(57)【要約】ファージディスプレイによる組換え抗体ライブラリーが開発され、ライブラリーはＶＥＧＦＲ−２に対してスクリーニングされた。スクリーニングおよびＥＬＩＳＡ実験の後、ＶＥＧＦＲ−２への結合特性を示す２個の組換え抗体が得られた。２個の組換え抗体と既に開発された組換え抗体との差異が、ＤＮＡ配列分析により明示された。２個の組換え抗体の内皮細胞増殖への阻害効果は、細胞アッセイにより明示された。その結果、これらの組換え抗体は、ＶＥＧＦ関連血管新生阻害物質として使用され得る。
2013540420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え抗体ライブラリーを通してＶＥＧＦＲ−２活性を遮断する組換え抗体を得ることを特徴とする、ＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）を発現する細胞の増殖および細胞内シグナル伝達を阻害する、ファージディスプレイ技術を基にした組換え抗体の選択方法。
【請求項２】
ファージ構造がその表面に融合タンパク質として組換え抗体を提示する、請求項１に記載のｓｃＦｖライブラリー。
【請求項３】
ＶＥＧＦＲ−２の１−７免疫グロブリンドメインに特異的に結合するマウス組換え抗体である、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項４】
請求項２に記載のＶＥＧＦＲ−２に対する選択に続いて得られる構造である、請求項１に記載のＶＥＧＦＲ−２活性を遮断する組換え抗体構造。
【請求項５】
一本鎖可変断片、Ｆａｂ、一本鎖抗体、二特異性抗体、三特異性抗体などの組換え抗体を含む、請求項４に記載のマウス組換え抗体。
【請求項６】
がん細胞を含む、細胞表面にＶＥＧＦＲ−２を発現する全ての細胞型の１−７免疫グロブリンドメインに特異的に結合する、請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、
配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、
配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、
配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３、
を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項８】
ａ．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６の少なくとも１つのアミノ酸配列、
ｂ．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６の少なくとも３つの連続するアミノ酸配列、
を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項９】
可変重鎖または可変軽鎖をコードする配列番号７または配列番号８の少なくとも１つの配列を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６のいずれかの組み合わせを含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項１１】
配列番号９で示される核酸配列を有するＣＤＲＨ１、
配列番号１０で示される核酸配列を有するＣＤＲＨ２、
配列番号１１で示される核酸配列を有するＣＤＲＨ３、
配列番号１２で示される核酸配列を有するＣＤＲＬ１、
配列番号１３で示される核酸配列を有するＣＤＲＬ２、
配列番号１４で示される核酸配列を有するＣＤＲＬ３、
を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項１２】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４の少なくとも１つの核酸配列を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項１３】
配列番号１５に示される可変重鎖核酸配列または配列番号１６に示される可変軽鎖核酸配列またはその両方を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項１４】
配列番号３３に示されるアミノ酸配列および配列番号３４に示される核酸配列をもつ少なくとも１４アミノ酸の軽および重可変鎖を接続するリンカーを含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項１５】
ａ．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６のいずれかのアミノ酸配列のキメラまたはヒト化抗体の一部としてまたはペプチドとしての使用、
ｂ．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６のいずれか３つの連続するアミノ酸配列のキメラまたはヒト化抗体の一部としてまたはペプチドとしての使用、
ｃ．配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４のいずれかの核酸配列のペプチドの合成またはキメラまたはヒト化抗体の産生のための使用、
を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項１６】
配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、
配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、
配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、
配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、
配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、
配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３、
を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項１７】
ａ．配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２の少なくとも１つのアミノ酸配列、
ｂ．配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２の少なくとも３つの連続するアミノ酸配列、
を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項１８】
配列番号２３に示される可変重鎖アミノ酸配列または配列番号２４に示される可変軽鎖アミノ酸配列またはその両方を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項１９】
配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２のいずれかの組み合わせを含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項２０】
配列番号２５で示される核酸配列を有するＣＤＲＨ１、
配列番号２６で示される核酸配列を有するＣＤＲＨ２、
配列番号２７で示される核酸配列を有するＣＤＲＨ３、
配列番号２８で示される核酸配列を有するＣＤＲＬ１、
配列番号２９で示される核酸配列を有するＣＤＲＬ２、
配列番号３０で示される核酸配列を有するＣＤＲＬ３、
を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項２１】
配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０の少なくとも１つの核酸配列を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項２２】
配列番号３１に示される可変重鎖核酸配列または配列番号３２に示される可変軽鎖核酸配列またはその両方を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項２３】
ａ．配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０のいずれかのアミノ酸配列のキメラまたはヒト化抗体の一部としてまたはペプチドとしての使用、
ｂ．配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０のいずれか３つの連続するアミノ酸配列のキメラまたはヒト化抗体の一部としてまたはペプチドとしての使用、
ｃ．配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０のいずれかの核酸配列のペプチドの合成またはキメラまたはヒト化抗体の産生のための使用、
を含む請求項４に記載の組換え抗体。
【請求項２４】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０の核酸配列を含む組換えベクター。
【請求項２５】
下記の核酸配列：配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０、の少なくとも１つを含む、細菌、ほ乳類細胞および酵母ベクターを含む組換えベクター。
【請求項２６】
下記のタンパク質またはＤＮＡ配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０を含む医薬組成物および医薬上許容できる担体としてのそれらの使用。
【請求項２７】
ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ−２の相互作用、ＶＥＧＦ介在血管内皮細胞増殖、血管新生、環境枝の制御された放出を提供する血管新生を阻害するための、請求項４に記載の組換え抗体の使用。
【請求項２８】
がんなどの血管新生関連疾患、糖尿病性網膜症、血液系腫瘍および血管新生症候群において血管新生を阻害するための請求項４に記載の組換え抗体を含む医薬化合物の製造。
【請求項２９】
請求項４に記載のペプチドを含むＶＥＧＦ標識試薬または捕捉試薬の開発。
【請求項３０】
治療目的の標識薬剤と結合した請求項４の組換え抗体の使用。
【請求項３１】
放射性および蛍光化合物、酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、ビオチン、ストレプトアビジン、ナノ粒子（例えば金および磁性粒子、ナノチューブ、量子ドット）の、請求項４に記載の組換え抗体の標識のための標識薬剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の第一の目的は、ＶＥＧＦＲ２（細胞外ドメイン）との相互作用を通じて、腫瘍成長において極めて重要な役割を果たす血管新生における阻害剤として関与でき、その結果血管新生に関する疾患メカニズムに関与することができる組換え型の一本鎖可変断片抗体を得ることである。
【背景技術】
【０００２】
生存組織の成長に必要である酸素および栄養物は、血管を通して組織まで運搬され、一方で廃棄物もまた、血管を通して組織から搬出される。血管新生、既に存在する血管からの新たな血管の成長、は胚形成、傷治癒および雌の生殖器官における月経期間での生理的現象である一方で、関節炎、慢性炎症、炎症性腸疾患および乾癬などの炎症性疾患、および胸、膀胱、大腸、肺、神経芽腫、黒色腫、腎臓、すい臓、子宮、頸部および膠芽腫などの様々な組織のがん、さらに加齢性黄斑変性症などの眼科疾患において病理学的に現れる。
【０００３】
固形腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏでの形成、増殖、および転移における血管新生の重要性は、１９７１年に最初に主張された。（Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．，１９７１，Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ，２８５，１１８２−１１８６）。血管新生は毛細血管内皮細胞の増殖を通して現れる（Ｒｉｓａｕ  Ｗ，  １９９７，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８６，  ６７１−６７４）。全ての生物学的事象と同様に、有機体は、抗血管新生因子を分泌することによって、血管新生の刺激に応じる。血管新生促成因子（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）および抗血管新生因子は正常な条件では均衡にあり、そして、この均衡が抗血管新生因子に対して攪乱されるとき、血管新生が開始する。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は１９８９年にＦｅｒｒａｒａらによって定義された（Ｆｅｒｒａｒａ  ａｎｄ  Ｈｅｎｚｅｌ，  １９８９  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １６１，  ８５１−８５８）。ＶＥＧＦは血管新生で重要な役割を果たす（Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８０：  ４３９−４４２）。マウスでの実験が、ＶＥＧＦに関する対立遺伝子座の欠損のみで、重大な血管の問題による早期の胚死率をもたらしたことを示した（Ｃａｒｍｉｌｅｔ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８０，  ４３５−４３９）。ＶＥＧＦは４５ｋＤａの重さで、ジスルフィド結合で結合するヘパリン結合性ホモ二量体型塩基性蛋白である。これまで、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＶＥＧＦ−Ｅなどの様々なサブグループが定義されている。哺乳動物において、ＶＥＧＦ−Ａはアミノ酸の数を基に、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６およびＶＥＧＦ１４５などのアイソフォームを有する。これらのアイソフォームのうち、ＶＥＧＦ１６５は主要な一つである（Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，２００９，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ２９，  ７８９−７９１，）。
