(57)【要約】  本発明は、磁場を用いて、高分子の１以上の特徴的特性、特に、ＤＮＡなどの核酸のトルクおよび／またはねじれ、を決定するための方法および装置に関する。【選択図】図２
2013532288.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子（３７）の１以上の特徴的特性を決定する方法であって、前記方法は、
ａ）前記高分子（３７）の第一端に常磁性マーカー（４０）を設け、それによって高分子−常磁性マーカー−アッセンブリを形成するステップ、
ｂ）前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの前記高分子（３７）の少なくとも一つの他端を、前記高分子（３７）の前記他端を保持するための保持手段（２２）の一以上の連結点に連結するステップであって、前記連結点がｘｙ平面内に位置して、前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリが、前記ｘｙ平面に実質的に垂直に配置されたメインマグネット（１２）と前記保持手段（２２）の表面との間で、前記ｘｙ平面に垂直なｚ方向に実質的に配置されるようにし、前記メインマグネット（１２）の極（１４、１６）がｚ方向に沿って配置され、前記メインマグネット（１２）が、前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの位置において実質的にｚ方向に向いた磁場を生成する前記ステップ、
ｃ）前記メインマグネット（１２）によって生成された磁場中における前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの前記常磁性マーカー（４０）の開始位置を決定するステップ、
ｄ）前記メインマグネット（１２）をその磁気軸に関して回転させ、それによって、前記常磁性マーカー（４０）を、測定位置まで、前記メインマグネット（１２）の前記磁気軸に関して回転させるステップ、
ｅ）前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの前記常磁性マーカー（４０）の前記測定位置を決定するステップ、
ｆ）前記測定位置から１以上の特徴的特性を算出するステップ
を含み、ステップａ）において、前記常磁性マーカー（４０）は、前記高分子（３７）に直接的に取り付けられている、方法。
【請求項２】
前記特徴的特性がトルクであり、前記常磁性マーカー（４０）に角度追跡マーカー（４２）が設けられ、該角度追跡マーカー（４２）によって、ステップｅ）における前記開始位置に対する前記測定位置の、前記ｘｙ平面における前記常磁性マーカー（４０）の位置の角度変位の決定が可能になる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｃ）の前に、サイドマグネット（１９）を用いた補助磁場を生成するステップをさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サイドマグネット（１９）の極（１４、１６）が前記メインマグネット（１２）の極（１４、１６）に対して逆向きとなるように、前記サイドマグネット（１９）が、前記メインマグネット（１２）に隣接して配置される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サイドマグネット（１９）が、水平のｘ方向に広がる２つの相隔たるｘコイル（５１）と、水平のｙ方向に広がる２つの相隔たるｙコイル（５２）を備える電磁コイル（５１、５２）のアッセンブリであり、前記電磁コイル（５１、５２）は、電線（５４）を介して電流源（５３）によって電力を供給され、前記電磁コイル（５１、５２）は、前記保持手段（２２）が前記電磁コイル（５１、５２）によって囲まれた空間内に埋め込まれるように配置される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記メインマグネット（１２）の磁力と前記サイドマグネット（１９）の磁力との強さの比が、10000:1〜10:1の範囲内である、請求項３から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ステップｂ）において、前記連結点が、前記メインマグネット（１２）の磁気軸と位置合わせされ、前記特徴的特性がねじれである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記メインマグネット（１２）の前記磁気軸と、前記保持手段（２２）の前記連結点が一致するように、前記メインマグネット（１２）と前記連結点が相対的に配置されうる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記メインマグネット（１２）の前記磁気軸と前記連結点が、０．１μｍの限度内で一致している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの、前記常磁性マーカー（４０）および／または角度追跡マーカー（４２）が１以上の可視化要素を備え、前記１以上の可視化要素が前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの回転を可視化する手段として用いられる、先行する請求項の１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記高分子（３７）が、ポリヌクレオチド部分、または、１以上のタンパク質部分と複合したポリヌクレオチド部分である、先行する請求項の１つに記載の方法。
【請求項１２】
先行する請求項の１つに記載の方法を行うための装置（１０）であって、前記装置（１０）は、
前記高分子（３７）を保持するための保持手段（２２）であって、前記保持手段（２２）は、高分子（３７）の少なくとも一端が連結される１以上の連結点を備え、前記連結点がｘｙ平面内に位置して、前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリが、前記ｘｙ平面に実質的に垂直に配置されたメインマグネット（１２）と前記保持手段（２２）の表面との間で、前記ｘｙ平面に垂直なｚ方向に実質的に配置されるようにするものである、前記保持手段（２２）、
前記高分子（３７）に力を適用するための磁場を生成するためのメインマグネット（１２）であって、前記メインマグネット（１２）は、その磁気軸に関して回転可能であり、前記保持手段（２２）から制御可能な距離に配置され、前記磁気軸は、前記保持手段（２２）のｘｙ平面に垂直に配置され、前記メインマグネット（１２）の極（１４、１６）が、前記ｚ方向に配置され、前記メインマグネット（１２）が前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの位置において実質的に前記ｚ方向に向いた磁場を生成するものである、前記メインマグネット（１２）、
前記メインマグネット（１２）を回転させるための手段、
前記常磁性マーカー（４０）および／または角度追跡マーカー（４２）の位置に関連する情報を画像化するための画像化手段（３２）
を備える装置（１０）。
【請求項１３】
前記メインマグネット（１２）を回転させると、常磁性マーカー（４０）が設けられた前記高分子（３７）を回転させることができるサイドマグネット（１９）をさらに備える、請求項１２に記載の装置（１０）。
【請求項１４】
前記サイドマグネット（１９）が、前記メインマグネット（１２）の側面に取り付けられた永久磁石である、請求項１３に記載の装置（１０）。
【請求項１５】
前記サイドマグネット（１９）が、水平のｘ方向に広がる２つの相隔たるｘコイル（５１）と、水平のｙ方向に広がる２つの相隔たるｙコイル（５２）を備える電磁コイル（５１、５２）のアッセンブリであり、前記電磁コイル（５１、５２）は、電線（５４）を介して電流源（５３）によって電力を供給され、前記電磁コイル（５１、５２）は、前記保持手段（２２）が前記電磁コイル（５１、５２）によって囲まれた空間内に埋め込まれるように配置されるものである、請求項１４に記載の装置（１０）。
【請求項１６】
前記メインマグネット（１２）の磁力と前記サイドマグネット（１９）の磁力の強さの比が、10000:1〜10:1の範囲内である請求項１３から１５のいずれかに記載の装置（１０）。
【請求項１７】
前記メインマグネット（１２）の前記磁気軸と、前記保持手段（２２）の前記連結点が好ましくは、０．１μｍの限度内で一致するように、前記メインマグネット（１２）と前記連結点が相対的に配置されうる、請求項１２に記載の装置（１０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子の１以上の特徴的特性を決定する方法に関する。本発明はさらに、その方法を行うための装置に関する。
【０００２】
そのような方法および装置は、Celedonら（Magnetic tweezers measurement of single molecule torque, Nano Letters, 9 (2009), 1720-1725）によって既知になっている。Celedonらは、ビーズ上の単一高分子によるトルクを、鉛直に配置された円筒状の磁石および該高分子に取り付けられたプローブを用いて測定する方法を開示している。プローブは、１μｍの超常磁性ビーズに連結された、強磁性体Niセグメントを有するNi−Ptナノロッドからなる。ナノロッドは、非対称性を導入する接続部分として機能する。Niセグメントと超常磁性ビーズとの連結は、それらの間の磁気的な引力によるものである。このことは、Niセグメントと超常磁性ビーズとの連結が、自己集合によって誘発されうることを意味する。プローブは、電気化学テンプレート技術を用いて別に準備される。
