(57)【要約】  本発明は、ターゲットのオリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含み、３′末端、５′末端もしくはそれら両末端に末端伸長部を有するプローブを用いたナノポア技術を基礎とする新規かつ改善されたオリゴヌクレオチド検出法を提供する。ポアを用いた改善されたナノポアセンサは、ｍｉＲＮＡなどのターゲットのオリゴヌクレオチドの、高感度の、選択的な、そして直接的な検出、識別及び定量化を可能にする。本発明による検出法は、また、患者の血液サンプル中のｍｉＲＮＡを基礎とする癌検出のための非侵襲性でかつ費用対効果の高い診断方法として使用することもできる。
2013540423.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖オリゴヌクレオチドの検出のためのプローブ分子であって、
ａ）ターゲットのオリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を有する中心ドメインと、
ｂ）前記中心ドメインの５′末端と３′末端の両方にタグ付けされた末端伸長部と
を含むプローブ分子。
【請求項２】
前記末端伸長部が、荷電されたポリマーを含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
少なくとも１つの末端伸長部が、荷電されたポリペプチド又はオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載のプローブ。
【請求項４】
前記の荷電されたポリペプチドが、少なくとも２つの正に荷電されたアミノ酸残基及び／又は少なくとも２つの芳香族アミノ酸残基を含む、請求項２に記載のプローブ。
【請求項５】
前記の伸長部のオリゴヌクレオチドが、前記ターゲットのオリゴヌクレオチドに相補的でない、請求項３に記載のプローブ。
【請求項６】
前記の伸長部のオリゴヌクレオチドが、約８ヌクレオチドないし約３０ヌクレオチドを含む、請求項３に記載のプローブ。
【請求項７】
前記の伸長部のオリゴヌクレオチドが、ホモポリマー、コポリマー又はヘテロポリマーを含む、請求項３に記載のプローブ。
【請求項８】
前記のホモポリマーが、ポリデオキシシトシン、ポリデオキシアデノシン又はポリデオキシチミンのオリゴヌクレオチドを含む、請求項７に記載のプローブ。
【請求項９】
前記のターゲットのオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１０】
前記のＲＮＡ分子が、ｍｉＲＮＡ又はその断片であり、その際、前記断片は、前記ｍｉＲＮＡ分子の少なくとも１５ヌクレオチドを含む、請求項９に記載のプローブ。
【請求項１１】
前記プローブの中心ドメインが、ターゲットのオリゴヌクレオチドに対して相補的な少なくとも約１５のヌクレオチド又はヌクレオベースを含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１２】
前記の末端伸長部が、前記中心ドメインの３′末端と５′末端の両方に共有結合されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から１１までのいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１３】
前記プローブが、オリゴヌクレオチドをデュアルコンパートメントナノポアシステムにおいて検出するにあたって使用するために適合されている、請求項１から１１までのいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１４】
サンプル中のオリゴヌクレオチドをナノポアシステムで検出する方法であって、
ａ）ターゲットのオリゴヌクレオチドを含むと疑われるサンプルと、前記ターゲットのオリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を有する中心ドメイン及びその３′末端と５′末端の少なくとも一方にタグ付けされた末端伸長部を含むプローブとを混合して、サンプル混合物を作成する工程と、
ｂ）前記サンプル混合物に、デュアルチャンバーナノポアシステムのcis側コンパートメントにおいて、前記のプローブとターゲットのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたものが、前記システムのナノポアを通じてアンジッピングプロセスによって移行するのを駆動するのに十分な電圧をかける工程と、
ｃ）前記のナノポアシステムにおいて経時的に電流パターンを分析する工程と、
を含み、
工程ａ）において、前記プローブの中心ドメインは、前記ターゲットのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズでき、
工程ｃ）において、前記サンプル中での前記のオリゴヌクレオチドの存在は、前記のサンプル単独又は前記プローブ単独で生ずるバックグラウンドの電流ブロックとは区別される、少なくとも１つのシグネチャ電流ブロックによって示される、前記検出方法。
【請求項１５】
前記のシグネチャ電流ブロックが、ｉ）バックグラウンド電流ブロックとは異なる時間の電流ブロック、ｉｉ）バックグラウンド電流ブロックとは異なる数の別個の電流遮断レベル、ｉｉｉ）バックグラウンド電流ブロックとは異なる発生順序の電流遮断レベル、ｉｖ）バックグラウンド電流ブロックとは異なる、遮断レベルでの電流振幅、ｖ）バックグラウンド電流ブロックとは異なる各遮断レベルの電流振幅、の少なくとも１つ又は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）もしくは（ｖ）の任意の組み合わせを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブが、請求項１から８までのいずれか１項に記載の又は請求項１１から１３までのいずれか１項に記載のプローブである、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記の末端伸長部が、少なくとも２つの正に荷電されたアミノ酸残基及び／又は少なくとも２つの芳香族アミノ酸残基を含む荷電されたポリペプチドを含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記の荷電されたポリペプチドは、前記プローブが前記ターゲットのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたときに正味の正電荷を提供する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記のナノポアが、ポアのtrans側開口部に負に荷電された残基の環状部を含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記のナノポアが、Ｋ１３１Ｄ、Ｋ１３１Ｅ又はＫ１３１Ｈのアミノ酸置換を含むα溶血素の変異体を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ａ）及び（ｂ）又は工程（ｂ）が、７未満のｐＨ値で行われる、請求項１７から２０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記のターゲットのオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記のＲＮＡ分子が、ｍｉＲＮＡ又はその断片であり、その際、前記断片は、前記ＲＮＡ分子の少なくとも１５ヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ分子が、メチル化されていないＤＮＡ分子、メチル化されたＤＮＡ分子及び／又はリン酸化されたＤＮＡ分子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記のシグネチャ電流ブロックの頻度を使用して、前記サンプル中の前記ターゲットのオリゴヌクレオチドの量を定量化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
非ターゲットのオリゴヌクレオチドを、前記サンプル中にスパイクインさせ、かつ前記の非ターゲットのオリゴヌクレオチドに寄与しうる電流ブロックの頻度を使用して、前記のシグネチャ電流ブロックの頻度を正規化する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記のナノポアシステムは、デュアルコンパートメントシステム、マイクロ液滴システム、チップシステム及びグラフェンシステムからなる群から選択される、請求項１４から２６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
サンプル中の２もしくはそれより多くの異なるターゲットのオリゴヌクレオチドであって少なくとも１つのヌクレオチドだけ異なるヌクレオチドをナノポアシステムで検出する方法であって、
ａ）前記の異なるターゲットのオリゴヌクレオチドを含むと疑われるサンプルと、前記ターゲットのオリゴヌクレオチドに対して完全にもしくは部分的に相補的な配列を有する中心ドメイン及びその３′末端と５′末端の少なくとも一方にタグ付けされた末端伸長部を含むプローブとを混合して、サンプル混合物を作成する工程と、
ｂ）前記サンプル混合物に、デュアルチャンバーナノポアシステムのcis側コンパートメントにおいて、前記のプローブとターゲットのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたものが、前記システムのナノポアを通じてアンジッピングプロセスによって移行するのを駆動するのに十分な電圧をかける工程と、
ｃ）前記のナノポアシステムにおいて経時的に電流パターンを分析する工程と、
を含み、
工程ａ）において、前記プローブの中心ドメインは、前記ターゲットのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズでき、
工程ｃ）において、前記サンプル中での前記の２もしくはそれより多くの異なるターゲットのオリゴヌクレオチドの存在は、２もしくはそれより多くの異なるシグネチャ電流ブロックによって示される、前記検出方法。
【請求項２９】
前記の２もしくはそれより多くの異なる電流ブロックが、ｉ）種々のシグネチャ電流ブロック時間（τsig）、ｉｉ）種々の数の異なる電流遮断レベル、ｉｉｉ）種々の発生順序の電流遮断レベル、ｉｖ）種々の電流振幅、ｖ）各遮断レベルの種々の電流振幅、の少なくとも１つ又は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）もしくは（ｖ）の任意の組み合わせを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記の工程（ｃ）における分析が、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下の面積の測定を含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記のターゲットのオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記のＲＮＡ分子が、ｍｉＲＮＡ又はその断片であり、その際、前記断片は、前記ＲＮＡ分子の少なくとも１５ヌクレオチドを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記のＤＮＡ分子が、メチル化されていないＤＮＡ分子、メチル化されたＤＮＡ分子及び／又はリン酸化されたＤＮＡ分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記末端伸長部が、荷電されたポリマーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記末端伸長部が、荷電されたポリペプチド又はオリゴヌクレオチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記の荷電されたポリペプチドが、少なくとも２つの正に荷電されたアミノ酸残基及び／又は少なくとも２つの芳香族アミノ酸残基を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記の荷電されたポリペプチドは、前記プローブが前記ターゲットのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたときに正味の正電荷を提供する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記のナノポアが、ポアのtrans側開口部に負に荷電された残基の環状部を含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記のナノポアが、Ｋ１３１Ｄ、Ｋ１３１Ｅ又はＫ１３１Ｈのアミノ酸置換を含むα溶血素の変異体を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
工程（ａ）及び（ｂ）又は工程（ｂ）が、７未満のｐＨ値で行われる、請求項３５から３９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記の伸長部のオリゴヌクレオチドが、前記ターゲットのオリゴヌクレオチドに対して相補的でない、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記の伸長部のオリゴヌクレオチドが、約８ヌクレオチドないし約３０ヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記の伸長部のオリゴヌクレオチドが、ホモポリマー、コポリマー又はヘテロポリマーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記のホモポリマーが、ポリデオキシシトシン、ポリデオキシアデノシン又はポリデオキシチミンのオリゴヌクレオチドを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記の中心ドメインが、ターゲットのヌクレオチドに対して相補的な少なくとも約１５のヌクレオチド又はヌクレオベースを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４６】
