(57)【要約】炎症促進性サイトカインレベルの許容できない上昇を伴うことなしに被験体に投与することができることを特徴とする、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片を提供する。更に、前記抗体又はその断片の使用を含む治療方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症促進性サイトカインレベルの許容できない上昇を伴うことなしに被験体に投与することができることを特徴とする、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項２】
２℃を超える体温の上昇を伴うことなしに被験体に投与することができる請求項１に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項３】
炎症促進性サイトカインの上昇が、正常値上限（ＵＬＮ）の５００％を超えることなしに被験体に投与することができ、前記炎症促進性サイトカインがＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１βから選択される請求項１又は２に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項４】
炎症促進性サイトカインの上昇が、正常値上限（ＵＬＮ）の３００％を超えることなしに被験体に投与することができる請求項３に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項５】
被験体において、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）を誘導することができる請求項１から４のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項６】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にインビトロで接触させたときに、前記細胞から放出される炎症促進性サイトカインのレベルにおいて５００％を超える上昇を引き起こさない請求項１に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項７】
炎症促進性サイトカインがＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１βのうちの少なくとも１つである請求項１から６のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項８】
マウスＢ−Ｎ１０抗体に由来する請求項１から７のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項９】
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、又は
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、且つマウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１から８のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項１０】
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖及び可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む請求項９に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項１１】
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列、
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列、又は
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列とマウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列とを含み、
これら配列中に、親和性及び特異性の少なくともいずれかを実質的に変化させることのない変異が任意で存在する請求項１から７のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項１２】
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のアミノ酸配列、及びマウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のアミノ酸配列の少なくともいずれかを含む請求項１から１１のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその断片をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸又は請求項１４に記載のベクターを含むことを特徴とするホスト細胞。
【請求項１６】
請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその断片を産生する方法であって、前記抗体又はその断片を発現させる条件下で培養培地中にて請求項１５に記載のホスト細胞を培養し、前記培養培地から前記抗体又はその断片を分離する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその断片を含み、且つ薬学的に許容し得る担体を更に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１８】
被験体における、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状を治療又は予防する方法であって、治療上有効な量の請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその断片を前記被験体に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
被験体における、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状を治療又は予防する方法であって、治療上有効な量の請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその断片を前記被験体に投与する工程を含み、前記被験体がコルチコステロイドによる治療を同時にも別々にも受けていないことを特徴とする方法。
【請求項２０】
病状が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である請求項１８又は１９に記載の被験体における病状を治療又は予防する方法。
【請求項２１】
医療において使用するための請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその断片。
【請求項２２】
患者におけるＳＬＥの治療において使用するための請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその断片。
【請求項２３】
患者がコルチコステロイドによる治療を同時にも別々にも受けていない請求項２２に記載の使用のための抗体又はその断片。
【請求項２４】
患者におけるＳＬＥを治療する医薬の製造における請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその断片の使用。
【請求項２５】
患者がコルチコステロイドによる治療を同時にも別々にも受けていない請求項２４に記載の抗体又はその断片の使用。
【請求項２６】
標識と請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその断片とを含むことを特徴とする標識されている抗体又はこれらの断片。
【請求項２７】
サンプル中のＩＬ−１０を中和するためのインビトロにおける方法であって、前記サンプルと請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその断片とを接触させて、前記抗体又はその断片をＩＬ−１０に結合させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
サンプル中のＩＬ−１０の存在を検出するためのインビトロにおける方法であって、前記サンプルと、請求項１又は２に記載の標識されていない抗体若しくはその断片又は請求項２６に記載の標識されている抗体若しくはその断片とを接触させる工程と、前記サンプルに結合していない抗体又は抗体断片を除去するために洗浄する工程と、前記サンプル中の前記抗体若しくは前記断片又は前記標識の存在を検出する工程とを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）及びＩＬ−１０に特異的な剤に関する。特に、本発明は、ヒト化ＩＬ−１０抗体及びその使用に関する。更に、本発明は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、自己免疫疾患であると考えられており、この疾患においては、Ｂリンパ球の異常な高活性及び免疫グロブリンガンマ（ＩｇＧ）自己抗体の異常な大量産生が重要な役割を果たしている。この病理過程では、Ｉｇでコーティングされた細胞が隔離及び破壊され、補体タンパク質が定着及び分割され、且つケモタキシン、血管作動性ペプチド、及び破壊酵素が組織に放出される（非特許文献１）。
【０００３】
ＳＬＥは、多様な徴候を特徴とする。この疾患の過程においては、合計９５％の患者が筋骨格系疾患を訴え、８０％が皮膚病変、８５％が血液疾患、６０％が神経障害、６０％が心肺疾患、３０％〜５０％が腎臓疾患、４０％が胃腸疾患、１５％が血栓症、及び１５％が眼疾患を示す。また、患者の大部分（９５％）が、疲労、倦怠感、発熱、食欲不振、及び体重減少等の全身性症状に苦しみ、これら症状は、殆ど常に発現している。大部分の患者では、寛解と突然再発する疾患期間とが交互に生じる。永続的に寛解する（治療をしなくても症状が出ない）ことは非常に稀である。５０年以上前、ＳＬＥと診断された患者の大部分は、５年間未満しか生存できなかった。現在は、１０年生存率が９０％を超えており、これは、早期診断、対症療法的な抗炎症及び免疫抑制治療によるものである。最も一般的な死因は、免疫抑制の結果としての感染症である（非特許文献１）。
【０００４】
ＳＬＥの治療には、通常、抗マラリア薬、抗炎症薬、及び免疫抑制薬が用いられている。症状の制御が困難になった場合には、非ステロイド性抗炎症薬にコルチコステロイドを加える。更に、多くの臓器に関連する活動性ＳＬＥは、シクロホスファミドを用いる積極的治療を必要とする。
