(57)【要約】  微生物バイオマスから少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる精製脂質組成物を得る方法が開示され、精製脂質組成物は、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなり、微生物バイオマス油組成物と比べてトリアシルグリセロールに富む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法であって、
ａ）少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる油組成物を有する未処理破壊微生物バイオマスを液体または超臨界流体二酸化炭素を含んでなる溶媒で処理して、
（ｉ）実質的にリン脂質を含まない脂質画分を含んでなる抽出物、および
（ｉｉ）リン脂質を含んでなる残留バイオマスを得るステップと、
ｂ）ステップ（ａ）パート（ｉ）で得られた抽出物を少なくとも一度分画して、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる精製脂質組成物を得るステップと
を含んでなり、ここで精製脂質組成物が、未処理破壊微生物バイオマスの油組成物と比べてトリアシルグリセロールに富む、上記方法。
【請求項２】
トリアシルグリセロールに富む精製脂質組成物が、
ａ）ジアシルグリセロール、
ｂ）モノアシルグリセロール、
ｃ）遊離脂肪酸、および
ｄ）それらの組み合わせ
からなる群から選択される少なくとも１つの脂質成分を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トリアシルグリセロールに富む精製脂質組成物が、未処理破壊微生物バイオマスと比べて少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸に富む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（１）ステップ（ａ）パート（ｉ）で得られた抽出物を分画して、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる精製脂質組成物を得るステップ（ここで精製脂質組成物が、未処理破壊微生物バイオマスの油組成物と比べて、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、遊離脂肪酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される脂質構成要素に富む）；および
（２）ステップ（ａ）パート（ｉｉ）のリン脂質を含んでなる残留バイオマスを抽出剤で処理して、本質的にリン脂質からなる残留バイオマス抽出物を得るステップ；
からなる群から選択されるステップをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）の処理が約２０℃〜約１００℃の温度、および約６０バール〜約８００バールの圧力でなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）の分画が、分画条件の温度または圧力、または温度および圧力を変えることで行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）の処理溶媒が、超臨界流体二酸化炭素を含んでなり；
ステップ（ｂ）の分画が、約３５℃〜約１００℃の温度および約８０バール〜約６００バールの圧力で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
未処理破壊微生物バイオマスが、油性微生物細胞を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸が、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１または３に記載の方法。
【請求項１０】
リン脂質を含んでなる残留バイオマス、または本質的にリン脂質からなる残留バイオマス抽出物が、水産養殖飼料中の成分として使用するのに適する、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１１】
未処理破壊微生物バイオマスが、該バイオマス中の総脂肪酸の質量％として測定して、少なくとも２５質量％のエイコサペンタエン酸を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる油組成物を有する未処理破壊微生物バイオマスを液体または超臨界流体二酸化炭素を含んでなる溶媒で処理して、
（ｉ）実質的にリン脂質を含まない脂質画分を含んでなる抽出物；および
（ｉｉ）リン脂質を含んでなる残留バイオマス；を得るステップを含んでなり、
ここで未処理破壊微生物バイオマスが、その乾燥細胞質量の２５％よりも多くを油として蓄積するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の油性微生物から得られ；そして
上記少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる油組成物が、少なくとも２０個の炭素原子と４つ以上の炭素−炭素二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を、総脂肪酸の質量％として測定して、少なくとも２５質量％含んでなる方法。
【請求項１３】
未処理破壊微生物バイオマスがヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から得られ、ここで少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸がエイコサペンタエン酸を含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
リン脂質を含んでなる残留バイオマスを抽出剤で処理して、本質的にリン脂質からなる残留バイオマス抽出物を得る、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１０年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／３２６，７９３号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、二酸化炭素を含んでなる溶媒による破壊微生物バイオマスの抽出と、分画によって、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなり、トリアシルグリセロール（ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｅｒｃｏｌｓ）に富む、精製脂質組成物を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
医薬品および食事療法製品に、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；ω−３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；ω−３）などの多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含めることに対する関心の高まりがある。ＰＵＦＡ含有脂質組成物は例えば天然微生物源から、組換え微生物から、または魚油および海洋性プランクトンから得られる。ＰＵＦＡ含有脂質組成物は、特定条件下で酸化的に不安定であることが認識されており、酸化されていない組成物を得るためには、かなりの注意を払う必要がある。
【０００４】
特許文献１は、低級アルカノールがある魚油グリセリドをエステル交換して低級アルキル脂肪酸エステルの混合物を形成するステップと、超臨界条件下で二酸化炭素（ＣＯ２）により前記エステルを抽出するステップを含んでなる、濃縮されるＰＵＦＡ部分と同一鎖長の飽和および一不飽和脂肪酸部分を比較的低比率で含有する、魚油中のＰＵＦＡ部分を濃縮する方法を開示する。
【０００５】
高濃度ＥＰＡを生じる連続向流超臨界ＣＯ２分画法のために開発された工程流れ図が、非特許文献１によって開示されている。工程の原材料は、メンハーデン油の尿素結晶化エチルエチルであり、デザインの基準は、９０％の収率で９０％のＥＰＡ（エチルエステル）の生成物濃度である。
【０００６】
特許文献２は、トリグリセリド含量が高く、酸化安定性が高い、微生物ＰＵＦＡ含有油を開示する。これに加えて、低温殺菌された発酵ブロスに由来する微生物バイオマスから、このような油を回収する方法が記載されており、微生物バイオマスを押出して顆粒状粒子を形成し、乾燥させ、次に適切な溶媒を使用して乾燥顆粒から油を抽出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，６７５，１３２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，７２７，３７３号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｖ．Ｊ．Ｋｒｕｋｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｄｖ．Ｓｅａｆｏｏｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、Ｐａｐ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．（１９９２），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９８７，１６９−１７９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＰＵＦＡ含有脂質組成物中のトリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、および遊離脂肪酸の配分を調節し得る方法が求められる。改善された酸化安定性を有するＰＵＦＡ含有脂質組成物を得る方法が、所望される。トリアシルグリセロールに富むＰＵＦＡ含有脂質組成物を得る方法もまた所望され、このような組成物を得る経済的な方法についても同様である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の実施形態では、本発明は、
ａ）少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる油組成物を有する未処理破壊微生物バイオマスを液体または超臨界流体二酸化炭素を含んでなる溶媒で処理して、
（ｉ）実質的にリン脂質を含まない脂質画分を含んでなる抽出物、および
（ｉｉ）リン脂質を含んでなる残留バイオマスを得るステップと、
ｂ）ステップ（ａ）パート（ｉ）で得られた抽出物を少なくとも一度分画して、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる精製脂質組成物を得るステップと
を含んでなる方法に関し、精製脂質組成物は、未処理破壊微生物バイオマスの油組成物と比べてトリアシルグリセロールに富む。
【００１１】
第２の実施形態では、トリアシルグリセロールに富む精製脂質組成物は、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、遊離脂肪酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの脂質構成要素を含んでなる。
【００１２】
第３の実施形態では、トリアシルグリセロールに富む精製脂質組成物は、未処理破壊微生物バイオマスと比べて少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸に富む。
【００１３】
第４の実施形態では、本発明の方法は、
ａ）ステップ（ａ）パート（ｉ）で得られた抽出物を分画して、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる精製脂質組成物を得るステップ、および
ｂ）ステップ（ａ）パート（ｉｉ）のリン脂質を含んでなる残留バイオマスを抽出剤で処理して、リン脂質から本質的になる残留バイオマス抽出物を得るステップ
からなる群から選択されるステップをさらに含んでなり、精製脂質組成物は、未処理破壊微生物バイオマスの油組成物と比べて、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、遊離脂肪酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される脂質構成要素に富む。
【００１４】
第５の実施形態では、ステップ（ａ）の処理は約２０℃〜約１００℃の温度、および約６０バール〜約８００バールの圧力で実施される。ステップ（ｂ）の分画は、分画条件の温度または圧力、または温度と圧力を変更することで実施される。
【００１５】
第６の実施形態では、ステップ（ａ）の処理溶媒は超臨界流体二酸化炭素を含んでなり；ステップ（ｂ）の分画は約３５℃〜約１００℃の温度および約８０バール〜約６００バールの圧力で実施される。
【００１６】
第７の実施形態では、未処理破壊微生物バイオマスは、油性微生物細胞を含んでなる。
【００１７】
第８の実施形態では、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸は、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００１８】
第９の実施形態では、リン脂質を含んでなる残留バイオマスまたはリン脂質から本質的になる残留バイオマス抽出物は、水産養殖飼料の構成要素として使用するのに適する。
【００１９】
第１０の実施形態では、未処理破壊微生物バイオマスは、未処理破壊微生物バイオマス中の総脂肪酸の重量％としての測定で少なくとも２５重量％のエイコサペンタエン酸を含んでなる。
【００２０】
第１１の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる油組成物を有する未処理破壊微生物バイオマスを液体または超臨界流体二酸化炭素を含んでなる溶媒で処理して、
（ｉ）実質的にリン脂質を含まない脂質画分を含んでなる抽出物、および
（ｉｉ）リン脂質を含んでなる残留バイオマスを得る方法に関し、
前記未処理破壊微生物バイオマスは、その乾燥細胞重量の２５％よりも多くを油として蓄積するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の油性微生物から得られ、
少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含んでなる前記油組成物は、少なくとも２０個の炭素原子と４つ以上の炭素−炭素二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を、総脂肪酸の重量％としての測定で少なくとも２５重量％含んでなる。
【００２１】
未処理破壊微生物バイオマスは、好適にはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から得られ、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸はエイコサペンタエン酸を含んでなる。
【００２２】
第１２の実施形態では、リン脂質を含んでなる残留バイオマスが抽出剤で処理されて、リン脂質から本質的になる残留バイオマス抽出物が得られる。
【００２３】
生物学的寄託
以下の生物学的材料が、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９の米国微生物系統保存機関  （ＡＴＣＣ）に寄託され、以下の名称、受入番号、および寄託日を有する。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
上に列挙した生物学的材料は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って寄託された。列挙された寄託は、指定の国際寄託機関で少なくとも３０年間維持され、それを開示する特許の付与に際して公的に入手可能となる。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
【００２６】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載される技法に従って、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１２８から誘導された。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載される技法に従って、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４１２から誘導された。同様に、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載される技法に従って、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８２５９から誘導された。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】フローチャートの形態で本発明の方法の概要を提供し、下の説明を考察する際に、併せ見るべきである。各テキストボックスは、Ａ〜Ｌの文字でラベルされている。具体的には、微生物発酵（図１Ａ、Ｉ）により、未処理微生物バイオマス（図１Ａ、Ｂ）をもたらす。次に機械加工または化学処理により、未処理破壊微生物バイオマス（図１Ａ、Ｃ）を生成する。未処理破壊微生物バイオマスの油抽出（図１Ａ、Ｄ）は、リン脂質を含んでなる残留バイオマス（図１Ａ、Ｅ）および実質的にリン脂質を含まない抽出油（図１Ａ、Ｉ）をもたらし、それを任意選択的に分画して（図１Ｂ、Ｉ）、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる精製脂質組成物を生成してもよく、精製脂質組成物は、未処理破壊微生物バイオマスの油組成物と比べてＴＡＧに富む（図１Ｂ、Ｌ）。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図２】微生物バイオマスをＣＯ２に接触させて抽出物を得て、次にそれを分画する、本発明の方法の一実施形態を概略的に示す。
