(57)【要約】  本発明は、細胞をｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の活性または発現のモジュレーターに接触させることにより、細胞の脂肪酸代謝を調節する方法を提供する。本発明はまた、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性の阻害剤を被験体に投与することにより、被験体で肥満症、糖尿病、メタボリック症候群などの代謝障害を治療または予防する方法を提供する。被験体でｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性を阻害することにより、被験体で病的心肥大、心臓リモデリング、心筋梗塞、または心不全を治療または予防する方法も、開示される。【選択図】      図１３Ａ−Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療または予防の必要な被験体において、病的心肥大、心臓リモデリング、心筋梗塞、または心不全を治療または予防する方法であって、前記被験体にｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記阻害剤の投与後、前記被験体の心臓細胞でｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性が低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の前記阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の成熟配列に少なくとも部分的には相補的な配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１または配列番号２に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの糖修飾および／または骨格修飾を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記糖修飾がロックド核酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記骨格修飾がホスホロチオエート結合である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが約７〜約１８ヌクレオチド長である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択される配列を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記阻害剤が、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、もしくは静脈内投与経路により、または心臓組織中への直接注射により、前記被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
治療または予防の必要な被験体の代謝障害を治療または予防する方法であって、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤を前記被験体に投与することを含み、投与後、前記被験体の細胞でｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性が低減される、方法。
【請求項１４】
前記代謝障害が、メタボリック症候群、肥満症、糖尿病、糖尿病性腎症、インスリン抵抗性、アテローム硬化症、脂質蓄積障害、糖原病、中鎖アシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損、または異常なグルコース取込みおよび／もしくは利用である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記脂質蓄積障害が、ニーマン・ピック病、ゴーシェ病、ファーバー病、ファブリ病、ウォルマン病、およびコレステリルエステル蓄積症からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の成熟配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１または配列番号２に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの糖修飾および／または骨格修飾を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記糖修飾がロックド核酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記骨格修飾がホスホロチオエート結合である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが約７〜約１８ヌクレオチド長である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択される配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記被験体がヒトである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記阻害剤が、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内投与経路により前記被験体に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
細胞の脂肪酸代謝を調節する方法であって、前記細胞をｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性のモジュレーターに接触させることを含む、方法。
【請求項２７】
前記モジュレーターがｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性の阻害剤である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
脂肪酸代謝が、前記ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊阻害剤との接触後の細胞において、前記阻害剤に暴露されなかった細胞と比較して、増大する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の成熟配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの糖修飾および／または骨格修飾を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記糖修飾がロックド核酸である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記骨格修飾がホスホロチオエート結合である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが約７〜約１８ヌクレオチド長である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記モジュレーターがｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性のアゴニストである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
脂肪酸代謝が、前記ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊アゴニストとの接触後の細胞において、前記アゴニストに暴露されなかった細胞と比較して、増大する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記アゴニストがｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の成熟配列を含むポリヌクレオチドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が、心筋細胞、骨格筋細胞、前脂肪細胞、または脂肪細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項４１】
ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の前記阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の成熟配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１または配列番号２に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの糖修飾および／または骨格修飾を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記糖修飾がロックド核酸である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記骨格修飾がホスホロチオエート結合である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは約７〜約１８ヌクレオチド長である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択される配列を有する、請求項４２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年６月４日出願の米国仮出願第６１／３５１，６８３号（その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
電子申請テキストファイルの説明
添付の電子申請テキストファイル、すなわち、配列リストのコンピューター可読形式コピー（ファイル名：MIRG_022_01WO_SeqList_ST25.txt、記録日：２０１１年６月６日、ファイルサイズ５キロバイト）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０００３】
発明の分野
本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の活性または発現を変調する作用剤を投与することによる心臓障害および代謝障害の治療および予防に関する。特定的には、本発明は、被験体の細胞内でｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊の発現または活性を阻害することにより心臓障害および代謝障害を治療または予防する方法を提供する。それに加えて、本発明は、細胞をｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊の発現または活性のモジュレーターに接触させることにより細胞内で脂肪酸代謝を調節する方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
現在の米国では、冠動脈疾患、心筋梗塞、鬱血性心不全、および心肥大を含めて、心疾患およびその症状は、明らかに主要な健康リスクを呈する。これらの疾患に罹患している患者の診断、治療、および支援にかかるコストは、何十億ドルにも及ぶ。心疾患の２つのとくに重篤な症状は、心筋梗塞および心肥大である。
【０００５】
心筋梗塞は、一般に心臓発作として知られ、通常は冠動脈の狭窄または閉塞の結果である心臓組織への突然のおよび持続的な血流不足により引き起こされる。適切な血液供給がなければ、組織は、虚血状態になり、心筋細胞（たとえば心臓筋細胞）および血管構造物の死をもたらす。心筋細胞の死から生じた壊死組織は、一般的には、瘢痕組織で置き換えられるが、この組織は、収縮性がなく、心機能に寄与できず、多くの場合、心収縮時に拡張することにより、または心室のサイズおよび有効半径を増大させて肥大化するなどにより、心臓の機能に有害な役割を果たす。
【０００６】
心肥大は、高血圧症、機械的負荷、心筋梗塞、心不整脈、内分泌障害、および心収縮タンパク質遺伝子の遺伝子突然変異に起因するものを含めて、実質上すべての形態の心疾患に対する心臓の適応応答である。肥大応答は、初期は心拍出量を増大させる代償機序であるが、肥大が持続すれば、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、心不全、および突然死をもたらし得る。米国では、毎年約５０万人が心不全と診断され、死亡率は５０％に近い。
【０００７】
多くのシグナリング経路、特定的には、異常カルシウムシグナリングが関与するものは、心肥大および病理学的リモデリングを駆動する（Heineke & Molkentin, 2006）。ストレスに応答する肥大増殖は、運動に応答して生じる生理的肥大とは異なるシグナリング経路およびより遺伝子発現パターンが関与する。ストレス媒介心筋肥大は、明瞭な分子的および組織学的特性を有する多くの有害な影響を伴う複雑な現象であり、心筋細胞の変性および死を介して、心臓の繊維化、拡張、および代償不全を引き起こし、多くの場合、その結果、心不全をもたらす。したがって有害な心臓増殖および最終的には心不全を抑制するために、根底をなす分子機序の解明および新規な治療標的の発見に強い関心が払われてきた。これらの機序を理解することは、心肥大および心不全を治療する新しい療法をデザインするのに不可欠である。
【０００８】
メタボリック症候群は、心血管疾患および糖尿病を発症するリスクを増大させる複数の内科障害が組み合わさったものである。それに５人に１人が罹患し、年齢と共に有病率が増加する。いくつかの研究によると、米国での有病率は、人口の２５％までであると推定される（Ford el al. (2002) JAMA, Vol. 287:356-359）。メタボリック症候群に罹患している人々は、一般的には、肥満であり、あまり運動せず、ある程度のインスリン抵抗性を有する。肥満症は、世界的に予防可能な主な死亡原因であり、成人および子供で有病率が増加しており、当局は、２１世紀の最も深刻な公衆衛生問題の１つとみている（Barness el al. (2007) Am. J. Med. Genet. A, Vol. 143A: 3016-34）。肥満症は、心疾患、２型糖尿病、睡眠時無呼吸、特定のタイプの癌、および骨関節炎を含めて、余命の短縮および健康問題の増大をもたらし得る。メタボリック症候群および肥満症の現在の療法は、ダイエットおよび運動に重点が置かれ、利用可能な効果的な薬学的介入は、きわめて少ない。これらの病態の改善でのダイエットおよび運動の有効性は、患者間でかなり異なり、中程度の体重減少および症状改善を提供する傾向があるにすぎない。したがって、代謝障害の治療ならびに心血管疾患および心不全の後続的発症の予防を行う新規な治療法の必要性が存在する。
