(57)【要約】  本発明は、リンパ血管新生、血管新生及び／又は腫瘍増殖を抑制するための方法及び組成物に関する。該方法は、腫瘍を、（ｉ）不活性の状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と接触させる工程を含む。【選択図】  図１Ａ
2013518909.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造
【化１】
2013518909.tif 000106
を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、Ｎ，Ｎ’−ジオキシド、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリオキシドまたはその薬学的に許容可能な塩であって、
式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、−ＮＨ２、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり、Ｚ’はＮまたはＣであり、ＲｍはＣ１−６アルキル、または、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキであり、および、Ｒ３は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、あるいはＣ３−１０シクロアルキルであり、または、随意に、ＲｍおよびＲ３は、５〜７員の炭素環式化合物を形成するように結合され、およびｎは、０〜４であることを特徴とする化合物。
【請求項２】
Ｒ１が、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキルまたはＣＦ３Ｓであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２が、随意の置換されたアミンまたはＮＨ２であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が随意の置換されたアルコキシまたは随意の置換されたチオアルキルであり、Ｒ２がＮＨ２であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒｍが、Ｃ１−６アルキルまたはＣＦ３であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ３が、Ｃ１−６アルキルまたはハロゲンで置換されたＣ１−６アルキルであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
ＲｍおよびＲ３が、５〜７員の炭素環式化合物を形成するように連結されることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物が、
【化２】
2013518909.tif 000107
から選択されることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
式（Ｉ）の化合物を調製するための工程であって、
【化３】
2013518909.tif 000108
該工程は、式（ＩＩ）の化合物
【化４】
2013518909.tif 000109
を、式（ＩＩＩ）の化合物
【化５】
2013518909.tif 000110
と、塩基の存在下で反応させる工程を含み、式中、Ｗは、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、キナゾリン、キノキサリン、１，２，４−ベンゾトリアジンおよびアザインドールからなる群から選択され、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨであり、および、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、−ＮＨ２、−ＯＨ、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、−ＳＣＦ３、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり、Ｒ３は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、またはＣ３−１０シクロアルキルであり、または、随意に、２つのＲ３は５〜７員の炭素環式化合物を形成するように結合され、およびｍは１−５であることを特徴とする工程。
【請求項１０】
式（Ｉａ）の化合物を調製するための工程であって、
【化６】
2013518909.tif 000111
該工程は、式（ＩＩａ）の化合物
【化７】
2013518909.tif 000112
を、式（ＩＩＩａ）の化合物
【化８】
2013518909.tif 000113
と、塩基の存在下で反応させる工程を含み、式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、−ＮＨ２、−ＯＨ、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、−ＳＣＦ３、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり、およびＲ３は、水素、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、またはハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシであることを特徴とする工程。
【請求項１１】
前記式（ＩＩ）の化合物の前記式（ＩＩＩ）の化合物に対するモル比は、０．６：１から０．９：１までの範囲にあることを特徴とする請求項９又は１０に記載の工程。
【請求項１２】
前記塩基がアミン塩基であることを特徴とする請求項９又は１０に記載の工程。
【請求項１３】
前記アミン塩基が２，６−ルチジンであることを特徴とする請求項１２に記載の工程。
【請求項１４】
Ｒ１が、水素、−ＮＨ２、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、−ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換アルキルスルホニルであることを特徴とする請求項９又は１０に記載の工程。
【請求項１５】
Ｒ２が、水素、ＮＨ２または随意の置換されたアルコキシであることを特徴とする請求項９又は１０に記載の工程。
【請求項１６】
Ｒ１およびＲ２が、独立して、随意の置換されたアミンであることを特徴とする請求項９又は１０に記載の工程。
【請求項１７】
Ｒ１が随意の置換されたチオアルキルであり、およびＲ２が随意の置換されたアミンであることを特徴とする請求項９又は１０に記載の工程。
【請求項１８】
Ｒ１がＭｅＳであり、およびＲ２がＮＨ２であることを特徴とする請求項１７に記載の工程。
【請求項１９】
Ｒ３が水素であることを特徴とする請求項１８に記載の工程。
【請求項２０】
式（ＩＶ）の化合物を調製するための工程であって、
【化９】
2013518909.tif 000114
該工程は、式（Ｖ）の化合物
【化１０】
2013518909.tif 000115
を、式（ＶＩ）の化合物
【化１１】
2013518909.tif 000116
と、塩基の存在下で反応させる工程を含み、式中、Ｌは脱離基であり、Ｙは−ＳＨ、−ＯＨまたは−ＮＨ２であり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換された保護アミン、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり、およびＲ４はＣ１−６アルキルであることを特徴とする工程。
【請求項２１】
前記式（ＩＶ）の化合物が、式（ＩＶａ）の構造
【化１２】
2013518909.tif 000117
を有する化合物であり、および前記式（Ｖ）の化合物が、（Ｖａ）の構造
【化１３】
2013518909.tif 000118
を有し、および前記式（ＶＩ）の化合物が、アルキルヒドロキシベンゾアートであることを特徴とする請求項２０に記載の工程。
【請求項２２】
Ｒ１およびＲ２が、独立して、随意の置換された保護アミンであることを特徴とする請求項２０又は２１に記載の工程。
【請求項２３】
前記随意の置換された保護アミンが、酸不安定保護基によって保護されることを特徴とする請求項２２に記載の工程。
【請求項２４】
Ｒ１およびＲ２が、独立して、−ＮＨＢｏｃまたはＮ（Ｂｏｃ）２であることを特徴とする請求項２３に記載の工程。
【請求項２５】
Ｒ１が随意の置換されたチオアルキルであり、およびＲ２が随意の置換された保護アミンであることを特徴とする請求項２０又は２１に記載の工程。
【請求項２６】
Ｒ１が−ＳＭｅであり、およびＲ２が−Ｎ（Ｂｏｃ）２であることを特徴とする請求項２５に記載の工程。
【請求項２７】
前記塩基が、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンであることを特徴とする請求項２０に記載の工程。
【請求項２８】
リンパ血管新生、血管新生及び／又は腫瘍の増殖を妨げる又は阻害するための方法であって、該方法は、腫瘍を、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
ヒト被験体において癌を処置するための方法であって、該方法は、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物を、必要とする患者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
細胞においてＡＳＫ１媒介性アポトーシスの阻害を妨げるための方法であって、該方法は、細胞を、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
外因性ストレスに対して細胞を感作する方法であって、該方法は、細胞を、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
ＭＥＫ１／２−及び／又はＥＲＫ１／２−媒介性細胞増殖又は移動を阻害するための方法であって、該方法は、細胞を、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
ヒト被験体において再狭窄を処置するための方法であって、該方法は、（ｉ）不活性なでプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物を、必要とする患者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
ヒト被験体において線維症を処置するための方法であって、該方法は、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物を、必要とする患者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
ＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化及び／又はＲＡＦ二量化を阻害するための方法であって、該方法は、細胞を、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
前記化合物が選択的ＩＩ型阻害剤であることを特徴とする請求項２８乃至３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物がＲＡＦキナーゼの選択的ＩＩ型阻害剤であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記化合物がＰＤＧＦ受容体の選択的ＩＩ型阻害剤であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ＲＡＦキナーゼがＢ−ＲＡＦキナーゼであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記化合物が、ＣＲＡＦによるＢＲＡＦのヘテロ二量体化を阻害することを特徴とする請求項２８乃至３４のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記化合物が、Ｃ−ＲＡＦのＳ３３８のリン酸化を阻害することを特徴とする請求項２８乃至３４のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記化合物が、群Ｂ−ＲＡＦ、Ｃ−ＲＡＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｆｌｔ３、Ｋｉｔ、およびＰＤＧＦＲβから選択される活性キナーゼを阻害しないことを特徴とする請求項２８乃至３５のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記化合物が、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｆｌｔ３及び／又はｃ−Ｋｉｔのアロステリック阻害剤であることを特徴とする請求項２８乃至３５のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記化合物がＧ２／Ｍ期で腫瘍細胞を停止させることを特徴とする請求項２８乃至３５のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記癌が、耐性があり、難治性であり、またはプロテインキナーゼのＩ型阻害剤、パン−ＲＡＦキナーゼ薬剤、ＶＥＧＦ標的化治療またはＡＴＰ拮抗阻害剤に反応しないことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４６】
前記癌が、耐性があり、難治性であり、またはソラフェニブ、ＰＬＸ４０３２、ＸＬ２８１、ＲＡＦ２６５、８８５−Ａ、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９４５０、ＡＺ６２８、ＡＡＬ８８１、ＬＢＴ６１３、ＭＣＰ１１０、１７−ＤＭＡＧ、ＣＩ１０４０、ＡＺＤ６２４４／ＡＲＲＹ１４２８８６、ＰＤ０３２５９０１、ＳＢ５９０８８５、ＤＰ３３４６、およびＤＰ２５１４から選択される薬物に反応しないことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４７】
前記癌が、ＲＡＦキナーゼの変異体形態に関係することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＲＡＦキナーゼの変異体形態は、変異体Ｔ５２９Ｉ、Ｔ５２９Ｎ、Ｇ４６４Ａ、Ｇ４６４Ｅ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ａ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｅ、Ｎ５８１Ｓ、Ｅ５８６Ｋ、Ｆ５９５Ｌ、Ｇ５９６Ｒ、Ｌ５９７Ｖ、Ｌ５９７Ｒ、Ｔ５９９Ｉ、Ｖ６００ＥおよびＫ６０１Ｅから選択されるＢＲＡＦキナーゼであることを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＲＡＦキナーゼの変異体形態が、Ｔ４２１ＮおよびＴ４２１Ｉから選択されるＣＲＡＦゲートキーパー変異体であることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記癌が、黒色腫、乳癌、結腸癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、および結腸癌から選択されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項５１】
前記癌が、Ｎ−Ｒａｓ、Ｂ−ＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）、Ｂ−ＲＡＦ／Ｒａｓ、ＨＥＲ１、Ｋ−ＲａｓまたはＰＩ３Ｋから選択される変異または異常を有することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項５２】
前記癌が、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のアップレギュレーションを示すことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項５３】
前記化合物が、必要とする患者に経口で投与されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項５４】
前記患者は、抗血管原性の治療、化学療法または放射線治療から選択される治療も提供されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項５５】
前記化合物に対する患者の反応が、ＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化の阻害によってモニタリングされることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項５６】
前記ストレスが、低酸素症、化学療法、放射線治療またはグルコース／栄養素飢餓から選択されることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項５７】
前記化合物が、腫瘍血管新生においてＶＥＧＦおよび／またはｂＦＧＦで刺激された内皮反応を遮断することを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項５８】
前記再狭窄が、血管損傷後に内膜の過形成によって引き起こされた再狭窄であることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項５９】
前記線維症が、肺線維症であることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項６０】
前記線維症が、肝線維症であることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項６１】
前記化合物が、構造
【化１４】
2013518909.tif 000119
を有し、式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、ＮＨ２、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり、Ｚは、ＮＨ、ＳまたはＯであり、Ｚ’はＮまたはＣであり、およびＡｒは、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、およびＣ３−１０シクロアルキルから選択される１つ以上の置換基により随意に置換されたフェニルまたは二環式フェニルであることを特徴とする請求項２９乃至６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
前記化合物が、構造
【化１５】
2013518909.tif 000120
を有し、式中、ＲｍはＣ１−６アルキル、またはハロゲンで置換されたＣ１−６アルキであり、およびＲ３は独立して水素、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、またはＣ３−１０シクロアルキルであり、または随意に、ＲｍおよびＲ３は、５〜７員の炭素環式化合物を形成するように結合され、ｎは、０−４であることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記化合物が、構造
【化１６】
2013518909.tif 000121
を有し、式中、Ｒ３は水素またはハロゲンであり、およびＺはＮＨ、ＳまたはＯであることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記化合物が、以下
【化１７】
2013518909.tif 000122
【化１８】
2013518909.tif 000123
【化１９】
2013518909.tif 000124
から選択されることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
ＲＡＦキナーゼのアロステリック阻害剤を同定するための方法であって、該方法は、ＲＡＦキナーゼを試験化合物と接触させる工程と、ＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化をモニタリングする工程とを含み、ここで、接触されなかったＲＡＦキナーゼに対するＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化の減少が、前記試験化合物がＲＡＦキナーゼのアロステリック阻害剤であることを示すことを特徴とする方法。
【請求項６６】
癌を処置するための治療剤を同定するための方法であって、該方法は、ＲＡＦキナーゼを試験化合物と接触させる工程と、ＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化をモニタリングする工程とを含み、ここで、接触されなかったＲＡＦキナーゼに対するＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化の減少は、前記試験化合物が癌を処置することができることを示すことを特徴とする方法。
【請求項６７】
化学療法処置における患者の薬理学的反応をモニタリングするための方法であって、該方法は、ＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化をモニタリングする工程を含み、ここで、接触されなかったＲＡＦキナーゼに対するＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化の減少は、前記化学療法処置が正の薬理学的反応を有することを示すことを特徴とする方法。
【請求項６８】
癌処置のための臨床管理のための予測バイオマーカーとしてのｐＳ３３８−ＣＲＡＦの使用。
【請求項６９】
接触されなかったＲＡＦキナーゼに対するＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化の減少が、前記癌処置から恩恵を受ける可能性を示すことを特徴とする請求項６８に記載の使用。
【請求項７０】
ヒト被験体において癌を処置するための方法であって、該方法は、偽キナーゼを結合する化合物を、それを必要とする患者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項７１】
前記偽キナーゼが、Ｒａｓのキナーゼサプレッサー（ＫＳＲ）であることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互関連）
本出願は、２０１０年２月８日に出願の米国仮特許出願第６１／３０２４７１号、及び２０１０年３月４日に出願の米国仮特許出願第６１／３１０６６３号の利益を主張するものであり、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究の記載）
本発明は、ＮＩＨ：  Ｐ０１−ＣＡ０７８０４５  （ＤＡＣ）、Ｐ０１−ＨＬ０５７９００  （ＤＡＣ）、およびＰ０１−ＣＡ１０４８９８  （ＤＡＣ）からの認可によって米国政府の援助でなされた。
【背景技術】
【０００３】
キナーゼは、腫瘍の増殖、転移、新血管新生および化学療法抵抗性を含む癌における基本的工程（ｐｒｏｃｅｓｓ）を調節する。従って、キナーゼ阻害剤は薬剤開発の大きな焦点であり、現在、いくつかのキナーゼ阻害剤が様々な癌の指標のために認可されている。典型的には、低いＡＴＰ濃度で触媒キナーゼドメインを使用するハイスループットスクリーニングによってキナーゼ阻害剤は選択され、この工程は、しばしば、ＡＴＰレベルが高い細胞内で特異性及び／又は機能を不十分に（ｐｏｏｒｌｙ）欠くＡＴＰミメティックをもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
１つの態様において、構造
【０００５】
【化１】
2013518909.tif 000003
【０００６】
を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、Ｎ，Ｎ’−ジオキシド、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリオキシドまたはその薬学的に許容可能な塩が提供され、ここで、Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、−ＮＨ２、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり；Ｚ’はＮまたはＣであり；ＲｍはＣ１−６アルキル、または、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキであり；および、Ｒ３は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、あるいはＣ３−１０シクロアルキルであり；または、随意に、ＲｍおよびＲ３は、５〜７員の炭素環式化合物を形成するように結合され；およびｎは、０〜４である。
【０００７】
別の態様において、式（Ｉ）の化合物を調製するための工程が提供され：
【０００８】
【化２】
2013518909.tif 000004
【０００９】
該工程は、式（ＩＩ）の化合物
【００１０】
【化３】
2013518909.tif 000005
【００１１】
を、式（ＩＩＩ）の化合物
【００１２】
【化４】
2013518909.tif 000006
【００１３】
と、塩基の存在下で反応させる工程を含み、ここで、Ｗは、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、キナゾリン、キノキサリン、１，２，４−ベンゾトリアジンおよびアザインドールからなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、−ＮＨ２、−ＯＨ、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、−ＳＣＦ３および随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり；Ｒ３は、独立して、水素、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、またはハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシであり、およびｍは１−５である。
【００１４】
別の態様において、式（Ｉａ）の化合物を調製するための工程が提供され：
【００１５】
【化５】
2013518909.tif 000007
【００１６】
該工程は、式（ＩＩａ）の化合物
【００１７】
【化６】
2013518909.tif 000008
【００１８】
を、式（ＩＩＩａ）の化合物
【００１９】
【化７】
2013518909.tif 000009
【００２０】
と、塩基の存在下で反応させる工程を含み、ここで、Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、−ＮＨ２、−ＯＨ、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、−ＳＣＦ３、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり、およびＲ３は、水素、ハロゲン、置換されたＣ１−６アルキル、またはハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシである。
【００２１】
本発明の別の態様において、式（ＩＶ）の化合物を調製するための工程が提供され：
【００２２】
【化８】
2013518909.tif 000010
【００２３】
該工程は、式（Ｖ）の化合物
【００２４】
【化９】
2013518909.tif 000011
【００２５】
を、式（ＶＩ）の化合物
【００２６】
【化１０】
2013518909.tif 000012
【００２７】
と、塩基の存在下で反応させる工程を含み、ここで、Ｌは脱離基であり；Ｙは−ＳＨ、−ＯＨまたは−ＮＨ２であり；Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換された保護アミン、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり、およびＲ４は、Ｃ１−６アルキルである。
【００２８】
本明細書にはまた、リンパ血管新生、血管新生及び／又は腫瘍の増殖のための方法が提供される。その方法は、腫瘍を、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と接触させる工程を含む。
【００２９】
別の態様において、本明細書で提供されるヒト被験体において癌を処置するための方法は、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物を、必要とする患者に投与する工程を含む。
【００３０】
別の態様において、細胞内でＡＳＫ１−媒介性アポトーシスの抑制を妨げるための方法が提供され、該方法は、細胞を、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と接触させる工程を含む。
【００３１】
別の態様において、本明細書には、外因性のストレスに対して細胞を感作する（ｅｎｓｉｔｉｚｅ）ための方法が提供され、該方法は、細胞を、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と接触させる工程を含む。
【００３２】
別の態様において、ＭＥＫ１／２−及び／又はＥＲＫ１／２−媒介性細胞増殖又は移動を阻害するための方法が提供され、該方法は、細胞を、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と接触させる工程を含む。
【００３３】
別の態様において、ヒト被験体において再狭窄を処置するための方法が提供され、該方法は、（ｉ）不活性なでプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物を、必要とする患者に投与する工程を含む。
【００３４】
別の態様において、本明細書で提供されるヒト被験体において線維症を処置するための方法は、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物を、必要とする患者に投与する工程を含む。
【００３５】
別の態様において、ＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化及び／又はＲＡＦの二量化を妨げるための方法が提供され、該方法は、細胞を、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と接触させる工程を含む。
【００３６】
本発明はまた、ＲＡＦキナーゼのアロステリック阻害剤を同定するための方法を提供する。その方法は、ＲＡＦキナーゼを試験化合物と接触させる工程、およびＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化をモニタリングする工程を含み、ここで、接触されなかった（ｎｏｎ−ｃｏｎｔａｃｔｅｄ）ＲＡＦキナーゼに関係するＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化の減少は、試験化合物がＲＡＦキナーゼのアロステリック阻害剤であることを示す。
【００３７】
（参照による組み込み）
本明細書で言及される出版物、特許、および特許出願はすべて、参照によってその目的のための本明細書に組込まれる。
【００３８】
本発明の新しい特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される、具体例を明記する後述する詳細な説明を参照することによって、及び以下の添付図面によって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｆは、ＰＤＧＦＲβとＲＡＦの二重標的化のための化合物に対する分子モデリング、およびアッセイスクリーニング（ａｓｓａｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を示す。（図１Ａ）それぞれ、ＰＤＧＦＲβおよびＲＡＦ内のアミノトリアゾールベースの小分子の分子モデリング。Ｂ−ＲＡＦの結晶構造（ＰＤＢ  １ｕｗｈ）が、望ましい不活性な状態（すなわちＤＦＧ−ｏｕｔ）における活性化ループのＤＦＧモチーフを含んでいたので、結合研究のために選択された。ＰＤＧＦＲβの相同モデルは、構造上関連するファミリーメンバー（ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＢ  １ｙ６ｂ）によって作製された。さらなるドッキング研究は、図６Ｂで提供される。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｆは、ＰＤＧＦＲβとＲＡＦの二重標的化のための化合物に対する分子モデリング、およびアッセイスクリーニング（ａｓｓａｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を示す。（図１Ｂ）ヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）は、１時間、化合物６（０、０．５、１および１０μＭ）で前処理され、その後、ＲＩＰＡ緩衝液中でＰＤＧＦ−ＢＢおよび溶菌によって７分刺激された。自己リン酸化のために、ホスホ−チロシン抗体によって免疫ブロットが行われた。膜は剥がされ、合計のＰＤＧＦＲβレベルについて再プローブされた。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｆは、ＰＤＧＦＲβとＲＡＦの二重標的化のための化合物に対する分子モデリング、およびアッセイスクリーニング（ａｓｓａｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を示す。（図１Ｃ）ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、５分の刺激）の化合物６（５μＭ）阻害は、血清不足のＨＵＶＥＣ中でＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化を誘発したことを示すウエスタン解析。化合物３および６の内皮細胞ベースのＲＡＦ阻害の比較は、図７Ａにおいて見出されることができる。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｆは、ＰＤＧＦＲβとＲＡＦの二重標的化のための化合物に対する分子モデリング、およびアッセイスクリーニング（ａｓｓａｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を示す。（図１Ｄ）ＰＤＧＦＲβとＢ−ＲＡＦの両方を比較する、アミノトリアゾールベースの小分子の構造活性相関。化合物３〜１１が調製され（米国特許第７，６５２，０５１号）、ウエスタン解析によって、ＶＳＭＣ中２μＭでのＰＤＧＦ−ＢＢ誘発ＰＤＧＦＲβ自己リン酸化またはＨＵＶＥＣｓ中５μＭでのｂＦＧＦ誘発ＭＡＰＫ活性の阻害に関してスクリーニングされた（−は、ｘ＜１０％阻害を表わし、＋は５０％＜ｘ＜７０％阻害を表わし、および＋＋は、ｘ＞９０％阻害を表わす）。
【図１Ｅ】図１Ａ−１Ｆは、ＰＤＧＦＲβとＲＡＦの二重標的化のための化合物に対する分子モデリング、およびアッセイスクリーニング（ａｓｓａｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を示す。１０％のＦＢＳを含む完全成長培地中で７２時間の間、様々な投与量で化合物３、６、イマチニブまたはソラフェニブによってＶＳＭＣ（図１Ｅ）またはＨＵＶＥＣ（図１Ｆ）が処理されたＸＴＴ生存率測定。曲線は、３つの別個の実験の平均を表わし、エラーバーは±ＳＥＭを表わす。
【図１Ｆ】図１Ａ−１Ｆは、ＰＤＧＦＲβとＲＡＦの二重標的化のための化合物に対する分子モデリング、およびアッセイスクリーニング（ａｓｓａｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を示す。１０％のＦＢＳを含む完全成長培地中で７２時間の間、様々な投与量で化合物３、６、イマチニブまたはソラフェニブによってＶＳＭＣ（図１Ｅ）またはＨＵＶＥＣ（図１Ｆ）が処理されたＸＴＴ生存率測定。曲線は、３つの別個の実験の平均を表わし、エラーバーは±ＳＥＭを表わす。
【図２】図２は、Ａｍｂｉｔ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（商標）プロファイリングサービスにおける化合物６、ソラフェニブおよびイマチニブの実例となる特性を提供する。化合物は競合的結合に関して７０のキナーゼに対してスクリーニングされ、凡例は、１０μＭでのキナーゼ標的の％対照（陽性対照に関する阻害）を記載する。スクリーニングされたキナーゼの完全なリストおよび％阻害は表２において入手可能であり、および化合物６に対するキナーゼ標的のＫｄｓのリストは、表３において見出され得る。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｄは、ゼブラフィッシュにおける血管新生に関する化合物６の効果を示す。（図３Ａ）トランスジェニックのｆｌｉ１−ｅｇｆｐゼブラフィッシュ胚における血管新生に対する化合物６の効果。胚は、受精の２０時間後（ｈｐｆ）から４８ｈｐｆまで、１μＭの６またはＳＵ５４１６、または１０μＭの３により処理された。血管構造の代表的な３Ｄ再構成は胚のヘッド領域とテール領域の両方のために示される。４８ｈｐｆでのゼブラフィッシュ胚のヘッドおよびテールにおける主要な血管についての明示は、図８Ａにおいて入手可能である。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｄは、ゼブラフィッシュにおける血管新生に関する化合物６の効果を示す。（図３Ｂ）後期の（ｌａｔｅ）血管成熟の間のゼブラフィッシュにおける内腔形成の破壊。２０−４８ｈｐｆの間、１μＭの６または１０μＭの３のいずれかによって処理されたゼブラフィッシュは、３５および４８ｈｐｆで画像化された。底パネル：化合物６は、ゼブラフィッシュにおける体節間の血管中のアポトーシスを誘発する。４８ｈｐｆでのＴＵＮＥＬ陽性核を備えた体節間の血管を示すＧＦＰの３Ｄオーバーラップ再構成が示される（赤で示される）。代表的な位相コントラスト視野と、図３Ａおよび図３Ｂからの体節間の血管容量の定量化は、それぞれ、図８Ｂ−Ｄにおい見出されることができる。
【図３Ｃ】図３Ａ−３Ｄは、ゼブラフィッシュにおける血管新生に関する化合物６の効果を示す。（図３Ｃ）ゼブラフィッシュに対する薬物付加の時間的経過。化合物（３または６に関して２．５μＭ、あるいは１μＭのソラフェニブまたは対照としてのＤＭＳＯ）は、１８ｈｐｆまたは３０ｈｐｆのいずれかで加えられ（実験の継続中、胚上に残され）、体節間の血管は薬物付加の対応する時間点のおよそ２４時間後画像化された。３０ｈｐｆで、ゼブラフィッシュ胚は、明白な内腔を有する初期の血管を確立した。化合物６およびソラフェニブは、先在する血管構造に対するそれらの効果を評価するために加えられた。
【図３Ｄ】図３Ａ−３Ｄは、ゼブラフィッシュにおける血管新生に関する化合物６の効果を示す。（図３Ｄ）化合物３、６またはソラフェニブ（図３Ｃにおけるのと同じ濃度）により処理されたゼブラフィッシュの位相コントラスト画像。画像は、３と６により処理された胚は生存可能であり、一方、ソラフェニブは死を引き起こすことを実証する。全ての処置に対して１つの条件当たりｎ＝４〜６のゼブラフィッシュ胚。すべてのスケールバー＝１００μｍ。
【図４Ａ】図４Ａ−４Ｃは、化合物６に類似する血管新生を阻害するイマチニブとＧＷ  ５０７４の組み合わせに関する結果を示す。（図４Ａ）Ｔｇ：（ｆｌｉ１−ｅｇｆｐ）ゼブラフィッシュ胚における体節間の血管形成に対する化合物３、６、バタラニブ、イマチニブ、ＧＷ  ５０７４、およびイマチニブ（ＰＤＧＦＲ阻害剤）とＧＷ  ５０７４（ＲＡＦの阻害剤）の組み合わせの効果。胚は、受精後１６時間（ｈｐｆ）から４８ｈｐｆまで、ＤＭＳＯ、５μＭの化合物３、５μＭの化合物６、１μＭのバタラニブ、５μＭのイマチニブ（Ｉｍ）、１μＭのＧＷ  ５０７４（ＧＷ）および５μＭのイマチニブと１μＭのＧＷ  ５０７４の組み合わせ（Ｉｍ＋ＧＷ）により処理された。レーザー走査型共焦点顕微鏡からのＺ−ｓｔａｃｋは、４８ｈｐｆでの体節間の血管の形成を描いて示される。ｎ＝６つの胚／処理。