【図３】微生物バイオマスをＣＯ２に接触させて抽出物を得る、本発明の方法の一実施形態を概略的に示す。
【図４】実施例１で得られた抽出曲線のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書で言及される全ての特許および非特許文献の開示は、その全体を参照によって本明細書に援用する。
【００２９】
量、濃度、またはその他の値またはパラメーターが、範囲、望ましい範囲、または好ましい上位値と好ましい下位値の一覧のいずれかとして提示される場合、これは範囲が別個に開示されるかどうかにかかわらず、あらゆる上側の範囲限界または望ましい値と、あらゆる下側の範囲限界または望ましい値とのあらゆる組から形成される、全ての範囲を具体的に開示するものと理解される。一連の数値が本明細書で列挙される場合、特に断りのない限り、範囲はその終点と、範囲内の全ての整数および分数を含むことが意図される。範囲を画定する際に列挙される特定の値に、本発明の範囲を限定することは意図されない。
【００３０】
本明細書の用法では、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｈａｓ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」または「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」またはあらゆるその他のバリエーションは、非排他的包含をカバーすることが意図される。例えば、構成要件の一覧を構成する組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの構成要件のみに限定されず、明示的に列挙されない、またはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有でない、その他の構成要件を含んでもよい。さらに特に断りのない限り、「ｏｒ」は排他的ｏｒでなく包括的ｏｒを指す。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれかによって満たされる。Ａが真で（または存在し）Ｂが偽であり（または存在せず）、Ａが偽で（または存在せず）Ｂが真であり（または存在する）、ＡおよびＢの双方が真である（または存在する）。
【００３１】
さらに本発明の構成要件または構成要素に先立つ不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、構成要件または構成要素の事例数（すなわち発生率）に関して非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈すべきであり、構成要件または構成要素の単数語形は、数が単数であることを明らかに意味する場合を除いて、複数もまた含む。
【００３２】
本明細書の用法では、「発明」または「本発明」という用語は、特許請求の範囲および明細書に記載される、本発明の全ての態様および実施形態を指すことが意図され、いかなる特定の実施形態または態様にも限定されないものと解釈される。
【００３３】
本開示では、以下の定義が使用される。
「超臨界流体」は、「ＳＣＦ」と略記される。
「二酸化炭素」は、「ＣＯ２」と略記される。
「米国微生物系統保存機関」は、「ＡＴＣＣ」と略記される。
「多価不飽和脂肪酸」は、「ＰＵＦＡ」と略記される。
「リン脂質」は、「ＰＬ」と略記される。
「モノアシルグリセロール」は、「ＭＡＧ」と略記される。
「ジアシルグリセロール」は、「ＤＡＧ」と略記される。
「トリアシルグリセロール」は、「ＴＡＧ」と略記される。本明細書では、「トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）」という用語は、「トリアシルグリセリド」という用語と同義であり、グリセロール分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂肪を指す。ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡおよび飽和脂肪酸、ならびに鎖長のより短い飽和および不飽和脂肪酸を含有し得る。
「遊離脂肪酸」は、「ＦＦＡ」と略記される。
「総脂肪酸」は、「ＴＦＡ」と略記される。
「脂肪酸メチルエステル」は、「ＦＡＭＥ」と略記される。
「乾燥細胞重量」は、「ＤＣＷ」と略記される
「重量％」は、「ｗｔ％」と略記される。
【００３４】
本明細書の用法では、「微生物バイオマス」という用語は、ＰＵＦＡを含んでなる微生物油を製造するために実施される、含油微生物の微生物発酵からの微生物細胞物質を指す。微生物バイオマスは、ホールセル、ホールセル溶解産物、均質化細胞、部分的加水分解細胞物質、および／または破壊細胞の形態であってもよい（したがって微生物バイオマスという用語は、未処理微生物バイオマスまたは未処理破壊微生物バイオマスを包括的に指してもよい、後述）。
【００３５】
「未処理微生物バイオマス」という用語は、溶媒による抽出前の微生物バイオマスを指す。微生物バイオマスは任意選択的に、例えば脱水して乾燥させ、ペレット化および／または顆粒化してもよい。「未処理微生物バイオマス」および「未精製微生物バイオマス」という用語は、本明細書で同義的に使用される。
【００３６】
「未処理破壊微生物バイオマス」という用語は、破砕処理されているが、溶媒による抽出はされていない微生物バイオマスを指す。当業者は理解するように、例えば細胞溶解のための化学的方法、またはビードビーター、スクリュー押出などの物理的手段を通じた機械的破砕をはじめとする多数の細胞破砕方法が利用できる。
【００３７】
「残留バイオマス」いう用語は、溶媒で少なくとも１回抽出された、含油微生物の発酵から得られる微生物細胞物質を指す。したがって残留バイオマスは、抽出によってＰＵＦＡ含有微生物油が除去された消耗微生物バイオマスである。
【００３８】
「富む」という用語は、例えば元の量をわずかにのみ超える量、または例えば元の量を指数関数的に上回る量などのより大きな量を有することを意味し、その間の全ての量を含む。
【００３９】
「低下」または「枯渇」という用語は、例えば元の量をわずかにのみ下回る量、または例えば特定材料が完全に欠如している量などのより少ない量を有することを意味し、その間の全ての量が含まれる。
【００４０】
「脂質」という用語は、あらゆる脂溶性（すなわち親油性）天然分子を指す。脂質は、細胞膜の構造的構成要素、エネルギー保存源、およびシグナル伝達経路中間体などの多数の重要な生物学的機能を有する多様な化合物である。脂質はケトアシルまたはイソプレン基のどちらかに、完全にまたは部分的に由来する、疎水性または両親媒性の小型分子として広く定義されてもよい。Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ（ＬＩＰＩＤ  ＭＡＰＳ）分類体系（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に基づく脂質の概説を下の表１に示す。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
「油」という用語は、２５℃で液体であり、通常は多価不飽和である脂質物質を指す。油性生物では、油が総脂質の大部分を構成する。「油」はトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）で主に構成されるが、その他の中性脂肪、リン脂質（ＰＬ）、および遊離脂肪酸（ＦＦＡ）もまた含有してもよい。油中の脂肪酸組成および総脂質の脂肪酸組成は、一般に類似しており；したがって総脂質中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少は、油中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少に対応し、逆もまた然りである。
【００４３】
「中性脂肪」とは、脂肪体の細胞中に貯蔵脂肪として一般に見られる脂質を指し、細胞のｐＨでは脂質は荷電基を有さないため、このように称される。概してそれらは完全に非極性であり、水に対する親和性がない。中性脂肪は、一般に脂肪酸とグリセロールのモノ−、ジ−、および／またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）またはＴＡＧと称され、または集合的にアシルグリセロールとも称される。アシルグリセロールからＦＦＡを放出するためには、加水分解反応が起きなくてはならない。
【００４４】
「抽出」という用語は、溶媒の手段によって、基質から１つまたは複数の構成要素を除去する物理的または化学的方法を指す。
【００４５】
「分画」という用語は、分子の複合混合物の構成要素を選択的に分離して、出発原料と異なり、また互いに異なる、構成要素配分を有する画分にすることを指す。
【００４６】
「抽出油」という用語は、その中で微生物油が合成される微生物などの細胞物質から分離される油を指す。抽出油は、多種多様な方法を通じて得られ、最も単純なものは物理的手段のみを伴う。例えば、様々なプレス構造（例えばスクリュー、エキスペラー、ピストン、ビードビーターなど）を使用した機械的破砕が、細胞物質から油を分離し得る。代替方法として、油抽出は様々な有機溶剤（例えばヘキサン、イソヘキサン）による処理を通じて、酵素的抽出を通じて、浸透圧衝撃を通じて、超音波抽出を通じて、超臨界流体抽出（例えばＣＯ２抽出）を通じて、鹸化を通じて、そしてこれらの方法の組み合わせを通じて行い得る。抽出油のさらなる精製または濃縮は、任意選択である。
【００４７】
「精製脂質組成物」という用語は、本明細書で開示される抽出および分画法の生成物である、微生物油組成物を指す。したがって精製脂質組成物は、実質的にリン脂質を含まない抽出油である。当業者は、分画プロセスにおいて様々な画分を分離し得ることを理解するが、分画から得られる少なくとも１つの精製脂質組成物は、微生物バイオマスの油組成物と比べてＴＡＧに富む。ＴＡＧに富む精製脂質組成物は、ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＦＦＡ、およびそれらの組み合わせを含んでなってもよい。ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＦＦＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される脂質構成要素に富む精製脂質組成物など、中性脂肪、ＦＦＡ、およびそれらの組み合わせの様々な画分を含んでなる追加的精製脂質組成物もまた分離されてもよい。精製脂質組成物をさらに精製して、「精製油」を製造してもよい。
【００４８】
「実質的にリン脂質（ＰＬ）を含まない」という用語は、約０．１重量％を下回るリン脂質を含んでなることを意味する。したがって脂質画分を含んでなる抽出物は、総脂質の重量％としての測定でＰＬ濃度が約０．１重量％を下回れば、実質的にＰＬを含まない。同様に精製脂質組成物を含んでなる抽出物は、総脂質の重量％としての測定でＰＬ濃度が約０．１重量％以を下回れば、実質的にＰＬを含まない。
【００４９】
本明細書では「総脂肪酸（ＴＦＡ）」という用語は、例えば微生物バイオマスまたは油であってもよい所与のサンプル中において、（当該技術分野で既知の）塩基エステル交換法によって、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に誘導体化できる全細胞脂肪酸の総和を指す。したがって総脂肪酸は、（ＤＡＧ、ＭＡＧ、およびＴＡＧをはじめとする）中性脂質画分からの、および（ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン画分をはじめとする）極性脂質画分からの脂肪酸を含むが、ＦＦＡは含まない。
【００５０】
細胞の「総脂質含量」という用語は、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のパーセントとしてのＴＦＡの尺度であるが、総脂質含量は、ＤＣＷのパーセントとしてのＦＡＭＥ（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）によって近似できる。したがって総脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）は、例えば１００ミリグラムのＤＣＷあたりの総脂肪酸のミリグラムに等しい。
【００５１】
総脂質中の脂肪酸濃度は、本明細書中で例えば１００ミリグラムのＴＦＡあたりの所与の脂肪酸のミリグラムなどのように、ＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］として表される。本開示中では、特に断りのない限り、総脂質に対する所与の脂肪酸のパーセントへの言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に等しい（例えば総脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ％ＴＦＡに等しい）。
【００５２】
場合によっては、細胞中の所与の脂肪酸含量をその乾燥細胞重量の重量％（％ＤＣＷ）として表すことが有用である。したがって例えばＥＰＡ％ＤＣＷは、次式に従って求められる。
（ＥＰＡ％ＴＦＡ）*（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００
しかし乾燥細胞重量の重量％（％ＤＣＷ）としての細胞中の所与の脂肪酸含量は、以下のように近似し得る。
（ＥＰＡ％ＴＦＡ）*（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）］／１００
【００５３】
「脂質プロフィール」および「脂質組成」という用語は同義であり、総脂質中または油中などの特定の脂質画分に含有される個々の脂肪酸の量を指し、この量はＴＦＡの重量％として表される。混合物中に存在する個々の脂肪酸の総和は、１００になるべきである。
【００５４】
「脂肪酸」という用語は、約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指すが、鎖長のより長い酸およびより短い酸の双方も知られている。優勢な鎖長は、Ｃ１６〜Ｃ２２の間である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」の簡易表記体系によって表され、式中、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは二重結合数である。「飽和脂肪酸」と「不飽和脂肪酸」、「一不飽和脂肪酸」と「多価不飽和脂肪酸」（ＰＵＦＡ）、および「ω−６脂肪酸」（「ω−６」または「ｎ−６」）と「ω−３脂肪酸」（「ω−３」または「ｎ−３」）の区別に関わる追加的詳細は、参照によって本明細書に援用する米国特許第７，２３８，４８２号明細書にある。
【００５５】
本明細書でＰＵＦＡを記述するのに使用される命名法を表２に示す。「略記法」と題された欄ではω−基準系を使用して、炭素数、二重結合数、そしてこの目的で１番目であるω炭素から数えたω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸とそれらの前駆体の一般名、明細書全体を通じて使用される略称、および各化合物の化学名を要約する。
【００５６】
【表３】
2013525549.tif 000005
【００５７】
「高レベルＰＵＦＡ産生」という用語は、微生物宿主の総脂質の少なくとも約２５％のＰＵＦＡ、好適には総脂質の少なくとも約３０％のＰＵＦＡ、より好適には総脂質の少なくとも約３５％のＰＵＦＡ、より好適には総脂質の少なくとも約４０％のＰＵＦＡ、より好適には総脂質の少なくとも約４０〜４５％のＰＵＦＡ、より好適には総脂質の少なくとも約４５〜５０％のＰＵＦＡ、より好適には少なくとも約５０〜６０％、最も好適には総脂質の少なくとも約６０〜７０％のＰＵＦＡの産生を指す。ＰＵＦＡの構造形態は限定的でなく；したがって例えばＰＵＦＡは、ＦＦＡとして、またはアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質または糖脂質などのエステル化形態で総脂質中に存在してもよい。
【００５８】
「含油微生物」という用語は、微生物油を産生できる微生物を指す。したがって含油微生物は、酵母、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイル、真菌、またはそれらの組み合わせであってもよい。好ましい実施形態では、含油微生物は油性である。
【００５９】
「油性」という用語は、それらのエネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。概して、油性微生物の細胞油はＳ字形曲線に従い、脂質濃度は対数後期または初期定常期においてそれが最大に達するまで増大し、次に静止期後期および死滅期中に徐々に減少する（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９−２５（１９９１））。油性微生物がそれらの乾燥細胞重量の約２５％を超えて、油として蓄積することは珍しくない。油性生物の例としては、モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、および様々な油性酵母からなる群から選択される属の生物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６０】
「油性酵母」という用語は、油を産生し得る酵母に分類される微生物を指す。油性酵母の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、決してこれに限定されるものではない。
【００６１】
「動物飼料」という用語は、ペット、家畜などの飼育動物をはじめとする動物、または例えば養魚業などの食物生産のために飼育される動物による専用消費が意図される飼料を指す。「水産養殖飼料」、「アクアフィード」および「飼料栄養素」という用語については、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書で定義される。
