(57)【要約】  本発明は、微生物による感染症及び／又は前記感染症に関連する症状を治療及び／又は予防するための血液凝固第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）、薬学的有効量の前記ＦＸＩＩＩを含んでなる医薬組成物、薬学的有効量の前記ＦＸＩＩＩを含んでなる薬剤の製造方法、及び薬学的有効量の前記ＦＸＩＩＩを、必要な患者に投与することを含む治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物による感染症及び／又は該感染症に関連する症状を治療及び／又は予防するための血液凝固第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）。
【請求項２】
ＦＸＩＩＩが濃縮製剤として用いられるか又は投与される、請求項１に記載のＦＸＩＩＩ。
【請求項３】
ＦＸＩＩＩがヒト血漿から単離されているか又は組換え型タンパク質として提供される、請求項１又は２に記載のＦＸＩＩＩ。
【請求項４】
治療及び／又は予防が、
（ｉ）患者の血漿中のＦＸＩＩＩ濃度が、健常者の血漿中のＦＸＩＩＩ濃度より上に増加するように、ＦＸＩＩＩが患者に投与されること、及び／又は
（ｉｉ）患者の血漿中のＦＸＩＩＩの初期濃度がその正常レベルの最大で１０倍までであるように、ＦＸＩＩＩが患者に投与されること、及び／又は
（ｉｉｉ）ＦＸＩＩＩが、先天性又は後天性ＦＸＩＩＩ欠乏症に罹患していない患者に投与されること、
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＦＸＩＩＩ。
【請求項５】
治療及び／又は予防が、ＦＸＩＩＩが全身的に又は局所的に患者に、好ましくは感染部位に局所的に投与されることを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＦＸＩＩＩ。
【請求項６】
治療及び／又は予防が、ＦＸＩＩＩが体重１ｋｇ当たり５〜１０００国際単位（ＩＵ）、好ましくは体重１ｋｇ当たり５〜５００ＩＵ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり５〜３００ＩＵ、さらにより好ましくは体重１ｋｇ当たり５〜２５０ＩＵ、なおより好ましくは体重１ｋｇ当たり１０〜２００ＩＵの用量で患者に投与されることを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦＸＩＩＩ。
【請求項７】
治療及び／又は予防が、患者の身体における微生物の全身性播種の抑制、不動化及び／又は死滅のためである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＦＸＩＩＩ。
【請求項８】
微生物が、線維素溶解を支持又は強化できる、プラスミノーゲンを活性化できる、そして／又はストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、タンパク質Ｐｌａ、線維素溶解酵素、線維素溶解を活性化する化合物又は他の細菌タンパク質からなる群より選ばれるプラスミノーゲン活性化タンパク質を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＦＸＩＩＩ。
【請求項９】
微生物が、プラスミノーゲン活性化の少なくとも１つの阻害因子の血漿中濃度を低下させ得る少なくとも１つの表面及び／又は細胞壁タンパク質を担持することによって線維素溶解を支持又は強化でき、該タンパク質が、好ましくはタンパク質ＧＲＡＢ（化膿連鎖球菌）、オーレオリシン（黄色ブドウ球菌）、炭疽菌の分泌中性メタロプロテアーゼ、及びペプトストレプトコッカスミクロスの分泌プロテアーゼからなる群より選ばれる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＦＸＩＩＩ。
【請求項１０】
微生物が、細菌、−好ましくは固形細胞壁を有しそして／又はグラム陽性である細菌からなる、より好ましくは好気性及び通性嫌気性球桿菌の科の細菌からなる、さらにより好ましくはストレプトコッカスからなる、なおより好ましくは溶血性連鎖球菌からなる、最も好ましくは化膿連鎖球菌である−細菌、酵母、ウイルス及び多細胞寄生生物からなる群より選ばれる、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＦＸＩＩＩ。
【請求項１１】
感染症が、皮膚、呼吸器系、咽喉、肺、脾臓、肝臓、腎臓、心血管系、心臓、中枢神経系、消化器系、尿生殖器系、筋肉及び軟組織からなる群の１つ若しくはそれ以上の組織から選ばれる感染症であるか、又は患者の身体の全身感染症にすでに進行している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＦＸＩＩＩ。
【請求項１２】
症状が、炎症、頭痛、発熱、下痢、疼痛、意識喪失又はそれらの１つ若しくはそれ以上の組み合わせからなる群より選ばれる請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＦＸＩＩＩ。
【請求項１３】
請求項１及び４〜１２のいずれか１項に定義されたような微生物による感染症及び／又は該感染症に関連する症状を治療及び／又は予防するための、薬学的有効量の請求項１〜３のいずれか１項に定義されたＦＸＩＩＩ、並びにヒトアルブミン、グルコース、塩化ナトリウム、水及びｐＨ調整用のＨＣｌ又はＮａＯＨからなる群より選ばれる１つ又はそれ以上、を含んでなる医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１及び４〜１２のいずれか１項に定義されたような微生物による感染症及び／又は該感染症に関連する症状を治療及び／又は予防するための、薬学的有効量の請求項１〜３のいずれか１項に定義されたＦＸＩＩＩ又は請求項１３に定義された医薬組成物を含んでなる薬剤の製造方法。
【請求項１５】
請求項１及び４〜１２のいずれか１項に定義されたような微生物による感染症及び／又は該感染症に関連する症状を治療及び／又は予防するために、薬学的有効量の請求項１〜３のいずれか１項に定義されたＦＸＩＩＩ又は請求項１３に定義された医薬組成物を、必要な患者に投与することを含む、治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物による感染症及び／又は前記感染症に関連する症状を治療及び／又は予防するための血液凝固第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）、薬学的有効量の前記ＦＸＩＩＩを含んでなる医薬組成物、薬学的有効量の前記ＦＸＩＩＩを含んでなる薬剤の製造方法、及び薬学的有効量の前記ＦＸＩＩＩを必要とする患者に投与することを含む治療方法に関する。
【０００２】
本明細書には、特許出願及び製造者のマニュアルを含む多くの文書が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連するとみなされるわけではないが、全体として参照により本明細書に組み込まれている。より詳しくは、参照されたすべての文書は、それぞれ個々の文書が、参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、同じ範囲まで参照により組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
セリンプロテアーゼカスケードは、止血、免疫応答及び創傷治癒を含む多くの病態生理学的過程において重要な役割を果たしている（総説については、非特許文献１を参照のこと）。通常、タンパク質限定加水分解（limited proteolysis）及び凝固によってそれらの活性化が起こり、そして補体（complement）は、おそらくヒトにおいて最も特徴づけられたセリンプロテイナーゼカスケードである。系統発生的研究は、２つの系が４億年を超える昔に発生したことを示しており（非特許文献２；非特許文献３）、そしてそれらは真核細胞中の共通祖先から共進化したことが提案されている（非特許文献４）。特に、凝固及び補体カスケードは、例えばショウジョウバエ（Drosophila）の背腹極性（Toll受容体のリガンド、Spaetzleの活性化を導く）及びカブトガニ（horseshoe crab）の血リンパ凝固系（非特許文献４）を調節する他のセリンプロテアーゼカスケードと驚くほどの収束進化を共有している。これらの発見は、旧口動物と新口動物の分岐前にいくつかのタンパク質分解カスケードの基本的モチーフが長く存在したことを示唆している（非特許文献５）。後者の２つの系（Spaetzleの活性化及びカブトガニ血リンパ凝固系）は、祖先免疫の重要な成分であり、それは、完全にではなくても、大いに先天性免疫系に依存していることに留意する必要がある。補体系は、３０年を超える間、先天性免疫系の一部である考えられていたが、凝固も初期免疫防御に加わることは、最近になってしか認められていない（総説については、非特許文献６を参照のこと）。後者の研究では、サイトカインの放出及びプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）の活性化のような、炎症誘発性及び抗炎症性反応を引き起こす凝固カスケードの能力に主な焦点があてられていた。しかし、凝固を拡張することで、侵入微生物の除去に能動的に寄与することができることについては、ほとんど知られていない。
【０００４】
本発明に関しては、凝固系が抗菌活性を発揮するどうかが研究された。特に注目したは、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）の役割であり、その昆虫相同体（homologue）（トランスグルタミナーゼ）は、近年、ショウジョウバエ感染症モデルの細菌性病原体に対する免疫応答において保護的役割を果たしていることが見出された（非特許文献７）。本発明では化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）を用いたが、この細菌は、最も重要なヒト細菌性病原体の１つと考えられており、ＷＨＯの推定によれば、世界的に重度感染症の少なくとも１８００万件の症例の原因となっており（毎年１７８万件の新たな症例）、そして毎年５０万人を超える人が死亡している（非特許文献８）。化膿連鎖球菌による感染症は、通常、表在性及び自己限定性であるが、高い罹病率及び死亡率を伴う壊死性筋膜炎及び連鎖球菌中毒性ショック症候群（ＳＴＳＳ）のような重篤な及び致命的状態に進展することがある（総説については、非特許文献９を参照のこと）。化膿連鎖球菌が、同じ感染症モデルにおいて局所性及び全身性感染症を発症しうるという事実から、化膿連鎖球菌は、本発明で研究される理想的な病原体となっている。
【０００５】
さらに、これまでの既存の抗菌剤は、いずれも、増大する病原性微生物菌株によりそれらに対して生じた耐性のため効果がなくなっている。従って、理想的には、不可能でなければ、病原性微生物が耐性を生じて、それにより抑制及び最終的に死滅を回避するのをより困難にする新たな作用様式に基づいた新たな抗菌剤に対して強い需要がある。
【０００６】
試験管内実験においてビオチン−カダベリン（Ｂ−ｃａｄ）のような標識人工基質及びマーカー分子を用いた機構的研究から、正常ショウジョウバエ（Drosophila）血リンパ又はヒト血漿中に存在するトランスグルタミナーゼ又はＦＸＩＩＩの活性は、それぞれ、血リンパのマトリックス又は血液クロット（blad clt）中に病原性大腸菌（E. coli）又は黄色ブドウ球菌（S. aureus）を隔離（sequestration）することが知られている（非特許文献７）。
【０００７】
しかし、細菌が、生体内でもこのように固定化されうることは、まだ示されていない。さらにまた、生物に侵入する微生物を、単純な固定化によって、その宿主生物の全身における全身性拡散から防ぐことができるかどうかは、特に興味深い。最後に、感染した宿主生物中で微生物の死滅を最終的に達成することも、依然として望ましいことである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Page, M.J., and Di Cera, E. (2008). Serine peptidases: classification, structure and function. Cell Mol Life Sci 65, 1220-1236.
