(57)【要約】【課題】  特異性能が高く、プライマー二量体に構成しなく、設計が簡単で、遺伝子の表現量とＳＮＰと稀突然変異との測定に合せるプライマーを作る。【解決手段】プライマーに一本のオリゴヌクレオチドを有し、その５’末端と３’末端に別々３個から２０個までの塩基が存在され、適当な条件下で二本の鎖が互いに結合されて、プライマーが一個の環状構造に構築され、プライマーがターゲットシーケンスに識別されて且つ交雑される場合、二本の鎖が開けられ、環状構造を消して、ターゲットシーケンスの無存在場合、プライマーを焼戻すと、環状構造に自行的に構築される。プライマーの内部には通用のラベルシーケンスを持つか持てないかのもできる。通用のラベルシーケンスを持つプライマーが通用のラベルシーケンスのプライマーと一緒に二回目の増幅を行って、信号を拡大することができる核酸増幅を用いる環状プライマー及びその応用を提供する。【選択図】図１ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーに一本のオリゴヌクレオチドを有すことにおいて、当オリゴヌクレオチドの３’末端にターゲットシーケンスと相補するターゲットシーケンス識別区が設けられて、５’末端にターゲットシーケンス識別区と相補する３個から２０個までの塩基が設けられて、適当な条件下で、５’末端と３’末端が互いに二本の鎖に結合され、プライマーが一個の環状構造に構築されて、プライマーがターゲットシーケンスと識別されて且つ交雑される場合、二本の鎖が開けられ、環状構造を消し、プライマーが自身の二本の鎖からターゲットシーケンスと結合する二本の鎖まで変わってＤＮＡの延伸能力を得ることによって形成されていることを特徴とする核酸増幅を用いる環状プライマー。
【請求項２】
前記環状プライマーにはさらに一個の突然変異識別区を有すことによって形成されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅を用いる環状プライマー。
【請求項３】
前記突然変異識別区がターゲットシーケンス識別区の３’末端或いはターゲットシーケンス識別区の内部に位置されることによって形成されていることを特徴とする請求項２に記載の核酸増幅を用いる環状プライマー。
【請求項４】
前記プライマーシーケンスのなかには、少なくとも一個の非自然のヌクレオシドを有すことによって形成されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅を用いる環状プライマー。
【請求項５】
上流プライマーＦと下流プライマーＲが用いられることにおいて、その中に少なくとも一本のプライマーが環状プライマーに設けられ、当環状プライマーの３’末端がターゲットシーケンスと相補するターゲットシーケンス識別区に設けられ、５’末端がターゲットシーケンス識別区と相補する３個から２０個までの塩基に設けられて、適当な条件下で、５’末端と３’末端が互いに二本の鎖に結合され、プライマーが一個の環状構造に構築されて、プライマーがターゲットシーケンスと識別されて且つ交雑される場合、二本の鎖が開けられ、環状構造を消し、プライマーが自身の二本の鎖からターゲットシーケンスと結合する二本の鎖まで変わってＤＮＡの延伸能力を得ることによって形成されていることを特徴とする核酸が増幅させる方法。
【請求項６】
前記環状プライマーにはさらに一個の突然変異識別区を有すことによって形成されていることを特徴とする請求項５に記載の核酸が増幅させる方法。
【請求項７】
前記突然変異識別区がターゲットシーケンス識別区の３’末端或いはターゲットシーケンス識別区の内部に位置されることによって形成されていることを特徴とする請求項６に記載の核酸が増幅させる方法。
【請求項８】
前記プライマーシーケンスのなかに、少なくとも一個の非自然のヌクレオシドを有すことによって形成されていることを特徴とする請求項５に記載の核酸が増幅させる方法。
【請求項９】
プライマーに一本のオリゴヌクレオチドを有すことにおいて、当オリゴヌクレオチドの３’末端がターゲットシーケンスと相補するターゲットシーケンス識別区に設けられて、５’末端がターゲットシーケンス識別区と相補する３個から２０個までの塩基に設けられて、適当な条件下で、５’末端と３’末端が互いに二本の鎖に結合され、プライマーが一個の環状構造に構築されて、そして、プライマーの内部に一個の通用のラベルシーケンスが持てて、適当な条件下で、プライマーの３’末端が二本の鎖に形成され、プライマーの内部に環状構造が構築されて、プライマーがターゲットシーケンスと識別されて且つ交雑される場合、二本の鎖が開けられ、環状構造を消し、プライマーが自身の二本の鎖からターゲットシーケンスと結合する二本の鎖まで変わってＤＮＡの延伸能力を得ることによって形成されていることを特徴とする核酸増幅を用いる環状プライマー。
【請求項１０】
前記環状プライマーにはさらに一個の突然変異識別区を有すことによって形成されていることを特徴とする請求項９に記載の核酸増幅を用いる環状プライマー。
【請求項１１】
前記突然変異識別区がターゲットシーケンス識別区の３’末端或いはターゲットシーケンス識別区の内部に位置されることによって形成されていることを特徴とする請求項１０に記載の核酸増幅を用いる環状プライマー。
【請求項１２】
前記プライマーシーケンスのなかには、少なくとも一個の非自然のヌクレオシドを有すことによって形成されていることを特徴とする請求項９に記載の核酸増幅を用いる環状プライマー。
【請求項１３】
プライマーの総長さが３５ｂｐから８０ｂｐまでに設けられて、ターゲットシーケンス結合区が１６ｂｐから４０ｂｐまでに設けられて、通用のラベルシーケンスが１６ｂｐから３０ｂｐまでに設けられることによって形成されていることを特徴とする請求項９に記載の核酸増幅を用いる環状プライマー。
【請求項１４】
システムに三本のプライマーを有し、それぞれ、上流プライマーＦと下流プライマーＲと通用プライマーＴとに分かれて、そのなかに、上流プライマーＦと下流プライマーＲに少なくとも一本の環状プライマーを有し、当環状プライマーの３’末端がターゲットシーケンスと相補するターゲットシーケンス識別区に設けられて、５’末端がターゲットシーケンス識別区と相補する３個から２０個までの塩基に設けられて、適当な条件下で、５’末端と３’末端が互いに二本の鎖に結合され、プライマーが一個の環状構造に構築されて、上流プライマーＦと下流プライマーＲの内部に別々同じな通用プライマーが各一個持てて、適当な条件下で、環状プライマーの３’末端が自身に相補して二本の鎖に形成され、プライマーの内部に環状構造が構築され、プライマーがターゲットシーケンスと識別されて且つ交雑されると、二本の鎖が開けられ、環状構造を消し、プライマーが自身の二本の鎖からターゲットシーケンスと結合する二本の鎖までに変わってＤＮＡの延伸能力を得て、通用プライマーＴのシーケンスが上流プライマーＦと下流プライマーＲとのラベルシーケンスに完全に合わされることによって形成されていることを特徴とする環状プライマーで増幅させる方法。
【請求項１５】
前記環状プライマーにはさらに一個の突然変異識別区を有することによって形成されていることを特徴とする請求項１４に記載の環状プライマーで増幅させる方法。
