(57)【要約】  単純なペプチドを検出する方法は、当該技術分野に存在する。しかしながら、指向性配列ポリマー（ＤＳＰ）の有効血漿濃度を測定するための方法は、画定されたアミノ酸配列を有する個別のペプチドとは対照的に、ＤＳＰがペプチドの複合的混合物であるため、複雑である。この出願は、ＤＳＰ組成物を検出する及び評価する改良された方法、ＤＳＰ組成物の検出及び定量化のための方法、特定の捕捉ペプチドのサブセットとの相互作用に基づくＤＳＰ組成物におけるペプチドのサブセットを決定する及び富化するための手段、及びそれらを必要とする対象にＤＳＰ組成物を投与するための方法、ここで、投与計画及び量は、検出及び定量化のための上述の方法に基づいて決定又は評価され得る、を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＳＰ組成物を検出するための方法であって、以下のステップ：
ａ．一つ又は複数の捕捉ポリペプチドの実質的に純粋な調製物を提供すること；
ｂ．ＲＳＰ組成物を定量的に検出するための手段に一つ又は複数の捕捉ポリペプチドを付着させること；
ｃ．ＲＳＰ組成物と一つ又は複数の捕捉ポリペプチドとの結合を測定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
ＲＳＰ組成物の設計を改良するための方法であって、以下のステップ：
ａ．一つ又は複数の捕捉ポリペプチドの実質的に純粋な調製物を提供すること；
ｂ．ＲＳＰ組成物を定量的に検出するための手段に一つ又は複数の捕捉ポリペプチドを付着させること；
ｃ．ＲＳＰ組成物と一つ又は複数の捕捉ポリペプチドとの結合を測定すること；
ｄ．一つ又は複数の捕捉ポリペプチドとの結合を増大させる、又は減少させる、いずれかのために前記ＲＳＰ組成物の設計を調節すること；
ｅ．ステップ（ｃ）を繰り返すこと；
ｆ．任意でステップ（ｃ〜ｅ）を繰り返すこと、
ここで、ＲＳＰ組成物の設計を調節することは、任意の一つ又は複数の以下：増加した生物学的利用性、毒性の減少、及び有効性の増加をもたらす、
を含む、方法。
【請求項３】
ＲＳＰ組成物中の種類を検出するための方法であって、以下：
ａ．一つ又は複数の捕捉ポリペプチドの実質的に純粋な調製物を提供すること；
ｂ．固体支持体に一つ又は複数の捕捉ポリペプチドを付着させること；
ｃ．固体支持体とＲＳＰ組成物とを接触させること；及び
ｄ．ＲＳＰ組成物の個別の種類と固体支持体との結合を測定すること、
を含む、方法。
【請求項４】
ＲＳＰ組成物中の種類の設計を改良するための方法であって、以下：
ａ．一つ又は複数の捕捉ポリペプチドの実質的に純粋な調製物を提供すること；
ｂ．固体支持体に一つ又は複数の捕捉ポリペプチドを付着させること；
ｃ．固体支持体とＲＳＰ組成物とを接触させること；
ｄ．ＲＳＰ組成物中の個別の種類と固体支持体との結合を測定すること；
ｅ．（ｃ）において一つ又は複数の捕捉ポリペプチドとの結合を増大させる、又は減少させる、いずれかのためにＲＳＰ組成物の設計を調節すること；
ｆ．ステップ（ｄ）を繰り返すこと；
ｇ．任意でステップ（ｄ〜ｆ）を繰り返すこと、
ここで、ＲＳＰ組成物の種類の設計を調節することは、任意の一つ又は複数の以下：増加した生物学的利用性、毒性の減少、及び有効性の増加をもたらす、
を含む、方法。
【請求項５】
（ａ）の一つ又は複数の捕捉ポリペプチドが、以下：
ｉ．ＲＳＰ組成物を固体支持体に付着させること；
ｉｉ．（ｉ）における前記固体支持体とタンパク質を含む生体液とを接触させること；
ｉｉｉ．（ｉ）における固体支持体と特異的に結合した（ｉｉ）からタンパク質を同定すること；
により同定され、
ここで、（ｉｉ）において同定されたタンパク質は捕捉ポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
捕捉ポリペプチドが、補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＲＳＰ組成物の存在を測定するための方法であって、以下のステップ：
ａ．補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択される一つ又は複数のタンパク質をサンプル中の前記ＲＳＰ組成物を定量的に検出するための手段に付着させること；及び
ｂ．前記サンプル中の前記ＲＳＰ組成物のレベルを測定すること、
を含む、方法。
【請求項８】
捕捉ポリペプチドが、補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
生体サンプル中のＲＳＰ組成物の存在を検出するための方法であって、以下：
ａ．生体サンプルと、正常ヒト血清、正常非ヒト霊長類血清、正常ウサギ血清、正常マウス血清、正常ラット血清、正常フェレット血清、正常ブタ血清、正常イヌ血清、正常ウマ血清、正常ヒツジ血清、正常ウシ血清に含まれる少なくとも一つの捕捉ポリペプチドとを接触させること；及び
ｂ．捕捉ポリペプチドとＲＳＰ組成物との結合の存在又は不存在を検出すること、
ここで、結合の存在は、生体サンプル中のＲＳＰ組成物の存在を示す、
を含む、方法。
【請求項１０】
捕捉ポリペプチドが、ＨＤＬプロテオーム、ＬＤＬプロテオームの少なくとも一つの成分、又は少なくとも一つの血清タンパク質を含むポリペプチドから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＲＳＰ組成物が、ＹＦＡＫペプチドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＳＰ組成物が、ＹＥＡＫペプチドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
生体サンプル中においてＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物の存在を検出するための方法であって、以下：
ａ．生体サンプルと、以下：補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択されるペプチドを含む少なくとも一つの捕捉ポリペプチドとを接触させること；及び
ｂ．捕捉ポリペプチドとＲＳＰ組成物との結合の存在又は不存在を検出すること、
ここで、結合の存在は、生体サンプル中のＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドの存在を示す、
を含む、方法。
【請求項１４】
生体サンプル中においてＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物の量を測定するための方法であって、以下：
ａ．生体サンプルと、補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択されるペプチドを含む少なくとも一つの捕捉ポリペプチドとを接触させること；
ｂ．捕捉ポリペプチドとＲＳＰ組成物との結合のレベルを定量すること、
ここで、結合のレベルは、生体サンプル中のＲＳＰ組成物の量を示す、
を含む、方法。
【請求項１５】
哺乳動物においてＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物の生物学的利用性を測定するための方法であって、以下：
ａ．ＲＳＰ組成物を含む組成物の用量を哺乳動物に投与すること；
ｂ．対象から生体サンプルを取り除くこと；及び
ｃ．生体サンプルと、補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択されるペプチドを含む少なくとも一つの捕捉ポリペプチドとを接触させること；
その結果、生体サンプル中のＲＳＰ組成物の生物学的利用性を測定すること、
を含む、方法。
【請求項１６】
それを必要とする対象に投与するために、ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物の好適な用量を決定するための方法であって、以下：
ａ．ＲＳＰ組成物の用量を対象に投与すること；
ｂ．対象から生体サンプルを取り除くこと；
ｃ．生体サンプルと、補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択されるペプチドを含む少なくとも一つの捕捉ポリペプチドとを接触させること；
ｄ．生体サンプル中の捕捉ポリペプチドのレベルを測定すること；
ｅ．様々な用量を用いて、任意でステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すこと；及び
ｆ．そのレベルを生体サンプル中のＲＳＰ組成物の所定の好適なレベルと比較すること；
ここで、好適な用量は、生体サンプル中のＲＳＰ組成物の所定の好適なレベルをもたらす用量である、
を含む、方法。
【請求項１７】
対象において望ましくない免疫反応を治療する又は予防するための方法であって、以下：
ａ．ＹＥＡＫ又はＹＦＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物の好適な用量を対象に投与すること、ここで、そのような好適な用量は以下：
（ｉ）ＲＳＰ組成物の用量を対象に投与すること；
（ｉｉ）実験対象から生体サンプルを取り除くこと；
（ｉｉｉ）生体サンプルと、補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択される少なくとも一つの捕捉ポリペプチドとを接触させること；
（ｉｖ）生体サンプル中の捕捉ポリペプチドのレベルを測定すること；
（ｖ）様々な用量を用いて、任意でステップ（ｉ）〜（ｉｖ）を繰り返すこと；及び
（ｖｉ）そのレベル（単数又は複数）と生体サンプル中のＲＳＰ組成物の所定の好適なレベルとを比較すること；
ここで、好適な用量は、前記生体サンプル中のＲＳＰ組成物の所定の好適なレベルをもたらす用量である、
により決定される、
を含む、方法。
【請求項１８】
捕捉ポリペプチドが標識化される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
捕捉ポリペプチドが固体支持体に付着される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＲＳＰ組成物と結合した捕捉ポリペプチドを含む複合体を単離することをさらに含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
捕捉ポリペプチドに対する抗体を用いて、捕捉ポリペプチドとＲＳＰ組成物との結合を検出することをさらに含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
組成物が皮下に投与される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
生体サンプルにおいてＹＥＡＫ又はＹＦＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物を検出するための組成物であって、補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択されるペプチドを含む少なくとも一つの捕捉ポリペプチドを含む組成物。
【請求項２４】
ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物を含むサンプルからペプチドを単離するための方法であって、以下：
ａ．サンプルと、補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択されるペプチドを含む少なくとも一つの捕捉ポリペプチドとを接触させること；及び
ｂ．混合物から捕捉ペプチドに結合するペプチドを分離すること、
を含む、方法。
【請求項２５】
捕捉ポリペプチドが固体支持体上に固定化される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
捕捉ポリペプチドがエピトープでタグ付けされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
捕捉ポリペプチドから結合したペプチドを分離することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
単離されたペプチドの特徴を決定することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
特徴を決定することが、結合したペプチドのアミノ酸配列を決定すること、又は結合したペプチド中のアミノ酸の相対比を決定することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
対象においてＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物中の生物学的に利用可能なペプチドを同定するための方法であって、以下：
ａ．第一に、対象にＲＳＰ組成物を投与すること；及び
ｂ．第二に、投与後、患者から組織サンプルを取り除くこと；及び
ｃ．補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択されるペプチドを含む少なくとも一つの捕捉ポリペプチドと結合するサンプル中でペプチドを同定すること、
を含む、方法。
【請求項３１】
減少した毒性を有するＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物を製造するための方法であって、以下：
ａ．ＲＳＰ組成物と、補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択されるペプチドを含む少なくとも一つの捕捉ポリペプチドとを接触させること；及び
ｂ．混合物から捕捉ペプチドに結合するペプチドを分離すること；
ｃ．分離されたペプチドの特徴を決定すること；及び
ｄ．分離されたペプチドの特徴を用いてペプチドのセットを調製すること、
を含む、方法。
【請求項３２】
増大した有効性を有するＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物を製造するための方法であって、以下：
ａ．ＲＳＰ組成物と、補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択されるペプチドを含む少なくとも一つの捕捉ポリペプチドとを接触させること；及び
ｂ．混合物から捕捉ペプチドに結合するペプチドを分離すること；
ｃ．分離されたペプチドの特徴を決定すること；及び
ｄ．分離されたペプチドの特徴を用いてペプチドのセットを調製すること、
を含む、方法。
【請求項３３】
対象において望ましくない免疫反応を治療する又は予防するための方法であって、以下：
ａ．ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物を提供すること；
ｂ．試験対象にＲＳＰ組成物を投与すること；
ｃ．試験対象から生体サンプルを取り除くこと；
ｄ．生体サンプルと、補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択されるペプチド配列を含む少なくとも一つの捕捉ポリペプチドとを接触させること；
ｅ．混合物から捕捉ペプチドに結合するペプチドを分離すること；
ｆ．分離されたペプチドの特徴を決定すること；
ｇ．分離されたペプチドの特徴を用いてペプチドのセットを調製すること、及び
ｈ．対象に新規のペプチドのセットを投与すること、