【非特許文献２】Davidson, C.J., Tuddenham, E.G., and McVey, J.H. (2003). 450 million years of hemostasis. J Thromb Haemost 1, 1487-1494.
【非特許文献３】Nonaka, M., and Kimura, A. (2006). Genomic view of the evolution of the complement system. Immunogenetics 58, 701-713.
【非特許文献４】Krem, M.M., and Di Cera, E. (2002). Evolution of enzyme cascades from embryonic development to blood coagulation. Trends Biochem Sci 27, 67-74.
【非特許文献５】Krem, M.M., and Di Cera, E. (2001). Molecular markers of serine protease evolution. EMBO J 20, 3036-3045.
【非特許文献６】Delvaeye, M., and Conway, E.M. (2009). Coagulation and innate immune responses: can we view them separately? Blood 114, 2367-2374.
【非特許文献７】Wang, Z., Wilhelmsson, C., Hyrsl, P., Loof, T.G., Dobes, P., Klupp, M., Loseva, O., Moergelin, M., Ikle, J., Cripps, R.M., et al. (2010). Pathogen Entrapment by Transglutaminase - a Conserved Early Innate Immune Mechanism. PLoS Pathog, 6:e1000763.
【非特許文献８】Carapetis, J.R., Steer, A.C., Mulholland, E.K., and Weber, M. (2005). The global burden of group A streptococcal diseases. Lancet Infect Dis 5, 685-694.
【非特許文献９】Cunningham, M.W. (2000). Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin Microbiol Rev 13, 470-511.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
さて驚くべきことに、マウスのような齧歯動物やヒト組織のいずれにおいても、ＦＸＩＩＩは、生体内でクロット（clots）のフィブリンネットワーク中に細菌を固定化し、そ
して抗菌活性を生じることが見出された。
【００１０】
また、驚くべきことに、ＦＸＩＩＩは、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）に感染した生体に投与された場合、フィブリンクロット（fibrin clots）内でこれらの細菌の固定化を誘発し、併せて血漿由来抗菌活性を誘導し、溶菌により最終的に死滅に導くことが見出された。
【００１１】
また、驚くべきことに、ヒトＦＸＩＩＩの適用は、肝臓及び脾臓のような臓器と同様に血流への感染面から細菌の全身性播種を防ぐことが見出された。
【００１２】
以前では、通常、そのストレプトキナーゼ（ＳＫ）活性によって又はそれとは別にプラスミノーゲンをプラスミンに活性化し、そこで線維素溶解によって血液クロットを溶解可能な微生物を防ごうと試みる場合、この作用様式で達成することは、むしろ不可能であると考えられていた。実際に、化膿連鎖球菌は、プラスミノーゲンと複合体を形成するストレプトキナーゼを担持することが知られている（Kayser, F.H. et al. (1989). Medizinische Mikrobiologie: Immunologie, Bakteriologie, Mykologie, Virologie, Parasitologie, 7th edition, Thieme, Stuttgart, 143）。次に、前記複合体は、プラスミノーゲンから、次いでフィブリンを切断する（線維素溶解）エンドペプチダーゼであるプラスミンへの変換を誘導する（Pschyrembel Klinisches Worterbuch (2007). 261st edition, Walter de Gruyter GmbH & Co. KG, Berlin, 602, 1505, and 1846）。
【００１３】
さらに、化膿連鎖球菌は、Ｇタンパク質関連α2−マクログロブリン−結合（ＧＲＡＢ）タンパク質と称する細胞壁付着タンパク質（cell wall attached protein）を担持しており、それは、その名称が示唆するように、ヒトプロテアーゼ阻害因子であるα2−マクログロブリン（α2−Ｍ）に結合する。ＧＲＡＢによるα2−Ｍ、そしてさらに細菌表面への結合は、２つのやり方で化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌又はＧＡＳ）による細菌感染を促進することが示唆されている：α2−Ｍの除去は、その阻害活性を低下させ、それによって侵入された宿主の組織を通して細菌がより効率的に拡散するための一定レベルのプロテアーゼ活性が維持されるのに対して、細菌自体は、その時点で、その表面上に直接それらに対する阻害因子を担持しているため、プロテアーゼから保護されたままである（Toppel et al., 2003）。しかしながら、これに対する第３の態様があることに留意しなければならない：プロテアーゼ阻害因子であるα2−Ｍは、プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化工程に対する阻害因子として作用するという点で、線維素溶解も調節する（Pschyrembel Klinisches Worterbuch (2007). 261st edition, Walter de Gruyter GmbH & Co. KG, Berlin, 602）。ＧＲＡＢのような細菌表面タンパク質がα2−Ｍに結合し、それに伴ってその血漿中濃度を低下させる場合、プラスミノーゲン活性化におけるα2−Ｍの阻害活性は、同様に低下し、そのため、線維素溶解は増強される。
【００１４】
従って、原則として、化膿連鎖球菌は、２つのやり方における線維素溶解制御機構、すなわちプラスミノーゲン活性化によって直接的に、そしてプラスミノーゲン阻害を低下させることによって間接的に線維素溶解を強化することにより阻害することができる。従って、化膿連鎖球菌は、むしろフィブリンクロット内への包括（entrapment）、そしてそのような固定化を逃れると予想される。
【００１５】
従って、本発明は、
（１）微生物による感染症及び／又は前記感染症に関連する症状を治療及び／又は予防するための血液凝固第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）；
（２）微生物による感染症及び／又は前記感染症に関連する症状を治療及び／又は予防するための、（１）の下で定義された薬学的有効量のＦＸＩＩＩ並びにヒトアルブミン、グルコース、塩化ナトリウム、水及びｐＨ調整用のＨＣｌ又はＮａＯＨからなる群より選ばれる１つ又はそれ以上の物質を含んでなる医薬組成物；
（３）微生物による感染症及び／又は前記感染症に関連する症状を治療及び／又は予防するための、薬学的有効量のＦＸＩＩＩを含んでなる薬剤又は（２）の下で定義された医薬組成物の製造方法；及び
（４）微生物による感染症及び／又は前記感染症に関連する症状を治療及び／又は予防するための薬学的有効量のＦＸＩＩＩ又は（２）の下で定義された医薬組成物を必要な患者に投与することを含む治療方法；
を提供する。
【００１６】
発明の詳述
系統発生的に保存されたセリンプロテアーゼカスケードは、無脊椎動物及び脊椎動物の免疫において重要な役割を果たしている。哺乳動物の凝固系は、約４億年さかのぼることができ、そしてそれは、例えば昆虫におけるToll受容体シグナル伝達及び血リンパ凝固中の抗菌ペプチドの放出に関与する祖先セリンプロテイナーゼカスケードと相同性を共有している。本発明は、細菌惹起性の凝固誘導がクロット内での微生物の固定化及び抗菌活性の生成を導くことを示している。従って、祖先セリンプロテアーゼ凝固カスケードは、初期免疫防御に新規な機能を発揮する。包括は、進化的に保存されたトランスグルタミナーゼ、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）の作用によって、細菌をフィブリン線維に架橋することによりもたらされる。感染したＦＸＩＩＩ-/-マウスは、重度の病的炎症の徴候を示し、そしてＦＸＩＩＩによる野生型動物の治療は、細菌播種を弱める。また、細菌の死滅及びフィブリンネットワークへの架橋を、連鎖球菌性壊死性筋膜炎患者の組織生検においてモニターすることで、凝固が初期先天性免疫系の一部であるという概念は支持された。
