(57)【要約】本発明は、有効投与量頻度で治療有効量のリソソーム酸リパーゼを哺乳類に投与することを含む、ＬＡＬ欠乏症（例えば、ウォルマン病、ＣＥＳＤ）の治療を提供する。ＬＡＬ欠乏症に罹患するヒト患者の成長および肝機能を改善する、ＬＡＬ組織中濃度を増加させる、ならびにＬＡＬ活性を増加させる方法も提供する。一局面において、本発明は、有効量の外因性リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）を投与することにより、ヒト患者のＬＡＬ欠乏症に関連する疾患または状態を治療する方法を提供する。外因性ＬＡＬは、少なくとも１つのマンノースおよび／またはマンノース−６−リン酸塩を含むＮ結合グリカン構造を有する組み換えヒトＬＡＬであり得る。外因性ＬＡＬは、例えばリンパ球、マクロファージ、および／または線維芽細胞のリソソーム中に効果的に内在化される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠乏症を有するヒト患者を治療する方法であって、組み換えヒトＬＡＬを前記患者に投与することを含み、前記投与は、肝機能を改善するのに十分である、方法。
【請求項２】
前記投与は、肝臓試験を正常化するのに十分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投与は、肝腫大を最小にするのに十分である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記投与は、肝臓の大きさを減少させるのに十分である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記投与は、肝臓トランスアミナーゼの血清レベルを減少させるのに十分である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記投与は、脂質レベルを減少させるのに十分である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記投与は、トリグリセリドレベルを減少させるのに十分である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記投与は、コレステリルエステルを減少させるのに十分である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＬＡＬ欠乏症を有するヒト患者のＬＡＬ活性を増大させる方法であって、組み換えヒトＬＡＬを前記患者に投与することを含み、前記投与は、前記患者におけるＬＡＬ活性の増大を結果としてもたらす、方法。
【請求項１０】
前記投与は、前記患者のＬＡＬ活性を少なくとも約３５ｐｍｏｌ／ｍｇ／分だけ増大させるのに十分である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
治療を必要とする患者においてＬＡＬ欠乏症に関連する状態を治療する方法であって、有効量の外因性ＬＡＬタンパク質を前記患者に５日に１回〜３０日に１回投与することを含む、方法。
【請求項１２】
治療を必要とする患者においてＬＡＬ欠乏症に関連する状態を治療する方法であって、７日に１回〜１４日に１回投与される、１キログラム当り０．１ｍｇ〜５０ｍｇの用量の外因性ＬＡＬを前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１３】
治療を必要とする患者においてＬＡＬ欠乏症に関連する状態を治療する方法であって、１キログラム当り約０．１ｍｇ〜５．０ｍｇの用量の外因性ＬＡＬを前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
治療を必要とするヒト患者においてウォルマン病またはＣＥＳＤを治療する方法であって、５日に１回〜３０日に１回投与される、１キログラム当り約０．１ｍｇ〜５０ｍｇの用量の外因性ＬＡＬを前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
前記外因性ＬＡＬは、組み換えヒトＬＡＬである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記外因性ＬＡＬは、少なくとも１つのマンノースまたはマンノース−６−リン酸塩を含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＬＡＬは、約０．１０ｍｇ／ｋｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１〜１２または請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記量は約０．３０ｍｇ／ｋｇである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記量は約０．３５ｍｇ／ｋｇである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記量は約１．０ｍｇ／ｋｇである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記量は約３．０ｍｇ／ｋｇである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記投与は、ほぼ毎週のものである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記投与は、約２週間に一度のものである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記投与は、治療前のレベルから少なくとも５０％だけ血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）のレベルを減少させるのに十分である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記投与は、治療前のレベルから少なくとも５０％だけ血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）のレベルを減少させるのに十分である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与は、約１７分未満のＬＡＬ半減期（ｔ１／２）を達成するのに十分である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記投与は、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、または約１７分のＬＡＬ半減期（ｔ１／２）を達成するのに十分である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記投与は、血清１ｍＬ当り少なくとも約２００ｎｇのＣｍａｘを達成するのに十分である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記投与は、血清１ｍＬ当り約２００ｎｇ〜血清１ｍＬ当り約８００ｎｇのＣｍａｘを達成するのに十分である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＬＡＬは、線維芽細胞によって内在化される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＬＡＬは、マクロファージによって内在化される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＬＡＬは、遺伝子導入鳥類によって産生される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＬＡＬは、哺乳類細胞系によって産生される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳類細胞系は、ヒト細胞系である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記投与は、静脈内のものである、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記投与は、点滴によるものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記点滴は、約２時間〜約４時間にわたるものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記点滴は、約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間〜約４ｍｇ／ｋｇ／時間の速度である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記投与は、前記組み換えヒトＬＡＬに対する免疫応答を最小にする、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記投与は、リンパ節腫大を減少させる、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記投与は、血清フェリチンレベルを減少させるのに十分である、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記投与は、血清ヘモグロビンレベルを増大させるのに十分である、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記投与は、小児患者の成長を増進させるのに十分である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記投与は、体重増加の速度を上昇させるのに十分である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
投与後の前記患者の成長速度は、前記投与前の前記患者の成長速度の少なくとも約２倍である、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記投与は、脂肪組織を増大させるのに十分である、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記患者は、１歳未満である、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記患者は、少なくとも１歳である、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記患者は、ウォルマン病（ＷＤ）と診断された、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記患者は、コレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）と診断された、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＣＥＳＤは、１０歳より前に診断された、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
第２の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２の治療薬は、コレステロール減少剤である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第２の治療薬は、スタチンである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第２の治療薬は、エゼチミブである、請求項５３に記載の方法
【請求項５６】
前記第２の治療薬は、ＬＡＬの免疫原性を減少させる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記第２の治療薬は、抗ヒスタミン剤である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記第２の治療薬は、免疫抑制剤である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗ヒスタミン剤は、前記ＬＡＬが投与される前に投与される、薬学的有効用量のジフェンヒドラミンである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ジフェンヒドラミンの用量は、１キログラム当たり約１ｍｇ〜約５ｍｇである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ジフェンヒドラミンは、ＬＡＬの投与の約２０分前〜約９０分前に投与される、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記患者の臨床的な提示および病理学的な提示を監視するための評価を完了することをさらに含む、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記評価は、脂質分析、胸部Ｘ線、肝機能試験、糞便チャート、血漿メバロン酸分析、免疫原性試験、血漿リソソーム酸性リパーゼ分析、キトトリオシダーゼ分析、門脈圧亢進分析、人体測定、肝臓または脾臓の特徴づけ、胃腸管の画像化またはこれらの組み合わせである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記画像化の技術は、超音波、磁気共鳴画像法または核磁気共鳴分光である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法にしたがってＬＡＬを投与するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）欠乏症は、酵素の欠乏によりリソソーム中のコレステリルエステル（ＣＥ）およびトリグリセリド（ＴＡＧ）を分解できないことを特徴とする、珍しいリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）である。ＬＡＬ欠乏症は、多くの組織および細胞種における基質の蓄積を伴う他のリソソーム蓄積障害に似ている。ＬＡＬ欠乏症において、基質の蓄積は、肝臓のクッパー細胞、脾臓の組織球、および小腸の固有層を含む網内系の細胞で最も際立つ。網内細胞は、結合、細胞の取り込み、およびＧｌｃＮＡｃもしくはマンノース末端Ｎ−グリカンを有するタンパク質のリソソーム内在化を媒介し、これらの重要な細胞種における酵素欠乏を潜在的に補正するための経路を提供する、マクロファージマンノース／Ｎ−アセチルグルコサミン受容体（マクロファージマンノース受容体ＭＭＲ、もしくはＣＤ２０６として知られる）を発現する。
【０００２】
ＬＡＬ欠乏症は、胃腸、肝臓、および心血管の合併症と共に最も一般的に顕在化し、顕著な罹患率および死亡率と関連する多系疾患である。ＬＡＬ欠乏症の臨床作用は、多くの組織のリソソームにおける脂質物質の大量の蓄積ならびに肝コレステロール合成の実質的な増加を含む、コレステロールおよび脂質における恒常的機序の著しい妨害による。ＬＡＬ欠乏症は、ウォルマン病（ＷＤ）およびコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）の少なくとも２つの表現型として現れる。
【０００３】
最初に説明した医師にちなんで名付けられたウォルマン病は、最も攻撃的なＬＡＬ欠乏症の表れである。この表現型は、成長阻害、吸収不良、脂肪便、著しい体重減少、リンパ節腫大、膵腫大、および肝腫大を含む、胃腸および肝臓の顕在化を特徴とする。ウォルマン病は、急速に進行し、通常生後１年以内に必ず命にかかわる。例症報告調査は、生後１年で重度のＬＡＬ欠乏症により成長阻害を示す患者において、１２ヶ月齢を超えた生存は、非常に珍しい。この最も攻撃的な形態において、成長阻害は、主な臨床特徴であり、早期死亡の主な寄与因子である。肝肥大およびトランスアミナーゼの上昇により示されるように、肝臓の関与も、乳児において一般的である。
【０００４】
ウォルマン病の診断は、身体所見および実験分析の両方により確立される。乳児は、典型的に、下痢、持続的嘔吐、摂食困難、成長阻止、および発育不良により生後２ヶ月内に入院する。身体所見は、肝腫大および膵腫大による腹部膨満を含み、Ｘ線検査は、副腎のカルシウム沈着を明らかにすることが多い。実験評価は、典型的に、血清トランスアミナーゼレベルの上昇および内因性ＬＡＬ酵素活性の不在または極端な低下を明らかにする。コレステロールおよびトリグリセリドの血中濃度の上昇が一部の患者に見られる。
【０００５】
ＬＡＬ欠乏症を有する患者は、後年、主な肝臓および心血管の関与を示すこともあり、これは、しばしば、コレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）と呼ばれる。ＣＥＳＤにおいて、肝臓は、著しい肝腫大、肝細胞壊死、トランスアミナーゼの上昇、肝硬変、および肝臓線維症の影響を強く受ける。ＣＥおよびＴＡＧのレベルの増加により、心血管の関与は、高脂血症を特徴とすることができる。ＣＥＳＤに罹患する一部の対象において、動脈壁上の脂肪沈着の蓄積（粥状動脈硬化）が報告されてきた。沈着は、動脈管腔を狭め、心筋梗塞および脳卒中を含む顕著な心血管事象のリスクを増加させる血管の閉塞をもたらす可能性がある。しかしながら、ＬＡＬ欠乏症に罹患する全ての患者が粥状動脈硬化を発症するわけではない。例えば、ウォルマン病の患者は、肝臓および脾臓の肥大、リンパ節腫大、および小腸による吸収不良を含む疾患に関連する他の症状に圧倒されるが、ＷＤは、一般に、粥状動脈硬化を特徴としない（Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｃｒｉｖｅｒ，Ｃ．Ｒ．，Ｂｅａｕｄｅｔ，Ａ．Ｌ．，Ｓｌｙ，Ｗ．Ｓ．ａｎｄ  Ｖａｌｌｅ  Ｄ．，ｅｄｓ）７ｔｈ  ｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅ２  ｐ．２５７０  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，１９９５）。同様に、全てのＣＥＳＤ患者が粥状動脈硬化を示すわけではない。Ｄｉ  Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１１：７６４−７７２（１９９０），Ａｍｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３６：２４１−２５０（１９９５）を参照のこと。ＣＥＳＤの表れは、合併症が成人期後期に顕在化するまで診断されない一部の患者により非常に変動するが、一方で、他は、幼児期早期に表れる肝不全を有する可能性がある。ＣＥＳＤは、短い寿命および著しい健康障害と関連する。ＣＥＳＤを有する者の平均余命は、関連する合併症の重篤度に依存する。
【０００６】
ウォルマン病の現在の治療選択肢は、非常に限られている。発熱および／または感染の兆候がある乳児に抗生物質が投与される。副腎不全のためのステロイド置換療法および専門的な栄養支援が処方され得、これらの介入が死を防止するという証拠はないが、これらが短期間の生存に影響を及ぼすかも、今のところはっきりしない。骨髄移植で治療されたＬＡＬ欠乏症を有する一連の４人の患者において、処置の合併症により、患者４人全員が移植の月内に死亡した。一部の成功が後の例症報告で説明されたが、死亡率は高く、多くの患者は、病気が重くて移植前状態調節レジームを耐え抜くことができないため、移植されない。非常に少数の報告された長期生存者は、造血性細胞のみの酵素欠乏の補正が、これらの疾患における臨床状態を実質的に改善するのに十分であることを示す。典型的に、臨床支援は、死をもたらす疾患の急な顕在化と関連する非可搬性脂質および非分解性脂質の蓄積を制限するための試みにおいて、食事制限により提供される。
【０００７】
ＣＥＳＤ表現型の現在の治療選択肢は、コレステロールおよびトリグリセリドが豊富な食物を除外する食事による脂質蓄積の制御、ならびにコレステロール低下剤（例えば、スタチンおよびコレスチラミン）の投与によるコレステロール合成およびアポリポタンパク質Ｂ産生の抑制を介した対症治療に集中する。ある程度の臨床改善が見られるかもしれないが、根底にある疾患の顕在化は持続し、疾患の進行がさらに起こる。
【０００８】
組み換えＬＡＬを用いた酵素置換療法がリソソーム酸リパーゼ欠乏症および関連する症状に対して現実的な治療選択肢であってもよいことが示されてきた（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．５（４）：４２３−４４２、特許文献１、およびＢｅｓｌｅｙ（１９８４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２６：１９５−２０３を参照）。ＬＡＬ欠乏症のマウスモデルを使用した一部の研究は、３日に１回、高用量（体重１キログラム当り１ミリグラムを超える）の組み換えヒトＬＡＬの点滴により、ＬＡＬ欠乏（ＬＡＬ−／−）マウスのいくつかの異常の補正を示した（例えば、Ｇｒａｂｏｗｓｋｉの特許文献２を参照）。ＬＡＬ欠乏マウス内の欠損を補正するためのこれらの初期の研究は、根底にある表現型を補正するために、比較的多量および高頻度投与量の組み換えＬＡＬタンパク質が必要であったことを示唆した。最初にＹｏｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｋｕｒｉｙａｍａ（１９９０）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ４０，ｐ４８６−４８９によって説明されたＬＡＬ−／−ラットモデルと異なり、上記の研究で使用されたＬＡＬ−／−マウスモデルは、ＬＡＬ欠乏マウスがヒト患者で見られる成長異常を示さないという点で、ヒトＷＤに密接に似ていないことに留意することも重要である。
【０００９】
今まで、外因性ＬＡＬは、ヒトに投与されておらず、ＷＤ、ＣＥＳＤ、およびその他を含むＬＡＬ欠乏症を治療するのに利用可能な有効な療法がない。したがって、患者の生活の質を改善するために、最小頻度の投与による療法の緊急な必要性が存在する。さらに、ヒト患者の成長を回復する、肝機能を正常化する、ＬＡＬ組織濃度を増加させる、およびＬＡＬ活性を増加させる治療有効用量が望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第９８/１１２０６号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／０２６４２４９号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、患者が外因性ＬＡＬで正常に投与された最初のヒト臨床例症に基づく。ＬＡＬ欠乏症（ウォルマン病または早発性ＬＡＬ欠乏症）の他の致命的な形態に罹患する乳児が、外因性ＬＡＬを投与することによって効果的に治療され、ＬＡＬ酵素置換療法の安全評価が、遅発性ＬＡＬ欠乏症に罹患するヒト患者群で評価された。早発性ＬＡＬ欠乏症を有する乳児は、いずれの有害事象または有害反応を引き起こすことなく、毎週低用量を投与された。有効性についての生命徴候および臨床／実験測定値の劇的な改善は、早ければ初期投与後１〜２週で観察された。４ヶ月を超える毎週投与後、治療された乳児は、正常な成長を回復し、吸収不良、肝腫大、および肝機能を含むＬＡＬ欠乏症に関連する全ての症状において著しい改善を示した。遅発性成人患者も、有害事象の兆しもなく、毎週低量の外因性ＬＡＬを投与された。したがって、今まで収集された臨床データは、本発明の外因性ＬＡＬを使用した酵素置換療法がＬＡＬ欠乏症に対して安全かつ効果的な治療を提供することを示す。