【図４Ｂ】図４Ａ−４Ｃは、化合物６に類似する血管新生を阻害するイマチニブとＧＷの５０７４の組み合わせに関する結果を示す。（図４Ｂ）ＨＵＶＥＣは、血管周囲細胞に関連する内皮の管形成をモニタリングするために、完全ＥＢＭ−２培地の存在下で、３Ｄコラーゲンマトリックス中でｈＴＥＲＴ−ヒト肝星細胞と一緒に共培養された。星細胞は、実験の開始前の１時間の間、１０μｇ／ｍｌの赤色蛍光染料（ＤｉＩＣ（３），  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）  により標識化された。阻害剤は、以下の濃度：ＤＭＳＯ、２．５μＭの３、２．５μＭの化合物６、１μＭのイマチニブ（Ｉｍ）、０．５μＭのＧＷ  ５０７４（ＧＷ）、および１μＭのイマチニブと０．５μＭのＧＷ  ５０７４の組み合わせ（Ｉｍ＋ＧＷ）で、接種６時間後に共培養物に加えられた。内皮管は、ウェル当たり２μｌのＦＩＴＣ標識化Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）を加えることにより、２４時間に染色された。画像は、細胞の接種４８時間後に得られた。３つの独立した実験からの１枚の代表的なパネルが示される。緑−ＦＩＴＣレクチン標識化内皮細胞、赤−ＤｉＩＣ（３）標識化星細胞。各パネルにおける挿入は、内皮細胞／星細胞の相互作用についてのより高い倍率の視野を示す。スケールバー＝２００μｍ。
【図４Ｃ】図４Ａ−４Ｃは、化合物６に類似する血管新生を阻害するイマチニブとＧＷの５０７４の組み合わせに関する結果を示す。（図４Ｃ）管長は、得られた１０の領域すべてについて各々の管に対してＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを使用して測定された。％血管周囲細胞で覆われた管長は、血管周囲細胞接触のある、およびない管に関する管長の合計の割合から計算された。エラーバーは、１つの群当たり２つのウェルの±ＳＥＭとして報告される。＊は、ＤＭＳＯ群と比較されたｐ＜０．０５を示す。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｆは、膵臓の腫瘍成長を阻害し、腫瘍血管密度を減少させる化合物６の例示の結果を示す。（図５Ａ）ビヒクルまたは化合物６（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、ｂｉｄ）のいずれかにより処置されたＮｅｓｔｉｎ−ＧＦＰマウス（ｎ＝５／群）の膵臓中のＸＰＡ−１−ＲＦＰ膵臓腫瘍異種移植片のリアルタイムの蛍光イメージング。薬物処置は、ＸＰＡ１−ＲＦＰ腫瘍および腫瘍進行の外科的同所移植（ＳＯＩ）の３日後に開始され、腫瘍増殖は、全体の動物画像診断によって３日毎にモニタリングされた。スケールバー＝１０ｍｍ。
【図５Ｂ】図５Ａ−５Ｆは、膵臓の腫瘍成長を阻害し、腫瘍血管密度減少させる化合物６の例示の結果を示す。（図５Ｂ）ビヒクルと化合物６による処置群に関する経時的な腫瘍の表面積のプロット。腫瘍の表面積は、腫瘍の腹側と外側の両方の画像の合計のピクセルを加えることにより計算された。＊Ｐ＝０．０３４。
【図５Ｃ】図５Ａ−５Ｆは、膵臓の腫瘍成長を阻害し、腫瘍血管密度減少させる化合物６の例示の結果を示す。（図５Ｃ）上記の図５Ａおよび５Ｂに記載された全体の動物画像の各日に測定されたマウスの平均体重。
【図５Ｄ】図５Ａ−５Ｆは、膵臓の腫瘍成長を阻害し、腫瘍血管密度減少させる化合物６の例示の結果を示す。（図５Ｄ）（ＳＯＩ）後１５日の切除された原発腫瘍の総重量、＊ｐ＝０．０２２。
【図５Ｅ】図５Ａ−５Ｆは、膵臓の腫瘍成長を阻害し、腫瘍血管密度減少させる化合物６の例示の結果を示す。（図５Ｅ）切除の後のＸＰＡ１−ＲＦＰ腫瘍内の内皮ＧＦＰ発現（Ｎｅｓｔｉｎプロモーターによって促進されたＧＦＰ発現）の代表的な蛍光画像。ＳＯＩ後１５日に得られた画像。スケールバー＝２００μｍ。
【図５Ｆ】図５Ａ−５Ｆは、膵臓の腫瘍成長を阻害し、腫瘍血管密度減少させる化合物６の例示の結果を示す。（図５Ｆ）図５Ｅにいて得られた画像からの腫瘍血管密度のプロット。５Ｅにおけるように画像化された血管は、長さ（ｍｍ）に変換され、腫瘍容積（ｍｍ３）に標準化された、＊ｐ＝０．０１。
【図６】図６のＡ−Ｂは、ＥＧＦＲ、Ｂ−ＲＡＦおよびＰＤＧＦＲβの一次配列の配列アラインメント、およびＥＧＦＲ活性化ループによるＰＤＧＦＲβへの化合物６のドッキングを提供する。（図６のＡ）１ｕｗｈは、ＢＲＡＦとのソラフェニブの共同結晶構造を表わし、１ｘｋｋはＧＷ  ５７２０１６とＥＧＦＲの共同結晶構造である。（ＰＤＧＦＲβ中の挿入ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１：ＬＱＨＨＳＤＫＲＲＰＰＳＡＥＬＹＳＮＡＬＰＶＧＬＰＬＰＳＨＶＳＬＴＧＥＳＤＧＧＹＭＤＭＳＫＤＥＳＶＤＹＶＰＭＬＤＭＫＧＤＶＫＹＡＤＩＥＳＳＮＹＭＡＰＹＤＮＹＶＰＳＡＰＥＲＴＣＲＡＴＬＩＮＥＳＰＶＬが除かれるなら）ＰＤＧＦＲβとＢＲＡＦキナーゼドメインの配列同一性は、２９．１％であり、全般的な類似性は、４７．３％である（ＥＢＩのプログラムＥＭＢＯＳＳ  Ａｌｉｇｎを用いて、開始ギャップペナルティー１５、伸長ギャップペナルティー１）である。（図６のＢ）ＰＤＧＦＲβ内の活性化ループに関する十分な結晶学的な情報の欠如のために、それは様々な可能なループ構造によりモデル化されることができる。テンプレートとして、ＥＧＦＲキナーゼ（ｐｄｂ  ｉｄ  １ｘｋｋ）を用いるＧｌｙ８５７の近くのＰＤＧＦＲβ内の活性化ループの構造をモデル化することによって、我々は、Ｇｌｙ８５７が６のフェニル環のすぐ近くに位置するだろうと認める。パラ位の任意の原子のさらなる付加は、ループによって立体的に妨害されるだろう。このことによって、タンパク質中の６の不安定な位置を作ることが予想され、潜在的には、なぜ４−ＣｌがＰＤＧＦＲβ活性に対して耐性がないのか説明するだろう。
【図７】図７のＡ−Ｇは、ＥＣにおけるＲＡＦ活性、活性Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｃ−ＲＡＦ  Ｓ３３８のリン酸化、およびＦＧＦＲまたはＶＥＧＦＲに影響を与えないＢ−／Ｃ−ＲＡＦのヘテロ二量体化を阻害する化合物６からの結果を示す。（図７のＡ）本明細書に記載されるように、血清不足ＨＵＶＥＣ中におけるｂＦＧＦまたはＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、５ｍｉｎの刺激）に誘発されたＥＲＫのリン酸化の、化合物３および化合物６（１０μＭ）阻害を比較するウエスタン解析。ＥＲＫ２染色はローディング管理のために示される。（図７のＢ）本質的に活性Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを内因的に発現する１２０５Ｌｕメラノーマ細胞は、一晩欠乏させ（ｓｔａｒｖｅｄ）、ＭＥＫとＥＲＫのリン酸化によって測定されるような腫瘍形成性のＢ−ＲＡＦ活性の阻害を測定するために、化合物６（１０μＭ）で１時間処置される。（図７のＣ）Ｓ３３８で、または１４−３−３結合部位、Ｓ２５９での活性化セグメント内でのＣ−ＲＡＦのリン酸化は、ウエスタン解析によって測定された。内皮細胞は一晩血清不足にされ、刺激１時間前に、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦのいずれかによって、５０ｎｇ／ｍｌで５分間、化合物６で前処理された。（図７のＤ）Ｂ−ＲＡＦ／Ｃ−ＲＡＦのヘテロ二量体化の免疫沈殿およびウエスタン解析。ＨＵＶＥＣは、一晩血清不足にされ、上記の図７Ｂに記載されているような化合物により処置された。ｂＦＧＦ（Ｆ）またはＶＥＧＦ（Ｖ）による成長因子刺激の後、Ｃ−ＲＡＦは、合計の細胞溶解物からの４００μｇのタンパク質から免疫沈殿させられた（アガロース結合Ｃ−ＲＡＦ  Ａｂ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、免疫沈殿物中のＢ−ＲＡＦ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）の存在はウェスタンブロッティングによって測定された。全体の細胞溶解物（ＷＣＬ）中のＥＲＫの対応するリン酸化は底パネルで示される。合計のＥＲＫ２および合計のＣ−ＲＡＦは、ローディング管理としてブロットに含まれた。（図７のＥ）ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）またはヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）は、１時間、ＤＭＳＯ、化合物６またはソラフェニブによって前処置され、その後、ＲＩＰＡ緩衝液中で成長因子および溶菌によって５分刺激された。５００μｇのタンパク質は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ  ＰＬＵＳアガロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）の付加の前に４℃で１時間、３μｇの抗体（ＰＤＧＦＲβのためのｓｃ−４３２およびｓｃ−６２５１  Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ（両方共Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから）；およびＦＧＦＲ１のためのＵｐｓｔａｔｅからの＃０５−１４９）と共にインキュベートされた。自己リン酸化を測定するために、免疫ブロットは１時間ホスホ−チロシン抗体（ＰＹ−２０，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）によって行われ、化学発光（ｃｈｅｍｉｌｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）により検出された。膜は剥ぎ取られ、それぞれ、ＤＧＦＲβ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲおよびＦＧＦＲ１の合計の受容体レベルに関して再プローブされた。それぞれ、（ｓｃ−３３９、ｓｃ−５０４、および０５−１４９、Ｓａｎｔａ  ＣｒｕｚおよびＵｐｓｔａｔｅから）。（図７のＦ）ＸＰＡ−１膵臓（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｅ）癌細胞におけるＢ−ＲＡＦ／Ｃ−ＲＡＦの二量体化の免疫沈殿およびウエスタン解析。代表的な化合物６は、ＲＡＦの二量体化を妨害するように見える。（図７のＧ）典型的な化合物６および３７によるＸＰＡ−１  膵臓癌細胞におけるＢ−ＲＡＦ／Ｃ−ＲＡＦの二量体化の免疫沈殿およびウエスタン解析。両方の化合物は、ＸＰＡ−１細胞においてＲＡＦの二量体化およびｐＳ３３８−ＣＲＡＦを妨げる。
【図８】図８のＡ−Ｄは、Ｔｇ：ｆｌｉ１−ｅｇｆｐゼブラフィッシュ血管構造の標識化およびＩＳＶ量に対する薬物処置効果の定量化を示す。（図８のＡ）画像は、主要な血管構造物を標識化して図３Ａから得られた。（ヘッドで）：ＭＣｅＶ、中央の大脳静脈；ＭｓＶ、中脳の静脈；ＰＨＳ、主要な頭の腔；ＩＯＣ、内部の視覚円；ＰｒＡ、前脳の動脈。（テールで）：ＤＬＡＶ、背側縦束吻合血管；ＤＡ、背動脈；ＰＣＶ、後基本静脈；ＩＳＶ、体節間の血管；ＶＴＡ、椎骨動脈。（図８のＢ）図３Ａにおけるように処置されたゼブラフィッシュ胚についての代表的な視野（画像は、Ｔｇ：ｆｌｉ１−ＥＧＦＰ胚のヘッドとトランクの領域の融合された相およびＧＦＰ蛍光視野を表わす）。スケールバー＝２００μｍ。（図８のＣ）図３Ａにおけるように処置された胚からのＩＳＶ量の定量化。（図８のＤ）図３Ｂでのように処置胚からＩＳＶ量の定量化。体節間の血管（ＩＳＶ）容積を測定するために、個々のＩＳＶは、Ｉｍａｒｉｓ反表面／等位面（Ｉｍａｒｉｓ  ｃｏｕｎｔｅｒｓｕｒｆａｃｅ／ｉｓｏｓｕｒｆａｃｅ）機能を使用して、デジタル的に分離された。４の独立した胚から３０の独立したＩＳＶが測定のために使用された。＋／−ｓｅｍを報告した。
【図９】図９のＡ−Ｄは、マウスにおける血管新生を乱す化合物６の結果を示す。（図９のＡ）化合物６は、マウスマトリゲルモデルにおいてｂＦＧＦ誘発血管新生を阻害する。マウス（ｎ＝５）は、横腹に、２００ｎｇのｂＦＧＦで充填された成長因子消耗マトリゲルを注入され、１日２回（ｂｉｄ）ｉｐ投与によって５０ｍｇ／ｋｇの化合物６により５日間処置された。マトリゲルの注入後５日目に、マウスは、血管にラベルを付けるためにＦＩＴＣレクチンを投与された。プラグは除去され、共焦点顕微鏡によって視覚化され、その後、均質化および総ＦＩＴCの定量化が行われた。エラーバーは±ＳＥＭを表わす。（図９のＢ）化合物６は、血管中のＥＲＫのリン酸化を阻害する。マトリゲルプラグの薄片（５μｍ）は、ＥＣ混合物（抗Ｆｌｋ、抗ＣＤ３１、抗−ＶＥカドヘリンおよび抗エンドグリン）によって血管に対して免疫染色された。マトリゲル部分は、共焦顕微鏡によって化合物６のインビボの阻害活性を検出するために、ホスホ−ＥＲＫに対して免疫染色された。（図９のＣ）６は、間質細胞中のＰＤＧＦＲβＹ７５１のリン酸化を阻害する。マトリゲルプラグの薄片（５μｍ）は、α−平滑筋アクチンによって血管周囲細胞および繊維芽細胞について、およびホスホＰＤＧＦＲβＹ７５１レベルのために免疫染色された。ＥＣは抗ＣＤ３１により免疫染色された。（図９のＤ）化合物６は、内皮においてアポトーシスを誘発するが、マトリゲルプラグ中の周囲の間質細胞においては誘発しない。マトリゲルプラグの薄片（５μｍ）は（図９のＢにおいて記載された）ＥＣ混合物によって血管について免疫染色された。ＴＯＰＲＯ−３は、核対比染色として使用され、およびＴＵＮＥＬ染色はアポトーシスの核を検出するために使用された。画像は、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して得られた。（図９のＢ、９のＣ、９のＤにおいて、ｎ＝４プラグ／群）。スケールバー＝２００μｍ（図９のＡ、９のＣ、９のＤ）；（図９のＢ）に対して１００μｍ。
【図１０】図１０のＡ−Ｂは、同所性の腎細胞癌に対して経口的に活性な化合物６の結果を示す。（図１０のＡ）ｎｕ／ｎｕマウスの横腹に同所的に注入されたＳＮ１２Ｃ−ＲＦＰの腎細胞のリアルタイムの蛍光イメージング。マウスは、ビヒクルまたは化合物６（１００ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、ｑｄ）のいずれかにより処置された。同所性の注入の７日後に薬物療法が始められ、および腫瘍成長は７日ごとに全体の動物画像診断によって視覚化された。示された画像は、２６日目のビヒクルおよび薬物で処置された群の４匹のマウスのものである。スケールバー＝１０ｍｍ。（図１０のＢ）研究の終わりに、左の腫瘍を有する腎臓および右腎の両方は摘出され、重さを量られた。グラフは、各動物の腫瘍を有する腎臓と正常な腎臓の間の重量の差の平均を示す。ｎ＝６匹の動物／群。＊ｐ＝０．０５．
【図１１】図１１のＡ−Ｅは、化合物６が血管内膜新生の過形成に対して経口的に活性であることを示す。（図１１のＡ）マウス頚動脈は、方法に記載されているようワイヤーで傷つけられた。動物（ｎ＝４／群）は、ビヒクルまたは化合物６（１００ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、ｑｄ）のいずれかにより翌日処置され、１４日間処置された。頚動脈は１４日目で切除され、切片にされ、ヘマトキシリン‐エオジン染色により視覚化された。（図１１のＢ）血管内膜／内側の比率は、ビヒクルおよび化合物６によって処置されたマウスについて測定された、＊ｐ＜０．００１。（図１１のＣ）対応するパーセント狭窄（血管狭窄を反映する）は、本明細書に記載されるように計算された、＊ｐ＜０．０１。エラーバーは±ＳＥＭとして報告される。（図１１のＤ）傷つけられた動脈中のＰＤＧＦＲβ自己リン酸化は、１４日目に、投与の４時間後に測定された。
【図１２Ａ】図１２Ａ−Ｂは、リンパ血管新生の有力な阻害剤としての化合物６結果を示す。（図１２Ａ）食塩水とＶＥＧＦ−Ｃマトリゲルの間の局所リンパ節リンパ血管新生モデルの画像。
【図１２Ｂ】図１２Ａ−Ｂは、リンパ血管新生の有力な阻害剤としての化合物６結果を示す。（図１２Ｂ）化合物６は、明らかにリンパ血管新生の阻害を示した。
【図１３】図１３のＡ−Ｃは、腫瘍細胞に対する典型的な化合物の成長抑制特性を示す。（図１３のＡ）化合物６はＮＣＩ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ＰｒｏｇｒａｍによってＮＣＩ６０パネルに概略され、細胞株の全パネルにわたる強力な増殖阻害によって４９０ｎＭの平均成長阻害濃度（ＧＩ５０）を実証した。従って、化合物６、３５、または３７（図１３のＢ）は、細胞増殖アッセイにおいて、ソラフェニブ、ＰＬＸ  ４７２０またはＬ７７９，４５０（図１３のＣ）と比較された。
【図１４】図１４は、ソラフェニブがＣＲＡＦ  Ｓ３３８上のリン酸化の増加を誘発し、一方、化合物６がこの増加を促進しないことを示す。
【図１５】図１５Ａ−Ｂは、典型的な化合物が前中期にＧ２／Ｍ停止（ａｒｒｅｓｔ）をもたらすことを示す。（図１５のＡ）化合物６に曝された腫瘍細胞の顕微鏡分析は、細胞が有糸分裂では丸くされ、停止され（ａｒｒｅｓｔｅｄ）、一方、ソラフェニブにより処置された細胞は、完全な（ｉｎｔａｃｔ）有系分裂の機能の証拠でもって、それらの付着性を維持したことを明らかにした。５μＭでのＰＤ０３２５９０１、化合物３、ソラフェニブ、化合物６または２００ｎＭでのパクリタキセルにより２０時間処置されたＸＰＡ−１細胞の明視野画像。（図１５のＢ）化合物３、ソラフェニブおよびＭＥＫ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）はこの効果を示さず、細胞はＤＭＳＯで処置された対照と類似しているように見える。スケールバー、２０μｍ。
【図１６】図１６は、Ｇ２／Ｍ期で種々様々の腫瘍細胞株を阻止する典型的な化合物６を示す。グラフは、０．１％のＤＭＳＯ対照と比較して、５μＭの化合物６による処置の後にＧ２／Ｍ期で停止された細胞の％を示す。グラフは、ヒト結腸（ｈＣＴ−１１６）、膵臓（Ｍｉａ−Ｐａｃａ２、ＦＧ、ＸＰＡ−１、ＢＸＰＣ３）、胸（ＭＢ−ＭＤＡ−２３１）および脳（Ｕ２５１）の癌細胞株のＧ２／Ｍ定量化を表す。エラーバーはｓ．ｄ．を表わす（ｎ  ４）。
【図１７】図１７は、化合物６がインビボで黒色腫腫瘍成長を抑制することを実証する。
【図１８】図１８のＡ−Ｃは、典型的な化合物６が乳癌においてＳ３３８のリン酸化を阻害することを立証し、これは、乳癌腫瘍成長抑制と関連する。図１８のＡにおいて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍は３日連続して処置され、腫瘍は最後のビヒクルまたは化合物６投与の１時間後に切除され、ＣＲＡＦ  Ｓ３３８上のリン酸化のために染色された。図１８のＢは、化合物６またはビヒクルによる処置の後の腫瘍成長特性を示す。図１８のＣは、インビトロでのＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞におけるｐＳ３３８  ＣＲＡＦレベルを示す。細胞は６時間の間、５μＭでのＤＭＳＯ（Ｃｔｒｌ）、化合物６またはソラフェニブにより処置され、細胞溶解物は１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で溶解され、イムノブロッティングは以下の抗体：ｐＳ３３８  ＣＲＡＦＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＣＲＡＦ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびアクチン（Ｓｉｇｍａ）、すべては１：１０００に希釈された。
【図１９】図１９のＡ−Ｃは、腫瘍細胞Ａ５４９（図１９のＡ）、Ｔ４７Ｄ（図１９のＢ）およびＭＤＡ−ＭＢ２３１（図１９のＣ）に対する細胞の生存アッセイにおける典型的な化合物６および３１−３７の高い効能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
ＲＡＦキナーゼは、内皮細胞におけるＦＧＦＲおよびＶＥＧＦＲ２シグナル伝達の下流に重要な収束点で、血管新生中に内皮細胞生存に重大な役割を果たす。間質のコンパートメントは血管新生と腫瘍成長に主に寄与する。これは、新しく形成する内皮に関係する血管周囲細胞を含み、それは、血管構造を安定させて、血管新生を促進する。ＰＤＧＦＲβは、適切な血管周囲細胞機能を促進するために不可欠な受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、それは血管を安定させて、血管成熟を可能にする。ＰＤＧＦＲβシグナル伝達は、新しく形成する血管に対する血管周囲細胞の動員、および局所微環境におけるＶＥＧＦＡ、ＦＧＦ２およびＡｎｇ１など抗血管新生分子の分泌を強める。これは、血管の安定化、および未熟な血管のネットワークを高度に順序づけられたネットワークに再形成することを促進する。血管コンパートメントの維持は、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＦＧＦ２の分泌のようなパラ分泌ループに依存し、それは、それぞれ、ＥＣ上のＶＳＭＣおよびＰＤＧＦＲα／βの上のＦＧＦＲ１の発現の増加につながる。それ故、壁および血管のコンパートメントの恒常性は、効果的な血管新生にとって重要である。
【００４１】
従って、これらの２つのコンパートメントを阻害することは、同時に、血管新生の強力な阻害を開始する。広域スペクトルの受容体チロシンキナーゼ阻害剤は利用可能であるが、目的は、新血管新生に関わる関連する経路を選択的に阻害するために限られたキナーゼ特性で化合物を設計することであった。ＲＡＦキナーゼは複数のＲＴＫの下流であり、ＥＣの増殖および生存に必要であるので、このキナーゼが標的とされ、ＰＤＧＦＲβは、血管周囲細胞の動員および血管成熟にとって重要である。
【００４２】
ＩＩ型阻害に要求される疎水的相互作用および特異的な水素結合により、キナーゼ活性部位に隣接しているアロステリック部位は、高度に保存されたヒンジ領域において活性なキナーゼ構造ともっぱら相互作用するＩ型阻害剤に対する特異性を改善するために利用されることがある。イマチニブ（１）およびソラフェニブ（２）は、それぞれの標的、Ｂ−ＲＡＦおよびＡｂｌのキナーゼドメイン、と共結晶化され、「ＤＦＧ−ｏｕｔ」構造のアロステリック部位と部分的に相互作用することが示され−「ＩＩ型」阻害と呼ばれた。イマチニブ（１）およびソラフェニブ（２）の結合様式に基づいて、インシリコスクリーニングとインビトロバイオアッセイの組み合わせを使用してＰＤＧＦＲβとＢ−ＲＡＦの両方のアロステリック部位を標的とするように設計されたアミノトリアゾールの足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）の化合物が調製された。
【００４３】
【化１１】
2013518909.tif 000013
【００４４】
【化１２】
2013518909.tif 000014
【００４５】
【化１３】
2013518909.tif 000015
【００４６】
【化１４】
2013518909.tif 000016
【００４７】
それらの中で、化合物６は、従来のインビトロのＡＴＰ依存性キナーゼアッセイを用いて無視されており（ｄｉｓｒｅｇａｒｄｅｄ）；１０μＭで、化合物６は、このスクリーニング・フォーマットでその標的のいずれも阻害しなかった（データ示さず）。ＰＤＧＦＲβについては、細胞のＩＣ５０および生化学的なＫｄは、両方ともおよそ５００ｎＭであったので（図１Ｂおよび表３）、非常によく一致し、このことは、細胞ベースのアッセイ対活性化されたキナーゼアッセイにおいて化合物６の活性の間の有意差を示す。組み換え型の酵素は完全細胞（ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌ）に関連する酵素は同じ構造的な不活性化を受けにくいので、これは驚くべきことではない。化合物６は、ＰＤＧＦＲβまたはＢ−ＲＡＦの不活性の構成を安定させることが予想されるが、それは抑制調節を受け難いこの酵素の組み換え型の活性化された形態の活性をインビトロで抑えることは期待されないかもしれない。同様に、イマチニブは、活性化ループがリン酸化されていない場合、Ａｂｌキナーゼドメインに対してり２００倍より活性である。
【００４８】
これらの化合物の中で、化合物６は、インビトロで活性化されたキナーゼを阻害せず、いずれかの標的のみの阻害によっては見られない強力な抗血管原性の効果を生むＰＤＧＦＲβ／ＲＡＦ活性の二重阻害を有する。ＰＤＧＦＲβとＲＡＦの別々の阻害剤の組み合わせは、インビボでのゼブラフィッシュおよびインビトロでの血管周囲細胞／内皮細胞管形成アッセイの両方において、化合物６の抗血管原性の効果を再現し、さらに、相乗効果の手法としてＰＤＧＦＲβとＲＡＦの二重標的化を有効にする。さらに、化合物６は、膵臓および腎臓の細胞癌の同所性の腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を抑える。化合物６は細胞のＰＤＧＦＲおよびＲＡＦを阻害したが、それはまたＦｌｔ３およびＫＩＴを破壊した（［表３］）。しかしながら、化合物３（それはＦｌｔ３、ＫｉｔおよびＰＤＧＦＲを遮断するが、ＲＡＦを阻害しない）が、血管形成を妨げなかったので（図３Ａ−Ｂ）、Ｆｌｔ３とＫＩＴは、化合物６の生物活性にとって不可欠ではない。この結果は、完全に異なる化学型を用いた図４に観察されるような増加した抗血管原性の活性に対してＰＤＧＦＲとＲＡＦの両方を阻害する相乗作用をさらに支持する。
【００４９】
同様に、偽キナーゼ（例えば、ＨＥＲ３、ＥｐｈＢ６、ＣＣＫ４、ＫＳＲ、Ｔｒｂ３、ＧＣＮ２、ＴＲＲＡＰ、ＬＩＫおよびＣＡＳＫ）（キナーゼのようなドメインを有するタンパク質）中のキナーゼ活性部位に隣接しているアロステリック部位は偽キナーゼの多様な細胞の工程を調節するために利用され得る。
【００５０】
本発明に従って、ＰＤＧＦＲβおよびＲＡＦ（例えばＡ−ＲＡＦ、Ｂ−ＲＡＦおよびＣ−ＲＡＦ）に向けられた選択的阻害剤の開発、および、血管新生と腫瘍成長の有効な阻害につながる相乗作用の組み合わせを明らかにされることが見出される。新しい臨床的に認可されたキナーゼ阻害剤は範囲が広い阻害および適切な標的の組み合わせを介して働くが、本発明の方法は、大きな相乗作用を提供する選択的な組み合わせにキナーゼ特性を狭くするために提供される。この手法は、最終的にはこれらの薬剤の治療領域を増加させて、最小限の副作用で治療上の有効性を提供する可能性を向上させる。
【００５１】
（典型的な化合物を調製する工程）
いくつかの場合において、本明細書に記載される典型的な化合物は、既知の手順または本明細書に開示される新規の手順に従って調製されている。
【００５２】
幾つかの実施形態において、式（Ｉ）のトリアゾール化合物を調製する工程が提供され：
【００５３】
【化１５】
2013518909.tif 000017
【００５４】
該方法は、塩基の存在下で、式（ＩＩ）の化合物
【００５５】
【化１６】
2013518909.tif 000018
【００５６】
を、式（ＩＩＩ）の化合物
【００５７】
【化１７】
2013518909.tif 000019
【００５８】
と反応させる工程を含み、ここで、Ｗは、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、キナゾリン、キノキサリン、１，２，４−ベンゾトリアジンおよびアザインドールからなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、−ＮＨ２、−ＯＨ、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、−ＳＣＦ３および随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり；Ｒ３は、独立して、水素、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、またはハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシであり、または、随意に、２つのＲ３は、５〜７員の炭素環式化合物を形成するように結合され；およびｍは１−５である。（模式図１を参照）
【００５９】
【化１８】
2013518909.tif 000020
【００６０】
１つの実施形態において、トリアゾール形成は、塩基、好ましくはアミン塩基；より好ましくは２，６−ルチジンを含む適切な溶媒下で良い収量で達成される。特定の実施形態において、式（ＩＩ）の化合物の式（ＩＩＩ）の化合物に対するモル比は、０．６：１から０．９：１までの範囲にある。
【００６１】
本明細書で提供されるトリアゾール形成は、多くのヒドラジド前駆物質に適用可能である。例えば、Ｗが、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、キナゾリン、キノキサリン、１，２，４−ベンゾトリアジン、アザインドールなどである場合、その反応は適用可能である。Ｗとフェニル環の間の結合は、エーテル、チオエテールまたはアミン結合であり得る。式（ＩＩＩ）のＳ−メチルチオ尿素は、メチル化の際（例えばＭｅＩ）、そのチオ尿素前駆物質からインサイツで調製される。適切な溶媒（ヒドラジド前駆物質およびインサイツのＳ−メチルチオ尿素の溶解度によって決定される）および塩基が使用されると、満足すべき純度で良い収量を達成することができる。その後、トリアゾール化合物は、時間のかかる及び／又は労働集約型のカラムクロマトグラフイーを用いることなく、次の工程（例えば塩調製）に直接移ることができる。
【００６２】
例えば、制限されないが、当業者は以下のヒドラジド前駆物質を使用してもよい。
【００６３】
【化１９】
2013518909.tif 000021
【００６４】
幾つかの実施形態において、式（Ｉ）、好ましくは式（Ｉａ）の化合物
【００６５】
【化２０】
2013518909.tif 000022
【００６６】
は、塩基の存在下で、式（ＩＩａ）の化合物
【００６７】
【化２１】
2013518909.tif 000023
【００６８】
を、式（ＩＩＩａ）の化合物
【００６９】
【化２２】
2013518909.tif 000024
【００７０】
と反応させることから調製することができ、ここで、Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、−ＮＨ２、−ＯＨ、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、−ＳＣＦ３、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり、およびＲ３は、水素、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、またはハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシである。特定の実施形態において、式（ＩＩａ）の化合物の式（ＩＩＩａ）の化合物に対するモル比は、０．６：１から０．９：１まで範囲にある。その工程は、満足な純度で式（Ｉａ）の化合物を提供し、それ故、クロマトグラフィー精製をほとんどまたはまったく必要としないように最適化されている。一般に、工程の後、粗生成物（ｔｈｅ  ｃｒｕｄｅ）は、例えば、その塩を調製するために、次の工程に備えた状態になっている。
【００７１】
【化２３】
2013518909.tif 000025
【００７２】
幾つかの実施形態において、式（Ｉ）、好ましくは、式（Ｉｂ）の化合物
【００７３】
【化２４】
2013518909.tif 000026
【００７４】
は、塩基の存在下で、式（ＩＩａ）の化合物
【００７５】
【化２５】
2013518909.tif 000027
【００７６】
を、式（ＩＩＩｂ）の化合物
【００７７】
【化２６】
2013518909.tif 000028
【００７８】
と反応させることから調製することができ、ここで、Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、−ＮＨ２、−ＯＨ、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、−ＳＣＦ３、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり；ＲｍはＣ１−６アルキル、または、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキであり；Ｒ３は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、あるいはＣ３−１０シクロアルキルであり；または、随意に、ＲｍおよびＲ３は、５〜７員の炭素環式化合物を形成するように結合され；およびｎは、０〜４である。特定の実施形態において、式（ＩＩａ）の化合物の式（ＩＩＩｂ）の化合物に対するモル比は、０．６：１から０．９：１まで範囲にある。その工程は、満足な純度で式（Ｉｂ）の化合物を提供し、それ故、クロマトグラフィー精製をほとんどまたはまったく必要としないように最適化されている。一般に、工程の後、粗生成物は、例えば、その塩を調製するために、次の工程に備えた状態になっている。
【００７９】
塩基の性質は、収量を最大にするのに重大であることが分かっている。幾つかの実施形態において、その工程に使用される塩基は、アミン塩基、好ましくは、２，６−ルチジンである。
【００８０】
溶媒の選択がトリアゾール形成の純度および収量に影響を与えることが見出されている。幾つかの実施形態において、本明細書においてトリアゾール形成の工程に使用される溶媒は、アセトニトリル、ＤＭＦ、Ｎ−メチル−ピロリド−２−オン（ＮＭＰ）、ｔＢｕＯＨまたはｉＰｒＯＨである。
【００８１】
他の実施形態において、式（Ｉ）、（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物を調製する工程が提供され、ここで、Ｒ１は、水素、−ＮＨ２および随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、−ＳＣＦ３、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換アルキルスルホニルである。例えば、Ｒ１は、−Ｈ、−ＮＨ２、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−ＳＭｅ、−ＳＥｔ、−ＳｔＢｕ、−ＳＯ２Ｍｅ、−ＳＣＦ３などであり得る。
【００８２】
他の実施形態において、式（Ｉ）、（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物を調製する工程が提供され、ここで、Ｒ２は、水素、−ＮＨ２または随意の置換されたアルコキシである。例えば、Ｒ２は、−Ｈ、−ＮＨ２、−ＮＨＭｅ、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−ＯＣＦ３などであり得る。
【００８３】
他の実施形態において、式（Ｉ）、（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物を調製する工程が提供され、ここで、Ｒ１とＲ２は、独立して、随意の置換されたアミンである。例えば、Ｒ１及び／又はＲ２は、−ＮＨ２、−ＮＨＭｅなどであり得る。
【００８４】
他の実施形態において、式（Ｉ）、（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物を調製する工程が提供され、ここで、Ｒ１は随意の置換されたチオアルキルであり、Ｒ２は随意の置換されたアミンである。例えば、Ｒ１は、−ＳＭｅ，−ＳＥｔ、−ＳｔＢｕ、−ＳＣＦ３などであり得、およびＲ２は、−ＮＨ２、−ＮＨＭｅなどであり得る。特定の実施形態において、Ｒ１はＭｅＳであり、Ｒ２はＮＨ２である。
【００８５】
１，２，４−トリアゾールの場合には、以下に示されるような３つの互変異性構造体が存在する。
【００８６】
【化２７】
2013518909.tif 000029
【００８７】
どの互変異性構造体が多くある（ｐｒｅｖａｉｌｉｎｇ）かは、トリアゾール部分上の置換基に、および反応条件に依存する。当業者に公知なように、典型的には１Ｈ−１，２，４−トリアゾールは、特にアミノ置換基が環へ付けられているならば、最も一般的な互変異性型である。たとえ３つの互変異性構造体がすべて存在することができても、１，２，４−トリアゾール部分を有する一般的な構造体および全ての例は、簡略さのために、および１，３，４−オキサジアゾール部分を含む例などのその直接的なアナログと比較するために、本明細書において、４Ｈ−１，２，４−トリアゾールのような１つの互変異性型で示される。簡略さのために構造を描くために４Ｈ互変異性型のみを使用することは、本明細書に提供されるトリアゾール化合物がその具体的な互変異性型に存在することを示唆しない。
【００８８】
本発明に従うと、式（ＩＶ）の化合物を調製するための工程が提供され：
【００８９】
【化２８】
2013518909.tif 000030
【００９０】
該工程は、式（Ｖ）の化合物
【００９１】
【化２９】
2013518909.tif 000031
【００９２】
を、式（ＶＩ）の化合物
【００９３】
【化３０】
2013518909.tif 000032
【００９４】
と、塩基の存在下で反応させる工程を含み、ここで、Ｌは、離脱基、例えばクロライド、トシラート、または他の適切な離脱基であり；Ｙは−ＳＨ、−ＯＨまたは−ＮＨ２であり；ここで、Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換された保護アミン、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり、およびＲ４は、Ｃ１−６アルキルである。その後、式（ＩＶ）の化合物はトリアゾール形成に適したヒドラジドに転換される（模式図３）。
【００９５】
【化３１】
2013518909.tif 000033
【００９６】
特定の実施形態において、式（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＶａ）の構造
【００９７】
【化３２】
2013518909.tif 000034
【００９８】
を有する化合物であり、および式（Ｖ）の化合物は、（Ｖａ）の構造
【００９９】
【化３３】
2013518909.tif 000035
【０１００】
を有する化合物であり、および式（ＶＩ）の化合物は、アルキルのヒドロキシベンゾアートである。本明細書に提供される式（ＩＶ）の化合物を調製する工程は、Ｒ１及び／又はＲ２がＢｏｃ保護アミンである場合、非常に穏やかな条件の下、例えば、約２５−３５℃（室温）である。その工程は、満足な純度で式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物を提供するように最適化されており、従って、クロマトグラフィー精製をほとんどまたはまったく必要としない。一般に、その工程の後、粗生成物は次の工程に使用されることができる。
【０１０１】
幾つかの実施形態において、式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物を調製する工程のために使用される塩基は、アミン塩基であり；好ましくは、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンである。他の実施形態において、メチル４−ヒドロキシベンゾアートが工程の中で使用される。
【０１０２】
他の実施形態において、式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物を調製する工程が提供され、ここで、Ｒ１は、水素、随意の置換された保護アミン、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルである。例えば、Ｒ１は、−Ｈ、−ＮＨ２、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−ＳＭｅ、−ＳＥｔ、−ＳｔＢｕ、−ＳＯ２Ｍｅ、−ＳＣＦ３などであり得る。
【０１０３】
他の実施形態において、式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物を調製する工程が提供され、ここで、Ｒ２は、水素、随意の置換された保護アミン、または随意の置換されたアルコキシである。例えば、Ｒ２は、−Ｈ、−ＮＨ２、−ＮＨＭｅ、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−ＯＣＦ３などであり得る。