【０００５】
現在まで、ＳＬＥを治癒させる及び／又は長期間に亘って患者の生活の質を向上させるために利用可能な原因療法は存在していない。しかし、近年、抗体技術が進歩し、また、この自己免疫疾患の原因である因子が更に同定されたことにより、治療の選択肢としてモノクローナル抗体を使用する可能性が開かれつつある。特に、ＳＬＥを治療するための好ましいアプローチは、ポリクローナル自己抗体を大量に過剰産生させる病的免疫反応と相互作用するか又は補正する特異的な治療である。ＳＬＥの病因は、主にＢ細胞の調節不全に関連しているので、Ｂ細胞を標的とすることができるモノクローナル抗体が特に注目されている。非特許文献２に記載の通り、潜在的なＢ細胞表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、及びＣＤ２２を標的とする。更に、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１２（非特許文献３）及びＩＬ−６（非特許文献４）は、免疫反応の調節において重要なサイトカインであり、特に、ＳＬＥ患者における突然の再発中に上昇する。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対する自己抗体及びＩＬ−１０の血漿濃度は、ＳＬＥ患者における疾患の活動性を反映していることが多い。ＩＬ−１０濃度の上昇は、ＳＬＥ患者における疾患の活動性と相関している（非特許文献５）。しかし、ＩＬ−１０は、免疫系に対して多面的な作用を有するサイトカインであり、また、炎症促進反応の低減に関与していることが知られている。
【０００６】
モノクローナル抗体を用いた臨床試験がＳＬＥ患者で実施されている。具体的には、幾つかの臨床試験では、非ホジキンリンパ腫を治療するために用いられるキメラマウス抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である抗体リタキシマブが用いられた。非特許文献２に記載の通り、これら臨床試験の結果は、ＳＬＥ患者においてこの抗体が高い活性を有していることを示したので、オファツムマブ、ＩＭＭＵ−１０６、及びＧＡ−１０１等のＣＤ２０を標的とする幾つかの新規抗体が開発された。ＳＬＥにおけるモノクローナル抗体の活性を報告している更なる臨床試験では、抗ＣＤ２２抗体であるエプラツズマブ、抗ＴＮＦα抗体であるインフリキシマブ、抗ＩＬ−１０抗体であるＢ−Ｎ１０（非特許文献６）、抗ＣＤ４０Ｌ抗体であるＩＤＥＣ１３１及びＢＧ９５８８、ＢＬＹＳ阻害剤であるベリムマブ、抗ＩＬ−６受容体抗体であるトクリムマブ、並びに抗Ｃ５抗体であるエクリズマブが用いられた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈａｈｎ  ＢＨ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｉｎ：Ｋａｓｐｅｒ  ＤＬ，Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  Ｅ，Ｆａｕｃｉ  ＡＳ，Ｈａｕｓｅｒ  ＳＬ，Ｌｏｎｇｏ  ＤＬ，Ｊａｍｅｓｏｎ，ＪＬ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（ＵＳ）：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ；２００５．ｐｐ．１９６０−１９６７
【非特許文献２】Ｒｏｂａｋ  ａｎｄ  Ｒｏｂａｋ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，２００９，Ｎｏ．１０，ｐａｇｅｓ２６−３７）
【非特許文献３】Ｃａｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４  Ｎｏｖ；１３８（２）：３４８−５６
【非特許文献４】Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ｓｅｐ；２７（５）：４６１−６
【非特許文献５】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９８  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１６（３）：２８３−８
【非特許文献６】Ｌｌｏｒｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２０００  Ａｕｇ；４３（８）：１７９０−８００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、更なる剤、特に、この領域において有用性を有する抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、炎症促進性サイトカインレベルの許容できない上昇を伴うことなしに被験体に投与することができる、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片を提供する。
【００１０】
ＩＬ−１０は、抗炎症性サイトカインの代表的な物質であるので、ブロック時には、サイトカイン量が著しく増加すると考えられる。マウスＩＬ−１０抗体であるＢ−Ｎ１０の場合には、無刺激の細胞培養物（健常個体のインビボの状態を反映する）において、ＩＬ−６やＴＮＦαなどの炎症促進性サイトカインの上昇が観察できる。しかしながら、本発明者らは驚くべきことに、本発明の抗体をインビトロで細胞に適用した場合及びこれをインビボで投与した場合に、サイトカイン放出量が遥かに低いことを見出した。サイトカイン放出量が低いことは、結果として、本発明の抗体が投与対象である個体に許容されるという点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
単なる一例として、以下の図面を参照して本発明を例証する。
【図１Ａ】図１Ａは、マウスＢ−Ｎ１０抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く（ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号５であり；ＬＣＤＲ３は、配列番号６である）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、マウスＢ−Ｎ１０抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く（ＨＣＤＲ１は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号８であり；ＨＣＤＲ３は、配列番号９である）。
【図２Ａ】図２Ａは、マウスＢ−Ｎ１０抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、マウスＢ−Ｎ１０抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、マウスＢ−Ｎ１０の軽鎖可変領域（配列番号１２）、Ａ１７（配列番号１４）、ＪＫ１（配列番号１５）、及びマウスＢ−Ｎ１０抗体のヒト化中に生じた可変領域ｈＶＬ１〜ｈＶＬ１２（配列番号１８〜２９）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、マウスＢ−Ｎ１０の重鎖可変領域（配列番号１３）、３−６６＋０４（配列番号１６）、ＪＨ４（配列番号１７）、及びマウスＢ−Ｎ１０抗体のヒト化中に生じた可変領域可変領域ｈＶＨ１〜ｈＶＨ１２（配列番号３０〜４１）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、マウスＢ−Ｎ１０抗体のヒト化中に生じた可変領域ｈＶＨ１３〜ｈＶＨ２９（配列番号４２〜５８）のアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、ｈＩＬ−１０抗原ＥＬＩＳＡを用いてキメラｃＢ−Ｎ１０抗体と比較した、ヒト化抗体変異体の抗原結合性を提供する。
【図５】図５は、精製抗体製剤を用いてキメラＢ−Ｎ１０抗体と比較した、３つのヒト化変異体ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７、ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８、及びｈＶＨ２６／ｈＶＬ７の結合性の測定結果を提供する。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｂ−Ｎ１０とインキュベーションした後の健常ボランティア由来全血培養物におけるＴＮＦαの放出レベルを、ＢＴ−０６３の場合と比較して示す（５０μｇ／ｍＬ）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｂ−Ｎ１０とインキュベーションした後のＳＬＥ患者由来全血培養物におけるＴＮＦαの放出レベルを、ＢＴ−０６３の場合と比較して示す（５０μｇ／ｍＬ）。
【図７Ａ】図７Ａは、Ｂ−Ｎ１０とインキュベーションした後の健常ボランティア由来全血培養物におけるＩＬ−６の放出レベルを、ＢＴ−０６３の場合と比較して示す（５０μｇ／ｍＬ）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、Ｂ−Ｎ１０とインキュベーションした後のＳＬＥ患者由来全血培養物におけるＩＬ−６の放出レベルを、ＢＴ−０６３の場合と比較して示す（５０μｇ／ｍＬ）。
【図８Ａ】図８Ａは、Ｂ−Ｎ１０とインキュベーションした後の健常ボランティア由来全血培養物におけるＩＬ−１βの放出レベルを、ＢＴ−０６３の場合と比較して示す（５０μｇ／ｍＬ）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｂ−Ｎ１０とインキュベーションした後のＳＬＥ患者由来全血培養物におけるＩＬ−１βの放出レベルを、ＢＴ−０６３の場合と比較して示す（５０μｇ／ｍＬ）。
【図９Ａ】図９Ａは、Ｂ−Ｎ１０とインキュベーションした後の健常ボランティア由来全血培養物におけるＩＦＮ−γの放出レベルを、ＢＴ−０６３の場合と比較して示す（５０μｇ／ｍＬ）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ｂ−Ｎ１０とインキュベーションした後のＳＬＥ患者由来全血培養物におけるＩＦＮ−γの放出レベルを、ＢＴ−０６３の場合と比較して示す（５０μｇ／ｍＬ）。
【図１０】図１０は、ＩＬ−１０に結合しているＢＴ−０６３のＦａｂ断片の全体構造を示す。ＩＬ−１０及びＦａｂ断片をリボン図で示す。
【図１１】図１１は、ＩＬ−１０受容体が結合する部位と同じＩＬ−１０の部位に結合するＢＴ−０６３のＦａｂ断片を示す。ＩＬ−１０、ＩＬ−１０Ｒ１、及びＦａｂ断片をリボン図で示す。
