(57)【要約】  本願発明は腫瘍の治療の分野にある。分化された複数の細胞型への分化能を有する成体幹細胞を液体細胞培地にて培養することより得られる訓化培地および／または訓化培地をそこから得ることできる成体幹細胞が、著しい抗腫瘍作用を発揮することが見出された。この治療用途に好ましい成体幹細胞誘導の訓化培地は、ヒト肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ−ＣＭ）より誘導される無細胞訓化培地である。
2013513366.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が分泌する複数の蛋白を含み、液体細胞培地にて分化される複数の細胞型への分化能を有する生体幹細胞を培養することで得られる、腫瘍の治療にて用いるための、訓化培地。
【請求項２】
生体幹細胞からなる細胞フラクションを含み、それから訓化培地を得ることができる、請求項１記載の訓化培地。
【請求項３】
無細胞である、請求項１記載の訓化培地。
【請求項４】
（ｉ）分化された複数の細胞型への分化能を有する成体幹細胞を液体細胞培地にて所定の時間培養する工程、および
（ｉｉ）細胞フラクションを該液体細胞培地から取り出し、それにより細胞が分泌する複数の蛋白を含む無細胞の訓化培地を得る工程
を含む方法により得ることができる、請求項３記載の訓化培地。
【請求項５】
細胞フラクションを液体細胞培地より遠心分離または濾過により取り出す、請求項４記載の訓化培地。
【請求項６】
液体細胞培地が付加的に、約２００００と３０００００ｇ、好ましくは約８００００と２０００００ｇの間のＧの力で、超遠心分離に供される、請求項５記載の訓化培地。
【請求項７】
方法がさらに、（ｉｉｉ）無細胞の訓化培地より、公称分子量が３ｋＤａより低い物質のフラクションを除去する、工程を含む、請求項４ないし６のいずれかに記載の訓化培地。
【請求項８】
公称分子量が３ｋＤａより低い物質のフラクションが無細胞の訓化培地より限外濾過により除去される、請求項７記載の訓化培地。
【請求項９】
方法がさらに工程（ｉｉ）にてまたは工程（ｉｉｉ）にて得られる無細胞の訓化培地をＲＮａｓｅで処理する工程を含む、請求項４ないし８のいずれかに記載の訓化培地。
【請求項１０】
分化された複数の細胞型への分化能を有する成体幹細胞が、肝臓幹細胞、腎臓幹細胞、脂肪幹細胞、間葉細胞幹細胞、血管周囲多能性前駆細胞、歯髄幹細胞、上皮幹細胞、造血幹細胞、剥脱した脱落歯からの幹細胞および臍帯幹細胞からなる群より選択される、請求項１ないし９のいずれかに記載の訓化培地。
【請求項１１】
分化された複数の細胞型への分化能を有する成体幹細胞が非楕円肝臓幹細胞である、請求項１０記載の訓化培地。
【請求項１２】
非楕円肝臓幹細胞が成熟肝細胞、インスリン産生細胞、骨形成原細胞および上皮細胞への分化能を有する、請求項１１記載の訓化培地。
【請求項１３】
分化された複数の細胞型への分化能を有する成体幹細胞がヒト細胞である、請求項１ないし１２のいずれかに記載の訓化培地。
【請求項１４】
腫瘍の治療にて用いるための、分化された複数の細胞型への分化能を有する成体幹細胞。
【請求項１５】
請求項１０ないし１３のいずれかに記載される、請求項１４に記載の成体幹細胞。
【請求項１６】
腫瘍が充実性腫瘍である、請求項１ないし１３のいずれかに記載の訓化培地または請求項１４もしくは１５に記載の成体幹細胞。
【請求項１７】
腫瘍が、肝腫瘍、上皮腫瘍、乳房の腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍および結腸腫瘍からなる群より選択される、請求項１６記載の訓化培地または成体幹細胞。
【請求項１８】
腫瘍が肝臓癌、カポシ肉腫および乳腺腺癌からなる群より選択される、請求項１７記載の訓化培地または成体幹細胞。
【請求項１９】
請求項１ないし１３のいずれかに記載の訓化培地または請求項１４または１５に記載の成体幹細胞の、腫瘍の治療にて用いるための医薬を製造するための使用。
【請求項２０】
腫瘍が請求項１６ないし１８のいずれかに記載されるとおりである、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
医薬が局所または全身投与用のものである、請求項１９または２０記載の使用。
【請求項２２】
医薬が注射により投与されるための、請求項２１記載の使用。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は腫瘍疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
