(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型、該ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩、並びに該化合物及びそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ及び溶媒和物を開示し、特に、神経変性疾患、認知障害、望ましくない酸化に関連する疾患、加齢に伴う病理過程及び早老症、アテローム性動脈硬化、心房細動、脂質異常症、高コレステロール血症、高脂血症及び高トリグリセリド血症のような心血管疾患、炎症若しくは炎症性過程、又はてんかん、てんかん発作及びけいれんの予防用の前記化合物、そのヒドロキシ酸型、塩等を開示する。2013540772.tif 000017
2013540772.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型、該ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩、並びに該化合物及びそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ及び溶媒和物。
【化１】
2013540772.tif 000016
【請求項２】
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物及び／又はそのヒドロキシ酸型及び／又は該ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩及び／又は該化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物と、少なくとも１種の医薬として許容されるアジュバント、担体及び／又はビヒクルとを含む、医薬組成物。
【請求項３】
医薬品として使用するための、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型又は該ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩及び／又は該化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物。
【請求項４】
ａ．神経変性疾患、
ｂ．認知障害、
ｃ．望ましくない酸化に関連する疾患、
ｄ．加齢に伴う病理過程及び早老症、
ｅ．アテローム性動脈硬化、心房細動、脂質異常症、高コレステロール血症、高脂血症及び高トリグリセリド血症のような心血管疾患、
ｆ．炎症若しくは炎症性過程、又は
ｇ．てんかん、てんかん発作及びけいれん
の予防用並びに／又は治療用の、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型又は該ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩並びに／又は該化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物。
【請求項５】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）又は多発性硬化症である、請求項４に記載の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型又は該ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩及び／又は該化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物。
【請求項６】
式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型、該ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩及び／又は該化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物の、医薬品の調剤における使用。
【請求項７】
前記医薬品が、
ａ．神経変性疾患、
ｂ．認知障害、
ｃ．望ましくない酸化に関連する疾患、
ｄ．加齢に伴う病理過程及び早老症、
ｅ．アテローム性動脈硬化、心房細動、脂質異常症、高コレステロール血症、高脂血症及び高トリグリセリド血症のような心血管疾患、
ｆ．炎症若しくは炎症性過程、又は
ｇ．てんかん、てんかん発作及びけいれん
の予防並びに／又は治療に用いられる、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の増加に使用するための、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型又は該ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩及び／又は該化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物。
【請求項９】
ｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子に関連する疾患の予防及び／又は治療に使用するための、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型又は該ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩及び／又は該化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物。
【請求項１０】
神経変性疾患、望ましくない酸化に関連する疾患又は加齢に伴う病的課程に関連する神経細胞死を予防及び／又は治療する、請求項９に記載の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型又は該ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩並及び／又は該化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物。
【請求項１１】
ｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の増加によって特徴付けられる医薬品の調剤における、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型又は該ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩及び／又は該化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物の使用。
【請求項１２】
ｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子に関連する疾患の予防用及び／又は治療用医薬品の調剤における、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型又は該ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩及び／又は該化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物の使用。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患若しくは望ましくない酸化に関連する疾患若しくは加齢に伴う病理過程の予防及び／又は治療、並びに、脂質異常症及び心血管疾患及び急性若しくは慢性炎症性過程に関連する疾患の予防のためのコレステロール値の低下及び酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼの阻害、並びに、てんかん、てんかん発作若しくはけいれんの予防及び／又は治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患及び加齢に伴う疾患の高い発生率は、世界中で最優先の問題である。従って、前記疾患を予防する又は緩和する神経保護化合物を探求する必要がある。それら全ての中でも、アルツハイマー病（ＡＤ）が、最も蔓延し、２０４０年までに８１００万人の人々がこの疾患に罹患すると推定されている（Ｂｌｅｎｎｏｗら、Ｌａｎｃｅｔ ２００６；３６８：３８７−４０３）。スペイン単独でも５０万人の人々が現在ＡＤに罹患していると推定される。この疾患に関連する費用は比例して高額であり、アルツハイマー病患者の介護に由来する総費用は、米国及び英国でそれぞれ８,１００,０００ユーロ及び２,２００,０００ユーロであると算出される。現在、この疾患を予防する又は遅らせる有効な薬物は存在しておらず、したがって、神経損傷を予防する新規な神経保護化合物を探求及び検証する必要がある。
【０００３】
現在の薬物は患者にあまり利益を提供しないことが示されているため、現在は、新規化合物を得るための様々な戦略が取られている。これら薬物は、病気の幾つかの症状を一時的に遅らせる（よくて、１年）が、その進展を防止しない。現在の治療の選択肢は、ドネペジル、ガランタミン若しくはリバスチグミンのような薬物を用いたアセチルコリンエステラーゼの阻害か、又はＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）型グルタミン酸受容体の拮抗におけるメマンチンの能力に基づく。
【０００４】
これら薬物の成功率の低さのため、研究の新たな進路が開かれており、その中で、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧＲ）酵素の阻害剤（スタチンとして知られる）に関する治療薬としての研究が近年目立っている。ＨＭＧＲは、コレステロール生合成の律速段階を触媒する酵素であり、そしてこの酵素のスタチンによる阻害は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に関連する高コレステロール値を低減する一般的な治療戦略である。これら薬物は、心筋梗塞及び冠状動脈死の危険性を低減し、安全であると考えられる。更に、高コレステロール血症（高血中コレステロール値として定義される）は、アテローム性動脈硬化のような心血管疾患（ＣＶＤ）の主要な危険因子である。
【０００５】
コレステロール代謝に影響を及ぼす様々な遺伝的及び環境的因子が、ＡＤに関連する。例えば、アポリポタンパク質Ｅε４（ａｐｏＥ４）アイソフォームは、ＡＤの危険因子であり、コレステロール値の増加に関係がある。高コレステロール血症を主要な危険因子とするアテローム性動脈硬化も、ＡＤに関連するようである。更に、疫学研究は、高血清コレステロール値がＡＤの危険性を増加させることを示し、アルツハイマー病では、コレステロール代謝の恒常性調節が変えられ得ることが提案されている。他方で、スタチンで治療した患者におけるアルツハイマー病の危険性の有意な低下が報告されている。これら研究の全ては一緒になって、コレステロール値の低下はアルツハイマー病の病因を阻害できることを示唆する（Ｃｏｌｅ ＆ Ｖａｓｓａｒ； Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ ２００６；２２[２]：２０９−２２）。
【０００６】
コレステロールは、様々な種類のリポタンパク質によって血中に輸送され、主要なコレステロール担体は低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）である。ＬＤＬは、コレステロール及びトリグリセリドの肝臓から末梢組織への輸送を専門とするリポタンパク質であり、それらは細胞膜におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−Ｒ）を介して細胞により捕捉される。ＬＤＬは、コレステロール合成も調節し、高ＬＤＬコレステロール値はＣＶＤに罹患する危険性に関連している。一方、ＨＤＬは、様々な組織から肝臓へコレステロールを輸送するリポタンパク質である。ＨＤＬは、動脈からコレステロールを除去して、それを排泄のため肝臓まで輸送して戻すことができるため、ＨＤＬは、心血管疾患に対して保護的役割が与えられている。ＨＭＧＲ阻害剤は、歴史上最も成功した脂質低下薬であり、ＨＤＬコレステロール値を変化させることなくＬＤＬコレステロール値を低下させることに基づき、総コレステロール値を低下させることができる。
【０００７】
スタチン類の新たな特性が最近報告されており、特に、外傷又は痴呆により引き起こされる脳損傷のレベルで新たな活性が提案されており（Ｐａｈａｎ、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ. ２００６；６３[１０]：１１６５−７８）、ある種のスタチン（例えば、シンバスタチン）は、マウスにおいて学習及び記憶能力を強化すること（Ｌｉｎｇら、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ. ２００６；６０[６]：７２９−３９）、又はてんかん現象に関連するけいれん性発作を防ぐこと（Ｌｅｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ. ２００８；４４０：２６０−４）が実証されている。更に、スタチン類は、網膜における虚血性損傷により誘導された神経細胞死に対して（Ｈｏｎｊｏら、Ａｒｃｈ. Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ. ２００２；１２０：１７０７−１３）だけでなく、脳血管攣縮の治療に関して（Ｆａｎｄｉｎｏら、Ｎｅｕｒｏｃｉｒｕｇｉ´ａ. ２００７；１８：１６−２７）、肯定的な結果を示唆するフェーズＩＩ臨床試験での有効性も実証されている。にもかかわらず、様々な市販のスタチン類（例えば、アトルバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン等）の神経保護効果が脂質代謝に関する直接的効果によるか否か、又は、対照的に、それらが別の経路の結果であるか否か、が現在議論されている。
【０００８】
神経変性疾患（ＮＤＤ）及びＣＶＤの両方の事象の因果関係の継続的な探求に加えて、また前記探求に関連して、慢性炎症がこれらの疾患に対する根本的な現象として提案されている。例えば、低悪性度末梢全身性炎症は、認知損傷の増加に関連することが見出されている。その意味で、全身性炎症は、ＡＤ罹患に対する危険因子であると断定されている（Ｈｏｌｍｅｓら、“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ”Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ. ２００９年に概説される）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
