(57)【要約】【解決手段】本発明は、特に虚血再灌流によって引き起こされる炎症において抗炎症活性を有する、ラムノースの存在を特徴とする、高分子量の糖脂質に関する。本発明のさらなる態様は、シアノバクテリアからの該糖脂質の製造方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式(I)の糖脂質：
(G)m-(OCOR)n                  (I)
式中、
(G)mは、全サッカリド画分（total saccharidic fraction）であり；
(OCOR)nは、全脂質画分（total lipidic fraction）であり；
Gは、サッカリドであり；
Rは、12〜24個の炭素原子を含む直鎖の炭化水素鎖であり；
mは、50〜150の整数であり；および
nは、2〜5の整数であり；
ここで、Gは、少なくとも1つのラムノース単位を含む。
【請求項２】
請求項１に記載の糖脂質であって、Gが、ガラクツロン酸、マンノース、ガラクトース、グルコース、グルコサミン、キシロースおよびそれらの組み合わせよりなる群から選択される、少なくとも1つのサッカリドユニットを含む、糖脂質。
【請求項３】
請求項１に記載の糖脂質であって、(G)mが、全サッカリド画分（total saccharidic fraction）(G)m（100％）に対して、48〜54重量％のラムノース（Rha）、10〜18重量％のガラクツロン酸（GaIA）、8〜14重量％のマンノース（Man）、8〜14重量％のガラクトース（Gal）、2〜9重量％のグルコース（Glc）、2〜6重量％のグルコサミン（GLcN）、2〜6重量％のキシロース（Xyl）を含む、糖脂質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の糖脂質であって、Rが18個の炭素原子を含む直鎖の炭化水素鎖[Ｃ18]である、糖脂質。
【請求項５】
請求項４に記載の糖脂質であって、(OCO[C18])nが、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して45〜65重量％である、糖脂質。
【請求項６】
請求項４に記載の糖脂質であって、Rが16個の炭素原子を含む直鎖の炭化水素鎖[Ｃ16]である、糖脂質。
【請求項７】
請求項６に記載の糖脂質であって、(OCO[C16])nが、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して20〜45重量％である、糖脂質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の糖脂質であって、Rが14、15、17、19または20個の炭素原子を含む直鎖の炭化水素鎖[ＣΣ]であり、(OCO[CΣ])nが、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して0〜15重量％である、糖脂質。
【請求項９】
分子量が30kDaであるか30kDaより大きい、請求項１〜８のいずれかに記載の糖脂質。
【請求項１０】
請求項１の糖脂質であって：
−該糖脂質の分子量が30kDaであるか30kDaより大きく；
−(G)mが、全サッカリド画分（total saccharidic fraction）(G)m（100％）に対して、48〜54重量％のラムノース（Rha）、10〜18重量％のガラクツロン酸（GaIA）、8〜14重量％のマンノース（Man）、8〜14重量％のガラクトース（Gal）、2〜9重量％のグルコース（Glc）、2〜6重量％のグルコサミン（GLcN）、2〜6重量％のキシロース（Xyl）を含み；
−nが2であり、少なくとも1つのRは、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して45〜65重量％が[C18]であり、および／または、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して20〜45重量％が[C16]であり、Rは全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して0〜15重量％が[CΣ]である、糖脂質。
【請求項１１】
請求項１の糖脂質であって：
−該糖脂質の分子量が30kDaであるか30kDaより大きく；
−(G)mが、全サッカリド画分（total saccharidic fraction）(G)m（100％）に対して、48〜54重量％のラムノース（Rha）、10〜18重量％のガラクツロン酸（GaIA）、8〜14重量％のマンノース（Man）、8〜14重量％のガラクトース（Gal）、2〜9重量％のグルコース（Glc）、2〜6重量％のグルコサミン（GLcN）、2〜6重量％のキシロース（Xyl）を含み；
−nが3であり、少なくとも1つのRは、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して45〜65重量％が[C18]であり、および／または、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して20〜45重量％が[C16]であり、Rは全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して0〜15重量％が[CΣ]である、糖脂質。
【請求項１２】
請求項１の糖脂質であって：
−該糖脂質の分子量が30kDaであるか30kDaより大きく；
−(G)mが、全サッカリド画分（total saccharidic fraction）(G)m（100％）に対して、48〜54重量％のラムノース（Rha）、10〜18重量％のガラクツロン酸（GaIA）、8〜14重量％のマンノース（Man）、8〜14重量％のガラクトース（Gal）、2〜9重量％のグルコース（Glc）、2〜6重量％のグルコサミン（GLcN）、2〜6重量％のキシロース（Xyl）を含み；