【０００９】
マイクロＲＮＡは、最近、とくに、発生タイミング、アポトーシス、脂肪代謝、および造血細胞分化の調節を含めて、いくつかの生物学的過程に関連付けられてきた。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、それぞれのｍｉＲＮＡ遺伝子に由来するか、タンパク質コード遺伝子のイントロンに由来するか、またはしばしば多数の近縁ｍｉＲＮＡをコードするポリシストロニック転写物に由来する、約１８〜約２５ヌクレオチド長の小さいタンパク質非コードＲＮＡである。Carrington et al. (Science, Vol. 301(5631):336-338, 2003)の総説を参照されたい。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡのリプレッサーとして機能し、それらの配列が完全に相補的である場合、その分解を促進することにより、またはそれらの配列がミスマッチを含有する場合、翻訳を阻害することにより機能する。
【００１０】
ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）または、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ；Qi el al. (2006) Cellular & Molecular Immunology, Vol. 3:411-419を参照されたい）により転写され、一般的には数千塩基長である一次ｍｉＲＮＡ転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる初期転写物から生じる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ＲＮアーゼＤｒｏｓｈａにより核内で約７０〜約１００ヌクレオチドのヘアピン形前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）にプロセシングされる。細胞質への輸送後、ヘアピンｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによりさらにプロセシングされて二本鎖ｍｉＲＮＡを生成する。次いで、成熟ｍｉＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれ、そこで塩基対相補性によりその標的ｍＲＮＡと対合する。ｍｉＲＮＡ塩基がｍＲＮＡ標的と完全に対をなす比較的稀な場合には、ｍＲＮＡ分解を促進する。より一般的には、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと不完全なヘテロ二本鎖を形成し、ｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼすかまたはｍＲＮＡの翻訳を阻害するかのいずれかである。
【００１１】
最近、心疾患のヒトおよびマウスモデルで病的心肥大、心不全、および心筋梗塞に関連するｍｉＲＮＡのシグネチャー発現パターンが同定された（van Rooij et al (2006) Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 103(48): 18255-60; van Rooij et al, (2007) Science, Vol. 316: 575-579）。マウスでの機能獲得および機能喪失の試験では、筋細胞の成長、収縮性、エネルギー代謝、繊維化、および血管新生の制御を含めて、心臓生物学の多くの側面でこれらのｍｉＲＮＡの重要かつ予想外な機能が明らかにされ、心疾患に対する新しい調節機序および可能性のある治療標的が垣間見られる。注目すべき点として、疾患誘導ｍｉＲＮＡが欠失したノックアウトマウスは、正常であるが、心臓ストレスに対して異常応答を呈することから、このｍｉＲＮＡが、組織恒常性ではなく疾患関連過程に寄与することが示唆され、治療標的としてのその可能性が指摘される。したがって、ｍｉＲＮＡは、心血管疾患、肥満症、糖尿病、および他の代謝障害を含めて、さまざまな疾患の治療を開発するための可能性のある新規な治療標的を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、部分的には、ｍｉＲ−３７８の発現が、圧負荷後、心臓組織でダウンレギュレートされ、かつ心臓特異的なｍｉＲ−３７８の過剰発現が、ストレスにより誘導される心肥大応答を悪化させるという発見に基づく。骨格筋中でのｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊の過剰発現は、脂肪細胞肥大およびおそらく脂肪細胞過形成に基づいて精巣上体脂肪パッドの質量増加から生じる体重増加を生じる。かくして、本発明者らは、驚くべきことに、ｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊が、心臓組織および脂肪組織を含めて、さまざまな組織で代謝過程を調節することを見いだした。したがって、本発明は、処置の必要な被験体の細胞内でｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性を変調することにより、肥満症や糖尿病などの心血管疾患および他の代謝障害を治療または予防する方法を提供する。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、被験体にｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤を投与することを含む、治療または予防の必要な被験体において、病的心肥大、心臓リモデリング、心筋梗塞、または心不全を治療または予防する方法を提供する。特定の実施形態では、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性は、投与後、被験体の心臓細胞で低減される。他の実施形態では、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤の投与後、酸化代謝から解糖代謝へのストレス誘導代謝シフトは、被験体の心臓細胞中で防止または低減される。
【００１４】
本発明はまた、治療または予防の必要な被験体において代謝障害を治療または予防する方法を含む。一実施形態では、この方法は、投与後、被験体の細胞内でｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性が低減される形で、被験体にｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤を投与することを含む。治療対象の代謝障害としては、メタボリック症候群、肥満症、糖尿病、糖尿病性腎症、インスリン抵抗性、アテローム硬化症、脂質蓄積障害、糖原病、中鎖アシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損、脂質酸化、または異常グルコース取込みおよび／もしくは利用が含まれ得る。これらの代謝障害から生じる続発性の疾患または病態もまた、本発明に係る方法で予防または治療することが可能である。たとえば、一実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤を投与することにより、睡眠時無呼吸、癌、骨関節炎などの肥満症から生じる続発性の疾患または障害を予防または治療する方法を提供する。
【００１５】
本発明に係る方法に使用するのに好適なｍｉＲ−３７８およびｍｉＲ−３７８＊の阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドでありうる。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−３７８またはｍｉＲ−３７８＊の成熟配列に少なくとも部分的には相補的な配列を含む特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ロックド核酸、二環式ヌクレオシド、ホスホノホルメート、２’Ｏ−アルキル修飾、ホスホロチオエート結合などの１つ以上の糖修飾または骨格修飾を含む。他の実施形態、ｍｉＲ−３７８またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤は、約７〜約１８ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１６】
他の実施形態では、本発明は、細胞をｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性のモジュレーターに接触させることを含む、細胞内で脂肪酸代謝を調節する方法を提供する。モジュレーターは、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性の阻害剤またはアゴニストであり得る。特定の実施形態では、脂肪酸代謝は、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤との接触後、阻害剤に暴露されなかった細胞と比較して、細胞内で増大される。他の実施形態では、脂肪酸代謝は、アゴニストに暴露されなかった細胞と比較して、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊のアゴニストとの接触後、細胞内で低減される。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞、肝細胞、または膵細胞である。
【００１７】
本発明はまた、心臓代謝を調節する方法を含む。一実施形態では、この方法は、心筋細胞をｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性のモジュレーターに接触させることを含む。心筋細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。他の実施形態では、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤との接触後、心筋細胞内で炭水化物代謝が低減される。さらに他の実施形態では、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤との接触後、心筋細胞内で脂肪酸代謝が増大される。
【００１８】
本発明は、本明細書で説明したｍｉＲ−３７８およびｍｉＲ−３７８＊の阻害剤およびアゴニストと、薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物を包含する。一実施形態では、医薬組成物は、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤と、薬学的に許容可能な担体と、を含み、阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１種の糖および／または骨格修飾を含む。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約７〜約１８ヌクレオチド長である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
図面の簡単な説明
【図１】Ａ．宿主遺伝子ＰＰＡＲＧＣ１β（上側）内のｍｉＲ−３７８のゲノム位置。ｍｉＲ−３７８（下側）の周囲のゲノム領域の保存性のＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ図。Ｂ．定量的リアルタイムＰＣＲ解析は、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３７８＊、およびＰＰＡＲＧＣ１β（ＰＧＣ−１β）（ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊の宿主遺伝子）は、特定的には、心臓組織、骨格筋、および褐色脂肪組織で発現されることを示す。Ｃ．ｍｉＲ−３７８は、心繊維芽細胞よりも心筋細胞でより高度に発現される。Ｄ．ｍｉＲ−３７８発現は、ＨＩＢ１Ｂ細胞をステアリン酸で処理すると低減される。Ｅ．脂肪細胞分化の誘導時のｍｉＲ−３７８およびＰＰＡＲＧＣ１β（ＰＧＣ−１β）の発現。ＣＭＣ：心筋細胞、ＢＡＴ：褐色脂肪組織、ＷＡＴ：白色脂肪組織。
【図２】Ａ．ｍｉＲ−３７８は、定量的リアルタイムＰＣＲにより示されるように、胸部大動脈絞扼（ＴＡＢ）を行うと、未処理の心臓（ｓｈａｍ制御）と比較して心臓でダウンレギュレートされる。Ｂ．ｍｉＲ−３７８の心筋過剰発現は、ＴＡＢを行うと、悪化した肥大応答を誘導する。
【図３】骨格筋中でのｍｉＲ−３７８の過剰発現により、体重および精巣上体脂肪塊が増大される。上側パネルは、野生型（ＷＴ）マウスおよびＭＣＫプロモーター（ＭＣＫ−ｍｉＲ−３７８  Ｔｇ）の制御下でｍｉＲ−３７８を過剰発現するマウスの白色脂肪組織の組織学的解析を示す。突然変異型動物は、肥大脂肪細胞を示す。下側パネルは、野生型マウスと比較してＭＣＫ−ｍｉＲ−３７８トランスジェニックマウス中での体重増加および白色脂肪塊増加を示す。
【図４】３Ｔ３−Ｌ１細胞中でのｍｉＲ−３７８の過剰発現は、脂肪生成および脂質生成を促進する。３Ｔ３−Ｌ１細胞は、誘導されて４日間で成熟脂肪細胞に分化した。ｍｉＲ−３７８の形質移入は、オイルレッドＯ染色により実証されるように、細胞内の脂質の蓄積を増大させた。
【図５】ＭＣＫ−ｍｉＲ−３７８トランスジェニックマウスは、耐グルコース能の低下を呈する。１６時間絶食した後、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター（Ｔｇ）の制御下でｍｉＲ−３７８を発現するマウスまたは野生型同腹仔（ｗｔ）の腹腔内に１．５ｇ／ｋｇグルコースを注射した。指定の時点で血糖値を評価した。
【図６】ＭＣＫ−ｍｉＲ−３７８トランスジェニックマウスへの抗ｍｉＲ−３７８の注射は、グルコースクリアランスを改善する。筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーターの制御下でｍｉＲ−３７８を発現するマウス（Ｔｇ）の静脈内に、ｍｉＲ−３７８成熟配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（抗ｍｉＲ）１０ｍｇ／ｋｇを、３日間連続して注射した。野生型（ｗｔ）マウスには生理食塩水を注射した。続いて、１６時間断食した後、Ｔｇおよびｗｔマウスの両方の腹腔内に１．５ｇ／ｋｇグルコースを注射した。指定の時点で血糖値を評価した（左側パネル）。抗ｍｉＲ−３７８または生理食塩水（右側パネル）を注射したＴｇおよびｗｔマウスのｍｉＲ−３７８発現のリアルタイムＰＣＲ解析。