【００１２】
したがって、本発明は、有効量の外因性リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）を投与することにより、ヒト患者のＬＡＬ欠乏症に関連する疾患または状態を治療する方法を提供する。外因性ＬＡＬは、少なくとも１つのマンノースおよび／またはマンノース−６−リン酸塩を含むＮ結合グリカン構造を有する組み換えヒトＬＡＬであり得る。外因性ＬＡＬは、例えばリンパ球、マクロファージ、および／または線維芽細胞のリソソーム中に効果的に内在化される。
【００１３】
一部の実施形態では、ＬＡＬ欠乏症に罹患するヒト患者は、ウォルマン病（ＷＤ）と診断される。一実施形態では、投与は、ＷＤ患者の成長を増加させるのに十分である。一実施形態では、投与は、ＷＤ患者の正常な成長を回復するのに十分である。他の実施形態では、ＬＡＬ欠乏症に罹患する患者は、コレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）と診断される。本発明による治療方法は、あらゆる年齢のヒト患者に提供され得る。
【００１４】
肝機能を改善するために有効量で組み換えヒトＬＡＬを患者に投与することにより、ＬＡＬ欠乏症に罹患するヒト患者を治療するための方法も、本明細書において提供する。一部の実施形態では、投与は、肝臓試験を正常化するのに十分である。一実施形態では、投与は、肝臓トランスアミナーゼの血清レベルを減少させるのに十分である。例えば、肝臓トランスアミナーゼは、血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）および／またはアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）を含んでもよい。一実施形態では、投与は、肝腫大を最小にするのに十分である。一実施形態では、投与は、患者の肝臓の大きさを減少させるのに十分である。一実施形態では、投与は、血清フェリチンレベルを減少させるのに十分である。
【００１５】
一実施形態では、投与は、例えば、コレステリルエステル（ＣＥ）および／またはトリグリセリド（ＴＧ）レベルを含む血清脂質レベルを減少させるのに十分である。
【００１６】
ＬＡＬ欠乏症を有するヒト患者のＬＡＬ活性を増加させる方法も提供する。そのような方法は、投与が、例えばリンパ球および／または線維芽細胞で測定され得るＬＡＬ活性の増加をもたらすように、組み換えヒトＬＡＬを患者に投与することを含む。
【００１７】
一実施形態では、５日に１回〜３０日に１回、有効量の外因性ＬＡＬタンパク質を患者に投与することにより、ヒト患者のＬＡＬ欠乏症に関連する状態を治療する方法を説明する。
【００１８】
一部の実施形態では、ＬＡＬ欠乏症に罹患するヒト患者は、体重１キログラム当り約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇの外因性ＬＡＬを投与される。一実施形態では、ヒト患者は、体重１キログラム当り約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの外因性ＬＡＬを投与される。一実施形態では、ヒト患者は、体重１キログラム当り約０．１ｍｇ〜約５ｍｇの外因性ＬＡＬを投与される。
【００１９】
一実施形態では、点滴速度は、約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間〜約４ｍｇ／ｋｇ／時間である。
【００２０】
一部の実施形態では、ヒト患者は第２の治療薬で治療される。第２の治療薬は、例えば、コレステロール低下剤（例えばスタチンもしくはエゼチミブ）、抗ヒスタミン剤（例えばジフェンヒドラミン）、または免疫抑制剤を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａは、外因性ＬＡＬ（ＳＢＣ−１０２）の投与を毎週受けたウォルマン病の小児男子（即ち、早発性ＬＡＬ欠乏症）患者の血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）のレベルを示す（用量：０．２ｍｇ／ｋｇ（初期点滴；０週目）；０．３ｍｇ／ｋｇ（１週目）；０．５ｍｇ／ｋｇ（２週目）；および１．０ｍｇ／ｋｇ（３〜８週目））。図１Ｂは、同じ患者の血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）のレベルを示す。患者の年齢は、初期点滴時、４ヶ月と１週であった。
【図２】外因性ＬＡＬ（ＳＢＣ−１０２）の投与を毎週受けたウォルマン病患者の血清フェリチンのレベルを示す（用量：０．２ｍｇ／ｋｇ（初期点滴；０週目）；０．３ｍｇ／ｋｇ（１週目）；０．５ｍｇ／ｋｇ（２週目）；および１．０ｍｇ／ｋｇ（３〜８週目））。患者の年齢は、初期点滴時、４ヶ月と１週であった。０週目の初期投与後１週目からの血清フェリチンレベルが示される。
【図３】外因性ＬＡＬ（ＳＢＣ−１０２）の投与を毎週受けたウォルマン病患者の成長速度を示す（用量：０．２ｍｇ／ｋｇ（初期点滴；０週目）；０．３ｍｇ／ｋｇ（１週目）；０．５ｍｇ／ｋｇ（２週目）；および１．０ｍｇ／ｋｇ（３〜８週目））。
【図４】ウォルマン病患者（ｋｇ、男子の年齢別体重パーセンタイル）の成長曲線を示す。
【図５】０．３５ｍｇ／ｋｇの用量の外因性ＬＡＬを毎週受けた４１歳のＣＥＳＤ白人男性患者の血清ＡＳＴレベルを示す。
【図６】０．３５ｍｇ／ｋｇの用量の外因性ＬＡＬを毎週受けた４１歳のＣＥＳＤ白人男性患者の血清ＡＬＴレベルを示す。
【図７】０．３５ｍｇ／ｋｇの用量の外因性ＬＡＬを毎週受けた４１歳のＣＥＳＤ白人男性患者の血清アルブミンレベルを示す。
【図８】０．３５ｍｇ／ｋｇの用量の外因性ＬＡＬを毎週受けた４１歳のＣＥＳＤ白人男性患者の血清フェリチンレベルを示す。
【図９】それぞれが次の４つの外因性ＬＡＬ投与量レジームのうちの１つに割り当てられた４匹の同年齢雄ラットにおける体重増加の速度を図示する：週に１回、１キログラム当り１ｍｇ、週に１回、１キログラム当り５ｍｇ、２週間に１回、１キログラム当り５ｍｇ、またはプラセボ。欄内の数字は、生後の日数を表す。
【図１０】野生型対照、外因性ＬＡＬで治療されたＬＡＬ欠乏ラット、およびＬＡＬ欠乏プラセボ治療されたラットの病理学的および組織病理学的検査の結果を示す。肉眼による病理像は、外因性ＬＡＬで治療されたラットの肝臓の色および大きさの正常化を示す。外因性ＬＡＬで治療されたラットからの肝組織の組織病理像は、プラセボ治療された動物の泡沫状のマクロファージの実質的な蓄積とは好対照に、基本的に正常な肝臓組織像を示す。
【図１１】定順位走査モードを使用した共焦点蛍光顕微鏡法により検査された細胞のリソソームにおける組み換えヒトＬＡＬ（ＳＢＣ−１０２）とリソソームマーカーの共局在化を示す。
【図１２】マクロファージ細胞系ＮＲ８３８３を使用した競合結合アッセイにより評価された組み換えヒトＬＡＬ（ＳＢＣ−１０２）のＧｌｃＮＡｃ／マンノース受容体への結合特異性を示す。
【図１３】生体外での正常細胞およびＬＡＬ欠乏細胞の細胞における組み換えヒトＬＡＬの活性を示す。
【図１４】ＬＡＬ欠乏ラットの内部臓器塊に対する組み換えヒトＬＡＬ（ＳＢＣ−１０２）の作用を図示する。臓器の大きさは、４週間、５ｍｇ／ｋｇのビヒクルまたはＳＢＣ−１０２を毎週投与された後のＬＡＬ−／−ラットおよびＬＡＬ＋／＋ラットにおける、８週齢で決定された体重率として表される。
【図１５】４週間、５ｍｇ・ｋｇ−１のビヒクルまたはＳＢＣ−１０２を毎週投与された後の野生型およびＬＡＬ欠乏ラットの体重を図示する。４週目で開始される用量投与は、Ｘ軸上でひし形で強調される。
【図１６】４週間、５ｍｇ・ｋｇ−１のビヒクルまたはＳＢＣ−１０２を毎週投与された後のＷＴおよびＬＡＬ欠乏ラットにおける、８週齢で決定された肝臓コレステロール、コレステリルエステル、およびトリグリセリドのレベルを示す。
【図１７】ＬＡＬ欠乏ラットの体重増加率を示す。
【図１８】４週間ＳＢＣ−１０２を投与した後のＬＡＬ欠乏ラットにおける体重率として肝臓の重量を示す。
【図１９】４週間ＳＢＣ−１０２を投与した後のＬＡＬ欠乏ラットにおける組織コレステリルエステルのレベルを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、外因性リソソーム酸リパーゼの投与に応答する疾患または状態に罹患するヒトを治療するための方法を提供する。
【００２３】
定義
便宜上、本明細書、実施例、および付属の特許請求の範囲に利用される特定の用語は、本発明を説明するために使用される様々な用語の意味および範囲を図示ならびに定義するために、本明細書に明記される。
【００２４】
本明細書で使用される「ＬＡＬ」とは、「リソソーム酸リパーゼ」を指し、この２つの用語は、本明細書全体を通して互換的に使用される。ＬＡＬは、ヒトタンパク質、即ち、ヒトリソソーム酸リパーゼであり得る。本明細書で使用される「ＳＢＣ−１０２」という用語は、組み換えヒトリソソーム酸リパーゼを指す。ＬＡＬは、文献において、酸コレステリルエステル加水分解酵素、コレステリルエステラーゼ、リパーゼＡ、ＬＩＰＡ、およびステロールエステラーゼとも称される。
【００２５】
ＬＡＬは、コレステロール、グリセロール、および遊離脂肪酸を取り除くために、コレステロールエステルおよびトリグリセリドの加水分解を触媒する。よって、「ＬＡＬ活性」は、例えば、蛍光基質であるオレイン酸４−メチルウンベリフェリル（４ＭＵＯ）の切断により測定され得る。４ＭＵＯの切断は、例えば、放出されたフルオロフォアである４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の約３６０ｎｍでの励起、および４６０ｎｍでの発光により検出され得る。結果は、相対的な蛍光単位（ＲＦＵ）で報告され得る。例えば、３０分のエンドポイントアッセイで切断された基質の量は、４ＭＵ標準曲線に対して定量化され得、活性の１単位（Ｕ）は、３７℃で１分当り１マイクロモルの４ＭＵＯを切断するために必要とされる酵素の量として定義され得る。したがって、ＬＡＬの機能断片または変異体は、ＬＡＬ活性、例えばコレステロールエステルおよび／もしくはトリグリセリドを加水分解する能力を有する断片または変異体を含む。
【００２６】
本明細書で使用される「外因性ＬＡＬ」とは、患者によって自然に産生されないＬＡＬを指す。例えば、外因性ＬＡＬは、患者に投与される組み換えＬＡＬタンパク質、個人または動物から単離され、患者に投与されるＬＡＬタンパク質、ならびにＬＡＬをコードするＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡの投与または外因性ＬＡＬタンパク質の発現を増加させる別の治療の結果として患者に産生される（即ち、発現する）ＬＡＬタンパク質を含む。
【００２７】
多くの場合医学的にＩＶプッシュ（ＩＶ  ｐｕｓｈ）またはボーラス注入とも称される「静脈内注入」は、シリンジがＩＶアクセスデバイスに接続され、薬物が直接、典型的には迅速に、そして静脈の過敏または非常に迅速な作用をもたらすかもしれない場合、最大１５分の期間、時折注入される投与経路を指す。薬品がＩＶ管類の液体流の中に注入されると、管類から患者に達することを確実にする何らかの手段がなければならない。通常、これは、液体流を正常に流動させ、それによって、薬品を血流の中に送ることにより達成される。しかしながら、いくつかの場合において、薬品が血流の中に入るのを容易にするために、第１の注入後、時折「フラッシュ」と呼ばれる第２の流体注入が使用される。
【００２８】
「静脈内点滴」とは、薬物が長期間にわたって送達される投与経路を指す。例えば、薬物は、１〜８時間の時間期間にわたって患者に送達され得る。薬物はまた、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、または約８時間にわたって患者に送達され得る。静脈内点滴を達成するために、ＩＶ重力滴下またはＩＶポンプが使用され得る。ＩＶ点滴は、典型的に、患者が特定の時間にのみ薬物を必要とし、用量が電解質、血糖、および水の損失回復するもの等の、追加の静脈内流体（例えば、ナトリウム、塩化物、グルコース、またはそのいずれかの組み合わせ）を必要としないときに使用される。
【００２９】
本明細書に使用される「鳥」という用語は、これらに限定されないが、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、およびダチョウ、エミュー、およびヒクイドリを含む走鳥類等の、分類学鳥類の生物のいずれの種、亜種、または種族を指す。本用語は、様々な既知のガルスガルス、またはニワトリ（例えば、ホワイトレグホーン（Ｗｈｉｔｅ  Ｌｅｇｈｏｒｎ）、ブラウンレグホーン（Ｂｒｏｗｎ  Ｌｅｇｈｏｒｎ）、バードロック（Ｂａｒｒｅｄ−Ｒｏｃｋ）、サセックス（Ｓｕｓｓｅｘ）、ニューハンプシャー（Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）、ロードアイランド（Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ）、オーストラロープ（Ａｕｓｔｒａｌｏｒｐ）、ミノルカ（Ｍｉｎｏｒｃａ）、アムロックス（Ａｍｒｏｘ）、カルフォルニアグレイ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｇｒａｙ））の系統、ならびにシチメンチョウ、キジ、ウズラ、アヒル、ダチョウ、および商業的規模で一般的に飼育される他の家禽の系統を含む。それはまた、胚形成期および胎仔期を含む、全ての発育段階の個々の鳥生物も含む。
【００３０】
「家禽由来」または「鳥由来」という用語は、家禽から産生された、またはそれから得られた組成物または物質を指す。「家禽」とは、これらに限定されないが、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ウズラ、および走鳥類を含む、家畜として飼育され得る鳥類を指す。例えば、「家禽由来」とは、ニワトリ由来、シチメンチョウ由来、および／またはウズラ由来を指してもよい。
【００３１】
本明細書で使用される「患者」とは、例えば、医療提供者により医療もしくは治療を受ける、または受けた、または受ける予定のいずれの個人を指す。
【００３２】
本明細書で使用される「治療有効用量」とは、意図される治療応答を産生するのに必要とされる薬物の用量（例えば、量および／または間隔）を指す。治療有効用量とは、そのような用量を受けなかった対応する対象と比較して、疾患、障害、もしくは副作用の治療、治癒、防止、または軽減の改善、あるいは疾患もしくは障害の発生または進行の速度の減少をもたらす用量を指す。本用語はまた、その範囲内で、生理学的機能を強化するために有効な用量も含む。
【００３３】
「治療する」「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）すること」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、予防的に、および／または症状が生じた後のいずれかに、疾患もしくは症状を緩和する、寛解する、または軽減する、さらなる症状を防止する、根底にある症状の原因を軽減する、または防止する、疾患もしくは状態を阻害する、疾患もしくは状態の進行を阻止する、疾患もしくは状態を和らげる、疾患もしくは状態の後退をもたらす、疾患もしくは状態によってもたらされた状態を和らげる、または疾患もしくは状態の症状を停止させる方法を指す。
【００３４】
特定の用量に関して本明細書で使用される「ｋｇ−１」、「１ｋｇ当り」「／ｋｇ」、および「１キログラム当り」とは、哺乳類の「体重１キログラム当り」を表し、よって、本用語は、互換的に使用され得る。
【００３５】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）により直鎖状に結合されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸のいずれの鎖または複数の鎖を指し、産物の特定の長さを指すものではない。よって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖もしくは複数の鎖を指すために使用される他のいずれかの用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれと互換的に使用され得る。「ポリペプチド」という用語は、非限定的に、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解の切断、または自然に生じないアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後の修飾の産物を指すことも意図される。ポリペプチドは、自然の生物学的起源に由来するか、または組み換え技術によって産生され得るが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されない。それは、化学合成を含む、いずれの手段で生成され得る。
【００３６】
本明細書で使用される２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間の相同性パーセントは、２つの配列間の同一性パーセントと等しい。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数（即ち、相同性％＝同一位置の＃／位置の総＃×１００）であり、２つの配列の最適な整合のために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、非限定的な以下の実施例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
【００３７】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用してＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれた、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを使用して決定され得る。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重量および１、２、３、４、５、または６の荷重（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００３８】
「単離された」ポリペプチド、またはその断片、変異体、もしくは誘導体により、その自然環境にはないポリペプチドが意図される。特定のレベルの精製は必要ない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然環境から除去される。宿主細胞で発現する、組み換えにより産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、いずれの適切な技法により分離、画分、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組み換えポリペプチドであるため、本明細書に開示されるように単離されたと考えられる。
【００３９】
本明細書で開示される他のポリペプチドは、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、およびそれらのいずれかの組み合わせである。本明細書に開示されるポリペプチドのいずれかを指すとき、「断片」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、対応する天然のポリペプチド（例えば、コレステロールエステルおよび／またはトリグリセリドを加水分解する能力を保持するＬＡＬポリペプチド断片、変異体、誘導体、および類似体）の活性の少なくとも一部を保持するいずれかのポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片は、例えば、タンパク質分解の断片ならびに欠失断片を含む。ポリペプチドの変異体は、上述の断片、およびアミノ酸置換、欠失、または挿入により、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。変異体は、自然に生じるか、または自然に生じなくてもよい。自然に生じない変異体は、当該技術分野に公知の変異誘発法を使用して産生され得る。変異体ポリペプチドは、保存もしくは非保存アミノ酸置換、欠失、または付加を含んでもよい。誘導体は、自然ポリペプチドで見られない追加特徴を示すように変更されたポリペプチドである。例としては融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドは、本明細書において、「ポリペプチド類似体」とも称され得る。本明細書で使用される対象ポリペプチドの「誘導体」は、官能側基の反応により化学的に誘導された１つ以上の残基を含有してもよい。２０の標準アミノ酸のうちの１つ以上の自然に生じるアミノ酸を含有するそれらのペプチドも、「誘導体」として含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンに代えて置換され得る、５−ヒドロキシリジンはリジンに代えて置換され得る、３−メチルヒスチジンはヒスチジンに代えて置換され得る、ホモセリンはセリンに代えて置換され得る、および／またはオルニチンはリジンに代えて置換され得る。
