(57)【要約】本発明は、分析物を標準化するための新規な組成物および定量用標準物質の調製方法を提供する。これらの組成物および方法は、分析物を分析し、臨床バイオマーカーを測定するための標準物質および検量用試料の調製を可能にする。また、本発明は、アッセイ、例えば、サンドイッチ免疫アッセイに使用するための新規な組成物を含むキットも提供する。
2013518927.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端免疫反応領域、Ｃ末端免疫反応領域およびリンカー領域を含む、組成物。
【請求項２】
Ｎ末端免疫反応領域、Ｃ末端免疫反応領域およびリンカー領域を含み、免疫アッセイにおいて標準物質として用いられる組成物。
【請求項３】
前記免疫アッセイが、サンドイッチ免疫アッセイ、単一抗体アッセイ、二重サンドイッチ免疫アッセイおよび競合アッセイからなる群から選択されるものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｎ末端免疫反応領域が、Ａβ42に結合する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
Ｃ末端免疫反応領域が、Ａβ42に結合する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
前記リンカー領域が、非免疫反応ドメインである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
前記リンカー領域が、ポリエチレングリコール、グルタミン残基、アラニン残基、リジン残基、脂質、球状タンパク質、核酸およびアルキル鎖からなる群から選択されるリンカーを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離された改変ペプチド分子。
【請求項９】
生物学的試料中の分析物の質量の測定方法であって：
（ａ）標準物質を少なくとも２種類のビーズに結合させ、それにより第１ビーズセットおよび第２ビーズセットを生成し（ここで、前記標準物質には、第１検出抗体によって認識されるエピトープが含まれ、各ビーズセットには異なる濃度の標準物質が含まれる）；
（ｂ）前記分析物に特異的な捕捉抗体を第３ビーズセットに結合させ；
（ｃ）全てのビーズセットを一緒に混合してサスペンションアレイを生成し；
（ｄ）前記生物学的試料を前記サスペンションアレイに適用し（これにより前記分析物は第３ビーズセット上の捕捉抗体に結合する）；
（ｅ）第１検出抗体を前記サスペンションアレイに加え（ここで、第１検出抗体は、標準物質および捕捉抗体に結合した分析物に結合する）；
（ｆ）第１ビーズセット中の標準物質に結合した第１検出抗体から第１シグナルを測定し；
（ｇ）第２ビーズセット中の標準物質に結合した第１検出抗体から第２シグナルを測定し；
（ｈ）第１および第２シグナルに基づいて検量線を作成し；次いで
（ｉ）第１検出抗体からの第３シグナルを測定し、前記第３シグナルを検量線上の第１および第２シグナル測定値と比較することによって、第３ビーズセット中の分析物を定量することを特徴とする測定方法。
【請求項１０】
前記標準物質が、請求項１、２または８に記載の組成物を含むものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的試料が、血液、血清、血漿、末梢血単核球、末梢血リンパ球、組織、脳脊髄液および細胞からなる群から選択されるものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記分析物が、Ａβ42、Ａβ40、Ａβ38、タウおよびインスリン増殖因子受容体１からなる群から選択されるものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、マルチウェルプレート、ニトロセルロースフィルター、ガラス繊維中またはスライドガラス上で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１シグナルおよび第２シグナルが、フィコエリスリン、アレクサ５３２、ストレプトアビジン−フィコエリスリンおよびストレプトアビジン−アレクサ５３２からなる群から選択されるシグナルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
Ａβ42ペプチドを検出する免疫アッセイを実施するためのキットであって、請求項１、２または８に記載の組成物を含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫アッセイにおいて臨床バイオマーカーを測定するために標準物質および検量用試料として用いることができる新規な組成物に関する。本発明はまた、前記組成物の使用方法および前記組成物を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドβ（Ａβ）ペプチドは、ベータセクレターゼおよびガンマセクレターゼ酵素複合体によるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断から生じる（非特許文献１）。ベータセクレターゼは、これらのアミロイドペプチドのＮ末端を生じ、ガンマセクレターゼは、Ｃ末端を生じる（非特許文献１）。続いて、ガンマセクレターゼのＡＰＰ切断に応じて、典型的に、３８から４２アミノ酸長の範囲にある数種類のペプチドが生じる。Ａβペプチドは、細胞外ドメイン（アミノ酸１〜２８）および脂質二層に埋まっている膜貫通領域（アミノ酸２９〜４２）を有する。４２アミン酸長であるアミロイドペプチド（Ａβ42）は、単独または凝集物として、推定上の神経毒性種であると考えられている。これらの凝集物は、脳に神経変性を生じ、結果としてアルツハイマー病および認知症を発症させることが疑われている。Ａβ42が臨床的に認知症を発症させるという仮説は、Ｈａｒｄｙら（非特許文献２）によって発表されたようにアミロイドカスケード説と呼ばれる。
【０００３】
Ａβペプチドの特徴の１つは、生理学的濃度でオリゴマーに自己集合できることである（非特許文献３および４）。Ａβ42種は、Ａβ40およびＡβ38種と比較して、オリゴマーをより形成しやすい。オリゴマー形成のメカニズムは、逆平行の形でＡβペプチドの結合を介在するアミノ酸１６から２０（ＫＬＶＦＦ）に位置する小さな５アミノ酸領域から生じることが示されている。よって、この小さな領域は、「凝集ドメイン」と呼ばれている（非特許文献５）。Ａβペプチド凝集は、一定条件下で、特に、低いｐＨ範囲で、急速に（すなわち、数分以内に）会合し、中和もしくは高いｐＨではわずかに遅延した反応速度で会合する（非特許文献３）。凝集物は、水溶液中で、特に、塩の存在中で溶解性に乏しい。ＡβペプチドのＣ末端は、塩橋により二量体のコア上で折り返し、それにより疎水性を高め、ペプチドのフィラメントもしくは線維へのさらなる多量体化を促進する。Ａβ42種のさらなる２つのＣ末端残基は、他のＡβ種と比較して疎水性を増加させる（非特許文献６）。
【０００４】
臨床データにより、認知症および認知機能低下の程度は、Ａβ40種またはＡβ38種のいずれよりもＡβ42濃度により強い関連を示すことが示唆されている。この知見により、Ａβ42の急速な凝集特性とともに、Ａβ42凝集の阻害が臨床的利益を示しうるという仮説が導き出された。Ａβ42凝集の形成を阻害するために用いることができる異なるメカニズムを示す多くの研究が存在している。Ｔｊｅｒｎｂｅｒｇら（非特許文献５）は、凝集ドメインを含むペプチドがＡβペプチドに十分に結合し、凝集物の形成を阻害することを示した。凝集ドメインに結合するいくつかの他の分子はまた、アミロイドペプチド凝集を阻害することが示されている（非特許文献７および８）。凝集コアドメインにおけるアミノ酸の置換または全体の凝集ドメインの欠失はまた、Ａβペプチド凝集および線維形成を阻害する（非特許文献９）。さらに、Ａβ42および関連するペプチド種の量を低下させるために、様々な薬物がガンマセクレターゼ活性を阻害するように設計されている。臨床におけるこれらのアプローチの有用性は、現在研究中である。
【０００５】
Ａβ42の発生を阻害するか、またはその凝集を阻害する分子の有効性を評価するために、Ａβ42量を正確に測定することが必要である。生物学的試料中のＡβ42を検出し、定量するために用いられるいくつかの技術が存在し、これらには、免疫アッセイ（非特許文献１０〜１２）および質量分析（ＭＳ）に基づく方法（非特許文献１３および１４）が含まれる。ＭＳに基づく方法には、質量分析法を準備した液体クロマトグラフィーと組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＳＥＬＤＩ−ＴＯＦが含まれ、当該方法は、生物学的試料中の多くのアミロイドベータ種を検出することができるが、現在、臨床サンプル中のＡβ42を測定するために必要とされる十分な定量的な値を供しない。
【０００６】
免疫アッセイ法は、Ｎ末端に特異的である第１の抗体およびＡβ42のＣ末端に高度に特異的である第２の抗体を含む（すなわち、その他のＡβペプチド種を認識しない）二重サンドイッチ免疫アッセイに基づくものである。２つの基本型の免疫アッセイが存在する。第一の型は、固相表面に固定化されたＮ末端領域に特異的な抗体により生物学的試料中のＡβペプチドを捕捉するものである。タグを保有するＡβ42特異的な抗体は、抗体サンドイッチを完成するために免疫アッセイに加えられる。第二の型は、固相表面上に固定化されたＡβ42のＣ末端領域に特異的な抗体により生物学的試料中のＡβペプチドを捕捉するものである。タグを保有するＮ末端領域特異的な抗体が免疫アッセイに加えられる。いずれの型においても、第二の抗体により導入されたタグが完全な複合体の検出を可能にする。これらのアッセイは、生物学的試料の代わりに加えられるＡβ42標準物質の使用により定量的に行われる。標準物質から測定されたシグナルは、検量線を作成するために用いられ、続いて生物学的試料中のＡβ42を定量するために用いられる。
【０００７】
これまで、免疫アッセイにおけるＡβ42標準物質の使用は、典型的に最も容易に調製される合成の全長Ａβ42ペプチドに依存していた。しかしながら、これらのペプチドは、強い疎水性を有しており、それゆえ水溶液に溶解しない。さらに、標準物質としてのＡβ42の保存および使用には多くの問題が存在する。上記のように、Ａβ42は急速に凝集物を形成し、この形成は室温および中性ｐＨでより容易に生じる。低温（−２０℃より低い）および低ｐＨでの長期保存は、保存中の凝集を最小にすることを助けるが、凝集を防げるものではない。免疫アッセイの影響を受けやすい緩衝液中でのＡβ42の再構成はまた、容易ではない。これらの溶液は、ほとんどの場合、水性であり、中性ｐＨで緩衝化され、塩を含有し、室温で用いられるため、Ａβ42凝集を促進する全ての条件に当てはまる。凝集したＡβ42ペプチドは、不溶性沈殿物であり、および検出または捕捉抗体のいずれかによって認識されるサイズおよび利用可能性の両方で不均一であるため、免疫アッセイにおける標準物質として有用ではない。
【０００８】
それゆえ、本発明は、液体または組織抽出試料中のＡβ42ペプチドの存在量を正確に測定するために、免疫アッセイまたはその他の方法で標準物質または検量用試料として用いることができるＡβ42ペプチドもしくはタンパク質構築物およびこれらの組成物を調製するのに有用な方法を提供することによって当該技術分野での必要性を満たす。とりわけ、本発明の組成物および方法は、免疫アッセイ法で使用するためのＡβ42の凝集しないペプチド標準物質を調製することを目的とする。本明細書に記載の組成物および方法は、測定し、定量することが困難である他の多くのペプチドに対する広範な適用性を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Wolfe, Biochemistry, 45:7931-7939 (2006)
