またはＰＣＲ、部分最小二乗またはＰＬＳ回帰、部分最小二乗識別分析またはＰＬＳ−ＤＡ、およびＰＡＲＡＦＡＣ分解から選択することができる。
−  前記距離は、ユークリッド距離、マハラノビス距離、および回帰モデルによって予測される距離から選択することができる。
−  前記工程ｅ）は、スチューデントの検定のような統計的検定を適用することによって実施され得る。
−  前記工程ｂ）は、前面蛍光スペクトルを取得する工程に存する。
−  前記方法は、また、前記取得された蛍光スペクトルを励起光放射の１次レイリー散乱による寄与を減じることによって前処理する工程ｂ’）を、前記工程ｂ）とｃ）との間に備えることができ、前記寄与は、一般化線形モデルを用いて計算される。
−  励起光放射の数、および、各試料の対応する蛍光スペクトルの数は、２と６との間であり得るものであり、好ましくは、３と５との間である。
−  前記励起光放射間の平均スペクトルギャップは、少なくとも２０ｎｍであり得るものであり、好ましくは、少なくとも５０ｎｍであり、少なくとも１００ｎｍのスペクトル範囲にわたる。
【００１３】
本発明の他の主題は、少なくとも１つの試料の分光分析のための装置であり、
−  分析されるべき前記または各試料を、異なる波長を持つ、それぞれの励起光放射によって照らすための光源の組、
−  前記または各試料が前記励起光放射によって照らされたときに前記または各試料によって放出された前面蛍光スペクトルを取得するための手段、および
−  前記の如く方法を実行するために適した、取得した蛍光スペクトルを処理するための手段、を備える。
【００１４】
単独で、または組み合わせて取り入れられる、本発明の各種の有利な特徴によれば、
−  前記装置は、少なくとも１００ｎｍのスペクトル範囲にわたる少なくとも２０ｎｍの平均スペクトルギャップを持つ、２と６の間、好ましくは、３と５の間の光源を含むことができる。
−  前記装置は、２７０と３００ｎｍとの間の波長を持つ放射を放出する第１光源、３００と３６０ｎｍとの間の波長を持つ放射を放出する第２光源、および、４００と５００ｎｍとの間の波長を持つ放射を放出する第３光源を含むことができる。
【００１５】
本発明の他の特徴、詳細、および利点は、以下のそれぞれの添付の図面を参照して、例示として成された記述を読むことにより明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】異なる波長を持つ３つの励起放射に対応する、農業食物製品（あぶったチコリ）の試料の前面蛍光の３つの「生」スペクトル。
【図２Ａ】一般化線形モデルを用いた方法によるレイリー散乱の減算を示したグラフ。
【図２Ｂ】一般化線形モデルを用いた方法によるレイリー散乱の減算を示したグラフ。
【図２Ｃ】一般化線形モデルを用いた方法によるレイリー散乱の減算を示したグラフ。
【図３】一般化線形モデルを用いた方法によるレイリー散乱の減算を示したグラフ。
【図４】スペクトル連結の概念の模式図。
【図５】ＰＡＲＡＦＡＣ因数分解の模式図。
【図６】本発明の一実施形態による分析装置の原理の図。
【図７】本発明の一実施形態による方法の原理の図。
【図８】本発明の一実施形態による方法の、ミルクの試料における自然度の決定への適用を示したグラフ。
【図９Ａ】本発明の他の実施形態による方法の、各種オレンジジュースの自然度の決定への適用のグラフ。
【図９Ｂ】本発明の他の実施形態による方法の、各種オレンジジュースの自然度の決定への適用のグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の一実施形態による方法は、ＵＶ−可視範囲（約２５０−７５０ｎｍ）における所定の波長を持つ光ビームによって照らした後に食物の表面で放出された自然蛍光シグナルを用いる。このシグナルは、定量化することが望まれる「自然度」または「新鮮度」の特徴と関連がある情報を抽出することを可能とする計量化学的方法によって分析される。