(57)【要約】本発明は、光を通す下部の担体層（１０）とその上に設けられて光を通さない少なくとも１つの主層（２０）とを持つ人工又は生体膜（４０）の特性を光学測定するための微小構造化された測定チップ（１）に関し、主層（２０）が、測定室（３０）として構成されて上部開口（２５）及び１つの内部側壁（２６）又は複数の内部側壁（２６）を有する複数の凹所（２７）を持っている。一層高い測定精度及び一層高い動作能力で生体系を測定できるように測定チップを改善するため、測定室（３０）の側壁（２６）が凹所（２７）及び／又は隆起（２８）を持っていることが提案される。本発明は、更に測定チップ（１）用保持体（２００）及び珪素ウエーハ（３００）から測定チップ（１）を製造する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光を通す下部の担体層（１０）とその上に設けられて実質的に光を通さない少なくとも１つの主層（２０）とを持つ人工又は生体膜（４０）の特性を光学測定するための微小構造化された測定チップ（１）であって、主層（２０）が、測定室として構成されて上部開口（２５）及び１つの内部側壁（２６）又は複数の内部側壁（２６）を有する複数の凹所（３０）を持っているものにおいて、測定室（３０）の側壁（２６）が凹所（２７）及び／又は隆起（２８）を持っていることを特徴とする、微小構造化された測定チップ。
【請求項２】
凹所（２７）と隆起（２８）が測定室（３０）の縦軸線の方向において交互に生じ、側壁（２６）が、こうして形成される溝により実質的に波形の表面構造を持っていることを特徴とする、請求項１に記載の微小構造化された測定チップ。
【請求項３】
交互に生じる凹所（２７）と隆起（２８）又は溝が、０．１〜０．６μｍの間隔及び／又は２０〜１１０ｎｍの深さを持っていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の微小構造化された測定チップ。
【請求項４】
測定室（３０）が円筒又は円錐台の基本形状を持ち、溝を形成する凹所（２７）及び隆起（２８）が、側壁（２６）を円状に取巻いていることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載の微小構造化された測定チップ。
【請求項５】
下部の光を通す担体層（１０）が、プラスチック又はガラス特にフロート法により製造されている硼珪酸ガラスからなることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載の微小構造化された測定チップ。
【請求項６】
光を通さない主層（２０）が珪素、又は金属又はプラスチックを持っていることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載の微小構造化された測定チップ。
【請求項７】
主層（２０）上に、なるべく二酸化珪素又は窒化珪素から成る覆い層（１２）が設けられて、測定室（３０）の開口（２５）の上に、測定室の開口（２５）より小さい口径を持つ覆い層開口（１４）を持っていることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載の微小構造化された測定チップ。
【請求項８】
測定チップ（１）の表面が、１つ又は複数の化学反応性及び／又は極性の被覆、特にポリ−エル−リジン及び／又はプロピオン酸及び／又はカルボキシル基及び／又は脂質誘導体及び／又はアミノ反応結合分子を持ち、それにより膜又は輸送系の適当な成分を測定チップ（１）に共有又は非共有結合することを特徴とする、先行する請求項の１つに記載の微小構造化された測定チップ。
【請求項９】
測定室（３０）の１つ又は複数の側壁（２６）及び／又は担体層（１０）に近い方にある主層（２０）の下側及び／又は測定室（３０）に近い方にある覆い層（１２）の下側及び／又は主層（２０）の上側が、なるべく金属特に金又はチタンから成るそれぞれ１つの付加的な光を通さない被覆（２１）を持っていることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載の微小構造化された測定チップ。
【請求項１０】
測定室（３０）の深さ（３３）と直径（３１）との比が１より大きく、なるべく５特に１０〜５０より大きいことを特徴とする、先行する請求項の１つに記載の微小構造化された測定チップ。
【請求項１１】
測定室（３０）がアレイとして設けられて、特に長円形に形成される測定室（３０′）又は測定室開口（２５）として構成されるなるべく光学的な標識を持っていることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載の微小構造化された測定チップ。
【請求項１２】
微小構造化された測定チップ（１）用の保持体（２００）が、上側（２０１）、下側（２０２）及び上側から液体を充填可能な１つ又は複数の貯槽（２０３）を持つ板を含み、それぞれ１つの貯槽（２０１）の底が、板（２００）の下側（２０２）に取付けられるそれぞれ１つの測定チップ又は接着される測定チップ（１）を持つカバーガラスにより形成されることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載の微小構造化された測定チップ。
【請求項１３】
基板として珪素を含むウエーハ（３００）が使用されることを特徴とする、先行する請求項の１つに記載の人工膜又は生物膜（４０）の特徴の光学的測定のための微小構造化された測定チップ（１）の製造方法。
【請求項１４】
下部珪素層（３１１）、上部珪素層（３２０）及びその間に設けられて埋込まれる層（３１２）をもつ珪素ウエーハが使用され、特に絶縁物ウエーハ上のシリコーンであり、埋込まれる層（３１２）がなるべく二酸化珪素又は窒化珪素から成っていることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
