(57)【要約】  本発明は、糖蜜が、エンドイヌリナーゼ活性および／またはフルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用に付されて、フルクタン含有糖蜜（フルクタン糖蜜）を生成する変換ステップ、フルクタン糖蜜がクロマトグラフィーによる分離に付され、それによってベタイン含有画分を得る分離ステップを含む、糖蜜からベタインを回収する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
−糖蜜がフルクタン生成酵素の作用に付されて、フルクタン含有糖蜜（フルクタン糖蜜）を生成する変換ステップ、
−前記フルクタン糖蜜はクロマトグラフィーによる分離に付され、それによってベタイン含有画分を得る分離ステップ
を含む、糖蜜からベタインを回収する方法。
【請求項２】
フルクタン生成酵素が、エンドイヌリナーゼ活性を有する酵素、フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、およびその混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分離ステップが、イオン交換クロマトグラフィーによって行われる、請求項１または２のに記載の方法。
【請求項４】
イオン交換クロマトグラフィーによる分離においてカチオン交換樹脂が使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
カチオン交換樹脂がナトリウム型である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
分離ステップに先立って、糖蜜またはフルクタン糖蜜がイオン交換ステップに付され、それによってカチオン交換樹脂の型のカチオンとは異なる、糖蜜またはフルクタン糖蜜中のカチオンの量が、少なくとも５０％低減される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
−糖蜜が、エンドイヌリナーゼ活性および／またはフルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用に付されて、フラクトオリゴ糖含有糖蜜（ＦＯＳ糖蜜）を生成する変換ステップ、
−前記ＦＯＳ糖蜜はクロマトグラフィーによる分離に付され、それによってベタイン含有画分を得る分離ステップ
を含む、請求項１から６までのいずれかに記載の方法。
【請求項８】
変換ステップが、糖蜜中の少なくとも１０重量％のスクロースが変換されるように実行される、請求項１から７までのいずれかに記載の方法。
【請求項９】
分離ステップが、擬似移動床式（ＳＭＢ）クロマトグラフィーシステムで実行される、請求項１から８までのいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
−総炭水化物乾燥物質に基づいて測定して、少なくとも１０重量％のフルクタン、および
−総乾燥物質に基づいて測定して、最大で１．０重量％のベタイン
を含有する、変換されたテンサイ糖蜜生成物。
【請求項１１】
総乾燥物質に基づいて測定して、少なくとも３重量％のベタイン含量を有するテンサイ糖蜜から得られる、請求項１０に記載の変換されたテンサイ糖蜜生成物。
【請求項１２】
動物飼料における請求項１０または１１に記載の変換されたテンサイ糖蜜生成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖蜜からベタインを回収する方法に関する。
【０００２】
このような方法は、ＵＳ−Ａ−５１２７９５７から知られている。この既知の方法では、ビート糖蜜の供給溶液を、擬似移動床式クロマトグラフィーシステムに供給する。溶離液として水が使用される。クロマトグラフィーによる分離は、様々な画分、とりわけ、高ベタイン含量を有する画分および高スクロース含量を有する画分の生成をもたらす。ＵＳ−Ａ−５１２７９５７の例１では、高ベタイン含量を有する画分は、７０．９重量％のベタイン（乾燥物質に関して）および１１．１重量％のスクロース（乾燥物質に関して）を有し、高スクロース含量を有する画分は、８６．６重量％のスクロース（乾燥物質に関して）および３．３重量％のベタイン（乾燥物質に関して）を有する。
【０００３】
この既知の方法の欠点は、糖蜜において、他の画分からのベタインの分離が必ずしも最適であるとは限らないことである。
【０００４】
前記欠点を低減することが本発明の目的である。
【０００５】
この目的は、方法が、
−糖蜜がフルクタン生成酵素の作用に付されて、フルクタン含有糖蜜（フルクタン糖蜜）を生成する変換ステップ、および
−前記フルクタン糖蜜はクロマトグラフィーによる分離に付され、それによってベタイン含有画分を得る分離ステップ
を含むという点において達成される。
【０００６】
高純度のベタイン含有画分をより効率的に得ることができることが、本発明の方法の利点である。
【０００７】