スタチン類の神経保護効果の可能性に関する文献は存在するが、本発明者らは、市販されていないモナコリンＪの誘導体、具体的には、２−プロピルペンタン酸(１Ｓ,３Ｒ,７Ｓ,８Ｓ,８ａＲ)−１,２,３,７,８,８ａ−ヘキサヒドロ−３,７−ジメチル−８−[２−[(２Ｒ,４Ｒ)−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２イル]エチル]−１−ナフタレニルエステル（時に、本特許出願ではＮＳＴ００６０とも特定される）が、高い血液脳関門（ＢＢＢ）通過能力、並びにコレステロール値の低下、具体的にはＨＭＧＲの阻害において、並びにてんかん、てんかん発作及びけいれんに対する保護において高い有効性を有することに加えて、驚くほどの神経保護可能性を有する薬剤であることを見出した。更に、また驚くべきことに、この化合物は、市販のスタチン類よりも安全であり、最高の生物学的安全性レベルを示すスタチンであるシンバスタチンのレベルを下回る毒性レベルを示す。加えて、これは、モナコリンＪ分子に付加される側鎖が低コストのため、合成が安上がりな化合物である。
【００１０】
酸化ストレス、プロテインホスファターゼ−１の阻害、コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害、小胞体ストレス及びアポトーシスを引き起こす様々な種類の攻撃によりコリン作動性起源のヒト細胞株で神経細胞死を引き起こす様々な攻撃に対して、前記化合物の神経保護活性が明確に示された（実施例２、図１〜６）。前記実施例は、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、てんかん重積症、ハンチントン病等）に関連する神経細胞死又は望ましくない酸化に関連する疾患又は加齢に伴う病理過程の予防及び又は治療における前記化合物の使用の可能性を明確に示す。
【００１１】
この化合物の作用メカニズムを研究するため、またその神経保護効果を確かめるため、ＡＤに関与する遺伝子であるｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子の発現に対する前記化合物の修飾を研究し（実施例３、図７）、化合物ＮＳＴ００６０が、コリン作動性起源のヒト細胞株において用量依存的様式でこの神経保護遺伝子のｍＲＮＡレベルを増加できることを観察した。
【００１２】
化合物ＮＳＴ００６０の血液脳関門通過をよりよく定義する目的で、本発明者らは、実施例４に記載するように、理論的脂溶性、通過率及び有効透過率のような様々なパラメータを分析して（図８及び表１）、ＮＳＴ００６０は、用いた陽性コントロール（ベラパミル）に非常に近い、高いＢＢＢ通過率を有すると判断した。  
【００１３】
前記化合物の脂質低下活性は、市販のスタチンであるシンバスタチンと比較してＨＭＧＲの阻害を測定することによって明確に示された（実施例５、図９）。前記化合物のコレステロール低下効果をより良く定義する目的で、本発明者らは、実施例５に記載するように、ヒト肝細胞株におけるコレステロールの低減を分析すること（図１０）によって、コレステロール低下作用を更に詳しく分析した。前記実施例は、心血管疾患（例えば、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化、先天性心臓病、後天性心臓病、虚血性心臓病、高血圧性心臓病、心弁膜症、心筋症、血液疾患等）に関連する高コレステロール血症の予防及び／又は治療における前記化合物の使用の可能性を明確に示す。
【００１４】
化合物ＮＳＴ００６０の生物学的安全性は、その毒性をゼブラフィッシュ胚モデルにおいて市販のスタチンであるシンバスタチンと比較して評価することによって明確に示され、ＮＳＴ００６０は、より低い死亡率（実施例６、表２）、実験の最後における健康な幼生の高い割合（実施例６、図１１）、及びシンバスタチンよりも少ない心拍の途絶（実施例６、図１２）をもたらすことから、様々な濃度でシンバスタチンよりも毒性が少ないことが観察された。
【００１５】
前記化合物の抗炎症活性は、リポ多糖（ＬＰＳ）の腹腔内注射によって発生させたマウスの全身性炎症モデルで明確に示された（実施例７、図１３〜１７）。前記実施例は、炎症及び関連疾患、中でも神経変性疾患又は心血管疾患が認められるものの予防及び／又は治療における前記化合物の使用の可能性を明確に示す。
【００１６】
前記化合物の抗てんかん及び抗けいれん活性は、マウスのてんかんモデルにおいて、てんかん発作及びけいれんに対する保護を測定することによって、明確に示された（実施例８、図１８及び１９）。前記実施例は、てんかん及びてんかん発作又はけいれんの予防及び／又は治療におけるこの化合物の使用の可能性を明確に示す。
【００１７】
前記化合物の生体内抗酸化活性は、興奮毒性物質を接種したマウスの脳で引き起こされる酸化ストレスに対する保護を測定することによって、明確に示された（実施例９、図２０及び２１）。前記実施例は、望ましくない酸化に関連する疾患の予防及び／又は治療における前記化合物の使用の可能性を明確に示す。
【００１８】
ＮＳＴ００６０の保護効果は、マウスの死を引き起こす興奮毒性損傷後の生存レベルを測定することによって、明確に示された（実施例１０、図２２）。前記実施例は、神経変性疾患のような興奮毒性症候群に関連する疾患の予防及び／又は治療における前記化合物の使用の可能性を明確に示す。
【００１９】
従って、本発明の一態様は、式（Ｉ）の化合物［本特許出願において、時にＮＳＴ００６０とも特定される］：
【化１】
2013540772.tif 000003
、そのヒドロキシ酸型、前記ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩、並びに前記化合物及びそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ及び溶媒和物に関する。
【００２０】
本発明の別の態様は、式（Ｉ）の化合物及び／又はそのヒドロキシ酸型及び／又は前記ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩及び／又は前記化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物と、少なくとも１種の医薬として許容されるアジュバント、担体及び／又はビヒクルとを含む、医薬組成物である。
【００２１】
本発明の別の態様は、医薬品として使用するための、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型、又は前記ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩、及び／又は前記化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物に関する。
【００２２】
別の態様によると、本発明は、特に
ａ．神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、てんかん重積症、ハンチントン病等）、より具体的には、酸化ストレス、プロテインホスファターゼ−１の阻害、コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害、小胞体ストレス及び前記慢性神経変性疾患に関連するアポトーシス過程に対する保護剤として、
ｂ．認知障害、
ｃ．望ましくない酸化に関連する疾患、
ｄ．加齢に伴う病理過程及び早老症、
ｅ．アテローム性動脈硬化、心房細動、脂質異常症、高コレステロール血症、高脂血症及び高トリグリセリド血症のような心血管疾患、
ｆ．炎症、炎症性過程、及び炎症と共に示されるか若しくは炎症によって引き起こされる疾患、又は
ｇ．てんかん、てんかん発作及びけいれん
の予防用並びに／又は治療用の、神経保護薬として使用するための、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型、又は前記ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩、及び／又は前記化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物に関する。
【００２３】
本発明の一態様は、医薬品の製造における、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型、前記ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩、及び／又は前記化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物の使用に関する。特定の実施形態によると、前記医薬品は、特に
ａ．神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、てんかん重積症、ハンチントン病等）、より具体的には、酸化ストレス、プロテインホスファターゼ−１の阻害、コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害、小胞体ストレス及び前記慢性神経変性疾患に関連するアポトーシス過程に対する保護剤として、
ｂ．認知障害、
ｃ．望ましくない酸化に関連する疾患、
ｄ．加齢に伴う病理過程及び早老症、
ｅ．アテローム性動脈硬化、心房細動、脂質異常症、高コレステロール血症、高脂血症及び高トリグリセリド血症のような心血管疾患、
ｆ．炎症、炎症性過程、及び炎症と共に示されるか若しくは炎症によって引き起こされる疾患、又は
ｇ．てんかん、てんかん発作及びけいれん
の予防及び／又は治療において、神経保護剤として使用されるためのものである。
【００２４】
本発明の別の態様は、ｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の増加に使用するための、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型、又は前記ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩、及び／又は前記化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物である。
【００２５】
本発明の別の態様は、ｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子に関連する疾患の予防及び／又は治療に使用するための、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型、又は前記ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩、及び／又は前記化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物である。
【００２６】
本発明の別の態様は、ｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の増加によって特徴付けられる医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型、又は前記ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩、及び／又は前記化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物の使用に関する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、治療上有効量の式（Ｉ）の化合物、そのヒドロキシ酸型、又は前記ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩、及び／又は前記化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物を対象者に投与する工程を具える、治療を必要とする対象者において、神経変性疾患、認知障害、望ましくない酸化に関連する疾患、加齢に伴う病理過程及び早老症、アテローム性動脈硬化、心房細動、脂質異常症、高コレステロール血症、高脂血症及び高トリグリセリド血症のような心血管疾患、てんかん、てんかん発作及びけいれん、又は炎症によって特徴付けられる若しくは引き起こされる疾患を予防及び／又は治療する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ）により引き起こされる死に対する化合物ＮＳＴ００６０の保護効果を表すＸＹ散布図である。この図は、１０μＭのキサンチン（Ｘ）、６０ｍＵ／ｍＬのキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）及び様々な濃度のＮＳＴ００６０で処理した培養物の細胞死率（ＸＸＯにより引き起こされる細胞死を１００％とする）を示し、３連で行った３つの独立な実験の平均値±ＳＤを表す。＊スチューデントｔ検定による、ＸＸＯ単独での処理に対する有意差（ｐ＜０．０５）。
【図２】オカダ酸（ＯＡ）により引き起こされる死に対する化合物ＮＳＴ００６０の保護効果を表すＸＹ散布図である。この図は、２０ｎＭのＯＡ及び様々な濃度のＮＳＴ００６０で処理した培養物の細胞死率（ＯＡにより引き起こされる細胞死を１００％とする）を示し、３連で行った２つの独立な実験の平均値±ＳＤを表す。＊スチューデントｔ検定による、ＯＡ単独での処理に対する有意差（ｐ＜０．０５）。
【図３】３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）により引き起こされる死に対する化合物ＮＳＴ００６０の保護効果を表わすＸＹ散布図である。この図は、３０μＭの３−ＮＰ及び様々な濃度のＮＳＴ００３７で処理した培養物の細胞死率（３−ＮＰにより引き起こされる細胞死を１００％とする）を示し、３連で行った２つの独立な実験の平均値±ＳＤを表す。＊スチューデントｔ検定による、３−ＮＰ単独での処理に対する有意差（ｐ＜０．０５）。
【図４】ツニカマイシン（ＴＭ）により引き起こされる死に対する化合物ＮＳＴ００６０の保護効果を表すＸＹ散布図である。この図は、２４μＭのＴＭ及び様々な濃度のＮＳＴ００６０で処理した培養物の細胞死率（ＴＭにより引き起こされる細胞死を１００％とする）を示し、３連で行った２つの独立な実験の平均値±ＳＤを表す。＊スチューデントｔ検定による、ＴＭ単独での処理に対する有意差（ｐ＜０．０５）。
【図５】カスパーゼ３／７（アポトーシスエフェクターカスパーゼ）の活性化に対する化合物ＮＳＴ００６０予備処理の阻害効果を表わす棒グラフであり、アポトーシスは、カンプトテシン（ＣＰＴ）により引き起こされる。この図は、ＣＰＴを用いないコントロール細胞及び５０μＭのＣＰＴを用いたコントロール細胞に対する活性カスパーゼ３／７の割合、並びに、１０μＭ若しくは４０μＭのＮＳＴ００６０での予備処理又は５０μＭの阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（阻害についてのコントロール）の効果を示し、３連で行った２つの独立な実験の平均値±ＳＤを表わす。＊スチューデントｔ検定による、ＣＰＴでの処理に対する有意差（ｐ＜０．０５）。