【図１２】図１２は、健常ボランティアにＢＴ−０６３を投与した後の、投薬量に対するサイトカインの血漿濃度の平均ｃｍａｘのグラフを示す。
【図１３】図１３は、健常ボランティアにＢＴ−０６３をインビボ投与した後の、経時的なＩＬ−１０平均血漿濃度のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片、及び高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状の治療におけるこの抗体又はその断片の使用に関する。
【００１３】
ヒトＩＬ−１０は、分子量３７ｋＤａのホモダイマーである。各モノマーは、１６０アミノ酸からなり、分子量は１８．５ｋＤａである。ＩＬ−１０のダイマーは、ＩＬ−１０Ｒ受容体α（ＩＬ−Ｒ又はＩＬ−１０Ｒ１）と相互作用し、次いで、ＩＬ−１０受容体β（ＩＬ−１０Ｒβ又はＩＬ−１０Ｒ２）を複合体に動員する。これら受容体は、様々な細胞、特に、単球、マクロファージ、Ｔリンパ球、及びＢリンパ球等の大部分の造血細胞を含む免疫細胞（Ａｓａｄｕｌｌａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．２００３  Ｊｕｎ；５５（２）：２４１−６９）で発現するが、表皮細胞又はケラチン産生細胞等の非造血細胞でも発現する。ＩＬ−１０受容体αとＩＬ−１０との結合及びＩＬ−１０受容体βの動員により、Ｊａｋ１及びＴｙｋ２チロシンキナーゼを介するシグナル伝達が導かれ、次いで、ＳＴＡＴファミリーの転写因子が活性化される。ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、好酸球、マスト細胞、ケラチン産生細胞、樹状細胞、更には癌細胞等、様々なＩＬ−１０の細胞源が公知である。Ｂ細胞におけるＩＬ−１０の機能は、アポトーシスの防止、増殖の強化、クラススイッチ事象、及びプラズマ細胞への分化（Ａｓａｄｕｌｌａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．２００３  Ｊｕｎ；５５（２）：２４１−６９）などである。
【００１４】
本発明は、炎症促進性サイトカインレベルの許容できない上昇を伴うことなしに被験体に投与することができる、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片を提供する。
【００１５】
治療用抗体の投与は、被験体に望ましくない副作用を引き起こす、炎症促進性サイトカインレベルの許容できない上昇を引き起こし得ることが知られている。特に、この許容できない上昇は、皮膚の発赤を引き起こすことがあると共に、体温の上昇などの発熱又はインフルエンザ様症状をもたらすことがある。したがって、本発明の好ましい態様においては、前記抗体又は抗体断片は、２℃を超える体温の上昇を伴うことなしに被験体に投与することができるものである。
【００１６】
更に、前記抗体又はその断片は、投与後の被験体の血漿中における炎症促進性サイトカイン量の実質的な上昇を引き起こさない。これらのサイトカインの許容できないレベルは、通常、サイトカインの正常値上限（ＵＬＮ）よりも数倍高い。該ＵＬＮは、被験体コホートで測定されるサイトカインの平均レベルに２×標準偏差を加えた値として定義される。
【００１７】
したがって、本発明の好ましい態様においては、前記抗体又はその断片は、炎症促進性サイトカインレベルが、正常値上限（ＵＬＮ）の５００％を超えて上昇することなしに、より好ましくは３００％を超えて上昇することなしに被験体に投与することができる。換言すれば、前記抗体又はその断片は、炎症促進性サイトカインレベルを、当該炎症促進性サイトカインのＵＬＮの５００％未満、より好ましくは３００％未満しか上昇させない。前記炎症促進性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１βのうちの少なくとも１つ、好ましくはこれらの全てであることが好ましい。或いは、前記炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−６とＩＬ−８のいずれでもない。
【００１８】
更に、本発明の抗体又はその断片は、抗炎症反応を引き起こす、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）を被験体において誘導することができることが特に好ましい。
【００１９】
本発明の好ましい態様においては、前記ヒト化抗体又はその断片は、ＰＢＭＣ、より具体的には免疫細胞から、これらの細胞にインビトロで接触させたときに放出される炎症促進性サイトカイン、特にＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、のレベルに５００％を超える上昇を引き起こさない。
【００２０】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明のヒト化抗体又はその断片が引き起こす炎症促進性サイトカインレベルのインビトロアッセイにおける上昇が、マウスＢ−Ｎ１０抗体よりも小さいことを見出した。
【００２１】
炎症促進性サイトカインの放出レベルは、単離した免疫細胞又はヒト全血培養物を用いるインビトロ研究によって測定することができ、例えば、以下の実施例５に記載の研究によって測定することができる。具体的には、前記測定方法は、（ａ）前記抗体又はその断片と共に細胞培養物をインキュベートする工程、及び（ｂ）少なくとも１つの炎症促進性サイトカインのレベルを測定する工程を含む。
【００２２】
ヒト全血培養物は、健常人又はＳＬＥを罹患している患者などの疾患患者から採取することができる。前記末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、免疫細胞であってもよく、特にマクロファージ、単球、樹状細胞、ヘルパーＴ細胞、及びＢ細胞から選択することができる。
【００２３】
前記少なくとも１つの炎症促進性サイトカインは、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ヘルパーＴサイトカイン（インターフェロンγ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４）、マクロファージサイトカイン（ＩＬ−１２）、ケモカイン（ＩＬ−８、ＭＣＰ−１）のそれぞれから選択することができる。これらのサイトカインの放出レベルは、当該技術分野で一般に知られている方法を用い細胞培養物上清中で測定することができる。
【００２４】
より具体的には、該インビトロ法は、以下の工程を含むことができる：
ａ）５０μｇ／ｍＬの抗体又は断片をヒト全血培養物と接触させる工程；
ｂ）前記抗体又は断片を前記全血培養物と共に３７℃で４８時間インキュベートする工程；及び
ｃ）前記培養物中の１以上の炎症促進性サイトカインの量を測定する工程。
【００２５】
特に、前記方法は、前記抗体と接触させないヒト全血培養物と共に行う。このコントロールと比較して、本発明の抗体又は抗体断片は、サイトカインレベルを５００％未満、より好ましくは３００％未満しか上昇させないことが好ましい。この方法におけるサイトカインは、ＩＬ−６とＩＬ−８のいずれでもないことが好ましい。
【００２６】
サイトカインは、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｂｅａｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（９６ウェルフィルタープレートで行う固相タンパク質アッセイ）を用いて培養物中で検出することができる。該方法は、特定のサイトカインに対する特定の抗体が結合していると共に所定の分光特性を示すビーズを用いる。これにより、ビーズを特異的に同定することができ、これらを既知の結合抗体に帰することができる。ビーズに結合したサイトカインは、検出抗体を該サイトカインに更に結合させることにより定量することができる。これは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αなどの最大１０種のヒトサイトカインを同時に検出することを可能にする。湿ったウェルにサンプル、標準物質、及びビーズ溶液がピペットで注入されたフィルタープレートを前記目的のために用いる。インキュベーション後、液体を真空ポンプで吸引除去し、残ったビーズを洗浄し、ビオチン化検出抗体の混合物を添加する。液体を吸引除去し且つウェルに残っているビーズを洗浄することにより、結合していない検出抗体を除去し、次いでストレプトアビジンコンジュゲートＲ−フィコエリスリン（ストレプトアビジン−ＲＰＥ）を添加する。これは、インキュベーション中にビオチン化検出抗体を認識し、再度洗浄した後に、形成された免疫複合体をＢｉｏ−Ｐｌｅｘ２００Ｓｙｓｔｅｍで分析することができる。この免疫学的アッセイは、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ２００装置を用いて分析する。この装置は、２つのレーザーシステムを用いており、これらのうちの一方は、ビーズの分光特性に基づいてビーズを同定し、他方は、第２抗体を用いる検出により結合したサイトカインの量を測定する。結合量の定量は、既知量のサイトカインを含む標準物質を並行して用いることで達成される。
【００２７】
更に、本発明は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、被験体に投与されたときにＩＬ−１０の血漿中のレベルを上昇させることができるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片を提供する。
【００２８】
以下の実施例８に示すように、本発明の抗体は、炎症促進性サイトカインレベルの許容できない上昇を伴うことなしに投与することができる一方で、投与により、血漿サンプル中に検出可能なＩＬ−１０の量が用量依存的に上昇する。中和抗体を適用したときにＩＬ−１０レベルが上昇するという知見は、予想外である。通常、サイトカイン中和剤を投与すると遊離サイトカインレベルが低下することが予想される（Ｓｔｒａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２００７、Ｖｏｌ．６、ｐｐ．７５−９２）。何ら理論に拘束されることを望むものではないが、抗体がＩＬ−１０に結合することにより、ＩＬ−１０のＩＬ−１０受容体への結合を阻害し、より多くのＩＬ−１０をＢ細胞に産生させるネガティブフィードバックループを誘導すると考えられる。にもかかわらず、このアップレギュレーションが本発明の抗体の治療有用性を阻害することはない。これは、実施例８にも示されるように、該抗体は、全てのＩＬ−１０を中和するのに十分高いレベルでも安全に投与されるからである。
【００２９】
