(57)【要約】本発明は、DNA修飾剤に対するゲノムDNAのアクセス可能性を判定する方法を提供する。2013540434.tif 000003
2013540434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）ゲノムDNAを有する核に、DNA修飾剤を、該DNA修飾剤が該核内のゲノムDNAを修飾するような条件下で導入する段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該DNA修飾剤によって異なる程度で修飾され、それにより、修飾されたDNAが形成される、段階；ならびに
（b）該修飾されたDNAにおける少なくとも1つのDNA領域のヌクレオチド配列の決定を行う段階であって、（1）該ヌクレオチド配列の決定、および（2）配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことを含む、段階
を含む、染色体DNAを分析するための方法。
【請求項２】
前記核が単離された核である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記核が細胞内にある、請求項1記載の方法。
【請求項４】
段階（a）の前または間に、前記細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊する段階を含み、かつ段階（a）が該細胞を前記DNA修飾剤と接触させることを含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
段階（a）が、前記細胞内で前記DNA修飾剤を発現させ、それにより該細胞に該DNA修飾剤を導入することを含む、請求項3記載の方法。
【請求項６】
前記修飾剤がDNAメチルトランスフェラーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記DNAメチルトランスフェラーゼがDNA中のアデノシンをメチル化する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記DNAメチルトランスフェラーゼがDNA中のシトシンをメチル化する、請求項6記載の方法。
【請求項９】
配列の決定を行う段階が、DNAポリメラーゼの反応速度をモニタリングすることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
配列の決定を行う段階では、ポリメラーゼを使用しない、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
配列の決定を行う段階が、ナノポア配列決定法を行うことを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
配列の決定を行う段階が、前記DNA領域を鋳型依存的に複製することを含み、該複製により、標識されたヌクレオチドの取り込みがもたらされ、取り込まれた異なるヌクレオチドから生成されるシグナルの到達時間および/または該シグナル間の時間間隔によって、前記修飾の有無および/または取り込まれたヌクレオチドの同一性が決定される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
前記標識されたヌクレオチドの標識が蛍光標識である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
透過処理する段階が、前記細胞を、前記細胞膜を透過性にする剤と接触させることを含む、請求項4記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞膜を透過性にする剤がリゾ脂質である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞の透過処理または破壊、および前記細胞と前記DNA修飾剤との接触が、同時に行われる、請求項4記載の方法。
【請求項１７】
（i）ある動物の本質的にすべての細胞においてアクセス可能；または
（ii）ある動物の本質的にすべての細胞においてアクセス不能
のいずれかである配列を含む対照DNA領域と比較して、前記少なくとも1つのDNA領域における修飾の程度を定量する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
（a）ゲノムDNAを有する核に、DNA修飾剤を、該DNA修飾剤が該核内のゲノムDNAを修飾するような条件下で導入する段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該DNA修飾剤によって異なる程度で修飾され、それにより、修飾されたDNAが形成される、段階；
（b）該DNAを精製する段階であって、それにより、精製されたDNAが生成される、段階；
（c）該精製されたDNAを断片化する段階；
（d）該精製および断片化されたDNAから、修飾されたDNAをアフィニティー精製する段階であって、それにより、修飾されたDNAについて濃縮されたDNA試料が生成される、段階；ならびに
（e）修飾されたDNAについて濃縮された該DNA試料における1つもしくは複数のDNA領域の存在、非存在もしくは量を検出するか、または修飾されたDNAについて濃縮された該DNA試料からの少なくとも1つのDNA断片のクローニング、単離もしくはヌクレオチド配列の決定を行う段階
を含む、細胞内の染色体DNAを分析する方法。
【請求項１９】
前記核が単離された核である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記核が細胞内にある、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
段階（a）の前または間に、前記細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊する段階を含み、かつ段階（a）が該細胞を前記DNA修飾剤と接触させることを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
段階（a）が、前記細胞内で前記DNA修飾剤を発現させ、それにより該細胞に該DNA修飾剤を導入することを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
前記修飾剤がDNAメチルトランスフェラーゼである、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
前記DNAメチルトランスフェラーゼがDNA中のアデノシンをメチル化する、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記DNAメチルトランスフェラーゼがDNA中のシトシンをメチル化する、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
アフィニティー精製する段階が、前記精製および断片化されたDNAを、修飾されたDNAに対する親和性を有するタンパク質親和性物質と、修飾されたDNAへの該親和性物質の結合を可能にするような条件下で接触させること、および該親和性物質に結合しないDNAを除去することを含む、請求項18記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質親和性物質が、修飾されたDNAに特異的な抗体を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記修飾されたDNAの前記修飾がアデノシンのメチル化またはシトシンのメチル化である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
検出する段階が、修飾されたDNAについて濃縮された前記DNA試料における少なくとも1つのDNA領域のコピーの量を検出することを含む、請求項18記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも1つのDNA領域を増幅する段階を含む、請求項18記載の方法。
【請求項３１】
増幅する段階がリアルタイムPCRを含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
検出する段階が、少なくとも1つのDNA領域のヌクレオチド配列の決定を行うことを含む、請求項18記載の方法。
【請求項３３】
ヌクレオチド配列の決定が、DNAポリメラーゼの反応速度をモニタリングすることを含む、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
ヌクレオチド配列の決定が、（1）該ヌクレオチド配列の決定、および（2）配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことを含む、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
検出する段階が、修飾されたDNAについて濃縮された前記DNA試料を複数の核酸プローブとハイブリダイズさせること、および該DNA試料と該核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項18記載の方法。
【請求項３６】
前記核酸プローブが固体支持体と連結されている、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
前記固体支持体が、マイクロアレイおよびビーズからなる群より選択される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
