(57)【要約】哺乳類様複合Ｎ−グリカンを含有するかまたは哺乳類グリコシル化経路中の中間体を含有する標的分子を生成するために有用な方法および遺伝子工学的に改変された真菌細胞が、本明細書に記載される。一実施形態において、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成できる真菌細胞を生成する方法が提供され、この方法は、ａ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された真菌細胞を提供するステップと、ｂ）該細胞に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩをコードする核酸を導入するステップとを含む。
2013511272.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成できる真菌細胞を生成する方法であって、該方法は、
ａ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された真菌細胞を提供するステップと、
ｂ）該細胞に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩをコードする核酸を導入するステップであって、ここで、該核酸が、コードされた該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを細胞内区画に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該真菌細胞における該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの発現が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するステップと
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、前記細胞に、標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップをさらに含み、ここで、該細胞が、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むように改変された該標的タンパク質を生成する、方法。
【請求項３】
前記標的タンパク質が、Ｆｃ受容体と結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的タンパク質が、抗体またはその断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記標的タンパク質が、治療用の糖タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記標的タンパク質が、インターフェロン−β、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンγまたはエリスロポエチンである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞内区画が、ゴルジ装置である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、ここで、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された前記真菌細胞が、ＯＣＨ１活性を欠損し、α−１，２−マンノシダーゼをコードする核酸を含み、ここで、該α−１，２−マンノシダーゼをコードする該核酸が、コードされた該α−１，２−マンノシダーゼを小胞体に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項９】
前記ターゲティング配列が、ＨＤＥＬ配列である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記真菌細胞が、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、前記細胞に、マンノシダーゼＩＩをコードする核酸を導入するステップであって、ここで、該マンノシダーゼＩＩをコードする該核酸が、コードされた該マンノシダーゼＩＩをゴルジ装置に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該真菌細胞における該マンノシダーゼＩＩの発現が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するステップをさらに含む、方法。
【請求項１２】
請求項１または請求項１１に記載の方法であって、該方法は、前記細胞に、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸を導入するステップであって、ここで、該ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする該核酸が、コードされた該ガラクトシルトランスフェラーゼをゴルジ装置に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、該真菌細胞における該ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するステップをさらに含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、該方法は、前記細胞に、標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップであって、ここで、該細胞が、前記ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むように改変された該標的タンパク質を生成するステップをさらに含む、方法。
【請求項１４】
前記ガラクトシルトランスフェラーゼが、ＵＤＰ−Ｇｌｃ−４−エピメラーゼと、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩの触媒ドメインとの融合体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むように改変された前記標的タンパク質を単離するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含む標的タンパク質を生成する方法であって、該方法は、
ａ）ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、α−１，２−マンノシダーゼと、マンノシダーゼＩＩとをコードする核酸を含むように遺伝子工学的に改変された真菌細胞を提供するステップであって、ここで、該核酸が、それぞれのコードされたタンパク質を細胞内区画に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該真菌細胞が、ＯＣＨ１活性を欠損しているステップと、
ｂ）該細胞に、標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップであって、ここで、該細胞が、該ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含む該標的タンパク質を生成するステップと
を含む方法。
【請求項１７】
前記真菌細胞が、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記α−１，２−マンノシダーゼをコードする前記核酸が、コードされた該α−１，２−マンノシダーゼを小胞体に向かわせるための小胞体ターゲティング配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ターゲティング配列が、ＨＤＥＬ配列である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩおよび前記マンノシダーゼＩＩをコードする前記核酸が、コードされた該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩおよびマンノシダーゼＩＩをゴルジ装置に向かわせるためのゴルジターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的タンパク質が、Ｆｃ受容体と結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的タンパク質が、抗体またはその断片である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的タンパク質が、治療用の糖タンパク質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的タンパク質が、インターフェロン−β、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンγまたはエリスロポエチンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞に、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸を導入するステップをさらに含む請求項１６に記載の方法であって、ここで、該ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする該核酸が、コードされた該ガラクトシルトランスフェラーゼをゴルジ装置に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで該真菌細胞における該ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むように改変された前記標的タンパク質を生成する、方法。
【請求項２６】
前記ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むように改変された前記標的タンパク質を単離するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成できる真菌細胞を作製する方法であって、該方法は、
ａ）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された真菌細胞を提供するステップと、
ｂ）該細胞に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩをコードする核酸を導入するステップであって、ここで、該核酸が、コードされた該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを細胞内区画に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該真菌細胞における該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの発現が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するステップと
を含む方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、該方法は、前記細胞に、標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップであって、ここで、該細胞が、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むように改変された該標的タンパク質を生成するをさらに含む、方法。
【請求項２９】
前記標的タンパク質が、Ｆｃ受容体と結合する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的タンパク質が、抗体またはその断片である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的タンパク質が、治療用の糖タンパク質である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的タンパク質が、インターフェロン−β、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンγまたはエリスロポエチンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞内区画が、ゴルジ装置である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２７に記載の方法であって、ここで、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された前記真菌細胞が、ＡＬＧ３活性を欠損し、α−１，２−マンノシダーゼをコードする核酸を含み、該核酸が、コードされた該α−１，２−マンノシダーゼを小胞体に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項３５】
Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された前記真菌細胞が、ＯＣＨ１活性をさらに欠損する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された前記真菌細胞が、α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含む、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼが、ＡＬＧ６である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記真菌細胞が、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項２７に記載の方法であって、該方法は、前記細胞に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩをコードする核酸を導入するステップであって、ここで、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩをコードする該核酸が、コードされた該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩを細胞内区画に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該真菌細胞における該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩの発現が、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するステップをさらに含む、方法。
【請求項４０】
請求項２７または請求項３９に記載の方法であって、該方法は、前記細胞に、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸を導入するステップであって、、ここで、該ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする該核酸が、コードされた該ガラクトシルトランスフェラーゼをゴルジ装置に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該真菌細胞における該ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するステップをさらに含む、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、該方法は、前記細胞に、標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップであって、ここで、該細胞が、前記ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むように改変された該標的タンパク質を生成するステップをさらに含む、方法。
【請求項４２】
前記ガラクトシルトランスフェラーゼが、ＵＤＰ−Ｇｌｃ−４−エピメラーゼと、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩの触媒ドメインとの融合体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
請求項４０に記載の方法であって、該方法は、前記細胞に、グルコシダーゼＩＩのαおよびβサブユニットをコードする核酸を導入するステップであって、ここで、該真菌細胞における該グルコシダーゼＩＩの該αおよびβサブユニットの発現が、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するステップをさらに含む、方法。
【請求項４４】
Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含む標的タンパク質を生成する方法であって、該方法は、
ａ）ＡＬＧ３活性を欠損するように遺伝子工学的に改変され、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩと、ガラクトシルトランスフェラーゼとをコードする核酸を含む真菌細胞を提供するステップであって、ここで、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩと、該ガラクトシルトランスフェラーゼとをコードする該核酸が、それぞれのコードされたタンパク質を細胞内区画に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含むステップと、
ｂ）該細胞に、標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップであって、ここで、該細胞が、該Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含む該標的タンパク質を生成するステップと
を含む方法。
【請求項４５】
前記真菌細胞が、ＯＣＨ１活性をさらに欠損する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記真菌細胞が、α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼをコードする前記核酸が、ＡＬＧ６である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項４４、請求項４５または請求項４６に記載の方法であって、ここで、前記真菌細胞が、グルコシダーゼＩＩのαおよびβサブユニットをコードする核酸をさらに含み、ここで、該真菌細胞における該グルコシダーゼＩＩの該αおよびβサブユニットの発現が、前記Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含む前記標的タンパク質を生成する、方法。
【請求項４９】
ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された単離真菌細胞であって、ここで、ＯＣＨ１活性を欠損し、α−１，２−マンノシダーゼと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、マンノシダーゼＩＩとをコードする核酸を含み、ここで、該α−１，２−マンノシダーゼと、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、該マンノシダーゼＩＩとをコードする該核酸が、それぞれのコードされたタンパク質を細胞内区画に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該真菌細胞における該α−１，２−マンノシダーゼ、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩおよび該マンノシダーゼＩＩの発現が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成する、単離真菌細胞。
【請求項５０】
前記遺伝子工学的に改変された真菌細胞が、標的タンパク質をコードする核酸をさらに含み、ここで、該細胞が、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むように改変された該標的タンパク質を生成する、請求項４９に記載の真菌細胞。
【請求項５１】
請求項４９または請求項５０に記載の真菌細胞であって、ここで、前記遺伝子工学的に改変された真菌細胞が、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩをコードする核酸をさらに含み、ここで、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩをコードする該核酸が、コードされた該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩを細胞内区画に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該真菌細胞における該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩの発現が、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成する、真菌細胞。
【請求項５２】
請求項５１に記載の真菌細胞であって、該真菌細胞は、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含み、ここで、該ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする該核酸が、コードされた該ガラクトシルトランスフェラーゼをゴルジ装置に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該真菌細胞における該ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成する、真菌細胞。
【請求項５３】
ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された単離真菌細胞であって、ここで、該真菌細胞は、ＡＬＧ３活性を欠損するように遺伝子工学的に改変され、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩとＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩとをコードする核酸を含み、ここで、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩとをコードする該核酸が、それぞれのコードされたタンパク質を細胞内区画に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該真菌細胞における該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩおよび該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩの発現が、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成する、単離真菌細胞。
【請求項５４】
前記遺伝子工学的に改変された真菌細胞が、ＯＣＨ１活性をさらに欠損する、請求項５３に記載の真菌細胞。
【請求項５５】
前記遺伝子工学的に改変された真菌細胞が、α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含む、請求項５３または請求項５４に記載の真菌細胞。
【請求項５６】
請求項５３、請求項５４または請求項５５に記載の真菌細胞であって、ここで、前記遺伝子工学的に改変された真菌細胞が、標的タンパク質をコードする核酸をさらに含み、ここで、該細胞が、前記ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むように改変された該標的タンパク質を生成する、真菌細胞。
【請求項５７】
請求項５３から５６のいずれか一項に記載の真菌細胞であって、該真菌細胞は、グルコシダーゼＩＩのαおよびβサブユニットをコードする核酸をさらに含み、ここで、該真菌細胞における該グルコシダーゼＩＩの該αおよびβサブユニットの発現が、前記ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含む前記タンパク質を生成する、真菌細胞。
【請求項５８】
請求項５７に記載の真菌細胞であって、該真菌細胞は、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含み、ここで、該ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする該核酸が、コードされた該ガラクトシルトランスフェラーゼをゴルジ装置に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該真菌細胞における該ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成する、真菌細胞。
【請求項５９】
相当数のＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞が、Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変されているＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞の実質的に純粋な培養物であって、ここで、該細胞が、ＡＬＧ３活性を欠損するように遺伝子工学的に改変され、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩと、ガラクトシルトランスフェラーゼとをコードする核酸を含み、ここで、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩと、該ガラクトシルトランスフェラーゼとをコードする該核酸が、それぞれのコードされたタンパク質を細胞内区画に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該細胞における該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩおよび該ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成する、実質的に純粋な培養物。
【請求項６０】
前記細胞が、ＯＣＨ１活性をさらに欠損する、請求項４９に記載の実質的に純粋な培養物。
【請求項６１】
前記細胞が、α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含む、請求項５９または請求項６０に記載の実質的に純粋な培養物。
【請求項６２】
前記細胞が、グルコシダーゼＩＩのαおよびβサブユニットをコードする核酸をさらに含み、ここで、該真菌細胞における該グルコシダーゼＩＩの該αおよびβサブユニットの発現が、前記Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含む前記標的タンパク質を生成する、請求項５９、請求項６０または請求項６１に記載の実質的に純粋な培養物。
【請求項６３】
相当数のＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞が、Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変されているＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞の実質的に純粋な培養物であって、ここで、該細胞が、ＯＣＨ１活性を欠損するように遺伝子工学的に改変され、α−１，２−マンノシダーゼと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、マンノシダーゼＩＩと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩと、ガラクトシルトランスフェラーゼとをコードする核酸を含み、ここで、該α−１，２−マンノシダーゼと、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、該マンノシダーゼＩＩと、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩと、該ガラクトシルトランスフェラーゼとをコードする該核酸が、それぞれのコードされたタンパク質を細胞内区画に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該細胞における該α−１，２−マンノシダーゼ、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ、該マンノシダーゼＩＩ、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩおよびガラクトシルトランスフェラーゼの発現が、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成する、実質的に純粋な培養物。
【請求項６４】
糖タンパク質を含む組成物であって、該糖タンパク質上のＮ−グリカンの少なくとも５０％が、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンである組成物。
【請求項６５】
前記糖タンパク質上のＮ−グリカンの少なくとも７０％が、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンである、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記糖タンパク質上のＮ−グリカンの少なくとも８５％が、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンである、請求項６４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
この出願は、２００９年１１月１９日に出願された米国出願第６１／２６２，８２８号に対する優先権を主張する。この前の出願の開示は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、真菌細胞において糖タンパク質を生成するための方法および材料、より具体的には、真菌細胞を遺伝子工学的に改変して、哺乳類様複合Ｎ−グリカンを含有するタンパク質または哺乳類グリコシル化経路内の中間体を含有するタンパク質を生成することに関する。