を含む、方法。
【請求項３４】
ペプチドが対象に複数回投与される、請求項３０又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
ペプチドが、１、２、３、４、６、１２、１８、２４、３６、４８、又は７２時間の間隔で対象に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物の様々な調製物を比較するための方法であって、以下：
ａ．第一のＲＳＰ組成物と、正常ヒト血清、正常非ヒト霊長類血清、正常ウサギ血清、正常マウス血清、正常ラット血清、正常フェレット血清、正常ブタ血清、正常イヌ血清、正常ウマ血清、正常ヒツジ血清、正常ウシ血清に含まれる少なくとも一つの捕捉ポリペプチドとを接触させること；及び
ｂ．第二のＲＳＰ組成物と、以下：正常ヒト血清、正常非ヒト霊長類血清、正常ウサギ血清、正常マウス血清、正常ラット血清、正常フェレット血清、正常ブタ血清、正常イヌ血清、正常ウマ血清、正常ヒツジ血清、正常ウシ血清から選択されるペプチドを含む少なくとも一つの捕捉ポリペプチドとを接触させること；及び
ｃ．必要に応じてステップ（ｂ）を繰り返すこと；及び
ｄ．ステップ（ａ〜ｃ）から、捕捉ペプチドに結合するペプチドを混合物から分離すること；
ｅ．ステップ（ｄ）から分離されたペプチドの特徴を決定すること；及び
ｆ．前記の分離されたペプチドのセットと、ステップ（ｄ）から分離されたペプチドの特徴を比較すること、
を含む、方法。
【請求項３７】
対象において標的組織に対する治療薬剤を調製するための方法であって、以下：
ａ．ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物を提供すること；及び
ｂ．治療薬剤とＲＳＰ組成物とを結合させ、複合体を形成すること、
を含む方法。
【請求項３８】
対象において特定の組織に治療薬剤を送達するための方法であって、以下：
ａ．以下：
（ｉ）ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物と、補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択されるペプチドを含む組織特異的ペプチドとを接触させること；及び
（ｉｉ）混合物から組織特異的なペプチドと結合するペプチドを分離すること；
によりペプチドタグを単離すること、
ｂ．ペプチドタグと治療薬剤とを結合させること；及び
ｃ．対象に複合体を投与すること、
を含む、方法。
【請求項３９】
ペプチドタグが結合した治療薬剤を含む複合体であって、ペプチドタグが、ＹＥＡＫ又はＹＦＡＫペプチドを含む、複合体。
【請求項４０】
ペプチドが、補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連蛋白質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ３４９７１）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩローカス／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖に対する結合親和性に基づいてＲＳＰ組成物から単離される、請求項３９に記載の複合体。
【請求項４１】
治療薬剤が小有機分子又は生体高分子である、請求項３７若しくは３８に記載の方法、又は請求項３９に記載の複合体。
【請求項４２】
組織が脳、肺、又は肝臓組織である、請求項３７若しくは３８に記載の方法、又は請求項３９に記載の複合体。
【請求項４３】
ペプチドタグが、ＹＥＡＫ又はＹＦＡＫペプチドを含む、請求項３７若しくは３８に記載の方法、又は請求項３９に記載の複合体。
【請求項４４】
ペプチドタグが共有結合、包接錯体、イオン結合、又は水素結合により治療薬剤と結合する、請求項３７若しくは３８に記載の方法、又は請求項３９に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００９年１１月１７日に出願された、米国仮出願第６１／２８１，４７０号、及び２０１０年９月２７日に出願された、米国仮出願第６１／３８６，９０９号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
単純なペプチドを検出する方法は、当該技術分野に存在する。しかしながら、複合的なペプチド混合物を検出及び測定するのに好適な方法はわずかである。群としてペプチドの混合物の有効血漿濃度を測定するための方法は、画定されたアミノ酸配列を有する個別のアミノ酸より、検出されるペプチドの不均質により、複雑である。例えば、ランダム配列ポリマー（ＲＳＰ）組成物は、ペプチド鎖にランダムに取り込まれたアミノ酸の複合的な混合物を含む。ＲＳＰ組成物は、アミノ酸の同一性及び比に従って画定され、画定された配列に従って画定されない。この多様性が与えられた場合、複数の製造方法を通して、これらのＲＳＰ組成物の普遍性及び組成を評価するための改良された方法が必要とされている。ＲＳＰ組成のインビボにおける状態を測定することは、投与の経路及び／又は頻度、及びＲＳＰに結合する血清タンパク質に応じて、混合物は、第一の炎症（ＴＨ１型）、又は第一の調節（ＴＨ２型）反応を引き起こし得、対象において薬物動態学的及び薬力学的効果におけるバリエーションを導くので、免疫学的重要性を有する。ＲＳＰのより厳格な設計及び一貫した投与は、治療効果を増加させ、有害な炎症反応についての可能性を減少させ得る。
【０００３】
従って、例えば、そのような混合物のインビボにおける評価を支援するための、及び治療目的のための好適な量及び投与の手段を決定するための、ＲＳＰ組成物の定量分析の方法についての必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
この出願は、ＲＳＰ組成物を検出及び評価する改良された方法を提供する。本発明は、ＲＳＰ組成物の検出及び定量のための方法を提供する。本発明は、特定の捕捉ポリペプチドとのサブセットの相互作用に基づくＲＳＰ組成物において、ペプチドのサブセットを決定する及び富化するための手段を提供する。本発明は、それらを必要とする対象にＲＳＰ組成物を投与するための方法をさらに提供し、ここで、投与計画及び量は、検出及び定量のための上述の方法に基づいて決定され又は評価され得る。
【０００５】
本開示はまた、以下のステップ：（ａ）前記ＲＳＰ組成物を固体支持体に付着させること；（ｂ）（ａ）における前記固体支持体と、タンパク質を含む生体液とを接触させること；（ｃ）（ａ）において固体支持体に特異的に結合した（ｂ）からタンパク質を同定すること；（ｄ）（ｃ）において結合したタンパク質の実質的に純粋な調製物を得ること；（ｅ）（ｃ）における前記タンパク質を、前記ＲＳＰ組成物を定量的に検出するための手段に付着させること、及び；（ｆ）前記ＲＳＰ組成物と（ｅ）におけるそれぞれの個別の前記タンパク質との結合を測定することを含む、ＲＳＰ組成物を検出するための方法を提供する。
【０００６】
この開示はまた、以下のステップ：（ａ）前記ＲＳＰ組成物を固体支持体に付着させること；（ｂ）（ａ）における固体支持体と、タンパク質を含む生体液とを接触させること；（ｃ）（ａ）において固体支持体に特異的に結合した（ｂ）からタンパク質を同定すること；（ｄ）（ｃ）において結合したタンパク質の実質的に純粋な調製物を得ること；（ｅ）（ｃ）における前記タンパク質を、前記ＲＳＰ組成物を定量的に検出するための手段に付着させること、；（ｆ）前記ＲＳＰ組成物と（ｅ）におけるそれぞれ個別の前記タンパク質との結合を測定すること；（ｇ）（ｅ）における一つ又は複数のタンパク質との結合を増大又は減少させるために前記ＲＳＰ組成物の設計を調節すること；（ｈ）ステップ（ｆ）を繰り返すこと；（ｉ）任意でステップ（ｆ〜ｈ）を繰り返すこと、ここで、前記ＲＳＰ組成物の設計への調節は、以下：増加した生物学的利用性、毒性の減少、及び有効性の増加を含む任意の一つ又は複数の群をもたらす、を含む、ＲＳＰ組成物の設計を改良するための方法を提供する。
【０００７】
さらに、この出願は、以下のステップ：（ａ）前記ＲＳＰ組成物を固体支持体に付着させること；（ｂ）（ａ）における固体支持体と、タンパク質を含む生体液とを接触させること；（ｃ）（ａ）における固体支持体に特異的に結合した（ｂ）からタンパク質を同定すること；（ｄ）（ｃ）において結合したタンパク質の実質的に純粋な調製物を得ること；（ｅ）（ｃ）における前記タンパク質を固体支持体に付着させること、；（ｆ）（ｅ）における前記固体支持体と前記ＲＳＰ組成物とを接触させること、及び；（ｇ）前記ＲＳＰ組成物の個別の種類と（ｆ）における前記固体支持体との結合を測定することを含む、ＲＳＰ組成物中の種類を検出するための方法を提供する。
【０００８】
加えて、この出願は、以下のステップ：（ａ）前記ＲＳＰ組成物を固体支持体に付着させること；（ｂ）（ａ）における固体支持体と、タンパク質を含む生体液とを接触させること；（ｃ）（ａ）において固体支持体に特異的に結合した（ｂ）からタンパク質を同定すること；（ｄ）（ｃ）において結合したタンパク質の実質的に純粋な調製物を得ること；（ｅ）（ｃ）における前記タンパク質を、固体支持体に付着させること、；（ｆ）（ｅ）における前記固体支持体と、前記ＲＳＰ組成物とを接触させること、；（ｇ）前記ＲＳＰ組成物の個別の種類と、（ｆ）における前記固体支持体との結合を測定すること；（ｈ）（ｆ）における一つ又は複数のタンパク質との結合を増大、又は減少させるために、前記ＲＳＰ組成物の設計を調節すること；（ｉ）ステップ（ｇ）を繰り返すこと、及び；（ｊ）任意でステップ（ｇ〜ｉ）を繰り返すこと、ここで、前記ＲＳＰ組成物の種類の設計への調節は、以下：増加した生物学的利用性、毒性の減少、及び有効性の増加を含む任意の一つ又は複数の群をもたらす、を含む、ＲＳＰ組成物中の種類の設計を改良するための方法を提供する。
【０００９】
本出願の方法を用いて、研究者らは、少量のＲＳＰ組成物の成分をより確実に検出することができるのみならず、また、例えば、毒性、又は有効性などの対象の生物学的活性に対して関与する、又は貢献するＲＳＰ組成物中の種類を特異的に検出することができる。
【００１０】
本発明の基礎となる発見は、特定のタンパク質性物質によるＲＳＰ組成物中の単一のペプチド又は非常に複数のペプチドの特異的な結合である。反対に、一旦、本明細書において「捕捉ポリペプチド」と称されるそのようなタンパク質性物質である「捕捉ペプチド」が同定されると、一つ又は複数の捕捉ペプチドは、ＲＳＰ組成物のペプチドを定量的に分析するために、ＲＳＰ組成物中のペプチドの機能的に優れたサブセットを単離するために、又は結合特異性に基づくＲＳＰ組成物の成分を分類するために用いられ得る。本発明を実施するために、ペプチドと結合する捕捉ポリペプチドは同定され、本発明を実施するために有用な形態に調製され、すなわち、ペプチドとのその結合が、他の成分の存在により損なわれないのに十分な程度まで、単離され、精製される。
【００１１】
本発明の一つの態様は、異なる製造調製物の製品におけるバリーションを評価する又は決定するための方法、製造の様々な方法、又はＲＳＰ組成物の様々な製造後加工方法を提供する。本発明の特定の方法は、調製物間の類似性及び／又は差異を決定するために、ＲＳＰ組成物の様々な調製物と捕捉ペプチドとの結合を比較することである。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、ＲＳＰ組成物又はＲＳＰ組成物を含むサンプルにおいて発見されるペプチドを定量的に分析するための方法を提供する。本発明のいくつかの実施形態は、投与されたＲＳＰ組成物のインビボにおける（例えば、血漿濃度）生物学的に利用可能な量又は濃度を決定するための方法である。
【００１３】
本発明の方法は、対象の組織においてＲＳＰ組成物の存在を検出すること、ここで、前記対象は事前にＲＳＰ組成物と接触させ、又はＲＳＰ組成物で処理されており、ここで、方法は、そのような接触のすぐ後、又はそのような接触後少なくとも約１０、２０、３０、若しくは４５分後、又は１、２、４、６、１２、２４、３６、若しくは４８時間後、又は３、４、５、６、７、若しくは１０日後、又は２、３、４、６、８、若しくは１２週間後に、一回又は複数回行われる。本発明の特定の方法は、哺乳動物の血清又は血漿中のＲＳＰ組成物の成分の存在を検出することであり、ここで、前記哺乳動物は、上述の期間内に前記方法を実行する前に、事前に前記ＲＳＰ組成物で処理されている。特定の実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。
【００１４】
特定の実施形態では、本方法は、ＲＳＰと一つ又は複数の所定の捕捉ペプチドとを結合させること、続く検出方法、例えば、免疫学的検出方法により、ＲＳＰ組成物の存在、及び任意でＲＳＰ組成物の量を測定することを含む。従って、本発明の一つの態様は、優先的にＲＳＰ組成物に結合する血清タンパク質を選択する又は同定することを含む。特定の実施形態では、一つ又は複数の血清タンパク質を同定する方法は、ＲＳＰ組成物と血清を含む生体サンプルとを接触させること、ＲＳＰ組成物中のペプチドと血清の一つ又は複数の成分との結合を、もしあれば、検出すること、結合成分を単離すること、及び一つ又は複数の結合成分を同定することを含む。いくつかの実施形態では、結合成分は、サンプルとＲＳＰ組成物のペプチドと結合するために設計されたアフィニティーカラムとを接触させ、続いて結合画分を溶出させ、続いて結合成分（単数又は複数）を同定することにより、単離され得る。
【００１５】
ＲＳＰ組成物のペプチドに結合する任意の血清結合タンパク質は、上記の方法に用いられ得る。好適な検出方法は、直接競合的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫フローサイトメトリー検出、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は任意の他の特異的抗原の定量的検出を可能にする免疫学的検出方法を含む。
【００１６】
本発明の一つの態様は、生体サンプル中のＲＳＰ組成物の存在を検出するための方法であり、以下：生体サンプルと少なくとも一つの捕捉ポリペプチドを接触させること；及び捕捉ポリペプチドとＲＳＰ組成物との結合の存在又は不存在を検出することを含み、ここで、結合の存在は、生体サンプル中のＲＳＰ組成物のペプチド成分の存在を示す。さらに、そのような方法は、サンプル中のＲＳＰ組成物の量又は濃度を測定するために拡張され得る。
【００１７】
本発明の別の態様は、哺乳動物中のＲＳＰ組成物の生物学的利用性を測定するための方法であり、以下：ＲＳＰ組成物の用量を哺乳動物に投与すること；対象から生体サンプルを取り除くこと；及び生体サンプルと少なくとも一つの捕捉ペプチドとを接触させること；それにより生体サンプル中のＲＳＰ組成物の生物学的利用性又は生物学的利用性の程度を決定することを含む。
【００１８】
