(57)【要約】  発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度の少なくとも１種の電解質の存在下での不水和性有機抽出剤への抽出により、発酵の最中にブタノール生成物が取り出される、微生物発酵を介してブタノールを生成する方法が提供されている。電解質は、発酵培地、または、二相発酵培地の水性相中で解離して遊離イオンを形成する塩を含んでいてもよい。また、発酵培地からブタノールを回収するための方法および組成物が提供されている。
2013511283.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ブタノール、水、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度の少なくとも１種の電解質、および、少なくとも１種の発酵性炭素源からブタノールを生成する遺伝子組み換え微生物を含む発酵培地を提供するステップ；
ｂ）前記発酵培地と、ｉ）Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第１の水不混和性有機抽出剤、ならびに、場合により、ｉｉ）Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第２の水不混和性有機抽出剤とを接触させて、水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物を形成するステップ；ならびに
ｃ）前記ブタノール含有有機相から前記ブタノールを回収して回収ブタノールを生成するステップ
を含む発酵培地からブタノールを回収する方法。
【請求項２】
前記ブタノールの一部が、前記発酵培地から：
ａ）前記発酵培地からブタノールを気体でストリッピングしてブタノール含有気相を形成するステップ；ならびに
ｂ）前記ブタノール含有気相からブタノールを回収するステップ
を含むプロセスにより同時に取り出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電解質が、前記発酵培地、前記第１の抽出剤、前記の場合による第２の抽出剤、または、これらの組み合わせに添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記電解質が、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、アンモニウム、ホスホニウム、および、これらの組み合わせからなる群から選択されるカチオンを有する塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記電解質が、硫酸、炭酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リン酸、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、および、これらの組み合わせからなる群から選択されるアニオンを有する塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記電解質が、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および、これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子組み換え微生物が、バクテリア、シアノバクテリア、糸状菌、および、酵母菌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記バクテリアが、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコックス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、および、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記イースト菌が、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、および、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の抽出剤が、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ラウリンアルデヒド、１−ドデカノール、および、これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の抽出剤がオレイルアルコールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の抽出剤が、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、２−ウンデカノール、１−ノナナール、および、これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ブタノールが１−ブタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ブタノールが２−ブタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ブタノールがイソブタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記発酵培地がエタノールをさらに含み、および、前記ブタノール含有有機相がエタノールを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子組み換え微生物が炭素流に対して競合する経路を不活化させる組み換えを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子組み換え微生物がアセトンを生成しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）少なくとも１種の発酵性炭素源からブタノールを生成する遺伝子組み換え微生物を提供するステップ；
ｂ）水性相と、ｉ）Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第１の水不混和性有機抽出剤、ならびに、場合により、ｉｉ）Ｃ７〜Ｃ２２アルコール、Ｃ７〜Ｃ２２カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ２２カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ２２アルデヒド、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第２の水不混和性有機抽出剤とを含む二相発酵培地であって、前記二相発酵培地はさらに、前記発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度で少なくとも１種の電解質を含む前記二相発酵培地中で、前記有機抽出剤へ前記ブタノールを抽出してブタノール含有有機相を形成させるのに十分な時間、前記微生物を増殖させるステップ；
ｃ）前記水性相から前記ブタノール含有有機相を分離するステップ；ならびに
ｄ）場合により、前記ブタノール含有有機相から前記ブタノールを回収して回収ブタノールを生成するステップ
を含むブタノールの生成方法。
【請求項２０】
前記電解質が、前記微生物の前記増殖相中に前記水性相に、前記ブタノール生成相中に前記水性相に、前記水性相中の前記ブタノール濃度が阻害性である場合に前記水性相に、前記第１の抽出剤に、前記の場合による第２の抽出剤に、または、これらの組み合わせに添加される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記電解質が発酵培地から得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）少なくとも１種の発酵性炭素源からブタノールを生成する遺伝子組み換え微生物を提供するステップ；
ｂ）前記微生物を発酵培地中で増殖させるステップであって、前記微生物が前記発酵培地中に前記ブタノールを生成してブタノール含有発酵培地が生成されるステップ；
ｃ）少なくとも１種の電解質を前記発酵培地で添加して、前記発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度で前記電解質を提供するステップ；
ｄ）前記ブタノール含有発酵培地の少なくとも一部分と、ｉ）Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第１の水不混和性有機抽出剤、ならびに、場合により、ｉｉ）Ｃ７〜Ｃ２２アルコール、Ｃ７〜Ｃ２２カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ２２カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ２２アルデヒド、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第２の水不混和性有機抽出剤とを接触させて、水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物を形成するステップ；
ｅ）場合により、前記ブタノール含有有機相から前記ブタノールを回収するステップ；ならびに
ｆ）場合により、前記水性相の少なくとも一部分を前記発酵培地に戻すステップ
を含むブタノールの生成方法。
【請求項２３】
前記電解質が、ステップ（ｃ）において、前記微生物増殖相が遅くなった際に前記発酵培地に添加される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記電解質が、ステップ（ｃ）において、前記ブタノール生成相が完了した際に前記発酵培地に添加される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１種の発酵性炭素源が前記発酵培地中に存在しており、および、農業原料、藻類、セルロース、ヘミセルロース、リグノセールロース、または、いずれかのこれらの組み合わせに由来する再生可能炭素を含む、請求項１、１９、または、２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）ブタノール、水、ブタノール分配係数イオン培地を高めるのに少なくとも十分な濃度の少なくとも１種の電解質、および、少なくとも１種の発酵性炭素源からブタノールを生成する遺伝子組み換え微生物を含む発酵培地；
ｂ）Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第１の水不混和性有機抽出剤；ならびに
ｃ）場合により、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第２の水不混和性有機抽出剤；
を含む組成物であって、水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物が形成され、
これにより、ブタノールが（ａ）の前記発酵培地から分離され得る組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が本明細書において参照により援用されている、２００９年１１月２３日に出願した米国仮特許出願第６１／２６３，５１９号明細書の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、バイオ燃料の分野に関する。より具体的には、本発明は、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度で少なくとも１種の電解質が発酵培地中に存在しており、ブタノール生成物が不水和性有機抽出剤への抽出により取り出される、微生物発酵を介してブタノールを生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ブタノールは、燃料添加剤として、ディーゼル燃料へのブレンド成分として、プラスチック産業における原材料化学物質として、ならびに、食品および香料産業における食品用銘柄の抽出剤としての使用など、多様な用途を有する重要な工業化学物質である。毎年、石油化学的手段により１００〜１２０億ポンドのブタノールが生成されている。ブタノールの需要が増加するに伴って、コーン、サトウキビ、または、セルロース系供給物などの再生可能資源からの発酵によるこの化学物質の生成に対する関心が拡大している。
【０００４】
ブタノールが生成される発酵プロセスにおいては、インサイチュ生成物除去がブタノールによる微生物の阻害を有利に低減させ、発酵液体培地中のブタノール濃度を制御することにより発酵速度が向上される。インサイチュ生成物除去のための技術としては、ストリッピング、吸着、浸透気化、メンブラン溶剤抽出、および、液体−液体抽出が挙げられる。液体−液体抽出においては、抽出剤が発酵液体培地と接触させられて、発酵液体培地相と抽出剤相との間でブタノールが分割される。ブタノールおよび抽出剤は例えば蒸留による分離プロセスによって回収される。
【０００５】
非特許文献１には、シクロペンタノール、ｎ−バレルアルデヒド、ｔ−アミルアルコール、および、Ａｄｏｌ  ８５ＮＦ（主にオレイルアルコールから構成される）を抽出剤として用いる希釈水溶液からの１−ブタノール、エタノール、および、アセトンの抽出に対する塩の添加の影響を評価する実験研究が開示されている。著者らは、塩添加は、発酵プロセスにおいて典型的に見出される希釈水溶液からのエタノール、１−ブタノール、および、アセトンの抽出をもたらすという利点にも関わらず、このようなプロセス構成の実際の実施は現在では限定的であると結論づけている。インサイチュ回収ストラテジー（抽出発酵）として必要とされ得る比較的高い塩濃度は、細胞に対して、浸透圧衝撃に起因して極度の悪影響を有している可能性がある。
【０００６】
特許文献１には、発酵液体培地などの希釈水溶液からＣ３〜Ｃ６アルコールを回収する方法が開示されている。この方法は、一分量の水溶液中のＣ３〜Ｃ６アルコールの活量を、少なくともこの分量におけるＣ３〜Ｃ６アルコールが飽和する活量に高める工程を含む。この発明の実施形態によれば、Ｃ３〜Ｃ６アルコールの活量を高める工程は水溶液への親水性の溶質の添加を含み得る。親水性の溶質の単なる添加、または、他の処理ステップとの組み合わせにより十分な親水性の溶質が添加されることで第２の液体相の形成が可能となる。添加される親水性の溶質は、塩、アミノ酸、水溶性の溶剤、糖質、または、これらの組み合わせであり得る。
【０００７】
２００９年６月４日出願の特許文献２には、発酵液体培地からブタノールを生成し、回収する方法が開示されており、これらの方法は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、および、これらの混合物からなる群から選択される不水和性有機抽出剤と発酵液体培地とを接触させて、水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物を形成するステップを含む。
【０００８】
２００９年４月１３日に同時に出願された、米国仮特許出願第６１／１６８，６４０号明細書；同６１／１６８，６４２号明細書；および、同６１／１６８，６４５号明細書；ならびに、２００９年８月６日に同時に出願された、同６１／２３１，６９７号明細書；同６１／２３１，６９８号明細書；および、同６１／２３１，６９９号明細書には、発酵培地からブタノールを生成し、回収する方法が開示されており、これらの方法は、第１の溶剤および第２の溶剤であって、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、および、これらの混合物からなる群から選択される第１の溶剤、ならびに、Ｃ７〜Ｃ１１アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ１１カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１アルデヒド、および、これらの混合物からなる群から選択される第２の溶剤を含む不水和性有機抽出剤と発酵培地とを接触させて、水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物を形成するステップを含む。
【０００９】
発酵培地からブタノールを生成しおよび回収するための向上した方法が継続的に探求されている。電解質の発酵培地への添加が向上したブタノール抽出効率および微生物との許容可能な生体適合性をもたらす、ブタノールのインサイチュ生成物除去プロセスが所望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０１７１１２９  Ａ１号明細書
【特許文献２】米国特許出願第１２／４７８，３８９号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊ．Ｊ．ＭａｌｉｎｏｗｓｋｉおよびＡ．Ｊ．Ｄａｕｇｕｌｉｓ，ＡＩＣｈＥ  Ｊｏｕｒｎａｌ  （１９９４），４０（９），１４５９〜１４６５ページ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ブタノール、水、少なくとも１種の電解質、および、少なくとも１種の発酵性炭素源からブタノールを生成する遺伝子組み換え微生物を含む発酵培地からブタノールを回収する方法を提供する。電解質は、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度で発酵培地中に存在する。本発明はまた、このような微生物および添加された電解質を用いるブタノールの生成方法を提供する。この方法は、発酵培地を、ｉ）第１の不水和性有機抽出剤、および、任意選択により、ｉｉ）第２の不水和性有機抽出剤と接触させるステップ、有機相からブタノール含有有機相を分離するステップ、ならびに、ブタノール含有有機相からブタノールを回収するステップを含む。本発明の一実施形態において、発酵培地からブタノールを回収する方法が提供されており、この方法は：
ａ）ブタノール、水、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度の少なくとも１種の電解質、および、少なくとも１種の発酵性炭素源からブタノールを生成する遺伝子組み換え微生物を含む発酵培地を提供するステップ；
ｂ）発酵培地を、ｉ）Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第１の不水和性有機抽出剤、ならびに、任意選択により、ｉｉ）Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第２の不水和性有機抽出剤と接触させて、水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物を形成するステップ；
ｃ）任意選択により、水性相からブタノール含有有機相を分離するステップ；ならびに
ｄ）ブタノール含有有機相からブタノールを回収して回収ブタノールを生成するステップ
を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ブタノールの一部は：ａ）発酵培地からブタノールを気体でストリッピングしてブタノール含有気相を形成するステップ；および、ｂ）ブタノール含有気相からブタノールを回収するステップを含むプロセスにより、発酵培地から同時に取り出される。
【００１４】
本発明の方法によれば、電解質は、発酵培地に、第１の抽出剤に、任意選択の第２の抽出剤に、または、これらの組み合わせに添加され得る。いくつかの実施形態において、電解質は、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、アンモニウム、ホスホニウム塩、および、これらの組み合わせからなる群から選択されるカチオンを有する塩を含む。いくつかの実施形態において、電解質は、硫酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リン酸塩、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、および、これらの組み合わせからなる群から選択されるアニオンを有する塩を含む。いくつかの実施形態において、電解質は、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および、これらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１５】
本発明の方法によれば、いくつかの実施形態において、遺伝子組み換え微生物は、バクテリア、シアノバクテリア、糸状菌、および、酵母菌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、バクテリアは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペジオコックス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、および、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、イースト菌は、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、および、酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される。
【００１６】
本発明の方法によれば、第１の抽出剤は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ラウリンアルデヒド、１−ドデカノール、および、これらの組み合わせからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、第１の抽出剤はオレイルアルコールを含む。いくつかの実施形態において、第２の抽出剤は、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、２−ウンデカノール、１−ノナナール、および、これらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ブタノールは１−ブタノールである。いくつかの実施形態において、ブタノールは２−ブタノールである。いくつかの実施形態において、ブタノールはイソブタノールである。いくつかの実施形態において、発酵培地はエタノールをさらに含み、および、ブタノール含有有機相はエタノールを含有する。
【００１８】
本発明の一実施形態において、ブタノールの生成方法が提供されており、この方法は：
ａ）少なくとも１種の発酵性炭素源からブタノールを生成する遺伝子組み換え微生物を提供するステップ；
ｂ）水性相と、ｉ）Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第１の不水和性有機抽出剤、ならびに、任意選択により、ｉｉ）Ｃ７〜Ｃ２２アルコール、Ｃ７〜Ｃ２２カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ２２カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ２２アルデヒド、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第２の不水和性有機抽出剤とを含む二相発酵培地であって、さらに、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度で少なくとも１種の電解質を含む二相発酵培地中で、有機抽出剤へブタノールを抽出してブタノール含有有機相を形成させるのに十分な時間、微生物を増殖させるステップ；
