(57)【要約】  本発明は、高温状態でインキュベーションすることによって試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を生じさせる方法に関し、より詳細には、高温状態でのインキュベーション、ならびに任意選択でＩＬ−７の添加および／またはＩＬ−１０の遮断によって、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を生じさせる方法に関する。さらにより詳細には、本発明は、全血または他の適切な生体試料を使用して抗原に対する細胞媒介性応答を生じさせる方法を提供する。この方法は、多くの感染性疾患を免疫診断するため、免疫応答性のマーカーとして、ならびに非自己抗原（すなわち感染およびワクチン）に対するＴ細胞応答を検出するために有用である。
2013532274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）哺乳動物由来の、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を含む試料を提供するステップと、
ｂ）前記試料を、高温状態で、少なくとも１つの試験抗原と共にインキュベーションするステップと、
ｃ）前記試料における試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を決定するステップと、
を含み、前記高温状態でのインキュベーションが、摂氏３７℃の通常の熱条件下でのインキュベーションによって得られる参照レベルと比較した場合に、試験抗原に特異的な免疫応答の増大を生じさせる、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を生じさせる方法。
【請求項２】
前記試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答が、少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子のレベルを測定することによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫シグナル伝達分子がサイトカインまたはケモカインである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫シグナル伝達分子のレベルが、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルを測定することによって決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫シグナル伝達分子のレベルの前記決定を、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ、免疫ブロッティング、免疫クロマトグラフィー側方流動アッセイ、酵素増幅免疫アッセイ技法、ＲＡＳＴ試験、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光および様々な免疫学的ドライスティックアッセイからなる群から選択される方法を使用して行う、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫シグナル伝達分子が、ＩＰ−１０、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−２、ＭＩＧ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１ａ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−ＲＡ、ｓＩＬ−２Ｒ、およびＩＬ−１２からなる群から選択される、請求項２から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記免疫シグナル伝達分子がＩＰ−１０である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫シグナル伝達分子がＩＦＮ−γである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
サイトカインＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１；ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５と結合する中和抗体、抗ＣＤ２５抗体でコーティングしたビーズ、抗ＣＤ３９抗体でコーティングしたビーズ、ＩＬ−１０、ＪＡＫ１またはＴＹＫ２をコードしている遺伝物質に対するセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＴＬＲ変調剤として作用するオリゴヌクレオチド、およびＴＬＲ変調剤からなる群から選択される少なくとも１つの免疫変調剤を、ステップｂで加える、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの試験抗原が、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、ＴＢ７．７、ならびに他のＲＤ−１およびＲＤ−１１抗原を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が、全血、または血液、胸膜液、気管支液、組織生検、腹水、および／もしくは脳脊髄液に由来する細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料が、末梢単核細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、ガンマ・デルタＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞およびＮＫ細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記高温状態が、摂氏３８．５〜４１．０℃の温度でのインキュベーションである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記高温状態が、摂氏３９〜４０℃の温度でのインキュベーションである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
炭化水素および／またはグリカンの形態の糖をステップｂで加える、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が前記試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答の改善されたシグナル対ノイズ比を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を使用して、前記試験抗原を発現することができる微生物によって引き起こされる感染症を診断する、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を使用してワクチン接種の応答を検出する、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を使用して、癌または新生物または悪性腫瘍を検出する、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記微生物が、マイコバクテリア属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）およびサイトメガロウイルスからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記マイコバクテリア属が結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合生物（結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）およびエム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ））、および相違領域（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）（ＲＤ１）が欠失していないマイコバクテリア属（カンサシ菌（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、エム・ツルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、エム・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、エム・フラベセンス（Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、エム・ガストリイ（Ｍ  ｇａｓｔｒｉｉ））またはヒトに病原性のあるマイコバクテリア属（トリ結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａ）もしくは他の非結核性マイコバクテリア）に属している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記マイコバクテリア属が結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉｃ）状態でインキュベーションすることによって試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を生じさせる一般方法に関し、より詳細には、高温状態でのインキュベーション、ならびに任意選択でＩＬ−７の添加および／またはＩＬ−１０の遮断によって、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を生じさせる方法に関する。さらにより詳細には、本発明は、全血または他の適切な生体試料を使用して抗原に対する細胞媒介性応答を生じさせる方法を提供する。本方法は、ヒト、家畜および獣医学、ならびに野生生物に適用するための、治療および診断プロトコルにおいて有用である。
【０００２】
細胞媒介性免疫応答の測定は、多くの感染性疾患を免疫診断するため、免疫応答性（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）のマーカーとして、ならびに非自己抗原（すなわち感染およびワクチン）に対するＴ細胞応答を検出するために重要である。
【０００３】
本発明は、免疫応答を誘発することができる免疫系の細胞を含む哺乳動物由来の試料を、少なくとも１つの抗原の存在下で、高温状態でインキュベーションすることによって、哺乳動物において試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を生じさせるおよび／またはそれを評価する方法を提供する。この方法は、ＩＬ−７および／またはＩＬ−１０と結合する抗体などの少なくとも１つの免疫変調剤を加えることを含む、補足ステップを含み得る。その後、ＩＰ−１０および／またはＩＦＮ−γなどの少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子の産生を検出する。したがって、免疫シグナル伝達分子の存在またはレベルは、対象の細胞媒介性応答性のレベルの指標である。
【背景技術】
【０００４】
高温インキュベーション
一般に、免疫学的方法における発熱様の温度（ｆｅｖｅｒ‐ｌｉｋｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ）の有用性は、かなりの議論の余地がある。
【０００５】
免疫診断方法における示差的インキュベーション温度の効果に関するいくつかの研究が発表されており、これらは、畜牛からの全血をマイトジェンと共にインキュベーションした際に、３７．５℃でのＩＦＮ−γ産生がより低い温度（約２１℃）と比較して減少することを報告している（Ｗａｔｅｒｓら、２００７、Ｒｏｂｂｅ−Ａｕｓｔｅｒｍａｎら、２００６）。それにもかかわらず、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ放出アッセイ（ＩＧＲＡ）の製造者は３７℃のインキュベーション温度を推奨しており（ｗｗｗ．ｃｅｌｌｅｓｔｉｓ．ｃｏｍ）、これはかなり良好なＩＦＮ−γ応答を与えると見られるが、本発明者らが知る限り、このインキュベーション温度の選択を支持するデータは発表されていない。
【０００６】
温度を上昇させることがｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫系の細胞にどのように影響を与えるかに関する研究は、現在確証的でない。免疫系の細胞を高温でインキュベーションした研究からの結果は、摂氏４０〜４１℃までの温度が免疫応答性を増大させるかどうかについて相反している。
【０００７】
一部の研究は、高温インキュベーションでの免疫機能の改善を示している。Ｂａｓｕらによる研究は、ＯＶＡ特異的ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドで負荷を与えた精製および「熱ショックを与えた」（摂氏４１℃で６時間のインキュベーション）マウス樹状細胞（ＤＣ）を使用し、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに特異的なＴ細胞系との相互作用に関する「熱ショックを与えた」ＤＣと正常なＤＣとの効果を比較する。この研究では、「熱ショックを与えた」ＤＣは、ＩＦＮ−γの産生を正常なＤＣと比較して３倍まで増大させることができたことが実証された（Ｂａｓｕら、２００３）。
【０００８】
別の研究では、ヒトＰＢＭＣを摂氏４０℃または４１℃に６時間曝し、次いで３７℃でマイトジェンまたは破傷風（ｔｅｔａｎｏｕｓ）トキソイドを用いた刺激に曝した場合に、ＩＦＮ−γを産生するＴ細胞の数が増加され、増殖性応答が増加されたことが実証された。モノクローナル抗体をＭＨＣクラスＩＩに加えることで効果が完全に抑止された（Ｈｕａｎｇら、１９９６）。同様の効果がＰＰＤを用いた刺激で実証されている（Ｋａｐｐｅｌら、１９９１）。高温が、抗原提示細胞に関する、ＭＨＣクラスＩＩおよびＢ７ファミリーメンバーＣＤ８０／８６などの共刺激分子の上方制御を介した効果を媒介すると考えられる。
【０００９】
しかし、これらの研究はどれも、より高い温度、すなわち高温状態でのインキュベーションが、疾患に特異的な抗原認識に対する効果を有することを示していない。
【００１０】
最も近い従来技術は、疾患に特異的な抗原認識を研究する、Ｓｃｈｉｌｌｅｒら、２００９による研究である。この研究では、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染した畜牛からの全血を摂氏２５℃、２９℃、３３℃および３９℃の様々な温度でインキュベーションし、結核菌特異的抗原ＥＳＡＴ６およびＣＦＰ１０に対するＩＦＮ−γの応答を研究した。しかし、著者らは摂氏３３℃〜３９℃でＩＦＮ−γの応答性に差異を観察していない。（試料は３７℃では測定しなかった。）（Ｓｃｈｉｌｌｅｒら、２００９）。このことは、高温状態でのインキュベーションが試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答をどのように増大させるかを実証する、本発明の教示と相反する。
【００１１】
ＩＬ−７および抗ＩＬ−１０
試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答をさらに改善させることが望ましい。これは、インキュベーションステップ中に免疫変調剤を加えることによって行うことができる。本発明者らは、本発明において、ＩＬ−７および／またはＩＬ−１０と結合する中和抗体を加えることによってこの改善を例示した。
【００１２】
Ｆｅｓｋｅらは、ＩＬ−７をＴＢ患者からのＥＳＡＴ６／ＣＦＰ１０で刺激した血液に加えることの効果を研究しており、ＩＦＮ−γの産生の増加を実証した（Ｆｅｓｋｅら、２００８）。しかし、高温とＩＬ−７の組合せによってバイオマーカーの応答を改善させることが可能であることは、まったく試験または示唆されていない。
【００１３】
Ｄｅｎｉｓらは、ＥＳＡＴ６／ＣＦＰ１０の存在下でウシ血液を培養中に、ＩＬ−１０に対するモノクローナル抗体を加えることで、ＩＦＮ−γの応答およびこのＴＢ試験の感度が改善されることを実証した［Ｄｅｎｉｓら、２００７］。高温とＩＬ−１０の遮断の組合せによってバイオマーカーの応答を改善させることは新規であり、提案または試験されていない。
【００１４】
結核
結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ＭＴＢ）に特異的な免疫優性抗原の発見は、結核（ＴＢ）を診断するための顕著な新しい手段を導いている。初期の研究により、定義されたＭＴＢ抗原に応答したＴ細胞によるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生をアッセイした試験が、ツベルクリン皮膚試験（ＴＳＴ）を置き換える潜在性を有することが示された。ほぼ同時期、大きな進歩として、特異性を顕著に改善させた免疫原性の高い抗原である、初期分泌性抗原性標的６（ＥＳＡＴ−６）、培養濾液タンパク質１０（ＣＦＰ−１０）およびＴＢ７．７の発見があった。これらの抗原は、病原体の相違領域（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）１（ＲＤ１）およびＲＤ１１内にコードされており、したがって、すべてのカルメットゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン株ならびにほとんどの非結核性マイコバクテリア中に不在である（例外にはカンサシ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）、およびマイコバクテリウム・ツルガイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｚｕｌｇａｉが含まれる）。ＲＤ１およびＲＤ１１の重複ペプチドにコードされている抗原ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、ＴＢ７．７に対するＩＦＮ−γの応答が、２つの認可かつ市販されている試験におけるＭＴＢ感染症の検出の基礎を形成する。
【００１５】
ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢ  Ｇｏｌｄ（Ｃｅｌｌｅｓｔｉｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、オーストラリア、ビクトリア州Ｃａｒｎｅｇｉｅ）および全血の酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、潜伏性ＴＢ感染症および疾患をどちらも検出するための、欧州ＣＥ認証（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ＣＥ  ｍａｒｋ）および米国食品薬品局（ＦＤＡ）の承認を有する。
【００１６】
末梢血単核球を使用する酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）であるＴ−ＳＰＯＴ．ＴＢ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ、英国Ｏｘｆｏｒｄ）は欧州ＣＥ認証を有しており、２００５年にカナダ内での使用が承認された。Ｔ−ＳＰＯＴ．ＴＢはＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０のみを使用する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
残念ながら、これらの試験の感度は、免疫不全の個体（ＨＩＶに感染した個体または免疫抑制治療を受けている患者など）では損なわれる。したがって、そうしなければ抗原に対して不十分な免疫応答を有するこれらの患者診断を可能にする、より感度の高い試験を開発することが望ましい。このことは、偽陰性試験結果および不確定試験結果の数を低下させ、したがって免疫診断試験の感度および対費用効果を改善させるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を増大させる方法を提供する。この方法は、より良好な、疾患に特異的な抗原認識を可能にする。
【００１９】
本発明の一態様は、生体試料と少なくとも１つの抗原とのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーション中における、上昇した温度の使用に関する。上昇した温度でのインキュベーションは、３７℃でのインキュベーションと比較して、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答の増加をもたらす。
【００２０】
したがって、本発明は、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を含む生体試料を、少なくとも１つの試験抗原と共に、３８〜４２℃の温度などの高温状態でインキュベーションするステップを含む方法を提供する。高温状態でのインキュベーションは、３７℃の通常の熱条件下でのインキュベーションによって得られる参照レベルと比較した場合に、試験抗原に特異的な免疫応答を増大させる。
【００２１】
