(57)【要約】本発明は、肝特異化を刺激する培養培地を用いて確定的内胚葉細胞を培養するステップを含む、肝前駆細胞の集団を得るための方法に関する。特定の実施態様では、このような肝特異化を刺激する培養培地は、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）アゴニスト、ＦＧＦファミリー成長因子及びアクチビンシグナリング経路の阻害剤を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝特異化を刺激する培養培地を用いて確定的内胚葉細胞を培養するステップを含む、肝前駆細胞の集団を得るための方法。
【請求項２】
肝特異化を刺激する培養培地が、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）アゴニストを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲＡＲアゴニストが、オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
肝特異化を刺激する培養培地が、ＦＧＦファミリー成長因子及びアクチビン／Ｎｏｄａｌシグナリング経路の阻害剤をさらに含む、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
ａ）確定的内胚葉細胞が、ＦＧＦファミリー成長因子と一緒に培養され；そして
ｂ）次いで、ステップａ）において培養された細胞が、前記肝特異化を刺激する培養培地を用いて培養される、
請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ＦＧＦファミリー成長因子が、ＦＧＦ１０である、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
アクチビンシグナリング経路の阻害剤が、SB431542、レフティーＡ及びケルベロスならびにアクチビンＮｏｄａｌシグナリング経路を阻害するレフティーＡ及びケルベロスの誘導体からなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記確定的内胚葉細胞が、ヒト確定的内胚葉細胞である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト確定的内胚葉細胞が、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ）、ヒト多能性細胞（ｉＰＳ）、臍帯血幹細胞、胎児幹細胞及び成体幹細胞からなる群より選択されるヒト多能性幹細胞又はヒト多分化能幹細胞から得られる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ａ）請求項１〜９のいずれか一項記載の方法に従って肝前駆細胞の集団を作製すること、及び
ｂ）前記肝前駆細胞の集団を胎児肝細胞に分化させること
からなるステップを含む、胎児肝細胞の集団を得るための方法。
【請求項１１】
ステップｂ）が、ＦＧＦファミリー成長因子、ＥＧＦシグナリング経路のアゴニスト及びＨＧＦシグナリング経路のアゴニストを含む培養培地を用いてステップａ）の肝前駆細胞を培養することによって実施される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項記載の方法によって得ることができる、肝前駆細胞の集団。
【請求項１３】
請求項１０又は１１のいずれか一項記載の方法によって得ることができる、胎児肝細胞の集団。
【請求項１４】
請求項１２記載の肝前駆細胞の集団又は請求項１３記載の胎児肝細胞の集団及び薬学的に許容しうる担体又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
肝病態の処置及び／もしくは肝臓の再構成もしくは再生のための、請求項１２記載の肝前駆細胞の集団又は請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
機能的ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト哺乳動物を作製する方法であって、請求項１２記載のヒト肝前駆細胞の集団及び／又は請求項１３記載のヒト胎児肝細胞の集団を前記非ヒト哺乳動物ヒトの肝臓に注射することからなるステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝特異化を刺激する培養培地を用いて確定的内胚葉細胞を培養するステップを含む、肝前駆細胞の集団を得るための方法に関する。特定の実施態様では、このような肝特異化を刺激する培養培地は、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）アゴニスト、ＦＧＦファミリー成長因子及びアクチビンシグナリング経路の阻害剤を含む。
【０００２】
背景技術：
肝疾患は、発展途上国における死亡の最も多い原因の１つになっている。現在、同所性肝移植は、唯一利用可能な処置である。しかしながら、適切なドナー肝臓の不足により、肝移植の順番待ちリストに載っている最中に死亡する患者の数は、増加している（Fox and Roy-Chowdhury, 2004）。最近、肝細胞移植は、急性不全及び生命を脅かす代謝性肝疾患の処置のための同所性肝移植の代替手段となっている（Puppi and Dhawan, 2009）。しかしながら、機能的ヒト肝細胞はin vitroで増殖できず、低温保存することが困難なので、この戦略も、ドナーの不足によって、及び、限られた数の細胞によって制限されている。主要な肝臓細胞の代表的なものである肝細胞をターゲティングするこの疾患群は、遺伝性代謝異常（例えば、クリグラー・ナジャー症候群Ｉ型、グリコーゲン貯蔵病、尿素サイクル異常症、家族性高コレステロール血症及びチロシン血症）、慢性肝不全及び急性肝不全を包含し、これらに関して、肝細胞移植物は、器官移植への橋渡しとして注入され得る。従って、in vitroで増殖する能力及び肝臓特異的機能を発現する能力を有する肝細胞を作製するための他の起源の細胞を調査することは、依然として主な目的である。
【０００３】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）は、細胞に基づいた治療に関して、有利な起源の細胞の代表的なものである。それらの自己複製能力は、肝臓細胞を含む多数の広範な細胞型に分化する性質を維持しながら、in vitroでほぼ無制限に成長する能力をそれらに与える。いくつかのグループが、様々な培養システムを使用した、ｈＥＳ細胞の肝細胞様細胞への分化を既に報告している（Chiao et al., 2008; Duan et al., 2007; Lavon et al., 2004; Rambhatla et al., 2003; Schwartz et al., 2005; Shirahashi et al., 2004）。しかしながら、これらのアプローチは全て、血清、複合マトリックス（例えば、マトリゲル）及び動物性産物を含む培養培地に基づいている。これらの全ては、発生機序の分析を曖昧なものにし得るか、又は得られた組織を将来の臨床応用に不適合なものにし得る未知の因子を起源とするものである。より重要なことに、これらのアプローチを使用して作製した肝細胞の機能性は、依然としてin vivoで実証されておらず、in vitroにおける完全に分化した肝細胞の作製は、依然として主な問題の代表的なものである。
【０００４】
従って、確定的内胚葉細胞から肝前駆細胞の集団を高効率で得る方法の必要性が、当技術分野において依然として存在する。実際、確定的内胚葉細胞から肝前駆細胞を分化させるための定義された培養条件の知見は、肝疾患の細胞に基づいた治療に適合する完全に機能的な肝臓細胞の作製へ向けた大きな一歩を示す。
【０００５】
発明の概要：
本発明は、肝特異化を刺激する培養培地を用いて確定的内胚葉細胞を培養するステップを含む、肝前駆細胞の集団を得るための方法に関する。
【０００６】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、細胞に基づいた治療ための得られた細胞の使用を害し得る動物性産物又は未知の因子を含まない完全に定義された培養システムを使用して、確定的内胚葉細胞の肝前駆細胞への分化を誘導する新たな培養システムを開発した。重要なことに、このアプローチは、ネイティブな性質を有する分化した細胞を作製するための最良のアプローチを提供し得る肝臓発生の主要段階を尊重することによって、開発の自然な道を行く。従って、確定的内胚葉細胞は、肝前駆体に分化し得、これは、次いで胎児肝細胞、そしてin vitro及びin vivoで機能性を示す完全に分化した肝細胞にさらに成熟し得る。
【０００７】
定義：
本明細書において使用される「確定的内胚葉細胞」という用語は、典型的には以下のマーカーＳｏｘ１７、ＧＳＣ、Ｍｉｘｌ１、Ｌｈｘ１、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ６、Ｅｏｍｅｓ及びＨｅｘを発現する細胞を意味する。さらに、このような確定的内胚葉細胞は、Ｓｏｘ７などの追加の胚マーカー及びＳｏｘ２などの神経外胚葉マーカーを発現しない。
【０００８】
本明細書において使用される「肝前駆細胞」、「肝芽細胞」及び「肝前駆体」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。それらは、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（Ａｌｂ）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）及び肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α）を含むがこれらに限定されない特徴的な生化学的マーカーを発現できる細胞を意味する。このような細胞は、胎児肝細胞又は胆管細胞のいずれかに分化し、両系列のマーカー（すなわち、胆管細胞の特異的マーカーである上記ＣＫ１９；胎児肝細胞の特異的マーカーであるＨＮＦ４α及びＡＦＰ）を発現し得る。
【０００９】