【００４０】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単一核酸ならびに複数の核酸を包含するように意図され、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）もしくはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のリン酸ジエステル結合または特殊結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等に見られるアミド結合）を含んでもよい。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドに存在するいずれかの１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドにより、その天然環境から除去された核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡが意図される。例えば、ベクターに含有されるＬＡＬをコードする組み換えポリヌクレオチドは、本発明の目的において単離されたと考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞または溶液中の（部分的に、または実質的に）精製されたポリヌクレオチドに維持される組み換えポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドの生体内または生体外ＲＮＡ転写物を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生されたそのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーター等の制御エレメントであり得る、またはそれを含んでもよい。
【００４１】
本明細書で使用される「コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されたコドンからなる核酸の一部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部と考えられてもよい、しかし、いずれの隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン等は、コード領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード領域は、例えば単一ベクター上の単一ポリヌクレオチド構築物、または例えば別個の（異なる）ベクター上の別個のポリヌクレオチド構築物に存在してもよい。さらに、いずれのベクターも、単一コード領域を含有するか、または２つ以上のコード領域を含んでもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、ＬＡＬポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体をコードする核酸に融合するまたは融合しない、いずれかの異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域は、非限定的に、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメイン等の、特殊エレメントもしくはモチーフを含む。
【００４２】
様々な転写調節領域は、当業者に公知である。これらは、これらに限定されないが、サイトメガロウイルスからのプロモーターおよびエンハンサーセグメント（イントロンＡと共に、即時初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（ラウス肉腫等）の、脊椎動物細胞で機能する転写調節領域を非限定的に含む。他の転写調節領域は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβ−グロビン等の脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核生物細胞での遺伝子発現を調節することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写調節領域は、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンホカイン誘発性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘発されるプロモーター）を含む。
【００４３】
同様に、様々な転写調節エレメントが当業者に公知である。これらは、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特に内部リボソーム侵入部位またはＩＲＥＳ、またＣＩＴＥ配列とも称される）を含むが、これらに限定されない。
【００４４】
他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指令する、分泌またはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と関連してもよい。シグナル仮説によると、粗面小胞体にわたって成長タンパク質鎖の輸出が開始されると、哺乳類細胞によって分泌されたタンパク質は、成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。脊椎細胞によって分泌されたポリペプチドは、一般に、分泌された、または「成熟」形態のポリペプチドを産生するために、完全または「完全長」のポリペプチドから切断される、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有することを、当業者は認識する。特定の実施形態では、天然のシグナルペプチド、例えばヒトＬＡＬのＭＫＭＲＦＬＧＬＶＶＣＬＶＬＷＴＬＨＳＥＧ（配列番号２）シグナルペプチド、またはそれと操作可能に関連するポリペプチドの分泌を指令する能力を保持するその配列の機能性誘導体が使用される。代替的に、異種のシグナルペプチド（例えば、異種の哺乳類または鳥のシグナルペプチド）またはその機能性誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβグルクロニダーゼのリーダー配列で置換され得る。
【００４６】
「ベクター」とは、一本鎖、二本鎖、環状、または超螺旋ＤＮＡもしくはＲＮＡからなるポリヌクレオチドを意味する。典型的なベクターは、機能遺伝子発現を可能にするために適切な距離で操作可能に結合された以下のエレメントから成り得る：複製起源、プロモーター、エンハンサー、５’ｍＲＮＡリーダー配列、リボソーム結合部位、核酸カセット、終結およびポリアデニル化部位、および選択マーカー配列。これらのエレメントの１つ以上は、特定の用途において省くことができる。核酸カセットは、発現する核酸配列の挿入において制限部位を含んでもよい。機能ベクターにおいて、核酸カセットは、転写開始および終結部位を含む、発現する核酸配列を含有する。任意に、イントロンが構築物に、例えば５’’がコード配列に含まれ得る。ベクターは、特定のコード配列が適切な制御配列を有するベクターに位置するように構築され、調節配列に対して、コード配列が調節または制御配列の「調節」下で転写されるようなコード配列の位置付けおよび配向である。この目的を達成するために、特定の関心のタンパク質をコードする配列の修飾が望ましい。例えば、一部の場合において、適切な配向を有する調節配列に結合され得るように、配列を修飾する、またはリーディングフレームを維持することが必要であり得る。調節配列および他の制御配列は、ベクターの中に挿入される前にコード配列に結合され得る。代替的に、コード配列は、調節配列を有するリーディングフレームにあり、かつその制御調節下にある調節配列および適切な制御部位を既に含有する発現ベクターの中に直接クローン化され得る。
【００４７】
本明細書で使用される「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質、例えばポリペプチドを産生するプロセスを指す。本プロセスは、非制限的に、遺伝子ノックダウンならびに一過性の発現および安定した発現の両方を含む細胞内の機能的な遺伝子の存在のいずれの顕在化を含む。それは、非限定的に、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、およびそのようなｍＲＮＡのポリペプチド（複数可）への翻訳を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書で使用される遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物は、転写後修飾、例えばポリアデニル化を伴う核酸、または転写後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットの会合、タンパク質分解切断等を伴うポリペプチドをさらに含む。
【００４８】
本明細書で使用される「宿主細胞」とは、組み換えＤＮＡ技法を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを持つ細胞を指す。
【００４９】
本明細書で使用される「Ｎ−グリカン」、「オリゴ糖」、「オリゴ糖構造」、「グリコシル化パターン」、「グリコシル化プロファイル」、および「グリコシル化構造」という用語は、基本的に同じ意味を有し、それぞれ、糖残基から形成され、グリコシル化タンパク質に結合される１つ以上の構造を指す。
【００５０】
本明細書で使用される「薬学的組成物」という用語は、本明細書に記載される化合物の、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、および／または賦形剤等の他の化学成分との混合物を指す。
【００５１】
不十分なＬＡＬ活性を有する患者
本発明をいずれかの特定の状態または状態の群の治療に制限するものではないが、本発明は、患者のリソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）欠乏症の治療を含む。本明細書で使用されるＬＡＬ欠乏症を有する患者は、不十分なＬＡＬ活性を有するあらゆる患者である。患者の不十分なＬＡＬ活性は、例えば、低ＲＮＡレベル、低タンパク質レベル、または低タンパク質活性の結果であり得る。不十分なＬＡＬ活性は、ＬＡＬコード配列、ＬＡＬ制御配列、または別の遺伝子（例えばＬＡＬを制御する遺伝子）の変異に起因してもよい。不十分なＬＡＬ活性はまた、環境要因の結果であってもよい。
【００５２】
本発明は、対象または患者において多様な状態を治療するために使用され得る。したがって、本発明による外因性ＬＡＬによって有益に治療され得るあらゆる状態が、本発明の範囲内に含まれる。
【００５３】
本発明の一実施形態は、リソソーム酸リパーゼの欠乏、特にウォルマン病（ＷＤ）およびコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）に起因するリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）の治療に焦点をあてる。本発明をいずれかの特定の理論または操作機構に制限するものではないが、ＷＤおよびＣＥＳＤの両方は、ＬＡＬ遺伝子座の変異によるものであり得、本発明の方法による外因性ＬＡＬの投与により治療され得る多くの組織のリソソームにおける脂質性物質の大量の蓄積、およびコレステロールおよび脂質の恒常的機序の著しい妨害をもたらす。よって、一実施形態では、本発明により治療されるＬＡＬ欠乏症は、ＷＤである。別の実施形態では、本発明により治療されるＬＡＬ欠乏症は、ＣＥＳＤである。一部の実施形態では、ＷＤまたはＣＥＳＤの診断は、遺伝子分析（例えば、ＬＡＬコード配列の機能的変異の識別）に基づく。他の実施形態では、ＷＤまたはＣＥＳＤの診断は、臨床知見（例えば、身体検査および／または実験試験）に基づく。
【００５４】
一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）等の、様々な状態の合併症を治療するために使用され得る。ＮＡＦＬＤは、過剰なアルコール摂取による肝疾患に類似する組織病理像を有する肝臓の疾患を指す。それは、肝臓の肥大をもたらす大滴性脂肪症を特徴とする。ＮＡＦＬＤは、線維症および肝硬変をもたらす可能性がある炎症ならびに肝臓への損傷に加え、ＮＡＦＬＤに類似する肝疾患を指すＮＡＳＨに進行する可能性がある。
【００５５】
一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、膵炎、例えば慢性膵炎および／または急性膵炎ならびにアルコール誘発性膵炎等の、アルコール誘発性膵傷害を含む状態を治療するために使用され得る。
【００５６】
いずれかの有用な方法によって産生された外因性ＬＡＬは、これらに限定されないが、肝臓、脾臓、消化管、および心血管組織等の身体組織に脂質エステルの蓄積をもたらす、これらのアルコール誘発性細胞傷害を含むがこれらに限定されないアルコール誘発性細胞傷害による疾患を治療するために使用され得る。本発明によると、吸収不良も外因性ＬＡＬを投与することにより治療され得る。外因性ＬＡＬは、タンジール病および家族性低αリポタンパク血症を有する患者の治療にも有用である。タンジール病／家族性低αリポタンパク血症は、外因性ＬＡＬの投与により治療され得る低ＨＤＬレベルと共に、肝脾腫大および／またはリンパ節腫大を伴うマクロファージにおけるコレステロールエステルの蓄積に関連する。例えば、本発明をいずれかの特定の理論または操作機構に制限するものではないが、傷害性ＬＡＬ活性は、ＡＢＣＡ１発現を減少させてもよく、逆に、タンジール病／家族性低αリポタンパク血症を有する患者に外因性ＬＡＬを投与することにより得られるＬＡＬ活性の増加は、多型の結果として機能的活性の減少を伴うＡＢＣＡ１遺伝子の作用を排除するためにＡＢＣＡ１発現を増加させる。
【００５７】
一部の実施形態では、治療前の患者のＬＡＬ活性レベルは、ＬＡＬ活性の正常レベルの約１％、約２％、約３％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、または約８０％である。一実施形態では、治療前の患者のＬＡＬ活性レベルは、ＬＡＬ活性の正常レベルの約５０％以下である。一実施形態では、治療前の患者のＬＡＬ活性レベルは、ＬＡＬ活性の正常レベルの約４０％以下である。一部の実施形態では、治療前の患者のＬＡＬ活性レベルは、ＬＡＬ活性の正常レベルの約３０％以下である。一部の実施形態では、治療前の患者のＬＡＬ活性レベルは、ＬＡＬ活性の正常レベルの約３０％以下である。一部の実施形態では、治療前の患者のＬＡＬ活性レベルは、ＬＡＬ活性の正常レベルの約２０％以下である。一部の実施形態では、治療前の患者のＬＡＬ活性レベルは、ＬＡＬ活性の正常レベルの約１０％以下である。一部の実施形態では、治療前の患者のＬＡＬ活性レベルは、ＬＡＬ活性の正常レベルの約５％以下である。一部の実施形態では、患者は、治療前に測定可能なＬＡＬ活性を示さない。
【００５８】
一部の実施形態では、ＬＡＬ活性レベルは、ＬＡＬ欠乏症に罹患するヒト患者より得た培養線維芽細胞中で測定される。一部の実施形態では、ＬＡＬ活性レベルは、ＬＡＬ欠乏症に罹患するヒト患者のリンパ球（例えば白血球）中で測定される。リンパ球は、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を含むが、これに限定されない。測定方法は、例えば、Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  １０１：２５−３２およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．＆Ｍｅｔａｂ．，６６：３３３−３４５に記載されており、その両方はそれらの全体が本明細書に組み込まれる。外因性ＬＡＬで治療される予定のＬＡＬ欠乏患者は、基質としてトリオレインを使用して測定されるように、約３０、約２０、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ｐｍｏｌ／ｍｇ／分未満である線維芽細胞ＬＡＬ酵素活性を示してもよい。外因性ＬＡＬで治療される予定のＬＡＬ欠乏患者は、基質としてトリオレインにより測定されるように、約３０、約２０、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ｐｍｏｌ／ｍｇ／分未満である白血球ＬＡＬ酵素活性を示してもよい。外因性ＬＡＬで治療される予定のＬＡＬ欠乏患者は、基質としてオレイン酸コレステリルを使用して測定されるように、約３０、約２０、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ｐｍｏｌ／ｍｇ／分未満である線維芽細胞ＬＡＬ酵素活性を示してもよい。外因性ＬＡＬで治療される予定のＬＡＬ欠乏患者は、基質としてオレイン酸コレステリルを使用して測定されるように、約３０、約２０、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ｐｍｏｌ／ｍｇ／分未満である白血球ＬＡＬ酵素活性を示してもよい。
【００５９】
外因性ＬＡＬの投与
本発明は、患者に外因性ＬＡＬを投与することを含む、外因性ＬＡＬでヒト患者を治療する方法を提供し、投与は、成長を回復させる、肝機能を改善する、肝臓損傷を減少させる、ＬＡＬの組織レベルを増加させる、および／または患者のＬＡＬ活性を増加させるのに十分である。本発明は、ＷＤおよびＣＥＳＤを含むＬＡＬ欠乏症により生じる状態を治療するのに有用かつ今までに特定されていない外因性ＬＡＬの投与頻度（即ち投与スケジュール）、ならびにこれらの状態を治療するための今までに特定されていない投与量を提供する。
【００６０】
本発明は、医学分野の専門家により決定された期間の間、５日に１回〜３０日に１回患者に投与される治療有効用量の外因性ＬＡＬを提供する。一実施形態では、期間は、患者の余生である。一実施形態では、投与頻度は、５日に１回〜２５日に１回である。一実施形態では、投与頻度は、５日に１回〜２１日に１回である。別の実施形態では、投与頻度は、７日に１回〜１４日に１回である。外因性ＬＡＬは、５日に１回、６日に１回、７日に１回、８日に１回、９日に１回、１０日に１回、１１日に１回、１２日に１回、１３日に１回、または１４日に１回投与され得る。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、ほぼ毎週投与される。他の実施形態では、外因性ＬＡＬは、約２週に１回投与される。一実施形態では、投与頻度は、約３０日に１回である。
【００６１】
状態の治療のために、一般に、投与される外因性ＬＡＬの量は、受給者の年齢、健康状態、および体重、並行治療の種類、治療の頻度等の既知の要因により変動してもよい。通常活性成分の投与量は、体重１キログラム当り約０．０１〜約５０ｍｇであり得る。一実施形態では、本発明による外因性ＬＡＬの投与量は、体重１キログラム当り約０．１〜約０．５ｍｇである。一実施形態では、用量は、１キログラム当り約０．１ｍｇ〜約５．０ｍｇである。一実施形態では、用量は、１キログラム当り約０．１ｍｇ〜約５．０ｍｇである。一実施形態では、用量は、１キログラム当り約０．１、約０．２、約０．２５、約０．３０、約０．３５、約０．４０、約０．４５、約０．５０ｍｇである。一実施形態では、用量は、１キログラム当り約１ｍｇ〜約５ｍｇである。一実施形態では、用量は、１キログラム当り約１ｍｇである。一実施形態では、用量は、１キログラム当り約３ｍｇである。例えば、体重１キログラム当り０．１ｍｇ、体重１キログラム当り０．２ｍｇ、体重１キログラム当り０．３ｍｇ、体重１キログラム当り０．４ｍｇ、体重１キログラム当り０．５ｍｇ、体重１キログラム当り１ｍｇ、体重１キログラム当り２ｍｇ、体重１キログラム当り３ｍｇ、体重１キログラム当り４ｍｇ、または体重１キログラム当り５ｍｇが投与され得る。一実施形態では、用量は、体重１キログラム当り約１ｍｇ〜約２０ｍｇである。
【００６２】
本発明は、本発明の投与スケジュールを利用するとき、他の投与量も含む。例えば、本発明の投与スケジュールによると、体重１キログラム当り約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇが患者に投与される。
【００６３】
一部の実施形態では、約０．５〜約５０ｍｇの外因性ＬＡＬが、例えば１ヶ月〜２４ヶ月の年齢のウォルマン病を有する患者に投与される。一実施形態では、患者は１歳未満である。別の実施形態では、患者は２歳未満である。一部の実施形態では、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇの外因性ＬＡＬが、ウォルマン病を有する患者に投与される。一部の実施形態では、約０．５〜約３０ｍｇ、約０．５〜約２０ｍｇ、約０．５〜約１０ｍｇ、または約０．５〜約５ｍｇが、ウォルマン病を有する患者に投与される。一部の実施形態では、約１〜約３０ｍｇ、約１〜約２０ｍｇ、約１〜約１０ｍｇ、または約１〜約５ｍｇが投与される。
【００６４】
一部の実施形態では、約１ｍｇ〜約３５０ｍｇの外因性ＬＡＬが、例えばＣＥＳＤと診断された患者に投与される。よって、一部の実施形態では、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、または３５０ｍｇの外因性ＬＡＬが、ＣＥＳＤを有する患者に投与される。一部の実施形態では、約５〜約３５０ｍｇ、約５〜約３００ｍｇ、約５〜約２５０ｍｇ、または約５〜約２００ｍｇが、ＣＥＳＤを有する患者に投与される。一部の実施形態では、約１０〜約３５０ｍｇ、約１０〜約３００、約１０〜約２５０、または約１０〜約２００ｍｇが、ＣＥＳＤを有する患者に投与される。
【００６５】
併用治療
本明細書に開示される治療用タンパク質は、他の治療剤と組み合わせて使用され得る。本発明は、本発明による外因性ＬＡＬの投与によって生じ得るいかなるアナフィラキシー反応の可能性を最小にする、または予防するための前治療処置を提供する。一実施形態では、アナフィラキシー反応の可能性を前治療するために、抗ヒスタミン剤（例えばジフェンヒドラミン）としても知られるＨ−１受容体拮抗薬が患者に投与される。一実施形態では、Ｈ−１受容体拮抗薬は、体重１キログラム当り約１ｍｇ〜約１０ｍｇの用量で投与される。例えば、抗ヒスタミン剤は、１キログラム当り約５ｍｇの用量で投与され得る。抗ヒスタミン剤の投与は、本発明による外因性ＬＡＬの投与前であり得る。一実施形態では、Ｈ−１受容体拮抗薬は、外因性ＬＡＬの約１０〜約９０分前、例えば約３０〜約６０分前に投与される。Ｈ−１受容体拮抗薬は、血管アクセスポートに接続された携帯型システムを使用して投与され得る。一実施形態では、抗ヒスタミン剤は、外因性ＬＡＬの投与約９０分前に投与される。一実施形態では、抗ヒスタミン剤は、外因性ＬＡＬの投与約１０〜約６０分前に投与される。別の実施形態では、抗ヒスタミン剤は、外因性ＬＡＬを投与する約２０〜約４０分前に投与される。例えば、抗ヒスタミン剤は、外因性ＬＡＬの投与２０、２５、３０、３５、または４０分前に投与され得る。一実施形態では、投与される抗ヒスタミン剤は、ジフェンヒドラミンである。あらゆる有用な抗ヒスタミン剤が使用され得る。そのような抗ヒスタミン剤は、非限定的に、クレマスチン、ドキシルアミン、ロラタジン、デスロラタジン、フェキソフェナジン、フェニラミン、セチリジン、エバスチン、プロメタジン、クロルフェニラミン、レボセチリジン、オロパタジン、クエチアピン、メクリジン、ジメンヒドリナート、エンブラミン、ジメチンデン、およびデキスクロルフェニルアミンを含む。
