(57)【要約】  本発明によれば、ウィルス感染に対するワクチンが提供される。上記ワクチンは、例えば、ウィルスワクチン株のウィルス抗原を含む。上記ウィルス抗原は、ウィルスワクチン株のウィルス調製物に由来する。上記ウィルスワクチン株のウィルス調製物は、感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションを含む。上記感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションは、ウィルス調製物のウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量に対する割合で表される。上記ワクチン株とは異なるウィルス株に対して、前記ワクチンが少なくとも部分的なサブタイプ間又はサブタイプ内の交差免疫応答をもたらすように、上記ウィルス調製物のウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量に対する感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合は、事前に定義された閾値を超える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンであって、
ウィルスワクチン株由来のウィルス抗原を含み、
前記ウィルス抗原は、ウィルスワクチン株のウィルス調製物に由来し、
前記ウィルスワクチン株のウィルス調製物は、感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションを含み、
前記感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションは、前記ウィルス調製物のウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量に対する割合で表され、
前記ウィルス調製物のウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量に対する感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合は、事前に定義された閾値を超えており、
前記ワクチン株とは異なるウィルス株に対して、少なくとも部分的なサブタイプ間又はサブタイプ内の交差免疫応答をもたらす、
ワクチン。
【請求項２】
前記ウィルスは、ヒト又は動物に感染できる、請求項1に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ウィルスは、インフルエンザウィルス、HIV、DENV、又はFMDVである、請求項2に記載のワクチン。
【請求項４】
前記ウィルス抗原は、前記ウィルスの表面抗原である、請求項1に記載のワクチン。
【請求項５】
前記ウィルス調製物は、細胞培養物、もしくは孵化鶏卵、又はウィルスの増殖を可能にする適切な宿主から得られる、請求項1に記載のワクチン。
【請求項６】
前記ウィルス調製物中の感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションは、プラーク形成単位試験（PFU）、組織培養感染量（TCID 50）、卵感染量（EID50）、及び致死量（LD50）を含むウィルス感染試験によって測定され、
前記ウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量は、血球凝集試験、ELISA、ウエスタンブロット、総蛋白質試験を含むウィルス総計試験によって測定される、
請求項1に記載のワクチン。
【請求項７】
前記感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合の事前に定義された閾値は、
(a)異なる感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合を有するウィルス調製物のセットを準備する工程、
(b)前記ウィルス調製物のセット由来のウィルス抗原を有するワクチンを調製する工程、
(c)調製したワクチンで適切な宿主を免疫する工程、
(d)ウィルスのチャレンジ株を用いて、免疫した宿主にチャレンジする工程、
(e)チャレンジ結果を分析する工程、
によって定義され、
前記(d)のチャレンジ株は、前記ウィルスワクチン株とは異なるものであり、
前記事前に定義された閾値は、所望の免疫によってもたらされたウィルス調製物の割合値として定義される、
請求項1に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ウィルス抗原は、精製ウィルス表面抗原、ウィルス由来のスプリット、ウィルスのウイロゾーム、又は不活化全粒子ワクチンを含む、請求項1に記載のワクチン。
【請求項９】
ワクチンの生産方法であって、
(f)ウィルスワクチン株のウィルス調製物を準備する工程、
(g)前記ウィルス調製物からウィルス抗原を得る工程、及び
(h)前記ウィルス抗原と、ワクチンを作るために生理的に許容可能なアジュバントとを混合する工程、
を含み、
前記(f)のウィルスワクチン株のウィルス調製物は、感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションを含み、
前記感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションは、ウィルス調製物のウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量に対する割合で表され、
前記ウィルス調製物のウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量に対する感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合は、事前に定義された閾値を超えており、
前記ワクチンは、前記ワクチン株とは異なるウィルス株に対して、少なくとも部分的なサブタイプ間又はサブタイプ内の交差免疫応答をもたらす、
生産方法。
【請求項１０】
前記ウィルスは、ヒト又は動物に感染できる、請求項9に記載の生産方法。
【請求項１１】
前記ウィルスは、インフルエンザウィルス、HIV、DENV、又はFMDVである、請求項10に記載の生産方法。
【請求項１２】
前記ウィルス抗原は、ウィルスの表面抗原である、請求項9に記載の生産方法。
【請求項１３】
前記ウィルス調製物は、細胞培養物、もしくは孵化鶏卵、又はウィルスの増殖を可能にする適切な宿主から得られる、請求項9に記載の生産方法。
【請求項１４】
前記ウィルス調製物中の感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションは、プラーク形成単位試験（PFU）、組織培養感染量（TCID 50）、卵感染量（EID50）、及び致死量（LD50）を含むウィルス感染試験によって測定され、