【００６２】
一般に、油性微生物中の脂質蓄積は、増殖培地内に存在する全炭素対窒素比に応えて引き起こされる。油性微生物中における遊離パルミチン酸（１６：０）の新規合成をもたらすこの過程については、米国特許第７，２３８，４８２号明細書で詳細に述べられる。パルミチン酸は、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じて形成される、鎖長のより長い飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆体である。
【００６３】
（飽和および不飽和脂肪酸、そして短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする）幅広い脂肪酸が、脂肪酸の主要保存単位であるＴＡＧに組み込める。本明細書に記載される方法では、長鎖ＰＵＦＡのＴＡＧへの組み込みが最も望ましいが、ＰＵＦＡの構造的形態は限定的でない（したがって例えばＥＰＡは総脂質中にＦＦＡとして、またはアシルグリセロール、ＰＬ、硫脂質または糖脂質などのエステル化形態で存在してもよい）。より具体的には、本方法の一実施形態では、含油微生物は、ＬＡ、ＧＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡ、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのＰＵＦＡを産生する。より好適には、少なくとも１つのＰＵＦＡは、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡ、およびそれらの混合物からなる群から選択されるＰＵＦＡのように、少なくともＣ２０鎖長を有する。別の実施形態では、少なくとも１つのＰＵＦＡは、少なくともＣ２０の鎖長と、４つ以上の炭素−炭素二重結合を有し、すなわちＰＵＦＡは、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−６、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡ、およびそれらの混合物からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、少なくとも１つのＰＵＦＡは、ＥＰＡおよびＤＨＡからなる群から選択される。
【００６４】
ほとんどのＰＵＦＡは中性脂肪としてＴＡＧに組み込まれて脂肪体中に保存されるが、油性生物中の総ＰＵＦＡの測定は、ホスファチジルコリン画分、ホスファチジルエタノールアミン画分、およびＴＡＧ画分中に位置するＰＵＦＡを最低限含むべきであることに留意することが重要である。
【００６５】
本明細書の一実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる精製脂質組成物を得る方法に関し、精製脂質組成物は未処理破壊微生物バイオマスの油組成物と比べてＴＡＧに富む。ＴＡＧに富む精製脂質組成物は、ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＦＦＡ、およびそれらの組み合わせをさらに含んでなってもよい。少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなり、ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＦＦＡ、およびそれらの組み合わせに富む、追加的精製脂質組成物画分が得られてもよい。好適には、ＴＡＧに富む少なくとも１つの精製脂質組成物は、微生物バイオマスの油組成物と比べて遊離ＦＦＡが枯渇しており、未処理破壊微生物バイオマスと比べて少なくとも１つのＰＵＦＡに富む。最も好適には、富化された少なくとも１つのＰＵＦＡは、少なくとも２０個以上の炭素原子を有する。
【００６６】
本明細書の代案の実施形態では、本発明は、未処理破壊微生物バイオマスが液体または超臨界流体二酸化炭素を含んでなる溶媒で処理される方法に関し；（ａ）未処理破壊微生物バイオマスは、その乾燥細胞重量の２５％よりも多くを油として蓄積するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の油性微生物から得られ；（ｂ）少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる油組成物は、少なくとも２０個の炭素原子と４つ以上の炭素−炭素二重結合を有するＰＵＦＡを、全脂肪酸の重量％としての測定で少なくとも２５重量％含んでなる。これは、（ｉ）実質的にリン脂質を含まない脂質画分を含んでなる抽出物；および（ｉｉ）リン脂質を含んでなる残留バイオマスをもたらす。
【００６７】
本発明は本明細書で開示される方法に広く関するが、未処理破壊微生物バイオマスがそれから得られる、含油微生物それ自体を得るのに有用であり得る関連方法の概要が、理解されるであろう（図１Ａおよび図１Ｂ、およびその中のテキストボックスへの言及を参照されたい）。ほとんどの方法は、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる微生物油の増殖および生産をできるようにする条件下で、特定の微生物が培養される微生物発酵（図１Ａ、Ａ）に始まる。適切な時期に、微生物細胞を発酵容器から収穫する。この未処理微生物バイオマス（図１Ａ、Ｂ）は、破砕処理（図１Ａ、Ｃ）を実施するのに先だって、脱水、乾燥、ペレット化、顆粒化などの様々な手段を使用して、任意選択的に処理してもよい。次に未処理破壊微生物バイオマスの油抽出（図１Ａ、Ｄ）を実施して、リン脂質［「ＰＬ」］を含んでなる残留バイオマス（例えば細胞残骸）（図１Ａ、Ｅ）と、実質的にＰＬを含まない抽出油（図１Ａ、Ｉ）を生成し、それを任意選択的に分画して（図１Ｂ、Ｊ）、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる精製脂質組成物を生成してもよく、精製脂質組成物は、未処理破壊微生物バイオマスの油組成物と比べてＴＡＧに富む（図１Ｂ、Ｌ）。ＰＬを含んでなる残留バイオマス（図１Ａ、Ｅ）をさらに抽出してもよい（図１Ｂ、Ｆ）。図１Ａおよび図１Ｂのこれらの各態様は、下でさらに詳細に考察される。
【００６８】
含油微生物は、微生物発酵を通じて微生物バイオマスを産生する。微生物バイオマスは、天然または組換え（「遺伝子改変」）に関わらず、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる微生物油を産生できる、あらゆる微生物から得られてもよい。したがって例えば、含油微生物は、酵母、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイル、真菌、およびそれらの混合物からなる群から選択されてもよい。好適には微生物は、微生物油中に高レベルのＰＵＦＡを産生できる。
【００６９】
例としてＡＲＡ油の商業的供給源は、典型的にモルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属（糸状菌）、ハエカビ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属、およびチノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）属（紅藻）の微生物から製造される。中でも注目すべきことに、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）はＡＲＡ含有真菌油（ＡＲＡＳＣＯ（登録商標）；米国特許第５，６５８，７６７号明細書）を製造し、これは実質的にＥＰＡを含まず、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）またはシウム・インシジオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｎｓｉｄｉｕｏｓｕｍ）のどちらかに由来する。
【００７０】
同様にＥＰＡは、用いられる特定微生物の天然能力に基づく多数の異なる方法を通じて、微生物を利用して製造し得る［例えば従属栄養珪藻キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）種およびニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）種（米国特許第５，２４４，９２１号明細書）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）種またはシュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）種（米国特許第５，２４６，８４１号明細書）；ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属の糸状菌（米国特許第５，２４６，８４２号明細書）；またはモルティエラ・エロンガータ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）、Ｍ．エクシグア（Ｍ．ｅｘｉｇｕａ）、またはＭ．ハイグロフィラ（Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）（米国特許第５，４０１，６４６号明細書）］。天然でＥＰＡを産生する微生物について述べる役立つレビューは、Ｚ．Ｗｅｎ  ａｎｄ  Ｆ．Ｃｈｅｎ，Ｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  ＣｅｌｌＯｉｌｓ；Ｃ．Ｒａｔｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  Ｚ．Ｃｏｈｅｎ，Ｅｄｓ．；ＡＯＣＳ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００５の「Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ＥＰＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」と題されたレビューである。
【００７１】
ＤＨＡもまた、天然微生物の天然能力に基づく方法を使用して製造し得る。例えばシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（米国特許第５，３４０，７４２号明細書；米国特許第６，５８２，９４１号明細書）；ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）（米国特許第６，５０９，１７８号明細書）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種ＹＳ−１８０（米国特許第６，２０７，４４１号明細書）；スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属ＬＦＦ１株（米国特許出願公開第２００４／０１６１８３１Ａ１号明細書）；クリプテコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）（米国特許出願公開第２００４／００７２３３０Ａ１号明細書；ｄｅＳｗａａｆ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ．，８１（６）：６６６−７２（２００３）およびＡｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６１（１）：４０−３（２００３）；エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）種（特開平５−３０８９７８号公報（１９９３）；およびジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（ＡＴＣＣ＃２８２０７；特開１９９５８８／１９８９号公報］のために開発された方法を参照されたい。さらに以下の微生物が、ＤＨＡを産生する能力を有することが知られている：ビブリオ・マリヌス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）（深海から単離された細菌；ＡＴＣＣ＃１５３８１）；微小藻類キクロテラ・クリプティカ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ）およびイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）；そしてスラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）（ＡＴＣＣ＃３４３０４；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ，Ｌｉｐｉｄｓ，２７：１５（１９９２）やＡＴＣＣ＃２８２１１、ＡＴＣＣ＃２０８９０、およびＡＴＣＣ＃２０８９１と称されるスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種などの有鞭毛真菌（ｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  ｆｕｎｇｉ）。目下、ＤＨＡを商業生産する少なくとも３つの異なる発酵法がある：ＤＨＡＳＣＯ（商標）を生産するためのＣ．コーニイ（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ）の発酵（Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）；以前にＤＨＡＧｏｌｄとして知られていた油を生産するためのシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種の発酵（Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；およびＤＨＡｃｔｉｖｅ（商標）を生産するためのウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）種の発酵（Ｎｕｔｒｉｎｏｖａ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００７２】
組換え手段を使用した微生物油中のＰＵＦＡの微生物生産は、天然微生物源からの生産と比べて、いくつかの利点を有することが期待される。例えば、宿主中への新しい生合成経路の導入によって、および／また望まれない生合成の経路の抑制によって、宿主の天然の微生物脂肪酸プロフィールを改変し得て、したがって所望のＰＵＦＡ（またはその抱合形態）の生産レベル増大と、望まれないＰＵＦＡの生産低下がもたらされるので、油生産のための望ましい特徴を有する組換え微生物を使用し得る。第二に組換え微生物は、特定用途を有してもよい特定形態で、ＰＵＦＡを提供し得る。さらに培養条件を制御することによって、とりわけ微生物的に発現される酵素のための特定基質源を提供することによって、または化合物／遺伝子操作を付加して望まれない生化学的経路を抑制することによって、微生物油産生を操作し得る。したがって例えば、このようにして産生されるω−３とω−６脂肪酸の比率を修正し、あるいはその他のＰＵＦＡの下流または上流生成物の顕著な蓄積なしに、特定のＰＵＦＡ（例えばＥＰＡ）の産生を遺伝子操作することが可能である。
【００７３】
したがって例えば、δ−５デサチュラーゼ、δ−６デサチュラーゼ、δ−１２デサチュラーゼ、δ−１５デサチュラーゼ、δ−１７デサチュラーゼ、δ−９デサチュラーゼ、δ−８デサチュラーゼ、δ−９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、およびＣ１８／２０エロンガーゼの特定の組み合わせなどの適切なＰＵＦＡ生合成経路遺伝子を導入することで、ＥＰＡを産生する天然能力を欠く微生物を遺伝子操作して、ＰＵＦＡ生合成経路を発現させ得るが、導入される特定酵素（およびこれらの酵素をコードする遺伝子）は、本発明をどのようにも限定するものではないと認識される。
【００７４】
一例として、数種類の酵母が、少なくとも１つのＰＵＦＡを産生するように組換え遺伝子操作されている。例えば、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｄｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９：２２４−２３０（２００２）；Ｄｏｍｅｒｇｕｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６９：４１０５−４１１３（２００２）；米国特許第６，１３６，５７４号明細書；米国特許出願公開第２００６−００５１８４７−Ａ１号明細書）、および油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（米国特許第７，２３８，４８２号明細書；米国特許第７，４６５，５６４号明細書；米国特許第７，５８８，９３１号明細書；米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書；米国特許第７，５５０，２８６号明細書；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書）における研究を参照されたい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、微生物宿主細胞が油性である場合に利点が認識される。油性微生物宿主細胞は、例えばモルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、および油性酵母からなる群から選択される属のメンバーであってもよい。油性酵母は天然で油を合成して蓄積でき、全油含量は、細胞乾燥重量の約２５％を超えて、より好適には細胞乾燥重量の約３０％を超えて、最も好適には細胞乾燥重量の約４０％を超えて構成し得る。代案の実施態様では、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの非油性酵母が、細胞乾燥重量の２５％を上回る油を産生し得るように、それを遺伝子操作して油性にし得る（国際公開第２００６／１０２３４２号パンフレット）。
【００７６】