【００１７】
従って、本発明は、以下のことを示す。
・凝固の誘導は、細菌の固定化及び抗菌活性をもたらす。
・第ＸＩＩＩ因子-/-マウスは、野生型動物よりもさらに重度の感染症を発症する。
・細菌の包括及び死滅を、感染患者の生検において記録する。そして
・ＦＸＩＩＩによる治療は、感染マウスにおける細菌播種を防止する。
【００１８】
炎症の感知及び侵入微生物の迅速な除去は、感染症に対する初期免疫応答の重要な特徴である。特に、潜在的な微生物進入口は、リスクが高く、そのため、特別な保護が必要である。従って、免疫系は、例えば、吸入された病原体の効率的浄化（例えば、マンノース−結合レクチンを利用して（Eisen, 2010）又は嚥下された病原体の効率的浄化（例えば、腸ムチンの作用による（Dharmani et al., 2009））を可能にする機構を進化させてきた。創傷は、別の進入口を呈しており、そして微生物を循環系に進入させて感染症を助長するリスクが高い。微生物の播種及び最終的な全身合併症を防ぐために、創傷の封鎖が開始されるとすぐに宿主の防御系が活性化されることが非常に重要である。そのため、おそらく、凝固は、これらの極めて初期の過程において重要な役割を果たしていると考えられる。しかし、免疫に対するこの寄与の範囲及び根底にある機構は、ほとんど理解されていない。
【００１９】
ここで、凝固は、その炎症誘発性の役割に加えて、細菌感染の封じ込め（containment）及び除去（elimination）において積極的な役割を果たしていることが初めてわかった。本発明で得られたデータは、フィブリンネットワーク内の微生物のＦＸＩＩＩ誘発性共有結合固定化及び抗菌活性の生成を含む、２つの別々の機構に基づくモデルを支持している。凝固は、接触系又はカリクレイン／キニン系とも称される凝固の内因性経路を介して細菌表面で活性化されることが見出された。細菌（総説については、（Frick et al., 2007）を参照のこと）の他に、真菌（Rapala-Kozik et al., 2008）及びウイルス（Gershom
et al., 2010）もまた、接触系と相互作用することが報告されており、接触活性化は、パターン認識の原理の支配下にあるという概念を支持している（Opal and Esmon, 2003）。特に、系は、数秒以内に活性化され、そして抗菌ペプチド（Frick et al., 2006; Nordahl et al., 2005）及び炎症性メディエーター（総説については、（Leeb-Lundberg et al., 2005）を参照のこと）の放出に至り、初期先天性免疫におけるその役割をさらに支持している。また、最近、凝固の内因性経路の活性化による抗菌ペプチドの生成に加えて、トロンビンの処理も、広い特異性を有する宿主防御ペプチドを放出することがわかった（Papareddy et al., 2010）。しかし、これらのペプチドが、本発明に見られる抗菌活性にどの程度寄与するかは、明らかにする必要がある。
【００２０】
本発明により示されたin vivoデータは、ＦＸＩＩＩの欠乏が、感染マウスで見られるような感染部位への広範囲の好中球流入及びその後の組織破壊によって説明される病的炎症反応を惹起することを示している。細菌を固定化することができないと、これらの動物における内因性主導の凝固時間が劇的に増加し、それは、感染症が、野生型のマウスよりもノックアウトマウスにおいて、より全身性になる徴候である。ヒト血漿ＦＸＩＩＩは、マウスにおいて完全に活性であり（Lauer et al., 2002）、そして概念の証明としてヒトタンパク質をマウス感染モデルにおいて投与した。野生型マウスをヒト血漿ＦＸＩＩＩで処置した場合、無処置マウスと比較して細菌播種が有意に低下したことが記録された。これらの結果は、侵入病原体に対する初期防御におけるＦＸＩＩＩの重要性を明確に示しており、そしてＦＸＩＩＩが、新規な抗菌療法の開発にとって興味深い標的であることを示唆している。
【００２１】
凝固は、以前から無脊椎モデルにおいて免疫に関係があるとされており、ここで、その免疫機能は、適応性エフェクター機構との冗長性の欠如のため、より明らかである。最も研究された例の１つは、カブトガニの凝固系であり、それはＬＰＳのような微量の細菌エリシターによって起動され、抗菌活性の生成を導き、そして他のエフェクター系との伝達を形成する。同様のやり方で、補体と血液凝固の間には、例えばフィブリン／フィブリノーゲンに対するフィコリンの結合を介してクロストークがありうる（Endo et al., 2009）。進化の比較から現れる様相は、タンパク質分解カスケード及びその成分プロテアーゼが、内因性及び外因性微生物エリシターによって起動することができる適応性のあるモジュール（flexible modules）として用いられることである（Bidla et al., 2009）。１つの、そして同じタンパク質分解事象でも、異なる状況において別のエリシターによって活性化することができる。１つのこのような例は、ショウジョウバエタンパク質Spaetzleの切断であり、それは発現中及び免疫系のいずれにおいても重要なシグナルとして作用しうる。いずれの場合も、切断されたSpaetzleはＴＬＲファミリーの初代メンバー、Tollに結合する。同様のやり方で、ここでは、これまで主にその生理学的止血機能に関して研究されてきた血液凝固が、エフェクター機構として、そして他の派生した免疫系との伝達によっていずれも免疫において重要な役割を果たしていることが示される。これにより、迅速かつ効率的な即時免疫防御（instant immune protection）が導かれ、それにより感染が局在化されたままになり、そして他のエフェクター機構が活性化されるさらなる時間が残される。
【００２２】
本発明によって用いられるように、第ＸＩＩＩ因子、すなわち血液凝固第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）は、血液凝固の最終段階においてフィブリンクロットを安定化する血漿トランスグルタミナーゼである。トロンビン活性化ＦＸＩＩＩは、隣接するフィブリン単量体のガンマ−グルタミル残基とイプシロン−リシル残基との間の共有結合性架橋形成に触媒作用を及ぼして成熟クロット（mature clot）を生じる。ＦＸＩＩＩは、２個のＡサブユニット及び２個のＢサブユニットで構成されるヘテロ四量体として血漿中を循環している。Ａサブユニットは、酵素の活性部位を含み、そして肝細胞、単球及び巨核球によって合成される。Ｂサブユニットは、血漿中の触媒的Ａサブユニットの担体として働き、そして肝臓によって合成される。
【００２３】
ＦＸＩＩＩ Ａサブユニット遺伝子は、トランスグルタミナーゼファミリーに属しており、それは少なくとも８つの組織トランスグルタミナーゼを含む。これらの酵素は、さまざまなタンパク質を架橋し、そして止血、創傷治癒、腫瘍成長、皮膚形成及びアポトーシスのような多くの生理学的及び病理学的過程に関与している。遺伝的ＦＸＩＩＩ欠乏症患者で観察される創傷治癒欠陥から推測することができるように、ＦＸＩＩＩは、組織トランスグルタミナーゼと同様に、組織再構築及び創傷治癒に関与している。また、ＦＸＩＩＩは、正常妊娠中の胚の着床にも関与しており；ＦＸＩＩＩ欠乏症についてホモ接合（homozygous）の女性は、反復性流産を経験する。
【００２４】
本発明によるＦＸＩＩＩの１つの供給源はＦＸＩＩＩ濃縮製剤（concentrate）、例えばフィブロガミン(R)（Fibrogammin(R)）P250/1250（CSL Behring）である。ＦＸＩＩＩの濃縮製剤は、凍結乾燥されたＦＸＩＩＩ、例えば、水中に溶解された粉末又はＦＸＩＩＩ凍結乾燥物であることができる。
【００２５】
ＦＸＩＩＩは、通常、ヒト血漿から単離されるが、当分野で知られた組換えＤＮＡ技術を用いて組換えタンパク質として提供することもできる。一般に、本発明によるＦＸＩＩＩは、血漿、胎盤から又は遺伝子工学の方法（組換え又はトランスジェニック）によって、いずれかで製造することができる。
【００２６】
単なるＦＸＩＩＩ補充療法と比べて、その目的は、ＦＸＩＩＩの先天性又は後天性欠乏症にかかった人にＦＸＩＩＩの正常で健全な血漿レベルを達成することであり、本発明によれば、ＦＸＩＩＩは、微生物による感染症を治療及び／又は予防するために、すなわち、抗生物質又は抗生物質活性の誘導剤のようなものとして用いられる。その際、ＦＸＩＩＩは、患者の血漿中のＦＸＩＩＩ濃度が健常者の血漿中のＦＸＩＩＩ濃度より上に高められるように患者に投与され、すなわち、ＦＸＩＩＩは、先天性又は後天性ＦＸＩＩＩ欠乏症にかかってない患者に投与することができる。しかし、本発明によるＦＸＩＩＩは、両方の理由又は適応症のため、すなわち、ＦＸＩＩＩの先天性又は後天性欠乏症を治療するためであると同時に微生物感染症を治療及び／又は予防するために投与されると考えられ；このような状況において、投与されるＦＸＩＩＩの全用量は、単一適応症のみの場合よりも高くなければならない。
【００２７】
