(57)【要約】グルコマンナン、キサンタンガムおよびアルギネートの混合物を含む食物サプリメントおよび食品。食品およびサプリメントは、代謝症候群、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、膵疾患または高脂血症の少なくとも１つの症状の発症を遅延させ、進行を遅らせ、かつ／または回復させるために使用する。グルコマンナン、キサンタンガムおよびアルギネートの混合物を、多糖類の酸加水分解、およびそれに続くクロマトグラフィー分離が関与する炭水化物分析の標準的な方法を用いて分析する。
2013525269.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝性疾患または障害と関連する１つまたは複数の症状の予防、処置、または回復のための医療食品であって、該医療食品は、
高粘性多糖類食物繊維組成物であって、約４８％〜約９０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約５％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約５％〜約３０％（ｗ／ｗ）のアルギネートを含む粘性繊維ブレンドまたはその複合体を含む、高粘性多糖類食物繊維組成物、ならびに
タンパク質、炭水化物、および脂肪からなる群より選択される少なくとも１種の多量養素
を含み、該医療食品は、代謝性疾患または障害と関連する１つまたは複数の症状の予防、処置、または回復のために調合される、医療食品。
【請求項２】
約１０ｇ〜約１００ｇの１日用量の前記高粘性多糖類食物繊維組成物を提供するために調合されるものである、請求項１に記載の医療食品。
【請求項３】
約１５ｇ〜約３５ｇの１日用量の前記高粘性多糖類食物繊維組成物を提供するために調合されるものである、請求項１に記載の医療食品。
【請求項４】
前記食物繊維組成物が、約６０％〜約８０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約１０％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約１０％〜約２０％（ｗ／ｗ）のアルギネートを含む、請求項１に記載の医療食品。
【請求項５】
前記代謝性疾患または障害が、代謝症候群、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、膵疾患、および高脂血症からなる群より選択される、請求項１に記載の医療食品。
【請求項６】
医療食品製品を調製する方法であって、グルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギネートを含む有効量の食物繊維組成物を、医療食品製品に加えるステップを含む、方法。
【請求項７】
前記医療食品は、代謝性疾患または障害と関連する１つまたは複数の症状の予防、処置、または回復のために調合される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記食物繊維組成物が、約６０％〜約８０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約１０％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約１０％〜約２０％（ｗ／ｗ）のアルギネートを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記医療食品は、約１０ｇ〜約１００ｇの１日用量の前記高粘性多糖類食物繊維組成物を提供するために調合される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
代謝性疾患または障害と関連する１つまたは複数の症状を予防、処置、または回復させるための方法であって、該方法は、代謝性疾患または障害と関連する１つまたは複数の症状の予防、処置、または回復を必要としているヒト被験体に、約２５ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日の高粘性多糖類食物繊維組成物を、該被験体において該代謝性疾患または障害と関連する１つまたは複数の症状を予防、処置または回復させるのに有効な期間の間投与するステップを含み、該高粘性多糖類食物繊維組成物は、約４８％〜約９０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約５％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約５％〜約３０％（ｗ／ｗ）のアルギネートを含む繊維ブレンドまたはその複合体を含む、方法。
【請求項１１】
前記代謝性疾患または障害が、代謝症候群、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、膵疾患、および高脂血症からなる群より選択される、請求項７または１０に記載の方法。
【請求項１２】
代謝性疾患または障害と関連する１つまたは複数の症状の予防、処置、または回復を必要としている前記被験体が、インスリン抵抗性を患っているか、またはインスリン抵抗性を生じる危険性がある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
代謝性疾患または障害と関連する１つまたは複数の症状の予防、処置、または回復を必要としている前記被験体が、グルコースによって誘導される器官損傷を患っているか、またはグルコースによって誘導される器官損傷を生じる危険性がある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記食物繊維組成物を、少なくとも１日１回少なくとも２週間の期間の間投与するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記食物繊維組成物が、医療食品製品として投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ＩＩ型糖尿病に罹患したか、またはＩＩ型糖尿病を発症する危険性がある被験体においてインスリン抵抗性の進行と関連する少なくとも１つの症状を回復させるための方法であって、該方法は、インスリン抵抗性の進行と関連する少なくとも１つの症状の回復を必要としている哺乳動物被験体に、約２５ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日の高粘性多糖類食物繊維組成物を少なくとも２週間の期間の間投与するステップを含み、該高粘性多糖類食物繊維組成物は、約４８％〜約９０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約５％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約５％〜約３０％（ｗ／ｗ）のアルギネートを含む繊維ブレンドまたはその複合体を含む、方法。
【請求項１７】
前記食物繊維組成物が、約６０％〜約８０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約１０％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約１０％〜約２０％（ｗ／ｗ）のアルギネートを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記食物繊維組成物が、医療食品製品として投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１種の多糖類を含む試料中の構成糖を決定するための方法であって、
（ａ）少なくとも１種の多糖類を含む試料を酸で加水分解して、加水分解産物を生成するステップと、
（ｂ）該加水分解産物中の加水分解生成物をクロマトグラフィー法によって分離するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において分離した該加水分解生成物を検出するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において検出された該加水分解生成物と１つまたは複数の参照標準とを比較して、該試料中の構成糖を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）において使用する前記酸が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ａ）における前記加水分解が、４８〜７２時間の期間の間行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）における前記加水分解が、９５℃〜１１０℃の温度で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記クロマトグラフィー法によって、中性糖をウロン酸から分離することができる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記クロマトグラフィー法が、Ｄｉｏｎｅｘ酸クロマトグラフィーを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が、少なくとも１種の食物繊維を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料が、アルギン酸ナトリウムを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料が、グルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギン酸ナトリウムを含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１０年３月１０日に出願された出願番号６１／３１２，６３０号、および２０１０年６月２３日に出願された出願番号６１／３５７，６５８号の利益を主張し、これらの開示は、その全容が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、食物繊維組成物、食物繊維組成物を含む医療食品、ならびに代謝症候群およびＩＩ型糖尿病の発症を遅延させ、かつ／またはその重症度を低下させるためのこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ＩＩ型糖尿病の発症をもたらし得る状態である肥満症および代謝症候群は、益々一般的になっている。内臓肥満、血清グルコース、およびインスリンレベルの増加は、高血圧症および脂質異常症と共に、代謝症候群と総称される一群の臨床状態である（非特許文献１）。これらの状態は細胞のインスリン抵抗性が高まることによることが見出されており、多くの場合、これらの症状は、ＩＩ型糖尿病の前兆である。代謝症候群を同定する正確な診断基準については現在議論があり、この処置のための医薬品は承認されていないが、関連する脂質異常症および高血圧症は、特定の薬物介入がなされている。ＩＩ型糖尿病は典型的には、血糖を制御する様々な医薬品によって管理され、より重症な例ではインスリン注射によって管理される。しかし、代謝症候群およびＩＩ型糖尿病の両方と関連する多くの代謝異常を治す上で、食事および体重減少が主要な役割を果たしている（非特許文献２）。調査によって、代謝症候群を有する人は、深刻な冠状動脈事象を起こす危険性が５０％を超えることが示されている（非特許文献３）。したがって、体重、空腹時インスリン、およびグルコースにおける任意の減少によって、それに罹患した個体は著しい健康上の利点を得る。
【０００４】
高い血糖上昇指数を有する食品の摂取は、過食および肥満症をもたらすことが公知である（非特許文献４）。したがって、糖尿病または前糖尿病状態の管理、および体重減少において使用される任意の薬剤は、血糖上昇指数が低いことが好ましい。このような薬剤は、食品の血糖上昇指数を減少させる場合に最も好ましい。
【０００５】
糖尿病状態の管理を成功させる上で、炭水化物摂取量の減少も必要とされる。食事カウンセリングは有益であるが、糖尿病患者は、低血糖の状態をより頻繁に経験すると、食品に対するより強い欲求を経験する（非特許文献５）。さらに、糖尿病患者において血中グルコース値を減少させる治療は、体重増加という望ましくない副作用を伴うことが多い（非特許文献６）。可溶性繊維に富む食物は、インスリン感受性の増加によって糖尿病の危険性を減少し得ることが報告されている（非特許文献７）。これは、食物繊維が血糖制御において果たし得る役割によって起こる可能性がある。低粘度の食事と比較して、高粘度の食事によってより大きな満腹感を得られることがまた報告されてきた（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｅ．Ｊ．  Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．、（２００８年）３７巻：５５９〜７９頁
【非特許文献２】Ｙｉｐら、Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｒｅｓ．、（２００１年）９巻：３４１Ｓ〜３４７Ｓ頁
【非特許文献３】Ｄ．Ｅ．  Ｍｏｌｌｅｒら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．、（２００５年）５６巻：４５〜６２頁
【非特許文献４】Ｌｕｄｗｉｇら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、（１９９９年）１０３巻（３号）：Ｅ２６頁
【非特許文献５】Ｓｔｒａｃｈａｎら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｅｈａｖ．、（２００４年）８０巻（５号）：６７５〜８２頁
【非特許文献６】Ｓｃｈｕｌｔｅｓら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂｏｌ．、（２００３年）８８巻（３号）：１１３３〜４１頁
【非特許文献７】Ｙｌｏｎｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、（２００３年）２６巻：１９７９〜８５頁
【非特許文献８】Ｍａｒｃｉａｎｉら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、（２００１年）２８０巻：Ｇ１２２７〜３３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、血糖値を減少させること、および満腹を促すことによって、糖尿病状態を含めた代謝症候群の管理を支援する食物繊維組成物が必要とされている。本発明は、この必要性などに対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
一態様において、本発明は、代謝性疾患または障害と関連する１つもしくは複数の症状の予防、処置、または回復のために調合された医療食品を提供する。本発明のこの態様による医療食品は、約４８％〜約９０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約５％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約５％〜約３０％（ｗ／ｗ）のアルギネートを含む粘性繊維ブレンド（「ＶＦＢ」）またはその複合体（「ＶＦＣ」）を含む高粘性多糖類食物繊維組成物と、タンパク質、炭水化物、および脂肪からなる群より選択される少なくとも１種の多量養素とを含む。
【０００９】
別の態様において、本発明は、グルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギネートを含む粘性繊維ブレンド（ＶＦＢ）またはその複合体（「ＶＦＣ」）を含む有効量の食物繊維組成物を医療食品製品に加えるステップを含む、医療食品製品を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、医療食品製品は、代謝性疾患または障害と関連する１つもしくは複数の症状の予防、処置または回復のために調合される。いくつかの実施形態において、医療食品製品に加えられる食物繊維組成物は、約４８％〜約９０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約５％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約５％〜約３０％（ｗ／ｗ）のアルギネートを含む。
【００１０】
別の態様において、本発明は、代謝性疾患または障害と関連する１つもしくは複数の症状を予防、処置、または回復させる方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、それを必要としているヒト被験体に、被験体において代謝性疾患または障害と関連する１つもしくは複数の症状を予防、処置、または回復させるのに有効な期間の間、約４８％〜約９０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約５％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約５％〜約３０％（ｗ／ｗ）のアルギネートを含む粘性繊維ブレンド（ＶＦＢ）またはその複合体（ＶＦＣ）を含む、約２５ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日の高粘性多糖類食物繊維組成物を投与することを含む。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、ＩＩ型糖尿病に罹患したか、またはそれを発症する危険性がある哺乳動物被験体においてインスリン抵抗性の進行と関連する少なくとも１つの症状を回復させる方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、それを必要としている哺乳動物被験体に、約４８％〜約９０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約５％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約５％〜約３０％（ｗ／ｗ）のアルギネートを含む粘性繊維ブレンド（ＶＦＢ）またはその複合体（ＶＦＣ）を含む、約２５ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日の高粘性多糖類食物繊維組成物を少なくとも２週間の期間投与することを含む。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、少なくとも１種の多糖類を含む試料中の構成糖を決定する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、（ａ）少なくとも１種の多糖類を含む試料を酸で加水分解して、加水分解産物を生成することと、（ｂ）加水分解産物中の加水分解生成物をクロマトグラフィー法によって分離することと、（ｃ）ステップ（ｂ）において分離した加水分解生成物を検出することと、（ｄ）ステップ（ｃ）において検出された加水分解生成物と１つまたは複数の参照標準とを比較して、試料中の構成糖を決定することとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明の上記の態様および付随する利点の多くは、添付の図面と共に、下記の詳細な説明を参照することによってより良好に理解され、より容易に認識される。
【図１】図１Ａは、実施例１に記載のように、ズッカー糖尿病ラットにおける８週間の研究の間の経時的な、体重（ｇ）に対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物の効果を図表によって例示する。図１Ｂは、実施例１に記載のように、ズッカー糖尿病ラットにおける８週間の研究の間の経時的な、食品消費量（ｇ／日）に対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物の効果を図表によって例示する。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例１に記載のように、ズッカー糖尿病ラットにおける８週間の研究の間の経時的な、空腹時血中グルコース値（ｍｇ／ｄＬ）に対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例１に記載のように、ズッカー糖尿病ラットにおける８週間の研究の間の経時的な、空腹時血清インスリン値（ｎｇ／ｍＬ）に対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実施例１に記載のように、ズッカー糖尿病ラットにおける８週間の研究の間の経時的な、非空腹時血中グルコース値（ｍｇ／ｄＬ）対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。
【図２Ｄ】図２Ｄは、実施例１に記載のように、ズッカー糖尿病ラットにおける８週間の研究の間の経時的な、空腹時恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ）スコア（ｍｇ＊Ｕ／ｍｌ２）に対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例１に記載のように、８週間の研究の間、ＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられた絶食ズッカー糖尿病ラットについての複合インスリン感受性指数（ＣＩＳＩ）スコアを図表によって例示する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例１に記載のように、８週間の研究の間、ＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられた非絶食ズッカー糖尿病ラットについての複合インスリン感受性指数（ＣＩＳＩ）スコアを図表によって例示する。
【図３Ｃ】図３Ｃは、実施例１に記載のように、８週間の研究の間、ＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられた非絶食ズッカー糖尿病ラットについてのＨＯＭＡスコアを図表によって例示する。
【図４】図４は、実施例１に記載のように、８週間の研究の間、ＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられた絶食ズッカー糖尿病ラットにおいて測定した血清トリグリセリドのレベルを図表によって例示する。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例１に記載のように、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間後の尿細管拡張についての、ズッカー糖尿病ラットに対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例１に記載のように、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間後の尿細管変性／再生についての、ズッカー糖尿病ラットに対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。
【図５Ｃ】図５Ｃは、実施例１に記載のように、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間後の腎臓メサンギウム拡大についての、ズッカー糖尿病ラットに対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。
【図６】図６は、実施例１に記載のように、抗ラットインスリン抗体で染色することによって決定して、８週間の研究の終わりにＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられたズッカー糖尿病ラット中に存在する膵島インスリン免疫反応性領域の百分率を図表によって例示する。
【図７Ａ】図７Ａは、実施例１に記載のように、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間の研究の終わりにＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられたズッカー糖尿病ラット中に存在する膵島単核炎症性細胞浸潤物についての組織学的スコアを図表によって例示する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施例１に記載のように、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間の研究の終わりにＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられたズッカー糖尿病ラット中に存在する膵島細胞変性についての組織学的スコアを図表によって例示する。
【図７Ｃ】図７Ｃは、実施例１に記載のように、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間の研究の終わりにＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられたズッカー糖尿病ラット中に存在する膵島線維形成の量についての組織学的スコアを図表によって例示する。
【図８Ａ】図８Ａは、実施例１に記載のように、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、減少したＳｕｄａｎ  ｂｌａｃｋ染色によって測定した、８週間後の脂肪肝についての、ズッカー糖尿病ラットに対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、実施例１に記載のように、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間後の肝臓の微小胞空胞化（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ）についての、ズッカー糖尿病ラットに対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。
【図８Ｃ】図８Ｃは、実施例１に記載のように、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間後の肝臓の大型小胞空胞化（ｍａｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ）についての、ズッカー糖尿病ラットに対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。
【図９】図９は、実施例２に記載のように、４３週間の研究にわたってスクロースを与えられたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける体重増加および血清トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）に対するＶＦＣまたはセルロースの効果を図表によって例示する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、実施例４に記載のように、３週間の研究期間（Ｖ１＝研究の開始、０日目；Ｖ２＝１４日目；Ｖ３＝２１日目）にわたる、全ての健康な成人の研究参加者における血漿ＰＹＹレベルに対するＶＦＣまたは対照（脱脂粉乳）の効果を図表によって例示する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、実施例４に記載のように、３週間の研究期間（Ｖ１＝研究の開始、０日目；Ｖ２＝１４日目；Ｖ３＝２１日目）にわたる、ＢＭＩ＜２３の健康な成人の研究参加者における血漿ＰＹＹレベルに対するＶＦＣまたは対照（脱脂粉乳）の効果を図表によって例示する。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、実施例４に記載のように、３週間の期間（Ｖ１＝研究の開始、０日目；Ｖ２＝１４日目；Ｖ３＝２１日目）にわたる、健康な成人の研究参加者における空腹時グレリンレベルに対するＶＦＣまたは対照（脱脂粉乳）の効果を図表によって例示する。
【図１１Ａ】図１１Ａは、実施例６に記載のように、０．５％（ｗ／ｗ）での非顆粒化ＶＦＢ（３成分混合物１、「ＴＭ１」と称する）および加工済（例えば、顆粒化）ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の流動曲線の比較を図表によって例示する。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、実施例６に記載のように、０．２％（ｗ／ｗ）での非顆粒化ＶＦＢ（３成分混合物１、「ＴＭ１」と称する）および加工済（例えば、顆粒化）ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の流動曲線の比較を図表によって例示する。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、実施例６に記載のように、０．１％（ｗ／ｗ）での非顆粒化ＶＦＢ（３成分混合物１、「ＴＭ１」と称する）および加工済（例えば、顆粒化）ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の流動曲線の比較を図表によって例示する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、実施例６に記載のように、非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）、加工済（例えば、顆粒化）ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））およびキサンタンガムの冪乗則Ｋの比較を図表によって例示する。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、実施例６に記載のように、非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）、加工済（例えば、顆粒化）ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））およびキサンタンガムの冪乗則ηの比較を図表によって例示する。
【図１３Ａ】図１３Ａは、実施例６に記載のように、２５℃で測定した、０．１％、０．２％、および０．５％（ｗ／ｗ）での、コンニャクグルコマンナンの流動曲線を図表によって例示する。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、実施例６に記載のように、２５℃で測定した、０．１％、０．２％、および０．５％（ｗ／ｗ）での、キサンタンガムの流動曲線を図表によって例示する。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、実施例６に記載のように、２５℃で測定した、０．１％、０．２％、および０．５％（ｗ／ｗ）での、アルギン酸ナトリウムの流動曲線を図表によって例示する。
【図１４Ａ】図１４Ａは、実施例６に記載のように、２５℃で測定した、一定比（ＫＭ：ＸＧ＝４．１２：１）のコンニャクグルコマンナン（ＫＭ）およびキサンタンガム（ＸＧ）、ならびに変動する量のアルギン酸ナトリウム（０％、２％、５％、８％、１１％、１３％、１７％、２１％、２４％、２７％、３０％、および３３％）を含有する、コンニャクグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギン酸ナトリウムを含む３成分混合物の非加熱水性溶液（０．５％濃度）の流動曲線を図表によって例示する。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、実施例６に記載のように、２５℃で測定した、一定比（ＫＭ：ＸＧ＝４．１２：１）のコンニャクグルコマンナン（ＫＭ）およびキサンタンガム（ＸＧ）、ならびに変動する量のアルギン酸ナトリウム（０％、２％、５％、８％、１１％、１３％、１７％、２１％、２４％、２７％、３０％、および３３％）を含有する、コンニャクグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギン酸ナトリウムを含む３成分混合物の１時間加熱した水性溶液（０．５％濃度）の流動曲線を図表によって例示する。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、実施例６に記載のように、２５℃で測定した、一定比（ＫＭ：ＸＧ＝４．１２：１）のコンニャクグルコマンナン（ＫＭ）およびキサンタンガム（ＸＧ）、ならびに変動する量のアルギン酸ナトリウム（０％、２％、５％、８％、１１％、１３％、１７％、２１％、２４％、２７％、３０％、および３３％）を含有する、コンニャクグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギン酸ナトリウムを含む３成分混合物の４時間加熱した水性溶液（０．５％濃度）の流動曲線を図表によって例示する。