本願において、用語「キメラ抗体」は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、或いは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の配列と同一であるが、一方、抗体の残りの部分は、異なる種、抗体クラス、又は抗体サブクラスに由来する抗体の配列と同一である抗体を指す。キメラ抗体のＣＤＲはある起源に由来するが、抗体の残りの部分は異なる起源に由来することが特に好ましい。具体的には、本発明において、キメラ抗体は、非ヒト抗体の抗原結合配列／可変ドメインがヒト抗体のフレームワーク領域にグラフトされているヒト化抗体であってよい。
【００３０】
本願において、用語「断片」は、望ましい生物活性を保持している抗体の断片又は誘導体を指す。断片は、一般的に、抗体の抗原結合領域、具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、並びに多価抗体誘導体、具体的には、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）又はタンデム二重特異性抗体を含む。断片は、少なくとも２５アミノ酸が好ましく、５０アミノ酸がより好ましく、２００アミノ酸〜５００アミノ酸が更により好ましい。或いは、断片は、３０ＫＤａ〜１５０ｋＤａのサイズを有する断片として定義することもできる。更に、抗体断片は、２以上のペプチド／ポリペプチド鎖を含んでいてもよい。例えば、各長さが２００アミノ酸〜３００アミノ酸である２本の鎖を含むＦａｂ断片、又は各長さが４００アミノ酸〜５００アミノ酸である２本の鎖を含むＴａｎｄＡｂｓ（登録商標）（四価二重特異的抗体フォーマット）である。
【００３１】
前記抗体又はその断片は、本明細書に記載されるマウスＢ−Ｎ１０抗体又はヒト化ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）抗体に由来することが、本発明の好ましい特徴である。具体的には、かかる抗体又はその断片は、Ｂ−Ｎ１０／ＢＴ−０６３可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、及び／又はＢ−Ｎ１０／ＢＴ−０６３可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む。マウスＣＤＲのアミノ酸配列を図１に示す。ＢＴ−０６３のＣＤＲのアミノ酸配列を実施例６に示す。前記配列は、Ｂ−Ｎ１０／ＢＴ−０６３抗体のＣＤＲの配列と少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一であることがより好ましい。本明細書中の実施例６に記載するＸ線結晶構造解析は、ＣＤＲ内のどの残基がＩＬ−１０との結合に重要であるかを示す。
【００３２】
或いは、本発明の抗体又は断片は、Ｂ−Ｎ１０／ＢＴ−０６３抗体に由来するものではあるが、抗体又はその断片の親和性及び／又は特異性を実質的に変化させることのない変異を配列中に任意で含む、Ｂ−Ｎ１０／ＢＴ−０６３可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列、及び／又はＢ−Ｎ１０／ＢＴ−０６３可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を含んでいてもよい。具体的には、マウスＢ−Ｎ１０抗体又はＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）抗体のＣＤＲを含む抗体又は断片と比べて、前記配列中の変異は、ＩＬ−１０に対する抗体又は断片の親和性又は特異性を低下させない。
【００３３】
特定の実施形態において、本発明は、Ｂ−Ｎ１０／ＢＴ−０６３の可変軽鎖及び／又は可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片を提供する。より好ましくは、本発明は、図１に示すマウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変ドメインのアミノ酸配列を含むヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片を提供する。最も好ましくは、前記抗体又は断片は、ＢＴ−０６３の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号６９及び７０）のうちのいずれか一方又は両方を含む。
【００３４】
一般的に、本発明の抗体は、ヒト定常領域（Ｆｃ）を更に含む。これは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラス、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプに由来する定常ドメインの中から選択することができる。好ましい定常領域は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１の定常ドメインの中から選択される。
【００３５】
他の生成物
本発明は、更に、上記抗体又は抗体断片をコードする核酸配列を提供する。前記核酸配列は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡが好ましい。前記配列は、発現カセット又はベクター内で用いることができ、本明細書に開示される抗体及びその断片の産生において特に用いられる。
【００３６】
本発明は、更に、これらポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターで形質転換されたホスト細胞を提供する。好適なホスト細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
【００３７】
或いは、ホスト細胞は、本発明の抗体を産生する細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより得られるハイブリドーマであってもよい。
【００３８】
上記ホスト細胞は、抗体又はその断片を産生するための方法で利用することができる。具体的には、かかる方法は、抗体又はその断片を発現させる条件下で好適な培養培地中にてホスト細胞を培養する工程と、培養培地から前記抗体又はその断片を分離する工程とを含んでいてもよい。この種の方法は、当技術分野において公知であり、報告されている。
【００３９】
医療的用途
本明細書に記載される抗体又はその断片は、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される疾患又は病状の治療において有用性を有する。結果として、被験体における病状を治療又は予防するための方法であって、前記病状が高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介され、治療上有効な量の本明細書に記載される抗体又はその断片を投与することを含む方法を提供する。
【００４０】
具体的には、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状は、ＳＬＥである。したがって、また、本発明は、ＳＬＥの治療において使用するための本明細書に記載される抗体又はその断片を提供する。
【００４１】
更なる例は、血小板減少性紫斑病、ループス腎炎、ＨＩＶ、ｈＣＭＶ、及びＣ型肝炎である。別の例は、免疫反応の増殖又は抑制を直接支持することによりＩＬ−１０に依存している腫瘍細胞を治療することである。
【００４２】
本発明の更なる実施形態は、薬学的に許容し得る担体又は希釈剤と共に、上記抗体又はその断片を含む医薬組成物である。１つの実施形態では、前記組成物は、抗体又はその断片がカップリングしているリポソームを含む。
【００４３】
かかる組成物は、患者に対して、非経口的に、静脈内に、又は皮下に投与することができる。ＳＬＥの治療において、前記抗体又はその断片は、静脈内又は皮下に投与されることが好ましい。
【００４４】
前記抗体及びその断片は、炎症促進性サイトカインレベルを大幅に上昇させることがなく、患者にとって許容できない「サイトカインストーム」を防ぐためのコルチコステロイドの併用投与の必要がないので、疾患の治療に特に有用である。
【００４５】
したがって、特定の態様においては、本発明は、被験体における、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状を治療又は予防する方法であって、治療上有効な量の本明細書に記載の抗体又はその断片を前記被験体に投与する工程を含み、前記被験体は、コルチコステロイドによる治療を同時にも別々にも受けていない（即ち、患者は、コルチコステロイドを併用していない）を提供する。この好ましい態様の実施形態においては、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状は、ＳＬＥである。
【００４６】
多くの患者において、ＳＬＥの治療にコルチコステロイドが併用される。しかしながら、本発明のこの態様は、コルチコステロイドの投与が望ましくない患者の治療において特に有用である。
【００４７】
非医療的用途
更に、本明細書に記載される抗体又はその断片と標識とを含む、標識されているヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片を提供する。前記標識は、サンプル中の抗体の存在を検出するために当技術分野において公知である任意の好適な種類であってよい。具体的には、前記標識は、蛍光標識であってよい。
【００４８】
標識されている抗体又は標識されていない抗体、具体的には、標識されている抗体は、サンプル中に存在するＩＬ−１０の存在を検出するためのインビトロ方法において特定の有用性を有する。前記方法は、標識されていない抗体若しくは標識されている抗体又はこれらの断片とサンプルとを接触させる工程と、前記サンプルを洗浄して、前記サンプルに結合していない抗体及びその断片（即ち、非結合抗体又は抗体断片）を除去する工程と、例えば標識を介して、前記サンプル中の前記抗体（又は断片）の存在を検出する工程とを含む。
【００４９】
或いは、サンプル中のＩＬ−１０を中和するためのインビトロ方法に、標識されていない抗体又は断片を使用してもよい。かかる方法は、抗体又はその断片をＩＬ−１０に結合させるために、前記抗体又は断片とサンプルとを接触させる工程を含む。
【実施例】
【００５０】
次に、以下の特定の実施形態に関連して本発明を更に説明する。
【００５１】
実施例１−マウス抗ＩＬ１０抗体Ｂ−Ｎ１０の特性評価
１．１  Ｂ−Ｎ１０抗体の可変ドメインをコードするＤＮＡの単離
マウスＢＮ−１０の可変配列を同定するために、細胞ペレットを用いた。−８０℃で保存しておいたサンプル（３×Ｂ−Ｎ１０、３代継代、１×１０７細胞）の細胞からｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成した後、Ｂ−Ｎ１０の可変配列をＰＣＲにより増幅させ、次いで、クローニングした。
