(57)【要約】  本発明は、移植のための冷臓器保存組成物であって、冷臓器保存液およびカルジオトロフィン−１またはその機能的に同等の変種を含んでなる組成物に関する。本発明はまた、その組成物の調製のための方法およびキット、（特に、腎臓、肺および心臓の）移植用の冷臓器保護および／または保存のためのその使用、さらに、冷保存方法およびこれらの方法によって冷保存された単離臓器にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）カルジオトロフィン−１またはその機能的に同等の変種、および
（ｉｉ）冷臓器保存液
を、一緒にまたは別々に、含んでなる、冷臓器保存組成物。
【請求項２】
冷臓器保存液が
（ａ）少なくとも１種類の緩衝剤、
（ｂ）少なくとも１種類の不浸透剤、および
（ｃ）少なくとも１種類の電解質
を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
緩衝剤が、リン酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、ヒスチジン、ヒスチジン−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩およびそれらの組合せからなる群から選択され；不浸透剤が、ヒスチジン、グルコース、スクロース、マンニトール、トレハロース、グルコン酸塩、クエン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラフィノースおよびそれらの組合せからなる群から選択され；および／または、電解質が、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
冷臓器保存液がユーロコリンズ液（ＥＣ）である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
冷臓器保存液が、少なくとも１種類のコロイド物質、少なくとも１種類の代謝物質、少なくとも１種類のアミノ酸、少なくとも１種類の酸化防止剤、少なくとも１種類のビタミン、および／または、少なくとも１種類の抗生物質をさらに含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
不浸透剤が、ラクトビオン酸塩、ラフィノースおよび両方の組合せからなる群から選択される、請求項２、３または５に記載の組成物。
【請求項７】
コロイド物質が、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコールまたは両方の組合せからなる群から選択される、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
冷臓器保存液がウィスコンシン大学液（ＵＷ）である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
カルジオトロフィン−１がヒト由来のものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
ヒト由来のカルジオトロフィン−１が配列番号１のものである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
カルジオトロフィン−１が、０．０１ｍｇ／ｌ〜０．５０ｍｇ／ｌの間の濃度である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
冷臓器保存組成物を調製する方法であって、カルジオトロフィン−１またはその機能的に同等の変種を冷臓器保存液に加えることを含んでなる、方法。
【請求項１３】
冷臓器保存液が
（ａ）少なくとも１種類の緩衝剤、
（ｂ）少なくとも１種類の不浸透剤または不浸透化剤、および
（ｃ）少なくとも１種類の電解質
を含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
緩衝剤が、リン酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、ヒスチジン、ヒスチジン−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩およびそれらの組合せからなる群から選択され；不浸透剤が、ヒスチジン、グルコース、スクロース、マンニトール、トレハロース、グルコン酸塩、クエン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラフィノースおよびそれらの組合せからなる群から選択され；および／または、電解質が、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
冷臓器保存液がユーロコリンズ液（ＥＣ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
冷臓器保存液が、少なくとも１種類のコロイド物質、少なくとも１種類の代謝物質、少なくとも１種類のアミノ酸、少なくとも１種類の酸化防止剤、少なくとも１種類のビタミン、および／または、少なくとも１種類の抗生物質をさらに含んでなる、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
不浸透剤が、ラクトビオン酸塩、ラフィノースおよび両方の組合せからなる群から選択される、請求項１３、１４または１６に記載の方法。
【請求項１８】
コロイド物質が、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコールまたは両方の組合せからなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
冷臓器保存液がウィスコンシン大学液（ＵＷ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
カルジオトロフィン−１がヒト由来のものである、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト由来のカルジオトロフィン−１が配列番号１のものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
カルジオトロフィン−１が、０．０１ｍｇ／ｌ〜０．５０ｍｇ／ｌの間の濃度である、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
移植のための冷臓器保護および／または保存用組成物の調製のための、カルジオトロフィン−１またはその機能的に同等の変種の使用。
【請求項２４】
移植のための冷臓器保護および／または保存のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２５】
移植用臓器が単離されている、請求項２４に記載の組成物の使用。
【請求項２６】
移植用臓器が腎臓である、請求項２４または２５に記載の組成物の使用。
【請求項２７】
移植用臓器が肺である、請求項２４または２５に記載の組成物の使用。
【請求項２８】
移植用臓器が心臓である、請求項２４または２５に記載の組成物の使用。
【請求項２９】
移植のための冷臓器保護および／または保存における使用のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の冷臓器保存組成物。
【請求項３０】
前記冷保護および／または保存が、ドナーにおけるin vivo灌流によって行われる、請求項２９に記載の使用のための組成物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の使用のための組成物であって、ドナーからの摘出後に、さらに、移植用臓器が該組成物への浸漬に付される、組成物。
【請求項３２】
前記冷保護および／または保存が、ドナーから単離臓器の灌流によって行われる、請求項２９または３０に記載の使用のための組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の使用のための組成物であって、単離臓器の灌流後に、さらに、前記移植用臓器が該組成物への浸漬に付される、組成物。
【請求項３４】
臓器の冷保存方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物と該臓器を接触させることを含んでなる、方法。
【請求項３５】
臓器が単離されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、洗浄、浸漬、灌流またはそれらの組合せによって臓器と接触する、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が、ドナーにおけるin vivo灌流によって臓器と接触する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物でin vivo灌流された臓器が、摘出後に請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物中で浸漬した状態で維持されない、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物が、ドナーにおける灌流によって、および、摘出後の浸漬によって臓器と接触する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
臓器がドナーから単離されている場合、前記組成物が、灌流によって該臓器と接触する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
単離臓器の灌流後に、さらに、該移植用臓器が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物中で浸漬した状態で維持されない、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
単離臓器の灌流後に、さらに、該移植用臓器が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物中の浸漬した状態で維持される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
臓器が死亡ドナーから得られたものである、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物が、死亡ドナーにおける灌流によって臓器と接触する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物で灌流された臓器が、摘出後に、請求項１〜１１に記載の組成物中で浸漬した状態で維持されない、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記組成物が、死亡ドナーにおける灌流によって、および、摘出後の浸漬によって臓器と接触する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記組成物が、灌流によって、および、該灌流後は浸漬によって、死亡ドナーから摘出された単離臓器と接触する、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記組成物が、灌流によって、死亡ドナーから摘出された単離臓器と接触しており、該灌流後に、請求項１〜１１に記載の組成物中で浸漬した状態で維持されない、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４９】
冷臓器保存組成物が０℃〜２５℃の間の温度である、請求項３４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
冷臓器保存組成物がおよそ４℃の温度である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
臓器が腎臓である、請求項３４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
臓器が肺である、請求項３４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
臓器が心臓である、請求項３４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
請求項３４〜５３のいずれか一項に記載の方法によって得られる、冷保存された単離臓器。
【請求項５５】
腎臓である、請求項５４に記載の臓器。
【請求項５６】
肺である、請求項５４に記載の臓器。
【請求項５７】
心臓である、請求項５４に記載の臓器。
【請求項５８】
冷臓器保存組成物の調製のためのキットであって、
（ｉ）カルジオトロフィン−１またはその機能的に同等の変種、および
（ｉｉ）冷臓器保存液、あるいは、該溶液の調製のための媒質および添加剤
を含んでなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植のための冷臓器保存組成物、ならびにその調製のための使用、調製方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器移植は、心臓、肺、膵臓、腸（結腸）、特に、腎臓および肝臓などの臓器に広く用いられている。臓器の需要の増大と、ドナーの不足によって、待機リストは増大し、最適以下のドナーの臓器を使用する必要性が高まってきている。
【０００３】
移植のために得られた臓器は、貯蔵し、病院間を輸送しなければならない。ドナーとレシピエントとの組織適合性を検査し、レシピエント患者を準備するには時間を要する。臓器および組織を体外で維持し得る時間は、臓器、ドナーの年齢および健康状態、保存方法および温度に応じて異なる。
【０００４】
現在、提供された臓器の生存期間を延長させるために臨床現場において用いられている標準的な技術は、特殊な保存液を用いた冷貯蔵または冷保存である。これらの保存液は、第１段階において、摘出前に、臓器を４℃に維持しながらドナーの血液を除去し置き換えるように設計された臓器の灌流（洗浄）に用いられる。第２段階において、冷保存液は、摘出された臓器を移植まで、この場合も低温（約４℃）下で、貯蔵し保存するために用いられる。冷保存の目的は、代謝の抑制によって臓器を保存することであり、第２には、冷虚血が原因で起こる可能性がある変化を防ぎ最小限に抑えることである。
【０００５】
Maathuis et al. (Transplantation, 2007; 83: 1289-1298)には、冷保存液についての最近の総説が提供されており、それには、一般的要件、ならびにユーロコリンズ(Euro-Collins)液（ＥＣ）、Marshallの高張クエン酸溶液（ＨＯＣ）、スクロースリン酸バッファー、ウィスコンシン大学(University of Wisconsin)液（ＵＷ）、ヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸（ＨＴＫ）液、セルシオ(Celsior)液（ＣＥＬ）、ジョルジロペス研究所（Institut Georges Lopez）液（ＩＧＬ−１）などの多数のものの組成および特性が開示されている。これらの冷保存液の一部については、腎臓(Ahmad et al. Kidney International 2006;69: 884-893)、心臓(Michel et al. J. Heart Lung Transplant 2002; 21: 1030-1039)、肝臓(El-Wahsh M. Hepatobiliary Pancreat Dis Int 2007; 6: 12-16)および腸(Wei et al. Gastroenterology 2007; 13: 3684-3691)の保存に関する有効性の比較研究がある。
【０００６】