【図６】ＣＰＴにより引き起こされるＤＮＡ断片化に対する化合物ＮＳＴ００６０予備処理の阻害効果を表わす棒グラフである。この図は、ＣＰＴを用いないコントロール細胞及び５０μＭのＣＰＴを用いたコントロール細胞に対するＤＮＡ断片化の割合、並びに、１０μＭ若しくは４０μＭのＮＳＴ００６０での予備処理又は５０μＭの阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（阻害についてのコントロール）の効果を示し、２連で行った２つの独立な実験の平均値±ＳＤを表わす。＊スチューデントｔ検定による、ＣＰＴでの処理に対する有意差（ｐ＜０．０５）。
【図７】定量ＲＴ−ＰＣＲにより定量化した、１μＭ、４μＭ、１０μＭ及び４０μＭの化合物ＮＳＴ００６０での細胞処理後のＧＡＰＤＨ正規化ｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現量を表わす。３連で行った実験の平均値±ＳＤが表わされ、アッセイにおける２つのコントロール（未処理細胞）の値が示される。＊スチューデントｔ検定による、コントロールに対する有意差（ｐ＜０．０５）。
【図８】活性型のシンバスタチン及び活性型のＮＳＴ００６０のＢＢ通過率（％）に関してＰｅ（ｃｍ／秒）として表現される有効透過率を表わすＸＹ散布図である；両パラメータは、ＰＡＭＰＡ法を用いて試験管内で測定した。ベラパミル及びテオフィリンをそれぞれ陽性コントロール及び陰性コントロールとして用いた。
【図９】試験管内アッセイを用いて測定した、様々な濃度の活性型のシンバスタチン及び活性型のＮＳＴ００６０により発揮されるＨＭＧＲ活性のコントロールに対する割合を表わすＸＹ散布図である。この結果は、２連で行った５つの独立なアッセイの平均値±ＳＤである。
【図１０】ヒト細胞株ＨｅｐＧ２における総コレステロール値に対する活性型のシンバスタチン及び活性型のＮＳＴ００６０の効果を表わす棒グラフである。この結果は、ＦＢＳの不存在下で２０時間化合物をインキュベートした後に各細胞株における、コントロールに対するコレステロール低減率として表わされる。測定は酵素法及び蛍光分光法によって行い、結果は３連で行った２つの独立なアッセイの平均値±ＳＤとして示される。＊スチューデントｔ検定による、未処理細胞に対する有意差（ｐ＜０．０５）。
【図１１】シンバスタチンと比較した、化合物ＮＳＴ００６０への曝露後の健常な幼生の割合を表わす棒グラフである。この結果は、様々な用量のＮＳＴ００６０及びシンバスタチンでの処理後の健常な動物（毒性学的問題がない）の割合の平均値±ＳＤとして表わされる。黒色の棒はＮＳＴ００６０で処理した動物の群を表わし、灰色の棒はシンバスタチンで処理した動物を表わす。
【図１２】シンバスタチンと比較した化合物ＮＳＴ００６０の心毒性の用量による変化を表わす。この結果は、漸増用量のＮＳＴ００６０又はシンバスタチンで処理した胚又は幼生の処理７２時間後の心拍数の割合の平均値±ＳＤとして表わされる。黒色の水平な点線は、コントロールに相当する心拍数の平均値を表わす。＊スチューデントｔ検定による、コントロールに対する処理の有意差（ｐ＜０．０５）。＃スチューデントｔ検定による、ＮＳＴ００６０とシンバスタチンとの有意差（ｐ＜０．０５）。
【図１３】８ｍｇ／ＫｇのＬＰＳの腹腔内投与２時間後のマウスの血漿中ＴＮＦα濃度の低下を介してもたらされる、シンバスタチン及びＮＳＴ００６０の抗炎症効果を表わす棒グラフである。オスのＣ５７ＢＬ６マウスにＬＰＳを注射する１２時間前及び１時間前に処理薬を投与した（ｎ＝８）。この結果は、ＥＬＩＳＡを用いて測定した血漿中ＴＮＦα濃度（ｐｇ／ｍＬ）として表わされ、平均値±ＳＥＭである。＊スチューデントｔ検定による、コントロール群（ビヒクル）に対する有意差（ｐ＜０．０５）；＃スチューデントｔ検定による、処理薬間の有意差（ｐ＜０．０５）。
【図１４】５０ｍｇ／ｋｇのＮＳＴ００６０又はビヒクルでの腹腔内処理後に生理食塩水又は８ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを腹腔内注射した後のオスのＣ５７ＢＬ６マウスの生存率を表わすＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフである。処理薬は、ＬＰＳを注射する１２時間前及び１時間前に投与した（ｎ＝８／群）。同じ投与計画でビヒクルを投与した（ｎ＝８）。＊スチューデントｔ検定による、コントロールに対する有意差（ｐ＜０．０５）。
【図１５】５０ｍｇ／ｋｇのＮＳＴ００６０での処理後に８ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを腹腔内接種した動物の全身症状に関連する経時的スコアを表わすＸＹ散布図である。処理薬は、オスのＣ５７ＢＬ６マウスにＬＰＳを注射する１２時間前及び１時間前に投与した（ｎ＝８／群）。＊スチューデントｔ検定による、コントロール＋ＬＰＳ群に対する有意差（ｐ＜０．０５）。様々な段階のスコアは、０＝無症状；１＝中程度の嗜眠及び低体温；２＝深刻な嗜眠、下痢及び震え；３＝完全な不動、に相当する。
【図１６】８ｍｇ／ｋｇのＬＰＳの腹腔内投与２時間後及び４時間後のマウスにおいて血漿中ＴＮＦα濃度の低下を介してもたらされるＮＳＴ００６０の抗炎症効果を表わす棒グラフである。処理薬は、オスのＣ５７ＢＬ６マウスにＬＰＳを注射する１２時間前及び１時間前に投与した（ｎ＝８〜１６）。この結果は、ＥＬＩＳＡを用いて測定した血漿中ＴＮＦα濃度（ｐｇ／ｍＬ）として表わされ、平均値±ＳＥＭである。＊スチューデントｔ検定による、コントロール群（ビヒクル）に対する有意差（ｐ＜０．０５）；＃スチューデントｔ検定による、処理薬間の有意差（ｐ＜０．０５）。
【図１７】８ｍｇ／ｋｇのＬＰＳの腹腔内投与２時間後のマウスにおいて血漿中ＩＬ−１β濃度の低下を介してもたらされるＮＳＴ００６０の抗炎症効果を表わす棒グラフである。処理薬は、オスのＣ５７ＢＬ６マウスにＬＰＳを注射する１２時間前及び１時間前に投与した（ｎ＝８）。この結果は、ＥＬＩＳＡを用いて測定した血漿中ＩＬ−１β濃度（ｐｇ／ｍＬ）として表わされ、平均値±ＳＥＭである。＊スチューデントｔ検定による、コントロール群（ビヒクル）に対する有意差（ｐ＜０．０５）。
【図１８】受けた予備処理（ｘ軸）に対し、最初のけいれんが起こったＫＡ接種後時間（分）の平均値±ＳＥＭ（ｙ軸）を表わす棒グラフである。ビヒクルで予備処理した予備処理群を黒色で表わし、体重１Ｋｇあたり５０ｍｇのＮＳＴ００６０で処理した処理群を白色で表わす。＊不等分散を有する試料について両側分布を用いたスチューデントｔ検定によるｐ値＜０．０５。
【図１９】てんかん誘発物質（カイニン酸又はカイニン酸の塩若しくはエステル、すなわちＫＡ）接種後のＲａｃｉｎｅスケール（Ｒａｃｉｎｅ, Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ １９７２；３２［３］：２８１−９４）によるてんかん発作症状重症度の経時的レベルを表わすＸＹ散布図である。このグラフは、受けた処理による動物のてんかん発作状態の進行を示す；ビヒクルを四角及び実線で表わし、体重１Ｋｇあたり５０ｍｇのＮＳＴ００６０で処理した処理群を円及び点線で表わす。ＡＮＯＶＡ検定及びＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定を用いた一般分散分析によるｐ値＜０．０５。
【図２０】異なる処理群：（ｉ）ビヒクル＋ＰＢＳ、（ｉｉ）ビヒクル＋ＫＡ、及び（ｉｉｉ）ＮＳＴ００６０＋ＫＡ、の光子放出動態の代表的な画像を含むパネルである。６０００〜３００００光子／秒／ｃｍ２／ｓｒのシグナル強度を表わすカラースケールを、撮影した画像の隣に示す。
【図２１】実験群：（ｉ）三角及び点線で表されるビヒクル＋ＰＢＳ、（ｉｉ）四角及び実線で表されるビヒクル＋ＫＡ、並びに（ｉｉｉ）円及び点線で表されるＮＳＴ００６０＋ＫＡ、における対象個体の異なる時点でのシグナルを定量化した平均値±ＳＥＭについてのＸＹ散布図である。＊不等分散を有する試料について片側分布を用いたスチューデントｔ検定による、ビヒクル＋ＰＢＳ群に対する各時点のｐ値＜０．０５。
【図２２】処理（興奮毒性物質［ＫＡすなわちカイニン酸の塩又はエステル］の接種に対して−２４時間３０分）、興奮毒性物質の接種（接種後０日目［ｄ．ｐ．ｉ：接種後日数］）及びそれに続く処理（最長で接種後７日目まで）によるマウスの生存率を表わすＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
［定義］
本特許出願の発明の目的の理解を助けるため、本発明の文脈上使用される幾つかの用語及び表現の意味を以下で説明する。
【００３０】
本明細書中で使用する「神経保護(的)」という用語は、既知若しくは知られるようになるあらゆるメカニズムによって、例えば、壊死、アポトーシス、自己消化、酸化損傷、興奮毒性、小胞体損傷、副産物の蓄積、細胞骨格の崩壊、電子伝達系の阻害、細胞構造の損失等による神経細胞の変性若しくは死の影響の減衰若しくは消失をもたらすことができるあらゆる物質、又はそれらの副作用の低減若しくは消失を指す。
【００３１】
本明細書中で使用する「スタチン」という用語は、コレステロール生合成の律速段階を触媒する３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧＲ）酵素の阻害剤を指し、あらゆる天然、合成又は半合成スタチンを包含する。幾つかのスタチンは、閉じた形態（ラクトン）又は開いた形態（ヒドロキシ酸）をとり得る。ヒドロキシ酸（開いた形態）は、例えば、メタノール中で水酸化ナトリウムを用いる、テトラヒドロフラン−水中で水酸化ナトリウムを用いる等といった通常の加水分解によって、対応するラクトンから調製することができる。開いた形態（ヒドロキシ酸）では、スタチンは反応して、医薬として許容される金属と有機又は無機塩基から形成されるアミンカチオンとを有する塩を形成する。スタチンの医薬として許容される塩は、対応する遊離酸と、溶解度及び融点のような幾つかの物理的特性において異なり得るが、それらは、本発明の目的について遊離酸型と等価であると考えられる。スタチンの開いた遊離型（ヒドロキシ酸）は、塩形態から、必要に応じて、その塩を塩酸等のような酸の希釈水溶液と接触させることによって、再生成させることができる。スタチンの閉じた形態（ラクトン）は、開いた形態（ヒドロキシ酸）を、例えば、トルエン、ベンゼン、酢酸エチル等のような未希釈溶媒に、およそ０℃からおよそ溶媒の沸点までの温度で溶解させることによって、典型的には（必然ではないが）、強酸、例えば、塩酸等を用いる生成した水及び触媒の同時分離で、再生成させることができる。さらに、スタチンは、溶媒和型又は非溶媒和型で存在することができ、かかる形態は、本発明の目的について非溶媒和型と等価である。
【００３２】
本明細書中で使用する「心臓保護(的)」という用語は、既知若しくは知られるようになるあらゆるメカニズムによって、例えば、壊死、アポトーシス、虚血、酸化損傷、不整脈、副産物の蓄積、細胞構造の損失等による心血管疾患若しくは心臓病又は心臓障害の元となる影響の減衰若しくは消失をもたらすことができるあらゆる物質、又はそれらの副作用の低減若しくは消失を指す。
【００３３】
本明細書で使用する「脂質低下(薬)」という用語は、血中脂質レベル又は他の組織中の脂質レベルを低減する特性を有する薬理学的に活性なあらゆる物質を指す。これら物質の重要性は、過剰な幾つかの種類の脂質（コレステロール若しくはトリグリセリド）又はリポタンパク質が心血管疾患の主要な危険因子の一つであるという事実のためである。
【００３４】
本明細書で使用する「コレステロール低下(薬)」という用語は、血中コレステロール値又は他の組織中のコレステロール値を低減する特性を有する薬理学的に活性なあらゆる物質を指す。
【００３５】
本明細書中で使用する「抗炎症(性)」という用語は、炎症過程、急性炎症、慢性炎症若しくは全身性炎症の減衰、例えば、長さ及び／若しくは強度における減衰、又は炎症過程、急性炎症、慢性炎症若しくは全身性炎症の消失、又はそれらの副作用の低減若しくは消失を指す。
【００３６】
本明細書中で使用する「生物学的に安全」という用語は、毒性的影響、腫瘍の発生、胚発生障害（催奇性）又は他の悪影響が存在しないことを指す。
【００３７】
本明細書で使用する「神経変性疾患」という用語は、時間をかけて機能障害又は機能低下を引き起こす、神経組織の、特に神経細胞の変性又は劣化に起因する疾患を包含する；変性という用語は、細胞の生存能力の損失、細胞機能の損失及び／又は（神経細胞又はその他の）細胞数の損失を包含する。例示的で非限定的な神経変性疾患の例としては、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症等が挙げられる。特定の実施形態では、前記神経変性疾患が、例えば、酸化ストレス又は小胞体ストレス又はアポトーシス又は興奮毒性又は細胞骨格の崩壊又は電子伝達系の阻害又は一般的な神経細胞死を引き起こす物質によって引き起こされる神経細胞死に関連する疾患である。
【００３８】
本明細書中で使用する「望ましくない酸化に関連する疾患」という用語は、望ましくない酸化（例えば、過度の酸化）により引き起こされるか又は前記望ましくない酸化が症状である疾患を指す。前記望ましくない酸化は、関与する特定のフリーラジカルや標的にかかわりなく、タンパク質、ＤＮＡ及び／又は脂質に対してフリーラジカルにより引き起こされる損傷の結果であり得る。望ましくない酸化は、細胞、組織又は器官の機能障害を引き起こし得る、またその結果、疾患の潜在的メカニズムを形成し得る、フリーラジカルの過剰な発生に関与する。特定の実施形態では、前記望ましくない酸化が、年齢（老化）によって又は神経変性過程によって引き起こされ、それ自体によって又は他の因子と組み合わさって幾つかの疾患の発症を引き起こし得る。特定の実施形態では、前記望ましくない酸化が、酸化ストレスを引き起こす物質によって引き起こされた酸化損傷に関する。
【００３９】
本明細書中で使用する「加齢に伴う病理過程」という用語は、細胞代謝機能障害、ストレス過程、病原体による感染、遺伝子変化、遺伝的感受性、外傷、虚血、てんかん等を含む、神経組織の細胞生存能力の損失、又は神経組織の細胞の感作、細胞機能の損失及び／又は（神経細胞又はその他の）細胞数の損失を引き起こす、加齢に伴うあらゆる事象又は事象の組み合わせを指す。
【００４０】
本明細書中で使用する「心血管疾患」という用語は、心臓又は残りの心血管系又は血液のあらゆる疾患又は機能障害又は変化を指す。
【００４１】
本明細書中で使用する「炎症」という用語は、環境的攻撃への非特異的応答、又は炎症性因子（細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、アポトーシス若しくは壊死のような細胞死過程、尿酸、ヌクレオチド、核酸若しくは毒物のような炎症性応答を活性化させる分子、外傷、異物、物理的因子、血管障害、変性過程、免疫性及び自己免疫性障害、過敏症等）によって生じた応答を指す。
【００４２】
本明細書中で使用する「認知障害」という用語は、持続的に徐々に影響を受ける社会活動及び人間の相互作用を妨げる、記憶、方向、言語、視覚認識若しくは行為のような精神機能の損失又は変化を指す。
【００４３】