【０００３】
高分子の位置の磁場の方向は主に鉛直方向である。これは、従来の磁気ピンセットでは水平方向であった。鉛直方向の磁場のため、プローブが示す角度トラップのねじり剛性は低い。これにより、プローブの配置における角度の変位の決定が可能になる。従来の磁気ピンセットの方法では、水平平面における常磁性マーカーの配置は、本質的に磁場によって決定される。取り付けられた高分子（Celedonらの場合、二本鎖のＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ））の影響によるいかなるトルクの影響も、測定するには小さすぎるためである。Celedonの測定装置では、高分子が取り付けられた基板を回転させて高分子に回転を誘発し、生じたトルクおよび試験される高分子の他の特性が測定される。この構成は、１ｐＮ．ｎｍ未満のトルク分解能を可能にするといわれる。
【０００４】
Celedonによる方法の欠点は、高分子−ナノロッド−ビーズ−アッセンブリの準備が煩わしく、骨が折れ、時間がかかるということである。
【０００５】
他の欠点は、ナノロッドを準備するために、複数の電気めっき浴を有する電気めっき装置の形態の特別な備品や方法が必要とされることである。
【０００６】
さらに他の欠点は、試験中のＤＮＡ分子にトルクを適用するために、ガラス基板（つまりフローセル）を磁気軸に関して回転させる必要があるということである。これらの回転は機械的振動を誘発し、敏感な単一分子の実験において非常に好ましくない。
【０００７】
またさらに他の欠点は構造の複雑さであり、顕微鏡で見ることのできる適切な構造の収率または密度が低いことを暗示していると予想されるということである。これは、磁気ピンセットの確立された利点、すなわち、同時に多くの高分子アッセンブリを可視化し測定することの可能性とは逆のものである。
【０００８】
さらなる欠点は、アッセンブリの極めて非球形の性質であり、それは、球形またはほぼ球形の対象物という仮定に通常基づいている追跡および力の校正の手順を複雑にしている。
【０００９】
Celedonらによって記載されている装置は、１．５ｐＮ以下の伸張力に限定され、ｚ方向の分解能は約５０ｎｍである。
【００１０】
本発明の目的は、上記欠点がより少ないまたは全くない測定方法を提供することにある。
【００１１】
さらに具体的には、本発明の目的は、プローブの準備の複雑性がより少なく、またこの準備が明確に定められた市販の粒子と互換的であるため、より容易に実行される測定方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、測定結果の精度の向上にある。
【００１３】
さらなる目的は、高分子のねじれの測定が可能である測定方法を提供することにある。
【００１４】
さらなる目的は、確立された引張力の校正手順にできるだけ近くなるようにすることにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、本発明に従う方法を行うための装置、特に、高分子におけるトルクおよび／またはねじれを測定するための装置を提供することにある。
【００１６】
上記目的の１以上は、本発明に従う高分子の１以上の特徴的特性を決定する方法により達成される。前記方法は、
ａ）前記高分子の第一端に常磁性マーカーを設け、それによって高分子−常磁性マーカー−アッセンブリを形成するステップ、
ｂ）前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの前記高分子の少なくとも一つの他端を、前記高分子の前記他端を保持するための保持手段の一以上の連結点に連結するステップであって、前記連結点がｘｙ平面内に位置して、前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリが、前記ｘｙ平面に実質的に垂直に配置されたメインマグネットと前記保持手段の表面との間で、前記ｘｙ平面に垂直なｚ方向に実質的に配置されるようにし、前記メインマグネットの極がｚ方向に沿って配置され、前記メインマグネットが、前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの位置において実質的にｚ方向に向いた磁場を生成する前記ステップ、
ｃ）前記メインマグネットによって生成された磁場中における前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの前記常磁性マーカーの開始位置を決定するステップ、
ｄ）前記メインマグネットをその磁気軸に関して予め定められた回数だけ回転させ、それによって、前記常磁性マーカーを、測定位置まで、前記メインマグネットの前記磁気軸に関して回転させるステップ、
ｅ）前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの前記常磁性マーカーの前記測定位置を決定するステップ、
ｆ）前記測定位置から１以上の特徴的特性を算出するステップ
を含み、ステップａ）において、前記常磁性マーカーは、前記高分子に直接的に取り付けられている。
【００１７】
本発明によれば、常磁性マーカーは高分子に直接的に取り付けられており、それにより、一方では高分子に力とトルクを適用し、他方では高分子を検出し回転させることができる。
【００１８】
前記トルクは、メインマグネットを回転させることによって適用される。Celedonらにおいてなされていたように保持手段ではなく、メインマグネットを回転させることの利点は、本願に記載の単一分子測定の精度を著しく悪化させる機械的な振動が導入されないということである。
【００１９】
出願人は、高分子−常磁性マーカー−アッセンブリにより、広い範囲の引張力（例えば、０．１ｐＮ〜１０ｐＮ）で弱い角度トラップにおいて常磁性マーカーの開始位置および測定位置の決定ができることを見出した。典型的には、該方法は、１００〜５００ｐＮ．ｎｍ／ｒａｄの角度トラップの剛性krotで実行され、その結果、平衡近辺で、５°より大きな変動になる。これによって、高分子によるトルクによって誘発された平衡角における変化を直接観察することができる。
【００２０】
さらに具体的には、磁場に保持された常磁性マーカーには、磁場の勾配のために一定の上向きの力Ｆがかかり、この力は、高分子の連結の復元力とつり合っている。さらに、ｚ軸（伸びた高分子の方向に沿う）に関するマーカーの回転は、磁場によって束縛される。ねじれトラップの剛性krotは、マーカーの回転の熱変動(δθ2)を観察し、等分配則krot = kBT/(δθ2)（式中、kBはボルツマン定数、Tは温度である。）を適用することによって校正されうる。高分子連結物が、マグネットの回転によって更に巻かれまたは巻き戻されれば、高分子は、常磁性マーカーに対して復元トルクTDNAを発揮する。ねじれ的に緩和された高分子についてトラップ剛性およびトラップの平衡角度θ0を校正した後、この平衡からの平均角度の変化(θ-θ0)からTMacromoleculeを決定できる。磁場の前記回転後、TMacromolecule = krot(θ-θ0)である。
【００２１】
高分子は、ポリヌクレオチド部分、他の天然ポリマーまたはオリゴマー、およびさらに合成ポリマーまたはオリゴマーであってもよい。これらのポリマー、特に天然ポリマーは、非天然の構造であってもよい。つまり、分子が天然には見出されえないような構造であってもよい。非天然の構造を有する天然ポリマーの例は、Douglasら（Nature, 459 (2009), 414-418）によって提示されたＤＮＡ折り紙構造がある。
【００２２】
本発明に従う方法にも適用される磁気ピンセットの利点の一つは、磁気ピンセットのセットアップは、複数の高分子の並行測定を可能にするという点である。有利なことに、本発明に従う方法を用いれば、常磁性マーカーが取り付けられた高分子のアレイ（例えば、その高分子の幾つかに常磁性マーカーが取り付けられている、高分子を備えた膜）を測定することができる。
【００２３】
典型的には、本発明に従う方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの、常磁性マーカーを取り付けることができる２以上の絡み合うストランドを含む高分子に適用される。本出願の文脈では、高分子は、２以上の高分子の複合体（例えば、クロマチンなどの１以上のタンパク質部分と複合したポリヌクレオチド部分）であってもよい。好ましくは、高分子は、ポリヌクレオチド部分、または、ポリヌクレオチド部分−タンパク質複合体である。ポリヌクレオチド−タンパク質複合体は、細胞プロセス（ＤＮＡまたはＲＮＡの複製、転写および修復に関与するプロセス）において重要な役割を演じる。これらのタイプのプロセスでは、物理的に安定な螺旋状態にあるＤＮＡまたはＲＮＡの絡み合いは崩される。このように、異なるタイプのタンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮＡのストランドに連結し、その情報にアクセスすることができる。そのようなタンパク質の例には、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼおよびポリメラーゼがある。
【００２４】