前記ウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量は、血球凝集試験、ELISA、ウエスタンブロット、総蛋白質試験を含むウィルス総計試験によって測定される、
請求項9に記載の生産方法。
【請求項１５】
前記感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合の事前に定義された閾値は、
(a)異なる感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合を有するウィルス調製物のセットを準備する工程、
(b)前記ウィルス調製物のセット由来のウィルス抗原を有するワクチンを調製する工程、
(c)調製したワクチンで適切な宿主を免疫する工程、
(d)ウィルスのチャレンジ株を用いて、免疫した宿主にチャレンジする工程、
(e)チャレンジ結果を分析する工程、
によって定義され、
前記(f)のチャレンジ株は、前記ウィルスワクチン株とは異なるものであり、
前記事前に定義された閾値は、所望の免疫によってもたらされたウィルス調製物の割合値として定義される、
請求項9に記載の生産方法。
【請求項１６】
前記ウィルス抗原は、精製ウィルス表面抗原、ウィルス由来のスプリット、ウィルスのウイロゾーム、又は不活化全粒子ワクチンを含む、請求項9に記載の生産方法。
【請求項１７】
被検体への免疫のための請求項1に記載のワクチンの使用であって、前記ワクチンはウィルス感染を予防又は治療する、使用。
【請求項１８】
請求項17に記載の使用であって、前記被検体は、ヒト又は動物である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豊富な感染性粒子のサブポピュレーションを有するウィルス調製物由来のウィルス抗原を含むウィルスワクチンと、さらにその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願番号61/408,575（2010年10月30日出願。タイトルは「ウィルスワクチン及び組成物並びにそれらの調製方法」。）の優先権を主張するものである。また、その開示内容の全てを本明細書に援用する。
【０００３】
感染性の強いウィルス（例えば、ヒト免疫不全ウィルス（HIV）、インフルエンザウィルス、デング熱ウィルス（DENV）、及びウィルス口蹄疫ウィルス（FMDV））は、依然としてヒトや動物に対して深刻な結果を引き起こしている。ワクチンは、ウィルス感染の予防及び治療のための最も効果的かつ経済的な手段と考えられる。
残念なことに、HIV、インフルエンザウィルス、DENV、FMDVのようなウィルスは多くの血清型（即ち、サブタイプ）を有し、且つ急激な抗原変化を受ける。このことは、サブタイプ間（inter-subtypic）及び／又はサブタイプ内（intra-subtypic）の交差防御のために効果的なワクチンを製造する上で重要な課題となる。
【０００４】
インフルエンザAウィルスは前世紀のインフルエンザの主なパンデミックの原因であり、また毎年発生するエピデミックインフルエンザのほとんどの原因物質である。WHOはエピデミックインフルエンザが毎年世界人口の5〜15%に影響を与えており、年間の最大300万?500万例の重症疾患、及び50万人の死亡の原因になっていると見積もっている（WHO Influenza Fact sheet 211. World Health Organisation, Geneva, Switzerland (2003).）。
【０００５】
インフルエンザAウィルスはオルトミクソウィルスファミリーに属し、ヒト、馬、犬、鳥、及びブタを含む、広範な宿主域を有している。インフルエンザAウィルスはエンベロープに包まれており、少なくとも10個のウィルス蛋白質をコードする8個のRNAセグメント（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、及びNSと略される）のセットを有するマイナス鎖RNAウィルスである。HAセグメントは、ヘマグルチニン（HA） 蛋白質をコードする。NAセグメントは、ノイラミニダーゼ（NA）をコードする。血清学的分類に基づいて、16個のHAサブタイプ（H1〜H16と称す）と9個のNAサブタイプ（N1〜N9と称す）が、これまでに同定されている。現在、世界的に人々の間で循環しているインフルエンザAのサブタイプは、H1N1、H1N2、及びH3N2ウィルスを含む。H5N1及びH9N2は鳥（例えば、ニワトリ）において循環している。H1N1及びH3N2はブタにおいて循環している。
【０００６】
現在の不活化インフルエンザワクチンは3価であり、2つのインフルエンザA（H1N1、及びH3N2）サブタイプの15干g HA、及び1つのインフルエンザB株を含む。基本的な技術やワクチン製造の原理は、1940年代の臨床用途への最初の導入以来、ほとんど同じ状態を維持している。従来の常識は、HA蛋白質を最大限の量有する従来のウィルス調製物を製造するための製造手順の最適化に焦点を当てている。加えて、インフルエンザワクチンはもっぱらHA量に基づいて標準化されている。
【０００７】
循環するウィルスとワクチンのために選択されたウィルス間での抗原関連性による、ワクチンの有効性の減少は、同じサブタイプの中でより起こり難くになる。
インフルエンザワクチンにおいて、毎年の季節性ワクチンに含まれる3種のウィルスの株の選択は、現在WHOで年2回行われている。選択された株は、たいてい循環株に抗原的に近いが、いくつかの年では近くならない。従って、幅広い防御免疫を生成するワクチンを持っている必要がある。 
【０００８】
HIV-1に関しては、3300万人の感染者（HIV-1類似種の実質的な集団を保有する）がすでに存在している。これは、膨大な数の変異体をもたらすものであり、その変異体はいっせいに播種され、ヒト集団内を循環する。この潜在的に感染性を有する分離株の膨大な集団に対する保護を提供することは、ワクチン開発における前例のない規模の課題となっている。驚くことではないが、化学的不活性化や生存減衰化の一般的なワクチンアプローチは、幅広く防御可能又は安全なHIV-1ワクチンを生産していない。
【０００９】
FMDVは食用動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、及びブタ）に感染する。正20面体対称で直径約30nmの非エンベロープウィルスであるFMDVは、インビトロで極めて不安定である。不活化ウィルスワクチンの有効性は、ウィルスの完全性に大きく依存している。140S定量ショ糖密度勾配分析は、ウィルス抗原を定量化し、それに基づいて、ワクチンを処方する上で推奨される方法である。しかしながら、140S量だけに基づいて処方されたFMDVワクチンは、しばしば現場で役に立たなかった。 
【００１０】