典型的に油性酵母として同定される属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には、例証的な油合成酵母としては、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プリケリーマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に分類された）が挙げられる。
【００７７】
最も好ましいのは、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり；さらなる実施形態では、最も好ましいのはＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，ａｎｄ  Ａｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３−９（２００２））。
【００７８】
いくつかの実施形態では、油性酵母が「高レベルＰＵＦＡ産生」できることが望ましいことがあり、生物は総脂質中に少なくとも約５〜１０％の所望のＰＵＦＡ（すなわち、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３、および／またはＤＨＡ）を産生し得る。より好適には、油性酵母は、総脂質中に少なくとも約１０〜２５％の所望のＰＵＦＡ、より好適には総脂質中に少なくとも約２５〜３５％の所望のＰＵＦＡ、より好適には総脂質中に少なくとも約３５〜５０％の所望のＰＵＦＡ、および最も好適には総脂質中に少なくとも約５０〜７０％の所望のＰＵＦＡを産生する。ＰＵＦＡの構造形態は限定的でなく；したがって例えば、ＥＰＡは総脂質中にＦＦＡまたはエステル化形態で存在してもよい。好適には、少なくとも１つのＰＵＦＡはＴＡＧの形態である。
【００７９】
したがって本明細書に記載されるＰＵＦＡ生合成経路遺伝子、および遺伝子産物は、異種微生物宿主細胞中、特に（例えばヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属などの）油性酵母細胞中で産生されてもよい。組換え微生物宿主中における発現は、様々なＰＵＦＡ経路中間体を生成するのに、または今まで宿主を使用して可能でなかった新しい生成物を合成するため宿主に既存のＰＵＦＡ経路を調節するのに、役立ち得る。
【００８０】
上で提供する引用された教示に基づいて、望ましいω−３／ω−６ＰＵＦＡ生成のために、多数の油性酵母を遺伝子操作できるが、油性酵母の代表的ＰＵＦＡ産生株であるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）について表３に記載する。これらの株は、ＰＵＦＡ生合成経路遺伝子δ−４デサチュラーゼ、δ−５デサチュラーゼ、δ−６デサチュラーゼ、δ−１２デサチュラーゼ、δ−１５デサチュラーゼ、δ−１７デサチュラーゼ、δ−９デサチュラーゼ、δ−８デサチュラーゼ、δ−９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼの様々な組み合わせを有するが、導入される特定酵素（およびそれらの酵素をコードする遺伝子）および産生される特定ＰＵＦＡは、決して本発明を制限するものではないことが認識される。
【００８１】
【表４】
2013525549.tif 000006
【００８２】
【表５】
2013525549.tif 000007
【００８３】
ＰＵＦＡ生合成経路を油性酵母に導入する手段は良く知られているので、当業者は、本
発明の技法が、上述のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株から得られる微生物バイオマスの使用、あるいはその中で発明が実証される種（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））または属（すなわちヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ））に限定されるものではないことを理解するであろう。それよりむしろ、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる微生物油を産生できる、あらゆる油性酵母またはあらゆるその他の適切な微生物が、本技法で使用するのに同等に適する。
【００８４】
脂質が微生物によって産生される条件下において、少なくとも１つの所望のＰＵＦＡを含有する脂質を産生する微生物種を発酵培地中で培養し、成長させてもよい（図１Ａ、Ａ）。典型的に、微生物には、微生物の成長および／または少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる微生物油の産生を可能にするいくつかの追加的化学薬品または物質と並んで、炭素および窒素源が供給される。発酵条件は、上の引用で述べられるように、使用される微生物に左右され、得られる微生物バイオマス中の少なくとも１つのＰＵＦＡを高含量にするために、最適化されてもよい。
【００８５】
一般に、炭素源のタイプと量、窒素源のタイプと量、炭素対窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、成長温度、ｐＨ、バイオマス生産段階の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時期と方法を変更することで、培地条件を最適化してもよい。例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、一般に、酵母抽出物−ペプトン−デキストロースブロス（ＹＰＤ）などの複合培地内で、または（例えば成長に必要な構成要素を欠き、それによってＰＵＦＡの産生を可能にする所望の組換え発現カセットの選択を強制する、酵母窒素原礎培地（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＩＭ）などの）限定最小培地内で培養される。
【００８６】
少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる微生物油が、微生物によって産生された場合、例えば乾燥、脱水、ペレット化および／または顆粒化を通じて発酵培地を処理し、微生物油を含んでなる未処理微生物バイオマスを得てもよい（図１Ａ、Ｂ）。
【００８７】
より具体的には、例えば発酵培地を濾過し、さもなければ（例えば乾燥によって）処理して、水性構成要素の少なくとも一部を除去してもよい。当業者には理解されるように、未処理微生物バイオマスは、典型的に水を含む。好適には、微生物発酵後に、水の一部を未処理微生物バイオマスから除去して、水分レベルが１０重量％未満、より好適には水分レベルが５重量％未満、最も好適には水分レベルが３重量％以下の微生物バイオマスを提供する。微生物バイオマスの水分レベルは、乾燥中に制御し得る。好適には、微生物バイオマスは、約１〜１０重量％の範囲内の水分レベルを有する。
【００８８】
発酵培地および／または微生物バイオマスを低温殺菌し、またはその他の手段によって処理して、微生物油および／またはＰＵＦＡ生成物を損ない得る、内在微生物酵素の活性を低下させてもよい。
【００８９】
次に溶媒による抽出に先だって、未処理微生物バイオマスに少なくとも１つの破砕ステップを実施して、「未処理破壊微生物バイオマス」を生成する（図１Ａ、Ｃ）。破砕は機械的／物理的手段によって（例えばビードビーター、スクリュー押出などを通じて）、または化学的手段によって（例えば細胞溶解を促進する酵素処理または浸透圧処理を通じて）行ってもよい。この破砕は、微生物の細胞内容物へのより容易なアクセスを提供する。
【００９０】
次に未処理破壊微生物バイオマスを例えば溶媒で抽出するなどして処理し（図１Ａ、Ｄ）、抽出油および残留バイオマスを得る。抽出油が実質的にＰＬを含まない脂質画分を含んでなる（図１Ａ、Ｉ）のに対し、残留バイオマスはＰＬを含んでなる（図１Ａ、Ｅ）。
【００９１】
油抽出は様々な有機溶剤（例えばヘキサン、イソヘキサン）を通じて、酵素抽出を通じて、浸透圧衝撃を通じて、超音波抽出を通じて、超臨界流体抽出（例えばＣＯ２抽出）を通じて、鹸化を通じて、そしてこれらの方法の組み合わせによる処理を通じて行い得るが、本明細書の好ましい実施形態では、溶媒は液体または超臨界流体ＣＯ２を含んでなる。
【００９２】
超臨界流体（ＳＣＦ）は、気体と液体の中間体の諸特性を示す。ＳＣＦの重要な特徴は、温度または圧力のどちらか、あるいはその組み合わせを変動させることで、流体密度が液体様から気体様密度に連続的に変動し得ることである。様々な密度依存性物理的特性も同様に、この領域で同様の連続的変動を示す。これらの特性のいくつかとしては、溶媒強度（ＳＣＦ媒体中の様々な物質の溶解度によって証明される）、極性、粘度、拡散率、熱容量、熱伝導率、等温圧縮率、膨張性、収縮性、流動性、および分子充填が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＳＣＦ密度の変動はまた、溶質の化学電位に、ひいては反応速度および平衡定数にも影響を及ぼす。したがって様々な密度依存性流体特性を調節することで、ＳＣＦ媒体中の溶媒環境を特定用途のために最適化し得る。
【００９３】
システム温度および圧力が、臨界温度（Ｔｃ）と圧力（Ｐｃ）によって定まる対応する臨界点値を超えると、流体はＳＣＦ状態になる。純物質では、ＴｃおよびＰｃは、気相と液相が共存し得る最高点である。Ｔｃを超えると、純物質では加圧力にかかわらず液体が形成しない。同様に、Ｐｃおよび臨界モル容積は、気相と液相が一体化する状態に対応する、このＴｃにおいて確定する。多成分混合物ではより複雑であるが、混合物臨界状態は同様に、共存する気相と液相の諸特性が識別不能になる状態と同定される。超臨界流体の考察については、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌ．ｏｆ  Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｖｏｌ．２３，ｐｇ．４５２−４７７を参照されたい。
【００９４】
全試薬および生成物に対して不活性であるという条件で、例えば、ＣＯ２、テトラフルロメタン（ｔｅｔｒａｆｌｕｒｏｍｅｔｈａｎｅ）、エタン、エチレン、プロパン、プロピレン、ブタン、イソブタン、イソブテン、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、およびそれらの混合物をはじめとするが、これに限定されるものではない、ＰＵＦＡ含有微生物油を微生物バイオマスから分離する溶媒による未処理破壊微生物バイオマスの処理など、一次抽出ステップでは、あらゆる適切なＳＣＦまたは液体溶媒を使用してもよい。望ましい溶媒としては、ＣＯ２またはＣ３〜Ｃ６アルカンが挙げられる。より望ましい溶媒は、ＣＯ２、ペンタン、ブタン、およびプロパンである。最も望ましい溶媒は、ＣＯ２を含んでなるＳＣＦ溶媒である。ＣＯ２を含んでなるＳＣＦは、例えば一次抽出ステップにおいて微生物バイオマス中に含有されるＰＬを可溶化しないなど、例えば追加的溶媒の存在または量が方法にとって無害でありさえすれば、上に列挙した溶媒の１つ以上などの少なくとも１つの追加的溶媒（すなわち共溶媒）をさらに含んでなってもよい。しかしエタノール、メタノール、アセトンなどの極性共溶媒を添加して溶媒相に意図的に極性を与え、残留微生物バイオマスからのＰＬ抽出を可能にして（すなわち任意の二次抽出中に）、ＰＬを単離してもよい。
【００９５】
少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる微生物油を含んでなる未処理破壊微生物バイオマスを、少なくとも２つの方法に従って、適切な抽出条件下で液体または超臨界ＣＯ２によって処理し（図１Ａ、Ｄ）、抽出油および残留バイオマスを提供してもよい。第１の方法に従って、例えば圧力増大および／または温度低下の下などの、溶媒密度増大に対応する抽出／分画条件下で、ＣＯ２による未処理破壊微生物バイオマスの処理を複数回実施して、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる精製脂質組成物を含んでなる少なくとも１つの抽出物を得る。抽出物の精製脂質組成物のＦＦＡ、ＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧ配分は、複数の各抽出の選択された抽出条件に対応する溶媒密度に左右される、それらの相対溶解度に従って変動するが、少なくとも１つの精製脂質組成物は、未処理破壊微生物バイオマスの油組成物と比べてＴＡＧに富む（図１Ｂ、Ｌ）。
【００９６】
別法として、本方法に従って、第２の方法では、実質的にＰＬを含まない脂質画分（図１Ａ、Ｉ）を含んでなる抽出油を提供するように選択された抽出条件下で、未処理破壊微生物バイオマスをＣＯ２などの溶媒で処理し（図１Ａ、Ｄ）、引き続いて一連の多段圧力降下分画ステップを実施して、精製脂質組成物を提供する。これらの各段階的圧力降下ステップは、溶媒密度低下に対応する圧力および温度条件において分離容器内で行われ、液相精製脂質組成物を単離して、それを例えば単純なデカンテーションによって抽出相から分離し得る。提供される精製脂質組成物のＦＦＡ、ＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧ配分は、段階的分離容器の選択された条件に対応する溶媒密度に左右される、それらの相対溶解度に従って変動する。少なくとも１つの精製脂質組成物は、未処理破壊微生物バイオマスの油組成物と比べて、ＴＡＧに富む（図１Ｂ、Ｌ）。
【００９７】
第２の方法によって得られる精製脂質組成物は、抽出条件が適切にマッチする場合、第１の方法で得られる抽出物に相当してもよい。したがって第１の方法の実行を通じて、本方法によって得られる得る精製脂質組成物を例示することが可能であると考えられる。
【００９８】
本方法に従って、実質的にＰＬを含まない脂質画分を含んでなる抽出物（すなわち抽出油）（図１Ａ、Ｉ）を得るのに十分な温度および圧力および処理時間で、未処理破壊微生物バイオマスを液体またはＳＣＦ  ＣＯ２などの溶媒によって処理してもよい。脂質画分は、中性脂肪（例えばＴＡＧ、ＤＡＧ、およびＭＡＧ）およびＦＦＡを含んでなってもよい。十分な処理時間、ならびに適切なＣＯ２とバイオマスの比率は、例えば実施例１に記載されるように、特定の微生物バイオマスサンプルについて抽出曲線を生成することで判定してもよい。これらの抽出曲線は、抽出温度、圧力、ＣＯ２流速条件、そして細胞破砕程度やバイオマス形態などの変数に左右される。本方法の一実施形態では、溶媒は、液体または超臨界流体ＣＯ２を含んでなり、ＣＯ２と微生物バイオマスの質量比は、例えば約２０：１〜約５０：１など、約２０：１〜約７０：１である。
【００９９】
次に、実質的にＰＬを含まない脂質画分を含んでなる抽出物（図１Ａ、Ｉ）を任意選択的に少なくとも１回分画して、精製脂質組成物を得てもよい。分画は、分画条件の温度、圧力、または温度と圧力とを変更することで、実施してもよい。分画は、例えばＳＣＦに富む抽出物の逐次圧力低下、一連の多段ミキサーセトラーまたは抽出塔内の液体またはＳＣＦ溶媒抽出、短行程蒸留、真空水蒸気蒸留、または溶融結晶化をはじめとする、いくつかの分離法の１つにおいて達成されてもよい。抽出物を分画するステップを１回または複数回反復して、追加的精製脂質組成物を提供してもよい。
【０１００】
例えば抽出物の圧力を低下させることは、溶解した溶質の溶解度を低下させて、各分離容器内に分離液相を形成する。例えば熱交換器の使用を通じて各分離容器に供給される抽出物温度を調節し、各分離容器内に、所望の溶媒密度と、対応する溶質溶解度を提供し得る。最初の抽出物は、同様の溶解度パラメーターを示す様々な種類の脂質構成要素（例えばＦＦＡ、ＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧ）の複合混合物からなるので、様々な構成要素の正確な分離は達成されず、むしろ分画ステップで得られる各精製脂質組成物が、生成物の配分を含有する。しかし一般に、溶解度がより低い化合物は、最高圧力で動作する第１の分離容器内に濃縮し、溶解度が最も高い化合物は、最低圧力で動作する最終分離容器内に濃縮する。最終分離容器は、抽出相の圧力を十分に低下させて抽出相内の残留溶質の大半が本質的に除去され、比較的純粋なＣＯ２ストリームが、この容器の上部から再循環されて、最初の抽出容器に戻されてもよい。
【０１０１】
少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる精製脂質組成物は、実質的にＰＬを含まない。精製脂質組成物の少なくとも１つは、微生物バイオマスの油組成物と比べてＴＡＧに富み（図１Ｂ、Ｌ）、ＤＡＧ、ＭＡＧ、またはそれらの組み合わせをさらに含んでなってもよい。ＴＡＧに富む精製脂質組成物は、ＦＦＡをさらに含んでなってもよい。分画ステップにおいて別個に、または組み合わさって得られてもよいその他の精製脂質組成物としては、ＦＦＡが枯渇しているＴＡＧ富化生成物、ＴＡＧが枯渇しているＦＦＡ富化生成物、ＭＡＧおよび／またはＤＡＧに富むＦＦＡ富化生成物、ＭＡＧおよび／またはＤＡＧが枯渇しているＦＦＡ富化生成物、ＭＡＧおよび／またはＤＡＧに富むＴＡＧ富化生成物、およびＭＡＧおよび／またはＤＡＧが枯渇しているＴＡＧ富化生成物が挙げられる（図１Ｂ、Ｋ）。用いられる分画条件に従って、本方法の一実施形態では、ＴＡＧに富む少なくとも１つの精製脂質組成物は、微生物バイオマスの油組成物と比べてＦＦＡが枯渇していてもよい。一実施形態では、ＴＡＧに富む少なくとも１つの精製脂質組成物はまた、微生物バイオマスの油組成物と比べて、少なくとも１つのＰＵＦＡに富んでいてもよい。
【０１０２】
一実施形態では、ＴＡＧに富む少なくとも１つの精製脂質組成物は、バイオマスの油組成物と比べて、２０個以上の炭素原子を有する少なくとも１つのＰＵＦＡに富んでいてもよく、２０個以上の炭素原子を有する少なくとも１つのＰＵＦＡは、好適には少なくとも４つの炭素−炭素二重結合を含んでなってもよい。
【０１０３】
処理および分画温度は、液体またはＳＣＦ  ＣＯ２を提供し、少なくとも１つのＰＵＦＡの熱安定範囲内にあり、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、およびＦＦＡを可溶化するのに十分なＣＯ２密度を提供するように、選択されてもよい。一般に、処理および分画温度は、例えば約３５℃〜約１００℃など、約２０℃〜約１００℃であってもよく；圧力は、例えば約８０バール〜約６００バールなど、約６０バール〜約８００バールであってもよい。