本方法の重要な残余画分、即ちフルクタン含有画分が、既知の方法におけるスクロース含有画分と比較して、既知の方法の対応するスクロース含有画分より高い価値を有し得ることは、本発明の方法の他の利点である。
【０００８】
Ｉｒａｊ  Ｇｈａｚｉ  ｅｔ  ａｌは、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００６，５４（８），ｐｐ２９６４−２９６８において、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）の酵素的合成のための低コストおよび利用可能な基質として、ビート処理からの糖シロップおよび糖蜜をどのように評価したかを開示している。フルクトシル転移活性が存在することによって特徴付けられる、市販のペクチナーゼ（Ｐｅｃｔｉｎｅｘ  Ｕｌｔｒａ  ＳＰ−Ｌ、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）由来）を生体触媒として使用した。
【０００９】
本発明の方法は、ベタインの回収に関する。本明細書で意味する場合、ベタインは、グリシンベタインまたはΝ，Ν，Ν−トリメチルグリシン、とりわけテンサイ（Βｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）中で見出される両性イオンの意味で使用され、式（Ｉ）の構造を有する。
【化１】
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【００１０】
知られているように、ベタインは、浸透圧およびメチル供与体としての機能に寄与する一因である等、哺乳動物においていくつかの機能を有する。これらの機能は、ベタインに対する市場が存在するという状況をもたらしており、したがって効率的な方法で生成物としてベタインを得ることが望ましい。ベタインの供給源の１つの知られているグループは、例えばテンサイ糖蜜等のベタイン含有糖蜜のものである。本明細書で使用される場合の糖蜜という用語は、スクロースを調製する方法において、詳細には結晶化段階において生成される副生成物であるという一般的な意味を有し、さらに、本発明による方法で使用される糖蜜はベタインを含有するべきである。本明細書で使用される場合、糖蜜という用語は、スクロースを調製する方法で得られる糖蜜、または希釈を好ましくは水相で実施するその希釈形態を表す。好ましくは、糖蜜はテンサイ糖蜜である。知られているように、テンサイ糖蜜は、典型的には、非希釈形態の総重量に対して、４５から６５重量％の間のスクロース、典型的には３から８重量％の間のベタイン、典型的には６から１０重量％の間のアミノ酸、約１重量％の少量のフルクトースおよびグルコース、並びに顕著な量の（無機）有機塩等の他の化合物を含有することができる。
【００１１】
本発明による方法では、糖蜜はフルクタン生成酵素の作用に付される。これは、それ自体知られている手段によって達成され得る。糖蜜は、それ自体としてまたは希釈形態で存在してもよく、好ましくは、糖蜜は希釈形態で存在し、希釈は好ましくは水で実施される。一定の希釈、または希釈の増加が使用される酵素の効率の低下をもたらす場合は、特定の状況に対する最適条件を確立するために、当業者によって常法に従って、希釈の利益は効率の低下に対してバランスが取られるべきである。一態様では、適当な酵素は、遊離型であり、糖蜜と十分混合される。酵素含有糖蜜を、酵素が明らかな活性を示すような温度およびｐＨの条件に合わせる。別の態様では、酵素は固定化型で入手可能であり、糖蜜は固定化酵素と一緒に、また温度およびｐＨを適当な条件に合わせて、流すようにする。
【００１２】
本発明による方法で使用される酵素は、スクロースからフルクタンの生成を触媒することが可能であるべきである。遊離のグルコースが副生成物として生成され得る。
【００１３】
本明細書で使用される場合のフルクタンという用語は、任意にグルコース開始部分を有するフルクトシル−フルクトース結合から主になる炭水化物物質に関する包括的な用語であるというその一般的な意味を有する。フルクタンの意味は、より特定の化合物イヌリン（ここで、フルクトシル−フルクトース結合は主にβ（２→１）タイプである）、およびレバン（ここでフルクトシル−フルクトース結合は主にβ（２→６）タイプである）を包含する。イヌリンおよびレバンのいずれも線状または分岐であってもよく、両方とも多分散型、即ち、様々な重合度の混合物の形態、または単分散型であってもよい。
【００１４】
イヌリンは、通常多分散系、即ち個々の化合物の重合度（ＤＰ）が２から１００またはより広い範囲であり得る、様々な鎖長の化合物の混合物である。本明細書で使用される場合のフラクトオリゴ糖（ＦＯＳと略される）という用語は、個々の化合物のＤＰが、２から１０、実際にはしばしば２から９、または２から８または２から７の範囲である単分散系または多分散系のいずれかの特定の形態のイヌリン物質を示す。市販のＦＯＳは、通常、約２から５の数平均重合度（ＤＰ）を有する多分散系物質である。
【００１５】
実際には、ＦＯＳはオリゴフルクトースとも称される。本明細書で使用される場合、フラクトオリゴ糖およびオリゴフルクトースは、同義語と考えられる。
