(57)【要約】  本発明は、人間医学の分野、特に、炎症性疾患に罹患している対象のサイトカイン標的薬(CyTD)治療に対する応答性の診断/予後に関する。より正確には、本発明は、CyTD応答性または非応答性の表現型についてのin vitroにおける診断/予後のための方法であって、(a)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の6つの遺伝子または遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは、(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイルならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子を含む発現プロファイルを対象生物学的試料から決定する工程、(b)得られた発現プロファイルを少なくとも1つの参照発現プロファイルと比較する工程、ならびに(c)当該比較から応答性または非応答性の表現型を決定する工程を含む方法に関する。本発明は、当該方法を実行するためのキットおよび核酸マイクロアレイにさらに関する。本発明は、炎症性疾患罹患患者の治療の方法にさらに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイン標的薬(CyTD)応答性または非応答性表現型についてのin vitroにおける診断または予後判定のための方法であって、
(b)
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
を含むまたはそれからなる発現プロファイルを、炎症性疾患に罹患している対象の生物学的試料から決定する工程、
(c)得られた発現プロファイルを少なくとも1つの参照発現プロファイルと比較する工程、ならびに
(d)前記比較から、応答性または非応答性表現型を決定する工程
を含む方法。
【請求項２】
得られた発現プロファイルは、工程(b)において、少なくとも1つの参照応答プロファイルおよび/または非応答発現プロファイルと比較される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
得られた発現プロファイルは、工程(b)において、少なくとも1つの参照応答発現プロファイルおよび少なくとも1つの参照非応答発現プロファイルと比較される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
発現プロファイルは、前記遺伝子の核酸転写物の量を測定することによって決定される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
発現プロファイルは、定量的PCRまたはオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用して決定される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
発現プロファイルは、ゲノムマイクロアレイまたはタンパク質マイクロアレイを使用して決定される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的試料は、血液試料である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記CyTDは、TNF-a遮断剤(TBA)である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記炎症性疾患は、関節リウマチ(RA)、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、尋常性乾癬、潰瘍性大腸炎、脈管炎;ウェゲナー肉芽腫症;サルコイドーシス;成人発症スチル病、多発筋炎/皮膚筋炎、および全身性エリテマトーデス(SLE)からなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記炎症性疾患は、関節リウマチである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも1つのさらなるパラメーターを決定する工程をさらに含み、前記さらなるパラメーターは、抗核抗体試験(ANA試験)、C反応性タンパク質試験(CRP試験)、環状シトルリン化ペプチド抗体試験(CCP試験)、およびリウマチ因子試験から選択される試験によって決定される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
を含むまたはそれからなる発現プロファイルの決定のための少なくとも1つの試薬を含む、CyTD応答性または非応答性表現型のin vitroにおける診断のためのキット。
【請求項１３】
少なくとも1つのさらなるパラメーターを決定するための少なくとも1つの試薬をさらに含み、前記試薬は、抗核抗体試験(ANA試験)、C反応性タンパク質試験(CRP試験)、環状シトルリン化ペプチド抗体試験(CCP試験)、およびリウマチ因子試験から選択される、請求項12に記載のキット。
【請求項１４】
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
に対して特異的な核酸を含む核酸マイクロアレイ。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイである、請求項14に記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項１６】
炎症性疾患に罹患している対象のCyTD治療を設計するための方法であって、
(a)
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
を含むまたはそれからなる発現プロファイルを前記対象の生物学的試料から決定する工程、
(b)得られた発現プロファイルを少なくとも1つの参照発現プロファイルと比較する工程、
(c)前記比較から、前記対象の応答性または非応答性表現型を決定する工程、ならびに
(d)前記同定された応答性または非応答性表現型に従ってCyTD治療の用量を設計する工程
を含む方法。
【請求項１７】
炎症性疾患に罹患している対象のCyTD治療を適応させるための方法であって、
(a)
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
を含むまたはそれからなる発現プロファイルを前記対象の生物学的試料から決定する工程、
(b)得られた発現プロファイルを少なくとも1つの参照発現プロファイルと比較する工程、
(c)前記比較から、前記対象の応答性または非応答性表現型を決定する工程、ならびに
(d)CyTD治療を適応させる工程
を含む方法。
【請求項１８】
RA罹患対象の治療のための方法であって、
(a)RAに罹患している前記対象に、治療用量の疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)を投与する工程、
(b)
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
を含むまたはそれからなる発現プロファイルを、RA罹患対象の生物学的試料から決定する工程、
(c)得られた発現プロファイルを少なくとも1つの参照発現プロファイルと比較する工程、
(d)前記比較から、前記RA罹患対象の応答性または非応答性表現型を決定する工程、
(e)CyTDの用量を決定する工程、ならびに
(f)前記用量のCyTDを投与する工程
を含む方法。
【請求項１９】
DMARDは、メトトレキサートである、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
炎症性疾患に罹患している対象の治療のための方法であって、
(a)
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
を含むまたはそれからなる発現プロファイルを前記対象の生物学的試料から決定する工程、
(b)得られた発現プロファイルを少なくとも1つの参照発現プロファイルと比較する工程、
(c)前記比較から、前記対象の応答性または非応答性表現型を決定する工程、
(d)CyTDの用量を決定する工程、ならびに
(e)前記用量のCyTDを投与する工程
を含む方法。
【請求項２１】
工程(a)の発現プロファイルは、CyTD治療の始まりの14週または22週後に決定される、請求項16〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
工程(a)の発現プロファイルは、遺伝子IL2RB、S100A9、およびCASP5またはその等価な発現プロファイルからなる、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
工程(a)の発現プロファイルは、遺伝子MAPK14およびS100A9またはその等価な発現プロファイルからなる、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
工程(a)の発現プロファイルは、遺伝子S100A9またはその等価な発現プロファイルからなる、請求項21に記載の方法。
【請求項２５】
工程(a)の発現プロファイルは、遺伝子MAPK14およびGNLYまたはその等価な発現プロファイルからなる、請求項21に記載の方法。
【請求項２６】
前記炎症性疾患は、関節リウマチ(RA)、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、尋常性乾癬、潰瘍性大腸炎、脈管炎;ウェゲナー肉芽腫症;サルコイドーシス;成人発症スチル病、多発筋炎/皮膚筋炎、および全身性エリテマトーデス(SLE)からなる群から選択される、請求項16〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記炎症性疾患は、関節リウマチである、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記CyTD治療は、TBA治療である、請求項16〜24のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