ｃ）任意選択により、水性相からブタノール含有有機相を分離するステップ；ならびに
ｄ）ブタノール含有有機相からブタノールを回収して回収ブタノールを生成するステップ
を含む。
【００１９】
本発明の一実施形態において、ブタノールの生成方法が提供されており、この方法は：
ａ）少なくとも１種の発酵性炭素源からブタノールを生成する遺伝子組み換え微生物を提供するステップ；
ｂ）微生物を発酵培地中で増殖させるステップであって、微生物が発酵培地中にブタノールを生成してブタノール含有発酵培地が生成されるステップ；
ｃ）少なくとも１種の電解質を発酵培地で添加して、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度で電解質を提供するステップ；
ｄ）ブタノール含有発酵培地の少なくとも一部分と、ｉ）Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第１の不水和性有機抽出剤、ならびに、任意選択により、ｉｉ）Ｃ７〜Ｃ２２アルコール、Ｃ７〜Ｃ２２カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ２２カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ２２アルデヒド、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第２の不水和性有機抽出剤とを接触させて、水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物を形成するステップ；
ｅ）任意選択により、水性相からブタノール含有有機相を分離するステップ；
ｆ）ブタノール含有有機相からブタノールを回収するステップ；ならびに
ｇ）任意選択により、水性相の少なくとも一部分を発酵培地に戻すステップ
を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、遺伝子組み換え微生物は、炭素流に対する競合する経路を不活化する組み換えを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子組み換え微生物はアセトンを生成しない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】第１の抽出剤および第２の抽出剤が、容器中で組み合わされた後に発酵容器中の発酵培地と接触させられる、本発明の方法の一実施形態を概略的に示す。
【図２】第１の抽出剤および第２の抽出剤が発酵培地と接触させられる発酵容器に、これらの抽出剤が別々に加えられる、本発明の方法の一実施形態を概略的に示す。
【図３】第１の抽出剤および第２の抽出剤が異なる発酵容器に別々に添加される、本発明の方法の一実施形態を概略的に示す。
【図４】生成物の抽出が発酵槽の下流で行われ、ならびに、第１の抽出剤および第２の抽出剤が容器中で組み合わされた後に、異なる容器の中でこれらの抽出剤が発酵培地と接触させられる、本発明の方法の一実施形態を概略的に示す
【図５】生成物の抽出が発酵槽の下流で行われ、ならびに、第１の抽出剤および第２の抽出剤が発酵培地と接触させられる容器に、これらの抽出剤が別々に加えられる、本発明の方法の一実施形態を概略的に示す。
【図６】生成物の抽出が発酵槽の下流で行われ、ならびに、第１の抽出剤および第２の抽出剤が、発酵培地と接触させられるために、異なる容器に別々に加えられる、本発明の方法の一実施形態を概略的に示す。
【図７】発酵槽を充填する発酵槽の底部または底部付近の不水和性有機抽出剤の並流を介して少なくとも１つの回分発酵槽において生成物の抽出が行われ、抽出剤が発酵槽の上部または上部付近で発酵槽から流出する本発明の方法の一実施形態を概略的に示す。
【００２２】
以下の配列は、米国特許施行規則第１．８２１  １．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願に対する要件−配列規則」）に準拠していると共に、Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列リスト要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに、実施細則の２０８号および付属書Ｃ）に合致している。
【００２３】
【表１】
2013511283.tif 000003
【００２４】
【表２】
2013511283.tif 000004
【００２５】
【表３】
2013511283.tif 000005
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、不水和性有機抽出剤に抽出して水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物を形成することにより、少なくとも１種の電解質を含む微生物発酵培地からブタノールを回収する方法を提供する。電解質は、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度で発酵培地中に存在する。ブタノール含有有機相が水性相から分離され、および、ブタノールが回収され得る。ブタノールを生成する方法もまた提供されている。
【００２７】
定義
以下の定義が本開示において用いられている。
【００２８】
「電解質」という用語は、水溶液中でイオン化または解離し、イオン性伝導体として機能し得る溶質を指す。
【００２９】
「ブタノール」という用語は、独立して、または、これらの混合物として、１−ブタノール、２−ブタノール、および／または、イソブタノールを指す。
【００３０】
「不水和性の」という用語は、１つの液体相を形成するようには発酵液体培地などの水溶液と混合が可能ではない抽出剤または溶剤などの化学成分を指す。
【００３１】
本明細書において用いられるところ、「抽出剤」という用語は、発酵液体培地からブタノールを抽出するために用いられる１種以上の有機溶剤を指す。
【００３２】
「二相発酵培地」という用語は、発酵培地（すなわち水性相）および好適な量の不水和性有機抽出剤を含む二相増殖培地を指す。
【００３３】
本明細書において用いられるところ、「有機相」という用語は、発酵液体培地と不水和性有機抽出剤とを接触させることにより得られる二相混合物の非水性相を指す。
【００３４】
本明細書において用いられるところ、「水性相」という用語は、水性発酵培地と不水和性有機抽出剤とを接触させることにより得られる、水を含む二相混合物の相を指す。
【００３５】
本明細書において用いられるところ、「インサイチュ生成物除去」という用語は、発酵などの生物学的プロセスから特定の発酵生成物を選択的に取り出して、生物学的プロセスにおける生成物濃度を制御することを意味する。
【００３６】
本明細書において用いられるところ、「発酵液体培地」という用語は、存在している微生物によるブタノール、水および二酸化炭素（ＣＯ２）への糖質の反応により生成物ブタノールが形成される発酵容器中に保持されている、水、糖質、溶解固形分、懸濁固形分、ブタノールを生成する微生物、生成物ブタノール、および、材料のすべての他の構成成分の混合物を意味する。発酵液体培地は、本明細書に記載のとおり糖質などの１種以上の発酵性炭素源を含んでいてもよい。発酵液体培地は、二相発酵抽出における水性相である。時々、本明細書において用いられるところ、「発酵培地」という用語は、「発酵液体培地」と同義的に用いられ得る。
【００３７】
本明細書において用いられるところ、「発酵容器」という用語は、生成物ブタノールが糖質から形成される発酵反応が実施される容器を意味する。「発酵槽」という用語は、本明細書において、「発酵容器」と同義的に用いられ得る。
【００３８】
「発酵性炭素源」という用語は、本明細書に開示の微生物によって代謝が可能である炭素源を指す。好適な発酵性炭素源としては、これらに限定されないが、グルコースまたはフルクトースなどの単糖；ラクトースまたはスクロースなどの二糖；オリゴ糖；デンプンまたはセルロースなどの多糖類；一炭素基質；および、これらの組み合わせが挙げられ、これらは発酵培地中に見出され得る。発酵性炭素の供給源としては、農業原料、藻類、セルロース、ヘミセルロース、リグノセールロース、または、いずれかのこれらの組み合わせに由来する炭素を含む、非石油系炭素である再生可能炭素を含む。
【００３９】
本明細書において用いられるところ、「脂肪酸」という用語は、飽和または不飽和である、Ｃ７〜Ｃ２２炭素原子の長い脂肪族鎖を有するカルボン酸を指す。
【００４０】
本明細書において用いられるところ、「脂肪族アルコール」という用語は、飽和または不飽和である、Ｃ７〜Ｃ２２炭素原子の長い脂肪族鎖を有するアルコールを指す。
【００４１】
本明細書において用いられるところ、「脂肪族アルデヒド」という用語は、飽和または不飽和である、Ｃ７〜Ｃ２２炭素原子の長い脂肪族鎖を有するアルデヒドを指す。
【００４２】
本明細書において用いられるところ、「脂肪族アミド」という用語は、飽和または不飽和である、Ｃ１２〜Ｃ２２炭素原子の長い脂肪族鎖を有するアミドを指す。
【００４３】
本明細書においてＫｐと略記される「分配係数」という用語は、平衡下の２種の不混和性の溶剤の混合物の２つの相における化合物の濃度の比を意味する。分配係数は、２種の不混和性溶剤間の化合物の異なる溶解度の尺度である。本明細書において用いられるところ、「ブタノールに関する分配係数」という用語は、抽出剤を含む有機相と発酵培地を含む水性相との間のブタノールの濃度の比を指す。本明細書において用いられるところ、分配係数は用語分布係数と同義である。
【００４４】
本明細書において用いられるところ、「分離」という用語は、「回収」と同義であり、初期混合物から化学化合物を除去して、初期混合物中の化合物の純度または濃度より高い純度または濃度で化合物を得ることを指す。
【００４５】
本明細書において用いられるところ、「ブタノール生合成経路」という用語は、１−ブタノール、２−ブタノール、または、イソブタノールを生成する酵素経路を指す。
【００４６】
本明細書において用いられるところ、「１−ブタノール生合成経路」という用語は、１−ブタノールをアセチル−コエンザイムＡ（アセチル−ＣｏＡ）から生成する酵素経路を指す。
【００４７】
本明細書において用いられるところ、「２−ブタノール生合成経路」という用語は、ピルビン酸塩から２−ブタノールを形成する酵素経路を指す。
【００４８】
本明細書において用いられるところ、「イソブタノール生合成経路」という用語は、ピルビン酸塩からイソブタノールを形成する酵素経路を指す。
【００４９】
本明細書において用いられるところ、「実効滴定濃度」という用語は、発酵／発酵培地１リットルにより生成されたブタノールの総量を指す。ブタノールの総量は：（ｉ）発酵培地中のブタノールの量；（ｉｉ）有機抽出剤から回収されたブタノールの量；および、（ｉｉｉ）ガスストリッピングが用いられる場合、気相から回収されたブタノールの量を含む。
【００５０】
本明細書において用いられるところ、「実効速度」という用語は、発酵／発酵培地１リットル／発酵１時間により生成されるブタノールの総量を指す。
【００５１】
本明細書において用いられるところ、「実効収率」という用語は、生成されたブタノールの量／生体触媒により消費される発酵性炭素基質の単位を指す。
【００５２】
本明細書において用いられるところ、「好気性条件」という用語は、酸素の存在下の増殖条件を意味する。
【００５３】
本明細書において用いられるところ、「微好気性条件」という用語は、低レベル（すなわち、通常の大気中の酸素レベル未満）の酸素が伴う増殖条件を意味する。
【００５４】
本明細書において用いられるところ、「嫌気性条件」という用語は、酸素が存在しない増殖条件を意味する。
【００５５】
本明細書において用いられるところ、「最低培地」という用語は、一般にアミノ酸が存在していない、増殖ために最低限の栄養分を含有する増殖培地を指す。最低培地は、典型的には、発酵性炭素源および種々の塩を含有するが、これらは、微生物および増殖条件により様々であり得；これらの塩は、一般に、マグネシウム、窒素、リンおよび硫黄などの必須元素を提供して、微生物にタンパク質および核酸を合成させる。
【００５６】
本明細書において用いられるところ、「規定培地」という用語は、例えば規定炭素源および窒素源といった存在する配合成分のすべて、ならびに、微生物によって要求される微量元素およびビタミンを既知の量で有している増殖培地を指す。
【００５７】
本明細書において用いられるところ、「生体適合性」という用語は、抽出剤の存在下でグルコースを利用する微生物の能力の尺度を指す。生体適合性抽出剤は、微生物によるグルコースの利用を許容する。非生体適合性（すなわち、生体毒性）抽出剤は、微生物によるグルコースの利用を許容しない（例えば、抽出剤が存在していない場合の割合の約２５％を超える割合）。
【００５８】
「℃」という用語は摂氏度を意味する。
【００５９】
「ＯＤ」という用語は光学密度を意味する。
【００６０】
「ＯＤ６００」という用語は、波長６００ｎｍでの光学密度を指す。
【００６１】
ＡＴＣＣという用語は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡを指す。
【００６２】
「ｓｅｃ」という用語は秒を意味する。
【００６３】
「ｍｉｎ」という用語は分を意味する。
【００６４】
「ｈ」という用語は時間を意味する。
【００６５】
「ｍＬ」という用語はミリリットルを意味する。
【００６６】
「Ｌ」という用語はリットルを意味する。
【００６７】
「ｇ」という用語はグラムを意味する。
【００６８】
「ｍｍｏｌ」という用語はミリモルを意味する。
【００６９】
「Ｍ」という用語はモル量を意味する。
【００７０】
「μＬ」という用語はマイクロリットルを意味する。
【００７１】
「μｇ」という用語はマイクログラムを意味する。
【００７２】
「μｇ／ｍＬ」という用語はマイクログラム／リットルを意味する。
【００７３】
「ｍＬ／ｍｉｎ」という用語はミリリットル／分を意味する。
【００７４】
「ｇ／Ｌ」という用語はグラム／リットルを意味する。
【００７５】
「ｇ／Ｌ／ｈ」という用語はグラム／リットル／時間を意味する。
【００７６】
「ｍｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ」という用語はミリモル／分／ミリグラムを意味する。
【００７７】
「ｔｅｍｐ」という用語は温度を意味する。
【００７８】
「ｒｐｍ」という用語は回転数／分を意味する。
【００７９】
「ＨＰＬＣ」という用語は高圧ガスクロマトグラフィを意味する。
【００８０】
「ＧＣ」という用語はガスクロマトグラフィを意味する。
【００８１】
本明細書に記載されているすべての公報、特許、特許出願、および、他の文献は、すべての目的についてそれらの全体が参照により特に援用されている。さらに、量、濃度、または、他の値もしくはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または、好ましい上方値および好ましい下方値の列挙として記載されている場合、これらは、範囲が別個に開示されているかどうかに関わらず、いずれかの範囲上限または好ましい上方値と、いずれかの範囲下限または好ましい下方値とのいずれかの対から形成されるすべての範囲を特定的に開示していると理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が言及されている場合、他に明記されていない限りにおいて、この範囲は、その端点、ならびに、この範囲内のすべての整数および少数を含んでいることが意図されている。本発明の範囲は、範囲が定義される際に言及されている特定の値に限定されることは意図されていない。
【００８２】
遺伝子組み換え微生物
ブタノール生成のための微生物ホストは、バクテリア、シアノバクテリア、糸状菌および酵母菌から選択され得る。用いられる微生物ホストは、生成されるブタノール生成物に耐性であり、ホストに対する生成物の毒性によって収率が限定されないべきである。ブタノール生成のための一連の微生物ホストが以下に詳細に記載されている。
【００８３】
高い滴定濃度レベルのブタノールで代謝的に活性な微生物は、技術分野において周知ではない。ソルベント生成能を有するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）からブタノール耐性変異体が単離されているが、他の潜在的に有用な菌株のブタノール耐性に関する情報はほとんど入手不可能である。バクテリアにおけるアルコール耐性の比較に関する研究のほとんどが、ブタノールはエタノールよりも毒性が高いことを示唆している（ｄｅ  Ｃａｖａｌｈｏら，Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．，６４：２１５〜２２ページ（２００４年）、および、Ｋａｂｅｌｉｔｚら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２２０：２２３〜２２７ページ（２００３年））。Ｔｏｍａｓら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８６：２００６〜２０１８ページ（２００４年））には、クロストリジウムアセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）における発酵の最中の１−ブタノールの収率はブタノールの毒性によって限定され得ることが報告されている。クロストリジウムアセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に対する１−ブタノールの主な影響はメンブラン機能の撹乱である（Ｈｅｒｍａｎｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０：１２３８〜１２４３ページ（１９８５年））。
【００８４】
ブタノールの生成のために選択される微生物ホストはブタノールに対して耐性であるべきであると共に、以下に記載した経路などの、導入された生合成経路を用いて炭水化物をブタノールに変換することが可能であるべきである。好適な微生物ホストの選択に対する判断基準は以下を含む：ブタノールに対する内因的な耐性、高い炭水化物利用割合、遺伝子操作のための遺伝学的ツールの入手可能性、および、安定した染色体変化の形成能。
【００８５】
ブタノールに対する耐性を有する好適なホスト菌株は、菌株の内因的な耐性に基づいたスクリーニングにより同定され得る。ブタノールに対する微生物の内因的な耐性は、最低培地における増殖中に増殖速度の５０％阻害を生じさせるブタノールの濃度（ＩＣ５０）を測定することにより測ることができる。ＩＣ５０値は、技術分野において公知である方法を用いて測定され得る。例えば、関心のある微生物を種々の量のブタノールの存在下で増殖させ、６００ナノメートルで光学密度を計測することにより増殖速度がモニターされ得る。倍加時間が増殖曲線の対数部分から算出され得、および、増殖速度の尺度として用いられ得る。増殖の５０％阻害をもたらすブタノールの濃度は、ブタノール濃度に対する増殖の阻害割合のグラフから判定され得る。好ましくは、ホスト菌株は、約０．５％を超えるブタノールに対するＩＣ５０を有しているべきである。ホスト菌株が約１．５％を超えるブタノールに対するＩＣ５０を有していることがより好適である。ホスト菌株が約２．５％を超えるブタノールに対するＩＣ５０を有していることが特に好適である。
【００８６】
ブタノール生成のための微生物ホストはまた、グルコースおよび／または他の炭水化物を高い割合で利用すべきである。ほとんどの微生物は、炭水化物を利用することが可能である。しかしながら、一定の環境下での微生物は炭水化物を効率的に用いることができず、従って、好適なホストとはならない。
【００８７】
ホストを遺伝子組み換え可能であることが組換え型微生物のいずれかをもたらすために必須である。用いられ得る遺伝子導入技術の形態はエレクトロポレーション、接合、形質導入または自然形質転換によるものを含む。幅広い範囲のホスト接合性プラスミドおよび薬剤耐性マーカが利用可能である。生体と共に用いられるクローニングベクタは、ホスト生体において機能することが可能である抗生物質耐性マーカの性質に基づいて、このホストに対して調整される。
【００８８】
微生物ホストはまた、種々の遺伝子を不活化することにより炭素流について競合する経路を不活化するために操作され得る。これは、直接的な不活化へのトランスポゾンまたは染色体組み込み型ベクタのいずれかの利用可能性を必要とする。また、化学的突然変異誘発に適用できる生成ホストは、化学的突然変異誘発および変異体スクリーニングを介して内因的なブタノール耐性が向上され得る。
【００８９】
炭素流のための競合する経路の不活化の例として、ピルビン酸デカルボキシラーゼが低減または排除され得る（例えば、米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書を参照のこと）。実施形態において、ブタノールは微生物の主生成物である。実施形態において、微生物はアセトンを生成しない。
【００９０】
上記の判断基準に基づいて、ブタノールの生成に好適な微生物ホストとしては、これらに限定されないが、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペジオコックス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、および、酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の構成メンバーが挙げられる。好ましいホストとしては：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルカリゲネスユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルスマセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカスエリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカスガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ペディオコッカスアシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、および、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【００９１】