また、本発明は、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を改善させるために、ＩＬ−７および／または抗ＩＬ−１０などの少なくとも１つの免疫変調剤を加えるステップをさらに含む方法にも関する。
【００２２】
本発明の一態様は、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を開始させる対象の性能または能力を決定するための、最適化された方法に関する。この方法は、抗原性刺激に応答した免疫系の細胞からの１つまたは複数の免疫シグナル伝達分子の産生を測定することに基づく。免疫シグナル伝達分子は、免疫シグナル伝達分子に特異的な抗体などのリガンドを使用して、または免疫シグナル伝達分子をコードしている遺伝子の発現レベルを決定することによって検出し得る。
【００２３】
本発明の別の態様は、免疫原性、すなわち細胞媒介性免疫応答を生じさせる抗原の潜在性または能力を決定するための、最適化された方法に関する。細胞性免疫応答を監視するためのこの方法は、ワクチンの合理的な開発のための１つの必須条件である。
【００２４】
したがって、本発明は、対象における試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答の応答性を決定する手段を提供し、ひいては、感染性疾患、病的状態、免疫応答性のレベルの推定、および内在性または外因性の抗原に対するＴ細胞応答性のレベルを診断する手段を提供する。
【００２５】
本発明によって提供される方法は、偽陰性および不確定試験結果の数を低下させ、したがって、通常のインキュベーション温度、すなわち３７℃で行われた試験と比較して感度を増加させる。したがって、この方法は試験および診断を改善させる。
【００２６】
本発明によれば、通常のインキュベーション条件下で低いまたは弱い免疫応答を有する患者／ドナーは、インキュベーション温度を上昇することによって、特にＩＬ−７および／または抗ＩＬ−１０などの少なくとも１つの免疫変調剤の存在下で、強く応答するようにさせることができる。これにより、本発明は、そうでなければ抗原に対して不十分な免疫応答を有する患者の免疫学的診断を可能にし、また、偽陰性試験結果の数も低下させる。したがって、本発明は、重要なことには免疫不全の個体においても、免疫診断試験の感度および対費用効果を改善させる。さらに、これはワクチン開発ならびにたとえば感染性因子および癌の監視において役割を果たし得る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＩＰ−１０およびＩＦＮ−γの応答性に対するインキュベーション温度の影響を示す図である。全血を採血し、１８時間、摂氏２５、３５、３７、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４１および４３℃で、抗原ＴＢ１０．４またはＰＨＡからのペプチドのカクテルと共にインキュベーションした。一部の実験では、より少ない温度を試験した。示したデータは、２人の代表的なドナーを用いた１つの実験からのものである。濃度はｐｇ／ｍｌである。
【図２】最低から最高の応答者の順序にした、３４人の健康なドナーからの血漿におけるＩＰ−１０の応答を示す図である。全血を採血し、１８時間、摂氏３７℃で、抗原ＴＢ１０．４からのペプチドのカクテルと共にインキュベーションした。>５００ｐｇ／ｍｌのＩＰ−１０で応答したドナーを応答者とみなした。
【図３Ａ−Ｂ】摂氏３７℃対３９℃での抗原およびマイトジェンの刺激に対するＩＰ−１０の応答、ならびにＩＬ−７の添加およびＩＬ−１０の遮断の影響を示す図である。全血を採血し、１８時間、摂氏３７℃または３９℃で、ＩＬ−７、およびＩＬ−１０に対する遮断抗体の存在下または非存在下でインキュベーションした。最初の４列は摂氏３７℃での実験であり、最後の４列は摂氏３９℃での実験である。  図３Ａは、抗原ＴＢ１０．４からの重複ペプチドを用いて刺激した１１人の「ＴＢ１０．４非応答者」からのデータを表す図である。値は無刺激の試料におけるレベルが減算してある。  図３Ｂは、抗原ＴＢ１０．４からの重複ペプチドを用いて刺激した２３人の「ＴＢ１０．４応答者」からのデータを表す図である。値は無刺激の試料におけるレベルが減算してある。
【図３Ｃ−Ｄ】摂氏３７℃対３９℃での抗原およびマイトジェンの刺激に対するＩＰ−１０の応答、ならびにＩＬ−７の添加およびＩＬ−１０の遮断の影響を示す図である。全血を採血し、１８時間、摂氏３７℃または３９℃で、ＩＬ−７、およびＩＬ−１０に対する遮断抗体の存在下または非存在下でインキュベーションした。最初の４列は摂氏３７℃での実験であり、最後の４列は摂氏３９℃での実験である。  図３Ｃは、応答者および非応答者からのプールしたバックグラウンドレベルを表す図である。  図３Ｄは、応答者および非応答者からの、プールしたマイトジェンで刺激したレベルを表す図である。値は無刺激の試料におけるレベルが減算してある。
【図４Ａ−Ｂ】摂氏３７℃対３９℃での抗原およびマイトジェンの刺激に対するＩＦＮ−γの応答、ならびにＩＬ−７の添加およびＩＬ−１０の遮断の影響を示す図である。全血を採血し、１８時間、摂氏３７℃または３９℃で、ＩＬ−７、およびＩＬ−１０に対する遮断抗体の存在下または非存在下でインキュベーションした。最初の４列は摂氏３７℃での実験であり、最後の４列は摂氏３９℃での実験である。  図４Ａは、抗原ＴＢ１０．４からの重複ペプチドを用いて刺激した１１人の「ＴＢ１０．４非応答者」からのデータを表す図である。値は無刺激の試料におけるレベルが減算してある。  図４Ｂは、抗原ＴＢ１０．４からの重複ペプチドを用いて刺激した２３人の「ＴＢ１０．４応答者」からのデータを表す図である。値は無刺激の試料におけるレベルが減算してある。
【図４Ｃ−Ｄ】摂氏３７℃対３９℃での抗原およびマイトジェンの刺激に対するＩＦＮ−γの応答、ならびにＩＬ−７の添加およびＩＬ−１０の遮断の影響を示す図である。全血を採血し、１８時間、摂氏３７℃または３９℃で、ＩＬ−７、およびＩＬ−１０に対する遮断抗体の存在下または非存在下でインキュベーションした。最初の４列は摂氏３７℃での実験であり、最後の４列は摂氏３９℃での実験である。  図４Ｃは、応答者および非応答者からのプールしたバックグラウンドレベルを表す図である。（無刺激のレベル）  図４Ｄは、応答者および非応答者からの、プールしたマイトジェンで刺激したレベルを表す図である。値は無刺激の試料におけるレベルが減算してある。
【図５】培養によりＴＢであると確認された９人の患者からのＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ  ＴＢ  Ｇｏｌｄ  Ｉｎ  ｔｕｂｅ試験管からの、ＩＰ−１０の応答を示す図である。全血をＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ  ＴＢ  Ｇｏｌｄ  Ｉｎ  ｔｕｂｅシステム中に回収し、１８時間、摂氏３７または３９℃で、ＩＬ−７の添加およびＩＬ−１０の遮断を用いてまたは用いずにインキュベーションした。それぞれのカラムの中央値レベルを示す。
【図６】培養によりＴＢであると確認された９人の患者からのＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ  ＴＢ  Ｇｏｌｄ  Ｉｎ  ｔｕｂｅ試験管からの、ＩＦＮ−γの応答を示す図である。全血をＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ  ＴＢ  Ｇｏｌｄ  Ｉｎ  ｔｕｂｅシステム中に回収し、１８時間、摂氏３７または３９℃で、ＩＬ−７の添加およびＩＬ−１０の遮断を用いてまたは用いずにインキュベーションした。それぞれの列の中央値レベルを示す。
【図７】摂氏３７℃対３９℃での、無刺激の試料（ｎｉｌ）中、およびＴＢ１０．４抗原やマイトジェンの刺激に応答したＩＦＮ−γの応答、ならびにＩＬ−７の添加およびＩＬ−１０の遮断の影響を示す図である（実施例２〜５）。全血を採血し、２４時間、摂氏３７℃または３９℃で、ＩＬ−７、およびＩＬ−１０に対する遮断抗体の存在下または非存在下でインキュベーションした。最初の１２列は摂氏３７℃での実験であり、最後の１２列は摂氏３９℃での実験である。
【図８】摂氏３７℃対３９℃での、無刺激の試料（ｎｉｌ）中、およびＴＢ特異的抗原やマイトジェンの刺激に応答したＩＦＮ−γの応答、ならびにＩＬ−７の添加およびＩＬ−１０の遮断の影響を示す図である。全血を採血し、２４時間、摂氏３７℃または３９℃で、ＩＬ−７、およびＩＬ−１０に対する遮断抗体の存在下または非存在下でインキュベーションした。最初の６列は摂氏３７℃での実験であり、最後の６列は摂氏３９℃での実験である。
【図９】摂氏３７℃対３９℃での、無刺激の試料（ｎｉｌ）中、およびＴＢ特異的抗原やマイトジェンの刺激に応答したＩＰ−１０の応答、ならびにＩＬ−７の添加およびＩＬ−１０の遮断の影響を示す図である。全血を採血し、２４時間、摂氏３７℃または３９℃で、ＩＬ−７、およびＩＬ−１０に対する遮断抗体の存在下または非存在下でインキュベーションした。最初の６列は摂氏３７℃での実験であり、最後の６列は摂氏３９℃での実験である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を増大させるための新規方法に関する。
【００２９】
サイトカインおよびケモカインの応答が、伝統的な摂氏３７℃でのインキュベーションと比較して高温インキュベーションで劇的に増加したことが、初めて示された。
【００３０】
また、本発明は、高温インキュベーションでの増大した免疫認識が、疾患またはワクチンに特異的な抗原に対する免疫応答に適用される現象であることも、初めて示す。また、本発明は、高温インキュベーションでの増大した免疫認識を、どのように診断試験またはワクチン応答の評価に適用できるかも示す。
【００３１】
さらに、生存サイトカインＩＬ−７を、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を遮断する抗体と合わせて加える場合、高温（および通常）インキュベーション温度のどちらでも免疫応答が顕著に増大されることも、初めて実証されている。
【００３２】
本発明の一態様は、生体試料と少なくとも１つの抗原とのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーション中における、上昇した温度の使用に関する。上昇した温度でのインキュベーションは、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答の増加をもたらす。
【００３３】
また、本発明は、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を改善させるための、ＩＬ−７および／または抗ＩＬ−１０などの免疫変調剤の使用にも関する。
【００３４】
したがって、本発明は、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を増大させる手段を提供し、ひいては、試験抗原に特異的な細胞媒介性応答の存在および／またはレベルを決定することが所望される方法および試験を改善させる手段を提供する。
【００３５】
本発明の別の態様は、試験抗原の細胞媒介性免疫応答を開始させる対象の潜在性または能力を測定する方法である。
【００３６】
試験抗原に特異的な免疫応答は、抗原刺激に応答した、免疫系の細胞による免疫シグナル伝達分子の産生を測定することによって決定することができる。免疫シグナル伝達分子は、免疫シグナル伝達分子に特異的な抗体などのリガンドを使用して、および／または免疫シグナル伝達分子をコードしている遺伝子の発現レベルを測定することによって検出し得る。
【００３７】
したがって、本発明は、感染性疾患を診断する、および／またはワクチン中で使用される抗原に対する免疫反応性の存在を診断してワクチンの有効性の監視を可能にする手段を提供する。
【００３８】
したがって、本発明は、免疫アッセイおよび他の免疫学的ツールを改善することができる単純な方法を提供する。
【００３９】
本発明の一態様は、試験抗原に特異的な細胞媒介性応答を増大させる方法に関する。この方法は、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を含む試料を、少なくとも１つの抗原と共に、高温状態でインキュベーションすることに基づく。
【００４０】
本発明の別の態様は、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を含む試料を、少なくとも１つの抗原と共に、高温状態で、ＩＬ−７の存在下でインキュベーションすることに基づく、試験抗原に特異的な細胞媒介性応答を増大させる方法に関する。
【００４１】
本発明の第３の態様は、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を含む試料を、少なくとも１つの抗原と共に、高温状態で、抗ＩＬ−１０の存在下でインキュベーションすることに基づく、試験抗原に特異的な細胞媒介性応答を増大させる方法に関する。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を含む試料を、少なくとも１つの抗原と共に、高温状態で、ＩＬ−７および抗ＩＬ−１０の存在下でインキュベーションすることに基づく、試験抗原に特異的な細胞媒介性応答を増大させる方法に関する。
【００４３】
試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答は、抗原性刺激に応答したＩＰ−１０および／またはＩＦＮ−γなどの免疫シグナル伝達分子のレベルを測定することによって決定することができる。ＩＰ−１０およびＩＦＮ−γのレベルは、ＩＰ−１０およびＩＦＮ−γに特異的な抗体などのリガンドを使用して、またはＩＰ−１０およびＩＦＮ−γをコードしている遺伝子の発現レベルを測定することによって検出し得る。本発明者らは、結核菌に特異的およびＢＣＧワクチンに特異的な刺激ならびに続くＩＰ−１０およびＩＦＮ−γのレベルの決定に基づく方法を使用して、試験抗原に特異的な細胞媒介性応答の増大の原理を実証した。この方法で結核菌に感染した人を同定することができる。また、この方法でワクチン接種が成功した人を同定することもできる。
【００４４】
本発明者らは、高温状態でのインキュベーションが、抗原およびマイトジェンの刺激に対するＴ細胞および単球からの免疫シグナル伝達分子の応答（ＩＰ−１０およびＩＦＮ−γ）を増加させることができることを示している（実施例２〜４）。この効果は、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０に対する中和抗体（抗ＩＬ−１０）を用いてまたは用いずに、Ｔ細胞生存サイトカインＩＬ−７を添加することよって、さらに増大させることができる。本発明者らは、抗ＩＬ−１０およびＩＬ−７の存在下における高温インキュベーションが、バイオマーカーの産生を相乗的に増加させることができることを示している（実施例３〜４）。したがって、記載した方法は、摂氏３７℃でのインキュベーションを用いた伝統的な方法と比較して、より高いレベル（またはより高い規模）の免疫シグナル伝達分子ＩＰ−１０およびＩＦＮ−γをもたらす。
【００４５】
本発明者らは、高温状態でのインキュベーションが、理論的には応答するべきである２人のＢＣＧワクチン接種した非応答者を、ＩＰ−１０およびＩＦＮ−γの両方による応答者へと変換したことを示している。また、これは、２人のＴＢ患者からの不確定結果をそれぞれ陽性および陰性の結果へと変換した。したがって、この方法は偽陰性および不確定試験結果の数を低下させる。高温状態でのインキュベーションは、バックグラウンドのＩＰ−１０産生をわずかに増加させたが、ＩＦＮ−γのバックグラウンド産生を低下させた（実施例３〜４および６）。したがって、本発明の方法は、摂氏３７℃のインキュベーションを使用した古典的な方法に基づく試験と同等に特異的かつより感度が高く、また、低応答者、たとえば免疫不全の個体の試験および診断を改善させる。
【００４６】
ＩＦＮ−γは主にＴリンパ球によって産生され、ＩＰ−１０は主に単球などの抗原提示細胞によって産生されるが、本発明者らは、バイオマーカーレベルでリンパ球または単球の計数に対していかなる影響も示すことができなかった（データ示さず）。
【００４７】
本発明に記載されている方法は、一連の問題を解決する。細胞媒介性免疫を監視する現在利用可能な方法は、効果パラメータＩＦＮ−γを測定する。ＩＦＮ−γは、最も高感度な検出方法の限界にさえ近い、非常に低いレベルで発現される（結核試験の場合、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ試験は０．３５国際単位／ｍｌ（１７．５ｐｇ／ｍｌ）、Ｔ−ＳＰＯＴ．ＴＢ試験は５スポット形成単位／フィールドの陽性試験カットオフレベルを有する）。感度を増強させるためにカットオフを減少させると、最終的には試験の特異性が損なわれる。低い範囲のＩＦＮ−γレベルを有する人の繰返しＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ試験に基づく出版物は、この領域のＩＦＮ−γレベルがカットオフ付近で揺れる傾向にあることを見い出している。すなわち、細胞媒介性免疫を監視する伝統的な方法は、アッセイの制限、すなわち免疫シグナル伝達分子またはバイオマーカーの低濃度での再現性の不良によって、損なわれている。このことは、偽陽性および偽陰性の結果の潜在的な危険性を強調している。
【００４８】
記載した方法は、応答、たとえばＩＦＮ−γおよびＩＰ−１０のレベルを増加させ、これにより、細胞媒介性の免疫アッセイ、たとえば結核試験の感度が増加され、これは、摂氏３７℃で行われる伝統的な試験と比較して偽陽性および偽陰性の結果の危険性を低下させる。
【００４９】
さらに、通常のインキュベーション条件下で低い免疫応答を有する患者／ドナーは、インキュベーション温度を上昇することによって、特にＩＬ−７および抗ＩＬ−１０の存在下で、応答するようにさせることができる。これにより、本発明は、そうでなければ抗原に対して不十分な免疫応答を有する患者の診断を可能にするため、偽陰性試験結果または不確定結果を有する患者の数を低下させる。
【００５０】
したがって、本発明は、重要なことには免疫不全の個体においても、免疫診断試験の感度および対費用効果を改善させる。さらに、これは感染性因子および癌のどちらのワクチン開発においても役割を果たし得る。
【００５１】
方法
本発明は、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を増大させる方法を提供する。
【００５２】
本発明の一態様は、生体試料と少なくとも１つの抗原とのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーション中における、上昇した温度の使用に関する。上昇した温度でのインキュベーションは、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答の増加をもたらす。
【００５３】
したがって、本発明は、
ａ）哺乳動物由来の、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を含む試料を提供するステップと、
ｂ）前記試料を、高温状態で、少なくとも１つの試験抗原と共にインキュベーションするステップと、
ｃ）前記試料における試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を決定するステップと
を含み、前記高温状態でのインキュベーションが、３７℃の通常の熱条件下でのインキュベーションによって得られる参照レベルと比較した場合に、試験抗原に特異的な免疫応答の増大を生じさせる、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を生じさせる方法に関する。
【００５４】
試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答とは、診断することを望む疾患または状態に特異的な抗原に対する応答として理解されたい。言い換えれば、細胞媒介性免疫応答の特異性は試験抗原の特異性から派生する。
【００５５】
ワクチンの有効性の監視の場合、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答は、ワクチン中に含まれる抗原に対して生じさせる。
【００５６】
試験抗原に特異的な細胞の免疫応答の例は、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染した個体におけるＥＳＡＴ−６に対する応答である。
【００５７】
好ましい実施形態では、試料は、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を含む。特に好ましい実施形態では、試料は免疫適格細胞を含む。免疫適格細胞は、抗原に曝露された後に、細胞媒介性免疫応答などの免疫応答を生じることができる。
【００５８】
免疫シグナル伝達分子
試験抗原に特異的な免疫応答は、特異的な抗原刺激に応答した免疫系の細胞による免疫シグナル伝達分子の産生を測定することによって決定することができる。
【００５９】
したがって、本発明の一態様は、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を、少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子のレベルを測定することによって決定する方法である。
【００６０】
