(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）によるケージドリジン又はその塩に関する。本発明は、さらに、ケージドリジンを含むポリペプチド、及びそれを作製する方法に関する。本発明は、さらに、ｔＲＮＡにケージドリジンを負荷することができるｔＲＮＡ合成酵素に関する。【選択図】図１４ｂ−ｃ
2013521269.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2013521269.tif 000008
(I)
によるケージドリジン又はその塩。
【請求項２】
請求項１に記載のケージドリジンを含むポリペプチド。
【請求項３】
ケージドリジンが、ポリペプチドにおける、野生型ポリペプチドにおけるリジン残基に対応する位置に存在する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ヌクレオチド三リン酸結合性タンパク質である、請求項２又は３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
キナーゼである、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ケージドリジンがキナーゼの触媒部位に存在する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
リジンが脱ケージングされることにより、ポリペプチドのキナーゼ活性が可能になる、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ポリペプチドをコードするＲＮＡの翻訳をアレンジすることを含む、請求項１に記載のケージドリジンを含む前記ポリペプチドを作製する方法であって、前記ＲＮＡが直交性コドンを含み、前記翻訳が、前記直交性コドンを認識し、請求項１に記載のケージドリジンを負荷されることができるｔＲＮＡの存在下、及び前記ｔＲＮＡに請求項１に記載のケージドリジンを負荷することができるｔＲＮＡ合成酵素の存在下、かつ請求項１に記載のケージドリジンの存在下で行われる、方法。
【請求項９】
ｔＲＮＡ合成酵素が、表Ｉに従って、野生型配列と比較して、１〜５個の位置にミューテーションを有するピロリジルｔＲＮＡ合成酵素を含み、前記ミューテーション（複数可）が、Ｍ２４１、Ａ２６７、Ｙ２７１、Ｌ２７４及びＣ３１３から選択される１〜５個の残基に対応する位置に存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｔＲＮＡ合成酵素が、Ｍ２４１Ｆ、Ａ２６７Ｓ、Ｙ２７１Ｃ及びＬ２７４Ｍである４つのミューテーションを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
直交性コドンがアンバーコドン（ＴＡＧ）である、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
直交性ｔＲＮＡがＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載のケージドリジンを含むポリペプチドを作製する方法であって、前記ポリペプチドをコードする核酸を修飾して、請求項１に記載のケージドリジンを組み入れることが望まれる前記ポリペプチド内の位置（複数可）に対応する１又は２以上の位置にアンバーコドンをもたらすことを含む、方法。
【請求項１４】
核酸を修飾することが、リジンのコドンをアンバーコドン（ＴＡＧ）にミューテーションさせることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項８〜１４のいずれかに記載の方法によって作製される、請求項２に記載の同種組換えポリペプチド。
【請求項１６】
表Ｉに従って、野生型配列と比較して、１〜５個の位置にミューテーションを有し、前記ミューテーション（複数可）がＭ２４１、Ａ２６７、Ｙ２７１、Ｌ２７４及びＣ３１３から選択される１〜５個の残基に対応する位置に存在する、ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項１７】
Ｍ２４１Ｆ、Ａ２６７Ｓ、Ｙ２７１Ｃ及びＬ２７４Ｍである４つのミューテーションを含む、請求項１６に記載の直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項１８】
直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素が請求項１６又は１７に記載の直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素であり、直交性ｔＲＮＡがＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡである、直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なケージング基、タンパク質に部位特異的に導入する方法におけるそれらの使用、及びその方法の使用を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物活性のある化合物は、その生物学的効力を遮断するために、分子内の重要な官能性を変化させる、光によって除去可能な保護基を用いて保護することができる。そのような基を保護する１つの方式は、ケージングとして公知である。例えば、系に照射することによる、脱ケージングは、保護（ケージング）基を除去し、分子の内因性の性質を回復させる。
【０００３】
タンパク質機能の正確な光化学的制御は、ケージング基を部位特異的に導入することによって実現することができる（(a) Deiters, A. Chembiochem 2010, 11, 47-53; (b) Lee, H. M.; Larson, D. R.; Lawrence, D. S. ACS Chem. Biol. 2009, 4, 409-427; (c) Deiters, A. Curr. Opin. Chem. Biol. 2009, 13, 678-686; (d) Young, D. D.; Deiters, A. Org. Biomol. Chem. 2007, 5, 999-1005、Mayer, G.; Heckel, A. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4900-4921）。タンパク質をインビトロで光ケージングするために、インビトロにおける翻訳（Endo, M.; Nakayama, K.; Kaida, Y.; Majima, T. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 5643-5645）及び化学的なライゲーション（Pellois, J. P.; Hahn, M. E.; Muir, T. W. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 7170-7171）を含めた化学的な方法及び酵素的な方法が使用されてきた。これらの方法は、拡張されて、透過処理（Hahn, M. E.; Muir, T. W. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 5800-5803）又はマイクロインジェクション（Pellois, J. P.; Muir, T. W. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 5713-5717）によってケージドタンパク質を細胞に導入することが可能になっているが、細胞送達は難しいままである。
【０００４】
最近、いくつかのアミノ酸のオルト−ニトロベンジル（ＯＮＢ，ortho-nitrobenzyl）ケージドバージョンが、アンバー終止コドンに対応して、遺伝的にコードされている（(a) Wu, N.; Deiters, A.; Cropp, T. A.; King, D.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 14306-14307; (b) Deiters, A.; Groff, D.; Ryu, Y. H.; Xie, J. M.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2728-2731; (c) Lemke, E. A.; Summerer, D.; Geierstanger, B. H.; Brittain, S. M.; Schultz, P. G. Nat. Chem. Biol. 2007, 3, 769-772、Chen, P. R.; Groff, D.; Guo, J. T.; Ou, W. J.; Cellitti, S.; Geierstanger, B. H.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 4052-4055）。ＯＮＢ基は、生理的条件下では安定であるが、２５０〜３６５ｎｍのＵＶ光で容易に除去される。
【０００５】
ＯＮＢの適用では、効率的に光分解するために、核酸の光化学反応、ジスルフィドの破壊及び他の細胞の損傷を招くので細胞に対して毒性である２５０〜３６５ｎｍのＵＶ光範囲の下部を不都合に使用し、これは、単純なＯＮＢ基を使用してリジンをケージングする場合に起こり得る（Chen, P. R.; Groff, D.; Guo, J. T.; Ou, W. J.; Cellitti, S.; Geierstanger, B. H.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 4052-4055）。
【０００６】
リジン残基は、核局在化配列についての重要な決定因子であり（Stewart, M. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2007, 8, 195-208）、ユビキチン化、メチル化、及びアセチル化を含めた重要な翻訳後修飾の標的であり（Yang, X. J. Oncogene 2005, 24, 1653-1662）、多くの重要な酵素活性部位において重要な残基である。しかし、ＯＮＢケージングをリジン残基に適用することは、さらに、ＯＮＢケージドリジン残基の光分解生成物により、リジンのε−アミノ基の望ましくない縮合が導かれるので、不都合である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】(a) Deiters, A. Chembiochem 2010, 11, 47-53; (b) Lee, H. M.; Larson, D. R.; Lawrence, D. S. ACS Chem. Biol. 2009, 4, 409-427; (c) Deiters, A. Curr. Opin. Chem. Biol. 2009, 13, 678-686; (d) Young, D. D.; Deiters, A. Org. Biomol. Chem. 2007, 5, 999-1005
【非特許文献２】Mayer, G.; Heckel, A. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4900-4921
【非特許文献３】Endo, M.; Nakayama, K.; Kaida, Y.; Majima, T. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 5643-5645
【非特許文献４】Pellois, J. P.; Hahn, M. E.; Muir, T. W. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 7170-7171
【非特許文献５】Hahn, M. E.; Muir, T. W. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 5800-5803
【非特許文献６】Pellois, J. P.; Muir, T. W. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 5713-5717
