(57)【要約】本明細書において、ｐＨ調節のために使用されるアルカリ溶液中へのアミノ酸の添加を含む、細菌細胞を培養するための方法を報告する。また、１つの局面は、ａ）ポリペプチドをコードする核酸を含む細菌細胞を準備する工程、ｂ）準備した細胞を培養する工程、ｃ）培養中に、アミノ酸を含む塩基性溶液を用いてｐＨ値を調整する工程、ｄ）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、そしてそれによりポリペプチドを産生する工程を含むポリペプチドを産生するための方法である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを発現するエシェリキアコリィ（Escherichia coli）細胞を培養するための方法であって、培養は、培養中におけるアスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸のアルカリ溶液の添加を含むことを特徴とし、
アミノ酸はアルカリ溶液中において、２０℃および中性ｐＨにおける水中のその溶解度よりも高い濃度を有し、そしてアミノ酸は３０ｇ/ｌ以上の濃度を有し、そして
アルカリ溶液は、１０％（ｗ/ｖ）以上のアンモニア溶液であり、そして
培養した細菌細胞の乾燥細胞重量は、培養の１時点において少なくとも２０ｇ/ｌである、前記方法。
【請求項２】
以下の工程
ａ）ポリペプチドをコードする核酸を含むエシェリキアコリィ（Escherichia coli）細胞を培養する工程、
ｂ）培養中にアスパラギン酸塩、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸を含むアルカリ溶液を用いてｐＨ値を調整する工程、
ｃ）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、そしてそれによりポリペプチドを産生する工程
を含むポリペプチドを産生するための方法であって、
アミノ酸は、アルカリ溶液中において３０ｇ/ｌ以上の濃度を有し、そして
アルカリ溶液は、１０％（ｗ/ｖ）以上のアンモニア溶液である、前記方法。
【請求項３】
細菌細胞がアミノ酸栄養要求性細胞であり、そして栄養要求性が、アスパラギン酸塩、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸に対してであることを特徴とする、請求項１〜２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４】
アルカリ溶液が、９以上のｐＨ値を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドがヒトアポリポタンパク質Ａ１またはその誘導体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
アポリポタンパク質Ａ１が、配列番号０１〜３５から選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
アポリポタンパク質Ａ１が、配列番号０１、０２、３４および３５から選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
アミノ酸が、約５０ｇ/ｌの濃度を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
アルカリ溶液が、アンモニア約１２．５％（ｗ/ｖ）のアンモニア水溶液であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
アミノ酸がロイシンであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
アルカリ溶液がロイシンおよびプロリンを含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
アルカリ溶液が約１２．５％（ｗ/ｖ）のアンモニア溶液であり、そして各々約５０ｇ/ｌの濃度のアミノ酸のロイシンおよびプロリンを含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
細菌細胞の培養におけるフィードとしてのアミノ酸のアルカリ溶液の使用であって、アミノ酸は、アスパラギン酸塩、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択され、そして培養は、２０ｇ/ｌ以上の乾燥細胞重量までであり、そしてアミノ酸はアルカリ溶液中において３０ｇ/ｌ以上の濃度を有し、そしてアルカリ溶液は１０％（ｗ/ｖ）以上のアンモニア溶液である、前記使用。
【請求項１４】
細菌細胞がアミノ酸栄養要求性細胞であり、そして栄養要求性が、アスパラギン酸塩、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸に対してであることを特徴とする、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
エシェリキアコリィ（Escherichia coli）細胞は、アミノ酸栄養要求性エシェリキアコリィ（Escherichia coli）細胞であることを特徴とする、請求項２〜１２のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において、ポリペプチドの産生のための化学的に既知組成培地中におけるエシェリキアコリィ（Escherichia coli）株などの原核細胞の高細胞密度培養のための方法を報告し、アミノ酸が、培養培地のｐＨを調節し、同時に窒素源としても作用する、濃縮アルカリ溶液によって供給される。
【０００２】
発明の背景
近年、タンパク質の生産は着実に増加し、そしてタンパク質は近い将来に種々の疾病の治療に利用できる最大の治療薬群になる可能性がある。タンパク質の効果は、その特異性、例えば特異的なターゲット認識および結合機能から生じる。
【０００３】
細胞培養は発酵プロセスで使用され、これにより物質、特にタンパク質が産生される。細胞培養が遺伝子的に改変されておらず、そしてそれ自体の代謝産物を形成するプロセスと、生物が、タンパク質などのより大量のそれ自身の物質を産生するか、または外来物質を産生するように遺伝子的に改変されているプロセスとの間で区別される。物質を産生する生物に、生物の生存を保証し、そして所望のターゲット化合物の産生を可能とする、栄養培地を供給する。特定の宿主の最適な培養を可能とするこれらの目的のための数多くの培養培地が知られている。
【０００４】