本明細書において使用される「胎児肝細胞」という用語は、肝細胞系列に従事し、成熟肝細胞を生じさせ得る細胞を意味する。典型的には、胎児肝細胞は、以下のマーカー：アルブミン、ＡＦＰ、ＣＫ１８、ＣＫ８、アポリポタンパク質ＡＩＩ、トランスセリシン（Transtherythin）、α−１−抗トリプシン、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ３β、β１−インテグリン、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＬＤＬ、Ｃｙｐ３Ａ７、ＡＳＧＲを発現する。インドシアニングリーンを取り込み、そして分泌する能力もまた、肝細胞の典型である。さらに、このような胎児肝細胞は、立方形の形状を有する。
【００１０】
本明細書において使用される「成熟肝細胞」又は「肝臓細胞」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。それらは、ＬＤＬを取り込んで、グリコーゲンを貯蔵し、アルブミン及び尿素を分泌できる細胞を意味する。典型的には、成熟肝細胞は、以下のマーカー：アルドラーゼＢ、アルブミン、Ｇｌｕｔ４、ＴＡＴ、ＴＯ、解毒期Ｉに関するタンパク質：シトクロムＰ４５０、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｅ１及び解毒期ＩＩに関するタンパク質：ＢｉｌＵＧＴならびに胆汁酸トランスポーターを発現する。
【００１１】
本明細書において使用される「胆管細胞（cholangiocytes）」、「胆道細胞（biliary cells）」、「胆管上皮細胞」及び「胆管細胞（bile duct cells）」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。それらは、胆管の上皮細胞を意味し、リン脂質及び胆汁塩の放出によって胆汁分泌に寄与する。典型的には、胆管細胞は、以下のマーカー：ＣＫ１４、ＣＫ１９、ＣＫ７及びインテグリンβ４を発現する。
【００１２】
本明細書において使用される「多能性幹細胞」という用語は、３個の胚葉：内胚葉（胃内膜、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、尿生殖路）又は外胚葉（表皮組織及び神経系）のいずれかに分化する可能性を有する未分化の細胞を意味する。従って、多能性幹細胞は、あらゆる胎児又は成熟細胞型を生じさせ得る。しかしながら、それらは、胎盤などの胚外組織に寄与する可能性がないので、単独では胎児又は成体動物に成長し得ない。典型的には、多能性幹細胞は、以下のマーカーＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３及び４、ＴＲＡ１／８１を発現し得る（International Stem Cell Initiative recommendations, 2007を参照）。
【００１３】
本明細書において使用される「胚性幹細胞」又は「ＥＳ細胞」又は「ＥＳＣ」という用語は、多能性であり、あらゆる成体細胞を形成する能力を有する細胞を意味する。ＥＳ細胞は、１週齢未満の受精胚から生じる。（Chung et al., 2008; Revazova et al., 2007）に記載されているように、例えば、ヒト胚性幹細胞は、胚破壊を含まないプロトコールに従って得られ得る。
【００１４】
本明細書において使用される「誘導多能性幹細胞」又は「ｉＰＳ細胞」又は「ｉＰＳＣ」という用語は、非多能性細胞（例えば、成体体細胞）から人工的に生じる種類の多能性幹細胞を意味する。誘導多能性幹細胞は、あらゆる成体細胞を形成する能力を有する点で胚性幹細胞と同一であるが、胚から生じない。典型的には、誘導多能性幹細胞は、あらゆる成体体細胞（例えば、線維芽細胞）におけるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子の誘導異所性発現を通じて得られ得る。
【００１５】
例えば、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）は、（Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007）によって記載されているプロトコールに従って得られ得るか、又はこれらの元のプロトコールにおいて細胞を再プログラム化するのに使用される１つもしくはその他の薬剤が、ｉＰＳ系の起源である体細胞に作用するかもしくは移される任意の遺伝子もしくはタンパク質によって置換されている任意の他のプロトコールに従って得られ得る。基本的には、成体体細胞は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子を含む、レトロウイルスなどのウイルスベクターを用いてトランスダクションされる。
【００１６】
本明細書において使用される「多分化能幹細胞」という用語は、複数の、しかし限られた数の系列から細胞を生じさせる可能性を有する幹細胞を意味する。
【００１７】
例えば、本発明の方法において使用され得る成体ヒト幹細胞は、多能性間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、成体多系列誘導性（ＭＩＡＭＩ）細胞（adult multilineage inducible cells）（D'Ippolito et al., 2004; Reyes et al., 2002）、ＭＡＰＣ（ＭＰＣとしても知られる）、臍帯血に由来する幹細胞（Kogler et al., 2004）及び中胚葉性血管芽細胞（Dellavalle et al., 2007; Sampaolesi et al., 2006）を含むがこれらに限定されない。本明細書において使用される「多能性間葉系間質細胞」、「間葉幹細胞」又は「ＭＳＣ」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、主に骨髄（Jiang et al., 2002）及び脂肪組織（adipose tissue）（Aurich et al., 2009）（又は脂肪組織（fat tissue））から単離されるが、滑膜、骨膜又は胎盤などの他の組織においても同定されている細胞を意味する。これらの細胞は、プラスチックに接着するそれらの性質、それらの表現型及び３個の異なる系列（軟骨細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞）に分化するそれらの能力によって特徴付けられる。
【００１８】
本明細書において使用される「培養培地」という用語は、確定的内胚葉細胞の肝前駆細胞への成長及び分化を補助できる任意の培地を意味する。確定的内胚葉細胞の肝前駆細胞への成長及び分化を補助するであろう好ましい培地製剤は、化学的に定義された培地（ＣＤＭ）を含む。
【００１９】
本明細書において使用される「化学的に定義された培地」（ＣＤＭ）という用語は、特定成分、好ましくは既知の化学構造の成分だけを含む、細胞を培養するための栄養液を意味する。化学的に定義された培地は、無血清かつフィーダーフリーの培地である。
【００２０】
本明細書において使用される「無血清」は、添加血清を含まない培養培地を意味する。
【００２１】
本明細書において使用される「フィーダーフリー」は、添加フィーダー細胞を含まない培養培地を意味する。フィーダーフリーという用語は、とりわけ、たとえ第一の培養物に由来するフィーダーの一部が第二の培養物中に存在するとしても、確定的内胚葉がフィーダーを含む培養物から添加フィーダーを含まない培養培地に移されるという状態を包含する。
【００２２】
従って、化学的に定義された培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの非ヒト動物に由来する成分及びマウスフィーダー細胞のような動物フィーダー細胞を含まない。
【００２３】
好適なＣＤＭは、ヒト化Johansson and Wiles CDMを含む。ヒト化Johansson and Wiles CDMは、（Johansson and Wiles, 1995）に記載されており、インスリン、トランスフェリン及びポリビニルアルコール（ＰＶＡ）に添加され得る既知の脂質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の代わりに補充されている。本明細書において使用される「ＣＤＭ−ＰＶＡ」は、ウシ又はヒト血清アルブミンの代わりにポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含むJohansson及びWilesの化学的に定義されたヒト化培地を意味する。
【００２４】
従って、本発明による適切なＣＤＭは、７μg/mlのインスリン（例えば、Roche製、サンドホーファー、ドイツ）、１５μg/mlのトランスフェリン（例えば、Roche製）、４５０μMのモノチオグリセロール（例えば、Sigma-Aldrich製、サン・クエンティン、フランス）及び１mg/mlのポリビニルアルコール（ＰＶＡ；例えば、Sigma製）が補充された５０％ＩＭＤＭ（例えば、Invitrogen製、セルジー、フランス）ならびに５０％Ｆ１２  ＮＵＴ  ＭＩＸ（例えば、Invitrogen製）でなり得る。
【００２５】
本明細書において使用される「肝特異化を刺激する培養培地」という表現は、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（Ａｌｂ）及び肝細胞核因子４ａ（ＨＮＦ４α）などの肝臓マーカーの発現を誘導できる培養培地を意味する。
【００２６】
本明細書において使用される「マーカー」という用語は、細胞表面上でもしくは細胞中で発現しているタンパク質、糖タンパク質又は他の分子を意味し、これらは、細胞を同定するのを補助するのに使用され得る。一般的に、マーカーは、従来の方法によって検出され得る。細胞表面マーカーの検出に使用され得る方法の限定されない具体例は、免疫細胞化学、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）及び酵素分析である。
【００２７】
本明細書において使用される「ほぼ均一な集団」という用語は、全細胞数の大半（例えば、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％）が、関心対象の肝前駆体の特定の特性を有する細胞の集団を意味する。
【００２８】