前記のナノポアシステムは、デュアルコンパートメントシステム、マイクロ液滴システム、チップシステム及びグラフェンシステムからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４７】
前記の末端伸長部が、前記中心ドメインの３′末端と５′末端の両方に共有結合されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項２８から４６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記のプローブに１もしくはそれより多くのミスマッチを有する前記サンプル中のターゲットのオリゴヌクレオチドの存在は、ミスマッチを有さない、ターゲットのオリゴヌクレオチドとプローブとのハイブリダイズされた複合体について観察されるシグネチャ電流ブロック時間（τsig）と比較して短縮されたシグネチャ電流ブロック時間（τsig）によって特徴付けられる、請求項２８から４６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
参照のターゲットのオリゴヌクレオチドよりも多くの前記プローブとのミスマッチを有する前記サンプル中のターゲットのオリゴヌクレオチドの存在は、前記の参照のターゲットのオリゴヌクレオチドについて観察されるシグネチャ電流ブロック時間（τsig）と比較して短縮された、前記ターゲットのオリゴヌクレオチドについてのシグネチャ電流ブロック時間（τsig）によって特徴付けられる、請求項２８から４６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１から１３までのいずれか１項に記載のプローブと、ナノポアとを含むキット。
【請求項５１】
前記プローブが、荷電されたポリペプチドである少なくとも１つの末端伸長部を含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記の荷電されたポリペプチドが、少なくとも２つの正に荷電されたアミノ酸残基及び／又は少なくとも２つの芳香族アミノ酸残基を含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５３】
前記の荷電されたポリペプチドは、前記プローブがターゲットのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたときに正味の正電荷を提供する、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記のナノポアが、ポアのtrans側開口部に負に荷電された残基の環状部を含む、請求項５０から５３までのいずれか１項に記載のキット。
【請求項５５】
前記のナノポアが、Ｋ１３１Ｄ、Ｋ１３１Ｅ又はＫ１３１Ｈのアミノ酸置換を含むα溶血素の変異体を含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
ターゲットのオリゴヌクレオチドに対して完全にもしくは部分的に相補的な配列を有する中心ドメイン及びその３′末端と５′末端の少なくとも一方にタグ付けされた荷電されたポリペプチドを含む末端伸長部を含むプローブと、ナノポアとを含むキット。
【請求項５７】
前記の荷電されたポリペプチドが、少なくとも２つの正に荷電されたアミノ酸残基及び／又は少なくとも２つの芳香族アミノ酸残基を含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記の荷電されたポリペプチドは、前記プローブがターゲットのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたときに正味の正電荷を提供する、請求項５６に記載のキット。
【請求項５９】
前記のナノポアが、ポアのtrans側開口部に負に荷電された残基の環状部を含む、請求項５６から５８までのいずれか１項に記載のキット。
【請求項６０】
前記のナノポアが、Ｋ１３１Ｄ、Ｋ１３１Ｅ又はＫ１３１Ｈのアミノ酸置換を含むα溶血素の変異体を含む、請求項５９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、米国特許仮出願第６１／３９９，５７８（出願日２０１０年７月１４日）の利益を主張する。この出願の全内容は、参照をもって本願に開示されたものとする。
【０００２】
助成の表明
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられた認可番号GM079613で政府支援のもと完成されたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、超高感度で低ノイズのナノポアを基礎とする単分子技術を用いた、単分子検出の方法／装置に関し、より具体的には一本鎖の核酸、例えばマイクロＲＮＡの定量的な検出のための方法／システムに関する。
【０００４】
配列表の言明
サイズ１２３０３バイト（オペレーティングシステムMS-Windowsで測定）を有する２０１１年７月１４日に作成されたファイル名"52553_96854_ST25.txt"のファイルに収容された配列表は、電子的送信によって本願とともに提出している。この配列表の全内容は、参照をもって本願に開示されたものとする。
【０００５】
発明の背景
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、転写後のレベルで遺伝子発現を調節する短鎖（約１８〜２４ヌクレオチド）のノンコーティングＲＮＡのクラスである(2)。それらのターゲット配列とのホモロジーの度合いに応じて、ｍｉＲＮＡの結合は、ターゲットｍＲＮＡの翻訳抑制か、その開裂かのいずれかを誘発する(2)。強力な遺伝子レギュレーターとして、ｍｉＲＮＡは、発生、細胞分化、そして細胞周期、アポトーシス及びシグナル伝達経路の調節において重要な役割を担っている(2),(3)。ｍｉＲＮＡの異常発現は、あらゆる種類の腫瘍においても見出されており(4),(5)、異なる癌の種類は、別個のｍｉＲＮＡ発現プロフィールを有する(6)。数個のヌクレオチドの違いを含む幾つかのｍｉＲＮＡファミリーを含む特定のｍｉＲＮＡは、原発腫瘍から血流へと絶えず放出されており、それは驚くべきほど安定な形態で存在する(7)。最近の研究では、循環しているｍｉＲＮＡはエキソソームベシクル内部に封入されており、受容細胞に移転可能であり、かつそこで機能的であることが実証されている(8),(9)。このように、腫瘍特異的な循環しているｍｉＲＮＡの検出は、癌細胞の早期診断、進行度分類及びモニタリングのための強力なツールを提供する(10)。
【０００６】
ｍｉＲＮＡ検出
ｍｉＲＮＡ検出のために、逆転写リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を含む技術と、マイクロアレイを含む技術の幾つかの技術が開発されてきている(11)-(13)。 それぞれの技術は、それ特有の利点を有するが、酵素による増幅が必要とされること、半定量的な結果であることが制限に含まれる(14)。特に、短鎖のｍｉＲＮＡ配列は、プライマー又はプローブの選択的な設計を困難なものにし、こうしてクロスハイブリダイゼーションと低い選択性がもたらされる。これは、特に、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡファミリーにおいて数個の又は単独のヌクレオチドの違いを含む場合に言える。比色法、生物発光、酵素ターンオーバー数及び電気化学を基礎とする新たに浮上した技術が提案されており、ナノ粒子と分子ビーコンは、高感度及び高選択性を有するｍｉＲＮＡ検出に応用されている（レビュー(14)）。しかし、固有の融通性は改善の必要がある。最近では、単分子蛍光とロックト核酸（lock-nucleic acid）（ＬＮＡ）(15)プローブとの統合が、組織サンプルにおけるｍｉＲＮＡプロファイリングのための高感度な方法を提供したが(16)、この方法は高価な機器を必要とする。
【０００７】
ナノポア式単分子検出
ナノメートルスケールのポア構造において、イオン電流は、イオン経路を占める単一のターゲット分子の存在、位置及び構造に非常に敏感になる(17)。この敏感さは、単分子を"可視化"することと、ポアのコンダクタンスの特徴的変化からそれらのキネティクスを解明することと、単分子シグネチャイベント（signature event）の発生からターゲットを定量化することを可能にする。ナノポアは、広範な生物工学的用途のために、受容体型（receptive）の単分子デテクタとして開発された（レビュー(17)-(19)）。ナノポアは、また、次世代のＤＮＡ配列決定技術の一つとも目されている(20),(21)。例えば、２ｎｍのナノポアであるα溶血素の膜貫通型のタンパク質ポアは、ＤＮＡ配列決定のためによく特徴付けられている一本鎖のオリゴヌクレオチドの迅速な移行（translocation）を可能にする(22)-(27)。 しかしながら、分子移行を基礎とする検知方式は、ｍｉＲＮＡ検出には適していない。それというのも、全ての成熟したｍｉＲＮＡの配列は短鎖（１８〜２４ヌクレオチド）であり、該ナノポアを通り抜けるときに、それらの異なるｍｉＲＮＡによる電流シグナルは区別できないからである。
【０００８】
従って、向上した感度、スピーディーなプロセス、そして費用効果を有したナノスケールのポア構造を基礎とする新規のｍｉＲＮＡ検出法を提供する必要がある。
【０００９】
発明の要旨
本発明の一態様において、一本鎖のオリゴヌクレオチド、例えばｍｉＲＮＡの検出及び識別のためのナノポアを基礎とする新規かつ改善された検知システムが記載されている。ターゲットの一本鎖のオリゴヌクレオチドを検出するための本発明によるシステムは、１）ナノポアと、２）アンジッピング（unzipping）を誘発するのに十分な電圧を提供する電源と、３）ターゲットのオリゴヌクレオチドに相補的な中心ドメインを有するプローブであって、前記ターゲットのオリゴヌクレオチドと前記プローブとのハイブリッドのアンジッピングにより一定の同定可能な電流シグナル変化が誘発されるプローブと、４）前記電流シグナル変化を検出するための手段とを含む。本発明によるプローブは、更に、その３′末端もしくは５′末端（又はその両方）に少なくとも１つのシグナルタグを含む。前記のシグナルタグは、電圧により駆動される、ナノポアを通じたアンジッピングによる移行を支援するのに十分な長さを有する任意の荷電した一本鎖分子であってよい。例えば、前記のシグナルタグは、ポリ（ｄＣ）n、ポリ（ｄＡ）n及びポリ（ｄＴ）nなどのオリゴヌクレオチド又は荷電したポリペプチドであってよい。
【００１０】
本発明のもう一つの態様において、一本鎖のオリゴヌクレオチドの検出及び識別のためのナノポア技術を基礎とする新規かつ改善された方法が記載されている。本発明による方法は、ナノポア中での、ターゲットのオリゴヌクレオチドとそのプローブとのハイブリッドのアンジッピングによって引き起こされる電流変化を検出する。本発明による方法は、１）ターゲットのオリゴヌクレオチドと、前記ターゲット配列とマッチするその中心ドメインとその３′末端及び５′末端の少なくとも一方にタグ付けされた荷電された一本鎖分子とを有する予め設計されたプローブとを混合することで、サンプル混合物を得る工程と、２）前記混合物を、ナノポアシステムのcis側チャンバー中にロードし、そしてtrans側チャンバーから電圧を加える工程と、３）予め決められた時間帯にわたって電流出力を記録する工程とを含んでいる。
【００１１】
本発明の更なるもう一つの態様において、患者の血液サンプルにおける癌関連のｍｉＲＮＡを検出及びモニタリングするための新規かつ改善された方法が記載されている。本発明による方法は、１）患者の血液サンプルから抽出された全血漿ＲＮＡと、ターゲティングするｍｉＲＮＡに対して相補的な配列を含むｍｉＲＮＡプローブであってその３′末端、５′末端又はその両方にシグナルタグを含むプローブとを混合する工程と、２）前記混合物を、予め選択された電圧を有するナノポアチャンバー中に添加する工程と、３）単独のｍｉＲＮＡ分子認識のための電気的マーカーとしてはたらく出力電流トレースにおいてシグネチャイベントをモニタリング及び分析する工程とを含んでいる。
【００１２】
一定の実施形態においては、一本鎖のオリゴヌクレオチド、例えばｍｉＲＮＡのナノポアを用いた検出のためのプローブ分子であって、１）ターゲットのオリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を有する中心ドメインと、２）前記中心ドメインの３′末端又は５′末端の少なくとも一方にタグ付けされた末端伸長部を含むプローブ分子が提供される。一定の実施形態においては、前記の末端伸長部は、荷電された鎖状分子である。一定の実施形態においては、前記の末端伸長部は、荷電されたポリペプチドである。一定の実施形態においては、前記の末端伸長部は、荷電されたポリマーである。
【００１３】
一定の実施形態においては、本発明は、デュアルコンパートメント式（dual-compartment）のナノポアシステムで一本鎖のオリゴヌクレオチドを検出する方法を提供するが、前記システムは、中心領域に開口部を有する仕切によって区分けされたcis側コンパートメントとtrans側コンパートメントと、両方のコンパートメントを満たす記録溶液と、前記の仕切の開口部で形成された脂質二重膜と、前記のcis側チャンバーとtrans側チャンバーとをまたぐ前記脂質二重膜を通じて差し込んだナノポアと、前記のcis側コンパートメントもしくはtrans側コンパートメントからそれぞれ突き出している一対の電極を介して前記システムに印加された電圧と、電流変化をモニタリングする電流デテクタとを含み、前記方法は、１）ターゲットのオリゴヌクレオチドと、前記ターゲット配列とマッチするその中心ドメインとその３′末端及び５′末端の少なくとも一方にタグ付けされた荷電された一本鎖分子とを有する予め設計されたプローブとを混合することで、サンプル混合物を得る工程と、２）前記混合物を、cis側コンパートメント中にロードする工程と、３）前記システムに予め決められた電圧を与える工程と、４）予め決められた時間帯にわたって電流出力を記録する工程とを含んでいる。前記方法の一定の実施形態においては、前記の記録工程は、更に、ターゲットのオリゴヌクレオチドとプローブとのハイブリッドがナノポア内でアンジッピングすることによって引き起こされる電流変化を分析する工程を含んでよい。