【００６６】
一実施形態では、抗ヒスタミン剤は、体重１キログラム当り約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの用量で投与される。一実施形態では、抗ヒスタミン剤は、体重１キログラム当り約１ｍｇ〜約５ｍｇの用量で投与される。例えば、用量は、体重１キログラム当り１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、または５ｍｇであり得る。抗ヒスタミン剤は、いずれかの有用な方法により投与され得る。一実施形態では、抗ヒスタミン剤は、静脈内投与される。別の実施形態では、抗ヒスタミン剤は、薬学的に許容されるカプセルにおいて投与される。
【００６７】
別の実施形態では、静脈内点滴に関して、ランプアッププロトコルを使用して点滴を投与することにより、アナフィラキシー反応の可能性を減少させることができる。これに関して、ランプアッププロトコルは、薬物の点滴に対して患者を脱感作するために、点滴の過程にわたって点滴の速度をゆっくり増加させることを指す。
【００６８】
これらに限定されないが、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、シロリムス、ボクロスポリン（ｖｏｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）、シクロスポリン、メトトレキサート、ＩＬ−２受容体指向性抗体、Ｔ−細胞受容体指向性抗体、ＴＮＦ−α指向性抗体、または融合タンパク質（例えばインフリキシマブ、エタネルセプト、またはアダリムマブ）、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（例えばアバタセプト）、抗ＯＸ−４０抗体等の免疫抑制剤は、例えばアナフィラキシー反応または有害免疫応答が予想される、または患者に認められる場合、外因性ＬＡＬ投与前、投与中、または投与後にも投与され得る。
【００６９】
本発明は、１つ以上のコレステロール低下剤（例えばＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤）と組み合わせた外因性ＬＡＬ含有組成物の投与を伴う療法も包含する。そのような薬剤の非限定的な例としては、アトルバスタチン（Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標）およびＴｏｒｖａｓｔ（登録商標））、フルバスタチン（Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標））、ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ、（登録商標）Ａｌｔｏｃｏｒ（登録商標）、Ａｌｔｏｐｒｅｖ（登録商標））、ピタバスタチン（Ｌｉｖａｌｏ（登録商標）、Ｐｉｔａｖａ（登録商標））、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標）、Ｓｅｌｅｋｔｉｎｅ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｔａｔ（登録商標））、ロスバスタチン（Ｃｒｅｓｔｏｒ（登録商標））、およびシンバスタチン（Ｚｏｃｏｒ（登録商標）、Ｌｉｐｅｘ（登録商標））が挙げられる。
【００７０】
外因性ＬＡＬの作用
本発明は、外因性ＬＡＬでの治療後、疾患関連症状の補正または正常化のために提供される。外因性ＬＡＬに応答する臨床的進行（即ち、状態の改善）は、いずれの有用な方法または手順により監視され得る。
【００７１】
一部の実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、約２００ｎｇ／ｍＬ〜約１，５００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを達成するのに十分である。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、約２００ｎｇ／ｍＬ〜約１，０００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを達成するのに十分である。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、約２００ｎｇ／ｍＬ〜約８００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを達成するのに十分である。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、約２００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ、約１，０００ｎｇ／ｍＬ、約１，２５０ｎｇ／ｍＬ、または約１，５００ｎｇ／ｍＬのＣｍａｘを達成するのに十分である。一部の実施形態では、Ｃｍａｘは、点滴中に達する。
【００７２】
一部の実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、４０分未満のＬＡＬ半減期（ｔ１／２）を達成するのに十分である。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、３０分未満のＬＡＬ半減期（ｔ１／２）を達成するのに十分である。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、２０分未満のＬＡＬ半減期（ｔ１／２）を達成するのに十分である。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、１５分未満のＬＡＬ半減期（ｔ１／２）を達成するのに十分である。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、１０分未満のＬＡＬ半減期（ｔ１／２）を達成するのに十分である。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０分のＬＡＬ半減期（ｔ１／２）を達成するのに十分である。
【００７３】
一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、患者のＬＡＬ活性を増加させる。ＬＡＬ活性は、例えば、肝臓、脾臓、リンパ腺、大動脈、末梢血白血球、および／または皮膚線維芽細胞で増加することができる。一部の実施形態では、ＬＡＬ活性は、血液試料から単離されたリンパ球の抽出物において測定される。
【００７４】
外因性ＬＡＬは、ＬＡＬ活性を、ＬＡＬの投与前の活性の少なくとも約１．５、約２、約２．５、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、または約２０倍に増加させることができる。外因性ＬＡＬは、ＬＡＬ活性を、ＬＡＬの投与前の活性の少なくとも約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０倍に増加させることができる。ＬＡＬ活性は、例えば、コレステリル１−１４Ｃ］オレエート、トリオレイン（グリセロールトリ［１−１４Ｃ］オレエート）、ｐ−ニトロフェニルミリステートまたは４−ＭＵＯ（オレイン酸４−メチルウンベリフェリル）基質を使用するアッセイを含む、当該技術分野に公知の方法を使用して評価され得る。
【００７５】
一実施形態では、内臓および組織容量ならびに特徴付けは、本発明による外因性ＬＡＬの投与後の状態の改善を決定するために利用される。
【００７６】
一実施形態では、外因性ＬＡＬの投与後の肝機能／傷害の臨床的進行は、経時的に、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）および／もしくはアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）等の血液トランスアミナーゼの定量化、ならびに／またはアルブミン、アルカリホスファターゼ、およびビリルビン等の他のバイオマーカー（直接および総量）により監視される。
【００７７】
一実施形態では、臨床的進行は、撮像技術を使用して監視される。例えばおよび非限定的に、使用される撮像技術は、超音波、ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法、および核磁気共鳴分光法であり得る。
【００７８】
一部の実施形態では、本明細書に記載される用量での外因性ＬＡＬの投与は、ヒト患者の成長を回復させ、かつ／または体重を増加させるのに十分である。外因性ＬＡＬの投与は、早発性ＬＡＬ欠乏症に罹患する乳児または小児患者の成長速度（即ち、体重増加）も増加させることができる。例えば、外因性ＬＡＬの投与は、投与前に見られる成長速度／速度の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、または約５００％体重増加の速度を増加させることができる。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、約１ヶ月〜約２４ヶ月の年齢の早発性ＬＡＬ欠乏症（例えばウォルマン病）に罹患する小児患者の正常な成長速度を回復させる。この内容において「正常」とは、医学分野の実施者によって決定される、治療される患者の正常な成長速度を指す。
【００７９】
一実施形態では、例えばＷＤおよびＣＥＳＤまたは他のＬＡＬ欠乏症に関して、肝腫大は顕著に好転し、肝臓の大きさが正常より約１％〜約６０％以内の大きさに戻った。この内容において「正常」とは、医学分野の実施者によって決定される、治療される患者の正常な大きさの肝臓を指す。一実施形態では、肝臓の大きさは、正常より約１％〜約５０％大きい大きさに減少する。別の実施形態では、肝臓の大きさは、正常より約１％〜約４０％大きい大きさに減少する。一実施形態では、肝臓の大きさは、正常より約１％〜約３０％大きい大きさに減少する。別の実施形態では、肝臓の大きさは、正常より約１％〜約２０％大きい大きさに減少する。別の実施形態では、肝臓の大きさは、正常より約１０％〜約２０％大きい大きさに減少する。例えば、肝臓は、正常の大きさより１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％大きくてもよい。また別の実施形態では、肝臓の大きさは、正常より約０％〜約１０％大きい大きさに減少する。例えば、肝臓は、肝臓の正常な大きさより０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％大きくてもよい。
【００８０】
外因性ＬＡＬを用いた治療は、肝機能も改善することができる。よって、一部の実施形態では、外因性ＬＡＬを用いた治療は、正常な肝機能を回復し、かつ／または肝臓試験を正常化するのに十分である。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬを用いた治療は、肝臓トランスアミナーゼの血清レベルを、例えば、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、および／または少なくとも約９０％減少させるのに十分である。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬを用いた治療は、肝臓トランスアミナーゼの血清レベルを少なくとも約４０％減少させるのに十分である。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬを用いた治療は、肝臓トランスアミナーゼの血清レベルを少なくとも約５０％減少させるのに十分である。一部の実施形態では、肝臓トランスアミナーゼの血清レベルを少なくとも約６０％減少させるのに十分である。一部の実施形態では、肝臓トランスアミナーゼの血清レベルを少なくとも約７０％減少させるのに十分である。一実施形態では、肝臓トランスアミナーゼの血清レベルを少なくとも約８０％減少させるのに十分である。一実施形態では、肝臓トランスアミナーゼの血清レベルを少なくとも約９０％減少させるのに十分である。
【００８１】
一部の実施形態では、肝臓トランスアミナーゼは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）である。一実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、血清ＡＬＴを減少させるのに十分である。例えば、外因性ＬＡＬの投与は、血清ＡＬＴを、例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少させることができる。血清ＡＬＴレベルは、肝傷害の兆候に役立つ。よって、本発明は、血清ＡＬＴを減少させるために有効量の外因性ＬＡＬを投与することにより、ＬＡＬ欠乏症に罹患するヒト患者の肝傷害を減少させる方法も包含する。
【００８２】
一部の実施形態では、肝臓トランスアミナーゼは、血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）である。一実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、血清ＡＳＴを減少させるのに十分である。例えば、外因性ＬＡＬの投与は、血清ＡＳＴを、例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少させることができる。血清ＡＳＴレベルは、肝傷害の兆候に役立つ。よって、本発明は、血清ＡＳＴを減少させるために有効量の外因性ＬＡＬを投与することにより、ＬＡＬ欠乏症に罹患する患者の肝傷害を減少させる方法も包含する。
【００８３】
一部の実施形態では、外因性ＬＡＬを用いた治療は、血清フェリチンレベルを低下させることができる。よって、一部の実施形態では、外因性ＬＡＬを用いた治療は、前治療レベルと比較して、血清フェリチンを、例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％減少させるのに十分である。一実施形態では、外因性ＬＡＬを用いた治療は、フェリチンの血清レベルを、少なくとも５０％低下させるのに十分である。さらに別の実施形態では、外因性ＬＡＬを用いた治療は、フェリチンの血清レベルを少なくとも約６０％低下させるのに十分である。一実施形態では、外因性ＬＡＬを用いた治療は、フェリチンの血清レベルを少なくとも約７０％低下させるのに十分である。一実施形態では、外因性ＬＡＬを用いた治療は、フェリチンの血清レベルを少なくとも約８０％低下させるのに十分である。一実施形態では、外因性ＬＡＬを用いた治療は、フェリチンの血清レベルを少なくとも約９０％低下させるのに十分である。一実施形態では、外因性ＬＡＬを用いた治療は、フェリチンの血清レベルを少なくとも約９５％低下させるのに十分である。
【００８４】
一実施形態では、例えばウォルマン病およびＣＥＳＤまたは他のＬＡＬ欠乏症に関して、脾腫大は顕著に好転し、脾臓の大きさが正常より約１％〜約６０％以内の大きさに戻った。この内容において「正常」とは、医学分野の実施者によって決定される、研究される患者の正常な大きさの脾臓を指す。一実施形態では、脾臓の大きさは、正常より約１％〜約５０％大きい大きさに減少する。別の実施形態では、脾臓の大きさは、正常より約１％〜約４０％大きい大きさに減少する。一実施形態では、脾臓の大きさは、正常より約１％〜約３０％大きい大きさに減少する。別の実施形態では、脾臓の大きさは、正常より約１％〜約２０％大きい大きさに減少する。別の実施形態では、脾臓の大きさは、正常より約１０％〜約２０％大きい大きさに減少する。例えば、脾臓は、正常の大きさより１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％大きくてもよい。また別の実施形態では、脾臓の大きさは、正常より約０％〜約１０％大きい大きさに減少する。例えば、脾臓は、脾臓の正常の大きさより０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％大きくてもよい。
【００８５】
一実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、リンパ節腫大（即ち、リンパ節の肥大）を減少させるのに十分である。よって、一部の実施形態では、リンパ節は、正常より約１％〜約６０％の大きさに減少する。この内容において「正常」とは、医学分野の実施者によって決定される、研究される患者の正常な大きさのリンパ節を指す。一実施形態では、リンパ節の大きさは、正常より約１％〜約５０％大きい大きさに減少する。別の実施形態では、リンパ節の大きさは、正常より約１％〜約４０％大きい大きさに減少する。一実施形態では、リンパ節の大きさは、正常より約１％〜約３０％大きい大きさに減少する。別の実施形態では、リンパ節の大きさは、正常より約１％〜約２０％大きい大きさに減少する。別の実施形態では、リンパ節の大きさは、約１０％〜約２０％大きい大きさに減少する。例えば、リンパ節は、正常の大きさより１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％大きくてもよい。また別の実施形態では、リンパ節の大きさは、正常より約０％〜約１０％大きい大きさに減少する。例えば、リンパ節は、リンパ節の正常な大きさより０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％大きくてもよい。
【００８６】
別の実施形態では、状態の改善を監視するために、脂質分析が実施される。例えば、脂質分析は、外因性ＬＡＬの治療効果を評価するために行われ得る。脂質分析は、これらに限定されないが、高性能液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量分光法、もしくは薄層クロマトグラフィー、またはそのいずれかの組み合わせ等の、当業者により適切と判断される有用な方法により、患者の組織試料（例えば、血液試料、肝臓生検試料）に対して実施され得る。一実施形態では、本発明により実施される脂質分析は、総コレステロール、トリグリセリド、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、および／またはコレステリルエステルのレベルを示す。
【００８７】
一実施形態では、例えばウォルマン病およびＣＥＳＤまたは他のＬＡＬ欠乏症に関して、本発明により治療される患者の脂質分析は、医学分野の実施者により決定され得る肝臓、脾臓、腸、リンパ節、および／または大動脈の脂質濃度の正常化を示す。
【００８８】
脂質レベルは、血漿脂質分析または組織脂質分析を使用して評価され得る。血漿脂質分析において、血漿が採取され得、例えばＣＯＤ−ＰＡＰキット（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いた比色アッセイを使用して総血漿遊離コレステロールレベルが測定され得る、例えばトリグリセリド／ＧＢキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、総血漿トリグリセリドが測定され得る、および／またはコレステロール／ＨＰキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、総血漿コレステロールが決定され得る。組織脂質分析において、脂質は、肝臓、脾臓、および／または小腸試料から抽出され得る（例えばＦｏｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２２６：４９７−５０５（１９５７）に提供されるＦｏｌｃｈ法を使用する）。例えばＯ−フタルアルデヒドを使用して、総組織コレステロール濃度が測定され得る。
【００８９】
一部の実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、栄養素吸収を増加させるのに十分である。一実施形態では、外因性ＬＡＬの投与は、血清αトコフェロール、２５ＯＨビタミンＤ、血清レチノール、ジデヒドロレチノイン酸またはトランスサイレチンのレベルによって測定される栄養素吸収を増加させる。
【００９０】
一部の実施形態では、例えばＷＤおよびＣＥＳＤまたは他のＬＡＬ欠乏症に関して、外因性ＬＡＬの投与は、血清ヘモグロビンレベル（Ｈｂ）を増加させるのに十分である。一実施形態では、ヘモグロビンレベルは、外因性ＬＡＬを用いて投与される前に観察されたものと比較して、少なくとも約１０％または約２０％増加する。
【００９１】
一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、副作用を最小にするための方法を使用して投与され得る。例えば、外因性ＬＡＬの投与は、外因性ＬＡＬに対する免疫応答を最小にすることができる。
【００９２】
外因性ＬＡＬを含むＬＡＬおよび薬学的組成物
本発明は、本明細書に記載されるＬＡＬ欠乏症関連状態のいずれか、および治療から利益を受けるであろう前述されない他の状態を治療することを包含する。本発明に従い利用される外因性ＬＡＬは、非限定的に、細胞培養物（例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞）、大腸菌等の細菌、哺乳類および鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、およびシチメンチョウ）等の遺伝子導入動物を含むいずれの有用なタンパク質発現系、および植物系（例えば、アオウキクサおよびタバコ植物）で産生され得る組み換えＬＡＬを含む。本発明の一態様は、２００６年１０月３日に発行された米国特許第７，５２４，６２６号、２００７年１０月１０日に出願された米国仮特許第１１／９７３，８５３号、２００７年１０月２９日に出願された第１１／９７８，３６０号、および２００９年１月７日に出願された第１２／３１９，３９６号に従い産生された組み換えＬＡＬに関し、その開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本発明の一態様は、Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７７：１０６１−１０７４およびＤｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，４９：１６４６−１６５７に記載されるように産生された組み換えＬＡＬに関し、その開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。有用な実施形態の１つにおいて、外因性ＬＡＬは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１１年４月２３日に出願された第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３６９９号に記載される方法により、遺伝子導入鳥（例えば遺伝子導入ニワトリ）の卵管で産生される。一部の実施形態では、組み換えＬＡＬは、鳥細胞系で産生される。一部の実施形態では、組み換えＬＡＬは、哺乳類（例えばヒト）細胞系で産生される。