TNFα-遮断剤(以後、本明細書において「TBA」と呼ぶ)などのようなサイトカイン標的薬は、様々な炎症性疾患の治療においてますます使用されている。そのようなTBAが承認された第1の適応は、関節リウマチおよびクローン病である。関節リウマチ(RA)は、人口のおよそ1%を冒す、病因がほとんど未知の、慢性で、進行性で、消耗性の自己免疫性疾患である(1)。RAは、滑膜の慢性炎症によって特徴付けられ、これは、最終的に、関節の損傷、痛み、および障害に至る(2)。RAの臨床スペクトルは、不均一であり、軽症から重症にまで及び、第2の器官系の併発における多様性を伴う。疾患不均一性は、治療応答率における通例の差によってさらに例証される。第一の治療は、メトトレキサート(MTX)などのような、いわゆる疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)を用いて通常開始される。患者のおよそ30%は、従来のDMARDに対して最適以下の応答または不耐性を示す(3)。これらの患者において、第二の治療は、腫瘍壊死因子-α(TNFα)およびインターロイキン-1(IL-1)またはB細胞およびT細胞などのような、疾患進行の媒介になると考えられる分子または細胞を遮断する薬剤である、「生物薬(biologics)」を用いて開始される。実際に、現在入手可能な9つの生物学的薬剤があり、それぞれ、重複するまたは特有の作用メカニズムを有する(4)。そのような治療に対する応答率は、広く変化し、多くの患者が、治療に対して不応性のままであるまたは部分的な改善を示すのみである(5)。疾患不均一性と共に、薬物の作用メカニズムの不十分な理解は、治療の開始に先立って様々な生物薬に対する患者適合性を同定する方法がないことを意味する。特異的な生物薬を患者のために選択するための合理的な根拠の確立は、患者をより効率的に治療するのを支援するであろう;応答する患者は、当生物薬を開始するだろう、それに対して、応答しそうにない患者には、他の治療を提供することができる。
【０００２】
生物薬の効能および安全性についての確かな文献がない状態で、応答しないまたは重症の副作用を経験する患者の割合、RAの破壊的な性質、および効能がない生物学的治療の社会的なコストを考慮すれば、療法を開始する前に成功を予測する強い必要性がある。臨床的なまたはX線撮影ベースの試験は、おそらく、不可逆性の破壊から関節を保護するために状態を評価するには遅すぎる。理想的には、療法応答性についての予測因子としての分子バイオマーカー特性は、末梢血などのような容易に入手可能なバイオ試料において、療法のスタートに先立って得られるべきである。RAの全身性の性質ならびに全身性のおよび器官特異的なコンパートメントの間の連絡を考慮すれば、末梢血は、直接、疾患病原性の理解のための関係を有していないかもしれないが、臨床的に適切なバイオマーカーを選択するための枠組みを提供する遺伝子発現プロファイルを分析することはとりわけ適している。さらに、血液ベースの試験は、滑膜組織ベースの試験よりも、患者に対してそれほど侵襲性でない。
【０００３】
最終的に、これは、医学の個別化された形態に至り得、それによって、最も適した療法が、個々の患者に対して適用されるであろう。
【０００４】
TBAが承認されているまたは予備試験の結果によりTBAが有用な治療となり得ることを示す他の炎症性疾患について同じことが言える。今のところ、TBAは、RAまたはクローン病の治療に加えて、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、尋常性乾癬、および潰瘍性大腸炎の治療について承認されている(特にインフリキシマブおよびエタナーセプトのFDAのラベルを参照されたい)。さらに、予備試験の結果は、TBAは、脈管炎(特にベーチェット病、チャーグ-ストラウス脈管炎、結節性多発動脈炎、および巨細胞動脈炎);ウェゲナー肉芽腫症;サルコイドーシス;成人発症スチル病、多発筋炎/皮膚筋炎、および全身性エリテマトーデス(SLE)などのような他のいくつかの炎症性疾患の治療に有用となり得ることを示唆する(31および32)。
【０００５】
すべての場合において、TBAを用いて治療された患者の一部のみ(時に、高い割合であるが)が、治療(特にインフリキシマブ(Remicade(登録商標))およびエタナーセプト(Enbrel(登録商標))のFDAのラベルを参照されたい)に対して臨床的な応答を示す。TBAが有用となり得るすべての疾患について、したがって、TBA治療に対して応答するまたは応答しない対象の傾向を予測することができることは非常に役立つであろう。
【０００６】
病態生理学的プロセスの根底にある分子的特性に対する見識を得るための非常に有力な方法が、DNAマイクロアレイ技術から生じ、これは、臨床的に明確な疾患を有する患者の間で、血液および組織試料において異なって発現される遺伝子の画分の同定を可能にする。これらの、異なって発現される遺伝子は、疾患の一因となる生物学的経路に対する見識をもたらすことができ、早期診断、予後、および応答の予測を分類するものに相当しうる。
【０００７】
この多段階で、比較的高価な技術を使用して、いくつかの落とし穴が発見され、これは、完全に標準化された条件に非常に依存する。感度および再現性に影響を及ぼしうる因子は、試料差異、出発RNA物質の量および品質における差、増幅および標識戦略、ならびに染料から、プローブ配列およびハイブリダイゼーション条件にまで及ぶ。さらに、基準化のための標準化されたアプローチおよびデータ分析アルゴリズムの使用の欠如は、結果に影響を及ぼし得る。さらに、ほとんどのマイクロアレイ研究は、前向きに(prospectively)計画されておらず、詳細なプロトコールを有していないことが多く、むしろ、既存の試料を利用する傾向がある。そのため、結果の照合は、マイクロアレイ研究の本質的な工程であり、品質基準が設定される必要がある。
【０００８】
いくつかのグループは、治療ベースライン時に収集された生物学的試料(滑膜または末梢血)の後ろ向き分析に基づき、治療に対する患者らの応答に従って、患者を分類することができる分子的形質(一塩基多型、遺伝子発現など)を同定する可能性を調査した。特に、多くの関心が、療法に対する応答の遺伝子発現ベースの予測についてのT Lequerreおよび同僚らによる数年前の最初のレポートによるTNFα-遮断剤インフリキシマブに対して払われた(6)。その時以来、他のいくつかのグループは、インフリキシマブに対する応答を予測するための手段として、末梢血の大規模遺伝子発現分析について同様に報告してきた(7) (8) (9)。これらの研究はすべて、療法に対する応答の予測のための、異なって発現される遺伝子およびその組み合わせについて報告した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Lee DM, Weinblatt ME. Rheumatoid arthritis. Lancet. 2001 Sep 15;358(9285):903-11
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これらの研究は、療法のベースライン時のインフリキシマブに対する応答の予測のための重要な概念実証を提供した。それにもかかわらず、この種のすべての研究と同様に、患者の比較的小さなコホートにおいて何千もの遺伝子を同時に測定するマイクロアレイ技術の使用は、データへの過剰適合の危険性があり、偽陽性の結果に至る。さらに、これらの研究の一施設による(mono-centric)性質は、より広く、より人口統計学的に様々な人口に対して同定される遺伝子の関連を制限し得る。
【００１１】
本発明は、多数の既存の研究からの情報を組み合わせることによってこれらの欠点を克服する。このアプローチは、結果の信頼性および一般化の可能性を増加させることができる。一連の関連する研究仮説を検討する個々の研究が、統計的に統合され、介入の効力を決定するために分析される定量的アプローチ(メタ分析)は、生物学的発見の目的で、ゲノム全体に渡るデータに対してメタ分析的アプローチを適用する広い有用性を示した。メタ分析は、2つのグループの間で異なって発現される遺伝子を同定するために、異なるマイクロアレイプラットフォーム上で得られた結果を比較する(プラットフォーム横断的な分類)、異種のデータセット由来の試料の間の重複を同定する、同時発現される遺伝子を同定する、または遺伝子ネットワークを再構築するために、既に使用されていた。
【００１２】
多数の遺伝子発現マイクロアレイデータセットのメタ分析は、異なる研究所およびマイクロアレイ技術によって生成される、多くのマイクロアレイ試料について同定され、検証される判別可能な遺伝子発現特性を提供する。このアプローチによって生成される予測モデルは、単一のデータセット上で生成されるものよりも、よく検証されており、高い予測能力および改善された一般化性能を示す。
【００１３】
本発明において、メタ分析は、Ramasamyら(10)において記載される、マイクロアレイデータセットに対するメタ分析を行なう際に段階的なアプローチに従って実行した(1-適したマイクロアレイ研究を同定する;2-研究からデータを抽出する(この工程はまた、選択された研究の著者からさらなる情報を得ることをも含んだ);3-個々のデータセットを用意する;4-個々のデータセットに注釈を付ける;5-プローブおよび遺伝子の間の多対多関係を決定する;6-研究特異的な評価を組み合わせる;7-結果を分析し、示し、解釈する)。
【００１４】
したがって、インフリキシマブ療法に対する将来の応答者および非応答者の間で異なって発現される61の遺伝子が、同定された。さらに、2つの個々の遺伝子が、試験された対象のインフリキシマブ応答性または非応答性の表現型に非常に関連づけられることが分かり、最低限の数の遺伝子のいくつかの組み合わせは、RA患者における抗TNF治療に対する一次(14週および22週)応答を予測するとして提唱される。これらの組み合わせは、インフリキシマブの代謝経路ではなく炎症または免疫プロセスに関与することが知られている遺伝子を含み、これは、明らかに、他の炎症性疾患、特に、TBAが承認されているまたは予備研究において有用であることが示されている炎症性疾患に罹患している対象のTNFα-遮断剤(TBA)応答性または非応答性の表現型を予測するためのそれらの一般的な有用性について理論的根拠を与える。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、したがって、サイトカイン標的薬(以下CyTDと呼ぶ、TNFα-遮断剤など、以下TBAと呼ぶ)応答性または非応答性表現型についてのin vitroにおける診断または予後判定のための方法であって、
(a)
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイルならびに
任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子を含むまたはそれからなる発現プロファイルを、炎症性疾患に罹患している対象の生物学的試料から決定する工程、
(b)得られた発現プロファイルを少なくとも1つの参照発現プロファイルと比較する工程、ならびに
(c)当該比較からCyTD応答性または非応答性表現型を決定する工程
を含む方法に関する。
【００１６】
本発明はまた、炎症性疾患に罹患している対象のために、CyTD治療を設計するための方法であって、
(a)(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイルならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子を含むまたはそれからなる発現プロファイルを、当該対象の生物学的試料から決定する工程、