【背景技術】
【０００３】
現在開発中のほとんどの生物製剤（例えば組換えタンパク質）を生成するために、高性能の発現系が要求される。これらの生物製剤の多くの生物活性は、それらの翻訳後修飾（例えばリン酸化またはグリコシル化）に依存する。酵母ベースの発現系は、微生物の遺伝子操作および発酵の容易さを、タンパク質を分泌し、修飾する能力と組み合わせる。しかし、酵母細胞で生成される組換え糖タンパク質は、主に不均質な高マンノースおよび過マンノースグリカン構造を示し、これはタンパク質機能、下流のプロセシングおよび後続の治療のための使用にとって、特にグリコシル化が生物学的に重要な役割を演じる場合に有害であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書で記載する方法および遺伝子工学的に改変された真菌細胞は、哺乳類様Ｎ−グリカンを含有するかまたは哺乳類（例えばヒト）グリコシル化経路内の中間体を含有する標的分子（例えば標的タンパク質）を生成するために用いることができる。このような工学的に改変された細胞から単離された標的分子は、抗体生成、サイトカイン生成を含む生物製剤の用途、およびリソソーム蓄積症のような代謝障害の処置のために用いることができる。
【０００５】
一態様では、この文書は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成できる真菌細胞（例えばＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）を生成する方法を特徴とする。方法は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された真菌細胞を提供するステップと、細胞に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩをコードする核酸を導入するステップであって、ここで、核酸が、コードされたＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを細胞内区画（例えばゴルジ装置）に向かわせる（ｔａｒｇｅｔ）ためのヌクレオチドターゲティング配列を含み、ここで、真菌細胞におけるＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの発現が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するステップとを含む。方法は、細胞に、標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップであって、ここで、細胞は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むように改変された標的タンパク質を生成するステップをさらに含むことができる。標的タンパク質は、Ｆｃ受容体と結合できる。標的タンパク質は、抗体またはその断片であり得る。標的タンパク質は、治療用の糖タンパク質であり得る。標的タンパク質は、インターフェロン−β、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンγまたはエリスロポエチンであり得る。
【０００６】
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された真菌細胞は、ＯＣＨ１活性を欠損でき、α−１，２−マンノシダーゼをコードする核酸を含み、ここで、α−１，２−マンノシダーゼをコードする核酸は、コードされたα−１，２−マンノシダーゼを小胞体に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ターゲティング配列は、ＨＤＥＬ配列であり得る。
【０００７】
方法は、細胞に、マンノシダーゼＩＩをコードする核酸を導入するステップであって、ここで、マンノシダーゼＩＩをコードする核酸は、コードされたマンノシダーゼＩＩをゴルジ装置に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、真菌細胞におけるマンノシダーゼＩＩの発現は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成するステップをさらに含むことができる。
【０００８】
方法は、細胞に、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸を導入するステップであって、ここで、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、コードされたガラクトシルトランスフェラーゼをゴルジ装置に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、真菌細胞におけるガラクトシルトランスフェラーゼの発現は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成するステップをさらに含むことができる。ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−Ｇｌｃ−４−エピメラーゼとβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩの触媒ドメインとの融合体であり得る。このような方法は、細胞に、標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップであって、ここで、細胞は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するように改変された標的タンパク質を生成するステップをさらに含むことができる。方法は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するように改変された標的タンパク質を単離するステップを含むことができる。
【０００９】
別の態様では、この文書は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有する標的タンパク質を生成する方法を特徴とする。方法は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、α−１，２−マンノシダーゼと、マンノシダーゼＩＩとをコードする核酸を含むように遺伝子工学的に改変された真菌細胞（例えばＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）を提供するステップであって、ここで、核酸が、それぞれのコードされたタンパク質を細胞内区画に向かわせるための１つのターゲティング配列をコードする１つのヌクレオチド配列または複数のターゲティング配列をコードする複数のヌクレオチド配列を含み、ここで、真菌細胞が、ＯＣＨ１活性を欠損しているステップと、細胞に、標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップであって、ここで、細胞が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有する標的タンパク質を生成するステップとを含む。α−１，２−マンノシダーゼをコードする核酸は、コードされたα−１，２−マンノシダーゼを小胞体に向かわせるための小胞体ターゲティング配列を含むことができる。例えば、ターゲティング配列は、ＨＤＥＬ配列であり得る。ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩおよびマンノシダーゼＩＩをコードする核酸は、コードされたＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩおよびマンノシダーゼＩＩをゴルジ装置に向かわせるための１つ以上のゴルジターゲティング配列を含むことができる。標的タンパク質は、Ｆｃ受容体と結合できる。標的タンパク質は、抗体またはその断片であり得る。標的タンパク質は、治療用の糖タンパク質であり得る。標的タンパク質は、インターフェロン−β、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンγまたはエリスロポエチンであり得る。
【００１０】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞に、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸を導入するステップであって、ここで、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、コードされたガラクトシルトランスフェラーゼをゴルジ装置に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、真菌細胞におけるガラクトシルトランスフェラーゼの発現は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するように改変された標的タンパク質を生成するステップをさらに含むことができる。ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するように改変された標的タンパク質は、真菌細胞から単離できる。
【００１１】
この文書は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成できる真菌細胞（例えばＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）を作製する方法も特徴とする。方法は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された真菌細胞を提供するステップと、細胞に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩをコードする核酸を導入するステップであって、ここで、核酸が、コードされたＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを細胞内区画（例えばゴルジ装置）に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、真菌細胞におけるＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの発現が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成するステップとを含む。方法は、細胞に、標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップであって、ここで、細胞は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するように改変された標的タンパク質を生成するステップをさらに含むことができる。標的タンパク質は、Ｆｃ受容体と結合できる。標的タンパク質は、抗体またはその断片であり得る。標的タンパク質は、治療用の糖タンパク質であり得る。標的タンパク質は、インターフェロン−β、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンγまたはエリスロポエチンであり得る。
【００１２】
Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された真菌細胞は、ＡＬＧ３活性を欠損でき、α−１，２−マンノシダーゼをコードする核酸を含み、ここで、核酸は、コードされたα−１，２−マンノシダーゼを小胞体に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含む。このような真菌細胞は、ＯＣＨ１活性をさらに欠損でき、かつ／またはα−１，３−グルコシルトランスフェラーゼ（例えばＡＬＧ６）をコードする核酸をさらに含むことができる。
【００１３】
方法は、細胞に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩをコードする核酸を導入するステップであって、ここで、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩをコードする核酸は、コードされたＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩを細胞内区画に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、真菌細胞におけるＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩの発現が、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成するステップをさらに含むことができる。
【００１４】
方法は、細胞に、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸を導入するステップであって、ここで、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、コードされたガラクトシルトランスフェラーゼをゴルジ装置に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、真菌細胞におけるガラクトシルトランスフェラーゼの発現は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成するステップをさらに含むことができる。ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−Ｇｌｃ−４−エピメラーゼと、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩの触媒ドメインとの融合体であり得る。方法は、細胞に標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップであって、ここで、細胞は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するように改変された標的タンパク質を生成するステップをさらに含むことができる。
【００１５】
方法は、細胞に、グルコシダーゼＩＩのαおよびβサブユニットをコードする核酸を導入するステップであって、ここで、真菌細胞におけるグルコシダーゼＩＩのαおよびβサブユニットの発現は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成するステップをさらに含むことができる。
【００１６】
この文書は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有する標的タンパク質を生成する方法も特徴とする。方法は、ＡＬＧ３活性を欠損するように遺伝子工学的に改変され、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩと、ガラクトシルトランスフェラーゼとをコードする核酸を含む真菌細胞を提供するステップであって、ここで、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩと、ガラクトシルトランスフェラーゼとをコードする核酸が、それぞれのコードされたタンパク質を細胞内区画（例えばゴルジ装置）に向かわせるための１つのターゲティング配列をコードする１つのヌクレオチド配列または複数のターゲティング配列をコードする複数のヌクレオチド配列を含むステップと、細胞に、標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップであって、ここで、細胞が、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有する標的タンパク質を生成するステップとを含む。真菌細胞は、ＯＣＨ１活性をさらに欠損でき、かつ／またはＡＬＧ６のようなα−１，３−グルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含むことができる。真菌細胞は、グルコシダーゼＩＩのαおよびβサブユニットをコードする核酸をさらに含むことができ、ここで、真菌細胞におけるグルコシダーゼＩＩのαおよびβサブユニットの発現は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有する標的タンパク質を生成する。
【００１７】
別の態様では、この文書は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された単離真菌細胞を特徴とする。真菌細胞は、ＯＣＨ１活性を欠損でき、α−１，２−マンノシダーゼと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、マンノシダーゼＩＩとをコードする核酸を含み、ここで、α−１，２−マンノシダーゼと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、マンノシダーゼＩＩとをコードする核酸は、それぞれのコードされたタンパク質を細胞内区画に向かわせるための１つのターゲティング配列をコードする１つのヌクレオチド配列または複数のターゲティング配列をコードする複数のヌクレオチド配列を含み、ここで、真菌細胞におけるα−１，２−マンノシダーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩおよびマンノシダーゼＩＩの発現は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成する。真菌細胞は、標的タンパク質をコードする核酸をさらに含むことができ、ここで、細胞は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するように改変された標的タンパク質を生成する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、このような真菌細胞は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩをコードする核酸をさらに含み、ここで、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩをコードする核酸は、コードされたＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩを細胞内区画に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、真菌細胞におけるＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩの発現は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、このような真菌細胞は、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含み、ここで、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、コードされたガラクトシルトランスフェラーゼをゴルジ装置に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、真菌細胞におけるガラクトシルトランスフェラーゼの発現は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成する。
【００２０】
さらに別の態様では、この文書は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変された単離真菌細胞を特徴とする。真菌細胞は、ＡＬＧ３活性を欠損するように遺伝子工学的に改変され、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩとＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩとをコードする核酸を含み、ここで、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩとＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩとをコードする核酸は、それぞれのコードされたタンパク質を細胞内区画に向かわせるための１つのターゲティング配列をコードする１つのヌクレオチド配列または複数のターゲティング配列をコードする複数のヌクレオチド配列を含み、ここで、真菌細胞におけるＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩの発現は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成する。遺伝子工学的に改変された真菌細胞は、ＯＣＨ１活性をさらに欠損でき、かつ／またはα−１，３−グルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含むことができる。遺伝子工学的に改変された真菌細胞は、標的タンパク質をコードする核酸をさらに含むことができ、ここで、細胞は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するように改変された標的タンパク質を生成する。真菌細胞は、グルコシダーゼＩＩのαおよびβサブユニットをコードする核酸をさらに含むことができ、ここで、真菌細胞におけるグルコシダーゼＩＩのαおよびβサブユニットの発現は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成する。真菌細胞は、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含むことができ、ここで、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、コードされたガラクトシルトランスフェラーゼをゴルジ装置に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、真菌細胞におけるガラクトシルトランスフェラーゼの発現は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成する。
【００２１】
この文書は、相当数のＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞が、Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有する糖タンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変されているＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞の実質的に純粋な培養物も特徴とする。細胞は、ＡＬＧ３活性を欠損するように遺伝子工学的に改変され、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩと、ガラクトシルトランスフェラーゼとをコードする核酸を含み、ここで、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩと、ガラクトシルトランスフェラーゼとをコードする核酸は、それぞれのコードされたタンパク質を細胞内区画に向かわせるための１つのターゲティング配列をコードする１つのヌクレオチド配列または複数のターゲティング配列をコードする複数のヌクレオチド配列を含み、ここで、細胞におけるＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩおよびガラクトシルトランスフェラーゼの発現は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有するタンパク質を生成する。遺伝子工学的に改変された真菌細胞は、ＯＣＨ１活性をさらに欠損でき、かつ／またはα−１，３−グルコシルトランスフェラーゼ（例えばＡＬＧ６）をコードする核酸をさらに含むことができる。細胞は、グルコシダーゼＩＩのαおよびβサブユニットをコードする核酸をさらに含むことができ、ここで、真菌細胞におけるグルコシダーゼＩＩのαおよびβサブユニットの発現は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有する標的タンパク質を生成する。
【００２２】
別の態様では、この文書は、相当数のＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞が、Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含有する糖タンパク質を生成するように遺伝子工学的に改変されているＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞の実質的に純粋な培養物であって、ここで、細胞が、ＯＣＨ１活性を欠損するように遺伝子工学的に改変され、α−１，２−マンノシダーゼと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、マンノシダーゼＩＩと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩと、ガラクトシルトランスフェラーゼとをコードする核酸を含み、ここで、α−１，２−マンノシダーゼと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩと、マンノシダーゼＩＩと、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩと、ガラクトシルトランスフェラーゼとをコードする核酸が、それぞれのコードされたタンパク質を細胞内区画に向かわせるための１つのターゲティング配列をコードする１つのヌクレオチド配列または複数のターゲティング配列をコードする複数のヌクレオチド配列を含み、ここで、細胞におけるα−１，２−マンノシダーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ、マンノシダーゼＩＩ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩおよびガラクトシルトランスフェラーゼの発現が、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを含むタンパク質を生成する培養物を特徴とする。
【００２３】
この文書は、糖タンパク質を含み、ここで、糖タンパク質上のＮ−グリカンの少なくとも５０％（例えば少なくとも７０％または少なくとも８５％）が、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンである組成物も特徴とする。
【００２４】
そうでないと定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当技術分野における当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で記載するものと同様または等価な方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、例示的な方法および材料は、以下に記載する。本明細書で言及する全ての出版物、特許出願、特許、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号およびその他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれている。矛盾がある場合には、定義を含む本出願が支配する。材料、方法および実施例は例示のためだけであり、限定することを意図しない。
【００２５】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１Ａは、Ｍａｎ５ＧＬｃＮＡｃ２構造およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造の図である。図１Ｂは、プラスミドｐＹｌＯＣＨ１  ＰＵＴ  ＴＯＰＯの模式図である。
【図２】図２は、ｐｏｌｄ  ｌｎｕｇａ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ野生型細胞またはΔｏｃｈ１  ｐｏｌｄ  ｌｎｕｇａ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞から得られた分泌タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図（ｅｌｅｃｔｒｏｆｅｒｏｇｒａｍ）である。ＯＣＨ１不活性化の際の主なＮ−グリカンは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２になる。分析は、ＤＮＡシーケンサー支援蛍光体支援糖質電気泳動（ＤＳΑ−ＦＡＣＥ）を用いて行った。「Ｍ５」、「Ｍ６」、「Ｍ８」および「Ｍ９」は、ベースのＮ−アセチルグルコサミン構造にコンジュゲートしたマンノース残基の数である。Ｙ軸は、各Ｎ−グリカン構造の量を示す相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、キャピラリーを通しての各Ｎ−グリカン構造の相対移動度を表す。先頭の電気泳動図は、移動度標準物質として用いるためのデキストランの分析である。
【図３】図３は、プラスミドｐＹＬＨＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬおよびｐＹＬＴＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬの模式図である。
【図４】図４は、ＭａｎＨＤＥＬ（＝ＨＤＥＬタグ付きα−１，２−マンノシダーゼ）発現カセット（ＴＥＦ１またはＨｐ４ｄのいずれかのプロモーター制御の下で）をＧ０１４株に導入した後のＮ−グリカンプロファイルを示す一連の電気泳動図である。「Ｒｄ」は、図３に示すベクターに存在するゼータ配列による「無作為組み込み」を表す。マンノシダーゼ発現の際の主要なＮ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。これらの株の１つ（Ｇ０１８、表２を参照されたい）からのＵＲＡ３マーカーのキュアリング（ｃｕｒｉｎｇ）は、Ｎ−グリカンプロファイルを変えない。
【図５】図５は、プラスミドＪＭＥ９２６  ｐＰＴＬｅｕ２−ＡＤＥ２ｅｘ−Ｈｐ４ｄＭａｎＨＤＥＬ（Ｙｌ）およびＯＸＹＰ２８９  ｐＰＴＡｘｐ１−ＬＥＵ２ｅｘ−Ｈｐ４ｄＭａｎＨＤＥＬ（Ｙｌ）についての構築方策の模式図である。ベクターｐＹＬＴｍＡＸｒＧｎＴＩＩの構築については、図２３を参照されたい。