【図１５Ａ】図１５Ａは、実施例６に記載のように、一定のＫＭ：ＸＧ比（４．１２：１）および変動する量のアルギネート（０〜３３％）における、コンニャクグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギン酸ナトリウムの混合物の非加熱または加熱した（１時間）０．５％水性溶液についての、混合物中のアルギン酸ナトリウムの割合に対するＫの依存性を図表によって例示する。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、実施例６に記載のように、一定のＫＭ：ＸＧ比（４．１２：１）および変動する量のアルギネート（０〜３３％）における、コンニャクグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギン酸ナトリウムの混合物の非加熱および加熱した（１時間）０．５％水性溶液についての、混合物中のアルギン酸ナトリウムの割合に対するｎの依存性を図表によって例示する。
【図１６Ａ】図１６Ａは、実施例６に記載のように、２ｍｇ／ｍｌのローディング濃度およびＩ＝０．０、４５，０００ｒｐｍのロータースピード、温度＝２０．０℃での、グルコマンナンについての見掛けの沈降濃度分布ｇ＊（ｓ）対ｓを図表によって例示する。縦座標は、スベドベルグ（Ｓ）毎のフリンジ単位で表し、横座標はスベドベルグ単位である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、２ｍｇ／ｍｌのローディング濃度およびＩ＝０．０、４５，０００ｒｐｍのロータースピード、温度＝２０．０℃での、アルギン酸ナトリウムについての見掛けの沈降濃度分布ｇ＊（ｓ）対ｓを図表によって例示する。実施例６に記載のように、縦座標は、スベドベルグ（Ｓ）毎のフリンジ単位で表し、横座標はスベドベルグ単位である。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、２ｍｇ／ｍｌのローディング濃度およびＩ＝０．０、４５，０００ｒｐｍのロータースピード、温度＝２０．０℃での、キサンタンについての見掛けの沈降濃度分布ｇ＊（ｓ）対ｓを図表によって例示する。実施例６に記載のように、縦座標は、スベドベルグ（Ｓ）毎のフリンジ単位で表し、横座標はスベドベルグ単位である。
【図１７Ａ】図１７Ａは、実施例６に記載のように、イオン強度０〜０．２Ｍにおける、未加工／非顆粒化ＶＦＢ（「ＴＭ１」と称する）についての見掛けの沈降濃度分布を図表によって例示する。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、実施例６に記載のように、イオン強度０〜０．０１Ｍにおける、未加工／非顆粒化ＶＦＢ（「ＴＭ１」と称する）についての見掛けの沈降濃度分布を図表によって例示する。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、実施例６に記載のように、イオン強度０〜０．０１Ｍにおける、加工済／顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））についての見掛けの沈降濃度分布を図表によって例示する。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、実施例６に記載のように、イオン強度０〜０．２Ｍにおける、加工済／顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））についての見掛けの沈降濃度分布を図表によって例示する。
【図１８】図１８Ａは、実施例６に記載のように、未加工／非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）についての、沈降係数＞３．５Ｓを有する材料の量に対するイオン強度（モル濃度単位Ｍで表す）の効果を図表によって例示する。図１８Ｂは、実施例６に記載のように、加工済／顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））についての、沈降係数＞３．５Ｓを有する材料の量に対するイオン強度（モル濃度単位Ｍで表す）の効果を図表によって例示する。
【図１９Ａ】図１９Ａは、実施例６に記載のように、固定グルコマンナン：キサンタン比（ＫＭ：ＸＧ＝４．１２：１）および変化するアルギネート濃度（０％〜３３％）を含有する非加熱混合物についての沈降係数分布を図表によって例示する。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、実施例６に記載のように、固定グルコマンナン：キサンタン比（ＫＭ：ＸＧ＝４．１２：１）および変化するアルギネート濃度（０％〜３３％）を含有する加熱（１時間または４時間）混合物についての沈降係数分布を図表によって例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本発明は、代謝性疾患または障害（代謝症候群、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、膵疾患、および／または高脂血症など）の症状の少なくとも１つの発症を遅延させ、進行を遅らせ、かつ／または回復させるのに有効な食物サプリメント、医療食品、および方法を提供する。
【００１５】
本明細書において使用する場合、「代謝症候群」という用語は、高血圧症および脂質異常症に加えて、下記の症状（内臓肥満、血清グルコース、およびインスリン値の増加）の１つまたは複数を意味する（Ｅ．Ｊ．  Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．、３７巻：５５９〜７９頁（２００８年））。代謝症候群は、冠動脈疾患、脳卒中、およびＩＩ型糖尿病と一緒に起こる症状、これらを発症する危険性の増加と関連する症状の群の名称である。代謝症候群の症状には、ウエストの周りの余分な重量（中心性肥満または腹部肥満）、高血圧、高トリグリセリド、インスリン抵抗性、低ＨＤＬコレステロール、および高グルコースによってもたらされる組織の損傷が含まれる。インスリン抵抗性は、代謝症候群の主要な原因であると考えられている。
【００１６】
本明細書において使用する場合、「代謝性疾患または障害の症状の少なくとも１つを回復させる」という用語には、疾患または障害の症状を和らげ、軽減し、またはマスクする対症療法、および処置される状態または症状の重症度の進行を予防、低下、停止、または逆転させるための治療が含まれる。したがって、「処置」という用語には、必要に応じた、確立された状態もしくは症状の医学治療的処置、および／または予防的投与の両方が含まれる。
【００１７】
本明細書において使用する場合、「処置する」という用語はまた、それを必要としている被験体の状態に依存して、代謝性疾患もしくは障害を予防すること、または代謝性疾患もしくは障害の病理と関連する１つもしくは複数の症状（代謝性疾患もしくは障害、またはこれと関連する任意の症状の発症を含めた）を予防すること、および代謝性疾患もしくは障害の重症度を低下させること、または代謝性疾患もしくは障害と関連する１つもしくは複数の症状の再発を予防することを包含する。
【００１８】
本明細書において使用する場合、「医療食品」という用語は、医師の管理下で経腸的に消費または投与されるように処方される食品、疾患または状態に対する特定の食物管理を意図する食品を意味する（認められた科学原理に基づいた特有の栄養要求量が、医学評価によって確立される）。
【００１９】
本明細書において使用する場合、「グルコマンナン」という用語は、概ね３：１の比のβ−（１，４）−連結−Ｄ−マンノースおよびβ−（１，４）−連結−Ｄ−グルコース残基、ならびに様々なα−連結ガラクトース末端基を有する水溶性食物繊維を意味する。これは最も一般的にはコンニャクの根（Ａｍｏｒｐｈｏｐｈａｌｌｕｓ  ｋｏｎｊａｃ）から単離されるが、他の植物供給源からも単離することもできる。
【００２０】
本明細書において使用する場合、「キサンタンガム」という用語は、グルコース、マンノース、グルクロン酸カリウム、グルクロン酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、ピルビン酸カリウムまたはピルビン酸ナトリウムを含有するヘテロ多糖類を意味する。
【００２１】
本明細書において使用する場合、「アルギネート」という用語は、マンヌロン酸およびグルロン酸の混合ポリマーを意味する。
【００２２】
本明細書において使用する場合、「繊維ブレンド」という用語は、繊維の混合物を意味する。
【００２３】
本明細書において使用する場合、「粘性繊維ブレンド」（「ＶＦＢ」）という用語は、グルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギネートの混合物を意味する。
【００２４】
本明細書において使用する場合、「粘性繊維複合体」（「ＶＦＣ」）という用語は、３つの構成成分であるグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギネートのインターロッキングマトリックス（ｉｎｔｅｒｌｏｃｋｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）を意味し、ここで、構成成分は、３つの別々の構成成分の混合物ではなく、相互作用して新規な成分を形成することを可能にする様式（例えば、顆粒化）において加工される。これは、個々の構成成分が、各々がこれらの純粋状態で示す特性を示すことを妨げる二次および三次相互作用（ジャンクションゾーンおよびネットワーク）を未加工成分間で形成することによる。
【００２５】
医療食品
一態様において、本発明は、慢性膵炎、および／または高脂血症に罹患した患者を含めて、代謝性疾患または障害（代謝症候群、Ｉ型もしくはＩＩ型糖尿病、膵外分泌機能不全など）と関連する１つもしくは複数の症状の予防、処置、または回復のために調合された医療食品を提供する。本発明のこの態様による医療食品は、約４８％〜約９０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約５％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約５％〜約３０％（ｗ／ｗ）のアルギネートを含む粘性繊維ブレンド（ＶＦＢ）またはその複合体（ＶＦＣ）を含む高粘性多糖類食物繊維組成物と、タンパク質、炭水化物、および脂肪からなる群より選択される少なくとも１種の多量養素とを含む。
【００２６】
各々が参照により本明細書に組み込まれている、２００６年４月７日に出願された係属中の米国特許出願第１１／４００，７６８号、および２００７年７月３０日に出願された係属中の米国特許出願第１１／８３０，６１５号に記載されているように、非常に高い保水性能力およびゲル形成特性を有する、「ＰｏｌｙＧｌｙｃｏｐｌｅＸ（登録商標）」または「ＰＧＸ（登録商標）」と商業的に称される、約４８％〜約９０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約５％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約５％〜約３０％（ｗ／ｗ）のアルギネートを組み合わせることによって生成される繊維ブレンド（ＶＦＢ）またはその複合体（ＶＦＣ）を含む高粘性多糖類食物繊維組成物が開発されている。この繊維組成物の構成要素である多糖類構成成分は相互補完的であり、相乗的に作用して、任意の他の現在知られている多糖類よりも３〜５倍高い粘度のレベルをもたらす強力な相互作用を形成する。本明細書において実施例５および６に記載するように、加工（例えば、顆粒化）されたとき、３つの構成成分であるグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギネートは相互作用して、個々の構成成分が、各々がこれらの純粋状態で示す特性を示すことを妨げる二次および三次相互作用（ジャンクションゾーンおよびネットワーク）を未加工成分間で形成することによって、３つの別々の構成成分の混合物ではなく、新規な成分（複合体（「ＶＦＣ」））を形成することが決定されている。
【００２７】
この高粘性食物繊維組成物は、他の可溶性繊維において必要とされるであろうものよりも低い重量測定量で、胃腸内容物に粘度の有意な増加を付与する。この高濃縮特性によって、この繊維組成物は、他の可溶性繊維より有意に低い用量で実質的な生理学的作用を付与することが可能となり、したがって、意味のある量のこの材料を食料品に組み込むことがより容易となる。
【００２８】
一実施形態において、粘性繊維ブレンド（ＶＦＢ）の生成において使用される多糖類は、顆粒化によって加工され、３つの構成成分のインターロッキングマトリックス（すなわち、複合体（ＶＦＣ））が生成される。本明細書において使用する場合、「顆粒化」とは、小さな粒子が、より大きな持続性のある凝集物へと一緒に集められるサイズ拡大の任意のプロセスを意味する。顆粒化は、混合機器中の撹拌によって、圧縮、押出し、または球体化によって達成し得る。食物繊維組成物は、様々なメッシュサイズを使用して顆粒化し得る。「メッシュ」という用語は、確定した寸法の穴を有するスクリーンを通過するその能力によって決定される粒子のサイズを意味する。本明細書において使用されるメッシュサイズは、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第５版、Ｐｅｒｒｙ＆Ｃｈｉｌｔｏｎ編）の表２１−１２に記載のタイラー等価物（Ｔｙｌｅｒ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）である。食物繊維組成物／複合体の顆粒化がより大きいほど（すなわち、メッシュサイズがより小さいほど）、所望の粘度が得られるまでにより長くかかる。いくつかの実施形態において、食物繊維組成物／複合体は、顆粒化材料をそれらの粒径によって分離し、次いで粒径によって分離した顆粒を再び合わせることによって、合わせたメッシュサイズを使用して顆粒化され、所望の粘度プロファイルが得られる。例えば、３０〜６０の合わせたメッシュサイズは、３０メッシュ（約６００ミクロン）の顆粒、約４０メッシュ（約４００ミクロン）顆粒、および約６０メッシュ（２５０ミクロン）顆粒を合わせることによって得られる。
【００２９】
医療食品中に含有される粘性食物繊維ブレンド／複合体（ＶＦＢ／Ｃ）中のグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギネートの割合は、約４８％〜約９０％のグルコマンナン（約６０％〜約８０％、または約６０％〜約９０％、または約６５％〜約７５％、または約５０％〜約８０％、または約５０％〜約７０％、または約７０％など）、約５％〜約２０％のキサンタンガム（約１０％〜約２０％または約１１％〜約１３％、または約１３％〜約１７％、または約１３％、または約１７％など）、および約５％〜約３０％のアルギネート（約１０％〜約２０％または約１３％〜約１７％、または約１３％、または約１７％など）でよい。いくつかの実施形態において、医療食品中に含有される食物組成物中のグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギネートの割合は、約７０％のグルコマンナン、約１３％〜約１７％のキサンタン、および約１３％〜約１７％のアルギネートである。
【００３０】
いくつかの実施形態において、医療食品を処方して、ヒト被験体において、約５ｇ〜約５０ｇのＶＦＢ／Ｃ／日、例えば、約１０ｇ〜約３５ｇのＶＦＢ／Ｃ／日、約１２ｇ〜３５ｇのＶＦＢ／Ｃ／日、または例えば、約１５ｇ〜３５ｇのＶＦＢ／Ｃ／日、例えば、約２０ｇ〜３５ｇのＶＦＢ／Ｃ／日、例えば、約１２ｇ〜約２５ｇのＶＦＢ／Ｃ／日、例えば、約１５ｇ〜約２５ｇのＶＦＢ／Ｃ／日など、約４８％〜約９０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約５％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約５％〜約３０％（ｗ／ｗ）のアルギネート（ＶＦＢ／Ｃ）を含む、１．０ｇ〜１００ｇの粘性繊維ブレンドまたはその複合体（ＶＦＢ／Ｃ）の１日の総消費量を提供する。いくつかの実施形態において、医療食品を処方して、ヒト被験体において、約２５ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約５０ｍｇ／ｋｇ／日〜約６００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約１００ｍｇ／ｋｇ／日〜約５００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約２００ｍｇ／ｋｇ／日〜約４００ｍｇ／ｋｇ／日のＶＦＢ／Ｃの１日投与量を提供する。
【００３１】
本発明の医療食品製品は、さらなる構成成分（タンパク質またはアミノ酸、炭水化物、脂質、ビタミン、ミネラル、および補助因子、天然もしくは人工香料、色素または他の着色添加物、および保存剤など）をさらに含有し得る。「ビタミン」という用語には、これらに限定されないが、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸、パントテン酸、ピリドキシン、ビオチン、葉酸、ビタミンＢ１２、リポ酸、アスコルビン酸、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびビタミンＫが含まれる。この用語「ビタミン」にまた含まれるのは、補助因子およびコエンザイム、例えば、下記を含むコエンザイム：チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＭ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、ピリドキサールリン酸、ビオシチン、テトラヒドロ葉酸、コエンザイムＢ１２、リポイルリシン、１１−ｃｉｓ−レチナール、および１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールである。「ビタミン」という用語にはまた、コリン、カルニチン、ならびにα、β、およびγカロテンが含まれる。「ミネラル」という用語は、これらに限定されないが、カルシウム、鉄、亜鉛、セレン、銅、ヨウ素、マグネシウム、リン、クロム、マンガン、カリウムなど、およびこれらの混合物を含めた、ヒトの食物において必要とされる無機物質、金属などを意味する。ミネラルは、塩、酸化物、またはキレート塩の形態でよい。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本発明の医療食品は、１種または複数の脂質をさらに含む。本発明のこの実施形態によって使用する場合、脂質は、アルコールには溶解するが水には溶解しない、脂肪、油、またはワックスなどの物質と定義される。本明細書において使用する場合、「脂肪」および「油」という用語は互換的に使用され、脂肪酸を含む。いくつかの実施形態において、組成物中に使用するための脂質は、乳製品脂肪（例えば、乳脂肪、バター脂肪）、動物性脂肪（例えば、ラード）または植物性脂肪（例えば、ココナツ油、カカオバター、パーム油、もしくはマーガリン）からなる群より選択される脂肪を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本発明の医療食品において使用するための脂質は、食用油、または油の混合物を含む。このような油には、植物油（例えば、カノーラ油、ダイズ油、パーム核油、オリーブ油、サフラワー油、ヒマワリ種油、亜麻仁（アマニ）油、コーン油、綿実油、落花生油、クルミ油、扁桃油、グレープシード油、月見草油、ココナツ油、ルリヂサ油、およびクロフサスグリ油）；海産油（例えば、魚油および魚肝油）、またはこれらの混合物が含まれる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明の医療食品において使用するための脂質は、中鎖トリグリセリドを含有する油、例えば、ココナツ油、パーム核油、およびバターまたは純粋な形態の中鎖トリグリセリドを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本発明の医療食品は、患者のためのカロリーおよび栄養素の唯一の供給源を提供する。いくつかの実施形態において、本発明による医療食品は、ヒト被験体の食物における繊維の主な供給源を提供するように設計される。いくつかの実施形態において、本発明による医療食品は、ヒト被験体の食物における繊維の唯一の供給源を提供するように設計され、ラベルで表示され、かつ／またはそれによって、医師により投与される。
【００３６】
完全なバランスの取れた食物の部分として消費される医療食品は典型的には、１日を通して１回または複数回の食事を置き換えるように処方され、それによって通常の食品から消費される繊維の量を減少させる。医療食品は医師の管理の下で投与されるため、患者が繊維を含有するさらなる食物繊維サプリメントを消費することはないであろう。
【００３７】
本発明の医療食品は、医師の治療および管理の下にある患者の選定された集団による使用のためのものである。本発明の医療食品は、本明細書にさらに記載されているように、代謝性疾患または障害と関連する１つもしくは複数の症状、例えば、代謝症候群（症候群Ｘおよびインスリン抵抗性症候群としてもまた公知である）、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（脂肪肝疾患）、膵疾患、および高脂血症を予防、処置、または回復させるために、代謝性状態に罹患したヒト、または代謝性状態を発症する危険性があるヒトなどの哺乳動物被験体に投与し得る。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本発明の医療食品を、それを必要としている被験体に少なくとも１日１回投与する。いくつかの実施形態において、本発明の医療食品を、１日２回、好ましくは朝１回および午後／夕方１回投与する。医療食品のための典型的な処置レジメンは、少なくとも２週間から８週間以上継続する。処置を受ける医学的状態および患者の反応などの要因によって、患者が疾患または障害の少なくとも１つの症状の回復を経験するまで、処置レジメンは延長してもよい。本発明の医療食品は典型的には、食事代替物または食事の間のスナックとして１日当たり２食分で消費される。いくつかの実施形態において、本発明の医療食品は、医学的に管理された非常に低いカロリーの食物レジメンの一部として、食品の唯一の供給源として１日３〜４回被験体に投与される。非常に低いカロリーの食物の例示的使用は、急速な体重減少をもたらし、心血管代謝危険因子を減少させるための肥満症の処置における使用である。
【００３９】
医療食品を作製する方法
別の態様において、本発明は、グルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギネートを含む粘性繊維ブレンド（ＶＦＢ）またはその複合体（ＶＦＣ）を含む、有効量の食物繊維組成物を医療食品製品に加えるステップを含む、医療食品製品を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、医療食品製品を調製する方法は、グルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギネートを含む、粘性繊維ブレンド（ＶＦＢ）から形成される繊維複合体（ＶＦＣ）を含む、有効量の食物繊維組成物を医療食品製品に加えるステップを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、医療食品製品は、代謝性疾患または障害と関連する１つまたは複数の症状の予防、処置、または回復のために調合される。いくつかの実施形態において、医療食品製品に加えられる食物繊維組成物は、約４８％〜約９０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン（約６０％〜約８０％、または約６０％〜約９０％、または約６５％〜約７５％、または約５０％〜約８０％、または約５０％〜約７０％、または約７０％など）、約５％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム（約１０％〜約２０％、または約１１％〜約１３％、または約１３％〜約１７％、または約１３％、または約１７％など）、および約５％〜約３０％（ｗ／ｗ）のアルギネート（約１０％〜約２０％または約１３％〜約１７％、または約１３％、または約１７％など）を含む、繊維ブレンド（ＶＦＢ）または繊維ブレンドから形成される繊維複合体（ＶＦＣ）を含む（例えば、顆粒化ＶＦＢ）。いくつかの実施形態において、医療食品に加えられる食物繊維組成物中に含有される、繊維ブレンド中、または繊維ブレンドから形成される繊維複合体中のグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギネートの割合は、約７０％のグルコマンナン、約１３％〜約１７％のキサンタン、および約１３％〜約１７％のアルギネートである。
【００４１】
いくつかの実施形態において、代謝性疾患または障害の処置または予防のために処方される医療食品製品に加える、粘性繊維ブレンド（ＶＦＢ）またはその複合体（ＶＦＣ）を含む食物繊維組成物の量は、医療食品製品の総重量に対して約５％〜約２０％である。いくつかの実施形態において、医療食品製品に加える食物繊維組成物またはその複合体（ＶＦＢ／Ｃ）の量は、１日当たり２食分の消費量に基づいて、約１ｇ〜１００ｇ／日、例えば、５ｇ〜約５０ｇ／日、約１０ｇ〜３５ｇ／日、例えば、約１２ｇ〜３５ｇ／日、例えば、約１５ｇ〜３５ｇ／日、例えば、約２０ｇ〜３５ｇ／日、例えば、約１２ｇ〜約２５ｇ／日、例えば、約１５ｇ〜約２５ｇ／日を含む。本発明の医療食品製品は典型的には、少なくとも１日１回、好ましくは１日２回または３回消費される。本発明による医療食品は、経口投与のためのものである。
【００４２】
繊維ブレンドまたはその複合体を含む食物繊維組成物は、固体、液体、または半固体の医療食品製品を含めた任意のタイプの医療食品製品と合わせてもよい。例示的な固体医療食品製品には、これらに限定されないが、穀物（例えば、米、シリアル（熱いまたは冷たい））、グラノーラ、オートミール、焼いた商品（パン、クッキー、マフィン、ケーキ、およびその他）、パスタ（米または他の穀物で作製した麺を含めて）、肉（例えば、家禽、牛肉、子羊肉、豚肉、シーフード）、ならびに乳製品（例えば、乳、ヨーグルト、チーズ、アイスクリーム、およびバター）が含まれる。例示的な液体または半液体の医療食品製品には、これらに限定されないが、食事代替飲料、果汁、スープ（乾燥スープミックスを含めた）、食物サプリメント、およびスムージーが含まれる。
【００４３】
繊維ブレンドまたはその複合体を含む食物繊維組成物は、任意の適切な方法を使用して、消費する前に医療食品製品に加えてもよい。例えば、食物繊維組成物は、医療食品製品にするために焼いてもよく、医療食品製品と混合してもよく、または医療食品製品上に振り掛けてもよい。
【００４４】
本発明の医療食品は単位用量でパッケージされ、ラベルは、製品が医師の管理の下で特定の代謝性疾患または障害の管理において使用することを意図することを明確に記載する。
【００４５】
代謝性疾患または障害と関連する１つもしくは複数の症状を予防、処置、または回復させる方法
別の態様において、本発明は、代謝性疾患または障害と関連する１つもしくは複数の症状、例えば、代謝症候群、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（脂肪肝疾患）、膵疾患、および高脂血症を予防、処置、または回復させる方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、それを必要としているヒト被験体に、約４８％〜約９０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン（約６０％〜約８０％、または約６０％〜約９０％、または約６５％〜約７５％、または約５０％〜約８０％、または約５０％〜約７０％、または約７０％など）、約５％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム（約１０％〜約２０％、または約１１％〜約１３％、または約１３％〜約１７％、または約１３％、または約１７％など）、および約５％〜約３０％（ｗ／ｗ）のアルギネート（約１０％〜約２０％、または約１３％〜約１７％、または約１３％、または約１７％など）を含む粘性繊維ブレンド（ＶＦＢ）またはその複合体（ＶＦＣ）を含む、有効量の高粘性多糖類食物繊維組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、繊維ブレンドまたはその複合体中のグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギネートの割合は、約７０％のグルコマンナン、約１３％〜約１７％のキサンタン、および約１３％〜約１７％のアルギネートである。
【００４６】
いくつかの実施形態において、この方法は、約４８％〜約９０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約５％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約５％〜約３０％（ｗ／ｗ）のアルギネートを含む粘性繊維ブレンド（ＶＦＢ）またはその複合体（ＶＦＣ、例えば、顆粒化ＶＦＢなど）を含む食物繊維組成物を、１．０ｇ〜１００ｇのＶＦＢ／Ｃ／日、例えば、約５ｇ〜約５０ｇのＶＦＢ／Ｃ／日、例えば、約１０ｇ〜約３５ｇのＶＦＢ／Ｃ／日、約１２ｇ〜３５ｇのＶＦＢ／Ｃ／日、または例えば、約１５ｇ〜３５ｇのＶＦＢ／Ｃ／日、例えば、約２０ｇ〜３５ｇのＶＦＢ／Ｃ／日、例えば、約１２ｇ〜約２５ｇのＶＦＢ／Ｃ／日、例えば、約１５ｇ〜約２５ｇのＶＦＢ／Ｃ／日の投与量で、それを必要としているヒト被験体に投与することを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、この方法は、食物繊維ブレンド（ＶＦＢ）またはその複合体（ＶＦＣ）を、それを必要としている哺乳動物被験体（ヒト被験体など）に、被験体において代謝性疾患または障害と関連する１つまたは複数の症状を予防、処置または回復させるのに有効な期間、約２５ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約５０ｍｇ／ｋｇ／日〜約６００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約１００ｍｇ／ｋｇ／日〜約５００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約２００ｍｇ／ｋｇ／日〜約４００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与することを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、繊維ブレンド（ＶＦＢ）またはその複合体（ＶＦＣ）を含む食物繊維組成物を、本明細書に記載の医療食品製品の形態で被験体に投与する。いくつかの実施形態において、食物繊維組成物を、それを必要としている被験体に少なくとも１日１回投与する。いくつかの実施形態において、本発明の食物繊維組成物を、１日２回、好ましくは朝１回および午後／夕方１回投与する。本発明のこの態様による典型的な処置レジメンを、少なくとも２週間から１６週間以上継続する。処置を受ける医学的状態および患者の反応などの要因によって、患者が代謝性疾患または障害の少なくとも１つの症状の回復を経験するまで、処置レジメンは延長し得る。
【００４９】
