(57)【要約】本発明は膿毒症及び自己免疫疾患を予防と治療する薬物を製造するためのクコアミンＡ及びクコアミンＢの用途に用いられることを提供する。本発明は膿毒症及び自己免疫疾患を誘発する主な病原体分子の細菌内毒素（LPS）及び非メチル化CpGを含むDNA（CpG DNA）をターゲットとし、生薬から指向的に薬物先導化合物を分離し、従来の生薬における成分及び抽出物に物質基礎及び作用ターゲットが不明との主な欠陥を克服し、安全と、有効と、品質をコントロールできることとの新規薬物を開発することより、膿毒症及び自己免疫疾患を有効的に治療する薬物が欠乏している現状を解決する。【選択図】図９
2013525382.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膿毒症及び自己免疫疾患を予防と治療する薬物を製造するためのクコアミンＡ及びクコアミンＢの用途。
【請求項２】
前記クコアミンＡ及びクコアミンＢが生薬の地骨皮から抽出されることを特徴とする請求項1に記載の用途。
【請求項３】
前記地骨皮はナス科の植物における枸杞または寧夏枸杞の乾燥根皮であることを特徴とする請求項2に記載の用途。
【請求項４】
前記薬物が膿毒症及び自己免疫疾患を予防と治療する薬物を製造することに用いられることを特徴とする請求項1に記載の用途。
【請求項５】
前記薬物が、膿毒症及び自己免疫疾患を引き起こす肝心な要素である細菌内毒素（LPS）及び非メチル化CpGを含むDNA（CpG DNA）を拮抗することに用いられることを特徴とする請求項1に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は膿毒症及び自己免疫疾患を予防と治療する薬物を製造するためのクコアミンＡ及びクコアミンＢの用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
膿毒症及び自己免疫疾患は人体自身が過度免疫反応することで誘発される二種類疾病である。現在、信頼される有効的な薬物療法がまだ無い。膿毒症は全身性炎症反応症候群の一種類であり、その致死率は30〜70％に達し、臨床重症患者の生命を厳重に脅かしている。概算統計によると、中国で膿毒症患者が毎年300万人のを超えており、これによる死亡者数は少なくとも50万人以上にのぼる。自己免疫疾患は慢性炎症性疾患の一種類であり、疫学データは、該疾患は発病率が中国で約3.2％〜5.3％であり、65歳以下女性の主な死亡原因の一つであることを示している。従って、膿毒症及び自己免疫疾患を目安にして予防と治療することは臨床で関心を持つ焦点及び注目点とする課題である。
【０００３】
現在、膿毒症及び自己免疫疾患を治療することはまだなかなか厄介で、臨床に主な方法は経験より、非特異的抗炎症薬物とする糖質コルチコイドなどを使用している。しかしながら、上記の薬物は、患者の生存率を上げること又は生存品質を改善できることとの効果を確定できない限りでなく、かえって酷い不良反応を起こす。従来の数十年間に、膿毒症及び自己免疫疾患を対する薬物の予防性と治療性に関する研究は免疫反応における鍵分子を抑制することと、血液凝固及び補体など（機体臓器の障害を導く直接原因）の混乱を是正することとを主な指導方向とする。かかる研究結果は、それらの方法より治療効果を達成することが困難（体内の免疫反応は非常に複雑なネットシステムであり、コントロールしにくい）限りでなく、かえって免疫システムの混乱が重くなるかもしれない、病気をさらに悪化すること導くことを示している。そのため、今までかかる研究でなにか大幅な進展がない、臨床で有効性及び信頼性を有する新規薬物がまだない。膿毒症及び自己免疫疾患の発病メカニズムと発動を本質的に理解する必要があり、且、これを突破点として対象を目指す治療作用を有する薬物を見つけることを上記の事実で表明する。
【０００４】
近年以来、膿毒症及び自己免疫疾患の発病メカニズムについての研究は重要な進展を得た。患者の内分泌と、遺伝と、環境要素との影響のほかに、細菌から放出される内毒素（LPS）及び非メチル化CpGを含むDNA（CpG DNA）は膿毒症及び自己免疫疾患を誘導する主な発動要素である。LPS及びCpG DNAが単独的に又は共同的に膿毒症を誘発でき、また、類リューマチ性関節炎の症状を直接に誘発又は悪化させることが多数の実験より証明された。急性感染にて、病原体が急速に侵入することより、大量なLPS及びCpG DNAを発生し、短い時間でTNF-aと、IL-1βと、IL-6などの多類の炎症性メディエーターの発現と放出を誘発し、初期器官機能衰弱及び末期免疫麻痺を引き起こし、さらに、膿毒症患者の死亡に導く。自己免疫疾患に対して、LPS及びCpG DNAが持続的に存在するのは炎症が持続と慢性進展することを導き、炎症メカニズムと、免疫グロブリンと、リウマトイド因子とが多量に発生することを誘発し、形成される免疫複合体が滑膜組織に沈積するとともに、補体を活性化させ、アナフィラトキシンが発生することによって、炎性病理損傷に導き、最後に人体の臓器に損害を与えてしまった。これより分かるのは、LPS及びCpG DNAを有効的に拮抗したら、膿毒症及び自己免疫疾患を根元的に予防及び治療する効力を発揮できる。LPS及びCpG DNAが免疫細胞に対する刺激作用を遮断し、TNF-a等の炎症性メディエーターの放出を抑制することにより、膿毒症及び自己免疫疾患に対して著しい治療効果が奏する、ことが係る薬物研究で証明された。従って、LPS及びCpG DNAを拮抗する活性は膿毒症及び自己免疫疾患を予防と治療する作用をよく反映できる。
【０００５】
長年以来、熱邪や熱毒を解除する伝統的な薬草は膿毒症及び自己免疫疾患などの免疫系機能障害を治療することに用いられ、比較的によい治療効果がある。薬草に含有される成分はLPS及びCpG DNA等の病原体分子を結合及び拮抗でき、且、これも免疫障害を是正する、膿毒症及び自己免疫疾患を予防と治療する効果を発揮する重要な物質基礎であることが現代薬理研究で表明された。大承氣湯と、熱毒清と、熱毒平と等の製剤は膿毒症患者の循環血液における内毒素と、TNF-αと、IL-1と、IL-6とのレベルを低減でき、金銀花と、連翹と、黄ゴンと、青蒿と等の20数種類の単味剤は体外でLPSなどの病原体分子に対して良好な拮抗活性を有する。白朮湯はリューマチ性関節炎の患者の血清における上昇されたLPS及びTNF-αを明らかに低減でき、血清のIgGと、IgAと、IgMとのレベルを抑制でき、RFの陽性率を下げることより、類リューマチ性関節炎を治療する効果を奏する。白花蛇舌草と、半枝蓮と、紫草と、丹参と、益母草と等の7類の清熱生薬からなれる狼瘡処方はLPSから刺激によって引き起こされるT細胞とB細胞との活性化を抑制でき、IL-6とIL-10と自体抗体とを発生することを減少でき、さらに全身性紅斑性狼瘡対する治療効果を発揮する。しかしながら、薬草における成分は非常に複雑ため、安全性が不明であり、それが臨床治療に応用されることがひどく制限されている。そのため、LPS及びCpG DNAを拮抗できる生薬単体を分離することは、膿毒症及び自己免疫疾患を予防と治療するレベルを上げることに対して重要な意義がある。
【０００６】
地骨皮はナス科の植物における枸杞（Lycium chinense Mill.）または寧夏枸杞（Lycium chinense Mill.）の乾燥根皮である。伝統中医薬理論よって、地骨皮が熱邪や熱毒を解除する効果を有する。地骨皮にて、アルカロイド類と、有機酸類と、アントラキノン類と、ペプチド類と成分を主に含有し、血圧を下げることと、血糖を下げることと、熱を下げと、痛みを抑えるとの効果を発揮する。しかしながら、地骨皮が直接にLPS及びCpG DNAを拮抗すること、及び、それが膿毒症及び自己免疫疾患を治療する活性研究と応用情況に関するのは国内とも国外ともの文献にて開示されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明では、従来の生薬における成分及び抽出物に物質基礎及び作用メカニズムが不明との主な欠陥を克服し、安全と、有効と、品質をコントロールできることとの膿毒症及び自己免疫疾患を有効的に治療する新規薬物を開発することより、現在に、臨床で応用できる有効的な薬物を欠乏するとの課題を解決する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の課題を解決する手段は下記である。
膿毒症及び自己免疫疾患を予防と治療する薬物を製造するためのクコアミンＡ及びクコアミンＢの用途。
前記クコアミンＡ及びクコアミンＢが生薬の地骨皮から抽出されるものである。
前記薬物が膿毒症及び自己免疫疾患を予防と治療する薬物を製造することに用いられる。
前記薬物が、膿毒症及び自己免疫疾患を引き起こす肝心な要素である細菌内毒素LPS及び細菌CpG DNAを拮抗することに用いられる。
前記地骨皮はナス科の植物における枸杞（Lycium chinense Mill.）または寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）の乾燥根皮である。
【発明の効果】
【０００９】
出願人は長年以来、LPS及びCpG DNAをターゲットとし、病原体分子を拮抗する薬物研究を行った。バイオセンサーの追跡と選別とのプラットフォームを構築することにより、熱邪や熱毒を解除する生薬からLPS及びCpG DNAを結合と拮抗する作用を有する活性単体を選別と指向分離する。
【００１０】
本発明は生薬の地骨皮を原料とし、lipid A及びCpG DNAをターゲットとして薬物を選別と指向分離するプラットフォームを構築する。生薬抽出物がlipid A及びCpG DNAを結合する活性を選別指標と指向分離との根拠とし、水煮、マクロ多孔性吸着樹脂、陽イオン交換、逆相高速液体クロマトグラフィ等の方法で抽出と分離と純化させ、且、体外LPS中和実験と、LPS及びCpG DNAが細胞と結合させる抑制実験と、LPS及びCpG DNAを刺激することより引き起こされる炎症反応を抑制する実験と、膿毒症モデル動物を保護する実験などのインビトロおよびインビボの薬理実験評判方法で、LPS及びCpG DNAを拮抗する有効な作用を有する二種類とするクコアミンＡ（Kukoamine A, KA）及びクコアミンＢ（Kukoamine B, KB）を最終に選別した。
本発明は活性を有効的に追跡する方法で支持され、薬草から分離されたLPS及びCpG DNAを拮抗する活性物質、その作用メカニズムを明確させ、膿毒症及び自己免疫疾患を予防と治療するための、安全と、有効と、信頼されることとの新規薬物を提供する。
【００１１】
上記クコアミンＡ及びクコアミンＢは地骨皮から抽出と分離することより得られたスペルミン類アルカロイドである。両方は異性体であり、その分子式はC28H42N4O6であり、化学構造は下記である：
2013525382.tif 000003
クコアミンＡ
2013525382.tif 000004
クコアミンＢ
【００１２】
本発明のクコアミンＡ及びクコアミンＢは膿毒症及び自己免疫疾患を有効に治療する薬物になる製薬前景を有する。具体的に、出願人よりインビトロ実験で、クコアミンＡ及びクコアミンＢがLPS及びCpG DNAとの高親和活性を有し、LPS及びCpG DNAを顕著に中和でき、両者とRAW264.7細胞（マウスマクロファージ細胞株）との結合を遮断し、さらに、LPS及びCpG DNAがRAW264.7細胞の発現を誘導すること及び炎症性メディエーター（TNF-αとIL-6等）を放出することを抑制し、細胞の炎症性活性化を根元的に遮断し、免疫反応の混乱を避ける。インビボ実験により、出願人は、クコアミンＡ及びクコアミンＢが加熱殺大腸菌（LPS及びCpG DNAの体内注射を模擬する）をマウスの体内に注射するLPSとTNF-αとのレベルを低減し、マウスの生存率を高め、LPS及びCpG DNAを拮抗することを発揮することも発現する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１はlipid AとCpG DNAとの固定反応曲線、及び6類の生薬の水煎液がlipid AとCpG DNAとを結合する反応曲線である。
【図２】図２はCL-1〜5成分の分離と、それがlipid AとCpG DNAとを結合する作用である。
【図３】図３はCL-4a〜c成分の分離と、それがlipid AとCpG DNAとを結合する作用である。
【図４】図４はCL-4b成分が体外でLPSを中和する作用である。
【図５】図５はCL-4bの成分がLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制する作用である。
【図６】図６はCL-4bの成分が致死量の加熱殺大腸菌（EC）がマウスを攻撃することを保護する作用である。
【図７】図７はCL-4bの成分を分離と分析する高速液体クロマトグラムである。
【図８】図８はKAとKBが体外でlipid AとCpG DNAを結合する作用である。
【図９】図９はKAとKBが体外でLPSを中和する作用である。
【図１０】図１０はKAとKBが蛍光標識したLPSとCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞を結合することを抑制する作用である。
【図１１】図１１はKAとKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞がTNF-αを放出する誘導を抑制する作用である。
【図１２】図１２はKAとKBがRAW264.7細胞の生存率に影響することである。
【図１３】図１３はKAとKBが加熱殺大腸菌（E.coil.）ATCC 35218がマウスの血液にけるLPSとTNF-αとのレベルを攻撃することに影響することである。
【図１４】図１４はKBとPMBがLPSとCpG DNAを結合する作用である。
【図１５】図１５はKBとPMBがLPSを中和する作用である。
【図１６】図１６はKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6とを放出することを誘導することを抑制する作用である。
【図１７】図１７はKBとPMBとがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6とを放出することを誘導することを抑制する作用である。
【図１８】図１８はKBとPMBとがLPSとCpG DNA（CpG）とがマウス腹腔マクロファージ細胞がTNF-αとIL-6とを放出することを誘導することを抑制する作用である。
【図１９】図１９はKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞のTNF-αと、IL-6と、iNOSと、COX-2 とのmRNA発現を刺激することに影響することである。
【図２０】図２０はKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがマウス腹腔マクロファージ細胞のTNF-αと、IL-6とのmRNA発現を刺激することに影響することである。
【図２１】図２１はKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制する用量−効果と時間−効果との作用を観察することである。