本発明の別の態様は、哺乳動物対象にＲＳＰ組成物を投与する方法を提供し、ここで、そのような量は、上述の方法又は本明細書で記述される他の方法により決定されるような投与される量の生物学的利用可能な部分に基づいて決定される。特定の実施形態では、本方法は、対照サンプルを含むこと、二つの結果を比較することによる対照サンプルと試験サンプルの間の生理学的マーカー、例えば、ホルモン、酵素、血清タンパク質、サイトカイン、免疫調節物質、又は任意のこれらの機能性タンパク質のエフェクター又はレギュレーターの変化を測定するために薬力学的試験を行うこと、及び薬力学的パラメーターの所望の変化を誘導するために効果的な用量を決定することさらに含む。特定の実施形態では、対象により報告されるような行動変化、自覚的変化、例えば、疼痛若しくは疾患の症状の改善、又は間接的な効果の他の証言は、観察される。特定の実施形態では、前記哺乳動物対象は、齧歯動物、例えば、マウス又はラットである。他の実施形態では、前記対象はヒトである。
【００１９】
本発明のこの態様の特定の実施形態は、それらを必要とする対象に投与するためのＲＳＰ組成物の好適な用量を決定するための方法であって、以下：（ａ）対象にＲＳＰ組成物の用量を投与すること；（ｂ）対象から生体サンプルを取り除くこと；（ｃ）生体サンプルと少なくとも一つの捕捉ポリペプチドとを接触させること；（ｄ）生体サンプル中のＲＳＰ組成物の成分のレベルを測定すること；（ｅ）様々な用量を用いてステップ（ａ）〜（ｄ）を任意で繰り返すこと；及び（ｇ）そのレベルと生体サンプル中のＲＳＰ組成物の所定の好適なレベルとを比較すること、ここで好適な用量は、生体サンプル中のＲＳＰ組成物の所定の好適なレベルをもたらす用量である、を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態は、ＲＳＰ組成物の生物学的利用可能な画分の部分を予測するための方法を提供する。そのような方法は、ＲＳＰ組成物を含むサンプルと、インサイチュにおいて、そのようなＲＳＰ組成物の投与及び送達が期待される部位で、発見される所定の捕捉ポリペプチドとを接触させること、及びＲＳＰ組成物と捕捉ポリペプチドとの結合を測定することを含む。ＲＳＰ組成物の大部分による結合は、治療的及び／又は生理学的に関連のあるペプチドの大部分を示し、強力な結合（解離定数決定につき）は、インビボでのそれらのペプチドの半減期を延長する保護効果を示し得る。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、実験対象から得られたデータに基づいて、対象（例えば、ヒト対象）に投与されるためのＲＳＰ組成物の治療的有効量を予測するための方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、ヒトでない実験哺乳動物対象にＲＳＰ組成物を投与すること、投与された量の生物学的利用可能な部分を決定すること（例えば、本明細書で記述される定量的検出の方法を用いて）、機能的読み出し（ｒｅａｄ−ｏｕｔ）を測定すること、並びに実験哺乳動物対象について得られたデータ及び治療と実験対象間の相関比に基づいて、治療対象に送達されるＲＳＰ組成物の治療的有効量を予測することを含む。本発明の目的について、「機能的読み出し（ｒｅａｄ−ｏｕｔ）」は、対象の表現型若しくは機能、対象由来の細胞物質の表現型若しくは機能、又は対象由来の一つ又は複数の液体の組成物である。機能的読み出しは、一つ又は複数の生合成又は代謝成分、例えば、ホルモン、酵素、血清タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、免疫調節物質、及び前記機能的読み出しのエフェクター又はレギュレーターの測定をさらに又は代わりに含み得る。特定の実施形態では、検出ステップは、生物学的利用性、代謝、及び／又は投与後のクリアランスの時間経過を測定するための、様々な規則的な又は不規則的な時間で繰り返され得る。特定の実施形態では、群としてのＲＳＰ組成物の血漿半減期は、この方法で決定され得る。さらなる実施形態では、ＲＳＰ組成物中の種の半減期は、この方法で決定され得る。特定の実施形態では、実験対象は、齧歯動物、例えば、マウス又はラットである。
【００２２】
本発明のさらなる別の態様は、ＲＳＰ組成物を投与することにより患者を治療する効率的で効果的な方法であって、以下：ペプチドを合成することによりＲＳＰ組成物を調製すること（例えば、その後、単独で複数のペプチドをプールすることにより、又は伸長のそれぞれのサイクルでアミノ酸モノマーのプールを用いることにより同時に）、前記ＲＳＰ組成物の医薬的に許容される製剤を調製すること、前記ＲＳＰ組成物を対象に投与すること、前記対象から組織サンプルを得ること、前記組織サンプル中のＲＳＰ組成物の量及び／又は濃度を測定すること、機能的読み出しを測定すること、機能的読み出しに対してＲＳＰ組成物の量を関連づけること、及び機能的読み出しを改良するために対象に対してＲＳＰ組成物の用量を調節することを含む、方法を提供する。
【００２３】
本発明の別の態様は、対象にＲＳＰ組成物の好適な用量を投与することを含む、対象において望ましくない免疫反応を治療又は予防するための方法であり、ここで、そのような好適な用量は、以下：（ｉ）対象にＲＳＰ組成物の用量を投与すること；（ｉｉ）実験対象から生体サンプルを取り除くこと；（ｉｉｉ）生体サンプルと少なくとも一つの捕捉ポリペプチドを接触させること；（ｉｖ）生体サンプル中の捕捉ポリペプチドのレベルを測定すること；（ｖ）様々な用量を用いてステップ（ｉ）〜（ｉｖ）を任意で繰り返すこと；（ｖｉ）そのレベル（単数又は複数）と生体サンプル中のＲＳＰ組成物の所定の好適なレベルと比較すること、ここで、好適な用量は、前記生体サンプル中のＲＳＰ組成物の所定の好適なレベルをもたらす用量である、により決定される。
【００２４】
いくつかの前述の態様及び実施形態では、捕捉ポリペプチドは標識される。いくつかの実施形態では、捕捉ポリペプチドは、固体支持体に付着される。いくつかの実施形態では、捕捉ポリペプチド及びＲＳＰ組成物の一つ又は複数のペプチド成分を含む複合体は、検出され及び／又は単離される。特定の実施形態では、捕捉ペプチド又はＲＳＰ組成物のペプチド成分に対してではなく、複合体に対して特異的な抗体により、複合体は検出され及び／又は単離される。
【００２５】
本発明のさらなる別の態様は、ＲＳＰ組成物を構成するペプチドの選択されたサブセットを単離するための方法を提供する。特定の例では、サブセットは、一つ又は複数のアミノ酸配列を有するペプチドからなり得る。他の場合では、捕捉ポリペプチドは、結合特異性に基づいてＲＳＰ組成物の成分を分類するために用いられ得る。
【００２６】
特定の実施形態では、ＲＳＰ組成物を含むサンプルからペプチドを単離するための方法は、以下：（ａ）サンプルと少なくとも一つの捕捉ペプチドとを接触させること；及び（ｂ）混合物から捕捉ポリペプチドに結合するペプチドを分離することを含む。特定のそのような実施形態では、捕捉ポリペプチドは、固体支持体に付着される。いくつかの実施形態では、捕捉ポリペプチドは、エピトープタグ付けられ、又は標識される。いくつかの実施形態では、方法は、ペプチドを単離するために、捕捉ポリペプチドから結合したペプチドを分離することをさらに含む。特定の実施形態では、方法は単離されたペプチドの特徴、例えば、単離されたペプチドのプールのアミノ酸組成、及び／又は単離されたペプチドのアミノ酸配列を決定することをさらに含む。
【００２７】
特定の実施形態では、対象におけるＲＳＰ組成物中の生物学的に利用可能なペプチドを同定する方法は、以下：（ａ）ＲＳＰ組成物を対象に投与すること；（ｂ）ステップ（ａ）を行った後、対象から組織サンプルを取り除くこと；及び（ｃ）少なくとも一つの捕捉ペプチドと結合するサンプル中のペプチドを同定することを含む。
【００２８】
特定の実施形態では、捕捉ポリペプチドと結合するペプチドのサブセットを同定する方法は、プロトコールに従ってＲＳＰ組成物を調製すること、前記ＲＳＰ組成物と所定の捕捉ポリペプチド（例えば、それはインビボ標的又は担体として望ましい）とを接触させること、ＲＳＰ組成物中のペプチドの結合を測定すること、結合しないペプチドから結合するペプチドを識別する特徴を特定すること、及び一つ又は複数の識別する特徴を反映した改良されたＲＳＰ組成物を調製することを含む。
【００２９】
本発明の別の態様は、ＲＳＰ組成物を含む組成物の製造プロセスを改良する方法である。いくつかの実施形態では、ＲＳＰ組成物は、捕捉ポリペプチドと結合するペプチドのサブセットを同定する前述の方法に基づいて設計される。いくつかの実施形態では、ＲＳＰ組成物は、アミノ酸組成物及び／又はアミノ酸配列が、捕捉ポリペプチドを結合するペプチドのサブセットのそれに近似するように設計される。いくつかの実施形態では、ＲＳＰ組成物は、参照ＲＳＰ組成物と比較して増大した有効性を有する、ここで、参照ＲＳＰ組成物は、捕捉ポリペプチドと接触された元のＲＳＰ組成物と同じ、又は実質的に同じである。他の実施形態では、ＲＳＰ組成物は、参照ＲＳＰ組成物と比較して低い毒性を有する。
【００３０】
代わりの実施形態では、方法は、プロトコールに従ってＲＳＰ組成物を調製すること、ＲＳＰを含む組成物を製剤化すること、機能的読み出しのレベル又は程度を検出することにより前記組成物中のＲＳＰの生物学的に利用可能な量を決定すること、そのような読み出しを標準と比較すること、及び所望の生物学的利用性を得るために組成物のプロトコール又は製剤化を調節することを含む。
【００３１】
本発明のさらに別の態様は、ＲＳＰ組成物（例えば、参照ＲＳＰ組成物又は本明細書で開示される方法により生成された改良されたＲＳＰ組成物）又はＲＳＰ組成物の成分と目的の治療薬剤とを結合させることにより特定の組織に対して治療薬剤の標的化することであり、ここで、前記ＲＳＰ組成物又はそれらの成分は、組織特異的な標的化特性を有する捕捉ポリペプチドと結合する。そのような結合した薬剤は、対応する捕捉ポリペプチドに結合する組織対して薬剤を標的化するために、患者に投与され得る。
【００３２】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態は、対象において特定の組織に治療薬剤を送達するための方法を提供し、そのような方法は以下：（ａ）ＲＳＰ組成物と組織特異的ペプチドを接触させ、組織特異的ペプチドと結合するペプチドを混合物から分離することによりペプチドタグを単離すること；（ｂ）ペプチドタグと治療薬剤とを結合させること；及び（ｃ）対象に複合物を投与することを含む。本発明の他の実施形態は、上述の方法のステップ（ａ）及び（ｂ）により、そのような標的化された治療薬剤を調製する方法、及びそれによって調製された標的化された治療を含む。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、任意の上述の方法に用いられる、有用な組成物である。本発明のこの態様の実施形態は、少なくとも一つの捕捉ポリペプチドを含む、生体サンプル中のＹＥＡＫ又はＹＦＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物を検出するための組成物である。特定の実施形態では、捕捉ポリペプチドは、正常ヒト血清、正常非ヒト霊長類血清、正常ウサギ血清、正常マウス血清、正常ラット血清、正常フェレット血清、正常ブタ血清、正常イヌ血清、正常ウマ血清、正常ヒツジ血清、正常ウシ血清、の成分、哺乳動物由来ＨＤＬプロテオームの成分、哺乳動物由来ＬＤＬプロテオームの成分、補体成分Ｃ３、アポリポタンパク質Ａ−１プレプロタンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプレプロタンパク質（アポリポタンパク質Ｄ）、補体成分Ｃ４Ａ、トリプシン阻害剤、インター−アルファ−トリプシン阻害剤ファミリー重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）、アルファ−１−Ｂ糖タンパク質、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、セルロプラスミン、無名のタンパク質生成物（ＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈ  ＩＤでは、ＩｇＭ  重鎖）、アポリポタンパク質Ｅ、補体因子Ｂ、プレアルブミン、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、アルファ２−ＨＳ糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、鎖Ｃ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンラムダ軽鎖、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、Ｉｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ（ＫＡＵ寒冷凝集素）、アポリポタンパク質Ｊ前駆体、ＩｇＡｌ  Ｂｕｒ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、ゲルゾリンアイソフォーム前駆体、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤、無名のタンパク質生成物（ＮＣＢＩ  Ｌｏｃｕｓ／登録番号ＣＡＡ２８６５９）、及びＩｇＪ鎖から選択される。
【００３４】
任意の前述の実施形態及び態様では、ＲＳＰ組成物は、ＹＥＡＫペプチド又はＹＦＡＫペプチドのいずれかを含み得る。ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドは、当該技術分野において知られており、下記に記述されており、ＲＳＰ組成物を含むペプチド、すなわちＹＦＡＫ  ＲＳＰ組成物又はＹＥＡＫ  ＲＳＰ組成物である。さらに、ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドの選択とは無関係に、特定の実施形態では、捕捉ポリペプチドは、血清結合タンパク質でもよい。より特定の実施形態では、捕捉ポリペプチドは、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｄ、及びプレアルブミンから、又はこの段落の直前の段落に列挙された捕捉ポリペプチドから、又は本明細書で開示される血清ポリペプチドから選択される。
【００３５】
さらに、いずれかの前述の実施形態では、ＲＳＰ組成物中のペプチドと捕捉ポリペプチド、例えば、血清タンパク質との結合は、さらなる生理学的に関連する成分の存在下で行われ得る。特定の実施形態では、さらなる成分は、脂質、例えば、コレステロール、又はトリグリセリドである。特定の実施形態では、さらなる成分は、捕捉ポリペプチド以外の実質的に遊離の任意のタンパク質成分であるＨＤＬ又はＬＤＬ複合体である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、ＲＳＰ組成物と支持体が結合した血清結合タンパク質との結合を検出するために用いられるアッセイの概略図である。血清タンパク質が同定された後、それらは固体支持体上に結合する。ＲＳＰ組成物は、単独又は血清中に含まれて、支持体に添加される。ＲＳＰ組成物（又はＲＳＰ組成物と血清タンパク質の複合体に対する）に対する一次抗体は添加され、一次抗体とその標的（単数又は複数）との結合は、二次抗体及び検出試薬により検出される。
【００３７】
【図２】図２は、抗体がそれらの標的と結合した後、抗ＹＦＡＫ及び抗ＹＥＡＫ抗体と結合したＨＲＰのＡ４５０比色吸収を示す。標的は、正常ヒト血清中に含まれる（又はそれに添加された）血清タンパク質に結合したＹＥＡＫ又はＹＦＡＫペプチドを含む複合ペプチド混合物を含む。複合ペプチド混合物の高濃度では、抗ＹＥＡＫ又は抗ＹＦＡＫ抗体による複合体の検出は、低濃度の複合ペプチド混合物より高くなる。１２．５ｎｇ／ｍＬは、ヒト患者における約２ｍｇの用量に相当する。