【非特許文献７】(a) Wu, N.; Deiters, A.; Cropp, T. A.; King, D.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 14306-14307; (b) Deiters, A.; Groff, D.; Ryu, Y. H.; Xie, J. M.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2728-2731; (c) Lemke, E. A.; Summerer, D.; Geierstanger, B. H.; Brittain, S. M.; Schultz, P. G. Nat. Chem. Biol. 2007, 3, 769-772
【非特許文献８】Chen, P. R.; Groff, D.; Guo, J. T.; Ou, W. J.; Cellitti, S.; Geierstanger, B. H.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 4052-4055
【非特許文献９】Stewart, M. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2007, 8, 195-208
【非特許文献１０】Yang, X. J. Oncogene 2005, 24, 1653-1662
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、当技術分野では、リジンに対する効率的なケージング分子を提供することに関する問題がある。別の問題は、リジンに対する効率的なケージング分子がタンパク質に部位特異的に取り込まれることを可能にする方法及び／又はシステムを提供することである。別の問題は、ケージドタンパク質の細胞送達に関する目下の問題を緩和しながら、前記タンパク質を産生する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、３４０ｎｍを超えるＵＶ光を照射することによって効率的に脱ケージングするために、電子供与性置換基によってケージング基を誘導する、ケージド（caged）リジン分子に関する。
【００１０】
本発明は、さらに、表Ｉに従って、最大５つの位置にミューテーション（mutation）を有し、そのミューテーションが、Ｍ２４１残基、Ａ２６７残基、Ｙ２７１残基、Ｌ２７４残基及びＣ３１３残基に存在する直交性（orthogonal）ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素、及びそれから生じる直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対に関する。
【００１１】
本発明の別の態様は、本発明によるケージドリジンアミノ酸を真核細胞内のタンパク質にインビトロで組み入れる方法であって、
ｉ）当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列における、所望の部位にアンバーコドンを導入する、又は特定のコドンを置き換えるステップと、
ii）本明細書に記載の発現系を細胞に導入するステップと
iii）培地中において、培地中に存在する本明細書に記載のケージドリジンと共に細胞を培養させるステップと
を含む、方法に関する。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、３４０ｎｍを超えるＵＶ光を照射することによって、タンパク質の少なくとも１つの性質を決定すること又は変化させることにおける、本発明によるケージドリジンアミノ酸の使用に関する。
【００１３】
本発明は、３４０ｎｍを超えるＵＶ光を照射することで効率的に脱ケージングするために、電子供与性置換基によってケージング基を誘導する、ケージドリジン分子に関する。３５５ｎｍを超えるＵＶ光、好ましくは３６５ｎｍのＵＶ光を照射することでケージング基が効率的に脱ケージングされることが適切である。
【００１４】
光分解の副生成物はリジンのε−アミノ基と縮合しないことが適切である。
【００１５】
ケージドリジンは、式（Ｉ）
【００１６】
【化１】
2013521269.tif 000003
(I)
【００１７】
による、又はその塩であることが適切である。
【００１８】
別の態様では、本発明は、そのアミノ酸配列内に上記のケージドリジンが組み入れられたタンパク質に関する。組み入れは部位特異的であることが適切である。ケージドリジンの組み入れは、リジンアミノ酸の置き換えであることが適切である。前記置き換えられたリジンアミノ酸は天然に存在する配列内に存在していたことが適切である。
【００１９】
タンパク質を標識用分子と連結させることが適切である。標識用分子は蛍光タンパク質であることが適切である。
【００２０】
別の態様では、本発明は、表Ｉに従って、１〜５個の位置にミューテーション（複数可）を有するピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素）であって、ミューテーション（複数可）がＭ２４１、Ａ２６７、Ｙ２７１、Ｌ２７４及びＣ３１３から選択される１〜５個の残基に存在するピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素）に関する。直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素は、Ｍ２４１Ｆ、Ａ２６７Ｓ、Ｙ２７１Ｃ及びＬ２７４Ｍである４つのミューテーションを含むことが適切である。
【００２１】
別の態様では、本発明は、直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素が上記の直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素である、直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対に関する。直交性ｔＲＮＡはＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡであることが適切である。
【００２２】
別の態様では、本発明は、
ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡの発現がＣＭＶエンハンサーの下流のＵ６プロモーターの制御下にある、プラスミドなどの核酸と、
ＣＭＶエンハンサーの制御下にある上記の直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素を含む、プラスミドなどの核酸と
を含む、上記の直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を発現させるための、真核細胞における発現系に関する。
【００２３】
上記のケージドリジンアミノ酸を細胞内のタンパク質にインビトロで組み入れる方法であって、
当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列における、所望の部位において、アンバーコドンなどの直交性コドンを導入する、又は、特定のコドンをアンバーコドンなどの直交性コドンに置き換えるステップと、
上記の発現系を細胞に導入し、その細胞を、培地中において、培地中に存在する上記のケージドリジンと共に培養させるステップと
を含む、方法。
【００２４】
当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列における、リジンのコドンをアンバーコドンに置き換えることが適切である。
【００２５】
別の態様では、本発明は、３４０ｎｍを超えるＵＶ光を照射することによって、タンパク質の少なくとも１つの性質を決定することにおいて使用するための上記のケージドリジンアミノ酸に関する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、３４０ｎｍを超えるＵＶ光を照射することによって、タンパク質の少なくとも１つの性質を変化させることにおいて使用するための上記のケージドリジンアミノ酸に関する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの性質を変化させることにより、そこから生じる生物学的効果の動態を測定することが可能になる、上記のケージドリジンアミノ酸に関する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、タンパク質の少なくとも１つの性質が真核細胞内のタンパク質の局在化である、上記のケージドリジンアミノ酸に関する。
【００２９】
当該タンパク質は真核細胞内にあることが適切である。
【００３０】
当該タンパク質はヒト体内にあることが適切である。
【００３１】
当該タンパク質はインビトロであることが適切である。
【００３２】
ここで、本発明を、番号を付したパラグラフによって説明する：
【００３３】
パラグラフ１．式（Ｉ）
【００３４】
【化２】
2013521269.tif 000004
(I)
【００３５】
によるケージドリジン又はその塩。
【００３６】
パラグラフ２．パラグラフ１に記載のケージドリジンを含むポリペプチド。
【００３７】
パラグラフ３．ケージドリジンが、ポリペプチドにおける、野生型ポリペプチドにおけるリジン残基に対応する位置に存在する、パラグラフ２に記載のポリペプチド。
【００３８】
パラグラフ４．ヌクレオチド三リン酸結合性タンパク質である、パラグラフ２又はパラグラフ３に記載のポリペプチド。
【００３９】
パラグラフ５．キナーゼである、パラグラフ４に記載のポリペプチド。
【００４０】
パラグラフ６．ケージドリジンがキナーゼの触媒部位に存在する、パラグラフ５に記載のポリペプチド。
【００４１】
したがって、本発明は、光活性化可能なキナーゼを提供する。本発明は、キナーゼを光活性化する方法であって、前記キナーゼの触媒ドメイン内のケージドリジン残基を脱ケージングするステップを含む方法にも関する。
【００４２】
ケージドリジンは、キナーゼの触媒部位の保存されたリジン残基、例えば、ＭＥＫのＫ９７に対応する残基などに存在することが適切である。
【００４３】
キナーゼは、ＭＡＰキナーゼカスケードのメンバーであることが適切である。キナーゼは、ＭＥＫ（ＭＡＰＫＫ）であることが適切である。
【００４４】
パラグラフ７．リジンが脱ケージングされることにより、ポリペプチドのキナーゼ活性が可能になる、パラグラフ６に記載のポリペプチド。
【００４５】
パラグラフ８．パラグラフ１に記載のケージドリジンを含むポリペプチドを作製する方法であって、前記ポリペプチドをコードするＲＮＡの翻訳をアレンジする（arranging）ことを含み、前記ＲＮＡが直交性コドンを含み、前記翻訳が、前記直交性コドンを認識し、パラグラフ１に記載のケージドリジンを負荷されることができるｔＲＮＡの存在下、及び前記ｔＲＮＡにパラグラフ１に記載のケージドリジンを負荷することができるｔＲＮＡ合成酵素の存在下、及びパラグラフ１に記載のケージドリジンの存在下で行われる、方法。
【００４６】
パラグラフ９．ｔＲＮＡ合成酵素が、表Ｉに従って、野生型配列と比較して、１〜５個の位置にミューテーションを有するピロリジルｔＲＮＡ合成酵素を含み、そのミューテーション（複数可）が、Ｍ２４１、Ａ２６７、Ｙ２７１、Ｌ２７４及びＣ３１３から選択される１〜５個の残基に対応する位置に存在する、パラグラフ８に記載の方法。
【００４７】
パラグラフ１０．ｔＲＮＡ合成酵素が、Ｍ２４１Ｆ、Ａ２６７Ｓ、Ｙ２７１Ｃ及びＬ２７４Ｍである４つのミューテーションを含む、パラグラフ９に記載の方法。
【００４８】
パラグラフ１１．直交性コドンがアンバーコドン（ＴＡＧ）である、パラグラフ８〜１０のいずれかに記載の方法。
【００４９】
パラグラフ１２．直交性ｔＲＮＡがＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡである、パラグラフ１１に記載の方法。
【００５０】
パラグラフ１３．パラグラフ１に記載のケージドリジンを含むポリペプチドを作製する方法であって、前記ポリペプチドをコードする核酸を修飾して、パラグラフ１に記載のケージドリジンを組み入れることが望まれる前記ポリペプチド内の位置（複数可）に対応する１又は２以上の位置にアンバーコドンをもたらすことを含む、方法。
【００５１】
パラグラフ１４．核酸を修飾することが、リジンのコドンをアンバーコドン（ＴＡＧ）にミューテーションさせることを含む、パラグラフ１３に記載の方法。
【００５２】
パラグラフ１５．パラグラフ８〜１４のいずれかに記載の方法によって作製される、パラグラフ２に記載の同種組換えポリペプチド。
【００５３】
パラグラフ１６．表Ｉに従って、野生型配列と比較して、１〜５個の位置にミューテーションを有し、そのミューテーション（複数可）が、Ｍ２４１、Ａ２６７、Ｙ２７１、Ｌ２７４及びＣ３１３から選択される１〜５個の残基に対応する位置に存在する、ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素。