【請求項１６】
前記突然変異識別区がターゲットシーケンス識別区の３’末端或いはターゲットシーケンス識別区の内部に位置されることによって形成されていることを特徴とする請求項１５に記載の環状プライマーで増幅させる方法。
【請求項１７】
環状プライマーの総長さが３５ｂｐから８０ｂｐまでに設けられて、ターゲットシーケンス結合区が１６ｂｐから４０ｂｐまでに設けられて、通用のラベルシーケンスが１６ｂｐから３０ｂｐまでに設けられることによって形成されていることを特徴とする請求項１４に記載の環状プライマーで増幅させる方法。
【請求項１８】
ラベルシーケンスＴの追加量がプライマーＦとプライマーＲとの総追加量の１０倍以上に設けられることによって形成されていることを特徴とする請求項１４に記載の環状プライマーで増幅させる方法。
【請求項１９】
増幅に以下のステップ：
予め変性に設けられる第一のステップ；変性とプライマー焼き戻しとプライマー延伸循環の第一部分のＰＣＲ増幅に設けられる第二のステップ；変性とプライマー焼き戻しとプライマー延伸循環の第二部分のＰＣＲ増幅に設けられる第三のステップ；を有し、
第二ステップの増幅の焼き戻し温度が６０℃から６６℃までに設定され、第三ステップの増幅の焼き戻し温度が５４℃から５８℃までに設定されることによって形成されていることを特徴とする請求項１４に記載の環状プライマーで増幅させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ボリメラーゼ連鎖反応［ＰＣＲ］に使う核酸増幅プライマーの設計と応用技術に関し、即ちリアルタイムのＰＣＲ反応中に応用して、特に突然変異の測定とまれな突然変異の測定の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ボリメラーゼ連鎖反応［ＰＣＲ］の技術は簡単にすばやく、高感度で、特異的な遺伝子が増幅される方法であり、その過程で２０個から５０個までの変性と焼き戻しと延伸との３つのステップによって構成される循環を有し、標的核酸配列が１．５時間から３時間までの間で特異的に１００万倍増幅される。近年来、リアルタイムのＰＣＲ測定器が出てくるので、普通のＰＣＲに対してゲル電気泳動分析を必要とせず、ＰＣＲ後の操作も不要とし、ＰＣＲの汚れが根絶される。それから、リアルタイムのＰＣＲの測定技術は臨床の上の応用はますます広くなる。リアルタイムの蛍光のＰＣＲ技術は昔に蛍光染料を使用し、例えばＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ、ＥＶＥ  ＧＲＥＥＮなどを使って、ＰＣＲの反応を示す。その後、リアルタイムのＰＣＲの測定技術にタグ蛍光の核酸ゾンデの応用が始まって、例えば、５’−エキソヌクレアーゼ技術にＴａｑｍａｎゾンデと分子の標識と蛍光エネルギー移転のプローブ［隣接のプローブ］とサソリプライマーと光プローブなどを使用する。染料方法は簡単だが、非特異的な増幅を識別することができず、特にプライマー二量体で起こる非特異的な増幅が識別されない。よって、実際の応用を大きく限定させてしまう。プローブ方法は増幅産物に対して第二の識別ステップを有するので、非特異的な増幅を避けることができ、その結果は更に信頼できる。しかし、プローブの設計が複雑し、合成のコストが高いという欠点がある。この二種類の方法の欠点は非特異的な増幅を十分に防ぐことができない。
【０００３】
まれな突然変異は大量の野生型の遺伝子の背景下できわめて少なく突然変異する遺伝子を表示し、特に単一塩基を突然変異する遺伝子である。一般に突然変異の遺伝子と野生型の遺伝子との比率が１／１０００以下である。例えば、妊婦の外周循環血液中には、胎児の突然変異の遺伝子が微量に含まれ、腫瘍患者の血液中或いは腫瘍組織中には、突然変異の腫瘍細胞が少量に含まれている。これらのまれな突然変異が精確に測定されるかどうかは現有の測定技術には挑戦的である。
【０００４】
ＰＣＲ方法には突然変異の測定に対す要点は標的遺伝子の配列によって一対の高厳格性及び標的遺伝子ＤＮＡ或いはＲＮＡに相補するプライマーが設けられるのである。増幅障害突然変異システム「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｇｒａｃｔｏｒｙ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＡＲＭＳ」の技術は１９８９年に創立して、等位遺伝子特異性ＰＣＲ「Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ，ＡＳ−ＰＣＡ」と呼ばれ、配列特異的なプライマーＰＣＲ「ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒｓ，ＰＣＲ−ＳＳＰ」とも呼ばれ、多い突然変異の測定方法に広く応用される。その基本構想は二本のＡＲＭＳ上流プライマーが設けられ、一本の下流プライマーを共用してＰＣＲ反応システムに構成されるものである。等位遺伝子特異性の塩基が３’末端に位置され、耐熱Ｔａｑ  ＤＮＡボリメラーゼに３’−５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性が不足するために、ＰＣＲ反応する時、プライマー３’の末端に位置する特異的塩基が別々野生型と突然変異との等位遺伝子の位点に結合され、この塩基対が誤って整合されると、ＤＮＡ鎖の延伸反応が３’−５’−リン酸ジエステル鎖に対する障害を構成するために妨げられる。しかし、ＡＲＭＳプライマー３’末端の塩基とは異なり、誤った整合の区別能力とは異なるため、ある突然変異の区別をする能力が限定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、核酸ＰＣＲ増幅に用いる新式プライマーに関する。当プライマーは設計構想上に現有プライマーと根本的に違って、巧みな設計によってプライマーの特異性を大きく向上させる。このプライマーは高特異性、プライマー二量体に形成せず、簡単な設計で合成し易く、遺伝子の表現量とＳＮＰと稀突然変異との測定に合わせるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のプライマーにはニ種類ある。一種類が単な増幅プライマーであり、遺伝子の通用増幅に用いられて、もう一種類が二重増幅機能を持つ環状プライマーであり、突然変異の測定システムに合わせ、特に突然変異の測定とまれな突然変異の測定システムに適用する。
【０００７】
本発明の中には、単な増幅プライマーに関する技術はターゲット核酸の直接交雑に基づき、当プライマー５’端にプライマー３’端と相補されるシーケンスを有するので、一個の環状構造に構築されて、環状構造を容易に開け、ターゲットシーケンスの増幅効率に影響しない。突然変異シーケンスに対す塩基がプライマー３’末端にもプライマー内部にも存在され、環状シーケンスの数量が異なるシーケンスに基づいて調整されて、プライマーが突然変異シーケンス識別に対す特異性が調整される。
【０００８】