転移性癌細胞は、幹細胞と、その自己複製能および多様な子孫の産生能などの多くの特徴点を共有する。さらには、幹細胞と癌細胞の表現型は微環境により大いに影響を受ける。同時に、胚微環境は種々の癌細胞系の腫瘍原性を阻害することが判明した。嚢胚形成の前に、転移性黒色腫細胞の胚ゼブラフィッシュ微環境への暴露が、非腫瘍原性表現型に対してその再プログラム化をもたらすことが証明された（Cucina Aら、(2006). Zebrafish embryo proteins induce apotosis in human colon cancer cells (Caco2). Apoptosis 11：1615-1628；Lee LMら (2005). The fate of human malignant melanoma cells transplanted into Zebrafish embryos: Assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev Dyn 233：1560-1570）。加えて、成長過程にある鶏胚に移された転移性黒色腫細胞は、神経堤移動経路に沿って進み、腫瘍原性の喪失および神経堤様表現型の獲得をもたらしうる。最近の研究は、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）微環境が、具体的に、胚モルホゲンノダル（Nodal）の転移性黒色腫および乳癌細胞における発現を中和し、それらをあまり攻撃的でない表現型に再プログラム化することを示した（Postovit LMら（2008）. Human embryonic stem cell microenvironment suppresses the tumorigenic phenotype of aggressive cancer cells. PNAS 105: 4329-4334）。Postovit LMらは、ｈＥＳＣ分泌のレフティ（Lefty）、これら現象の重要な伝達物質の一つとしての、Nodalシグナル伝達の阻害剤を見いだせなかった。これらの研究は、胚幹細胞の微環境が、攻撃的な腫瘍細胞にて異常に発現された胚性因子の制御のための、以前には言及されなかった治療的存在を提供する。
【０００３】
Giuffrida Dらにおいては、ヒト胚幹細胞は癌細胞の増殖を阻害する可溶性因子を分泌する。Cell Prolif. 2009 Sep 1にて、ヒト上皮癌細胞株の増殖の阻害はｈＥＳＣにより産生される可溶性因子により媒介されることを明らかにした。著者らはＧ（１）相の癌細胞の割合がｈＥＳＣ  ＣＭ治療により増加し、ＳおよびＧ（２）相における細胞の減少を伴い、これらの因子が細胞周期阻害により癌細胞の進行の速度を落とすことを示唆することを見いだした。
【０００４】
しかしながら、かかる結果は、胚幹細胞を得るのに胚の破壊が必要とされる点において、倫理的および方法論的関心の両方を獲得し、生じさせることが困難である、胚幹細胞により達成された。さらには、胚幹細胞はインビボでの移植において増殖が制御できないかもしれない。
【０００５】
間葉細胞および胚幹細胞の両方のマーカーを発現し、多能性分化能および再生特性を有するヒト成体非楕円（non-oval）肝幹／前駆細胞（ＨＬＳＣ）は、本願発明者らによって、ＷＯ２００６／１２６２１９として公開される国際特許出願にて開示された。
【０００６】
ＷＯ２００６／１２６２１９にて、ＨＬＳＣは「多能性前駆細胞」と定義されるが、「前駆細胞」および「幹細胞」の語は共に、特殊化した（すなわち、分化した）細胞型に自己再生能および分化能を有する細胞をいう。
【０００７】
さらには、「多能性（multipotent）または（pluripotent）」なる語は、その両方が幹／前駆細胞の複数の特殊化した（分化した）細胞型に分化する能力をいう点で、本願明細書の中で相互変換可能であると考えられる。本願明細書の中で、「複数」なる語は、少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種の特殊化した（分化した）細胞型を意味する。
【０００８】
本願明細書の記載にて、「成体幹細胞」なる語は、胚盤胞の内部細胞塊より単離される「胚幹細胞」とは異なり、成体組織から単離される幹細胞を意味する。成体幹細胞はまた「体幹細胞」としても知られている。
【０００９】
ＷＯ２００６／１２６２３６に開示のヒト非楕円肝多能性前駆／幹細胞は、種々の組織細胞型（すなわち、成熟肝細胞、上皮細胞、インスリン産生細胞および骨形成原細胞）への分化を受け、器官再生効果を発揮することが示された。かかる細胞は、肝細胞マーカーを発現する非楕円ヒト肝多能性前駆細胞株より誘導される。かかる細胞は：
（ｉ） 成体肝由来のヒト成熟肝細胞を、成熟肝細胞が死亡し、類上皮形態を有する生存細胞の集団を選択するまで、細胞培地にて培養し；
（ｉｉ）類上皮形態を有する生存細胞の集団を、血清含有の、グルコース含有の、ｈＥＧＦ（ヒト上皮成長因子）およびｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）を補足し、通常の無機塩、アミノ酸および哺乳動物細胞の成長に不可欠なビタミンを含む培地にて培養することで拡張する、
特に、成熟肝細胞を抗凍結剤の存在下にて血清含有の培地にて凍結させ、ついで工程（ｉ）の培養の前に解凍させる工程を含む、方法により単離される。
【００１０】
ＷＯ２００６／１２６２３６に開示のヒト非楕円肝幹／前駆細胞の特徴付けおよびその製造法を出典明示により本願発明の一部とする。
【００１１】