上述の微生物は、技術分野において公知である方法を用いて、遺伝子組み換えされて、発酵性炭素源を、特に１−ブタノール、２−ブタノール、または、イソブタノールといったブタノールに変換し得る。好適な微生物としては、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、および、酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。好適な微生物としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、および、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。また、微生物は、Ｂｒａｍｕｃｃｉら（米国特許出願第１１／７６１４９７号明細書；および国際公開第２００７／１４６３７７号パンフレット）によって説明されている方法を用いて単離される、上記に列挙した微生物の一種のブタノール耐性菌株であり得る。このような菌株の一例は、ラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株ＰＮ０５１２（ＡＴＣＣ：ＰＴＡ−７７２７、米国特許出願第１１／７６１４９７号明細書について２００６年７月１２日に受託された生体）である。
【００９２】
ブタノールの生成のための好適な生合成経路は技術分野において公知であり、および、一定の好適な経路が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、ブタノール生合成経路は、ホスト細胞に対して非相同的である少なくとも１種の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ブタノール生合成経路は、ホスト細胞に対して非相同的である２種以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ブタノール生合成経路は、生合成経路の各ステップに対応するポリペプチドをコードする非相同的遺伝子を含む。
【００９３】
同様に、示された基質−生成物転換の触媒能を有する一定の好適なタンパク質が本明細書に記載されており、他の好適なタンパク質は技術分野において提供されている。例えば、米国特許出願公開第２００８／０２６１２３０号明細書、同２００９０１６３３７６号明細書、および、同２０１００１９７５１９号明細書には、２０１０年９月２９日に出願の米国特許出願第１２／８９３，０７７号明細書と同様に、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼが記載されており；米国特許出願公開第２０１０／００８１１５４号明細書にはジヒドロキシ酸デヒドラターゼが記載されており；アルコールデヒドロゲナーゼが、米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書および米国仮特許出願第６１／２９０６３６号明細書に記載されている。
【００９４】
微生物は、遺伝子組み換えされて、１−ブタノールを生成する１−ブタノール生合成経路を含んでいることが可能である。好適な組み換えとしては、国際公開第２００７／０４１２６９号パンフレットにおいて、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎらによって記載されているものが挙げられる。例えば、微生物は、遺伝子組み換えされて、以下の酵素触媒基質−生成物転換を含む１−ブタノール生合成経路を発現し得る：
ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ；
ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ；
ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ；
ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ；
ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド；ならびに
ｆ）ブチルアルデヒドａ−ブタノール。
【００９５】
微生物はまた、遺伝子組み換えされて、２−ブタノールを生成する２−ブタノール生合成経路を発現し得る。好適な組み換えとしては、米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書および同２００７／０２９２９２７号明細書、ならびに、国際公開第２００７／１３０５１８号パンフレットおよび国際公開第２００７／１３０５２１号パンフレットにおいて、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎらによって記載されているものが挙げられる。例えば、一実施形態においては、微生物は、遺伝子組み換えされて、以下の酵素触媒基質−生成物転換を含む２−ブタノール生合成経路を発現し得る：
ａ）ピルビン酸塩からα−アセト乳酸；
ｂ）α−アセト乳酸からアセトイン；
ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオール；
ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン；ならびに
ｅ）２−ブタノンから２−ブタノール。
【００９６】
微生物はまた、遺伝子組み換えされて、イソブタノールを生成するイソブタノール生合成経路を発現し得る。好適な組み換えとしては、米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書および国際公開第２００７／０５０６７１号パンフレットにおいて、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎらによって記載のものが挙げられる。例えば、微生物は、遺伝子組み換えされて、以下の酵素触媒基質−生成物転換を含むイソブタノール生合成経路を含んでいてもよい：
ａ）ピルビン酸塩からアセト乳酸；
ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸；
ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸；
ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド；ならびに
ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノール。
【００９７】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株は、以下を含み得る：（ａ）以下の遺伝子によってコードされているイソブタノール生合成経路：アセト乳酸シンターゼ（配列番号：２が付されている）をコードする肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するｂｕｄＢ（配列番号：１）、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（配列番号：４が付されている）をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するｉｌｖＣ（配列番号：３が付されている）、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ（配列番号：６が付されている）をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するｉｌｖＤ（配列番号：５が付されている）、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ（配列番号：８が付されている）をコードする乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するｋｉｖＤ（配列番号：７が付されている）、および、ブタノールデヒドロゲナーゼ（配列番号：１０が付されている）をコードするアクロモバクターキシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に由来するｓａｄＢ（配列番号：９が付されている）。イソブタノール生合成経路の遺伝子によりコードされた酵素は、上記のとおり、ピルビン酸塩をイソブタノールに変換する基質−生成物転換を触媒する。特に、アセト乳酸シンターゼはピルビン酸塩のアセト乳酸への転換を触媒し、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼはアセト乳酸の２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への転換を触媒し、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼは２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸のα−ケトイソ吉草酸への転換を触媒し、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼはα−ケトイソ吉草酸のイソブチルアルデヒドへの転換を触媒し、および、ブタノールデヒドロゲナーゼはイソブチルアルデヒドのイソブタノールへの転換を触媒する。この組換え型大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株は、技術分野において公知である方法（同時継続中の米国特許出願第１２／４７８，３８９号明細書および同１２／４７７，９４６号明細書を参照のこと）、および／または、本明細書において以下に記載の方法を用いて構築可能である。好適な菌株は、本明細書に記載のタンパク質配列に対して、少なくとも約７０〜７５％の同一性、少なくとも約７５〜８０％、少なくとも約８０〜８５％の同一性、または、少なくとも約８５〜９０％の同一性を有する配列を含んで構築され得ることが予期される。
【００９８】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株は、イソブタノール生成を限定する競合する経路を排除するために、以下の遺伝子、配列番号：７１が付されたｐｆｌＢ（ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする）、配列番号：７３が付されたＩｄｈＡ（乳酸デヒドロゲナーゼをコードする）、配列番号：７７が付されたａｄｈＥ（アルコールデヒドロゲナーゼをコードする）、ならびに、ｆｒｄＡＢＣＤオペロン（フマル酸レダクターゼをコードする）、特に、配列番号：９０が付されたｆｒｄＡ、配列番号：７５が付されたｆｒｄＢ、配列番号：９２が付されたｆｒｄＣ、および、配列番号：９４が付されたｆｒｄＤを含む少なくとも１種の遺伝子が欠失されていてもよい。
【００９９】
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株は：以下の遺伝子によってコードされるイソブタノール生合成経路：アセト乳酸シンターゼ（配列番号：１２）をコードする枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号：１１）に由来するａｌｓＳコード領域、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ；配列番号：１４）および／またはＰｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８によってコードされたものなどの変異ＫＡＲＩ（配列番号：１５；タンパク質配列番号：１６）をコードする出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（配列番号：１３）に由来するＩＬＶ５、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ（配列番号：１８）をコードするミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）（配列番号：１７）に由来するｉｌｖＤ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ（配列番号：２０）をコードする枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号：１９が付されているコドン最適化配列）に由来するｋｉｖＤ、ならびに、ブタノールデヒドロゲナーゼ（配列番号：１０）をコードするアクロモバクターキシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）（配列番号：９）に由来のｓａｄＢを含み得る。イソブタノール生合成経路の遺伝子によりコードされた酵素は、本明細書に記載のとおり、ピルビン酸塩をイソブタノールに変換する基質−生成物転換を触媒する。好適な菌株は、本明細書に記載のタンパク質配列に対して、少なくとも約７０〜７５％の同一性、少なくとも約７５〜８０％、少なくとも約８０〜８５％の同一性、または、少なくとも約８５〜９０％の同一性を有する配列を含んで構築され得ることが予期される。
【０１００】
細胞質ゾルにおいてアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）活性でイソブタノール経路を発現し、および、内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子の欠失を有するイースト菌株が、米国特許出願第１２／４７７，９４２号明細書に記載されている。この細胞質ＡＬＳと低ＰＤＣ発現との組み合わせが、次いでイソブタノールの生成のための経路に流れる、ピルビン酸塩からアセト乳酸への流動を大きく増大させることが見いだされている。このような組換え型出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株は、技術分野において公知である方法および／または本明細書に記載の方法を用いて構築されることが可能である。他の好適なイースト菌株は技術分野において公知である。追加の例が、米国仮特許出願第６１／３７９５４６号明細書、同６１／３８０５６３号明細書、および、米国特許出願第１２／８９３０８９号明細書に提供されている。
【０１０１】
本明細書において提供されているプロセスと併せて用いられる微生物に好適な追加の組み換えとしては、米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書に記載されているグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減させる組み換え、米国特許出願公開第２０１０／０１２０１０５号明細書に記載されているＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路または還元当量のバランスを介して高い炭素流動をもたらすホスト細胞への組み換えが挙げられる。活性のためにＦｅ−Ｓクラスターの結合を必要とする非相同的タンパク質の活性が高められたイースト菌株が米国特許出願公開第２０１０／００８１１７９号明細書に記載されている。他の組み換えとしては、米国仮特許出願第６１／２９０，６３９号明細書に記載されている二元性ヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける組み換え、米国仮特許出願第６１／３８０５６３号明細書に記載されているピルビン酸塩利用生合成経路におけるステップを触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの組み込みが挙げられる。
【０１０２】
また、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に作用するポリペプチドをコードする内因性遺伝子に少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または、置換を含むホスト細胞が米国仮特許出願第６１／３０５３３３号明細書に記載されており、ならびに、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする非相同的ポリヌクレオチドを含むホスト細胞、および、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする非相同的ポリヌクレオチドを含むホスト細胞が米国仮特許出願第６１／３５６３７９号明細書に記載されている。
【０１０３】
好適なイースト菌株の構築
ＮＧＩ−０４９が、好適な出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株の一例である。ＮＧＩ−０４９は、内因性ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６遺伝子が挿入不活化されており、ならびに、発現ベクタｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８およびｐＬＨ４６８を含む菌株である。ＰＤＣ１、ＰＤＣ５およびＰＤＣ６遺伝子は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの３種の主たる同位酵素をコードする。この菌株は、統合されているかまたはプラスミド上のイソブタノール生合成経路のための酵素をコードする遺伝子を発現する。ＮＧＩ−０４９菌株の構築が本明細書において提供されている。
【０１０４】
イースト菌における内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性はピルビン酸塩をアセトアルデヒドに変換し、これが、次いで、エタノール、または、アセテートを介してアセチル−ＣｏＡに変換される。従って、内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、副産物形成の低減または排除のための標的である。
【０１０５】
ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の撹乱によりピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低い他のイースト菌株の例は、Ｆｌｉｋｗｅｅｒｔら（Ｙｅａｓｔ（１９９６年）１２：２４７〜２５７ページ）において酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｂｉａｎｃｈｉら（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６年）１９（１）：２７〜３６ページ）においてクリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）などが報告されており、および、Ｈｏｈｍａｎｎ（Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．（１９９３年）２４１：６５７〜６６６ページ）において調節性遺伝子の撹乱が報告されている。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有さない酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌株はＡＴＣＣ（受託番号２０００２７および番号２０００２８）から入手可能である。
【０１０６】
ｐｄｃ６：：ＧＰＭｐ１−ｓａｄＢ組み込みカセットの構築およびＰＤＣ６欠失：
ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組み込みカセットを、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（配列番号：６３）由来のＧＰＭ−ｓａｄＢ−ＡＤＨｔセグメント（配列番号：２１）をｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ由来のＵＲＡ３ｒ遺伝子に接合することにより形成した。ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ（配列番号：２２）は、インビボでの
相同的組み換えおよびＵＲＡ３マーカの除去を可能とする、７５ｂｐの相同的な反復配列が隣接するｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ番号７７１０７）由来のＵＲＡ３マーカを含む。２つのＤＮＡセグメントを、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；カタログ番号Ｆ−５４０Ｓ）およびプライマー１１４１１７−１１Ａ〜１１４１１７−１１Ｄ（配列番号：２３、２４、２５および２６）、ならびに、１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ（配列番号：２７および２８）と共に、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢおよびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡを鋳型として用いるＳＯＥ  ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ，７７：６１〜６８ページにより記載されているとおり）により接合した。
【０１０７】
ＳＯＥ  ＰＣＲ（１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ）に対するアウタープライマーは、それぞれＰＤＣ６プロモータおよびターミネータの上流領域および下流領域と相同的である５’および３’約５０ｂｐ領域を含んでいた。完全なカセットＰＣＲ断片をＢＹ４７００（ＡＴＣＣ番号２００８６６）に形質転換し、および、形質転換体を、標準的な遺伝学的技術を用い、３０℃で、ウラシルを欠くと共に２％グルコースを補った合成完全培地で維持した（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５年，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０１〜２０２ページ）。プライマー１１２５９０−３４Ｇおよび１１２５９０−３４Ｈ（配列番号：３０および３１）、ならびに、１１２５９０−３４Ｆおよび１１２５９０−４９Ｅ（配列番号：２９および３２）を用いるＰＣＲにより形質転換体をスクリーニングして、ＰＤＣ６コード領域の欠失が伴うＰＤＣ６遺伝子座での組み込みを検証した。ＵＲＡ３ｒマーカを、標準的なプロトコルに従い、３０℃で、２％グルコースおよび５−ＦＯＡを補った合成完全培地でプレーティングにより再生した。マーカの除去は、５−ＦＯＡプレートからコロニーのパッチをＳＤ−ＵＲＡ培地に植えて増殖が見られないことを検証することによって確認した。得られる同定した菌株は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔを有している。
【０１０８】
ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１−ｉｌｖＤ組み込みカセットの構築およびＰＤＣ１欠失：
ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組み込みカセットを、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；カタログ番号Ｆ−５４０Ｓ）およびプライマー１１４１１７−２７Ａ〜１１４１１７−２７Ｄ（配列番号：３４、３５、３６および３７）と共に、ｐＬＨ４６８およびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡを鋳型として用いるＳＯＥ  ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ，７７：６１〜６８ページに記載されているとおり）により、ｐＬＨ４６８由来のｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔセグメント（配列番号：３３）をｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ由来のＵＲＡ３ｒ遺伝子に接合することにより形成した。