「レセプター」又は「レセプター分子」は、リガンドが結合して、レセプター−リガンド複合体を形成する１つ以上のドメインを含む可溶性もしくは膜結合性／関連タンパク質又は糖タンパク質である。アゴニスト又はアンタゴニストであり得るリガンドに結合することによって、レセプターは、活性化されるか又は不活性化され、経路シグナリングを開始又は遮断し得る。
【００２９】
「レセプターアゴニスト」は、レセプターに結合して、レセプター−アゴニスト複合体を形成し、前記レセプター及びレセプター−アゴニスト複合体をそれぞれ活性化させることによって、経路シグナリング及びさらなる生物学的過程を開始させる天然又は合成化合物である。
【００３０】
「レセプターアンタゴニスト」又は「レセプター阻害剤」は、レセプターアゴニストの生物学的効果とは反対の生物学的効果を有する天然又は合成の化合物を意味する。この用語は、「真の」アンタゴニスト及びレセプターの逆アゴニストを意味するのに区別なく使用される。「真の」レセプターアンタゴニストは、レセプターに結合し、レセプターの生物学的活性化を阻害し、それによって例えば、前記レセプターに対するアゴニストと競合することによってレセプターアゴニストの作用を阻害する化合物である。逆アゴニストは、アゴニストと同一のレセプターに結合するが、逆の効果を発揮する化合物である。逆アゴニストは、アゴニストの非存在下においてレセプター活性化の構成的レベルを減少させる能力を有する。
【００３１】
本明細書において使用される「病態」という用語は、肝損傷に関連するあらゆる疾患又は症状を意味する。「肝損傷に関連する病態」という用語は、肝損傷、傷害、機能不全、欠陥又は異常によって特徴付けられるあらゆる疾患又は臨床症状を意味する。従って、この用語は、例えば、傷害、変性疾患及び遺伝性疾患を包含する。ある実施態様では、関心対象の病態は、代謝性疾患、急性肝不全、慢性肝炎を含む遺伝性疾患である。
【００３２】
本明細書において使用される「被験体」という用語は、肝損傷に関連する病態に罹患している可能性があるが、この病態を有していても有していなくてもよい、哺乳動物、好ましくはヒトを意味する。
【００３３】
本発明の文脈において、本明細書において使用される「処置する」又は「処置」という用語は、病態の発症を遅延もしくは予防すること、病態の症状の進行、増悪もしくは悪化を逆行、寛解、阻止、減速もしくは停止すること、病態の症状の回復をもたらすこと、及び／又は病態を治癒することを目的とした方法を意味する。
【００３４】
肝前駆細胞を得るための方法：
第一の態様において、本発明は、肝特異化を刺激する培養培地を用いて確定的内胚葉細胞を培養するステップを含む、肝前駆細胞の集団を得るための方法に関する。
【００３５】
典型的には、前記確定的内胚葉細胞は、多能性幹細胞又は多分化能幹細胞の分化から得られる。
【００３６】
一実施態様では、確定的内胚葉細胞は、ヒト確定的内胚葉細胞である。一実施態様では、前記ヒト確定的内胚葉細胞は、国際特許出願WO 2008/056166に記載されている方法に従って、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ）又はヒト誘導多能性細胞（ｉＰＳ）などの多能性幹細胞から得られる。特に、確定的内胚葉細胞は、ＥＳ又はｉＰＳを、アクチビン５〜２０ng/ml、好ましくは１０ng/ml及びＦＧＦ２  １〜５０ng/ml、好ましくは１２ng/mlが補充されたＣＤＭ−ＰＶＡ中で、１〜４日間、好ましくは２日間；次いで、アクチビン１〜２００ng/ml、好ましくは１００ng/ml、ＦＧＦ２  １〜１００ng/ml、好ましくは２０ng/ml、ＢＭＰ４  １〜１００ng/ml、好ましくは１０ng/ml及びLY294002 １０μMが補充されたＣＤＭ−ＰＶＡ中で、１〜５日間、好ましくは３日間培養することによって得られ得る。
【００３７】
別の実施態様では、前記ヒト確定的内胚葉細胞は、臍帯血幹細胞などの多分化能幹細胞から得られる。
【００３８】
一実施態様では、多能性幹細胞又は多分化能幹細胞は、遺伝性肝疾患の原因となる遺伝子突然変異を含む。有利なことに、この実施態様では、前記多能性幹細胞又は多分化能幹細胞から得られる肝前駆細胞の集団も前記突然変異を含み、従って、疾患の良い細胞モデルを提供し得る。
【００３９】
一実施態様では、肝特異化を刺激する培養培地は、ＲＡＲアゴニストを含む。
【００４０】
本明細書において使用される「ＲＡＲアゴニスト」という用語は、レチノイン酸レセプターの活性化の増加をもたらす天然又は合成の任意の化合物を意味する。
【００４１】
実際には、レチノイドレセプターは、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）及びレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）（それぞれが３個の異なるサブタイプからなる）という２個のファミリーに分類される。ＲＡＲ遺伝子ファミリーの各サブタイプは、２個の一次ＲＮＡ転写産物のディファレンシャルなスプライシングから生じる変化する数のアイソフォームをコードする。オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）は、レチノイン酸レセプターの生理的なホルモンであり、ほぼ等しい親和性で３個のＲＡＲサブタイプの全てに結合する。ＡＴＲＡは、ＲＸＲレセプターに結合せず、従って、選択的ＲＡＲアゴニストではない。「ＲＡＲ選択的アゴニスト」は、ＲＡＲを活性化するが、ＲＸＲの活性化をほとんど示さないかもしくは全く示さないか、又はＲＸＲを実際に阻害する化合物を意味する。特に、「選択的」は、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）に対するアゴニストの親和性が、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）に対する親和性よりも少なくとも２５倍、好ましくは５０倍、より好ましくは１００倍高いことを意味し得る。
【００４２】
ＲＡＲのアゴニストの選択性は、例えば、ＵＭＳＣＣ１０Ｂ、ＵＭＳＣＣ１１Ｂ、ＵＭＳＣＣ１４Ｂ、ＵＭＳＣＣ１７Ａ、ＵＭＳＣＣ１７Ｂ、ＵＭＳＣＣ２２Ａ及びＵＭＳＣＣ２２Ｂ（Krause et al., 1981）、ＵＭＳＣＣ３８及び１８３Ａ（Grenman et al., 1991）、ＭＤＡ８８６Ｌｎ（Sacks et al., 1989）、１４８３（Sacks et al., 1988）、ＳｑＣＣ／Ｙ１（Reiss et al., 1985）、ＴＲ１４６（Rupniak et al., 1985）などのヒト頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）細胞株の成長阻害を前記化合物が誘導するかを決定することによって、アッセイされ得る。実際、ＲＡＲ選択的レチノイドは、これらのＨＮＳＣＣ細胞株の大部分の成長を阻害するのに活性があったが、ＲＸＲ選択的アゴニストは、これらの細胞株の全てに対する弱い阻害効果を示すか、又は全く示さなかったことが見出された（Sun et al., 2000）。
【００４３】
（３８）に記載されているように、ＲＡＲ又はＲＸＲ選択性は、レセプター結合、トランス活性化及びＲＸＲホモ二量体形成を誘導する能力を測定することによっても、アッセイされ得る。
【００４４】
本発明の一実施態様では、ＲＡＲアゴニストは、選択的ＲＡＲアゴニストである。この実施態様によれば、選択的ＲＡＲアゴニストは、オールトランス型レチノイン酸（ＲＡ）、パンＲＡＲアゴニスト（すなわち、α、β及びγアイソタイプのＲＡＲを活性化する化合物）、ＬＧＤ１５５０、Ｅ６０６０、選択的ＲＡＲアゴニスト（例えば、ＣＤ３３６（Ａｍ５８０）、ＡＧＮ１９３３１２、Ａｍ５５５Ｓ、Ａｍ８０、ＣＤ２３１４、ＡＧＮ１９３１７４、ＬＥ５４０、ＣＤ４３７、ＣＤ６６６、ＣＤ２３２５、ＳＲ１１２５４、ＳＲ１１３６３、ＳＲ１１３６４、ＡＧＮ１９３０７８、ＴＴＮＮ（Ｒｏ１９−０６４５）、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２６６５、ＳＲ３９８５、ＡＧＮ１９３２７３、Ｃｈ５５、２ＡＧＮ１９０５２１、ＣＤ２３６６、ＡＧＮ１９３１０９、Ｒｅ８０（Sun et al., 1997））からなる群より選択される。ＲＡＲアゴニストは、Ｒｏ４０−６９７６、Ｒｏ１３−７４１０（ＴＴＮＰＢ）、Ｒｏ１１−０８７４、Ｒｏ０４−３７８０（１３−シス−ＲＡ）、Ｒｏ１１−４８２４（４−オキソ−ＲＡ）、Ｒｏ１１−１８１３、Ｒｏ０８−８７１７、Ｒｏ１０−０１９１、Ｒｏ１０−２６５５（４−ヒドロキシ−ＲＡ）及びＲｏ１１−０９７６（Crettaz et al., 1990）、又はＲｏ４０−６０５５及びＲｏ４１−５２５３（Horn et al., 1996）又はＣＤ２０１９でもあり得る。
【００４５】
好ましい実施態様では、ＲＡＲアゴニストは、ビタミンＡの酸性型であるオールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）である。
【００４６】
肝特異化を刺激する培養培地中のＲＡＲアゴニストの濃度は、１０−８Ｍ〜１０−６Ｍ、好ましくは約１０−７Ｍであり得る。
【００４７】
別の実施態様では、肝特異化を刺激する培養培地は、ＦＧＦファミリー成長因子及びアクチビン／Ｎｏｄａｌシグナリング経路の阻害剤をさらに含む。
【００４８】
本明細書において使用される「ＦＧＦファミリー成長因子」という用語は、１つの線維芽細胞成長因子レセプター（ＦＧＦＲ）に結合することによって、細胞の成長、増殖及び細胞の分化を刺激できる天然に存在する任意の物質（例えば、タンパク質）を意味する。１つのＦＧＦＲに結合することによって、この物質は、例えば、前記レセプターのチロシンリン酸化を増加させる。
【００４９】
本発明の一実施態様では、ＦＧＦファミリー成長因子は、ＦＧＦ７（ＫＧＦとしても知られる）、ＦＧＦ１０及びＦＧＦ２２からなる群より選択され、これらの３個の成長因子は、好ましくは、上皮細胞によって発現されるケラチノサイト成長因子レセプター（ＫＧＦＲ）及び線維芽細胞成長因子レセプターに結合するので（ＦＧＦ１０に関してのみ、ＦＧＦＲ２−ＩＩｂ及びＦＧＦＲ１Ｂ）、ＦＧＦファミリーメンバーの中でサブファミリー（ＦＧＦ７サブファミリー（Yeh et al., 2003））を構成する。
【００５０】