【００１６】
スクロースからのフルクタンの生成は、フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を選択することによって達成することができる。このような酵素は、例えば、酵素カテゴリー番号ＥＣ２．４．１．９９またはＥＣ２．４．１．９として分類されているようにそれ自体知られている。このような酵素の初期の開示が、「アスペルギルス・フィクウム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）由来のイヌリナーゼまたはフルクトシルトランスフェラーゼを用いたイヌリンまたはスクロースからフラクトオリゴ糖の製造（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｉｎｕｌｉｎ  ｏｒ  Ｓｕｃｒｏｓｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｕｌｉｎａｓｅ  ｏｒ  Ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）」、Ｂａｒｒｉｅ  Ｅ．Ｎｏｒｍａｎ  ＆  Ｂｉｒｇｉｔｔｅ  Ｈｏｊｅｒ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｄｅｎｐｕｎ  Ｋａｇａｋｕ  ｖｏｌ  ３６、Ｎｏ．２、ｐｐ１０３−１１１（１９８９）にある。
【００１７】
さらに、いくつかのβ−フルクトフラノシダーゼまたはインベルターゼ、即ち、ＥＣ３．２．１．２６として分類された酵素も、フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有することができ、それによって本発明による方法に適するであろうであることが知られている。
【００１８】
さらに、ＥＣ３．２．１．７として分類される酵素等のエンドイヌリナーゼ活性を有する酵素も、スクロースの存在下、特に、４０若しくは５０重量％スクロースまたはそれを超える高スクロース含量を有する混合物中で酵素が作用する場合、ＦＯＳ等のフルクタンを生成させ得る。
【００１９】
さらに、ＥＣ２．４．１．１０として分類される酵素等のレバンスクラーゼ活性を有する酵素は、本発明による方法に使用するのに適する可能性がある。
【００２０】
本発明の変換ステップに使用するのに好ましい酵素の一例は、エンドイヌリナーゼＮｏｖｏｚｙｍｅ  ９６０（供給業者：Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）である。本発明の変換ステップに使用するのに好ましい酵素の別の例は、Ｐｅｃｔｉｎｅｘ  Ｕｌｔｒａ  ＳＰ−Ｌ（供給業者：Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）である。酵素がフルクトシルトランスフェラーゼ活性および／またはエンドイヌリナーゼ活性を有する２種または３種以上の酵素の組合せを構成することも、本発明によれば可能である。
【００２１】
本発明の主要な態様では、糖蜜を、スクロースからフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）の生成を触媒することが可能な酵素と接触させる。したがって、この主要な態様は、
−糖蜜が、エンドイヌリナーゼ活性および／またはフルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用に付されて、フラクトオリゴ糖含有糖蜜（ＦＯＳ糖蜜）を生成する変換ステップ、
−ＦＯＳ糖蜜がクロマトグラフィーによる分離に付され、それによってベタイン含有画分を得る分離ステップ
に関する。
【００２２】
本発明による方法で必要な酵素量は、様々な、それ自体知られている要素、例えば、プロセス温度、原材料の量、ｐＨ、許容されるプロセス期間、および所望の変換率により決まる。上記およびその他の要素は、当業者によりこの技術分野における一般に認められている手順に従って、本発明のプロセスに対して決定され得る。
【００２３】
本発明による方法では、酵素は、フルクタン含有糖蜜、好ましくはＦＯＳ含有糖蜜を生じさせるのに十分長い時間糖蜜に作用するようにさせる。本発明によるこのステップを実行する期間は、主に所望のフルクタン、好ましくはＦＯＳの量に応じて選択される。当業者には知られているように、この期間は、０．５または１から７２時間、好ましくは５から５０時間、より好ましくは１２から３６時間の範囲であることが多く、この間にフルクタン含有糖蜜（フルクタン糖蜜）、好ましくはＦＯＳ含有糖蜜（ＦＯＳ糖蜜）が生成される。
【００２４】
変換ステップにおいて、糖蜜中の５重量％から１００重量％の間のスクロースが変換されることが好ましい。より好ましくは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０重量％のスクロースが変換される。本質的にすべてのスクロースを変換することが特に好ましい。変換されるスクロースの割合が増加すると、後続のベタインの回収がより効率的に実行され得ることが判明した。