【００１４】
当該発明は、また、プローブと、ナノポアと、前記プローブ及びナノポアを含むキットと、関連の使用方法とを含んでおり、それらは、以下の明細書の部分、これと一緒に提供される図面及び特許請求の部分に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態による、一つの例示的なナノポア検知システムの概略図である。
【図２】図２は、脂質二重膜を通じて差し込んだ一つの例示的なナノポアの拡大概略図である。
【図３】図３は、一つの例示的な電流トレースと、シグネチャイベントの拡大された電気的マークと、アンジッピングイベントと移行イベントの概略図を含んでいる。
【図４】図４（Ａ）〜（Ｄ）は、本発明によるプローブであるＰ155によるｍｉＲ−１５５の一つの例示的な検出を図解している。
【図５】図５（ａ）及び（ｂ）は、ナノポアセンサを用いたｍｉＲＮＡの定量化で使用した発明を図説している。
【図６】図６（ａ）及び（ｂ）は、ｍｉＲＮＡと類似の配列との識別で使用した発明を図説している。
【図７】図７（ａ）〜（ｆ）は、肺癌患者の血漿におけるｍｉＲ−１５５の検出で使用した発明を図説している。
【図８】図８Ａ〜Ｇは、ナノポアにおける、特定のプローブを有する単一ｍｉＲＮＡ分子の捕捉を示している。
【図９】図９Ａ〜Ｂは、プローブ配列の最適化による検出感度の向上を示している。
【図１０】図１０Ａ〜Ｄは、１もしくは２つの異なるヌクレオチドを含むｌｅｔ−７ ｍｉＲＮＡの識別を示している。
【図１１】図１１Ａ〜Ｈは、肺癌患者の血漿におけるｍｉＲ−１５５の検出を示している。
【図１２】図１２Ａ〜Ｄは、ブロック時間のヒストグラムを示している。
【図１３】図１３は、ｍｉｒ−１５５・Ｐ155のシグネチャイベントの電圧に依存する頻度を示している。
【図１４】図１４は、他の合成ｍｉＲＮＡ成分の存在下での、Ｐ155（１００ｎＭ）を用いて検出されたｍｉＲ−１５５シグネチャイベントの頻度を示している。
【図１５】図１５は、Ｌｅｔ−７ａ・Ｐaのハイブリッド及びＬｅｔ−７ｂ・Ｐaのハイブリッドによって形成されるシグネチャイベント数の時間ヒストグラムを示している。
【図１６】図１６Ａ〜Ｂは、イベント時間に基づく、完全マッチ（陽性）イベント及びミスマッチ（陰性）イベントの分離についてのシミュレーションを示している。
【図１７】図１７は、ｍｉｒ−１５５及びＰ155の移行頻度を示している。
【図１８】図１８Ａ〜Ｆは、ｍｉＲＮＡ／プローブの複合体の図、ペプチド−ＰＮＡプローブのＰ７ｂの移行についてのイベント、＋１８０ｍＶでの溶液において、遊離したｍｉＲＮＡ ｌｅｔ−７ｂ（プローブなし）では遮断イベントが観察できないこと、ｌｅｔ−７ｂ／Ｐ７ｂの複合体のトラップについてのシグネチャイベント、Ｌｅｔ−７ｂとは異なる２つのヌクレオチドを有するＬｅｔ−７ｃが、プローブのＰ７ｂのＰＮＡに結合できず、従って図Ａ１ｃに示されるようにシグネチャイベントを生じないこと、Ｌｅｔ−７ｂ（完全マッチ、重なりのない２つの離れたクラスター）及びＬｅｔ−７ｃ（２つのミスマッチ、完全に重なった２つのクラスター）に結合するＰ７ｂについての時間−振幅の特性の比較を示している。
【図１９】図１９Ａ〜Ｃは、短鎖の３′末端にヘアピンを有するＨＰ−Ｃ３０を使用した場合に、新しい種類の３レベルの電流パターンが観察されたこと、短鎖の３′末端にストレプトアビジンが結合されたＳＡ−Ｃ３０を使用した場合にも、新しいマルチレベルの電流パターンが観察されたこと、２つのＤＮＡを結合する短鎖のオリゴヌクレオチドを使用した場合に、その複合体がナノポア中で２工程で逐次アンジッピングされうることを示している。
【００１６】
図面の説明
図１は、本発明の一実施形態による、一つの例示的なナノポア検知システムの概略図である。
【００１７】
図２は、脂質二重膜を通じて差し込んだ一つの例示的なナノポアの拡大概略図である。
【００１８】
図３は、一つの例示的な電流トレースと、シグネチャイベントの拡大された電気的マークと、アンジッピングイベントと移行イベントの概略図を含んでいる。
【００１９】
図４（Ａ）〜（Ｄ）は、本発明によるプローブであるＰ155によるｍｉＲ−１５５の一つの例示的な検出を図解している：  図４（Ａ）は、異なるタイプのブロックを示す電流トレースである。それらのブロックプロフィールと相応の分子プロセスは、パネルＢ、Ｃ及びＤに示されている；  図４（ｂ）／（ｂ′）は、遊離したｍｉＲ−１５５もしくはＰ155分子がポアを通じて移行することによって発生される一つの例示的なスパイク様の短いブロックである；  図４（ｃ）／（ｃ′）は、ｍｉＲ−１５５・Ｐ155ハイブリッドのアンジッピングと、ナノ空隙内でのｍｉＲ−１５５の閉じ込めと、ｍｉＲ−１５５の移行とによって一連に生成される複数のコンダクタンスレベルを有する拡大された長いブロックである；  図４（ｄ）／（ｄ′）は、アンジッピングせずにcis側入口から出るトラップされたｍｉｒ−１５５・Ｐ155ハイブリッドによって生成される単独のコンダクタンスレベルを有する一つの例示的な長いブロックである。
【００２０】
図５（ａ）及び（ｂ）は、ナノポアセンサを用いたｍｉＲＮＡの定量化で使用した発明を図説している。（ａ）．１００ｎＭのＰ155の存在下での種々の濃度のｍｉＲ−１５５での電流トレース。ポアと相互作用するｍｉＲ−１５５・Ｐ155に関するシグネチャイベントを、赤色の矢印で印している。（ｂ）．ｍｉＲ−１５５濃度［ｍｉＲ−１５５］とシグネチャイベントの頻度（ｆsig）との間の相関。有意性（ｐ＜０．０１）は、任意の２種類のｍｉＲ−１５５濃度での検出の間で妥当である。ｆsig−［ｍｉＲ−１５５］曲線は、式１を使用して当てはめている。
【００２１】
図６（ａ）及び（ｂ）は、ｍｉＲＮＡと類似の配列との識別で使用した発明を図説している。（ａ）．プローブＰa（＋１２０ｍＶ）を使用したｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｂの検出のための電流トレース。（ｂ）．ｌｅｔ−７ａ・Ｐa、ｌｅｔ−７ｂ・Ｐa、ｌｅｔ−７ａ・Ｐb及びｌｅｔ−７ｂ・Ｐbのためのシグネチャイベントの時間（τsig）。
【００２２】
図７（ａ）〜（ｆ）は、肺癌患者の血漿におけるｍｉＲ−１５５の検出で使用した発明を図説している。（ａ）〜（ｄ）．シグネチャイベントは、健全なボランティア（ａ）及び肺癌患者（ｂ）からの全血漿ＲＮＡについての電流トレースにおいて、１００ｎＭのＰ155プローブの存在下で見出されたが、Ｐ155（（ｃ）及び（ｄ））の不在下では観察されなかった。それらのトレースは、１ＭのＫＣｌ中で＋１００ｍＶで記録された。（ｅ）．６人の健全な個体（Ｎ１〜Ｎ６）及び肺癌を保有する６人の患者（Ｐ１〜Ｐ６）からのｍｉＲ−１５５シグネチャイベントの頻度（ｆsig）。各サンプルを、独立したナノポアを用いてｎ回（ｎ≧４）測定した。データは、平均±ＳＤとして示した。患者の状態は以下の通りである。（Ｐ１）転移性肺扁平上皮癌；（Ｐ２）再発小細胞癌；（Ｐ３）早期段階の小細胞癌、化学療法と放射線の後の状況；（Ｐ４）早期段階の小細胞癌、化学療法の後の状況；（Ｐ５）末期段階の非小細胞癌、切除と化学療法の後の状況；（Ｐ６）末期の腺癌、化学療法の後の状況。（ｆ）．ナノポアセンサとｑＲＴ−ＰＣＲで測定された、健全なグループ（左）及び肺癌患者グループ（右）における相対ｍｉＲ−１５５レベル。平均と一緒にＳＤを示した。
【００２３】
図８Ａ〜Ｇは、ナノポアにおける、特定のプローブを有する単一ｍｉＲＮＡ分子の捕捉を示している。（Ａ）．ｍｉＲＮＡ・プローブのハイブリッドの分子図；（Ｂ）．cis側溶液中の１００ｎＭのｍｉＲ−１５５／Ｐ155の存在下での逐次発生したナノポア電流ブロック。記録溶液は、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）で緩衝された１ＭのＫＣｌを含有していた。それらのトレースは、＋１００ｍＶで記録した。同定された電流パターンと相応する分子メカニズムとを、パネルｃ、ｆ及びｇに示した。枠に入れたブロックは、パネルｃ及びｄに示したマルチレベル電流パターンを示した；（ｃ）．ポア内にトラップされ、アンジッピングされ、引き続き、アンジッピングされたＰ155とｍｉＲ−１５５の該ポアを通じた連続的な移行が行われる、ｍｉＲ−１５５・Ｐ155ハイブリッドによって発生された、＋１００ｍＶでのマルチレベルの長いブロック；（ｄ）．＋１５０ｍＶ及び＋１８０ｍＶでの特徴的なマルチレベルの長いブロック；（ｅ）．cis側溶液中に存在する種々の濃度のｍｉＲ−１５５及びＰ155で約６時間の電気記録の後のcis側溶液とtrans側溶液におけるｑＲＴ−ＰＣＲで検出したｍｉＲ−１５５レベル（補足情報中の文）；（ｆ）．アンジッピングせずにcis側入口からポアを出たトラップされたｍｉｒ−１５５・Ｐ155ハイブリッドによって発生されたシングルレベル電流パターン；（ｇ）．ハイブリダイズしていないｍｉＲ−１５５又はＰ155のcis側溶液からの移行によって発生されたスパイク状の短いブロック。
【００２４】
図９Ａ〜Ｂは、プローブ配列の最適化による検出感度の向上を示している。（Ａ）．（左）＋１００ｍＶで１ＭのＫＣｌにおいてモニタリングした、プローブＰ5'-C30（上部）、Ｐ3'-C30（中央）及びＰ155（下部）とハイブリダイズしたｍｉＲ−１５５についてのシグネチャイベントの頻度を示す電流トレース、（右）種々のプローブを用いたｍｉＲ−１５５検出についてのシグネチャイベントの発生頻度定数（第５表）。有意性（ｐ＜０．００５）は、任意の２種類のプローブを用いた結果の間で妥当である。（Ｂ）．（左）１０〜１００ｎＭの範囲のターゲット濃度についての［ｍｉＲ−１５５］−ｆ155相間、（右）０．１〜１００ｐＭといったよりかなり低いターゲット濃度について、０．５Ｍ／３Ｍ（cis／trans）のＫＣｌ非対称溶液において測定された［ｍｉＲ−１５５］−ｆ155相間。有意性（ｐ＜０．０１）は、任意の２種類のｍｉＲ−１５５濃度での検出の間で妥当であった。
【００２５】
図１０Ａ〜Ｄは、１もしくは２つの異なるヌクレオチドを含むｌｅｔ−７ ｍｉＲＮＡの識別を示している。ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ及びｌｅｔ−７ｃの配列は、第３表に示した。（ａ）．＋１２０ｍＶでのプローブＰa又はＰbを使用したｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｂの検出。（左）電流トレースと、（右）シグネチャイベント時間（τsig）の比較；（ｂ）．＋１００ｍＶでのプローブＰa又はＰcを使用したｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｃの検出。（左）電流トレースと、（右）シグネチャイベント時間（τsig）の比較；データは、第６表に示した。（ｃ）．ミスマッチを有さない（陽性）及びミスマッチを有する（陰性）ｍｉＲＮＡ・プローブのハイブリッドについてのイベントの区別のための受信者操作特性（ＲＯＣ）。（中抜き四角）：ｌｅｔ−７ａ・Ｐa／ｌｅｔ−７ｂ・Ｐa、（中抜き丸）：ｌｅｔ−７ｂ・Ｐb／ｌｅｔ−７ａ・Ｐb、（中塗り四角）：ｌｅｔ−７ａ・Ｐa／ｌｅｔ−７ｃ・Ｐa及び（中塗り丸）：ｌｅｔ−７ｃ・Ｐc／ｌｅｔ−７ａ・Ｐc；（ｄ）．ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）と、完全マッチイベント及びミスマッチイベントの間の時間比との間の相関。（中塗り丸）：パネルｃにおけるＲＯＣ曲線から測定されたＡＵＣ（第７表）、（中抜き丸）：シミュレートされたデータセットを基礎としてＲＯＣ分析から計算されたＡＵＣ（図１６及び第８表）。それらのイベントは、指数分布した時間で発生した。完全マッチイベント（陽性）とミスマッチイベント（陰性）の時間比は、それぞれ１、２、３、４、５及び１０であった。
【００２６】
図１１Ａ〜Ｈは、肺癌患者の血漿におけるｍｉＲ−１５５の検出を示している。（ａ）〜（ｄ）．シグネチャイベントは、健全なボランティア（ａ）及び肺癌患者（ｂ）からの全血漿ＲＮＡについての電流トレースにおいて、１００ｎＭのＰ155プローブの存在下で見出されたが、Ｐ155（（ｃ）及び（ｄ））の不在下ではシグネチャイベントは観察されなかった。それらのトレースは、１ＭのＫＣｌ中で＋１００ｍＶで記録した。（ｅ）．スパイクインされた（spiked-in）合成ｍｉＲ−３９の存在下での、６人の健全な個体（番号１〜番号６）及び肺癌を保有する６人の患者（番号７〜番号１２）からのｍｉＲ−１５５シグネチャイベントの頻度（ｆ155）。（ｆ）．（ｅ）で使用した全てのサンプルからのＰ39（第３表中の配列を参照）により検出されたｍｉＲ−３９シグネチャイベントの頻度。各サンプルを、独立したナノポアを用いてｎ回（ｎ≧４）測定した。データは、平均±ＳＤとして示した。患者の状態は以下の通りであった。（番号７）転移性肺扁平上皮癌；（番号８）再発小細胞癌；（番号９）早期段階の小細胞癌、化学療法と放射線の後の状況；（番号１０）早期段階の小細胞癌、化学療法の後の状況；（番号１１）末期段階の非小細胞癌、切除と化学療法の後の状況；（番号１２）末期の腺癌、化学療法の後の状況。（ｇ）．パネルｅ及びｆから計算されたｆ155／ｆ39。（ｈ）．ナノポアセンサとｑＲＴ−ＰＣＲで測定された、健全なグループ及び肺癌グループにおける相対ｍｉＲ−１５５レベルの箱ひげ図。箱は、２５パーセンタイルと７５パーセンタイルとの間の間隔を印している。箱の内側黒い線は、中央値を示している。ひげは、５パーセンタイルと９５パーセンタイルとの間の間隔を示している。中塗りの丸は、５パーセンタイルと９５パーセンタイルの外側のデータ点を示している。データは、第９表に示した。
【００２７】
図１２Ａ〜Ｄは、ブロック時間のヒストグラムを示している。（ａ）．ｍｉｒ−１５５・Ｐ155のハイブリッドによって発生したシグネチャブロック。（ｂ）．シグネチャブロックにおける短いレベル３状態。（ｃ）及び（ｄ）．ｍｉＲ−１５５（ｃ）及びＰ155（ｄ）単独の移行による短いブロック。データは、１ＭのＫＣｌ中で＋１００ｍＶで記録した電流トレースから得た。