一実施形態において、本発明は、ＩＩ型糖尿病に罹患したヒト被験体、またはそれを発症する危険性があるヒト被験体においてインスリン抵抗性の進行と関連する少なくとも１つの症状を回復させる方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、血中グルコース値の減少など、インスリン抵抗性の進行の少なくとも１つの症状を回復させるのに有効な期間、それを必要としているヒト被験体に、約４８％〜約９０％（ｗ／ｗ）のグルコマンナン、約５％〜約２０％（ｗ／ｗ）のキサンタンガム、および約５％〜約３０％（ｗ／ｗ）のアルギネートを含む、繊維ブレンドまたはその複合体（ＶＦＢ／Ｃ）を含む、約２５ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日（例えば、１００ｍｇ／ｋｇ／日〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、または３５０ｍｇ／ｋｇ／日〜約４５０ｍｇ／ｋｇ／日）の高粘性多糖類食物繊維組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、食物繊維組成物を少なくとも２週間から１６週間以上までの期間投与することを含む。
【００５０】
米国心臓協会および国立心肺血液研究所によると、被験体が下記の３つ以上を有する場合、代謝症候群が存在すると診断される：１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧；１００ｍｇ／ｄＬ以上の血糖（グルコース）；大きなウエスト周り（男性：４０インチ以上；女性：３５インチ以上）；低ＨＤＬコレステロール（男性：４０ｍｇ／ｄＬ未満；女性：５０ｍｇ／ｄＬ未満）；または１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリド。したがって、いくつかの実施形態において、ＩＩ型糖尿病に罹患したヒト被験体、またはそれを発症する危険性があるヒト被験体においてインスリン抵抗性の進行と関連する少なくとも１つの症状を回復させる方法は、被験体に、（１）被験体において１００ｍｇ／ｄＬ未満のレベルまで血糖（グルコース）を下げる、（２）ウエスト周りを、男性被験体について４０インチ未満まで、もしくは女性被験体について３５インチ未満まで減少させる、および／または（３）トリグリセリドのレベルを１５０ｍｇ／ｄＬ以下のレベルに減少させるのに有効な期間、有効量のＶＦＢ／Ｃを投与することを含む。
【００５１】
実施例１〜４に記載するように、ＶＦＣ（例えば、顆粒化ＶＦＢ）の効力は、対照群と比較して、グルコースによって誘導される器官損傷の進行を遅らせる能力、肝臓における脂質の集積を減少させる能力、膵臓β細胞の保存、および改善されたインスリン感受性を含めた、哺乳動物被験体において初期の代謝症候群の発症および進行を回復させることについて示される。
【００５２】
少なくとも１種の多糖類を含む試料を分析する方法
さらに別の態様において、本発明は、繊維ブレンドまたはその複合体を含む食物繊維組成物などの、少なくとも１種の多糖類を含む試料中の構成糖を決定する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、（ａ）少なくとも１種の多糖類を含む試料を酸で加水分解して、加水分解産物を生成することと、（ｂ）加水分解産物中の加水分解生成物をクロマトグラフィー法によって分離することと、（ｃ）ステップ（ｂ）において分離した加水分解生成物を検出することと、（ｄ）ステップ（ｃ）において検出された加水分解生成物と１つまたは複数の参照標準とを比較して、試料中の構成糖を決定することとを含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、試料は、少なくとも１種の食物繊維を含む。いくつかの実施形態において、試料は、アルギン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、試料は、アルギネート、グルコマンナンおよびキサンタンガムを含む繊維ブレンドまたはその複合体を含む。
【００５４】
加水分解
本発明のこの態様の方法によると、少なくとも１種の多糖類を含む試料を酸で加水分解して、加水分解産物を生成する。いくつかの実施形態において、試料を加水分解するために使用する酸は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である。
【００５５】
いくつかの実施形態において、試料は、アルギネート、マンヌロン酸およびグルロン酸の混合ポリマーを含む。そのような実施形態において、アルギネートを含む試料の加水分解ステップは、Ｌ−グルロン酸およびＤ−マンヌロン酸の放出および保存を実現するのに適した条件下で行う。例えば、一実施形態において、ＦｉｓｃｈｅｒおよびＤｏｒｆｅｌによって記載されるように、アルギン酸の最初の加水分解は、９５％硫酸で３℃にて１４時間、または８０％硫酸で室温にて１４時間で達成されることができる。このような実施形態によると、アルギン酸中で撹拌する前に、鉱酸を−１０〜−５℃に冷却する。粘性塊を徹底的に撹拌し、かたまりの形成を回避する。次いで、硫酸溶液が約０．５Ｎとなるまで、混合物を砕氷および水で希釈する。次いで、溶液を沸騰水浴上で６時間加熱し、次いで炭酸カルシウムで中和させる。硫酸カルシウム沈殿物の濾過および洗浄後、鮮黄色の濾液洗浄水を濃縮し、次いでカチオン交換カラムを通過させ、減圧下で薄いシロップまで濃縮する。デシケーター中でのさらなるゆっくりとした濃縮、および融点１９１℃のＤ−マンノフラヌロノ−ラクトンの導入（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）の後で、ラクトンのいくらかがシロップから結晶化するが、これは加水分解したアルギン酸が、Ｌ−グルロン酸よりもＤ−マンヌロン酸を含有した場合に限る。結晶性Ｄ−マンヌロノラクトンの除去後、残りのＤ−マンヌロノラクトンおよびＬ−グルロン酸を、本明細書に記載のクロマトグラフィー法によって分離する。
【００５６】
別の実施形態において、アルギネートを含む試料の加水分解ステップは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の使用を含む。ＴＦＡは、鉱酸よりも、単純に加水分解産物を凍結乾燥することによって除去が可能であるというように、十分に揮発性であるという利点を有する。例えば、約８時間〜約１８時間の期間の１００℃にて窒素下で２ＭのＴＦＡ中の加水分解は、同じ条件下で、１ＭのＨ２ＳＯ４中の加水分解に適切に代わるものであることが示されてきた。（Ｈｏｕｇｈら）。６〜８時間の加水分解時間は典型的には、中性糖からなる多糖類の分解に十分であるが、相当な割合のウロン酸残基の存在によって、グリコシドウロン酸結合は一般に、他のグリコシド結合より酸加水分解に対して非常に耐性であるというさらなる困難を生じさせることに留意されたい。概ね１６〜３０％モルの程度までウロン酸を含有する細菌の莢膜多糖類などの多糖類について、１００℃にて窒素下で２ＭのＴＦＡ中の１８時間の加水分解が、場合によっては申し分ないことが示されてきた（Ｈｏｕｇｈら）。しかし、酸による分解に特に感受性の糖残基が存在する場合（Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、またはＬ−ラムノースなど）、加水分解の時間は好ましくは８時間に制限され、その後、ウロン酸に連結したままの糖についての分析結果は補正され、加水分解産物中のアルドビウロン酸の割合が、密に架橋したゲル上のゲルクロマトグラフィーによって見出される。
【００５７】
いくつかの実施形態において、アルギネートを含む試料を加水分解するステップは、試料をＴＦＡと共に約９５℃〜約１１０℃の範囲の温度で約４８〜７２時間の期間インキュベートすることによって行われる。実施例６に記載するように、７２時間のＴＦＡによる加水分解が、アルギネートを含む試料（ＶＦＢ／Ｃ含有試料など）からの糖の加水分解による放出のために有効であったことが本発明者らによって決定された。
【００５８】
加水分解産物のクロマトグラフィー分離
本発明のこの態様の方法によると、加水分解産物中の加水分解生成物を、次いで、Ｃ１８逆相材料の使用を含めたクロマトグラフィー法（例えば、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）、または液体クロマトグラフィー（ＬＣ）など）によって分離する。いくつかの実施形態において、Ｄｉｏｎｅｘクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法は、中性糖をウロン酸から分離することができる。
【００５９】
クロマトグラフィー法によって分離された加水分解生成物を検出し、１つまたは複数の参照標準と比較し、試料中の構成糖を決定する。糖を検出するのに適した代表的な検出器には、Ｄｉｏｎｅｘによるパルスアンペロメトリック検出器（Ｐｕｌｓｅｄ  Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）、またはＥｖａｐｏｒａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＥＬＳＤ）またはＨＰＬＣシステムに取り付けられている質量分析計が含まれる。公知の構成成分を有する試料などの参照標準は、試験試料と並行して対照試料として操作することができる。代わりに、実施例５に記載のように、参照標準は、特定のクロマトグラフィー法によって分析された参照試料中の１つまたは複数の特定の構成糖の公知の特徴であり得る（例えば、保持時間／高さ／相対面積）。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本発明のこの態様による方法は、アルギネートなどの少なくとも１種の多糖類を含む試料をＴＦＡで加水分解することと、加水分解産物中の加水分解生成物をクロマトグラフィー法（Ｃ１８カラムを有するＨＰＬＣシステムなど）によって分離することと、加水分解生成物を検出器（ＥＬＳＤまたは質量分析計など）で検出することと、検出された生成物と１つまたは複数の参照標準とを比較して試料中の構成糖を決定することとを含む。
【００６１】
下記の実施例は、本発明を実施するために現在意図される最良の態様を単に例示するが、本発明を限定すると解釈すべきではない。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
この実施例は、ズッカー糖尿病ラットにおけるインスリン抵抗性、体重、膵臓β細胞生存率、および脂質プロファイルに対する顆粒化粘性繊維ブレンド（ＰｏｌｙＧｌｙｃｏｐｌｅＸ（ＰＧＸ（登録商標））として商業的に公知である粘性繊維複合体（ＶＦＣ）ともまた称される）を含む食物繊維組成物の効果を記載する。
【００６３】
基本原理：雄性ズッカー糖尿病ラット（ＺＤＦ）（ＺＤＦ／Ｃｒ１−Ｌｅｐｒｆａ／ｆａ）は、この動物モデルが共存性のＩＩ型糖尿病を伴う成人発症型肥満症および／または若年でのインスリン感受性の低下の優れたモデルであると考えられるため、この研究において使用するための動物モデルとして選択した（Ｃ．  Ｄａｕｂｉｏｕｌら、Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、１３２巻：９６７〜９７３頁（２００２年）；Ｊ．Ｍ．  Ｌｅｎｈａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．、３２４巻：９２〜９７頁（２００４年）；Ｊ．Ｎ．  Ｗｉｌｓｏｎ、Ａｔｈｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、４巻：１４７〜１５３頁（１９８４年））。ＺＤＦは、脳のレプチン受容体を欠いていることが見出された変異体である。レプチンは、食欲抑制のシグナルを送る、脂肪組織によって分泌されるタンパク質である。したがって、これらの変異体ラットにおいて、食欲を減少させるか、または満腹を誘導するフィードバックシグナル伝達は存在しない。ＺＤＦラットは、非常に速く食品を消費し、非常に急速に肥満となる。したがって、このモデルは、過食によって肥満であるヒトを模倣する。ＺＤＦラットは肥満となるにつれ、ヒトにおいて見られるように、インスリンに対して急速に非感受性となる（代謝症候群とまた称される）。ＺＤＦラットはまた高脂血症であり、このラットモデルが、ヒトにおける代謝症候群のための良好なモデルであることを示す。糖尿病は、ヒトにおける進行と同様にＺＤＦモデルにおいて経時的に進行し、膵臓β細胞（インスリン分泌細胞）集団の損失を伴って顕症期（ｆｌｏｒｉｄ）となる。タンパク質は過剰なグルコースによって糖化され、ＺＤＦおよびヒトの両方において器官機能、特に腎臓に問題を引き起こす。高いグルコース値はタンパク質の糖化をもたらし、これは糖尿病性腎症および血管の損傷をもたらす。粘性繊維複合体（ＶＦＣ）顆粒の投与が、糖尿病の発症を遅延させ、かつ／または重症度を低下させることができるか否かを決定するために、若年のＺＤＦ（５週齢）を、高脂肪食を伴わずにこの研究において使用した。
【００６４】
タンパク質へのグルコース損傷の程度の標準的マーカーは、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）であり、これはＺＤＦにおいて上昇し、今やヒトにおける薬物承認のための最も重要なマーカーの１つである。尿中のアルブミンの測定はまた、腎臓への糖尿病性損傷の標準的マーカーである。糖尿病の処置のためのＦＤＡのガイドラインは、血糖管理、および高グルコースによってもたらされる組織の損傷の減少を必要としている。
【００６５】
方法
繊維を増強したラット飼料
粘性繊維複合体（ＶＦＣ）（コンニャク／キサンタン／アルギネート（７０：１３：１７）顆粒）（すなわち、繊維ブレンドを顆粒化によって加工し、ＰＧＸ（登録商標）として商業的に公知の複合体を形成させた）を、基本的ラット飼料（Ｄ１１７２５：Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）に組み込んだ。この研究において使用する代替食物は、下記の表１に示すように他の繊維形態を組み込んでいた。全ての食物は、各繊維供給源の異なるエネルギーの寄与を考慮してできるだけ等エネルギーとなるように処方された（ＶＦＣおよびイヌリン食物は、３．９８ｋｃａｌ／ｇを提供し、セルロースは、３．９０ｋｃａｌ／ｇを提供した）。
【００６６】
不溶性であり、非発酵性であり、不活性な参照化合物であると考えられるセルロースを、基本的な参照繊維として選択した（Ｊ．Ｗ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、１２４巻：７８〜８３頁（１９９４年））。イヌリンは、水溶性であり消化できない、植物由来のフルクトースポリマーであり、いくつかの研究において脂質減少および血糖管理に関して効力を示されてきたが、結果は様々である（Ｐ．  Ｒｏｚａｎら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、９９巻：１〜８頁（２００８年）を参照されたい。）イヌリンのフルクトースまたはグルコース単位の数（重合度「ＤＰ」）は、９９．９％≧５であった（平均ＤＰは≧２３である）。
【００６７】
【表１−１】
2013525269.tif 000003
【００６８】
【表１−２】
2013525269.tif 000004
＊各々、ＰｏｌｙＧｌｙｃｏｐｌｅＸ（登録商標）（ＰＧＸ（登録商標））として商業的に公知であるＶＦＣ繊維顆粒（ＩｎｎｏｖｏＢｉｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｃａｌｇａｒｙ、Ａｌｂｅｒｔａ、Ｃａｎａｄａ）、セルロース（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、およびイヌリン（Ｒａｆｔｉｌｉｎｅ（登録商標）ＨＰ、Ｏｒａｆｔｉ、Ｔｉｅｎｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）。
【００６９】
試験デザイン
３０匹（３０）の雄性ＺＤＦ／Ｃｒｌ−Ｌｅｐｒｆａ／ｆａラットを、５週齢でＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）から入手した。動物を、最新の実験動物の管理と使用に関する指針、ＤＨＥＷ（ＮＩＨ）において推奨されたサイズに適合させた、つり下げたワイヤーメッシュのケージ（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｗｉｒｅ  ｍｅｓｈ  ｃａｇｅ）に単独で収容した。全ての研究は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。動物室を温度および湿度制御し、１２時間の明／暗サイクルとし、清潔で害虫なしに保った。動物を到着後１週間適応させた。動物は、食品および水に自由にアクセスさせた。
【００７０】
馴化後、ラットを、最初の血中グルコースおよび体重に基づいて３つの群の１つに無作為に割り当てた。ラットの各群は、上記の表１に示すように、全て５％（ｗｔ／ｗｔ）で、ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標）として商業的に公知）、セルロース、またはイヌリン（Ｒａｆｔｉｌｉｎｅ（登録商標）ＨＰ、チコリ由来のイヌリン）を含有する１タイプの飼料を８週間の期間与えられた。８週間の研究を通して、週に３回の食品重量の測定、週に１回の体重の測定、ならびにグルコースおよびインスリンの血液試料の採取を含めた基礎的モニタリング手順を行った。グルコースの非空腹時分析は第３週で開始し、一方空腹時分析は第１週で開始したことに留意されたい。非絶食動物において、インスリンは、最後の時点でのみ測定した。恐らくズッカーラットは昼と夜の両方において連続的に食べるという事実によって、繊維が消化管中に物理的に存在する間、グルコース値を安定化させることに対するＶＦＣのより大きな効果が観察されたという観察によって、非絶食状態の分析を研究に加えた。絶食動物において、血清トリグリセリドを、研究を通して測定し、一方非絶食動物においては、終末の測定のみを行った（ＩＤＥＸＸ、Ｎｏｒｔｈ  Ｇｒａｆｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。
【００７１】
全ての研究について、グルコースおよびインスリンのために使用した血液試料を１日の概ね同じ時間（午前の中頃）に採取した。研究は、１週間の間隔を開けた２回の経口グルコース負荷試験および死体解剖で終えた。
【００７２】
測定
下記の測定は、８週間の研究を通して行った。
【００７３】
食品摂取：実験用食品飼料の導入の前および後に、食品重量を週３回測定した。
【００７４】
体重は、週１回測定した。
【００７５】
血中グルコースおよびインスリン：実験用飼料の導入の前、および導入の後週１回の間隔で、一晩の絶食後に後眼窩からの採血によって血液を集めた。グルコースおよびインスリンのために、血液試料を１週間に１回、１日の概ね同じ時間（午前の中頃）に採取した。少量を、手持ち式グルコメーターによって分析した。インスリン分析のために試料を取り出した後、１ｍＬを凝固させた。０．５ｍＬの血清を取り出し、トリグリセリド含量について分析した。動物が食品にアクセスしたときに、さらなる試料をテイルニック（ｔａｉｌ  ｎｉｃｋ）によって集めた。血中グルコースは、Ｂａｙｅｒ  Ａｓｃｅｎｓｉａ  Ｅｌｉｔｅ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を使用して測定した。インスリンは、ＥＬＩＳＡ（Ａｎｉ  Ｌｙｔｉｃｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用して測定した。
【００７６】
経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）
第９週および第１０週に、絶食および非絶食ラットにおける２回の経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）によって研究を終了し、非絶食ＯＧＴＴを最後に行った。絶食および非絶食ＯＧＴＴの両方のために、インスリン分析およびグルコース測定のためのベースライン血液試料を採取した。最終の非絶食ＯＧＴＴのための最初の血液試料をまた、下記のような臨床化学パネルのために使用した。
【００７７】
絶食および非絶食動物の両方についてのＯＧＴＴは、経口グルコース処理（２ｇ／ｋｇのグルコース、胃管による）によって誘導された。血液試料をグルコース負荷の３０分後、６０分後、９０分後、および１２０分後に採取し、グルコースおよびインスリン量について分析した。第２のグルコース負荷試験の終わりに、ラットをイソフルラン過剰投与によって屠殺し、関連する器官を組織病理学的分析のために収集した。
【００７８】
恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ）スコアを、研究を通して、グルコースｍｇ×インスリン（Ｕ／ｍＬ２）として計算した。これは一般的にインスリン抵抗性の変化を示す信頼できる方法として認められており、より低いＨＯＭＡスコアは、末梢性インスリン抵抗性のより大きな減少を表す。経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）の研究についての複合インスリン感受性指数（ＣＩＳＩ）スコアはまた、下記の式を使用して計算した。
【００７９】
【数１】
2013525269.tif 000005
このＣＩＳＩスコアは、グルコース変動および曲線下面積を考慮に入れ、より高いスコアは、改善されたインスリン感受性を示す。
【００８０】
絶食および非絶食ＯＧＴＴの両方のために、インスリン分析およびグルコース測定のためのベースライン血液試料を採取した。最終（非絶食）ＯＧＴＴのための最初の血液試料はまた、電解質、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ビリルビン（直接＋間接）ならびに血漿総コレステロールを含めた臨床化学パネルのために使用した（ＩＤＥＸＸ、Ｎｏｒｔｈ  Ｇｒａｆｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓが分析を行う）。
【００８１】
血清トリグリセリド：絶食動物において、血清トリグリセリドを、研究にわたって測定し、一方非絶食動物においては、終末の測定のみを行った（ＩＤＥＸＸ、Ｎｏｒｔｈ  Ｇｒａｆｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓが分析を行う）。
【００８２】
臨床化学パネル：最終非絶食ＯＧＴＴのための最初の血液試料は、電解質、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ビリルビン（直接＋間接）ならびに血漿総コレステロールを含めた臨床化学パネルのために使用した（ＩＤＥＸＸ、Ｎｏｒｔｈ  Ｇｒａｆｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓが分析を行う）。
【００８３】
組織分析：１葉の肝臓、１つの腎臓、および膵臓を、１０％中性ホルマリン緩衝液（ＮＢＦ）中で固定した。２４時間後に、膵臓を７０％エタノールに移した。組織を加工し、パラフィンに包埋した。肝臓および腎臓を概ね５ミクロンに切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。膵臓を概ね５ミクロンで連続的に２回切断し、断片をＨ＆Ｅ、またはラットインスリンに対するマウス抗体（１：３００ウサギ抗ラットインスリン、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で免疫組織化学的に染色した。
【００８４】
免疫組織化学：
免疫組織化学を下記のように行った。アイソタイプ対照抗体（ノーマルウサギＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を使用して、非特異的なバックグラウンド染色の全体的なレベルを評価した。脱パラフィン化に続いて、Ｄｅｃｌｅｒｅ（登録商標）溶液（Ｃｅｌｌ  ＭａｒｑｕｅＴＭＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｌｉｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、１２０℃で１５分間、続いて室温で５分間、熱いＤｅｃｌｅｒｅ（登録商標）溶液中で抗原賦活化を行った。内因性ペルオキシダーゼ活性を、脱イオン水中の３％過酸化水素中でインキュベートすることによって１０分間クエンチした。スライドを、５％ノーマルヤギ血清中で２０分間インキュベートした。次いで、スライドを一次抗体と共に６０分間インキュベートし、続いてビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体中で３０分間インキュベートした。次いで、スライドを、ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で３０分間インキュベートした。最後に、検体をジアミノベンジジン中で５分間インキュベートし、続いてヘマトキシリンによって対比染色した。
【００８５】
死体解剖に続いて、さらなる肝臓葉を瞬間冷凍（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）し、ＯＣＴ中に包埋し、５μＭで切断し、脂質含量（遊離脂肪酸およびトリグリセリド）の分析のためにＳｕｄａｎ  ｂｌａｃｋで染色した。
【００８６】
Ｈ＆Ｅで染色した全てのスライドを、ＺＤＦにおいて一般に観察されるもの（腎臓における細管拡張の増加および細管変性の増加、膵島細胞変性、ならびに脂肪肝など）と関連する形態変化について評価した。これらの変化を、その所見の重症度に基づいて０〜５のスケール（５が最も重症）で半定量的にグレード付けした。
【００８７】
Ｓｕｄａｎ  ｂｌａｃｋで染色した肝臓スライドを評価し、０〜５のスケール（５が最も重症）でＳｕｄａｎ  ｂｌａｃｋ陽性空胞の存在について半定量的にグレード付けした。
【００８８】
インスリン陽性細胞を有する膵島面積のパーセントは、抗インスリン抗体で免疫組織化学的に染色した膵臓スライドで測定した。この測定は、形態計測学的に行った。膵臓毎に１０の膵島について、獣医病理学者が手作業で輪郭を描いた。これらの膵島内のインスリン染色陽性面積について同様に輪郭を描き、インスリン陽性膵島面積のパーセントを、ＩｍａｇｅＰｒｏ（登録商標）Ｐｌｕｓイメージングソフトウェアを使用して計算した。
【００８９】
統計的方法：
複数の時間に集めた間隔データを、二元配置反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した。Ｍｏｔｕｌｓｋｙ  Ｈ．、Ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、ＮＹ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５年）に記載されるように、有意な効果はボンフェローニの多重比較試験を使用した事後比較を伴った。
【００９０】
非絶食ラットにおいて研究の終わりにのみ測定したインスリン、コレステロール、および血液化学は、一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。Ｍｏｔｕｌｓｋｙ  Ｈ．、Ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、ＮＹ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５年）に記載されるように、有意な効果はダネットの多重比較試験（ＭＣＴ）を使用した事後比較を伴った。非間隔または不連続データ（例えば、組織学スコア）は、Ｍｏｔｕｌｓｋｙ  Ｈ．、Ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、ＮＹ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５年）に記載されているようにクラスカルワリス検定によって分析した。有意な効果はダネットのＭＣＴを使用した事後比較を伴った。
【００９１】
結果
体重および食品消費量
図１Ａは、ズッカー糖尿病ラットにおける８週間の研究の間にわたる、体重（ｇ）に対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物の効果を図表によって例示する。図１Ａに示すように、時間に対する体重の増加は、第１週から、セルロースを与えられた動物またはイヌリンを与えられた動物に対して、ＶＦＣ処理されたラットにおいて有意に鈍化した。研究の開始時に、全てのズッカー糖尿病ラットは、同様の体重（概ね１６０ｇ）を有した。次の３週間にわたり、セルロースまたはイヌリン含有飼料を与えられたラットは、ＶＦＣ含有飼料を与えられたラットより平均して概ね４０ｇ多く増量した。セルロースまたはイヌリン含有食物に対するＶＦＣを与えられたラットの有意差は、第１第から第８週まで観察された（記号「＊＊＊」は、ｐ＜０．００１を示す。ボンフェローニのＭＣＴ）。イヌリンおよびセルロース含有食物を与えられたラットの間に有意差は観察されなかった。
【００９２】
図１Ｂは、ズッカー糖尿病ラットにおける８週間の研究の間にわたる、食品消費量（ｇ／日）に対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物の効果を図表によって例示する。図１Ｂに示すように、最初の３週間について食品消費量は、ＶＦＣ処理されたラットにおいて有意に減少した（記号「＊」は、第１週のｐ＜０．０５を示す；記号「＊＊＊」は、第２週のｐ＜０．００１を示す；および記号「＊＊」は、第３週のｐ＜０．０１を示す）。ＶＦＣ群における食品摂取は、プロトコルの残りにわたって低いままであったが、研究の４週間目以降、レベルは他の２群と統計的には異ならなかった。イヌリンおよびセルロース含有食物を与えられたラットの間で有意差は観察されなかった。
【００９３】
ＶＦＣ含有飼料を与えられたラットは典型的には、２０〜２３ｇ／日を食べた（こぼすことに対して補正；概ね７０〜８５ｋｃａｌ／日と等しい）。セルロースまたはイヌリン含有飼料を与えられたラットは典型的には、２１〜２７ｇ／日を食べた（こぼすことに対して補正；概ね７５〜１００ｋｃａｌ／日と等しい）。
【００９４】
要約すれば、これらの結果は、典型的にＺＤＦラットモデルにおいて観察された時間に対する体重の増加が、ＶＦＣ処理された動物において有意に鈍化されたことを示す。
【００９５】
血糖管理：血糖および代謝
図２Ａ〜Ｄは、８週間の研究の間にわたるＺＤＦラットにおける、空腹時血中グルコース（図２Ａ）、空腹時血清インスリン（図２Ｂ）、非空腹時血中グルコース（図２Ｃ）、および空腹時恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ）スコア（図２Ｄ）に対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。図２Ａに示すように、絶食ラットにおける血中グルコース値は、いずれのラットにおいてもあまり上昇せず、ＶＦＣ処理されたラットについてのグルコース値に僅かな上昇が観察された（記号「＊」は、第３週および第６週にｐ＜０．０５を示す）。
【００９６】
図２Ｂに示すように、絶食ラットにおける血清インスリンレベルは、研究期間を通してＶＦＣ処理されたラットにおいて減少し、血清インスリンレベルは、統計的に有意なレベルで減少（５週で開始）した（記号「＊＊＊」は、第４週より後にｐ＜０．００１を示す）。
【００９７】
図２Ｃに示すように、非絶食ラットにおける血中グルコース値は、セルロースおよびイヌリンを与えられたラットと比較して、ＶＦＣ処理されたラットにおいて、有意に減少（概ね５週で開始）した（記号「＊＊＊」は、第５週より後にｐ＜０．０００１を示す）。
【００９８】
図２Ｄに示すように、ＶＦＣ処理されたラットは、研究においてＨＯＭＡスコアを有意に減少（５週で開始）させ（記号「＊」は、ｐ＜０．０５を示す）、第５週〜第７週（ｐ＜０．０５）、および第８週（記号「＊＊」は、ｐ＜０．０１を示す）であった。
【００９９】
一般に、絶食状態で（すなわち、動物は、食品へのアクセスなしの概ね１６時間の後、朝に試験を受けた）、ＺＤＦラットは、食品が満たされた（非絶食）状態下で見られるものより非常に低い血中グルコース濃度を維持した（図２Ａと図２Ｃを比較）。図１Ａに示すように、全ての絶食群について、血中グルコース値は典型的には、９５ｍｇ／ｄＬ〜１４５ｍｇ／ｄＬの範囲で観察されたが、これはわずかに糖尿病性であると考えられ、ＶＦＣ、セルロース、またはイヌリンを与えられた群の間で差異は殆ど観察されなかった。
【０１００】
図２Ｂに示すように、絶食状態で、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットは、セルロースまたはイヌリン含有飼料を与えられたラットよりも非常に安定的な血清インスリン濃度を維持した。図２Ｂに示すように、空腹時血清インスリンレベルは、研究の時間経過を通して、ＶＦＣ処理されたＺＤＦラットにおいて減少し、有意な減少が観察され（５週で開始）、第８週を通して有意に維持された（第４週より後にｐ＜０．００１、記号「＊＊＊」によって示す）。イヌリンおよびセルロース含有食物を与えられたラットの間で有意差は観察されなかった。