別の実施態様では、ＦＧＦファミリー成長因子は、ＦＧＦ１０様活性（例えば、ＦＧＦ１０模倣）を有する物質である。このような物質は、レセプターＦＧＦＲ２ｂがノックアウトされた細胞においてＦＧＦ１０シグナリングを修復するそれらの能力、又はＬＰＳ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４及びスプラウティ（Ｓｐｒｏｕｔｙ）（Ｓｐｒｙ）タンパク質などのＦＧＦＲ２ｂの阻害剤と接触された細胞の表面においてＦＧＦＲ２ｂを活性化するそれらの能力に関して化合物をスクリーニングすることによって、同定され得る。
【００５１】
好ましい実施態様では、ＦＧＦファミリー成長因子は、ＦＧＦ１０である。ＦＧＦ１０は、AutogenBioclearから購入され得る。典型的には、ＦＧＦファミリー成長因子、特にＦＧＦ１０は、１〜２００ng/ml、好ましくは２０〜１００ng/mlの範囲及び好ましくは約５０ng/mlの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００５２】
本明細書において使用される「アクチビン／Ｎｏｄａｌシグナリング経路の阻害剤」という用語は、アクチビン／Ｎｏｄａｌシグナリング経路（これは、アクチビンファミリーの任意のメンバーが細胞表面レセプターに結合することの結果として発生される一連の分子シグナルである）の活性化の減少をもたらす任意の天然又は合成の化合物を意味する。典型的には、アクチビン／Ｎｏｄａｌシグナリング経路の阻害剤は、タンパク質Ｓｍａｄ２のリン酸化のレベルの減少を引き起こす（Shi and Massague, 2003）。
【００５３】
アクチビン／Ｎｏｄａｌシグナリング経路の阻害剤は、アクチビン／Ｎｏｄａｌアンタゴニスト又は、アクチビン／Ｎｏｄａｌシグナリング経路の任意の下流ステップを阻害する分子であり得る。アクチビン／Ｎｏｄａｌシグナリングの阻害剤は、天然又は合成の化合物であり得る。アクチビン／Ｎｏｄａｌシグナリング経路の阻害剤がタンパク質である場合、それは、精製タンパク質又はリコンビナントタンパク質又は合成タンパク質であり得る。
【００５４】
リコンビナントタンパク質を製造するための方法は、当技術分野において公知である。当業者であれば、既知のタンパク質の配列又は前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列の知識から、標準分子生物学及び生化学技術を使用して、前記タンパク質を容易に製造できる。
【００５５】
本発明の一実施態様では、アクチビン／Ｎｏｄａｌシグナリング経路の阻害剤は、SB431542、レフティーＡ、ケルベロス、ココ（アクセッションナンバーＧｅｎＢａｎｋ２２７４９３２９又はＮＣＢＩ  ＮＰ＿６８９８６７．１）ならびに、アクチビンシグナリング経路を阻害するレフティーＡ及びケルベロスの誘導体からなる群より選択される。ケルベロスのこのような誘導体の例は、切断ケルベロス（truncated Cerberus）（Ｃｅｒｂ−Ｓ）（Smith et al, 2008）、Ｎ末端において残基１０６〜１１９（含む）のどこかから始まり残基２４１の後のどこかで終わるヒトケルベロス（アクセッションナンバーＮＣＢＩ  ＮＰ＿００５４４５）のフラグメント、及び、Ｎ末端において残基１０６〜１１９（含む）のどこかから始まり残基２４１の後のどこかで終わるマウスケルベロス（アクセッションナンバーＮＣＢＩ  ＮＰ＿０３４０１７）のフラグメントである。
【００５６】
好ましい実施態様では、アクチビン／Ｎｏｄａｌシグナリング経路の阻害剤は、Tocris及びSigmaから購入され得るSB431542としても知られる４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピロリジン（pyrlidn）−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物である。典型的には、ＳＢ４３１５４２は、１〜１００μM、好ましくは５〜２５μMの範囲、さらに好ましくは約１０μMの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００５７】
好ましくは、肝特異化を刺激する培養培地は含む。肝特異化を刺激する培養培地は、上記ＲＡＲアゴニスト、ＦＧＦファミリー成長因子及びアクチビン／Ｎｏｄａｌシグナリング経路の阻害剤が補充された５０％ＩＭＤＭ及び５０％Ｆ１２  ＮＵＴ、インスリン７μg/ml、トランスフェリン１５μg/ml、モノチオグリセロール４５０μMならびにポリビニルアルコール（ＰＶＡ）１mg/mlからなるＣＭＤ−ＰＶＡ基本培地を含み得る。
【００５８】
好ましくは、肝特異化を刺激する培養培地は：
−  １０−８Ｍ〜１０−６Ｍ、好ましくは約１０−７ＭのＲＡＲアゴニスト、特にＡＴＲＡ；
−  １〜２００ng/ml、好ましくは２０〜１００ng/ml、さらに好ましくは約５０ng/mlの、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０及びＦＧＦ２２からなる群より選択されるＦＧＦファミリー成長因子、好ましくはＦＧＦ１０；ならびに
−  １〜１００μM、好ましくは５〜２５μM、さらに好ましくは約１０μM  SB431542
を含む。
【００５９】
さらに好ましくは、肝特異化を刺激する培養培地は：
−  １０−８Ｍ〜１０−６Ｍ、好ましくは約１０−７ＭのＲＡＲアゴニスト、特にＡＴＲＡ；
−  １〜２００ng/ml、好ましくは２０〜１００ng/ml、さらに好ましくは約５０ng/mlの、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０及びＦＧＦ２２からなる群より選択されるＦＧＦファミリー成長因子、好ましくはＦＧＦ１０；ならびに
−  １〜１００μM、好ましくは５〜２５μM、さらに好ましくは約１０μM  SB431542が補充された基本培地ＣＭＤ−ＰＶＡ
を含む。
【００６０】
肝特異化を刺激する培養培地を用いて確定的内胚葉細胞を培養するステップは、確定的内胚葉細胞の肝特異化に要する必要時間実施されるべきである。この培養ステップの継続時間は、当業者によって容易に決定され得る。例えば、培養中、当業者であれば、確定的内胚葉細胞において特異的に発現しているマーカー（例えば、Ｓｏｘ１７、ＧＳＣ、Ｍｉｘｌ１、Ｌｈｘ１、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ６、Ｅｏｍｅｓ及びＨｅｘ）の発現の非存在に関して、及び／又は、肝前駆細胞によって特異的に発現されているマーカー（例えば、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（Ａｌｂ）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）及び肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α））の発現に関して、培養細胞をモニタリングできる。確定的内胚葉細胞に特異的なマーカーの少なくとも１つ、好ましくはいくつかの発現が検出され得ないか、及び／又は、肝前駆細胞に特異的なマーカーの少なくとも１つ、好ましくはいくつかの発現が検出される場合、肝特異化を刺激する培養培地を用いて培養する段階は、中止され得る。本発明を例示する以下の実施例に示されるように、これらのマーカーのモニタリングは、例えば、特異的プライマーを用いた培養細胞から抽出されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析、マーカーに特異的な抗体を用いた免疫蛍光分析及びＦＡＣＳを使用して、実施され得る。典型的には、前記肝特異化を刺激する培地を用いた確定的内胚葉細胞の培養は、少なくとも２日間、好ましくは少なくとも３日間、特により好ましくは少なくとも５日間実施され得る。一実施態様によれば、前記肝特異化を刺激する培地を用いた確定的内胚葉細胞の培養は、２〜５日間、特に２又は３日間実施される。
【００６１】
本発明の培養培地は、一定の間隔で部分的又は全体的に取り換えられなければならない。典型的には、本発明の培養培地は、本発明の新鮮な培養培地と１日おきに置き換えられ得る。
【００６２】
培養は、タンパク質、ペプチド又は細胞接着を助ける分子（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン又はゼラチン）でコーティングされた支持体（プレート、フラスコなど）において実施され得る。
【００６３】
好ましい一実施態様では、確定的内胚葉細胞は、肝特異化を刺激する培養培地を用いてそれらを培養する前に、ＦＧＦファミリー成長因子と一緒にあらかじめ培養される。従って、この実施態様では、確定的内胚葉細胞は、第一のステップａ）においてＦＧＦファミリー成長因子と一緒に培養され、次いで第二のステップｂ）において、ステップａ）において培養された細胞は前記肝特異化を刺激する培養培地を用いて培養される。
【００６４】
この実施態様によれば、ＦＧＦファミリー成長因子は、ＦＧＦ１０である。典型的には、ＦＧＦ１０は、１〜１００ng/mlの範囲、好ましくは約５０ng/mlの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００６５】
典型的には、前記ＦＧＦファミリー成長因子と一緒にする確定的内胚葉細胞の培養は、少なくとも２日間、好ましくは少なくとも３日間、特により好ましくは少なくとも５日間実施され得る。例えば、前記ＦＧＦファミリー成長因子と一緒にする確定的内胚葉細胞の培養は、２〜１０日間、好ましくは２〜５日間、さらに好ましくは３日間実施され得る。本発明の培養培地は、一定の間隔で（例えば、毎日）部分的又は全体的に取り換えられ得る。
【００６６】
上記方法によって作製される肝前駆細胞は、任意の適切な方法（例えば、フローサイトメトリー）を使用して、単離及び／又は精製され得る。
【００６７】
肝前駆細胞は、例えば、培養物中で展開もしくは増殖され得るか、又は臨床応用に使用され得る。
【００６８】
いくつかの実施態様では、肝前駆細胞は、関心対象の核酸を用いてさらに遺伝的に改変され得る。従って、改変された肝前駆細胞は、核酸を送達するためのベクターとして有用であり得る。
【００６９】
他の実施態様では、肝前駆細胞は、さらに分化され得る。
【００７０】
従って、本発明の確定的内胚葉細胞に由来する肝前駆細胞の集団は、胎児肝細胞を得るのに好適であり得る。
【００７１】
胎児肝細胞を得るための方法：
従って、本発明の第二の態様は、