断片化する段階が、前記DNAをせん断もしくは超音波処理すること、または前記DNAを配列非特異的ヌクレアーゼで消化することを含む、請求項18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、2010年9月10日付で出願された米国仮特許出願第61/381,825号、および2011年1月25日付で出願された米国仮特許出願第61/436,138号の優先権の恩典を主張し、この各々があらゆる目的で参照により組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞内のほとんどのDNAは、ヌクレオソームとして知られるコイル構造として、一群のヒストンタンパク質の周りにパッケージングされる。このヌクレオソームは、DNAを密に詰めた高密度の構造へさらに巻きつけられる。このDNAとタンパク質のパッケージングの組み合わせは一般的にクロマチンと呼ばれる。クロマチンは、DNAが転写装置にアクセス可能な、かつ必ずというわけではないが、通常、転写的に活性な、疎にパッケージングされたクロマチンの形態であるユークロマチン、およびDNAが転写装置にアクセス不能な、かつ必ずというわけではないが、通常、転写的にサイレントな、緻密にパッケージングされた形態であるヘテロクロマチンという2つの形態をとる。
【０００３】
ユークロマチンとヘテロクロマチンの間の移行は、3つのエピジェネティックな事象である、DNAメチル化、ヒストン修飾およびRNA相互作用によって主に制御される。これらのエピジェネティックな事象は、細胞内のゲノムDNAが疎にパッケージングされた転写的に活性な形態にあるか、または緻密にパッケージングされた転写的にサイレントな形態にあるかに影響を与える。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、染色体DNAを分析するための方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
（a）ゲノムDNAを有する核に、DNA修飾剤を、該DNA修飾剤が該核内のゲノムDNAを修飾するような条件下で導入する段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該DNA修飾剤によって異なる程度で修飾され、それにより、修飾されたDNAが形成される、段階；ならびに
（b）該修飾されたDNAにおける少なくとも1つのDNA領域のヌクレオチド配列の決定を行う段階であって、（1）該ヌクレオチド配列の決定、および（2）配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことを含む、段階。
【０００５】
いくつかの態様において、核は単離された核である。いくつかの態様において、核は細胞内にある。
【０００６】
いくつかの態様において、本方法は、段階（a）の前または間に、細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊する段階を含み、かつ段階（a）は細胞をDNA修飾剤と接触させることを含む。いくつかの態様において、段階（a）は、細胞内でDNA修飾剤を発現させ、それによりDNA修飾剤を細胞に導入することを含む。
【０００７】
いくつかの態様において、修飾剤はDNAメチルトランスフェラーゼである。いくつかの態様において、DNAメチルトランスフェラーゼはDNA中のアデノシンをメチル化する。いくつかの態様において、DNAメチルトランスフェラーゼはDNA中のシトシンをメチル化する。
【０００８】
いくつかの態様において、配列の決定を行う段階は、DNAポリメラーゼの反応速度をモニタリングすることを含む。いくつかの態様において、配列の決定を行う段階では、ポリメラーゼを使用しない。
【０００９】
いくつかの態様において、配列の決定を行う段階は、ナノポア配列決定法を行うことを含む。
【００１０】
いくつかの態様において、配列の決定を行う段階は、DNA領域を鋳型依存的に複製することを含み、該複製により、標識されたヌクレオチドの取り込みがもたらされ、取り込まれた異なるヌクレオチドから生成されるシグナルの到達時間および/または該シグナル間の時間間隔によって、修飾の有無および/または取り込まれたヌクレオチドの同一性が決定される。いくつかの態様において、標識されたヌクレオチドの標識は蛍光標識である。
【００１１】
いくつかの態様において、透過処理する段階は、細胞を、細胞膜を透過性にする剤と接触させる段階を含む。いくつかの態様において、細胞膜を透過性にする剤はリゾ脂質である。いくつかの態様において、細胞の透過処理または破壊、およびDNA修飾剤と細胞との接触が、同時に行われる。
【００１２】
いくつかの態様において、本方法は、
（i）ある動物の本質的にすべての細胞においてアクセス可能；または
（ii）ある動物の本質的にすべての細胞においてアクセス不能
のいずれかである配列を含む対照DNA領域と比較して、少なくとも1つのDNA領域における修飾の程度を定量する段階をさらに含む。
【００１３】
本発明はまた、以下の段階を含む、細胞内の染色体DNAを分析する方法を提供する：
（a）ゲノムDNAを有する核に、DNA修飾剤を、該DNA修飾剤が該核内のゲノムDNAを修飾するような条件下で導入する段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該DNA修飾剤によって異なる程度で修飾され、それにより、修飾されたDNAが形成される、段階；
（b）該DNAを精製する段階であって、それにより、精製されたDNAが生成される、段階；
（c）該精製されたDNAを断片化する段階；
（d）該精製および断片化されたDNAから、修飾されたDNAをアフィニティー精製する段階であって、それにより、修飾されたDNAについて濃縮されたDNA試料が生成される、段階；ならびに
（e）修飾されたDNAについて濃縮された該DNA試料における1つもしくは複数のDNA領域の存在、非存在もしくは量を検出するか、または修飾されたDNAについて濃縮された該DNA試料からの少なくとも1つのDNA断片のクローニング、単離もしくはヌクレオチド配列の決定を行う段階。
【００１４】
いくつかの態様において、核は単離された核である。いくつかの態様において、核は細胞内にある。いくつかの態様において、本方法は、段階（a）の前または間に、細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊する段階を含み、かつ段階（a）は、細胞をDNA修飾剤と接触させる段階を含む。いくつかの態様において、段階（a）は、細胞内でDNA修飾剤を発現させる段階であって、それにより、DNA修飾剤を細胞に導入する段階を含む。
【００１５】
いくつかの態様において、修飾剤はDNAメチルトランスフェラーゼである。いくつかの態様において、DNAメチルトランスフェラーゼはDNA中のアデノシンをメチル化する。いくつかの態様において、DNAメチルトランスフェラーゼはDNA中のシトシンをメチル化する。
【００１６】
いくつかの態様において、アフィニティー精製する段階は、断片化および精製されたDNAを、修飾されたDNAに対する親和性を有するタンパク質親和性物質と、修飾されたDNAに対する親和性物質の結合を可能にするような条件下で接触させる段階、および親和性物質に結合しないDNAを除去する段階を含む。いくつかの態様において、タンパク質親和性物質は、修飾されたDNAに特異的な抗体を含む。いくつかの態様において、修飾されたDNAの修飾はアデノシンのメチル化またはシトシンのメチル化である。
【００１７】
いくつかの態様において、検出する段階は、修飾されたDNAについて濃縮されたDNA試料における少なくとも1つのDNA領域のコピーの量を検出することを含む。
【００１８】
いくつかの態様において、本方法は少なくとも1つのDNA領域を増幅する段階を含む。いくつかの態様において、増幅する段階はリアルタイムPCRを含む。
【００１９】
いくつかの態様において、検出する段階は、少なくとも1つのDNA領域のヌクレオチド配列の決定を行うことを含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の決定を行う段階は、DNAポリメラーゼの反応速度をモニタリングすることを含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の決定を行う段階は、（1）当該ヌクレオチド配列の決定、および（2）配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことを含む。
【００２０】
いくつかの態様において、検出する段階は、修飾されたDNAについて濃縮されたDNA試料を複数の核酸プローブとハイブリダイズさせること、およびDNA試料と核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することを含む。いくつかの態様において、核酸プローブは固体支持体と連結されている。いくつかの態様において、固体支持体は、マイクロアレイおよびビーズからなる群より選択される。
【００２１】
いくつかの態様において、断片化する段階は、DNAをせん断もしくは超音波処理すること、またはDNAを配列非特異的ヌクレアーゼで消化することを含む。
【００２２】
定義
「DNA修飾剤」とは、本明細書で用いる場合、DNAを検出可能な様式に改変する分子のことを指す。いくつかの態様において、DNA修飾剤は、特異的な位置でDNA鎖内の特異的塩基をメチル化する分子である。例示的なDNA修飾剤には、酵素、タンパク質および化学物質が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００２３】
「DNA領域」とは、本明細書で用いる場合、ゲノムDNA内部の関心対象の標的配列のことを指す。DNA領域は、関心対象であって用いるDNA修飾剤がアクセス可能である、任意の長さでありうる。いくつかの態様において、DNA領域は単一塩基対を含みうるが、ゲノムDNA内部の短い配列セグメント（例えば、2〜100、2〜500、50〜500bp）またはより長いセグメント（例えば、100〜10,000、100〜1000または1000〜5000bp）でもありうる。DNA領域内のDNAの量は、時には、PCR反応において増幅させようとする配列の量によって決まる。例えば、標準的なPCR反応は一般に約35〜5000塩基対を増幅することができる。
【００２４】