【００３８】
【図３−１】図３−１は、ＰＩ−２３０１又はＣｏｐａｘｏｎｅと結合する血清タンパク質のリストを示す。血清タンパク質の由来は、示されるように、正常マウス血清又は正常ヒト血清のいずれかである。ＰＩ−２３０１は、アセチル化又は非アセチル化され得る。ＰＩ−２３０１又はＣｏｐａｘｏｎｅの結合複合体は、抗ＹＦＡＫ又は抗ＹＥＡＫ抗体により認識され、二次抗体及び検出試薬で検出される。血清タンパク質は、複合体から溶出され、同定される。タンパク質は、検出試薬のＡ４５０吸収に基づいてスコアが割り当てられる。ｐ＝０．００１に相当する７０のスコアは、バックグラウンド吸収と比較して、統計学的に有意であると考えられる。
【図３−２】図３−２は、ＰＩ−２３０１又はＣｏｐａｘｏｎｅと結合する血清タンパク質のリストを示す。血清タンパク質の由来は、示されるように、正常マウス血清又は正常ヒト血清のいずれかである。ＰＩ−２３０１は、アセチル化又は非アセチル化され得る。ＰＩ−２３０１又はＣｏｐａｘｏｎｅの結合複合体は、抗ＹＦＡＫ又は抗ＹＥＡＫ抗体により認識され、二次抗体及び検出試薬で検出される。血清タンパク質は、複合体から溶出され、同定される。タンパク質は、検出試薬のＡ４５０吸収に基づいてスコアが割り当てられる。ｐ＝０．００１に相当する７０のスコアは、バックグラウンド吸収と比較して、統計学的に有意であると考えられる。
【図３−３】図３−３は、ＰＩ−２３０１又はＣｏｐａｘｏｎｅと結合する血清タンパク質のリストを示す。血清タンパク質の由来は、示されるように、正常マウス血清又は正常ヒト血清のいずれかである。ＰＩ−２３０１は、アセチル化又は非アセチル化され得る。ＰＩ−２３０１又はＣｏｐａｘｏｎｅの結合複合体は、抗ＹＦＡＫ又は抗ＹＥＡＫ抗体により認識され、二次抗体及び検出試薬で検出される。血清タンパク質は、複合体から溶出され、同定される。タンパク質は、検出試薬のＡ４５０吸収に基づいてスコアが割り当てられる。ｐ＝０．００１に相当する７０のスコアは、バックグラウンド吸収と比較して、統計学的に有意であると考えられる。
【００３９】
【図４】図４は、ＹＥＡＫが正常ヒト血清に含まれる血清タンパク質と結合したＹＥＡＫペプチドからなるその標的と結合した後、ＨＲＰ結合抗ＹＥＡＫ抗体のＡ４５０比色吸収を用いた、４ｍｇ／ｋｇのＹＥＡＫでＩＶ、又は２１ｍｇ／ｋｇでＳＣ投与されたマウスの血清中のＹＥＡＫを示す。図は、ＧＡ（酢酸グラチラマー）フラグメントが投与後約１５分で、１８００ｎｇ／ｍＬの最大血清濃度に達することを示す。ＳＣ投与されたＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）の見積もられた生物学的利用性は、ＩＶ投与されたＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）と比較して、１２％である。ＧＡ画分は、投与の２時間後における血清中でもまだ検出される。
【００４０】
【図５】図５は、ＭＤＣとしてもまた知られるこのＣＣＬ２２の場合において、マウスにおける、ＹＥＡＫ投与に対する応答における血清又は血漿中の可溶性画分の急性放出の例を示す。図に見られるように、マウスにＳＣ投与されたＹＥＡＫの用量と観察された最大ＣＣＬ２２血漿濃度間に線形相関が存在する。
【００４１】
【図６】図６は、ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈカラム上に固定されたＹＥＡＫフラグメントから溶出された血清タンパク質からのＬＣ−ＭＳにより観察されたペプチドパターンを示す。ペプチド配列は、検索エンジンであるＭａｓｃｏｔを用いて同定される。手短に言えば、トリプシン酵素消化により生成したＹＥＡＫフラグメントは、Ｃｙａｎｏｇｅｎ  Ｂｒｏｍｉｄｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈ）４ｂと結合され、ヒト又はマウス血清のいずれかで、室温で２時間インキュベートされる。ＹＥＡＫフラグメントと結合した血清タンパク質は、０．１Ｍ  グリシン−ＨＣＬ、ｐＨ２．８の溶液を用いて溶出され、５０％メタノール／５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中トリプシンで消化され、乾燥され、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を用いて分離され、脱溶媒和され、イオン化され、質量分析計（ＭＳ）にスプレーされ、視覚化され、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンを用いて同定される。
【００４２】
【図７】図７は、図１に表される本発明の方法を用いたＥＬＩＳＡアッセイを示し、ここで、ＹＥＡＫは、男性及び女性正常ヒト血清及びプールされた男性及び女性正常ヒト血清に添加される。アッセイは、１〜１００ｎｇ／ｍｌの血清中でＹＥＡＫを検出する線形範囲を示す。このアッセイは、マウス由来の血清を用いて、再現されることができず、無関係の対照、例えば、抗キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）ポリ血清が用いられた場合もできなかった。
【００４３】
【図８】図８は、同様のプロファイルを有することが示された分子量を有するＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）（ＹＥＡＫ）ロットＰ５３２１８、及び１１９１４２のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【００４４】
【図９】図９は、図１に表された本発明の方法に用いられる図８に示されるＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）の二つのロットを示す。
【００４５】
【図１０】図１０は、ＹＥＡＫに曝露された単球細胞株ＲＡＷ２６４．７が濃度依存的方法においてＣＣＬ２２を放出したバイオアッセイにおける図８及び９に用いられるＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）の二つのロットを示す。
【００４６】
【図１１】図１１は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて、様々な所定の長さのＹＥＡＫの共ポリマーの実際と理論的平均分子量との厳格な線形の関係性を示す。理論値は、アミノ酸の共ポリマーの長さ、すなわち、２０、４０、６０及び８０に、一つの水の分子を加えた一つの理論的なアミノ酸の平均分子量を掛けることにより計算された。一つの理論的なアミノ酸の重量は、アミノ酸結合の際に喪失する一つの水の分子を引いたＹ、Ｅ、Ａ及びＫのそれぞれの質量、及び１．０、１．５、４．５、３．６のアミノ酸比を用いることにより計算された。
【００４７】
【図１２】図１２は、アミノ酸分析、及び図８、９、及び１０に見られるＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）の二つのロットで行われた同様の分析により決定される固相合成により製造される様々な長さのＹＥＡＫ共ポリマーの１００のアミノ酸に標準化されるようなアウトプット比を示す。
【００４８】
標準曲線は、２０、４０、６０及び８０個のアミノ酸のＹＥＡＫ共ポリマーを用いて生成された。比較のために、Ｃｏｐａｘｏｎｅを用いた標準曲線はまた、生成された。図１２は、ＹＥＡＫ共ポリマーのサイズと、競合的ＥＬＩＳＡに基づくＰＫアッセイによる検出との関係性を示す。２０ｍｅｒのＹＥＡＫ共ポリマーは、わずかな阻害効果を有したが、しかし８０ｍｅｒのＹＥＡＫ共ポリマーを用いて生成された標準曲線は、Ｃｏｐａｘｏｎｅで得られた曲線に重ね合わされる。
【００４９】
【図１３】図１３は、ウサギポリ血清のＩｇ画分がＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）と強く相互作用するＥＬＩＳＡアッセイを示し、固相合成されたＹＥＡＫ共ポリマーの長さの増加するにつれて増加する認識を示す。
【００５０】
【図１４】図１４は、固相合成されたＹＥＡＫ共ポリマーを用いた前述のＰＫ法（その全体において参照により本明細書に援用されるＰＣＴ出願ＷＯ２００９／０７５８５４に記述されるように）を用いたＥＬＩＳＡアッセイを示し、ＹＥＡＫ共ポリマーのサイズと前述のアッセイシステムの方法による検出との関係性を示す。
【００５１】
【図１５】図１５は、図１２、１３、及び１４に見られる様々なサイズの固相合成された共ポリマーで培養された単球細胞株ＲＡＷ２６４．７は、共ポリマーの長さが増加するにつれて、ＣＣＬ２２の増加した量を産生することを示す。
【００５２】
【図１６】図１６は、２．５ｍｇ／ｋｇのＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）を用いて３週間免疫付与されたマウス由来の脾臓細胞のエクスビボ増殖を誘導するための、図８、９、１０、及び１２に用いられたＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）の二つのロット、及び図１２、１３、１４、及び１５に用いられた様々な長さの固相合成されたＹＥＡＫ共ポリマーの能力を示す。最後のＳＣ投与の一週間後、脾臓は回収され、細胞懸濁液は作られ、細胞は様々な濃度の様々な共ポリマーと４日間培養された。脾臓細胞増殖は、当該技術分野においてよく知られた方法を用いた重水素化したチミジン取り込みを測定することにより測定された。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
発明の詳細な説明
ランダム配列ポリマー（ＲＳＰ）組成物
本発明を記述する目的のためのランダム配列ポリマー（ＲＳＰ）組成物は、様々な割合で二つ又はそれ以上のランダムに配列されたアミノ酸残基を含む、アミノ酸ポリマー（典型的に、ペプチド結合を介して連結される）の任意の混合物であり得、哺乳動物に投与された場合に特定の免疫的及び他の反応を引き起こすことについて有用である。配列混合物のランダムな多様性のために、多数のペプチド配列が混合物中に存在する。ペプチド配列の多様性は、多様性の低い組成物よりも増加した有効性を与える。
【００５４】
ＲＳＰ組成物は、ポリマー配列のアミノ酸のセット及びそれらのアミノ酸の相対的なモル比により画定される。例えば、ＹＦＡＫは、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）、及びリジン（Ｋ）からなるＲＳＰ組成物を示すが、ポリマーはその順番でアミノ酸配列Ｙ−Ｆ−Ａ−Ｋを有することを示さず；これらのアミノ酸残基は、ランダムな配列に取り込まれ、従って、ＲＳＰ組成物は、Ｙ、Ｆ、Ａ、及びＫの様々な配列を有するペプチドを含み、他のアミノ酸から自由又は実質的に自由である。相対的なモル比は、二つの方法：モルインプット比及びモルアウトプット比で表現され得る。「モルインプット比」とは、ＲＳＰを合成するための用いられたアミノ酸のモル比を意味する。例えば、ＲＳＰが固相合成により合成する際に、Ｙ：Ｆ：Ａ：Ｋの１：１：１０：６のモルインプット比を有することが言われた場合、伸長のそれぞれのサイクルについて、１：１：１０：６のモル比において保護されたアミノ酸Ｙ、Ｆ、Ａ、及びＫの混合物は、ペプチド鎖を伸長するために反応される。他方で、「モルアウトプット比」とは、それらが生成物であるＲＳＰペプチドに現れるようなアミノ酸のモル比を意味する。モルアウトプット比は、ＲＳＰ組成物のアミノ酸含量を分析することにより測定される。インプット及びアウトプット比は、取り込み効率におけるアミノ酸間の違いのために同一ではない。
【００５５】
好適なＲＳＰは、国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／０５２５０、ＷＯ００／０５２４９；ＷＯ０２／５９１４３、ＷＯ００２７４１７、ＷＯ９６／３２１１９に、米国特許出願公開ＵＳ２００８／００２１１９２、２００４／００３８８８、２００２／００５５４６、２００３／０００４０９９、２００３／００６４９１５、及び２００２／００３７８４８に、米国特許第６，５１４，９３８号、同第５，８００，８０８号、及び同第５，８５８，９６４号に記述されたもの、及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／０６８２２に記述されたものを含む。これらの参考文献は、ＲＳＰを合成する方法、ＲＳＰを含む組成物、ＲＳＰの治療製剤、ＲＳＰ組成物を対象に投与する方法、ＲＳＰで治療され得る疾患、及びＲＳＰを含む対象に共投与され得るさらなる治療的に有効な薬剤を記述する。本発明に使用のためのさらなるＲＳＰ、及びそれらを合成する方法は、文献、例えば、Ｓｈｕｋａｌｉａｋ  Ｑｕａｎｄｔ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０（１４−１５）：１０７５−８７；Ｍｏｎｔａｕｄｏ，ＭＳ（２００４）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１５（３）：３７４−８４；Ｔａｋｅｄａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９５（２）：３４３−５５；Ｐｏｌｌｉｎｏ，ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６（２）：５６３−７；Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（１２）：１６３５−４３；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＤＭ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４９）：３８１２７−３０；Ｔｓｅｌｉｏｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８（８）：１９０３−９；ａｎｄ  Ｃａｄｙ，ＣＴ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（４）：１７９０−８．において発見され得る。これらの全ての特許、出願、及び公表物の技術は、それらの全体において、特にそれらの中で記述されるＲＳＰの構造、調製、及び機能に関して、参照により本明細書に援用される。
【００５６】