【図２２】図２２は異なる加入試料方法でKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制するに対する影響である。
【図２３】図２３はKBが複数の病原体分子（LPS、CpG DNA、Pam3CSK4、Poly I:C、TNF-α及びIL-1β）がRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6とを放出することを刺激することを抑制する作用である。
【図２４】図２４はフローサイトメトリーでKBがLPSとCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞を結合することを影響することを測定することである。
【図２５】図２５は共焦点レーザー顕微鏡でKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞に結合と内在化に影響することを観察することである。
【図２６】図２６はKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがTLR4とTLR9との発現の向上を誘導することを抑制する作用である。
【図２７】図２７はKBがLPSと、CpG DNA（CpG）と、TNF-αと、IL-1βとがRAW264.7細胞シグナリング分子IκB-αとp38とのリン酸化レベルを刺激することを抑制する作用である。
【図２８】図２８はKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞NF-κBを活性化することを抑制する作用である。
【図２９】図２９はKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞TLR4と、TLR9と、MyD88との発現の向上することと、NF-κBを活性化することとを刺激することを抑制する作用である。
【図３０】図３０はKBがLPS又はCpG DNA（CpG）を結合して、マウス腹腔マクロファージ細胞の生存率に対する影響である。
【図３１】図３１はKBが致死量の加熱殺大腸菌（EC）がマウスを攻撃することを保護する作用（用量−効果関係）を観察することである。
【図３２】図３２はKBが亜致死量の加熱殺大腸菌（EC）がマウスを攻撃することを治療する作用である。
【図３３】図３３はKBが致死量の加熱殺大腸菌（EC）がマウスを攻撃することを保護する作用（時間−効果関係）を観察することである。
【図３４】図３４はKBが主要臓器の病理形態に影響することである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
図1はlipid AとCpG DNAとの固定反応曲線、及び6類の生薬の水煎液がlipid AとCpG DNAとを結合する反応曲線である。その中に、図1aはlipid Aの固定反応曲線であり、図1bはCpG DNAの固定反応曲線であり、図1cは地骨皮などの6類の生薬とlipid Aを結合する作用であり、図1dは地骨皮などの6類の生薬とCpG DNAを結合する作用である。図1cと図1dにおける数値それぞれ、下記を表す：1.地骨皮、2.牡丹皮、3.山茱萸、4.大黄、5.黄ゴン、6.肉桂。
図2はCL-1〜5成分の分離と、それがlipid AとCpG DNAとを結合する作用である。その中に、図2aはCL-1〜5成分の分離のクロマトグラムであり、図2 bはCL-1〜5成分がlipid Aを結合する作用であり、図2cはCL-1〜5成分がCpG DNAを結合する作用である。
図3はCL-4a〜c成分の分離と、それがlipid AとCpG DNAとを結合する作用である。その中に、図3aはCL-4a〜c成分の分離のクロマトグラムであり、図3bはCL-4の各成分がlipid Aを結合する作用であり、図3cはCL-4各成分がCpG DNAを結合する作用である。
図4はCL-4b成分が体外でLPSを中和する作用であり、図中の**：p<0.01 vs LPS。
図5はCL-4bの成分がLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制する作用である。その中に、図5aはCL-4b成分がLPSがRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6を放出することを誘導することを抑制する作用であり、図5bはCL-4b成分がCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6を放出することを誘導することを抑制する作用であり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs LPS 又は CpG DNA（CpG）。
【００１５】
図6はCL-4bの成分が致死量の加熱殺大腸菌（EC）がマウスを攻撃することを保護する作用であり、図中の*：p<0.05 vs E.coli.（EC）。
図7はCL-4bの成分を分離と分析する高速液体クロマトグラムである。その中に、図7aはCL-4b1成分の高速液体クロマトグラムであり、図7bはCL-4b2成分の高速液体クロマトグラムである。
図8はKAとKBが体外でlipid AとCpG DNAを結合する作用である。その中に、図8aはKAとKBがlipid Aとの親和力を測定することであり、図8 bはKAとKBがCpG DNAとの親和力を測定することである。
図9はKAとKBが体外でLPSを中和する作用であり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs LPS。
図10はKAとKBが蛍光標識したLPSとCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞を結合することを抑制する作用である。その中に、図10aはKAとKBが蛍光標識したLPSがRAW264.7細胞を結合する作用に影響することであり、図10bはKAとKBが蛍光標識したCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞を結合する作用に影響することでり、図中の**：p<0.01 vs FITC-LPS 又は5-FAM-CpG DNA。
【００１６】
図11はKAとKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞がTNF-αを放出する誘導を抑制する作用である。その中に、図11aはKAとKBがLPSがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することに影響することであり、図10bはKAとKBがCpG DNAがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することに影響することであり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs LPS 又はCpG DNA。
図12はKAとKBがRAW264.7細胞の生存率に影響することである。
図13はKAとKBが加熱殺大腸菌（E.coil.）ATCC 35218がマウスの血液中のLPSとTNF-αとのレベルを攻撃することに影響することである。その中に、図13aはKAとKBが加熱殺E.coil.がマウスの血液中のLPSのレベルを攻撃することに影響することであり、図13bはKAとKBが加熱殺E.coil.がマウスの血液中のTNF-αのレベルを攻撃することに影響することであり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs E.coli.。
図14はKBとPMBがLPSとCpG DNAを結合する作用である。その中に、図14aはKBとPMBがLPSとの親和力を測定することであり、図14bはKBとPMBがCpG DNAとの親和力を測定することである。
図15はKBとPMBがLPSを中和する作用である。
【００１７】
図16はKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6とを放出することを誘導することを抑制する作用である。その中に、図16aはKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを刺激することを抑制する作用であり、図16bはKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がIL-6を放出することを刺激することを抑制する作用であり、図中の*：p<0.01 vs LPS；##：p<0.01 vs CpG DNA。
図17はKBとPMBとがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6とを放出することを誘導することを抑制する作用である。その中に、図17aはKBとPMBとがLPSがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを刺激することを抑制する作用であり、図17bはKBとPMBとがCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを刺激することを抑制する作用であり、図17cはKBとPMBとがLPSがRAW264.7細胞がIL-6を放出することを刺激することを抑制する作用であり、図17dはKBとPMBとがCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞がIL-6を放出することを刺激することを抑制する作用であり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs LPS 又は CpG DNA。
図18はKBとPMBとがLPSとCpG DNA（CpG）とがマウス腹腔マクロファージ細胞がTNF-αとIL-6とを放出することを誘導することを抑制する作用である。その中に、図18aはKBとPMBとがLPSがマウス腹腔マクロファージ細胞がTNF-αを放出することを刺激することを抑制する作用であり、図18bはKBとPMBとがCpG DNA（CpG）がマウス腹腔マクロファージ細胞がTNF-αを放出することを刺激することを抑制する作用であり、図18cはKBとPMBとがLPSがマウス腹腔マクロファージ細胞がIL-6を放出することを刺激することを抑制する作用であり、図18dはKBとPMBとがCpG DNA（CpG）がマウス腹腔マクロファージ細胞がIL-6を放出することを刺激することを抑制する作用であり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs LPS 又は CpG DNA。
【００１８】
図19はKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞のTNF-αと、IL-6と、iNOSと、COX-2 とのmRNA発現を刺激することに影響することである。その中に、図19aはKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞のTNF-αのmRNA発現を刺激することを抑制する作用であり、図19bはKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞のIL-6のmRNA発現を刺激することを抑制する作用であり、図19cはKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞のiNOSのmRNA発現を刺激することを抑制する作用であり、図19dはKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞のCOX-2のmRNA発現を刺激することを抑制する作用であり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs LPS 又は CpG DNA。
図20はKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがマウス腹腔マクロファージ細胞のTNF-αと、IL-6とのmRNA発現を刺激することに影響することである。その中に、図20aはKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがマウス腹腔マクロファージ細胞のTNF-αのmRNA発現を刺激することを抑制する作用であり、図20bはKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがマウス腹腔マクロファージ細胞のIL-6のmRNA発現を刺激することを抑制する作用であり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs LPS 又は CpG DNA。
図21はKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制する用量−効果と時間−効果との作用を観察することである。その中に、図21aはKBがLPSとCpG DNA（CpG）とに対して拮抗作用の用量−効果関係を観察することであり、図21bはKBがLPSがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制する時間−効果作用を観察することであり、図21cはKBがCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制する時間−効果作用を観察することであり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs LPS 又は CpG DNA。
【００１９】
図22は異なる加入試料方法でKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制するに対する影響である。その中に、図22aはKBがLPS又はCpG DNA（CpG）とプレインキュベーションされた加入試料がLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制する作用であり、図22bはKBが異なる時点で加入試料されることがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを刺激することを抑制することであり、図22cはKBが血清なし条件でLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを刺激することを抑制することであり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs LPS 又は CpG DNA。