異なる「程度」の修飾とは、複数の試料間での、または1つもしくは複数の試料中の2つもしくはそれ以上のDNA領域間での、1つまたは複数のDNA領域の修飾されたコピー数（実際の数または相対数）が異なることを指す。例えば、2つのDNA領域（便宜上「領域A」および「領域B」と呼ぶ）の100個のコピーがそれぞれ、ある細胞内の染色体DNA上に存在するならば、異なる程度での修飾の一例は、領域Aの10個のコピーが修飾され、一方、領域Bの70個のコピーが修飾された場合であると考えられる。
【００２５】
膜を「透過処理すること」とは、本明細書で用いる場合、修飾剤が細胞内に入ることを可能にするように細胞膜の完全性を低減させることを指す。透過処理された細胞膜を有する細胞は一般に細胞膜を保ち、そのため細胞の構造は実質的にインタクトなままに保たれる。対照的に、細胞膜を「破壊すること」とは、本明細書で用いる場合、細胞の構造がインタクトなままでは保たれないように細胞膜の完全性を低減させることを指す。例えば、細胞膜を非イオン性界面活性剤と接触させることは、細胞膜を除去および／または溶解させ、それにより、少なくともいくらかの染色体構造を保っているゲノムDNAに対する修飾剤のアクセスを可能にする。
【００２６】
「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、リボース核酸（RNA）もしくはデオキシリボース核酸（DNA）の重合体またはそれらの類似体に対応しうる、単量体の重合体のことを互換的に指す。これには、RNAおよびDNA、さらにはそれらの修飾形態、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸（locked nucleic acid, LNA（商標））といったヌクレオチドの重合体が含まれる。ある用途において、核酸は、複数の種類の単量体、例えば、RNAサブユニットおよびDNAサブユニットの両方を含む重合体でありうる。
【００２７】
核酸は典型的には一本鎖または二本鎖であり、一般にホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、本明細書で概説するように、代替的な骨格を有しうる核酸類似体が含められ、これには例えば、ホスホルアミド（Beaucage et al.（1993）Tetrahedron 49（10）:1925およびその中の参考文献；Letsinger（1970）J. Org. Chem. 35:3800；Sprinzl et al.（1977）Eur. J. Biochem. 81:579；Letsinger et al.（1986）Nucl. Acids Res. 14: 3487；Sawai et al.（1984）Chem. Lett. 805；Letsinger et al.（1988）J. Am. Chem. Soc. 110:4470；およびPauwels et al.（1986）Chemica Scripta 26:1419）、ホスホロチオエート（Mag et al.（1991）Nucleic Acids Res. 19:1437および米国特許第5,644,048号）、ホスホロジチオエート（Briu et al.（1989）J. Am. Chem. Soc. 111:2321）、O-メチルホスホロアミダイト結合（O-methylphophoroamidite linkage）（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press（1992））、ならびにペプチド核酸骨格および結合（Eghoim（1992）J. Am. Chem. Soc. 114:1895；Meier et al.（1992）Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008；Nielsen（1993）Nature 365:566；およびCarlsson et al.（1996）Nature 380:207）が非限定的に含まれ、これらの参考文献はそれぞれ参照により組み入れられる。他の類似体核酸には、正に荷電した骨格（Denpcy et al.（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097）；非イオン性骨格（米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号および第4,469,863号；Angew（1991）Chem. Intl. Ed. English 30: 423；Letsinger et al.（1988）J. Am. Chem. Soc. 110:4470；Letsinger et al.（1994）Nucleoside & Nucleotide 13:1597；Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cook；Mesmaeker et al.（1994）Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395；Jeffs et al.（1994）J. Biomolecular NMR 34:17；Tetrahedron Lett. 37:743（1996））、および、米国特許第5,235,033号および第5,034,506号ならびにChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cookに記載されたものを含む非リボース骨格を有するものが含まれ、これらの参考文献はそれぞれ参照により組み入れられる。1つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸も、核酸の定義の範囲に含まれる（Jenkins et al.（1995）Chem. Soc. Rev. pp169-176、これは参照により組み入れられる）。いくつかの核酸類似体は、例えば、Rawls, C & E News Jun. 2, 1997 page 35にも記載されており、これは参照により組み入れられる。リボース-リン酸骨格のこれらの修飾は、標識部分などの追加部分の付加を容易にするため、または生理的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を変更するために行ってもよい。
【００２８】
核酸中に典型的に認められる、天然に存在する複素環式塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）に加えて、核酸類似体にはまた、天然に存在しない複素環式塩基または他の修飾塩基も含まれ、その多くは本明細書中に記載されているか、そうでなければ参照されている。特に、天然に存在しない多くの塩基は、例えば、Seela et al.（1991）Helv. Chim. Acta 74:1790, Grein et al.（1994）Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971-976、およびSeela et al.（1999）Helv. Chim. Acta 82:1640にさらに記載されており、これらはそれぞれ参照により組み入れられる。さらに例を挙げるならば、融解温度（Tm）変更因子として作用するヌクレオチド中に用いられるある種の塩基が任意で含められる。例えば、これらのいくつかには、7-デアザプリン（例えば、7-デアザグアニン、7-デアザアデニンなど）、ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、プロピニル-dN（例えば、プロピニル-dU、プロピニル-dCなど）などが含まれる。例えば、参照により組み入れられる、Seelaに対して1999年11月23日に発行された「7-デアザ-2'-デオキシグアノシンヌクレオチドの合成」と題する米国特許第5,990,303号を参照のこと。他の代表的な複素環式塩基には、例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの8-アザ誘導体；アデニン、グアニン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの7-デアザ-8-アザ誘導体；6-アザシトシン；5-フルオロシトシン；5-クロロシトシン；5-ヨードシトシン；5-ブロモシトシン；5-メチルシトシン；5-プロピニルシトシン；5-ブロモビニルウラシル；5-フルオロウラシル；5-クロロウラシル；5-ヨードウラシル；5-ブロモウラシル；5-トリフルオロメチルウラシル；5-メトキシメチルウラシル；5-エチニルウラシル；5-プロピニルウラシルなどが含まれる。
【００２９】
DNA修飾剤に対するDNA領域の「アクセス可能性」とは、本明細書で用いる場合、細胞の染色体内の特定のDNA領域が、特定のDNA修飾剤によって接触されて修飾される能力のことを指す。本発明の範囲を限定することは意図しないが、DNA領域を含む特定のクロマチン構造は、DNA修飾剤が特定のDNA領域を修飾する能力に影響を及ぼすと考えられている。例えば、DNA領域がヒストンタンパク質の周りに巻き付けられていることもあり、さらに、関心対象のDNA領域に対するDNA修飾剤のアクセスを防止または抑制するさらなるヌクレオソーム構造を有することもある。
【００３０】
「ヌクレオチド配列の決定を行う段階」とは、本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドまたは核酸断片のヌクレオチド組成を決定するプロセスのことを指す。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の決定を行う段階は、特定の核酸断片のヌクレオチドの順序と、配列決定されたヌクレオチドの1つまたは複数が、例えば、特異的な位置でのヌクレオチドのメチル化により、修飾されているかどうかの両方の決定を含む。本発明の例示的なヌクレオチド配列決定法には、単一分子リアルタイム配列決定法およびナノポア配列決定法が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００３１】