【図７】ｏｂ／ｏｂマウス中への抗ｍｉＲ−３７８の注射は、グルコースクリアランスを改善する。肥満マウス（ｏｂ／ｏｂ）の静脈内に、ｍｉＲ−３７８成熟配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（抗ｍｉＲ）１０ｍｇ／ｋｇを、３日間連続して注射した。１６時間断食した後、未処理および抗ｍｉＲ処理されたｏｂ／ｏｂマウスの腹腔内に、１．５ｇ／ｋｇグルコースを注射した。指定の時点で血糖値を評価した。
【図８】Ａ．ｍｉＲ−３７８ターゲッティング戦略。ターゲッティング構築物をゲノムｍｉＲ−３７８遺伝子座中に導入して、相同的組換えを起こした。Ｂ．野生型（ＷＴ）および標的化ＥＳ細胞（ＭＵＴ）のサザンブロット分析。Ｃ．野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）、およびノックアウト（−／−）マウスの全ＲＮＡを用いて行ったノーザンブロット解析は、作製された突然変異マウス系ではｍｉＲ−３７８発現（矢印）が消失することを示す。Ｈ：心臓、ＢＡＴ：褐色脂肪組織、ｓｋ．Ｍ：骨格筋。Ｄ．ＷＴマウスおよびｍｉＲ−３７８ノックアウト（ＫＯ）マウスから単離された心臓組織のリアルタイムＰＣＲ（左側パネル）およびウェスタンブロット解析（右側パネル）は、ｍｉＲ−３７８宿主遺伝子（ＰＰＡＲＧＣ１β（ＰＧＣ−１β））の発現がｍｉＲ−３７８ノックアウト動物で有意に変化しないことを示す。
【図９】ｍｉＲ−３７８ノックアウト動物は、胸部大動脈絞扼（ＴＡＢ）に応答して心肥大の減少を呈する。
【図１０】胸部大動脈絞扼（ＴＡＢ）の２１日後、野生型（ＷＴ）マウスおよびｍｉＲ−３７８ノックアウト（ＫＯ）マウスで心エコー検査を行い、内径短縮率（Ａ）、駆出率（Ｂ）、収縮期径（Ｃ）、および拡張期−収縮期径（ＤＤ−ＳＤ）（Ｄ）を決定した。
【図１１】リアルタイムＰＣＲにより評価したときの、胸部大動脈絞扼（ＴＡＢ）後の、野生型（ＷＴ）マウスおよびｍｉＲ−３７８ノックアウト（ＫＯ）マウスの心臓組織中でのストレス誘導遺伝子ＢＮＰ（Ａ）、Ｍｙｈ７（Ｂ）、およびＭｙｈ６（Ｃ）の発現。
【図１２】ｍｉＲ−３７８（ｏｂ／ｏｂ  ＫＯ）の発現が欠失した肥満マウスを得るために、肥満マウス（ｏｂ／ｏｂ）をｍｉＲ−３７８ノックアウト動物と交配した。１６時間絶食した後、肥満マウスおよびｏｂ／ｏｂ  ＫＯマウスの腹腔内に１．５ｇ／ｋｇグルコースを注射した。指定の時点で血糖値を評価した。
【図１３】Ａ．ｍｉＲ−３７８ノックアウト（ＫＯ）マウスは、数週間の高脂肪食摂取後、野生型（ＷＴ）動物よりも少ない体重増加を呈する。Ｂ．５週間の高脂肪食摂取後、ｍｉＲ−３７８ノックアウトマウスおよび野生型マウスは両方とも、１６時間絶食した後、１．５ｇ／ｋｇグルコースを腹腔内に注射した。指定の時点で血糖値を評価した。
【図１４】ｍｉＲ−３７８ノックアウト（ＫＯ）マウスは、６週間の高脂肪食摂取後、野生型（ＷＴ）動物よりも低減された脂肪パッドおよび肝脂質蓄積を有する。ＷＡＴ：白色脂肪組織。
【図１５】ｍｉＲ−３７８ノックアウト（ＫＯ）マウスは、野生型（ＷＴ）動物と比較して、６週間の高脂肪食摂取後、低減された脂肪塊を有する。ＢＡＴ：褐色脂肪組織；ＷＡＴ：白色脂肪組織。
【図１６】６週間の高脂肪食レジメン後の野生型（ＷＴ）マウスおよびｍｉＲ−３７８ノックアウト（ＫＯ）マウスの白色脂肪組織（ＷＡＴ）、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、および肝臓の組織学的解析。倍率：４０倍。
【図１７】αミオシン重鎖プロモーター（α−ＭＨＣ  ＴＧ）の制御下で心臓組織中でｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊を過剰発現するマウスは、増大された体重（Ａ）を有し、野生型（ＷＴ）同腹仔と比較して、高脂肪食摂取で体重のより大きい増加を呈する（ＢおよびＣ）。
【図１８】Ａ．絶食の６時間後の野生型（ＷＴ）およびｍｉＲ−３７８ノックアウト（ＫＯ）から単離された褐色脂肪組織のウェスタンブロット解析。ブロットをＡＭＰＫおよびＡＫＴのリン酸化形および非リン酸化形に特異的な抗体でプローブした。αチューブリンを対照として使用された。Ｂ．ＡＭＰＫおよびＡＫＴのシグナリング経路による代謝調節を示す図
【図１９】Ａ．ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊に対する推定結合部位を表すＭＥＤ１３の３’ＵＴＲの概略図。Ｂ．野生型（ＷＴ）動物、αＭＨＣプロモーターの制御下でｍｉＲ−３７８を過剰発現するｍｉＲ−３７８トランスジェニック（αＭＨＣ  Ｔｇ）動物、およびｍｉＲ−３７８ノックアウト（ＫＯ）動物中でのＭＥＤ１３の発現レベル。Ｃ．ｍｉＲ−３７８および対照ｍｉＲＮＡに対する発現プラスミドと共にＭＥＤ１３  ３’ＵＴＲルシフェラーゼ構築物をＣＯＳ１細胞に形質移入した。示された値は、レポーター単独と比較したルシフェラーゼ発現の倍率変化（±ＳＥＭ）である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
心臓への慢性および急性のストレスの結果として、肥大、繊維化、筋細胞アポトーシスを伴った病理学的リモデリング応答を生じ、そして心力不全および不整脈による最終的な死に至る。古典的な薬理学的治療戦略（たとえば、β−ブロッカーおよびＡＣＥ阻害剤）は心不全患者の生存を延長し得るが、これらの療法は、最終的には、疾患の進行の予防に効果的でないので、新しい機序的洞察および治療手段の必要性が高い。
【００２１】
心不全は、推定５７０万人のアメリカ人が罹患している進行性長期疾患であり、関連医療費が増大している（Lloyd-Jones ei al. (2009) Circulation, Vol. 119:21-181）。ｍｉＲＮＡは、心臓の肥大およびリモデリングに重要な分子成分として最近登場したので、心疾患の予防および治療に有望な標的になっている。それぞれのｍｉＲＮＡは、多くの場合、関連する機能を有する多数の標的遺伝子の発現を調節するので、単一のｍｉＲＮＡの発現を変調すれば、原理的には、全遺伝子ネットワークに影響を及ぼし、それにより、複合疾患表現型を改変することが可能である。
【００２２】
本発明は、部分的には、心臓、骨格筋、および褐色脂肪の高ミトコンドリア組織で高度に発現されるかつ種々の心疾患状態で調節されるｍｉＲＮＡの発見に基づく。特定的には、本発明者らは、驚くべきことに、ｍｉＲ−３７８およびそれに対応する副次的配列ｍｉＲ−３７８＊が、広範な代謝のレギュレーターであることを見いだした。ｍｉＲ−３７８は、心臓代謝の調節を介してストレス誘導心肥大応答の役割を果たし、骨格筋中でグルコース利用および脂肪酸代謝に関与する。したがって、本発明は、被験体の細胞内でｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性を阻害することにより、被験体で種々の心臓障害および代謝障害を予防または治療する方法を提供する。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、「被験体」または「患者」という用語は、ヒトおよび他の霊長動物（たとえば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル類）、家畜（たとえば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）、家畜哺乳動物（たとえば、イヌおよびネコ）、実験動物（たとえば、マウス、ラット、モルモットなどの齧歯動物）、ならびにトリ（たとえば、家禽、野鳥、および猟鳥、たとえば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他のジュンケイ類のトリ、アヒル、ガチョウなど）を含めて（ただし、これらに限定されるものではない）、任意の脊椎動物を意味する。いくつかの実施形態では、被験体は哺乳動物である。他の実施形態では、被験体はヒトである。
【００２４】
ｍｉＲ−３７８は、ネズミ１８番染色体上のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１−β（ＰＰＡＲＧＣ１β）遺伝子の最初のイントロン内にコードされている。ヒトでは、ｍｉＲ−３７８（旧名ｍｉＲ−４２２ｂ）は、５番染色体上のＰＰＡＲＧＣ１β遺伝子の第１のイントロンから発現される。ｍｉＲ−３７８のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、成熟配列およびスター（すなわち副次的）配列にプロセシングされる。スター配列は、ステムループ構造の他のアームからプロセシングされる。マウスおよびヒトのｍｉＲ−３７８のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列（たとえば、ステムループ配列）、成熟配列、およびスター配列を以下に与える。
ヒト成熟ｍｉＲ−３７８（配列番号１）
５’−ＡＣＵＧＧＡＣＵＵＧＧＡＧＵＣＡＧＡＡＧＧ−３’
ヒトｍｉＲ−３７８＊（配列番号２）
５’−ＣＵＣＣＵＧＡＣＵＣＣＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＵ−３’
ヒトｐｒｅ−ｍｉＲ−３７８（配列番号３）
５’−ＡＧＧＧＣＵＣＣＵＧＡＣＵＣＣＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＵＧＵＵＡＣＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＣＵＧＧＡＣＵＵＧＧＡＧＵＣＡＧＡＡＧＧＣＣＵ−３’
マウス成熟ｍｉＲ−３７８（配列番号４）
５’−ＡＣＵＧＧＡＣＵＵＧＧＡＧＵＣＡＧＡＡＧＧ−３’
マウスｍｉＲ−３７８＊（配列番号５）
５’−ＣＵＣＣＵＧＡＣＵＣＣＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＵ−３’
マウスｐｒｅ−ｍｉＲ−３７８（配列番号６）
５’−ＡＧＧＧＣＵＣＣＵＧＡＣＵＣＣＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＵＧＵＵＡＣＣＵＣＧＡＡＡＵＡＧＣＡＣＵＧＧＡＣＵＵＧＧＡＧＵＣＡＧＡＡＧＧＣＣＵ−３’
【００２５】
本明細書に開示されたリボ核酸配列はすべて、配列中のウリジン塩基の代わりにチミジン塩基を用いることによりデオキシリボ核酸配列に変換可能であるものとみなされる。同様に、本明細書に開示されたデオキシリボ核酸配列はすべて、配列中のチミジン塩基の代わりにウリジン塩基を用いることによりリボ核酸配列に変換可能である。デオキシリボ核酸配列、リボ核酸配列、および本明細書に開示されたすべて配列のデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの混合物を含有する配列はすべて、本発明に含まれる。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、被験体にｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤を投与することを含む、治療または予防の必要な被験体において、病的心肥大、心臓リモデリング、心筋梗塞、または心不全を治療または予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性は、阻害剤の投与後、被験体の心臓細胞で低減される。「心臓細胞」は、本明細書で用いられる場合、心筋細胞、心繊維芽細胞、および心内皮細胞を含む。特定の一実施形態では、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性は、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤の投与後、被験体の心筋細胞で低減されている。
【００２７】
他の実施形態では、処置の必要な被験体は、病的心肥大、心臓リモデリング、心不全、または心筋梗塞を発症するリスクがあり得る。そのような被験体は、長期持続性コントロール不良高血圧、肺動脈高血圧、非根治弁膜疾患、慢性狭心症、亜急性心筋梗塞、心疾患先天的素因、または病的肥大を含めて（ただし、これらに限定されるものではない）、１つ以上リスク因子を呈し得る。リスクのある被験体は、心肥大遺伝的素因を有すると診断され得るか、または心肥大の家族歴を有すると診断され得る。いくつかの実施形態では、リスクのある被験体は、肥満症、ＩＩ型糖尿病、高脂血症またはメタボリック症候群と診断され得る。
【００２８】
好ましくは、被験体へのｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤の投与は、被験体で、心肥大、心不全、もしくは心筋梗塞、または遅れて心肥大から心不全まで移行の１つ以上の症状の改善をもたらす。１つ以上の改善される症状は、たとえば、運動能力増加、心駆出量増加、左室拡張末期圧低下、肺毛細血管楔入圧低下、心拍出量増加、心係数増加、肺動脈圧低下、左室の収縮末期および拡張末期の大きさの減少、心臓繊維化減少、心筋中のコラーゲン堆積減少、左・右室壁ストレス減少、壁張力低下、生活の質の向上、および疾患関連の罹患率または死亡率の低下であり得る。
【００２９】
本発明はまた、治療または予防の必要な被験体において代謝障害を治療または予防する方法を含む。一実施形態では、この方法は、投与後、被験体の細胞内でｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性が低減される形で、被験体にｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤を投与することを含む。本発明に係る方法で治療可能な代謝障害としては、メタボリック症候群、肥満症、糖尿病、糖尿病性腎症、インスリン抵抗性、アテローム硬化症、脂質蓄積障害（たとえば、ニーマン・ピック病、ゴーシェ病、ファーバー病、ファブリ病、ウォルマン病、もしくはコレステリルエステル沈着症）、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、または異常なグルコース取込みおよび／もしくは利用が含まれるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、代謝障害は糖原病（ＧＳＤ）である。たとえば、本発明に係る方法は、被験体にｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤を投与することにより、治療または予防の必要な被験体においていずれかの型のＧＳＤ（たとえば、０型ＧＳＤおよびＩ型ＧＳＤ〜ＸＩＩＩ型ＧＳＤ）を治療または予防することを提供する。ＧＳＤとしては、フォンギルケ病、ポンペ病、コーリ病または、フォーブズ病、アンダーセン病、マックアードル病、エルス病、垂井病、ファンコニー・ビッケル症候群、および赤血球アルドラーゼ欠損症が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の実施形態では、代謝障害は、中鎖アシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＭＣＡＤ）欠損症である。ＭＣＡＤ欠損症を有する者は、致命的であり得る脂肪酸酸化障害を呈する。本発明の一実施形態では、脂肪酸代謝は、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤の投与後、ＭＣＡＤ欠損症を有する被験体で増大される。