本発明の中の二重増幅環状プライマーにおいて、プライマーの内部に一端の通用ラベルシーケンスが引き入れて、ラベルシーケンスと環状プライマーが一定的な比例に基づいて「ラベルシーケンスが一般に環状プライマーの用量の１０倍以上になる。」、同時にＰＣＲ増幅システムに加入し、ＰＣＲサイクルの前２つのサイクルに、環状プライマーが高特異的に突然変異ターゲットシーケンスに識別されて初期増幅されてから、第三のサイクルを始まって、ラベルプライマーが大量に存在するために、ラベルプライマーが大量増幅されて初期に蓄積する特異的なＰＣＲ産物が急速に増幅して拡大されて、まれな突然変異ターゲットシーケンスに対す極めて高い特異性と極めて高い感度が保持される。
【０００９】
これによって、本発明の環状プライマーがリアルタイムＰＣＲ中のターゲット核酸を検出するのに用いられる。
【００１０】
本発明のゾンデに使わせるヌクレオチドがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、或いはＰＮＡ、或いは任意な非自然ヌクレオシドで構成される。
【００１１】
本発明は環状プライマー技術の応用にも関する。
【００１２】
本発明は核酸にＰＣＲ増幅される新式プライマーに関する。当プライマーを一本のオリゴヌクレオチドに設けられて、当オリゴヌクレオチドの５’端と３’端に別々３個から２０個までの互いに相補する塩基が存在されて、一定の条件下で、互いに結合されて二本の鎖に形成されて、プライマーが一個の環状構造に構築されて、突然変異の識別に対して３’端の第一塩基にもプライマーの内部にも放置される。一定の条件下で、プライマー３’端が二本の鎖に形成されて、プライマーの内部が一個の環状構造に構築されて、プライマーがターゲットシーケンスと識別されて且つ交雑されると、二本の鎖が開けられ、環状構造を消し、プライマーが自身の二本の鎖からターゲットシーケンスと結合する二本の鎖まで変わってＤＮＡの延伸能力を得る。ターゲットシーケンスが存在しない時、プライマーが焼き戻すと、自分で環状構造に構築されて、３’末端に二本の鎖に形成されて、プライマー３’端のＤＮＡ延伸能力を閉じて、非特異増幅を特にプライマープライマー二量体を産生することができない。図１ａと図１ｂを参照。
【００１３】
図１ａを示すように、単な増幅環状プライマーの本発明システムに二本のプライマーを有し、それぞれ、単な増幅環状上流プライマーＦと単な増幅環状下流プライマーＲに分ける。本例の中の単な増幅環状上流プライマーＦが３つの異なる機能の区域３１、区域３２、区域３３から組成されて、その中、区域３１がターゲットシーケンス識別区と呼べて、区域３２が突然変異識別区と呼ばれ、突然変異識別区が３’端に或いは３’端から遠い位置に設計され、まれな突然変異の異なるタイプに基づいて決められて、区域３３が相補識別区と呼べる。例の中の単な増幅環状下流プライマーＲが２つの異なる機能の区域３４、区域３５から組成されて、その中、区域３４がターゲットシーケンス識別区と呼べて、区域３５が相補識別区と呼べる。
【００１４】
図１ｂを示すように、本発明設計するプライマー単な増幅突然変異のターゲットシーケンスを利用して、普通ＳＮＰの検出及び普通ＰＣＲの検出及び多重ＰＣＲの検出に起因するプライマーニ量体の悩みを首尾良く解決している。一般的な状況下で上流プライマーと下流プライマーが皆環状構造に構築されて、プライマーニ量体の形成を避けて、高温変性する時のみ、環状を開けて、焼き戻すと、ターゲットシーケンスと結合されて、図のように単なる増幅環状上流プライマーが焼き戻す時に突然変異を持つターゲットシーケンス４１と結合されて、単なる増幅環状下流プライマーがターゲットシーケンス４２と結合されて延伸してから産物４３と産物４４を得る。産物４３のシーケンスが単な増幅環状下流プライマーのターゲットシーケンスに形成されて、単なる増幅環状下流プライマーが産物４３のシーケンスと結合されて延伸してから目標産物４５を得る。
【００１５】
本発明は、遺伝子突然変異を、特にまれな突然変異を用いて、ＰＣＲ検出及びリアルタイムＰＣＲ検出を実施する新式プライマーに関する。当プライマーが一本のオリゴヌクレオチドに設けられ、当オリゴヌクレオチドの５’端と３’端に別々３個から２０個までの塩基が存在し、一定の条件下で、互いに二本の鎖に結合され、プライマーが一個の環状構造に構築されて、且つプライマーの内部に通用ラベルシーケンスを持って、突然変異の識別に対して３’端の第一塩基にもプライマーの内部にも放置される。一定の条件下で、プライマー３’端が二本の鎖に形成され、プライマーの内部が一個の環状構造に構築され、プライマーがターゲットシーケンスと識別されて且つ交雑されると、二本の鎖が開けられ、環状構造を消し、プライマーが自身の二本の鎖からターゲットシーケンスと結合する二本の鎖まで変わってＤＮＡの延伸能力を得る。ラベルシーケンスと環状プライマーが一定的な比例に基づいて「一般的にラベルシーケンスが環状プライマーの用量の１０倍以上に設けられる。」、同時にＰＣＲ増幅システムに存在されて、ＰＣＲサイクルの前２つのサイクルに、環状プライマーが突然変異ターゲットシーケンスに高特異的に識別されて初期増幅されてから、第三のサイクルを始まって、ラベルプライマーが大量に存在するために、ラベルプライマーが大量に増幅されて初期に蓄積する特異的なＰＣＲ産物が急速に増幅して拡大されて、まれな突然変異ターゲットシーケンスに対す極めて高い特異性と極めて高い感度が保持される。ターゲットシーケンスが存在しない場合、プライマーが焼き戻すと、自分で環状構造に構築されて、３’末端に二本の鎖に形成されて、プライマーの３’端のＤＮＡ延伸能力を閉じて、非特異増幅を特にプライマープライマー二量体を産生することができない。突然変異ポイントのシーケンス識別に対してターゲットシーケンスの特徴に基づいて識別サイトが３’末端にもプライマーの内部にも放置される。プライマー特異性の強弱がプライマー自身の３’端に位置する二本鎖の区域の長さによって調整されて、ターゲットシーケンスに一個または複数個のプライマーとマッチングしない塩基が存在する場合、プライマー自身の環状構造が開けられず、プライマー３’末端に位置する二本鎖の構造がまだ形成されて、プライマー３’末端のＤＮＡの延伸能力も閉じるので、増幅されない。図２ａと図２ｂを参照。
【００１６】
（環状プライマーの構築）
本発明の環状プライマーには二種類のプライマーの設計を有して、それぞれ、異なるニーズに対して、一種類が単な増幅環状プライマーに設計され、普通の遺伝子増幅に応用され、プライマー二量体が排除されて、もう一種類が二重増幅環状プライマーに設計され、まれな突然変異を高特異的に検出するのに応用される。
【００１７】
単な増幅環状プライマーにおいて、当プライマーが一本のオリゴヌクレオチドに設けられ、当オリゴヌクレオチドの５’端と３’端に別々３個から２０個までの塩基が存在されて、一定の条件下で、互いに結合されて二本の鎖に形成されて、プライマーが一個の環状構造に構築されて、一定の条件下で、プライマー３’端が二本の鎖に形成されて、プライマーの内部が一個の環状構造に構築されて、プライマーがターゲットシーケンスと識別されて且つ交雑されると、二本の鎖が開けられ、環状構造を消し、プライマーが自身の二本の鎖からターゲットシーケンスと結合する二本の鎖まで変わってＤＮＡの延伸能力を得る。ターゲットシーケンスが存在しない時、プライマーが焼き戻すと、自分で環状構造に構築されて、３’末端に二本の鎖が形成されて、プライマー３’端のＤＮＡ延伸能力を閉じて、非特異増幅を特にプライマープライマー二量体を産生することができない。図１ａと図１ｂを参照。