【０１０４】
図２は、本発明の方法の一実施形態を概略的に示す。図２では、未処理破壊微生物バイオマスを含んでなるストリーム１０、およびＣＯ２を含んでなるストリーム３８が、容器１４に入るのが示される。未処理破壊微生物バイオマスを含んでなるストリーム１２、および平衡化ＣＯ２と抽出物の混合物を含んでなるストリーム１６が、容器１８に入るのが示される。少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる微生物油を含んでなる未処理破壊微生物バイオマスのＣＯ２による処理は、容器１４内において初期温度Ｔ１４および圧力Ｐ１４で、および容器１８内において温度Ｔ１８および圧力Ｐ１８で行われる。Ｔ１４はＴ１８と同一であっても異なってもよく；Ｐ１４はＰ１８と同一であっても異なってもよい。得られた平衡化ＣＯ２と抽出物の混合物は、ストリーム１６として容器１４を出て容器１８に入り、その中で微生物バイオマスおよびＣＯ２のさらなる処理が行われて、ストリーム２０として示される、実質的にＰＬを含まない脂質画分を含んでなる抽出物が提供される。残留バイオマス（図示せず）は、容器１４および１６内に残る。所望ならば、追加的抽出容器が本方法に含まれてもよい（図示せず）。代替方法としては、所望ならば、本方法は１つの抽出容器のみを使用してもよい（図示せず）。２つ以上の抽出容器の使用は、抽出容器への溶媒添加の相対順序を変更することで（図示せず）、および例えば微生物バイオマスを装填しまたは残留バイオマスを除去するために１つまたは複数の抽出容器をラインから外す間に（図示せず）、工程全体にわたる連続的ＣＯ２フローを可能にするので、有利であり得る。
【０１０５】
抽出容器の下流には、直列に配置される２つの分離容器、容器２２および２８が示され、その中では、抽出物の分画が、例えば熱交換器（図示せず）の使用を通じて任意選択的に温度調節されて、段階的圧力低下を通じて実施される。所望ならば、追加的分離容器を本方法に含めることもできる（図示せず）。ＣＯ２と実質的にＰＬを含まない脂質画分とを含んでなる抽出物が、ストリーム２０として容器２２に入るのが図示される。容器２２内では、圧力Ｐ２２はＰ１８よりも低く、温度Ｔ２２はＴ１８と同一であっても異なってもよく；本方法の操作条件下では、溶解度がより低い脂質構成要素を含んでなる別個の液相が形成される。本方法によって得られる第１の精製脂質組成物に相当するストリーム２４として、抽出物の分画から得られる分離液相が容器２２を出るのを示す。ストリーム２６として示される残留抽出物は、圧力Ｐ２８がＰ２２と比較してより低く、温度Ｔ２８がＴ２２と同一であってもなくてもよい、次の分離容器２８に装入される。本方法の操作条件は容器２８内に分離液相の形成を可能にし、それがストリーム３０として分離容器２８を出るのが示される。ストリーム３０は、本方法によって得られる第２の精製脂質組成物に相当する。
【０１０６】
ストリーム３２として示される比較的純粋なＣＯ２を含んでなる残留抽出物を、容器２８から抽出容器１４および／または別の抽出容器（図示せず）に再循環させてもよい。再循環ＣＯ２は、貫流型ＣＯ２の使用に優る、経済上の利点を典型的に提供する。ストリーム３４として示されるパージストリームを使用して、工程へのＣＯ２の連続的再循環によって蓄積し得る揮発性構成要素を除去し得る。補給ＣＯ２を添加して、パージを通じて発生するＣＯ２損失を埋め合わせてもよい。図２に示すように、ストリーム３６と合流する補給ＣＯ２ストリーム８によって、補給ＣＯ２を再循環ＣＯ２ストリームに添加し、合併ＣＯ２ストリーム３８を提供してもよい。代案としては、追加的ＣＯ２を別個の供給ストリーム（図示せず）として、容器１４および／または容器１８に添加することもできる。
【０１０７】
図３は、本発明の方法の抽出ステップの一実施形態を概略的に示す。図３では、ＣＯ２を含んでなるストリーム７０が、未処理破壊微生物バイオマス（図示せず）を含有する抽出容器７６内に装入される。任意選択的に、ポンプ（図示せず）を使用して、共溶媒（ストリーム７２として示される）がＣＯ２ストリームに添加され、ＣＯ２と共溶媒とを含んでなる合併ストリーム７４を提供する。共溶媒を使用しない場合は、ストリーム７０とストリーム７４は同一であり、ＣＯ２のみを含有する。少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる未処理破壊微生物バイオマスのＣＯ２処理は容器７６内で行われ、実質的にＰＬを含まない脂質画分を含んでなる抽出物が、ＣＯ２溶媒および任意選択的に共溶媒と共に、ストリーム７８として容器から取り出される。残留バイオマス（図示せず）は、抽出容器内に残る。次に実質的にＰＬを含まない脂質画分を含んでなる抽出物は、図２に関して上述したように少なくとも１つの分離容器内で分画してもよく、または任意選択的に、実質的にＰＬを含まない脂質画分は、ＣＯ２および任意選択的に共溶媒（図示せず）を放出することで抽出物から単離してもよい。
【０１０８】
上記一次抽出からの残留バイオマスは、ＰＬを含んでなる（図１Ａ、Ｅ）。この残留バイオマスに、例えば塩化メチレンなどの極性有機溶剤、またはＣＯ２とアルコールなどの極性共溶媒とを含んでなる混合溶媒など、極性抽出溶媒による２回目の抽出をして（図１Ｂ、Ｆ）、実質的に中性脂肪を含まないＰＬ画分（すなわちＰＬから本質的になる残留バイオマス抽出物；図１Ｂ、Ｈ）を得てもよい。極性共溶媒は、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、および／または２−プロパノールを含んでなってもよい。ＰＬを含んでなる残留バイオマス（図１Ａ、Ｅ）または抽出ＰＬ画分（図１Ｂ、Ｈ）のどちらかが、例えば水産養殖飼料として使用するのに適してもよい。
【０１０９】
本明細書に記載されるＣＯ２ベースの抽出／分画法は、従来の有機溶剤ベースの方法と比べていくつかの利点を提供する。例えばＣＯ２は、無毒で不燃性であり、環境に優しく、容易に入手でき、安価である。ＣＯ２（Ｔｃ＝３１．１℃）は、微生物バイオマスから熱的に不安定な脂質を比較的低い温度で抽出して、微生物油中の脂質分解を最小化し得る。抽出脂質は、有機溶剤を取り除く熱的処理を通じてでなく、加圧抽出物からＣＯ２を単に放出することで、ＣＯ２溶媒から単離されてもよい。抽出物中の脂質画分は実質的にＰＬを含まず、微生物バイオマスから単離されてもよい。ＰＬを含有する残留微生物バイオマス（図１Ａ、Ｅ）は、例えば水産養殖飼料のための販売に適した副産物であってもよい。ＰＬは、中性脂肪が枯渇した比較的純粋な副産物（図１Ｂ、Ｈ）として、残留微生物バイオマスから抽出されてもよい。実質的にＰＬを含まない脂質画分（図１Ａ、Ｉ）を分画し（図１Ｂ、Ｊ）、例えば破壊微生物バイオマスと比べてＦＦＡおよびＤＡＧに富む（そしてＴＡＧが枯渇している）精製脂質組成物（図１Ｂ、Ｋ）と、破壊微生物バイオマスと比べてＴＡＧに富む（そしてＦＦＡおよびＤＡＧが枯渇している）精製脂質組成物（図１Ｂ、Ｌ）を生成してもよい。
【０１１０】
したがって少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる精製脂質組成物を得る方法が提供され：
ａ）少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる油組成物を有する未処理破壊微生物バイオマスが液体またはＳＣＦ  ＣＯ２を含んでなる溶媒で処理されて、
（ｉ）実質的にＰＬを含まない脂質画分を含んでなる抽出物、および
（ｉｉ）ＰＬを含んでなる残留バイオマスが得られ、
ｂ）ステップ（ａ）パート（ｉ）で得られた抽出物が少なくとも一度分画されて、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる精製脂質組成物が得られ、精製脂質組成物は、未処理破壊微生物バイオマスの油組成物と比べてＴＡＧに富む。
【０１１１】
好適には、ステップ（ａ）の処理は約２０℃〜約１００℃の温度と、約６０バール〜約８００バールの圧力で実施され、ステップ（ｂ）の分画は約３５℃〜約１００℃の温度と、約８０バール〜約６００バールの圧力で実施される。本明細書で開示される方法は、分画条件の温度、圧力、または温度と圧力とを変更することで、実施されてもよい。
【０１１２】
なおも別の態様では、本明細書で開示される方法はまた、
（１）ステップ（ａ）パート（ｉ）で得られた抽出物を分画して、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる精製脂質組成物を得るステップ、および
（２）ステップ（ａ）パート（ｉｉ）のＰＬを含んでなる残留バイオマスを抽出剤で処理して、ＰＬから本質的になる残留バイオマス抽出物を得るステップ
からなる群から選択されるステップもさらに含んでなり、精製脂質組成物は、未処理破壊微生物バイオマスの油組成物と比べて、ＤＡＧ、ＭＡＧ、ＦＦＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される脂質構成要素に富む。
【０１１３】
別の実施形態では、本明細書で開示される方法は、油性微生物細胞を含んでなる未処理破壊微生物バイオマスを利用する。これらの油性微生物細胞は、好適には、酵母、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイル、真菌、およびそれらの混合物からなる群から選択される。より好適には、細胞は、モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属からなる群から選択される属のメンバーであり、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属が特に望ましい。
【０１１４】
微生物バイオマスは、ＬＡ、ＧＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡ、およびそれらの混合物からなる群から選択される、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる。好適には、少なくとも１つのＰＵＦＡは、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−３、ＤＨＡ、およびそれらの混合物（すなわち少なくとも２０個の炭素原子を有するＰＵＦＡに相当する）からなる群から選択される。本例で実証されるように、未処理破壊微生物バイオマスは、ＴＦＡの重量％としての測定で好適には少なくとも２５重量％のＥＰＡを含んでなるが、これは本発明を制限するものではない。
【０１１５】
代案の実施態様では、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる油組成物を有する未処理破壊微生物バイオマスを液体またはＳＣＦ  ＣＯ２を含んでなる溶媒で処理して、
（ｉ）実質的にＰＬを含まない脂質画分を含んでなる抽出物、および
（ｉｉ）ＰＬを含んでなる残留バイオマス
を得るステップを含んでなる方法が提供され、
前記未処理破壊微生物バイオマスは、その乾燥細胞重量の２５％よりも多くを油として蓄積するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の油性微生物から得られ、
前記少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる油組成物は、少なくとも２０個の炭素原子と４つ以上の炭素−炭素二重結合を有するＰＵＦＡを、ＴＦＡの重量％としての測定で少なくとも２５重量％含んでなる。
【０１１６】
未処理破壊微生物バイオマスは、好適にはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から得られ、少なくとも１つのＰＵＦＡは好適には少なくとも１つのＥＰＡを含んでなる。
【０１１７】
ＥＰＡ（またはその誘導体）などの少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる抽出油組成物および／または精製脂質組成物は、公知の臨床および医薬的価値を有する。例えば米国特許出願公開第２００９−００９３５４３Ａ１号明細書を参照されたい。例えばＰＵＦＡを含んでなる脂質組成物は、静脈内栄養補給される患者のための、または栄養失調を予防または治療するための食餌性代替品または栄養補給剤として、特に乳児用調製粉乳として使用されてもよい。代案としては、精製ＰＵＦＡ（またはその誘導体）は、通常の使用において、受容者が、栄養素補充の所望量を受領するように配合された料理用油、脂肪またはマーガリンに組み込まれてもよい。ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養補給剤またはその他の食品に組み込まれてもよく、抗炎症性またはコレステロール低下剤としての用途があることもある。任意選択的に、組成物は、医学または獣医学いずれかの医薬用途のために使用してもよい。
【０１１８】
ヒトまたは動物のＰＵＦＡ補給は、添加されたＰＵＦＡ、ならびにそれらの代謝子孫（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｙ）のレベル増大をもたらし得る。例えばＥＰＡによる処理は、ＥＰＡだけでなく、エイコサノイド（すなわちプロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン）、ＤＰＡｎ−３、およびＤＨＡなどのＥＰＡの下流生成物のレベル増大もまたもたらし得る。複雑な調節機構は、このような機構を阻止、制御または克服して、個体中において特定ＰＵＦＡの所望レベルを達成するために、様々なＰＵＦＡを組み合わせ、またはＰＵＦＡの異なる抱合体を添加することを望ましくし得る。
【０１１９】
代案としては、動物および水産養殖飼料は、概して少なくとも１〜２％の栄養成分がω−３および／またはω−６ＰＵＦＡであることを要するので、ＰＵＦＡまたはその誘導体を乾燥飼料、半湿潤および湿潤飼料などとして、これらの配合物の合成において利用し得る（米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書）。特に本明細書で、ＰＬを含んでなる残留バイオマスが、水産養殖飼料またはその構成要素として使用するのに適してもよいことが熟考された。代案としては、残留バイオマスを抽出剤で抽出し、水産養殖飼料調製品中で有用であり得る、ＰＬから本質的になる残留バイオマス抽出物を得てもよい。
【実施例】
【０１２０】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本発明の本質的特徴を見極め得てその範囲と精神を逸脱することなく本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。本発明の範囲を示すものとして、前述の明細書よりもむしろ添付の特許請求の範囲を参照すべきである。
【０１２１】
以下の略称が使用される：
「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーであり、「Ｃ」は摂氏であり、「ｋＰａ」はキロパスカルであり、「ｍｍ」はミリメートルであり、「μｍ」はマイクロメートルであり、「μＬ」はマイクロリットルであり、「ｍＬ」はミリリットルであり、「Ｌ」はリットルであり、「ｍｉｎ」は分であり、「ｍＭ」はミリモル濃度であり、「ｃｍ」はセンチメートルであり、「ｇ」はグラムであり、「ｗｔ」は重量であり、「ｈｒ」は時間であり、「ｔｅｍｐ」または「Ｔ」は温度であり、「ＳＳ」はステンレス鋼であり、「ｉｎ」はインチであり、「ｉ．ｄ．」は内径であり、「ｏ．ｄ．」は外径であり、「％」はパーセントである。
【０１２２】
材料
以下の材料が、実施例で使用された。全ての商業的試薬は、受け取られたまま使用された。使用された全ての溶媒は、ＨＰＬＣ等級であった。塩化アセチルは、９９＋％であった。ＴＬＣプレートおよび溶媒は、ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）から得られた。ＨＰＬＣまたはＳＣＦ等級二酸化炭素は、ＭＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）から得られた。
【０１２３】
微生物バイオマスの調製
少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる様々な量の微生物油を産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のいくつかの酵母株について、下述する。微生物バイオマスは二段階流加発酵プロセスで得られ、次に下述するように後処理過程を実施した。
【０１２４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株：
本明細書の比較例、および実施例１、２、３、４、７、８、および９は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株バイオマスを使用した。Ｙ８６７２株の作成については、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載される［参照によって本明細書に援用する］。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するＹ８６７２株は、δ−９エロンガーゼ／δ−８デサチュラーゼ経路の発現を通じて、総脂質に対して約６１．８％のＥＰＡを産生できた。
【０１２５】