【０００４】
ＶＥＧＦは、細胞膜中のチロシンキナーゼ受容体に結合することにより、細胞内効果を示す。ＶＥＧＦ受容体は２個の部分を含む。第一の部分は、チロシンキナーゼを含む細胞内領域部分である。第二の部分は、リガンド結合領域を含む５から７個の免疫グロブリン様構造を含む細胞外領域である（Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．９：６６９−６７６）。ＶＥＧＦ受容体としてのＦｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）、ｆｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、およびＦｌｔ−４（ＶＥＧＦＲ−３）の同定に加えて、内皮細胞表面で発現され、ＶＥＧＦ−Ａに低い結合特性を有する、ニューロピリン−１およびニューロピリン−２と呼ばれる受容体構造が最近定義された。ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン含有受容体）はＴｅｒｍａｎ  ｅｔ．  ａｌ．により１９９１年に特許番号ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１３００によって定義された（Ｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：  １６７７−１６８３）。Ｆｌｋ−１配列は１９９１年に配列決定法により明らかにされた（Ｍａｔｈｈｅｗｓ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ，  ８８：９０２６−９０３０）。これらの研究は、ＫＤＲがＦＬＫ−１受容体のヒトアナログであることを示した。また、ＫＤＲおよびＦＬＫ−１受容体はまたＶＥＧＦＲ２としても知られる。
【０００５】
最も重要なＶＥＧＦ受容体は、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）であり、内皮細胞増殖および走化性に関与する（Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，  ９，  ６６９−６７６，）。ＶＥＧＦＲ−２（キナーゼ挿入ドメイン受容体／ＫＤＲ）は高レベルで血管内皮細胞および造血性細胞で発現される（Ａｓａｈａｒａ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７５，  ９６４−９６７；  Ｚｉｅｇｌｅｒ  Ｂｌ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８５，１５５３−１５５８；  Ｐｅｉｃｈｅｖ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，２０００，  Ｂｌｏｏｄ，  ９５，９５２−９５８）。ＫＤＲの細胞外部に存在する７免疫グロブリン様ドメインは、環境からのシグナルが細胞の細胞質に伝達されることを可能にする。ＫＤＲの細胞内部は細胞質内のシグナル伝達を仲介する。それゆえ、ＫＤＲとＶＥＧＦの相互作用を阻害することを目的とするいかなる分子も、受容体の１〜７免疫グロブリン様細胞外ドメインをを標的とするはずである（ＬＵ  Ｄ．  ｖｅ  ａｒｋ．，  ２０００，  ＪＢＣ  ，  ２７５，  １４３２１−１４３３０）。
【０００６】
今までのところ行われているいくつかの研究により、ＶＥＧＦが、膠芽腫、結腸直腸癌、非小細胞肺、すい臓、卵巣、急性骨髄白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病および非ホジキン、および骨髄腫など多くのタイプの癌で増加することが見いだされた（Ｒａｎｉｅｒｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，  １３，  １８４５−１８５７）。したがって、血管新生の抑制における優先目標の中にＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体がある。ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体に対して生じた構造での、ＶＥＧＦの内皮細胞上の膜貫通チロシンキナーゼ受容体との結合によって作動されるシグナル経路という異なる角度の阻害によってＶＥＧＦの機能を阻止することが可能である。
【０００７】
ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）に対する結合親和性は、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）と比較して５０倍以上であるが、ＶＥＧＦの血管新生因子の特徴、内皮細胞増殖および走化性へのその効果、は、ＫＤＲとの関連により起こる（Ｃｒｏｓｓ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  ，２００３，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；  ２８．４８８−４９４）。ＶＥＧＦＲ２をコードするプラスミドが、ＶＥＧＦＲ２を欠失する豚の大動脈内皮細胞に与えられるとき、これらの細胞が有糸分裂を起こし、走化性に関与することが示された（Ｓｈｉｂｕｙａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  ，１９９０，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８：５１９−５２４）。マウスに関するいくつかの研究が、これらの動物が、ＶＥＧＦＲ２の不十分であるか欠失された発現において、組織化された血管を欠いていたことを示した。Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．は、ＶＥＧＦＲ−２発現を欠いているマウス胚が、内皮の、および造血の前駆細胞の発生における欠如のため、初期胚期の間に死ぬことを示した（Ｓｈａｌａｂｙ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，  Ｎａｔｕｒｅ．  ３７６  （６５３５）：６２−６）。この実験で、ＶＥＧＦとＫＤＲの間の関係を遮断することが血管新生の抑制の点で重要であることが示されている。
【０００８】
１９７１年に、Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎは腫瘍の増殖が腫瘍の近くに位置する血管から生じた新たな毛細血管から運ばれる酸素およびエネルギー源に依存すると断言し、抗血管新生についての試みががんの増殖を防ぐことに関して有効なアプローチであり得ると主張した。腫瘍の増殖と血管形成活性の密接な関連は、がんの治療における、治療の追加オプションとしての血管形成剤の調査へとつながった。ＶＥＧＦに対して生じた抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を抑えたという事実の実証（Ｋｉｍ  ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：  ８４１−８４４）が、ＶＥＧＦアンタゴニストが腫瘍の血管新生の抑制剤として治療において使用され得ることを示した。今日、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体は、腫瘍学において血管新生とその結果の抑制における優先的な目的である（Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ  ａｎｄ  Ｋｅｒｂｅｌ  Ｒ．Ｓ．  ，２００５，  Ｎａｔｕｒｅ．４３８：  ９６７−９７４）。
【０００９】
近年、ＶＥＧＦ／受容体の関係の遮断を基にしたいくつかの抗血管新生の戦略が開発された。この枠組みの中では、血管新生および腫瘍を阻害するための、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ相互作用を防ぎ、かつ／またはＫＤＲシグナル伝達を抑制する抗ＶＥＧＦ抗体（Ｋａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７７，  ９３３−９３６；  Ｍａｒｇｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １９，  ８５１−８５６）；抗ＫＤＲ抗体（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８，  ３２０９−３２１４；  Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７，  ６０４−６１  １；  Ｐｒｅｗｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９，  １０  ５２０９−５２１８）；抗ＶＥＧＦ抗毒素（Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７３，  ８６５−８７０）；リボザイム（Ｐａｖｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６，  ２０９４−２１０３）；可溶性受容体（Ｈｏｌａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９，  １１３９３−１１３９８）；チロシンキナーゼ阻害剤（Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９，  ９９−１０６；  Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０，  ２１７８−２１８９；  Ｇｒｏｓｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｉｎｆｌａｍｍ．  Ｒｅｓ．  ５３（４）：１３３−４２）；抗ＶＥＧＦアンチセンス（Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４，  Ｃａｎｃｅｒ  １５  Ｌｅｔｔ．  ２０；２１２（１）：９５−１０３）；およびＲＮＡ干渉（Ｔａｋｅｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４  （１０）：３３６５−７０；  Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ９：２１０−６）などの、様々な構造がある。
【００１０】
ＶＥＧＦおよび受容体を標的とする血管新生の抑制に焦点を合わせる研究が、高まった。多くの戦略がこの目的を達成するために開発された。ｒｈｕＭａｂ  ＶＥＧＦ（ベバシズマブ）、抗血管新生および抗腫瘍活性をもつ組換えヒトモノクローナルＶＥＧＦ抗体（Ｍｏｎｋ  Ｂ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ９６，  ９０２−９０５，）およびＶＥＧＦＲ−１’ｅに対するＷｕ  Ｙらによって２００６年に開発されたモノクローナルヒト抗体（Ｗｕ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１２（２１），  ６５７３−８４）が最も重要なものの一つである。ヒトＩｇＧ１定常領域と組み合わせられたＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２ハイブリッド構造をもつＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ神経膠腫動物モデルが初期および進行期における腫瘍の治療に用いることができることを示す結果がある。（Ｇｏｍｅｚ−Ｍａｎｚａｎｏ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  １０，  ９４０．）。ラニビズマブ、４８ｋＤａ、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体のＦａｂ（抗原結合）部に含まれる、は、それに由来するモノクローナル抗体ベバシズマブ（１４８ｋＤａ）よりも軽くて薄く、その結果、硝子体内適用において細胞内膜を通り抜けることができ、すべてのＶＥＧＦアイソフォームを阻害する（Ｇａｕｄｒｅａｕｌｔ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｍ  Ａｓｓｏｃ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｓｕｐｐｌ，  １，  ２１４２）。今日、加齢黄斑変性症における治療のためのラニビズマブの使用において有望な結果を得た（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  Ｐ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，２００６，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，  ３５５，  １４１９−１４３１）。
【００１１】
モノクローナル抗体構造に加えて、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤として働くＶＥＧＦアンタゴニストのような小分子の使用もまた可能である。Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ  Ｊ．Ｗ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．によって２００３年に行われた、ＶＥＧＦ分子とＫＤＲの相互作用が起こるところの、エクソン６領域から開始されて作成されたペプチド構造の研究において、ＶＥＧＦとその受容体の相互作用を遮断することによって血管新生を阻害する７アミノ酸構造がｉｎ  ｖｉｖｏで同定された。最近、スニチニブおよびソラフェニブ、２個の小分子ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ががん治療において使用され始めた（ＫＯ  Ｊ．Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １５（６），  ２１４８−２１５７，；  Ｊｉｌａｖｅａｎｕ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １５，  １０７６）。
【００１２】