【０１０９】
ＳＯＥ  ＰＣＲ（１１４１１７−２７Ａおよび１１４１１７−２７Ｄ）に対するアウタープライマーは、ＰＤＣ１プロモータの下流領域およびＰＤＣ１コード配列の下流領域と相同的である５’および３’約５０ｂｐ領域を含んでいた。完全なカセットＰＣＲ断片をＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔに形質転換し、および、形質転換体を、標準的な遺伝学的技術を用い、３０℃で、ウラシルを欠くと共に２％グルコースを補った合成完全培地で維持した（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５年，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０１〜２０２ページ）。プライマー１１４１１７−３６Ｄおよび１３５（配列番号３８および３９）、ならびに、プライマー１１２５９０−４９Ｅおよび１１２５９０−３０Ｆ（配列番号３２および４０）を用いるＰＣＲにより形質転換体をスクリーニングして、ＰＤＣ１コード配列の欠失が伴うＰＤＣ１遺伝子座での組み込みを検証した。ＵＲＡ３ｒマーカを、標準的なプロトコルに従い、３０℃で、２％グルコースおよび５−ＦＯＡを補った合成完全培地でプレーティングにより再生した。マーカの除去は、５−ＦＯＡプレートからコロニーのパッチをＳＤ−ＵＲＡ培地に植えて増殖が見られないことを検証することによって確認した。得られる同定した菌株「ＮＹＬＡ６７」は、遺伝子型：ＢＹ４７００ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔを有している。
【０１１０】
ＨＩＳ３欠失
内因性ＨＩＳ３コード領域を欠失させるために、ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３ｒ２カセットをＵＲＡ３ｒ２鋳型ＤＮＡ（配列番号；４１）からＰＣＲ増幅した。ＵＲＡ３ｒ２は、インビボでの相同的組み換えおよびＵＲＡ３マーカの除去を可能とする、５００ｂｐの相同的な反復配列が隣接するｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ番号７７１０７）由来のＵＲＡ３マーカを含む。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー１１４１１７−４５Ａおよび１１４１１７−４５Ｂ（配列番号：４２および４３）を用いてＰＣＲを行って、約２．３ｋｂのＰＣＲ生成物を生成した。各プライマーのＨＩＳ３部分は、ＵＲＡ３ｒ２マーカの組み込みがＨＩＳ３コード領域の置換をもたらすように、ＨＩＳ３プロモータの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得た。ＰＣＲ生成物を標準的な遺伝学的技術を用いてＮＹＬＡ６７に形質転換し（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５年，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０１〜２０２ページ）、および、形質転換体を、３０℃で、ウラシルを欠くと共に２％グルコースを補った合成完全培地上で選択した。形質転換体をスクリーニングし、３０℃で、ヒスチジンを欠くと共に２％グルコースを補った合成完全培地への形質転換体のレプリカプレーティングにより正しい組み込みを検証した。ＵＲＡ３ｒマーカを、標準的なプロトコルに従い、３０℃で、２％グルコースおよび５−ＦＯＡを補った合成完全培地でプレーティングにより再生した。マーカの除去は、５−ＦＯＡプレートからコロニーのパッチをＳＤ−ＵＲＡ培地に植えて増殖が見られないことを検証することによって確認した。得られる同定した菌株「ＮＹＬＡ７３」は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３を有している。
【０１１１】
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ組み込みカセットの構築およびＰＤＣ５欠失：
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４カセットを、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＦおよびＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＲ（配列番号：４４および４５）を用いて、菌株ＹＬＲ１３４Ｗ染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３４０９１）からＰＣＲ増幅して、約２．２ｋｂのＰＣＲ生成物を生成した。各プライマーのＰＤＣ５部分は、ｋａｎＭＸ４マーカの組み込みがＰＤＣ５コード領域の置換をもたらすように、ＰＤＣ５プロモータの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得た。ＰＣＲ生成物を標準的な遺伝学的技術を用いてＮＹＬＡ７３に形質転換し（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５年，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０１〜２０２ページ）、および、形質転換体を、３０℃で、１％エタノールおよびジェネティシン（２００μｇ／ｍｌ）を補ったＹＰ培地で選択した。形質転換体をＰＣＲによりスクリーニングし、プライマーＰＤＣ５ｋｏｆｏｒおよびＮ１７５（配列番号：４６および４７）を用いたＰＤＣ５コード領域の置換でＰＤＣ遺伝子座での正しい組み込みを検証した。同定された正しい形質転換体は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ
Δｈｉｓ３  ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４を有している。
【０１１２】
ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８構築
ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８プラスミド（配列番号：４８）を、イースト菌におけるＡＬＳおよびＫＡＲＩの発現のために構築した。ｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８は、以下のキメラ遺伝子を有しているｐＨＲ８１ベクタ（ＡＴＣＣ番号８７５４１）である：
１）ＣＵＰ１プロモータ（配列番号：４９）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のアセト乳酸シンターゼコード領域（ＡｌｓＳ；配列番号：１１；タンパク質配列番号：１２）およびＣＹＣ１ターミネータ（ＣＹＣ１−２；配列番号：５０）；
２）ＩＬＶ５プロモータ（配列番号：５１）、Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード領域（配列番号：１５；タンパク質配列番号：１６）およびＩＬＶ５ターミネータ（配列番号：５２）；ならびに、３）ＦＢＡ１プロモータ（配列番号：５３）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＡＲＩコード領域（ＩＬＶ５；配列番号：１３；タンパク質配列番号：１４）およびＣＹＣ１ターミネータ（配列番号：５４）。
【０１１３】
Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード領域は蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のＫＡＲＩをコードする配列であるが、米国特許出願公開第２００９／０１６３３７６号明細書に記載された突然変異を含んでいる。Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード化ＫＡＲＩ（配列番号：１６）は、天然の蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＫＡＲＩと比して以下のアミノ酸変化を有している：
Ｃ３３Ｌ：位置３３でシステインがロイシンに変化しており、
Ｒ４７Ｙ：位置４７でアルギニンがチロシンに変化しており、
Ｓ５０Ａ：位置５０でセリンがアラニンに変化しており、
Ｔ５２Ｄ：位置５２でスレオニンがアスパラギンに変化しており、
Ｖ５３Ａ：位置５３でバリンがアラニンに変化しており、
Ｌ６１Ｆ：位置６１でロイシンがフェニルアラニンに変化しており、
Ｔ８０Ｉ：位置８０でスレオニンがイソロイシンに変化しており、
Ａ１５６Ｖ：位置１５６でアラニンがスレオニンに変化しており、および
Ｇ１７０Ａ：位置１７０でグリシンがアラニンに変化している。
【０１１４】
Ｐｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８コード領域を、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のために最適化したコドンに基づいて、ＤＮＡ２．０（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ；配列番号：１５）により合成した。
【０１１５】
発現ベクタｐＬＨ４６８
イースト菌におけるＤＨＡＤ、ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨの発現のためにｐＬＨ４６８プラスミド（配列番号：５５）を構築した。
【０１１６】
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）およびウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（ＨＡＤＨ）についてのコード領域を、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（それぞれ、配列番号：１９および５６）における発現のために最適化したコドンに基づいてＤＮＡ２．０により合成し、プラスミドｐＫｉｖＤｙ−ＤＮＡ２．０およびｐＨａｄｈｙ−ＤＮＡ２．０中にもたらした。コードされるタンパク質は、それぞれ、配列番号２０および５７である。ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨに対する個別の発現ベクタを構築した。ｐＬＨ４６７（ｐＲＳ４２６：：ＰＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−ＧＰＤ１ｔ）をアセンブルするために、ベクタｐＮＹ８（配列番号：５８；（ｐＲＳ４２６．ＧＰＤ−ａｌｄ−ＧＰＤｔとも命名されている）米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書の実施例１７に記載されている）をＡｓｃＩおよびＳｆｉＩ酵素で消化し、これにより、ＧＰＤ１プロモータ（配列番号：５９）およびａｌｄコード領域を切断した。ｐＮＹ８由来のＧＰＤ１プロモータ断片（ＧＰＤ１−２；配列番号：６０）をＰＣＲ増幅し、５’プライマーＯＴ１０６８および３’プライマーＯＴ１０６７（配列番号：６１および６２）を用いて５’末端にＡｓｃＩ部位を、および、３’末端にＳｐｅＩ部位を付加した。ＡｓｃＩ／ＳｆｉＩで消化したｐＮＹ８ベクタ断片をＡｓｃＩおよびＳｐｅＩで消化したＧＰＤ１プロモータＰＣＲ生成物と、ベクタｐＫｉｖＤ−ＤＮＡ２．０から単離したコドン最適化ｋｉｖＤコード領域を含むＳｐｅＩ−ＳｆｉＩ断片とライゲートした。三種のライゲーションで、ベクタｐＬＨ４６７（ｐＲＳ４２６：：ＰＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−ＧＰＤ１ｔ）を生成した。ｐＬＨ４６７を制限マッピングおよび配列決定により検証した。
【０１１７】
ｐＬＨ４３５（ｐＲＳ４２５：：ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔ）は、米国特許出願第１２／４７７９４２号明細書の実施例３に記載のベクタｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（配列番号：６３）から得た。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢは、ＧＰＭ１プロモータ（配列番号：６４）、アクロモバクターキシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼ由来のコード領域（ｓａｄＢ；配列番号：９；タンパク質配列番号：１０：米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書に開示されている）、および、ＡＤＨ１ターミネータ（配列番号：６５）を含むキメラ遺伝子を有するｐＲＳ４２５ベクタ（ＡＴＣＣ番号７７１０６）である。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭｐ−ｓａｄＢは、それぞれ、ｓａｄＢコード領域の５’および３’末端にＢｂｖＩおよびＰａｃＩ部位を含む。プライマーＯＴ１０７４およびＯＴ１０７５（配列番号：６６および６７）を用いる特定部位の突然変異誘発によりｓａｄＢコード領域の５’末端にＮｈｅＩ部位を付加してベクタｐＲＳ４２５−ＧＰＭｐ−ｓａｄＢ−ＮｈｅＩを生成し、これを、配列決定により検証した。ｐＲＳ４２５：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＮｈｅＩをＮｈｅＩおよびＰａｃＩで消化してｓａｄＢコード領域を外し、ベクタｐＨａｄｈｙ−ＤＮＡ２．０由来のコドン最適化ＨＡＤＨコード領域を含むＮｈｅＩ−ＰａｃＩ断片とライゲートしてｐＬＨ４３５を生成した。
【０１１８】
単一ベクタ中にＫｉｖＤおよびＨＡＤＨ発現カセットを結合させるために、イースト菌ベクタｐＲＳ４１１（ＡＴＣＣ番号８７４７４）をＳａｃＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔカセットを含むｐＬＨ４３５由来のＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片と共に、ＰＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−ＧＰＤ１ｔカセットを含むｐＬＨ４６７由来のＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片と三種ライゲーション反応においてライゲートした。これによりベクタｐＲＳ４１１：：ＰＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ（ｐＬＨ４４１）を得、これを制限マッピングにより検証した。
【０１１９】
低級イソブタノール経路における三種の遺伝子：ｉｌｖＤ、ｋｉｖＤｙ、および、Ｈａｄｈｙのすべてのための同時発現ベクタを生成するために、本発明者らは、米国特許出願第１２／５６９６３６号明細書においてＩｌｖＤ遺伝子の供給源として記載されているｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（配列番号：６８）を用いた。このシャトルベクタは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における維持のためにＦ１複製起点（ｎｔ１４２３〜１８７９）を有していると共に、イースト菌中に２ミクロン複製起点（ｎｔ８０８２〜９４２６）を有している。ベクタは、ＦＢＡプロモータ（ｎｔ２１１１〜３１０８；配列番号：５３；）およびＦＢＡターミネータ（ｎｔ４８６１〜５８６０；配列番号：６９）を有している。加えて、ベクタは、イースト菌における選択のためにＨｉｓマーカ（ｎｔ５０４〜１１６３）を、および、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択のためにアンピシリン耐性マーカ（ｎｔ７０９２〜７９４９）を有している。ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９（ＡＴＣＣ番号７００６１０）由来のｉｌｖＤコード領域（ｎｔ３１１６〜４８２８；配列番号：１７；タンパク質配列番号：１８）はＦＢＡプロモータとＦＢＡターミネータとの間に位置して発現のためのキメラ遺伝子を形成する。加えて、ｌｕｍｉｏ  ｔａｇがｉｌｖＤコード領域（ｎｔ４８２９〜４８４９）に融合している。
【０１２０】
第１のステップでは、ＳａｃＩおよびＳａｃＩＩ（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化したＳａｃＩＩ部位を有する）を有するｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ（ＳｐｅＩ）−ＩｌｖＤ（ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ））−Ｌｕｍｉｏとも称される）を直線化して、全長が９，４８２ｂｐのベクタを得た。第２のステップでは、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化したＫｐｎＩ部位を有する）を有するｐＬＨ４４１からｋｉｖＤｙ−ｈＡＤＨｙカセットを単離したところ、６，０６３ｂｐ断片を得た。この断片を、ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ（ＳｐｅＩ）−ＩｌｖＤ（ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ））−Ｌｕｍｉｏ由来の９，４８２ｂｐのベクタ断片とライゲートした。これによりベクタｐＬＨ４６８（ｐＲＳ４２３：：ＰＦＢＡ１−ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）Ｌｕｍｉｏ−ＦＢＡ１ｔ−Ｐ−ＧＰＤ１−ｋｉｖＤｙ−ＧＰＤ１ｔ−ＰＧＰＭ１−ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔ）が生成され、これを、制限マッピングおよび配列決定により確認した。
【０１２１】
プラスミドベクタｐＬＨ４６８およびｐＬＨ４７５−Ｚ４Ｂ８を標準的な遺伝学的技術を用いて、菌株ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＧＰＭ１ｐ−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＤＣ１ｐ−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３  ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４に同時に形質転換し（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５年，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、および、得られた菌株を、３０℃で、ヒスチジンおよびウラシルを欠くと共に１％エタノールを補った合成完全培地で維持した。得られた菌株をＮＧＩ−０４９と命名した。
【０１２２】
有機抽出物
抽出剤は、発酵液体培地からのブタノールの抽出に有用とされる特徴を有する不水和性の有機溶剤、または、溶媒混合物である。好適な有機抽出剤は、ブタノールの生成または回収のための商業用二相抽出発酵のための理想的な溶剤に対する判断基準を満たしているべきである。具体的には、抽出剤は、（ｉ）例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、および、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）といった微生物に対して生体適合性であるべきであり、（ｉｉ）発酵培地と実質的に不混和性であるべきであり、（ｉｉｉ）ブタノールの抽出に対する高い分配係数（ＫＰ）を有しているべきであり、（ｉｖ）栄養分の抽出に対する低い分配係数を有しているべきであり、（ｖ）発酵培地とエマルジョンを形成する傾向が低くあるべきであり、ならびに、（ｖｉ）低コスト、かつ、安全であるべきである。加えて、向上したプロセス操作性および経済性のために、抽出剤は、（ｖｉｉ）低い粘度（μ）を有しているべきであり、（ｖｉｉｉ）水性発酵培地と比して低い密度（ρ）を有しているべきであり、ならびに、（ｉｘ）抽出剤およびブタノールの下流分離のために好適な沸点を有しているべきである。
【０１２３】
一実施形態において、抽出剤は、微生物に対して生体適合性であり得、すなわち、微生物に対して無毒であるか、または、微生物が連続してブタノール生成物を発酵培地中に生成するよう、許容可能なレベルで微生物が障害を受ける程度でのみ毒性であり得る。抽出剤の生体適合性の程度は、定義された発酵条件下で計測される、抽出剤およびブタノール生成物の存在下での微生物のグルコース利用率により判定されることが可能である。例えば、米国仮特許出願第６１／１６８，６４０号明細書；同６１／１６８，６４２号明細書；および、同６１／１６８，６４５号明細書における実施例を参照のこと。生体適合性抽出剤は、微生物によるグルコースの利用を許容するが、非生体適合性抽出剤は、例えば、抽出剤が存在しない場合の利用率の約２５％を超える割合での微生物によるグルコースの利用を許容しない。発酵生成物ブタノールの存在が微生物の抽出剤に対する感受性に影響を及ぼす可能性があるため、抽出剤の生体適合性テストの最中に発酵生成物が存在しているべきである。例えばエタノールといった追加の発酵生成物の存在が、抽出剤の生体適合性に同様に影響を及ぼし得る。微生物を含む発酵液体培地と有機抽出剤との接触の後もブタノールの連続的な生成が所望されるプロセスのためには、生体適合性抽出剤の使用が所望される。
【０１２４】
一実施形態においては、抽出剤は、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択され得る。好適な抽出剤の例としては、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ラウリンアルデヒド、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、２−ウンデカノール、１−ノナナール、２−ブチルオクタノール、２−ブチル−オクタン酸、および、これらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の溶剤を含む抽出剤が挙げられる。実施形態において、抽出剤はオレイルアルコールを含む。実施形態において、抽出剤は、ＩＳＯＦＡＬ（登録商標）１２（Ｓａｓｏｌ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）、または、Ｊａｒｃｏｌ  Ｉ−１２（Ｊａｒｃｈｅｍ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪ）として市販されている、例えば２−ブチルオクタノールといった分岐鎖飽和アルコールを含む。実施形態において、抽出剤は、それぞれ、ＩＳＯＣＡＲＢ（登録商標）１２、ＩＳＯＣＡＲＢ（登録商標）１６、および、ＩＳＯＣＡＲＢ（登録商標）２４（Ｓａｓｏｌ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）として市販されている、例えば２−ブチル−オクタン酸、２−ヘキシル−デカン酸または２−デシル−テトラデカン酸といった分岐鎖カルボン酸を含む。