図23はKBが複数の病原体分子（LPS、CpG DNA、Pam3CSK4、Poly I:C、TNF-α及びIL-1β）がRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6とを放出することを刺激することを抑制する作用である。その中に、図23aはKBが複数の病原体分子がRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制する効果であり、図23bはKBが複数の病原体分子がRAW264.7細胞がIL-6を放出することを誘導することを抑制する効果である。
図24はフローサイトメトリーでKBがLPSとCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞を結合することを影響することを測定することである。その中に、図24aはKBがRAW264.7細胞表面のLPS平均蛍光強度を影響することであり、図24bはKBがRAW264.7細胞表面のCpG DNA（CpG）平均蛍光強度を影響することであり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs FITC-LPS 又は 5-FAM-CpG DNA。
図25は共焦点レーザー顕微鏡でKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞に結合と内在化に影響することを観察することである。その中に、図25aはKBがLPSがRAW264.7細胞に結合と内在化に影響することであり、図25bはKBがRAW264.7細胞表面の5-FAM-CpG DNAの平均蛍光強度に影響することであり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs FITC-LPS 又は5-FAM-CpG DNA。
【００２０】
図26はKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがTLR4とTLR9との発現の向上を誘導することを抑制する作用である。その中に、図26aはKBがLPS又はCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞TLR4のmRNA発現を高めることを抑制することであり、図26bはKBがLPS又はCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞TLR9のmRNA発現を高めることを抑制することであり、図中の**：p<0.01 vs LPS 又は CpG DNA。
図27はKBがLPSと、CpG DNA（CpG）と、TNF-αと、IL-1βとがRAW264.7細胞シグナリング分子IκB-αとp38とのリン酸化レベルを刺激することを抑制する作用である。その中に、図27aはLPS、CpG DNA（CpG）、TNF-α又はIL-1βが異なる時間（15、30、45、60 min）でRAW264.7細胞を刺激した後のIκB-αの分解であり、図27bはKBがLPSと、CpG DNA（CpG）と、TNF-αと、IL-1βとがRAW264.7細胞シグナリング分子p38のリン酸化レベルを高めるすること、IκB-αの分解及びリン酸化とを抑制する作用である。
図28はKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞NF-κBを活性化することを抑制する作用である。その中に、図28aはKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞核の中にNF-κB p50サブユニットを高めることを抑制する作用であり、図28bはKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞核の中にNF-κB p65サブユニットを高めることを抑制する作用であり、図28cはルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイでKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞NF-κBを活性化することを抑制する作用を測定することであり、図中の**：p<0.01 vs LPS 又は CpG DNA。
【００２１】
図29はKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞TLR4と、TLR9と、MyD88との発現の向上することと、NF-κBを活性化することとを刺激することを抑制する作用である。その中に、図29aはKBがLPS及びCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞TLR4とTLR9とのmRNA発現を高めることを抑制する作用であり、図29bはKBがLPS及びCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞MyD88のmRNA発現を高めることを抑制する作用であり、図29cはKBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞NF-κBを活性化することを刺激と引き起こすことを抑制する作用である。
図30はKBがLPS又はCpG DNA（CpG）を結合して、マウス腹腔マクロファージ細胞の生存率に対する影響である。その中に、図30aはKBがRAW264.7細胞の生存率に対する影響であり、図30bはKBがLPS又はCpG DNA（CpG）を結合して、RAW264.7細胞の生存率に対する影響であり、図30cはKBがマウス腹腔マクロファージ細胞の生存率に対する影響であり、図30dはKBがLPS又はCpG DNA（CpG）を結合して、マウス腹腔マクロファージ細胞の生存率に対する影響である。
図31はKBが致死量の加熱殺大腸菌（EC）がマウスを攻撃することを保護する作用（用量−効果関係）を観察することである。その中に、図31aはKB（30 mg/kg）の単回投与で致命的な用量の加熱殺大腸菌（EC）がマウスを攻撃することを保護する作用であり、図31bはKB（1.25、2.5、5 mg/kg）の単回投与で致命的な用量の加熱殺大腸菌（EC）がマウスを攻撃することを保護する作用であり、図31cはKB（1.25、2.5、5 mg/kg）の反復投与で致命的な用量の加熱殺大腸菌（EC）がマウスを攻撃することを保護する作用であり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs E.coli.（EC）。
【００２２】
図32はKBが亜致死量の加熱殺大腸菌（EC）がマウスを攻撃することを治療する作用である。その中に、図32aはKBが亜致死量の加熱殺大腸菌（EC）がマウスの血漿中のLPSのレベルを攻撃することに影響することであり、図32bはKBが亜致死量の加熱殺大腸菌（EC）がマウスの血清中のTNF-αのレベルを攻撃することに影響することであり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs E.coli.（EC）。
図33はKBが致死量の加熱殺大腸菌（EC）がマウスを攻撃することを保護する作用（時間−効果関係）を観察することであり、図中の*：p<0.05；**：p<0.01 vs E.coli.（EC）。
図34はKBが主要臓器の病理形態に影響することである。その中に、図34aはKBを注射されたマウスの肺組織の形態学的な構造であり、図34bはKBを注射されたマウスの肝組織の形態学的な構造であり、図34cはKBを注射されたマウスの腎組織の形態学的な構造であり、図34dはKBを注射されたマウスの心筋組織の形態学的な構造である。
【実施例】
【００２３】
LPS及び細菌CpG DNAは膿毒症と自己免疫疾患とを引き起こす肝心な要素であるため、LPS及びCpG DNAを拮抗する活性は薬物が膿毒症及び自己免疫疾患を予防と治療する作用をよく反映できる。本実施例にて選択された研究モデルはクコアミンＡ及びクコアミンＢがLPS及びCpG DNAに対する結合と拮抗するの活性を評価することに用いられ、これにより両方は膿毒症と自己免疫疾患とを治療する効果を反映し、下記の実施例を用いて本発明を更に説明する。ここで強調すべきなのは、下記実施例により本発明を説明するが本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例に生薬及び主な実験試薬の出所
1、114類生薬の出所は名称と産地について表1を参照する。
【表１】
2013525382.tif 000005
【００２５】
2、主な実験試薬
重慶川東化工場（集団）有限公司から無水アルコール（EtOH）とリン酸水素ナトリウム（Na2HPO4）とを購入し、天津南開大学化工場からAB-8型マクロ多孔性吸着樹脂とD001型強酸性陽イオン交換樹脂とを購入し、天津光復精細化工研究所からトリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid, TFA）を購入し、アメリカHoneywell社からメタノール（MeOH）を購入し、アメリカInvitrogen社からGIBCO(R)DMEM培地を購入し、アメリカHyclone社から新生子牛血清（NCS）を購入し、武漢博士▲徳▼公司からPBS（20 mM、pH 7.2）を購入し、重慶川東化工場（集団）有限公司から塩酸（HCl）を購入し、米国標準培養コレクション（ATCC）からRAW264.7細胞と大腸菌の標準菌株とを購入し、アメリカSigma社からLPSと、Poly I:Cと、ポリミキシンB（PMB）と、lipid Aと、FITC標識したLPSと、5-FAM標識したCpG DNAと、チアゾリル青（MTT）とを購入し、アメリカInvivogen社からPam3csk4を購入し、アメリカPeproTech社から組み換えマウスTNF-αとIL-1βとを購入し、Thermo社からのバイオセンサのキュベットと固定化試薬とを購入し、湛江安度斯生物有限公司からリムルス試薬とLPS検査用水とを購入し、アメリカR&D社からマウスTNF-α及び IL-6 ELISAキットを購入し、日本アクティブ・モティフ株式会社からNF-κB ELISAキットを購入し、日本東洋紡株式会社からリアルタイムRT-PCRキットを購入し、アメリカSanta Cruz社及びCST社から抗体を購入し、アメリカpierce社から化学発光ウェスタンブロッティングキットを購入し、アメリカPromega社からルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドとキットとを購入し、第三軍医大学実験動物中心からKMマウス（SPFグレード）を購入する。
【００２６】
実施例1：114類の生薬の水煎液がlipid AとCpG DNAとを結合する反応を測定する。
1.1  実験方法
lipid AとCpG DNAとを固定すること：光学的親和性バイオセンサー技術を用いて、IAsys Affinity Sensorの技術明細書を参照しながら、LPSの生物学的活性サイト分子とするリピド A（lipid A）とCpG DNA、それぞれをIAsys plus Affinity Sensorとするバイオセンサーのキュベットに固定する。lipid Aに対して、その一端の疎水性側鎖が疎水表面を有するキュベットと結合することより、別の一端とするリン酸基（lipid Aの活性基）が遊離と外側に暴露させ、このようにして生薬における疾患を治療する活性物質と結合する作用を発生するターゲットとし、溶液に活性物質が静電相互作用などの方式でlipid Aと結合する作用を発生する。CpG DNAに対して、まず、アビジンをビオチン分子を有する表面のキュベットに固定し、次、ビオチン標識したCpG DNAがアビジンと架橋させることより、それをキュベットに固定し、標識しない基が遊離と外側に暴露させ、且、このようにして生薬における疾患を治療する活性物質と結合する作用を発生するターゲットとし、溶液に活性物質が静電相互作用とインターカレーションなどの方式でCpG DNAと結合する作用を発生する。
生薬抽出液の測定：114類の生薬それぞれを粉末につぶし、上記粉末それぞれ1ｇを番号付き試験管に入れ、それぞれに蒸留水10mlを加えて、100℃水浴に1.5時間で加熱し、4000rpm, 20分の遠心分離を行ない、得られたものを濾過して、上清溶液を取る。毎種類の生薬について、それぞれ5μlの上清溶液を取り、それがlipid A又はCpG DNAとを結合する反応を測定する。具体的なステップは下記である：(1)結合反応：PBS 45 μlを加えた後、対象サンプル5μlを加え、結合反応が平衡に達した後、吸い出す。(2)分離反応：PBS 50μlで三回洗い、分離反応が平衡に達した後、吸い出す。(3)再生反応：0.1NのHCl 50μlで三回洗い、再生反応が平衡に達した後、吸い出す。(4)PBS 50 μlで三回洗い、曲線がベースラインに帰り、穏やかになった後、PBS 45μlを加え、新たな循環をスタートすることより、新たなサンプルを測定する。測定終了、ソフトFASTplotを用いてデータを分析する。
【００２７】
1.2  実験結果：114類の生薬に、地骨皮等の6類の生薬はlipid AとCpG DNAとに対して高親和活性を有し、その中に、地骨皮の親和活性は一番高いため、それにLPS及びCpG DNAを抵抗する活性物質を含有することが他の生薬に比べて、可能性が比較的に高いと暗示する。従って、それを抽出分離の研究対象とする。結果を図1に示す。その中に、図1aはlipid Aの固定反応曲線であり、図1bはCpG DNAの固定反応曲線であり、図1cは地骨皮などの6類の生薬がlipid Aを結合する作用であり、図1dは地骨皮などの6類の生薬がCpG DNAを結合する作用である。
【００２８】
実施例2：地骨皮に、LPS及びCpG DNAを抵抗する有効成分とするクコアミンＡ及びクコアミンＢを抽出と分離する。
2.1  マクロ多孔性吸着樹脂の分離及び活性サイトの選択
2.1.1  実験方法：約500ｇ地骨皮（CL）を5Ｌ蒸留水に24時間浸し、100℃で1時間煮て、粗孔ろ紙で濾過し、8000 rpm/min, 30分の遠心分離を行ない、得られた上清溶液を約1 Lまで減圧濃縮した後、それをAB-8型マクロ多孔性吸着樹脂に入れ、蒸留水と10%、20%、40%、100%のアルコールそれぞれで順次洗浄し、各の洗浄液それぞれを取り、それぞれを減圧濃縮した後、冷凍乾燥する。5種類の成分を得る。洗浄順番に基づき順にCL-1〜5と命名する。PBSでCLの各成分を1.0 mg/mlまで溶解し、得られた溶液の5 mlを対象サンプルとし、実施例1の実験方法より、それがlipid AとCpG DNAとを結合する活性を測定する。
2.1.2  実験結果：5類の成分に、CL-4がlipid AとCpG DNAとを結合する活性は比較的に高い、それがCL成分の主な活性サイトと暗示される。従って、CL-4を選択して、さらに分離する。結果を図2に示す。その中に、図2aはCL-1〜5成分の分離のクロマトグラムであり、図2bはCL-1〜5成分がlipid Aを結合する作用であり、図2cはCL-1〜5成分がCpG DNAを結合する作用である。
【００２９】
2.2  強酸性陽イオン交換樹脂の分離及び活性サイトの選択