エシェリキアコリィ（Escherichia coli）の高細胞密度培養は、Riesenberg (Riesenberg, D., et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991) 380-384)およびHorn (Horn, U., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 46 (1996) 524-532)によって報告されている。Riesenberg, D.およびGuthke, R. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 51 (1999) 422-430)は、微生物の高細胞密度培養を報告した。E.coliを高細胞密度まで増殖させることは、Shiloach, J.およびFass, R. (Biotechnol. Advances 23 (2005) 345-357)によって概説されている。
【０００５】
ＷＯ９１／１０７２１では撹拌ボイラー発酵槽におけるEscherichia coliの高細胞密度発酵のためのプロセスが報告されている。プラスミドＤＮＡ産生および精製の方法がＷＯ９７／２９１９０に報告されている。溶存酸素濃度および酸素移動速度を制御することによる好気性水浸微生物培養液の増殖の制御は、ＤＤ２９５８６７に報告されている。ＥＰ０８６６８７６では、高細胞密度発酵によるE.coliにおける組換えタンパク質の調製が報告されている。
【０００６】
ＷＯ０３／０４８３７４では、芳香族アミノ酸代謝物またはその誘導体の産生プロセスが報告されている。高細胞密度発酵によるE.coliにおける組換えタンパク質の調製プロセスがＷＯ９７／２１８２９に報告されている。
【０００７】
発明の要約
アミノ酸をアルカリ溶液において培養培地に加えるならば、原核細胞、特にアミノ酸栄養要求性E.coli K12株を高細胞密度で化学的に既知組成培地で培養することができることが判明した。
【０００８】
本明細書に報告した１つの局面は、細菌細胞、特にE.coli細胞を高細胞密度で培養するための方法であり、前記細胞は組換えポリペプチドを発現し、培養は、培養中におけるアスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸のアルカリ溶液の添加を含み、
アミノ酸はアルカリ溶液において、２０℃および中性ｐＨにおける水中のその溶解度よりも高い濃度を有し、そして
培養した細菌細胞の乾燥細胞重量は、培養の１時点において少なくとも２０ｇ/ｌである。
【０００９】
本明細書に報告した１つの局面は、以下の工程
ａ）ポリペプチドをコードする核酸を含む、細菌細胞、特にE.coli細胞を準備する工程、
ｂ）準備した細胞を培養する工程、
ｃ）培養中にアスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸を含むアルカリ溶液を用いてｐＨ値を調整する工程、
ｄ）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、そしてこれによりポリペプチドを産生する工程
を含む、ポリペプチドを産生するための方法である。
【００１０】
本明細書に報告した別の局面は、細菌細胞の培養中におけるｐＨ値を調整するためのアミノ酸を含むアルカリ溶液の使用である。
【００１１】
また、本明細書に報告した局面は、細菌細胞の培養におけるフィード（feed）としてのアミノ酸のアルカリ溶液の使用であり、アミノ酸はアスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択され、そして培養は、２０ｇ/ｌ以上の乾燥細胞重量までである。
【００１２】
以下は、以前に概略を示した全ての局面の具体的な態様である。
【００１３】
１つの態様において、アミノ酸は水難溶性アミノ酸である。１つの態様において、細菌細胞はアミノ酸栄養要求性細胞であり、そして栄養要求性は、アスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸に対してである。別の態様において、細菌細胞はEscherichia coli細胞またはその突然変異体である。さらなる態様において、アミノ酸は２０℃の水中において５０ｇ/ｌ以下の溶解度を有する。さらなる態様において、アミノ酸は２０℃の水中において４０ｇ/ｌ以下の溶解度を有する。また１つの態様において、アミノ酸は、アスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択される。別の態様において、アミノ酸は、アスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンおよびチロシンから選択される。１つの態様において、アミノ酸はロイシンである。さらに別の態様において、アミノ酸はアルカリ溶液中において、２０℃の水中におけるその溶解度よりも高い濃度を有する。１つの態様において、溶解度は、２０℃の水中の溶解度よりも２倍高く、別の態様において３倍高い。別の態様において、溶解度は、２０℃およびｐＨ６〜８のｐＨ値の水中の溶解度よりも高い。１つの態様において、アミノ酸はアルカリ溶液中において２５ｇ/ｌ以上、またはさらなる態様において３０ｇ/ｌ以上、またはさらに別の態様において３５ｇ/ｌ以上の濃度を有する。１つの態様において、アミノ酸は、アルカリ溶液中において４５ｇ/ｌ以上の濃度を有する。１つの態様において、アミノ酸は、アルカリ溶液中において約５０ｇ/ｌの濃度を有する。さらなる態様において、アルカリ溶液は、９以上の、さらなる態様において１０以上の、また別の態様において１０．５以上のｐＨ値を有する。１つの態様において、アルカリ溶液は、５％（ｗ/ｖ）より高い、または１０％（ｗ/ｖ）以上、または１５％（ｗ/ｖ）以上のアンモニア溶液である。１つの態様において、アルカリ溶液は、約１２．５％（ｗ/ｖ）のアンモニア水溶液である。また１つの態様において、ポリペプチドはヒトアポリポタンパク質Ａ１またはその誘導体である。さらなる態様において、アポリポタンパク質Ａ１は、配列番号０１〜配列番号３５から選択されたアミノ酸配列を有する。１つの態様において、ポリペプチドは、配列番号０１、配列番号０２、配列番号３４または配列番号３５から選択されたアミノ酸配列を有する。
【００１４】
発明の詳細な説明
本明細書において、原核細胞、例えばアミノ酸栄養要求性細菌細胞を培養するための方法を報告し、少なくとも１つのアミノ酸、例えば細胞が栄養要求性であるアミノ酸を、アルカリ溶液中に加える。
【００１５】