「DNAポリメラーゼの反応速度」とは、本明細書で用いる場合、DNAポリメラーゼによるDNA合成の速度のことを指す。DNA合成の速度は、ヌクレオチドの結合およびポリメラーゼの移行を含む多数の要因による影響を受け、かつ、DNA合成の速度を低下させる、修飾されたヌクレオチド（例えば、メチル化されたヌクレオチド）の存在による影響を受ける。「DNAポリメラーゼの反応速度をモニタリングすること」とは、本明細書で用いる場合、DNAポリメラーゼによるDNA合成の速度を測定する方法のことを指す。いくつかの態様において、DNA合成の速度はリアルタイムでモニターされる。いくつかの態様において、DNAポリメラーゼの反応速度は、ヌクレオチドを蛍光標識すること、および、ヌクレオチドの蛍光パルスを測定することにより測定される。蛍光標識は成長中のDNA鎖に組み込まれるからである。DNAポリメラーゼの反応速度は、パルス幅（蛍光パルスの持続時間）およびパルス間隔時間（連続パルス間の間隔）を含むが、これらに限定されない、いくつかの測定基準のいずれかによって測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】DNA修飾の原理。（A）細胞をDNA修飾剤によりインサイチューで処理して、アクセス可能なクロマチンを修飾する；アクセス不能なクロマチン領域は修飾に対して抵抗性である。（B）修飾されたDNAを精製し、DNA修飾の部位を検出できる技術を用いて直接配列決定する。
【図２】アクセス可能なクロマチンのDAM修飾。透過処理した細胞をDAMメチルトランスフェラーゼによりインサイチューで処理して、アクセス可能なクロマチンを修飾した（DAMはGATCモチーフの6位でA残基をメチル化する）；対照細胞は透過処理用緩衝液のみで処理した。DNAを精製し、DAM修飾されていないGATCモチーフのみを消化するメチル化感受性制限酵素DpnIIで消化した；対照反応では緩衝液のみで処理した。次に、DNA試料を、B2M（A）、RHO（B）、p14（C）およびCDH13（D）プロモーターに特異的なプライマーを用いて増幅させた。三角形、DAMなし/DpnIIなし；四角形、DAMなし/DpnIIあり；菱形、DAMあり/DpnIIなし；丸形、DAMあり/DpnIIあり。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
I．序論
核内のゲノムDNAをDNA修飾剤で修飾し、その後、修飾されたDNAにおける少なくとも1つのDNA領域のヌクレオチド配列の決定を行うことにより、染色体DNAのクロマチン構造を分析するための方法が提供される。DNA領域における修飾の程度を定量することができ、これは、修飾剤に対するDNAのその領域のアクセス可能性を示し、したがって、その領域のクロマチン構造を反映する。
【００３４】
本発明の1つの利点は、修飾されたDNAを分析し、DNA鎖のヌクレオチド配列の決定、および配列決定されたヌクレオチドが修飾されているか（例えば、メチル化されているか）の決定を同時に行うことができるということである。この、配列決定中に修飾塩基を直接検出することは、結果の迅速な生成を可能にする。
【００３５】
II．一般的方法
本発明の方法は、DNA修飾剤が核内のゲノムDNAを修飾するような条件下で、ゲノムDNAを有する核にDNA修飾剤を導入する段階であって、ゲノムDNAの異なる領域が、（クロマチン構造の違いが原因で）DNA修飾剤によって異なる程度で修飾される、段階、その後、ヌクレオチド配列の決定、および配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことを含む、修飾されたDNAにおける少なくとも1つのDNA領域のヌクレオチド配列の決定を行う段階を含みうる。いくつかの態様において、少なくとも1つのDNA領域における修飾の程度が定量される。DNAのさまざまなアクセス可能性は、ゲノムDNAのヌクレオソーム/染色体構造を反映する可能性がある。例えば、いくつかの態様において、DNA修飾剤に対してよりアクセス可能であるDNA領域は、より「疎」なクロマチン構造内にある可能性が高い。
【００３６】
いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の決定を行う段階は、DNAポリメラーゼの反応速度をモニタリングすることを含む。関心対象のDNA配列に関するDNA重合を、例えば、単一分子リアルタイム（SMRT）配列決定法を用いて、リアルタイムで観察することができる。いくつかの態様において、ヌクレオチドの組み込みを触媒する際のヌクレオチド特異的な相違を検出することができ、組み込まれたヌクレオチドの同一性および/または組み込まれたヌクレオチドの修飾の有無と関連付けることができる。
【００３７】
いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の決定を行う段階は、ナノポア配列決定法を行うことを含む。関心対象のDNA配列を印加電圧下で細孔（例えば、タンパク質細孔）に通すことができ、その間に、細孔を通過するイオン電流の変化を記録することができる。細孔電流および滞留時間の変化は、各種ヌクレオチドで異なるので、これらの、細孔電流および滞留時間の変化を検出することができ、組み込まれたヌクレオチドの同一性および/または組み込まれたヌクレオチドの修飾の有無と関連付けることができる。
【００３８】
いくつかの態様において、DNA修飾剤が導入される核は、単離された核である。いくつかの態様において、核は細胞内にある。
【００３９】
DNA修飾剤が導入される核が細胞内にある場合、本発明の方法は、細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊する段階であって、それにより細胞に該剤を導入する段階、および/または細胞への該剤の導入を増強する段階を含むことができる。細胞膜の透過処理または破壊は、細胞へのDNA修飾剤の導入前に行われてもよく、あるいは細胞へのDNA修飾剤の導入と同時に行われてもよい。あるいは、DNA修飾剤は単離された核に導入されてもよい。
【００４０】
種々の真核生物細胞を本発明に用いることができる。いくつかの態様において、細胞は、ヒトの、または非ヒトの哺乳動物細胞を非限定的に含む動物細胞である。非ヒト哺乳動物細胞には、霊長動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、ブタ細胞およびウシ細胞が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、細胞は植物細胞または（非限定的に酵母を含む）真菌細胞である。細胞は、例えば、初代培養細胞、不死化培養細胞であってもよく、または生検試料もしくは組織試料に由来し、任意で培養した上でアッセイする前に分裂するように刺激したものでもよい。培養細胞は、透過処理および／またはDNA修飾の段階の前および／または最中に、浮遊していてもよく、または付着していてもよい。細胞が動物組織、生検試料などに由来してもよい。例えば、細胞は腫瘍生検試料に由来しうる。
【００４１】
本発明は、以下によって細胞内の染色体DNAを分析する方法も提供する：（1）DNA修飾剤が一部のゲノム領域を他のものよりも（例えば、クロマチン構造の違いによる立体障害により）多く修飾するように細胞の核にDNA修飾剤を導入すること、（2）DNA修飾に特異的な親和性物質を用いて、修飾されたDNAをアフィニティー精製すること、続いて（3）修飾されたDNAについて濃縮されたアフィニティー精製試料を分析すること。
【００４２】
本明細書で説明されるように、いくつかの方法によってDNA修飾剤を細胞の核に導入することができる。核内のゲノムDNAが修飾されたら、DNAを、例えば、標準的な分子生物学法を通じて精製し、任意で断片化してもよい。断片化は、例えば、DNAせん断（例えば、小口径注射針を通じたDNAの押し出し）、超音波処理、または核酸ヌクレアーゼ（例えば、DNアーゼ）による切断により達成することができる。
【００４３】
精製され、任意で断片化されたら、DNAを、DNA修飾に特異的な親和性物質を用いた1つまたは複数のアフィニティー精製段階にかけることができる。1つまたは複数のDNA修飾を含有するDNA断片は、そのために試料中に濃縮されるようになると考えられるが、修飾をほとんどまたは全く持たない断片は洗い流されうる。得られた濃縮試料中のDNAをその後、分析することができる。濃縮試料中に濃縮された配列は、DNAを得た細胞中でDNA修飾剤が当該配列に接触して修飾しうるような、より「オープンな」クロマチン立体配置を有する可能性が高いであろう。
【００４４】
DNA親和性物質は、DNA修飾に対する選択的な親和性を有する任意の分子であってもよい。いくつかの態様において、親和性物質は抗体である。例えば、メチル-シトシンおよびメチル-アデノシンに対する親和性を有する抗体が知られており市販されている。他の種類のDNA修飾に特異的な抗体も企図される。あるいは、親和性物質は非抗体タンパク質であってもよい。一例として、DNA修飾がメチル-シトシンである場合には、メチル結合タンパク質（MBP）を用いることができる。さらに他の態様において、親和性物質は糖質、脂質、（非限定的にアプタマーを含む）核酸または他の分子のような、非タンパク質分子である。
【００４５】
いくつかの態様において、親和性物質は固体支持体と連結されている。いくつかの態様において、断片化および精製されたDNAは、修飾されたDNAに親和性物質が結合することを可能にする条件の下で、固体支持体と連結された親和性物質に接触され、結合していないDNAは洗浄されるか、別の方法でまたは結合したDNAから分離される。
【００４６】
III. DNA修飾剤
本発明の方法によれば、DNA修飾剤は、DNA修飾剤が核内のゲノムDNAを修飾するような条件下で、ゲノムDNAを有する核に導入される。非限定的に酵素、タンパク質および化学物質を含む多種多様なDNA修飾剤を本発明に用いることができる。
【００４７】
いくつかの態様において、DNA修飾剤は、単離された核に導入される。いくつかの態様において、DNA修飾剤は、透過処理の後または透過処理と同時に（例えば、エレクトロポレーション中もしくは透過処理剤とのインキュベーション中に）細胞内の核に導入される。