野性型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）  ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、Ｙ８６７２株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ  １−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ２−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ４−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ５−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ６−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ７−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ８−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＡＣＯ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６  （２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、およびＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１であった。上の発現カセットの構造は、簡易表記体系「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」によって表され、Ｘはプロモーター断片を記述し、Ｙは遺伝子断片を記述し、Ｚはターミネーター断片を記述し、それらは全て互いに作動的に連結する。略称は、次のとおり：ＦｍＤ１２は、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）δ−１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＦｍＤ１２Ｓは、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］に由来するコドン最適化δ−１２デサチュラーゼ遺伝子であり；ＭＥ３Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］に由来するコドン最適化Ｃ１６／１８エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ９ｅは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）δ−９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅＳは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］に由来するコドン最適化δ−９エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ８Ｍは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］に由来するδ−８デサチュラーゼ遺伝子合成変異体［米国特許第７，７０９，２３９号明細書］であり；ＥａＤ８Ｓは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  Ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，７９０，１５６号明細書］に由来するコドン最適化δ−８デサチュラーゼ遺伝子であり；Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９  δ−９エロンガーゼ（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）に由来するコドン最適化δ−９エロンガーゼ遺伝子（「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」）と、δ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作成されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥｇＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍは、δ−９エロンガーゼ「ＥｇＤ９ｅＳ」（前出）とδ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作成されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥｇＤ５ＭおよびＥｇＤ５ＳＭは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］に由来する合成変異体δ−５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許出願公開第号明細書２０１０−００７５３８６−Ａ１］であり；ＥａＤ５ＳＭは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  Ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許出願公開第号明細書２００８−０２７４５２１−Ａ１］に由来する合成変異体δ−５デサチュラーゼ遺伝子であり［米国特許出願公開第号明細書２０１０−００７５３８６−Ａ１］；ＰａＤ１７は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）δ−１７デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり；ＰａＤ１７Ｓは、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］に由来するコドン最適化δ−１７デサチュラーゼ遺伝子であり；ＹｌＣＰＴ１は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子［国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット］であり；ＭＣＳは、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ  ３８４１［米国特許出願公開第２０１０−０１５９５５８−Ａ１号明細書］に由来するコドン最適化マロニル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子である。
【０１２６】
Ｙ８６７２株の総脂質含量および組成の詳述な分析のために、細胞を二段階で合計７日間培養するフラスコアッセイを実施した。分析に基づいて、Ｙ８６７２株は３．３ｇ／Ｌの乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を産生し、細胞の総脂質含量は２６．５［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］であり、乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含量は［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］１６．４であり、各脂肪酸濃度を重量％ＴＦＡ［「％ＴＦＡ」］とする脂質プロフィールは次のようであった。１６：０（パルミテート）は２．３、１６：１（パルミトレイン酸）は０．４、１８：０（ステアリン酸）は２．０、１８：１（オレイン酸）は４．０、１８：２（ＬＡ）は１６．１、ＡＬＡは１．４、ＥＤＡは１．８、ＤＧＬＡは１．６、ＡＲＡは０．７、ＥＴｒＡは０．４、ＥＴＡは１．１、ＥＰＡは６１．８、その他は６．４。
【０１２７】
本明細書の実施例６は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株バイオマスを使用した。Ｙ９５０２株の作成については、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載される。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するＹ９５０２株は、δ−９エロンガーゼ／δ−８デサチュラーゼ経路の発現を通じて、総脂質に対して約５７．０％のＥＰＡを産生できた。
【０１２８】
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較したＹ９５０２株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ１−、ｕｎｋｎｏｗｎ２−、ｕｎｋｎｏｗｎ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ４−、ｕｎｋｎｏｗｎ５−、ｕｎｋｎｏｗｎ６−、ｕｎｋｎｏｗｎ７−、ｕｎｋｎｏｗｎ８−、ｕｎｋｎｏｗｎ９−、ｕｎｋｎｏｗｎ１０−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６であった。先に定義されていない略称は、次のとおり：ＥａＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）δ−９エロンガーゼ［米国特許第７，７９４，７０１号明細書］に由来するコドン最適化δ−９エロンガーゼ遺伝子（「ＥａＤ９ｅＳ」）とδ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作成されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）米国特許第７，８７９，５９１号明細書］に由来するコドン最適化リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子である。
【０１２９】
Ｙ９５０２株の総脂質含量および組成の詳述な分析のために、細胞を二段階で合計７日間培養するフラスコアッセイを実施した。分析に基づいて、Ｙ９５０２株は３．８ｇ／Ｌの乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を産生し、細胞の総脂質含量は３７．１［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］であり、乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含量は［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］２１．３であり、各脂肪酸濃度を重量％ＴＦＡ［「％ＴＦＡ」］とする脂質プロフィールは次のようであった。１６：０（パルミテート）は２．５、１６：１（パルミトレイン酸）は０．５、１８：０（ステアリン酸）は２．９、１８：１（オレイン酸）は５．０、１８：２（ＬＡ）は１２．７、ＡＬＡは０．９、ＥＤＡは３．５、ＤＧＬＡは３．３、ＡＲＡは０．８、ＥＴｒＡは０．７、ＥＴＡは２．４、ＥＰＡは５７．０、その他は７．５。
【０１３０】
本明細書の実施例５は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｆ１Ｂ１株バイオマスを使用した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来して、δ−９エロンガーゼ／δ−８デサチュラーゼ経路の発現を通じて、２８〜３２％の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］で、総脂質に対して約５０〜５２％のＥＰＡを産生できる、Ｙ４３０５Ｆ１Ｂ１株の作成について下に記載する。具体的には、Ｙ４３０５株Ｆ１Ｂ１は、その開示の内容全体を参照によって援用する、２００９年４月９日に公開された米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１号明細書の一般方法で先に記述された、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５株に由来する。野性型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較したＹ４３０５株の最終遺伝子型は、ＳＣＰ２−（ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ）、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−、Ｐｅｘ１０−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、ｕｎｋｎｏｗｎ１−、ｕｎｋｎｏｗｎ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ８−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（３コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ：：ＯＣＴ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：ＡＣＯ、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯであった。先に定義されていない略称は、次のとおり：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳは、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］に由来するコドン最適化δ−９エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ５はミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）δ−５デサチュラーゼ［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］であり；ＥｇＤ５Ｓは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］に由来するコドン最適化δ−５デサチュラーゼ遺伝子であり；ＲＤ５Ｓは、ペリディニウム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）種ＣＣＭＰ６２６［米国特許第７，６９５，９５０号明細書］に由来するコド��最適化δ−５デサチュラーゼである。
【０１３１】
Ｙ４３０５細胞の総脂質含量は２７．５［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］であり、各脂肪酸濃度を重量％ＴＦＡ［「％ＴＦＡ」］とする脂質プロフィールは次のようであった。１６：０（パルミテート）は２．８、１６：１（パルミトレイン酸）は０．７、１８：０（ステアリン酸）は１．３、１８：１（オレイン酸）は４．９、１８：２（ＬＡ）は１７．６、ＡＬＡは２．３、ＥＤＡは３．４、ＤＧＬＡは２．０、ＡＲＡは０．６、ＥＴＡは１．７、およびＥＰＡは５３．２。
【０１３２】
スルホニル尿素［「ＳＵＲ」］耐性に基づく、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のための優勢非抗生物質マーカーを用いて、Ｙ４３０５株に形質転換を実施した。より具体的には、マーカー遺伝子は、単一アミノ酸変化、すなわちスルホニル尿素除草剤耐性を与えるＷ４９７Ｌを有する、天然アセトヒドロキシ酸シンターゼ（「ＡＨＡＳ」またはアセト乳酸シンターゼ；Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）である（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットの配列番号２９２）。
【０１３３】
米国特許出願公開第２０１１−００５９２０４−Ａ１号明細書に記載されるように、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ４３０５株へのＳＵＲ遺伝子マーカーのランダム組み込みを使用し、油性条件下で培養した際に、親Ｙ４３０５株と比べて増大した脂質含量を有する細胞を同定する。
【０１３４】
２リットル発酵条件下で評価すると、Ｙ４３０５株の平均ＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は、変異ＳＵＲＹ４３０５−Ｆ１Ｂ１株の５０〜５２と比較して、５０〜５６であった。Ｙ４３０５株の平均脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、Ｙ４３０５−Ｆ１Ｂ１株の２８〜３２と比較して２０〜２５であった。したがってＥＰＡ生産性への影響を最小限に抑えて、Ｙ４５０３−Ｆ１Ｂ１株の脂質含量は２９〜３８％増大した。
【０１３５】
発酵：
振盪フラスコ内で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の凍結培養物から接種菌液を調製した。培養期間後、培養物を使用して種発酵槽に接種した。種培養が適切な標的細胞密度に達したら、次にそれを使用してより大きな発酵槽に接種した。発酵は、二段階流加法であった。第一段階では、高細胞密度への迅速な増殖を促進する条件下で酵母を培養し；培地は、グルコース、様々な窒素源、微量金属、およびビタミンを含んでなった。第二段階では、酵母を窒素飢餓状態にしてグルコースを連続的に供給し、脂質とＰＵＦＡの蓄積を促進した。標準操作条件によって、温度（３０〜３２℃に制御）、ｐＨ（５〜７に制御）、溶存酸素濃度、およびグルコース濃度をはじめとするプロセス変量をモニターして制御し、一貫した工程性能および最終ＰＵＦＡ油の品質を確保した。
【０１３６】
発酵当業者は、発酵操作それ自体、培地条件、工程パラメーター、スケールアップなど、ならびに培養物が試料採取される特定の時点に応じて特定ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の油プロフィールに変動が起きることを知るであろう（例えば米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書を参照されたい）。
【０１３７】
後処理過程：
処理に先だって抗酸化剤を発酵ブロスに任意選択的に添加して、微生物油の酸化安定性を確保する。酵母微生物バイオマスを脱水し、洗浄して塩と残留培地を除去し、リパーゼ活性を最小化した。次にドラム乾燥（典型的に８０ｐｓｉｇの蒸気で）または噴霧乾燥のどちらかを実施して、水分含量を５％未満に低下させ、短期保存および輸送中の油安定性を確保した。二軸スクリュー押出機を使用して、ドラム乾燥フレークまたは噴霧乾燥粉末を機械的に破壊し、微生物油がより容易に露出するようにして、それによって抽出を促進した。