【００５４】
パラグラフ１７．Ｍ２４１Ｆ、Ａ２６７Ｓ、Ｙ２７１Ｃ及びＬ２７４Ｍである４つのミューテーションを含む、パラグラフ１６に記載の直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素。
【００５５】
パラグラフ１８．直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素がパラグラフ１６又は１７に記載の直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素であり、直交性ｔＲＮＡがＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡである、直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
ここで、本発明を以下の図面との関連で説明する：
【図１】化合物４の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】化合物１の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３】Ａ．ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ及び４位にアンバーコドンを有するミオグロビン（ｐＭｙｏ４ＴＡＧＨｉｓ６）を発現している大腸菌細胞由来の細胞抽出物の、１ｍＭの光ケージドリジン１の存在下又は非存在下での抗Ｈｉｓタグ免疫ブロットを示す図である。Ｂ．ＭｂＰｙｌＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対を含有し、ε−Ｂｏｃ−リジン（ＢｏｃＫ）（１ｍＭ）と一緒に培養させた細胞、又はＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対を含有し、１（５ｍＭ）と一緒に培養させた細胞のいずれか由来の、Ｎｉ−ＮＴＡ精製したｓｆＧＦＰ−ｈｉｓ６のクーマシー染色したゲルを示す図である。１４５位のアンバーコドンに応じて、ｓｆＧＦＰに非天然アミノ酸が導入された。ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対を使用して１を組み入れることによって得られたｓｆＧＦＰ−ｈｉｓ６の収量は１ｍｇ／Ｌであり、これは、ＭｂＰｙｌＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対を用いて効率的に組み入れられることが公知のＢｏｃＫ(Nguyen, D. P.; Lusic, H.; Neumann, H.; Kapadnis, P. B.; Deiters, A.; Chin, J. W. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 8720-8721)を用いて得られた収量に匹敵する。Ｃ．ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ（２ｍＭの１と一緒に）によって産生されるミオグロビンのＥＳＩ−ＭＳ分析により、質量が１８６３４Ｄａであることが明らかになった（ピークＡ；予測された質量１８６３１．７Ｄａ）。遊離のリジンを有するミオグロビンに対応する第２のピークも検出される（ピークＢ；得られた質量１８３９６Ｄａ、予測された質量１８３９５．７Ｄａ）。遺伝子の発現実験及びタンパク質の発現実験により、タンパク質の発現はアミノ酸に依存的であることが示されたので、このピークは、光を排除することができない試料の調製中に、組み入れられた１が脱ケージングされたことに起因し得る。Ｄ．ｓｆＧＦＰ（１４５−１）に由来するトリプシンペプチドのＭＳ／ＭＳ断片化を示す図である（スペクトルの上にペプチド配列が示されている；ＭＨ＋ペプチド質量２１４５．９７２Ｄａ）。このスペクトルにより、コドン１４５における１の組み入れが確認される。スペクトルの上に断片化部位を例示している。アスタリスク（＊）が付いている断片は、試料を脱ケージングする３５５ｎｍのＭＡＬＤＩレーザーを使用するので、ケージド基を含有しない。Ｅ．３６５ｎｍの光を用いて０分間、１分間及び５分間、光分解した後の、ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ（２ｍＭの１と一緒に）によって産生されるミオグロビンのＥＳＩ−ＭＳ分析を示す図である（Ａ：ケージドタンパク質の質量１８６３３．０±１．８Ｄａ、予測された質量１８６３１．７Ｄａ；Ｂ：アンケージドタンパク質の質量１８３９５．４±０．７Ｄａ、予測された質量１８３９５．７）。
【図４】１．哺乳動物の細胞への光ケージドリジンの遺伝的な組み入れを示す図である。Ａ．光ケージドリジン１である。Ｂ、Ｃ．ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対により、アンバーコドンに応じて１（１ｍＭ）をＨＥＫ２９３細胞に特異的に組み入れることが可能になる；Ｂ．１と一緒に、又は１なしでｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＡＧ−ｅｇｆｐ−ｈａ及びＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡを発現しているＨＥＫ２９３細胞の蛍光共焦点顕微鏡写真である；Ｃ．Ｂからの細胞の、抗ＨＡを用いた免疫ブロット（ＩＢ）である。Ｄ．ＨＥＫ２９３細胞において発現させた１を組み入れたｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＧＦＰ−ＨＡを、その後のＭＳ／ＭＳ分析のために抗ＨＡ免疫沈降によって精製した。精製されたタンパク質に由来するトリプシンペプチドのＭＳ／ＭＳ断片化のスペクトルにより、１が予測された部位に組み入れられたことが確認される。アスタリスク（＊）で印をつけた断片は、ＭＳ／ＭＳの間のペプチド断片の脱ケージングの結果生じたものである。
【図５】ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対により、アンバーコドンに応じて１（１ｍＭ）をＨＥＫ２９３細胞内のタンパク質に特異的に組み入れることが可能になることを示す図である。ＨＥＫ２９３細胞に、１ｍＭの１の存在下又は非存在下でｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＡＧ−ｅｇｆｐ−ｈａ及びＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡでトランスフェクトした。実験の抗ＨＡ免疫ブロット、抗ＤｓＲｅｄ免疫ブロット及び抗Ｆｌａｇ免疫ブロットが示されている。抗ＨＡ免疫ブロットは、全長のｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ−ＨＡの発現レベルを示し、抗Ｄｓ−Ｒｅｄ免疫ブロットは、短縮されたタンパク質の相対量を示し、抗ｆｌａｇ免疫ブロットは、Ｎ末端のｆｌａｇタグを保有するＰＣＫＲＳの発現レベルを示す。ＰＣＫＲＳが存在しない、又は／及びＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡが存在しない、又はｈＴｙｒｔＲＮＡＣＵＡに置き換わっている対照実験も示されている。
【図６】ＭｂＰｙｌＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対及びＭｍＰｙｌＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対（ＭｂＰｙｌＲＳはＭ．バーケリ（M. barkeri）由来であり、ＭｍＰｙｌＲＳはＭ．マゼイ（M. mazei）由来である）により、ε−Ｂｏｃ−リジン（ＢｏｃＫ）（２ｍＭ）を、アンバーコドンに応じて、ＨＥＫ２９３細胞内のタンパク質に特異的に組み入れることが可能になることを示す図である。Ａ．２ｍＭのＢｏｃＫの存在下又は非存在下でｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＡＧ−ｅｇｆｐ−ｈａ及びＭｂＰｙｌＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡを発現しているＨＥＫ２９３細胞の蛍光共焦点顕微鏡写真である（緑色：ＥＧＦＰ蛍光、赤色：ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光）。Ｂ．２ｍＭのＢｏｃＫの存在下又は非存在下でｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＡＧ−ｅｇｆｐ−ｈａ及びＭｍＰｙｌＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡを発現しているＨＥＫ２９３細胞の蛍光共焦点顕微鏡写真である（緑色：ＥＧＦＰ蛍光、赤色：ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光）。Ｃ．Ａ．及びＢ．に示されている実験の抗ＨＡ免疫ブロット及び抗Ｆｌａｇ免疫ブロットである。抗ｆｌａｇ免疫ブロットは、Ｎ末端のｆｌａｇタグを保有するＭｂＰｙｌＲＳ及びＭｍＰｙｌＲＳの発現レベルを示す。ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡが存在しない、又はｈＴｙｒｔＲＮＡＣＵＡに置き換わっている対照実験も示されている。Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル。
【図７】タンパク質の局在化の光による制御を示す図である。Ａ．核質の二分核定位シグナル（ＮＬＳ，Bipartite nuclear localization signal）である：太字のリジンをアラニンにミューテーションさせた（ＮＬＳ−Ａ）又はアンバー終止コドンに置き換えた（ＮＬＳ−＊）。Ｂ．ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対により、１（１ｍＭ）を、アンバーコドンに応じてｎｌｓ−＊−ｇｆｐ−ｈａに特異的に組み入れることが可能になる（レーン２及び３）。対照：ＷＴＮＬＳ−ＧＦＰ−ＨＡ（レーン１）の発現、ＮＬＳ−Ａ−ＧＦＰ−ＨＡ（レーン５）、ＮＬＳ−＊−Ｙ−ＧＦＰ（ｈＴｙｒ−ｔＲＮＡＣＵＡを用いてＹを組み入れた）の発現（レーン４）、トランスフェクトしていない細胞（レーン６）。Ｃ．ＧＦＰ融合物の細胞内への局在化を示す蛍光共焦点顕微鏡写真である；光分解：１秒、３６５ｎｍ、１.２ｍＷ／ｃｍ２。Ｄ．ＮＬＳ−＊−１−ＧＦＰ−ＨＡの場合の、光分解する前、及び光分解の４分後の平均の核のＧＦＰ蛍光と細胞質のＧＦＰ蛍光のＦ（ｎ／ｃ）比である（データは、２７個の細胞の平均±ＳＤを表す、代表的な例については図１０を参照されたい）。Ｅ．核内移入プロセスの動態分析：グラフは、時間に応じた、正規化されたＦ（ｎ／ｃ）を示す（４つの細胞の平均±ＳＤ）。２０秒の半減時間を決定した。スケールバーは１０μｍである。
【図８】ｐ５３の局在化の光による制御を示す図である。Ａ．ｐ５３の二分核定位シグナル（ＮＬＳＰ５３）である：太字のリジンＫ３０５を、アラニンにミューテーションさせた（ＮＬＳＰ５３−Ｋ３０５Ａ）又はアンバー終止コドンに置き換えた（ＮＬＳｐ５３−Ｋ３０５Ａ＊）。Ｂ．ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対により、１（１ｍＭ）を、アンバーコドンに応じて、ＨＥＫ２９３細胞内のｐ５３−Ｋ３０５＊−ＥＧＦＰ−ＨＡに特異的に組み入れることが可能になる（レーン２及び３）。対照：ｐ５３−ＥＧＦＰ−ＨＡ及びＰ５３−Ｋ３０５Ａ−ＥＧＦＰ−ＨＡの発現（レーン１及び５）、ｐ５３−Ｋ３０５＊−Ｙ−ＥＧＦＰ−ＨＡ（ｈＴｙｒ−ｔＲＮＡＣＵＡを用いてＹを組み入れた）の発現（レーン４）、トランスフェクトしていない細胞（レーン６）。Ｃ．野生型ｐ５３、ｐ５３−Ｋ３０５ＡのＥＧＦＰ融合物の細胞内への局在化を示す蛍光共焦点顕微鏡写真である。Ｄ．ＥＧＦＰ融合物の、光分解する前、及び光分解（５秒；３６５ｎｍ；１.２ｍＷ／ｃｍ２）の５０分後の細胞内への局在化を示す共焦点顕微鏡写真である。Ｅ．ｐ５３−Ｋ３０５＊−１−ＥＧＦＰ−ＨＡの場合の、光分解する前、及び光分解の３０分後の平均の核のＥＧＦＰ蛍光と細胞質のＥＧＦＰ蛍光のＦ（ｎ／ｃ）比である（データは、７つの細胞の平均±ＳＤを表す）。スケールバーは１０μｍである。