したがって、本発明によれば、１、２、３、４、５、６、７または８つの免疫シグナル伝達分子のレベルを決定する。好ましくは、１つまたは２つまたは３つまたは４つの免疫シグナル伝達分子のレベルを決定する。最も好ましくは、１つまたは２つの免疫シグナル伝達分子のレベルを決定する。
【００６１】
したがって、好ましい実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つの免疫シグナル伝達分子のレベルを測定する。最も好ましいのは、少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子のレベルを測定することである。
【００６２】
最も好ましいのは、１〜２つの免疫シグナル伝達分子のレベルの測定、または１〜３つの免疫シグナル伝達分子のレベルもしくは１〜４つの免疫シグナル伝達分子のレベルである。最も好ましい実施形態では、１つまたは２つの免疫シグナル伝達分子のレベルを測定する。
【００６３】
本発明の一実施形態では、複数の免疫シグナル伝達分子のレベルを測定することは、この方法を診断試験に適用した際に、偽陽性の数を低下させ、判別力を増加させ得る（たとえば増加した感度および／または特異性）。このことは、たとえば、この方法を、対象における試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を決定することができる試験として使用する場合に有用であり、ひいては、たとえば感染性疾患、癌を診断する、および／またはワクチンの有効性を監視するための手段を提供する。
【００６４】
したがって、一実施形態では、この方法は、前記試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答が、少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子のレベルを測定することによって決定されるステップをさらに含む。
【００６５】
したがって、一実施形態では、この方法は、前記試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答が、サイトカインまたはケモカインの応答などの少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定することによって決定されるステップをさらに含む。
【００６６】
免疫シグナル伝達分子とは、特定の免疫系の細胞によって分泌される、および／または免疫系の細胞に対して効果を有する物質の大きなファミリーとして理解されたい。したがって、免疫シグナル伝達分子は免疫系の細胞などの細胞間の情報の伝達に関与している。
【００６７】
好ましい本実施形態では、免疫シグナル伝達分子または少なくとも１つのシグナル伝達分子は、サイトカイン、ケモカイン、可溶性受容体および可溶性受容体拮抗剤の群から選択される。
【００６８】
本発明の特に好ましい実施形態では、免疫シグナル伝達分子はサイトカインまたはケモカインである。
【００６９】
本発明の最も好ましい実施形態では、免疫シグナル伝達分子はサイトカインである。
【００７０】
サイトカインとは、細胞間でシグナルを局所的に運ぶ免疫系の特定の細胞によって分泌され、したがって他の細胞に対して効果を有する、いくつかの物質のうちの任意のものとして理解されたい。サイトカインはシグナル伝達分子として分類することができる。これらは、タンパク質、ペプチド、または糖タンパク質である。用語サイトカインには、身体全体にわたって多様な発生学的起源の細胞によって広く産生される、ポリペプチド調節因子の大きくかつ多様なファミリーが包含される。基本的に、用語「サイトカイン」とは、それだけには限定されないが、インターロイキン、インターフェロンなどの免疫変調剤をいう。免疫シグナル伝達分子は、サイトカインＩＮＦ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１ｂおよびＩＬ−１２からなる群から選択される。
【００７１】
本発明の別の最も好ましい実施形態では、免疫シグナル伝達分子はインターフェロンである。
【００７２】
本発明の別の最も好ましい実施形態では、免疫シグナル伝達分子はＩＦＮ−γである。
【００７３】
ＩＦＮ−γ
インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）とは、ウイルスおよび細菌の感染症に対する免疫応答に重要なサイトカインである。ヒトでは、ＩＦＮ−γタンパク質はＩＦＮＧ遺伝子によってコードされている。ＩＦＮ−γは、免疫賦活性および免疫調節性の効果の両方を有する。ＩＦＮ−γは、主にナチュラルキラーおよびナチュラルキラーＴ細胞によって自然免疫応答の一部として、ならびに、抗原に特異的な免疫が発生した後はＣＤ４およびＣＤ８細胞毒性Ｔリンパ球エフェクターＴ細胞によって、産生される。
【００７４】
別の最も好ましい実施形態では、免疫シグナル伝達分子はケモカインである。ケモカインとは、小さなサイトカイン、または細胞によって分泌されるタンパク質のファミリーである。その名前は、付近の応答性細胞において定方向の走化性を誘導するその能力に由来しており、これらは走化性サイトカインである。これらのタンパク質は、その標的細胞の表面上に選択的に見つかる、ケモカイン受容体と呼ばれるＧタンパク質結合膜貫通受容体と相互作用することによって、その生物学的効果を発揮する。ケモカインは、免疫系の発生、恒常性、および機能において基礎的な役割を果たし、中枢神経系の細胞および血管形成若しくは血管形成阻害（ａｎｇｉｏｓｔａｓｉｓ）に関与する内皮細胞に対して効果を有する。ケモカインは、４個の保存的なシステイン残基のうちの最初の２個の配置に基づいて、２つの主要なサブファミリー、すなわちＣＸＣおよびＣＣに分類される。２個のシステインは、ＣＸＣケモカイン中では単一のアミノ酸によって分離されており、ＣＣケモカイン中では隣接している。ＣＸＣケモカインは、ＣＸＣモチーフに隣接し、かつＮ末端側にあるｇｌｕ−ｌｅｕ−ａｒｇ配列の存在または非存在に基づいて、ＥＬＲおよび非ＥＬＲ型へとさらに亜分類される。ＥＬＲ型は好中球で走化性である一方、非ＥＬＲ型はリンパ球で走化性である。
【００７５】
好ましい実施形態では、免疫シグナル伝達分子はＣＣ−ケモカインからなる群から選択される。
【００７６】
別の好ましい実施形態では、免疫シグナル伝達分子は、ＣＸＣ−ケモカインからなる群から選択される。
【００７７】
さらに別の好ましい実施形態では、免疫シグナル伝達分子は、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３からなる群から選択される。
【００７８】
本発明に関連する他の免疫シグナル伝達分子は、ＩＬ−１受容体の拮抗剤であるＩＬ−１ＲＡおよび可溶性受容体であるｓＩＬ−２Ｒである。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子は、ＩＰ−１０、ＩＮＦ−γ、ＭＩＧ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１ａ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１ＲＡ、ｓＩＬ−２Ｒ、ＣＤ４０−リガンドおよびＩＬ−１２からなる群から選択される。本発明の別の好ましい実施形態では、少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子は、ＩＰ−１０、ＩＮＦ−γおよびＩＬ−２からなる群から選択される。
【００８０】
本発明の別の好ましい実施形態では、免疫シグナル伝達分子はＩＦＮ−γである。
【００８１】
本発明の最も好ましい実施形態では、免疫シグナル伝達分子はＩＰ−１０である。
【００８２】
また、免疫シグナル伝達分子のレベルの概念は、それだけには限定されないが、少なくとも２つのサイトカインの応答の乗算、除算および／または加算などの、濃度測定値の数学的な操作もカバーする。
【００８３】
ＩＰ−１０
ＩＦＮ−γ−誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）またはＣＸＣＬ１０は、ケモカインである。ＩＰ−１０の遺伝子は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって４ｑ２１にマッピングされている。ＩＰ−１０の発現は、インターフェロン（ＩＦＮ、すなわちインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ））および炎症性刺激によって上方制御されており、これは多くのＴｈ１型の炎症性疾患において様々な組織および細胞種中で発現されている。
【００８４】
ヒト遺伝子配列は、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ中で受託番号ＢＣ０１０９５４号（ｇｉ１５０１２０９９）の下で見つけることができる。
【００８５】
ＩＰ−１０は、骨髄コロニー形成を阻害し、ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を有しており、ヒト単球およびＴ細胞の化学誘引物質であり、内皮細胞へのＴ細胞接着を促進する。ＩＰ−１０は、ｉｎ  ｖｉｖｏ血管形成の強力な阻害剤である。ＩＰ−１０は、炎症および腫瘍形成中の血管形成の調節に関与し得る。ＩＰ−１０はＲＡＳ標的遺伝子でもあり、大多数の結腸直腸癌において過剰発現されている。ＩＰ−１０が、ＩＬ８などの他のケモカインの相互作用表面に類似のＩＰ−１０のＮ−ループおよび４０ｓ−ループ領域によって形成される疎水性の裂け目を介して、ＣＸＣＲ３のＮ末端と相互作用することが、核磁気共鳴分光分析を使用して示されている。ＩＰ−１０のＮ末端および３０ｓループによって形成される疎水性の裂け目からなる追加の相互作用領域が同定されている。このことは、３０ｓループに関与する機構およびベータ鎖２の立体配置がＩＰ−１０とＣＣＲ３との相互作用および拮抗機能を説明し得ることを示唆している。
【００８６】
結核の場合、高レベルのＩＰ−１０は、ＴＢ患者および免疫再構築症候群を経験しているＴＢ−ＨＩＶ同時感染患者のリンパ節および肺結核性肉芽腫中、胸水中、および血清または血漿中に見つかっている。
【００８７】
したがって、一実施形態では、この方法は、ＩＰ−１０およびＩＦＮ−γの両方のレベルを測定することをさらに含む。したがって、本発明の一態様は、
ａ）哺乳動物由来の、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を含む試料を提供するステップと、
ｂ）前記試料を、高温状態で、少なくとも１つの試験抗原と共にインキュベーションするステップと、
ｃ）前記試料中のＩＰ１０および／またはＩＦＮ−γのレベルを決定するステップと
を含み、前記高温状態でのインキュベーションが、３７℃の通常の熱条件下でのインキュベーションによって得られる参照レベルと比較した場合に、試験抗原に特異的な免疫応答の増大を生じさせる、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を生じさせる方法に関する。
【００８８】
さらに別の実施形態では、この方法は、ＩＰ−１０および／またはＩＦＮ−γならびに少なくとも１つの他のシグナル伝達分子のレベルを測定することをさらに含む。
【００８９】
シグナル伝達分子（複数可）のレベルの決定
免疫シグナル伝達分子は、免疫シグナル伝達分子に特異的な抗体などのリガンドを使用して、または免疫シグナル伝達分子をコードしている遺伝子の発現レベルを測定することによって検出し得る。
【００９０】
したがって、一実施形態では、この方法は、前記免疫シグナル伝達分子のレベルが、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルを測定することによって決定されるステップをさらに含む。
【００９１】
さらに別の実施形態では、免疫シグナル伝達分子の位置は、免疫蛍光および顕微鏡観察などの方法によってｉｎ  ｓｉｔｕで決定される。
【００９２】
したがって、本発明の一態様は、
ａ）哺乳動物由来の、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を提供するステップと、
ｂ）前記試料を、高温状態で、少なくとも１つの試験抗原と共にインキュベーションするステップと、
ｃ）前記試料における試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を決定するステップと
を含み、前記高温状態でのインキュベーションが、３７℃の通常の熱条件下でのインキュベーションによって得られる参照レベルと比較した場合に、試験抗原に特異的な免疫応答の増大を生じさせ、前記免疫シグナル伝達分子のレベルが、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルを測定することによって決定される、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を生じさせる方法に関する。
【００９３】
免疫シグナル伝達分子は、好ましくは、それだけには限定されないがＩＰ−１０および／またはＩＦＮ−γなどのサイトカインまたはケモカインである。免疫シグナル伝達分子の存在またはレベルは、分子自身のレベルで、または遺伝子が発現される程度によって決定し得る。ＩＰ−１０および／またはＩＦＮ−γなどの免疫シグナル伝達分子のレベルは、当技術分野で知られている免疫学的方法などの慣用の分析方法によって測定する。
【００９４】
免疫シグナル伝達分子の測定は、本明細書中の教示に従って、遺伝子、ＲＮＡ、またはタンパク質のレベルでの他の免疫シグナル伝達分子の測定と組み合わせることができる。
【００９５】
本発明中に記載の方法はどれもプラットフォーム非依存性であることを理解されたい。したがって、それだけには限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ、免疫ブロッティング、免疫クロマトグラフィー側方流動アッセイ、酵素増幅免疫アッセイ技法、ＲＡＳＴ試験、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光および様々な免疫学的ドライスティックアッセイ（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｒｙ  ｓｔｉｃｋ  ａｓｓａｙｓ）（たとえば側方流動またはクロマトグラフィースティック試験）などの任意の免疫学的方法を本発明に適用し得る。
【００９６】
上述のように、免疫シグナル伝達分子の検出は、タンパク質または核酸のレベルで行い得る。その結果、前記免疫シグナル伝達分子の存在またはレベルへの言及には、直接的および間接的なデータが含まれる。たとえば、高レベルのＩＰ−１０  ｍＲＮＡは、ＩＰ−１０のレベルの増加を示す間接的なデータである。
【００９７】
さらに、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡのレベルを測定するための任意の方法、たとえばＰＣＲ技法を、シグナル伝達分子のレベルの測定に使用し得ることを理解されたい。シグナル伝達分子のレベルをＤＮＡまたはＲＮＡのレベルで測定する方法は、それだけには限定されないが、定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）および逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などである。
【００９８】
したがって、本発明の一態様は、前記免疫シグナル伝達分子のレベルの前記決定を、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ、免疫ブロッティング、免疫クロマトグラフィー側方流動アッセイ、酵素増幅免疫アッセイ技法、ＲＡＳＴ試験、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光および様々な免疫学的ドライスティックアッセイからなる群から選択される方法を使用して行う方法に関する。
【００９９】
免疫シグナル伝達分子に対するリガンドは、これらの分子の検出および／または定量において特に有用である。
【０１００】
免疫シグナル伝達分子に対する抗体が特に有用である。本明細書中で企図される方法のための技法は当技術分野で知られており、たとえば、サンドイッチアッセイ、ｘＭＡＰ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ、Ｌｕｍｉｎｅｘ、ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳｐｏｔが含まれる。抗体への言及には、抗体の部分、哺乳動物化（たとえばヒト化）抗体、組換えまたは合成抗体ならびにハイブリッドおよび単鎖抗体が含まれる。
【０１０１】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体はどちらも、免疫シグナル伝達分子またはその抗原性断片を用いた免疫化によって入手可能であり、どちらの種類も免疫アッセイに利用可能である。どちらの種類の血清を入手する方法も当技術分野で周知である。
【０１０２】
ポリクローナル血清はより好ましくないが、適切な実験動物に有効量の免疫シグナル伝達分子またはその抗原性部分を注射し、動物から血清または血漿を採取し、既知の免疫吸着技法のうちの任意のものによって特異的な血清を単離することによって比較的容易に調製される。この方法によって産生される抗体は事実上任意の種類の免疫アッセイにおいて利用可能であるが、産物の潜在的な不均一性が理由で、一般により好まれない。
【０１０３】
大量に産生する能力および産物の均一性が理由で、免疫アッセイにおけるモノクローナル抗体の使用が特に好ましい。不死化細胞系と免疫原性調製物に対して感作させたリンパ球とを融合することによって誘導した、モノクローナル抗体を産生するためのハイブリドーマ細胞系の調製は、当業者に周知の技法によって行うことができる。
【０１０４】
また、検出は、シグナル伝達分子、たとえばＩＰ−１０に特異的な抗体を競合的蛍光偏光イムノアッセイ（ＣＦＩＰＡ）において直接測定すること、またはインターフェロン−ガンマのホモ二量体化を二量体化誘導蛍光偏光（ＤＩＦＰ）によって検出することのどちらかによっても、得ることができる。どちらの場合でも、検出および定量は６ｐｇ／ｍｌ以下まで下がる。
【０１０５】
ＩＰ−１０などの生物学的マーカーを決定するためのいくつかの技法が、当業者に知られている。免疫エフェクターの存在またはレベルは、ＥＬＩＳＡ、Ｌｕｍｉｎｅｘ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＲＴ−ＰＣＲなどのｍＲＮＡに基づく技法、または細胞内フローサイトメトリーによって決定し得る。
【０１０６】
Ｌｕｍｉｎｅｘ
インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）は、感染性疾患の免疫学、特にＴＢの免疫学においてＴｈ１応答を測定するための判断基準である。Ｌｕｍｉｎｅｘによって決定されるＩＦＮ−γは、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ試験のために開発された市販のＥＬＩＳＡなどのより感度の高い方法と比較して感度が低いため、不良のマーカーである。
【０１０７】
ｘＭＡＰまたはＬｕｍｉｎｅｘは、フローサイトメトリーを用いた溶液中の分析物の多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）を可能にする。特許（ｐｒｏｐｒｉｅｔｙ）技法を使用して、Ｌｕｍｉｎｅｘは、２つの蛍光色素の様々な比を組み合わせることによってｘＭＡＰミクロスフェアを内部で色分けする。それぞれのビーズ組は異なる捕捉抗体とコンジュゲートしている。Ｒ−フィコエリスリンで標識した検出抗体の使用により、相対蛍光強度を測定することによってミクロスフェア表面上で起こっている抗原−抗体反応の定量が可能となる。
【０１０８】
ＥＬＩＳＡ
酵素結合免疫吸着アッセイとは、ＥＬＩＳＡ、酵素免疫アッセイまたはＥＩＡとも呼ばれ、試料中の抗体または抗原の存在を検出するために、主に免疫学において使用される生化学的技法である。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡでは、未知の量の抗原を表面に固定し、その後、特異的抗体を、抗原と結合できるように表面上に洗い流す。この抗体を酵素と連結させ、最終ステップで、酵素が何らかの検出可能なシグナルへと変換することができる物質を加える。蛍光ＥＬＩＳＡの場合、適切な波長の光を試料に照らした際、任意の抗原／抗体複合体が蛍光発光して、試料中の抗原の量を蛍光の規模によって推測できるようになる。少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子のレベルを決定するためにＥＬＩＳＡを使用することは、実施例中にさらに記載されている。
【０１０９】
免疫クロマトグラフィー試験（ＩＣＴ）
ＩＣＴ（たとえば側方流動スティック（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｓｔｉｃｋ））の原理は、すべてＩＰ−１０などの免疫シグナル伝達分子に特異的な一次抗体（Ａｂ）および１〜４つの二次Ａｂを利用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫診断試験である。一次Ａｂはコロイド金に付着しており、二次Ａｂを固定した線で含有するレーンを有する試料パッド内に含浸されている。
【０１１０】
