(57)【要約】  結核菌の薬剤感受性試験法と、その試験法におけるインディケータの利用法と、その試験法で使用される固体培地並びに定温加熱器及び培養ボックスとが提供される。この結核菌の薬剤感受性試験法は、提供された検体を前処理し、濃縮培養を実施するために液体培地を加え、液状の固体培地を作製するために固体培地を加熱して溶解させ、濃縮培養後にその検体を液状の固体培地と混合し、冷却して固化し、薬剤感受性紙片と共に固体薬剤感受性試験検体を作製し、それを５日間から１５日間培養し、インディケータを使用して薬剤抑制リングを観察することで薬剤感受性を判定するものである。この方法は安価で迅速であり、結核菌の薬剤感受性試験を安全に、且つ高コスト効果な形態で行わせる。
2013526874.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）濃縮された検体を取得するために標的検体を前処理するステップと、
ｂ）液体培養検体を取得するために前記濃縮された検体に液体培地を加え、濃縮培養を０から７日間実施するステップと、
ｃ）液化した固体培地を取得するために固体培地を加熱して溶解させ、該液化した固体培地の温度を、前記液体培養検体の対応する培養温度または室温にまで低下させるステップであって、前記固体培地は融点が５０℃から９５℃であり、固化温度が２５℃から４５℃であり、該固体培地は寒天またはアガロースと栄養素とを含んでいる、温度低下ステップと、
ｄ）薬剤感受性試験のための液体検体を取得するために前記液体培養検体を前記液化した固体培地と混合するステップと、
ｅ）薬剤感受性紙片を使用した薬剤感受性試験のための固体検体が作製されるよう、薬剤感受性試験のために前記液体検体を固化させるステップと、
ｆ）薬剤感受性試験のために前記固体検体を５日間から１５日間培養するステップと、
ｇ）インディケータの表示を通して薬剤抑制領域を観察し、結核菌の薬剤感受性を判定するステップと、
を含む、結核菌の薬剤感受性試験法。
【請求項２】
前記インディケータは、結核菌の増殖インディケータであるか、または生化学反応インディケータであることを特徴とする請求項１記載の試験法。
【請求項３】
前記インディケータは、亜テルル酸塩、亜テルル酸塩と尿素との混合物、尿素、ＭＴＴ、ＸＴＴ、あるいはアラマール・ブルーを含んだものであることを特徴とする請求項２記載の試験法。
【請求項４】
薬剤感受性試験のための前記固体検体の５日間から１５日間の培養後に、前記インディケータとしての前記亜テルル酸塩が前記固体薬剤感受性試験検体内に滴下されることを特徴とする請求項３記載の試験法。
【請求項５】
亜テルル酸塩を除いた前記インディケータが、前記液体培地または前記固体培地に加えられることを特徴とする請求項２から４のいずれかに記載の試験法。
【請求項６】
請求項１記載の結核菌の薬剤感受性試験法のためのインディケータの利用法であって、該インディケータは亜テルル酸塩または亜テルル酸塩と尿素との混合物であり、薬剤感受性試験のための固体検体の５日間から１５日間の培養後に、薬剤感受性試験のため、前記インディケータとしての亜テルル酸塩が固体検体内に滴下され、尿素が液体培地または固体培地に加えられることを特徴とする利用法。
【請求項７】
前記亜テルル酸塩は亜テルル酸ナトリウムまたは亜テルル酸カリウムを含んでいることを特徴とする請求項６記載の利用法。
【請求項８】
請求項１記載の結核菌の薬剤感受性試験法のための固体培地であって、該固体培地の各部分量は、５０ｍＬから１００ｍＬの卵黄液、２ｇから８ｇの溶解性スターチ、０．１ｇから０．８ｇのＬ−カゼイン、２ｍＬから８ｍＬのフェノールレッド、０．５ｇから３．５ｇの寒天またはアガロース、および適量の静菌剤を含んでいることを特徴とする固体培地。
【請求項９】
前記固体培地の各部分量に０．１ｇから０．５ｇの尿素が加えられることを特徴とする請求項８記載の固体培地。
【請求項１０】