最も一般的に用いられる冷保存液は、特に肝臓および腎臓にはウィスコンシン大学液であり；心臓の保存にはセルシオ液であり；肺の保存にはユーロコリンズまたはペルファデックス（Ｐｅｒｆａｄｅｘ）である。灌流装置のために、これらは改良され、例えば、ＵＷ−グルコン酸塩（Ｂｅｌｚｅｒ  ＭＰＳ）に改良されている。
【０００７】
米国特許第４７９８８２４号公報には、グルコン酸塩およびヒドロキシエチルデンプンを含んでなる冷保存液が開示されている。米国特許第４８７９２８３号公報には、次の特異的成分：細胞腫脹を軽減するように設計された不浸透剤としての、ラクトビオン酸塩およびラフィノース；ならびに浮腫を予防するためのヒドロキシエチルデンプンを含んでなる、ウィスコンシン大学液（ＵＷまたはＢｅｌｚｅｒ液）が開示されている。
【０００８】
しかしながら、現行の保存液を用いた冷保存には重大な制限がある。冷保存に起因する組織損傷および炎症応答は、免疫原性を増加させ、臓器の拒絶反応を開始させる可能性がある。そのため、例えば、拒絶反応を示す腎臓移植の実験モデルでは、冷虚血が腎不全および促進型急性拒絶反応による死亡率増加の一因となった(Salahudeen AK. Am J Physiol Renal Physiol. 2004; 287: F181-F187; Herrero-Fresneda et al. Transplant Proc. 2005; 37: 3712-3715)。
【０００９】
冷虚血は、浸透圧調節、エネルギーおよび好気性代謝の変化と関係している。Ｎａ−Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性およびＡＴＰレベルの低下によって、ナトリウムおよび水の細胞内蓄積がなされ、その結果、細胞腫脹が起こる。さらに、グルコース代謝により生じた乳酸によって、リソソームの不安定化およびミトコンドリア機能の変化に至り、腫脹、ミトコンドリアアポトーシス経路の活性化およびフリーラジカルの産生が起こる。
【００１０】
一方、移植が行われると、既に受けた冷虚血から感受性が高くなっていると考えられる臓器の再灌流に起因して、新たな損傷が加わる。この損傷過程には以下が関与している：反応性酸素フリーラジカル、炎症応答および細胞質カルシウムの増加、ならびにタンパク質分解酵素、例えば、カスパーゼの活性化。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、技術の現状において、冷保存された臓器の冷虚血および移植後再灌流に関連した損傷を減らすことを可能にする適当な冷臓器保存組成物を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の側面は、
（ｉ）カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）またはその機能的に同等の変種、および
（ｉｉ）冷臓器保存液
を、一緒にまたは別々に、含んでなる冷臓器保存組成物に関する。
【００１３】
本発明の別の側面は、冷臓器保存組成物を調製する方法であって、カルジオトロフィン−１またはその機能的に同等の変種を冷臓器保存液に加えることを含んでなる方法に関する。
【００１４】
本発明の別の側面は、移植のための冷臓器保護および／または保存用組成物の調製のためのカルジオトロフィン−１またはその機能的に同等の変種の使用に関する。
【００１５】
本発明のさらに別の側面は、移植のための冷臓器保護および／または保存に用いる、本発明による組成物の使用に関する。
【００１６】
本発明の別の側面は、移植のための冷臓器保護および／または保存における使用のための、本発明による冷臓器保存組成物に関する。
【００１７】
本発明の別の側面はまた、臓器の冷保存方法であって、本発明による組成物と該臓器を接触させることを含んでなる方法にも関する。
【００１８】
本発明の別の側面は、本発明の方法によって得られる冷保存された単離臓器に関する。
【００１９】
本発明の最後の側面は、冷臓器保存組成物の調製のために設計されたキットであって、
（ｉ）カルジオトロフィン−１またはその機能的に同等の変種、および
（ｉｉ）冷臓器保存液、あるいは、該保存液の調製のための媒質および添加剤
を含んでなるキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ユーロコリンズ液（ＥＣ）および０．１ｍｇ／ｌのＣＴ−１を含有するユーロコリンズ液（ＥＣ［ＣＴ１］）を用いた異なる時間（ｔ）（時間で表す）の冷保存（４℃）の、ウィスター系ラット腎臓に対する影響の比較研究。ラット模擬群も含めた（Ｓｉｍ）。ｎ＝５（１群当たりの動物数）。Ａ）スーパーオキシドアニオンフリーラジカルの腎レベル（ＳＯＡ）（ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質／分で表す）。Ｂ）腫瘍壊死因子αの腎レベル（ＴＮＦα）（ｐｇ／ｍｌで表す）。Ｃ）誘導型一酸化窒素合成酵素の腎レベル（ｉＮＯＳ）（任意単位で表す）。Ｄ）腎ＩκＢレベルによって測定したＮＦκＢ転写因子の活性化（ＩκＢ）（任意単位で表す）。
【図２】ウィスコンシン大学液（ＵＷ）および０．１ｍｇ／ｌのＣＴ−１を含有するウィスコンシン大学液（ＵＷ［ＣＴ１］）を用いた異なる時間（ｔ）（時間で表す）の冷保存（４℃）の、ウィンスター系ラット腎臓に対する影響の比較研究。ラット模擬群（Ｓｉｍ）も含めた。ｎ＝５（１群当たりの動物数）。Ａ）スーパーオキシドアニオンフリーラジカルの腎レベル（ＳＯＡ）（ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質／分で表す）。Ｂ）腫瘍壊死因子αの腎レベル（ＴＮＦα）（ｐｇ／ｍｌで表す）。Ｃ）誘導型一酸化窒素合成酵素の腎レベル（ｉＮＯＳ）（任意単位で表す）。Ｄ）腎ＩκＢレベルによって測定したＮＦκＢ転写因子の活性化（ＩκＢ）（任意単位で表す）。
【図３】ウィスコンシン大学液（ＵＷ）および０．２ｍｇ／ｌのＣＴ−１を含有するウィスコンシン大学液（ＵＷ［ＣＴ１］）を用いた異なる保存時間（ｔ）：３０分（３０’）、６時間、２４時間および４８時間の冷保存（４℃）の、ウィンスター系ラット腎臓に対する影響の比較研究。ラット模擬群も含めた（Ｓｉｍ）。ｎ＝５（１群当たりの動物数）。Ａ）スーパーオキシドアニオンの腎レベル（ＳＯＡ）（ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質／分で表す）。Ｂ）腫瘍壊死因子αの腎レベル（ＴＮＦα）（ｐｇ／ｍｌで表す）。Ｃ）誘導型一酸化窒素合成酵素の腎レベル（ｉＮＯＳ）（任意単位で表す）。Ｄ）転写因子の活性化。ｐ６５タンパク質または腎ＮＦκＢのレベル（ＮＦκＢ）（任意単位で表す）。Ｅ）Ｓｅｒ３１１リン酸化ｐ６５タンパク質の腎レベル（ｐＮＦκＢ）。Ｆ）ＶＣＡＭ−１血管接着分子の腎レベル（ＶＣＡＭ−１）。
【図４】同種正所性腎臓移植のラット実験モデルでの、０．１ｍｇ／ｌのＣＴ−１を含有するＵＷ液（ＵＷ［ＣＴ１］）およびウィスコンシン大学液（ＵＷ）（対照として使用）を用いた冷保存の腎臓に対する影響の研究。異なる群についての事前設定再灌流時間は、それぞれ、ｔ（ｄ）：１、３、７および１４（単位：日）であった。ラット模擬群も含めた（Ｓｉｍ）。ｎ＞１５（１群当たりの移植数）。Ａ）生存（全体に対する生体ラットの割合％として表す）。Ｂ）血清クレアチニンレベル（ＣＲＥＡＴ）（ｍｇ／ｄｌで表す）。Ｃ）クレアチニンクリアランスレベル（ＣＲＣＬ）（相対単位で表す）。Ｄ）スーパーオキシドアニオンフリーラジカルの腎レベル（ＳＯＡ）（ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質／分で表す）。Ｅ）腫瘍壊死因子αの腎レベル（ＴＮＦα）（ｐｇ／ｍｌで表す）。Ｆ）インターロイキン−６の腎レベル（ＩＬ−６）（ｐｇ／ｍｌで表す）。Ｇ）腎ＩκＢレベルによって測定したＮＦκＢ転写因子の活性化（ＩκＢ）（任意単位で表す）。Ｈ）可溶型ＩＣＡＭ−１接着分子のレベル（ｓＩＣＡＭ−１）。Ｉ）可溶型ＶＣＡＭ−１接着分子のレベル（ｓＶＣＡＭ−１）。
【図５】ウィスコンシン大学液（Ｓ／ＣＴ−１）および０．２ｍｇ／ＬのＣＴ−１を含有するウィスコンシン大学液（Ｃ／ＣＴ−１）を用いた異なる時間（時間で表す）の冷保存（４℃）のウィンスター系ラット肺に対する影響の比較研究。ｎ＝５（１群当たりの動物数）。Ａ）誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）組織レベル（任意単位で表す）。＊ｐ＜０．０５（ＣＴ−１含有または不含の０群との比較）。Ｂ）ｐ６５またはＮＦκＢ（ｐ６５  ＮＦκＢ）タンパク質組織レベル（任意単位で表す）。＊ｐ＜０．０５（ＣＴ−１含有または不含の０群との比較）。Ｃ）Ｓｅｒ３１１リン酸化ｐ６５タンパク質（ｐＮＦκＢ）の組織レベルによって測定したＮＦκＢ転写因子の活性化（任意単位で表す）。＊ｐ＜０．０５（ＣＴ−１含有または不含の０群との比較、および、ＣＴ−１含有の４８時間群との比較）。Ｄ）スーパーオキシドアニオン（ＳＯＡ）フリーラジカル組織レベル（ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質／分で表す）。＊ｐ＜０．０５（ＣＴ−１含有の０群、２４時間群および４８時間群との比較、およびＣＴ−１不含の０群との比較）。
【図６】ウィスコンシン大学液（Ｓ／ＣＴ−１）および０．２ｍｇ／ＬのＣＴ−１を含有するウィスコンシン大学液（Ｃ／ＣＴ−１）を用いた異なる時間（時間で表す）の冷保存（４℃）のウィンスター系ラット心臓に対する影響の比較研究。ｎ＝５（１群当たりの動物数）。Ａ）誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）組織レベル（任意単位で表す）。Ｂ）ｐ６５  ＮＦκＢ組織レベルによって測定したＮＦκＢ転写因子の活性化（任意単位で表す）。Ｃ）チューブリンによって補正した可溶性ＩＣＡＭ−１接着分子（ｓＩＣＡＭ−１）組織レベル（任意単位で表す）。Ｄ）スーパーオキシドアニオン（ＳＯＡ）フリーラジカル組織レベル（ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質／分で表す）。＊ｐ＜０．０５（ＣＴ−１含有の０群、２４および４８ｈとの比較、および、ＣＴ−１不含の０群との比較）。＆ｐ＜０．０５（ＣＴ−１含有の０群、２４時間群および４８時間群との比較、および、ＣＴ−１不含の０群との比較）。
【図７】Ｗｉｓｔａｒラット心肺ブロックにおける、保存液中の腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）濃度（ｐｇ／ｍＬで表す）に対する、ウィスコンシン大学液（Ｓ／ＣＴ−１）および０．２ｍｇ／ＬのＣＴ−１を含有するウィスコンシン大学液（Ｃ／ＣＴ−１）中での異なる時間（時間で表す）の冷保存（４℃）の影響の比較研究。ｎ＝５（１群当たりの動物数）。
【図８】Ｗｉｓｔａｒラット腎臓における、保存液中のみ（Ｐ）、洗浄液中のみ（Ｗ）または保存液中にも洗浄液中にも（Ｐ＋Ｗ）０．２ｍｇ／ＬのＣＴ−１を含有するウィスコンシン大学（ＵＷ）液の２４時間および４８時間の冷保存（４℃）の影響の比較研究。ｎ＝５（１群当たりの動物数）。Ａ）およびＧ）：２４時間および４８時間の各時点における、スーパーオキシドアニオン（ＳＯＡ）フリーラジカル腎レベル（ｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質／分で表す）。Ｂ）およびＨ）：２４時間および４８時間の各時点における、保存液中の腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）濃度（ｐｇ／ｍＬで表す）。Ｃ）およびＩ）：２４時間および４８時間の各時点における、チューブリンによって補正した誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）腎レベル（任意単位で表す）。Ｄ）およびＪ）：２４時間および４８時間の各時点における、チューブリンによって補正した可溶性ＩＣＡＭ−１接着分子（ＩＣＡＭ−１）腎レベル（任意単位で表す）。Ｅ）およびＫ）：２４時間および４８時間の各時点における、ＩκＢ（ＩκＢ）組織レベルとして測定した、チューブリンによって補正したＮＦκＢ転写因子の腎における活性化（任意単位で表す）。Ｆ）およびＬ）：２４時間および４８時間の各時点における、チューブリンによって補正したＳｅｒ３１１リン酸化ｐ６５タンパク質（ｐｈｏｓｐｈｏｐ６５）組織レベルとして測定した腎ＮＦκＢ転写因子の活性化（任意単位で表す）。任意単位（ＡＵ）。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
本発明の著者らは、驚くべきことに、冷臓器保存液にカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）を添加することによって、（とりわけ、腎臓、肺および心臓用に）適当な冷臓器保存組成物を得ることが可能になり、その組成物が該臓器における冷虚血および移植後再灌流に関連した損傷を減らすものであることに気がついた。該効果は、本発明の組成物の、
・酸素フリーラジカルの産生を減少させることによって生じる酸化的ストレスを減らす能力（図１Ａ、図２Ａ、図５Ｄおよび図６Ｄ）；
・炎症誘発性シグナル伝達経路（ＮＦκＢ）の活性化を防止すること（図１Ｄおよび図２Ｄ）、炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ｉＮＯＳ、ＩＬ−６）（図１Ｂ〜Ｃ、図２Ｂ〜Ｃ、図４Ｆ、図５Ａおよび図７）および炎症誘発性接着分子（ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１）（図３Ｆおよび図４Ｈ〜Ｉ）の産生を減少させることによって、炎症応答の活性化を低下させる能力
に依存している。
【００２２】
本発明の別の目的は、実質臓器移植の実現性および生存率を向上させる、移植に適当な冷臓器保存組成物を提供することである。
【００２３】
本発明の著者らは、さらに、本発明の組成物は、虚血−再灌流によって引き起こされる尿細管壊死を防ぎ、それによって腎機能（血清クレアチニンレベルの低下およびクレアチニンクリアランスの増加）および生存率を改善する（図４）ことから、移植用の腎臓の冷保存に適していることを実証した。
【００２４】
本発明の組成物
よって、本発明の第１の側面は、
（ｉ）カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）またはその機能的に同等の変種、および
（ｉｉ）冷臓器保存液
を、一緒にまたは別々に、含んでなる冷臓器保存組成物に関する。
【００２５】
本明細書において用いる「冷臓器保存組成物」または「冷臓器保存のために設計された組成物」という用語は、カルジオトロフィン−１（またはその機能的に同等の変種）および冷臓器保存液を含む、液体組成物（好ましくは滅菌した）を指す。該組成物では、ＣＴ−１（またはその機能的に同等の変種）は、一緒に使用するために単一処方物を構成し、冷臓器保存液中に分散されていてよい。あるいは、本発明の組成物が、別々に処方された２つの成分、（ｉ）および（ｉｉ）を含んでなる可能性も考えられ、この場合には、その投与前に混ぜ合わせる必要がある。
【００２６】
本発明による組成物は冷臓器保存に適した組成物である。「冷臓器保存」とは、低温条件下で臓器を保全、保護、保存および／または貯蔵して、代謝の抑制をもたらしかつ冷虚血により該臓器において起こり得る変化を防止または減殺する物質を用いることによって、該臓器における細胞損傷を最小限に抑える能力を意味すると理解される。本発明において、カルジオトロフィン−１および冷臓器保存液は冷臓器保存に適した物質である。
【００２７】