4つの血清型を有するデングウィルス（DENV）は、デング熱の原因である。それは、フラビウィルス科のシングルプラス鎖RNAウィルスである。ゲノムは約11000塩基であり、3つの構造蛋白質（キャプシド蛋白質C、膜蛋白質M、エンベロープ蛋白質E）と7つの非構造蛋白質（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5）をコードする。このウィルスのヌクレオチド置換率は、6.5×10-4／ヌクレオチド／年であり、他のRNAウィルスと類似の比率となっている。現在のところワクチンは得られていない。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の一目的は、ウィルスに対する少なくとも部分的なサブタイプ間又はサブタイプ内の交差性免疫を誘発することができるワクチンを提供することである。
【００１２】
本発明の一態様によれば、ワクチンが提供される。一実施形態では、上記ワクチンは、ウィルスワクチン株由来のウィルス抗原を含み、上記ウィルス抗原は、ウィルスワクチン株のウィルス調製物に由来し、上記ウィルスワクチン株のウィルス調製物は、感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションを含み、上記感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションは、上記ウィルス調製物のウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量に対する割合で表され、上記ウィルス調製物のウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量に対する感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合は、事前に定義された閾値を超えており、上記ワクチン株とは異なるウィルス株に対して、少なくとも部分的なサブタイプ間又はサブタイプ内の交差免疫応答をもたらす。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、ワクチンの生産方法が提供される。一実施形態では、上記方法は、(f)ウィルスワクチン株のウィルス調製物を準備する工程、(g)上記ウィルス調製物からウィルス抗原を得る工程、及び(h)上記ウィルス抗原と、ワクチンを作るために生理的に許容可能なアジュバントとを混合する工程、を含み、上記(f)のウィルスワクチン株のウィルス調製物は、感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションを含み、上記感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションは、ウィルス調製物のウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量に対する割合で表され、上記ウィルス調製物のウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量に対する感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合は、事前に定義された閾値を超えており、上記ワクチンは、上記ワクチン株とは異なるウィルス株に対して、少なくとも部分的なサブタイプ間又はサブタイプ内の交差免疫応答をもたらす。  
【００１４】
本発明の別の態様によれば、被検体への免疫のためのワクチンの使用であって、上記ワクチンは、ウィルス感染を予防又は治療するために、ウィルスに対する少なくとも部分的なサブタイプ間又はサブタイプ内の交差性免疫を誘発する、ワクチンの使用が提供される。
【発明の詳細な説明】
【００１５】
本発明は、以下の本発明の実施形態の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解することができる。
【００１６】
本出願中で刊行物が参照される場合、その刊行物の開示内容は、本発明が属する技術の状況をより完全に説明するために、参照することによりその全てが本出願に援用される。
【００１７】
特に断らない限り、本発明の実施には、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の一般的な技術（これらは当業者の有する技術内である）を採用する。そのような技術は、文献（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, third edition (Sambrook and Russel, 2001)、Animal Cell Culture (R.I. Freshmey, ed., 1987)、Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2001)、Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)、The Immuno assay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994)、Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W.H. Albert, and N.A. Staines, eds., Weinheim:VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993)）で十分に説明されている。
【００１８】
ウィルスは細胞内で複製する。そのため、ウィルス調製物は、例えば、ニワトリ胚、エクスビボ組織、及び培養細胞中で増殖させることによって生産できる。例えば、インフルエンザウィルスはインフルエンザワクチンを生産するために、ニワトリ胚及びVero細胞中で増殖され、FMDVはFMDVワクチンを生産するために、BHK-21細胞中で増殖される。現在のワクチン生産の常法では、ワクチンに使用されるインフルエンザウィルス調製物は、血球凝集試験でのHA力価に基づいて最適化され、ワクチンに使用されるFMDV調製物は、TCID50力価に基づいて最適化される。HA力価は、いずれの粒子サブポピュレーションの割合に関わらず、全てのウィルス粒子サブポピュレーションの量を表す。また、TCID50力価は、全てのウィルス粒子サブポピュレーション中の割合に関わらず、感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションのみを表す。
【００１９】
ウィルス調製物が全てのウィルス粒子サブポピュレーション（例えば、感染性ウィルス粒子サブポピュレーション、及び非感染性ウィルス粒子サブポピュレーション）を含むことはよく知られている。サブタイプ間又はサブタイプ内株に対する広範な免疫を有するウィルスワクチンの生産を追求する中で、本発明の発明者は、ウィルス調製物中の感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合が、広範な免疫を誘発可能なワクチンを生産するために重要な意味を持つこと、さらには、ウィルス調製物中の感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合は、例えば、培養条件の最適化によって増加できることを発見した。本発明は、現在のインフルエンザ及びFMDVワクチンが、サブタイプ内又はサブタイプ間の交差性免疫を誘発するために役に立たない理由と、HIV又はデングワクチンが得られていない理由の、少なくとも部分的な説明を提案する。さらに重要なことには、本発明によれば、任意のウィルス感染に対する広範なサブタイプ内及びサブタイプ間の交差性免疫を誘発可能なワクチンを生産する原理が提供される。