(b)得られた発現プロファイルを少なくとも1つの参照発現プロファイルと比較する工程、
(c)当該比較からCyTD応答性または非応答性表現型を決定する工程、ならびに
(d)当該同定されたCyTD応答性または非応答性表現型に従ってCyTD治療の用量を設計する工程を含む方法にも関する。
【００１７】
本発明はまた、CyTDを用いる、炎症性疾患に罹患している対象の治療のための方法であって、
(a)本発明による方法を使用して、CyTD応答性または非応答性表現型の存在を当該対象の生物学的試料から決定する工程および
(b)工程(a)の結果に依存してCyTD治療を適応させる工程を含む方法にも関する。
【００１８】
CyTD治療の当該適応は、
-対象が、CyTD非応答と診断されている場合、当該CyTD治療の縮小もしくは停止または
-対象が、CyTD応答と診断されている場合、当該CyTD治療の継続であってもよい。
【００１９】
本発明はまた、炎症性疾患の治療におけるCyTDの新たな用途であって、
(a)本発明による方法を使用して、CyTD応答性または非応答性表現型の存在を、炎症性疾患に罹患している対象の生物学的試料から決定する工程および
(b)工程(a)の結果を基準にして、投与するCyTDの用量を決定する工程を含む、新たな用途に関する。
【００２０】
任意選択で、工程(b)において決定されたCyTDの用量は、対象に投与される。
【００２１】
本発明は、したがって、炎症性疾患の治療において使用するためのCyTDに関し、CyTDは、本発明による方法を使用して、応答性と診断されているおよび/または予後判定されている、当該炎症性疾患に罹患している対象に投与される。
【００２２】
本発明はまた、本発明による方法を使用して、応答性と診断されているおよび/または予後判定されている、当該炎症性疾患に罹患している対象における炎症性疾患の治療のための薬物を調製するためのCyTDの使用にも関する。
【００２３】
本発明の説明のすべてにおいて、「炎症性疾患」は、身体の損傷に至る制御不良の炎症プロセスを伴う疾患を指し、当業者らによって炎症性疾患と一般に見なされるあらゆる疾患を含む。好都合にも、当該炎症性疾患は、少なくともいくつかの場合において、病原性炎症性サイトカイン(IL-1、IL-6、IL15、IL-17、IL-18、IL-23、またはTNF-α)分泌を伴うことが知られている。次いで、本発明による方法は、CyTD治療に応答する彼/彼女の傾向を予測し、したがって、彼のCyTD応答/非応答性表現型を考慮して、彼/彼女の治療を適応させるために、試験される対象におけるそのような病原性炎症性サイトカイン分泌の存在を診断するのを可能にする。さらにより好都合にも、当該炎症性疾患は、少なくともいくつかの場合において、病原性TNF-α分泌を伴うことが知られている。次いで、本発明による方法は、TBA治療に応答する彼/彼女の傾向を予測し、したがって、彼のTBA応答/非応答性表現型を考慮して、彼/彼女の治療を適応させるために、試験される対象におけるそのような病原性TNF-α分泌の存在を診断するのを可能にする。そのような炎症性疾患は、自己免疫または非自己免疫を原因とするものであってもよい。本発明による方法およびキットが、特にTBA応答性または非応答性表現型を決定するために有用である炎症性疾患の非限定的な例は、関節リウマチ(RA)、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、尋常性乾癬、潰瘍性大腸炎、脈管炎(特にベーチェット病、チャーグ-ストラウス脈管炎、結節性多発動脈炎、および巨細胞動脈炎);ウェゲナー肉芽腫症;サルコイドーシス;成人発症スチル病、多発筋炎/皮膚筋炎、および全身性エリテマトーデス(SLE)を含む。本発明の方法が有用である疾患の好都合なグループは、TBAが承認されている治療におけるもの:関節リウマチ(RA)、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、尋常性乾癬、潰瘍性大腸炎である。本発明による方法は、TBA応答性または非応答性表現型を決定するためにRA罹患患者に特に有用である。
【００２４】
関節リウマチ(RA)について、第一の治療が、いわゆる疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)を用いて通常開始されるので、本発明はまた、RA罹患対象の治療のための方法であって、
(a)RAに罹患している当該対象に治療用量のDMARDを投与する工程、
(b)本発明による方法を使用して、CyTD応答性または非応答性表現型の存在を、当該RA罹患対象の生物学的試料から決定する工程、および
(c)工程(b)の結果を基準にして、投与するCyTDの用量を決定する工程を含む方法にも関する。
【００２５】
したがって、本発明はまた、RAの治療のためのDMARDおよびCyTDの組み合わせであって、
(a)RAに罹患している対象に治療用量のDMARDを投与する工程、
(b)本発明による方法を使用して、CyTD応答性または非応答性表現型の存在を、当該RA罹患対象の生物学的試料から決定する工程、および
(c)工程(b)の結果を基準にして、投与するCyTDの用量を決定する工程を含む組み合わせにも関する。
【００２６】
任意選択で、工程(c)において決定されたCyTDの用量は、対象に投与される。
【００２７】
好ましい実施形態では、DMARDは、メトトレキサート(MTX)である。
【００２８】
「サイトカイン標的薬」または「CyTD」によって、それは、特に、サイトカインまたはその受容体に結合し、中和することによって、サイトカインシグナル伝達を中和する任意の分子を意味する。そのような結合および中和分子は、特に、当該サイトカインもしくはサイトカイン受容体に対して特異的な抗体またはその断片、サイトカイン受容体アンタゴニスト、または当該サイトカインもしくはサイトカイン受容体に結合し、中和する、組換えタンパク質などのような任意の他の分子であってもよい。当該CyTDは、好ましくは、IL-1、IL-6、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、もしくはTNF-αなどのような炎症性サイトカインまたはそのような炎症性サイトカインの受容体を標的にする。IL-1シグナル伝達を標的にする分子は、カナキヌマブ(商品名Ilaris(登録商標))などのようなIL-1に対するモノクローナル抗体、ヒト抗-IL-1βモノクローナル抗体;アナキンラ(商品名Kineret(登録商標))などのようなIL-1受容体のアンタゴニスト、ならびにリロナセプト(商品名Arcalyst(商標))などのような、IgG1 Fc部分ならびにヒトIL-1RIおよびIL-1AcPのリガンド結合ドメインの間の融合タンパク質を含む。II-6シグナル伝達を標的にする分子は、特に、抗-IL-6Rモノクローナル抗体であるトシリズマブを含む。Il-15シグナル伝達を標的にする分子は、特に、抗-IL-15モノクローナル抗体であるHuMax-IL-15(AMG 714)を含む。Il-17シグナル伝達を標的にする分子は、特に、抗-IL-17Aモノクローナル抗体であるAIN457を含む。本発明の説明のすべてにおいて、CyTDの好ましい実施形態は、「TNFα-遮断剤」または「TBA」である。
【００２９】
「TNFα-遮断剤」または「TBA」によって、それは、本明細書において、TNFαの効果を中和することができる生物学的薬剤を意味する。当該薬剤は、優先的に、可溶性TNFα受容体、たとえばペグスネルセプトまたは抗体などのようなタンパク質である。さらに好ましい実施形態では、当該薬剤は、モノクローナル抗体である。さらに好ましい実施形態では、当該薬剤は、エタナーセプト(Enbrel(登録商標))、インフリキシマブ(Remicade(登録商標))、アダリムマブ(Humira(登録商標))、およびセルトリズマブペゴール(Cimzia(登録商標))からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、当該薬剤は、インフリキシマブである。
【００３０】
本発明による任意の方法の特に好ましい実施形態では、炎症性疾患は、関節リウマチであり、CyTDは、インフリキシマブ、特にTBAである。
【００３１】
本発明によれば、「CyTD応答性表現型」は、CyTDの投与に対する対象の応答状態として定義される。「応答状態」は、当該対象(CyTD応答性対象または応答性対象または応答性の対象と呼ばれる:本出願の目的のために、これらの用語は同類とする)が、治療に応答する、つまり、治療が、当該対象において効果的であることを意味する。応答の定義は、臨床症状における改善である。そのような応答の定量は、14週もしくは22週のACR20、ACR50、ACR70基準(11)および/またはEULAR基準もしくはDAS28>1.2における変化に従って行われる。14週のEULAR応答基準がより好ましい。これらの基準は(31)、分野における専門家を再編成する組織によって確立された(ACR: American College of Rheumatology; EULAR: European League Against Rheumatism)。これらの基準は、当業者によく知られており、したがって、ここで詳述する必要はない。
【００３２】
対照的に、「CyTD非応答性表現型」は、応答の状態の当該対象における不在を指し(本明細書において、CyTD非応答性対象または非応答性対象または非応答性の対象と呼ばれる:これらの用語は、同じ意味を有するとして本出願の文脈において解釈されるべきである)、当該対象が、治療に対して不応性のままであることを意味する。
【００３３】
本発明による診断/予後判定の上記のin vitroにおける方法のいずれかの好ましい実施形態では、当該対象は、RA罹患対象である。「RA罹患対象」は、RAについてAmerican College of Rheumatology(ACR)の基準を満たす対象である(11)。さらなる一実施形態では、当該対象は、CyTDを用いて治療されず、他のさらなる実施形態では、当該対象は、CyTDを用いて治療される。
【００３４】
当該対象がCyTDを用いて治療されていない場合、本発明の方法は、当該対象の応答性/非応答性についての予後判定を可能にすることが容易に理解されるであろう。したがって、この実施形態では、本発明の方法は、当業者が、CyTD治療に対する応答に感受性である対象を予後判定する(つまり同定する)ことを可能にする。これは、RAの破壊的な性質および効能がない生物学的治療の社会的なコストのために、重要となる。さらに、あらゆる治療が開始される前に、本発明のこの実施形態が非応答性の対象の同定を可能にするので、ある治療対象が重症の副作用に遭遇する危険性は、大幅に減少する。
【００３５】