本発明において用いる「カルジオトロフィン−１」または「ＣＴ−１」という用語は、少なくともｇｐ１３０／ＬＩＦＲβヘテロ二量体からなるＬＩＦＲ受容体複合体によって媒介されるシグナル伝達を、結合し活性化することができるインターロイキン−６ファミリーに属するサイトカインを指す。本発明において、「ＣＴ−１」とは、ヒトカルジオトロフィンのアイソフォーム１に相当する、受託番号ＮＰ＿００１３２１．１のＮＣＢＩデータベース配列によって定義されているタンパク質（配列番号１の配列に相当する）；またはヒトカルジオトロフィンのアイソフォーム２に相当する、受託番号ＮＰ＿００１１３６０１６．１のＮＣＢＩデータベース配列によって定義されているタンパク質を意味すると理解される。好ましい実施形態では、ＣＴ−１は、ヒト由来のＣＴ−１であり、好ましくは配列番号１の配列を有するものである。
【化１】
2013526600.tif 000002
【００２８】
本発明では、ＣＴ−１の機能的に同等の変種の使用を考慮に入れている。本明細書において用いる「ＣＴ−１の機能的に同等の変種」とは、ＣＴ−１と関連があることを本発明において記載している機能の１つ以上を、in vitroおよびin vivoの両方で共有し、アミノ酸配列において最低限の同一性を示す任意の分子を意味すると理解される。ＣＴ−１の変種は、自然のものであってよくまたは人工的なものであってもよい。
【００２９】
「自然変種」という表現は、他の種において自然発生する、上に述べた、ヒトＣＴ−１の総ての変種、すなわち、ＣＴ−１のオーソログを指す。該自然変種としては、限定されるものではないが、マウスＣＴ−１（ＮＣＢＩデータベースにおける受託番号Ｑ５４１Ｕ３／Ｑ６０７５３の配列）または１９６アミノ酸のアイソフォーム（ＮＣＢＩデータベースにおける受託番号Ｐ８３７１４の配列に相当する）；ラットＣＴ−１（受託番号Ｑ６３０８６の配列に相当する）；マカクザルＣＴ−１（受託番号ＸＰ＿００１１０３３１５の予測配列に相当する）；イヌＣＴ−１（受託番号ＸＰ＿８４９０７２の予測配列に相当する）；ウマＣＴ−１（受託番号ＸＰ＿００１９１５４５７の予測配列に相当する）；ウシ由来のＣＴ−１（受託番号ＸＰ＿５９２７０９の予測配列に相当する）；およびチンパンジーＣＴ−１（受託番号ＸＰ＿５９２７０９の予測配列に相当する）が挙げられる。本発明における使用に適したＣＴ−１の自然変種は、前記配列から、１個以上のアミノ酸を挿入、置換または欠失していてもよく、それらには、天然対立遺伝子（例えば、ヒトＣＴ−１の変種Ａ９２Ｔなど）、選択的プロセシングの結果として生じる変種、ならびに自然発生する分泌型および末端切断型が含まれる。
【００３０】
従って、本発明において有用なＣＴ−１は、天然配列を有していてよく、その場合、それは自然界から得られるＣＴ−１と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。そのような天然配列のポリペプチドは、自然界から単離され得るしまたは組換え手法および／または合成手法によって生産され得る。よって、本発明のＣＴ−１は、異種生物、例えば、細菌、酵母または昆虫または哺乳類の細胞などにおいてＣＴ−１またはその機能的に同等の変種をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって得られる組換えタンパク質であり得る。該組換えタンパク質は、その後の精製を容易にするアミノ末端のヒスチジンテールを有する融合タンパク質として得てもよい。該タンパク質の発現および精製は、当業者に公知の、技術の現状において記載されている方法に従って行われ得る。
【００３１】
好ましい実施形態では、ＣＴ−１はヒト由来のものであり、配列番号１の配列に相当する。別の好ましい実施形態では、ＣＴ−１はラット由来のものであり、好ましくは、アミノ末端のヒスチジンテールを有する融合タンパク質であり、より好ましくは、配列番号２である。
【化２】
2013526600.tif 000003
【００３２】
あるいは、ＣＴ−１は、ＣＴ−１の機能的に同等の人工変種であってよく、それは組換え手法および／または合成手法によって得られ得る。
【００３３】
本発明において考慮に入れるＣＴ−１の変種は、少なくとも、ＣＴ−１の機能の１つを示し、そのような機能は、例えば、限定されるものではないが、以下などである：
・酸素フリーラジカルの産生を減少させる能力（この能力は、技術の現状において記載されている方法、例えば、本発明の材料および方法の節に示す方法などによって決定され得る）。
・炎症誘発性シグナル伝達経路（ＮＦｋＢ）の活性化を防止する能力（この能力は、本発明の材料および方法の節に示すとおり、ウエスタンブロットによって決定され得る）。
・炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ｉＮＯＳ、ＩＬ−６）の産生を減少させる能力（この能力は、本発明の材料および方法の節に記載する方法によって決定され得る）。
・炎症誘発性接着分子（ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１）の産生を減少させる能力（この能力は、本発明の材料および方法の節に記載するとおり、ウエスタンブロットによって決定され得る）。
・組織損傷を減少させ、その結果として、腎機能を保護する能力（腎機能は、（上昇しない）血清クレアチニンレベルによっておよび（減少しない）クレアチニンクリアランスによって決定される）。これらのパラメーターの決定に適した方法は、本発明の材料および方法の節において記載する。
【００３４】
さらに、本発明の関連の中で考えられるＣＴ−１の機能的に同等の変種としては、上に述べた、ＣＴ−１の様々な自然変種と少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の類似性または同一性を示すポリペプチドが挙げられる。
【００３５】
２つのポリペプチド間の同一性の程度は、当業者に広く知られている、コンピュータにより実行されるアルゴリズムおよび方法を用いることによって決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて決定される(BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J., 1990, Mol. Biol. 215: 403-410)。
【００３６】
本発明による組成物のカルジオトロフィン−１は、薬理学上有効な濃度で含まれる。「薬理学上有効な濃度」とは、ＣＴ−１に起因する、上に列挙した効果の１以上をもたらすことが可能な濃度を意味すると理解され、その濃度は、本明細書において説明する方法に基づき、標準的な技術よって決定され得る。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、カルジオトロフィン−１は、０．００１ｇ／ｌ〜５．０００ｇ／ｌの間；好ましくは、０．００５ｇ／ｌ〜１．０００ｇ／ｌの間；より好ましくは、０．０１０ｇ／ｌ〜０．５００ｇ／ｌの間；さらに好ましくは、０．０８ｇ／ｌ〜０．２０ｇ／ｌの間；さらに好ましくは、０．１ｇ／Ｌ〜０．２ｇ／Ｌの間の濃度で含まれる。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、カルジオトロフィン−１は、０．００１ｍｇ／ｌ〜５．０００ｍｇ／ｌの間；好ましくは、０．００５ｍｇ／ｌ〜１．０００ｍｇ／ｌの間；より好ましくは、０．０１０ｍｇ／ｌ〜０．５００ｍｇ／ｌの間；さらに好ましくは、０．０８ｍｇ／ｌ〜０．２０ｍｇ／ｌの間；さらに好ましくは、０．１ｍｇ／Ｌ〜０．２ｍｇ／Ｌの間の濃度で含まれる。
【００３９】
本発明において、「冷臓器保存液」または「冷臓器保全液」という表現は、レシピエント対象者への移植を待つ間の冷虚血プロセスで、さらに移植時の再灌流プロセス中に臓器においてもたらされる損傷を最小限に抑える物質を含有する、低温条件下で移植用臓器を保全、保存および貯蔵するのに適当な溶液を指す。該溶液は、代謝の抑制をもたらすことおよび冷虚血自体が引き起こし得る変化を防止し最小限に抑えることによって、臓器保全および保存効果を達成する。
【００４０】
これらの冷臓器保存液は、低温条件下で保護特性を示す。「低温条件」とは、０℃〜２５℃の間の、生理的温度より低い温度を意味すると理解される。本発明の実施形態では、本発明の冷臓器保存液および冷臓器保存組成物は、０℃〜２５℃の間；好ましくは、０℃〜１５℃の間；より好ましくは、２℃〜７℃の間；さらに好ましくは、およそ４℃の温度である。
【００４１】
本発明において、「冷虚血」とは、冷条件下での保存が原因で、すなわち、曝された低温状態によって臓器において起こる組織損傷および炎症応答を意味すると理解される。
【００４２】
本発明の関連の中で、「再灌流」という用語は、冷虚血期間後の臓器における血流の回復を指す。
【００４３】
本発明において、「代謝の抑制」とは、臓器の代謝活動および機能を停止または最低限度まで低下させる作用を意味すると理解される。
【００４４】
本発明の、冷臓器保存液、さらには、組成物は、例えば、限定されるものではないが、哺乳類（霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、齧歯類、ウサギなど）、鳥類などの任意の種、好ましくは、ヒト由来、の実質臓器、例えば、心臓、肺、膵臓、小腸、結腸、腎臓などを保存することを可能にするものである。そのような臓器は、生体ドナーからまたは死体から得たものであってよい。本発明の関連の中で、本発明の、冷臓器保存液、さらには、組成物は、移植用の腎臓の冷保存にとりわけ適している。
【００４５】
典型的には、前記冷臓器保存液は
（ａ）少なくとも１種類の緩衝剤、
（ｂ）少なくとも１種類の不浸透剤または不浸透化剤、および
（ｃ）少なくとも１種類の電解質
を含んでなる。
【００４６】
好ましい実施形態では、前記冷臓器保存液は、ｐＨが６．５〜８．５の間であり、かつ、オスモル濃度が３００〜４１０ｍＯｓｍ／ｌの間のものである（両パラメーターは２０℃で測定されたものである）。
【００４７】
本発明の関連の中で、「緩衝剤」とは、溶液のｐＨを制御することによって、臓器に対する虚血性損傷の一因となり得る重篤なアシドーシスを防止することが可能な薬剤を意味すると理解される。本発明に適した緩衝剤は、リン酸塩（一酸および二酸）、重炭酸塩、硫酸塩、ヒスチジン、ヒスチジン−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩およびそれらの組合せである。特定の実施形態では、前記冷臓器保存液は、リン酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、ヒスチジン、ヒスチジン−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩およびそれらの組合せからなる群から選択される緩衝剤を含んでなる。本発明の好ましい実施形態では、前記保存液は、緩衝剤として、一酸のリン酸塩および／または二酸のリン酸塩および／またはヒスチジン−ＨＣｌを含んでなる。
【００４８】
「不浸透剤」および「不浸透化剤」という用語は、本発明において同義的に用いられ、浸透圧への影響が高く、また細胞膜に対して比較的不透過性である薬剤を指し、この薬剤は、細胞内への水の浸入を防止することによって細胞外の浸透圧を維持することが可能であり、その結果として、細胞腫脹を防止および／または軽減する。本発明に適した不浸透剤または不浸透化剤は、ヒスチジン、グルコース、スクロース、マンニトール、トレハロース、グルコン酸塩、クエン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラフィノースおよびそれらの組合せ、例えば、ラクトビオン酸塩およびラフィノース；ラクトビオン酸塩およびマンニトール；トレハロースおよびグルコン酸塩；グルコン酸塩およびグルコース；グルコン酸塩およびラフィノース；マンニトールおよびクエン酸塩；マンニトールおよびヒスチジン；ラクトビオン酸塩、マンニトールおよびヒスチジン、の組合せなどである。本発明の特定の実施形態では、前記冷臓器保存液は、ヒスチジン、グルコース、スクロース、マンニトール、トレハロース、グルコン酸塩、クエン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラフィノースおよびそれらの組合せからなる群から選択される不浸透剤または不浸透化剤、好ましくは、ラクトビオン酸塩、ラフィノース、マンニトールおよびそれらの組合せから選択される、不浸透剤または不浸透化剤を含んでなり；より好ましくは、前記冷臓器保存液はラクトビオン酸塩およびマンニトールを含んでなり；さらに好ましくは、前記冷臓器保存液はラクトビオン酸塩およびラフィノースを含んでなり；最も好ましくは、前記冷臓器保存液はラクトビオン酸塩を含んでなる。
【００４９】
より好ましい実施形態では、前記冷臓器保存液は、ラクトビオン酸塩、ラフィノースおよび両方の組合せからなる群から選択される不浸透剤を含んでなる。
【００５０】
「電解質」とは、導電媒質として働く、遊離イオン、一般的には、溶解イオンを含む任意の物質であると理解される。本発明における使用に適した電解質は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物およびそれらの組合せである。本発明の特定の実施形態では、前記冷臓器保存液は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物およびそれらの組合せからなる群から選択される電解質を含んでなる。
【００５１】
本発明の別の好ましい実施形態では、前記冷臓器保存液は、不浸透剤または不浸透化剤としてグルコースを含んでなり、好ましくは、前記冷臓器保存液はユーロコリンズ液（ＥＣ）である。本発明において用いる「ユーロコリンズ液」という表現は、高濃度のグルコースおよびカリウムと低濃度のナトリウムを含んでなる細胞内冷臓器保存液を指す。ユーロコリンズ液は、１９６９年にG.M. Collinsによって最初に報告され(Collins GM et al., 1969, Lancet, 2: 1219)、１９７６年にユーロトランスプラント財団(Eurotransplant Foundation)によって、マグネシウムを排除して改良された(Annual Report Eurotransplant International Foundation. Leiden, The Netherlands: Eurotransplant International Foundation, 1976)。ユーロコリンズ液は、不浸透剤としてグルコースを；電解質として塩素、カリウムおよびナトリウムを；緩衝剤としてＫ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４およびＮａＨＣＯ３を含む。ユーロコリンズ液の典型的な組成は以下であり得る：１９５ｍＭグルコース、１５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、４３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１５ｍＭ塩化物、１１５ｍＭカリウムおよび１０ｍＭナトリウム。しかしながら、該組成は異なっていることもあり；そのため、本発明の関連の中で、ユーロコリンズ液は、文献においてそのようなものとして分類されているまたはその名前で市販されている任意の溶液であると考えられるであろう。
【００５２】
本発明の特定の実施形態では、前記冷臓器保存液は、成分（ａ）が、リン酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、ヒスチジン、ヒスチジン−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩およびそれらの組合せからなる群から選択され；成分（ｂ）が、ヒスチジン、グルコース、スクロース、マンニトール、トレハロース、グルコン酸塩、クエン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラフィノースおよびそれらの組合せからなる群から選択され；および／または、成分（ｃ）が、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物およびそれらの組合せからなる群から選択される、溶液である。