【００３０】
本発明はまた、処置の必要な被験体にｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤を投与することにより、糖尿病や肥満症などの代謝障害から生じる続発性の疾患または病態を予防または治療する方法を包含する。たとえば、一実施形態では、本発明は、処置の必要な被験体にｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤を投与することを含む、睡眠時無呼吸を予防または治療する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、処置の必要な被験体にｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤を投与することにより、癌を予防または治療する方法を提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、処置の必要な被験体にｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤を投与することにより、骨関節炎を予防または治療する方法を提供する。
【００３１】
他の実施形態では、本発明は、被験体にｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の活性または発現の阻害剤を投与することを含む、必要な被験体でグルコース取込みおよび／または利用を増大させる方法を包含する。いくつかの実施形態では、被験体は、インスリン抵抗性または糖尿病と診断される。一実施形態では、被験体の血糖値は、阻害剤の投与前の被験体の血糖値と比較して、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤の投与後、低減される。他の実施形態では、被験体の血糖値は、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤の投与後、経口耐グルコース能検査により測定される正常レベル内に低減される。たとえば、特定の実施形態では、被験体の空腹時血中グルコースレベルは、約１１０ｍｇ／ｄｌ未満である。他の実施形態では、グルコース摂取の２時間後の被験体の血糖値は、約１４０ｍｇ／ｄｌ未満である。
【００３２】
本発明はまた、細胞内で脂肪酸代謝を調節する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性のモジュレーターに細胞を接触させることを含む。本明細書で用いられる場合、「モジュレーター」とは、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性を調節する分子のことである。モジュレーターは、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の機能のアゴニストであり得るか（すなわち、ｍｉＲ−３７８またはｍｉＲ−３７８＊の活性または発現を促進する）、またはｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の機能の阻害剤であり得る（すなわち、ｍｉＲ−３７８またはｍｉＲ−３７８＊の活性または発現を低減する）。モジュレーターは、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または小分子を含み得る。ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性のモジュレーターは、本明細書で説明したｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤およびアゴニストを含む。特定の実施形態では、モジュレーターは、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性の阻害剤であり、脂肪酸代謝は、阻害剤に暴露されていない細胞と比較して、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤との接触後、細胞内で増大される。他の実施形態では、モジュレーターは、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性のアゴニストであり、脂肪酸代謝は、アゴニストに暴露されていない細胞と比較して、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊アゴニストとの接触後、細胞内で低減される。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞、肝細胞または膵細胞であるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
特定の一実施形態では、細胞は心筋細胞である。したがって、本発明はまた、心筋細胞をｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性のモジュレーターに接触させることにより、心臓代謝を調節する方法を包含する。一実施形態では、心筋細胞をｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤に接触させると、ストレッサーにより誘導される酸化代謝から解糖代謝への代謝シフトが予防または低減される。他の実施形態では、心筋細胞をｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤に接触させると、心筋細胞内で炭水化物代謝が低減される。さらに他の実施形態では、心筋細胞をｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤に接触させると、心筋細胞内で脂肪酸代謝が増大される。心筋細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。
【００３４】
他の態様では、本発明は、細胞をｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性のモジュレーターに接触させることにより、細胞内でミトコンドリア機能不全を調節する方法を包含する。一実施形態では、細胞をｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤に接触させると、未処理細胞と比較して、細胞内でミトコンドリア生合成が増大される。他の実施形態では、細胞をｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤に接触させると、未処理細胞と比較して、細胞内でミトコンドリア脂肪酸酸化が促進される。さらに他の実施形態では、細胞をｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊のアゴニストに接触させること、未処理細胞と比較して、細胞内で脂質生成が促進される。さらに他の実施形態では、細胞をｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊のアゴニストに接触させると、未処理細胞と比較して、細胞内でグルコース代謝が促進される。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。特定の実施形態では、細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞、肝細胞、または膵細胞であるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明はまた、解糖代謝または脂肪酸代謝の欠損に関連する障害または疾患を予防するまたは治療する方法を提供する。一実施形態では、たとえば、本発明は、被験体にｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊のアゴニストを投与することにより、治療または予防の必要な被験体において低血糖症または高インスリン症を予防または治療する方法を提供する。低血糖症または高インスリン症を発症するリスクのある被験体としては、インスリンまたは特定の糖尿病薬（たとえば、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、グリピジド、またはトルブタミド）が過量投与された糖尿病患者、インスリン分泌腫瘍（インスリノーマ）を有する被験体、肝疾患または高インスリン症を引き起こす遺伝的病態と診断された患者が含まれる。ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊のアゴニストで治療または予防可能な他の障害または病態は、患者が正常体重を維持するのが困難であるか、または意図しない体重減少を経験するものである。たとえば、一実施形態では、本発明は、被験体にｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊のアゴニストを投与することにより、治療または予防の必要な被験体において甲状腺機能亢進（グレーブス病）を治療または予防する方法を包含する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはそれらの組合せを含み得る。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾（たとえば、糖または骨格修飾）を有する。たとえば、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＳＮを含有するオリゴヌクレオチドとその相補的マイクロＲＮＡ標的鎖との間で形成される複合体に増強された熱安定性を付与する１つ以上の「コンフォメーション拘束型」または二環式の糖ヌクレオシド修飾（ＢＳＮ）を含み得る。たとえば、一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの「ロックド核酸」を含有する。ロックド核酸（ＬＮＡ）は、リボース糖部分が「ロックド」コンフォメーションをとる２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド（構造Ａ）を含有する。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’，４’−Ｃ−架橋２’デオキシリボヌクレオシド（ｃＤＮＡ、構造Ｂ）を含有する。たとえば、米国特許第６，４０３，５６６号およびWang el al. (1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 9: 1147-1150（その両方ともその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）を参照されたい。さらに他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、構造Ｃで示される構造を有する少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含有する。ｍｉＲ−３７８をターゲッティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＳＮ（ＬＮＡ、ｃＤＮＡなど）または他の修飾ヌクレオチド、リボヌクレオチド、もしくはデオキシリボヌクレオチドの組合せを含有することが可能である。
【化１】
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【００３７】
他の選択肢として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖−リン酸骨格ではなくペプチド系骨格を含有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドへの他の修飾糖またはホスホジエステル修飾も利用可能であると考えられる。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチド含有し得る他の化学修飾としては、糖修飾、たとえば、２’−Ｏ−アルキル（たとえば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ、および４’チオ修飾、ならびに骨格修飾、たとえば、１つ以上のホスホロチオエート、モルホリノまたはホスホノカルボキシレート結合（たとえば、米国特許第６，６９３，１８７号明および同第７，０６７，６４１号（それらの全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドターゲッティングｍｉＲ−３７８またはｍｉＲ−３７８＊は、２’Ｏ−メチル糖修飾を各塩基に含有し、ホスホロチオエート結合により結合される。アンチセンスオリゴヌクレオチド、特定的には、より短い長さ（たとえば１５ヌクレオチド未満）のものは、１つ以上の親和性促進修飾、たとえば、ＬＮＡ、二環式ヌクレオシド、ホスホノホルメート、２’Ｏ−アルキル修飾などを含み得るが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’末端および３’末端の両方に２’−Ｏ−メトキシエチル修飾リボヌクレオチドを含有し、その中心に少なくとも１０デオキシリボヌクレオチドを有する２’−Ｏ−メトキシエチル「ギャップマー」である。これらの「ギャップマー」は、ＲＮＡ標的のＲＮアーゼ非依存的分解機構を開始可能である。安定性を向上させかつ有効性を改善するアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾、たとえば、米国特許第６，８３８，２８３号（その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）に記載のものは、当技術分野で公知であり、本発明に係る方法で使用するのに好適である。たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達および安定性を向上させるために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、コレステロール部分などのステロイド、ビタミン、脂肪酸、炭水化物もしくはグリコシド、ペプチド、または他の小分子リガンドに、その３’末端で結合させることが可能である。