【００４８】
いくつかの態様においては、透過処理剤の除去後に、任意で緩衝液の変更とともに、DNA修飾剤を、透過処理を行った細胞と接触させる。または、いくつかの好ましい態様においては、1つまたは複数の中間段階を省いて（例えば、緩衝液の変更、細胞の洗浄などを省いて）、DNA修飾剤をゲノムDNAと接触させる。上述した通り、この後者のアプローチは、手間のかかる作業および必要な時間の量を減らすために好都合であり得、さらに、アッセイにおける誤差および混入をもたらす可能性のある原因も減らす。
【００４９】
用いるDNA修飾剤の量、ならびにDNA修飾剤との反応時間は、用いる剤に依存すると考えられる。当業者は、用いる剤に応じて条件をどのように調整すべきかを認識しているであろう。全般的に、DNA修飾段階の条件は、「完全な」修飾が達成されないように調整する。したがって、例えば、いくつかの態様において、修飾段階の条件は、陽性対照（すなわち、修飾がアクセス可能でありかつ修飾が生じる対照）に対して、修飾された陽性対照DNA領域のコピー数が少なくとも約10％、少なくとも約15％、20％、25％、30％、40％、またはそれ以上であるように設定される。
【００５０】
A．メチルトランスフェラーゼ
本発明のいくつかの態様において、DNA修飾剤はDNAに対する共有結合修飾を生じさせる。例えば、いくつかの態様において、本発明のDNA修飾剤はメチルトランスフェラーゼである。種々のメチルトランスフェラーゼが当技術分野において公知であり、本発明に用いることができる。
【００５１】
いくつかの態様において、用いるメチルトランスフェラーゼはDNA中のアデノシンに対してメチル部分を付加する。そのようなメチルトランスフェラーゼの例には、大腸菌（E. coli）DAMメチルトランスフェラーゼ、M.TaqI、M.EcoRV、M.FokI、およびM.EcoRIが非限定的に含まれる。アデノシンは一般的に真核生物細胞ではメチル化されないため、特定のDNA領域におけるメチル化アデノシンの存在は、DAMメチルトランスフェラーゼ、M.TaqI、M.EcoRV、M.FokI、およびM.EcoRI（または類似の活性を有する他のメチルトランスフェラーゼ）がDNA領域にアクセス可能であったことを示す。
【００５２】
いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼはGC配列中のシトシンをメチル化する。そのようなメチルトランスフェラーゼの例には、M.CviPIが非限定的に含まれる。例えば、Xu et al., Nuc. Acids Res. 26（17）: 3961-3966（1998）を参照のこと。GC配列は一般的に真核生物細胞ではメチル化されないため、特定のDNA領域におけるメチル化GC配列の存在は、DNA修飾剤（すなわち、GC配列中のシトシンをメチル化するメチルトランスフェラーゼ）がDNA領域にアクセス可能であったことを示す。
【００５３】
いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼは、CG（「CpG」としても知られる）配列中のシトシンをメチル化する。そのようなメチルトランスフェラーゼの例には、M.SssIが非限定的に含まれる。一般的にそのようなメチルトランスフェラーゼの使用は、、典型的にはメチル化されないDNA領域に対する使用に限定される。これは、CG配列が真核生物細胞では内因性にメチル化され、それ故に、メチル化が稀であるようなDNA領域を除き、CG配列が内因性メチルトランスフェラーゼではなく修飾剤によってメチル化されると想定することは一般に不可能なためである。
【００５４】
当技術分野において公知である他の適したメチルトランスフェラーゼには、例えば、N4位でシトシンをメチル化するメチルトランスフェラーゼ（例えば、M.BamHIおよびM.PvuII）ならびにC5位でシトシンをメチル化するメチルトランスフェラーゼ（例えば、M.HhaI）が含まれる。あるいは、DNA標的部位特異性の変化またはDNA修飾特異性の変化を示す、変異したまたは遺伝子操作したメチルトランスフェラーゼを用いることができる。
【００５５】
B．化学物質
いくつかの態様において、DNA修飾剤はDNA修飾性化学物質である。大部分のDNA修飾性化学物質はクロマチンと比較して相対的に小さいため、融合パートナーを伴わないDNA修飾性化学物質の使用は、異なるDNA領域のアクセス可能性の程度に仮に違いがあるにしてもわずかであると考えられることから、状況によっては有効でない。このため、いくつかの態様において、DNA修飾剤は、DNA修飾性化学物質と連結された立体障害を有する分子を含む。立体障害を有する分子は、クロマチン構造に応じてDNA修飾剤のアクセス可能性に違いをもたらす任意のタンパク質または他の分子でありうる。これは例えば、結果を、本明細書に記載したメチルトランスフェラーゼを用いた結果と比較することによって検討することができる。
【００５６】
いくつかの態様において、立体障害を有する分子は、少なくとも5、7、10または15kDのサイズであると考えられる。おそらく当業者は、立体障害を備える分子としてポリペプチドを用いることが好都合であると判断するであろう。DNA修飾剤がDNAを修飾する能力を著しく妨害することのない任意のポリペプチドを用いることができる。いくつかの態様において、ポリペプチドは、以下でさらに詳細に考察している二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメインである。
【００５７】
本発明のDNA修飾性化学物質は、立体障害を有する分子と直接連結させること、またはリンカーを介して連結させることができる。種々のホモおよびヘテロ二官能性リンカーが公知であり、この目的に用いることができる。
【００５８】
例示的なDNA修飾性化学物質には、ヒドラジン（および、例えば、Mathison et al., Toxicology and Applied Pharmacology 127（1）:91-98（1994）に記載されているようなその誘導体）および硫酸ジメチルが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、ヒドラジンはDNA中のグアニンにメチル基を導入するか、他の様式でDNAを損傷させる。いくつかの態様において、硫酸ジメチルはグアニンをメチル化するか、または、グアニン中に存在するイミダゾール環を開裂させることにより、DNA中のグアニンの塩基特異的切断をもたらす。
【００５９】
C．DNA修飾剤を改良するためのDNA結合ドメイン
いくつかの態様においては、本発明のDNA修飾剤を、二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメイン（例えば、DNA結合ドメイン）と融合させるかまたは他の様式で連結させる。DNA修飾剤がポリペプチドである場合には、二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメインを、例えば、DNA修飾剤とのタンパク質融合物として、組換えDNA技術を介して合成することができる。二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメインは、二本鎖核酸と配列非依存的な様式で結合するタンパク質またはタンパク質の定まった領域であり、すなわち結合は、特定の配列に対する全体的な選好性を示さない。いくつかの態様において、二本鎖核酸結合タンパク質は、二本鎖核酸に対して一本鎖核酸よりも10倍またはそれより高い親和性を示す。二本鎖核酸結合タンパク質は、本発明のいくつかの態様において耐熱性である。そのようなタンパク質の例には、古細菌小型塩基性DNA結合タンパク質Sac7dおよびSso7d（例えば、Choli et al., Biochimica et Biophysica Acta 950:193-203, 1988；Baumann et al., Structural Biol. 1:808-819, 1994；およびGao et al, Nature Struc. Biol. 5:782-786, 1998を参照）、古細菌HMf様タンパク質（例えば、Stanch et al., J. Molec. Biol. 255:187-203, 1996；Sandman et al., Gene 150:207-208, 1994を参照）、およびPCNA相同体（例えば、Cann et al., J. Bacteriology 181:6591-6599, 1999；Shamoo and Steitz, Cell:99, 155-166, 1999；De Felice et al., J. Molec. Biol. 291, 47-57, 1999；およびZhang et al., Biochemistry 34:10703-10712, 1995を参照）が非限定的に含まれる。DNA結合ドメインに関するそのほかの情報については、欧州特許第1283875B1も参照のこと。
【００６０】
Sso7dおよびSac7d
Sso7dおよびSac7dは、それぞれ超好熱性古細菌スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）およびS.アシドカルダリウス（S. acidocaldarius）に由来する小型（約7,000kd MW）の塩基性染色体タンパク質である。これらのタンパク質はリジンに富み、高い耐熱性、酸安定性および化学安定性を有する。それらはDNAと配列非依存的な様式で結合し、結合すると、DNAのTMをいくつかの条件下では最大40℃上昇させる（McAfee et al., Biochemistry 34:10063-10077, 1995）。これらのタンパク質およびそれらの相同体は、典型的には、高温でゲノムDNAを安定化させることに関与すると考えられている。
【００６１】
HMf様タンパク質