【００２０】
本発明によれば、感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションを有するウィルス調製物由来のウィルス抗原を含むウィルスワクチンであって、そのサブポピュレーションの割合が、それぞれのウィルスに特有の事前に定義された値よりも高い、ウィルスワクチンが提供される。さらに、本発明によれば、そのようなワクチンの作製方法が提供される。
【００２１】
ウィルスの増殖中に、感染性及び非感染性ウィルス粒子は生じる。このとき、感染性粒子は、例えば、細胞ベースプラークコロニー試験（即ち、プラーク形成粒子）においてプラークを形成できる粒子、もしくはCPEを生じさせる粒子、又は宿主に投与したときに臨床症状を引き起こす粒子として定義され、且つ非感染性粒子は、感染性粒子の感染性機能を果たすことができない粒子として定義される。加えて、多くのウィルスフラグメント及び可溶性抗原は、ウィルスの増殖を通じて生産される。本発明の原理を最もシンプルに利用する場合、ウィルス調製物の2つのパラメータを測定する（1つは、感染性ウィルス粒子のサブポピュレーション（例えば、プラーク形成単位（PFU）、TCID50、EID50、LD50で示される）であり、もう一つはウィルス粒子総量（例えば、HA力価で示される）又はウィルス抗原総量（例えば、ELISA測定値、ウエスタンブロットの強度で示される）である）。その後、ウィルス調製物中の感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合を、それら2つのパラメータに基づき計算する。実際には、その割合は、複数のウィルス調製物を比較したときに、感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合の差異を示すために使用できる限り、任意の値であってもよい。これは唯一、利便性のためである。もし状況が許すなら、各パラメータの絶対値を使用できる。
【００２２】
ウィルス調製物中の感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合は、操作（例えば、異なる培養条件、分離、精製）の影響を受ける。一実施形態では、ワクチン株において、異なる接種量（例えば、同じストックの異なる希釈溶液）及び異なるインキュベーション期間（例えば、接種後24、36、48、72時間）は、結果として得られるウィルスストック中に感染性粒子の最適な（即ち、高い）ポピュレーションを生じさせる接種量及びインキュベーション期間が見つかるように、ウィルスが増殖する範囲で採用する。ここで、結果として得られるウィルスストックは、ワクチンの調製に使用される、又はさらなる処理（例えば、精製、部分的溶解）にかけられる。別の実施形態では、増殖後のウィルスストックは、感染性粒子のポピュレーションが大きいウィルスのフラクションを得るために物理的分離（例えば、勾配遠心分離）にかけられる。なお、もしウィルスストックを生ウィルスで分ける場合に、予備試験で感染性粒子のポピュレーションがより多く含まれていると考えられる部分を同定するときは、物理的分離は、バイオハザードを最小限にするためにウィルスの不活性化の後に行ってもよい。別の実施形態では、最適な増殖に起因する感染性粒子の最適なポピュレーションを含むウィルスストックを、感染性粒子のポピュレーションがさらに増加する又は豊富に存在するように、さらなる物理的分離にかける。ある程度純度が高い感染性粒子を分離できる任意の方法は、明らかに本発明に適している。
【００２３】
本発明の医薬組成物又はワクチンに使用されるウィルス抗原中に豊富に存在する感染性粒子は、交差防御免疫応答の誘導を促進する。どの特定の理論にも縛られないが、本発明によれば、以下が推論される。1)ウィルス生産中のウィルス粒子は、感染性粒子及び非感染性粒子を含む。ここで、感染性粒子は、感染を成功させるために適切な受容体結合エピトープを担う表面抗原を含んでいる必要があり、一方で非感染性粒子はそのような抗原を欠いている必要がある。現在のワクチン製品におけるウィルス調製物中の感染性粒子のデータは手に入らないが、我々の実験では、一般的な増殖条件（即ち、高希釈溶液（100〜1000倍希釈溶液）及び長いインキュベーション期間（48〜72時間）による接種）によって生じるインフルエンザウィルスのウィルスストックは、ウィルス粒子総量中の感染性粒子の割合が低い（1％未満）ことが示された。2)特定のウィルスの細胞表面受容体は、全てが又はめったに変異しない。このことは、異なるサブタイプ又は血清型の特定のウィルス（例えば、インフルエンザウィルス）が、受容体結合分子（即ち、表面抗原）内において、同一又は実質的に類似の受容体結合エピトープ又はドメインを有することを暗示している。表面抗原上の適切な受容体結合エピトープは、特定のウィルスにおいて異なるサブタイプ又は血清型の感染性粒子の間で共有される傾向にある。その結果、現在のワクチンの交差防御の欠如又は無効性は、受容体結合エピトープ又はドメインに特異的な抗体が不足していることに起因すると考えられる。なぜならば、ウィルス抗原総量に対して、感染性粒子に低い割合で存在している受容体結合エピトープ又はドメインは、宿主免疫システムから見落とされると考えられるためである。さらに、感染性粒子の割合が増加するなら、全ウィルス抗原中の適切な受容体結合エピトープ又はドメインの存在が増加することが想定される。またそのとき、適切な受容体結合エピトープ又はドメインの数は、異なるサブタイプ又は血清型と反応し交差防御を生じさせるために十分な抗体反応（エピトープ又はドメインに特異的抗体反応）を誘発する数に達する。 
【００２４】
ウィルス調製物中の感染性粒子量を増加させる方法は、任意の適切な方法を含む。例えば、適切なウィルス調製は、種ウィルスの異なる希釈溶液を用いて孵化卵又は細胞に接種する工程、その後、異なる期間インキュベートする工程、その後、ウィルス抗原総量（例えば、インフルエンザAウィルスでは、HA試験又はHA蛋白質量）及び感染性粒子（例えば、インフルエンザAウィルスでは、細胞ベースプラーク試験）を試験する工程、その後、適切なウィルス調製物が生産される条件を決定する工程、から選ばれてもよい。加えて、感染性粒子は他の粒子もしくは不完全な粒子又は可溶性抗原とは物理的に異なっていると考えるのが妥当である。そのため、ワクチンのために高容量の感染性粒子を有するウィルス調製物を得るために、残ったウィルス調製物から、感染性粒子を分離することが可能である。感染性粒子を残ったウィルス調製物から厳密に分離できることが理想的である。例えば、感染性粒子の密度は特有であるため、豊富な感染性粒子を有するフラクションを得るために、勾配超遠心分離を使用できる。実際には、最適なウィルス調製物を2つ以上の方法を組み合わせることによって得てもよい。