間葉細胞幹細胞（ＭＳＣ）の製剤はある組織にて再生効果を発揮することも知られている。例えば、骨髄誘導ＭＳＣは、必然的に、可溶性細胞外マトリックス糖蛋白、サイトカインおよび成長因子を含む、多数の栄養分子を分泌することで造血作用を支持することが知られている。
【００１２】
しかしながら、ある幹細胞製剤は投与されると免疫反応を惹起する主たる欠点を有する。ある幹細胞製剤は癌を惹起する可能性さえある。
【００１３】
本願発明者らは、この度、液体細胞培地にて、複数の分化細胞型を生じさせる能力のある十分に分化されていない成体幹細胞を培養することで得られた訓化培地（ＣＭ）が、意外にも、後記する本願明細書の実験セクションにて示されるインビトロおよびインビボの実験にて明らかにされるように効果的な抗腫瘍活性を示すことを見出した。
【００１４】
本願発明の抗腫瘍の治療用途での使用に適する訓化培地 （ＣＭ）は、複数の分子および生体分子、複数の蛋白、より具体的には培養の間に幹細胞によって分泌されるサイトカインを含む。
【００１５】
かくして、本願発明の第一の態様は、細胞が分泌する複数の蛋白を含み、液体細胞培地にて分化される複数の細胞型への分化能を有する生体幹細胞を培養することで得られる、腫瘍の治療にて用いるための、訓化培地である。
【００１６】
好ましい実施態様において、訓化培地は無細胞である。もう一つ別の実施態様において、訓化培地は、そこから訓化培地を得ることができる、成体幹細胞のみからなる細胞フラクションを含む。また、上記した成体幹細胞そのものは腫瘍の治療に用いられる。
【００１７】
本願発明のもう一つ別の態様は、細胞が分泌する複数の蛋白を含み、液体細胞培地にて分化される複数の細胞型への分化能を有する成体幹細胞を培養することにより得ることができる、腫瘍の治療用医薬を製造するための、訓化培地を用いることである。無細胞または細胞フラクション含有の訓化培地のいずれかは腫瘍の治療に用いるのに適している。しかしながら、無細胞訓化培地が好ましい。
【００１８】
本願発明の好ましい実施態様の腫瘍の治療に用いるのに適する無細胞訓化培地は、例えば、
（ｉ）分化された複数の細胞型への分化能を有する成体幹細胞を液体細胞培地にて所定の時間培養し、および
（ｉｉ）細胞フラクションを該液体細胞培地から取り出し、それにより細胞が分泌する複数の蛋白を含む無細胞の訓化培地を得る
ことを含む、方法により得ることができる。
【００１９】
腫瘍を治療するのに有用な訓化培地を得るのに適する液体細胞培地は、本願明細書に記載の実験セクションに開示されている。
【００２０】
しかしながら、哺乳動物の幹または前駆細胞、好ましくはヒト幹または前駆細胞を培養するのに適する液体細胞培地は、本願発明の細胞培地を得るのに用いることができると理解すべきである。以下に示す別の培地は、限定されるものではないが：Dulbecco's Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12（DMEM/F-12）、Roswell Park Memorial Institute medium（RPMI-1640）、Minimum Essential Medium（MEM）Alpha Medium（α-MEM）、Medium 199およびIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）に言及される。
【００２１】
例えば、培地を産生するのに使用される特定の型の幹細胞に応じて、適当な培地の選択および使用は、十分に当業者の知識および能力の範囲内にある。
【００２２】
好ましい実施態様において、細胞フラクションは所定の期間培養され、ついでそれを遠心分離または濾過により液体細胞培地より取り出す。適当な所定の期間は、例えば、６ないし４８時間から、好ましくは１２ないし２４時間から構成される。成体幹／前駆動物またはヒト細胞、好ましくは哺乳動物細胞の培養に適する培地は、非分化条件下、液体細胞培地として使用するのに適する。
【００２３】
細胞フラクションを取り出した後、それにより得られた無細胞訓化培地は、所望により、さらなる精製工程に付されてもよく、例えば超遠心分離により精製されてもよい。超遠心分離は、通常、約２００００ないし３０００００ｇ、好ましくは約８００００ないし２０００００ｇで、約１時間、室温より低い温度で、例えば約４℃で実施される。
【００２４】
さらなる任意の精製工程は、例えば、超遠心分離により、および／または訓化培地内に含有される可能性のある遊離ＲＮＡを分解するために、ＲＮａｓｅで処理することにより実施される、公称分子量（ＮＭＷ）が約３ＫＤａより小さな物質のフラクションを取り除くことである。
【００２５】
胚幹細胞と対照的に、分化される複数の細胞型に分化する能力を有し、成体組織より単離される幹細胞／前駆細胞は、本願発明の治療用途に有用な訓化培地を産生するのに適している。好ましい実施態様において、成体幹細胞は、肝臓幹細胞、腎臓幹細胞、脂肪幹細胞、間葉細胞幹細胞、血管周囲多能性前駆細胞、歯髄幹細胞、上皮幹細胞、造血幹細胞、剥脱した脱落歯からの幹細胞および臍帯幹細胞からなる群より選択される。成体幹細胞は動物幹細胞またはヒト幹細胞のいずれかであり得る。ヒト幹細胞は、治療剤がヒト患者に投与されるべきである場合に好ましい。