−nが3、4または5であり、少なくとも1つのRは、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して45〜65重量％が[C18]であり、および／または、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して20〜45重量％が[C16]であり、Rは全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して0〜15重量％が[CΣ]である、糖脂質。
【請求項１３】
医薬品として使用するための、請求項１〜１２のいずれかの糖脂質。
【請求項１４】
抗炎症剤として使用するための、請求項１〜１２のいずれかの糖脂質。
【請求項１５】
虚血再灌流に関連する炎症の治療に使用するための、請求項１４に記載の糖脂質。
【請求項１６】
請求項１５に記載の糖脂質であって、該炎症が組織虚血および臓器虚血に関連する、糖脂質。
【請求項１７】
請求項１４に記載の糖脂質であって、心筋梗塞、コロナロパシー、心不全、アテローム性動脈硬化、脳虚血、心虚血、腎虚血、腸虚血、肝虚血、肺虚血、移植および多臓器不全症候群における炎症の治療に使用するための、糖脂質。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれかに記載の糖脂質の製造方法であって、以下の工程：
ａ．少なくとも1つのシアノバクテリウムの培養物を供給する工程；
ｂ．培養物から糖脂質を抽出する工程；
ｃ．工程（ｂ）からの糖脂質を沈殿させる工程；および
ｄ．工程（ｃ）からの抽出および沈殿した糖脂質を精製する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、該抽出（ｂ）が、マイクロ波で処理する工程およびその後変性溶液と混合する工程を含み、かつ、該精製（ｄ）が、陰イオン交換カラムでの溶出およびその後のカットオフが30kDaのフィルターでの濾過を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、工程（ｂ）のマイクロ波による該処理が約750Wで約1〜2分間実施され、工程（ｂ）の該変性溶液が、有機極性プロトン性溶媒系試薬、カオトロピック剤、および非プロトン性有機溶媒を含み、かつ、工程（ｄ）の該陰イオン交換カラムが塩基性交換基を有し、かつ、該溶出が重炭酸アンモニウム勾配を用いて実施される、方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法であって、少なくとも1つのシアノバクテリアの該培養物がOscillatoria sp.（No.1459/45, CCAP）を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法によって得られ、分子量が30kDaまたは30kDaより大きい、糖脂質。
【請求項２３】
請求項２２の糖脂質であって、全サッカリド画分（total saccharidic fraction）(G)m（100％）に対して30〜60重量％のラムノースを含む、糖脂質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に虚血再灌流傷害後の損傷によって引き起こされる炎症において抗炎症活性を有する、ラムノースの存在を特徴とする、高分子量の糖脂質に関する。
【０００２】
本発明のさらなる態様は、該糖脂質の製造方法である。
【背景技術】
【０００３】
虚血再灌流傷害は、心筋梗塞、冠動脈性心疾患、脳卒中および脳、心、腎、腸、肝または肺虚血および移植等の、いくつかの病態を特徴付ける。損傷は、虚血組織が一時的に血液供給を断たれたときに起き、その後の再灌流、即ち、組織におけるその後の血流の回復により、激しい免疫反応が起き、その結果、当初の虚血性傷害に関連しない臓器が損傷する可能性がある（アルムガム(Arumugam)TVら、2004年、Shock 21:401-409頁）。これは無菌性炎症過程を表し、感染に関連しないが、患部では免疫細胞の遊走、接着および活性化が認められる（S.ステフェンズ(Steffens)ら、2009年、Thromb. Haemost., 102:240-247頁；ジャン(Jang) H.R.ら、2009年、Clin Immunol., 130:41-50頁；ラクハン(Lakhan) S.E.ら、2009年、J. Transl. Med. 7: 97-107頁）。このような活性化は、免疫細胞からのいくつかの炎症誘発性メディエーターの放出に関係し、加えて、損傷組織細胞からの細胞外マトリックスの組成および構造を変える酵素の放出にも関係する。
【０００４】
ATPの細胞外放出により、免疫反応が有意に増幅され、その結果、自然免疫系の細胞によって、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン（IL-）6、IL-8およびIL-1等のサイトカインが大量に産生されることは、よく知られている。
【０００５】
ATPの細胞外放出は、局所組織だけではなく、全臓器にも不可逆的な損傷を引き起こす可能性があり、拒絶につながる臓器移植不全の根底にあることから、心筋梗塞または脳虚血等の病態の解消に支障を来すこともある。
【０００６】
加えて、虚血／再灌流（I/R）によって引き起こされる激しい炎症は、ATPの細胞外放出の結果でもあるが、時に致命的である、いわゆる「多臓器不全症候群（MODS）」を引き起こす可能性があることから、患者の病状を悪化させる恐れがある。従って、ATPの細胞外放出が引き起こす炎症誘発性ループを阻害する能力は、組織または臓器でI/Rによって誘発される強い炎症誘発性反応を特徴とする全ての病態において、根本的に重要である。
【０００７】
炎症誘発性メディエーターの産生が、虚血ストレスを受けた組織で局所的に産生された分子によって刺激される場合、特に、サイトカイン等の炎症誘発性メディエーターの放出を阻害する必要があると思われる。
【０００８】
グラム陰性菌に由来するリポポリサッカリド（LPS）の効果が、この目的のために研究されてきた。
【０００９】