本発明に従う方法のステップａ）において、高分子の第１端には常磁性マーカーが、典型的には化学的な結合によって、設けられる。高分子と常磁性マーカーとの間に用いられ得る非共有結合の例としては、ビオチン−ストレプトアビジン結合などの、タンパク質−リガンド結合がある。
【００２５】
常磁性マーカーは、高分子に直接的に取り付けられる。本発明の文脈では、高分子への常磁性マーカーの直接的な取り付けには、常磁性マーカーの高分子への取り付けを可能にするおよび／または向上させる中間分子部分の利用も包含される。そのような中間分子部分はその後、２つのれんがを離れないように付着させるために使用されるモルタルと同様に、分子接着剤として機能する。注意すべきは、前記中間分子部分は特異的な取り付けの目的のみを果たすということである。中間分子部分の寸法は、常磁性マーカーや高分子の寸法と比べると小さい。つまり、中間分子部分の典型的な寸法は、常磁性マーカーの寸法よりも約１０倍以上小さくなければならない。典型的に、中間分子の寸法は、５〜５００ｎｍの間であるべきであり、好ましくは、１００〜２５０ｎｍの間であるべきである。例えば、常磁性マーカーをＤＮＡコンストラクトに取り付ける場合、有利には、ＤＮＡコンストラクトは、例えば複数のビオチン基を有する官能性ＤＮＡ  ＰＣＲ断片にそれぞれの末端で結合される。次いで、常磁性マーカーはストレプトアビジンまたはニュートラアビジンで官能化される。利用されうる他のタンパク質−リガンド結合には、ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン結合またはフルオレセイン−抗フルオレセイン結合がある。
【００２６】
注意すべきは、常磁性マーカーを高分子に取り付けるために中間分子部分を利用することは、ナノロッド−アッセンブリを用いて高分子を常磁性マーカーに取り付けるCeledonらの状況とは異なるということである。このナノロッド−アッセンブリ（０．１μｍのＮｉ−セグメントに取り付けられた２μｍのＮｉ−Ｐｔナノロッド）は、実際、ナノロッド−常磁性マーカー−高分子−アッセンブリの機能する機械的な部分である。ナノロッドは、高分子の回転を可能にし検出するのに必要である。ナノロッド無しには、トルクは測定できない。これは、常磁性マーカーの位置または配置の決定において何の役割も演じない、中間高分子部分とは異なる。化学的に可能であれば、中間高分子部分は削除されてもよい。
【００２７】
その他に、Celedonらに従うナノロッドは、それ自体、上記中間高分子部分を用いて（つまり、ニュートラアビジン−ビオチン／ジゴキシゲニン結合を用いて）高分子に取り付けられている。
【００２８】
最後に、Celedonらに従うナノロッドの長さは約２μｍであり、本発明に従う中間分子部分よりはるかに大きい。
【００２９】
このように、本出願の文脈では、ナノロッドは中間分子部分と似ていない。
【００３０】
好ましくは、高分子を保持手段の表面に連結するために用いられるタンパク質−リガンド結合は、高分子を常磁性マーカーに取り付けるのに用いられるタンパク質−リガンド結合を妨げない。
【００３１】
常磁性マーカーは球状の粒子であり得るが、立方体または不規則な形など、他の形状であってもよい。ビーズなどの球状の粒子は、測定を実行するときに従うべき校正手順が、粒子がおおよそ球状であると仮定することによって単純化されうるという利点がある。
【００３２】
常磁性マーカーの常磁性の性質は、常磁性マーカーが作られる材料の固有の特性であってもよい。有利には、常磁性マーカーは、例えば、分子または粒状物などの強常磁性粒子が埋め込まれたポリマーマトリックスを備えている。非磁性キャリアに常磁性コーティングが施されたものが用いられてもよい。好ましくは、ポリマーはポリスチレンである。ストレプトアビジンが被覆されたDynabeads(登録商標)（Invitrogen）が一例である。
【００３３】
有利には、高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの常磁性マーカーは、高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの回転の可視化を容易にする可視化要素を備える。可視化は、蛍光性の化合物によって、例えば、蛍光性の分子および／または粒状物を有する常磁性マーカーを埋め込むことによって、与えられうる。
【００３４】
高分子−常磁性マーカー−アッセンブリは、標準（つまり、商業的に利用可能な）技術および材料を用いて簡単に準備されうる。さらに、高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの準備は、常磁性マーカーの角度追跡を可能にするナノロッドを合成する必要なしに、数分以内になされうる。本発明によれば、常磁性マーカーは、非対称性を誘発する接続の挿入なしに高分子に取り付けられる。本発明に従う方法の他の利点は、単位表面積あたりの高い密度の適切なアッセンブリを可能にするということである。本発明に従う方法を用いて、４０平方ミクロンあたり約１分子を測定することができる。６０×４４μｍ２の視野を持つ１００ｘ対物レンズでアッセンブリを画像化する場合、このことは、約６０のアッセンブリを同時に測定できることを意味する。本発明に従う方法は、常磁性マーカーを官能化する結合部分の使用に限定されず、他のリガンド−タンパク質結合形成部分が利用されてもよいことが認識されるであろう。
【００３５】
常磁性マーカーが設けられた高分子は高分子−常磁性マーカー−アッセンブリを形成する。請求項１のステップｂ）において、このアッセンブリが保持手段（例えば、顕微鏡カバースリップなどのガラス板）の１以上の連結点に連結される。一般に、この連結は、高分子の、常磁性マーカーが設けられていない端を１以上の連結点に化学的に取り付けることによってなされる。好ましくは、アッセンブリは、１つより多くの連結点に連結される。１つの連結点へのアッセンブリの連結では、アッセンブリがその連結の辺りで少なからず自由に回転することが可能であるためである。この取り付けもまた、保持手段の表面のおよび／または高分子のそれぞれの端の適切な改良（ジゴキシゲニン官能性ＤＮＡ  ＰＣＲ断片またはジゴキシゲニン官能性ＲＮＡ転写産物（いずれの場合も複数のジゴキシゲニン標識を含む）など）によって可能にされおよび／または向上されうる。高分子−常磁性マーカー−アッセンブリを保持手段の連結点に連結するために、好ましくは、連結点を備える保持手段の表面も、例えば、抗ジゴキシゲニン基で官能化される。
【００３６】
連結点は、ｘｙ平面内に位置し、高分子−常磁性マーカー−アッセンブリが、ｘｙ平面に実質的に垂直に配置されたメインマグネットと保持手段の表面との間で、前記ｘｙ平面に垂直なｚ方向に実質的に配置される。前記メインマグネットによって生成される磁場は、高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの位置において実質的にｚ方向を向く。有利には、メインマグネットは、ｚ方向が鉛直方向と一致するようにして保持手段の上方に配置される。高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの常磁性マーカーに発揮される引張力は、メインマグネットと常磁性マーカーとの間のｚ方向の距離に依存する。つまり、距離が小さいほど常磁性マーカーに発揮される引張力は高い。そのため、メインマグネットと常磁性マーカーとの間の距離を精密に制御できればできるほど、適用される力をより精密に制御できる。本発明に従う方法では、メインマグネットと常磁性マーカーとの間の距離は約１μｍの精度で確定されうる。本発明に従う方法のステップｃ）において、高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの常磁性マーカーの開始位置は、メインマグネットによって生成される磁場中で決定される。この開始位置は、固定された位置ではなく、時間平均された位置である。磁場中での常磁性マーカーの位置は、熱変動のために変動する。開始位置において、高分子はねじれ的に緩和された状態にあり得る。他の可能性としては、高分子を開始位置まであらかじめ巻いておき、その後本発明に従う方法を行う。
【００３７】
本発明に従う方法のステップｄ）において、メインマグネットは、その主たる磁気軸に関して予め定められた回数だけ回転される。これにより、常磁性マーカーもまた、メインマグネットの磁気軸に関して回転する。マグネットは、予め定められた回数Ｎだけ回転される。この文脈において、Ｎは実数であり得る。好ましくは、Ｎは整数である。
【００３８】
Ｎ回転後、高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの常磁性マーカーは測定位置を取る。この測定位置もまた、熱変動のため、時間平均された位置である。この測定位置において、高分子−常磁性粒子マーカー−アッセンブリは、復元トルクを発揮する。このトルクの結果として、一般に、開始位置と測定位置との間（つまり、開始位置と測定位置のｘｙ平面における位置と、ｘｙ平面における角度的な配置）には差異がある。磁場によって誘発される角度トラップのねじり剛性が低いため、この差異は測定可能である。
【００３９】
特徴的特性がトルクである場合、常磁性マーカーの位置上の差異および角度の変位を決定する必要がある。これは、常磁性マーカーの形状において小さな不規則性を用いることによってなされ得る。その不規則性は、高分子−常磁性マーカー−アッセンブリに非対称性を与え、従って常磁性マーカー画像において非対称性を与える。他の選択肢としては、角度追跡マーカーの使用である。これもまた、常磁性マーカー画像において非対称性を与える。該不規則性および角度追跡マーカーによって、ステップｅ）における、開始位置に対する測定位置のｘｙ平面における常磁性マーカーの位置における角度の変位の決定が可能になる。