【非特許文献２】Science, 256:184-185 (1992)
【非特許文献３】Burdick et al., Journal of Biological Chemistry, 267:546-554 (1992)
【非特許文献４】Cerf et al., Biochemical Journal, 421:415-423 (2009)
【非特許文献５】Tjernberg et al., Journal of Biological Chemistry, 271:8545-8548 (1996)
【非特許文献６】Kim et al., Journal of Biological Chemistry, 280:35069-35076 (2005)
【非特許文献７】Martharu et al., Journal of Neurological Sciences, 280:49-58 (2009)
【非特許文献８】Kim et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 303:576-279 (2003)
【非特許文献９】Tjernberg et al., Journal of Biological Chemistry, 274:12619-12625 (1999)
【非特許文献１０】Olsson et al., Clinical Chemistry, 51:336-345 (2005)
【非特許文献１１】Verwey et al., Journal of Immunological Methods, 348:57-66 (2009)
【非特許文献１２】Sjogren et al., Journal of Neural Transmission, 107:563-679 (2000)
【非特許文献１３】Cantone et al., Journal of Neuroscience Methods, 180:255-260 (2009)
【非特許文献１４】Journal of Mass Spectrometry, 40:142-145 (2005)
【発明の概要】
【００１０】
ある態様において、本発明は、Ｎ末端免疫反応領域、Ｃ末端免疫反応領域およびリンカー領域を含む組成物を提供する。別の態様において、本発明は、Ｎ末端免疫反応領域、Ｃ末端免疫反応領域およびリンカー領域を含む組成物であって、免疫アッセイにおいて標準物質として用いられる組成物を提供する。ある実施態様において、前記免疫アッセイは、サンドイッチ免疫アッセイ、単一抗体アッセイ、二重サンドイッチ免疫アッセイおよび競合アッセイからなる群から選択されるものである。別の実施態様において、前記組成物は、タンパク質、ペプチド、フラグメントおよび改変タンパク質からなる群から選択されるものである。ある実施態様において、Ｎ末端免疫反応領域は、Ａβ42、Ａβ40、Ａβ38、タウまたはインスリン増殖因子受容体１に結合する。別の実施態様において、Ｃ末端免疫反応領域は、Ａβ42、Ａβ40、Ａβ38、タウまたはインスリン増殖因子受容体１に結合する。別の実施態様において、前記リンカー領域は、非免疫反応ドメインである。別の実施態様において、前記リンカー領域には、ポリエチレングリコール、グルタミン残基、アラニン残基、リジン残基、脂質、球状タンパク質、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡを含むが、これらだけに限定されない）およびアルキル鎖からなる群から選択されるリンカーが含まれる。
【００１１】
別の態様において、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７のアミノ酸配列を有する、単離されたペプチド分子を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、生物学的試料中の分析物の質量の測定方法であって：標準物質を少なくとも２種類のビーズに結合させ、それにより第１ビーズセットおよび第２ビーズセットを生成し（ここで、前記標準物質には、第１検出抗体によって認識されるエピトープが含まれ、各ビーズセットには、異なる濃度の標準物質が含まれる）；前記分析物に特異的な捕捉抗体を第３ビーズセットに結合させ；全てのビーズセットを一緒に混合してサスペンションアレイを生成し；前記生物学的試料を前記サスペンションアレイに適用し（これにより前記分析物は、第３ビーズセット上の捕捉抗体に結合する）；第１検出抗体をサスペンションアレイに加え（ここで、第１検出抗体は、標準物質および捕捉抗体に結合した分析物に結合する）；第１ビーズセット中の標準物質に結合した第１検出抗体から第１シグナルを測定し；第２ビーズセット中の標準物質に結合した第１検出抗体から第２シグナルを測定し；前記第１および第２シグナルに基づいて検量線を作成し；次いで、第１検出抗体から第３シグナルを測定し、前記第３シグナルを検量線上の第１および第２シグナル測定値と比較することによって、第３ビーズセット中の分析物を定量することを特徴とする方法を提供する。
【００１３】
ある実施態様において、標準物質には、Ｎ末端免疫反応領域、Ｃ末端免疫反応領域およびリンカー領域を含む組成物が含まれる。別の実施態様において、標準物質には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９．１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７のアミノ酸配列を有するペプチドまたは改変ペプチドが含まれる。
【００１４】
別の実施態様において、生物学的試料は、血液、血清、血漿、末梢血単核球、末梢血リンパ球、組織、脳脊髄液および細胞からなる群から選択されるものである。別の実施態様において、分析物は、Ａβ42、Ａβ40、Ａβ38、タウまたはインスリン増殖因子受容体１からなる群から選択されるものである。
【００１５】
別の実施態様において、前記方法は、マルチウェルプレート、ニトロセルロースフィルター、ガラス繊維中またはスライドガラス上で行われる。別の実施態様において、第１シグナルおよび第２シグナルは、フィコエリスリン、アレクサ５３２、ストレプトアビジン−フィコエリスリンおよびストレプトアビジン−アレクサ５３２からなる群から選択されるシグナルである。別の実施態様において、標準物質は、ビーズに共有結合している。別の実施態様において、捕捉抗体は、ビーズに共有結合している。別の実施態様において、前記共有結合は、カルボジイミド結合である。
【００１６】
別の態様において、本発明は、Ａβ42ペプチドを検出する免疫アッセイを実施するためのキットであって、本発明の組成物を含むことを特徴とするキットを提供する。
【００１７】
表の簡単な説明
表１は、Ａβペプチドの所望される物理学的特性およびこれらの特性を測定するために用いられる試験を示す。
【００１８】
表２は、Ａβ42ペプチドおよび改変ペプチド配列ならびに説明を示す。
【００１９】
表３は、タウペプチドおよび改変ペプチド配列ならびに説明を示す。
【００２０】
表４は、３種類のヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中のＡβ42ペプチドの測定濃度を示す。
【００２１】
表５は、特徴付けられた新規なＡβペプチドの一覧を示す。
【００２２】
表６は、動的光散乱（ＤＬＳ）データの概要を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、両側（two-sided）またはサンドイッチ可溶性標準物質のスキームを示す。
【図２】図２は、典型的なＡβ42サンドイッチ免疫アッセイからの検量線を示す。
【図３】図３は、改変Ａβ42ペプチド標準物質を用いた典型的なＡβ42サンドイッチアッセイを示す。図３Ａは、改変された標準物質２（配列番号２）および４（配列番号４）からの検量線を示す。図３Ｂは、改変された標準物質１２（配列番号１２）および１３（配列番号１３）からの検量線を示す。図３Ｃは、改変された標準物質１４（配列番号１４）および６（配列番号６）からの検量線を示す。
【図４】図４は、Ａβ42アッセイ内ビーズ法（intra-assay bead approach）のスキームを示す。
【図５】図５Ａは、異なる濃度のＡβ１〜１０ペプチド（配列番号１５）と共有結合した６種類の異なるルミネックスビーズセットの測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図５Ｂは、図２に示される曲線に類似する、Ａβ40アッセイ内標準物質（円）または可溶性標準物質としての天然Ａβ42ペプチド（三角形）のいずれかから４−ＰＬで作成した検量線を示す。図５Ｃは、可溶性Ａβ42ペプチドまたはアッセイ内Ａβ40標準物質のいずれかから作成した検量線を用いたヒトＣＳＦ試料中の測定されたＡβ42ペプチドを示す。
【図６】図６は、ヒト末梢血単核球溶解物中のリン酸化されたインスリン増殖因子受容体１（ＩＧＦ−Ｒ１）のレベルを示す。Ａ４パラメータ検量線は、異なるビーズセットにおけるＭＦＩ値から作成し（図６Ａ）、ＰＢＭＣ溶解物中のリン酸化されたＩＧＦ−Ｒ１の相対的なレベルを決定するために用いた（図６Ｂ）。
【図７】図７は、ＤＬＳデータを示す。
【図８】図８は、円二色性分析を示す。
【図９】図９は、ペプチド安定性データを示す。全長Ａβ42および７種類の改変ペプチドは、異なる温度で４０日間安定性実験に付した（図９Ａ〜９Ｆ）。
【図１０】図１０は、全長Ａβ42と７種類の改変ペプチドとの検量線の比較を示す。
【図１１】図１１は、全長と改変ペプチドとの検量線分析を示す。
【図１２】図１２は、全長と改変ペプチドとを用いたＣＳＦ試料分析を示す。
【図１３】図１３は、Ａβ(1-42)ペプチドに取り込まれたポリエチレングリコールスペーサーの構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、下記の本発明の好ましい実施態様の詳細な説明および本明細書に含まれる実施例を参照することによってより容易に理解されうる。
【００２５】
本発明は、免疫アッセイで臨床バイオマーカーを測定するために、標準物質および検量用試料として用いることができる新規な組成物および方法に関する。本発明はまた、前記組成物および前記組成物を含むキットの使用方法に関する。とりわけ、本発明の組成物および方法は、免疫アッセイ法において使用するためのＡβ42またはタウについての凝集しないペプチド標準物質を作成することを目的とする。
【００２６】
本発明はまた、本発明の組成物を含むキットに関する。
【００２７】
定義
本明細書で用いられるように、用語「Ａβ」は、アミロイドベータを意味する。
【００２８】
本明細書で用いられるように、用語「Ａβ42」は、アミロイドベータ１〜４２を意味する。「Ａβ42」は、表２に示されるようなアミノ酸配列である配列番号１を有する４２アミノ酸長ペプチドを意味する。
【００２９】
本明細書で用いられるように、用語「Ａβ38」は、アミロイドベータ１〜３８を意味する。「Ａβ38」は、配列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG（配列番号１７）を有する３８アミノ酸長のペプチドを意味する。