【００５２】
合計１４クローンの配列を決定し（ＳＥＱ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）、可変軽鎖及び可変重鎖について分析した。Ｂ−Ｎ１０の可変配列を明確に決定した。Ｎ−末端のプライマー領域でのみ差が生じた（表１を参照されたい）。可変重鎖については、プライマー領域における配列変異ＱＶＱＬＫＱ（配列番号５９）が９クローンで生じていたが、他の変異は１クローン又は２クローンでしか生じていなかった。サブクローニングするためにこの変異体を選択した。可変軽鎖については、２つの変異体が同比率で存在していた。マウス生殖細胞系配列と比較したところ、３つの突然変異しか有しないｃｒ１配列が、同定されたＶＬ配列と高い相同性を示した。これは、ＤＶＬＭＴＱ（配列番号６０）配列が正確な配列である可能性が非常に高いことを意味する。配列ＤＩＶＭＴＱ（配列番号６１）は、典型的な別のクラスの生殖細胞系配列であるので、除外した。
【表１】
2013511994.tif 000002
【００５３】
可変軽鎖ＶＬ及び可変重鎖ＶＨのタンパク質配列を、それぞれ図１Ａ及び１Ｂに示す。超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く。対応するＤＮＡ配列を、それぞれ図２Ａ及び２Ｂに示す。
【００５４】
実施例２−キメラＢ−Ｎ１０抗体の作製
組換え抗体を発現させるために、実施例１で同定された抗体の重鎖及び軽鎖の可変配列をベクター系にクローニングした。第１の工程として、前記配列をＢＳリーダーにクローニングし、Ｎ末端に分泌シグナルを付加し、Ｃ末端にスプライスドナー配列を付加した。第２の工程として、それぞれ定常ヒトカッパ鎖及び定常ヒトガンマ−１鎖を含有する発現ベクターにこれら配列をクローニングした。軽鎖用ベクター及び重鎖用ベクターを調製し、次いで、リン酸カルシウム沈殿又はリポフェクションによってＣＯＳ−７細胞に一過的にコトランスフェクトした。２日間後、細胞培養上清を回収した。ＣＯＳ−７細胞中でキメラＢ−Ｎ１０を発現させ、上清中の抗体の力価を検出した（サンドイッチＥＬＩＳＡ）後、ヒトインターロイキン−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１７−ＩＬ／ＣＦ、ロット番号ＥＴ１１４０２１、−２０℃で保存）に対する結合能をＥＬＩＳＡで試験した。
【００５５】
サンドイッチＥＬＩＳＡの場合、マウス抗ヒトカッパ鎖抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をキャッチャー抗体としてプレート表面に結合させ、次いで、細胞培養上清と共にインキュベートし、ＰＯＤと複合体化しているウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いてキメラ抗体の存在を検出した。規定の濃度（０．１２５μｇ／ｍＬ〜１２μｇ／ｍＬ）のキメラ対照抗体をポジティブコントロールとして用いた。
【００５６】
抗原ＥＬＩＳＡの場合、０．５μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬの濃度でプレート表面にヒトＩＬ−１０を結合させた。細胞培養上清（未希釈及び１：５希釈）と共にインキュベートした後、ＰＯＤと複合体化しているウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いてキメラＢ−Ｎ１０の結合を検出した。マウスＢ−Ｎ１０をポジティブコントロールとして用いた。０．５μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬの濃度の抗体を用い、ＰＯＤと複合体化しているウサギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ抗体（Ｄａｋｏ）で結合を検出した。
【００５７】
ＥＬＩＳＡの結果については、実施例３で論じる。
【００５８】
実施例３−抗ＩＬ−１０抗体のヒト化
げっ歯類抗体のヒトにおける免疫原性を低下させようとする最初の試みは、げっ歯類抗体の定常ドメインをヒト抗体の定常ドメインに置き換えることによりキメラ抗体を作製することであった。依然として可変ドメイン内のげっ歯類のフレームワーク領域が免疫反応を誘導する場合があったので、より進歩したＣＤＲのグラフト方法、即ち、抗原結合配列（相補性決定領域、ＣＤＲ）を完全にヒト抗体フレームワークに転移させる（ヒト化）方法が開発された。通常、マウスドナー抗体に最も類似するヒトアクセプターフレームワークを選択して、ヒト化プロセス中にオリジナル抗原の特異性及び親和性が回復される可能性を高める。ヒト抗体生殖細胞系配列、発現抗体のコンセンサス配列、ＣＤＲループ構造の分析、及び抗体／抗原複合体のＸ線構造を用いる異なるアプローチを用いてもよく、これらと組み合わせて前記プロセスを改善してもよい。通常、幾つかのヒト化抗体変異体は、この方法で作製され、後に、互いに異なる及びオリジナル抗体と異なる可能性のある生物学的作用に関して分析される。最後に、抗体の望ましい機能に従って、好適なヒト定常領域を選択することができる。
【００５９】
３．１  Ｂ−Ｎ１０のマウス可変配列とヒト配列との配列比較、並びにヒト化ＶＬ（ｈＶＬ）及びＶＨ（ｈＶＨ）の配列のセットの設計
マウス抗ＩＬ−１０抗体であるＢ−Ｎ１０を選択した（Ｌｌｏｒｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．１９９３  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；４（６）：４２１−７；及びＬｌｏｒｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２０００  Ａｕｇ；４３（８）：１７９０−８０）。ヒト化抗体を得るための方法は、相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトアクセプター領域に融合させるＣＤＲグラフト手順に基づく。
【００６０】
以下の３つのデータセットの複合分析に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークを選択した：
１．  体細胞突然変異のリスクを最小化するための、マウス配列とヒト生殖細胞系配列との相同性、
２．  異常なアミノ酸残基を同定するための、マウス配列とヒトコンセンサス配列との比較、及び
３．  重要な構造フレームワークアミノ酸残基についての情報を得るための、ＣＤＲ配列の基準となる構造クラスの同定。
【００６１】
Ｂ−Ｎ１０のマウス可変軽鎖は、ヒト生殖細胞系可変セグメント２−３０＊０１（Ａ１７（配列番号１４））及び接合セグメントＪＫ１（配列番号１５）に対して最も高い相同性を示す。Ｂ−Ｎ１０に対して最も高い相同性を有するヒトコンセンサス配列は、ＨｕＫＩＩである。可変軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｌ１の場合クラス４に、Ｌ２及びＬ３の場合クラス１に分類することができた。重要なアミノ酸残基を同定した。
【００６２】
クラス４−１−１の基準構造を有するマウスＣＤＲとヒト生殖細胞系ＶＬ遺伝子との配列比較により、２−３０＊０１と最も高い相同性を有する（一致しないアミノ酸数が最も少ない）ことが明らかになった。
【００６３】
Ｂ−Ｎ１０のマウス可変重鎖は、ヒト生殖細胞系可変セグメントＶＨ３−３３及び接合セグメントＪＨ４（配列番号１７）に対して最も高い相同性を示す。Ｂ−Ｎ１０に対して最も高い相同性を有するヒトコンセンサス配列は、ＨｕＨＩＩＩである。可変重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｈ１及びＨ２の場合クラス１に分類することができた。重要なアミノ酸残基を同定した。クラス１−１の基準構造を有するマウスＣＤＲとヒト生殖細胞系ＶＨ遺伝子との配列比較により、３−６６＊０４（配列番号１６）と最も高い相同性を有する（一致しないアミノ酸数が最も少ない）ことが明らかになった。したがって、生殖細胞系配列ＶＨ３−６６を考慮した。
【００６４】
ヒト化可変軽鎖（１２変異体）と可変重鎖（２９変異体）との様々な可変配列のセットを設計するために、得られた全てのデータを検討した。
【００６５】
３．２  ヒト化ｈＩＬ−１０結合抗体断片の小さなライブラリの構築及び選択
ｈＩＬ−１０に結合する可能性のある抗体断片のライブラリを作製して最適なヒトＩＬ−１０結合抗体を得るために、真核細胞のコドン使用頻度を考慮した上で、図３に示す１２個のｈＶＬ断片及び２９個のｈＶＨ断片をコードするｃＤＮＡ配列を作製した。
【００６６】
次いで、得られたｃＤＮＡをクローニングベクターにクローニングし、ＳＥＱ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において配列を決定した。ｈＶＬ断片をコードする１２個の各ｃＤＮＡとｈＶＨ断片をコードする２９個のｃＤＮＡとを組み合わせて、発現する可能性のある３４８個の抗体断片を得るという方法でライブラリを構築した。
【００６７】
細菌で発現させ、ヒトＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１７−ＩＬ／ＣＦ）に対して２ラウンドの選択を行った後、ｈＩＬ−１０（同様に選択した）に対する結合についてＥＬＩＳＡにより前記抗体断片を分析した。簡潔に述べると、４℃で一晩、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのｈＩＬ−１０でＭａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をコーティングした。前記プレートをブロッキング及び洗浄した後、抗体断片を産生する細菌の上清を添加した。結合しているヒト化抗体断片を検出するために、ＰＯＤと複合体化している二次抗体を用いた。
【００６８】
優れた結合剤のコード配列を分析し、同定されたｈＶＬ断片及びｈＶＨ断片の発生について列記した（表２）。
【表２】
2013511994.tif 000003
【００６９】
太字にした配列は、抗体全体について結合特性を分析するために、適切な真核発現ベクターにサブクローニングするために選択した配列である。括弧内に示す配列は、発現ベクターにサブクローニングするために選択したが、欠陥コンストラクトしか得られなかった配列である。
【００７０】
３．３  選択したＢＴ−０６３のヒト化軽鎖及び重鎖の変異体用の発現ベクターの作製