測定室（３０）が、なるべくＤＲＩＥ方で、埋込まれている層（３１２）の所まで上部珪素層（３２０）へ食刻されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
光を通さない被覆（２１）が珪素ウエーハ（３００）へ設けられることを特徴とする、請求項１３〜１５の１つに記載の方法。
【請求項１７】
食刻された測定室（３０）を持つ珪素ウエーハ（３００）の上部珪素層（３２０）が、なるべく陽極ボンディングにより担体層（１０）に結合されていることを特徴とする、請求項１４〜１６の１つに記載の方法。
【請求項１８】
珪素ウエーハ（３００）の下部珪素層（３１１）がなるべく食刻により除去されることを特徴とする、請求項１４〜１７の１つに記載の方法。
【請求項１９】
埋込まれる層（３１２）が、なるべく食刻により、完全に又は測定室（３０）を覆う個所において選択的に除去され、それによりなるべく請求項７の特徴を持つ覆い層開口（１４）が形成されていることを特徴とする、請求項１４〜１８の１つに記載の方法。
【請求項２０】
微小構造化された個々の測定チップ（１）が珪素ウエーハ（３００）から鋸引きされ、特に請求項１２に記載の板（２００）保持体に接着されることを特徴とする、請求項１４〜１９の１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、光を通す下部の担体層とその上に設けられて実質的に光を通さない少なくとも１つの主層とを持つ人工又は生体膜の特性を光学測定するための微小構造化された測定チップであって、主層が、測定室として構成されて上部開口及び１つの内部側壁又は複数の内部側壁を有する複数の凹所を持っているものに関する。本発明は、更に測定チップを製造する方法及びこの測定チップ用の保持体に関する。【０００２】  生体膜は、細胞を外部の媒質から分離し、また細胞内の個々の細胞区分室を分離する。例えば輸送たん白質、チャネルたん白室、分泌系及び膜細孔のような膜輸送系は、膜透過性の変化により膜の物質通過を選択的に制御する。これに反し受容体は、細胞内で二次過程に至る例えば細胞外配位子結合のような信号を与える。
【背景技術】
【０００３】  輸送体及びチャネルの機能障害は、多数の広範囲な病気に対して責任がある。２００４年に米国において最も多く販売された１００の薬品のうち、薬理学的作用機構が膜輸送系に基いている薬品が最も多かった。少なくとも１３０２種のこのような薬品が３２６社の書類に世界的に存在し、しかも導入されかつ開発中である。製薬会社において、全体として現在１００以上の膜輸送系が研究され、このことは、どんな大きい経済的意味をこれらが持っているかを示している。【０００４】  新しい作用物質の開発のために、膜輸送系による特別な基質分子の輸送速度及び作用物質候補の影響のような特性を評価できる方法及び装置が必要である。この場合膜輸送系は自動化されて、高い動作能力で特徴づけられ、こうして標的たん白質による所定の輸送基質の輸送速度の変化の統計的に重要な実証により、作用物質候補の発見を可能にする。【０００５】  膜透過性は、例えば細胞における作用物質の利用可能性にとって重要であるが、脳内でも重要である。なぜならば、このために血液−脳障壁を透過せねばならないからである。従って作用物質の開発において、目標場所における利用可能性は、可能性のある物質の適当な特性である。【０００６】  これに反し効果的な細胞の分泌は、例えば哺乳動物細胞、線毛虫類、酵母菌及びバクテリアのように算出する真核細胞及び原核細胞の培養による抗体、たん白質等のような生体調剤製品の製造にとって重要である。このような培養において望まれるモノクローナルにもかかわらず個々の細胞の産出割合の相違が生じるので、高産出量の細胞の発見及び選択は、培養の産出割合にとって重要である。生体薬品の世界的市場は、２０１０年に７０００万ドルに評価される。【０００７】  膜受容体は、例えばアレルギー、神経痛、うつ病、痛み、炎症、糖尿病、てんかん、高血圧症、ぜん息のような多くの国民経済的に重大な病気の発生の際、中心的な役割を果たす。膜受容体のうち、２００２年に、たん白質キナーゼの亜族に対して、１２７億ドルのシェアが生じ、２０１０年には５８６億ドルへの予想される上昇が見込まれる（バイオフェニックコンサルティング）。【０００８】  Ｇたん白質共役形受容体（ＧＰＣＲ）のような受容体たん白質は、リガンド結合のための細胞外範囲、膜共通範囲、及び信号を細胞の信号カスケードへ伝送するのに役立つ細胞間ドメインを持っている。受容体活性化を特徴づけるため、信号従って細胞間ドメインの配座変化の検出、又はそれに続く信号カスケードの成分の形成が必要になる。【０００９】  イオン及び帯電粒子の輸送の分析のために、再び電気測定を使用することができる。この方法は、生体工学及び薬学研究において既に大いに使用されている。しかしそれはイオンに限られ、従ってイオンチャネルのグループに対してのみ使用される。アミノ酸、ペプチド、糖化合物及び脂肪酸のような分子の輸送、ただしＲＮＡ，ＤＮＡ及びたん白質のような生体分子の輸送も、電気的方法では全く又は間接にしか測定できない。【００１０】  これに反しこれらの分子の輸送の測定のために、蛍光分析が非常によく適している。そのための最初の準備作業は、キャノパスラエビスから成る核被覆内の核孔複合体による生体分子の��送のための学術グループによって行われた。それは、予め製造された人工脂質膜へ直接挿入されてその際変質された構造から機能的な形へ戻るα−ハモリシン孔により、カルシウムイオンの輸送の測定にも使用された。そのため刊行物においては、ポリカーボネートフィルタ又はポリカーボネート構造が使用され、その凹所が共焦点レーザ走査顕微鏡による輸送割合の蛍光測定のために利用された。これは、特にポリカーボネートの屈折率及び測定緩衝装置の相違のため、悪い光学特性を生じる。【００１１】  光を通さない材料にある測定室を持つ別の測定チップが公知であり、その凹所は上部膜又は細胞又は組織により覆うことができ、こうして閉じた測定室が形成され、膜を経て基質分子の輸送又は細胞から測定室への分泌が測定可能である。