本発明による対象が、CyTDを用いて治療される場合、本発明の方法は、対象が当該CyTDに対して応答するかどうかおよび当該対象が、したがって、当該治療の継続から利益を得るかどうかを診断するのに有用である。さらに、それらは、治療に対して応答していない、つまり、CyTDに対して不応性であり、したがって、速やかに、他の療法に移るべきである対象を診断するのに有用である。RAの消耗性の性質に関して、この成功は、重大である。特に、本発明の方法は、CyTD治療の始まりの14週または22週後に診断を可能にする。
【００３６】
この記載において、CyTDについて記載されることはまた、特に、TBAについても当てはまり、これは、本発明による任意の方法またはキットにおけるCyTDの好ましい実施形態である。
【００３７】
「生物学的試料」は、血清試料、血漿試料、尿試料、血液試料、リンパ液試料、または生検材料などのような、対象から採取されてもよい任意の試料であってもよい。そのような試料は、
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
を含むまたはそれからなる発現プロファイルの決定を可能にしなければならない。
【００３８】
発現プロファイルの決定のための好ましい生物学的試料は、血液試料、血漿試料、リンパ液試料、または生検材料などのような試料を含む。好ましくは、生物学的試料は、血液試料である。実際に、そのような血液試料は、患者から、完全に無害な血液収集によって得られてもよく、したがって、CyTD応答性または非応答性表現型の非侵襲性の診断を可能にする。
【００３９】
これらの発現プロファイルが、対象の応答/非応答性表現型の評価にとって特に適切であることが実証されたので、「発現プロファイル」によって、
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
を含むまたはそれからなる遺伝子の群の発現レベルを意味する。最も好ましい実施形態では、対象が、CyTD治療の始まりの14週または22週後に応答しているかどうかを診断するための発現プロファイルは、遺伝子IL2RB、S100A9、およびCASP5または遺伝子S100A9またはその等価な発現プロファイルならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子を含むまたは好ましくはそれからなる。他の最も好ましい実施形態では、CyTD治療(特にTBA治療)の始まりの14週または22週後に応答性を診断するための発現プロファイルは、遺伝子MAPK14およびS100A9またはその等価な発現プロファイルならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子を含むまたは好ましくはそれからなる。さらに他の最も好ましい実施形態では、CyTD治療(特にTBA治療)の始まりの14週または22週後に応答性を診断するための発現プロファイルは、遺伝子S100A9またはその等価な発現プロファイルならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子を含むまたは好ましくはそれからなる。さらに他の最も好ましい実施形態では、CyTD治療(特にTBA治療)の始まりの14週または22週後に応答性を診断するための発現プロファイルは、遺伝子MAPK14およびGNLYまたはその等価な発現プロファイルならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子を含むまたは好ましくはそれからなる。
【００４０】
CyTD応答性または非応答性表現型の存在の決定は、工程(b)において、少なくとも1つの参照発現プロファイルとの、得られた発現プロファイルの比較により実行される。
【００４１】
本明細書における用語「等価な発現プロファイル」は、
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14C
の発現プロファイルを指し、遺伝子のうちのいくつかの追加、欠失、または置換は、試験の信頼性を有意に変化させず、「許容できる発現プロファイル」と見なされる。例として、同じ代謝経路に属する他の遺伝子による、本発明において記載されるセットのうちの遺伝子のうちのいくつかの追加または置換もまた、等価な発現プロファイルと見なされるべきである。たとえば、S100A8は、S100A9と等価であり、S100A9がS100A8と交換される、任意の上記に言及される(i)または(ii)の発現プロファイル(つまり、遺伝子MAPK14およびS100A8;またはS100A9がS100A8と交換されるTable 2(表2)の61の遺伝子;または遺伝子S100A8;または遺伝子S100A8、IL2RB、およびCASP5;または遺伝子S100A8、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;または遺伝子S100A8、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cを含むまたはそれからなる発現プロファイル)は、上記に言及される(i)および(ii)の発現プロファイルの等価な発現プロファイルと見なされ、したがって、本発明の範囲に含まれるべきである。より全般的には、任意の発現プロファイルが、等価な発現プロファイルと見なされ、遺伝子のうちのいくつかは、下記図2および3において記載されるなどのように、同じ生物学的ネットワークに属する遺伝子と交換される。
【００４２】
本明細書における用語「許容できる発現プロファイル」は、分析される試料の少なくとも60%、好ましくは65%、より好ましくは70%を正確に分類することができ、少なくとも60%、好ましくは65%、より好ましくは70の感度および特異度を有する発現プロファイルを指す。感度値は、CyTDを用いて治療されるすべての患者の中で、CyTD治療に対して実際に臨床的に応答し、本発明による試験を使用し、応答するとして分類される患者の数の比率として定義される。特異度は、CyTDを用いて治療されるすべての患者の中で、CyTD治療に対して実際に臨床的に応答せず、本発明による試験を使用して正確に同定される患者の割合を測定する。
【００４３】
「最良の発現プロファイル」によって、分析される試料の少なくとも80%を正確に分類することができ、少なくとも80%の感度または感度を有する発現プロファイルを意味する。
【００４４】
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14C
のリストは、応答性/非応答性を評価するのに最良の発現プロファイルとして決定されたが、上記に定義されるものなどのような等価な発現プロファイルは、許容できる信頼性を伴って、応答性を評価するのをなお可能にする。特定の実施形態では、
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14C
のサブリストは、好適な信頼性を伴って応答性を評価するのをなお可能にし、許容できる発現プロファイルと見なされるべきである。
【００４５】
CyTD(特にTBA)応答性または非応答性の表現型を決定するために使用される発現プロファイルは、
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
からなるのみではなく、それを含んでいてもよいが、発現プロファイルは、任意選択で1つまたは複数のハウスキーピング遺伝子と共に、上記に記載される(i)、(ii)、または(iii)の発現プロファイルからなるまたは本質的に成ることが好ましく、上記に記載される(i)、(ii)、もしくは(iii)の発現プロファイルのうちの1つまたはハウスキーピング遺伝子に属する遺伝子ではない、せいぜい50、40、30、25、20、好ましくはせいぜい15、好ましくはせいぜい10、好ましくはせいぜい9、8、7、6、5、4、3、2、または1の遺伝子しか、発現プロファイルに含まれないことを意味する。
【００４６】
「ハウスキーピング遺伝子」によって、それは、それらが、絶えず細胞によって必要とされるタンパク質をコードし、よって、それらが、細胞に不可欠であり、あらゆる条件下で常に存在するので、多数またはすべての知られている状態にわたって比較的一定のレベルで恒常的に発現される遺伝子を意味する。それらの発現は、実験条件に影響されないと考えられる。それらがコードするタンパク質は、一般に、細胞の栄養または維持に必要な基本機能に関与する。本発明の方法において使用されてもよいハウスキーピング遺伝子の非限定的な例は、
-HPRT1(ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1)、
-UBC(ユビキチンC)、
-YWHAZ(チロシン3-モノオキシゲナーゼ/トリプトファン5-モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド)、
-B2M(ベータ-2-ミクログロブリン)、
-GAPDH(グリセリンアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ)、
-FPGS(ホリルポリグルタミン酸シンターゼ)、
-DECR1(2,4-ジエノイルCoAレダクターゼ1、ミトコンドリア)、
-PPIB(ペプチジルプロリルイソメラーゼB(シクロフィリンB))、
-ACTB(アクチンβ)、
-PSMB2(プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン(macropain))サブユニット、ベータ型、2)、
-GPS1(Gタンパク質経路サプレッサー1)、
-CANX(カルネキシン)、
-NACA(新生ポリペプチド関連複合体(nascent polypeptide-associated complex)アルファサブユニット)、
-TAX1 BP1(Tax1(ヒトT細胞白血病ウイルスI型)結合タンパク質1)、および
-PSMD2(プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)26Sサブユニット、非ATPアーゼ、2)
を含む。好ましくは、本発明による方法において基準化に使用されるハウスキーピング遺伝子の数は、1〜5を含み、好ましくは3である。
【００４７】
応答性または非応答性の表現型の存在の決定は、工程(b)において、少なくとも1つの参照プロファイルと、得られた発現プロファイルにより実行される。
【００４８】
「参照発現プロファイル」は、知られている特定の応答状態を有する対象由来の生物学的試料から得られる所定の発現プロファイルである。この比較を、意味があり、頑健なものにしておくために、「参照発現プロファイル」は、以下の工程から結果として生じるアルゴリズムのトレーニングによって決定される:
-応答性および非応答性患者から得られる生物学的試料の発現プロファイルの収集、
-応答性および非応答性の表現型として当該発現プロファイルを分類するための、前述の患者の発現プロファイルに対するアルゴリズムのトレーニング。