【００２５】
本明細書で使用される「ワクチン」は、個体中で免疫応答を誘導するために使用される抗原調製物である。ワクチンは、複数の抗原性の成分を含有することができる。
【００２６】
本明細書で使用される「非蛋白質キャリア」は、蛋白質ではなく、且つインフルエンザマトリクス及び／又は核蛋白質の多量体ディスプレイを実現するために使用可能なキャリアである。
【００２７】
「アジュバント」は、免疫原性の薬剤（例えば、抗原）に添加するときに、混合物を摂取した患者個体において、その薬剤に対する免疫応答を非特異的に促進又は増強する物質に対して用いられる。
【００２８】
用語「マイクロキャリア」は、微粒子組成物に対して使用される。この微粒子組成物は、水に不溶性であり、約150、120又は100um未満、より一般的には約50〜60umのサイズを有している。このサイズは約10 um未満又は約5um未満であってもよい。マイクロキャリアは、「ナノキャリア」を含む。このナノキャリアは、約1um未満、好ましくは約500nm未満のサイズを有するマイクロキャリアである。マイクロキャリアは、固相粒子を含む。この固相粒子は、生体適合性の自然に生じるポリマー又は合成コポリマーから形成される。アガロース又は架橋結合したアガロースから形成されたマイクロキャリアは、本技術分野で知られている他の生分解性材料と同様に、ここでのマイクロキャリアの定義に含めてもよいが、除外してもよい。
【００２９】
「個体」又は「被検体」は脊椎動物（例えば、鳥）であり、好ましくは動物（例えば、ヒト）である。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、スポーツアニマル、実験動物、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）、及びペットを含むがこれらに限定されない。
【００３０】
物質の「有効量」又は「十分量」は、所望の生物学的効果（例えば、有益な結果）（臨床結果を含む）をもたらすのに十分な量である。また、「有効量」は用いられる状況に依存する。本発明の状況下では、所望の抗原を含む組成物の有効量の一例は、個体中で免疫応答を誘発するのに十分な量である。有効量は、1回以上の投与回数で投与することができる。
【００３１】
免疫応答（例えば、体液性免疫応答又は細胞性免疫応答）の「刺激」は、応答の増加を意味する。これは、応答の誘発及び／又は増強に起因してもよい。
【００３２】
本明細書で使用され、且つ本技術分野でよく理解されている「治療」は、有益な又は所望の結果（臨床結果を含む）を得るためのアプローチである。本発明の目的では、有益な又は所望の臨床結果は、検出可能又は不可能な、1以上の症状の軽減又は改善、感染の程度の縮小、感染状態の安定化（即ち、非悪化）、感染状態の改善又は緩和、及び寛解（一部又は全部）を含むが、これらに限定されない。「治療」は、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間が延長することを意味していてもよい。
【００３３】
本発明において、ワクチン組成物の「投与量」は、特定の時点で投与されるワクチン組成物の量である。「投与量」は、徐放剤及び／又は徐放用装置を用いて動物へ徐々に投与するワクチン組成物の量であってもよい。本発明の一実施形態では、2種以上のワクチン組成物の投与量が、異なる時間に動物に投与される。
【００３４】
本発明において、インフルエンザウィルス（例えば、不活性化インフルエンザウィルス）の「免疫学的有効量」は、治療動物において、鳥インフルエンザウィルスの悪性株による後続のチャレンジに対して、完全又は部分的に免疫を誘導するインフルエンザウィルスの量である（通常は、ヘマグルチニンユニット又は「HAユニット」の用語で表現される）。完全又は部分的な免疫は、インフルエンザウィルスの悪性株でチャレンジした後の、ワクチン非投与動物と比較したワクチン投与動物のインフルエンザウィルス感染の臨床症状を、定性的又は定量的のいずれかで観察することで評価できる。チャレンジ後のワクチン投与動物のインフルエンザウィルス感染の臨床症状が、類似又は同一のチャレンジ後のワクチン非投与動物で観察された症状に対して、縮小、減少、又は除去されるとき、ワクチン投与動物に投与されたインフルエンザウィルスの量は、免疫学的有効量として評価される。
【００３５】
「交差防御免疫応答」は、ウィルス株による感染から防御する減少である。このウィルスは、応答を誘発するために使用されるものと同一ではない。「交差防御免疫応答」は、サブタイプ間又はサブタイプ内であってもよい。
【００３６】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３７】
HAユニットを決定する方法は本技術分野で知られている。本明細書で使用する場合、HAユニットは、赤血球と組み合わせたときに可視的な赤血球凝集を引き起こすサンプルを含有するインフルエンザウィルスの最大希釈濃度の逆数として定義される。 
【００３８】
ウィルスは、インフルエンザウィルス、HIVs、FDMV、デング熱ウィルス、肝炎Cウィルス、エボラウィルス、麻疹（measles）ウィルス, パラインフルエンザウィルス、及び呼吸器合胞体ウィルス（RSウィルス）、又はエピデミック株の循環において連続的な変化を受ける抗原エピトープを有する任意のウィルスを含むが、これらに限定されない。そのようなウィルスは、パラミクソウィルス（センダイウィルス、パラインフルエンザウィルス、ムンプス、ニューキャッスル病ウィルス）、モルビリウィルス（麻疹ウィルス、イヌジステンパーウィルス、及び牛疫ウィルス）、ニューモウィルス（呼吸器合胞体ウィルス及びウシ呼吸器ウィルス）、ラブドウィルス（水疱性口内炎ウィルス及びリッサウィルス）を含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【００３９】
細胞培養でインフルエンザウィルスを生産する方法は本技術分野で知られている。ウィルスは、哺乳類、鳥、又はヒト由来の細胞（例えば、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（MDCK）、Vero、MDBK、CLDK、Ebx、又はPERC6細胞）で増殖させることができる。FMDVためにはBHK-21細胞が好適である。
【００４０】
ウィルス抗原の投与量は、0.1〜60μgの範囲であり、好ましくは3〜30μgの範囲であり、最も好ましくは5〜15μgの範囲である。ウィルス抗原は、不活化ウィルス粒子、スプリットウィルス抗原、ウイロゾーム、又は精製抗原の形態であってもよい。
【００４１】