【０１０４】
他の実施形態において、式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物を調製する工程が提供され、Ｒ１とＲ２は、独立して、随意の置換された保護アミンであり；好ましくは、随意の置換された保護アミンは、Ｂｏｃのような酸不安定保護基（ａｃｉｄ  ｌａｂｉｌｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）によって保護される。例えば、Ｒ１及び／又はＲ２は、−ＮＨ２、−Ｎ（Ｂｏｃ）Ｍｅ、−Ｎ（Ｂｏｃ）２などであり得る。好ましくは、Ｒ１とＲ２は独立して−Ｎ（Ｂｏｃ）２である。
【０１０５】
他の実施形態において、Ｒ１は随意の置換されたチオアルキルであり、およびＲ２は、随意の置換された保護アミン、好ましくは−Ｂｏｃなど酸性の不安定な保護基を有するアミンであることを特徴とする工程が提供される。例えば、Ｒ１は、−ＳＭｅ、−ＳＥｔ、−ＳｔＢｕ、−ＳＣＦ３などであり得、およびＲ２は、−ＮＨ（Ｂｏｃ）、−Ｎ（Ｂｏｃ）Ｍｅ、−Ｎ（Ｂｏｃ）２などであり得る。幾つかの実施形態において、ここで式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物を調製する工程が提供され、Ｒ１はａ−ＳＭｅであり、およびＲ２は−Ｎ（Ｂｏｃ）２である。
【０１０６】
（投与方法及び治療計画の例）
１つの態様において、化合物（すなわち、本明細書中に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）を含む組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与される。治療用途において、組成物は、すでに疾患、障害又は疾病を患う患者に、その疾患、障害又は疾病の症状を治療するか又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で、投与される。この使用に有効な量は、疾患、障害又は疾病の重症度及び経過、以前の治療、患者の健康状態、体重、薬物への反応、および治療に当たる医師の判断に依存する。
【０１０７】
予防上の適用において、化合物（すなわち、本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）を含有する組成物は、特定の疾患、障害、又は疾病の影響を受け易く、またはその危険に曝されている患者に投与される。このような量は、「予防的に有効な量又は用量」と定義される。この使用において、正確な量もまた、患者の健康状態、体重などに依存する。幾つかの実施形態において、患者に使用されると、この使用に有効な量は、疾患、障害、又は疾病の重症度および経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物への反応、および処置に当たる医師の判断に依存する。
【０１０８】
幾つかの実施形態において、患者の疾病が改善しない場合、医師の判断で、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）の投与は、患者の疾患、障害又は疾病の症状を改善させるか、さもなければ抑制又は制限するために、慢性的に、即ち、患者の寿命が尽きるまでの間を含む、長期間、投与され得る。
【０１０９】
幾つかの実施形態において、患者の状態が改善する場合、医師の判断で、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）の投与は、継続的に行われ得；あるいは、投与される薬物の投与量を、特定の期間、一時的に減らしたり、一時的に中止したりすることもある（すなわち、「休薬期間」）。他の実施形態において、休薬期間の長さは、２日から１年までの間で変えられ、ほんの一例として、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約１０日、約１２日、約１５日、約２０日、約２８日、約３５日、約５０日、約７０日、約１００日、約１２０日、約１５０日、約１８０日、約２００日、約２５０日、約２８０日、約３００日、約３２０日、約３５０日、または約３６５日を含む。さらなる実施形態において、休薬期間中の投与量の減少は、約１０％から約１００％の間で、ほんの一例として、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％である。
【０１１０】
一旦患者の症状が改善すると、必要ならば維持量が投与される。続いて、他の実施形態において、投与の量もしくは頻度、またはその両方が、その症状の関数として、改善された疾患、障害、または疾病が維持される量まで減らされる。しかしながら、さらなる実施形態において、患者は、いかなる症状の再発時にも長期的に間欠的処置を必要とするだろう。
【０１１１】
他の実施形態において、そのような量に相当する所与の薬剤の量は、具体的な化合物、処置を必要とする被験体または宿主の疾患、障害または疾病およびその重症度、アイデンティティ（例えば体重）などの要因に依存して変わるが、それにもかかわらず、例えば、投与されている具体的な薬剤、投与経路、処置されている疾病、および処置されている被験体または宿主を含む症例を取りまく具体的な環境に応じた様式で定めることができる。しかしながら、いくつかの実施形態において、成人ヒトの処置に用いられる投与量は、典型的には、一日当たり約０．０２から約５０００ｍｇ、または、一日当たり約１ｍｇから約１５００ｍｇである。さらなる実施形態において、所望の投与量は、単回投与で、または同時に（もしくは短時間にわたって）投与される、または適切な間隔、例えば一日に２回、３回、４回、またはそれ以上の下位投与量として投与される分割用量で、都合よく提供される。
【０１１２】
幾つかの実施形態において、本明細書中に記載される医薬組成物は、正確な投与量の単回投与に適した単位剤形である。単位剤形において、製剤は、１以上の化合物の適量を含有する単位用量に分割される。他の実施形態において、単位用量は、製剤の離散量を含有する包装された形状であってもよい。制限しない例は、包装された錠剤又はカプセル剤、及びバイアル又はアンプル中の粉末である。別の実施形態において、水性懸濁液組成物は、単回用量用の再密閉できない容器に包装される。さらなる実施形態において、複数回用量用の再密閉できる容器が使用され、この場合は、組成物中に保存剤を含むことが一般的である。ほんの一例として、非経口注射用の製剤は、単位剤形で提供され、この形態は、防腐剤を加えたアンプル、又は複数回投与用の容器を含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
本明細書に記載される合物（すなわち、アロステリックキナーゼ阻害剤）に適した１日の投与量は、体重あたり約０．０１から約２．５ｍｇ／ｋｇまでである。限定されないが、ヒトを含む、大型哺乳類における示される１日の投与量は、約０．５ｍｇから約１００ｍｇの範囲であり、限定されないが、一日に４回までを含む、分割量で、又は徐放形態で都合よく投与される。経口投与に適切な単位剤形は、約１ｍｇから約５０ｍｇの活性成分を含む。個々の処置レジメンに関する変数の数が大きいため、前述の範囲は単に示唆的なものでしかなく、これらの推奨値からかなり外れることはまれではない。さらなる実施形態において、このような投与量は、限定されないが、使用される化合物の活性、処置される疾患、障害又は疾病、投与の形式、個々の被験体の要件、処置されている疾患、障害又は疾病の重症度、及び医師の判断の多くの変数によって変化し得る。
【０１１４】
別のさらなる実施形態において、このような処置レジメンの毒性および治療効果は、限定されないが、ＬＤ５０（個体群の５０％致死量）およびＥＤ５０（個体群の５０％における治療上有効な用量）の決定などを含む細胞培養物または実験動物における標準の薬学的手順により定められる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、幾つかの実施形態において、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比率として表現される。他の実施形態において、細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトに使用するための様々な投与量を調剤する際に使用され得る。いくつかの実施形態において、このような化合物の１日の投与量は、最小限の毒性でのＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。別の更なるの実施形態において、投与量は、用いられる剤形及び利用される投与の経路によって、この範囲内で変化する。
【０１１５】
（リンパ血管新生、血管新生及び／又は腫瘍の増殖）
本明細書には、リンパ血管新生、血管新生及び／又は腫瘍の増殖を阻害する又は妨げるための方法が提供され、該方法は、腫瘍を、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と接触させる工程を含む。幾つかの実施形態において、その方法のための化合物は選択的ＩＩ型阻害剤であり；好ましくはＲＡＦキナーゼ（例えばＢ−ＲＡＦキナーゼ）の選択的ＩＩ型阻害剤であり；より好ましくは、化合物はまた、ＰＤＧＦ受容体の選択的ＩＩ型阻害剤である。幾つかの実施形態において、その方法のための化合物はＡ−ＲＡＦを調節する。他の実施形態において、その方法のための化合物は、ＣＲＡＦによるＢＲＡＦのヘテロ二量体化を阻害する。幾つかの実施形態において、化合物は、Ｃ−ＲＡＦのＳ３３８のリン酸化を阻害する。別の実施形態において、化合物は、群Ｂ−ＲＡＦ、Ｃ−ＲＡＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｆｌｔ３、Ｋｉｔ、およびＰＤＧＦＲβから選択される活性キナーゼを阻害しない。幾つかの実施形態において、化合物は、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｆｌｔ３及び／又はｃ−Ｋｉｔのアロステリック阻害剤である。幾つかの実施形態において、化合物は、構造
【０１１６】
【化３４】
2013518909.tif 000036
【０１１７】
を有し、ここで、Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、−ＮＨ２、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり；Ｚは、ＮＨ、ＳまたはＯであり；Ｚ’はＮまたはＣであり；およびＡｒは、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、およびＣ３−１０シクロアルキルから選択される１つ以上の置換基により随意に置換されたフェニルまたは二環式フェニルである。幾つかの実施形態において、化合物は、構造
【０１１８】
【化３５】
2013518909.tif 000037
【０１１９】
を有し、ここで、ＲｍはＣ１−６アルキル、またはハロゲンで置換されたＣ１−６アルキであり；およびＲ３は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、あるいはＣ３−１０シクロアルキルであり；または随意に、ＲｍおよびＲ３は、５〜７員の炭素環式化合物を形成するように結合され；ｎは、０−４である。特定の実施形態において、化合物は、構造
【０１２０】
【化３６】
2013518909.tif 000038
【０１２１】
を有し、ここで、Ｒ３は水素またはハロゲンであり；およびＺはＮＨ、ＳまたはＯである。別の実施形態において、化合物は、以下
【０１２２】
【化３７】
2013518909.tif 000039
【０１２３】
【化３８】
2013518909.tif 000040
【０１２４】
【化３９】
2013518909.tif 000041
【０１２５】
【化４０】
2013518909.tif 000042
【０１２６】
から選択される。
【０１２７】
本明細書に使用されるような用語「アルキル」は、直鎖の、分枝鎖の、または環式の（この場合、「シクロアルキル」としても知られる）１−１０の炭素原子を含む炭化水素を意味する。アルキルの代表的な例は、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル基、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニルおよびｎ−デシルを含む。
【０１２８】
用語「炭素環式」又は「炭素環」は、環を形成する原子の各々が炭素原子である環を表す。炭素環は、アリール及びシクロアルキルを含む。従って、該用語は、環骨格（ｒｉｎｇ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）が、炭素とは異なる少なくとも１の原子（即ちヘテロ原子）を包含する複素環（「複素環式」）と、炭素環を区別する。複素環は、ヘテロアリール及びヘテロシクロアルキルを含む。炭素環及び複素環は、随意に置換され得る。下記は、幾つかの代表的な炭素環式化合物を示す。
【０１２９】
【化４１】
2013518909.tif 000043
【０１３０】
本明細書に定義されるように、用語「随意に置換された」は、言及された基が、本明細書に定義されるようなゼロまたは１若しくはそれ以上の置換基によって置換されることを意味する。
【０１３１】
本明細書で使用されるように、用語「スルフィニル」は、−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒを指し、ここで、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、（環炭素を介して結合される）ヘテロアリール、及び（環炭素を介して結合される）ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される。
【０１３２】
本明細書で使用されるように、用語「スルホニル」は、−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｒを指し、ここで、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、（環炭素を介して結合される）ヘテロアリール、及び（環炭素を介して結合される）ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される。
【０１３３】
リンパ管系は、組織液恒常性の維持に、免疫反応のａｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｈａｓｅにおいて、および癌の転移（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｓｐｒｅａｄ）において重要な役割を果たす。血管内皮細胞成長因子−Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）およびＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦ受容体−２（ＶＥＧＦＲ−２）およびＶＥＧＦＲ−３を活性化する分泌性糖タンパク質であり（Ａｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：  ５４８−５５３；  Ｊｏｕｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １５：  ２９０−２９８）−それぞれ、血管およびリンパの内皮上で優勢に発現する細胞表面受容体チロシンキナーゼである（検討のために、Ｓｔａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １６：  ９２２−９３４，  ２００２をｓ参照）。ＶＥＧＦＲ−３は、リンパ血管新生の信号を送り（Ｖｅｉｋｋｏｌａら、（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：１２２３−１２３１）、一方、ＶＥＧＦＲ−２は血管新生の信号を送ると考えられる。ヒトＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄはインビボでの血管新生およびリンパ血管新生の両方を刺激する（例えば、Ｂｙｚｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｂｌｏｏｄ  ９９：  ４４３４−４４４２；Ｖｅｉｋｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２０：  １２２３−１２３１；  Ｍａｒｃｏｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：  ９６７１−９６７６を参照）。
【０１３４】
リンパ管が、急性および慢性の炎症に活発に関係するという証拠も増加している。リンパ血管新生も慢性の気道炎症の実験モデルで観察されてきた。皮膚のＵＶＢ照射はまた、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）−Ａの高められた発現を結果として生じ、ＶＥＧＦ−Ａの全身性の遮断は、マウスにおいて、ＵＶＢに誘発されたリンパ管異常性および皮膚炎症を減じるように導き、これは、リンパ管機能のＶＥＧＦ−Ａ媒介性機能障害は、浮腫の形成および炎症を促進することを示す。従って、活性状態でのプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤でない化合物によって、不活性状態のプロテインキナーゼを安定させるプロテインキナーゼ（例えばＢ−ＲＡＦキナーゼ）の選択的ＩＩ型阻害剤は、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄの活性化を遮断するために使用することができ、それによって、血管新生、リンパ血管新生および部分的に処理された、または完全に処理されたＶＥＧＦＣまたはＶＥＧＦによって誘発される他の生物学的作用を阻害する。
【０１３５】
（偽キナーゼ）
幾つかの実施形態において、ヒト被験体において癌を処置するための本明細書に記載の方法は、偽キナーゼを結合する化合物を、必要とする患者に投与する工程を含む。特定の実施形態において、偽キナーゼは、ＲＡＳ（ＫＳＲ）のキナーゼサプレッサー（ＫＳＲ）である。
【０１３６】
プロテインキナーゼドメインのいくつかの構造と配列相同性の研究は、触媒活性に必要とされる一般的モチーフであるものの一致（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）を明らかにした。幾つかの場合において、これらは、ヌクレオチド（ＡＴＰ）結合、金属イオン（Ｍｇ２＋）結合、およびフォスフォリル基転移に必要な残基に必要な残基を含む。第３の最も一般的な機能的なドメインを表わす５１８の既知のヒトプロテインキナーゼがある。興味深いことには、ｋｉｎｏｍｅの約１０％は、触媒作用に必要とされるモチーフの少なくとも１つを欠くように思われ、偽キナーゼと称された。
【０１３７】
いくつかの研究は、偽キナーゼドメインに影響を与える変異が、それぞれ、それらのパートナー偽キナーゼモジュレーター、ＳＴＲＡＤ、ＫＳＲおよびＪａｋ２  ＪＨ２ドメインによる、ＬＫＢ１、ＲａｆおよびＪａｋ２を含むいくつかの臨床的に重要なキナーゼの触媒能力の調節異常の基礎となることを示す。これらの研究は、シグナル伝達の偽キナーゼ媒介性調節異常と、癌および血球悪性腫瘍を含む多くの疾患との間のつながりを提供する。典型的な偽キナーゼが本明細書で提供される。
【０１３８】
（ＳＴＲＡＤα）
Ｓｔｅ２０に関連するアダプター（ＳＴＲＡＤαとＳＴＲＡＤβ）アイソフォームはＬＫＢ１のヘテロ三量体の腫瘍サプレッサー複合体の一部である。アダプタータンパク質ＭＯ２５と一緒に、ＳＴＲＡＤは、ＬＫＢ１活性化ループリン酸化を必要としないアロステリック機構を介してＬＫＢ１キナーゼを活性化する。（Ｚｅｑｉｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９；  ３２６（５９６０）：  １７０７−１７１１）グリシンに富んだループにおける変化にもかかわらず、第３のコンセンサスグリシンはＭｅｔ８３と交換されており、ＳＴＲＡＤαの結晶構造は、ＳＴＲＡＤαが低いナノモルの親和性でＡＴＰを結合することができ、標準の「活性な」キナーゼ構造に典型的であるキナーゼの折り畳み（ｆｏｌｄ）を保持することを明らかにした。（Ｚｅｑｉｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ２００９；７（６）：ｅ１０００１２６）  ＳＴＲＡＤαの活性な構造は、ＡＴＰのみでなくその結合パートナーＭＯ２５を結合することにより調節されることが示された。ＡＴＰおよびＭＯ２５結合の喪失は、ＳＴＲＡＤがＬＫＢ１キナーゼを活性化する能力に影響を与える。これは、ＳＴＲＡＤαの「活性な」構造が重要な役割を果たすことを示唆する。
【０１３９】
（ＩＬＫ）
インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）は、釣り餌タンパク質（ｂａｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）としてインテグリンβ１による酵母ツーハイブリッドスクリーニング法を行う間に元来確認された５９ｋＤａタンパク質である  （Ｈａｎｎｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。その発見以来、ＩＬＫは、細胞移動、細胞増殖、細胞接着、シグナル伝達を含む複数の細胞機能に関係している。インテグリン−結合キナーゼ（ＩＬＫ）は、β−１インテグリンの細胞質ドメインと相互に作用する。この遺伝子は、４つのアンキリン様反復で、セリン／トレオニンプロテインキナーゼをコード化し、それはベータ・インテグリンの細胞質ドメインと関連し、インテグリン媒介性シグナル伝達を規制する近位の受容体キナーゼとして作用する。同じタンパク質をコード化する複数の代わりにスプライスされた転写変異体は、この遺伝子について見出された。ＩＬＫは、ＰＩＮＣＨおよびパルビン（ｐａｒｖｉｎ）（いわゆるＩＰＰ複合体）とともにヘテロ三量体の複合体の一部である。例えばＬｅｇａｔｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００６；７（１）：２０−３１を参照。α−パルビンへ結合したＩＬＫの最近の結晶構造は、ＩＬＫ機能の分子的基礎を明らかにしており、なぜＩＬＫが任意の基質をリン酸化することができないのか説明する（Ｆｕｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９；  ３６（５）：８１９−８３０）。ＩＬＫ−α−パルビン複合体構造の顕著な特徴は、グリシンに富んだループにおける重要なグリシン残基のいくつかの非保存的置換にもかかわらず、ＩＬＫヌクレオチド結合ポケットにおけるＡＴＰの存在である。
【０１４０】
（ＨＥＲ３）
ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３は、ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２およびＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４も含む、チロシンキナーゼ受容体のヒト表皮増殖ファミリー（ＨＥＲ）のメンバーである。４つのメンバーのうち、ＨＥＲ３は、触媒作用にとって重要な１１の残基のうちの２つを欠くので、偽キナーゼとして分類される。ＥＧＦ受容体に結合するリガンド上で、細胞内のキナーゼドメインは活性な非対称の二量体の形成を結果として生じるホモ二量体化およびヘテロ二量体化を受ける。ＥｒｂＢ３／Ｈｅｒ３は、ヒトにおいてＥＲＢＢ３遺伝子によってコード化される酵素である。この遺伝子は、受容体チロシンキナーゼの表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーをコード化する。この膜結合型のタンパク質は、ニューレグリン結合ドメインを有するが、活性なキナーゼドメインは有さない。それ故、それは、このリガンドを結合することができるが、タンパク質のリン酸化を介し細胞へシグナルを伝えることができない。しかしながら、それは、キナーゼ活性を有している他のＥＧＦレセプターファミリーメンバーとヘテロ二量体を形成する。ヘテロ二量体化は、細胞の増殖または分化につながる経路の活性化をもたらす。この遺伝子の増幅及び／又はそのタンパク質の過剰発現は、前立腺、膀胱および胸壁腫瘍を含む多数の癌において報告された。
【０１４１】
（ＶＲＫ３）
ＶＲＫ３（牛痘関連キナーゼ３（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  ３））は、１１の活性部位残基のうちの６つの残基の置換に起因して触媒能力を欠く。ＶＲＫ３の構造は、これらの触媒のモチーフの非保存的置換がどのようにＶＲＫ３触媒適格（ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）を損なうかを明らかにする。グリシンに富んだループ（残基Ａｓｐ１７５）および残基Ｇｌｎ１７７からの小さなグリシン残基の置換は、ＡＴＰ結合、ひいては、触媒能力に対して有害な効果を示す。置換はＡＴＰのリン酸塩部分と競合することが予想される。これらの構造の観察と一致して、ＶＲＫ３はヌクレオチドを結合できない。ＶＲＫ３構造は、密接に関連する活性キナーゼＶＲＫ２の構造に類似している。最近の研究は、ＶＲＫ３直接結合は、牛痘Ｈ１関連（ＶＨＲ）ホスファターゼ、ＥＲＫを脱リン酸化し不活性化する二重特異性ホスファターゼ、を阻害することを示唆する（例えば、  Ｋａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００６；８（８）：８６３−８６９；    Ｋａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００８；１７８３（１）：４９−５８を参照）。従って、ＶＲＫ３は、ＥＲＫ活性の阻害を介してＭＡＰキナーゼシグナル伝達を調節する。
【０１４２】
（ＫＳＲ）
タンパク質のＲａｓファミリーのキナーゼサプレッサー（ＫＳＲ）は、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫカスケードの異なるコンポーネントを集めることによってＲａｓシグナル伝達のモジュレーターとして機能する分子の足場の保存された群を含む。これらの予想された偽キナーゼは、ＭＡＰキナーゼ経路の３つのコンポーネント（ＭＡＰＫＫＫ、ＭＡＰＫＫおよびＭＡＰＫ）を集める足場として作用し、その結果、シグナル伝達出力および増強作用を調節する。ＫＳＲ１の偽キナーゼドメインはＭＥＫとＲＡＦを結合し、一方、ＥＲＫは、偽キナーゼドメインに対する保存ドメインＮ末端を介してシグナル伝達複合体に補充される。さらに、ＫＳＲ２をＭＡＰキナーゼシグナル伝達の重要な足場（ＫＳＲ１に類似している）として確立した最近の研究は、ＫＳＲ２は、Ｃａ２＋レベルの変化に応じてカルシニューリンによる脱リン酸によって規制することができることを明らかにする。（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９；３４（６）：６５２−ｂ６６２）  ＫＳＲタンパク質が、Ｓ／ＴキナーゼのＲａｆファミリーのメンバーに類似していて、それ自体、キナーゼのチロシ様キナーゼ（ＴＬＫ）に含まれる。ここまで確認されたすべてのＫＳＲタンパク質は、保存領域（ＣＡ）１からＣＡ５と名付けられた５つの異なるドメインの全てまたは幾つかを有する。
【０１４３】
（癌の処置）
幾つかの実施形態において、ヒト被験体において癌を処置するための本明細書に記載の方法は、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物を、必要とする患者に投与する工程を含む。特定の実施形態において、癌は、耐性があり、難治性であり、またはプロテインキナーゼのＩ型阻害剤に反応しない。特定の実施形態において、癌は、耐性があり、難治性であり、またはパン−ＲＡＦキナーゼまたはＡＴＰ拮抗阻害剤に反応しない。特定の実施形態において、癌は、耐性があり、難治性であり、またはソラフェニブ、ＰＬＸ４０３２、ＸＬ２８１、ＲＡＦ２６５、８８５−Ａ、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９４５０、ＡＺ６２８、ＡＡＬ８８１、ＬＢＴ６１３、ＭＣＰ１１０、１７−ＤＭＡＧ、ＣＩ１０４０、ＡＺＤ６２４４／ＡＲＲＹ１４２８８６、ＰＤ０３２５９０１、ＳＢ５９０８８５、ＤＰ３３４６、およびＤＰ２５１４から選択される薬物に反応しない。特定の実施形態において、癌は、耐性があり、難治性であり、またはＶＥＧＦ標的化治療に反応しない。特定の実施形態において、癌は、ＲＡＦキナーゼの変異体形態に関係し；好ましくは、変異体形態は、変異体Ｔ５２９Ｉ、Ｔ５２９Ｎ、Ｇ４６４Ａ、Ｇ４６４Ｅ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ａ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｅ、Ｎ５８１Ｓ、Ｅ５８６Ｋ、Ｆ５９５Ｌ、Ｇ５９６Ｒ、Ｌ５９７Ｖ、Ｌ５９７Ｒ、Ｔ５９９Ｉ、Ｖ６００ＥおよびＫ６０１Ｅから選択されるＢＲＡＦキナーゼである。別の実施形態において、変異体形態は、Ｔ４２１ＮとＴ４２１Ｉから選択されるＣＲＡＦゲートキーパー変異体である。他の実施形態において、癌は、黒色腫、乳癌、結腸癌、膵臓癌、肺癌（例えば肺非小細胞癌）、腎臓癌、膠芽腫および結腸癌から選択される。特定の実施形態において、癌は間質が豊富な腫瘍を特徴とする。特定の実施形態において、癌は、Ｎ−Ｒａｓ、Ｂ−ＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）、Ｂ−ＲＡＦ／Ｒａｓ、ＨＥＲ１、Ｋ−ＲａｓまたはＰＩ３Ｋから選択される変異または異常を有する。特定の実施形態において、癌は、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のアップレギュレーションを示す。幾つかの実施形態において、その方法のための化合物は選択的ＩＩ型阻害剤であり；好ましくはＲＡＦキナーゼ（例えばＢ−ＲＡＦキナーゼ）の選択的ＩＩ型阻害剤であり；より好ましくは、化合物も、ＰＤＧＦ受容体の選択的ＩＩ型阻害剤である。幾つかの実施形態において、化合物は、Ａ−ＲＡＦを調節する。他の実施形態において、その方法のための化合物は、ＣＲＡＦによるＢＲＡＦのヘテロ二量体化を阻害する。幾つかの実施形態において、化合物は、Ｃ−ＲＡＦのＳ３３８のリン酸化を阻害する。別の実施形態において、化合物は、群Ｂ−ＲＡＦ、Ｃ−ＲＡＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｆｌｔ３、ＫｉｔおよびＰＤＧＦＲβから選択される活性キナーゼを阻害しない。
幾つかの実施形態において、化合物は、Ｇ２／Ｍ期に腫瘍細胞を阻止する。ある実施形態において、化合物はＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｆｌｔ３及び／又はｃ−Ｋｉｔのアロステリック阻害剤である。幾つかの実施形態において、化合物は、アミノ−トリアゾール足場を含む。幾つかの実施形態において、化合物は、構造
【０１４４】
【化４２】
2013518909.tif 000044
【０１４５】
を有し、
ここで、Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、−ＮＨ２、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり；Ｚは、ＮＨ、ＳまたはＯであり；Ｚ’はＮまたはＣであり；およびＡｒは、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、またはＣ３−１０シクロアルキルから選択される１つ以上の置換基により随意に置換されたフェニルまたは二環式フェニルである。特定の実施形態において、化合物は、構造
【０１４６】
【化４３】
2013518909.tif 000045
【０１４７】
を有し、ここで、ＲｍはＣ１−６アルキル、またはハロゲンで置換されたＣ１−６アルキであり；およびＲ３は独立して水素、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、あるいはＣ３−１０シクロアルキルであり；または随意に、ＲｍとＲ３は、５〜７員の炭素環式化合物を形成するように結合され；ｎは、０−４である。特定の実施形態において、化合物は、構造
【０１４８】
【化４４】
2013518909.tif 000046
【０１４９】
を有し、ここで、Ｒ３は水素またはハロゲンである；およびＺはＮＨ、ＳまたはＯである。別の実施形態において、化合物は以下から選択される。
【０１５０】
【化４５】
2013518909.tif 000047
【０１５１】
【化４６】
2013518909.tif 000048
【０１５２】
【化４７】
2013518909.tif 000049
【０１５３】
特定の実施形態において、化合物は、必要とする患者に経口で投与される。幾つかの実施形態において、患者は、抗血管原性の治療、化学療法または放射線治療から選択される治療も提供される。他の実施形態において、化合物に対する患者の反応は、ＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化の阻害によってモニタリングされる。
【０１５４】
幾つかの実施形態において、本明細書に提供される方法によって処置される癌は、限定されないが以下を含む：噴門：肉腫（血管肉腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、繊維腫、脂肪腫および奇形腫；肺：気管支原生癌（りん状細胞、未分化の小細胞、未分化の大細胞、腺癌）、胞巣状癌（細気管支）癌腫、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；胃腸：食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（導管癌、インシュリノーマ、グルカゴン産生腫瘍、ガストリノーマ、類癌腫、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、類癌腫、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経繊維腫、繊維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；尿生殖路：腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽細胞腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮腫、奇形腫、胚性癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌腫、繊維腫、線維腺癌、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓：肝臓癌（肝細胞癌）、肝内胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、繊維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨腫（ｏｓｔｅｏｃｈｒｏｎｆｒｏｍａ）（骨軟骨性外骨症）、良性の軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫および巨細胞腫；神経系：頭蓋骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、脳室上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形膠芽腫、乏突起膠腫、シュワン腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄（神経繊維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；産婦人科：子宮（子宮内膜癌）、頚部（子宮頚癌、前腫瘍子宮頚部異形成（ｐｒｅ−ｔｕｍｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）））  卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、ムチン性嚢胞腺癌、子宮内膜性腫瘍、腺肉腫（ｃｅｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、明細胞癌、未分類の癌腫］、顆粒層卵胞膜細胞腫瘍、セルトリ−ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰（扁平上皮癌、上皮内癌腫、腺癌、繊維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫［胚性横紋筋肉腫］、ファロピアン管（癌腫）；血液学的：血液（骨髄性白血病［急性および慢性］、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、ほくろ、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；および副腎：神経芽腫。
【０１５５】
幾つかの実施形態において、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び／又は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）は、単剤療法または併用治療において化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）を使用して処置される。
【０１５６】
（ＡＳＫ１媒介性アポトーシス）
他の実施形態では、細胞においてＡＳＫ１媒介性アポトーシスの阻害を妨げるための本明細書に記載の方法は、細胞を、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と接触させる工程を含む。幾つかの実施形態において、その方法のための化合物は選択的ＩＩ型阻害剤であり；好ましくはＲＡＦキナーゼ（例えばＢ−ＲＡＦキナーゼ）の選択的ＩＩ型阻害剤であり；より好ましくは、化合物はまたＰＤＧＦ受容体の選択的ＩＩ型阻害剤である。幾つかの実施形態において、その方法のための化合物は、Ａ−ＲＡＦを調節する。他の実施形態において、その方法のための化合物は、ＣＲＡＦによるＢＲＡＦのヘテロ二量体化を阻害する。幾つかの実施形態において、化合物は、Ｃ−ＲＡＦのＳ３３８のリン酸化を阻害する。別の実施形態において、化合物は群Ｂ−ＲＡＦ、Ｃ−ＲＡＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｆｌｔ３、ＫｉｔおよびＰＤＧＦＲβから選択される活性キナーゼを阻害しない。いくつかの実施形態において、化合物はＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｆｌｔ３及び／又はｃ−Ｋｉｔのアロステリック阻害剤である。幾つかの実施形態において、本明細書に記載の化合物は、Ｇ２／Ｍ期に腫瘍細胞を阻止する。例えば、典型的な化合物６は、Ｇ２／Ｍ期に、ＨＣＴ−１１６、Ｍｉａ−Ｐａｃａ２、ＦＧ、ＸＰＡ−１、ＢＸＰＣ３、ＭＤＡ−２３１およびＵ２５１などの腫瘍細胞を阻止する。幾つかの実施形態において、化合物は、構造
【０１５７】
【化４８】
2013518909.tif 000050
【０１５８】
を有し、ここで、Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、−ＮＨ２、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり；Ｚは、ＮＨ、ＳまたはＯであり；Ｚ’はＮまたはＣであり；およびＡｒは、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、またはＣ３−１０シクロアルキルから選択される１つ以上の置換基により随意に置換されたフェニルまたは二環式フェニルである。特定の実施形態において、化合物は、構造
【０１５９】
【化４９】
2013518909.tif 000051
【０１６０】