ＦＸＩＩＩは、全身に又は局所的に患者に投与することができ、感染部位を特定することができる場合、感染部位からの拡散がより効果的かつ迅速に抑制される及び／又は完全に予防されるように、感染部位における局所投与が好ましい。投与は、一般に注射によって行われ、全身適用の場合には、一般に静脈注射が好ましい。他のＦＸＩＩＩ投与経路は、動脈内、皮下、筋肉内、皮内（intradermal）、腹腔内、皮内（intracutaneous）、腰椎内又は髄腔内であることができる。
【００２８】
本発明によるＦＸＩＩＩ投与の典型的な投与計画では、体重１ｋｇ当たり５〜１０００国際単位（ＩＵ）のＦＸＩＩＩ、好ましくは体重１ｋｇ当たり５〜５００ＩＵのＦＸＩＩＩ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり５〜３００ＩＵのＦＸＩＩＩ、さらにより好ましくは体重１ｋｇ当たり５〜２５０ＩＵのＦＸＩＩＩ、なおより好ましくは体重１ｋｇ当たり１０〜２００ＩＵのＦＸＩＩＩの投与が必要である。好ましくは、ＦＸＩＩＩは１日当たり１回又は多くとも３回投与される。
【００２９】
ＦＸＩＩＩ投与は、全身性播種の抑制、患者の体内の微生物の不動化及び／又は死滅といったような効果がある。
【００３０】
本発明によって標的設定される微生物は、線維素溶解を支持又は強化することが可能であり、プラスミノーゲンを活性化することが可能であり、及び／又はストレプトキナーゼ（β型溶血連鎖球菌（beta-hemolytic streptococci））、スタフィロキナーゼ（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））、タンパク質Ｐｌａ（ペスト菌（Yersinia pestis））、線維素溶解酵素、線維素溶解を活性化する化合物又は、例えばライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）、大腸菌（Escherichia coli）、フゾバクテリウムヌクレアツム（Fusobacterium nucleatum）、ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）、マイコプラズマフェルメンタンス（Mycoplasma fermentans）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、腸炎菌（Salmonella enteritidis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）の種からの他の細菌タンパク質からなる群より選ばれるプラスミノーゲン活性化タンパク質を有するという点において、比較的高い毒性のものであることができる。
【００３１】
さらに又は代わりに、前記微生物は、プラスミノーゲン活性化の少なくとも１つの阻害因子の血漿中濃度を低下させることが可能な少なくとも１つの表面及び／又は細胞壁タンパク質を担持することによって線維素溶解を支持又は強化することが可能であり、前記タンパク質は、タンパク質ＧＲＡＢ（化膿連鎖球菌）、オーレオリシン（aureolysin）（黄色ブドウ球菌）、炭疽菌（Bacillus anthracis）の分泌された中性メタロプロテアーゼ、及びペプトストレプトコッカスミクロスの分泌されたプロテアーゼからなる群より好ましくは選ばれる。
【００３２】
本発明による微生物は、細菌、酵母、ウイルス及び多細胞性寄生生物（multicellular parasites）からなる群より選ぶことができる。好ましくは、微生物は、固形細胞壁（solid cell wall）を有する及び／又はグラム陽性である細菌、より好ましくは好気性及び通性嫌気性球桿菌（coccobacilli）科の細菌、さらにより好ましくは連鎖球菌科（Streptococcaceae）、なおより好ましくは、β型溶血連鎖球菌、最も好ましくは、微生物は化膿連鎖球菌である。
【００３３】
感染のタイプは、皮膚、呼吸器系、咽喉、肺、脾臓、肝臓、腎臓、心血管系、心臓、中枢神経系、消化器系、尿生殖器系、筋肉及び軟組織からなる群の１つ又はそれ以上の組織から選ぶことができる。しかし、患者の身体の全身性感染症も良好に治療することができる。
【００３４】
感染症に関連する症状は、炎症、頭痛、発熱、下痢、疼痛、意識喪失又はそれらの１つ若しくはそれ以上の組み合わせといったような、本発明によって標的設定された微生物による感染症に伴う典型的な症状である。
【００３５】
医薬組成物は、薬学的有効量の本発明のＦＸＩＩＩ並びにヒトアルブミン、グルコース、塩化ナトリウム、水及びｐＨ調整用のＨＣｌ又はＮａＯＨからなる群より選ばれる１つ又はそれ以上の物質を含んでなる。医薬組成物の好ましいｐＨは、７．０〜７．６、より好ましくは７．２〜７．４である。
【００３６】
医薬組成物は、一般に当分野で知られたような医薬担体、賦形剤及び助剤をさらに含むことができる。
【００３７】
本発明による薬学的有効量は、その正常レベルの最大で１０倍までの、好ましくはその正常レベルの５倍までの患者血漿中のＦＸＩＩＩ初期濃度が保証されるＦＸＩＩＩ、その濃縮製剤又は医薬組成物の量である。他の部位において、患者血漿中のＦＸＩＩＩの初期濃度は、正常なＦＸＩＩＩ活性の少なくとも２５０％である。
【００３８】
図面の説明
特定の略語の意味
ＣＦＵ：コロニー形成単位
ＯＤ：光学濃度
ＯＤ４０５：４０５ｎｍの波長で測定された光学濃度
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】細菌表面における接触系及びＦＸＩＩＩの活性化  （Ａ）５０μＭ ＺｎＣｌ2を含むＴｒｉｓ中のＡＰ１細菌を、ヒト正常、ＰＫ−欠乏又はＦＸＩＩＩ欠乏血漿と共に３０分間インキュベートした。次いで、細菌を洗浄し、そして化膿連鎖球菌の表面における血漿カリクレイン活性を測定するため基質溶液中に再懸濁した。  （Ｂ）５０μＭ ＺｎＣｌ2を含むＴｒｉｓ中の化膿連鎖球菌をＣａＣｌ2及びリン脂質の存在下で正常、トロンビン−、ＦＸＩＩ−及びＦＸＩＩＩ−欠乏血漿と共に３０分間インキュベートした。細菌を洗浄し、そして基質溶液中に再懸濁してトロンビン活性を測定した。両方の図は、３回の独立した実験の平均ＳＤを表す。  （Ｃ）ＺｎＣｌ2、ＣａＣｌ2、リン脂質及びＮ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシンに対する金標識抗体の存在下、クエン酸ナトリウム単独、正常血漿、ＦＸＩＩ−、又はＦＸＩＩＩ欠乏（血漿をクエン酸ナトリウム中で１／１００希釈した）中でＡＰ１細菌を１５分間インキュベートし、そして、その後、ネガティブ染色（negative staining）電子顕微鏡検査によって分析した。スケールバーは、１００ｎｍを表す。
【図２】トロンビン活性化血漿は、抗菌活性に取って代わる。  （Ａ）ＡＰ１細菌をトロンビン−活性化正常血漿又はＦＸＩＩＩ−欠乏血漿（１／１００希釈した）と共にインキュベートした。指示された時点の後、血液寒天培地上への連続希釈物の平板培養によって細菌数を測定した。細菌を、対照として用いた非活性化正常血漿又はＦＸＩＩＩ−欠乏血漿と共にインキュベートした。図は、３回の独立した実験の平均ＳＤを表す。  （Ｂ）実験方法に記載されたように、ＡＰ１細菌を正常血漿（左パネル）、トロンビン活性化正常血漿（中央パネル）、又はトロンビン活性化ＦＸＩＩＩ欠乏血漿（右パネル）中でインキュベートし、そしてネガティブ染色電子顕微鏡検査による分析にかけた。スケールバーは、１μｍを表す。  （Ｃ）ＡＰ１細菌を正常又はＦＸＩＩＩ−欠乏血漿と共にインキュベートし、そしてトロンビンの添加によって凝固を開始した。３７℃で１時間前（上部レーン）及び１時間後（下部レーン）の薄く切断されたクロットを示している。インキュベーション後の両サンプルでは、同程度の量の死菌が検出された。スケールバーは、１μｍを示す。
【図３】クロット内への化膿連鎖球菌の包括及び固定化  走査型電子顕微鏡写真は、細菌の非存在下（Ａ、Ｂ）又は存在下（Ｃ〜Ｆ）で、正常血漿（Ａ、Ｃ、Ｅ）又はＦＸＩＩＩ−欠乏血漿（Ｂ、Ｄ、Ｆ）から生じたクロットの構造を示している。スケールバーは、それぞれＡ〜Ｄにおいて１０μｍ、そしてＥ〜Ｆにおいて１μｍを表す。透過型電子顕微鏡写真は、化膿連鎖球菌単独（Ｇ）、トロンビン活性化血漿に暴露後（Ｈ）、そして血漿への暴露に続いてＦＸＩＩＩ架橋部位を認識する金標識Ｎ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシン抗体による免疫染色後（Ｊ）を示している。スケールバーは、それぞれＧ及びＨにおいて１μｍ、そしてＪにおいて１００ｎｍに相当する。
【図４】ＦＸＩＩＩは、連鎖球菌性Ｍ１タンパク質をフィブリノーゲンと架橋させてクロット内への細菌の固定化を導く。  （Ａ）電子顕微鏡写真は、ＦＸＩＩＩ架橋前（上部パネル）及び後（中央パネル）のｒＭ１−タンパク質との複合体（細長い）中のネガティブ染色されたヒトフィブリノーゲン（３つのドメインを特徴とする）を示している。架橋は、Ｎ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシンに対する金標識抗体とのフィブリノーゲンＭ１タンパク質複合体を免疫染色することによって検出した（下部パネル）。フィブリノーゲン（灰色）及びＭ１タンパク質（黒色）の略図は、フィブリノーゲンとＭ１タンパク質の間の相互作用を強調することが考慮されている。スケールバーは、２５ｎｍを表す。  （Ｂ）細菌を、正常又はＦＸＩＩＩ−欠乏血漿と共にインキュベートし、そしてトロンビンの添加により凝固を開始した。クロットを簡単に洗浄し、ＴＨＢ培地で覆い、そして３７℃でさらにインキュベートした。指示された時点の後、上澄みの連続希釈物の血液寒天培地上への平板培養によって細菌数を測定した。図は、３回の独立した実験の平均ＳＤを表す。