第１のステップでは、インキュベーションした試料を試料パッドの左側部分に加える。血清または血漿はレーン内で前方に流れ、存在するすべてのＩＰ−１０がコロイド金で標識した一次Ａｂと結合することが可能となる。二次Ａｂは、レーンの膜を横切る線に固定する。その後、試料および標識した一次Ａｂは、膜レーンに沿って、固定された二次Ａｂの線を横切って遊走する。試験の解釈：金で標識した一次Ａｂと複合体形成したすべてのＩＰ−１０は膜上の二次Ａｂによって捕捉され、線の色変化が起こる。その後、試験を、ａ．色強度に基づいて、またはｂ．応答試料（たとえば全血などの抗原刺激した試験材料の血漿）で行ったものとｎｉｌ試料で行ったものとの２つの試験を比較し、ｎｉｌ試験の色変化の強度をＡｇ試験の色変化の強度から減算し、これを参照と比較することによって、解釈する。
【０１１１】
また、試験の読み取りは、コンピュータインタフェースを使用した自動または半自動であってもよい。この設定は、自動インタフェースにより線の色変化の強度が決定されるように構築することができる。
【０１１２】
好ましい実施形態では、読み取りは、スキャナ、たとえば平面スキャナ、リーダまたは携帯用リーダを使用して行う。線の強度は、たとえば関連するソフトウェアを使用して参照と比較することによって、定量することができる。
【０１１３】
別の好ましい実施形態では、読み取りは、カメラ、たとえば携帯電話のデジタルカメラを使用して行う。線の強度は、たとえば裸眼または関連するソフトウェアを使用して参照と比較することによって、定量することができる。携帯電話のカメラを使用する場合、分析のために写真をたとえばマルチメディアメッセージサービス（すなわちＭＭＳ）で電話からセントラルサーバーに送信することができる。
【０１１４】
別の好ましい実施形態では、分析の読み取りは、携帯電話のデジタルカメラを使用して、搭載されたソフトウェアを使用して行う。
【０１１５】
免疫変調剤
本発明は、試料と少なくとも１つの試験抗原とのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーション温度を上昇することによって炎症誘発性の免疫応答を増加させる方法に関する。したがって、本発明は、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を、バイオマーカーの応答を増強させる高温状態でインキュベーションする試験を提供する。
【０１１６】
高温は細胞ストレスを潜在的にもたらすため、本発明のさらなる態様は、これらの機構に対抗するために免疫変調剤を加えることである。したがって、本発明の特に好ましい実施形態は、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を改善させるために、少なくとも１つの免疫変調剤を加えるステップさらに含む方法である。
【０１１７】
また、本発明は、少なくとも１つの免疫変調剤を加えることによって免疫診断試験を改善させることにも関する。
【０１１８】
用語、免疫変調剤とは、免疫応答を改変させる物質として理解されたい。免疫変調剤とは、免疫増強、免疫抑制、もしくは免疫寛容の誘導などのように、免疫応答の調整を所望のレベルまで誘導することができる物質、および／または、細胞は高温が原因でストレスを受けるため、潜在的な有害効果に対抗することができる物質である。また、免疫変調剤とは、免疫系の特定領域、たとえばＴリンパ球細胞またはＴリンパ球部分集団をブーストまたは阻害することができる物質としても理解される。
【０１１９】
本発明による好ましい免疫変調剤は、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を改善させるサイトカインおよび中和抗体である。特定の好ましい免疫変調剤は、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１などのサイトカインである。他の特定の好ましい免疫変調剤は、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、および／またはＩＬ−５と結合する中和抗体である。
【０１２０】
本発明の一態様は、サイトカインＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１；ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５と結合する中和抗体、抗ＣＤ２５抗体でコーティングしたビーズ、抗ＣＤ３９抗体でコーティングしたビーズ、ＩＬ−１０、ＪＡＫ１またはＴＹＫ２をコードしている遺伝物質に対するセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＴＬＲ変調剤として作用するオリゴヌクレオチド、およびＴＬＲ変調剤からなる群から選択される少なくとも１つの免疫変調剤をステップｂで加える、少なくとも１つの免疫変調剤の添加をさらに含む方法である。免疫変調剤を加える効果は、実施例中に、ＩＬ−１０に対する抗体、およびＩＬ−７の添加によって例示されている。
【０１２１】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの免疫変調剤は、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１からなる群から選択されるサイトカインである。
【０１２２】
別の好ましい実施形態では、少なくとも１つの免疫変調剤は、ＩＬ−１０と結合する中和抗体、ＩＬ−４と結合する中和抗体、ＩＬ−５と結合する中和抗体およびＣＤ２５と結合する中和抗体からなる群から選択される中和抗体である。
【０１２３】
さらに別の好ましい実施形態では、少なくとも１つの免疫変調剤は、抗ＣＤ２５抗体でコーティングしたビーズ、ＩＬ−１０、ＪＡＫ１またはＴＹＫ２をコードしている遺伝物質に対するセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＴＬＲ変調剤として作用するオリゴヌクレオチド、およびＴＬＲ変調剤からなる群から選択される。
【０１２４】
サイトカインであるインターロイキン−７（ＩＬ−７）がナイーブおよびメモリーのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞部分組の生存および恒常性に必須であることは、十分に確立されている。高温は細胞のストレスおよび損傷を引き起こす可能性があり、インキュベーション中に生存サイトカインＩＬ−７を加えることでこれらの潜在的に有害な効果から保護し得る。
【０１２５】
本発明の特に好ましい実施形態は、細胞を高温状態でのインキュベーションの潜在的に有害な効果から保護するためにＩＬ−７を加える方法に関する。
【０１２６】
本発明の別の態様は、炎症誘発反応をブーストするために、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０に対する抗体を加えることである。
【０１２７】
高温状態でのインキュベーション、または抗ＩＬ−１０を用いてもしくは用いずにＩＬ−７を加えることで、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答が増加することが、本発明によって示されている。
【０１２８】
本発明の好ましい実施形態は、炎症誘発反応をさらにブーストするために抗炎症性サイトカインＩＬ−１０に対する抗体の添加を用いてまたは用いずに、細胞を高温インキュベーションのこれらの潜在的に有害な効果から保護するためにＩＬ−７を加える方法に関する。
【０１２９】
したがって、本発明は、ＩＬ−１０と結合する中和抗体を用いてまたは用いずにＩＬ−７を加えることによって、免疫診断試験を改善させる方法にも関する。
【０１３０】
また、本発明は、ＩＬ７の存在下での、抗ＩＬ１０を用いたまたは用いない、高温状態でのインキュベーションにも関する。ＩＬ−７および抗ＩＬ−１０の両方の存在が、抗原依存性かつマイトジェン誘導性の両方の免疫シグナル伝達分子を産生するために最適なインキュベーション条件を提供すると考えられる。
【０１３１】
また、本発明は、免疫シグナル伝達分子、たとえばケモカインＩＰ−１０および／またはサイトカインＩＦＮ−γを、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を抗原性タンパク質／ペプチドで刺激した後に、高温状態で、ならびに／またはＩＬ−７および／もしくは抗ＩＬ−１０の存在下で測定することに基づく、たとえば結核菌の感染症を検出することができる試験システムにも関する。
【０１３２】
記載した試験システムは、通常のインキュベーション温度、すなわち３７℃で行われた試験よりも感度が高く、偽陰性および不確定試験結果の数を低下させる。これは試験および診断を改善させる。本発明によれば、通常のインキュベーション条件下で低い免疫応答を有する患者／ドナーは、インキュベーション温度を上昇することによって、特にＩＬ−７および抗ＩＬ−１０の存在下で、応答するようにさせることができる。これにより、本発明は、そうでなければ抗原に対して不十分な免疫応答を有する患者の診断を可能にする。さらに、本発明は、重要なことには免疫不全の個体においても、免疫診断試験の感度および対費用効果を改善させる。さらに、これは感染性因子および癌のワクチン開発において役割を果たし得る。
【０１３３】
Ｉｌ−７
インターロイキン７（ＩＬ−７）とは、ヒトではＩＬ７遺伝子によってコードされているタンパク質である。ＩＬ−７は生存サイトカインである。ＩＬ−７はリンパ系前駆細胞の増殖を刺激することが知られており、ＢおよびＴ細胞の発生に重要である。サイトカインであるインターロイキン−７は、ナイーブおよびメモリーのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の生存および恒常性に必須であることが示されており、ＩＬ−７シグナル伝達の欠損はヒトにおいて重篤な免疫不全をもたらす。
【０１３４】
ＩＬ−１０
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）とは、ヒトサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）としても知られ、抗炎症性サイトカインである。ヒトでは、ＩＬ−１０はＩＬ１０遺伝子によってコードされている。ＩＬ−１０は重要な免疫調節分子であることが知られている。これは、マクロファージおよびＴｈ１細胞などの細胞からのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦなどの炎症誘発性サイトカインの合成を阻害することができる。また、ＩＬ−１０は、抗原提示細胞の抗原提示能力の強力な抑制因子でもある。しかし、これは特定のＴ細胞および肥満細胞に対して刺激性でもあり、Ｂ細胞の成熟および抗体産生を刺激する。ＩＬ−１０を顕著に阻害する中和抗体が開発されており、これによりＩＬ−１０の生物学的効果が阻害または中和される。また、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡと結合するサイレンシングオリゴヌクレオチドも、ＩＬ−１０に媒介されるシグナルの阻害に有効である。
【０１３５】
細胞集団の免疫変調
別の実施形態では、抗炎症を阻害することによってアッセイをさらに増強させることができる。これは、調節性Ｔ細胞またはＴｈ２細胞などの試験抗原の細胞媒介性免疫応答を阻害する細胞集団の阻害、枯渇または排除によって行うことができる。
【０１３６】
好ましい免疫変調剤は、Ｔ調節性細胞の機能または活性を阻害する。これらの免疫変調剤は、ＣＤ２５リガンド、ヤヌスキナーゼ１（ＪＡＫ１）またはチロシンキナーゼ２（ＴＹＫ２）をコードしている遺伝物質に対するセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＴＬＲ変調剤として作用するオリゴヌクレオチド、およびＴＬＲ変調剤からなる群から選択される。より詳細には、Ｔ調節性細胞阻害性質を有する免疫変調剤は、抗ＣＤ２５抗体および／またはホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドである。より詳細には、免疫細胞媒介性アッセイの感度を増大または増強させるために、オリゴヌクレオチドは、ＪＡＫ１またはＴＹＫ２分子をコードしている遺伝物質（ＲＮＡまたはＤＮＡ）に相補的または相同的であることができる。本明細書中で企図されるオリゴヌクレオチドは、修飾された主鎖を有し得る、またはホスホロチオエートで修飾されたオリゴヌクレオチドなどの化学修飾されたヌクレオチドもしくはヌクレオシドを有し得る。
【０１３７】
本発明の一態様は、ビーズの表面上にコーティングした抗ＣＤ２５抗体である、少なくとも１つの免疫変調剤を加えることをさらに含む方法である。
【０１３８】
試験抗原
本発明は、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を増大させる方法に関する。本発明に適した抗原の選択肢は、試験抗原とも呼ばれ、所望する場合に細胞媒介性免疫応答に対する前記抗原の効果を決定する、任意の抗原である。
【０１３９】
試験抗原とは、診断することを望む疾患または状態に特異的な抗原として理解されたい。
【０１４０】
試験抗原は、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、炭水化物、糖タンパク質、リン脂質、リンタンパク質もしくはホスホリポタンパク質または非タンパク質化学薬品の形態であり得る。
【０１４１】
試験抗原の一例は、結核菌中でほぼ排他的に発現され、結核菌に特異的であるとみなすことができる抗原である、ＥＳＡＴ−６である。ＥＳＡＴ−６ペプチドは抗原提示細胞上に提示され、ＥＳＡＴ−６抗原に特異的なＴ細胞受容体を保有するＴ細胞によって認識される。
【０１４２】
非特異的抗原の一例は、カルメットゲラン桿菌（ＢＣＧ）の精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）または結核菌、ウシ結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）もしくはトリ結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）のツベルクリンＰＰＤである。ＰＰＤはいくつかの非特異的な抗原を含むタンパク質沈殿物である。ＰＰＤがほとんどのマイコバクテリア種（らい病の疾患を引き起こすらい菌（Ｍ．Ｌｅｐｒａｅ）が含まれる）と交差反応することは十分に確立されており、さらに、ＰＰＤはマイトジェン様効果を含めた非特異的な効果を有する。それ故、ＰＰＤは試験抗原としてみなすことができない、すなわちＰＰＤは非特異的抗原である。
【０１４３】
非特異的抗原の他の例は、強力な自然免疫応答を誘発する抗原、たとえばＴ細胞および生得的受容体のどちらによっても認識されるリポ多糖（ＬＰＳ）である。ＬＰＳは試験抗原として分類することができる特異的抗原を含むが、多くの場合は生得的応答の方が強力であり、これは試験抗原誘導性シグナルを不明瞭にする。生得的応答は免疫学的メモリーに非依存的であるため、これらは、哺乳動物が、以前にその特異的試験抗原に遭遇し、それにより特異的試験抗原（複数可）に対する免疫学的反応性を生じたかどうか、または以前に他の抗原に遭遇して特異的試験抗原（複数可）に対する免疫学的交差反応性を生じたかどうかを識別することができる特異的シグナルを生じることができない。
【０１４４】
言い換えれば、細胞媒介性免疫応答の特異性は試験抗原の特異性に由来する。
【０１４５】
疾患または状態を評価するために必要な特異性の度合に応じて、精通した技術者は様々な特異性の試験抗原を選択することができる。
【０１４６】
本発明の一態様では、本発明に適した試験抗原の選択肢は、精通した技術者が評価したい感染症の種類に依存する。したがって、選択された抗原は疾患に関連する。たとえば、結核菌の感染症を監視する場合、任意の利用可能な結核菌抗原が必要な応答を生じることができ、逆もそうである。いくつかの試験抗原が既存の市販アッセイにおいて既に使用されている。
【０１４７】
感染症が結核に関連していると考えられている場合、抗原または少なくとも１つの抗原はＲＤ−１および／またはＲＤ−１１抗原である。
【０１４８】
好ましい実施形態では、抗原は、ＲＤ−１抗原、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、ＴＢ７．７、融合タンパク質ＥＳＡＴ−６／ＣＦＰ−１０、ＴＢ１０．４、および異なるが特異的ないくつかの抗原を組み合わせた融合タンパク質からなる群から選択される。
【０１４９】
試験抗原に特異的なバイオマーカーの応答の一例は、たとえば実施例６に例示されている、結核菌特異的抗原ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ１０およびＴＢ７．７を用いた刺激である）
【０１５０】
別の好ましい実施形態では、抗原または少なくとも１つの抗原は、以下のｉｎ  ｖｉｖｏ発現された遺伝子からの潜伏抗原からなる群から選択される：Ｒｖ００７９、Ｒｖ０５７０、Ｒｖ０７１７、Ｒｖ１１７０、Ｒｖ１２８４、Ｒｖ１３６３、Ｒｖ１９５６、Ｒｖ２０３４、Ｒｖ２２２５、Ｒｖ２３２４、Ｒｖ２３８０、Ｒｖ２４３５、Ｒｖ２４６５、Ｒｖ２７３７ｃ、Ｒｖ２８３８ｃ、Ｒｖ２９８２ｃ、Ｒｖ３３５３ｃ、Ｒｖ３４２０ｃおよびＲｖ３５１５。
【０１５１】
さらに別の好ましい実施形態では、抗原または少なくとも１つの抗原は、以下の耐久性低酸素応答（Ｅｎｄｕｒｉｎｇ  Ｈｙｐｏｘｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）遺伝子からの抗原からなる群から選択される：Ｒｖ０１４０、Ｒｖ０２４４ｃ、Ｒｖ０２５１、Ｒｖ０３８４ｃ、Ｒｖ０７５３ｃ、Ｒｖ０７６７、Ｒｖ０８４６、Ｒｖ０８４７、Ｒｖ０９６７、Ｒｖ０９９０、Ｒｖ０９９１、Ｒｖ１２８４、Ｒｖ１４０３、Ｒｖ１４７１、Ｒｖ１７３３、Ｒｖ１８０６、Ｒｖ１８７４、Ｒｖ１８７５、Ｒｖ１９０９、Ｒｖ１９５５、Ｒｖ１９５６、Ｒｖ１９５７、Ｒｖ２０３４、Ｒｖ２０３５、Ｒｖ２３２４、Ｒｖ２３８９、Ｒｖ２４６５、Ｒｖ２４６６、Ｒｖ２５５８、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ２６２７、Ｒｖ２６２８、Ｒｖ２６４２、Ｒｖ２６４３、Ｒｖ２６５８、Ｒｖ２６６０、Ｒｖ２６６２、Ｒｖ２７４５、Ｒｖ２９１３、Ｒｖ３２２３、Ｒｖ３４０６、Ｒｖ３５１５、Ｒｖ３５３６およびＲｖ３８６２。
【０１５２】
本発明に関連する試験抗原は、特異性を損なわせずに免疫原性を改善させるために、たとえばＭＨＣからの不変鎖とカップリングさせることによって改変することができる。
【０１５３】
また、トリ結核菌、エム・ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）およびエム・ゼノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）からなるリストから選択されるＮＴＭセンシチン（ｓｅｎｓｉｔｉｎ）も、好ましい抗原である。
【０１５４】
現在好ましい実施形態では、試験抗原または少なくとも１つの試験抗原は、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、ＴＢ７．７、ならびに他のＲＤ−１およびＲＤ−１１抗原からなる群から選択される。
【０１５５】
本発明のさらなる一実施形態では、試験抗原はＥＳＡＴ−６である。
【０１５６】
本発明の別の実施形態では、試験抗原はＣＦＰ−１０である。
【０１５７】
本発明のさらなる実施形態では、試験抗原はＴＢ７．７である。
【０１５８】
本発明の現在好ましい実施形態では、試験抗原はＲＤ抗原である。
【０１５９】
本発明の現在好ましい実施形態では、試験抗原はＲＤ−１抗原である。
【０１６０】
本発明のさらなる現在好ましい実施形態では、抗原はＲＤ−１１抗原である。
【０１６１】
いくつかの研究所が、個々の感染性因子、いわゆる微生物または疾患に特異的な抗原によって厳粛に発現される試験抗原の同定に取り組んでいる。結核菌の場合、特異的試験抗原は、それだけには限定されないが、休眠、潜伏、活動、近時（ｒｅｃｅｎｔ）、肺、肺外、局在または治癒段階などの、感染の様々な段階で発現される。
【０１６２】
本発明は、そのような試験抗原を使用して実装することができ、したがってその具体的な段階（たとえば結核菌の潜伏感染）を同定するためのツールを提供する。
【０１６３】
好ましい実施形態では、応答試料を作製する際に同じ微生物からのいくつかの抗原を加えることができる。様々な組織型の好みを有するいくつかの抗原を加えることによって、方法の強度が増す。結核の場合、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０およびＴＢ７．７タンパク質の抗原ペプチドを組み合わせることで、この試験が幅広い範囲の組織型をカバーし、したがって様々な患者集団においてより強力かつ信頼性のある試験結果を与えることが確実となる。
【０１６４】
感染症がクラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）に関連していると考えられている場合、抗原は、血清型Ｄ抽出物、主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）、システインに富んだ外膜タンパク質（ＯＭＰ）、ＯＭＰ２、ＯＭＰ３、多形ＯＭＰ（ＰＯＭＰ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）のアデノシン二リン酸／アデノシン三リン酸転位酵素、ポリンＢタンパク質（ＰｏｒＢ）、およびＣＴ５２１からなる群から選択される。