【００４０】
角度追跡マーカーは、好ましくは非磁性であり、ステップｅ）における、開始位置に対する常磁性マーカーの測定位置の角度の変位の決定を可能にする機能を有する。角度追跡マーカーがなければ、印加される磁場によって誘発される常磁性マーカーの回転は、追跡するのが困難であろう。
【００４１】
常磁性マーカーと同様に、有利には、角度追跡マーカーは微粒子であり、好ましくは、常磁性マーカーよりも小さなサイズを有する球状の粒子である。このように、角度追跡マーカーは、常磁性マーカーの球形を著しく乱すものではない。このことは、引張手順を校正するための追跡および校正手順が高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの全体的な球形を仮定しているので有利である。このため、アッセンブリの全体的な形状が球であればあるほど、校正手順の精度は上がる。
【００４２】
角度追跡マーカーは、任意に、蛍光性の化合物および／または粒状物などの蛍光性の粒子を含むポリマーマトリックスを含んでもよい。そのようなマーカーは、Fluorospheres(登録商標) マイクロスフェア（Invitrogen）によって例示される。これらのマイクロスフェアは、標準の生物分析技術を用いて常磁性マーカーに取り付けることができる。角度追跡マーカーを常磁性マーカーに取り付けるためには、角度追跡マーカーをビオチンで官能化し、該ビオチンをストレプトアビジン官能化常磁性マーカーに連結する。典型的には、角度追跡マーカーを常磁性マーカーに取り付ける場合、１以上の角度追跡マーカーが常磁性マーカーに取り付けられる。実際には、方法の精度は角度追跡マーカーの数にあまり影響されない。好ましくは、各常磁性マーカーには、１つの角度追跡マーカーが取り付けられる。
【００４３】
任意に、常磁性マーカーにはまた、蛍光性の分子および／または粒子が埋め込まれる。有利には、常磁性マーカーの回転角度は、好ましくは、常磁性マーカーのＣＣＤ画像の相互相関分析を用いて追跡される。
【００４４】
常磁性マーカーの決定された角度の変位から、高分子の１以上の特徴的特性が算出されうる。そのような特徴的特性の例は、トルク、ねじれ、ねじり剛性、座屈トルク、および、高分子の相転移または高分子からのタンパク質部分の解放に影響を与えるものなどの臨界トルクがある。注意すべきは、本文脈において、測定されるのは、高分子において誘発されたねじれの変化であり高分子のねじれの絶対値ではないということである。しかし便宜上、ねじれの変化を「ねじれ」と呼ぶ。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態において、高分子のトルク（つまり、常磁性マーカーの予め定められた回数の回転に応じて高分子が発揮する復元トルク）が決定される。
【００４６】
驚くべきことに、本発明者らは、Celedonらに記載のナノロッドを必要とすることなしに、前記力およびトルクを適用することができた。前記論文において、著者らは、トルクは、高分子に対するプローブの取付け位置と、プローブの磁気中心との間の距離の水平成分LHに依存していることを主張している（１７２１頁、「Controlled Introduction of Turns into the Molecule」、図１の説明文）。従って、高分子に対するトルクの適用を可能にするために、LHは、非ゼロでなければならないということになる。しかし、本発明に従う構造を有する高分子にトルクを適用する場合、高分子は、常磁性マーカーのＳ極に取り付けられてもよい。このことは、水平成分LHがないことを意味し、Celedonらに従えば、高分子にトルクを適用することが不可能なはずであることを意味している。しかし、本発明者らは、サイドマグネットをメインマグネットと組合せて使用することで、高分子にトルクを適用できた。サイドマグネットによる補助磁場によってメインマグネットによって生成される磁場に非対称性を生じさせ、その非対称性によって、サイドマグネットが取り付けられたメインマグネットが回転されたときに常磁性マーカーは回転する。ゼロの水平成分LHを有する高分子−常磁性マーカー−アッセンブリでさえ、本発明者らがトルクを適用できたことは、本発明が進歩性を有していることを強く示している。
【００４７】
前記トルクの決定を可能にするために、補助磁場は、メインマグネットに隣接して配置されたサイドマグネットを用いて生成される。実行上の理由のために、磁気軸は、好ましくは平行に配置される。この補助磁場は、メインマグネットの磁場に対して水平成分を提供し、主に鉛直方向を向いた場に対して充分な非対称性を与えて常磁性マーカーの回転を可能にする。サイドマグネットの極は、サイドマグネットの極がメインマグネットの極に対して平行または逆向きのいずれかとなるように、配置されてもよい。有利には、サイドマグネットの極は、メインマグネットの極に対して反対に配置される。
【００４８】
前記サイドマグネットは、永久磁石であってもよいが、電磁石であってもよい。
【００４９】
好ましくは、サイドマグネットによる磁力と比較した、メインマグネットによる、主たる引張り方向（つまり、ｚ方向）における磁力の強さの比は、10000:1 〜10:1の範囲内である。この範囲内において、サイドマグネットの追加は、全体的な磁力の再校正を必要としない。付加的には、メインマグネットによる主たる引張り方向（ｚ）における磁力と、サイドマグネットによる横断方向（ｘまたはｙ）における磁力との強さの比は、10000:1 〜10:1の範囲内である。
【００５０】
有利には、高分子において測定されるトルクとトラップのねじり剛性krotとの比は、測定位置の角度的な配置と開始位置の角度的な配置との間の差が、０．１°〜１００°の範囲内となり、好ましくは０．１°〜１０°の範囲内となるようなものである。
【００５１】
有利には、サイドマグネットは、水平のｘ方向に広がる２つの相隔たるｘコイルと、水平のｙ方向に広がる２つの相隔たるｙコイルとを備える電磁コイルのアッセンブリからなり、前記電磁コイルは、電線を介して電流源によって電力を供給される。この構造において、前記電磁コイルは、前記保持手段が前記電磁コイルによって囲まれた空間内に埋め込まれるように配置される。
【００５２】
本発明のさらに他の好ましい実施形態では、請求項１のステップｂ）において、連結点は、メインマグネットの磁気軸と位置合わせされる。サイドマグネットがなく、その結果として、角度トラップの剛性krotは、典型的な高分子のそれよりも低いレベルまで下がる。
【００５３】
驚くべきことに、本発明者らは、メインマグネットの磁気軸と連結点が正確に一致するようにメインマグネットと保持手段の連結点が相対的に配置された場合、常磁性マーカーは連結点の回りで円運動をし、それによって連結点の回りで円軌道をたどることを見出した。前記一致は、表面に対する高分子の連結に関して定義される。この円運動は、高分子のねじれに変化をもたらす熱変動と、結果として生じる常磁性マーカーの応答によって起こされるので、外部磁場の回転なしに起こる。さらに精密には、ｘｙ平面内のほとんどゼロの場でのこの特定の測定位置において、常磁性マーカーの円状の動きは、連結点の回りの回転（角度追跡マーカーの使用によって確認される）と一致する。この同時に起こる回転と円運動は、月が地球の回りの回転と同じ速さで自身の軸に関して回転するという、地球の回りの月の回転に似ている（その結果、地球からの観察者は常に月の同じ側を見る）。
【００５４】
従って、運動中の常磁性マーカーの円軌道上の位置をモニタリングすることは、角度追跡マーカーの必要なく、高分子の角度変動または変位運動をモニタリングするための代替的方法である。前記回転軌道はマイクロメートルのスケールの半径を有し、適切に測定されるのに充分である。円状の動きは、こうして高分子のねじれにおける変化を決定するのに利用されうる。回転軌道または円弧に沿ったｘｙ座標の角座標への変換もまた、高分子のトルクの測定に利用されうる。注意すべきは、後者の場合、メインマグネットの回転と、サイドマグネットによる補助磁場は、前述のように、前記トルクを適用するために利用されるということである。
【００５５】
前記メインマグネットの磁気軸と前記連結点とは、約１０μｍ、好ましくは１μｍ、さらに好ましくは０．１μｍの限度内で一致する。
【００５６】
本実施形態において、円軌道の半径は、常磁性マーカーの半径のオーダーの最大値、および最小値ゼロを有するということが分かる。正確な値は、常磁性マーカーの表面上の、高分子が常磁性マーカーに取り付けられた位置に依存する。
【００５７】
本発明に従う方法の好ましい実施形態において、ステップｃ）およびｅ）は、放射線を放出する照明手段を用いて高分子−常磁性マーカー−アッセンブリを照明すること、常磁性マーカーおよび／または角度追跡マーカーにおける放出された放射線の透過、散乱、または反射を測定すること、ならびに常磁性マーカーおよび／または角度追跡マーカーとの放射線の相互作用に関するデータを画像化することを含む。
【００５８】
他の好ましい実施形態において、高分子−常磁性マーカー−アッセンブリは、中空のメインマグネットを通る照明手段によって照明される。この文脈における中空は、メインマグネットの一面から他面への通路が、前記照明の光学軸に沿って存在することを意味する。
【００５９】