【図５】化膿連鎖球菌による野生型及びＦＸＩＩＩ-/-マウスの皮下感染  非感染の（Ａ、Ｂ）及び感染した（２４時間；Ｃ、Ｄ）野生型（Ａ、Ｃ）及びＦＸＩＩＩ-/-マウス（Ｂ、Ｄ）からの、ヘマトキシリン（Haematoxilin）／エオシンで染色された代表的な組織切片が示されている。スケールバーは、５００μｍを表す。  走査型電子顕微鏡写真は、野生型（Ｅ）及びＦＸＩＩＩ-/-マウス（Ｆ）からの生検を示す。スケールバーは、挿入物において１０μｍ及び１μｍに相当する。  （Ｇ）活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を非感染の及び感染した野生型及びＦＸＩＩＩ-/-マウスからの血漿中で測定した（感染後２４時間）。データは、３回の独立した実験から得られた、３匹又は５匹の非感染動物及び９匹の感染動物から得た血漿サンプルの平均ＳＤ値として示した。
【図６】ヒト生検の免疫組織化学的分析  化膿連鎖球菌によって生じた壊死性筋膜炎患者（上部パネル）及び健常ボランティア（下部パネル）から組織生検を得た。生検を薄片に切り、そして連鎖球菌性Ｍ１−タンパク質、ＦＸＩＩＩ及びＮ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシンについて免疫組織化学的に染色した。一次抗体のない染色は、陰性であった（データは示さず）。スケールバーは、５０μｍに相当する。
【図７】ＦＸＩＩＩ処置マウスにおけるＭ１タンパク質及びＦＸＩＩＩ架橋及び細菌播種の共局在性  （Ａ）連鎖球菌性壊死性筋膜炎患者からの組織生検を薄片に切り、そして抗Ｎ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシン（赤色）と組み合わせてＭ１タンパク質（緑色）について免疫蛍光的に染色した。細胞核は、ＤＡＰＩにより青色に染色した。バーは、１０μｍを示す。  （Ｂ）走査型電子顕微鏡検査は、連鎖球菌性壊死性筋膜炎患者の生検におけるフィブリンネットワーク中に捕捉された細菌を示している。スケールバーは、５μｍを示す。  （Ｃ）透過型電子顕微鏡写真は、Ｎ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシンに対する金標識抗体の検出によってフィブリンネットワークへの細菌表面タンパク質のＦＸＩＩＩ介在性架橋を示している。スケールバーは、１００ｎｍを表す。  （Ｄ）透過型電子顕微鏡検査は、連鎖球菌性壊死性筋膜炎患者からの生検におけるフィブリンクロット内の死菌を示している。スケールバーは、０．５μｍを表す。  （Ｅ）マウスに化膿連鎖球菌の皮下注射を行い、そして感染３時間後に、フィブロガミン(R)Ｐで処置した。無処置マウスを対照として用いた。感染２４時間後、マウスを殺し、そして血液、肝臓及び脾臓中の細菌負荷を測定した。データは、一群１０匹のマウスの平均として示し、そして３回の独立した実験から得た。
【図８】マウス血漿から生じたクロット中の化膿連鎖球菌ＫＴＬ３のＦＸＩＩＩ依存性包括  走査型電子顕微鏡写真は、マウスの血漿から生じたクロット中の化膿連鎖球菌のＦＸＩＩＩ依存性包括を示している。野生型（Ａ、Ｃ）及びＦＸＩＩＩ-/-マウス（Ｂ、Ｄ）から得た血漿を２×１０9ＣＦＵの化膿連鎖球菌菌株ＫＴＬ３の非存在下及び存在下でインキュベートし、そしてトロンビンの添加により凝固を開始した。ヒト血漿を用いた結果と同様に、野生型（正常）血漿（Ｃ）から生じたクロット内には大量の化膿連鎖球菌が捕捉されたのに対して、ＦＸＩＩＩ−欠乏クロット（Ｄ）ではほんの少しの細菌しか見出されなかった。細菌におけるより詳細な考察では、野生型では化膿連鎖球菌表面とフィブリンネットワークとの強い相互作用が示されているが、ＦＸＩＩＩがないクロットでは、示されなかった（Ｃ及びＤの挿入図）。スケールバーは、挿入図中でそれぞれ１０μｍ、１μｍを表す。
【図９】感染した野生型及びＦＸＩＩＩ-/-マウスにおける細菌播種  野生型及びＦＸＩＩＩ-/-マウスに化膿連鎖球菌菌株ＫＴＬ３を皮下感染させた。接種２４時間後、マウスを殺し、そして血液、肝臓及び脾臓中の細菌負荷を測定した。データは、一群１０匹のマウスの平均として示し、そして３回の独立した実験から得た。実施例により本発明を説明する。
【００４０】
一般的方法
方法１：菌株及び培養条件
血清型Ｍ１の化膿連鎖球菌菌株ＡＰ１（４０／５８）は、連鎖球菌の照合及び研究のための世界保健機構（ＷＨＯ）協力センター（World Health Organization (WHO) Collaborating Center for Reference and Research on Streptococci）（プラハ、チェコ共和国）に由来する。化膿連鎖球菌菌株ＫＴＬ３（Ｍ１血清型）は、連鎖球菌性菌血症患者の血液から、最初に単離された（Rasmussen et al., 1999）。保存培養株を−７０℃に維持し、そしてトッド−ヒューウィット（Todd-Hewitt）培地（ＴＨＢ、Gibco；Grand Island, NY）中、３７℃で培養した。対数期半ばに細菌を集め、滅菌ＰＢＳ又はＴｒｉｓで２回洗浄し、希釈して必要な接種物にし、そして希釈し、そして血液寒天培地プレート中で平板培養した後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数することによって生菌数を決定した。
【００４１】
方法２：ヒト血漿
健常ドナーから得た血漿を、ランド大学病院（Lund University Hospital）（Lund, スウェーデン）から購入し、血漿カリクレイン−（ＰＫ）−、トロンビン−、ＦＸＩＩ−欠乏血漿及びＦＸＩＩＩ欠乏症患者から得た血漿（ＦＸＩＩＩ−欠乏血漿）をGeorge King Bio-Medicals Inc. (Overland Park, KS)から購入した。
【００４２】
方法３：基質アッセイ
正常、ＰＫ−又はＦＸＩＩＩ−欠乏血漿に暴露した後、細菌表面における血漿カリクレイン活性は、以前に記載されたように（Oehmcke et al., 2009）発色性基質Ｓ−２３０２（Chromogenix, Milan, Italy）を用いて測定した。トロンビン−活性の測定には、正常、トロンビン−、ＦＸＩＩ−及びＦＸＩＩＩ−欠乏血漿を５０μＭ ＺｎＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2及び１μＭリン脂質で補充された５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中の１×１０10ＣＦＵの化膿連鎖球菌（Rossix, Molndal, スウェーデン）と共にインキュベートした。テトラペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（Bachem, Bubendorf, スイス）を１．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で加えて凝固を回避した。サンプルを３７℃で３０分間インキュベートし、Ｔｒｉｓで２回洗浄し、そして沈殿物を５０μＭ ＺｎＣｌ2及び１ｍＭ発色性基質Ｓ−２２３８（Chromogenix）を含むＴｒｉｓ中に再懸濁し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。遠心分離した後、上澄みの吸光度を４０５ｎｍで測定した。ＦＸＩＩＩの架橋部位を認識するマウス抗ヒト金標識Ｎ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシン［１５３−８１Ｄ４］抗体（GeneTex, Irvine, CA）を用いてＦＸＩＩＩ活性を測定した。細菌を上記のように一夜増殖させ、そして正常、トロンビン−ＦＸＩＩ−又はＦＸＩＩＩ−欠乏血漿（すべて、クエン酸ナトリウム中で１／１００希釈した）に暴露し、そして５０μＭ ＺｎＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2及び１μＭリン脂質で補充した。サンプルを金標識抗体の存在下、３７℃で１５分間インキュベートし、そしてネガティブ染色電子顕微鏡検査によって分析した。
【００４３】
方法４：ヒト血漿中の細菌増殖
細菌を上記のように一夜増殖させた。ヒト血漿及びＦＸＩＩＩ−欠乏血漿を１２．９ｍＭクエン酸ナトリウム中で１：１００に希釈し、そして２．５×１０5ＣＦＵの化膿連鎖球菌を含む溶液５００μｌと混合した。０．２Ｕヒトトロンビン（Sigma, St. Louis, MO）を加えた後、３７℃でインキュベートした。指示された時点の後、混合物５０μｌを１０倍連続希釈で血液寒天培地上へ平板培養し、そして３７℃で１８時間インキュベーション後、コロニーを数えることによって細菌数を測定した。別法として、細菌をネガティブ染色電子顕微鏡検査にかけた。
【００４４】