そのような相関性の存在は、農業生産、貯蔵および変換の際、食物の自然の成分（ビタミン、タンパク質、および、自然の、或いは意図的にまたは意図せずに追加された他の成分）の固有の蛍光、さらにまたそれらの反射率が変化し、一方で、同時に、新しい分子の形成に起因して新しいシグナルが現れる、という事実から推論される。「新しく形成された蛍光」または「取得された蛍光」の用語は、蛍光体が新規に形成されるか、または環境から生ずるかによって使用される。ネイティブシグナル（ＮＳ）、新たに形成されたシグナル（ＮＦＳ）、および新たに取得されたシグナル（ＮＡＳ）における共同の変化は、食物の物理的、物理化学的、化学的、または微生物学的な改変に強く関連し、特に、製造、貯蔵、および／または改変の際に誘起される品質パラメータにおける変化に関連する。食物の品質に影響する変化要因は、酸化紫外線放射、微生物の破壊、或いは逆に、マイコトキシンの合成をもたらす、微生物の幾つかの発生、農作物への人的介入（肥料、農薬等）、または、食物内の温度、圧力、または他の物理的パラメータを改変し、結果的に物理化学的組成および品質パラメータの改変を引き起こす処理の適用である。
【００１８】
励起光放射は、ＵＶ−可視スペクトルを可能な限り広範に探索するように選択された波長を持っている。一般に、以下のものを演繹的に選択することが可能である。
・２７０と３００ｎｍとの間の波長であり、トリプトファン、クロロゲン酸またはヒドロキシチロソールのようなフェノール、または他のビタミンＥ、ＵＶ範囲で放出する分子を励起することを可能とする。
・４００と４５０または５００ｎｍとの間の波長であり、リボフラビン、ポルフィリン、およびクロロフィル、可視範囲（５００−７００ｎｍ）で放出する分子を励起することを可能とする。
・本質的にメイラード生成物および脂質過酸化生成物であるが、遠紫外線近傍の可視範囲（４００−５００ｎｍ）で放出するマイコトキシンでもある、新しく形成された蛍光体を励起するために、３００と３６０または、さらには４００ｎｍとの間の１つまたは２つの波長が導入される。
【００１９】
これらの波長は、特定の適用に従って改変され得る。いずれにしても、より正確さを期すために、代表試料のバッチ上の実験室蛍光光度計により得られた完全ＥＥＭマトリクスのＰＡＲＡＦＡＣ分解によって得られた励起ベクトルを代表するローディングの最大に出来る限り近い波長を選択することが可能である。一般に、可視または紫外線の励起放射を用いた蛍光スペクトルを調べることで、赤外線スペクトルを調べる場合よりも、農業食物製品が受けた変換に関する情報が、より多く提供される。
【００２０】
好ましくは、使用される波長の数は２と６との間であり、有利には３と５との間であり、好ましくは５に等しく、順番に、上述した蛍光体のグループの中の対応する数を励起することが可能となる。そのような制限された波長の数の使用は、産業環境において本発明の方法を実行することを可能とするために有利である。これは、数多くの励起波長の使用に基づく従来の計量化学技術とは対照的である。一方、以下で議論するように、これは追加の制限を強いる。
【００２１】
励起放射の強度は、これら蛍光体の蛍光放出エネルギーが、変換（低温殺菌、殺菌等）の際に、または特徴付けられるべき製品の貯蔵に際に、かなり改変されるように選択される。
【００２２】
図６は、本発明の方法を実行するための装置の非常に簡略化した構成を示す。この装置は、３つの光源Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３を備えており、各々が、試料Ｅを照らすように方向付けられた異なる波長の単色放射のビームを放出する。この試料によって放出された蛍光シグナルＦ（実際、蛍光および１次および時には２次のレイリー散乱の混合）は、光ファイバーを介して、放出された光放射をスペクトルに分解する分光計に送られる。取得したスペクトルは、データ処理手段ＭＴＤ（典型的には、適切にプログラム化されたコンピュータ）を用いて処理され、所望の計量化学情報をそこから抽出することを可能とする。
【００２３】
光源は、典型的には発光ダイオードであり、或いは、より強い強度が要求される場合には、レーザー（好ましくは半導体レーザー）でも良い。