請求項１記載の結核菌の薬剤感受性試験法のための、請求項８または９記載の固体培地の利用法であって、薬剤感受性試験のための液体検体内の固体培地と液体培地との混合比は、該固体培地の部分量を該液体培地１００ｍＬごとに加える比率であることを特徴とする固体培地利用法。
【請求項１１】
請求項１記載の結核菌の薬剤感受性試験法のための加熱サーモスタット装置であって、導熱ブロック（４）と、電熱装置（９）と、温度調節装置とを含んでおり、高温領域および定温領域が前記導熱ブロック（４）に設けられ、高温カップ（６）を保持する第一孔部が前記高温領域に形成され、定温カップ（８）を保持する第二孔部が前記定温領域に形成されることを特徴とする加熱サーモスタット装置。
【請求項１２】
本加熱サーモスタット装置の前記定温領域には定温均衡領域と混合領域とが設けられ、定温カップ（８）を保持する前記第二孔部は該定温均衡領域に形成され、混合カップ（３）を保持する第三孔部が前記混合領域に形成されることを特徴とする請求項１１記載の加熱サーモスタット装置。
【請求項１３】
反転プレート（２）の保持溝部が本加熱サーモスタット装置の前記混合領域に形成されることを特徴とする請求項１２記載の加熱サーモスタット装置。
【請求項１４】
請求項１記載の結核菌の薬剤感受性試験法のための培養ボックスであって、閉鎖周壁部、閉鎖底部および開放上端部を備えたボックス体（１０）を含んでおり、該ボックス体（１０）の前記底部には定規（１２）が設けられており、該ボックス体（１０）の前記底部の上面には薬剤感受性紙片（１１）が貼付されることを特徴とする培養ボックス。
【請求項１５】
前記ボックス体（１０）の前記底部の上面には６枚の薬剤感受性紙片（１１）が貼付されることを特徴とする請求項１４記載の培養ボックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は結核菌の薬剤耐性を試験する実験医学分野に関し、特には、結核菌の薬剤感受性試験法、結核菌の薬剤感受性試験法で使用されるインディケータの利用法、並びに結核菌の薬剤感受性試験法のための固体培地、加熱サーモスタット装置、および培養ボックスに関する。
【背景技術】
【０００２】
結核の薬剤耐性は、現在進行している公衆保健の問題であり、結核の抑制に対する重大な脅威である。中国技術アカデミー会員であるゾン・ナンシャンによれば、中国には活動性結核患者が約４５０万人存在する。保菌者数は５億５千万人ほども存在し、保菌者の人生における発症率は１０％程度と推測されている。２００９年、中国保健省大臣チェン・ジュウは、北京市で開催された「多剤耐性ＴＢおよび強薬剤耐性ＴＢの危惧国」をテーマとした閣僚会議にて中国における薬剤耐性結核の事例を報告した。中国疾病抑制及び予防センターのサンプル調査によれば、中国の結核患者における多剤耐性ＴＢの割合が８．３２％であり、多剤耐性ＴＢの全患者数は約１２万人であり、その数は世界第２位であり、強薬剤耐性ＴＢの割合は０．６８％であり、強薬剤耐性ＴＢの全患者数は約１万人であり、その被害はＡＩＤＳを遥かに凌ぐ。薬剤感受性試験は結核菌の薬剤耐性検出のために重要である。結核菌の薬剤感受性を試験する従来の方法には、一般的に紙片試験法および濃縮試験法が含まれる。この紙片試験法は、固体培地の表面に接着された薬剤含浸紙片の表面に形成された薬剤抑制領域を観察することによって薬剤に対する結核菌の感受性を判定するために利用される。この濃縮試験法は、異なる薬剤と異なる薬剤濃度に従って作製された試験容器内での結核菌の増殖状態を観察および検出することで薬剤に対する結核菌の感受性を判定するために利用される。紙片試験法と濃縮試験法の両方において、薬剤感受性試験プロセス全般には一般的に３つの段階が含まれる。すなわち検体前処理、増殖あるいは分離培養、および薬剤感受性試験である。従来の紙片試験法では、サンプル前処理の段階は以下のステップを含んでいる。
【０００３】