【図９】Ａ．野生型ｐ５３、ｐ５３−Ｋ３０５Ａ、ｐ５３−Ｋ３０５＊−Ｙ（ｈＴｙｒ−ｔＲＮＡＣＵＡを用いてＹを組み入れた）、ｐ５３−Ｋ３０５＊−Ｂｏｃ（ＭｂＰｙｌＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡを使用してＢｏｃＫを組み入れた）及びｐ５３−Ｋ３０５＊−１（ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡを使用して１を組み入れた）のＥＧＦＰ融合物の細胞内への局在化を示す蛍光共焦点顕微鏡写真である。Ｂ．光分解する前、及び光分解（５秒；３６５ｎｍ；１．２ｍＷ／ｃｍ２）の５０分後のｐ５３−Ｋ３０５＊−ＢｏｃＫの局在化を示す写真である。Ｃ．光分解（５秒；３６５ｎｍ；１.２ｍＷ／ｃｍ２）後のｐ５３−Ｋ３０５＊−１−ＥＧＦＰの再局在化の例を示す写真である。各枠に光分解後の時間が分単位で示されている。１６色のスケールを使用してＥＧＦＰ蛍光を示している。Ｄ．ｐ５３の再局在化の動態解析を示す図である。２つの異なる例について、平均の核のＧＦＰ蛍光と細胞質のＧＦＰ蛍光のＦ（ｎ／ｃ）比が、時間に応じて示されている。スケールバーは１０μｍを示す。
【図１０】ＮＬＳ＊１−ＧＦＰ融合物（ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡを使用して１を組み入れた）の、光分解する前、及び光分解（１〜２秒；３６５ｎｍ；１．２ｍＷ／ｃｍ２）の４分後の細胞内への局在化を示す代表的な共焦点顕微鏡写真である。スケールバーは１０μｍを示す。
【図１１】使用した主要なプラスミドのマップである。
【図１２】本発明のケージドリジン及び適用を示す図である。
【図１３】本発明において適用可能な代替のケージドリジンを示す図である。
【図１４】ＭＥＫ１活性部位の光ケージドリジンを遺伝的にコードすることによるＭＡＰキナーゼシグナル伝達におけるサブネットワークの分離を示す図である。（ａ）ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路及びその光活性化可能なサブネットワークの概略である。（ｂ）ＭＥＫ１活性部位のほぼ普遍的に保存されたリジンをケージングすることにより、ＡＴＰの結合が立体的に遮断されることによって酵素が不活性化する。光を用いて脱ケージングすることにより、ケージング基が急速に除去され、キナーゼが活性化する（Ｐｙｍｏｌの構造及びＭＥＫ１の構造を使用して創出した図、ＰＤＢ：１Ｓ９Ｊ）。（ｃ）ＰＣＫＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対によって遺伝的にコードし、アンバーコドンに応じて１をタンパク質に組み入れることを可能にすることができる、光ケージドリジン１の構造。
【図１５】ケージドＭＥＫ１を光活性化した際のＥＲＫ２の特異的なリン酸化及び活性化を示す図である。（ａ）ＰＣＫＲＳ、ピロリジルｔＲＮＡＣＵＡ、Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡ及びＥＧＦＰ−ＥＲＫ２（ＴＥＹ、レーン７及び８；又はＡＡＡ、レーン９及び１０のいずれか）をコードするプラスミドを同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＥＴ細胞を、２ｍＭのアミノ酸１を補充した培地中（レーン８及び１０）、又はアミノ酸１なしの培地中（レーン７及び９）で、２４時間にわたって培養させた。対照として、細胞に、ＰＣＫＲＳ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２（ＴＥＹ又はＡＡＡ）及びピロリジルｔＲＮＡＣＵＡ及びＡ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン１及び２）；又はＰＣＫＲＳ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２（ＴＥＹ又はＡＡＡ）及びピロリジルｔＲＮＡＣＵＡ及びＤ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡ（レーン３及び４）をコードするプラスミド；又はＰＣＫＲＳ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２（ＴＥＹ又はＡＡＡ）及びチロシンｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ及びＣ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン５及び６、アンバーサプレッサーであるチロシンｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを使用することによって、アンバーコドンに応じてＣ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡ遺伝子にＴｙｒを組み入れて、Ｄ＊−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡと称される不活性なＭＥＫ１をもたらした）をトランスフェクトした。（ｂ）ＰＣＫＲＳ、ピロリジルｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、及びＡ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン２）、又は、ＰＣＫＲＳ、ピロリジルｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、及びＤ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン３〜６）、又は、ＰＣＫＲＳ、ピロリジルｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、及びＣ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン７〜１０）を同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＥＴ細胞を、２ｍＭの１及び０．１％のＦＢＳを補充した培地中で２４時間にわたって培養させた。Ｄ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡ及びＣ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡを発現している細胞を、３６５ｎｍのＬＥＤランプを用いて６０秒間照明した。照明した１分後、１０分後及び６０分後に細胞を溶解した。（ｃ）ＰＣＫＲＳ、ピロリジルｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、及びＡ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン２）、又は、ＰＣＫＲＳ、ピロリジルｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、及びＤ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン３、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８）又は、ＰＣＫＲＳ、ピロリジルｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、及びＣ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン４、７、８、１１、１２、１５、１６、１９、２０）を同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＥＴ細胞を、２ｍＭのアミノ酸１及び０．１％のＦＢＳを補充した培地中で２４時間にわたって培養させた。Ｄ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡ及びＣ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡを発現している細胞を、３６５ｎｍのＬＥＤランプを用いて５秒間（レーン５〜８）、１５秒間（レーン９〜１２）、３０秒間（レーン１３〜１６）及び６０秒間（レーン１７〜２０）照明した。照明した１分後及び１０分後に細胞を溶解���た。（ｄ）ＰＣＫＲＳ、ピロリジルｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、及びＣ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン１〜４）、又は、ＰＣＫＲＳ、ピロリジルｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、及びＤ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン５〜８）、又は、ＰＣＫＲＳ、ピロリジルｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、及びＡ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン９〜１２）を同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＥＴ細胞を、２ｍＭのアミノ酸１及び０．１％のＦＢＳを補充した培地中で２４時間にわたって培養させた。照明する前に、細胞を、０μＭ又は１０μＭのＵ０１２６と一緒に３０分間インキュベートした。示されている場合、細胞を、３６５ｎｍのＬＥＤランプを用いて６０秒間照明した。照明した１０分後に細胞を溶解した。（ａ〜ｄ）細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後、示された抗体を用いて免疫ブロット（ＩＢ，immunoblotting）を行った。
【図１６】ＥＧＦ刺激の際のＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核内移行を示す図である。（ａ）同時発現させたｗｔ−ＭＥＫ１を１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを加えることによって活性化した後の異なる時点におけるＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の細胞内の蛍光を示すモンタージュである。スケールバーは、５μｍを示す。（ｂ）グラフは、活性化後の時間に応じた、正規化されたＦ（ｎ／ｃ）（７つの代表的な細胞の平均±ＳＤ）を示す。（ｃ）グラフは、７回の独立した実験の、活性化後の時間に応じたＦ（ｎ／ｃ）を示す。（ｄ）グラフは、７回の独立した実験の、活性化後の時間に応じた、正規化されたＦ（ｎ／ｃ）を示す。
【図１７】ケージドＭＥＫ１を光活性化した際のＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核内移行を示す図である。（ａ）ＰＣＫＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ、及びＣ−ＭＥＫ１−ＤＤ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２−ＴＥＹをコードするプラスミド（ケース１及び２）、又は、ＰＣＫＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ、及びＤ−ＭＥＫ１−ＤＤ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２−ＴＥＹをコードするプラスミド（ケース３）、又は、ＰＣＫＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ、及びＣ−ＭＥＫ１−ＤＤ／ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２−ＡＡＡをコードするプラスミド（ケース４）を同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＥＴ細胞を、２ｍＭのアミノ酸１及び０．１％のＦＢＳを補充した培地中で２４時間にわたって培養させた。ケース２では、細胞を、１０μＭのＵ０１２６と一緒にプレインキュベートした。照明する前、及び照明（２秒、３６５ｎｍ、１ｍＷ／ｃｍ２）の１０分後の代表的な細胞のＥＧＦＰ蛍光が各ケースに示されている。図は、点線に沿って、照明前（黒色）及び照明後（灰色）の蛍光強度を示す。スケールバーは、１０μｍを示す。（ｂ）ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核内移行の定量的分析である。左側のグラフは、（ａ）に示されている場合の照明前（白棒）及び照明の１０分後（黒棒）の平均の核のＥＧＦＰ蛍光と細胞質のＥＧＦＰ蛍光のＦ（ｎ／ｃ）比を示す。それぞれの場合について、１０個の代表的な細胞の平均±標準偏差（ＳＤ，standard deviation）が示されている。右側のグラフは、（ａ）に示されている場合の、照明する前、及び照明した１０分後のＦ（ｎ／ｃ）の差異を示す（ΔＦ（ｎ／ｃ）＝照明後のＦ（ｎ／ｃ）−照明前のＦ（ｎ／ｃ））。それぞれの場合について、１０個の代表的な細胞からのデータを箱ひげ図として示している（ひげの末端は、全データの最小値及び最大値を示す）。