【００２４】
ＭＴＤコンピュータによって実行される分光学的データの解析は、以下の４つの工程を含んでいる。
−  スペクトルの前処理、
−  低下した次元（Ｆ次元）の空間にそれらを「投影する」ことを可能とする多変量または好ましくは多方式の分析方法の前記スペクトルへの適用、
−  Ｆ次元を持つ前記空間内で、前記または各試料を代表する点と、１つまたはより多くの参照試料との間の距離の計算、
−  前記距離に従った前記または各試料の特徴（新鮮度、自然度等）の定量的決定。
【００２５】
特定の試料を参照し、あぶったチコリの試料が、２８０、３４０、および４２９ｎｍの３つの励起放射によって連続的に照らされた場合のスペクトルの前処理について最初に検討する。３つの蛍光スペクトルの各々は、多くの異なる波長λとして、１５１５スペクトル強度値から成る。スペクトル分解能は、０．２５ｎｍ／ピクセルであるが、観察された本発明の方法の結果を劣化させることなく、５、或いはより大きな数で割ることができる。
【００２６】
「生」のスペクトル（図１）は、励起放射の波長（２８０、３４０、および４２９ｎｍ）にて、１次レイリー散乱によって支配されている。実際、各蛍光シグナルのスペクトルは、散乱された励起放射上に部分的に重畳されており、より高い強度である。この問題は知られており、一般に、スペクトルの重畳領域に対応する強度値を、ゼロまたは欠測値で置き換えることによって解決される。これら従来の方法は、ゼロとの置き換えによりアーティファクトを生成し、それゆえ、人工的な分散を生成することにより分析を歪めてしまう、という欠点を持っている。欠測値との置き換えは、データ分析のために使用される多方式モデルの収束という点で困難をもたらす。さらに、欠測値の存在は、標準化前処理（後記参照）の使用を妨げ、真の値にのみ適用できる。これらの問題は、先行技術において通常である、大きな寸法のＥＥＭの使用に基づく技術の場合には許容できるが、本発明の好ましい実施形態のように、励起波長に関して非常に低い分解能を持つデータ分析に基づく方法においては、容易に禁制的となる。
【００２７】
この理由から、ログリンク関数を持つ一般化された線形モデル（ＧＬＺ）を介して蛍光を重ねる散乱領域の予測に基づく革新的な技術を用いて１次レイリー散乱の寄与を除去することが好ましい。この点に関して、以下を参照されたい。
−  Ｊ．Ｒｉｚｋａｌｌａｈ，  「前面蛍光データの計量化学分析  −  処理された食物内の新たに形成された混入物の推定」、博士論文、Ａｇｒｏ  Ｐｒｉｓ  Ｔｅｃｈ  Ｆｒａｎｃｅ，  ２００７。
−  「計量経済学の理論および方法」の中のＲ．  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，  Ｊ．Ｇ．  ＭａｃＫｉｎｎｏｎ，「計量経済学の理論および方法。  一般化された最小二乗および関連の方法」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００４，  ｐｐ．２５５−２６１。
【００２８】
本技術は、本出願人の名前で２００９年１２月１６日に出願され、本件出願の出願日において公開されていない、フランス特許出願０９／０６０８８に既に記載されている。
【００２９】
このモデルは、蛍光の寄与が無視できるスペクトルの領域で較正され、スペクトル強度は、専ら散乱（図２Ａおよび２Ｂにおける符号ＲＤ）に帰することになる。
【００３０】
一般化された線型モデルは、以下の式となる。
【００３１】
ｆ（μｙ）  ＝  ｂ０  ＋  ｂ１ｘ
【００３２】
この数式において、ｆ（μｙ）は、ｙの期待値、μｙのリンク関数であり、ｙは蛍光と重ならないレイリー散乱強度のベクトルであり、一方、ｘはｙと同じ大きさの指数（１、２、３等）のベクトルである。
【００３３】
一般化されたモデルによって、（ｘとｙとの間の）非線形関係をリンク関数を介してモデル化することができる。この一般化されたモデルは、指数族（ノーマル、ガンマ、ポアソン等）に属する分布を持つ従属変数をモデル化するために使用することができる。多重線形回帰は、強度関数に等しいリンク関数およびノーマル分布を持つ従属変数（ｙ）に対応するＧＬＺモデルの特別なケースである。