【００３０】
本明細書で用いられるように、用語「Ａβ40」は、アミロイドベータ１〜４０を意味する。「Ａβ40」は、表２に示されるような配列である配列番号１５を有する４０アミノ酸長ペプチドを意味する。
【００３１】
本明細書で用いられるように、用語「タウ」は、表３に示されるようなアミノ酸配列である配列番号２０に相当する天然のタウタンパク質を意味する。
【００３２】
本明細書で用いられるように、用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、とりわけ、それらが選択された抗原に対して結合活性または親和性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（すなわち、二重特異性抗体）および抗体フラグメント（すなわち、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、ｓｕｂ．２およびＦｖ）を包含する。「抗体」はまた、単離された抗体と同一の特性を有するファージまたはその他の表示担体などの担体タンパク質／生物に結合または融合した抗体または抗体フラグメントを意味しうる。
【００３３】
本明細書で用いられるように、用語「単離された」は、目的タンパク質およびタンパク質複合体に関して本明細書で用いられるように、通常、そのタンパク質または複合体とともに存在するであろう（すなわち、そのタンパク質または複合体が内在的に見出される細胞環境において）混入タンパク質を本質的に含まないタンパク質またはタンパク質複合体の調製を意味する。それゆえ、単離されたタンパク質複合体は、通常、単離した複合体の研究、例えば、その調節因子についてのスクリーニングに「混入する」か、または妨げるであろう細胞構成物から単離される。しかしながら、かかる「単離された」複合体は、目的タンパク質またはタンパク質複合体による調節が研究されている他のタンパク質を取り込んでいる可能性があることが理解されるべきである。
【００３４】
本明細書で用いられるように、用語「単離された」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸について本明細書でも用いられるように、天然に存在しない形態の分子を意味する。さらに、「単離された核酸」は、フラグメントとして天然に存在しておらず、自然界で見出されないであろう核酸フラグメントを含むものとされる。
【００３５】
本明細書で用いられるように、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、必要な場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを意味する。当該用語はまた、ヌクレオチド類似体から作り出されたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体を等価物として含み、ならびに記載される実施態様に適用可能であるとして一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むものと理解されるべきである。「核酸」はまた、ペプチド核酸「ＰＮＡ」または人工的に合成されたＤＮＡもしくはＲＮＡを意味しうる。
【００３６】
本明細書で用いられるように、用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において相互に同じ意味として用いられる。用語「精製されたタンパク質」は、通常、細胞または細胞溶解物中でタンパク質に付着した他のタンパク質からできる限り単離されるか、あるいは実質的に含まないタンパク質の調製物を意味する。本明細書で用いられるように、用語「改変ペプチド」は、ペプチドの天然配列に対して改変されているペプチドを意味する。例えば、改変には、天然ペプチド配列内の有害なドメインの除去またはリンカーの付加が含まれる。
【００３７】
本明細書で用いられるように、用語「結合する」は、生理学的条件下において、例えば、共有結合、静電気、疎水性、イオン性および／または水素結合相互作用などによる、２分子間の直接の結合を意味する。同様に、２つまたはそれ以上のポリペプチド間の「複合体形成」は、生理学的条件下において、例えば、共有結合、静電気、疎水性、イオン性および／または水素結合相互作用などによる、ポリペプチド間の直接の結合を意味する。
【００３８】
本明細書で用いられるように、用語「ドメイン」は、特定の構造を含み、および／または特定の機能を発揮するタンパク質の領域（すなわち、凝集ドメインである「リン酸化ドメイン」）を意味する。本明細書で用いられるように、用語「凝集ドメイン」は、逆平行の形でＡβペプチドの結合を介在するアミノ酸１６から２０に位置する５アミノ酸領域（KLVFF（配列番号１８））を意味する。
【００３９】
本明細書で用いられるように、用語「免疫反応ドメイン」は、抗体によって認識されうる特定のアミノ酸配列を含むタンパク質の領域を意味する。この領域には、当業者に公知のグリコシル化、メチル化、リン酸化またはその他の翻訳後修飾などの改変を含有するアミノ酸配列が含まれる。リン酸化されうるアミノ酸の例には、チロシン、セリンまたはスレオニンアミノ酸が含まれる。リン酸化されるアミノ酸が含まれる「免疫反応ドメイン」はまた、リン酸化ドメインとして特徴付けされうる。「免疫反応」ドメインにはまた、タンパク質の天然の折りたたみ状態で相互に近接し、抗体結合部位をともに含むタンパク質の２つまたはそれ以上の領域が含まれるであろう。
【００４０】
本明細書で用いられるように、本明細書で用いられる用語「免疫アッセイ」は、１つまたはそれ以上の抗体を利用して生体マトリックス中の分析物の存在または濃度を測定する生化学的試験を意味する。このアッセイは、特異的なタンパク質またはペプチドの免疫反応ドメインに対する抗体の特異的結合に応じて測定可能なシグナルを生じうる。
【００４１】
標準物質
ある態様において、本発明は、臨床バイオマーカーを測定するために標準物質および検量用試料として用いることができる組成物に関する。ある実施態様において、前記標準物質には、ペプチドが含まれる。当該ペプチドは、改変ペプチドでありうる。改変ペプチドには、非免疫反応ドメイン中のリンカー、欠失もしくは置換が含まれうる。別の実施態様において、非免疫反応ドメインは、凝集ドメインまたはリン酸化ドメインである。
【００４２】
凝集または非免疫反応ドメインにおける変異
ある態様において、本発明は、標準物質として用いることができる改変ペプチドを提供する。Ａβ42のような付着ペプチドとそれ自身および他の分子との自己凝集および非特異的な相互作用を生じる、公知のドメインまたはアミノ酸配列が存在する。それ自身として、これらの有害なドメインを欠失する標準物質または検量用試料を構築することができる。本発明は、有害なドメインを取り除くためにペプチドを改変するいくつかの方法を提供する。ある実施態様において、有害ドメインを含むアミノ酸は、アミノ酸配列から取り除かれ、Ｎ末端免疫反応ドメインは、Ａβ42の場合、中心の１７〜２０アミノ酸配列ならびに様々な長さの隣接するＣ末端ペプチドを欠如するＣ末端免疫反応ドメインに結合される。欠失された中心ドメインを有するＡβ42ペプチドの例は、表２、配列番号２、３および４に示される。別の実施態様において、中心の凝集ドメインと隣接するアミノ酸は、多くの異なるタイプの物質からなるリンカーまたはスペーサーと置換される。
【００４３】
別の実施態様において、凝集しないアミノ酸は、リンカーとされる。ある実施態様において、凝集しないアミノ酸は、アミノ酸配列の疎水性スペーサーまたはリンカーの形態であるか、あるいはＡβ42のＣ末端の３７〜４２配列（配列番号５）およびＡβ42のＣ末端の３２〜４２部分（配列番号６）の両方で示されるＥＥＲＰを形成する。別の実施態様において、Ａβ42ペプチドには、より長い疎水性リンカー、例えば、Ａβ42のＣ末端３７〜４２（配列番号７）およびＣ末端３２〜４２（配列番号８）部分の両方を有するアミノ酸配列DREPNR（配列番号１６）が含まれる。
【００４４】
さらに別の実施態様において、一連の荷電残基は、Ｎ末端およびＣ末端免疫反応ドメインの間のリンカーの形態で用いられる。別の実施態様において、整数ｍのリジン残基（配列番号９）または整数ｎのグルタミン酸残基（配列番号１０）からなるリンカーが作り出される。別の実施態様において、一連の中性残基がリンカーとして用いられる。別の実施態様において、整数ｐのアラニン残基からなる構築物（配列番号１１）が含まれる。
【００４５】
本発明の別の実施態様において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の様々な形態がリンカーとして用いられる。好ましい実施態様において、ＰＥＧ−６ａｔｏｍおよびＰＥＧ−２０ａｔｏｍは、様々なＣ末端部分（配列番号１２〜１４）とともに用いられる。別の実施態様において、アミノ酸残基に化学的に結合できるポリマーは、リンカーまたはスペーサーとして用いられる。このポリマーには、Ａβ42オリゴマーおよびその他の類似する付着もしくは自己凝集分子の免疫反応性を活性化する、線形のもの、ならびにデンドリマーおよび分岐コポリマーのような公知の枝分かれ形態のものが含まれる。
【００４６】
タウのリン酸化領域は、標準物質として用いられうる改変ペプチドを作成するためにも用いられうる。異常な過リン酸化タウは、神経原線維変化に関連する。タウには複数のリン酸化部位が存在しており；それらの各々は、その生物学的機能について異なる効果を有する。Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ１８１／Ｔｈｒ２１２／Ｔｈｒ２３１またはＳｅｒ２６２がリン酸化されたタウの測定は、ＭＣＩ患者における認知機能低下との関連を理解する助けとなりうる。よって、別の実施態様において、改変タウペプチドは標準物質とされる。改変タウペプチドの例は、表３に示される。
【００４７】
別の実施態様において、リンカーには、下記の分子のいずれか１つが含まれる：脂質、球状タンパク質、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡが含まれるが、これらに限定されない）、アルキル鎖または免疫アッセイにおいて目的の２つの免疫エピトープに安定性を加えるいずれか他の連鎖。別の実施態様において、ペプチド骨格およびリンカーの間の結合には、共有結合、アビジン−ビオチン複合体またはいずれか他の安定な結合が含まれる。別の実施態様において、前記構築物は、研究実験用プラスチック、特に、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボン、ならびにピペットチップ、チューブ、プレートおよび目的の分析物が測定されうる液体を保持するその他の容器などのその他の研究実験用プラスチック樹脂に対して、自己凝集または非特異的な吸収を生じない。
【００４８】
別の実施態様において、新規なＡβ42またはタウ免疫アッセイ標準物質もしくは検量用試料は、Ｎ末端特異的な抗体によって認識されるＮ末端エピトープの存在を必要とする。当該技術分野で公知の多くのＡβ42のＮ末端結合抗体が存在する。例えば、６Ｅ１０は、Ａβ3-8エピトープを認識することが知られており、３Ｄ６は、ＡβのＮ末端エピトープを認識することが知られている。重複するエピトープは、免疫アッセイの必要性および検出システムに応じて、いくつかの用いられるＮ末端特異的な抗体が選択できるように設計されうる。
【００４９】