【図１８】ケージドＭＥＫ１を光活性化した際のＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核内移行の動態を示す図である。（ａ）同時発現させたＣ−ＭＥＫ１−ＤＤを光活性化（２秒、３６５ｎｍ、１ｍＷ／ｃｍ２）した後の異なる時点におけるＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の細胞内の蛍光を示すモンタージュである。スケールバーは、５μｍを示す。（ｂ）グラフは、光活性化した後の時間に応じた、正規化されたＦ（ｎ／ｃ）を示す（１０個の代表的な細胞の平均±ＳＤ）。灰色の線は、細胞をＥＧＦで刺激した場合に観察された、図１６ｂに示されている正規化されたＦ（ｎ／ｃ）の比較として示されている。（ｃ）グラフは、１０回の実験の、活性化後の時間に応じたＦ（ｎ／ｃ）を示す。（ｄ）グラフは、１０回の独立した実験の、活性化後の時間に応じた正規化されたＦ（ｎ／ｃ）を示す。（ｅ、ｆ）ＥＧＦを用いて刺激した際のＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核内移行において観察された細胞間の変動性（データは図１６ｂ〜ｄに示されている、ｎ＝細胞７個）と、Ｃ−ＭＥＫ１−ＤＤを光活性化した際のＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核内移行において観察された細胞間の変動性（データはｂ〜ｄに示されている、ｎ＝細胞１０個）の比較である。２つのグラフは、それぞれ、（ｅ）活性化の際の移行プロセスの半減時間（ｔ１／２）及び（ｆ）観察されたＦ（ｎ／ｃ）の変化（ΔＦ（ｎ／ｃ）＝最大（Ｆ（ｎ／ｃ））−最小（Ｆ（ｎ／ｃ）））を示す。データは、箱ひげ図として表されている（ひげの末端は、全データの最小値及び最大値を示す）。（ｇ）同時発現させたＣ−ＭＥＫ１−ＤＤを光活性化（２秒、３６５ｎｍ、１ｍＷ／ｃｍ２）した後の初期の異なる時点における代表的なＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の細胞内の蛍光を示すモンタージュである（動画Ｓ１も参照されたい）。スケールバーは、１０μｍを示す。（ｈ）光活性化した後の初期の移行の動態である。光活性化した後の時間に応じた、正規化されたＦ（ｎ／ｃ）（１０個の代表的な細胞の平均±ＳＤ）が示されている。データはシグモイド関数に適合した。
【図１９】ＥＲＫ２の核細胞質間往復輸送（nucleocytoplasmic shuttling）を示す図である。（ａ）Ｃ−ＭＥＫ１−ＤＤ及びＥＧＦＰ−ＥＲＫ２を同時発現しているＨＥＫ２９３ＥＴ細胞を照明し（２秒、３６５ｎｍ、１ｍＷ／ｃｍ２）、次いで、照明の８分後に、光活性化されたＣ−ＭＥＫ１−ＤＤの活性を遮断するため、及び、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核からの流出を明らかにするために、Ｕ０１２６（１０μＭ）を加えた。下のモンタージュは、照明した後及びＵ０１２６を用いた照明後の遮断の異なる時間における、代表的なＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の細胞内の蛍光を示す。上のモンタージュは、Ｕ０１２６の添加を伴わない場合の、光活性化した後の異なる時間における、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の細胞内の蛍光の参照として示されている。スケールバーは、５μｍを示す。（ｂ）グラフは、照明した後の時間に応じた、正規化されたＦ（ｎ／ｃ）を示す（１０個の代表的な細胞の平均±ＳＤ）。矢印は、Ｕ０１２６を加えた時間を示す。比較として、阻害剤を添加しない場合の正規化されたＦ（ｎ／ｃ）が図１８ｂに灰色の線としてプロットされて示されている。
【図２０】（ａ）ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２（上）及びＥＧＦＰ−ＥＲＫ２Δ４（下）の、同時発現させたＣ−ＭＥＫ１−ＤＤを光活性化（２秒、３６５ｎｍ、１ｍＷ／ｃｍ２）した後の異なる時点における細胞内の蛍光を示すモンタージュである。スケールバーは、５μｍを示す。（ｂ）Ｃ−ＭＥＫ１−ＤＤを光活性化した際のＥＧＦＰ−ＥＲＫ２Δ４の核内移行の動態（１０個の代表的な細胞の平均±ＳＤ）を示すグラフである。灰色の線は、図１８ｂに示されているＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核内移行の動態の比較として示されている。（ｃ）（ａ）に示されている実験からのＦ（ｎ／ｃ）の最大値を示すプロットである（１０個の代表的な細胞の平均±ＳＤ）。（ｄ、ｅ）Ｃ−ＭＥＫ１−ＤＤ及びＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、又はＣ−ＭＥＫ１−ＤＤ及びＥＧＦＰ−ＥＲＫ２Δ４を同時発現しているＨＥＫ２９３ＥＴ細胞を、ＬＥＤランプを用いて１分間にわたって照明し、１分後、５分後、１０分後、１５分後、２０分後及び３０分後に溶解した。（ｄ）細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後、示された抗体を用いて免疫ブロット（ＩＢ）を行った。（ｅ）（ｄ）において観察されたＥＧＰＦ−ＥＲＫ２ミューテーション体のリン酸化を、それらの発現レベルによって数量化し、正規化し、時間に応じてプロットした（代表的な３つの独立したデータセットからのデータ）。
【図２１】（ａ）ＰＣＫＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ及びＣ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡ（レーン３及び４）をコードするプラスミドを同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＥＴ細胞を、１ｍＭの１（レーン４）を補充した培地中、又は１なしの培地中（レーン３）で２４時間にわたって培養させた。対照として、細胞に、ＰＣＫＲＳ及びピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ及びＡ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン１）；又は、ＰＣＫＲＳ及びピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ及びＤ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン２）；又は、ＰＣＫＲＳ及びチロシンｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ及びＣ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン５；アンバーサプレッサーであるチロシンｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを使用することによって、アンバーコドンに応じて、Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡ遺伝子にＴｙｒを組み入れ、Ｄ＊−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡと称される不活性な機能しないＭＥＫ１をもたらした）を同時トランスフェクトした。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後、示された抗体を用いて免疫ブロット（ＩＢ）を行った。（ｂ）内在性のＭＥＫを有する異なるＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡミューテーション体の発現レベルを比較した免疫ブロットである。
【図２２】細胞に、ＰＣＫＲＳ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２及びピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ及びＡ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン１及び２）；又は、ＰＣＫＲＳ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２及びピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ及びＤ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン３及び４）；又は、ＰＣＫＲＳ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２及びピロリジンｔＲＮＡＣＵＡのみをコードするプラスミド（レーン５及び６）；又は、ＰＣＫＲＳ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２及びチロシンｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ及びＣ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン７及び８；アンバーサプレッサーであるチロシンｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを使用することによって、アンバーコドンに応じて、Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡ遺伝子にＴｙｒを組み入れ、Ｄ＊−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡと称される不活性な機能しないＭＥＫ１をもたらした）；又は、ＰＣＫＲＳ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２及びピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ及びＣ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン９及び１０）を同時トランスフェクトした。レーン１１及び１２は、偽の、トランスフェクトしていない細胞を示す。トランスフェクトした後、ＨＥＫ２９３ＥＴ細胞を、２ｍＭの１及び０．１％のＦＢＳを補充した培地中で２４時間にわたって培養させた。示されている場合、細胞を３６５ｎｍのＬＥＤランプを用いて６０秒間照明し、照明の６０分後に溶解した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後、示された抗体を用いて免疫ブロット（ＩＢ）を行った。