少なくとも１つのアミノ酸（例えば、細胞が栄養要求性を有するアミノ酸）を含むフィードを、アルカリ溶液において培養培地に加えれば、原核細胞、例えばアミノ酸栄養要求性E.coli K12株を高細胞密度で培養することができることが判明した。これは、アミノ酸が水に難溶性である場合に特に有利であり、そして、アルカリ溶液中にアミノ酸を溶解することによって溶解度を増加させることができる。同時にアルカリ溶液を使用して、培養培地のｐＨ値を調整することができる。高度に濃縮された単一フィード溶液においてアミノ酸溶液とｐＨ調整溶液とを合わせることによって、添加する容量を減少させることができ、従って、原核細胞の高細胞密度培養が可能となる。さらに、アルカリ性フィード溶液中における少なくとも４５ｇ/ｌのアミノ酸の濃度により、組換えポリペプチドの増加した産生がもたらされることが判明した。
【００１６】
１つの態様において、原核細胞を培養するための方法は、以下の工程
ａ）原核細胞を準備する工程、
ｂ）原核細胞を培養する工程、
ｃ）原核細胞の培養中に、アスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸を含むアルカリ溶液を用いてｐＨ値を調整する工程
を含む。
【００１７】
「アミノ酸栄養要求性原核細胞」は、例えば対応する生合成経路のタンパク質をコードする構造遺伝子を含む遺伝子座内における突然変異または欠失に因り、必須アミノ酸を合成することができない原核細胞である。それぞれのアミノ酸を培養培地に添加しなければ、細胞は増殖することができない。栄養要求性は、任意のアミノ酸に対してであり得る。原核細胞はまた、１つより多くのアミノ酸に対して栄養要求性であり得る。従って、１つの態様において、アミノ酸栄養要求性原核細胞は、少なくとも１つのアミノ酸に対して栄養要求性である。別の態様において、アミノ酸栄養要求性原核細胞は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個のアミノ酸に対して栄養要求性である。さらなる態様において、アミノ酸栄養要求性原核細胞は、５個まで、または１０個まで、または１５個までのアミノ酸に対して栄養要求性である。別の態様において、アミノ酸栄養要求性原核細胞は、１〜５個のアミノ酸、または１〜３個のアミノ酸、または１〜２個のアミノ酸、または１個のアミノ酸、または２個のアミノ酸、または３個のアミノ酸、または４個のアミノ酸に対して栄養要求性である。アミノ酸栄養要求性原核細胞は、１つの態様において、細菌細胞である。
【００１８】
１つの態様において、細胞は、Escherichia細胞、またはバチラス（Bacillus）細胞、またはラクトバチラス（Lactobacillus）細胞、またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）細胞、または酵母細胞(サッカロミセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、またはピキア（Pichia)である。さらなる態様において、細胞はEscherichia coli細胞、またはバチラススブチリス（Bacillus subtilis）細胞、またはラクトバチラスアシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）細胞、またはコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）細胞、またはピキアパストリス（Pichia pastoris）酵母細胞である。
【００１９】
「値を調整する」という用語は、それぞれの値を、培養全期間を通して予め決定されたレベルで維持することを示し、すなわち、値を連続的にまたは予め決定された一定の時間間隔で確認し、そして値が予め設定された許容範囲を外れた場合に修正液の添加により変化させる。例えば、「ｐＨ値を調整する」という用語は、培養培地のｐＨ値を一定の時点で周期的に、すなわち一定の時間間隔で決定し、そしてもし決定されたｐＨ値が、例えば０．１ｐＨ単位、または０．１５ｐＨ単位、または０．２ｐＨ単位だけ許容範囲外であるならば、ｐＨ値を、酸性またはアルカリ性溶液などの修正液の添加によって予め決定されたｐＨ値に再度調整する。
【００２０】
原核細胞を培養するための方法およびまたアミノ酸栄養要求性原核細胞を培養するための方法は、当業者には公知である（例えば、Riesenberg, D., et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991) 380-384参照）。培養は、任意の方法を用いてであり得る。１つの態様において、培養は、バッチ培養、流加培養、灌流培養、半連続培養、または完全もしくは部分的に細胞の保持された培養である。培養のための唯１つの必要条件は、アルカリ溶液を加えなければならないことである。この添加は、単にフィード溶液であっても、またはフィードとｐＨ調整溶液を合わせたものとしてであってもよい。
【００２１】
細胞の培養の開始に使用される培養培地は、当業者に公知の任意の培地であり得、供給されるアミノ酸の濃度は、培地中において、５ｇ/ｌ未満、または７．５ｇ/ｌ未満、または１０ｇ/ｌ未満である。それぞれの化合物の濃度を、細胞の増殖と負の干渉が予期されないように選択しなければならないことを指摘しなければならない。１つの態様において、培地は、既知組成のグルコース−ミネラル塩培地である。
【００２２】
１つの態様において、培養は高細胞密度培養である。「高細胞密度培養」という用語は、培養した原核細胞の乾燥細胞重量が、培養中の１時点において少なくとも１０ｇ/ｌである培養法を示す。１つの態様において、乾燥細胞重量は、培養中の１時点において、少なくとも２０ｇ/ｌ、または少なくとも５０ｇ/ｌ、または少なくとも１００ｇ/ｌ、または１００ｇ/ｌを超える。このような高細胞密度状態に到達するためには、培養中に加えられるフィードおよび／または調整溶液の容量は、できるだけ小さくなければならない。乾燥細胞重量を決定するための方法は、例えば、Riesenberg, D., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 34 (1990) 77-82に報告されている。
【００２３】
準備した培地中の栄養分は、培養中に代謝されるので、制限を回避するために補充しなければならない。アミノ酸が難溶性であれば、低い濃度のフィード溶液しか調製し添加することができない。必要量のアミノ酸を提供するために、大量のフィード溶液を加えなければならない。この結果、全培養容量は増加し、培養ブロスは希釈され、従って高細胞密度プロセスには不利である。
【００２４】
２０個の天然に存在するアミノ酸の溶解度を以下の表に列挙する。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