ａ．本発明の方法に従って肝前駆細胞の集団を作製するステップ、及び
ｂ．前記肝前駆細胞の集団を胎児肝細胞に分化させるステップ
を含む、胎児肝細胞の集団を得るための方法に関する。
【００７２】
好ましい一実施態様では、肝前駆細胞の集団を胎児肝細胞に分化させるステップは、ＦＧＦファミリー成長因子、ＥＧＦシグナリング経路のアゴニスト及びＨＧＦシグナリング経路のアゴニストを含む培養培地を用いて前記肝前駆細胞を培養することによって実施される。
【００７３】
胎児肝細胞を得るための方法に関連して使用される「ＦＧＦファミリー成長因子」という用語は、１つの線維芽細胞成長因子レセプター（ＦＧＦＲ）に結合することによって、細胞の成長、増殖及び細胞の分化を刺激できる天然に存在する任意の物質（例えば、タンパク質）を意味する。１つのＦＧＦＲに結合することによって、この物質は、例えば、前記レセプターのチロシンリン酸化を増加させる。
【００７４】
一実施態様では、ＦＧＦファミリー成長因子は、ＦＧＦ４（ヘパリン分泌形質転換タンパク質１又はカポジ肉腫ガン遺伝子としても知られる）である。典型的には、ＦＧＦ４は、１〜１００ng/ml、好ましくは１〜５０ng/mlの範囲、さらに好ましくは約３０ng/mlの濃度で本発明の培養培地に添加される。ＦＧＦ４は、Peprotechから購入され得る。
【００７５】
本明細書において使用される「ＥＧＦシグナリング経路のアゴニスト」という用語は、ＥＧＦの細胞膜レセプターである上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）の活性化の増加をもたらす天然又は合成の任意の化合物を意味する。ＥＧＦＲはまた、ＥＧＦ様モチーフとして分類されるアミノ酸配列を含む他のリガンドに結合する。ＥＧＦＲは、ＥｒｂＢ−１レセプターとしても知られており、レセプターチロシンキナーゼのＩ型ファミリーに属する。ＥＧＦレセプターに対するアゴニストを設計するための方法は、例えば、国際特許WO 99/62955に記載されている。
【００７６】
本発明の一実施態様では、ＥＧＦシグナリング経路のアゴニストは、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及び免疫グロブリン結合タンパク質（ＩＧＢＰ）からなる群より選択される。
【００７７】
好ましい一実施態様では、ＥＧＦシグナリング経路のアゴニストは、ＥＧＦである。典型的には、ＥＧＦは、１〜１００ng/mlの範囲、好ましくは約５０ng/mlの濃度で本発明の培養培地に添加される。ＥＧＦは、Peprotechから購入され得る。
【００７８】
本明細書において使用される「ＨＧＦシグナリング経路のアゴニスト」という用語は、ＨＧＦ生物学的活性もしくはＨＧＦレセプター活性化を直接的もしくは間接的に、実質的に誘導、促進もしくは増強できる天然又は合成の任意の化合物を意味する。US patent 6,099,841に記載されているように、ＨＧＦ生物学的活性は、例えば、肝細胞成長促進のin vitro又はin vivoアッセイにおいて測定され得る。
【００７９】
ＨＧＦシグナリング経路のアゴニストは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（Michieli et al., 2002）又はＨＧＦ経路を活性化できる任意の物質（例えば、薬物、ＨＧＦの合成又は天然の類似物、例えばＨＧＦの切断型）であり得る。特に、アゴニストは、マジック因子１、Ｍｅｔチロシンキナーゼの部分的アゴニスト、ＨＧＦの高親和性レセプターであり得る（３９）。
【００８０】
好ましい一実施態様では、ＨＧＦシグナリング経路のアゴニストは、ＨＧＦである。典型的には、ＨＧＦは、１〜１００ng/mlの範囲、好ましくは約５０ng/mlの濃度で本発明の培養培地に添加される。ＨＧＦは、Peprotechから購入され得る。
【００８１】
肝前駆細胞の分化を刺激する培養培地を用いて細胞を培養するステップは、肝前駆細胞の作製に要する必要時間実施すべきである。この培養ステップの継続時間は、当業者によって容易に決定され得る。例えば、培養中、当業者であれば、肝前駆細胞によってのみ発現されているマーカー（例えば、サイトケラチン１９）の発現の非存在に関して、及び／又は、胎児肝細胞によって特異的に発現されているマーカー（例えば、アルブミン、ＡＦＰ、ＣＫ１８、ＣＫ８、アポリポタンパク質ＡＩＩ、トランスセリシン、α−１−抗トリプシン、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ３β、β１−インテグリン、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＬＤＬ、Ｃｙｐ３Ａ７、ＡＳＧＲならびにインドシアニングリーン取り込み及び分泌）の発現に関して、培養細胞をモニタリングできる。確定的内胚葉細胞に特異的なマーカーの少なくとも１つ、好ましくはいくつかの発現が検出され得ないか、及び／又は、肝前駆細胞に特異的なマーカーの少なくとも１つ、好ましくはいくつかの発現が検出される場合、肝前駆細胞の分化を刺激する培養培地を用いて培養する段階は、中止され得る。これらのマーカーのモニタリングは、例えば、特異的プライマーを用いた培養細胞から抽出されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析、マーカーに特異的な抗体を用いた免疫蛍光分析及びＦＡＣＳを使用して、実施され得る。典型的には、前記本発明の培地を用いた確定的内胚葉細胞の培養は、少なくとも３日間、好ましくは少なくとも７日間、特により好ましくは少なくとも１５日間実施され得る。
【００８２】
必要な場合、本発明の培養培地は、一定の間隔で部分的又は全体的に取り換えられ得る。典型的には、本発明の培養培地は、本発明の新鮮な培養培地と１日おきに１５日間置き換えられ得る。
【００８３】
上記方法によって作製される胎児肝細胞は、任意の適切な方法（例えば、ＦＡＣＳ）を使用して、単離及び／又は精製され得る。
【００８４】
胎児肝細胞は、例えば、培養物中で展開もしくは増殖され得るか、又は臨床応用に使用され得る。いくつかの実施態様では、胎児肝細胞は、成熟肝細胞にさらに分化され得る。
【００８５】
従って、本発明の胎児肝細胞の集団は、成熟肝細胞を得るのに好適であり得る。
【００８６】
医薬組成物：
次いで、本発明の方法に従って得られた確定的内胚葉細胞に由来する肝前駆細胞及び／又は胎児肝細胞の集団は、肝臓治療及び／又は肝臓の再構築もしくは再生に好適であり得る。
【００８７】
従って、本発明は、本発明の肝前駆細胞の集団及び場合により薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。ある実施態様では、医薬組成物は、少なくとも１つの生物学的に活性な物質又は生物活性因子をさらに含み得る。
【００８８】
本明細書において使用される「薬学的に許容される担体又は賦形剤」という用語は、前駆細胞の生物学的活性の効力を妨げず、投与される濃度においてホストに対して過度に有毒ではない、担体培地を意味する。適切な薬学的に許容される担体又は賦形剤の例は、水、塩溶液（例えば、リンガー液）、オイル、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミラーゼ又はデンプン）、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリンを含むがこれらに限定されない。医薬組成物は、液体、半液体（例えば、ゲル、アルギン酸ビーズ）又は固体（例えば、マトリックス、格子、足場など）として製剤化され得る。
【００８９】
本明細書において使用される「生物学的に活性な物質又は生物活性因子」という用語は、本発明の医薬組成物におけるその存在が組成物を受ける被験体にとって有益である、任意の分子又は化合物を意味する。当業者によって認識されているように、本発明の実施における使用に好適な生物学的に活性な物質又は生物活性因子は、生物活性分子及び化合物の多種多様なファミリーにおいて見出され得る。例えば、本発明の文脈において有用な生物学的に活性な物質又は生物活性因子は、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、免疫抑制剤又は免疫調節剤、抗酸化剤、成長因子及び薬物から選択され得る。
【００９０】
本発明の関連態様は、肝病態に罹患している被験体を処置するための方法であって、確定的内胚葉細胞に由来する肝前駆細胞の集団（又はその医薬組成物）の有効量を被験体に投与するステップを含む方法に関する。
【００９１】
本発明のこの態様によれば、処置され得る肝病態は、遺伝性代謝異常（例えば、クリグラー・ナジャー症候群Ｉ型、糖原病（glucogenosis）１ａ、尿素サイクル異常症、家族性高コレステロール血症、チロシン血症及びウィルソン病）、ウイルス感染（特に、ＨＢＶ又はＨＣＶによる感染）によって引き起こされ得る慢性もしくは急性肝不全、毒性（アルコール）及び薬物又は自己免疫疾患（自己免疫性慢性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎）からなる群より選択される。
【００９２】
本明細書において使用される「有効量」という用語は、意図した目的を達成するのに十分である、確定的内胚葉細胞に由来する肝前駆細胞の集団（又はその医薬組成物）の任意の量を意味する。
【００９３】
本発明の確定的内胚葉細胞に由来する肝前駆細胞の集団（又はその医薬組成物）は、任意の適切な方法を使用して被験体に投与され得る。
【００９４】
本発明の確定的内胚葉細胞に由来する肝前駆細胞の集団は、単独でもしくは他の細胞と組み合わせて、ならびに／又は他の生物学的に活性な因子もしくは試薬、及び／もしくは薬物と組み合わせて移植され得る。当業者によって理解されているように、これらの他の細胞、生物学的に活性な因子、試薬及び薬物は、本発明の細胞と一緒に同時に又は連続的に投与され得る。
【００９５】
ある実施態様では、本発明による処置は、細胞に基づいた処置を開始する前に、被験体を薬理学的に免疫抑制することをさらに含む。被験体の全身的又は局所的免疫抑制法は、当技術分野において周知である。
【００９６】
効果的な投与量及び投与レジメンは、被験体の病態の性質に基づいた適正医療業務によって容易に決定され得、病態の症状の程度、及び関心対象の組織もしくは器官の損傷又は変性の程度、及び被験体の特徴（例えば、年齢、体重、性別、身体全体の健康など）を含むがこれらに限定されない多くの因子に依存するであろう。