【００２８】
図１３は、ｍｉｒ−１５５・Ｐ155のシグネチャイベントの電圧に依存する頻度を示している。データは、１ＭのＫＣｌにおいて、１００ｎＭのＰ155の存在下で１０ｎＭ（中抜き三角）の及び２５ｎＭ（中抜き四角）のｍｉｒ−１５５を用いて記録された、そして５ｐＭのＰ155の存在下で１０ｐＭのｍｉｒ−１５５を用いて（中抜き丸）記録された電流トレースから得られた。
【００２９】
図１４は、他の合成ｍｉＲＮＡ成分の存在下での、Ｐ155（１００ｎＭ）を用いて検出されたｍｉＲ−１５５シグネチャイベントの頻度を示している。３つの棒は、ｍｉＲ−１５５単独（５０ｎＭ）を、Ｌｅｔ−７ａ（５０ｎＭ）の存在下でのｍｉＲ−１５５を、そしてＬｅｔ−７ａ（５０ｎＭ）とＬｅｔ−７ｂ（５０ｎＭ）の両方の存在下でのｍｉＲ−１５５を表している。データは、１ＭのＫＣｌ中で＋１００ｍＶで記録した電流トレースから得た。
【００３０】
図１５は、Ｌｅｔ−７ａ・Ｐaのハイブリッド及びＬｅｔ−７ｂ・Ｐaのハイブリッドによって形成されるシグネチャイベント数の時間ヒストグラムを示している。データは、１ＭのＫＣｌ中で＋１２０ｍＶで記録した電流トレースから得た。（ａ）．Ｌｅｔ−７ａ・Ｐa  （ｂ）．Ｌｅｔ−７ｂ・Ｐa  全てのＲＮＡ及びＤＮＡの成分の濃度は、１００ｎＭであった。
【００３１】
図１６Ａ〜Ｂは、イベント時間に基づく、完全マッチ（陽性）イベント及びミスマッチ（陰性）イベントの分離についてのシミュレーションを示している。（ａ）．様々な時間の比率でのＲＯＣ曲線。該分析に関与する２つの種類のイベントが４００存在した；（ｂ）．２つの種類のイベントの様々なイベント数の比率でのＲＯＣ曲線。時間の比率τP／τNは３である。
【００３２】
図１７は、ｍｉｒ−１５５及びＰ155の移行頻度を示している。データは、１ＭのＫＣｌ中で＋１００ｍＶで記録した電流トレースから得た。２つのオリゴの濃度は、１００ｎＭであった。
【００３３】
図１８Ａ〜Ｆは、以下を示す：図１８Ａは、ｍｉＲＮＡ／プローブの複合体の図を示している。図１８Ｂは、ペプチド−ＰＮＡプローブのＰ７ｂの移行についてのイベントを示している。特徴的なイベントは３ｍｓにわたって継続し、そして電流は、＋１８０ｍＶで１０ｐＡにまで下がる。図１８Ｃは、＋１８０ｍＶでの溶液において、遊離したｍｉＲＮＡ ｌｅｔ−７ｂ（プローブなし）では遮断イベントが観察できないことを示している。図１８Ｄは、ｌｅｔ−７ｂ／Ｐ７ｂの複合体のトラップについてのシグネチャイベントを示している。図１８Ｅは、Ｌｅｔ−７ｂとは異なる２つのヌクレオチドを有するＬｅｔ−７ｃが、プローブのＰ７ｂのＰＮＡに結合できず、従って図Ａ１ｃに示されるようにシグネチャイベントを生じないことを示している。殆ど全ての観察されたイベントは、プローブそれ自身によるものである。図１８Ｆは、Ｌｅｔ−７ｂ（完全マッチ、重なりのない２つの離れたクラスター）及びＬｅｔ−７ｃ（２つのミスマッチ、完全に重なった２つのクラスター）に結合するＰ７ｂについての時間−振幅の特性を比較している。
【００３４】
図１９Ａ〜Ｃは、以下を示す：図１９Ａでは、短鎖の３′末端にヘアピンを有するＨＰ−Ｃ３０を使用した場合に、新しい種類の３レベルの電流パターンが観察された。図１９Ｂでは、短鎖の３′末端にストレプトアビジンが結合されたＳＡ−Ｃ３０を使用した場合にも、新しいマルチレベルの電流パターンが観察された。図１９Ｃは、２つのＤＮＡを結合する短鎖のオリゴヌクレオチドを使用した場合に、その複合体がナノポア中で２工程で逐次アンジッピングされうることを示している。２回のアンジッピングは、２つのレベル２の状態によって明らかに表すことができる。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、エラー強さのあるナノポア検知システムであって、感度の高い、選択的な、かつ直接的な、ｍｉＲＮＡなどの一本鎖オリゴヌクレオチドの検出、識別及び定量化を可能にする前記システムを提供する。さらに、本発明の検知技術は、また、ｍｉＲＮＡファミリーのメンバーにおける単独のヌクレオチド差を見分けるのに使用することもできる。更に、本発明による技術は、患者の血液サンプルにおける癌マーカーの非侵襲性でかつ費用対効果の高い早期診断及び連続的なモニタリングのための可能性を含んでいる。
【００３６】
ｍｉＲＮＡなどのターゲットの一本鎖のオリゴヌクレオチドを検出するための本発明によるナノポア検知システムは、１）一本鎖のオリゴヌクレオチドの迅速な移行を可能にするナノポアと、２）二本鎖のオリゴヌクレオチドのアンジッピングを誘発する駆動力として予め決められた電圧を提供する電源と、３）ターゲットのオリゴヌクレオチドと混合されて前記ナノポア中にロードされるプローブ分子と、その際、ターゲットのオリゴヌクレオチドとプローブとのハイブリッドが前記ポア中でアンジッピングすると、一定の同定可能な電流シグナル変化が生じ、４）前記電流変化を検出するための手段とを含む。
【００３７】
図１に関して、それは、一つの例示的なナノポア検知システムの概略図である。図１に示されるように、検知チャンバ１は、cis側コンパートメント２とtrans側コンパートメント３とを含み、それらは仕切４によって隔たれている。両方のコンパートメントは、予め選択された、１ＭのＫＣｌなどの記録溶液で満たされている。仕切４は、その中央領域に開口部５を有し、その上に脂質二重膜が形成され、かつナノポア６が、該脂質二重膜を通じて差し込まれている。電源７は、前記の２つのコンパートメント中の一対の電極を通してロードされる電圧を与え、ピコアンペア増幅器などの電流デテクタ８が電流変化のモニタリングのために接続されている。試験において、ターゲットのオリゴヌクレオチド９とその相補的なプローブ１０の混合物サンプルは、cis側コンパートメント２中にロードされる。
【００３８】
図２に関して、それは、ナノポア６の拡大した概略図である。図２に示されるように、ナノポア６は、円錐形又は漏斗形であり、それは２つの開口部、つまり広い端部にcis側開口部１１と、下の狭い端部にtrans側開口部１２とを有する。検出の間に、対になったオリゴヌクレオチド９／１０は、ナノ空隙１３中に捕捉される。次いで電圧は、狭窄部１４でオリゴヌクレオチド９／１０のアンジッピングを促し、その際、プローブ１０は、まずβ−バレル１５を通り抜け、trans側開口部１２から出て、その後にターゲットのオリゴヌクレオチド９が通り抜ける。
【００３９】
前記のナノポアは、広い開口部と狭い開口部とを有する円錐形もしくは任意の非対称形の任意のイオンチャネルであってよく、前記イオンチャネルは、平坦な脂質二重膜中に差し込まれており、より広い空隙に続いて狭いチャネルを有し、それにより、アンジッピングによる移行イベントを促進できる。前記のナノポアは、任意の存在するタンパク質イオンチャネル、例えば以下の例で採用されたα溶血素膜貫通型タンパク質又はシリコンなどの無生物材料を用いてナノテクノロジーの様式で作成された様々な合成ポアであってよい。
【００４０】
本発明によるプローブは、マルチドメインの一本鎖分子であって、ターゲットのオリゴヌクレオチドと完全に相補的な中心ドメインと、その３′末端もしくは５′末端に少なくとも１つの末端伸長部、すなわちシグナルタグとを含み、その際、シグナルタグは両末端にあることが好ましい。本発明は、３′でタグ付けされたプローブは、５′でタグ付けされたプローブよりも好ましいことを示唆している。捕捉率に依存するプローブ指向性は、おそらく、ｓｓＤＮＡの塩基がその鎖の５′末端に向けて総じて傾いており(38)、この非対称の塩基の配向により、５′末端よりも容易に３′末端からＤＮＡが動くことによるものである。
【００４１】
前記の末端伸長部（シグナルタグ）は、電圧により駆動される、ナノポアを通じたアンジッピングによる移行を支援するのに十分な長さを有する任意の荷電した一本鎖分子であってよい。前記のシグナルタグは、ポリ（ｄＣ）n、ポリ（ｄＡ）n及び／又はポリ（ｄＴ）nなどのオリゴヌクレオチドであってよい荷電したポリマー鎖又は荷電したポリペプチドであってよい。例えば、α溶血素膜貫通型タンパク質ポアがナノポアとして使用される場合に、ポリ（ｄＣ）タグがポリ（ｄＡ）タグもしくはポリ（ｄＴ）タグよりも好ましく、さらに、ポリ（ｄＣ）30は、シグネチャイベント（以下に議論される）の発生において、ポリ（ｄＣ）8などのより短いタグを用いたものよりもさらに効率的である。捕捉率は、高電圧での検出、内腔中に設計された荷電プロフィールを有する工学ポアの使用(33)、及びポアの両側の間での非対称の塩濃度での検出(39)を含む他の効果的なアプローチと組み合わせるとさらに高めることができる。
【００４２】
本発明は、また、オリゴヌクレオチドがナノポアを通じてアンジッピングし移行することによって引き起こされる電流変化をモニタリングすることによって一本鎖のオリゴヌクレオチドを検出及び識別する方法を提供する。図１に図解される、デュアルコンパートメント式のナノポアシステムを用いた一本鎖のオリゴヌクレオチドの本発明による検出方法は、１）ターゲットのオリゴヌクレオチドと、前記ターゲット配列とマッチするその中心ドメインとその３′末端及び５′末端の少なくとも一方にタグ付けされた荷電された一本鎖分子とを有する予め設計されたプローブとを混合することで、サンプル混合物を得る工程と、２）前記混合物を、cis側コンパートメント中にロードする工程と、３）該システムに予め決められた電圧を与える工程と、４）予め決められた時間帯にわたって電流出力を記録する工程とを含んでいる。ターゲットのオリゴヌクレオチドとその相補的なプローブとのハイブリッドがナノポアを通じてアンジッピングし、移行することによって引き起こされる電流変化は、ユニークなシグネチャイベントであり、それは、ターゲットのオリゴヌクレオチドの検出及び識別に使用される。図３に関して、それは、一つの例示的な検出の間に記録された一つの例示的な電流トレースと、シグネチャイベントの拡大された電気的マークと、アンジッピング−移行イベントの概略図を含んでいる。
【００４３】
更なる説明
定義
本願で使用される場合に、用語"ＲＯＣ曲線"は、受信者操作特性曲線を指す。ＲＯＣ曲線は、選択性と感度との間の関連性の分析に使用した。ＲＯＣ曲線は、プロットを上方領域とより下方の領域とに分離する。
【００４４】
本願で使用される場合に、用語"ＡＵＣ"は、ＲＯＣ曲線下の面積を指す。ＡＵＣは、０．５〜１．０の間の範囲であってよい。ＡＵＣ値がより高いと、分離結果がより良好である。
【００４５】
本願で使用される場合に、用語"ＯＣＰ"は、至適カットオフポイントを指す。一定の実施形態においては、ＯＣＰは、ＲＯＣ曲線から計算することができる。一定の実施形態においては、ＯＣＰは、Youden指数の最大値でのカットオフ時間である。
【００４６】
本願で使用される場合に、"Youden指数"という文言は、｛感度＋選択性−１｝として定義される。Youden指数は、ＲＯＣ曲線から計算され、０と１との間の範囲であってよい。長期分布と短期分布の完全な分離に導くカットオフ時間は、Youden指数＝１となり、一方で、完全な重複は、Youden指数＝０となる。一定の実施形態においては、Youden指数の最大値を生じるカットオフ時間の値、すなわち"至適"カットオフポイント（ＯＣＰ）（Greiner et al., 2000 Preventive Veterinary Medicine 45, 23-41）は、最も正確な分離をもたらす。
【００４７】
プローブ、ナノポア、そのプローブとナノポアを含むキット、及び関連の使用方法の説明
一つの広範な態様においては、当該発明は、プローブとターゲットとの相互作用から生ずるこれらのイベントを他のイベントと識別する"シグネチャ"電流遮断イベントを提供する、プローブ、ナノポア、該プローブ及びナノポアを含むキット並びに関連の使用方法に関する。この文脈においては、前記他のイベントは、"バックグラウンド"イベントと呼称する。バックグラウンドイベントには、制限されないが、プローブとターゲットではない核酸との相互作用、プローブとナノポア検出システム中に存在する他の成分、ナノポア検出システム中に存在する遊離の核酸などとの相互作用が含まれる。かかるシグネチャイベントのかかる特徴には、制限されないが、ｉ）バックグラウンド電流ブロックとは異なる時間の電流ブロック、ｉｉ）バックグラウンド電流ブロックとは異なる数の別個の電流遮断レベル、ｉｉｉ）バックグラウンド電流ブロックとは異なる発生順序の電流遮断レベル、ｉｖ）バックグラウンド電流ブロックとは異なる、遮断レベルでの電流振幅、ｖ）バックグラウンド電流ブロックとは異なる各遮断レベルの電流振幅、の少なくとも１つ又は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）もしくは（ｖ）の任意の組み合わせが含まれる。一定の実施形態においては、シグネチャ遮断イベントは、バックグラウンド遮断イベントと、各遮断イベントの特徴的なバックグラウンドノイズにおける違いの点で識別できる。一定の実施形態においては、シグネチャイベントにおける別個の時間、数又は振幅は、バックグラウンドイベントにおいて観察されるものよりも大きい。一定の実施形態においては、シグネチャイベントにおける別個の時間、数又は振幅は、バックグラウンドイベントにおいて観察されるものよりも小さい。一定の実施形態においては、シグネチャイベントにおける別個の時間、数、順序又は振幅は、バックグラウンドイベントのそれらとは、統計学的に識別できる。一定の実施形態においては、前記のシグネチャイベントは、α溶血素（αＨＬ）又はその工学変異体によって形成されたタンパク質ナノポアを平坦な脂質二重膜系中に含むナノポアシステムにおいて提供される。一定の実施形態においては、前記のシグネチャイベントは、脂質二重膜中に包埋された単独のタンパク質ナノポアを有する脂質二重膜のヒドロゲルで封入されて形成されたバイオチップ又はマイクロ液滴二重膜系において提供されうる。バイオチップ及びマイクロ液滴二重膜系は、説明されてきている（Shim and Gu; Stochastic Sensing on a Modular Chip Containing a Single-Ion Channel Anal. Chem. 2007, 79, 2207-2213; Bayley,H. et al. Droplet interface bilayers. Mol. Biosyst. 4, 1191-1208 (2008)）。