【００１８】
二重増幅環状プライマーにおいて、当プライマーが一本のオリゴヌクレオチドに設けられ、当オリゴヌクレオチドの５’端と３’端に別々３個から２０個までの塩基が存在されて、一定の条件下で互いに二本の鎖に結合されて、プライマーが一個の環状構造に構築されて、且つプライマーの内部に通用ラベルシーケンスを持って、一定の条件下でプライマー３’端が二本の鎖に形成されて、プライマーの内部が一個の環状構造に構築されて、プライマーがターゲットシーケンスと識別されて且つ交雑されると、二本の鎖が開けられ、環状構造を消し、プライマーが自身の二本の鎖からターゲットシーケンスと結合する二本の鎖まで変わってＤＮＡの延伸能力を得る。ラベルシーケンスと環状プライマーが一定的な比例に基づいて「一般的にラベルシーケンスが環状プライマーの用量の１０倍以上に設けられる。」、同時にＰＣＲ増幅システムに存在されて、ＰＣＲサイクルの前２つのサイクルに、環状プライマーが突然変異ターゲットシーケンスに高特異的に識別されて初期増幅されてから、第三のサイクルを始まって、ラベルプライマーが大量に存在するために、ラベルプライマーが大量に増幅されて初期に蓄積する特異的なＰＣＲ産物が急速に増幅されて拡大されて、まれな突然変異ターゲットシーケンスに対す極めて高い特異性と極めて高い感度が保持される。ターゲットシーケンスが存在しない場合、プライマーが焼き戻すと、自分で環状構造に構築されて、３’末端に二本の鎖に形成されて、プライマーの３’端のＤＮＡ延伸能力を閉じて、非特異増幅を特にプライマープライマー二量体を産生することができない。突然変異ポイントのシーケンス識別に対してターゲットシーケンスの特徴に基づいて識別サイトが３’末端にもプライマーの内部にも放置される。プライマー特異性の強弱がプライマー自身の３’端に位置する二本鎖の区域の長さによって調整されて、ターゲットシーケンスに一個または複数個のプライマーとマッチングしない塩基が存在する場合、プライマー自身の環状構造が開けられず、プライマー３’末端に位置する二本鎖の構造がまだ形成されて、プライマー３’末端のＤＮＡの延伸能力も閉じるので、増幅されない。図２ａと図２ｂを参照のこと。
【００１９】
図２ａを示すように、伝統的なまれな突然変異検出に対して設計したプライマーが不十分なことに鑑みて、本発明はまれな突然変異に基づいてプライマーが設けられる方法を創造的に提示する。図２によって、本発明システムの中に三本のプライマーを有して、それぞれ、二重増幅環状上流プライマーＦと、二重増幅環状下流プライマーＲと、通用プライマーＴに分ける。本例の中の二重増幅環状上流プライマーＦが４つの異なる機能の区域１１、区域１２、区域１３、区域１４から組成され、その内、区域１１がターゲットシーケンス識別区と呼ばれ、区域１２が突然変異識別区と呼ばれ、突然変異識別区が３’端に或いは３’端から遠い位置に設計され、まれな突然変異の異なるタイプに基づいて決められて、区域１３がラベルシーケンスと呼ばれ、区域１４が相補シーケンスと呼べる。例の中の二重増幅環状下流プライマーＲが３つの異なる機能の区域１３、区域１５、区域１６から組成されて、その中、区域１３がラベルシーケンスと呼ばれ、それが二重増幅環状上流プライマー中の区域１３のシーケンスと同じ、区域１５がターゲットシーケンス識別区と呼ばれ、区域１６が相補シーケンスと呼べる。本例の中の通用プライマーＴが二重増幅環状上流プライマーＦ及び二重増幅環状下流プライマーＲ中の区域１３のラベルシーケンスと完全にマッチングされる。
【００２０】
図２ｂを示すのは、本発明に基づいて設計したプライマー二重増幅のまれな突然変異のターゲットシーケンスである。増幅には２つの段階を有し、第一段階の増幅中でまれな突然変異を初期に含むターゲットシーケンスが二重増幅環状上流プライマーＦ及び二重増幅環状下流プライマーＲの存在下に、高い焼戻し温度下に位置し、当段階のよい焼戻し温度が６０℃から６６℃までに設定される。この温度下に、通用プライマーＴに対してＴｍ値が低いために、整合されなくて、二重増幅環状上流プライマーＦ及び二重増幅環状下流プライマーＲがターゲットシーケンス２１、２２と高特異的に整合される。延伸してからシーケンス２３と２４を得て、シーケンス２３が高い焼戻し温度下に二重増幅環状下流プライマーＲに整合させて、延伸してからシーケンス２５を得て、まれな突然変異のシーケンスを蓄積するのに実現する。高い温度で焼き戻すので、プライマーがターゲットシーケンスと結合される効率を下げて、この段階の蓄積が高い効率の指数的な蓄積に達成されない。
【００２１】
本発明第二段階の増幅中に通用プライマーＴを使用して、第一段階の増幅中に蓄積されるまれな突然変異シーケンス２５の３’端に通用プライマーＴと整合するシーケンスを持って、わりに低い焼戻し温度下に位置し、当段階のよい焼戻し温度が５４℃から５８℃までに設定される。この焼戻し温度下に、通用プライマーＴがまれな突然変異シーケンス２５と高い効率的に結合されて、延伸してからまれな突然変異を持つシーケンス２６を得て、シーケンス２５と２６が同時に通用プライマーＴに整合させて、指数的な増幅に達成され、最終に突然変異を持つシーケンス２７が多く得て、まれな突然変異シーケンスの増幅に実現する。
【００２２】
（環状プライマーの設計方法）
ターゲットシーケンスと組み合わせる結合区のＴｍ値において、プライマー中にターゲットシーケンスと特異的に結合される区域のＴｍ値が普通プライマーのＴｍ値を保持して、ターゲットシーケンスのＧＣ含有量に基づいて決められ、一般的にＴｍ値が約５５℃から６５℃までに設定される。増幅時の焼戻し温度がプライマーのＴｍ値と一致するか、あるいはプライマーのＴｍ値よりも３℃から５℃までに低くすることもできる。
【００２３】
内部二本鎖の結合区域のＴｍ値において、ほとんどの場合、プライマーの相補塩基が３ｂｐから２０ｂｐまでに設けられ、そのＴｍ値が増幅プライマーのＴｍ値と相当されてまたは焼戻し温度の２℃から５℃までより高く設定される。本発明一部分の実施例の試験結果に基づいて、単な塩基突然変異を区別して検出するリアルタイムＰＣＲの環状プライマー相補区Ｔｍ値が焼戻し温度の３℃から５℃までより高いことが出来る。まれな突然変異を検出するプライマーとして、二本鎖結合部分のＴｍ値が焼戻し温度の５℃から１２℃までより高いことが出来る。
【００２４】
突然変異識別塩基の位置において、正常ポイントの突然変異などのターゲットシーケンスに対し、突然変異識別ポイントが３’末端の第一個の塩基に位置されて、欠落と挿入の突然変異に対し、３’末端のいくつかの連続性の塩基に設けられて、ターゲット遺伝子突然変異ポイントの近く距離に出現可能の多種の他の似る突然変異に対し、突然変異識別塩基が正常にプライマーの内部に放置されて、プライマーの３’末端の第一個の塩基に位置されない。
【００２５】