近年の遺伝子工学における発展に沿って、抗体分子の抗原認識を模擬する機能的な組換え抗体断片の形成が可能である。抗体断片として発現された、一本鎖可変断片が、ペプチド結合を介した重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の結合により構成された。これらの抗体断片は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と呼ばれる（米国特許番号４，９４６７７８  Ｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；Ｗ０８８／０９３４４，Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）。ＳｃＦｖ構造が抗原結合可変領域（Ｆｖ）を含むように、それらは最小構造で抗体分子の結合特性を提供する特徴を有する。他方で、単一領域抗体構造は標的抗原構造に結合するのに有効であり得る。
【００１３】
１９９３年に、Ｊｅｆｆｒｅｙらは、重鎖がジゴキシンに対して生じた抗体のジゴキシン結合において必須であることを示した（Ｊｅｆｆｒｅｙ，  Ｐ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  １９９３，  ９０：１０３１０−１０３１４９）。最近の研究において、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して生じた抗体の重鎖可変断片からなる「ナノボディ」構造が、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）のＥＧＦＲへの結合を妨げることが示された（Ｒｏｏｖｅｒｓ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５：３０３−３１７）。ファージディスプレイ技術において、線状ファージの表面上にＳｃＦｖが存在する（ＷＯ  ９２／０１０４７  Ｍｃ  Ｃａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．）。このアプローチで、ＶＥＧＦＲに対するナノ抗体構造を開発することが可能である。しかしながら、およそ１５ｋＤのナノ抗体構造の血液循環からの迅速な除去は治療用途の制限につながる。しかしながら、これらのナノ抗体構造は、アルブミンへの結合の特性を提供されることを確実にする５０ｋＤの多価としてそれらを再構築することにより、より長い期間血液循環中に滞在することが可能となった（Ｔｉｊｉｎｋ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．２００８，  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  ７（８）：２２８８−２２９７）。
【００１４】
ファージディスプレイ技術における線状ファージの使用は様々な利点をもたらした。培養上清からのファージ粒子の簡単な精製、遺伝子と系列データへのアクセシビリティ、および、「バイオパニング」法を使用する、多くの抗原から標的抗原を同定できる少数のファージクローンを選択する機会はこれらの利点のいくつかである。バクテリオファージ複製起点およびプラスミド複製起点の両方を含むファージミドベクターは、ファージディスプレイ技術におけるこの利便性を活用するために好ましい。これらのファージミドベクターにおける多重クローニング部位（ＭＣＳ）はファージミド（例えば、ｇＩＩＩ）のシース構造タンパク質に属する遺伝子の開始点に位置する。したがって、シースタンパク質でなされた融合の結果として得られた産物が、正常な環境における免疫系で存在するＢリンパ球の表面に位置する抗体を模擬できる。しかしながら、この工程は抗体遺伝子とｇＩＩＩの間に位置するアンバー終止コドンが宿主細菌によってどのように読まれるかによる。ファージｓｕｐＥが抑制性宿主（例えば、大腸菌ＴＧ１）で増殖するならば、抗体断片は、マイナーなシースタンパク質に融合し、ファージ表面に残る。ファージ表面のこの構造はＢ表面抗体のような、異物構造（ｆｏｒｅｉｇｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を検出する受容体として作用できる。ファージが（ＨＢ２１５１などの）非抑制性（ｓｕｐ−）大腸菌株で増殖すると、その後アンバーコドンが終止コドンとして読まれ、抗体粒子が可溶型で細菌から分泌されるであろう。そのようなものとして、ファージミドベクターで形質細胞から合成された抗体の模擬が可能となる。非抑制性細菌に溶解されるような多重クローニング部位へのクローン化された遺伝子断片の発現に続く、ファージミドベクター上の６個のヒスチジンを含む領域は、Ｚｎ＋＋、Ｎｉ＋＋またはＣｏ＋＋で帯電されたアフィニティーカラムを用いる環境からこの組み換えタンパク質の容易な精製を可能にする（Ｗｅｉｎｅｒ  Ｌ．Ｍ，  １９９６，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  ２５５（１），  ２８−４３）。
【００１５】
ファージディスプレイ技術の技術的な利点により、ｓｃＦｖ構造は多くの領域において、広い範囲の利用の機会を反映する。約１５０ｋＤａサイズの全抗体分子と対照的に、抗体のｓｃＦｖ構造、それは約３０ｋＤａのサイズであり、抗体の定常領域およびＦｃ部位を欠いている、が今日の診断と治療に焦点を合わせる医学の研究に増加する数で使用されている（Ｂｒａｄｂｕｒｙ  Ａ．Ｒ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２９０，  ２９−４９）。
【００１６】
本発明で述べられるＫＤＲ１．３および２．６ｓｃＦｖ抗体構造は、ＶＥＧＦＲ−２の細胞内シグナル伝達活性を遮断することにより、細胞表面のＶＥＧＦＲ２（１−７  免疫グロブリンドメイン）の細胞外部分に結合することにより、およびＶＥＧＦ依存性細胞増殖を阻害することにより、抗血管新生特性を示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
１９７１年に、Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎは腫瘍の増殖が腫瘍の近くに位置する血管から生じた新たな毛細血管から運ばれる酸素およびエネルギー源に依存すると断言し、抗血管新生についての試みががんの増殖を防ぐことに関して有効なアプローチであり得ると主張した（Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．，  １９７１  Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ．，  ２８５，  １１８２−６）。様々な研究が、抗血管新生アプローチが癌の治療で有望であると立証した（Ｋｉｍ  ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：  ８４１−８４４）。血管形成活性の、がん発生、高い死亡率による最も重要な病理学的現象、との密接な関連は、がん治療の新しいオプションとしての抗血管新生剤の調査への道を特に導いた。
【００１８】
近年、血管新生において重要な役割をはたすＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体が、抗血管新生構造の開発における標的として注目されている。ＶＥＧＦに対して生じた構造ががん治療において有用であり得ることを示す最初の兆候は、中和抗体を用いて作出されたマウス神経芽腫モデルから得られた（Ｍｏｒｄｅｎｔｉ  Ｊ、  １９９９Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ．２７（１）：１４−２１）。この研究は、抗ＶＥＧＦ中和抗体構造が、腫瘍増殖を阻止することを示した。この研究の結果は、腫瘍増殖を阻止するためのＶＥＧＦおよびその受容体を遮断する構造の開発を目的とした研究を奨励した。これらの研究は、抗ＨＩＦ（抗低酸素誘導性因子）剤、ＶＥＧＦアンチセンス・オリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦリボソーム、可溶性ＶＥＧＦ受容体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、およびＶＥＧＦ  ＤＮＡワクチンなどの抗がん治療活動に用いられる新しい構造を入手することを可能にした（Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．．，  ２００３，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，  ９，  ６６９−６７６）。
【００１９】
ＶＥＧＦに対して生じた抗体は、腫瘍増殖を遅らせることがわかっている（Ｈｉｃｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ，２００１，ＤＴＴ  ６：  ５１７−５２８）。マウス・モノクローナル抗体は臨床検査診断で広く使われるが、それらの成功はヒトにおける治療用途においては制限される。この第一の理由は、マウス抗体で治療された約８０％の患者における、反復投与に続いて、マウス抗体に対して生じる免疫反応の活性化である。さらに、マウス抗体のＦｃ部分は人間の免疫系においてそれほど有効でない役割を果たし、マウス抗体は治療用途においてヒト抗体と比べて、より短い半減期を有する。これらの理由は治療用途におけるマウス抗体の使用を制限する。
【００２０】
Ｇｅｎｅｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．は、２０００年に組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体構造（ベバシズマブ；米国特許番号ＵＳ６０５４２９７）を立ち上げた。この抗体構造は今日直腸癌の治療で使用され、それは他の型の腫瘍細胞で試験されている。ベバシズマブに基づく治療は、１患者あたり４２．８００〜５５．０００米ドルの追加治療費を引き起こし、その結果、進行結腸癌治療のために米国だけで１５億米ドルの臨時支出が作られるであろうと見積もられている。したがって、細菌において高容量でより安く生産し、その結果治療コストを減少させるであろう組換え抗体のような、代替手段としての新規な抗血管新生構造の開発の必要性がある。
【００２１】
今までのところ行われている様々な研究は、ファージディスプレイ技術が血管新生を阻止できる新しい組換え抗体構造の同定において有効な手段となり得ることを示した。一本鎖可変断片形の抗体構造は、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ融合を通じて作成されたＫＤＲ（ＫＤＲ−ＡＰ）の細胞外ドメインでのＢａｌｂ／ｃマウスの免疫付与に続いて得られた（ＷＯ００／４４７７７、Ｚｈｕ  Ｚ、２０００）。ファージディスプレイ技術を利用し、ヒトの抗体ライブラリーを用いて、Ｆａｂとキメラ抗体の形の、ＫＤＲに対する抗血管新生アプリケーションの候補である抗体構造を開発した（ＰＣＴ／ＵＳ０３／０６４５９、Ｚｈｕ  Ｚ、２００３）。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
ここで示された特許研究における、上記に概説された標的抗血管新生アプリケーションを開発する研究と異なり、約１５０ｋＤａのサイズの抗体の代わりに、組換え型ＫＤＲ（１−７）でのＢＡＬＢ／ｃ  Ｊマウスに誘導された免疫付与の後に開発された組換え抗体ライブラリーからのＫＤＲ（１−７）に対しての選択に次いで、３３ｋＤａのサイズの組換え一本鎖可変断片抗体を得るためにファージディスプレイ技術が用いられた。これらの抗体構造の開発に用いられた抗原および選択の後に得られた組換え抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列は、上記の研究および特許におけるものと異なる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＫＤＲに対して作成されたｓｃＦｖの可変軽鎖および重鎖のアガロースゲル電気泳動画像。１−ｐＵＣ／ＨｉｎｆＩ消化；２−ＶＨＰＣＲ産物；３−ＶＬＰＣＲ産物
【００２４】
【図２】可変軽鎖および重鎖と（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３をコードするリンカーのライゲーションからの作成された一本鎖可変断片のアガロースゲル電気泳動画像。１−ｓｃＦｖマーカー（７５０ｂｐ）；２−ｓｃＦｖライブラリー；３−ｓｃＦｖライブラリー
【００２５】
【図３】大腸菌ＴＧ１細菌のＫＤＲ１．３ｓｃＦｖのライゲーション産物での形質転換により得られた無作為に選択したコロニーのコロニーＰＣＲ結果。１−ｐＵＣ１９／ＨｉｎｆＩ消化；２−ｓｃＦｖマーカー（７５０ｂｐ）；３−対照ｓｃＦｖのＰＣＲ；４−陰性対照のＰＣＲ；５−空；６−コロニーＰＣＲ；７−コロニーＰＣＲ；８−コロニーＰＣＲ；９−コロニーＰＣＲ；１０−空；１１−コロニーＰＣＲ；１２−コロニーＰＣＲ；１３−コロニーＰＣＲ；１４−コロニーＰＣＲ（ＫＤＲ１．３ｓｃＦｖ存在）。
【００２６】
【図４】大腸菌ＴＧ１細菌のＫＤＲ２．６ｓｃＦｖのライゲーション産物での形質転換により得られた無作為に選択したコロニーのコロニーＰＣＲ結果。１−ｐＵＣ１９／ＨｉｎｆＩ消化；２−ｓｃＦｖマーカー（７５０ｂｐ）；３−陰性対照のＰＣＲ；４−対照ｓｃＦｖのＰＣＲ；５−空；６−コロニーＰＣＲ；７−コロニーＰＣＲ；８−コロニーＰＣＲ；９−コロニーＰＣＲ；１０−空；１１−コロニーＰＣＲ（ＫＤＲ２．６ｓｃＦｖ存在）；１２−コロニーＰＣＲ；１３−コロニーＰＣＲ；１４−コロニーＰＣＲ（ＫＤＲ１．３ｓｃＦｖ存在）。
【００２７】
【図５】ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６ｓｃＦｖクローンのＢｓｔｎＩ消化プロフィール。１−マーカー；２−ＫＤＲ１．３ｓｃＦｖ；３−ＫＤＲ１．３ｓｃＦｖのＢｓｔｎＩ消化；４−ＫＤＲ２．６ｓｃＦｖのＢｓｔｎＩ消化；５−ＫＤＲ２．６ｓｃＦｖ。
【００２８】
【図６】ＩＭＧＴウェブサイトから予測されるＫＤＲ１．３ｓｃＦｖのＤＮＡ配列およびＣＤＲ領域の配置（ｅｍｐｌａｃｅｍｅｎｔ）。
【００２９】
【図７】ＩＭＧＴウェブサイトから予測されるＫＤＲ２．６ｓｃＦｖのＤＮＡ配列およびＣＤＲ領域の配置。
【００３０】