【００４８】
一定の実施形態においては、シグネチャイベントは、合成のナノポアにおいて提供されうる。合成のナノポアには、制限されないが、窒化ケイ素又はグラフェンを含むナノポアが含まれる。
【００４９】
本願で提供されるプローブ分子は、その５′末端及び／又は３′末端の一方又は両方に末端伸長部を含む。理論にとらわれることを求めるものではないが、これらの末端伸長部は、有用な機能を提供すると考えられており、前記機能には、制限されないが、高い比率でのナノポア中へのプローブ／ターゲットの複合体のトラップ（すなわち、単位記録時間あたりの、単位ターゲット濃度あたりの、シグネチャイベントの数）が含まれる。トラッピング率は、直接的に感度を決める。同じターゲットの濃度と同じ記録時間においては、トラッピング率が高ければ検知結果はより正確となる。理論にとらわれることを求めるものではないが、また、これらの末端伸長部は、有用な機能を提供すると考えられており、前記機能には、制限されないが、プローブ／ターゲットの複合体の電圧により駆動される解離の誘導が含まれる。この解離機能は、混合物中でプローブとターゲットとの相互作用を他の成分から区別するのに使用でき、それにより選択性又は特異性が保証されるシグネチャイベントを生成する。
【００５０】
プローブの末端伸長部は、任意の長さの荷電されたポリマーを含んでよい。一定の実施形態においては、前記ポリマーは、負に荷電した一本鎖の核酸であってよい。かかる核酸の末端伸長部の利点には、制限されないが、極めて低い合成費用及びｐＨ、塩濃度及び温度により制御可能な荷電が含まれる。かかる核酸伸長部は、ホモポリマー、ヘテロポリマー、コポリマー又はそれらの組み合わせを含む。一定の実施形態においては、かかる核酸の末端伸長部の長さは、約１もしくは２ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドまでの範囲であってよい。なおも他の実施形態においては、前記の核酸伸長部は、約５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドまでの長さの範囲であってよく、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドまでの長さの範囲であってよく、又は約２０ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドまでの長さの範囲であってよい。本願により提供される一つの例示的な末端伸長部は、ホモポリマーであるポリ（ｄＣ）30である。しかしながら、制限されないが、CTCTCTCT…又はCATCATCAT…などのジヌクレオチドもしくはトリヌクレオチドのヘテロポリマーを含むヘテロポリマー配列も使用できる。一定の実施形態においては、非塩基（abase）を含むコポリマー又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を末端伸長部において使用することができる。末端伸長部におけるこれらのコポリマー又はそれらのドメインは、該プローブの末端伸長部に新たな機能を付与しうる。非塩基は、塩基を有さないヌクレオチドであるが、リン酸によって提供される負電荷を有する。非塩基の大きさは通常のヌクレオチドより狭いので、隣のヌクレオチドによって形成されるものとは異なるシグネチャイベントシグナルが生成することがある。ＰＥＧは荷電されていない。理論にとらわれることを求めるものではないが、核酸配列中のＰＥＧドメインがポア中にトラップされるときに、それは駆動力を減じ、こうしてプローブ／ターゲットの複合体の解離を厳密に調節すると考えられている。
【００５１】
プローブの末端伸長部は、また、ポリペプチドを含んでよい。アミノ酸の選択がより豊富であると、ポリペプチドの末端伸長部の配列及び官能性を、オリゴヌクレオチドの末端伸長部よりも多くの計画を可能にする。例えば、ポリペプチドの末端伸長部は、より高い識別が可能なプローブ／ターゲットのシグネチャイベントを生成するために、最適な位置に荷電アミノ酸の挿入を可能にする。理論にとらわれることを求めるものではないが、プローブ／ターゲットの複合体は、好適な電圧下で正に荷電したポリペプチド末端伸長部を含むプローブを用いて選択的にトラップされうるが、一方で、混合物中の全ての他の負に荷電した非ターゲットのオリゴヌクレオチドは、ポア中に入ることから阻まれ、こうして超選択的な検出がもたらされると考えられている。一定の実施形態においては、ポリペプチド末端伸長部は、正電荷を有してよい２つ、３つ、４つ又はそれより多くのアミノ酸残基（すなわち、リシン及び／又はアルギニン及び／又はヒスチジン）を含んでよい。一定の実施形態においては、前記プローブがターゲットのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたときに正味の正電荷を提供するために、十分な数の正に荷電された残基がポリペプチド末端伸長部に含まれる。一定の実施形態においては、プローブがリシン、アルギニンもしくはヒスチジンなどの残基によって授けられた正電荷を有する末端伸長部を含むとき、関連のナノポアを基礎とする検出法の性能は、酸性条件下（すなわちｐＨ値が７未満であるとき）に、又は残基がプロトン化される条件下で増強されうる。このように、かかるプローブは、約１〜約６．９のｐＨ値で、１〜約６．０のｐＨ値で、約１〜約５．５のｐＨ値で、約３〜約５．５のｐＨ値で、かつ同様のｐＨ値で使用される。一定の実施形態においては、かかるポリペプチドの末端伸長部の長さは、約１もしくは２残基から約３０残基までの範囲であってよい。なおも他の実施形態においては、前記のポリペプチド伸長部は、約５残基から約２０残基までの長さの範囲であってよく、約８残基から約２０残基までの長さの範囲であってよく、又は約８残基から約１５残基までの長さの範囲であってよい。一つの例示的な実施形態においては、正に荷電したアルギニン残基及びリシン残基を含むＨＩＶ−ＴＡＴポリペプチドは、末端伸長部として使用されうる。一定の実施形態においては、ターゲットのオリゴヌクレオチドに相補的なプローブの中心ドメインは、正電荷を有するアミノ酸を含む末端伸長部に共有結合されたペプチド核酸を含んでよい。一定の実施形態においては、ペプチド核酸を含む中心ドメインは、前記プローブがターゲットのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたときに正味の正電荷を提供するために、正電荷を有するアミノ酸を含む末端伸長部と連結して使用される。一定の実施形態においては、制限されないが、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、チロキシンなどを含む芳香族側鎖を有するアミノ酸を含むポリペプチド末端伸長部は、ポリペプチド末端伸長部中に組み込まれてよい。理論にとらわれることを求めるものではないが、かかる芳香族アミノ酸は、芳香族スタッキングを通じてポアと相互作用でき、ナノポアを基礎とする検出方法で得られたシグネチャの有用な変化を提供すると考えられている。
【００５２】
理論にとらわれることを求めるものではないが、十分な数の正に荷電したアミノ酸がポリペプチド末端伸長部に存在して、該末端伸長部を含むプローブがターゲットのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたときにターゲットのオリゴヌクレオチド／プローブの複合体の正味の電荷がまだ正であるならば、前記のターゲットのオリゴヌクレオチド／プローブの複合体全体は、強力な双極子分子を形成するものと考えられている。プローブの双極子の正に荷電したペプチドドメインが両者とも正の電圧（cis側接地）によって押されて、trans側開口部にある負の環状部によって引き寄せられて、ポア中へのオリゴヌクレオチド／プローブの複合体のトラップが導かれると考えられている。正の電圧では、任意の他の遊離した核酸成分は、遊離したハイブリダイズされていない核酸によって運ばれる負電荷のためポアに入ることが妨げられる。これは遊離した核酸成分によりシグナルを大きく下げるため、観察される電流遮断イベントの大部分は、オリゴヌクレオチド／プローブの複合体のトラップによるか、プローブの移行によるものかのいずれかである。
【００５３】
一定の実施形態においては、正味の正電荷を有するオリゴヌクレオチド／プローブの複合体は、ポアのtrans側開口部に負に荷電した環状部を有するナノポアに向かいうる。この文脈においては、ポアのtrans側開口部は、分子が出てくるポアの開口部であり、一方で、ポアのcis側開口部は、そこから分子が入る開口部である。これらの実施形態においては、ポアのtrans側開口部の負に荷電した環状部は、ポアのtrans側開口部で負に荷電した環状部を有するように適宜合成及び／又は誘導体化した任意のタイプのナノポアを使用することによって得ることができると解されるべきである。ポアのtrans側開口部に負に荷電した環状部を有するかかるナノポアには、制限されないが、タンパク質ナノポア及び合成ナノポアが含まれる。ポアのtrans側開口部に負に荷電した環状部を有するタンパク質のナノポアには、制限されないが、α溶血素タンパク質の工学変異体が含まれる。一定の実施形態においては、前記の工学されたα溶血素の変異体は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のα溶血素であって、Ｋ１３１Ｄ、Ｋ１３１Ｅ又はＫ１３１Ｈのアミノ酸置換を含むものを含んでよい。例示的なかつ制限されないスタフィロコッカス・アウレウスのα溶血素の野生型配列は、本願で提供され（配列番号２０、核酸コーディング領域；配列番号２１、タンパク質コーディング領域）、他でも入手できる（National Center for Bioinformatics又はGenBankのアクセッション番号M90536及びAAA26598）。例示的なかつ制限されないスタフィロコッカス・アウレウスのα溶血素の変異体であってＫ１３１Ｄ置換を含むものは、配列番号２２として提供される。一定の実施形態においては、工学されたα溶血素の変異体は、ポアのtrans側開口部に負に荷電された環状部を提供する部分で誘導体化された適宜誘導体化された変異体を含んでよい。ポアのtrans側開口部に負に荷電された環状部を有するタンパク質ナノポアを提供するように置換又は誘導体化できる一つの例示的な野生型のスタフィロコッカス・アウレウスのα溶血素タンパク質は、これとともに配列番号２１として提供されている。しかしながら、ポアの形成が可能な他の溶血素の変異体は、ポアのtrans側開口部に負に荷電された環状部を有するタンパク質ナノポアを提供するように置換又は誘導体化されていてよい。ポアのtrans側開口部に負に荷電された環状部を有する合成ナノポアも提供されている。一定の実施形態においては、ポアのtrans側開口部に負に荷電された環状部を有するかかる合成のナノポアには、制限されないが、ポアのtrans側開口部に負に荷電された環状部を提供する部分で適宜誘導体化された窒化ケイ素又はグラフェンのナノポアが含まれる。
【００５４】
本願に提供されるプローブの中心ドメインは、ターゲット分子の捕捉のために使用される。一定の実施形態においては、前記の中心ドメインは、ターゲット配列と完全に相補性であるか又は部分的に相補性であってよい。一定の実施形態においては、中心ドメインは、天然ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ（ＤＮＡ）又はａ、ｕ、ｇ、ｃ（ＲＮＡ））及び／又は人工ヌクレオチド、例えば制限されないが、イノシン、キサントシン、７−メチルグアノシン、ジヒドロウリジン及び５−メチルシチジンなどのヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを含んでよい。一定の実施形態においては、中心ドメインは、ロックト核酸（ＬＮＡ）又はペプチド核酸（ＰＮＡ）を含んでよい。ロックト核酸は、ＲＮＡ誘導体であって、リボース環が２′酸素と４′炭素との間にメチレン結合を含む誘導体を含む。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ヌクレオベース側鎖を有するペプチド骨格を含む。一定の実施形態においては、ＬＮＡ又はＰＮＡの中心ドメインは、天然ヌクレオベース（アデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシル）及び／又は人工ヌクレオベース、例えば制限されないがヒポキサンチン、キサントシン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロウラシル及び５−メチルシトシンを含んでよい。一定の実施形態においては、オリゴヌクレオチド、ＬＮＡ又はＰＮＡのコポリマーを含むプローブの中心ドメインが提供される。一定の実施形態においては、プローブの中心ドメインは、ターゲット核酸に対して相補的な、少なくとも約４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のヌクレオチド又はヌクレオベース残基を有する。一定の実施形態においては、プローブの中心領域は、ターゲット核酸に対して相補的な、少なくとも約４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のヌクレオチド又はヌクレオベース残基ないし約３０、３５、４０又は５０個のヌクレオチド又はヌクレオベース残基のいずれかを有する。一定の実施形態においては、配列内に挿入される合成ヌクレオチド又はヌクレオベースは、ターゲットとのハイブリダイゼーションエネルギーを正確に適合でき、こうして単独のヌクレオチドの多形、メチル化又はｍｉＲＮＡとそのターゲットのメッセンジャーＲＮＡとの間の相互作用などのターゲットの特徴が識別されうる。
【００５５】