特定のＲＳＰは、フィルターとして役に立つ、負電荷（好ましくは少ない量で）を有するアミノ酸、例えば、グルタミン酸、又はアスパラギン酸との組み合わせで、任意で電気的に中性のアミノ酸、例えば、アラニン、又はグリシンとの組み合わせで、正電荷のアミノ酸、例えば、リジン、又はアルギニンの好適な量を含み、共ポリマーに免疫原性特性与えるために適合させたアミノ酸、例えば、チロシン又はトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を任意でさらに含み得る。そのような組成物は、ＷＯ００／００５２５０に開示される任意のもの、ここでその中で開示されたＲＳＰの構造、調製、及び機能を議論する部分に対する特別な注意とともに、その全体の内容は参照により本明細書に援用される、を含み得る。本発明の特定の実施形態では、ＲＳＰ組成物は、ランダム又は部分的にランダムなアミノ酸配列を有し、以下の４つの群：（ａ）正に荷電したアミノ酸、すなわち、リジン及びアルギニン；（ｂ）負に荷電したアミノ酸、すなわち、グルタミン酸及びアスパラギン酸；（ｃ）小さい中性のアミノ酸、すなわち、アラニン、スレオニン、セリン、及びグリシン；及び（ｄ）嵩高いアミノ酸、すなわち、ロイシン、イソロイシン、バリン、チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファン、からアミノ酸を含むポリマーの混合物である。そのようなＲＳＰの特定の実施形態は、ＹＥＡＫ（下記に記述されるＣｏｐ−１を含む）、ＶＥＡＫ、及びＦＥＡＫである。他の実施形態では、ＲＳＰは、３つのアミノ酸、それは４つの先の群の中の３つの群のそれぞれから選択される、からなるターポリマーである。特定の実施形態は、さらに下記で記述されるＹＡＫ、ＹＥＫ、ＫＥＡ、及びＹＥＡである。
【００５７】
本発明の他の実施形態では、ＲＳＰ組成物は、ランダム又は部分的にランダムなアミノ酸配列有し、（ａ）グルタミン酸、（ｂ）アスパラギン酸、並びに以下の群：（ｃ）小さい中性のアミノ酸、すなわち、アラニン、スレオニン、セリン、及びグリシン；並びに（ｄ）疎水性アミノ酸、すなわち、バリン、ロイシン、及びイソロイシンのそれぞれからアミノ酸を含むポリマーの混合物である。そのようなＲＳＰの特定の実施形態は、ＤＡＬＥ、ＤＡＩＥ、ＤＡＶＥ、ＤＧＬＥ、ＤＧＩＥ、及びＤＧＶＥである。本発明がそれに有用であるＲＳＰの他の実施形態は、疎水性アミノ酸を含まないものである。特定の実施形態は、ＤＡＳＥ、ＤＡＴＥ、ＤＧＳＥ、及びＤＧＴＥである。
【００５８】
他の好適なＲＳＰは、ランダム又は部分的にランダムなアミノ酸配列有し、以下の４つの群：（ａ）負に荷電したアミノ酸、すなわち、グルタミン酸及びアスパラギン酸；（ｂ）小さい脂肪族アミノ酸、すなわち、アラニン及びグリシン；（ｃ）疎水性、脂肪族アミノ酸、すなわち、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン；及び（ｄ）小さい親水性側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、システイン、スレオニン）のそれぞれのアミノ酸を含む、加えて、共ポリマーは、プロリン残基を含み得る、ポリマーの混合物である。一つの実施形態では、共ポリマーは、アミノ酸であるグルタミン（Ｅ）及び／又はアスパラギン酸（Ｄ）、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）、及びアラニン（Ａ）を用いて生成され、本明細書で「ＥＬＳＡ」共ポリマーとして称される。
【００５９】
特定の他の実施形態では、ＲＳＰは、ランダム又は部分的にランダムなアミノ酸配列有し、以下の４つの群：（ａ）負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；（ｂ）疎水性、脂肪族アミノ酸、すなわち、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン；（ｃ）嵩高い疎水性アミノ酸、すなわちチロシン、フェニルアラニン；及び（ｄ）小さい中性側鎖を有するアミノ酸、すなわち、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン；からアミノ酸を含み、加えて、共ポリマーは、プロリン残基を含み得る、配列である。典型的な共ポリマーは、アミノ酸残基であるグルタミン（Ｅ）及び／又はアスパラギン酸（Ｄ）、ロイシン（Ｌ）、チロシン（Ｙ）、及びバリン（Ｖ）を用いて生成され、本明細書で「ＤＬＹＶ」共ポリマーとして称される。
【００６０】
ＲＳＰの他の特定の実施形態は、ＶＹＡＫ、ＶＷＡＫ、及びＹＦＡＫであり、それはさらに後述される。さらなる他の実施形態では、本発明で使用のために好適なＲＳＰは、アミノ酸残基Ｋ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｖ、及び任意でＰを含む。より好ましくは、Ｋ：Ｅ：Ａ：Ｓ：Ｖの比が０．３：０．７：９：０．５：０．５：０．３である。好ましくは、ＲＳＰは、約１０〜１００個のアミノ酸残基長、より好ましくは、２０〜８０個のアミノ酸残基長、さらに好ましくは４０〜６０個のアミノ酸残基長、及びより好ましくは約５０個のアミノ酸残基長である。ＲＳＰの典型的な調製物は、様々な長さのペプチドの混合物であり、その大部分は、所望の長さであるが、特定の短い又は長いペプチドを含み得る。
【００６１】
本明細書で記述される組成物及び方法に好適な特定のＲＳＰは、ＹＥＡＫであり、それは、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−リジン（Ｋ）、及びＬ−チロシン（Ｙ）の組み合わせを含み、正味で全体として正の電荷を有する。一つの特定の例は、酢酸グラチラマーとも称される共ポリマー１（Ｃｏｐ−１）である。Ｃｏｐ−１は、商標名ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）（Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．，Ｐｅｔａｈ  Ｔｉｋｖａ，Ｉｓｒａｅｌの商標）の下で、多発性硬化症（ＭＳ）の治療のために、いくつかの国において承認されている。Ｃｏｐ−１は、ランダムポリペプチドの混合物であるので、それは含まれるペプチドの全て又はサブセットのみが「活性」であり得る。目的のＣｏｐ−１  ＲＳＰは、約２，０００〜約４０，０００ダルトン、特により好ましくは、約２，０００〜約１３，０００ダルトンの分子量を有する。Ｃｏｐ−１は、約４，７００〜約１３，０００ダルトンの平均分子量を有するが、小さい及び大きいペプチドも含む。Ｃｏｐ−１について最も興味のある平均分子量は、約５，０００〜約９，０００ダルトンである。従って、Ｃｏｐ−１  ＲＳＰは、約１５〜約１００個のアミノ酸残基、好ましくは、約４０〜約８０個のアミノ酸残基長からのポリペプチドでもよい。特定の実施形態では、Ｃｏｐ−１  ＲＳＰの長さは、３５〜７５個のアミノ酸残基である。より好ましくは、Ｃｏｐ−１  ＲＳＰの長さは、３５〜６５個のアミノ酸残基である。特定の実施形態では、Ｃｏｐ−１の長さは、約５０個のアミノ酸である。別の特定の実施形態では、Ｃｏｐ−１  ＲＳＰの長さは、約５２個のアミノ酸である。特定の実施形態では、当該技術分野でよく知られている液相又は固相化学のいずれかにより合成され、Ｃｏｐ−１は、Ｙ：Ｅ：Ａ：Ｋそれぞれについて、約１．０：２．０：６．０：５．０の平均モルアウトプット比を有する。従来のペプチド合成及び同様の他のＲＳＰの調製と対照的に、Ｃｏｐ−１の合成は、それぞれのサイクルについて、単一のアミノ酸よりもむしろ、画定の割合で適切に保護されたＹ、Ｅ、Ａ、及びＫの混合物を添加することにより行われる。アウトプット比の可変性は、様々なアミノ酸間で約１０％の範囲を含む。分子量範囲及びＣｏｐ−１の好ましい形態を作るためのプロセスは、米国特許第５，８００，８０８号に記述され、その内容は、全体及び特に記述されたＲＳＰの構造、調製、及び機能に関して本明細書に援用される。
【００６２】
約５２個のアミノ酸残基のＣｏｐ−１  ＲＳＰの特定の実施形態では、アミノ酸部位３１〜５２におけるアラニン成分の割合が、アミノ酸部位１１〜３０においてよりも多く、アミノ酸部位１１〜３０におけるアラニン成分の割合は、アミノ酸部位１〜１０においてよりも多い。特定の実施形態では、Ｃｏｐ−１  ＲＳＰ配列の残基１〜１０は、約１．０：２．０：５．５：５．０のモルアウトプット比を有し、残基１１〜３０は、約１．０：２．０：６．０：５．０のモルアウトプット比を有し、残基３１〜５２は、約１．０：２．０：６．５：５．０のモルアウトプット比を有し、全ての比は順番にＹ、Ｅ、Ａ、Ｋ間のモル比について示された。
【００６３】
本発明の目的について、語句「Ｃｏｐ−１又はＣｏｐ−１関連ペプチド若しくはポリペプチド」とは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）と機能的に交差反応する任意のペプチド又はポリペプチドを含むことを意図し、抗原提示におけるＭＨＣ  クラスＩＩに対して、ＭＢＰと競合することができる。本明細書で開示される実用性についてのＣｏｐ−１の活性は、一つ又は複数の以下の置換：グルタミン酸（Ｅ）についてアスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）についてグリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）についてアルギニン（Ｒ）、及びチロシン（Ｙ）についてトリプトファン（Ｗ）がされる場合、維持することが予測される。
【００６４】
他の実施形態では、ＲＳＰ組成物は、以下の群：（ａ）負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；（ｂ）疎水性の、脂肪族アミノ酸、すなわち、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン；（ｃ）嵩高い、疎水性のアミノ酸、すなわち、チロシン、フェニルアラニン；及び（ｄ）小さい中性側鎖を有するアミノ酸、すなわち、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン、から３つの異なるアミノ酸を含み、さらに共ポリマーはプロリン残基を含み得る。これらの共ポリマーは、本明細書で「ターポリマー」として称される。平均分子量は、約２，０００〜約４０，０００ダルトン、好ましくは、約３，０００〜約３５，０００ダルトンである。より特定の実施形態では、平均分子量は、約５，０００〜約２５，０００ダルトンである。典型的なターポリマーは、下記の表に示される。これらのターポリマーにおけるアミノ酸の平均モル画分は、変更され得、一般的な範囲として示される。
【００６５】
【表１】
2013511725.tif 000002
【００６６】
特定の実施形態では、ターポリマーのアミノ酸のモル画分は、Ｃｏｐ−１について好ましいもの、例えば、グルタミン酸約０．１４、アラニン約０．４３、チロシン約０．１０、及びリジン約０．３４と同様である。
【００６７】
他の好適なＲＳＰは、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−リジン（Ｋ）、及びＬ−チロシン（Ｙ）の組み合わせを含み、本明細書では、ＹＦＡＫとして称される。任意のそのようなＲＳＰの長さは、約２５〜３００個のアミノ酸残基である。治療組成物における使用に好ましいＹＦＡＫ  ＲＳＰは、約３５〜７５個のアミノ酸残基である。より好ましくは、ＲＳＰの長さは、約３５〜６５個のアミノ酸残基である。好ましいＲＳＰは、約５０又は５２個のアミノ酸の長さを有する。
【００６８】
ＹＦＡＫ（Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、及びＬ−リジン）の特定の組成物は、それぞれ約１．０：１．２：ＸA：６．０のモルアウトプット比を有し、ここで、ＸAは、１１．０よりも大きく、３０．０より小さく、より好ましくは、２０．０よりも大きく、３０．０より小さく、アウトプット比における可変性は、様々なアミノ酸の間で約１０％の範囲を含む。治療的使用のために好ましいランダムポリマーのＹＦＡＫのモルアウトプット比は、下記の表Ｂに示される。
【００６９】
【表２】
2013511725.tif 000003
【００７０】
特定のＹＦＡＫ組成物は、約１．０：１．３：２４．０：６．０（それぞれ、Ｙ、Ｆ、Ａ、Ｋ）の平均モルアウトプット比を有し、当該技術分野において知られるような固相合成により調製され得る。
【００７１】
治療的使用のために好ましい別のＹＦＡＫ組成物は、約１．０：１．２：ＸA：６．０のモルアウトプット比を有し、ここで、ＸAは、２０．０よりも大きく、アラニンの割合は共ポリマーの長さと共に増加する。特定の組成物では、そのようなＲＳＰの長さは、約５２個のアミノ酸残基であり、アミノ酸部位３１〜５２におけるアラニンの割合は、アミノ酸部位１１〜３０においてよりも多く、アミノ酸部位１１〜３０におけるアラニンの割合は、アミノ酸部位１〜１０においてよりも多い。
【００７２】
ＲＳＰは、アミノ酸組成及びそれらの比に直接的に由来する、それらの優先的な結合標的、及びそれらの生理学的機能に従って分類され得る。任意の利用可能な方法は、ＲＳＰ組成物が候補の又は既知の標的タンパク質と結合するかどうかを解明するために用いられ得る。例えば、ポリペプチドは、レポーター分子（例えば、放射性核種又はビオチン）で標識され、標的タンパク質の粗製の又は純粋な調製物と混合され、未結合のポリペプチドの除去後、レポーター分子が標的タンパク質に付着した場合、結合は検出される。
【００７３】
ＲＳＰは、任意の割合で任意のアミノ酸残基を含み、潜在的に様々な生理学的効果を有し得るが、特定のＲＳＰは認識される免疫学的活性を有する。特定のＲＳＰは、それらが優先的に特異的Ｔ細胞エピトープと相互作用するように設計され、そのいくつかは、病理学的障害に直接的に関連し得る。本発明が有用であるＲＳＰの一つの種類はＴ細胞に特異的であり、それは可溶性メディエーター、例えば、サイトカインを分泌し得る。好ましくは、そのようなＲＳＰは、アミノ酸の２〜８種類を含むペプチドの混合物であり、優先的に特異的Ｔ細胞エピトープと相互作用し、そのいくつかは、可溶性メディエーター、例えば、サイトカインの異常な生産により深刻化する病理的障害と直接的に関連する、又は関連していると考えられる。
【００７４】
ＲＳＰの別のクラスは、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子による提示を介した数千、好ましくは数十万、より好ましくは数百万のＴ細胞エピトープと機能的に相互作用する潜在力を有する。ヒトにおけるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、又はＨＬＡ−ＤＰ分子からなる。これらのＨＬＡ分子のそれぞれの種類をコードする多数の対立遺伝子はまた、存在する。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子は、Ｂリンパ球、及び抗原提示細胞、例えば、マクロファージの表面に主に発現される。クラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質は、ほぼ同じ大きさのα及びβサブユニットからなり、その双方は、膜貫通タンパク質である。ペプチド結合クレフトは、α及びβサブユニットの双方のアミノ末端の部分により形成される。このペプチド結合クレフトは、Ｔ細胞に対する抗原の提示の部位である。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の特定の対立遺伝子変異体は、自己免疫及び他の異常な免疫学的障害に関連する。
【００７５】