【００３８】
ｍｉＲＮＡの活性の抑制に有用な好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５〜約２５ヌクレオチド長、約１０〜約３０ヌクレオチド長、または約２０〜約２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドターゲッティングｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊は、約７〜約１８ヌクレオチド長であり、他の実施形態では、約１２〜約１６ヌクレオチド長である。ｍｉＲ−３７８またはｍｉＲ−３７８＊に相補的な任意の７−ｍｅｒ以上のもの、すなわち、ｍｉＲＮＡの５’末端に相補的であり、そこから進んでｍｉＲＮＡの全相補的配列に及ぶまでの任意の抗ｍｉＲを使用可能である。たとえば、一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＣＣＵＵＣＵＧＡＣＵＣＣＡＡＧＵＣＣＡＧＵ−３’（配列番号７）の配列を有する。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＡＧＵＣＣＡＧＵ−３’（配列番号８）の配列を有する。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＣＡＡＧＵＣＣＡＧＵ−３’（配列番号９）の配列を有する。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＵＣＣＡＡＧＵＣＣＡＧＵ−３’（配列番号１０）の配列を有する。さらに他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＡＣＵＣＣＡＡＧＵＣＣＡＧＵ−３’（配列番号１１）の配列を有する。さらに他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＵＧＡＣＵＣＣＡＡＧＵＣＣＡＧＵ−３’（配列番号１２）または５−ＣＵＧＡＣＵＣＣＡＡＧＵＣＣＡＧ−３’（配列番号１３）の配列を有する。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＴＧＡＣＴＣＣＡＡＧＴＣＣ  ＡＧ−３’（配列番号２１）の配列を有する。
【００３９】
ｍｉＲ−３７８＊の発現または活性を抑制するための例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、５’−ＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＵＧＧＡＧＵＣＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１４）、５’−ＧＵＣＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１５）、５’−ＧＡＧＵＣＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１６）、５’−ＵＧＧＡＧＵＣＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１７）、５’−ＣＣＵＧＧＡＧＵＣＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１８）、５’−ＧＡＣＣＵＧＧＡＧＵＣＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１９）、５’−ＧＧＡＣＣＵＧＧＡＧＵＣＡＧＧＡ−３’（配列番号２０）、および５’−ＧＡＣＣＴＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡ−３’（配列番号２２）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟または副次的（すなわちスター）ｍｉＲ−３７８配列に少なくとも部分的に相補的な配列、たとえば、成熟または副次的（すなわちスター）ｍｉＲ−３７８配列に少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的な配列を含み得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟または副次的ｍｉＲ−３７８配列に実質的に相補的でありうる。すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的でありうる。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟または副次的ｍｉＲ−３７８配列に１００％相補性的な配列を含む。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１に少なくとも部分的に相補的である。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２に少なくとも部分的に相補的である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンタゴｍｉｒである。「アンタゴｍｉｒ」は、ｍｉＲ−３７８またはｍｉＲ−３７８＊の配列に部分的に少なくとも相補的な一本鎖化学修飾リボヌクレオチドである。アンタゴｍｉｒは、２’−Ｏ−メチル糖修飾などの１つ以上修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、アンタゴｍｉｒは、修飾ヌクレオチドのみを含む。アンタゴｍｉｒはまた、部分的または完全なホスホロチオエート骨格を生じる１つ以上のホスホロチオエート結合を含み得る。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達および安定性を向上させるために、アンタゴｍｉｒをその３’末端でコレステロールまたは他の部分に結合することが可能である。ｍｉＲ−３７８またはｍｉＲ−３７８＊の阻害に好適なアンタゴｍｉｒは、約１５〜約５０ヌクレオチド長、より好ましくは約１８〜約３０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０〜約２５ヌクレオチド長である。アンタゴｍｉｒは、成熟または副次的ｍｉＲ−３７８配列に少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的であり得る。いくつかの実施形態では、アンタゴｍｉｒは、成熟または副次的ｍｉＲ−３７８配列に実質的に相補的、すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に少なくとも約９５％で、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的であり得る。他の実施形態では、アンタゴｍｉｒは、成熟または副次的ｍｉＲ−３７８配列に１００％相補的である。
【００４２】
本明細書で説明した阻害ヌクレオチド分子は、好ましくは、ｍｉＲ−３７８（配列番号１）の成熟配列を標的とする。一実施形態では、本明細書で説明した阻害ヌクレオチド分子、ｍｉＲ−３７８（配列番号２）の副次的（すなわちｍｉＲ−３７８＊）配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤は、成熟または副次的ｍｉＲ−３７８配列に完全に相補的な配列を含むアンタゴｍｉｒである。一実施形態では、ｍｉＲ−３７８の阻害剤は、５’−ＡＣＵＧＧＡＣＵＵＧＧＡＧＵＣＡＧＡＡＧＧ−３’（配列番号１）に部分的にまたは完全に相補的な配列を有するアンタゴｍｉｒである。他の実施形態では、ｍｉＲ−３７８＊の阻害剤は、５’−ＣＵＣＣＵＧＡＣＵＣＣＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＵ−３’（配列番号２）に部分的にまたは完全に相補的な配列を有するアンタゴｍｉｒである。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤は、化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、ｍｉＲ−３７８の阻害剤は、５’−ＡＣＵＧＧＡＣＵＵＧＧＡＧＵＣＡＧＡＡＧＧ−３’（配列番号１）に実質的に相補的な配列を含む化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、ｍｉＲ−３７８＊の阻害剤は、５’−ＣＵＣＣＵＧＡＣＵＣＣＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＵ−３’（配列番号２）に実質的に相補的な配列を含む化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書で用いられる場合、「実質的に相補的」とは、標的ポリヌクレオチド配列（たとえば、成熟、副次的、または前駆体ｍｉＲＮＡ配列）に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的な配列を意味する。
【００４３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンタゴｍｉｒは、ｍｉＲ−３７８に対する前駆体ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）または一次ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）に実質的に相補的な配列を含みうる。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−３７８配列のステムループ領域の外側に位置する配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ−３７８機能の阻害剤は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−３７８配列（配列番号３）に実質的に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００４４】
ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の発現または活性のアゴニストは、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊配列を含むポリヌクレオチドであり得る。たとえば、一実施形態では、ｍｉＲ−３７８アゴニストは、成熟ｍｉＲ−３７８配列（配列番号１）を含むポリヌクレオチドである。他の実施形態では、ｍｉＲ−３７８＊アゴニストは、副次的（すなわちスター）ｍｉＲ−３７８配列（配列番号２）を含むポリヌクレオチドである。さらに他の実施形態では、ｍｉＲ−３７８アゴニストは、ｍｉＲ−３７８に対するｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドであり得る。さらに他の実施形態では、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊アゴニストは、ｍｉＲ−３７８（たとえば配列番号３）に対するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドであり得る。ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊配列を含むポリヌクレオチドは、約１８〜約２０００のヌクレオチド長、約７０〜約２００ヌクレオチド長、約２０〜約５０ヌクレオチド長、約１８〜約２５ヌクレオチド長であり得る。成熟ｍｉＲ−３７８、副次的ｍｉＲ−３７８（すなわちｍｉＲ−３７８＊）、ｐｒｅ−ｍｉＲ−３７８約またはｐｒｉ−ｍｉＲ−３７８配列を含むポリヌクレオチドは、一本鎖かもまたは二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドは、１つ以上の化学修飾、たとえば、ロックド核酸、ペプチド核酸、糖修飾、たとえば、２’−Ｏ−アルキル（たとえば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ、および４’チオ修飾、ならびに骨格修飾、たとえば、１つ以上のホスホロチオエート、モルホリノまたはホスホノカルボキシラート結合を含有することが可能である。一実施形態では、ｍｉＲ−３７８配列（たとえば、成熟ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３７８＊、ｐｒｅ−ｍｉＲ−３７８、またはｐｒｉ−ｍｉＲ−３７８）を含むポリヌクレオチドは、ステロイド、たとえば、コレステロール、ビタミン、脂肪酸、炭水化物もしくはグリコシド、ペプチド、または他の小分子リガンドにコンジュゲートされる。
【００４５】
本明細書で説明したｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤またはアゴニストは、ｍｉＲ−３７８阻害剤またはアゴニストをコードする発現ベクターを細胞に送達することにより、標的細胞（たとえば、心臓、脂肪、または骨格筋の細胞）に配達することが可能である。「ベクター」は、細胞の内部に対象の核酸を送達するために使用可能な物質組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含めて（ただし、これらに限定されるものではない）、多くのベクターが当技術分野で公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。発現構築物は、生存細胞中で複製可能であるか、または、それは合成で作製可能である。本出願の目的では、「発現構築物」、「発現ベクター」、および「ベクター」という用語は、一般的な例示的な意味で本発明の適用を示すべく同義的に用いられ、本発明を限定しようとするものではない。
【００４６】