アミノ酸のアスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンの溶解度は５０ｇ/ｌ以下であり、従って、これらのアミノ酸は水難溶性と呼ばれる。
【００２７】
例えば、アミノ酸のロイシンは、２０℃の水中において２４ｇ/ｌの溶解度を有し、従って難溶性である。１２．５％（ｗ/ｖ）アンモニアを含むアルカリ溶液中では、溶解度は７６ｇ/ｌまで増加し、従って、水中の溶解度の３倍を超える。同時に必要とされるフィード容量は６０％超減少する。同時にアルカリ溶液を、培養液のｐＨ値を調整するためにも使用するならば、追加する容量をさらにより減少させることができる。例えば、アミノ酸のチロシンは、２０℃の水中において０．４ｇ/ｌの溶解度を有し、従って、難溶性である。１２．５％（ｗ/ｖ）のアンモニアを含むアルカリ溶液中では、溶解度は３９ｇ/ｌまで増加し、従って、水中の溶解度の約１００倍である。
【００２８】
１つの態様において、アミノ酸は、アスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよび／またはチロシンである。また１つの態様において、アミノ酸は、アスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンおよび／またはチロシンである。１つの態様においてアミノ酸はロイシンである。１つの態様において、アミノ酸は、２０℃で約７のｐＨ値の水中において難溶性であるアミノ酸である。また１つの態様において、アミノ酸はロイシンおよびプロリンであるか、またはアミノ酸はロイシンおよびプロリンおよびトリプトファンである。さらなる態様において、アミノ酸はアルカリ溶液中において、２０℃における水中の溶解度よりも高い溶解度を有する。さらなる態様において、アルカリ溶液中の溶解度は、２０℃の水中の溶解度の２倍から１０倍である。１つの態様において、アミノ酸は４０ｇ/ｌ以下の水中の溶解度を有する。別の態様において、アミノ酸は、３０ｇ/ｌ以下の水中の溶解度を有する。また１つの態様において、アミノ酸は、アルカリ溶液中において２５ｇ/ｌ以上の溶解度を有する。さらなる態様において、アミノ酸は、アルカリ溶液中において３０ｇ/ｌ以上の濃度を有する。別の態様において、アミノ酸は、アルカリ溶液中において３５ｇ/ｌ以上の濃度を有する。また１つの態様において、アミノ酸は、アルカリ溶液中において５０ｇ/ｌ以上の溶解度を有する。
【００２９】
以下の表において、異なるフィーディングモードを用いて得られた１０リットルの作業容量の同じロイシンおよびプロリン栄養要求性E.coli細胞を用いての培養容器中の培養結果を示す。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
２つのアミノ酸が培養培地に別々のフィードとして加えられている実験１および２では、培養の終了時に得られる全バイオマスおよび組換えタンパク質の収率は、アミノ酸が、混合性のアルカリ性フィード（これは同時に培養培地のｐＨ値を調整するためにも使用される）として加えられている実験３および４と比較して低いことが分かる。
【００３２】
また、実験３および４における最終培養容量は、実験１および２の培養容器の作業容量を超えていない。
【００３３】
１つの態様において、アルカリ溶液は、１２．５％（ｗ/ｖ）アンモニア水溶液であり、そして約５０ｇ/ｌ以上の濃度の少なくとも１つのアミノ酸を含む。１つの態様において、アルカリ溶液は、約５０ｇ/ｌの濃度のロイシンおよびプロリンを含む。
【００３４】
本明細書に報告した方法において使用することのできる原核細胞は、１つ以上のアミノ酸栄養要求性を含み得る。例えば、ロイシン生合成経路の欠損したE.coli細胞は、LeuB6 欠損細胞13-6, χ148, χ156, χ2224, χ462, χ463, χ474, χ478, χ515, χ65, χ697, χ760, 2000k MSE248, 342-167, 342MG, 679-680, A586, A592, A593, AA100, AA7852, AA787, AB1102,  AB1111, AB1115, AB1122, AB1129, AB113, AB1132, AB1133, AB114, AB1157, AB1157-D, AB1314, AB1330, AB1331, AB1881, AB1884, AB1885, AB188, CP78, CP79, CR34 Thy-, CR34 Thy- SR, CR34/308, CR34/313, CR34/399, CR34/43, CR34/454, CR34/500, CR34/7a, CS130, CS312, CS419, CS425, CS426, CS460, CS471, CS472, CS50, CS81, CS85, CSR06, CSR603, CSR603/pDR1996, CT28-3b, DA10, DA11, DB1161, DB1257, DE1878, DE1882, DE2345, DF225, DF41, JRG94, JS10 C600r-m-, T6R, P678SSR pro-, PA20SR, PA200 SR, PA201  SR, PA214SRT6R, PA265 SR, PA309, PDE70, PA340, PA340/T6, PA360, PA414, PAM161, PAM162, PAM163, PAM164, PAM660, PAT84, PB349, PB69, PC1, PC2, PC3, PC5, PC6, PC8, PJ1, PJ2, PJ3, PJ4, PJ5, PJ C600 (= CRSR), W208 SR AzR, W2660, LAM-, W945his, WA2127, WA2379, WA2548, WA2552, WA2574, WA2899, WA921, WA946, WA960, Y10, Y46, Y53, Y70, YYC100から選択され得る。
【００３５】
１つの態様において、原核細胞は、E.coli K12細胞またはE.coli B細胞である。
【００３６】
１つの態様において、アルカリ溶液は強アルカリ性の溶液である。別の態様において、アルカリ溶液は、ｐＨ９以上、またはｐＨ１０以上、またはｐＨ１０．５以上のｐＨ値を有する。さらなる態様において、アルカリ溶液中のアミノ酸の溶解度は、水中のアミノ酸の溶解度の少なくとも２倍である。
【００３７】
１つの態様において、以下の工程
ａ）ポリペプチドをコードする核酸を含むアミノ酸栄養要求性細菌細胞を準備する工程、
ｂ）準備した細胞を培養する工程、
ｃ）培養中に、細菌細胞が栄養要求性であるアミノ酸を含むアルカリ溶液を用いてｐＨ値を調整する工程、