I/R誘導の前の、致死未満量のリポポリサッカリドでの前処理が、動物モデルの肝臓および心臓におけるI/Rの組織損傷に対して保護効果を有する可能性が示されている（メング(Meng) Xら、1997年、Am. J. Physiol. 273:H1894-902頁）。LPSは、炎症誘発性サイトカインの産生を刺激する分子であり、I/R誘導の24時間前に投与した場合、短時間の間、I/R後の強い炎症誘発性反応に再度臓器が耐えられなくなる。
【００１０】
しかし、LPSをI/R誘導の24時間前に投与するようなアプローチは、臨床の場では現実的ではない。事実上、LPS処置は当然予防的であるべきで、従って、虚血再灌流による損傷に関連する殆どの病理に適用できず、さらに、このような処置は、細菌感染の存在下で起こる免疫活性化に似た症状を呈して、発熱や他の兆候を引き起こすことから、患者を衰弱させている。最終的には、敗血性ショックを引き起こし得る分子を含むため、死に至ることがある。
【００１１】
グラム陰性菌由来のリポポリサッカリドの効果に加えて、糖脂質RC-552およびモノホスホリルリピドA（MPLA）の心保護効果が示されている（GTエリオット(Elliot)ら、2000年、J. Mol. Cell Cardiology, 1327-39頁）。
【００１２】
これらの分子は、細菌LPSの活性部分（リピドA）に類似した構造的特徴を有するため、それらの作用メカニズムもまた、炎症誘発性反応の予防的刺激よりなる。
【００１３】
しかし、不可逆的な組織の損傷、さらには全臓器への損傷を避けるために、なおもATPの細胞外放出に作用し得る分子を特定する必要性がある。
【００１４】
このような分子は、臓器移植の拒絶を予防し、心筋梗塞または脳虚血等の疾患を解消するために有用であると思われる。
【００１５】
この特許出願の著者らは、これまで、大腸菌由来のLPS（A.マカノ(Macagno)ら、2006年、J. Exp. Med 203: 1481-92頁）、髄膜炎菌由来のLPS（K.ジェメット(Jemmett)、2008年、Infect. Immun. 76:3156-63頁）およびP.ジンジバリス菌由来のLPS（PCT/EP2009/059565）等の外因性細菌性分子によって誘導される炎症誘発性効果に拮抗し得る、ユレモ目(Oscillatoriales)のシアノバクテリア由来の糖脂質画分を発表した。
【００１６】
故に、前記の糖脂質画分は、もっぱら自然免疫系の細胞に作用する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、本発明の目的は、LPS拮抗活性能を有し、同時に、自然免疫系の細胞、および全ての他の細胞型の血漿膜上に存在するATP合成酵素に作用することによって、細胞外ATPの合成を阻害する能力がある糖脂質を特定することである。
【００１８】
このような相乗活性により、自然免疫系に属しない細胞に対しても活性のある、より強力な総合的抗炎症作用が得られる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、一般式(I)の糖脂質に関する：
(G)m-(OCOR)n                  (I)
式中、
(G)mは、全サッカリド画分（total saccharidic fraction）であり；
(OCOR)nは、全脂質画分（total lipidic fraction）であり；
Gは、サッカリドであり；
Rは、12〜24個の炭素原子を含む直鎖の炭化水素鎖であり；
mは、50〜150の整数であり；および
nは、2〜5の整数であり；
ここで、Gは、少なくとも1つのラムノース単位を含む。
【００２０】
別の態様では、本発明は、本発明の糖脂質の医薬品としての使用に関する。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、本発明による糖脂質の抗炎症剤としての使用に関する。
【００２２】
本発明の別の態様は、虚血再灌流に関連する炎症の治療のための、本発明の糖脂質に関する。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、糖脂質の製造方法であって、以下の工程：
ａ．少なくとも1つのシアノバクテリアの培養物を供給する工程；
ｂ．培養物から糖脂質を抽出する工程；
ｃ．工程（ｂ）からの糖脂質を沈殿させる工程；および
ｄ．工程（ｃ）からの抽出および沈殿した糖脂質を精製する工程
を含む、方法に関する。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法によって得ることができ、分子量が30kDaまたは30kDaより大きい、糖脂質に関する。
【００２５】
以下、添付の図面を参照して、本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図1は、本発明による式(I)の糖脂質の二次元電気泳動分析の結果を示す。
【図２】図2は、ヒト・マクロファージ細胞株において、低酸素状態によって誘発されたIL-8産生に対する、式(I)の糖脂質による阻害のグラフ表示を示す。
【図３Ａ】図3Aは、ヒト・マクロファージ細胞株において、HSP70によって誘発されたIL-6産生に対する、式(I)の糖脂質による阻害のグラフ表示を示す。
【図３Ｂ】図3Bは、ヒト・マクロファージ細胞株において、HSP70によって誘発されたTNF-α産生に対する、式(I)の糖脂質による阻害の結果のグラフ表示を示す。
【図４】図4は、C57BL/6マウスにおいて、虚血再灌流によって引き起こされた梗塞の、式(I)の糖脂質による減少のグラフ表示を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
従って、本発明は、一般式(I)の糖脂質に関する：
(G)m-(OCOR)n                  (I)
式中、
(G)mは、全サッカリド画分（total saccharidic fraction）であり；
(OCOR)nは、全脂質画分（total lipidic fraction）であり；
Gは、サッカリドであり；
Rは、12〜24個の炭素原子を含む直鎖の炭化水素鎖であり；
mは、50〜150の整数であり；および
nは、2〜5の整数であり；
ここで、Gは、少なくとも1つのラムノース単位を含む。
【００２８】