スクリーニングアプローチにより求められた統計値に基づいて、ベクター系にクローニングするためのＢＴ−０６３のヒト化ＶＬ及びヒト化ＶＨの変異体のセットを選択した。第１の工程では、分泌シグナル５’及びスプライスドナー配列３’をコードしている配列とクローニングしたｃＤＮＡとを融合させるために、ヒト化ＶＬ及びＶＨの変異体をコードするｃＤＮＡを適切なベクターに転移させた。第２の及び最後のサブクローニング工程で、それぞれ、ヒト定常カッパ鎖及びヒト定常ガンマ−１鎖をコードする発現ベクターにこれらｃＤＮＡコンストラクトを転移させた。内毒素を含まないＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、独立に得られたｈＶＬ及びｈＶＨを含有する発現ベクターのプラスミドを調製した。
【００７１】
３．４  ＣＯＳ−７細胞における選択されたヒト化ＢＴ−０６３変異体の一過的発現及びｈＩＬ−１０に対する抗体結合の比較
ＣＯＳ−７細胞におけるヒト化抗体変異体を一過的に発現させるために、選択した各ヒト化ＶＬ変異体（ｈＶＬ７及びｈＶＬ８）と、選択した各ヒト化ＶＨ変異体（ｈＶＨ１、ｈＶＨ９、ｈＶＨ１３、ｈＶＨ１８、ｈＶＨ２０、ｈＶＨ２６、ｈＶＨ２８）とを組み合わせて、１４個の異なるヒト化抗体を得た。
【００７２】
簡潔に述べると、２４ウェルフォーマットにおいて１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で、リン酸カルシウム沈殿により、軽鎖及び重鎖をコードする発現ベクターをＣＯＳ−７細胞に一過的にコトランスフェクトした。トランスフェクション後、培地を無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に置換し、トランスフェクションの２日間後〜３日間後にＣＯＳ−７細胞の上清を回収した。トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の上清に分泌されたヒト化抗体の抗体力価をサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析した。求められた抗体濃度に基づいて、全てのサンプルの上清を同じ抗体濃度に調整した。ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのｈＩＬ−１０でコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる抗原ＥＬＩＳＡにより、全てのサンプルを用いてヒトＩＬ−１０に対する結合を分析した。
【００７３】
図４に示す通り、分析した変異体は全てｈＩＬ−１０に結合するが、結合性は異なっている。有意に、抗原ＥＬＩＳＡにおいて最も高いシグナルは、キメラＢ−Ｎ１０抗体で得られた強度に匹敵するシグナル強度を示すＢＴ−０６３変異体ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７、ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７、及びｈＶＨ２０／ｈＶＬ８で得られた。これら３つの抗体内のシグナル強度の差（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８のシグナルがより強く、ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７及びｈＶＨ２６／ｈＶＬ７のシグナルがより弱い）は、定量サンドイッチＥＬＩＳＡ（上記を参照されたい）の結果、抗体濃度の差に起因していた可能性がある。調べた他の全ての変異体からは、キメラＢ−Ｎ１０抗体と比べてかなり弱いシグナルが得られた。
【００７４】
３．５  キメラ及びヒト化抗体の変異体の産生及びアフィニティー精製
選択されたヒト化ＢＴ−０６３変異体（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７、ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８、ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）及びキメラｃＢ−Ｎ１０（実施例２で論じた）をＣＯＳ−７細胞で産生させた。
【００７５】
１０ｃｍの組織プレートを用いて、セクション３．４に記載の通り一過的に発現させた。トランスフェクションの５日間後、各変異体から約０．５Ｌの無血清上清を回収した。
【００７６】
前記無血清上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製した。２ＭのＮａＣｌの存在下で上清をロードした。０．１Ｍのクエン酸バッファ（ｐＨ４．０）により抗体を溶出し、２Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．２）を含有するチューブに分画した。ＰＢＳでバッファ交換し、３０ｋＤａでカットオフする膜を用いて遠心分離することにより個々の抗体のプローブを濃縮した。抗原ＥＬＩＳＡ、非還元条件及び還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、並びに２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるＵＶ測定により、精製された物質の品質をチェックした。
【００７７】
精製したキメラＢ−Ｎ１０及びヒト化変異体のｈＩＬ−１０に対する結合を、実施例２に記載した方法に従ってＥＬＩＳＡにより試験した。ｈＩＬ１０をコーティングし、変異体ｃＢ−Ｎ１０、ＢＴ−０６３−１（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７）、ＢＴ−０６３−２（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８）、及びＢＴ−０６３−３（ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）について抗体の結合を測定した。結果を図５に示す。
【００７８】
キメラＢ−Ｎ１０及びｈＶＨ２０／ｈＶＬ７変異体のシグナル強度は同程度であったが、変異体ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８及びｈＶＨ２６／ｈＶＬ７のシグナル強度は僅かに低かった。
【００７９】
３．６  ＢｉａｃｏｒｅヒトＩＬ−１０による親和性の測定
ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ｈＩＬ−１０に対する様々な抗体（マウス、キメラ、３つのヒト化変異体）の結合についての会合速度定数及び解離速度定数を測定するために表面プラズモン共鳴分析を用いた。製造業者の条件に従って、ｈＩＬ−１０をＣＭ−５センサチップに固定化した。５μＬ／分の流速で２０μｇ／ｍＬのアリコート５０μＬを添加することによりｈＩＬ−１０を固定化して、固定化密度３２０ＲＵにした。５０μＬ／分の流速で０．１Ｍの炭酸バッファ（ｐＨ９．２）及び０．０１ＭのＨＣＬ／１ＭのＮａＣｌを各１分間用いることにより２段階サイクルで、固定化ｈＩＬ−１０表面を再生した。２０μｇ／ｍＬ〜０．１５μｇ／ｍＬの抗体濃度範囲で少なくとも４回各抗体サンプルを分析した。ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３（１９９９）ソフトウェアを用いることにより、センサグラムからの計算を実施した。
【００８０】
表３に、全てのＢｉａｃｏｒｅ測定の結果を要約する。全ての変異体が同程度ｈＩＬ−１０に結合する。しかし、僅かな差が検出可能である。結果として、マウスモノクローナル抗体Ｂ−Ｎ１０、キメラｃＢ−Ｎ１０、及びヒト化変異体ＢＴ−０６３−１（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７）は、同程度の親和性で結合するが、２つの他のヒト化変異体ＢＴ−０６３−２（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８）及びＢＴ−０６３−３（ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）は、（マウスＢ−Ｎ１０に比べて約３倍）低い親和性を示す。会合速度及び解離速度の僅かな差も検出可能である。
【表３】
2013511994.tif 000004
【００８１】
カニクイザルのＩＬ−１０
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた更なる表面プラズモン共鳴実験により、ＢＴ−６３変異体３（ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）のカニクイザルＩＬ−１０に対する親和性を分析した。
【００８２】
ＢＴ−０６３を１０ｍＭの酢酸（ｐＨ５．５）で５μｇ／ｍＬに希釈し、アミンカップリング手順を用いて固定化して、最終レベルを約１，０００ＲＵにした。１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．８）を３０秒間注入して、センサチップ表面を再生した。フローセル及びレファレンスセルに異なる濃度のサンプルを注入した。検出器フローセルから得られたシグナルからレファレンスセルから得られたシグナルを減じ、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて、得られた結合プロファイルを評価した。濃度依存性の結合プロファイルが得られ、カニクイザルのＩＬ−１０についての平均ＫＤは１９４ｐＭであると計算された。ポジティブコントロールとして、ｒｈＩＬ−１０を分析したところ、ＫＤは４．６ｎＭであった。結果を表４に要約する。
【表４】
2013511994.tif 000005
【００８３】
実施例４−インビトロにおける抗ＩＬ−１０抗体の活性
ＢＴ−０６３の能力を確認するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ−６放出の遮断について調べた。ＰＢＭＣは、リポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激されるとインターロイキン−６（ＩＬ−６）を放出する。インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の生理学的活性は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−６の分泌阻害である。したがって、ＬＰＳで刺激された細胞にＩＬ−１０を添加すると、ＩＬ−６の分泌が阻害され、細胞培養培地中に存在するＩＬ−６が著しく低下する。しかし、細胞培養物にＢＴ−０６３を添加するとＩＬ−１０と結合するので、ＩＬ−１０が細胞表面上の受容体に結合することができなくなる。ＩＬ−１０の阻害作用は補償され、ＩＬ−６分泌は回復し、培地中にＩＬ−６が放出される。
【００８４】