一つの特定のそのような障害は、多発性硬化症（ＭＳ）である。ＭＳ関連ＨＬＡ−ＤＲ２（ＤＲＢ１*１５０１）分子は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）と高い親和性で結合し、それはＴ細胞にミエリン鞘を攻撃させる。上述のＣｏｐ−１は、高い親和性で、且つペプチド特異的な方法で、精製されたＨＬＡ−ＤＲ２（ＤＲＢ１*１５０１）、ＨＬＡ−ＤＲ１（ＤＲＢ１*０１０１）、及びＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＢ１*０４０１）と結合する。他のＲＳＰ、例えばＹＦＡＫはまた、そのようなＭＨＣクラスＩＩタンパク質の抗原結合溝について、Ｃｏｐ−１が有するのと同様の、又はより高い親和性を有し得る。それ故、これらのＲＳＰは、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質からミエリン自己抗原の結合を阻害し、又は結合を置き換え得る。
【００７６】
同様に、本明細書で記述される方法に用いられるＲＳＰ組成物は、関節炎疾患、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、又は変形性関節症（ＯＡ）を治療するのに有用であり得る。Ｃｏｐ−１と結合するＨＬＡ−ＤＲ１（ＤＲＢ１*０１０１）、又はＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＢ１*０４０１）は、関節リウマチ（ＲＡ）に関連する。この発明が有用なＣｏｐ−１、ＹＦＡＫ、及び他のＲＳＰは、そのようなＨＬＡの抗原結合溝について、関節リウマチ病理の標的であるＩＩ型コラーゲン２６１〜２７３ペプチドが有するよりも高い親和性を有し得る。それ故、これらのＲＳＰは、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の抗原結合溝からＩＩ型コラーゲン２６１〜２７３ペプチドの結合を阻害し、又は置き換え得る。
【００７７】
発明の方法の特定の実施形態が有用である他のＲＳＰは、ＨＬＡ−ＤＱＡ１分子、よりさらに好ましくは、対立遺伝子であるＤＱＡ１*０５０１−ＤＱＢ１*０２０１、ＤＱＡ１*０３０１、ＤＱＢ１*０４０１、及びＤＱＡ１*０３−ＤＱＢｌ*０３０２にコードされている一つ又は複数のＨＬＡ分子と結合するＲＳＰである。
【００７８】
特定の実施形態では、ＲＳＰは、ＨＬＡ−ＤＲ分子及び／又は他のＤＱアイソタイプと結合するための共ポリマーの解離定数（Ｋd）Ｋdよりも少なくとも１０倍未満のＫdを有し、そのような分子の担体を自己免疫関連疾患、例えば、Ｉ型糖尿病及びセリアック病に係りやすくする特定のＨＬＡ−ＤＱ分子と結合する。そのようなＨＬＡ−ＤＱ分子は、ＤＱＢ１*０２０１、ＤＱＢ１*０３０２、ＤＱＢ１*０３０４、ＤＱＢ１*０４０１、ＤＱＢ１*０５０１、ＤＱＢ１*０５０２；及びＤＱＡ１*０３０１、ＤＱＡ１*０３０２、ＤＱＡ１*０３０３、及びＤＱＡ１*０５０１として知られる特異的なＨＬＡ−ＤＱＢｌ及びＤＱＡｌ対立遺伝子の組み合わされたタンパク質生成物である。これらの対立遺伝子は、同じハプロタイプ（「シス」対立遺伝子）、例えば、ＤＱＢ１*０２０１−ＤＱＡ１*０５０１−ＤＲＢ１*０３０１、及びＤＱＢ１*０３０２−ＤＱＡ１*０３０１−ＤＲＢ１*０４０１上にコードされ得る。「シス」対立遺伝子のポリペプチド生成物を含む得られたＨＬＡ分子は、「シスダイマー」として称される。あるいは、対立遺伝子は、異なるハプロタイプ（「トランス」対立遺伝子）上にコードされ得る。「トランス」対立遺伝子のポリペプチド生成物を含むＨＬＡ分子は、「トランス」ダイマーとして称される。「トランス」対立遺伝子の例は、ＤＱＢ１*０２０１−ＤＱＡ１*０５０１−ＤＲＢ１*０３０１上のＤＱＢ１*０２０１、及びＤＱＢ１*０３０１−ＤＱＡｌ*０３０１−ＤＲＢ１*０４０４上のＤＱＡｌ*０３０１の組み合わせである。
【００７９】
特定の実施形態では、本発明に有用なＲＳＰ組成物は、１μΜ以下の平均Ｋdで、より好ましくは１００ｎＭ、１０ｎＭ、又は１ｎＭ未満の平均Ｋdで、一又は複数のＤＱアイソタイプと結合する。好ましい共ポリマーを同定するための別の方法は、例えば、Ｓｉｄｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５０９８、それはＩＣ50値として表現される、に記述されている競合的結合アッセイにおいて、別のものに置き換えるための共ポリマーの測定に基づく。本発明の好ましいＲＳＰは、１μＭ未満、より好ましくは、５００ｎＭ未満、さらには１００ｎＭ未満のＩＣ50を有する。ＨＬＡ−ＤＱに対して特異性を有するいくつかのＲＳＰは、ＥＬＳＡ及びＶＬＹＶである。
【００８０】
特定の他の実施形態では、本発明の方法は、疾患と関連するエピトープに基づくＡＰＬの特定の特徴を有するＲＳＰに関連する。
【００８１】
特定の実施形態では、本発明に有用なＲＳＰは、２５，０００未満、より好ましくは、１００００、５０００、１０００、５００、１００、５０未満、又はさらには１０未満の多分散性を有するように、医薬として使用のために製剤化される。
【００８２】
薬物動態的方法
いくつかの実施形態では、ＲＳＰ組成物の吸収及び分布は測定され得る。ＲＳＰ組成物が変化をもたらすその速度、及びその効果の存続、並びにＲＳＰ組成物の組成に対する化学的変化はまた、測定され得る。
【００８３】
特定のＲＳＰ組成物は、他の混合物よりも、血清及び他の生体液において、より長く存続する。例えば、ＹＦＡＫ、ＰＩ−２３０１の調製物は、同じ初期重量／体積濃度で投与されたＣｏｐ−１と比較して１０倍の血清濃度で発見された（米国出願公開２００９−０２７５４９６）。いくつかの例では、投与されたペプチドは、インサイチュでいくつかのインビボ成分と結合され、結合することにより捕捉され、その結果は、生物学的利用性の増大を含む又は含まない、その環境において長い半減期である。特定の実施形態では、環境は、血漿又はリンパ液である。代わりの実施形態では、環境は、脊髄又は脳脊髄液である。さらに他の実施形態では、環境は、ＲＳＰ組成物からペプチドが送達される任意の組織又は臓器の場所である。
【００８４】
ＲＳＰ組成物からのアミノ酸ポリマーに結合する生理学的ポリペプチド及びタンパク質の同定
本発明の一つの態様は、ＲＳＰ組成物に結合する捕捉ポリペプチドの同定である。用語「捕捉ポリペプチド」とは、任意のポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント、タンパク脂質、又は正常な組織及び臓器に見られるタンパク質性物質を含む他の分子を意味するために本明細書で用いられる。それは、単一のポリペプチド、又は複数のポリペプチド及び／又はサブユニットを含むタンパク質、又は他の物質、例えば、脂質と結合した（共有結合的に又は非共有結合的に）タンパク質を含む複合体であってもよく、それは、ＲＳＰ組成物に結合するための捕捉ポリペプチドのための望ましい又は必須の画定された構造をさらに有し得る。しばしば、捕捉ポリペプチドは、一過性でなく、すなわち、誘導された又は増大された一時的な存在があるかにかかわらず、全ての時間において見つけられるベースで安定的な量が存在する。好ましくは、捕捉ポリペプチドはタンパク質である。より好ましくは、捕捉ポリペプチドは生体液中で発見されるタンパク質、例えば血清タンパク質である。
【００８５】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態は、ＲＳＰ組成物を構成するペプチドと結合する捕捉ポリペプチドを同定する方法であって、本方法は、以下：ＲＳＰ組成物の量を含むサンプルと正常組織サンプルとを接触させること；及びＲＳＰ組成物のペプチドと正常組織サンプルの任意の成分との結合を検出することを含む。特定の実施形態では、ＲＳＰ組成物のペプチドは、レジン（ペプチドと活性化されたレジンとを反応させることにより共有結合を通して）、又は固体支持体、例えばポリスチレン上のいずれかに固定化される。例えば、組織サンプルは、固定化されたペプチドと接触され、インキュベートされ、非特異的な結合を取り除くために洗浄され得、組織サンプル中のペプチドと結合した物質は同定される。結合した物質は、任意の好適な方法により、例えば、物質を特異的抗体のパネルに供すること；そのような物質がポリペプチド又はヌクレオチドであることが疑わしい場合、物質のマイクロ配列解析を行うこと；そのような物質が多糖であることが疑わしい場合、そのような物質を特異的な色素に供して、トリプシン消化に続く質量分析計と直列に結合された液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）；又は十分に高い感度を有する任意の分析方法により、同定され得る。
【００８６】
上述の同定の非限定的な例として、ＰＩ−２３０１又はＣｏｐ−１は、ＹＥＡＫ又はＹＦＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物に結合する血清タンパク質を同定するために、直接ＥＬＩＳＡアッセイ（物質及び方法を参照のこと）に用いられ得る。下記の表Ｃは、正常ヒト血清中でＹＥＡＫ及び／又はＹＦＡＫペプチドと結合することが実験的に示された血清タンパク質を一覧にする。ＹＥＡＫ及びＹＦＡＫペプチドが異なる結合特異性を有し；反対に、血清タンパク質は様々な特異性でＹＥＡＫ及びＹＦＡＫペプチドに結合すると言われ得ることは観察される。表Ｄ及びＥは、それぞれＨＤＬ及びＬＤＬと結合する血清タンパク質を一覧にする。任意の血清タンパク質は、親和性及び選択性を変えることにより本明細書で記述されたＲＳＰ組成物と結合し得る。
【００８７】
一旦ＲＳＰ組成物を構成するペプチドと結合する捕捉ポリペプチドが同定されると、同様のペプチドに対する、又は完全にランダムなペプチドに対する結合の特異性は、測定され得る。同定され、特徴付けられた捕捉ポリペプチド（実際に同定された同じ分子、又は様々な起源から得られた同様の分子のいずれか）は従って、順番に、結合するここが分かっているＲＳＰ組成物を定量的に分析するために用いられ得る。
【００８８】
血清タンパク質
いくつかの実施形態では、ＲＳＰ組成物と血清タンパク質との結合は、それらの生物学的活性の重要な態様を構成する。ＲＳＰ組成物と血清タンパク質との結合は、それらの組織分布、及び抗原提示細胞、例えば、単球及びマクロファージによる捕捉を容易にし得る。上述のように、ペプチドと血清タンパク質との結合は、分解及び／又は代謝回転からそれらを保護し得る。例えば、ＰＩ−２３０１（プロバマー（ｐｌｏｖａｍｅｒ）、ＹＦＡＫ  ＲＳＰ）及びＣｏｐ−１（酢酸グラチラマー、ＹＥＡＫ  ＲＳＰ）は、皮下投与の数時間後、ヒトを含む様々な種の血清において検出され得るのに対し、対照ＲＳＰは短時間で血清から消失した（米国特許出願公開第２００９−０２７４９６号）。
【００８９】
従って、血清タンパク質は、ＲＳＰ組成物からの一つ又は複数のペプチドを捕捉する及び／又は同定するために用いられ得る。全体として、ＲＳＰ組成物は、多数の様々な別々のペプチドを含み、それの一つ又は複数のサブフラクションは、他のサブフラクションがそうでないのに対し、血清タンパク質結合特性について関与し得る。これは、ＲＳＰ組成物の異なるロットが、血清タンパク質に結合することができるペプチドの百分率においてバリエーションを含み得る、液相ペプチド合成により作られた混合物に特に当てはまる。例えば、異なるロットのＲＳＰ組成物に亘って、血清タンパク質結合画分が定量的に及び定性的に同等であることを実証するために、変異体の生物学的同等性を実証するために、血清中の酢酸グラチラマーの一般的な変異体を観察することは重要であり得る。
【００９０】
血清タンパク質は、ＲＳＰ組成物から結合パートナーを選択する及び／又は特徴付けるためにインビトロで用いられ得る。血清タンパク質はまた、血清タンパク質と結合するペプチドを選択する、測定する、及び／又はさもなければ特徴付けるためにインビトロで用いられ得、従って、血清タンパク質とのそれらの結合及び／又はインビボでのそれらの残存に基づいて、特異的なペプチド又はペプチドのサブセットを識別する方法を提供する。血清タンパク質と結合するペプチドの特定の特徴は、特定のアミノ酸配列、混合物中のアミノ酸の割合、構造、独特のモチーフ、荷電残基の配置を含み得る。例えば、ＰＩ−２３０１とＨＤＬ又はＬＤＬにおいて複合体で発見されるリポタンパク質との結合は、正のリジンとリポタンパク質の外部上の負に荷電した残基との相互作用、及びアラニン及びフェニルアラニンとリポタンパク質の疎水性部分との相互作用のために、可能であり得る。
【００９１】
【表３】
2013511725.tif 000004
【００９２】
【表４】
2013511725.tif 000005
【００９３】
【表５】
2013511725.tif 000006
【００９４】
【表６】
2013511725.tif 000007
【００９５】
血清タンパク質とＲＳＰ組成物との結合
理論により縛られることを望まないで、機構的に、ＲＳＰ組成物（例えば、ＰＩ−２３０１及びＣｏｐ−１）中のペプチドと血清タンパク質、例えば、ＨＤＬ及びＬＤＬと結合して発見されるリポタンパク質との結合は、受容体、例えば、ＳＲ−ＢＩ又はＡＢＣＡ１を通して単球によるそれらの捕捉を容易にし得る。この結合は、単球の活性化、及び抗炎症性細胞へのそれらの分化を誘導し得る。ＰＩ−２３０１とＣｏｐ−１は、血清タンパク質との結合において異なる（図３を参照のこと）。違いについての一つの理由は、Ｃｏｐ−１及び酢酸グラチラマーの一般的な変異体が液相ペプチド合成により作られ、従って、組成物中の有意なバリエーションは、ロットからロットまで観察され得ることである。対照的に、ＰＩ−２３０１は固相合成により製造される。ＰＩ−２３０１は、双方の方法により狭いガウス分布を有するＳＥＣ−ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより実証されるように大変狭い分子量分布を有する。従って、混合物中のＰＩ−２３０１  ５２ｍｅｒペプチドの大部分は、機能的であると見られる。Ｃｏｐ−１は、より広い分子量分布を有し、それは混合物のいくつかの種類、例えば、混合物中の小さいペプチド種類は効果が無いと見られる。その考えと一致して、ＰＩ−２３０１は、多発性硬化症及びクローン病の前臨床モデルにおける有効性に関してＣｏｐ−１より強力であり、優れた血清曝露を達成する。
【００９６】
ＰＩ−２３０１又はＣｏｐ−１と結合する血清タンパク質についてのアッセイでは、血清タンパク質の異なるサブセットはＹＦＡＫ及びＹＥＡＫペプチドと結合する（図３を参照のこと）。
【００９７】
血清タンパク質は、コレステロール複合体、例えば、ＨＤＬ又はＬＤＬ複合体の一部として、及び／又は生理的条件下で血清タンパク質との結合で発見される他のタンパク質及びポリペプチド（それのいずれかはまた、捕捉ポリペプチドとして個別に機能し得る）との複合体で、ＲＳＰ組成物と結合し得る。従って、本発明の方法は、ＲＳＰ組成物と血清タンパク質とが結合する場合、血清中で発見されるさらなる成分を有することを予期する。
【００９８】
生体サンプルにおけるＲＳＰ組成物の検出：生物学的利用性の測定