を有し、ここで、ＲｍはＣ１−６アルキル、またはハロゲンで置換されたＣ１−６アルキであり；およびＲ３は独立して水素、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、あるいはＣ３−１０シクロアルキルであり；または随意に、ＲｍとＲ３は、５〜７員の炭素環式化合物を形成するように結合され；ｎは、０−４である。特定の実施形態において、化合物は、構造
【０１６１】
【化５０】
2013518909.tif 000052
【０１６２】
を有し、ここで、Ｒ３は水素またはハロゲンであり；およびＺはＮＨ、ＳまたはＯである。別の実施形態において、化合物は、以下から選択される。
【０１６３】
【化５１】
2013518909.tif 000053
【０１６４】
【化５２】
2013518909.tif 000054
【０１６５】
【化５３】
2013518909.tif 000055
【０１６６】
【化５４】
2013518909.tif 000056
【０１６７】
アポトーシスまたはプログラム細胞死は、正常な発生および組織恒常性において中心的な役割を果たす生理学的工程である。細胞死または細胞生存につながるために、多くの因子が複雑な経路で相互に作用する。抗癌薬によって誘発された遺伝毒性ストレスは、血管原性の内皮細胞と増殖する腫瘍細胞の両方のアポトーシスを導き得る。しかしながら、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）およびＶＥＧＦなどの成長因子は、これらの細胞においてアポトーシス機構を抑制することによって腫瘍微環境内に存在する。アポトーシスシグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）は、ＥＣにおけるｂＦＧＦ媒介性生存シグナル伝達の標的になり得ることが確認された（Ａｌａｖｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：（６）  ２７６６）。具体的には、ｂＦＧＦ刺激は、ミトコンドリアでＲａｆ−１／ＡＳＫ１複合体の形成を促進し、ＡＳＫ１キナーゼ活性を阻害し、遺伝毒性ストレスからＥＣを保護する、と考えられる。Ｒａｆ−１活性化ドメイン（ＳＳ３３８／９ＡＡ）の変異はＲａｆ−１／ＡＳＫ１複合体形成を予防するだけでなく、遺伝毒性ストレスからのｂＦＧＦ媒介性ＥＣ保護を無効にする。従って、選択的ＩＩ型阻害剤のプロテインキナーゼは、活性な状態のプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤でない化合物によって不活性の状態のプロテインキナーゼを安定させ、ミトコンドリアでＡＳＫ１を遮断し、ストレス媒介性アポトーシスを防ぐだろう。
【０１６８】
（外因性ストレスに対する細胞の感作）
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、外因性ストレスに対して細胞を感作するために使用され、該方法は、細胞を、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と、（該細胞をストレスにさらす前または後に）接触させる工程を含む。特定の実施形態において、ストレスは、低酸素症、化学療法、放射線治療またはグルコース／栄養素飢餓から選択される。幾つかの実施形態において、その方法のための化合物は選択的ＩＩ型阻害剤であり；好ましくはＲＡＦキナーゼ（例えばＢ−ＲＡＦキナーゼ）の選択的ＩＩ型阻害剤であり；より好ましくは、化合物はまた、ＰＤＧＦ受容体の選択的ＩＩ型阻害剤である。幾つかの実施形態において、化合物は、Ａ−ＲＡＦを調節する。他の実施形態において、その方法のための化合物は、ＣＲＡＦによるＢＲＡＦのヘテロ二量体化を阻害する。幾つかの実施形態において、化合物は、Ｃ−ＲＡＦのＳ３３８のリン酸化を阻害する。別の実施形態において、化合物は群Ｂ−ＲＡＦ、Ｃ−ＲＡＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｆｌｔ３、ＫｉｔおよびＰＤＧＦＲβから選択される活性キナーゼを阻害しない。幾つかの実施形態において、化合物は、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｆｌｔ３及び／又はｃ−Ｋｉｔのアロステリック阻害剤である。幾つかの実施形態において、化合物は、構造
【０１６９】
【化５５】
2013518909.tif 000057
【０１７０】
を有し、ここで、Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、−ＮＨ２、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり；Ｚは、ＮＨ、ＳまたはＯであり；Ｚ’はＮまたはＣであり；およびＡｒは、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、およびＣ３−１０シクロアルキルから選択される１つ以上の置換基により随意に置換されたフェニルまたは二環式フェニルである。特定の実施形態において、化合物は、構造
【０１７１】
【化５６】
2013518909.tif 000058
【０１７２】
を有し、ここで、ＲｍはＣ１−６アルキル、またはハロゲンで置換されたＣ１−６アルキであり；およびＲ３は独立して水素、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、あるいはＣ３−１０シクロアルキルであり；または随意に、ＲｍとＲ３は、５〜７員の炭素環式化合物を形成するように結合され；ｎは、０−４である。
特定の実施形態において、化合物は、構造
【０１７３】
【化５７】
2013518909.tif 000059
【０１７４】
を有し、ここで、Ｒ３は水素またはハロゲンである；およびＺはＮＨ、ＳまたはＯである。別の実施形態において、化合物は以下から選択される。
【０１７５】
【化５８】
2013518909.tif 000060
【０１７６】
【化５９】
2013518909.tif 000061
【０１７７】
【化６０】
2013518909.tif 000062
【０１７８】
（併用処置）
一般的に、本明細書に記載の組成物と、併用療法が用いられる実施形態において、他の薬剤は、同一の医薬組成物内で投与される必要はなく、幾つかの実施形態において、異なる物理的及び化学的特徴のために、異なる経路で投与される。幾つかの実施形態において、初期の投与は確立された手順に従ってなされ、その後、観察された効果に基づいて、投与の量、投与方法、及び投与時間は熟練した臨床医によって修正される。
【０１７９】
幾つかの実施形態において、薬物が処置の組み合わせにおいて使用される場合、治療上の有効量は変わる。併用処置は、更に、患者の臨床管理を援助するために様々な時点で開始および停止される定期的処置も含む。本明細書に記載される併用療法に関して、同時投与される化合物の用量は、使用される同時薬（ｃｏ−ｄｒｕｇ）のタイプ、使用される具体的な薬、処置されている疾患、障害または疾病などに依存して変わる。
【０１８０】
幾つかの実施形態において、緩和が求められる症状を処置、予防、または改善するための投与レジメンは、様々な要因に従って改変されることを理解されたい。これらの要因は、被検体の年齢、体重、性別、食事および病状と同様に被検体が患う障害も含む。従って、他の実施形態において、実際に用いられる投与レジメンは、広く変化し、それ故、本明細書に明記される投与レジメンから逸脱する。
【０１８１】
他の抗癌剤または化学療法剤との化合物（すなわち本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）の組み合わせは、カバーされるように意図される。幾つかの実施形態において、そのような薬剤の例は、Ｖ．Ｔ．  ＤｅｖｉｔａおよびＳ．  Ｈｅｌｌｍａｎ  （ｅｄｉｔｏｒｓ）によるＣａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｂｙ  ，  ６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （『ｔ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １５，  ２００１），  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓに見出される。そのような抗癌剤は、限定されないが、下記を含む：エストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン受容体モジュレーター、レチノイド受容体モジュレーター、細胞傷害性／細胞増殖抑制性薬剤、抗増殖性薬剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素化合物、血管形成阻害剤、細胞増殖および生存シグナル伝達経路の阻害剤、アポトーシス誘発剤、細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を妨害する薬剤、インテグリン遮断薬、ＮＳＡＩＤ、ＰＰＡＲアゴニスト、固有の多剤耐性（ＭＤＲ）の阻害剤、抗嘔吐剤、貧血症の処置に役立つ薬剤、好中球減少症の処置に役立つ薬剤、免疫増強薬、ビスホスフォネート、アロマターゼ阻害剤、腫瘍細胞の末端分化誘発剤、γ−セクレターゼ阻害剤、癌ワクチンおよびそれらの任意の組み合わせ。
【０１８２】
「エストロゲン受容体モジュレーター」は、機構にかかわらず、受容体に対するエストロゲンの結合を妨げる又は阻害する化合物を指す。エストロゲン受容体モジュレーターの例は、限定されないが、タモキシフェン、ラロキシフェン、イドキシフェン、ＬＹ３５３３８１、ＬＹ１１７０８１、トレミフェン、フルベストラント、４−［７−（２，２−ジメチル−１−オキソプロポキシ−４−メチル−２−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル］−フェニル−２，２−ジメチルプロパネート、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン−２，４−ジニトロフェニルヒドラゾンおよびＳＨ６４６を含む。
【０１８３】
幾つかの実施形態において、エストロゲン受容体モジュレーターは、タモキシフェンとラロキシフェンである。
【０１８４】
「アンドロゲン受容体モジュレーター」は、機構にかかわらず、受容体に対するアンドロゲンの結合を妨げる又は阻害する化合物を指す。アンドロゲン受容体モジュレーターの例は、フィナステリドおよび他の５α−還元酵素阻害剤、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、リアロゾールおよび酢酸アビラテロンを含む。
【０１８５】
「レチノイド受容体モジュレーター」は、機構にかかわらず、受容体に対するレチノイドの結合を妨げるまたは阻害する化合物を指す。そのようなレチノイド受容体モジュレーターの例は、ベキサロテン、トレチノイン、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、α−ジフルオロメチルオルニチン、ＩＬＸ２３−７５５３、トランス−Ｎ−（４’−ヒドロキシフェニル）レチンアミドおよびＮ−４−カルボキシフェニルレチンアミドを含む。
【０１８６】
「細胞傷害性／細胞増殖抑制性薬剤」は、主として細胞の機能化を直接妨害することにより細胞死を引き起こす、または細胞増殖を阻害する、または細胞有糸分裂（  ｍｙｔｏｓｉｓ）を阻害する又は妨げる化合物を指し、それは、アルキル化剤、腫瘍壊死因子、インターカレータ、低酸素で活性化可能な化合物、微小管阻害剤／微小管安定化剤、有系分裂キネシンの阻害剤、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤、有系分裂の進行に関係するキナーゼの阻害剤、代謝拮抗剤；生物学的応答修飾物質；ホルモン／抗ホルモンの治療薬、造血成長因子、モノクローナル抗体標的化薬、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤およびユビキチンリガーゼ阻害剤を含む。
【０１８７】
細胞毒性薬剤の例は、限定されないが、チラパザミン（ｔｉｒａｐａｚｉｍｉｎｅ）およびセルテネフ（ｓｅｒｔｅｎｅｆ）、カケクチン、イホスファミド、タソネルミン、ロニダミン、カルボプラチン、アルトレタミン、プレドニマスチン、ジブロモズルシトール（ｄｉｂｒｏｍｏｄｕｌｃｉｔｏｌ）、ラニムスチン、ホテムスチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、テモゾロミド、ヘプタプラチン（ｈｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、エストラムスチン、トシル酸インプロスルファン、トロホスファミド、ニムスチン、塩化ジブロスピジウム、プミテパ（ｐｕｍｉｔｅｐａ）、ロバプラチン、サトラプラチン、ポルフィロマイシン（ｐｒｏｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、シスプラチン、イロフルベン、デキフォスダミド、ｃｉｓ−アミンジクロロ（２−メチル−ピリジン）白金、ベンジルグアミン、グルホスファミド、ＧＰＸ１００、（ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ）−ビス−ｍｕ−（ヘキサン−１，６−ジアミン）−ｍｕ−［ジアミン−白金（ＩＩ）］ビス［ジアミン−（クロロ）白金（ＩＩ）］−テトラクロリド、ジアリジヂニルスペルミン（ｄｉａｒｉｚｉｄｉｎｙｌｓｐｅｒｍｉｎｅ）、三酸化ヒ素、１−（１１−ドデシルアミノ−１０−ヒドロキシウンデシル）−３，７−ジメチルキサンチン、ゾルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ビスアントレン、ミトキサントロン、ピラルビシン、ピナファイド（ｐｉｎａｆｉｄｅ）、バルルビシン、アムルビシン、アンチネオプラストン、３’−デアミノ  −３’−モルホリノ−１３−デオキシ−１０−ヒドロキシカルミノマイシン、アナマイシン、ガラルビシン（ｇａｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、エリナフィド（ｅｌｉｎａｆｉｄｅ）、ＭＥＮ１０７５５および４−デメトキシ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ）−３−デアミノ（ｄｅａｍｉｎｏ）−３−アジリジニル−４−メチルスルホニルダウノルビシンを含む（ＷＯ  ００／５００３２を参照）。
【０１８８】
マイクロチュブリン阻害剤の例は、パクリタキセル、硫酸ビンデシン、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ルビンカロイコブラスチン、ドセタキソル、リゾキシン、ドラスチン、イセチオン酸ミボブリン、アウリスタチン、セマドチン、ＲＰＲ１０９８８１、ＢＭＳ１８４４７６、ビンフルニン、クリプトファイシン、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−ベンゼンスルホンアミド、アンヒドロビンブラスチン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、ＴＤＸ２５８、及びＢＭＳ１８８７９７を含む。
【０１８９】
トポイソメラーゼ阻害剤のいくつかの例は、トポテカン、ハイカプタミン、イリノテカン、ルビテカン、６−エトキシプロピオニル−３’，４’−Ｏ−エキソ−ベンジリデン−シャルトルーシン、９−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−ニトロピラゾロ［３，４，５−ｋｌ］アクリジン−２−（６Ｈ）プロパンアミン、１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２、３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ、１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：ｂ，７］−インドリジノ［１，２ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）ジオン、ラルトテカン、７−［２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）−エチル］−（２０Ｓ）カンプトテシン、ＢＮＰ１３５０、ＢＮＰＩ１１００、ＢＮ８０９１５、ＢＮ８０９４２、エトポシドリン酸塩、テニポシド、ソブゾキサン、２’−ジメチルアミノ−２’−デオキシ−エトポシド、ＧＬ３３１、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−９−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−カルボキシアミド、アスラクリン、（５ａ、５ａＢ、８ａａ、９ｂ）−９−［２−［Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］エチル］−５−［４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル］−５，５ａ，６，８，８ａ，９−ヘキソヒドロフロ（３’，４’：６，７）コルキック（２，３−ｄ）−１，３−ジオキソル−６−オン、２，３−（メチレンジオキシ）−５−メチル−７−ヒドロキシ−８−メトキシベンゾ［ｃ］−フェナントリジニウム、６，９−ビス［（２−アミノエチル）−アミノ］ベンゾ［ｇ］イソギノリン−５，１０−ジオン、５−（３−アミノプロピルアミノ）−７，１０−ジヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシエチルアミノメチル）−６Ｈ−ピラゾロ［４，５，１−ｄｅ］アクリジン−６−オン、Ｎ−［１−［２（ジエチルアミノ）エチルアミノ］−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−チオキサンテン−４−イルメチル］フォルムアミド、Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）アクリジン−４−カルボキサミド、６−［［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ］−３−ヒドロキシ−７Ｈ−インデノ［２−，１−ｃ］キノリン−７−オン、及びジメスナである。
【０１９０】
「抗増殖性の薬剤」は、Ｇ３１３９、ＯＤＮ６９８、ＲＶＡＳＫＲＡＳ、ＧＥＭ２３１、及びＩＮＸ３００１などの、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡのオリゴヌクレオチド、及びエノシタビン、カルモフール、テガフール、ペントスタチン、ドキシフルリジン、トリメトレキサート、フルダラビン、カペシタビン、ガロシタビン、シタラビンオクホスファート、ホステアビン水酸化ナトリウム、ラルチトレキセド、パルチトレキシド、エミテフール、チアゾフリン、デシタビン、ノラトレキセド、ペメトレキセド、ネルザラビン、２’−デオキシ−２’−メチルイデネシチジン、２’−フルオロメチレン−２’−デオキシ−シチジン、Ｎ−［５−（２，３−ジヒドロ−ベンゾフリル）スルホニル］−Ｎ’−（３，４−ジクロロフェニル）尿素、Ｎ６−［４−デオキシ−４−［Ｎ２−［２（Ｅ），４（Ｅ）−テトラデカジエノイル］−グリシルアミノ］−Ｌ−グリセロ−Ｂ−Ｌ−マンノ−ヘプトピラノシル］−アデニン、アプリジン、エクテイナシジン、トロキサシタビン、４−［２−アミノ−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−ピリミジノ［５，４−ｂ］［１，４］チアジン−６−イル−（Ｓ）−エチル］−２，５−チエノイル−Ｌ−グルタミン酸、アミノプテリン、５−フルロウラシル、アラノシン、１１−アセチル−８−（カルバモイルオキシメチル）−４−ホルミル−６−メトキシ−１４−オキサ−１、１１−ジアザテトラ シクロ（７．４．１．０．０）−テトラデカ−２，４，６−トリエン−９−イル 酢酸エステル、スウェインソニン、ロメテレキソール、デクスラゾキサン、メチオニナーゼ、２’−シアノ−２’−デオキシ−Ｎ４−パルミトイル−１−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、及び３−アミノピリジン−２−カルボキサルデヒドチオセミカルバゾンなどの、代謝拮抗剤を含む。「抗増殖性の薬剤」はまた、トラスツズマブなどの、「血管形成阻害剤」、及びｐ５３などの、腫瘍抑制遺伝子の下にリストされるもの以外の、成長因子に対するモノクローナル抗体を含み、これは、いくつかの実施形態において、組み換えウイルスを媒介した遺伝子移入を介して送達される。
【０１９１】
「プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤」は、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ（ＦＰＴａｓｅ）、ゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼ型Ｉ（ＧＧＰＴａｓｅ−Ｉ）、及びゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼ型ＩＩ（Ｒａｂ ＧＧＰＴａｓｅとも呼ばれる、ＧＧＰＴａｓｅ−ＩＩ）を含む、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ酵素のいずれか１つ又は任意の組み合わせを阻害する化合物を指す。化合物を阻害するプレニル−タンパク質トランスフェラーゼの例は、（±）−６−［アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン、（−）−６−［アミノ（４−クロロフェニル−ｌ）（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン、
（＋）−６−［アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン、５（Ｓ）−ｎ−ブチル−１−（２，３−ジメチル−フェニル）−４−［１−（４−シアノベンジル）−５−イミダゾリルメチル］−２−ピペラジノン、（Ｓ）−１−（３−クロロフェニル）−４−［１−（４−シアノベンジル）−５−イミダゾリルメチル］−５−［２−（エタンスルホニル）−メチル）−２−ピペラジノン、５（Ｓ）−ｎ−ブチル−１−（２−メチルフェニル）−４−［１−（４−シアノベンジル）−５−イミダゾリルメチル］−２−ピペラジノン、１−（３−クロロフェニル）−４−［１−（４−シアノベンジル）−２−メチル−５−イミダゾリルメチル］−２−ピペラジノン、１−（２，２−ジフェニルエチル）−３−［Ｎ−（１−（４−シアノベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル−エチル）カルバミル］−ピペリジン、４−｛５−［４−ヒドロキシメチル−４−（４−クロロピリジン−２−イルメチル）−ピペリジン−１−イルメチル］−２−メチルイミダゾル−１−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−｛５−［４−ヒドロキシメチル−４−（３−クロロベンジル）−ピペリジン−１−イルメチル］−２−メチルイミダゾル−１−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−｛３−［４−（２−オキソ−２Ｈ−ピリジン−１−イル）ベンジル］−３Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−｛３−［４−（５−クロロ−２−オキソ−２Ｈ−［１，２’］ビピリジン−５’−イルメチル］−３Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−｛３−［４−（２−オキソ−２Ｈ−［１，２’］ビピリジン−５’−イルメチル］−３Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−［３−（２−オキソ−１−フェニル−１，２−ジヒドロピリジン−４−イルメチル）−３Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル｝ベンゾニトリル、１８，１９−ジヒドロ−１９−オキソ−５Ｈ，１７Ｈ−６，１０：１２，１６−ジメテノ−１Ｈ−イミダゾ［４，３−ｃ］［１，１１，４］ジオキサ−アザシクロノナデシン−９−カルボニトリル、（±）−１９，２０−ジヒドロ−１９−オキソ−５Ｈ−１８，２１−エタノ−１２，１４−エタノ−６，１０−メタノ−２２Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾ［４，３−ｋ］［１，６，９，１２］−オキサトリアザ−シクロオクタデシン−９−カルボニトリル、１９，２０−ジヒドロ−１９−オキソ−５Ｈ，１７Ｈ−１８，２１−エタノ−６，１０：１２，１６−ジメテノ−２２Ｈ−イミダゾ［３，４−ｈ］［１，８，１１，１４］オキサトリアザシクロ−エイコシン−９−カルボニトリル、及び（±）−１９，２０−ジヒドロ−３−メチル−１９−オキソ−５Ｈ−１８，２１−エタノ−１２，１４−エタノ−６，１０−メタノ−２２Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾ［４，３−ｋ］［１，６，９，１２］オキサ−トリアザシクロオクタデシン−９−カルボニトリルを含む。
【０１９２】
「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤」は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素の阻害剤を指す。幾つかの実施形態において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のための阻害活性を有する化合物は、既知のアッセイを使用することによって容易に確認される。用語「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤」及び「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害剤」は、本明細書に使用されるときに、同じ意味を有する。
【０１９３】
幾つかの実施形態において、使用されるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の例は、限定されないが、ロバスタチン（ＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標））、シンバスタチン（ＺＯＣＯＲ（登録商標））、プラバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ（登録商標））、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ（登録商標））、アトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ（登録商標））及びセリバスタチン（リバスタチン及びＢＡＹＣＨＯＬ（登録商標）としても知られる）を含む。幾つかの実施形態において、本発明の方法に使用されるさらなるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の構造式は、Ｍ．  Ｙａｌｐａｎｉ，  ”Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｏｗｅｒｉｎｇ  Ｄｒｕｇｓ”，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，  ｐｐ． ８５−８９  （１９９６年２月５日）の８７頁及び米国特許第４，７８２，０８４号及び第４，８８５，３１４号に記載される。本明細書に使用されるような用語、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害活性を有する、化合物の塩及びエステルの形態と同様にすべての薬学的に許容可能なラクトン及び開いた酸（ｏｐｅｎ−ａｃｉｄ）の形態（すなわち、ここで、ラクトン環は遊離酸を形成するために開かれる）も含み、それ故、このような塩、エステル、開いた酸及びラクトンの形態の使用が、包含されるように意図される。
【０１９４】
幾つかの実施形態において、開いた酸の形態が存在するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤では、塩及びエステルの形態は、開いた酸から形成され、本明細書に使用されるように、このような形態はすべて、用語「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤」の意味内に含まれる。幾つかの実施形態において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ロバスタチン及びシンバスタチンから選択される。１つの実施形態において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、シンバスタチンである。
本明細書では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤に関する、用語「薬学的に許容可能な塩」は、遊離酸を適切な有機塩基又は無機塩基と反応させることによって一般に調製される、利用される化合物の無毒な塩、特に、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛及びテトラメチルアンモニウムなどの、陽イオンから形成されるものに加え、アンモニア、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、１−ｐ−クロロベンジル−２−ピロリジン−１’−イル−メチルベンズイミダゾール、ジエチルアミン、ピペラジン、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどの、アミンから形成されるものも意味する。他の実施形態において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の塩形態のさらなる例は、限定されないが、酢酸塩、ベンゼンスルホナート、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、カルシウムヒドロキシル、カンシラート、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸、シトラート、二塩化水素化物、ヒドロキシル、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、フマル酸、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトアート、ヨウ化物、イソチオナート、乳酸塩、ラクトビオン酸、ラウリン酸、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸、硫酸ジメチル、ムチン酸、ナプシラート、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸、パルミチン酸塩、パントテン酸、リン酸塩／ピロ燐酸塩、ポリガラクツロ酸、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、琥珀酸エステル、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸、トシラート、トリエチオダイド、及び吉草酸塩を含む。
【０１９５】
他の実施形態において、記載されるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤化合物のエステル誘導体は、温血動物の血流へ吸収されるときに、薬物形態を解放し、薬物が改善した治療効果を与えるのを可能にするような方法で開裂する、プロドラッグとして作用する。
【０１９６】
ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の例は、アンプレナビル、アバカビル、ＣＧＰ−７３５４７、ＣＧＰ−６１７５５、ＤＭＰ−４５０、インジナビル、ネルフィナビル、チプラナビル、リトナビル、サキナビル、ＡＢＴ−３７８、ＡＧ １７７６、及びＢＭＳ−２３２、６３２を含む。逆転写酵素阻害剤の例は、デラビリジン、エファビレンツ、ＧＳ−８４０、ＨＢ Ｙ０９７、ラミブジン、ネビラピン、ＡＺＴ、３ＴＣ、ｄｄＣ、及びｄｄｌを含む。インジナビル又はサキナビルなどの、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤が、強力な抗血管原性の活性を有し、カポージ肉腫の退行を促進することが報告されている。
【０１９７】
「血管形成阻害剤」は、機構にかかわらず、新しい血管の形成を阻害する化合物を指す。血管形成阻害剤の例は、限定されないが、チロシンキナーゼ受容体Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ１）及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２０）の阻害剤などの、チロシンキナーゼ阻害剤、表皮由来、繊維芽細胞由来、又は血小板由来の成長因子の阻害剤、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）阻害剤、インテグリン遮断薬、インターフェロン−α、インターロイキン−１２、ペントサンポリサルフェート、アスピリン及びイブプロフェンなどの非ステロイド性の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を含む、シクロオキシゲナーゼ阻害剤の他にセレコキシブ、バレコキシブ、及びロフェコキシブなどの、選択的サイクロオキシゲナーゼー２阻害剤、カルボキシアミドトリアゾール、コンブレタスタチンＡ−４、スクワラミン、６−Ｏ−クロロアセチル−カルボニル）−フマギロール、サリドマイド、血液造成阻害剤、トロポニン−１、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、及びＶＥＧＦに対する抗体を含む。
【０１９８】
血管形成阻害剤の他の例は、限定されないが、エンドスタチン、ウクライン、ランピルナーゼ、ＩＭ８６２、５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）オキシラニル］−１−オキサスピロ［２，５］オクタ−６−イル（クロロアセチル）カルバマート、アセチルジナナリン、５−アミノ−１−［［３，５−ジクロロ−４−（４−クロロベンゾイル）フェニル］−メチル］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−カルボキサミド、ＣＭ１０１、スクワラミン、コンブレタスタチン、ＲＰ１４６１０、ＮＸ３１８３８、硫酸化マンノペントースリン酸塩、７，７−（カルボニル−ビス［イミノ−Ｎ−メチル−４，２−ピロロカルボニル−イミノ［Ｎ−メチル−４，２−ピロール］−カルボニルイミノ］−ビス−（１，３−ナフタリンジスルホン酸塩）、及び３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１６）を含む。
【０１９９】
「細胞増殖及び生存シグナル伝達経路の阻害剤」は、細胞表面受容体及びそれらの表面受容体の下流の信号伝達カスケードを阻害する医薬品を指す。このような医薬品は、ＥＧＦＲの阻害剤（例えばゲフィチニブ及びエルロチニブ）、ＥＲＢ−２の阻害剤（例えばトラスツズマブ）、ＩＧＦＲの阻害剤、ＣＤ２０の阻害剤（リツキシマブ）、サイトカイン受容体の阻害剤、ＭＥＴの阻害剤、ＰＤＫの阻害剤（例えばＬＹ２９４００２）、セリン／トレオニンキナーゼ（限定されないが、（ＷＯ  ０３／０８６４０４、ＷＯ  ０３／０８６４０３、ＷＯ  ０３／０８６３９４、ＷＯ  ０３／０８６２７９、ＷＯ  ０２／０８３６７５、ＷＯ  ０２／０８３１３９、ＷＯ  ０２／０８３１４０及びＷＯ  ０２／０８３１３８）に記載されるようなＡｋｔの阻害剤を含む）、Ｒａｆキナーゼの阻害剤（例えばＢＡＹ−４３−９００６）、ＭＥＫの阻害剤（例えばＣＩ−１０４０及びＰＤ−０９８０５９）及びｍＴＯＲの阻害剤（例えばＷｙｅｔｈ ＣＣＩ−７７９及びＡｒｉａｄ ＡＰ２３５７３）の阻害剤を含む。このような医薬品は、小さな分子阻害剤化合物及び抗体アンタゴニストを含む。
【０２００】
「アポトーシス誘発剤」は、限定されないが、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー（ＴＲＡＩＬ受容体を含む）の活性化因子を含む。
【０２０１】
「細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤」は、細胞周期チェックポイントシグナルを変換するプロテインキナーゼを阻害する化合物を指し、それによって、ＤＮＡ損傷剤に対して癌細胞を感作する。このような薬剤は、ＡＴＲ、ＡＴＭ、Ｃｈｋｌ及びＣｈｋ２のキナーゼの阻害剤及びｃｄｋ及びｃｄｃのキナーゼ阻害剤を含み、７−ヒドロキシスタウロスポリン、フラボピリドール、ＣＹＣ２０２（Ｃｙｃｌａｃｅｌ）及びＢＭＳ−３８７０３２によって具体的に例証される。
【０２０２】
「受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を妨害する薬剤」は、ＲＴＫを阻害する化合物、及びそれによって腫瘍形成及び腫瘍発達に関係する機構を指す。このような薬剤は、限定されないが、c-Ｋｉｔ、Ｅｐｈ、ＰＤＧＦ、Ｆｌｔ３及びｃ−Ｍｅｔの阻害剤などの、チロシンキナーゼ阻害剤を含む。さらなる薬剤は、ＲＴＫの阻害剤を含む。「チロシンキナーゼ阻害剤」の例は、限定されないが、Ｎ−（トリフルオロメチルフェニル）−５−メチリソキサゾール−４−カルボキサミド、３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル）インドリン−２−オン、１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン、４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−［３−（４−モルフォリニル）プロポキシル］−キナゾリン、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミン、ＢＩＢＸ１３８２、２，３，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−１０−（ヒドロキシメチル）−１０−ヒドロキシ−９−メチル−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１−オン、ＳＨ２６８、ゲニステイン、ＳＴ１５７１、ＣＥＰ２５６３、４−（３−クロロフェニルアミノ）−５，６−ジメチル−７−Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンメタンスルホン酸塩、４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、４−（４’−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、ＳＵ６６６８、ＳＵ１１２４８、ＳＴＩ５７１Ａ、Ｎ−４−クロロフェニル−４−（４−ピリジルメチル）−１−フタラジンアミン、及びＥＭＤ１２１９７４を含む。
【０２０３】
化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）はまた、癌細胞の転移を阻害するのに、チロフィバンなどの、血小板フィブリノゲン受容体（ＧＰ Ｉｉｂ／ＩＩＩａ）アンタゴニストと組み合わせると有用である。腫瘍細胞はまた、大部分はトロンビン生成を介して血小板を活性化する。この活性化は、ＶＥＧＦの放出に関係する。ＶＥＧＦの放出は、血管内皮への付着の部分で血管外遊出を増加させることにより、転移を高める（Ａｍｉｒｋｈｏｓｒａｖｉ，  １９９９，  Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  １０：  ２８５−２９２）。
【０２０４】