2.2.1  実験方法：超純水でCL-4凍結乾燥粉末を100 mg/mlまで希釈し、0.45 μmの濾膜で濾過した後、それをD001型強酸性陽イオン交換樹脂に入れ、蒸留水と0.3 M、0.5 MのNa2HPO4それぞれで順次洗浄し、各の洗浄液それぞれを取り、それぞれを減圧濃縮した後、冷凍乾燥する。3種類の成分を得る。順次にCL-4a、b、cと命名する。PBSでCL-4の各成分を1.0 mg/mlまで溶解し、得られた溶液の5 mlを対象サンプルとし、実施例1の実験方法より、それがlipid AとCpG DNAとを結合する活性を測定する。
2.2.2  実験結果：得られたCL-4a、b、cとの3種類成分にて、CL-4b成分がlipid AとCpG DNAとを結合する活性は一番高い。結果を図3に示す。その中に、図3aはCL-4a〜c成分の分離のクロマトグラムであり、図3bはCL-4の各成分がlipid Aを結合する作用であり、図3cはCL-4各成分がCpG DNAを結合する作用である。
【００３０】
2.3  CL-4b成分がLPSとCpG DNAとを抵抗する活性を検証する
2.3.1  CL-4b成分が体外でLPSを中和する作用
2.3.1.1  実験方法： CL-4bをLPS検査用水で溶解して、8 μg/mlまで希釈し、それと1 ng/mlのLPS水溶液と同体積ずつ混合し、37℃水浴に30分で中和反応を行う。CL-4bとLPSを混合された溶液100 μlに同体積の溶解したリムルス試薬を加え、均一までやさしく振り動かし、キネティック濁度測定器で37℃で60分反応させ、遊離LPSから起こられたリムルス試薬の凝集反応を測定する。陽性対照はLPS水溶液に同量のLPS検査用水を加えたものであり、毎組はチューブ3本セットとし、測定結果がLPSのエンドトキシン単位とするEU/mlで示す。具体的な操作はEDS-99細菌内毒素測定システム明細書より行う。
2.3.1.2  実験結果：CL-4b成分自身はリムルス試薬の凝集反応を引き起こさないが、それとLPSを30分で培養された後、LPSがリムルス試薬の凝集を促進する作用を明らかに低減でき、実験結果から分かるのは、CL-4bがLPSを直接に中和する活性を有する。結果を図4に示す。
【００３１】
2.3.2  CL-4bの成分がLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6とを放出することを誘導することを抑制する作用
2.3.2.1  実験方法：10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液でRAW 264.7細胞の濃度を1×106/mlまで調整し、96ウェルプレート（200μl/ウェル）に入れ、37℃、5% CO2で4時間培養することより、細胞付着させた後、試料加入を行う。実験は陰性対照組（medium）と、刺激組と、薬物処理組とを設け、毎組はウェル3個セットである。対照組に何か試薬を加えない、刺激組にただLPS（終濃度は100 ng/ml）又はCpG DNA（終濃度は10 μg/ml）を加え、薬物処理組の毎ウェルに、CL-4b成分（終濃度は200 μg/ml）と、LPS（終濃度は100ng/ml）又はCpG DNA（終濃度は10 μg/ml）とを同時に加え、37℃、5% CO2で24時間続いて培養した後、上清溶液を取る。ELISAキットの取り扱い説明書により操作を行い、TNF-αとIL-6とを測定し、その結果は平準値±標準偏差値で表示され。
2.3.2.2  実験結果：CL-4b成分自身はRAW264.7細胞がTNF-αを分泌することを刺激しないが、CL-4b（200 μg/ml）を加入する場合、LPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを明らかに低減できるため、CL-4b成分が体外でLPSとCpG DNAとに対して、拮抗活性を有するとを示す。結果を図5に示す。その中に、図5aはCL-4b成分がLPSがRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6を放出することを誘導することを抑制する作用であり、図5bはCL-4b成分がCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6を放出することを誘導することを抑制する作用である。
【００３２】
2.3.3  CL-4bの成分は致死量の加熱殺大腸菌がマウスを攻撃することを保護する作用
2.3.3.1  実験方法：加熱殺大腸菌（E.coil.）ATCC 35218の調製：細菌の培養が臨床検査測定操作法で行い。まず、種ループでLBアガー プレートに培養されたシングル大腸菌菌群を選択し、高圧滅菌処理されたLB培養液の10mlへ接種し、37℃,250rpmで振とうしながら増菌培養させ、培養基が清澄から混濁となった後、全部なものを2000mlの新鮮なLB培養液に移し、37℃、250rpmで12時間続けて培養させる。菌液を取出し、1000 ml遠心管へ移し、5000 rpm,15 分間で遠心分離させ、上清を廃棄し、細菌沈澱を収集し、生理食塩水を用いて細菌を洗濯と再懸濁させ、同じ条件で遠心分離させ、上記プロセスを三回繰り返した後、50ml生理食塩水を用いて細菌を吹き打つと再懸濁し、100 ml食塩水瓶へ移し、電気炉を用いて30分間煮沸した、加熱殺大腸菌懸濁液を得た。この懸濁液を100倍希釈した後、核酸蛋白質測定装置を用いて波長600 nmでOD値を測定する。OD値と菌液濃度の回帰方程式より換算して、この濃度に基づき希釈を行い、マウス注射用作動液を得る。
CL-4b成分が加熱殺大腸菌がマウスを攻撃することを保護する作用に対する観察：昆明産マウス30匹（18〜20ｇ）は雄雌各半分であり、ランダムで3つの群に分け、毎群は10匹を有し、雄雌各半分である。それぞれはCL-4b対照群、加熱殺大腸菌対照群、CL-4b薬投与群とする。CL-4b対照群のマウスへCL-4b(60mg/kg)と生理食塩水を注射され、加熱殺大腸菌対照群のマウスへ加熱殺大腸菌(1.0×1010 CFU/ml) と生理食塩水を注射され、CL-4投与群のマウスに対して、加熱殺大腸菌の注射後、10分間経過した、CL-4 (60mg/ml)を注射する。毎種類の溶液の注射量は体重当たり200μl/20 gであり、全部はマウス尾静脈より注射され、毎マウスの注射体積は400μl/20 gである。7日内にマウスの一般状態及び死亡状況を観察し、対照群と薬投与群との間に生存差異を比較する。
【００３３】
2.3.3.2  実験結果：ただCL-4b(60mg/kg)と生理食塩水を投与することはマウスの状態及び生存率に影響しない。加熱殺大腸菌対照群のマウスが3日内の死亡率は90％である。細菌を注射するとともに、60mg/mlのCL-4b成分を投与して介入を行うことより、加熱殺大腸菌がマウスを攻撃する死亡率を50％以下まで下げることができる。この結果から分かるのは、CL-4b成分は致死量の加熱殺大腸菌がマウスを攻撃することに対する保護する作用が著しい。結果を図6に示す。
【００３４】
2.4  液体クロマトグラフィの分離に関する調製
2.4.1  実験方法：
クロマトグラフィ条件の設定：Agilent 1200 Series高速液体クロマトグラフィ（分析型）を分析装置とし、流動相（A(0.1% TFA):B(MeOH)=80:20,v/v,）を用いてCL-4bを0.5 mg/ml濃度と希釈する。シリカゲルにオクタデシルシラン基を化学結合したものを充填剤とするAgilent XDB-C18クロマトグラフィカラム（150×4.6 mm，5 mm）を用いて、検出波長が280 nmであり、流量が1 ml/minであり、カラム温度が25℃であり、サンプルサイズが10 μlである。
高速液体クロマトグラフィに関する調製：Agilent 1100 Series高速液体クロマトグラフィ（調製型）を分析装置とし、流動相（A(0.1% TFA):B(MeOH)=80:20,v/v,）を用いてCL-4bを20 mg/ml濃度と希釈する。シリカゲルにオクタデシルシラン基を化学結合したものを充填剤とするAgilent KF-C18クロマトグラフィカラム（200×20 mm，10 mm）を用いて、検出波長が280 nmであり、流量が10ml/minであり、カラム温度が室温であり、サンプルサイズが20μlである。保持時間が16〜20、20〜30分であるクロマトグラフピークの溶離液それぞれを集める。減圧乾燥し、2種類の成分を得る。保持時間的に相前後して順にCL-4b1、CL-4b2と命名する。CL-4b1とCL-4b2成分がそれぞれにPBSで1.0 mg/ml濃度まで溶解させる。その5mlを取出し、実施例1の実験方法より、それがlipid AとCpG DNAとを結合する活性を測定する。
2.4.2  実験結果：高速液体クロマトグラムより分析と調製を行い、CL-4b1とCL-4b2との主な成分を得た。そのクロマトグラムを図7に示す。その中に、図7aはCL-4b1成分の高速液体クロマトグラムであり、図7bはCL-4b2成分の高速液体クロマトグラムである。高速液体クロマトグラムで純度を分析することより、単一化合物であることを予め確認できる。
【００３５】
2.5  化合物CL-4b1とCL-4b2との化学構造を確定する。
2.5.1  実験方法：CL-4b1とCL-4b2とに対して、紫外線吸収スペクトル法、赤外吸収スペクトル法、核磁気共鳴スペクトル法、マススペクトル法より測定を行う。
2.5.2  実験結果：化合物CL-4b1とCL-4b2は淡黄色の結晶体であり、紫外線吸収スペクトル法でλmaxが281 nm(メチルアルコール)であり、ESI-MSマススペクトル法で[M+H]+ m/zが531である。その結果は上記の二つ化合物が異性体であるとの示唆を与えた。核磁気共鳴結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
2013525382.tif 000006
構造を分析することより、CL-4b1はクコアミンＡ（Kukoamine A、KA）であり、CL-4b2はクコアミンＢ（Kukoamine B、KB）であることを確定する。
【００３７】
実施例3：KAとKBが体外でlipid AとCpG DNAとの親和力を測定する。
3.1  実験方法：KAとKBそれぞれを100 μM濃度である作動液と調製し、それぞれの5mlを取出し、実施例1の実験方法より、それがlipid AとCpG DNAとを結合する反応を測定する。
3.2  実験結果：KA及びKBがLPS及びCpG DNAとの高親和活性を有する。その結果を図8に示す。その中に、図8aはKAとKBがlipid Aとの親和力を測定することであり、図8 bはKAとKBがCpG DNAとの親和力を測定することである。
【００３８】
実施例4：KAとKBが体外でLPSを中和する活性
4.1  実験方法：KAとKB（1、2、4 μg/ml）それぞれに、2.0 ng/mlのLPSと同体積ずつ混合し、37℃で30分間培養され、LPS対照組に同量の非発熱性水を加入し、キネティック濁度リムルス反応より培養されたLPS値を検査する。毎濃度を三回繰り返して検査する。LPS含有量は平準値±標準偏差値で表示され。具体的な操作はEDS-99細菌内毒素測定システム明細書より行う。
4.2  実験結果：KAとKBとはLPSを中和する活性を有する。統計的分析より、KAとKBはLPSに対して、顕著な中和作用を有すること（p<0.05またはp<0.01）が表明され、且、明らかな用量−効果関係を示す。それは、両方がLPSを有効的に拮抗でき、更に、膿毒症及び自己免疫疾患を予防及び治療する効力を発揮できるとの示唆を与える。結果を図9に示す。
【００３９】
実施例5：KAとKBが蛍光標識したLPSとCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞を結合する作用を影響する。
5.1  実験方法：10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液でRAW 264.7細胞の濃度を1×106/mlまで希釈し、24ウェル細胞培養用プレートに入れ、37℃、体積分数が5%であるCO2で4時間培養することより、壁に付着させた後、KA とKB（0、200μg/ml）を加入する。すぐにFITC標識したLPS（最終の濃度が400ng/ml）と、5-FAM標識したCpG DNA（最終の濃度が10ng/ml）とを加入し、且、何か試薬を加えない空白対照組（medium）を設け、30分間続けて培養させた後、PBSで細胞を三回洗い、細菌を吹き打ち、EP管へ移し、4%パラホルムアルデヒドを用いて10分間固定した後、PBSで細胞を三回洗い、細胞懸濁液を調製する。フローサイトメトリーでそれを測定し、毎組を三回繰り返して測定する。平均蛍光強度は平準値±標準偏差値で表示される。
5.2  実験結果：KAとKBがRAW264.7細胞のLPSとCpG DNAとの蛍光強度を明らかに低減できる（p<0.01）。これから分かるのは、両者はLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞を結合することを影響でき、両者の刺激より起こられた過度免疫反応を有効的に抑制し、有機体の損傷を避け、膿毒症及び自己免疫疾患を予防及び治療する効力を発揮する。その結果を図10に示す。その中に、図10aはKAとKBが蛍光標識したLPSがRAW264.7細胞を結合する作用に影響することであり、図10bはKAとKBが蛍光標識したCpG DNAがRAW264.7細胞を結合する作用に影響することである。
【００４０】
実施例6：KAとKBは、LPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞をがTNF-αを誘導放出することを影響する。
6.1  実験方法：10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液でRAW 264.7細胞の濃度を1×106/mlまで希釈し、96ウェルプレート（200μl/ウェル）に入れ、37℃、体積分数が5%であるCO2で4時間培養することより、壁に付着させた後、新鮮な培養液と交換する。終濃度が0、50、100μg/mlとするKA とKBを加入して、すぐにLPS（終濃度は100 ng/ml）とCpG DNA（終濃度は 10μg/ml）を加入し、その同時に、何か刺激物を加えない空白対照組（medium）を設け、4時間続けて培養させ、上清溶液を取り、ELISAキットの取り扱い説明書により操作を行い、TNF-αの濃度を測定し、その結果は平準値±標準偏差値で表示され。
6.2  実験結果：KAとKBは用量依存の方式でLPSとCpG DNAとがTNF-α放出を誘導することを抑制し、対照組に比べて、顕著な差異を有する（p<0.01）。TNF-αを大量的に又は持続的に放出することは膿毒症と自己免疫疾患との病理損傷に対して重要な意義がある。そのため、TNF-α放出を抑制することより、膿毒症及び自己免疫疾患を予防と治療する作用をよく発揮できる。その結果を図11に示す。その中に、図11aはKAとKBがLPSがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することに影響することであり、図10bはKAとKBがCpG DNAがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することに影響することである。