本発明の一つの態様は、生体サンプル中のＲＳＰ組成物の存在を検出するための方法であって、以下：生体サンプルと少なくとも一つの捕捉ポリペプチドとを接触させること；及び捕捉ポリペプチドとＲＳＰ組成物との結合の存在又は不存在を検出すること、ここで、結合の存在は生体サンプル中のＲＳＰ組成物のペプチド成分の存在を示す、を含む。さらに、そのような方法は、サンプル中のＲＳＰ組成物の量又は濃度を測定するために拡張され得る。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＲＳＰ組成物（例えば、ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含む）の存在は、生体サンプルと少なくとも一つの捕捉ポリペプチド（例えば、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｄ、及びプレアルブミンから選択されるペプチドを含む）と接触させること；及び捕捉ポリペプチドとＲＳＰ組成物との結合の存在又は不存在を検出することにより、生体サンプルにおいて検出され得る。このアッセイでは、結合の存在は、生体サンプル中のＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドの存在を示す。さらに、本発明は、生体サンプルと少なくとも一つの捕捉ポリペプチド（例えば、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｄ、及びプレアルブミンから選択されるペプチドを含む）とを接触させること；及び捕捉ポリペプチドとＲＳＰ組成物との結合のレベルを定量することにより、生体サンプル中のＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物の量を測定する方法を提供する。
【０１００】
本発明の他の実施形態は、対象においてＲＳＰ組成物（例えば、ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含む）の生物学的利用性を測定する方法であって、ＲＳＰ組成物を含む組成物の用量を対象に投与すること；対象から生体サンプルを取り除くこと；及び生体サンプルと少なくとも一つの捕捉ポリペプチド（例えば、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｄ、及びプレアルブミンから選択されるペプチドを含む）とを接触させることを含む方法を提供する。ＲＳＰ組成物のペプチドがインビボにおいて捕捉ポリペプチドと広く結合することは予期される。それにもかかわらず、さらなる特徴化のために、ＲＳＰ組成物のペプチド及び捕捉ペプチドを含む複合体に対する特異的な抗体は、それらそれぞれが単独ではなく、生物学的に利用可能なＲＳＰ組成物の検出のために用いられ得る。
【０１０１】
投与の用量及び方法の改良
本発明の別の態様は、上述の方法又は本明細書に記述される他の方法により決定されるような投与量の生物学的利用可能な部分に基づいて決定される量において、哺乳動物対象にＲＳＰ組成物を投与する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、対照サンプルを含むこと、対照サンプルと試験サンプルの二つの結果を比較することにより生理学的マーカー、例えば、ホルモン、酵素、血清タンパク質、サイトカイン、免疫調節物質、又は任意のそれらの機能性タンパク質のエフェクター又はレギュレーターの変化を測定するための薬力学的試験を行うこと、及び薬力学的パラメーターの所望の変化を誘導するために有効な用量を決定することをさらに含む。特定の実施形態では、行動変化、対象により報告されるような自覚的変化、例えば、疼痛又は疾患の症状の改善、又は間接的効果の他の証拠は観察される。特定の実施形態では、前記哺乳動物対象は、齧歯動物、例えば、マウス又はラットである。他の実施形態では、前記対象はヒトである。
【０１０２】
より一般的には、対象における望ましくない免疫反応を治療する又は予防するための方法は、ＲＳＰ組成物（例えば、ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含む）を提供すること；ＲＳＰ組成物を試験対象に投与すること；試験対象から生体サンプルを取り除くこと；生体サンプルと少なくとも一つの捕捉ポリペプチド（例えば、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｄ、及びプレアルブミンから選択されるペプチド配列を含む）とを接触させること；捕捉ポリペプチドと結合したペプチドを混合物から分離すること；分離されたペプチドの特徴を決定すること；分離されたペプチドの特徴を有するペプチドのセットを調製すること、及び対象にペプチドの調製されたセットを投与することを含み得る。
【０１０３】
これらの方法では、ＲＳＰ組成物は、一回以上対象に投与され得る。ＲＳＰ組成物は、例えば、１、２、３、４、６、１２、１８、２４、３６、４８又は７２時間の間隔で、対象に投与され得る。
【０１０４】
従って、本発明のいくつかの実施形態は、それを必要とする対象に好適な用量のＲＳＰ組成物（例えば、ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含む）を投与する方法であり、ここで、好適な用量は、ＲＳＰ組成物に第一の用量を対象に投与すること；対象から生体サンプルを取り除くこと；生体サンプルと少なくとも一つの捕捉ポリペプチド（例えば、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｄ、及びプレアルブミンから選択されるペプチドを含む）とを接触させること；生体サンプル中の捕捉ポリペプチドのレベルを測定すること；第二の異なる用量を用いて任意で前述のステップを繰り返すこと；及びそのレベルと生体サンプル中のＲＳＰ組成物の所定の好適なレベルとを比較することにより決定される。これらの条件下では、好適な用量は、生体サンプル中のＲＳＰ組成物の所定の好適なレベルをもたらす用量である。生体サンプル中のＲＳＰ組成物の好適なレベルは、所望の機能的読み出し又は代理のマーカー変化が得られるレベルである。機能的読み出しは、対象の表現型又は機能、対象由来の細胞物質の表現型又は機能、又は対象由来の液体の組成物であり得る。特定の実施形態では、検出ステップは、投与後の生物学的利用性の時間経過を測定するための特定の時間間隔後、繰り返される。特定の実施形態では、群としてのＲＳＰ組成物の半減期は、そのような時間経過から決定される。ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫの場合における機能的読み出し及び免疫反応増強又は抑制についての例は、以下：望ましくない免疫刺激の指標としてのＴＮＦａ、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、及びＩＬ−１２ｐ７０の増加又は検出、及び所望の好ましい変化の指標としてのＩｌ−１ｒａ、ＣＸＣＬ１３、及びＣＣＬ２２の増加又は検出である。これらのマーカーにおける変化は、当該技術分野において知られており、容易に入手可能である技術及び物質により容易に測定される。
【０１０５】
本発明の特定の実施形態は、種に亘る有効用量の比較を容易にする。ヒトと実験動物、例えば、マウス又はラットにおける有効用量の比較は、体の大きさの違い及び一般的な代謝における違いによるだけでなく、薬物の生物学的利用性が動物種間で異なることが観察されているので困難である。ＲＳＰ組成物の生物学的利用性が、成分ペプチドと血清タンパク質との結合により部分的に補正されることは、本発明の一つの態様であり、それは、長い半減期及び特定の組織分布を許容し得る。従って、本発明のいくつかの実施形態は、対象におけるＲＳＰ組成物の好適な用量を決定する方法であり、そのような方法は、実験動物モデルにおいてＲＳＰ組成物の第一の好適な用量を決定すること、ここで第一の好適な用量は、好ましい読み出しを与え、インビボで血清タンパク質と結合したＲＳＰ組成物のレベルに相当するそのような用量である、及び対象におけるインビボで血清タンパク質と結合したＲＳＰ組成物のレベルが実験動物に第一の好適な用量を投与することにより達成されるレベルと同様又は一致するように、対象に投与することにより対象においてＲＳＰ組成物の第二の好適な用量を決定することを含む。
【０１０６】
特定の実施形態では、ＲＳＰ組成物（例えば、対象において望ましくない免疫反応を治療する又は防ぐために用いられるＹＦＡＫ又はＹＥＡＫ  ＲＳＰペプチドを含む）の投与は、本発明の方法を用いて高められ得る。一つの方法は、好適な用量のＲＳＰ組成物（例えば、ＹＥＡＫ又はＹＦＡＫ  ＲＳＰ組成物を含む）を対象に投与すること、ここで、そのような好適な用量はＲＳＰ組成物の用量を対象に投与することより決定される；実験対象から生体サンプルを取り除くこと；生体サンプルと少なくとも一つの捕捉ポリペプチド（例えば、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｄ、及びプレアルブミンから選択される）を接触させること；生体サンプル中の捕捉ポリペプチドのレベルを測定すること；任意で全ての前述のステップを繰り返すこと、及びそのレベル（単数又は複数）と生体サンプル中のＲＳＰ組成物の所定の好適なレベルとを比較することを含む。好適な用量は、好ましい読み出しに基づいて、上述のように決定される。
【０１０７】
ペプチドは、任意の好適な方法、例えば、蛍光部分を付着させること、放射性標識、化学複合体の形成、ビオチン化、エピトープタグ、又は検出を容易にする任意の他の部分の付与により標識され得る。上述のように検出用ポリペプチドとして作用する血清タンパク質は、固体支持体に付着され得る。血清タンパク質がＲＳＰ組成物からの一つ又は複数のペプチドと結合後、ＲＳＰ組成物と結合した捕捉ポリペプチドを含む結合した複合体は、単離され得る。
【０１０８】
結合複合体を単離するための方法は、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、免疫検出、又は標識捕捉ポリペプチドの検出を含み得る。捕捉ポリペプチドとＲＳＰ組成物との結合の検出は、捕捉ポリペプチドに対する抗体、ＲＳＰ組成物に対する抗体（例えば、抗ＹＦＡＫ又は抗ＹＥＡＫポリクローナル抗体）、又は結合複合体を認識するために生成された抗体を用いて行われ得る。
【０１０９】
ＲＳＰ組成物は、皮下に、筋肉内に、静脈内に、鼻腔内に、又は任意のオリフィス若しくは粘膜を介して投与され得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＹＥＡＫ又はＹＦＡＫペプチドを含むＲＳＰ組成物を検出するための組成物は、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｄ、及びプレアルブミンから選択されるペプチドを含む少なくとも一つの捕捉ポリペプチドを含み得る。
【０１１１】
ＲＳＰ組成物中からの特定のペプチドの選択
本発明の一つの態様は、ＲＳＰ組成物からペプチド又はペプチドのサブセットを同定すること及び単離することにおけるその使用である。もっとも、単一種類又はいくつかの特定のペプチドサンプルと比較したＲＳＰ組成物の一つの有利な特徴は、その不均一性であるが、混合物を構成するペプチドのサブセットが別のサブセットよりもより有効的であること、又はサブセットが実際望ましくないものであることが考えられる。従って、本発明は、ペプチドを特定の捕捉ポリペプチドに対するペプチドの親和性に基づくＲＳＰ組成物を含むサンプルから同定する及び／又は単離するための方法を提供する。特定の例では、サブセットは、一つ又は複数の様々なアミノ酸配列を有するペプチドを含み得る。他の例では、捕捉ポリペプチドは、結合特異性に基づいたＲＳＰ組成物の成分を分類するために用いられ得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、捕捉ポリペプチドと結合するペプチドのサブセットを同定する方法は、プロトコールに従ってＲＳＰ組成物を調製すること、ＲＳＰ組成物と所定の捕捉ポリペプチド（例えば、それはインビボにおいて標的又は担体として望ましい）とを接触させること、ペプチドとＲＳＰ組成物との結合を測定すること、結合しないペプチドから結合するペプチドを識別する特徴を同定すること、及び一つ又は複数の識別する特徴を反映する改良されたＲＳＰ組成物を調製することを含む。
【０１１３】
特定の実施形態では、ＲＳＰ組成物を含むサンプルは、捕捉ポリペプチドと捕捉ポリペプチドと接触され、捕捉ポリペプチドが結合するＲＳＰ組成物を構成するペプチドは、単離され及び同定される。いくつかの実施形態では、ＲＳＰ組成物は、ＹＦＡＫ  ＲＳＰ組成物であり、特定の実施形態では、混合物は、ＰＩ−２３０１である。他の実施形態では、ＲＳＰ組成物は、ＹＥＡＫ  ＲＳＰ組成物であり、特定の実施形態では、混合物は、Ｃｏｐ１である。特定の実施形態では、ＲＳＰ組成物は、捕捉ポリペプチドとして作用する少なくとも一つの血清タンパク質と接触される。より特定の実施形態では、そのような血清タンパク質は、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｄ、及びプレアルブミン捕捉ポリペプチドから選択される。
【０１１４】
捕捉ポリペプチドは、固体支持体に固定化され得、及び／又は当該技術分野において知られている方法により標識され得る。固定化及び標識化は、捕捉ポリペプチドから結合したペプチドを分離する、及び／又は単離されたペプチドの特徴を決定するさらなるステップに用いられ得る。そのような特徴は、結合したペプチドのアミノ酸配列、結合したペプチド中のアミノ酸の相対比率、配列中の荷電した残基の配置又は性質、ペプチドの構造、電荷、又は任意の他の好適な特徴を含み得る。
【０１１５】
ＲＳＰ組成物と血清タンパク質との結合はまた、ＲＳＰ組成物中の生物学的利用可能なペプチド、例えば、対象中のＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含む生物学的利用可能なペプチドを同定するために用いられ得る。本明細書では、ＲＳＰ組成物は、第一に対象に投与され得；その後、投与後第二に、組織サンプルは患者から取り除かれ得る。組織サンプルでは、少なくとも一つの捕捉ポリペプチド、例えば、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｄ、及びプレアルブミンから選択されるペプチドを含む、と結合するサンプル中のペプチドは同定され得る。
【０１１６】
ＲＳＰ組成物の改良された調製
本発明の別の態様は、ＲＳＰ組成物を含む組成物の製造プロセスを改良する方法である。いくつかの実施形態では、ＲＳＰ組成物は、捕捉ポリペプチドと結合するペプチドのサブセットを同定する前述の方法に基づいて設計される。いくつかの実施形態では、ＲＳＰ組成物は、アミノ酸組成物及び／又はアミノ酸配列が捕捉ポリペプチドと結合するペプチドのサブセットのそれと近くなるように、設計される。
【０１１７】
特定の実施形態では、減少した毒性を有するＲＳＰ組成物（例えば、ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含む）を製造する方法は、ＲＳＰ組成物と少なくとも一つの捕捉ポリペプチド（例えば、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｄ、及びプレアルブミンから選択されるペプチドを含む）とを接触させること；混合物から捕捉ペプチドに結合するペプチドを分離すること；分離されたペプチドの特徴を決定すること；及び分離されたペプチドの特徴を用いてペプチドのセットを調製することを含み得る。
【０１１８】
同様に、増大した有効性を有するＲＳＰ組成物（例えば、ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含む）を製造する方法は、ＲＳＰ組成物と、ペプチドを含む少なくとも一つの捕捉ポリペプチド（例えば、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｄ、及びプレアルブミンから選択される）を接触させること；及び混合物から捕捉ペプチドに結合するペプチドを分離すること；分離されたペプチドの特徴を決定すること；及び分離されたペプチドの特徴を用いてペプチドのセットを調製することを含み得る。