上に使用されるように、「インテグリン遮断薬」は、生理学的リガンドのαｖβ３インテグリンへの結合を選択的に拮抗、阻害又は中和する化合物、生理学的リガンドのαｖβ５インテグリンへの結合を選択的に拮抗、阻害又は中和する化合物、生理学的リガンドのαｖβ３インテグリン及びαｖβ５インテグリンへの結合を拮抗、阻害又は中和する化合物、及び毛細血管の内皮細胞上で発現される特定のインテグリンの活性を拮抗、阻害又は中和する化合物を指す。該用語はまた、αｖβ６のアンタゴニスト、αｖβ８、α１β１、α２β１、α５β１、α６β１及びα６β４のインテグリンを指す。該用語はまた、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、α１β１、α２β１、α５β１、α６β１及びα６β４のインテグリンの任意の組み合わせのアンタゴニストを指す。
【０２０５】
抗腫瘍化合物以外の化合物との組み合わせもまた、本発明の方法において包含される。例えば、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）の、ＰＰＡＲ−γ（すなわち、ＰＰＡＲガンマ）アゴニスト及びＰＰＡＲ−δ（すなわちＰＰＡＲデルタ）アゴニストとの組み合わせは、特定の悪性腫瘍の処置に有用である。ＰＰＡＲ−γ及びＰＰＡＲ−δは、核ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ及びδである。より最近では、ＰＰＡＲ−γアゴニストは、インビトロのＶＥＧＦに対する血管原性反応を阻害すると示され、トログリタゾン及びロシグリタゾンマレイン酸塩の両方は、マウスにおける網膜血管新生の発達を阻害する。ＰＰＡＲ−γアゴニスト及びＰＰＡＲ−γ／αアゴニストの例は、限定されないが、チアゾリジンジオン（ＤＲＦ２７２５、ＣＳ−０１１、トログリタゾン、ロシグリタゾン、及びピオグリタゾンなど）、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、クロフィブレート、ＧＷ２５７０、ＳＢ２１９９９４、ＡＲ−Ｈ０３９２４２、ＪＴＴ−５０１、ＭＣＣ−５５５、ＧＷ２３３１、ＧＷ４０９５４４、ＮＮ２３４４、ＫＲＰ２９７、ＮＰＯｌ １０、ＤＲＦ４１５８、ＮＮ６２２、ＧＩ２６２５７０、ＰＮＵ１８２７１６、ＤＲＦ５５２９２６、２−［（５，７−ジプロピル−３−トリフルオロメチル−１，２−ベンズイソオキサゾール−６−ｙｌ）オキシ］−２−メチルプロピオン酸（ＵＳＳＮ ０９／７８２，８５６に開示される）、及び２（Ｒ）−７−（３−（２−クロロ−４−（４−フルオロフェノキシ）フェノキシ）プロポキシ）−２−エチルクロマン−２−カルボン酸を含む。
【０２０６】
幾つかの実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）は、癌の処置のための遺伝子療法と組み合わせて使用される。他の実施形態において、遺伝子療法は、任意の腫瘍抑制遺伝子を送達するために使用される。このような遺伝子の例は、限定されないが、いくつかの実施形態において、組み換えウイルス媒介性の遺伝子移入を介して送達されるｐ５３、Ｄｕｃ−４、ＮＦ−Ｉ、ＮＦ−２、ＲＢ、ＷＴｌ、ＢＲＣＡｌ、ＢＲＣＡ２、ｕＰＡ／ｕＰＡＲのアンタゴニストを含む。
【０２０７】
他の実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）はまた、固有の多剤耐性（ＭＤＲ）、特に、輸送体タンパク質の高レベルの発現に関係するＭＤＲの阻害剤と組み合わせて投与される。このようなＭＤＲ阻害剤は、ＬＹ３３５９７９、ＸＲ９５７６、ＯＣ１４４−０９３、Ｒ１０１９２２、ＶＸ８５３及びＰＳＣ８３３（バルスポーダー（ｖａｌｓｐｏｄａｒ））などの、ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の阻害剤を含む。
【０２０８】
幾つかの実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）の使用に起因する、急性、遅延性、後期性、先行性の嘔吐を含む、吐き気又は嘔吐を処置するために、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）は、抗嘔吐性の薬剤と併用して、単独で又は放射線治療によって利用される。さらなる実施形態において、嘔吐の予防又は処置のために、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）は、他の抗嘔吐性の薬剤、特に、ニューロキニン−１受容体アンタゴニスト、オンダンセトロン、グラニセトロン、トロピセトロン、及びザチセトロンなどの、５ＨＴ３受容体拮抗薬、バクロフェンなどの、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニスト、デカドロン（デキサメタゾン）などのコルチコステロイド、ケナログ、アリストコート、ナサリド、プレフェリド、ベネコルテン又は米国特許第２，７８９，１１８号、第２，９９０，４０１号、第３，０４８，５８１号、第３，１２６，３７５号、第３，９２９，７６８号、第３，９９６，３５９号、第３，７４９，７１２号に開示されるような他のもの、フェノチアジン（例えばプロクロルペラジン、フルフェナジン、チオリダジン及びメソリダジン）などの、ドーパミン拮抗薬、メトクロプラミド又はドロナビノールと併用して使用される。実施形態において、ニューロキニン−１受容体アンタゴニスト、５ＨＴ３受容体アンタゴニスト及びコルチコステロイドから選択される制吐剤は、本化合物の投与で生じる嘔吐の処置又は予防のためのアジュバントとして投与される。
【０２０９】
他の実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）はまた、貧血症の処置に有用な薬剤とともに投与される。このような貧血症を処置する薬剤は、例えば、連続的な赤血球生成受容体活性化因子（エポエチン−αなど）である。
【０２１０】
さらなる実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）はまた、好中球減少症の処置に有用な薬剤とともに投与される。このような好中球減少症を処置する薬剤は、例えば、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などの、好中球の生成及び機能を規制する造血成長因子である、Ｇ−ＣＳＦの例はフィルグラスチムを含む。
【０２１１】
幾つかの実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）はまた、レバミソール、カルメット・ゲラン菌、オクトレオチド、イソプリノシン及びＺａｄａｘｉｎなどの、免疫増強薬とともに投与される。
【０２１２】
他の実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）はまた、ビスホスホネート（ビスホスホネート、ジホスホン酸塩、ビスホスホン酸及びジホスホン酸を含むと理解される）と組み合わせて、骨癌を含む癌を処置するか又は予防するのに有用である。ビスホスホネートの例は、限定されないが、任意の及び全ての薬学的に許容可能な塩、誘導体、水化物及びそれらの混合物を含む、エチドロネート（ダイドロネル）、パミドロネート（アレディア）、アレンドロネート（フォサマックス）、リセドロネート（アクトネル）、ゾレドロネート（ゾメタ）、イバンドロネート（ボニバ）、インカドロネート又はシマドロネート、クロドロネート、ＥＢ−１０５３、ミノドロネート、ネリドロネート、ピリドロネート及びチルドロネートを含む。
【０２１３】
さらなる実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）はまた、アロマターゼ阻害剤と組み合わせて、乳癌を処置するか又は予防するのに有用である。アロマターゼ阻害剤の例は、限定されないが、アナストロゾール、レトロゾール及びエキセメスタンを含む。
【０２１４】
幾つかの実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）はまた、ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉの治療と組み合わせて、癌を処置するか又予防するのに有用である。
【０２１５】
いくつかの他の実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）はまた、腫瘍細胞の末端分化を誘発する化合物と組み合わせて、癌を処置するか又は予防するのに有用である。適切な分化薬剤は、以下の化合物を含む：（ａ）極性化合物；（ｂ）ビタミンＤ及びレチノイン酸の誘導体；（ｃ）ステロイドホルモン；（ｄ）成長因子；（ｅ）プロテアーゼ；（ｆ）腫瘍プロモーター；及び（ｇ）ＤＮＡ又はＲＮＡの合成の阻害剤。
【０２１６】
「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤」は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素によってその塩基のＣ−５位置でＤＮＡ塩基シトシンのメチル化を阻害する化合物を指す。このようなＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤の例は、５−アザシトシン及びゼブラリン（登録商標）を含む、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む。
【０２１７】
抗腫瘍薬の例は、一般に、微小管安定化剤（（タキソール（登録商標）としても知られる）パクリタキセル、（タキソテール（登録商標）としても知られる）ドセタキセル、エポチロンＡ、エポチロンＢ、デソキシエポチロンＡ、デソキシエポチロンＢ又はそれらの誘導体など）；微小管かく乱薬剤；アルキル化剤、抗代謝物質；エピドフィロトキシン；抗腫瘍性酵素；トポイソメラーゼ阻害剤；プロカルバジン；ミトキサントロン；白金配位化合物；生物学的応答修飾物質及び成長阻害剤；ホルモンの／抗ホルモンの治療薬及び造血成長因子を含む。
【０２１８】
抗腫瘍薬の例の種類は、例えば、薬物のアントラサイクリンファミリー、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性のヌクレオシド、タキサン、エポチロン、ディスコデルモリド、薬物のプテリジンファミリー、ジイネン及びポドフィロトキシンを含む。これらの種類の特に有用なメンバーは、例えば、ドキソルビシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロ−メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、ハーセプチン（登録商標）、リツキサン（登録商標）、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、ゲムシタビン、サイトシンアラビノサイド、ポドフィロトキシン、又はコルヒチン、エトポシド、エトポシドリン酸塩又はテニポシド、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシデン、ビンデシン、ロイロシン、パクリタキセルなどの、ポド−フィロトキシン誘導体を含む。他の有用な抗腫瘍薬は、エストラムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、タモキシフェン、イホスファミド（ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン、エダトレキサート（ｉｄａｔｒｅｘａｔｅ）、トリメトレキサート、ダカルバジン、Ｌ−アスパラギナーゼ、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、トポテカン、ａｒａ−Ｃ、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロン及びインターロイキンを含む。幾つかの実施形態において、抗腫瘍薬はタキサンであり、抗腫瘍薬はパクリタキセルである。
【０２１９】
（放射線治療）
幾つかの実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）は、放射線治療と組み合わせて投与される。放射線治療（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）とも呼ばれる放射線治療は、電離放射線での癌及び他の疾患の処置である。電離放射線は、処置されている領域の細胞（「標的組織」）を、それらの遺伝物質を破損させることによって損傷させる又は破壊するエネルギーを与え、これが、これらの細胞が成長し続けることを不可能にしている。放射線は、癌細胞及び正常細胞の両方を破損させるが、後者の方がより、それ自体を修復し、適切に機能することができる。幾つかの実施形態において、放射線治療は、皮膚、舌、喉頭、脳、胸、前立腺、結腸、子宮及び／又は頚部の癌などの、局所的な固形腫瘍を処置するために使用される。幾つかの実施形態において、放射線治療はまた、白血病及びリンパ腫（それぞれ、造血細胞及びリンパ系）を処置するために使用される。
【０２２０】
一般に使用される放射線治療の１つのタイプは、光子、エネルギーの「塊」を含む。Ｘ線、γ線は、両方とも癌を処置するために使用される光子放射線である。所有するエネルギーの量によって、放射線は、身体の表面上又は身体のより深くの癌細胞を破壊するために使用される。他の実施形態において、放射線ビームのエネルギーが高ければ高いほど、放射線は標的組織により深く入る。
【０２２１】
癌細胞に放射線を送達するための別の技術は、腫瘍又は体腔内に直接放射性挿入管を置くことである。これは、内部放射線治療（小線源治療、組織内照射、及び腔内照射は、内部放射線治療の型である）と呼ばれる。内部放射線治療を使用して、放射線量は小面積部で濃縮され、患者は数日の間入院する。内部放射線治療は、舌、子宮、前立腺、結腸、及び頚部の癌のために頻繁に使用される。
【０２２２】
用語「放射線治療」又は「電離放射線」は、限定されないが、α、β、及びγ放射線及び紫外線を含む、放射線のすべての形態を含み、これらは、細胞又はウイルスの遺伝物質を直接又は間接的に破損することができる。用語「照射」は、電離放射線に対する対象のサンプルの被爆を指す。同時的又は連続的な化学療法を伴う又は伴わない放射線治療は、頭頸部、胸、皮膚、肛門性器の癌、及びケロイド、類腱腫、血管腫、動静脈奇形、及び骨組織球症Ｘなどの、特定の非悪性の疾患のための有効な物理療法である。しかしながら、治療効果は、放射線及び化学療法に誘発された粘膜上皮損傷及び皮膚放射線症候群（ＣＲＳ）によって限定され、これは、組織膨張、粘膜炎、皮膚炎、落屑、及び潰瘍化の急性反応、及び組織／皮膚の線維症、壊死の長時間効果、及び肉腫細胞癌、扁平上皮癌及び基底細胞癌の生命を脅かす後遺症の進行を含む。
【０２２３】
（ＭＥＫ１／２−及び／又はＥＲＫ１／２−媒介性細胞増殖または移動）
他の実施形態において、ＭＥＫ１／２−及び／又はＥＲＫ１／２−媒介性の細胞増殖または移動を阻害するための本明細書に記載の方法は、細胞を、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物と接触させる工程を含む。特定の実施形態において、化合物は、腫瘍血管新生においてＶＥＧＦ−及び／又はＦＧＦ−に刺激された内皮反応を遮断する。幾つかの実施形態において、その方法のための化合物は選択的ＩＩ型阻害剤であり；好ましくは、ＲＡＦキナーゼ（例えばＢ−ＲＡＦキナーゼ）の選択的ＩＩ型阻害剤であり；より好ましくは、化合物はまた、ＰＤＧＦ受容体の選択的ＩＩ型阻害剤である。他の実施形態において、その方法のための化合物は、ＣＲＡＦによるＢＲＡＦのヘテロ二量体化を阻害する。幾つかの実施形態において、化合物は、Ｃ−ＲＡＦのＳ３３８のリン酸化を阻害する。別の実施形態において、化合物は群Ｂ−ＲＡＦ、Ｃ−ＲＡＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｆｌｔ３、ＫｉｔおよびＰＤＧＦＲβから選択される活性キナーゼを阻害しない。幾つかの実施形態において、化合物は、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｆｌｔ３及び／又はｃ−Ｋｉｔのアロステリック阻害剤である。幾つかの実施形態において、化合物は、構造
【０２２４】
【化６１】
2013518909.tif 000063
【０２２５】
を有し、ここで、Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、ＮＨ２、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり；Ｚは、ＮＨ、ＳまたはＯであり；Ｚ’はＮまたはＣであり；
およびＡｒは、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、またはＣ３−１０シクロアルキルから選択される１つ以上の置換基により随意に置換されたフェニルまたは二環式フェニルである。特定の実施形態において、化合物は、構造
【０２２６】
【化６２】
2013518909.tif 000064
【０２２７】
を有し、ここで、ＲｍはＣ１−６アルキル、またはハロゲンで置換されたＣ１−６アルキであり；およびＲ３は独立して水素、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、あるいはＣ３−１０シクロアルキルであり；または随意に、ＲｍとＲ３は、５〜７員の炭素環式化合物を形成するように結合され；ｎは、０−４である。特定の実施形態において、化合物は、構造
【０２２８】
【化６３】
2013518909.tif 000065
【０２２９】
を有し、ここで、Ｒ３は水素またはハロゲンである；およびＺはＮＨ、Ｓまたはゼロである。別の実施形態において、化合物は、以下から選択される。
【０２３０】
【化６４】
2013518909.tif 000066
【０２３１】
【化６５】
2013518909.tif 000067
【０２３２】
【化６６】
2013518909.tif 000068
【０２３３】
【化６７】
2013518909.tif 000069
【０２３４】
ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路は、細胞表面受容体への成長因子の結合に細胞内の反応を結び付けるシグナル伝達経路である。表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）などの受容体結合チロシンキナーゼは、細胞外のリガンドによって活性化される。ＥＧＦＲに表皮成長因子（ＥＧＦ）を結合することは、受容体の細胞質ドメインのチロシンキナーゼ活性を活性化する。ＥＧＦＲは、チロシン残基上でリン酸化されるようになる。図に示される基本的経路は、ＭＥＫ／ＥＲＫ活性化につながるＢ−ＲＡＦとＣ−ＲＡＦの間の複合体のタンパク質足場形成およびアッセンブリに依存する、細胞におけるＭＡＰＫシグナル伝達を記載する。
【０２３５】
【化６８】
2013518909.tif 000070
【０２３６】
このように、Ｂ−／Ｃ−ＲＡＦ複合体の破壊は、血管新生の抑制につながるＭＡＲＫシグナル伝達を阻害する。従って、（ｉ）不活性なでプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物を使用することによって、ＭＥＫ１／２−及び／又はＥＲＫ１／２−媒介性細胞増殖または移動の阻害を行うことができる。
【０２３７】
（再狭窄の処置）
幾つかの実施形態において、本発明は、ヒト被験体において再狭窄を処置するための方法を提供し、該方法は、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物を、必要とする患者に投与する工程を含む。特定の実施形態において、再狭窄は血管損傷の後の内膜過形成によって引き起こされた再狭窄である。幾つかの実施形態において、その方法のための化合物は、ＲＡＦキナーゼ（例えばＢ−ＲＡＦキナーゼ）の選択的ＩＩ型阻害剤であり；より好ましくは、化合物はまた、ＰＤＧＦ受容体の選択的ＩＩ型阻害剤である。幾つかの実施形態において、化合物は、Ａ−ＲＡＦを調節する。他の実施形態において、その方法のための化合物は、ＣＲＡＦによるＢＲＡＦのヘテロ二量体化を阻害する。幾つかの実施形態において、化合物は、Ｃ−ＲＡＦのＳ３３８のリン酸化を阻害する。別の実施形態において、化合物は群Ｂ−ＲＡＦ、Ｃ−ＲＡＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｆｌｔ３、ＫｉｔおよびＰＤＧＦＲβから選択される活性キナーゼを阻害しない。幾つかの実施形態において、化合物は、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｆｌｔ３及び／又はｃ−Ｋｉｔのアロステリック阻害剤である。幾つかの実施形態において、化合物は、構造
【０２３８】
【化６９】
2013518909.tif 000071
【０２３９】
を有し、ここで、Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、ＮＨ２、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり；Ｚは、ＮＨ、ＳまたはＯであり；Ｚ’はＮまたはＣであり；およびＡｒは、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、およびＣ３−１０シクロアルキルから選択される１つ以上の置換基により随意に置換されたフェニルまたは二環式フェニルである。特定の実施形態において、化合物は、構造
【０２４０】
【化７０】
2013518909.tif 000072
【０２４１】
を有し、ここで、ＲｍはＣ１−６アルキル、またはハロゲンで置換されたＣ１−６アルキであり；およびＲ３は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、あるいはＣ３−１０シクロアルキル  であり；または随意に、ＲｍとＲ３は、５〜７員の炭素環式化合物を形成するように結合され；ｎは、０−４である。特定の実施形態において、化合物は、構造
【０２４２】
【化７１】
2013518909.tif 000073
【０２４３】
を有し、ここで、Ｒ３は水素またはハロゲンであり；およびＺはＮＨ、ＳまたはOである。別の実施形態において、化合物は以下から選択される。
【０２４４】
【化７２】
2013518909.tif 000074
【０２４５】
【化７３】
2013518909.tif 000075
【０２４６】
【化７４】
2013518909.tif 000076
【０２４７】
【化７５】
2013518909.tif 000077
【０２４８】
再狭窄は、文字通り、狭窄（血管の狭窄）の再発生を意味し、制限された血流をもたらす。再狭窄は、通常、狭くなり、遮断物を取り除くための処置を受けて、その後に再度狭くなるようになった動脈または他の大血管を指す。これは、通常、動脈または他の血管、または恐らく器官内の血管の再狭窄である。再狭窄は、一般に、新生内膜過形成（ＮＩＨ）と記載された工程によって動脈の最終的な閉塞を結果として生じるバルーン血管形成及び／又はステント装着に起因する。動脈損傷の後、ＰＤＧＦＲα／β  （Ｅｎｇｌｅｓｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  ３９，  ４４０−６）およびＭＡＰＫ経路活性化（Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１１，  １６７２−８；  Ｐｉｎｔｕｃｃｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ２０，  ３９８−４００）の両方に依存することが以前に示された、血管平滑筋細胞の過剰増殖が生じる。それ故、ＰＤＧＦＲβ／ＲＡＦ阻害の組み合わせはＮＩＨの典型的な治療法であり；例えば、本明細書には、選択され得るＰＤＧＦＲβ／ＲＡＦ阻害剤であり得る、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物が提供される。
【０２４９】
（線維症の処置）
組織損傷は、複雑な一連の宿主創傷治癒反応を開始し；上手くいけば、これらの反応は、正常組織構造および機能を回復する。上手くいかなければ、これらの反応は組織線維症および機能の喪失につながり得る。他の実施形態において、ヒト被験体において線維症を処置するための本明細書に記載の方法は、（ｉ）不活性な状態でプロテインキナーゼを安定させ、かつ（ｉｉ）活性な状態でプロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤ではない化合物を、必要とする患者に投与する工程を含む。特定の実施形態において、線維症は肺線維症である。特定の実施形態において、線維症は肝繊維症である。幾つかの実施形態において、その方法のための化合物は選択的ＩＩ型阻害剤であり；好ましくはＲＡＦキナーゼ（例えばＢ−ＲＡＦキナーゼ）の選択的ＩＩ型阻害剤であり；より好ましくは、化合物はまた、ＰＤＧＦ受容体の選択的ＩＩ型阻害剤である。幾つかの実施形態において、その方法のための化合物はＡ−ＲＡＦを調節する。他の実施形態において、その方法のための化合物は、ＣＲＡＦによるＢＲＡＦのヘテロ二量体化を阻害する。幾つかの実施形態において、化合物は、Ｃ−ＲＡＦのＳ３３８のリン酸化を阻害する。別の実施形態において、化合物は群Ｂ−ＲＡＦ、Ｃ−ＲＡＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｆｌｔ３、ＫｉｔおよびＰＤＧＦＲβから選択される活性キナーゼを阻害しない。幾つかの実施形態において、化合物は、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｆｌｔ３及び／又はｃ−Ｋｉｔのアロステリック阻害剤である。幾つかの実施形態において、化合物は、構造
【０２５０】
【化７６】
2013518909.tif 000078
【０２５１】
を有し、ここで、Ｒ１とＲ２は、独立して、水素、随意の置換されたアルキル、ハロゲン、随意の置換されたアミン、ＮＨ２、随意の置換されたアルコキシ、随意の置換されたチオアルキル、ＣＦ３Ｓ、随意の置換されたアルキルスルフィニルまたは随意の置換されたアルキルスルホニルであり；Ｚは、ＮＨ、ＳまたはＯであり；Ｚ’はＮまたはＣであり；およびＡｒは、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、およびＣ３−１０シクロアルキルから選択される１つ以上の置換基により随意に置換されたフェニルまたは二環式フェニルである。特定の実施形態において、化合物は、構造
【０２５２】
【化７７】
2013518909.tif 000079
【０２５３】
を有し、ここで、ＲｍはＣ１−６アルキル、またはハロゲンで置換されたＣ１−６アルキであり；およびＲ３は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１−６アルコキシ、あるいはＣ３−１０シクロアルキルであり；または随意に、ＲｍとＲ３は、５〜７員の炭素環式化合物を形成するように結合され；ｎは、０−４である。特定の実施形態において、化合物は、構造
【０２５４】
【化７８】
2013518909.tif 000080
【０２５５】
を有し、ここで、Ｒ３は水素またはハロゲンであり；およびＺはＮＨ、Ｓまたはゼロである。別の実施形態において、化合物は以下から選択される。
【０２５６】
【化７９】
2013518909.tif 000081
【０２５７】
【化８０】
2013518909.tif 000082
【０２５８】
【化８１】
2013518909.tif 000083
【０２５９】
用語「線維症」または「繊維組織を形成する障害」は、本明細書に使用されるように、細胞及び／又はフィブロネクチン及び／又はコラーゲンの異常な蓄積及び／又は増加した繊維芽細胞の動員に関係する症状を指し、限定されないが、心臓、腎臓、肝臓、関節、肺、胸膜組織、腹膜組織、皮膚、角膜、網膜、筋骨格および消化管などの個々の器官または組織の線維症を含む。
【０２６０】
線維症を伴う典型的な疾患、障害または疾病は、限定されないが、以下を含む：線維症に関係する肺疾患、例えば、特発性肺線維症、関節リウマチなどの全身性炎症性疾患に付随して起こる肺線維症、硬皮症、狼瘡、特発性間質性肺炎、放射線誘発線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、硬皮症、慢性喘息、珪肺症、石綿誘発肺又は胸膜線維症、急性肺障害および急性呼吸窮迫（細菌性肺炎誘発性、外傷誘発性、ウイルス性肺炎誘発性、通風装置誘発性、非肺敗血症誘発性および吸引誘発性）；損傷／線維症（腎線維症）に関係する慢性腎症、例えば狼瘡および硬皮症などの全身性炎症性疾患に付随して起こる糸球体腎炎、糖尿病、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、ＩｇＡ腎症、高血圧、異型移植およびアルポート；腸線維症、例えば硬皮症および放射線誘発性腸線維症；肝臓線維症、例えば肝硬変、アルコール誘発性肝臓線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変症、感染またはウイルス誘発性肝臓線維症（例えば、慢性ＨＣＶ感染）、および自己免疫性肝炎；頭および首の線維症、例えば、放射線によって引き起された；角膜の瘢痕化、例えばＬＡＳＩＫ（レーザー光線による近視手術）、角膜移植、および線維柱帯切除術；肥大性瘢痕およびケロイド、例えば、火傷誘発性または外科的；および他の線維症の疾患、例えばサルコイドーシス、硬皮症、脊髄損傷／線維症、骨髄線維症、血管の再狭窄、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、ヴェーゲナー肉芽腫症、混合性結合組織病およびペーロニー病。
【０２６１】
１つの態様において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）は、器官または組織の線維症を伴う、または器官または組織の線維症になる素質を有する哺乳動物に、線維症を処置するために使用される１以上の他の薬剤と共に投与される。１つの態様において、１つ以上の薬剤はコルチコステロイドを含む。１つの態様において、１つ以上の薬剤は免疫抑制剤を含む。１つの態様において、１つ以上の薬剤はＢ細胞アンタゴニストを含む。１つの態様において、１つ以上の薬剤はウテログロビンを含む。
【０２６２】
（特定の薬学および医学用語）
製剤、組成物または成分に関する用語「許容可能な」は、本明細書で使用されるように、処置されている被験体の一般的な健康に対する持続的な悪影響がないことを意味する。
【０２６３】
用語「アンタゴニスト」は、本明細書に用いられるように、別の分子の作用または受容体部位の活性を減少、抑制、または妨げる化合物などの分子を表す。アンタゴニストは、競合的アンタゴニスト、非競合的アンタゴニスト、不競合的アンタゴニスト、半アゴニスト、または逆アゴニストを含むが、これらに限定されない。
【０２６４】
競合的アンタゴニストは、内因性リガンドまたはアゴニストと同じ結合部位（活性部位）で受容体に可逆的に結合するが、受容体を活性化しない。
【０２６５】
アロステリック阻害剤（非競合的アンタゴニストとしても知られている）は、アゴニストから明確に分離された結合部位に結合し、他の結合部位を経由してその受容体に作用を及ぼす。非競合的アンタゴニストは、結合のためにアゴニストと競合しない。結合したアンタゴニストは、受容体のアゴニストの親和性を低下させるか、または、代替的に、アゴニストの結合後に受容体活性化に必要とされる受容体の構造変化を妨げてもよい。
【０２６６】
不競合的アンタゴニストは、分離したアロステリック結合部位に結合できるようになる前に、アゴニストによる受容体の活性化を必要とするという点で、非競合的アンタゴニストとは異なる。
【０２６７】
用語「癌」は、本明細書に使用されるように、制御されない方法で増殖し、幾つかの場合において、転移（拡大）する傾向がある細胞の異常な増殖を指す。癌の種類は、固形腫瘍（膀胱、腸、脳、乳房、子宮内膜、心臓、腎臓、肺、リンパ組織（リンパ腫）、卵巣、膵臓、または他の内分泌臓器（甲状腺）、前立腺、皮膚（メラノーマ）の腫瘍）、または、血液腫瘍（白血病など）などを含むが、これらに限定されない。
【０２６８】
用語「担体」は、本明細書に使用されるように、細胞または組織へ化合物を組み込むのを促進する、相対的に無毒な化学化合物または薬剤を指す。
【０２６９】
用語「同時投与」などは、本明細書に使用されるように、一人の患者に選択された治療薬の投与を包含することを意味し、治療薬が同じまたは異なる投与経路によって、あるいは、同じまたは異なる時間に投与される、処置レジメンを含むように意図されている。
【０２７０】
用語「希釈剤」は、送達前に対象となる化合物を希釈するために使用される化学化合物を指す。希釈剤は、より安定した環境を提供できるので、化合物を安定させるために使用され得る。緩衝液中に溶解される塩（これは、ｐＨの制御または維持を提供することもできる）は、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩溶液を含む、当技術分野における希釈剤として利用される。
【０２７１】
用語「有効な量」または「治療上有効な量」は、本明細書に使用されるように、処置されている疾患または疾病の１以上の症状をある程度和らげる、投与される十分な量の薬剤または化合物を指す。その結果、疾患の徴候、症状、または原因を減少および／または軽減され、あるいは、生物系の任意の他の所望の変化をもたらされ得る。例えば、治療上の使用のための「有効な量」は、疾患の症状を臨床的に有意に減少させるために必要とされる、本明細書に開示される化合物を含む組成物の量である。適切な「有効な」量は、いかなる個体の場合でも、用量増加試験などの技術を使用して定められてもよい。
【０２７２】
用語「増強する（ｅｎｈａｎｎｃｅ）」または「増強すること（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」は、本明細書に使用されるように、効力または持続時間のいずれかにおいて、所望の効果を増加または延長させることを意味する。従って、治療薬の効果を増強することに関して、用語「増強すること」は、効力または持続時間のいずれかにおいて、系に対する他の治療薬の効果を増加または延長させる能力を指す。「増強させる有効な量」は、本明細書に使用されるように、所望の系において別の治療薬の効果を増強するのに十分な量を指す。
【０２７３】
用語「キット」および「製品」は、同義語として使用される。
【０２７４】
本明細書に開示される化合物の「代謝物質」は、化合物が代謝される時に形成される、その化合物の誘導体である。用語「活性代謝物」は、化合物が代謝される時に形成される、化合物の生物学的に活性な誘導体を指す。用語「代謝される」は、本明細書に使用されるように、有機体によって特定の物質が変化する（限定されないが、加水分解反応および酵素により触媒される反応などを含む）工程の全体を指す。従って、酵素は、化合物への特定の構造的変化をもたらし得る。例えば、チトクロームＰ４５０は、様々な酸化反応および還元反応を触媒する一方で、ウリジン二リン酸グルクロニルトランスフェラーゼは、芳香族アルコール、脂肪族アルコール、カルボン酸、アミン、および、遊離スルフィヒドリル基への活性化グルクロン酸分子の転移を触媒する。本明細書で開示の化合物の代謝物は、宿主への化合物の投与および宿主から採取した組織サンプルの解析により、または、肝細胞と化合物のインビトロでのインキュベーションおよび得られた化合物の分析のいずれかにより、随意に同定される。
【０２７５】
用語「薬学的な組み合わせ（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」は、本明細書に使用されるように、１以上の活性成分の混合または組み合わせから結果的に生じ、活性成分の固定されたおよび固定されない組み合わせの両方を含む、生成物を意味する。用語「固定された組み合わせ」は、活性成分、例えば、化合物（すなわち、本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）と助剤の両方が、単一の実体または用量の形態で患者に同時投与されることを意味する。用語「固定されない組み合わせ」は、活性成分、例えば、化合物（すなわち、本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）と助剤が、特異的な時間制限の介入なく、同時に、平行して、または、連続して、別の実体として患者に投与されることを意味し、このような投与は、患者の身体に有効なレベルの２つの化合物を提供する。後者の用語はまた、カクテル療法、例えば、３以上の活性成分の投与にも当てはまる。
【０２７６】
用語「医薬組成物」は、化合物（すなわち、本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）と、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、および／または、賦形剤などの他の化学成分との混合物を指す。医薬組成物は、有機体への化合物の投与を促進する。化合物を投与する多数の技術は、次のものを含むが、これらに限定されない技術に存在する。即ち、静脈内、経口、エアロゾル、非経口、眼、肺、および、局所への投与。
【０２７７】
用語「被験体」または「患者」は、哺乳動物を含む。哺乳動物の例は、限定されないが、哺乳動物のクラスの任意のメンバー：ヒト、チンパンジーのようなヒト以外の霊長類、および、他の類人猿およびサル類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜、ウサギ、イヌ、およびネコなどの飼育動物、ラット、マウスおよびモルモットなどのような、げっ歯類を含む、実験動物を含む。一つの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０２７８】
用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書に使用されるように、疾患、障害または疾病の少なくとも１つの症状を軽減、緩和、または改善すること、更なる症状を予防すること、疾患または疾病を抑制すること、例えば、疾患または疾病の進行を停止すること、疾患または疾病を和らげること、疾患または疾病を退行させること、疾患または疾病によって引き起こされる状態を和らげること、または、予防的および／または治療的のいずれかで、疾患または疾病の症状を止めることを含む。
【０２７９】
（投与経路）
適切な投与経路は、経口投与、静脈内投与、直腸投与、エアロゾル投与、非経口投与、経眼投与、経肺投与、経粘膜投与、経皮投与、膣内投与、経耳投与、経鼻投与、および、局所投与を含むが、これらに限定されない。更に、ほんの一例ではあるが、非経口送達は、くも膜下腔内、直接脳室内、腹腔内、リンパ内、および、鼻腔内の注入だけでなく、筋肉内、皮下、静脈内、髄内の注入も含む。
【０２８０】
特定の実施形態において、本明細書に記載される化合物は、しばしばデポ製剤または持続放出性製剤として、例えば、器官への直接的な化合物の注射を介して、全身よりもむしろ局所に投与される。具体的な実施形態において、長期間作用型製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内に）または筋肉内注射により投与される。さらに、他の実施形態において、薬は、標的とする薬送達系、例えば、抗臓器抗体（ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）でコーティングしたリポソームにおいて、送達される。このような実施形態において、リポソームは、臓器を標的とし、臓器によって選択的に取り込まれる。さらに他の実施形態において、本明細書に記載の化合物は、急速放出製剤の形態、拡張放出製剤の形態、または、中間放出製剤の形態で提供される。さらに他の実施形態において、本明細書に記載の化合物は、局所的に投与される。
【０２８１】
（医薬組成物／製剤）
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物は、医薬組成物へと処方される。具体的な実施形態において、医薬組成物は、活性化合物を薬学的に使用可能な製剤へと処理するのを促進する賦形剤および助剤を含む、１以上の生理学的に許容可能な担体を用いて、従来の方式で処方される。適切な製剤は、選択される投与の経路に依存する。薬学的に許容可能なあらゆる技術、担体、および、賦形剤は、本明細書に記載の医薬組成物を処方するのに適したものとして使用される。
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：
Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ  （Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，  Ｊｏｈｎ  Ｅ．，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，  Ｈ．Ａ．  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，  Ｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８０；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）。
【０２８２】
本明細書に提供されるものは、化合物（すなわち、本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）、および、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、または、担体を含む医薬組成物である。特定の実施形態において、記載の化合物は、化合物（すなわち、本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）が併用療法におけるように他の活性部分と混合される医薬組成物として投与される。本明細書に含まれるものは、下の区分およびこの開示の至る所にある併用療法で説明される、活性分子（ａｃｔｉｖｅｓ）の全ての組み合わせである。特異的な実施形態において、医薬組成物は、１つ以上の化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）を含む。
【０２８３】
医薬組成物は、本明細書に使用されるように、化合物（すなわち、本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）と、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘安定剤、および／または、賦形剤などの他の化学成分との混合物を指す。特定の実施形態において、医薬組成物は、有機体への化合物の投与を容易にする。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される処置方法または使用を行うことで、治療的に有効な量の化合物（すなわち、本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）は、処置されるべき疾患または疾病を有する哺乳動物に医薬組成物として投与される。特定の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。特定の実施形態において、治療的に有効な量は、被験体の疾患の重症度、年齢、および、相対的な健康状態、使用される化合物の力価、および、他の因子に依存して変化する。本明細書に記載される化合物は、単一で、または、混合物の成分としての１以上の治療薬と組み合わせて使用される。
【０２８４】
１つの実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）は、水溶液で処方される。特定の実施形態において、その水溶液は、ほんの一例であるが、ハンクス溶液、リンガー溶液、または、生理的食塩水などといった生理的に適合する緩衝液から選択される。他の実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）は、経粘膜投与のために処方される。特定の実施形態において、経粘膜製剤は、浸透すべきバリアにとって適切な浸透剤を含む。本明細書に記載の化合物が他の非経口投与のために処方されるさらに他の実施形態において、適切な処方は、水溶性または非水溶性の溶液を含む。特定の実施形態において、そのような溶液は、生理学的に適合する緩衝液および／または賦形剤を含む。
【０２８５】
別の実施形態において、本明細書に記載の化合物は、経口投与のために処方される。化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）を含む本明細書に記載の化合物は、例えば、薬学的に許容可能な担体または賦形剤などと、活性な化合物を混合させることによって処方される。様々な実施形態において、本明細書に記載の化合物は、ほんの一例であるが、錠剤、粉剤、丸薬、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、エリキシル剤、スラリー剤、懸濁剤などを含む、経口の投与形態で処方される。
【０２８６】
特定の実施形態において、経口使用の医薬調製物は、１以上の固体の賦形剤を、本明細書中に記載されている１以上の化合物と混合することによって、随意に結果として得られた混合物を任意に粉砕することによって、および、錠剤または糖衣錠コア（ｄｒａｇｅｅ  ｃｏｒｅｓ）を得るために、必要に応じて、適切な助剤を添加した後に、顆粒の混合物を処理することによって、得られる。適切な賦形剤は、特に、ラクトーゼ、ショ糖、マンニトール、または、ソルビトールを含む砂糖などの充填剤；次のものなどのセルロース製剤：例えば、トウモロコシデンプン、小麦澱粉、米澱粉、じゃが芋澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウム・カルボキシメチルセルロース；あるいは、次のものなど他のもの：ポリビニルピロリドン（ＰＶＰまたはポビドン）あるいはリン酸カルシウム。具体的な実施形態において、崩壊剤は任意に加えられる。崩壊剤は、ほんの一例ではあるが、架橋結合したクロスカルメロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、あるいは、アルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩を含む。
【０２８７】
１つの実施形態において、糖衣錠コアや錠剤などの剤形は、１以上の適切なコーティングを提供する。具体的な実施形態において、濃縮糖液は、剤形をコーティングするために使用される。糖液は、ほんの一例ではあるが、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または、二酸化チタン、ラッカー溶液、および、適切な有機溶媒、または、混合溶媒などのさらなる成分を任意に含む。染料および／または色素は同様に、同定目的のため、コーティングに任意に加えられる。さらに、染料および／または色素は、活性な化合物の投与量の異なる組み合わせを特徴づけるため任意に利用される。
【０２８８】
特定の実施形態において、本明細書中に記載されている少なくとも一つの治療上有効な量の化合物は、他の経口剤形で処方される。経口剤形は、ゼラチン製の柔らかい密封されたカプセル剤のみでなく、ゼラチン製の押し込み型のカプセル剤、および、グリセロールやソルビトールなどの可塑剤を含む。具体的な実施態様において、押し込み型のカプセル剤は、１以上の充填剤と混合された活性成分を含む。充填剤は、ほんの一例ではあるが、ラクトース、でん粉などの結合剤、および／または、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および、任意に安定剤を含む。他の実施形態において、軟カプセル剤は、適切な液体中で溶解または懸濁された１以上の活性な化合物を含む。適切な液体は、ほんの一例ではあるが、１以上の脂肪油、流動パラフィン、または、液体ポリエチレングリコールを含む。
さらに、安定剤が任意に加えられる。
【０２８９】
他の実施形態において、本明細書中に記載されている治療上有効な量の少なくとも一つの化合物は、口腔投与または舌下投与のために処方される。口腔投与または舌下投与に適した製剤は、ほんの一例ではあるが、錠剤、ロゼンジ剤、または、ゲル剤を含む。更に他の実施態様において、本明細書中に記載されている化合物は、ボーラス注入または持続注入に適した製剤を含む、非経口注入のために処方される。具体的な実施形態において、注入用製剤は、単位剤形で（例えば、アンプルで）、または、複数回用量容器で提供される。保存剤は任意に注入製剤に加えられる。更なる他の実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）の医薬組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の、滅菌の懸濁剤、溶剤、または、エマルションとして、非経口注入に適した形態で処方される。非経口注入製剤は、懸濁剤、安定剤、および／または、分散剤などの処方剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を任意に含む。具体的な実施形態において、非経口投与のための医薬製剤は、水溶性形態の活性な化合物の水溶液を含む。更なる実施形態において、活性な化合物の懸濁剤は、適切な油性注入懸濁剤として調製される。本明細書中に記載されている医薬組成物で使用される適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ほんの一例ではあるが、ごま油などの脂肪油、または、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、あるいは、リポソームを含む。１つの具体的な実施形態において、水性注入懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、または、デキストランのような懸濁剤の粘度を増加させる物質を含む。懸濁剤は、高濃縮溶液の調製を可能にするため、化合物の溶解度を増加させる適切な安定剤または薬剤を任意に含む。代わりに、他の実施形態において、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水とともに構成するための粉末形態である。
【０２９０】
１つの観点では、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）は、本明細書に記載された、または、当該技術で知られている、非経口注射のための溶液として調製され、自動注入器で投与される。米国特許番号４，０３１，８９３、５，３５８，４８９；５，５４０，６６４；５，６６５，０７１、５，６９５，４７２、および、ＷＯ／２００５／０８７２９７に開示されたものなどの自動注入器（各々の文献はそのような開示のための参照によって本明細書に組み入れられる）が知られている。一般に、自動注入器はすべて、注入される化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）を含む大量の溶液を含んでいる。一般に、自動注入器は、溶液を維持するためのリザーバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を含み、該リザーバーは、薬物を届けるための注射針との流体連通しており、さらに、自動的に注射針を展開させて、患者に注射針を挿入し、患者へ投与量を送達するための機構とも流体連通している。典型的な注入器は、１ｍＬの溶液あたり、０．５ｍｇ乃至１０ｍｇの化合物（すなわち本明細書に記載されるアロステリックなキナーゼ阻害剤）の濃度で約０．３  ｍＬの溶液を提供する。注射器はそれぞれ、化合物を１回分だけ送達することができる。
【０２９１】
さらに他の実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）が局所的に投与される。本明細書中に記載されている化合物は、溶液、懸濁剤、ローション剤、ゲル剤、ペースト剤、薬用スティック、バーム、クリーム、または、軟膏といった様々な局所投与が可能な組成物へと処方される。そのような医薬組成物は、可溶化剤、安定剤、等張増強剤、緩衝剤、および、保存剤を任意に含む。
【０２９２】
さらに他の実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）は、経皮的な投与のために処方される。具体的な実施形態において、経皮製剤は、経皮送達装置および経皮送達パッチを利用し、ポリマーまたは粘着剤の中で溶解および／または分散した親油性エマルションまたは緩衝水溶液であってもよい。様々な実施形態において、このようなパッチは、医薬品の連続送達、パルス送達、または、オンデマンド送達に合わせて構築される。更なる実施形態において、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）の経皮送達は、イオン泳動性パッチなどの手段により達成される。特定の実施形態において、経皮的なパッチは、化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）の制御送達を提供する。具体的な実施形態において、吸収速度は、律速膜（ｒａｔｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を使用することで、または、化合物をポリマーマトリックスもしくはゲルの中に閉じ込めることで低減される。代替の実施形態において、吸収促進剤は、吸収性を高めるために使用される。吸収促進剤または担体は、皮膚を介する通過を補助する、薬学的に許容可能な吸収性溶媒を含む。例えば、一つの実施形態において、経皮装置は、支持部材、任意に担体と共に化合物を含むリザーバー、任意に長時間にわたって制御された所定の速度で宿主の皮膚に化合物を送達するための律速用バリア、および、皮膚に装置を固定する手段を含む包帯の形態である。
【０２９３】
本明細書に記載の経皮製剤は、当該技術分野で記載された様々な装置を用いて投与される。例えば、そのような装置は、限定されないが、以下を含む：米国特許第３，５９８，１２２号、米国特許第３，５９８，１２３号、米国特許第３，７１０，７９５号、米国特許第３，７３１，６８３号、米国特許第３，７４２，９５１号、米国特許第３，８１４，０９７号、米国特許第３，９２１，６３６号、米国特許第３，９７２，９９５号、米国特許第３，９９３，０７２号、米国特許第３，９９３，０７３号、米国特許第３，９９６，９３４号、米国特許第４，０３１，８９４号、米国特許第４，０６０，０８４号、米国特許第４，０６９，３０７号、米国特許第４，０７７，４０７号、米国特許第４，２０１，２１１号、米国特許第４，２３０，１０５号、米国特許第４，２９２，２９９号、米国特許第４，２９２，３０３号、米国特許第５，３３６，１６８号、米国特許第５，６６５，３７８号、米国特許第５，８３７，２８０号、米国特許第５，８６９，０９０号、米国特許第６，９２３，９８３号、米国特許第６，９２９，８０１号、および、米国特許第６，９４６，１４４号。
【０２９４】
本明細書に記載の経皮剤形は、当該技術分野では従来技術である、特定の薬学的に許容可能な賦形剤を組み込んでもよい。１つの実施形態において、本明細書に記載される経皮的な製剤は、少なくとも３つのコンポーネント：（１）化合物（すなわち、本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）の製剤；（２）  浸透促進剤；および、（３）水性の補助薬を含む。加えて、経皮製剤は、例えば、ゲル化剤、クリーム、および軟膏基剤などの付加的な化合物（但しこれらに限定されるわけではない）をさらに含むことができる。幾つかの実施形態において、経皮製剤は、吸収を促進するとともに皮膚から経皮製剤が取り除かれることを防ぐために、繊維裏地または不織布裏地さらに含む。他の実施形態において、本明細書に記載の経皮製剤は、肌への拡散を促進するために飽和状態または過飽和状態を維持する。
【０２９５】
他の実施形態において、化合物（すなわち本明細書に記載されるアロステリックキナーゼ阻害剤）は、吸入による投与のために処方される。吸入投与に適した様々な形態は、エアロゾル、ミスト、または粉末を含むが、これら限定されない。化合物（即ち、本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）の医薬組成物は、適切な噴霧剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他適切なガス）を使用して、加圧包装またはネブライザーからエアロゾルスプレー提示形態で都合よく送達される。具体的な実施形態において、加圧されたエアロゾルの用量単位は、計量された量を送達するために、バルブを提供することによって決定される。特定の実施形態において、吸入器または注入器で使用するための、ほんの一例ではあるが、ゼラチンなどから成るカプセル剤および薬包は、化合物の粉末混合、およびラクトースまたはでん粉などの適切な粉末基剤を含み処方される。
【０２９６】
鼻腔内用の製剤は当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第４，４７６，１１６号、米国特許第５，１１６，８１７号、米国特許第６，３９１，４５２号に記載され、その各々は引用文によって特に組込まれる。化合物（即ち、本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）を含み、これら及び当該技術分野において周知の他の技術に従って調製される製剤は、ベンジルアルコール又は他の適切保存料、フルオロカーボン、及び／又は当該技術分野において既知の他の可溶化剤又は分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製される。例えば、Ａｎｓｅｌ，  Ｈ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄ．  （１９９５）を参照されたい。好ましくは、これらの組成物及び製剤を、適切で毒性のない、薬学的に許容可能な成分を用いて調製する。これらの成分は、この分野において標準の参照である、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ、２１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００５などの供給源において見出される。適切な担体の選択は、所望の鼻腔剤形（例えば、溶液、懸濁液、軟骨剤、又はゲル）の正確な性質に大きく依存している。鼻腔剤形は、一般的に活性成分に加えて、大量の水を含有する。ｐＨ調節剤、乳化剤又は分散剤、保存料、界面活性剤、ゲル化剤、又は緩衝剤及び他の安定剤及び可溶化剤などの少量の他の成分も、同様に存在してもよい。好ましくは、鼻腔剤形は、鼻からの分泌物と等張である。
【０２９７】
吸入による投与のため、本明細書に記載の化合物は、エアロゾル、噴霧、又は粉末としての形態であってもかまわない。本明細書に記載の医薬組成物は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の好適な気体）を用いて、加圧型パック又は噴霧器から送り出されるエアロゾルの噴霧という形状で効果的に送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与ユニットは、測定された量を送達するための弁を提供することによって決定され得る。例えば、ほんの一例として、インヘラー又は吸入器において使用するためのゼラチンのカプセル及び薬包を、ラクトース又はデンプンなどの、本明細書に記載の化合物の粉末混合物及び適切な粉末を含むように処方してもかまわない。
【０２９８】
更なる他の実施形態において、化合物（即ち、本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）は、ポリビニルピロリドン、ＰＥＧなどの合成ポリマーと同様に、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を含む、浣腸剤、直腸ゲル剤、直腸気泡剤、直腸エアロゾル、坐薬、ゼリー状坐薬、または保持用浣腸剤などの直腸用組成物で処方される。組成物の坐薬形態において、限定されないが、脂肪酸グリセリドの混合物などの低融点ワックスは、随意にココアバターと組み合わされて、最初に融解される。
【０２９９】
特定の実施形態において、医薬組成物は、活性化合物を薬学的に使用できる調製物へと処理するのを促進する賦形剤および補助剤を含む、１以上の生理的に許容可能な担体を使用して、任意の従来の様式で処方される。適切な製剤は、選択される投与の経路に依存する。薬学的に許容可能なあらゆる技術、担体、および賦形剤は、適切に、当技術分野で理解されているように任意に使用される。
【０３００】
化合物（即ち、本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）を含む医薬組成物は、ほんの一例ではあるが、従来の混合、溶解、造粒、ドラゼー製造、粉砕、乳化、封入、包括、又は圧迫の工程の手段などの、従来の方法で製造されてもよい。医薬組成物は、少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含み、および本明細書中に記載される少なくとも一つの化合物（即ち、本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）を、活性成分として含む。活性成分は、遊離酸形態もしくは遊離塩基形態、または薬学的に許容可能な塩の形態である。さらに、本明細書に記載される方法及び医薬組成物は、Ｎ−オキシド、（多形体としても知られる）結晶形態に加え、同じ種類の活性を有するこれらの化合物の活性代謝物の使用も含む。本明細書に記載される化合物の全ての互変異性体は、本明細書提示の化合物の範囲内に含まれる。更に、本明細書に記載される化合物は、水やエタノールなどの薬学的に許容可能な溶媒を有する溶媒和形態のみでなく、非溶媒和形態も含む。本明細書に示される化合物の溶媒和形態はまた、本明細書に開示されるものと考えられる。更に、医薬組成物は、保存剤、安定剤、湿潤剤、もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調整する塩、緩衝剤、および／または他の治療上有効な物質などの、他の薬用または医薬品、担体、アジュバントを任意に含む。
【０３０１】
本明細書に記載される化合物を含む組成物の調製の方法は、固体、半固体又は液体を形成するために、１以上の不活性な、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体を用いて、化合物を調剤する工程を含む。固体組成物は、限定されないが、粉末、錠剤、分散性顆粒、カプセル剤、カシェ剤、及び坐剤を含む。液体組成物は、化合物を溶解する溶液、化合物を含むエマルション、又はリポソーム、ミセル、又は本明細書に開示されるような化合物を含むナノ粒子を含む溶液を含む。半固体組成物は、限定されないが、ゲル、懸濁液及びクリームを含む。本明細書中に記載される医薬組成物の形態は、液体溶液または懸濁液、使用前に液体における溶解又は懸濁に適した固体形態、またはエマルションを含む。これらの組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの微量の非毒性の補助物質を任意に含む。
【０３０２】
いくつかの実施形態において、少なくとも化合物（即ち、本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）を含む医薬組成物は、薬剤が溶液、懸濁液、またはその両方に存在する液体の形態を実例として取る。一般的に組成物が溶液または懸濁液として投与されると、薬剤の第一の部分は溶液中に存在し、薬剤の第二の部分は液体マトリックス中の懸濁液中に、粒子形態で存在する。いくつかの実施形態において、液体組成物はゲル製剤を含む。他の実施形態において、液体組成物は水性である。
【０３０３】
特定の実施形態において、医薬品の水溶性懸濁液は、懸濁剤として１以上のポリマーを含む。ポリマーは、セルロースポリマー、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの水溶性ポリマー、架橋カルボキシル含有ポリマーなどの非水溶性ポリマーを含む。本明細書中に記載されている特定の医薬組成物は、例えばカルボキシメチルセルロース、カルボマー（アクリル酸ポリマー）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリアクリルアミド、ポリカルボフィル、アクリル酸／アクリル酸ブチルコポリマー、アルギン酸ナトリウム、およびデキストランから選択される粘膜付着性ポリマーを含む。
【０３０４】
医薬組成物はまた、化合物（すなわち本明細書に記載のアロステリックキナーゼ阻害剤）の溶解度を援助するために随意に可溶化剤を含む。用語「可溶化剤」は、一般的に、薬剤のミセル溶液又は真性溶液の形成をもたらす薬剤を含む。特定の許容可能な非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０は、眼科用として許容可能なグリコール、ポリグリコール、例えばポリエチレングリコール４００、およびグリコールエーテルのように、可溶化剤として役立つ。
【０３０５】
更に、医薬組成物は、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸および塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウムおよびトリス−ヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基；およびシトラート／デキストロース、重炭酸ナトリウム及び塩化アンモニウムなどの緩衝液を含む、１以上のｐＨ調整剤又は緩衝剤を含む。このような酸、塩基、および緩衝液は、組成物のｐＨを許容可能な範囲で維持するのに必要とされる量で含まれる。
【０３０６】
更に、医薬組成物は、組成物の重量モル浸透圧濃度を許容可能な範囲にするために必要な量の１以上の塩を任意に含む。このような塩は、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン又はアンモニウムカチオン及び塩化物アニオン、クエン酸アニオン、アスコルビン酸アニオン、ホウ酸アニオン、リン酸アニオン、重炭酸アニオン、硫酸アニオン、チオ硫酸アニオン又は亜硫酸水素アニオンを有するものを含み、適切な塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム及び硫酸アンモニウムを含む。
【０３０７】
他の医薬組成物は、微生物の活性を抑制する１以上の保存剤を任意に含む。適切な保存剤は、マーフェン（ｍｅｒｆｅｎ）及びチオマーサルなどの、水銀包含物質；安定した二酸化塩素；および塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム及び塩化セチルピリジニウムなどの四級アンモニウム化合物を含む。
【０３０８】
更なる他の医薬組成物は、物理的安定性を増幅するため、または他の目的のために、１以上の界面活性剤を含む。適切な非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド及び植物油、例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油；およびポリオキシエチレンアルキルエーテル及びアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０を含む。
【０３０９】
更なる他の医薬組成物は、必要な場合に化学安定性を増幅させる１以上の抗酸化剤を含んでもよい。適切な抗酸化剤は、ほんの一例として、アスコルビン酸及び二亜硫酸ナトリウムを含む。
【０３１０】
特定の実施形態において、医薬品の水性懸濁液組成物は、単回用量用の再密閉できない容器に包装される。あるいは、複数回用量用の再密閉できる容器が使用され、この場合は、組成物中に保存剤を含むことが一般的である。
【０３１１】
代替の実施形態において、疎水性医薬化合物用の他の送達系が利用される。リポソームおよびエマルションは、本明細書の送達用ビヒクルまたは担体の例である。特定の実施形態において、Ｎ−メチルピロリドンなどの有機溶媒も利用される。更なる実施形態において、本明細書中に記載される化合物は、治療薬剤を含む固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの、持続放出系を用いて送達される。様々な持続放出物質が本明細書で役立つ。いくつかの実施形態において、持続放出カプセルは、数時間から２４時間までの間、化合物を放出する。治療試薬の化学的性質と生物学的安定性に依存して、タンパク質安定化のための追加方策が用いられてもよい。
【０３１２】
特定の実施形態において、本明細書中に記載される製剤は、１以上の抗酸化剤、金属キレート剤、チオール含有化合物、および／または他の一般的な安定剤を含む。これら安定剤の例は、限定されないが、（ａ）約０．５％から約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０．１％から約１％ｗ／ｖのメチオニン、（ｃ）約０．１％から約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｄ）約１ｍＭから約１０ｍＭのＥＤＴＡ、（ｅ）約０．０１％から約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｆ）０．００３％から約０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０、（ｇ）０．００１％から約０．０５％ｗ／ｖのポリソルベート２０、（ｈ）アルギニン、（ｉ）ヘパリン、（ｊ）硫酸デキストラン、（ｋ）シクロデキストリン、（ｌ）ペントサンポリサルフェート及び他のヘパリノイド、（ｍ）マグネシウム及び亜鉛などの二価カチオン；または（ｎ）それらの組み合わせを含む。
【０３１３】
＜アッセイおよび臨床的な管理（Ｍａｎｇｅｍｅｎｔ）＞
特定の実施形態において、ＢＲＡＦキナーゼを試験化合物と接触させ、ＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化を監視することを含む、ＲＡＦキナーゼのアロステリック阻害剤を確認する方法が本明細書で提供され、ここで、接触されなかったＢＲＡＦキナーゼに関するＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化の減少は、試験化合物がＢＲＡＦキナーゼのアロステリック阻害剤であることを示す。特定の実施形態において、ＲＡＦキナーゼのアロステリック阻害剤は、ＢＲＡＦキナーゼのアロステリック阻害剤である。
【０３１４】
特定の実施形態において、ＲＡＦキナーゼ（例えばＢＲＡＦ）を試験化合物と接触させ、ＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化を監視することを含む、眼を処置するための治療薬剤を確認する方法が本明細書で提供され、ここで、接触されなかったＢＲＡＦキナーゼに関するＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化の減少は、試験化合物が癌を処置できることを示す。
【０３１５】
幾つかの実施形態において、ＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化を監視することを含む、化学療法（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｉｃ）処置における患者の薬理学の反応を監視する方法が本明細書で提供され、接触されなかったＢＲＡＦキナーゼに関するＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化の減少は、化学療法（ｃｈｅｍｏｅｈｔｒａｐｉｃ）処置が、正の（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）薬理学的反応を有していることを示す。
【０３１６】
幾つかの実施形態において、癌処置の臨床的な管理のための予測的なバイオマーカーとして、ｐＳ３３８−ＣＲＡＦの用途が提供される。特定の実施形態において、接触されなかったＲＡＦキナーゼに関するＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化の減少は、前記癌処置から利益の可能性を示す。バイオマーカーは、患者が特定の処置のための良い候補であるかを測定するため、患者の疾患状態を特徴づけるために使用される前処置測定である。これらのバイオマーカーは予言的なバイオマーカーと呼ばれる。この開示で示されるように、接触されなかったＲＡＦキナーゼに関するＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化は、癌増殖に相関する。ＲＡＦ  ＡＴＰミメティックは、ＲＡＦ  ｐＳ３３８−ＣＲＡＦを誘発し、従って癌細胞中のＲＡＦ二量体形成を誘発する。予測的なバイオマーカーとしてのｐＳ３３８−ＣＲＡＦの使用は、従って、臨床的な癌処置の管理を提供することができる。
【０３１７】
ＩＩ型阻害剤は、イマチニブ（１）を有するＡｂｌおよびソラフェニブ（２）を有するＢ−ＲＡＦの共同結晶構造で見られるように、薬物選択用の新しいパラダイムを表わす。不活性のキナーゼ構成を安定させる手法は、ＤＦＧ−ｏｕｔ構成を安定させる、新しい阻害剤の発達をもたらした（Ｌｉｕ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：３５８−３６４，  Ｏｋｒａｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：７７９−７８６）。以前に考察されたように、Ｒａｆ−１活性化ドメイン（ＳＳ３３８／９ＡＡ）の変異は、Ｒａｆ−１／ＡＳＫ１複合体形成を妨げるだけでなく、遺伝毒性のストレスからのｂＦＧＦを媒介としたＥＣ保護を無効にする。従って、ＢＲＡＦキナーゼを試験化合物と接触させ、ＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化を監視することによって、ここで、接触されなかったＢＲＡＦキナーゼに関するＣＲＡＦのＳ３３８のリン酸化の減少は、試験化合物がＢＲＡＦキナーゼのアロステリック阻害剤であることを示す。
【実施例】
【０３１８】
＜動物研究＞
全ての動物手順を、カリフォルニア大学サンディエゴ校の動物管理使用委員会（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって認可された、プロトコル＃ＳＯ５０１８および＃Ｓ０６００８の下で、すべての適切な規定上の基準に従って行なった。
【０３１９】
計算上のドッキング研究および化学合成。ＰＤＧＦＲβの分子モデリングおよび相同性のモデルを、以下の通りに記載する。全ての化合物を、市販の出発物質から合成し、スキーム、合成手順、および精製の詳細は、以下のように利用可能である。
【０３２０】
望ましい不活性の状態（即ち、ＤＦＧ−ｏｕｔ）において活性化ループのＤＦＧモチーフを含んでいたため、ＢＡＹ４３−９００６（ソラフェニブ）を有するＢ−ＲＡＦのＸ線結晶構造を、ドッキング研究のために選択した。さらに、この不活性の状態を、小分子によって安定させ、結果として、６とのドッキングのため、適切なリガンドに誘発された構成を提供する。ＩｎｓｉｇｈｔＩＩのドッキングのモジュール（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）を、ＢＡＹ  ４３−９００６（ソラフェニブ）を有するＢ−ＲＡＦの以前に報告された共同結晶構造でリガンドドッキング研究を行なうために使用した。構造外のＤＦＧを安定させることが、ＩＩ型キナーゼ阻害様式にとって重要であるため、この不活性な構成を選択した。ドッキングの正確性の測定として、結晶構造からのリガンド、ＢＡＹ４３−９００６を取り除き、この分子の２Ｄ構造からのドッキングを行い、質的に解釈した。ＰＤＧＦＲβキナーゼモジュールの相同性のモデルを、ＶＥＧＦＲ２（ｐｄｂ  ＩＤ  １Ｙ６Ｂ）の結晶構造に基づいて作った。ＶＥＧＦＲ２とＰＤＧＦＲβは、キナーゼドメイン内の４６％の配列の同一性を共有する。相同性モデリングを、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）の相同性のモジュールを使用して行なった。モデルは、その構造の後にｐｒｏｇｒａｍ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）による、１０，０００の反復分子力学の最小化を受けた。この構造への化合物６のドッキングを、上述の通りに行った。
【０３２１】
＜免疫沈殿と免疫ブロット法＞
ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦＡ、またはＰＤＧＦ−ＢＢでの刺激の後、細胞を氷冷のＰＢＳを有する１Ｘで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。ＶＳＭＣｓにおけるＰＤＧＦＲβ自己リン酸化アッセイのため、溶解物からの５００μｇのタンパク質を、４℃で１時間、３μｇの抗−ＰＤＧＦＲβ（ｓｃ−４３２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でインキュベートし、続いて、免疫沈殿のためにプロテインＡ／Ｇビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）により一晩転がした。ＨＵＶＥＣｓ内でのＭＡＰＫアッセイに関して、標準のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法を、ホスホ−ＭＥＫ  Ｓ２１７／Ｓ２２１、ホスホ−ＭＥＫ  Ｓ２９８、ホスホ−ＥＲＫ  Ｔ２０２／Ｙ２０４、ホスホ−Ｃ−ＲＡＦ  Ｓ２５９およびＳ３３８（細胞シグナル伝達からすべて、マサチューセッツ州ダンヴァーズ）、ＭＥＫ１（サンタクルーズ）、ＥＲＫ２（ＳＣ）およびＣ−ＲＡＦ（ＳＣ）に対する抗体を使用して行なった。ＰＤＧＦＲβ自己リン酸化アッセイに関して、ＰＤＧＦＲβ（ｓｃ−３３９、ＳＣ）およびＨＲＰ結合ＰＹ−２０（ｓｃ−５０８、ＳＣ）に対する抗体を、ＰＤＧＦＲβとホスホ−チロシンレベルの各々の合計を検出するために使用した。ＨＲＰ結合の最初の又は第２のＡｂｓを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）により検出した。
【０３２２】
＜細胞生存率アッセイ＞
ＸＴＴアッセイのため、細胞を、９６−ウェルプレート中で一晩成長させ、全てのアッセイを十分な血清および添加剤がある成長培地で実行した。化合物を、ＤＭＳＯ中で連続的に希釈し、次に培地においてさらに希釈して適切な濃度を得、一方で培地だけでの連続的な希釈に関連する沈殿を最小限にした。阻害剤を７２時間加え、細胞の生存率を、フェノキシメトスルファート（ｐｈｅｎｏｘｙｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むフェノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地に１ｍｇ／ｍｌのＸＴＴ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた後、４５０ｎｍに定量した。用量反応曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェアを使用してプロットし、ＥＣ５０を、このプログラムを使用して計算した。
【０３２３】
＜内皮管形成のための星状細胞／内皮細胞共培養アッセイ＞
初期の継代（ｐ＜５）ヒトテロメラーゼの逆転写酵素肝臓の星状細胞（星細胞）、Ｄｒ．Ｄａｖｉｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒからの寛大なギフトを、３７℃で２時間、１０μｇ／ｍの赤い蛍光染料ＤｉＩＣ（３）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識化する。星状細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１：４の比率で初期の継代ＨＵＶＥＣｓ（ｐ＜５）と混合し、Ｍ−１９９培地において３．７５ｍｇ／ｍｌの１型ラットテールコラーゲンマトリクス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）へ混合した。３０μｌのこの混合物を、半分の領域の９６ウェルプレートの各々の容器に播種した（Ｃｏｒｎｉｎｇ）。コラーゲンが３７℃で３０分間重合するのを許容し、１００μｌの完全なＥＢＭ−２培地を各々の容器に加えた。様々な阻害剤をＤＭＳＯ中で連続的に希釈し、続いて、細胞の播種の後６時間、複製容器（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｗｅｌｌｓ）に加えた。内皮管を、１つの容器当たり２μｌのＦＩＴＣ標識化Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を加えることにより、２４時間で染色した。内皮管および星状細胞を、共焦点顕微鏡上の１０ｘの目標により、４８時間で画像化した。画像を、１つの容器当たり５つの領域にわたって集めた。管の長さを、複製容器から全てで１０の顕微鏡視野のため、各々の管にＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを使用して測定した。％周皮細胞で覆われた管の長さを、周皮細胞接触を備えた、および備えていない管に関する管の長さ合計の比率から計算した。