【００２６】
好ましい実施態様において、成体幹細胞は非楕円幹細胞、好ましくはＷＯ２００６／１２６２３６に開示に非楕円ヒト肝臓多能性前駆細胞（ＨＬＳＣ）である。
【００２７】
しかしながら、腫瘍疾患の治療に効果的な訓化培地はまた、上記した段落に記載される方法などの、他の幹細胞からも得られる。
【００２８】
本願明細書の実験セクションに記載の「比較例」は、ＨＬＳＣ−ＣＭおよびＭＳＣ−ＣＭは共にＨｅｐＧ２細胞のアポトーシスの増加に有効であるが、ＨＳＬＣ−ＣＭがＭＳＣ−ＣＭよりもより効果的である。比較例はまた、両方の訓化培地（ＨＳＬＣ−ＣＭおよびＭＳＣ−ＣＭ）の両方がＴＧＦ−β単独よりも効果的であることを示す。
【００２９】
以下の、非楕円肝臓幹細胞、好ましくはＷＯ２００６／１２６２３６に開示される非楕円ヒト肝臓多能性前駆細胞は、「ＴＬＳＣ−ＣＭ」と称されるであろう。ＨＬＳＣ−ＣＭは無細胞であることが好ましい。
【００３０】
好ましい実施態様において、ＨＬＳＣは、ＷＯ２００６／１２６２３６の第７頁の氷Ｉに要約される特徴を有し（その中で該細胞は「ＨｕＨＥＰ」と称される）、そこでは、ＦＡＣＳおよび免疫蛍光分析による特徴付けを説明する。かかる分析の結果を本願明細書にて以下に説明する。
【００３１】
【表１】
2013513366.tif 000003
【００３２】
ＷＯ２００６／１２６２３６に開示の非楕円ヒト肝臓多能性前駆細胞より得られるＨＬＳＣ−ＣＭの組成物が特徴付けられており、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５７２３２に開示されている。かかる特徴は出典明示により本願明細書の一部とする。
【００３３】
一例として、無細胞ＨＬＳＣ−ＣＭは、ＷＯ２００６／１２６２３６に開示されるＨＬＳＣを、当業者に知られているＧＭＰ条件下で、またはこれも当業者に公知であるＢＡＬ（BioArtificial Liver）システムの下で培養することで得られる。
【００３４】
肝臓多能性前駆／幹細胞を増殖し、その無細胞訓化培地（ＣＭ）を収集するＧＭＰ条件の一例は次のとおりである。
【００３５】
肝臓多能性前駆／幹細胞はＷＯ２００６／１２６２３６に開示される方法により単離され、その中で拡張工程は、前駆幹細胞をウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、好ましくは約１０％の濃度で、ｈＥＧＦ（ヒト上皮成長因子）およびｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）の存在下で培養することで行われる。ＦＣＳ、ｂＦＧＦおよびｈＥＧＦは、好ましくは、ＧＭＰグレード、例えばInvitrogenにより製造されるものである。
【００３６】
ＧＭＰ条件の訓化培地を集めるために、ＦＣＳを培養基より除去する。というのも、ヒトへの注入に適しない異質蛋白だからである。最後に、細胞を洗浄し、例えば、ＧＭＰグレードのヒトアルブミンを補足したアルファ−ＭＥＭを含む収集培地にて２４時間培養する。アルブミンは約０．０５％の濃度であることが好ましい。また、アルファ−ＭＥＭは単独で、または２％ＦＣＳを補足したアルファ−ＭＥＭを用いてもよい。次に、無細胞訓化培地を遠心分離または濾過により集める。
【００３７】
本願発明の一の実施態様によれば、腫瘍は充実性腫瘍である。好ましくは、腫瘍は、肝腫瘍、上皮腫瘍、乳房の腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍および結腸腫瘍からなる群より選択される。より好ましくは、腫瘍は肝臓癌、カポシ肉腫または乳腺腺癌である。
【００３８】
無細胞訓化培地は、それ自体が使用されるか、濃縮した形態で使用されるかのいずれかである。濃縮形態は、例えば、少なくとも約５倍に、好ましくは少なくとも約１０倍に、より好ましくは少なくとも約２０倍に、その上より好ましくは約２５倍に濃縮される。無細胞訓化培地は局所的または全身的のいずれかで投与される。局所および全身投与の両方に適する医薬剤形は注射可能な剤形である。一例として、無細胞ＣＭは、腫瘍が充実性腫瘍である場合、局所的な腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射により、転移の場合には静脈内注射により投与され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本願発明のさらなる目的および利点は、純粋に発明の説明のために設けられている、以下の実験セクションよりさらに明らかとなるであろう。該実験セクションにおいては、次の図面に言及する：
【００４０】
【図１】ＨｅｐＧ２細胞を異なる用量の２５ｘ濃縮したＨＬＳＣ−ＣＭと一緒に４８時間インキュベートすることで実施されたインビトロ増殖アッセイの結果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２の増殖はインキュベーションの４８時間後にＢｒｄＵ取り込みアッセイにより評価した。ＨｅｐＧ２を、ＤＭＥＭ単独で、または０．５；２；８または１６％の２５ｘ濃縮したＣＭを補足したＤＭＥＭ中で培養した。４８時間後、ＨｅｐＧ２の増殖をＢｒｄＵ取り込みアッセイを用いて定量した。該実験を四重重複して行った。図示されているデータは８回の実験の平均値±標準偏差である（Ｐ＜０．０５）。