【００４１】
実施例7：KAとKBが細胞生存率を影響する測定（MTT法）。
7.1  実験方法：チアゾリル青（MTT）方法により、DMEM培養液でRAW 264.7細胞の濃度を1×106/mlまで希釈し、96ウェルプレート（200μl/ウェル）に入れ、37℃、CO2の体積分数が5%である培養器に4時間培養した後、終濃度が200μg/mlであるKAとKBを実験組に順次加入し、正常対照組に何か試料を加えない。毎組に並列な6並行ウェルを設ける。24時間続けて培養させ、上清溶液を取り捨て、毎ウェルに180ml培養液と20ml MTT溶液（5mg/ml）を加入した、さらに4時間続けて培養させ、細胞培養上清を取り捨て、毎ウェルに150 mlジメチルスルホキシドを加入し、10分間振とうし結晶を十分に溶解させ、550 nmで測定する各ウェルの吸光度（OD550）よりRAW264.7細胞の生存率を表示して、KAとKB、対照組との吸光度の差異を比較する。
7.2  実験結果：MTT実験結果からわかるのは、200μg/ml KAとKBはRAW264.7細胞の生存率に対する影響がない（p>0.05）。これは、当該濃度のKAとKBはRAW264.7細胞がTNF-αを放出する抑制作用が、その細胞毒性より導くことではない。その結果を図12に示す。
【００４２】
実施例8：KAとKBが体内でLPS及びCpG DNAを拮抗する作用。
8.1  実験方法：実施例2の2.3.3の実験方法を参照して、加熱殺E.coil.懸濁液を調製する。波長600 nmで懸濁液の吸光度を測定する（OD600値1.0≒1.0 ×1010 CFU/ml）。昆明産マウス84匹は雄雌各半分であり、ランダムで、加熱殺E.coil.対照群、KA（40 mg/kg）+ E.coil.群、KB（40 mg/kg）+ E.coil.群と3つの群に分け、毎群は28匹を有する。動物の重さを量った後、加熱殺E.coil.対照群へ加熱殺E.coil.（1.1 ×1010 CFU/ Kg）を投与し、KA治療群とKB治療群とへ加熱殺E.coil.（1.1 ×1011 CFU/ Kg）を投与し、そして10分後、それぞれに40mg/KgのKAとKBを注射する。動物ごとに投与総量は200ml/20 gであり、注射した0、2、4、8、12、24、48、72時間後それぞれに眼窩から静脈血を取出し、キネティック濁度リムルス反応よりLPSレベルを測定し、ELISA方法よりTNF-αレベルを測定する。
8.2  実験結果：加熱殺E.coil.細胞自身は増殖能力を有しないが、その中に大量のLPSとCpG DNAを含有するため、体内でLPSとCpG DNAとの刺激作用をよく模擬できる。加熱殺E.coil.対照群のマウスは4時間後、そのLPSとTNF-αを迅速に上げ、24〜48時間内に初期状態へ戻る。加熱殺大腸菌対照群と比べて、KA治療群とKB治療群は各時点でマウス血のLPSとTNF-αレベル（p<0.05又はp<0.01）を明らかに低減でき、LPSとCpG DNAの刺激作用を抑制することより、TNF-αを大量的に又は持続的に放出することを阻止して、膿毒症及び自己免疫疾患を予防と治療する作用をよく発揮できる。その結果を図8に示す。その中に、図13aはKAとKBが加熱殺E.coil.がマウスの血液中のLPSのレベルを攻撃することに影響することであり、図13bはKAとKBが加熱殺E.coil.がマウスの血液中のTNF-αのレベルを攻撃することに影響することである。
【００４３】
実施例9：KBがLPSとCpG DNAを結合する親和力定数（解離平衡定数）を測定する。
9.1  実験方法：PBSでKBを下記濃度の溶液と調製する：0.25、0.5、1、2、4μM。それぞれに5 μlを取出し、実施例1の実験方法より、各濃度のKBがLPSとCpG DNAを結合する反応を測定し、IAsys FASTfitソフトウェアよりKBがLPSとCpG DNAを結合する解離平衡定数（KD）を計算する。
9.2  実験結果：KBがLPSとCpG DNAとの解離平衡定数（KD）はそれぞれに、1.24μMと 0.66μMである。その結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
2013525382.tif 000007
【００４５】
実施例10：KBとポリミキシンB（PMB）がLPSとCpG DNAを結合する作用を検査と比較する。
10.1  実験方法：PBSでKBとPMBを4μM濃度の溶液と調製する。それぞれに5μlを取出し、実施例1の実験方法より、KBとPMBはLPSとCpG DNAとの親和力をそれぞれに測定する。
10.2  実験結果：図14はKBとPMBがLPSとCpG DNAを結合する作用である。その中に、図14aはKBとPMBがLPSとの親和力を測定することであり、図14bはKBとPMBがCpG DNAとの親和力を測定することである。
【００４６】
実施例11：KBとPMBがLPSに対して体外で中和する作用を検査と比較する。
11.1  実験方法：KBとPMBのそれぞれを内毒素検査用水で下記の9個の濃度溶液と調製する：0.5、1、2、4、8、16、32、64、128μM。実施例4の実験方法より、上記KBとPMB の溶液それぞれに、同体積の2ng/ml濃度のLPSと混合と反応させ、そして、測定を行う。
11.2  実験結果：KBはLPSの中和反応に対して、PMBと類似し、明らかな用量−効果関係も示す。しかしながら、その抑制効果はPMBより弱い。KBとPMBが2ng/ml のLPSに対する半数阻害濃度（half inhibitory concentration, IC50）はそれぞれに14.93μM、4.80 μMである。結果を図15に示す。
【００４７】
実施例12：KBがLPSとCpG DNA（CpG）とがRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6とを放出することを誘導することを抑制する作用。
12.1  実験方法：実施例6の実験方法より、KBが10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液で溶解させ、細胞培養液に加入し、終濃度は100、200μMである。その同時に、LPS（終濃度は100ng/ml）とCpG DNA（終濃度は10μg/ml）を加入する。24時間続けて培養させた後、上清溶液を取り、ELISAキットの取り扱い説明書により操作を行い、各組みのTNF-αとIL-6との濃度を測定し、その結果は平準値±標準偏差値で表示され。
12.2  実験結果：KBはLPSとCpG DNAとの刺激で起こられるTNF-αとIL-6との放出を同時に抑制できる。結果を図16に示す。その中に、図16aはKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを刺激することを抑制する作用であり、図16bはKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞がIL-6を放出することを刺激することを抑制する作用である。
【００４８】
実施例13：KBとPMBとがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6とを放出することを誘導することに対して影響と比較。
13.1  実験方法：実施例6の実験方法より、KBとPMBのそれぞれが10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液で溶解させ、細胞培養液に加入し、終濃度は50、100、200 μMである。その同時に、LPS（終濃度は100ng/ml）とCpG DNA（終濃度は10μg/ml）を加入する。4時間続けて培養させた後、上清溶液を取り、ELISAキットの取り扱い説明書により操作を行い、各組みのIL-6の濃度を測定し、その結果は平準値±標準偏差値で表示され。
13.2  実験結果：KBはLPSとCpG DNAとの刺激で起こられるTNF-αとIL-6の放出を同時に抑制できる。PMBはただLPS刺激でTNF-αとIL-6の放出に対して顕著な抑制作用を有する。その結果を図17に示す。その中に、図17aはKBとPMBとがLPSがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを刺激することを抑制する作用であり、図17bはKBとPMBとがCpG DNAがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを刺激することを抑制する作用であり、図17cはKBとPMBとがLPSがRAW264.7細胞がIL-6を放出することを刺激することを抑制する作用であり、図17dはKBとPMBとがCpG DNAがRAW264.7細胞がIL-6を放出することを刺激することを抑制する作用である。
【００４９】
実施例14：KBがLPSとCpG DNAとがマウス腹腔マクロファージ細胞がTNF-αとIL-6とを放出することを誘導することに対して影響。
14.1  実験方法：
マウス腹腔マクロファージ細胞の分離と培養：KMマウスを頚椎脱臼法で殺し、すぐに75％アルコールに浸され、皮膚消毒を行う。無菌操作で腹皮を切り、腹膜を暴露させる。5ml注射器で予冷されたDMEM細胞培養液を抽出し、徐々に腹腔に注入し、機械で腹部を軽くマッサージすることより、細胞が十分に集められる。そして、DMEM培養液を逆抽出し、10ml遠心管へ移行し、500rpm, 5分間の遠心分離を行なった後、10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液を用いて細胞を再懸濁させ、細胞培養容器へ移行し、37℃、5% CO2で2時間培養した後、培養液を交換し、未接着細胞を取り除き、残すのは95％が腹腔マクロファージ細胞であり、続いて培養と増殖する。
試料加入と測定：KBとPMBのそれぞれを10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液で50、100、200μMとの濃度と調製する。実施例6の実験方法より、細胞培養液に加入し、続けて培養する。4時間続けて培養させた後、上清溶液を取り、ELISAキットの取り扱い説明書により操作を行い、各組みのTNF-αの濃度を測定し；12時間培養させた後、上清溶液を取り、ELISAキットの取り扱い説明書により操作を行い、各組みのIL-6の濃度を測定する。その結果は平準値±標準偏差値で表示され。  
14.2  実験結果：RAW264.7細胞に観察された結果と大体同じ、KBはLPSとCpG DNAとの刺激で起こられたTNF-αとIL-6との放出を同時に抑制でき、PMBはただLPSの刺激で起こられたTNF-αとIL-6との放出に対して顕著な抑制作用を有する。その結果を図18に示す。その中に、図18aはKBとPMBとがLPSがマウス腹腔マクロファージ細胞がTNF-αを放出することを刺激することを抑制する作用であり、図18bはKBとPMBとがCpG DNAがマウス腹腔マクロファージ細胞がTNF-αを放出することを刺激することを抑制する作用であり、図18cはKBとPMBとがLPSがマウス腹腔マクロファージ細胞がIL-6を放出することを刺激することを抑制する作用であり、図18dはKBとPMBとがCpG DNAがマウス腹腔マクロファージ細胞がIL-6を放出することを刺激することを抑制する作用である。
【００５０】
実施例15：KBはLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞のTNF-αと、IL-6と、iNOSと、COX-2 とのmRNA発現を刺激することに影響する。
15.1  実験方法：
細胞準備：10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液で細胞懸濁液の濃度を1×106/mlまで調整し、その懸濁液2mlを取り、6ウェルプレートに入れ、37℃、5% CO2インキュベータで2時間培養する。実験は対照組（medium）と、KB対照組と、刺激物組と、KB介入組とを設ける。対照組に何か試薬を加えない、KB対照組にただKB（200μM）を加え、刺激物組にただLPS（100ng/ml）とCpG DNA（10μg/ml）とを加え、KB介入組にLPS又はCpG DNAを加えるとともに、終濃度が100と200μMであるKBを投入する。4時間培養して細胞を集める。
RNA抽出：上清を取り除き、毎ウェルに1ml tripureを加え、ピペットで数回に吹き打つことより、細胞を十分に溶解させ、溶解物を1.5 ml EP管へ移し、室温で5分間培養させ、リボ核タンパク質複合体が完全に分離されたことを確保する。EP管にクロロホルム0.2 mlを加え、EP管のキャップをかぶせて、遠心管を15秒間激しく逆転させ振り動かし、室温で10分間培養させ、EP管内の液体が分離した後、4℃、12000g、15分間で遠心分離させ、溶液が三相と分離する。EP管の上層の溶液（無色の液相であり、約0.4 ml）を新たなEP管（DEPC処理）へ移し、イソプロピルアルコール0.5 mlを加え、数回で激しく逆転させ振り動かすことで液体をよく混ぜ合わせる、室温で10分間培養させ、RNA沈澱を形成させるよう促す。4℃、12000g、10分間で遠心分離させ、上清を廃棄する。75%アルコール1mlを加え、RNA沈澱をボルテックスよって洗濯し、4℃、12000g、10分間で遠心分離させ、上清を廃棄する。室温でEP管を15分間乾燥し、余計なアルコールを除く。DEPCで処理されたddH2O 20μlでRNA沈澱を再懸濁させ、ピペットを用いて数回に吹き打つことより、RNA沈澱を溶解させるよう促す。55〜60℃で10分間培養させた後、-70℃で冷凍貯蔵する。
逆転写：氷浴にRT反応液（Rnase-free H2O，10μl、5×RT buffer，4μl、dNTP mixture，2μl、RNase inhibitor，1μl、Oligo(dT)20，1μl、RNA，1μl、ReverTra Ace，1μlを含有する）を調製し、よく混ぜ合わせ、42℃で1時間置き、99℃で5分間、-20℃で保管する。
PCR増幅：Primer Premier 5ソフトウェアを用いて設計する。上海生物工程技術有限公司より合成する。かかるプライマー配列は下記である。
【００５１】
2013525382.tif 000008
反応混合物を0.2mlのPCR管に加える。反応混合物は1.5μlcDNA、10.0μl 2×SYBR Green Master Mix、0.5μl上流プライマー(10μM)，0.5μl下流プライマー(10μM)、7.5 μl RNase-free H2Oを含有する。増幅プログラムは下記である。
【００５２】
2013525382.tif 000009
その結果がCT値より示され、2-ΔΔCT方法より、内部リファレンスであるβ-actinに対する比に換算する。
【００５３】