【０１６５】
本発明から明らかなように、感染源は変動し得る。本発明の一実施形態では、抗原は、固定上鞭毛型、固定錐鞭毛型、破壊上鞭毛型、破壊錐鞭毛型、上鞭毛型からの精製した抗原性画分、上鞭毛型からの半精製した抗原性画分、錐鞭毛型排出−分泌抗原（ＴＥＳＡ）、優性可変抗原型（ＶＡＴ）、可変表面糖タンパク質（ＶＳＧ）、トランスシアリダーゼ（ＴＳ）、たとえばＴＳ１３、無鞭毛型表面タンパク質−２（ＡＳＰ２）、ＫＭＰ−１１ｍ、ＣＲＡ、Ａｇ３０、ＪＬ８、ＴＣＲ２７、Ａｇ１、ＪＬ７、Ｈ４９、ＴＣＲ３９、ＰＥＰ−２、Ａｇ３６、ＪＬ９、ＭＡＰ、ＳＡＰＡ、ＴＣＮＡ、Ａｇ１３、ＴｃＤ、Ｂ１２、ＴｃＥ、ＪＬ５、Ａ１３、１Ｆ８、Ｔｃ−２４、Ｔｃ−２８、Ｔｃ−４０、Ｃｙ−ｈｓｐ７０、ＭＲ−ＨＳＰ７０、Ｇｒｐ−ｈｓｐ７８、ＣＥＡ、ＣＲＰ、ＳＡ８５−１．１、ＦＣａＢＰ（鞭毛Ｃａ２＋結合タンパク質）、ＦＬ−１６０（１６０ｋＤａの鞭毛表面タンパク質）およびＦＲＡ（鞭毛反復抗原）からなる群から選択され、前記抗原はトリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）に関連する。
【０１６６】
本発明の好ましい実施形態では、抗原は、固定上鞭毛型、固定錐鞭毛型、破壊上鞭毛型、破壊錐鞭毛型、上鞭毛型からの精製した抗原性画分、上鞭毛型からの半精製した抗原性画分、錐鞭毛型排出−分泌抗原（ＴＥＳＡ）、優性可変抗原型（ＶＡＴ）、可変表面糖タンパク質（ＶＳＧ）、トランスシアリダーゼ（ＴＳ）、たとえばＴＳ１３、無鞭毛型表面タンパク質−２（ＡＳＰ２）、ＦＣａＢＰ（鞭毛Ｃａ２＋結合タンパク質）、ＦＬ−１６０（１６０ｋＤａの鞭毛表面タンパク質）およびＦＲＡ（鞭毛反復抗原）からなる群から選択される。
【０１６７】
感染症が住血吸虫属（ｓｃｈｉｔｏｓｏｍａ）に関連している場合、抗原は、破壊住血吸虫卵、排出／分泌性糖タンパク質（ＥＳ）、外皮（ＴＧ）糖タンパク質、可溶性卵抗原（ＳＥＡ）、マンソン住血吸虫（Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ）の可溶性抽出物（ＳＷＡＰ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＲＰ２６、Ｓｊ３１、Ｓｊ３２、パラミオシン、Ｓｍ６２−ＩｒＶ５、Ｓｍ３７−ＳＧ３ＰＤＨ、Ｓｍ２８−ＧＳＴ、Ｓｍ１４−ＦＡＢＰ、ＰＲ５２−フィラミンＰＬ４５−ホスホグリセリン酸キナーゼ、ＰＮ１８−シクロフィリン、ＭＡＰ３、Ｓｍ２３、ＭＡＰ４、Ｓｍ２８−ＴＰＩ、Ｓｍ９７、ＣＡＡ、ＣＣＡ、およびマンソン住血吸虫熱ショックタンパク質７０からなる群から選択される。
【０１６８】
本発明の好ましい実施形態では、抗原は、排出／分泌性糖タンパク質（ＥＳ）、外皮（ＴＧ）糖タンパク質、可溶性卵抗原（ＳＥＡ）、マンソン住血吸虫の可溶性抽出物（ＳＷＡＰ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびＲＰ２６からなる群から選択される。
【０１６９】
リーシュマニア属（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）に関して、抗原または少なくとも１つの抗原は、破壊前鞭毛型、リーシュマニン、ｒＧＢＰ、ｒＯＲＦＦ、ｒｇｐ６３、ｒＫ９、ｒＫ２６、ｒＫ３９、ＰＮ１８−シクロフィリン、ＭＡＰ３、Ｓｍ２３、ＭＡＰ４、Ｓｍ２８−ＴＰＩ、Ｓｍ９７、ＣＡＡ、およびＣＣＡからなる群から選択される。
【０１７０】
実際、分析する種に特異的な任意の試験抗原が、本発明において有用な場合がある。
【０１７１】
本発明の一態様は、前記試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を使用して、癌または新生物または悪性腫瘍を検出する方法に関する。
【０１７２】
癌に関しては、試験抗原は、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ２、ｎｅｕ、ＭＡＧＥ  Ａ３、ｐ５３突然変異体および非突然変異体、ＮＹ−ＥＯＳ−１、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ、ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ−突然変異体、ｇｐ１００、ＰＲ１、Ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、生存、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転位切断点（ｓａｒｃｏｍａ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＮＹＣＮ、ＴＲＰ−２、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰ１８１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、精子線維鞘タンパク質、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−２ならびにＦＡＰからなる群から選択される。
【０１７３】
実際、癌、前癌または突然変異に特異的な任意の試験抗原が、本発明において癌を診断および監視するために有用な場合がある。
【０１７４】
別の好ましい実施形態では、様々な疾患からの様々な抗原を組み合わせて、個々の疾患について低い特異性であるが、「感染症」について高い感度であるスクリーニングツールを可能にすることができる。たとえば、兵士が任務中に曝露される微生物（たとえば、マラリア、結核、リーシュマニア、住血吸虫および／またはトリパノソーマ症）からの抗原のパレットを組み合わせるキットは、医者が様々な試験の代わりに１つの素早いスクリーニング試験を行うことを可能にする。
【０１７５】
別の好ましい実施形態では、様々な性行為感染症からの様々な抗原を組み合わせて、個々の疾患について低い特異性であるが、性行為感染症（ＳＴＤ）について高い感度であるスクリーニングツールを可能にすることができる。たとえば、親密な粘膜接触で感染症を伝播する微生物（たとえば、軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、トラコーマ病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クレブシエラ・グラヌロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、紅色白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）、カンジダ症、ヘルペス、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＳＶ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＭＣＶ、恥毛ジラミ（Ｐｈｔｈｉｒｉｕｓ  ｐｕｂｉｓ）、ヒゼンダニ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ））からの抗原のパレットを組み合わせるキットは、医者が様々な試験の代わりに１つのスクリーニング試験を行うことを可能にする。そのような試験は、それだけには限定されないが性労働者などの、危険性を負う個体における、ＳＴＤの素早いスクリーニングツールとして役割を果たすであろう。
【０１７６】
別の好ましい実施形態では、組み合わせたキットは、臓器に感染する様々な微生物（たとえば、骨盤炎症性疾患を引き起こすネセリア属（Ｎｅｓｓｅｒｉａ）およびクラミジア属の種）からの抗原を含み得る、または一般的な症状を引き起こす感染性因子（たとえば、カンピロバクター（ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）および赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ）の感染症によって引き起こされる処置可能な下痢は、ウイルス、たとえばロタウイルスによって引き起こされる処置不能な下痢から区別することができる）からの抗原を含み得る。
【０１７７】
試料
本発明の一実施形態は、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を生じさせる方法を企図し、前記方法は、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を含む試料を哺乳動物から提供するステップと、前記試料を、高温状態で、少なくとも１つの試験抗原と共にインキュベーションするステップと、前記試料における試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を決定するステップとを含む。
【０１７８】
本発明の別の実施形態は、対象において試験抗原に特異的な媒介性免疫応答を生じさせる方法を企図し、前記方法は、前記対象から、少なくとも１つの試験抗原による刺激の後に免疫シグナル伝達分子を産生することができる免疫系の細胞を含む試料を採取するステップと、前記試料を高温温度で前記少なくとも１つの試験抗原と共にインキュベーションし、その後、少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子のレベルの存在または上昇を測定するステップであって、前記免疫シグナル伝達分子の存在またはレベルが、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を開始させる前記対象の能力の指標であるステップとを含む。
【０１７９】
一実施形態では、試料は、全血、または血液、胸膜液、気管支液、組織生検、腹水、および／もしくは脳脊髄液に由来する細胞に由来する。
【０１８０】
好ましい実施形態では、試料は血液に由来する。
【０１８１】
特に好ましい実施形態では、試料は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、Ｔ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、ガンマ・デルタＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞およびＮＫ細胞からなる群から選択される細胞を含む。
【０１８２】
好都合には、試料が全血である場合、採血チューブを、抗凝固剤（たとえばヘパリン）および任意選択で免疫変調剤および任意選択で栄養素を用いて処理する。全血が好ましく、最も好都合な試料であるにもかかわらず、本発明は、それだけには限定されないが、胸膜液、腹水、リンパ液、脊髄または大脳液、組織液、ならびに鼻汁および肺液を含めた呼吸器の液などの、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を含有する他の試料にまで及ぶ。
【０１８３】
「全血」への言及には、組織培養物、培地、試薬、賦形剤などによって希釈されていない全血が含まれる。一実施形態では、用語「全血」には、少なくとも１０体積％の全血を含むアッセイ試料（すなわち反応混合物）が含まれる。用語「少なくとも１０体積％」には、反応混合物の全アッセイ体積の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００体積％の血液量が含まれる。「全血」を含む試料から逸脱せずに、培養培地、酵素、免疫変調剤、賦形剤、抗原などの追加の薬剤を加え得る。
【０１８４】
したがって、一実施形態では、本発明は、試料が、全血、または血液、胸膜液、気管支液、組織生検、腹水、および／もしくは脳脊髄液に由来する細胞である方法に関する。
【０１８５】
したがって、別の実施形態では、本発明は、試料が、末梢単核細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、ガンマ・デルタＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞およびＮＫ細胞からなる群から選択される細胞を含む方法に関する。
【０１８６】
一実施形態では、試料は、抗原、マイトジェンまたは「ｎｉｌ」がそれ中に存在する３つの適切な容器中に採取し得る全血である。別の実施形態では、抗原、マイトジェンまたは「ｎｉｌ」は、試料、たとえば全血を含有するアリコートに後で加えることができる。
【０１８７】
別の実施形態では、試料は、抗原、マイトジェンもしくは「ｎｉｌ」を含有する採取チューブ中で採取し得る全血であるか、または、抗原、マイトジェンもしくはｎｉｌを加える全血のアリコートであり得る。
【０１８８】
好ましい実施形態では、試料は、乾燥させた試験抗原および任意選択で細胞に栄養素を提供する物質（たとえば炭水化物の形態）および任意選択で免疫変調剤を用いてコーティングした、空にしたチューブ内に採取した全血である。
【０１８９】
別の好ましい実施形態では、試料は、直径約３〜４ｍｍの毛細管内に採取する。
【０１９０】
一般に、血液は、抗凝固剤（好ましくはヘパリン、またはたとえばクエン酸塩もしくはＥＤＴＡ）の存在下で維持する。抗凝固剤は、血液を加える際に採血チューブ内に存在する。採血チューブの使用が好ましいが、標準の自動実験室システムに適合性がある必要はなく、これらは大スケールおよびランダムアクセスサンプリングにおける分析を受け入れ易い。また、採血チューブは、取扱いの費用を最小限にし、実験室での全血および血漿への曝露を低下させ、それにより、実験室の人員が、それだけには限定されないがヒト免疫不全ウイルスなどの病原性因子にかかる危険性を低下させる。
【０１９１】
全血のアリコートは、１０μＬ〜４０００μｌの範囲の体積、たとえば、それだけには限定されないが、１０μＬ、２０μＬ、３０μＬ、４０μＬ、５０μＬ、６０μＬ、７０μＬ、８０μＬ、９０μＬ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、５０１μＬ、５２５μｌ、５５０μＬ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、１０００μｌ、１１００μｌ、１２００μｌ、１３００μｌ、１４００μｌ、１５００μｌ、１６００μｌ、１７００μｌ、１８００μｌ、１９００μｌ、２０００μｌ、２１００μｌ、２２００μｌ、２３００μｌ、２４００μｌ、２５００μｌ、２６００μｌ、２７００μｌ、２８００μｌ、２９００μｌまたは３０００μｌであり得る。
【０１９２】
試料は、チューブ、組織培養ウェルまたは他の容器中でインキュベーションすることができ、抗原、マイトジェンおよび「ｎｉｌ」は関連する濃度で加えることができる。
【０１９３】
採血チューブにはｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒチューブまたは別の同様の容器が含まれるが、血液は開口チューブまたは毛細管内に直接採血することもできる。
【０１９４】
高温状態でのインキュベーション
細胞媒介性免疫系の細胞は、対象から採血してから長時間の後、全血中の細胞媒介性免疫応答を開始させる能力を失う。応答は、血液試料が、それだけには限定されないが摂氏１０℃〜３９℃の温度での保存などの細胞の生命を延長する様式で処理されていない場合、採血の２４時間後にしばしば激しく低下しているか存在しない。
【０１９５】
一実施形態では、作業の軽減が、抗原を用いた試料の刺激を、医院、クリニック、外来患者施設、獣医クリニックまたは農場などの看護現場で行うことを可能にする。抗原刺激が完了した後は、新鮮かつ活性のある細胞の必要性は存在しなくなる。ＩＰ−１０およびサイトカインまたは免疫シグナル伝達分子などの他のバイオマーカーは血漿中で安定しており、したがって、試料を特別な条件または迅速な時間要件なしに、他の感染性疾患または他の疾患の診断に使用される標準の血漿試料と同様の様式で、保管、凍結または輸送することができる。
【０１９６】
インキュベーションステップは、５〜１４４時間、より好ましくは５〜１２０時間、さらにより好ましくは１２〜２４時間またはその間の期間であり得る。したがって、本発明の一実施形態では、インキュベーション時間は、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２６時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、または１４４時間である。
【０１９７】
本発明では、インキュベーションステップは高温状態で行う。高温状態には、摂氏３８℃〜４２℃の範囲の温度でのインキュベーションが含まれる。
【０１９８】
インキュベーションステップは、摂氏３８℃〜４２℃の範囲の温度で行うことができる。したがって、本発明の一実施形態では、インキュベーション温度は、摂氏３８℃、摂氏３８．１℃、摂氏３８．２℃、摂氏３８．３℃、摂氏３８．４℃、摂氏３８．５℃、摂氏３８．６℃、摂氏３８．７℃、摂氏３８．８℃、摂氏３８．９℃、摂氏３９．０℃、摂氏３９．１℃、摂氏３９．２℃、摂氏３９．３℃、摂氏３９．４℃、摂氏３９．５℃、摂氏３９．６℃、摂氏３９．７℃、摂氏３９．８℃、摂氏３９．９℃、摂氏４０．０℃、摂氏４０．１℃、摂氏４０．２℃、摂氏４０．３℃、摂氏４０．４℃、摂氏４０．５℃、摂氏４０．６℃、摂氏４０．７℃、摂氏４０．８℃、摂氏４０．９℃、摂氏４１．０℃、摂氏４１．２℃、摂氏４１．３℃、摂氏４１．４℃、摂氏４１．５℃、摂氏４１．６℃、摂氏４１．７℃、摂氏４１．８℃、摂氏４１．９℃または摂氏４２．０℃であり得る。
【０１９９】
より好ましい実施形態では、インキュベーション温度は摂氏３８．５℃、摂氏３９．０℃、摂氏３９．５℃、摂氏４０．０℃、または摂氏４０．５℃である。
【０２００】
インキュベーションステップは、固定されていない温度、それだけには限定されないが、摂氏３８℃〜４２．０℃、より好ましくは３８．０℃〜４１℃、より好ましくは３８．２℃〜４０．７℃、より好ましくは摂氏３８．５℃〜４０．５℃、さらにより好ましくは摂氏３９．０℃〜摂氏４０．０℃で行うことができる。
【０２０１】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、前記高温状態が摂氏３８．５〜４１．０℃の温度でのインキュベーションであるものである。
【０２０２】
より好ましい実施形態は、前記高温状態が摂氏３９〜４０℃の温度でのインキュベーションであるものである。
【０２０３】
試料を高温状態でインキュベーションするためのいくつかの方法が、精通した技術者に知られている。たとえば、インキュベーター、水浴および加熱ブロックを使用することが可能である。
【０２０４】
本発明の一実施形態は、細胞培養物に培養培地を加えた、希釈した試料の刺激を行うことを可能にする。
【０２０５】
本発明の別の実施形態は、不活性希釈液（たとえば生理食塩水）を細胞培養物に加えて試料を刺激することを可能にする。
【０２０６】
本発明では、試料を少なくとも１つの試験抗原とインキュベーションする際に、少なくとも１つの炭水化物が存在することが好ましいことを理解されたい。炭水化物の存在は、細胞培養物の成長を改善させる。
【０２０７】
したがって、本発明は、小さな炭水化物、たとえば単糖および二糖などの少なくとも１つの炭水化物が前記インキュベーションステップ中に存在することが好ましい方法にも関する。
【０２０８】
特に好ましい実施形態は、炭化水素および／またはグリカンの形態の糖をインキュベーションステップ中で加える方法である。
【０２０９】
最も好ましい実施形態では、加えた糖はデキストロースである。
【０２１０】
この炭水化物、たとえばデキストロースは、前記インキュベーションステップ中で加え得る。
【０２１１】
増大
本発明の一態様は、高温温度でのインキュベーションによる試験抗原の細胞媒介性免疫応答の増大に関する。
【０２１２】
増大は、高温状態でのインキュベーション後の少なくとも１つのシグナル伝達分子のレベルから参照レベルを減算することによって決定することができる。精通した技術者によって理解されるように、参照レベルは、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を含む前記試料を、少なくとも１つの試験抗原と共に３７℃でインキュベーションすることによって決定することができる。
【０２１３】
好ましい実施形態では、試験抗原の細胞媒介性免疫応答の増大とは、少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子のレベルを測定することによって決定することができる、試験抗原の細胞媒介性免疫応答の改善として理解されたい。
【０２１４】
好ましい実施形態では、この改善または増大とは、高温温度での前記試料のインキュベーション後の少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子のレベルが、３７℃でのインキュベーション後よりも高いこととして理解されたい。
【０２１５】
好ましい実施形態では、この改善または増大とは、高温温度での前記試料のインキュベーション後の少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子の規模が、３７℃でのインキュベーション後よりも高いこととして理解されたい。
【０２１６】
好ましい実施形態では、この改善または増大とは、高温温度での前記試料のインキュベーション後の少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子の分子数（たとえばｐｇ／ｍｌまたはモル／ｍｌを使用して測定可能）が、３７℃でのインキュベーション後よりも高いこととして理解されたい。
【０２１７】