HMf様タンパク質は、DNAと直接相互作用すると考えられている真核生物H4ヒストンとアミノ酸配列および構造の両方の点で相同性のある古細菌ヒストンである。HMfファミリーのタンパク質は溶液中で安定な二量体を形成し、いくつかのHMf相同体が耐熱性種（例えば、メタノテルムス・フェルビダス（Methanothermus fervidus）およびパイロコッカス属GB-3a菌株）から同定されている。HMfファミリーのタンパク質は、Taq DNAポリメラーゼまたは固有の処理能力が低い任意のDNA修飾酵素と結合させると、その酵素がDNA基質に沿ってスライドする能力を強化し、それ故にその処理能力を高める。例えば、二量体HMf様タンパク質を、Taq DNAポリメラーゼのN末端に、例えば化学修飾を介して共有結合で連結させ、それによりそのポリメラーゼの処理能力を改善することができる。
【００６２】
当業者は、当技術分野において公知であるその他の二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメインを認知していると考えられ、それらを本明細書に記載したように用いることもできる。
【００６３】
IV．細胞の透過処理および破壊
細胞膜は、当技術分野において公知の任意の方法で透過処理すること、または破壊することができる。本明細書で説明しているように、本方法は、DNAの単離の前にゲノムDNAを接触させることを伴い、それ故に、細胞膜の透過処理または破壊の方法は、ヌクレオソームまたはクロマチンの構造が破壊されるように細胞のゲノムDNAの構造を破壊することはないと考えられる。
【００６４】
いくつかの態様において、細胞膜を、細胞膜を透過性にするかまたは破壊する剤と接触させる。リゾ脂質は、細胞膜を透過性にする例示的なクラスの剤である。例示的なリゾ脂質には、リゾホスファチジルコリン（当技術分野においてリゾレシチンとしても公知である）またはモノパルミトイルホスファチジルコリンが非限定的に含まれる。種々のリゾ脂質が、例えば、WO／2003／052095号にも記載されている。
【００６５】
非イオン性界面活性剤は、細胞膜を破壊する例示的なクラスの剤である。例示的な非イオン性界面活性剤には、NP40、Tween 20およびTriton X-100が非限定的に含まれる。
【００６６】
いくつかの態様において、透過処理剤とDNA修飾剤が同時に送達される。したがって、いくつかの態様においては、両方の剤を含む緩衝液を細胞と接触させる。緩衝液は、細胞クロマチンの構造を維持させながら両方の剤の活性を維持させるのに適合しているべきである。
【００６７】
または、エレクトロポレーションまたは微粒子銃法を、DNA修飾剤が細胞内に導入され、従ってゲノムDNAと接触しうるように、細胞膜を透過処理するために用いることもできる。多岐にわたるエレクトロポレーション法が周知であり、本明細書に記載されたDNA修飾剤の送達用に適合させることができる。例示的なエレクトロポレーション法には、WO／2000／062855号に記載されたものが非限定的に含まれる。微粒子銃法には、米国特許第5,179,022号に記載されたものが非限定的に含まれる。
【００６８】
V．DNA修飾段階後のDNAの分析
いくつかの態様において、DNA修飾段階の後に、利用可能な任意の方法に従ってゲノムDNAを核から単離する。その後の配列決定段階のために許容しうる純度のDNAがもたらされる限り、本質的にあらゆるDNA精製手順を用いることができる。例えば、標準的な細胞溶解試薬を、細胞を溶解するために用いることができる。任意でプロテアーゼ（プロテイナーゼKを非限定的に含む）を用いることができる。DNAは、当技術分野において公知である通りに混合物から単離することができる。いくつかの態様においては、フェノール／クロロホルム抽出を用い、DNAをその後に（例えば、エタノールにより）沈殿させて、精製する。いくつかの態様においては、必要に応じて（例えば、RNアーゼにより、またはDNA精製カラムにより）RNAを除去または分解する。
【００６９】
A．標的DNA領域
いくつかの態様において、全ゲノム配列の決定のために本発明の方法が用いられる。あるいは、いくつかの態様において、標的DNA領域の配列の決定のために本発明の方法が用いられる。DNA領域は、ゲノムDNA内部の関心対象の標的配列である。ゲノムDNA中の任意のDNA配列を、本明細書に記載した通りに、DNA修飾剤のアクセス可能性に関して評価することができる。例えば、複数の異なる細胞型において、処理していない細胞と薬物刺激、化学刺激もしくは環境的刺激に曝露された細胞との間で、または正常組織と罹患組織との間で異なるアクセス可能性を呈する、関心対象のDNA領域を同定するために、DNA領域をスクリーニングする。したがって、いくつかの態様において、本発明の方法は、アクセス可能性の変化が疾患（またはその欠如）のマーカーとして作用するDNA領域を同定するために用いられる。例示的な疾患には、癌が非限定的に含まれる。癌でない細胞と比較して癌細胞において、変化したDNAメチル化および／またはクロマチン構造を有する、数多くの遺伝子が記載されている。
【００７０】
種々のDNA領域を、研究目的で、および／または試薬が予想通りに機能することを確認するための対照DNA領域として、検出することができる。例えば、いくつかの態様においては、ある動物の本質的にすべての細胞においてアクセス可能であるDNA領域をアッセイする。そのようなDNA領域は、例えば、アクセス可能性に関する陽性対照として有用である。そのようなDNA領域は、例えば、構成的であるかまたはほぼ構成的である遺伝子の内部または近傍に見いだすことができる。そのような遺伝子には、一般に「ハウスキーピング」遺伝子と呼ばれるもの、すなわち、基本的な生物機能を維持するためにその発現が必要とされる遺伝子が含まれる。そのような遺伝子の例には、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）およびβアクチン（ACTB）が非限定的に含まれる。DNA領域には、任意でプロモーターの少なくとも一部分を含む、そのような遺伝子の全体または一部分が含まれうる。
【００７１】
いくつかの態様において、DNA領域は、ある動物のほとんどの細胞においてアクセス不能であるDNAの少なくとも一部分を含む。そのようなDNA領域は、例えば、アクセス可能性に関する陰性対照として有用である。この文脈における「アクセス不能な」とは、そのコピーが、DNA領域のコピーのわずかに5％前後の割合でしか修飾されないDNA領域のことを指す。そのような遺伝子配列の例には、「異質染色質」性として一般に認識されているものが含まれ、極めて特定の細胞型のみで発現される（例えば、組織特異的または臓器特異的な様式で発現される）遺伝子が含まれる。（特定の細胞型を除いて）一般にアクセス不能である例示的な遺伝子には、ヘモグロビン-β鎖（HBB）、免疫グロブリン軽鎖κ（IGK）、およびロドプシン（RHO）が非限定的に含まれる。
【００７２】
いくつかの態様において、DNA領域は、細胞の罹患状態に応じて異なるアクセス可能性を有するか、またはさもなければ細胞の型または生育環境に応じてさまざまなアクセス可能性を有する、遺伝子配列である。例えば、ある種の遺伝子は、癌でない細胞では一般にアクセス不能であるが、癌細胞ではアクセス可能である。さまざまなアクセス可能性を有する遺伝子には、例えば、グルタチオン-s-トランスフェラーゼπ（GSTP1）が含まれる。
【００７３】
いくつかの態様において、DNA領域は、例えば、異なる細胞型の間、異なる条件の間、正常細胞と罹患細胞との間などで異なるアクセス可能性を有する領域を同定するために、ランダムに選択される。
【００７４】
B. ヌクレオチド配列の決定
種々の方法を用いて、ヌクレオチド配列の決定、および配列決定されたヌクレオチドが修飾されている（例えば、メチル化されている）程度の決定を行うことができる。ヌクレオチド配列の決定、および配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことができる限り、当技術分野において公知の任意の配列決定法を用いることができる。本明細書で用いる場合、「同時に」とは、配列決定プロセスによって核酸断片におけるヌクレオチドの順序が決定される時に、それに加えて、修飾ヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチド）と非修飾ヌクレオチド（例えば、非メチル化ヌクレオチド）を区別することもできることを意味する。ヌクレオチド配列の検出と、配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの区別とを同時に行うことができる配列決定プロセスの例としては、単一分子リアルタイム（SMRT）配列決定法およびナノポア配列決定法が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００７５】
いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の決定は、DNA領域を鋳型依存的に複製することを含み、該複製により、標識されたヌクレオチド（例えば、蛍光標識されたヌクレオチド）の取り込みがもたらされ、取り込まれた異なるヌクレオチドから生成されるシグナルの到達時間および/または該シグナル間の時間間隔が、修飾の有無および/または取り込まれたヌクレオチドの同一性を示す。
【００７６】
単一分子リアルタイム配列決定法
いくつかの態様において、標的DNA領域を含むゲノムDNAは単一分子リアルタイム（SMRT）配列決定法により配列決定される。SMRT配列決定法は、単一のDNAポリメラーゼ分子がリアルタイムで認識され、その間に、それらが鋳型核酸鎖と相補的な蛍光標識ヌクレオチドの取り込みを触媒するというプロセスである。SMRT配列決定法は当技術分野において公知であり、Flusberg et al., Nature Methods, 7:461-465（2010）によって最初に記載されており、これはすべての目的で参照により本明細書に組み入れられる。
【００７７】