ｄ）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、そしてそれによりポリペプチドを産生する工程
を含む、本明細書において報告したポリペプチドを産生するための方法。
【００３８】
本発明の具体的な態様
１．ポリペプチドを発現するEscherichia coli細胞を培養するための方法であって、培養は、培養中におけるアスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸のアルカリ溶液の添加を含むことを特徴とし、
アミノ酸はアルカリ溶液において、２０℃および中性ｐＨにおける水中のその溶解度よりも高い濃度を有し、そしてアミノ酸は３０ｇ/ｌ以上の濃度を有し、そして
アルカリ溶液は、１０％（ｗ/ｖ）以上のアンモニア溶液であり、そして
培養した細菌細胞の乾燥細胞重量は、培養の１時点において少なくとも２０ｇ/ｌである、前記方法。
【００３９】
２．以下の工程
ａ）ポリペプチドをコードする核酸を含むEscherichia coli細胞を培養する工程、
ｂ）培養中にアスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸を含むアルカリ溶液を用いてｐＨ値を調整する工程、
ｃ）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、そしてそれによりポリペプチドを産生する工程
を含むポリペプチドを産生するための方法であって、
アミノ酸は、アルカリ溶液において３０ｇ/ｌ以上の濃度を有し、そして
アルカリ溶液は、１０％（ｗ/ｖ）以上のアンモニア溶液である、前記方法。
【００４０】
３．細菌細胞がアミノ酸栄養要求性細胞であり、そして栄養要求性が、アスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸に対してであることを特徴とする、上記態様１〜２のいずれか１つに記載の方法。
【００４１】
４．アルカリ溶液が、９以上のｐＨ値を有することを特徴とする、上記態様１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【００４２】
５．ポリペプチドがヒトアポリポタンパク質Ａ１またはその誘導体であることを特徴とする、上記態様１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【００４３】
６．アポリポタンパク質Ａ１が、配列番号０１〜３５から選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、態様５記載の方法。
【００４４】
７．アポリポタンパク質Ａ１が、配列番号０１、０２、３４および３５から選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、態様６記載の方法。
【００４５】
８．アミノ酸が、約５０ｇ/ｌの濃度を有することを特徴とする、上記態様１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【００４６】
９．アルカリ溶液が、約１２．５％（ｗ/ｖ）のアンモニア水溶液であることを特徴とする、上記態様１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【００４７】
１０．アミノ酸がロイシンであることを特徴とする、上記態様１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【００４８】
１１．アルカリ溶液がロイシンおよびプロリンを含むことを特徴とする、上記態様１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【００４９】
１２．アルカリ溶液が約１２．５％（ｗ/ｖ）のアンモニア溶液であり、そして各々約５０ｇ/ｌの濃度のアミノ酸のロイシンおよびプロリンを含むことを特徴とする、上記態様１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【００５０】
１３．細菌細胞の培養におけるフィードとしてのアミノ酸のアルカリ溶液の使用であって、アミノ酸は、アスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択され、そして培養は、２０ｇ/ｌ以上の乾燥細胞重量までであり、そしてアミノ酸はアルカリ溶液中において３０ｇ/ｌ以上の濃度を有し、そしてアルカリ溶液は１０％（ｗ/ｖ）以上のアンモニア溶液である、前記使用。
【００５１】
１４．細菌細胞がアミノ酸栄養要求性細胞であり、そして栄養要求性が、アスパラギン酸塩（aspartate）、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンから選択されたアミノ酸に対してであることを特徴とする、態様１３記載の使用。
【００５２】
１５．Escherichia coli細胞は、アミノ酸栄養要求性Escherichia coli細胞であることを特徴とする、態様２〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【００５３】
以下の実施例、配列表および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく示された手順に改変を行なうことができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】実施例３のパラメータープロット−別々のアミノ酸フィーディング
【図２】実施例３のパラメータープロット−別々のアミノ酸のフィーディング
【図３】実施例４のパラメータープロット−混合したアミノ酸のフィーディング
【図４】実施例４のパラメータープロット−混合したアミノ酸のフィーディング
【００５５】
材料および方法
培養液の吸光度を、ＤＲ２８００光度計（Hach-Lange, Dusseldorf, Germany）を用いて５７８nmで測定した。
【００５６】
タンパク質濃度を、ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル上で、標準タンパク質バンドの容積と、発酵試料内の産生されたタンパク質のバンド容積とを比較することによって濃度測定的に決定した。
【００５７】
実施例１
アンモニア溶液中のロイシンの溶解度の決定
計算された量のロイシンを、５００mlのフラスコに評量した。２５０mlの脱イオン水の添加後、溶液をオートクレーブにかけることにより滅菌する。その後、２５０mlの２５％（ｗ/ｖ）アンモニア溶液を加え、そしてロイシンが溶解したかしないかを決定する。ロイシンの溶解後、溶液の最終容量を決定した。それが５００mlよりも顕著に逸脱している場合には、溶液を、再度、減量した水を用いて調製した（表３参照）。