【０１１９】
いつかの実施形態では、ＲＳＰ組成物の所望のサブセットは、予備的スケールにおいて固定化された捕捉ポリペプチドを用いることにより得られ得る。ＲＳＰ組成物は、事前に熟考、及びは記述されたように調製され、所望の改良に関連する固定化された捕捉ポリペプチドと接触される。未結合のペプチドは、サンプルを洗浄することにより取り除かれ、ＲＳＰ組成物の結合した部分は、適切な分離条件、例えば変化させたｐＨ、塩濃度、又は有機溶媒の添加、を用いて溶出される。プールされた結合した部分は、濃縮するために、及び蒸発により、又は適切なクロマトグラフィー又は結晶化又は他の精製方法を経たさらなる精製により、治療的に望ましくない成分、例えば、有機溶媒を取り除くために処理される。そのようにして調製されたＲＳＰ組成物のサブセットは、治療薬剤として用いられる。
【０１２０】
さらに、本発明のこの態様は、用量及び投与における上述の改良と組み合わされ得る。優れた適合したＲＳＰ組成物が調製された場合、投与の用量及び方法は、適宜調節され得ることが予期される。従って、代わりの実施形態では、本発明は、プロトコールに従ってＲＳＰ組成物を調製すること、ＲＳＰ組成物を含む組成物を製剤化すること、機能的読み出しのレベル又は程度を検出することにより前記組成物中のＲＳＰ組成物の生物学的利用可能な量を決定すること、標準とそのような読み出しを比較すること、所望の生物学的利用性を得るためにプロトコール又は組成物の製剤化を調節することを含む。
【０１２１】
治療薬剤の組織特異的標的化
ＲＳＰ組成物と血清タンパク質の関係性の別の可能性のある使用は、治療薬剤の組織特異的標的化である。一つの実施形態では、対象の標的組織に対する治療薬剤を調製するための方法は、ＲＳＰ組成物（例えば、ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含む）を提供すること；及び治療薬剤とＲＳＰ組成物とを結合させ、複合体を形成することを含み得る。
【０１２２】
従って、本発明のいくつかの実施形態は、ＲＳＰ組成物（例えば、ＹＦＡＫ又はＹＥＡＫペプチドを含む）と組織特異的ペプチド（例えば、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｄ、及びプレアルブミンから選択されるペプチドを含む）とを接触させること；及び混合物から組織特異的ペプチドに結合するペプチドを分離すること；ペプチドタグと治療薬剤とを結合させること；及び（ｃ）対象に複合体を投与することにより、ペプチドタグを単離することにより、対象において特定の組織に治療薬剤を送達する方法である。
【０１２３】
本発明の他の実施形態は、ペプチドタグと結合した治療薬剤を含む複合体、及び得られた複合体それら自体を調製する方法を含む。本明細書で熟考されるペプチドタグは、例えば、ＹＥＡＫ又はＹＦＡＫペプチドでもよい。そのようなペプチドは、アルファ−１−抗トリプシン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アルファ−１−Ｂ−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アポリポタンパク質Ｄ、及びプレアルブミンに対する結合親和性に基づいてＲＳＰ組成物から単離され得る。
【０１２４】
治療薬剤は、小有機分子又は生体高分子でもよく、特異的な組織は、脳、肺又は肝臓組織でもよい。ペプチドタグは、ＹＥＡＫ又はＹＦＡＫペプチドを含んでもよい。ペプチドタグは、共有結合、包接錯体、イオン結合、又は水素結合により治療薬剤と結合し得る。この発明の実施に有用な治療薬剤の例は、代謝拮抗物質、サイトカイン、及び増殖因子阻害剤、キナーゼ阻害剤、血管新生阻害剤、抗炎症剤、疾患特異的抗体、ワクチン、及び抗生物質を含む抗腫瘍剤である。
【０１２５】
標準的な免疫学、生化学、及び／又は分子生物学的方法は、本明細書で用いられ得、当該技術分野において知られている。標準的なプロトコールの例は、例えば、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓにより公開されているＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓシリーズに見ることができ、現在入手可能な全ては更新され、分子生物学、免疫学、細胞生物学、タンパク質化学、薬理学等におけるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを含む。本明細書で引用される全ての参考文献、及び特許、及び特許出願は、それらの全体において参照により援用される。
【実施例】
【０１２６】
実施例１
正常ヒト血清中のＰＩ−２３０１及びＣｏｐ−１の検出
ＲＳＰ組成物であるＰＩ−２３０１（ＹＦＡＫ）又はＣｏｐ−１（ＹＥＡＫ）は、５００ｎｇ／ｍＬの濃度にされ、ＰＢＳ中５％正常ヒト血清に、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、又は１２．５ｎｇ／ｍＬの濃度まで希釈され、正常ヒト血清に添加された。ＲＳＰ組成物と正常ヒト血清に含まれる血清タンパク質との結合は、ウサギ抗ＹＦＡＫ又はウサギ抗ＹＥＡＫ抗体の添加により検出された。
【０１２７】
未コートのＥＬＩＳＡプレートは、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で、室温で２時間ブロックされた。ＰＩ−２３０１又はＣｏｐ−１サンプルは、ＰＢＳ／５％正常ヒト血清で段階的に希釈され、ブロック及び洗浄されたＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加された。正常ヒト血清中のＰＩ−２３０１又はＣｏｐ−１サンプルはプレートに結合され、未結合のＰＩ−２３０１又はＣｏｐ−１は、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを洗浄することにより取り除かれた。力価に基づいて好適な濃度に希釈されたタンパク質Ａ−精製された抗ウサギ抗ＰＩ−２３０１、又は抗ウサギ抗Ｃｏｐ−１は、室温で１時間添加された。未結合のウサギ抗２３０１、又はウサギ抗Ｃｏｐ−１抗体を取り除くための別の洗浄ステップ後、二次抗体であるヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ウサギＩｇＧに対するセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗体）はウェルに添加される。任意の未結合の二次抗体を洗い流した後、ＨＲＰの基質は、ウェルに添加され、１５分間インキュベートされ、それはストップ溶液が添加されると黄色に変化する青色を生じ、その色の強度はウェル中の全ＰＩ−２３０１又はＣｏｐ−１の量と相関する。光学濃度は、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで測定され、力価曲線は、それぞれＰＩ−２３０１及びＣｏｐ−１が添加された血清サンプルのそれぞれのセットについて生成された。血清ＰＩ−２３０１又は血清Ｃｏｐ−１検出の限界は、バックグラウンドよりも３倍高いＡ４５０ｎｍ吸収をもたらす濃度として画定される。バックグラウンドを決定するために用いられたＥＬＩＳＡプレートウェルは、ＲＳＰ組成物からのペプチドが除かれたことを除いて、上述のように処理される。
【０１２８】
結果は図２にプロットされる。Ｘ軸上で、ＲＳＰ組成物の濃度が示される。Ｙ軸上で、ＨＲＰ結合二次抗体のＡ４５０比色吸収が示される。ＲＳＰ組成物の高い濃度において、抗ＰＩ−２３０１又は抗Ｃｏｐ−１抗体による複合体の検出は、低い濃度のＲＳＰ組成物よりも高かった。１２．５ｎｇ／ｍＬは、ヒト患者における約２ｍｇの用量に相当する。
【０１２９】
実施例２
カラム上での複合体の捕捉
固定化されたＲＳＰ組成物は、ペプチドとＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）である、臭化シアン法を用いて１級アミンを含むリガンド（タンパク質、ペプチド、核酸）を固定化するために用いられる事前に活性化された大孔性クロマトグラフィーメディアとを反応させることにより調製された。手短に言えば、所望の量を検量後、凍結乾燥されたＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）は、冷却された１ｍＭ  ＨＣＩ（約２００ｍＬ  １ｍＭ  ＨＣＩ／グラム乾燥セファロースを使用）で、１０Ｘ１５分、その後、結合バッファーで２Ｘ洗浄された。リガンドは、所望の濃度まで結合バッファーに溶解され、１：２の比（２容量の洗浄されたＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ゲルに対して１容量のリガンドを使用）でＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）と合わされ、その後、ロッキングプラットフォーム（ｒｏｃｋｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で、４℃で一晩インキュベートされた。ゲル上の任意の残っている活性部位は、ブロックされ、その後、任意の過剰のリガンドを取り除くために洗浄された。リガンド特異的タンパク質を精製するために、結合したゲルは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２Ｘ洗浄され、所望の試薬（血清、細胞上清）は、１：２の比（２容量の洗浄されたＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ゲルに対して１容量の試薬を使用）で添加され、その後、ロッキングプラットフォーム（ｒｏｃｋｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で、４℃で一晩インキュベートされた。ゲル／試薬懸濁液は、使い捨てカラムに充填され、未結合の試薬を取り除くために洗浄され、その後、リガンド特異的タンパク質は低ｐＨバッファーで溶出された。ｐＨ中和後、溶出した画分の２８０ｎｍでの吸収は、リガンドを含む画分を同定するために測定される。カラムは洗浄され、繰り返しの使用のために４℃で保管された。
【０１３０】
実施例３
ＰＩ−２３０１又はＣｏｐ−１に結合したタンパク質の同定
ＰＩ−２３０１結合タンパク質、又はＣｏｐ−１結合タンパク質を含むサンプルは、実施例１又は実施例２の方法により得られた。これらのサンプルは、ＰＩ−２３０１又はＣｏｐ−１に結合するタンパク質を同定する目的のために、酵素的に消化され、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により分析された。手短に言えば、それぞれのサンプルの一定量は、配列特異的プロテアーゼであるトリプシンで消化された。消化後、タンパク質ペプチド混合物は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析された。ペプチドは、放出相カラムに対するそれらの保持時間に基づいて分離され、その後質量分析計にスプレーされた。ペプチドが＋２又は＋３の電荷を受け取るスプレープロセスの間、質量分析計は質量電荷比を観察する。ペプチドが有意な質量電荷比を有する場合、それは従って、気体との衝突によりフラグメント化され、フラグメントパターンは記録される。これらのフラグメントパターンは、その後、全ての既知のタンパク質の理論的なフラグメントパターンと比較され得る。理論的フラグメントパターンへの実験的フラグメントパターンのこの成形は、ＨＤＬ及びＬＤＬ複合体からいくつかのリポタンパク質の同定をもたらした。これらのリポタンパク質は、ＰＩ−２３０１サンプル及びＣｏｐ−１サンプルの双方において見られた。Ｃｏｐ−１サンプルはまた、補体タンパク質、例えば、Ｃ３及びＣ４Ａを含むいくつかの独特のタンパク質を有した。
【０１３１】
図３は、ＰＩ−２３０１又はＣｏｐ−１と結合することにより同定された正常マウス血清又は正常ヒト血清中の血清タンパク質を要約する。ＰＩ−２３０１は、アセチル化又は非アセチル化され得る。サンプルタンパク質は、実施例１のものと同様の方法において得られ、ここでＲＳＰ組成物のペプチドが混合され、血清中の成分と結合された。ＰＩ−２３０１又はＣｏｐ−１の結合複合体は、抗ＹＦＡＫ又は抗ＹＥＡＫ抗体により認識され、二次抗体及び検出試薬で検出された。血清タンパク質は、複合体から溶出され、同定された。タンパク質は、検出試薬のＡ４５０吸収に基づいたスコアを割り当てられる。７０のスコアは、バックグラウンド吸収と比較して、ｐ＜０．００１の有意な値に対応し、統計学的に有意であると考えられる。
【０１３２】
実施例４
ＲＳＰ組成物の様々な長さ及びロットに亘るペプチド組成物の比較
例えば、固相合成又は液相合成による、様々な長さのＲＳＰ組成物の合成に続いて、同様の製造プロセスにより作られた個別のロット又はバッチ、及び様々なプロセスにより製造された混合物の個別のバッチは、試験され、バイオアッセイ、例えば、単球細胞株ＲＡＷ２６４．７による、エクスビボ増殖アッセイによる、及び血清タンパク質とＲＳＰ組成物中のペプチドとの結合を測定することによるＣＣＬ２２の放出、を用いたバリエーションと比較され、ペプチドのサブセット又は任意の所定のプロセス若しくはロットにおいて存在する個別のペプチドを決定することが可能である。ＲＳＰ組成物のプロセス及びロットは、ペプチドの同様のサブセット及び／又はペプチドの種類が様々なプロセス及びロットに亘って一貫して繰り返されているかどうかを決定するために比較される。
【０１３３】
多数の同定するレジンは、固体支持体上に血清タンパク質の選択物を固定化することにより調製される。Ｃｏｐ−１又はＰＩ−２３０１の分析のために、血清タンパク質は、Ｃｏｐ−１又はＰＩ−２３０１のそれぞれと結合するとして実施例１（図３を参照のこと）において同定された一つ又は複数のこれらのタンパク質でもよい。Ｃｏｐ−１又はＰＩ−２３０１と結合するとしてさらに同定された他のタンパク質は、必要に応じて用いられ得る。それぞれの固体支持体は、少なくとも一つの血清タンパク質を含み、一以上の血清タンパク質が固体支持体に結合した場合、従って、所定の固体支持体と結合した個別の血清タンパク質の割合は、それぞれの同定するレジンに亘って一致する。Ｃｏｐ−１又はＰＩ−２３０１のそれぞれのロットからの一定量は、Ｃｏｐ−１ペプチド又はＰＩ−２３０１のサブセットと血清タンパク質とを結合させる条件下で、その自らの固体支持体に適用される。未結合ペプチドを洗い流した後、結合ペプチドは溶出される。この方法で単離されたＣｏｐ−１ペプチドは、（１）独特なＣｏｐ−１ペプチドの存在、（２）互いに対するペプチドの割合、（３）全ＲＳＰ組成物と比較した血清結合タンパク質と結合するペプチドの割合、（４）結合モチーフ及びペプチド配列の存在、（５）アミノ酸組成、及びアミノ酸の割合、及び／又はペプチドの他の特徴について、さらに特徴付けられる。それぞれのロットから単離されたＣｏｐ−１ペプチドの特徴は、互いに比較される。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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