【図６】図６は、ＬＥＵ２またはＡＸＰ１遺伝子座のいずれかでの標的化組み込み（Ｔｇ）により、ＭａｎＨＤＥＬ（＝ＨＤＥＬタグ付きα−１，２−マンノシダーゼ）発現カセット（Ｈｐ４ｄプロモーター制御の下で）をＧ０１４株に導入した後のＮ−グリカンプロファイルを示す一連の電気泳動図である。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が主なＮ−グリカンになる。
【図７】図７は、Ｋｒｅ２ｐの１００個のＮ末端アミノ酸とヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの触媒ドメインとの間の融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）およびＹａｒｒｏｗｉａコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号４）を示す図である。太字で：融合タンパク質のＫｒｅ２ｐ部分；通常のフォントで：融合タンパク質のＧｎＴ  Ｉ部分；下線：開始コドンおよび停止コドン。
【図８】図８は、プラスミドｐＹＬＴｍＡＸｈＧｎＴＩおよびｐＹＬＨｐ４ｍＡＸｈＧｎＴＩについての構築方策の模式図である。
【図９】図９は、ＧｎＴ  Ｉを発現するベクターでの形質転換によりＧｎＴ  Ｉ活性をＧ０３６株に導入した後のＮ−グリカンプロファイルを示す一連の電気泳動図である。「Ｒｄ」は、図８に示すベクターに存在するゼータ配列による「無作為組み込み」を表す。ＧｎＴ  Ｉ活性の発現の際の主要なＮ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。α−１，２−マンノシダーゼでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理は、プロファイルを著しく変えず、このことは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２以外の高マンノースＮ−グリカンは少量しか存在しないことを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏヘキソサミニダーゼ処理は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのシフトをもたらす。
【図１０−１】図１０は、Ｍｎｎ２ｐの３６個のＮ末端アミノ酸とＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩの触媒ドメインとの間の融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号７）およびＹａｒｒｏｗｉａコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号８）を示す図である。太字で：融合タンパク質のＭｎｎ２ｐ部分；通常のフォントで：融合タンパク質のＭａｎＩＩ部分；下線：開始コドンおよび停止コドン。
【図１０−２】図１０は、Ｍｎｎ２ｐの３６個のＮ末端アミノ酸とＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩの触媒ドメインとの間の融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号７）およびＹａｒｒｏｗｉａコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号８）を示す図である。太字で：融合タンパク質のＭｎｎ２ｐ部分；通常のフォントで：融合タンパク質のＭａｎＩＩ部分；下線：開始コドンおよび停止コドン。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＹＬＴｍＡＸＤｍＭａｎＩＩおよびｐＹＬＴｍＡＸＤｍＭａｎＩＩ（ＬＥＵ２ｅｘ）についての構築方策の模式図である。
【図１２】図１２は、ＭａｎＩＩ発現ベクターでの形質転換によりＭａｎＩＩ活性をＧ０４０株に導入した後のＮ−グリカンプロファイルを示す一連の電気泳動図である。「Ｒｄ」は、図１１に示すベクターに存在するゼータ配列による「無作為組み込み」を表す。ＭａｎＩＩ活性の発現の際に、より高い電気泳動移動度を有する新しいピークならびに、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２とほぼ同じ位置に泳動される「ショルダー」ピークが出現する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏヘキソサミニダーゼ処理は、これらのピークについて前へのシフトをもたらし（ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への観察されたシフトの隣りに）、このことは、末端ＧｌｃＮＡｃの存在を示し、よって、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２のようなピークが同定される。α−１，２−マンノシダーゼでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理は、プロファイルを著しく変化させず、このことは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２以外の高マンノースＮ−グリカンは少量しか存在しないことを示す。
【図１３−１】図１３は、Ｍｎｎ２ｐの４６個のＮ末端アミノ酸とＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ＵＤＰ−Ｇｌｃ−４−エピメラーゼ様タンパク質とヒトβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩの触媒ドメインとの間の融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）およびＹａｒｒｏｗｉａコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号１０）である。融合タンパク質のＭｎｎ２ｐ部分は配列番号９の１〜４６であり、リンカー配列は４７〜４９および４０５〜４０８であり、融合タンパク質のエピメラーゼ配列は５０〜４０４であり、融合タンパク質のＭａｎＩＩ部分は４０９〜７６３である。Ｍｎｎ２ｐ部分は配列番号１０のヌクレオチド１〜１３８であり、リンカー配列はヌクレオチド１３９〜１４７および１２１３〜１２２４であり、エピメラーゼ配列はヌクレオチド１４８〜１２１２であり、ＭａｎＩＩ部分は１２２５〜２２８９である。開始コドンおよび停止コドンに下線を付す。
【図１３−２】図１３は、Ｍｎｎ２ｐの４６個のＮ末端アミノ酸とＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ＵＤＰ−Ｇｌｃ−４−エピメラーゼ様タンパク質とヒトβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩの触媒ドメインとの間の融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）およびＹａｒｒｏｗｉａコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号１０）である。融合タンパク質のＭｎｎ２ｐ部分は配列番号９の１〜４６であり、リンカー配列は４７〜４９および４０５〜４０８であり、融合タンパク質のエピメラーゼ配列は５０〜４０４であり、融合タンパク質のＭａｎＩＩ部分は４０９〜７６３である。Ｍｎｎ２ｐ部分は配列番号１０のヌクレオチド１〜１３８であり、リンカー配列はヌクレオチド１３９〜１４７および１２１３〜１２２４であり、エピメラーゼ配列はヌクレオチド１４８〜１２１２であり、ＭａｎＩＩ部分は１２２５〜２２８９である。開始コドンおよび停止コドンに下線を付す。
【図１４】図１４は、プラスミドｐＹＬＴｍＡＸＳｐＧａｌ１０ｈＧａｌＴＩおよびｐＹＬＴｍＡＸＳｐＧａｌ１０ｈＧａｌＴＩ（ＡＤＥ２ｅｘ）についての構築方策の模式図である。
【図１５】図１５は、Ｇａｌ１０−ＧａｌＴＩ活性をＧ０４０株に導入した後のＮ−グリカンプロファイルを示す一連の電気泳動図である。得られた形質転換体Ｇ０４４を、２つの異なる培地で培養した。「Ｒｄ」は、図１４に示すベクターに存在するゼータ配列による「無作為組み込み」を表す。Ｇａｌ１０−ＧａｌＴＩ活性の発現の際に、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２とＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２との間の位置に泳動される新しいピークが出現する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏガラクトシダーゼ処理は、このピークについての前へのシフトと、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の等しい増加とをもたらす（後者は、ガラクトシダーゼとヘキソサミニダーゼを用いる二重処理によりこのＮ−グリカンを表すことが確認される）。このことは、末端ガラクトースの存在を示し、よって、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２としてのＧ０４４プロファイルの新しいピークが同定される。α−１，２−マンノシダーゼでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２にまでまだ刈り込まれていない（ｎｏｔ  ｙｅｔ  ｔｒｉｍｍｅｄ）多量の高マンノースＮ−グリカン（特にＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２）の存在を示す。
【図１６】図１６は、プラスミドｐＹＬａｌｇ３ＰＵＴ−ＡＬＧ６の模式図である。
【図１７】図１７は、ｐＹＬａｌｇ３ＰＵＴ−ＡＬＧ６をＧ０３６株に導入した後のＮ−グリカンプロファイルを示す一連の電気泳動図である。ＡＬＧ６の過剰発現は、相当量のグリコシル化ピーク（ＧｌｃＭａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃ２Ｍａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２）をもたらし、このことは、新生タンパク質に移されたＧｌｃ３Ｍａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２構造が、グルコシダーゼＩＩによりＭａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２に完全には刈り込まれていないことを示す。増殖培地に依存して、生じるＭａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２は、ＥＲ局在化ＨＤＥＬタグ付きＴ．ｒｅｅｓｅｉα−１，２−マンノシダーゼの作用によりＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に部分的（まだいくらかのＭａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ４’ＧｌｃＮＡｃ２）、またはほぼ完全に刈り込まれている。Ｍａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ４’ＧｌｃＮＡｃ２のピークは、α−１，２−マンノシダーゼに対するそれらの感受性により、そのままで同定される。キャッピンググルコースにより、ＧｌｃＭａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃ２Ｍａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２はこの処理に対して非感受性である。ナタマメマンノシダーゼは、遊離のα−１，６結合マンノースを部分的に除去できるが、これは、Ｍａｎ３−５’ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２に変換もする。
【図１８】図１８は、プラスミドｐＹＬＴｍＡＸｈＧｎＴＩ（Ｈｙｇｒ  ｅｘ）についての構築方策の模式図である。
【図１９】図１９は、ＧｎＴ  Ｉ発現ベクターでの形質転換によりＧｎＴ  Ｉ活性をΔａｌｇ３−Ｈｐ４ｄＡＬＧ６株のキュアしていない（Ｇ０３９）かまたはキュアした（Ｇ０４５）いずれかのバージョンに導入した後のＮ−グリカンプロファイルを示す一連の電気泳動図である。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の産生は、ヘキソサミニダーゼ消化により証明された。新しいピークは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に完全にシフトして戻った。Ｇ０４８株では、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２への変換は完全でなかった。なぜなら、いくらかのＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２がまだ観察できたからである。この株は、α−１，２−マンノシダーゼ消化により示されるように、いくらかの残りのＭａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２も有する。
【図２０】図２０は、プラスミドＪＭＥ９２５  ｐＰＴＡｄｅ２−ＵＲＡ３ｅｘ−Ｈｐ４ｄｈＧｎＴＩについての構築方策の模式図である。
【図２１】図２１は、ＧｎＴ  Ｉ活性をΔａｌｇ３−Ｈｐ４ｄＡＬＧ６株のキュアしたバージョン（＝Ｇ０４５）に導入し、Ｈｐ４ｄ駆動型発現構築物をＡＤＥ２遺伝子座（Ｔｇ−ａｄｅ２）に組み込んだ後のＮ−グリカンプロファイルを示す一連の電気泳動図である。この培養では、グリコシル化Ｎ−グリカンの量は高く、Ｍａｎ４’−５’ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２への変換は、完全でなかった。Ｍａｎ４’ＧｌｃＮＡｃ２の隣りに泳動される新しいピークが形質転換体Ｇ０５７で観察され、ヘキソサミニダーゼ消化の結果に基づいてＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であると示すことができた。この新しいピークは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に完全にシフトして戻る。
【図２２】図２２は、Ｍｎｎ２ｐの３６個のＮ末端アミノ酸とラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩの触媒ドメインとの間の融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）およびＹａｒｒｏｗｉａコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号１８）である。太字で：融合タンパク質のＭｎｎ２ｐ部分；通常のフォントで：融合タンパク質のＧｎＴ  ＩＩ部分；下線：開始コドンおよび停止コドン。
【図２３】図２３は、プラスミドｐＹＬＴｍＡＸｒＧｎＴＩＩおよびｐＹＬＴｍＡＸｒＧｎＴＩＩ（ＡＤＥ２  ｅｘ）についての構築方策の模式図である。
【図２４】図２４は、ＧｎＴ  ＩＩ活性を、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を合成する株に導入した後のＮ−グリカンプロファイルを示す一連の電気泳動図である。得られた株は、Ｇ０４５をＧｎＴＩおよびＧｎＴ  ＩＩ発現構築物で二重形質転換するか、またはＧ０４７をＧｎＴＩＩ発現構築物で形質転換することのいずれかにより得た。両方の場合では、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を表すピークはほぼ完全に消失し、約１グルコース単位大きい新しいピークが出現した。ヘキソサミニダーゼ処理は、新しいＮ−グリカン上での２つの末端ＧｌｃＮＡｃ残基の存在；約２グルコース単位左へのピークシフトを示し、よって、それは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を表す。α−１，２−マンノシダーゼ処理は、大きな違いをもたらさず、このことは、Ｍａｎ４’−５’ＧｌｃＮＡｃ２が限られた量だけ存在することを示す。
【図２５】図２５は、グルコシダーゼＩＩ活性の発現のためのプラスミドｐＹＬＴＵＸｄＬ２ｐｒｅＡｎＧｌｃＩＩおよびｐＹＬｅｕ２ＥｘＴＥＦｐｒｅＬｉｐ２ＡｎＧｌｕｃＩＩβの模式図である。
【図２６】図２６は、プラスミドＪＭＥ９２３  ｐＰＴｕｒａ３−ＬＥＵ２ｅｘ−ＴｅｆＬ２ｐｒｅＡｎＧｌｃＩＩａ＋ｂ［ａｌｔｌ］についての構築方策の模式図である。
【図２７】図２７は、プラスミドＪＭＥ９２３  ｐＰＴｕｒａ３−ＬＥＵ２ｅｘ−Ｈｐ４ｄＬ２ｐｒｅＡｎＧｌｃＩＩａ＋ｂ［ａｌｔｌ］およびＺｅｔａ−ＬＥＵ２ｅｘ−Ｈｐ４ｄＬ２ｐｒｅＡｎＧｌｃＩＩａ＋ｂ［ａｌｔ］についての構築方策の模式図である。
【図２８】図２８は、グルコシダーゼＩＩ活性を、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を合成する株に導入した後のＮ−グリカンプロファイルを示す一連の電気泳動図である。得られた株は、ｇｌｓ２αおよびｇｌｓ２βサブユニットについての二重発現構築物の無作為（Ｇ０６０）または標的化（Ｇ０６１）組み込みのいずれかにより得た。両方の場合では、グルコシル化ピークの低減が観察される。α−１，２−マンノシダーゼ処理は、産生されたＭａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２の全てが、異種ＨＤＥＬタグ付きα−１，２−マンノシダーゼによりＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換されたのではないことを示す。キャッピンググルコースのために、ＧｌｃＭａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃ２Ｍａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２は、この処理に非感受性である。ナタマメマンノシダーゼは、残存グルコシル化Ｎ−グリカンおよびＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の両方における遊離のα−１，６結合マンノースを部分的に除去できる。さらに、この処理は、Ｍａｎ３−５’ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２に変換する。「Ｒｄ」は、図２７に示すベクターに存在するゼータ配列による「無作為組み込み」を表す。「Ｔｇ−ａｄｅ２」および「Ｔｇ−ｕｒａ３」は、ＡＤＥ２ｒｅｓｐ．ＵＲＡ３遺伝子座における標的化組み込みを表す。
【図２９】図２９は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩをＧ０６１株に導入することにより作製したＧ０７０株およびＧ０７１株のセクレトーム（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）のＮ−グリカンプロファイルを示す一連の電気泳動図である。Ｎ−グリカンを、α−１，２−マンノシダーゼ（全ての末端α−１，２結合マンノース残基を除去する）またはヘキソサミニダーゼ（末端β−１，２結合ＧｌｃＮＡｃ残基を除去する）のいずれかで処理して、Ｇ０７０およびＧ０７１の天然プロファイルにおけるピークを同定した。グルコース含有Ｎ−グリカンは、２つの酵素のいずれにも感受性でない。α−１，２−マンノシダーゼ処理は、Ｍａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２への刈り込みをもたらす。ヘキソサミニダーゼ処理は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩおよびＩＩにより付加されたβ−１，２結合末端ＧｌｃＮＡｃ残基を除去して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を産生する。
【図３０Ａ】図３０Ａは、合成プレプロＬｉｐ２−軽鎖（ＬＣ）のヌクレオチド配列（配列番号３２）である。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、合成プレプロＬｉｐ２−ＬＣのアミノ酸配列（配列番号３３）である。
【図３１Ａ】図３１Ａは、合成プレプロＬｉｐ２−重鎖（ＨＣ）のヌクレオチド配列（配列番号３４）である。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、合成プレプロＬｉｐ２−ＨＣのアミノ酸配列（配列番号３５）である。
【図３２】図３２は、ｐＹＬＨｐ４Ｌ２ｐｒｅｐｒｏＨｅｒＨＣ／ＬＣ（ＧＵＴ２ｅｘ）−ｏｒｉ２で形質転換した、糖鎖工学的に改変したＧ０４５株、Ｇ０５７株、Ｇ０６１株およびＧ０７１株のＳｕｐｅｒＴ／グリセロール振とうフラスコ培養物のＮ−グリカンプロファイル分析を示す一連の電気泳動図である。Ｇ０４５株、Ｇ０５７株、Ｇ０６１株およびＧ０７１株の記載について、表２を参照されたい。
【図３３】図３３は、Ｇ０９６流加発酵での異なる時点での機能的ＥＬＩＳＡからの結果のグラフである。
【図３４Ａ】図３４Ａは、Ｇ０９６流加発酵における異なる時点でのセクレトームのＮ−グリカンプロファイル分析を示す一連の電気泳動図である。
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、Ｇ０９６流加発酵における異なる時点でのセクレトームのＮ−グリカンプロファイル分析を示す一連の電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書で記載する場合、酵母分泌糖タンパク質における哺乳類様複合Ｎ−グリカンのｉｎ  ｖｉｖｏ合成は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２基本構造またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２基本構造のいずれかに基づくことができる（図１Ａを参照されたい、「Ｍａｎ」はマンノースのことであり、「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ−グルコサミンのことである）。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２基本構造を生成するために、酵母細胞を、α−１，２−マンノシダーゼ活性が細胞内区画で増加し、外鎖伸長（Ｏｕｔｅｒ  ＣＨａｉｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）（ＯＣＨ１）活性が減少するように工学的に改変できる。Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２基本構造を生成するために、アスパラギン結合グリコシル化３（ＡＬＧ３）の活性と、いくつかの実施形態ではＯＣＨ１とが減少し、α−１，２−マンノシダーゼの活性と、いくつかの実施形態ではα−１，３−グルコシルトランスフェラーゼの活性とが増加する。このような酵母細胞で生成されたタンパク質のＮ−グリカンプロファイルは、酵母細胞を、以下の活性の１つ以上を含有するようにさらに工学的に改変することにより変更できる：ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ  Ｉ）活性、マンノシダーゼＩＩ活性、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ  ＩＩ）活性、グルコシダーゼＩＩ活性およびガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇａｌ  Ｔ）活性。例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを生成する酵母細胞においてＧｎＴ  Ｉを発現させることにより、それぞれＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンが生成されるように、ＧｌｃＮＡｃ部分がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンに移動する。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを生成する細胞では、マンノシダーゼＩＩを発現させることにより、２つのマンノース残基がＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンから除去されて、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンが生成される。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを生成する細胞では、ＧｎＴ  ＩＩを発現させることにより、別のＧｌｃＮＡｃ部分がＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンに移動して、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンが生成される。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを生成する細胞でＧａｌ  Ｔを発現させることにより、ガラクトースがＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンに移動して、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンが生成される。いくつかの実施形態では、グルコシダーゼＩＩ（例えばαおよびβサブユニットを発現させることにより）を発現させて、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２基本構造の生成を増加できる。
【００２８】
標的分子
標的分子は、本明細書で用いる場合、遺伝子工学的に改変された細胞（例えばＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓもしくはその他の関連する種二形性酵母細胞（ｏｔｈｅｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｉｍｏｒｐｈｉｃ  ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌ））のような真菌細胞；植物細胞または動物細胞）においてＮ−グリコシル化を受ける任意の分子のことをいう。いくつかの実施形態では、標的分子は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ（またはその他の関連する種二形性酵母）の分泌経路の１つ以上のステップを介して輸送されて、宿主細胞機構によるそれらのＮ−グリコシル化をもたらすことができる。標的分子は、内因性または外因性であり得る。
【００２９】
適切な標的タンパク質は、病原体タンパク質（例えば破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；ウイルス表面タンパク質（例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）糖タンパク質Ｂ、ＨおよびｇＣＩＩＩ；ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）エンベロープ糖タンパク質；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンベロープ糖タンパク質；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）エンベロープ糖タンパク質；エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）エンベロープ糖タンパク質；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）エンベロープ糖タンパク質；ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）エンベロープ糖タンパク質；インフルエンザウイルス糖タンパク質；および肝炎ファミリー表面抗原）、リソソームタンパク質（例えばグルコセレブロシダーゼ、セレブロシダーゼまたはガラクトセレブロシダーゼ）、インスリン、グルカゴン、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、Ｆｃ受容体と結合するタンパク質、抗体もしくはその断片、またはタンパク質のいずれかと抗体もしくは抗体の断片との融合体（例えばタンパク質−Ｆｃ）を含む。増殖因子は、例えば血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）；ニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含む。サイトカインは、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３またはＩＬ−１５のようなＩＬ−１〜ＩＬ−３３）およびインターフェロン（例えばインターフェロンβまたはインターフェロンγ）を含む。ケモカインは、例えばＩ−３０９、ＴＣＡ−３、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｃ１０、ＭＲＰ−２、ＭＡＲＣ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−２、ＭＲＰ−２、ＣＣＦ１８、ＭＩＰ−１γ、エオタキシン、ＭＣＰ−５、ＭＣＰ−４、ＮＣＣ−１、Ｃｋβ１０、ＨＣＣ−１、ロイコタクチン−１、ＬＥＣ、ＮＣＣ−４、ＴＡＲＣ、ＰＡＲＣまたはエオタキシン−２を含む。腫瘍糖タンパク質（例えば腫瘍関連抗原）、例えば癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ヒトムチン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよび前立腺特異抗原（ＰＳＡ）も含まれる［ＨｅｎｄｅｒｓｏｎおよびＦｉｎｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６２巻、２１７〜５６頁（１９９６年）］。一実施形態では、標的タンパク質は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、リソソーム蓄積症と関連するものであり得、この標的タンパク質は、例えばアルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ベータ−ヘキソサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−マンノシダーゼ、アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、アルファ−Ｎ−アセチルガ��クトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、アルファ−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−Ｄ−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）、ヒアルロニダーゼ、アルファ−Ｌ−マンノシダーゼ、アルファ−ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫおよびリポタンパク質リパーゼを含む。