【０１２５】
一実施形態においては、第１の不水和性有機抽出剤は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択され得る。好適な第１の抽出剤は、さらに、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、１−ドデカノールとも称されるラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ラウリンアルデヒド、および、これらの混合物からなる群から選択され得る。一実施形態においては、抽出剤は、オレイルアルコールを含んでいてもよい。
【０１２６】
一実施形態においては、任意選択の第２の不水和性有機抽出剤は、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択され得る。好適な第２の抽出剤は、さらに、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、２−ウンデカノール、１−ノナナール、および、これらの混合物からなる群から選択され得る。一実施形態においては、第２の抽出剤は１−デカノールを含む。
【０１２７】
一実施形態においては、第１の抽出剤はオレイルアルコールを含み、第２の抽出剤は１−デカノールを含む。
【０１２８】
第１の抽出剤および第２の抽出剤が用いられる場合、各々の相対量は好適な範囲内で様々であることが可能である。例えば、第１の抽出剤は、第１の抽出剤および第２の抽出剤の組み合わせた体積の約３０パーセント〜約９０パーセント、または、約４０パーセント〜約８０パーセント、または、約４５パーセント〜約７５パーセント、または、約５０パーセント〜約７０パーセントである量で用いられ得る。最適な範囲には、例えば、ブタノールに対する比較的高い分配係数と許容可能なレベルの生体適合性とのバランスといった抽出剤の特徴が最大限反映されている。ブタノールの生成もしくは回収のための二相抽出発酵に関しては、温度、接触時間、発酵培地中のブタノール濃度、抽出剤と発酵培地との相対量、用いられる特定の第１の抽出剤および第２の抽出剤、第１の抽出剤と第２の抽出剤との相対量、他の有機溶質の存在、電解質の存在および濃度、ならびに、微生物の量およびタイプが関連しており；それ故、これらの可変要素は、適切な制限の中で、本明細書に記載の抽出プロセスが最適化されるよう必要に応じて調節され得る。
【０１２９】
好適な有機抽出剤は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの種々の供給源から、種々の銘柄で商業的に入手可能であり得、これらの多くは、ブタノールを生成もしくは回収するために抽出発酵における使用に好適であり得る。工業銘柄の溶剤は、所望の成分と、より高分子量および低分子量の成分とを含む化合物の混合物を含有していることが可能である。例えば、市販されている工業銘柄オレイルアルコールの１種は、約６５％オレイルアルコールと、より高級および低級脂肪族アルコールの混合物とを含有する。
【０１３０】
電解質
本方法によれば、発酵培地は、少なくとも１種の電解質を、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度で含有する。電解質は、発酵基礎培地に含有されている１種以上の塩を含んでいてもよく、この場合、電解質は、発酵基礎培地中に含有されている塩の合計濃度を超える濃度で存在している。電解質は、発酵基礎培地中に存在していない１種以上の塩を含んでいてもよい。発酵基礎培地は、例えばリン酸、マグネシウム、および／または、アンモニウム塩を含有していてもよく、一般に、特定の微生物に対して調節される。発酵基礎培地の提案される組成が、Ｄｉｆｃｏ（商標）＆ＢＢＬ（商標）マニュアル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ  ２１１５２，ＵＳＡ）に見いだされ得る。一般に、微量元素によってもたらされる塩は、濃度がきわめて低いために、発酵基礎培地の合計塩濃度の算出において無視され得る。
【０１３１】
電解質は、発酵培地中で、または、二相発酵培地の水性相中で解離して遊離イオンを形成する塩を含み得る。例えば、電解質は、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、アンモニウム、ホスホニウム塩、および、これらの組み合わせからなる群から選択されるカチオンを有する塩を含み得る。例えば、電解質は、硫酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リン酸塩、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、および、これらの組み合わせからなる群から選択されるアニオンを有する塩を含み得る。電解質は、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および、これらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【０１３２】
電解質は、商業的に、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの種々の供給源から種々の銘柄で入手可能であり得、これらの多くは、本明細書に開示の方法によるブタノールの生成もしくは回収のため、抽出発酵における使用に好適であり得る。電解質は、発酵培地から、もしくは、発酵培地と抽出剤とを接触させることにより、または、沈殿、結晶化および／あるいは蒸発などの他の物理的もしくは化学的方法により形成された水性相から、技術分野において公知の方法により回収され得る。回収された電解質はその後の発酵に用いられ得る。
【０１３３】
発酵培地において、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比してブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度を達成するために必要とされる電解質の量は、例えば、以下の本明細書における実施例の手法によって開示されるとおり判定することが可能である。分配係数に好適な影響を有する電解質濃度の範囲は、例えば実験によって測定される。関心のある微生物に対して許容可能な生体適合性を示す電解質濃度の範囲もまた判定される。そして、好適な電解質濃度範囲は、ブタノール分配係数に好適な影響を有するために必要とされる電解質の量と、微生物に対して許容可能なレベルの生体適合性をもたらす濃度範囲とのバランスがとられるよう、これらの２つの範囲の重複部から選択される。経済的な考慮もまたオスモライトの使用量の選択における要因であり得る。
【０１３４】
一実施形態において、電解質は、発酵培地中に、微生物に対して生体適合性である濃度で存在し得、すなわち、微生物に対して無毒であるか、または、微生物が、電解質の存在下に、連続してブタノール生成物を発酵培地中に生成するよう、許容可能なレベルで微生物が障害を受ける程度でのみ毒性である濃度で存在し得る。電解質の生体適合性の程度は、以下の本明細書における実施例２に記載されているとおり、様々な濃度の電解質の存在下での微生物の増殖速度により判定されることが可能である。生体適合性の電解質濃度は、微生物によるグルコース（もしくは他の炭素源）の利用、または、微生物の増殖を許容するが、非生体適合性の電解質濃度は、微生物によるグルコース（もしくは他の炭素源）の利用、または、例えば、過剰量の電解質が存在しない場合の増殖速度の約２５％を超える速度での微生物の増殖を許容しない。例えばブタノールといった発酵生成物の存在もまた、微生物に対して生体適合性を有する電解質の濃度範囲に影響を及ぼし得る。微生物を含む発酵培地と電解質との接触の後にブタノールの連続的な生成が必要とされるプロセスのためには、生体適合性を有する濃度範囲内での電解質の使用が所望される。微生物を含む発酵培地と電解質との接触の後のブタノールの連続的な生成が必要とされないプロセスにおいては、電解質は、微生物に対する生体適合性があったとしてもほとんどない濃度範囲で用いられてもよい。
【０１３５】
発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比してブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な電解質の濃度を発酵培地において達成するために、電解質は、ブタノール濃度が阻害性である場合、微生物の増殖相の最中、ブタノール生成相の最中に、発酵培地もしくは二相発酵培地の水性相に添加され得るか、または、これらの組み合わせに添加され得る。電解質は、第１の抽出剤に、第２の抽出剤に、または、これらの組み合わせに添加され得る。電解質は、固体として、スラリーとして、または、水溶液として添加され得る。任意選択により、電解質は、発酵培地および抽出剤の両方に添加され得る。電解質は、連続的に、半連続的に、または、回分式で添加され得る。電解質は、例えば発酵槽中の発酵培地全体といった導入される流れ全体に、または、例えば発酵槽からの流れの一部といった、１つ以上の容器からの一部の流れに添加され得る。
【０１３６】
実施形態において、発酵培地中の電解質の合計濃度は、約０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍまたは１Ｍ超である。いくつかの実施形態において、発酵中の電解質の濃度は約１Ｍ未満であり、および、いくつかの実施形態において、発酵中の電解質の濃度は２Ｍ未満である。
【０１３７】
発酵
微生物は、好適な発酵槽中の好適な発酵培地において培養されてブタノールを生成し得る。任意選択の好適な発酵槽が用いられ得、攪拌タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、バブル発酵槽、または、いずれかのこれらの組み合わせが挙げられ得る。微生物培養物の維持管理および増殖のための材料および方法は、細菌学または発酵科学の当業者に周知である（例えば、Ｂａｉｌｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，第２版，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６年を参照のこと）。微生物、発酵、および、プロセスの特定の要求に応じて、適切な発酵培地、ｐＨ、温度、および、好気性、微好気性または嫌気性条件に対する要求に対する考慮が成されなければならない。用いられる発酵培地は重要ではないが、用いられた微生物の増殖を支持し、および、所望のブタノール生成物の生成に必要な生合成経路を促進させなければならない。従来の発酵培地が用いられ得、特にこれらに限定されないが、イースト抽出物またはペプトンおよび少なくとも１種の発酵性炭素源などの有機窒素源を含有する複合培地；最低培地；ならびに、規定培地が挙げられ得る。好適な発酵性炭素源としては、これらに限定されないが、グルコースまたはフルクトースなどの単糖；ラクトースまたはスクロースなどの二糖；オリゴ糖；デンプンまたはセルロースなどの多糖類；１炭素基質；ならびに、これらの混合物が挙げられる。適切な炭素源に追加して、発酵培地は、アンモニウム塩などの好適な窒素源、イースト抽出物またはペプトン、ミネラル、塩、補助因子、緩衝剤、および、当業者に公知である他の成分を含有していてもよい（Ｂａｉｌｅｙら，前述のとおり）。抽出発酵のための好適な条件は用いられる特定の微生物に応じ、当業者は日常的な実験を用いて容易に判定し得る。
【０１３８】
電解質の添加を伴う抽出発酵を用いるブタノールの回収方法
ブタノールは、ブタノール、水、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度の少なくとも１種の電解質、任意選択により少なくとも１種の発酵性炭素源、および、遺伝子組み換え（すなわち、遺伝子的に操作）されて少なくとも１種の炭素源から生合成経路を介してブタノールを生成する微生物を含有する発酵培地から回収され得る。このような遺伝子組み換え微生物は、バクテリア、シアノバクテリア、糸状菌および酵母菌から選択されることが可能であり、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、および、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。プロセスにおける１ステップは、発酵培地と、第１の不水和性有機抽出剤と、任意選択により第２の不水和性有機抽出剤とを接触させて、水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物を形成することである。「接触させるステップ」とは、発酵プロセスの最中のいずれかの時点で、発酵培地と、有機抽出剤またはその溶剤成分とが物理的に接触させられることを意味する。電解質は、発酵培地に、第１の抽出剤に、任意選択の第２の抽出剤に、または、これらの組み合わせに添加され得る。一実施形態においては、発酵培地はエタノールをさらに含み、ブタノール含有有機相はエタノールを含有していることが可能である。
【０１３９】
第１の抽出剤および第２の抽出剤が用いられる場合、接触させるステップは、既に組み合わされた第１の抽出剤および第２の抽出剤で実施され得る。例えば、第１の抽出剤および第２の抽出剤は混合タンクなどの容器中で組み合わされ得、次いで、複合抽出剤が、発酵培地を含有する容器に添加され得る。あるいは、接触させるステップは、接触させるステップの最中に組み合わされることとなる第１の抽出剤および第２の抽出剤で実施され得る。例えば、第１の抽出剤および第２の抽出剤は、発酵培地を含有する容器に別々に添加され得る。一実施形態において、発酵培地と有機抽出剤とを接触させるステップは、発酵培地を第１の抽出剤と第２の抽出剤と接触させる前に、発酵培地と第１の抽出剤とを接触させるステップをさらに含む。一実施形態においては、第２の抽出剤と接触させるステップは、第１の抽出剤と接触させるステップと同一の容器中で行われ得る。一実施形態においては、第２の抽出剤と接触させるステップは、第１の抽出剤と接触させるステップとは異なる容器中で行われ得る。例えば、第１の抽出剤が一の容器中の発酵培地と接触させられ、その内容物が他の容器に移され、この中で、第２の抽出剤と接触させるステップが行われ得る。これらの実施形態において、電解質は、発酵培地に、第１の抽出剤に、任意選択の第２の抽出剤に、または、これらの組み合わせに添加され得る。
【０１４０】
有機抽出剤は、二相発酵培地が形成される発酵の開始時に発酵培地と接触させられ得る。あるいは、有機抽出剤は、微生物が所望の増殖量を達成した後（これは培養物の光学密度を計測することにより測定可能である）に発酵培地と接触させられ得る。一実施形態においては、第１の抽出剤が一の容器中で発酵培地と接触させられ得、第２の抽出剤が発酵培地および第１の抽出剤と同一の容器中で接触させられてもよい。他の実施形態において、第２の抽出剤は、第１の抽出剤が発酵培地と接触させられるものとは異なる容器中で発酵培地および第１の抽出剤と接触させられてもよい。これらの実施形態において、電解質は、発酵培地に、第１の抽出剤に、任意選択の第２の抽出剤に、または、これらの組み合わせに添加され得る。
【０１４１】
さらに、有機抽出剤は、例えば、ブタノール濃度が有害レベルまたは阻害性レベルに達する前といった、発酵培地中のブタノールレベルが予め選択されたレベルに達する時に発酵培地と接触させられ得る。ブタノール濃度は、ガスクロマトグラフィまたは高性能液体クロマトグラフィーによるものなどの技術分野において公知である方法を用いて、発酵の最中に監視され得る。電解質は、ブタノール濃度が有毒レベルもしくは阻害性レベルに達する前、もしくは、その後に発酵培地に添加されてもよい。実施形態において、有機抽出剤は脂肪酸を含む。実施形態において、本明細書に記載のプロセスは、ブタノールが、リパーゼなどの触媒を用いて脂肪酸などの有機酸でエステル化されてブタノールエステルが形成される米国仮特許出願第６１／３６８４２９号明細書および同６１／３７９５４６号明細書に記載のプロセスと併せて用いられることが可能である。
【０１４２】
発酵は、好気性条件下で、光学密度計測により判定される、培養物が予め選択された増殖レベルを達成するのに十分な時間をかけて行われ得る。電解質は、予め選択されたレベルの増殖が達成される前、もしくは、その後に発酵液体培地に添加され得る。次いで、米国特許出願第１２／４７８，３８９号明細書の実施例６に詳細に記載されているとおり、インデューサが添加されて組み換え微生物におけるブタノール生合成経路の発現が誘起され得、および、発酵条件が微好気性または嫌気性条件に切り替えられてブタノール生成が促される。抽出剤は、微好気性または嫌気性条件への切り替え後に添加され得る。電解質は、微好気性または嫌気性条件への切り替えの前もしくはその後に添加され得る。一実施形態においては、第１の抽出剤は、発酵培地および第１の抽出剤と第２の抽出剤との接触の前に、発酵培地に接触させられてもよい。例えば、回分発酵プロセスにおいて、発酵培地と第１の抽出剤および第２の抽出剤との接触間には好適な期間が経過させられ得る。連続発酵プロセスにおいて、発酵培地と第１の抽出剤との接触は一の容器の中で行われ得、および、その容器の内容物と第２の抽出剤との接触は第２の容器の中で行われてもよい。これらの実施形態において、電解質は、発酵培地に、第１の抽出剤に、任意選択の第２の抽出剤に、または、これらの組み合わせに添加され得る。
【０１４３】
電解質の存在下に発酵培地を有機抽出剤と接触させた後、ブタノール生成物は有機抽出剤中に分配されて、微生物を含有する水性相中の濃度は低減し、これにより、阻害性のブタノール生成物に対する生成微生物の露出が制限される。用いられるべき有機抽出剤の体積は、以下に記載のとおり、発酵培地の体積、発酵槽のサイズ、ブタノール生成物に対する抽出剤の分配係数、電解質濃度、および、選択された発酵モードを含む多数の要因に応じる。有機抽出剤の体積は発酵槽実容積の約３％〜約６０％であり得る。抽出剤対発酵培地の比は、体積：体積基準で、約１：２０〜約２０：１、例えば約１：１５〜約１５：１、または、約１：１２〜約１２：１、または、約１：１０〜約１０：１、または、約１：９〜約９：１、または、約１：８〜約８：１である。
【０１４４】
添加されるべき電解質の量は、ブタノール生成微生物の増殖特性に対する添加される電解質の影響、および、二相発酵におけるブタノールのＫｐに対する添加される電解質の影響を含む多数の要因に応じる。添加されるべき電解質の最適な量はまた、初期発酵基礎培地の組成にも応じ得る。電解質の濃度が過度に高い場合、おそらくはブタノールのＫｐを高め、微生物に対するブタノールの毒性の影響を軽減するが、それ自身が微生物に対して阻害性である可能性がある。一方で、電解質の濃度が過度に低い場合、ブタノールのＫｐは、微生物に対するブタノールの阻害作用を軽減させるほどに十分に高くならない可能性がある。従って、発酵培地への過剰量の電解質の添加の正味の効果が、ブタノール生成の速度および滴定濃度の全体的な増加を確実にもたらすよう、実験を通してバランスを見いだす必要性がある。加えて、微生物に対する塩の生体適合性は、外因的な浸透圧保護剤もしくはオスモライトの培地への添加により、または、オスモライトを内因的に生成するよう微生物を遺伝子組み換えすることにより、調節されることが可能である。実施形態において、Ｋｐは、電解質が無添加の場合のＫｐと比して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、または、約２００％増加される。実施形態において、Ｋｐは、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または、少なくとも約６倍増加される。実施形態において、電解質の合計濃度は、微生物の増殖速度を、電解質が無添加の場合の増殖速度の少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、または、少なくとも約９０％のレベルで維持しながら、Ｋｐがある程度増加されるよう選択される。実施形態において、発酵培地中の電解質の合計濃度は、ブタノール生成の実効速度を、電解質が無添加の場合の速度と比して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または、少なくとも約１００％高めるのに十分な濃度である。実施形態において、発酵培地中の電解質の合計濃度は、ブタノールの実効収率を、電解質が無添加の場合の実効収率と比して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または、少なくとも約１００％高めるのに十分な濃度である。実施形態において、発酵培地中の電解質の合計濃度は、ブタノールの実効滴定濃度を、電解質が無添加の場合の実効滴定濃度と比して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または、少なくとも約１００％高めるのに十分な濃度である。
【０１４５】
実施形態において、添加される電解質の量は、少なくとも約７ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約２５ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、または、少なくとも約４０ｇ／Ｌの実効滴定濃度をもたらすのに十分な量である。実施形態において、添加される電解質の量は、少なくとも約０．１２、少なくとも約０．１５、少なくとも約０．２、少なくとも約０．２５、または、少なくとも約０．３の実効収率をもたらすのに十分な量である。実施形態において、添加される電解質の量は、少なくとも約０．１ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約０．１５ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約０．２ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約０．３ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約０．４ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約０．６ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約０．８ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約１ｇ／Ｌ／ｈ、または、少なくとも約１．２ｇ／Ｌ／ｈの実効速度をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態において、実効速度は約１．３ｇ／Ｌ／ｈである。