本発明では、以下の通り規定する：
−「サッカリド画分またはサッカリド」とは、50から150までのサッカリドユニットを含むポリサッカリドを言い、ここでグリコシド部分は、アミノ酸、リン酸および硫酸荷電基等のアグリコン置換基の存在を示してもよく；
【００２９】
−「糖脂質」とは、サッカリド画分および脂質画分を含む化合物(G)m-(OCOR)nを言い、ここで脂質画分は、サッカリド画分に、エステルまたはアミド結合によって共有結合し、そして、
【００３０】
−「脂質または脂肪酸画分」とは、脂肪族モノカルボン酸であり、ここで前記のモノカルボン酸は、12から24個までの炭素原子の範囲の長さの炭化水素鎖を含む。前記の脂肪酸は、炭素鎖中に二重結合が不在または存在する場合、それぞれ、飽和または不飽和であってもよく、さらに、それらは、構造中にOH基が存在する場合、ヒドロキシル化されてもよい。このような脂肪酸の例は：ラウリン酸（ドデカン）、ミリスチン酸（テトラデカン）、パルミチン酸（ヘキサデカン）、マルガリン酸（ヘプタデカン）、ステアリン酸（オクタデカン）、アラキジン酸（エイコサン）、ベヘン酸（ドコサン酸）、およびリグノセリン酸（テトラコサン）である。
【００３１】
本発明によるGおよびRの量は、それぞれ、100重量部の全(G)mおよび(OCOR)n画分（100％）に対する重量部で表す。
【００３２】
好ましい態様では、前記の糖脂質もまた、ガラクツロン酸、マンノース、ガラクトース、グルコース、グルコサミン、キシロースおよびそれらの組み合わせを含み、ここで、これらの糖は単糖であってもよく、より好ましくは複合体および／または誘導体である。
【００３３】
好ましくは、本発明による糖脂質は、(G)mが、全サッカリド画分（total saccharidic fraction）(G)m（100％）に対して、40〜60重量％のラムノース（Rha）、5〜22重量％のガラクツロン酸（GaIA）、5〜20重量％のマンノース（Man）、5〜20重量％のガラクトース（Gal）、1〜15重量％のグルコース（Glc）、1〜15重量％のグルコサミン（GLcN）、1〜15重量％のキシロース（Xyl）を含む。
【００３４】
より好ましくは、本発明による糖脂質は、(G)mが、全サッカリド画分（total saccharidic fraction）(G)m（100％）に対して、48〜54重量％のラムノース（Rha）、10〜18重量％のガラクツロン酸（GaIA）、8〜14重量％のマンノース（Man）、8〜14重量％のガラクトース（Gal）、2〜9重量％のグルコース（Glc）、2〜6重量％のグルコサミン（GLcN）、2〜6重量％のキシロース（Xyl）を含む。
【００３５】
より好ましくは、本発明による糖脂質は、(G)mが、ラムノース50.8 ± 0.6%、ガラクツロン酸13.5% ± 2.4、キシロース3.7% ± 0.5、マンノース10.5% ± 1、ガラクトース11.1% ± 0.8、グルコース5.4% ± 2、グルコサミン4.3% ± 0.7を含む（データは平均±標準偏差として表す）。
【００３６】
サッカリド残基の定性および定量分析は、糖脂質混合物をメタノールおよび塩酸（HCl 1M/MeOH）と80℃で20時間加水分解し、ヘキサンで抽出し、ピリジンおよび無水酢酸を用いたアセチル化の後に、アセチル化メチルグリコシドのGC-MSによって、および／または、2Mトリフルオロ酢酸を用いて120℃で1時間処理し、1時間ホウ素化水素ナトリウム処理を行い、その後ピリジンおよび無水酢酸でアセチル化した後に得られるアルジトールアセテートを分析することによって、実施し得る。
【００３７】
好ましくは、Rは、18個の炭素原子を含む直鎖の炭化水素鎖[Ｃ18]である。
【００３８】
好ましい態様では、(OCOR)nは、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）の45〜65重量％を構成する。
【００３９】
好ましくは、Rは、16個の炭素原子を含む直鎖の炭化水素鎖[Ｃ16]である。
【００４０】
好ましい態様では、(OCOR)nは、全脂質画分（total lipidic fraction）（100％）の20〜45重量％を構成する。
【００４１】
好ましくは、Rが14、15、17、19または20個の炭素原子を含む直鎖の炭化水素鎖[ＣΣ]である場合、(OCOR)nは、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）の0〜15重量％を構成する。
【００４２】
より好ましい態様では、脂肪酸の組成物は：C18:0 55% ± 7.5; C16:0+C16:3OH 34.9% ± 5.1; C15:3OH 7.6% ± 4.1; C20:0 1.7%±1.7を含む（データは、3つの独立したサンプルの平均±標準偏差を表す）。
【００４３】
糖脂質の元素分析により、炭素41％、酸素48.5％、水素6.5％、窒素4％が存在することが示された。
【００４４】
好ましくは、本発明による糖脂質は、Rが直鎖の水酸化炭化水素鎖および／または直鎖の飽和炭化水素鎖である。
【００４５】
脂肪酸の分析は、化合物をメタノールおよび塩酸（HCl 1M/MeOH）で80℃で20時間加水分解し、ヘキサン相中メチルエステルとして抽出した後、GC-MSによって実施し得るが、これは実施例2でより詳細に記載される。
【００４６】
好ましくは、本発明による糖脂質は、分子量が30kDaであるか30kDaより小さい。より好ましくは、糖脂質は、分子量が30〜45kDaであり、より好ましくは分子量が約33kDaであり、ラムノースを含む。
【００４７】
特に好ましいものは、本発明による糖脂質であって：
−前記の糖脂質の分子量が30kDaであるか30kDaより大きく；
−(G)mが、全サッカリド画分（total saccharidic fraction）(G)m（100％）に対して、48〜54重量％のラムノース（Rha）、10〜18重量％のガラクツロン酸（GaIA）、8〜14重量％のマンノース（Man）、8〜14重量％のガラクトース（Gal）、2〜9重量％のグルコース（Glc）、2〜6重量％のグルコサミン（GLcN）、2〜6重量％のキシロース（Xyl）を含み；