【００３０】
標的タンパク質は、融合タンパク質でもあり得る。融合タンパク質は、例えば（ｉ）本明細書で記載する任意のタンパク質またはその断片と、（ｉｉ）抗体またはその断片との融合体を含む。本明細書で使用する場合、用語「抗体断片」とは、（ａ）抗原結合断片または（ｂ）Ｆｃ受容体と相互作用できる抗体のＦｃ部分のことをいう。抗原結合断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片であり得る。ｓｃＦｖ断片は、このｓｃＦｖが由来する抗体の重鎖および軽鎖の両方の可変領域を含む単一ポリペプチド鎖である。さらに、ダイアボディ［Ｐｏｌｊａｋ（１９９４年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２巻（１２号）：１１２１〜１１２３頁；Ｈｕｄｓｏｎら（１９９９年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ２３巻（１〜２号）：１７７〜１８９頁］およびイントラボディ［Ｈｕｓｔｏｎら（２００１年）Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ１０巻（３〜４号）：１２７〜１４２頁；Ｗｈｅｅｌｅｒら（２００３年）Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ８巻（３号）：３５５〜３６６頁；Ｓｔｏｃｋｓ（２００４年）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ９巻（２２号）：９６０〜９６６頁］を本発明の方法で用いることができる。
【００３１】
標的タンパク質は、ポリマー、キャリア、アジュバント、免疫毒素または検出可能（例えば蛍光、発光もしくは放射活性）部分の１つ以上とつなぐこともできる。例えば、標的タンパク質をポリエチレングリコールとつなぐことができ、これは小さいタンパク質の分子量を増加させ、かつ／または循環滞留時間を増加させるために用いることができる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、標的分子は、ドリコールであるかまたはドリコールを含むことができる。
【００３３】
遺伝子工学的に改変された細胞
本明細書で記載する遺伝子工学的に改変された細胞は、哺乳類様Ｎ−グリカンを含有する標的分子、または哺乳類グリコシル化経路内の中間体を含有する標的分子を生成するために用いることができる。例えば、本明細書で記載する場合、１つ以上の酵素をコードする核酸を、細胞が所望のＮ−グリカン（例えばＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカン）を生成するように真菌細胞に導入できる。つまり、本明細書で記載する実施形態のいずれでも、真菌細胞は、１つの酵素をコードする核酸を含有し得るか、または複数の酵素をコードし得る核酸を含有し得る。このような核酸のそれぞれは、以下で論じるようなターゲティング配列も含有できる。さらに、標的分子をコードする核酸も、標的分子が生成され、所望のＮ−グリカン（例えばＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカン）を含有するように改変されるように真菌細胞に導入できる。
【００３４】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書で交換可能に用い、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび核酸類似体を含有するＤＮＡ（またはＲＮＡ）を含むＲＮＡならびにＤＮＡの両方のことをいう。核酸は、任意の３次元構造を有することができる。核酸は、２本鎖または１本鎖（すなわちセンス鎖またはアンチセンス鎖）であり得る。核酸の非限定的な例は、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、有枝鎖状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー、ならびに核酸類似体を含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で交換可能に用い、長さまたは翻訳後修飾にかかわらず、アミノ酸の任意のペプチド連結鎖を意味する。
【００３５】
「単離核酸」とは、天然で生じるゲノム（例えば酵母ゲノム）中で核酸の一方の側または両側に通常接している核酸を含む、天然で生じるゲノムに存在するその他の核酸分子から分離される核酸のことをいう。用語「単離」は、核酸に関して本明細書で用いる場合、任意の天然で生じない核酸配列も含む。なぜなら、このような天然で生じない配列は天然で見出されず、天然で生じるゲノムにおいて直接隣接する配列を有さないからである。
【００３６】
単離核酸は、例えばＤＮＡ分子であり得るが、但し、天然で生じるゲノムにおいてそのＤＮＡ分子を直接挟む（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ことが通常見出される核酸配列の一方が、除去されているかまたは存在しないことを条件とする。つまり、単離核酸は、限定することなく、他の配列から独立した分離した分子（例えば化学合成核酸、あるいはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）、ならびにベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば任意のパラミクソウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡを含む。さらに、単離核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸の一部であるＤＮＡ分子のような工学的に改変された核酸を含み得る。例えばｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーまたはゲノムＤＮＡ制限酵素消化物（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｄｉｇｅｎｓｔ）を含有するゲルスライス内の数百〜数百万のその他の核酸のうちに存在する１つの核酸は、単離核酸とみなさない。
【００３７】
用語「外因性」は、核酸および特定の宿主細胞に関して本明細書で用いる場合、その特定の細胞において天然で見出されるとおりに生じない（そして該細胞から得ることができない）任意の核酸のことをいう。つまり、天然で生じない核酸は、宿主細胞に一旦導入されると、該宿主細胞にとって外因性であるとみなす。天然で生じない核酸は、天然で見出される核酸配列の核酸サブシーケンスまたは断片を含有できるが、この核酸が全体として天然に存在しないことを条件とすることに注意することが重要である。例えば、発現ベクター内のゲノムＤＮＡ配列を含有する核酸分子は、天然で生じない核酸であり、よって、宿主細胞に一旦導入されると、該宿主細胞にとって外因性である。なぜなら、この核酸分子は、全体（ゲノムＤＮＡ＋ベクターＤＮＡ）として天然に存在しないからである。つまり、全体として天然に存在しない任意のベクター、自己複製プラスミドまたはウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）は、天然で生じない核酸とみなす。このことは、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されたゲノムＤＮＡ断片ならびにｃＤＮＡを、これらが天然で見出されない分離した分子として存在するので、天然で生じない核酸とみなすことに従う。このことは、天然で見出されない配置でプロモーター配列およびポリペプチドコード配列（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を含有する任意の核酸が、天然で生じない核酸であることにも従う。天然で生じる核酸は、特定の細胞にとって外因性になり得る。例えば、酵母ｘの細胞から単離された染色体全体は、該染色体が酵母の細胞に一旦導入されると、酵母ｙの細胞に関して外因性核酸である。
【００３８】
遺伝子工学的改変のために適切な細胞は、例えば真菌細胞（例えばＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたは本明細書で記載する任意のその他の関連する二形性酵母細胞）、植物細胞または動物細胞を含む。細胞は、初代細胞、不死化細胞または形質転換細胞であり得る。細胞は、動物、例えば非ヒト哺乳動物におけるものであり得る。本明細書で特定する遺伝子工学的改変の前のこのような細胞は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）のような多様な商業的供給源および研究資源施設から得ることができる。
【００３９】
細胞の遺伝子工学的改変は、（ｉ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする内因性遺伝子の欠失；（ｉｉ）Ｎ−グリコシル化活性を有する（すなわちＮ−グリコシル化活性を有する変異タンパク質を発現する）タンパク質（例えば内因性または外因性タンパク質）の変異形態をコードする組換え核酸の導入；（ｉｉｉ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の機能的発現に干渉するＲＮＡ分子の導入または発現；（ｉｖ）Ｎ−グリコシル化活性を有する（すなわちＮ−グリコシル化活性を有するタンパク質を発現する）野生型（例えば内因性または外因性）タンパク質をコードする組換え核酸の導入；または（ｖ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする１つ以上の内因性遺伝子のプロモーター要素またはエンハンサー要素を変更して、そのことによりそれらのコードされるタンパク質の発現を変更することのような遺伝子改変を含み得る。ＲＮＡ分子は、例えば小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。項目（ｉｉ）は、例えば、内因性遺伝子を、置き換えられるこの内因性遺伝子と比べてより大きいＮ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子で置き換えることを含む。遺伝子工学的改変は、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする内因性遺伝子を、付加（例えば異種配列）、欠失または置換（例えば点変異；保存的または非保存的変異のような変異）を有するタンパク質を生成するように変更することも含む。変異は、特異的に導入できる（例えば部位特異的変異誘発または相同組換え）か、または無作為に導入できる（例えば、細胞は、例えばＮｅｗｍａｎおよびＦｅｒｒｏ−Ｎｏｖｉｃｋ（１９８７年）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５巻（４号）：１５８７頁に記載されるように、化学的に変異誘発させることができる）。
【００４０】
本明細書で記載する遺伝子改変は、（ｉ）遺伝子改変された細胞における１種以上のＮ−グリコシル化活性の増加、（ｉｉ）遺伝子改変された細胞における１種以上のＮ−グリコシル化活性の減少、（ｉｉｉ）遺伝子改変された細胞における１種以上のＮ−グリコシル化活性の局在化または細胞内分布の変化、あるいは（ｉｖ）遺伝子改変された細胞における１種以上のＮ−グリコシル化活性の比の変化のうちの１つ以上をもたらすことができる。Ｎ−グリコシル化活性の量の増加は、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質の過剰発現、内因性遺伝子のコピー数の増加（例えば遺伝子重複）、または内因性遺伝子によりコードされるタンパク質の発現の増加を刺激する該遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーの変更によることができることが理解される。１種以上のＮ−グリコシル化活性の減少は、Ｎ−グリコシル化を変更する活性を有する１つ以上のタンパク質の変異形態（例えばドミナントネガティブ形態）の過剰発現、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質の発現を低減する１つ以上の干渉ＲＮＡ分子の導入または発現、あるいはＮ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする１つ以上の内因性遺伝子の欠失によることができる。
【００４１】
１つ以上の内因性遺伝子を欠失または破壊する方法は、付随の実施例に記載する。例えば、相同組換えにより遺伝子を破壊するために、「遺伝子置き換え」ベクターを、選択可能マーカー遺伝子を含むような様式で構築できる。選択可能マーカー遺伝子は、５’および３’の両方の端で、相同組換えを媒介するのに十分な長さの遺伝子の部分に作動可能に結合できる。選択可能マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補完するかまたは抗生物質耐性をもたらす任意の数の遺伝子の１つであり得、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２およびＨＩＳ３遺伝子を含む。その他の適切な選択可能マーカーは、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を付与するＣＡＴ遺伝子、またはβ−ガラクトシダーゼの発現により青色コロニーをもたらすｌａｃＺ遺伝子を含む。遺伝子置き換えベクターの直鎖状にしたＤＮＡ断片を、次いで、細胞に、当技術分野において周知の方法を用いて導入する（以下を参照されたい）。ゲノムへの直鎖状断片の組み込みおよび遺伝子破壊は、選択マーカーに基づいて決定でき、例えばサザンブロット分析により確認できる。
【００４２】
付随の実施例に詳細に示すように、選択におけるその使用の後に、選択可能マーカーを宿主細胞のゲノムから、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰ系により除去できる（以下を参照されたい）。マーカー除去のこのプロセスは、実施例を通して「キュアリング」という。
【００４３】
代わりに、遺伝子置き換えベクターは、破壊する遺伝子の部分を含むような様式で構築でき、ここで、この部分は、いずれの内因性遺伝子プロモーター配列がなく、その遺伝子のコード配列をコードしないかまたは該コード配列の不活性断片をコードする。「不活性断片」は、例えば遺伝子の全長コード配列から生成されるタンパク質の活性の約１０％未満（例えば約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満または０％）を有するタンパク質をコードする遺伝子の断片である。遺伝子のこのような部分は、既知のプロモーター配列は遺伝子配列に作動可能に結合されていないが、停止コドンおよび転写終結配列が遺伝子配列のこの部分と作動可能に結合されているような様式でベクターに挿入される。このベクターは、その後、遺伝子配列のこの部分で直鎖状にして、細胞を形質転換できる。単一の相同組換えにより、この直鎖状にしたベクターを、次いで、その遺伝子の内因性対応物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）に組み込む。
【００４４】
発現ベクターは、自律型または組み込み型であり得る。
【００４５】
組換え核酸を、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミドまたはウイルス粒子のような発現ベクターの形態で細胞に導入できる。組換え核酸は、染色体外で維持できるか、またはこれを酵母細胞染色体ＤＮＡに組み込むことができる。発現ベクターは、選択された条件下で細胞生存性に要求されるタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子（例えばウラシル生合成のために必要な酵素をコードするＵＲＡ３、またはトリプトファン生合成に要求される酵素をコードするＴＲＰ１）を含有して、所望の核酸で形質転換されたこれらの細胞の検出および／または選択を許容できる（例えば米国特許第４，７０４，３６２号を参照されたい）。発現ベクターは、自己複製配列（ＡＲＳ）も含むことができる。例えば、米国特許第４，８３７，１４８号は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中でプラスミドを維持するために適切な手段を提供する自己複製配列について記載している。
【００４６】
組み込み型ベクターが、例えば米国特許第４，８８２，２７９号に開示されている。組み込み型ベクターは、一般的に、少なくとも第１挿入可能ＤＮＡ断片と、選択可能マーカー遺伝子と、第２挿入可能ＤＮＡ断片との連続的に配置された配列を含む。第１および第２の挿入可能ＤＮＡ断片は、それぞれ、約２００（例えば約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００または約１０００以上）ヌクレオチドの長さであり、形質転換される種のゲノムＤＮＡの部分に相同なヌクレオチド配列を有する。発現のための目的の遺伝子（例えばＮ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子）を含有するヌクレオチド配列は、第１および第２の挿入可能ＤＮＡ断片の間で、マーカー遺伝子の前かその後のいずれかにおいて、このベクターに挿入される。組み込み型ベクターを酵母形質転換の前に直鎖状にして、宿主細胞ゲノムへの目的のヌクレオチド配列の組み込みを容易にすることができる。
【００４７】
発現ベクターは、それらを酵母で発現させることを可能にする酵母（例えばＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓまたはその他の関連する二形性酵母種）プロモーターの制御下の組換え核酸を特徴とすることができる。適切な酵母プロモーターは、ＴＥＦ１、ＨＰ４Ｄ、ＧＡＰ、ＰＯＸ２、ＡＤＣ１、ＴＰＩ１、ＡＤＨ２、ＰＯＸおよびＧａｌ１０プロモーターを含む。例えばＭａｄｚａｋら（２０００年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２巻：２０７〜２１６頁；Ｇｕａｒｅｎｔｅら（１９８２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ７９巻（２３号）：７４１０頁を参照されたい。さらなる適切なプロモーターは、例えばＺｈｕおよびＺｈａｎｇ（１９９９年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１５巻（７〜８号）：６０８〜６１１頁および米国特許第６，２６５，１８５号に記載されている。発現ベクターが哺乳類細胞のような動物細胞に導入される場合、発現ベクターは、目的の宿主細胞での発現に適切な動物細胞プロモーターの制御下の組換え核酸を特徴とすることができる。哺乳類プロモーターの例は、ＳＶ４０およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。
【００４８】
プロモーターは、構成性（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）または誘導性（条件的）であり得る。構成性プロモーターは、その発現が標準的培養条件下で一定であるプロモーターであると理解される。誘導性プロモーターは、１つ以上の誘導指示（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｕｅ）に応答性であるプロモーターである。例えば、誘導性プロモーターは、化学的に調節され得る（例えばその転写活性が、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属またはその他の小分子のような化学的誘導物質の存在または非存在により調節されるプロモーター）か、または物理的に調節され得る（例えばその転写活性が、光または高温もしくは低温のような物理的誘導因子の存在または非存在により調節されるプロモーター）。誘導性プロモーターは、それら自体が化学的もしくは物理的な指示により直接調節される１つ以上の転写因子により間接的に調節されることもできる。
【００４９】
細胞の遺伝子工学的改変は、宿主細胞に存在するが、その細胞で通常は発現されないかまたはその細胞で著しいレベルでは発現されない内因性遺伝子（例えばＮ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子）を活性化することも含む。例えば、内因性遺伝子の調節配列（例えば遺伝子プロモーターまたはエンハンサー）を、作動可能に結合したコード配列が発現の増加を示すように改変できる。相同組換えまたはターゲティングを用いて、遺伝子と通常関連する調節領域を、対応する遺伝子工学的に改変されていない細胞で明らかなレベルよりも高いレベルで遺伝子を発現させるか、または対応する遺伝子工学的に改変されていない細胞で明らかなものとは異なる調節もしくは誘導のパターンを遺伝子が示すようにする調節配列で置き換えるかあるいは不能にすることができる。遺伝子の調節配列（例えばプロモーターまたはエンハンサー）の変更を導入するために適切な方法は、例えば米国特許出願公開第２００３０１４７８６８号に記載されている。
【００５０】
その他の遺伝子工学的に作製された改変も、条件的であり得ることが理解される。例えば、遺伝子は、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰ系のような部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを用いて条件的に欠失できる（例えばＧｏｓｓｅｎら（２００２年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ３６巻：１５３〜１７３頁および米国特許出願公開第２００６００１４２６４号を参照されたい）。
【００５１】
組換え核酸は、本明細書で記載する細胞に、スフェロプラスト技術または全細胞塩化リチウム酵母形質転換法のような様々な方法を用いて導入できる。プラスミドまたは直鎖状核酸ベクターで細胞を形質転換するために有用なその他の方法は、例えば米国特許第４，９２９，５５５号；Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ７５巻：１９２９頁；Ｉｔｏら（１９８３年）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３巻：１６３頁；米国特許第４，８７９，２３１号；ならびにＳｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら（１９８７年）Ｇｅｎｅ５９巻：１１５頁に記載されている。エレクトロポレーションおよびＰＥＧ１０００全細胞形質転換手順も、ＣｒｅｇｇおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第３章、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．、２７〜３９頁（１９９８年）に記載されるようにして用いることができる。動物細胞のトランスフェクションは、例えば、ベクターを細胞に、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、熱ショック、リポソーム、またはＦＵＧＥＮＥ（登録商標）もしくはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）のようなトランスフェクション試薬を用いて、あるいは裸の核酸ベクターを細胞と溶液中で接触させることにより導入することを特徴とすることができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版１、２および３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ、１９８９年１１月を参照されたい）。
【００５２】
形質転換酵母細胞は、それらに限定されないが、形質転換後の栄養要求性細胞を、要求される生化学的生成物の非存在下で培養すること（細胞の栄養要求性による）、新しい表現型についての選択およびその検出、または形質転換体に含有される耐性遺伝子の非存在下で酵母にとって毒性がある抗生物質の存在下で培養することを含む適当な技術を用いて選択できる。形質転換体は、ゲノムへの発現カセットの組み込みにより選択および／または確認することもでき、これは、例えばサザンブロットまたはＰＣＲ分析により評価することができる。
【００５３】
目的の標的細胞にベクターを導入する前に、ベクターを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞中で増殖（例えば増幅）させることができる。ベクターＤＮＡを、細菌細胞から、細菌環境からのベクターＤＮＡの精製をもたらす当技術分野において公知の方法のいずれかにより単離できる。精製ベクターＤＮＡは、フェノール、クロロホルムおよびエーテルを用いて広く抽出して、プラスミドＤＮＡ調製物中にＥ．ｃｏｌｉタンパク質が存在しないことを確実にできる。なぜなら、これらのタンパク質は、哺乳類細胞にとって有毒であり得るからである。
【００５４】