本明細書中で使用する「てんかん」という用語は、脳神経細胞による神経インパルスの過剰な高共時的放電による再発性発作によって特徴付けられ、最終的には様々な臨床的及びパラクリニカルな兆候に関連する、様々な原因を有する慢性脳症候群を指す。てんかん性発作は、けいれん性又は非けいれん性であり得る。てんかんは、数多くの原因を有する；幾つかの事例では、様々な種類の脳損傷（例えば、脳外傷、髄膜炎の後遺症、腫瘍等）のためであり得る；他の事例では、損傷は存在しないが、発作に対する遺伝的素因が存在する；他の事例では、てんかんの病因が、環境的なもの、薬理学的処置によるもの、興奮毒性、外傷、ストレス過程、老化、発達障害、神経疾患、心理的危機、妊娠期間中の問題、出産中の問題等によるものであり得る。
【００４４】
本明細書中で使用する「てんかん又はけいれん」という用語は、例えば、遺伝的、環境的、薬理学的処置によるもの、興奮毒性によるもの、外傷によるもの、ストレス過程によるもの、老化によるもの、発達障害によるもの、神経疾患によるもの、心理的危機によるもの、妊娠期間中の問題によるもの、出産中の問題によるもの等といった、あらゆる病因のあらゆるてんかん性発作又はけいれんを指す。てんかん性発作は、脳内の異常な電気活動が身体の運動又は機能、感覚の不随意変化を引き起こすときに、警戒する能力又は行動として起こり、部分性又は全般性（けいれん性又は非けいれん性）であり得る。
【００４５】
本明細書中で使用する「対象者」という用語は、哺乳動物種の一員を指し、限定しないが、家畜、霊長類及びヒトが挙げられる；好ましくは、対象者は、あらゆる年齢又は人種の人間の男性又は女性である。特定の実施形態では、前記対象者は、老化のような加齢に伴う病理過程又は慢性神経変性疾患のような神経変性疾患に苦しむか又は苦しんでいることが疑われる哺乳動物である。
【００４６】
本明細書中で使用する「医薬として許容される」という用語は、化合物が、生理学的に容認でき、対象者に投与したときに、アレルギー反応、又は、例えば胃障害、めまい等といった類似の好ましくない反応を一般に引き起こさないという事実を指す；前記「医薬として許容される」という用語は、好ましくは、政府の規制官庁によって承認されたこと又は合衆国薬局方若しくは別の一般的に認知されている動物用薬局方（例えば、ヨーロッパ薬局方等）に収載されていることを意味する。
【００４７】
本明細書中で使用する「医薬として許容される塩」という用語は、「医薬として許容されるアミン塩」の他に「医薬として許容される金属塩」を包含する。「医薬として許容される金属塩」という用語は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、アルミニウムイオン、鉄イオン又は亜鉛イオンで形成される塩を意図する。「医薬として許容されるアミン塩」という用語は、カルボン酸で塩を形成するのに充分に強いアンモニア塩基及び有機窒素塩基を有する塩を意図する。前記医薬として許容される塩は、当業者に既知の通常の方法によって得ることができる。
【００４８】
化合物２−プロピルペンタン酸(１Ｓ,３Ｒ,７Ｓ,８Ｓ,８ａＲ)−１,２,３,７,８,８ａ−ヘキサヒドロ−３,７−ジメチル−８−[２−[(２Ｒ,４Ｒ)−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２イル]エチル]−１−ナフタレニルエステルは、米国特許第４８６６０９０号で同族の他の化合物について記載されたもののような半合成法によって得ることができる。
【００４９】
本発明者らによって行われた多数のアッセイは、酸化ストレスを引き起こす物質の作用に対する化合物ＮＳＴ００６０の神経保護効果、細胞骨格の崩壊を引き起こす物質に対する前記化合物の神経保護効果、電子伝達系の阻害を引き起こす物質に対する前記化合物の神経保護効果、小胞体ストレスを引き起こす物質の作用に対する前記化合物の神経保護効果、及びヒトのコリン作動性ニューロンのアポトーシスを引き起こす物質の作用に対する前記化合物の神経保護効果を明確に示した。
【００５０】
キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ）のような、酸化ストレスを引き起こす物質の作用に対する神経保護効果を、実施例２で説明する。前記実施例において、化合物ＮＳＴ００６０は、酸化ストレスによって引き起こされる神経細胞死を有意に且つ定量的に低減できることが観察された。このことは、前記化合物の神経保護能力を明確に示す（図１）。前記化合物の神経保護効果をより良く定義する目的で、本発明者らは、プロテインホスファターゼ−１の阻害による細胞骨格の崩壊によって死を引き起こすオカダ酸（ＯＡ）の作用によって引き起こされる神経細胞死を解析することによって、神経変性過程をより詳細に解析し、化合物ＮＳＴ００６０が細胞骨格の崩壊によって引き起こされる神経細胞死を定量的且つ有意に低減できることを突き止めた。このことは、前記化合物の神経保護能力を明確に示す（図２）前記化合物の神経保護効果をより良く定義する目的で、本発明者らは、ハンチントン病のモデルとして受け入れられているコハク酸デヒドロゲナーゼの阻害による電子伝達系の阻害によって死を引き起こす３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）の作用によって引き起こされる神経細胞死を解析することによって、神経変性過程をより詳細に解析し、化合物ＮＳＴ００６０が電子伝達系の阻害によって引き起こされる神経細胞死を定量的且つ有意に低減できることを突き止めた。このことは、前記化合物の神経保護能力を明確に示す（図３）。前記化合物の神経保護効果をより良く定義する目的で、本発明者らは、小胞体ストレスを引き起こす物質（ツニカマイシン）の作用によって引き起こされる神経細胞死を解析することによって、神経変性過程をより詳細に解析し、化合物ＮＳＴ００６０が小胞体ストレスによって引き起こされる神経細胞死を定量的且つ有意に低減できることを突き止めた。このことは、前記化合物の神経保護能力を明確に示す（図４）。前記化合物の神経保護効果をより良く定義する目的で、本発明者らは、アポトーシスを引き起こす物質（カンプトテシン、ＣＰＴ）の作用によって引き起こされる神経細胞死を解析することによって、神経変性過程をより詳細に解析し、化合物ＮＳＴ００６０がアポトーシスを引き起こすエフェクターカスパーゼ３／７の活性化を定量的且つ有意に低減できることを突き止めた。このことは、前記化合物の神経保護能力を明確に示す（図５）。更に、前記化合物の神経保護効果をより良く定義する目的で、本発明者らは、フローサイトメトリーを用いて、アポトーシスにより引き起こされる神経細胞死及びその阻害を、アポトーシスによる神経細胞死の特異的阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋと比較して解析することによって、神経変性過程をより詳細に解析し、アポトーシスにより引き起こされる神経細胞死を化合物ＮＳＴ００６０が定量的且つ有意に低減できることを突き止めた（図６）。
【００５１】
加えて、アルツハイマー病に関してｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の増加の神経保護効果が実証されているため（Ｃｅｃｈｉら., Ｊ. Ｃｅｌｌ. Ｍｏｌ. Ｍｅｄ. ２００８； １２： １９９０−２００２）、化合物ＮＳＴ００６０がｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現を増加させる能力を調べた。ｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子の産物は、カスパーゼ−３の阻害による抗アポトーシス効果によって、またデルモステロールからのコレステロール合成を制御することによって、その神経保護作用を発揮することが報告されており（Ｇｒｅｅｖｅら、Ｊ. Ｎｅｕｒｏｓｃｉ. ２０００； ２０： ７３４５−５２）、このことは、神経毒攻撃に対するバリアの生成を実証し、βアミロイドの産生を予防する。これら作用メカニズムは、ｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の増加が包括的な神経保護効果を有することを示し、従って、この遺伝子の発現の増加をもたらすこれら薬物が、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、てんかん重積症、ハンチントン病等）に関連する神経細胞死若しくは酸化に関連する疾患若しくは加齢に伴う病理過程の予防及び／又は治療に使用できる可能性がある。ＮＳＴ００６０の投与によりｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現を増加させる能力は、実施例３で説明する。前記実施例では、化合物ＮＳＴ００６０がｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現を定量的且つ有意に且つ用量依存的な様式で増加させることができることが観察され、これは、リアルタイム定量ＰＣＲを用いた相対発現量解析によって実証された。これらの結果は、化合物ＮＳＴ００６０の神経保護能力を明確に示す（図７）。
【００５２】
化合物ＮＳＴ００６０の血液脳関門通過をより良く定義する目的で、本発明者らは、実施例４に説明するように、理論的脂溶性、通過率及び有効透過率のような様々なパラメータを分析した（図８及び表１）。化合物ＮＳＴ００６０は、驚くべきことに、陽性コントロール（ベラパミル）のものと実質的に同一であり、最も高いＢＢＢ通過率を有する既知のスタチンよりもかなり高いＢＢＢ通過率を生み出した。
【００５３】
更に、化合物ＮＳＴ００６０の性質のため、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧＲ）酵素の阻害能力を調べた。驚くべきことに、実施例５に示すように、その結果は、化合物ＮＳＴ００６０が明らかなコレステロール低下効果を有することを実証した。観察された結果で分かるように、また図９で示されるように、化合物ＮＳＴ００６０のＨＭＧＲに対する阻害活性は、ヒト集団においてコレステロール値を低減するのに通常用いられる市販のスタチン（シンバスタチン）のものに近い。前記化合物のコレステロール低下効果をより良く定義する目的で、本発明者らは、ヒト肝細胞株におけるコレステロール低減を分析することによって、コレステロール低下活性をより詳細に分析した。得られた結果で分かるように、また図１０で示されるように、化合物ＮＳＴ００６０のコレステロール低下活性は、市販のスタチン（シンバスタチン）のものに近い。
【００５４】
化合物を人間集団に投与するために、その無害性及び安全性が実証されなければならない。この目的で、本発明者らは、実施例６で説明するように、ＯＥＣＤ  Ｃ．１５プロトコルに記載された方法論に従って、広く用いられる毒物学的モデルであるゼブラフィッシュ胚で化合物ＮＳＴ００６０の生物学的安全性を分析した。このモデルにおいて、本発明者らは、前記化合物の副作用をより良く定義することができるように、前記胚で明確な損傷を引き起こす目的で、臨床診療で使用される用量よりも高い濃度で、前記化合物の影響をシンバスタチンと比較した。そして、高用量のＮＳＴ００６０の投与は、同用量のシンバスタチンを用いて検出されたものよりも少ない死亡率をもたらした（表２）。前記化合物の生物学的安全性をより良く定義する目的で、実験の最後で健常な幼生の割合をシンバスタチンと比較して調べ、シンバスタチンと比較して、ＮＳＴ００６０を用いた処理でより多くの健常な幼生が観察された（図１１）。前記化合物の生物学的安全性をより良く定義する目的で、使用した用量による  心拍の割合をＮＳＴ００６０とシンバスタチンとで比較して調べ、最高評価用量のシンバスタチンでＮＳＴ００６０のものよりも多い心拍数の低下が観察された（図１２）。このことは、化合物ＮＳＴ００３７の高い生物学的安全性を示している。
【００５５】
化合物ＮＳＴ００６０の抗炎症活性を、それ自体で、また既知のスタチン（シンバスタチン）と比較しても調べた。得られた結果は、化合物ＮＳＴ００６０が高い抗炎症性の可能性を有することを示し、これは、マウスにおけるＬＰＳの注射によって引き起こされた影響だけでなく、ＴＮＦαレベル及びＩＬ−１βレベルの有意な低下をもたらしたため（図１３〜１７）、驚くべきことにシンバスタチンよりも有意に良好であった。
【００５６】
また、知られているように、興奮毒性物質の投与は幾つかの事例では動物においてけいれんの急性発症及びてんかんを誘導する；このため、本発明者らは、化合物ＮＳＴ００６０の神経保護効果が、興奮毒性物質によって引き起こされるものに対する抗てんかん及び抗けいれん効果（図１８及び１９）、興奮毒性物質によって引き起こされる望ましくない酸化に対する神経保護効果（図２０及び２１）、興奮毒性物質によって引き起こされる死に対する神経保護効果（図２２）を伴うかを分析し、ＮＳＴ００６０の投与がこれらすべてのパラメータの低下をもたらしたことを観察した。
【００５７】
本発明によって提供される医薬組成物は、１種又は２種以上の医薬として許容されるアジュバント、ビヒクル若しくは賦形剤と共に、化合物ＮＳＴ００６０及び／又はそのヒドロキシ酸型及び／又は前記ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩及び／又は前記化合物若しくはそのヒドロキシ酸型の医薬として許容されるプロドラッグ若しくは溶媒和物を含有することができる。
【００５８】
医薬として許容される「塩、プロドラッグ又は溶媒和物」という用語は、被投与者に投与されたときに本明細書で説明するように化合物を（直接的又は間接的に）提供できる、医薬として許容されるあらゆる塩、溶媒和物又は他のあらゆる化合物を指す。にもかかわらず、医薬として許容されない塩もまた、医薬として許容される塩の調整に有用であり得ることから、本発明の範囲内に含まれる。前記塩及びプロドラッグは、本技術分野で既知の方法によって調製することができる。
【００５９】
式（Ｉ）の化合物の又はそのヒドロキシ酸型のプロドラッグであるあらゆる化合物は、本発明の範囲内である。「プロドラッグ」という用語は、その最も広い意味で用いられ、生体内で本発明の化合物に転換される誘導体を包含する。かかる誘導体は、当業者にとって明白であり、本発明の次の誘導体：エステル、アミノ酸エステル、リン酸エステル、金属スルホン酸塩エステル、カルバメート及びアミドを含み得る。本発明の化合物は、結晶形態で又は遊離化合物として又は溶媒和物（例えば、水和物）として存在することができ、どちらの形態も本発明の範囲内であることを意図する。溶媒和の方法は一般に当業者に知られている。特定の実施形態では、溶媒和物が水和物である。
【００６０】