Ｆｉｃｏｌｌ勾配によりヒト血液からＰＢＭＣを単離した。単離した細胞を１×１０６細胞／ｍＬで播種し、ＩＬ−６を分泌させるためにＬＰＳで刺激したが、ＩＬ−１０の添加により阻害された。ＢＴ−０６３の添加によりＩＬ−１０の阻害作用が中和されたので、ＩＬ−６分泌が回復した。添加したＢＴ−０６３の目的（レファレンス、又は低品質若しくは高品質の対照サンプル）によって、異なる力価濃度のＢＴ−０６３を用い、濃度依依存的にＩＬ−６を分泌させた。このＩＬ−６の分布は、細胞培養の上清において検出した。
【表５】
2013511994.tif 000006
【００８５】
表５に示す通り、分泌されたＩＬ−６の量は、ＢＴ−０６３の濃度と直接相関している。ＢＴ−０６３の濃度が高くなるほど、より多くの量のＩＬ−６がＰＢＭＣから分泌され、上清中に存在する。ポジティブコントロール（ＩＬ−１０を含まない、刺激されたＰＢＭＣをインキュベートしたもの）と比べて、４０μｇ／ｍＬのＢＴ−０６３と共に細胞をインキュベートした場合はＩＬ−６分泌が約７３％回復するが、一方、０．９８８μｇ／ｍＬのＢＴ−０６３と共にインキュベートしても（用量設定の下限）、培地中で検出可能であったＩＬ−６濃度は僅か１７．５％であった。
【００８６】
実施例５−ヒト全血培養物におけるサイトカイン合成／レベルに対するＢ−Ｎ１０及びＢＴ−０６３の異なる作用
ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）の免疫薬理学的プロファイルを、ヒト全血培養物において実験的に誘導したサイトカイン合成の薬物依存的モジュレーションにより評価した。この方法を用いて、免疫細胞の活性に対するＢＴ−０６３の直接的及び間接的影響を求めることができる。ＢＴ−０６３活性は、Ｂ−Ｎ１０の作用と比較した。
【００８７】
前記アッセイでは、健常ボランティアとＳＬＥ患者の両方に由来する全血培養物を用い、これらをＢＴ−０６３又はＢ−Ｎ１０存在下におけるサイトカイン放出量について分析した。全血培養物中の免疫細胞によるサイトカイン放出は、Ｂ−Ｎ１０抗体又はＢＴ−０６３抗体それぞれとのインキュベーション後の静止状態で試験した。健常ボランティアに由来する白血球と全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の罹患患者に由来する細胞を含む。
【００８８】
以下に記載する実験に用いた細胞は、ボランティア又はＳＬＥ患者を出血させることで採取し、ＢＴ−０６３又はＢ−Ｎ１０それぞれとのインキュベーションは、マイクロ培養プレートで２日間行った。
【００８９】
これらの実験で測定した主なメディエータは、Ｔｈ−１−、Ｔｈ−２−、又は単球／マクロファージ−活性化などに関連するサイトカイン及びケモカインであり、例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）などである。培養物上清中の各測定パラメータの濃度は、マルチパラメトリックなビーズを利用した読み出しシステム（マルチアナライトプロファイル（ＭＡＰ）試験と呼ばれるＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）に基づく技術、Ｒｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＲＢＭ（オースティン、テキサス州、ＵＳＡ））。これらのアッセイは、ＥＤＩ  ＧｍｂＨ（ロイトリンゲン、ドイツ連邦共和国）によって行われた。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）技術は、ＥＬＩＳＡとフローサイトメトリーの組合せに類似した技術であり、アナライト１個当たり１００個のビーズをカウントする。したがって、各濃度は、１００個の各測定値の平均蛍光強度から逆算される。
【００９０】
５０μｇ／ｍＬの抗体濃度でのみ、サイトカイン放出の誘導が観察された。
【００９１】
Ｂ−Ｎ１０又はＢＴ−０６３とインキュベートした健常ドナー及びＳＬＥ患者由来の細胞培養物で測定されたサイトカインレベルの絶対値を次の表６及び７にまとめる。
【表６】
2013511994.tif 000007
【表７】
2013511994.tif 000008
【００９２】
図６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、８Ａ、８Ｂ、９Ａ及び９Ｂは、健常ボランティアとＳＬＥ患者の双方に由来する全血培養物において無刺激条件下で炎症促進性サイトカインの制御が異なることを示す。これらの図は、健常ボランティアとＳＬＥ患者由来の全血培養物は、ＢＴ−０６３（５０μｇ／ｍＬ）と比較してＢ−Ｎ１０とインキュベートした後にＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、及びＩＦＮ−γの放出量がより多いことを示している。ＩＬ−６は、炎症促進機能に加えて、Ｂ細胞のプラズマ細胞への分化のための因子としても働くことは注目に値する。
【００９３】
注目すべきことに、これらの結果から、ＩＬ−１０及び炎症促進性サイトカインのＢ−Ｎ１０によるアップレギュレーションの程度が、ＢＴ−０６３とインキュベートされた健常ドナー及びＳＬＥドナーの双方に由来する培養物の場合よりも高く、より安全なプロファイルを示唆していることが分かる。このことは、ヒト化の手順の結果として予想されるものではない。
【００９４】
実施例６−Ｘ線結晶構造解析
６．１  ヒトＩＬ−１０との複合体におけるＢＴ−０６３  Ｆａｂの結晶化
公開されている構造データに従って幾つかのＩＬ−１０コンストラクトを設計し（Ｚｄａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３，１９９５，ｐｐ．５９１）、標準的な手順により大腸菌で異種発現させるためのベクターにクローニングした。クローニングしたコンストラクトを標準的なプロトコールに従って試験的に発現させたところ、約１８ｋＤａの予測範囲でバンドが増加したことにより示される通り、ＩＬ−１０の高発現を示した。
【００９５】
後でタンパク質を精製するために、最適な条件下で発現したＩＬ−１０タンパク質を様々な量得た。再折り畳みの後、固定化アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質を精製して、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定したところ９５％を超える均質性を有するタンパク質が得られた。精製タンパク質の収量は、発現培養物１リットル当たり約０．３ｍｇであり、これは結晶化試験に十分であった。
【００９６】
ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）のＦａｂ断片を、プロテアーゼパパインを用いてインタクトな抗体から切断し、プロテインＡにより精製した。次いで、サイズ排除クロマトグラフィーによりＦａｂ断片を更に精製した。
【００９７】
精製タンパク質をモル過剰のＩＬ−１０と混合することによりＩＬ−１０：ＢＴ−０６３  Ｆａｂ複合体を形成し、サイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。保持体積は、複合体のサイズと一致していた。次いで、結晶化に好適な濃度にタンパク質を濃縮した。
【００９８】
ＩＬ−１０：ＢＴ−０６３  Ｆａｂ複合体の結晶を共結晶化法により調製した。
【００９９】
６．２  データ収集及び処理
結晶を急速冷凍させ、１００Ｋの温度で測定した。低温条件を用いてＳＷＩＳＳ  ＬＩＧＨＴ  ＳＯＵＲＣＥ（ＳＬＳ，Ｖｉｌｌｉｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でＢＴ−０６３のＦａｂ断片と共にＩＬ−１０の共結晶からＸ線回折データを収集した。
【０１００】
結晶は、非対称単位における２つの複合体と共に空間群Ｐ６に属する。プログラムＸＤＳ及びＸＳＣＡＬＥを用いてデータを処理した。データ収集統計値を表８に要約する。
【表８】
2013511994.tif 000009
【０１０１】
６．３  構造のモデリング及び構造の精密化
分子置換により、構造を決定及び分析するのに必要な位相情報を得た。ＩＬ−１０及びＦａｂ断片の公開モデルをサーチモデルとして用いた。次いで、ソフトウェアパッケージＣＣＰ４及びＣＯＯＴを用いて標準的なプロトコールに従って、モデルの構築及び構造の精密化を実施した。最終モデルの正確さを交差検定するための尺度であるフリーＲ因子を計算するために、構造の精密化手順から測定された反射の４．２％を除外した（表９を参照されたい）。
【０１０２】
プログラムＣＨＥＭＳＫＥＴＣＨを用いてナノボディのパラメータ化を実施した。対応するライブラリファイルを作製するためにＬＩＢＣＨＥＣＫ（ＣＣＰ４）を用いた。
【０１０３】
３．０σで一致するＦｏ−Ｆｃマップのピークに水分子を置くことによりＣＯＯＴの「Ｆｉｎｄ  ｗａｔｅｒｓ…」アルゴリズムを用いて水モデルを構築し、次いで、ＲＥＦＭＡＣ５で構造を精密化し、ＣＯＯＴの検証ツールを用いて全ての水をチェックした。疑わしい水のリストの基準は、以下の通りであった：Ｂ因子：８０超、２Ｆｏ−Ｆｃマップ：１．２σ未満、最も近接する接触までの距離：２．３Å未満又は３．５Å超。疑わしい水分子及び活性部位（阻害剤までの距離が１０Å未満）におけるものを用手的にチェックした。Ｆｏ−Ｆｃマップ（−３．０σに一致）におけるネガティブピークに存在していた側鎖の占有率をゼロに設定し、次いで、次の精密化サイクル後にポジティブピークが生じた場合、０．５に設定した。
【０１０４】
最終モデルのラマチャンドランプロットは、全ての残基の８０．８％が最も好ましい領域に、１７．９％が更に許容される領域に、残基の０．７％が寛容に許容される領域にあることを示す。残基Ｖａｌ８６（Ａ）、Ｈｉｓ１４（Ｂ）、Ａｓｐ８６（Ｂ）、Ｓｅｒ１３１（Ｃ）、Ｖａｌ５６（Ｄ）、及びＶａｌ５６（Ｆ）は、ラマチャンドランプロットの許容されない領域にみられる（表９）。これらは、電子密度マップにより確認される、即ち別の知覚可能な立体構造ではモデル化することができなかった。最終構造及び精密化プロセスの統計値を表９に示す。
【表９】
2013511994.tif 000010
【０１０５】
６．４  Ｘ線構造解析
ＢＴ−０６３  Ｆａｂ抗体断片が結合するヒトＩＬ−１０の複合体構造を３．４８Åの解像度で分析し、Ｆａｂ抗体断片の詳細な結合様式を明らかにする。
【０１０６】
得られた電子密度は、Ｆａｂ断片の配向及び立体構造を含むＦａｂ断片の明確な結合様式を示す。空間群Ｐ６の結晶は、非対称単位における２つの複合体を含有する。
【０１０７】
Ｆａｂとの複合体におけるＩＬ−１０の構造を図７に示す。２つのＦａｂ断片は、ＣＤＲループでＩＬ−１０の各ホモダイマーに結合する。
【０１０８】
以下のＩＬ−１０の残基（分子Ａ及びＢ）は、３．９Åの最大距離内でＣＤＲループの近傍に見出すことができる：Ａｒｇ２７、Ｌｙｓ３４、Ｇｌｎ３８、Ｍｅｔ３９、Ａｓｐ４１、Ｇｌｎ４２、Ａｓｐ４４、Ｌｅｕ４６、Ｇｌｕ５０、Ｌｅｕ５３、Ｇｌｕ１４２、Ａｓｐ１４４、Ｉｌｅ１４５、Ａｓｎ１４８、Ｔｙｒ１４９、Ｇｌｕ１５１、及びＴｈｒ１５５。