【００５３】
本発明の冷臓器保存液を特徴付けるパラメーターはｐＨおよびオスモル濃度である。
【００５４】
「ｐＨ」という用語は、溶液の酸度またはアルカリ度の尺度を指す。ｐＨは、典型的には、水溶液中で０〜１４であり、ｐＨが７より低い溶液は酸性であり、ｐＨが７より高い溶液はアルカリ性である。溶媒が水である場合には、ｐＨ＝７は溶液が中性であることを示す。溶液のｐＨは、技術の現状において広く知られている方法を用いて、電位差計（またはｐＨメーター）によって正確に決定し得るし、指示薬によって近似決定し得る。ｐＨ値は温度によって異なり得るため、本発明の関連の中で、ｐＨは２０℃で測定している。本発明の冷保存液は、２０℃で測定されるｐＨが６．５〜８．５の間；好ましくは、７．０〜７．５の間である。
【００５５】
本発明の関連の中で、「オスモル濃度」という用語は、溶液１リットル当たりの溶質のオスモル数として定義される、溶液中の物質の総濃度の尺度であり、溶液を体内に導入したときに細胞内で起こる浸透圧の潜在的変化を示す。オスモル濃度は、オスモル濃度値から計算し得、オスモル濃度値は当業者に公知の方法を用いて浸透圧計によって測定される。オスモル濃度は温度に依存するため、本発明の関連の中で、オスモル濃度は２０℃で計算している。２０℃で測定される、本発明の冷臓器保存液のオスモル濃度は、３００〜４１０ｍＯｓｍ／ｌの間；好ましくは、３１０〜３９０ｍＯｓｍ／ｌの間；より好ましくは、３２０〜３６０ｍＯｓｍ／ｌの間である。
【００５６】
前記冷臓器保存液は他の成分をさらに含んでよい。本発明の特定の実施形態では、前記冷臓器保存液は、少なくとも１種類のコロイド物質、少なくとも１種類の代謝物質、少なくとも１種類のアミノ酸、少なくとも１種類の酸化防止剤、少なくとも１種類のビタミンおよび／または少なくとも１種類の抗生物質をさらに含んでなる。
【００５７】
「コロイド物質」とは、溶解せずに液体中に浮遊している多数の小粒子によって構成された物質であり、半透膜を通過することができない物質であると理解され、この理由で、コロイド物質は再灌流中の間質腔の膨張を防止するのに有用である。コロイド物質としては、とりわけ、以下を組み込んでよい：ヒドロキシエチルデンプン（ペンタフラクションまたはＨＥＳとしても知られる）、ポリエチレングリコール、デキストランおよびアルブミン。本発明の好ましい実施形態では、コロイド物質はＨＥＳである。本発明の別の好ましい実施形態では、コロイド物質はポリエチレングリコールである。別の、さらに好ましい実施形態では、コロイド物質は、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコールまたは両方の組合せからなる群から選択される。
【００５８】
本発明の関連の中で、「代謝物質」または「代謝基質」とは、エネルギー前駆物質を意味すると理解される。「アミノ酸」とは、アミノ基およびカルボキシル基を有する有機分子を意味すると理解される。本発明の溶液への導入に適した代謝物質およびアミノ酸としては、とりわけ、アデノシン、グルタミン酸塩またはグルタミン酸、グルコース、ケトグルタル酸塩、インスリン、ピルビン酸塩、アスパラギン酸塩およびトリプトファンが挙げられる。
【００５９】
「酸化防止剤」とは、他の分子の酸化を遅延または防止することが可能である、酸素反応種の隔離剤を意味すると理解される。酸化防止剤としては、とりわけ、アロプリノール、グルタチオン、マンニトール、トロロックス、ビタミンＥ、トリプトファン、α−トコフェロールおよび／またはアスコルビン酸が挙げられ得る。
【００６０】
「ビタミン」という用語は、体内で合成されない、補酵素の前駆体である物質を指し、この物質は生化学反応において触媒として関与する。本発明において用い得るビタミンの例は、限定されるものではないが、アスコルビン酸、ビオチン、パントテン酸カルシウム、塩化コリン、イノシトール、エルゴカルシフェロール、葉酸、メナジオン、ニコチンアミド、ニコチン酸、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１２およびビタミンＥである。
【００６１】
「抗生物質」とは、低濃度で、ある特定種の感受性微生物を死滅させるまたはその増殖を防止する、生物によって産生された化学物質またはその合成誘導体を意味すると理解される。本発明において有用な抗生物質の例は、限定されるものではないが、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、ペニシリンなどである。
【００６２】
本発明の冷臓器保存組成物は、他の薬学上許容される成分、すなわち、動物、より特には、ヒトに用いるために、連邦または州政府の監督官庁によって認可を受けているか、あるいは米国薬局方、または別の一般的に認められている薬局方に収載されている成分をさらに含んでよい。これらの薬学上許容される成分としては、限定されるものではないが、前記組成物の投与に用いる、希釈剤、補助剤、賦形剤またはビヒクルが挙げられる。抗凝固剤、例えば、ヘパリンなどもまた挙げられ得る。本発明の好ましい実施形態では、前記組成物はヘパリンナトリウムをさらに含む。
【００６３】
当業者ならば分かるように、これらの成分群の複数の組合せを得ることが可能であり、そのような組合せは前記冷臓器保存液の複数の実施形態へとつながり、それらの総ては、移植のための冷臓器保存に適しており、とりわけ、移植用の腎臓の保存に適している。
【００６４】
前記冷臓器保存液は、所望の成分の添加によって即席で得ることができるが、技術の現状において知られている冷臓器保存液であってもよく、それらの一部は市販されている。用い得る、技術の現状において知られている冷臓器保存液としては、限定されるものではないが、ウィスコンシン大学液（ＵＷ）(Belzer FO and Southard JH. Transplantation, 1988; 45: 673)、ジョルジロペス研究所液（ＩＧＬ−１）(Ben Abdennebi H et al. Transpl Int 2002; 15: 348)、セルシオ液（ＣＥＬ）(Menasche P et al. Eur J Cardiothorac Surg, 1994; 8: 207)、Ｋｙｏｔｏ液（ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ）(Chen F et al. Yonsei Med J, 2004; 45: 1107-1114)、ポリゾール液(Wei L et al. World J Gastroenterol, 2007; 13: 3684-3691)、ブレトシュナイダー（Ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）液またはヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸液（ＨＴＫ）(Bretschneider HJ. Thorac Cardiovasc Surg, 1980; 28: 295)、マーシャル（Marshall）の溶液（ＨＯＣまたは高張クエン酸塩）(Southard JH, Belzer FO. Annu Rev Med 1995; 46: 235)、ユーロコリンズ液（ＥＣ）(Annual Report Eurotransplant International Foundation. Leiden, The Netherlands: Eurotransplant International Foundation, 1976)、スクロースリン酸バッファー(Lam FT et al. Transplantation, 1989; 47: 767)、ペルファデックス（Ｐｅｒｆａｄｅｘ）液(Muller C et al. Transplantation, 1999; 68: 1139-43)、セントトーマス病院（Ｓｔ．  Ｔｈｏｍａｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）液１および２（ＳＴＨ−１、ＳＴＨ−２）(Michel P et al. J Heart Lung Transplant, 2002; 21: 1030-9)、リオン（Ｌｙｏｎ）保存液（ＬＹＰＳ）(Michel P et al. J Heart Lung Transplant, 2000; 19: 1089-1097)またはスタンフォード（Ｓｔａｎｆｏｒｄ）液（ＳＴＦ）(Michel P et al. J Heart Lung Transplant, 2002; 21: 1030-9)が挙げられる。
【００６５】
あるいは、低温灌流装置に適した冷臓器保存液、例えば、上述の溶液またはそれらの改良物、例えば、改良ＵＷ−グルコン酸塩液（Ｂｅｌｚｅｒ  ＭＰＳ）などを用いてもよい。
【００６６】
よって、本発明の好ましい実施形態では、前記冷臓器保存液はラクトビオン酸塩およびＨＥＳを含んでなる。別の実施形態では、本発明の冷保存液はラクトビオン酸塩およびポリエチレングリコールを含んでなる。本発明のさらに別の実施形態では、該冷保存液はラクトビオン酸塩、ラフィノースおよびＨＥＳを含んでなり、特に、該溶液はウィスコンシン大学液（ＵＷ）である。本発明において用いる「ウィスコンシン大学液（ＵＷ）」という表現は、コロイド物質としてＨＥＳを、不浸透剤としてラクトビオン酸塩およびラフィノースを含んでなる冷臓器保存液を指す。典型的には、ウィスコンシン大学液は、少なくとも１種類の緩衝剤（例えば、ＫＨ２ＰＯ４など）および少なくとも１種類の電解質（例えば、塩化物、硫酸マグネシウム、カリウムおよびナトリウムなど）をさらに含む。さらに、該溶液の典型的な組成には、アロプリノールおよびグルタチオンなどの酸化防止剤、およびアデノシンなどの添加剤が含まれる。具体的には、BelzerとSouthardによって開発されたウィスコンシン大学液(Transplantation, 1988; 45: 673)は、コロイド物質としてＨＥＳ（５０ｇ／ｌ）を、不浸透剤としてラクトビオン酸塩（１００ｍＭ）およびラフィノース（３０ｍＭ）を、緩衝剤としてＫＨ２ＰＯ４（２５ｍＭ）を、電解質として塩化物（２０ｍＭ）、硫酸マグネシウム（５ｍＭ）、カリウム（１２０ｍＭ）およびナトリウム（２５ｍＭ）を、酸化防止剤としてアロプリノール（１ｍＭ）およびグルタチオン（３ｍＭ）を、添加剤としてアデノシン（５ｍＭ）を含んでなる。しかしながら、該溶液の組成は異なっていることもあり、それは最新の文献（米国特許第４８７９２８３号公報）や市販の溶液、すなわち、一部の非必須成分（例えば、塩化物イオンなど）を含まないＵＷ液、または成分濃度がわずかに変化したもの、において認められる。そのため、本発明において有用なウィスコンシン大学液には、組成が、BelzerとSouthardによって記載されたものと一致しているかどうかに関係なく、ウィスコンシン液として市販されている総ての溶液または文献においてそのようなものとして分類されているものが含まれる。 
【００６７】
本発明の別の実施形態では、本発明の冷保存液は、ラクトビオン酸塩、ラフィノースおよびポリエチレングリコールを含んでなり、特に、該溶液はジョルジロペス研究所液（ＩＧＬ−１）である。
【００６８】
本発明の別の実施形態では、前記冷保存液はラクトビオン酸塩、ラフィノースおよびマンニトールを含んでなり、特に、前記溶液はセルシオ液である。
【００６９】
本発明の別の実施形態では、前記冷保存液はグルコン酸塩、トレハロースおよびＨＥＳを含んでなり、特に、前記溶液はＫｙｏｔｏ液（ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ）である。
【００７０】
本発明の別の実施形態では、前記冷保存液はグルコン酸塩、トレハロースおよびポリエチレングリコールを含んでなり、特に、前記溶液はポリゾール液である。
【００７１】
本発明の別の実施形態では、前記冷保存液はヒスチジンおよびマンニトールを含んでなり、特に、前記溶液はブレトシュナイダー液（ＨＴＫ、ヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸塩）である。
【００７２】
本発明の別の実施形態では、前記冷保存液はクエン酸塩およびマンニトールを含んでなり、特に、それはマーシャルの溶液（ＨＯＣまたは高張クエン酸塩）である。
【００７３】
本発明の組成物は、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）またはその機能的に同等の変種が前記冷臓器保存液中に分散されている単一組成物によって構成されていてよいことは当業者には分かるであろう。しかしながら、本発明では、適した時点に、例えば、使用直前に、両方の成分を合わせることによって最終組成物が調製され得るように、両方の成分が「パーツキット(kit-of-parts)」の形で別々になっていることも考慮に入れている。
【００７４】
本文書において用いる「キット」という用語は、市販用に用いられる適当な容器および包装などと一体になっている、本発明による組成物を得るのに適した一連の成分の組合せを指す。
【００７５】
本発明において、「本発明による組成物を得るのに適した成分」とは、（ｉ）および（ｉｉ）を得るために使用し得る任意の化合物を指し、限定されるものではないが、媒質、添加剤、ＣＴ−１、電解質、不浸透化剤、バッファー、冷臓器保存液などが含まれる。
【００７６】
よって、例えば、キットは
ｉ）カルジオトロフィン−１（またはその機能的に同等の変種）が冷臓器保存液と既に混合されている、完全に構成された冷臓器保存組成物が入った容器；
ｉｉ）あるいは、構成されたまたは部分的に構成された冷臓器保存液が入った容器；カルジオトロフィン−１（またはその機能的に同等の変種）を含んでなるさらなる容器；および場合によって、冷臓器保存液の構成成分またはさらなる添加剤が入った他の容器（この場合、本発明の完全に構成された冷臓器保存組成物を調製するための成分の混合は使用直前に行われる）；
ｉｉｉ）あるいは、本発明の冷臓器保存組成物の調製に必要な媒質および構成成分が入った様々な容器（この場合、該容器の少なくとも１つにカルジオトロフィン−１（またはその機能的に同等の変種）が入れられる）
を含んでなってよい。
【００７７】
本発明による冷臓器保存組成物の調製のための媒質、構成成分および添加剤は、薬学上許容されるものでなければならない。「薬学上許容される」という用語は、動物、より特には、ヒトに用いるために、連邦または州政府の監督官庁によって認可を受けているか、あるいは米国薬局方または別の一般的に認められている薬局方に収載されていることを意味する。媒質および添加剤とは、本発明の組成物を投与する際に含められる希釈剤、補助剤、賦形剤またはビヒクルであると理解される。そのような媒質および添加剤は滅菌した液体であり得る。
【００７８】
よって、本発明の１つの側面は、
（ｉ）カルジオトロフィン−１またはその機能的に同等の変種、および
（ｉｉ）冷臓器保存液、あるいは、該溶液の調製のための媒質および添加剤
を含んでなる冷臓器保存組成物の調製のためのキットに関する。
【００７９】
本発明のキットによって得られる冷臓器保存組成物に関する該キットの異なる実施形態は、本発明の組成物の関連の中で既に記載した。
【００８０】
本発明の組成物の調製方法
本発明の別の側面は、冷臓器保存組成物を調製する方法であって、カルジオトロフィン−１またはその機能的に同等の変種を冷臓器保存液に加えることを含む方法に関する。
【００８１】
「冷臓器保存組成物」、「カルジオトロフィン−１」、「機能的に同等の変種」および「冷臓器保存液」という表現、ならびにその成分およびそれらを特徴付けるパラメーターは、本発明の組成物の関連の中で既に定義し、詳細に記載した。
【００８２】
好ましい実施形態では、前記冷臓器保存液は、
（ａ）少なくとも１種類の緩衝剤、