−nが2であり、少なくとも1つのRが、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して45〜65重量％の量の[C18]であり、および／または、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して20〜45重量％の量の[C16]であり、Rが全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して0〜15重量％の量の[CΣ]である、糖脂質である。
【００４８】
特に好ましいものは、本発明による糖脂質であって：
−前記の糖脂質の分子量が30kDaであるか30kDaより大きく；
−(G)mが、全サッカリド画分（total saccharidic fraction）(G)m（100％）に対して、48〜54重量％のラムノース（Rha）、10〜18重量％のガラクツロン酸（GaIA）、8〜14重量％のマンノース（Man）、8〜14重量％のガラクトース（Gal）、2〜9重量％のグルコース（Glc）、2〜6重量％のグルコサミン（GLcN）、2〜6重量％のキシロース（Xyl）を含み；
−nが3、4または5であり、少なくとも1つのRが、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して45〜65重量％の量の[C18]であり、および／または、全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して20〜45重量％の量の[C16]であり、Rが全脂質画分（total lipidic fraction）(OCOR)n（100％）に対して0〜15重量％の量の[CΣ]である、糖脂質である。
【００４９】
別の態様では、本発明は、本発明の糖脂質の医薬品としての使用に関する。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、本発明による糖脂質の抗炎症剤としての使用に関する。
【００５１】
さらに別の態様では、本発明は、本発明による糖脂質の、虚血再灌流に関連する炎症を治療するための使用に関する。
【００５２】
該糖脂質は純度の程度が高く、その純度は少なくとも90％であり、好ましくは少なくとも95％であり、虚血再灌流傷害による損傷の結果としての臓器自身によって産生される分子によって生じた炎症誘発性反応を不活化する能力がある。
【００５３】
本発明は、有効成分として式Iの糖脂質、および薬理学的に許容される担体を有する、医薬組成物に関する。
【００５４】
糖脂質の総水溶性により、特に液体製剤に関して、当分野の技術者に知られている水性賦形剤および希釈剤を用いた医薬組成物に糖脂質を使用することが可能になる。
【００５５】
組成物中に適宜処方された糖脂質は、炎症が虚血再灌流傷害によって引き起こされた損傷の結果である場合、抗炎症作用を有するが、これは、前記の糖脂質が、ATP等の虚血再灌流の過程の間に形成される分子によって誘導される、炎症誘発性反応を阻害するためである。
【００５６】
式Iの糖脂質は、心筋梗塞、冠動脈疾患、心停止、アテローム性動脈硬化、脳卒中、脳、心、腎、腸、肝または肺虚血、移植およびMODSの症例のような、組織または臓器における虚血イベントに関連する炎症に、特に有用である。
【００５７】
好ましくは、前記の炎症は、組織または臓器における虚血イベントに関連し、より好ましくは、心筋梗塞、冠動脈疾患、心停止、アテローム性動脈硬化、脳卒中、脳虚血、心虚血、腎虚血、腸虚血、肝虚血、肺虚血、移植、多臓器不全症候群における炎症の治療における、虚血イベントに関する。
【００５８】
好ましくは、本発明は、本発明による糖脂質の製造方法であって、以下の工程：
ａ．少なくとも1つのシアノバクテリアの培養物を供給する工程；
ｂ．培養物から糖脂質を抽出する工程；
ｃ．工程（ｂ）からの糖脂質を沈殿させる工程；および
ｄ．工程（ｃ）からの抽出および沈殿した糖脂質を精製する工程
を含む、方法に関する。
【００５９】
より好ましくは、本発明は、前記の抽出（ｂ）が、マイクロ波処理の工程およびその後変性溶液と混合する工程を含み、かつ、前記の精製（ｄ）が、陰イオン交換カラムからの溶出およびその後のカットオフが30kDaのフィルターでの濾過を含む、方法に関する。
【００６０】
さらにより好ましいものは、工程（ｂ）の前記のマイクロ波処理が、約750Wで約1〜2分間実施され、工程（ｂ）の前記の変性溶液が、極性プロトン性有機溶媒系の試薬、カオトロピック剤、および非プロトン性有機溶媒を含み、かつ、工程（ｄ）の前記の陰イオン交換カラムが塩基性交換基を含み、かつ、前記の溶出が、重炭酸アンモニウム勾配を用いて実施される、方法である。
【００６１】
好ましくは、少なくとも1つのシアノバクテリアの前記の培養物は、Oscillatoria sp.（No.1459/45, CCAP 藻類原生動物カルチャーコレクション(Culture Collection of Algae and Protozoa)、SAMSリサーチサービス社(SAMS Research Services Ltd.)、ダンスタッフネージ海洋研究所(Dunstaffnage Marine Laboratory)、ダンベック(Dunbeg)、アーガイル、PA37 1QA、英国）を含む。
【００６２】
本発明の方法の好ましい態様では、前記の方法は以下の工程を含む：
増殖の定常期に達した後、シアノバクテリア培養物を、例えば遠心分離により堆積させ（ペレット化）；堆積物（またはボトムまたはペレット）を、抽出前に凍結乾燥し得る工程。
【００６３】
続いて、凍結乾燥したシアノバクテリアを：
ａ）好ましくは乾燥生物量1 g当たり20〜50 mlの容量の、25 mM Tris-HCl pH 7.5、デオキシコール酸塩（0.5％）およびEDTA（5 mM）を含有する水溶液中に再水和し；
【００６４】
ｂ）糖脂質の抽出過程を加速するため、750Wで1〜2分間、マイクロ波処理し；
【００６５】
ｃ）好ましくは8000〜10000xgで遠心分離して、細胞残屑のペレットを除去し、糖脂質を含有する上澄を回収し；