【図２３】（ａ）ＰＣＫＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ及びＣ−ＭＥＫ１−ＤＤ−ＨＡ（レーン３及び４）をコードするプラスミドを同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＥＴ細胞を、２ｍＭの１を補充した培地中（レーン４）又は１なしの培地中（レーン３）で２４時間にわたって培養させた。対照として、細胞に、ＰＣＫＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ及びＡ−ＭＥＫ１−ＤＤ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン１）；又は、ＰＣＫＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ及びＤ−ＭＥＫ１−ＤＤ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン２）；又は、ＰＣＫＲＳ、チロシンｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ及びＣ−ＭＥＫ１−ＤＤ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン５；アンバーサプレッサーであるチロシンｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを使用することによって、アンバーコドンに応じて、Ｃ−ＭＥＫ１−ＤＤ−ＨＡ遺伝子にＴｙｒを組み入れ、Ｄ＊−ＭＥＫ１−ＤＤ−ＨＡと称される不活性な機能しないＭＥＫ１をもたらした）を同時トランスフェクトした。（ｂ）ＰＣＫＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、及びＡ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン１）、又は、ＰＣＫＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、及びＤ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン２〜３）又は、ＰＣＫＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、及びＣ−ＭＥＫ１−ΔＮ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン４〜５）、又は、ＰＣＫＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、及びＡ−ＭＥＫ１−ＤＤ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン６）、又は、ＰＣＫＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２、及びＤ−ＭＥＫ１−ＤＤ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン７〜８）又はＣ−ＭＥＫ１−ＤＤ−ＨＡをコードするプラスミド（レーン９〜１０）を同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＥＴ細胞を、２ｍＭの１及び０．１％のＦＢＳを補充した培地中で２４時間にわたって培養させた。示されている場合、Ｄ−ＭＥＫ１−ΔＮ又はＤＤ）−ＨＡ及びＣ−ＭＥＫ１−（ΔＮ又はＤＤ）−ＨＡを発現している細胞を、３６５ｎｍのＬＥＤランプを用いて６０秒間照明した。照明した１０分後に細胞を溶解した。（ａ〜ｂ）細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後、示された抗体を用いて免疫ブロット（ＩＢ）を行った。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明は、３４０ｎｍを超えるＵＶ光を照射することで効率的に脱ケージングするために、電子供与性置換基によってケージング基を誘導する、ケージドリジン分子に関する。ケージング基への電子の供与の効果により、３４０ｎｍを超える光を照射した場合にケージング基が効率的に脱ケージングされることが可能になる。ＵＶ照射は３５５ｎｍを超えることが好ましく、３６０〜３７０ｎｍであることが好ましく、約３６５ｎｍであることがさらに好ましい。他のケージング分子に関する利点は、これらの高いＵＶ波長で照射した場合のケージド分子の光分解の効率であることは当業者には明らかである。図３及び実施例３に示されているように、３６５ｎｍのＵＶ照射により、５分後に、本質的にケージドタンパク質の集団全体が脱ケージされる。
【００５８】
ケージング基は、光分解の際に光分解の副生成物がリジンのｅ−アミノ基との縮合反応において反応しないように構築することがさらに好ましい。好ましい実施形態は、本発明によるケージドリジンが式（Ｉ）
【００５９】
【化３】
2013521269.tif 000005
(I)
【００６０】
によるものである、又はその塩である場合である。
【００６１】
本発明の別の態様は、タンパク質のアミノ酸配列に組み入れられた場合の上記のケージドリジンである。以下に考察するように、利点は、これにより、タンパク質の特定の性質の決定及び／又は変更が可能になることである。ケージドリジンがタンパク質の特定のポイントに存在することに起因してタンパク質の特定の性質の決定／変更が有利に可能になるので、組み入れは部位特異的であることが好ましい。
【００６２】
部位特異的なケージドリジンアミノ酸の組み入れは、ポリペプチド配列内の任意のポイントにおけるものであってよい。これは、一般には、対象とするポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列の部位特異的ミューテーション、その後のその核酸の、ポリペプチドへの転写（必要であれば）及び翻訳によって実現される。組み入れは、現存するコドンを置き換えることによるものであってよい、又は、コドンを挿入することによるものであってよい。一般には、ケージドリジンを指定するために使用されるコドンは、アンバーコドンＴＡＧ（ＣＵＡ）である。しかし、当然、組み入れのために使用されるｔＲＮＡ合成酵素−ｔＲＮＡ対が、異なるコドン（又は四つ組コドン）を認識するｔＲＮＡを含む場合、アンバーコドンの代わりにそのｔＲＮＡ合成酵素−ｔＲＮＡ対の対応する同族のコドンを使用する。アンバーコドンは、それによって遺伝的な組み入れを容易に実現することができる適切な直交性コドンの好ましい例であるが、そのような任意の他のコドン（複数可）の同族のｔＲＮＡに負荷する適切な系を使用することができるのであれば、これに限定するものでも、他のコドン（複数可）の使用を排除するものでもない。
【００６３】
タンパク質のアミノ酸配列へのケージドリジンアミノ酸の部位特異的な組み入れは、タンパク質の野生型配列に存在するリジン残基の置き換えであることがさらに好ましい。前記タンパク質の利点は、一度照射及びその結果として生じる脱ケージングが起これば、そのリジン残基の内因性の性質、したがって、そのリジンによって媒介される（又はその影響を受ける）タンパク質の生物学的効果（複数可）を経験的に決定することが可能になることである。
【００６４】
好ましい一実施形態では、上記の本発明によるタンパク質を、さらに標識用分子と連結させる。標識用分子は、タンパク質の一部の生物学的に関連性のある性質又は機能を決定するための実験的な状況の下で当業者が使用することができる任意の分子であってよい。そのような分子の一部の例は、放射性元素、蛍光マーカー又は発光マーカーである。タンパク質と標識用分子を連結する方法は、使用する標識用分子の種類に完全に左右され、その選択は、十分に当業者の専門知識の範囲内である。前記系の好ましい例では、標識用分子は、ケージドリジンが組み入れられたタンパク質のＣ末端と融合したＧＦＰなどの蛍光タンパク質である。前記例は、タンパク質を連結する方法は、ＧＦＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、ケージドアミノ酸を有するタンパク質をコードするプラスミドに組み入れることによって容易に実現されるので、好ましい。前記好ましい例では、細胞において発現させた、生じたタンパク質は、容易に可視化される。
【００６５】
本発明の別の態様は、ケージドリジンアミノ酸を、真核細胞内にあることが適切である選択されたタンパク質に、遺伝的且つ部位特異的に組み入れる方法、例えばインビトロにおける方法などである。ケージドリジンアミノ酸を前記方法によって遺伝的に組み入れることの１つの利点は、この実施形態では、ケージドアミノ酸を含むタンパク質を直接標的細胞において合成することができるので、一度形成されたら、ケージドアミノ酸を含むタンパク質を細胞に送達する必要がなくなることである。この方法は、
ｉ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列における、所望の部位において、アンバーコドンなどの直交性コドンを導入する、又は特定のコドンをアンバーコドンなどの直交性コドンに置き換えるステップと、
ii）直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対の発現系を細胞に導入するステップと、
iii）本発明によるケージドリジンと共に培地中で細胞を培養させるステップと
を含む。
【００６６】
ステップ（ｉ）は、タンパク質の遺伝子配列における、所望の部位において、特定のコドンをアンバーコドンなどの直交性コドンに置き換えることを伴う。これは、ケージドリジンが導入される／それに置き換えられることが望まれる部位を、アンバーコドンなどの直交性コドンを含むように変化させた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するプラスミドなどの構築物を単に導入することによって実現することができる。これは、十分当業者の能力の範囲内であり、そのようなものの例が本明細書の以下に示されている。
【００６７】
ステップ（ii）は、ケージドリジンアミノ酸を所望の位置に特異的に組み入れるための直交性の発現系を必要とする（例えば、アンバーコドン）。したがって、一緒に前記ｔＲＮＡにケージドリジンを負荷することができる、直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素などの特異的な直交性ｔＲＮＡ合成酵素と特異的な対応する直交性ｔＲＮＡの対が必要である。
【００６８】
したがって、本発明の別の態様は、本発明によるケージドリジンのためのピロリジルｔＲＮＡ合成酵素などの直交性ｔＲＮＡ合成酵素を提供することである。前記直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素は、表Ｉにおいて定義されている、最大５つの位置、Ｍ２４１残基、Ａ２６７残基、Ｙ２７１残基、Ｌ２７４残基及びＣ３１３残基において存在するミューテーション（複数可）を有する野生型ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素であることが適切である。好ましい実施形態では、直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素は、表Ｉのクローン７である、すなわち、ミューテーションは、Ｍ２４１Ｆ、Ａ２６７Ｓ、Ｙ２７１Ｃ及びＬ２７４Ｍであり、これは、表Ｉにおいて定義されている通り、最も効率的な合成酵素クローンであることが見いだされているという利点を有する。
【００６９】
上記方法のステップ（ii）を実行することを可能にするための発現系を構成するために、本発明による直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素を直交性ｔＲＮＡと結びつける必要がある。ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡをコードする遺伝子であるＰｙｌＴの使用は、真核生物のｔＲＮＡに見いだされるコンセンサス内部ＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーター配列を欠いており、直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対において使用するための直交性ｔＲＮＡ系として当技術分野でよく知られている（Galli, G.; Hofstetter, H.; Birnstiel, M. L. Nature 1981, 294, 626-631）。ＰｙｌＴは、転写のために外部のプロモーターを必要とする。ｔＲＮＡ発現は、ＰｙｌＴの効率的な転写を可能にする、ＣＭＶエンハンサーの下流のＵ６プロモーター（Xia, X. G.; Zhou, H. X.; Ding, H. L.; Affar, E. B.; Shi, Y.; Xu, Z. S. Nucl. Acids Res. 2003, 31, e100）の制御下にあることが好ましい。
【００７０】
したがって、上記方法のステップ（ii）において使用するために好ましい発現系は、
ａ．ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ発現がＣＭＶエンハンサーの下流のＵ６プロモーターの制御下にあるプラスミド、
ｂ．ＣＭＶエンハンサーの制御下にある本明細書に記載の直交性ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素を含むプラスミド
を含む。
【００７１】