適切なアジュバントは、限定されないが、例えば、スクアラン及びスクアレン（又は動物由来の他の油）、ブロックコポリマー; Tween-80等の界面活性剤; クイルA、ドラケオール又はマルコール等のミネラルオイル、ピーナッツオイル等のベジタブルオイル; コリネバクテリウム・パルヴム等のコリネバクテリウム由来アジュバント; プロピオニバクテイリウム・アクン等のプロピオニバクテイルム由来アジュバントマイコバクテリウム・ボビス（バシル・カルメット及びゲラン又はBCG）インターロイキン2及びインターロイキン12等のインターロイキン; インターロイキン1等のモノカイン; 腫瘍壊死因子; ガンマインターフェロン等のインターフェロン; ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、N,N-ジクオクタデシル-N ',N'bis）2-ヒドロキシエチル-プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、プルロニックポリオール等の界面活性物質; ピラン、デキストランサルフェイト、ポリICカルボポール等のポリアミン; ムラミルジペプチド及び誘導体、ジメチルグリシン、タフトシン等のペプチド; オイルエマルジョン;  及び、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム又はミョウバン等のミネラルゲル; サポニン-水酸化アルミニウム又はクイルA水酸化アルミニウム等の組み合わせ; リポソーム; マイコバクテリア細胞壁抽出物; ムラミルジペプチド又は他の誘導体等の合成糖ペプチド; アブリジン; 脂質A誘導体; デキストランサルフェイト; DEAE-デキストラン又はリン酸アルミニウムとの組合わせ; カルボキシポリメチレン等のCarbopol'EMA; Neocryl A640等のアクリル系コポリマーエマルジョン; ワクシニア又はアニマルポックスウィルス蛋白質; コレラ毒素等のサブウィルス粒子アジュバント、又はそれらの混合物を含む。
【００４２】
単糖又は二糖誘導体は、少なくとも1つ（但しN−1を超えない数）の脂肪酸エステル基を有するか、任意に、少なくとも1つ（但しN−1を超えない数）の硫酸エステル基を有する。ここで、Nは、誘導体を生じさせる単糖又は二糖のヒドロキシル基の数である。ショ糖脂肪酸硫酸エステルは、サブミクロンのスクアラン／水エマルジョンに組み込まれた。ショ糖脂肪酸硫酸エステルの投与量は、0.1〜40mgの範囲である。好ましくは、ショ糖脂肪酸硫酸エステルの投与量は、0.5〜10mgの範囲である。最も好ましくは、ショ糖脂肪酸硫酸エステルの投与量は、0.5〜4mgの範囲である。スクアランの投与量は、0.4〜160mgの範囲である。好ましくは、スクアランの投与量は、1〜40mgの範囲である。最も好ましくは、スクアランの投与量は、2〜16mgの範囲である。 
【００４３】
本発明の治療用組成物は、治療する対象が許容できる賦形剤中に製剤化できる。賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、及び他の水溶性の生理学的平衡塩類溶液を含む。賦形剤は、少量の添加剤（例えば、等張性、及び化学的又は生物学的安定性を促進する物質）を含んでいてもよい。緩衝液は、例えば、リン酸緩衝液、重炭酸塩緩衝液、及びトリス緩衝液を含み、また、安定剤は、例えば、ダイアモンドアニマルヘルス（デモイン、アイオワ）から入手可能なA1/A2安定剤を含む。
【００４４】
個体は、本発明の状況下では、鳥及び／又は哺乳類（これらに限定されないが、例えば、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒト、サル、又は飼いならされた動物（ペット）（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ウサギ、フェレット、ウシ、ウマ、ヤギ、及び羊））に対して使用される。鳥又は鳥類は、鳥綱の温血脊椎動物の一つとして本明細書では定義される。この鳥網は、典型的には、翼に変化した前肢、うろこ状の足、くちばしを含み、硬い殻の卵の中に子供を産む。本明細書において、好ましい鳥類のグループは、飼いならされたニワトリ、七面鳥、ダチョウ、アヒル、ガチョウ、白鳥、及びコーニッシュ・ゲーム・ヘンズである。より好ましいグループは、飼いならされたニワトリ、及び七面鳥である。
【００４５】
効果的に治療用組成物を投与するために許容されるプロトコルは、個人の投与量サイズ、投与回数、投与量の頻度、及び投与形態を含む。そのようなプロトコルの決定は、当業者によって成すことができ、その例は本明細書に記載されている。
【００４６】
投与又は投与するは、個体の体内へ物質を導入することとして定義され、経口、経鼻、眼、直腸、膣、及び非経口経路を含む。組成物は、任意の投与経路（皮下（SQ）、筋肉内（IM）、静脈内（IV）、腹腔内（IP）、皮内（ID）、鼻、眼、又は口腔粘膜経由（IN）、又は経口を含むが、これらに限定されない）で、単独又は他の薬剤との組合わせで投与してもよい。
【００４７】
本発明の状況下において、患者に投与される投与量は、適切な期間にわたって患者に有益な応答をもたらすのに十分量であるべきである。投与すべき薬剤の量は、治療される被験体の年齢、性別、体重、及び一般的な健康状態、医師の判断に依存する因子に依存し得る。
【００４８】
本発明の免疫療法組成物は、ヒト等の動物に予防的又は治療的に免疫するために使用することができる。但し、他の動物も考慮される（好ましくは、家畜、コンパニオン・アニマル等の飼いならされた動物を含む脊椎動物）。
【００４９】
ワクチンは例えば、他の物質と組み合わせて使用してもよい（例えば、弱毒化ワクチンを用いたプライミングの後に不活化ワクチンを用いたブーストを続ける）。
【００５０】
本発明は、抗原、アジュバント、および薬理学的に許容されるキャリアを含む、全ての医薬組成物を包含する。
【００５１】
本発明において使用する上で好ましい薬理学的に許容されるキャリアは、非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンの滅菌水溶液を含んでいてもよい。非水性溶媒は、例えば、ベジタブルオイル（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル）、及び注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性キャリアは、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液を含み、またそれらは、生理食塩水及び緩衝化媒体を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及びソディウムクロリド、乳酸リンガー、又は固定オイルを含む。静脈用ビヒクルは、水分及び栄養補給剤、電解質補給剤（例えば、リンガーデキストロースに基づくもの）等を含む。防腐剤及び他の添加剤としては、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスが挙げられる。
【００５２】
＜実施例＞
【００５３】
以下、本発明の原理の説明を唯一の目的として実施例を提供する。この実施例は、本発明を限定することを意図するものではない。
【００５４】
I. インフルエンザウィルス