【００２５】
フルクタン糖蜜、好ましくはＦＯＳ糖蜜の生成が完了後、および遊離の、非固定化酵素が使用され、糖蜜中に混合された場合、酵素が非活性化されたことを保証することが望ましいことがある。この場合は、酵素の非活性化ステップを実行してもよい。酵素の非活性化は、それ自体知られている方法によって達成することができ、各酵素の特定のタイプに対して異なり得る。非活性化のこのような方法の一例は、温度を例えば約８０、８５または９０℃のレベルに上昇させ、この上昇させた温度で５から３０分間の滞留時間が続くことである。このような温度への曝露の他の利益は、存在し得るあらゆる細菌の量が減少することである。
【００２６】
本発明の方法では、フルクタン糖蜜に対して分離ステップが実施される。分離ステップは、変換ステップ中にまたは変換ステップ後のいずれかで実行される。好ましくは、分離ステップは、変換ステップ後に実行される。分離ステップでは、フルクタン糖蜜はクロマトグラフィーによる分離に付される。知られているように、物質をクロマトグラフィーによる分離に付すことにより、物質の様々な画分への分割をもたらすことができる。本発明による分離は、ベタイン含有画分が生成されるように実施されるものである。当業者には、クロマトグラフィーによる分離における固定相の個々の選択が、分離の性能に影響を及ぼし得ることが知られている。クロマトグラフィーによる分離は、フルクタン糖蜜を樹脂上を通過させる等のそれ自体知られている手段によって実行してもよい。
【００２７】
本発明の主要な態様において、分離ステップはイオン交換クロマトグラフィーを介して実施される。知られているように、樹脂ベースのイオン交換クロマトグラフィー等の、様々なイオン交換クロマトグラフィー技術が、おそらくサイズ排除メカニズムを組み合わせて利用可能である。本明細書でも、様々な樹脂がこの目的ために利用可能である。本発明の方法の好ましい一態様では、強酸型カチオン交換樹脂が選択される。カチオン交換樹脂を選択した場合、カチオンの選択は分離効率に影響を及ぼし得ることも判明した。本発明の一態様では、本質的にナトリウム型のカチオン交換樹脂が好ましい。この態様では、置換は分離効率に影響を及ぼし得るため、ナトリウムイオンは、カリウム等の他のイオンによって大きな程度までは置換されず、好ましくは５０、４０、３０、２５までを超えず、またはさらには２０または１５％までを超えないことを保証することが好ましい。したがって、分離ステップがカチオン交換樹脂で実施され、ここで、カチオンタイプ（例えば、ナトリウム）が分離効率に顕著に関係があり、フルクタン糖蜜が顕著な量の他のイオン（例えば、カリウムイオン）を含有する場合、分離ステップに先立って、糖蜜に対してまたはフルクタン糖蜜に対してイオン交換ステップおよび／または除去ステップを実行することが好ましい。このようなステップは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたは電気透析を介する等、それ自体知られている。
【００２８】
したがって、分離ステップに先立って、糖蜜またはフルクタン糖蜜がイオン交換ステップに付され、それによってカチオン交換樹脂の型のカチオンとは異なる、糖蜜またはフルクタン糖蜜中のカチオンの量が低減されることが好ましい。この低減は、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、さらには少なくとも９５％である。
【００２９】
樹脂が分離ステップに使用される場合に知られているように、例えば、樹脂中の架橋度を変化させることによって最適タイプの樹脂を選択するために、特定の常法による最適化が必要であることがある。
【００３０】
好ましくは、クロマトグラフィーによる分離は、擬似移動床（ＳＭＢ）システム、または連続擬似移動床（ＳＳＭＢ）または改良擬似移動床（ＩＳＭＢ）等の、ＳＭＢシステムのさらなる開発により実施される。これは、分離ステップおよび／またはベタイン含有画分の回収を連続的に実施することができるという利点を有する。
【００３１】
驚くべきことに、高純度のベタイン含有画分がフルクタン糖蜜から回収され得ることが判明した。いかなる理論にも拘束されることは望まないが、クロマトグラフィーによる分離におけるフルクタン、特にＦＯＳ、およびおそらくさらにグルコースの挙動は、フルクタンが、スクロースよりシャープな、分散性の少ないピークで流出し、おそらくそれによって、高純度ベタインを得るのに有利に、特定の他の化合物の溶離挙動に影響を及ぼすようなものであり得ることが予想される。
【００３２】
本発明の方法では、ベタイン含有画分が得られる。本明細書で意味する場合、ベタイン含有画分は、他の乾燥物質の成分に対するベタインの比が、分離ステップに流入するフルクタン糖蜜と比較して増加した画分を意味する。好ましくは、他の乾燥物質の成分に対するベタインの比は、少なくとも２５：７５、より好ましくは４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、またはさらには少なくとも９０：１０若しくは９５：５まで増加される。