「参照発現プロファイルとの、得られた発現プロファイルの比較」は、得られた発現プロファイルに対する調整されたアルゴリズムの適用として理解することができる。
【００４９】
特定の実施形態では、工程(b)において試験試料との比較に使用される参照発現プロファイルは、CyTD応答性の対象由来の生物学的試料から(「CyTD応答性参照発現プロファイル」もしくは「応答性参照発現プロファイル」;本明細書において使用されるように、これらの表現は同意語である)および/またはCyTD非応答性対象由来の生物学的試料から(「CyTD非応答性参照発現プロファイル」もしくは「非応答性参照発現プロファイル」;本明細書において使用されるように、これらの表現は同じ意味を有する)得られてもよい。
【００５０】
好ましくは、少なくとも1つの参照発現プロファイルは、CyTD応答性参照発現プロファイルである。その代わりに、少なくとも1つの参照発現プロファイルは、CyTD非応答性参照発現プロファイルであってもよい。より好ましくは、CyTD応答性の表現型の存在または不在の決定は、少なくとも1つの応答者参照発現プロファイルおよび少なくとも1つの非応答者参照発現プロファイルと比較して実行される。診断または予後判定は、したがって、1つの応答性参照発現プロファイルおよび1つの非応答性参照発現プロファイルを使用して、実行されてもよい。好都合にも、より強い診断または予後判定を得るために、当該診断または予後判定は、いくつかの応答性参照発現プロファイルおよびいくつかの非応答性参照発現プロファイルを使用して実行される。
【００５１】
彼/彼女の発現プロファイルに基づいて、試験される対象の臨床応答の予測を可能にする、当該参照発現プロファイルとの試験された対象発現プロファイルの比較は、統計モデルまたは機械学習技術を使用して、当業者らによって行うことができる。PLS(部分最小二乗)回帰は、小さな参照試料の場合に予測を示すのに特に適切である。比較はまた、Support Vector Machines(SVM)、ロジスティク回帰、線形判別分析、Random Forests、k-NN(最近傍)、またはPAM(Predictive Analysis of Microarrays)統計的方法を使用して実行されてもよい。
【００５２】
発現プロファイルは、当業者によって知られている任意の技術によって決定されてもよい。特に、それぞれの遺伝子発現レベルは、ゲノムおよび/または核酸および/またはタンパク質(proteic)レベルで測定されてもよい。好ましい実施形態では、発現プロファイルは、それぞれの遺伝子の核酸転写物の量の測定によって決定される。他の実施形態では、発現プロファイルは、それぞれの遺伝子によって産生されるタンパク質の量の測定によって決定される。
【００５３】
核酸転写物の量は、当業者によって知られている任意の技術によって測定することができる。特に、測定は、抽出されたメッセンジャーRNA(mRNA)試料に対してまたは当技術分野においてよく知られている技術によって抽出されたmRNAから調製された、逆転写された(retrotranscribe)相補的DNA(cDNA)に対して直接実行されてもよい。mRNAまたはcDNA試料から、核酸転写物の量は、核酸マイクロアレイ、定量的PCR、および標識されたプローブを用いるハイブリダイゼーションを含む、当業者によって知られている任意の技術を使用して測定されてもよい。
【００５４】
好ましい実施形態では、発現プロファイルは、定量的PCRを使用して決定される。定量的またはリアルタイムPCRは、当業者らにとってよく知られており、容易に入手可能な技術であり、正確な説明を必要としない。
【００５５】
本発明の範囲を限定するとして見なされるべきではない特定の実施形態では、定量的PCRを使用する発現プロファイルの決定は、以下のように実行されてもよい。手短に言えば、リアルタイムPCR反応は、TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)を使用して実行される。6μL cDNAは、7.5μL TaqMan Universal PCR Master Mix、プローブおよびプライマーの20×混合物の0.75μL、ならびに0.75μLの水を含有する9μL PCR混合物に追加される。反応は、摂氏50度での2分間、それに続く摂氏95度での10分間の1回の開始工程ならびに摂氏95度での15秒間および摂氏60度での1分間を含む、40サイクルの増幅からなる。反応およびデータ獲得は、ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)を使用して実行することができる。試料中の鋳型転写分子の数は、蛍光シグナルをバックグラウンド蛍光を超えて検出することができる対数期における増幅サイクルを記録することによって決定される(サイクル閾値またはCT)。したがって、鋳型転写分子の開始数は、CTに反比例する。遺伝子の発現のレベルは、「△△CT法」を使用して測定され、手短に言えば、遺伝子は、参照/ハウスキーピング遺伝子の1つまたはグループの値によっておよび/またはプールされた試料などのような参照試料もしくはqPCR Human Universal Reference cDNA、random primed; Ozyme; ref639654などのような市販で入手可能な参照によって基準化される。
【００５６】
他の好ましい実施形態では、発現プロファイルは、核酸マイクロアレイの使用によって決定される。
【００５７】
本発明によれば、「核酸マイクロアレイ」は、マイクロチップ、スライドガラス、またはマイクロスフェアサイズのビーズとすることができる基体に結合された異なる核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカもしくはシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、またはニトロセルロースから構成されてもよい。プローブは、cDNA(「cDNAマイクロアレイ」)またはオリゴヌクレオチド(「オリゴヌクレオチドマイクロアレイ」)などのような核酸とすることができ、オリゴヌクレオチドは、長さが約25〜約60塩基対以下であってもよい。
【００５８】
標的核酸試料の発現プロファイルを決定するために、当該試料は、標識し、ハイブリダイゼーション条件においてマイクロアレイと接触させ、マイクロアレイ表面に付加されたプローブ配列と相補的である標的核酸の間の複合体の形成に至る。次いで、標識され、ハイブリダイズした複合体の存在が、検出される。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変形が、当業者に入手可能である。
【００５９】
好ましい実施形態では、核酸マイクロアレイは、
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
に対して特異的なオリゴヌクレオチドを含むまたはそれからなるオリゴヌクレオチドマイクロアレイである。
【００６０】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さが約50塩基である。本発明の核酸マイクロアレイまたはオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、上記に定義される等価な発現プロファイルに対して特異的なマイクロアレイを包含することが認められる。
【００６１】
Table 2(表2)の任意の遺伝子に対して特異的な、適したマイクロアレイオリゴヌクレオチドは、当技術分野において知られているマイクロアレイオリゴヌクレオチド設計の任意の方法を使用し、それぞれの遺伝子(Table 2(表2)のGenbank受託番号を参照されたい)のゲノム配列に基づいて、設計されてもよい。特に、たとえばOligoArrayソフトウェア(http://berrv.enqin.umich.edu/oliqoarrav/で入手可能)、GoArraysソフトウェア(http://www.isima.fr/bioinfo/goarrays/で入手可能)、Array Designerソフトウェア(http://www.premierbiosoft.com/dnamicroarray/index.htmlで入手可能)、Primer3ソフトウェア(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/primer3 code.htmlで入手可能)、またはPromideソフトウェア(http://oliqos.molqen.mpq.de/で入手可能)などのような、マイクロアレイオリゴヌクレオチドの設計のために開発された任意の入手可能なソフトウェアが、使用されてもよい。
【００６２】
他の実施形態では、発現プロファイルは、タンパク質マイクロアレイの使用によって決定される。
【００６３】
本発明による方法の特定の実施形態では、当該方法は、診断に有用な少なくとも1つのさらなるパラメーターを決定するステップをさらに含んでいてもよい。そのような「診断に有用なパラメーター」は、診断に単独で使用することができないが、応答性の対象および明らかに不応性の対象の間で有意に異なる値を示すとして説明されているパラメーターであり、したがって、また、本発明による上記に記載される方法に従って診断を精密にするおよび/または確認するために使用されてもよい。それらは、特に、炎症性疾患に依存する適切な臨床パラメーターを含んでいてもよい。関節リウマチ(RA)については、そのような臨床パラメーターは、対象の痛み、朝のこわばりの持続期間、関節腫脹の数、有痛関節の数、などのアセスメントを含む。好ましくは、診断に有用なパラメーターは、対象の非侵襲性の生物学的試料から決定される。特に、RAについては、それらは、RAに特異的な標準的な生物学的パラメーターから選択されてもよい。本発明によれば、「RAに特異的な標準的な生物学的パラメーター」は、RAの治療の効能をモニターするために臨床医によって通常使用される生物学的パラメーターである。RAまたは自己免疫疾患に特異的なこれらの標準的な生物学的パラメーターは、通常、当業者らによく知られている特定のタンパク質の血清または血漿濃度を含む。RAに特異的な当該標準的な生物学的パラメーターは、抗核抗体試験(ANA試験)、C反応性タンパク質試験(CRP試験)、赤血球沈降速度(ESR試験)、環状シトルリン化ペプチド抗体試験(CCP試験)、およびリウマチ因子試験を含む試験によって決定することができる。これらの試験は、当業者によく知られており、本明細書で詳述しない。それらは、単独でまたは組み合わせて使用されてもよい。
【００６４】
そのようなさらなるパラメーターは、
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
を含むまたはそれからなる発現プロファイルを使用して得られる診断を確認するために使用されてもよい。
【００６５】