化合物ＮＳＴ００６０、又はそのヒドロキシ酸型又は前記ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩を含有する医薬組成物は、選択された投与経路、例えば、経口、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内等）、局所、直腸経路等による投与に適するあらゆる医薬剤形に調剤することができる。非限定的例示として、本発明により提供される医薬組成物は、経口経路によって投与される固体医薬剤形（例えば、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等）、経口経路によって投与される液体医薬剤形（例えば、液剤、懸濁液、エマルション等）、非経口経路によって投与される医薬剤形（例えば、液剤、懸濁液、エマルション等）に調剤することができる。そのため、各事例において、選択された医薬剤形及び投与経路に適する医薬として許容されるビヒクル及び賦形剤、例えば、固体医薬剤形の調剤用の結合剤、希釈剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤剤等及び液体医薬剤形の調剤用の緩衝剤、界面活性剤等が選択されるであろう。前記ビヒクル及び賦形剤は、医薬として許容され且つ薬理学的に容認されなければならず、治療される対象者に対していかなる悪影響も発揮せずに処方の他の成分と組み合わせることができなければならない。前記有効成分の前記医薬剤形に関する情報の他に、前記ビヒクル及び賦形剤に関する情報も、ガレン（Ｇａｌｅｎ）の調剤学論にみることができる。薬物一般のさまざまな医薬剤形の概説及びそれらの調製方法は、書籍“Ｔｒｅａｔｅｄ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌｅ´ｎｉｃａ” （Ｃ. Ｆａｕｌｉ´ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ, １ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ, １９９３, Ｌｕｚａ´ｎ ５, Ｓ.Ａ. ｄｅ Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ）にみることができる。
【００６１】
本発明によって提供される医薬組成物は、治療上有効量で、化合物ＮＳＴ００６０又はそのヒドロキシ酸型又は前記ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩を含む。この説明に用いる意味において、「治療上有効量」という表現は、所望の効果をもたらすように計算された化合物量に関する。対象者に投与される化合物ＮＳＴ００６０、又はそのヒドロキシ酸型又は前記ヒドロキシ酸の医薬として許容される塩の用量は、数多くの要因に左右されて広範な範囲内で変化し、前記要因の中でも、使用される化合物の特性、例えば、その生物学的半減期及び活性、医薬組成物中の前記化合物の濃度、対象者の臨床像、病態の重症度、選択された医薬剤形等が挙げられる。本発明によって提供される医薬組成物は、予防又は治療の目的で１日に１回又は２回以上投与することができる、あるいは、毎日必要ではないが、毎週的確な回数、等の他の投与計画に従うことができる。
【００６２】
必要に応じ、本発明によって提供される医薬組成物は、本発明によって提供される医薬組成物の有効性を高める目的で、他の薬物、例えば、神経変性疾患、認知障害、望ましくない酸化に関連する疾患、加齢に伴う病理過程及び早老症、てんかん、てんかん性発作、けいれん、炎症若しくは炎症過程又は心血管疾患の治療に有用な薬物と共に使用することができる、従って、併用療法を行うことができる。この追加の薬物は、同じ医薬組成物の一部とすることができ、あるいは、別個の医薬組成物として、本発明によって提供される医薬組成物の投与に関し、本発明によって提供される医薬組成物と同じときに（同時投与）又は異なるときに（連続投与）提供することができる。
【００６３】
以下の実施例は、本発明を説明するのに役立つものであり、本発明を限定するものと見なしてはならない。
【実施例１】
【００６４】
［２−プロピルペンタン酸(１Ｓ,３Ｒ,７Ｓ,８Ｓ,８ａＲ)−１,２,３,７,８,８ａ−ヘキサヒドロ−３,７−ジメチル−８−[２−[(２Ｒ,４Ｒ)−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２イル]エチル]−１−ナフタレニルエステルの合成］
ＮＳＴ００６０として特定されるこの化合物を、Ｈｏｆｆｍａｎらの論文（Ｊ. Ｍｅｄ. Ｃｈｅｍ., １９８６, ２９, ８４９−８５２）で類似化合物について報告された方法論に従って、調製した。
【００６５】
［１．１．ロバスタチンの精製］
ヘキサン及び酢酸エチルグラジエントを溶離液として用いたカラムクロマトグラフィによって、ロバスタチンを天然起源の抽出物から精製した。
【００６６】
［１．２．モナコリンＪの入手］
【化２】
2013540772.tif 000004
０．５ｍＬの水に０．７ｇの水酸化カリウムを含む溶液を調製し、３ｍＬのメタノールを少しずつ加えた。０．５ｇのロバスタチンを連続して加え、溶液を還流下２１時間放置した。反応物の処理後、モナコリンＪと開環生成物との５０％混合物が得られた。    
【００６７】
2013540772.tif 000005
【００６８】
［１．３．保護誘導体の調製］
【化３】
2013540772.tif 000006
１０ｍＬのジクロロメタンに０．５ｇのモナコリンＪを含む溶液を調製した。０．４３４５ｇのイミダゾールを加えて、溶解するまで攪拌した。次いで、５ｍＬのジクロロメタンに溶解した０．４８３５ｇのｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシランクロリドを加え、２４時間攪拌を続けた。この反応物に、ジクロロメタン−メタノール（１０：１）を溶離液として用いてＴＬＣを行った。収率：９６％。
【００６９】
2013540772.tif 000007
【００７０】
［１．４．アシル化誘導体の調製］
【化４】
2013540772.tif 000008
先で得られた保護誘導体０．３ｇをフラスコ中で不活性雰囲気下２ｍＬのピリジンに溶解させた。２ｍＬのピリジンに溶解させた０．０６ｇのＤＭＡＰを連続して加えた。反応フラスコを氷浴中に置き、０．３７８ｍＬの２−エチルブチリルクロリドを加えた。次いで、０℃で１時間と室温で１８時間撹拌した。この反応物に、溶離液としてヘキサン−酢酸エチル（２：１）を用いてＴＬＣを行った。収率：９５％。
【００７１】
［１．５．最終化合物の合成］
【化５】
2013540772.tif 000009
先で得られた誘導体０．３６８ｇを２ｍＬのＴＨＦに溶解させた。次いで、０．１６ｍＬの酢酸と２．１６ｍＬの１Ｍフッ化テトラブチルアンモニウムとの溶液を反応媒体に加えた。この反応混合物を室温で１６時間撹拌した。この反応物に、溶離液としてジクロロメタン−アセトン（６：１）を用いてＴＬＣを行った。収率：７５％。
【００７２】
2013540772.tif 000010
【実施例２】
【００７３】
［様々な攻撃：酸化ストレス、プロテインホスファターゼ−１の阻害、コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害、小胞体ストレス及びアポトーシスによって誘導される神経細胞死に対するＮＳＴ００６０による保護］
［２．１．酸化ストレスによって誘導される神経細胞死に対するＮＳＴ００６０による保護］
アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）由来の培養下のヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ株で、アッセイを行った。全ての事例において、無菌の厳格な規則に従い、欧州標準ＥＮ１２４６９に従って、第二種バイオセーフティキャビネット中で操作を行った。細胞を、次の培地中で維持した：１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸類、０．０５ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン及び１０％のウシ胎児血清を補充したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）。
【００７４】
細胞死を起こす酸化損傷を発生させる（過酸化水素、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカルのようなフリーラジカルを生じる）キサンチン／キサンチンオキシダーゼでの処理によって引き起こされる細胞死に対し、化合物ＮＳＴ００６０によりもたらされる阻害を分析した。１５代継代を超えていない前記細胞を、接着細胞用に処理した９６ウェルプレート上に５×１０４細胞／ウェルの細胞濃度で播種した；プレートのうち３ウェルを各アッセイ条件用に播種した。
【００７５】
２４時間の細胞インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、下記条件について、１００μＬの総容積で細胞の処理を行った：
- コントロール：培地（培養液）
- キサンチン／キサンチンオキシダーゼ（ＸＸＯ）：１０μＭのキサンチン／６０ｍＵ/ｍＬのキサンチンオキシダーゼを加えた培地、５０％の細胞死を引き起こす。
- ＸＸＯプラスＮＳＴ００６０：ＮＳＴ００６０を１、４、１０、２０、４０又は１００μＭで加えた、ＸＸＯ（１０μＭ／６０ｍＵ/ｍＬ）添加培地。
【００７６】
これら処理薬と共に細胞を２２時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）し、その後、ＷＳＴ−１試薬（ロシュ社）を加えた。このＷＳＴ−１試験は、代謝活性の測定に基づく。細胞損傷は、細胞がその代謝機能及び細胞増殖を維持するのに必要なエネルギーを得る能力の損失を引き起こし、よって、代謝的に活性な（生きている）細胞は、（ミトコンドリア呼吸鎖の）コハク酸−テトラソリウムレダクターゼ系によってテトラゾリウム塩をホルマザンへ還元した。形成したホルマザンは、４４０ｎｍの吸光度を有するため、比色分析で検出することができる。試薬を加えて２時間後にプレートリーダーで４４０ｎｍの測定値を読み取った。
【００７７】
得られた結果を、図１に示されるように、ＸＸＯによって引き起こされる死に対する各処理の細胞死の割合として示す。死に対する保護を１〜４０μＭの濃度のＮＳＴ００６０で観察し、ＸＸＯに関する相違はスチューデントｔ検定によって統計的に有意であり、１０μＭで８０％の最大保護に到達した。これらの結果は、化合物ＮＳＴ００６０が、酸化ストレスによって引き起こされる神経細胞起源のヒト細胞の死に対して保護効果を示すことを表す。
【００７８】
［２．２．プロテインホスファターゼ−１（ＰＰ１）の阻害によって誘導される神経細胞死に対するＮＳＴ００６０による保護］
第２．１節で説明したように維持した培養下のヒト神経胚ＳＫ−Ｎ−ＭＣに対して、アッセイを行った。
【００７９】
プロテインホスファターゼ−１（ＰＰ１）の活性を阻害するオカダ酸（ＯＡ）での処理によって引き起こされる細胞死に対し、化合物ＮＳＴ００６０によってもたらされる阻害を分析した。ＯＡは、ＡＤの病因及び進行に関係するタウタンパク質のリン酸化メカニズムの研究用に最も広く用いられている薬物の一つである。ＰＰＩの阻害は、細胞骨格変化及びミトコンドリア損傷を引き起こす。１５代継代を超えていない前記細胞を、接着細胞用に処理した９６ウェルプレート上に５×１０４細胞／ウェルの細胞濃度で播種した；プレートのうち３ウェルを各アッセイ条件用に播種した。
【００８０】
２４時間の細胞インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、下記条件について、１００μＬの総容積で細胞の処理を行った：
- コントロール：培地（培養液）
- オカダ酸（ＯＡ）：２０ｎＭのオカダ酸を加えた培地、５０％の細胞死を引き起こす。
- ＯＡプラスＮＳＴ００６０：ＮＳＴ００６０を１、４、１０、４０又は１００μＭで加えた、ＯＡ（２０ｎＭ）添加培地。
【００８１】
これら処理薬と共に細胞を２２時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）し、その後、ＷＳＴ−１試薬（ロシュ社）を加えた。このＷＳＴ−１試験は、代謝活性の測定に基づく（第２．１節で説明した方法）。
【００８２】
得られた結果を、図２に示されるように、ＯＡによって引き起こされる死に対する各処理の細胞死の割合として示す。４μＭ及び１０μＭのＮＳＴ００６０で死に対して統計的に有意な保護が観察され、１０μＭで８３％に到達した。これらの結果は、化合物ＮＳＴ００６０が、ＰＰＩの阻害によって引き起こされる神経細胞起源のヒト細胞の死に対して保護効果を示すことを表す。
【００８３】
［２．３．コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害によって誘導される神経細胞死に対するＮＳＴ００６０による保護］
第２．１節で説明したように維持した培養下のヒト神経胚ＳＫ−Ｎ−ＭＣに対して、アッセイを行った。
【００８４】
３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）での処理によって引き起こされる細胞死に対する化合物ＮＳＴ００６０によりもたらされる阻害を分析した。３−ＮＰは、コハク酸デヒドロゲナーゼ酵素の不可逆的阻害剤であり、動物モデルにおいて、酸化ストレス及び線条体におけるアポトーシス細胞死を引き起こし、ハンチントン病（ＨＤ）に関連する神経化学的変化及び解剖学的変化を模倣する。１５代継代を超えていない前記細胞を、接着細胞用に処理した９６ウェルプレート上に５×１０４細胞／ウェルの細胞濃度で播種した；プレートのうち３ウェルを各アッセイ条件用に播種した。
【００８５】
２４時間の細胞インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、下記条件について、１００μＬの総容積で細胞の処理を行った：
- コントロール：培地（培養液）
- ３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）：３０μＭの３−ＮＰを加えた培地、５０％の細胞死を引き起こす。
- ３−ＮＰプラスＮＳＴ００６０：ＮＳＴ００６０を１、４、１０、４０又は１００μＭで加えた、３−ＮＰ（３０μＭ）添加培地。
【００８６】
これら処理薬と共に細胞を２２時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）し、その後、ＷＳＴ−１試薬（ロシュ社）を加えた。このＷＳＴ−１試験は、代謝活性の測定に基づく（第２．１節で説明した方法）。
【００８７】
得られた結果を、図３に示すように、３−ＮＰによって引き起こされる死に対する各処理についての細胞死の割合として示す。４μＭ〜４０μＭの範囲のＮＳＴ００６０で死に対する統計的に有意な保護が観察され、４０μＭで３２％に到達した。これらの結果は、化合物ＮＳＴ００６０が、コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害によって引き起こされる神経細胞起源のヒト細胞の死に対して保護効果を示すことを表す。
【００８８】
［２．４．小胞体ストレスによって誘導される神経細胞死に対するＮＳＴ００６０による保護］
第２．１節で説明したように維持した培養下のヒト神経胚ＳＫ−Ｎ−ＭＣに対して、アッセイを行った。
【００８９】
小胞体ストレスを発生させるツニカマイシンでの処理によって引き起こされる細胞死に対し、化合物ＮＳＴ００６０によりもたらされる阻害を分析した。ツニカマイシンは、タンパク質のＮ−グリコシル化の阻害剤であり、小胞体において異常なタンパク質フォールディングを引き起こし、よって、そのようなタンパク質が蓄積してストレスを引き起こし、細胞死に至る。１５代継代を超えていない前記細胞を、接着細胞用に処理した９６ウェルプレート上に５×１０４細胞／ウェルの細胞濃度で播種した；プレートのうち３ウェルを各アッセイ条件用に播種した。