【０１０１】
この研究の過程における絶食ラットのインスリン抵抗性を、恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ）を計算することによって評価した。図２Ｄに示すように、ＨＯＭＡスコアは、全ての群について研究にわたって上昇したが、セルロースまたはイヌリンを与えられたラットより、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットについて有意に上昇が少なかった。ＶＦＣとセルロースまたはイヌリンとの間の有意差は、５週、６週、および７週（ｐ＜０．０５、記号「＊」によって示す）、ならびに８週（ｐ＜０．０１、記号「＊＊」によって示す）に見られた。セルロースまたはイヌリン含有食物を与えられたラットの間で有意差は観察されなかった。
【０１０２】
図３Ａは、８週間の研究の間、ＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられた絶食ズッカー糖尿病ラットについての複合インスリン感受性指数（ＣＩＳＩ）スコアを図表によって例示する。図３Ａに示すように、絶食動物においてＯＧＴＴ試験について計算したＣＩＳＩスコアは、ＶＦＣ処理された動物について有意により高かったが（ｐ＜０．０１、記号「＊＊」によって示す）、これは、セルロースおよびイヌリンを与えられた群と比較して、このＶＦＣ群についての改善されたインスリン感受性をさらに示す。
【０１０３】
図３Ｂは、８週間の研究の間、ＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられた非絶食ズッカー糖尿病ラットについての複合インスリン感受性指数（ＣＩＳＩ）スコアを図表によって例示する。図３Ｂに示すように、ＶＦＣ処理された非絶食動物は、セルロースおよびイヌリン処理された群と比較して、有意により高いＣＩＳＩスコア（ｐ＜０．００１、記号「＊＊＊」によって示す）、したがってより高いインスリン感受性を示した。ピークグルコース値はグルコースチャレンジの３０分後に見られ、ＶＦＣ群は、他の２つの群と比較して有意により低いピーク値を有した。
【０１０４】
図２Ｃに示すように、非絶食（摂食）状態で（すなわち、その前の２４時間に連続して食品へアクセスした動物を朝に試験した）ＶＦＣ含有食物を与えられたラットは、試験した全ての週の間、セルロースまたはイヌリン含有食物を与えられたラットより低い血中グルコース値を維持した。血中グルコース試験は研究の第３週中に開始され、第８週まで続けた。空腹時グルコース値は正常範囲に非常に近かったという観察を考慮して、摂食状態の動物のグルコース試験を研究プロトコルに加えた。任意の特定な理論に束縛されることは望まないが、ＶＦＣの機構的作用の多くは、食品とのその直接の接触が関与すると考えられる。
【０１０５】
摂食状態下で、インスリンは最後の時点でのみ測定したが、最終時点で測定したときに、絶食動物において見られるのと同様の改善されたインスリン感受性が観察された。図２Ｃに示すように、摂食状態の血中グルコース応答は、イヌリンまたはセルロース処理された動物と比較して、ＶＦＣ処理された動物において有意に減少した（ｐ＜０．００１、記号「＊＊＊」によって示す）。イヌリンまたはセルロース含有食物を与えられたラットの間で有意差は観察されなかった。
【０１０６】
図３Ｃは、８週間の研究の最終採血について、ＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられた非絶食ズッカー糖尿病ラットについて計算したＨＯＭＡスコアを図表によって例示する。図３Ｃに示すように、ＨＯＭＡスコアは、ＶＦＣ処理された群（ｐ＜０．００１）において、セルロースおよびイヌリン群と比較して有意により低いことが見出された。上で述べたように、より低いＨＯＭＡスコアは、末梢性インスリン抵抗性のより大きな減少を表す。
【０１０７】
脂質プロファイル
血清トリグリセリドを、絶食（研究を通して測定）および非絶食（８週間の研究の終わりにのみ測定）動物において測定した。図４は、８週間の研究の間にわたって、ＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられた絶食ズッカー糖尿病ラットにおいて測定した血清トリグリセリドのレベルを図表によって例示する。図４に示すように、絶食動物について、ＶＦＣ処理された動物は、イヌリンおよびセルロース処理された群と比較して、トリグリセリドに対する初期かつ有意な低下効果を示した。２〜３週間後、血清トリグリセリドは、全ての群において低下し、セルロース処理された動物は、イヌリンおよびＶＦＣ処理された動物と比較して、いくらかより低いトリグリセリドを有する傾向があった。下記の表２に示すように、非絶食動物において、研究の終わりに測定すると、血清トリグリセリドは、ＶＦＣ処理およびセルロース処理された動物について同様であり、イヌリン処理された動物は、他の２つの群よりも有意に低いトリグリセリドレベルを有することが見出された。
【０１０８】
８週間の研究の終わりに、血漿コレステロールを、最後のＯＧＴＴの前に摂食している動物から得たベースライン試料中で測定した。下記の表２に示すように、動物は高コレステロール血症であり、ＶＦＣは、セルロースおよびイヌリンを与えられた群と比較して、コレステロールレベルを半分を超えて有意に減少させた。
【０１０９】
標的器官の効果：肝臓、膵臓および腎臓の組織学的評価
グルコースおよびインスリンについて上記で記載したデータはＶＦＣ処理による改善されたインスリン感受性および血糖管理を示す一方、組織分析を行い、腎臓などの器官の損傷の程度を回復させることに対するＶＦＣの効果を評価した。特に、腎臓は、高血糖および過剰な糖化に関連する可能性が高い糖尿病性腎症に感受性であることが公知である。測定した全ての組織について、損傷の程度を、糖尿病の進行を遅延させ、かつ／または糖尿病と関連する症状を回復させるＶＦＣ処理の能力の指標として評価した。
【０１１０】
腎臓
Ｈ＆Ｅで染色した糖尿病性腎臓組織の全てのスライドを、細管拡張の増加および細管変性／再生の増加を含めて、ＺＤＦにおいて一般に観察されるものと関連する形態変化について評価した。いくつかの腎臓病理のパラメーターは、ＶＦＣ含有食物を与えられたズッカー糖尿病ラット（ＺＤＦ）ラットとイヌリンまたはセルロース含有飼料を与えられたＺＤＦラットとの間に差異を示した。
【０１１１】
図５Ａは、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間後の尿細管拡張についての、ズッカー糖尿病ラットに対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。図５Ａに示すように、細管拡張は、ＶＦＣ処理されたＺＤＦラットにおいて存在しないとスコア化された。対照的に、細管拡張は、セルロースおよびイヌリンを与えられたＺＤＦラットにおいて存在することが見出された。図５Ａに示したスコアは、ＶＦＣを与えられた群とセルロースまたはイヌリンを与えられた群との間で有意な処理効果を示した（ｐ＜０．００１、記号「＊」によって示す）。イヌリンを与えられた動物とセルロースを与えられた動物との間で、細管拡張の量において有意差は観察されなかった。
【０１１２】
図５Ｂは、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間後の尿細管変性／再生についての、ズッカー糖尿病ラットに対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。図５Ｂに示すように、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットは、０．１の平均細管変性／再生スコアを示したが、このスコアは、群における１匹のラットにおける１のスコア（重症度が最も低い）、および他の９匹のラットについての０のスコア（正常範囲内）からなる。対照的に、セルロースまたはイヌリン含有食物を与えられたラットについての平均スコアは、さらに図５Ｂに示すように１．０であった。細管変性／再生の重症度の低下に対するＶＦＣの処理効果は有意であり（ｐ＜０．０１、記号「＊＊」によって示す）、セルロースまたはイヌリンに対して、ＶＦＣを与えられた群で有意差が観察された。セルロースまたはイヌリンの間で有意差は観察されなかった。
【０１１３】
図５Ｃは、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間後の腎臓メサンギウム拡大についての、ズッカー糖尿病ラットに対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。図５Ｃに示すように、糸球体メサンギウム拡大のスコアリングは、セルロースまたはイヌリン含有食物と比較して、ＶＦＣ含有食物を与えられた群についてより低いスコアを示した。メサンギウム拡大についてのスコアは全体的な統計的有意性（ｐ＜０．０５）に達したが、事後検定において有意に異なった処理群の対は、ＶＦＣ含有食物を与えられた群およびイヌリン含有食物を与えられた群のみであった（ｐ＜０．０５、記号「＊」によって示す）。しかし、セルロース食物と比較して減少の強い傾向があった。
【０１１４】
膵臓
図６は、抗ラットインスリン抗体による染色によって決定されるように、８週間の研究の終わりにＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられたズッカー糖尿病ラット中に存在する膵島インスリン免疫反応性面積の百分率を図表によって例示する。図６に示すように、インスリン免疫組織化学によって測定して、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットは、セルロースまたはイヌリン含有食物を与えられたラットと比較して、総膵島面積のパーセントとしてより高いインスリン免疫反応性面積を維持した（すなわち、より大きな膵臓β細胞量）。ＡＮＯＶＡ分析は、有意な処理効果を示した（ｐ＜０．０００１、記号「＊＊＊」によって示す）が、一方、事後検定は、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットとセルロース含有食物を与えられたラットとの間に差異を示した（ｐ＜０．００１）。イヌリン含有食物を与えられた動物とセルロース含有食物を与えられた動物との間に差異は見られなかった。重要なことに、より低い空腹時血清インスリン濃度（図２Ｂ）およびより高いインスリン感受性（図３Ｂ）を示すデータと合わせたこれらのデータは、ＶＦＣ含有食物を与えられたズッカー糖尿病ラットが、セルロースまたはイヌリン含有食物を与えられたラットと比較して、インスリン分泌のための有意により大きな貯蔵能力を維持することを示す。
【０１１５】
図７Ａは、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間の研究の終わりにＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられたズッカー糖尿病ラット中に存在する膵島単核炎症性細胞浸潤物についての組織学的スコアを図表によって例示する。図７Ａに示すように、膵島単核浸潤物の存在についてスコアで観察された処理効果において差異は存在しなかった。
【０１１６】
図７Ｂは、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間の研究の終わりにＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられたズッカー糖尿病ラット中に存在する膵島細胞変性についての組織学的スコアを図表によって例示する。図７Ｂに示すように、島細胞の変性についてのスコアは、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットにおいて存在せず、セルロースまたはイヌリン含有食物を与えられたラットにおいてより高い傾向があった。しかし、これらの差異は、統計的有意性に達しなかった。
【０１１７】
図７Ｃは、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間の研究の終わりにＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン食物を与えられたズッカー糖尿病ラット中に存在する膵島線維形成の量についての組織学的スコアを図表によって例示する。図７Ｃに示すように、膵島線維形成の量についてのスコアは、セルロースまたはイヌリン含有食物を与えられたラットと比較して、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットにおいてより低い傾向があった。しかし、これらの差異は、統計的有意性に達しなかった。出血または血鉄素の存在についてのスコアによって、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットにおけるより低いスコアの傾向が明らかになったが、結果は統計的に有意ではなかった（データは示さず）。
【０１１８】
肝臓
図８Ａは、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、減少したＳｕｄａｎ  ｂｌａｃｋ染色によって測定した８週間後の脂肪肝についての、ズッカー糖尿病ラットに対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。図８Ａに示すように、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットは、セルロースまたはイヌリン含有食物を与えられたラットより少ない脂肪肝を示した（Ｓｕｄａｎ  ｂｌａｃｋ染色によって測定）。０（正常な範囲内）から５（重症）のスケールにおいて、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットは、平均して３．４であった。これを、セルロース含有食物を与えられたラットについての４．６のスコア、およびイヌリン含有食物を与えられたラットについての４．１と比較する。セルロース含有食物およびイヌリン含有食物を与えられたラット群に対して、ＶＦＣ含有食物を与えられたラット群では有意に異なった（ｐ＜０．０１、記号「＊＊」によって示す）。イヌリン含有食物を与えられたラットとセルロース含有食物を与えられたラットとの間に有意差は観察されなかった。
【０１１９】
ＶＦＣ含有食物を与えられたラットはまた、セルロースまたはイヌリン含有食物を与えられたラットより少ない肝細胞微小胞空胞化を示した。図８Ｂは、８週間後の肝臓の微小胞空胞化についての、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づく、ズッカー糖尿病ラットに対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。図８Ｂに示すように、微小胞空胞化は、セルロースまたはイヌリン含有食物を与えられた全てのラットにおいて重症とスコア化された（４．６の平均スコア、高い）。対照的に、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットは、平均して３．２のスコア（軽度）であった。ダネットのＭＣＴは、ＶＦＣ含有食物を与えられた群とセルロース含有食物を与えられた群との間で有意差を示したが（ｐ＜０．００１、記号「＊＊」によって示す）、イヌリン含有食物を与えられた群とセルロース含有食物を与えられた群との間で有意差を示さなかった。
【０１２０】
図８Ｃは、０〜５の組織学的スコア（５が最も重症である）に基づいて、８週間後の肝臓の大型小胞空胞化についての、ズッカー糖尿病ラットに対するＶＦＣ、セルロース、またはイヌリン含有食物の効果を図表によって例示する。図８Ｃに示すように、全ての処理群において、より低い重症度スコアに反映されるように、肝細胞大型小胞空胞化は一般に、肝細胞微小胞空胞化より顕著でなかった（図８Ｂと８Ｃを比較）。イヌリン含有食物を与えられたラットは、セルロース含有食物を与えられたラットと比較して少ない空胞化を有する傾向を示したが、この差異は統計的に有意でなかった。セルロース含有およびイヌリン含有食物に対して、ＶＦＣを与えられた群で有意差があった（ｐ＜０．００１、記号「＊＊＊」によって示す）。イヌリン含有食物を与えられた群とセルロース含有食物を与えられた群との間で有意差は見られなかった。嚢胞性肝細胞変性および線維形成はまた、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットにおいて、より重症ではないスコアへの傾向を示したが、これは統計的有意性に達しなかった（データは示さず）。
【０１２１】
下記の表２に示すように、肝臓損傷についてのいくつかの臨床化学指標は、ＶＦＣによる実質的な処理効果を示した。肝酵素であるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）は、肝細胞損傷（インタクトな細胞膜を伴っていたとしても）によって血液中に放出される。明白な肝疾患の範囲を有さないＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、２２〜４８ＩＵ／ＬのＡＬＴレベルを有する（ＩＤＥＸＸ参照データ）。表２に示したデータは、ＡＬＴおよびＡＳＴレベルに関して全体的な処理効果を示した。事後検定は、セルロースまたはイヌリン含有食物を与えられたラットと比較して、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットにおいてより低い血液ＡＬＴレベル（ｐ＜０．０５）、およびセルロース含有食物を与えられたラットと比較して、イヌリン含有食物を与えられたラットにおいて有意により高い血液ＡＬＴレベル（ｐ＜０．０５）を示した。
【０１２２】
表２にさらに示すように、血液ＡＳＴは、同様のパターンの結果を示した。明白な肝疾患の範囲を有さないＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、３３〜５３ＩＵ／ＬのＡＳＴレベルを有する（ＩＤＥＸＸ参照データ）。ＶＦＣ含有食物を与えられたラットは、平均して概ね１７０ＩＵ／Ｌであり、セルロース含有食物を与えられたラットは、平均して８７０ＩＵ／Ｌであったが、一方、イヌリン含有食物を与えられたラットは、平均して１０１０ＩＵ／Ｌであった。全体的な処理効果は統計的に有意であったが（ｐ＜０．０００１）、イヌリン含有食物を与えられた群とセルロース含有食物を与えられた群との間の差異は有意でなく、ＶＦＣ含有食物を与えられた群とセルロース含有食物を与えられた群との間の差異は有意であった（ｐ＜０．００１、ダネットのＭＣＴ）。
【０１２３】
表２に示すように、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットは、セルロースまたはイヌリン含有食物を与えられたラットより低い血清アルカリホスファターゼレベルを有した。公知の肝疾患または骨疾患を有さないＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおけるこのパラメーターについての正常範囲は、０〜２６７ＩＵ／Ｌである（ＩＤＥＸＸ参照データ）。表２に示すように、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットについての平均血清アルカリホスファターゼレベルは、この正常範囲内であったが、一方、セルロースまたはイヌリン含有食物を与えられたラットについての平均は、両方とも正常範囲の外であった。セルロースまたはイヌリン含有食物に対して、ＶＦＣ含有食物を与えられた群でアルカリホスファターゼの減少は有意であった（ｐ＜０．００１）。ＶＦＣによるより低い血清アルカリホスファターゼレベルは、胆汁うっ滞に対する保護効果を示唆し、一方、ＡＬＴおよびＡＳＴの増加は、肝細胞損傷を示す（Ｄ．Ｓ．  Ｐｒａｔｔら、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１５版、１７１１〜１７１５頁（２００１年））。逆に、グロブリンおよびビリルビンは、肝臓によってクリアランスされ、上昇は欠陥がある肝機能を反映する。
【０１２４】
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットについてのグロブリンの正常範囲は、２．８〜４．５ｇ／ｄＬである（ＩＤＥＸＸ参照データ）。表２に示すように、グロブリン濃度は、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットについて、平均して３．４ｇ／ｄＬであり、セルロース含有食物およびイヌリン含有食物を与えられたラットについて各々、４．０ｇ／ｄＬおよび３．９ｇ／ｄＬであった。繊維タイプの効果は有意であり（ｐ＜０．００１）、ＶＦＣ含有飼料を与えられた群とセルロース含有飼料を与えられた群との間に有意差（ｐ＜０．００１、ダネットのＭＣＴ）があり、イヌリン含有食物を与えられた群とセルロース含有食物を与えられた群との間に有意差はなかった。同様に、表２に示すように、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットは、平均して０．１３ｍｇ／ｄＬの総（直接および間接）ビリルビンを有し、一方セルロースおよびイヌリン含有食物を与えられたラットは、平均して各々、０．１９ｍｇ／ｄＬおよび０．１８ｍｇ／ｄＬであった。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットについての参照範囲は、０〜０．４ｍｇ／ｄＬである（ＩＤＥＸＸ参照データ）。処理効果は統計的に有意であり（１Ｗ  ＡＮＯＶＡ、Ｆ（２，２８）＝４．９３、ｐ＜０．０５）、ＶＦＣ含有食物を与えられた群との間に有意差があったが（ｐ＜０．０５、ダネットのＭＣＴ）、イヌリン含有食物を与えられた群とセルロース含有食物を与えられた群との間に有意差はなかった。全ての群についてグロブリンおよびビリルビンレベルは正常範囲内であったが、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットは、他の群に対して有意により低い濃度（ｐ＜０．００１）の両方の分析物を示し、これは改善された肝機能を示唆する。
【０１２５】
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットについてのビリルビンの正常範囲は、０〜０．４ｍｇ／ｄＬである（ＩＤＥＸＸ参照データ）。処理群間で、ビリルビンにおいて有意差は観察されなかった。肝臓によって合成されるアルブミンは、全ての処理群において同様であった。
【０１２６】
【表２】
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＊  セルロース群と有意に異なる  （ｐ＜０．０５）
＊＊  セルロース群と有意に異なる  （ｐ＜０．０１）
＊＊＊  セルロース群と有意に異なる  （ｐ＜０．００１）。
【０１２７】
結果の考察：
ズッカー糖尿病ラットモデルにおけるこの研究は、ＶＦＣ含有食物が、有意に、血糖管理を改善し、腎臓損傷を減少させ、膵臓β細胞を保存し、インスリン感受性を改善し、したがって体内で総グルコース負荷を減少させることを示す。さらに、研究にわたる体重増加の割合の概ね１０％の低下が、他の繊維が強化された食物と比較して、ＶＦＣ含有食物を与えられたラットにおいて観察された。これは、研究中に見られる食品摂取の減少に部分的に起因し得るが、食品摂取の減少は研究の最初の３週間においてのみ有意であった。実施例４にさらに示すように、ＶＦＣはまた、ＧＬＰ−１および満腹誘導ＰＹＹの分泌を増加させる。
【０１２８】
この研究において使用したＶＦＣ顆粒の量は、ラット飼料に加えられた５％ＶＦＣであった。図１Ａおよび１Ｂに示すように、ＶＦＣを与えられたラットについての１日当たりの食品の消費量は、平均して概ね２２ｇ／日であった（２２グラムで、１．１ｇのＶＦＣ）。ズッカーラットの平均体重が概ね３００ｇであると仮定すれば（図１Ａを参照されたい）、この研究における１ｋｇ当たりの投与量は、概ね３．６６ｇ／ｄ／ｋｇであった。ヒトは約６０ｋｇであると仮定すれば、この投与量は、ヒトについて約２１９．６ｇ／日に相当するであろう。Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗら、ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２２巻：６５９〜６６１頁（２００７年）に記載されるように、０．１から０．１５の体積に対する体表面積に基づき、投与量についてラットの用量からヒトへの変換を使用して、これは約２２グラム〜約３３グラムのＶＦＣ／日、または約３６６ｍｇ／ｋｇ／日〜約５５０ｍｇ／ｋｇ／日の６０ｋｇのヒトにおける投与量範囲に翻訳される。
【０１２９】
この研究において、絶食ズッカー糖尿病ラット（すなわち、動物は、食品へのアクセスなしの概ね１６時間の後、朝に試験を受けた）は、恐らく疾患がちょうど明らかになり始めたときに観察された高インスリン血症によってもたらされた適当な補償によって、グルコース値が大幅に上昇しなかった。試験の前１６時間絶食した動物において、食物群にわたり、インスリンレベルは、ＶＦＣ処理された群と比較して、セルロースおよびイヌリン処理された群においてより高かったが、これはＨＯＭＡおよびＣＩＳＩスコアと合わせて、ＶＦＣ処理された動物と比較してイヌリンおよびセルロース処理された群におけるより大きな末梢性インスリン抵抗性を示す。したがって、ＶＦＣは、インスリン感受性を改善するために消化管中に存在する必要はないようである。任意の特定な理論に束縛されることは望まないが、試験の前１６時間絶食したＶＦＣ処理された動物において観察された改善されたインスリン感受性は、プログルカゴン発現の増加によるものであり得（Ｓ．Ｐ．  Ｍａｓｓｉｍｉｎｏら、Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、１２８巻：１７８６〜１７９３頁（１９９８年）；Ｒ．Ａ．  Ｒｅｉｍｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３７巻：３９４８〜３９５６頁（１９９６年））、または筋肉ＧＬＵＴ−４の上方制御によるものであり得る（Ｙ．Ｊ．  Ｓｏｎｇら、Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７巻：４１〜４５頁（２０００年））。
【０１３０】
試験の前１６時間絶食した動物はほんの僅かに高血糖であったため、非絶食状態（すなわち、試験の前の食品への連続的なアクセス）下のラットにおいて、研究の第３週で開始して、血漿グルコースをまた測定した。非絶食状態で試験した動物において、セルロースおよびイヌリン処理された群の動物は高血糖であり、一方、ＶＦＣ処理された群の動物は、グルコース値が殆ど非糖尿病性レベルまで減少したことが決定された。非絶食状態のインスリンレベルは研究の終わりにおいてのみ測定され、ＶＦＣ処理された動物においてインスリンが有意に減少したことが見出され、ＨＯＭＡおよびＣＩＳＩスコアはまた、他の群と比較して、ＶＦＣ処理された動物において改善されたインスリン感受性を示した。
【０１３１】
したがって、ＶＦＣ処理された動物において、絶食および非絶食状態の両方において血清インスリンが有意に減少し、試験したＶＦＣ処理された動物において、非絶食状態において血中グルコースが有意に減少したという結果を考慮して、ズッカー糖尿病ラットのＶＦＣ処理は、糖尿病の初期の進行を遅延させるのに有効であったようである。
【０１３２】
血糖管理における改善に加えて、ＶＦＣ処理された動物はまた、セルロースおよびイヌリン処理された動物と比較して器官損傷が減少したことが決定された。代謝性障害および血行動態の変化からもたらされる、特に糸球体基底膜の肥厚、ならびにメサンギウム（ｍｅｓａｎｇｕｉｍ）および細管の拡大、ならびに細管変性などの糖尿病性腎症は、糖尿病の臨床的に重要な続発症である（Ｈ．Ｒ．  ＢｒａｄｙおよびＢ．Ｍ．  Ｂｒｅｎｎｅｒ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  Ｉｎｊｕｒｙ、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１５版、Ｅ．  Ｂｒａｕｎｗａｌｄら、１５７２〜１５８０頁（２００１年））。興味深いことに、この研究において、かなりの器官損傷が、相対的に軽度の糖尿病にもかかわらず、糖尿病の早期の発症を伴う若年のズッカー糖尿病ラットにおいて非常に急速に起こることが決定された。重要なことに、ＶＦＣ処理された動物は、イヌリンまたはセルロース処理された群と比較して、有意に高い密度の膵臓β細胞（８週間の研究の終わりに存在する）を有したことが観察された。このデータは、ＶＦＣ含有食物を８週間与えられたズッカー糖尿病ラットが、インスリン分泌のための有意により大きな貯蔵能力を維持したことを示す。膵臓β細胞の保存は、インスリン分泌促進剤ＧＬＰ−１のレベルを増加させるＤＰＰ  ＩＶインヒビターについて見られてきており、ＤＰＰ  ＩＶインヒビターを使用したいくつかの研究において、インスリン、特に食後インスリンレベルは、ＩＩ型糖尿病のモデルにおいて対照より高いことに留意されたい（Ａ．  Ｖｉｌｊａｎｅｎら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．、９４巻：５０〜５５頁（２００９年））。
【０１３３】
この研究において使用されたズッカー糖尿病ラットモデルにおいて、非空腹時グルコース値は、腎臓損傷をもたらすのに十分であるようであった。ＶＦＣ処理された群において、（特にメサンギウム拡大に関して）腎損傷がより少なかったことが決定された。通常食における血糖管理の増強、およびそれに続く組織糖化の減少は、腎損傷の減少において主要な要因としての役割を果たした可能性が高い。興味深いことに、および予想外に、組織学は、ＶＦＣが腎臓を糖化損傷から有意に保護したことを示し、このことは、総グルコース負荷の減少、したがって糖化の減少を示した。ＦＤＡは、血中グルコースが単に減少することは、薬物承認のために十分であるとはもはや見なさず、糖化の減少を抗糖尿病効果の主要なマーカーとして見なしている。
【０１３４】
血清および肝臓の脂質プロファイルに対するＶＦＣ処理の効果に関して、ＶＦＣ処理された群において血漿コレステロールは有意に減少した。血清トリグリセリドレベルに対する効果は、より様々であった。それにもかかわらず、肝臓の脂質レベル（脂肪症）ならびに肝臓の測定（血清ビリルビン、ＡＬＴ、およびＡＳＴなど）は、ＶＦＣ処理された群において有意に減少し、これはＶＦＣ処理された群における肝損傷の減少を示した。さらに、組織分析に基づいて、ＶＦＣ処理された動物が、肝細胞損傷の指標の減少およびアルカリホスファターゼの血清レベルの減少を有することがまた決定されたが、これはＶＦＣ処理された動物が、胆汁うっ滞の減少、および代謝症候群に一般に付随する脂肪性肝炎の減少を有したことを示し得る（Ａ．  Ｖｉｌｊａｎｅｎら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．、９４巻：５０〜５５頁（２００９年））。
【０１３５】
したがって、ＶＦＣの使用についての効力は、血糖管理、腎臓損傷の減少および膵臓β細胞の保存に関してＺＤＦにおいて示される。この実施例に示されるように、ＶＦＣ処理されたラットは、腎損傷、特にメサンギウム拡大が減少した。血糖管理の増強およびそれに続く組織糖化の減少は、腎損傷の減少における主要な要因としての役割を果たした可能性が高い。したがって、ＶＦＣを食物添加物として使用して、グルコースが誘導する器官損傷、肝臓における脂質の集積の進行を遅らせ、膵臓β細胞の喪失を阻害する能力を含めて、初期の代謝症候群の発症および進行を回復させるのを助けることができる。
【０１３６】
（実施例２）
この実施例は、膵臓の調節不全、脂質異常症、および肥満症に対する、顆粒化粘性繊維ブレンド（ＶＦＣ顆粒）（繊維複合体ＰｏｌｙＧｌｙｃｏｐｌｅＸ（ＰＧＸ（登録商標））ともまた称される）を含む食物繊維組成物の効果を決定するための、高スクロース食物によって誘導された肥満症ラットモデルにおいて行われた研究を記載する。
【０１３７】