【図８】ＫＤＲ１．３組換え抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析結果。Ａ；精製ＫＤＲ１．３ｓｃＦｖのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色。Ｂ；精製ＫＤＲ１．３ｓｃＦｖのウエスタンブロット分析。１−マーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＳＭ０４４１）；２−４時間の誘導後のペレット、Ｔ４；３−精製の第一段階後の上清；４−精製の第二段階後の上清；５−精製の第三段階後の上清；６−精製の第四段階後の上清；７−精製の第五段階後の上清；８−精製の第六段階後の上清；９−６回目の抽出工程後のペレット；１０−対照ｓｃＦｖ（Ｌｉｇ７）。
【００３１】
【図９】ＫＤＲ２．６組換え抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析結果。Ａ；精製ＫＤＲ２．６ｓｃＦｖのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色。Ｂ；精製ＫＤＲ２．６ｓｃＦｖのウエスタンブロット分析。１−マーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＳＭ０４４１）；２−４時間の誘導後のペレット、Ｔ４；３−精製の第一段階後の上清；４−精製の第二段階後の上清；５−精製の第三段階後の上清；６−精製の第四段階後の上清；７−精製の第五段階後の上清；８−精製の第六段階後の上清；９−６回目の抽出工程後のペレット；１０−対照ｓｃＦｖ（Ｌｉｇ７）。
【００３２】
【図１０】ＴＡＬＯＮアフィニティーカラム精製されたＫＤＲ１．３ｓｃＦｖのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析結果。Ａ；ｔａｌｏｎアフィニティーカラム精製されたＫＤＲ１．３ｓｃＦｖのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色。Ｂ；ｔａｌｏｎアフィニティーカラム精製されたＫＤＲ１．３ｓｃＦｖのウエスタンブロット分析。ローディングの順番および量は両方のゲルで同じである。１−マーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＳＭ０４４１）；２−６段階の精製後の透析された上清；３−第一のｔａｌｎｏアフィニティーカラム溶出チューブ；４−第二のｔａｌｎｏアフィニティーカラム溶出チューブ；５−第三のｔａｌｎｏアフィニティーカラム溶出チューブ；６−第四のｔａｌｎｏアフィニティーカラム溶出チューブ；７−第五のｔａｌｎｏアフィニティーカラム溶出チューブ；８−第六のｔａｌｎｏアフィニティーカラム溶出チューブ；９−第七のｔａｌｎｏアフィニティーカラム溶出チューブ；１０−対照ｓｃＦｖ（Ｌｉｇ７）。
【００３３】
【図１１】ＴＡＬＯＮアフィニティーカラム精製されたＫＤＲ２．６ｓｃＦｖのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析結果。Ａ；ｔａｌｏｎアフィニティーカラム精製されたＫＤＲ２．６ｓｃＦｖのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色。Ｂ；ｔａｌｏｎアフィニティーカラム精製されたＫＤＲ２．６ｓｃＦｖのウエスタンブロット分析。ローディングの順番および量は両方のゲルで同じである。１−マーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＳＭ０４４１）；２−６段階の精製後の透析された上清；３−第一のｔａｌｎｏアフィニティーカラム溶出チューブ；４−第二のｔａｌｎｏアフィニティーカラム溶出チューブ；５−第三のｔａｌｎｏアフィニティーカラム溶出チューブ；６−第四のｔａｌｎｏアフィニティーカラム溶出チューブ；７−第五のｔａｌｎｏアフィニティーカラム溶出チューブ；８−第六のｔａｌｎｏアフィニティーカラム溶出チューブ；９−第七のｔａｌｎｏアフィニティーカラム溶出チューブ；１０−対照ｓｃＦｖ（Ｌｉｇ７）。
【００３４】
【図１２】ＴＡＲＬＯＮ精製されたＫＤＲ１．３、２．６およびＬｉｇ７（対照）ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡ結果。Ａ；抗原で一晩被覆されたウェルは黒色の矢印で示される。抗原被覆後に添加された抗体は赤色の矢印で示される。Ｂ；Ａで言及されたウェルのＥＬＩＳＡ  ＯＤ４０５値。
【００３５】
【図１３】細胞増殖アッセイによるＶＥＧＦ−ＨＵＶＥＣ相互作用への組換え抗体の効果。継代（ｐａｓｓａｇｅ）５からのＨＵＶＥ細胞は２％ＦＢＳを含む培地および２種類の異なる濃度（０．１および１μｇ／ｍｌ）のＡｂ２９３、ＫＤＲ１．３、２．６および陰性対照ｓｃＦｖとしてのＬｉｇ７などの様々な抗体と培養された。
【００３６】
【図１４】角膜血管新生アプリケーションの概要、および写真による説明（Ｋｏｎｙａ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，  ２００５，  Ｖｏｌｕｍｅ  ５６，  Ｎｏ：  ６，  Ｊｕｎｅ  ｐ：１３３９  −  １３４６）。
【００３７】
【図１５】角膜血管新生モデルでの抗体の抗血管新生効果。ラット角膜に移植された動静脈奇形組織に対する３、５、７、および９日目での組換え抗体の血管新生阻害効果についての実験のラット角膜造影。
【００３８】
【図１６】抗体の抗血管新生効果の間の違い。ラット角膜に移植された動静脈奇形組織に対する３、５、７、および９日目での組換え抗体の血管新生阻害効果についての実験の間に形成された血管の数。
【００３９】
表１：ｓＫＤＲ１−７に結合できるｓｃＦｖの選択および濃縮のためのバイオパニング段階。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞表面のＶＥＧＦＲ２（１−７  免疫グロブリンドメイン）の細胞外部に結合することにより、およびＶＥＧＦ依存細胞増殖を抑制することにより、ＶＥＧＦＲ−２の細胞内シグナル伝達活性を遮断して抗血管新生特性がある組換え抗体構造を提示する。
【００４１】
血管新生は抗体で阻止された。抗血管新生実施に対して開発された市場における抗ＶＥＧＦ抗体は、網膜に入ることができず、その１４８ｋＤＡ分子量のために血管内皮を通過することがほとんどできない。しかしながら、低分子量の小さい組換え抗体構造には、それらの欠点がない。上記の研究により、ファージディスプレイ技術が血管新生を阻害する新しい抗体断片を定義するための有効な手段であり得ることが示されている。しかしながら、今日までに分離された抗血管新生抗体断片は、ヒト抗ＶＥＧＦ組換え抗体（Ｚｈｉｈｕａ  ｅｔ  ａｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２００８）  １４４：１５−２６）、ＶＥＧＲ２−Ｆｃ融合タンパク質、二価抗体に対して解析された抗ＶＥＧＦＲ２  Ｆａｂ断片（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ：  ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ  （２００６）．  ２８１，  １６：．  １０７０６−１０７１４）、またはＫＤＲ−ＡＰ免疫付与で得られた一本鎖マウス抗体（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８，  ３２０９−３２１４）などである。ＶＥＧＦの血管由来の特徴、内皮細胞増殖および走化性へのその効果、は、ＫＤＲの細胞外１−７ドメインとの関係によって起こる。本発明では、ＶＥＧＦＲ２の可溶性細胞外１−７ドメインは免疫およびファージディスプレイ抗体ライブラリーの選別に使用された。その結果、ＶＥＧＦの活性を阻止する組換え抗体を発見すること、この抗体構造をコードするヌクレオチド配列を決定すること、これらの配列をコードする新たなファージの定義、ＶＥＧＦとその受容体の相互作用の廃棄を経た内皮細胞増殖を抑制する抗体構造の血管新生の阻害のための新たな方法の開発は、提示された発見の目的である。
【００４２】
用語「組換え抗体」は完全抗体および抗原結合断片（すなわち、「抗原結合タンパク質」、「抗原結合ポリペプチド」または「免疫結合剤（ｉｍｍｕｎｏ−ｂｉｎｄｅｒ）」）またはその一本鎖のことをいう。
【００４３】
用語「抗原結合」は抗原に特異的に結合する能力のことをいう。抗体の抗原結合機能は完全長抗体の断片、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなる単一ドメインまたはｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）合成リンカーにより任意に接続され得る２以上の単離ＣＤＲの組み合わせ、により機能できることが示されている。さらに、Ｆｖ断片の２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨ、は離れた、しかしそれらを、一価の分子を形成するためのＶＬおよびＶＨ領域を含む単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）として作成されることを可能とする合成リンカーにより、組換え方法を用いて接続できる遺伝子、によりコードされる。これらの抗体断片は当業者に慣用の技術を用いて得られ、断片は完全な抗体と同様の方法で、実用性のために選別される。
【００４４】
本発明の範囲において用いられる抗体なる用語は、選択された抗原に結合するｓｃＦｖ抗体または抗体断片をいう。したがって、本発明のｓｃＦｖ抗体は、配列ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＳ（配列番号３３）のリンカーを含む短いリンカーペプチドにより連結されたＶＬおよびＶＨドメインを含む完全ｓｃＦｖであることもできる。ＶＬおよびＶＨの連結は両方の順序、ＶＬ−リンカー−ＶＨまたはＶＨ−リンカー−ＶＬをとることができる。本発明において、ｓｃＦｖ構造はＶＨ−リンカー−ＶＬの順序である。
【００４５】
ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された点在する領域にさらに分割できる。各々のＶＨおよびＶＬは３個のＣＤＲと４個のＦＲで構成され、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【００４６】
本発明のポリペプチドは１個以上の非必須アミノ酸残基にて保存アミノ酸置換を含み得る。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、ポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えられる。他の実施形態において、アミノ酸の鎖を、順序および／または側鎖ファミリーの構成において異なる、構造的に類似の鎖に置き換えることができる。あるいは、他の実施形態において、飽和突然変異誘発などにより、変異は免疫グロブリンコード配列の全てまたは一部に無作為に導入され得、得られた変異体を本発明のポリペプチドに組み込み、それらの所望の標的に結合する能力により選別することができる。
【００４７】
本発明のさらなる態様において、ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６ｓｃＦｖは７９％のアライメントスコアを有する。本発明で述べられる２個のｓｃＦｖの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、９０％のアライメントスコアを示し、重鎖可変ドメインは６０％のアライメントを示す。
【００４８】
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６ｓｃＦｖと、Ｚｈｕ  ｅｔ．  ａｌ．により２０００年に特許化されたｓｃｆｖのＣＤＲ領域（ＷＯ００／４４７７７）とで比較された。完全なアライメントがＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６のＣＤＲＬ１領域（配列番号：４および配列番号：２０）の間で見いだされ、ＺｈｕのｓｃＦｖのＣＤＲＬ１領域の一部が配列番号：４および配列番号：２０と同じ配列を含むことがわかった。ＺｈｕのｓｃＦｖのＣＤＲＬ２領域は、ＫＤＲ２．６  ＣＤＲＬ２領域（配列番号：２１）と７５％のアライメントスコアを有し、ＫＤＲ１．３  ＣＤＲＬ２領域（配列番号：５）と６６％のアライメントスコアを有する。ＣＤＲＬ２領域のＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６  ｓｃＦｖｓのアライメントスコアは６６％であった。ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６のＣＤＲＬ３領域は、ＺｈｕのＣＤＲＬ３領域ｓｃＦｖと５５％のスコアでに整列されていた（ａｌｉｇｎ）が、ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６の間の同じ領域でのアライメントスコアは２２％だけであった。３個のＣＤＲＬ３領域は、すべて９個のアミノ酸を有し、コンセンサス配列（−Ｑ−Ｓ−−−−Ｔ）を有し、これは、ｓｃＦｖのＫＤＲへの相互作用に、グルタミン、セリン、およびトレオニンアミノ酸が重要であることを意味し得る。ＫＤＲ１．３およびＺｈｕのｓｃＦｖのＣＤＲＨ３領域間で５０％の類似性だけが見いだされた。これらの結果は、ＫＤＲ分子認識のための重鎖可変領域と比較して、軽鎖可変領域およびそのＣＤＲ領域の高い配列保存を示す。
【００４９】
本発明は標的結合特異性が維持される限り、開示されたＶＨ配列のいずれか、および組み合わせて開示されたＶＬ配列のいずれか、も包含する。ＶＥＧＦＲ−２に結合するファージは、ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦ受容体をその表面（ＨＵＶＥＣ）で発現するヒト臍帯内皮細胞との相互作用についてのそれらの遮断特性に関する予備的認定を評価するためにＥＬＩＳＡ法で主に試験された。ＥＬＩＳＡの結果、ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ１．６は定義された。細胞増殖へのそれらの効果が評価され、これら組換え型の両方が、細胞増殖に悪影響を及ぼすことが示された。
【００５０】