（ｂ）少なくとも１種類の不浸透剤または不浸透化剤、および
（ｃ）少なくとも１種類の電解質
を含んでなる。
【００８３】
さらに好ましい実施形態では、前記冷臓器保存液は、ｐＨが６．５〜８．５の間であり、かつ、オスモル濃度が３００〜４１０ｍＯｓｍ／ｌの間のものである（両パラメーターは２０℃で測定されたものである）。
【００８４】
前記冷臓器保存組成物の調製は、使用直前に、治療上有効な量のカルジオトロフィン−１またはその機能的に同等の変種を冷臓器保存液に加えることによって、即席で行ってよい。該冷臓器保存液は、市販の溶液であってよく、技術の現状において知られている溶液であってよく、またはｐＨが６．５〜８．５でありかつオスモル濃度が３００〜４１０ｍＯｓｍ／ｌの間である（両パラメーターは２０℃で測定されたものである）溶液を得るために、少なくとも１種類の緩衝剤、少なくとも１種類の不浸透剤または不浸透化剤、および少なくとも１種類の電解質を混合することによって得られる溶液であってよい。本発明による組成物は、事前に調製し、使用するまで低温条件下で保存してもよい。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態では、この方法によって調製される冷臓器保存組成物は、本発明の第１の側面の関連の中で記載したものの中に含まれる任意の組成物であり得る。
【００８６】
好ましい実施形態では、本発明の組成物を調製する方法は、ヒト由来のカルジオトロフィン−１、より特には、配列番号１に相当するカルジオトロフィン−１を用いて行われる。好ましい実施形態では、該方法は、該組成物中のカルジオトロフィン−１の終濃度が、０．００１ｇ／Ｌ〜５．０００ｇ／Ｌの間；好ましくは、０．００５ｇ／Ｌ〜１．０００ｇ／Ｌの間；より好ましくは、０．０１０ｇ／Ｌ〜０．５００ｇ／Ｌの間；さらに好ましくは、０．０８ｇ／Ｌ〜０．２０ｇ／Ｌの間；さらに好ましくは、０．１ｇ／Ｌ〜０．２ｇ／Ｌの間となるように行われる。さらに好ましい実施形態では、該方法は、該組成物中のカルジオトロフィン−１の終濃度が、０．００１ｍｇ／Ｌ〜５．０００ｍｇ／Ｌの間；好ましくは、０．００５ｍｇ／Ｌ〜１．０００ｍｇ／Ｌの間；より好ましくは、０．０１０ｍｇ／Ｌ〜０．５００ｍｇ／Ｌの間；さらに好ましくは、０．０８ｍｇ／Ｌ〜０．２０ｍｇ／Ｌの間；さらに好ましくは、０．１ｍｇ／Ｌ〜０．２ｍｇ／Ｌの間となるように行われる。
【００８７】
本発明の冷保存方法
本発明の別の側面は、臓器の冷保存のための方法であって、
（ｉ）カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）またはその機能的に同等の変種、および
（ｉｉ）冷臓器保存液
を含んでなる冷臓器保存組成物と該臓器を接触させることを含む方法にも関する。
【００８８】
「冷臓器保存液」という表現は、本発明の組成物に関連して詳細に説明した。好ましい実施形態では、前記冷臓器保存液は
（ａ）少なくとも１種類の緩衝剤、
（ｂ）少なくとも１種類の不浸透剤または不浸透化剤、および
（ｃ）少なくとも１種類の電解質
を含んでなる。
【００８９】
好ましい実施形態では、前記冷臓器保存液は、ｐＨが６．５〜８．５の間であり、および／または、オスモル濃度が３００〜４１０ｍＯｓｍ／ｌの間であるものである（両パラメーターは２０℃で測定されたものである）。
【００９０】
「臓器の冷保存」とは、低温条件下で臓器を保全、保存、保護および／または貯蔵して、代謝の抑制によってかつ臓器の冷虚血と再灌流により該臓器において起こる変化を防止または減殺することによって、該臓器に対する細胞損傷を最小限に抑える能力を意味すると理解される。臓器の該冷保存は、臓器が採取されるヒトまたは動物の体内で、その体外でまたは体内および体外の両方で行うことができる。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態では、臓器は単離されている。「単離」とは、ドナーから摘出された、臓器が採取されるヒトまたは動物の体外にある臓器を意味すると理解される。
【００９２】
本発明による冷臓器保存組成物と「臓器を接触させること」とは、該組成物を、洗浄、浸漬または灌流によって、該臓器と接触させることを意味すると理解される。
【００９３】
前記冷臓器保存方法、とりわけ、移植用臓器を対象とした方法は、該臓器が冷臓器保存液で灌流される第１段階を一般的に含む。本発明の関連の中で、「灌流」とは、次の保存工程を妨げる可能性があるドナーの血液残留物を除去するため、さらに、該臓器が所望の温度に冷却されるようにその血液を冷保存液と置き換えるための、該臓器に挿入されたカニューレを通じた該臓器の血管内洗浄を意味すると理解される。
【００９４】
前記灌流は、生体ドナーまたは死亡ドナー生物体においてまたは単離臓器において行うことができる。本発明者らは、本発明による組成物での臓器の灌流は、該臓器を適切に貯蔵しかつ／または該臓器を保存するのに十分であり、同じ組成物による次の処置を必要としないことを実証した。従って、本発明の特定の実施形態では、該組成物は、ドナーにおけるin vivo灌流によって臓器と接触している。さらに特定の実施形態では、該組成物でin vivo灌流された臓器は、摘出後に維持されず、本発明による組成物に浸漬される。
【００９５】
本発明の関連の中で、「in vivo灌流」とは、生体ヒトまたは動物ドナーの体内で行われる灌流として理解される。
【００９６】
本発明の別の実施形態では、前記臓器がドナーから単離されている場合、前記組成物は、灌流によって臓器と接触している。さらに特定の実施形態では、前記組成物で灌流された単離臓器は、摘出後に本発明による組成物中で浸漬された状態で維持されない。別の特定の実施形態では、前記組成物で灌流された単離臓器は、本発明による組成物に浸漬された状態で維持される。
【００９７】
単離臓器において灌流することとは、ドナーから摘出されてから行うこととして理解される。特定の実施形態では、該臓器は、「冷臓器保存液」により「in vivo」で灌流された後、単離されてから、本発明による組成物で再び灌流される場合もある。その後、それは、本発明による組成物中で浸漬された状態で維持されない。
【００９８】
本発明の別の実施形態では、前記組成物は、ドナーにおける灌流によっておよび摘出後の浸漬によって臓器と接触する。
【００９９】
本発明では、生命および健康の維持をあまり重要としないヒトまたは動物生物体における物理的介入も企図される。従って、本発明の別の特定の実施形態では、臓器は死亡ドナーから得られたものである。さらに特定の実施形態では、前記組成物は、死亡ドナーにおける灌流によって臓器と接触する。さらに特定の実施形態では、前記組成物で灌流された臓器は、摘出後に、本発明による組成物中で浸漬された状態では維持されない。
【０１００】
別の実施形態では、前記組成物は、灌流によっておよび該灌流後に、浸漬によって、死亡ドナーから摘出された単離臓器と接触する。別の実施形態では、前記組成物は、灌流によって、死亡ドナーから摘出された単離臓器と接触し、該灌流後に、それは、本発明による組成物中で浸漬された状態では維持されない。
【０１０１】
本発明の関連の中で、「死亡」とは、脳幹をはじめとする脳全体の生命活動が不可逆的に停止しており、明確に定義された神経学的臨床プロトコールによって確認されているヒトまたは動物体として理解され、当業者には公知の特殊検査によって裏付けられる。本文書において、「死亡」という用語には、死体の他に、心臓および呼吸活動が人工的に維持されている脳死状態の生物が含まれる。
【０１０２】
本発明の関連の中で、「ドナー」という用語は、移植用臓器を提供するヒトまたは動物生物体に関するものである。
【０１０３】
灌流に続いて、臓器は洗浄されかつ／または浸漬に付されることがある。本発明の関連の中で、「洗浄」とは、冷臓器保存組成物または溶液での臓器の外表面および／または内表面の短時間処置を意味すると理解される。
【０１０４】
一般的には、ドナーからの臓器摘出とレシピエントへの移植との間に、数時間あるいは数日が経過することがある。これらの場合、摘出された臓器は、冷臓器保存組成物または溶液への浸漬によって保存される。本発明の関連の中で、「浸漬」とは、臓器を保存液に浸すことを意味すると理解される。臓器は、例えば、本発明の組成物が、該臓器を保護するのに十分な量で入っている容器に入れて浸してよい。
【０１０５】
あるいは、臓器は低温灌流装置内の貯蔵器に保存してもよい。そのような装置は、本発明による冷臓器保存組成物の制御された連続流または脈動流を維持する装置である。
【０１０６】
最後に、本発明の組成物はまた、再灌流時に、すなわち、冷虚血を受けた臓器が血流を回復する際にも灌流され得る。
【０１０７】
いずれの場合も、必要な量の冷保存液が使用される。
【０１０８】
臓器は、数秒〜数時間または数日にわたる期間、本発明の組成物との接触を続ける可能性がある。典型的には、臓器と前記組成物は、体外で、少なくとも１５０秒間、少なくとも３０分間、少なくとも３時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間など；好ましくは、２４〜４８時間の間；より好ましくは、２４時間、接触が保たれる。本発明による組成物と臓器との全接触時間を通じて、その集合体は、０℃〜２５℃の間；好ましくは、０℃〜１５℃の間；より好ましくは、；２℃〜７℃の間の温度で；さらに好ましくは、およそ４℃で維持されなければならない。
【０１０９】
例えば、ヒト腎臓の灌流は、腎臓重量の１０倍までの容量の冷保存液を用いて１０〜１５分間行い得る。その後、この腎臓は冷保存液に入れて、必要に応じて、数秒〜７２時間の間の期間、貯蔵し得る。
【０１１０】
本発明の関連の中で、臓器は、別法として、本発明による組成物による灌流、浸漬または洗浄に付してよく；またはそれらの組合せに付してよい。本発明の実施形態では、臓器の最初の灌流は本発明の冷保存組成物で行われ、その後、該臓器は、移植時まで該溶液に入れて貯蔵され、保存される。灌流の第１段階は、生体ドナーまたは死亡ドナーの臓器において行うことができる。従って、別の特定の実施形態では、該組成物は、ドナーにおけるin vivo灌流によっておよび摘出後に、浸漬によって臓器と接触する。別の特定の実施形態では、該組成物は、死亡ドナーにおける灌流によっておよび摘出後に、浸漬によって臓器と接触する。
【０１１１】
本発明では、カルジオトロフィン−１を含まない冷保存液を用いて灌流が行われ、その後、浸漬または洗浄によって臓器を維持するために、本発明による組成物が用いられるという可能性も考慮に入れている。
【０１１２】
本発明の好ましい実施形態では、前記冷臓器保存組成物は、洗浄、浸漬、灌流またはそれらの組合せによって臓器と接触する。
【０１１３】
好ましい実施形態では、この方法において用いられる冷臓器保存組成物は、本発明の組成物の関連の中で上に説明した冷保存組成物である。
【０１１４】
本発明の方法を用いて接触している臓器は、例えば、限定されるものではないが、哺乳類（霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、齧歯類、ウサギなど）、鳥類などの任意の種由来の任意の実質臓器であってよいが、好ましくは、ヒト由来のものである。該臓器は、同じ種またはレシピエントとは異なる種の生体ドナーまたは死体から得たものであってよい。本発明の冷保存方法に適した臓器は、限定されるものではないが、心臓、肺、膵臓、小腸、結腸、腎臓であり得る。本発明の好ましい実施形態では、本発明の組成物と接触している臓器は腎臓である。本発明の別の好ましい実施形態では、該臓器は肺である。さらに別の好ましい実施形態では、該臓器は心臓である。
【０１１５】
本発明の使用
本発明の別の側面は、移植のための冷臓器保護および／または保存用組成物の調製のためのカルジオトロフィン−１またはその機能的に同等の変種の使用に関する。
【０１１６】
本発明の好ましい実施形態では、冷臓器保存組成物は、本発明の組成物の関連の中で上に記載した組成物である。
【０１１７】
本発明の別の側面は、移植のための冷臓器保護および／または保存に用いる、本発明による組成物の使用に関する。
【０１１８】
本発明の別の側面は、移植のための冷臓器保護および／または保存における使用のための、本発明による冷臓器保存用組成物に関する。「移植のための冷臓器保護および／または保存」とは、低温条件下で臓器を保全、保存、保護および／または貯蔵して、代謝を抑制することおよび移植時に行われる該臓器の冷虚血と再灌流により該臓器において起こる変化を防止または減殺することによって該臓器に対する細胞損傷を最小限に抑える能力を意味すると理解される。
【０１１９】
本発明の特定の実施形態では、移植用臓器の冷保護および／または保存は、ドナーにおいてin vivoで、好ましくは、in vivo灌流によって行われる。該in vivo保護および／または保存は、ドナーのヒトまたは動物の体内で、通常本発明による組成物を灌流することによって行われる。
【０１２０】
本発明の別の特定の実施形態では、移植用臓器の冷保護および／または保存は２段階で行われる：第１のin vivo灌流は、カルジオトロフィンを含まない「冷臓器保存液」を用いてドナーにおいて行われ、その後、その臓器は摘出される。臓器が単離された時点で、第２段階でその臓器は本発明の組成物で再び灌流される。
【０１２１】
臓器は、in vivoでまたは単離されてから、本発明の組成物で灌流したら、場合によって、該組成物への浸漬に付すことにより該単離臓器を保存および／または保護することができる。従って、別の特定の実施形態では、冷保護および／または保存は、ドナーにおけるまたは単離臓器における本発明の組成物のin vivo灌流によって行われ、移植用臓器がドナーから摘出された後にそれはさらに、該組成物への浸漬に付される。別の特定の実施形態では、冷保護および／または保存は、ドナーの単離臓器において本発明による組成物を灌流することによって、さらに、該臓器を該組成物に浸漬することによって行われる。
【０１２２】
本発明では、生命および健康の維持をあまり重要としないヒトまたは動物生物体における物理的介入も企図される。従って、本発明の別の特定の実施形態では、移植用臓器の冷保護および／または保存は、死亡ドナーのヒトまたは動物の体内で灌流することによって行われる。
【０１２３】
本発明の関連の中で、「死亡」とは、脳幹をはじめとする脳全体の生命活動が不可逆的に停止しており、明確に定義された神経学的臨床プロトコールによって確認されているヒトまたは動物体として理解され、当業者には公知の特殊検査によって裏付けられる。本文書において、「死亡」という用語には、死体の他に、心臓および呼吸活動が人工的に維持されている脳死状態の生物が含まれる。
【０１２４】
本発明の好ましい実施形態では、移植用臓器は単離されている。「単離」とは、臓器を提供するヒトまたは動物生物体から摘出された、該生物体の体外にある臓器として理解される。
【０１２５】
本発明の方法において用いられる移植用臓器は、例えば、限定されるものではないが、哺乳類（霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、齧歯類、ウサギなど）、鳥類などの任意の種の任意の実質臓器であってよいが、好ましくは、ヒト由来のものである。該臓器は、同じ種またはレシピエントとは異なる種の生体ドナーまたは死体から得たものであってよい。本発明の冷保存方法に適した臓器は、限定されるものではないが、心臓、肺、膵臓、小腸、結腸、腎臓であり得る。本発明の好ましい実施形態では、本発明の組成物を用いて移植のために保護および／または保存される臓器は腎臓である。本発明の別の好ましい実施形態では、本発明の組成物を用いて移植のために保護および／または保存される臓器は肺である。さらに別の好ましい実施形態では、その臓器は心臓である。
【０１２６】
本発明の保存された臓器