15.2  実験結果：マウスRAW264.7細胞に対してLPS又はCpG DNAの刺激を与えない場合、TNF-αと、IL-6と、iNOSと、COX-2 とのmRNA発現レベルが比較的に低く、100ng/mlのLPS又は10μg/mlのCpG DNAを与えたら、上記炎症性メディエーターがRAW264.7細胞に発現されることを顕著的に上げる。しかし、KB（100, 200μM）を投与することはLPSとCpG DNAとがTNF-αと、IL-6と、iNOSと、COX-2 とのmRNA発現を上げることに対して、顕著的な抑制作用を有し、且、ある程度の用量−効果関係を示す。その結果を図19に示す。その中に、図19aはKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞のTNF-αのmRNA発現を刺激することを抑制する作用であり、図19bはKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞のIL-6のmRNA発現を刺激することを抑制する作用であり、図19cはKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞のiNOSのmRNA発現を刺激することを抑制する作用であり、図19dはKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞のCOX-2のmRNA発現を刺激することを抑制する作用である。
【００５４】
実施例16：KBはLPSとCpG DNAとがマウス腹腔マクロファージ細胞のTNF-αと、IL-6とのmRNA発現を刺激することに影響する。
16.1  実験方法：KBがLPSとCpG DNAとがマウス腹腔マクロファージ細胞のTNF-αと、IL-6とのmRNA発現を刺激することに影響することを観察する。その実験方法は実施例15と同じ。
16.2  実験結果：RAW264.7細胞に観察する結果と基本的に同じ、すなわち、KB（100, 200 μM）はLPSとCpG DNAとがTNF-αと、IL-6とのmRNA発現を上げることに対して、顕著的な抑制作用を有し、且、ある程度の用量−効果関係を示す。その結果を図20に示す。その中に、図20aはKBがLPSとCpG DNAとがマウス腹腔マクロファージ細胞のTNF-αのmRNA発現を刺激することを抑制する作用であり、図20bはKBがLPSとCpG DNAとがマウス腹腔マクロファージ細胞のIL-6のmRNA発現を刺激することを抑制する作用である。
【００５５】
実施例17：KBはLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制する用量−効果と時間−効果との作用を観察する。
17.1  実験方法：10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液を細胞培養液とし、RAW 264.7細胞の濃度を1×106/mlまで希釈し、96ウェルプレート（200μl/ウェル）に入れ、37℃、5% CO2で4時間培養する。
（1）用量−効果の関係を観察する：実験は対照組（medium）と、薬物処理組とを設け、毎組はウェル3個セットである。対照組に何か試薬を加えない、薬物処理組の毎ウェルにKB（終濃度は12.5、25、50、100、200μMである）を加え、そして、LPS (終濃度は100 ng/mlである)又はCpG DNA(終濃度は10μg/mlである)を加え、37℃、5% CO2で12時間続いて培養した後、上清溶液を取る。ELISAキットの取り扱い説明書により操作を行い、TNF-αの濃度を測定し、その結果は平準値±標準偏差値で表示され。
（2）時間−効果の関係を観察する：実験は対照組（medium）と、刺激組と、薬物処理組とを設け、毎組はウェル3個セットである。対照組に何か試薬を加えない、対照組にただLPSとCpG DNAを加え、薬物処理組に、LPSとCpG DNAを加える同時に、KB（終濃度は200 μM）を加えて、37℃、5% CO2で24時間続いて培養した後、刺激した0、2、4、8、12、24時間後それぞれに上清溶液を集める。ELISAキットの取り扱い説明書により操作を行い、TNF-αの濃度を測定し、その結果は平準値±標準偏差値で表示され。
【００５６】
17.2  実験結果：（1）用量−効果の関係を観察する：RAW264.7細胞に100ng/ml LPS又は10μg/ml CpG DNAを投与した後、TNF-αの放出が顕著に増加して、それぞれに5710.85±98.03 pg/ml、3126.39±237.67 pg/mlに達する。KB介入を与えた後、細胞のTNF-α放出をある程度抑えることを受ける。その時、KBの濃度が12.5μMである場合、RAW264.7細胞活性化に対する影響はLPS組またはCpG DNA組と比べて、統計的に有意差がない（p>0.05）、KBの濃度が25μM以上である場合、LPSとCpG DNAとはRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することに対して、抑制活性が著しく強める(p<0.05またはp<0.01)。KBがLPSとCpG DNAに対する拮抗作用は明らかな用量−効果関係を示す。その結果を図21aに示す。
（2）時間−効果の関係を観察する：RAW264.7細胞に対して何か処理を行い場合、0、2、4、8、12、24 hにただ基礎レベルのTNF-αを検出し、且、各の時点の間に、TNF-αレベルは有意差がない。単にLPS (100 ng/ml)の刺激を与えた後、細胞上清のTNF-αレベルは2 hで急激に上昇し、4 h後次第に緩やかになり、同時にKB200μMを投与したら、全部な各の時点で細胞上清のTNF-αレベルを低減できる。単にCpG DNA (10μg/ml)の刺激を与えた後、細胞上清のTNF-αレベル上昇時間はLPS組と大体同じ、12 hでピーク値に達し、同時にKB200μMを投与したら、全部な各の時点でCpG DNA刺激より起こられた細胞上清のTNF-αレベルを顕著に抑制でき、且、その抑制作用はLPSに対する拮抗作用より強い。その結果を図21bと図21cに示す。その中に、図21bはKBがLPSがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制する時間−効果作用を観察することであり、図21cはKBがCpG DNAがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制する時間−効果作用を観察することである。
【００５７】
実施例18：異なる加入試料方法でKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制するに対する影響。
18.1  実験方法：10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液を細胞培養液とし、RAW 264.7細胞の濃度を1×106/mlまで希釈し、96ウェルプレート（200μl/ウェル）に入れ、37℃、5% CO2で4時間培養する。
（1）KBがLPS又はCpG DNAとプレインキュベーションされた後加入：10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液で調製されたKB（400μM）又はPBSがLPS（200 ng/ml）又はCpG DNA（20μg/ml）と500μlずつ混合し、37℃で20分間、40分間培養した後、それぞれに96ウェルプレートの細胞培養液を置換し、12時間続いて培養した後、上清溶液を取り、ELISAキットの取り扱い説明書により操作を行い、TNF-αの濃度を測定し、その結果は平準値±標準偏差値で表示され。
（2）異なる時点でKB加入：LPS（100ng/ml）またはCpG DNA（10μg/ml）を加入する時点を零時点とし、前の40 min、前の20 min、同時点、並びにその20、40、60、120 min後でそれぞれにKB（200μM）を加え、12時間続いて培養した後、上清溶液を取り、ELISAキットの取り扱い説明書により操作を行い、TNF-αの濃度を測定し、その結果は平準値±標準偏差値で表示され。
（3）無血清加入試料で細胞を刺激する：RAW 264.7細胞培養液の代わりにDMEM培養液を用いる。その同時に、KB (50、100、200 μM)と、LPS(100ng/ml)又はCpG DNA(10μg/ml)を加入し、12時間続いて培養した後、上清溶液を取り、ELISAキットの取り扱い説明書により操作を行い、TNF-αの濃度を測定し、その結果は平準値±標準偏差値で表示され。
【００５８】
18.2  実験結果：LPS又はCpG DNAそれぞれにPBS又はKBと20分間又は40分間プレインキュベーションした、加入試料で細胞を刺激し、KBがLPS又はCpG DNA がTNF-αの放出を誘導することに対して抑制する効果は著しく強める。その次、LPS又はCpG DNAを加入する時点を零時点とし、繰り上げ（-40、-20分間）、同時（0分間）、又は延長（20、40、60、120分間）、KB介入を与える。結果から分かるのは、LPSとCpG DNAの刺激前に、KBを与え細胞を処理する場合、該処理組のTNF-αレベルは同時にKBを与える組と比べて、有意差がない。KBを与えることを延長するのは60分間内に、LPS又はCpG DNA がTNF-αの放出を刺激することに対して抑制作用がまだ有する。しかしながら、120分を超えたら、KBを与えることは抑制活性が有しない。尚、無血清との条件で、KBはまだ用量依存の方式でLPS又はCpG DNA がRAW 264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制する。KBは血清タンパクを介して間接的にLPS又はCpG DNAに対する抑制効力を発揮する。その結果を図22に示す。その中に、図22aはKBがLPS又はCpG DNAとプレインキュベーションされた加入試料がLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制する作用であり、図22bはKBが異なる時点で加入試料されることがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを刺激することを抑制することであり、図22cはKBが血清なし条件でLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを刺激することを抑制することである。
【００５９】
実施例19：KBが複数の病原体分子がRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6とを放出することに対して抑制する活性を測定する。
19.1  実験方法：LPS（100ng/ml）、CpG DNA（CpG、10μg/ml）、Pam3CSK4（Pam3、10μg/ml）、Poly I:C（I:C、20μg/ml）、TNF-α（50ng/ml）、IL-1β（50ng/ml）との六つ病原体分子それぞれを用いてRAW264.7細胞を刺激する。その同時に、KB（終濃度は200μM）を加入する。実施例6の実験方法より、上清溶液を取り、ELISAキットの取り扱い説明書により操作を行い、TNF-αの濃度を測定し、その結果は平準値±標準偏差値で表示され。
19.2  実験結果：KB（200μM）の介入はただLPSとCpG DNAとの刺激で起こられるTNF-αとIL-6との放出に対して、顕著な抑制作用を有し、ほかの刺激物に対して拮抗効力が有しない。これから分かるのは、KBの作用ターゲットはただLPSとCpG DNAを目指す。その結果を図23に示す。その中に、図23aはKBが複数の病原体分子がRAW264.7細胞がTNF-αを放出することを誘導することを抑制する効果であり、図23bはKBが複数の病原体分子がRAW264.7細胞がIL-6を放出することを誘導することを抑制する効果である。
【００６０】
実施例20：フローサイトメトリーでKBがLPSとCpG DNAがRAW264.7細胞を結合することを影響することを測定することである。
20.1  実験方法：10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液でRAW 264.7細胞の濃度を1×106/mlまで希釈し、2ml を取り24ウェル細胞培養用プレートに入れ、37℃、5%CO2で培養器に4時間培養する。実験は対照組（medium）と、刺激物組と、KB介入組とを設ける。対照組に何か試薬又は刺激物を加えない、刺激物組にただFITC-LPS（200ng/ml）と5-FAM-CpG DNA(10μg/ml)を加え、KB介入組にLPS又はCpG DNAを加えるとともに、終濃度が50、100、200μMであるKBを投入して30分間続いて培養し、PBS で細胞を二回洗い、結合されないLPSとCpG DNAをを取り除き、細胞を集め、4%パラホルムアルデヒドを用いて10分間固定した後、PBS で細胞を三回洗い、フローサイトメトリーで細胞膜表面の蛍光強度を測定する前に、遮光放置する。
20.2  実験結果：処理されないRAW264.7細胞を陰性対照とし、FITC-LPSと5-FAM-CpG DNAを加えて細胞を処理した後、曲線が右に移し、細胞膜MFI値よりプロッティングして、そのレベルは顕著に増加する。これから分かるのは、LPS又はCpG DNAは細胞膜受容体と結合し、FITC-LPSと5-FAM-CpG DNAを与える同時に、異なる濃度のKBを加入することで介入を行うことより、用量依存の方式で細胞膜表面のMFI値を低減し、曲線が右に移すことを抑制する可能であり、該抑制作用は統計的有意性がある。その結果を図24に示す。その中に、図24aはKBがRAW264.7細胞表面のLPS平均蛍光強度を影響することであり、図24bはKBがRAW264.7細胞表面のCpG DNA平均蛍光強度を影響することである。
【００６１】
実施例21：共焦点レーザー顕微鏡でKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞に結合と内在化に影響することを観察する。
21.1  実験方法：共焦点レーザーための細胞培養用ディッシュ(20 mm)を予め用意してRAW264.7細胞を培養する。10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液で細胞懸濁液の濃度を5×105/mlまで調整し、その懸濁液1mlを取り、細胞培養用ディッシュに入れ、37℃、5% CO2インキュベータで4時間培養する。実験は対照組（medium）と、刺激物組と、KB介入組とを設ける。各組濃度及び加入試料方法は実施例12と同じ、30分間培養した後4%パラホルムアルデヒドを用いて10分間固定した後、PBS で細胞を三回洗い、DAPI(100ng/ml)を加入して核を2分間染色し、PBS で細胞を三回洗う。50%グリセロール/PBSの溶液で封入し、共焦点レーザー顕微鏡でRAW264.7細胞にLPSとCpG DNAの蛍光の強度及び分布状況を測定する前に、遮光放置する。