本発明の一の態様において、ＶＥＧＦＲ−２に特異的に結合し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖およびｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生を阻害する、組換え抗体（ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６）が提供された。それらのラット角膜ｉｎ  ｖｉｖｏモデルでの抗血管新生効果が確認された。このアッセイは、通常は角膜の血管において本質的に新たに形成された血管であるに違いない新生血管が容易に検出されるという利点を有する。統計学的評価は、ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６抗体の抗血管新生活性が統計的に有意であることを（ＫＤＲ１．３；ｐ＜０．０５およびＫＤＲ２．６；ｐ＜０．０５）明らかにした。しかし、ＫＤＲ２．６抗体が使用されたとき、ラットの死が起こった。ｉｎ  ｖｉｖｏの実験は、ＫＤＲ１．３抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで使用する中で最も効果的な抗血管新生分子であることを示した。
【００５１】
結論として、両方の組換え抗体がＶＥＧＦ活性に対してアンタゴニスト効果を有し、それらは血管新生阻害剤として認められた。
【実施例】
【００５２】
実施例の項は、発明の理解を助けるための、組換え抗体構造の生成、発現、量的統制および細胞増殖への抗体構造の効果の検査を含む。実施例は、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、遺伝子のベクターへの伝達、宿主細菌への組換えベクターの移入のような、発明の間に使用される慣用（既知）の方法を含む。これらの方法は様々な刊行物（Ｓａｍｓｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されており、それは実施例の項においてその目的のために記載されないであろう。
【００５３】
免疫
免疫研究のために、３匹の７週齢雄Ｂａｌｂ／ｃＪマウスが使用された。初回注射は、各々のマウスの脇の下の皮膚にＰＢＳ１５０μｌ、および１０μｇのｓＫＤＲ１−７（組換えヒト（ｓＶＥＧＦＲ２）ｓＫＤＲ  Ｄ１−７、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を含む完全フロイントアジュバント１５０μｌを含む３００μｌの溶液を注射することにより行われた。最初の免疫に続いて３週で、同量の混合物が調製され、不完全フロイントアジュバントを用いてマウスに注射された。２番目の免疫に続く１カ月の休息の期間の後に、２匹のマウスが尾静脈から１０μｇのｓＫＤＲＤ１−７を含む１５０μｌのＰＢＳ溶液の注射に供された。４日後にこれらのマウスの脾臓が取り出され、総ＲＮＡを得た。
【００５４】
ＲＮＡ単離
ＥＺ−ＲＮＡ総ＲＮＡ単離キット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）は脾臓からの総ＲＮＡの単離に使用された。マウスの脾臓は１ｍｌの「変性溶液」で均質化された（Ｊａｎｋｅ  ＆  Ｋｕｎｋｅｌ  Ｉｋａ  Ｗｅｒｋ  ＲＷ２０）。均質化された組織の、室温での５分間の培養の後に、１ｍｌの「抽出溶液」が加えられ、試料は１５秒間、完全に混合された。この後、試料は１０分間室温で培養され、次に、それらは１５分間、１２０００ｇ、＋４℃で遠心分離された。遠心後、上清が新しいチューブに移され、１ｍｌのイソプロパノール（Ｍｅｒｃｋ）が添加され、試料が混合された。室温で１０分間の試料の培養後に、試料は８分間、１２０００ｇ、＋４℃で遠心分離された。上清が除去され、ＲＮＡペレットが２ｍｌの％７５エタノール（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号１００９８６２５００）でボルテックスにより洗浄された。ＲＮＡ含有チューブが７５００ｇ、＋４℃で５分間遠心分離され、ペレットを室温で放置して乾燥した。１００μｌのＤＥＰＣ処理ｄＨ２Ｏを添加した後、チューブは５５℃で１５分間培養され、ＲＮＡを溶解した。
【００５５】
ＶＨおよびＶＬライブラリー構築
標的分子、ｓＫＤＲ１−７での免疫の後に、Ｂａｌｂｃ／Ｊマウス脾臓を取り出し、総ＲＮＡ単離を実施した。ＲＮＡは分光光度法で検査され、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比は１．９と計算された。六量体プライマーを基にした標準方法（Ｓａｍｓｂｒｏｏｋ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）は、得られた総ＲＮＡからｃＤＮＡを作成するために用いられた。作成されたｃＤＮＡはＰＣＲによる免疫グロブリン重鎖（ＶＨ、３４０ｂｐ）および軽鎖（ＶＬ、３２５ｂｐ）可変領域の増幅のためのテンプレートとして用いられた。
【００５６】
重鎖（ＶＨ）可変領域増幅は、５μｌのＴａｑポリメラーゼバッファー（１０×）；３μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）；１μｌのｄＮＴＰ／各１０ｍＭ、１μｌの重鎖プライマー１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２７−１５８６−０１）、１μｌの重鎖プライマー２（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２７−１５８６−０１）、２μｌのテンプレートｃＤＮＡ、１μｌのＴａｑポリメラーゼ酵素（１Ｕ／μｌ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含む５０μｌの総容量で実施された。
【００５７】
軽鎖（ＶＬ）可変領域増幅は、５μｌのＴａｑポリメラーゼバッファー（１０×）；３μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）；１μｌのｄＮＴＰ／各１０ｍＭ、１μｌの軽鎖プライマーミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２７−１５８３−０１）、２μｌのテンプレートｃＤＮＡ、１μｌのＴａｑポリメラーゼ酵素（１Ｕ／μｌ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含む５０μｌの総容量で実施された。
【００５８】
重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）可変領域の増幅のためのＰＣＲプログラムは、９４℃で５分間の培養および３０サイクル、各サイクルは９４℃で１分間、５５℃で２分間および７２℃で２分間であった。ＰＣＲ反応は７２℃で１０分間の培養で完了した。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲルで検査した。ＤＮＡ変性またはＤＮＡ破壊はＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ２０００画像システムで分析された（図１）。
【００５９】
一本鎖可変断片（ＳＣＦＶ）ライブラリー構築
アガロースゲルからのバンド分離は、３４０ｂｐのＶＨおよび３２５ｂｐのＶＬの純粋なＰＣＲ産物の入手のため、「Ｒｏｃｈｅ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」キット（ＲＯＣＨＥ  ＡＧＡＲＯＳＥ  ＧＥＬ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ＫＩＴ、カタログ番号：１  ６９６  ５０５）を使用することによりなされた。一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の構築が２段階のＰＣＲ反応で実施された。
【００６０】
第一の段階は、５μｌのＴａｑポリメラーゼバッファー（１０×）；３μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）；１μｌのｄＮＴＰ／各１０ｍＭ、３μｌのＶＨＰＣＲ産物（１００ｎｇ／μｌ）、３μｌのＶＬＰＣＲ産物（１００ｎｇ／μｌ）、４μｌのリンカープライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２７−１５８８−０１）、１μｌのＴａｑポリメラーゼ酵素（１Ｕ／μｌ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含む全量５０μｌの反応混合物において行われた。反応混合物を含むチューブは、Ｂｉｏｍｅｔｒａ  Ｔｒｉｏｂｌｏｃｋ  Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ装置に置かれ、（９４℃、１分間、６３℃、４分間）で７サイクルの反応プログラムに供された。第二の段階において、５０μｌの混合物（３４μｌｄＨ２Ｏ、５μｌのＴａｑポリメラーゼバッファー（１０×）、３μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）、１μｌのｄＮＴＰ／各１０ｍＭ、４μｌのＲＳプライマーミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２７−１５８９−０１）、１μｌのＴａｑポリメラーゼ酵素（１Ｕ／μｌ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））が、７サイクル終了の反応混合物に添加された。その後、２５サイクル（９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃２分間）の反応プログラムに供された。ｓｃＦｖ  ＰＣＲ産物は１．２％アガロースゲル上で制御された（図２）。ｓｃＦｖ構造およびｐＤＵＣＫベクターはＳｆｉＩおよびＮｏｔＩでそれぞれ消化され、互いにライゲートされた。
【００６１】
ライゲーションの後、ライゲーション産物は７０℃で１０分間培養され、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＴＧ１細菌に移入された。
【００６２】
感染性ファージ生産
ｓｃＦｖライブラリーを含む細菌が、５ｍｌのＬＢ培地（１リットルの２ＸＴＹ：１０ｇのバクトトリプトン、５ｇの酵母エキス、１０ｇのＮａＣｌ）に接種され、３７℃および２２０ｒｐｍで一晩培養された（振とう培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  ｓｈａｋｅｒ）、Ｉｎｎｏｖａ）。翌日、一晩おいた培養物は、１：１００の希釈係数で５０ｍｌの２ＸＴＹ／Ａｍｐ培地に接種され、ＯＤ６００値が０．５に達するまで、培養物は３７℃および２２０ｒｐｍで培養された（振とう培養器、Ｉｎｎｏｖａ）。培養物のＯＤ６００値が０．５に達したとき、１０ｍｌの細菌培養物は１０１１ｃｆｕ  Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを含む５０ｍｌの新しい２ＸＴＹ／Ａｍｐ媒地に移され、振とうなしで３７℃４５分間、次いで、２２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃４５分間培養された。培養の後、細菌培養物は室温にて３０００ｇで１０分間遠心分離され（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ＋）、上清は廃棄された。ペレットは、３０ｍｌの２ＸＴＹ／Ａｍｐ／Ｋａｎ媒地（１リットルの２ＸＴＹ：１００ｍｇのアンピシリンおよび５０ｍｇのカナマイシン）に再懸濁され、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩培養された。翌日、細菌培養物は７０００ｇ（冷凍遠心器、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ＋）、４℃で１０分間遠心分離された。上清はその後新しい遠心チューブの中に移され、再度同じ条件で遠心分離された。２０ｍｌの上清が新しい遠心チューブの中に移され、５ｍｌのＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００、２．５ＭのＮａＣｌ）が添加された。混合物はファージ沈殿のために氷上で２時間培養された。次いで、ファージは４５分間＋４℃、７０００ｒｐｍ（冷凍遠心器、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ）で遠心分離され、上清は廃棄された。ペレットは、１ｍｌのＰＢＳ（３．２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ、１．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ）に溶解され、滅菌マイクロ遠心チューブの中に移された。懸濁液は２５０μｌのＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００、２．５ＭのＮａＣｌ）と混合され、その後氷上で３０分間培養された。懸濁液は２０分間、＋４℃、７０００ｒｐｍで遠心分離（Ｍｉｃｒｏｓａｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、５４１５Ｃ）され、上清は廃棄された。ペレットは２００μｌのＰＢＳ（３．２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ、１．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ）に溶解され、ファージ滴定はファージ量の決定のために実施された。
【００６３】
ファージ滴定