プライマーの長さにおいて、プライマーの総長さが２０ｂｐから８０ｂｐまでに設けられて、ターゲットシーケンス結合区が１６ｂｐから４０ｂｐまでに設けられて、プライマー内部の相補区即ち二本の鎖結合区の５’端と３’端がそれぞれ３ｂｐから２０ｂｐまでに設けられて、環状区域の長さが約５ｂｐから６０ｂｐまでに設けられて、通用ラベルシーケンスが約１６ｂｐから３０ｂｐまでに設けられる。
【００２６】
非自然ヌクレオチドの使用において、いかなる非自然ヌクレオチド例えばＬＮＡとＰＮＡが皆プライマーの任意な位置に用いられる。
【００２７】
環状プライマーの最適な検出構造において、環状プライマーがリアルタイムＰＣＲ中に特異ターゲットシーケンスの増幅検出に応用される。環状プライマーに適用する現有のリアルタイムＰＣＲ装置には、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ「ＡＢＩ」会社の７３００または７５００または７７００と、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のＩＱ  Ｃｙｃｌｅｒと、Ｒｏｃｈｅ社のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０と、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ３０００または６０００と、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社のＭＸ３０００ＰまたはＭＸ３００５Ｐ等と、を有す。
【００２８】
（環状プライマーの積極的な効果）
簡単な設計において、環状プライマーを設ける際にたいしてあまり要求せず、プライマーの３’端シーケンスがターゲットシーケンス増幅の一部分に設けられ、５’端に位置する幾つかの塩基がプライマーの３’端シーケンスと相補され、ラベルシーケンスがプライマーの内部に追加されるか追加されないかを決定でき、突然変異識別塩基が３’末端の第一個の塩基にもプライマー内部に位置され、ただ、プライマー二本鎖結合区のＴｍ値が相応のＰＣＲ反応システム中に使う焼戻し温度と一致保持される、または抜きんでられるのみである。ＰＣＲプライマーを設計した人には誰でも設けられる。
【００２９】
プライマー二量体の無産生において、ＰＣＲのあらかじめ変性温度が変性温度まで上昇する前、プライマー自身の二本鎖が結合されるために、プライマーＤＮＡ延伸の機能が閉じられ、後ろのＰＣＲサイクルの中に、一定の焼戻し温度の下で、ターゲットシーケンスと結合されないプライマーが自身の二本鎖結合の成り行きで更に先行して二本鎖が結合され、もう一本のプライマーと二本鎖に構成されないから、プライマー二量体が増幅されてこない。
【００３０】
特異性が高いことにおいて、当プライマーに自身で反対方向と相補する一個の二本鎖構造が存在するために、ただ、ターゲットシーケンスとプライマーとの結合区の結合力が反対方向相補の二本鎖の結合エネルギーより大きいと、プライマーがターゲットシーケンスと交雑され、環状構造が開け、プライマーのＤＮＡ延伸の機能が得る。もしターゲットシーケンス中にプライマーと合わない塩基を存在すれば、例えば合わない単な塩基を存在すれば、合わない位置がいかなる３’末端またはプライマーの内部に位置されても、当プライマーが自分の環状構造の安定性に優先的保持され、プライマーのＤＮＡ延伸の機能が閉じられる。また、自身で反対方向と相補する一個の二本鎖構造が存在するために、設計時に相補区域の長さが調節されるので、プライマーの特異性が調整される。まれな突然変異にたいして、大量の野生型ＤＮＡ背景の体細胞変異に直面すれば、当プライマーが更にその特異性に保証される。しかし、プライマーの３’末端からのシーケンス特異性は相補シーケンスの競争を同時に受ける状態を除く。
【００３１】
感度が高いことにおいて、二重増幅環状プライマーに通用ラベルシーケンスを有すために、ターゲットシーケンスに対して二回目の拡大ができる。モデル中のまれな突然変異ＤＮＡに対して自身の含有量が低く、突然変異プライマーが大量の野生型ＤＮＡ背景の体細胞変異に直面するので、その増幅効率が低い。しかし、ただ１つのコピーが増幅されてくると、システムの中に存在する高濃度なラベルプライマーがこのターゲットシーケンスに高率的速めに増幅されて拡大する。
【００３２】
多重のＰＣＲシステムに合うことにおいて、プライマーの自身で極めて高い特異性が保証されるので、プライマー二量体を無産生して、且つラベルシーケンスを持って、２つのラウンドの初期増幅を通った後、全ての増幅産物が全部に同じベルシーケンスで増幅され、各プライマーに増幅効率の差が存在するまたはプライマーが互いに影響される問題を存在しないから、非常に多重のＰＣＲシステムに合って、いくつかの多遺伝子が相対的な定量に表現される検出システムに適合する。
【００３３】
密集する突然変異区に単な突然変異が精確に増幅されることにおいて、研究者に興味を与える突然変異の遺伝子区域に対して、多くの場合、同時にいくつかの研究と関係しない突然変異タイプが密集に発生されて、このタイプの突然変異が研究者に興味を与える突然変異とよく似て、常に特異塩基をプライマーの３’末端に放置するＡＲＭＳプライマー方法で交叉反応が発生し易く、二重増幅環状プライマーにたいして特異塩基をプライマーの内部に放置してもと多いターゲットシーケンス区域を覆い、このように、増幅の正確性が保証される。図６を参照。
【００３４】
合成が易いことにおいて、いかなる特別の装置が要らなく、普通のＤＮＡ合成装置で合成が完成できる。
【００３５】
適用範囲が広いことにおいて、それは豊富な集区ＡＴと豊富な集区ＧＣの困難モデル、及びポイント突然変異、及び欠失突然変異、及び挿入突然変異に対して皆よい応用性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１ａ】単な増幅環状プライマーを示す図である。
【図１ｂ】単な増幅環状プライマーがＰＣＲサイクル検出時の反応原理を示す図である。
【図２ａ】二重増幅環状プライマーを示す図である。
【図２ｂ】二重増幅環状プライマーがＰＣＲサイクル検出時の反応原理を示す図である。
【図３】環状プライマーが染料法に応用されるリアルタイムＰＣＲ検出システムを示す図である。（実施例１）
【図４】環状プライマーがゾンデと結合されてリアルタイムＰＣＲ検出してモデルが十倍希釈されるのを示す図である。（実施例２）
【図５ａ】環状プライマーがＳＮＰに対す区分機能を示す図である。（実施例３）
【図５ｂ】環状プライマーがＳＮＰに対す区分機能を示す図である。（実施例３）
【図５ｃ】環状プライマーがＳＮＰに対す区分機能を示す図である。（実施例３）
【図５ｄ】環状プライマーがＳＮＰに対す区分機能を示す図である。（実施例３）
【図６】二重増幅環状プライマーが密集突然変異区に用いる単一まれな突然変異の精確な増幅を示す図である。（実施例４）
【発明を実施するための形態】
【００３７】
実施例１  環状プライマーは染料法リアルタイムＰＣＲに使ってシロイヌナズナＳＵＣ２遺伝子を検出している。
【００３８】