【０３２４】
＜血管新生のマウスＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）モデル＞
メスのＮｕ／Ｎｕマウスを、ＰＢＳまたは２００ｎｇのｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）のいずれかを含む側腹部における、成長因子により消耗されたマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  カリフォルニア州サンノゼ）により移植した。翌朝、マウスを、ｂｉｄ用量スケジュール（ｂｉｄ  ｄｏｓｉｎｇ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ）上の腹膜腔内注入によって、６、対照化合物、又はビヒクル（３．３％のデキストロース中の１０％のＨＳ−１５）で処置した。マトリゲルの移植後５日、マウスをＦＩＴＣレクチンでテール静脈に注入し、プラグを採取して共焦点の顕微鏡検査によって画像化し、蛍光のマイクロプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．，  カリフォルニア州サンノゼ）を使用して、氷冷のＰＢＳ内での均質化の後に定量した。
【０３２５】
免疫組織化学のため、マウスに、上述された同じ用量スケジュールでマトリゲルプラグを移植した。５日目に、プラグを切除し、５μｍの切片を作った。切片を、核対比染色用のＴＯ−ＰＲＯ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  カリフォルニア州カールズバッド）と同様に、ＴＵＮＥＬ染色工程の間に免疫染色を加えたＡｐｏｐｔａｇプロトコルに従って固定した。切片を、抗ホスホ−ＥＲＫ  Ｔ２０２／Ｙ２０４（細胞シグナル伝達）および抗ＣＤ３１、抗−Ｆｌｋ、抗−ＶＥ−カドヘリン（すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  カリフォルニア州サンノゼからのもの）、および抗エンドグリン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から成る内皮細胞混合物により標識化した。主要な抗体を１：１００の希釈液に加え、対応する二次的な抗−ラットＡｂを１：２５０の希釈液に加えた。三色の画像を、共焦点の顕微鏡検査により作った。
【０３２６】
＜同所性の膵臓癌モデル＞
膵癌の細胞株ＸＰＡ１−ＲＦＰからの同所性のヒト膵臓癌異種移植片を、外科の同所性の移植（ＳＯＩ）によってヌードマウスにおいて確立した。簡潔に、指数増殖段階における皮下のＸＰＡ１−ＲＦＰ腫瘍を採取し、血清の無いＲＰＭＩ培地において１ｍｍ３の小片に区分した。マウスに、２μｌ／ｇの投与量で筋肉内に注入される、５０％のケタミン、３８％のキシラジンおよび１２％のアセプロマジン（ａｇｅｐｒｏｍａｚｉｎｅ  ｍａｌｅａｔｅ）を使用して、麻酔をかけ、それらの腹壁をアルコールで殺菌した。その後、小さな切開を、皮膚と腹膜を通じて右の直腸傍の線において行った。膵臓の本体をさらし、１ｍｍ３の腫瘍断片を、単一の８−０ナイロン外科縫合（Ｄａｖｉｓ−Ｇｅｃｋ，  Ｉｎｃ．  Ｍａｎａｔｉ，  Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ）を使用して、膵臓に縫合した。その後、膵臓を腹部に戻し、腹膜と皮膚を、６−０のバイクリル外科縫合を使用して、２層で閉じた。
【０３２７】
ＳＯＩの後３日目に、動物は、１２時間の間隔で、化合物、６（２００μｌの全容積中の５０ｍｇ／ｋｇの投与量）、またはビヒクル対照の毎日２回のＩＰ注入により処置を始めた。動物を、ＭＴ−２０光源（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｌａｎｅｇｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＤＰ７０  ＣＣＤカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｒｐ．  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を含む、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＶ１００小型動物画像システム（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｒｐ．  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を使用して、ＳＯＩの後３日目から始まり、３日ごとにその重さを量り、画像化した。画像をすべて、フォトショップエレメント−４の使用により、コントラストと明るさのために処理した。測定をすべて、画像−Ｊソフトウェアを使用して行った。ＳＯＩ後１２日目に、動物を犠牲にし、それらの腫瘍を切除し、重さを量り、腫瘍容積を計算するために３次元で測定した。腫瘍容積を、式：容積＝高さｘ幅ｘ長さｘ０．５２により計算した。その後、エクスビボの腫瘍を圧縮し、ＯＶ１００を使用して画像化した。各々の腫瘍に関する合計の血管の長さを、画像−Ｊソフトウェアを使用して測定し、腫瘍容積で合計の腫瘍の血管の長さを割ることにより、血管密度に転換した。
【０３２８】
＜同所性の腎細胞癌モデル＞
オスのＮｕ／Ｎｕマウスに、５０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇのメデトミジンの腹膜腔内注入で麻酔をかけた。小さな切開をマウスの左側腹部に沿って行い、腎臓をさらした。２７ゲージのインスリンシリンジを、ＳＮ１２Ｃ−ＲＦＰ細胞の同所性の注入に使用した。２０μｌの１：１のＰＢＳ：マトリゲル混合物における１００万の腫瘍細胞を、腎臓の被膜下のちょうど下で、腎臓の下側ポール（ｌｏｗｅｒ  ｐｏｌｅ）に注入した。針を、目に見える疱疹が形成された後に取り除き、腫瘍細胞懸濁液の漏出は最小であった。腹壁を、腹膜を縫合して皮層をステープルで留めることにより閉じた。最小の漏出を伴う被膜下における注入時に目に見える疱疹を形成した動物を、有効性の研究に使用した。ＳＮ１２Ｃ−ＲＦＰ細胞の同所性の注入を伴うオスのＮｕ／Ｎｕマウスを、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＶ１００小型動物画像システムを使用して画像化し、重量と画像結果に基づき、７日目にグループ分けした。マウスに、１０％のＨＳ−１５および３．３％のデキストロース中の６で、毎日１００ｍｇ／ｋｇを経口投薬した。研究の終わりに、腎臓腫瘍を、ＲＦＰ発現のためのＯＶ−１００システムにより画像化し、その後腎臓を切除し、重さを量った。腫瘍を有する腎臓と正常な腎臓の間の重量の違いを報告した。
【０３２９】
＜新しい化合物の合成および特徴づけ＞
＜一般的な合成方法＞
特に断りのない限り、材料を商用の供給源から得、精製することなく使用した。真空内での溶媒の除去は、Ｂｕｅｃｈｉ  Ｒ−２００回転蒸発装置およびＷｅｌｃｈ  ２０２５真空ポンプを使用する蒸留を指す。マイクロ波照射実験をすべて、専売のＢｉｏｔａｇｅソフトウェアを含む標準構成におけるＩｎｉｔｉａｔｏｒ（商標）（Ｂｉｏｔａｇｅ）マイクロ波装置で実行した。反応を、５ｍＬのＥｍｒｙｓ（商標）マイクロ波バイアルで行なった。照射期間の後、反応槽を、ガス噴射冷却によって周囲温度にまで急速に冷却した（１−２分）。
【０３３０】
１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ−ＩＩ（５００ＭＨｚ）分光計で記録した。プロトン共鳴を、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）からの１００万分の１（ｐｐｍ）の低磁場において報告する。１Ｈ  ＮＭＲデータを、多重度（ｓ  一重項、ｄ  二重項、ｔ  三重項、ｑ  四重項、ｄｄ  二重項の二重項、ｄｔ  三重項の二重項、ｂｒ  ｓ  広範囲の一重項）として報告し、ヘルツにおける定数とプロトンの数を組み合わせる。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、ＤＭＳＯ−ｄ６（０．０３ｖ／ｖのＴＭＳを有する９９．９６  ＤＭＳＯ−ｄ６）において得た。１，２，４−トリアゾールに関する１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、トリアゾール環のＮ−プロトンの急速な交換を誘発するために、８０℃で記録した。室温でのトリアゾール環のＮ−プロトンの中間から遅い交換（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ｔｏ−ｓｌｏｗ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）により、ピークの広幅化を、周囲温度で記録される１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの両方において得た。データをすべて、Ｘｗｉｎ−ＮＭＲソフトウェアにより処理した。
【０３３１】
高圧液体クロマトグラフィーを、１５１  ＵＶ／Ｖｉｓ検出器を伴うＧｉｌｓｏｎ  Ｕｎｉｐｏｉｎｔ  ２１５  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｅｒ、およびＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｅｌｄ（商標）ＲＰ１８  ７ｕｍ  ４０ｘ１００ｍｍのＰｒｅｐＰａｋ（登録商標）カートリッジを有するＷａｔｅｒｓ  ＰｒｅｐＬＣ（商標）４０ｍｍ  Ｍｏｄｕｌｅを使用して達成した。高圧液体クロマトグラフィーによる化合物の精製を、溶媒Ａ（０．１％のＴＦＡを有する水）における１０％の溶媒Ｂ（０．１％のＴＦＡを有するアセトニトリル）から、２５分の１００％の溶媒Ｂまでの勾配を伴う、４０ｍＬ／分の流量で行い、その後１００％の溶媒Ｂで５分溶出した。分析的な薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、商用のシリカプレート（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、シリカゲル６０  Ｆ２５４、０．２５ｎｍの厚さ）上で行った。化合物を紫外線（２５４ｎｍ）によって視覚化した。フラッシュクロマトグラフィーを、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）（Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（登録商標）、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯ）により、またはシリカゲル（ＩＣＮシリカ３２−６３  Ｄ６０Å）を使用して行った。Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（登録商標）ＺＱ（商標）及び２９９６  ＰＤＡ検出器を有するＷａｔｅｒｓ  ２７９５  ＬＣ／ＭＳを、反応の進行を監視し、生成物の純度を確認するために使用した。質量スペクトルを、エレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）陽性様式で得た。正確な質量を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分光計上で行なわれる、エレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）飛行時間（ＴＯＦ）反射実験により測定した。サンプルに、４０００ＶのＥＳＩ電圧および２００μｌ／分の流量で、ＴＯＦ反射分析器においてエレクトロスプレーを行った。
【０３３２】
＜インビトロでのキナーゼスクリーンおよび競合結合アッセイ＞
試験化合物と同様にソラフェニブを、インビトロジェンにかけ、それらのＳｅｌｅｃｔＳｃｒｅｅｎ（商標）プロファイリングサービスを利用してスクリーンした。競合結合アッセイのため、試験化合物を、ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（商標）技術（を使用して、７０の多様なキナーゼ標的に対し１０μＭでスクリーンしたＡｍｂｉｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｋａｒａｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１２７−１３２）。１１点のＫｄ曲線を、初期のスクリーン中に確認されたヒット（ｈｉｔｓ）のため測定した。
【０３３３】
＜細胞培養および細胞ベースのスクリーニング＞
継代＜６で行われるすべての実験により推奨されるように、ＨＵＶＥＣｓおよびＶＳＭＣｓ（Ｌｏｎｚａ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を維持した。ＸＰＡ１−ＲＦＰおよびＳＮ１２Ｃ−ＲＦＰ細胞を、１０％のＦＢＳで補足されるＲＰＭＩにおける標準培養条件下に維持した。ＸＰＡ−１細胞は、ジョンホプキンズ大学のＤｒ．Ａｎｉｒｂａｎ  Ｍａｉｔｒａからのギフトであり、以前に記載されたような（Ｔｓｕｊｉ，  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊｏｐ  ７：１９３−１９９）、安定したＲＦＰ発現細胞を確立するため、レトロウイルスにより伝達された。細胞ベースのアッセイのため、下合流細胞（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）を、血清の無い培地で一晩欠乏し、阻害剤により前処理し、図の説明文に記載されるような成長因子により刺激した。免疫沈殿、免疫ブロット法、および抗体の説明を、本明細書に記載する。
【０３３４】
＜ゼブラフィッシュ研究＞
遺伝子組み換えのＴｇ（ｆｌｉ１：ＥＧＦＰ）ゼブラフィッシュ胚を、ｗｗｗ．ｚｆｉｎ．ｏｒｇから購入し、他で報告し（Ｌａｗｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２４８：３０７−３１８）、（“Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  −  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ“，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００２）に従って維持した。ＤＭＳＯ保存液中の化合物を、水へ直接希釈し、血管を、Ｎｉｋｏｎ  ｃ１−ｓｉ共焦点顕微鏡を使用して、ＧＦＰ発現のために画像化した。アポトーシスを、以前に記載されたプロトコルを伴う（Ｓｔａｎｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８１：２８７８２−２８７９３）、Ａｐｏｐｔａｇインサイツの赤色蛍光キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用するＴＵＮＥＬ染色によって測定した。
【０３３５】
＜星状細胞／内皮細胞管形成アッセイおよびマウスマトリゲルモデル＞
このアッセイを、ＳＩ方法に記載の通りに行った。星状細胞は、Ｄｒ．Ｄａｖｉｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒからのギフトであり、以前に記載された（Ｓｃｈｎａｂｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ；ａ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ８２：３２３−３３３）。管形成のための３Ｄ−コラーゲンアッセイを、以前に記載されたとおりに行った（Ｋｏｈ，  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｘｙｍｏｌｏｇｙ  ４４３：８３−１０１）。マウスマトリゲルモデルを、以前に記載されたとおりに行い（Ｅｌｉｃｅｉｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ４：９１５−９２４  ５）、免疫組織化学および動物投薬のさらなる詳細を、本明細書に見出すことができる。
【０３３６】
＜同所性の膵臓癌および腎細胞癌モデル＞
以前に記載された６週齢のオスのネスチン−ＧＦＰのヌードマウス（Ａｍｏｈ，  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５：５３５２−５３５７；Ａｍｏｈ，  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  １３２：１６４−１６９）は、以前に記載されるように（Ｋａｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：５５２１−５５２５，  ３９；Ｂｏｕｖｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２：１５３４−１５４０）、及び本明細書で開示される更なる詳細において、ＸＰＡ−１−ＲＦＰ膵臓腫瘍細胞の外科の同所性の移植を受けた。腎細胞癌モデルを、以前に記載されたように使用し（Ａｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １７：２６５−２７０）、本明細書のさらなる詳細に記載する。
【０３３７】
＜統計学上の計算＞
統計評価をすべて、ＮＣＳＳ  ２００７統計ソフトウェア（Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，  ＵＴ）を使用して行った。２つのグループ間の比較のため、両側ｔ検定を、等しい変動を伴うデータに使用し、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ不等変動試験（Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈ  Ｕｎｅｑｕａｌ  Ｖａｒｉａｎｃｅ  Ｔｅｓｔ）を、不等な変動を伴うデータに使用した。２つ以上のグループ間の比較のため、一元配置分散分析を使用した。Ｐ値を図の説明文で言及する。
【０３３８】
＜実施例１：トリアゾール化合物６の調製＞
【０３３９】
【化８２】
2013518909.tif 000084
【０３４０】
化合物６を、模式図４に従い、市販の４，６−ジクロロ−２−（メチルチオ）ピリミジンから調製した。化合物６．１を調製するため、４，６−ジクロロ−２−（メチルチオ）ピリミジンを、密封管内のＴＨＦにおけるアンモニアと反応させ、良い収量で４−アミノ−６−クロロ−２−（メチルチオ）ピリミジンを提供した。結果として生じる化合物のアミノ基を、ＢＯＣなどの適切な保護基により保護し、化合物６．１を得た。その後、化合物６．１を、塩基が存在する状態で、メチル４−ヒドロキシベンゾアートと反応させ、アミンで保護した中間体２を得て、それは、酸性の条件下の脱保護により、メチル４−（６−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−４−イルオキシ）ベンゾエート（３）を得た。メタノール中のヒドラジン水和物との化合物３の反応は、良い収量で４−（６−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−４−イルオキシ）ベンゾヒドラジド（６．４）を提供した。その後、ヒドラジドを、塩基が存在する状態でＳメチルＮ−［３−（トリフルオロメチル−フェニル）チオ尿素と反応させ、化合物６を得た。
【０３４１】
＜実施例１−１：４−アミノ−６−クロロ−２−（メチルチオ）ピリミジンの調製＞
【０３４２】
【化８３】
2013518909.tif 000085
【０３４３】
【表１】
2013518909.tif 000086
【０３４４】
実験手順：
＊  ２ＬのオートクレーブへＴＨＦ中のアンモニアを入れ、４，６−ジクロロ−２−（メチルチオ）ピリミジンをゆっくり加える。
＊  ５０−６０℃にまで反応混合物を加熱し、３−４時間、５０−６０℃で反応を維持する（本来備わっている圧力（Ｉｎｂｕｉｌｔ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）７−８ｋｇ／ｃｍ２）。
＊  ＴＬＣによって反応の進行を確認する。完了に際して、反応を２５−３５℃にまでもたらした。
＊  真空下で反応混合物を濃縮する。
＊  ヘキサンを充填し（ｃｈａｒｇｅ）、２５−３５℃で３０−４５分間撹拌する。
＊  固体を濾過し、ヘキサンで固体を洗浄する。
＊  水（２Ｘ４００ｍＬ）で固体を洗浄する。
＊  Ｍ．Ｃが２％未満に達するまで、２５−３５℃で固体を乾燥する。
収量３５２．０ｇ。
収量の％：９７．７７％。
ＨＰＬＣによる純度：９９．０７％。
異なるアナログが使用されるとき、ＭｅＯＨまたはジオキサンにおけるアンモニアなどの他の適切な条件を、従って使用することができる。
【０３４５】
＜実施例１−２：４−アミノ−６−クロロ−２−（メチルチオ）ピリミジン、６．１の調製＞
【０３４６】
【化８４】
2013518909.tif 000087
【０３４７】
【表２】
2013518909.tif 000088
【０３４８】
実験手順
＊  ２５−３５℃で、４−アミノ−６−クロロ−２−（メチルチオ）ピリミジン及びＴＨＦを、清潔で乾燥した丸底フラスコへ充填する。
＊  ５−１０分で、２５−３５℃でＫ２ＣＯ３ロットワイズ（ｌｏｔ  ｗｉｓｅ）を加える。
＊  １５−３０分で、２５−３５℃でＢｏｃ無水物をゆっくり加える。
＊  １５−３０分間、２５−３５℃で撹拌する。
＊  ２５−３５℃で、５−１０分でＤＭＡＰをゆっくり加える。
＊  ５−３５℃で１−２時間、反応質量を維持する。
＊  ＴＬＣによって反応の進行を確認する。
＊  完了に際して、酢酸エチルと水を充填する。
＊  １０−１５分間、２５−３５℃で反応質量を撹拌する。
＊  水層と有機質層を分離する。
＊  飽和した塩化ナトリウム溶液で有機質層を洗浄する。
＊  硫酸ナトリウム上で有機質層を乾燥する。
＊  硫酸ナトリウムを濾過して取り除く。
＊  酢酸エチルで硫酸ナトリウムを洗浄する。
＊  真空下で完全に有機質層を濃縮する。
＊  収量：６３２ｇ。
＊  収量の％：９８．４６．
＊  ＨＰＬＣによる純度：７７．９８％のＤｉ−Ｂｏｃ化合物。
＊  １１．４９％のＭｏｎｏ  Ｂｏｃ化合物。
あるいは、化合物６．１を、対応する４，６−ジクロロピリミジンまたは当該技術分野において既知の他の適切な方法に、（ＢＯＣ）２ＮＨ陰イオンを加えることによって調製することができる。
【０３４９】
＜実施例１−３：化合物２の調製＞
【０３５０】
【化８５】
2013518909.tif 000089
【０３５１】
【表３】
2013518909.tif 000090
【０３５２】
実験手順：
＊  ２５−３５℃で、清潔な乾燥したＲＢフラスコへ化合物６．１を充填する。
＊  ２５−３５℃で、ＲＢフラスコへＤＭＦを充填する。
＊  ２５−３５℃で、メチルヒドロキシルベンゾアートを充填する。
＊  ２５−３５℃で、ＲＢフラスコへ１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）を充填する。
＊  ２５−３５℃で反応質量を撹拌する。
＊  ＴＬＣによって反応の進行を確認する。
＊  ＴＬＣが従う場合、水ロット−１を加える。
＊  ２５−３５℃で１−２時間撹拌する。
＊  固体を濾過し、水ロット−２で固体を洗浄する。
＊  ２５−３５℃で固体を乾燥し、Ｍ．Ｃは３％未満に達する。
＊  収量：６８０ｇ
＊  収量の％：８０％。
＊  ＨＰＬＣによる純度：９０．５６％。
その他の適切なアミン塩基、好ましくは、第三級アミン塩基（例えばＤＢＵ、ピリジン、ＤＭＡＰ）を、良い収量を達成するために使用することができることが見出された。例えば、ピリジンを還流で１８時間使用し、生成物の８８％の収量を得た。ＴＨＦまたはアセトニトリルを、好ましいアセトニトリルで、ＤＭＦの代わりの溶媒として使用した。
【０３５３】
＜実施例１−４：化合物６．３の調製＞
【０３５４】
【化８６】
2013518909.tif 000091
【０３５５】
【表４】
2013518909.tif 000092
【０３５６】
実験手順
＊  ２５−３５℃で、清潔な乾燥したＲＢフラスコへ化合物６．２を充填する。
＊  ２５−３５℃で、ＲＢフラスコへＤＣＭを充填する。
＊  ０−５℃まで、反応質量を冷却する。
＊  ０−５℃で、ＴＦＡ（あるいはジオキサン中のＨＣｌ）をゆっくり加える。
＊  ２５−３５℃まで、反応質量の温度を上げる。
＊  ２５−３５℃で１８−２０時間、反応質量を撹拌する。
＊  ＴＬＣによって反応の進行を確認する。
＊  ＴＬＣが従う場合、４０℃以下に真空下で反応質量を蒸留する。
＊  ２５−３５℃で、ジイソプロピルエーテルを充填する。
＊  ２５−３５℃で３０−４５分間、撹拌する。
＊  固体を濾過し、ジイソプロピルエーテルロット−２で固体を洗浄する。
＊  １５分間、固体を空にする（Ｓｕｃｋ  ｄｒｙ）。
＊  清潔な乾燥したビーカーへ湿った固体を充填する。
＊  ２５−３５℃で水ロット−１を充填する。
＊  飽和した（ｓａｔ．）ＮａＨＣＯ３溶液により、反応質量をｐＨ９−１０にまでゆっくり調節する。
＊  ２５−３５℃で１５−３０分間、反応質量を撹拌する。
＊  固体を濾過し、水ロット−２で固体を洗浄する。
＊  一定の重量を得るまで、２５−３５℃で固体を乾燥する。
＊  収量：１６０ｇ
＊  収量の％：８８％。
＊  ＨＰＬＣによる純度：９８．６８％。
また、ＨＣｌ／ジオキサン、ＨＣｌ／ＭｅＯＨなどの他の適切な条件を、Ｂｏｃ保護基を取り除くために使用することができることも見出された。
【０３５７】
＜実施例１−５：化合物６．４の調製＞
【０３５８】
【化８７】
2013518909.tif 000093
【０３５９】
【表５】
2013518909.tif 000094
【０３６０】
実験手順
＊  ２５−３５℃で、清潔な乾燥したＲＢフラスコへ化合物６．３を充填する。
＊  ２５−３５℃で、メタノールおよびヒドラジン水和物（あるいは無水ヒドラジン）を充填する。
＊  還流まで反応質量を加熱する。
＊  ９−１０時間、還流で撹拌した。
＊  ＴＬＣによって進行を確認する。
＊  完了に際して、４０−５０℃で、真空下で完全に溶媒から蒸留する。
＊  ２５−３５℃で、水ロット−１を充填する。
＊  ２５−３５℃で１時間、撹拌する。
＊  固体を濾過し、水ロット−２で固体を洗浄する。
＊  一定の量を得るまで、２５−３５℃で固体を乾燥する。
＊  収量：１９１ｇ。
＊  収量の％：７７％。
＊  ＨＰＬＣによる純度：９９．５４％。
【０３６１】
＜実施例１−６：化合物６の調製＞
【０３６２】
【化８８】
2013518909.tif 000095
【０３６３】
【表６】
2013518909.tif 000096
【０３６４】
実験手順
＊  ２５−３５℃で、清潔な乾燥したＲＢフラスコへ、トリフルオロメチルフェニルチオ尿素（６．５）を充填する。
＊  ２５−３５℃でＤＣＭとヨウ化メチルを充填する。
＊  還流まで反応質量を加熱する。
＊  ３−４時間、還流で撹拌した。
＊  ＴＬＣによって進行を確認する。
＊  反応の完了に際して、４０−５０℃で、真空下で完全に溶媒から蒸留する。
＊  Ｎ２雰囲気において、２５−３５℃で上記の原料にアセトニトリルを充填する。
＊  化合物６．４および２，６−ルチジンを充填する。
＊  還流まで反応質量を加熱する。
＊  Ｎ２雰囲気において、１６−１７時間還流下で反応質量を維持する。
＊  ＴＬＣによって反応の進行を確認する。
＊  完了に際して、真空下で完全に溶媒から蒸留する。
＊  酢酸エチルロット−１において残留物を溶解する。
＊  水ロット−１で酢酸エチル層を洗浄する。
＊  １０％のクエン酸溶液で酢酸エチル層を洗浄する。
＊  水ロット（Ｌａｔ）−２で酢酸エチル層を洗浄する。
＊  硫酸ナトリウム上で酢酸エチル層を乾燥する。
＊  酢酸エチルロット−２で硫酸ナトリウムを洗浄する。
＊  ５０−５５℃で、真空下で合計の酢酸エチル層から蒸留する。
＊  固体を濾過し、水ロット−２で固体を洗浄する。
＊  一定の量を得るまで、２５−３５℃で固体を乾燥する。
＊  収量：２４５ｇ（粗生成物）。
＊  ＨＰＬＣによる純度：８６．４％。
適切な塩基の使用が、収量と純度を大きく改善することが見出された。例えば、ＤＭＦ内でのＣｓ２ＣＯ３の使用は、生成物をもたらすことができず、５時間還流での溶媒／塩基のようなピリジン（５ｅｑ）の使用は、５５％の収量をもたらし、取り除くのが難しい等配電子のオキサジアゾールアナログで汚染した。ルチジンを伴う本明細書において発展した条件は、オキサジアゾールアナログの形成を抑えて、対照の化合物を調製する効果的で経済な方法を提供する。反応に関する他の適切な溶媒は、アセトニトリル、ＤＭＦ、Ｎ−メチル−ピロリド−２−オン（ＮＭＰ）、ｔＢｕＯＨまたはｉＰｒＯＨであってもよい。
【０３６５】
＜実施例２：化合物６のメシル酸塩＞
メシル酸塩を、ほぼ同じ収量を伴う未精製の又は精製された化合物６から調製した。分析データは、一水化物溶媒和物を伴うビス−２メシル酸塩を示す。
【０３６６】
【表７】
2013518909.tif 000097
【０３６７】
手順
＊  ２５−３５℃で、清潔な乾燥したＲＢフラスコへ未精製の化合物６を充填する。
＊  ２５−３５℃で、ＲＢフラスコへメタノールロット−１を充填する。
＊  ２５−３５℃で１０−１５分間、撹拌する。
＊  ２５−３５℃で、メタンスルホン酸をゆっくり加える。
＊  ２５−３５℃で３−４時間、反応質量を撹拌する。
＊  固体を濾過し、冷却したメタノールロット−２（予め冷却された）で固体を洗浄する。
＊  一定の重量を得るまで、２５−３５℃で固体を乾燥する（ＨＰＬＣによる純度：９４．５％）。
＊  ２５−３５℃で、清潔な乾燥したＲＢフラスコへ固体を充填する。
＊  ２５−３５℃で、メタノールロット−３を充填する。
＊  ２５−３５℃で１−２時間、撹拌する。
＊  固体を濾過し、冷却したメタノールロット−４（予め冷却した）で固体を洗浄する。
＊  一定の重量を得るまで、２５−３５℃で固体（ｓｏｌｄ）を乾燥する。
＊  収量：３８ｇ。
＊  ＨＰＬＣによる純度：９８．２％。
＊  メシレート含有量：３３．２８％（ビスメシレート）。
＊  含水量：６．０８％（一水和物）
【０３６８】
＜実施例３：ピリジンヒドラジド前駆物質４４の調製＞
【０３６９】
【化８９】
2013518909.tif 000098
【０３７０】
化合物４２を、塩基性条件（例えば、２−６−ルチジンまたはＤＡＢＣＯ）下で、メチル３−メルカプトベンゾアート（４１）および化合物４２から調製する。その後、化合物４３のエステル官能基を、最初にヒドラジドに転換し（ヒドラジン反応）、次に、Ｂｏｃ保護基を、酸性条件（例えばＴＦＡ）下で脱保護し、化合物４４を得る。
【０３７１】
＜実施例４：キナゾリンヒドラジド４８の調製＞
【０３７２】
【化９０】
2013518909.tif 000099
【０３７３】
化合物４７を、塩基性条件（例えば、２−６−ルチジンまたはピリジン）下で、メチル４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ベンゾアート（４５）及び化合物４６から調製する。その後、化合物４７のエステル官能基を、最初に（ヒドラジンにより）ヒドラジドに転換し、次に、Ｃｂｚ保護基を、水素付加条件下で脱保護し、化合物４８を得る。
【０３７４】
＜実施例５：トリアゾール４９の調製＞
【０３７５】
【化９１】
2013518909.tif 000100
【０３７６】
トリアゾール化合物４９を、化合物４８から実施例６に記載されているような同様の条件下で調製する。
【０３７７】
＜実施例６：選択的なＩＩ型ＰＤＧＦＲβ／Ｂ−ＲＡＦ阻害剤の設計＞
ＰＤＧＦＲβおよびＢ−ＲＡＦキナーゼドメインの全体的な相同性が、比較的低い（２９．１％の相同性および４７．３％の類似性、図６Ａを参照）一方で、これらの２つのキナーゼは、構造上関連するＩＩ型ポケットを特色とし、ＡＴＰポケットを回避する間に、これらおよび他のキナーゼの不活性の構成におけるアロステリック部位に適合するためのアミノトリアゾールの足場の設計を誘導する（図１Ａ）。アミノトリアゾールベースの化合物を、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）におけるＰＤＧＦ−ＢＢ−媒介性ＰＤＧＦＲβ自己リン酸化および内皮細胞（ＥＣ）における成長因子を媒介としたＭＥＫおよびＥＲＫリン酸化を抑える能力のため、主要なヒト細胞ベースのアッセイにおいてスクリーンした（図１ＢおよびＣ）。構造活性相関は、細胞ベースのＰＤＧＦＲβおよびＲＡＦの阻害のための重大な置換基を実証し（図１Ｄ）、さらに本明細書に記載される。その後、活性化合物を、セグメント間の血管の成長を評価することにより、発育途上のゼブラフィッシュ（受精後２０−４８時間（ｈｐｆ）から）における抗血管原性の活性のためにスクリーンした（図３）。細胞ベースの及びゼブラフィッシュのスクリーニングと同様に、分子モデリング、化学合成の連続的な一巡を、活性分子を精製するために行なった。
【０３７８】
＜実施例７：細胞の生存率に対する化合物の効果＞
ＶＳＭＣまたはＥＣ生存率に対する化合物３対６の効果を、化合物３がＰＤＧＦＲβを阻害し、一方で化合物６がＲＡＦとＰＤＧＦＲβの両方を阻害したため、試験した（図１ＤのＳＡＲを参照）。化合物６は、０．５９μＭのＥＣ５０でＶＳＭＣ生存率を阻害し、一方で３は、１５．０μＭのＥＣ５０を生成した（図１Ｅ）。イマチニブ（そのキナーゼ標的中のＰＤＧＦＲβ）は、試験される最も高い濃度（２０μＭ）でのＶＳＭＣ生存率の任意の阻害を実証しなかった。化合物６は、０．５４μＭのＥＣ５０で内皮細胞生存率を阻害し、３は、メチルチオール群および両方のＰＤＧＦＲβおよびｐ−ＭＥＫ阻害活性は、観察される細胞毒性効果に重要であることを実証する我々のＳＡＲを確認する、１８．０４のμＭのＥＣ５０を生成した（図１Ｆ）。興味深いことに、ソラフェニブ、ＩＩ型およびＡＴＰ競合的結合特性の両方を有するＲＡＦ阻害剤は、ソラフェニブが、この細胞ベースのアッセイにおいて６より２５倍有力でなかったことを示すＥＣの生存率で、１３．２４μＭのＥＣ５０を生成した。
【０３７９】
＜実施例８．  インビトロでの化合物６とソラフェニブの比較＞
化合物６とソラフェニブを、ソラフェニブによって阻害される様々な標的から成る、インビトロでのＡＴＰ依存性キナーゼアッセイのパネルにおいて、さらに比較した。化合物６は、１０μＭでも、他のものと同様に、以下の活性キナーゼ：Ｂ−ＲＡＦ、Ｃ−ＲＡＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｆｌｔ３、Ｋｉｔ、及びＰＤＧＦＲβの何れも阻害しなかった（表１）。化合物６が相互作用のために酵素の不活性の構成を必要とする場合、これは驚くべきことではない。対照的に、ソラフェニブは、ＶＥＧＦＲ２および他のいくつかの受容体チロシンキナーゼに加えてＢ−ＲＡＦおよびＣ−ＲＡＦのキナーゼ活性を阻害するが、一方で化合物３は、６のように、試験される活性キナーゼの何れも阻害しなかった。
【０３８０】
＜表１：化合物３、６、及びソラフェニブを比較するインビトロでのキナーゼパネル＞
【０３８１】
【表８】
2013518909.tif 000101
【０３８２】
次に、化合物６を、カイノームの多様なファミリーメンバーを表わす７０のキナーゼ（不活性のものとして大多数を伴う）に対して、競合結合測定法（Ｋａｒａｍａｎ  ＭＷ，  ｅｔａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００８）２６：１２７−１３２）で分析した（図２及び表２）。他のＩＩ型阻害剤、イマチニブおよびソラフェニブに関連して、化合物６は、改善された選択性を表示し、それはキナーゼの樹状図上で表わされる（図２）。キナーゼの中で、化合物６は、それぞれ５２および１７０ｎＭでのＦｌｔ３およびｃ−Ｋｉｔと同様に、それぞれ３００および５２０ｎＭのＫｄｓを有する単なるＰＤＧＦＲαおよびβを阻害した（表３）。ＣＤＫのパネルを試験し、弱い結合をＣＤＫＬ２（５．１μＭ）およびＣＤＫ１１（７．５μＭ）により観察した。化合物６がこのアッセイにおいてＲＡＦを阻害しなかった一方、このアッセイで使用されるＲＡＦ構築物が、アロステリック立体構造に影響を及ぼし得るＮ−末端調節性ドメイントランケーション（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｄｏｍａｉｎ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を有するため、このことは驚くものではない。
【０３８３】
＜表２：図２を構築するために使用されるＡｍｂｉｔ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓでのＫＩＮＯＭＥｓｃａｎプロファイリングアッセイにおける、１０μＭの化合物６でスクリーンされるキナーゼ＞
【０３８４】
【表９】
2013518909.tif 000102
【０３８５】
＜表３．  競合結合アッセイ（ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ）における化合物６のカイノーム特性＞
【０３８６】
【表１０】
2013518909.tif 000103
【０３８７】
化合物６は、競合結合アッセイにおいて切断型ＲＡＦを阻害しなかったが、それは、Ｂ−ＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）の構成的に活性な変異体を発現する細胞におけるＥＲＫ  Ｔ２０２／Ｙ２０４のリン酸化を完全に乱し、化合物６が細胞においてＲＡＦを標的とする補足を提供した。代わりに、化合物６は、内皮細胞（図７Ｅ）における又はインビトロでの（表２）ＦＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２のいずれかの活性化を阻害しなかったが、血管平滑筋細胞におけるＰＤＧＦＲβの活性化を阻害した（図１Ｂおよび図７Ｅ）。ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦＡで刺激されたＥＣにおいて検査されたホスホ−部位の概要は、表４に見出される。
【０３８８】
＜表４：化合物６の細胞ベースのプロファイリング＞
【０３８９】
【表１１】
2013518909.tif 000104
【０３９０】
ＨＵＶＥＣｓを１時間、化合物６で前処理し、５分間ｂＦＧＦで刺激した。ＰＤＧＦＲβに関して、ＨＵＶＥＣがこの受容体を発現しないので、ＶＳＭＣを１時間、化合物６で前処理し、７分間ＰＤＧＦ−ＢＢで刺激した。
【０３９１】
＜実施例９：化合物６のリン酸化分析＞
ＲＡＦに関する化合物６の特異性を、ＲＡＦ活性化ドメイン内及び該ドメイン外の両方の特異的なリン酸化部位に対するその効果を評価することにより、さらに分析した。ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦの両方は、Ｃ−ＲＡＦの活性化ドメイン内のセリン３３８のリン酸化を引き起こし（ＰＡＫによる）、一方でＣ−ＲＡＦのアダプタータンパク質１４−３−３への結合を媒介するセリン２５９（Ｒｏｍｍｅｌ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９６）１２：６０９−６１９）を、構成的にリン酸化する（図７Ｃ）。化合物６は、Ｓ３３８リン酸化を選択的に遮断するが、Ｓ２５９に影響を及ぼさず（図７Ｃ）、ＲＡＦとのその相互作用が、優先的にその活性化ドメインに影響を及ぼすことを示す。重要なことに、化合物６がこれらの細胞におけるＭＥＫ  Ｓ２９８の上のＰＡＫ媒介性リン酸化を遮断しなかったので、化合物６はＰＡＫを阻害しなかった（図１Ｃ）。
【０３９２】
＜実施例１０：ＲＡＦのヘテロ二量体化に対する化合物６の効果の評価＞