【図２】ＨｅｐＧ２細胞を異なる用量の２５ｘ濃縮したＨＬＳＣ−ＣＭと一緒に４日間インキュベートすることで実施されたインビトロ増殖アッセイの結果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２の増殖はインキュベーションの４日後にＢｒｄＵ取り込みアッセイにより評価した。ＨｅｐＧ２を、ＤＭＥＭ単独で、または１；８または１６％の２５ｘ濃縮したＨＬＳＣ−ＣＭを補足したＤＭＥＭ中で４日間培養した。該実験を四重重複して行った。図示されているデータは８回の実験の平均値±標準偏差である（Ｐ＜０．０５）。
【図３】ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７およびカポシ細胞（ＫＳ）を２５ｘ濃縮したＨＬＳＣ−ＣＭの２種の異なる調製物と一緒にインキュベートすることにより実施されたインビトロ増殖アッセイの結果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７およびカポシ細胞（ＫＳ）の増殖は１６％の２５ｘ濃縮したＨＬＳＣ６ｂから、およびＨＬＳＣ２から由来のＣＭと一緒に４８時間インキュベートした後にＢｒｄＵ取り込みアッセイにより評価した。該実験を二重重複して行った。図示されているデータは４回の実験の平均値±標準偏差である（Ｐ＜０．０５）。
【図４】ＨｅｐＧ２細胞を２５ｘ濃縮したＨＬＳＣ−ＣＭと一緒にインキュベートすることにより実施されたインビトロアポトーシスアッセイの結果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２のアポトーシスは、異なる用量のＣＭ（０．５；２；６および１６％の２５ｘ濃縮したＣＭ）と一緒に２４時間インキュベーションした後のアポトーシス細胞の割合としてＴＵＮＥＬアッセイにより評価した。アポトーシス誘発の陽性対照として、ビクリスチンおよびドキソルビシンを用い；陰性対照において、ＨｅｐＧ２をビヒクル単独で処理した。結果を３種の異なる実験の平均値±ＳＤとして表す。
【図５】ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７およびＫＳ細胞を２５ｘ濃縮したＨＬＳＣ−ＣＭと一緒にインキュベートすることで実施されたインビトロアポトーシスアッセイの結果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７およびＫＳ細胞のアポトーシスは１６％の２５ｘ濃縮した２種の異なる細胞調製物（ＨＬＳＣ−６ｂおよびＨＬＳＣ−２）から由来のＣＭと一緒に７２時間インキュベートした後のアポトーシス細胞の割合としてＴＵＮＥＬアッセイにより評価した。アポトーシス誘発の陽性対照として、ビクリスチンを用い；陰性対照において、該細胞をビヒクル単独で処理した。結果を３種の異なる実験の平均値±ＳＤとして表す（Ｐ＜０．０５）。
【図６】ＨｅｐＧ２を移植されたＳＣＩＤマウスに腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与されたＨＬＳＣ−ＣＭの抗腫瘍活性を示すグラフである。腫瘍の体積は、毎週、移植片の２本の直交した直径をキャリパーで測定することにより決定された。
【図７】ＣＭ−ＨＬＳＣ（ｎ＝６）またはビヒクル（ｎ＝６）で腫瘍内処理した後、マウスを殺す際に、回収されたＨｅｐＧ２腫瘍の腫瘍体積を測定することで得られたデータを示すグラフである。腫瘍の体積は、毎週、移植片の２本の直交した直径をキャリパーで測定することにより決定された。
【図８】ＣＭ−ＨＬＳＣ（ｎ＝６）またはビヒクル（ｎ＝６）で腫瘍内処理した後、マウスを殺す際に、回収されたＨｅｐＧ２腫瘍の腫瘍重量を測定することで得られたデータを示すグラフである。
【図９】ＨＬＳＣ−ＣＭ処理による腫瘍増殖のインビボ阻害および腫瘍内アポトーシスの誘発を示す顕微鏡写真である（Ａ）。ＣＭ処理したマウスおよび処理していないマウスから由来の、４週間後に回収されたＨｅｐＧ２腫瘍の代表的顕微鏡写真。Ｂ）ＨｅｐＧ２腫瘍のＣＭ−処理した、または処理していないマウスのヘマトキシリン−エオジン染色（Ｃ）。Ｄ）ビヒクル単独で処理した回収されたＨｅｐＧ２腫瘍、またはＨＬＳＣからのＣＭで処理したＨｅｐＧ２腫瘍の回収のアポトーシスを示す代表的な顕微鏡写真。
【図１０】原文に記載なし
【発明を実施するための形態】
【００４１】
実験セクション
材料および方法
【００４２】
細胞培養
ヒト肝臓癌細胞株、ＨｅｐＧ２を、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭにて培養し、インキュベーター中、５％ＣＯ２の湿気のある環境下、３７℃で維持した。
【００４３】