遺伝子工学的改変は、本明細書で記載する場合、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする任意の数の遺伝子を発現（例えば過剰発現）するか、該遺伝子に改変を導入するか、または該遺伝子を欠失させるために用いることができる。このようなタンパク質は、例えば、ＯＣＨ１、ＡＬＧ３、α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼ、ＧｎＴ  Ｉ、マンノシダーゼＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩ、グルコシダーゼＩＩまたはＧａｌ  Ｔを含む。Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、このような遺伝子を含有する任意の種に由来し得る。Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を得ることができる例示的な真菌種は、限定することなく、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｒｓｏｎｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆａｒｉｎｏｓｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｌｕｘｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｖａｌｉｄａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｓｃａｌａｐｈｉｄａｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｍｐｈｉｘｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｔｌａｎｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｔｍｏｓｐｈａｅｒｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｌａｔｔａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｒｐｏｐｈｉｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｈａｕｌｉｏｄｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｏｒｙｄａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｏｓｓｅｙｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｒｇａｔｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｒｕｃｔｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｓｅｃｔａｍｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｓｅｃｔｏｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｊｅｆｆｒｅｓｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｙｘｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｉｌｌｅｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｏｌｅｏｐｈｉｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｏｒｅｇｏｎｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｅｍｎｏｃｈｉｌａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｅｎｕｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｓｕｃｈｉｙａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｉｎｏｌａｂｏｒａｎｔｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｏｊａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｈｏｄａｔｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅ��ａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｎｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｓｃｕｌｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｒｏｂｅｒｔｓｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｉｔｏｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｒａｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｅｒｒｉｃｏｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｖａｎｒｉｊｉ、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｍｄｓｈｕｒｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｉｇｕｏｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｌｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｗｉｌｌｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ  ｌｕｄｗｉｇｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｃａｐｓｕｌａｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ、Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ  ｈｏｒｄｅｉ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｏｂｕｌｉｇｅｒａ．  Ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒａ  ｓａｉｔｏｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄａｉｒｅｎｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｒｏｓｅｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ、Ｄｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｇｌｏｂｏｓａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌｏｂｏ���ａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｓａｔｕｒｎｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｄｉｓｐｏｒｕａ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒａｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｌｌｉｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｏｒｉａｎｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉｍ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｊｏｒ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｓｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｒｓｏｎｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆａｒｉｎｏｓｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｌｕｘｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｒｏｂｅｒｔｓｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ  ｌｕｄｗｉｇｉｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｇｌｏｂｏｓａ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｓａｔｕｒｎｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｌｌｉｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉまたは当技術分野で公知であるかもしくは本明細書で記載する任意のその他の真菌（例えば酵母）を含む。例示的な下等真核生物は、それらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｅｓｉｅｌｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｎｄｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｒｎｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｄｅｆｌｅｃｔｕｓ��Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｇｌａｕｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｉｄｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓｔｕｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの様々な種も含む。Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を得ることができる例示的な原生動物の属は、限定することなく、Ｂｌａｓｔｏｃｒｉｔｈｉｄｉａ、Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｒｙｐａｎｕｍ、Ｈｅｒｐｅｔｏｍｏｎａｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｌｅｐｔｏｍｏｎａｓ、Ｐｈｙｔｏｍｏｎａｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ（例えばＴ．ｂｒｕｃｅｉｉ、Ｔ．ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、Ｔ．ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅおよびＴ．ｃｒｕｚｉ）およびＷａｌｌａｃｅｉｎａを含む。例えば、ＧｎＴ  Ｉをコードする遺伝子は、ヒト（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｐ２６５７２）、ラット、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、マウスまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａから得ることができ、ＧｎｔＩＩをコードする遺伝子は、ヒト、ラット（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｑ０９３２６）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓまたはマウスから得ることができ、Ｍａｎ  ＩＩをコードする遺伝子は、ヒト、ラット、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、マウス、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｑ２４４５１）から得ることができ、ＧａｌＴをコードする遺伝子は、ヒト（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｐ１５２９１）、ラット、マウスまたはウシから得ることができる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に改変された細胞は、ＯＣＨ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ５６３９２０）遺伝子またはその遺伝子生成物（ｍＲＮＡまたはタンパク質）を欠く。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に改変された細胞は、ＡＬＧ３（Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号ＸＭ＿５０３４８８、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ参照：ＹＡＬＩ０Ｅ０３１９０ｇ）遺伝子またはその遺伝子生成物（ｍＲＮＡまたはタンパク質）を欠く。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に改変された細胞は、α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼ（例えばＡＬＧ６、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号ＸＭ＿５０２９２２、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ参照：ＹＡＬＩ０Ｄ１７０２８ｇ）タンパク質を発現（例えば過剰発現）する。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に改変された細胞は、α−１，２−マンノシダーゼ（例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２１２１５３）タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に改変された細胞は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（例えばＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．受託番号Ｐ２６５７２）タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に改変された細胞は、マンノシダーゼＩＩタンパク質またはその触媒ドメイン（例えばＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．受託番号Ｑ２４４５１）を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に改変された細胞は、ガラクトシルトランスフェラーゼＩタンパク質またはその触媒ドメイン（例えばＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．受託番号Ｐ１５２９１）を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に改変された細胞は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩタンパク質またはその触媒ドメイン（例えばＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．受託番号Ｑ０９３２６）を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に改変された細胞は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグルコシダーゼＩＩのようなグルコシダーゼＩＩのアルファまたはベータサブユニット（またはアルファおよびベータの両方のサブユニット）を発現する。遺伝子工学的に改変された細胞は、これらの改変の任意の組み合わせを有することができる。
【００５６】
例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に改変された細胞は、ＯＣＨ１遺伝子を欠き、α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ、マンノシダーゼＩＩおよびガラクトシルトランスフェラーゼＩを発現できる。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に改変された細胞は、ＡＬＧ３遺伝子を欠き、α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩおよびガラクトシルトランスフェラーゼＩを発現できる。このような遺伝子工学的に改変された細胞は、α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼをさらに発現し、かつ／またはグルコシダーゼＩＩのアルファおよびベータサブユニットを発現し、かつ／またはＯＣＨ１遺伝子を欠くことができる。
【００５７】
このようなタンパク質の１つ以上は、異種ターゲティング配列を含有する融合タンパク質であり得る。例えば、α−１，２−マンノシダーゼは、ＨＤＥＬ小胞体（ＥＲ）保持アミノ酸配列を有することができる（実施例を参照されたい）。Ｎ−グリコシル化活性を有する任意のタンパク質を、ＨＤＥＬ配列を含む融合タンパク質中に工学的に作製できることが理解される。その他のタンパク質は、タンパク質をゴルジ装置に向かわせるための異種配列を有することができる。例えば、酵母Ｋｒｅ２ｐ遺伝子によりコードされる最初の１００個のＮ末端アミノ酸、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍｎｎ２遺伝子によりコードされる最初の３６個のＮ末端アミノ酸（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．受託番号Ｐ３８０６９）またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍｎｎ２ｐ遺伝子によりコードされる最初の４６個のＮ末端アミノ酸を用いて、タンパク質をゴルジに向かわせることができる。そのままで、真菌細胞で発現されるタンパク質をコードする核酸は、コードされたタンパク質を細胞内区画に向かわせるためのターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、α−１，２−マンノシダーゼをＥＲに向かわせることができ、ＧｎＴ  Ｉ、ＧｎＴＩＩ、マンノシダーゼおよびＧａｌ  Ｔをゴルジに向かわせることができる。
【００５８】
Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、該タンパク質を発現させる細胞とは異なる型（例えば異なる種）のタンパク質である細胞に由来する実施形態では、タンパク質をコードする核酸は、特定の目的の細胞における発現のためにコドン最適化できる。例えば、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉからのＮ−グリコシル化を有するタンパク質をコードする核酸は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのような酵母細胞での発現のためにコドン最適化できる。このようなコドン最適化は、目的の細胞でのタンパク質の発現を増加させるために有用になり得る。タンパク質をコードする核酸をコドン最適化するための方法は、当技術分野において公知であり、例えばＧａｏら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．（２００４年）２０巻（２号）：４４３〜４４８頁）、Ｋｏｔｕｌａら（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．（１９９１年）９巻、１３８６〜１３８９頁）およびＢｅｎｎｅｔｚｅｎら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９８２年）２５７巻（６号）：２０３６〜３０３１頁）に記載されている。表１は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａについてのコドン使用頻度を示す。データは、５，９６７のコード配列に存在する２，９４５，９１９のコドンに由来した。表１の内容は、コドン使用頻度データベース（Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）から得たが、これは、ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝２８４５９１のワールドワイドウェブで見出すことができる。
【００５９】
【表１】
2013511272.tif 000003
いくつかの実施形態では、ヒトタンパク質を細胞に導入でき、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上の内因性酵母タンパク質を抑制（例えば欠失または変異）できる。真菌グリコシル化経路を「ヒト化」するための技術は、例えばＣｈｏｉら（２００３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ１００巻（９号）：５０２２〜５０２７頁；Ｖｅｒｖｅｃｋｅｎら（２００４年）Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂ．７０巻（５号）：２６３９〜２６４６頁；およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ（２００４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２巻（１１号）：１４１０〜１４１４頁に記載されている。
【００６０】
遺伝子工学的改変が例えばタンパク質の発現の変化または外因性タンパク質（内因性タンパク質の変異形態を含む）の発現を含む場合、遺伝子工学的に改変された細胞がタンパク質を発現するかを決定するために様々な技術を用いることができる。例えば、タンパク質をコードするｍＲＮＡまたはタンパク質自体の存在を、例えばノザンブロットもしくはＲＴ−ＰＣＲ分析またはウェスタンブロット分析をそれぞれ用いて検出できる。Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の細胞内局在化は、細胞成分分画（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）および免疫蛍光を含む様々な技術を用いることにより分析できる。
【００６１】
標的分子のグリコシル化を検出する方法は、ＤＮＡシーケンサー支援（ＤＳＡ）、蛍光体支援糖質電気泳動（ＦＡＣＥ）または表面増強型レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を含む。例えば、分析は、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを利用でき、ここでは、例えば、糖タンパク質を変性させ、その後、例えばメンブレン上に固定化する。糖タンパク質は、次いで、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはβ−メルカプトエタノールのような適切な還元剤を用いて還元できる。タンパク質のスルフヒドリル基は、ヨード酢酸のような酸を用いてカルボキシル化できる。次に、Ｎ−グリコシダーゼＦのような酵素を用いてＮ−グリカンをタンパク質から切り離すことできる。Ｎ−グリカンは、必要に応じて、再構成して、還元的アミノ化により誘導体化できる。誘導体化Ｎ−グリカンは、次いで、濃縮できる。Ｎ−グリカン分析のために適切な装置は、例えばＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７  ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含む。データ解析は、例えばＧＥＮＥＳＣＡＮ（登録商標）３．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行うことができる。必要に応じて、単離マンノタンパク質（ｍａｎｎｏｐｒｏｔｅｉｎ）は、１種以上の酵素でさらに処理して、それらのＮ−グリカン状態を確認できる。Ｎ−グリカン分析のさらなる方法は、例えば質量分析（例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、順相（ｎｏｒｍａｌ  ｐｈａｓｅ）、逆相での高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびイオン交換クロマトグラフィー（例えばグリカンが標識されていない場合にパルス電流滴定検出を用いて、またグリカンが適当に標識されているならばＵＶ吸収もしくは蛍光を用いて）を含む。Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔら（２００１年）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１１巻（４号）：２７５〜２８１頁およびＦｒｅｉｒｅら（２００６年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．１７巻（２号）：５５９〜５６４頁も参照されたい。
【００６２】
遺伝子工学的に改変された細胞の遺伝子改変のいずれかが、誘導指示（例えば化学的または物理的指示）の存在によって誘導性または条件的である場合、遺伝子工学的に改変された細胞は、必要に応じて、核酸の導入前、導入中または導入後に誘導剤の存在下で培養できる。例えば、標的タンパク質をコードする核酸の導入の後に、細胞を、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質の発現を促進できる化学的誘導剤に曝露できる。複数の誘導指示が、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質の条件的発現を誘導する場合、細胞は、複数の誘導剤と接触できる。
【００６３】
所望のＮ−グリカンを含むように改変された標的分子は、遺伝子工学的に改変された細胞から単離できる。改変された標的分子を、酵母細胞内で維持し、細胞溶解の際に遊離できるか、または改変標的分子を、細胞からの分子の分泌を誘導するコード配列（外因性核酸に本来備わっているかまたは発現ベクター中に工学的に作製されたかのいずれか）によりもたらされる機構により培養培地中に分泌させることができる。細胞溶解産物または培養培地中の改変標的分子の存在は、その分子の存在を検出するための様々な標準的プロトコールにより確認できる。例えば、変更された標的分子がタンパク質である場合、このようなプロトコールは、それらに限定されないが、変更された標的タンパク質（または標的タンパク質自体）に特異的な抗体を用いる免疫ブロッティングもしくは放射性免疫沈降法、変更された標的タンパク質（または標的タンパク質自体）に特異的なリガンドの結合、または改変された標的タンパク質（または標的タンパク質自体）の特異的酵素活性の試験を含むことができる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に改変された細胞から単離される標的分子の少なくとも約２５％は、所望のＮ−グリカンを含有する。例えば、遺伝子工学的に改変された細胞から単離される標的分子の少なくとも約２７％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％または少なくとも約９９％が、所望のＮ−グリカンを含有できる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載する方法を用いて生成される標的分子において、糖タンパク質上のＮ−グリカンの少なくとも５０％（例えば少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０または８５％）は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンであり得る。ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンのパーセンテージは、ＤＳＡ−ＦＡＣＥ電気泳動図中のピーク面積から見積もることができる。実施例１３を参照されたい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、単離改変標的分子は、凍結、凍結乾燥または固定化して、例えば変更された標的分子が生物活性を保持することを可能にする適当な条件下で貯蔵できる。
【００６７】
工学的に改変された細胞の培養
この文書は、本明細書で記載する遺伝子工学的に改変された細胞のいずれかの実質的に純粋な培養物も提供する。本明細書で用いる場合、遺伝子工学的に改変された細胞の「実質的に純粋な培養物」は、この細胞の培養物であって、培養物中の生存細胞の合計数の約４０％未満（すなわち約３５％；約３０％；約２５％；約２０％；約１５％；約１０％；約５％；約２％；約１％；約０．５％；約０．２５％；約０．１％；約０．０１％；約０．００１％；約０．０００１％またはさらにはそれ未満）が遺伝子工学的に改変された細胞以外の生存細胞、例えば細菌、真菌（酵母を含む）、マイコプラズマまたは原生生物の細胞である培養物である。この状況での用語「約」は、関連するパーセンテージが、特定されたパーセンテージより１５％上または下であり得ることを意味する。つまり、例えば、約２０％は、１７％〜２３％であり得る。遺伝子工学的に改変された細胞のこのような培養物は、細胞と、増殖培地、貯蔵培地または輸送培地とを含む。培地は、液体、半固体（例えばゼラチン状培地）、または凍結したものであり得る。培養物は、液体培地中または半固体培地中／上で増殖しているか、あるいは凍結貯蔵培地もしくは輸送培地を含む貯蔵培地または輸送培地中で貯蔵または輸送されている細胞を含む。培養物は、培養容器または貯蔵容器または基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（例えば培養皿、フラスコもしくは試験管または貯蔵バイアルもしくは貯蔵試験管）中にある。
【００６８】
本明細書で記載する遺伝子工学的に改変された細胞は、例えば、例えばグリセロールもしくはスクロースのような凍結保護物質を含有するバッファー中での凍結細胞懸濁物として、凍結乾燥細胞として貯蔵できる。代わりに、これらは、例えば流動床乾燥もしくは噴霧乾燥または任意のその他の適切な乾燥方法により得られる乾燥細胞調製物として貯蔵できる。
【００６９】
変更されたＮ−グリコシル化分子により処置可能な障害
所望のＮ−グリカンを含有するように改変された単離標的分子は、代謝障害、がんおよび炎症性障害を含む様々な障害を処置するために用いることができる。
【００７０】
（ｉ）代謝障害
代謝障害は、個別のヒト（または動物）細胞内でエネルギーの生成に影響する障害である。ほとんどの代謝障害は遺伝的であるが、いくつかは、食餌、毒素、感染症などの結果として「後天性」であり得る。遺伝性代謝障害は、先天性代謝異常としても公知である。一般的に、遺伝性代謝障害は、遺伝子欠陥により引き起こされ、これにより、細胞の代謝プロセスにおけるいくつかのステップに必要な酵素がなくなるかまたは誤って構築される。代謝障害の最大のクラスは、炭水化物代謝障害、アミノ酸代謝障害、有機酸代謝障害（有機酸性尿症）、脂肪酸酸化およびミトコンドリア代謝障害、ポルフィリン代謝障害、プリンまたはピリミジン代謝障害、ステロイド代謝障害、ミトコンドリア機能障害、ペルオキシソーム機能障害ならびにリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）である。
【００７１】