【００９７】
化合物をスクリーニングするための方法：
本発明の細胞の異なる集団は、他の用途も有し得る。これらの用途は、肝損傷に関連する傷害又は病態をモデリングするための、及び、齧歯類において化合物をスクリーニングするための使用を含むがこれらに限定されない。
【００９８】
例えば、前記細胞の集団は、様々なin vitro及びin vivo試験にも使用され得る。特に、限定されないが、それらは、医薬候補化合物などの化合物の肝毒性の評価における用途を見出す。
【００９９】
従って、本発明のさらなる態様は、肝防御又は肝毒性作用を有する化合物をスクリーニングするための方法であって：
ａ．試験化合物の存在下において、本発明による肝前駆細胞の集団、胎児肝細胞の集団又は成熟肝細胞の集団を培養するステップ、及び
ｂ．ステップａ）の細胞の生存を、前記試験化合物の非存在下において培養された上記の前記細胞の集団のものと比較するステップ
を含む、方法に関する。
【０１００】
「肝毒性」という用語は、肝前駆細胞又は肝細胞の生存の減少を引き起こす化合物を意味する。化合物の存在下において培養された生細胞の数が、前記化合物の非存在下において培養された生細胞の数よりも少ない場合、前記化合物は、肝毒性作用を有するとみなされる。
【０１０１】
「肝防御」という用語は、肝前駆細胞又はニューロンの生存の増加をもたらす化合物を意味する。化合物の存在下において培養された生細胞の数が、前記化合物の非存在下において培養された生細胞の数よりも多い場合、前記化合物は、肝防御作用を有するとみなされる。典型的には、肝防御作用は、肝臓栄養因子（hepatotrophic factors）の非存在下においてアッセイされ得る。あるいは、肝防御作用は、公知の肝毒性薬物の存在下においてアッセイされ得る。公知の肝毒性薬物は、アミオダロン、メトトレキサート、ニトロフラントインを含むがこれらに限定されない。
【０１０２】
動物モデル
ヒトＥＳもしくはｉＰＳに由来し得る肝前駆細胞及び／又は胎児肝細胞の利用可能性は、ヒト肝疾患及び肝指向性ウイルス性疾患、特にＢ又はＣ型肝炎のin vitroならびにin vivoモデルを設計することをさらに可能にする。より具体的には、ヒト肝疾患及び肝指向性ウイルス性疾患のin vivoモデルは、ヒト肝前駆体及び／又は胎児肝細胞を用いて非ヒト哺乳動物の肝臓を再構築することによって提供され得る。
【０１０３】
従って、本発明は、機能的ヒト肝細胞を含む非ヒト哺乳類ホストを作製するための、本発明による方法によって得られたか、もしくは得られ得るヒト肝前駆細胞及び／又はヒト胎児肝細胞の使用にさらに関する。
【０１０４】
機能的ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト哺乳動物を作製する適切な方法は、本発明によるヒト肝前駆細胞及び／又はヒト胎児肝細胞を前記非ヒト哺乳動物の肝臓に注射する段階からなるステップを含み得る。ヒト肝前駆細胞及び／又はヒト胎児肝細胞の生着を助けるために、非ヒト哺乳動物は、抗マクロファージ処置を受けて、非適応的防衛をコントロールし得る。これは、例えば、ジクロロメチレン二リン酸を投与することによって（例えば、リポソーム被包性ジクロロメチレン二リン酸の腹腔内注射によって）実施され得る。
【０１０５】
本発明は、本発明の方法によって得られたか、又は得られ得る機能的ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト哺乳動物にさらに関する。
【０１０６】
本発明の非ヒト哺乳動物は、ヒト肝細胞が導入及び保持され得る任意の非霊長類哺乳動物であり得る。これは、ウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、ラット、ハムスター、ウサギ、スナネズミ、テンジクネズミ及びマウスを含むがこれらに限定されない。好ましくは、ホスト動物は、齧歯類、さらに好ましくはマウスである。それは、非ヒト霊長類（マカク属）でもあり得る。
【０１０７】
非ヒト哺乳動物は、特に、異種細胞（ヒト肝細胞）に対する十分な免疫応答を一般的に高めることができないであろう免疫不全哺乳動物であり得る。移植に好適な免疫不全哺乳類ホストは存在しているか、又は、例えば１つ以上の化合物（例えば、サイクロスポリン）の投与によって、もしくは、例えば免疫グロブリン及びＴ細胞抗原レセプターをコードするローカスにおける生殖系列ＤＮＡ再構成を起こす能力の喪失をもたらす遺伝的欠損によって作り出され得る。
【０１０８】
ヒト肝細胞の機能性は、それらの非ヒト哺乳類（特に、マウス）と区別できるヒト肝細胞の生理的産物、免疫学的又は定量的基準による類似物（例えば、ヒト血清アルブミンの発現又はＩＬ−６に反応するＣ反応性タンパク質の発現）などを含む、肝細胞活性に関する代理マーカーを見ることによってモニタリングされ得る。これらのマーカーは、レシピエントの犠牲を伴わない細胞の存在を決定するのに使用され得る。
【０１０９】
機能的ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト哺乳動物は、特に、ヒトＢ型肝炎感染症のin vivoモデルとして使用され得る。
【０１１０】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるであろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、なんら本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、化学的に定義された培地を使用して、ヒト多能性幹細胞又はヒト多分化能幹細胞を肝前駆体に分化させるための本発明による方法のスキームを表す。
【０１１２】
実施例：
材料と方法
確定的内胚葉（ＤＥ）細胞の肝前駆体への分化：
肝内胚葉を誘導するために、ＦＧＦ１０（５０ng/ml、Autogenbioclear、ノッティンガム、イギリス）の存在下において、ＣＤＭ−ＰＶＡ中でＤＥ細胞を３日間培養し、次いで、レチノイン酸（１０−７Ｍ、Sigma）、SB431542（１０μM、Tocris、ブリストル、イギリス）及びＦＧＦ１０（５０ng/ml、Autogenbioclear）の存在下において、得られた細胞を成長させた。最後に、ＦＧＦ４（３０ng/ml、Peprotech、ヌイイシュルセーヌ、フランス）、ＨＧＦ（５０ng ml-1、Peprotech）及びＥＧＦ（５０ng ml-1、Peprotech）の存在下において、得られた肝前駆体を３〜１５日間成長させて、それらの肝細胞への分化を誘導した。
【０１１３】
ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的ＰＣＲ分析：
RNeasy Mino Kit（Quiagen、コートアボフ、フランス）を使用して、総ＲＮＡを細胞から抽出した。RNAse-free DNAse（Quiagen）で各サンプルを処理した。各サンプルに関して、Superscript II Reverse Transcriptase（Invitrogen）を使用して、０．６μgのＲＮＡを逆転写した。GoTaq Flexi DNA Polymerase（Promega、シャルボニエ、フランス）を使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。使用したプライマー及び条件を表１に記載する。
【０１１４】
【表１】
2013511969.tif 000002
【０１１５】
Stratagen Mw3005Pを使用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、製造業者（SensiMiX Protocol Quantace、ロンドン、イギリス）によって記載されているように混合物を調製し、次いで、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間変性させ、続いて、４０サイクル終了後に７２℃で１０分間最終伸長させた。
【０１１６】
定量的ＰＣＲに使用したプライマーを表２に記載する。各反応を２回実施し、同じランでＰＢＧＤに対して標準化した。結果を３回の独立した実験の平均として提示し、エラーバーは標準偏差を示す。
【０１１７】
【表２】
2013511969.tif 000003
【０１１８】
免疫蛍光：
パラホルムアルデヒド４％（Alpha Aesar、カルルスルーエ、ドイツ）中で細胞を４℃で２０分間固定し、次いで、３％ＢＳＡ又は１％ゼラチンを含むＰＢＳ溶液中で１時間ブロッキングした。細胞内染色に関して、ブロッキング前に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で細胞を透過処理した。細胞を、一次抗体と一緒に室温で１時間インキュベーションした。ヒトα−１−抗トリプシンに対する一次抗体（１：１００）、ＣＫ１９（１：５０）及びαフェトプロテイン（１：３００）をDAKO（DakoCytomation、トラップ、フランス）から購入した。ヒトＯｃｔ４に対する抗体（１：１００）、ＨＮＦ４に対する抗体（１：１００）をTebu Bio（ル  ペレ  アン  イブリーヌ、フランス）から購入した。ＰＢＳ中で細胞を３回洗浄した後、細胞を二次抗体と一緒に室温で１時間インキュベーションし、結合ヤギ抗マウスＣｙ３（１：８００）及び結合ニワトリ抗ウサギalexa 488（１：６００）をGE-HealthCare Bio-Sciences ABから入手した。ＰＢＳ中で３回洗浄することによって、未結合の二次抗体を除去した。Hoescht 33258（１：１００００、Sigma）を最初の洗浄に添加した。
【０１１９】
ＦＡＣＳ分析（フローサイトメトリー）：
ＰＢＳ中で０．２mg/mlＥＤＴＡ（Sigma）及び１mg/mlBSA fraction V（Sigma）を用いて３７℃で５分間解離することによって細胞を回収し、洗浄し、ＰＢＳ＋３％ＦＢＳ中で再懸濁した。細胞を、一次抗体（ウサギ抗ヒトｃ−ｍｅｔ（１：２５）（Tebu Bio）又はウサギ抗ヒトＡＳＧｒ（１：２５）（Abcam、ケンブリッジ、イギリス）、ウサギ抗ヒトｒＬＤＬ（１：２０）（Abcam）又はＣＤ−４９ｆＦＩＴＣ結合抗体（１：２０）（BD Pharmingen、ブリュマト、フランス））と一緒に４℃でインキュベーションした。３回洗浄した後、細胞を抗体（ＰＥ結合ヤギ抗ウサギ（１：１００））と一緒にインキュベーションした。次いで、FACS-Calibur（BD Biosciences）を使用して、細胞を分析した。