【０１４６】
次のステップは、任意選択により、特にこれらに限定されないが、サイフォニング、傾瀉、遠心分離、重力沈降槽の使用、および、膜支援（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）相分離を含む技術分野において公知である方法を用いて、ブタノール含有有機相を水性相から分離するステップである。
【０１４７】
ブタノール含有有機相からのブタノールの回収は、特にこれらに限定されないが、蒸留、樹脂による吸着、分子ふるいによる分離、および、浸透気化を含む技術分野において公知である方法を用いて行われ得る。具体的には、蒸留を用いてブタノール含有有機相からブタノールを回収し得る。抽出剤は、ブタノール生成および／または回収プロセスに再利用されてもよい。
【０１４８】
電解質は、発酵培地から、または、二相混合物の水性相から技術分野において公知である方法により回収され得る。例えば、水性相または発酵培地は、蒸留、ストリッピング、浸透気化、または、他の方法によって濃縮されて、電解質を含む濃縮水性混合物が得られてもよい。任意選択により、電解質は、発酵培地に戻され、これにより、発酵プロセスに再利用されてもよい。任意選択により、発酵培地から得られた電解質が発酵培地に添加されて、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比してブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度がもたらされてもよい。
【０１４９】
ガスストリッピングを、有機抽出剤、および、発酵培地からブタノール生成物を取り出すための電解質の添加と同時に用いてもよい。ガスストリッピングは、空気、窒素または二酸化炭素などの気体を発酵培地に通し、これによりブタノール含有気相を形成することにより行われ得る。ブタノール生成物は、冷水トラップを用いるブタノールの凝縮、または、溶剤での気相の洗浄などの技術分野において公知である方法を用いてブタノール含有気相から回収され得る。
【０１５０】
発酵が完了後に発酵培地中に残っているブタノールはすべて、新たなまたは再利用された有機抽出剤を用いる連続抽出によって回収され得る。あるいは、ブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液体−液体抽出、吸着、ガスストリッピング、メンブラン蒸発、浸透気化等などの技術分野において公知である方法を用いて発酵培地から回収されることが可能である。発酵培地がプロセスに再利用されない場合、ブタノール分配係数をさらに高め、および、ブタノール回収効率をさらに向上させるために、追加の電解質が添加され得る。
【０１５１】
二相抽出発酵法は攪拌タンク発酵槽中で連続形態で実施され得る。この形態においては、発酵培地およびブタノール含有有機抽出剤の混合物が発酵槽から取り出される。２つの相は、上記のとおり、特にこれらに限定されないが、サイフォニング、傾瀉、遠心分離、重力沈降槽の使用、膜支援（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）相分離等を含む技術分野において公知である手段によって分離される。分離の後、発酵培地およびその中の電解質が発酵槽に再利用されるか、または、新たな培地で置き換えられ、これに追加の電解質が添加されてもよい。次いで、抽出剤が処理されて上記のとおりブタノール生成物が回収される。次いで、抽出剤は、生成物のさらなる抽出のために発酵槽に戻されて再利用されてもよい。あるいは、新たな抽出剤が発酵槽に連続的に添加されて、取り出された抽出剤が置き換えられてもよい。この連続形態での操作では数々の利点がもたらされる。生成物は反応器から連続的に取り出されるため、必要とされる有機抽出剤の体積は小さく、より大体積の発酵培地を用いることが可能となる。これはより高い生成収率をもたらす。有機抽出剤の体積は、発酵槽実容積の約３％〜約５０％；発酵槽実容積の３％〜約２０％；または、発酵槽実容積の３％〜約１０％であり得る。発酵槽中で用いる抽出剤の量を可能な限り少なくして、水性相の体積、従って、発酵槽中の細胞の量を最大限とすることが有益である。プロセスは、発酵槽と分離装置との間で抽出剤が連続的に再利用されていると共に、発酵槽から発酵培地が連続的に取り出され、新たな培地が補充されている完全な連続形態で操作され得る。この完全な連続形態においては、ブタノール生成物が臨界有毒濃度に達することはなく、また、発酵が長期間にわたって実施され得るよう、新たな栄養分が連続的に提供される。これらの形態の二相抽出発酵の実施に用いられ得る装置は技術分野において周知である。例えば、Ｋｏｌｌｅｒｕｐらによって、米国特許第４，８６５，９７３号明細書に例が記載されている。
【０１５２】
回分式発酵形態もまた用いられ得る。技術分野において周知である回分発酵は、発酵培地の組成物が発酵の開始時に設定され、プロセスの最中に人為的に変更されることがない閉鎖系である。この形態においては、所望量の追加の電解質と一定体積の有機抽出剤とが発酵槽に添加され、プロセスの最中に抽出剤は取り出されない。有機抽出剤が、第１の抽出剤と任意選択の第２の抽出剤との別々の添加により発酵槽中で形成されてもよく、または、発酵槽にいずれかの抽出剤を添加する前に、第１の抽出剤と第２の抽出剤とが組み合わされて抽出剤が形成されてもよい。電解質は、発酵培地に、第１の抽出剤に、任意選択の第２の抽出剤に、または、これらの組み合わせに添加され得る。この発酵形態は上記の連続形態または完全な連続形態よりも単純であるが、発酵培地中の阻害性のブタノール生成物の濃度を最低とするために、より大体積の有機抽出剤が必要とされる。従って、発酵培地の体積は小さく、生成される生成物の量は連続形態を用いて得られる量よりも少ない。回分式形態における有機抽出剤の体積は、発酵槽実容積の２０％〜約６０％；または、発酵槽実容積の３０％〜約６０％であり得る。上記の理由により、発酵槽中で用いられる抽出剤の体積が可能な限り最小限であることが有益である。
【０１５３】
半回分発酵形態もまた用いられ得る。半回分発酵は、例えばグルコースといった栄養分が発酵の最中に複数回に分けて添加される標準的な回分系の変形である。栄養分の添加量および速度は日常的な実験により判定され得る。例えば、発酵培地中の重要な栄養分の濃度が発酵の最中に監視されてもよい。あるいは、ｐＨ、溶存酸素、および、二酸化炭素などの排出気体の分圧などのより容易に計測可能な要因が監視されてもよい。これらの計測されたパラメータから、栄養分の添加速度が判定されればよい。この形態における用いられる有機抽出剤の量およびその添加方法は、上記の回分式形態において用いられるものと同じである。添加される電解質の量は他の発酵形態と同じであってもよい。
【０１５４】
生成物の抽出は、発酵槽の中ではなくその下流で行われてもよい。この外的形態においては、ブタノール生成物の有機抽出剤への抽出は発酵槽から取り出された発酵培地で行われる。電解質が発酵槽から取り出された発酵培地に添加され得る。用いられる抽出剤の量は、発酵槽実容積の約２０％〜約６０％；または、発酵槽実容積の３０％〜約６０％である。発酵培地は発酵槽から連続的に、または、定期的に取り出され得、有機抽出剤によるブタノール生成物の抽出は、発酵培地からの細胞の除去を伴って、または、除去を伴わずに行われ得る。細胞は、特にこれらに限定されないが、ろ過または遠心分離を含む技術分野において公知である手段によって発酵培地から除去され得る。電解質は、細胞を除去する前、または、除去した後に発酵培地に添加され得る。上記の手段により発酵培地を抽出剤から分離した後、発酵培地は発酵槽に再利用され、廃棄され、または、いずれかの残留しているブタノール生成物の取り出しのために処理され得る。同様に、単離された細胞もまた発酵槽に再利用されてもよい。ブタノール生成物を回収する処理の後、抽出剤は、抽出プロセスにおいて使用するために再利用されてもよい。あるいは、新たな抽出剤が用いられてもよい。この形態において、抽出剤は発酵槽中に存在しておらず、従って、抽出剤の毒性はそれほど問題にならない。抽出剤との接触に先だって細胞が発酵培地から分離されれば、抽出剤の毒性の問題はさらに低減され得る。しかも、この外的形態を用いることでエマルジョンの形成および抽出剤の蒸発が生じる可能性が最低限とされ、環境問題が軽減される。
【０１５５】
電解質の添加を伴う抽出発酵を用いるブタノールの生成方法
ブタノールの生成のための向上した方法が提供されており、ここで、遺伝子組み換えされて少なくとも１種の発酵性炭素源から生合成経路を介してブタノールを生成する微生物は、水性相、ならびに、ｉ）第１の不水和性有機抽出剤および任意選択によりｉｉ）第２の不水和性有機抽出剤を含む二相発酵培地において増殖されており、この二相発酵培地は、さらに、少なくとも１種の電解質を、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度で含む。このような遺伝子組み換え微生物は、バクテリア、シアノバクテリア、糸状菌および酵母菌から選択されることが可能であり、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、および、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。第１の不水和性有機抽出剤は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択され得、ならびに、任意
選択の第２の不水和性有機抽出剤は、Ｃ７〜Ｃ２２アルコール、Ｃ７〜Ｃ２２カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ２２カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ２２アルデヒド、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択され得、ここで、二相発酵培地は、有機抽出剤の体積基準で約１０％〜約９０％を構成している。あるいは、二相発酵培地は、有機抽出剤の体積基準で、約３％〜約６０％、もしくは、約１５％〜約５０％を構成していてもよい。微生物は、ブタノールを抽出剤に抽出してブタノール含有有機相を形成するのに十分な時間の間、二相発酵培地において増殖される。発酵培地における電解質の少なくとも十分な濃度は、微生物の増殖相の最中に水性相に、ブタノール生成相の最中に水性相に、水性相中のブタノール濃度が阻害性である場合に水性相に、第１の抽出剤に、第２の抽出剤に、または、これらの組み合わせに電解質を添加することにより達成され得る。
【０１５６】
一実施形態においては、発酵培地はエタノールをさらに含み、ブタノール含有有機相はエタノールを含有していることが可能である。次いで、上記のとおり、ブタノール含有有機相が水性相から分離される。その後、上記のとおり、ブタノールがブタノール含有有機相から回収される。
【０１５７】
遺伝子組み換えされて少なくとも１種の炭素源から生合成経路を介してブタノールを生成する微生物が発酵培地中で増殖される向上したブタノールの生成方法もまた提供されており、ここで、微生物はブタノールを発酵培地中に生成してブタノール含有発酵培地をもたらす。このような遺伝子組み換え微生物は、バクテリア、シアノバクテリア、糸状菌および酵母菌から選択されることが可能であり、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、および、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。少なくとも１種の電解質が発酵培地に提供されて、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度の電解質がもたらされる。一実施形態においては、電解質は、微生物増殖相が遅くなった際に発酵培地に添加され得る。一実施形態においては、電解質は、ブタノール生成相が完了した際に発酵培地に添加され得る。ブタノール含有発酵培地の少なくとも一部分、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第１の不水和性有機抽出剤、ならびに、任意選択により、ｉｉ）Ｃ７〜Ｃ２２アルコール、Ｃ７〜Ｃ２２カルボン酸、Ｃ７〜Ｃ２２カルボン酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ２２アルデヒド、Ｃ７〜Ｃ２２脂肪族アミド、および、これらの混合物からなる群から選択される第２の不水和性有機抽出剤とが接触させられて、水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物が形成される。次いで、上記のとおり、ブタノール含有有機相が水性相から分離される。その後、上記のとおり、ブタノールがブタノール含有有機相から回収される。水性相の少なくとも一部分は発酵培地に戻される。一実施形態においては、発酵培地はエタノールをさらに含み、ブタノール含有有機相はエタノールを含有していることが可能である。
【０１５８】
イソブタノールは、米国特許出願第１２／４７８，３８９号明細書に開示されているとおり、組み換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株を有機抽出剤としてのオレイルアルコールと組み合わせて用いる抽出発酵により生成され得る。この方法では、従来の発酵技術（米国特許出願第１２／４７８，３８９号明細書の実施例６を参照のこと）を用いた場合と比して、イソブタノールに対する高い実効滴定濃度（すなわち３７ｇ／Ｌ）が達成される。例えば、Ａｔｓｕｍｉら（Ｎａｔｕｒｅ，４５１（３）：８６〜９０ページ，２００８年）は、遺伝子組み換えによってイソブタノール生合成経路を有している大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発酵を用いて、２２ｇ／Ｌ以下のイソブタノール滴定濃度を報告している。米国特許出願第１２／４７８，３８９号明細書に開示の抽出発酵法で得られた高いブタノール滴定濃度は、少なくとも部分的に、有害なブタノール生成物を発酵培地から取り出し、これにより、微生物に対して有害であるレベルより低く維持していたことによる。本明細書において定義されているとおり、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比してブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度で少なくとも１種の電解質を発酵培地において用いる本抽出発酵法を同様に用いることで、同様の結果がもたらされるであろうと仮定することは妥当である。
【０１５９】
本明細書に開示の方法によって生成されるブタノールは、２２ｇ／発酵培地１リットルを超える実効滴定濃度を有し得る。あるいは、開示の方法により生成されるブタノールは少なくとも２５ｇ／発酵培地１リットルの実効滴定濃度を有し得る。あるいは、本明細書に記載の方法により生成されるブタノールは、少なくとも３０ｇ／発酵培地１リットルの実効滴定濃度を有し得る。あるいは、本明細書に記載の方法により生成されるブタノールは、少なくとも３７ｇ／発酵培地１リットルの実効滴定濃度を有し得る。
【０１６０】
本方法が、図１〜図７を参照して以下に全体的に説明されている。
【０１６１】
ここで図１を参照すると、インサイチュ抽出発酵を用いてブタノールを生成し、回収するプロセスの一実施形態の概略図が示されている。任意選択により電解質を含有する少なくとも１種の発酵性炭素源の水性流１０が、少なくとも１種の発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生成する少なくとも１種の遺伝子組み換え微生物（図示せず）を含有する発酵槽２０に導入される。任意選択により、電解質は、別個の流れ（図示せず）として発酵槽に加えられてもよい。第１の抽出剤１２の流れおよび任意選択の第２の抽出剤１４の流れが容器１６に導入され、この中で、第１の抽出剤および第２の抽出剤は組み合わされて複合抽出剤１８が形成される。任意選択により、電解質は（図示せず）、流れ１８、容器１６、第１の抽出剤１２の流れ、第２の抽出剤１４の流れ、または、これらの組み合わせに添加され得る。抽出剤１８の流れが発酵槽２０に導入され、この中で、発酵培地と抽出剤との接触が行われて水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物が形成される。水性相および有機相の両方を含む流れ２６が３８容器に導入され、この中で水性相と有機相との分離が実施されてブタノール含有有機相４０および水性相４２が生成される。任意選択により、電解質を含有する水性相４２の少なくとも一部分が発酵槽２０または他の発酵槽（図示せず）に戻される（図示せず）。電解質をプロセスに添加する箇所は、水性相４２中の電解質の濃度が、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比してブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分であるよう選択される。
【０１６２】
ここで図２を参照すると、インサイチュ抽出発酵を用いてブタノールを生成し、回収するプロセスの一実施形態の概略図が示されている。任意選択により電解質を含有する少なくとも１種の発酵性炭素源の水性流１０が、少なくとも１種の発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生成する少なくとも１種の遺伝子組み換え微生物（図示せず）を含有する発酵槽２０に導入される。任意選択により、電解質は、別個の流れ（図示せず）として発酵槽に加えられてもよい。第１の抽出剤１２の流れと任意選択の第２の抽出剤１４の流れとが発酵槽２０に別々に導入され、この中で、発酵培地と抽出剤との接触が行われて水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物が形成される。任意選択により、電解質は（図示せず）、流れ１２、流れ１４、または、これらの組み合わせに添加されてもよい。水性相および有機相の両方を含む流れ２６が３８容器に導入され、この中で水性相と有機相との分離が実施されてブタノール含有有機相４０および水性相４２が生成される。任意選択により、電解質を含有する水性相４２の少なくとも一部分が発酵槽２０または他の発酵槽（図示せず）に戻される（図示せず）。電解質をプロセスに添加する箇所は、水性相４２中の電解質の濃度が、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比してブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分であるよう選択される。
【０１６３】
ここで図３を参照すると、インサイチュ抽出発酵を用いてブタノールを生成し、回収するプロセスの一実施形態の概略図が示されている。任意選択により電解質を含有する少なくとも１種の発酵性炭素源の水性流１０が、少なくとも１種の発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生成する少なくとも１種の遺伝子組み換え微生物（図示せず）を含有する第１の発酵槽２０に導入される。任意選択により、電解質は、別個の流れ（図示せず）として発酵槽に加えられてもよい。第１の抽出剤１２の流れが発酵槽２０に導入され、第１の抽出剤と発酵槽２０の内容物との混合物を含む流れ２２が第２の発酵槽２４に導入される。任意選択の第２の抽出剤１４の流れが第２の発酵槽２４に導入され、この中で発酵培地と抽出剤との接触が行われて水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物が形成される。任意選択により、電解質は（図示せず）、流れ１２、流れ２２、流れ１４、容器２４、または、これらの組み合わせに添加されてもよい。水性相および有機相の両方を含む流れ２６が３８容器に導入され、この中で水性相と有機相との分離が実施されてブタノール含有有機相４０および水性相４２が生成される。任意選択により、電解質を含有する水性相４２の少なくとも一部分が発酵槽２０または他の発酵槽（図示せず）に戻される（図示せず）。電解質をプロセスに添加する箇所は、水性相４２中の電解質の濃度が、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比してブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分であるよう選択される。
【０１６４】
ここで図４を参照すると、生成物の抽出がインサイチュではなく発酵槽の下流で実施される、ブタノールを生成し、回収するプロセスの一実施形態の概略図が示されている。任意選択により電解質を含有する少なくとも１種の発酵性炭素源の水性の流れ１１０が、少なくとも１種の発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生成する少なくとも１種の遺伝子組み換え微生物（図示せず）を含有する発酵槽１２０に導入される。任意選択により、電解質は、別個の流れ（図示せず）として発酵槽に加えられてもよい。第１の抽出剤１１２の流れと任意選択の第２の抽出剤１１４の流れとが容器１１６に導入され、この中で第１の抽出剤および第２の抽出剤が組み合わされて複合抽出剤１１８が形成される。流れ１２２として示される発酵槽１２０中の発酵培地の少なくとも一部が、容器１２４に導入される。任意選択により、電解質は（図示せず）、流れ１１２、流れ１１４、容器１１６、流れ１１８、容器１２４、または、これらの組み合わせに添加されてもよい。抽出剤１１８の流れもまた容器１２４に導入され、この中で発酵培地と抽出剤との接触が行われて水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物が形成される。水性相および有機相の両方を含む流れ１２６が容器１３８に導入され、この中で、水性相と有機相との分離が実施されて、ブタノール含有有機相１４０および水性相１４２が生成される。電解質を含有する水性相１４２の少なくとも一部が発酵槽１２０に、または、任意選択により他の発酵槽（図示せず）に戻される。電解質をプロセスに添加する箇所は、水性相１４２中の電解質の濃度が、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比してブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分であるように選択される。
【０１６５】
ここで図５を参照すると、生成物の抽出がインサイチュではなく発酵槽の下流で実施される、ブタノールを生成し、回収するプロセスの一実施形態の概略図が示されている。任意選択により電解質を含有する少なくとも１種の発酵性炭素源の水性の流れ１１０が、少なくとも１種の発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生成する少なくとも１種の遺伝子組み換え微生物（図示せず）を含有する発酵槽１２０に導入される。任意選択により、電解質は、別個の流れ（図示せず）として発酵槽に加えられてもよい。第１の抽出剤１１２の流れと第２の抽出剤１１４の流れとが別々に容器１２４に導入され、この中で、第１の抽出剤と第２の抽出剤とが組み合わされて複合抽出剤が形成されている。任意選択により、電解質は（図示せず）、流れ１１２、流れ１１４、流れ１２２、容器１２４、または、これらの組み合わせに添加されてもよい。流れ１２２として示されている発酵槽１２０中の発酵培地の少なくとも一部もまた容器１２４に導入され、この中で発酵培地と抽出剤との接触が行われて水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物が形成される。水性相および有機相の両方を含む流れ１２６が容器１３８に導入され、この中で、水性相と有機相との分離が実施されて、ブタノール含有有機相１４０および水性相１４２が生成される。電解質を含有する水性相１４２の少なくとも一部が発酵槽１２０に、または、任意選択により他の発酵槽（図示せず）に戻される。電解質をプロセスに添加する箇所は、水性相１４２中の電解質の濃度が、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比してブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分であるように選択される。