【００３４】
ＧＬＺモデルのパラメータｂｉは、確度（Ｌ）の極大化の統計モデルによって推定される。
【００３５】
2013528814.tif 000003
【００３６】
ｐ［ｙｉ，ｂｉ］は、ｂｉに依存するｙｉの確率である。
【００３７】
目的は、すべての観察についてｙを生成する最大確率（同時密度）を提供するパラメータを見つけることである。反復推定（準ニュートン法であるフィッシャーアルゴリズム）が、Ｌを最大化しながら、パラメータｂｉを見つけるために使用される。
【００３８】
2013528814.tif 000004
【００３９】
一度パラメータｂｉが推定されると、ＧＬＺモデルが、「純粋な」散乱の強度を予測するために蛍光（図２Ｂ−予測ＲＰの領域）によって重畳されるスペクトル領域に対応する散乱指数に適用される。この予測の後、完全散乱スペクトル（実際の、および予測された部分）をＥＥＭから減じて、純粋な蛍光ＳＦのスペクトル（図２Ｃ  −  散乱光スペクトル上に部分的に重畳された蛍光スペクトルを示す図２Ａとの比較）を取得する。
【００４０】
図３において、符号Ｆ２８０、Ｆ３４０、およびＦ４２９は、２８０、３４０、および４２９ｎｍでの励起に関連する蛍光スペクトルをそれぞれ示しており、ここでは、レイリー散乱が、一般化モデルの適用によって予測され、減じらた。
【００４１】
レイリー散乱の除去は、密な前面蛍光スペクトルに分析が基づいており、そのため、混濁した試料である場合に特に重要である。しかしながら、本発明は、希薄試料にもまた実行可能であり、希薄資料ではデータの前処理の重要性を低くする。
【００４２】
連続的な操作は、個々に考慮される３つの蛍光スペクトルにはもはや関連せず、連結されたスペクトル、すなわち、単一のカラム内で次々に配置されたスペクトル（図４参照）に関連する。
【００４３】
連結されたスペクトルは、適切な方法で、以下の処理を受ける。
【００４４】
・連結された各スペクトルの各放出値を、この同じベクトルＸｉの標準で割ることによる簡単な標準化。この標準化は、各試料（ｉ＝１からＩの試料）に以下の通り適用される。
【００４５】
2013528814.tif 000005
【００４６】
ここで、ｊは、連結された放出スペクトル（ｊ＝１から４５４５）の波長の数であり、
2013528814.tif 000006
である。
【００４７】
または、
・「多重散乱補正」（ＭＳＣ）による補正であり、以下の通り、ベクトルＸｉ（各試料ｉの連結された放出スペクトル）と、すべての試料（ｉ＝１からＩの試料）の平均の連結されたベクトルとの間の回帰を実施し、そして原点にて座標を差し引き、および、それぞれの勾配によって各試料の連結された放出スペクトルの各強度を割る。
【００４８】
2013528814.tif 000007
【００４９】
この点に関して、Ｒ．Ｂｒｏによる上記刊行物、さらにまた、Ｍ．Ｓ．Ｄｈａｎｏａ等による「多重散乱補正（ＭＳＣ）とＮＩＲスペクトルの標準ノーマル変数（ＳＮＶ）変換とのリンク」Ｊ．  Ｎｅａｒ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．  １９９４，  ２，  ４３−４７を参照されたい。
【００５０】
所定数の較正試料（少なくとも２つであり、定量化すべきパラメータの極値に対応し、好ましくはより多い）の蛍光スペクトルを取得し、処理した後、特徴付けられるべき他の試料の分析のために使用される多方式の統計モデルを決定することが可能である。これは、このモデルの「ローディング」ベクトルの計算を含む。
【００５１】
「ＰＡＲＡＦＡＣ」タイプの三線モデルのケースが最初に検討される。原理は、図５に示されているように、三方構造（データキューブ）Ｘを外部三ベクトル積（「トライアド」）ａｉ、ｂｉ、ｃｉの和に分解し、剰余Ｅを足し、これはそれ自身がまた「データキューブ」の形式である。「キューブ」Ｘを構成する三方は、試料、励起放射、および、放出波長である。従って、以下のように記述される。