基本原理：実施例１に記載するように、ＰｏｌｙＧｌｙｃｏｐｌｅＸ（登録商標）（ＰＧＸ（登録商標））とも称される新規な水溶性繊維複合体であるＶＦＣ顆粒（コンニャクマンナン、キサンタンガム、およびアルギネートから製造して、高い保水性およびゲル形成特性を有する高粘性多糖類複合体を形成する）は、ズッカー糖尿病ラットにおいて体重を減少させ、インスリン感受性を増加させる。しかし、血清トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）に関して、ズッカー糖尿病ラットにおいて観察されるＶＦＣ顆粒の効果は様々であった。血清ＴＡＧレベルを減少させる様々な繊維の変動性は、他の研究において観察されてきたが、繊維タイプおよび特定の動物モデルに関連し得る（Ｗ．Ｕ．Ｊｉｅら、Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｓｃｉ．、１０巻：２７〜３７頁（１９９７年）；Ａ．  Ｓａｎｄｂｅｒｇら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．、６０巻：７５１〜７５６頁（１９９４年）；Ｒ．  Ｗｏｏｄら、Ｍｅｔａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．、５６巻：５８〜６７頁（２００７年）；およびＮ．Ｍ．  Ｄｅｌｚｅｎｎｅら、Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、１２９巻：１４６７Ｓ〜１４７０Ｓ頁（１９９９年））。例えば、Ｍａｏ−Ｙｕらによる研究は、消化できない繊維によるＴＡＧの減少が、ＴＡＧ増加の重症度およびある期間にわたる安定性に依存することを示した（Ｚ．  Ｍａｏ−Ｙｕら、Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｓｃｉ．、３巻：９９〜１０５頁（１９９０年））。
【０１３８】
この実施例において記載する研究を行い、スクロースを与えられた雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ヒトＩＩ型糖尿病をかなりの程度まで模倣し、特に、慢性的に与えられたとき、体重増加、ならびに肝臓および血清ＴＡＧレベルの一貫した増加がもたらされることが公知である食物誘導性肥満症のモデルである（高スクロース６５％ｗｔ／ｗｔ））における、体重増加、血清トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、および脂肪肝に対する顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の効果を決定した（Ａ．Ｍ．  Ｇａｄｊａら、Ａｎ．  Ｌａｂ  Ｎｅｗｓ、１３巻：１〜７頁（２００７年）；Ｍ．  Ｈａｆｉｄｉら、Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎ．、２８巻：６６９〜６８１頁（２００６年）；およびＰ．  Ｒｏｚａｎら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、９８巻：１〜８頁（２００８年））。この実施例において記載する研究は、ラットのライフサイクルの妥当な部分をとらえ、このモデルの特徴を示している血清ＴＡＧレベルの一貫した増加を最大化するために４３週間行った。
【０１３９】
方法：
繊維を増強したラット飼料：
粘性繊維複合体（ＶＦＣ）（コンニャク／キサンタン／アルギネート（７０：１３：１７））顆粒（すなわち、繊維ブレンドを顆粒化によって加工し、ＰＧＸ（登録商標）として商業的に公知の複合体を形成させた）を、基本的ラット飼料（Ｄ１１７２５：Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）に組み込んだ。この研究に使用された代替食物は、下記の表３に示すように他の繊維形態を組み込んでいた。不溶性であり、非発酵性であり、不活性な参照化合物であると考えられるセルロースを、基本的参照繊維として選択した（Ｊ．Ｗ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、１２４巻：７８〜８３頁（１９９４年））。
【０１４０】
【表３】
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＊ＰｏｌｙＧｌｙｃｏｐｌｅＸ（登録商標）（ＰＧＸ（登録商標））として商業的に公知なＶＦＣ繊維顆粒（ＩｎｎｏｖｏＢｉｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．Ｃａｌｇａｒｙ、ＡＢ、Ｃａｎａｄａ）。
【０１４１】
動物モデル：スクロースを与えられたラットは、正常な遺伝的背景の存在下における高トリグリセリド血症の優れたモデルであると考えられるため、雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを選択した（Ａ．Ｍ．  Ｇａｄｊａら、Ａｎ  Ｌａｂ  Ｎｅｗｓ、１３巻：１〜７頁（２００７年））。
【０１４２】
試験デザイン：３０匹の雄性ＳＤラットを、６週齢でＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  ＮＹ）から入手した。動物を、最新の実験動物の管理と使用に関する指針、ＤＨＥＷ（ＮＩＨ）において推奨されたサイズに適合させた、つり下げたワイヤーメッシュのケージに単独で収容した。動物室を温度および湿度制御し、１２時間の明／暗サイクルとし、清潔で害虫なしに保った。試験の前に動物を４日間適応させた。
【０１４３】
水：濾過した水道水を、自動水供給システムによって自由摂取状態で（ａｄ  ｌｉｂｉｔｕｍ）供給した。
【０１４４】
食品：馴化後、ラットを２群（群毎にｎ＝１０）の１つに無作為に割り当て（５％（ｗｔ／ｗｔ）セルロースまたは５％ＶＦＢ（ｗｔ／ｗｔ））、６５％（ｗｔ／ｗｔ）スクロースを両方の群の食物に加えた。食物は殆ど等エネルギーであり、セルロース食物は３．９０ｋｃａｌ／ｇであり、ＶＦＣ食物は３．９８ｋｃａｌ／ｇであり、全部で概ね３９０２食物キロカロリーであった。ラットは、セルロース（２１４．７±２．６ｇの開始体重）またはＶＦＢ（２２０．８±３．５ｇの開始体重）を伴った高スクロース食物を全部で４３週間、自由摂取状態で与えられた。
【０１４５】
研究における測定：食品消費量（毎日）、体重（毎週）、および血清トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）（ＩＤＥＸＸ、Ｎｏｒｔｈ  Ｇｒａｆｔｏｎ、ＭＡによって分析）、血中グルコース（Ａｃｅｎｓｉａ  Ｅｌｉｔｅ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒによる）および血清インスリン（Ａｎｉ  Ｌｙｔｉｃｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の測定のための血液試料の毎週の採取を、研究を通して行った。研究は、ヘモグロビン糖化および血中尿素窒素を測定するための最終血液分析で終えた。次いで、限定された死体解剖を下記のように行った。１葉の肝臓を、Ｓｕｄａｎ  ｂｌａｃｋ組織化学を使用した脂質含量の分析のために瞬間冷凍した。１葉の肝臓を、ヘマトキシリンおよびエオシン（ｏｅｓｉｎ）染色のために事後固定した。
【０１４６】
統計的方法：体重増加は、研究を通して体重増加の差異についての反復測定ＡＮＯＶＡおよび一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的差異について分析した。多重比較についてのαエラー率は、ボンフェローニ補正を使用して管理した。組織学スコアは、ノンパラメトリックデータについてのクラスカルワリス試験を使用して測定した。
【０１４７】
結果：
図９は、４３週間の研究にわたってスクロースを与えられたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける体重増加および血清トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）に対する顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））またはセルロース食物の効果を図表によって例示する（「＊」記号は、ｐ＜０．０５を示し；「＊＊」記号は、ｐ＜０．０１を示し；「＊＊＊」記号は、ｐ＜０．００１を示す）。最初の体重は、ＶＦＣを与えられた群（２１５±３グラム）とセルロースを与えられた群（２２１±３ｇ）との間で異ならなかった。図９に示すように、体重はスクロースに富んだ食物によって両方の群において経時的に増加したが、体重増加は研究の開始から第２２週までにおいて、セルロースを与えられた群と比較して、ＶＦＣを与えられた群において有意に弱まった（ｐ＜０．０５）。反復測定は、体重増加（ｐ＝０．０４）に対する有意な処理効果を示し、ＶＦＣを与えられたラットは、体重増加の減少を示した。最終体重は群間で有意に異なることはなかったが（ｐ＝０．２０；各々、ＶＦＣおよびセルロース摂食について６６０±２２対６４５±２６ｇ）、ＶＦＣラットは、研究の終わりにおいて７％低い体重を維持した。ＶＦＣを与えられたラットについての食品消費量は、セルロースを与えられたラットと同様であった（データは示さず）。
【０１４８】
図９にさらに示すように、血清ＴＡＧレベルは研究の初期の部分では安定的であったが、セルロースを与えられた群において経時的に４３週間での研究の終わりまで上昇した。対照的に、ＶＦＣを与えられたラットは、セルロースを与えられた群に対して、有意により低い血清ＴＡＧレベルを示した（ｐ＜０．０１）。ＶＦＣを与えられた群は、セルロースを与えられた群におけるベースラインＴＡＧレベルから有意に異ならなかったベースラインＴＡＧレベルを有した。
【０１４９】
ＶＦＣ含有食物を与えられたラットは、セルロース食物を与えられたラットよりも少ない脂肪肝（Ｓｕｄａｎ  ｂｌａｃｋ染色によって測定）を示した。肝臓組織切片をＳｕｄａｎ  ｂｌａｃｋによって染色し、スライドを評価し、Ｓｕｄａｎ  ｂｌａｃｋ陽性空胞の存在について０〜５のスケール（５が最も重症）で半定量的にグレード付けすることによって脂質含量を決定した。重症度スコアは、セルロース処理された群について３．９±０．３、およびＶＦＣ処理された群について２．７±０．４であり、これは有意に異なった。セルロースを与えられたラットと比較した、ＶＦＣを与えられたラットにおける肝細胞損傷の減少についての強い傾向がまた観察されたが、差異は統計的に有意ではなかった（大型小胞空胞化についてｐ＜０．０７、および微小胞空胞化についてｐ＜０．１１、データは示さず）。
【０１５０】
血中グルコースおよびインスリンレベルを、研究の間、毎週モニターしたが、変化しなかった。このことは、この動物モデルについて予測されることである（Ａ．Ｍ．  Ｇａｄｊａら、Ａｎ．  Ｌａｂ  Ｎｅｗｓ、１３巻：１〜７頁（２００７年））。
【０１５１】
考察：
この肥満症の食物誘導性モデルにおいて予想されるように、スクロースを与えられたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットは、概ね１８〜２５週間まで、経時的に急速に体重を増やしたが、この時点で体重はより遅い増加速度へと安定化した。図９に示すように、急速な体重増加期間中、ＶＦＣ顆粒は、セルロースと比較して体重変化を有意に減少させ、研究の後期におけるより遅い増加相の間には、わずかな減少が観察された（すなわち、より高齢のラット）。図９にさらに示すように、血漿ＴＡＧは、高齢のラットにおいてのみベースラインを超えて増加し、ＶＦＣは、ＴＡＧにおけるこの上昇を有意に鈍化させた。このデータと一致して、脂肪肝は、組織形態計測によって測定すると、セルロースを与えられた動物と比較して、ＶＦＣを与えられた動物において有意に減少した。
【０１５２】
消化できない繊維を消費する被験体において、体重減少は、下記の１つまたは複数と関連すると考えられる。食品摂取の減少、満腹ホルモン応答の変化、胃の緩慢化に続く栄養素吸着の減少、および／または繊維による栄養素吸着（Ｎ．Ｃ．  Ｈｏｗａｒｔｈら、Ｎｕｔｒ．  Ｒｅｖ．、５９巻：１６３〜１６９頁（２００１年）；Ａ．  Ｓａｎｄｂｅｒｇら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．、６０巻：７５１〜７５６頁（１９９４年）；Ｇ．  Ｇｒｕｎｂｅｒｇｅｒら、Ｄｉａｂｅｔ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．、２３巻：５６〜６２頁（２００６年）；およびＪ．Ｒ．  Ｐａｘｍａｎら、Ｎｕｔｒ．  Ｒｅｓ．、５１巻：５０１〜５０５頁（２００８年）を参照されたい）。本研究において、食品消費量の減少は殆ど観察されず、したがってこの要因は、ＶＦＣを与えられた動物における観察された体重減少に寄与しなかったようであることに留意することは興味深い。任意の特定な理論に束縛されることは望まないが、グルカゴン様タンパク質（ＧＬＰ−１）の分泌の増加によるものであり得る、より遅い胃内容物の排出および食べた食品の栄養素吸収の低下が、体重減少に関与し得ることが考えられる（Ｎ．Ｎ．  Ｋｏｋら、Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、１２８巻：１０９９〜１１０３頁（１９９８年））。
【０１５３】
肝臓または血漿ＴＡＧの減少は多くの食物繊維研究の目的であったが、その結果は非常に幅広い（Ｗ．Ｕ．  Ｊｉｅら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｓｃｉ．、１０巻：２７〜３７頁（１９９７年）；Ａ．  Ｓａｎｄｂｅｒｇら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．、６０巻：７５１〜７５６頁（１９９４年）；Ｒ．  Ｗｏｏｄら、Ｍｅｔａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．、５６巻：５８〜６７頁（２００７年）；およびＮ．  Ｍ．  Ｄｅｌｚｅｎｎｅら、Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、１２９巻：１４６７Ｓ〜１４７０Ｓ頁（１９９９年）；Ｐ．  Ｒｏｚａｎら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、９８巻：１〜８頁（２００８年））。全ての研究が、ＴＡＧ吸収の著しい減少を示すわけではなく、繊維タイプ間でいくらかの差異が観察される。例えば、ＤｅｌｚｅｎｎｅおよびＫｏｋによる研究は、フルクトースを与えられたラットにおいて脂肪生成を低下させることによって、オリゴフルクトースが脂肪肝を減少させたことを示した（Ｎ．Ｍ．  Ｄｅｌｚｅｎｎｅら、Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、１２９巻：１４６７Ｓ〜１４７０Ｓ頁（１９９９年））。同様に、Ｋｏｋらは、オリゴフルクトース繊維によって誘導されたＧＬＰ−１分泌がまた、減少した脂肪生成および脂肪動員に関与し得ることを示唆する（Ｎ．Ｎ．  Ｋｏｋら、Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、１２８巻：１０９９〜１１０３頁（１９９８年））。任意の特定な理論に束縛されることは望まないが、脂肪生成の減少および脂肪吸収の減少の両方は、この研究においてＶＦＣを与えられた動物において観察されたＴＡＧの減少において役割を果たしていたようである。栄養素吸収の減少は、食品消費量の減少を伴わずに観察された体重増加の減少を説明する。
【０１５４】
結論として、この研究は、ＶＦＣ顆粒が、スクロースを与えられたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットモデルにおいて血清ＴＡＧを有意に低下させることを示す（現在の医薬品は低下においてあまり有効ではない）。脂肪肝の減少は、血清ＴＡＧの減少と並行して起こり、このような特性によって、ＶＦＣ顆粒は、高脂血症、および代謝症候群の他の局面を有する患者を処置するため（例えば、体重減少）の有用な食品添加物となる。
【０１５５】
（実施例３）
この実施例は、短期間の体重減少および関連する危険因子に対する、顆粒化粘性繊維複合体（ＶＦＣ顆粒）（繊維複合体ＰｏｌｙＧｌｙｃｏｐｌｅＸ（ＰＧＸ（登録商標））とまた称される）を含む食物繊維組成物の効果を示す、過体重および肥満の成人ヒト被験体における研究について記載する。
【０１５６】
基本原理：世界保健機構によって発表された最近のデータによると、肥満症は、世界的蔓延のような規模に達し、１０億人超の過体重の成人がこの慢性障害に襲われている（ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ、３／１５／０８にアクセス）。冠動脈疾患および脳卒中、インスリン抵抗性、（代謝症候群）、ＩＩ型糖尿病、高血圧症、およびがんは全て、過剰な体重の周知の医学的共存症である（Ｋ．  Ｆｕｋｉｏｋａ、Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｒｅｓ、１０巻（補遺１２）：１１６Ｓ〜１２３Ｓ頁（２００２年））。さらに、最近の疫学的研究によって、成人肥満症が平均余命の有意な低下と関連することが確認された。この研究は、４０歳の男性および女性の非喫煙者の寿命が、肥満症のために平均して各々７．１年および５．８年短くなったことを示した（Ａ．Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ａｎｎ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．、１３８巻：２４〜３２頁（２００３年））。これらの後者の危険因子を考慮すると、手術、薬物療法、ならびにライフスタイルの改善（食物および運動など）を含むことができる、いくつかの治療的介入を過体重／肥満のために利用できる。
【０１５７】
任意の体重管理プログラムの重要な食物戦略には、相当量の高繊維食品、特に、粘性可溶性繊維を含有する食品または食品サプリメントの摂取が関与すべきである（Ｋ．Ｍ．  Ｑｕｅｅｎａｎら、Ｎｕｔｒ．  Ｊ．（２００７年））。平均的なアメリカ合衆国国民は、１日当たり概ね２．４グラムの粘性可溶性繊維（１日当たりの基準で消費することが推奨される５〜１０グラムの食物粘性可溶性繊維の半分）を消費していると推定される（Ｔ．Ａ．  Ｓｈａｍｌｉｙａｎら、Ｊ．  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５５巻：７６１〜６９頁（２００６年））。
【０１５８】
食物単独によって理想的な量の可溶性繊維を摂取することが困難なため、食品成分として使用されるか、またはサプリメントとして消費され、可溶性繊維の一貫して高い摂取を可能とすることができる可溶性繊維濃縮物が明らかに求められている。ＰＧＸ（登録商標）（ＰｏｌｙＧｌｙｃｏｐｌｅＸ（登録商標））ともまた称される顆粒化ＶＦＣは、ＥｎｖｉｒｏＳｉｍｐｌｅｘ（登録商標）と称されるプロセスを使用して、グルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギネートを反応させることによって製造される新規な高粘性多糖類複合体である。このように得られた多糖類複合体（α−Ｄ−グルクロノ−α−Ｄ−マンノ−β−Ｄ−マンノ−β−Ｄ−グルカン），（α−Ｌ−グルロノ−β−Ｄ−マンヌロナン），β−Ｄ−グルコ−β−Ｄ−マンナン，α−Ｄ−グルクロノ−α−Ｄ−マンノ−β−Ｄ−マンノ−β−Ｄ−グルコ），（α−Ｌ−グルロノ−β−Ｄ−マンヌロノ），β−Ｄ−グルコ−β−Ｄ−マンナンは、実施例５および６に記載されている構造分析に示されているように新規な実体であり、任意の現在公知の繊維の中で最も高い粘度および保水性能力を有する。
【０１５９】
この実施例は、過体重および肥満の成人における１４週間の期間中の、体重減少、ボディマス指数（ＢＭＩ）、ならびに心血管代謝危険因子、例えば、コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、トリグリセリド、空腹時インスリン、空腹時グルコース、および２時間のグルコース負荷試験に対する、ＶＦＣ顆粒および適度なライフスタイルの改善の効力を調べるために行われた研究について記載する。
【０１６０】
方法：
参加者：全部で２９人のあまり体を動かさない（ｓｅｄｅｎｔａｒｙ）成人（２３人の女性；６人の男性、２０〜６５歳、概ね２５ｋｇ／ｍ２〜３６ｋｇ／ｍ２のボディマス指数（ＢＭＩ）範囲）は、地方紙に掲載した一連の広告によって参加するように招かれた。被験体は、このプログラムへの参加の前にインフォームドコンセントを与えられた。１９７５年のヘルシンキ宣言に記載された倫理基準によって観察的分析を行った。
【０１６１】
人体計測および他の測定：参加者を、週２回ベースで身長（ｃｍ）、体重（キログラム）、およびウエスト−ヒップ測定（ｃｍ）（標準的な医療タイプの巻き尺を使用）について評価した。使い捨ての紙のガウンを着用した被験体のへその上概ね２．２ｃｍおよび大転子におけるヒップ周りにおける、一貫した解剖学的位置でのウエスト−ヒップ測定を行った。体脂肪パーセントは、ベースライン（研究の開始前）およびその後２週間毎に生体電気インピーダンス試験（ＲＪＬ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）を使用して決定した。ボディマス指数（ＢＭＩ）および体脂肪パーセントを決定するために、インピーダンスデータのコンピュータ分析を用いた。
【０１６２】
食物および補給：各ボランティアは、健康的な食事、体重減少および運動について医師から一般的指示を受けた。さらに、食物および運動カウンセリングセッションが、２週間毎に１４週間、上記群に与えられた。これらの講義において強調されたのは、カロリー計算ではなく、食事量の制御ならびにどのように低脂肪、低血糖上昇指数食物を取り入れ（ｆｏｌｌｏｗ）て維持するかに主に焦点が当てられた。全体的な体重減少を増強するであろう運動の多様性、タイプ、およびタイミング（例えば、体力および心血管−有酸素トレーニング）に焦点を当てた一般的な助言がまたこのプログラムに含まれた。さらに、被験体は、飲料または食品（例えば、無脂肪ヨーグルト）に加えることができる顆粒化粘性繊維複合体（ＶＦＣ）（コンニャク／キサンタン／アルギネート（７０：１３：１７）顆粒、繊維複合体ＰｏｌｙＧｌｙｃｏｐｌｅＸ（ＰＧＸ（登録商標））ともまた称される）を与えられた。
【０１６３】
１０〜１５グラムの顆粒化ＶＦＣ／日の毎日の総摂取のために、５グラムのＶＦＣ顆粒を、各食事の５〜１０分前に１日２〜３回で１４週間、５００ｍｌの水と共に消費した。
【０１６４】
採血および試験施設の生化学分析：全ての試験施設測定は、カナダのブリティッシュコロンビアの独立した試験施設によって行われた。ベースライン（研究の開始の前）では、被験体は、下記の試験を含んだ採血手順の１０時間前に絶食するように求められた。総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ、グルコース、インスリン、および２時間インスリン。７５グラムの経口グルコース負荷試験をまた、試験施設によって決定された基準および手順に従って行った。異常な危険因子を有するもののみを、第１４週に後者の試験施設パラメーターを使用して再試験した。
【０１６５】
統計分析：処置の前および後の身長、体重、ＢＭＩ、体脂肪％、および様々な試験施設での値を含めたいくつかのタイプの変数を評価するために、コンピュータによる統計分析を対応のあるｔ検定を使用して行った。＜０．０５のｐ値を生じたこれらの変数において有意な結果が得られた。
【０１６６】
結果：
体重減少および他の人体計測パラメーター：１４週間のＶＦＣ使用の間に、群の体重（−５．７９±３．５５ｋｇ）、ウエスト測定（−１２．０７±５．５６ｃｍ）、体脂肪％（−２．４３±２．３９％）、およびＢＭＩ（−２．２６±１．２４ｋｇ／ｍ２）に有意な減少があった。完全な結果を、下記の表４および５に示す。
【０１６７】
【表４】
2013525269.tif 000008
＊第０週からのｐ＜０．０５
ａ＝体重はキログラム（ｋｇ）である
ｂ＝ウエストおよびヒップは、センチメートル（ｃｍ）である
【０１６８】
【表５】
2013525269.tif 000009
＊第０週からのｐ＜０．０５
ｃ＝ＢＭＩ（ｋｇ／ｍ２）。
【０１６９】
同様に、両方の性別は、下記の表６および表７に示すように、試験した体重減少の変数において個々に有意な減少を示した。下記の表７に示すように、男性は、１４週間の研究にわたり平均８．３０±２．７９ｋｇを減量した（平均７．４３％の体重減少）。表６に示すように、女性は、１４週間の研究にわたり平均５．１４±３．４９ｋｇを減量した（平均６％の体重減少）。
【０１７０】
【表６】
2013525269.tif 000010
＊  第０週からのｐ＜０．０５
ａ＝体重はキログラム（ｋｇ）である
ｂ＝ウエストおよびヒップは、センチメートル（ｃｍ）である
【０１７１】
【表７】
2013525269.tif 000011
＊  第０週からのｐ＜０．０５
ａ＝体重はキログラム（ｋｇ）である
ｂ＝ウエストおよびヒップは、センチメートル（ｃｍ）である。
【０１７２】
脂質レベル：研究の開始の前に得たベースライン値と比較して、ＶＦＣ使用の１４週間後、被験体は、総コレステロール値が平均して１９．２６％減少し（ｎ＝１７；第０週からｐ＜０．０５）、ＬＤＬコレステロール値が平均して２５．５１％減少した（ｎ＝１６；第０週からｐ＜０．０５）。表８に示すように、さらに、この研究において観察されたトリグリセリドの減少およびＨＤＬコレステロール値の増加についての傾向が観察されたが、観察された差異は統計的に有意ではなかった。
【０１７３】
空腹時インスリンおよびグルコース：１４週間のＶＦＣ使用の後、この研究における被験体は、研究の開始前に行ったベースライン測定と比較して、空腹時グルコースにおいて平均６．９６％の減少（ｎ＝２０；第０週からｐ＜０．０５）、２時間グルコース負荷において平均１２．０５％の減少（ｎ＝２１；第０週からｐ＜０．０５）、および空腹時インスリンレベルにおいて平均２７．２６％の減少（ｎ＝１７；第０週からｐ＜０．０５）を経験した。
【０１７４】
【表８−１】
2013525269.tif 000012
【０１７５】
【表８−２】
2013525269.tif 000013
＊  第０週からｐ＜０．０５；＊＊ベースラインからＮＳ（有意でない）。
【０１７６】
自己申告性スケールを使用した効力の分析：研究の終わりに参加者によって完成された自己申告性スケールにおいて、９７．７％のＶＦＣ使用者は、食品への欲求および空腹感の両方を抑制することにおいて、生成物への肯定的な応答を有したことに留意されたい。
【０１７７】
試験調製品の副作用：ＶＦＣの使用は全体的に、参加者にとって耐容性良好であり、軽症の胃腸の（ＧＩ）症状が全ての報告された愁訴の大部分を構成した。６８パーセントは、ＶＦＣの開始の概ね３週間以内に軽度のＧＩ症状（例えば、ガス、腹部膨満、便秘、軟便）が解決したことに留意されたい。参加者の３２パーセントはプログラムを通して軽度のＧＩ副作用を有することを見出したが、副作用はその重症度において、使用を中断するには十分でなかった。ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の耐容性に対する最近の対照研究が、フランスにおいて行われたが、これもまたこれらの後者の知見を確認した（Ｉ．Ｇ．  Ｃａｒａｂｉｎら、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｊ．、８巻：９頁（２００８年））。
【０１７８】
考察：この実施例において記載する医学的に管理された体重減少研究は、１４週間の期間にわたる食物および身体的活動の全体的な変化と合わせたＶＦＣ顆粒の使用が、過体重および肥満の被験体において心血管代謝危険因子の変化において有益であったことを示す。全体的に、群の体重（−５．７９±３．５５ｋｇ）、ウエスト測定（−１２．０７±５．５６ｃｍ）、および体脂肪パーセント（−２．４３±２．３９％）においてベースラインから有意な減少があった。さらに、これらの後者の肉体的な変化に、１４週間の相対的に短い期間にわたる、空腹時ＬＤＬ（−２５．５１％）、空腹時グルコース（−６．９６％）、および空腹時インスリン（−２７．２６％）レベルの有意な減少が並行して起こった。
【０１７９】
１４週間の期間にわたり、男性（−８．３０±２．７９ｋｇ）は、女性（−５．１４±３．４９ｋｇ）よりも多くの体重を平均して減量したことに留意することは興味深い。この変化は、安息時エネルギー消費において見られる基礎的な性差に基づき得る。Ｄｒ．  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｆｅｒｒａｒｏらは、年齢、活動性、および体組成についての統計的調節の後で、あまり体を動かさない状態の２４時間のエネルギー消費は男性と比較して女性において概ね５〜１０％低いことを示した（Ｒ．  Ｆｅｒｒａｒｏら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、９０巻：７８０〜７８４頁（１９９２年））。
【０１８０】
体重減少におけるＶＦＣによって得た結果（−５．７９ｋｇ）は、抗肥満症の医薬品であるオルリスタット（Ｘｅｎｉｃａｌ（登録商標）、Ａｌｌｉ（登録商標））を摂取したものに匹敵する。オルリスタットは、脂肪の吸収を減少させるリパーゼインヒビターである（Ｊ．Ｂ．  Ｄｉｘｏｎら、Ａｕｓｔ．  Ｆａｍ．  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ、３５巻：５７６〜７９頁（２００６年））。対照試験において、１６週間の期間にわたり１日３回６０ｍｇの用量で薬物オルリスタットを用いた軽度から中等度に過体重の３９１人の個体は、プラセボ群の１．９０ｋｇと比較して、３．０５ｋｇを減量した（Ｊ．Ｗ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ａｎｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．、４０巻：１７１７〜２３頁（２００６年））。
【０１８１】
ＶＦＣ使用はまた、軽度から中等度の肥満症と関連する他の危険因子の減少をもたらした。全体的に、１４週間のＶＦＣ治療の後に、ベースライン値（ｐ＜０．０５）からの総コレステロールレベル（−１９．２６％；−１．０９ｍｍｏｌ／Ｌ）およびＬＤＬコレステロールレベル（−２５．５１％；−０．８７ｍｍｏｌ／Ｌ）の有意な減少が観察された。ＶＦＣによって達成された脂質値の減少は、このような初期世代のスタチン薬物（ロバスタチン（ＭｅｖａｃｏｒＴＭ）など）の使用に匹敵した。例えば、１つの研究は、ロバスタチン治療開始の一カ月以内に、上昇したコレステロールレベルを有するものにおいて、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールが、各々１９％および２７％減少したことに注目した（Ｗ．Ｂ．  Ｋａｎｎｅｌら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．、６６巻：１Ｂ〜１０Ｂ頁（１９９０年））。
【０１８２】
さらに、実施例１および２に記載のように、ＶＦＣの使用は、血中脂質レベルを減少させるだけでなく、初期の代謝症候群の発症および進行を回復させるためにも使用し得る。内臓肥満、血清グルコース、およびインスリンレベルの増加は、高血圧症および脂質異常症と共に、代謝症候群と総称される一群の臨床状態である（Ｅ．Ｊ．  Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．、３７巻：５５９〜７９頁（２００８年））。調査によって、代謝症候群を有する人は、深刻な冠状動脈事象を起こす危険性が５０％を超えることが示された（Ｄ．Ｅ．  Ｍｏｌｌｅｒら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．、５６巻：４５〜６２頁（２００５年））。したがって、体重、空腹時インスリン、およびグルコースの任意の減少によって、それに罹患している個体は著しい健康上の利点を得る。
【０１８３】
この１４週間の研究において、ＶＦＣ使用によって、空腹時インスリンレベルの８９．４１±４４．８４ｐｍｏｌ／Ｌから６５．０４±３３．２１ｐｍｏｌ／Ｌ（ｐ＜０．０５）への減少をもたらした。空腹時インスリンの減少は、インスリン感受性の改善を反映し、これは、体重減少を伴うインスリン感受性の改善を伴った、ＧＬＰ−１活性の増加および食後高血糖の減少に部分的に起因し得る（Ｇ．  Ｒｅａｖｅｎら、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ．  Ｈｏｒｍ．  Ｒｅｓ．、５９巻：２０７〜２３頁（２００４年）を参照されたい）。
【０１８４】