有利には、メインマグネットにより高分子に適用される引張力は、少なくとも０．００１〜１０００ｐＮ、好ましくは０．０１〜１００ｐＮ、さらに好ましくは０．１〜１０ｐＮの範囲内である。５００ｐＮを超える非常に高い引張力は、アクチン繊維または微小管などのより堅い分子を測定するのに有益である。
【００６０】
本発明はまた上記の方法を実行するための装置に関する。前記装置は、
前記高分子を保持するための保持手段であって、前記保持手段は、高分子の少なくとも一端が連結される１以上の連結点を備え、前記連結点がｘｙ平面内に位置して、前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリが、前記ｘｙ平面に実質的に垂直に配置されたメインマグネットと前記保持手段の表面との間で、前記ｘｙ平面に垂直なｚ方向に実質的に配置されるようにするものである、前記保持手段、
前記高分子に力を適用するための磁場を生成するためのメインマグネットであって、前記メインマグネットは、その磁気軸に関して回転可能であり、前記保持手段から制御可能な距離に配置され、前記磁気軸は、前記保持手段のｘｙ平面に垂直に配置され、前記メインマグネットの極が、前記ｚ方向に配置され、前記メインマグネットが前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの位置において実質的に前記ｚ方向に向いた磁場を生成するものである、前記メインマグネット、
前記メインマグネットを回転させるための手段、
前記常磁性マーカーおよび／または角度追跡マーカーの位置に関連する情報を画像化するための画像化手段
を備える。
【００６１】
本発明に従うメインマグネットは、永久磁石でありえ、また電磁石であってもよい。上記で説明したように、常磁性マーカーが経験する力は、メインマグネットと保持手段との間のｚ方向の距離を変えることによって変えうる。電磁石は、メインマグネットを通過する電流の量を変化させることによって力を変化させることもできるというさらなる利点を有している。
【００６２】
本発明に従って、前記装置は、磁気軸に関してマグネットを回転させるための回転手段を備える。有利には、前記回転手段は、ｚ方向にメインマグネットを移動させるための移動手段も備える。
【００６３】
前述のトルクを測定するための装置は、メインマグネットの側面に取り付けられ、メインマグネットを回転させると、常磁性マーカーが設けられた高分子を回転させることができるサイドマグネットをさらに備える。
【００６４】
前記サイドマグネットは、メインマグネットとは独立して移動可能な永久磁石でありえ、または、前記サイドマグネットは、電磁石でありうる。これらの有利な状況の両方において、トルククランプと引張力の強さは別々に変動させることができる。
【００６５】
本発明の有利な実施形態において、サイドマグネットは、水平のｘ方向に広がる２つの相隔たるｘコイルと、水平のｙ方向に広がる２つの相隔たるｙコイルを備える、電磁石のアッセンブリ（つまり、ヘルムホルツコイル）からなり、前記電磁コイルは、電線を介して電流源によって電力を供給され、前記電磁コイルは、前記保持手段が前記電磁コイルの間の空間内に埋め込まれるように配置される。
【００６６】
電磁石と永久磁石との組み合わせを用いることによって、常磁性マーカーに適用されるトルクを引張力から切り離すことができ、常磁性マーカーの制御における更なる自由度を導入する。
【００６７】
ねじれを測定するための装置において、メインマグネットの磁気軸と保持手段の連結点とは、前記メインマグネットの磁気軸と連結点とが、約１０μｍ、好ましくは１μｍ、さらに好ましくは０．１μｍの限度内で一致するように相対的に配置されうる。
【００６８】
本発明に従う方法に対して記載された好ましい実施形態は、同様に装置に適用可能である。
【００６９】
有利には、前記装置は、高分子−常磁性マーカー−アッセンブリを照明するための光源をさらに備え、前記光源は、メインマグネットが前記光源と高分子−常磁性マーカー−アッセンブリとの間にあるように、ｚ方向において配置され、メインマグネットは、光源から放出される放射線がメインマグネットを通過して高分子−常磁性マーカー−アッセンブリに到達しうるように中空になっている。
【００７０】
有利な実施形態において、前記装置は、メインマグネットと保持手段との間の距離を変え、それによって高分子に適用される力を変化させるための移動手段（距離の増加に従い力が小さくなる）、および／または、ｘｙ平面において保持手段を移動させるためのステージ（ナノメートルのスケールで移動可能）をさらに備える。
【００７１】
好ましくは、保持手段は、流体が配置され得る内部チャンバを備え、前記内部チャンバは、照明手段によって放出される放射線を透過する少なくとも２つの壁を備え、前記壁は実質的に平行に配置され、前記透過壁の少なくとも１つは、高分子が連結される保持手段の少なくとも１つの表面に該当するものであり、それ故、高分子は内部チャンバ内に位置する。
【００７２】
一般に、画像化手段は、常磁性マーカーおよび／または角度追跡マーカーの位置を可視化するための光学的拡大手段、前記常磁性マーカーの位置を検出するための検出手段、および、前記情報を表示するための表示手段を備える。特定の実施形態では、検出器は、ＣＣＤカメラである。前記ＣＣＤカメラで提供される画像は、サブピクセル適合ステップを有する画像解析ルーチンに送られる。このようにして、ｘｙ平面における常磁性マーカーの位置は、約１ｎｍおよび約０．１°の分解能で決定されうる。典型的には、前記装置は、マーカーの位置および／または算出された特徴的特性を記録するための記録手段も備える。
【００７３】
特に好ましい実施形態では、保持手段は、常磁性マーカーの位置の基準点として、高分子が連結される保持手段の少なくとも１つの表面に取り付けられた１以上の基準要素を備える。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
本発明の各種態様が添付の図面を用いてさらに説明される。
【００７５】
【図１】図１は、本発明に従う、高分子のトルクを測定するための装置の図式的に表わされた実施形態を示す。
【図２】図２は、ねじれ的に緩和された高分子の位置を示す。
【図３】図３は、Ｎ回転後の高分子の位置を示す。
【図４】図４は、角度追跡マーカーが取り付けられた常磁性マーカーの位置の画像である。このアッセンブリは高分子に取り付けられている。画像は、常磁性マーカーの焦点面より約５μｍ上にある集束面で記録されている。
【図５】図５は、表面固定化ビーズ（上の信号）、従来の磁気ピンセットに保持されたＤＮＡ連結ビーズ（例えばUS2003/0166262 A1を参照）（真ん中の信号）、および本発明に従うＤＮＡ連結ビーズについての、ＣＣＤ画像の解析から得られた回転変動の軌跡間の比較である。
【図６】図６〜図９は、ｄｓＤＮＡのトルクの結果を示す。
【図７】図６〜図９は、ｄｓＤＮＡのトルクの結果を示す。
【図８】図６〜図９は、ｄｓＤＮＡのトルクの結果を示す。
【図９】図６〜図９は、ｄｓＤＮＡのトルクの結果を示す。
【図１０】図１０は、サイドマグネットとして電磁コイルを用いたトルクを測定するための実施形態を示す。
【図１１】図１１は、電磁コイルによる磁場の増加の関数としての（ｘ，ｙ）変動のプロットを示す。
【図１２】図１２は、本発明に従う高分子のねじれを測定するための装置の図式的に表された実施形態である。
【図１３】図１３は、連結された高分子の位置と、高分子に連結された常磁性マーカーの詳細を示す。
【図１４】図１４は、常磁性マーカーの熱変動を示す、図１０の実施形態を用いて測定された（ｘ，ｙ）変動のプロットを示す。
【図１５】図１５は、角度追跡マーカーの直接の追跡から決定された回転角度と、（ｘ，ｙ）平面における常磁性マーカーの位置から決定された回転角度との比較（ａ）、および、時間の関数としての常磁性マーカーが行った回転のプロット（ｂ、ｃ）を示す。図１５ｂは、図１４のＸ−Ｙ−プロットを角度へ変換することで得られる。
【図１６】図１６〜図１８は、ＤＮＡ上の組み換えタンパク質Ａ（ＲｅｃＡ）フィラメントのアッセンブリをモニタリングした結果を示す。
【図１７】図１６〜図１８は、ＤＮＡ上の組み換えタンパク質Ａ（ＲｅｃＡ）フィラメントのアッセンブリをモニタリングした結果を示す。
【図１８】図１６〜図１８は、ＤＮＡ上の組み換えタンパク質Ａ（ＲｅｃＡ）フィラメントのアッセンブリをモニタリングした結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