【００５２】
2013528814.tif 000008
【００５３】
ここで、「ｉ」は試料の指数であり、「ｊ」は励起放射の指数であり、「ｋ」は放出波長の指数であり、および、「ｆ」はＦ  ＰＡＲＡＦＡＣ分解因子の指数である。
【００５４】
スペクトルの連結は、ＰＡＲＡＦＡＣ分解をマトリクス形式で書くことを可能とする。
【００５５】
2013528814.tif 000009
【００５６】
ここで、
−  Ｉ、ＪおよびＫは、それぞれ、試料の数、励起波長の数、および放出波長の数であり、
−  ＸＩ＊ＪＫは、すべての試料の連結された蛍光のマトリクスであり、
−  ＢＪＦおよびＣＫＦは、（それぞれ、寸法Ｊ＊ＦおよびＫ＊Ｆ要素の）励起および放出「ローディング」マトリクス（双線形蛍光プロファイル）であり、
−  ＡＩＦは、「スコア」（またはスペクトルローディングの強度）の（寸法Ｉ＊Ｆの）マトリクスであり、
−  シンボル
2013528814.tif 000010
はカトリ−ラオ（Ｋｈａｔｏｒｉ−Ｒａｏ）テンソル積を表し、および
−  上付き文字Ｔは、カラムマトリクスの転置行列を示す。
【００５７】
ローディングベクトルは、続いて特徴付けられるべき試料のグループにおいて期待される全変動性の代表となるように選択される較正試料に基づいて計算される。例えば、製品の自然度を定量化することが望まれる場合、新鮮な製品（完全な自然度）に対応する較正試料、高度に変換された製品（低い自然度）に対応する他のもの、および、好ましくは、中間の自然度値に対応するさらに他のもの、が使用される。定量化されるべき他のパラメータについても同様である。本モデルは経験的であると考えられるべきであり、従って、較正のために使用されたものと同様の試料についてのみ有効である。
【００５８】
ＰＡＲＡＦＡＣモデルのパラメータＡ、ＢおよびＣは、最小二乗を交互にする方法（非線形反復方法）によって計算され得る。この方法において、マトリクスＡの最初の推定は、剰余の二乗の和を最小化するために、ＢおよびＣに割り当てられた初期のランダム値上で条件付きで計算される。そして、パラメータＢは、Ａの推定を用いて更新され、ついで、パラメータＣは、Ｂの新しい値を用いて更新され、以下同様である。Ａ、ＢおよびＣの各反復更新は、それゆえ、解を改善する（誤差面における減少）。反復のレベルでの解における改善が非常に小さくなったときに、アルゴリズムが収束する（既定では、この基準は１０−６）。
【００５９】
弱く分解され、さらには真に三線ではないデータのためのＰＡＲＡＦＡＣモデルの収束は、問題かもしれない（Ｒ．ＢｒｏおよびＲｉｚｋａｌｌａｈによる上述の刊行物を参照）。実際に、モデルの誤差面は、局所的な極小（それらの近傍におけるものよりも低く、表面の真の極小よりも高い）、鞍点、平坦領域、および、アルゴリズムの収束をスローダウンさせ、或いはさらに防止できる非常に狭い谷を含んでいるかもしれない。
【００６０】
本件発明者は、反復数に制限を課すことによって（例えば、最大３０反復）および／または収束基準を増大させることによって（１０−６に代えて１０−２または１０−３）、本モデルは、パラメータ（ローディングおよびスコア）のレベルで相当に改善されることを特筆している。実際に、過度の反復数は、モデルの関連性を低下させ得る。
【００６１】
経験的に、蛍光スペクトル、さらにはそれらの相対強度は負の値を取れないことが知られているので、収束は、非負性の制約を課すことによって促進され得る。
【００６２】
最後に、ＧＬＺモデルを適用することによるレイリー散乱の除去のための前処理が、ＰＡＲＡＦＡＣモデルのローディングおよびスコアマトリクスを計算するための反復方法の収束を促進することが特筆されている。
【００６３】
完全に三線のデータの場合、理論的にＰＡＲＡＦＡＣモデルは単一解のみを許容する。しかしながら、３つの励起に限定されるＥＥＭの場合、蛍光が表面に集められると、ＥＥＭマトリクスの三線性が大幅に破壊される。その結果、解はもはや単一解ではなく、因子の数、さらには最終モデルを選択するための基準を開発することが必要である。