【００３３】
本発明の方法で得られる１つまたは複数のベタイン含有画分は、所望により、例えば、溶離液量を蒸発または膜技術等の手段を介して減少させるまたはさらには本質的に０にさせる濃縮ステップ等の、それ自体知られている手段によってさらに処理し得る。
【００３４】
本発明の方法により、フルクタン含有画分を得ることもできる。好ましくはＦＯＳ等のフルクタンの存在のために、このような画分は、そのベタイン含量が低いことがあるにもかかわらず、動物飼料等の様々な用途において大きな価値を有し得る。したがって、本発明は、少なくとも１０重量％（総炭水化物乾燥物質に基づいて測定して）のフルクタン（好ましくはフラクトオリゴ糖）、および同時に最大で２．０、１．０または０．５重量％のベタイン（変換されたテンサイ糖蜜生成物の総乾燥物質に基づいて測定して）を含有する変換されたテンサイ糖蜜生成物にも関する。本発明の変換されたテンサイ糖蜜生成物は、少なくとも２、２．５、３、３．５、またはさらには４重量％（テンサイ糖蜜の総乾燥物質に基づいて測定して）のベタインの含量を有するテンサイ糖蜜から得ることが可能であり、好ましくは得られる。好ましくは、変換されたテンサイ糖蜜生成物は、最大で２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、またはさらには１重量％のスクロース（総炭水化物乾燥物質に基づいて測定して）を含有する。変換されたテンサイ糖蜜生成物が、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、またはさらには５０重量％のＦＯＳ（総炭水化物乾燥物質に基づいて測定して）を含有することがさらに好ましい。好ましくは、変換されたテンサイ糖蜜生成物は、（総乾燥物質の）最大で０．４、０．３、０．２またはさらには０．１重量％のベタインを含有する。さらに、変換されたテンサイ糖蜜生成物は、最大で３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５重量％のグルコース（総炭水化物乾燥物質に基づいて測定して）を含有する。
【００３５】
所望により、本発明の変換されたテンサイ糖蜜生成物を、例えば、フルクタン、特にＦＯＳを本質的に純粋な形態で得る目的でさらに処理してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】例１の分離ステップの結果をグラフによって表示したものである。
【００３７】
本発明の方法を以下の例の手段によって例示するが、例は本発明の範囲を限定するものと理解するべきではない。
（例１）
【００３８】
８４％の固体含量を有する１０００ｇのテンサイ糖蜜を、糖蜜が５７．６％の固体含量を有するように水で希釈した。この結果、スクロース含量は３８．５重量％であった。糖蜜のｐＨを８．１から６．２に調整した。この例におけるあらゆるｐＨ調整は、ＨＣｌ（９％）水溶液またはＮａＯＨ（４％）水溶液を用いて実施した。糖蜜の温度を５６℃に合わせた。糖蜜に５９１μｌの量の酵素Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ９６０を添加した。糖蜜をｐＨ６．２および５６℃の条件に２４時間保持し、その後、ＦＯＳ糖蜜が成功裏に生成された。ＦＯＳの量は、５１％（総炭水化物の重量％）であると決定された。
【００３９】
ＦＯＳ糖蜜をクロマトグラフィーによる分離のためにバッチ式カラム中に供給した。カラムは、高さ１００ｃｍおよび直径５ｃｍであり、ナトリウム型のＤｏｗｅｘ  ９９／３２０樹脂で９８ｃｍ充填された。知られているように、この樹脂は強酸型カチオン交換樹脂である。溶離液の水を１０ｍｌ／ｍｉｎの速度でカラム中に供給し、ＦＯＳ糖蜜の７０ｍｌの試料をカラム中に供給した。試料注入後６９から２０９分の期間、１０分毎に個々の画分を回収し、分析した。
【００４０】
結果を表１およびグラフにて図１に示す。
【表１】
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表１についての説明
−時間＝試料注入後の時間（分）
−数値は濃度である（ｇ／ｋｇ）。
−画分「残余」は、表中に具体的に特定されたもの（これらは、フルクトース、グルコース、スクロース、ＦＯＳ、およびベタインである）以外のすべての乾燥物質の成分を含有する。画分「残余」に含有される化合物の例は塩である。
【００４１】
上記結果から、ベタインが非常に高い純度で得られ、１６９から１９９分の間に得られた画分は、本質的にはスクロースまたは他の化合物を含有せず、一方、ＦＯＳ含有画分は本質的にベタインを含有しないことが明らかに分かる。
【図１】
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【国際調査報告】
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