【０１３８】
一般方法
微生物バイオマス、抽出油、および残留バイオマスサンプル中の脂質配分を測定する方法：Ｂｌｉｇｈ  ＆  Ｄｙｅｒ法（Ｌｉｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｅｄ．，Ｏｉｌｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｒｉｄｇｗａｔｅｒ，２００３で概説される手順に基づく）の変法を使用して、酵母微生物バイオマスおよび残留バイオマス（すなわちＣＯ２抽出後）のサンプルを抽出し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で分離して、メタノール塩酸を使用して、直接、エステル化／エステル交換した。油サンプルをクロロホルム／メタノールに溶解し、次にＴＬＣで分離して、直接エステル化／エステル交換した。エステル化／エステル交換サンプルをガスクロマトグラフィーによって分析した。
【０１３９】
酵母微生物バイオマスおよび残留バイオマスのサンプルは、典型的に乾燥粉末として受領された。規定分（ＰＵＦＡ濃度に応じて１００〜２００ｍｇ以下）のサンプルをＴｅｆｌｏｎ（商標）キャップ付き１３×１００ｍｍガラス試験管内に量り入れ、それに３ｍＬ容積の２：１（容積：容積）メタノール／クロロホルム溶液を添加した。サンプルを完全にボルテックスして、穏やかに撹拌および反転させて、室温で１時間インキュベートした。１時間後、１ｍＬのクロロホルムおよび１．８ｍＬの脱イオン水を添加して混合物を撹拌し、次に形成された２層を遠心分離して分離した。パスツールピペットを使用して、最下層を取り出して第２の風袋測定済み１３ｍｍガラスバイアルに入れ、水性最上層を第２の１ｍＬ部分のクロロホルムで３０分間再抽出した。２つの抽出物を合わせて、「第１の抽出物」と見なした。乾燥窒素によって５０℃でＴｕｒｂｏＶａｐ（商標）を使用して溶媒を除去し、残留油を適量の６：１（容積：容積）クロロホルム／メタノールに再懸濁して、１００ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。
【０１４０】
（酵母微生物バイオマスおよび残留バイオマスサンプルについて）上述したようにして得られた抽出油と、微生物バイオマスのＣＯ２抽出からの油サンプルを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析した。ＴＬＣは典型的に１つのタンクを使用して行われたが、個々のＰＬを同定する場合、２タンク手順もまた用いられた。１タンクＴＬＣ手順では、プレートの端から端まで底部から２ｃｍに鉛筆で薄い線を引くことで、５×２０ｃｍシリカゲル６０プレート（ＥＭＤ＃５７２４−３、ＶＷＲから得られた）を準備した。鉛筆線の上から、スポット間にいかなる間隙も残さずに、プレートの端から端まで適量のサンプル（約６０μＬ）をスポットした。１〜２μＬの量を使用して、第２のプレートに、既知の標準物質およびサンプルをスポットした。プレートを５〜１０分間風乾して、プレートのランニングに先だって１枚の吸い取り紙と共にタンク内で少なくとも３０分間平衡化させた、ヘキサン−ジエチルエーテル−酢酸混合物（容積比７０：３０：１）を使用して展開した。
【０１４１】
上から１／４インチ以内までプレートを展開した後、それらをＮ２環境内で１５分間乾燥させた。次に標準物質および小型サンプルスポットのある２枚目のプレートを、ヨウ素結晶で飽和させたタンク内で展開して、分取プレートの参照とした。バンドの端をヨウ素で非常に薄く染め、鉛筆を使用して分取プレートのバンドを識別し、各画分（すなわちそれぞれＰＬ、ＦＦＡ、ＴＡＧ、およびＤＡＧ画分）に従ってバンドをグループ分けした。ＤＡＧバンドは、１，２−ＤＡＧ、１，３−ＤＡＧ、およびＭＡＧバンド間にいくらかの分離を示し得て、典型的にこの全領域はＤＡＧバンドとして切り抜かれる。バンドをゲルから切り抜いて、１３ｍｍガラスバイアルに移した。プレートの残部をヨウ素タンク内で展開し、対象のバンドの完全な除去を確認した。
【０１４２】
各バンドを含有するガラスバイアルに、トルエン中の適量のトリグリセリド内標準を添加した。各バンドの可視濃度に応じて、１００μＬの０．１〜５ｍｇ／ｍＬの内標準を通常使用した。共溶媒（この場合トルエン）を内標準と共に添加した。内標準を使用しない場合、追加的な共溶媒を添加して、鎖長のより長い脂質のエステル化／エステル交換を完了した。１ｍＬの１％メタノール塩酸溶液（５ｍＬ塩化アセチルを５０ｍＬの冷乾燥メタノールに緩慢に添加して調製された）を添加し、サンプルに蓋をして穏やかに混合し、８０℃の加熱ブロックに入れた。１後時間後、サンプルを取り出して放冷した。１ｍＬの１Ｎ塩化ナトリウム溶液および４００μＬのヘキサンを添加し、次にサンプルを少なくとも１２秒間ボルテックスして遠心分離し、２相を分離した。次に水性（最下）層で汚染しないように注意しながら、最上層を取り出した。最上層をインサートを装着したＧＣバイアル内に入れて蓋をした。
【０１４３】
水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）とＯｍｅｇａｗａｘ  ３２０カラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ内径×２５μｍ膜厚；製造元Ｓｕｐｅｌｃｏ（Ｂｅｌｌｆｏｎｔｅ，ＰＡ））とを装着したＡｇｉｌｅｎｔモデル６８９０ガスクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、サンプルを分析した。ヘリウムキャリアガスは、分割比２０：１または３０：１で、１〜３ｍＬ／分の範囲内で一定に保たれた。オーブン条件は次のとおりであった。初期温度１６０℃で、初期時間０分および平衡時間０．５分間。温度勾配は、２００℃まで５℃／分で最終保持時間０分間、次に２４０℃まで１０℃／分で４分間の保持時間で合計１６分間であった。入口は２６０℃に設定した。ＦＩＤ検出器もまた２６０℃に設定した。Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ  ＧＬＣ参照標準（＃４６１）を滞留時間検証のために注入した。
【０１４４】
ＡｇｉｌｅｎｔのＣｕｓｔｏｍ  Ｒｅｐｏｒｔｓを使用してＧＣ結果を収集し、百分率を計算するために各脂肪酸の面積をＥｘｃｅｌスプレッドシートに転送した。次に脂肪酸総量を脂質クラスに変換する補正率を適用することができた。各構成要素の合計百分率を、ＴＬＣに先だって誘導体化された元の抽出物と比較した。
【０１４５】
抽出法：
乾燥させて機械的に破壊した酵母細胞（「微生物バイオマス」）を通常、抽出容器に装填し、グラスウールプラグの間に詰めてＣＯ２でフラッシュし、次にＣＯ２流の下で所望の操作条件に加熱および加圧した。排出管を装着した市販のシリンダーからＣＯ２を直接供給し、高圧ポンプで量り入れた。容器の流出側の絞り弁の使用を通じて抽出容器上で圧力を維持し、ＣＯ２溶媒を大気中に同時に排気しながら、微生物油サンプルをサンプル容器内に収集した。共溶媒（例えばエタノール）を共溶媒ポンプ（Ｉｓｃｏモデル１００Ｄシリンジポンプ）の使用を通じて、抽出容器に供給される抽出溶媒に任意選択的に添加することができる。残留バイオマスを測定して抽出中の全質量損失を判定することにより、報告される微生物バイオマスからの抽出収率を重量測定的に求めた。
【０１４６】
実施例５は、市販の自動ＳＣＦ抽出器（ＩｓｃｏモデルＳＦＸ３５６０）を使用して実施された。この装置は、抽出容器の両端に２ミクロンの焼結金属フィルターを装着した１０ｍＬプラスチック抽出容器を使用した。抽出する基質をこの容器に装填し、次に抽出容器の内外で圧力を均等化する、高圧抽出チャンバーに装入した。ＣＯ２溶媒をシリンジポンプ（ＩＳＣＯモデル２６０Ｄ）で量り入れ、規定の抽出温度に予熱して、次に抽出容器に通過させた。抵抗加熱ヒーターによって、抽出チャンバーを所望の抽出温度に加熱した。装置の不可分の一部である自動可変絞り弁によって、容器上で圧力を維持した。
【０１４７】
実施例１〜４および６〜９は、特注高圧抽出装置内で行われた。抽出容器は３１６ＳＳ管材料から組み立てられ、容器の流出端上に２ミクロン焼結金属フィルターが装着された。冷蔵ヘッドアセンブリー（ＪａｓｃｏモデルＰＵ−１５８０−ＣＯ２）を装着した容積型ポンプによって、ＣＯ２を量り入れた。自動温度調節器によって制御される４つのＣａｌｒｏｄ加熱カートリッジを装着した、特注機械加工アルミニウムブロック内に、抽出容器を据え付けた。自動背圧調整器（ＪａｓｃｏモデルＢＰ−１５８０−８１）によって、抽出圧力を維持した。
【０１４８】
本実施例で報告される微生物バイオマス、残留バイオマス、および抽出油中の様々な脂質構成要素の分析は、本明細書で上述した薄層およびガスクロマトグラフィー法を使用して判定した。この要約は、分析的手順を使用して微生物バイオマスから抽出された脂質の分析を反映する；しかし残留バイオマスサンプルについてこの手順によって分析される脂質の量は、微生物バイオマスおよび抽出油サンプルのそれと比べて比較的小さい（典型的に最初の微生物バイオマス中の抽出油の＜３％）。
【０１４９】
微生物バイオマス、残留バイオマス、および抽出油サンプルについて脂質構成要素の相対配分を示す要約表に、結果を報告する。表の最上部の横列に示す同定された各脂肪酸について、リン脂質（ＰＬ）、ジアシルグリセリドジアシルグリセリド（ＤＡＧ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、およびトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）としてのその構成要素の相対配分を表縦列に垂直に示す。各サンプルの最初の行が、ＴＬＣに先だって誘導体化された元の抽出物の分析を示す一方、後続の列は、ＴＬＣおよびＧＣによる各構成要素の分析を提供し、各構成要素の合計百分率は、そのサンプルの右端の縦列に示される。
【０１５０】
報告された微生物油抽出収率は、抽出前微生物バイオマスと抽出後残留バイオマス間の重量差によって決定され、百分率として表される。重量差は、ＣＯ２での処理によって抽出された微生物油量に起因すると想定された。得られた油の実重量は一般に、質量差に基づいて予想された重量の約８５％以内であることが分かった。
【０１５１】
実施例１
３１１バールおよび４０℃における抽出曲線
本実施例の目的は、抽出曲線の生成を実証することである。３１６ＳＳ管材料（０．９５ｃｍ外径×０．６２ｃｍ内径×２６．７ｃｍ長さ）から組み立てられた８ｍＬの抽出容器に、公称２．７ｇの乾燥させ機械的に破壊したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株の酵母細胞（すなわち微生物バイオマス）を一連の抽出のために繰り返し装填して、４０℃および３１１バールにおけるこの微生物バイオマスの抽出曲線を求めた。各抽出では、抽出容器および微生物バイオマスをＣＯ２でフラッシュし、次に４０℃においてＣＯ２で３１１バールに加圧した。これらの条件および１．５ｇ／分のＣＯ２流速で、微生物バイオマスを様々な回数抽出し、一連の溶媒対供給材料比を提供して、表４に示すように、対応する抽出収率を得た。
【０１５２】
【表６】
2013525549.tif 000008
【０１５３】
図４は、これらのデータを抽出曲線中にプロットする。約４０ｇ  ＣＯ２／ｇの酵母溶媒対供給材料比における曲線の中断は、選択された温度と圧力において、この特定の微生物バイオマス中で利用可能な微生物油を効果的に抽出するために、少なくともこの溶媒比が必要であることを示唆する。
【０１５４】
異なる温度および／または圧力条件で一連の抽出を繰り返し、特定の微生物バイオマスサンプルについて一連の抽出曲線を生成し得て、例えば経済性、所望の抽出収率、またはＣＯ２総使用量に基づいて、最適抽出条件を選択できるようにする。
【０１５５】
比較例
抽出油の分画なしの酵母細胞の抽出
この比較例の目的は、抽出物の分画または残留バイオマスの逐次抽出なしで、ＣＯ２による微生物バイオマスの抽出を実証し、得られた抽出物の脂質組成を提供することである。
【０１５６】
３１６ＳＳ管材料（１．２７ｃｍ外径×０．９４ｃｍ内径×２６．０ｃｍ長さ）から組み立てられた１８ｍＬ抽出容器に、４．９９ｇの乾燥させ機械的に破壊したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株の酵母細胞（すなわち微生物バイオマス）を装填した。微生物バイオマスをＣＯ２でフラッシュし、次に４０℃に加熱して、２２２バールに加圧した。これらの条件および２．３ｇ／分ＣＯ２の流速で微生物バイオマスを５．５時間抽出し、１４９ｇ  ＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒対供給材料比を提供した。抽出物の収率は、１８．２重量％であった。
【０１５７】
下の表は、微生物バイオマス、残留バイオマス、および抽出油の脂質分析を要約する。
【０１５８】
【表７】
2013525549.tif 000009
【０１５９】
酵母微生物バイオマスでは、ＦＦＡの５０重量％［「ｗｔ％」］およびＴＡＧの５９．８重量％が、ＥＰＡを含有することが分かった。具体的には、ＦＦＡ中のＥＰＡの重量％は、微生物バイオマス中のＦＦＡの全重量％（すなわち６）で除した、微生物バイオマス中でＥＰＡを含んでなるＦＦＡの重量％（すなわち３）として計算され、百分率として表され、どちらのパーセント値も上の表５に示されるようにＴＬＣ分析から得られた。同様に、ＴＡＧ中のＥＰＡの重量％は、微生物バイオマス中のＴＡＧの全重量％（すなわち８２）で除した、微生物バイオマス中のＥＰＡを含んでなりＴＡＧの重量％（すなわち４９）として計算され、百分率として表され、どちらのパーセント値も前出のＴＬＣ分析から得られた。
【０１６０】
抽出油中のＰＬの不在（すなわち０重量％）は、最初の微生物バイオマス中に存在する脂質のＰＬ画分が残留バイオマス（４３重量％ＰＬ）中に残り、ＣＯ２によって抽出油中に分割されないことを示す。さらに抽出油は、微生物バイオマスのＴＡＧ含量（すなわち８２重量％）と比べてＴＡＧに富む（すなわち９０重量％）。したがって抽出油は精製脂質組成物である。
【０１６１】
より具体的には、結果は、抽出油の精製脂質組成物が９０重量％のＴＡＧ、４重量％のＦＦＡ、および６重量％のＤＡＧを含有することを示し、５０％のＦＦＡおよび５８．９％のＴＡＧはＥＰＡを含有することが分かった。より具体的には、ＦＦＡ中のＥＰＡ重量％は、抽出油中のＦＦＡの全重量％（すなわち４）で除した、抽出油中のＥＰＡを含んでなるＦＦＡの重量％（すなわち２）として計算され；ＴＡＧ中のＥＰＡ重量％は、抽出油中のＴＡＧの全重量％（すなわち９０）で除した、抽出油中のＥＰＡを含んでなるＴＡＧの重量％（すなわち５３）として計算された。精製脂質組成物は、微生物バイオマスと比べてＥＰＡに富まない。
【０１６２】
実施例２〜４
逐次圧力抽出による脂質分画
実施例２、３、および４の目的は、様々な抽出条件下における微生物バイオマスの逐次圧力抽出を実証し、得られた抽出油の脂質組成を提供することである。
【０１６３】
実施例２、３、および４は、抽出油の脂質構成要素の分割が、多段階抽出における抽出条件の選択によって、影響を被り得ることを集合的に例証する。このような分割は、同様に、図３で例証される工程によって得られる、抽出油の逐次圧力低下から得られる。
【０１６４】
実施例２、３、および４で得られるこれらの結果は、抽出油が引き続いて段階的圧力低下によって分画される、微生物バイオマスのＳＣＦ  ＣＯ２抽出によって得られる結果と同様であることが予期される。
【０１６５】
実施例２：
１２５バール〜２２２バール
３１６  ＳＳ管材料（１．２７ｃｍ外径×０．９４ｃｍ内径×２６．０ｃｍ長さ）から組み立てられた１８ｍＬ抽出容器に、３．５０ｇの乾燥させ機械的に破壊したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株の酵母細胞を微生物バイオマスとして装填した。
【０１６６】
抽出物Ａ：
微生物バイオマスをＣＯ２でフラッシュし、次に４０℃に加熱して１２５バールに加圧した。これらの条件および２．３ｇ／分ＣＯ２の流速で微生物バイオマスを５時間抽出し、その時点で圧力を１５０バールに上昇させた。抽出をさらに１．２時間継続し、２３８ｇ  ＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒対供給材料比を提供した。抽出物Ａの収率は、１１．７重量％であった。
【０１６７】
抽出物Ｂ：
圧力を２２２バールに上昇させ、ＣＯ２流を２．３ｇ／分で４．０時間継続することで、同じ部分的に抽出した微生物バイオマスに抽出を継続し、この画分について１５３ｇ  ＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒対供給材料比を提供した。抽出物Ｂの収率は、抽出容器に装填した元の微生物バイオマスの６．２重量％であった。
【０１６８】
下の表は、微生物バイオマスと２つの抽出油画分（すなわち抽出物Ａおよび抽出物Ｂ）の脂質分析を要約する。
【０１６９】
【表８】
2013525549.tif 000010
【０１７０】
用いられた抽出条件下では、抽出油のいくらかのＴＡＧ（すなわち８２重量％）と、ＦＦＡおよびＤＡＧの大部分は、抽出物Ａ（各９重量％を含有する）中に選択的に分割された。最初の微生物バイオマス中に存在する脂質のＰＬ画分は、ＣＯ２によって抽出物Ａ中に分割されなかった。したがって抽出物Ａは精製脂質組成物である。
【０１７１】
用いられた抽出条件下では、抽出物ＢはＴＡＧに富み（１重量％のＤＡＧのみを含有し、測定されるＦＦＡを含有しない）、実質的にＰＬを含まなかった。したがって抽出物Ｂの抽出油は、ＴＡＧに富む精製脂質組成物である。より具体的には、抽出物Ｂは９９％のＴＡＧを含んでなり、その内６２．６％はＥＰＡを含有した（すなわち抽出物Ｂ中のＴＡＧの全重量％［すなわち９９］で除した、抽出物Ｂ中のＥＰＡを含んでなるＴＡＧの重量％として計算され［すなわち６２］、百分率として表され、どちらのパーセント値もＴＬＣ分析から得られた）。対照的に、ＥＰＡは、微生物バイオマス中の約５９．８％のＴＡＧ中に存在した（すなわち微生物バイオマス中のＴＡＧの全重量％［すなわち８２］で除した、微生物バイオマス中のＥＰＡを含んでなるＴＡＧの重量％［すなわち４９］として計算される）。したがって抽出物Ｂの精製脂質組成物は、微生物バイオマスと比べて、Ｃ２０  ＰＵＦＡであるＥＰＡに富む。