【００６６】
ｄ）このように得られた抽出物（上澄）を、上述の通り、変性剤よりなる好適な容量の溶液と混合するが、この溶液は、例えばチョムクツィンスキー(Chomczynski) P.およびマッケイ(Mackey)が記載した通り（バイオテクニクス(BioTechniques)、1995年、19:942-5頁）、好ましくはフェノールであるプロトン性極性有機溶媒系試薬、および、例えばTri試薬（シグマカタログ番号T3934）または類似の試薬であるトリゾール(TrizolR)（インビトロゲン(Invitrogen)）等のカオトロピック剤（チオシアン酸グアニジウム等）、および、例えばクロロホルムまたは1-ブロモ-3-クロロプロパン等の非プロトン性有機溶媒を好ましくは含み、約1容量のシアノバクテリア上澄、1〜2容量、好ましくは約1容量の抽出溶液、および約0.5〜1容量のクロロホルム（または1-ブロモ-3-クロロプロパン）の割合であり、これはより優れた糖脂質の精製を達成するためであり、特に光合成色素および付随タンパク質よりなる複合体の除去に好都合であり；
【００６７】
ｅ）抽出物を室温で少なくとも5分間、より好ましくは少なくとも10分、かつ60分未満の期間、インキュベートし；
【００６８】
ｆ）好ましくは約8000xgで遠心分離し、極性糖脂質を含有する上澄（水相）を回収するが、これは、例えば電気泳動および銀染色またはPro-Qエメラルド300による染色によって測定することができ；
【００６９】
ｇ）例えば酢酸ナトリウム（最終5〜20 mM）または塩化マグネシウム（150 mM）である塩、および約2容量の好ましくはアセトンまたはエタノールである有機溶媒を加え、4℃で少なくとも2時間、好ましくは一晩、インキュベートすることによって、水相中に存在する糖脂質を沈殿させ；
【００７０】
ｈ）上記の条件下で遠心分離し、ペレットを回収し、水中に再懸濁し；
【００７１】
ｉ）強アニオン交換カラム（塩基性交換基：第四級アンモニウム）、例えばQ75X（サルトリウス(Sartorius)）を通し、重炭酸アンモニウム勾配を用いて溶出し、糖脂質を含有する、800 mMの重炭酸アンモニウムで溶出される分画を回収し；
【００７２】
ｊ）このように得られた分画を、カットオフが30KDaのフィルターを使用して水洗することを繰り返し、糖脂質分子（分子量が30KDaより大きいため、フィルターを通過しない）を高純度で回収し、例えばブラッドフォード法でタンパク質混濁の存在を、および260 nmでの分光光度測定値で核酸の混濁の存在を測定することによって評価する。
【００７３】
いずれの理論にも拘泥しないが、該方法により、マイクロ波処理の間に変性剤および界面活性剤が組み合わせて存在することによって、シアノバクテリア細胞壁の構造を動かし、そのような構造から親水性成分および高分子複合体を抽出することが可能になり、一方、粗細胞分画が（遠心分離により）除去される。さらに、水溶液中で再水和された細胞にマイクロ波を使用することは、細胞から溶液への糖脂質分子の放出に非常に好都合であり、放出は加速されて、生成物の最終収率が上がる。マイクロ波処理で得られる糖脂質サンプルは、この処理を行わずに得られたサンプルよりも、グルコースを含有する混濁物である細胞外ポリサッカリドの量も少ない。事実、マイクロ波処理を行ったサンプル中のグルコース含量（全サッカリド成分に対して）は5.4％であったことと比較して、この処理を行わなかったサンプルでは＞10％であったことから、この処理は生成物の最終純度において重要な役割を有する。このように得られた水性上澄に含有される糖脂質は、有機溶媒とカオトロピック剤を用いて分配することによって精製する。この方法は、フェノール相中に分配される光合成色素および付随タンパク質を除去するために行う。この方法には、その後、イオン交換カラムを通過させ、重炭酸アンモニウム勾配を用いて溶出することが含まれる。活性成分を含有する溶出物は、分子量カットオフが30KDaのフィルター上に位置し、遠心分離して、水洗を繰り返す。カットオフ限界未満の全ての物質は除去され、一方、糖脂質のみがフィルター上に残る。
【００７４】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法を通して得ることができる糖脂質であって、分子量が30kDaであるか30kDaより大きい糖脂質に関する。
【００７５】
本発明による方法によって得られる糖脂質は、驚くべきことに純度が高く、その純度は少なくとも90％であり、好ましくは少なくとも95％であり、虚血再灌流傷害による損傷の結果として臓器自身が産生する分子によって生ずる、炎症誘発性反応を不活化する能力がある。
【００７６】
驚くべきことに、マイクロ波処理は、細胞から溶液への糖脂質分子の放出に非常に好都合であり、放出を加速し、生成物の最終収率を上げる。また、マイクロ波処理を含む本発明による方法によって得られる糖脂質サンプルは、この処理を行わずに得られたサンプルよりも、グルコースを含有する細胞外ポリサッカリド混濁物の量が予想外に少ない。事実、マイクロ波処理を行ったサンプル中のグルコース含量（全サッカリド成分に対して）は5.4％であったことと比較して、この処理を行わなかったサンプルでは＞10％であったことから、この処理は生成物の最終純度において重要な役割を有する。
【００７７】
より好ましくは、本発明の方法によって得られる糖脂質は、全サッカリド成分(G)m（100％）に対して30〜60重量％のラムノースを含有する。
【実施例】
【００７８】
実施例１
シアノバクテリアからの式Iの糖脂質の調製