１．吸引管を通して試験容器内に検体を投入する。
２．試験容器内に消化液を加え、検体の粘液を消化させ、検体の粘液および不純物に被膜された細菌を完全に露出させる。
３．遠心分離後、濃縮された検体を得るために上澄み液を廃棄し、濃縮された検体が得られた後に増殖培養または分離培養を実施する。
【０００４】
増殖培養または分離培養の段階は以下のステップを含む。
【０００５】
４．少数の濃縮された検体を一つの強細菌液に作製するステップ。
５．その強細菌液を固体培地に接種、例えば、Ｌ−Ｊ培地の表面で増殖培養または分離培養し、通常では、強細菌液を培養器内で１ヶ月間、３７℃の温度で培養し、続いて、個別の細菌を細菌コロニーに培養し、細菌コロニーが得られた後に薬剤感受性試験の段階に入るステップ。
【０００６】
薬剤感受性試験の段階は以下のステップを含む。
【０００７】
６．少量の細菌コロニー（一般的には１から３の細菌コロニー）を使用し、細菌コロニーを溶解および分散させて強細菌液を得るステップ。
７．強細菌液を固体培地に接種、例えば、寒天培地の表面に接種するステップ。
８．薬剤含浸紙片を固体培地の表面に貼付するステップ。
９．強細菌液を約１ヶ月間、３７℃の培養器内で培養し、続いて、薬剤に対する結核菌の感受性を判定するために薬剤抑制領域を観察するステップ。
【０００８】
従来の薬剤紙片試験法は、運用が簡単であり、装置が単純であり、投資費用が安価であるという利点を有する。しかし、次の弱点も有する。（１）試験全体に要する時間が長すぎる。増殖培養または分離培養の段階には約１ヶ月を要し、薬剤感受性試験の段階には約１ヶ月を要し、試験全体には約２ヶ月を要する。もし薬剤感受性試験後に薬剤治療が施されるなら、その治療時間に深刻な影響が及ぶ。臨床薬剤感受性試験が介在しない条件下で採用される薬剤治療は不都合な影響を引き起こす可能性がある。まず、深刻な結核菌の薬剤耐性が引き起こされる可能性がある。続いて、薬剤耐性結核菌による症状を患う結核患者に対する良好な治療効果の達成が困難になる。（２）運用は安全性に欠ける。人工接種は試験全体で２度実施される。結核菌は感染性であるため、安全上の問題が運用者に発生する虞があり、環境汚染の危険性も無視できない。
【０００９】
従来の濃縮試験法では、固体培地は増殖培養の段階で採用される。検体の前処理および増殖培養または分離培養の２段階のステップは、従来の試験片試験法と同一ではあるが、薬剤感受性試験の段階のステップは従来の試験片試験法のものとは異なる。特に、固体培地から増殖培養または分離培養を介して得られた１以上の細菌コロニーを利用し、細菌縣濁液を得るためにその細菌コロニーを溶解および分散させ、比較試験検体を作製するために、異なる薬剤および異なる濃度に従って作製された複数の試験容器内に細菌縣濁液を投入し、薬剤に対する結核菌の感受性を判定するために、試験容器内の結核菌の増殖状態を観察して検出することが異なる。濃縮試験法は単純な装置で投資費用が安価であるという利点を有するが、次の弱点も有する。（１）所要時間が長すぎる。なぜなら、増殖培養または分離培養の方法および段階のステップは、従来の紙片試験法の場合と同一であり、増殖培養または分離培養の段階でのみ必要とされる時間は約１ヶ月である。（２）運用は煩雑で安全性に欠け、間違った試験結果が導かれる可能性が高い。複数の試験容器が作製される必要があり、その設置プロセスは複雑で安全性に欠け、作業員に危険が及ぶ可能性があり、環境汚染の可能性も排除できない。試験容器は設置中に他の細菌によって容易に汚染される可能性が高いため、間違った試験結果が発生し易い。
【００１０】