【００５５】
1. ウィルス株
【００５６】
インフルエンザA/ブタ/広東/01/2002 (H3N2)を華南の健康豚から分離した。
【００５７】
2. ニワトリ胚のウィルス増殖
【００５８】
十日齢の孵化卵をウィルス複製に使用した。卵に、ウィルスストック由来の異なる濃度の希釈溶液を有する接種物0.2 mlを摂取させた。摂取後の卵を、指定した期間、適温でインキュベーションした。インキュベーション終了時に、胚を冷却して殺し、卵を12〜60時間2〜8℃で保存した。 冷却した孵化卵由来の尿膜腔液を回収した。
【００５９】
3. HA試験とプラーク形成試験
【００６０】
HA試験及びプラーク形成試験は技術的によく知られている。ニワトリ赤血球をHA試験に使用した。MDCK細胞をプラーク形成試験に使用した。この結果を表1にまとめた。PFUは感染粒子の指標として見なした。また、HA力価はヘマグルチニン蛋白質の総量の指標として見なした。計算上では、1HAユニットは5x106ウィルス粒子（ヘマグルチニン粒子（HAP））に等しい。現在のインフルエンザワクチンにおいて、ヘマグルチニンの量は、ワクチンの用量を決定するために使用される唯一の指標である。ここで、HA力価（HAP）に対するPFUの比率を、ワクチンとしての有効性を試験するためのウィルスストックの選択に使用した。36時間インキュベーションした10-6倍希釈溶液のグループは、2番目に良い比率をもたらした（24時間では、比率は最も高かったが、非常に低いHA力価であった。抗原の総量は、実務で用いるには低すぎた。）。一方で、72時間インキュベーションした10-2倍希釈溶液のグループは、比率が最も低かった（但し、最も高いHAを示した。これは、インフルエンザワクチン作製のための現在の手順に適していると考えられる。）。
そこで、これら2つのグループを以降の実験に用いた。
【００６１】
【表１】
2013540825.tif 000002
【００６２】
SDS PAGEゲルをウィルス調製物中のHA蛋白質の定量のために用いた。ウィルス特異的血清を用いて、ELISAで定量化を行った。
【００６３】
4. 精製
【００６４】
はじめに、回収した尿膜腔液を中程度の速度の遠心分離（範囲: 4000〜14000g）で精製した。次に、ショ糖勾配遠心によって分離させた。35〜55%のフラクションをワクチン調整のために収集した。
【００６５】
5. ワクチン組成物及び調整物
【００６６】
未処理の尿膜腔液又は精製ウィルスを0.1%ホルマリンによって不活性化させた。その後、ミネラルオイルを混ぜ、乳化ワクチンを作製した。
【００６７】
6. 免疫: 抗体ELISAデータ、HIデータ
【００６８】
10日齢のひよこに、500ulの乳化ワクチンで後頸部の皮下から免疫した。血清をチャレンジ前に収集した。 
【００６９】
血球凝集抑制（HI）試験では、ウィルス懸濁液を、コレラ濾液（ビブリオコレラ培養物から得た）で事前処理した血清サンプルの段階（2倍）希釈溶液とともにインキュベートした。次に、赤血球を希釈溶液に加え、インキュベーション後、血球凝集の完全な抑制を示す試験物質の最大希釈溶液をHI抗体力価として定義した。
【００７０】
7. チャレンジ
【００７１】
免疫後20日のワクチン摂取ニワトリに対して、H5N1株の1つ（30 LD50）でチャレンジした。チャレンジから5日後に、各群で生き残ったニワトリをカウントした。10-2倍希釈溶液（72時間、精製済）由来のウィルスでワクチン接種したグループ、及び10-6倍希釈溶液（36時間、未精製）由来のウィルスでワクチン接種したグループでは、H5N1チャレンジに対する部分的な防御が見られた（生存数はそれぞれ5又は7）。しかし、10-2倍希釈溶液（72時間、未精製）由来のウィルスでワクチン接種したグループでは、H5N1チャレンジに対する防御が見られなかった（生存数は0）。
【００７２】
II. FMDV
【００７３】
1. ウィルス
【００７４】
早い増殖性と安定性のため、1つのFMDV株をワクチン株として選択した（VS）。また、2つのFMDV株をチャレンジ株として選択した（CS1及びCS2）。VSはCS1に対して97.3%の、CS2に対して77.3％の相同性を有していた。全てのウィルスを一般的な条件及び手順で、BHK-21細胞で増殖させた。
【００７５】
2. 異なる希釈溶液及び回収時間における、VSのTCID50、PFU、及びELISAの結果
【００７６】
VSの実験用ストックを下記の一般的な条件及び手順でBHK-21細胞で調製し、-80℃で保存した。VSの実験用ストックを10、100、1000、10,000、及び100,000倍に希釈し、BHK-21細胞に感染させた。TCID50の計算のために、感染後10、12、14、16、18、20、及び22時間にCPEを記録した。また、PFU力価及びELISA実験のために、各サンプルを3回凍結・解凍させた。CPE、PFU、及びELISA試験は技術的によく知られている。後述の表2及び表3に結果をまとめた。TCID50及びPFUの値は、感染ウィルス粒子のサブポピュレーションを意味し、ELISA力価は、ウィルス粒子総量又はウィルス抗原の総量を意味する。従って、ウィルス抗原の総量に対する感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合は、ELISA測定値に対するTCID50及びPFUの値として表すことができる。ここで、この割合の値は任意であるが、どのウィルス調製物が感染性ウィルス粒子のより大きなサブポピュレーションを含むかを明らかにする上で非常に有用である。任意の方法を適切に使用すれば、事前に定義した感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合の値を、ワクチン生産のためのウィルス調製物の調製条件の選択に使用できる。さらに、ウィルス調製物中のウィルス抗原の総量は、他の方法（例えば、全ウィルス抗原を精製すること）によって決定でき、また、ウィルス抗原の濃度は公知の方法に従って決定できる。
【００７７】
【表２】
2013540825.tif 000003
【００７８】
【表３】
2013540825.tif 000004
【００７９】
3. ワクチン調製、免疫、及びチャレンジ 
【００８０】
表2及び3から、ワクチン生産のためのウィルス調製物の2つの生産条件を選択した（10倍希釈、及び1000倍希釈で、両方とも回収前に18時間インキュベートした）。いくつかのより大きな希釈条件がより大きな割合をもたらしたのは事実だが、全ウィルス抗原の量（ELISA測定値によって示される）は非常に小さかった。実務的には、全ウィルス抗原の合理的な生産量と、所望の割合とのバランスをとることが必要である。もし生産量が低すぎると、非経済的になる。以下に示す一般的な手順でワクチンを生産した。FMDV陰性ブタを2週間のインターバルを置いて、2回免疫した。2回目の免疫から4週間後、ブタに対してCS1又はCS2でチャレンジし、18日間観察した。全ての実験は、以下の標準的なプロトコルで行った。結果を以下にまとめる。
【００８１】
【表４】