そのため膜又は細胞が測定チップ内の測定室にわたって張られるので、測定室が閉鎖されて密封される。測定チップは、人工又は生体膜又は細胞の透過性の分析に適している。蛍光測定のような光学測定により、測定室内の基質分子を検出して、量定することができる。その際測定結果を誤らないようにするため、測定室外のできるだけ僅かな基質分子しか蛍光へ励起されないようにする。【００１２】  米国特許出願第２００３／０１７４９９２号明細書から、光を通す担体及びその上にある光を通さない金属層を持つ生化学的過程の蛍光分析用のナノ構造の測定チップが公知である。金属層は、下から入射する励起光の波長よりずっと小さい直径を持つ測定室を含み、それによりいわゆる零モード導波管として作用する。従って励起光は凹所へ侵入しないが、光エネルギの一部は測定室へ達する。測定室より上で、基質分子は励起されない。しかしこのような測定チップは多くの欠点を持っている。僅かな寸法のため、測定室の容積は非常に小さいので、これらの寸法を輸送過程のために利用することができない。更に測定室の下部範囲しか利用できない。なぜならば、そこでしか励起が行われないからである。それにより測定の信号対雑音比は非常に悪く、費用のかかる測定装置が必要になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】  本発明の課題は、市販の普通の測定装置により、膜又は輸送系の特性を一層高い測定精度及び一層大きい輸送量で測定できる測定チップを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】  この課題は、光を通す下部の担体層とその上に設けられて実質的に光を通さない少なくとも１つの主層とを持つ人工又は生体膜の特性を光学測定するための微小構造化された測定チップであって、主層が、測定室として構成されて上部開口及び１つの内部側壁又は複数の内部側壁を有する複数の凹所を持っているものにおいて、測定室の側壁が凹所及び／又は隆起を持っていることによって解決される。これにより励起光が、下から光波長以上の寸法を持つ測定室へ進入して大きい蛍光信号を発生することができるけれども、強く弱められてのみ上部開口へ達する。本発明において、実質的に光を通す層とは、層が光に対して圧倒的に透過性であることを意味する。光を通さない層とは、吸収又は反射により、光に対して圧倒的に又は完全に不透過性であることを意味する。光とは、約４００〜７００ｎｍの電磁放射線の可視範囲を意味する。しかし概念はこれに限定されず、紫外線又は赤外線の隣接範囲も含むことができる。光学測定のために、蛍光灯の非干渉性光を持つ通常の蛍光顕微鏡、ただしレーザ走査顕微鏡も使用することができる。測定は、測定チップの光を通す担体層を通して下から行われる。従って担体層は、蛍光灯の励起光を通す。励起光によって、例えば適当な基質分子が測定室内の蛍光に励起される。それからこの蛍光は、蛍光顕微鏡の光学系に組込まれている適当なカメラにより測定され、続いて評価される。測定チップで得られる測定精度は、蛍光励起のみにより測定室内に発生される放射光がどの程度測定されるかに大きく関係している。即ち測定室外で発生される放射が付加的に測定されると、これは測定結果を悪くするか又は誤らせる妨害放射である。例えば測定室より上の膜又は測定液内の基質分子を励起することができる。この妨害放射を少なくするため、測定室の側壁は滑らかでなく、本発明により凹所及び／又は隆起を持っている。なめらかな鏡面の側壁は、妨害放射を測定室より上からカメラの所まで反射するが、凹所及び隆起は妨害放射を散乱し、従って測定室内での伝搬を最小にする。更に測定室からその上にある膜又は測定液への励起光の伝搬が少なくされる。全体として膜の中又は上の基質分子の放射の望ましくない光学的検出が最小にされ、膜内の基質分子の放射の圧倒的な検出が行われる。これは従来の蛍光顕微鏡でも可能である。【００１５】  有利な構成が従属請求項に示されており、以下に説明される。【００１６】  凹所と隆起が測定室の縦軸線の方向において交互に生じ、側壁が、こうして形成される溝により実質的に波形の表面構造を持っていると、測定精度の一層の改善が行われる。【００１７】  好ましい実施形態では、交互に生じる凹所と隆起又は溝が、０．１〜０．６μｍの周期的間隔を持っている。しかしこの間隔は数ｎｍ〜数μｍであってもよい。溝の深さ、即ち隆起の最高点と凹所の最低点との間隔は２０〜１１０ｎｍであるが、数μｍであってもよい。【００１８】  好ましい実施形態では、測定室が円筒又は円錐台の基本形状を持っている。測定室は主層にある凹所によって形成されるので、凹所自体は外形を持っていない。従って本発明の意味において測定室の基本形状とは、主層によって包囲されるその空所を意味する。この��味において測定室の側壁は、円筒又は円錐台の周面によって形成される。両方の実施形態では、溝を形成する凹所及び隆起が、側壁を円状に取巻いており、即ち測定室も溝も、測定室の縦軸線に対して直角な断面においてほぼ円形である。このように波形の表面構造は、珪素の深度食刻のため反応珪素−イオン−深度食刻（ＤＲＩＥ、ボッシュ処理）によって得られる。これは食刻処理と不働態化段階との交互の連続を含み、食刻方向に対して直角に側壁の波形構造又は櫛形構造を生じる。溝の形状及び間隔は処理設定及び食刻深さに応じて変化する。不透性でむしろ鏡のように輝く材料から成る側壁にある溝は、入射する励起光及び測定室内の放射光の散乱を生じ、他方滑らかな側壁は、むしろ測定室による光の反映従って光ファイバにおけるような伝送を可能にするであろう。これにより測定チップの下側から入射する励起光は、測定室の上部開口からの漏出から一層よく遮蔽される。同様に測定室より上の妨害放射は、測定室の底からカメラまでの通過によって一層特遮蔽され、測定精度が全体として一層改善される。【００１９】  下部の光を通す担体層は、例えばプラスチック又はガラスから成っている。特にフロート法により又は磨きウエーハとして製造されている硼珪酸ガラスが適していることがわかった。