本発明の著者らは、本発明の組成物によって、該臓器における冷虚血および移植後再灌流に関連した損傷を減らすことが可能になることを実証した。さらに、本発明の著者らは、本発明の組成物は、虚血−再灌流によって引き起こされる尿細管壊死を防ぎ、それによって腎機能（血清クレアチニンレベルの低下およびクレアチニンクリアランスの増加）および生存率を改善する（図４）ことから、移植用の腎臓の冷保存に適していることを示した。
【０１２７】
従って、本発明の別の側面は、本発明による方法によって得られる冷保存された単離臓器に関する。
【０１２８】
本明細書において用いる「臓器」という用語は、特定の機能を有する、体の分化部位を指す。例としては、それに限定されるものではないが、呼吸、分泌または消化などの特定の機能を有する部位が挙げられる。該臓器は「単離されている」、すなわち、臓器を提供する動物またはヒトの体外にある。本発明による保存された単離臓器としては、限定されるものではないが、心臓、腎臓、肺、心臓、心肺、腸、脾臓および胸腺が挙げられる。
【０１２９】
好ましい実施形態では、保存された単離臓器は腎臓である。
【０１３０】
別の好ましい実施形態では、保存された単離臓器は肺である。
【０１３１】
さらに別の好ましい実施形態では、保存された単離臓器は心臓である。
【０１３２】
保存された臓器は移植に基づく療法において特に有用である。
【０１３３】
以下、下記の実施例によって本発明を説明するが、これらの実施例は単に例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものと決して考えてはならない。
【実施例】
【０１３４】
材料および方法
サンプルの調製および分析
腎臓の一部を分離し、ホモジネートバッファー［０．０５Ｍ第一リン酸カリウムおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％コール酸ナトリウム含有；ｐＨ７．８］で、０℃〜４℃の間に及ぶ温度で洗浄して、酸化の進行を最小限に抑えた。続いて、それを重量測定し、１：１０  ｗ／ｖの割合の量の同じホモジネートバッファーを用いてホモジナイズした。ホモジネートを、温度４℃で、１００，０００ｇで６０分間遠心分離した。得られた可溶性画分をアリコートに分け、分析まで−８０℃で凍結保存した。これらのサンプルを用いて、スーパーオキシドアニオン（ＳＯＡ）、ＴＮＦαおよびＩＬ−６の腎レベルを決定した。
【０１３５】
腎臓の別の部分を分離して、ウエスタンブロットによりタンパク質を測定した。まずに、サンプルを、組織１００ｍｇ当たり１ｍｌの割合の溶解バッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０；１０％グリセロール；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．２５％デオキシコール酸ナトリウム；１０μｇ／ｍｌアプロチニン；１０μｇ／ｍｌロイペプチン；１０ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）；１００ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムＮａ２ＶＯ４；および２５ｍＭフッ化ナトリウム（ＮａＦ））で、氷中で３０〜６０分間ホモジナイズした。続いて、それを１２，０００ｇおよび４℃で２５分間遠心分離し、上清を集め、使用するまで、アリコートで、−８０℃で凍結した。
【０１３６】
スーパーオキシドアニオンＯ２−（ＳＯＡ）の産生の決定
腎臓におけるＳＯＡ産生レベルを決定するために、Ｏ２−ラジカルによるシトクロムＣの還元に基づいた、ミトコンドリアに関するBoverisにより記載されている技術[Boveris A. Methods Enzymol. 1984; 105: 429-435]の改良法を用いた。簡潔には：
・１００μｌのシトクロムＣ（７５μＭ）、２０μｌのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ；およそ２６４Ｕ）、２５μｌのサンプルおよび緩衝液（０．１Ｍリン酸カリウム＋０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ７．８）を入れ、容量１，０００μｌにして、分光測定用キュベット（１−ｍｌキュベット）を準備し；
・サンプルは加えず、１００μｌのシトクロムＣ（７５μＭ）、２０μｌのＳＯＤおよび緩衝液を入れ、容量１，０００μｌにして、参照キュベットを準備し；
・シトクロムＣの非特異的還元を調査するために、ＳＯＤを含めない別の同様のキュベットを準備し；
・２つの状態、１．−シトクロムＣの非特異的還元（ＳＯＤ不含）、および２．−シトクロムＣのスーパーオキシド依存性還元（ＳＯＤ含有）において、分光光度測定値［λ  ５５０ｎｍ；ｐＨ７．８および温度２５℃で、６秒間隔で１分間、１−ｍｌキュベットにおいて、１−ｃｍ光路長による］によって、シトクロムＣの還元を追跡し；
・参照キュベット中のシトクロムＣは完全に酸化され、観測された吸光度の増加は還元生成物の吸光度を単に表す（Δ吸光度：還元型−酸化型）ことを前提として、反応混合物における吸光度単位の増加を、モル吸光係数：ΔＥ５５０／２１．０ｘ１０３Ｍ−ｌｃｍ−１を用いてＳＯＡのナノモルに換算し；
・このようにして、ＳＯＡスーパーオキシドアニオンの産生をｎｍｏｌ／ｍｇ  タンパク質／分で表した。
【０１３７】
サイトカインＴＮＦαおよびＩＬ−６の決定
腎組織、血清および保存液中のＴＮＦαのレベルをＥＬＩＳＡによって、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｒａｔ  ＴＮＦα／ＴＮＦＳＦ１Ａ  ｋｉｔ(R&D Systems; Minneapolis, USA)を用い、製造業者の使用説明書に従って決定した。
【０１３８】
同様に、ＩＬ−６のレベルをＥＬＩＳＡによって、市販のＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｒａｔ  ＩＬ−６  ｋｉｔ(R&D Systems)を用いて決定した。
【０１３９】
どちらの場合も、レベルをｐｇ／ｍｌで表した。
【０１４０】
ウエスタンブロットによるｉＮＯＳ、ｓＩＣＡＭ−１、ｓＶＣＡＭ−１、ＩκＢおよびＮＦκＢの決定
ウエスタンブロットによりタンパク質を定量するために、組織サンプルを溶解バッファーで希釈し（１：２０）、ローリー法に基づいたBio-Rad社製キットを使用した。反応は９６ウェルプレート（Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ（商標）９６, Becton Dickinson Labware, NJ, USA）において、サンプルおよび標準曲線についていずれも５μｌを用いて行った。各測定は三反復で行った。これに先立ち、既知濃度のＢＳＡを含有する標準溶液に基づいて、較正曲線を準備した。続いて、２５μｌの試薬Ａ（サンプルは界面活性剤：ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０を含有していたため、試薬Ａ  １ｍｌ当たり２０μｌの試薬Ｓを添加した）を添加した。その後、２００μｌの試薬Ｂを添加した。混合物を少なくとも１５分間インキュベートし、吸光度を７５０ｎｍで測定した。
【０１４１】
電気泳動によるタンパク質の分離はレムリ(Laemmli)法に基づく。１７％アクリルアミドミックスローディングゲル（２９．２％アクリルアミド、０．８％ビス−アクリルアミド）と、タンパク質のサイズおよびローディングするサンプル容量に応じた様々な厚さのアクリルアミドミックス分離ゲルとを含む１．５−ｍｍ厚のトリス−グリシン−ポリアクリルアミドゲル中にタンパク質をローディングした。分子量マーカーもローディングした（Ｌｏｗ／Ｂｒｏａｄ  ｒａｎｇｅ, Bio-Rad Laboratories, CA, USAまたはＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）着色済みタンパク質ラダー(Pre-Stained Protein Ladder), Invitrogen Corporation, CA, USA）。
【０１４２】
用いた組織抽出物の量はタンパク質２００μｇ／ウェルであった。各サンプルを、等容量のローディングバッファー（１％２−メルカプトエタノール、２％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、１０％グリセロール、１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、０．０００５％ｗ／ｖブロモフェノールブルー）と混合し、タンパク質を１００℃で５分間変性させ、続いて、少量のローディングバッファーを、サンプルを加えずに、ウェルの底に入れ、全ウェルの残りのスペースに電気泳動バッファー（１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ８．３）を満たした。
【０１４３】
電気泳動は、電気泳動バッファー中、一定の電圧１００Ｖを印加した状態で行った。
【０１４４】
アクリルアミドゲル中で分離され含まれているタンパク質を膜へ転写した。転写は、転写液（１９０ｍＭグリシン、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３）が入ったキュベット中、一定のアンペア数４００ｍＡを保った状態で行い、材料（ブロッティングペーパーおよびスポンジ）は予め浸漬し、ゲルおよびニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ, Amersham Bioscience）は転写バッファー中で１５分間平衡化しておいた。
【０１４５】
転写が完了したら、膜をＴＴＢＳ洗浄バッファー（０．１％ｖ／ｖ  ＴＷＥＥＮ−２０；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で洗浄し、その直後に、免疫検出の間の非特異的結合を防ぐため、１０ｍｌのブロッキングバッファーとともに、常に撹拌しながらインキュベートした。対応するバッファー中適当な希釈度および温度での一次抗体との、常に撹拌しながらのインキュベーションは、各タンパク質に応じて異なる時間で行った。一次抗体とのインキュベーション後、洗浄バッファーを用いて５分間の洗浄を４回行い、続いて、適当な希釈度の対応する二次抗体とともに、各タンパク質について指定の時間で膜をインキュベートした。最後に、洗浄バッファーを用いてさらに５分間の洗浄を４回行った。
【０１４６】
異なるタンパク質の特異的バンドは化学発光アッセイによって検出した；このために、市販の顕色液(Amersham Biosciences, United Kingdom)の１：１の割合での混合物を、常に撹拌しながら１分間、周囲温度で維持し、続いて、その顕色液を捨てた。その後、膜をチャンバーに入れて、画像を撮った（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＲＴ  ＥＣＬ  Ｉｍａｇｅｒ, GE Healthcare）。画像が撮れたら、得られたバンドの光学濃度を、プログラムを用いて定量した（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  Ｔソフトウェア）。
【０１４７】
各測定の後、続いて、ローディング対照として用いたα−チューブリンを定量するために、市販の溶液（Ｒｅ−Ｂｌｏｔ  Ｐｌｕｓ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ, Chemicon International, CA, USA）を用いて「ストリッピング」を行った。
【０１４８】
使用した抗体は以下であった：
α−チューブリン抗体（＃２１４４＃  Cell Signaling Technology）
ｉＮＯＳ／ＮＯＳ  ＩＩ型抗体（BD Transduction Laboratories, ６１０３３２）
ＩＣＡＭ−１抗体（Santa Cruz Biotechnology, INC. ｓｃ−１５１１）
ＶＣＡＭ−１抗体（Santa Cruz Biotechnology, INC. ｓｃ−１５０４）
ＩκＢ−β抗体（R&D Systems, ＭＡＢ３４２５）
ＮＦκＢ抗体（Santa Cruz Biotechnology, ＮＦκＢ  ｐ６５（Ｆ−６）：ｓｃ−８００８）
ｐＮＦκＢ抗体（Santa Cruz Biotechnology, ｐ−ＮＦκＢ  ｐ６５（Ａ−８）：ｓｃ−１６６７４８）
【０１４９】
腎機能（クレアチニンおよびクレアチニンクリアランス）の分析
腎機能を測定するために、クレアチニンの血漿濃度および、糸球体濾過速度の尺度であるクレアチニンクリアランスを決定した。クレアチニンクリアランス（ＣＣｒ）は下式を用いて計算した：
ＣＣｒ＝ＦＵ×ＣｒＯ／ＣｒＰ、
（式中、ＦＵは尿流率（ｍｌ／分）であり、ＣｒＯは尿中のクレアチニンの濃度（ｍｇ／ｍｌ）であり、ＣｒＰはクレアチニンの血漿濃度（ｍｇ／ｍｌ）である）。尿中および血漿中のクレアチニン濃度は半自動分析装置（レフレトロン, Roche）によって測定した。
【０１５０】
統計学
データの統計分析は、ダブルエントリー分散分析(double-entry variance analysis)を用いて行い、続いて、データがパラメトリックであるかノンパラメトリックであるかによって、シェフェ法またはクラスカル・ワリス検定を用いて行った。有意差は、ｐ値が０．００５以下の場合に認められると判断した。分析にはＮＣＳＳ  ２０００統計プログラム(Dr. Jerry L. Hintze, Utah, USA)を用いた。
【０１５１】
実施例１  冷臓器保存組成物の調製
基礎冷臓器保存液として、ユーロコリンズ液（ＥＣ）あるいはウィスコンシン大学液（ＵＷ）を用い、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）を添加した様々な冷臓器保存組成物を調製した。
【０１５２】
前記冷保存液を実験ラットモデルでアッセイするため、その媒質を補うために、DRO Biosystemsにより供給されているラットＣＴ−１を用いた。そのＣＴ−１は、大腸菌(E. Coli)ＢＬ２１(Invitrogen, Barcelona, Spain)において、アミノ末端のヒスチジンテールを有する融合タンパク質として製造されたものである。該組換えタンパク質の発現は、終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧ(Sigma)により２５℃にて２時間で誘導された。細菌ペレットのホモジナイゼーション後、ニッケル親和性カラムクロマトグラフィー（Qiagen, Barcelona, Spain）によってＨｉｓ−ＣＴ−１融合タンパク質は精製された。用いたＣＴ−１の配列は配列番号２である。
【化３】
2013526600.tif 000004
【０１５３】
ＥＣ液はLaboratorios Esteve (Barcelona, Spain)から購入し、ＵＷ液はBristol-Myers-Squibbから購入した（ＶｉａＳｐａｎ; Bristol-Myers-Squibb S.L.; Madrid; Spain）。
【０１５４】
臓器保存および移植アッセイのために、基礎溶液に異なる量のＣＴ−１を加えることによって異なる冷臓器保存組成物を調製した。表１および表２に、調製した異なる冷臓器保存組成物の組成を示す。
【０１５５】
【表１】
2013526600.tif 000005
【０１５６】
【表２】
2013526600.tif 000006
【０１５７】
実施例２  カルジオトロフィン−１濃度０．１ｍｇ／ｌでの冷腎保存の研究
ウィンスター系ラットを用いた（第１回目の研究では２２５〜３００ｇ／ラット雄、第２回目の研究では２２５〜２５０ｇ／ラット雄）。塩化ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）＋ジアゼパム（５０ｍｇ／ｋｇ）およびアトロピン（２０ｍｇ／ｋｇ）の腹膜内注射によりラットに麻酔した。正中開腹を行い、後腹膜を切開して、腹部大動脈および腎動脈〜大動脈分岐部（腸骨動脈）を露出した。続いて、腎血管を、下副腎動脈分枝部および性腺動脈分枝部の結紮によって解離し、尿道周囲脂肪に注意しながら尿管の近位半分を乾燥させた。