環状プライマーがリアルタイムＰＣＲシステムに応用されてプライマー二量体を産生する状況を考察するために、シロイヌナズナＳＵＣ２遺伝子に対す一対のプライマーが設けられて、増幅フラグメントの長さが１００ｂｐに設けられる。シロイヌナズナの葉の組織から抽出するＤＮＡがＰＣＲモデルに設けられる。反応システムの総体積が５０μｌに設けられ、それには５０μｌ１０×ｂｕｆｆｅｒ  「１６０  ｍＭ  ［ＮＨ４］２ＳＯ４，６７０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ８．８，ａｎｄ  ０．１％  ｗ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０」、１．５μｌ  ２５  ｍＭ  ＭｇＣＬ２、各種のｄＮＴＰ  ４００μΜ、上下流プライマー０．４μΜ、Ｅｖｅ  Ｇｒｅｅｎ  ０．５μｌ、１．０  Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡボリメラーゼ、５μｌモデルＤＮＡを含む。リアルタイムＰＣＲ反応がＲｏｔｏｒＧｅｎｅ  ３０００のリアルタイムＰＣＲ装置で実施される。反応条件には、９６℃の予め変性が３ｍｉｎに、９４℃が３ｍｉｎに、９４℃が１５ｓに、５５℃が２０ｓ「ＦＡＭ蛍光信号を検出する」に、７２℃が１５ｓに、設置されて、共に３５個のサイクルを有し、そうしたら、溶解曲線の分析を行う。Ｈ２Ｏが陰性対照とする。環状プライマーには増幅産物と相補される一段の核酸シーケンスを含む。上流プライマーには、５’−ＡＡＣＣＡＧＣＴＣＡＴＣＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＴ−３’、下流プライマーには、５’−ＡＴＣＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＧＧＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＴＧＡＴ−３’、プライマー５’端と３’端に下線を持って示す塩基がゾンデ中の二本鎖結合区の塩基を形成するのに参加される。
【００３９】
ＰＣＲ増幅の場合、蛍光リアルタイム検出には３５個のサイクルが測定されて、溶解曲線の分析を行って、その結果は図３に示すようなものである。
【００４０】
図３に示すように、ａは本発明の方法に基づいて設けるプライマー及び伝統の方法に基づいて設けるプライマーが染料で蛍光ＰＣＲ増幅されるＮＴＣ「空白の対照」の結果である。ライン５１は伝統の方法に基づいて設けるプライマーが増幅されるＮＴＣの結果であり、プライマー二量体が多く形成されるのをはっきり見える。ライン５２は本発明の方法に基づいて設けるプライマーが増幅されるＮＴＣの結果であり、明らかに本発明の方法に基づいて設けるプライマーがプライマー二量体に有効に減少されて、必要ない増幅を避ける。
【００４１】
図３ｂに示すのは本発明の方法に基づいて設けるプライマーが染料で蛍光ＰＣＲ増幅されてからの溶解曲線の分析結果である。伝統の方法で設けるプライマーにプライマー二量体が形成されるために、溶解曲線で分析する時に２つのピークが形成される。本発明の方法に基づいて設けるプライマーが増幅される時にただ１つの産物ピークが形成される。
【００４２】
実施例２、環状プライマーがゾンデと結合されることでリアルタイムＰＣＲ定量的Ｂ型肝炎ウイルスの検出に用いる。
【００４３】
環状プライマーがリアルタイムＰＣＲシステム中に応用される有効性を考察するために、ＰＣＲモデルが一連に希釈する標準ＤＮＡサンプルに設けられる。反応システムの総体積が５０μｌに設けられ、それには５０μｌ１０×ｂｕｆｆｅｒ  「１６０  ｍＭ  ［ＮＨ４］２ＳＯ４，６７０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ８．８，ａｎｄ  ０．１％  ｗ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０」、１．５μｌ  ２５  ｍＭ  ＭｇＣＬ２、各種のｄＮＴＰ  ４００μΜ、上流と下流プライマー０．４μΜ、ゾンデ０．１μΜ、１．０  Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡボリメラーゼ、５μｌモデルＤＮＡを含む。リアルタイムＰＣＲ反応がＲｏｔｏｒＧｅｎｅ  ３０００のリアルタイムＰＣＲ装置で実施される。反応条件には、９４℃が５ｍｉｎに、その後９４℃の変性が１５ｓに、５８℃が２５ｓに、７２℃の延伸が１５ｓに、設置されて、共に１０個のサイクルを有し、９４℃が１５ｓに、５８℃が２０ｓ「ＦＡＭ、蛍光信号を検出する」に、７２℃が１５ｓに、設置されて、共に３５個のサイクルを有す。標準ＤＮＡが１０倍勾配に連続希釈されて、Ｈ２Ｏが陰性対照とする。環状プライマーには増幅産物と相補される一段の核酸シーケンスを含む。上流と下流プライマーには、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ区遺伝子「ＮＣ−００３９７７」が増幅され、１７ｂｐが増幅される。その上流プライマーには、５’−ＧＧＴＣＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡＣＣ−３’、下流プライマーには、５’−ＣＡＡＣＣＴＣＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＴＧ−３’、ゾンデのターゲットシーケンスが上流プライマーに近い、シーケンスがＦＡＭ−５’−ＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣ−３’−ＢＨＱに設けられる。プライマー５’端と３’端に下線を持って示す塩基がプライマー中の二本鎖結合区の塩基を形成するのに参加される。
【００４４】
ＰＣＲ増幅する場合、蛍光リアルタイム検出に３５個のサイクルが測定され、その結果、図４のように示す。初めるターゲット濃度には希釈物の高濃度に位置するライン８１、ライン８２、ライン８３、ライン８４でモデルが１０倍に連続希釈される３つの勾配後の蛍光曲線をそれぞれ表示している。
【００４５】
実施例３  リアルタイムＰＣＲ中に環状プライマーでＳＮＰが検出される。
【００４６】
人類の同種の抗原血小板異形「ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ，ＨＰＡ」のＨＰＡ−４遺伝子を選択して、当遺伝子の中に一個のＧ＞Ａの突然変異が存在するために、ＨＰＡ−４ａと  ＨＰＡ−４ｂとの２つの血小板抗原が産生されて、ＨＰＡ−４ａが野生形に表示され、ＨＰＡ−４ｂが突然変異形に表示される。２つの抗原の遺伝子シーケンスに対してそれぞれダブルループゾンデに設計され、二個のゾンデの間に一個の塩基の差が設けられて、また典型的な三個の既知の遺伝子型のサンプルを選択して試験される。一個がホモ接合体のＨＰＡ−４ａサンプルに表示され、一個がホモ接合体のＨＰＡ−４ｂサンプルに表示され、一個がヘテロ接合体サンプルに表示され、皆ＨＰＡ−４ａと  ＨＰＡ−４ｂを同時に含む。試験する場合、同時に無「陰性」サンプル即ちＨ２Ｏ対照を作る。野生形ＨＰＡ−４ａプライマーシーケンスが５’−  ＣＧＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＴＧＣＧ−３’に設けられ、突然変異形ＨＰＡ−４ｂプライマーシーケンスが５’−  ＣＧＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＴＧＣＡ−３’に設けられ、下線を持つ塩基が突然変異塩基に設けられ、外フレームを持つ塩基がリング結合区塩基に設けられる。通用下流プライマーが５’−ＴＧＣＣＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣ−３’に設けられる。