一実施形態では、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤を発現するための発現ベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み、発現されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、ｍｉＲ−３７８（たとえば、配列番号１または配列番号２）の成熟または副次的配列に部分的にまたは完全に相補的である。他の実施形態では、ｍｉＲ−３７８配列を含むポリヌクレオチドを発現するための発現ベクターは、成熟ｍｉＲ−３７８配列（例えば配列番号１）、副次的ｍｉＲ−３７８配列（例えば配列番号２）、ｐｒｅ−ｍｉＲ−３７８配列（たとえば配列番号３）、またはｐｒｉ−ｍｉＲ−３７８配列を含むポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含む。本明細書で用いられる「機能可能に連結された」または「転写制御下で」という表現は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御すべく、ポリヌクレオチドに対して適正な位置および向きでいることを意味する。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、「プロモーター」とは、細胞の合成系または導入された合成系により認識され、遺伝子の特定の転写を開始するのに必要とされるＤＮＡ配列を意味する。好適なプロモーターとしては、ＲＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ、およびウイルスプロモーター（たとえば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス長末端反復）が含まれるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。特定に興味深いのは、筋肉特異的プロモーター、より特定的には、心臓特異的プロモーターである。これらには、ミオシン軽鎖−２プロモーター（Franz el al. (1994) Cardioscience, Vol. 5(4):235-43; Kelly el al. (1995) J. Cell Biol , Vol. 129(2):383-396）、αアクチンプロモーター（Moss et al. (1996) Biol. Chem. , Vol. 271 (49):31688-31694）、トロポニン１プロモーター（Bhavsar et al. (1996) Genomics, Vol. 35(1): 11 -23）、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体プロモーター（Barnes el al. (1997) J. Biol. Chem. , Vol. 272(17): 11510-11517）、ジストロフィンプロモーター（Kimura et al. (1997) Dev. Growth Differ., Vol. 39(3):257-265）、α７インテグリンプロモーター（Ziober and Kramer (1996) J Bio. Chem, , Vol. 271 (37):22915-22）、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーター（LaPointe et al. (1996) Hypertension, Vol. 27(3 Pt 2):715-22）、およびαＢ−クリスタリン／低分子熱ショックタンパク質プロモーター（Gopal-Srivastava (1995) J. Mol. Cell. Biol , Vol. 15(12):7081 -7090）、
αミオシン重鎖プロモーター（Yamauchi-Takihara et al. (1989) Proc. Nail. Acad. Sci. USA, Vol. 86(10):3504-3508）、ならびにＡＮＦプロモーター（LaPointe el al. (1988) J. Biol. Chem. , Vol. 263(19):9075-9078）が含まれる。一実施形態では、組織特異的プロモーターは、脂肪細胞タンパク質２（ａｐ２）／脂肪酸結合性タンパク質４（ＦＡＢＰ４）プロモーターまたはＰＰＡＲｙプロモーターなどの脂肪細胞特異的プロモーターである。
【００４８】
特定の実施形態では、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤をコードするポリヌクレオチドまたはｍｉＲ−３７８配列をコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは当技術分野で公知であり、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーター、および誘導マウス乳腺腫瘍ウィルスＬＴＲが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
細胞に発現構築物および核酸を送達する方法は、当技術分野で公知であり、たとえば、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、ポリアミン形質移入試薬を利用する形質移入、細胞超音波処理、高速度マイクロプロジェクタイルを使用する遺伝子衝撃およびレセプター媒介形質移入を含み得る。
【００５０】
本発明はまた、治療後、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤を捕捉またはクリアランスする方法を包含する。この方法は、心筋組織中または骨格筋組織中でｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤に対する結合部位を過剰発現することを含み得る。結合部位領域は、好ましくは、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊のシード領域の配列を含有する。シード領域は、標的認識に重要な塩基２〜８に及ぶｍｉＲＮＡの５’部分である。いくつかの実施形態では、結合部位は、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の１つ以上の標的、たとえば、ＳｕＦｕ、Ｆｕｓ−１、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ−２（ＧＦＰＴ２）、およびＭＥＤ１３などの３’ＵＴＲの配列を含有し得る。
【００５１】
本発明はまた、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤またはアゴニストを含む医薬組成物を包含する。臨床用途を想定する場合、医薬組成物は、目的の用途に適合する形態で調製されるであろう。一般的には、このため、発熱原さらにはヒトまたは動物に有害になり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することが必要であろう。
【００５２】
一実施形態では、医薬組成物は、有効用量のｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊の阻害剤と薬学的に許容可能な担体とを含む。たとえば、医薬組成物は、本明細書で説明したｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊を標的とする有効用量の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択される配列を有する修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、本明細書で説明した有効用量のｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊アゴニストと薬学的に許容可能な担体とを含む。「有効用量」とは、有利または所望の臨床結果を得るのに十分な量のことである。本発明に係るｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡアゴニストの有効用量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇであり得る。何が有効用量とみなされるのかの正確な決定は、背格好、年齢、障害のタイプ（たとえば、心筋梗塞、心不全、心肥大、代謝障害）、および阻害剤またはアゴニストの性質（たとえば、アンタゴｍｉｒ、発現構築物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド二本鎖など）を含めて、各患者それぞれの因子に基づき得る。したがって、投与量は、本開示および当技術分野の知識から、当業者であれば容易に確認可能である。
【００５３】
ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊機能のオリゴヌクレオチド阻害剤、ｍｉＲ−３７８および／またはｍｉＲ−３７８＊アゴニストをコードするポリヌクレオチド、あるいは特定のｍｉＲＮＡ阻害剤またはアゴニストを発現する構築物の送達媒体として、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含めて、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質系システムなどのコロイド分散系を使用することが可能である。本発明に係る核酸を心筋組織および骨格筋組織に送達するのに好適な市販の脂肪エマルジョンとしては、イントラリピド（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、および他の類似の脂質エマルジョンが含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏの送達媒体として使用するのに好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち人工膜ベシクル）である。そのような系の調製および使用は、当技術分野で周知である。例示的な製剤もまた、米国特許第５，９８１，５０５号、米国特許第６，２１７，９００号明細書、米国特許第６，３８３，５１２号明細書、米国特許第５，７８３，５６５号明細書、米国特許第７，２０２，２２７号明細書、米国特許第６，３７９，９６５号明細書、米国特許第６，１２７，１７０号明細書、米国特許第５，８３７，５３３号明細書、米国特許第６，７４７，０１４号明細書、および国際公開第０３／０９３４４９号（それらの全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）開示されている。
【００５４】
送達媒体を安定状態にして標的細胞による取込みを可能にすべく、一般的には、適切な塩および緩衝液を利用することが望まれるであろう。本発明に係る水性組成物は、薬学的に許容可能な担体または水性媒体中に溶解または分散された阻害剤ポリヌクレオチドを含む有効量の送達媒体（たとえば、リポソームまたは他の複合体または発現ベクター）を含む。「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」という表現は、動物またはヒトに投与したときに、有害反応、アレルギー性反応、または他の不利な反応を引き起こさない分子体および組成物を意味する。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能な担体」としては、ヒトへの投与に好適な医薬などの医薬の製剤化での使用が許容される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、被覆材、抗細菌剤および抗菌類剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬活性物質用のそのような媒体および作用剤の使用は、当技術分野で周知である。いかなるの従来の媒体または作用剤の場合にもそれが本発明に係る活性成分と不適合でないかぎり、治療組成物でのその使用が可能であると考えられる。組成物のベクターやポリヌクレオチドを不活性化しないかぎり、補助的活性成分もまた、組成物中に組込み可能である。
【００５５】
本発明に係る活性組成物は、伝統的な医薬製剤を含み得る。本発明に係るこれらの組成物の投与は、標的組織を利用可能な経路であるかぎり、任意の通常経路を介して行い得る。これは、経口、経鼻、または頬腔内を含む。他の選択肢として、投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内への注射、または心臓組織中への直接注射により行い得る。ｍｉＲＮＡ阻害剤、ｍｉＲＮＡアゴニスト、またはｍｉＲＮＡ阻害剤もしくはアゴニストを含む発現構築物を含む医薬組成物はまた、カテーテルシステムまたは心臓に療法剤を送達するために冠循環を分離するシステムにより投与可能である。心臓および冠血管系に療法剤を送達するための種々のカテーテルシステムは、当技術分野で公知である。本発明で使用するのに好適なカテーテルに基づく送達法または冠分離法のいくつかの実施例（これらに限定されるものではない）は、米国特許第６，４１６，５１０号、米国特許第６，７１６，１９６号、米国特許第６，９５３，４６６号、国際公開第２００５／０８２４４０号、国際公開第２００６／０８９３４０号、米国特許出願公開第２００７／０２０３４４５号、米国特許出願公開第２００６／０１４８７４２号および米国特許出願公開第２００７／００６０９０７号（それらはすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）に開示されている。そのような組成物は、本明細書で説明した薬学的に許容可能な組成物として通常投与されるであろう。
【００５６】
活性化合物はまた、非経口投与または腹腔内投与が可能である。例として、遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水中に調製可能である。グリセロール中、液体ポリエチレングリコール中、およびそれらの混合物中、ならびに油中に組み込んで、ディスパージョン剤を調製することも可能である。通常の貯蔵条件下および使用条件下では、こうした調製物は、微生物の増殖を防止するために一般的には保存剤を含有する。
【００５７】