加えて、機器を使用した薬剤感受性特定法も開示されている。例えば、ＢＡＣＴＥＣ−ＴＢ４６０システムやＢＡＣＴＥＣ９６０システムが利用されている。この方法は試験プロセスの簡単な運用および短時間であることの利点を有する。その平均検出時間は１４．４日であり、最短では約１０日である。この方法の主たる弱点は次のようなものである。使用機器の価格が高く、高投資費用が必要であり、活用コストが高い。まず、機器の利用コストが高い。次に、複数の比較試験用検体が必要であるため、試薬のコストが高くなる。これら高額費用は普通の病院では賄えず、よって、この方法は容易に一般化しない。
【００１１】
結核菌の薬剤感受性を試験する従来方法の詳細な分析により、従来の紙片試験法および濃縮試験法は次の弱点を有することが判明している。１．試験プロセス全体には長時間が必要であり、２．運用が複雑であり、３．運用の安全性に問題があり、４．検出誤差が容易に発生する。機器を使用した薬剤感受性特定法は、初期投資が高額となり、利用コストが高いため、一般化が困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の１目的は、初期投資が安価で、低利用コストであり、安全で、利用が簡単な結核菌の薬剤感受性の試験法、インディケータの利用法、並びに固体培地の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の上記目的を達成するため、結核菌の薬剤感受性試験法は以下のステップを含む。
【００１４】
（１）濃縮検体を得るために標的検体を前処理するステップ。
（２）その濃縮検体に液体培地を加えて液体培養検体を作製し、濃縮された培養処理を０日から７日間実施するステップ。
（３）固体培地を過熱して溶解させ、液化した固体培地を作製し、液化した固体培地の温度を、液体培養検体の対応する培養温度あるいは室温にまで低下させるステップ。固体培地は融点が５０℃から９５℃であり、固化温度は２５℃から４５℃であり、固体培地は寒天またはアガロースと栄養素を含んでいる。
（４）液体培養検体を液化した固体培地と混合し、薬剤感受性試験用の液体検体を入手するステップ。
（５）薬剤感受性の試験のために液体検体を固化し、薬剤感受性試験用紙片により薬剤感受性を試験するための固体検体を作製するステップ。
（６）５日間から１５日間、薬剤感受性試験のために固体検体を培養するステップ。
（７）インディケータの表示内容を通じて薬剤抑制領域を観察し、結核菌の薬剤感受性を判定するステップ。
【００１５】
結核菌の薬剤感受性の試験法において、インディケータは、結核菌の増殖を示すインディケータあるいは生化学反応インディケータである。
【００１６】
結核菌の薬剤感受性の試験法で使用するインディケータは亜テルル酸塩、亜テルル酸塩と尿素との混合物、尿素、ＭＴＴ、ＸＴＴあるいはアラマール・ブルーを含んで成る。
【００１７】
結核菌の薬剤感受性の試験法においては、薬剤感受性試験用の固体検体の５日間から１５日間の培養後に、インディケータである亜テルル酸塩が固体薬剤感受性試験検体内に滴下される。
【００１８】
結核菌の薬剤感受性の試験法においては、亜テルル酸塩以外のインディケータ成分が液体培地または固体培地に加えられる。
【００１９】
ステップ（３）において、液化された固体培地が作製された後に、その温度を液体培地検体の対応培養温度または室温にまで降下させると、液化した固体培地の温度は、液体培養検体の濃縮された培養条件下で液体培養検体と同じ温度か類似した温度にまで低下される。もし、濃縮培養が実行されなければ、その温度は室温にまで低下されるが、それでも固体培地は液状で存在する。
【００２０】
本発明は、結核菌の薬剤感受性試験法のためのインディケータ利用法を提供する。このインディケータは亜テルル酸塩あるいは亜テルル酸塩と尿素との混合物であり、インディケータの亜テルル酸塩が薬剤感受性試験のために固体検体に滴下される状態にて、５日間から１５日間の薬剤感受性試験のための固体検体培養後に、尿素は液体培地または固体培地に加えられる。
【００２１】
亜テルル酸塩は亜テルル酸ナトリウムまたは亜テルル酸カリウムを含む。
【００２２】