ヒト肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）を、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したα−ＭＥＭ／ＥＢＭ（３：１）にて培養した。ＥＢＭをｈＥＧＦ（ヒト上皮成長因子）、ヒドロコルチゾン、ＧＡ（ゲンタマイシン）、ＢＢＥ（脳ウシエキス）で復元した。
【００４４】
ＭＣＦ−７乳腺癌細胞株をアメリカンタイプカルチャコレクション（ＶＡ、マナッサス）より入手し、１０％のＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭにて培養し、インキュベーター中、５％ＣＯ２の湿気のある環境下、３７℃で維持した。
【００４５】
カポシ肉腫細胞（ＫＳ細胞）の一次培養を、免疫抑制療法の下で腎臓同種移植片を担持する患者の皮膚病変より入手し、１０％のＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した。
【００４６】
ＨＬＳＣ細胞からの訓化培地（ＣＭ）の精製
ＨＬＳＣからの無細胞訓化培地（ＣＭ）を、培養した２４時間後に遠心分離に付すことにより細胞培地より集めることで調製した。実験を２ｘ１０６の細胞集団で行った。培地を超遠心分離に付し、３ｋＤａの分子量をカットオフする限外濾過装置（Amicon Ultra-PL 3）を用いて、２７００ｇで７５分間遠心分離に付すことで約２５倍に濃縮した。合計２５０μｌの容量の濃縮された訓化培地を得た。インビトロ実験に使用される濃縮されたＣＭの蛋白濃度はＣＭ＝４．８ｍｇ／ｍｌであった。選択された実験において、無細胞ＣＭを１Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅで３７℃で１時間処理した。該反応は１０Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅ阻害剤を添加することで停止された。
【００４７】
Raybio（登録商標）Biotin Label-Based Antibody ArrayによるＣＭ組成分析
ＨＬＳＣ−ＣＭから由来の５０７ヒト標的蛋白の発現レベルが同時に検出された。蛋白アレイプロトコルに記載されるように、０．２％のＦＣＳを補足したαＭＥＭの存在下で１ｘ１０６細胞を４８時間培養した後でＣＭを集めた。分子パネルは、細胞培養上澄中に、サイトカイン、ケモカイン、アジポカイン、成長因子、血管新生因子、プロテアーゼ、可溶性受容体、可溶性接着分子および他の蛋白を包含した。
【００４８】
ＨＬＳＣ−ＣＭを調製するのに、細胞を１００ｍｍの組織培養皿に１ｘ１０６細胞／皿の密度で置いた。ついで、細胞を完全培地で２４−４８時間培養した。その後で、培地を低血清（０．２％ＦＣＳ）と置き換え、ついで該細胞を再びもう一度４８時間培養した。ＣＭを集め、１０００ｇで遠心分離に付した。ビオチン標識化工程の前にＣＭを透析した。サンプリング工程を介して、該サンプル中の蛋白の第一アミンをビオチニル化し、続いて透析し、遊離ビオチンを取り除いた。ここから、新たにビオチニル化されたサンプルをアレイ膜上に加え、室温でインキュベートした。ＨＲＰ−ストレプトアビジンと一緒にインキュベーションした後、化学発光によりシグナルを可視化した。このアレイにて、ビオチン標識および抗体アレイを含む全行程をモニター観察するのに内部対照を用いた。結果をRaybio Biotin Label-Based Antibody Arrayの分析用に具体的に設計されたプログラムであるRayBio Analysis Toolを用いて解析した。このアッセイのさらなる詳細は、RayBio（登録商標）Biotin Label-based Human Antibody Array I User Manualに見られる。
【００４９】
RayBio Biotin Label-based Antibody Arrayアッセイの結果をすべて次の表に要約する。
【００５０】
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【００５１】
ＨＬＳＣ−ＨｅｐＧ２共培養実験
ＨＬＳＣが癌細胞の悪性表現型を反転させ得るかどうかを調査するために、肝細胞株ＨｅｐＧ２を、トランスウェルチャンバー中、ＨＬＳＣと一緒に共培養した。実験の最後に、ＨｅｐＧ２の増殖を評価した。下部のコンパートメントにＨｅｐＧ２（２．５ｘ１０４細胞）を播種した。上部のコンパートメントにＨＬＳＣ（１ｘ１０５）を播種した。共培養を４日間維持した。４日後、培地を取り出し、ＨｅｐＧ２を１０％ホルマリンで固定し、Ｈ＆Ｅで染色した。
【００５２】
細胞増殖
種々の濃度のＣＭを用い、ＦＣＳを与えないＤＭＥＭ（Sigma）中、９６−ウェルのプレートにてＨｅｐＧ２を８０００細胞／ウェルで播種した。ＨＬＳＣから由来のＣＭが異なる腫瘍からの細胞株においてもその抗腫瘍活性を発揮するかどうかを調査するために、ＭＣＦ−７乳腺腺癌およびカポジ肉腫を用い、その抗腫瘍作用をＨｅｐＧ２で観察される作用と比較した。培養して４８時間経過した後、５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）の細胞ＤＮＡへの取り込みとして、ＤＮＡ合成が検出された。ついで、細胞を０．５Ｍのエタノール／ＨＣｌで固定し、ヌクレアーゼと一緒にインキュベートし、ＤＮＡを消化した。ＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵを、ＢｒｄＵペルオキシダーゼに拮抗してコンジュゲートするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて検出し、可溶性発色基質で可視化した。光学密度をＥＬＩＳＡ読み取り装置を用いて４０５ｎｍで測定した。