【０１２０】
肝細胞機能
McManusによる過ヨウ素酸シッフ技術によって、グリコーゲン貯蔵をアッセイした。
【０１２１】
Dil-Ac-LDL staining kit（Biomedical Technologies、ストートン、MA）を使用してＬＤＬの取り込みを実施し、製造業者の使用説明書に従ってアッセイを実施した。肝臓マーカーとの共局在化に関して、４％パラホルムアルデヒド中で細胞を固定し、次いで、上記のように免疫蛍光によってさらにアッセイした。
【０１２２】
ヒトタンパク質に特異的なキット（Dade Behring）を用いて、アルブミン濃度を測定した。
【０１２３】
細胞を１mg/mlＩＣＧと一緒に６０分間インキュベーションすることによって、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）取り込み試験を実施した。次いで、培地中で細胞を洗浄し、１６時間後にＩＣＧの放出を評価した。
【０１２４】
P450-Glo assays kit（Promega）を使用して、製造業者の提言に従ってＣＹＰ３Ａ７活性を測定した。次いで、P450-GloMax９６マイクロプレート照度計を使用してシトクロム活性を分析した。
【０１２５】
レンチウイルス作製及びヒト胚性幹細胞のトランスダクション
ＥＦ１α−ＧＦＰレンチベクターを構築し、Vectalys（トゥールーズ、フランス）によって作製した。研究室においてＡＰＯＡ−ＩＩ−ＧＦＰレンチベクターを構築し、Vectalysによって作製した。
【０１２６】
レンチウイルスによるトランスダクションの前に、ｈＥＳＣを解離し、４ng/mlＦＧＦ２（R&D systems）を含むｈＥＳＣ培地中で分裂期に不活性化したＭＥＦに播種する前に、緩やかな振動の下でlow-attachment 24-well plate（Corning Life Sciences）においてウイルスパーティクルと一緒に３７℃で３時間インキュベーションした。上記化学的に定義された条件を使用して、未分化のトランスダクションした細胞を増殖及び分化させた。
【０１２７】
動物：
French Ministry of Agricultureによって承認されたプロトコールの下で、動物試験を行った。分化した細胞（５０μl食塩水中の５ｘ１０５細胞／動物）を、５日齢ｕＰＡｘＲａｇ２γｃ−／−マウス（ｎ＝９）の肝臓に注射した。非適応的防衛をコントロールするために、マウスは、（Strick-Marchand et al., 2004）に記載されているように、リポソーム被包性ジクロロメチレン二リン酸（２５０μgのクロドロネート）の腹腔内注射によって、抗マクロファージ処置を受けた。移植後８週間に、移植マウスを殺した。血液サンプルを採取し、Ｅｌｉｓａ試験によって血清中のヒトアルブミンを定量化した。組織学的分析のために肝臓を取り出し、肝臓フラグメントをＯＣＴ化合物中に包埋し次いで液体窒素中で凍結させたか、又はＰＦＡ４％中で固定しパラフィン中に包埋した。非移植マウスをコントロールとして使用した。
【０１２８】
結果
ヒト内胚葉細胞の肝前駆体への分化
Ｈ９細胞又はｈＩＰＳＣを、ＣＤＭ＋１０ng/mlアクチビン＋ＦＧＦ２ １２ng/mlにおいて２日間、ＣＤＭ−ＰＶＡ、１００ng/mlアクチビン、２０ng/mlＦＧＦ２、１０ng/mlＢＭＰ４、１０μM  LY294002において３日間培養することによって、ＤＥ細胞を作製した。様々な組み合わせの因子（例えば、ＦＧＦ１０、Ｗｎｔ、レチノイン酸（ＲＡ）及びアクチビンＡ）の存在下において、肝前駆体にさらに分化するＤＥ細胞の能力。アクチビン／Ｎｏｄａｌレセプターの薬理学的阻害剤であるSB431542（Inman et al., 2002）又はＷｎｔシグナリング経路の阻害剤であるＦｒｉｚｚｌｅｄ８／Ｆｃキメラ（Hsieh et al., 1999）をそれぞれ使用して、アクチビン及びＷｎｔ経路を阻害する効果も分析した。
【０１２９】
ＨＮＦ４α及びαフェトプロテイン（ＡＦＰ）（これらは、肝臓発生の初期段階の間に肝前駆体において発現している２個のマーカーである）の発現に関して、肝臓細胞の作製をモニタリングした。ＤＥ細胞を、まずＦＧＦ１０の存在下において３日間、次いで、ＦＧＦ１０、ＲＡ及びSB431542の組み合わせにおいてさらに２日間成長させた場合に、ＨＮＦ４α及びＡＦＰ発現の最も高い誘導が認められた。
【０１３０】
Ｗｎｔシグナリングの阻害は肝分化を減少させたが、このことは、ＤＥ細胞の肝内胚葉への分化をコントロールする機序において、Ｗｎｔが本質的機能を有することを示す最近の観察（Hay et al., 2008）を裏付けている。しかしながら、ＤＥ細胞は、高いレベルのＷｎｔ３ａを既に発現していたので、外来性のＷｎｔは、本発明者らの培養条件に必要ではなかった。
【０１３１】
これらの結果は、ＦＧＦ１０及びＷｎｔシグナリングによって相乗作用を与えられる肝特異化において、ＲＡが重要な役割を果たすのに対して、肝前駆体へのＤＥ細胞分化の初期ステップをＴＧＦβシグナリングが妨げる可能性を示唆している。
【０１３２】
ＦＧＦ１０、ＲＡ及びSB431542の組み合わせによって作製した肝前駆体のほとんどは、ＥｐＣＡＭを発現していた。６０％及び５０％の細胞において、ＨＮＦ４α及びＡＦＰ又はＣＫ１９がそれぞれ共発現していた。肝臓発生中に、肝細胞及び胆管上皮細胞は、共通の両性能前駆体（肝芽細胞）から生じるので、本発明者らの結果は、分化過程中に肝芽細胞の集団が発生したことを示唆している。
【０１３３】
肝前駆体の肝細胞様細胞への成熟
次いで、肝前駆体を肝細胞に分化させるために、培養条件を開発した。本発明者らは、ＦＧＦ４、ＨＧＦ及びＥＧＦの組み合わせが、肝前駆体のより分化した細胞への分化を誘導するのに十分であったことを認めた。５日後、これらの培養条件において、細胞の形態は、肝細胞の典型である立方形の形状に似ていた。加えて、ヒト胎児及び成体肝細胞と比較して、作製した細胞は、α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ（ＡｐｏＡＩＩ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ、トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ、因子ＩＸならびに解毒酵素Ｃｙｐ３Ａ７及びＣｙｐ７Ａ１を含む成熟肝臓細胞に特異的なマーカーを発現していた。
【０１３４】
肝細胞の発生を免疫染色分析によって確認したところ、分化している肝前駆体がＣＫ８／１８をほぼ均一的に発現していたこと、ならびに、細胞の集団がＡＡＴ及び高いレベルのアルブミン（Ａｌｂ）を発現していたことが示された。３５％の細胞がＡＳＧＲ１、ＬＤＬＲ、ｃ−ｍｅｔ及びα６インテグリンを発現していたことが、ＦＡＣＳ分析によって示された。興味深いことに、これらの細胞表面マーカーの最後の２個は、in vivoで増殖している肝細胞の特徴である。
【０１３５】
これらの肝細胞様細胞の同一性をさらに確認するために、本発明者らは、ヒトＡＰＯＡ−ＩＩ調節配列のコントロール下において、ＧＦＰを保持するリコンビナントレンチウイルスで未分化のｈＥＳＣをトランスダクションし、それらの分化を誘導した。ＥＦ１αプロモーターのコントロール下において、ＧＦＰを保持するレンチベクターでトランスダクションした細胞を、陽性コントロールとして使用した。トランスダクション後４８時間に７５％のコントロール細胞が蛍光を発したのに対して、ＡＰＯＡ−ＩＩプロモーターによって誘導した場合はＧＦＰの発現が検出できなかったことが、フローサイトメトリー分析によって示された。ＡＰＯＡ−ＩＩ−ＧＦＰレンチベクターでトランスダクションした細胞は、たった１３日間の分化の後にＧＦＰを発現し始めたが、このことは、内胚葉細胞の成熟肝臓細胞への進行性分化を裏付けており、本発明者らの培養システムにおいて作製した肝細胞が肝臓特異的プロモーターの生理学的調節を示すことも実証している。
【０１３６】
加えて、本発明者らは、これらの分化した細胞がin vitroで機能的であったか否かを試験した。６０％の細胞がグリコーゲンを貯蔵できたことが、過ヨウ素酸シッフ染色によって明らかになった。加えて、ＣＫ１９陽性細胞及びＡＦＰ陽性細胞は、ＬＤＬを取り込むことができた。本発明者らは、肝細胞の機能特性であるＩＣＧインドシアニングリーンの取り込み及び排出も検査した。ＩＣＧ陽性細胞を可視化したところ、細胞は、培地から取り出した１６時間後にＩＣＧを排出した。これらの細胞が５．９＋０．７μg／１０６細胞／日の速度でアルブミンを分泌したことが、培養培地中のアルブミンの分泌量の分析によって明らかになった。最後に、作製した肝細胞は、ＣＹＰ３Ａ７活性を示した。
【０１３７】
ＥＳに由来する肝細胞は、in vivoで機能的である
次いで、ｈＥＳＣから作製した肝細胞の生着能力及び肝実質内での分化能力を調査した。ＧＦＰを発現しているｈＥＳＣを２１日間分化させ、得られた細胞をｕＰＡｘｒａｇ２γｃ−／−マウスの肝臓に移植した。これらの免疫不全トランスジェニックマウスは、Ａｌｂプロモーターのコントロール下において、ウロキナーゼ遺伝子を発現する。この導入遺伝子は肝細胞にとって有毒であり、従って、それは、肝臓成長を一時的に（常在細胞において、導入遺伝子が不活性化されるまで）阻害し、移植細胞のより良い生着を可能にする。
【０１３８】
移植マウスの肝臓においてヒトＡＡＴ及びＡＬＢを発現している細胞の存在（これは、ｈＥＳＣから作製した肝細胞がin vivoで生着でき、肝細胞のタンパク質特性を発現できたことを裏付けている）が、免疫組織化学的分析によって示された。ヒト細胞は、主に小さな及び大きな細胞集団として肝臓全体にわたって分布していたが、このことは、移植細胞が増殖し、肝臓成長に関与したことを示唆している。加えて、ヒトＡＡＴ及びＧＦＰタンパク質は、同じ細胞において共発現していたが、このことは、これらの細胞集団がヒト由来であることを裏付けている。さらに、移植動物の血清は、３ng/mlヒトアルブミンを含んでいたが、このことは、移植細胞がin vivoで肝細胞のいくつか機能特性を示したことを裏付けている。最後に、奇形腫又は肝内腫瘍の存在は、組織学的検査によって明らかにならなかったが、このことは、注射した細胞集団だけが完全に分化した細胞を含むことを示唆している。