本明細書で記載する１つまた複数のグリコシル化分子（またはその薬学的組成物）の投与により処置できる代謝障害の例は、遺伝性ヘモクロマトーシス、眼皮膚白皮症、プロテインＣ欠損症、Ｉ型遺伝性血管浮腫、先天性スクラーゼ−イソマルターゼ欠損症、クリグラー−ナジャー症候群ＩＩ型、ラロン症候群、遺伝性ミエロペルオキシダーゼ、原発性甲状腺機能低下症、先天性ＱＴ延長症候群、チロキシン（ｔｙｒｏｘｉｎｅ）結合グロブリン欠損症、家族性高コレステロール血症、家族性カイロミクロン血症、無ベータリポタンパク質血症、低血漿リポタンパク質Ａレベル、肝臓損傷を伴う遺伝性気腫、先天性甲状腺機能低下症、骨形成不全症、遺伝性低フィブリノゲン血症、アルファ−１アンチキモトリプシン欠損症、腎性尿崩症、神経下垂体性尿崩症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、ペリツェウスメルツバッヘル病、フォンウィルブランド病ＩＩＡ型、第Ｖ、ＶＩＩＩ因子合併欠損症（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ  Ｖ  ａｎｄ  ＶＩＩＩ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、遅発性脊椎骨端異形成症、コロイデレミア、Ｉ細胞病、バッテン病、毛細血管拡張性運動失調、ＡＤＰＫＤ−常染色体優性多嚢胞性腎疾患、微絨毛封入体病、結節硬化症、ロウ眼脳腎症候群、筋委縮性側策硬化症、骨髄異形成症候群、不全リンパ球症候群、タンジール病、家族性肝内胆汁うっ滞、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、スコット症候群、ヘルマンスキー−プドラック症候群１型および２型、ツェルウェガー症候群、近節短縮性点状軟骨異形成症、常染色体劣性原発性高シュウ酸尿症、モーアトラネジャーグ症候群、球脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ  ａｎｄ  ｂｕｌｌａｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、原発性線毛運動不全（ｄｉｓｋｅｎｅｓｉａ）（カルタゲナー症候群）、巨人症および先端巨大症、乳汁漏出症、アジソン病、副腎性男性化、クッシング症候群、ケトアシドーシス、原発性または続発性アルドステロン症、ミラーディーカー症候群、脳回欠損、運動ニューロン疾患、アッシャー症候群、ウィスコット−アルドリッチ症候群、オピッツ（Ｏｐｔｉｚ）症候群、ハンチントン病、遺伝性膵炎、抗リン脂質抗体症候群、オーバーラップ結合組織病、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、ブルガダ症候群、フィンランド型先天性腎炎症候群、デュビン−ジョンソン症候群、Ｘ連鎖低リン酸血症（ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉａ）、ペンドレッド症候群、新生児持続性高インスリン血症性低血糖症、遺伝性球状赤血球症、無セルロプラスミン血症、乳児性神経セロイドリポフスチン沈着症、偽軟骨形成不全および多発性骨端骨異形成（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ）、シュタルガルト様黄斑ジストロフィー、Ｘ連鎖シャコール−マリー−トゥース病、常染色体優性網膜色素変性、ウォルコット−ラリソン症候群、クッシング病、肢帯筋ジストロフィー、ムコ多糖症ＩＶ型、フィンランド型遺伝性家族性アミロイドーシス、アンダーソン病、肉腫、慢性骨髄単球性白血病、心筋症、顔面生殖器異形成、捻転ジストニア（Ｔｏｒｓｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントンおよび脊髄小脳運動失調、遺伝性高ホモシステイン血症（ｈｙｐｅｒｈｏｍｏｓｙｔｅｉｎｅｍｉａ）、多発ニューロパチ��、下位運動ニューロン疾患、色素性網膜炎、血清反応陰性多発性関節炎、間質性肺線維症、レイノー現象、ウェゲナー（Ｗｅｇｎｅｒ’ｓ）肉芽腫症、タンパク尿（ｐｒｅｏｔｅｉｎｕｒｉａ）、ＣＤＧ−Ｉａ、ＣＤＧ−Ｉｂ、ＣＤＧ−Ｉｃ、ＣＤＧ−Ｉｄ、ＣＤＧ−Ｉｅ、ＣＤＧ−Ｉｆ、ＣＤＧ−ＩＩａ、ＣＤＧ−ＩＩｂ、ＣＤＧ−ＩＩｃ、ＣＤＧ−ＩＩｄ、エーラース−ダンロス症候群、多発性外骨腫症、グリセリ症候群（１型または２型）、あるいはＸ連鎖非特異性精神遅滞を含み得る。さらに、代謝障害は、それらに限定されないが、ファブリー病、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１−ガングリオシド−シス、テイ−サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２活性化因子病（ＧＭ２  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン−ピック病（Ａ型、Ｂ型およびＣ型）、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー−ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、マンノシドーシス、シンドラー病、シアリドーシス１型、ポンぺ病、濃化異骨症（Ｐｙｃｎｏｄｙｓｏｓｔｏｓｉｓ）、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、多種スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピド−シス（ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型）、シスチン症、シアル酸蓄積症、マリネスコ−シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン保持病、ヘルマンスキー−プドラック症候群、チェディアック−東症候群、ダノン病または幸福顔貌骨異形成（Ｇｅｌｅｏｐｈｙｓｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）のようなリソソーム蓄積症も含み得る。
【００７２】
代謝障害の症状は多数で多様であり、例えば貧血、疲労、容易に挫傷すること、血液中の血小板低下、肝腫大、脾腫大、骨格脆弱、肺機能障害、感染症（例えば胸部感染症または肺炎）、腎臓機能障害、進行性脳損傷、発作、過剰に粘稠な胎便、咳、喘鳴、過剰な唾液もしくは粘液生成、息切れ、腹痛、腸または消化管（ｂｏｗｅｌ  ｏｒ  ｇｕｔ）の閉塞、生殖能力の問題、鼻内のポリープ、ばち指／足指の爪および皮膚、手もしくは足の疼痛、被角血管腫、発汗低下、角膜および水晶体の混濁、白内障、僧帽弁の逸脱および／もしくは逆流、心肥大、温度不耐、歩行困難、嚥下困難、進行性視力喪失、進行性聴力喪失、緊張低下、巨舌症、反射消失、腰痛、睡眠時無呼吸、起坐呼吸、傾眠、脊柱前弯または脊柱側弯の１つ以上を含み得る。欠陥のあるまたは存在しないタンパク質およびその結果としての疾患の表現型（例えば代謝障害の症状の現れ）の性質が多様なので、ある所定の障害は、その特定の障害に特徴的な症状だけを一般的に示す。例えば、ファブリー病の患者は、それらに限定されないが、温度不耐、角膜渦状化、疼痛、皮膚の発疹、悪心または下痢（ｄｉｒａｒｒｈｅａ）のような上記の症状の特定の部分集合を示し得る。ゴーシェ症候群の患者は、巨脾腫、肝硬変、痙攣、緊張亢進、無呼吸、骨粗鬆症または皮膚変色を示し得る。
【００７３】
本明細書で記載する１つ以上の分子を投与することに加えて、代謝障害は、適当な栄養素およびビタミン（例えば補助因子療法）、理学療法および疼痛薬物療法により処置することもできる。
【００７４】
ある所定の代謝障害の特定の性質に依存して、患者は、これらの症状をいずれの年齢でも示すことができる。多くの場合では、症状は小児期または早期成人期に現れ得る。例えば、ファブリー病の症状は、早い年齢、例えば１０または１１歳で現れることがある。
【００７５】
本明細書で用いる場合、「代謝障害を発生する危険性がある」被験体は、障害を発生する素因、すなわちアルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ベータ−ヘキソサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−マンノシダーゼ、アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、アルファ−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−Ｄ−グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、アルファ−Ｌ−マンノシダーゼ、アルファ−ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒｏｍｉｎｉｄａｓｅ）、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ（ｓｐｈｉｎｏｇｍｙｅｌｉｎａｓｅ）、チオエステラーゼ、カテプシンＫまたはリポタンパク質リパーゼのような酵素の変異の結果として代謝障害を発生する遺伝的素因を有する被験体である。明らかに、「代謝障害を発生する危険性がある」被験体は、目的の種内の被験体全てではない。
【００７６】
「障害を有することが疑われる」被験体は、本明細書で記載するもののような障害の１つ以上の症状を有する被験体である。
【００７７】
（ｉｉ）がん
がんは、細胞の制御されない分裂と、浸潤により隣接組織内で直接成長することまたは転移（がん細胞が血流またはリンパ系を通して輸送される場合）により離れた部位へ植え込まれることのいずれかによりそれらが広がる能力とを特徴とする。がんは、全ての年齢の人が罹患し得るが、危険性は年齢とともに増加する傾向にある。がんの型は、例えば肺がん、乳がん、結腸がん、膵臓がん、腎がん、胃がん、肝臓がん、骨がん、血液のがん、神経組織がん、黒色腫、甲状腺がん、卵巣がん、精巣がん、前立腺がん、子宮頚がん、膣がんまたは膀胱がんを含み得る。
【００７８】
本明細書で用いる場合、「がんを発生する危険性がある」被検体は、がんを発生する素因、すなわち腫瘍抑制遺伝子における変異（例えばＢＲＣＡ１、ｐ５３、ＲＢまたはＡＰＣにおける変異）のようながんを発生する遺伝的素因を有するか、またはがんをもたらし得る条件に曝露された被験体である。つまり、被験体は、変異原性または発癌性のレベルの特定の化合物（例えばアクロレイン、ヒ素、ベンゼン、ベンズ｛ａ｝アントラセン、ベンゾ｛ａ｝ピレン、ポロニウム−２１０（ラドン）、ウレタンまたは塩化ビニルのような煙草の煙の中の発癌性化合物）に曝露された場合、該被験体は、「がんを発生する危険性がある」ものであり得る。さらに、被験体は、例えば高い線量の紫外線またはＸ線照射に曝露されたかまたはパピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスまたはヒトＴ細胞白血病−リンパ腫ウイルスのような腫瘍の原因となる／腫瘍と関連するウイルスに曝露された（例えば感染した）場合、該被験体は、「がんを発生する危険性がある」ことができる。上記のことから、「がんを発生する危険性がある」被験体は、目的の種内の被験体全てではないことが明らかである。
【００７９】
「がんを有することが疑われる」被験体は、がんの１つ以上の症状を有する被験体である。がんの症状は当業者に周知であり、限定されることなく、乳房腫瘤、乳頭変化、乳房嚢胞、胸部痛、体重減少、脱力、過剰な疲労、摂食困難、食欲喪失、慢性の咳、息切れの悪化、咳による血液排出（ｃｏｕｇｈｉｎｇ  ｕｐ  ｂｌｏｏｄ）、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部肥満（ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｆｕｌｌｎｅｓｓ）、鼓脹、腹膜腔内の流体、膣出血、便秘、腹部膨満（ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｄｉｓｔｅｎｓｉｏｎ）、結腸穿孔、急性腹膜炎（感染、発熱、疼痛）、疼痛、吐血（ｖｏｍｉｔｉｎｇ  ｂｌｏｏｄ）、重度の発汗、発熱、高い血圧、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋肉攣縮、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難などを含む。上記のことから、「がんを有することが疑われる」被験体は、目的の種内の被験体全てではないことが明らかである。
【００８０】
本明細書で記載する１つ以上の変更されたＮ−グリコシル化分子の投与に加えて、がんは、化学療法剤、電離放射線、免疫療法剤または温熱療法剤によっても処置できる。化学療法剤は、例えばシスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、アドリアマイシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド、ベラパミル（ｖｅｒａｍｐｉｌ）、ポドフィロトキシン、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセートを含む。
【００８１】
（ｉｉｉ）炎症性障害
「炎症性障害」は、本明細書で用いる場合、１つ以上の物質（例えば被験体において天然に生じない物質）が、白血球細胞（例えばＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、単球または樹状細胞）の作用により、病的応答、例えば病的免疫応答を不適当に引き起こすプロセスのことをいう。よって、炎症性応答に関与するこのような細胞は、「炎症性細胞」という。不適当に引き起こされる炎症性応答は、外来物質（例えば抗原、ウイルス、細菌、真菌）が被験体内または被験体上に存在しないものであり得る。不適当に引き起こされる応答は、自己成分（例えば自己抗原）が炎症性細胞により標的にされるものであり得る（例えば多発性硬化症のような自己免疫障害）。不適当に引き起こされる応答は、大きさまたは持続期間が不適当である応答、例えばアナフィラキシーでもあり得る。つまり、不適当に標的にされる応答は、微生物感染（例えばウイルス、細菌または真菌）の存在によることができる。炎症性障害の型（例えば自己免疫疾患）は、それらに限定されないが、変形性関節症、関節リウマチ（ＲＡ）、脊椎関節症（ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）、ＰＯＥＭＳ症候群、クローン病、多中心性キャッスルマン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋ジストロフィー（ＭＤ）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、皮膚筋炎、多発性筋炎、ギランバレー症候群のような炎症性神経障害、ウェゲナー肉芽腫症のような血管炎、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、側頭動脈炎、シェーグレン症候群、ベーチェット（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ）病、チャーグ−ストラウス症候群または高安動脈炎を含み得る。鼻炎、副鼻腔炎、じんま疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）、じんま疹（ｈｉｖｅｓ）、血管浮腫、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー（例えばナッツアレルギー）、薬物アレルギー（例えばペニシリン）、昆虫アレルギー（例えばハチ刺傷に対するアレルギー）のような特定の型のアレルギーまたは肥満細胞症も炎症性障害に含まれる。炎症性障害は、潰瘍性大腸炎および喘息も含み得る。
【００８２】
「炎症性障害を発生する危険性がある」被験体とは、１種以上の炎症性障害の家族歴（例えば１種以上の炎症性障害に対する遺伝的素因）を有する被験体または１種以上の炎症誘導性状態に曝露された被験体のことをいう。例えば、被験体は、それらに限定されないが、ブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ外毒素（ＳＰＥ）、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ毒素ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、連鎖球菌分裂促進性外毒素（ＳＭＥ）および連鎖球菌スーパー抗原（ＳＳＡ）のようなウイルスまたは細菌のスーパー抗原に曝露された可能性がある。上記のことから、「炎症性障害を発生する危険性がある」被験体は、目的の種内の被験体全てではないことが明らかである。
【００８３】
「炎症性障害を有することが疑われる」被験体は、炎症性障害の１つ以上の症状を示す被験体である。炎症性障害の症状は当技術分野で周知でありそれらに限定されないが、発赤、腫脹（例えば腫脹関節）、触れると温かい関節、関節痛、こわばり、関節機能の喪失、発熱、悪寒、疲労、エネルギーの喪失、頭痛、食欲喪失、筋肉こわばり、不眠、そう痒、鼻づまり、くしゃみ、咳、めまい、発作または疼痛のような１つ以上の神経性の症状を含む。上記のことから、「炎症性障害を有することが疑われる」被験体は、目的の種内の被験体全てではないことが明らかである。
【００８４】
本明細書で記載する１つ以上の分子の投与に加えて、炎症性障害は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、生体応答修飾物質またはコルチコステロイドによっても処置できる。生体応答修飾物質は、例えば抗ＴＮＦ剤を含む。抗ＴＮＦ剤の非限定的な例は、アダリムマブ（ａｄｕｌｉｍｕｍａｂ）、インフリキシマブもしくはエタネルセプトのような可溶性ＴＮＦ受容体またはＴＮＦに特異的な抗体を含む。
【００８５】
変更されたＮ−グリコシル化分子（またはその薬学的組成物）のいずれかを用いて本明細書で記載する障害のいずれかを処置する（例えばその１つ以上の症状を予防するかまたは改善する）ために適切な方法は、以下の項に示す。
【００８６】
薬学的組成物および処置方法
所望のＮ−グリカンを有するように改変された標的分子は、治療有効量の分子と、１つ以上のアジュバント、賦形剤、キャリアおよび／または希釈剤とを含有する薬学的組成物に組み込むことができる。許容される希釈剤、キャリアおよび賦形剤は、典型的に、受容者の恒常性（例えば電解質バランス）に有害に影響しない。許容されるキャリアは、生体適合性、不活性または生体吸収性の塩、緩衝剤、オリゴ糖もしくは多糖、ポリマー、粘度改善剤、防腐剤などを含む。１つの例示的なキャリアは、生理食塩水である（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０〜７．４）。別の例示的なキャリアは、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムである。薬学的組成物の処方および投与のための技術についてのさらなる詳細は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．）で見出すことができる。補足の活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【００８７】
Ｎ−グリカンを有する分子を含有する薬学的組成物の投与は、全身的または局部的であり得る。薬学的組成物は、それらが非経口および／または非経口でない投与に適切であるように処方できる。具体的な投与様式は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、髄腔内、経口、直腸、頬側、局所、鼻、眼、関節内、動脈内、くも膜下、気管支、リンパ節、膣および子宮内の投与を含む。
【００８８】
投与は、薬学的組成物のボーラスの周期的な注射によることができるか、あるいは外的（例えばＩＶバッグ）もしくは内的（例えば生体浸食性インプラント、バイオ人工臓器（ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｏｒｇａｎ）または埋め込まれた変更されたＮ−グリコシル化分子生成細胞のコロニー）であるリザーバからの静脈内または腹腔内投与による不断または連続的であり得る。例えば米国特許第４，４０７，９５７号、第５，７９８，１１３号および第５，８００，８２８号を参照されたい。薬学的組成物の投与は、ポンプ（例えばＡｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ、２７巻：９１２頁（１９９３年）；Ｃａｎｃｅｒ、４１巻：１２７０頁（１９９３年）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４４巻：１６９８頁（１９８４年）を参照されたい）；マイクロカプセル封入（例えば米国特許第４，３５２，８８３号；第４，３５３，８８８号；および第５，０８４，３５０号を参照されたい）；連続放出ポリマーインプラント（例えばＳａｂｅｌ、米国特許第４，８８３，６６６号を参照されたい）；マクロカプセル封入（例えば米国特許第５，２８４，７６１号、第５，１５８，８８１号、第４，９７６，８５９号および第４，９６８，７３３号ならびにＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９５／０５４５２を参照されたい）；皮下、静脈内、動脈内、筋肉内もしくはその他の適切な部位のいずれかでの注射；またはカプセル、液体、錠剤、丸剤もしくは延長放出処方物での経口投与のような適切な送達手段を用いて達成できる。
【００８９】
非経口送達系の例は、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入系、ポンプ送達、カプセル封入細胞送達、リポソーム送達、針送達注射、針なし注射、ネブライザー、エアゾール器（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒ）、エレクトロポレーションおよび経皮パッチを含む。
【００９０】
非経口投与のために適切な処方物は、変更されたＮ−グリコシル化分子の滅菌水性調製物を簡便に含有し、これは、好ましくは、受容者の血液と等張である（例えば生理食塩水溶液）。処方物は、単位用量または複数回用量の形態で提供し得る。
【００９１】
経口投与のために適切な処方物は、それぞれが所定量の変更されたＮ−グリコシル化分子を含有するカプセル剤、カシェ剤、錠剤もしくはロゼンジのような分かれた単位、またはシロップ剤、エリキシル剤、乳剤もしくは飲料（ｄｒａｕｇｈｔ）のような水性流体（ｌｉｑｕｏｒ）または非水性の液体中の懸濁剤で提供し得る。
【００９２】
局所投与のために適切なＮ−グリカンを有する分子は、哺乳動物（例えばヒト患者）に、例えばクリーム、スプレー、フォーム、ゲル、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）またはドライラブ（ｄｒｙ  ｒｕｂ）として投与できる。ドライラブは、投与部位にて再水和できる。このような分子は、包帯、ガーゼまたはパッチに直接注入（例えば浸して乾燥する）することもでき、これらは、次いで、局所的に施用できる。このような分子は、半液体、ゲル化または完全な液体の状態で、局所投与用の包帯、ガーゼまたはパッチ中に維持することもできる（例えば米国特許第４，３０７，７１７号を参照されたい）。
【００９３】
治療有効量の薬学的組成物は、それを必要とする被験体に、当業者が確認できる投与量計画（ｄｏｓａｇｅ  ｒｅｇｉｍｅｎ）において投与できる。例えば、組成物は、被験体に、例えば全身的に、１投薬あたり被験体の体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１０，０００μｇまでの投与量で投与できる。別の例では、投与量は、１投薬あたり被験体の体重１ｋｇあたり１μｇから１００μｇまでである。別の例では、投与量は、１投薬あたり被験体の体重１ｋｇあたり１μｇから３０μｇまで、例えば１投薬あたり被験体の体重１ｋｇあたり３μｇから１０μｇまでである。
【００９４】
治療効力を最適化するために、Ｎ−グリカンを含有する分子は、まず、異なる投薬計画（ｄｏｓｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅｎ）で投与できる。単位用量および計画は、例えば哺乳動物の種、その免疫状態、哺乳動物の体重を含む因子に依存する。典型的に、組織におけるこのような分子のレベルは、例えば所定の処置計画の効力を決定するために、臨床試験手順の一部として適当なスクリーニングアッセイを用いて監視できる。
【００９５】
分子の投薬の頻度は、医療従事者（例えば医師または看護士）の熟練および臨床的判断の範囲内である。典型的に、投与計画（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｍｅｎ）は、最適投与パラメータを確立し得る臨床試験により確立される。しかし、従事者は、被験体の年齢、健康、体重、性別および医療状態に従ってそのような投与計画を変更してよい。投薬頻度は、処置が予防的または治療的であるかに依存して変更できる。
【００９６】
このような分子またはその薬学的組成物の毒性および治療効力は、公知の薬学的手順により、例えば細胞培養または実験動物において決定できる。これらの手順は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために用いることができる。毒性作用と治療効果との間の用量の比は、治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。毒性の副作用を示す薬学的組成物を用いることができるが、そのような化合物を罹患組織の部位に向かわせるための送達系を設計して、正常細胞（例えば非標的細胞）への潜在的な損傷を最小限にし、そのことにより副作用を低減するように注意を払うべきである。
【００９７】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、適当な被験体（例えばヒト患者）において用いるための投与量の範囲を処方する場合に用いることができる。このような薬学的組成物の投与量は、通常、ほとんどまたは全く毒性を有さずにＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、採用する投与形態および利用する投与経路に依存してこの範囲内で変更し得る。本明細書で記載するようにして用いる薬学的組成物（例えば被験体における代謝障害を処置するため）について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから見積もることができる。用量は、動物モデルにおいて処方して、細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する薬学的組成物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成できる。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定できる。血漿におけるレベルは、例えば高性能液体クロマトグラフィーにより測定できる。
【００９８】
本明細書で定義するように、Ｎ−グリカンを含有する分子の「治療有効量」は、処置した被験体において医療的に望ましい結果（例えば代謝障害の１つ以上の症状の改善）を生じることができる分子の量である。治療有効量（すなわち有効投与量）は、被験体または試料重量１キログラムあたりミリグラムまたはマイクログラム量の化合物を含むことができる（例えば１キログラムあたり約１マイクログラムから１キログラムあたり約５００ミリグラム、１キログラムあたり約１００マイクログラムから１キログラムあたり約５ミリグラムまたは１キログラムあたり約１マイクログラムから１キログラムあたり約５０マイクログラム）。
【００９９】
被験体は、任意の哺乳動物、例えばヒト（例えばヒト患者）または非ヒト霊長類（例えばチンパンジー、ヒヒまたはサル）、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ウマ、ある型の家畜（例えばウシ、ブタ、ヒツジまたはヤギ）、イヌ、ネコまたはクジラであり得る。
【０１００】
本明細書で記載する分子またはその薬学的組成物は、被験体に、別の処置、例えば代謝障害（例えばリソソーム蓄積症）のための処置との併用療法として投与できる。例えば併用療法は、被験体（例えばヒト患者）に、代謝障害（例えばリソソーム蓄積症）を有するかまたはその障害を発生する危険性がある（もしくは有することが疑われる）被験体に対して治療利益をもたらす１種以上の追加の薬剤を投与することを含むことができる。つまり、化合物または薬学的組成物と、１種以上の追加の薬剤とは、同時に投与できる。代わりに、分子をまず投与して、１種以上の追加の薬剤を２番目に投与するか、またはその逆が可能である。
【０１０１】
以前の療法が特に毒性である場合（例えば著しい副作用プロファイルを有する代謝障害の処置）、本明細書で記載する分子の投与を用いて、以前の療法の量を、同じまたは改善された治療利益を与えるのに十分であるが毒性がないレベルまで埋め合わせ（ｏｆｆｓｅｔ）かつ／または少なくすることができることが認識される。
【０１０２】
本明細書で記載する薬学的組成物のいずれも、投与についての使用説明書と一緒に容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
【０１０３】
以下は、本発明の実施の例である。これらは、いずれの様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されない。
【実施例】
【０１０４】
表２は、以下に記載する実験で用いた全ての株のリストを含む。表２では、ＭＨ＝ＨＤＥＬタグ付きα−１，２−マンノシダーゼ；ζ＝ゼータ配列による無作為組み込み；ドッキングΔ＝特定の遺伝子座への組み込み；および（Ｈ）＝ハイグロマイシン耐性。
【０１０５】
【表２−１】
2013511272.tif 000004
【０１０６】
【表２−２】
2013511272.tif 000005
【０１０７】
【表２−３】
2013511272.tif 000006
【０１０８】
【表２−４】
2013511272.tif 000007
【０１０９】
【表２−５】
2013511272.tif 000008
【０１１０】
【表２−６】
2013511272.tif 000009
（実施例１）Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＯＣＨ１破壊
糖鎖工学的に改変したタンパク質発現株の作製を、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ｐｏｌｄ  ｌｎｕｇａ株（ｌｅｕ２−、ｕｒａ３−、ｇｕｔ２−およびａｄｅ２−の栄養要求性を有する株）で行った。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいてＯＣＨ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ５６３９２０）遺伝子をノックアウトするための方策は、ＬＩＰ２遺伝子について記載されたようにして設定した（Ｆｉｃｋｅｒｓら、２００３年Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．５５巻（３号）：７２７〜３７頁）。ＯＣＨ１遺伝子について従った遺伝子構築方策は、米国特許出願公開第２００９００６９２３２−Ａ１号に記載されている。得られたベクターをｐＹｌＯＣＨ１  ＰＵＴ  ＴＯＰＯ（図１Ｂ）と称した。
【０１１１】
ＯＣＨ１  ＫＯ断片を、プラスミドから、ＳｐｅＩ／Ｂｓｔ１１０７Ｉ制限消化により単離し、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ｐｏｌｄ  ｌｎｕｇａ株を形質転換した。いくつかのウラシル原栄養性株を得て、ＰＣＲによりゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）上でプライマーＹｌｏｃｈ１  ｐｒｏｍ  ｆｗ（５’−ＴＣＧＣＴＡＴＣＡＣＧＴＣＴＣＴＡＧＣ−３’、配列番号１）およびＹｌｏｃｈ１  ｔｅｒｍ  ｒｅｖ（５’−ＡＣＴＣＴＧＴＡＴＡＣＴＴＧＴＡＴＧＴＡＣＴＧＴＧＡＧＡＣ−３’、配列番号２）を用いてスクリーニングして、プラスミドのゲノム組み込みを分析した。正しいサイズの断片（すなわち、２３２８ｂｐ対野生型での１８９４ｂｐ）が、試験したいくつかのクローンについて増幅された。ＯＣＨ１遺伝子のノックアウトも、増殖培地中に分泌された全糖タンパク質プール（＝セクレトーム）のＮ−グリカン分析により確認した：Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造は、糖プロファイル内の優勢なＮ−グリカンになった（図２）。このプロファイルは、より高い量のＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２とともにより高い数のマンノース残基さえ有するいくつかの構造を含有する野生型株のものとは異なる（後者は、Ｏｃｈ１ｐ活性の結果として追加のマンノースを含有する可能性が高い）。