【００９０】
２４時間の細胞インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、下記条件について、１００μＬの総容積で細胞の処理を行った：
- コントロール：培地（培養液）
- ツニカマイシン（ＴＭ）：２４μＭのツニカマイシンを加えた培地、５０％の細胞死を引き起こす。
- ＴＭプラスＮＳＴ００６０：ＮＳＴ００６０を１、４、１０、４０又は１００μＭで加えた、ＴＭ（２４μＭ）添加培地。
【００９１】
これら処理薬と共に細胞を２２時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）し、その後、ＷＳＴ−１試薬（ロシュ社）を加えた。このＷＳＴ−１試験は、代謝活性の測定に基づく（第２．１節で説明した方法）。
【００９２】
得られた結果を、図４に示すように、ＴＭによって引き起こされる死に対する各処理の細胞死の割合として示す。１μＭ〜４０μＭの範囲のＮＳＴ００６０で死に対する統計的に有意な保護が観察され、４μＭで４２％に到達した。これらの結果は、化合物ＮＳＴ００６０が、小胞体ストレスによって引き起こされる神経細胞起源のヒト細胞の死に対して保護効果を示すことを表す。
【００９３】
［２．５．ＮＳＴ００６０での処理は、アポトーシスの細胞モデルにおけるカスパーゼ３／７の活性化を阻害する］
第２．１節で説明したように維持した培養下のヒト神経胚ＳＫ−Ｎ−ＭＣに対して、アッセイを行った。
【００９４】
培養下の細胞に対するアポトーシスの誘導は、細胞のアポトーシスの活性化を誘発するカンプトテシン（ＣＰＴ）を用いて行った。アポトーシスをエフェクターカスパーゼであるカスパーゼ３又はカスパーゼ７の活性化の測定によって定量化し、そのために、活性カスパーゼ３／７の蛍光検出用キット（Ａｐｏ−ＯＮＥ(登録商標)ホモジーニアスカスパーゼ−３／７、プロメガ社）を用いた。細胞の活性なカスパーゼ３又は７は、蛍光光度計によって読み取られる蛍光発光を生じる。従って、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞において５０μＭのカンプトテシン（ＣＰＴ）によって引き起こされるカスパーゼ３／７の活性化に対する化合物ＮＳＴ００６０の１０μＭ及び４０μＭでの予備処理の効果を分析した。１５代継代を超えていない前記細胞を、接着細胞用に処理した９６ウェルプレート上に５×１０４細胞／ウェルの細胞濃度で播種した；プレートのうち３ウェルを各アッセイ条件用に播種した。
【００９５】
２４時間の細胞インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、１０μＭ及び４０μＭのＮＳＴ００６０で予備処理を行った。
【００９６】
２４時間後、下記条件について、１００μＬの総容積で細胞の処理を行った：
- コントロール：培地（培養液）
- カンプトテシン（ＣＰＴ）：５０μＭのＣＰＴを加えた培地は、１０μＭ及び４０μＭのＮＳＴ００６０で予備処理した両アッセイにおいて、並びに予備処理していない細胞で、アポトーシスを引き起こす。
- ＣＰＴプラスＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ：Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋを５０μＭで加えた、ＣＰＴ（上述の条件と同じ濃度）添加培地、カスパーゼの活性化の阻害の陽性コントロール。
【００９７】
これら処理薬と共に細胞を６時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）し、その後、細胞溶解バッファーと製造元によって指定された濃度のカスパーゼ基質とを加えた；これを室温で３０分間インキュベートし、次いで、−２０℃で一晩凍結させた。翌日、蛍光を測定した（４９９／５２１ｎｍ、Ｅｘｃｉ／Ｅｍｉ）。
【００９８】
図５は、様々な処置のコントロール細胞に関し、カスパーゼ３／７の活性化の割合を示す。ＮＳＴ００６０の１０μＭ及び４０μＭで５８％及び３２％のカンプトテシンに関してカスパーゼ３／７の阻害が観察され、このことは、かかる化合物の機能的抗アポトーシス効果を実証する。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは、カスパーゼ阻害剤として、カスパーゼ３／７の活性化を完全に阻害した。
【００９９】
［２．６．ＮＳＴ００６０での処理は、アポトーシスの細胞モデルにおいてＤＮＡ断片化を阻害する］
本実施例の先の節で得られた及び表された結果のため、本発明者らは、ＤＮＡ断片化を測定することによって、アポトーシスの新たな細胞モデルにおけるＮＳＴ００６０の効果を分析することを決めた、
【０１００】
第２．１節で説明したように維持した培養下のヒト神経胚ＳＫ−Ｎ−ＭＣに対して、アッセイを行った。
【０１０１】
トポイソメラーゼＩ酵素を阻害し、ＤＮＡ複製を妨げ、アポトーシス性細胞死を誘発するカンプトテシン（ＣＰＴ）での処理によって引き起こされるアポトーシスに対して、化合物ＮＳＴ００６０により阻害がもたらされる。１５代継代を超えていない前記細胞を、接着細胞用に処理した６ウェルプレート上に７×１０５細胞／ウェルの細胞濃度で播種した；プレートのうち２ウェルを各アッセイ条件用に播種した。
【０１０２】
２４時間の細胞インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、１０μＭ及び４０μＭのＮＳＴ００６０で細胞の予備処理を２４時間行った；続いて、これらを５０μＭのＣＰＴで６時間処理した。更に、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋを５０μＭで阻害についての陽性コントロールとして用いた。
【０１０３】
処理の後、細胞を培地と一緒に集め、３００×ｇで５分間、遠心分離した。培地を除去し、ＰＢＳで洗滌を行い、−２０℃で５００μＬの７０％エタノールを用いて２分間固定した。固定したら、これらを４００×ｇで５分間、遠心分離し、ＰＢＳで洗滌し、サイクリングバッファー（０．１％クエン酸ナトリウム、０．３％ノニデットＰ−４０及び０．０２ｍｇ／ｍＬのＲＮＡｓｅ）に希釈した０．０５ｍｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを加えて、３７℃で１時間インキュベートした。この後、これらをフローサイトメトリーにより解析して、ＤＮＡ量に関してヨウ化プロピジウムの蛍光と比較した。それぞれの条件のサブＧ１領域に関して、アポトーシスの割合を測定した。
【０１０４】
得られた結果を、図６に示すように、ＣＰＴによって引き起こされるアポトーシスに対する各処理の（ＤＮＡの断片化による）アポトーシスの割合として示す。１０μＭのＮＳＴ００６０で４１％の最大保護が観察された。そして、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは、ＣＰＴにより引き起こされるアポトーシスを特異的に阻害した。これらの結果は、化合物ＮＳＴ００６０が神経細胞起源のヒト細胞におけるアポトーシスに対して保護効果を示すことを表す。
【実施例３】
【０１０５】
［ＮＳＴ００６０での処理による２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ遺伝子（Ｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４）の細胞発現の誘導］
アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）由来の培養下のヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ株で、アッセイを行った。全ての事例において、無菌の厳格な規則に従い、欧州標準ＥＮ１２４６９に従って、第二種バイオセーフティキャビネット中で操作を行った。細胞を、次の培地中で維持した：１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸類、０．０５ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン及び１０％のウシ胎児血清を補充したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）。
【０１０６】
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて、Ｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子の発現を分析した。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を、ＮＳＴ００６０の不存在下（コントロール）又は１、４、１０若しくは４０μＭのＮＳＴ００６０の存在下で２４時間処理した。Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（ロシュ社）によって、全ＲＮＡを抽出し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００  ＮａｎｏＱｕａｎｔシステム（Ｔｅｃａｎ社）によって、そのＲＮＡの量及び品質を分析した。ＲＴ−ＰＣＲを２段階によって行い、最初に、ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡキット（アプライド・バイオシステムズ社）を用いて、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに形質転換し、続いて、７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ装置（アプライド・バイオシステムズ社）で、双方ともヒト特異的である、Ｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４について有用性が確認されているＨｓ００２０７３８８＿ｍ１プローブとＧＡＰＤＨについて有用性が確認されているＨｓ９９９９９９０５＿ｍ１プローブ（結果の正規化に用いる）とを用い、ＴａｑＭａｎプローブ法によって、遺伝子発現を分析した。アッセイは、３連で行った。ＳＤＳ  ｖ２．１．１ソフトウエア（アプライド・バイオシステムズ社）でΔΔＣｔ法を用いることによって、相対的な遺伝子発現量を測定した；ＧＡＰＤＨの発現量を用いて、結果を正規化した。
【０１０７】
得られた結果は、図７に示され、試験した全ての濃度のＮＳＴ００６０での処理でＳｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の増加が観察され、４μＭのＮＳＴ００６０ではコントロールに対して２．５倍の増加をもたらした。これらの結果は、ＮＳＴ００６０での処理が、Ｓｅｌａｄｉｎ−１／ＤＨＣＲ２４遺伝子発現の増加をもたらし、コレステロール生合成及び抗アポトーシス能力に関係することを表す。
【実施例４】
【０１０８】
［試験管内アッセイにおいてシンバスタチンと比較したＮＳＴ００６０の血液脳関門通過］
このアッセイの目的は、化合物ＮＳＴ００６０が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できるか否かを予測することであった。そのため、受動拡散による化合物の通過を考慮したサンドイッチシステムを使用した、いわゆるＰＡＭＰＡ（平行人工膜透過アッセイ）を用い、細胞を用いずに前記化合物を評価することを可能にする試験管内系において、ＢＢＢを模倣した。高い透過率を有する化合物であるベラパミルを陽性コントロールとして用い、一方、ＢＢＢを通過しない化合物であるテオフィリンを陰性コントロールとして用いた。類似構造を有し、ある程度はＢＢＢを通過できることが既に知られている化合物であるシンバスタチンをＮＳＴ００６０と一緒に試験した。
【０１０９】
血液脳関門を形成するものと非常に類似するリン脂質組成を有し且つＰＢＬ（ブタ脳極性脂質）としても知られるブタ脳由来の市販の脂質混合物を用いて、血液脳関門を模倣した。この混合物を、ガラスバイアル中でドデカンに１００μｇ／ｍＬにて溶解して−２０℃で保存した。ベラパミル及びテオフィリンをＤＭＳＯで１０ｍＭに調製した。ＮＳＴ００６０の酸型及びシンバスタチンの酸型を水中で調製し、０．１ＮのＮａＯＨで４℃にて１２時間活性化させた。
【０１１０】
アッセイの時点で、評価する化合物及びコントロール１．５ｍＬを調製した。全事例において、リン酸一ナトリウム（０．４１Ｍ）及びリン酸二カリウム（０．２８７Ｍ）を含有するｐＨ７．４のリン酸バッファー中に１００μＭで前記ストックを含んだ。そのため、化合物の１／１００希釈を行って、ＤＭＳＯ含有量を全事例で１％にした。
【０１１１】
１００μｇ／ｍＬの凍結ストックから調製した２０μｇ／ｍＬのＰＢＬを５μＬ、ＰＶＤＦ膜及び４５μｍの孔径を有する９６ウェルフィルタープレート（ＭＡＩＰＡＮ４５５０、ミリポア社）に加えた。２分後、化合物を希釈するのに用いたリン酸バッファー３００μＬを加えた。このプレートをアクセプタープレートと考え、サンドイッチの上部に置いた。３００μＬの前記化合物を別の９６ウェルプレートに３連で１００μＭにて加えて、先のプレートと組み立てた（ＭＡＴＲＡＮＰ５５０、ミリポア社）。更に、ブランクは、１％ＤＭＳＯを含む使用したリン酸バッファーのみを含んだ。このプレートをドナープレートと呼んだ。アクレプタープレートをドナープレート上に置いてサンドイッチシステムを形成した。研究対象の化合物は、ドナープレートのウェルからアクセプタープレートの対応するウェルへと１８時間拡散し、この間このシステムをそのままにした。準備した残りの化合物を、プレートによって形成したサンドイッチシステムと同じ湿度、温度及び暗所条件で保存した。その後、ドナープレート及びアクセプタープレートのウェルから１００μＬを特別なＵＶ測定用９６ウェルプレートに移した。更に、アッセイを行うために準備して同じように保存した化合物１００μＬをそのプレートに３連で移した（基礎ウェル）。ＵＶプレートを分光光度計に挿入し、４ｎｍごとに２３０〜４９８ｎｍのＵＶで測定してスキャンを行った。血液脳関門通過率及び有効透過率（Ｐｅ）を分光光度データから算出した。下記式は、を算出するのに適用される。
【数１】
2013540772.tif 000011
（式中、        
【数２】
2013540772.tif 000012
であり、
[Ｄｒｕｇ]ａｃｃｅｐｔｏｒ＝アクセプターウェルの吸光度であり、
[Ｄｒｕｇ]ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ＝基礎ウェルの平均値の吸光度／２であり、
ＶＡ＝アクセプターウェルの容積＝０．３ｃｍ３であり、
ＶＤ＝ドナーウェルの容積＝０．３ｃｍ３であり、
Ａｒｅａ＝０．２４ｃｍ３であり、
Ｔｉｍｅ＝６４,０００秒であった。
【０１１２】
ｃＬｏｇＰと略されるオクタノール／水分配係数の対数を計算することによって、化合物の脂容性の理論的計算値を得ることができ、これは、ＣＬＯＧＰプログラム（ＯＳＩＲＩＳ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）を用いて、化学構造をこのソフトウエアに入力することによって計算した。