様々なターゲットの核酸又はオリゴヌクレオチドであって、プローブ、ナノポア、該プローブとナノポアを含むキット及び関連のプローブの使用方法によって、非ターゲットの核酸から検出及び識別できるものが本願に提供されている。一定の実施形態においては、前記のターゲットは、細胞、体液、組織、細菌又はウイルスからの核酸又はその断片であってよい。一定の実施形態においては、前記のターゲットは、ＰＣＲ産物又は合成オリゴヌクレオチドであってよい。一定の実施形態においては、ターゲットは、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、未熟もしくは成熟のｍｉＲＮＡ、人工ｍｉＲＮＡ、非コーティングＤＮＡもしくはＲＮＡ、核酸バイオマーカ又は合成アプタマーを含んでよい。一定の実施形態においては、ｍｉＲＮＡターゲットは、血漿及びホルマリン固定された組織及びパラフィン包埋された組織などの任意の組織由来の生体流体からのＲＮＡ抽出を起源としうる。一定の実施形態においては、ターゲット核酸は、ターゲットタンパク質と結合される、核酸結合タンパク質、抗体又はアプタマーのいずれかと複合体形成された核酸断片を含んでよい。一定の実施形態においては、ターゲット核酸は、制限されないが薬剤を含む低分子量化合物と複合体形成された核酸断片を含んでよい。一定の実施形態においては、ターゲットは、突然変異を有する、単一のヌクレオチド多形を有する、又はメチル化及びリン酸化などの化学的修飾を有する配列を含んでよい。
【００５６】
実施例
例１．肺癌のバイオマーカーであるｍｉＲ−１５５の検出
本発明は、さらに、肺癌のバイオマーカーであるｍｉＲ−１５５の検出のための一つの例示的なナノポア検知システムを提供する。前記ナノポア検知システムは、α溶血素膜貫通型タンパク質ポアと、ｍｉＲ−１５５のために予め設計されたプローブとを含む。プローブは、ＤＮＡ多重ブロックコポリマーであって、ターゲットのｍｉＲ−１５５に対して相補的なその中心ドメインと、３′末端、５′末端又は両末端にシグナルタグとして機能する少なくとも１つのポリ（ｄＣ）30伸長部とを有する前記コポリマーである。第１表に列記されるのは、ｍｉＲ−１５５の配列と、トリブロックコポリマーを有する例示的なプローブの配列であり、Ｐ155が好ましい。
【００５７】
第１表．ｍｉＲＮＡ及びそれらのプローブの配列
【表１】
2013540423.tif 000003
【００５８】
一つの例示的な検知プロセスの間に、ｍｉＲ−１５５／Ｐ155の混合物は、ポアのcis側に添加され、一連の短期継続型の及び長期継続型の電流ブロックを有する電流トレースは、＋１００ｍＶで１ＭのＫＣｌ中でモニタリングして、図４ａに示されるように記録できる。スパイク状の短いブロックは、図４ａにおいてｂとして表示され図４ｂにも示されているが、そのブロックは、２２０±２１μｓの時間を有し相対コンダクタンスｇ／ｇ0＝０．１６でポアコンダクタンスをほぼ完全に減じ、その際、ｇ及びｇ0は、ブロックのコンダクタンス及び非占有のナノポアのコンダクタンスである。時間とコンダクタンスの両方は、ｍｉＲ−１５５とＰ155単独によるブロックのそれと類似しており、こうして混合物中の短いブロックは、図４ｂ′に図説されるポアを通じた一本鎖の遊離したｍｉＲ−１５５もしくはＰ155の迅速な通過に関連している。
【００５９】
短いブロックに対して、図４ａでｃ及びｄとして表示される、記録における長いブロックは、２５０±５８ｍｓにわたって持続する。図４ａにｃとして表示される長いブロックの１つのタイプは、３つの順次のコンダクタンスレベル、レベル１→レベル２→レベル３（図４ｃに示される）を特徴付けている。このタイプのブロックは、ｍｉＲ−１５５かＰ155が単独で存在する場合には観察されず、それは、ｍｉＲ−１５５／Ｐ155のハイブリッド（ｍｉＲ−１５５・Ｐ155）に由来することを示している。レベル１は、コンダクタンスをほぼ完全にｇ／ｇ0＝０．１５にまで減じる。このコンダクタンスレベルは、ｍｉＲ−１５５・Ｐ155がポア中により広い開口部（cis側）からトラップされ、その際、Ｐ155の３′シグナルタグか５′シグナルタグのいずれかが最も狭いβ−バレルを占拠している配置と一致している（図４ｃ′のレベル１）。前記のβ−バレル中のシグナルタグは、電圧により駆動されるｍｉＲ−１５５・Ｐ155のアンジッピングを誘導しうる。アンジッピング時間又はレベル１の時間は、ポア中でのＤＮＡアンジッピングについて先に報告された時間規模に匹敵する。例えば５０塩基対のｄｓＤＮＡの＋１４０ｍＶでのアンジッピングのためには約４３５ｍｓ、そして１０塩基対のヘアピンＤＮＡの＋９０ｍＶでのアンジッピングのためには約４０ｍｓ。そのアンジッピング過程は、さらに、レベル１からレベル２への離散的な遷移によって実証された。レベル２は、４１０±２０μｓ続き、そのコンダクタンスはｇ／ｇ0＝０．４２へと大きく増加する（図１ｃ′のレベル２）。この部分的なブロックは、β−バレル中を占めているオリゴヌクレオチドとして解釈できない。恐らく、ｍｉＲ−１５５・Ｐ155のアンジッピングに引き続きＰ155の移行があった後に、ｍｉｒ−１５５は、一時的にポアのナノ間隙中に閉じ込められうる。ナノ間隙中に留まる一本鎖のオリゴヌクレオチドはかかる部分的なブロックを生じうることが実証されている(33),(34)。そのナノ間隙中にあるｍｉＲ−１５５分子は最終的にβ−バレルを横切って、レベル３を生じる。これは、コンダクタンスをｇ／ｇ0＝０．０８にまで完全に減じる（図４ｃ）。レベル３の時間は２７０±３０μｓであって、ｍｉｒ−１５５単独による短いブロックについての２２０μｓと近く、＋１２０ｍＶでの７５塩基のＲＮＡの移行についての約４００μｓの時間スケール(35)及び＋１２０ｍＶでの２１０塩基のＲＮＡについての８００μｓの時間スケール(36)と一致している。レベル３の時間は、電圧が上がると短くなり、さらに、このコンダクタンスレベルに関しては、一本鎖のオリゴヌクレオチドの移行を支援している。
【００６０】
多重コンダクタンスの長いブロックに加えて、ｇ／ｇ0＝０．１５での単独のコンダクタンスレベルを有する長いブロック（図４ａにｄとして表示され、図４ｄに示されている）も観察されている。このタイプの長いブロックは、捉えられたｍｉＲ−１５５・Ｐ155がアンジッピングすることなくポアをcis側入口から出るときに生じうる。
【００６１】
本発明は、特徴的な長いブロックが、ターゲットのｍｉＲＮＡの単一分子を同定するためのシグネチャイベントとして役立ちうることを教示している。シグネチャイベントの頻度（ｆsig）から、ターゲットのｍｉＲＮＡは、式１を使用して定量化できる（補足材料における方法、以下の例２に提供される）
【数１】
2013540423.tif 000004
【００６２】
式１においては、［ｍｉＲ］0及び［Ｐ］0は、ｍｉＲＮＡとプローブの初期濃度であり、ｋonは、シグネチャイベントの発生率であり、かつＫdは、溶液中でのｍｉＲ・Ｐについての解離定数である。［ｍｉＲ］0＜＜［Ｐ］0である場合に、ｆsig≒ｋon［ｍｉＲ］0である。電流トレースは、まさに、ｍｉＲ−１５５濃度が高まるほど、ｍｉＲ−１５５・Ｐ155のシグネチャイベントの頻度が高まることを示している（図５ａ）。ｆsig−［ｍｉＲ−１５５］データは、式１を使用して、Ｋd＝３０ｎＭ及びｋon＝３．６×１０6Ｍ-1ｓ-1で当てはめることができる（図５ｂ）。文献(8)によれば、循環しているｍｉＲＮＡの平均濃度は、対照グループの６８．１ｎｇ／ｍＬ（約１０ｎＭ）に対して、肺癌グループについては１５８．６ｎｇ／ｍＬ（約２５ｎＭ）であった。従って、１０ｎＭと２５ｎＭのｍｉｒ−１５５でのｆsig値を比較した（図５ｂ）。分析により、２つのレベルのｍｉＲＮＡ濃度が分けられうることが示され（ｐ＜０．００５）、それは、本発明による方法が、肺癌患者においてｍｉＲＮＡレベルを区別して検出する見込みを有することを示唆している。
【００６３】
本発明は、また、類似のｍｉＲＮＡ配列であるｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｂとを高度に識別するために、本発明によるナノポア検知システムを使用する一つの例示的な方法を提供する。ｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｂは、Ｌｅｔ−７腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡファミリー(4)-(6)のメンバーであり、かつ２つのＬｅｔ−７メンバーは、位置１７及び１９で異なるヌクレオチドを有するに過ぎず、それらはｌｅｔ−７ａではアデニンであり、かつｌｅｔ−７ｂではグアニンである。本発明によるプローブＰa及びＰbは、第２表中に列記される配列をそれぞれ有するｌｅｔ−７ａとｌｅｔ−７ｂのために設計されている。
【００６４】
第２表．ｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｂ並びにそれらのプローブの配列
【表２】
2013540423.tif 000005
【００６５】
図６ａ及び図６ｂに示されるように、Ｐaを使用して各ｍｉＲＮＡを検出する場合に、ｌｅｔ−７ａ・Ｐa（ミスマッチなし）についてのシグネチャイベントの時間（τsig）は、１５５±２８ｍｓであり、一方で、ｌｅｔ−７ｂ・Ｐa（２ヌクレオチドのミスマッチを有する）についてのτsigは、４８±１１ｍｓにまで大きく短縮される（ｐ＜０．００５）。同様に、Ｐbを使用して両方のｍｉＲＮＡを検出する場合に、ｌｅｔ−７ｂ・Ｐb（ミスマッチなし）についてのτsigは、１６５±４７ｍｓであり、図６ｂに示されるように、ｌｅｔ−７ａ・Ｐb（２ヌクレオチドのミスマッチを有する）についての２４±２ｍｓ（ｐ＜０．００５）よりもかなり長い。時間における有意差は、ミスマッチが、ｍｉＲＮＡとプローブとの間のハイブリダイゼーション相互作用を大きく弱めることと解釈できる。同じ電界中に置かれた場合に、ミスマッチを含むハイブリッドは、完全にマッチしたハイブリッドよりもアンジッピングのためにより低いエネルギーしか必要としない。このように、本発明によるナノポア検知システムは、アンジッピング時間に基づき単独のミスマッチを識別可能であり、こうして、類似の配列及びＳＮＰｓを有するｍｉＲＮＡを検出する見込みを裏付けている。
【００６６】
本発明は、さらに、肺癌患者における血漿ｍｉＲ−１５５を、本発明によるナノポア検知システムで検出する一つの例示的な方法を提供する。その例示的な方法の間に、末梢血サンプルを、６人の肺癌患者と６人の健全なボランティアから地域のＩＲＢ承認をもって入手した。ｍｉＲＮＡを含む全血漿ＲＮＡを、各血漿サンプル３５０μｌからｍｉＲＶａｎａ ＰＡＲＩＳキット（Ambion）を用いて最終希釈容量１００μｌで抽出し、それらを次いでナノポアとＲＴ−ＰＣＲアッセイ(44)のために２つのアリコート（５０μｌ）に分けた。一方のアリコートを、Ｐ155と予備混合し、ナノポアチャンバ中の２ｍｌの記録溶液に直接添加した。ナノポア電流は、血漿サンプルの存在下でさえも低レベルのノイズを保ち、そして別個の短いブロック及び長いブロック（赤い矢印で印した）は、対照グループ（図７ａ）及び肺癌グループ（図７ｂ）の両方で同定できる。多重コンダクタンスと単独のコンダクタンスの両方を含む特徴的な長いブロックは、図１ａにおける合成ｍｉＲ−１５５ＲＮＡについてのものと同じコンダクタンスプロフィール及びそれと類似の特性を特徴としている。Ｐ155の不在下で、かかるタイプの長いブロックは観察できない（図７ｃ及びｄ）が、短いブロックは、遊離したｍｉＲＮＡなどの一本鎖のオリゴヌクレオチドの移行に関して見出された（図７ｃ及びｄ）。総合して、前記の特徴的な長いブロックは、ｍｉＲ−１５５・Ｐ155のハイブリッドによるものとすることができ、単独のｍｉＲＮＡ分子検出のためのシグネチャイベントとして役立つ。
【００６７】
肺癌患者グループにおける全てのサンプルについてのｍｉＲ−１５５シグネチャイベントの頻度ｆsigは、１．１５〜１．５１分-1の間で変動し、その平均は、１．４０±０．１６分-1である（図７ｅ）。このレベルは、０．３２〜０．７０分-1の範囲で、０．４８±０．１４分-1を平均とする対照グループ（図７ｅ）におけるｆsigよりもかなり高かった。全てのサンプルは標準的な手順（補足材料における方法）に従って調製したので、２つのグループにおける相対ｍｉＲＮＡレベルを比較するのは妥当であるべきである。健全な血漿における平均ｆsigを１とした場合に、肺癌の血漿におけるｍｉＲ−１５５の倍数を２つの方法で比較した。図７ｆは、肺癌患者における相対ｍｉｒ−１５５レベルが、ナノポアセンサを用いて２．７９であった（ｐ＜０．００１）ことを示している。比較によって、相対ｍｉＲ−１５５レベルは、ＲＴ−ＰＣＲ法で４．７２（ｐ＜０．０２）であり、より大きなばらつきを有していた。従って、ナノポアとＲＴ−ＰＣＲアッセイの両方は、１．６９倍の差があるとはいえ、肺癌患者の血漿におけるｍｉＲ−１５５のかなりの上昇を示している。ナノポア法は、標識及び増幅を必要としないので、これが、ナノポアアッセイにおけるばらつきの少なさの理由かもしれない（図７ｆ）。総合して、工学プローブを用いるナノセンサは、臨床の肺癌患者における循環しているｍｉＲＮＡを検出する能力を裏付けており、これは、独立したＲＴ−ＰＣＲ法によって検証されている。
【００６８】
例２．補足情報
試料．
ｍｉＲＮＡ及びＤＮＡプローブを含むオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies（Coralville, IA）によって合成され、電気泳動精製された。試験前に、ｍｉＲＮＡとＤＮＡプローブの混合物を、９０℃で５分にわたり加熱し、次いで徐々に室温へと冷却し、そして４℃で貯蔵した。ＲＮアーゼ不含の水を使用してＲＮＡ溶液を調製した。
【００６９】
ナノポア検出の設定と手法．