【００２０】  微小構造化されて光を通さずかつ測定室として役立つ凹所を持つ主層が、金属、プラスチック又は珪素を含んでいる。珪素という概念は珪素化合物も含んでいる。珪素は、加工する場合従って凹所を形成する場合、電子マイクロチップの分野から一部公知の方法を使用できる、という利点を持っている。【００２１】  主層上に、なるべく二酸化珪素及び／又は金属から成る覆い層を設けることができる。その場合覆い層は測定室の開口の上に設けられる開口を持っている。覆い層にある開口は、測定室の開口の上に設けられているのがよい。覆い層の開口の口径は、測定室の開口の口径より小さい。これにより覆い層により絞りが形成されて、測定チップの下側から入射する励起光を、測定室の上部開口から出る際一部遮蔽することができる。同様に覆い層の上の妨害放射も遮蔽される。これにより測定精度が更に改善される。別の利点は、測定チップの実施形態が、生物学的に規定される輸送体密度を持つ生体膜に適していることである。生体膜における単位面積当たりの輸送たん白質の数は、直ちには変化しないので、測定室容積が変化しない場合、なるべく１つ又は少数の輸送たん白質だけが覆い層開口上にあるように、覆い層開口の口径を選ぶことができる。これが、延長される測定期間で一層正確な測定を可能にする。【００２２】  測定チップの表面が、１つ又は複数の化学反応性及び／又は極性の被覆、特にポリ−エル−リジン及び／又はプロピオン酸及び／又はカルボキシル基及び／又は脂質誘導体及び／又はアミノ反応結合分子を持ち、それにより人工膜又は自然膜を測定チップに直接又は間接に共有結合又は非共有結合することができる。【００２３】  測定室の１つ又は複数の側壁及び／又は担体層に載っている主層の下側及び／又は測定室に近い方にある覆い層の下側及び／又は主層の上側が、なるべく金属特に金又はチタンから成るそれぞれ１つの付加的な光を通さな���被覆を持っている。これは、なるべく公知のＰＶＤ法（物理蒸着）により行われるのがよい。被覆は複数の利点を持っている。主層の残留透光性が存在する限り、これは被覆により回避される。こうして珪素は、６００ｎｍまでの可視光の波長に対して透過的でない。深紅光及び赤外光に対して、珪素はますます透過的である。励起光又は妨害放射がこの波長範囲にあると、珪素は妨害となるであろう。光を通さない付加的な被覆は、この場合測定精度を改善する。別の利点は、金から成る被覆では、被覆が接触し、電気的測定又は励起のために電極として利用されることである。更に別の利点は、上記の化学反応又は極性被覆との組合わせで生じる。測定室の側壁にある金から成る被覆に、βメルカプトエタノール又はメルカプトプロピオン酸のようなチオール化合物、ただし受容体活性化の検出システムの成分も結合可能である。珪素又は二酸化珪素から成る層はこれを結合せず、それによりシラン化によって選択的に変更することができる。それにより測定チップの測定室及び上側の異なる変更が可能になり、これが特定の測定課題に対して有利である。【００２４】  測定室の深さと直径との比が１より大きく、なるべく５特に１０〜５０より大きいことによって、測定室の側壁に対して平行に入射する励起光の実質的に僅かな成分だけが、測定室の上部開口を通って伝搬することができる。これに反し側壁に対して平行に入射しない励起光の成分は、測定室を通る途中に側壁で散乱されるか又は吸収されるが、測定室の下部範囲で蛍光を励起する。この効果は、測定室の上方へ小さくなる直径によって強められる。それにより測定精度が更に改善される。【００２５】  本発明は更に上述した微小構造化された測定チップの保持体を含んでいる。保持体は、上側、下側及び上側から液体を充填可能な１つ又は複数の貯槽を持つ板を含んでいる。保持体は、例えば市販の微小滴定板に類似の直方体の形状を持ち、同じように使用することもできる。好ましい実施形態では、幅、長さ及び／又は高さに関して、微小滴定板又はカバーガラスに対してＡＮＳＩ規格を満たす規格化された寸法を持っている。しかし市販の微小滴定板とは異なり、貯槽は貫通する通路であり、即ち底を持たず、下部開口を持っている。貯槽の底は、むしろ板の下側に取付けられる測定チップによって初めて形成される。保持体のすべての測定チップは、保持体の大きさの薄いガラス担体上へ初めて接着し、下から貯槽へ沈めることができるので、ガラス担体は保持体の下に接着される。【００２６】  取付けは、耐水及び水密の接着剤によって行うことができ、しかも測定室が貯槽の方向を向くように行うことができる。貯槽へ測定液を充填する際、こうして測定チップの測定室も充填される。ＵＶ硬化される接着剤又は接着フィルムを持つチップが、貯槽の下部開口の下へ接着され、調節後接着剤がＵＶ光の照射により硬化されるのがよい。その代わりに付加的なガラス担体を使用する場合、シリコーン接着剤なるべくシルガード１８４が、ガラス担体上に測定チップを接着するのに適していることがわかった。貯槽は、こうして微小構造化された測定チップのために、適当な測定液用の容器を形成する。光学測定は、保持体の下側から、測定チッ��の光を通す担体層を通して、又は付加的にガラス担体及び接着剤を通して、上述したように行われる。【００２７】  本発明は更に、上述した特徴を持つ微小構造化された測定チップの製造方法に関する。この場合原材料として又は基板として、集積回路の製造のためマイクロエレクトロニクスにおいて使用されるような珪素ウエーハが使用される。その利点は、例えば写真石版及び食刻のような公知の微小構造化方法を利用できることである。【００２８】  “絶縁体ウエーハ上の珪素”又は略して“ＳＯＩウエーハ”が特に適している。このＳＯＩウエーハは従来技術により公知であり、３つの層、即ち下部珪素層、上部珪素層及びその間に設けられて電気絶縁特性を持ついわゆる埋込み層から成っている。埋込み層は例えば二酸化珪素又は窒化珪素から成っている。ＳＯＩウエーハから製造されている電気部品例えば集積回路は、比較的短い開閉時間及び比較的小さい消費電力を持っている。なぜならば、埋込み層により漏れ電流が回避されるからである。