【００６４】
この選択は、それ自体知られている幾つかの基準によって導かれる（Ｒ．Ｂｒｏによる上述の参考文献を参照）。
−  取得されたスペクトルパラメータ（マトリクスＢおよびＣ）と、分析された試料内に存在する蛍光体の先験的知識との適合性の検証、
−  完全な三線モデルに関して本モデルの百分率偏差を検証するために使用される、ＣＯＲＣＯＮＤＩＡの名の下で知られた基準、
−  本モデルによって説明される蛍光データの百分率分散の研究、
−  ランダムであるべき剰余の構造の研究、
−  較正試料のバッチへの変換の適用から予測されるものに関するスコアにおける変化のコヒーレンスに関するスコアの構造（マトリクスＡ）の研究、
−  スコア等の反復性および再現性。
【００６５】
このように構築されたＰＡＲＡＦＡＣモデルは、特徴付けられるべき新しい各モデルのＥＥＭに適用され、或いは、より一般的には、データキューブを形成するように組み立てられ、同時に特徴付けられるべき幾つかの試料のＥＥＭに適用される。
【００６６】
新しいスコアは、本モデルの「ローディング」マトリクスＢおよびＣに基づいて、以下の通り計算される。
【００６７】
2013528814.tif 000011
【００６８】
ここで、上付き＋は、テンソル積の一般化された逆数を示し、Ｘｎｅｗは、新しい試料の連結され且つ前処理されたスペクトルデータを示す。
【００６９】
ＰＡＲＡＦＡＣ分解は、分光学的データの次元降下のための技術であると考えられる。分解前、各試料は、３×１５１５＝４５４５のスペクトル強度値によって同定され、そのため、４５４５次元を持つ空間内の点によって代表される。しかる後、各試料は、スコアのＦ値によって同定され、小さな次元の空間内の点（図７内の符号ＰＥ）によって代表される。実際、Ｆは、１または２と同じくらい小さく選定される。
【００７０】
多変量または多方式の分析の他の方法が、ＰＡＲＡＦＡＣ分解に代わりに使用され得る。非制限的な例として、主成分分析またはＰＣＡ、主成分回帰（ＰＣＲ）、部分最小二乗（ＰＬＳ）、または、より良くは、部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）に言及が成され得る。ＰＬＳ−ＤＡ法は、同様の処置を受けた各種の試料グループの先行知識を考慮する利点を持っており、これにより、その分離を最適化することが可能となる。主成分分析または回帰の場合、点ＰＥの座標は、「スコア」によっては与えられず、「主成分」によって与えられる。
【００７１】
いかなる統計的分析方法が使用されようと、参照試料が、この低下した次元の空間内の点の雲を形成する。この点の雲は、（１次元の）区間、（２次元の）円、（３次元の）球または（３次元より多くの）超球の特有の形体を持つ、「ターゲット」を決定することを可能とする。図７は、次元の数が２に等しい例を示し、ターゲットＣＩは、その中心ＣＣＩ（点の雲の質量中心または重心、または、一次元の、その中央値）およびその半径（ＲＣＩ）によって特徴付けられる円である。この半径は、特に、参照点の信頼区間によって、または、中心と、最も遠い点との距離によって定義され得る。使用される次元の数Ｆは、例えば、１と１０との間、および、好ましくは１と５との間であり得る。
【００７２】
特徴付けられるべき試料に対応する各点ＰＥに関し、ターゲットからの距離Ｄ（考慮した実施形態によれば、ターゲットの中心またはその周辺の関数として測定される距離）を決定することが可能である。距離Ｄは、通常のユークリッド距離であり得るが、ＰＡＲＡＦＡＣ因数分解の場合、ＰＡＲＡＦＡＣ因子によって定義された「座標」の非完全独立性を考慮したマハラノビス距離を使用することが好ましい。いかなる場合も、試料の新鮮度および／または自然度を定量化することを可能とするのはこの距離である。
【００７３】
変形として、スチューデントの検定のような統計的検定を用いて自然度（または新鮮度、信頼性等）を定義することが可能である。本手順は、以下の方法で実行される。
【００７４】