シアノバクテリア、Oscillatoria sp.、CCAPリポジトリ番号1459/45（2008年7月9日、英国スコットランドの藻類原生動物カルチャーコレクション(Culture Collection of Algae and Protozoa)センターで製造）を、培地BG11（シアノバクテリアBG11新鮮水溶液、カタログ番号C3061、シグマアルドリッチ(Sigma Aldrich)）より遠心分離によって回収し、凍結乾燥した。その後、Tris-HCl pH 7.5（25 mM）、デオキシコール酸塩（0.5％）およびEDTA（5 mM）を含有する水溶液で、生物量1 g当たり30 mlの割合で再水和し、2分間750Wのマイクロ波中に置いた。その後、懸濁液を9000xgで20分間遠心分離し、糖脂質を含有する上澄を回収し、1容量のカオトロピック溶液（TRI試薬、シグマ(Sigma)）および1/2容量のクロロホルムと共に室温で10分間インキュベートした。8000xgで10分間遠心分離した後、水性上澄を回収し、その後、酢酸ナトリウム（10 mM）および2容量のアセトンの存在下、4℃で一晩インキュベートした。8000xgで15分間遠心分離した後、糖脂質を含有するペレットを乾燥し、その後、水中に再懸濁した。
【００７９】
次に、活性成分の精製を、アニオン交換クロマトグラフィー（サルトリウス(Sartorius)）および重炭酸アンモニウムを用いた勾配溶出によって実施した。糖脂質を800 mM重炭酸アンモニウムで溶出し、その後、30KDaの分子量カットオフのフィルター上に置き、MilliQ水で洗浄し、その後遠心分離した。フィルターの上部に水を加えて生成物を回収した後、凍結乾燥した。その後、後の化学的および生物学的試験のため、サンプルを水または生理食塩水に再懸濁した。
【００８０】
シアノバクテリアは、培地中で生長し得るが、培地は例えばBG-11（シグマ-アルドリッチ(Sigma-Aldrich)、カタログ番号C3061）よりなり、25℃〜27℃の温度で、24時間の連続光下、100 μmol m-2秒-1の光子強度の白色光(cool white light)の存在下で生長し得る。
【００８１】
実施例２
ガスクロマトグラフィーおよび質量分析技術による糖脂質の化学分析（GC-MSまたはガスクロマトグラフィー-質量分析）
実施例１に記載した通り抽出および精製した糖脂質は、特徴として、ブラッドフォード法によって検出されるタンパク質混濁が少なく（1%未満）、スペクトル分析で定量される通り核酸の混濁が3%未満である。
【００８２】
サッカリド残基の定性および定量分析は、アセチル化メチルグリコシドおよびアルジトールアセテートのGC-MSによって実施し、同様に、脂肪酸は、クロマトグラフのピークの保持時間解析および質量分析のフラグメンテーション解析を行うGC-MSによって、メチルエステルとして検出した。
【００８３】
方法：
詳しくは、サンプルの一定分量（1 mg）をメタノールおよび塩酸（HCl 1M/MeOH）で80℃で20時間処理した後、乾燥し、ヘキサンで抽出したところ、ヘキサン相は脂肪酸をメチルエステルとして含有し、一方メタノール相はO-メチルグリコシドを含有する。
【００８４】
アセチル化メチルグリコシドは、以下の通り調製した：メタノール相を空気流で乾燥し、50 μlのピリジンおよび50 μlの無水酢酸で100℃で30分間アセチル化した。混合物を乾燥し、CHCl3に溶解し、サンプルを精製するため水で数回抽出した後、回収して乾燥した。
【００８５】
アルジトールアセテートについては、同一量のサンプルを2Mトリフルオロ酢酸で120℃で1時間処理した。酸を乾燥した後、サンプルを水中に取り、スパチュラの先端部程の水素化ホウ酸ナトリウムで1時間処理した。過剰な水素化物は酢酸で破壊し、溶液をメタノールおよび酢酸で数回乾燥した。最後に、アセチル化メチルグリコシドについて、アセチル化を実施した。アセチル化メチルグリコシドおよびアルジトールアセテートの両者をGC-MSで分析した。
【００８６】
アセチル化メチルグリコシドおよびアルジトールアセテートの分析結果は、各誘導体化モノサッカリドが独自の保持時間を示す、クロマトグラムに見ることができ、各モノサッカリドの特徴的マススペクトルは各ピークに関連する。ピーク下面積は、混合物中に存在するモノサッカリドの量に比例する。アルジトールアセテートの分析により、検出されたモノサッカリドの構成を確認および完成することができ、この分析は各モノサッカリドに特徴的なシグナルを与えるという付加的利点を有する。
【００８７】
3つの独立したサンプルの分析から、以下のサッカリドが検出された（データは、平均±標準偏差として表す）：
ラムノース50.8 ± 0.6%、ガラクツロン酸13.5% ± 2.4、キシロース3.7% ± 0.5、マンノース10.5% ± 1、ガラクトース11.1% ± 0.8、グルコース5.4% ± 2；グルコサミン4.3% ± 0.7。
【００８８】
メチルグリコシドから分離するため、化合物を塩酸およびメタノールで処理し、ヘキサン抽出して、その後に得られた脂質をGC-MSで分析し、以下の脂肪酸組成を得た（データは、3つの独立したサンプルの平均±標準偏差を表す）：
C18:0 55% ± 7.5; C16:0+C16:3OH 34.9% ± 5.1; C15:3OH 7.6% ± 4.1; C20:0 1.7%±1.7
【００８９】
糖脂質について実施した元素分析により、炭素41％、酸素48.5％、水素6.5％、窒素4％の存在が明らかになった。
【００９０】
糖脂質の分子量
10％ Bis-Tris Novex NuPAGEゲル（インビトロジェン(Invitrogen)）中、pH勾配二次元電気泳動および分子量分離を行い、その後、LPS等の極性糖脂質構造に特異的なPro-Qエメラルド300（インビトロジェン、分子プローブ、カタログ番号P20495）により染色することによって、サンプル（5 μg負荷）が、分子量が30KDよりわずかに大きく、等電点が酸性pHである単一のスポットに移動することが示された（図1）。
【００９１】
糖脂質は水溶性であり、溶液は透明、無色、無臭、無味である。化合物は、5分間沸騰後または1回の凍結融解サイクルの後、安定である。
【００９２】
実施例３：
ヒトマクロファージの低酸素処理によって誘導されたIL-8産生に対する、式Iの糖脂質による阻害。
虚血の間、組織に低酸素濃度による低酸素負荷をかける。マクロファージは、組織における細胞壊死の程度に比例して虚血領域に蓄積し、それらの活性化は、IL-8、IL-6、TNF-α等の一連の炎症誘発性メディエーターの放出に関連するが、これらは、その後の再灌流相の間、損傷部位に多形核白血球および単核白血球を集める働きをし、それにより炎症反応を増幅する。低酸素環境中で細胞を直接的にインキュベートすることによって、インビトロで、マクロファージ活性化に対する低酸素濃度の効果を再現することが可能である。マクロファージを24時間低酸素処理することによって、培地中へのIL-8の放出が誘導され、一方でIL-8値は、式Iの糖脂質の存在下で有意に阻害される。