【００２９】  驚くべきことに、二酸化珪素から成る埋込まれる層を持つＳＯＩウエーハの使用が、微小構造化される測定チップの製造の際利点を持っていることがわかった。【００３０】  製造方法は次の段階を持っている。即ち測定室が珪素ウエーハの埋込まれる層の所まで上部珪素層へ食刻される。その際珪素のみを選択的に腐食させて溶解する食刻媒体が使用されると、埋込まれる層が食刻過程を有利に停止する。食刻媒体として酸又はガスをなるべくＤＲＩＥ法で使用することができる。【００３１】  望まれる場合、それから例えばチタン及び／又は金のような光を通さない付加的な被覆が、上部珪素層上に設けられる。【００３２】  それから食刻された測定室を持つ珪素ウエーハの上部珪素層が、なるべく陽極ボンディングにより担体層に結合され、その際測定室の以前の開口が、底としての担体層によりその下側となる。【００３３】  それから珪素ウエーハの下部珪素層がなるべく食刻により除去される。この方法段階においても、選択的に珪素を腐食させて溶解する食刻剤が使用されると、埋込まれる層が食刻過程を有利に停止する。【００３４】  それから埋込まれる層が、なるべく食刻により、完全に又は部分的に除去され、その際埋込まれる層を腐食させて溶解する特別な食刻剤例えば弗化水素酸が使用される。部分的除去の際埋込まれる層は、測定室開口を覆う個所で、写真石版法により選択的に構造化される。埋込まれる層は、それから測定チップの覆い層開口を持つ覆い層を形成する。【００３５】  最後に、微小構造化された個々の測定チップが珪素ウエーハから鋸引きされ、特に２×２ｍｍ〜１０×１０ｍｍの大きさにされる。特に好ましい大きさは２．５×２．５ｍｍである。測定チップは個々に使用でき、特に上述した保持体に接着することができる。【００３６】  図面を参照して、本発明が例により説明され、それ以外の有利な詳細が図面の図からわかる。その際機能的に同じ部分は同じ符号を付けられている。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】  測定チップの一部の垂直断面を示す。
【図２】  測定チップの他の実施例の測定室の細部の垂直断面図を示す。
【図３】  脂質膜を持つ図１の測定室を示す。
【図４】  覆い層を持つ測定チップの他の実施例の一部の垂直断面図を示す。
【図５】  覆い層及び被覆を持つ測定室の詳細図を示す。
【図６】  円錐台状測定室を持つ測定チップの別の実施例の一部の垂直断面図を示す。
【図７】  測定チップの一部の平面図を示す。
【図８ａ】  保持体の垂直断面図を示す。
【図８ｂ】  図８ａの保持体の平面図を示す。
【図９】  保持体の別の実施例の垂直断面図を示す。
【図１０】  公知のＳＯＩウエーハの一部の垂直断面図を示す。
【図１１】  食刻される測定室を持つ図１０のようなＳＯＩフェーハの垂直断面図を示す。
【図１２】  結合される上部担体層を持つ図１１のようなＳＯＩウエーハの垂直断面図を示す。
【図１３】  下部珪素層を除去した後の図１２のようなＳＯＩウエーハの垂直断面図を示す。
【図１４】  回転後図１３のようなＳＯＩウエーハの垂直断面図を示す。
【図１５】  覆われる層の部分的除去後図１４のようなＳＯＩウエーハの垂直断面図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】  図１は本発明により測定チップ１の一部の垂直断面図を示す。（図示しない）平面図において測定チップ１は正方形で、２．５×２．５ｍｍ、従って６．２５ｍｍ２の全面積を持っている。測定チップ１は互いに結合される層又は材料から成っている。それは、土台として、フロート法で製造されるか又は研磨されて光を通す硼珪酸ガラスから成る担体層１０を持っている。“ボロフロート３０”又は“パイレックス”が適切であることがわかった。担体層１０の厚さは約１４０〜２００μｍであるが、それより厚くても薄くてもよい。担体層１０は励起光８０又は放射される蛍光８を通す。担体層１０上には、実質的に光を通さない珪素から成る主層２０が設けられて、測定チップ１の上側１７を形成している。完全性を期するため書き留めておくべきことは、珪素から成る主層２０が外面を空気により酸化され、こうして表面のｎｍの厚さの二酸化珪素層が形成される。
【００３９】  主層２０は陽極ボンディングにより担体層１０に固定的に結合されている。主層２０は円筒状の連続する凹所を持っている。凹所は円筒状空所により測定室３０を形成している。測定室３０の一方の内部側壁２６は、いわば円筒の周面により形成され、円形の上部開口２５はその天井面により形成される。主層２０は貫通する凹所を持っているので、各測定室３２０の底１８は、光を通す担体層１０の上側又は上面により形成される。測定室３０は１０〜３０μｍの深さ３３を持っているが、数ｎｍ〜ｍｍの深さも可能である。測定室３０の直径３１は約１μｍであるが、数ｎｍ〜１ｍｍの直径も可能である。個々の測定室３０の縦軸線の間隔３２は２．５μｍ〜４μｍであるが、数ｎｍ〜１ｍｍの間隔３２も可能である。各測定室３０の側壁２６は滑らかでなく、波形又はひだ付き表面構造を形成する交互の凹所２８及び隆起２７を持っている。波の周期は１００〜６００ｎｍの大きさであるが、数ｎｍ〜数μｍであってもよい。
【００４０】  図２は測定室１の他の実施例の測定室の詳細図を縦断面図で示す。この実施例では、測定室３０の深さ２２と直径３１との比は約１：１０である。これにより測定室壁２６に対して実質的に平行に入射する励起光８０のみが、測定室の開口を通って伝搬することができる。測定室３０の側壁２６は、測定室３０の中心軸線の方向に反復する隆起２７及び凹所２８によって形成される波形の表面構造を持っている。滑らかな鏡面の側面は、測定室３０へ入射する光を更に上方へ反射することになる。これに反し波形の表面構造によって、測定室３０内又は測定室３０からの励起光８０又は妨害放射８２（図示せず、図３参照）の望ましくない伝搬が減少される（これは、基質分子６０のみが測定室３０内で励起されて検出されるようにするので、望ましくない）。この効果は、ちょうど下から入射して凹所２７及び隆起２８により散乱又は転向される（図示しない）蛍光灯の励起光８０の不干渉光束によって明らかにされる。これにより、測定室３０を通ってその上にある膜及び測定液（図示せず、図３参照）への励起光８０の伝搬が著しく少なくされる。