【０１６６】
ここで図６を参照すると、生成物の抽出がインサイチュではなく発酵槽の下流で実施される、ブタノールを生成し、回収するプロセスの一実施形態の概略図が示されている。任意選択により電解質を含有する少なくとも１種の発酵性炭素源の水性の流れ１１０が、少なくとも１種の発酵性炭素源を含む発酵培地からブタノールを生成する少なくとも１種の遺伝子組み換え微生物（図示せず）を含有する発酵槽１２０に導入される。任意選択により、電解質は、別個の流れ（図示せず）として発酵槽に加えられてもよい。第１の抽出剤１１２の流れが容器１２８に導入され、および、流れ１２２として示される発酵槽１２０中の発酵培地の少なくとも一部もまた容器１２８に導入される。任意選択により、電解質は（図示せず）、流れ１２２、流れ１１２、容器１２８、または、これらの組み合わせに添加されてもよい。第１の抽出剤と発酵槽１２０の内容物との混合物を含む流れ１３０が第２の容器１３２に導入される。任意選択により、電解質は（図示せず）、流れ１３０、流れ１１４、容器１３２、または、これらの組み合わせに添加されてもよい。任意選択の第２の抽出剤１１４の流れが第２の容器１３２に導入され、この中で発酵培地と抽出剤との接触が行われて水性相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物が形成される。水性相および有機相の両方を含む流れ１３４が容器１３８に導入され、この中で、水性相と有機相との分離が実施されて、ブタノール含有有機相１４０および水性相１４２が生成される。電解質を含有する水性相１４２の少なくとも一部が発酵槽１２０に、または、任意選択により他の発酵槽（図示せず）に戻される。電解質をプロセスに添加する箇所は、水性相１４２中の電解質の濃度が、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比してブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分であるように選択される。
【０１６７】
本明細書に記載の抽出プロセスは、回分式プロセスとして行われることが可能であり、または、発酵プロセス全体を通して発酵槽中の抽出剤の量が一定に維持されるよう新たな抽出剤が添加され、用いられた抽出剤が送出される連続形態で行われることが可能である。このような発酵からの生成物および副産物の連続抽出は、実効速度、滴定濃度および収率を高めることが可能である。
【０１６８】
さらに他の実施形態において、液体−液体抽出を、一連の回分発酵槽が用いられる場合の回分式操作プロファイルにおける偏差を解消する、自由度の高い並流、または、代わりに、向流法で操作することも可能である。このシナリオにおいては、プラントが操業されている限り、少なくとも１種の発酵性炭素源を供給する発酵性マッシュと微生物とが、複数の発酵槽に順次に連続的に充填される。図７を参照すると、発酵槽Ｆ１００に一旦マッシュおよび微生物が充填されると、マッシュおよび微生物供給物は、連続ループ式に、発酵槽Ｆ１０１に、次いで発酵槽Ｆ１０２に進み、次いで発酵槽Ｆ１００に戻される。電解質は（図示せず）、１つ以上の発酵槽、発酵槽に入る流れ、発酵槽を出る流れ、または、これらの組み合わせに添加されてもよい。いずれか一つの発酵槽における発酵はマッシュおよび微生物が一旦一緒になって存在してから開始され、発酵が完了するまで継続する。マッシュおよび微生物の充填時間は、発酵槽の数を総サイクル時間（充填、発酵、排出、および、洗浄）で除したものに等しい。総サイクル時間が６０時間であると共に３つの発酵槽がある場合、充填時間は、２０時間である。総サイクル時間が６０時間であると共に４つの発酵槽がある場合、充填時間は１５時間である。
【０１６９】
適応性の並流抽出は、高い液体培地相滴定濃度で操作される発酵槽はブタノール濃度が最も高い抽出溶剤流を利用することが可能であると共に、最も低い液体培地相滴定濃度で操作される発酵槽ではブタノール濃度が最も低い抽出溶剤流が有効であろうことが仮定される発酵プロファイルに従う。例えば、図７を再度参照すると、発酵槽Ｆ１００が発酵の開始点であって、比較的低いブタノール液体培地相（Ｂ）滴定濃度で操作され、発酵槽Ｆ１０１は発酵の中間にあって、比較的中程度のブタノール液体培地相滴定濃度で操作され、および、発酵槽Ｆ１０２は発酵の終了に近く、比較的高いブタノール液体培地相滴定濃度で操作される事例が考慮されている。この場合、ブタノールがほとんどもしくはまったく抽出されていない希薄抽出溶剤（Ｓ）が発酵槽Ｆ１００に供給されることが可能であり、次いで、一定のブタノール成分が抽出された発酵槽Ｆ１００からの「流出溶剤」流（Ｓ’）が「流入溶剤」流として発酵槽Ｆ１０１に供給されることが可能であり、および、Ｆ１０１からの流出溶剤流が、次いで、流入溶剤流として発酵槽Ｆ１０２に供給されることが可能である。次いで、Ｆ１０２からの流出溶剤流が、流れ中に存在するブタノールの回収処理のために送られることが可能である。ブタノールの大部分が除去された処理済みの溶剤流は、希薄抽出溶剤として系に戻されることが可能であり、上記発酵槽Ｆ１００への流入溶剤供給物となる。
【０１７０】
発酵は系統だって進行されるため、抽出溶剤マニホルドにおけるバルブは、最も希薄な抽出溶剤が最も低いブタノール液体培地相滴定濃度で操作される発酵槽に供給されるよう転位されることが可能である。例えば、（ａ）発酵槽Ｆ１０２で発酵が完了し、再度仕込まれて発酵が新たに開始され、（ｂ）発酵槽Ｆ１００は発酵の中間にあって、中程度のブタノール液体培地相滴定濃度で操作されており、および、（ｃ）発酵槽Ｆ１０１は発酵の終了に近く、比較的高いブタノール液体培地相滴定濃度で操作されていると仮定する。このシナリオにおいては、最も希薄な抽出溶剤がＦ１０２に供給され、Ｆ１０２を出る抽出溶剤が発酵槽Ｆ１００に供給され、および、発酵槽Ｆ１００を出る抽出溶剤が発酵槽Ｆ１０１に供給されることとなる。
【０１７１】
この方法での操作の利点は、可能な限りの間、液体培地相ブタノール滴定濃度が可能な限り低く維持されて生成性が向上されることである可能性がある。また、より高いブタノール液体培地相滴定濃度で操作されており、発酵がさらに進行している他の発酵槽における温度を低下させることが可能である可能性がある。温度の低下は、より高いブタノール液体培地相滴定濃度に対する耐性を向上させる可能性がある。
【０１７２】
本方法の利点
本抽出発酵法は、ガソリンと同様のエネルギー含有量を有し、かつ、任意選択の化石燃料とブレンドすることが可能であるブタノールを提供する。ブタノールは、標準的な内燃機関において燃焼された場合に、ＣＯ２のみをもたらし、ＳＯＸまたはＮＯＸをほとんど、もしくは、全くもたらさないために、燃料または燃料添加剤として好まれている。また、ブタノールはエタノールよりも腐食性が低く、現時点において、最も好ましい燃料添加剤である。
【０１７３】
バイオ燃料または燃料添加剤としての実用性に追加して、本方法により生成されるブタノールは、台頭しつつある燃料電池産業における水素流通問題に影響を与える潜在性を有している。今日における燃料電池は、水素の輸送および流通に関連する安全性に対する懸念により悩まされている。ブタノールは、その水素含有量について容易に改質されることが可能であり、および、燃料電池または車両に要求される純度で、既存の給油所を介して流通されることが可能である。しかも、本方法は、植物由来の炭素源からブタノールを生成するものであって、ブタノール生成に関する標準的な石油化学的プロセスに関連する環境に対する悪影響が回避されている。
【０１７４】
本方法の利点は、発酵基礎培地における塩濃度の存在下でのブタノール分配係数と比して、ブタノール分配係数を高めるのに少なくとも十分な濃度での少なくとも１種の電解質の添加が伴わない二相抽出発酵プロセスにより得られるブタノールの閾値レベルよりも顕著に高い正味実効速度、滴定濃度、および、収率、ならびに、高い経済性でのブタノールの生成の実現可能性を含んでいる。本方法はまた、回分発酵からのブタノール生成を所望のレベルで達成するために必要とされる新たなまたは再利用抽出剤の正味量を低減させることが可能である。
【０１７５】
実施例
本発明が以下の実施例においてさらに定義されている。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、単なる例示のためにもたらされていることが理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を把握することが可能であり、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の用途および条件に適応させるために本発明に種々の変形および組み換えを成すことが可能である。
【０１７６】
材料
以下の材料を実施例において用いた。すべての市販されている試薬は入手したままで用いた。
【０１７７】
すべての溶剤はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手し、さらに精製することなく用いた。用いたオレイルアルコールは工業銘柄であり、オレイルアルコール（６５％）と、より高級およびより低級脂肪族アルコールとの混合物を含有していた。イソブタノール（純度９９．５％）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、さらに精製することなく用いた。硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４，ＣＡＳ７７５７−８２−６，純度９９％超）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ，ＣＡＳ７６４７−１４−５，工業銘柄）は、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入した。
【０１７８】
一般的な方法
微生物細胞濃度を計測するための光学密度の読み取りを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｈｅｌｉｏｓ  Ａｌｐｈａ分光測光計を用いて行った。計測は、典型的には、６００ナノメートルの波長を用いて行った。
【０１７９】
培養液体培地中のグルコース濃度を、２７００  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ）を用いて迅速に計測した。培養液体培地サンプルを、室温で、２分間、１．８ｍＬ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に１３，２００ｒｐｍで遠心分離し、および、水性の上澄みをグルコース濃度について分析した。分析機は、各組の発酵槽サンプルのアッセイをする前に既知のグルコース標準で自己較正を行った；外部標準もまた定期的にアッセイして培養液体培地アッセイの一貫性を保証した。分析のための分析機の仕様は以下のとおりであった：
サンプルサイズ：１５μＬ
黒色プローブの化学物質：ブドウ糖
白色プローブの化学物質：ブドウ糖
水性相中のイソブタノールおよびグルコース濃度は、適切なガードカラムを備えたＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム、７．８ｍｍ×３００ｍｍ、（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いるＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｍｏｄｅｌ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡまたはＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で、溶出液として均一濃度の０．０１Ｎ水性硫酸を使用して計測した。サンプルを、０．２μｍ遠心フィルタ（Ｎａｎｏｓｅｐ  ＭＦ変性ナイロン）を通してＨＰＬＣバイアルに入れた。ＨＰＬＣの実施条件は以下のとおりであった：
注入体積：１０μＬ
流速：０．６０ｍＬ／分
実施時間：４０分間
カラム温度：４０℃
検出器：屈折率
検出器温度：３５℃
ＵＶ検出：２１０ｎｍ、８ｎｍ帯域幅
【０１８０】
ＨＰＬＣを行った後、サンプル中の濃度を化合物の各々の検量線から判定した。保持時間は、イソブタノールおよびグルコースについて、それぞれ、３２．６および９．１分間であった。
【０１８１】
有機抽出剤相中のイソブタノールおよびエタノールを以下に記載のとおり、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）を用いて計測した。
【０１８２】
以下のＧＣ法を用いて有機相中のイソブタノールおよびエタノールの量を測定した。ＧＣ法では、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）製のＪ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲカラム（５０ｍ×０．３２ｍｍ  ＩＤ，１μｍフィルム）を利用した。キャリアガスは、一定のヘッド圧力で、４ｍＬ／ｍｉｎの流速のヘリウム；インジェクタスプリットは２５０℃で１：５；オーブン温度は、４０℃で５ｍｉｎ、１０℃／ｍｉｎで４０℃〜２３０℃、および、２３０℃で５ｍｉｎであった。炎イオン化検出を２５０℃で、４０ｍＬ／ｍｉｎのヘリウム補給ガスで用いた。培養液体培地サンプルを注入の前に遠心分離した。注入体積は１．０μＬであった。較正検量線をエタノールおよびイソブタノールに関して生成した。これらの条件下で、イソブタノールの保持時間は９．９分間であり、および、エタノールの保持時間は８．７分間であった。
【０１８３】
ｐｆｌＢ、ｆｒｄＢ、ｌｄｈＡ、および、ａｄｈＥ遺伝子の欠失を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築
ｐｆｌＢ、ｆｒｄＢ、ｌｄｈＡ、および、ａｄｈＥ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から欠如させるための好適な方法が本明細書に提供されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のＫｅｉｏ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂａｂａら，Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．，２：１−１１，２００６年）を用いて、８種のノックアウトを生成した。Ｋｅｉｏ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（日本の国立遺伝学研究所のＮＢＲＰから入手可能）は、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．＆Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９７：６６４０〜６６４５ページ，２０００年）により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＷ２５１１３において作成された単一遺伝子ノックアウトのライブラリである。このコレクションにおいて、欠失遺伝子の各々を、Ｆｌｐリコンビナーゼによって除去可能なＦＲＴ−隣接カナマイシンマーカで置換した。複数のノックアウトを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、Ｋｅｉｏドナー菌株由来のノックアウト−カナマイシンマーカをバクテリオファージＰ１形質導入によってレシピエント菌株に移すことにより構築した。ノックアウトを生成する各Ｐ１形質導入の後、カナマイシンマーカをＦｌｐリコンビナーゼにより除去した。このマーカレス菌株は、次のＰ１形質導入のための新たなレシピエント菌株として機能した。既述のノックアウトの１つを、Ｐ１形質導入ではなく、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ法（前述）を用いて菌株において直接的に構築した。
【０１８４】
４ＫＯ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、Ｋｅｉｏ菌株ＪＷ０８８６において、３種のＫｅｉｏ菌株から調製したＰ１ファージライセートでＰ１ｖｉｒ形質導入により構築した。用いたＫｅｉｏ菌株が以下に列挙されている：
−ＪＷ０８８６：ｋａｎマーカがｐｆｌＢに挿入されている
−ＪＷ４１１４：ｋａｎマーカがｆｒｄＢに挿入されている
−ＪＷ１３７５：ｋａｎマーカがｌｄｈＡに挿入されている
−ＪＷ１２２８：ｋａｎマーカがａｄｈＥに挿入されている
［不活化遺伝子に対応している配列は：ｐｆｌＢ（配列番号：７１）、ｆｒｄＢ（配列番号：７３）、ｌｄｈＡ（配列番号：７７）、ａｄｈＥ（配列番号：７５）である。］
【０１８５】
染色体からのＦＲＴ−隣接カナマイシンマーカの除去を、カナマイシン耐性菌株をｐＣＰ２０アンピシリン耐性プラスミド（ＣｈｅｒｅｐａｎｏｖおよびＷａｃｋｅｒｎａｇｅｌ，前述のとおり））で形質転換することにより実施した。形質転換体を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢプレート上に塗布した。プラスミドｐＣＰ２０は、λＰＲプロモータの調節下でイースト菌ＦＬＰリコンビナーゼを有しており、このプロモータ由来の発現はプラスミドに存在するｃＩ８５７温度感受性レプレッサによって調節される。ｐＣＰ２０の複製起点もまた温度感受性である。
【０１８６】
染色体からのｌｏｘＰ−隣接カナマイシンマーカの除去を、カナマイシン耐性菌株をバクテリオファージＰ１  Ｃｒｅリコンビナーゼに保持されるｐＪＷ１６８アンピシリン耐性プラスミド（Ｗｉｌｄら，Ｇｅｎｅ．２２３：５５〜６６ページ，１９９８年）で形質転換することにより実施した。Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｈｏｅｓｓ，Ｒ．Ｈ．＆Ａｂｒｅｍｓｋｉ，Ｋ．，前述のとおり）は、ｌｏｘＰ部位での組み換えを介するカナマイシン耐性遺伝子の切断を仲介する。ｐＪＷ１６８の複製起点は温度感受性ｐＳＣ１０１である。形質転換体を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢプレート上に塗布した。
【０１８７】
菌株ＪＷ０８８６（ΔｐｆｌＢ：：ｋａｎ）をプラスミドｐＣＰ２０で形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプレート上に３０℃で塗布した。次いで、アンピシリン耐性形質転換体を選択し、ＬＢプレート上にストリークし、および、４２℃で増殖させた。単離したコロニーをアンピシリンおよびカナマイシン選択培地プレートおよびＬＢプレート上でパッチ培養した。カナマイシン感受性コロニーおよびアンピシリン感受性コロニーを、プライマーｐｆｌＢ  ＣｋＵｐ（配列番号：７８）およびｐｆｌＢ  ＣｋＤｎ（配列番号：７９）を伴うコロニーＰＣＲによりスクリーニングした。１０μＬアリコートのＰＣＲ反応混合物をゲル電気泳動により分析した。予期していた概ね０．４ｋｂのＰＣＲ生成物は、マーカの除去、および、「ＪＷ０８８６マーカレス」菌株の作成が確認された。この菌株はｐｆｌＢ遺伝子の欠失を有している。
【０１８８】
「ＪＷ０８８６マーカレス」菌株にＪＷ４１１４（ｆｒｄＢ：：ｋａｎ）由来のＰ１ｖｉｒライセートを形質導入し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢプレート上にストリークした。カナマイシン耐性形質導入体を、プライマーｆｒｄＢ  ＣｋＵｐ（配列番号：８０）およびｆｒｄＢ  ＣｋＤｎ（配列番号：８１）を伴うコロニーＰＣＲによりスクリーニングした。予期していた概ね１．６ｋｂのＰＣＲ生成物を生成したコロニーをエレクトロコンピテントとし、上記のとおりマーカ除去のためにｐＣＰ２０で形質転換した。先ず、形質転換体を、３０℃で、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢプレート上に塗布し、次いで、アンピシリン耐性形質転換体を選択し、ＬＢプレート上にストリークし、および、４２℃で増殖させた。単離したコロニーを、アンピシリンおよびカナマイシン選択培地プレートおよびＬＢプレート上でパッチ培養した。カナマイシン感受性、アンピシリン感受性コロニーを、プライマーｆｒｄＢ  ＣｋＵｐ（配列番号：８０）およびｆｒｄＢ  ＣｋＤｎ（配列番号：８１）を伴うＰＣＲによりスクリーニングした。予期していた概ね０．４ｋｂのＰＣＲ生成物は、マーカ除去、および、ダブルノックアウト菌株、「ΔｐｆｌＢ  ｆｒｄＢ」の作成が確認された。
【０１８９】
ダブルノックアウト菌株にＪＷ１３７５（ΔｌｄｈＡ：：ｋａｎ）由来のＰ１ｖｉｒライセートを形質導入し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢプレート上に塗布した。カナマイシン耐性形質導入体を、プライマーｌｄｈＡ  ＣｋＵｐ（配列番号：８２）およびｌｄｈＡ  ＣｋＤｎ（配列番号：８３）を伴うコロニーＰＣＲによりスクリーニングした。予期していた１．５ｋｂのＰＣＲ生成物を生成するクローンをエレクトロコンピテントとし、上記のとおりマーカ除去のためにｐＣＰ２０で形質転換した。形質転換体を、３０℃で、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢプレート上に塗布し、アンピシリン耐性形質転換体をＬＢプレート上にストリークし、および、４２℃で増殖させた。単離したコロニーをアンピシリンおよびカナマイシン選択培地プレートおよびＬＢプレート上でパッチ培養した。カナマイシン感受性、アンピシリン感受性コロニーを、０．３ｋｂ生成物について、プライマーｌｄｈＡ  ＣｋＵｐ（配列番号：８２）およびｌｄｈＡ  ＣｋＤｎ（配列番号：８３）を伴うＰＣＲによりスクリーニングした。予期していた概ね０．３ｋｂのＰＣＲ生成物を生成したクローンは、マーカの除去が確認され、「３ＫＯ」（ΔｐｆｌＢ  ｆｒｄＢ  ｌｄｈＡ）と称されるトリプルノックアウト菌株を作成した。
【０１９０】