液体薬剤感受性試験検体内の固体培地と液体培地との間の混合比率は、液体培地１００ｍＬごとに固体培地の一部分量を加えている。固体培地の各部分量は、５０ｍＬから１００ｍＬの卵黄液、２ｇから８ｇの溶解性スターチ、０．１ｇから０．８ｇのＬ−カゼイン、２ｍＬから８ｍＬのフェノールレッド、０．５ｇから３．５ｇの寒天またはアガロース、および適量の静菌剤を含んで成る。
【００２３】
尿素は固体培地に加えることができる。すなわち、０．１ｇから０．５ｇの尿素が固体培地の各部分量に加えられる。
【００２４】
固体培地は分封され、一度の使用量に応じて密封される。
【００２５】
本発明の液体培地は、結核菌に対する濃縮効果を備えた従来培地であり、例えば、７Ｈ９と称される培地である。
【００２６】
結核菌の薬剤感受性試験法のための加熱サーモスタット装置は、導熱ブロックと、電熱装置と、温度制御装置とを含み、高温領域と定温領域が導熱ブロック内に設定され、高温カップを保持する第一孔部が高温領域に形成されており、定温カップを保持する第二孔部が定温領域内に形成されている。
【００２７】
定温均衡領域と混合領域が、加熱サーモスタット装置の定温領域内にそれぞれ設けられている。定温カップを保持する第二孔部が定温均衡領域内に形成されており、混合カップを保持する第三孔部が混合領域内に形成されている。
【００２８】
反転プレートの保持溝部は加熱サーモスタット装置の混合領域に形成されている。
【００２９】
結核菌の薬剤感受性試験法のための培養ボックスは、閉鎖周壁部、閉鎖底部および開放上端部を備えたボックス体を含む。このボックス体の底部には定規が配置されており、薬剤感受性紙片がボックス体の底部の上面に貼付される。
【００３０】
この培養ボックスでは、６枚の薬剤感受性紙片がボックス体の底部の上面に貼付される。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の薬剤感受性試験法は、従来の紙片試験法および濃度試験法と比較される。試験プロセス全体に要する時間の短さの理由は以下の通りである。
【００３２】
１．提供される検体の試験用結核菌の完全利用。提供される検体の濃縮された結核菌のほとんどが薬剤感受性試験のために使用され、検体の試験対象結核菌は完全に利用される。薬剤感受性試験における当初細菌は多量であり、濃縮培養の時間は減少するため、試験時間全体が短縮される。
【００３３】
２．濃縮培養の段階の時間短縮。本発明の濃縮培養は液体培地で実施されるため、比較的には、液体培地での細菌の増殖率は固体培地での細菌の増殖率よりも大きい。従って、提供される検体の試験対象結核菌は完全に利用され、濃縮培養以前の当初細菌は多量であるため、増殖培養の段階の時間は短く、せいぜい７日間である。結核患者の状態に関する検出結果が＋＋＋＋であるときには、薬剤感受性試験検体で使用される大量の結核菌が提供され、薬剤感受性試験中の増殖培養が省略できる。
【００３４】
３．薬剤感受性試験段階の時間短縮。増殖培養後の液体培養検体は、本発明の液化された固体培地と混合され、薬剤感受性紙片が提供される固体薬剤感受性試験検体が傾斜注入プロセスにより作製され、増殖培養後の全結核菌が薬剤感受性試験に使用されるため、薬剤感受性試験での当初細菌は多量となり、薬剤抑制領域はさらに容易に形成され、その抑制領域はインディケータの表示作用のもとで視覚的に検査可能になり、薬剤感受性試験の段階にはたった５日間から１５日間を要するだけであり、従来の紙片試験法と比較して必要な時間はさらに短くなっている。
【００３５】
４．迅速色彩インディケータの利用。亜テルル酸塩が本発明のインディケータとして使用されるので、発明者による反復試行を介して、固体薬剤感受性試験検体に形成される細菌コロニーは、２時間から４８時間以内に黒色または暗灰色となることが証明されている。
【００３６】