簡潔に言えば、SMRT配列決定法では、ヌクレオチドの取り込みが蛍光のパルスとして検出され、その色によりそのヌクレオチドが特定される。パルスは、ポリメラーゼがDNA鋳型中の次の塩基へ移行する前に、ヌクレオチドの末端と連結されている蛍光体がポリメラーゼによって切断される際に止まる。蛍光パルスは、発光スペクトル、ならびにパルスの持続時間（「パルス幅」）および連続パルス間の間隔（「パルス間隔時間」または「IPD」）により特徴付けられる。パルス幅は、ヌクレオチド結合後かつ蛍光体放出までのすべての動的段階と相関関係にあり、IPDは、ヌクレオチド結合およびポリメラーゼ移行の反応速度と相関関係にある。このように、SMRT配列決定法において蛍光パルスを測定することにより、DNAポリメラーゼの反応速度をモニターすることができる。
【００７８】
蛍光標識された各ヌクレオチド（すなわち、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシン）に特徴的な蛍光パルスの差異を測定することに加えて、非メチル化塩基と対比してメチル化塩基の差異を測定することもできる。例えば、メチル化塩基の存在は、メチル化塩基のIPDをその非メチル化対応物と比べて変化させる（例えば、非メチル化アデノシンと比べてメチル化アデノシン）。さらに、メチル化塩基の存在は、メチル化塩基のパルス幅をその非メチル化対応物と比べて変化させ（例えば、非メチル化シトシンと比べてメチル化シトシン）、さらに、異なる修飾は、異なるパルス幅を有する（例えば、5-ヒドロキシメチルシトシンは5-メチルシトシンよりも顕著な変化範囲を有する）。このように、各種の非修飾塩基および修飾塩基は、ある状況下でのIPDおよびパルス幅の組み合わせに基づいた固有のサインを有する。SMRT配列決定法の感度は、溶液条件、ポリメラーゼ変異、およびヌクレオチドの動態サインを活用するアルゴリズム法の最適化、ならびに隣接したメチル化シトシン塩基を分解するのを補助するデコンボリューション法によってさらに向上することができる。
【００７９】
ナノポア配列決定法
いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の決定を行う段階は、DNA領域を鋳型依存的に複製することを含まない。いくつかの態様において、標的DNA領域を含むゲノムDNAがナノポア配列決定法によって配列決定される。ナノポア配列決定法は、ポリヌクレオチドまたは核酸断片を印加電圧の下で細孔（例えば、タンパク質細孔）に通し、その間に細孔を通過するイオン電流の変化を記録するプロセスである。ナノポア配列決定法は当技術分野において公知である；例えば、Clarke et al., Nature Nanotechnology 4:265-270（2009）を参照されたく、これはすべての目的で参照により本明細書に組み入れられる。
【００８０】
簡潔に言えば、ナノポア配列決定法では、一本鎖DNA分子がタンパク質細孔を通過する際に各塩基が細孔をブロックする程度により生じる電流振幅の特徴的な減少により、各塩基が順番に記録される。静的な鎖における個々の核酸塩基を特定することができ、DNA移行の速度を（例えば、酵素の使用を通じて）十分に減速させることにより、または細孔によるDNA捕捉率を改善することにより（例えば、タンパク質細孔内の重要な残基を変異させることにより）、移動中に個々の核酸塩基を特定することもできる。
【００８１】
いくつかの態様において、ナノポア配列決定法は、塩基が放出の順に特定されるように、DNA鎖から個々のヌクレオチドを解放するためのエキソヌクレアーゼの使用、およびDNA分子が細孔中を移動する際に連続的な塩基の検出を可能とするための、細孔に共有結合されているアダプター分子の使用を含む。ヌクレオチドが細孔を通過する際に、ヌクレオチドはアダプター内での特徴的な残留電流および特徴的な滞留時間により特徴付けられ、非メチル化ヌクレオチドを区別することが可能になる。さらに、メチル化ヌクレオチドと、対応する非メチル化ヌクレオチドとの間に異なる滞留時間（例えば、5-メチル-dCMPはdCMPよりも長い滞留時間を有する）が認識され、したがって、ヌクレオチド配列の決定、および配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことが可能になる。ナノポア配列決定法の感度は、塩濃度を最適化することによって、印加電圧、pHおよび温度を調節することによって、またはエキソヌクレアーゼを変異させてその処理効率を変化させることによって、さらに増強することができる。
【００８２】
C. 修飾の程度の定量
いくつかの態様において、本発明は、少なくとも1つのDNA領域におけるDNA修飾の程度を定量する段階を含み、ここでDNA領域におけるDNA修飾の程度がその領域におけるクロマチン中のDNAのアクセス可能性を示す。一般に、対照と比べて、DNA領域における高レベルのDNA修飾は、疎なまたはアクセス可能な立体配置にあり、かつ一般的には転写的に活性であるクロマチン領域を示す。対照と比べて、DNA領域における低レベルのDNA修飾は、密に詰められたまたはアクセス不能な立体配置にあり、かつ一般的には転写的にサイレントであるクロマチン領域を示す。
【００８３】
本発明のヌクレオチド配列決定法を用いて、DNA領域における修飾の量を対照と比較することにより、DNA修飾、例えば、メチル化の程度を定量することができる。いくつかの態様において、関心対象の試料のDNA領域における修飾の量は、試料の対照DNA領域（例えば、試料のすべての細胞において一般的にアクセス可能であるまたは一般的にアクセス不能であることが知られているDNA領域）における修飾の量と比較することにより相対値として定量することができる。いくつかの態様において、関心対象の試料のDNA領域における修飾の量は、対照試料（例えば、正常試料または非病変試料）の対応するDNA領域における修飾の量と比較することにより相対値として定量することができる。
【００８４】
本発明の方法による修飾された（または修飾されていない）DNA領域の定量は、いくつかの態様において、DNA領域の修飾されたコピーまたは修飾されていないコピーの、その同じ領域のコピーの総数と比較した相対量（例えば、比またはパーセンテージなどの標準化された値）を決定することによって、さらに改良することができる。いくつかの態様において、1つのDNA領域の修飾されたコピーまたは修飾されていないコピーの相対量を、第2の（またはそれ以上の）DNA領域の修飾されたコピーまたは修飾されていないコピーの数と比較する。いくつかの態様において、2つまたはそれ以上のDNA領域の間で比較する場合には、各DNA領域の修飾されたコピーまたは修飾されていないコピーの相対量を、まず、DNA領域のコピーの総数に対して標準化する。または、同じ試料から得られる場合には、いくつかの態様において、各DNA領域のコピーの総数はおおよそ同じであると仮定し、そのため2つまたはそれ以上のDNA領域の間で比較する場合に、各値をコピーの総数に対してまず標準化することなしに、修飾されたコピーまたは修飾されていないコピーの相対量（例えば、比またはパーセンテージ）を各DNA領域間で決定することもできる。
【００８５】
いくつかの態様においては、修飾されたコピーまたは修飾されていないコピーの実際の量または相対量（例えば、全DNAとの対比）を、対照値と比較する。対照値は、例えば、特定のDNA領域に対するアクセス可能性が特定の値を上回るかそれ未満であるかを知りたい場合に、好都合に用いることができる。例えば、特定のDNA領域が正常細胞では典型的にはアクセス可能であるが罹患細胞ではアクセス不能である（またはその反対の）状況では、修飾されたコピーまたは修飾されていないコピーの実際の数または相対数を、単に、（例えば、10％超またはそれ未満が修飾されているかまたは修飾されていない、20％超またはそれ未満が修飾されているかまたは修飾されていない、などの）対照値と比較してもよい。または、対照値が、対照DNA領域に関する過去のデータまたは予想されるデータであってもよい。これらの場合には、対照DNA領域の実際の量または相対量を（任意で数回）決定し、その結果得られたデータを用いて、関心対象のDNA領域に関して決定された修飾されたコピーまたは修飾されていないコピーの実際の数または相対数と比較することのできる対照値を作成することができる。
【００８６】
本明細書に記載された方法のための計算は、コンピュータベースの計算およびツールを含みうる。これらのツールは、従来設計の汎用コンピュータシステム（本明細書では「ホストコンピュータ」と称する）によって実行可能なコンピュータプログラムの形態で提供されることが好都合である。ホストコンピュータは数多くのさまざまなハードウェア構成部分を用いて構成されてよく、さまざまな寸法および方式で製造することができる（例えば、デスクトップPC、ラップトップ、タブレットPC、ハンディ型コンピュータ、サーバー、ワークステーション、大型汎用コンピュータ）。モニター、キーボード、ディスクドライブ、CDおよび／またはDVDドライブなどの標準的な構成部品が含まれてもよい。ホストコンピュータをネットワークに結びつける場合、接続は任意の適した伝達媒体（例えば、有線媒体、光媒体および／または無線媒体）ならびに任意の適した通信プロトコル（例えば、TCP/IP）を介して提供されうる；ホストコンピュータが適したネットワーク用ハードウェア（例えば、モデム、イーサネットカード、WiFiカード）を含んでもよい。ホストコンピュータは、UNIX、Linux、Microsoft Windows、MacOSまたは任意の他のオペレーティングシステムを含む、さまざまなオペレーティングシステムの任意のものを実行してよい。
【００８７】
本発明の実行局面に関するコンピュータコードは、PERL、C、C＋＋、Java、JavaScript、VBScript、AWK、または、ホストコンピュータ上で実行されうるか、もしくはホストコンピュータ上で実行されるようにコンパイルされうる、任意の他のスクリプト言語またはプログラム言語を含むさまざまな言語で記述されうる。また、コードを、アセンブリ言語またはマシン言語のような低水準言語で記述するかまたは分散させてもよい。
【００８８】