本発明は、さらに
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
を含むまたはそれからなる発現プロファイルの決定のための少なくとも1つの試薬を含む、CyTD応答性または非応答性の表現型についてのin vitroにおける診断のためのキットに関する。
【００６６】
「発現プロファイルの決定のための試薬」によって、特に、当該発現プロファイルの決定を可能にする試薬、つまり、特に、発現プロファイルに含まれる遺伝子の発現レベルの特異的な決定のために意図される試薬を意味する。この定義は、Taqポリメラーゼまたは増幅バッファーなどのような、任意の遺伝子の発現レベルの決定に有用な汎用の試薬を除くが、そのような試薬は、本発明によるキットに含まれていてもよい。
【００６７】
本発明によるキットの好ましい実施形態では、当該キットは、
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
を含むまたはそれからなる発現プロファイルに基づくCyTD応答性または非応答性の表現型についてのin vitroにおける診断に専用である。
【００６８】
「専用の」によって、本発明のキットにおける発現プロファイルの決定のための試薬は、任意選択で、1つまたは複数のハウスキーピング遺伝子を有する、上記の(i)、(ii)、または(iii)の発現プロファイルの発現レベルを決定するための試薬から本質的に成り、したがって、上記に記載される(i)、(ii)、または(iii)の発現プロファイルおよびハウスキーピング遺伝子において言及されるもの以外の他の遺伝子の発現を決定するための最低限の試薬を含むことを意味する。たとえば、本発明の専用のキットは、好ましくは、上記に記載される(i)、(ii)、または(iii)の発現プロファイルのうちの1つに属さず、かつハウスキーピング遺伝子ではない遺伝子の発現レベルを決定するための、せいぜい50、40、30、25、20、好ましくはせいぜい15、好ましくはせいぜい10、好ましくはせいぜい9、8、7、6、5、4、3、2、または1の試薬しか含まない。
【００６９】
CyTD応答性または非応答性の表現型についてのin vitroにおける診断のためのそのようなキットは、応答性の表現型の存在または不在の決定のための説明書をさらに含んでいてもよい。
【００７０】
応答性の表現型のin vitroにおける診断のためのそのようなキットはまた、標準的な生物学的パラメーターなどのような、診断に有用な少なくとも1つのさらなるパラメーターの決定のための、少なくとも1つの試薬をさらに含んでいてもよい。特に、当該試薬は、以下の試験のいずれかを実行するのに有用である:抗核抗体試験(ANA試験)、C反応性タンパク質試験(CRP試験)、赤血球沈降速度(ESR試験)、環状シトルリン化ペプチド抗体試験(CCP試験)、およびリウマチ因子試験。
【００７１】
本発明による応答性の表現型のin vitroにおける診断のための任意のキットにおいて、
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
を含むまたはそれからなる発現プロファイルの決定のための試薬は、好ましくは、
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
の転写物の特異的な定量的増幅に対して特異的な増幅プライマーならびに/またはプローブならびに/または
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
の検出のための核酸マイクロアレイを含む。発現プロファイルの決定は、したがって、定量的PCRならびに/または核酸マイクロアレイ、好ましくはオリゴヌクレオチドマイクロアレイおよび/もしくはタンパク質マイクロアレイを使用して実行されてもよい。
【００７２】
さらに、CyTD(特にTBA)表現型の存在または不在の決定のための説明書は、好ましくは、少なくとも1つの参照発現プロファイルまたは参照発現プロファイルを得るための少なくとも1つの参照試料を含む。好ましい実施形態では、少なくとも1つの参照発現プロファイルは、応答性発現プロファイルである。その代わりに、少なくとも1つの参照発現プロファイルは、非応答性発現プロファイルであってもよい。より好ましくは、応答性のレベルの決定は、上記に記載される応答性および非応答性発現プロファイルとの比較によって実行される。
【００７３】
本発明はまた、
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
に対して特異的な核酸を含むまたはそれからなる核酸マイクロアレイにも関する。
【００７４】
当該核酸マイクロアレイは、さらなる遺伝子に対して特異的なさらなる核酸および任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子を含んでいてもよいが、好ましくは、最大500、400、300、200、好ましくは100、90、80、70、より好ましくは60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、またはさらに少ない(たとえば9、8、7、6、5、4、3、2、もしくは1)の異なる核酸からなる。
【００７５】
好ましい実施形態では、当該核酸マイクロアレイは、上記に記載される(i)、(ii)、または(iii)の発現プロファイルのうちの1つに属さず、かつハウスキーピング遺伝子ではない遺伝子に対して特異的な、せいぜい50、40、30、25、20、好ましくはせいぜい15、好ましくはせいぜい10、好ましくはせいぜい9、8、7、6、5、4、3、2、または1の異なる核酸しか含まない。
【００７６】
好都合にも、当該マイクロアレイは、
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iii)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
に対して特異的な核酸からなる。
【００７７】
好ましい実施形態では、当該核酸マイクロアレイは、
(i)遺伝子MAPK14;もしくは遺伝子MAPK14およびS100A9;もしくは遺伝子MAPK14およびGNLY;もしくはTable 2(表2)の61の遺伝子または
(ii)遺伝子S100A9;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、およびCASP5;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、およびGNLY;もしくは遺伝子S100A9、IL2RB、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14Cまたは
(iv)(i)および(ii)の発現プロファイルのいずれか1つの等価な発現プロファイル
ならびに任意選択で、1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子
に対して特異的なオリゴヌクレオチドを含むまたはそれからなるオリゴヌクレオチドマイクロアレイである。
【００７８】
本発明を全般的に記載したが、本発明の特徴および利点についてのさらなる理解は、例証のみの目的のために本明細書において提供され、別段の定めがない限り限定となるようには意図されないある種の特定の実施例および図に対する参照によって得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１Ａ】GO用語(GO term)。上位の、異なって発現される8つの遺伝子についての2つの最も有意に豊富なGO用語は、「インターフェロン-ガンマ産生の正の調節」(A)および「ナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害の調節」(B)である(p値<5×10-3)。
【図１Ｂ−１】GO用語(GO term)。上位の、異なって発現される8つの遺伝子についての2つの最も有意に豊富なGO用語は、「インターフェロン-ガンマ産生の正の調節」(A)および「ナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害の調節」(B)である(p値<5×10-3)。
【図１Ｂ−２】GO用語(GO term)。上位の、異なって発現される8つの遺伝子についての2つの最も有意に豊富なGO用語は、「インターフェロン-ガンマ産生の正の調節」(A)および「ナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害の調節」(B)である(p値<5×10-3)。
【図２】PathGenを使用するMAPK14およびS100A9についての経路分析。
【図３】Ingenuity(登録商標)システム分析。Ingenuity(登録商標)システム分析から出された上位の、異なって発現される8つの遺伝子は、単一の生物学的ネットワーク(細胞間シグナル伝達および相互作用、血液系(haematological system)の発達および機能、免疫細胞輸送)に属する。図3において、記号は、異なるタイプの分子を示し、-上向きの三角形:ホスファターゼ、-下向きの三角形:キナーゼ、-水平方向の楕円:転写制御因子、-垂直方向の楕円:膜貫通受容体、-菱形:酵素、-水平方向の長方形:リガンド依存性核受容体、-垂直方向の長方形:Gタンパク質共役受容体、-単純な円:他のタイプの分子、-二重の円:複合体グループ、網掛けの形状は、61のリストの一部である分子を示す。線のタイプは、相互作用のタイプを示す:-単純な矢印:第1の分子が、第2の分子に対して直接作用することを意味する(これに限定されないが活性化など)-点線入りの矢印:第1の分子が、第2の分子に対して間接的に作用することを意味する-短い弧で終わる線は、阻害を示す-単純な線は、相互作用を示す(これに限定されないがタンパク質間相互作用など)。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
(実施例)
(実施例1)
2つのデータセットのメタ分析(Bienkowskaら(9)およびJuliaら(8))
材料および方法
本実施例では、続く実施例1〜3において使用する材料および方法論を記載する。
【００８１】