別の実施態様において、新規なＡβ42免疫アッセイ標準物質または検量用試料は、Ｃ末端Ａβ42特異的な抗体によって認識されるＣ末端エピトープの存在を要する。十分に特徴付けられているＣ末端Ａβ42ｎｅｏ−エピトープ抗体の例には、Ｇ２−１１（ヘイデルバーグ大学）、２１Ｆ１２（Ａｔｈｅｎａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、４Ｄ７Ａ３（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）および１２Ｆ４（Ｃｏｖａｎｃｅ，旧Ｓｉｇｎｅｔ）が含まれる。重複するＣ末端エピトープは、免疫アッセイの必要性および検出システムに応じて、いくつかの用いられるＣ末端Ａβ42特異的な抗体が選択できるように設計されうる。
【００５０】
別の実施態様において、当業者に公知のＮ末端結合、Ｃ末端結合またはリン酸化タウ結合抗体が本発明で用いられうる。
【００５１】
本発明はまた、液体または組織抽出試料中のペプチドの量を正確に測定するための免疫アッセイにおいて、標準物質または検量用試料として用いることができるペプチドまたはタンパク質構築物およびその組成物を作成する方法に関する。免疫アッセイは、多くの場合、目的の分析物またはバイオマーカーを捉えるために、抗体などの生物学的に特異的な捕捉試薬を必要とする。抗体は、当該技術分野で周知の方法によって、すなわち、抗原としてバイオマーカーで動物を免疫することによって産生することができる。バイオマーカーは、それらの結合特性に基づいて、試料から単離することができる。あるいは、ポリペプチドバイオマーカーのアミノ酸配列が公知である場合、ポリペプチドは、当該技術分野で周知の方法によって抗体を作成するために合成され、使用されうる。バイオマーカーの例には、Ａβペプチドおよびタウが含まれる。
【００５２】
本発明には、例えば、ＥＬＩＳＡまたは蛍光に基づく免疫アッセイを含むサンドイッチ免疫アッセイ、ならびにその他の酵素免疫アッセイを含む従来の免疫アッセイが包含される。ＳＥＬＤＩに基づく免疫アッセイにおいて、バイオマーカーの生体特異性捕捉試薬は、前もって活性化されたＰＲＯＴＥＩＮＣＨＩＰ（登録商標）アレイのような質量分析（ＭＳ）プローブの表面に結合される。次いで、前記バイオマーカーは、この試薬を介してバイオチップ上に特異的に捕捉され、捕捉されたバイオマーカーが質量分析によって検出される。
【００５３】
よって、ある態様において、本発明は、本発明の標準物質を用いる臨床マーカーの測定方法に関する。ある実施態様において、前記標準物質は、免疫アッセイによって測定される。別の実施態様において、前記免疫アッセイは、サンドイッチ免疫アッセイである。別の実施態様において、前記免疫アッセイは、免疫反応結合部位に対して競合的もしくは「競合」様式で実施される単一抗体免疫アッセイである。さらに別の実施態様において、前記免疫アッセイは、二重サンドイッチ免疫アッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。
【００５４】
好ましい実施態様において、臨床マーカーの測定方法は、標準物質を少なくとも２種類のビーズに結合させ、それにより第１ビーズセットおよび第２ビーズセットを生成し（ここで、前記標準物質には、第１検出抗体によって認識されるエピトープが含まれ、各ビーズセットには異なる濃度の標準物質が含まれる）；前記分析物に特異的な捕捉抗体を第３ビーズセットに結合させ；全てのビーズセットを一緒に混合してサスペンションアレイを生成し；前記生物学的試料を前記サスペンションアレイに適用し（これにより前記分析物は第３ビーズセット上の捕捉抗体に結合する）；第１検出抗体を前記サスペンションアレイに加え（ここで、第１検出抗体は、標準物質および捕捉抗体に結合した分析物に結合する）；第１ビーズセット中の標準物質に結合した第１検出抗体から第１シグナルを測定し；第２ビーズセット中の標準物質に結合した第１検出抗体から第２シグナルを測定し；第１および第２シグナルに基づいて検量線を作成し；次いで第１検出抗体から第３シグナルを測定し、前記第３シグナルを検量線上の第１および第２シグナル測定値と比較することによって、第３ビーズセット中の分析物を定量する工程を特徴とする免疫アッセイを用いることによる。多重化された情報が特定の検出技術または装置とは無関係に測定できる他の固相のいずれかによって置換されうることは、本発明を限定することなく理解される。
【００５５】
ある実施態様において、標準物質には、本明細書に記載の組成物が含まれる。別の実施態様において、生物学的試料は、血液、血清、血漿、末梢血単核球、末梢血リンパ球、組織、脳脊髄液および細胞からなる群から選択されるものである。さらに別の実施態様において、前記分析物は、Ａβ42、Ａβ40、Ａβ38、タウまたはインスリン増殖因子受容体１である。
【００５６】
分析物および／または標準物質は、様々な表面に結合しうる。前記表面は、抗体または標準物質が、共有結合、受動吸収（passive absorbance）、ビオチン−ストレプトアビジンまたは当業者に公知のいずれか他の結合によって固定化することができる固相表面のいずれかでありうる。例えば、前記表面は、ビーズ、プレート、スライド、繊維、表面プラズモン共鳴センサーまたはいずれかの固相でありうる。
【００５７】
別の実施態様において、前記方法は、マルチウェルプレート、ニトロセルロースフィルターまたはスライドガラス上で行われる。別の実施態様において、第１および第２シグナルは、蛍光によって検出される。例えば、第１シグナルおよび第２シグナルは、フィコエリスリン、アレクサ５３２、ストレプトアビジン−フィコエリスリンおよびストレプトアビジン−アレクサ５３２からなる群から選択されるシグナルでありうる。別の実施態様において、前記シグナルは、酵素活性（すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）、化学発光、放射能、赤外線放射、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）または当業者に公知のいずれか他の方法によって検出される。
【００５８】
別の態様において、本発明には、Ａβ42またはタウペプチドを検出する免疫アッセイを実施するためのキットであって、本発明の標準物質が含まれるキットが含まれる。
【００５９】
天然Ａβ42に対する新規な免疫アッセイ標準物質または検量用試料の性能比較
新規な免疫アッセイ標準物質または検量用試料の性能は、免疫アッセイにおいて天然Ａβ42と同程度の性能を有するべきである。天然の全長Ａβ42ペプチドは、標準的な固相技術を用いて合成しうるか、またはそれらは多くの製造業者からカタログ品として購入されうる（Ａｎａｓｐｅｃ  Ｉｎｃ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＣｏｍｐａｎｙまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）。標準的な方法は、当該技術分野で周知であるアミノ酸解析などの質量分析技術を用いて、不完全な種類のものから全長構築物の量を調べるために用いられうる（Kanu et al., Journal of Mass Spectrometry, 43:1-22 (2008)；Bernstein et al., Journal of American Chemical Society, 127:2075-2084 (2005)；Li et al., Encyclopedia of Analytical Chemistry, Meyers, R.A., ed., John Wiley & Sons Ltd. (2009)）。
【００６０】
例として、表１は、Ａβ42ペプチドの所望される物理特性およびこれらの特性を試験するために用いられる様々な方法を列挙する。これらの方法は、標準物質の特性が天然Ａβ42ペプチドの特性と同等であるかどうかを調べるために用いることができる。
表１
【表１】
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【００６１】
抗体に基づく免疫アッセイにおける改変された標準物質または検量用試料の使用
本発明の別の態様において、改変された標準物質は、単一抗体に基づくアッセイで用いられる。ある実施態様において、単一抗体を含有する免疫アッセイは、競合免疫アッセイによって生物学的試料中のＡβ42またはタウを測定するために用いることができる。Ａβ42またはタウに特異的な単一抗体は、マイクロタイタープレートのウェル、ビーズまたはその他の免疫アッセイに関連する表面などの固体表面に固定化されている。前記抗体は、カルボキシル基およびアミン基のＥＤＣ介在結合などの多くの異なる方法により、あるいは受動吸収によりまたはプロテインＡもしくはプロテインＧ界面を介して共有結合されうる。続いて、Ａβ42またはタウ競合因子は、捕捉抗体のエピトープを保持する全長Ａβ42またはタウペプチドあるいは改変型を含有するＡβ42またはタウ標準物質または検量用試料から調製される。Ａβ42またはタウ競合因子は、生物学的試料中の天然Ａβ42またはタウと、固定化された抗体上の結合部位（パラトープ）との間に競合を作り出すために用いられる。パラトープは、分析物におけるエピトープまたは免疫反応ドメインを認識する抗体上の結合領域を表すために用いられる用語である。前記Ａβ42またはタウ競合因子は、検出用のタグが付けられる。ある実施態様において、前記タグは、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素である。別の実施態様において、前記タグは、フィコエリスリンなどの蛍光色素である。さらに別の実施態様において、前記タグは、ビオチンまたはルテニウムなどの別のタグである。さらに別の実施態様において、前記タグは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などの核酸フラッグを検出するための高感度技術を用いて、抗体の検出により定量化されるＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡなどの核酸である。Ａβ42またはタウ競合因子の単一濃度は、前記アッセイで用いられ、生物学的試料中で見出されるＡβ42またはタウの天然レベルと競合する能力に基づいて決定されるであろう。
【００６２】
別の実施態様において、前記アッセイは、検量線を作成することによって定量される。別の実施態様において、定量は、全長Ａβ42もしくはタウペプチドまたは捕捉抗体のエピトープを保持する改変型のいずれかであるＡβ42もしくはタウ標準物質または検量用試料の一組を作成することによって行われる。これらのタグが付けられていない標準物質または検量用試料は、Ａβ42またはタウを含んでいない緩衝液または生体マトリックスのいずれかで調製される。ある実施態様において、検量線は、ある濃度のタグが付けられていない標準物質または検量用試料を、固定化された抗体に対するタグが付けられたＡβ42もしくはタウ競合因子と混合することによって作成される。タグが付けられていない標準物質または検量用試料の各試験濃度から得られたシグナル値は、検量線を作成するために用いられる、すなわち、タグが付けられていないＡβ42またはタウ標準物質または検量用試料の濃度に対して、得られたシグナル値をプロットする。標準定量曲線が一旦作成されると、アッセイは、同一の固定濃度のタグが付けられたＡβ42またはタウ競合因子を、生物学的試料と混合することによって生物学的試料中の天然Ａβ42またはタウのレベルを決定するために用いられる。得られたシグナル値は、生物学的試料中のＡβ42またはタウのレベルを決定するために検量線上にプロットされる。