５．従来インディケータの利用。尿素が本発明の固体培地に加えられ、結核菌は尿素の分解のためのウレアーゼをさらに発生させ、薬剤感受性試験検体はピンク色から淡黄色となり、固体薬剤感受性試験検体の結核菌の増殖状態が、固体薬剤感受性試験検体の色彩を観察することで薬剤感受性試験の段階にて予備的に判断される。固体薬剤感受性試験検体がピンク色または淡黄色であるときには、固体薬剤感受性試験検体の結核菌数が、抑制領域の形成に必要な数量に到達していることが示され、明白な抑制領域が、亜テルル酸塩インディケータの滴下後２時間から４８時間以内に形成可能であり、薬剤感受性試験の段階の時間が短縮できる。発明者による反復試行により、本発明の結核菌薬剤感受性試験法が採用されると、平均検出時間は約１０日間となる。結論すると、従来の紙片試験法や濃度試験法と比べて、本発明の薬剤感受性試験法は試験プロセスにおける時間短縮目標を達成する。
【００３７】
この薬剤感受性試験法は投資額が少なく、利用コストが低い理由は、本発明の実施に必要な装置が、遠心分離装置、培養器、加熱サーモスタット装置、等々のみを必要とするからである。これら遠心分離装置、培養器、加熱サーモスタット装置は製造が容易であり、製造コストが安価であるため、試験全体を完了するのに必要な装置への投資額が少なく、使い捨ての試験容器、並びに培地、インディケータおよび他の試薬は数が少なくて安価であり、それらは本発明を適した形態で実施するのに使用され、本発明の機器の費用が安くて利用コストも低いため、本発明の利用コストはさらに引き下げが可能である。従って、機器を使用した薬剤感受性特定法と比べて、この薬剤感受性試験法は、装置が安価で低利用費用である目的を効果的に達成する。
【００３８】
この薬剤感受性試験法が安全で利用に便利である理由は、試験される検体の濃縮と、結果の解釈が使い捨て閉鎖容器内で可能であり、他の機器が汚染されず、統一された殺菌処理が運用完了後に実行され、試験プロセス中の人手による運行処理がほとんど存在せず、簡単であり、作業員と環境に対する結核菌の影響が低減され、試験の生物学的安全性が大きく増強され、他の細菌による汚染の可能性が低下し、間違った試験結果が効果的に減少されることである。従って、従来の紙片試験法および濃度試験法と比較して、薬剤感受性試験法は安全性と便利性の目的を効果的に達成する。
【００３９】
以下の図面および実施例は、結核菌の薬剤感受性の試験法、インディケータの利用法および本発明の固体培地の利用のさらなる説明に供することを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の加熱サーモスタット装置の平面図である。
【図２】図１で示される加熱サーモスタット装置のＡ−Ａ線に沿った断面図である。
【図３】ボックスカバーが外されている状態の本発明の培養ボックスの平面図である。
【図４】図３で示す培養ボックスの断面図である。
【符号の説明】
【００４１】
外殻体（１）、反転プレートの保持溝部（２）、混合カップを保持する第三孔部（３）、導熱ブロック（４）、断熱壁部（５）、高温カップを保持する第一孔部（６）、制御パネル（７）、定温カップを保持する第二孔部（８）、電熱装置（９）、ボックス体（１０）、薬剤感受性紙片（１１）、定規（１２）、ボックスカバー（１３）
【発明を実施するための形態】
【００４２】
加熱サーモスタット装置は図１と図２で示す。導熱ブロック４は外殻体１の上に設置されており、高温領域と定温領域が提供されている。高温領域の温度は５０℃から９５℃の範囲で調節可能であり、最良の温度は９０℃である。定温領域の温度は２５℃から４５℃の範囲で調節可能であり、最良温度は４２℃である。高温カップ６を保持する第一孔部と制御パネル７は高温領域に設けられる。定温均衡領域と混合領域は定温領域に設けられる。定温カップ８を保持する第二孔部は定温均衡領域に形成される。混合カップ３を保持する第三孔部と、反転プレート２の保持溝部はそれぞれ混合領域に形成されている。断熱壁部５は高温領域と定温領域の間に提供されている。電熱装置９は導熱ブロック４内に設置されている。温度制御装置は外殻部１内に設置されている。