【０１５８】
続いて、臓器の灌流（洗浄灌流）のために、腎動脈口下で大動脈をクランプし、それによってその血管新生を維持した。分岐部での遠位結紮後に、前面での大動脈横切開によって大動脈カテーテル挿入を行った。クランプを外して、アッセイする１ｍｇ／ｋｇヘパリンナトリウム含有冷臓器保存組成物での冷灌流（４℃）を開始すると同時に、左腎動脈上での結紮によって大動脈を閉塞した。大静脈との接合部で切断した腎静脈を通じて排液を行った。
【０１５９】
腎臓を灌流したら、尿管（乾燥させた経路内）および腎動脈を切断した。腎臓を摘出し、アッセイする冷保存組成物が、臓器を保護するのに十分な量で入った容器に入れて浸し、温度４℃で維持した。
【０１６０】
前設定時間での冷保存後に、サンプルを採取して、異なる対象パラメーターを分析した。
【０１６１】
各研究では、ｉ）様々な冷保存組成物；およびｉｉ）様々な前設定保存時間（それぞれ、３時間、６時間、１２時間、２４時間および４８時間）の保存効力を評価し比較するために、異なる動物群を用いて、平行アッセイを行った。
【０１６２】
各研究では、保存していない場合の研究パラメーターのベースライン値（保存０時点）を決定するために、ラット「模擬」群（Ｓｉｍ）も含めた。模擬群は、保存していないサンプルを評価するために、腎臓を摘出し、腎臓を冷保存液での洗浄灌流に付し、直ちにサンプルを採取し処理することにより構成した。
【０１６３】
評価したパラメーターは、酸化的ストレスの指標としてのスーパーオキシドアニオンフリーラジカル（ＳＯＡ）の産生；および腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）の産生、一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）誘導、ならびに炎症過程のマーカーとしてのＮＦκＢ転写因子の活性化であった。
【０１６４】
第１回目の研究では、ＣＴ−１（０．１ｍｇ／ｌ）の効力を、基礎溶液としてユーロコリンズ液を用いた冷保存組成物（ＥＣ［ＣＴ１］）において、この組成物における保存効力を、対照として用いたユーロコリンズ液（ＥＣ）における保存と比較して、評価した。分析したパラメーターの結果を図１に示す。
【０１６５】
スーパーオキシドアニオンフリーラジカルの腎レベル（ＳＯＡ）を測定した結果、総ての時点においてＥＣ群とＥＣ［ＣＴ１］群との間に有意差（ｐ＜０．００１）が認められ；Ｓｉｍ群とＥＣ［ＣＴ１］群との間でも４８時間の時点において認められた（ｐ＜０．００１）（図１Ａ）。腫瘍壊死因子αの腎レベル（ＴＮＦα）に関しては、６時間後にＥＣ群とＥＣ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．００１）；１２時間後にＳｉｍ群とＥＣ［ＣＴ１］群との間に認められた（１２時間：ｐ＜０．０５；２４時間後：ｐ＜０．００１）（図１Ｂ）。誘導型一酸化窒素合成酵素の腎レベル（ｉＮＯＳ）に関しては、総ての時点においてＥＣ群とＥＣ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められた（ｐ＜０．００１）（図１Ｃ）。腎ＩκＢレベルによって測定したＮＦκＢ転写因子の活性化（ＩκＢ）では、総ての時点においてＥＣ群とＥＣ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．００１）；ＥＣ［ＣＴ１］群ではＳｉｍ群と比べて有意な低下も認められた（ｐ＜０．００１）（図１Ｄ）。
【０１６６】
第２回目の研究では、ＣＴ−１（０．１ｍｇ／ｌ）の効力を、基礎溶液としてウィスコンシン大学液を用いた冷保存組成物（ＵＷ［ＣＴ１］）において評価した。同様に、ＵＷ［ＣＴ１］における保存効力を、対照として用いたウィスコンシン大学液（ＵＷ）における保存と比較した。分析したパラメーターの結果を図２に示す。
【０１６７】
スーパーオキシドアニオンフリーラジカルの腎レベル（ＳＯＡ）を測定した結果、４８時間の時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．０５）、ＵＷ［ＣＴ１］群とＳｉｍ群との間でも認められた（ｐ＜０．０１）（図２Ａ）。腫瘍壊死因子αの腎レベル（ＴＮＦα）に関しては、２４時間後にＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．０５）；１２時間後にＵＷ群とＳｉｍ群との間に認められ（ｐ＜０．０５）；ＵＷ［ＣＴ１］群とＳｉｍ群との間でも４８時間の時点において認められた（ｐ＜０．００１）（図２Ｂ）。誘導型一酸化窒素合成酵素の腎レベル（ｉＮＯＳ）に関しては、総ての時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められた（ｐ＜０．００１）（図２Ｃ）。ＩκＢの腎レベルによって測定したＮＦκＢ転写因子の活性化（ＩκＢ）では、総ての時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．００１）；ＵＷ［ＣＴ１］群とＳｉｍ群との間でも認められた（ｐ＜０．０１）（図２Ｄ）。
【０１６８】
実施例３．カルジオトロフィン−１濃度０．２ｍｇ／ｌでの冷腎保存の研究
雄ウィンスター系ラット、２２５〜２５０ｇ／ラットを用いた。摘出の前に、腎臓および肝臓の冷灌流を、保存組成物を用いて４℃で行った。続いて、同じ外科的行為の間に、２つの臓器を別々に摘出した。まずに、肝間膜を切断した。続いて、移植ドナー手術をシミュレートするために胆管を切断し、右腎静脈および右腎動脈を結紮した。続いて、幽門静脈の両端の二重結紮を行い、それを乾燥させた。その後、１ｍｌのヘパリン添加生理食塩水を静脈内注射により投与した。大動脈に２０Ｇカテーテルを用いてカニューレ挿入し、１２ｍｌの冷保存組成物を用いて速度４ｍｌ／分で灌流した。灌流直後に、下大静脈を切開して、灌流液の排出を可能にし、その後、肝上の大静脈および門脈を切開した。同時灌流の６分後に、左腎動脈および左腎静脈を結紮し、左腎を摘出し、保存組成物中に４℃で前設定時間の間、浸した。肝臓をさらに６ｍｌで灌流し続け、肝臓腔から摘出し、最後にまた、４℃で前設定時間の間、冷保存組成物が入った容器に入れて浸した。予め決定した冷保存時間が経過したら、サンプルを採取して分析した。
【０１６９】
０．２ｍｇ／ｌのＣＴ−１を含有する、本発明による組成物をウィスコンシン大学液においてアッセイし（ＵＷ［ＣＴ１］）、ウィスコンシン大学液を対照として用いた（ＵＷ）。
【０１７０】
本研究には９つのラット群を含めた：
・ＵＷを用いて、それぞれ、３０分、３時間、２４時間および４８時間の期間、保存を行った４群；
・ＵＷ［ＣＴ１］を用いて、それぞれ、３０分、３時間、２４時間および４８時間の期間、保存を行った４群；さらに
・異なる対象パラメーターのベースライン値を評価するための、冷保存していない１模擬群（Ｓｉｍ）。
【０１７１】
前設定時間での冷保存後に、サンプルを採取して、異なる対象パラメーターを分析した。この場合には、以下を評価した：ＳＯＡの産生、ＴＮＦαの産生、ｉＮＯＳの誘導、ＮＦκＢ因子の活性化およびＶＣＡＭ−１血管接着分子のレベル（これも炎症過程の指標である）。得られた結果を図３に示す。
【０１７２】
スーパーオキシドアニオンの腎レベル（ＳＯＡ）を測定した結果、６時間および２４時間の時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．０５）；Ｓｉｍ群とＵＷ群との間でも認められた（ｐ＜０．０５）（図３Ａ）。腫瘍壊死因子αの腎レベル（ＴＮＦα）に関しては、２４時間および４８時間の時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．０５）、Ｓｉｍ群とＵＷ群との間でも認められた（ｐ＜０．０５）（図３Ｂ）。誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）腎レベルに関しては、６時間の時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．０５）；Ｓｉｍ群とＵＷ群との間でも差が認められた（図３Ｃ）。Ｓｅｒ３１１リン酸化ｐ６５タンパク質の腎レベル（ｐＮＦκＢ）に関しては、６時間の時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ；Ｓｉｍ群とＵＷ群との間でも有意差が認められた（図３Ｅ）。ＶＣＡＭ−１血管接着分子の腎レベルでは、２４時間の時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．０５）；Ｓｉｍ群とＵＷ群との間でも有意差が認められた（ｐ＜０．０５）（図３Ｆ）。
【０１７３】
実施例４  カルジオトロフィン−１濃度が０．１ｍｇ／ｌの組成物を用いた冷腎保存および移植の研究
外科手技は、Garcia-Criado et al.によって既に記載されているプロトコールに従ってを行った(J. Interferon Cytokine Res. 2009; 29: 441-450)。
【０１７４】
本研究は雄フィッシャーラット、２２５〜２５０ｇ／ラットにおいて行った。
【０１７５】
まず第一に、腎臓を採取するために、５０ｍｇ／ｋｇ塩酸ケタミン（ケトラール、Parke-Davis）、５０ｍｇ／ｋｇジアゼパム（Ｖａｌｉｕｍ、Roche）および２５ｍｇ／ｋｇアトロピン（Ａｔｒｏｐｉｎａ、Braun）の組合せによりドナー動物に麻酔した。動物を恒温表面に置き、腎臓の特定および指示後、腎周囲および尿管周囲脂肪のごく一部を保存して、扱いやすくした。尿管を切断し、プラスチックチューブ（０．６８ｍｍ  ＯＤ、０．２８ｍｍ  ＩＤ、問い合わせ番号４２７４００、Ｉｎｔｒａｍｅｄｉｃ、Clay Adams）を用いてカニューレ挿入した。この時点において、ラットにヘパリン（１，０００ＩＵ）を投与し、心臓拍動中に、腎臓を４℃および速度０．７４ｍｌ／分で１５０秒間、アッセイする冷保存組成物で灌流した。その後、腎動脈および腎静脈を切り離し、ポリエチレンチューブ（１．５７ｍｍ  ＯＤ、１．１４ｍｍ  ＩＤ、問い合わせ番号４２７４３０、Ｉｎｔｒａｍｅｄｉｃ（商標）−Clay Adams）を腎静脈に挿入した。
【０１７６】
腎臓を摘出したら、腎臓を冷保存組成物（４℃）中で２４時間保存した。
【０１７７】
最後に、移植自体を行った。レシピエントラットは、既に記載したとおりに麻酔した。開腹後、左腎を摘出し、保存する腎臓を洗浄し、レシピエントラットに正所性に移し、ポリアミドモノフィラメント糸を用いて腎動脈の吻合を行った。ドナー腎臓に予め挿入しておいたプラスチックチューブを用いてドナーおよびレシピエントの静脈および尿管を吻合した。腹膜および腹筋は、バイクリル５／０での連続縫合により単一面で閉鎖した。皮膚はステープルで閉鎖した。吻合−再灌流の継続は１０分以下とし、レシピエントラットでの合計時間は３０分を超えなかった。動作および反応が正常に戻るまで、白熱電球を用いて動物を温め続けた。
【０１７８】
移植が完了したら、血液再灌流を前設定時間の間維持し、その後、血液、尿および腎臓サンプルを採取した。
【０１７９】
異なる群についての前設定再灌流時間は、それぞれ、（単位：日）ｔ（ｄ）：１、３、７および１４であった。さらに、ラット模擬群を含めた（Ｓｉｍ）。
【０１８０】
０．１ｍｇ／ｌのＣＴ−１を含有する、本発明による組成物をウィスコンシン大学液においてアッセイし（ＵＷ［ＣＴ１］）、ウィスコンシン大学液を対照として用いた（ＵＷ）。
【０１８１】
本研究には１１のラット群を含めた（総ての群で、ｎ＞１５  移植数）：
・ＵＷを用いて腎臓保存を行い、再灌流時間が各群で異なっている（それぞれ、１日、３日、７日、１４日および３０日）５群；
・ＵＷ［ＣＴ１］を用いて該保存を行い、再灌流時間が同様に異なっている５群；および
・上記のとおりに腎臓を各ドナーラットから摘出したが、冷保存液（ＵＷ）での洗浄後、直ちに移植した１模擬群（Ｓｉｍ）。
【０１８２】
この研究では以下を分析した：移植レシピエントラットの生存時間；ＳＯＡおよびＴＮＦα、ＩＬ−６、および可溶型のｓＩＣＡＭ−１およびｓＶＣＡＭ−１細胞間接着分子の産生；ＮＦκＢの活性化；ならびに、腎機能の指標として、血清クレアチニンレベルおよびクレアチニンクリアランス。
【０１８３】
得られた結果を図４に示す。
【０１８４】
生存に関しては、第５日目からＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間（ｐ＜０．０１）およびＵＷ群とＳｉｍ群との間（ｐ＜０．００１）に有意差が認められた（図４Ａ）。血清クレアチニンレベル（ＣＲＥＡＴ）を測定した結果、総ての時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．０５）、ＵＷ群とＳｉｍ群との間でも認められた（ｐ＜０．０１）（図４Ｂ）。クレアチニンクリアランスのレベル（ＣＲＣＬ）に関しては、総ての時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．０１）、ＵＷ群とＳｉｍ群との間でも認められた（ｐ＜０．０１）（図４Ｃ）。スーパーオキシドアニオンフリーラジカルの腎レベル（ＳＯＡ）に関しては、総ての時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．００１）、ＵＷ群とＳｉｍ群との間でも認められた（ｐ＜０．００１）（図４Ｄ）。腫瘍壊死因子αの腎レベル（ＴＮＦα）については、総ての時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．０１）、ＵＷ群とＳｉｍ群との間でも認められた（ｐ＜０．０１）（図４Ｅ）。インターロイキン−６の腎レベル（ＩＬ−６）については、総ての時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．０５）、ＵＷ群とＳｉｍ群との間では３日の時点において認められた（ｐ＜０．０１）（図４Ｆ）。ＩκＢの腎レベルによって測定したＮＦκＢ転写因子の活性化（ＩκＢ）に関しては、総ての時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．０１）、ＵＷ群とＳｉｍ群との間でも認められた（ｐ＜０．０１）（図４Ｇ）。可溶型ＩＣＡＭ−１接着分子のレベル（ｓＩＣＡＭ−１）に関しては、総ての時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．０１）、ＵＷ群とＳｉｍ群との間でも認められた（ｐ＜０．０１）（図４Ｈ）。可溶型ＶＣＡＭ−１接着分子のレベル（ｓＶＣＡＭ−１）に関しては、総ての時点においてＵＷ群とＵＷ［ＣＴ１］群との間に有意差が認められ（ｐ＜０．０１）、ＵＷ群とＳｉｍ群との間でも認められた（ｐ＜０．０１）（図４Ｉ）。
【０１８５】
実施例５．カルジオトロフィン１濃度０．２ｍｇ／Ｌでの冷心肺保存の研究
本研究は雄ウィンスター系ラット（２８０〜３２０ｇ）において行った。腹膜内チオペンタール（３０ｍｇ／ｋｇ）によりラットに麻酔し、気管切開を行い、気管挿管した。ラットを齧歯類用ベンチレーター(Harvard instrument, MA, USA)とつなぎ、周囲空気を通した。ラットに５０ＩＵのヘパリンを、陰茎静脈を通じて投与し、５分後に腹腔鏡下で胸骨切開を行った。胸部大静脈を切断し、２０ｍｌの冷ウィスコンシン液を用いて水圧２０ｃｍで肺動脈を通して肺を灌流した。肺を膨らませ、気管を結紮した後、心肺ブロックを動物から分離し、４０ｍｌのウィスコンシン液が入った容器に入れ、４℃で０時間、２４時間および４８時間それを維持した。その時間が経過したら、心臓および肺を分離し、重量を測定し、液体窒素中で凍結した。それぞれの時間の動物の半数において、カルジオトロフィン−１を濃度０．２μｇ／ｍｌで保存液に加えた（ｎ＝５）。