注射またはカテーテル送達に使用するのに好適な医薬製剤としては、たとえば、滅菌された注射用の溶液または分散液を即時調製するための滅菌された水性の溶液剤またはディスパージョン剤および滅菌粉末剤が挙げられる。一般的には、これらの製剤は、殺菌されており、容易な注入が行える程度に流動性である。製剤は、製造条件下および貯蔵条件下で安定でなければならず、かつ細菌や菌類などの微生物の汚染作用を受けないように貯蔵されなければならない。適切な溶媒または分散媒体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、ならびに植物油を含有可能である。適正な流動性は、たとえば、レシチンなどのような被覆剤を用いることにより、分散体の場合には所要の粒子サイズを保持することにより、および界面活性剤を用いることにより、保持可能である。微生物の活動の防止は、種々の抗細菌剤および抗菌類剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより行うことが可能である。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖または塩化ナトリウムを組み込むことが好ましいであろう。吸収を遅らせる作用剤、たとえば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを組成物で使用することにより、注射用組成物を長期間にわたり吸収させるようにすることが可能である。
【００５８】
滅菌注射用溶液剤は、適切な量の活性化合物を、所望により任意の他の成分（たとえば、以上に列挙したもの）と共に、溶媒中に組み込んでから、濾過滅菌を行うことにより、調製可能である。一般的には、ディスパージョン剤は、基剤としての分散媒と所望の他の成分（たとえば、以上に列挙したもの）とを含有する滅菌媒体中に種々の滅菌された活性成分を組み込むことにより調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望の成分とよりなる粉末を事前に滅菌濾過されたその溶液から生成する真空乾燥技術および凍結乾燥技術を含む。
【００５９】
本発明に係る組成物は、中性形または塩形で製剤化可能である。薬学的に許容可能な塩としては、たとえば、無機酸（たとえば塩酸もしくはリン酸）からまたは有機酸（たとえば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）から誘導される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が含まれる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩もまた、無機塩基（たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは第二鉄の水酸化物）、または有機塩基（たとえば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン）から、誘導可能である。
【００６０】
製剤化後、溶液剤は、好ましくは、投与処方に適合し得る形でかつ治療上有効な量で投与される。製剤は、注射用溶液剤、薬剤放出カプセル剤などのようなさまざまな剤形で容易に投与可能である。たとえば水溶液の状態で非経口投与に供する場合、一般的には、溶液を適切に緩衝化し、かつたとえば十分な生理食塩水またはグルコースを用いて最初に液体希釈液を等張化する。そのような水性溶液は、たとえば、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内への投与に使用可能である。好ましくは、当業者に公知のように、特定的には本開示に照らして、滅菌された水性媒体が利用される。例として、１回の投与量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解させて、１０００ｍｌの皮下注入液に添加するかまたは提案された注入部位に注射することが可能である（たとえば、”Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照されたい）。治療される被験体の病態に依存して投与量のいくらかの変更を生じることは避けられないであろう。いずれにせよ、投与の責任者が個々の被験体に対して適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、FDA Office of Biologics基準に規定された、無菌性、発熱原性、ならびに一般的安全性および純度の基準を満たさなければならない。
【００６１】
本発明の特定の実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、投与に供される用具と共にパッケージ化されるか、または用具内に貯蔵される。注射用製剤の用具としては、注射ポート、自動注射器、注射ポンプ、および注射ペンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。エアロゾル製剤または粉末製剤の用具としては、吸入器、吹送器、吸引器などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。したがって、本発明は、本明細書で説明した障害の１つ以上を治療または予防するための本発明に係る医薬組成物を含む投与用具を含む。
【００６２】
以下の追加の実施例により本発明をさらに説明するが、それらに限定されるものとみなしてはならない。当業者であれば、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を加え得ることかつそれにより本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同一もしくは類似の結果が得られることはわかるはずである。
【実施例】
【００６３】
実施例
実施例１．ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊は高ミトコンドリア組織中で高度に発現される
心不全でのｍｉＲＮＡの発現プロファイリングは、以前に心疾患のマウスモデルを用いて報告されている。（van Rooij et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 103 : 18255-18260）圧負荷により誘導された肥大心臓から得られた組織で行われたマイクロＲＮＡマイクロアレイ解析では、カルシニューリン過剰発現またはイソプロテレノール投与により、ｍｉＲ−３７８（ＧｅｎｅＩＤ：７２３８８９）が、これらの条件下で最もロバストに調節されたｍｉＲＮＡの１つであることが明らかにされた。ｍｉＲ−３７８はまた、心筋梗塞でダウンレギュレートされることから、ｍｉＲ−３７８が心臓ストレス応答プログラムの重要な決定要因であるというさらなる証拠が提供される（van Rooij et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 105: 13027-13032）。ｍｉＲ−３７８は、ネズミ１８番染色体上のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１−β（ＰＰＡＲＧＣ１β、ＧｅｎｅＩＤ：１７０８２６）遺伝子の最初のイントロン内に位置する（図１Ａ）。
【００６４】
ｍｉＲ−３７８およびｍｉＲ−３７８＊の発現プロファイルを調べるために、マウスから単離された種々の組織の定量的リアルタイムＰＣＲ解析を行った。ｍｉＲ−３７８およびｍｉＲ−３７８＊は、心臓、骨格筋、および褐色脂肪組織で高度に発現されることが判明した（図１Ｂ）。心臓組織では、ｍｉＲ−３７８は、心繊維芽細胞よりも心筋細胞でより高度に発現された（図１Ｃ）。ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊およびそれらの宿主遺伝子（ＰＰＡＲＧＣ１β（ＰＧＣ−１β））の発現パターンを重ね合わせたところ（図１Ｂ）、ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊およびＰＰＡＲＧＣ１βは共転写されることが示唆された。この仮説に一致して、ＰＰＡＲＧＣ１β発現の既知のリプレッサーのステアリン酸処理時に、ｍｉＲ−３７８の発現レベルの減少が細胞培養で観測された（図１Ｄ）。ｍｉＲ−３７８およびその宿主遺伝子（ＰＰＡＲＧＣ１β（ＰＧＣ−１β））の発現は両方とも、脂肪生成時に増大される（図１Ｅ）。ステアリン酸さらには他の短鎖脂肪酸の血漿中レベルの急上昇は、ＰＰＡＲＧＣｌａ、ＰＰＡＲＧＣｉおよびＰＰＡＲａ発現をダウンレギュレートすることが示されている（Ｓｔａｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  Ｖｏｌ．  ４８：２１１５−２１１８）。ｍｉＲ−３７８および宿主遺伝子ＰＰＡＲＧＣ１βの両方の転写が平行的な調節パターンに従うという観測から、２種の遺伝子が共調節されることが示唆される。ＰＰＡＲＧＣ１βは、脂肪酸酸化、グルコース利用、およびミトコンドリア生合成（Ｈａｎｄｓｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  （２００６）  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．，  Ｖｏｌ．  ２７：７２８−７３５；  Ｌｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．  ４：２０４２−２０５６；  Ｌｕｐｔａｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  Ｖｏｌ．  １  １２：２３３９−２３４６；  Ｓｏｎｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．  １０４：５２２３−５２２８；  ａｎｄ  Ｖｉａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．，  Ｖｏｌ．  ４：４５３−４６４）の調節の役割を果たしていることが知られている。イントロンｍｉＲＮＡは、多くの場合、宿主遺伝子と同一のネットワークの遺伝子プログラムに関与するので、ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊は、これらの同一の過程で役割を果たすと思われる。
【００６５】
実施例２．ｍｉＲ−３７８はストレス誘導心肥大応答を調節する
心疾患におけるｍｉＲ−３７８の役割をさらに解明するために、野生型マウスで胸部大動脈絞扼（ＴＡＢ）による心肥大の誘導の後、心臓組織でｍｉＲ−３７８発現を評価した。特定的には、大動脈を２７ゲージ針の直径に縫合して、心臓に圧負荷を誘導し、高血圧を模倣した。対照動物は、大動脈を変化させない偽手術に付した。ＴＡＢ手順の２１日後に単離された心臓組織のマイクロＲＮＡマイクロアレイ解析およびリアルタイムＰＣＲから、ｍｉＲ−３７８が圧負荷に応答してダウンレギュレートされることが判明した（図２Ａ）。
【００６６】
心疾患時におけるｍｉＲ−３７８の過剰発現の効果を調べるために、心筋細胞特異的α−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）プロモーターの制御下でｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊を過剰発現するトランスジェニックのマウスを作製した。ＴＡＢ後、これらのトランスジェニック動物は、野生型マウス（図２Ｂ）と比較して悪化した心肥大応答を示した。これらの知見から、心疾患時におけるｍｉＲ−３７８の強制的発現は、心臓に有害であり、ＴＡＢ後の野生型マウスのｍｉＲ−３７８の低減は、加えられたストレスに対する心臓の防御応答であることが示唆される。
【００６７】
ｍｉＲ−３７８は、おそらく、心臓代謝、特定的には肥大代謝シフトの過程で役割を果たすであろう（Luptak et al. (2005) Circulation, Vol. 1 12:2339-2346）。ｍｉＲ−３７８は、心臓代謝シフトを増大させ、したがって、ストレス下の心肥大応答に関与することが示唆される。ｍｉＲ−３７８の発現または活性の阻害は、心血管疾患の患者に治療効果を提供し得る。
【００６８】
実施例３．骨格筋中でのｍｉＲ−３７８の過剰発現により、体重および精巣上体脂肪塊が増大される。
骨格筋でｍｉＲ−３７８の過剰発現の効果を調べるために、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーターの制御下でｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製した。ＣＫｍｉＲ−３７８トランスジェニック動物の予備調査では、ｍｉＲ−３７８は、グルコースおよび脂肪酸利用を変調することが判明した。特定的には、より高年齢（１０ヶ月齢）のトランスジェニック動物は、野生型同腹仔よりも有意に体重増加した（図３）。野生型動物と比較して、体重の差は、突然変異型動物の精巣上体白色脂肪パッドの増大された重量に起因した（図３）。白色脂肪組織の組織学的解析は、ｍｉＲ−３７８−過剰発現するマウス（図３）の脂肪細胞肥大を示した。ＭＣＫｍｉＲ−３７８トランスジェニック動物の脂肪細胞中のトリグリセリドの増大された蓄積は、おそらく増大されたインスリン抵抗性およびグルコース利用の全体的な欠損の結果である。
【００６９】
他の一連の実験では、ｍｉＲ−３７８を３Ｔ３−Ｌ１細胞内で過剰発現させ、続いて、脂肪細胞に誘導分化させた。オイルレッドＯ染色により実証されるように、ｍｉＲ−３７８を過剰発現する細胞内で、増大された脂質蓄積が観測され、代謝過程の調節へのｍｉＲ−３７８の関与のさらなるの証拠が提供される（図４）。
【００７０】
肥満マウス（ｏｂ／ｏｂ）および糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）から単離された種々の組織のマイクロアレイ解析から、ｍｉＲ−３７８が強くダウンレギュレートされることが判明した（示されていないデータ）。ｏｂ／ｏｂマウスは、レプチンをコードする遺伝子に突然変異を有し、レプチンホルモンを生産させず、適正に食欲を調節できない。ｄｂ／ｄｂマウスは、レプチン受容体をコードする遺伝子に突然変異を有し、転写物の異常なスプライシングを引き起こして、受容体の細胞ドメインのトランケーションをもたらす。突然変異型レプチン受容体は、シグナル伝達機能が欠如している。肥満症および糖尿病のこれらの動物モデル中のｍｉＲ−３７８の調節が、レプチンシグナリングの撹乱により誘導される代謝障害に対する防御機序を表すことが示唆される。したがって、ｍｉＲ−３７８は、種々の代謝障害の効果的な治療標的になり得る。
【００７１】
実施例４．骨格筋でｍｉＲ−３７８を過剰発現するトランスジェニックマウスは低減された耐グルコース能を呈する