【０１１２】
ＵＲＡ３遺伝子を除去するために、陽性Δｏｃｈ１クローン（Ｇ０１３と称する、表２を参照されたい）を、Ｃｒｅリコンビナーゼについての発現カセットを含有するエピソームプラスミドｐＵＢ４−Ｃｒｅ（Ｆｉｃｋｅｒｓら、２００３年、既出）で形質転換した。ＵＲＡ３遺伝子の除去は、プライマーＹｌｏｃｈ１  ｐｒｏｍ  ｆｗおよびＹｌｏｃｈ１  ｔｅｒｍ  ｒｅｖ（上記を参照されたい）を用いるｇＤＮＡのＰＣＲによりスクリーニングした。ＵＲＡ３マーカーが切り出されたクローンでは、２３２８ｂｐのバンドはもはや増幅されなかった。代わりに、１０７５ｂｐのＰＣＲ断片（ｅｘｃｌ．ＵＲＡ３）が得られた。陽性クローンは、セクレトームのＮ−グリカンレベルにおいて確かめられたが、該クローンはキュアしていない株のものと非常によく似たプロファイルを示す（図２）。キュアした株の１つ（Ｇ０１４と称する、表２を参照されたい）を、さらなるＮ−グリカン工学的改変のために選択した。
【０１１３】
（実施例２）無作為組み込みまたは標的化／ドッキング組み込みのいずれかによるＥＲ保持α−１，２−マンノシダーゼの過剰発現
Δｏｃｈ１株により発現された糖タンパク質と結合したＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の作製を可能にするために、α−１，２−マンノシダーゼを発現させて、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（すなわち、ゴルジ型α−１，２−マンノシダーゼ活性）に切断した。このようなマンノシダーゼは、分泌系に向けられるべきである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのプレプロ接合因子と融合し、それをＥＲに局在化させるためにＨＤＥＬ配列（配列番号２１）でタグ付きＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのα−１，２−マンノシダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２１２１５３）は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてならびにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に刈り込むことができる。ＨＤＥＬタグ付きＴ．ｒｅｅｓｅｉα−１，２−マンノシダーゼのコドン最適化バージョンがＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＩＰ２プレシグナル配列と融合し、ＴＥＦＩ、Ｈｐ４ｄ（Ｍａｄｚａｋら、２０００年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２巻：２０７〜２１６頁）、ＧＡＰまたはＰＯＸ２プロモーターのいずれかの転写制御下に配置された発現構築物を作製した。これらのプラスミドの構築方策は、米国特許出願公開第２００９００６９２３２−Ａ１号に記載されている。
【０１１４】
Ｈｐ４ｄ  ｒｅｓｐ．ＴＥＦＩプロモーターの転写制御下のマンノシダーゼを有するこれらのベクターのうち２つ、ｐＹＬＨＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬおよびｐＹＬＴＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬ（図３）を用いて、Ｇ０１４株（実施例１に由来する）を形質転換した。ベクターをＮｏｔＩで消化して、ゼータ配列によるゲノムへの無作為組み込みを可能にした。ＵＲＡ３原栄養性形質転換体を、Ｎ−グリカン分析のために選択した。いくつかの形質転換体は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への明確な変換を示す（図４）。ＴＥＦ１プロモーター制御下でマンノシダーゼを発現するクローンは、緩慢で塊状の増殖表現型を示したので（これらのクローンのうちの１つをＧ０１６と称した）、糖鎖工学的改変のさらなるステップを、遺伝子がＨｐ４ｄ転写制御下にある株のバックグラウンド（ｓｔｒａｉｎ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）において行った。
【０１１５】
ＭａｎＨＤＥＬをｈｐ４ｄプロモーターの制御下で発現する１つの陽性クローン（Ｇ０１８）を選び、これからＵＲＡ３マーカーを、Ｃｒｅ−リコンビナーゼを発現するプラスミドｐＲＲＱ２（Ｒｉｃｈａｒｄら、２００１年Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３巻：３０９８〜３１０７頁）の一過性形質転換によりキュアした。いくつかのｕｒａ３−クローンを手順の後に選択し、セクレトーム上で明確なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２プロファイルを示す１つのクローン（Ｇ０３６）を、さらなる工学的改変作業のために用いた（図４）。このクローンのサザン分析により、１つの無作為に組み込まれたマンノシダーゼ発現カセットの存在が明らかになった。このサザン分析は、ＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡについて、プライマーＭａｎ  ｆｏｒ（５’−ＧＣＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＴＣＴＴＧＧＡＡＣＧＣＣＴＡＣＣＡＣＣ−３’、配列番号２２）およびＭａｎ  ｒｅｖ（５’−ＧＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＴＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧ−３’、配列番号２３）を用いて作製したＤＩＧ標識マンノシダーゼ特異的ＰＣＲ断片を用いて行った。
【０１１６】
代替の方策では、ＹａｒｒｏｗｉａゲノムのＬＥＵ２またはＡＸＰ１遺伝子座のいずれかへのＨｐ４ｄ駆動型マンノシダーゼ発現カセットの標的化組み込みを可能にする２つの構築物を作製した。これらのプラスミド、ＪＭＥ９２６＿ｐＰＴＬｅｕ２−ＡＤＥ２ｅｘ−Ｈｐ４ｄＭａｎＨＤＥＬ（Ｙｌ）およびＯＸＹＰ２８９＿ｐＰＴＡｘｐ１−ＬＥＵ２ｅｘ−Ｈｐ４ｄＭａｎＨＤＥＬ（Ｙｌ）の構築を、図５に記載する。Ｇ０１４株への形質転換の前に、両方の構築物をＮｏｔＩで消化し、各発現カセットを単離した。選択したＡＤＥ２原栄養性クローンは、マンノシダーゼ発現カセットをＬＥＵ２遺伝子座に潜在的に組み込み、一方、ＬＥＵ２原栄養体は、カセットをＡＸＰ１遺伝子座に潜在的に組み込んだ。形質転換体は、サザン分析により確かめて、ゲノムへの正しいターゲティングを評価した。これは、ＢａｍＨＩ消化（ＬＥＵ２遺伝子座への組み込み）またはＨｉｎｄＩＩＩ消化（ＡＸＰ１遺伝子座への組み込み）ゲノムＤＮＡについて、プライマーＭａｎ  ｆｏｒ（５’−ＧＣＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＴＣＴＴＧＧＡＡＣＧＣＣＴＡＣＣＡＣＣ−３’、配列番号２２）およびＭａｎ  ｒｅｖ（５’−ＧＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＴＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧ−３’、配列番号２３）を用いて作製したＤＩＧ標識マンノシダーゼ特異的ＰＣＲ断片を用いて行った。選択したクローンは、分泌された糖タンパク質上に合成されたＮ−グリカンの性質についても確かめた。ほとんどの場合では、正しく標的にされたＨｐ４ｄ駆動型α−１，２−マンノシダーゼ発現は、優勢にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖の合成をもたらした（図６）。それぞれのターゲティング遺伝子座について、１つのマンノシダーゼ発現クローン（ＬＥＵ２ドッキングの場合はＧ０４６；ＡＸＰ１ドッキングの場合はＧ０５３）を、Ｇ０４６株についてプラスミドｐＲＲＱ２およびＧ０５３株についてｐＵＢ４−Ｃｒｅを用いるＣｒｅリコンビナーゼの一過的発現によるキュアリングのために選択した。得られたキュアした株（それぞれＧ０５５およびＧ０５４）を、サザンブロッティングにより再度確かめ、それらのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２プロファイルを、ＤＳΑ−ＦＡＣＥを用いるＮ−グリカン分析により確認した。
【０１１７】
（実施例３）ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの発現
Ｙａｒｒｏｗｉａコドン最適化配列を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｋｒｅ２タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  受託番号Ｐ２７８０９）の最初の１００個のＮ末端アミノ酸と、それに続くヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  受託番号Ｐ２６５７２）の触媒ドメインとからなる融合タンパク質（図７、配列番号３および配列番号４）の発現のために作製した。酵母Ｋｒｅ２ｐの１００個のＮ末端アミノ酸は、触媒ＧｎＴ  Ｉドメインのためのゴルジ局在化シグナルとして働く。この様式で、ＧｎＴ  Ｉ融合タンパク質が、分泌経路において、ＥＲ保持ＨＤＥＬタグ付きα−１，２−マンノシダーゼよりも後に局在化されることを確実にして、酵素がタンパク質結合Ｎ−グリカンをＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換できるようにする。融合タンパク質の発現のためのコドン最適化合成遺伝子を、ＴＥＦ１またはＨｐ４ｄプロモーターのいずれかの転写制御下に配置して、プラスミドｐＹＬＴｍＡＸｈＧｎＴＩおよびｐＹＬＨｐ４ｍＡＸｈＧｎＴＩを得た。構築方策を図８に示す。Ｋｒｅ２−ＧｎＴ  Ｉ融合タンパク質の機能的発現は、利用可能なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカン上へのβ−１，２結合ＧｌｃＮＡｃ残基の付加をもたらして、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の合成をもたらすはずである。
【０１１８】
プラスミドｐＹＬＴｍＡＸｈＧｎＴＩおよびｐＹＬＨｐ４ｍＡＸＧｎＴＩをＮｏｔＩ消化した後に、その分泌タンパク質上にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを生成することが公知であるＧ０３６株を形質転換した（実施例２を参照されたい）。形質転換体を、ウラシル原栄養性について選択した。これらのクローンのいくつかのセクレトームについてのＮ−グリコシル化プロファイルの分析は、Ｎ−グリカンパターンの明確な変化を示した：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、著しく低減され、より高い分子量（約１グルコース単位過剰）を有するＮ−グリカンを表す新しいピークが出現した。単離Ｎ−グリカンを、末端β結合ＧｌｃＮＡｃ残基を除去できる酵素であるナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼで処理すると、新しいＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２であることが示された：その新しいピークは消失し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に完全に変換された（図９）。用いた培養方法に依存して、全Ｎ−グリカンプールの約７０％がＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２であることが証明された（利用可能なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のおよそ７７％が変換された）。
【０１１９】
Ｋｒｅ２−ＧｎＴ  Ｉ融合タンパク質をＴＥＦ１プロモーターの制御下で発現する１つの形質転換体をＧ０４０株と命名し、さらなる使用のために選択した。この株のサザンブロットによるゲノム解析は、１つの発現カセットの存在を示した。サザン分析は、ＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡについて、プライマー５’−ＧＧＡＴＧＡＴＣＡＣＡＣＡＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号５）および５’−ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＧＴＣ−３’（配列番号６）を用いて作製したＤＩＧ標識ＧｎＴ  Ｉ特異的ＰＣＲ断片を用いて行った。Ｇ０４０株対１〜３コピー（同じサザンブロットにより確認）のＨｐ４ｄ駆動型Ｋｒｅ２−ＧｎＴ  Ｉ発現カセットを有する株のセクレトームについてのグリコシル化プロファイルの分析は、ＧｌｃＮＡｃ移動能力について著しい違いを示さなかった。
【０１２０】
（実施例４）マンノシダーゼＩＩの発現
Ｙａｒｒｏｗｉａコドン最適化配列を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍｎｎ２タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  受託番号Ｐ３８０６９）の最初の３６個のＮ末端アミノ酸と、それに続くＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＩ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  受託番号Ｑ２４４５１）の触媒ドメインとからなる融合タンパク質（図１０、配列番号７および配列番号８）の発現のために作製した。酵母Ｍｎｎ２の３６個のＮ末端アミノ酸は、触媒Ｍａｎ  ＩＩドメインのためのゴルジ局在化シグナルとして働く。この様式で、Ｍｎｎ２−Ｍａｎ  ＩＩ融合タンパク質が、分泌経路において、Ｋｒｅ２−ＧｎＴ  Ｉ融合タンパク質と同じまたはそれより後の位置にさえ局在化されることを確実にして、よって、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２をＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換できた。融合タンパク質の発現のためのＹａｒｒｏｗｉａコドン最適化合成遺伝子を、ＴＥＦ１プロモーターの転写制御下に配置して、プラスミドｐＹＬＴｍＡＸＤｍＭａｎＩＩおよびｐＹＬＴｍＡＸＤｍＭａｎＩＩ（ＬＥＵ２ｅｘ）を得た。構築方策を図１１に示す。
【０１２１】
プラスミドｐＹＬＴｍＡＸＤｍＭａｎＩＩ（ＬＥＵ２ｅｘ）をＮｏｔＩ消化した後に、その分泌タンパク質上にＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを生成することが公知であるＧ０４０株を形質転換した（実施例３を参照されたい）。形質転換体を、ロイシン原栄養性について選択した。これらのクローンのいくつかのセクレトームについてのＮ−グリコシル化プロファイルの分析は、Ｎ−グリカンパターンの変化を示した：約２グルコース単位のより低い分子量を有するＮ−グリカンを表す新しいピークが出現し、これにより、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の形成を示すことができ、よって、部分的マンノシダーゼＩＩ活性を示し得た。また、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（すなわちピークのショルダー）とほとんど同じ位置に泳動される別のピークが出現し、これは、潜在的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２を表す。後者の構造は、マンノシダーゼＩＩ活性が２つではなく１つのマンノース残基だけを除去した部分的な刈り込み事象の結果である可能性がある。単離Ｎ−グリカンをナタマメβ−Ν−アセチルヘキソサミニダーゼで処理すると、グリカンパターンが約１グルコース単位の左側へのシフトをもたらし、よって、末端ＧｌｃＮＡｃ残基の喪失によるより高い電気泳動移動度をもたらした（図１２）。このことにより、機能的マンノシダーゼＩＩ活性の発現によるＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からのＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の作製がさらに確認される。用いた培養方法に依存して、全Ｎ−グリカンプールの約１５％が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であることが証明された：利用可能なＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のおよそ３５％が１または２個のマンノース残基を失い、２０％がＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に完全に刈り込まれた。
【０１２２】
（実施例５）ガラクトシルトランスフェラーゼＩの発現
末端ガラクトース残基を有するＮ−グリカンの合成は、分泌経路内の機能的で良好に局在化されたガラクトシルトランスフェラーゼの存在だけでなく、この酵素により用いられるドナー基質であるＵＤＰ−Ｇａｌの利用可能性にも依存する。ＵＤＰ−ＧｌｃとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは、酵母生物のゴルジ装置中で十分に利用可能であると一般的に考えられているが、このことはＵＤＰ−Ｇａｌについてはあまり知られていない。糖鎖工学的改変中の潜在的なＵＤＰ−Ｇａｌ欠乏を克服するために、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ＵＤＰ−Ｇｌｃ−４−エピメラーゼ（ＧＡＬ１０様遺伝子ＳＰＢＣ３６５．１４ｃ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  受託番号Ｑ９Ｙ７Ｘ５）によりコードされる）とヒトβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩ（ＧａｌＴ  Ｉ）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  受託番号ＰＩ５２９１）の触媒ドメインとの間の融合タンパク質を酵母ゴルジ装置に向かわせる試みが以前になされた（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１４巻（９号）：７５７〜７６６頁、２００４年）。分泌経路におけるＧａｌ１０ｐ−ＧａｌＴ  Ｉ融合タンパク質の局在化を、好ましくはＧｌｃＮＡｃ移動およびマンノシダーゼＩＩ活性が分泌のために定められたタンパク質のＮ−グリカンに対して既に作用した位置にて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍｎｎ２ｐの最初の４６個のＮ末端アミノ酸をＮ末端ターゲティングシグナルとして用いることにより遂行した。
【０１２３】
よって、Ｙａｒｒｏｗｉａコドン最適化配列を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍｎｎ２タンパク質の最初の４６個のＮ末端アミノ酸と、それに続くＳ．ｐｏｍｂｅ  Ｇａｌ１０様タンパク質およびヒトＧａｌＴ  Ｉの触媒ドメインとからなる融合タンパク質（図１３）の発現のために作製した。得られた合成遺伝子を、ＴＥＦ１プロモーターの転写制御下に配置して、プラスミドｐＹＬＴｍＡＸＳｐＧａｌ１０ｈＧａｌＴＩおよびｐＹＬＴｍＡＸＳｐＧａｌ１０ｈＧａｌＴＩ（ＡＤＥ２ｅｘ）を得た。構築方策を図１４に示す。
【０１２４】
プラスミドｐＹＬＴｍＡＸＳｐＧａｌ１０ｈＧａｌＴＩ（ＡＤＥ２ｅｘ）をＮｏｔＩ消化した後に、その分泌タンパク質上にＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを生成することが公知であるＧ０４０株を形質転換した（実施例３を参照されたい）。形質転換体を、それらのアデニン原栄養性について選択した。これらのクローンのいくつかのセクレトームについてのＮ−グリコシル化プロファイルの分析は、Ｎ−グリカンパターンの変化を示した：Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２とＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２との間の位置に泳動される新しいピークが出現する（図１５）。Ｎ−グリカンを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａβ−１，４−ガラクトシダーゼで処理すると、このピークがＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を表すことが示される。なぜなら、このｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化は、この新しいピークの消失と、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の等しく高い増加とをもたらすからである。
【０１２５】
この設定を用い、かつ増殖条件に依存して、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の約７５％がＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換された。ガラクトシル化構造の全量は、全Ｎ−グリカンプールの約２５％を占めた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏα−１，２−マンノシダーゼ消化から、しかし、相当量の高マンノースＮ−グリカンがＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換されなかったことが明確である（図１５）。用いる培養培地に依存して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への変換率も、親のＧ０４０株で観察されるものより低い。このことは、このＭｎｎ２−Ｇａｌ１０−ＧａｌＴ  Ｉ融合タンパク質の形質転換体について観察されたより緩慢な増殖速度と関連する可能性が高い。
【０１２６】
（実施例６）ＹｌＡＬＧ３のノックアウトおよびＹｌＡＬＧ６の同時過剰発現
Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２プラットフォームの作製を可能にするために、Ｇ０３６株のＡＬＧ３遺伝子（ｐｏｌｄ  ｌｎｕｇａ  Δｏｃｈ１＋Ｈｐ４ｄ駆動型α−１，２−マンノシダーゼ）は、不活性化する必要がある。このことはＥＲ局在化Ａｌｇ３ｐα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性の喪失をもたらし、脂質結合Ｎ−グリカン前駆体構造の組成を変化させる。この構造を新生ポリペプチド鎖のＮ−グリコシル化部位に移動させることにより、酵母グリコシル化プロファイルを、哺乳類様Ｎ−グリカン構造に、マンノシダーゼＩＩの発現を必要とすることなく変換できる。しかし、この新しい脂質結合構造は、新生ポリペプチドにそれほど効率的に移動されないので、潜在的なタンパク質の低グリコシル化（ｕｎｄｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）をできる限り減らすために、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ＡＬＧ６遺伝子（ＥＲ局在化Ａｌｇ６ｐα−１，３−グルコシルトランスフェラーゼをコードする）を同時に過剰発現させる必要がある。
【０１２７】
ｐＹＬａｌｇ３ＰＵＴ−ＡＬＧ６と称するベクター（図１６）が以前に構築され、ＹｌＡＬＧ３のノックアウトおよびそれと同時のＹｌＡＬＧ６のＨｐ４ｄ駆動型過剰発現を可能にした。米国特許出願公開第２００９００６９２３２−Ａ１号を参照されたい。このノックアウト／ノックインカセットを含有するこのベクターのＮｏｔＩ／ＰａｃＩ断片でＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｇ０３６を形質転換し、形質転換体を、それらのウラシル原栄養性に基づいて選択した。構築物が正しく組み込まれたクローンを、セクレトームについてのＮ−グリカン分析により直接スクリーニングした。８０のスクリーニングしたクローンのうち、２つのクローンが、ＥＲにあるα−１，２−マンノシダーゼを発現する株におけるＹｌＡＬＧ３の不活性化に一致し得るＮ−グリコシル化プロファイルを示した。少量のＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンとは別に、まだいくらかのＭａｎ４’ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２と、相当量のグルコシル化Ｎ−グリカン（ＧｌｃＭａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃ２Ｍａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２）とがあった。後者は、グルコシダーゼＩＩによる非効率的な刈り込みの結果である（ＧｒｉｎｎａおよびＲｏｂｂｉｎｓ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５巻、２２５５〜２２５８頁、１９８０年）。Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の構造の性質は、Ｎ−グリカンをα−１，２−マンノシダーゼでｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理することにより確認した（図１７）。用いた増殖条件に依存して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のレベルは、全Ｎ−グリカンプールの６０％まで増加でき、グルコシル化ピークは、α−１，２−マンノシダーゼに対して非感受性であり、ナタマメα−マンノシダーゼ処理（α−１，２−、α−１，３−およびα−１，６結合マンノース残基に対して作用できる特異的でないα−マンノシダーゼ）に対してわずかに感受性であるだけであった。これとは対照的に、後者の酵素は、生じたＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２に変換する（図１７）。
【０１２８】
２つの陽性形質転換体のうちの１つをＧ０３９と称し、さらなる糖鎖工学的改変作業のために用いた。この株を、Ｃｒｅ−リコンビナーゼを発現するｐＲＲＱ２で一過的に形質転換して、Ｇ０３６をベクターｐＹＬａｌｇ３ＰＵＴ−ＡＬＧ６で形質転換した際に導入されたＵＲＡ３マーカーのキュアリングを可能にした。分析は、グリコシル化プロファイルが、キュアリング後に同じままであることを示す。１つのキュアした株を、さらなる使用のために選択して、Ｇ０４５と称した。
【０１２９】
（実施例７）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２生成株でのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの発現
実施例３で行ったことと同様に、ＧｎＴ  Ｉ活性の導入を、Ｋｒｅ２−ＧｎＴ  Ｉ融合タンパク質の発現により遂行した。ＧｎＴ  Ｉについてのこのような発現構築物の無作為組み込みは、３つの方法で遂行した：１）キュアしていないＧ０３９株（実施例６を参照されたい）を、ＮｏｔＩ消化ベクターｐＹＬＴｍＡＸｈＧｎＴＩ（Ｈｙｇｒ  ｅｘ）で形質転換し、ＧｎＴ  Ｉ発現クローンを、選択プレートに加えられた３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンで生存するそれらの能力に基づいて最初に選択した、２）キュアしたＧ０４５株（実施例６を参照されたい）を、ＮｏｔＩ消化ベクターｐＹＬＴｍＡＸｈＧｎＴＩ（これもまた実施例３を参照されたい）で形質転換し、ＧｎＴ  Ｉ発現クローンを、それらのウラシル原栄養性に基づいて最初に選択した、または３）キュアしたＧ０４５株（実施例６を参照されたい）を、ＮｏｔＩ消化ベクターｐＹＬＨｐ４ｍＡＸｈＧｎＴＩで形質転換し、ＧｎＴ  Ｉ発現クローンを、それらのウラシル原栄養性に基づいて最初に選択した。ｐＹＬＴｍＡＸｈＧｎＴＩ（Ｈｙｇｒ  ｅｘ）についての構築方策を、図１８に示す。プラスミドｐＹＬＴｍＡＸｈＧｎＴＩ（Ｈｙｇｒ  ｅｘ）およびｐＹＬＴｍＡＸｈＧｎＴＩを用いる場合、ＧｎＴ  Ｉの発現は、ＴＥＦ１プロモーターの転写制御下であった；プラスミドｐＹＬＨｐ４ｍＡＸｈＧｎＴＩを用いる場合、ＧｎＴ  Ｉ発現は、Ｈｐ４ｄプロモーターの制御下であった。
【０１３０】
Ｇ０３９をｐＹＬＴｍＡＸｈＧｎＴＩ（Ｈｙｇｒ  ｅｘ）で形質転換することにより、期待されたよりも長いインキュベーション期間の後に、培養プレート上に３つのクローンだけが出現した。しかし、これらのクローンのセクレトームのＮ−グリコシル化プロファイルの分析は、Ｎ−グリカンパターンの明確な変化を示した：非形質転換Ｇ０３９株に存在するＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２は、著しく低減されたかまたはほぼ完全に存在しなかったが、より高い分子量（約１グルコース単位過剰）を有するＮ−グリカンを表す新しいピークが出現した。単離Ｎ−グリカンを、末端β結合ＧｌｃＮＡｃ残基を除去できる酵素であるナタマメβ−Ν−アセチルヘキソサミニダーゼで処理すると、新しいＮ−グリカンが実際にＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であることが示された。新しいピークは消失し、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に完全に変換された（図１９）。評価した形質転換体のうちの１つを、さらなる糖鎖工学的改変作業のために用い、Ｇ０４７と命名した。同様の結果が、キュアしたＧ０４５株をｐＹＬＴｍＡＸｈＧｎＴＩ（Ｇ０４８）またはｐＹＬＨｐ４ｍＡＸｈＧｎＴＩ（Ｇ０５６）で形質転換した場合にも得られた。Ｇ０５６株は、プラスミドｐＲＲＱ２を用いるＣｒｅリコンビナーゼの一過的発現によるキュアリングのために選択した。得られた株は、Ｇ０５８と称した。