【００４１】  図３は、図１におけるような測定チップの一部を示す。測定の際測定チップ１と共に使用される脂質膜４０も示されている。脂質膜４０は測定チップの上側１７へ取付けられているので、少なくとも若干の測定室開口２５が脂質膜により覆われて閉鎖される。膜４０は、負荷される際自動的にチップ表面に融合して膜４０を形成できる人工のプロテオリポソームから製造されている。膜４０は、輸送分析のため、個々の輸送たん白質５０例えばチャネルたん白質を含んでいる。膜４０の上に、固有の蛍光を発するか又は蛍光色素で標識付けされて光学的に検出可能な基質分子６０が付加される。膜４０へ入れられる輸送たん白質５０により、測定チップ１の測定室３０へ基質分子６０の輸送は、輸送たん白質５０に対して特有であり、測定室３０における蛍光の検出によって測定することができる。これは、輸送割合及び透過性のように特別なパラメータの逆推論を可能にし、例えば医薬用添加剤候補の評価を可能にする。測定は水性媒体中で行われ、即ち測定室３０、膜４０、たん白質５０及び基質たん白質６０は、（図示しない）測定液体側たとえば適当な塩含有緩衝液により包囲されている。図示されているように、測定のため保持体２００（図示せず、図９参照）が使用されると、測定チップ１は、測定チップ１の上に測定液を満たされている貯槽２０３の底を形成する。
【００４２】  測定は例えば蛍光顕微鏡（図示せず）によって行われ、それにより基質分子６０の蛍光を励起する励起光８０用の蛍光灯又はレーザが提供される。その際励起光８０（破線で示す）は、下からほぼ直角に光を通す担体層１０を通って測定室３０へ入射されて、測定チップ１の上側から膜４０を通って測定室３０へ搬送される基質分子６０を蛍光となるように励起する。励起される基質分子６０から出る蛍光放射８１（点線で示す）は、測定室３０から光を通す担体層１０を通って放射され、適当なカメラ又は蛍光顕微鏡の検出器（図示せず）により測定される。
【００４３】  図２に示すように、波形の表面構造により、測定室３０から励起光８０の望ましくない伝搬が少なくされる。しかし励起光８０の若干の残り成分が測定室３０及び膜４０を通って放射されることがあると、測定チップ１の上方従って測定室３０外にあって膜４０を経て測定室３０へ輸送されなかった基質分子６０も望ましくないように励起されて、妨害放射８２を生じる。波形表面構造２７，２８により、測定室３０を通って測定チップ１より上の妨害放射８２がカメラへ伝搬するのを最小にされる。これにより測定精度の著しい改善が行われる。
【００４４】  図４は、図１に示すものにほぼ一致しているけれども付加的な覆い層１２を持つ測定チップ１の別の好ましい実施例を示す。覆い層１２は主層２０上に設けられている。覆い層１２は、測定室３０の開口２５の上に設けられている開口１４を持っている。覆い層１２にあるそれぞれの開口１４は、測定室３０の開口の中心の上に設けられている。覆い層１２の開口１４の口径は、測定室３０の開口２５の口径より小さい。その利点は、図４に示す測定チップ１の実施例が、生物学的に規定される輸送体密度を持つ生体膜に対して特に適していることである。単位面積当たりの輸送たん白質５０の数が人工膜４０におけるようには変化しないので、測定室３０の容積が変化しない場合、なるべく１つ又は少数の輸送たん白質５０しか覆い層開口１４の上に存在しないように、覆い層開口１４の口径を選びかつ最適化することができる。測定精度は覆い層１２によって高められる。なぜならば、単位時間当たり少数の基質分子が測定室３０内へ輸送され、高い輸送速度のため覆い層開口１４なしでは不可能になる時間的に分解される測定が行われるからである。
【００４５】  図５は、二酸化珪素から成る覆い層１２及びチタン及び／又は金から成る付加的な光を通さない被覆２１を持つ測定チップ１の別の実施例の詳細な垂直断面図を示す。金が使用される場合、チタンは接着媒体として役立つ。金属被覆２１を持つ測定チップ１の構成部分が、図５に太い線で示されている。これは測定室３０の側壁２６、測定室３０に近い方にある覆い層１２の下側１６、及び担体層１０に載っている主層２０の下側２４である。
【００４６】  金属被覆２１は複数の利点を持っている。まず覆い層１２として、光を通す二酸化珪素を使用することができる。これは、測定チップ１を製造する場合利点を持っている。珪素から成る主層２０は、６００ｎｍまでの可視光の波長に対して実質的に不透明である。しかし深紅の光及び赤外光に対して、珪素は次第に透明になる。これは、励起光８０又は妨害放射８２（図示せず）がこの波長範囲にある時、有害になる。しかしチタン及び金は、赤外光の波長範囲の中まで光を通さない。それにより被覆される覆い層１２により絞りが形成されて、測定チップ１の下側から入射される励起光８０（図示せず、図２参照）を、測定室３０から出る際一部遮蔽する。同様に覆い層１２より上の妨害放射が遮蔽される。付加的な光を通さない金属被覆２１は、従って測定精度を改善する。その代わりに、覆い層１２より上の金属被覆によって同じ効果を得ることができる。
【００４７】  別の利点は、金属被覆２１が接触を行い、電気測定又は励起のために電極として利用可能なことである（図示せず）。こうして金属被覆２１は、膜４０、細胞層又は膜にある輸送システム（図示せず）の電気特性の特徴づけのために使用することができる。その際測定チップ１は、その上に張られる膜４０又は細胞（図示せず）のインピーダンスを測定できるように使用することができる。これにより膜４０、細胞層又は組織層の密度を求めることができる。