【０１８６】
従って、実験群は以下となるであろう：
１．０時点−対照：ＣＴ−１不含ウィスコンシン液で灌流したら、臓器を直ちに凍結する（Ｎ＝５）。
２．０時点−ＣＴ−１：ＣＴ−１含有ウィスコンシン液で灌流したら、臓器を直ちに凍結する（Ｎ＝５）。
３．２４時間時点−対照：ＣＴ−１不含ウィスコンシン液で灌流したら、臓器をＣＴ−１不含ウィスコンシン液中で２４時間保存する（Ｎ＝５）。
４．２４時間時点−ＣＴ−１：ＣＴ−１含有ウィスコンシン液で灌流したら、臓器をＣＴ−１含有ウィスコンシン液中で２４時間保存する（Ｎ＝５）。
５．４８時間時点−対照：ＣＴ−１不含ウィスコンシン液で灌流したら、臓器をＣＴ−１不含ウィスコンシン液中で４８時間保存する（Ｎ＝５）。
６．４８時間時点−ＣＴ−１：ＣＴ−１含有ウィスコンシン液で灌流したら、臓器をＣＴ−１含有ウィスコンシン液中で４８時間保存する（Ｎ＝５）。
【０１８７】
用いたカルジオトロフィンはラットＣＴ−１であった。
【０１８８】
予め決定した時間での冷保存後に、様々な対象パラメーターを分析するためのサンプルを準備し、分析した。凍結した肺および心臓を、（０．５０ｍｌ／ｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００も含めた）５容量のｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）中４℃で、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５ホモジナイザ−(IKA, Staufen)を用いて１３，０００ｒｐｍで２分間ホモジナイズした。遠心分離後、上清を得、ローリー法を用いてそのタンパク質濃度を測定した。この場合、肺については、ｉＮＯＳ誘導、ｐ６５  ＮＦκＢレベル、ｐＮＦκＢレベルおよびＳＯＡ産生を評価した。心臓については、ｉＮＯＳ誘導、ｐ６５  ＮＦκＢレベル、ＩＣＡＭレベル、ＳＯＡ産生およびＴＮＦα産生を評価した。
【０１８９】
この場合に用いる抗体は、前の実験に用いたものとは異なる企業のものであり、それらは以下である：
α−チューブリン抗体（Cell Signaling, ２１４４）（ローディング対照）
ｉＮＯＳ／ＮＯＳ  ＩＩ型抗体（Ｓ−２０）（Santa Cruz, Biotechnology, ｓｃ−６５１）
ＮＦκＢ抗体（Cell Signaling, ＮＦκＢ  ｐ６５，  ９２４２）
ｐＮＦκＢ抗体（Cell Signaling, ｐ−ＮＦκＢ  ｐ６５，  ３０３１）
ＩＣＡＭ−１抗体（Labgen, ＣＴＳ  １１３３３）
活性型カスパーゼ３抗体（Ａｓｐ−１７５）（Cell Signaling, ９６６１）
図５Ａは、ＣＴ−１不含ウィスコンシン液を用いた保存によって、ラット肺において誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）発現（チューブリンによって補正した）の増加が誘導され、２４時間の保存ではそのようであり、４８時間の保存ではなおさらそのようであることを示している。ＣＴ−１含有ウィスコンシン液を用いて保存した場合にはこの増加は認められない。
【０１９０】
図５Ｂは、ＣＴ−１不含ウィスコンシン液を用いた２４時間および４８時間の保存によって、ラット肺においてｐ６５  ＮＦκＢ発現の小幅な増加が誘導されることを示している。ＣＴ−１含有ウィスコンシン液を用いて保存した場合にはこの増加は認められない。
【０１９１】
図５Ｃは、ＣＴ−１不含ウィスコンシン液を用いた２４時間および４８時間の保存によって、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ６５  ＮＦκＢ（ｐ  ＮＦκＢ）組織レベルの著しい上昇が誘導されることを示している。ＣＴ−１含有ウィスコンシン液を用いて肺を保存した場合にはこの上昇は認められない。
【０１９２】
図５Ｄは、ＣＴ−１不含ウィスコンシン液を用いたラット肺の２４時間および４８時間の保存によって、スーパーオキシドアニオン濃度の著しい上昇が誘導されることを示している。ＣＴ−１含有ウィスコンシン液を用いて保存した場合にはこの上昇はずっと小さい。
【０１９３】
図６Ａは、ＣＴ−１不含ウィスコンシン液を用いた保存によって、ラット心臓において誘導型一酸化窒素合成酵素発現（チューブリンによって補正した）の増加が誘導され、２４時間の保存ではそのようであり、４８時間の保存ではなおさらそのようであることを示している。この増加は、ＣＴ−１含有ウィスコンシン大学液を用いて保存した場合と違いはなかった。
【０１９４】
図６Ｂは、ＣＴ−１不含ウィスコンシン液を用いた４８時間の保存によって、ラット心臓においてｐ６５  ＮＦκＢ発現の増加が誘導されることを示している。ＣＴ−１含有ウィスコンシン液を用いて保存した場合にはこの増加は認められなかった。
【０１９５】
図６Ｃは、ＣＴ−１不含ウィスコンシン液を用いた２４時間および４８時間の保存によって、ラット心臓においてＩＣＡＭ−１組織レベルの著しい上昇が誘導されることを示している。この上昇は、ＣＴ−１含有ウィスコンシン液を用いて保存した場合と同様である。
【０１９６】
図６Ｄは、ＣＴ−１不含ウィスコンシン液を用いた２４時間および４８時間の保存によって、ラット心臓においてスーパーオキシドアニオン（ＳＯＡ）濃度の著しい上昇が誘導されることを示している。ＣＴ−１含有ウィスコンシン液を用いて保存した場合にはこの上昇は著しく小さい。
【０１９７】
図７は、保存液（ウィスコンシン大学液）にＣＴ−１を加えた場合には、該保存液中に認められるＴＮＦ−αの量が、ＣＴ−１を加えなかった場合よりも少ないことを示している。これは保存２４時間および４８時間の両方の時点において認められる（０時点の保存液ではＴＮＦ−αは検出されない）。
【０１９８】
実施例６．カルジオトロフィン１濃度０．２ｍｇ／Ｌの場合の、冷保存誘発性腎損傷に対する、洗浄液、保存液またはそれらの両方に入っているカルジオトロフィン１の保護効果の比較
ウィンスター系ラット（雄２２５〜２５０ｇ／ラット）を用いた。塩化ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）＋ジアゼパム（５０ｍｇ／ｋｇ）およびアトロピン（２０ｍｇ／ｋｇ）の腹膜内注射によってラットに麻酔した。正中開腹を行い、後腹膜を切開して、腹部大動脈および腎動脈〜大動脈分岐部（腸骨動脈）を露出した。続いて、腎血管を、下副腎動脈分枝部および性腺動脈分枝部を結紮することによって解離し、尿管をその近位半分に切開し、尿管周囲脂肪を保存した。
【０１９９】
次いで、臓器の灌流のために、腎動脈口下で大動脈をクランプし、それによって血管新生を維持した（洗浄灌流  Ｗ）。分岐部の高さでの遠位結紮後に、前面での大動脈横切開によって大動脈カテーテル挿入を行った。クランプを外して、冷臓器保存組成物（ＣＴ−１含有または不含の、１ｍｇ／Ｋｇヘパリンナトリウム含有ウィスコンシン大学（ＵＷ）液）での冷灌流（４℃）を開始したら、左腎動脈上での結紮によって大動脈を閉塞した。大静脈との接合部で切断した腎静脈を通じて排液を行った。腎臓を灌流したら、大動脈および尿管を切断することにより腎臓を分離し、２０ｍｌの保存液（０．２ｍｇ／Ｌ  ＣＴ−１含有または不含の０．２５ｍｇ／Ｌのヘパリンナトリウム含有ウィスコンシン大学（ＵＷ）液）に浸漬した。腎臓を保存液中で２４時間または４８時間維持した。
【０２００】
研究群は６群であった：
１−Ｐ−２４時間群：ＣＴ−１を保存液に含めたが、洗浄液には含めなかった場合の２４時間の保存。
２−Ｗ−２４時間群：ＣＴ−１を洗浄液に含めたが、保存液には含めなかった場合の２４時間の保存。
３−Ｐ＋Ｗ−２４時間群：ＣＴ−１を保存液にも洗浄液にも含めた場合の２４時間の保存。
４−Ｐ−４８時間群：ＣＴ−１を保存液に含めたが、洗浄液には含めなかった場合の４８時間の保存。
５−Ｗ−４８時間群：ＣＴ−１を洗浄液に含めたが、保存液には含めなかった場合の４８時間の保存。
６−Ｐ＋Ｗ−４８時間群：ＣＴ−１を保存液にも洗浄液にも含めた場合の４８時間の保存。
【０２０１】
各群を５動物で構成した。
【０２０２】
保存時間が経過したら、腎臓を保存媒質から取り出し、冷生理食塩水で洗浄し、直ちに液体窒素中で凍結した。
【０２０３】
評価したパラメーターは、酸化的ストレスの指標としてのスーパーオキシドアニオン（ＳＯＡ）フリーラジカルの産生；および腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）の産生、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）およびＩＣＡＭ−１接着分子の組織レベル、ならびに腎臓における保存誘発性炎症過程マーカーとしてのＮＦκＢ転写因子活性化（ホスホ−ｐ６５およびＩκＢの組織レベルとして測定）であった。
【０２０４】
サンプル調製および分析ならびにＳＯＡ、ＴＮＦα、ｉＮＯＳ、ＩＣＡＭ−１およびＮＦκＢ活性化を決定するための方法は、材料および方法の節に記載した。
【０２０５】
保存を２４時間行った場合に得られた結果は以下の通りであった。
【０２０６】
・ＳＯＡ組織レベルは、洗浄液にも保存液にもＣＴ−１を加えた場合により低かったが、保存液にのみ（Ｐ）、洗浄液にのみ（Ｗ）またはそれらの両方に（Ｐ＋Ｗ）ＣＴ−１を加えた場合では有意差は認められなかった（図８Ａ）。
【０２０７】
・洗浄液に（Ｗ）または保存液にも洗浄液にも（Ｐ＋Ｗ）ＣＴ−１を入れた場合には、保存液中のＴＮＦαレベルは、保存液にのみＣＴ−１を入れた場合（Ｐ）よりも著しく低く（図８Ｂ）、これらの２群の間に有意差はなかった。
【０２０８】
・保存液にのみ（Ｐ）、洗浄液にのみ（Ｗ）またはそれらの両方に（Ｐ＋Ｗ）ＣＴ−１を入れた場合では、腎組織におけるｉＮＯＳ（チューブリンによって補正した）レベルに有意差はない（図８Ｃ）。
【０２０９】
・保存液にのみ（Ｐ）、洗浄液にのみ（Ｗ）またはそれらの両方に（Ｐ＋Ｗ）ＣＴ−１を入れた場合では、腎組織におけるＩＣＡＭ−１接着分子（チューブリンによって補正した）レベルに有意差は認められなかった（図８Ｄ）。保存液にのみ（Ｐ）、洗浄液にのみ（Ｗ）またはそれらの両方に（Ｐ＋Ｗ）ＣＴ−１を入れた場合では、ＮＦκＢ転写因子腎活性化（ＩκＢ組織レベルとして測定した）に有意差は認められなかった（図８Ｅ）。
【０２１０】
・保存液にのみ（Ｐ）、洗浄液にのみ（Ｗ）またはそれらの両方に（Ｐ＋Ｗ）ＣＴ−１を入れた場合では、ＮＦκＢ転写因子腎活性化（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ６５組織レベルとして測定した）に有意差は認められなかった（図８Ｆ）。
【０２１１】
保存を４８時間行った場合に得られた結果は以下であった：
・保存液にも洗浄液にもＣＴ−１を入れた場合（Ｐ＋Ｗ）には、ＳＯＡ組織レベルは、保存液にのみそれを入れた場合（Ｐ）より低かったが、洗浄液にのみそれを加えた場合（Ｗ）と差はないことが認められた（図８Ｇ）。
【０２１２】
・保存液にも洗浄液にもＣＴ−１を入れた場合（Ｐ＋Ｗ）には、灌流液中のＴＮＦ−αレベルは、保存液にのみそれを入れた場合（Ｐ）より低かったが、洗浄液にのみそれを入れた場合（Ｗ）と差はなかった（図８Ｈ）。
【０２１３】
・保存液にも洗浄液にもＣＴ−１を入れた場合（Ｐ＋Ｗ）には、ｉＮＯＳ（チューブリンによって補正した）組織レベルは、保存液にのみ（Ｐ）または洗浄液にのみ（Ｗ）それを入れた場合より低かったが、それらに有意差はなかった（図８Ｉ）。
【０２１４】
・保存液にのみ（Ｐ）、洗浄液にのみ（Ｗ）、または保存液にも洗浄液にも（Ｐ＋Ｗ）ＣＴ−１を入れた場合では、ｉＣＡＭ（チューブリンによって補正した）組織レベルに有意差はなかった（図８Ｊ）。保存液にのみ（Ｐ）、洗浄液にのみ（Ｗ）またはそれらの両方に（Ｐ＋Ｗ）ＣＴ−１を入れた場合では、ＮＦκＢ転写因子腎活性化（ＩκＢ組織レベルとして測定した）に有意差は認められなかった（図８Ｋ）。
【０２１５】
・保存液にのみ（Ｐ）、洗浄液にのみ（Ｗ）またはそれらの両方に（Ｐ＋Ｗ）ＣＴ−１を入れた場合では、ＮＦκＢ転写因子腎活性化（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ６５組織レベルとして測定した）に有意差はなかった（図８Ｌ）。
【０２１６】
この研究では、ＣＴ−１不含の保存液および洗浄液を使用する対照群を含めていないが、該対照を含めた前の比較実験において得られたデータは、総ての分析群（保存液中にのみ（Ｐ）、洗浄液中にのみ（Ｗ）またはそれらの両方に（Ｐ＋Ｗ）ＣＴ−１）において、ＳＯＡ、ｉＮＯＳ（チューブリンによって補正した）、ＩＣＡＭ（チューブリンによって補正した）、ＩκＢおよびｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ６５の組織レベル、ならびに灌流液中のＴＮＦ−αレベルが、該対照群において観測されたものより、常にずっと低かったことを示し、記載した３条件のいずれの場合にも用いたＣＴ−１の抗酸化作用および抗炎症作用を実証していることを指摘することが重要である。
【０２１７】
結論
上記研究から、まずに、移植のために用いる冷臓器保存液にＣＴ−１を加えることによって、それがユーロコリンズ液であろうとウィスコンシン大学液であろうと、特には、ウィスコンシン大学液を非常に長い保存時間（２４〜４８時間）に付した場合に、保存される腎臓での酸素フリーラジカルの産生は減少すると結論づけられる。ユーロコリンズ保存液とＵＷ保存液は組成がまったく異なっているため、ＣＴ−１は他の冷保存液に関しても同様に効果的であると考えるのが妥当であろう。
【０２１８】
第二に、ＣＴ−１の保護効果は、ユーロコリンズ液を基礎溶液として用いて腎臓を保存した場合により明らかであり、それは恐らく、ユーロコリンズ液が腎臓の冷保存において提供する性能がより低いためである。しかしながら、行ったアッセイでは、ＣＴ−１含有ＵＷ液を用いた場合に、冷保存および再灌流の両方で最良の結果が得られた。
【０２１９】
最後に、保存された腎臓を同系ラットに移植する場合に、冷保存液にＣＴ−１を加えることによって、動物の生存、腎機能、組織学的損傷、酸化的ストレス、炎症誘発性サイトカインの産生、ｉＮＯＳの誘導、好中球の浸潤およびＮＦκＢ転写因子の活性化は、ＣＴ−１不含の冷保存液中で保存された腎臓と比べて改善される。
【０２２０】
要するに、冷保存液にＣＴ−１を添加することで、冷虚血によって引き起こされる損傷や、虚血／移植後再灌流（腎臓における急性尿細管壊死の原因）によって引き起こされる損傷を防ぎ減少させ、それによって、腎機能および生存が改善されるといえる。
【０２２１】
加えて、心肺ブロックに関しては、実験により、心肺ブロックの冷保存液にＣＴ−１を添加することで、生じるＮＦκＢ活性化は低下し、心臓および肺の両方においてスーパーオキシドアニオン（ＳＯＡ）産生は減少し、さらに保存液へのＴＮＦ−α放出も減少すると結論付けることができ、虚血および冷保存により刺激される酸化過程および炎症過程の誘導がより少なくなることが実証されている。
【０２２２】
肺の場合、さらに、冷保存液にＣＴ−１を添加することで、生じるｉＮＯＳ誘導が減少することも観察される。
【０２２３】
最後に、ラットにおいてウィスコンシン大学冷保存液を用いた実験腎保存モデルでは、腎臓洗浄液にのみＣＴ−１を加えた場合でも、測定した抗酸化作用および抗炎症作用に関する因子に関しては、洗浄液および保存液の両方にＣＴ−１を加えた場合より悪い結果は生じないことが見出された。このことから、臓器保存プロセスでのＣＴ−１の処理を非常に単純化することおよびＣＴ−１へのレシピエントの潜在的曝露を著しく減少させることも可能であろう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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