特徴付けられるべき試料および参照試料の前面蛍光ＥＥＭの幾つかの複製が取得され、以下のマトリクス形式で記述されるＰＡＲＡＦＡＣモデルを用いて分解される三方キューブに配置される。
【００７５】
2013528814.tif 000012
【００７６】
ここで、ＢおよびＣは、励起「ローディング」マトリクスであり、Ａは、スコアマトリクスであり、ＥＩ＊ＪＫは残余マトリクスである。
【００７７】
そして、距離インジケーターベクトルｙは、以下の線形回帰モデルを用いて計算される。
【００７８】
ｙ  ＝  ｂ１ａ１  ＋  ｂ２ａ２＋  ．．．  ＋  ｂＦａＦ  ＋  ｅ．
【００７９】
ベクトルｙは、２値であり、および、参照試料についてゼロの値を取り、特徴付けられるべき試料について１を取る。ベクトルａは、マトリクスＡのカラムであり、スカラーｂｉは、線形モデルの係数であり、ｅは、剰余ベクトルであり、および、Ｆは、本データを十分に説明するために要求されるＰＡＲＡＦＡＣ因子の数である。スチューデントのｔ検定は、参照試料のＥＥＭに基づいて予想される距離
2013528814.tif 000013
、および、特徴付けられるべき試料のＥＥＭに基づいて予想される距離
2013528814.tif 000014
に適用される。統計値ｔは、以下の等式を介して計算される。
【００８０】
2013528814.tif 000015
【００８１】
ここで、
2013528814.tif 000016
および
2013528814.tif 000017
は、それぞれ、線形回帰モデルによって予想される距離の平均、その分散、および、参照（指数ｒ）および試料（指数ｓ）のための較正において使用されるＥＥＭの複製の数である。自然度は、以下の確率密度の関数として現される。
【００８２】
2013528814.tif 000018
【００８３】
ここで、Γはガンマ関数であり、および、νは自由度である。
【００８４】
2013528814.tif 000019
【００８５】
分散
2013528814.tif 000020
上の帰無仮説に基づいて、より高い外部確率を持つ試料は、より良い自然度値を受ける。
【００８６】
図８は、各種の熱処理を受けたミルクの自然度の決定への、本発明による方法の適用を例示している。これらの試料に、２８０、３４０および４２９ｎｍの３つの励起放射が連続的に照射された。３つの蛍光スペクトルの各々は、多くの異なる波長λについて、１５１５スペクトル強度値で構成される。スペクトル分解能は、０．２５ｎｍ／ピクセルであるが、本発明の方法の結果を劣化させることなく、５、或いはより大きな数で割ることができる。
【００８７】
本スペクトルは、ＧＺＬモデルの適用によるレイリー散乱の除去によって前処理され、ＳＮＶ法によって連結され、および標準化され、そして、ＰＣＡモデルは、前処理されたスペクトルから構築され、および、ミルクが受けた各種の処理に対応する、各種の試料グループ間の差異を最も明確に表示する主成分が選択された（この場合、第１主成分が、試料の変動性の約６５％を説明している）。各種グループの記述統計値（最小および最大値、平均、第１および第３四分位数の値、グループの質量中心間の距離）は、この主成分のスコアに基づいて計算される。これらの統計値は、グループが実際に分離されているか、すなわち、それらの平均間の距離が重要か否かを決定することを可能とする。
【００８８】
図８において、参照試料、Ｒｅｆは、生のミルクに対応する。他の試料は、低温殺菌（グループＧ１）、直接ＵＨＴ処理（Ｇ２）、間接ＵＨＴ処理（Ｇ３）、および殺菌（Ｇ４）を受けた。試料（または、より詳細には、それらの蛍光スペクトル）は、一次元の空間の中に放出された。グループＧ１−Ｇ４は、予想された通り、自然度の減少に対応していることが分かる。長方形は、各グループの変動性の９５％を閉じ込めている。
【００８９】