【００５８】
【表３】
2013537432.tif 000005
【００５９】
実施例２
E.coli発現プラスミドの作製および説明
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドを組換え手段によって調製した。Ｎ末端からＣ末端の方向の発現された融合ポリペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである：
−  アミノ酸メチオニン（Ｍ）、
−  CDLPQTHSL（配列番号３６）のアミノ酸配列を有するインターフェロン配列のフラグメント、
−  ＧＳリンカー、
−  HHHHHH（配列番号３７）のアミノ酸配列を有するヘキサヒスチジンタグ、
−  ＧＳリンカー、
−  VVAPPAP（配列番号３８）のアミノ酸配列を有するＩｇＡプロテアーゼ開裂部位、および
−  配列番号０２のアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ。
【００６０】
前記したようなテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドは、前駆体ポリペプチドであり、これからテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドが、ＩｇＡプロテアーゼを使用してin vitroにおいて酵素的開裂によって放出された。
【００６１】
前駆体ポリペプチドをコードする融合遺伝子は、適切な核酸セグメントの接続によって公知の組換え法および技術を用いて構築された。化学合成によって作製された核酸配列は、ＤＮＡシークエンスによって確認された。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの産生のための発現プラスミドを以下のように調製した。
【００６２】
E.coli発現プラスミドの作製
プラスミド４９８０（４９８０−ｐＢＲｏｒｉ−ＵＲＡ３−ＬＡＣＩ−ＳＡＣ）は、E.coliにおけるコアストレプトアビジンの発現のための発現プラスミドである。それは、プラスミド１９６６に由来する３１４２ｂｐ長のＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩベクターフラグメント（１９６６−ｐＢＲｏｒｉ−ＵＲＡ３−ＬＡＣＩ−Ｔ−リピート；EP-B 1 422 237に報告）を、４３５ｂｐ長のコアストレプトアビジンをコードするＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩフラグメントとライゲーションすることによって作製された。
【００６３】
コアストレプトアビジンE.coli発現プラスミドは、以下のエレメントを含む：
−  E.coliにおける複製のためのベクターｐＢＲ３２２に由来する複製起点（Sutcliffe, J.G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90に記載のｂｐ位置２５１７〜３１６０に対応）、
−  E.coli pyrF突然変異株の補完によるプラスミド選択を可能とする（ウラシル栄養要求性）、オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするSaccharomyces cerevisiaeのＵＲＡ３遺伝子（Rose, M., et al., Gene 29 (1984) 113-124）、
−  以下を含むコアストレプトアビジン発現カセット
−  Stueber, D., et al.（後記参照）に記載の合成リボソーム結合部位を含む、Ｔ５ハイブリッドプロモーター（Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433およびStueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152に記載のＴ５−ＰＮ２５／０３／０４ハイブリッドプロモーター）、
−  コアストレプトアビジン遺伝子、
−  バクテリオファージに由来する２つの転写終結因子であるλ−Ｔ０終結因子（Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414）およびｆｄ終結因子（Beck, E., and Zink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58）、
−  E.coli由来のｌａｃＩリプレッサー遺伝子（Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769）。
【００６４】
単一のフランキングしているＥｃｏＲＩおよびＣｅｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を使用してベクター４９８０からコアストレプトアビジン構造遺伝子を切り出し、そして、前駆体ポリペプチドをコードする核酸にフランキングするＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩ制限酵素部位を、３１４２ｂｐ長のＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩ−４９８０ベクターフラグメントに挿入することによって、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ前駆体ポリペプチドの発現のための最終発現プラスミドを調製した。
【００６５】
実施例３
別々の溶液としてのロイシンおよびプロリンのフィーディング
この参照実施例において、アミノ酸のＬ−ロイシンおよびＬ−プロリンの別々のフィーディングと組み合わせたRiesenberg, et al.(1991、前記)によって報告された高細胞密度培養法を用いての栄養要求性E.coli株の培養を実施した。
【００６６】
E.coli K12株ＣＳＰＺ−２（ｌｅｕＢ、ｐｒｏＣ、ｔｒｐＥ、ｔｈ−１、ΔｐｙｒＦ）を使用した。前記株を、治療タンパク質の産生のための発現プラスミドを用いて形質転換し、そして、既知組成のプレ培養培地上で約１の吸光度（５７８nmにおいて決定）となるまで増殖させた１mlの株および１mlのグリセロール８５％（ｖ/ｖ）を含むアンプル中において初代シードバンクとして維持し、そして−８０℃で保存した。
【００６７】
既知組成のプレ培養培地は、
１．０ｇ/ｌのＬ−ロイシン、