21.2  実験結果：処理されないRAW264.7細胞がFITC又は5-FAMの緑色蛍光を測定されることはできない、ただ細胞をDAPIで染色するより青い蛍光を見える。FITC-LPS (200 ng/ml)又は5-FAM-CpG DNA (10μg/ml)を加入する場合、RAW264.7細胞表面及び細胞内にドット状分布された緑色蛍光は顕著に増加する。これは、LPS又はCpG DNAが細胞の受容体と結合し細胞に侵入する。濃度が50、100、200μMであるKBより介入を行った後、FITC-LPSと5-FAM-CpG DNAはRAW264.7細胞表面及または細胞内に分布する緑色蛍光強度が顕著に弱くなり、且、KBの抑制作用は用量依存を明らかに示す。その結果を図25に示す。その中に、図25aはKBがLPSがRAW264.7細胞に結合と内在化に影響することであり、図25bはKBがRAW264.7細胞表面の5-FAM-CpG DNAの平均蛍光強度に影響することである。
【００６２】
実施例22：KBがLPSとCpG DNAとがTLR4とTLR9との発現の向上を誘導することに対して抑制する作用を測定する。
21.1  実験方法：KB、LPS、CpG DNAとの用量、具体的なステップ、結果の計算及び表示は実施例15の実験方法と同じ、TLR4とTLR9とのmRNA発現を測定する。TLR4とTLR9とのプライマー配列は下記である。
【００６３】
2013525382.tif 000010
【００６４】
22.2  実験結果：RT-PCRの測定結果から分かるのは、処理されないRAW264.7細胞TLR4とTLR9の発現を対照とし、LPSとCpG DNAとの刺激はTLR4とTLR9との発現を顕著に向上でき、100と200 μMのKBを加入することで介入を行った後、TLR4とTLR9との向上が顕著に抑制されることは、KBがTLR4とTLR9との発現の向上を遮断でき、一層刺激反応を抑制する。その結果を図26に示す。その中に、図26aはKBがLPS又はCpG DNAがRAW264.7細胞TLR4のmRNA発現を高めることを抑制することであり、図26bはKBがLPS又はCpG DNAがRAW264.7細胞TLR9のmRNA発現を高めることを抑制することである。
【００６５】
実施例23：KBがLPSと、CpG DNAと、TNF-αと、IL-1βとがRAW264.7細胞シグナリング分子IκB-αとp38とのリン酸化レベルを刺激することを抑制する作用である。
23.1  実験方法：
細胞質タンパク質を抽出すること：10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液でRAW264.7細胞懸濁液の濃度を1×106/mlまで調整し、その懸濁液5mlを取り、60mm細胞培養容器に入れ、37℃、5% CO2インキュベータで4時間培養する。まず、予備実験を行う：LPS(100ng/ml)、CpG DNA(10μg/ml)、TNF-α（50ng/ml）又はIL-1β（50 ng/ml）を用いてRAW264.7細胞を刺激し、刺激時間はそれぞれに15、30、45、60 分間である。本実験は対照組（medium）と、KB対照組と、刺激組(LPS、CpG DNA、TNF-α又はIL-1β)と、KB介入組（LPS+KB組、CpG DNA+KB組、TNF-α+KB組、IL-1β+KB組）とを設ける。対照組に何か試薬を加えない、KB組にただKB（200μM)を加え、刺激組にただLPS(100 ng/ml)、CpG DNA(10 μg/ml)、TNF-α（50ng/ml）又はIL-1β（50 ng/ml）を加え、KB介入組に、LPS、CpG DNA、TNF-α又はIL-1βを加えるとともに、KB(100、200μM)を投入する。予備実験の時間より培養時間を確定する（30分間）。PBSで一回洗い、遠心によって細胞を集める、上清溶液を取り尽し、細胞沈澱を用意する。20 μl細胞沈澱ごとにPMSFを添加された細胞質タンパク質抽出試薬200μlを加え、5秒激しく振り動かして細胞沈澱を完全に浮遊と分離させ、10〜15分間氷浴中で放置、4℃、12000g、5分間で遠心分離させ、すぐに上清を取ってあらかじめ冷やされたプラスチックチューブへ移す。抽出された細胞質タンパク質を得る。
SDS-PAGEゲル電気泳動：
(1)濃縮ゲルと分離ゲルを調製するのは、下記である。
【００６６】
2013525382.tif 000011
【００６７】
(2)ゲル鋳込：分離ゲルを前板トップから約1.5cmまでに鋳込み、分離ゲルを鋳込んだ後、溢れ出すようにdd H2Oを注ぎ込む。室温で水平な所に30分間静かに放置する。ゲル化した後、水を出し、余分のdd H2Oをろ紙で吸い取り、濃縮ゲルを前板トップまでに加入し、10ウェルの垂直挿入した30分後、垂直方向にコームを軽く抜き出し、dd H2Oでゲルウェルを二回洗い、余分のゲルを取り除く。
(3)試料調製：4:1の割合によってタンパク質サンプルを5×濃縮されたゲルローディングバッファーに加え、100℃、5分変性させる。
(4)プレパラティブ電気泳動：不純物を除去するため、120Ｖで無負荷5分間泳動する。
(5)ローディング：各サンプルのタンパク質は20μgになるため、タンパク質の濃度に基づきサンプルの体積を調整する。マイクロシリンジによりサンプルを注入する（5 μlタンパク質分子量マーカーをロードする）。
(6)電気泳動：80Ｖで30分間泳動し（濃縮）、100Ｖで60分間泳動し（分離）、ブロモフェノールブルーのフロントラインが下パネルから1cmに達するまでに泳動が停止する。
移動膜：湿式移動法を行い、実験条件は200 mA、60分である。
【００６８】
ブロックと交配：
(1)電気泳動槽から膜を取出し、0.05% PBSTで洗い、水平シェーカーで200rpm、1時間ブロックする。
(2)ブロッキングバッファーを用いて1次抗体濃縮溶液を希釈し（1:1000）、ボルンろう板にタンパクバンドを置き、バンド全体を覆うように抗体を滴下し、4℃で夜通し培養する。
(3)PBSTを用いてバンドを五回洗い、毎回に水平シェーカーで200rpm、5分間振動する。
(4)一次抗体の供給源により酵素標識二次抗体のタイプを確定し、1:5000で希釈し、培養皿に加え、37℃で30分間培養する。
(5)PBSTを用いてバンドを五回洗い、毎回に水平シェーカーで200rpm、5分間振動する。
化学発光の検証：化学発光基質AとBを同体積ずつ混合して、得られた作動液を膜に滴下し、ゲル撮影装置より化学発光法で測定し、イメージが収集と記憶される。
【００６９】
23.2  実験結果：LPSとCpG DNAは受容体と結合した後、細胞内のシグナルトランスダクション経路が発動され、炎症に関するシグナリング分子が活性化された。western blotによりIκB-αとp38との総蛋白及びリン酸化蛋白レベルを測定する。p38の測定結果から分かるのは、内部リファレンスタンパクとするtubulinとp38に対して各組みに発現レベルが大体同じ、p-p38タンパクに対して、medium組とKB組にp-p38発現がほとんどない、LPS組とCpG DNA組にp-p38タンパク発現を顕著的に上げる。KB（100、200μM）の介入を与えた後、p-p38発現を顕著的に抑える。IκB-αの測定結果から分かるのは、内部リファレンスタンパクとするtubulinとp38に対して各組みに発現レベルが大体同じ、medium組を参照とし、ただKBを投与することは、IκB-αとp-IκB-αの発現に影響しない。LPSとCpG DNAで刺激した後、IκB-αの分解（LPSとCpG DNAがRAW264.7細胞を45分間刺激した後、IκB-αの分解を測定できないため本実験の時間は30分間を選択する）と、p-IκB-α発現を上げることとを起こすことができる。上記と同じ濃度のKBの介入を与えた後、IκB-α分解とp-IκB-α発現とを顕著的に抑える。これはKBがLPSとCpG DNAとを中和し、両方から起これた細胞内のシグナリング分子の活性化を抑える。その結果を図27に示す。その中に、図27aはLPS、CpG DNA、TNF-α又はIL-1βが異なる時間（15、30、45、60 min）でRAW264.7細胞を刺激した後のIκB-αの分解であり、図27bはKBがLPSと、CpG DNAと、TNF-αと、IL-1βとがRAW264.7細胞シグナリング分子p38のリン酸化レベルを高めるすること、IκB-αの分解及びリン酸化とを抑制する作用である。
【００７０】
実施例24：KBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞NF-κBを活性化することに対して抑制する作用である。
24.1  実験方法：
細胞核タンパク質を抽出すること：10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液でRAW264.7細胞懸濁液の濃度を1×106/mlまで調整し、その懸濁液5mlを取り、60mm細胞培養容器に入れ、37℃、5% CO2で4時間培養する。実験は対照組（medium）と、KB対照組と、刺激組(LPS又はCpG DNA)と、KB介入組（LPS+KB組、CpG DNA+KB組）とを設ける。対照組に何か試薬を加えない、KB組にただKB（200μM)を加え、刺激組にただLPS(100ng/ml)又はCpG DNA(10μg/ml)を加え、KB介入組に、LPS又はCpG DNAを加えるとともに、KB(200μM)を投入する。2時間培養する。PBSで一回洗い、遠心によって細胞を集める、上清溶液を取り尽し、細胞沈澱を用意する。20μl細胞沈澱ごとにPMSFを添加された細胞質タンパク質抽出試薬A  200μlを加え、5秒激しく振り動かして細胞沈澱を完全に浮遊と分離させ、10〜15分間氷浴中で放置、10μl細胞質タンパク質抽出試薬Bを加入し、すぐに5秒激しく振り動かし、1分間氷浴中で放置、5秒激しく振り動かし、4℃、12000〜16000g、5分間で遠心分離させ、余計な上清を取り尽し、沈澱にPMSFを添加された細胞核タンパク抽出試薬50μlを加え、20秒激しく振り動かして細胞沈澱を完全に浮遊と分離させ、また氷浴中で放置、1〜2分ごとに20秒高速激しく振り動かし、そのまま30分間続き、4℃、12000g、10分間で遠心分離させ、上清を予冷されたEP管へ移して、抽出された細胞核タンパク質を得る。それを-70°C冷凍保管して、測定を行う。
【００７１】
ELISA方法よりNF-κBの活性を測定する：毎ウェルに結合液30μl（1.6 ml結合液に、3.2 μl DTTと16.2μl Herring sperm DNAを溶解する）を加入し、サンプルウェルに20 μlサンプル（10μg抽出されたタンパクを含有する）を加入し、陽性対照ウェルにp50 20 μlを加え、空白対照ウェルに20μl溶解液（177.3μl溶解液AM2に0.9μl 1M DTTと1.8μlプロテアーゼ阻害剤を溶解する）を加え、30秒振り動かして完全に均一に混合させる。室温で1時間培養し、1×洗浄液（450μl 10×洗浄液を4.05ml ddH2Oに溶解する）で三回洗い、毎回に200 μl溶液を加えて5分間穏やかに振とうする。毎ウェルに100μl NF-κB抗体（1:1000）を加え、室温で1時間培養し、1×洗浄液で三回洗い、毎回に200μl溶液を加えて5分間穏やかに振とうする。毎ウェルに100μl HRP抗体（1:1000）を加え、室温で1時間培養し、1×洗浄液で四回洗い、毎回に200μl溶液を加えて5分間穏やかに振とうする。毎ウェルに100μl発光試薬を加え、5分間遮光培養する。100μl停止液を加え、波長600 nmで各ウェルの吸収値を測定する。
（2）ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイで測定する：Invitrogen Lipofectamine 2000 reagentの取り扱い説明書より、pGL-luc2P/NF-κBREとpGL-hRlucプラスミドを同時にRAW264.7細胞へ導入した、48時間後、LPS（100ng/ml）又はCpG DNA（10μg/ml）からの刺激と、KB（200μM）からの介入を与え、6時間培養し、Dual-Gloルシフェラーゼアッセイキットの取り扱い説明書より測定を行う。
【００７２】
24.2  実験結果：LPSとCpG DNAはシグナリング分子を活性化させた後、NF-κB等の転写因子を活性化することを引き起こす。ELISA方法より、核タンパク質におけるNF-κBのp50とp65サブユニットを測定する。その結果から分かるのは、刺激を受けないRAW264.7細胞に比べて、ただKBよりp50とp65との発現に影響しない、LPSとCpG DNAからの刺激はp50とp65とのレベルが顕著に増加することを誘導でき、200 μM KBからの介入を与えた後、LPSとCpG DNAからの刺激に起こられた核タンパク質におけるp50とp65とのレベルが増加することが顕著に抑制される。尚、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイで測定結果も、KBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞NF-κBを活性化することに対して抑制作用を有すること、を示す。その結果を図28に示す。その中に、図28aはKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞核の中にNF-κB p50サブユニットを高めることを抑制する作用であり、図28bはKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞核の中にNF-κB p65サブユニットを高めることを抑制する作用であり、図28cはルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイでKBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞NF-κBを活性化することを抑制する作用を測定することである。
【００７３】
実施例25：KBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞TLR4と、TLR9と、MyD88と、NF-κB（p65）との発現の向上することを刺激することを抑制する作用である。
25.1  実験方法：
（1）KBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞TLR4と、TLR9と、MyD88とのmRNA発現を高めることを抑制する作用（半定量的RT-PCR法）である：10% NCS（v/v）を含有するDMEM培養液でRAW264.7細胞懸濁液の濃度を1×106/mlまで調製する。実験は、LPS又はCpG DNA刺激組と、薬投与組と、空白組とを設ける。LPS又はCpG DNA対照組それぞれにLPS（100ng/ml）又はCpG DNA（10μg/ml）を加え、KB薬投与組にLPS（100ng/ml）又はCpG DNA（10μg/ml）を加えるとともに、KB(200μM)を加入し、空白対照組（Medium）に何か試薬を加えない。試料加入終了、1時間続けて培養する。トータルRNA抽出及び逆転写が実施例15のステップにより行われる。PCR法を用いてTLR4と、TLR9と、MyD88とのmRNA発現を増幅する。配列は下記である。