【００９３】
実施例１に記載した通り調製した式Iの糖脂質をインビトロで使用して、低酸素条件で24時間インキュベートしたマクロファージによるIL-8産生に対する効果を研究した。THP1ヒト単球細胞株（T.オダ(Oda)ら、2006年、Am J. Physiol. Cell Physiol.291:104-113頁）を、5x10-8Mのホルボールミリスチン酸アセテート（PMA）で48時間処理した後、低酸素処理の前に他の刺激を与えずに24時間インキュベートすることによって、インビトロで分化させた（96穴培養プレートで1x105細胞/ウェル）。次に、細胞を糖脂質（20 ug/ml）と共に、または糖脂質を用いずにインキュベートし、37℃、5% CO2の酸素正常状態に置くか（対照）、または、酸素濃度1%未満で培養物のインキュベートを可能にするアンアエロゲン・バッグ(AnaeroGen bag)（オキソイド(Oxoid)、英国）を用いて、37℃で低酸素条件下に置いた。24時間後に上澄を回収し、IL-8の濃度の定量的評価を行った。IL-8は、ELISA（ダイアクロン(Diaclone)、ヒトIL-8カタログ番号851530001）によって評価し、結果から、シアノバクテリアの糖脂質の存在下および非存在下のいずれの場合でも、酸素正常状態で、IL-8の産生がゼロに近かったことが示された。低酸素処理によりIL-8値が上がるが、これは、培養物中に式Iの糖脂質が存在する場合には有意に阻害される（図2。データは3回の実験の平均±標準偏差を表す）。
【００９４】
従って、虚血に関連する全体的な炎症誘発性反応を低下させる際に、糖脂質による処理が非常に重要であることが明らかである。
【００９５】
実施例４
熱ショックタンパク質（HSP）70によって誘導されるヒトマクロファージにおける炎症誘発性サイトカインIL-6およびTNF-α産生に対する、糖脂質による阻害。
上述の通り分化させたTHP1ヒト単球細胞株を、20 μg/mlの濃度の式Iの糖脂質の存在下または非存在下、10 ug/mlの組み換えHSP70（ストレスゲン(Stressgen)、低エンドトキシン組み換えタンパク質値、カタログ番号ESP-555）で刺激した。培養物を5％のCO2中37℃で18時間インキュベートし、その後上澄を回収してIL-6およびTNF-αの濃度を評価した（図3A、3B）。サイトカインは、ELISA法（ダイアクローン(Diaclone)、ヒトIL-6カタログ番号851,520,005、ヒトTNF-αカタログ番号851570005）によって分析した。結果（平均±SD）から、図3Aに示す通り、式Iの糖脂質がIL-6産生を阻害することが示され、図3Bに示す通り、TNF-α産生を阻害することが示された。
【００９６】
実施例５
式Iの糖脂質の、インビボでの耐容量の評価
インビボでの心臓I/R傷害に対する実験を進める前に、予備実験を実施して、式Iの糖脂質の非毒性範囲を評価し、注射液のあらゆる潜在的降圧効果を排除した。これらの実験は、ラットにおいて、化合物を生理食塩水中、75 mg/kgまでの投与量を静注することにより実施した。結果から、75 mg/kgの投与量は全く非毒性であり、良好な耐溶性を示し、循環器系に対して降圧効果がないことが示された。
【００９７】
実施例６
冠動脈結紮による急性心筋梗塞およびその後の再灌流（I/R）を施したマウスにおける、インビボでの式Iの糖脂質の抗炎症活性の評価。
M.サリオ(Salio)ら、Circulation, 117:1055-1064, 2008年に記載された通り、C57BL/6マウスにおいて急性心筋梗塞の誘発を行った。動物を対照群と処置群の2群に分け、処置群には、PBSに溶解した式Iの糖脂質を、I/Rの30分前に10 mg/kgの投与量で腹腔内投与し、その後再灌流時に5 mg/kgを静注した。対照群は同様にPBSのみで処置した。
【００９８】
動物を麻酔し（シグマ・アルドリッチ(Sigma Aldrich)、アバチン(Avertin)、250 mg/kg、腹腔内）、その後、22Gのカニューレを挿入して換気を行い、体温は常に37±2℃に保った。次に、第四肋間で開胸して心臓を露出し、冠動脈左前枝を縫合糸で一時的に閉じて、閉塞を作った。虚血の45分後に止血帯を除いた。その後、気胸が減少し、動物は回復することができた。ブプレノルフィン（0.1 mg/kg、皮下、12時間間隔、1日）で術後鎮痛法を実施し、術後、アンピシリン（150 mg/kg）を投与した。マウスは、虚血の誘発から24時間後に屠殺した。
【００９９】
梗塞範囲を測定するため、エバンスブルー色素を下大静脈に注入し、左右の心室を分離した。その後、左心室を横に切開し、1mm厚の薄片とし、塩化テトラゾリウム（TTC、シグマ・アルドリッチ(Sigma Aldrich)）を含む溶液（PBS）中でインキュベート（37℃で20分間）した後、4％ホルマリンに移し、一晩インキュベートして画像解析した（アナリティカル・イメージング・ステーション(Analytical Imaging Station)、Ver.3.0、イメージング・リサーチ(Imaging Reseach)、カナダ・オンタリオ州セントキャサリンズ）。既に虚血にさらされた非梗塞範囲（危険領域、AAR）は赤色を呈し、一方、梗塞組織（I）は白色を呈する。危険領域の拡張は、対照動物および式Iの糖脂質で処置した動物において同程度であった。結果から、式Iの糖脂質での処置により、危険領域内の梗塞範囲（I/AAR）が有意に減少し、対照と比較して（図4）、平均25％減少したことが示された（実験は、対照動物10匹および式Iの糖脂質で処置した動物10匹を用いて行った）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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