方法５：血漿クロットの生成
細菌を上記のように一夜増殖させた。電子顕微鏡分析のため、ヒト又はマウス血漿（正常及びＦＸＩＩＩ−欠乏）５０μｌを凝固計（Amelung、Lemgo、ドイツ）中、３７℃で６０秒間インキュベートした。ＰＢＳ５０μｌ中の２×１０９のＣＦＵ化膿連鎖球菌を加え、続いて６０秒間インキュベートした。次いで、トロンビン試薬（Technoclone, Vienna, オーストリア）１００μｌを加えることによって凝固を開始した。対照クロットは、細菌の不在下でトロンビン試薬を血漿に加えることによって生成した。電子顕微鏡分析のために、２．５％グルタルアルデヒドを含む０．１５Ｍカコジル酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）中にクロットを固定した。
【００４５】
方法６：クロット内の細菌の架橋及び固定化
ヒト血漿から精製されたフィブリノーゲン（ICN Biomedicals, Aurora, OH）を、クエン酸ナトリウム中で３００μｇ／ｍｌの濃度に調製し、そしてトロンビン活性化ヒトＦＸＩＩＩ（Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN）の非存在下又は存在下、３７℃で１ｎｇ／ｍｌの組換えＭ１タンパク質と共に３０分間、インキュベートした。その後の電子顕微鏡検査による可視化のため、金標識Ｎ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシン抗体（GeneTex）を反応混合物に与えた。細菌の固定化を分析するため、クロットを、上記のように正常及びＦＸＩＩＩ−欠乏血漿から生成し、ＰＢＳで簡単に洗浄し、そしてＴＨ培地で覆った。指示された時点の後、上澄み５０μｌを１０倍連続希釈で血液寒天培地上へ平板培養し、そして３７℃で１８時間インキュベーション後、コロニーを数えることによって細菌数を測定した。
【００４６】
方法７：電子顕微鏡検査
電界放射型走査型電子顕微鏡検査のため、固定化された標本をカコジル酸塩緩衝液中で洗浄した。サンプルを段階系列のエタノールで脱水し、ＣＯ2により臨界点乾燥し、そして金でスパッタコーティングした後、JEOL JSM-350走査型電子顕微鏡（JEOL Ltd., 東京,
日本）において加速電圧５ｋＶ、そして倍率２０００で操作して試験した。金標識Ｎ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシン抗体を用いた透過型電子顕微鏡検査分析及び免疫染色は、前述のとおり実施した（Bengtsson et al., 2009）。ネガティブ染色電子顕微鏡検査のため、サンプルを、４００メッシュのカーボンコートカッパーグリッドに１分間吸着させ、水２滴で簡単に洗浄し、そして０．７５％ギ酸ウラニル２滴で染色した。空気中で低圧のグロー放電によってグリッドを親水性にした。Jeol 1200 EX透過型電子顕微鏡において加速電圧６０ｋＶで操作してサンプルを観察した。
【００４７】
方法８：動物の感染症モデル
ＣＢＡ／ＣａＯｌａＨｓｄ野生型のマウスは、Harlan (Venray, オランダ）から購入し、そしてＦＸＩＩＩ-/-マウスはCSL Behring (Marburg, ドイツ）によって供給された。特定病原体を含まない動物施設にマウスを収容した。すべての動物実験は、動物実験ための地方倫理委員会（regional ethical committee for animal experimentation）、Malmo/Lund djurforsoksetiska namnd, Lund District Court, Lund, スウェーデンによって認可された（許可証Ｍ２２０／０８）。感染前に、電気カミソリを用いてマウスの背中において２ｃｍ2の領域から下毛を除去した。以前に記載されたように（Toppel et al., 2003）、ＰＢＳ１００μｌ中の２．５×１０８ ＣＦＵの化膿連鎖球菌ＫＴＬ３でマウスに皮下感染させた。感染２４時間後、ＣＯ2吸入によりマウスをした。注射部位周辺で広範囲辺縁切除（wide marginal excision）によって皮膚サンプルを採取し、そして組織学的検査まで３．７％ホルムアルデヒド中に固定した。血漿分析のため、殺した時に心臓からクエン酸血を採取し、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして使用まで−８０℃で凍結した。細菌負荷を測定するため、肝臓及び脾臓からの血液及びホモジネートを血液寒天培地上へ１０倍連続希釈で平板培養した。３７℃で１８時間インキュベーション後、細菌コロニーを数えた。いくつかの実験では、細菌接種の３時間後、感染部位においてマウスに２００Ｕ／ｋｇ体重のヒトＦＸＩＩＩ濃縮製剤（フィブロガミン(R)Ｐ, CSL Behring）を皮下処置した。
【００４８】
方法９：凝固パラメーターの測定
内因性の（接触活性化）及び凝固の外因経路の活性化は、それぞれ、非感染の及び感染した野生型及びＦＸＩＩＩ-/-マウスの血漿における活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）及びプロトロンビン時間（ＰＴ）を測定することによって決定した。ａＰＴＴを測定するため、カオリン（Dapttin TC）（Technoclone, Vienna, オーストリア）５０μｌをマウス血漿５０μｌと共に３７℃で１分間インキュベートした。２５ｍＭ ＣａＣｌ2溶液５０ｍｌの添加により凝固を開始した。マウス血漿５０μｌを３７℃で１分間インキュベートし、続いてカルシウムを含むトロンボマックス（thrombomax）試薬（Trinity Biotech, Lemgo, ドイツ）５０μｌを添加して凝固を開始することによってＰＴを測定した。
【００４９】
方法１０：マウスの皮膚サンプルの検査
マウスをＰＢＳ １００μｌ中の２．５×１０8のＣＦＵの化膿連鎖球菌で皮下感染させ、そして感染２４時間後に皮膚病変ができた。組織サンプルを３．７％ホルムアルデヒド中に固定し、エタノール中で脱水し、パラフィン中に包埋し、それから３μｍ厚の切片に切断した。脱パラフィン処理（de-paraffination）後、上記のように走査型電子顕微鏡検査のためにサンプルを調製するか又はEclipse 80i顕微鏡（Nikon, 東京, 日本）を用いた組織学的分析のためヘマトキシリン・エオシン（Histolab, Gothenburg, スウェーデン）で染色した。
【００５０】
方法１１：ヒト組織生検の検査
Ｍ１Ｔ１血清型の化膿連鎖球菌によって生じた壊死性筋膜炎の２人の患者の感染中心から採取して瞬間凍結した組織生検を染色し、そして健常ボランティアから採取して瞬間凍結したパンチ生検と比較した。トロント大学（University of Toronto）の及びカロリンスカ大学病院（Karolinska University Hospital）のヒト被験者審査委員会（Human Subjects Review Committee）は、研究を認可し、そして患者及びボランティアからインフォームドコンセントを得た。生検を８μｍにクライオスタット切断し（cryostat-sectioned）、新たに調製したＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒド中に固定した。免疫組織化学的染色は、以前に記載されたように行った（Malmstroem et al., 2009）。免疫蛍光染色は、以前に記載されたプロトコール（Thulin et al., 2006）に従ってＭ１タンパク質及びＮ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシンについて行った。上記の免疫染色では、以下の抗体：抗Ｎ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシン（GeneTex）、抗第ＸＩＩＩａ因子（Acris, Herford, Germany）、ランスフィールドＡ群（Lancefield group A）炭水化物（Difco）に特異的なポリクローナルウサギ抗血清及びＭ１に対するポリクローナルウサギ抗血清を１：２５０〜１：１００００の範囲の所定の最適希釈度で用いた。免疫組織化学的染色では、25×/0.55 NA油浸対物レンズを備えたRXM Leica顕微鏡（Leica, Wetzlar, ドイツ）で評価したのに対して、免疫蛍光染色では、Leica DMR顕微鏡に接続されたLeica共焦点スキャナTCS SP IIを用いて評価し、そして視覚化した。
【００５１】
方法１２：統計分析
データは、Excel 2007（Microsoft Office, Microsoft, Redmont, WA）又はGraphPad Prism 5（GraphPad Software, San Diego, CA）を用いて分析した。実験群の数値間の有意性は、分散分析（ｔ検定）の使用によって決定した。有意性レベルは、Ｐ＜０．０５に設定した。
【００５２】
実施例１：化膿連鎖球菌表面の接触活性化はＦＸＩＩＩを誘導する。