【０１７２】
実施例３：
１２５バールから１４１バールから２２２バール
３１６  ＳＳ管材料（２．５４ｃｍ外径×１．９３ｃｍ内径×３０．５ｃｍ長さ）から組み立てられた８９ｍＬ抽出容器に、１５．０ｇの乾燥させ機械的に破壊したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株の酵母細胞を微生物バイオマスとして装填した。
【０１７３】
抽出物Ａ：
微生物バイオマスをＣＯ２でフラッシュし、次に４０℃に加熱して、１２５バールに加圧した。これらの条件および流速２．３ｇ／分のＣＯ２で微生物バイオマスを３．９時間抽出し、その時点で４．７ｇ／分ＣＯ２に流速を増大させて抽出をさらに２．３時間継続した。次に圧力を１４１バールに上昇させた。抽出を４．７ｇ／分のＣＯ２／ｇでさらに４．１時間継続し、１５４ｇ  ＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒対供給材料比を提供した。抽出物Ａの収率は、８．７重量％であった。
【０１７４】
抽出物Ｂ：
圧力を２２２バールに上昇させ、ＣＯ２流を４．７ｇ／分で８．０時間継続することで、同じ部分的に抽出した微生物バイオマスに抽出を継続し、この抽出物について１５０ｇ  ＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒対供給材料比を提供した。抽出物Ｂの収率は、抽出容器に装填した最初の微生物バイオマスの１５．４重量％であった。
【０１７５】
下の表は、微生物バイオマス、最終抽出後の残留バイオマス、および２つの抽出油画分（すなわち抽出物Ａおよび抽出物Ｂ）の脂質分析を要約する。
【０１７６】
【表９】
2013525549.tif 000011
【０１７７】
結果は、微生物バイオマス中に存在する脂質のＰＬ画分が、残留バイオマス中に残ることを示した（すなわち抽出物Ａ中の０重量％および抽出物Ｂ中の１重量％と対比して、残
留バイオマス中に３７重量％のＰＬ）。
【０１７８】
用いられた抽出条件下では、微生物バイオマスのＦＦＡおよびＤＡＧが抽出物Ａの精製脂質組成物中に選択的に分割される一方、精製脂質組成物抽出物ＢはＴＡＧに富んでいた。より具体的には、抽出物Ｂは約９７％ＴＡＧで、測定されるＦＦＡはなく、約６１．９％のＴＡＧはＥＰＡを含有することが分かった。対照的に、ＥＰＡは、微生物バイオマス中の約５９．８％のＴＡＧ中に存在した（すなわち微生物バイオマス中のＴＡＧの全重量％［すなわち８２］で除した、微生物バイオマス中のＥＰＡを含んでなるＴＡＧの重量％［すなわち４９］として計算される）。したがって抽出物Ｂの精製脂質組成物は、微生物バイオマスと比べて、Ｃ２０  ＰＵＦＡであるＥＰＡに富む。
【０１７９】
実施例４：
１１０バールから２２２バール
３１６  ＳＳ管材料（２．５４ｃｍ外径×１．９３ｃｍ内径×３０．５ｃｍ長さ）から組み立てられた８９ｍＬ抽出容器に、２０．０ｇの乾燥させ機械的に破壊したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株の酵母細胞を微生物バイオマスとして装填した。
【０１８０】
抽出物Ａ：
微生物バイオマスをＣＯ２でフラッシュし、次に４０℃に加熱して、１１０バールに加圧した。これらの条件および４．７ｇ／分ＣＯ２の流速で微生物バイオマスを７．１時間抽出し、１００ｇ  ＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒対供給材料比を提供した。抽出物Ａの収率は、４．１重量％であった。
【０１８１】
抽出物Ｂ：
圧力を２２２バールに上昇させ、ＣＯ２流を４．７ｇ／分で１５．０時間継続することで、同じ部分的に抽出した微生物バイオマスに抽出を継続し、この抽出物について２１２ｇ  ＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒対供給材料比を提供した。抽出物Ｂの収率は、抽出容器に装填した元の微生物バイオマスの１４．６重量％であった。
【０１８２】
下の表は、出発供給酵母、最終抽出後の残留バイオマス、および２つの抽出油画分（すなわち抽出物Ａおよび抽出物Ｂ）の脂質分析を要約する。
【０１８３】
【表１０】
2013525549.tif 000012
【０１８４】
結果は、微生物バイオマス中に存在する脂質のＰＬ画分が、残留バイオマス中に残ることを示した（すなわち抽出物Ａおよび抽出物Ｂ中の０重量％と対比して、残留バイオマス
中に４１重量％のＰＬ）。
【０１８５】
用いられた抽出条件下では、微生物バイオマスのＦＦＡおよびＤＡＧが抽出物Ａの精製脂質組成物中に選択的に分割される一方、抽出物Ｂの精製脂質組成物はＴＡＧに富んでいた。より具体的には、抽出物Ｂは約９５％ＴＡＧで、測定されるＦＦＡはなく、約５８．９％のＴＡＧはＥＰＡを含有することが分かった。抽出物Ｂの精製脂質組成物は、微生物バイオマスと比べてＥＰＡに富まない。
【０１８６】
実施例５〜７
様々な圧力における超臨界流体ＣＯ２抽出
実施例５、６、および７の目的は、様々な圧力（すなわちそれぞれ５００バール、３１０バール、および２２２バール）において、超臨界流体（ＳＣＦ）としてのＣＯ２による微生物バイオマスの抽出を実証し、得られた抽出油の脂質組成を提供することである。このような抽出条件は、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる精製組成物を得る方法の最初のステップで使用することができ、方法は、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる微生物バイオマスを適切な抽出条件下でＣＯ２によって処理するステップと、引き続いて例えば逐次圧力低下によって抽出物を分画するステップを含んでなる。
【０１８７】
実施例５：
５００バールにおけるＳＣＦ  ＣＯ２抽出
１０ｍＬの抽出容器に、２．０１ｇの乾燥させ機械的に破壊したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５−Ｆ１Ｂ１株の酵母細胞を微生物バイオマスとして装填し、容器をＩｓｃｏモデルＳＦＸ３５６０抽出器内にマウントした。微生物バイオマスをＣＯ２でフラッシュし、次に４０℃に加熱して、５００バールに加圧した。これらの条件および０．８６ｇ／分ＣＯ２の流速で微生物バイオマスを５．８時間抽出し、１５０ｇ  ＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒対供給材料比を提供した。抽出油の収率は、３２．８重量％であった。下の表は、微生物バイオマス、残留バイオマス、および抽出油の脂質分析を要約する。
【０１８８】
【表１１】
2013525549.tif 000013
【０１８９】
表９の結果は、微生物バイオマス中に存在する脂質のＰＬ画分が残留バイオマス中に残り、ＣＯ２抽出油中に分割されなかったことを示す（すなわち抽出油中の０重量％と対比
して残留バイオマス中に４８重量％のＰＬ）。抽出油はまた、微生物バイオマスと比べてＴＡＧにも富んだので、この油は精製脂質組成物であった。精製脂質組成物は、５重量％ＦＦＡ、７重量％ＤＡＧ、および８８重量％ＴＡＧを含んでなった。
【０１９０】
実施例６：
３１０バールにおけるＳＣＦ  ＣＯ２抽出
３１６  ＳＳ管材料（２．５４ｃｍ外径×１．９３ｃｍ内径×３０．５ｃｍ長さ）から組み立てられた８９ｍＬ抽出容器に、２５．１ｇの乾燥させ機械的に破壊したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株の酵母細胞を微生物バイオマスとして装填した。微生物バイオマスをＣＯ２でフラッシュし、次に４０℃に加熱して、３１０バールに加圧した。これらの条件および５．０ｍＬ／分ＣＯ２の流速で微生物バイオマスを４．４時間抽出し、５０ｇ  ＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒対供給材料比を提供した。抽出油の収率は、２８．８重量％であった。下の表は、微生物バイオマス、残留バイオマス、および抽出油の脂質分析を要約する。
【０１９１】
【表１２】
2013525549.tif 000014
【０１９２】
表１０の結果は、微生物バイオマス中に存在する脂質のＰＬ画分の大部分が残留バイオマス中に残り、ＣＯ２抽出油中に分割されなかったことを示す（すなわち抽出油中の１重量％と対比して残留バイオマス中に４０重量％のＰＬ）。抽出油はまた、微生物バイオマスと比べて実質的にＰＬを含まずＴＡＧに富んだので、この油は精製脂質組成物であった。精製脂質組成物は、１６重量％ＦＦＡ、６重量％ＤＡＧ、および７７重量％ＴＡＧを含んでなった。
【０１９３】
実施例７：
２２２バールにおけるＳＣＦ  ＣＯ２抽出
３１６  ＳＳ管材料（２．５４ｃｍ外径×１．９３ｃｍ内径×３０．５ｃｍ長さ）から組み立てられた８９ｍＬ抽出容器に、２５．１ｇの乾燥させ機械的に破壊したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株の酵母細胞を微生物バイオマスとして装填した。微生物バイオマスをＣＯ２でフラッシュし、次に４０℃に加熱して、２２２バールに加圧した。これらの条件および４．７ｇ／分ＣＯ２の流速で微生物バイオマスを１３．７時間抽出し、１５４ｇ  ＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒対供給材料比を提供した。抽出油の収率は、１８．１重量％であった。
【０１９４】
毎回微生物バイオマスの新鮮サンプルを用いて、前出のこの抽出をさらに４回反復した。５つの残留バイオマスサンプルおよび５つの抽出油サンプルは、統合して混合し、５回の抽出からの複合試料を提供した。
【０１９５】
下の表は、微生物バイオマス、統合残留バイオマス、および統合抽出油の脂質分析を要約する。
【０１９６】
【表１３】
2013525549.tif 000015
【０１９７】
表１１の結果は、微生物バイオマス中に存在する脂質のＰＬ画分が残留バイオマス中に残り、ＣＯ２抽出油中に分割されなかったことを示す（すなわち抽出油中の０重量％と対
比して残留バイオマス中に５９重量％のＰＬ）。抽出油はまた、微生物バイオマスと比べてＴＡＧにも富んだので、この油は精製脂質組成物であった。精製脂質組成物は、７重量％ＦＦＡ、７重量％ＤＡＧ、および８６重量％ＴＡＧを含んでなった。
【０１９８】
実施例８
８５バールにおける液体ＣＯ２抽出
本実施例の目的は、８５バールにおいて液体としてのＣＯ２による微生物バイオマスの抽出を実証し、得られた抽出油の組成を提供することである。このような抽出条件は、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる精製組成物を得る方法の第１のステップで使用することができ、方法は、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる微生物バイオマスを適切な抽出条件下でＣＯ２によって処理するステップと、引き続いて例えば逐次圧力低下によって抽出物を分画するステップを含んでなる。
【０１９９】
３１６  ＳＳ管材料（０．９５ｃｍ外径×０．６２ｃｍ内径×２６．７ｃｍ長さ）から組み立てられた８ｍＬ抽出容器に、０．９６６ｇの乾燥させ機械的に破壊したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株の酵母細胞を微生物バイオマスとして装填した。微生物バイオマスをＣＯ２でフラッシュし、次に２２℃で液体ＣＯ２によって８５バールに加圧した。これらの条件および０．６９ｇ／分ＣＯ２の流速で微生物バイオマスを８．５時間抽出し、３６１ｇ  ＣＯ２／ｇ酵母の最終溶媒対供給材料比を提供した。抽出油の収率は、２１．４重量％であった。
【０２００】
下の表は、微生物バイオマス、残留バイオマス、および抽出油の脂質分析を要約する。
【０２０１】
【表１４】
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【０２０２】
表１２の結果は、微生物バイオマス中に存在する脂質のＰＬ画分が残留バイオマス中に残り、ＣＯ２抽出油中に分割されなかったことを示す（すなわち抽出油中の０．７重量％
と対比して残留バイオマス中に２８重量％のＰＬ）。抽出油はまた、微生物バイオマスと比べて実質的にＰＬを含まずＴＡＧに富んだので、この油は精製脂質組成物であった。
【０２０３】
精製脂質組成物は、８重量％ＦＦＡ、５重量％ＤＡＧ、および８６重量％ＴＡＧを含んでなった。
【０２０４】
実施例９
ＳＣＦ  ＣＯ２／ＥｔＯＨによる残留リン脂質の抽出
本実施例の目的は、抽出剤としてのＳＣＦ  ＣＯ２とエタノールの混合物による第１の残留バイオマスサンプルの抽出を実証して、ＰＬ画分と第２の残留バイオマスサンプルを得ることである。
【０２０５】
３１６ＳＳ管材料（１．２７ｃｍ外径×０．９４ｃｍ内径×２６．０ｃｍ長さ）から組み立てられた１８ｍＬ抽出容器に、本明細書で「第１の残留バイオマス」と称される、実施例３からの６．３９ｇの残留バイオマス（すなわち１２５バールおよび２２２バールにおけるＣＯ２抽出に続くヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株バイオマス）を装填した。材料をＣＯ２でフラッシュし、次に４０℃でＣＯ２／エタノール混合物（抽出剤）によって、２２２バールに加圧した。ＣＯ２流速は２．３ｇ／分で、エタノール流速は０．１２ｇ／分であり、抽出容器に供給される溶媒に５．０重量％のエタノール濃度を与えた。これらの条件で第１の残留バイオマスを５．３時間抽出して、１ｇの残留バイオマスあたり１２０ｇ  ＣＯ２／エタノールの最終溶媒対供給材料比を与えた。抽出済み材料からの油の抽出収率は、２．４重量％であった。
【０２０６】
下の表は、第１の残留バイオマス（本実施例の出発サンプル）、第２の残留バイオマス（本実施例の抽出後の第１の残留バイオマス）、および第１の残留バイオマスの抽出によって得られた抽出油の脂質分析を要約する。
【０２０７】
【表１５】
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【０２０８】
表１３の結果は、抽出油が本質的に純粋なＰＬを含んでなることが分かることを示す。実施例３で先に実施された抽出が、微生物バイオマスから中性脂肪（すなわちＴＡＧ、ＤＡＧ、およびＭＡＧ）とＦＦＡを既に除去していた。
【０２０９】
実施例１０
本実施例の目的は、本明細書に記載される抽出および分画法で使用することができる、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる代案の微生物バイオマスを提供し、微生物バイオマスの油組成物と比べてＴＡＧに富む精製脂質組成物をもたらすことである。
【０２１０】
ω−３／ω−６ＰＵＦＡ生産のために遺伝子操作されている多数の油性酵母が、本明細書の開示に準じて適切な微生物バイオマスであるが、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の代表株を表３に記載する。これらとしては、ＡＴＣＣに寄託された以下の株が挙げられる。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７株（ＡＲＡ産生；ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−７１８６）；Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０９６株（ＥＰＡ産生；ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−７１８４）；Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２０１株（ＥＰＡ産生；ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−７１８５）；Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ３０００株（ＤＨＡ産生；ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−７１８７）；Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１２８株（ＥＰＡ産生；ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−８６１４）；Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１２７株（ＥＰＡ産生；ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−８８０２）；Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株（ＥＰＡ産生；ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１００２５）；Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４１２株（ＥＰＡ産生；ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１００２６）；およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８２５９株（ＥＰＡ産生；ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１００２７）。
【０２１１】
したがって例えば、表３は総脂肪酸の２５．９％〜３４％のＧＬＡ、総脂肪酸の１０．９％〜１４％のＡＲＡ、総脂肪酸の９％〜５３．２％のＥＰＡ、および総脂肪酸の５．６％のＤＨＡを産生する微生物宿主を示す。
【０２１２】
当業者は、本発明の技法が、高レベルＥＰＡ産生を実証する微生物バイオマスに限定されるものではなく、代案のω−３／ω−６ＰＵＦＡまたはその組み合わせまたはそのＰＵＦＡの高レベル産生を実証する微生物バイオマスにも等しく適切であることを理解するであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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