【００５３】
アポトーシスアッセイ
ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７およびＫＳ細胞を、１０％ＦＣＳを補足した低グルコースＤＭＥＭ（Sigma）中、ドキソルビシン（１００ｎｇ／ｍｌ、Sigma）またはビンクリスチン（５０ｎｇ／ｍｌ、Sigma）あるいは異なる濃度のＣＭ（０．５；１；２；８；１６％の２５ｘ濃縮したＣＭ）の存在下にて、８０００細胞／ウェルで播種した。アポトーシスをＴＵＮＥＬアッセイ（ApopTag Oncor、Gaithersburg、MD、USA）で評価した。
【００５４】
インビボ実験設計
雄の４ないし５週齢のＳＣＩＤマウスをCharles River Laboratoriesより入手した。マウスを全て透明な施設で保護し、１週間慣れるように維持した。０日目に、マトリゲル基底膜マトリックスを１：１の割合で含む、無血清ＤＭＥＭに懸濁させた３ｘ１０６のＨｅｐＧ２腫瘍細胞を投与した。ＨｅｐＧ２を０．２ｍｌの総容量にてＳＣＩＤマウスの左右の鼠径部に注射した。マウスを無作為に２つの処理群：試験群、２０μｌの２５ｘ濃縮したＣＭを腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射（ｎ＝３）により投与した群、および対照群、２０μｌのＰＢＳ（ｎ＝３）を注射した群に分けた。腫瘍は１０日目でそれ以後は触診可能となった。腫瘍を移植した１０日後に、３回のｉ．ｔ．注射でＣＭ処理を開始した。３回合計で２０μｌのＣＭを成長した各腫瘍に投与した。腫瘍が約１５ｍｍ３の体積に達した場合に処理を開始した。動物を活性および生理的状態について毎日モニター観察し、体重の決定および腫瘍の体積の測定を各処理で行った。
【００５５】
腫瘍をキャリパーで測定した。腫瘍の体積は移植された腫瘍の２本の直交した直径を測定することにより決定され、式：１／２ａｘｂ２（式中、ａは長径であり、ｂは短径である）を用いて計算した。
【００５６】
形態学的実験
顕微鏡試験用に、腫瘍を１０％緩衝剤処理の中性ホルマリンに固定し、慣用的に処理し、パラフィンに埋め込み、５μｍで切断し、Ｈ＆Ｅで染色した。増殖の検出用の免疫組織化学を抗−ＰＣＮＡモノクローナル抗体を用いて行った。断片を遮断し、抗マウスＨＲＰ第二抗体（１：３００希釈）で標識した。第一抗体の削除または非免疫マウスＩｇＧとの置換を対照として用いた。アポトーシスをＴＵＮＥＬによりパラフィンに埋め込んだ腫瘍断片にて評価した。１０個の非連続的断片をアポトーシスの陽性腫瘍細胞について６３０Ｘの倍率で計数した。ヘキスト３３２５８色素を加えて核を染色した。
【００５７】
統計分析
種々の実験操作のデータをすべて平均＋ＳＤで表す。統計分析は、適当ならば、Newmann-Keulsの複数の比較試験を用いるＡＮＯＶＡにより行われた。
【００５８】
結果
腫瘍細胞に対するＨＬＳＣ−ＣＭのインビトロ生物学的作用
ＨＬＳＣより由来のＣＭはＨｅｐＧ２細胞のインビトロ増殖を阻害する
【００５９】
ヒトＨＬＳＣより由来のＣＭの抗腫瘍活性を、ＨｅｐＧ２細胞株の増殖を阻害するその能力を測定することでインビトロにて評価した。
【００６０】
ＨｅｐＧ２を異なる用量のＣＭと一緒に４８時間（図１）および４日間（図２）インキュベートすることで、ビヒクル単独でインキュベートした対照細胞と比べて増殖が顕著に阻害される。
【００６１】
ＨＬＳＣから由来のＣＭはＭＣＦ−７およびＫＳ細胞のインビトロ増殖を阻害する
組織内在の幹細胞の抗腫瘍作用が同じ組織を起源とする腫瘍に対して特異的であるかどうかを調査するのに、ＨＬＳＣ−ＣＭの関連しない器官の腫瘍からの癌細胞、例えば乳腺腺癌およびカポシ肉腫に対する作用を評価した。ＭＣＦ−７乳腺腺癌とカポシ肉腫の細胞をＨＬＳＣの２種の調製物（ＨＬＳＣ−６ＢおよびＨＬＳＣ−２）から由来の１６％のＣＭ（図３）と一緒にインキュベートすることで、ビヒクル単独でインキュベートした対照細胞と比べて増殖が顕著に阻害される。
【００６２】
ＨＬＳＣより由来のＣＭはＨｅｐＧ２細胞のインビトロアポトーシスを誘発した
ＨｅｐＧ２をＨＬＳＣ−ＣＭと一緒に２４時間インキュベートすることで、ビヒクル単独でインキュベートした対照と比べて、およびドキソルビシンまたはビンクリスチン刺激（アポトーシス分子；陽性対照と考えられる）と比べて、アポトーシスが顕著に促進された（図４）。
【００６３】
ＨＬＳＣより由来のＣＭはＭＣＦ−７およびＫＳ細胞のインビトロアポトーシスを促進した
ＭＣＦ−７乳腺腺癌およびカポシ肉腫の細胞をＨＬＳＣ−６Ｂから由来の１６％のＣＭ（図５）と一緒にインキュベートすることで、ビヒクル単独でインキュベートした対照細胞と比べて、化学療法剤であるビンクリスチンの作用と同様の作用で、アポトーシスが顕著に誘発された。