図１には、高分子の特徴的特性を測定するための装置１０が図式的に示されている。装置１０は、鉛直に配置されたメインマグネット１２を備える。メインマグネット１２は、底部にＳ極１４、上部にＮ極１６を有し、krotを低減させつつ力を適用するように設計されている。メインマグネット１２は、後に説明するように、照明の目的のために中央孔１８を画定している。それよりも小さなサイドマグネット１９は、トルクを適用するためのものであって、メインマグネット１２の極とは逆の極を有し、メインマグネット１２の円筒状の外壁に取り付けられて、試験対象の高分子のビーズの回転を可能にする。結果として生じる磁場を点線で表している（図２を参照）。マグネット１２および１９はフレーム２０に取り付けられており、フレーム２０は、モータ（図示せず）により回転および鉛直方向に移動しうる。メインマグネット１２の下に保持手段２２が配置される。保持手段２２は、ｘｙ平面内でナノメートルのスケールで移動させることができる。図示した実施形態では、保持手段２２はフローセル２４を備え、フローセル２４は、水密性のスペーサを用いて短い距離の間隔をあけて平行に配置された透明な顕微鏡のカバースライド２６（例えばガラス製）から作られている。底部スライド２６’の内側表面２８（図２および図３を参照）は、ニトロセルロースまたはポリスチレンなどの粘着剤で被覆されている。粘着性となった底部スライド２６の内側表面２８に対して、機械的なドリフトを補正するための１以上の非磁性の基準物２９（ここで、非磁性のラテックスビーズの直径は、例えば約３．０マイクロメートルである）が非特異的に取り付けられている。照明手段３０（例えば、１以上のＬＥＤ）および焦点レンズが該フレームに取り付けられ、中央孔１８と一直線に並んでいる。フローセル２４の下に、ＣＣＤカメラおよび／または光検出器などの画像化手段３２と、１００ｘの油浸対物レンズなどの適切な拡大手段３３が配置され、これらもまた、照明手段３０および中央孔１８と一直線に並んでいる。拡大手段３３の下には、圧電制御ナノメーターステージ４０が配置され、これにより、対物レンズの焦点平面のｚ方向の微調整が可能となる。画像化手段３２は、画像化手段３２からの信号を受信し、信号を解析し、特徴的特性を算出するためのコンピュータ３４に接続される。通常、信号およびデータは、コンピュータ３４のメモリ３６に記録される。コンピュータ３４には、受信した情報および算出した特徴を表示するためのスクリーン３８ならびにプリンタ（図示せず）が設けられている。
【００７７】
基準ビーズ２９は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ緩衝液）中での約３０分間の培養によりスライド２６’にランダムに取り付けることができる。
【００７８】
高分子３７には常磁性マーカー４０が設けられ、保持手段２２に連結される。例えば、ＤＮＡコンストラクトは、両端で官能性ＤＮＡ  ＰＣＲ断片（特には、複数のビオチン基を有する第１のＰＣＲ断片と、複数のジゴキシゲニン基を有する第２のＰＣＲ断片）に連結される。高分子を保持手段１８に取り付けるために、下側カバースライド２６の内側表面に抗ジゴキシゲニン部分を非特異的に取り付けることにより表面を官能化し、そこにジゴキシゲニン官能性の高分子のＰＣＲ断片を結合させる。次いで、内側表面２６’をＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ポリ−Ｌ−グルタミン酸またはカゼインなどのブロッキング剤と接触させることにより、該表面を不動態化させる。
【００７９】
ビオチンＰＣＲ断片は、常磁性マーカー（例えば、直径２．８マイクロメートルのストレプトアビジン被覆超常磁性ビーズＭ２７０（Invitrogenから入手可能））に連結される。連結の後、角度追跡マーカー（例えば、ビオチン標識化Fluosphere マイクロスフェア（同様にInvitrogenから入手可能）などの、１以上のそれより小さな非磁性ビーズ４２）を、マーカー−高分子アッセンブリのそれより大きな常磁性マーカー４０に取り付ける。取り付けは、これらのマイクロスフェアの予め定められた希釈溶液と共に充分な時間フローセルを培養することによって為される。典型的には、１つもしくは２つ、またはそれより多くのマイクロスフェアが、磁性ビーズに取り付けられる。これらの蛍光性マイクロスフェアは、視覚上の非対称性を該アッセンブリに与える。その非対称性は、ビーズの画像に同様の非対称性を与えて回転を追跡するのに充分なものである（図４を参照）。
【００８０】
より詳細には、より小さな角度追跡ビーズにより、以下のアルゴリズムを用いて、約０．１°の精度で、非焦点ＣＣＤ画像の相互関係分析（cross-relation analysis）を通じて位置および回転角度を追跡することが可能となる。常磁性ビーズおよび非対称性を示すより小さなマイクロスフェアの非焦点ＣＣＤ画像を得る。常磁性ビーズ画像の対称性の中心を位置追跡アルゴリズムにより決定する。この対称性の中心の回りで、非対称性を含む半径方向の区域を選択し、極変換を行う。非焦点画像およびそれ自身の鏡像を半径方向に平均化することにより、２つの角度シグネチャ（angular signature）が得られる。これらの角度シグネチャの相互相関により、対称性シフトを示す最大値が与えられる。サブピクセルフィッティングにより、角度フィットとして以前に決定された最大値の周囲での選択を用いて角度位置を決定することで、サブピクセル分解能での角度位置が得られる。
【００８１】
上記の構成を用いて、そのように連結された高分子を先ず、図２に示されるように、ねじれ的に緩和された状態（＝０回転）で画像化する。ＣＣＤ画像の解析から、ｘ、ｙおよびｚ方向におけるビーズの位置を決定する（Science 271: 1835-1837）。その後、回転するように配置されたマグネット１２および１９を、所定の方向（例えば、螺旋構造の二本鎖ＤＮＡの場合に、更に巻く方向（即ち、螺旋の方向）または巻き戻す方向（逆方向））に予め定められた回数Ｎだけ回転させる。図３を参照されたい。その後、ねじれ的に緊張した高分子に接続された常磁性マーカーを、僅かに非焦点化された方法で再び画像化する。図４を参照されたい。
【００８２】
図５は、ＣＣＤ画像の解析から得られた回転変動の軌跡を、表面取付ビーズ（上の信号およびヒストグラム）、従来の磁気ピンセットに保持されたＤＮＡ連結ビーズ（例えばUS2003/0166262 A1を参照）（真ん中の信号およびヒストグラム）、および本発明に従うＤＮＡ連結ビーズ（真ん中の信号およびヒストグラム）について比較したものである。伸張力は全ての軌跡について３ｐＮである。
【００８３】
図６〜図９は、ｄｓＤＮＡ（具体的には、８キロ塩基対（ｋｂｐ）のＤＮＡ分子）について、ＰＢＳ緩衝液中、３．５ｐＮの伸張力でのトルク測定結果を示す。図６は、ねじれ的に緩和されたＤＮＡ（開始位置＝０回転）およびＮ＝４０回転について、ＤＮＡ連結ビーズの角度変動のガウス分布を示す。ＤＮＡによる復元トルクに起因する分布中心のシフトが見られる。図７は、角度分布の幅、従ってトラップ剛性がＤＮＡによるトルクの範囲について一定であることを示す。図８は、回転数の関数としての平均角度（左のＹ軸）を示し、これは、式krot = kBT/(δθ2)およびTMacromolecule = krot (θ-θ0)を用いて、トルクに直接変換することができる（右のＹ軸）。座屈トルクは、図８中の正の回転におけるトルク対回転数のデータのプラトーから決定できる。力の関数としてのＤＮＡのねじれ持続長Ｃは、弾性ねじれレジームにおけるこれらのデータの線形適合から決定できる。図９は、連結されたＤＮＡの伸長を示す。
【００８４】
当該装置を用いて、単一の高分子を更に巻きおよび巻き戻しながら、高分子連結物の伸長およびトルク応答を決定する。ねじれ的に緩和された分子（０回転）から開始すると、ＤＮＡは当初、等方性の柔軟なロッドのように振る舞う。分子に対して正の回転が付加されるとき、その伸長はほぼ一定のままであり、平均角度信号におけるシフトは、回転数の増加につれて直線的に減少する。小さい角度変位の範囲では、ねじれトラップの剛性は適用される回転数に依存しないため、このことは、ねじれ歪みは分子内で直線的に増大することを示す。Ｎ回転後のトルクT(N)は2πNkBTC/Lc（式中、CおよびLcはそれぞれ、ＤＮＡのねじれ持続長および輪郭長である）に等しいため、Ｃはトルク応答の直線の傾きから直接的に決定される（Ｌは、独立したＤＮＡ伸張実験から決定される）。分子が倒れて絡み合った超らせん（plectonemic supercoils）を形成する臨界ねじれ密度に達するまで、正の回転が更に付加されるにつれてねじれ歪みの増大が続く。この遷移を超えると、分子におけるトルクはTb（座屈トルク）で一定となり、更なる回転は、伸長の急速な減少に関連する絡み合った超らせんの蓄積に繋がる。負の回転がねじれ的に緩和されたＤＮＡに適用された場合、同様に、ＤＮＡは当初、等方性のロッドのように振る舞い、正の回転での状況と比較して逆の符号を有する復元トルクを発揮する。１ｐＮ以上の張力下で、巻き戻すときにＤＮＡは倒れず（分子の伸長はおおよそ一定となる）、代わりに、分子は局所的に変性する。該当する変性トルクTdenat = -10 ± 1 pN.nm。
【００８５】
伸張力Ｆの関数として座屈トルクTbおよびねじれ持続長Ｃを決定するための体系的なトルク応答測定を単一のＤＮＡに対して行った。Ｆの増加に伴い、体系的にTbは増加する。ＤＮＡの弾性の単純なモデルでは、Tb = (2kBTLpF)1/2（式中、Lpは、独立した伸張実験から決定される曲げ持続長である）と予測される。
【００８６】
回転数の関数としてのトルクの線形適合から導出されたＤＮＡの有効ねじり剛性Ｃは、有意なＦ依存性を示している。
【００８７】
本発明に従う方法および装置を用いたトルクの直接測定は、ＤＮＡ−タンパクフィラメントなどの複雑な構造のねじれ特性を調べることもできるという利点を有する。ＲｅｃＡへテロ二本鎖を試験した。ＲｅｃＡへテロ二本鎖は、生存細胞内においては、ＲｅｃＡ被覆一本鎖ＤＮＡによる二本鎖ＤＮＡのストランド侵入の産物である。リコンビナーゼＲｅｃＡのフィラメントは、相同的組換えによるＤＮＡ修復経路において中心的役割を果たしている。
【００８８】