グルコース利用の調節におけるｍｉＲ−３７８の役割をさらに調べるために、骨格筋（ＭＣＫ−ｍｉＲ−３７８  Ｔｇ；  実施例３参照）でｍｉＲ−３７８を過剰発現するトランスジェニックマウスを耐グルコース能試験（ＧＴＴ）に付して、血液からのグルコースのクリアランスの欠損の可能性を検出する。マウスを１６時間絶食させ、続いて、１．５ｇ／ｋｇのグルコースを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。グルコース注射前ならびにグルコース注射の１５、３０、６０、および１２０分間後に血液サンプルを取得した。図５に示されるように、血糖値は、野生型マウスと比較して、ｍｉＲ−３７８トランスジェニックマウスで高く、血液からグルコースのクリアランスは遅れた。これらの結果から、骨格筋でｍｉＲ−３７８を過剰発現させると、おそらく、これらの動物インスリン抵抗性の増大するため、耐グルコース能が低下する。
【００７２】
耐グルコース能に及ぼす効果がとくにｍｉＲ−３７８過剰発現によるものであることを調べるために、尾静脈を介してＭＣＫ−ｍｉＲ−３７８トランスジェニック動物に１０ｍｇ／ｋｇの抗ｍｉＲ−３７８を連続３日間注射した。抗ｍｉＲ−３７８は、成熟ｍｉＲ−３７８配列（５’−ＴＧＡＣＴＣＣＡＡＧＴＣＣＡＧ−３’（配列番号２１））のヌクレオチド２〜１６に相補的でありかつロックド核酸とデオキシリボヌクレオチドとの組合せ（８ＬＮＡおよび７ＤＮＡ）を含有する配列を有していた。抗ｍｉＲ−３７８は、十分なホスホロチオエート骨格を含有していた。抗ｍｉＲ−３７８の最後の注入に続いて、マウスを１６時間絶食させた。グルコース（１．５ｇ／ｋｇ）を腹腔内に注射し、グルコース注射前および注射後種々の時間で血液サンプルを取得した。抗ｍｉＲ−３７８は、トランスジェニックマウスでのｍｉＲ−３７８の発現を、生理食塩水が注射された野生型マウス（図６）で観測されたよりも低いレベルに効果的に低減させた。トランスジェニック動物の抗ｍｉＲ−３７８処理は、グルコースクリアランスを改善し、これらの動物は、耐グルコース能試験に対して野生型動物と類似の応答を呈した。これらの結果から、ｍｉＲ−３７８トランスジェニックマウスでの異常なグルコース利用は、ｍｉＲ−３７８の過剰発現に基づくものであり、ｍｉＲ−３７８の発現を低減させることにより、正常な代謝過程を取り戻すことが可能であることが示唆される。
【００７３】
抗ｍｉＲ−３７８が２型糖尿病のマウスモデルで正常なグルコース利用を取り戻すことができるかを試験するために、肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウスの静脈内に１０ｍｇ／ｋｇの抗ｍｉＲ−３７８を連続３日間注射した。最後の抗ｍｉＲ−３７８注射後、マウスを１６時間絶食させ、１．５ｇ／ｋｇのグルコースを腹腔内に注射した。血糖値を評価するために、注射後種々の時間間隔で血液サンプルを取得した。図７に示されるように、抗ｍｉＲ−３７８で処理されたｏｂ／ｏｂマウスは、未処理動物と比較して改善されたグルコースクリアランスを呈した。これらの知見から、ｍｉＲ−３７８発現の阻害がレプチンシグナリングの慢性撹乱で動物体内のグルコース利用を改善しうることが実証される。したがって、ｍｉＲ−３７８阻害剤は、糖尿病や肥満症などの代謝障害を治療するための新規な治療手段を提供する。
【００７４】
実施例５．ｍｉＲ−３７８ノックアウトマウスの作製
ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊の機能をｉｎ  ｖｉｖｏで調べるために、ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊の遺伝子欠失を有するマウス系列を作製した。ターゲッティングベクターおよび相同的組換え（図８Ａ）を用いて、ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊を標的とし、遺伝子欠失の生殖系列伝播をサザンブロット分析を用いて確認した（図８Ｂ）。ノーザンブロット解析では、ｍｉＲ−３７８グローバル突然変異体で調べられたすべての組織でｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊発現の損害を確認した、（図８Ｃ）。ＰＰＡＲＧＣ１βに対してＴａｑｍａｎプローブを用いたリアルタイムＰＧＲ解析およびＰＰＡＲＧＣ１β（ＰＧＣ−１β）に対するウェスタンブロット解析により、ＰＰＡＲＧＣ１β（ＰＧＣ−１β）発現がｍｉＲ−３７８ノックアウト動物で変化しないことが示された（図８Ｄ）。
【００７５】
心臓リモデリングに及ぼすｍｉＲ−３７８機能喪失の効果を調べるために、野生型マウスおよびｍｉＲ−３７８グローバルノックアウトマウスで胸部大動脈絞扼（ＴＡＢ）を行った。ＴＡＢの２１日後、内径短縮率、心収縮力および機能の尺度、駆出率、収縮期径、ならびに拡張期収縮期径（ＤＤ−ＳＤ）を決定するために、心エコー検査を行った。心エコーの検査の１日後、心臓を摘出した。細胞形態を決定するために、組織学的検査を行った。心臓リモデリング／ストレス遺伝子（たとえば、ＡＮＦ、ＢＮＰ、Ｍｙｈ７、Ｍｙｈ６、およびｃｏｌｌａｇｅｎ）発現をリアルタイム定量的ＰＣＲにより測定した。
【００７６】
この一連の実験の結果から、ｍｉＲ−３７８ノックアウト動物は、ＴＡＢ誘導心臓リモデリングから保護されたことが示される。ノックアウト動物の心臓は、野生型マウスと比較した場合、組織学的解析により測定された低減された筋細胞肥大および心臓繊維化を呈した（図９）。同様に、ｍｉＲ−３７８ノックアウトは、心エコー検査により測定される心収縮力および機能の低下から保護された（図１０Ａ〜Ｄ）。ｍｉＲ−３７８ノックアウト動物はまた、リモデリング／ストレス遺伝子アップレギュレーションの減衰を呈した（図１１Ａ〜Ｃ）。これらの結果から、ｍｉＲ−３７８は、心肥大／リモデリングの正のレギュレーターであり、ｍｉＲ−３７８の発現および活性の阻害は、心臓ストレッサーに応答する病理学的リモデリングを低減するための新規な治療手段になることが実証される。
【００７７】
また、ｍｉＲ−３７８ノックアウトマウスを、肥大型心筋症の形態を誘導する向肥大性ホスファターゼカルシニューリンを過剰発現する動物と、交配した。それに加えて、心臓リモデリングでのｍｉＲ−３７８の損失の効果を調べるために、心肥大アゴニストイソプロテレノールまたは生理食塩水（対照）をｍｉＲ−３７８ノックアウトマウスに投与する。ｍｉＲ−３７８ノックアウト動物は、同様に、イソプロテレノールおよびカルシニューリンによる誘導される心臓リモデリングから保護される予想される。
【００７８】
実施例６．ｍｉＲ−３７８ノックアウトマウスは高脂肪食により誘導される体重増加に対してより大きい耐性を有する
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたｍｉＲ−３７８の阻害は、２型糖尿病のモデルである肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウスでグルコース利用の改善をもたらした（実施例４参照）。代謝の調節におけるｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊の役割をさらに探究するために、ｍｉＲ−３７８ノックアウトマウス（実施例５参照）を肥満マウスと交配し、グルコース利用を評価した。マウスを１６時間絶食させ、１．５ｇ／ｋｇグルコースを腹腔内に注射した。血糖値を評価するために、注射後種々の時間間隔で血液サンプルを取得した。図１２に示されるように、肥満（ｏｂ／ｏｂ）動物と比較して、ｍｉＲ−３７８ノックアウトおよびｏｂ／ｏｂ交配（ｏｂ／ｏｂ  ＫＯ）の子孫は、改善された耐グルコース能を呈す。
【００７９】
高脂肪食により誘導される肥満症などの他の形態の肥満症の発症でｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊が役割を果たすかを調べるために、ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊ノックアウト動物および野生型同腹仔に４５％ｋｃａｌ脂肪よりなる高脂肪食を摂取させた。ノックアウト動物は、４週間超の高脂肪食摂取後にそれらの野生型対応物よりも有意に少ない体重を獲得した（図１３Ａ）。それに加えて５週間の高脂肪食摂取後、野生型同腹仔（図１３Ｂ）と比較して、ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊ノックアウト動物は、増強された耐グルコース能を呈した。興味深いことに、野生型動物と比較して、ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊ノックアウトマウスは、６週間の高脂肪食摂取後、低減された脂肪パッドおよび肝脂質蓄積を有していた（図１４〜１６）。
【００８０】
α−ＭＨＣプロモーターの制御下で心臓組織中でｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊を過剰発現するトランスジェニックマウス（実施例２参照）は、野生型動物と比較して、体重が増大し、さらには高脂肪食に応答して、野生型動物よりも大きい体重変化パーセントを示した（図１７）。
【００８１】
６時間絶食した後、野生型動物およびｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊ノックアウト動物から単離された褐色脂肪組織のウェスタンブロット解析では、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）シグナリングは、リン酸化形のＡＭＰＫの増加により示されるように、ノックアウトマウスから単離された脂肪組織で増強されることが判明した（図１８Ａ）。ＡＭＰＫは、脂質およびグルコースの代謝の中心的レギュレーターである。ＡＭＰＫが活性化されると、インスリンに刺激されてグルコース取込みが促進され、脂肪酸酸化や解糖などの異化過程が刺激される。ＡＭＰＫが活性化されると、グルコース新生、グリコーゲン、脂質、およびタンパク質の合成が阻害される。したがって、ノックアウト動物にはｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊が不在であるので、ＡＭＰＫが活性化されて、脂肪酸酸化および脂質蓄積の減少が促進される（図１８Ｂ）。
【００８２】
ｍｉＲＮＡ標的を同定するためにｍｉＲａｎｄａソフトウェア（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒから入手可能な）を用いて、甲状腺ホルモン受容体関連タンパク質１（ＴＨＲＡＰ１）としても知られるメディエーター複合体サブユニット１３（ＭＥＤ１３）をｍｉＲ−３７８の予測標的として同定した。ＭＥＤ１３の３’ＵＴＲは、種（たとえば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、オランウータン、およびウマ）間で保存されたｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊の４つの推定結合部位を含有する（図１９Ａ）。心臓でｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊を過剰発現するマウス（αＭＦＩＣ  Ｔｇ）でＭＥＤ１３発現を調べたところ、ＭＥＤ１３発現は、野生型動物に対してはダウンレギュレートされるが、ＭＥＤ１３発現は、ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊ノックアウト動物（ＫＯ）ではアップレギュレートされることが判明したことから、ＭＥＤ１３がｍｉＲ３７８／ｍｉＲ−３７８＊の生理学的標的であることが示唆される。図１９Ｂを参照されたい。ＥＤ１３がｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊に認識される標的であるかをさらに調べるために、ＭＥＤ１３転写物の全長３’−ＵＴＲをルシフェラーゼ発現プラスミドに挿入して、ＣＯＳ１細胞中に形質移入した。ＣＭＶ駆動ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊の量の増大により、ルシフェラーゼ活性が用量依存的に減少したが、同等量の対照ｍｉＲＮＡは、効果がなかった（図１９Ｃ）。ＭＥＤ１３の３’ＵＴＲの配列の突然変異はまた、ルシフェラーゼ活性（図１９Ｃ）のｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊誘導抑制を阻止した。
【００８３】
以上をまとめると、この一連の実験の結果から、ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊は、ＡＭＰＫおよびＭＥＤ１３シグナリングに影響を及ぼすことにより代謝過程の調節における主要な役割を果たすことが示される。ｍｉＲ−３７８／ｍｉＲ−３７８＊活性の阻害は、肥満症やＩＩ型糖尿病などの代謝障害を治療するために利用可能な治療手段になり得る。
【００８４】
本明細書で考察および引用された出版物、特許、および特許出願はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。開示された本発明は、記載の特定の方法、プロトコル、および材料に限定されるものではない。なぜなら、これらは、変更可能であるからである。同様に、本明細書中で用いられる用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的としたものにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００８５】
当業者であれば、通常の実験の域を出ることなく、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価形態がわかるであろう。またはそれらを確認することができるであろう。そのような等価形態は、以下の特許請求の範囲内に包含されるものとする。
【図１Ａ】
2013532141.tif 000004
【図１Ｂ−Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ−Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１０Ｃ−Ｄ】
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【図１１Ａ−Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ−Ｃ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１９Ａ−Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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