ホストコンピュータシステムは、ユーザーがツールの動作を制御するインターフェースを好都合に提供する。本明細書に記載された例において、ソフトウェアツールはスクリプト（例えば、PERLを用いる）として実行され、その遂行はユーザーにより、LinuxまたはUNIXなどのオペレーティングシステムの標準的なコマンドラインインターフェースから開始される。当業者は、コマンドをオペレーティングシステムに対して適宜適合させうることを認識しているであろう。他の態様において、ユーザーがポインティングデバイスを用いて動作を制御することを可能にするグラフィカルユーザーインターフェースが提供されてもよい。したがって、本発明は、いかなる特定のユーザーインターフェースにも限定されない。
【００８９】
本発明のさまざまな特徴を組み入れたスクリプトまたはプログラムを、記憶および／または伝達のために、さまざまなコンピュータ可読媒体上に符号化して記録してもよい。適した媒体の例には、磁気ディスクまたはテープ、コンパクトディスク（CD）またはDVD（デジタル多目的ディスク）などの光学記憶媒体、フラッシュメモリー、ならびにインターネットを含む種々のプロトコルに準拠する有線、光および／または無線ネットワークを介した伝達用に適合化されたキャリア信号が含まれる。
【００９０】
VI. 診断法および予後予測法
本発明はまた、ゲノムDNAにおけるDNA修飾の程度および位置に基づき、疾患もしくは病態に対する診断を行うためのもしくは予後予測を提供するための方法、または疾患もしくは病態に対する処置経過を決定するための方法を提供する。いくつかの態様において、DNA領域は、特定の細胞の罹患状態または発生状態に応じて、アクセス可能性に差異を伴うことが判明している。これらの態様において、本発明の方法は、診断ツールまたは予後予測ツールとして用いることができる。例えば、いくつかの態様において、標的領域におけるDNAは、正常細胞もしくは組織においては高度にアクセス可能でありかつ（例えばメチル化により）修飾されることが可能でありうるが、病変細胞もしくは組織においてはアクセス不能でありかつ修飾に対して抵抗性でありうる（またはその逆も同様）。
【００９１】
本発明の方法を用いて診断または予後予測がひとたび確定されれば、その診断または予後予測を考慮して、治療レジメンを設定すること、または既存の治療レジメンを変更することができる。例えば、本発明の方法に従った癌細胞の検出は、癌細胞が検出された個体に対する化学療法薬および／または放射線の投与につながりうる。
【００９２】
VII．反応混合物
本発明はまた、本明細書に記載された試薬の1つまたは複数を、任意で（クロマチン状態を決定しようとする）真核細胞とともに含む、反応混合物も提供する。いくつかの態様において、反応混合物は、例えば、DNA修飾剤（例えば、メチルトランスフェラーゼまたはDNA修飾性化学物質）および細胞透過処理剤および／または細胞破壊剤、ならびに真核細胞を含む。また、本明細書に記載された他の試薬（配列決定試薬を非限定的に含む）を本発明の反応混合物中に含めることもできる。
【００９３】
VIII．キット
本発明はまた、本発明のアクセス可能性アッセイを行うためのキットも提供する。キットは、書面による使用説明書、または電子的な使用説明書（例えば、CD-ROMまたはDVD上）を任意で含んでもよい。本発明のキットは、例えば、DNA修飾剤、ならびに細胞透過処理剤および／または細胞破壊剤を含んでもよい。DNA修飾剤には、例えば、メチルトランスフェラーゼまたはDNA修飾性化学物質を含む、本明細書中に詳細に記載されたものが含まれうる。本発明のキットは、透過処理剤およびDNA修飾剤を、同じバイアル／容器内（およびそれ故に同じ緩衝液中）に含む。または、透過処理剤およびDNA修飾剤が別々のバイアル／容器内にあってもよい。
【００９４】
本発明のキットはまた、1つまたは複数の対照細胞および／または核酸も含みうる。例示的な対照核酸には、例えば、ある動物の本質的にすべての細胞においてアクセス可能である（例えば、ハウスキーピング遺伝子配列またはそのプロモーター）か、またはある動物のほとんどの細胞においてアクセス不能であるかのいずれかである遺伝子配列を含むものが含まれる。いくつかの態様において、本キットは、そのような遺伝子配列を増幅するためのプライマーの1つまたは複数のセットを（遺伝子配列または細胞がキットに実際に含まれるか否かにかかわらず）含む。例えば、いくつかの態様において、本キットは、DNA修飾剤ならびに細胞透過処理剤および／または細胞破壊剤、ならびに対照DNA領域を増幅するための1つまたは複数のプライマーセット、ならびに任意で、第2のDNA領域（例えば標的DNA領域）を増幅するための1つまたは複数のプライマーセットを含む。
【００９５】
いくつかの態様において、本発明のキットは、以下のもののうち1つまたは複数を含む：
（i）メチルトランスフェラーゼもしくは他のDNA修飾剤；
（ii）細胞膜の透過処理剤もしくは破壊剤；
（iii）修飾剤によるさらなる修飾を防止することのできる「停止」用溶液；
（iv）核酸の抽出および/もしくは精製のための材料（例えば、ゲノムDNAの精製および/もしくは「停止」用溶液の成分などの非DNA成分を除去するためのスピンカラム）；ならびに
（v）DNAの配列決定のための試薬（例えば、単分子リアルタイム配列決定試薬またはナノポア配列決定試薬）。
【実施例】
【００９６】
以下の実施例は、特許請求する本発明を限定するためではなく、それを例示するために提供される。
【００９７】
DNA修飾剤による修飾に対するクロマチン領域のアクセス可能性を、4種の細胞株でさまざまなアクセス可能性レベルの4種の遺伝子について調べた（図2）。DAMメチルトランスフェラーゼは、GATCモチーフの6'位でアデニンをメチル化する細菌酵素である。
【００９８】
4種の遺伝子、すなわちロドプシン（RHO）、β-2ミクログロブリン（B2M）、P14およびH-カドヘリン（CDH13）におけるDNA修飾を、4種の細胞株：HeLa、PC3、LNCaPおよびHCT15を用いて本明細書に記載されるように分析した。各遺伝子および各細胞株に対し、透過処理した細胞をDAMメチルトランスフェラーゼで処理した（DAM処理なしを対照として用いた）。ゲノムDNAを単離し、その後、DpnIIで消化した（DpnII処理なしを対照として用いた）。選択したゲノム領域のDpnII消化を、当技術分野において公知の定量的PCR（qPCR）法を用いて評価した。増幅された領域のそれぞれに、1箇所の潜在的なDAM修飾部位（GATC）が存在していた。
【００９９】
DAMメチルトランスフェラーゼによるゲノムDNAのDNA修飾の後、DNA修飾の程度（したがって、ゲノムDNA領域のアクセス可能性のレベル）を、メチル化感受性制限酵素DpnIIを用いて定量したが、DNA修飾の程度を分析するのにSMRT配列決定法またはナノポア配列決定法のような他の方法も適当であろう。DpnIIは、非メチル化DNAにおけるGATC領域を認識して消化する酵素であるが、DpnII酵素活性はDAMメチル化によって遮断される；したがって、DNA領域におけるアデノシンがメチル化されたGATCモチーフは消化から保護される。
【０１００】
B2Mプロモーターの分析
B2Mは、すべての細胞株において構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子である。すべての細胞株において、DAMあり/DpnIIありの線（丸形）は、DAMなし/DpnIIありの線（四角形）から左にシフトしている（図2A）。これは、DAMがB2Mプロモーターを修飾し、それをDpnII消化から保護したことを示しており、B2Mプロモーターがすべての細胞株においてアクセス可能であること、つまり以前のデータと一致する所見を示唆している。
【０１０１】
RHOプロモーターの分析
RHOは、分析されるすべての細胞株において発現されておらず、そのプロモーターはアクセス不能なクロマチン立体配置の中にある。すべての細胞株において、DAMあり/DpnIIありの線（丸形）は、DAMなし/DpnIIありの線（四角形）と同じ形跡をたどっている（図2B）。これは、RHOプロモーターがDpnII消化から保護されており、RHOプロモーターの位置がアクセス不能なクロマチンにあることと一致することを示している。
【０１０２】
p14プロモーターの分析
p14はHCT15細胞において発現されておらず、そのプロモーターはアクセス不能である。p14はHela、PC3およびLNCaP細胞において発現されており、そのプロモーターはアクセス可能である。DAM修飾に関する本発明者らの分析から、主に閉ざされたクロマチン立体配置にあるp14プロモーターはHCT15細胞においてのみであることが明らかである（図2C）。
【０１０３】
CDH13プロモーターの分析
CDH13はHela細胞において高度に発現されており、そのプロモーターはアクセス可能である。CH13はPC3、LNCaPおよびHCT15細胞において十分に発現されておらず、そのプロモーターはアクセス不能である。DAM修飾に関する本発明者らの分析から、高度にアクセス可能なクロマチン立体配置にあるCDH13プロモーターはHela細胞においてのみであることが明らかである（図2D）。その他の細胞株においてCDH13プロモーターは中等度から強固に閉ざされている。
【０１０４】
このデータは、インサイチューでのクロマチンのDAM修飾がアクセス可能なクロマチン領域では起こるが、アクセス不能な領域では起こらないことを実証している。これらの結果はまた、修飾されたDNA塩基をDNA配列決定中に検出することにより、アクセス可能なクロマチン領域を特定できることを意味している。
【０１０５】
本明細書に記載された例および態様が例示のみを目的としていること、ならびにそれらを考慮してさまざまな改変および変更が当業者には想起されると考えられ、それらが本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることは、理解されるであろう。本明細書中に引用された刊行物、特許および特許出願はすべて、それらの全体が、あらゆる目的で参照により組み入れられる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【国際調査報告】
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