以前の研究は、血漿中の化膿連鎖球菌の存在は、細菌表面で接触系の会合及び活性化を導くことを示している（Herwald et al., 2003）。これらの実験は、止血において重要な補因子であり、かつ接触系上流の凝固因子の活性化に必要なカルシウム及びリン脂質の非存在下で実施した（総説については、(Hoffman and Monroe, 2001)を参照のこと）。従って、本発明者らは、カルシウム及びリン脂質再構成が細菌表面に残っている凝固カスケードの誘導を引き起こすかどうかを疑った。以前の発見を確認するため、本発明者らは、正常亜鉛処理（zincified）ヒト血漿と共にインキュベーションしたＡＰ１細菌上の血漿カリクレイン活性を測定した。血漿カリクレイン−欠乏及びＦＸＩＩＩ−欠乏血漿を、これらの実験の対照として用いた。図１Ａに示したように、細菌を正常及びＦＸＩＩＩ−欠乏血漿と共にインキュベートしたときに、基質加水分解をモニターしたが、血漿が血漿カリクレイン欠乏のときは行わなかった。これらの発見は、以前の報告と一致しており、そのため、次にＦＸＩＩＩの活性化剤、トロンビン活性を測定することによって、細菌誘発性接触活性化が、凝固カスケード全体を誘導するかどうかを研究した。このために、亜鉛、カルシウム及びリン脂質を用いて正常血漿を再構成した。また、サンプルにテトラペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ）を補充してトロンビンにより生成されたフィブリン単量体の重合、そしてその後のコアゲル形成を回避した（詳細な情報については、実験方法を参照のこと）。この反応混合物を正常血漿に加え、そしてＡＰ１細菌と共にインキュベートしたときに、細菌表面のトロンビン活性の増加がモニターされた（図１Ｂ）。ＦＸＩＩＩ−欠乏でも同様の結果が得られたが、ＦＸＩＩ−欠乏又はトロンビン−欠乏血漿では得られず、残存する凝固因子の活性化を引き起こすには細菌表面の接触系の活性化が必要であることを意味している（図１Ｂ）。ＦＸＩＩＩは、トロンビンの基質の１つであり、そのため、細菌に誘発されたトロンビン活性化が、ＦＸＩＩＩからその活性形態への変換を引き起こすかどうかを試験した。このために、本発明者らは、ＦＸＩＩＩの作用によって共有結合的に架橋されたアミノ酸を特異的に認識するＮ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシンに対する抗体を用いた（el Alaoui et al., 1991）。実験では、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏが温和な静菌効果を発揮したので、抗凝固剤としてこのペプチドを用いないことが決定された。その代わりに、血漿を濃度（１／１００）に希釈し、ここでは、トロンビンによって活性化されたときに、フィブリン濃度があまりに低いとその重合が生じた。金標識抗体、亜鉛、カルシウム及びリン脂質の存在下で、希釈された正常、トロンビン−、ＦＸＩＩ−及びＦＸＩＩＩ−欠乏血漿と共に細菌をインキュベートした。次いで、サンプルをネガティブ染色電子顕微鏡検査によって分析した。図１Ｃは、希釈された正常血漿で処置された化膿連鎖球菌の細菌表面への抗体結合を示しているのに対して、細菌をＦＸＩＩ−又はＦＸＩＩＩ−欠乏血漿と共にインキュベートしたときは、バックグラウンドシグナルしか検出されなかった（図１Ｃ）。トロンビン−欠乏血漿（データは示さず）では同様の結果を得た。総合す���と、これらの結果は、血漿に暴露されたときに細菌表面の接触活性化は、凝固カスケード全体の誘導を惹起することができ、そして最終的に、ＦＸＩＩＩが、化膿連鎖球菌表面タンパク質において作用するのを可能にすることを示唆している。
【００５３】
実施例２：連鎖球菌は、トロンビン活性化血漿中では死滅するが、非活性化血漿中では死滅しない。
次の一連の実験において、本発明者らは、活性化されたが凝固してない血漿、正常血漿及びＦＸＩＩＩ−欠乏血漿中の架橋された細菌の最期を研究しようとした。図２Ａは、トロンビン−活性化正常血漿及びＦＸＩＩＩ−欠乏血漿中で細菌増殖が有意に損なわれたことを示している。この効果は、時間依存性であり、そして血漿が非活性化のままであった場合は見られなかった。血漿の活性化が抗菌活性の誘導に結びつくかどうかを研究するため、血漿処理した細菌をネガティブ染色電子顕微鏡検査にかけた。図２Ｂ（左のパネル）は、非活性化正常血漿と共にインキュベートされた無傷の細菌を示しており、そして細菌が非活性化ＦＸＩＩＩ−欠乏血漿と共にインキュベートされた場合、同様の所見が観察された（データは示さず）。しかしながら、トロンビンで活性化されたら、正常血漿（図２Ｂ、中央のパネル）及びＦＸＩＩＩ−欠乏血漿（図２Ｂ、右のパネル）と共にインキュベーションすると細菌細胞壁の多数の破裂を生じ、そして細菌死滅の徴候である細胞質ゾル内容物の流出を引き起こした（Malmstroem el al., 2009）。特に、血漿不在下でトロンビンと共にインキュベーションすると細菌増殖を損なうこともなく、又は細胞質ゾルの漏出が生じることもなかった（データは示さず）。
【００５４】
形成されたクロット内で細菌が死滅したかどうかを試験するため、ＡＰ１細菌及び薄めていない血漿を混合し、続いてトロンビンで活性化した。形成されたコアゲルを１時間インキュベートし、薄く切断し、そして透過型電子顕微鏡検査によって分析した。図２Ｃは、正常血漿及びＦＸＩＩＩ−欠乏血漿（下部のパネル）から生じたクロット中のほとんどの細菌において、細胞質ゾル内容物がないことを示しており、細胞膜の実質的な破裂及び細菌死滅を示唆している。対照的に、トロンビンの添加直後にクロットを薄く切断したときは少しの死菌しか見られなかった（上部のパネル）。総合すると、これらのデータは、凝固カスケードが、活性化されると現れるが、ＦＸＩＩＩと独立した抗菌活性を有していることを示している。
【００５５】
実施例３：血漿クロット内の細菌包括は、ＦＸＩＩＩ依存性である。
最近、ヒトＦＸＩＩＩは、in vitroで血漿クロット内に黄色ブドウ球菌及び大腸菌種の細菌を架橋して固定化することが示された。これが化膿連鎖球菌にもあてはまるかどうか試験するため、ＡＰ１細菌を、正常及びＦＸＩＩＩ−欠乏血漿と共にインキュベートし、そしてトロンビン−活性化クロットを走査型電子顕微鏡検査によって分析した。図３Ａ及び３Ｂは、細菌の非存在下での正常及びＦＸＩＩＩ−欠乏血漿から生じたクロットを示している。顕微鏡写真は、両タイプのクロットが類似形態を共有しているが、ＦＸＩＩＩ−欠乏血漿から生じたクロットがあまり密集してないように見えることを示している。しかし、ＡＰ１細菌の存在下でクロットが形成された場合、劇的な変化が観察された。正常血漿から誘導されたクロット中には大量の細菌が捕捉されたのに対して（図３Ｃ）、ＦＸＩＩＩ−欠乏血漿を用いた場合、少しの細菌しかクロットに付着していないことが見出された（図３Ｄ）。また、細菌を正常血漿と共にインキュベートした場合、フィブリンネットワーク形成が低下したが、これは、ＦＸＩＩＩ欠乏血漿を用いた場合には見られなかった（図３Ｃ及び３Ｄ）。より高い解像度では、フィブリン線維及び細菌が正常血漿から生じたクロット中で非常に接近しているのが顕著であり、そして繊維が細菌表面から生じているようにさえ見える（図３Ｅ）。対照的に、ＦＸＩＩＩ欠乏血漿からクロット中では、細菌はゆるやかに集合し、そしてフィブリン線維との直接相互作用は、検出できなかった（図３Ｆ）。これらの発見を確認するため、正常血漿からのクロットを薄く切断し、そして透過型電子顕微鏡検査にかけ、それによりさらに高解像度での分析が可能となった。図３Ｇ−Ｉは、正常血漿と共にインキュベーションする前（図３Ｇ）及びそれに続いてトロンビン活性化した直後（図３Ｈ）の薄く切断されたＡＰ１細菌を示す。クロット内で、細菌はフィブリン線維に沿ってつながっており、そしてそれらは多くの相互作用部位を有しているように見える。Ｎ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシンに対する金標識抗体によるさらなる免疫染色を用いて、細菌とフィブリン線維の間に相互作用の様式を研究した。フィブリン線維内に多くの架橋事象が検出された。また、電子顕微鏡分析は、フィブリン線維がＡＰ１細菌表面に貪欲に架橋されていることを示した（図３Ｉ）。細菌をＦＸＩＩＩ−欠乏血漿と共にインキュベートしたときは、架橋活性を記録しなかった（データは示さず）。
【００５６】
ほとんどの連鎖球菌血清型は、フィブリノーゲンに対して高い親和性を有し、そしてＭ１タンパク質は、ＡＰ１菌株で最も重要なフィブリノーゲン受容体であることが報告されている（Akesson et al., 1994）。それぞれの結合部位は、Ｍ１タンパク質及びフラグメントＤのアミノ末端領域にマップされており、それはフィブリノーゲンの末端球状ドメインの一部である（Akesson et al., 1994）。ネガティブ染色電子顕微鏡検査を用いて分子レベルでＭ１タンパク質及びフィブリノーゲンの相互作用を研究した。結果は、連鎖球菌の表面タンパク質の１つの末端領域がフィブリノーゲンの球状ドメインとの複合体中にあることを示しており（図４Ａ、上部のパネル）、それはマッピング研究と良好に一致する。この複合体の性質は、活性化ＦＸＩＩＩを２つのタンパク質と共にコインキュベートしたときに変わらなかった（図４Ａ、中央のパネル）。実際に、Ｎ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシンに対する金標識抗体によるさらなる免疫学的検出は、相互作用部位がＦＸＩＩＩによって共有結合的に架橋されていることを示した（図４Ａ、下部のパネル）。Ｍタンパク質は、連鎖球菌で最も豊富な表面タンパク質であるため、ＡＰ１細菌のＭ１タンパク質が、ＦＸＩＩＩの作用によってフィブリン線維に共有結合する主要な相互作用パートナーの１つであることは妥当であると考えられる。しかし、他の連鎖球菌表面タンパク質もＦＸＩＩＩによって標的設定されることは排除することができない。