【００９３】
一実施形態では、本発明により使用される外因性リソソーム酸リパーゼは、実質的にＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびマンノース終結Ｎ結合構造を有するグリカンを含有する。外因性ＬＡＬ上のＧｌｃＮＡｃおよびマンノース終結グリカンは、マクロファージおよび線維芽細胞により特異的に認識および内在化され得る。タンパク質を、外因性ＬＡＬの投与によって治療可能な状態に関与する細胞上で発現するＧｌｃＮＡｃ／マンノース受容体の標的とすることができるマンノース−６−リン酸塩（Ｍ６Ｐ）も、典型的に、本発明により使用される外因性ＬＡＬ上に存在する。
【００９４】
典型的に、本明細書に説明され、開示される本発明の外因性ＬＡＬは、ヒトＬＡＬである。一実施形態では、外因性ＬＡＬは、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿０００２３５．２）に提供されるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、成熟外因性ＬＡＬは、以下のアミノ酸配列を有する。
【００９５】
【化１】
2013540733.tif 000002
【００９６】
一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、配列番号１のアミノ酸１−３７８、配列番号１のアミノ酸３−３７８、配列番号１のアミノ酸６−３７８、または配列番号１のアミノ酸７−３７８を含む。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、配列番号１のアミノ酸１−３７８、配列番号１のアミノ酸３−３７８、配列番号１のアミノ酸６−３７８、および配列番号１のアミノ酸７−３７８からなる群から選択される少なくとも２つのポリペプチドの混合物を含む。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、配列番号１のアミノ酸１−３７８を含むポリペプチド、配列番号１のアミノ酸３−３７８を含むポリペプチド、および配列番号１のアミノ酸６−３７８を含むポリペプチドの混合物を含む。
【００９７】
一部の実施形態では外因性ＬＡＬは、配列番号１のアミノ酸１−３７８、配列番号１のアミノ酸３−３７８、配列番号１のアミノ酸６−３７８、または配列番号１のアミノ酸７−３７８と同一であるポリペプチドを含む。他の実施形態では、外因性ＬＡＬは、配列番号１のアミノ酸１−３７８、配列番号１のアミノ酸３−３７８、配列番号１のアミノ酸６−３７８、または配列番号１のアミノ酸７−３７８に少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、配列番号１の機能断片、または配列番号１の機能断片に少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるポリペプチドを含む。
【００９８】
一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１１年４月２３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３６９９号に記載される組み換えＬＡＬタンパク質である。
【００９９】
同一ではないアミノ酸位置は、しばしば、アミノ酸残基が類似する化学特性（例えば電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に代えて置換され、したがって、分子の機能特性を変更しない保存アミノ酸置換基により異なることが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質を補正するために上方に調節され得る。この調節を行うための方法は、当業者に周知である。保存的置換の得点は、例えばＭｅｙｅｒｓ＆Ｍｉｌｌｅｒｓ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムにより計算され得る。
【０１００】
「比較ウインドウ」とは、２つの配列が最適に整合された後に配列を同一数の隣接位置の参照配列と比較してもよい、約２５〜約４００位置、または約５０〜２００位置、または約１００〜１５０位置等の連続位置のセグメントを指す。比較用の配列のアライメント方法は、当該技術分野において周知である。比較用の配列の最適なアライメントは、例えば、小域相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．  ２：４８２（１９８１）により、大域アライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）により、類似性法の検索（Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２（１９９７）により、典型的にはデフォルト設定を使用した、これらのアルゴリズム（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＢＬＡＳＴ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のコンピュータ化された実装により、または手動アライメントおよび目視（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９４を参照）により実施され得る。例えば、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、配列番号１のアミノ酸配列またはその断片に８０％超相同であるアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を使用して実施され得る。
【０１０１】
有用なアルゴリズム実装の一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブペアワイズアライメント（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を使用して、関連する配列の群から複数の配列アライメントを作製する。それは、アルゴリズムを作製するために使用されるクラスタリング関係を示す系統樹もプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）のプログレッシブアライメント法の単純化を使用する。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−３（１９８９）により説明される方法に類似する。複数のアライメント手順は、最も類似する２つの配列のペアワイズアライメントから始まり、整合させた２つの配列のクラスターを産生する。このクラスターは、次いで、次の最も関連する配列または整合された配列のクラスターに整合され得る。配列の２つのクラスターは、２つの個々の配列のペアワイズアライメントの単純な伸長により整合され得る。繰り返す毎に次第に類似性を失う配列および配列のクラスターを含む一連のそのようなペアワイズアライメントは、最終アライメントを産生する。
【０１０２】
一部の実施形態では、本発明の外因性ＬＡＬポリペプチドは、野生型配列の変異体を含む。これらの変異体は、置換、挿入、または欠失変異体の３つのクラスのうちの１つ以上に該当する。これらの変異体は、自然に生じる対立遺伝子または種間変異体であり得るか、またはそれらは、ＤＮＡコードタンパク質のヌクレオチドの部位特異的変異誘発により調製され得る。部位特異的変異誘発は、カセット、またはＰＣＲ変異誘発、または変異体をコードするＤＮＡを産生するための、当該技術分野において周知の他の技法を使用して実施され、その後、組み換え細胞培養物中でＤＮＡを発現させる。最大約１００〜１５０のアミノ酸残基を有する変異体標的タンパク質断片は、確立された技法を使用して、生体外合成により調製され得る。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において周知である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２））。
【０１０３】
アミノ酸置換は、典型的に単一残基のものである。かなり長い挿入を許容することができるが、挿入は、通常、およそ約１〜約２０のアミノ酸である。いくつかの場合では、欠失は非常に長い場合もあるが、欠失は、約１〜約２０の残基の範囲である。最終誘導体に到達するために、置換、欠失、および挿入、またはそれらのいずれかの組み合わせが使用され得る。
【０１０４】
一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、少なくとも約１００Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、少なくとも約２００Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、少なくとも約２５０Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、約１００〜約１，０００Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、約１００〜約５００Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、約１００〜約３５０Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、約２００〜約３５０Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、約２５０〜約３５０Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、約２５０Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、約２７５Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、約３００Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。ヒトＬＡＬは、Ｎ結合グリコシル化のためにそのアミノ酸配列に、配列番号１に明記されるＡｓｎ３６、Ａｓｎ７２、Ａｓｎ１０１、Ａｓｎ１６１、Ａｓｎ２７３、およびＡｓｎ３２１の６つの可能性のある部位を有する。一部の実施形態では、少なくとも１、２、３、４、または５のＮ結合グリコシル化部位がグリコシル化される。一部の実施形態では、６つのグリコシル化部位全てがグリコシル化される。一部の実施形態では、Ａｓｎ３６、Ａｓｎ１０１、Ａｓｎ１６１、Ａｓｎ２７３、およびＡｓｎ３２１がグリコシル化される。一部の実施形態では、Ａｓｎ３６、Ａｓｎ１０１、Ａｓｎ１６１、Ａｓｎ２７３、およびＡｓｎ３２１がグリコシル化され、Ａｓｎ７２はグリコシル化されない。一部の実施形態では、Ｎ−グリジン構造は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、マンノース、および／またはマンノース−６−リン酸塩（Ｍ６Ｐ）を有する２分枝型、３分枝型、および４分枝型構造を含む。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、Ａｓｎ１０１、Ａｓｎ１６１、およびＡｓｎ２７３にＭ６Ｐ修飾されたＮ−グリカンを含む。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、Ｏ結合グリカンを含まない。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、シアル酸を含まない。一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１１年４月２３日に出願された第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３６９９号に記載されるグリコシル化パターンを有する。
【０１０５】
一部の実施形態では、外因性ＬＡＬの分子量は、約５５ｋＤである。
【０１０６】
特定に実施形態では、対象は、例えばベクターに外因性ＬＡＬをコードする核酸分子を用いて治療され得る。ポリペプチドをコードする核酸の用量は、患者当り約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇＤＮＡの範囲である。感染ウイルスベクターの用量は、用量当り１０〜１００ビリオン以上まで変動する。
【０１０７】
本発明の一部の実施形態では、外因性ＬＡＬは、（１）ＬＡＬ、またはその活性断片、変異体、もしくは誘導体を発現する核酸、例えばベクターで移植可能な宿主細胞を形質転換または形質移入する、および（２）形質転換した宿主細胞を哺乳類に移植することを含む治療法で投与される。本発明の一部の実施形態では、移植可能な宿主細胞を、外因性ＬＡＬをコードする単離された核酸で一時的に培養された、形質転換された、または形質移入された哺乳類から除去し、それが除去された同じ哺乳類に移植し戻す。必要はないが、細胞は、移植される同じ部位から除去され得る。時折エクスビボ遺伝子療法としても知られるそのような実施形態は、制限された期間の間、連続した外因性ＬＡＬポリペプチドの供給を提供することができる。
【０１０８】
本発明で提供される治療用タンパク質である組み換えＬＡＬは、未精製の形態で投与することが可能であるが、治療用タンパク質を薬学的製剤の一部として投与することが好ましい。
【０１０９】
よって、本発明は、鳥由来のグリコシル化された治療用タンパク質またはその薬学的に許容される誘導体、ならびに１つ以上のその薬学的に許容される担体、および任意に、他の治療および／または予防的成分を含む薬学的製剤、ならびにそのような薬学的製剤を投与する方法をさらに提供する。本発明は、哺乳類由来のグリコシル化された治療用タンパク質またはその薬学的に許容される誘導体、ならびに１つ以上のその薬学的に許容される担体、および任意に、他の治療および／または予防的成分を含む薬学的製剤、ならびにそのような薬学的製剤を投与する方法も提供する。
【０１１０】
担体（複数可）は、製剤の他の成分と適合可能であり、その受給者に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。本発明の薬学的組成物を使用して患者を治療する方法（例えば、投与される薬学的タンパク質の量、投与の頻度、および治療期間の継続期間）は、当該技術分野の医師に既知の標準的な方法論を使用して決定され得る。
【０１１１】
薬学的製剤は、経口、直腸、鼻腔、局所（頬および舌下を含む）、膣、または非経口に適切なものを含む。薬学的製剤は、筋肉内、皮下、および静脈内投与を含む注入による投与に適切なものを含む。薬学的製剤は、吸入または吹送により投与されるものも含む。適切な場合、製剤は、便宜上、別個の投与量単位で提示され得、薬学の分野において周知の方法のいずれかにより調製され得る。薬学的製剤を産生する方法は、典型的に、治療用タンパク質を、液体担体もしくは微粉砕した固体担体または両方と混合し、必要であれば産物を所望の製剤に成形するステップを含む。
【０１１２】
経口投与に適切な薬学的製剤は、便宜上、それぞれが所定量の活性成分を含有するカプセル、カシェ剤もしくは錠剤等の別個の単位として、粉末もしくは顆粒として、溶液として、懸濁液として、またはエマルジョンとして提示され得る。活性成分も、ボーラス、舐剤、またはペーストとして提示され得る。経口投与用の錠剤およびカプセルは、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、または湿潤剤等の従来の賦形剤を含有することができる。錠剤は、当該技術分野に周知の方法によりコーティングされ得る。経口液体調製物は、例えば、水性もしくは油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ、またはエリキシル剤の形態であるか、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するために乾燥産物として提示され得る。そのような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤非水性ビヒクル（食用油を含む）、または防腐剤等の従来の添加剤を含有することができる。
【０１１３】
本発明の治療用タンパク質は、非経口投与（例えば注入、例えば、ボーラス注入または連続点滴）用にも製剤化され得、アンプル、前充填シリンジ、少量点滴、または防腐剤添加された多回用量容器の単位用量形態で提示され得る。治療用タンパク質は、例えば皮下注入、筋肉内注入、および静脈内（ＩＶ）点滴もしくは注入により注入され得る。一実施形態では、外因性ＬＡＬは、いずれの有用な方法により、ＩＶ点滴により静脈内投与され得る。一例では、外因性ＬＡＬは、末梢路を通した静脈内点滴により投与され得る。別の例では、外因性ＬＡＬは、末梢的に挿入された中央カテーテルを通して静脈内点滴により投与され得る。別の例では、外因性ＬＡＬは、静脈血管アクセスポートに取り付けられた携帯型点滴機によって促進される静脈内点滴により投与され得る。静脈内点滴の一実施形態では、薬物は、当該技術分野の医師によって決定される、点滴される薬物の量および患者の以前の点滴に関する反応歴により、１〜８時間の期間にわたって投与される。別の実施形態では、外因性ＬＡＬは、ＩＶ注入により静脈内投与される。別の実施形態では、外因性ＬＡＬは、腹腔内注入を介して投与され得る。また別の実施形態では、外因性ＬＡＬは、治療用タンパク質の薬学的に許容されるカプセルを介して投与される。例えば、カプセルは、腸溶性コーティングされたゼラチンカプセルであり得る。
【０１１４】
一部の実施形態では、治療用タンパク質は点滴により投与され、点滴は、例えば、３０分〜１０時間の長期間にわたって行われてもよい。よって、点滴は、例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、または約５時間の期間にわたって行われてもよい。点滴はまた、様々な速度で行われてもよい。よって、例えば、点滴速度は、１時間当り１ｍＬ〜１時間当り約２０ｍＬであり得る。一部の実施形態では、点滴速度は、１時間当り５ｍＬ〜１０ｍＬである。一実施形態では、点滴速度は、１時間当り１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｍＬである。一実施形態では、点滴速度は、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ／時間である。一実施形態では、点滴速度は、約０．１、約０．２、約０．３、約０．５、約１．０、約１．５、約２．０、または約３ｍｇ／ｋｇ／時間である。
【０１１５】
治療用タンパク質は、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンのような形態を取ることができ、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤等の製剤用作用物質を含有することができる。治療用タンパク質は、使用前に適切なビヒクル、例えば減菌発熱性物質除去蒸留水を用いて構成するために、減菌固体を無菌単離することにより、または溶液から凍結乾燥することにより得られた粉末形態であり得る。
【０１１６】
表皮への局所投与において、治療用タンパク質は、軟膏、クリーム、もしくはローションとして、または経皮パッチとして製剤化され得る。軟膏およびクリームは、例えば、適切な増粘剤および／またはゲル化剤を添加することにより、水性または油性基材を用いて製剤化され得る。ローションは、水性または油性基材を用いて製剤化され得、一般に、１つ以上の乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、または着色剤も含有する。
【０１１７】
口内の局所投与に適切な製剤は、風味基材、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガントに活性成分を含むロゼンジ剤、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア等の不活性基材に活性成分を含む芳香錠、および適切な液体担体に活性成分を含む口内洗浄液を含む。担体が固体である直腸投与に適した薬学的製剤は、最も好ましくは、単位用量の坐剤として提示される。適切な担体は、ココアバターおよび当該技術分野で通常使用される他の材料を含み、坐剤は、便宜上、活性化合物の、軟化させたまたは融解させた担体（複数可）との混合物により形成され、その後冷却され、鋳型で成形される。
【０１１８】
膣投与に適した製剤は、活性成分に加え、適切であることが当該技術分野において公知であるそのような担体を含有する膣坐剤、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡状物、またはスプレーとして提示され得る。
【０１１９】
鼻腔内投与において、本発明の治療用タンパク質は、液体スプレーまたは分散性粉末として、または滴剤の形態で使用され得る。
【０１２０】
滴剤は、１つ以上の分散剤、可溶化剤、または懸濁剤も含む水性もしくは非水性基材を用いて製剤化される。液体スプレーは、便宜上、加圧パックから送達される。
【０１２１】
吸入による投与において、本発明による治療タンパク質は、便宜上、吸入器、ネブライザ、もしくは加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の簡便な手段から送達され得る。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガス等の適切な推進剤を含んでもよい。加圧エアロゾルの場合において、投与量単位は、計量した量を送達するための弁を提供することにより決定され得る。
【０１２２】
吸入または吹送による投与において、本発明による治療用タンパク質は、乾燥粉末組成物、例えば、化合物とラクトースもしくはデンプン等の適切な粉末基材の粉末ミックスの形態を取ることができる。粉末組成物は、例えば、カプセルもしくはカートリッジの単位投与量形態で、または粉末が吸入器もしくは吹送器の補助により投与され得るゼラチンもしくはブリスターパックで提示され得る。所望する場合、活性成分を持続放出するように適合された上記の製剤が利用され得る。