これらの知見は、実施例１に記載するズッカー糖尿病ラット研究において得た結果と一致しており、このことは、ライフスタイルの改善と併せたＶＦＣの治療用途は、肥満症および特定の心血管代謝危険因子に罹患したものにとって実際的な利益になることを示唆する。肥満症およびコレステロールレベルの上昇を処置するために利用できる他のタイプの標準的な医療介入とは異なり、ＶＦＣ使用は、最小の副作用と関連する。この有利な安全性プロファイルは、この治療有効性と共に、過体重／肥満であり、上昇したコレステロールレベルを有し、かつ／またはインスリン抵抗性であるもののための第一の治療として、ＶＦＣを考えるべきであることを示唆する。
【０１８５】
（実施例４）
この実施例は、脱脂粉乳を与えられた対照被験体と比較した、粘性繊維複合体（ＶＦＣ）の補給の後の、血漿ＰＹＹレベルの増加および糞便の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の増加を示す標準体重を有する健康な成人における研究について記載する。
【０１８６】
基本原理：
多数の食物繊維は、消化管満腹ホルモンの分泌の増強および腸機能の改善を含めた多数の健康上の利益を有することが示されてきた（Ｒ．Ａ．  Ｒｅｉｍｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３７巻：３９４８〜３９５６頁（１９９６年）；ＲｅｉｍｅｒおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｏｂｅｓｉｔｙ、１６巻：４０〜４６頁（２００８年）；Ｐ．Ｄ．  Ｃａｎｉら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、９２巻：５２１〜５２６頁（２００４年）；Ｔ．Ｃ．  ＡｄａｍおよびＲ．Ｓ．  Ｗｅｓｔｅｒｅｒｐ−Ｐｌａｎｔｅｎｇａ、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、９３巻：８４５〜８５１頁（２００５年））。グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）およびペプチドＹＹ（ＰＹＹ）は、食品摂取の減少に関与する食欲不振誘発性のペプチドであり、一方、唯一の公知の食欲促進性ペプチドであるグレリンは、空腹感と関連する（ＷｒｅｎおよびＢｌｏｏｍ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１３２巻：２１１６〜２１３０頁（２００７年））。
【０１８７】
食物繊維の利点を制御する機序は完全には理解されていないが、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の生成は、効果のいくつかを媒介すると考えられる。ＳＣＦＡ、および主に酢酸、酪酸、およびプロピオン酸は、発酵性食物繊維の嫌気的発酵によって大腸内で生成され、満腹ホルモンの刺激および血清コレステロールの調節と関連付けられてきた。
【０１８８】
この研究の目的は、ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））または対照（脱脂粉乳）を２１日間消費した後で、健康な被験体における消化管満腹ホルモンＧＬＰ−１、ＰＹＹおよびグレリンのレベル、ならびに糞便中ＳＣＦＡ濃度を調べることであった。
【０１８９】
方法：
被験体：参加者は、１８．５〜２８．４ｋｇ／ｍ２のＢＭＩ（すなわち、標準体重）を有する１８歳〜５５歳の健康な非喫煙者の男性および女性であった。
【０１９０】
試験デザイン：無作為化二重盲検プラセボ対照試験を、下記のように行った。
【０１９１】
参加者を、２つの群に無作為に割り当てた。
【０１９２】
群１（ｎ＝２７）は、試験生成物である粘性繊維複合体（ＶＦＣ）（コンニャク／キサンタン／アルギネート（７０：１３：１７））顆粒（すなわち、繊維ブレンドを顆粒化によって加工し、Ｉｎｏｖｏｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｃａｌｇａｒｙ、ＣＡによって供給されるＰＧＸ（登録商標）として商業的に公知の複合体を形成した）を消費した。
【０１９３】
群２（ｎ＝２７）は、対照生成物（脱脂粉乳、試験生成物と同様の色およびテクスチャーであった）を消費した。
【０１９４】
対照および試験生成物を、ＣＲＩＤ  Ｐｈａｒｍａ、Ｆｒａｎｃｅによる１０ｇの市販の朝食シリアルと事前混合し、１３５ｍｌの市販のプレーンヨーグルトと共にパッケージングした。参加者は、摂取の前にヨーグルトおよび事前混合した生成物を合わせた。
【０１９５】
研究の最初の７日間について、参加者は、２回の主要な食事の一部として２．５ｇの生成物（試験または対照）を１日２回消費した。研究の最後の１４日間に、参加者は、５ｇの生成物（試験または対照）を１日２回消費した。研究の期間中、参加者は、繊維に富んだ食品の消費を控え、食物繊維摂取を１日当たり概ね１０ｇに制限するように指示された。事前混合した生成物およびヨーグルトを除いて、全ての他の食品は、参加者が通常の食物として購入および調製した。
【０１９６】
評価：参加者は、４回の別々の来院に行われた評価を有した。スクリーニング（来院０、スクリーニング来院、「Ｖ０」）は、理学的検査を伴った。
【０１９７】
血液試料：空腹時血液試料を、来院１、研究の０日目に集めた（ベースライン）。来院２＝研究の７日目、１週間の５ｇの生成物摂取後。来院３＝研究の２１日目、２週間の１０ｇの生成物摂取後。各来院において、Ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ（０．０３４ｍｇ／ｍｌ血液；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を加えたＥＤＴＡ処理したチューブ中に血液を集め、３０００ｒｐｍで４℃にて１２分間遠心分離した。分析まで血漿を−８０℃で保存した。
【０１９８】
便の採取：糞便試料は、ベースライン（Ｖ１、０日目）、１週間の５ｇ／ｄの生成物摂取後（Ｖ２、８日目±１）、および２週間の１０ｇ／ｄの生成物摂取後（Ｖ３、２２日目±２）において、被験体から得た。被験体は、各々の計画的な来院の前４８時間以内に１回分の糞便試料を集めた。概ね５ｇの試料は、分析のためにドライアイス上で輸送した。
【０１９９】
血漿分析：
ＧＬＰ−１：活性ＧＬＰ−１を、ＬＩＮＣＯ  ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ、ＭＯ）からのＥＬＩＳＡキットを使用して定量化した。メーカーによると、アッセイ感受性は、１００μｌの試料のサイズについて２ｐＭである。４ｐＭで、アッセイ内ＣＶは８％であり、アッセイ間ＣＶは１３％である（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ、ＭＯ）。
【０２００】
ＰＹＹおよびグレリン：ＰＹＹおよびグレリンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）からのＥＬＩＳＡキットを使用して定量化した。ＰＹＹについてのアッセイ感受性は０．０６ｎｇ／ｍｌであり、グレリンについては０．１３ｎｇ／ｍｌであった。両方のアッセイについてアッセイ内ＣＶは＜５％であり、ＰＹＹおよびグレリンについてアッセイ間ＣＶは、各々、＜１４％および＜９％であった。
【０２０１】
インスリン：インスリンを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｔ（Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ、ＭＯ）からのＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。アッセイ感受性は、２μＵ／ｍｌであり、アッセイ内ＣＶは＜７％、およびアッセイ間ＣＶは＜１１．４％である。
【０２０２】
統計分析：結果を平均±ＳＥＭとして示す。３回の来院におけるペプチドレベルを、ボンフェローニ調節を伴う反復測定ＡＮＯＶＡによって分析した［パラメーターとして時間（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３）および食物を伴う二因子分析］。２つのパラメーターの間の関連を、ピアソン相関係数を使用してコンピュータ処理した。インスリン抵抗性についての恒常性モデル評価は、式［ＨＯＭＡ−ＩＲ＝空腹時インスリン（μＵ／ｍｌ）×空腹時グルコース（ｍｍｏｌ／ｌ）／２２．５］を使用して計算した。データは、ＳＰＳＳ  ｖ１６．０ソフトウェア（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を使用して分析した。
【０２０３】
糞便分析：ＳＣＦＡ測定は、Ｖａｎ  Ｎｕｅｎｅｎら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、１５巻：１３７〜１４４頁（２００３年）によって行った。手短に言えば、糞便試料を遠心分離し、ギ酸（２０％）、メタノールおよび２−エチル酪酸（内部標準、メタノール中２ｍｇ／ｍｌ）の混合物を、透明な上清に加えた。０．５ｍｌの試料を、自動試料採取装置を使用して、Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ  ＣＰ９００１ガスクロマトグラフィーのＧＣ−カラム（Ｓｔａｂｉｌｗａｘ−ＤＡ、長さ１５ｍ、ＩＤ０．５３ｍｍ、フィルム厚さ０．１ｍｍ；Ｖａｒｉａｎ  Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ、Ｂｅｒｇｅｎ  ｏｐ  Ｚｏｏｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に注入した。Ｌ−およびＤ−乳酸の両方を、Ｃｏｂａｓ  Ｍｉｒａ  ｐｌｕｓ  ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ、Ａｌｍｅｒｅ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって透明な上清中で酵素的に決定した。ｐＨを、微小電極を使用して測定した。サブ試料を１１０℃で最低２日間乾燥させることによって乾物を測定した。
【０２０４】
統計分析：結果を平均±ＳＥＭとして示す。３回の来院におけるＳＣＦＡを、来院（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３）を被験体内要因として、および処置を群間要因として、反復測定ＡＮＯＶＡによって分析した。ＳＣＦＡと他の測定した結果（満腹ホルモン、グルコース、インスリンおよびＨＯＭＡ−ＩＲ）との間の相関を、ピアソンの相関分析を使用して決定した。有意性は、Ｐ≦０．０５に設定した。
【０２０５】
結果：
５４人の被験体（２５人の男性および２９人の女性）が研究に参加し、４回の来院（Ｖ０〜Ｖ３）全てに参加した。研究から離脱した被験体はなく、生成物は耐容性良好であった。対照生成物を与えられた対照群（１１人の男性、１６人の女性）は、平均年齢が３０．９±１０．８歳であり、最初のＢＭＩが２２．８±２．４であった。試験生成物（ＶＦＣ）を与えられた群は、平均年齢が３２．３±１０．３歳であり、最初のＢＭＩが２２．７±２．１であった。群間でベースラインの臨床および生化学的特性の差異はなかった。
【０２０６】
Ｖ１、Ｖ２およびＶ３における体重、グルコース、インスリンおよびＨＯＭＡ−ＩＲスコアを、下記の表９に提供する。
【０２０７】
【表９】
2013525269.tif 000014
値は、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝２７／群）。Ｎ／Ｍ＝検出不可。性別が反復測定ＡＮＯＶＡにおける共変量として含まれたとき、試験群についてＨＯＭＡ−ＩＲについての来院間の差異は有意であった（ｐ＝０．０２４）。
【０２０８】
表９において上記で示すように、対照および試験群においてＶ１とＶ３との間に体重の有意な変化はなかった。空腹時血漿グルコースは、経時的にまたは群間で変わらなかった。試験群（すなわち、ＰＧＸによる）においてＶ１とＶ３との間に空腹時インスリンの１４％の減少があったが、この差異は、対照群と統計的に異ならなかった。ＨＯＭＡ−ＩＲスコアについての平均未加工および変化パーセントは、対照群について−０．０４または−３．６％、および試験群において−０．２１または−１８．３％であった。ＨＯＭＡ−ＩＲにおける減少パーセントは、試験群において対照（Ｐ＝０．０３）より有意に大きかった。反復測定ＡＮＯＶＡは、来院の効果についてＰ＝０．０６７を示した。性別が反復測定分析における共変量として含まれたとき、来院の効果は統計的に有意であった（Ｐ＝０．０２４）。別々に分析したときに、男性は、Ｖ１とＶ３との間に、女性よりもＨＯＭＡ−ＩＲスコアの大きな減少を示した（Ｐ＝０．０４２）。ＨＯＭＡ−ＩＲにおける減少は、男性参加者において対照および試験について同様であった（各々、−０．３６±０．２０および−０．３１±０．１８）。しかし、女性において、ＨＯＭＡ−ＩＲスコアは対照群において増加し（＋０．１８±０．１７）、試験群において減少した（−０．０８±０．１９）。
【０２０９】
来院間でまたは群間で、空腹時ＧＬＰ−１レベルの有意差はなかった（データは示さず）。
【０２１０】
図１０Ａは、Ｖ１（０日目）、Ｖ２（１４日目）およびＶ３（２１日目）での、全ての参加者（ｎ＝５４）についての、健康な成人における空腹時ＰＹＹレベルに対する、対照対ＶＦＣの効果を図表によって例示する。値は平均±ＳＥＭである。図１０Ａに示すように、反復測定分析は、空腹時ＰＹＹレベルについて来院の統計的に有意な効果を示した（Ｐ＝０．００４）。図１０Ａに示す結果がＢＭＩによって層別化されたとき、ＢＭＩ＜２３を有するこれらの参加者は、図１０Ｂに示すように、来院（Ｐ＝０．０３）および処置（Ｐ＝０．０３７）の効果としてＰＹＹレベルにおける有意差を示した。分散分析は、研究の終わりに、対照群に対して試験群において有意により高いレベルのＰＹＹを示した（Ｐ＝０．０４３）。増加したＰＹＹレベルは、これが食品摂取の減少と関連する食欲不振誘発性のホルモンであるため有利であることに留意されたい。
【０２１１】
図１０Ｃに示すように、反復測定ＡＮＯＶＡは、空腹時総グレリンレベルについての来院（Ｐ＜０．００１）および処置（ｐ＝０．０３７）の有意な効果を示した。図１０Ｃに示すように、対照およびＶＦＣ処置された試験群において、各々、８９．７±２０．０および９７．７±２６．６ｐｍｏｌ／ｌの減少が観察された。
【０２１２】
ＰＹＹは、Ｖ２においてグルコースと負の相関関係があった（ｒ＝−０．２７、Ｐ＝０．０４６）。Ｖ１およびＶ２においてグレリンとインスリンとの間に（各々、ｒ＝−０．２８、Ｐ＝０．０３８およびｒ＝−０．３１、Ｐ＝０．０２２）、ならびにＶ１およびＶ２においてグレリンとＨＯＭＡとの間に（各々、ｒ＝−０．２７、Ｐ＝０．０５２およびｒ＝０．２８、Ｐ＝０．０４１）また有意な負の相関があった。
【０２１３】
糞便のＳＣＦＡおよび乳酸：
下記の表１０に示すように、ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））による酢酸の濃度は、対照（Ｐ＝０．０１）群に対して有意により高かった。Ｖ１（ベースライン；ｐ＝０．２８６）またはＶ２（ｐ＝０．０９６）において群間で酢酸濃度の差異はなかったが、Ｖ３においてＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））による濃度は対照群より有意に高かった（ｐ＝０．０１８）。群間で、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、または乳酸濃度において、有意な処置差はなかった。反復測定分析は、対照（Ｐ＝０．０６）に対して、ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））を消費した被験体において、Ｖ３におけるより高い総ＳＣＦＡとして同定された、総ＳＣＦＡについての有意な処置効果を示した（Ｐ＝０．０３）。糞便のｐＨ（０．０２）について来院の有意な効果があり、両方の群はＶ１とＶ３との間で減少した。
【０２１４】
満腹ホルモン、インスリンおよびグルコースとの相関
血漿グレリン、ＰＹＹ、ＧＬＰ−１、インスリン、グルコース、およびＨＯＭＡ−ＩＲのレベルの分析の結果を、上記の表９に示す。下記の表１０に示すように、Ｖ３において空腹時グレリンとプロピオン酸との間に有意な負の相関があった（ｒ＝−０．２９；Ｐ＝０．０３）。ベースラインと最終来院との間のプロピオン酸の変化は、Ｖ３−Ｖ１として計算し、δプロピオン酸と称した。δプロピオン酸は、δインスリン（ｒ＝−０．２６；Ｐ＝０．０５）およびδＨＯＭＡ−ＩＲ（ｒ＝−０．２５；Ｐ＝０．０７）と負に関連した。
【０２１５】
【表１０】
2013525269.tif 000015
考察
血漿ＰＹＹレベルの分析
この実施例において記載する研究の結果は、ＶＦＣ使用が、対照生成物と比較して、空腹時ＰＹＹのレベルを増加させ、これはＢＭＩ＜２３の参加者において統計的に有意であることを示す。ＰＹＹの血漿濃度は典型的には、過体重および肥満のヒトにおいて減少し（Ｒ．Ｌ．  Ｂａｔｔｅｒｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、４１８巻：６５０〜６５４頁（２００２年））、ＰＹＹのこの分泌の障害は、肥満症の発症を促進し、かつ／または体重減少を妨げ得る。
【０２１６】
この研究の対照群（ａｒｍ）における参加者は、３週間の研究にわたって空腹時ＰＹＹのあまり大きくはない減少を経験した一方、ＶＦＣを消費した参加者は、これらのＰＹＹレベルを維持し、ＢＭＩ＜２３を有するものの場合、実際増加させることができた。プレバイオティクス（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ）の微生物発酵は、健康な成人におけるＧＬＰ−１およびＰＹＹ生成の増加と関連することが最近示されてきた（Ｐ．Ｄ．  Ｃａｎｉら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．（２００９年））。げっ歯類において、食物繊維の微生物発酵の副生成物である短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、ＰＹＹ分泌を直接刺激することが示されてきた（Ｖ．  Ｄｕｍｏｕｌｉｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３９巻：３７８０〜３７８６頁（１９９８年））。ＶＦＣの出発物質の１つであるコンニャクグルコマンナンは、ヒトにおいて酢酸、プロピオン酸、および酪酸の糞便中濃度を増加させることが示されてきた（Ｈ．Ｌ．  Ｃｈｅｎら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｎｕｔｒ．、２７巻：１０２〜１０８頁（２００８年））。繊維の粘度はまた、独立して食品摂取に影響を与えることが示されてきており、この効果は、満腹ホルモン放出における変化によって媒介され得る。
【０２１７】
空腹時グレリンのレベルは、ＶＦＣを含有する試験生成物を消費する群および対照生成物を消費する群の両方において、来院１（０日目）と来院３（２１日目）との間に抑制された。グレリンは食品摂取を刺激し、脂肪過多を促進するため（Ａ．Ｍ．  Ｗｒｅｎら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．、８６巻：５９９２〜５９９５頁（２００１年）；Ｍ．  Ｔｓｃｈｏｐら、Ｎａｔｕｒｅ、４０７巻：９０８〜９１３頁（２０００年））、食事の前にグレリンの漸進的上昇を弱める化合物は魅力的である。対照群に対してＶＦＣ群において観察されたグレリンの８ｐｍｏｌ／ｌ超の減少は、この研究において有意に異ならなかったが、他は、食物繊維による空腹時および食事関連グレリンの減少を示した（例えば、ＰａｒｎｅｌｌおよびＲｅｉｍｅｒ、２００９年を参照されたい）。食物化合物がグレリンを抑制する機序は周知ではないが、栄養素の吸収速度および腸管腔のオスモル濃度が役割を果たし得ることが仮定されてきた（Ｏｖｅｒｄｕｉｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４６巻：８４５〜８５０頁（２００５年））。さらにこれに関して、ＶＦＣは、任意の現在公知の個々の多糖類よりも３〜５倍大きい粘度を有し、したがって腸による栄養素吸収を変化させる可能性が高いことに留意されたい。
【０２１８】
この研究において、３週間にわたって２群の間に、ＧＬＰ−１の空腹時レベルにおける差異は検出されなかった。ＧＬＰ−１についてこのように変化が欠如していることは、他の食物繊維において観察されてきた（Ｔ．Ｃ．  ＡｄａｍおよびＲ．Ｓ．  Ｗｅｓｔｅｒｅｒｐ−Ｐｌａｎｔｅｎｇａ、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．、９３巻：８４５〜８５１頁（２００５年）；Ｋ．Ｓ．  Ｊｕｎｔｕｎｅｎら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．、７８巻：９５７〜９６４頁（２００３年））。
【０２１９】
この研究に参加した健康な被験体におけるグルコースおよびインスリンの濃度は十分に正常範囲内であったが、試験群における研究にわたるインスリンの１４％の減少、および対照群に対する試験群におけるＨＯＭＡ−ＩＲスコアの５．３倍大きな減少は、インスリン感受性の基礎的な改善を示し得、これは実施例１および３で得られた結果と一致している。要約すれば、この研究は、ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））が、健康な参加者において、食品摂取の減少に関与する消化管ペプチドであるＰＹＹの空腹時レベルを増加させることを示す。
【０２２０】
糞便のＳＣＦＡレベルの分析
上記で記載のように、発酵性食物繊維は、エネルギー摂取を減少させること、および食欲不振誘発性の消化管ホルモンの分泌を増加させることが示されてきた。遠位消化管における食物繊維の微生物発酵からＳＣＦＡが生じることは、この制御において役割を果たすと考えられる。最近、Ｃａｎｉら、Ａｍ  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ、９０巻：１２３６〜１２４３頁（２００９年）は、呼気水素ガス排出（消化管微生物発酵の尺度）と、食品摂取を減少させる強力なインスリン分泌性ホルモンである血漿ＧＬＰ−１との間に有意な相関を示した。１０ｇ／ｄまでの新規な機能繊維複合体であるＰＧＸ（登録商標）を消費している被験体における総ＳＣＦＡ、特に、酢酸の糞便中濃度の有意な増加を示すことによって、本研究はこれらのデータを基礎とする。
【０２２１】
酢酸、プロピオン酸、および酪酸は、遠位消化管において生成される主要なＳＣＦＡである。腸内でＳＣＦＡを感知する遊離脂肪酸受容体（ＦＦＡＲ）は、ＦＦＡＲ２（ＧＰＲ４３としてもまた公知である）およびＦＦＡＲ３（ＧＰＲ４１としてもまた公知である）として最近同定されてきた。Ｉｃｈｉｍｕｒａ  Ａ．ら、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ＆  Ｏｔｈｅｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ、８９巻：８２〜８８頁（２００９年）を参照されたい。ＦＦＡＲ２は、ＰＹＹを発現している腸内分泌細胞において発現しており、これは、ＳＣＦＡがＰＹＹ放出を刺激することを示すデータと一致する（Ｉｃｈｉｍｕｒａら、２００９年）。インビトロで、酢酸およびプロピオン酸は、ＦＦＡＲ２活性化を介して３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において脂肪分解を阻害すること、マウスにおいてインビボで、血漿遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を抑制することが示されてきた。Ｇｅ  Ｈら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４９巻：４５１９〜４５２６頁（２００８年）を参照されたい。ＦＦＡの上昇は、インスリン抵抗性および脂質異常症と関連付けされてきた。経口的に投与されたプロピオン酸が、ＦＦＡＲ３を介してマウスにおいてレプチンを増加させることを示唆する証拠もまた存在する（Ｉｃｈｉｍｕｒａら、２００９年）。レプチンが食品摂取を減少させることにおいて中心的に作用することを考えれば、食物繊維の微生物発酵によって生成されるＳＣＦＡが、部分的にＦＦＡＲ２およびＦＦＡＲ３を介して宿主の代謝を制御することが考えられる。
【０２２２】
この研究の結果は、３週間のＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））補給の終わりまでの、酢酸および総ＳＣＦＡの有意な増加を示す。３週間の補給にわたり本発明者らの被験体において体重に変化はなかったが、３カ月の期間にわたりオリゴフルクトースなどの他の可溶性繊維によって示されてきたように、試験した最終用量（１０ｇ／ｄ）におけるＰＧＸ（登録商標）繊維の消費によって、体脂肪量を減少させることができたと考えられる（Ｐａｒｎｅｌｌ  Ｊ．Ａ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ、８９巻：１７５１〜１７５９頁（２００９年））。プロピオン酸とグレリンとの間の負の相関は、食物繊維（特に、ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））などの高粘度を有するもの）と関連する食品摂取の全体的な減少に適合する。インスリンおよびＨＯＭＡ−ＩＲとの負の相関は、全体的な代謝的健康を改善させ、インスリン抵抗性を減少させるこの機能繊維の能力と一致する。
【０２２３】
結論として、この実施例の結果は、３週間の期間にわたり適度な量の高粘性かつ可溶性の繊維であるＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））を消費した被験体における糞便の酢酸の増加を示す。ＳＣＦＡ（プロピオン酸）は、空腹時グレリン、インスリンおよびＨＯＭＡ−ＩＲと負の相関関係があった。これは、本発明者らの知識では、ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））による糞便中ＳＣＦＡ濃度の増加を示す最初の報告であり、結腸中のこの発酵が、ＦＦＡＲ２およびＦＦＡＲ３を介して媒介され得る生理学的作用のカスケードを誘発し得ることを示唆している。
【０２２４】
（実施例５）
この実施例は、顆粒化粘性繊維複合体（ＶＦＣ）（コンニャク／キサンタン／アルギネート（７０：１３：１７））の一次構造の分析を記載する（すなわち、繊維ブレンドを顆粒化によって加工し、ＰＧＸ（登録商標）として商業的に公知の複合体を形成した）。
【０２２５】
基本原理：
多糖類は、グリコシドのヒドロキシル基によって連結している糖（単糖類）から構成される天然ポリマーである。これらは分岐状または直鎖状でよく、数千ダルトンから２百万ダルトン超の範囲の非常に高い分子量を有することができる。顆粒化ＶＦＣ（７０％のコンニャクマンナン、１７％のキサンタンガム、１３％のアルギン酸ナトリウム）の一次構造を、メチル化分析、加水分解およびクロマトグラフィーならびに加水分解およびＮＭＲ分光法を使用して決定した。
【０２２６】
コンニャクグルコマンナンは、Ａｍｏｒｐｈｏｐｈａｌｌｕｓ  ｋｏｎｊａｃまたはコンニャクの根の塊茎から得られる、部分的にアセチル化された（１，４）−β−Ｄ−グルコマンナンである（Ｂｅｗｌｅｙら、１９８５年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｉｎ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｌａｎｔｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２８９〜３０４頁）。
【０２２７】
キサンタンガムは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓによって生成される微生物多糖類である。これは、独特な流体力学的特性およびゲル形成特性を有する。キサンタンの構造は、β−（１，４）−連結グルコース単位（ｕｎｉｔｓｋ）のセルロース骨格をベースとし、これは、主鎖において１つおきのグルコース単位に連結しているマンノース−グルクロン酸−マンノースの三糖類側鎖を有する。いくつかの末端マンノース単位はピルビル化（ｐｙｒｕｖｙｌａｔｅｄ）され、内部マンノース単位のいくつかは、アセチル化される（Ａｎｄｒｅｗ  Ｔ．Ｒ．、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、４５号（１９７７年））。
【０２２８】
アルギン酸ナトリウムは、褐海藻（例えば、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｈｙｐｅｒｂｏｒｅａ、Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ、Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ）から得られる多糖類のナトリウム塩である。この化学構造は、（１，４）連結−β−Ｄ−ポリマンヌロン酸のブロック（ポリＭ）、（１，４）連結−α−Ｌ−ポリグルロン酸のブロック（ポリＧ）、および２種のウロン酸の交互ブロック（ポリＭＧ）からなる。Ｇｒａｓｄａｌｅｎ，  Ｈ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ、８９巻：１７９〜１９１頁（１９８１年）。アルギネートは二価金属カチオンと強力なゲルを形成し、「エッグボックス」モデルは、この形態のゲル化を記載するために使用されてきた。Ｇｒａｎｔ，  Ｇ．Ｔ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、３２巻：１９５〜１９８頁（１９７３年）を参照されたい。
【０２２９】
方法：
この実施例において使用した全ての多糖類は、ＩｎｏｖｏＢｉｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ（Ｃａｌｇａｒｙ、Ａｌｂｅｒｔａ、Ｃａｎａｄａ）から供給された。単一の多糖類は、コンニャクグルコマンナン（ロット番号２５３８および２６８１）；キサンタンガム（ロット番号２５０４および２５０５）；ならびにアルギン酸ナトリウム（ロット番号２４５５、２６３８、および２６３９）であった。顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ、ロット番号９００４９５および２０２９０７０５２３）は、７０％のコンニャクマンナン、１７％のキサンタンガム、および１３％のアルギン酸ナトリウムをブレンドし、３０％〜６０％（ｗ／ｗ）の水をＶＦＢに加え、続いて熱を加えて、加えた水を乾燥させることによって生成した。３成分混合物♯１（ＴＭ１、ロット番号９００２８５、９００４１６、および１１１２０５０８０９）と称される、同じ３成分混合物（未加工ＶＦＢ）の試料を、加工（例えば、顆粒化）の前に採取した。
【０２３０】
１．メチル化分析
基本原理：部分メチル化アルジトール酢酸のＧＣＭＳ分析を使用して、多糖類の単糖類構成成分およびこれらの結合の位置を明らかにした（Ｈ．  Ｂｊｏｅｒｎｄａｌら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５巻：４３３〜４０頁（１９６７年））。したがって、メチル化分析によって、３つの多糖類（コンニャクマンナン、キサンタンガム、およびアルギネート）を一緒に加えて、これらを熱処理および顆粒化プロセスによって加工するプロセスによって生じた新規かつ予想外の糖および結合位置を明らかにすることができる。しかし、メチル化分析は、糖がどのように一緒に連結しているか（αまたはβ）を示さない。メチル化分析は、メチル化せず、加水分解に対して耐性であるウロン酸（例えば、アルギン酸ナトリウム）の分析には不十分であることは公知である（Ｐｅｒｃｉｖａｌら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｌ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１０１頁（１９６７年））。アルギン酸ナトリウムは完全にウロン酸（マンヌロン酸およびグルロン酸）から構成されるため、ＶＦＣを分析するためにさらなる方法が必要であり、これには、加水分解、ならびに下記のようなパルスアンペロメトリック検出法を有する高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）、および１Ｈ  ＮＭＲ分光法による、得られた中性糖およびウロン酸の分析が関与する。