【００４３】
培養ボックスは図３と図４で示されている。ボックス体１０は閉鎖周壁部、閉鎖底部および開放上端部を備えた構造を有し、定規（目盛り）１２がボックス体１０の底部に提供されており、薬剤感受性紙片１１はボックス体１０の底部の上面に接着され、ボックスカバー１３がボックス体１０の開放端部をカバーしている。
【実施例】
【００４４】
本発明の結核菌の薬剤感受性試験法、インディケータ利用法および固体培地の実施例は以下に提供されている。
【００４５】
実施例の培養ボックスでは、６枚の薬剤感受性紙片１１がボックス体１０の底部の上面に貼付されている。ボックス体の容量は３０ｍＬである。
【００４６】
１）５ｍＬの患者の朝喀痰検体が回収され、２％の水酸化ナトリウムと０．５％のＮＡＬＣの混合液で消化される。
【００４７】
２）この朝喀痰検体は遠心分離機に入れられ、４５００ｒｐｍの回転速度で１０分間遠心分離処理され、検体中の結核菌は完全に沈殿される。
【００４８】
３）上澄み液が取り除かれて濃縮検体が得られ、その後に検体前処理が実施される。
【００４９】
４）濃縮検体は１０ｍＬの液体培地で溶離され、液体細菌縣濁液の形態である液体培養検体が作製される。
【００５０】
５）液体培養検体は濃縮培養のために３７℃の培養器に入れられ、特定時間の濃縮培養が患者の細菌量に従って決定される。もし結核患者の症状に関する検出結果が＋＋＋＋であるなら濃縮培養は不要である。
【００５１】
６）結核菌の液体薬剤感受性試験検体の作製。
（１）加熱サーモスタット装置の高温領域は９０℃に設定され、定温領域は４２℃に設定される。
（２）固体培地は加熱される加熱サーモスタット装置の高温領域に設けられた高温カップ６を保持する第一孔部に入れられ、液体に溶解される。液体培養検体が固体培地と混合された後の容量は３０ｍＬであり、固体培地は、温度が９０℃に上昇すると、固体培地が固体から液体に溶解され、温度が４０℃に降下した後に液体から固体に固化される物性を備える。
（３）液化された固体培地は、冷却のために加熱サーモスタット装置の定温均衡領域の定温カップ８を保持する第二孔部に入れられ、液化した固体培地が４２℃に降下した後にも固体培地は液状である。
（４）濃縮培養後の液体培養検体は、加熱サーモスタット装置の定温領域の定温カップ８を保持する第二孔部に入れられ、温度を４２℃にまで上昇させる。
（５）４２℃の液化した固体培地と、４２℃の液体培養検体が混合カップに入れられ、薬剤感受性試験用の液体検体が得られる。この固体培地が混合プロセス中に液体であることを確実にするため、混合カップは、混合のために加熱サーモスタット装置の定温領域で混合カップ３を保持する第三孔部に入れられる。
【００５２】
７）薬剤感受性試験用固体検体の作製
（１）ボックスカバー１３を外したボックス体１０が加熱サーモスタット装置の定温領域で反転プレート２の保持溝部に入れられ、温度を４２℃にまで上昇させる。
（２）薬剤感受性試験用液体検体はボックス体１０に入れられる。
（３）ボックスカバー１３が閉じられた後に、培養ボックスが取り出されて常温で放置され、液体薬剤感受性試験検体ＩＶは固化され、固体薬剤感受性試験検体が作製される。
【００５３】
８）固体薬剤感受性試験検体は培養のために３７℃の培養器に入れられる。固体薬剤感受性試験検体の色彩が観察され、その色彩がピンク色または淡黄色となったとき、次の試験ステップが実行できる。
【００５４】
９）ボックスカバー１３が取り外された後、インディケータとして１ｍＬの亜テルル酸カリウムが固体薬剤感受性試験検体内に滴下され、ボックスカバー１３が閉じられる。
【００５５】
１０）固体薬剤感受性試験検体は３７℃の培養器内に入れられ、抑制領域が観察され、細菌に対する薬剤の効果が、抑制領域のサイズに従って判定される。
【００５６】