本発明の別の態様では、本発明によるケージドリジンは、３４０ｎｍを超えるＵＶ光を照射することによって、タンパク質の少なくとも１つの性質を決定するため又は変化させるために使用することができる。照射は３５５ｎｍを超えることが好ましく、３６０〜３７０ｎｍであることがより好ましく、約３６５ｎｍであることがさらにより好ましい。
【００７２】
そのような使用の利点は、ケージドリジンを有するタンパク質が脱ケージングされる時間及び百分率の両方の意味で、ケージドから脱ケージドに切り換える方式が効率的に実現されること、及びそのようなシステムが非侵襲的であり、細胞に対して毒性でないことである。
【００７３】
有利に、そのようなシステムは、真核生物内、それどころかヒト体内にあるタンパク質の少なくとも１つの性質を決定又は変更するために使用することができる。
【００７４】
当該タンパク質の前記少なくとも１つの性質は、野生型タンパク質に存在し、ケージドアミノ酸が存在する場合には存在しない、当該タンパク質の生化学的性質であってよい。これは、当該タンパク質の唯一の生物学的機能であってよい、又は当該タンパク質のいくつかの性質のうちの１又は２以上であってよい。その性質が当該タンパク質の唯一の生物学的機能ではない例は、腫瘍抑制因子ｐ５３に存在するＮＬＳ配列である。その性質及びタンパク質に対するその効果は、タンパク質のサイズ、形状、及び同様に重要なことにポリペプチド鎖にケージドリジンが組み入れられる位置に応じて変動し得る。したがって、光分解によって脱ケージングした際の決定に使用される場合、本発明は、脱ケージングされるとタンパク質の生物学的効果に影響を及ぼすケージドリジン残基によって、どのように性質が妨害されるかを試験するためのオペレーターを可能にする。タンパク質の性質を変化させることにおけるその使用では、変化によって生じる生物学的効果は既知であり、したがって、研究することができる、又は、未知であってよく、その場合、本発明は、そのような性質を決定又は推測することに有意に適用することができる。既知の性質への本発明の適用の例は、今度はアンケージド配列が適切な細胞の区画内のタンパク質に局在化することを可能にし、それによって、動態研究又は他の観察を行うことを可能にするために、局在化配列に位置するケージドリジンを放出させるという要望である。
【００７５】
ケージドリジンを、野生型タンパク質に存在するリジンに置き換えることが好ましい。これは、脱ケージングするとタンパク質がその野生型構造に戻るので、脱ケージングによって細胞内のタンパク質の内因性の機能を決定することが可能になるので、好ましい。
【００７６】
変更のために使用する場合、変更によって生じる生物学的効果は既知である及び／又は所望のものであることを想定する。ケージドリジンのオルタネーター（alternator）（スイッチ［switch］）としてのこのような使用は、脱ケージングによって生じるタンパク質の動態を試験するために作動させることができる。１つの例は、ケージドリジンが存在することによってタンパク質の折りたたみが妨害される場合である。そのような場合では、ケージドアミノ酸を脱ケージングすることにより、タンパク質の折りたたみが再び起こることが可能になり、さらに、それにしたがって、脱ケージングに起因するタンパク質の折りたたみの動態を測定することが可能になる。別の例は、ケージドリジンアミノ酸を局在化配列に組み入れることである。これにより、脱ケージングされるまでタンパク質の適切な局在化が攪乱され、タンパク質の局在化の動態を測定することが可能になる。したがって、所望のタンパク質の性質が脱ケージングによって変化する本発明の実施形態は、時には、「スイッチング（switching）」又は「オルタネーション（alternation）」（すなわち、脱ケージングされた状態である、タンパク質の代替の形態に移ること）と称される。
【００７７】
さらに、３４０ｎｍを超えるＵＶ光を照射することによってタンパク質の少なくとも１つの性質を変化させること（オルタネーティングさせること）に関する本明細書の上記の使用は、治療目的で使用することができるものと企図する。脱ケージングによるオルタネーションにより、以前は局在化する／ある特定の機能を有する／完全に折りたたまれていることが望ましくなかったタンパク質を、今度は局在化する／ある特定の機能を有する／完全に折りたたまれている、したがって、特定の治療的機能を有するようにすることができる。起こり得るそのような状況のタンパク質の例は、膜タンパク質であり、特に公知の表面抗原分類タンパク質、又は、例えば、補体免疫系に属する抗体若しくはタンパク質の発現である。
【００７８】
ケージドリジン種
式Ｉのケージドリジン以外の代替のケージドリジンを本発明において使用することができる。有用なケージドリジン化合物の例を図１３に示している。
【００７９】
可能性のある化合物は、（Mayer, G.; Heckel, A. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4900-4921）に概説されている。
【００８０】
図１３に示されている化合物は、以下の引用に詳細に記載されている。これらの引用の、図１３に示されている化合物を説明している節、具体的には、図１３に示されている対応する化合物（複数可）の構造又は産生の詳細について特に参照により本明細書に組み込まれる：
化合物４：Momotake et al. Nat. Meth. 3、35-40(2006)
化合物５：Walbert et al. Helv. Chim. Acta 84、1601−1611(2001)
化合物６：Singh et al. Bioconjug. Chem. 13、1286-1291(2002)
化合物７：Furuta et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 96、1193-1200(1999);Suzuki et al. Org. Lett. 5、4867-4870(2003);Hagen et al. ChemBioChem 4、434-442(2003)。
化合物８：Fedoryak et al. Org. Lett. 4、3419-3422(2002)。
化合物９：Park et al. JACS 119、2453-2463(1997);Zhang et al. JACS 121、5625-5632(1999);Conrad II et al. Org Lett 2、1545-1547(2000)。
化合物１０：Atemnkeng et al. Org Lett 5、4469-4471(2003)。
化合物１１：Klan et al. Photochem Photobiol Sci 1、920-923(2002);Klan et al. Org Lett 2、1569-1571(2000)
【００８１】
ケージドリジンは、式Ｉに示されている通りであることが最も適切である。
【００８２】
参照配列
メタノサルシナ・バーケリ（Methanosarcina barkeri）ＰｙｌＴ遺伝子は、ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ  ｔＲＮＡをコードする。
【００８３】
メタノサルシナ・バーケリのＰｙｌＳ遺伝子は、ＭｂＰｙｌＲＳ  ｔＲＮＡ合成酵素タンパク質をコードする。数値アドレスを用いて特定のアミノ酸残基を参照する場合、ＭｂＰｙＩＲＳ（メタノサルシナ・バーケリ  ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素）アミノ酸配列を参照配列（すなわち、公的に入手可能な野生型メタノサルシナ・バーケリ  ＰｙｌＳ遺伝子、受託番号Ｑ４６Ｅ７７にコードされる）として用いて番号付けする：
MDKKPLDVLI SATGLWMSRT GTLHKIKHYE VSRSKIYIEM ACGDHLVVNN SRSCRTARAF RHHKYRKTCK RCRVSDEDIN NFLTRSTEGK TSVKVKVVSA PKVKKAMPKS VSRAPKPLEN PVSAKASTDT SRSVPSPAKS TPNSPVPTSA PAPSLTRSQL DRVEALLSPE DKISLNIAKP FRELESELVT RRKNDFQRLY TNDREDYLGK LERDITKFFV DRDFLEIKSP ILIPAEYVER MGINNDTELS KQIFRVDKNL CLRPMLAPTL YNYLRKLDRI LPDPIKIFEV GPCYRKESDG KEHLEEFTMV NFCQMGSGCT RENLESLIKE FLDYLEIDFE IVGDSCMVYG DTLDIMHGDL ELSSAVVGPV PLDREWGIDK PWIGAGFGLE RLLKVMHGFK NIKRASRSES YYNGISTNL
【００８４】
これは、所望の残基を位置づけるために当技術分野でよく理解されている通りに使用するべきである。これは常に厳密な計数行為というわけではない−前後関係に注意を払わなければならない。例えば、所望のタンパク質が、長さがわずかに異なる場合、その配列内の（例えば）Ｙ２７１に対応する正しい残基の位置づけには、単に所望の配列の２７１番目の残基を取るのではなく、配列をアラインメントし、等価物又は対応する残基を選ぶことが必要になる場合がある。これは、十分当業者（skilled reader）の範囲内である。
【００８５】
ミューテーションとは、当技術分野における通常の意味を有し、言及されている残基、モチーフ又はドメインの置換又は短縮又は欠失を指し得る。ミューテーションは、ポリペプチドレベルで、例えば、ミューテーションした配列を有するポリペプチドを合成することによって行うことができる、又は、ヌクレオチドレベルで、例えば、ミューテーションした配列をコードする核酸を作製することによって行うことができ、その核酸を、その後翻訳してミューテーションしたポリペプチドを産生することができる。所与のミューテーション部位に対する置き換えアミノ酸として特定されるアミノ酸がない場合、例えば、本明細書に記載の通り、本発明のｔＲＮＡ合成酵素の進展及び適応に関連して、前記部位のランダム化を用いることが適切である。初期状態のミューテーションとして、アラニン（Ａ）を用いることができる。特定の部位（複数可）において使用されるミューテーションは本明細書で示されている通りであることが適切である。
【００８６】
断片は、長さが少なくとも１０アミノ酸であることが適切である、少なくとも２５アミノ酸であることが適切である、少なくとも５０アミノ酸であることが適切である、少なくとも１００アミノ酸であることが適切である、少なくとも２００アミノ酸であることが適切である、少なくとも２５０アミノ酸であることが適切である、少なくとも３００アミノ酸であることが適切である、少なくとも３１３アミノ酸であることが適切である、又は、所望のｔＲＮＡ合成酵素ポリペプチドの大多数であることが適切である。
【００８７】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え型の複製可能なベクターに組み入れることができる。ベクターを使用して、適合性宿主細胞内の核酸を複製することができる。したがって、別の実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入すること、ベクターを適合性宿主細胞に導入すること、及びベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を培養させることによって本発明のポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収することができる。適切な宿主細胞としては、大腸菌などの細菌が挙げられる。
【００８８】
ベクター内の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらすことができる制御配列に作動可能に連結していることが好ましい、すなわち、ベクターは、発現ベクターである。「作動可能に連結している」という用語は、記載されている構成成分が、それらが、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にあることを意味する。コード配列に「作動可能に連結している」調節配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が実現されるようにライゲーションする。
【００８９】
本発明のベクターは、本発明のタンパク質の発現をもたらすために、記載の通り、適切な宿主細胞に形質転換すること又はそれにトランスフェクトすることができる。このプロセスは、上記の発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞を、ベクターによってタンパク質をコードするコード配列の発現がもたらされる条件下で培養することを含んでよく、場合によって発現されるタンパク質を回収することを含んでもよい。