図８のグラフの左側のスケールは、「自然度の喪失」を示しており、これは、生のミルクの試料（最小の改変）において０％に近く、および、殺菌されたミルクの試料（強い改変）において１００％に近い。点ＰＥは、精密濾過されたミルクの試料に対応している。自然度の喪失（２２．２％）は、加熱していないにもかかわらず、低温殺菌された新鮮なミルクについてのものと実質的に同様である。これは、精密濾過されたミルクにおいて、脂肪が殺菌されるという事実によって説明できる。
【００９０】
図９Ａおよび９Ｂは、本発明の他の実施形態による方法の、オレンジジュースの自然度の決定への適用を示している。以下のことが考慮された。
・  新鮮なオレンジジュースの参照試料（Ｒｅｆ）、
・  １００℃まで加熱され、次に冷却された、新鮮なオレンジジュースの試料Ｇ１、
・  瞬間殺菌が施され、生鮮食品デパートで販売された、ブランドＭ１、果肉入り１００％純粋ジュースの、商業用ジュースの試料Ｇ２、
・  同じブランドＭ１の、長期保存可能な、濃縮ベースのジュースの試料Ｇ３、
・  瞬間殺菌が施され、生鮮食品デパートで販売された、ブランドＭ２、果肉なし１００％純粋ジュースの、商業用ジュースの試料Ｇ４、
・  ブランドＭ３、果肉なし１００％純粋ジュースの、ビタミンＣ含有が保証され、長期保存可能な、商業用ジュースの試料Ｇ５。
【００９１】
前の例と同様な方法で、蛍光スペクトルが取得され、前処理された。主成分分析が実施され、および、最初の３つの主成分ＰＣ１、ＰＣ２、およびＰＣ３が考慮された。第１主成分ＰＣ１は、試料の変動性の６５．８３％を説明し、第２主成分ＰＣ２は、変動性の２２．６９％を説明し、および、第３成分は、僅かに５．０８％を説明する。図９Ａは、ＰＣ１／ＰＣ２表現を示しており、図９Ｂは、ＰＣ１／ＰＣ３表現を示している。この２番目の表現は、各種のグループを最も明瞭に分離していることが分かる。
【００９２】
この図９Ｂは、以下の通り特筆される。
・  オレンジジュースの、１００℃への、単純な加熱は、スペクトル蛍光サインによって測定された、その自然度への僅かな影響のみを有し（試料Ｇ１は、参照に最も近い）、
・  逆に、果肉の添加は、ジュースの自然度を改善し（試料Ｇ２−果肉入りで新鮮−は、果肉なしで新鮮なＧ４の試料よりも、明らかに参照に近い）、および
・  新鮮なジュースは、長期保存可能な試料よりも大きな自然度を示している（新鮮な試料Ｇ２およびＧ４は、長期保存可能なＧ３およびＧ５の試料よりも参照に近い）。
【００９３】
製品の信頼性および／または適合性は二値パラメータであり、積は、信頼性があるか、或いはそうではなく、適合性があるか、或いはそうではない。これらのパラメータは、ターゲットの質量中心から閾値までの試料の距離Ｄを比較することによって決定され得る。例えば、この閾値は、ＲＣＩと等しくなり得るものであり、本試料は、もしその代表点ＰＥがターゲットの内側であれば、信頼性がある／適合性があると考えられ、もしターゲットの外側であれば、不純物がある／適合性がないと考えられる。
【図１】
2013528814.tif 000021
【図２Ａ】
2013528814.tif 000022
【図２Ｂ】
2013528814.tif 000023
【図２Ｃ】
2013528814.tif 000024
【図３】
2013528814.tif 000025
【図４】
2013528814.tif 000026
【図５】
2013528814.tif 000027
【図６】
2013528814.tif 000028
【図７】
2013528814.tif 000029
【図８】
2013528814.tif 000030
【図９Ａ】
2013528814.tif 000031
【図９Ｂ】
2013528814.tif 000032
【国際調査報告】
2013528814.tif 000033
2013528814.tif 000034
2013528814.tif 000035
2013528814.tif 000036
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2013528814.tif 000039
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