ファージ滴定のために、最初に、最小量のプレート（ｍｉｎｉｍａｌ  ｐｌａｔｅ）が調製された。１００ｍｌの最少培地のために：５０ｍｌの２×Ｍ９培地（１２ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、６ｇ  ＫＨ２ＨＰＯ４、１ｇ  ＮａＣｌ、２ｇ  ＮＨ４Ｃｌ、１リットルに仕上げ、２０分間１２１℃でオートクレーブされた）を５０ｍｌの溶解した３％寒天、２００μｌの１Ｍ  ＭｇＳＯ４、および１０μｌの１Ｍ  ＣａＣｌ２と混合した。混合物が冷却されたとき、２ｍｌの濾過滅菌（０．２２μｍ  ＴＰＰ、ｃａｔ  ｎｏ：９９５２２）されたブドウ糖（２０％）および１００μｌの濾過滅菌（０．２２μｍ  ＴＰＰ、ｃａｔ  ｎｏ：  ９９５２２）されたチアミン（Ｓｉｇｍａ  Ｔ４６２５；１０ｍｇ／ｍｌ）が添加され、培地はペトリ皿に置かれた。Ｆ’雄性菌（Ｆ’  ｍａｌｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１）は、最少培地を含むプレートに広げられ、３７℃で一晩培養された。翌日、Ｆ’雄性菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１）コロニーが採取され、ＬＢ培地（１リットルに対して：１０ｇ  バクトトリプトン（ＢＤ、ｃａｔ  ｎｏ：２１７０５）、５ｇ酵母エキス（ＢＤ、ｃａｔ  ｎｏ２１１９２９）、１０ｇ  ＮａＣｌ（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、ｃａｔ  ｎｏ：Ａ２９４２）に接種された。細菌は振とう培養器（Ｉｎｎｏｖａ、４２３０）で３７℃にてＯＤ６００値が０．５（Ｓｍａｒｔ  Ｓｐｅｃ登録商標  ３０００  ＢｉｏＲａｄ）に達するまで培養された。待機段階の間、適切なファージ希釈物（１０−２；１０−４；１０−６；１０−８  １０−１０）が、ＰＢＳ（８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、および１３７ｍＭ  ＮａＣｌ）で調製された。細菌のＯＤ６００値が０．５（Ｓｍａｒｔ  Ｓｐｅｃ登録商標  ３０００  ＢｉｏＲａｄ）に達したとき、１００μｌの菌培養物は滅菌マイクロ遠心チューブに移された。１０μｌの各々希釈されたファージは、細菌と混合され、３７℃で３０分間培養された。培養の終わりに、感染した細菌はＬＢ／Ａｍｐプレート（１００ｍｇのアンプリコンと混合された、１リットルの溶解したＬＢ／寒天）上に広げられ、プレートは３７℃で一晩、逆さの状態で恒温器（Ｎｕｖｅ  ＥＮ５００）に置かれた。翌日、形成された細菌コロニーの数が数えられ、原液のファージ濃度が決定された。
【００６４】
バイオパニングでのＫＤＲに特異的な組換えファージの選択
ＶＥＧＦＲ−２結合組換え抗体の選択は、１９９３年のＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．１９９３，Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  ｆｉａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ．  Ｉｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１７：２２８−２５７）に従って行われた。
【００６５】
この作業において、２５０ｎｇのｓＫＤＲ１−７を含む５００μｌのコーティング溶液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．６）は、バイオパニングチューブ（７５ｍｍＸ１２ｍｍイムノチューブ、Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｂ）にコートされた。次の日に、コーティング溶液は廃棄され、イムノチューブは遮断バッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）で１時間遮断された。培養の終わりに、イムノチューブは６回ＴＰＢＳ（ＰＢＳ＋０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）溶液で洗浄された。そして、５００μｌのＴＰＢＳ（ＰＢＳ＋０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）中の１０１１ｃｆｕのファージディスプレイされたｓｃＦｖライブラリーが添加された。２時間の室温での培養の後に、非結合性ファージはＴＰＢＳ（ＰＢＳ＋０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で３０回、次いでＰＢＳで３０回洗浄することにより廃棄された。洗浄段階の後に、標的分子に結合したファージは、５００μｌの溶離液（グリシン（０．２Ｍ  ｐＨ：２．２）、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ  ｎｏ：７３５０８６）を添加することによって、溶出された。ファージを含む溶離液は、７５μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）で中和された。溶出したファージの量は１μｌ、１０μｌ、および１／１０μｌの溶出ファージの滴定により得られた。残りのファージは第２のバイオパニング段階のために増幅された（表１）。
【００６６】
【表１】
2013540420.tif 000003
【００６７】
第２のバイオパニング段階の後に、ｓＫＤＲ結合ファージの増加は全く観察されなかったが、第３段階の後に濃縮が観察された。第３のバイオパニング溶出段階の後に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細菌は３７℃で３０分培養され、細菌はＬＢ／Ａｍｐ／寒天プレート上に置かれた。翌日、細菌コロニー中のｓｃＦｖ遺伝子の存在がコロニーＰＣＲ法で制御された。
【００６８】
コロニーＰＣＲ
細菌コロニー中のｓｃＦｖ遺伝子の存在がコロニーＰＣＲ法で制御された。コロニーから採取された細菌は１５μｌの蒸留水を含有する０．５ｍｌエッペンドルフ遠心チューブ内で可溶化された。チューブは、９５℃で３分間培養され、遠心分離され、上部の流体はポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして使用された。プライマー４５８：５’ｔｔｔ  ｔｇｔ  ｃｇｔ  ｃｔｔ  ｔｃｃ  ａｇａ  ｃｇｔ  ｔ３’およびプライマー４５９：５’ｔａｔ  ｇａｃ  ｃａｔ  ｇａｔ  ｔａｃ  ｇｃｃ  ａａｇ３’は、それぞれフォワーおよびリバースプライマーとして使用された。ＰＣＲプログラムは９４℃で５分、次いで９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で２分を３０サイクル、次いで７２℃で１０分の延長段階に設定された。
【００６９】
ＰＣＲ後に、産物はアガロースゲルで１．２％で検査され（図３、４）、２個のｓｃＦｖクローン（ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６）が同定された。２つのクローンの違いはｓｃＦｖＰＣＲ産物をＢｓｔｎＩ酵素で消化するＤＮＡフィンガープリンティングで検査され、ＤＮＡフィンガープリンティング研究が実施された（図５）。
【００７０】
ファージＥＬＩＳＡ法によるＶＥＧＦＲ−２に結合できるファージディスプレイ組換え抗体の選択
２個の異なるクローンとして同定されたＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６の結合特性を同定するため、ファージＥＬＩＳＡが行われた。ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６を提示するファージを得るため、ｓｃＦｖ遺伝子を含む細菌が感染ファージを生成するために用いられた。感染ファージはファージＥＬＩＳＡ試験に用いられた。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ，ｃａｔ  ｎｏ：３５３９１２）の各々のウェルは５００ｎｇｌのｓＫＤＲ１−７を含むコーティングバッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ：８．６）で＋４℃にて一晩コートされた。翌日、ウェルは２００μｌのＴＰＢＳ（ＰＢＳ（３．２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ、１．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ）を含む０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄され、２００μｌの遮断バッファー（１％ＢＳＡ＋ＴＰＢＳ）がウェルに加えられ、プレートは室温にて１時間培養された。ウェルはその後ＴＰＢＳで３回洗浄され、ＶＥＧＦＲ−２特異的組換え抗体（１０１１ｐｆｕ）を提示するファージを含む１００μｌの遮断バッファー（ＰＢＳ＋２％脱脂乳）が添加され、室温にて２時間培養された。培養の後、ウェルはＴＰＢＳで６回洗浄され、その後、１：１０００希釈の抗Ｍ１３ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む１００μｌの遮断バッファーが各ウェルに添加された。室温での１時間の培養後、ウェルはＴＰＢＳで６回洗浄された。１００μｌのＡＢＴＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ｃａｔ  ｎｏ２７−９４０２−１）基質溶液が酵素的検出のために各々のウェルに添加された。室温での１時間の培養の後、各々のウェルのＯＤ４０５値がＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｅｒ）で読み取られた。
【００７１】
組換え抗体の配列解析
ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６のＤＮＡ配列解析反応はＢｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ  ＧｅｎｏｍｅＬａｂ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｋｉｔ  （６０８０００）のプロトコルに基づいて行われた。プライマー４５９および４５８はそれぞフォワードおよびリバース読み込みに用いられた。配列解析反応は配列解析システムＣＥＱ８００で自動化されたＣＥＱ８００  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇで分析された。
【００７２】
ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６クローンに属するＤＮＡ配列は、互いにＷｏｒｋｂｅｎｃｈ  「ＣＬＵＳＴＡＬＷ−Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｍｅｎｔ」プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ）で比較され、配列の違いはＢｓｔｎＩ酵素消化結果で確認された。ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６のＤＮＡ配列は図６および図７に示される。配列解析の結果によると、ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６ｓｃＦｖはそれぞれ７４７ｂｐおよび７６２ｂｐ長である。
【００７３】
細菌でのＳＣＦＶの生成、発現ＳＣＦＶの再生、フォールディングおよび精製
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞での組換え抗体の生成
組換え抗体を生産するため、ｐＤＵＣＫファージミドベクター中のＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６クローンを含む各Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ２１５１株が、１００μｇ／ｍｌのアンプリコンを含む５０ｍｌの２ｘＹＴに接種され、３０℃にて一晩増殖させられた。翌日、一晩おいた培養物は１００μｇ／ｍｌのアンプリコンおよび２％グルコースを含む新鮮な５００ｍｌの２ｘＹＴ培地に接種（ＯＤ６００  ０．０５）された。培養物はＯＤ６００が０．５〜０．６に達するまで３７℃、２５０ｒｐｍにて増殖された。その後、細菌は３５００ｒｐｍで１０分間、室温にて遠心分離された。得られたペレットは、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル  β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）およびアンプリコン（１００μｇ／ｍｌ）を含む５００ｍｌの新鮮な２ＸＴＹ培地に溶解され、さらに４時間、３０℃、２５０ｒｐｍにて増殖させられた（ＳＡＮＣＨＥＺ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ  ．．  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ７２  （１−２），  １３−２０，  （１９９９）。培養物は４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、上清は廃棄された。ＳｃＦｖ生産を制御するため、誘導直前（Ｔ０）および誘導の４時間後（Ｔ４）の試料がＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードされた。
【００７４】
細菌培養物からの組換え抗体構造の精製
培養の後、ペリプラズム抽出（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）がタンパク質精製のためになされた（Ｓａｎｃｈｅｚ，  １９９９）。細菌ペレットは５．３ｍｌのＴＥＳ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＥＤＴＡ）中に再懸濁され、氷上で５分間培養された。その後、６ｍｌの１／３希釈ペリプラズム抽出バッファーが添加され、細菌は時折振動させながら２０分間氷上で培養された。細胞抽出物は１４０００ｒｐｍ、＋４℃にて１０分間遠心分離された。上清にｓｃＦｖが全く観察されなかったので、ペレットは封入体抽出プロトコル（ＤＡＳ，  ２００４）に供された。まず、ペレットは、０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む５ｍｌの溶解（ｌｙｓｉｓ）バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解され、氷上で３０分間培養された。懸濁液は氷上で１０秒間、６回の超音波処理に供された。その後、細菌性懸濁液は１２，０００ｒｐｍ、＋４℃にて１５分間遠心分離された。第一の上清は＋４℃で保管された。
【００７５】
ペレットは０．２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む１２ｍｌの溶解バッファーに再懸濁された。室温での１５分間の培養の後、第二の超音波処理がなされた（６回、１０秒間）。細菌性懸濁液は１２０００ｒｐｍ、＋４℃にて３０分間遠心分離された。第二の上清は＋４℃で保管された。
【００７６】