【００６４】
ＨＥＰＧ２腫瘍増殖に対するＣＭのインビボ生物学的作用
結果
腫瘍成長および増殖がＳＣＩＤマウスでの異種移植片実験にてＨＬＳＣより由来のＣＭにより阻害された
【００６５】
ＨＬＳＣより由来のＣＭのインビボにおける腫瘍成長に対する作用を測定するために、ＳＣＩＤマウスにヒト肝細胞癌細胞株、ＨｅｐＧ２を皮下に埋め込んだ。ＨｅｐＧ２を注入した１０日後で、腫瘍の体積が約１５ｍｍ３である場合に、ＣＭを最大２０μｌの容量にて腫瘍内注射することでマウスを処理した。対照マウスでは、腫瘍に２０μｌのＰＢＳを注射した。ＨｅｐＧ２を注入した１０日後に、すべての腫瘍を回収し、分析した。この異種移植片実験にて、ＣＭの腫瘍内注射（図６；図９、パネルＡ）は腫瘍成長に対する阻害作用を示した。加えて、組織学的分析はＣＭで処理した腫瘍にて壊死の領域を示し（図９、パネルＢ）、ＰＣＮＡ染色法を用いて抗増殖作用が観察された（図９、パネルＣ）。ＣＭの腫瘍内アポトーシスにおける作用を測定するのに、ＣＭで処理した腫瘍のパラフィン切片をＴＵＮＥＬで分析した。ＣＭ処理はビヒクル単独で処理した腫瘍（図９、パネルＤ）と比べて、アポトーシスを誘発した（図９、パネルＢ）。殺すその時に、腫瘍の体積（図７）および腫瘍の重量（図８）を測定した。
【００６６】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路は胚形成および発癌と関連することが知られている。臨床実験はＷｎｔ／β−カテニン経路の異常な活性化が肝細胞癌発生にて頻繁に生じていることを報告した。Ｗｎｔ−１リガンドは、ＨＣＣを含む種々のヒト癌にて異常に発現されると報告されている。
【００６７】
いずれの理論に拘束されるものでもないが、本願発明者らは、上記した該発明者らによって試験された幹細胞由来の訓化培地の抗腫瘍作用の、場合によっては、根底にある作用機序の一つが、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を阻害することであると、仮定する。
【００６８】
比較例
材料および方法
ＨｅｐＧ２を１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭにて培養し、インキュベーター中、５％ＣＯ２の湿気のある環境下、３７℃で維持した。
【００６９】
ＨＬＳＣを１０％ウシ胎仔血清を補足したα−ＭＥＭ／ＥＢＭ（３：１）にて培養した。ＨＬＳＣ  ＣＭを集める前の日に、ＥＢＭ培地に含まれる成長因子を取り除くために、ＨＬＳＣを１０％ウシ胎仔血清を補足したα−ＭＥＭだけと一緒にインキュベートした。この培地の変換は実施される各実験の前に行われた。
【００７０】
アポトーシスアッセイ
ＨｅｐＧ２を、１０％ＦＣＳを含む低グルコースＤＭＥＭ（Sigma）中、１６％の２５ｘ濃縮したＨＬＳＣまたはＭＳＣより得られたＣＭの存在下、あるいは３ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βの存在下、９６−ウェルプレートに８０００細胞／ウェルで播種した。２４時間後、アポトーシスをＴＵＮＥＬアッセイで評価した。
【００７１】
統計分析はNewmann-Keulsの複数の比較試験によるＡＮＯＶＡにより行われた。
【００７２】
結果
ＨｅｐＧ２のＨＬＳＣ−ＣＭとの２４時間にわたるインキュベーションは、ビヒクル単独でインキュベートされた対照と比べてアポトーシスを顕著に促進した。ＭＳＣ−ＣＭもまた、ＨＬＳＣ−ＣＭに関するほど顕著ではないが、ＨｅｐＧ２ならびにＴＧＦ−βのアポトーシスを促進した。
【００７３】
得られた結果を図１０に示す。
【００７４】
図１０はＨｅｐＧ２を２５ｘ倍濃縮したＨＬＳＣ−ＣＭ（１６％）またはＭＳＣ−ＣＭ（１６％）と一緒に、あるいはＴＧＦ−β（３ｎｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートすることで実施されたインビトロにおけるアポトーシスアッセイの２４時間後の結果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２のアポトーシスをアポトーシス細胞の割合として評価する。結果は二重重複して実施された実験の平均±ＳＤとして表される。＊：ＨＬＳＣ−ＣＭ（１６％）またはＭＳＣ−ＣＭ（１６％）で、またはＴＧＦ−β（３ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＨｅｐＧ２  ｖｓ  処理されなかったＨｅｐＧ２（ｐ＜０．０５）；§：ＨＬＳＣ−ＣＭ（１６％）で処理されたＨｅｐＧ２  ｖｓ  ＭＳＣ−ＣＭ（１６％）で、またはＴＧＦ−β（３ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＨｅｐＧ２（ｐ＜０．００５）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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