【０１１３】
図８は得られた結果を示し、ヒドロキシ酸型の化合物ＮＳＴ００６０は、陽性コントロール（ベラパミル）に非常に近く且つシンバスタチンのものよりもはるかに高いＢＢＢ透過度を有することが分かる。このデータは、化合物ＮＳＴ００６０の高い脂容性と相関する。下記表（表１）は、この研究で得られたパラメータ（平均値±標準偏差）を示し、これは、血液脳関門通過（ＢＢＢ通過率）、有効透過率（Ｐｅ）、実験を行った数（ｎ）及び理論的脂容性の計算値（ＣＬＯＧＰ(ＯＳＩＲＩＳ  Ｐｒｏｐｅｒｔ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ)を用いて理論的に計算される。ｃＬｏｇＰ）を示す。
【０１１４】
【表１】
2013540772.tif 000013
【０１１５】
驚くべきことに、この実施例で示された結果は、化合物ＮＳＴ００６０の高い効率的ＢＢＢ通過を明確に示す。
【実施例５】
【０１１６】
［化合物ＮＳＴ００６０のコレステロール低下効果］
［５．１．シンバスタチンと比較したＮＳＴ００６０による試験管内での３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧＲ）酵素の活性化の阻害］
このアッセイの目的は、細胞内コレステロール合成及びその合成の生理学的制御における重要な酵素であるＨＭＧＲの化合物ＮＳＴ００６０による阻害の度合いを測定することであった。この化合物の効果を、ＨＭＧＲに対する強力な阻害効果が既に報告されているスタチンであるシンバスタチンの効果と比較した。
【０１１７】
反応の間、ＨＭＧＲは、ＮＡＤＰＨを還元剤として、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａを基質として使用する。それに続く反応の基質として用いられコレステロール合成を継続するメバロチン酸が、反応生成物として得られる。研究対象の酵素反応は、下に図式化される．
ＨＭＧＣｏＡ＋２ＮＡＤＰＨ＋２Ｈ＋→メバロチン酸＋２ＮＡＤＰ＋＋ＣｏＡＳＨ
【０１１８】
この試験管内アッセイは、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ基質の存在下でＨＭＧＲの触媒サブユニットによるＮＡＤＰＨの酸化を表わす３４０ｎｍでの吸光度の低下の分光光度測定に基づく。
【０１１９】
研究対象の化合物を超純水で１０ｍＭに調製し、０．１ＮのＮａＯＨで１２時間、４℃で活性化させた。アッセイを、９６ウェルプレートで２００μＬの合計反応容積にて行った。反応を行ったときに反応バッファー（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１ＭのＫＣｌ、２ｍｇ／ｍＬのウシ胎児血清[ＢＳＡ]及び５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ＝７．３）を調製し、３７℃で維持した。下記のものがアッセイに含まれた：
- ブランク：ＨＭＧＲを欠き、反応の間のＮＡＤＰＨの安定性について報告する。
- コントロール：反応の成分を全て含有するが、被験化合物を含まない。
- 被験化合物：ＮＡＴ００６０又はシンバスタチンが様々な濃度で反応バッファー中に溶解されている。
【０１２０】
両化合物の効果を、５つのアッセイにおいて２連で、また両化合物について並行して、０．０００４μＭ、０．００１μＭ、０．００４μＭ、０．０１μＭ、０．０４μＭ、０．１μＭ、０．４μＭ、１μＭ、４μＭ、１０μＭ及び４０μＭで評価した。被験化合物をプレート中の反応バッファーに加え、ＤＭＳＯ濃度を、反応の間に不干渉であることが既に実証されている１０μＬで統一した。反応混合物に関与する試薬の濃度は次のとおりであり、表記した順番で反応バッファーに加えて溶解させた：
- ＨＭＧＣｏＡ：０．２ｍＭ
- ＨＭＧＲ（ＧＳＴタンパク質に結合する触媒ドメイン）：３μＵ／反応
- ＮＡＤＰＨ：０．２ｍＭ。
【０１２１】
ＮＡＤＰＨは反応誘起化合物であり、よって、これを全てのウェルに同時に加えた。ＮＡＤＰＨを加えるごとに、ブランク及びコントロールを含めた。簡単に振盪した後、２０秒ごとに１２００秒間読み取らせる動態プログラムを用いて、分光光度計で、３４０ｎｍ、３７℃にてプレートを読み取った。
【０１２２】
３４０ｎｍでの吸光度の低下は、コントロールに対するＨＭＧＲ酵素活性の割合の計算を可能にするため、ＨＭＧＲ酵素活性に対する様々な化合物の阻害能力を、図９に示す曲線に基づいて５０％阻害定数（ＩＣ５０）を決定することによって算出した。ＩＣ５０は、Ｔｒｉｍｍｅｄ Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法（バージョン１．５）により決定した。この結果は、ＨＭＧＲに対するシンバスタチンの阻害効果を裏づけ（ＩＣ５０：８３．３±２４．３ｎＭ、２連で行った５つの独立アッセイ）、一方、驚くべきことにＮＳＴ００６０は前記酵素に対して高い阻害能力を示した（ＩＣ５０：１２６．０±３４．６ｎＭ、２連で行った５つの独立アッセイ）。
【０１２３】
［５．２．ヒト肝細胞株における細胞内総コレステロール値に対するＮＳＴ００６０及びシンバスタチンの塩形態での効果］
先の節の結果に基づき、本発明者らは、化合物ＮＳＴ００６０に関するＨＭＧＲ酵素の阻害活性がヒト肝細胞株における総コレステロールの変化と一致するか否かを調べることに決めた。
【０１２４】
このため、活性型の化合物ＮＳＴ００６０がヒト肝細胞癌株ＨｅｐＧ２において総コレステロール値を修飾できるか否かを決定する目的を有するアッセイを行った。ＮＳＴ００６０の効果を、既知のスタチンであるシンバスタチンの効果と比較した。このアッセイを行うため、化合物を超純水で１０ｍＭに調製し、０．１ＮのＮａＯＨにより４℃で１２時間活性化させた。化合物は、使用するまで−２０℃で保存した。
【０１２５】
アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）からＨｅｐＧ２株を入手した。継代で維持したこの細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸類及び０．０５ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補充したＭＥＭ中で９６ウェルプレートに播種した（４×１０４細胞／ウェル）。播種の２４時間後、細胞から８時間ＦＢＳを奪った。次いで、細胞を様々な濃度の処理薬と共に２０時間インキュベートした。インキュベーション時間の後、細胞をＰＢＳで洗滌し、０．５％のトリトンＸ−１００を含むリン酸バッファーで溶解させた。２回凍結融解により、溶解を完了させた。
【０１２６】
酵素手法及び蛍光手法により、総コレステロールを定量化した。２５μＬの各溶解液を、標準コレステロール曲線（０．０８μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬまで）と共に９６ウェルプレートに移した。コレステロールオキシダーゼ（０．５Ｕ／ｍＬ）、コレステロールエステラーゼ（０．８Ｕ／ｍＬ）、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（４Ｕ／ｍＬ）及びＡｍｐｌｉｆｌｕレッド（２０μｇ／ｍＬ）を含有する０．０５Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）をベースとして調製した反応混合液７５μＬを試料に加えて、３７℃で１５分間インキュベーションを行った。蛍光分光器により５３０ｎｍの励起及び５８０ｎｍの発光で蛍光強度を測定した。結果を、ＢＣＡ法を用いて決定したタンパク質量により標準化した。
【０１２７】
図１０は、驚くべきことに、ＮＳＴ００６０が、シンバスタチンによって発揮されたのと同様に前記細胞においてどれほど総コレステロールの低下をもたらしたかを示す。このデータは、ＨＭＧＲに対して発揮され且つ先の節で示された阻害の結果として、ＮＳＴ００６０のコレステロール低下能力を裏付ける。
【実施例６】
【０１２８】
［ゼブラフィッシュ胚における化合物ＮＳＴ００６０の生物学的安全性の研究］
［６．１．シンバスタチン処理と比較したＮＳＴ００６０処理後のゼブラフィッシュ胚における生存率の分析。急性毒性アッセイ］
化合物ＮＳＴ００６０の生物学的安全性を評価するため、ＯＥＣＤ  Ｃ．１５プロトコル「魚、胚及び嚢に対する短期間毒性試験−稚魚段階」半止水式法に準拠して安全性パラメータを測定することにより、ゼブラフィッシュ胚モデルに対するその毒性学的影響を分析した。
【０１２９】
ゼブラフィッシュ（ダニオ・レリオ(Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ)、ＡＢ系統）の自然交配により、受精卵を得た。各交配に合計８〜１０ペアを用い、１ペアあたり平均して合計２００〜２５０個の卵が産まれた。産卵直後に卵を集め、ＯＥＣＤ法Ｃ．１のＥＣ規則４４０／２００８に準拠して、ｐＨ７．８±０．２に調整した希釈水（０．２９ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ２、０．１２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２、０．０６５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、０．００６ｇ／ＬのＫＣｌ）で洗滌し、ペトリ皿に置いた。
【０１３０】
発生の最初期段階での曝露を確実にするために、試験する化合物の溶液を用いて、卵を素早く別のペトリ皿に移した（１条件あたり最低限５０個）。続いて、ピペットを用いて、受精卵のみ（１実験条件あたり３０個）をペトリ皿から曝露チャンバー（Ｍ９６マイクロタイタープレート）に移し、希釈水（コントロール）又は様々な濃度の処理薬（１〜１００ｍｇ／ｋｇ）を用いて、評価する物質（ＮＳＴ００６０及びシンバスタチン）に曝露した。追加の通気なしに適切な温度（２５±１℃）で、胚をインキュベートした。更に、操作プロセスの間の汚染を防ぐため厳格な予防策を講じた。実験は、処理後７２時間で行い、処理は毎日新しくし、これにより半止水式アッセイを行った。３個の胚それぞれの１０の複製を用い、次の処理計画に従って、各実験を行った：
- ３０のコントロール動物、希釈水をアッセイの終了まで毎日取り替えて処理した；
- ３０の化合物ＮＳＴ００６０処理動物（３個の胚全てについて１０個の複製）、希釈水で１〜１００ｍｇ／ｋｇの用量に希釈した化合物ＮＳＴ００６０で処理し、アッセイが継続する日数の間、毎日その物質を取り替えた；
- ３０のシンバスタチン処理動物（３個の胚全てについて１０の複製）、希釈水で１〜１００ｍｇ／ｋｇの用量に希釈したシンバスタチンで処理し、アッセイが継続する日数の間、毎日その物質を取り替えた。
【０１３１】
研究対象物質に対する曝露の期間の後、幼生の死亡率成績を決定し、その結果を下記表２に示す。この表は、実験に使用した幼生の数、ｍｇ／Ｋｇ（動物の体重）での用量、処理期間、及び全体に対して死亡した幼生数を示す。
【０１３２】
研究の結果は、両化合物が、ゼブラフィッシュ幼生で死亡を誘導するパラメータに関して非常に類似した毒物学的プロフィールを有することを示し、ＮＳＴ００６０群では１０ｍｇ／Ｋｇの用量で３０動物のうち７匹の死が観察され、シンバスタチンを同じ用量及び期間で用いて１６匹の死亡が観察された。両方の処理群の間で統計的に有意な相違は検出されなかった（スチューデントｔ検定）。
【０１３３】
【表２】
2013540772.tif 000014
【０１３４】
上記表に現した結果は、驚くべきことに、化合物ＮＳＴ００６０が少なくともシンバスタチンと同程度に安全であることを示す。
【０１３５】
［６．２．シンバスタチンと比較した化合物ＮＳＴ００６０への曝露後の健常な幼生の割合の分析。急性毒性アッセイ。］
先の節の結果に基づき、本発明者らは、処理に起因する死亡率の変化が、外部病態生理学的異常（形態的及び／行動的）の症状を示さない生きた幼生の数として定義される健常な幼生の割合の測定によって裏付けられるか否かを調べることに決めた。後者は、研究対象物質の生物学的安全性を決定するパラメータであり、生存率を補完するものである。
【０１３６】
図１１に示すように、評価した２つの処理薬間で、１ｍｇ／Ｋｇ及び３ｍｇ／Ｋｇの用量で健常な幼生の割合に相違が観察され、１ｍｇ／Ｋｇの用量で化合物ＮＳＴ００６０は１００±０．０％及びシンバスタチンは５０．０±２２．４％であり、３ｍｇ／Ｋｇの用量で化合物ＮＳＴ００６０は８６．７±６．２％及びシンバスタチンは５０．０±２２．４％に到達し、驚くべきことに、ゼブラフィッシュ幼生モデルにおいて化合物ＮＳＴ００６０のより良い生物学的安全性が示された。
【０１３７】
これらの結果は、ＮＳＴ００６０がシンバスタチンよりも良好な生物学的安全性プロフィールを有することを示す。
【０１３８】
［６．３．シンバスタチンと比較した化合物ＮＳＴ００６０の心毒性の用量に応じた変化の分析］
先の節の結果に基づき、本発明者らは、様々な化合物を用い様々な用量で処理した後の心毒性を分析することにより、シンバスタチンと比較して化合物ＮＳＴ００６０の高い生物学的安全性が裏付けられるかを調べることに決めた。このパラメータ（心毒性）の研究は、動物の心拍数を測定するだけでなく、心拍の変化（頻脈、徐脈等）又は心臓の発達異常（心膜炎、萎縮、肥大等）も決定することを可能にする。
【０１３９】
ゼブラフィッシュ胚又は幼生の心拍の測定は、視覚的に行われる。心拍（手動カウンターの助けにより）を、拡大鏡（４〜４０×拡大）により１５秒間計測した。１処理当たり使用した合計で３０動物のうちの１２の心拍を計測した。得られた心拍数に４をかけて、動物の１分あたりの心拍数を得た。
【０１４０】
結果は図１２に示され、胚又は幼生の心拍数のコントロールに対する割合は、使用する用量に依存することが分かる。７２ｈｐｔで、３ｍｇ／Ｋｇ及び１０ｍｇ／Ｋｇの用量のシンバスタチンで処理した幼生のコントロールに対する心拍数の有意な現象が観察される。ＮＳＴ００６０について、１０ｍｇ／Ｋｇの用量では心拍数の減少が例外的に検出されるが、驚くべきことに３ｍｇ／Ｋｇでは検出されない。加えて、ＮＳＴ００６０及びシンバスタチンについて１ｍｇ／Ｋｇ及び３ｍｇ／Ｋｇの用量での心拍数の比較は、ＮＳＴ００６０がシンバスタチンよりも生物学的に安全であることを示す。従って、概して、ＮＳＴ００６０は心毒性研究においてシンバスタチンよりも良好に機能した。
【実施例７】
【０１４１】
［マウスの全身性炎症モデルにおけるＮＳＴ００６０の抗炎症効果］
［７．１．ＮＳＴ００６０及びシンバスタチンの抗炎症効果の比較研究］
本発明者らは、当該分子の特徴及び特性を前提として、コレステロール低下活性及び神経保護活性に関して別の活性を評価する必要を考えた。この理由のため、化合物ＮＳＴ００６０の抗炎症能力を、抗炎症効果が報告されている化合物であるシンバスタチンと比較して評価した。この活性を評価するため、サイトカイン媒介性、主としてＴＮＦ−α媒介性の炎症応答を誘導するグラム陰性細菌の構成成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）によって誘導されるマウスの全身性ショックモデルを用いた。