【００６３】
本発明の別の態様において、改変された標準物質は、サンドイッチ法に基づく免疫アッセイで用いられる。
【００６４】
アッセイ内標準物質に基づく免疫アッセイにおける改変された標準物質または検量用試料の使用
本発明の別の態様において、Ａβ42またはタウペプチドは、アッセイ内校正システムに取り入れられる。この方法において、ルミネックスビーズに基づくシステムまたはメソスケールディスカバリーＥＣＬプレートに基づくシステムなどの多重化免疫アッセイ法が用いられうる。検出抗体の抗体結合エピトープを包含するアミノ酸残基を含有するペプチドが作成される。ある実施態様において、これらのペプチドには、固相に共有結合させる改変または水溶性免疫アッセイにおける溶解性および用途を増加する改変が含まれる。これらのペプチドは、明確に定義された一組の標準物質を作成して検量線を作成するために、多重化免疫アッセイシステムにより定義されるような関連する固相に対して異なる濃度で固定化される。
【００６５】
臨床試料中の水溶性バイオマーカーの測定は、多くの場合、二重抗体サンドイッチアッセイを用いて行われる。これらのアッセイは、バイオマーカーに特異的である２種類の抗体および第２の「レポーター」または「検出」抗体を用いて捕捉バイオマーカーを検出する技術を必要とする。タンパク質標準物質は、アッセイを定量するために必要とされる。これらの標準物質は、しばしば、組み換えタンパク質の形態であるが；それらはまた、生物学的試料から取得されうる。これらのアッセイのための従来のアッセイ法には、臨床試料の分析に適した定量化を供するＥＬＩＳＡ技術が含まれる。しかしながら、それらは、多くの場合、１ウェルあたり１種類のバイオマーカーアッセイに限定される。複数のバイオマーカーが単一のウェルもしくは反応管で分析できる最新の技術が開発されている。いくつかの多重化技術は、スライドガラスまたは特殊なマイクロタイタープレートなどの固体表面上にスポットされた抗体を利用する。別の方法は、抗体が溶液中で一緒に混合されるラテックスビーズに結合してアレイを形成するサスペンションアレイによるものである。
【００６６】
ある実施態様において、サスペンションアレイ技術が用いられる。別の実施態様において、サスペンションアレイ技術は、ルミネックスｘＭＡＰ技術である。ルミネックスｘＭＡＰ技術は、２種類の蛍光色素を一定の割合で含有するラテックスビーズを使用する。異なるビーズ「セット」は、これらの２種類の色素の割合を変更することによって作成される。前記ビーズは一緒に混合されてサスペンションアレイを生成する。前記ビーズ混合物は、レーザーの前を通過する際に、各ビーズを蛍光比率によって同定する装置により分析される。これらのビーズセットは、タンパク質、ペプチド、抗体などの分子の共有結合に用いられるそれらの表面上で異なる改変を有する。これにより、これらのビーズの表面上でアッセイを行うことができる。アッセイは、フィコエリスリンのような第３蛍光標識の目的分析物に対するレポーター抗体への取り込みにより定量される。装置の第２のレーザーは、ビーズが装置を通過する際にこのレポーター標識の蛍光を測定する。
【実施例】
【００６７】
実施例１−Ａβ42を測定するために用いることができるサンドイッチに基づくアッセイ
両側またはサンドイッチ可溶性標準の模式図が図１に示される。簡単に説明すると、Ａβ42のＣ末端に特異的な捕捉抗体を固体表面に固定化させた。生物学的試料を加え、これによりＡβ42が固定化させた抗体によって捕捉されるようにした。Ａβ42のＮ末端に特異的である第２のタグが付けられた検出抗体を加えた。タグが付けられた検出抗体によって作成した測定シグナルを定量のために用いた。
【００６８】
Ａβ42を測定するために用いることができるサンドイッチアッセイの一例が図２に示される。簡単に説明すると、ビオチン標識抗Ｃ末端Ａβ42抗体（５６５）を、９６ウェルメソスケールディスカバリーのストレプトアビジンでコートしたプレート（MesoScale Discovery Inc., Gaithersburg, Maryland (MSD)）に固定化させた。標準物質Ａβ42ペプチド（天然配列の全長）を異なるウェルに添加した。Ａβ42ペプチドを固定化した捕捉抗体によって捕捉した。Ａβ42のＮ末端に対して第２のルテニウム（Ｒｕ）タグを付けた抗体（２６Ｄ６）を加え、サンドイッチを完成させた。この複合体は、ＥＣＬを採用するＭＳＤセクター６０００装置を用いて検出した。前記装置によって測定した生の蛍光単位（raw fluorescence unit）（ＲＦＵ）を４−パラメータロジスティックモデルに適合させて検量線を作成した。別の例において、いくつかの改変Ａβ42ペプチドが標準物質として用いられる（表２、配列番号２、４、６、１２、１３および１４）。これらの改変された検量用試料によって作成した検量線を図３に示す。
表２：Ａβ42ペプチドおよび改変ペプチド配列および説明
【表２】
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【００６９】
免疫アッセイはまた、タウを測定するために用いることができる。本発明の標準物質として用いることができる改変タウペプチド配列の例を下記の表３に示す。
表３：タウペプチド配列および構築物
【表３】
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【００７０】
実施例２−生物学的試料中のＡβ42を測定するサンドイッチＡβ42アッセイ
生物学的試料中のＡβ42を測定するサンドイッチＡβ42アッセイの例を表３に示す。ビオチン標識抗Ｃ末端Ａβ42抗体（５６５）を９６ウェルＭＳＤストレプトアビジンでコートしたプレートに固定化させた。標準物質Ａβ42ペプチド（天然配列の全長）または改変Ａβ42標準物質（配列番号２）を異なるウェルに添加した。ヒトＣＳＦ試料を異なる希釈率で異なるウェルに加えた。当該プレートを室温で２時間インキュベートして、Ａβ42ペプチドを固定化させた捕捉抗体によって捕捉させた。Ａβ42のＮ末端に対して第２のルテニウムでタグを付けた（Ｒｕ）抗体（２６Ｄ６）を加えて、サンドイッチを完成させた。この複合体は、ＥＣＬを採用するＭＳＤセクター６０００装置を用いて検出した。前記装置によって測定した生の蛍光単位（raw fluorescence unit）（ＲＦＵ）を４−パラメータロジスティックモデルに適合させて検量線を作成した。ヒトＣＳＦ試料中のＡβ42の測定濃度を表３に示す。
表４：３つのヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中のＡβ42ペプチドの測定濃度
【表４】
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【００７１】
実施例３−Ａβペプチドに基づくアッセイ内ルミネックスアッセイ
図４は、Ａβ42アッセイ内ビーズ法のスキームを示す。異なる濃度のＡβ42標準物質ペプチド（またはその他の天然または改変Ａβペプチド）と結合させたビーズセットを、抗Ａβ42−Ｃ末端特異的な捕捉抗体と結合させたビーズセットと合わせて、サスペンションアレイを生成した。当該アレイを生物学的試料とともにインキュベートする。ここで、生物学的試料中のＡβ42ペプチドは、抗Ａβ42捕捉抗体と結合させたビーズによって捕捉される。Ａβ42ペプチドのＮ末端に特異的であるタグを付けた検出抗体をサスペンションアレイに加え、それにより捕捉されたＡβ42ペプチドに結合し、またそれらの表面に結合したＡβ42ペプチドを有するビーズにも結合する。それらの表面に結合させたＡβ42ペプチドを有するビーズから得たＭＦＩ値を用いて、アッセイ内検量線を作成する。生物学的試料中のＡβ42量は、アッセイ内検量線を用いて、抗Ａβ42捕捉物と結合させたビーズ上の捕捉Ａβ42の量から決定する。
【００７２】
抗体および標準物質
天然の全長Ａβ42および全長Ａβ40ペプチド（それぞれ配列番号１および１５）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙから得た。１１６Ｂ５６５．１マウス抗ヒトＡβ42Ｃ末端抗体および２６Ｄ６−Ｂ２−Ｂ３マウス抗ヒトＡβ42Ｎ末端抗体は、関連するＢＭＳが保有するハイブリドーマ細胞株から産生された培養上澄み液のプロテインＧ精製により得た。
【００７３】
フィコエリスリン−ストレプトアビジン抱合体は、ジャクソン研究所（ペンシルバニア州，ウェストグルーブ）から得た。Ｔｗｅｅｎ−２０、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、アジ化ナトリウム、ＩｇＧを含まないウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびリン酸ナトリウムは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ミズーリ州，セントルイス）から購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（バージニア州，ハーンドン）から入手した。カルボキシル化されたルミネックスビーズは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（カリフォルニア州，ハーキュリーズ）から購入した。フィコエリスリン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体は、ジャクソン研究所（ペンシルバニア州，ウェストグルーブ）から入手した。
【００７４】
抗Ａβ42捕捉抗体のルミネックスビーズへの共有結合
１１６Ｂ５６５．１マウス抗ヒトＡβ42Ｃ末端抗体は、２工程のカルボジイミド法を用いてカルボキシル化させたビーズの表面に共有結合させた。ビーズは、１．２５ｘ１０7個のビーズをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１５Ｄ遠心機（ニューヨーク州，ウエストベリー）で１４０００ｘｇにて４℃で５分間遠心分離することによって洗浄した。該上澄み液を慎重に取り除き、別の１．２５ｘ１０7個のビーズを分注し、４℃で１４０００ｘｇにて５分間遠心した。上澄み液を再度慎重に取り除き、ｐＨ４．８の０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（活性化緩衝液）の８００μｌ中で再懸濁させた。次いで、ビーズを１５秒間ボルテックスにかけ、ＳＰＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）ＬＴＤ超音波洗浄機（アリゾナ州，スコッツデール）を用いて１５秒間超音波処理した。前記ビーズを活性化緩衝液でさらに２回洗浄し、活性化緩衝液中で新たに調製した５ｍｇ／ｍｌのＥＤＣの２００μｌ中で再懸濁させた。該ビーズは、光から保護しながら、回転板にて室温で２０分間インキュベートした。ＥＤＣ工程の終了後、ビーズを洗浄し、ＰＢＳで調製した２５０μｇ／ｍｌの捕捉抗体の１０００μｌ中に再懸濁させ、光から保護した回転板にて室温で１時間インキュベートした。前記ビーズを洗浄し、１ｍｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で光から保護しながら回転板中にて室温で１時間インキュベートした。最後に、ビーズを血球計でカウントし、ブロッキング緩衝液中に２ｘ１０6個のビーズ／ｍｌで再懸濁させ、使用準備を開始するまで４℃で光から保護しながら保存した。