【０２３１】
方法：
ＶＦＣの各個々の構成成分（コンニャクマンナン、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム）、非顆粒化ＶＦＢ（「３成分混合物♯１」または「ＴＭ１」と称する）および顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標）と称する）が含まれる、表１１において下記で示す試料を分析した。秤量した量の単一の多糖類および３成分混合物を取り、数滴のジメチルスルホキシドを４５０μｇの各試料に加えた。試料を水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ／ヨウ化メチル（ＭｅＩ））を使用してペルメチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）し、試料を振盪し、次いで２時間の期間にわたり全部で４回超音波処理した。試料をクロロホルム抽出によって精製し、次いで２Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で１２０℃にて２時間加水分解し、２ＭのＮＨ４ＯＨ中の重水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＤ４）で２時間室温にて還元した。重水素化ホウ素の分解によって生成されたボレートを、氷酢酸中のメタノールの混合物（９０：１０）を３回添加することによって除去し、続いて凍結乾燥した。次いで、無水酢酸を使用して試料をアセチル化した（１時間、１００℃）。アセチル化試料を、クロロホルムへの抽出によって精製した。
【０２３２】
メチル化分析の結果：
【０２３３】
【表１１】
2013525269.tif 000016
「ＴＭ１」：３成分混合物♯１。
【０２３４】
表１１は、７つの試料に由来する部分メチル化アルジトール酢酸（ＰＭＡＡ）において行った連結分析の再構成イオンクロマトグラム（図示せず）において観察された結果の要約を提供する。表１１に示すように、アルギン酸ナトリウムの試料は、４−連結グルコースについての弱いシグナルのみを生じた。各多糖類試料において観察されるシグナルの比較は、コンニャクマンナン粉末中で見出される構成成分が、報告された構造、すなわち、短い末端側鎖を伴った、４位を介して連結しているグルコースおよびマンノースと一致したことを示す。キサンタンガム試料は、末端マンノースおよび／または末端グルコースおよび４−連結グルコースについての強いシグナルに加えて、２−連結マンノースについての弱いシグナルを生じた。１４．６５分で溶出するシグナルは、３，４−連結分岐状ヘキソースと一致するフラグメンテーションパターンを示した。全てのキサンタンガムシグナルは、報告される構造と一致する。キサンタンガムならびに全てのＶＦＢおよびＶＦＣ試料中で約１４．６５分に現れるシグナルは、キサンタンガム試料において観察される３，４−連結ヘキソース分岐点と一致する。
【０２３５】
要約すれば、試料中の割当てができるシグナルの全体的なプロファイルは、コンニャクマンナンと一致する構成成分を含有し、キサンタンガム（分岐点）に割り当てることができる構成成分をまた含有する。これらのメチル化の結果は下記の結論と一致する。第１に、非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）および顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の両方は、コンニャクマンナン（４−連結マンノース）およびキサンタンガム（３，４−連結分岐状グルコース）の両方を含有する。スペクトルにおける他のメチル化糖は、これらの生体高分子のいずれかから生じさせることができる。第２に、６−連結グルコース（デンプン）などの他の一般の生体高分子は存在しない（例えば、ガラクトマンナン、カラギーナン、または同様のものについての証拠はない）。第３に、これらの結果から、新規な糖様構造が形成されたという証拠はない（例えば、他の糖と一致する質量はなく、顆粒化ＶＦＣおよび非顆粒化ＶＦＢの両方は、同様の質量スペクトルを有す）。第４に、この分析は、天然ウロン酸がメチル化しないという事実によって、アルギン酸ナトリウム構成成分を同定することができない（Ｐｅｒｃｉｖａｌら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｌ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１０１頁（１９６７年））。アルギン酸ナトリウムの分析は、下記のような加水分解およびクロマトグラフィー、ならびに加水分解およびＮＭＲ分光法を使用して対処する。
【０２３６】
２．加水分解およびＧＣＭＳ分析
基本原理：
キサンタンガムおよびアルギン酸ナトリウムは両方とも、ウロン酸、すなわち、グルクロン酸（キサンタンガム）ならびにマンヌロン酸およびグルロン酸（アルギン酸ナトリウム）を含有する。これらの構造的特徴を同定することは困難である。これは、電子求引性カルボキシル基によってもたらされる多糖類中のウロン酸の極度な加水分解抵抗性によるものであり、これによって酸触媒加水分解における第１段階、すなわち、グリコシド酸素原子のプロトン化を達成することが非常に困難となる（Ｐｅｒｃｉｖａｌら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｌ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１０４頁（１９６７年））。これによって、これらの多糖類が、攻撃に対し非常に安定的なものになるという効果を有する。より古い文献において、アルギン酸ナトリウム加水分解の方法である数時間の９０％Ｈ２ＳＯ４による処理、続いて希釈後の２４時間の煮沸が記載されている（Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、３０２巻：１８６頁（１９５５年））。しかしより最近では、強力な揮発性酸であるトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が使用されてきており、除去の容易さについての揮発性があるという追加的な利点を伴って、ポリウロニド中の非常に耐性の結合を加水分解することが見出されてきた（Ｌ．  Ｈｏｕｇｈら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１巻：９頁（１９７２年））。
【０２３７】
この実施例は、クロマトグラフィーの使用およびＮＭＲの任意選択の使用によって、ＶＦＢおよびＶＦＣ（「ＶＦＢ／Ｃ」とまた称する）の加水分解、ならびに全ての加水分解生成物（グルコース、マンノース、グルコロン酸、マンヌロン酸、およびグルロン酸）の特性決定のために開発された新規な分析法について記載する。
【０２３８】
方法：
ＧＣＭＳ分析：部分メチル化アルジトール酢酸（ＰＭＡＡ）を、ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣＭＳ）によって分離し、同定した。ＧＣ分離はＤＢ５カラムで行った（４５℃にてオンカラム注入、４０℃で１分、次いで、１００℃へと２５℃／分、次いで、２９０℃へと８℃／分の温度プログラム、最後に２９０℃にて５分間で維持）。ＭＳ同定は、単位分解によって５０〜６２０ダルトンの質量範囲にわたって走査モードで７０ｅＶのイオン化電圧にて行った。
【０２３９】
部分加水分解条件：加水分解：条件は、結果が望まれない分解生成物によってマスクされる程度まで糖を攻撃することなく、多糖類をできるだけ完全に加水分解するＶＦＢ／Ｃのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）加水分解のために工夫された。
【０２４０】
ＴＦＡ加水分解を、２ＭのＴＦＡを有する密封したチューブ中に入れた表１１に示す３０ｍｇの試料で行い、１００℃にて１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、および７２時間加熱した。試料を規定された時間で熱から取り出し、ＴＦＡをフリーズドライヤー中で蒸発させ、試料をシリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ  ＴＬＣシリカゲル６０°Ｆ）上で、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（溶媒：ブタノール：エタノール：水、５：３：２）によって調べた。メタノール中の硫酸（５％）を使用してスポットを可視化した。望まれない分解生成物によって結果がマスクされる程度まで糖を攻撃することなく、ＶＦＢ／Ｃ中の多糖類を構成糖にできるだけ完全に加水分解するための最良の条件は、７２時間の１００℃での２ＭのＴＦＡインキュベーション、濾過、凍結乾燥×２であったことが決定された。結果を表１２に要約する。
【０２４１】
加水分解分析の結果：
【０２４２】
【表１２−１】
2013525269.tif 000017
【０２４３】
【表１２−２】
2013525269.tif 000018
クロマトグラフィー：
３種の多糖類から構成糖を放出させる加水分解条件を確立して、両方の中性糖（グルコース、マンノース）をウロン酸（グルクロン酸、マンヌロン酸、およびグルロン酸）から分離することができるクロマトグラフィー法を開発した。
【０２４４】
Ｄｉｏｎｅｘ酸クロマトグラフィーは、糖および関連する化合物に広範に使用されてきたクロマトグラフィー法である。この検出方法は、屈折率などの過去に用いられてきた方法の多くと比較すると、非常により高感度である。
【０２４５】
方法：
機器：Ｄｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００  ＤｕａｌポンプＩＣシステム、電気化学的検出器、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎデータシステム。
材料：水（脱イオン化および濾過済み）、水酸化ナトリウム（５０％溶液、ＨＰＬＣ電気化学的グレード）、酢酸ナトリウム、無水（≧９９．５％）。
【０２４６】
【表１３−１】
2013525269.tif 000019
【０２４７】
【表１３−２】
2013525269.tif 000020
試料の調製：（濃度、約０．０２ｍｇ／ｍｌ）
試料溶液を、３０ｍｇ／ｍｌのＤ２Ｏ中の最初の濃度から概ね０．０２ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した（ＮＭＲ試料）。アリコート（１５μｌ）の加水分解産物および標準液を脱イオン水（３０ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、分析のために脱イオン水で０．０２２５ｍｇ／ｍｌに希釈した。３つの多糖類からの予想される加水分解産物構成成分の各々の標準液を、同様に調製した：グルコースおよびマンノース（コンニャクグルコマンナンおよびキサンタンガムから）、グルクロン酸（キサンタンガムから）、ならびにマンヌロン酸およびグルロン酸（アルギン酸ナトリウムから）。
【０２４８】
試料を、ガードカラム（５０×４ｍｍ）を有するＤｉｏｎｅｘ  ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１（２５０×４ｍｍ）カラムに３０℃で注入した。表１３に示すように、１ｍｌ  分−１の流速で、Ａ：脱イオン水；Ｂ：１００ｍＭのＮａＯＨ（ＨＰＬＣ電気化学的グレード）中の５０ｍＭの酢酸ナトリウム（無水≧９９．５％）、およびＣ：１００ｍＭのＮａＯＨによって形成される溶媒の勾配で、カラムを溶出した。
【０２４９】
クロマトグラフィー分析の結果：
表１４は、様々な繊維試料の加水分解産物のＤｉｏｎｅｘイオンクロマトグラフィーの結果を示す。
【０２５０】
【表１４−１】
2013525269.tif 000021
【０２５１】
【表１４−２】
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＊標準としてのグルロン酸の使用は、アルギン酸ナトリウムの加水分解から確認した（第２の有意なピークがグルロン酸であったと仮定）。
【０２５２】
【表１５】
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表１４に示すように、ＧＣＭＳ分析の結果は、構成糖および糖酸が１回の３５分の操作で十分に分離したことを示す。表１４にさらに示すように、ＶＦＢ／ＣのＴＦＡ加水分解によって独特なプロファイルが生じ、考えられる単糖類の４つ、すなわち、グルコース、マンノース、グルコロン酸（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、およびマンヌロン酸が、Ｄｉｏｎｅｘトレースにおいて明らかに観察された。これらの結果は、コンニャクグルコマンナン（マンノース、グルコース）、キサンタンガム（グルコース、マンノース、グルクロン酸）、ならびにアルギン酸ナトリウム（マンヌロン酸およびグルロン酸）を含むＶＦＢ／Ｃの組成と一致する。
【０２５３】
表１５は、様々な市販の生体高分子の単糖類構成成分を示し、ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））が単糖類構成成分の独特なプロファイルを有することを示す。したがって、これらの結果は、ＴＦＡ加水分解およびＧＣＭＳ分離を使用して、ＶＦＣを単糖類の他の組合せから識別し得ることを示す。
【０２５４】
要約すれば、コンニャクグルコマンナンおよびキサンタンガムのＰＭＡＡのＧＣＭＳ分析は、公知の一次構造から予想される特徴的な糖および結合の存在を示す。コンニャクグルコマンナンは、４−連結グルコース、４−連結マンノース、ならびに末端グルコースおよび／またはマンノース（主に側鎖から）に相当するＧＣピークを生じた。キサンタンガムは、末端マンノースおよび／またはグルコース（側鎖から）および４−連結グルコース（主鎖中）に相当する強力なピーク、ならびに３，４−連結ヘキソース（グルコース）についてのピーク、ならびに２−連結マンノースについての弱いピーク（両方とも側鎖から）を生じた。実質的にこれらのピークの全てはまた、表１１に示すように、ＴＭ１および顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））のＰＭＡＡのＧＣＭＳ分析において検出され、これらは両方ともコンニャクグルコマンナンおよびキサンタンガムを含有することを示す。キサンタンガム構成成分からの２−連結マンノースの位置で溶出するトレースピーク（ｔｒａｃｅ  ｐｅａｋ）は弱すぎて、質量スペクトルから断定的に割り当てることができなかったが、約１２．４７分および１４．６５分の保持時間におけるシグナルは、キサンタンガムの各々、末端マンノースおよび３，４−連結ヘキソース（グルコース）と一致した。重要なことに、これらの分析は、ＴＭ１もしくは顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））において任意のさらなる予想外の糖もしくは糖結合（他の構成成分生体高分子から、または加工の間に形成され得る任意の新規な糖もしくは糖結合から生じ得る）を明らかにしなかった。予想どおりに、ＴＭ１および顆粒化ＶＦＣのＰＭＡＡのＧＣＭＳ分析は、アルギン酸ナトリウム同定することができなかった。
【０２５５】
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析に関して、表１４は、ＴＭ１および顆粒化ＶＦＣの予想加水分解産物構成成分を含む標準の測定保持時間を、ＴＭ１および顆粒化ＶＦＣの加水分解産物から得たクロマトグラムの要約と共に示す。表１４に示すように、４つの可能性のある構成成分（グルコース、マンノース、グルクロン酸およびマンヌロン酸）は、ＴＭ１および顆粒化ＶＦＣの加水分解産物において検出された。第５の構成成分であるグルロン酸は、恐らく混合物の相対的に低いアルギン酸ナトリウム含量によって、この分析において検出されなかった。予想外の加水分解産物構成成分は検出されなかった。これらの結果は、ＰＭＡＡのＧＣＭＳ分析から得た結果と一致し、ＴＭ１および顆粒化ＶＦＣが、化学的に未変化のコンニャクグルコマンナンおよびキサンタンガムを含有するという結論を支持する。さらに、加水分解産物中のマンヌロン酸の検出は、化学的に未変化のアルギン酸ナトリウムのさらなる存在を示唆する。
【０２５６】
３．インタクトなポリマーおよび部分的に加水分解されたポリマー、ならびにモノマー標準の核磁気共鳴分光法
基本原理：
核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）は、スペクトルが、有機分子中のプロトン（水素原子）の位置による分子の一次構造についての膨大な情報を含有するため、有機分子の分析のための価値あるツールである。したがって、基本的レベルで、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの能力は、対象の混合物中の標準化合物および未知試料の化学シフトおよび積分に対する十分に確立した規則を使用して、様々な特徴を「フィンガープリント」することができる適当なレベルの一次構造の情報を提供することである。炭水化物は、ＮＭＲにおいて、分析のために有用なものとなるいくつかの特有の特徴を有する。炭水化物のＮＭＲスペクトルの２つの主要な特有の特徴は、（ｉ）糖環中のＣ１と関連するプロトンであり、典型的には他の主要な特徴より低い磁場で起こるいわゆる「アノマー」共鳴；（ｉｉ）糖環の残りと関連するプロトンの「環エンベロープ」である。例えば、グルコースについて、αおよびβアノマー共鳴は、各々、５．２ｐｐｍおよび４．６ｐｐｍにおいてであり、環プロトンエンベロープは、各々、３．１ｐｐｍ〜３．９ｐｐｍである。
【０２５７】
興味深いことに、ウロン酸は、上記の典型的なヘキソーススペクトルといくぶん異なるＮＭＲスペクトルを有し、これらの共鳴は、グルコースおよびマンノース（３．９〜５．６ｐｐｍ）についてのものよりも僅かにより高い磁場である程度集団となる。Ｓａｎｔｉら、１２ｔｈ  Ｉｎｔ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏｎｆ  ｏｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＥＣＳＯＣ−１２）：１〜３０頁（２００８年）。したがって、対象の多糖類（例えば、ＶＦＢ／Ｃ）の加水分解産物のＮＭＲスペクトルを使用して、ポリマー中の構造単位（グルコース、マンノース、ウロン酸など）のフィンガープリントを決定し得る。
【０２５８】
この実施例において記載する研究において、ＮＭＲスペクトルを使用して、様々な多糖類およびＶＦＢの加水分解から得られた複合混合物をフィンガープリントした。多糖類全体は、粘度などの物理的特性による問題によって、ＮＭＲでポリマーレベルにおいて調べることができないことに留意されたい。
【０２５９】
方法：
単一の多糖類および３成分混合物の試料を、１００℃にて２ＭのＴＦＡで４時間および２４時間部分的に加水分解した。濾過した加水分解産物試料（３０ｍｇ）をＤ２Ｏ（１ｍｌ）に溶解し、凍結乾燥し、その後Ｄ２Ｏに再溶解し、ＮＭＲチューブ中に入れた。予想される２種の単糖類および３種のウロン酸の標準液を、同様に調製した。
【０２６０】
ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｔｏｐｓｉｎソフトウェアを実行する、自動調節広帯域多核プローブおよび可変温度アクセサリーを有するＢｒｕｋｅｒ４００ＭＨｚ  Ａｄｖａｎｃｅ  ＩＩＩ分光計によって２９８．１Ｋにて加水分解産物および標準液で得た。２５６スキャンを行ったグルロン酸試料を除いて、試料の大部分について１６スキャンを行った。
【０２６１】
ＮＭＲ分析の結果：
単糖類およびウロン酸標準についての１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは十分に分解され、これらの特徴的な化学シフトを、キサンタンガムおよびアルギン酸ナトリウムの加水分解産物、ならびにＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の加水分解産物（データは示さず）の両方において見出した。キサンタンガムからのグルコースおよびマンノースについて観察された化学シフトは、アノマー共鳴（４．６〜５．２ｐｐｍ）に、および糖環共鳴（３〜４ｐｐｍ）に分解することができた。アルギン酸ナトリウムからのマンヌロン酸およびグルロン酸について観察された化学シフトは、一緒により近接した（３．６〜５．２ｐｐｍ）。顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））加水分解産物において見出されたウロン酸共鳴は、明らかにキサンタンガムおよびアルギン酸ナトリウムの加水分解産物において見出されるものの組合せであったが、これは顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））中の化学的に未変化のアルギン酸ナトリウムの存在をさらに支持する。
【０２６２】
要約すれば、純粋な標準、構成成分加水分解産物、およびＶＦＣ加水分解産物のＮＭＲスペクトルは、ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））が、未変化グリコシド連結を有する、単糖類構成成分の一次構造の特徴において未変化の多糖類から構成されることを示す。
【０２６３】
全体的な結論：
この実施例に記載する結果は、顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の一次化学構造が、事前処方された未加工／非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）と比較して本質的に未変化であったことを示す。この実施例に記載するように、メチル化の古典的方法によって、コンニャクグルコマンナンおよびキサンタンガム構成成分が予想される単位および連結を含有し、ＶＦＢ／Ｃ構成成分を一緒に混合または加工することによって導入され得る説明不可能なさらなる構造構成成分は存在しなかったことが示された。
【０２６４】
ＶＦＢ／Ｃの構成成分の１つであるアルギン酸ナトリウムはメチル化に耐性であるため、ＶＦＢ／Ｃの一次化学構造の未変化性質についてのさらなる支持証拠を提供するために、さらなる方法を用いて、部分加水分解、クロマトグラフィーおよびＮＭＲを含めた構造分析を完了させた。
【０２６５】
要約すれば、この実施例に記載されている研究によって、顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））は、顆粒化プロセスによってその主要な特徴が化学的に修飾されていないという結論が支持される。
【０２６６】
（実施例６）
この実施例は、顆粒化粘性繊維複合体（ＶＦＣ）（コンニャク／キサンタン／アルギネート（７０：１３：１７））顆粒の流動挙動および巨大分子特性の分析について記載する（すなわち、繊維ブレンドを顆粒化によって加工し、ＰＧＸ（登録商標）として商業的に公知の複合体を形成させた）。この実施例に記載する結果は、相互作用がポリマーレベルで顆粒化ＶＦＣの構成成分の間に起こっており、ネットワークおよびジャンクションゾーンを確立し、下記の名称（ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）を有する新規な多糖類を形成していることを示す。α−Ｄ−グルクロノ−α−Ｄ−マンノ−β−Ｄ−マンノ−β−Ｄ−グルコ），（α−Ｌ−グルロノ−β−Ｄ−マンヌロノ），β−Ｄ−グルコ−β−Ｄ−マンナン。
【０２６７】
基本原理：
この実施例において記載する研究を行い、コンニャクマンナン、キサンタンガム、およびアルギン酸ナトリウムを含む３成分顆粒化ＶＦＢ／Ｃ混合物が、３つの構成成分全てが関与するネットワークおよびジャンクションゾーンを含有して、その結果、未加工／非顆粒化ＶＦＢ、または個々の構成成分であるコンニャクマンナン、キサンタンガム、もしくはアルギン酸ナトリウムと比較して、加工済／顆粒化ＶＦＣに独特な溶液流動特性がもたらされているか否かを調査した。溶液中の顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））中の３種の多糖類の間の非共有結合性巨大分子相互作用の存在を、下記で記載する技術によって調査した。コンニャクグルコマンナンとキサンタンガムとの間の２成分相互作用が、実施例５に記載する研究の結果から予想されため、さらなる分析を行い、考えられる３成分相互作用における第３の多糖類であるアルギン酸ナトリウムの任意の関与を特に調べた。
【０２６８】
１．流体力学的測定
第１の研究において、流動曲線を、いくつかの濃度の未加工／非顆粒化ＶＦＢ（３成分混合物♯１、「ＴＭ１」と称される）および顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））で生じさせ、これらを同じ濃度のＶＦＢ／Ｃの各々の単一の構成成分単独の溶液についての流動曲線と比較し、３成分混合物の水性溶液の流動挙動における相乗効果を明らかにした。
【０２６９】
【表１６】
2013525269.tif 000024
試料の調製：
単一の多糖類および３成分混合物は、脱イオン蒸留水の溶液中で研究した。精密に秤量した試料を、２５℃にて１００ｇの水において０．１ｇ、０．２ｇ、および０．５ｇの濃度（各々、０．１％、０．２％、および０．５％）で分散させ、撹拌しながら２時間水和させた。ここで、秤量した量の水を磁気スターラー上に置き、渦を生じさせ、その後、小数第４位まで秤量した試料を渦の中央にゆっくりと注いだ。２時間後、溶液を高速ミキサー（ＩＫＡ剪断ミキサー（１５Ｋ  ｒｐｍ））で１分間剪断し、全ての粒子材料が完全に混合されることを確実にした。次いで、分析のために適切であると見なす前に、試料をさらに１時間撹拌した。
【０２７０】
流動曲線測定：
溶液流動挙動は、２５．０±０．１℃でＣ１４  ＤＩＮ  ５３０１９同心円筒測定システムを使用して、Ｂｏｈｌｉｎ  Ｇｅｍｉｎｉレオメーターで測定した。定常状態ずり速度を、一連の絶え間なく加えたずり応力（０．１Ｐａから１０Ｐａへと上昇する）で測定した。流動挙動を、最初に、対数ずり速度に対する対数粘度の流動曲線を使用して特性決定した。
【０２７１】
結果：
図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃは、２５℃で測定した、各々、０．１％ｗ／ｗ、０．２％ｗ／ｗ、および０．５％ｗ／ｗでの、コンニャクグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギン酸ナトリウムの流動曲線を図表によって例示する。図１３Ａ〜Ｃに示す個々の多糖類の溶液についての流動曲線は、キサンタンガムが最も強力な粘性化剤（図１３Ｂ）であり、続いてコンニャクグルコマンナン（図１３Ａ）および最後にアルギン酸ナトリウム（図１３Ｃ）であることを示す。試料の単一の多糖類の異なるロットの溶液の間に流動挙動の差異はほとんど見られなかった。キサンタンガム溶液はまた、多くのずり速度の桁にわたる最も広範なずり流動化（ｓｈｅａｒ  ｔｈｉｎｎｉｎｇ）領域（ここで、対数プロットは直線的であった）を有した。
【０２７２】
図１１Ａ〜Ｃは、０．５％（ｗ／ｗ）（図１１Ａ）、０．２％（ｗ／ｗ）（図１１Ｂ）および０．１％（ｗ／ｗ）（図１１Ｃ）での、未加工／非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）および顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の流動曲線の比較を図表によって例示する。
【０２７３】
図１１Ａ〜Ｃにおいて示すデータを、下記のように、各流動曲線を、粘度ηとずり速度Ｄとの間の冪乗則関係にフィットさせることによってさらに調べた。
【０２７４】
【数２】
2013525269.tif 000025
式中、Ｋはコンシステンシー指数（濃厚さの全体的な値を与える）、およびηは流動挙動指数（ニュートン挙動からの偏差を示す）であり、それぞれ、冪乗則流体について直線的である、ずり速度に対する粘度の対数プロットの切片および傾きから導かれる。Ｋ値は、全体的なコンシステンシーを示し、ηは、ニュートン挙動からの偏差を示す（η＝１）。ニュートン流体は１のη値を有し、ηが１未満に減少するにつれ、流体は増々ずり流動化となる。
【０２７５】
図１１Ａ〜Ｃに示すように、全ての未加工／非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）および顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））試料は、各濃度で非常に類似した流動曲線を生じさせ、このことは、加工における、またはプレミックスの事前のエージングにおける低い水分活性が、混合物の特性に影響を与えたことを示す。熱処理の希釈溶液条件より非常に低い全体的な水分活性において、加工を行ったことに留意されたい。ＶＦＢ／Ｃ混合物の流動曲線は、キサンタンガムの流動曲線に最も近かった。ＶＦＢ／Ｃ混合物の流動曲線は冪乗則に従い、広範なずり流動化挙動を示したが、各濃度における粘度の大きさおよびずり流動化の程度は、キサンタンガム単独のそれらより実際に高かった。これは、図１２Ａに示すように、ＶＦＢ／Ｃ混合物の溶液とキサンタンガムの溶液との間の冪乗則Ｋおよびη値における差異によって明らかに示される。
【０２７６】
図１２Ａは、未加工／非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）、顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））、およびキサンタンガムの冪乗則Ｋの比較を図表によって例示する。図１２Ａに示すように、未加工／非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）および顆粒化ＶＦＢ（ＰＧＸ（登録商標））試料は、各濃度で非常に類似のＫ値を生じ、Ｋ値は濃度と共に上昇した。濃度範囲にわたり、より高いＫ値はより大きな粘度に相当し、より低いη値はより大きな程度のずり流動化に相当することに留意されたい。
【０２７７】
図１２Ｂは、未加工／非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）、顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））およびキサンタンガムの冪乗則ηの比較を図表によって例示する。図１２Ｂに示すように、η値はまた、各濃度において全てのＶＦＣ試料で同様であったが、０．３０〜０．３５％の領域において、最小η値、またはずり流動化の程度における最大値の存在の可能性を示唆するようであった。
【０２７８】
顆粒化ＶＦＣ（７０％のコンニャクグルコマンナン、１７％のキサンタンガム、および１３％のアルギン酸ナトリウム）を生じさせるのに使用した割合に基づいて、混合物の流動挙動は、多糖類の間に相互作用がないと仮定すれば、１００％のコンニャクグルコマンナンの流動挙動と大まかに同様であることが予想される。しかし、コンニャクグルコマンナンが３成分混合物中で主な多糖類であり、キサンタンガムおよびアルギン酸ナトリウムが両方とも少数の構成成分であることを考慮すると、未加工／非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）および顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））溶液の流動挙動は、これらの混合物中の多糖類の間の相互作用を明示する。
【０２７９】
要約：
図１１に示す顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の流動曲線と図１３Ａ〜１３Ｃに示す個々の構成成分の流動曲線とを比較すると、これらの結果から、相互作用が顆粒化ＶＦＣ中の多糖類の間に起こり、未加工／非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）または顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））中に存在する特定の３成分組成物について予想されるものより大きな粘度およびずり流動化挙動の程度を生じさせたことが示唆される。顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））試料の全体的な流動挙動は、キサンタンガムの流動挙動と最も近かったが、驚いたことに、顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の粘度はキサンタンガム単独の粘度より実際高かった。これを図１２Ａおよび１２Ｂに示し、これにより、キサンタンガムと比較した顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））についての、より高いＫ値、および概ね０．４５％濃度未満で、より低いη比較値が強調される。未加工／非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）および顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））のキサンタンガム含量が１７％のみであり、残りの８３％があまり強力ではない増粘剤であるコンニャクマンナンおよびアルギン酸ナトリウムを含むことを考慮すれば、これらの結果は、顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））試料中の多糖類の間に起こった相互作用の明白な証拠を提供する。