【０１０９】
ＣＤＲループの以下の残基は、３．９Åの最大距離内でＩＬ−１０の近傍に見出すことができる：Ｐｈｅ２７、Ｓｅｒ２８、Ａｌａ３０、Ｔｈｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｒｐ５２、Ａｒｇ５３、Ｇｌｙ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｓｎ７３、Ｓｅｒ７４、Ｔｙｒ１００、Ｇｌｙ１０１、Ｔｙｒ１０３（分子Ｃ及びＥ）、Ｓｅｒ３２、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ３５、Ｔｙｒ３７、Ｌｙｓ５５（分子Ｄ及びＦ）。
【０１１０】
ＩＬ−１０：ＩＬ−１０Ｒ１受容体複合体の公開されている構造にＩＬ−１０：ＢＴ−０６３の複合体構造を重ねることにより示される通り、ＢＴ−０６３の結合部位は、ＩＬ−１０の表面上のＩＬ−１０受容体の結合部位と一致する（図７）。
【０１１１】
Ｘ線解析によって同定されたヒトＩＬ−１０と接触しているＢＴ−０６３のアミノ酸残基を、以下に示すＢＴ−０６３抗体可変ドメインの直鎖アミノ酸配列において強調する。
【表１０】
2013511994.tif 000011
ＣＤＲ領域（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０９，６５７−６７０）に下線を引く（軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７１、７２、及び７３であり；重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７４、７５、及び７６である）。ＩＬ−１０と接触する残基を太字で示す。
【０１１２】
軽鎖内において、接触残基は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２にはみられるが、ＣＤＲ３にはみられない。３つ全てのＣＤＲの重鎖残基は抗原結合に関与していると考えられる。ＦＲ３の２つの残基（Ａｓｎ７３及びＳｅｒ７４）も抗原結合に寄与している。
【０１１３】
ＣＤＲ１の最初のＳｅｒ２８及びＡｌａ３０は、マウスＶＨの元になった配列（ＢＮ−１０）の一部であり、選択されるヒトフレームワーク（３−６６＊０４）中には存在しない。両方の位置は、それほど高い頻度で抗原結合に関与しておらず、ヒト化プロセス中に代替アミノ酸として導入された。
【０１１４】
残基Ａｓｎ７３及びＳｅｒ７４は、マウスにみられ、ヒト抗体フレームワーク配列でも頻繁にみられるが、通常、抗原結合には関与していない（ｗｗｗ．ｂｉｏｃ．ｕｚｈ．ｃｈ／ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，２００１）。抗原結合に対するこれらの寄与は、予測されていない。
【０１１５】
ＢＴ−０６３結合に関与するＩＬ−１０アミノ酸残基を以下に示す。また、高親和性ＩＬ−１０受容体鎖（ＩＬ−１０Ｒ１）及び低親和性受容体鎖（ＩＬ−１０Ｒ２）に対する結合に関与しているＩＬ−１０の残基も示す。両方の受容体鎖が、ＩＬ−１０ホモダイマーの結合に関与しており、シグナル伝達に必要である。配列Ａでは、ＢＴ−０６３に接触する残基を太字で示す。配列Ｂでは、ＩＬ−１０Ｒ１に対する接触残基を太字で示し、ＩＬ−１Ｒ２に対する接触残基をイタリック体で示し、下線を引き、ＩＬ−１０Ｒ１とＩＬ−１０Ｒ２により共有されている接触残基を太字、イタリック体、及び下線で示す（Ｐｌｅｔｎｅｖ  ｅｔ  ａｌ  ２００５）。
【表１１】
2013511994.tif 000012
【０１１６】
ＢＴ−０６３は、第１のＩＬ−１０モノマーのへリックスＡの連結ループ配列（Ｇｌｕ４２、Ａｓｐ４４、Ｌｅｕ４６）を含む残基（Ａｒｇ２７、Ｌｙｓ３４、Ｇｌｎ３８、Ｍｅｔ３９、Ａｓｐ４１）、及びへリックスＢ（Ｇｌｕ５０及びＬｅｕ５３）のＮ−末端部分と、第２のＩＬ−１０モノマーのへリックスＦ’の残基（Ｇｌｕ１４２、Ａｓｐ１４４、Ｉｌｅ１４５、Ａｓｎ１４８、Ｔｙｒ１４９、Ｇｌｕ１５１、Ｔｈｒ１５５）とを含むＩＬ−１０の不連続なエピトープに結合することが分かる。
【０１１７】
実施例７−カニクイザルにおけるインビボ単回用量毒性試験
カニクイザルで、ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）の単回静脈内注射後、安全性薬理学的パラメータを含む単回用量毒性試験を実施した。４匹／性別／群になるように動物を４群に分けた（プラセボ、１ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、及び５０ｍｇ／ｋｇ）。１日目にＢＴ−０６３を静脈内注射した。５日間後に動物の半数を剖検し、残りの動物は２８日目に屠殺した。
【０１１８】
この実験における低用量レベルである１ｍｇ／ｋｇは、ヒトにおける約３００μｇ／ｋｇの用量と等しく、合計ヒト（体重６０ｋｇ）用量は１８ｍｇになる。少数の研究者で開始した実験では、ＢＴ−０６３の元になった抗体Ｂ−Ｎ１００を同用量２１日間毎日投与した（Ｌｌｏｒｅｎｔｅ，２０００）。この量の抗体は、薬理学的効果及び臨床的有効性を示した。したがって、この結果を踏まえて低用量レベルを選択した。高用量は、出発用量の倍数（５０μｇ）として選択した。中間用量は、低用量と高用量との幾何平均である。
【０１１９】
試験中、生理学的パラメータ又は組織病理学的パラメータにおいて毒物学的に有意又は明らかな変化はみられなかった。更に、臨床化学パラメータの変化は、毒物学的有意性が僅かである又は存在しないとみなされた。
【０１２０】
実施例８−健常ボランティアにおけるインビボ単回用量毒性試験
健常ボランティアにおいて漸増用量の抗体を用いて、ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）の安全性及び忍容性、並びにＢＴ−０６３の投与の効果をモニターするために実験を行った。２３人のボランティアを８用量群に分け、ＢＴ−０６３を単回静脈内投与した。用量群は、以下の通りであった：０．１７５ｍｇ、０．７５ｍｇ、３．５ｍｇ、７ｍｇ、１５ｍｇ、３０ｍｇ、６０ｍｇ、及び１００ｍｇ。１００ｍｇ用量群のボランティアが２人であったことを除いて、１群当たりのボランティアは３人であった。
【０１２１】
各用量を０．９％塩化ナトリウム注射液で合計体積２０ｍＬに希釈した。２時間に亘って用量を単回連続静脈内注射した。注入後８５日間に亘ってボランティアを評価し、この期間中の複数の時点で血液を採取した。
【０１２２】
サイトカイン
採取した血漿から、ＢＴ−６３の注入前後のサイトカインＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、及びＴＮＦαの濃度を評価した。
【０１２３】
表１０は、投与前の値とスクリーニングの値とから算出したＩＬ−６、ＩＬ−８、及びＩＬ−１０の正常値上限を示す。
【表１２】
2013511994.tif 000013
【０１２４】
サイトカインの測定値から得られた更なる結果は、図１２及び１３に示す。
【０１２５】
注入後２４時間以内では、ＩＬ−６及びＩＬ−８が非用量依存的に一過的に増加したが、３日間後には投与前のレベルに戻った。この作用は、抗体ではなく注入事象に関連すると考えられる。その理由は、用量との相関がなく、また最低用量で既に前記事象が生じたためである。
【０１２６】
驚くべきことに、ＩＬ−１０が重要な調節性サイトカインであるにも関わらず、図１２に示される通り、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＴＮＦαの濃度増加は検出されなかった。また、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２の濃度が増加しないことにより、ＢＴ−０６３の投与がヘルパーＴ細胞を活性化させないことが確認される。更に、体温も炎症促進性サイトカインの大量放出の指標であるので、処理されたボランティアにおいてこのパラメータも測定した。しかし、投与後、体温の上昇は検出されなかった。
【０１２７】
図１３に示す通り、ＩＬ−１０の血漿濃度のみが、ＢＴ−０６３の投与により影響を受け、ＢＴ−０６３の用量が増加するにつれて検出される血漿ＩＬ−１０も増加する。用いたアッセイは、遊離ＩＬ−１０及びＢＴ−０６３に結合しているＩＬ−１０の両方を検出することに留意すべきである。増加の理由としては、以下の２つの可能性がある：（１）ＩＬ−１０の半減期の延長、ＩＬ−１０のＢＴ−０６３への結合がＩＬ−１０の内部移行を妨げ、同時に、血液からＩＬ−１０を排出させなくする（通常、ＩＬ−１０は速やかにターンオーバーし、分泌されたＩＬ−１０の半減期は約２．３時間〜３．５時間である（Ｈｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（１９９６）Ｊａｎ  １５：８７（２）：６９９−７０５）；及び／又は（２）ネガティブフィードバックループの誘導−ＢＴ−０６３は、ＩＬ−１０のその受容体への結合をブロックするので、ＩＬ−１０が細胞に取り込まれることができなくなり、したがって、Ｂ細胞がより多くのＩＬ−１０を産生するようになる。ＢＴ−０６３及びマウスＩＬ−１０Ｒノックアウト細胞を用いた全血培養実験から得られたインビトロにおけるデータにより確認されているので（Ｍａｈｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、未公開データ）、仮説（２）の可能性の方が高いと考えられる。
【０１２８】
薬物動態
薬物動態データは、ＢＴ−０６３のＣｍａｘ、ＡＵＣ、及び半減期が、予測される理論値の範囲内であることを示した。ＢＴ−０６３の終末半減期は、１５日間〜３０日間である。３０ｍｇ以上の用量を投与した後、８５日間後も依然としてＢＴ−０６３を血漿中で検出することが可能である。
【０１２９】
他のサイトカイン中和抗体（例えば、アダリムマブ、ヒト化抗ＴＮＦ−α）ではヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）応答がみられるという事実にも関わらず、処理したボランティアにおいてはＨＡＨＡがみられなかった。
【０１３０】
ＢＴ−０６３投与後、ＩＬ−１０の検出量は増加したが、この実験が、更に多い用量のＢＴ−０６３の安全性及び許容性を示したことに留意すべきであり、したがって、過剰のＩＬ−１０の効果を相殺するために十分な用量のＢＴ−０６３をＳＬＥ患者に安全に投与できる（具体的には、炎症促進性サイトカインレベルの許容できない上昇がない）と結論付けることができる。
【図３Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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