2013540825.tif 000005
【００８２】
表4の通り、ワクチン中の感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合の増加が、より低い相同性を有するウィルスに対する優れた防御をもたらした。
【００８３】
本発明を特定の実施形態を参照して説明したが、その実施形態は例示であること、及び本発明の範囲はそれらに限定されないことは理解される。本発明の別の実施形態は、本発明が属する分野の当業者に明らかである。そのような代わりの実施形態は、本発明の趣旨及び範囲内に包含されると考えられる。結果的に、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されており、上述の説明によってサポートされている。 
【手続補正書】
【提出日】平成25年6月27日(2013.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンであって、
ウィルスワクチン株由来のウィルス抗原を含み、
前記ウィルス抗原は、ウィルスワクチン株のウィルス調製物に由来し、
前記ウィルスワクチン株のウィルス調製物は、感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションを含み、
前記感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションは、前記ウィルス調製物のウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量に対する割合で表され、
前記ウィルス調製物のウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量に対する感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合は、事前に定義された閾値を超えており、
前記ワクチン株とは異なるウィルス株に対して、少なくとも部分的なサブタイプ間又はサブタイプ内の交差免疫応答をもたらす、
ワクチン。
【請求項２】
前記ウィルス抗原は、前記ウィルスの表面抗原である、請求項1に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ウィルス調製物は、細胞培養物、もしくは孵化鶏卵、又はウィルスの増殖を可能にする適切な宿主から得られる、請求項1に記載のワクチン。
【請求項４】
前記ウィルス調製物中の感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションは、プラーク形成単位試験（PFU）、組織培養感染量（TCID 50）、卵感染量（EID50）、及び致死量（LD50）を含むウィルス感染試験によって測定され、
前記ウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量は、血球凝集試験、ELISA、ウエスタンブロット、総蛋白質試験を含むウィルス総計試験によって測定される、
請求項1に記載のワクチン。
【請求項５】
前記感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合の事前に定義された閾値は、
(a)異なる感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合を有するウィルス調製物のセットを準備する工程、
(b)前記ウィルス調製物のセット由来のウィルス抗原を有するワクチンを調製する工程、
(c)調製したワクチンで適切な宿主を免疫する工程、
(d)ウィルスのチャレンジ株を用いて、免疫した宿主にチャレンジする工程、
(e)チャレンジ結果を分析する工程、
によって定義され、
前記(d)のチャレンジ株は、前記ウィルスワクチン株とは異なるものであり、
前記事前に定義された閾値は、所望の免疫によってもたらされたウィルス調製物の割合値として定義される、
請求項1に記載のワクチン。
【請求項６】
ワクチンの生産方法であって、
(f)ウィルスワクチン株のウィルス調製物を準備する工程、
(g)前記ウィルス調製物からウィルス抗原を得る工程、及び
(h)前記ウィルス抗原と、ワクチンを作るために生理的に許容可能なアジュバントとを混合する工程、
を含み、
前記(f)のウィルスワクチン株のウィルス調製物は、感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションを含み、
前記感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションは、ウィルス調製物のウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量に対する割合で表され、
前記ウィルス調製物のウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量に対する感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合は、事前に定義された閾値を超えており、
前記ワクチンは、前記ワクチン株とは異なるウィルス株に対して、少なくとも部分的なサブタイプ間又はサブタイプ内の交差免疫応答をもたらす、
生産方法。
【請求項７】
前記ウィルス抗原は、ウィルスの表面抗原である、請求項6に記載の生産方法。
【請求項８】
前記ウィルス調製物は、細胞培養物、もしくは孵化鶏卵、又はウィルスの増殖を可能にする適切な宿主から得られる、請求項6に記載の生産方法。
【請求項９】
前記ウィルス調製物中の感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションは、プラーク形成単位試験（PFU）、組織培養感染量（TCID 50）、卵感染量（EID50）、及び致死量（LD50）を含むウィルス感染試験によって測定され、
前記ウィルス粒子総量又はウィルス抗原総量は、血球凝集試験、ELISA、ウエスタンブロット、総蛋白質試験を含むウィルス総計試験によって測定される、
請求項6に記載の生産方法。
【請求項１０】
前記感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合の事前に定義された閾値は、
(a)異なる感染性ウィルス粒子のサブポピュレーションの割合を有するウィルス調製物のセットを準備する工程、
(b)前記ウィルス調製物のセット由来のウィルス抗原を有するワクチンを調製する工程、
(c)調製したワクチンで適切な宿主を免疫する工程、
(d)ウィルスのチャレンジ株を用いて、免疫した宿主にチャレンジする工程、
(e)チャレンジ結果を分析する工程、
によって定義され、
前記(f)のチャレンジ株は、前記ウィルスワクチン株とは異なるものであり、
前記事前に定義された閾値は、所望の免疫によってもたらされたウィルス調製物の割合値として定義される、
請求項6に記載の生産方法。
【国際調査報告】
2013540825.tif 000006
2013540825.tif 000007