【０１２３】
本発明による薬学的組成物は、抗菌剤または防腐剤等の他の活性成分も含有してもよい。
【０１２４】
一部の実施形態では、薬学的組成物中の外因性ＬＡＬの濃度は、約０．５〜約１０ｍｇ／ｍｌである。一部の実施形態では、ＬＡＬの濃度は、約１〜約５ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ＬＡＬの濃度は、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、または約７．５ｍｇ／ｍＬである。
【０１２５】
一部の実施形態では、外因性ＬＡＬを含む薬学的組成物は、緩衝液をさらに含む。代表的な緩衝液としては、酢酸、リン酸、クエン酸、およびグルタミン酸緩衝液が挙げられる。代表的な緩衝液としては、クエン酸リチウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸カルシウム、乳酸リチウム、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸カルシウム、リン酸リチウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、マレイン酸リチウム、マレイン酸ナトリウム、マレイン酸カリウム、マレイン酸カルシウム、酒石酸リチウム、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム、酒石酸カルシウム、コハク酸リチウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム、コハク酸カルシウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸カルシウム、およびそれらの混合物も挙げられる。一部の実施形態では、緩衝液は、クエン酸三ナトリウム二水和物である。一部の実施形態では、緩衝液は、クエン酸一水和物である。一部の実施形態では、薬学的組成物は、クエン酸三ナトリウム二水和物およびクエン酸一水和物を含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、外因性ＬＡＬを含む薬学的組成物は、安定剤をさらに含む。代表的な安定剤としては、アルブミン、トレハロース、糖類、アミノ酸、ポリオール、シクロデキストリン、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カルシウム等の塩類、凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、ならびにそれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、薬学的組成物は、ヒト血清アルブミンを含む。
【０１２７】
特定の例において、本明細書に開示されるように産生された組み換えヒトＬＡＬは、１ミリリットル当りに外因性ＬＡＬ（例えば２ｍｇのＬＡＬ）、クエン酸三ナトリウム二水和物（例えば１３．７ｍｇ）、クエン酸一水和物（例えば１．５７ｍｇ）、およびヒト血清アルブミン（例えば１０ｍｇ）を含有する薬学的製剤に利用され、５．９±０．１等の酸性ｐＨに製剤化される。本発明は、外因性ＬＡＬの関連内臓および組織のリソソームへの取り込みを促進するいずれの投与形態経路を包含する。
【実施例】
【０１２８】
以下の特定の実施例は、本発明を図示することが意図され、特許請求項の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【０１２９】
実施例１
組み換えＬＡＬの投与による早発性ＬＡＬ欠乏症（ウォルマン病）の治療
生まれたとき（出生時体重、３．８８ｋｇ）から体重増加不良のため、１５週齢の男児が入院した。乳児は、嘔吐、摂食問題、栄養状態の不良、下痢、腹部膨満の増加、および貧血を示した。患者はウォルマン病と診断された。
【０１３０】
最初の身体検査で、患者の体重は５．６２ｋｇであり、年齢別体重の第５パーセンタイルより下であった。１５週齢での最初の検査から４週間の間、および１９週齢での最初の点滴前には、患者の体重は増加しなかった。推定された成長速度は、年齢別体重の第１パーセンタイル未満であると計算された。腹部は極端に膨満し、顕著な肝腫大および脾腫大を伴った。腹部の超音波およびＣＴスキャンは、カルシウム沈着を伴う肝脾腫大および両側性の対照的に肥大した副腎を認めた。２１６Ｕ／Ｌ（正常１０〜４５Ｕ／Ｌ）のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）と同様に、血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）のレベルは、１１９Ｕ／Ｌ（正常１０〜５０Ｕ／Ｌ）に上昇した。治療開始前の炎症のマーカーである血清フェリチンは、約１，５００μｇ／Ｌ（正常７〜１４４μｇ／Ｌ）であった。患者は、治療前は一貫して貧血であり、ヘモグロビン値は７．２〜８．３ｇ／ｄＬの範囲であった。
【０１３１】
１９週齢で、０．２ｍｇ／ｋｇの初期用量で、週に１回のｒｈＬＡＬ（ＳＢＣ−１０２）のＩＶ点滴を開始した。点滴反応の可能性を相殺するために、患者は、ＳＢＣ−１０２点滴の約９０分前に１ｍｇ／ｋｇのジフェンヒドラミンで前治療された。点滴時間は、約４時間であった。点滴は良好に耐容され、患者は、いずれの有害事象または点滴関連反応を起こさなかった。
【０１３２】
初期点滴の７日後、２回目の点滴が患者に投与された。患者は、約４時間、０．３ｍｇ／ｋｇのＳＢＣ−１０２を投与され、いずれの有害事象の兆しを示すことなく耐容性を示した。
【０１３３】
治療を開始してから２週間以内に、患者は、鋭敏さおよび反応性を含む一般的な健康において顕著な改善を示した。下痢および嘔吐は安定した。患者の体重は増加し始め、血清トランスアミナーゼ（例えばＡＳＴおよびＡＬＴ）において、基本的に正常レベルへの著しい減少を示した（図１Ａおよび１Ｂ）。患者の成長速度は、急速に正常化した（図３および４）。腹部膨満は、腹囲の減少と対応して減少した。肝機能試験は、継続的に改善を示した（図１Ａおよび１Ｂ）。
【０１３４】
３回目の来院で、患者は０．５ｍｇ／ｋｇのＳＢＣ−１０２を受けた。点滴は、継続的に良好に耐容された。臨床状態は継続的に改善し、治療開始から体重は７日で１５０ｇ増加し、腕囲は１．５ｃｍ増加した（図３および４）。肝臓試験は安定しており、ヘモグロビンレベルは増加し（１０〜１１ｇ／ｄＬ）、フェリチンレベルは減少し続けた（図２）。アルカリホスファターゼは、治療前、正常の低範囲の１３７Ｕ／Ｌ（正常１１０〜３００Ｕ／Ｌ）であったが、治療により増加した（２０４Ｕ／Ｌ）。ＳＢＣ−１０２投与によるこの効果は、前臨床疾患モデルで認められた知見と一致した。
【０１３５】
４回目の点滴を発端に、患者は毎週１．０ｍｇ／ｋｇの用量を受け始めた。治療開始２ヶ月後、患者の成長は、実質的に改善し、推定成長速度は、第９５パーセンタイルに近かった。この成長増加は、６３日で１．２５ｋｇまたは２．７９ポンドの増加をもたらし、体重が７．２１ｋｇとなり、年齢別体重の第３０パーセンタイルとなった（図３および４）。ＡＳＴおよびＡＬＴの両方のレベルは、最初の点滴後、急速に低下した。
【０１３６】
治療を経て３ヶ月、ＡＳＴおよびＡＬＴは正常であった。肝機能の改善に加え、フェリチンの著しい減少も見られた（図２）。
【０１３７】
４ヶ月の治療にわたって、患者のＧＩ症状は回復し、患者の栄養状態は良好であった。患者の体重は増加し続け（図３および４）、正常で健康な乳児の身体徴候を示した。患者は、いずれの点滴反応または他の副作用を示すことなく点滴の耐容性を示し続けた。患者は、外来患者として２１回目の１．０ｍｇ／ｋｇの用量を受けた。
【０１３８】
実施例２
早発性ＬＡＬ欠乏症に対する研究設計
遺伝子導入ガルス属で産生されたｒｈＬＡＬであるＳＢＣ−１０２が、ＩＶ点滴により毎週投与された。研究は、ＩＶ点滴により毎週投与されるＳＢＣ−１０２の２用量レジメンの安全性、耐容性、および有効性を評価するために考案される。そのため、この研究における主な結果変数は、ＬＡＬ欠乏症による成長阻害を有する小児におけるＳＢＣ−１０２の安全性および耐容性を決定し、生命徴候および身体検査所見、臨床実験試験、抗薬物抗体試験、ならびに併用薬物の使用を含む。成長阻害がＬＡＬ欠乏症／ウォルマン表現型の共通する臨床特徴であることを考えると、この疾患の良好な療法は、ＬＡＬ欠乏症により影響を受けた小児に見られる成長阻害に対処することができるはずである。小児の成長および栄養状態に直接関連するパラメータは、二次または探索目的、例えば、漸進的な体重の成長速度、体重増加、および線形の成長速度として評価される。この研究は、薬物動態生物マーカーに対するＳＢＣ−１０２の作用、肝臓および脾臓の大きさ、リンパ節腫大、ヘモグロビンおよび血小板、肝機能および栄養の実験評価、腹囲、中上腕囲、および頭囲も調査する。この研究は、血漿Ｃｍａｘおよび推定クリアランスを含むＬＡＬ欠乏症による成長阻害を有する小児のＳＢＣ−１０２の予備薬物動態も説明する。
【０１３９】
【表１】
2013540733.tif 000003
【０１４０】
対象は、等しい大きさの２つの遂次コホート（各４人の対象）に参加する。投与は、各コホート内、コホート間、低用量コホート（コホート１；開始用量０．３５ｍｇ・ｋｇ−１）の最初の対象で開始する投与により調整される。コホート１の追加対象の投与および高用量コホート（コホート２；開始投与量１ｍｇ・ｋｇ−１）の投与の開始は、前の対象の許容可能な安全性および耐容性に基づく。
【０１４１】
コホート１
最初の４人の対象は、コホート１を構成する研究に参加した。このコホートの最初の対象は、０．３５ｍｇ・ｋｇ−１の単一用量のＳＢＣ−１０２を受け、少なくとも投与後２４時間の間の安全性の検討に基づき投与の継続が許可されれば、対象は、次いで、０．３５ｍｇ・ｋｇ−１の２回目の用量のＳＢＣ−１０２を１週間後に受ける。対象が２回目の用量のＳＢＣ−１０２を受けた後、全ての利用可能な安全データが検討され、その時点で、最初の対象の用量を１ｍｇ・ｋｇ−１に上げ、コホート１の他の対象の投与を開始するかどうかに関しての容認性が決定される。コホート１の他の対象３人の投与は、同様の様式で進める。安全性の検討は、０．３５ｍｇ・ｋｇ−１から１ｍｇ・ｋｇ−１への対象の用量の増大を保障しないが、対象が開始用量での治療を継続することが安全であると考えられる場合、対象は、０．３５ｍｇ・ｋｇ−１の用量を受けるのを継続してもよい。コホート１のいずれかの対象が、１ｍｇ・ｋｇ−１の少なくとも４用量のＳＢＣ−１０２を受けた後に、治療に対して最適以下の応答を示す場合、３ｍｇ・ｋｇ−１へのさらなる用量増大は考慮される。
【０１４２】
コホート２
コホート２の投与開始は、コホート１が完全に参加し、安全性がコホート１で１ｍｇ・ｋｇ−１の２用量以上のＳＢＣ−１０２を受けた少なくとも２人の対象について検討された後である。研究に登録された最後の４人の対象が参加し、コホート２で投与された。このコホートの最初の対象は、１ｍｇ・ｋｇ−１の単一用量のＳＢＣ−１０２を受け、少なくとも投与後２４時間の間の安全性の検討に基づき投与の継続が許可されれば、対象は、次いで、１ｍｇ・ｋｇ−１の２回目の用量のＳＢＣ−１０２を１週間後に受ける。対象が２回目の用量のＳＢＣ−１０２を受けた後、全ての利用可能な安全データが以下の容認性に対して検討される：最初の対象の用量を３ｍｇ・ｋｇ−１に上げ、コホート２の他の対象の投与を開始する。コホート２の他の対象３人の投与は、安全性の検討を用いて同様の様式で実施される。安全性の検討は、１ｍｇ・ｋｇ−１から３ｍｇ・ｋｇ−１への対象の用量の増大を容認しないが、対象が開始用量での治療を継続することが安全であると考えられる場合、対象は、１ｍｇ・ｋｇ−１の用量を受けるのを継続してもよい。対象が１ｍｇ・ｋｇ−１の開始用量に耐容性を示さない場合、０．３５ｍｇ・ｋｇ−１の低用量が考慮され得る。
【０１４３】
研究は、約２２回の来院予定からなる：来院１回目（スクリーニング）、来院２回目（ベースライン評価、研究薬物の開始）〜２１回目（研究薬物の毎週投与）、来院２２回目（研究調査の終了）。ＬＡＬ欠乏症による早発性成長阻害の重篤度および生命を脅かす性質を考慮すると、これらの対象は入院する可能性がある。
【０１４４】
研究の標的集団は、ＬＡＬ欠乏症による成長阻害を有する男子および女子である。対象は、以下の基準を満たす場合、この研究に参加する条件を満たす：（１）対象の親または法廷後見人が、リスクおよび副作用の可能性を含む、完全な研究の性質および目的を理解し、実施されるいずれの研究手順前に書面による同意／許可を提供する、（２）アッセイを実施するラボの正常範囲に対して文書化されたＬＡＬ活性の低下、またはＬＡＬ欠乏症の診断を確認する分子遺伝子試験の文書化された結果を持つ男子または女子、および（３）生後６ヶ月前に発症した成長阻害。
【０１４５】
安全性
主要安全評価項目は、有害事象（ＡＥ）および点滴関連反応（ＩＲＲ）の発生、生命徴候（血圧、心拍数、呼吸数、および体温）のベースラインからの変化、身体検査所見および臨床実験試験（ＣＢＣ／血液学検査、血清化学、および尿検査）、併用薬物／療法の使用、ならびに血清転換率、血清転換まで時間、中央およびピーク免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ＡＤＡ力価を含む抗ＳＢＣ−１０２抗体（ＡＤＡ）の特徴付け、およびピークＩｇＧ  ＡＤＡ力価までの時間を含む。
【０１４６】
有効性
有効性評価項目は、（１）肝臓および脾臓の大きさ（超音波による）ならびに肝臓および脾臓の容量ならびに脂肪含量（磁気共鳴映像法［ＭＲＩ］による）のベースラインからの変化および／またはパーセント変化、ならびに（２）血清トランスアミラーゼ、血清脂質（総コレステロール、トリグリセリド、高密度リポタンパク質［ＨＤＬ］、および低密度リポタンパク質［ＬＤＬ］）、ヘモグロビン、および血小板数のベースラインからの変化を含む。パーセンタイルおよびｚスコアのベースラインからの変化を含む成長パラメータも≦１８歳の対象について評価される。これらの成長パラメータは、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）成長チャートに基づき、対象の年齢が＜３０ヶ月の年齢別体重（ＷＦＡ）、身長別体重（ＷＦＬ）、年齢別身長（ＬＦＡ）、および年齢別頭囲（ＨＣＦＡ）、ならびに対象が≧３６ヶ月〜１８歳のＷＦＡ、年齢別背丈（ｓｔａｔｕｒｅ−ｆｏｒ−ａｇｅ）（ＳＦＡ；注記：背丈とは対象の身長を指す）、および背丈別体重（ＷＦＳ）、ならびに全対象の体重不足、衰弱（ｗａｓｔｉｎｇ）、および成長阻害の成長状態の指標を含む。
【０１４７】
実施例３
早発性ＬＡＬ欠乏症患者の身体評価
全身麻酔に耐えるのに十分な臨床的に安定である患者に対して、長期血管アクセスのための中心静脈カテーテル留置が考慮されるべきである。他の手順で全身麻酔および／または鎮静を受ける患者において、ベースライン腹部磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）スキャンが考慮される。全身麻酔および／または鎮静を必要とする新しい手順の事象において、それが１回目の点滴後３ヶ月以降である場合、調査ＭＲＩが考慮される。身体計測（体重、身長、腹囲、中上腕囲、および頭囲）が測定される。一般的な身体検査が実施される。詳細な身体検査が行われる。検査は、対象の一般的な外見、皮膚、頭、眼、耳、鼻、および喉の評価、心臓、肺、腹部、脚／関節、および精神状態を含む。全ての身体検査は以下も含む。
肝臓の大きさ：肝臓の大きさ（触診／非触診および肋骨縁からのセンチメートル）、規則性（平滑／結節性）、および感応性（敏感／非敏感）の臨床評価が行われる。
脾臓の大きさ：脾臓の大きさ（触診／非触診および肋骨縁からのセンチメートル）、規則性（平滑／結節性）、および感応性（敏感／非敏感）の臨床評価が行われる。
リンパ節腫大：大きさ、位置、およびあらゆる触診可能なリンパ節の特徴の評価が行われる。検査される領域は、頭部（後頭部、耳介前、耳後部、頤下、顎下）、頚部、鎖骨、腋窩、および鼠径部を含む。いずれの拡大した節は、敏感または非敏感として特徴付けされる。
撮影：仰臥位での対象のデジタル画像（全長および腹部拡大）が撮影される。
【０１４８】
肝臓／脾臓超音波およびＭＲＩ
肝臓および脾臓の大きさを測定するために、腹部超音波検査が実施され得る。腹部ＭＲＩは、肝臓および脾臓の容量の良好な定量化を提供することができ、ベースラインおよび１回目の点滴の少なくとも３ヶ月後の来院で考慮される。
【０１４９】
生命徴候
生命徴候は、脈拍数、呼吸数、収縮期および拡張期の血圧、ならびに深部体温（肛門および口腔）を含む。脈拍数および血圧の評価は、対象が仰臥位であった後に取られる。生命徴候は、全ての研究来院で測定される。投与日、生命徴候は、点滴前、点滴中および点滴後２時間の間１５分（±１０）毎、次いで、点滴が完了した後２〜４時間の間３０分（±１５）毎に記録される。
【０１５０】
実施例４
実験評価
以下の実験評価は、診断試験および有効性として実施される。
１）ＣＢＣ／血圧学検査：白血球数、赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、血小板数、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、細胞形態の検査のための末梢血塗沫標本
２）化学的パネル：グルコース、尿素窒素、クレアチニン、ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム（総量およびイオン化）、マグネシウム、無機リン、総タンパク質、乳酸デヒドロゲナーゼ
３）肝機能試験：ＡＳＴ／血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）、ＡＬＴ／血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、アルカリホスファターゼ、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴＰ）、アルブミン、ビリルビン（直接、総量）
４）抗薬物抗体：抗ＳＢＣ−１０２抗体
５）尿検査：ｐＨ、グルコース、ケトン、血液、タンパク質、亜硝酸塩
６）凝集研究：白血球（顕微鏡検査は、血液、亜硝酸塩、および／または白血球が異常である場合行われ得る）
７）実験栄養評価：血清αトコフェロール：コレステロール比、２５ＯＨビタミンＤ、血清レチノール、ジデヒドロレチノール、トランスサイレチン、血清フェリチン
８）脂質パネル：総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ
９）遺伝子プロファイル
タンパク質コード配列ならびに遺伝子転写、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、安定性および認識され得るタンパク質の有効性を制御する配列の両方を含むＤＮＡ配列は、以下を含む：
１．リソソーム酸リパーゼ（ＬＩＰＡ遺伝子）
２．ＬＡＬ欠乏症の疾患表現型の一因となる、および／またはそれを修飾してもよい脂質生物学に関与する他のタンパク質をコードする遺伝子、例えば、ＡＢＣＡ１
３．いずれかのＳＢＣ−１０２に対する脆弱性を修飾してもよい遺伝子
１０）薬物動態評価
医原性貧血のリスクを低減するために、ＰＫ試料採取は制限され得る。重要度によって、試料は、以下のパラメータを導き出すために収集される：１）Ｃｍａｘおよび２）ＣＬの推定。０日目（用量１）および１０５日目（用量１６）のＳＢＣ−１０２の血清レベルの測定のために試料採取が収集される。全ての対象において、試料は、前用量（投与の３０分以内）、点滴開始９０（±５）分後、および点滴開始１１０（±５）分後に収集される。ＢＰ評価のために点滴をしない腕の加圧帯を膨らませる前に、生命徴候の評価と同じ時点で、全てのＰＫ試料が採取される。他の時間点でのＰＫ試料は、加圧帯の収縮の少なくとも５分後に採取される。
【０１５１】
実施例５
用量調製および点滴
ＳＢＣ−１０２は、透明な液体として単一用量の１０ｍＬのガラスバイアルで提供される。溶液（総量１０．５ｍＬ、５％の過剰を含む）は、２ｍｇ・ｍＬ−１の濃度である。全てのＳＢＣ−１０２バイアルは、２〜８℃の調節温度で保管された。バイアルは凍結され、保管中、光から保護される。０．９％の生理食塩水に希釈されたＳＢＣ−１０２を含有するシリンジは、点滴直前に調製された。ＳＢＣ−１０２のシリンジが、前もって調製されたときは、希釈された溶液にはラベルが貼られ、調製の４時間以内に使用された。
【０１５２】
点滴の朝の投与前に記録され、最も近い０．１ｋｇに四捨五入された患者の体重は、各点滴のＳＢＣ−１０２量を計算するために使用された。研究に使用された総点滴量は、表２に示される投与レジメンに基づく。
【０１５３】
【表２】
2013540733.tif 000004
【０１５４】
用量調製および投与は、シリンジ、針、移送管、および二方コックを含むがこれらに限定されない、減菌の非発熱性の使い捨て材料を使用して実施されるべきである。
【０１５５】
流量制御デバイス上の点滴速度は、表３に示されるように、約１２０分にわたって総量を投与するように設定されるべきである。
【０１５６】
【表３】
2013540733.tif 000005
【０１５７】
実施例６
有害事象（ＡＥ）
臨床的に顕著な心血管、呼吸器、または他の作用を伴うＡＥまたは点滴関連反応（ＩＲＲ）が認められる患者においては点滴を中断するべきであり、２歳未満の小児における重度の点滴反応管理のための協会のガイドラインにより、対象はアナフィラキシー反応について治療されなければならない。これは、必要な場合、静脈内抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、およびエピネフリンを含んでもよい。関連する生物学的産物において、大半の遅延性ＩＲＲは、点滴後２４時間超で生じる。症状は、関節痛、筋肉痛、インフルエンザ様症状、頭痛、疲労、および発疹または蕁麻疹を含む。臨床的に示されるように、遅延性反応は、鎮痛剤または抗ヒスタミン剤で治療され得る。ＩＲＲは、急性（点滴開始２４時間以内に生じる）または遅延性（点滴の１〜６日後に生じる）のいずれかに分類される。過敏反応の治療のための薬物および機器は、予想外の重度の過敏反応の場合の即時使用のために利用可能でなければならない。これらの供給品は、酸素、アセトアミノフェン、抗ヒスタミン剤（例えば、ジフェンヒドラミン、非経口、およびＰＯ）、コルチコステロイド、エピネフリン、および心肺機能救急蘇生デバイスを含むが、これらに限定されない。類似する生物学的産物において、最も急性のＩＲＲは、点滴の２４時間以内に生じる（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）、ＶＰＲＩＶ（登録商標）、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）処方情報）。急性ＩＲＲの可能性の兆しは、軽度から中程度のＩＲＲに分類され得る：充血、紅潮、発熱および／または悪寒、吐気、そう痒、蕁麻疹、胃腸症状（嘔吐、下痢、腹部痙攣）。軽度の反応は、一時的な中止または点滴速度の減少後の自己限定性の自然回復反応として定義される。中程度の反応は、単純な措置で回復しない、観察の延長を必要とする、および療法を中断する反応として定義される。重度のＩＲＲは、胸痛、呼吸困難、喘鳴、喘音、低血圧もしくは高血圧、呼吸停止、無呼吸、呼吸困難、徐脈、または頻拍を伴う。上記の兆しおよび症状のいずれか点滴中に観察され、対象が血行動態的に安定している場合、点滴速度を遅くすることができ（事象の開始時に行われた速度の半分、例えば１０ｍＬ・時間−１から５ｍＬ・時間−１に減少させる）、点滴時間を延長する。事象が解決されたら、点滴スケジュールの元の速度の７５％に速度を増加させる前に、点滴は、最低３０分間減速で継続するべきである。対象が過敏症の兆しを示し続ける場合、２歳未満の小児の点滴反応管理のための協会ガイドラインにより、ＩＭまたは低ＩＶ用量の抗ヒスタミン剤が投与され得る。