【００７４】
2013525382.tif 000012
反応混合物を0.2ml PCR管に入れ、反応混合物にて1μl cDNAと、10.0μl 2×Taq Master Mixと、1μl上流プライマー(10μM) と、1μl下流プライマー(10μM) と、7μl RNase-free H2Oとを含有する。増幅プログラムは下記である。
【００７５】
2013525382.tif 000013
最後に、アガロースゲル電気泳動より産物を測定し、1%アガロースゲルを調製してキャスト成形する。各管の増幅産物5μlを取出して、装置に注入する。100Ｖで30分間電気泳動する。ゲルを取出し、スキャニングを行い、Quantity Oneソフトウェアを用いてイメージを分析する。
（2）KBがLPSとCpG DNAとがRAW264.7細胞のNF-κB p65活性化を刺激することに対する抑制作用（westernblot法）である。実験方法は上記と同じ、試料加入終了、1時間続けて培養し、核タンパク質を抽出し、westernblot法よりそのNF-κB p65を測定する。細胞核タンパク質抽出及びwesternblot操作ステップは実施例23と同じ。
【００７６】
25.2  実験結果：（1）半定量的RT-PCR測定結果から分かるのは、KB（200μM）はLPS（100ng/ml）又はCpG DNA（10μg/ml）から刺激で起こられるRAW264.7細胞TLR4と、TLR9と、MyD88との発現の向上を抑制できる。その結果を図29aとbに示す。その中に、図29aはKBがLPS及びCpG DNAがRAW264.7細胞TLR4とTLR9とのmRNA発現を高めることを抑制する作用であり、図29bはKBがLPS及びCpG DNA（CpG）がRAW264.7細胞MyD88のmRNA発現を高めることを抑制する作用である。（2）western blot測定結果から分かるのは、KB（200μM）はLPS（100ng/ml）又はCpG DNA（10μg/ml）がRAW264.7細胞核のNF-κB p65サブユニットを向上することに対して抑制作用を有する。これは、KBがLPSとCpG DNAとから刺激で起こられるRAW264.7細胞NF-κBを活性化することをに対して抑制作用を有する。その結果を図29cに示す。
【００７７】
実施例26：KBがLPS又はCpG DNAを結合して、RAW264.7細胞とマウス腹腔マクロファージ細胞の生存率に対する影響である（MTT法）。
26.1  実験方法：
（1）RAW264.7細胞生存率に対する影響：実施例7と同じ、実験は対照組（medium）と、KB組（50、100、200、400、800μM）と、LPS（100ng/ml）+KB（0、100、200、400μM）組と、CpG DNA（10μg/ml）+KB（0、100、200、400μM）組とを設ける。PBSでMTTを5 mg/mlと調製し、溶解させ、濾過した後、原液とし、-20℃で保管する。RAW264.7細胞懸濁液の濃度を1×106/mlまで調製し、96ウェル細胞培養用プレート（200μl/ウェル）に入れ、37℃、5% CO2で4時間培養した後、実験の組みに応じて、それぞれに所定濃度のLPS、CpG DNA、KBを加え、37℃、5% CO2で24時間培養した後、1000rpm/min、5分の遠心分離を行ない、細胞培養上清を取り捨て、毎ウェルに180ml培養液と20ml MTT原液を加入し、37℃、5% CO2で4時間培養した後、1000 rpm/min、10分の遠心分離を行ない、細胞培養上清を取り捨て、毎ウェルに150mlジメチルスルホキシド（DMSO）を加入し、10分間振とうし結晶を十分に溶解させ、すぐにマイクロプレートリーダーより波長550nmで各ウェルの吸光度を測定して、RAW264.7細胞の相対生存率を示す。
（2）マウス腹腔マクロファージ細胞の生存率に対する影響：実験方法は上記と同じ、KBがLPS又はCpG DNA（CpG）を結合して、マウス腹腔マクロファージ細胞の生存率に対する影響を測定する。
【００７８】
26.2  実験結果：KB又は、KBとLPS又はCpG DNAと共同でRAW264.7細胞を処理した後、各組みは対照組（Medium）に比べて、吸光度は統計的に有意差がない。これから分かるのは、KBよりRAW264.7細胞がTNF-αとIL-6を放出することに対して抑制作用はその細胞毒性から起こされない。マウス腹腔マクロファージ細胞の生存率を観察する結果も同じ、KBは初代細胞にLPSとCpG DNAに対する拮抗活性もマウス腹腔マクロファージ細胞の生存率を影響することから起こされない。その結果を図30に示す。その中に、図30aはKBがRAW264.7細胞の生存率に対する影響であり、図30bはKBがLPS又はCpG DNAを結合して、RAW264.7細胞の生存率に対する影響であり、図30cはKBがマウス腹腔マクロファージ細胞の生存率に対する影響であり、図30dはKBがLPS又はCpG DNAを結合して、マウス腹腔マクロファージ細胞の生存率に対する影響である。
【００７９】
実施例27：KBが致死量の加熱殺大腸菌がマウスを攻撃することを保護する作用（用量−効果関係）を観察する。
27.1  実験方法：
（1）単回投与実験：
(1)実験1：昆明産マウス40匹（18〜20ｇ）は雄雌各半分であり、ランダムで加熱殺大腸菌対照群と、KB（30 mg/kg）処理群に分け、毎群に20匹を有する。動物の重さを量った後、加熱殺大腸菌対照群へ加熱殺大腸菌（体重当たり200 ml/20 g）と生理食塩水（体重当たり200 ml/20 g）を注射し、KB処理群へ加熱殺大腸菌を注射した5分後、KB（体重当たり200 ml/20 g）を注射する。その加熱殺大腸菌の注射量は1.0×1011 CFU/kgであり、KBの注射量は30 mg/kgである。注射終了、各群のマウスはそれぞれ個別のケージに移し飼育し、充分な同量の飼料及び水を与え、7日間内に各群のマウスの一般状態（精神状態、食欲、運動、刺激に対する反応）、死亡率、死期を観察する。
(2)実験2：生理食塩水でKBをそれぞれに1.5、3.0和6.0 mg/mlまで希釈し、加熱殺大腸菌懸濁液を生理食塩水で1.0×1010 CFU/mlまで希釈する。昆明産マウスは80匹は雄雌各半分であり、ランダムで加熱殺大腸菌対照群と、KB 15 mg/kg、KB 30 mg/kg、KB 60 mg/kg処理群に分け、毎群に16匹を有する。動物の重さを量った後、加熱殺大腸菌対照群へ加熱殺大腸菌（体重当たり200 ml/20 g）と生理食塩水（体重当たり200 ml/20 g）を注射し、KB処理群へ加熱殺大腸菌を注射した5分後、それぞれに1.5、3.0、6.0 mg/ml とのKB（体重当たり200 ml/20 g）を注射する。注射終了、各群のマウスはそれぞれ個別のケージに移し飼育し、充分な同量の飼料及び水を投与して、7日間内に各群のマウスの一般状態（精神状態、食欲、運動、刺激に対する反応）、死亡率、死期を観察する。
（2）反復投与実験：生理食塩水でKBをそれぞれに0.125、0.25、0.5 mg/mlまで希釈し、加熱殺大腸菌懸濁液に対する処理は上記と同じ、実験群を分けるのは上記と同じ。KB分量は1.25、2.5、5 mg/kgであり、投与時間は三日間内に8時間毎に一回投与する。各群のマウスの一般状態、死亡率、死期を観察する。
【００８０】
27.2  実験結果：
（1）単回投与実験：KMマウスが加熱殺大腸菌を注射された後、寄り集まり、振戦、飲食停止、6時間後病状が悪くなり、目を閉じ、外部からの刺激に対して反応が大きく低下し、体表温度を下げる。深刻なものは死亡が現れ、症状が重いものは次第に死亡が現れることを始め、死亡数のピークは主に12〜24時間に分布する。24時間後、個別マウスが死亡し、72時間以降マウスが死亡することは起こらない。7日間に、KB注射量の増加によるマウスの死亡率は下がる。その結果を図31aとbに示す。その中に、図31aはKB（30 mg/kg）の単回投与で致命的な用量の加熱殺大腸菌がマウスを攻撃することを保護する作用であり、図31bはKB（1.25、2.5、5 mg/kg）の単回投与で致命的な用量の加熱殺大腸菌がマウスを攻撃することを保護する作用である。
（2）反復投与実験：反復投与実験（三日間内に8時間毎に一回投与する）にて、その結果もKBがモデル動物の生存率を高めることを示す。その結果を図31cに示す。
【００８１】
実施例28：KBが亜致死量の加熱殺大腸菌がマウスを攻撃することに対して治療作用を観察する。
28.1  実験方法：昆明産マウスはランダムで二つ群に分られ、毎群に56匹を有する。1.0×109 CFU/ml大腸菌液を調製し、生理食塩水でKBを6 mg/mlと調製する。尾静脈注射方法を用いて対照群へ加熱殺大腸菌液（体重当たり0.2 ml/20 g）と生理食塩水（体重当たり0.2 ml/20 g）を注射し、KB治療群へ加熱殺大腸菌液S（体重当たり0.2 ml/20 g）とKB（体重当たり0.2 ml/20 g）を注射し、対照群及びKB治療群それぞれに薬物を注射した0、4、8、12、24、48、72 時間でランダムでマウスを選択して眼窩から静脈血を取出す。具体的な方法は下記である：マウスを頚椎脱臼法で殺し、75％アルコールで皮膚を消毒する。眼球を摘出して、自然に出す血を1.5 ml EP管へ移す。それに10μlを取出して非発熱性水に加入し、自然に5〜10 分間沈澱させ、1000rpm, 10分間の遠心分離を行い、上清を取って新たな遠心管へ移す。測定する前に-20℃で保管する。ほかのものを静かに放置して凝集になり、血清が析出した後、3000rpm, 10分間の遠心分離を行い、上清を取って新たな遠心管へ移す。測定する前に-20℃で保管する。
（1）血漿中のLPSレベルを測定する：血漿試料10 μlを190 μl生理食塩水に溶解して、よく混ぜ合わせる。EDS-99細菌内毒素測定システムの操作ステップよりLPS測定を行う。その結果は平準値±標準偏差値で表示され。
（2）血清サイトカインレベルを測定する：マウスの血量が少ないから、実験中、血清を希釈液で2倍希釈した後、測定する。ELISAキットの取り扱い説明書により操作を行い、TNF-αを測定し、その結果は平準値±標準偏差値で表示される。
【００８２】
28.2  実験結果：正常なKMマウスの血漿中のLPSのレベルは検出限界値以下（0.0015 EU/ml以下）である。亜致死量の加熱殺大腸菌（1.0×1010 CFU/ml）を注射した後、KMマウスの血漿中のLPSのレベルは急激に上昇し、8時間でピーク値（819.42±159.02 EU/ml）に達し、その後、次第に下がる。72時間で大体に正常レベルに接近する。KB治療群にマウスの血漿中のLPSのレベルは時間に応する変化傾向は細菌対照群と類似、なお、4、8、12、24、48時間などの複数時点で対照群より、著しくて低い（p<0.05またはp<0.01）。その同時に、正常なKMマウスの血清はただ基本レベルTNF-α（100 pg/ml以下）を有し、亜致死量の加熱殺大腸菌（1.0×1010 CFU/ml）を注射した後、KMマウスの血清中のLPSのレベルは急激に上昇し、4時間でピーク値（4068.40±962.49 pg/ml）に達し、その後、次第に下がる。72時間で大体に正常レベルに接近する。KB治療群にマウスの血清中のTNF-αのレベルは時間に応する変化傾向は細菌対照群と類似、4、8、12、24時間で対照群より、著しくて低い（p<0.01）。その結果を図32に示す。その中に、図32aはKBが亜致死量の加熱殺大腸菌がマウスの血漿中のLPSのレベルを攻撃することに影響することであり、図32bはKBが亜致死量の加熱殺大腸菌がマウスの血清中のTNF-αのレベルを攻撃することに影響することである。
【００８３】
実施例29：KBが致死量の加熱殺大腸菌がマウスを攻撃することを保護する作用（時間−効果関係）を観察する。
29.1  実験方法：生理食塩水でKBを6mg/mlと調製する。加熱殺大腸菌懸濁液を生理食塩水で1.0×1010 CFU/mlまで希釈する。昆明産マウス96匹は雄雌各半分であり、ランダムで加熱殺大腸菌対照群と、0 時間薬物投与群と、2 時間薬物投与群と、4 時間薬物投与群と、6 時間薬物投与群と、8 時間薬物投与群に分け、毎群に16匹を有する。動物の重さを量った後、加熱殺大腸菌対照群へ加熱殺大腸菌（体重当たり200ml/20 g）と生理食塩水（体重当たり200ml/20g）を注射し、KB薬物投与群へ加熱殺大腸菌を注射した0、2、4、6、8 時間後それぞれに6.0 mg/mlのKB（体重当たり200ml/20 g）を注射する。注射終了、各群のマウスはそれぞれ個別のケージに移し飼育し、充分な同量の飼料及び水を与え、7日間内に各群のマウスの一般状態（精神状態、食欲、運動、刺激に対する反応）、死亡率、死期を観察する。
29.2  実験結果：加熱殺大腸菌（1.0×1011CFU/kg）を注射した後、2時間でKB（60 mg/kg）を単回投与することで介入を行い、まだモデル動物の生存率を高める。しかし、2時間後（4、6、8時間）、薬物を投与することは明らかな保護作用を有しない。その結果を図33に示す。
【００８４】
実施例30：KBがマウスの主要臓器の病理形態に影響する。
30.1  実験方法：昆明産マウス16匹はランダムで四つの群に分けられ、毎群に4匹を有し、雄雌各半分である。実験は正常対照群とKB（60mg/kg）注射群に分け、正常群は頚椎脱臼法で殺し、KB注射群は注射した24、48、72 h時間でそれぞれに殺し、胸腔と腹腔を開け、マウスの心臓、肝、肺、腎、腸などの臓器を取出し、生理食塩水で洗浄した後、ホルムアルデヒド溶液に固定し、常軌で脱水、パラフィン包埋、HE染色、封止する。光学顕微鏡で組織病理学的変化を観察する。
30.2  実験結果：正常群のマウスに比べて、肺組織にて、KB群はより顕著な充血及び細胞浸潤がない、肝組織にて、KB群は各の肝細胞組織が中央静脈を中心とし、構造がはっきり、細胞膨張、壊死などの病理変化がない、腎組織にて、KB群は各時点で糸球体、ボーマン嚢の形態が正常で、顕著な変化がない、心筋組織にて、KB群の心筋細胞の配列ははっきり規則であり、壊死及び炎性細胞浸潤がない。上記の結果から分かるのは、KBは各時点（24、48、72 時間）でマウスの心臓、肺、肝、腎組織に対して、光学顕微鏡で顕著な変化を発見しない。その結果を図34に示す。その中に、図34aはKBを注射されたマウスの肺組織の形態学的な構造であり、図34bはKBを注射されたマウスの肝組織の形態学的な構造であり、図34cはKBを注射されたマウスの腎組織の形態学的な構造であり、図34dはKBを注射されたマウスの心筋組織の形態学的な構造である。
【図２３】
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【図３１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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