【０２８０】
２．アルギン酸ナトリウム濃度および／または熱処理の効果の研究
さらなる実験を行い、下記のようにＶＦＢ／Ｃの流動挙動および巨大分子特性に対する、様々な濃度のアルギン酸ナトリウムの効果および熱処理の効果を決定した。
【０２８１】
方法：
コンニャクグルコマンナン、キサンタンガムおよびアルギン酸ナトリウムの混合物を調製した。混合物は、一定比（ＫＭ：ＸＧ＝４．１２：１）のコンニャクグルコマンナン（ＫＭ）およびキサンタンガム（ＸＧ）、ならびに変動する量のアルギン酸ナトリウム（Ａ０〜Ａ３３）（０％、２％、５％、８％、１１％、１３％、１７％、２１％、２４％、２７％、３０％、および３３％）を含有した。全ての試料は、２成分（コンニャクグルコマンナンおよびキサンタンガム）または３成分（コンニャクグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギネート）繊維の組合せの乾燥混合物として最初に調製した。各試料（混合物）を、小数点第４位まで秤量し（乾燥）、リストシェーカー（ｗｒｉｓｔ  ｓｈａｋｅｒ）を使用して徹底的に混合し、必要とするまで−１９℃に保持した。各組成物の水性溶液を、磁気スターラーによって撹拌しながら５．０ｇの各試料（混合物）を１ｋｇの脱イオン水に加えることによって、０．５％の単一の濃度で調製し（すなわち、渦を脱イオン水中に最初に生じさせ、試料を渦の中心にゆっくりと注いだ）、均一となるまで４時間にわたり水和させた。全ての試料を調製するまで、混合物の水性溶液を５℃に維持した。
【０２８２】
熱処理
２０ｍｌアリコートの各溶液を次いで取り出し、下記のように処理した。（ｉ）周囲温度（２２℃）でインキュベートした（非加熱）か、または（ｉｉ）サーモスタット制御を有するオーブン中で９０℃にて１時間（Ａ０ＨからＡ３３Ｈ）または４時間（Ａ０Ｈ４からＡ３３Ｈ４）加熱した（試料は蒸発による損失を避けるために密閉容器中に入れ、定期的に振盪して、完全な水和を確実にした）。
【０２８３】
２５℃での、一定比（ＫＭ：ＸＧ＝４．１２：１）のコンニャクグルコマンナン（ＫＭ）およびキサンタンガム（ＸＧ）、ならびに変動する量のアルギン酸ナトリウム（０％、２％、５％、８％、１１％、１３％、１７％、２１％、２４％、２７％、３０％、および３３％）を含有する、コンニャクグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギン酸ナトリウムの混合物の水性溶液の流動曲線を、０．５％の単一の濃度で測定した。上記のように、溶液は非加熱、１時間加熱、または４時間加熱した。
【０２８４】
結果：
非加熱の２成分（Ａ＝０）、および３成分混合物についての流動曲線（２５℃で測定）を図１４Ａに示す。１時間加熱した２成分および３成分混合物についての流動曲線（２５℃で測定）を、図１４Ｂに示す。４時間加熱した２成分および３成分混合物についての流動曲線（２５℃で測定）を、図１４Ｃに示す。
【０２８５】
図１４Ａに示すように、非加熱混合物について、２種の強力な増粘剤（ＫＭおよびＸＧ）が弱い増粘剤であるアルギン酸ナトリウムと置き換えられた場合、予想されるように、粘度はアルギン酸ナトリウムの含量の増加と共に減少したようであった。
【０２８６】
図１４Ｂに示すように、１時間加熱した混合物について、増加したアルギン酸ナトリウム含量を有する３成分混合物は、加熱されなかった同じ比のアルギネートを有する混合物（図１４Ａに示す）より高いレベルに、これらの粘度を維持した。図１４Ｃに示すように、４時間加熱した混合物の粘度は、１時間加熱した後に観察された粘度と同様であった。これらの結果は、アルギン酸ナトリウムを含む３成分混合物を加熱することによって、多糖類の間の３成分相互作用がもたらされたことを示す。
【０２８７】
図１５Ａおよび１５Ｂは、一定のＫＭ：ＸＧ比（４．１２：１）および変動する量のアルギネート（０〜３３％）での、コンニャクグルコマンナン、キサンタンガム、およびアルギン酸ナトリウムの混合物の０．５％水性溶液についての、混合物中のアルギン酸ナトリウムの割合に対するＫおよびη両方の依存性を例示する。図１５Ａは、アルギネート含量に対する、非加熱および加熱３成分混合物の冪乗則Ｋ値の依存性を図表によって例示する。熱処理されなかった３成分混合物の溶液についての流動曲線は、冪乗則に従い、アルギン酸ナトリウムの含量の増加によって粘度の減少を主に示した。図１５Ａに示すように、非加熱溶液について、冪乗則Ｋ値は、アルギン酸ナトリウム含量の増加と共に小さな最初の増加を示したが、これに続いて大幅な減少があった。約３〜５％のアルギン酸ナトリウム含量で最大Ｋ値があったようである。図１５Ｂに示すように、混合物中のアルギン酸ナトリウムの含量の増加によってη値は（ニュートン挙動に向かって）増加した。これは、コンニャクグルコマンナンおよびキサンタンガム（アルギン酸ナトリウムを有さない）の高粘性およびずり流動化２成分混合物から、３３％のアルギン酸ナトリウムでの有意に粘性がより小さく、ずり流動化がより小さい３成分混合物への進行を示した。これらの結果は、アルギン酸ナトリウムがより弱い増粘剤として作用したことを示す。
【０２８８】
約５％超のアルギン酸ナトリウムでのＫ値の減少およびη値の増加は、図１５Ａおよび図１５Ｂに示すように、２種の強力な増粘剤（コンニャクグルコマンナンおよびキサンタンガム）が、弱くずり流動化が小さい増粘剤（アルギン酸ナトリウム）で置き換えられたときに予想された。図１５Ａに示すように、１時間加熱した溶液について同様のデータが得られ、これは、約５％未満のアルギン酸ナトリウム含量での熱処理によるＫ値の最初の減少を示した。しかし１１％以上における、Ｋ値の減少は、非加熱溶液について観察されたものよりも急勾配ではなかった。熱処理した溶液において、Ｋ値の最大値は、３成分混合物中の８％〜１１％の僅かにより高いアルギン酸ナトリウム含量で起こった。図１５Ｂに示すように、熱処理した溶液のη値は、アルギン酸ナトリウム含量の範囲にわたって低く未変化のままであった。限定された数の４時間加熱した溶液について、Ｋおよびη値は、１時間のみ加熱した同じ溶液について得たＫおよびη値と同様であった（データは示さず）。
【０２８９】
結果の要約：
全体的に、これらの結果は、３成分溶液の熱処理が、巨大分子相互作用の全体的なレベルを有意に増加させたことを示す。加工の前および後の流動挙動が同様であった加工における状況と対照的に、これらの試料を希釈溶液中で熱処理し、新たに混合した構成成分から作製した。０％〜約５％のアルギン酸ナトリウムを含有する粉末混合物の溶液についてのＫ値は、熱処理後に実際に減少したため、相互作用のこのより高いレベルは、コンニャクグルコマンナンとキサンタンガムとの間の相互作用の増強によるものである可能性は低かった。むしろ、熱処理は、アルギン酸ナトリウムとコンニャクグルコマンナンおよびキサンタンガムの１つまたは両方との相互作用を増強させたようである。
【０２９０】
全体的に、これらのデータは、混合物の熱処理の後に、アルギン酸ナトリウムが、コンニャクグルコマンナンとキサンタンガムとの間の相互作用を回復および強化したか、またはそれ自体が溶液中の他の２種の多糖類との相互作用に関与したことを示唆する。したがって、これらの結果は、２成分混合物のレオロジーを有意に損なうことなく、熱処理と組み合わせて、アルギン酸ナトリウムを８％超〜２０％のレベルでグルコマンナンおよびキサンタンガムに加えてもよいことを示唆する。
【０２９１】
３．分析用超遠心機における沈降
基本原理：
ＰｏｌｙＧｌｙｃｏｐｌｅＸ（登録商標），（α−Ｄ−グルクロノ−α−Ｄ−マンノ−β−Ｄ−マンノ−β−Ｄ−グルコ），（α−Ｌ−グルロノ−β−Ｄ  マンヌロノ），β−Ｄ−グルコ−β−Ｄ−マンナン（ＰＧＸ（登録商標））ともまた称されるＶＦＣ（コンニャク／キサンタン／アルギネート（７０：１３：１７））顆粒の予想外に高い粘度によって（すなわち、繊維ブレンドを顆粒化によって加工し、ＰＧＸ（登録商標）として商業的に公知の複合体を形成させた）、本発明者らは、これらの巨視的な観察の背後にある分子基盤を提供し得る分子レベルでの相互作用を探すために、分析用超遠心機におけるこれらの沈降速度挙動によって明らかになるような、コンニャクグルコマンナン、キサンタン、およびアルギネートの混合物の水力学的特性を調査するに至った。この研究において、分析用超遠心機における沈降速度の技術を、グルコマンナンが主要な構成成分であった混合物（キサンタンおよびアルギネートが補われた）の特性を調査するためのプローブとして使用した。
【０２９２】
方法：
多糖類
研究に使用される全ての多糖類は、ＩｎｏｖｏＢｉｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ、（Ｃａｌｇａｒｙ、Ａｌｂｅｒｔａ、Ｃａｎａｄａ）から供給された。すなわち、コンニャクグルコマンナン、ロット番号２５３８；キサンタンガム、ロット番号２５０４；およびアルギン酸ナトリウム、ロット番号２４５５／２６３９。多糖類を、個々に、ならびに顆粒化ＶＦＣ（この研究において「ＰＧＸ（登録商標）」と称する）、および非顆粒化ＶＦＢ（この研究において「ＴＭ１」と称する）を含む３成分混合物として研究した。試料を脱イオン蒸留水に溶解し、次いでホスフェートクロリド緩衝液におけるイオン強度０．０００１Ｍ、０．００１Ｍ、０．０１Ｍ、０．１Ｍ、および０．２Ｍの溶液にｐＨ約６．８で透析した。イオン強度＞０．０５Ｍは、ＮａＣｌを加えることによって補った。
【０２９３】
分析用超遠心分離
分析用超遠心機における沈降速度の技術を、相互作用研究のためのプローブとして使用した。この自由溶液法（ｆｒｅｅ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）は、そうでなければ相互作用現象を破壊または妨害し得るカラム、膜材料、他の分離媒体または固定化を必要としないため、他の方法に勝る利点を有する（Ｓ．Ｅ．  Ｈａｒｄｉｎｇ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１〜２５２頁、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００５年））。Ｒａｙｌｅｉｇｈ干渉顕微鏡を備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＸＬ−Ｉ超遠心機を使用した。ＣＣＤカメラシステムを使用して、データを得た。最初のスキャンを３０００ｒｐｍの低いロータースピードで行い、４５０００ｒｐｍのロータースピードに調節する前に、非常に高い分子量の粒子（検出されなかった）の存在をモニターした。沈降係数ｓを、２０．０℃における水の密度および粘度の標準条件に補正し、ｓ２０，ｗを得た。スキャンを、２分の間隔で約１２時間の操作時間の間に行った。Ｃｌａｖｅｒｉｅら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、１４巻：１６８５〜１７００頁（１９７５年）の有限要素分析法に基づいた「最小二乗ｇ（ｓ）」ＳＥＤＦＩＴアルゴリズム（Ｄａｍ＆Ｓｃｈｕｃｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、３８４巻：１８５頁（２００３年））を使用して、沈降係数分布ｇ（ｓ）対ｓの分布に関してデータを分析した（例えば、Ｓ．Ｅ．  Ｈａｒｄｉｎｇ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３４巻：８１１〜８２６頁（２００５年）を参照されたい）。沈降係数分布の変化の分析を使用して、相互作用の存在を確認した。２．０ｍｇ／ｍｌまたは０．５％（１００ｇの水中０．５ｇ）の総ローディング濃度を、対照および混合物のために用いた。
【０２９４】
結果および考察
反応物の完全性
コンニャクグルコマンナン、キサンタン、およびアルギネートを分析用超遠心機によって最初に別々に特性決定し、これらの分子の完全性を確立した。
【０２９５】
図１６は、グルコマンナン（図１６Ａ）、アルギン酸ナトリウム（図１６Ｂ）およびキサンタン（図１６Ｃ）について、２ｍｇ／ｍｌのローディング濃度およびＩ＝０．０での、見掛けの沈降濃度分布ｇ＊（ｓ）対沈降係数（ｓ）を図表によって例示する。ロータースピード４５０００ｒｐｍ、温度＝２０．０℃。縦座標は、スベドベルグ（Ｓ）毎のフリンジ単位で表し、横座標はスベドベルグ単位である。
【０２９６】
図１７は、イオン強度０〜０．２Ｍでの未加工／非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）（図１７Ａ）；イオン強度０〜０．０１ＭでのＴＭ１（図１７Ｂ）；イオン強度０〜０．０１Ｍでの顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））（図１７Ｃ）；およびイオン強度０〜０．２Ｍでの顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））（図１７Ｄ）について、見掛けの沈降濃度分布を図表によって例示する。ロータースピード４５０００ｒｐｍ、温度＝２０．０℃。
【０２９７】
図１８は、未加工／非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）（図１８Ａ）；または顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））（図１８Ｂ）についての、沈降係数＞３．５Ｓを有する材料の量に対するイオン強度（モル濃度単位Ｍで表す）の効果を図表によって例示する。対数スケールを容易にするために、Ｉ＝０．００値は、Ｉ＝０．００００１Ｍで表す。
【０２９８】
単峰形のプロットが、全ての場合において、見掛けの沈降係数分布について見られた（図１６Ａ、Ｂ、Ｃ）。このような条件下において、コンニャクグルコマンナンは約１．６Ｓ、アルギネートは約１．３Ｓ、およびキサンタンは約３．５Ｓの見掛けの重量平均沈降係数ｓ２０，ｗを有する（１Ｓ＝１０−１３ｓである）。
【０２９９】
複合体形成および加えられた電解質の効果
次いで、沈降係数分布プロットを、対照（２ｍｇ／ｍｌ）において使用されたのと同じ総ローディング濃度で、下記の３成分混合物：未加工／非顆粒化／非加熱ＶＦＢ（ＴＭ１）（図１７Ａ、Ｂ）および顆粒化／加熱ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））（図１７Ｃ、Ｄ）について生じさせた（最大１０Ｓまで）。相互作用についての本発明者らの基準として、本発明者らは、対照における最も沈降する種（キサンタン）よりも大きな見掛けの沈降係数を有する材料の量を推定した。つまり、＞３．５Ｓで沈降する材料は、相互作用生成物と見なす。
【０３００】
表１７は、沈降材料＞３．５Ｓの濃度を示す。超遠心機セルローディング濃度は、いずれの場合にも２．０ｍｇ／ｍｌであった。
【０３０１】
【表１７】
2013525269.tif 000026
表１７は、特に低い沈降係数（約２Ｓ）においてかなりの割合の未反応材料がまだ存在するが、個々の構成成分と比較した、ＴＭ１および顆粒化ＶＦＣ混合物の両方についての沈降材料の濃度の明らかな増加を示す。図１８および表１８はまた、より高い沈降材料の出現に対するイオン強度の増加の効果を示す。
【０３０２】
表１８は、ＴＭ１（未加工／非顆粒化ＶＦＢ）に対するイオン強度の効果の結果を示す。いずれの場合にも超遠心機セルローディング濃度は、２．０ｍｇ／ｍｌであった。
【０３０３】
【表１８】
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表１９は、ＰＧＸ（登録商標）（顆粒化ＶＦＣ）に対するイオン強度の効果の結果を示す。いずれの場合にも超遠心機セルローディング濃度は、２．０ｍｇ／ｍｌであった。
【０３０４】
【表１９】
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顆粒化および非顆粒化混合物両方について、０．０１Ｍのイオン強度まで相当な量の高い沈降材料が観察され、これを超えると、このような材料の出現は抑制されたことを見ることができた（図１８Ａ、Ｂ）。図１８Ａは、未加工／非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）について、沈降係数＞３．５Ｓを有する材料の量に対するイオン強度（モル濃度単位Ｍで表す）の効果を図表によって例示する。図１８Ｂは、加工済（例えば、顆粒化）ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））について、沈降係数＞３．５Ｓを有する材料の量に対するイオン強度（モル濃度単位Ｍで表す）の効果を図表によって例示する。
【０３０５】
３成分混合物の沈降係数の分布
固定グルコマンナン：キサンタンガム比および変化するアルギネート濃度（０％〜３３％）を含有する混合物についての沈降係数分布。混合物は、非加熱（０）であるか、または１時間（Ｈ１）もしくは４時間（Ｈ４）熱処理された。
【０３０６】
沈降係数分布を、５ｍｇ／ｍｌ（０．５％）の総ローディング濃度での脱イオン蒸留水中の試料から決定した。非加熱試料についての結果を、図１９Ａに示す。熱処理した試料についての結果を、図１９Ｂに示す。図１９ＡおよびＢに示すように、アルギネートの非存在下で、有意な相互作用生成物は、非加熱（Ａ０）または１時間（Ａ０Ｈ１）もしくは４時間（Ａ０Ｈ４）処理した試料についての、グルコマンナンが優位を占めている２成分グルコマンナン：キサンタン混合物について観察されない（本質的にグルコマンナン対照の沈降係数分布を有する）（Ａｂｄｅｌｈａｍｅｅｄら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、２０１０年を参照されたい）。しかし、アルギネートの存在下で、状況は異なる。図１９Ａに示すように、非加熱３成分混合物は、より高い沈降係数材料の出現に基づいて、１３％、１７％、２１％、２４％までのアルギネート含量のいくらかの相互作用を示したが、２７％超のアルギネート濃度で有意な効果は観察されなかった。熱処理試料について、図１９Ｂに示すように、約８％超のアルギネート濃度で複合体が観察されたが、これは流体力学的測定と一致する。１時間加熱処理された高いアルギネート含量の試料のいくつか（Ａ２１Ｈ１（２１％のアルギネート混合物、１時間加熱）、Ａ２４Ｈ１、Ａ２７Ｈ１、Ａ３０Ｈ１など）、およびアルギネートを含有する全ての４時間処理した試料は、熱処理プロセス後にゲルを形成し、沈降速度法によって分析することができなかったことに留意されたい。これは、これらをゲル状態に変化させるのに十分な強度の最初の溶液における相互作用の存在を意味する。対照的に、非加熱試料中の分子間相互作用は、このようなゲル化現象を促進するには不十分であった。
【０３０７】
結論
グルコマンナン、キサンタン、およびアルギネートの混合物は、中程度の量の電解質を加えることによって除去される相互作用生成物の存在を示す。これらの観察は、０．０１Ｍ超のイオン強度の支持電解質を加えることによって抑制することができる３成分混合物内の相互作用と一致する。低い沈降係数（＜３．５Ｓ、本発明者らが研究した条件下で）で沈降するかなりの割合の材料が存在するため、相互作用は化学量論的ではない。
【０３０８】
４．塩化カルシウムによるＶＦＣおよびアルギン酸ナトリウムの比較処理
基本原理：
顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））は水中で非常に粘性の溶液を生成するが、粘着性ゲルを形成しない。上記の結果は、ポリマーレベルでの３つの構成成分（コンニャクマンナン、キサンタンガム、およびアルギネート）の複合体相互作用の形成と一致する。アルギネートをＶＦＣから分離できるか否かを決定するために、実験を行い、カルシウムイオンによってアルギネートを溶液中のＶＦＣから分離することができるか否かを試験した。アルギネートは、カルシウムが媒介する沈殿およびゲル化特性を有することが公知である（Ｋ．  Ｃｌａｒｅ、「Ａｌｇｉｎ」Ｗｈｉｓｔｌｅｒ  Ｒ．Ｌ．およびＢｅＭｉｌｌｅｒ  Ｊ．Ｎ．編、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｇｕｍｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１１６頁（１９９３年）；Ａ．  Ｈａｕｇら、Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．  Ｓｃａｎｄ．、１９巻：３４１〜３５１頁（１９６５年））。アルギン酸ナトリウムの純粋な溶液は、カルシウムイオンの添加に対して強力および即座に反応し、カルシウム添加の様式によって沈殿物またはゲルを形成する（Ｃｌａｒｅら（１９９３年）；Ｈａｕｇら（１９６５年））。したがって、典型的なゲル化反応において、無水第二リン酸カルシウムなどの不溶性カルシウム塩、続いてグルコノデルタラクトン（ｇｌｕｃｏｎｏ  ｄｅｌｔａｌａｃｅｔｏｎｅ）などのゆっくり放出される酸を、アルギン酸ナトリウム溶液に加え、これによってＣａ＋＋イオンがゆっくりと放出され、均一なゲルの形成をもたらす。しかし、塩化カルシウムの場合のように、Ｃａ＋＋イオンが急速に加えられた場合、即座の沈殿が起こる。アルギネート巨大分子のポリグルロネートセグメントは、Ｃａ＋＋イオンと最も強力に結合することが公知である（Ｋｏｈｎら、Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ、２２巻：３０９８〜３１０２頁（１９６８年））が、これらのセグメントが他の２種の多糖類の１つまたは両方との相互作用によってあまり利用可能ではなくなった場合、アルギン酸カルシウム沈殿は制限される可能性がある。
【０３０９】
方法：
０．５％（１００ｇの水中の０．５ｇ）の脱イオン蒸留水中の未加工ＶＦＢ（ＴＭ１）および加工済／顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の溶液のアリコートを、０．１％ｗ／ｗ、０．０５％ｗ／ｗ、および０．０１％ｗ／ｗに希釈した。各濃度で、５ｍｌの１０％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ溶液を加え、溶液において徹底的に混合し、０．５％のＣａ２＋イオン濃度を達成した。Ｃａ２＋イオンの同じ添加をまた、（１）未加工ＶＦＢ（ＴＭ１）および加工済／顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））溶液の濃度と同じアルギネート濃度を含有する並行した一連のアルギン酸ナトリウム単独の対照溶液；ならびに（２）未加工ＶＦＢ（ＴＭ１）および加工済／顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の０．５％溶液中と同じアルギン酸ナトリウム濃度（１００ｇの水中のｇで測定）を含有し、同じ相対割合の２種の多糖類を含有する、コンニャクグルコマンナンまたはキサンタンガムとアルギン酸ナトリウムとの２成分混合物の溶液に対して行った。沈殿物の存在／不存在についての外観検査の前に、溶液を３０分間静置した。
【０３１０】
結果：
結果を下記の表２０に示す。
【０３１１】
【表２０】
2013525269.tif 000029
表２０に要約する結果に示されるように、少なくとも０．００７５％のレベルまで低下したアルギン酸カルシウムを沈殿させる０．５％Ｃａ＋＋イオンの存在下で、顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の溶液において、同等のアルギネートレベルまで低下すると沈殿の指標がないことは明白である。この知見は、ＶＦＢ／Ｃ構成成分が溶液中で相互作用し、（すなわち、多糖類構造の二次および三次レベルで）ジャンクションゾーンおよびネットワークを形成し、次いでこれは個々の構成成分がその純粋状態で示すであろう特性を示すことを妨げることと一致する。０．５％Ｃａ＋＋イオンによって沈殿するのに不十分なアルギネートを含有した大部分の希釈溶液を除いて、アルギン酸カルシウム沈殿物が、相当するアルギン酸ナトリウム溶液中で形成された。
【０３１２】
結論：
顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））におけるアルギネート挙動のこの研究において、塩化カルシウムを添加することによってカルシウムイオンが急速に導入されたとき、沈殿またはゲル生成が起こらなかったことが示された。並行対照実験において、塩化カルシウムを、漸減濃度のアルギン酸ナトリウムの純粋な溶液に加え、これによって非常に低いアルギネート濃度でさえアルギン酸カルシウムの即座の沈殿が生じた。これらの結果は、通常溶液中でＣａ＋＋イオンと強力に結合するアルギネート巨大分子のポリグルロネートセグメントが、アルギン酸ナトリウムがコンニャクグルコマンナンおよびキサンタンガムの存在下にあるＶＦＢ／Ｃ溶液中のこのような相互作用のために、あまり利用可能ではなかった（または、利用不可能であった）ことを示唆する。これは、他の２種の多糖類の１つまたは両方との代替の相互作用によって、Ｃａ＋＋イオンに対して巨大分子のこれらのセグメントがあまり利用可能でないかまたは利用不可能であるためであり得る。アルギン酸ナトリウムを有するコンニャクグルコマンナンまたはキサンタンガムの２成分溶液にＣａ＋＋イオンを加えたときに、アルギン酸カルシウム沈殿物が観察されたが、これは、アルギン酸ナトリウムは相互作用するのに他の２種の多糖類の両方の存在を必要とすることを示す。
【０３１３】
全体的な結果の考察
実施例５に記載するＶＦＢ／Ｃの一次構造分析の結果は、顆粒化後に、顆粒化ＶＦＣ中に存在する構成成分である多糖類の一次構造が未変化のままであり、共有結合性相互作用は、熱入力を伴う加工の前（ＴＭ１）にも後（顆粒化ＶＦＣ）にも起こらなかったことを示す。しかし、この実施例に記載する巨大分子会合の分析の結果によって、非共有結合性相互作用が起こり、ＶＦＢ／Ｃにおいて巨大分子レベルで生成されている新規な多糖類複合体がもたらされていることが明らかになる。流体力学的研究によって、未加工／非顆粒化ＶＦＢ（ＴＭ１）および顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））両方の溶液粘度は、混合物中の個々の多糖類の粘性化挙動の組合せから予想されるより有意により高いことが明らかに示される。溶液中のＶＦＣの全体的な流動特徴は、キサンタンガム単独の流動特徴に最も近いが、ＶＦＣの粘度は、キサンタンガムの粘度よりさらに高い。この実施例において試験したＶＦＣの実施形態（７０％のＫＭ、１７％のキサンタン、１３％のアルギン酸ナトリウム）が、１７％の最も強力な増粘剤であるキサンタンガム、ならびに８３％の２種の弱い増粘剤であるコンニャクマンナン（７０％）およびアルギン酸ナトリウム（１３％）のみを含有することを考慮すると、水中のこの流動挙動はコンニャクマンナンの流動挙動と同様であることが予想される。しかし、ＶＦＣの溶液流動挙動は、キサンタンガム単独の溶液流動挙動に実際にはより近く、この粘度はキサンタンガムよりさらに高かったことが決定された。
【０３１４】
試験施設で調製された、変動するアルギネート含量を含有する３成分混合物の溶液の流体力学的および沈降挙動のさらなる研究によって３成分相互作用を確認し、これは、特に混合物のアルギン酸ナトリウム含量が約５％超であった場合に、溶液を熱処理することによって増強された。さらに、Ｃａ＋＋イオン添加実験は、他の２種の多糖類の両方の存在が、アルギン酸カルシウム沈殿を防止するために必要であったことを示した。
【０３１５】
これらの結果によって、溶液中で、アルギン酸ナトリウムは、コンニャクグルコマンナンおよびキサンタンガムと相互作用し、ネットワークおよびジャンクションゾーンを確立し、下記の名称を有する新規な多糖類複合体を形成することが示される。α−Ｄ−グルクロノ−α−Ｄ−マンノ−β−Ｄ−マンノ−β−Ｄ−グルコ），（α−Ｌ−グルロノ−β−Ｄ−マンヌロノ），β−Ｄ−グルコ−β−Ｄ−マンナン。
【０３１６】
実施例１〜４に記載するように、顆粒化ＶＦＣ（ＰＧＸ（登録商標））の投与は、それを必要としている被験体において、代謝性疾患または障害と関連する１つもしくは複数の症状（代謝症候群、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、膵疾患、または高脂血症など）の予防、処置、または回復のために有用であることが示されてきた。
【０３１７】
例示的実施形態を例示および記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更をその中で行うことができることを理解されたい。
【０３１８】
排他的権利または特許権が請求されている本発明の実施形態を、下記のように定義する。
【図１】
2013525269.tif 000030
【図２Ａ】
2013525269.tif 000031
【図２Ｂ】
2013525269.tif 000032
【図２Ｃ】
2013525269.tif 000033
【図２Ｄ】
2013525269.tif 000034
【図３Ａ】
2013525269.tif 000035
【図３Ｂ】
2013525269.tif 000036
【図３Ｃ】
2013525269.tif 000037
【図４】
2013525269.tif 000038
【図５Ａ】
2013525269.tif 000039
【図５Ｂ】
2013525269.tif 000040
【図５Ｃ】
2013525269.tif 000041
【図６】
2013525269.tif 000042
【図７Ａ】
2013525269.tif 000043
【図７Ｂ】
2013525269.tif 000044
【図７Ｃ】
2013525269.tif 000045
【図８Ａ】
2013525269.tif 000046
【図８Ｂ】
2013525269.tif 000047
【図８Ｃ】
2013525269.tif 000048
【図９】
2013525269.tif 000049
【図１０Ａ】
2013525269.tif 000050
【図１０Ｂ】
2013525269.tif 000051
【図１０Ｃ】
2013525269.tif 000052
【図１１Ａ】
2013525269.tif 000053
【図１１Ｂ】
2013525269.tif 000054
【図１１Ｃ】
2013525269.tif 000055
【図１２Ａ】
2013525269.tif 000056
【図１２Ｂ】
2013525269.tif 000057
【図１３Ａ】
2013525269.tif 000058
【図１３Ｂ】
2013525269.tif 000059
【図１３Ｃ】
2013525269.tif 000060
【図１４Ａ】
2013525269.tif 000061
【図１４Ｂ】
2013525269.tif 000062
【図１４Ｃ】
2013525269.tif 000063
【図１５Ａ】
2013525269.tif 000064
【図１５Ｂ】
2013525269.tif 000065
【図１６Ａ】
2013525269.tif 000066
【図１６Ｂ】
2013525269.tif 000067
【図１６Ｃ】
2013525269.tif 000068
【図１７Ａ】
2013525269.tif 000069
【図１７Ｂ】
2013525269.tif 000070
【図１７Ｃ】
2013525269.tif 000071
【図１７Ｄ】
2013525269.tif 000072
【図１８】
2013525269.tif 000073
【図１９Ａ】
2013525269.tif 000074
【図１９Ｂ】
2013525269.tif 000075
【国際調査報告】
2013525269.tif 000076
2013525269.tif 000077
2013525269.tif 000078
2013525269.tif 000079
2013525269.tif 000080
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