１．０ｇ/ｌのＬ−プロリン、および
１．０mg/lのチアミンＨＣｌ
の補充されたSambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載のＭ９培地であった。
【００６８】
発酵のためにRiesenberg, et al., (1991、前記）によるバッチ培地を使用した：
２７．６ｇ/ｌのグルコース、
１３．３ｇ/ｌのＫＨ２ＰＯ４、
４．０ｇ/ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、
１．７ｇ/ｌのクエン酸塩、
１．２ｇ/ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、
６０mg/ｌのクエン酸鉄（III）、
２．５mg/ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、
１５mg/ｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、
１．５mg/ｌのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、
３mg/ｌのＨ３ＢＯ３、
２．５mg/ｌのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、
８mg/ｌのＺｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・２Ｈ２Ｏ、
８．４mg/ｌのTitriplex III、および
１．３ml/ｌのSynperonic１０％消泡剤。
【００６９】
バッチ培地に、
５．４mg/ｌのチアミンＨＣｌ、並びに
１．２ｇ/ｌのｌ−ロイシンおよびｌ−プロリンをそれぞれ補充した。
【００７０】
フィード１溶液は、
７００ｇ/ｌのグルコース、および
１９．７ｇ/ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含んでいた。
【００７１】
フィード２溶液は、２０ｇ/ｌのｌ−ロイシンを含んでいた。
【００７２】
フィード３溶液は、１００ｇ/ｌのｌ−プロリンを含んでいた。
【００７３】
アミノ酸を評量し、アミノ酸を水中に溶解し、そして前記溶液をオートクレーブにかけることによってフィード２および３を調製した。その後、溶液のｐＨ値が、フィード２については約６．１５、フィード３については約６．４３であると決定された。
【００７４】
ｐＨ調節のために使用されたアルカリ溶液は１２．５％（ｗ/ｖ）ＮＨ３水溶液であった。
【００７５】
全成分を脱イオン水に溶解した。
【００７６】
プレ培養のために、３個の整流装置のついた１０００mlのエーレンマイヤーフラスコ中の３００mlのＭ９培地に、２mlの初代シードバンクアンプルを接種した。１〜３の吸光度（５７８nmにおいて決定）に到達するまで、培養を回転振とう器で１３時間かけて３７℃で実施した。
【００７７】
主な発酵を、１０リットルのBiostat C DCU3発酵槽（Sartorius, Melsungen, Germany）で実施した。６．４リットルの無菌バッチ培地と３００mlのプレ培養液で開始して、バッチ発酵を、３７℃、ｐＨ６．９±０．２、５００mbarおよび通気速度１０リットル/分で実施した。最初に補充したグルコースが枯渇した後、温度を２８℃にシフトさせ、そして発酵は、溶存酸素（ｐＯ２）を５０％に維持し（DO-stat、例えばShay, L.K., et al., (1987、下記)参照）、一定して増加している撹拌速度（１０時間で５５０rpmから１０００rpmに、１６時間で１０００rpmから１４００rpmに）および通気速度（１０時間で１０リットル/分から１６リットル/分に、５時間で１６リットル/分から２０リットル/分に）と組み合わせてフィード１を添加することによって流加培養モードに入った。ｐＨが下限の調節限界、すなわちｐＨ６．７０に到達した時に、追加のアミノ酸を用いての供給を、フィード２（１４時間の間は３３．８ml/ｈで開始し、その後、９７．６ml/ｈまで増加）およびフィード３（１４時間の間は６．８ml/ｈで開始し、その後、１９．５ml/ｈまで増加）の追加により開始した。流速を別々の発酵実行から計算し（実施例４参照）、これにより、フィーディング戦略に関係なく正確に同じ量のアミノ酸を培養液にそれぞれ適用した。組換え治療タンパク質の発現は、７０の吸光度において１mMのＩＰＴＧの添加によって誘導された。
【００７８】
この発酵のパラメータープロットを図１および２に示す。
【００７９】
接種、そしてその後の短い誘導期の後、細胞は、μmax＝０．３０リットル/ｈの最大比増殖速度で増殖していた。８時間の培養後に下限のｐＨ調節限界に到達し、そしてｐＨを、６．７０において、１２．５％ＮＨ４ＯＨ溶液の添加により制御した。同時にアミノ酸フィーディングをフィード２およびフィード３の添加によって開始した。１６時間後、グルコースを使い尽くし、これはｐＯ２値の急勾配の増加によって示された。この時、培養温度は３７℃から２８℃にシフトしていた。さらに１５分後、ｐＯ２−フィード制御を開始し、そしてｐＯ２を、５０％においてフィード１の添加によって、撹拌速度および通気速度をそのそれぞれの最大値である１４００rpmおよび２０リットル/分まで連続的に増加させながら制御した。増殖速度は、０．１５リットル/ｈから約０．０５リットル/ｈまで連続的に減少していた。同時に撹拌速度は、３６時間の培養後に段階的に減少させた。吸光度のさらなる増加を決定することができなければ、発酵を終了し、そして細菌細胞を収集前に一晩かけて４℃まで冷却した。
【００８０】
発酵終了時に全バイオマス収率は、４９．４ｇ/ｌ（乾物）であった。発酵中にアセテートはほぼ全く排出されなかったが、終了にむけて濃度は急勾配に７ｇ/ｌまで増加した。組換えタンパク質の形成は９．９６ｇ/ｌであった。培養ブロスの容量は発酵容器の通常の作業容量を超え、そして１１．８リットルまで増加した。
【００８１】
発酵を繰り返し、そして最終吸光度１３０、最終バイオマス収率５０．６ｇ/ｌ、および組換えタンパク質収率９．０ｇ/ｌが得られ、発酵終了時の培養ブロス容量は１２．２リットルであった。
【００８２】
実施例４
ｐＨ調節のためのアルカリ溶液に取り込まれたロイシンおよびプロリンのフィーディング
この発酵においては、アミノ酸フィーディングを、アルカリ性ｐＨ制御溶液に取り込んだ。この発酵の基本は、実施例３に使用したRiesenberg, et al., (1991、上記)によるのと同じ高細胞密度培養法である。アミノ酸のＬ−ロイシンおよびＬ−プロリンを１２．５％ＮＨ３水溶液に取り込み、ｐＨ制御中にアルカリの添加と共に与えた。