実施例の液体培地は７Ｈ９を採用している。
【００５７】
実施例における固体培地と液体培地の混合比率は、１００ｍＬの７Ｈ９ごとに固体培地の一部分量を加えるものである。各部分量の固体培地は、７５ｍＬの卵黄液、４．６ｇの溶解性スターチ、０．２５ｇのＬ−カゼイン、４ｍＬのフェノールレッド、１．２５ｇのアガロース、０．２ｇの尿素、および適量の静菌剤（マラカイトグリーン）を含む。
【００５８】
オプションでは、実施例のインディケータは亜テルル酸ナトリウムである。
【００５９】
本発明では固体培地のアガロースは薬剤感受性試験で培地の固化に使用される。アガロース以外に寒天も選択可能である。
【００６０】
本発明では固体培地は、常温では固体培地は固体であり、温度が融点付近にまで上昇しても固体培地は固体状態であり、温度が融点を超えた後に固体培地は液体に溶解し、温度が固化温度付近にまで降下しても、固体培地は固体のままであり、温度が固化温度以下になった後に固体培地は固化して固体となる物性を有する。
【００６１】
本発明の固体培地の融点の選択基準は次の通りである。１．固体培地の温度が融点にまで上昇しても栄養素が破壊されない。２．固体薬剤感受性試験検体が３７℃の培養器に入れられても固体状態が保たれる。３．運用が簡単である。従って、本発明の固体培地の融点は５０℃から９５℃である。
【００６２】
本発明の固体培地の固化温度の選択基準は次の通りである。１．固体培地の温度が固化温度以下に降下すると、結核菌が固体培地と混合されるが、その温度は結核菌の生存に適したものでなければならない。２．結核菌の３７℃の培養温度が迅速に到達可能である。３．運用が簡単である。従って、本発明の固体培地の固化温度は２５℃から４５℃である。固化温度が低すぎ、特に室温以下であれば、特に気候が暑いときには、固体培地を固化のために冷蔵装置に入れられなければならない。よって運用は不便である。一方、固化温度が結核菌の３７℃の培養温度よりもずっと低ければ、結核菌の培養温度はさほど迅速に達成することができなくなる。もし固化温度が高すぎると、結核菌の生存には不都合となる。
【００６３】
本発明のインディケータは増殖インディケータまたは生化学反応インディケータでよい。増殖インディケータは、結核菌の増殖と再生が表示される条件を満たされ、観察可能な変色現象が発生されなければならない。ＭＴＴ，ＸＴＴおよびアラマール・ブルーが実用的である。生化学反応インディケータは、生化学反応インディケータが結核菌の特定生化学反応において生化学反応し、観察可能な変色現象が発生するものでなければならない。尿素、亜テルル酸カリウムおよび亜テルル酸ナトリウムが実用的である。
【００６４】
上述実施例のインディケータは、尿素と亜テルル酸カリウムを採用しているが、尿素、ＭＴＴ、ＸＴＴおよびアラマール・ブルーのうちの１つをインディケータとして選択することもできる。この試験プロセスは８ステップのみを含むが、最初の７ステップは同じであり、最後の１ステップは、固体薬剤感受性試験検体が培養のために３７℃の培養器に入れられ、抑制領域が観察され、細菌に対する薬剤の効果は抑制領域のサイズによって追加的に判断されるものである。
【図１】
2013526874.tif 000003
【図２】
2013526874.tif 000004
【図３】
2013526874.tif 000005
【図４】
2013526874.tif 000006
【国際調査報告】
2013526874.tif 000007
2013526874.tif 000008
2013526874.tif 000009
2013526874.tif 000010
2013526874.tif 000011
2013526874.tif 000012
2013526874.tif 000013
2013526874.tif 000014
2013526874.tif 000015
2013526874.tif 000016