【００７５】
Ａβ42捕捉抗体のルミネックスビーズに対する共有結合効率の表面試験
ビーズ表面上の捕捉抗体の存在は、表面試験を用いて確認した。２５００個のビーズを含有するアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％（ｗ／ｖ）アジド）の５０μｌをＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターボトルプレートウェル（マサチューセッツ州，ベッドフォード）に加えた。該ビーズは、該プレートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅバキュームマニフォールド（マサチューセッツ州，ベッドフォード）上に置いて液体を除去することによって洗浄し、続いて１００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ洗浄緩衝液中に再懸濁させた。最後に、洗浄緩衝液を真空によりウェルから除去し、ビーズを、アッセイ緩衝液で１／１００に希釈した１００μｌ／ウェルのＰＥヤギ抗マウスＩｇＧでインキュベートした。該プレートは、光から保護しながら９６ウェルプレートシェーカー（Ｌａｂ  Ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，イリノイ州，メルロースパーク）で３００ｒｐｍにて室温で３０分間インキュベートした。続いて、該ビーズを、１００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液を用いて真空濾過により３回洗浄し、１００μｌ／ウェルのアッセイ緩衝液中に再懸濁させた。少なくとも５０個のビーズ／ウェルのＭＦＩを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州，ハーキュリーズ）から入手したルミネックス100装置を用いて、Ｂｉｏｐｌｅｘ  ｍａｎａｇｅｒ  ４．１．１ソフトウェアを稼動して測定した。少なくとも２０，０００のＭＦＩを用いて、ビーズ表面上の抗体の使用可能な量の存在を確認した。
【００７６】
アッセイ内Ａβ40ペプチドのルミネックスビーズに対する共有結合
Ａβ40の天然全長ペプチド（配列番号１５）は、２．５ｍｌのＰＢＳ中で凍結乾燥させたペプチドを再構成して１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度にすることによって調製した。Ａβ40ペプチドは、２６Ｄ６抗体の結合に必要とされるＮ末端Ａβ42エピトープをすでに発現し、抱合に必要とされる水性緩衝液中でより安定であることから、Ａβ42ペプチドの代わりにＡβ40ペプチドをこのアッセイに選択した。Ａβ40ペプチドを、希釈緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて異なる濃度（図５Ａに示される）に希釈した。Ａβ40ペプチドの各調製物は、２工程のカルボジイミド法を用いて、選択されたビーズセット（各濃度に対して異なるビーズセット）の表面に共有結合させた。各ビーズセットは、１．２５ｘ１０7個のビーズをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１５Ｄ遠心機（ニューヨーク州，ウエストベリー）で１４０００ｘｇにて４℃で５分間遠心分離することによって洗浄した。該上澄み液を慎重に取り除き、ｐＨ４．８で８００μｌの０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（活性化緩衝液）を加えた。続いて、該ビーズを１５秒間ボルテックスにかけ、ＳＰＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）ＬＴＤ超音波洗浄機（アリゾナ州，スコッツデール）を用いて１５秒間超音波処理した。前記ビーズを活性化緩衝液でさらに洗浄し、活性化緩衝液で新たに調製した５ｍｇ／ｍｌのＥＤＣの２００μｌ中に再懸濁させた。該ビーズは、光から保護しながら回転板にて室温で２０分間インキュベートした。ＥＤＣ工程の終了後、各ビーズセットを洗浄し、所定濃度のＡβ40ペプチドで再懸濁させ、光から保護しながら回転板中にて室温で１時間インキュベートした。前記ビーズセットを洗浄し、１ｍｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、光から保護しながら回転板にて室温で１時間インキュベートした。最後に、各ビーズセット調製物の濃度は、血球計でビーズをカウントすることによって測定した。次いで、各ビーズセットをブロッキング緩衝液中に２ｘ１０6個のビーズ／ｍｌで再懸濁させ、使用準備を開始するまで光から保護しながら４℃で保存した。
【００７７】
Ａβ40ペプチド結合ルミネックスビーズの試験
ビーズ表面上のＡβ42Ｎ末端特異的抗体に対するＮ末端エピトープを含有するＡβ40ペプチドの存在は、表面試験を用いて確認した。２５００個のビーズを含有するアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％（ｗ／ｖ）アジド）の５０μｌを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターボトルプレートウェル（マサチューセッツ州，ベッドフォード）に加えた。ビーズは、該プレートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅバキュームマニフォールド（マサチューセッツ州，ベッドフォード）上に置いて液体を除去することによって洗浄し、ビーズを１００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ洗浄緩衝液中に再懸濁させた。最後に、洗浄緩衝液を真空によりウェルから除去し、ビーズを、アッセイ緩衝液で希釈した１００μｌ／ウェルのビオチン標識２６Ｄ６−Ｂ２−Ｂ３抗体とインキュベートさせた。該プレートを、光から保護しながら９６ウェルプレートシェーカー（Ｌａｂ  Ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，イリノイ州，メルロースパーク）で３００ｒｐｍにて室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション工程後、該ビーズを４回洗浄し、１μｇ／ｍｌのフィコエリスリン−ストレプトアビジン抱合体の５０μｌ／ウェル中に再懸濁させ、光から保護しながらプレートシェーカーにて室温で２０分間インキュベートした。続いて、ビーズを、１００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液を用いて真空濾過により３回洗浄し、１００μｌ／ウェルのアッセイ緩衝液中に再懸濁させた。少なくとも５０個のビーズ／ウェルのＭＦＩは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州，ハーキュリーズ）から入手したルミネックス100装置を用いて、Ｂｉｏｐｌｅｘ  ｍａｎａｇｅｒ  ４．１．１ソフトウェアを稼動して測定した。各々のビーズセットについて測定したＭＦＩを図５Ａに示す。
【００７８】
生物学的試料のＡβ42アッセイ内分析
アッセイ内ルミネックスに基づくアッセイを用いる試料分析は、最初に、抗Ｃ末端特異的Ａβ42５６５捕捉抗体と結合したビーズセットおよび異なる濃度のＡβ40ペプチドと結合したビーズセットを混合することによって行った（図５Ａに示される）。アッセイ緩衝液で調製した５０，０００個のビーズ／ｍｌの懸濁液の全てのビーズセットを合わせた混合物の５０μｌ／ウェルを、前もって湿らせたフィルターボトム９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。該ビーズを真空濾過によりアッセイ緩衝液の１００μｌ／ウェルで洗浄した。捕捉ビーズは、希釈したヒトＣＳＦ試料、品質コントロール試料（ＱＣ）、標準物質としての異なる濃度の全長天然Ａβ42ペプチドまたは異なる濃度の改変Ａβ42ペプチド標準物質の５０μｌ中に２ウェルずつ再懸濁させ、光から保護しながらプレートシェーカーにて室温で１時間インキュベートした。１．０μｇ／ｍｌのビオチンで標識した抗Ａβ42２６Ｄ６レポーター抗体を加え、次いで、光から保護しながらプレートシェーカーにて室温で０．５時間インキュベートした。インキュベーション工程後、ビーズを４回洗浄し、１μｇ／ｍｌのフィコエリスリン−ストレプトアビジン抱合体の５０μｌ／ウェル中に再懸濁させ、次いで、光から保護しながらプレートシェーカーにて室温で２０分間インキュベートした。最後に、該ビーズを４回洗浄し、アッセイ緩衝液の１００μｌ／ウェル中に再懸濁させた。１ウェルあたり少なくとも５０個のビーズのＭＦＩは、Ｂｉｏｐｌｅｘ  ｍａｎａｇｅｒ  ５．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カリフォルニア州，ハーキュリーズ）を稼動するＢｉｏｐｌｅｘルミネックス装置を用いて測定した。検量線は、加重４−パラメータロジスティック曲線（weighted 4-parameter logistic curve fit）を用いて、可溶性Ａβ42ペプチドから、あるいは異なる濃度のＡβ40ペプチド（内部標準）でコートしたビーズセットから調製したシグナルから作成した（図５Ｂ）。ＣＳＦまたはＱＣ試料中のＡβ42ペプチド濃度は、関連する検量線から算出し、図５Ｃに示す。
【００７９】
実施例４−ルミネックスビーズを用いたＩＧＦＲ１についてのペプチドに基づくアッセイ内
下記は、ヒトＩＧＦ−Ｒ１受容体においてリン酸化されたチロシン残基である１１６２および１１６３の検出のためのペプチドアッセイ内に基づいたアッセイの別の実施例である。タウのリン酸化領域もまた、同じように用いられうる。
【００８０】
抗体および標準物質
特注のＩＧＦ１Ｒ［ｐＹｐＹ1162/1163］ペプチドは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ（英国）から供された。マウス抗ＩＧＦ１Ｒ捕捉抗体は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カリフォルニア州，サンディエゴ）から入手し、ウサギ抗ホスホチロシン（１１６２／１１６３）−ＩＧＦ１Ｒ受容体抗体は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（マサチューセッツ州，ビレリカ）から購入した。フィコエリスリン標識ヤギ抗ウサギ抗体は、ジャクソン研究所（ペンシルバニア州，ウェストグルーブ）から入手した。Ｔｗｅｅｎ−２０、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、アジ化ナトリウム、ＩｇＧを含まないウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびリン酸ナトリウムは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ミズーリ州，セントルイス）から購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（バージニア州，ハーンドン）から購入した。カルボキシル化されたルミネックスビーズは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（カリフォルニア州，ハーキュリーズ）から購入した。健常者のＰＢＭＣ試料は、会社内ドナー（ＢＭＳ，ＮＪ）から入手した。該ＰＢＭＣ試料をＰＢＳまたは１００ｎｇ／ｍｌの精製したヒトＩＧＦ１（Ｇｅｎｅｔｅｘ  Ｉｎｃ，テキサス州）のいずれかで３７℃で１０分間処理して、細胞上に存在するＩＧＦＲにリン酸化を導入した。該細胞を洗浄し、改変ＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、−８０℃で保存した。