【０１３１】
用いた培養方法に依存して、Ｇ０４７株の全Ｎ−グリカンプールの約７０％がＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であり、Ｇｌｃ１−２Ｍａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２がいくらか残存し、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２がほとんど存在しないことが証明された（変換率＞＞９０％）（図１９）。高い変換率にかかわらず、１コピーのＧｎＴ  Ｉ発現カセットだけがこの株でサザンブロットにより同定できた。サザン分析は、ＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡについて、プライマー５’−ＧＧＡＴＧＡＴＣＡＣＡＣＡＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号１１）および５’−ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＧＴＣ−３’（配列番号１２）を用いて作製したＤＩＧ標識ＧｎＴ  Ｉ特異的ＰＣＲ断片を用いて行った。
【０１３２】
代替の方策では、構築物ＪＭＥ９２５  ｐＰＴＡｄｅ２−ＵＲＡ３ｅｘ−Ｈｐ４ｄｈＧｎＴＩを作製して、ＹａｒｒｏｗｉａゲノムのＡＤＥ２遺伝子座へのＨｐ４ｄ駆動型ＧｎＴ  Ｉ発現カセットの標的化組み込みを可能にした。構築方策を図２０に示す。Ｇ０４５株への形質転換の前に、プラスミドをＮｏｔＩ消化し、ターゲティング／発現カセットを単離した。形質転換体を、それらのアデニン原栄養性に基づいて選択した。ＡＤＥ２遺伝子座への発現カセットの正しい組み込みは、順方向プライマーＶｅｒｌＡｄｅ２（５’−ＣＧＡＣＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＴＣＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＴＧＣＴＧ−３’、配列番号１３）、逆方向プライマーＶｅｒ２Ａｄｅ２（５’−ＣＴＡＣＡＣＴＧＡＣＧＡＡＧＴＧＧＡＣＡＴＣＣＣＧＧＣＴＴＧＧＡＣＴＧ−３’、配列番号１４）を用いるＰＣＲにより確かめ、サザンブロッティングによりさらに確認した。これは、ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ消化ゲノムＤＮＡについて、プライマー５’−ＧＧＡＴＧＡＴＣＡＣＡＣＡＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号１５）および５’−ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＧＴＣ−３’（配列番号１６）を用いて作製したＤＩＧ標識ＧｎＴ  Ｉ特異的ＰＣＲ断片を用いて行った。セクレトーム上へのＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の合成は、Ｎ−グリカン分析およびｉｎ  ｖｉｔｒｏナタマメβ−Ν−アセチルヘキソサミニダーゼ処理により確認した（図２１）。１つのＧｎＴ  Ｉ発現形質転換体（Ｇ０５７と称する）を、プラスミドｐＲＲＱ２を用いるＣｒｅリコンビナーゼの一過的発現によるキュアリングのために選択した。得られた株は、Ｇ０５９と称した。
【０１３３】
（実施例８）ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩの発現
Ｙａｒｒｏｗｉａコドン最適化配列を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍｎｎ２タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  受託番号Ｐ３８０６９）の最初の３６個のＮ末端アミノ酸と、それに続くラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ  ＩＩ）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  受託番号Ｑ０９３２６）の触媒ドメインとからなる融合タンパク質（図２２、配列番号１７および配列番号１８）の発現のために作製した。酵母Ｍｎｎ２の３６個のＮ末端アミノ酸は、触媒ＧｎＴ  ＩＩドメインのためのゴルジ局在化シグナルとして働く。この様式で、Ｍｎｎ２−ＧｎＴ  ＩＩ融合タンパク質が、分泌経路において、Ｋｒｅ２−ＧｎＴ  Ｉ（およびＭｎｎ２−Ｍａｎ  ＩＩ）融合タンパク質と同じまたはそれより後の位置にさえ局在化されることを確実にして、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２をＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換できた。融合タンパク質の発現のための合成遺伝子を、ＴＥＦ１プロモーターの転写制御下に配置して、プラスミドｐＹＬＴｍＡＸｒＧｎＴＩＩおよびｐＹＬＴｍＡＸｒＧｎＴＩＩ（ＡＤＥ２ｅｘ）を得た。構築方策を図２３に示す。
【０１３４】
ＧｎＴ  ＩＩ活性を発現する株を、２つの異なる様式で作製した：１）Ｇ０４５株（実施例６を参照されたい）を、ＮｏｔＩ消化ｐＹＬＴｍＡＸｈＧｎＴＩおよびＮｏｔＩ消化ｐＹＬＴｍＡＸｒＧｎＴＩＩ（ＡＤＥ２  ｅｘ）で同時に形質転換し、形質転換体を、それらのウラシルおよびアデニン原栄養性に基づいて選択した、または２）Ｇ０４７株（実施例７）を、ＮｏｔＩ消化ｐＹＬＴｍＡＸｒＧｎＴＩＩ（ＡＤＥ２  ｅｘ）で形質転換し、形質転換体を、それらのアデニン原栄養性に基づいて選択した。発現カセットの組み込みを、順方向プライマーＴｅｆＰｒｏｍＦＷ５’−ＧＴＣＣＣＣＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号１９）および逆方向プライマーＬｉｐ２ＴｅｒｍＲＶ５’−ＡＧＧＴＡＧＡＡＧＴＴＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧ−３’（配列番号２０）を用いて確かめた。ナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼでの単離糖のｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理と組み合わせたセクレトームについてのＮ−グリカン分析は、いくつかの形質転換体が、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成でき、よって機能的ＧｎＴ  ＩＩ活性を発現できたことを示した（図２４）。ある選択された条件では、全Ｎ−グリカンプールの約４０％が、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２で構成された。基質ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２への変換率は、９０％であった。最終的に選択した株をＧ０５０（Ｇ０４５の二重形質転換）およびＧ０５１（Ｇ０４７でのＧｎＴ  ＩＩ発現）と称した。
【０１３５】
（実施例９）グルコシダーゼＩＩアルファおよびベータサブユニット（Ｇｌｓ２αおよびＧｌｓ２β）の発現
実施例６〜８に記載した実験に基づいて、ＹｌＡＬＧ３のノックアウトとそれと同時のＹｌＡＬＧ６の過剰発現とを含む方策は、１または２つの末端グルコース残基を保持するＮ−グリカン（Ｇｌｃ１−２Ｍａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２）の産生をもたらす。これらのグルコース残基の存在は、ＥＲ局在化ＨＤＥＬタグ付きα−１，２−マンノシダーゼによるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２への変換を妨げる。グルコース残基を除去するために、ＥＲ内でのグルコシダーゼＩＩ活性を増大させる必要がある。α−１，２−マンノシダーゼ発現がないバックグラウンドでは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコシダーゼＩＩアルファおよびベータサブユニットの過剰発現が、Ｇｌｃ１−２Ｍａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２への最高の変換をもたらした（米国特許出願公開第２００９００６９２３２−Ａ１号）。Ａ．ｎｉｇｅｒ  ｇｌｓ２サブユニットの過剰発現のための構築物を、以下のようにして生成した：１）Ｙａｒｒｏｗｉａコドン最適化ｃＤＮＡを、成熟（シグナルペプチドを欠く）Ａ．ｎｉｇｅｒ  ｇｌｓ２αおよびｇｌｓ２βサブユニットの発現のために作製し、２）ｃＤＮＡをインフレームでＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＩＰ−２プレ配列にクローニングし、３）得られたＬＩＰ２プレｇｌｓ２αおよびＬＩＰ２プレｇｌｓ２β配列を、構成性ＴＥＦ１プロモーターの転写制御下にクローニングした。得られたプラスミドを、ｐＹＬＴＵＸｄＬ２ｐｒｅＡｎＧｌｃＩＩαおよびｐＹＬｅｕ２ＥｘＴＥＦｐｒｅＬｉｐ２ＡｎＧｌｕｃＩＩβと称した（図２５）。
【０１３６】
これらのプラスミドに基づいて、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ｇｌｓ２αおよびｇｌｓ２βサブユニットを、ＴＥＦ１プロモーター制御（標的化組み込みのためのベクターＪＭＥ９２３  ｐＰＴｕｒａ３−ＬＥＵ２ｅｘ−ＴｅｆＬ２ｐｒｅＡｎＧｌｃＩＩａ＋ｂ［ａｌｔｌ］、図２６）またはＨｐ４ｄプロモーター制御（標的化組み込みのためのベクターＪＭＥ９２３  ｐＰＴｕｒａ３−ＬＥＵ２ｅｘ−Ｈｐ４ｄＬ２ｐｒｅＡｎＧｌｃＩＩａ＋ｂ［ａｌｔｌ］および無作為組み込みのためのベクターＺｅｔａ−ＬＥＵ２ｅｘ−Ｈｐ４ｄＬ２ｐｒｅＡｎＧｌｃＩＩａ＋ｂ［ａｌｔ］、図２７）のいずれかの下で同時過剰発現するために、新しい構築物を作製した。
【０１３７】
Ｇ０５７株（実施例７を参照されたい）を、ＮｏｔＩ消化プラスミドＪＭＥ９２３  ｐＰＴｕｒａ３−ＬＥＵ２ｅｘ−Ｈｐ４ｄＬ２ｐｒｅＡｎＧｌｃＩＩａ＋ｂ［ａｌｔｌ］およびＺｅｔａ−ＬＥＵ２ｅｘ−Ｈｐ４ｄＬ２ｐｒｅＡｎＧｌｃＩＩａ＋ｂ［ａｌｔ］で形質転換し、形質転換体を、それらのロイシン原栄養性に基づいて選択した。いくつかのクローンを、ＰＣＲおよびサザン分析によりゲノム学的に分析して、ｇｌｓ２αおよびｇｌｓ２β発現カセットの組み込みを評価した。ｇｌｓ２αサブユニットについてのＰＣＲ分析およびＤＩＧプローブ作製は、プライマーＡｎＧｌｓ２α−ＦＷ（５’−ＧＣＴＧＧＡＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＴＣＣ−３’）（配列番号２４）およびＡｎＧｌｓ２α−ＲＶ（５’−ＧＧＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧ−３’）（配列番号２５）を用いて行った。ｇｌｓ２βサブユニットについて、本発明者らは、プライマーＡｎＧｌｓ２β−ＦＷ（５’−ＣＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣ−３’）（配列番号２６）およびＡｎＧｌｃ２β−ＲＶ（５’−ＣＣＣＴＴＧＡＣＧＡＣＣＴＴＡＧＡＧＧ−３’）（配列番号２７）を用いた。二重Ｈｐ４ｄＧｌｓ２α／β発現カセットの標的化組み込みを確認するためのサザン分析を、ｇｌｓ２αプローブを用いる場合にＥｃｏ４７ＩＩＩ消化ｇＤＮＡについて、およびｇｌｓ２βプローブを用いる場合にＳｐｅＩ／ＳｆｉＩ消化ｇＤＮＡについて行った。選択したクローンの大多数は、ＵＲＡ３遺伝子座への二重発現カセットの正しい組み込みを示した。二重Ｈｐ４ｄＧｌｓ２α／β発現カセットの無作為組み込みについてのサザン分析は、両方のプローブを用いてＰｖｕＩ消化ｇＤＮＡについて確かめた。全ての場合において、１コピーの二重発現カセットだけが組み込まれていた。
【０１３８】
次に、Ｎ−グリカン分析を、二重Ｈｐ４ｄＧｌｓ２α／β発現カセットが（正しく）組み込まれていることが確認されたいくつかのクローンについて行った。Ｎ−グリコシル化を、３日間のファルコン培養の後の全分泌タンパク質について検査した。いくつかのクローンは、グルコシル化糖の著しい低減と、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の増加とを示した。二重発現カセットが一方で無作為に組み込まれたクローン（＝Ｇ０６０株）と、他方で標的化された様式で組み込まれたクローン（＝Ｇ０６１株）のプロファイルを、図２８に示す。２つのより小さいピークは、Ｍａｎ４’ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２を表す。なぜなら、これらは、α−１，２−マンノシダーゼおよびナタマメマンノシダーゼでの処理の際にＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ｒｅｓｐ．Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２にシフトするからである。後者の処理は、残存Ｇｌｃ１−２Ｍａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２からＧｌｃ１−２Ｍａｎ４’ＧｌｃＮＡｃ２、およびＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からＧｌｃＮＡｃＭａｎ２ＧｌｃＮＡｃ２への部分的変換ももたらす。Ｍａｎ４’ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ５’ＧｌｃＮＡｃ２の存在は、しかし、異種的に（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌｙ）同時発現されたＨＤＥＬタグ付きα−１，２−マンノシダーゼによる、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２への不完全な変換を示す。同様に、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の存在は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を得るための組換えヒトＧｎＴ  ＩによるＧｌｃＮＡｃ残基の不完全な移動を示す。しかし、上記の結果に基づいて（例えば実施例７でのＧ０４７培養、図１９）、培養条件の違いは、変換率を著しく増加でき、よって、終末の結果を改善できることが明確である。
【０１３９】
（実施例１０）ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２生成Ｇ０６１株におけるＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩの発現
実施例８で記載したようにして、Ｙａｒｒｏｗｉａコドン最適化配列を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍｎｎ２タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  受託番号Ｐ３８０６９）の最初の３６個のＮ末端アミノ酸と、それに続くラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ  ＩＩ）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  受託番号Ｑ０９３２６）の触媒ドメインとからなる融合タンパク質（図２２、それぞれ配列番号１７および配列番号１８）の発現のために作製した。酵母Ｍｎｎ２の３６個のＮ末端アミノ酸は、触媒ＧｎＴ  ＩＩドメインのためのゴルジ局在化シグナルとして働く。この様式で、Ｍｎｎ２−ＧｎＴ  ＩＩ融合タンパク質が、分泌経路においてＫｒｅ２−ＧｎＴ  Ｉ融合タンパク質と同じまたはそれより後の位置にさえ局在化されることを確実にして、その結果、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２をＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換できた。融合タンパク質の発現のための合成遺伝子を、Ｈｐ４ｄプロモーターの転写制御下に配置して、プラスミドｐＹＬＨｐ４ｍＡＸｒＧｎＴＩＩを得て、これを、ＹａｒｒｏｗｉａゲノムへのＨｐ４ｄ駆動型ＧｎＴ  ＩＩ発現カセットの無作為組み込みのために用いた。代替の方策では、構築物ＯＸＹＰ２８９  ｐＰＴＡｘｐｌ−ＡＤＥ２ｅｘ−Ｈｐ４ｄｈＧｎＴＩＩを作製して、ＹａｒｒｏｗｉａゲノムのＡＸＰ１遺伝子座へのＨｐ４ｄ駆動型ＧｎＴ  ＩＩ発現カセットの標的化組み込みを可能にした。
【０１４０】
Ｇ０６１株（実施例９を参照されたい）の形質転換の前に、プラスミドをＮｏｔＩ消化し、ターゲティング／発現カセットを単離した。形質転換体を、それらのアデニン原栄養性に基づいて選択した。ＡＤＥ２遺伝子座への発現カセットの正しい組み込みは、ゲノムＤＮＡをＸｍｎＩで消化した後のサザンブロット分析により確認した。ＧｎＴ  ＩＩコード配列に対する特異性を有するＤＩＧ標識プローブを、順方向プライマーｒＧｎＴＩＩ−ＦＷ（５’−ＧＡＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＡＡＡＣＧ−３’）（配列番号２８）および逆方向プライマーｒＧｎＴＩＩ−ＲＶ（５’−ＣＴＴＧＡＣＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＣＧ−３’）（配列番号２９）を用いて作製した。この方策により、遺伝子がＡｘｐ１遺伝子座にうまく組み込まれる場合には、３１７２ｂｐのバンドが生成される。
【０１４１】
代替の方策では、Ａｘｐ１遺伝子座への正しい組み込みは、順方向プライマーＡＸＰＶｅｒ１ｂ（５’−ＧＣＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＣＧＡＴＧＣＧＡＴＣＧＴＧＧＣＡＡＴＣＣ−３’）（配列番号３０）および逆方向プライマーＡＸＰＶｅｒ２ｂ（５’−ＣＡＡＧＡＡＧＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＧＧＣＧＡＡＴＣＴＣＣＡＴＣ−３’）（配列番号３１）を用いるゲノムＤＮＡについてのＰＣＲ反応により検査できる。Ａｘｐ１遺伝子座へ正しくターゲティングされた場合は、６４８９ｂｐのＰＣＲ断片が予測される。
【０１４２】
セクレトームについてのＮ−グリカン分析と、それと組み合わせた単離糖のナタマメβ−Ν−アセチルヘキソサミニダーゼまたはＴ．ｒｅｅｓｅｉα−１，２−マンノシダーゼでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理は、いくつかの形質転換体がＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生成でき、よって機能的ＧｎＴ  ＩＩ活性を発現できることを示した（図２９）。その分析は、全Ｎ−グリカンプールの約２５〜３０％が、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなり、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２への変換率が約９０％であることを示した。最終的に選択した株をＧ０７０（Ｇ０６１へのｐＹＬＨｐ４ｍＡＸｒＧｎＴＩＩの組み込み）およびＧ０７１（Ｇ０６１へのＯＸＹＰ２８９  ｐＰＴＡｘｐ１−ＡＤＥ２ｅｘ−Ｈｐ４ｄｈＧｎＴＩＩの組み込み）と称した。
【０１４３】
（実施例１１）Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａへの抗ＨＥＲ２重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の同時Ｈｐ４ｄ駆動型発現のためのタンデムプラスミドの構築
抗ＨＥＲ２抗体重鎖および軽鎖についてのアミノ酸配列を、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、８９巻（１０号）：４２８５〜４２８９頁（１９９２年）；およびＷａｒｄら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７０巻（５号）：２５６７〜２５７６頁（２００４年）から得た。関連するアミノ酸配列は、逆翻訳され（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｉｔｉｃａについてコドン最適化され、ＧｅｎＡｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙにより合成された。非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域は、可能であれば回避した。最適化プロセス中に、以下のシス作用性配列モチーフは回避した：内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位およびリボソーム進入部位、ＡＴリッチまたはＧＣリッチ配列ストレッチ、反復配列およびＲＮＡ  ２次構造ならびに（潜在的）スプライス供与部位および受容部位。異所性タンパク質の分泌を可能にするために、Ｌｉｐ２タンパク質「プレプロ」シグナルのコード配列（ペプチドリンカー「ＧＧＧ」のコード配列が後に続く）を、コード配列の５’領域に付加した。「ＧＧＧ」を、正しいＫｅｘ２プロセシングのための変化を増進するために付加した。図３０Ａは、合成プレプロＬｉｐ２−ＬＣのヌクレオチド配列（＝７５０ｂｐ）（配列番号３２）を含有する。図３０Ｂは、プレプロＬｉｐ２−ＬＣのアミノ酸配列（＝２５０Ａａ；ＭＷ＝２７．０１１Ｄａ；ｐＩ＝８．４６）（配列番号３３）を含有する。図３１Ａは、合成プレプロＬｉｐ２−ＨＣのヌクレオチド配列（＝１４５８ｂｐ）（配列番号３４）を含有する。図３１Ｂは、プレプロＬｉｐ２−ＨＣのアミノ酸配列（＝４８６Ａａ；ＭＷ＝５２．８５３Ｄａ；ｐＩ＝８．６５）（配列番号３５）を含有する。プレプロＬｉｐ２−ＨＣおよび−ＬＣについてのコード配列を、ｐＹＬＨｐ４Ｌ２ｐｒｅｐｒｏＨｅｒＨＣ／ＬＣ（ＧＵＴ２ｅｘ）−ｏｒｉ２と称する同じベクターに導入した。
【０１４４】
（実施例１２）様々な程度の糖鎖工学的改変によるＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株での抗ＨＥＲ２抗体ＨＣおよびＬＣの発現
プラスミドｐＹＬＨｐ４Ｌ２ｐｒｅｐｒｏＨｅｒＨＣ＆ＬＣ（ＧＵＴ２ｅｘ）−ｏｒｉ２をＮｏｔＩで消化し、ＨＣ−／ＬＣ−タンデム発現カセットを単離した後に、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｇ０４５株、Ｇ０５７株、Ｇ０６１株およびＧ０７１株（表２を参照されたい）を形質転換した。無作為に組み込まれたＨＣ−／ＬＣ−発現カセットを含有する形質転換体を、グリセロールを唯一の炭素源として増殖するそれらの能力に基づいて選択した。ＨＣおよびＬＣの発現解析は、選択した形質転換体を、グリセロールを唯一の炭素源として含有するリッチ培地（ＳｕｐｅｒＴ／グリセロール培地：０．５％酵母抽出物；２％麦芽抽出物；１％トリプトン；１．５％グリセロール；２００ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ６．８）中で４日間振とうフラスコ培養した後にウェスタンブロッティングにより行った。ＬＣ検出は、カッパ遊離軽鎖に対するマウスモノクローナル（４Ｃ１１）（Ａｂｅａｍ）を用いて行い、ＨＣ検出は、マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。
【０１４５】
抗ＨＥＲ２抗体生成株のセクレトームのＮ−グリカンは、いずれのＨＣおよびＬＣも発現しない対応する糖鎖工学的に改変した株と同様のプロファイルを示した（図３２）。Ｇ０４５、Ｇ０５７、Ｇ０６１およびＧ０７１バックグラウンドを有する株でのＮ−グリカンのパーセンテージは、ＳｕｐｅｒＴ／グリセロール培地中での６日間の振とうフラスコ培養の後に決定した。Ｇ０４５バックグラウンドでは、５４．６％のＮ−グリカンがＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であった。Ｇ０５７バックグラウンドでは、４７．５％のＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であった。Ｇ０６１バックグラウンドでは、５８．９％のＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であった。Ｇ０７１バックグラウンドでは、３７．６％のＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であった。
【０１４６】
（実施例１３）抗ＨＥＲ２抗体ＨＣおよびＬＣを発現するＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２合成株であるＹａｒｒｏｗｉａ  Ｇ０９６株の発酵
ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を合成できる株であるＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｇ０７１のいくつかのｐＹＬＨｐ４Ｌ２ｐｒｅｐｒｏＨｅｒＨＣ＆ＬＣ（ＧＵＴ２ｅｘ）−ｏｒｉ２形質転換体を、ＨＣおよびＬＣ発現レベルについて分析した。これらのクローンのうちの１つであるＧ０９６を、さらなる分析のために選択した。
【０１４７】
発酵は、プロセス制御および管理システム（Ｌｕｃｉｌｌｕｓ  ＰＩＭＳ）を備える１４リットル撹拌タンクバイオリアクタ（ＭＡＶＡＧ  ＡＧ）で行った。培地中の相対的酸素分圧、排出ガス中のＣＯ２とＯ２の濃度、ｐＨ値、温度、リアクタ過圧、リアクタ重量、フィード重量および基本重量（ｂａｓｅ  ｗｅｉｇｈｔ）は全てオンラインで監視した。泡の発生は、消泡剤ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を加えることにより妨いだ。ｐＨの調整は、２５％アンモニア溶液または８．５％リン酸溶液のいずれかの添加により行った。
【０１４８】
Ｇ０９６の種培養物を２８℃にて、リッチ培地を含有する振とうフラスコで増殖させた。種培養物を、無機質培地を含有する発酵槽に接種して、グリセロールを唯一の炭素源として用いて、回分段階（ｂａｔｃｈ  ｐｈａｓｅ）を２８℃にて無制限増殖で開始した。この段階は、高いバイオマス濃度に迅速に到達するために用いた。この時点以降、プロセスを、０．０２の定常増殖速度の指数グリセロール流加（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ）（グリセロールを唯一の炭素源およびエネルギー源として用いる；ｐＨ６）にシフトした。例として、２８℃での流加発酵の結果を以下に記載する。
【０１４９】
流加段階は、１４８時間継続した。発酵の異なる時点で試料を採取して、以下のパラメータを追跡した：１）ウェスタンブロットによるＬＣおよびＨＣタンパク質主鎖の発現；２）ＥＬＩＳＡによる機能的抗ＨＥＲ２抗体の発現；ならびに３）セクレトームのＮ−グリコシル化プロファイルの進展。全長ＨＣ発現レベルは、時点７（３９時間）付近で最大に到達し、それ以降ほぼ等しいままである。ＬＣ発現は、時点７（３９時間）と１０（７３時間）の間で最大に到達したが、その後の時点で幾分か減少した。いくらかのＬＣ二量体が、時点５（２５時間）と９（６２時間）の間で生成されたが、これもまたその時点以降で消失した。
【０１５０】
機能的ＥＬＩＳＡを開発して、少なくとも１つの機能的抗原結合ドメインを有する抗ＨＥＲ２抗体の生成を測定した。プレートを、天然ＨＥＲ２抗原の組換えバリアントである組換えヒトＥｒｂＢ２／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングした。次いで、異なる時点で採集した培地の希釈物を、コーティングしたプレートに加えた。抗原結合タンパク質の量の評価を、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトカッパＬＣ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。流加発酵でのＥｒｂＢ２／Ｆｃキメラ結合タンパク質の量の進展（分泌された機能的抗ＨＥＲ２抗体の量の指標）を、図３３に示す。データは、抗ＨＥＲ２抗体のレベルの漸増と、生成段階の終末での１０〜１２ｍｇ／Ｌの最大値とを示す。
【０１５１】
Ｎ−グリカン分析を、流加発酵中のいくつかの時点で採取した試料について行った。結果を図３４Ａおよび３４Ｂに示す。流加段階の開始時に、相当量のグルコース含有Ｎ−グリカンが存在した。時点６以降から（指数的栄養補給の開始後３４時間）、グルコシル化Ｎ−グリカンのレベルは著しく減少し、採集の時点（時点１８、１４８時間）ではほとんど残っていなかった。このことは、グルコース含有Ｎ−グリカンを元来保持するタンパク質が、発酵の終末に薄められことを示した。この時点で、セクレトームから単離されたＮ−グリカンの約８６％が、構造ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有した。
【０１５２】
その他の実施形態
本発明を、その詳細な説明と関連付けて記載したが、上記の記載は、例示することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない（本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義される）。その他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
2013511272.tif 000011
【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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