好ましい実施形態では、この改善または増大とは、高温温度での前記試料のインキュベーション後の少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子の分子濃度が、３７℃でのインキュベーション後よりも高いこととして理解されたい。
【０２１８】
特に好ましい実施形態では、改善とは、高温温度での前記試料のインキュベーション後の少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子の絶対的レベルが、３７℃でのインキュベーション後よりも高いこととして理解されたい。絶対的レベルとは、試料中で決定される少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子のレベル、すなわち少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子のバックグラウンドレベルを減算していないものとして理解されたい。
【０２１９】
別の好ましい実施形態では、改善とは、高温温度での前記試料のインキュベーション後の少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子の、少なくとも１つの免疫シグナル伝達分子のバックグラウンドレベルを減算した後のレベルが、３７℃でのインキュベーション後よりも高いこととして理解されたい。
【０２２０】
特に好ましい実施形態では、改善とは、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答の改善されたシグナル対ノイズ比（ＳＮ比）として理解されたい。
【０２２１】
したがって、特に好ましい実施形態では、本発明は、前記試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答の改善されたシグナル対ノイズ比を生じる方法に関する。これは実施例７中に例示されている。
【０２２２】
一般に、用語シグナル対ノイズ比とは、所望のシグナルのレベル（この場合は免疫シグナル伝達分子のレベルによって測定した試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答／試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答から生じる免疫シグナル伝達分子のレベル）をバックグラウンドノイズのレベル（無刺激の試料中に存在する前記免疫シグナル伝達分子のレベル）と比較する。比が高ければ高いほど、バックグラウンド「ノイズ」は突出しない。試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答の改善されたシグナル対ノイズ比は、免疫シグナル伝達分子のバックグラウンドレベルを下げることによって、および／または試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答のレベルを増加させることによって、達成することができる。
【０２２３】
バックグラウンドレベルは、無刺激の試料（試験抗原と共にインキュベーションする試料と同一）中の免疫シグナル伝達分子のレベルを測定することによって決定される。
【０２２４】
シグナル対ノイズ比は、刺激した試料中の免疫シグナル伝達分子のレベルを無刺激の試料中の前記免疫シグナル伝達分子のレベルで除算することによって決定することができる。
【０２２５】
高温温度のインキュベーションによる改善されたシグナル対ノイズ比は、試料および特異的試験抗原または少なくとも１つの特異的試験抗原のシグナル対ノイズ比を、摂氏３７℃および高温温度、たとえば摂氏３９℃の両方で決定することによって、決定することができる。
【０２２６】
改善されたシグナル対ノイズレベルとは、前記試験抗原について摂氏３７℃でおよび前記試験抗原について摂氏３９℃などの高温温度で決定されたシグナル対ノイズ比を比較した際に、シグナル対ノイズ比が増加している場合として理解されたい。したがって、高温温度で達成されるシグナル対ノイズ比は、摂氏３７℃でのものよりも良好である。
【０２２７】
相乗効果
相乗作用とは、最終結果のための、異なる実体の有利な企業として定義される。すなわち、２つ以上の実体及び／または修飾間の相互作用）が、それぞれの実体単独での合計よりも全体的により良好な結果を生じる。本発明に従って、かつ実施例中に実証されているように、高温インキュベーションは、加えた免疫変調剤と、対でおよびすべて一緒のどちらにおいても、相乗作用で作用する。
【０２２８】
参照およびカットオフレベル
当業者に一般に理解されるように、細胞媒介性免疫反応性のスクリーニング方法は、比較による意思決定方法である。どのような意思決定方法においても、目的の疾患もしくは状態に罹患している対象および／または目的の疾患、感染症、もしくは状態に罹患していない対象に基づく参照値が必要であり、本発明にはさらに、本明細書中に記載の高温領域の様々な温度レベルに対するそのような比較も必要である。
【０２２９】
カットオフレベルは、それだけには限定されないが、試験した特定の個体群などのいくつかの基準に基づいて調整することができる。たとえば、免疫不全を有する個体および活動性疾患へと進行する危険性が高い患者ではカットオフレベルを低く設定することができ、活動性疾患を発生する危険性が低い、それ以外は健康な個体群では、カットオフは高くてもよい。
【０２３０】
判別値とは、摂氏３７℃の対照群または試料および高温状態での群または試料の両方におけるパラメータまたは複数のパラメータを測定して、判別値（複数可）を決定することによって決定された値である。判別値は受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を使用して決定することができる。この様式で決定された判別値は、将来の個々の実験における同じ実験設定に有効である。
【０２３１】
たとえばバイオマーカー濃度の測定は国際単位（ＩＵ）へと翻訳することができる。ＩＵはバイオマーカーの生物活性に関連し、様々な測定方法間のベンチマークへの参照である。
【０２３２】
本発明の他の実施形態では、決定されたカットオフ値は、たとえば抗原で刺激されたＩＰ−１０濃度を非刺激の血漿濃度によって除算したものとして定義される刺激指数と組み合わせることができる。
【０２３３】
これらの分析物のレベルを測定するための既知の分析方法のうちの任意のものが本発明において機能するが、当業者には明らかなように、それぞれのマーカーで使用する分析方法は、その特定のマーカーの参照データを生成するために使用した方法と同じでなければならない。特定のマーカーまたはマーカーの組合せに新しい分析方法を使用した場合は、その方法を用いて開発したデータに基づく新しい参照データの組を生成しなければならない。
【０２３４】
多変量の判別分析および他の危険性評価は、市販のコンピュータプログラム統計的パッケージ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．により製造および販売）上で、あるいは当業者に知られている他の多変量統計分析方法または他の統計的ソフトウェアパッケージもしくはスクリーニングソフトウェアによって行うことができる。
【０２３５】
当業者には明らかなように、上述の実施形態のうちの任意のものにおいて、陽性試験の危険性カットオフレベルを変化させること、または集団中の様々な部分群に適用され得る様々な演繹的危険性を使用することは、それぞれの患者の判別分析の結果を変化させる場合がある。
【０２３６】
本発明の文脈においては、用語「参照」とは、たとえば検量線などの、他の値または特徴をそれに対して比較することができる、量、品質または種類に関連する標準に関する。
【０２３７】
診断
一実施形態では、かつ上述のように、この方法は、感染症などの様々な免疫学的状態が疑われる対象の診断に使用し得る。診断に使用する場合、本発明による方法は、通常は臨床症状およびさらなる臨床検査を評価することによって達成される、感染症などの免疫学的状態の存在の決定を援助し得る。試験は、感染症の様々な段階、すなわち、どのような症状もない個体における最近遭遇した感染症、その感染症の症状を有さない個体における何年も前に遭遇した感染症、または感染症が原因の症状を患者が有する活動性の感染症を診断し得る。
【０２３８】
したがって、本発明は、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を開始させる対象の潜在性または能力を決定する方法に関する。本発明は、細胞媒介性免疫応答を生じさせることができる免疫系の細胞を、抗原性タンパク質／ペプチドを用いて、高温状態でならびに／またはＩＬ−７および／もしくは抗ＩＬ−１０の存在下で刺激した後に、免疫シグナル伝達分子、たとえばケモカインＩＰ−１０および／またはサイトカインＩＦＮ−γを測定することに基づく、たとえば結核の感染症の検出を可能にする方法を提供する。
【０２３９】
したがって、本発明の特に好ましい実施形態は、前記試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を使用して、前記試験抗原を発現することができる微生物によって引き起こされた感染症を診断する方法に関する。
【０２４０】
記載した試験システムは、偽陰性試験結果および不確定試験結果の数を低下させ、摂氏３７℃でのインキュベーションステップを含む試験よりも感度が高い。したがって、本発明による方法は、試験および診断を改善させる。
【０２４１】
別の実施形態では、この方法は、結核が疑われる対象（たとえば、活動性、潜伏性または最近のＴＢ感染症）、特に潜伏性から活動性の結核への進行の危険性が増加した患者、すなわち、免疫抑制医薬品（すなわちモノクローナル抗体処置（抗ＣＤ２０抗体（たとえばリツキシマブ（著作権））もしくはＴＮＦ−α遮断処置（たとえば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（著作権）、Ｅｎｂｒｅｌ（著作権）、Ｈｕｍｉｒａ（著作権））））またはステロイドもしくは癌−化学療法を受けている患者、あるいは、免疫抑制状態（たとえば、ＨＩＶ感染症、癌、ＩＤＤＭもしくは非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、自己免疫状態、栄養失調、高齢、静脈内薬物使用（ＩＶＤＵ）または遺伝性免疫障害）を患っている患者、および最近感染した個体の診断に使用し得る。実際、標準の指針に従って、医療を開始する前に、これらの患者を活動性、潜伏性または最近のＴＢについてスクリーニングするべきである。
【０２４２】
現在では、ＴＮＦ−α遮断剤処置の候補である、またはＨＩＶ陽性である患者を、ＴＳＴまたは結核菌抗原に特異的なＩＦＮ−γ試験のどちらかでスクリーニングすることが強く勧められている。しかし、研究により、これらの試験は上述した患者分類では信頼できないことが示されており、したがって、本方法は、偽陰性試験結果および不確定試験結果の数を低下させるため、より良好な選択肢である。
【０２４３】
別の実施形態では、本方法は、クラミジア属感染症（たとえば、泌尿生殖器の感染症、骨盤の感染症および／または眼の感染症）が疑われる個体をスクリーニングするために使用し得る。
【０２４４】
したがって、本発明の方法は、感染性疾患の危険性が高い人、たとえば疾患の流行地域に滞在または旅行していた人のスクリーニングに適用可能であり得る。
【０２４５】
したがって、本発明の一実施形態では、感染性疾患は、マラリア、結核、髄膜炎、日本脳炎、コレラ、リーシュマニナ（ｌｅｉｓｈｍａｎｉｎａ）、デングおよびポリオからなる群から選択される。
【０２４６】
本発明の別の実施形態では、感染性疾患は、軟性下疳、クラミジア属感染症、淋病、鼠径リンパ肉芽腫、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、梅毒トレポネーマ、Ｂ型肝炎、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、軟属腫、恥毛ジラミ、ヒゼンダニおよび膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）からなる性行為感染症から選択される。
【０２４７】
本発明のさらなる一実施形態では、感染性疾患は、処置可能な胃腸管系感染性因子、たとえば、赤痢菌、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、カンピロバクター、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）細菌、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）細菌およびマウスチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）細菌からなる群から選択される。
【０２４８】
本発明のさらなる一実施形態では、感染性疾患は、抗生物質で処置可能でない胃腸管系感染性因子、たとえば、ロタウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、サポウイルス、およびアストロウイルスからなる群から選択される。
【０２４９】
本発明のさらなる実施形態では、感染性疾患は、たとえば血液バンクにおいてスクリーニングの対象となる血液関連疾患、すなわち、Ａ型肝炎、Ｅ型肝炎、マラリア、シャガス病、バベシア症、リーシュマニア症、サル泡沫状ウイルス、クロイツフェルト−ヤコブ（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｔ−Ｊａｃｏｂ）病（ｖＣＪＤ）、クロイツフェルト−ヤコブ（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ）病（ＣＪＤ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびエプスタイン−バーウイルスからなる群から選択される。
【０２５０】
本発明の一実施形態では、感染性疾患は、細菌性髄膜炎を引き起こすことができる細菌、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）からなる群から選択される。
【０２５１】
したがって、特異的抗原の選択は、精通した技術者がたとえばマイコバクテリアの様々な種間を識別することを可能にするため、本発明の目的は、種に特異的な診断を作製することである。
【０２５２】
予後診断
一実施形態では、この方法は、感染症などの様々な免疫学的状態が診断された個体の予後診断を予測するために使用し得る。患者の予後診断で使用する場合、本発明による方法は、感染症などの免疫学的状態の過程および可能性の高い結果の予測を援助し、したがって、当業者が適切な処置方法を選択し、状態のための特定の処置の可能性の高い効果を評価することを支援し得る。
【０２５３】
監視
一実施形態では、この方法は、感染症を診断された個体を監視するために使用し得る。患者の監視で使用する場合、本発明による方法は、処置中およびその終了後に処置の有効性を評価すること、たとえば感染症の再発の可能性を監視および予測することを援助し得る。
【０２５４】
本発明によって治療の有効性を監視する可能性は、以下の理由で特に関連性がある（結核菌の感染症を例として使用）：
ａ）痰の顕微鏡観察、マイコバクテリア培養、Ｘ線または他の方法などの現在利用可能な方法の代わりに、単純な採血によって容易に行われる、
ｂ）痰の顕微鏡観察、マイコバクテリア培養、Ｘ線または他の方法と比較して、より再現性がある、
ｃ）痰の顕微鏡観察、マイコバクテリア培養、Ｘ線または他の方法、たとえば肺外の結核が疑われる場合の生検に関連する侵襲性の手術手順、もしくは患者が痰陰性の場合は気管支鏡検査と比較して安価である、
ｄ）ＲＤ１重複ペプチドに基づく古典的な３７℃のアッセイと比較して、偽陰性試験結果および不確定試験結果の数を低下させ、より感度が高い、
ｅ）他の免疫アッセイは感染症の有無のみを判別するが、これは活動性および潜伏性の結核を判別し得る。
【０２５５】
スクリーニング
一実施形態では、本発明による方法はスクリーニング目的に使用する。すなわち、これは、ＩＰ−１０のレベルを本発明に従って測定し、測定されたレベルを事前に指定されたレベルと相関させることによって、以前に関連する感染症（複数可）を診断されていない対象を評価するために使用し、それにより様々な感染症（たとえば結核菌の感染症）の存在または非存在が示される。別の実施形態では、本発明による方法はスクリーニング目的に使用する。すなわち、これは、ＩＰ−１０のレベルを、本発明を示す事前に指定されたレベルに従って測定し、測定されたレベルを様々な感染症（たとえば結核菌の感染症）の存在または非存在と相関させることによって、以前に関連する感染症（複数可）を診断されていないが、潜伏性疾患の再活性化の危険性にある対象を評価するために使用する。
【０２５６】
以前に述べたように、本発明は、少なくとも２つの感染性疾患を同時にスクリーニングする方法を開示する。
【０２５７】
本発明の別の実施形態では、この方法は、血液ドナーからの血液を、それだけには限定されないがたとえば寄生生物またはウイルスによって引き起こされる感染症（複数可）などの様々な疾患についてスクリーニングするために使用することができる。
【０２５８】
接触者追跡
好ましい実施形態では、本発明による方法は、結核菌などの様々な感染症に曝露された対象の診断に使用し得る。接触者追跡で使用する場合、本発明による方法は、結核菌の感染症などの感染症の存在の決定を援助し得る。
【０２５９】
他の実施形態では、本発明による方法は、それだけには限定されないが、結核、コロナウイルス（たとえば重症獲得呼吸器症候群）、インフルエンザ、エボラまたはマールブルグウイルスなどの伝染性の高い感染症の大流行において、伝染性の症例に曝露された対象の診断に使用し得る。結核の場合：接触者追跡で使用する場合、本発明による方法は、通常はＴＳＴまたは現在利用可能なＩＦＮ−γ放出アッセイを評価することによって達成される、感染症の存在の決定を援助し得る。
【０２６０】
強化症例発見（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃａｓｅ  ｆｉｎｄｉｎｇ）
好ましい実施形態では、本発明による方法は、感染症などの様々な疾患の診断に使用し得る。強化症例発見で使用する場合、本発明による方法は、それだけには限定されないが、そうでなければ感染症の微生物学的証拠の欠如（通常は臨床症状を評価することによって達成される）、処置に対する応答の欠如、および代替診断の欠如または痰培養などの時間のかかるアッセイ（数週間）が原因で診断が困難である、顕微鏡観察陰性ＴＢなどの感染症の存在の決定を援助し得る。
【０２６１】
有病率の研究
好ましい実施形態では、本発明による方法は、それだけには限定されないが、子供、ＨＩＶ陽性移民、難民、医療従事者、学童、囚人、検査技師などの目的の集団における感染症などの、様々な免疫学的状態の有病率の研究に使用し得る。有病率の研究で使用する場合、本発明による方法は、通常はＴＳＴによって達成する、集団における潜伏性および活動性のＴＢなどの感染症の存在の決定を援助し得る。
【０２６２】
研究目的
一実施形態では、本発明による方法は、マイコバクテリア属、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、腸球菌、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ビブリオ属（ｖｉｂｒｉｏ）、トレポネーマ属（ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）（梅毒）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、レプトスピラ属（ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｅ）、クラミジア属（Ｃｌａｍｙｄｉａ）、レトロウイルス（ＳＩＶ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）およびＮＬ−６３などのコロナウイルス、サイトメガロウイルス、ロタウイルス、メタニューモウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ポックスウイルス、エブスタイン（Ｅｂｓｔｅｉｎ）バーウイルス、エンテロウイルス、モルビリウイルス、ラブドウイルス（狂犬病）、ルビウイルス（風疹）、フラビウイルス（デング、黄熱）、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌｅａ−ｚｏｓｔｅｒ）ウイルス、ＣおよびＢ型肝炎、リーシュマニア属、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、トリパノソーマ、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）（熱帯熱マラリア原虫（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（ｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原虫（ｏｖａｌｅ）、四日熱マラリア原虫（ｍａｌａｒｉａ））、ニューモシスチス・カリニ（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｉｎｉ）（ＰＣＰ）および様々な線虫、吸虫からなる群から選択される微生物に由来する潜在的な新しい抗原をスクリーニングする場合に、研究所によって使用され得る。これらの抗原は、たとえば、脂質、多糖分子、タンパク質およびペプチドであることができる。実験室の研究目的で使用する場合、本発明による方法は、ワクチンおよび診断試験の開発に応用可能な、調査した抗原、タンパク質またはペプチドに対する免疫反応性の決定を援助し得る。