データ同定およびデータ抽出:研究は、インフリキシマブを用いる療法を開始した、生物薬の投薬を受けたことがないRA患者に対して研究が実行され、治療に対する彼らの応答の測定値が、14週または22週に得られたという基準で選択した。大規模遺伝子発現情報は、ベースライン時に(治療に先立って)得られなければならなかった。Ramasamyら(10)において記載される工程に従って、発明者らは、研究基準と一致した4つの研究を同定した:Lequerreら(6)、Sekiguchiら(7)、Bienkowskaら(9)、およびJuliaら(8)。発現データ、表現型、およびアノテーションデータはすべて、GEO(それぞれGSE3592、GSE8350、GSE12051、およびGSE15258)からダウンロードした。4つの研究はすべて、「抗TNF療法に対する応答の遺伝子発現特性」を同定した。しかしながら、興味深いことには、同じアプローチを使用した刊行物はなく、これにより、報告された特性の間に共通部分がないことをある程度は説明することができる。4つの研究をより比較可能にするために、発明者らは、応答の単一の定義(応答者と見なされる「適度で」および「好適な」応答者を有するEULAR基準)を使用するための、ベースラインおよび14週または22週のDAS28などのようなさらなる個人情報またはインフリキシマブ治療患者のみを分析したことを確実にするための治療の詳細を得るために著者らと連絡をとった。そのため、発明者らは、14週および22週のEULAR定義に基づいて応答者として患者を分類し直し、好適で適度な応答者対非応答者の二成分分析を実行した。この二成分のグループ分けは、特に、非応答者の同定に適している。最終データセットは、Table 1(表1)に要約し、これは、発明者らが得ることができた、全体を通じて最も共通の特性を持つデータであった。
【００８２】
【表１】
2013526845.tif 000002
【００８３】
データ品質および処理:Bienkowskaらからデータは、発明者らが生のCELファイルをダウンロードし、発明者らの内部のプロトコールを使用してそれらを処理した唯一のデータであった(基準化はGENEDATA Expressionist(登録商標)(Genedata AG、Basel、Switzerland)により、リファイナーアレイ(refiner array)においてGC-RMAを使用して実行した)。歪みの増加による品質の問題により6つのチップにフラグを立てた。しかしながら、インフリキシマブ試料に利用可能なアレイの数に限りがあったので、発明者らは、発明者らの分析にそれらを含めた。
【００８４】
Lequerreら、Juliaら、およびSekiguchiらからのデータはすべて、基準化後の発現値に対応する発現マトリックスとしてダウンロードした。Lequerreらによるデータは、技術面の反復実験(technical replicate)を含んでおり、発明者らは、技術面の反復実験を平均し、分析から対照試料を除いた。
【００８５】
プローブ情報を遺伝子情報に翻訳するために、発明者らは、GEOで見つけられるそれぞれのアノテーションファイルにおいて提供されるNCBIのGeneldを使用した。多数のプローブが利用可能であった場合、発明者らは、プラットフォームにわたって同じNCBI GI番号を有するプローブを選択した。プローブがGIに関して異なった場合、それらはランダムに選択した。そのため、それぞれの遺伝子について、1つのプローブのみを分析に提供した。
【００８６】
統計分析:Sekiguchiらによって使用されたアレイ上のプローブの数に限りがあり、Lequerreらによる研究における試料供給源によって招かれる主な違い(PBMCは全血とは全く異なる)があるために、発明者らは、最初に、BienkowskaらおよびJuliaらのデータセットに対してのみメタ分析を実行した。次いで、発明者らは、Sekiguchiらからのデータ、最後にLequerreらからのデータを追加して、メタ分析を実行した。したがって、3つのメタ分析を実行した(それぞれ、実施例1、2、および3)。
【００８７】
統計分析は、MetaArrayパッケージ(D GhoshおよびH Choi、2009)を使用して、Rで実行した。このパッケージは、(H Choi、2005)において記載される潜在変数モデルおよび統合的な相関を実行する(12)。発現の可能性(POE)の評価については、発明者らは、EM評価法を使用した。プローブは、100%の存在で、かつ平均相関>-0.2に基づいてフィルターした。個々のプローブ寄与率は、Rで、multtestライブラリーにおいて実行されるt検定を使用して評価した。発明者らは、分布プロットの目視検査に基づいて、2.5で有意性についての閾値を設定した。
【００８８】
このアプローチを使用して同定されたプローブのリストは、次いで、それらの予測性能を評価するために個々のデータセットにおいてさらに評価した。これはFisher LDA予測因子およびleave-one-out cross validationを使用して、Genedata Expressionist(登録商標)において行った。生物学的プロセス強化のアセスメントは、Gene Ontology Fisher's Exact Test関数を使用し、Genedata Expressionist(登録商標)(Genedata AG、Basel、Switzerland)において行った。有意なプローブのリストは、試験したプローブ(共通のプローブ)のリストと比較した。経路分析は、PathGen(http://dna.cs.byu.edu/pathgenで入手可能)を使用して実行した。
【００８９】
結果
2つのデータセット(つまりBienkowskaらおよびJuliaら)の最初のメタ分析は、4022のプローブに対して実行した。2つの研究の間のいくらかの不均一性は、疾患の重症度、2回に対して1回の療法の使用などのような残りの臨床差異または使用された異なるプラットフォーム(Illuminaに対してAffymetrixマイクロアレイ)によるプローブの違いによるものとすることができた。マージしたデータセットからのPOEのt検定に基づいて、発明者らは、それらの有意性に基づいて遺伝子をランク付けした。Table 2(表2)は、応答者および非応答者の間の、61の最も異なって発現された遺伝子の遺伝子記号および方向を提供する。興味深いことには、この遺伝子リストは、Juliaらによって同定された遺伝子による2つの遺伝子およびBienkowskaらによって同定された1つの遺伝子のみが重複する。遺伝子のグループの差別的な性能を評価するために、発明者らは、上位の8つの遺伝子を選択し、個々のデータセットにそれらを適用した。性能は、Table 3(表3)において知ることができる。この8つの遺伝子セットは、Juliaらのデータセットにおいて非常に十分に機能し、LOOによって、44の試料のうちの7つが、誤って分類され、84%の総合誤差率を示し、PPVは、97%もの高さであった。
【００９０】
【表２Ａ】
2013526845.tif 000003
【表２Ｂ】
2013526845.tif 000004
【表２Ｃ】
2013526845.tif 000005
【表２Ｄ】
2013526845.tif 000006
【００９１】
【表３】
2013526845.tif 000007
【００９２】
上位8つの最も有意に異なって発現された遺伝子(IL2RB、S100A9、KLRK1、HCK、GNLY、CTSZ、ARF5、およびUTP14C)はすべて、Ingenuity(登録商標)システム分析によって、同じ生物学的ネットワークに関連した(「細胞間シグナル伝達および相互作用、血液系の発達および機能、免疫細胞輸送」)(図3)。
【００９３】
さらに、上位5つの最も有意に異なって発現された遺伝子(IL2RB、S100A9、KLRK1、HCK、GNLY)は、RA生理病理学に特に関連する。
【００９４】
IL2RB(インターロイキン2受容体サブユニットベータ)
IL2RB遺伝子は、IL2Rのベータサブユニットをコードし、これは、IL2からのシグナル伝達に必要とされる受容体の中程度のおよび高い親和性形態で存在する。いくつかの研究は、IL2RB遺伝子におけるSNP(とりわけrs743777)が、RAに有意に関連することを示した(13)。
【００９５】
自己反応性T細胞レパートリーの胸腺選択が、関節リウマチ(RA)にとって重要な危険因子であることが最近提唱されている(14)。
【００９６】
T細胞の活性化および調節においてIL2によって果たされる重要な役割のために、IL2RB遺伝子は、したがって、RAについての興味を引く候補である。
【００９７】
S100A9(S100カルシウム結合タンパク質A9)
S100A9遺伝子は、タンパク質のS100ファミリーに属する、骨髄関連タンパク質14(MRP14)またはカルグラニュリンBとも呼ばれるS100A9タンパク質をコードする。S100タンパク質は、嚢胞性線維症(15)、癌(16)、および炎症性疾患(17)などのようないくつかの病的な状態と関連することが知られている。
【００９８】
S100A9はまた、MAPK依存性のメカニズムを介して好中球脱顆粒(RAにおける組織損傷を説明するかもしれない)を誘発することが示された(18)。
【００９９】
最近公開された研究は、S100タンパク質が、RA炎症および自己抗体産生と関連することを示した(19)。
【０１００】
KLRK1
KLRK1遺伝子は、活性化NK細胞受容体(NKR)のファミリーに属するナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)タンパク質をコードする。
【０１０１】
RA患者において、有意な割合のCD4+CD28-T細胞は、RA滑膜細胞に対する自己反応性応答を刺激したNKG2Dを発現することが示された(20)。
【０１０２】
HCK
HCK遺伝子は、造血細胞型において主に発現されるチロシンタンパク質キナーゼHCK(造血細胞キナーゼ)をコードする。
【０１０３】
HCKは、RA生理病理学の初期において重要な役割を果たす、FcR媒介性の呼吸バースト(21)、好中球遊走(22)、および好中球脱顆粒(23)などのような、機能的な炎症誘発性応答に関与することが示された。
【０１０４】
さらに、HCKが、ヒト単球においてIL-2シグナル伝達を媒介することもまた、示された(24)。
【０１０５】
GNLY
GNLY遺伝子は、細胞溶解性のT細胞およびNK細胞の細胞毒性顆粒中に存在し、抗原刺激に際して放出されるサポニン様タンパク質であるグラニュライシンをコードする。
【０１０６】
グラニュライシンは、Tリンパ球、単球、および他の炎症細胞にとって化学誘引物質であり、RANTES、MCP-1、MCP-3、MIP-1α、IL-10、IL-1、IL-6、およびIFN-αを含む多くのサイトカインの発現を誘発する(25)。
【０１０７】
グラニュライシンはまた、感染、癌、移植、自己免疫病、皮膚、および生殖の疾患を含むいくつかの疾患にも関与する(26)。
【０１０８】
(実施例2)
3つのデータセット(Bienkowskaら、Juliaら、およびSekiguchiら)のメタ分析
第2のメタ分析は、Sekiguchiらのデータセットをマージした後に実行した。これにより、試験している遺伝子の数が劇的に低下し、数が290まで下がった。先のように検定統計量について同じ閾値を保つと(2.5)、61の先に記載される(実施例1を参照されたい)遺伝子のうちの3つのみが有意であった:IL2RB、S100A9、およびCASP5。しかしながら、これらの遺伝子は、22週の追跡調査に対するインフリキシマブ治療の予測の範囲を広げる。IL2RBおよびS100A9ならびにRAの生理病理学(上記を参照されたい)の間の関係に加えて、CASP5遺伝子もまた、この自己免疫性障害における関連する有意性を有する。