ATP-γSの存在下、ねじれ的に束縛されたＤＮＡ上にＲｅｃＡをアッセンブルさせた。ねじれ的に緩和された状態でＲｅｃＡフィラメントを完全にアセンブルさせるために、マグネットの回転を用いた。緩和されたヘテロ二本鎖のシフトは、裸の状態に対して−３３０回転であった。これは、ＲｅｃＡの結合で１ｂｐあたり１５°の巻き戻しが観察されたことを考慮して、７．９ｋｂｐのＤＮＡコンストラクトのＲｅｃＡでの完全な被覆として予測したものである。伸長およびトルクの両方を測定しながら、ＲｅｃＡへテロ二本鎖を更に巻きまたは巻き戻した。トルクの初期の増大の適合からCRecAが得られる。CRecAは、同じ力での裸の状態のＤＮＡのそれよりも１．８倍大きかった。
【００８９】
図１０は、本発明の代替的な実施形態を示す。高分子のトルクを測定するための装置には、サイドマグネット１９として、電磁コイル５１、５２のアッセンブリが備えられている。左の図は、そのようなアッセンブリの側面図を示し、右の図は、アッセンブリの概略的な平面図を描いている。アッセンブリは２つの相隔てられたｘコイル５１と、２つの相隔てられたｙコイル５２とからなる。特定の実施形態において、２つのｙコイル間の距離は約１０ｃｍであり、ｘコイル間の距離は約５ｃｍである。注意すべきは、これらの寸法は、自由に調整可能であり、決して本発明の範囲を限定するものではないということである。右図に見られるように、電磁コイル５１、５２は、電線５４を介して任意の適切な電源（例えば、交流電源）によって電力を供給される。
【００９０】
電磁コイル５１、５２は、フローセル２２が電磁コイル５１、５２の間の空間に埋め込まれるように配置される。
【００９１】
サイドマグネット１９として電磁コイル５１、５２を用いることによって、フローセル２２に平行な平面においてのみ、均一な場を作ることができる。トルクを適用するために用いられるこの場は、メインマグネット１２による上方への引張力とは独立して別に制御することができる。電磁コイル５１、５２の組合せおよび永久磁石を用いることで、常磁性マーカー４０に適用されるトルクをメインマグネット１２の引張力から切り離すことができ、それにより、常磁性マーカー４０の制御における更なる自由度を導入できる。
【００９２】
図１１は、メインマグネット１２の一定の引張力の下で、電磁コイル５１、５２の磁場強度の増加の下での常磁性マーカー４０の変動の幾つかのプロットを示す。電磁コイルがオフのとき、角度変動はほぼ円軌道上にある。電磁コイル５１、５２を作動させると、電磁コイル５１、５２による磁場の増加につれて角度変動の束縛はますます大きくなる。電磁コイル５１、５２を用いる利点は、これらのコイルによる場が、コイルに流れる電流を単純に調整することにより（つまり、ノブを回して）調整され得るということである。永久のサイドマグネット１９で同じプロットを得ようとすると、再現可能な方法で、サイドマグネットと常磁性マーカー４０との間の距離を調整する必要があるであろう。
【００９３】
図１２は、高分子のねじれを測定するための方法および装置の一実施形態を示す図である。図１から図３と同様の部分は、同じ参照符号で示されている。高分子のねじれを測定するための装置１０は、鉛直に配置された環状のメインマグネット１２を備える。メインマグネット１２は、底部にＳ極１４、上部にＮ極１６を有する。こうしてメインマグネット１２は中央孔１８を画定する。先に示したトルク測定装置とは異なり、この実施形態は、より小さなサイドマグネット１９を欠いている。結果として生じる磁場を、図１３の左部分に点線で表している。メインマグネット１２はフレーム２０に取り付けられており、フレーム２０は、モータ（図示せず）により回転および鉛直方向に移動しうる。メインマグネット１２の下には保持手段２２が配置される。保持手段２２は、ｘｙ平面内をナノメートルのスケールで移動させることができる。図示された実施形態では、保持手段２２はフローセル２４を備え、フローセル２４は、スペーサを用いて短い距離の間隔をあけて平行に配置された透明な顕微鏡のカバースライド２６（例えばガラス製）から作られている。底部スライド２６’の内側表面２８（図２および図３を参照）は、ニトロセルロースで被覆されている。底部スライド２６’の内側表面２８に対して、機械的なドリフトを補正するための１以上の非磁性基準物２９（ここで、非磁性のラテックスビーズの直径は、例えば約３．０マイクロメートルである）が取り付けられている。照明手段３０（例えば、１以上のＬＥＤ）が該フレームに取り付けられ、中央孔１８と一直線に並んでいる。フローセル２４の下に、ＣＣＤカメラなどの画像化手段３２と、１００ｘの油浸対物レンズなどの適切な拡大手段３３が配置され、これらもまた、照明手段３０および中央孔１８と一直線に並んでいる。拡大手段３３の下には、圧電制御ナノメーターステージ４０が配置され、これにより、対物レンズの焦点平面のｚ方向の微調整が可能となる。画像化手段３２は、画像化手段３２からの信号を受信し、信号を解析し、特徴的特性を算出するためのコンピュータ３４に接続される。通常、信号とデータは、コンピュータ３４のメモリ３６に記録される。コンピュータ３４には、受信した情報および算出した特徴を表示するためのスクリーン３８とプリンタ（図示せず）が設けられている。
【００９４】
基準ビーズ２９は、ＰＢＳ緩衝液中での約３０分間の培養によりスライド２６’にランダムに取り付けることができる。
【００９５】
高分子３７には常磁性マーカー４０が設けられ、保持手段２２に連結される。例えば、ＤＮＡコンストラクトは、両端で官能性ＤＮＡ  ＰＣＲ断片（特には、複数のビオチン基を有する第１のＰＣＲ断片と、複数のジゴキシゲニン基を有する第２のＰＣＲ断片）に連結される。高分子を保持手段２２に取り付けるために、下側カバースライド２６’の内側表面を抗ジゴキシゲニンで官能化することにより表面を調製し、そこにジゴキシゲニン官能性の高分子のＰＣＲ断片を結合させる。ビオチンＰＣＲ断片は、常磁性マーカー（例えば、直径２．８マイクロメートルのストレプトアビジン被覆超常磁性ビーズＭ２７０（Invitrogenから入手可能））に連結される。
【００９６】
ねじれを決定するために、連結された分子は、その主軸がマグネット１２の長手軸に一致するように配置される。このようにして、常磁性マーカーは、連結点の回りで円運動をし、それによって連結点の回りで円軌道をたどる。この円運動は、高分子のねじれに変化をもたらす熱変動と、その結果の常磁性マーカーの応答とによって起こる。ｘｙ平面内のほぼゼロ磁場であるこの特定の測定位置において、常磁性マーカーの円運動は、上述の通り、連結点に関する回転と一致する。図１３の右側を参照されたい。円形のメインマグネット１２の主にｚ方向に揃った場を破線で表している。マグネットは、主にｚ方向に揃った場で使用される。常磁性マーカー４０の好ましい磁化軸m0は、鉛直の磁場と一直線に並び、常磁性マーカー４０はｚ軸の回りを自由に回転しうる。
【００９７】
図１４は、ねじれ構造において測定された常磁性マーカー４０の（ｘ，ｙ）変動のプロットを示す。つまり、連結された分子は、ゼロの位置において、その主軸がマグネット１２の長手軸と一致するように配置されている。この状況では、常磁性マーカーの回転に対するメインマグネットからの束縛はないため、前記マーカーは円上での熱変動を起こす。この円は、該プロット中に示される。これらの熱変動は角度に変換することができる。該角度は、高分子のねじれの変化に関連し得る。
【００９８】
図１５は、中央に位置合わせされた円筒形のマグネット１２の下での、連結された１．４μｍの半径の常磁性マーカー４０のｘ、ｙ変動を示す。０．５μｍの半径の角度追跡マーカー４２は、連結された常磁性マーカー４０に取り付けられ、回転を検出するための基準マーカーとして機能する。全ての（ｘ，ｙ）位置を灰色で示している。軌跡（黒色の軌跡で示される）の区域からの選択されたフレームについて、対応するＣＣＤカメラ画像を示している。常磁性マーカー４０の位置のｘ、ｙおよびｚの追跡を容易にするために、常磁性マーカー４０の画像は焦点を〜４μｍ外したものであった。画像から、ビーズの回転（小さいマーカービーズの相対的な位置から追跡可能）と、ｘ、ｙ平面内の円環上の常磁性マーカー４０の位置との間に一定の関係があることが明らかである。角度追跡マーカー４２の位置は、常磁性マーカー４０の円環上の位置と同期して回転しており、動径ベクトルから反時計方向に〜５°の角度を維持している。角度追跡マーカー４２の位置（灰色）および（ｘ，ｙ）平面内の位置（黒）から決定される常磁性マーカー４０の回転角度のプロットも示している。両プロットは非常によく一致し、区別ができない。図１５（ｃ）は、最初の３秒に焦点を当てた、（ｂ）の軌跡の拡大を示す。灰色と黒色の軌跡は明らかに別個のものであるが、互いに近接した軌跡を描いている。
【００９９】
図１６〜図１８は、７．９ｋｂｐのＤＮＡ１０１上への組み換えタンパク質Ａ（ＲｅｃＡ）フィラメント１０２のアッセンブリのモニタリングによる、ＤＮＡ連結物のねじれにおける動的な変化をモニタリングするためのねじれ構造の能力の一例である。ＲｅｃＡおよび非加水分解性のＡＴＰ類似体であるATP-γSを添加すると、ねじれ構造中に保持された直径１．４μｍの常磁性マーカー４０は螺旋状の軌跡を描き、これは、ＤＮＡ連結物が巻き戻されながら長くなっていることを示す（図１６）。灰色の値は経過時間を示す。螺旋状の軌跡は、ｔ＝０秒においてｚ〜０で開始し、１０００秒後にｚ〜μｍで終了した。図１７および図１８は、６．５ｐＮの引張力の下でのＲ＝１．４μｍの常磁性マーカー４０（Ｂ）、および、１．５ｐＮの引張力の下でのＲ＝０．５μｍの常磁性マーカー（Ｒ）について、時間の関数として回転角度θ（図１７）および高さｚ（図１８）をモニタリングすることによって、どのように、完了までヘテロ二本鎖のアッセンブリが追跡されうるかを示す。７．９ｋｂｐのＤＮＡ１０１の、−３２８±１０回転までの総巻き戻しと、４．１±０．１μｍまでの伸長が観察される。
【図１】