【００４８】  しかし測定チップ１を、金属被覆２１により、更に電界の発生のためにも、特に電圧に感応する輸送システムの制御のために使用することができる。これは、例えば電圧に関係するイオンチャネル、即ち膜電圧の特定の限界値において開閉するイオンチャネルである。印加される電界の変化により、結果として膜４０を介する基質分子６０の輸送７０の変化が生じる（図示せず）ことになる機能的開閉過程が開始される。その場合基質分子６０を、測定室３０において蛍光により検出することができる。
【００４９】  測定チップ１の別の使用は、測定チップ１の上部覆い層１２が孔たん白質例えばイオンチャネルを含む脂質膜で覆われていることである。測定のため、測定チップの金属チップ上側１７の金被覆２１又は付加的な金属被覆として作用する電極へ、電界が印加される。膜より上の溶液内の他の電極は膜電位を生じる。印加される電圧はイオンチャネルを活性化する。
【００５０】  従って測定チップ１の図示した実施例は、生物学的輸送系が電気的に機能するように開閉され、同時にそれにより生じる膜４０を介する輸送が、蛍光により光学的に測定可能である、という利点を持っている。
【００５１】  更に別の利点が、（図示しない）化学反応性又は極性被覆との組合わせで生じる。測定室３０の側壁２６にある金属被覆２１に、標準化されて、βメルカプトエタノール又はメルカプトプロピオン酸のようなチオ化合物が、ただし受容体活性化の検出系の成分も結合することができる。珪素から成る主層２０又は酸化珪素から成る覆い層１２は、これらを結合せず、従ってシラン化により選択的に変更することができる。それにより測定室３０の側壁２６及び測定チップの上側１７の異なる変更が可能になり、これは特定の測定課題のために有利である。
【００５２】  図５は更に覆い層１２の作用を示す。測定室３０の開口２５の上の中心に、覆い層１２の開口１４が設けられている。励起光束８０が下から入射されると、それが覆い層１２により一部絞られるか、又は覆い層１２の下側１６にある金被覆２１により反射されて、減少した強さでのみ測定チップ１より上の範囲へ達し、それが測定精度を高める。測定チップ１より上の妨害放射は、図示した実施例では、二酸化珪素から成る光を通す覆い層２１を貫通するが、金被覆２１により反射される。
【００５３】  図６は、円錐台状測定室３０を持ち珪素から成る主層２０を持つ測定チップ１の別の実施例の垂直断面図を示す。円錐台状とは、測定室３０の下部直径３５が、担体層１０の測定室底１８から測定室上部開口２５まで減少していることを意味する。この場合測定室１の下側から入射する励起光８０は、測定室３０の上部開口２５から出るのを一層よく防止される。図６は、側壁２６の波形の表面構造により、上方へ先細になる測定室３０に関連して、下から入射する励起光８０の大部分が測定室開口２５からもはや出ないことを示している。同様に妨害放射８２（図示せず）が、主層２０より上で小さい上部開口２５により一層よく遮蔽される。両方の特徴の共同作用によって、測定チップ１により得られる測定精度が更に著しく高められる。
【００５４】  図７は測定チップ１の平面図を示す。図は、測定チップ１の部分図で、アレイの形で設けられている測定室３０，３０′を示している。図示した測定室３０は１μｍの直径３１を持っているが、数ｎｍ〜数１００μｍの直径を持つ実施例も可能である。測定室の中心の間隔３２は２．５〜４μｍであるが、数ｎｍも可能である。
【００５５】  測定室３０は円筒の基本形状を持っている。しかし図７に示すように、測定チップ１は、異なる形状、図示した平面図では断面が長円形の測定室３０′を持っている。その際選ばれた数、図示した測定チップでは１１個の測定室３０の後に周期的に、それぞれ１つの長円形の測定室３０′が設けられ、しかもアレイの縦方向にも横方向にも設けられている。これらの測定室３０′は、カメラにより認識可能な光学標識として役立ち、測定室３０の位置の簡単化された一義的な対応や、測定中における測定チップ１の側方移動の手段又は自動修正を可能にする。
【００５６】  図８ａは、上述した微小構造化された測定チップ１用保持体２００の垂直断面図を示す。保持体２００は、上部開口２０５を通して充填可能な貯槽２０３を持つ直方体状板、なるべく市販の微小滴定板に類似しているが長さ及び幅を対象担体サイズに合わせた類似の室を含んでいる。保持体２００はなるべく微小滴定板の標準化された高さを持っている。しかし市販の微小滴定板とは異なり、貯槽２０３は貫通する通路を持ち、即ちそれは底を持たず、下部開口２１０を持っている。貯槽２０３の底は、板の下側に例えば紫外線で硬化する接着剤で取付けられる測定チップ１により初めて形成され、その際接着剤は、測定チップ１の調節後紫外光により硬化される。貯槽２０３は、このようにして微小構造化された測定チップ１により、所望の測定液を満たすことができる室を形成する。
【００５７】  測定チップ１は、その上側１７の（図示しない）測定室開口が貯槽２０３の方を向き、それにより測定室３０が貯槽２０３を通して充填可能であるように設けられている。光学測定は、保持体２００の下側２０２から、測定チップ１の光を通す下部担体層１０を通して行われる。
【００５８】  図８ａは更に、貯槽２０３の直径がその下の部分で上方へ増大することによって、その容積が大きくされることを示し、即ち貯槽２０３の上部開口２０５の直径がその下部開口２１０の直径より大きく、この下部開口が測定チップ１の面積より若干小さく、それにより測定チップが下部開口２１０の下へ密封するように接着可能である。
【００５９】  図８ｂは保持体２００の上側２０１の平面図を示す。保持体２００は市販のスライドガラスの長さ及び幅を持っている。例えば下に接着される測定チップ１を持つ１６個の貯槽２０３が設けられている。上部開口２０５の中心の間隔は９ｍｍであり、上部開口２０６の直径は６ｍｍであり、直径は下方へ先細になっているので、下部開口２１０は２ｍｍの直径を持っている。下部開口２１０の下には、辺長が３×３ｍｍの正方形の測定チップ１が接着されている。