【０１０９】
CASP5
CASP5遺伝子は、アスパラギン酸残基で他のタンパク質をタンパク分解性で切断するカスパーゼ5酵素をコードする。免疫系(27)においておよび細胞アポトーシス(28)の複雑なプロセスにおいて役割を果たす炎症性カスパーゼである。線維芽細胞様のまたはマクロファージ様の滑膜細胞のアポトーシスにおける異常な減少または細胞周期活性の増加は、滑膜の過形成の原因であり、RA患者において、軟骨および骨の破壊の一因となり、したがって、RAの生理病理学におけるアポトーシス関連カスパーゼの可能性のある役割を示唆する(29)。
【０１１０】
(実施例3)
4つのデータセット(Bienkowskaら、Juliaら、Sekiguchiら、およびLequerreら)のメタ分析
Lequerreらによるデータをさらに追加し、したがって、179の遺伝子において分析された103の試料の総数に至り、非応答者において有意に増加する、61の先に記載される(実施例1を参照されたい)遺伝子のうちの2つの遺伝子のみ:MAPK14およびS100A9を同定した(図2)。これらの2つの遺伝子の組み合わせは、したがって、14週または22週での、生物学的試料(全血またはPBMC)に対するインフリキシマブ治療に対する応答を予測することができる。
【０１１１】
MAPK14
MAPK14遺伝子は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ14、MAPキナーゼファミリーのメンバーをコードする。MAPキナーゼは、多数の生化学的シグナルについての統合ポイントとして作用し、増殖、分化、転写調節、および発生などのような種々様々の細胞のプロセスに関与する。MAPキナーゼ経路は、翻訳および転写レベルの両方で、炎症誘発性サイトカインTNFαおよびIL-1βの生合成に特に影響を及ぼしている(30)。この経路は、したがって、RA治療のための重要な抗炎症性標的であるかもしれない。
【０１１２】
(実施例4)
マイクロアレイデータのメタ分析から得られる特性の効率についての定量的PCRによる確認
患者および方法
患者
関節リウマチを有し、応答のEULAR定義に従って(好適で中程度の応答者は、応答者として分類され、弱い応答者は、非応答者として分類される)、14週でインフリキシマブ治療に対する応答者および非応答者として分類された40人の患者由来の末梢血試料を、同定し、RT-PCRによって分析した。患者の臨床的なおよび人口統計学的な変数を、Table 4(表4)に要約する。
【０１１３】
【表４】
2013526845.tif 000008
【０１１４】
方法
末梢血は、RNA PAXgene(登録商標)チューブ(PreAnalytix、Switzerland)の中に収集し、全血からのRNAは、Juliaらにおいて記載される方法に従って抽出した(8)。試料は、品質管理を受け、RTおよびPCRの工程に先立って高速真空を使用して乾燥させた。リアルタイムPCR反応は、TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)を使用して、合計40の試料に対して実行した。6μL cDNAは、7.5μL TaqMan Universal PCR Master Mix、プローブおよびプライマーの20×混合物の0.75μL、ならびに0.75μLの水を含有する9μL PCR混合物に追加した。反応は、摂氏50度での2分間、それに続く摂氏95度での10分間の1回の開始工程ならびに摂氏95度での15秒間および摂氏60度での1分間を含む、40サイクルの増幅から成った。反応およびデータ獲得は、ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)を使用して実行した。「△△CT法」は、遺伝子発現の測定法として使用した。抽出後工程および分析は、TcLand Expression ISO13485研究所で実行した。
【０１１５】
11の遺伝子のうちの7つの遺伝子については、プローブは、特注設計し、配列情報は、Table 5a(表5)において知ることができる。11の遺伝子のうちの3つの遺伝子については、プローブは、Applied Biosystemsから直接、注文し、Table 5b(表6)に参照しやすくして載せる。
【０１１６】
【表５】
2013526845.tif 000009
【０１１７】
【表６】
2013526845.tif 000010
【０１１８】
結果
メタ分析からの結果に従って、Taqmanプローブは、Applied Biosystemsを通して注文したまたは社内で設計した。発明者らの内部の品質管理工程後に、本発明の11の遺伝子のうちの8つの遺伝子を、RA試料に対して試験した。Juliaらの研究においてマイクロアレイ分析に使用したもとの試料のサブセットに相当する40の試料を、発明者らの内部のプロトコールに従ってRT-PCRによって分析した。以下の統計分析を実行した:応答者対非応答者の2つのグループの間の個々に異なって発現された遺伝子の同定(Table 6(表7))。使用した選択基準は、少なくとも0.05の有意t検定とした。さらに、本発明において列挙される1、2、5、および8つの遺伝子の組み合わせの差別的な能力は、ロジスティク回帰を使用して評価し、分類率を提供した(Table 7(表8))。
【０１１９】
【表７】
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【０１２０】
【表８】
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【０１２１】
結論
上記の結果により、いくつかの独立した研究において得られたマイクロアレイデータのメタ分析に基づいて、RA罹患患者のインフリキシマブに対する応答を予測するとして同定された遺伝子の特定の組み合わせ(特性)は、RA罹患患者の検証グループのインフリキシマブ治療に対する応答の予測について、実際に効率的である(高い感度および特異度、低い誤差率)ことが確認される。
【０１２２】
(実施例5)
遺伝子の異なる下位組み合わせを使用する、含まれる患者の14週でのインフリキシマブに対する応答の予測
患者
実施例4と同じ患者を研究した。
【０１２３】
結果
応答者および非応答者を、一緒に最も良く区別する遺伝子の最適なサブグループの同定を、次いで、実行した。ロジスティク回帰を適用し、分類誤差は、遺伝子の最適なサブセットを同定するために使用した。
【０１２４】
それ自体で最も区別できる遺伝子は、MAPK14であり(Table 7(表8))、最適な2つの遺伝子の組み合わせは、GNLYおよびMAPK14である。
【０１２５】
【表９】
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【０１２６】
結論
これらの結果は、4つの独立した研究から得られたマイクロアレイデータのメタ分析によって実施例3において有意であるとして既に同定されていたMAPK14が、RA罹患患者におけるインフリキシマブ治療に対する応答について、単独ででさえ、実際に非常に予測するものであることを示す。さらに、実施例3において有用であるとして既に同定され、実施例4においてqPCR実験によって確認された、遺伝子S100A9およびMAPK14の組み合わせに加えて、遺伝子MAPK14およびGNLY(GNLYは、実施例1において有意であるとして既に同定されている)の組み合わせもまた、RA罹患患者におけるインフリキシマブに対する応答を非常に予測するものであり、試験した患者はすべて、この組み合わせを使用して、正確に分類された。
【０１２７】
全体的に、実施例1〜5において提示される結果は、RA罹患対象のインフリキシマブ応答性または非応答性の表現型との、2つの個々の遺伝子、MAPK14およびS100A9または等価な相関する遺伝子の密接な相関を支持する。さらに、RA罹患対象のインフリキシマブ応答性または非応答性の表現型と関連することが分かっている少数の他の遺伝子(特に、Table 2(表2)の61の遺伝子ならびにより具体的には、遺伝子GNLY、IL2RB、S100A9、KLRK1、HCK、CTSZ、ARF5、およびUTP14C)との、これらの遺伝子の一方または両方の組み合わせは、RA罹患対象のインフリキシマブ応答性または非応答性の表現型の高い感度および特異度(非常に低いエラー率)の予測を可能にする。
【０１２８】
最後に、発明者らは、RA罹患対象のインフリキシマブ応答性または非応答性の表現型に高度に相関することが分かっている遺伝子は、インフリキシマブの代謝に関与し得る遺伝子ではなく、むしろ、それら自体、疾患またはその根本的な機能不全に関連し得る遺伝子であることに注目する。特に、RA罹患対象のインフリキシマブ応答性または非応答性の表現型に高度に相関することが分かっている多くの遺伝子は、炎症性または免疫プロセスに関与することが知られている。これは、明らかに、他の炎症性疾患、特に、病原性のTNFα分泌を伴うものおよびさらに、より具体的には、TBAが承認されているまたは予備研究において有用であることが示されているものに罹患している対象のTBA応答性または非応答性の表現型の予測のための、本発明の方法の拡張に理論的根拠を与える。
【０１２９】
(実施例6)
関節リウマチ患者におけるDAS28、CRP、およびESRによって測定される遺伝子発現および炎症反応の間の相関
DAS28、C-反応性タンパク質(CRP)、および赤血球沈降速度(ESR)などのようなベースライン時に炎症を測定する臨床パラメーターは、応答者および非応答者を区別しない(t検定についてのそれぞれのp値は、0.7792、0.4839、および0.1755である)。遺伝子発現レベルが炎症の臨床パラメーターと相関するかどうかを評価するために、相関係数を計算した(Table 8(表10))。Table 8(表10)は、記号の遺伝子は、臨床パラメーターと相関せず、したがって、独立した情報を追加することを示す。IL2RBの遺伝子発現レベルのみが、CRPに対して負に相関し(相関係数=-0.35、p値  0.03)、このp値が、多数の試験に対して補正されていないことに注意されたい。
【０１３０】
【表１０】
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【０１３１】
これらの結果は、発明者らの遺伝子発現特性が、臨床的変数を超えて、独立した差別的な能力を提供するという主張を支持する。
(参考文献)
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【図２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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