2013532288.tif 000003
【図２】
2013532288.tif 000004
【図３】
2013532288.tif 000005
【図５】
2013532288.tif 000006
【図６】
2013532288.tif 000007
【図７】
2013532288.tif 000008
【図８】
2013532288.tif 000009
【図９】
2013532288.tif 000010
【図１８】
2013532288.tif 000011
【図４】
2013532288.tif 000012
【図１０】
2013532288.tif 000013
【図１１】
2013532288.tif 000014
【図１２】
2013532288.tif 000015
【図１３】
2013532288.tif 000016
【図１４】
2013532288.tif 000017
【図１５】
2013532288.tif 000018
【図１６】
2013532288.tif 000019
【図１７】
2013532288.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成24年8月28日(2012.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子（３７）の１以上の特徴的特性を決定する方法であって、前記方法は、
ａ）前記高分子（３７）の第一端に常磁性マーカー（４０）を設け、それによって高分子−常磁性マーカー−アッセンブリを形成するステップ、
ｂ）前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの前記高分子（３７）の少なくとも一つの他端を、前記高分子（３７）の前記他端を保持するための保持手段（２２）の一以上の連結点に連結するステップであって、前記連結点がｘｙ平面内に位置して、前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリが、前記ｘｙ平面に実質的に垂直に配置されたメインマグネット（１２）と前記保持手段（２２）の表面との間で、前記ｘｙ平面に垂直なｚ方向に実質的に配置されるようにし、前記メインマグネット（１２）の極（１４、１６）がｚ方向に沿って配置され、前記メインマグネット（１２）が、前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの位置において実質的にｚ方向に向いた磁場を生成する前記ステップ、
ｃ）前記メインマグネット（１２）によって生成された磁場中における前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの前記常磁性マーカー（４０）の開始位置を決定するステップ、
ｄ）前記メインマグネット（１２）をその磁気軸に関して回転させ、それによって、前記常磁性マーカー（４０）を、測定位置まで、前記メインマグネット（１２）の前記磁気軸に関して回転させるステップ、
ｅ）前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの前記常磁性マーカー（４０）の前記測定位置を決定するステップ、および
ｆ）前記測定位置から１以上の特徴的特性を算出するステップ
を含み、ステップａ）において、前記常磁性マーカー（４０）は、前記高分子（３７）に直接的に取り付けられており、ステップｃ）の前に、サイドマグネット（１９）を用いて補助磁場が生成される、方法。
【請求項２】
前記特徴的特性がトルクであり、前記常磁性マーカー（４０）に角度追跡マーカー（４２）が設けられ、該角度追跡マーカー（４２）によって、ステップｅ）における前記開始位置に対する前記測定位置の、前記ｘｙ平面における前記常磁性マーカー（４０）の位置の角度変位の決定が可能になる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイドマグネット（１９）の極（１４、１６）が前記メインマグネット（１２）の極（１４、１６）に対して逆向きとなるように、前記サイドマグネット（１９）が、前記メインマグネット（１２）に隣接して配置される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記サイドマグネット（１９）が、水平のｘ方向に広がる２つの相隔たるｘコイル（５１）と、水平のｙ方向に広がる２つの相隔たるｙコイル（５２）を備える電磁コイル（５１、５２）のアッセンブリであり、前記電磁コイル（５１、５２）は、電線（５４）を介して電流源（５３）によって電力を供給され、前記電磁コイル（５１、５２）は、前記保持手段（２２）が前記電磁コイル（５１、５２）によって囲まれた空間内に埋め込まれるように配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記メインマグネット（１２）の磁力と前記サイドマグネット（１９）の磁力との強さの比が、10000:1〜10:1の範囲内である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）において、前記連結点が、前記メインマグネット（１２）の磁気軸と位置合わせされ、前記特徴的特性がねじれである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記メインマグネット（１２）の前記磁気軸と、前記保持手段（２２）の前記連結点が一致するように、前記メインマグネット（１２）と前記連結点が相対的に配置されうる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記メインマグネット（１２）の前記磁気軸と前記連結点が、０．１μｍの限度内で一致している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの、前記常磁性マーカー（４０）および／または角度追跡マーカー（４２）が１以上の可視化要素を備え、前記１以上の可視化要素が前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの回転を可視化する手段として用いられる、先行する請求項の１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記高分子（３７）が、ポリヌクレオチド部分、または、１以上のタンパク質部分と複合したポリヌクレオチド部分である、先行する請求項の１つに記載の方法。
【請求項１１】
先行する請求項の１つに記載の方法を行うための装置（１０）であって、前記装置（１０）は、
前記高分子（３７）を保持するための保持手段（２２）であって、前記保持手段（２２）は、高分子（３７）の少なくとも一端が連結される１以上の連結点を備え、前記連結点がｘｙ平面内に位置して、前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリが、前記ｘｙ平面に実質的に垂直に配置されたメインマグネット（１２）と前記保持手段（２２）の表面との間で、前記ｘｙ平面に垂直なｚ方向に実質的に配置されるようにするものである、前記保持手段（２２）、
前記高分子（３７）に力を適用するための磁場を生成するためのメインマグネット（１２）であって、前記メインマグネット（１２）は、その磁気軸に関して回転可能であり、前記保持手段（２２）から制御可能な距離に配置され、前記磁気軸は、前記保持手段（２２）のｘｙ平面に垂直に配置され、前記メインマグネット（１２）の極（１４、１６）が、前記ｚ方向に配置され、前記メインマグネット（１２）が前記高分子−常磁性マーカー−アッセンブリの位置において実質的に前記ｚ方向に向いた磁場を生成するものである、前記メインマグネット（１２）、
前記メインマグネット（１２）を回転させるための手段、
前記常磁性マーカー（４０）および／または角度追跡マーカー（４２）の位置に関連する情報を画像化するための画像化手段（３２）
を備え、前記メインマグネット（１２）を回転させると、常磁性マーカー（４０）が設けられた前記高分子（３７）を回転させることができるサイドマグネット（１９）をさらに備える装置（１０）。
【請求項１２】
前記サイドマグネット（１９）が、前記メインマグネット（１２）の側面に取り付けられた永久磁石である、請求項１１に記載の装置（１０）。
【請求項１３】
前記サイドマグネット（１９）が、水平のｘ方向に広がる２つの相隔たるｘコイル（５１）と、水平のｙ方向に広がる２つの相隔たるｙコイル（５２）を備える電磁コイル（５１、５２）のアッセンブリであり、前記電磁コイル（５１、５２）は、電線（５４）を介して電流源（５３）によって電力を供給され、前記電磁コイル（５１、５２）は、前記保持手段（２２）が前記電磁コイル（５１、５２）によって囲まれた空間内に埋め込まれるように配置されるものである、請求項１２に記載の装置（１０）。
【請求項１４】
前記メインマグネット（１２）の磁力と前記サイドマグネット（１９）の磁力の強さの比が、10000:1〜10:1の範囲内である請求項１１から１３のいずれかに記載の装置（１０）。
【請求項１５】
前記メインマグネット（１２）の前記磁気軸と、前記保持手段（２２）の前記連結点が好ましくは、０．１μｍの限度内で一致するように、前記メインマグネット（１２）と前記連結点が相対的に配置されうる、請求項１１に記載の装置（１０）。
【国際調査報告】
2013532288.tif 000021
2013532288.tif 000022
2013532288.tif 000023