菌株「３ＫＯ」に、ＪＷ１２２８（ΔａｄｈＥ：：ｋａｎ）由来のＰ１ｖｉｒライセートを形質導入し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢプレート上に塗布した。カナマイシン耐性形質導入体を、プライマーａｄｈＥ  ＣｋＵｐ（配列番号：８４）およびａｄｈＥ  ＣｋＤｎ（配列番号：８５）を伴うコロニーＰＣＲによりスクリーニングした。予期していた１．６ｋｂのＰＣＲ生成物を生成したクローンを３ＫＯ  ａｄｈＥ：：ｋａｎと命名した。菌株３ＫＯａｄｈＥ：：ｋａｎをエレクトロコンピテントとし、マーカ除去のためにｐＣＰ２０で形質転換した。形質転換体を、３０℃で、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢプレート上に塗布した。アンピシリン耐性形質転換体を、ＬＢプレート上にストリークし、および、４２℃で増殖させた。単離したコロニーをアンピシリンおよびカナマイシン選択プレートおよびＬＢプレート上にパッチ培養した。カナマイシン感受性、アンピシリン感受性コロニーを、プライマーａｄｈＥ  ＣｋＵｐ（配列番号：８４）およびａｄｈＥ  ＣｋＤｎ（配列番号：８５）を伴うＰＣＲによりスクリーニングした。予期していた概ね０．４ｋｂのＰＣＲ生成物を生成したクローンを「４ＫＯ」（ΔｐｆｌＢ  ｆｒｄＢ  ｌｄｈＡ  ａｄｈＥ）と命名した。
【０１９１】
イソブタノール生合成経路、ならびに、ｐｆｌＢ、ｆｒｄＢ、ｌｄｈＡおよびａｄｈＥ遺伝子の欠失を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）生成ホスト（菌株ＮＧＣＩ−０３１）の構築
アクロモバクターキシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のｓａｄＢ（ブタノールデヒドロゲナーゼ）（ＤＮＡ配列番号：９；タンパク質配列番号：１０）をコードするＤＮＡ断片を、標準条件を用いて、Ａ．キシロソキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ゲノムＤＮＡから増幅した。ＤＮＡを、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号Ｄ−５５００Ａ）を用い、グラム陰性生体に対して推奨されるプロトコルに従って調製した。順方向および逆方向プライマーＮ４７３およびＮ４６９（配列番号：８６および８７）を用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に対してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ生成物をｐＣＲ４ＢＬＵＮＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔクローン化して、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢを生成し、これを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ−１細胞に形質転換した。その後、プラスミドを４つのクローンから単離し、配列を検証した。
【０１９２】
次いで、ｓａｄＢコード領域をベクタｐＴｒｃ９９ａにクローン化した（Ａｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ，６９：３０１〜３１５ページ，１９８８年）。ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢをＥｃｏＲＩで消化し、ｓａｄＢ断片を放出し、これを、ＥｃｏＲＩで消化したｐＴｒｃ９９ａと共にライゲートしてｐＴｒｃ９９ａ：：ｓａｄＢを生成した。このプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ１細胞に形質転換し、得られた形質転換体をＭａｃｈ１／ｐＴｒｃ９９ａ：：ｓａｄＢと命名した。これらの細胞においてｓａｄＢ遺伝子から発現される酵素の活性は、イソブチルアルデヒドを標準として用いて分析した場合、無細胞抽出物中に３．５ｍｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質であると測定された。
【０１９３】
次いで、以下に記載のとおり、ｓａｄＢ遺伝子をｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤにサブクローン化した。ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤは、イソブタノール発現のためのオペロンを有するｐＴｒｃ−９９ａ発現ベクタである（米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書の実施例９〜１４に記載されている）。ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤイソブタノールオペロン中の第１の遺伝子は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ２５９５５由来のアセト乳酸シンターゼをコードするｂｕｄＢ、続いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼをコードするｉｌｖＣ遺伝子である。これに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤが続き、および、最後に乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）由来の分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼをコードするｋｉｖＤ遺伝子が続く。
【０１９４】
ｓａｄＢコード領域を、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）と共にプライマーＮ６９５Ａ（配列番号：８８）およびＮ６９６Ａ（配列番号：８９）を用いて、ｐＴｒｃ９９ａ：：ｓａｄＢから増幅した。増幅は、９８℃で１ｍｉｎの初期変性、続いて、９８℃での１０ｓｅｃの変性を３０サイクル、６２℃で３０ｓｅｃのアニーリング、７２℃で２０ｓｅｃの延長、および、７２℃で５ｍｉｎの最終延長サイクル、続いて４℃での保持で実施した。プライマーＮ６９５Ａは、クローニングのためのＡｖｒＩＩ制限部位およびｓａｄＢコード領域のＡＴＧ開始コドンの上流にＲＢＳを有していた。Ｎ６９６Ａプライマーは、クローニングのためのＸｂａＩ部位を含んでいた。１．１ｋｂのＰＣＲ生成物をＡｖｒＩＩおよびＸｂａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化し、ゲルをＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を用いて精製した。精製した断片を、同一の制限酵素で切断されたｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤと共に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いてライゲートした。ライゲーション混合物を１６℃で一晩インキュベートし、次いで、製造業者のプロトコルに従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ１（商標）コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天上で増殖させた後に得た。形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを、製造業者によるプロトコルに従って、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製した。得られたプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｓａｄＢと呼んだ。
【０１９５】
４ＫＯ菌株のエレクトロコンピテント細胞を既述のとおり調製し、ｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｓａｄＢ（「ｐＢＣＤＤＢ」）で形質転換した。形質転換体を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上にストリークした。プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ：：ｂｕｄＢ−ｉｌｖＣ−ｉｌｖＤ−ｋｉｖＤ−ｓａｄＢを４ＫＯと共に有する得られた菌株（菌株ＮＧＣＩ−０３１とした）を、示した実施例における発酵研究に用いた。
【０１９６】
実施例１
分配係数（Ｋｐ）に対する電解質濃度の影響
この実施例の目的は、オレイルアルコールを抽出剤として用いた場合の、イソブタノールの分配係数（Ｋｐ）に対する発酵培地中の電解質濃度の影響を評価することであった。この実施例においては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵において典型的に用いられる発酵基礎培地（ＢＦＭ）を発酵培地として用いた。ＢＦＭ組成物は表２に示されている。
【０１９７】
【表４】
2013511283.tif 000006
【０１９８】
上記培地において用いた微量元素溶液は以下の通り調製した。以下に列挙した配合成分を列挙されている順番に加え、すべての成分が完全に溶解するまで溶液は５０〜６０℃に加熱される。他の配合成分が溶解した後にクエン酸第二鉄を徐々に添加した。溶液を０．２ミクロンフィルタを用いてろ過滅菌した。
【０１９９】
【表５】
2013511283.tif 000007
【０２００】
表２に示されているＢＦＭ中の塩全体（一塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸アンモニウム、クエン酸一水和物、および、硫酸マグネシウム七水和物の和）の初期レベルは約１４４．２ｍＭと算出される。以下に示した実施例において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）生体触媒を用いたため、文献（Ｃｏｓｑｕｅｒ  Ａら；１９９９年；Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６５：３３０４〜３３１１ページ）において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の塩耐性を向上させることが報告されていることを理由として、塩酸ベタイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．３１ｇ／Ｌ（２モル／Ｌ）で発酵基礎培地に添加した。
【０２０１】
以下の実験手法を用いて表３および表４中のデータを生成した。これらのＫｐ計測実験においては、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）として特定量の電解質を発酵基礎培地に添加した。３０ｍＬの電解質−補足ＢＦＭに、１６８ｇ／Ｌのイソブタノールを含有する富イソブタノールオレイルアルコール（ＯＡ）抽出剤１０ｍＬを添加し、卓上振盪機（Ｉｎｎｏｖａ  ４２３０，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）中で２５０ｒｐｍで撹拌して、３０℃で約４〜８時間激しく混合して２つの相の間で平衡を得た。各フラスコ中の水性相および有機相を傾瀉により分離した。水性相を遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機モデル５４１５Ｒで、１３，０００ｒｐｍで２分間）して、残存する抽出剤相を除去し、上澄みを、グルコースおよびイソブタノールについてＨＰＬＣにより分析した。撹拌から４時間後の水性相中のイソブタノールレベルの分析は混合から８時間後に得られたものと同様であり、２つの相の間の平衡は４時間以内で得られたことが示唆された。４時間を超えるさらなる混合はＫｐを変化させなかったことを示すことが意図されていた。
【０２０２】
有機相と水性相との間のイソブタノールの分布に関する分配係数（Ｋｐ）を、フラスコに加えた既知の量のイソブタノールと水性相で計測されたイソブタノール濃度データとから算出した。抽出剤相中のイソブタノールの濃度は質量バランスにより判定した。分配係数は、有機相と水性相との中のイソブタノール濃度の比、すなわち、Ｋｐ＝［イソブタノール］有機相／［イソブタノール］水性相として判定した。表３および表４に示されている特定のレベルの電解質に対応する各データ点は２回反復されており、および、Ｋｐに対する値は２つのフラスコの平均として報告されている。
【０２０３】
【表６】
2013511283.tif 000008
【０２０４】
【表７】
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【０２０５】
表３および４からの結果は、電解質Ｎａ２ＳＯ４およびＮａＣｌによる水性発酵培地の補足は、抽出剤相としてオレイルアルコールを含む二相系におけるイソブタノールのＫｐを高めることを実証する。
【０２０６】
実施例２
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖速度に対する電解質補足の影響
生体触媒の増殖特性に対するＮａ２ＳＯ４などの電解質の影響を評価するために、４ＫＯ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、０．３１ｇ／ｌの塩酸ベタインおよび異なるレベルのＮａ２ＳＯ４（０〜２８４ｇ／Ｌ）で補足した振盪フラスコ中のＢＦＭ培地で、３０℃、２５０ｒｐｍで、Ｉｎｎｏｖａ卓上振盪機で増殖させた。冷凍バイアルから、２５ｍＬの種培養を、ＢＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｃｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，２１１５２，ＵＳＡ）から購入したＤｉｆｃｏ  ＬＢ液体培地、Ｍｉｌｌｅｒ培地中で、３０℃、２００ＲＰＭで増殖させた。この種培養の１ｍＬを、０．３１ｇ／Ｌの塩酸ベタインおよび様々なレベルのＮａ２ＳＯ４で補足した３０ｍＬのＢＦＭ培地を含有する振盪フラスコに添加した。規定の時点でサンプルを採り、ＯＤ６００により計測してバイオマスの増殖を監視した。指数関数的な増殖速度式を適用することによりバイオマス時間プロファイルから増殖速度を算出した。
【０２０７】
【表８】
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【０２０８】
表５に示されている増殖速度データは、生体触媒は、電解質を含まない対照と比して３０％の増殖速度の損失を伴いながらも、約０．６７Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４（０．８１Ｍの合計塩レベル）もの高さの塩レベルに耐えることが可能であることを示唆する。しかしながら、１Ｍ塩濃度で増殖速度の顕著な低下（約８０％超）が見られる。表３中のデータは、抽出剤相としてオレイル−アルコールが存在している場合には、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋｐの０．６７Ｍ濃度では、塩の添加を伴わない対照と比して、ブタノールが２倍に増加していることを示す。それ故、組換え型ブタノール生成微生物を用いる二相抽出発酵への電解質添加の正味の全体的な影響は、電解質は一方では細胞の増殖を阻害することが可能であり（表３）、他方では、有害なブタノール生成物の分配係数を高めることが可能であり、これは、微生物に対する悪影響を軽減することが可能であるため、予測が不可能である可能性がある。
【０２０９】
実施例３
二相抽出発酵プロセスにおけるブタノール生成の速度、滴定濃度および収率に対する電解質添加の影響
この実施例の目的は、組換え型微生物（イソブタノール生合成経路を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＮＧＣＩ−０３１）株）によってブタノールが生成される二相抽出発酵の水性相への少なくとも十分な量の電解質の添加による利点を実証することであった。抽出発酵は、不水和性有機抽出剤としてオレイルアルコールを用いる。
【０２１０】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＮＧＣＩ−０３１を、本明細書における上記一般的な方法の項に記載のとおり構築した。種菌調製のためのすべての種培養は、選択抗生物質としてアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地で増殖させた。用いた発酵培地は２ミリモル／Ｌの塩酸ベタインで補足した半合成培地であり、その組成は表６に示されている。
【０２１１】
【表９】
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【０２１２】
【表１０】
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【０２１３】
表６からの配合成分１〜１１を所定の濃度で水に加えて、発酵槽中に０．４Ｌの最終体積とした。発酵槽の内容物を加圧滅菌により滅菌した。成分１２〜１４を混合し、ろ過滅菌し、および、加圧滅菌した培地が冷却されてから発酵槽に添加した。発酵培地（水性相）の合計最終体積は、５０ｍＬの種菌の添加後で約０．５Ｌであった。
【０２１４】
電解質の形態でＮａ２ＳＯ４を、０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌまたは６０ｇ／Ｌ濃度で滅菌前の培地に添加した。アンピシリン、塩酸チアミン、および、グルコースのろ過滅菌した溶液を、滅菌した後に発酵槽培地に、それぞれ、１００ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌおよび２０ｇ／Ｌの最終濃度で添加した。１Ｌの加圧滅菌可能なバイオリアクタである、Ｂｉｏ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  ＡＤＩ１０２５（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｉｎｃ，Ｈｏｌｌａｎｄ）（９００ｍＬの実容積を有する）を用いて発酵を行った。発酵全体を通して温度を３０℃に維持し、および、ｐＨは水酸化アンモニウムを用いて６．８に維持した。種培養（２〜１０ｖｏｌ％）による滅菌発酵培地への播種に続いて、発酵槽を、撹拌速度（ｒｐｍ）の自動制御により、０．３ｖｖｍの空気流を伴う３０％溶解酸素（ＤＯ）設定点で、好気的に操作した。一旦所望の光学密度（ＯＤ６００）に達したら（すなわち、ＯＤ６００＝１０）、０．４〜０．５ｍｍイソプロピルβ−Ｄ−１チオガラクトピラノシドの添加で培養物を誘起してイソブタノール生合成経路を過剰発現させた。誘起から４時間、発酵条件を、空気流を０．１３ｓｌｐｍに低減し、および、ＤＯ設定点を３〜５％に設定することにより微好気性条件に切り替えた。微好気性条件への移行によりイソブタノール生成を開始させ、一方で、バイオマス生成に向かう炭素量を最低限とし、これにより、イソブタノール生成からバイオマス形成を脱共役させた。オレイルアルコール（約２５０ｍＬ）をイソブタノール生成相の最中に添加して、水性相中へのイソブタノールの蓄積による阻害の問題を軽減した。グルコースレベルを２０ｇ／Ｌ〜２ｇ／Ｌに維持するための必要性に応じて、グルコースをボーラスとして（５０重量％ストック溶液）発酵槽に添加した。
【０２１５】
イソブタノールの効率的な生成は、生合成経路におけるレドックスバランスをとるために微好気性条件を必要とするため、０．３ｖｖｍで空気を連続的に発酵槽に供給した。継続的な曝気は、発酵槽の水性相からのイソブタノールの顕著なストリッピングをもたらした。ストリッピングによるイソブタノールの損失を定量化するために、発酵槽からの排ガスを質量分析計（Ｐｒｉｍａ  ｄＢ質量分析計，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に直接的に送って、ガス流中のイソブタノールの量を定量化した。７４または４２の質量対充填の比でのイソブタノールピークを連続的に監視して、ガス流中のイソブタノールの量を定量化した。
【０２１６】
イソブタノール生成、実効滴定濃度、実効速度、および、実効収率に関して、ストリッピングによるイソブタノールの損失に対して補正したすべてが作表されて以下に示されている（表８）。水性相中のイソブタノールは本明細書に上述されているＨＰＬＣ法を用いて計測した。オレイル−アルコール抽出剤相中のイソブタノールは本明細書に上述されているＧＣ法を用いて計測した。グルコースレベルは本明細書において上記のとおりＨＰＬＣおよびＹＳＩを用いて監視した。
【０２１７】
表８中の結果に見ることが可能であるとおり、イソブタノール生成のための抽出発酵における電解質の使用は、塩の添加が行われない場合と比して、顕著に高い実効滴定濃度、実効速度、および、実効収率をもたらす。細菌性ホストに有害であるイソブタノール生成物は、オレイルアルコール相に連続的に抽出されて、水性相におけるその濃度が低減され、これにより、微生物に対する毒性が低減される。また、培地に塩が添加された場合に、意図されていなかった実効速度、実効滴定濃度、および、実効収率の向上が観察されている。塩の添加は、原理上、ブタノール生成生体触媒の代謝に有害な効果を有する可能性があるだけではなく、塩が無添加の対照と比してブタノールのＫｐを高めることによりブタノールの阻害性効果をも軽減させる可能性がある。本発明者らの二相抽出系における塩の添加正味の効果は、ブタノールの生成および回収の増加を支持する。
【０２１８】
【表１１】
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【０２１９】
実施例４
発酵中のブタノールのガスストリッピングが組み合わされたブタノール生成の速度、滴定濃度および収率に対する電解質添加の影響
オレイルアルコール抽出剤の添加が伴わない水性相発酵の最中のブタノール生成に対する電解質添加の影響を評価するために、発酵槽のいずれにもオレイル−アルコールを添加しなかったことを除き、実施例３を繰り返した。この実施例においては、発酵槽の空気スパージングにより、水性相からのブタノールのガスストリッピングが優勢であった。排ガスにストリップされたブタノールの量を質量分析装置を用いて実施例３のように定量化した。ストリッピングによるブタノール損失に対して補正した実効速度、滴定濃度、および、収率のすべてが以下の表９に示されている。
【０２２０】
【表１２】
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【０２２１】
表９からの結果は、オレイルアルコールの不在下で、イソブタノールのストリッピング量を高めることにより、水性相への電解質の添加がブタノール生成の速度、滴定濃度、および、収率を高めることを示す。ストリップされたブタノールのグラム数は、電解質が無添加の場合と比して塩の存在下では略２倍高い。
【０２２２】
本発明の特定の実施形態が前述の説明において記載されているが、本発明は、本発明の趣旨または基本的な特性から逸脱することなく、数多くの変更、置き換え、および、変形が可能であることが当業者により理解されているであろう。本発明の範囲を示すものとして、前述の明細書ではなく添付の特許請求の範囲が参照されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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