【００５７】
ＦＸＩＩＩによる細菌の架橋が、クロット内で病態生理学的機能を有するかどうかを、正常及びＦＸＩＩＩ−欠乏血漿から生じたクロットからＡＰ１細菌の流出を測定することによって研究した。このために、連鎖球菌を薄めていない正常又はＦＸＩ−ＩＩ欠乏血漿と混合し、そしてトロンビンの添加により凝固を誘発させた。次いで、クロットをＰＢＳで簡単に洗浄し、そして増殖培地で覆った。異なる時点で、サンプルを上澄みから集め、そしてそれらの細菌負荷を測定した。図４Ｂに参照されるように、ＦＸＩＩＩに誘発された架橋は、クロットからの細菌放出を有意に低下させ、クロット内での細菌の固定化及び死滅を示唆している。総合すると、結果は、化膿連鎖球菌の細菌は、ＦＸＩＩＩの作用によってフィブリンネットワークに共有結合的に組込まれており、そしてこれによりクロットからの細菌の播種が防止されることを示している。
【００５８】
実施例４：化膿連鎖球菌を感染させたＦＸＩＩＩ-/-マウスは、野生型動物より多くの炎症徴候を有する。
in vitroデータは、凝固が、協調作用においてクロット内での化膿連鎖球菌の固定化及び死滅を誘発する初期先天性免疫応答の一部であることを示唆している。従って、本発明者らは、細菌播種の防止及びその浄化は、感染部位で炎症反応を弱めることができると仮定した。これを試験するため、それぞれ別のＭ１血清型、ＫＴＬ３で確立された皮膚感染モデルを利用した（Toppel et al, 2003）。ＫＴＬ３菌株を接種すると、通常、局所感染が生じ、最終的に感染巣から広がって全身感染に至る（Toppel et al., 2003）。走査型電子顕微鏡分析を用いて、トロンビン−活性化ヒト正常又はＦＸＩＩＩ−欠乏血漿と共にＫＴＬ３菌株をin vitroでインキュベーションすると、ＡＰ１細菌により生じたものと同類似形態のクロットを生じることが見出された（データは示さず）。マウス血漿（正常及びＦＸＩＩＩ−欠乏）をＫＴＬ３細菌と共にインキュベートした場合も類似の結果が得られた（図８）。
【００５９】
化膿連鎖球菌による局所感染に対する炎症反応を研究するため、野生型及びＦＸＩＩＩ-/-マウスをＫＴＬ３菌株で皮下感染させた。感染２４時間後、マウスを殺し、そして局所感染巣からの皮膚を外科的に摘出し、そして組織病理学的分析のためヘマトキシリン・エオシンで染色した。非感染の野生型及びＦＸＩＩＩ-/-マウスからの皮膚生検の顕微鏡検査では、炎症徴候を示さなかったのに対して（図５Ａ＋Ｂ）、感染した野生型動物からの生検では、浮腫形成、好中球浸潤及び組織損傷が見られた（図５Ｃ）。特に、これらの病変は、感染したＦＸＩＩＩ-/-マウスからの生検を顕微鏡分析したときに、はるかにより重度であった（図５Ｄ）。
【００６０】
野生型及びＦＸＩＩＩ-/-マウスからの組織生検のさらなる電子顕微鏡検査は、すべて感染部位で重度出血を示した（データは示さず）。しかし、感染した野生型マウスのフィブリン網目構造内に細菌が捕捉されて密集していることが見出されたが（図５Ｅ）、感染したＦＸＩＩＩ-/-マウスからの皮膚生検を分析したときは、細菌がクロット上にすべて散在していた（図５Ｆ）。さらなる統計分析は、野生型動物のフィブリンネットワーク中に推定（pro）１００μｍ２の約８個の細菌クラスターを示したが、連鎖球菌は、主に推定１００μｍ２の４１個の細菌／鎖の密度で単一細菌又は小さな鎖として見られた。より高い倍率では、細菌は、感染した野生型マウスからのフィブリンネットワークの一体部分であるように見える（図５Ｅ、挿入図）。これは、ＦＸＩＩＩ-/-マウスからの生検では観察されず、ここでは連鎖球菌がネットワーク成分と会合しているが、ネットワーク成分としてではない（図５Ｆ、挿入図）。細菌の固定化が、その播種に影響を及ぼすかどうかを、凝固の内因性経路の凝固時間（活性化部分トロンボプラスチン時間又はａＰＴＴ）を測定することによって調べたが、それは、増加した場合、感染に対する全身性反応の徴候である（Oehmcke et al., 2009）。このために、マウスを２４時間感染させた。その後、血漿サンプルを回収し、そして凝固の内因性経路の凝固時間を測定した。図５Ｇは、感染した野生型マウスからの血漿サンプルのａＰＴＴが、穏やかであるが有意に増加したたが、ＦＸＩＩＩ-/-マウスからの血漿サンプルでは凝固時間が急上昇したことを示す。両群のマウスでは、感染２４時間後、プロトロンビン時間（ＰＴ）は、変わらないままであった（データは示さず）。肝臓及び脾臓における細菌負荷の分析は、特にＦＸＩＩＩ-/-マウスの脾臓において細菌レベルの僅かな上昇を示したが、野生型動物と比較したときは、違いがあまりなかったことを示した（図９）。全体として、これらの結果は、ＦＸＩＩＩの欠如が、全身性反応の誘導と併せて感染部位での炎症反応の増強を導くことを示している。
【００６１】
実施例５：化膿連鎖球菌によって生じた壊死性筋膜炎患者におけるＦＸＩＩＩ架橋
動物実験から得た結果が、臨床的な状況にもあてはまるかどうかを試験するため、化膿連鎖球菌によって生じた壊死性筋膜炎患者からの生検を免疫組織学的及び電子顕微鏡的手段で分析した。図６は、感染部位での広範囲の組織壊死を示しており、そしてその後の免疫学的検出は、これらの部位でのＭ１タンパク質及びＦＸＩＩＩについてポジティブ染色を示した。これは感染巣への血漿の流入を示唆しており、そして実際にこれらの部位での架橋活性の増加が記録された（図６、上部レーン）。対照として、健常者からの生検を用いたが、生検を同じ実験プロトコールにかけたときに、免疫染色は記録しなかった（図６、下部レーン）。Ｍ１タンパク質及びＮ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシンに対する抗体を用いて共焦点免疫蛍光顕微鏡検査によって組織切片をさらに分析した。図７Ａは、感染部位での細菌架橋を示唆する２つの抗体の共局在性を示している。走査型電子顕微鏡検査によって生検を分析したとき、感染部位での大量の出血が記録され（データは示さず）、そして細菌は、フィブリンネットワーク内に密集して捕捉されていることがわかった（図７Ｂ）。また、標本を薄く切断し、そしてＮ−イプシロン−ガンマ−グルタミル−リシンに対する金標識抗体を用いた免疫透過型電子顕微鏡検査によって研究した。図７Ｃは、フィブリン線維と接触した領域における細菌表面での免疫染色を示している。また、顕微鏡写真は、図７Ｄに示すように捕捉された細菌のかなりの部分が生存可能でなかったことを示している。これらの所見は、in vitro及びin vivo実験と一致しており、そしてそれらは、化膿連鎖球菌による重度の侵襲性感染症患者からのクロットにおいて細菌の固定化及び抗菌活性の生成が見られることを説明している。
【００６２】
実施例６：ＦＸＩＩＩによる局所治療は、感染マウスにおける細菌の全身拡散を弱める。
ＦＸＩＩＩによる処置が、感染動物モデルにおける細菌拡散を防止することができるかどうかを試験するため、野生型マウスを化膿連鎖球菌で皮下感染させた。接種３時間後、マウスの半分をヒト血漿ＦＸＩＩＩ濃縮製剤、フィブロガミン(R)Ｐで処置し、それを感染部位に注射した。体重１ｋｇ当たり２００国際単位（ＩＵ）の用量を選択し、それは正常血漿レベルの約１０倍であり、そしてこれはマウスにおいて十分に許容されることがわかっている（Lauer et al., 2002）。化膿連鎖球菌で感染させたがフィブロガミン処置してないマウスを対照として用いた。感染２４時間後、動物を殺し、そして血液、肝臓及び脾臓中の細菌負荷を測定した。図７Ｅに示すように、３つのすべて場合において、フィブロガミン処置したマウスでは細菌量の有意な低下が見られ、ＦＸＩＩＩが感染動物における化膿連鎖球菌の全身性播種を弱めることを示唆している。総合すると、本発明に関して示された結果は、血漿由来の抗菌活性の誘導及びその後の細菌死滅と併せてクロット内への細菌のＦＸＩＩＩ介在性固定化を含む細菌感染に対する初期防御系の概念を支持している。データは、これらの２つの機構は、協調作用において働き、そしてこれは細菌播種を弱め、そして炎症反応を抑制しうることを示唆している。
【００６３】
文献
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000763.
【図１】
2013532649.tif 000002
【図２】
2013532649.tif 000003
【図３】
2013532649.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
2013532649.tif 000011
2013532649.tif 000012
2013532649.tif 000013
2013532649.tif 000014