【００６０】  図９は保持体２００ｂの別の好ましい実施例の垂直断面図を示す。保持体２００ｂは、図８ａに示したように、上部開口２０５を通して充填可能な貯槽２０３を持つ直方体状板を含んでいる。しかし貯槽２０３の底は、約５０〜２００μｍの厚さのカバーガラス２１５により形成されている。このためまずすべての測定チップ１が、透明な非蛍光接着剤なるべくシリコーン接着剤特にシルガード１８４により、カバーガラス２１５上へ全面で接着される。それからカバーガラス２１５全体が保持体２００ｂの下へ接着され、すべての貯槽２０３を密封し、測定チップ１が貯槽２０３へ埋込まれる。こうして貯槽２０３が、カバーガラス２１５により、所望の測定液を充填できる室を形成する。測定チップ１が下部開口２１０に場所をとることができるようにするため、下部開口２１０は図８ａに示す保持体２００におけるより少し大きい。カバーガラス２１５は光を通すので、カバーガラス２１５を通して下から光学測定を行うことができる。
【００６１】  図１０は、従来技術によりこうちのＳＯＩウエーハ３００の一部の垂直断面図を示す。これは、従来技術によれば電子部品及び集積回路の製造用原材料又は基板として使用される。しかし本発明では、これは微小構造化された測定チップ１の製造用原材料又は基板として用いられる。本発明による製造では、写真石版法及び食刻のように電子部品の公知の製造方法が有利に使用される。
【００６２】  公知のＳＯＩウエーハ３００は、サンドイッチのように、互いに固定的に結合された３つの層から構成されている。即ち下部の厚く光を通さない珪素層３１１、上部の薄く光を通さない珪素層３２０、及びその間に設けられて電気絶縁特性を持ちかつ光を通す二酸化珪素から成る非常に薄いいわゆる“埋込まれる”層３１２。
【００６３】  図１０に示すＳＯＩウエーハ３００から本発明による微小構造化された測定チップ１を製造する方法は、大体において図１１〜１５により以下に説明される段階を含んでいる。
【００６４】  上部の薄く光を通さない珪素層３２０へ、まず写真石版法及びＤＲＩＥ（ボッシュ処理）又は湿式化学食刻のような適当な食刻法により、後で測定室として役立つ凹所３０が形成される。
【００６５】  ボッシュ処理を使用すると、その際交代する通常の食刻段階と不働態化段階により交代する）凹所２７と隆起２８が側壁２６に形成されて、大体において波形の表面構造を生じされる。
【００６６】  食刻の際、珪素のみを溶解するが二酸化珪素を溶解しない食刻媒体が使用される。従って食刻は、いわば“停止層”として作用して食刻過程を停止させる埋込まれる二酸化珪素層３１２の所までのみ有利に行われる。図１１は、上部珪素層３２０に食刻されて波形の側壁を持つ測定室３０を有する図１０のウエーハ３００を示す。所望の場合、例えばチタン又は金から成る金属被覆を上部珪素層上へ設けることができる。
【００６７】  その後図１２に示すように硼珪酸ガラスから成り光を通す担体層１０が、陽極ボンディングにより上部珪素層３２０上へ取付けられる。
【００６８】  それから図１３に示すように、下部珪素層３１１が食刻により除去される。この方法段階においても、食刻が、食刻過程を停止させる埋込まれた二酸化珪素層３１２の所までのみ有利に行われる。
【００６９】  図１４は、このように処理されるＳＯＩウエーハ３００がその後ひっくり返されて、“転倒”位置にある。それにより担体層１０が最下層になり、ＳＯＩウエーハ３００の上部珪素層３２０が測定チップ１の後になっての主層２０になる。ＳＯＩウエーハ３００の最初に埋込まれる層３１２は最上層であり、測定チップ１の後になっての覆い層１２を形成する。
【００７０】  その後、測定チップ１の覆い層１２を形成する埋込まれた層３１２が、写真石版法及び適当な食刻法により部分的に構造化されるか又は完全に除去されるので、測定室３０の上方のなるべく中心に設けられて絞りとして作用する開口１４が形成される。これが図４に相当する図１５に示される。埋込まれる層３１２は完全に除去することもでき、それにより図１に示すような測定チップ１の実施例が製造される。
【００７１】  最後にＳＯＩウエーハから個々の測定チップ１が鋸引きされる。測定チップ１は個々に使用するか、又は図８に示すように上述した保持体２００の下へ接着することができる。
【符号の説明】
【００７２】１          測定チップ
５          小胞
１０        担体層
１２        覆い層
１４        覆い層開口
１５        生体細胞
１６        覆い層下側
１７        測定チップ上側
１８        測定室底
２０        主層
２１        被覆
２４        主層下側
２５        測定室開口
２６        測定室側壁
２７        凹所
２８        隆起
３０        測定室
３０′      長円形測定室
３１        測定室直径
３２        隣接する測定室中心の間隔
３３        測定室の深さ
３５        下側測定室直径
４０        膜
５０        輸送分子
６０        基質分子
７０        膜を通る輸送又は拡散
８０        励起光
８１        放射
８２        妨害放射
９０        膜受容体
１００      分泌たん白室
１１０      分泌
１１１      検出システム
１２０      検出システムの蛍光分子
１３０      配位子
１４０      検出システムによる蛍光分子への変換
２００      保持体
２０１      上側
２０２      下側
２０３      貯槽
２０５      貯槽の上部開口
２１０      貯槽の下部開口
２１５      カバーガラス
２３０      監視基質
３００      珪素ウエーハ
３１１      下部珪素層
３１２      埋込まれた層
３２０      上部珪素層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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