この節は、以前から十分に文書になっている（Shim,J.W., Tan,Q., & Gu,L.Q. Single-molecule detection of folding and unfolding of a single G-quadruplex aptamer in a nanopore nanocavity. Nucleic Acids Res. 37, 972-982 (2009)）。簡単に言うと、記録装置は、テフロンフィルムで仕切られた２つのチャンバ（cis側及びtrans側）から構成されていた。１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロホスファチジルコリン（Avanti Polar Lipids）の平坦な脂質二重膜は、仕切の中心にある１００〜１５０ｎｍの穴にわたって形成された。cis側チャンバとtrans側チャンバの両方を、１０ｍＭのＴｒｉｓで緩衝されかつｐＨ８．０に滴定された対称的な１Ｍの塩溶液（ＫＣｌ）で満たした。全ての溶液は、使用前に濾過している。単独のα溶血素タンパク質を、前記二重膜中にcis側から挿入することで、膜内に分子ポアを形成させた。ｍｉＲＮＡとＤＮＡプローブと臨床的なＲＮＡサンプルを含む全てのオリゴヌクレオチドを、またcis側溶液へと添加した。ポア電流を記録するために、cis側溶液を接地し、そして電圧をtrans側溶液から与えた。この慣行において、正電圧は、負に荷電したＤＮＡをポアを通じてcis側からtrans側へと移行させることを駆動できる。単一チャネル電流を、Axopatch 200A増幅器（Molecular Device Inc. Sunnyvale, CA）を用いて記録し、内蔵の４極ローパス・ベッセルフィルタを用いて５ｋＨｚでフィルタリングし、Clampex 9.0ソフトウェア（Molecular Device Inc.）を用いてDigidata 1332 A/Dコンバータ（Molecular Device Inc.）を通じて２０ｋＨｚのサンプリング速度で収集した。それらのデータは、Clampfit 9.0ソフトウェア（Molecular Device Inc.）、Excelソフトウェア（MicroSoft）及びSigmaPlotソフトウェア（ＳＰＳＳ）を使用して解析した。
【００７０】
遊離したｍｉＲＮＡ又はプローブのポアを通じた移行によって、非常に短い電流ブロック（約１０1〜１０2μｓ）が生じた。幾つかの短いブロックは、部分的に減じられたポアコンダクタンスを示しており、それは、５ｋＨｚでの記録のフィルタリングによるものであるか、又はトラップされたオリゴヌクレオチドがcis側溶液に戻ることによって形成されるかのいずれかが考えられる（Maglia,G., Restrepo,M.R., Mikhailova,E., & Bayley,H. Enhanced translocation of single DNA molecules through alpha-hemolysin nanopores by manipulation of internal charge. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 19720-19725 (2008)）。この実験では、これらの部分的なブロックを含む全ての短いブロックを、ヒストグラムの作成のために収集した。移行イベント（約１０1〜１０2μｓ）はシグネチャイベント（約１０1〜１０3ｍｓ）とは十分に識別されるので、本願では、短いイベントと長いイベントとの分離のための境界として簡便に１ｍｓを使用した。それらのデータは、少なくとも３つの別個の実験（ｎ＞３）に基づく、平均±ＳＤとして示した。ｔ検定において、ｐ＜０．０５を、２つのグループ間での有意差と見なした。電気生理学実験は、２２±２℃で行った。
【００７１】
血漿からの全ＲＮＡ抽出とｑＲＴ−ＰＣＲによるｍｉＲＮＡ定量化．
末梢血サンプルを、ＩＲＢ承認をもってミズーリ大学Ellis Fischelがんセンターで取得した。ＥＤＴＡ保存剤を有する全血を室温で１６００ｇで１０分間にわたり遠心分離し、血漿を新しいチューブへと移した。ｍｉＲＮＡを含有する全ＲＮＡを、３５０μｌの血漿から、miRVana PARISキット（Ambion, Austin, TX, USA）を使用して製造元のプロトコールに従って抽出した。最終希釈容量は、１００μｌであった。
【００７２】
サイバーグリーン（SYBR green）をベースとする定量化ＲＴ−ＰＣＲアッセイを、ｍｉＲＮＡ定量化のために使用した。簡潔には、ｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡサンプル１０μｌを、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ambion）によってポリアデニル化し、そしてSuperScript III リバーストランスクリプターゼ（Invitrogen）を使用して製造元の指示に従い、ポリ（Ｔ）アダプタープライマー（5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’；配列番号１０）を用いてｃＤＮＡへと逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を使用してｍｉＲ−１５５特異的フォワードプライマー（5’-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3’；配列番号１１）と、リバースプライマーとしてのポリ（Ｔ）アダプターと相補的な配列（5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；配列番号１２）を用いてiQ5 Real-time PCR system（Bio-Rad, USA）において実施した。そのＰＣＲは、以下のとおり実施した：９５℃での３分間の初期変性後に、９５℃で１５秒を４０サイクルと、引き続き６０℃で１分間を行った。ｍｉＲ−１５５の相対レベルを、２-ΔCt法を使用して計算し、その際、健全な血漿のレベルを１と正規化した。データは、３つの独立した試験の平均±ＳＤとして表し、その差は、スチューデントのｔ検定を使用することによって、ｐ＜０．０５で統計的有意であると見なされた。
【００７３】
ナノポア及びｑＲＴ−ＰＣＲのデータの、対照としてスパイクインされたＣ．エレガンス（C. elegans）のｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−３９を用いた正規化．
ここで、ヒトのサンプルでのナノポアセンサーによるｍｉＲＮＡ検出能力の説得力のある実証をするために、対照として、スパイクインされた合成ｍｉＲＮＡを導入した。検出におけるスパイクインされたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ヒトゲノムに存在しないｍｉＲＮＡであるＣ．エレガンスのｍｉＲ−３９の配列と一致している。３．５μＬの１ｎＭの合成ｍｉＲ−３９溶液を、各３５０μＬの血漿サンプルへと、２×変性溶液（miRVana PARISキット）を血漿に添加した後に導入し、こうして血漿中のｍｉＲ−３９濃度は１０ｐＭであった。変性溶液は、ＲＮＡが分解を受けることを内因性の血漿ＲＮＡアーゼの阻害により妨げる。各サンプルについて、ｍｉＲ−１５５とスパイクインされたｍｉＲ−３９の両方を、ナノポアセンサとサイバーグリーンをベースとするｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した。ナノポアデータと正規化の結果を、第９表に示した。ナノポア検出において、ｍｉＲ−１５５とｍｉＲ−３９についてのプローブは、Ｐ155とＰ39であった。ここでまず、ｍｉＲ−１５５・Ｐ155とｍｉＲ−３９・Ｐ39のそれぞれのハイブリッドのシグネチャイベントの頻度ｆ155及びｆ39を測定した。ｆ39のばらつきは、ＲＮＡ抽出後のサンプルの間でのｍｉＲ−３９濃度の差を反映した。従って、２つの頻度の比ｆ155／ｆ39は、原則的にこのばらつきを排除すべきである。ここで最後に、６つの健全なサンプルの平均ｆ155／ｆ39（Ａnormal）を標準として使用し、各サンプルの相対ｍｉＲ−１５５レベルを、ｆ155／ｆ39をＡnormalに正規化すること、すなわちｆ155／ｆ39／Ａnormalによって計算した。
【００７４】
ｍｉＲＮＡ濃度とシグネチャイベントの頻度との間の相関．
演繹法において、"ｍｉＲ"はｍｉＲＮＡを表し、"Ｐ"はプローブを表し、Ｋdは、ｍｉＲ・Ｐについての平衡解離定数を表し、ｋonは、ｍｉＲ・Ｐのシグネチャイベントの発生率定数を表し、そしてｆsigは、シグネチャイベントの頻度を表す。ｍｉＲＮＡとプローブの混合物において、反応物であるｍｉＲ及びＰと、生成物であるｍｉＲ・Ｐとの平衡が確認できる。
【００７５】
【数２】
2013540423.tif 000006
【００７６】
Ｋdは、
【数３】
2013540423.tif 000007
によって決定され、その式中、［ｍｉＲ］0及び［Ｐ］0は、ｍｉＲＮＡとプローブの全濃度であり、かつ［ｍｉＲ・Ｐ］は、ｍｉＲ・Ｐの濃度である。こうして、［ｍｉＲ・Ｐ］と［ｍｉＲ］0の関係は、
【数４】
2013540423.tif 000008
である。
【００７７】
ナノポア中でのｍｉＲ・Ｐのトラッピングとアンジッピングに関するキネティクスは、
【数５】
2013540423.tif 000009
である。
【００７８】
ｆsigは、［ｍｉＲ・Ｐ］と線形に関連しているので、
【数６】
2013540423.tif 000010
であり、式Ｓ２と式Ｓ３とから
【数７】
2013540423.tif 000011
である。
【００７９】
式Ｓ４は、ｆsigが、ターゲットのｍｉＲＮＡの全濃度である［ｍｉＲ］0と正比例にないことを示している。しかしながら、［ｍｉＲ］0が［Ｐ］0よりもかなり小さい場合に、それはここでのｍｉＲＮＡ検出における場合であるが、式Ｓ４は、
【数８】
2013540423.tif 000012
として単純化できる。
【００８０】
この条件では、ｆsigは、［ｍｉＲ］0と比例している。式Ｓ４は、最終的にｆsigが飽和状態になるとも示唆している。これは、ｆsigの大きさがｍｉＲ・Ｐの捕捉頻度であることと、ｍｉＲ・Ｐの最大濃度（［ｍｉＲ・Ｐ］）は、プローブの濃度（［Ｐ］0）よりも高くありえないことからである。
【００８１】
trans側溶液中のｍｉＲ−１５５のＲＴ−ＰＣＲを用いた同定．
モデルに示されるように（図８）、ｍｉＲＮＡ・プローブの複合体がポア中でアンジッピングされると、別個のプローブとｍｉＲＮＡとは、β−バレルを通じてtrans側溶液へと順次移行しうる。このモデルを検証するために、ここでＲＴ−ＰＣＲを使用して、trans側溶液中のアンジッピングされたｍｉＲＮＡを検出した。しかしながら、ＰＣＲ法は、trans側のｍｉＲＮＡが、アンジッピングされたｍｉＲＮＡからであるか又はcis側溶液からtrans側溶液へと単に移行した遊離したｍｉＲＮＡ（ハイブリダイズしていない）からであるかを区別できない。従ってここで、cis側溶液中のｍｉＲＮＡよりもさらに高い濃度のプローブが添加され、こうして、殆どのｍｉＲＮＡ分子は前記プローブと結合され、遊離したｍｉＲＮＡは殆ど残らず、それにより遊離したｍｉＲＮＡが、ＰＣＲの結果と干渉しうるtrans側溶液へと移行することが排除される。ここでのターゲットは、ｍｉＲ−１５５であり、そしてプローブは、Ｐ155であった。ターゲット／プローブの濃度は、０．１／１０００、１／１０００及び１０／１０００（ｎＭ）であった。多くのポアに関する６時間にわたる二重膜記録の後に、cis側溶液とtrans側溶液の両方２μＬを、ポリアデニル化、逆転写及びＲＴ−ＰＣＲにかけて、上記の方法に示されるようにしてｍｉＲ−１５５の濃度を検出した。その間に、合成されたｍｉＲ−１５５の希釈列を行い、較正のための標準曲線を作成した。cis側のｍｉＲ−１５５とtrans側のｍｉＲ−１５５を、個別に測定した。ｍｉＲ−１５５／Ｐ155の濃度が１０／１０００（ｎＭ）である場合に、trans側のＲＮＡサンプルについての融解曲線のピークは、合成されたｍｉＲ−１５５と同じであった。ｍｉＲ−１５５の標準曲線に従って、trans側溶液中のｍｉＲ−１５５の濃度は、１４、３４及び６３ａＭ（１０-18Ｍ）であり、これにより、微量のｍｉＲ−１５５が、ポアのtrans側に運ばれたことが示された。
【００８２】
注釈Ｓ１．
前駆ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）は、ＲＮアーゼＩＩＩに媒介された開裂のサインとしての２ヌクレオチドの３′突出部を有する約７０ヌクレオチドのステムループ型のＲＮＡである（Lee,Y., Jeon,K., Lee,J.T., Kim,S., & Kim,V.N. MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellular localization. EMBO J 21, 4663-4670 (2002)）。血漿の全ＲＮＡ抽出物がｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含むかどうかは未知である。しかしながら、ここで、ｍｉＲ・Ｐについての捕捉率は、プローブ中のシグナルタグが非常に短いのであれば非常に低いことが実証された（図９、図１６及び未公表のデータ）。従って、ここで、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは存在するものの、短い突出部によって、ナノポア中でのトラッピングが妨げられることが予想された。
【００８３】
注釈Ｓ２．
ここでまた、ナノポアとｑＲＴ−ＰＣＲ（補足情報において）によってｍｉＲＮＡを分析するためにかかった時間を比較した。ここでのＲＴ−ＰＣＲ検出は、多くても１６のサンプルを一度で、スパイクインを用いたのと用いないので各試験について三重反復試験を含めて試験できる。ＰＣＲには約５〜６時間がかかり、そこには、１時間のポリＡ反応と、１時間の逆転写と、２．５時間のｑＰＣＲと、サンプル添加のための１時間が含まれる。ナノポア法は、標識不要であり、増幅が必要なく、そして短い核酸断片について選択的である。しかし、最近のナノポアの設定では、一つのサンプルを一度で検出することが可能である。ヒトの血漿サンプルからのｍｉＲ−１５５についての平均記録時間は、約１００イベントを収集して約９０分であった。従って、高スループットのナノポア法は、進展が必要とされる。これは、合成のナノポアアレイ［Advanced Materials 18, 3149-3153 (2006)］とタンパク質ポア−合成ポアのハイブリッドシステム［Nat. Nanotechnol. 5, 874-877 (2010)］の両方が報告されているので可能である。
【００８４】
第３表．調査されるｍｉＲＮＡ及びそれらのプローブの配列
【表３】
2013540423.tif 000013
【００８５】
第４表．ｍｉＲ−１５５・Ｐ１５５のハイブリッドによって生成されるシグネチャイベントと、ｍｉＲ−１５５かＰ１５５単独の移行によるスパイク状の短いブロックのコンダクタンス
【表４】
2013540423.tif 000014
【００８６】