最近の研究は、ヘテロ二量体化がＢ−ＲＡＦおよびＣ−ＲＡＦの両方の活性を劇的に増加させるため、効果的なＭＡＰＫシグナル伝達のためのＢ−ＲＡＦ／Ｃ−ＲＡＦヘテロ二量体化の重要性を実証する（Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２６：２２６２−２２７２；Ｗｅｂｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１：３５９５−３５９８）。更に、Ｂ−ＲＡＦの「開構成」を誘発する一定の変異は、癌細胞におけるＣ−ＲＡＦに構成的に結合することを促進し、ｌｐこのヘテロ二量体化は、Ｃ−ＲＡＦおよびＭＥＫシグナル伝達を活性化する（Ｇａｒｎｅｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ２０：９６３−９６９）。これは、細胞におけるＲＡＦの活性を乱すための興味深い標的として、ＲＡＦのヘテロ二量体化を定義する。
【０３９３】
ＲＡＦのヘテロ二量体化に対する化合物６の効果を評価するために、内因性のＲＡＦのヘテロ二量体化を、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦで細胞を刺激することにより、ＥＣにおいて誘発し、化合物６がこの複合体の形成に影響を与える能力を研究した（図７Ｄ）。化合物６での細胞の処置は、どちらかの成長因子に反応するＥＲＫリン酸化と同様に、このヘテ二量体形成も完全に阻害し、一方で化合物３は効果がなかった（図７Ｄ）。加えて、ＭＥＫ阻害剤、Ｕ０１２６は、予想通りにＥＲＫのリン酸化を阻害したが、成長因子の刺激のみで達成された上記のＲＡＦのヘテロ二量体化を大幅に増加させ、ＭＥＫ阻害時のフィードバックループの可能性を示唆する。化合物６が、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦで刺激される内皮細胞中のＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化を阻害するという所見（図１Ｃ）は、化合物６が細胞中のＢ−ＲＡＦおよびＣ−ＲＡＦの両方を標的とし、ＲＡＦヘテロ二量体化を乱すことによるＭＡＰＫシグナル伝達の阻害は、Ｂ−ＲＡＦおよびＣ−ＲＡＦの代償的な役割に対処する、理想的な機構かもしれないという証拠を提供する。
【０３９４】
＜実施例１１：ゼブラフィッシュ胚形成中の新しい血管成長に対する化合物６の効果の分析＞
化合物６の効果を、ゼブラフィッシュ胚形成中に新しい血管成長に対するその機構的な影響を評価するためにさらに分析した。化合物６（水中で１μＭ）により処置される胚において、内皮細胞は、対照動物で典型的に観察されるように、背部大動脈から離れて遊走するが、４８ｈｐｆまで、それらは成熟したセグメント間の血管を形成することができず、ヘッド領域（図３Ａ）内の発達する血管構造に同様に影響を与え、一方でＢ−ＲＡＦではなくＰＤＧＦＲβを阻害する化合物３は効果がなかった。処理の後、現れる血管は非常に混乱し、血流を支持する能力を欠いた。対照的に、化合物３で処理された魚は、１０μＭまででさえ、処理されない対照と見分けがつかなかった（図３Ａ）。図２で使用される競合結合アッセイにおいて、化合物３がＦｌｔ３、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβそれぞれに対して、１．４、３．７、３２および４０ｎＭのＫｄｓをそれぞれ有していることに留意することが重要である。化合物３が、ゼブラフィッシュの発展的な胚発生モデルにおける血管新生の阻害に効果がないため、Ｆｌｔ３とＫＩＴが、血管形成において役割を果たさないことは明らかである。興味深いことに、ＳＵ５４１６（Ｓｅｍａｘａｎｉｂ）（１２）、ＶＥＧＦＲ２阻害剤は、テールにおける内皮細胞遊走および新血管新生を完全に乱す間に、これらの動物における眼の血管に最小の効果を及ぼし、ＶＥＧＦが眼の血管の発達中に重要な役割を果たさないことを示唆する。
【０３９５】
＜実施例１２：血管新生に対する化合物６の一時的な効果の分析＞
血管新生に対する化合物６の一時的な効果を分析するために、ゼブラフィッシュを、１８ｈｐｆにて化合物６で処置し、次に、内腔が生じ始めていたとともに、３５ｈｐｆで分析した。化合物６は、３５ｈｐｆにて血管に対する明らかな効果を示さなかった一方で、４８ｈｐｆでの画像化は、化合物６が内腔形成における後期段階に影響を与えることを示唆する（図３Ｂ）。この次に、４８ｈｐｆでＴＵＮＥＬにより染色したセグメント間のＥＣによって示されるようなアポトーシスの誘発を行った（図３Ｂ）。対照的に、３０ｈｐｆでの化合物６の追加（セグメント間の血管構造が最初に確立される時に）は、血管の成長およびパターン化を抑止せず（図３Ｃ）、一旦内腔形成が開始されると、これらの動物における新血管が６の効果に抵抗力があることを示唆する。対照的に、ソラフェニブは新しい血管の形成を妨げるだけでなく、３０ｈｐｆで追加された時に成熟したセグメント間の血管を乱した（図３Ｃ）。さらに、４８−７２ｈｐｆでの化合物６による胚の処置は、成熟したセグメント間の血管に影響を及ぼさず、ゼブラフィッシュはすべて生存可能であったが、一方でこの遅い時点でのソラフェニブによる処置は、試験されたすべての動物における死亡を誘発した（図３Ｄ）。従って、化合物６は、ソラフェニブが、致死率につながる胚発生中に複数の工程を抑えている間に、検知可能な毒性のない新血管新生における後期段階を乱すように思われる。
【０３９６】
＜実施例１３：ＰＤＧＦＲβとＲＡＦの二重阻害による抗血管原性の効果の分析＞
血管新生阻害のためのＰＤＧＦＲβおよびＲＡＦの二重阻害のための必要条件を、ゼブラフィッシュモデルにおいて調べた。ＲＡＦ阻害（ＧＷ  ５０７４）およびＰＤＧＦＲβ阻害（イマチニブ）の組み合わせのみが、化合物６に類似した表現型をもたらし、それにおいて、血管芽細胞は、背部大動脈と後基本静脈から遊走するが、血流を支持することができる開いた内腔を備えた機能的な血管を形成しない（図４Ａ）。Ｔｇ：ｆｌｉ１−ＥＧＦＰゼブラフィッシュ胚の代表的な画像は、５μＭのイマチニブまたは１μＭのＧＷ  ５０７４がセグメント間の血管形成に効果を及ぼさず、開いた内腔を備えた機能的な血管が観察されることを実証する（図４Ａ）。
【０３９７】
＜実施例１４：共培養血管新生アッセイ＞
実施例１０の結果を検証するために、共培養血管新生アッセイを、ＰＤＧＦＲとＲＡＦの阻害剤の類似の組み合わせを評価するために利用した。前記アッセイにおいて、ＨＵＶＥＣを、３Ｄコラーゲンゲルにおける肝臓の星状細胞（肝臓の類洞周囲腔において見出される周皮細胞）と混合する。共培養は、図４Ｂ及びＣで示されるように画像化され定量することができる周皮細胞接触（星状細胞からの）で、内皮管を生成した。２．５μＭの６での共培養の処置は、％の周皮細胞で覆われた管の長さと同様に、両方の全体的な内皮管形成において、劇的な減少をもたらした（図４ＢおよびＣ）。両方ともＰＤＧＦＲβ阻害剤である、２．５μＭの３または１．０μＭのイマチニブ（Ｉｍ）の追加は、内皮管形成に影響を与えず、又は内皮管の周皮細胞被覆において著しい変化を引き起こす（図４ＢおよびＣ）。以前に確認されたＲＡＦ阻害剤、ＧＷ  ５０７４（１３）は、周皮細胞被覆又は管の長さだけに影響を与えなかったが、１．０μＭのイマチニブとの組み合わせは、６と比較して、％の周皮細胞で覆われた管の長さにおいて、同様の減少を生じた（図４ＢおよびＣ）。
【０３９８】
＜実施例１５：哺乳動物モデルにおける化合物６の抗血管原性の特性の評価＞
哺乳類モデルにおける化合物６の抗血管原性の特性を評価するために、マウスを、新血管新生を誘発するためにｂＦＧＦを含むマトリゲルで皮下注入し、５０ｍｇ／ｋｇ，ｉｐ，ｂｉｄで、化合物６により体系的に処置した（使用される化合物６の投与量および製剤の薬物動態学の分析は、３．６μｇ／ｍｌまたは７．７μＭのＣｍａｘ、１１．５ｈに相当するＴ１／２、および１４．７μｇ＊ｈ／ｍｌのＡＵＣ０−１２ｈを示した。この投与量で、化合物６は、ビヒクル対照に関する血管新生を完全に遮断した（図９Ａ）。インビボでのＲＡＦシグナル伝達に対する化合物６の効果を監視するため、ｐ−ＥＲＫ免疫染色法の存在のためｂＦＧＦで刺激された組織の凍結切片を評価した。これら組織のｂＦＧＦ刺激は、侵襲性内皮細胞及び間質細胞の両方において、激しいｐ−ＥＲＫ染色をもたらした。これら細胞内でのｐ−ＥＲＫ染色における抑制を観察したとともに、化合物６での動物の全身処置は、内皮細胞内のＭＡＰＫ経路シグナル伝達を遮断した（図９Ｂ）。さらに、ビヒクルで処置されたマウスは、ＳＭＡ陽性細胞において激しいｐ−ＰＤＧＦＲβ  Ｙ７５１を示し（図９Ｃ）、一方で、化合物６で処置されたマウスは、内皮細胞を囲む間質性のコンパートメントに関連する、ｐ−ＰＤＧＦＲβ  Ｙ７５１シグナルにおいて、完全な抑制を実証した（図９Ｃ）。これら組織における新血管中での激しいＴＵＮＥＬ染色を観察したが、これらの血管に隣接している間質の細胞に関連する染色ほどではなかった（図９Ｄ）。化合物６は血管新生を遮断し、マウスにおけるＲＡＦ／ＰＤＧＦＲｂを阻害した。それ故、化合物６は、活発に成長する血管における生存シグナルを乱す。
【０３９９】
＜実施例１６：同所性の膵臓癌モデルにおける腫瘍成長を予防するための化合物６の効果＞
ＸＰＡ−１の膵臓の腫瘍異種移植片を発現するＲＦＰを、発達する血管（ＧＦＰ）および原発腫瘍（ＲＦＰ）の両方の検出を可能にする、ネスチンＧＦＰ−マウスの膵臓へ移植した。動物を、ビヒクルまたは化合物６（５０ｍｇ／ｋｇ、ｂｉｄ）のいずれかにより全身的に処置し、それは、腫瘍断片の外科的な同所性の移植（ＳＯＩ）の後３日目に始まる。腫瘍成長を、膵臓内の腫瘍移植からＲＦＰシグナルを検出するため、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＯＶ１００小型動物画像システムを使用する全身の画像化により、非侵略的に監視した。腫瘍成長を、ＳＯＩ後１２日でのビヒクル単独と比較して、化合物６で処置された動物において完全に抑えた。３匹の動物からの代表的な時間的経過画像（側面図）は、化合物６で処置された膵臓の腫瘍の成長を抑制し、ＲＦＰの強度を、ビヒクルで処置された動物と比較して、ＳＯＩ後１２日までに消失したことを実証する（図５Ａ）。腫瘍表面積のプロットは、時間とともに、６で処置された動物と相対的なビヒクルで処置された動物における増加を明らかにする。明らかに、６は、このモデルにおける腫瘍成長を抑えたが、体重損失（図５Ｃ）又は検知可能な毒性（示されないデータ）を引き起こさなかった。
【０４００】
腫瘍成長に対する化合物６の効果を正確に測定するため、腫瘍を切除し、１５日目に重さを計った。６で処置された動物は、ビヒクルで処置された動物に関して４．１ｍｇの腫瘍重量と比較して、２６．７ｍｇの平均腫瘍重量を生じた（図５Ｄ）。この時に、ＧＦＰで標識化した血管を画像化し、腫瘍に関連する血管密度を、合計の血管の長さ対腫瘍容積の比率を測定することにより、定量した（図５Ｅおよび５Ｆ）。６で処置された腫瘍を、ビヒクルの処置に関して本質的にあまり血管新生化せず、ＧＦＰで標識化した腫瘍脈管構造の画像は、存在する血管の合計の著しい減少を示した（図５Ｅ）。平均の血管の長さ／腫瘍容積は、ビヒクルと６に関する０．２ｍｍ／ｍｍ３と比較して、それぞれ２．５ｍｍ／ｍｍ３であった（図５Ｆ）。これら結果は、化合物６が同所性の膵臓癌モデルにおける腫瘍成長を予防することを示す。
【０４０１】
＜実施例１７：経口投与後の腫瘍成長に対する化合物６の効果＞
経口投与後の腫瘍成長に対する６の効果を試験するため、ＲＦＰを発現するヒトＳＮ１２Ｃ腎臓細胞を、ヌードマウスの腎臓カプセルに注入し、腫瘍が７日間発達するのを許容した。化合物６を１００ｍｇ／ｋｇで投薬し、４．９μｇ／ｍｌのＣｍａｘ、６．１ｈのＴ１／２、および８．７μｇ＊ｈ／ｍｌのＡＵＣ０−２４ｈを伴う都合のよい薬物動態を実証した。腫瘍成長の抑制を、６で処置された動物において容易に観察した（図１０Ａ）。２６日目に、腎臓をこれら動物から切除し、腫瘍による重量を、各々の動物に関して腫瘍を有する腎臓の重量から、正常な腎臓の重量を控除することにより計算した。ビヒクル群の平均腫瘍量は、化合物６で処置された群に関する４９±１８ｍｇと比較して、１３２±３９ｍｇであった（図１０Ｂ）。これは、同所性の腎細胞癌モデルの腫瘍成長を予防する際に６の経口活性を実証する。
【０４０２】
＜実施例１８：ＩＳＶ量に対する化合物６効果の定量化（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｉｔｏｎ）＞
図３Ａにおけるように処置されたゼブラフィッシュ胚の代表図（画像は、Ｔｇ：ｆｌｉ１−ＥＧＦＰ胚のヘッド領域と体幹の領域の、合併段階およびＧＦＰ蛍光図を表わす）。スケールバー＝２００μｍ。（図８Ｃ）図３Ａにおけるように処置された胚からのＩＳＶ量の定量化。（図８Ｄ）図３Ｂにおけるように処置された胚からのＩＳＶ量の定量化。セグメント間の血管（ＩＳＶ）量を測定するために、個々のＩＳＶを、Ｉｍａｒｉｓ対抗面（ｃｏｕｎｔｅｒｓｕｒｆａｃｅ）／等位面の機能を使用して、デジタル技術で分離した。４つの独立した胚から３０の独立したＩＳＶを、測定に使用した。＋／−ｓｅｍを報告した。
【０４０３】
＜実施例１９：マウスにおける内膜過形成に関する化合物６の効果＞
再狭窄は、血管内膜新生の過形成（ＮＩＨ）として記載された工程による、動脈の最終的な閉塞をもたらすバルーン血管形成及び／又はステント装着に一般に起因する工程である。動脈損傷の後、血管平滑筋細胞の過剰増殖が生じ、それは、ＰＤＧＦＲα／β（Ｅｎｇｌｅｓｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  ３９，  ４４０−６）およびＭＡＰＫ経路活性化（Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１１，  １６７２‐８；  Ｐｉｎｔｕｃｃｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ２０，  ３９８−４００）の両方に依存することが以前に示された。それ故、ＰＤＧＦＲβ／ＢＲＡＦ阻害の組み合わせは、ＮＩＨのための理想的な処置である。図１Ｅで示されるように、化合物６は血清の存在下でＶＳＭＣ生存率を強力に阻害し、それ故、動脈のワイヤー損傷（ａｒｔｅｒｉａｌ  ｗｉｒｅ−ｉｎｊｕｒｙ）のマウスモデルにおいて試験した。マウスの頚動脈をワイヤーで傷つけ、翌日、経口の胃管栄養によって１００ｍｇ／ｋｇ，ｑｄで処置した。ヘマトキシリンとエオジンで染色した、損傷した動脈の代表的な部分を（図１１Ａ）、血管内膜の／内側の比率を計算するために使用し、この計算は、動脈壁の内部の２つの層の厚さの測定であり、血管内腔の大きさと相関する。動脈損傷後１日に化合物６で投薬することにより、血管内膜の／内側の比率を徹底的に減少させた（図１１Ｂ）。血管内膜の／内側の比率の縮小によって予想される通り、パーセント狭窄を、ビヒクル処置に関する化合物６の処置によって大幅に減少させる（図１１Ｃ）。薬理学的なエンドポイントとして、最終的な投薬後４時間、代表的な動脈を切除し、溶解物を、活性化されたＰＤＧＦＲβを検出するために免疫ブロットした。６によるマウスの処置は、ビヒクルで処置されたマウスと比較された時（図１１Ｄ）、これら組織におけるＰＤＧＦＲβ活性化を阻害し、インビボでの標的の阻害の後に経口投与を確認した。
【０４０４】
＜実施例２０：腫瘍細胞生存率を阻害するための化合物６の効果＞
化合物６を、正常な休止細胞に安全な濃度で、広範囲にわたる著しい腫瘍細胞の死滅または増殖阻害を有すると示した（表５）。データは、化合物６のＥＣ５０が、ソラフェニブより１５−１００倍強力な、広い範囲の腫瘍株１００−６００ｎＭにあることを示した。化合物６はまた、野生型および突然変異体ＲＡＦの阻害によるＰＬＸ４０３２とＭｅｋ阻害剤から、識別された機構を実証した。
【０４０５】
＜表５：ＲＡＦおよびＲＡＳにより変異された及び変異されなかった腫瘍株における化合物６の強力な効果＞
【０４０６】
【表１２】
2013518909.tif 000105
【０４０７】
＜実施例２１：リンパ脈管新生の阻害のための化合物６の適用＞
リンパ脈管新生アッセイを、野生型のＣ５７Ｂｌ／６マウスに食塩水または１ｍｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）を含む、３５０μｌの冷たいマトリゲルを皮下注入することにより行なった。ＶＥＧＦ−Ｃ移植されたマウスをその後、１日２回の２００μｌの食塩水、５．２５ｍｇ／ｍｌの化合物６またはビヒクル対照（１０％のＨＳ−１５および３．３３％のデキストロース）の腹膜腔内注射を毎日行うことによって処置し、それは１日目（ｎ＝７）に始まる。７日後、リンパ節を除去し、ＯＣＴに埋め込み、冷凍し、切断した。薄片（５μｍ）を、５分間氷冷のアセトンにおいて固定し、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．１％のトリトンＸ−１００で透過処理し、室温で１．５時間、ＰＢＳで希釈された８％の正常なロバ血清において遮断し、その後、４℃で一晩、食塩水中で希釈した８％の正常なロバ血清中の２μｇ／ｍｌの抗マウスのＬｙｖｅ−１（ＲＤＩ−１０３ＰＡ５０）によりインキュベートした。広範囲な洗浄の後、スライドを、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に抱合される、１μｇ／ｍｌのクロス吸収（ｃｒｏｓｓ−ａｂｓｏｒｂｅｄ）ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）によりインキュベートした。スライドをＤＡＰＩで対比染色した。カバーガラスを、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎの蛍光取付培地（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，  ＣＡ）により取り付けた。組織の切片／マウス当たり少なくとも５つの顕微鏡視野を、定量化研究用に分析した。結果を図１２Ａおよび１２Ｂで示す。
【０４０８】
＜実施例２２：繊維症の処置のための化合物６の適用＞
化合物６（５０ｍｇ／ｋｇ／日、経口）を、ＩＬＤの新しい診断のための評価及び／又は処置を受ける、Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｌｕｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｌｉｎｉｃに紹介された９０の患者（２つのグループ−薬物を有する４５の患者およびプラセボを有する４５人の患者）を、繊維症の処置のために評価する。これは、推定された肺線維症／間質性肺炎（ＩＰＦ、ＵＩＰ、ＮＳＩＰ）、サルコイドーシス、過敏性肺炎、特発性器質化肺炎、薬物誘発性または他の特発性のＩＬＤのために紹介された患者を含むことができる。患者を処置の６カ月後に評価する。化合物６の処置を伴う患者は、プラセボ群に関する改善を見つける。
【０４０９】
＜実施例２３：腫瘍細胞上の化合物６の成長抑制特性＞
化合物６は、ＮＣＩの発展的な治療学プログラムによってＮＣＩ６０パネルにおいてプロットされ、細胞株の全パネルにわたる強力な増殖阻害で４９０ｎＭの平均成長抑制濃度（ＧＩ５０）を実証した。図１３Ａを参照する。さらに、化合物６、３５、または３７を、細胞増殖アッセイにおいてソラフェニブ、ＰＬＸ  ４７２０またはＬ７７９，４５０と比較した。発癌性のＫ−ＲＡＳを内生的に発現するＡ５４９細胞を、一晩、低い血清ＤＭＥＭ（０．５％のウシ胎児血清）において、２５００細胞／容器の９６−ウェルプレートに蒔いた。翌朝、化合物を、ＤＭＳＯ中で連続的に希釈して、新鮮なＤＭＥＭ＋０．５％の培地において再懸濁し、それは７２時間細胞に加えられた。この時点で、細胞を固定し、増殖を、ブロモデオキシウリジン（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｇ）の取り込み（ＢｒｄＵ  ＥＬＩＳＡ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）のためにＥＬＩＳＡを使用して定量した。ＢｒｄＵの取り込みは、Ｓ相の間に生じ、細胞増殖率を測定するための古典的な方法である。図１４Ｂ−Ｃにおいて、ＢｒｄＵの取り込みを、対照として０．１％のＤＭＳＯで処置された細胞において生じる、ＢｒｄＵの取り込みの割合として発現する。点線は、ＤＭＳＯだけで処置された細胞の成長率を表わす。化合物６、３５、または３７は、すべて細胞増殖を阻害し（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（図１３Ｂ）、一方で、ＤＭＳＯで処置された対照細胞と比較した時、市販のＲＡＦの阻害剤（ソラフェニブ、ＰＬＸ  ４７２０、またはＬ−７７９，４５０）はすべて、過剰増殖を誘発する（図１３Ｃ）。
【０４１０】
＜実施例２４：ＣＲＡＦ  Ｓ３３８の上でのリン酸化に関するソラフェニブとの、化合物６の比較＞
Ｒ４０Ｐ細胞は、ｐ１６／Ｉｎｋ４ａ／ＡＲＦが失われている間に、Ｋ−ｒａｓＧ１２Ｄを発現する、自発的な膵臓腺癌マウスモデルに由来する。Ｒ４０Ｐ細胞を１２時間欠乏させ、５μＭでＭＥＫ阻害剤（Ｕ０１２６）、ソラフェニブ、および化合物３により１２時間処置した。５、２．５および１．２５μＭの用量反応を、化合物６に使用した。この時に、細胞を溶解し、タンパク質レベルをＢＣＡ分析によって定量した。その後、溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填し、ウェスタンブロッティング用のニトロセルロースに伝送した。免疫ブロット法を以下の抗体で行なった：ｐＭＥＫ１／２  Ｓ２１７／Ｓ２２１（細胞シグナル伝達）、ｐＣＲＡＦ  Ｓ３３８（細胞シグナル伝達）、および合計のＣＲＡＦ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。化学発光（Ｃｈｅｍｉｌｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を、フィルム上の検出に使用した。我々が利用したすべてのＡＴＰ競争的阻害剤は、ＣＲＡＦ  Ｓ３３８上でのリン酸化の同様の誘発を実証する。図１４は、ソラフェニブがＣＲＡＦ  Ｓ３３８上でのリン酸化の増加を誘発する一方で、化合物６がこの増加を促進しないことを示す。
【０４１１】
＜実施例２５：アロステリックＲＡＦ阻害剤化合物で処置されたＸＰＡ−１細胞の細胞周期および共焦点の顕微鏡検査分析＞
アロステリックＲＡＦの阻害化合物６、ＡＴＰ競争的阻害剤ソラフェニブ、ＭＥＫ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）、化合物３またはパクリタキセルで処置されたＸＰＡ−１細胞の細胞周期および共焦点の顕微鏡検査分析。細胞周期分析は、化合物６の処置が、試験されたすべての腫瘍細胞株におけるＧ２／Ｍの抑止を引き起こし、抗有系分裂の薬剤パクリタキセルの活性を模倣し、一方でｃ−Ｋｉｔ、Ｆｌｔ−３およびＰＤＧＦＲを阻害するが、ＲＡＦを阻害しない化合物３、化合物６の構造の類似体は、効果を示さなかった。図１５Ａおよび１５Ｂを参照する。重要なことに、ソラフェニブまたはＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１での細胞の処置は、予想通りにＥＲＫ阻害を引き起こしたが（図示せず）、有系分裂の進行に効果がなかった。細胞周期分析について、細胞は、各々の阻害剤の存在下で完全なＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳにおいて成長し、２０時間の阻害剤処置の後に採取された。細胞周期分析を、フローサイトメトリー、その後のヨウ化プロピジウム染色によって行なった。細胞を採取し、氷冷のメタノールで固定し、１０μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅで４５分間処理し、１０μｇ／ｍｌのＰＩを含むＰＢＳにおいて再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。細胞周期分析を、５μＭの濃度での化合物６、ソラフェニブ、またはＭＥＫ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）、または１００ｎＭでのパクリタキセルで処置された細胞において行なった。対応する共焦点の顕微鏡検査画像に関して、カバーガラスに付けられた細胞を、冷たいメタノールで固定し、０．１％のトリトンＸ−１００を含むＰＢＳにおいて２分間透過処理し、ＰＢＳにおいて２％のＢＳＡを伴う室温で、６０分間遮断した。細胞を、ＤＮＡを標識化する色素ＴＯＰＲＯ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、核膜を標識化するラミンＢ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を結合するＤＮＡで染色した。抗ラミンＢ抗体を、室温で２時間、１：１００の希釈液で使用した。ＰＢＳで数回洗浄した後、細胞を、１：３００で希釈された二次的な抗体で、室温で２時間染色し、ＴＯＰＲＯ−３（１：５００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で共同インキュベート（ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｅｄ）した。サンプルを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ｈａｒｄ−ｓｅｔ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に取り付け、最小のピンホール（３０μｍ）を使用して、１．４ＮＡ  ６０ｘ油浸レンズを伴うＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｃ１共焦点顕微鏡上で画像化した。画像を補足し、Ｚ−Ｃ１  ３．５０画像化ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ，  Ｉｎｃ．）を使用して処理した。スケールバー、１０μｍ。
【０４１２】
＜実施例２６：化合物６の細胞周期分析＞
細胞周期分析をＦＡＣＳによって行なった。図１６を参照。グラフは、０．１％のＤＭＳＯ対照と比較して、５μＭの化合物６での処置の後にＧ２／Ｍで阻止された細胞の％を表わす。グラフは、ヒト結腸（ｈＣＴ−１１６）、膵臓（Ｍｉａ−Ｐａｃａ２、ＦＧ、ＸＰＡ−１、ＢＸＰＣ３）、胸（ＭＢ−ＭＤＡ−２３１）および脳（Ｕ２５１）の癌細胞株のＧ２／Ｍ定量化を描く。エラーバーはｓ．ｄを表わす。（ｎ＝４）。
【０４１３】
＜実施例２７：インビボでの黒色腫腫瘍成長に対する化合物６の分析＞
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを発現する、ヒト１２０５  Ｌｕ黒色腫細胞を、６−８週齢のメスのＮｕ／Ｎｕマウスの側腹部へ皮下に移植した。腫瘍細胞をトリプシン処理し、１：１のＰＢＳ：成長因子枯渇マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において再懸濁し、１ｘ１０＾６の細胞を含む５０μｌを、側腹部に注入した。腫瘍を有する過剰なマウスを利用し、６匹の動物のグループを、腫瘍の対称性に基づいて選択し、無作為化して、各々のグループに平均５０ｍｍ３を与えた（１０日目）。処置を、２週間（２４日目を通じて）、ビヒクルまたは５０ｍｇ／ｋｇの化合物６、ｂｉｄ，ｉｐにより、この時点で開始した。ビヒクルは、３．３３％のデキストロースにおける１０％のＨＳ−１５（Ｓｏｌｕｔｏｌ，  ＢＡＳＦ，  Ｉｎｃ．として知られる）であった。より小さな測定値が長さとして利用された場合、腫瘍成長を、３日ごとに精度カリパスで腫瘍の長さと幅を測定することにより、及び次の式：腫瘍容積＝０．５＊（長さ）＊（幅）２を使用して、腫瘍容積を計算することにより監視した。図１７は、化合物６がインビボでの黒色腫腫瘍成長を抑制することを実証する。
【０４１４】
＜実施例２８：インビボでの乳癌成長に対する化合物６の分析＞
腫瘍は、６−８週齢のメスのＮｕ／Ｎｕマウスの乳房の脂肪体に、ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞（５０μｌの無菌のＰＢＳにおける１ｘ１０６の腫瘍細胞）を注入することによって発生した。腫瘍の成長を許容し、マウスを、１００ｍｍ３の平均腫瘍容積を伴う２つのグループへ無作為化した。マウスに、ビヒクル（１０％のＨＳ−１５、３．３３％のデキストロース）または５０ｍｇ／ｋｇの化合物６を投薬した（ｂｉｄ，  ｉｐ）。より小さな測定値が長さとして利用された場合、腫瘍成長を、２日ごとに精度カリプスで腫瘍の長さと幅を測定することにより、及び次の式：腫瘍容積＝０．５＊（長さ）＊（幅）２を使用して腫瘍容積を計算することにより、監視した。図１８Ａにおいて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を、３日間連続して処置し、腫瘍を最終的なビヒクルまたは化合物６投与の１時間後に切除し、ＣＲＡＦ  Ｓ３３８の上でのリン酸化のために染色した。化合物６は、胸壁腫瘍におけるＳ３３８のリン酸化を明らかに阻害する。これは、ｐＳ３３８  ＣＲＡＦが、臨床設定における薬物の活性を測定するための潜在的なバイオマーカーとして機能し得ることを示唆する。スケールバー２０μＭ。図１８Ｂは、化合物６またはビヒクルでの処置の後の腫瘍成長特性を示す。化合物６は、ビヒクル処置と比較して、腫瘍成長を抑える。図１８Ｃは、インビトロでのＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞におけるｐＳ３３８  ＣＲＡＦレベルを示す。細胞を、６時間５μＭで、ＤＭＳＯ（Ｃｔｒｌ）、化合物６、またはソラフェニブで処置し、細胞溶解物を、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解し、免疫ブロット法を、全て１：１０００で希釈される、次の抗体：ｐＳ３３８  ＣＲＡＦ（細胞シグナル伝達）、ＣＲＡＦ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびアクチン（Ｓｉｇｍａ）で行なった。細胞を、完全なプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ）、５０ｍＭのＮａＦ、および１ｍＭのＮａ３ＶＯ４で補足され、及び４℃で１０分間、１３，０００ｇで遠心分離したＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのトリスｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ、１．０％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％のデオキシコレート）で溶解した。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイによって測定し、３０μｇのタンパク質を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーンごとに充填した。図１８Ａにおける免疫組織化学を、同所性の異種移植片乳癌マウスモデル（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）からパラフィン包埋腫瘍の５μＭの切片上で、製造業者の推奨（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）に従って行なった。ホスホ−Ｓ３３８  ＣＲＡＦ免疫組織化学的検査のため、抗原検索を、９５℃で２０分間、シトラート緩衝液ｐＨ６．０において行なった。切片を、３０分間０．３％のＨ２Ｏ２で処理し、３０分間正常なヤギ血清、ＰＢＳＴにおいて、その後アビジンＤにおいて遮断し、その後、遮断溶液において１：１００で希釈されるｐＳ３３８  ＣＲＡＦ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に対する主要な抗体で、４℃で一晩インキュベートした。組織切片を洗浄し、その後１時間、遮断溶液中のビオチン化された二次的な抗体（１：５００，  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）でインキュベートした。切片を洗浄し、３０分間ベクタス��インＡＢＣ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）でインキュベートした。染色を、ニッケルで増強したジアミノ−ベンジジン反応（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用して進行し、切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【０４１５】
＜実施例２９：細胞の生存率アッセイ＞
腫瘍細胞（Ａ５４９（図１９Ａ）、Ｔ４７Ｄ（図１９Ｂ）、およびＭＤＡ−ＭＢ２３１（図１９Ｃ））を、完全な成長培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ、抗生物質／抗真菌剤、ファンギソン、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および非必須アミノ酸）において、２５００細胞／容器の９６−ウェルプレートに蒔いた。細胞の成長を一晩許容し、その後、ＤＭＳＯ内の対応する化合物の系列希釈を、新鮮で完全な成長培地に加え、７２時間細胞に加えた。細胞の生存率を、５ｍｇ／ｍｌで４時間、細胞にＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ）を加え、その後、培地を取り除き、結晶を可溶性にするため５０μｌのＤＭＳＯで各々の容器を再懸濁することにより、測定した。９６−ウェルプレートを、５６０ｎｍの吸収度でのプレートスキャン分光測光器（ＢｉｏＴｅｋ）上で読み取った。１１ｐｔの細胞の生存率曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用してプロットし、ＥＣ５０ｓを、ソフトウェアおよび非線形回帰の特徴を使用して計算した。化合物３７および化合物３５などの化合物は、検査された各々の細胞株中の化合物６に関する大きく改善された効能を実証し、いくつかの例において細胞の生存率を阻害するために、１桁のｎＭのＥＣ５０ｓに至る。
【０４１６】
＜実施例３０：非経口組成物＞
注入による投与に適切な非経口医薬組成物を調製するために、１００ｍｇの化合物６の水溶性の塩をＤＭＳＯ中で溶解し、その後、１０ｍＬの０．９％無菌食塩水と混合する。混合物を、注入による投与に適した投与ユニット形態に組み込む。
【０４１７】
＜実施例３１：経口組成物＞
経口送達用の医薬組成物を調合するために、１００ｍｇの化合物６を７５０ｍｇのスターチと混合する。混合物を、経口投与に適する、硬ゼラチンカプセルのような経口投与ユニットに組み込む。
【０４１８】
＜実施例３２：舌下（硬ロゼンジ）組成物＞
硬ロゼンジなどの、口腔送達用の医薬組成物を調合するために、１００ｍｇの化合物６を、４２０ｍｇの粉末状の砂糖、１．６ｍＬのライトコーンシロップ、２．４ｍＬの蒸留水、及び０．４２ｍＬのミント抽出物と混合する。混合物を軽く混ぜ、型に流し込むことで、口腔投与に適したロゼンジを形成する。
【０４１９】
＜実施例３３：早く崩壊する舌下錠剤＞
速く崩壊する舌下錠剤を、４８．５重量％の化合物６、４４．５重量％の微結晶性セルロース（ＫＧ−８０２）、５重量％の低置換ヒドロキシプロピルセルロース（５０ｙｅ（ｙ  ｕｍｌａｕｔ）ｍ）、及び２重量％のステアリン酸マグネシウムの重量によって調製する。錠剤を、直接の圧縮によって調製する（ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ．  ２００７；８１（２）：７８３−９０．）。圧縮錠剤の全重量を１５０ｍｇに維持する。製剤を、４．５分間、３次元の手動ミキサー（ｌｎｖｅｒｓｉｎａ（登録商標），  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＡＧ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用することにより、微結晶性セルロース（ＭＣＣ）の合計量を備えた式（Ｉ）の化合物の量と、低置換ヒドロキシプロピルセルロース（Ｌ−ＨＰＣ）の量の３分の２と混合することにより、調製する。ステアリン酸マグネシウム（ＭＳ）のすべてと、Ｌ−ＨＰＣの量の残りの３分の１を、混合が終わる前の３０秒で加える。
【０４２０】
＜実施例３４：吸入用組成物＞
吸入送達用の医薬組成物を調製するために、２０ｍｇの化合物６を、５０ｍｇの無水クエン酸及び１００ｍＬの０．９％塩化ナトリウム溶液と混合する。混合物を、吸入投与に適切な、噴霧器などの吸入送達用ユニットに組み込む。
【０４２１】
＜実施例３５：直腸ゲル組成物＞
直腸送達用の医薬組成物を調製するために、１００ｍｇの化合物６を、２．５ｇのメチルセルロース（１５００ｍＰａ）、１００ｍｇのメチルパラペン（ｍｅｔｈｙｌｐａｒａｐｅｎ）、５ｇのグリセリン及び１００ｍＬの精製水と混合する。結果として生じるゲル混合物をその後、直腸投与に適切な、注射器などの直腸送達用ユニットに組み込む。
【０４２２】
＜実施例３６：局所ゲル組成物＞
医薬的局所ゲル組成物を調合するために、１００ｍｇの化合物６を、１．７５ｇのヒドロキシプロピルセルロース、１０ｍＬのプロピレングリコール、１０ｍＬのミリスチン酸イソプロピル、及び１００ｍＬの精製アルコールＵＳＰと混合する。結果として生じるゲル混合物をその後、局所投与に適切な、チューブなどの容器に組み込む。
【０４２３】
＜実施例３７：点眼溶液組成物＞
医薬点眼液組成物を調合するために、１００ｍｇの化合物６を、１００ｍＬの精製水中の０．９ｇのＮａＣｌと混合し、０．２ミクロンのフィルタを用いて濾過する。結果として生じる等張液を、その後、点眼投与に適切な、点眼薬容器などの点眼用の送達ユニットに組み込む。
【０４２４】
＜実施例３８：鼻腔用スプレー溶液＞
医薬鼻腔用スプレー溶液を調製するために、１０ｇの化合物６を、３０ｍＬの０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ４．４）と混合する。溶液を、各々の適用のため、１００ｙｅ（ｙ  ｕｍｌａｕｔ）ｌのスプレーを送達するように設計されたことを目指した鼻アドミニストレイター（ｎａｓａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ）に置く。
【０４２５】
本明細書に記載される実施例及び実施形態は、説明的な目的のためだけのものであり、当業者に示唆される様々な修正又は変更は、この出願の精神及び範囲、並びに添付の請求項の範囲内に含まれるべきものである。本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され記載されている一方で、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは、当業者には明白であろう。多数の変更、変化、及び置換は現在、本発明から逸脱することなく、当業者によって想到される（ｏｃｃｕｒ）だろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明を実行する際に利用され得ることを理解されたい。以下の請求の範囲が本発明の範囲を定義するものであり、これら請求の範囲及びそれらの同等物の範囲内の方法及び構造が、それによって包含されることが意図される。
【図１】
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【図１Ｂ−１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2013518909.tif 000133
【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ−Ｅ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ−Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ−Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１６】
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【図１９Ａ−Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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2013518909.tif 000167
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