【００８３】
E.coli K12株ＣＳＰＺ−２（ｌｅｕＢ、ｐｒｏＣ、ｔｒｐＥ、ｔｈ−１、ΔｐｙｒＦ）を使用した。前記株を、治療タンパク質の産生のための発現プラスミドを用いて形質転換し、そして、既知組成のプレ培養培地上で約１の吸光度（５７８nmにおいて決定）となるまで増殖させた１mlの株および１mlのグリセロール８５％（ｖ/ｖ）を含むアンプル中において初代シードバンクとして維持し、そして−８０℃で保存した。
【００８４】
既知組成のプレ培養培地は、
１．０ｇ/ｌのＬ−ロイシン、
１．０ｇ/ｌのＬ−プロリン、および
１．０mg/lのチアミンＨＣｌ
の補充されたSambrook, J., et al., （Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)）によるＭ９培地であった。
【００８５】
発酵のためにRiesenberg, et al., (1991、前記）によるバッチ培地を使用した：
２７．６ｇ/ｌのグルコース、
１３．３ｇ/ｌのＫＨ２ＰＯ４、
４．０ｇ/ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、
１．７ｇ/ｌのクエン酸塩、
１．２ｇ/ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、
６０mg/ｌのクエン酸鉄（III）、
２．５mg/ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、
１５mg/ｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、
１．５mg/ｌのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、
３mg/ｌのＨ３ＢＯ３、
２．５mg/ｌのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、
８mg/ｌのＺｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・２Ｈ２Ｏ、
８．４mg/ｌのTitriplex III、および
１．３ml/ｌのSynperonic１０％消泡剤。
【００８６】
バッチ培地に、
５．４mg/ｌのチアミンＨＣｌ、並びに
１．２ｇ/ｌのｌ−ロイシンおよびｌ−プロリンをそれぞれ補充した。
【００８７】
フィード１溶液は、
７００ｇ/ｌのグルコース、および
１９．７ｇ/ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含んでいた。
【００８８】
ｐＨ調節のために使用したアルカリ溶液は、５０ｇ/ｌのＬ−ロイシンおよび５０ｇ/ｌのＬ−プロリンのそれぞれ補充された１２．５％（ｗ/ｖ）ＮＨ３水溶液であった。
【００８９】
全成分を脱イオン水に溶解した。
【００９０】
主な発酵を、１０リットルのBiostat C DCU3発酵槽（Sartorius, Melsungen, Germany）で実施した。６．４リットルの無菌バッチ培地と３００mlのプレ培養液で開始して、バッチ発酵を、３７℃、ｐＨ６．９±０．２、５００mbarおよび通気速度１０リットル/分で実施した。最初に補充したグルコースが枯渇した後、温度を２８℃にシフトさせ、そして発酵は、溶存酸素（ｐＯ２）を５０％に維持し（DO-stat、例えばShay, L.K., et al., (Shay, L.K., et al., J. Indus. Microbiol. 2 (1987) 79-85）参照）、一定して増加している撹拌速度（１０時間で５５０rpmから１０００rpmに、１６時間で１０００rpmから１４００rpmに）および通気速度（１０時間で１０リットル/分から１６リットル/分に、５時間で１６リットル/分から２０リットル/分に）と組み合わせてフィード１を添加することによって流加培養モードに入った。ｐＨがｐＨ６．７０の下限の調節限界に到達した時に、追加のアミノ酸を用いての供給はアルカリの追加から行なわれた。アルカリ追加の時間経過から、実施例２のフィード２および３に対する流速を計算し、これにより、フィーディング戦略に関係なく正確に同じ量のアミノ酸を培養液にそれぞれ適用した。組換え治療タンパク質の発現は、７０の吸光度において１mMのＩＰＴＧの添加によって誘導された。
【００９１】
典型的には、この発酵のパラメータープロットを図３および４に示す。
【００９２】
接種、そしてその後の短い誘導期の後、細胞は、μmax＝０．３０リットル/ｈの最大比増殖速度で増殖していた。８時間の培養後に下限のｐＨ調節限界に到達し、そしてｐＨを、ｐＨ６．７０において、５０ｇ/ｌのＬ−ロイシンおよび５０ｇ/ｌのＬ−プロリンのそれぞれ補充された１２．５％ＮＨ３水溶液の添加により制御した。これにより同時にアミノ酸フィーディングを開始する。１６時間後、与えられたグルコースを使い尽くした。この時、培養温度は３７℃から２８℃にシフトしていた。さらに１５分後、ｐＯ２−フィード制御を開始し、そしてｐＯ２を、５０％においてフィード１の添加によって、撹拌速度および通気速度をそのそれぞれの最大値である１４００rpmおよび２０リットル/分まで連続的に増加させながら制御した。増殖速度は、０．１５リットル/ｈから約０．０５リットル/ｈまで連続的に減少していた。吸光度のさらなる増加が認識されなければ、発酵を終了し、そして細菌細胞を収集前に一晩かけて４℃まで冷却した。
【００９３】
発酵終了時の吸光度は１６９であり、そして全バイオマス収率は７５．７ｇ/ｌ（乾物）であった。発酵中にアセテートはほぼ全く排出されず、終了にむけて濃度は１ｇ/ｌまで増加した。組換えタンパク質の形成は１６．５ｇ/ｌであった。培養ブロスの容量は１０．２リットルであった。
【００９４】
発酵を、アルカリ溶液に溶解した種々の量のアミノ酸（３３ｇ/ｌのＬ−ロイシンおよびＬ−プロリン）を用いて繰り返した。供給されたアミノ酸の量はより少なく、そして吸光度１４５、最終バイオマス収率５６．５ｇ/ｌ、および組換えタンパク質収率１３．５ｇ/ｌが得られ、発酵終了時における培養ブロス容量は９．３リットルであった。
【図１】
2013537432.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2013537432000001.app
【国際調査報告】
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2013537432.tif 000011
2013537432.tif 000012
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