【０１３９】
ｈＥＳＣ用に開発した培養条件を使用した、ヒト誘導多能性幹細胞からの肝前駆体の作製
ヒト誘導多能性幹細胞は、再プログラム化した線維芽細胞から生じ得る。従って、本発明者らは、ｈＥＳＣから肝細胞を作製するために開発した培養条件が、ｈＩＰＳＣを肝細胞に分化させるのにも効果的であり得るか否かを調査した。Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４及びｃＭｙｃを発現しているレトロウイルスを使用して、（Vallier et al., 2009）に記載されているＣＤＭ＋アクチビンＡ＋ＦＧＦ２において、包皮線維芽細胞を再プログラム化し、３個の得られたｈＩＰＳＣ株を上記培養条件で成長させた。これらの培養条件下で作製した細胞が、同じ培養条件を使用して分化させたｈＥＳＣよりも同じようなレベルで、ＨＮＦ４α、ＡＦＰ及びアルブミンを発現していたことが、免疫染色及びＱ−ＰＣＲ分析によって示された。要するに、これらのデータは、ｈＥＳＣを用いて開発した本発明者らのアプローチが、ｈＩＰＳＣから肝臓細胞を作製するのにも使用できることを示唆している。
【０１４０】
現在、いくつかの方法が、ｈＥＳＣから肝細胞様細胞を作製するのに利用可能であるが、本発明者らのアプローチは、２つの主な利点を有する。それは、フィーダー細胞及び血清を含まない完全に定義された培地に基づいており、それはまた、酪酸ナトリウム又はＤＭＳＯ（これらは両方とも、それぞれ、ヒストンアセチル化を阻害すること、及び、ＤＮＡメチル化を増加させることによって、哺乳類細胞のエピジェネティックプロファイルに影響を与えることが知られている（Iwatani et al., 2006））の使用を避けている。その結果として、本発明者らの方法は、ｈＥＳＣの肝細胞への分化を可能にする既存の方法（Cai et al., 2007; Duan et al., 2007; Lavon et al., 2004; Rambhatla et al., 2003; Schwartz et al., 2005）に明らかな進歩をもたらす。
【０１４１】
さらに、本発明者らのプロトコールは、哺乳類の発生における確定的内胚葉細胞の肝細胞への進行性分化を模倣する過程に従っている。第一のステップにおいて、高投与量のアクチビンＡ、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４及びLY294002の組み合わせを使用して、ｈＥＳＣをＤＥ細胞に分化させる。ｈＥＳＣの内胚葉分化を増大させるためのこのＰＩ３キナーゼ阻害剤の使用は、以前に示されている（Johansson and Wiles, 1995）。しかしながら、この研究は、血清、マトリゲル及びフィーダーを含む培地に基づいていた。加えて、本発明者らの条件におけるＰＩ３キナーゼの阻害は、多能性におけるアクチビンシグナリングの作用を阻害するのに十分ではなかった。その結果として、多能性遺伝子の発現を抑制し、アクチビンシグナリングを内胚葉分化の誘導シグナルに変換するのに、ＢＭＰ４などの他の因子を必要とする。これらの結果は、完全に定義された培養条件を使用して、重要な細胞の運命選択をコントロールするシグナリング経路を定義することの重要性を強調している。第二のステップにおいて、ＦＧＦ１０及びＲＡ（これらは、in vivoにおける肝臓成長及び肝芽細胞生存に重要であることが知られている２個の因子である（Hatzis and Talianidis, 2001; Berg et al, 2007; Zaret, 2008））の組み合わせは、ＣＫ１９及びＨＮＦ４αを共発現する肝前駆体への内胚葉細胞の分化を誘導するのに不可欠なようである。これらの２個のマーカーは、発生の初期段階において、両性能肝芽細胞によって特異的に共発現されており、それらの発現は、肝臓器官形成中、胆管上皮細胞と肝細胞との間でそれぞれ別々である。しかしながら、本発明者らは、ＴＧＦβが肝芽形成に必要であることを示すマウス胚における研究（Lemaigre and Zaret, 2004）と比較して、アクチビンシグナリングの阻害が肝分化を増大させ得ることも認めた。しかしながら、マウス及びヒト肝臓発生におけるアクチビン／ＴＧＦβシグナリングの機能は、保存されていない可能性がある。あるいは、肝芽特異化は、マウスにおける１２〜２４時間に対して、ヒトにおいては３〜４日間を必要とし、従って、マウス発生中に非常に迅速に起こる機序は、in vitroにおけるｈＥＳＣの分化中により明白になり得る。
【０１４２】
第三のステップは、in vivoでこの過程に関与することが知られている成長因子（ＦＧＦ４、ＥＧＦ及びＨＧＦ）（Jung et al., 1999; Suzuki et al., 2003）の組み合わせを使用して増殖状態を維持しながら、これらの肝前駆体を肝細胞に分化させる段階にある。作製した細胞は、様々な成体肝臓特異的タンパク質、及び、多くの肝臓特異的遺伝子の発現をコントロールするのに必要である重要な肝細胞核因子を発現していた。加えて、これらの細胞は、肝臓細胞の特異的機能も示した。これらの特性は、ｈＥＳＣに由来する肝細胞が分化されることを示唆しているが、本発明者らの結果は、この集団が依然として胎児肝臓発生段階にあることも示唆している。実際、これらの肝細胞は、他者によって既に報告されているＡＦＰの発現（Basma et al., 2009; Cai et al., 2007）などのいくつかの未成熟特性を保持している。完全な成熟肝細胞を作製するための条件を決定するには、さらなる調査が必要であろう。高密度細胞培養、又は、他の細胞型（例えば、内皮細胞）との共培養と組み合わせたさらなる誘導因子は、この主な課題を克服する潜在的解決策を示す可能性がある。
【０１４３】
本発明者らの研究は、ｈＥＳＣに由来する肝細胞が、増殖能力、及び、分化した正常肝細胞の特性を示す能力を保持しながら、ホストの肝実質内で効果的に生着したことも実証している。しかしながら、移植マウスの血清中の少量のヒトアルブミンは、ヒトタンパク質分泌と生着効果との間に相関がないことを示唆している。このことは、本発明者らの１人及び他者によって、このモデルにおいて既に報告されている（Mahieu-Caputo et al., 2004）。一説によると、移植後２ヶ月において肝細胞分化の程度は部分的であり、生着細胞は予想よりも少ない量のアルブミンを産生する。異種の環境が、ヒト前駆体の完全に分化する能力を過小評価している可能性もある。
【０１４４】
in vivoでｈＥＳに由来する細胞を使用する場合、腫瘍形成及び異常成長は、依然として別の主な問題である。実際、作製した集団は、奇形腫を形成する能力を有する未分化の多能性細胞が容易に混入し得る（D'Amour et al., 2006; Kroon et al., 2008）。加えて、成体環境が、初期前駆体の増殖能力をコントロールできず、コントロールされない増殖につながる可能性がある。従って、最近、ｈＥＳＣに由来するＡＦＰ産生細胞が奇形腫形成を誘導したことが報告された（Ishii et al., 2007）。ｈＥＳＣに由来する肝細胞を移植した無アルブミン血症ラットにおいて、腺ガンも腹腔内に認められた（Basma et al., 2009）。重要なことに、本発明者らの３つのステップアプローチを使用して作製した肝細胞は、移植後に腫瘍を産生しなかったが、このことは、本発明者らの方法が多能性細胞全体の分化を誘導することを示唆している。
【０１４５】
大量の肝細胞を発生させる能力は、薬理毒性学（pharmacotoxicology）などのin vitro研究にとって明らかな利点を提示するのに対して、最終分化した細胞の利用は、細胞に基づいた治療にとっていくつかの欠点を提示する可能性がある。実際、肝細胞が増殖利点を示さない限り、それらはin vivoで増殖しないことが、齧歯類における多くの研究によって実証されている（Azuma et al., 2007）。前駆体／胎児肝細胞の使用は、これらの主な限界を解決する可能性がある有利な代替手段を示す可能性がある。実際、本発明者らは、以前、ヒト肝臓の初期発生段階からこのような未成熟細胞を単離し、それらが齧歯類の肝臓において分化及び増殖できたことを示した（Mahieu-Caputo et al., 2004）。さらに、前駆体を細胞に基づいた治療に効果的に使用できるという原理の証明は、神経変性疾患との関連で、他の器官（例えば、ニューロン幹細胞）に関して、明らかに確立されている（Bachoud-Levi et al., 2006）。
【０１４６】
どのような場合でも、マウスモデルは、それら自体によっては、分化した細胞が臨床応用に安全であるか否かを決定することを可能にしないであろう。実際、移植細胞の量は器官のサイズによって限られており、非ヒト霊長類などの大きな動物における研究は、安全性問題に慎重に取り組むのに必要とされるであろう。
【０１４７】
結論として、本発明者らは、肝臓発生を模倣する完全に定義された条件が、in vitro及びin vivoにおける機能的肝細胞の作製をもたらすという最初の実証を提供した。本発明者らは、このアプローチが、個々の患者に由来する成体体細胞を再プログラム化することによって作製した多能性幹細胞に直接的に置換可能であることも示した。この研究は、肝疾患に罹患している患者に由来する再プログラム化したｈＥＳＣ又はｈｉＰＳＣから肝臓細胞を作製するための道を開く。これは、薬物スクリーニングを実施するための、及び、肝疾患の新たな治療を開発するための新たなin vitroモデルの作製を可能にするはずである。
【０１４８】
参考文献：
本出願を通じて、様々な参考文献が、本発明が関連する技術水準を記載する。これらの参考文献の開示は、本明細書において参照により本開示に組み込まれる。
【０１４９】
【表３】
2013511969.tif 000004
2013511969.tif 000005
2013511969.tif 000006
2013511969.tif 000007
2013511969.tif 000008
2013511969.tif 000009
【図１】
2013511969.tif 000010
【配列表】
2013511969000001.app
【国際調査報告】
2013511969.tif 000011
2013511969.tif 000012
2013511969.tif 000013
2013511969.tif 000014
2013511969.tif 000015