【０１５８】
実施例７
遅発性ＬＡＬ欠乏症を有するヒト患者へのｒｈＬＡＬの投与
研究の主な目的は、遅発性ＬＡＬ欠乏症による肝不全を有する患者におけるＳＢＣ−１０２の安全性および耐容性（生命徴候、身体検査、臨床実験試験、免疫原性試験、有害事象評価、併用療法）を評価することである。第２の目的は、単一用量および複数用量（点滴前および点滴後、０日目および２１日目）後にＩＶ点滴により送達されたＳＢＣ−１０２の薬物動態を特徴付けするためである。遅発性ＬＡＬ欠乏症の対象の採択基準は、以下を含む：
１．患者がリスクおよび副作用を含む研究の完全な性質および目的を理解し、全ての研究手順に従う意思があり、かつそれに従うことができ、同意を提出する；
２．≧１８歳から≦６５歳の男性または女性；
３．アッセイを実施するラボの正常範囲に対して文書化されたＬＡＬ活性の低下、またはＬＡＬ欠乏症の診断を確認する分子遺伝子試験の文書化された結果、
４．臨床像（肝腫大）および／または実験試験結果（ＡＬＴまたはＡＳＴ≧１．５ｘＵＬＮ）に基づく肝臓関与の証明、
５．スタチンまたはエゼチミブを受けている場合、患者は、スクリーニング前の少なくとも４週間の間、安定した用量を受けていなければならない、
６．女性は全員、スクリーニング時、血清妊娠試験が陰性でなければならず、また授乳をすることができない、および
７．妊娠の可能性がある女性患者は、研究期間中、高度に有効で承認された避妊法（複数可）を使用することに同意し、最終用量後３０日間使用を継続しなければならない。
【０１５９】
臨床評価は、身体検査、尿検査、臨床化学分析、ＣＢＣ／血液検査、急性期反応物、凝集研究、１２誘導ＥＣＧ、抗ＳＢＣ−１０２抗体、およびＣｍａｘを導き出すためのＰＫ、ＡＵＣｉｎｆ、Ｔ１／２、Ｃｌ、およびＶＳＳを含む。
【０１６０】
患者は、毎週１回、２時間にわたり静脈内（ＩＶ）点滴を介して０．３５ｍｇ・ｋｇ−１、１ｍｇ・ｋｇ−１、または３ｍｇ・ｋｇ−１のＬＡＬを与えられる。最初の対象が投与され、コホートの他の対象への投与を進める前に少なくとも２４時間、耐容性について監視される。各対象は、最初のＳＢＣ−１０２の点滴後、２４時間入院する。対象は、ＳＢＣ−１０２用量のさらなる３用量の毎週１回のＩＶ点滴を継続するが、但し、耐容性および安全性が許容可能であることを条件とする。
【０１６１】
薬物動態
ＰＫデータは、少なくとも１用量の研究薬物を受けた、研究に参加した全ての対象を使用して分析されるが、主なプロトコルの逸脱により影響を受けた可能性がある、あらゆるデータ点を除外する。ＰＫ分析は、１つのコンパートメント点滴モデルを使用して実施される。以下のＰＫパラメータが導き出され、コホートにより提示される（Ｃｍａｘ、ＡＵＣｉｎｆ、Ｔ１／２、Ｃｌ、およびＶＳＳ）。単一用量および複数用量のＰＫパラメータは、来院２回目および来院６回目のデータを使用して比較される。
【０１６２】
この研究の用量間での提案された増分は、３、４、５、または６倍であり得、これは、ｍｇ・ｋｇ−１での６倍の用量範囲にわたって、ヒトにおける最初の安定性、耐容性、および薬物動態の評価を可能にしてもよい。関連のある前臨床ラットモデルにおいて、毎週１回１ｍｇ・ｋｇ−１、２週に１回３ｍｇ・ｋｇ−１、および毎週１回５ｍｇ・ｋｇ−１の薬物動態作用が比較可能である。よって、毎週１回３ｍｇ・ｋｇ−１より多い用量を必要とすることは予想されないが、疾患の重症度により、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇ・ｋｇ−１等の、３ｍｇ・ｋｇ−１を超える用量が考慮され得る。
【０１６３】
研究設計
この状態の患者の希少性を考えると、この研究の標的数は、９人の評価可能な対象である。対象は、コホート当り対象３人の３つの遂次コホートに参加する。コホート１に割り当てられた対象は、最初に投与を開始し、続いて、コホート２に割り当てられたもの、次いでコホート３のものが続く。
【０１６４】
【表４−１】
2013540733.tif 000006
【０１６５】
コホート１
３人の対象が０．３５ｍｇ・ｋｇ−１のＳＢＣ−１０２のＩＶ点滴を受ける。最初の対象が投与され、コホートの他の２人の対象への投与を進める前に少なくとも２４時間、耐容性について監視される。各対象は、最初のＳＢＣ−１０２の点滴後、２４時間入院する。対象は、０．３５ｍｇ・ｋｇ−１の３回のさらなるＩＶ点滴を継続するが、但し、耐容性および安全性が許容可能であることを条件とする。
【０１６６】
コホート２
３人の対象が１ｍｇ・ｋｇ−１のＳＢＣ−１０２のＩＶ点滴を受ける。コホート２の最初の対象が投与され、コホートの他の２人の対象への投与を進める前に少なくとも２４時間、耐容性について監視される。各対象は、最初のＳＢＣ−１０２の点滴後、２４時間入院する。対象は、１ｍｇ・ｋｇ−１の３回のさらなるＩＶ点滴を継続するが、但し、耐容性および安全性が許容可能であることを条件とする。
【０１６７】
コホート３
３人の対象が３ｍｇ・ｋｇ−１のＳＢＣ−１０２のＩＶ点滴を受ける。コホート３の最初の対象が投与され、コホートの他の対象への投与を進める前に少なくとも２４時間、耐容性について監視される。各対象は、最初のＳＢＣ−１０２の点滴後、２４時間入院する。対象は、３ｍｇ・ｋｇ−１のさらなる３用量の毎週１回のＩＶ点滴を継続するが、但し、耐容性および安全性が許容可能であることを条件とする。
【０１６８】
安全委員会（ＳＣ）は、耐容性の不良または安全上のリスクの可能性により、いずれかの時点で、コホート全て、または個々の対象への投与を一時停止してもよい。
【０１６９】
対象が、来院８回目（研究の終了）以外の来院予定で、または来院予定外で研究治療を中断する場合、対象は、来院８回目で行われる研究評価の終了のために、最後のＳＢＣ−１０２の用量後７日以降に再来院するべきである。
【０１７０】
ＳＢＣ−１０２は、来院２、４、５、および６日目にＩＶ点滴により投与される。併用療法は、研究中記録される。有害事象は、同意の署名時から記録される。
【０１７１】
各対象は、合計４用量のＳＢＣ−１０２を毎週受けるが、但し、耐容性および安全性が許容可能であることを条件とする。
【０１７２】
研究期間
研究は、安全性の評価、および後続の臨床試験のための投与スケジュールを支持するために、４週間のＳＢＣ−１０２での投与、および休薬期を伴う。この研究の完了後、対象は、ＬＡＬ欠乏症／ＣＥＳＤ表現型を有する患者のＳＢＣ−１０２の長期安全性および有効性を評価するための別個のプロトコルのもと、ＳＢＣ−１０２を再開する対象であってもよい。
【０１７３】
身体検査
一般的な身体検査は医学資格保有者によって実施される。系（心血管、呼吸器、胃腸、および神経系を含むがこれらに限定されない）が特定され、記録される。検査が行われる各時点で、いかなる異常も記述されるべきである。新しい異常の診断は、適切な場合、有害事象として記録されるべきである。
【０１７４】
スクリーニング来院で実施される追加の身体検査評価：
ａ）肝臓の大きさ：肝臓の大きさ（触診／非触診および肋骨縁からのセンチメートル）、規則性（平滑／結節性）、および感応性（敏感／非敏感）の臨床評価が行われる。
ｂ）リンパ節腫大：大きさ、位置、およびいずれの触診可能なリンパ節の特徴の評価が行われる。検査される領域は、頭部（後頭部、耳介前、耳後部、頤下、顎下）、頚部、鎖骨、腋窩、および鼠径部を含む。いずれの肥大した節は、敏感または非敏感として特徴付けされる。
ｃ）動脈疾患：右側および左側の後脛骨筋および足背動脈の脈拍が臨床的に評価され、右側および左側の足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）が記録される。ＡＢＩは、右側または左側の腕の上腕収縮期圧（どちらか高い方）で割った足背動脈または後部脛骨動脈の収縮期圧の比として定義される。
【０１７５】
生命徴候
脈拍数、呼吸数、収縮期および拡張期の血圧、および体温を含む生命徴候が測定される。脈拍数および血圧の評価は、対象が少なくとも５分間半仰臥位であった後に取られた。投与日、生命徴候は、点滴前、点滴中および点滴後２時間の間１５分（±５）毎、ならびに点滴が完了した後２〜４時間の間３０分（±１０）毎に記録される。点滴関連反応（ＩＲＲ）の場合には、治験担当医師の判断でさらなる数値が取られてもよい。対象が少なくとも５分間、仰臥であった後、正式記録値を含む１２誘導心電図（ＥＣＧ）が取られる。
【０１７６】
実験評価
実験試験の試料は、評価スケジュールに示される時間点で収集される。以下の分析（ＥＳＲ、凝集研究、および抗ＳＢＣ−１０２抗体を除く）が実施される。
【０１７７】
ＣＢＣ／血液学検査：白血球数、赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、血小板数、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球
化学的パネル：グルコース、尿素窒素、クレアチニン、ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、無機リン、総タンパク質、乳酸デヒドロゲナーゼ、尿酸
肝機能試験：ＡＳＴ／ＳＧＯＴ、ＡＬＴ／ＳＧＰＴ、アルカリホスファターゼ、ＧＧＴＰ、アルブミン、ビリルビン（直接、総量）
脂質パネル：総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ
凝集研究：プロトロンビン時間（ＰＴ）国際標準率（ＩＮＲ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）
尿検査：グルコース、ケトン、血液、ｐＨ、タンパク質、亜硝酸塩、および白血球（顕微鏡検査は、血液、タンパク質、亜硝酸塩、および／または白血球が異常である場合にのみ行われる）
ウイルス性肝炎スクリーニング：ＨＢｓＡｇおよびＨＣＶ血清学検査（スクリーニング時、または試験中に臨床的に示される場合）
自己免疫肝炎スクリーニング：抗平滑筋抗体（ＡＳＭＡ）、抗核抗体（ＡＮＡ）、抗ＬＫＭ１抗体、抗ＳＬＡ抗体
抗薬物抗体：抗ＳＢＣ−１０２抗体
急性期反応物：高感受性Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、および血清フェリチン
妊娠試験：女性は全員、最低でも月に１回妊娠試験を行う。これらは、来院１日目および来院８日目に血清、ならびに来院２日目および来院６日目に尿を使用して実施される。
薬物動態（ＰＫ）評価：ＰＫ試料は点滴カニューレとは反対の腕から採取される。０日目（用量１、来院２回目）および２１日目（用量４、来院６日目）のＳＢＣ−１０２血清レベルを測定するための詳細な試料採取が収集される：前投与直前（投与の３０分以内）、点滴中１０（±１）、１５（±１）、２０（±１）、４０（±２）、６０（±２）、および９０（±２）分、ならびに点滴の終わり（約１２０分）、ならびに点滴の完了５（±１）、１０（±１）、２０（±１）、３０（±１）、４０（±２）、６０（±２）、および１２０（±２）分後。
【０１７８】
ＳＢＣ−１０２の調製
来院１日目に記録された対象の体重は、各点滴のＳＢＣ−１０２量を計算するために使用される。ＩＶ点滴用のＳＢＣ−１０２医薬品は、以下のステップを使用して、希釈により調製される。
１．バイアルが冷蔵庫から取り出される。
２．バイアルの使用期限が過ぎていないことを確認する。
３．投与に必要な計算されたＳＢＣ−１０２の総量が決定される。
例：
対象の体重（ｋｇ）：７０ｋｇ
対象の用量レベル：３ｍｇ・ｋｇ−１
薬物の濃度：２．０ｍｇ・ｍＬ−１
【０１７９】
【表４−２】
2013540733.tif 000007
【０１８０】
４．以下の０．９％の生理食塩水の点滴袋は、投与群の割り当てに基づき使用される。
【０１８１】
【表４−３】
2013540733.tif 000008
【０１８２】
５．投与に必要なＳＢＣ−１０２の容量に等しい容量（上記ステップ３で計算される）は、１００ｍＬまたは２５０ｍＬのいずれかの０．９％の生理食塩水の点滴袋から取り出される（即ち、上記の例を使用すると、１０５ｍＬの生理食塩水が２５０ｍＬの点滴袋から取り出される）。
【０１８３】
６．０．９％の生理食塩水に対する計算されたＳＢＣ−１０２の総量が作製され、移される（即ち、上記の例を使用すると、１０５ｍＬのＳＢＣ−１０２溶液が作製され、点滴袋に移される）。
【０１８４】
７．袋を混合するために、ゆっくりした反転を使用する。
【０１８５】
ｒｈＬＡＬの投与
１．ＩＶ点滴管類が希釈されたＳＢＣ−１０２の袋に取り付けられる。
２．管類を準備し、全ての空気を排出する。
３．約１００分にわたり以下の速度で総量を投与するために、流動制御デバイス上の点滴速度を設定する。
【０１８６】
【表４−４】
2013540733.tif 000009
【０１８７】
４．対象によって変動し、かつ前肘静脈または手首の静脈（または中心静脈カテーテル）を含んでもよいＩＶ点滴部位が選択される。
５．ＩＶ管類が血管カテーテルに取り付けられる。開通性を評価し、生理食塩水が容易に流れるかを検証するために、生理食塩水がＩＶ路に注入される。
６．ＩＶ路は、テープで固定される。
７．流動制御でデバイスを使用して、ＳＢＣ−１０２点滴が開始される。
８．点滴は、定期的に監視される。
９．袋が空になったら、注入ポートを使用して、２５ｍＬの０．９％生理食塩水を直ぐに点滴袋に注入する。
１０．点滴が完了するまで、ラインを同じ点滴速度で流す（０．３５ｍｇ・ｋｇ−１および１ｍｇ・ｋｇ−１用量において、１時間当り６０ｍＬ［１分当り１ｍＬ］、そして３ｍｇ・ｋｇ−１用量において、１時間当り１５０ｍＬ［１分当り２．５ｍＬ］）。点滴の終了は、点滴および流しが完了し、文書化されたときと定義される。
【０１８８】
点滴反応
点滴関連反応（ＩＲＲ）は、少なくとも点滴におそらく関連する免疫学的に媒介される有害事象として定義される。ＩＲＲは、急性（点滴の開始の２４時間以内に生じる）または遅延性（点滴後１〜１４日の間に生じる）のいずれかとして分類される。
【０１８９】
過敏反応の治療のための薬物および機器は、予想外の重度の過敏反応の場合の即時使用のために利用可能でなければならない。これらは、酸素、アセトアミノフェン、抗ヒスタミン剤（例えば、ジフェンヒドラミン、非経口、およびＰＯ）、コルチコステロイド、エピネフリン、および心肺機能救急蘇生デバイスを含むが、これらに限定されない。
【０１９０】
急性ＩＲＲの可能性の兆しは、充血、紅潮、発熱および／または悪寒、吐気、そう痒、蕁麻疹、胃腸症状（嘔吐、下痢、腹部痙攣）、胸痛、呼吸困難、喘鳴、喘音、低血圧もしくは高血圧を含む心肺反応であり得る。上記の兆しおよび症状のいずれか点滴中に観察され、対象が血行動態的に安定している場合、点滴速度を遅くするか、または停止しなければならない。対象が過敏症の兆しを示し続ける場合、ＩＭまたは低ＩＶ用量の抗ヒスタミン剤を投与するべきである。臨床的に顕著な心血管または呼吸器作用を伴う重度の点滴反応が認められる患者においては、点滴を中断するべきである。そのようなアナフィラキシー反応において、対象は、静脈内抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、およびエピネフリンを用いて治療され得る。
【０１９１】
実施例８
ラットモデルにおける組み換えＬＡＬの投与
組み換えヒトＬＡＬの反復投与の体重、組織トリグリセリドおよびコレステロール、肝腫大、脾腫大、リンパ節腫大、腸管重量、および他のパラメータに対する作用が、Ｙｏｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｋｕｒｉｙａｍａ（１９９０）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ  ４０，ｐ４８６−４８９に記載されるＬＡＬ欠乏ドンリュウラットにおいて評価され（Ｋｕｒｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ３１，ｐ１６０５−１６１１、Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ  ３６，ｐ２２１２−２２１８も参照）、その開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ＬＡＬ欠失（ＬＡＬ−／−）にホモ接合性である４週齢のドンリュウラットは、遺伝子導入ニワトリの卵管系で産生された組み換えヒトＬＡＬまたは生理食塩水プラセボのいずれかを用いて投与される群に割り当てられた。野生型の同年齢の同腹仔のラットを対照として使用した。ＬＡＬ−／−ラットは、単一用量として、または３０分の間隔をあけて与えられる２等用量で、尾血管注入により、４週間の間、週に１回（合計４用量）または４週間の間、２週に１回（合計２用量）を投与された。組み換えＬＡＬの用量は、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇであった。投与スケジュールを表５に示す。アナフィラキシー反応の可能性を相殺するために、ラットをジフェンヒドラミン（５ｍｇ／ｋｇ）を用いて前治療されたが、これは、リソソーム蓄積症の治療のための酵素置換療法の動物モデルにおける以前の経験に基づく手順であり（Ｓｈｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ９１，ｐ．１２９３７、Ｂｉｅｌｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４，ｐ．３６３３５、Ｖｏｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４５，ｐ．８３８．）、それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９２】
図９は、１週当り１ｍｇ／ｋｇの組み換えＬＡＬ、もしくは１週当り５ｍｇ／ｋｇの組み換えＬＡＬ、または２週当り５ｍｇ／ｋｇの組み換えＬＡＬのいずれかで投与されたラットの体重増加の毎日の進展を示す。２つの用量数と頻度との間の治療的作用には、ほとんど、または全く差がないことが図から分かる。
【０１９３】
【表５】
2013540733.tif 000010
【０１９４】
実施例９
組み換えＬＡＬを用いて治療されたＬＡＬ−／−ラットの病理検査
実施例８に記載される研究の終了時、研究動物は、人道的に安楽死され、肉眼による病理像、組織病理像、および臨床化学を検査するために剖検された。肉眼による剖検は、身体の外表面、全ての開口部、ならびに頭部、胸部、および腹部空洞、ならびにそれらの内容物の検査を含んだ。内部臓器および組織の塊は、ラットに対して決定され、臓器および組織は、採取され、１０％の中性−緩衝ホルマリンで固定された。固定後、組織を処理し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色切片の組織学的スライドを準備し、評価した。
【０１９５】
分析された治療された動物の肉眼による病理学的検査は、図１０に示される解剖に見られるように、肝臓の大きさおよび色の実質的な正常化を示した。臓器対体重比が決定され、プラセボ治療されたラットと比較して、解剖された良好に治療された動物の肝臓、脾臓、腸間膜組織、十二指腸、空腸、および回腸の相対的な臓器の大きさにおいて減少を示した。分析された組み換えＬＡＬ治療されたラットからの肝組織の組織病理像は、プラセボ治療された動物の泡沫状のマクロファージの実質的な蓄積とは好対照に、基本的に正常な肝臓組織像を示す（図１０）。
【０１９６】
実施例１０
マクロファージおよび線維芽細胞リソソームにおける組み換えヒトＬＡＬの内在化
遺伝子導入鳥由来の組み換えヒトＬＡＬ（「ＳＢＣ−１０２」）が細胞に結合する、およびリソソームコンパートメントに内在化される能力は、マクロファージおよび線維芽細胞の細胞を使用して、生体外で検証された。マクロファージ細胞と共にインキュベートされるとき、蛍光的に標識されたＳＢＣ−１０２は、リソソームに局在化することが分かった。この作用は、マンノース多糖競合物を使用する、Ｎ−アセチルグルコサミン／マンノース（ＧｌｃＮＡｃ／マンノース）受容体を認識の機構として関係付ける、およびこれらの細胞による取り込みにより弱毒化され得る。ＳＢＣ−１０２は、生体外でインキュベートした後、ＬＡＬ欠乏ヒト線維芽細胞および正常なマウス線維芽細胞の両方において、細胞関連ＬＡＬ活性を増加させ、ＳＢＣ−１０２への露出が欠乏した酵素活性の実質的な置換をもたらすことができることを示す。
【０１９７】
マンノース−６−リン酸塩（Ｍ６Ｐ）は、遍在するＭ６Ｐ受容体を介して、リソソーム酵素の広範な細胞の種類への送達に関与することが示されているＳＢＣ−１０２のオリゴ糖構造に存在する。
【０１９８】
組み換えＬＡＬは、遺伝子導入メンドリの卵白から精製された。Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ＮＨＳは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）（＃０−１０２４１）から得た。ラット肺胞マクロファージ系のＮＲ８３８３、およびマウス線維芽細胞系のＮＩＨ−３Ｔ３は、ＡＴＣＣから得た。ＬＡＬ欠乏ウォルマン線維芽細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから得、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）から得た。
【０１９９】
酵素標識：ＰＢＳ中の４ｍｇの遺伝子導入鳥由来のＬＡＬを、製造者の推奨に従いＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎで標識し、続いて反応をＰＢＳに対して透析し、次いで濃縮した。
【０２００】