【００８１】
抗ＩＧＦ−Ｒ１捕捉抗体のルミネックスビーズに対する共有結合
マウス抗ヒトＩＧＦ１Ｒ捕捉抗体は、２工程のカルボジイミド法を用いてカルボキシル化ビーズの表面に共有結合させた。該ビーズは、１．２５ｘ１０7個のビーズをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１５Ｄ遠心機（ニューヨーク州，ウェストベリー）にて１４０００ｘｇで４℃にて５分間遠心分離することによって洗浄した。該上澄み液を慎重に取り除き、別の１．２５ｘ１０7個のビーズを分注し、１４０００ｘｇにて４℃で５分間遠心した。上澄み液を再度慎重に取り除き、ｐＨ４．８の０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（活性化緩衝液）８００μｌ中に再懸濁させた。続いて、ビーズを１５秒間ボルテックスにかけ、ＳＰＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）ＬＴＤ超音波洗浄機（アリゾナ州，スコッツデール）を用いて１５秒間超音波処理した。前記ビーズを活性化緩衝液でさらに２回洗浄し、活性化緩衝液で新たに調製した５ｍｇ／ｍｌのＥＤＣの２００μｌ中に再懸濁させた。ビーズを、光から保護しながら回転板にて室温で２０分間インキュベートした。ＥＤＣ工程の終了後、ビーズを洗浄し、ＰＢＳ中で調製した２５０μｇ／ｍｌの捕捉抗体の１０００μｌ中に再懸濁させ、光から保護しながら回転板中にて室温で１時間インキュベートした。前記ビーズを洗浄し、１ｍｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で、光から保護しながら回転板中にて室温で１時間インキュベートした。最後に、ビーズを血球計でカウントし、ブロッキング緩衝液中に２ｘ１０6個のビーズ／ｍｌで再懸濁させ、使用準備を開始するまで光から保護しながら４℃で保存した。
【００８２】
ルミネックスビーズに共有結合したＩＧＦ−Ｒ１捕捉抗体の試験
ビーズ表面上の捕捉抗体の存在は、表面試験を用いて確認した。２５００個のビーズを含有するアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％（ｗ／ｖ）アジド）の５０μｌを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターボトルプレートウェル（マサチューセッツ州，ベッドフォード）に加えた。該ビーズは、該プレートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅバキュームマニフォールド（マサチューセッツ州，ベッドフォード）上に置いて液体を除去することによって洗浄し、続いて１００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ洗浄緩衝液中に再懸濁させた。最後に、洗浄緩衝液を真空によりウェルから除去し、ビーズを、アッセイ緩衝液で１／１００に希釈した１００μｌ／ウェルのＰＥ−ＧＡＭでインキュベートした。該プレートを、光から保護しながら９６ウェルプレートシェーカー（Ｌａｂ  Ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，イリノイ州，メルロースパーク）で３００ｒｐｍにて室温で３０分間インキュベートした。続いて、該ビーズを、１００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液を用いて真空濾過により３回洗浄し、１００μｌ／ウェルのアッセイ緩衝液中に再懸濁させた。少なくとも５０個のビーズ／ウェルのＭＦＩは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州，ハーキュリーズ）から入手したルミネックス100装置を用いて、Ｂｉｏｐｌｅｘ  ｍａｎａｇｅｒ  ４．１．１ソフトウェアを稼動して測定した。少なくとも２０，０００のＭＦＩを用いて、ビーズ表面上の抗体の使用可能な量の存在を確認した。
【００８３】
アッセイ内ＩＧＦ−Ｒ１ペプチド標準物質のルミネックスビーズに対する共有結合
ＩＧＦ１Ｒ［ＰＹＰＹ１１６２／１１６３］標準物質ペプチドは、２．５ｍｌのＰＢＳ中に凍結乾燥させたペプチドを再構成して１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度にすることによって調製した。最初の１０倍希釈は、後の１０倍希釈を用いて希釈緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で調製した。ホスホＩＧＦ１Ｒペプチドは、２工程のカルボジイミド法を用いて、４種類の異なる濃度でカルボキシル化ビーズの４種類の異なるセットの表面に共有結合させた。該ビーズセットは、１．２５ｘ１０7個のビーズをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１５Ｄ遠心機（ニューヨーク州，ウエストベリー）で１４０００ｘｇにて４℃で５分間遠心分離することによって洗浄した。該上澄み液を慎重に取り除き、ｐＨ４．８で８００μｌの０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（活性化緩衝液）を加えた。次いで、該ビーズを１５秒間ボルテックスにかけ、ＳＰＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）ＬＴＤ超音波洗浄機（アリゾナ州，スコッツデール）を用いて１５秒間超音波処理した。前記ビーズを活性化緩衝液でさらに洗浄し、活性化緩衝液で新たに調製した５ｍｇ／ｍｌのＥＤＣの２００μｌ中に再懸濁させた。ビーズを、光から保護しながら回転板で室温にて２０分間インキュベートした。ＥＤＣ工程の終了後、各ビーズを洗浄し、ＰＢＳで調製した１０ｍｇ／ｍｌの１０倍連続希釈から作成したホスホＩＧＦ１Ｒペプチドの１０００、１００、１０および１ｎｇ／ｍｌの各濃度で再懸濁させた。続いて、該ビーズは、光から保護した回転板中にて室温で１時間インキュベートした。前記ビーズを洗浄し、１ｍｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で、光から保護しながら回転板中にて室温で１時間インキュベートした。最後に、ビーズを血球計でカウントし、ブロッキング緩衝液中に２ｘ１０6個のビーズ／ｍｌで再懸濁させ、使用準備を開始するまで光から保護しながら４℃で保存した。
【００８４】
ＩＧＦ−Ｒ１ペプチド結合ルミネックスビーズの試験
ビーズ表面上のホスホＩＧＦ１Ｒペプチドの存在は、表面試験を用いて確認した。２５００個のビーズを含有するアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％（ｗ／ｖ）アジド）の５０μｌを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターボトルプレートウェル（マサチューセッツ州，ベッドフォード）に加えた。ビーズは、該プレートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅバキュームマニフォールド（マサチューセッツ州，ベッドフォード）上に置いて液体を除去することによって洗浄し、ビーズを１００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ洗浄緩衝液中に再懸濁させた。最後に、洗浄緩衝液を真空によりウェルから除去し、ビーズを、アッセイ緩衝液で希釈した１００μｌ／ウェルのウサギ抗ホスホＩＧＦ−Ｒ１抗体でインキュベートした。該プレートを、光から保護しながら９６ウェルプレートシェーカー（Ｌａｂ  Ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，イリノイ州，メルロースパーク）で３００ｒｐｍにて室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション工程後、該ビーズを４回洗浄し、１μｇ／ｍｌのフィコエリスリンで標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ抱合体の５０μｌ／ウェル中に再懸濁させ、光から保護しながらプレートシェーカーにて室温で２０分間インキュベートした。続いて、ビーズを、１００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液を用いて真空濾過により３回洗浄し、１００μｌ／ウェルのアッセイ緩衝液中に再懸濁させた。少なくとも５０個のビーズ／ウェルのＭＦＩは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州，ハーキュリーズ）から入手したルミネックス100装置を用いてＢｉｏｐｌｅｘ  ｍａｎａｇｅｒ  ４．１．１ソフトウェアを稼動して測定した。ホスホＩＧＦ１Ｒペプチド。
【００８５】
生物学的試料のＩＧＦ−Ｒ１アッセイ内分析
アッセイ内ルミネックスに基づくアッセイを用いる試料分析は、アッセイ緩衝液で調製した５０，０００個のビーズ／ｍｌの捕捉抗体懸濁液の５０μｌを、前もって湿らせたフィルターボトム９６ウェルプレートの各ウェルに加えることによって行った。該ビーズを真空濾過によりアッセイ緩衝液の１００μｌ／ウェルで洗浄した。捕捉ビーズは、希釈した試料または品質コントロール試料（ＱＣ）の５０μｌ中で２ウェルずつ再懸濁させ、光から保護しながらプレートシェーカーにて室温で１時間インキュベートした。該ビーズを４回洗浄し、項目２．２．３に記載のペプチドの４種類の異なるビーズセットの５０，０００個のビーズ／ｍｌの５０μｌ中で再懸濁させた。該ビーズを濾過し、１．０μｇ／ｍｌの抗ホスホＩＧＦ１Ｒレポーター抗体の５０μｌ／ウェル中に再懸濁させ、次いで、光から保護しながらプレートシェーカーにて室温で０．５時間インキュベートした。インキュベーション工程後、該ビーズを４回洗浄し、１μｇ／ｍｌのＰＥ−ヤギ抗ウサギＩｇＧの５０μｌ／ウェル中に再懸濁させ、光から保護しながらプレートシェーカーにて室温で２０分間インキュベートした。最後に、ビーズを４回洗浄し、アッセイ緩衝液の１００μｌ／ウェル中に再懸濁させた。１ウェルあたり少なくとも５０個のビーズのＭＦＩは、Ｂｉｏｐｌｅｘ  ｍａｎａｇｅｒ  ４．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カリフォルニア州，ハーキュリーズ）を稼動するＢｉｏｐｌｅｘルミネックス装置を用いて測定した。ホスホＩＧＦ−Ｒ１検量線内から作成した検量線を図６Ａに示す。アッセイ内４パラメータロジスティック曲線を用いた各々のＰＢＭＣ溶解試料中のホスホＩＧＦ１Ｒ濃度を図６Ｂに示す。
【００８６】
実施例５−Ａβペプチドの特徴付け
ペプチド