【０２６３】
たとえばペプチドなどのいくつかの抗原分子が、種に特異的または疾患に特異的として同定されているが、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞反応性を誘導するその性能の決定は、感度の高いマーカーが欠如していることが原因で困難である。そのような候補抗原を用いた高温温度での刺激後に決定された免疫シグナル伝達分子（複数可）のレベルを使用して、潜在的に興味深い新しい抗原または分子についてスクリーニングし、それを同定することができる。より詳細には、結核菌、トラコーマ病原体（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ＨＩＶ−１またはＨＣＶに由来する抗原の場合、この方法は、これらの抗原の免疫原性を試験する場合に、すなわちたとえばワクチンを開発するためのＴ細胞の反応性の測度として、研究所によって使用され得る。
【０２６４】
本発明による決定に関連して本明細書中に記述した任意の特長および／または態様が、本発明による「診断」、「予後診断」、「監視すること」、「スクリーニング」、「研究目的」、「接触者追跡」、「強化症例発見」および「有病率の研究」にも同様に適用され、逆もそうであることを理解されたい。
【０２６５】
本発明は、試験および診断を改善させる方法を提供する。実施例中に見られるように、増加したインキュベーション温度は、最も低い応答者において増加した応答性をもたらす。これらの驚くべき発見は、高温インキュベーション方法は、そうでなければ「偽陰性」である低応答者からの応答をブーストさせ、より少ない偽陰性試験結果をもたらし、したがって伝統的な摂氏３７℃の方法と比較して感度を増加させることができることを示している。さらに、３９℃＋ＩＬ７および抗ＩＬ−１０では、非常に少ないドナーがマイトジェンに対して低い応答性を示す。これは、本発明者らが患者からの細胞を免疫抑制（ＨＩＶ、癌、様々な種類の医療）応答性にすることができ、これが不確定試験結果の量を減少させ、したがって対費用効果を増加させることを示すため、重要な発見である。
【０２６６】
ワクチン接種
本発明の一態様は、参照レベルを超える試験抗原依存性の免疫シグナル伝達分子の応答が、哺乳動物が、以前に抗原と遭遇している、または本明細書中で言及した任意の微生物に対するワクチン接種が原因で抗原と交差反応性を生じる他の抗原と以前に遭遇していることを示す方法に関する。
【０２６７】
生きていない物質に基づくワクチンに対する応答は、低いレベルの抗原に特異的な免疫シグナル伝達分子をもたらす場合があり、本方法は改善された免疫応答（免疫シグナル伝達分子のより高い放出またはより低いバックグラウンドレベルなど）をもたらすため、これを使用して、前臨床、臨床治験、および続いてルーチン的設定におけるワクチン応答を検出し得る。
【０２６８】
本発明の別の好ましい実施形態では、この方法は、ワクチンの効果の監視に有用である。本発明の教示に従って、ワクチン中に含まれる抗原を使用して、ＩＰ−１０の応答を監視することによって、ワクチン接種の効果を決定することが可能である。そのような手段は、再ワクチン接種の必要性またはワクチンの潜在的な利点の可能性を評価する場合に重要である。
【０２６９】
したがって、本発明は、前記試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を使用してワクチン接種の応答を検出する方法にも関する。
【０２７０】
微生物
本発明によれば、感染症は、それだけには限定されないが、細菌、寄生生物、真菌、ウイルス、プリオン、および／またはウイロイドなどの微生物によって引き起こされ得る。
【０２７１】
現在好ましい実施形態では、微生物は、マイコバクティエラ属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｉｅｒａ）、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、リステリア属、腸球菌、ナイセリア属、ビブリオ属、トレポネーマ属（梅毒）、ボレリア属、レプトスピラ属、クラミジア属、レトロウイルス（ＳＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、サイトメガロウイルス、ポックスウイルス、エブスタイン（Ｅｂｓｔｅｉｎ）バーウイルス、エンテロウイルス、モルビリウイルス、ラブドウイルス（狂犬病）。ルビウイルス（風疹）、フラビウイルス（デング、黄熱）、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＣおよびＢ型肝炎、リーシュマニア属、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ、マラリア原虫（熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫）、ニューモシスチス・カリニ（ＰＣＰ）、コロナウイルス（たとえば重症獲得呼吸器症候群（ＳＡＲＳ））、エボラまたはマーブルグおよび様々な線虫、吸虫からなる群から選択される。
【０２７２】
さらにより好ましい実施形態では、微生物は、マイコバクテリア属、リーシュマニア属、クラミジア属およびサイトメガロウイルスからなる群から選択される。
【０２７３】
感染症がマイコバクテリア属によって引き起こされているまたは引き起こされていた場合、前記マイコバクテリア属は、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合生物（結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ結核菌およびエム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ））、および相違領域（ＲＤ１）が欠失していないマイコバクテリア属（カンサシ菌、エム・ツルガイ、エム・マリヌム、エム・フラベセンス（Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、エム・ガストリイ（Ｍ  ｇａｓｔｒｉｉ））またはヒトに病原性のあるマイコバクテリア属（トリ結核菌、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａ）もしくは他の非結核性マイコバクテリア）に属する。
【０２７４】
したがって、現在好ましい一実施形態では、マイコバクテリア属は結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である。
【０２７５】
結核
結核（一般的にＴＢと略記される）とは、最も一般的には肺（肺ＴＢ）を冒すが、身体中のすべての他の器官、たとえば、中枢神経系（髄膜炎）、リンパ系、循環系（粟粒結核）、泌尿生殖器系、骨および関節も冒すことができる、細菌である結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）によって引き起こされる感染性疾患である。また、結核菌の感染症は無症候性のまま保たれる場合もあり、これは一般的に潜伏性、休眠中または無症候性のＴＢ感染症として知られる。この段階から、感染症は活動性疾患へと進行することができ、これは、多くの場合は免疫不全、たとえばＨＩＶの同時感染症または免疫抑制性の処置によって引き起こされるものが原因である。
【０２７６】
現在好ましい実施形態では、本発明は、結核の様々な、たとえば明確な提示、すなわち、活動性結核性疾患、活動性の顕微鏡観察陽性または顕微鏡観察陰性のＴＢ感染症、潜伏性結核感染症、および最近の結核感染症を診断および監視する方法に関する。
【０２７７】
この方法は、結核菌の分泌タンパク質の選択されたペプチド配列に応答する抗原提示細胞（たとえば単球／マクロファージ）と相互作用する抗原に特異的なＴリンパ球による、ＩＰ−１０などの免疫シグナル伝達分子の産生の評価に基づく。これらのペプチド配列は、その免疫原性およびその特異性について選択されており、潜在的には他のペプチドも同様に使用することができる。
【０２７８】
この方法は、活動性結核性疾患を診断するため、痰陽性の肺結核を有する患者と接触した健常者における最近の感染症を診断するため、潜伏感染を有する健常者を診断するため、肺のおよび肺外の結核の場合は処置に対する応答を監視するため、および潜伏感染と活動性結核病状とを判別するために使用することができる。
【０２７９】
哺乳動物
「哺乳動物」または「対象」への言及には、ヒト、または霊長類、それだけには限定されないが、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、臨床検査動物およびコンパニオン動物などの家畜動物を含めた非ヒト種が含まれる。したがって、本発明は、ヒトの医学において応用を有しており、また、家畜および獣医学ならびに野生生物の応用も有する。
【実施例】
【０２８０】
以下の実施例では、試験抗原に特異的な細胞媒介性免疫応答を増大させるための、高温状態の使用ならびに／またはＩＬ７および抗ＩＬ−１０の存在を、結核菌からの抗原を用いた刺激を例として使用して実証する。
【０２８１】
全般的な方法
ドナー
予備研究（実施例１）には、血液試料を、研究現場で採用した健康なドナー、およびビィドゥビェ病院、感染性疾患科（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｈｖｉｄｏｖｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の外来患者クリニックに通う、ＴＢが疑われるまたはその処置を開始する患者から採取した。
【０２８２】
ＢＣＧワクチン研究（実施例２〜５および７）には、血液試料を、研究現場であるデンマークのビィドゥビェ病院、感染性疾患科または臨床研究センター（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ）の外来患者クリニックで採用した３５人の健康なドナーから採取した。３５人のドナーをＢＣＧワクチン接種またはＢＣＧワクチン非接種に分類し、デンマーク人の子供のＢＣＧワクチン接種は１９７５年に廃止されたため、ドナーが自身のＢＣＧワクチン接種状態を知っていない限りは、分類は出生年に従って行った。
【０２８３】
ＴＢ診断研究（実施例６〜７）には、血液を、デンマークのビィドゥビェ病院、感染性疾患科の外来患者クリニックに通う、ＴＢが疑われるまたはその処置を開始する患者から採取した。
【０２８４】
試薬および器材
ＢＣＧワクチン研究には、ＴＢ１０．４ペプチドを抗原として使用し（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ、ドイツＢｅｒｌｉｎ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）からのレクチンをマイトジェンとして使用した（ＰＨＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ、米国ミズーリ州）。追加の刺激剤（免疫変調剤）として、本発明者らは組換えヒトＩＬ−７（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、米国Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）およびヒトインターロイキン１０に対するモノクローナル抗体（抗ＩＬ−１０、ＭＢＬ  Ｉｎｔｌ．、米国マサチューセッツ州）を使用した。温度インキュベーションには、本発明者らはインキュベーター、水浴および加熱ブロックを使用した。
【０２８５】
ＴＢ診断研究には、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ  ＴＢ  Ｇｏｌｄ  Ｉｎ  ｔｕｂｅ採血チューブを使用した。これらは、ＴＢ特異的抗原（ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、ＴＢ７．７）を含有する抗原チューブ、ＰＨＡを含有するマイトジェンチューブ、およびｎｉｌチューブからなる。ＢＣＧワクチン研究およびＴＢ診断研究には、３７℃でのインキュベーションにはインキュベーターを使用した一方で、３９℃でのインキュベーションにはインキュベーター内に入れた水浴を使用した。温度はそれぞれのインキュベーションのラウンド中に少なくとも２時間間隔で少なくとも４回確認し、０．２℃を超える変動はなかった。
【０２８６】
バイオマーカー測定のための採血およびインキュベーション
ＴＢ診断研究のために、血液をヘパリン処理したチューブ（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、英国Ｐｌｙｍｏｕｔｈ）またはＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ採血チューブ中に採取した。
【０２８７】
予備研究には、１ｍｌの血液をｎｕｎｃ  ｃｒｙｏｔｕｂｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、デンマークＲｏｓｋｉｌｄｅ）に移し、ここで本発明者らはインキュベーションを最適化するための一連のステップに従った。ステップ１：ＰＨＡおよびＴＢ１０．４の、それぞれ０．１６〜２０μｇ／ｍｌおよび０．０４〜２０μｇ／ｍｌの滴定。ステップ２：  ３回の連続的な試行における、様々な温度での試料のインキュベーション：ｉ）２０、３０、３７、３９、４１および４３℃、ｉｉ）３７、３８、３９、４０、４１および４２℃ならびにｉｉｉ）３７．０、３７．３、３７．９、３８．５、３９．０、３９．５および３９．９℃で、それぞれ１８時間のインキュベーション。ステップ３：０、６、９、１２、１５、１８、２４および４８時間、それぞれ３７および３９℃での試料のインキュベーション。ステップ４：ＩＬ−７（２．０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＩＬ−１０（１．０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−７と抗ＩＬ−１０の両方と共に、１８時間、それぞれ３７および３９℃で、かつそれぞれのチューブに２ｍｇ／ｍｌのデキストロースを加えた、試料のインキュベーション。ＩＬ−７および抗ＩＬ−１０の濃度は文献から採用した［Ｆｅｓｋｅ、Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００８、Ｄｅｎｉｓ、Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００７］。
【０２８８】
ＢＣＧワクチン研究には、１ｍｌの血液をｎｕｎｃ  ｃｒｙｏｔｕｂｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、デンマークＲｏｓｋｉｌｄｅ）に移し、関連する刺激剤を加えた。それぞれの試行について、３つの試料を異なる刺激剤と共に、すなわち、抗原チューブをＴＢ１０．４ペプチド懸濁液と共に、マイトジェンチューブをＰＨＡ懸濁液と共に、およびバックグラウンド測定用にｎｉｌチューブをＰＢＳと共に、追加のサイトカインなしで、ＩＬ−７（２．０ｎｇ／ｍｌ）と共に、抗ＩＬ−１０（１．０μｇ／ｍｌ）と共に、またはＩＬ−７および抗ＩＬ−１０の両方と共に、１８時間、それぞれ３７および３９℃でインキュベーションして、ドナーあたり合計２４本チューブが得られた。デキストロースをすべてのチューブに２ｍｇ／ｍｌの濃度まで加えた。
【０２８９】
ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ研究には、１ｍｌの血液をそれぞれの採血チューブ（ｎｉｌ、抗原およびマイトジェン）に移した。その後、これらを、追加の刺激剤なしで、またはＩＬ−７（２．０ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ−１０（１．０μｇ／ｍｌ）と共に、摂氏３７または３９℃で１８時間インキュベーションした。
【０２９０】
測定
予備およびＢＣＧワクチンの研究には、ＩＰ−１０の測定を血漿収集の直後に行い、ここで試料を摂氏−８０℃で凍結した。６カ月後、ＢＣＧワクチン研究試料を解凍し、ＩＦＮ−γの測定を行った。ＴＢ診断研究には、血漿をインキュベーションの直後に収集し、摂氏−８０℃で凍結した。ＩＰ−１０およびＩＦＮ−γの測定は６〜８カ月後に同時に行った。ＩＰ−１０の測定には、試料をアッセイ希釈剤で１：９に希釈し、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して二つ組で２０００ｐｇ／ｍｌから３１．８ｐｇ／ｍｌまでの直線性を有する検量線を用いて実行した。手短に述べると、ＮＵＮＣ  ＭａｘｉＳｏｒｂプレートを、ヒトＩＰ−１０に特異的なマウスモノクローナルｍＡｂで終夜コーティングした。プレートを洗浄し、１０％のウシ血清アルブミンを含む緩衝液を使用して遮断した。その後、血漿試料を二つ組で加え、１時間、摂氏３７℃でインキュベーションした。その後、プレートを洗浄し、西洋ワサビ過酸化酵素とカップリングさせたマウス検出ｍＡｂを加え、摂氏３７℃で４５分間インキュベーションさせた。その後、プレートを×７洗浄し、ＴＭＢ基質を加えた。プレートを１５分間展開させ、その後、１ＭのＨ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止させた。市販のＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢ  Ｇｏｌｄ（ＱＦＴ−ＩＴ）ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ−γレベルを測定した。ＩＦＮ−γのレベルをより良好に定量するために、ＱＦＴ−ＩＴ  ＥＬＩＳＡの検量線を延ばして、８００〜１２．５ｐｇ／ｍｌの直線性を与えた。すべての他の側面は製造者の指示に従った。１ＩＵは５０ｐｇのＩＦＮ−γに等しい。
【０２９１】
提示したデータでは、別段に指定しない限りはバイオマーカーのバックグラウンドレベル（ｎｉｌ）を減算した（生の値）。バイオマーカーの抗原依存性レベルを「ａ」と示す一方で（すなわちａＩＦＮ−γおよびａＩＰ−１０）、マイトジェン誘導性のバイオマーカーレベルを「ｍ」と示す（すなわちｍＩＦＮ−γおよびｍＩＰ−１０）。
【０２９２】
白血球のレベルおよび分画はビィドゥビェ病院の臨床検査室（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で測定した。
【０２９３】
統計分析。
データはＳＡＳ９．２（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国ノースカロライナ州Ｃａｒｙ）を使用して分析した。どのパラメータも正規分布されていなかったため、すべての試験はノンパラメトリック試験を使用して行った（ウィルコクソン符号順位検定およびスピアマン相関試験）。相乗効果は、それぞれの刺激単独を加算した値よりも大きい、２つの刺激（抗ＩＬ−１０、ＩＬ−７および温度）を合わせた効果として定義された。すべての試験は両側で行い、ｐ値≦０．０５を有する結果が有意とみなされた。
【０２９４】
倫理的配慮。
研究を実施する許可は、コペンハーゲン自治体の倫理委員会から得た。すべての研究参加者は参加のインフォームドコンセントを書面で預け、いつでも研究から脱退することが自由であった。
【０２９５】
［実施例１］
（予備研究）
高温温度はＩＰ−１０およびＩＦＮ−γの応答を増大させる。
【０２９６】
本発明者らは、インキュベーション温度を上昇することによってＩＰ−１０およびＩＦＮ−γの応答を増大させることができるかどうかを調査した。
【０２９７】
結果
図１は、予備研究からの２人の代表的な個体を示すスパゲッティ図であり、これらの実験の発見を１１人の追加の個体でも再現することができた。本発明者らは、シグナルは摂氏３９．５℃までの温度で一貫してかつ有意に増加したことを見い出したが、より高い温度では応答の急減を観察した。
【０２９８】
結論として、高温状態でのインキュベーションは、摂氏３７℃でのインキュベーションと比較して、ＢＣＧワクチン接種した個体からの全血をＢＣＧ特異的抗原で刺激した場合に、増加したＩＰ−１０およびＩＦＮ−γの応答をもたらす。
【０２９９】
高温でのインキュベーションは、偽陰性および不確定試験結果の数を低下させ、したがって、抗原に特異的な刺激の後に誘導されたＩＰ−１０および／またはＩＦＮ−γなどのバイオマーカーの存在／レベルの決定に依存する試験の感度および対費用効果を改善させるための容易な方法として、大きな潜在性を有している。
【０３００】
［実施例２］
（ＢＣＧワクチン研究）
全血を結核菌特異的抗原（ＴＢ１０．４）で刺激することによって誘導した血漿ＩＰ−１０のレベルを測定することによる、ドナーの非応答者および応答者への区分。
【０３０１】
合計３５人のドナー、すなわち、１６人のＢＣＧワクチン接種し、したがってＴＢ１０．４抗原に応答する可能性の高いドナー、および１９人のワクチン接種していない、ＴＢ１０．４抗原に応答する可能性の低いドナーを試験した。全血を採血し、１８時間、それぞれ摂氏３７℃および摂氏３９℃で、抗原ＴＢ１０．４からのペプチドのカクテルと共にインキュベーションした。
【０３０２】