【００４７】
反応が二個のＰＣＲから構成されて、一個に野生形プライマーが含め、一個に突然変異形プライマーが含める。反応総体系が２５μｌに設けられ、それには２．５μｌ  １０×ｂｕｆｆｅｒ  「１６０ｍＭ  ［ＮＨ４］２ＳＯ４、６７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ８．８，ａｎｄ  ０．１％  ｗ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０」、１．５μｌ  ２５  ｍＭ  ＭｇＣＬ２、各種のｄＮＴＰ  ４００μΜ、各種のプライマー０．４μΜ、Ｅｖｅ  Ｇｒｅｅｎ  ０．５μｌ、１．０  Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡボリメラーゼ、２０ｎｇモデルＤＮＡを含む。リアルタイムＰＣＲ反応がＲｏｔｏｒＧｅｎｅ  ３０００のリアルタイムＰＣＲ装置で実施される。反応条件には、９６℃の予め変性が２ｍｉｎに、その後９６℃の変性が１５ｓに、６８℃−５９℃「一回の循環ごとに１℃の温度が下がる」が１５ｓに、７２℃の延伸が１５ｓに、設置されて、共に１０個のサイクルを有し、９４℃が３ｍｉｎに、９４℃が１５ｓに、５８℃が２０ｓ「ＦＡＭ蛍光信号を検出する」に、７２℃が１５ｓに、設置されて、共に３５個のサイクルを有する。
【００４８】
図５でリアルタイム蛍光ＰＣＲにＳＮＲの分析を行う循環結果データを示し、二個のＰＣＲから構成されて、一個が野生形に対応し、一個が突然変異形に対応する。野生形ターゲットプライマー増幅に対す結果が実芯正方形で表示され、異なる種の突然変異に対す結果が実芯リングで表示される。
【００４９】
陰性サンプルに対して、野生形プライマー「曲線６１」及び突然変異形プライマー「曲線６２」には皆増幅産物が存在されない。結果ではモデルが反応の中に含まれるのみ、相応的な増幅が発生される。二個のターゲットシーケンスが皆サンプルの中に存在すると、野生形プライマー「曲線６７」及び突然変異形プライマー「曲線６８」の増幅産物が著しくて増加される。しかし、野生形ターゲットに対して、増幅産物を著しくて増加するのが野生形プライマーの増幅「曲線６３」から決定され、突然変異形プライマーの増幅「曲線６４」ではない。逆に、突然変異形ターゲットに対して、増幅産物を著しくて増加するのが突然変異形プライマー増幅「曲線６５」から決定されて、増幅野生形プライマー「曲線６６」ではない。その結果では、ただ完全に整合するプライマーが増幅される。野生モデルと突然変異モデルが完全に１００パーセント検出される。これは、本発明に基づいてプライマーが一個または幾つかのヌクレオシドによってターゲットに区分されるのを証明している。モデルが無い時、増幅されない信号が発見されて、モデルが二個存在する時、二個のＰＣＲ反応の増幅信号が皆発見される。
【００５０】
実施例４、二重増幅環状プライマーがＫ−ｒａｓ遺伝子１２コードンの密集突然変異区の単一のまれな突然変異の正確な増幅に用いられる。
【００５１】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子は細胞の成長と分化の方面に重要な作用を持ち、約７０パーセントの腫瘍がある程度の上に１２及び１３コードンの突然変異と関して、その他のコードンの突然変異が５９及び６１位置に存在する。１２及び１３コードン中の三個の塩基が皆突然変異に発生され、大部分にコードンの第１と第２の塩基が突然変異に発生され、自身以外に、その他のいかなる三種類の塩基の一種類に突然変異され、また第１と第２の塩基も一緒に突然変異される。例えば、１２コードンの第１の塩基がＡに突然変異され、即ちＧＧＴ＞ＴＧＴ「Ｃｏｓｍｉｃ  ＩＤ：４８０」であり、この突然変異がホットスポットの突然変異になれ、大腸がんの治療の薬物アービタックスの耐薬性に関連されて、１２コードンの第１と第２の塩基が一緒に突然変異され、例えば、ＧＧＴ＞ＴＧＣ「Ｃｏｓｍｉｃ  ＩＤ：５１３」、ＧＧＴ＞ＴＴＴ「Ｃｏｓｍｉｃ  ＩＤ：５１２」、ＧＧＴ＞ＴＡＴ「Ｃｏｓｍｉｃ  ＩＤ：２５０８１」であり、この三個の突然変異が普通の突然変異であり、大腸がんの治療の薬物アービタックスの耐薬性に関連するかどうかまだはっきりしない。普通使うＡＲＭＳプライマーは容易に突然変異の種類をＧＧＡＴ＞ＴＧＴに誤って検出する。
【００５２】
本発明の二重増幅環状プライマーが、Ｃｏｓｍｉｃデータで公開するＫ−ｒａｓ遺伝子１２コードンの野生形遺伝子シーケンスとＧＧＴ＞ＴＧＴ突然変異形遺伝子シーケンス「Ｃｏｓｍｉｃ  ＩＤ：４８０」に基づく比較分析によって、一対のプライマーとゾンデに設けられて、即ちＫ−ｒａｓ−Ｍ１−Ｆ、Ｋ−ｒａｓ−Ｍ１−Ｒ、Ｋ−ｒａｓ−Ｐである。Ｃｏｓｍｉｃデータで公開するＨＧＨ遺伝子の野生形遺伝子シーケンスに基づく分析によって、一対のプライマーとゾンデに設けられて、即ちＨＧＨ−Ｆ、ＨＧＨ−Ｒ、ＨＧＨ−Ｐである。
【００５３】
前記蛍光ＰＣＲシステムを利用して、臨床採集のパラフィン組織のサンプルがＫ−ｒａｓ
遺伝子ＧＧＴ＞ＴＧＴに突然変異される方法は以下のステップを含む。
【００５４】
（１）サンプルの処理とモデルの抽出である。臨床からのパラフィン組織のサンプルを採って、サンプルが５μｍ−１０μｍ  に切れ、１ｍｌのキシレン脱ろうが追加され、遠心沈殿物が収集され、沈殿物の中に無水アルコールが１ｍｌ追加され、室温または３７℃の状態で乾かし、プロテアーゼＫとＢｕｆｆｅｒ  ＡＴＬが追加され、５６℃で一時間に消化して分裂分解され、９０℃で一時間に孵化され、２００ｍｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＬが追加されて十分に混合してから、また無水アルコールが２００μｌ追加されて十分に混合し、上清液がＱＩＡ２ｍｌの遠心柱中へ慎重に転送され、６０００×ｇ「８０００ｒｐｍ」で一分間に遠心され、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ１が追加され、６０００×ｇ「８０００ｒｐｍ」で一分間に遠心され、カバーを慎重に開けて５００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ２が追加され、６０００×ｇ「８０００ｒｐｍ」で一分間に遠心され、空管遠心で２００００×ｇ「１４０００ｒｐｍ」で三分間分に遠心され、フイルムの中央に１００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＴＥが追加され、五分間に暖かく育て、２００００×ｇ「１４０００ｒｐｍ」で一分間分に遠心される。３μｌを取って、ＯＤ値が測定され、抽出したサンプルのＤＮＡが２ｎｇ／μｌまでに希釈され、５μｌを取って反応される。