ペレットは１２ｍｌの溶解バッファーに再懸濁され、室温にて１５分間培養された。その後、細菌性懸濁液は各回１０秒間、６回超音波処理された。超音波処理の後、ＳＤＳが最終濃度１％で添加され、懸濁液が室温にて３０分間培養され、その後１２０００ｒｐｍ、＋４℃にて３０分間遠心分離された。第三の上清は＋４℃で保管された。ペレットは１２ｍｌの溶解バッファーに再懸濁され、１２０００ｒｐｍ、＋４℃にて２０分間遠心分離された。第四の上清は＋４℃で保管された。ペレットは６Ｍ尿素を含む５０ｍＭ  ＴｒｉｓバッファーｐＨ８．０に再懸濁され、氷上で４５分間培養された。その後、試料は１２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離された（ＤＡＳＡ  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １１７  （２），  １６９−７７）。
【００７７】
精製工程の間に得られた全ての上清はＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析により制御された。ＫＤＲ１．３ｓｃＦｖおよびＫＤＲ２．６のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の結果はそれぞれ図８および図９に示す。
【００７８】
第六の上清が両方のクローン（ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６）で最も精製されたｓｃＦｖを含んでおり、それゆえこれらの上清はさらなる精製工程のために選ばれた。これらの上清はＬ−アルギニンを含む再フォールディングバッファーに対して＋４℃、二晩透析された。上清はその後超音波処理バッファー（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）に対してさらに二晩透析された。透析の後、試料精製は金属アフィニティーカラム（ＴＡＬＯＮ−ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で実施された。この研究のために、樹脂は５０ｍｌチューブにおいて１３００ｒｐｍ、５分間遠心分離され、上清は除去された。樹脂は１０樹脂容量の超音波処理バッファーで平衡化され、室温にて１３００ｒｐｍ、３分間遠心分離された。上清は廃棄され、透析された試料がチューブに添加された。混合物は３０分間培養され、その後室温にて１３００ｒｐｍ、５分間遠心分離された。上清は廃棄され、樹脂は１０樹脂容量の超音波処理バッファーで１０分間、２回洗浄された。その後、樹脂は１容量の超音波処理バッファーで再懸濁され、懸濁液はエンドキャップカラムに移された。樹脂のデカンテーションの後、カラムは１樹脂容量の超音波処理バッファーで３回洗浄された。その後、組換え抗体は５樹脂容量の１Ｘ溶出バッファーでカラムから溶出された。溶出した試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットで分析された。ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６クローンのＴＡＬＯＮ精製結果は図１０および図１１に示された。
【００７９】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に対して開発されたＬｉｇ７組換え抗体は、ＶＥＧＦ関連ＨＵＶＥ細胞増殖アッセイでのＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６組換え抗体の効果分析のための陰性対照として用いられた。
【００８０】
第二溶出チューブのＴＡＬＯＮ精製ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６ｓｃＦｖ、およびＬｉｇ７溶出試料はＰＢＳに対して一晩透析され、濾過滅菌の後、細胞培養物アッセイに用いられた。ｓｃＦｖ濃度はＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ  ２３２２５）で測定された。
【００８１】
５００ｍｌの培地中の組換え抗体処理の誘導の後に、５００μｌのＴＡＬＯＮ精製ｓｃｆｖが得られた。精製ＫＤＲ１．３ｓｃＦｖの量は８５ｎｇ／μｌから１５６ｎｇ／μの間、平均１２０ｎｇ／μで変化し、ＫＤＲ２．６については、ｓｃＦｖの量は８８ｎｇ／μｌから１２５ｎｇ／μｌの間、平均１０５ｎｇ／μｌで変化した。組換え抗体精製産物の量および活性の間の違いは、精製工程の間の抗体構造のフォールディングにおける違いに起因し得る（Ｗｕｌｆｉｎｇ，  Ｃ．  Ａｎｄ  Ｐｌｕｎｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．，  １９９４，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２４２，  ６５５−６６９，）；  Ｄａｓａ  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ  ．  ２００４，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １１７  （２），  １６９−７７）。これらのフォールディングの変化は、宿主細胞の遺伝的安定性もまた妨げ得る配列の違いによるであろう（Ｋｎａｐｐｉｋ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９３，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １１，  ７７−８３）。
【００８２】
ＥＬＩＳＡによる可溶性ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６ＳＣＦＶの可溶性ＫＤＲへの結合特性の測定
ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６ｓｃＦｖの結合特性はＥＬＩＳＡ法により測定された。ＥＬＩＳＡウェルプレートの各々のウェルは＋４℃にて一晩１００μｌの標的抗原（０．５μｇ）でコートされた。翌日、ウェルは２００μｌのＴＰＢＳ（ＰＢＳを含む０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄され、２００μｌの遮断バッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）で室温にて１時間遮断された。ウェルはＴＰＢＳで３回洗浄され、抗ＫＤＲ組換え抗体（〜１μｇ）を含むかまたは陰性対照としての組換え抗体を含まない１００μｌの遮断バッファーがウェルに添加され、室温にて２時間培養された。培養の後、ウェルはＴＰＢＳで６回洗浄され、その後１：５０００抗Ｍｙｃタグホースラディッシュペルオキシダーゼ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体（Ｓｉｇｍａ）を含む１００μｌの遮断バッファーが各々のウェルに添加され、室温にて１時間培養された。ＴＰＢＳでの６回の洗浄の後、１００μｌのＡＢＴＳ基質溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  ｃａｔ  ｎｏ  ２７−９４０２−０１）が各々のウェルに添加された。室温での１時間の培養の後、各々のウェルのＯＤ４０５値がＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｅｒ）で検出された。ＥＬＩＳＡの結果は図１２に示された。陰性対照のＯＤ４０５値が約０．０９である一方で、第二の溶出チューブのＫＤＲ１．３、ＫＤＲ２．６およびＬｉｇ７のＯＤ４０５値は、０．２５０、０．５１２および０．６０５であった。可溶性的に発現されたＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６ｓｃＦｖでもＫＤＲに結合し、細胞培養実験に使用可能であった。
【００８３】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）単離およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養
上記によって得られた組換え抗体の期待される特性は、ＶＥＧＦＲ−２の活性を遮断することによる細胞増殖阻害である。ＨＵＶＥＣ増殖の阻害のために必要な組換え抗体の濃度および阻害割合の決定というこの目的のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイが実施された。
【００８４】
ＨＵＶＥ細胞は、Ｊａｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊａｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９７３；  ５２：２７４５−５６）に記載された手段を改変したものを使用して精製および培養された。細胞は、ヒト血漿フィブロネクチン（４０μｇ／ｍｌ）でコートされた組織培養プレート中で、２０％ウシ胎仔血清、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ：７．４、ペニシリン（１００μｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびヘパリン（５μ／ｍＬ）を含むＭ１９９内皮細胞増殖培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｓｒａｅｌ）内で維持された。
【００８５】
ＨＵＶＥＣ  ＢＲＢＵ  増殖アッセイ
組換え抗体の細胞増殖に対するＫＤＲ遮断活性の検出のため、ヌクレオチドアナログ（ＢｒｄＵ）の複製ＤＮＡへの組込みの測定を可能にするキットが使用された。
【００８６】
この目的のため、Ｒｏｃｈｅ  ＢＲＤＵキットが用いられた（Ｒｏｃｈｅ，  Ｋａｔ．  Ｎｏ．１４４６１１）。ＢｒｄＵは細胞分裂の間に複製ＤＮＡに組込まれるヌクレオチドアナログである。その後、ＢｒｄＵの細胞への取込みは、抗ＢｒｄＵ抗体に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）された蛍光マーカーにより測定された。
【００８７】
ＢＲＤＵアッセイのため、ＨＵＶＥ細胞は９６ウェル組織培養プレートに置かれ、上記のように培養された。実験のため、ＨＵＶＥ細胞は１％ゼラチンでコートされた９６ウェル組織培養プレートに５０００細胞／ウェルの密度で播種された。細胞を３時間おいた後、培地は２％ＦＢＳを含むＭ１９９培地に置き換えられ、細胞は１６時間培養された。
【００８８】
抗体は、５または１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含む培地に室温で希釈され、これらの調製したての抗体希釈物を２日間の各日、細胞培養物に添加した。
【００８９】
実験の１６時間前に、ＢｒｄＵは細胞に最終濃度１０μＭで添加された。実験の終わりに、細胞は洗浄され、固定された。ＢｒｄＵラベリングは製造者の指示書に従って行われた。各々の細胞のＢｒｄＵ組込み量４０５ｎｍでの分光光度読み取りで測定された。４９０ｎｍでの吸収値は各々の試料について、４０５ｎｍの吸収値から引かれた。
【００９０】
次の実験で、異なる時間での異なるＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６組換え抗体濃度のＨＵＶＥ細胞増殖への効果が分析された（図１３）。１μｇ／ｍｌ濃度の組換え抗体ＨＵＶＥ細胞増殖阻害の百分率は、４個の異なる増殖アッセイの平均によって算出した。
Ａｂ２９３：８４±２０．１％
ＫＤＲ１．３：６０±２３．７％
ＫＤＲ２．６：４０±１７．４％
【００９１】
角膜血管新生モデルにおける組換え可溶性抗体の抗血管新生効果のｉｎ  ｖｉｖｏでの検証
角膜血管新生モデルで用いられる動静脈奇形（ＡＶＭ）組織はＭａｒｍａｒａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅでの手術により入手し、ＫＤＲ１．３、ＫＤＲ２．６およびＬｉｇ７組換え抗体はこれらのモデルにおいて試験された。
【００９２】
角膜血管新生モデル
角膜は、通常血管を含まない、無血管の組織である。血管新生で活性な組織（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ）が角膜の表面のマイクロポケットに置かれると、３または４週で角膜の血管新生が開始する。角膜のこの特徴は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生を研究するための手段を維持する（Ｂａｒｂｅｌ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｖ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．，  １９９６，  Ｖｏｌ：３７，  Ｎｏ：８  ｐ．１６２５−１６３２）。各組織試料（１８７℃での液体窒素中のＡＶＭ）は、角膜に接種され、室温にされ、ジメチルスルホキシドで洗浄され、顕微鏡下で適当な大きさ（約２〜３ｍｍの直径）の小片に切断される。
【００９３】
１０匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットが本実験で用いられた。ラットの内の１匹は感染のため本実験から除外した。角膜移植の手順における段階は、過去に刊行された文献（Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ  ＰＪ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １９８４，  ５１，  ６３５−６４２）に従って行われ、図１４に示される。各々のラットは、ケタミンの腹腔内投与で麻酔させられ、すべての操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）が顕微鏡下で無菌条件のもとで実行された。それぞれの動物の両方の角膜は、局所の０．５％プロパラカインで麻酔され、各々の眼球は宝石用ピンセット（ｊｅｗｅｌｅｒ’ｓ  ｆｏｒｃｅｐｓ）で静かに突出させた。手術用顕微鏡下で、傍中心の基質内の線状角膜切開（ｐａｒａｃｅｎｔｒａｌ  ｉｎｔｒａｓｔｒｏｍａｌ  ｌｉｎｋｅｒ  ｋｅｒａｔｏｔｏｍｙ）（約４ｍｍ長、縁に対して直角に）が、くも膜用刃（ａｒａｃｈｎｏｉｄ  ｂｌａｄｅ）で実施された。その後、角膜組織でマイクロポケットを形成するためにマイクロフックが用いられた。均一な量の組織が角膜の２個の上皮層間のマイクロポケットに移植された。手順が実行された日を０日とした。
【００９４】