予備調整に基づいて、本発明者らは、標準の摂氏３７℃のインキュベーションを新しい摂氏３９℃のインキュベーションと比較することを選択した。本発明者らは、安定なシステムに関する概念証明のデータを望んでいたため、明らかに劣性の摂氏３９℃〜摂氏３９．５℃を選択した。
【０３０３】
結果
本発明者らは、全血を３４人の健康なドナーから採取した（静脈穿刺に失敗したため、１人のＢＣＧワクチン接種したドナーを排除した）。ＴＢ１０．４と共にインキュベーションした全血試料の血漿中のＩＰ−１０のレベルをインハウスＥＬＩＳＡによって測定した（上述のように）。
【０３０４】
ＩＰ−１０を測定した後、本発明者らは参加者を２つの群、すなわち、誰がｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫応答を生じさせることができるかおよびできないかによって定義した、応答者および非応答者に分割した（標準のインキュベーション温度３７℃でインキュベーションした場合に、タンパク質ＴＢ１０．４からのペプチドに対するＩＰ−１０産生>５００ｐｇ／ｍｌを用いて、自由裁量で定義）（図２および表１を参照）
【０３０５】
【表１】
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【０３０６】
非応答者および応答者の間に、年齢にも白血球数にも有意な差異は存在しなかった。
【０３０７】
［実施例３］
ＩＬ−７および／または抗ＩＬ−１０を用いたまたは用いない高温インキュベーションはＩＰ−１０の応答を改善させる。
【０３０８】
本発明者らは、上述の３４人の応答者および非応答からの試料を試験することによって、ＩＰ−１０の応答に対する高温インキュベーションの効果を妥当性確認した。
【０３０９】
次に、本発明者らは、インキュベーション中のサイトカインＩＬ−７の存在が応答を改善させるかどうかを試験した。また、本発明者らは、系中の既知の主要な（ｃａｒｄｉｎａｌ）阻害剤を阻害すること（すなわち阻害剤を阻害すること）によって、阻害性サイトカインＩＬ−１０の遮断がＩＰ−１０の応答に影響を与えるかどうかも試験した。
【０３１０】
結果
図３Ａ〜Ｄは、ＩＰ−１０の応答を８列で示す。最初の４列は摂氏３７℃でのインキュベーションを表し、最後の４列は摂氏３９℃でのインキュベーションを表す。研究参加者からの血液をアリコートへと分割し、すべての様々な培養条件に供した、すなわち、列を直接比較することができる。バックグラウンドレベル（ｎｉｌ）を抗原およびマイトジェン応答から減算している。
【０３１１】
図３Ａは、非応答者（ｎｏｎ−ｒｅｓｐ．）における、バイオマーカーレベルに対する様々なインキュベーション条件の影響を示す。様々な培養条件間で応答性のわずかな有意な差異が見られたが、興味深いことに、非応答者のうちの２人が摂氏３９℃で応答するようになった。非応答者群の中でＢＣＧワクチン接種した人は、現在使用されている方法では非応答者となるこの２人だけであり、また、この２人は、図２中の非応答者のうちで「最も高い」ＩＰ−１０シグナルを有する者でもあった。これらの驚くべき発見は、高温インキュベーション方法は、そうでなければ「偽陰性」である低応答者からの応答をブーストさせ、したがって、伝統的な摂氏３７℃の方法と比較して感度を増加させることができることを示している。
【０３１２】
図３Ｂは応答者の結果を示す。摂氏３７℃と比較して摂氏３９℃でＩＰ−１０の応答性の特筆すべき改善が見られる。ＩＬ−７の添加、ＩＬ−１０の遮断、および特に両方の組合せが、ＩＰ−１０シグナルをさらに改善させる。したがって、非常に少数が摂氏３９℃で「低応答者」のままである。
【０３１３】
図３Ｃでは、本発明者らは、インキュベーションの様々な改変に伴う増加したバックグラウンドＩＰ−１０レベルの潜在的な問題を調査する。特に高温が実際に、系中でより高い度合のノイズをもたらすことは明らかであるが、このレベルは、応答者からの応答で見られる特筆すべき改善と比較して無視できる（軸スケールの差に注目されたい）。
【０３１４】
図３Ｄでは、本発明者らは、非特異的ＰＨＡマイトジェン刺激に対するＩＰ−１０の応答を比較する。本発明者らは３Ｂからの発見を再現しており、したがって、この発見が、特異的ペプチドで刺激した場合のみだけでなく、非特異的刺激でも存在することを実証している。
【０３１５】
したがって、３４人の応答者および非応答者を試験する際、本発明者らは、実施例１でも観察されたように、摂氏３９℃での高温インキュベーションがＩＰ−１０の応答を改善させることを見い出した。
【０３１６】
グラフから、マイトジェンに対するＩＰ−１０の応答性の増加は抗原刺激に対する応答性よりも低かったように見えるが、アッセイの上限濃度がＩＰ−１０およびＩＦＮ−γでそれぞれ２００００ｐｇ／ｍｌおよび８００ｐｇ／ｍｌであるため、これは人為結果（ａｒｔｅｆａｃｔ）であり、したがってこれらの限界を超える濃度は不正確である。
【０３１７】
結論として、この発見は、高温インキュベーション方法が、放出されたＩＰ−１０の規模を増加させ、偽陰性および不確定試験結果の数を低下させ、これにより伝統的な摂氏３７℃の方法と比較して感度を増加させることができることを示している。さらに、ＩＬ−７の添加、ＩＬ−１０の遮断、および特に両方の組合せが、ＢＣＧワクチン接種した個体からの全血をＢＣＧ特異的抗原で刺激した場合に、ＩＰ−１０の応答を増加させる。
【０３１８】
［実施例４］
高温インキュベーションならびにＩＬ−７および／または抗ＩＬ−１０の存在がＩＦＮ−γの応答を改善させる。
【０３１９】
本発明者らは、３４人の応答者および非応答者からの試料を試験し、ＩＬ−７の添加またはＩＬ−１０の遮断がＩＦＮ−γの応答を改善させるかどうかを分析することによって、ＩＦＮ−γの応答に対する高温インキュベーションの効果を妥当性確認した。
【０３２０】
結果
図４Ａでは、ＩＰ−１０非応答者はＩＦＮ−γ非応答者でもあったことが見られる。本発明者らは、図３Ａからの発見を、同じ２人のＢＣＧワクチン接種した非応答者が３９℃のインキュベーションによって急にＴＢ−１０．４抗原に応答したことで再現できたことに満足であった。
【０３２１】
図４Ｂは、ＴＢ１０．４応答者のＩＦＮ−γレベルに対するインキュベーション条件の効果を示しており、本発明者らは、ＩＰ−１０で見られた特筆すべき改善がこのワクチンリコール試験システムにおいてＩＦＮ−γについてそれほど明白でなかったという発見に驚いた。ノンパラメトリック分析によって分析した場合に、上昇した温度単独での顕著な改善は存在しなかったが、本発明者らは、増加したインキュベーション温度が、最も低い応答を有する応答者において増加した応答性をもたらしたことを見い出した。
【０３２２】
図４Ｃは、摂氏３９℃のインキュベーション温度が、顕著により低いＩＦＮ−γのバックグラウンドレベルをもたらすことを例示している。興味深いことに、これは、抗原に特異的なＩＦＮ−γの応答性の改善はＩＰ−１０ほど明白でないが、より低いバックグラウンドレベルが系中でより良好なシグナル対ノイズ比をもたらす可能性があることを示す、ＩＰ−１０で見られるものとは逆の効果である（図５中に詳しく示す）。
【０３２３】
図４Ｄでは、本発明者らは非特異的ＰＨＡマイトジェン刺激に対するＩＮＦ−γの応答を比較し、この発見は図３Ｄでの発見に類似している。しかし、摂氏３９℃でのインキュベーションが単独で応答を有意に増加させることは、注目すべきである。さらに、摂氏３９℃＋ＩＬ７および抗ＩＬ−１０では、マイトジェンに対する応答性が低いドナーが非常に少数であることが見られる。
【０３２４】
したがって、３４人の応答者および非応答者を試験した際、本発明者らは、摂氏３９℃でのインキュベーションの、ＩＮＦ−γの応答に対する同様の有益効果を見い出した。
【０３２５】
グラフから、マイトジェンに対するＩＮＦ−γの応答性の増加は抗原刺激に対する応答性よりも低かったように見えるが、アッセイの上限濃度がＩＰ−１０およびＩＦＮ−γでそれぞれ２００００ｐｇ／ｍｌおよび８００ｐｇ／ｍｌであるため、これは人為結果（ａｒｔｅｆａｃｔ）であり、したがってこれらの限界を超える濃度は不正確である。
【０３２６】
結論として、高温状態でのインキュベーションは、全血をＢＣＧ特異的抗原で刺激した場合に、最も低い応答者において増加した応答性および減少したバックグラウンドレベルをもたらす。さらに、ＩＬ−７の添加およびＩＬ−１０の遮断はＩＮＦ−γシグナルを増大させた。したがって、非常に少数が摂氏３９℃で「低応答者」のままである。
【０３２７】
したがって、本発明の一実施形態は、免疫抑制（ＨＩＶ、癌、様々な種類の医療）を有する患者からの細胞を、摂氏３９℃でのインキュベーションによって応答性にさせる方法に関する。これにより、これらの困難な患者群において、免疫診断試験のより良好な性能（すなわちより少ない不確定試験結果）がもたらされる。
【０３２８】
［実施例５］
ＩＰ−１０およびＩＮＦ−γの産生に対する、高温インキュベーションならびにＩＬ−７および／または抗ＩＬ−１０の存在の相乗効果。
【０３２９】
すべての刺激を組み合わせることで、抗原およびマイトジェンの両方の刺激後のすべての他の組合せと比較して、ＩＰ−１０およびＩＦＮ−γの両方のより優れたレベルが与えられた。本発明者らは、高温インキュベーション（温度）と抗ＩＬ−１０を添加する組合せを除いて、抗原およびマイトジェンの両方の刺激後に高温インキュベーションをＩＬ−７および／または抗ＩＬ−１０の添加と共に使用することの、ＩＰ−１０産生に対する相乗効果を見い出した（すべてｐ<０．０５、表２）。バックグラウンドＩＰ−１０レベルで観察される相乗効果は、刺激を適用した際の増加したバックグラウンドＩＰ−１０レベルが原因であった。ＩＦＮ−γでは、相乗効果は、抗原刺激後に高温インキュベーションをＩＬ−７および抗ＩＬ−１０と一緒に使用した際に観察された。また、抗ＩＬ−１０の添加を用いてまたは用いずに、ＩＬ−７を加え、高温インキュベーションを使用することは、バックグラウンドＩＦＮ−γレベルを相乗的に下げた。
【０３３０】
本発明者らは、単球またはリンパ球数と、ＩＰ−１０またはＩＦＮ−γの抗原依存性またはマイトジェン誘導性の産生レベルとの間に、相関を見い出さなかった（データ示さず）。
【０３３１】
【表２】
2013532274.tif 000004
【０３３２】
［実施例６］
高温インキュベーションは、ＴＢを診断するためのＴＢ特異的試験抗原に対するＩＦＮ−γおよびＩＰ−１０の両方の応答性を増加させる。
【０３３３】
その後、本発明者らは、ＩＬ−７の添加およびＩＬ−１０の遮断を用いたまたは用いない、摂氏３９℃でのＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ  ＴＢ  Ｇｏｌｄ  Ｉｎ  ｔｕｂｅ試験管のインキュベーション後のＩＦＮ−γおよびＩＰ−１０レベルを、それぞれ摂氏３７℃での通常のインキュベーションと比較した。血液を、ＴＢが疑われるまたはその処置を開始する、結核が疑われる９人の患者から採取した。血漿中のＩＰ−１０のレベルはインハウスＥＬＩＳＡによって測定し（上述のように）、ＩＦＮ−γのレベルはＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ  ＴＢ  Ｇｏｌｄ  ＥＬＩＳＡを使用して測定した（上述のように）。
【０３３４】
結果
図５Ａ〜Ｃおよび６Ａ〜Ｃは、ＩＰ−１０およびＩＦＮ−γについてそれぞれＩＰ−１０の応答を４列で示す。最初の２列は摂氏３７℃でのインキュベーションを表し、後者はＩＬ−７および抗ＩＬ−１０を用いたまたは用いない、摂氏３９℃でのものをそれぞれ表す。バックグラウンドレベル（ｎｉｌ）を抗原およびマイトジェンの応答から減算している。
【０３３５】
図５Ａおよび６Ａでは、本発明者らは、インキュベーションの様々な改変に伴う増加したバックグラウンドレベルの潜在的な問題を調査する。様々なインキュベーション条件間でバックグラウンドＩＰ−１０レベルの有意な増加は見い出されなかった。興味深いことに、ワクチン特異的応答の発見と類似しているが、ＩＦＮ−γのバックグラウンドレベルは、摂氏３９℃でインキュベーションした場合により低かった。
【０３３６】
図５Ｂおよび６Ｂは、抗原チューブ中のＩＰ−１０およびＩＦＮ−γのレベルをそれぞれ示す。特にＩＬ−７を加え、ＩＬ−１０を遮断した場合に、摂氏３７℃と比較して、摂氏３９℃でＩＰ−１０およびＩＦＮ−γの両方におけるＴＢ特異的抗原の応答性の特筆すべき改善が見られる。効果は、ワクチン特異的応答で見られる効果よりもさらに明白である（図３および４中）。したがって、非常に少数が摂氏３９℃で低または非応答者のままである。
【０３３７】
図５Ｃおよび６Ｃでは、本発明者らは、ＰＨＡマイトジェンチューブ中のＩＰ−１０およびＩＦＮ−γの応答をそれぞれ比較する。本発明者らは５Ｂおよび６Ｂからの発見を再現しており、したがって、この発見が、特異的ペプチドで刺激した場合のみだけでなく、非特異的刺激でも存在することを実証している。
【０３３８】
したがって、本発明者らは、疑わしいＴＢ患者をＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ  ＴＢ  Ｇｏｌｄ  Ｉｎ  ｔｕｂｅ試験システムで試験した際、上記のワクチンリコールの実施例でも観察されたように、摂氏３９℃での高温インキュベーションがＩＰ−１０およびＩＦＮ−γの応答をどちらも改善させたことを見い出した。
【０３３９】
試験結果へと解釈した際、摂氏３７℃でインキュベーションした場合に、ＩＬ−７および抗ＩＬ−１０を加えた場合でも、１人の患者が陰性（１７．５ｐｇ／ｍｌ未満の抗原応答および２５ｐｇ／ｍｌを超えるマイトジェン応答）、２人が不確定なＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ結果（１７．５ｐｇ／ｍｌ未満の抗原応答および２５ｐｇ／ｍｌ未満のマイトジェン応答）を有していた。ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ陰性結果を有する患者は、インキュベーション条件に関係なく陰性のままであった。最初はＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ不確定結果を有する１人の患者が、摂氏３９℃でインキュベーションした際に、どちらのＩＦＮ−γも非常に高レベルの陽性へと変換された。不確定のｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ結果を有する他方の患者は、抗原性刺激後に一貫して低いＩＦＮ−γの応答を有するが摂氏３９℃でのインキュベーション後にのみマイトジェン刺激に強く応答しており、摂氏３９℃でのインキュベーション後にｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ陰性であるとして明らかとなった。これらの患者において同じパターンがＩＰ−１０でも見い出された。
【０３４０】
結論として、高温状態でのインキュベーションは、最も低い応答者においてでも、結核菌特異的抗原に対する増加したＩＰ−１０およびＩＦＮ−γの応答性をもたらす。さらに、これは、全血を結核菌に特異的な抗原で刺激した場合にもバックグラウンドＩＦＮ−γレベルを減少させた。ＩＬ−７の添加およびＩＬ−１０の遮断は、ＩＰ−１０およびＩＦＮ−γの両方のレベルを増大させた。したがって、非常に少数が摂氏３９℃で「低応答者」のままである。
【０３４１】
これらの発見は、高温インキュベーション方法が偽陰性および不確定試験結果の数を低下させ、それにより伝統的な摂氏３７℃の方法と比較して感度を増加させることができることを示している。この方法はワクチン応答および抗原に特異的な刺激に基づく診断試験について例示されており、抗原の特異性を変化させることによって、それだけには限定されないが癌の診断学および癌の監視などの他の指標にも拡張することができる。
【０３４２】
［実施例７］
この方法は、ｎｉｌと抗原との間の分離を改善させ、これにより抗原特異的応答のシグナル対ノイズ比を改善させる。
【０３４３】
なぜ本方法がＩＦＮ−γの診断的情報を改善させるかをより良好に例示するために、すべての様々な培養条件について、ワクチン特異的抗原刺激後に、抗原およびマイトジェンの生の値をｎｉｌと比較してプロットした（図７）。ｎｉｌと抗原との間のより良好な分離は、より良好なシグナル対ノイズを意味する。摂氏３９℃＋ＩＬ−７＋抗ＩＬ−１０のカクテルが、より高い抗原応答およびより低いｎｉｌ応答、したがってｎｉｌと抗原との間の完璧な分離をもたらすことは、明らかである。
【０３４４】
改善された分離を完全に理解するために、マイトジェンおよび結核菌に特異的な（ＥＳＡＴ６、ＣＦＰ１０、ＴＢ７．７）抗原を用いた刺激の両方について、応答比を計算した（すなわち刺激したレベルをｎｉｌレベルで除算した）。図８ＡにＩＦＮ−γ  ｎｉｌ値を提示し、抗原およびマイトジェンを用いた応答比をそれぞれ８Ｂおよび８Ｃ中に提示する。図９ＡにＩＰ−１０  ｎｉｌ値を提示し、抗原およびマイトジェンを用いた応答比をそれぞれ９Ｂおよび９Ｃ中に提示する。ここでも、摂氏３９℃（任意選択でＩＬ−７および抗ＩＬ−１０カクテルを用いる）がより高い抗原応答およびより低いｎｉｌ応答、したがってｎｉｌと抗原との間の完璧な分離をもたらすことは明らかである。
【０３４５】
参考文献
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Ｋａｐｐｅｌ  Ｍ、Ｄｉａｍａｎｔ  Ｍ、Ｈａｎｓｅｎ  ＭＢ、Ｋｌｏｋｋｅｒ  Ｍ、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ＢＫ。血液単核細胞部分組の増殖性応答、ならびにインターロイキン１および６、腫瘍壊死因子−アルファおよびインターフェロン−ガンマの検出に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ高温の効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ，ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ  １  ａｎｄ  ６，  ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ）。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９１年７月、７３（３）：３０４〜８。
Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  Ｉ、Ｗａｔｅｒｓ  ＷＲ、Ｖｏｒｄｅｒｍｅｉｅｒ  ＨＭ、Ｎｏｎｎｅｃｋｅ  Ｂ、Ｗｅｌｓｈ  Ｍ、Ｋｅｃｋ  Ｎ、Ｗｈｅｌａｎ  Ａ、Ｓｉｇａｆｏｏｓｅ  Ｔ、Ｓｔａｍｍ  Ｃ、Ｐａｌｍｅｒ  Ｍ、Ｔｈａｃｋｅｒ  Ｔ、Ｈａｒｄｅｇｇｅｒ  Ｒ、Ｍａｒｇ−Ｈａｕｆｅ  Ｂ、Ｒａｅｂｅｒ  Ａ、Ｏｅｓｃｈ  Ｂ。ウシ結核菌に感染した畜牛を検出するための全血ガンマインターフェロンアッセイの最適化（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｗｈｏｌｅ−ｂｌｏｏｄ  ｇａｍｍａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃａｔｔｌｅ）。Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００９、１６（８）：１１９６〜１２０２。
Ｆｅｓｋｅ  Ｍ、Ｎｕｄｅｌｍａｎ  ＲＪ、Ｍｅｄｉｎａ  Ｍ、Ｌｅｗ  Ｊ、Ｓｉｎｇｈ  Ｍ、Ｃｏｕｔｕｒｉｅｒ  Ｊ、Ｇｒａｖｉｓｓ  ＥＡ、Ｌｅｗｉｓ  ＤＥ。インターロイキン−７によるヒト抗原に特異的なメモリーＴ細胞応答の増強は結核の診断において正確さを改善させ得る（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−７  ｍａｙ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｉｎ  ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００８、１９：１６１６〜２２。
Ｄｅｎｉｓ  Ｍ、Ｗｅｄｌｏｃｋ  ＤＮ、ＭｃＣａｒｔｈｙ  ＡＲ、Ｐａｒレーン  ＮＡ、Ｃｏｃｋｌｅ  ＰＪ、Ｖｏｒｄｅｒｍｅｉｅｒ  ＨＭ、Ｈｅｗｉｎｓｏｎ  ＲＧ、Ｂｕｄｄｌｅ  ＢＭ。畜牛におけるウシ結核菌の感染症を診断するための全血ガンマインターフェロンアッセイの感度の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗｈｏｌｅ−ｂｌｏｏｄ  ｇａｍｍａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ）。Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００７、１１：１４８３〜９。
【図２】
2013532274.tif 000005
【図１】
2013532274.tif 000006
【図３Ａ−Ｂ】
2013532274.tif 000007
【図３Ｃ−Ｄ】
2013532274.tif 000008
【図４Ａ−Ｂ】
2013532274.tif 000009
【図４Ｃ−Ｄ】
2013532274.tif 000010
【図５】
2013532274.tif 000011
【図６】
2013532274.tif 000012
【図７】
2013532274.tif 000013
【図８】
2013532274.tif 000014
【図９】
2013532274.tif 000015
【国際調査報告】
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2013532274.tif 000017
2013532274.tif 000018