【００５５】
（２）蛍光ＰＣＲ増幅及びその反応システムには、１×ＰＣＲバッファ液が
【００５６】
【表１】
2013518559.tif 000003
に設けられて、プライマーゾンデシーケンスには、Ｋ−ｒａｓ−Ｍ１−Ｆが、ＡＣＡＡＧＣＴＣＣＧＣＡＡＧＧＧＧＴＣＡＧＴＡＡＡＧＣＧＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴに設けられ、その中、下線を持つ塩基がラベルシーケンスに表示され、５’端にフレームを持つ塩基が３’端の塩基と相補されるシーケンスに表示され、太字の塩基が突然変異識別の塩基に表示されて、Ｋ−ｒａｓ−Ｍ１−Ｒが、ＧＣＡＡＧＧＧＧＴＣＡＧＴＡＡＡＧＣＧＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧに設けられ、その中、下線を持つ塩基がラベルシーケンスに表示されて、ラベルシーケンスＴがＧＣＡＡＧＧＧＧＴＣＡＧＴＡＡＡＧＣＧに設けられる。Ｋ−ｒａｓ−Ｐが、ＦＡＭ−５’ＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴ３’−ＢＨＱに設けられる。内部制御のＨＧＨシステムには、ＨＧＨ−Ｆが、５’−ＧＣＡＡＧＧＧＧＴＣＡＧＴＡＡＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴ−３’に設けられ、ＨＧＨ−  Ｒが、５’−ＧＣＡＡＧＧＧＧＴＣＡＧＴＡＡＡＧＣＧＣＡＴＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＣＴＣ−３’に設けられ、その中、下線を持つ塩基がラベルシーケンスに表示され、ＨＧＨ−Ｐが、ＨＥＸ−５’ＴＴＧＡＣＡＡＣＧＣＴＡＴＧＣＴＣＣＧＣ３’−ＢＨＱに設けられる。
【００５７】
リアルタイムＰＣＲの反応条件には、９６℃の予め変性が３分間に、１５個の循環で９５℃の変性が１５秒に、６４℃の焼戻しが２５秒に、７２℃の延伸が１０秒に、３５個の循環で９５℃の変性が１５秒に、５８℃の引戻しが２５秒に、３５個の循環で７２℃の延伸が１０秒に、設けられて、後ろの３５個の循環で焼戻す時にＦＡＭとＨＥＸの蛍光信号が測定される。
【００５８】
（３）測定には、ＭＸ３０００ＰのリアルタイムＰＣＲ増幅装置「ＳＲＡＴＧＥＮＥ会社製」を採用して、焼戻しの階段に蛍光が測定され、反応液を含むＰＣＲ管が蛍光ＰＣＲ増幅装置に１つ１つ放置されて測定される。
【００５９】
結果判断には、蛍光ＰＣＲ増幅装置で表示するＣｔ値に基づいて判断される結果によって、反応システムのＦＡＭとＨＥＸの蛍光強度が測定され、ＨＥＸ信号が設定閾値「Ｃｔ＞１８」に到達される時のＤＮＡサンプルの量が許容範囲の中に位され、ＦＡＭ信号の結果が信頼でき、ＦＡＭ信号を上げるかどうかの陰性・陽性を判断する標準として、正常の「Ｓ」型ＰＣＲ増幅曲線が陽性に表現される。
【００６０】
特異性分析測定には、ＳＷ４８細胞のＤＮＡで対照として、収集されたサンプルに対してＫ−ｒａｓ遺伝子ＧＴＧ＞ＴＧＴの突然変異が測定され、突然変異が分析される結果で、Ｋ−ｒａｓ遺伝子ＧＴＧ＞ＴＧＴを含む突然変異のサンプルのみ蛍光信号を有し、対照とするＳＷ４８細胞のＤＮＡに対して蛍光信号を持たなく、同時に血液の収集ステーションで収集された血液サンプル血液の１００症例が更に蛍光ＰＣＲの特異性が証明される。その結果、血液の収集ステーションで収集された血液サンプルＤＮＡが蛍光ＰＣＲ測定されて蛍光信号を持たない結果が表示される。
【００６１】
（５）感度分析には、合成されたＫ−ｒａｓ遺伝子ＧＴＧ＞ＴＧＴを含む突然変異のプラスミドＤＮＡにたいして定量分析されて、定量された１０００個のコピー数の濃度を有すサンプルＤＮＡを取って、１０倍の希釈を行って、共に３個の希釈度が作られて、それから、順序に４個の希釈度が５μｌ抽出され、８個の平行組で蛍光ＰＣＲの反応が実施される。本発明蛍光ＰＣＲの方法が高感度で、直に１ｃｏｐｙｓ／μｌ−１０ｃｏｐｙｓ／μｌの範囲で測定される。
【００６２】
（６）選択性試験には、合成されたＫ−ｒａｓ遺伝子ＧＴＧ＞ＴＧＴを含む突然変異のプラスミドＤＮＡの５個のコピー数について１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇの背景下で蛍光ＰＣＲの測定が実施される。図６を参照。
【００６３】
図６に示すのは、本発明の設計に基づくまれな突然変異二重増幅形プライマーが異なる濃度の背景下のまれな突然変異モデルに対して増幅される測定結果である。５個のコピーの突然変異モデルがそれぞれ１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇの背景下で測定が実施されて、ライン７１について５個のコピーが１ｎｇの背景下で測定が実施されて、ライン７２について５個のコピーが５ｎｇの背景下で測定が実施されて、ライン７３について５個のコピーが１０ｎｇの背景下で測定が実施されて、ライン７４について５個のコピーが５０ｎｇの背景下で測定が実施されて、ライン７５について５個のコピーが１００ｎｇの背景下で測定が実施されて、ライン７６について５個のコピーが２００ｎｇの背景下で測定が実施される。本発明の設計に基づく二重増幅形プライマーの選択性が強い。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、核酸増幅を用いる環状プライマー及びその応用に関する。当プライマーは高特異性、プライマー二量体に形成しなく、簡単な設計、合成し易く、遺伝子の表現量とＳＮＰと稀な突然変異との測定にあわせて、優れた工業実用性を具備するものである。
【符号の説明】
【００６５】
１１  ターゲットシーケンス識別区
１２  突然変異識別区
１３  ラベルシーケンス
１４  相補シーケンス
１５  ターゲットシーケンス識別区
１６  相補シーケンス
２１  ターゲットシーケンス
２２  ターゲットシーケンス
２３  シーケンス
２４  シーケンス
２５  まれな突然変異シーケンス
２６  まれな突然変異を持つシーケンス
２７  突然変異を持つシーケンス
３１  ターゲットシーケンス
３２  識別区突然変異識別区
３３  相補識別区
３４  ターゲットシーケンス識別区
３５  相補識別区
４１  突然変異を持つターゲットシーケンス
４２  ターゲットシーケンス
４３  産物
４４  産物
４５  目標産物
2013518559.tif 000004
【図１ａ】
2013518559.tif 000005
【図１ｂ】
2013518559.tif 000006
【図２ａ】
2013518559.tif 000007
【図２ｂ】
2013518559.tif 000008
【図３】
2013518559.tif 000009
【図４】
2013518559.tif 000010
【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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