マクロファージの取り込み：蛍光的に標識された遺伝子導入鳥由来のＬＡＬ（５μｇ／ｍＬ）およびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄを、２時間、ＮＲ８３８３細胞と共にインキュベートした。４８８ｎｍ、次いで５１４ｎｍの定順位走査モードを使用して、共焦点蛍光顕微鏡法により細胞を検査した。
【０２０１】
マンナンを用いた拮抗阻害：蛍光的に標識されたＳＢＣ−１０２（５ｕｇ／ｍＬ）およびマンナンを、２時間、ＮＲ８３８３細胞と共にインキュベートした。細胞をトリプシン処理し、エンドポイントとして中央蛍光強度を使用して、蛍光活性化された細胞選別により組み換えＬＡＬ取り込みを測定した。
【０２０２】
遺伝子導入鳥由来ＬＡＬが取り込まれ、続いて標的細胞のリソソームの中へ組み込まれる能力は、マクロファージ細胞系のＮＲ８３８３を使用して検査された。蛍光的に標識された遺伝子導入鳥由来ＬＡＬおよびリソソームマーカーの「ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ登録商標）を、２時間、細胞と共にインキュベートした。遺伝子導入鳥由来ＬＡＬおよびリソソームマーカーの、これらの細胞のリソソームへの共局在化は、続いて、定順位走査モードを使用して、共焦点蛍光顕微鏡法により検査された（図１１）。組み換えＬＡＬは、リソソームへの局在化を示し、これは、様々な供給源からの組み換えヒト（ｒｈＬＡＬ）を使用した類似する生体外研究と一致する。
【０２０３】
遺伝子導入鳥由来ＬＡＬのＧｌｃＮＡｃ／マンノース受容体への結合特異性は、マクロファージ細胞系のＮＲ８３８３を使用して、競合結合アッセイにより評価された（図１２）。５μｇ／ｍＬの蛍光標識された（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）遺伝子導入鳥由来ＬＡＬ、および様々な濃度のマンノース含有オリゴ糖、マンナンを、２時間、細胞と共に同時にインキュベートした。エンドポイントとして中央蛍光強度を使用して、マンナンを含まない対照と比較した、マンナンにより取り込まれた遺伝子導入鳥由来ＬＡＬの相対阻害が、蛍光活性化された細胞選別分析により定量化された。遺伝子導入鳥由来ＬＡＬ結合／取り込みにおいて、マンノース用量依存阻害が観察され、これは、遺伝子導入鳥由来ＬＡＬ：ＧｌｃＮＡｃＲ相互作用と一致する。
【０２０４】
加えて、線維芽細胞の細胞におけるマンノース−６−リン酸塩媒介取り込みが、マンノース−６−リン酸塩との競合実験により示された。
【０２０５】
実施例１１
治療された細胞におけるＬＡＬ活性の増加
ＬＡＬは、コレステロール、グリセロール、および遊離脂肪酸を取り除くために、コレステロールエステルおよびトリグリセリドの加水分解を触媒する。よって、ＬＡＬ活性は、例えば、蛍光基質であるオレイン酸４−メチルウンベリフェリル（４ＭＵＯ）の切断により測定され得る。
【０２０６】
線維芽細胞
遺伝子導入鳥由来ＬＡＬの曝露が細胞のＬＡＬ活性を増加させる能力が、生体外で正常細胞およびＬＡＬ欠乏細胞の両方を使用して検査された。線維芽細胞をウォルマン患者から単離し、０、０．１６、または０．５マイクログラム／ｍＬのいずれかの濃度の遺伝子導入鳥由来ＬＡＬの存在下で、正常なマウス線維芽細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）を５時間インキュベートした。次いで、非特異的シグナルを取り除くために細胞を洗浄し、オレイン酸４−メチルインベリフェリル（４−ＭＵＯ）基質を使用して、ＬＡＬ活性について細胞溶解物をアッセイした。図１３は、内因性細胞関連ＬＡＬ活性が、ＮＩＨ−３Ｔ３と比較して、ウォルマン線維芽細胞で低く、遺伝子導入鳥由来ＬＡＬと共にインキュベートした後のＬＡＬ活性の用量依存増加が両方の細胞種において観察されたことを示す（図１３）。
【０２０７】
白血球
血清単核白血球は、投与前および投与後のＬＡＬ欠乏症患者から得た。血液試料は、酵素活性を損失することなく冷蔵庫で保管された。単核白血球（リンパ球）は、フィコールおよびジアトリゾ酸ナトリウムの調製物を使用して、血液から単離された。ハンクス平衡塩溶液で１：１に事前に希釈した４〜８ｍＬの血液を、３ｍＬのフィコール−パック上に静かに重ね、遠心分離した。単核細胞環を吸引し、ハンクス溶液で１回、次いで、１〜２ｍＬの水にペレットを再懸濁することにより少なくとも２回洗浄した。使用前に−２０℃でペレットを凍結させた。アッセイ前に、ペレットを解凍し、蒸留水に再懸濁し、氷上で超音波処理した。次いで、調製物を２０，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。アッセイ前に、上清（０．５〜１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬを含有する）を氷上に維持した。
【０２０８】
酸リパーゼアッセイ用の基質は、ヘキサン中の１ｍｌの１０ｍＭ  ４ＭＵＯ（オレイン酸４−メチルウンベリフェリル）を、ＣＨＣＩ３中の１ｍＬの１６ｍＭ  Ｌ−α−ホスファチジルコリンに添加することにより調製された。Ｎ２下で溶媒を蒸発させ、水中の２５ｍｌの２．４ｍＭタウロデオキシコール酸（ナトリウム塩）を添加した。混合物を３０〜４０Ｗで１〜２分間、氷上で超音波処理した。アッセイ前に、１容量の基質ストックを７容量の２００ｍＭ酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で希釈した。各２ｍＬの反応キュベットは、１００ｎｍｏｌのオレイン酸４−メチルウンベリフェリル、１６０ｎｍｏｌのＬ−α−ホスファチジルコリン、および６００ｎｍｏｌのタウロデオキシコール酸ナトリウムを含有した。
【０２０９】
５〜１００μＬの酵素を添加することによって反応を開始させ、分光蛍光光度計を使用して３７℃で監視した。４ＭＵＯの切断は、例えば、放出されたフルオロフォアである４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の約３６０ｎｍでの励起、および約４６０ｎｍでの発光により検出された。経時的な蛍光の変化が記録された。
【０２１０】
実施例１２
組み換えヒトＬＡＬ（ＳＢＣ−１０２）の生体内分析
ＬＡＬ欠乏ヨシダラット（即ち、ホモ接合）（Ｋｕｒｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３１，ｐ１６０５−１６１１、Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３６，ｐ２２１２−２２１８、およびＹｏｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｋｕｒｉｙａｍａ（１９９０）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．４０，ｐ４８６−４８９を参照）は、４週齢から４週間の間、１回／週でＳＢＣ−１０２（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）またはプラセボのいずれかで治療された。各投与において、ＳＢＣ−１０２は、３０分の間隔をあけて２等用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）でラットの尾血管に注入された。ラットおよび同年齢野生型対照は、最終用量の１週間後に検査された。分析は三つ組で行われた。
【０２１１】
ＳＢＣ−１０２治療された動物の肉眼による病理検査は、臓器の大きさの減少に加え、肝臓の色の正常化を示した。ＳＢＣ−１０２治療されたラットは、ビヒクル治療された動物の泡沫状のマクロファージの実質的な蓄積とは好対照に、基本的に正常な肝臓組織像を示した。ＬＡＬ−／−ラットでは上昇した血清アラニンおよびアスパラギントランスフェラーゼのレベルも、ＳＢＣ−１０２治療されたラットでは低下した。
【０２１２】
内部臓器および組織の塊は、各ラットに対して決定され、そのデータを図１４に示す。臓器の大きさは、４週間、５ｍｇ／ｋｇのビヒクルまたはＳＢＣ−１０２を毎週投与された後のＬＡＬ−／−ラットおよびＬＡＬ＋／＋ラットにおける、８週齢で決定された体重率として表される。
【０２１３】
ＳＢＣ−１０２またはビヒクル治療されたヨシダラットの体重は、図１５に示されるように、野生型ラットと比較された。ＳＢＣ−１０２（５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルは、単一用量として、または分割用量（４時間以内の間に与えられる）としてのいずれかで、ＩＶ注入によりＬＡＬ−／−ラットに投与された。ＬＡＬ＋／＋ラットは、同年齢の同腹仔対照であった。
【０２１４】
実施例１３
トリグリセリド分析
トリグリセリド分析は、野生型のホモ接合プラセボおよびホモ接合ＳＢＣ−１０２治療された動物からの肝臓および脾臓組織に対して実施された。トリグリセリド分析は、標準的な方法論（即ち、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのトリグリセリド定量化キット、カタログ＃ＪＭ−Ｋ６２２−１００）を使用して実施され、三つ組で行われた。
【０２１５】
【表６】
2013540733.tif 000011
【０２１６】
肝臓基質レベル
図１６は、４週間、５ｍｇ・ｋｇ−１のビヒクルまたはＳＢＣ−１０２を毎週投与された後のＷＴおよびＬＡＬ欠乏ラットにおける、８週齢で決定された肝臓コレステロール、コレステリルエステル、およびトリグリセリドのレベルを示す。
【０２１７】
実施例１４
ラット用量反応研究
上記で実施された研究に基づき、ＬＡＬ−／−ラットにおいて、用量の範囲および投与スケジュール（ｑｗおよびｑｏｗ）の薬物動態（ＰＤ）作用を検査した。これらの研究において、４週齢から１ヶ月間、ＳＢＣ−１０２が、０．２、１、３、および５ｍｇ／ｋｇ（ｑｏｗ）、または０．３５、１．０、および５．０ｍｇ／ｋｇ（ｑｗ）の投与量で、ＩＶ注入により投与された。結果は、体重（ＢＷ）増加（図１７）、臓器巨大症（図１８）、および組織基質レベル（図１９）の改善を示す。ＳＢＣ−１０２の用量が増加すると、血清トランスアミナーゼレベルも低下し、より高い用量で、レベルは、実質的に野生型レベルに達した。
【０２１８】
実施例１５
ＳＢＣ−１０２の薬物動態
ａ．試料採取
ＰＫ試料は、遅発性ＬＡＬ欠乏症に罹患する成人患者から得た。患者は、２時間、０．３５ｍｇ／ｋｇを投与された。０日目（用量１、来院２回目）および２１日目（用量４、来院６日目）の血清試料が、用量直前（投与の３０分以内）、点滴中（ＤＩ）１０（±１）、１５（±１）、２０（±１）、４０（±２）、６０（±２）、および９０（±２）分、ならびに点滴の終わり（EＯＩ）（点滴の開始から約１２０分）、ならびに点滴の完了（ＡＩ）５（±１）、１０（±１）、２０（±１）、３０（±１）、４０（±２）、６０（±２）、および１２０（±２）分後に収集される。
【０２１９】
ｂ．血清酵素アッセイ
−２０℃の冷凍庫に保持された４−ＭＵＯ（４ｍＭ）を、使用前に、暗所で、４℃の冷蔵庫で解凍し、暗所で１．５時間、２５℃のインキュベータに設置した。ＳＢＣ−１０２医薬品を１．５６ｎｇ／ｍＬに希釈することにより標準物を調製した。ブランクアッセイ緩衝液を含んだ。第１希釈用に、全ての試料を５０ｎｇ／ｍＬに希釈した。希釈物を作製した直後に標準物および試料を平板培養した。標準物および試料を調製した後、６２．５ｕＬのアッセイ緩衝液（０．２ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム三水和物、ｐＨ５．５）を各ウェルに添加した。二つ組で、１２．５ｕＬの標準物および試料を各ウェルに添加した。４％のトリトンＸ−１００を用いて４−ＭＵＯ（４ｍＭ）を１．６×に希釈し、ウェル当り２５ｕＬを添加した。多穴プレートを軽く数回たたいて混合し、きつく密封し、３０分間、３７℃のインキュベータに設置した。インキュベート後、５０ｕＬの停止溶液（０．７７Ｍトリス、ｐＨ８．０）を各ウェルに添加し、１５０ｕＬ／ウェルの最終容量を作製した。プレートをマイクロプレートリーダーに設置し、３６０ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光で、プレートの底部から蛍光のレベルを測定した。
【０２２０】
表７〜１１に示されるように、遅発性ＬＡＬ欠乏症に罹患する成人患者に投与された組み換えＬＡＬの血清Ｃｍａｘは、約２７０ｎｇ／ｍＬ〜７２０ｎｇ／ｍＬの範囲であった。半減期（ｔ１／２）は、７．６分〜１６．７分の範囲であり、平均ｔ１／２は、約１３分（標準偏差３．８１２）であった。
【０２２１】
【表７】
2013540733.tif 000012
【０２２２】
【表８】
2013540733.tif 000013
【０２２３】
【表９】
2013540733.tif 000014
【０２２４】
【表１０】
2013540733.tif 000015
【０２２５】
【表１１】
2013540733.tif 000016
【０２２６】
実施例１６
免疫原性分析：抗ＳＢＣ−１０２の測定
各不明の陽性および陰性試料を、１×ＰＢＳ中の５％の粉ミルクに１：２０に希釈し、回転器（５００ｒｐｍ）上で１２〜１８時間、４℃でインキュベートした。アッセイ前に、試料を２０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を新しい１．５ｍｌ管に移した。
【０２２７】
ＳＢＣ−１０２を、１ＸＰＢＳ緩衝液中で０．５ｕｇ／ｍＬの濃度に希釈し、１００ｕＬを９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに設置した。プレートを接着カバーで覆い、室温で８時間または一晩、４℃でインキュベートした。インキュベート後、ウェルを１×洗浄緩衝液で３回洗浄した。２００ｕＬの５％ＢＳＡ−無ＩｇＧを各ウェルに添加し、プレートを密封し、４℃で１２〜１８時間または室温で２時間インキュベートした。インキュベート後、ウェルを１×洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００ｕＬの各対照試料、不明試料、および陰性試料を三つ組でウェルに添加した。プレートをマイクロプレート振とう器（５００ｒｐｍ）上で室温で１．５時間インキュベートした。インキュベート後、ウェルを１×洗浄緩衝液で３回洗浄した。希釈緩衝液で１００ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈された１００ｕＬのビオチン化したＳＢＣ−１０２を各ウェルに添加し、プレートをマイクロプレート振とう器（５００ｒｐｍ）上で、室温で１．５時間インキュベートした。インキュベート後、ウェルを１×洗浄緩衝液で洗浄した。希釈緩衝液で１：４０００に希釈された１００ｕＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ抱合体を各ウェルに添加した。プレートをマイクロプレート振とう器（５００ｒｐｍ）上で、室温で１．５時間インキュベートした。インキュベート後、ウェルを１×洗浄緩衝液で４回洗浄した。１００ｕＬのＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、プレートを暗所で１５分間インキュベートした。５０ｕＬの停止溶液（０．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を各ウェルに添加し、反応を停止させた。４５０ｎｍでのＯＤを測定した。
【０２２８】
表１２に一覧にされるように、４週間、０．３５ｍｇ／ｋｇの用量のＳＢＣ−１０２を毎週受けた患者は、抗ＳＢＣ−１０２抗体のレベルの上昇を示さず、ＳＢＣ−１０２点滴による酵素置換療法がヒト患者においていずれの顕著な免疫原性を引き起こさないことを示唆する。これらの患者は、いずれの有害事象または点滴関連反応（ＩＲＲ）を示さなかった。
【０２２９】
【表１２】
2013540733.tif 000017
【０２３０】
実施例１７
組み換えＬＡＬの投与によるウォルマン病（ＷＤ）の治療
生後以来体重増加困難および発育不良のため、７週齢の女子の患者が入院した。最初の身体検査で、患者の体重は、３．６ｋｇ（出生時体重３．７ｋｇ）であり、痩せており、皮下脂肪は緩い。腹部は膨満し、６ｃｍの堅い肝腫大および４ｃｍの脾腫大を伴う。肥大したリンパ節が鼠径部で認められ、筋活動は弱い。
【０２３１】
最初のヘモグロビンレベルは９．２ｇｍ、血小板は５０６，０００、白血球は１１，５５０である。尿検査は正常であり、骨髄塗抹標本から、空胞のあるリンパ球および多数の泡沫状細胞が明らかである。血清化学測定値：総脂質８３４ｍｇ／１００ｍｌ、リン脂質１７６ｍｇ／１００ｍｌ、トリグリセリド１４１ｍｇ／１００ｍｌ、コレステロール１２９ｍｇ／１００ｍｌ、ビリルビン０．３ｍｇ／１００ｍｌ、アルカリホスファターゼ９．０ＢＵ％、ＳＧＯＴ９０単位、ＳＧＰＴ５０単位、コリンエステラーゼ２０単位、尿素窒素８．３ｍｇ、空腹時の糖４５ｍｇ／１００ｍｌ。腹部のＣＴスキャンは、カルシウム沈着を伴う肝脾腫大および両側性の対照的に肥大した副腎を示す。
【０２３２】
患者は、投与のための静脈血管アクセスポートを外科的に移植される。ポートを携帯型点滴機に接続した後、アナフィラキシー点滴反応の可能性を相殺するために、患者は、組み換えＬＡＬ点滴の前に２０分間、１ｍｇ／ｋｇのジフェンヒドラミンで前治療される。次いで、患者は、静脈内点滴により５時間にわたり１ｍｇ／ｋｇの組み換えＬＡＬを投与される。この療法は、無期限で、７日毎に１回繰り返される。
【０２３３】
最初の用量の組み換えＬＡＬを投与してから２週間以内に、患者は、超音波により決定される、体重増加および主要な腹部臓器の大きさについて評価される。患者のリソソーム酸リパーゼ活性を試験する実験結果も実施される。
【０２３４】
実施例１８
組み換えＬＡＬの投与によるコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）の治療
そう痒性腹部皮疹を伴う３歳の男子が、彼の小児科医によって検査される。腹部検査時、肝腫大が医師によって認められ、超音波によって確認される。この時点では、診断は行われず、患者は定期的に監視される。
【０２３５】
８歳で、彼は胃腸炎で病院に入院する。肝臓生検の光学顕微鏡法は、肝細胞に細胞質内グリコーゲンおよび小さい脂質滴の増加を示す。電子顕微鏡法は、小さい高電子密度顆粒を伴う膜結合脂質滴を示す。グリコーゲン蓄積症ＩＩＩ型（脱分枝酵素欠損症）の仮診断がなされたが、皮膚線維芽細胞脱分枝活性は正常である。
【０２３６】
１０歳で、肝腫大が持続し、２回目の肝臓生検が行われる。光学顕微鏡法は、軽度の門脈周囲線維症を伴う、細胞質顆粒および空胞を含有する膨満した肝細胞を伴った肝臓軟組織の小葉構造の変化を示す。線維芽細胞酸リパーゼ活性は、正常の７％であることが判明し、ＣＥＳＤの診断を確認する。総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の血漿濃度は、それぞれ、７．５１、３．２４、および５．５８ｍｍｏｌ／Ｌで、年齢および性別の第９５パーセンタイルよりそれぞれ上であるが、一方で、血漿高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）は、０．４７ｍｍｏｌ／Ｌで、第５パーセンタイルより下であり、彼は、複合型高脂血症（高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低αリポタンパク血症、および高βリポタンパク血症）である。
【０２３７】
患者は、投与のための静脈血管アクセスポートを外科的に移植される。ポートを携帯型点滴機に接続した後、アナフィラキシー点滴反応の可能性を相殺するために、患者は、組み換えＬＡＬ点滴の前に２０分間、５ｍｇ／ｋｇのジフェンヒドラミンで前治療される。次いで、患者は、静脈内点滴により５時間にわたり５ｍｇ／ｋｇの組み換えＬＡＬを投与される。この療法は、無期限で、１４日毎に１回繰り返される。
【０２３８】
最初の用量の組み換えＬＡＬを投与してから２週間以内に、患者は体重増加および主要な腹部臓器の大きさについて、超音波検査によって決定されたとおりに評価される。患者のリソソーム酸リパーゼ活性を試験する実験結果も実施される。
【０２３９】
＊＊＊
上記明細書の各実施例は、本発明の説明のために提供され、本発明を制限するものではない。実際、様々な修正、組み合せ、追加、除去、および変形が本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく本発明になされてもよいことは、当業者には明らかであろう。例えば、一実施形態の一部として図示または説明される特色は、またさらなる実施形態を得るために、別の実施形態に使用されてもよい。本発明は、そのような修正、組み合わせ、追加、除去、および変形を網羅することが意図される。
【０２４０】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、および受入番号／データベース配列（ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の両方を含む）は、各個別の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、および受入番号／データベース配列が参照によりそのように組み込まれるように具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2013540733.tif 000018
【図２】
2013540733.tif 000019
【図３】
2013540733.tif 000020
【図４】
2013540733.tif 000021
【図５】
2013540733.tif 000022
【図６】
2013540733.tif 000023
【図７】
2013540733.tif 000024
【図８】
2013540733.tif 000025
【図９】
2013540733.tif 000026
【図１０】
2013540733.tif 000027
【図１１】
2013540733.tif 000028
【図１２】
2013540733.tif 000029
【図１３】
2013540733.tif 000030
【図１４】
2013540733.tif 000031
【図１５】
2013540733.tif 000032
【図１６】
2013540733.tif 000033
【図１７】
2013540733.tif 000034
【図１８】
2013540733.tif 000035
【図１９】
2013540733.tif 000036
【配列表】
2013540733000001.app
【国際調査報告】
2013540733.tif 000037
2013540733.tif 000038
2013540733.tif 000039
2013540733.tif 000040