【０１４２】
実験過程の間に含まれる動物は全て１２週齢のオスのＣ５７ＢＬ６マウスであった。実験は、「動物の操作に関する手引き」と題された基準 (Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ, Ａｃｔ. １９８６)に厳しく準拠して行った。動物は、それぞれの検疫期間を経て、処置及び取り扱いの間の汚染の可能性を最小限にするために最大限の予防策を講じて処理された。
【０１４３】
マウスを３群に分けた：コントロール群（ｎ＝８）；シンバスタチン群（ｎ＝８）；ＮＳＴ００６０群（ｎ＝８）。５０ｍｇ／Ｋｇのシンバスタチン又はＮＳＴ００６０を１２時間の間隔を空けて２用量、マウスに腹腔内投与した。両事例において、０．５％メチルセルロースを含む生理食塩水を、ビヒクルとして用い、同じ投与計画でコントロール群のマウスに投与した。８ｍｇ／ＫｇのＬＰＳの単回腹腔内注射による最終処理１時間後に、末梢全身性炎症が誘導された。２時間後血液を採取し、血漿を得て用い、ＥＬＩＳＡでＴＮＦαの血漿中濃度を分析することにより、抗炎症効果を評価した。
【０１４４】
図１３は、ＬＰＳの接種２時間後にＴＮＦαの血中レベルが劇的に増加することを示す。そして、シンバスタチン及びＮＳＴ００６０双方の投与が、コントロール群に対して有意に、ＴＮＦαの血中レベルの大きな低下をもたらす。化合物ＮＳＴ００６０は、このレベルで驚くほど強力であり、シンバスタチン群に対して統計的に有意なＴＮＦα血漿中レベルの低下をもたらした。従って、概して、ＮＳＴ００６０はシンバスタチンよりも良好な抗炎症性能を示した。
【０１４５】
［７．２．マウスの全身性ショックモデルにおける全体症状評価による、炎症マーカー、生存率及び炎症応答に関するＮＳＴ００６０の効果］
化合物ＮＳＴ００６０の驚くべき抗炎症能力を実証して、本発明者らは、前記抗炎症効果を更に研究すること並びに同じ全身性ショックモデルにおいて処理薬の生存率及び全体症状に対する化合物ＮＳＴ００６０の効果を判断することが好都合であると考えた。
【０１４６】
そのため、含まれる動物全てが１２週齢のオスのＣ５７ＢＬ６マウスである追加のアッセイを行った。実験は、「動物の操作に関する手引き」と題された基準(Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ, Ａｃｔ. １９８６)に厳しく準拠して行った。動物は、それぞれの検疫期間を経て、処置及び取り扱いの間の汚染の可能性を最小限にするために最大限の予防策を講じて処理された。
【０１４７】
マウスを３群に分けた：コントロール群（ｎ＝８）；コントロール＋ＬＰＳ群（ｎ＝１６）；ＮＳＴ００６０＋ＬＰＳ群（ｎ＝１６）。５０ｍｇ／ＫｇのＮＳＴ００６０（そのラクトン形態で）を１２時間の間隔を空けて２用量、マウスに腹腔内投与した。０．５％メチルセルロースを含む生理食塩水を、ビヒクルとして用い、同じ投与計画でコントロール群のマウスに投与した。８ｍｇ／ＫｇのＬＰＳの単回腹腔内注射による最終処理１時間後に末梢全身性炎症が誘導された。マウスの半分に全身性ショックが誘導され（コントロール＋ＬＰＳ群の８動物及びＮＳＴ００６０＋ＬＰＳ群の８動物）、ＬＰＳの接種２時間後に屠殺した。血液を採取し、血漿を得て、両方とも凍結させた。ＬＰＳで処理した動物の残り半分から、ＬＰＳの注射４時間後に血液を採取し、血漿を得た。これら動物をその後１５日間観察し、死亡率を決定し、０〜３（０＝全身症状なし；１＝中程度の嗜眠及び低体温；２＝深刻な嗜眠、下痢及び震え；３＝完全な不動）のスコア順位付けにより、損傷を評価した。ＬＰＳの代わりに生理食塩水の腹腔内投与を行ったコントロール動物は、その後の結果の比較のために２ｈｐｉ及び４ｈｐｉで血液を採取した後、研究の最後に屠殺した。得られた血漿中の炎症サイトカインＴＮＦα及びＩＬ−１βの濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて評価した。
【０１４８】
図１４は、様々な処理群に対応する動物の生存率を表し、ＬＰＳによって誘導される死亡がＮＳＴ００６０の投与によって統計的に有意な様式で妨げられ、このことは化合物ＮＳＴ００６０の抗炎症活性を示す。この神経保護効果は、ＬＰＳの注射後に生存している動物によって示された全身症状に関連するスコア（２４時間で統計的に有意であった）を示す図１５で分かるように、全身性ショック過程の低い重症度にも反映される。加えて、図１６で分かるように、ＮＳＴ００６０での処理は、ＬＰＳの２時間後及び４時間後の両方で炎症応答の低下をもたらした。ＮＳＴ００６０での処理は、更に、図１７に示すように、ＬＰＳの２時間後に血漿中のサイトカインＩＬ−１βレベルの統計的に有意な低下をもたらした。
【０１４９】
従って、概して、化合物ＮＳＴ００６０は、シンバスタチンのものよりも驚くほど高い、高度な抗炎症活性を有する。
【実施例８】
【０１５０】
［興奮毒性物質の作用に対するＮＳＴ００６０の抗てんかん効果］
動物における神経毒性物質の投与は、動物に時折てんかん性発作及びけいれんを誘導することが知られている。従って、本発明者らは、ＮＳＴ００６０の神経保護効果が興奮毒性物質によって引き起こされるてんかんに対する抗てんかん効果を伴うか否か研究することを決めた。
【０１５１】
実験過程の間に含まれる動物は全て、ＦＶＢ／ＮＨａｎ系統由来の１２週齢のオスであった。実験は、「動物の操作に関する手引き」と題された基準 (Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ, Ａｃｔ. １９８６)に厳しく準拠して行った。動物は、それぞれの検疫期間を経て、処置及び取り扱いの間の汚染の可能性を最小限にするために最大限の予防策を講じて処理された。
【０１５２】
動物に、ＰＢＳで溶解した２５ｍｇ／Ｋｇのカイニン酸の塩又はエステル（ＫＡ）を腹腔内接種した。１４匹の動物に、ＫＡ接種の２４時間３０分前で、０．２５％のメチルセルロースを含むＰＢＳを腹腔内注射して予備処理し（ビヒクル＋ＫＡ投与計画）、１４匹に、ＫＡ接種の２４時間３０分前で、５０ｍｇ／Ｋｇの用量の化合物ＮＳＴ００６０を腹腔内注射して予備処理した（ＮＳＴ００６０＋ＫＡ投与計画）。接種の後、動物を別々のトレーで飼育してモニターした。観察の間、少なくとも接種後１２０分間（ｍ．ｐ．ｉ．）のあいだ１０分毎に動物のてんかんの最高レベルをＲａｃｉｎｅスケールに従って記録した。
【０１５３】
続いて、ビヒクルでの処理（ビヒクル＋ＫＡ）とＮＳＴ００６０での処理（ＮＳＴ００６０＋ＫＡ）との間で、てんかん発作現象の比較研究を行った。下記表（表３）に示すように、てんかん重積症に突入した、すなわち、強直関代性発作を提示する動物の割合に相違が観察され、ビヒクル＋ＫＡ群は９３％（１４匹のうちの１３匹）であるのに対しＮＳＴ００６０＋ＫＡ群の中では３６％（１４匹のうちの５匹）であり、このことは、化合物ＮＳＴ００６０が抗けいれん薬であることを実証した。更に、少なくとも３０分休みなしに続くてんかん重積症に突入した、すなわち、強直関代性発作を提示する動物の割合に相違が観察され、ビヒクル＋ＫＡで処理した処理計画群は７９％（１４匹のうちの１１匹）であるのに対しＮＳＴ００６０＋ＫＡ群の中では２９％（１４匹のうちの４匹）であり、このことは、化合物ＮＳＴ００６０が抗けいれん薬に加えて抗てんかん薬であることを実証した。
【０１５４】
【表３】
2013540772.tif 000015
【０１５５】
これらの結果のため、本発明者らは、ＮＳＴ００６０の抗てんかん効果が潜伏期（最初のけいれんが起こる時期）の遅延を伴うか否か調べることを決めた。図１８に示すように、両方の群の間で潜伏時間に相違が観察され、ＮＳＴ００６０＋ＫＡ群では１００分を上回り、これはビヒクル＋ＫＡ処理計画の場合（４５．７±７．５分）よりも統計的に有意な様式で（ｐ＜０．０５）長く、化合物ＮＳＴ００６０の抗てんかん特性及び抗けいれん特性を裏付けた。
【０１５６】
これらの結果に基づき、本発明者らは、その抗てんかん及びこうけいれん効果が、ＫＡの接種２時間後に観察されるてんかんのレベル及び症状の重症度で確認されるか否か調べることを決めた。図１９に示すように、ビヒクル＋ＫＡ投与計画を用いた群の動物は、やがて、特に４０分後の、様々な時点において、Ｒａｃｉｎｅスケールで４を上回るてんかんレベルに到達し、一方、ＮＳＴ００６０＋ＫＡ投与計画は、どの時点においてもＲａｃｉｎｅスケールで３より大きな平均てんかんレベルを引き起こさなかった。実際、ＫＡによって引き起こされるてんかん発作症状の発症速度及び重症度が、ＮＳＴ００６０での処理とビヒクルでの処理との間で統計的に有意な様式で異なる（Ｆ(１．２６)＝６．８０１６；ｐ＝０．０１４９；ＡＮＯＶＡ検定とＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定による一般分散分析）。
【０１５７】
これらの結果は、興奮毒性物質の投与に対する化合物ＮＳＴ００６０の抗てんかん及び抗けいれん能力を決定的に示す。
【実施例９】
【０１５８】
［興奮毒性物質により誘導された脳の酸化ストレスに対するＮＳＴ００６０の生体内抗酸化効果］
興奮毒性物質の作用に対する化合物ＮＳＴ００６０の抗てんかん及び抗けいれん能力を知って、本発明者らは、興奮毒性物質をマウスに投与したときに、興奮毒性に対してＮＳＴ００６０により示されるこの神経保護効果が、脳内で発生する酸化ストレスの低下を伴うか否か調べることを決めた。
【０１５９】
実験過程の間に含まれる動物は全て、酸化ストレスにより調節され、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子に結合した遺伝子のプロモーター有する遺伝子構築物のキャリアであるＦＶＢ／Ｎ系統由来の１２週齢のオスであった。実験は、「動物の操作に関する手引き」と題された基準(Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ, Ａｃｔ. １９８６)に厳しく準拠して行った。動物は、それぞれの検疫期間を経て、処置及び取り扱いの間の汚染の可能性を最小限にするために最大限の予防策を講じて処理された。
【０１６０】
動物に、ＰＢＳで溶解した２５ｍｇ／Ｋｇのカイニン酸の塩又はエステル（ＫＡ）を腹腔内接種した。７匹のマウスに、ＫＡ接種の２４時間３０分前と、続いて接種後毎日最長７日目まで、０．２５％のメチルセルロースを含むＰＢＳをビヒクルとして腹腔内注射して予備処理し（ビヒクル＋ＫＡ投与計画）、別の７匹に、ＫＡ接種の２４時間３０分前と、続いて接種後毎日最長７日目まで、５０ｍｇ／Ｋｇの用量の化合物ＮＳＴ００６０を腹腔内注射して予備処理した（ＮＳＴ００６０＋ＫＡ投与計画）。接種の後、動物を別々のトレーで飼育してモニターした。加えて、コントロールとして役立つように、３匹のマウスを全ての投与でビヒクルのみ用いて処理して、ＫＡ注射を受けさせなかった。脳内の酸化ストレスは、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａシステム（Ｃｌｉｐｅｒ  ＬＳ）を用いて生体内生物発光技術によりモニターした。実験群の全てにおいて−１ｄｐｉ（ベースラインシグナル）及び１ｄｐｉ、２ｄｐｉ、３ｄｐｉ、４ｄｐｉで画像取得を行った。画像取得に先立って、動物に１５０ｍｇ／ＫｇのＤ−ルシフェリンを腹腔内接種した。次いで、マウスを３％ノイソフルオランで２分間麻酔した。ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａシステム内に収容してから、画像取得時間中、１．５％イソフルオラン、０．２Ｌ／分／マウスのＯ２及び２Ｌ／分／マウスの圧縮空気を用いてマウスを麻酔したままにした。Ｄ−ルシフェリンの投与１５分後に、５分の取得時間、高感度位置で、光子放出画像を撮影した。
【０１６１】
異なる実験群の光子放出動態の画像を示す図２０に示されるように、ＫＡの投与は、１ｄｐｉから４ｄｐｉまで脳内の酸化ストレスの有意な増加を誘導し、その時点で、脳内の遺伝子発現の大きな増加が記録された。驚くべきことに、ＫＡを接種してＮＳＴ００６０で処理した動物は、研究した動態全体を通じて、酸化ストレスに関連する前記遺伝子発現の有意な増加を示さなかった。
【０１６２】
異なる実験群に対応する対象者全ての平均シグナルの定量化を表す図２１に示されるように、ＫＡの投与は、１ｄｐｉから４ｄｐｉまで脳内の酸化ストレスの有意な増加を誘導し、その時点で、脳内の遺伝子発現の大きな増加が記録された。驚くべきことに、ＫＡを接種してＮＳＴ００６０で処理した動物は、研究した動態全体を通じて、酸化ストレスに関連する前記遺伝子発現の有意な増加を示さなかった。
【０１６３】
これらの結果は、化合物ＮＳＴ００６０が抗酸化特性を有することと、脳の場合において、この化合物が、興奮毒性物質の投与によって引き起こされる酸化ストレスに対して保護することを示す。
【実施例１０】
【０１６４】
［マウスにおける興奮毒性物質の急性投与により引き起こされる死に対するＮＳＴ００６０の保護効果］
マウスにおける興奮毒性物質の作用に対する化合物ＮＳＴ００６０の抗てんかん、抗けいれん及び抗酸化能力を知って、本発明者らは、興奮毒性に対してＮＳＴ００６０により示されるこの保護効果が、マウスにおける興奮毒性物質により引き起こされる死のレベルの低下を伴うか否か調べることを決めた。
【０１６５】
実験過程の間に含まれる動物は全て、ＦＶＢ／ＮＨａｎ系統由来の１２週齢のオスであった。実験は、「動物の操作に関する手引き」と題された基準(Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ, Ａｃｔ. １９８６)に厳しく準拠して行った。動物は、それぞれの検疫期間を経て、処置及び取り扱いの間の汚染の可能性を最小限にするために最大限の予防策を講じて処理された。
【０１６６】
動物に、ＰＢＳで溶解した２５ｍｇ／Ｋｇのカイニン酸の塩又はエステル（ＫＡ）を腹腔内接種した。１４匹の動物に、ＫＡ接種の２４時間３０分前と、続いて接種後毎日最長７日目まで、０．２５％のメチルセルロースを含むＰＢＳをビヒクルとして腹腔内注射して予備処理し（ビヒクル＋ＫＡ投与計画）、１４匹に、ＫＡ接種の２４時間３０分前と、続いて接種後毎日最長７日目まで、５０ｍｇ／Ｋｇの用量の化合物ＮＳＴ００６０を腹腔内注射して予備処理した（ＮＳＴ００６０＋ＫＡ投与計画）。接種の後、動物を別々のトレーで飼育してモニターした。加えて、コントロールとして役立つように、８匹のマウスを全ての投与でビヒクルのみ用いて処理して、ＫＡ注射を受けさせなかった。実験全体を通して異なる処理群における死亡を記録し、このデータを用いて、図２２に示す対応生存曲線を確立した。
【０１６７】
この結果は、２５ｍｇ／Ｋｇの用量の腹腔内ＫＡ投与がマウスの死亡の統計的に有意な増加を引き起こすことを示した。驚くべきことに、ＫＡの接種の前後のＮＳＴ００６０での処理は、観察される死亡率を統計的に有意な様式（Ｐ＜０．０５）で低減する。
【０１６８】
これらの結果は、化合物ＮＳＴ００６０が、興奮毒性物質により引き起こされる死亡について生存個体を増加させることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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