ラット角膜血管新生アッセイにおける組換え抗体の抗血管新生効果の研究
体重３００から４００グラムのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットが全ての実験で用いられた。９匹のラットが角膜血管新生アッセイに用いられた。ＫＤＲ１．３、ＫＤＲ２．６およびＬｉｇ７抗体（２５ｎｇ／μｌ）が、ラットが角膜でＡＶＭにさらされると同時に静脈注射によって投与され、群は１０日間続けられた。この研究においてＬｉｇ７は陰性対照として用いられ、各々の角膜は３、５、７および９日で撮影され、新規に形成された血管を評価のために数えた。１０日間で観察されたラット角膜は撮影され、画像は図１５に示された。ＫＤＲ１．３が用いられた群は対照群と比較されるとき、血管新生の軽減が視覚化された。血管新生軽減はまたＫＤＲ２．６群でも視覚化されたが、衰弱によるラットの死亡が９日で起こった。
【００９５】
血管新生活性測定はＫＤＲ１．３、ＫＤＲ２．６および対照群で実施され、次いで３、５、７、および９日の血管数の統計的な比較のために一般線形モード（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｍｏｄｅ）（ＧＬＭ）、単変量差異分析試験がＳＰＳＳ１５．０版で実施され、Ｔｕｋｅｙ  ＨＳＤおよびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌテストが事後の比較のために用いられた。統計学的評価は、ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６抗体の抗血管新生活性が統計的に有意である（ＫＤＲ１．３；ｐ＜０．０５およびＫＤＲ２．６；ｐ＜０．０５）ことを明らかにした。しかし、ＫＤＲ２．６抗体が使用されたとき、ラットの死亡が起こった。ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験は、ＫＤＲ１．３抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで使用する中で最も有効な抗血管新生分子であることを示した。
【００９６】
本発明で言及された２個の組換え抗体（ＫＤＲ１．３およびＫＤＲ２．６）のＨＵＶＥ細胞増殖の遮断能力およびラット角膜ｉｎ  ｖｉｖｏモデルでのそれらの抗血管新生効果が示された。１９９８年に、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．はＫＤＲ−ＡＰでマウスに免疫を与えることにより、２．１ｎＭの親和性でＫＤＲに対するｓｃＦｖ（ｐ１Ｃ１１）を生産し、１μｇ／ｍｌの濃度のＫＤＲでＨＵＶＣ細胞増殖の４８％の阻害を得た（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８，  ３２０９−３２１４）。さらに、Ｆｌｋ１に対して開発されたモノクローナル抗体がＧ５５細胞で２５％の阻害効果を示した（Ｋｕｎｋｅｌ  Ｐ  ｖｅ  ａｒｋ．２００１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１，  ６６２４−６６２８）。ＫＤＲ  ＩｇドメインＩＩＩに対して開発されたモノクローナル抗体（ＹｃｏｍＢ３）は０．５ｍｇ／Ｌの濃度でＨＵＶＥ細胞に５０％の阻害効果を示し、この抗体は抗血管新生への応用の候補として提案された（Ｌｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４；  ＡｃｔａＰｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ  ２５  （１０）：  １２９２−１２９８）。
【００９７】
抗体構造の親和性増加に関する研究がある。１９９６年に、ＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎは、重鎖可変領域での変異がＣＤＲ１親和性に関与したことを示した。抗体親和性は１６０ｎＭから２５ｎＭに減少した（Ｄａｖｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｈｍａｎｎ，  １９９６  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２，  １６９−７９，  （１９９６）。Ｌｉｐｐｏｗ  ｅｔ  ａｌ．は２００７年に、リゾチームに対する抗体の軽鎖領域の４アミノ酸の変更が親和性を１４０倍（３０ｐＭ）増加させたことを示した（Ｌｉｐｐｏｗ  Ｓ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７，Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２５，  １１７１−１１７６）。今日、血管新生阻害剤として使用されるラニビズマブは、ベバシズマブの可変領域の５アミノ酸変更および定常領域の１アミノ酸変更による誘導体である。これらの変更は、ＶＥＧＦ（１９２ｐＭ）に対する抗体の親和性を１００倍増加させた。要約すれば、ＫＤＲ１．３および２．６組換え抗体構造の親和性は、それらの配列を修飾することにより、結果としてその抗血管新生特性を増加させることができる。
【００９８】
配列番号１
【化１】
2013540420.tif 000004
【００９９】
配列番号２
【化２】
2013540420.tif 000005
【０１００】
配列番号３
【化３】
2013540420.tif 000006
【０１０１】
配列番号４
【化４】
2013540420.tif 000007
【０１０２】
配列番号５
【化５】
2013540420.tif 000008
【０１０３】
配列番号６
【化６】
2013540420.tif 000009
【０１０４】
配列番号７
【化７】
2013540420.tif 000010
【０１０５】
配列番号８
【化８】
2013540420.tif 000011
【０１０６】
配列番号９
【化９】
2013540420.tif 000012
【０１０７】
配列番号１０
【化１０】
2013540420.tif 000013
【０１０８】
配列番号１１
【化１１】
2013540420.tif 000014
【０１０９】
配列番号１２
【化１２】
2013540420.tif 000015
【０１１０】
配列番号１３
【化１３】
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【０１１１】
配列番号１４
【化１４】
2013540420.tif 000017
【０１１２】
配列番号１５
【化１５】
2013540420.tif 000018
【０１１３】
配列番号１６
【化１６】
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【０１１４】
配列番号１７
【化１７】
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【０１１５】
配列番号１８
【化１８】
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【０１１６】
配列番号１９
【化１９】
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【０１１７】
配列番号２０
【化２０】
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【０１１８】
配列番号２１
【化２１】
2013540420.tif 000024
【０１１９】
配列番号２２
【化２２】
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【０１２０】
配列番号２３
【化２３】
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【０１２１】
配列番号２４
【化２４】
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【０１２２】
配列番号２５
【化２５】
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【０１２３】
配列番号２６
【化２６】
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【０１２４】
配列番号２７
【化２７】
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【０１２５】
配列番号２８
【化２８】
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【０１２６】
配列番号２９
【化２９】
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【０１２７】
配列番号３０
【化３０】
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【０１２８】
配列番号３１
【化３１】
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【０１２９】
配列番号３２
【化３２】
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【０１３０】
配列番号３３
【化３３】
2013540420.tif 000036
【０１３１】
配列番号３４
【化３４】
2013540420.tif 000037
【図１】
2013540420.tif 000038
【図２】
2013540420.tif 000039
【図３】
2013540420.tif 000040
【図４】
2013540420.tif 000041
【図５】
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【図６】
2013540420.tif 000043
【図７】
2013540420.tif 000044
【図８】
2013540420.tif 000045
【図９】
2013540420.tif 000046
【図１０】
2013540420.tif 000047
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
2013540420000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年5月23日(2013.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）；
配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）、
を含む、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの組換え抗体。
【請求項２】
請求項１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも一個を含む組換え抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の組換え抗体をコードするＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号１５で示される核酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）；
配列番号１６で示される核酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）、
を含む、請求項３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項４に記載される核酸配列の少なくとも一個を含むＤＮＡ分子。
【請求項６】
配列番号３３で示されるアミノ酸配列を有し、請求項１に記載の可変重鎖および可変軽鎖を連結する、リンカー。
【請求項７】
配列番号３４の配列を有し、請求項６に記載のリンカーをコードするＤＮＡ分子。
【請求項８】
請求項４に記載される配列の少なくとも一個を含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターまたは請求項１に記載のアミノ酸配列のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１０】
酵素または蛍光蛋白質をコードする遺伝子と融合した請求項３に記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項１１】
配列番号２３で示されるアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）；
配列番号２４で示されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）、
を含む、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの組換え抗体。
【請求項１２】
請求項１１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも一個を含む組換え抗体。
【請求項１３】
請求項１１に記載の組換え抗体をコードするＤＮＡ分子。
【請求項１４】
配列番号３１で示される核酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）；
配列番号３２で示される核酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）、
を含む、請求項１３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載される核酸配列の少なくとも一個を含むＤＮＡ分子。
【請求項１６】
請求項１４に記載される配列の少なくとも一個を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターまたは請求項１１に記載のアミノ酸配列のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１８】
酵素または蛍光蛋白質をコードする遺伝子と融合した請求項１３に記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
【国際調査報告】
2013540420.tif 000051
2013540420.tif 000052
2013540420.tif 000053