全てのペプチドは、凍結乾燥粉末として入手した。改変ペプチドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＧＳ）およびＡｎａｓｐｅｃ（ＡＮ）から入手した。これらのペプチドは、当業者に公知の固相法を用いて合成した（例えば、Barany, G. et al., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology - Special Methods in Peptide Synthesis, Part A, Vol. 2, pp. 3-284、Gross, E. et al., eds., Academic Press, New York, publ. (1980)；および Stewart, J.M. et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, publ. (1984)）。
【００８７】
ＧＳ１〜６およびＡＮ７ペプチドを入手し、ｄｄＨ2Ｏで１ｍｇ／ｍｌの濃度に再構成した。続いて、これらを、１．４ｍｌの空のチューブＰＰ、円形の（round）マトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ＃４２４９，ｌｏｔ１０３０５０９）中に１００μｌの一定分量ずつ分注した。全長Ａβ42ペプチドは、ＭＳＤ（ｌｏｔ＃Ｔ０３０８０Ｘ１）から購入した。このペプチドをＤＭＳＯで希釈して０．１ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した。続いて、これを１．４ｍｌの空のチューブ中に１００μｌの一定分量ずつ分注した。これらのペプチドは、保存用に−７０℃で凍結した。図１３は、改変Ａβ(1-42)ペプチドに導入したポリエチレングリコールスペーサーの構造を示す。
表５：Ａβペプチドの一覧
【表５】
2013518927.tif 000009
【００８８】
動的光散乱
新規なペプチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）は、乾燥粉末として入手し、２セットの保存試料は、１．８ｍｌのポリプロピレン管に少量（各々〜０．５ｍｇ）を量りとり、リン酸緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、９９．９％のＤ2Ｏ中で調製した；０．２μｍフィルターにより濾過した）中に溶解させることによって調製した。１つのセットは、１．０ｍｇ／ｍｌで調製し、もう１つのセットは、０．１０ｍｇ／ｍｌで調製し、室温で保存した。ペプチドを１分間ボルテックスにかけて溶解し、微量遠心機を用いて室温にて１，４０００ｒｐｍで５分間遠心した。Ａβ42試料（ＭＳＤ）については、０．１ｍｇのペプチドを含有するバイアルを１．０ｍｌの緩衝液中に懸濁させ、上記のように処理した。各遠心分離させた１．０ｍｇ／ｍｌの保存液の一定量（２００μｌ）を０．５ｍｌのポリプロピレン管に移し、ＮＭＲ分析にかけた。
【００８９】
全ての試料の吸収スペクトルは、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）ＮＤ−１００００装置を用いて記録し（２２０〜７５０ｎｍ）、緩衝液をブランクとした。動的光散乱分析は、Ｗｙａｔｔ  ＤＬＳ  ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダーを用いて３８４ウェルポリスチレンプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標），タイプ３５４０）中で上記ペプチドについて行った。データ収集および分析は、製造業者（ＤＹＮＡＭＩＣＳ，バージョン７．０．０．９４および７．０．１．１２）から入手したソフトウェアを用いて実行した。各ペプチドは、１ウェルあたり３０μｌを載せて３回ずつ評価し、蒸発を最少にするために５μｌのミネラルオイルで覆った。緩衝液ブランクもまた、対照用の分析として含ませた。プレートを載せ、透明な接着シールテープでプレートに蓋をし、該プレートを１０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。プレート上の各試料は、２５℃の温度を維持しながら、１試料につき５秒で３０回読み取った。データセットは、１．０ｍｇ／ｍｌおよび０．１０ｍｇ／ｍｌの両方の試料について２７日間にわたり収集した。接着カバーは、プレートリーダー内で試料を読み取るために取り外し、２７日間にわたる読み取りの間プレートを覆うために使用した。
【００９０】
図７Ａから７Ｆは、動的光散乱データを示す。図７において、全長Ａβ42ペプチドをＤＬＳ分析にかけ、４種類の代表的な改変ペプチドを比較した。全長ペプチドは、８２から２３１ｎｍ長である異なる凝集種の半径が算出された結果により、凝集することが示された。これは、溶液中で大きな分子量の凝集物となることを示す。しかしながら、改変ペプチドは、分子量ならびに半径の両方によって決定されるように単量体のままである。ＧＳ♯３は、凝集したままであったため、その他のペプチドと比較した（図７Ｅ）。これらの結果は、凝集ドメインを欠失している改変ペプチドが実際に溶液中で単量体のままであることを示す。図７ａは、全５種類のペプチドについて蓄積された生のデータを示す。時間に対する強度自己相関を示す。より高い強度自己相関数は、溶液中のペプチドのより大きい半径を示す。図７ｂ〜７ｆは、ペプチド半径に対するパーセント質量を示す。単量体ペプチドは、より小さい半径サイズでより大きいパーセント質量によって表されるであろう。より大きな凝集ペプチドは、大きい半径サイズでより小さいパーセント質量を有する。
表６：ＤＬＳデータの概要
【表６】
2013518927.tif 000010
【００９１】
円二色性
円二色性（ＣＤ）スペクトルは、Ａｖｉｖモデル２０２円二色性分光法を用いて収集した。試料を１ｍｍ層長の石英キュベット中にピペットで移し、２６０〜１８５ｎｍでスキャンした。データを収集するためのパラメータには、１．００ｎｍのスペクトルバンド幅、１．０ｎｍの刻み幅、１回あたり２０秒の平均時間、２５℃の温度設定が含まれる。試料を室温で石英キュベットに保存し、２３日間の一定期間にわたりスキャンした。生のデータをブランク緩衝液の寄与について補正し、波長に対してｍｄｅｇの形で表した。
【００９２】
図８は、円二色性分析を示す。円二色性分析は、全長Ａβ42および４種類の代表的なペプチドについて行い、これらのペプチドの規則性（order）および二次構造を決定した。図８に示されるように、全長ペプチドは、他のペプチドより規則的な構造を示す。４種類の代表的なペプチドは、全長ペプチドと比較して不規則なＣＤスペクトルを含有する。これらのデータにより、改変ペプチドは凝集することなく、または全長ペプチドより高い規則性の構造を形成していないことが示される。
【００９３】
ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡ
ビオチンで標識した抗Ｃ末端Ａβ42抗体（５６５〜２０μｇ／ｍｌ）は、３０μｌ／ウェルを加えることによって９６ウェルＭＳＤストレプトアビジンでコートしたプレートに固定化させた。次いで、プレートをカバーし、５００ｒｐｍで振蘯させながら２５℃で終夜インキュベートした。次いで、プレートを３００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ  ｃａｔ♯ＷＡ１２６）で３回洗浄した。洗浄後、２２５μｌ／ウェルでブロッキング緩衝液（ＰＢＳで１％  ＢＳＡ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）をプレートに加え、５００ｒｐｍで振蘯させて室温で３０分間インキュベートした。ブロッキング工程後、プレートを上記のように洗浄した。標準物質Ａβ42ペプチド（全長または改変ペプチド）をウェルに加えた。Ａβ42ペプチドは、固定化させた捕捉抗体によって捕捉した。Ａβ42のＮ末端に対して第２のルテニウムでタグを付けた（Ｒｕ）抗体（２６Ｄ６）を加え、これによりサンドイッチを完成させた。この複合体は、ＥＣＬを採用するＭＳＤセクター６０００装置で検出した。前記装置によって測定した生の蛍光単位（raw fluorescence unit）（ＲＦＵ）を４−パラメータロジスティックモデルに適合させて検量線を作成した。
【００９４】
図９は、ペプチド安定性データを示す。全長Ａβ42および７種類の改変ペプチドは、４０日間にわたり異なる温度で安定性実験にかけた（図９Ａ〜９Ｆ）。これらのペプチドを４℃、２５℃および３７℃で一定期間保ち、次いでアッセイを行うまで凍結させた。続いてペプチドを収集し、ＭＳＤ  Ｅｌｉｓａ法にかけた。結果は、０時間で測定した各ペプチドの基準シグナルのパーセントとして示す。実際、３７℃での短時間のインキュベーションを用いて、４℃および室温での分子の長期間の安定性が推定されている（Anderson et al., Clinical Chemistry, 37（3）: 398-402 （1991））。よって、短期間の分析のための３７℃でのペプチドのインキュベーションを用いて、ペプチドの長期間の安定性を測定することができる。図９に示されるように、全長Ａβ42ペプチドシグナルは、３７℃で１６時間のインキュベーションで劇的に低下し始める。対照的に、改変ペプチドは、測定した全ての温度で安定のままである。このデータにより、これらの改変ペプチドが全長Ａβ42より安定であることが示されうる。
【００９５】
図１０Ａ〜１０Ｉは、全長Ａβ42および７種類の改変ペプチドを６０日間にわたり異なる温度で安定性実験にかけた。これらのペプチドを２５℃および３７℃で一定期間保ち、次いでアッセイを行うまで凍結させた。続いて、ペプチドを収集し、ＭＳＤ  Ｅｌｉｓａ法にかけた。結果は、ペプチド濃度に対してシグナルをプロットする検量線として示す。図１０に示されるように、全長ペプチドは、２５℃および３７℃で検量線の減少を示した。対照的に、分析した全７種類のペプチドは、全ての時点および温度範囲で同様の曲線を示した（３７℃のみを示す）。これらの結果は、アッセイ再現性に関して標準物質として用いる場合、改変ペプチドが全長Ａβ42ペプチドより一貫したシグナルを供することを示す。
【００９６】
図１１は、全長と改変ペプチドの検量線分析を示す。全長Ａβ42および７種類の改変ペプチドを８点検量線について希釈し、ＭＳＤ  Ｅｌｉｓａ法にかけた。図１１に示すように、全てのペプチドがほぼ同一の検量線を生じた。この結果は、試料マトリックス中のＡβの算出について、改変ペプチドが全長ペプチドの代わりに用いることができることを示す。
【００９７】
図１２は、全長と改変ペプチドを用いたＣＳＦ試料分析を示す。全長Ａβ42および７種類の改変ペプチドを８点検量線について希釈し、１３個のＣＳＦ試料でＭＳＤ  Ｅｌｉｓａ法にかけた。各ＣＳＦ試料中のＡβ濃度は、各ペプチドの検量線に基づいて算出した。図１２に示されるように、ＣＳＦ試料中の逆算されたＡβ濃度は同等であり、検量線用に用いられたＡβペプチドとは無関係であった。このことは、Ａβレベルの算出に影響を与えることなくこれらのアッセイにおいて、これらの改変ペプチドが全長Ａβ42ペプチドの代わりに用いることができることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１０−９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年9月21日(2012.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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