a：ｇ0は、占有されていないα溶血素ポアのコンダクタンス。ｇ0＝１ＭのＫＣｌ（ｐＨ８．０）中、＋１００ｍＶで１３８０ｐＳ
【００８７】
第５表．様々なプローブで検出されたシグネチャイベントの頻度と発生率
【表５】
2013540423.tif 000015
【００８８】
a：１００ｎＭのｍｉＲ−１５５とプローブの存在下での＋１００ｍＶでの頻度。
b：ｆsig≒ｋon［ｍｉＲ−１５５］からの発生率定数、その際、［ｍｉＲ−１５５］＝１００ｎＭ。
【００８９】
第６表．完全マッチのｍｉＲＮＡ・プローブのハイブリッドとミスマッチを有するものについてのシグネチャイベントの時間
【表６】
2013540423.tif 000016
【００９０】
第７表．１つのヌクレオチド差を有するｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｃ）の分離及び２つのヌクレオチド差を有するｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｂ）の分離のためのＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）
【表７】
2013540423.tif 000017
【００９１】
a：受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線は、時間の分布全体を陽性成分と陰性成分とに分離する種々の可能性のあるカットオフポイントについての、偽陽性率（１−選択性）に対する真陽性率（感度）のプロットである。ｍｉＲＮＡ検出において、完全マッチのｍｉＲＮＡ・プローブのハイブリッドについてのイベントを"陽性"と示し、そしてミスマッチのハイブリッドについてのイベントを"陰性"と示した。分離精度は、ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）によって測定した。ＡＵＣが１であることは、完璧な分離を表し、０．５の面積は、分離能がないことを表す。ＡＵＣは、オンラインでワールドワイドウェブ上の無料ソフトウェアを使用して分析した（インターネットアドレス）rad.jhmi.edu/jeng/javarad/roc/JROCFITi.html。
【００９２】
第８表．様々な時間比とイベント数比でのＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）及び至適カットオフポイント（ＯＣＰ）
【表８】
2013540423.tif 000018
【００９３】
a：ＡＵＣとＯＣＰの両方とも、図１６Ａ〜Ｂに示されるＲＯＣ曲線から計算した。ＯＣＰは、Youden指数の最大値でのカットオフ時間である。Youden指数は、｛感度＋選択性−１｝として定義され、ＲＯＣ曲線から計算され、０と１との間の範囲である。長期分布と短期分布の完全な分離に導くカットオフ時間は、Youden指数＝１となり、一方で、完全な重複は、Youden指数＝０となる。Youden指数の最大値を生じるカットオフ時間の値、すなわち"至適"カットオフポイント（ＯＣＰ）（Greiner et al., 2000 Preventive Veterinary Medicine 45, 23-41）は、最も正確な分離をもたらす。
b：τP／τN："陽性"のデータセットと"陰性"のデータセットの時間比。各データセットは、２００の指数分布した時間値を含んでいた。より長い平均時間を有するデータセットを"陽性"として示し、より短いものを"陰性"として示した。
c：ＮP／ＮN："陽性"（ＮP）のデータセットにおける、"陰性"のデータセットに対するイベント数比。τP／τNは、このシミュレーションでは５であった。
【００９４】
第９表．ナノポアセンサによって検出されたヒト血漿サンプル中のｍｉＲ−１５５とスパイクインされたｍｉＲ−３９のレベル
【表９】
2013540423.tif 000019
【００９５】
a：相対ｍｉＲ−１５５レベルは、各サンプルのｆ155／ｆ39を、表中で強調表示した０．２３９である、健全なサンプル１〜６の平均のｆ155／ｆ39に正規化することによって得られた。
【００９６】
例３．マイクロＲＮＡのペプチド誘導型の選択的検出
原理的説明．
ここで長期の目的は、血漿又は組織からの全ＲＮＡ抽出物においてターゲットｍｉＲＮＡを正確に検出するためのナノポア単一分子センサを開発することである。前記のＲＮＡ抽出物は、多くの複雑な核酸成分を含んでおり、少なくともｍｉＲＮＡ（未熟な及び成熟のｍｉＲＮＡの両方）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、他のＲＮＡを含む。全ての成分は、通常は、負電荷を有する。このように、ターゲットのｍｉＲＮＡが印加電圧でポア中にトラップされうる場合に、任意の他の成分も駆動されて該ナノポアと相互作用することがあり、それによりターゲットのｍｉＲＮＡ／プローブの複合体によって生じたシグネチャイベントの認識と干渉する非特異的な電流シグナルが発生する。ここで、ターゲットのｍｉＲＮＡ／プローブの複合体だけをポア中にトラップできるが、どの他の核酸成分も前記ポアとの干渉から妨げられるため、従って選択性と感度の両方が大きく改善されたエラー強さのあるストラテジーが提供される。このストラテジーは、ｍｉＲＮＡのペプチド誘導型の選択的検出と呼ばれる。
【００９７】
方法．
ここで、図１８Ａに示されるように、プローブとしてペプチド−ＰＮＡ（ペプチド核酸）コポリマーを設計した。そのＰＮＡ配列（図１８Ａで"ＰＮＡ"で囲われる）は、側鎖のヌクレオベースを有するペプチド骨格であって、ターゲットのｍｉＲＮＡ（図１８Ａ中の"ｍｉＲＮＡ（Ｌｅｔ−７ｂ，−７ｃ）"で囲われる）の全配列又は部分配列と相補的な骨格を有し、こうして溶液中のターゲットのｍｉＲＮＡを捕捉するための中心ドメインとして役立つ。これらの配列を以下に規定する：
プローブ
NH2-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-AACCACACAA-COOH、ここで、プローブ全体はペプチド骨格（すなわち、プローブのAACCACACAA部分は、指摘されたAACCACACAAヌクレオベースを有するペプチド骨格を含む）を有する；配列番号１７。
【００９８】
プローブのＰＮＡ（中心ドメイン）：
NH2-AACCACACAA-COOH、ここで、該分子は、指摘されたAACCACACAAヌクレオベースを有するペプチド骨格を含む（配列番号１８）。
【００９９】
ＨＩＶ−ＴＡＴ：
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（配列番号１９）。
【０１００】
オリゴヌクレオチドプローブと対立して、新たなプローブのリポーター（又は末端伸長部）は、一連の正に荷電したアミノ酸を有するペプチド（図１８Ａ中の"ペプチドリポーター"で囲われる）であり、そして中心ドメインは、ターゲットの核酸と相補的なヌクレオチドを含むペプチド核酸である。プローブのリポーター又は末端伸長部における正に荷電したアミノ酸が十分な数で存在する場合に、ｍｉＲＮＡ／プローブの複合体の正味の電荷は、依然として正であり、こうしてターゲットのｍｉＲＮＡがプローブのＰＮＡ（ペプチド核酸）ドメインに結合する場合に、ｍｉＲＮＡ／プローブの複合体全体は、強力な双極子分子を形成する。ここで、ポアのtrans側開口部に負に荷電した残基の環状部を有するナノポアを工学した（Ｓ．アウレウス（S. aureus）のα溶血素であってＫ１３１Ｄ突然変異を含むもの）。野生型のＳ．アウレウスのα溶血素のペプチド配列（National Center for Bioinformaticsのアクセッション番号：AAA26598.1）は、以下の通りである：
ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWTDRSSERYKIDWEKEEMTN（配列番号２１）
【０１０１】
変異体のＳ．アウレウスＫ１３１Ｄα溶血素ペプチド配列は、以下の通りである：
ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGDIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWTDRSSERYKIDWEKEEMTN（配列番号２２）
【０１０２】
従って、プローブの双極子の正に荷電したペプチドドメインが両者とも正の電圧（cis側接地）によって押されて、trans側開口部にある負の環状部によって引き寄せられて、ポアのβ−バレル中へのｍｉＲＮＡ／複合体のトラップが導かれる。正の電圧では、任意の他の遊離した核酸成分は、保有する負電荷のためポアに入ることが妨げられる。これは遊離したＲＮＡ成分によりシグナルを大きく下げ、最も観察されるイベントは、ｍｉＲＮＡ／プローブの複合体のトラップによるか、プローブの移行によるものかのいずれかである。ペプチドＰＮＡプローブの使用は、ターゲットのｍｉＲＮＡの選択的な検出を可能にする。
【０１０３】
結論．
図１８Ａは、ｍｉＲＮＡ／プローブの複合体の図を示している。囲われたｍｉＲＮＡは、ターゲットのｍｉＲＮＡであるＬｅｔ−７ｂである。囲われたプローブであるＰ７ｂは、囲われた"ペプチドリポーター"部と、囲われた"ＰＮＡ"（ペプチド核酸）部を有する。ＰＮＡは、Ｌｅｔ−７ｂの捕捉のためであり、囲われた"ペプチドリポーター"は、ＨＩＶ−ＴＡＴの配列に相当する正に荷電した、アルギニン及びリシンを原因とする＋８ｅを有するペプチドである。図１８Ｂは、ペプチド−ＰＮＡプローブのＰ７ｂの移行についてのイベントを示している。特徴的なイベントは３ｍｓにわたって継続し、そして電圧は、＋１８０ｍＶで１０ｐＡにまで下がる。図１８Ｃは、＋１８０ｍＶでの溶液において、遊離したｍｉＲＮＡ ｌｅｔ−７ｂ（プローブなし）では遮断イベントが観察できないことを示している。
【０１０４】
図１８Ｄは、ｌｅｔ−７ｂ／Ｐ７ｂの複合体のトラッピングについてのシグネチャイベントを示している。これらのイベントは、特徴的に１００ｍｓにわたって継続し、そして電流を、プローブに関するものとは完全に異なる＋１８０ｍＶで５７ｐＡにまで下がる。図１８Ｅは、Ｌｅｔ−７ｂからの２種の異なるヌクレオチドを有するＬｅｔ−７ｃが、プローブのＰ７ｂのＰＮＡに結合でき、従って図１８Ｃに示されるようにシグネチャイベントを生じないことを示している。殆ど全ての観察されたイベントは、プローブそれ自身によるものである。
【０１０５】
図１８Ｆは、Ｌｅｔ−７ｂ（完全マッチ、重なりのない２つの離れたクラスター）及びＬｅｔ−７ｃ（２つのミスマッチ、完全に重なった２つのクラスター）に結合するＰ７ｂについての時間−振幅の特性を比較している。このことは、２つの異なるヌクレオチドを有する配列の類似したｍｉＲＮＡを識別するにあたりほとんど１００％の精度を示している。
【０１０６】
バイオセンシング用途のためのナノポアにおける様々な分子プロセスを理解するためのシグネチャイベントの利用も提供される。図１９Ａにおいて、ここで、短鎖の３′末端にヘアピンを有するＨＰ−Ｃ３０を使用した場合に、新しいタイプの３つのレベルの電流パターンが確認された。そのレベル１とレベル２は、ＨＰ−Ｃ３０のアンジッピングと、アンジッピングされた短鎖のナノ間隙からβ−バレルへの移行と一致している。しかしながら、レベル１′の時間は、ヘアピンを有さないターゲットと比較して、１５±１．９ｍｓへと８０倍だけ劇的に延長された。延長されたレベル１′は、β−バレルにおける通過（threading）の前にヘアピンのアンジッピングと一致している。アプタマーなどの多くのＤＮＡ又はＲＮＡ構造はヘアピンを含むので、ここでこのシステム及びシグネチャイベントは、これらの構造を調べるために、そしてそれらのタンパク質ターゲットとの結合相互作用を調べるために使用することができる。図１９Ｂにおいて、ここでまた、短鎖の３′末端にストレプトアビジンと結合されたＳＡ−Ｃ３０を使用した場合に、新しい多重レベルの電流パターンが裏付けられた。再び、完全に遮断されたレベル１と部分的に遮断されたレベル２は、ＳＡ−Ｃ３０のアンジッピングと、アンジッピングされた短鎖のナノ間隙からβ−バレルへの移行と一致している。その電流は、負電圧によって強制的に回復されるまで数分にわたってレベル１′に留まった。長期のレベル１′は、ＳＡ−Ｃ３０の短鎖がアンジッピング後にβ−バレル中に動くものの、その移行は結合された大きなストレプトアビジンによって抑えられることによって説明できる。この結果は、タンパク質検出のためにシグネチャイベントを使用する可能性を示している。図１９Ｃにおいて、ここで、前記複合体は、２つのＤＮＡの結合に短いオリゴヌクレオチドを使用した場合に、ナノポア中で２つのステップにおいて逐次アンジッピングされうることが裏付けられた。２つのＤＮＡのアンジッピングは、２つのレベル２状態によって明らかに表すことができる。
【０１０７】
結論．
ペプチド−ＰＮＡプローブは、１）ターゲットのｍｉＲＮＡの選択的な検出、２）配列が類似したｍｉＲＮＡの識別における大きく向上した精度を可能にする。
【０１０８】
本発明は、その特定の実施形態と関連づけて説明されているが、本発明によるデバイスには更なる変更が可能であると解される。本件特許出願は、発明のいかなる変更、使用もしくは適合も、一般に本発明の原理に従って、そして本発明の属する技術分野内で公知の又は通常の慣行に含まれかつ本願で先に示した及び以下の特許請求の範囲における必須の特徴に当てはまりうる本願開示からの逸脱を含めて対象に含めることを意図している。
【０１０９】
参考資料
2013540423.tif 000020
【０１１０】
2013540423.tif 000021
【０１１１】
2013540423.tif 000022
【０１１２】
2013540423.tif 000023
【符号の説明】
【０１１３】
１  検知チャンバ、  ２  cis側コンパートメント、  ３  trans側コンパートメント、  ４  仕切、  ５  開口部、  ６  ナノポア、  ７  電源、  ８  電流デテクタ、  ９  ターゲットのオリゴヌクレオチド、  １０  プローブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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