【００９０】
ベクターは、例えば、複製開始点、場合によって前記ポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーター、及び場合によってプロモーターの調節因子を備えるプラスミド又はウイルスベクターであってよい。ベクターは、１又は２以上の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合ではアンピシリン耐性遺伝子を含有してよい。ベクターは、例えば、宿主細胞をトランスフェクト又は形質転換するために用いることができる。
【００９１】
本発明のタンパク質をコードする配列に作動可能に連結した制御配列は、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む。これらの制御配列は、発現ベクターを使用するために設計する対象の宿主細胞と適合するように選択することができる。プロモーターという用語は当技術分野で周知であり、最小のプロモーターから上流エレメント及びエンハンサーを含むプロモーターまでのサイズ及び複雑さにわたる核酸領域を包含する。
【００９２】
タンパク質の発現及び精製
本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を使用して、本発明のタンパク質を発現させることができる。宿主細胞は、本発明のタンパク質の発現を可能にする適切な条件下で培養することができる。本発明のタンパク質の発現は、それらが連続的に産生されるように構成的であってよい、又は、発現を開始するために刺激を必要とする誘導性であってよい。誘導性の発現の場合では、タンパク質の産生は、必要な時に、例えば、培地に、誘導性物質、例えば、デキサメタゾン又はＩＰＴＧを加えることによって開始することができる。
【００９３】
本発明のタンパク質は、宿主細胞から、酵素的溶解、化学的溶解及び／又は浸透性の溶解及び物理的な破壊を含めた当技術分野で公知のさまざまな技法によって抽出することができる。
【００９４】
以下の非限定的な例は、本発明の例示である：
【００９５】
全ての実施例において、式（Ｉ）によるケージドリジンは、それ自体で表示する、又は化合物１として表示する。
【００９６】
我々は、タンパク質の局在化、翻訳後修飾及び酵素活性を制御するためのリジンの光ケージングについて教示している。タンパク質のリジン残基によって媒介されるこれらの重要な機能を光化学的に制御することは、生細胞においてこれまで実証されていない。本発明では、１を合成し、哺乳動物の細胞において、アンバーコドンに応じてこのアミノ酸の組み入れを遺伝的にコードするように、ピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を進化させる。このアミノ酸の有用性を例証するために、ヒト細胞における核質の核局在化配列（ＮＬＳ，nuclear localization sequence）及び腫瘍抑制因子ｐ５３をケージし、したがって、これらのタンパク質を細胞質ゾルに誤って局在化させる（mis-localizing）。核内移入の動態を直接数量化することを可能にする光のパルスを用いてタンパク質の核内移入を誘発する。
【実施例１】
【００９７】
式Ｉによるケージドリジンの合成
ニトロベンジルケージドリジン１を、塩基性ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ溶液中、０℃でＮα−Ｂｏｃ−リジンとクロロギ酸エステル３を反応させ、４を収率８２％でもたらし、その後ＣＨ２Ｃｌ２中ＴＦＡを用いて収率９５％で脱保護することによって調製した（スキームＳ１）。クロロギ酸エステル３を、アルコール３（ｒｅｆ１９に従って合成された）を、Ｎａ２ＣＯ３の存在下でＴＨＦ中トリホスゲンを用いたアシル化、その後の揮発性物質の蒸発、及びさらなる精製を伴わない直接的な反応によって生成した。Ｎａ２ＣＯ３を存在させることにより、２が脱水されて対応するスチレンになることを防いだ。
【００９８】
【化４】
2013521269.tif 000006
【００９９】
合成プロトコール
（２Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６−｛［１−（６−ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）エトキシ］カルボニルアミノ｝ヘキサン酸（４）
１（６−ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）エタノール（２）（５００ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ）を、Ｎａ２ＣＯ３（２４７ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ）を含有するＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却した。この溶液に、トリホスゲン（７０１ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で１２時間撹拌し続けた。反応物を濾過し、その後、揮発性物質を加熱せずに蒸発させ、残渣を真空下で乾燥させて、ＮＰＯＣクロロギ酸エステル３を定量的変換で得た（６４４ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ）。Ｎε−Ｂｏｃ−リジン（５００ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／１ＭのＮａＯＨ（ａｑ．）中溶液（１：４混合物、総量８ｍＬ）に、０℃で、ＮＰＯＣ−α−メチルクロロギ酸エステル３（４９６ｍｇ、１.８２ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で１２時間撹拌した後、水層をＥｔ２Ｏ（５ｍＬ）で洗浄し、その後、氷冷の１ＭのＨＣＩ（２０ｍＬ）を用いてｐＨ１まで酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）を用いて抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、揮発性物質を蒸発させ、４を黄色の泡として収率８２％でもたらした（７２０ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１．１８〜１．８１（ｍ，１８Ｈ）、３．０８（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）、４．２３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、５．１１〜５．３８（ｍ，１Ｈ）、６．０７（ｓ，２Ｈ）、６．２０〜６．３６（ｍ，１Ｈ）、６．９９（ｓ，１Ｈ）、７．４０（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＨＣｌ３）δ＝２２．３、２２．６、２８．５、２９．４、３２．３、４０．８、５３．３、６９．１、８０．４、１０３．３、１０５．４、１０５．８、１３６．７、１４１．５、１４７．２、１５２．６、１５５．７、１５６．１、１７６．４。ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ計算値Ｃ２１Ｈ２９Ｎ３Ｏ１０［Ｍ＋Ｎａ］＋：５０６．１７４５；実測値：５０６．１７４８。（１Ｈ  ＮＭＲスペクトルについては図１参照）
【０１００】
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［１−（６−ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）エトキシ］カルボニルアミノ｝ヘキサン酸ＴＦＡ塩（１）
化合物４（７２０ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ：ＴＦＡ（１：１混合物、総量１４ｍＬ）に溶解させ、反応物を４０分間攪拌した。その後、揮発性物質を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に再溶解させ、Ｅｔ２Ｏ（２５０ｍＬ）中に沈殿させ、１を白色固体として収率９５％でもたらした（６７９ｍｇ、１.４２ｍｍｏｌ）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ＝１．０８〜１．４０（ｍ，７Ｈ）、１．６３〜１．８８（ｍ，２Ｈ）、２．８０〜２．８８（ｍ，２Ｈ）、３．８３〜３．９７（ｍ，１Ｈ）、５．９１〜６．００（ｍ，３Ｈ）、６．９２（ｓ，１Ｈ）、７．２８（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ＝２１．１、２１．７、２８．５、２９．５、３９．９、５２．７、６８．８、１０３．６、１０４．４、１０５．７、１３６．１、１４０．６、１４６．９、１５２．７、１５６．９、１７１．９。ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ計算値Ｃ１５Ｈ２１Ｎ３Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋：３８４．１４０２；実測値：３８４．１４０３。（１Ｈ  ＮＭＲスペクトルについては図２参照）
【実施例２】
【０１０１】
式（Ｉ）によるケージドリジンのための直交性のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対の合成
アンバーコドンに応じてケージドリジン１を組み入れるための直交性のＭｂＰｙｌＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対（Neumann, H.; Peak-Chew, S. Y.; Chin, J. W. Nat. Chem. Biol. 2008, 4, 232-234）を進化させるために、ピロリジン環の結合ポケット内の５つの位置（Ｍ２４１、Ａ２６７、Ｙ２７１、Ｌ２７４、Ｃ３１３）を可能性のある全てのアミノ酸に対してランダム化した１０８種のＭｂＰｙＩＲＳのミューテーション体のライブラリーを創出した。
【０１０２】
ｐＢＫＡｃＫＲＳ３ａｍｐ（Neumann, H.; Hancock, S. M.; Buning, R.; Routh, A.; Chapman, L.; Somers, J.; Owen-Hughes, T.; van Noort, J.; Rhodes, D.; Chin, J. W. Molecular Cell 2009, 36, 153-163）を、ＭｂＰｙＩＲＳミューテーション体のライブラリーの生成における鋳型として使用した。インバースＰＣＲ（Rackham, O.; Chin, J. W. Nat. Chem. Biol. 2005, 1, 159-166）を３ラウンド実施して、このライブラリー内の２０種の天然アミノ酸全てに対してＭ２４１、Ａ２６７、Ｙ２７１、Ｌ２７４及びＣ３１３のコドンをランダム化した。ＰＣＲ反応の各ラウンドにおいて以下のプライマーを使用した：
・（ラウンド１）PylSM241f（5’-GCGCAGGTCTCAGAACGTNNKGGCATTAACAACGACACCGAACTGAGCAAAC-3’）及びPylSM241r（5’-GCGCAGAGTAGGTCTCAGTTCCACATATTCCGCCGGAATCAGAATC-3’）；
・（ラウンド２）PylSAYLf（5’-GCGCAGGTCTCAATGCTGN NKCCGACCCTGNNKAACTATNNKCGTAAACTGGATCGTATTCTGCCGGGC-3’）及びPylSAYLr（5’-GCGCAGAGTAGGTCTCAGCATCGGACGCAGGCACAGGTTTTTATC-3’）；
・（ラウンド３）PylSC313f（5’-GCGCAGGAAAGGTCTCAAACTTTN NKCAAATGGGCAGCGGCTGCACCCGTGAAAAC-3’）及びPylSC313r（5’-GCGCAGAGTAGGTCTCAAGTTAACCATGGTGAATTCTTCCAGGTGTTCTTTG-3’）。
【０１０３】
各ラウンドにおけるＰＣＲ産物を、まず、Dpnl及びBsalを用いて消化し、ライゲーションによって再環状化し、エレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂを形質転換するために使用した。再単離したプラスミドは、ミューテーション誘発の次のラウンドの鋳型としての機能を果たした。ミューテーション誘発の第３ラウンドのライゲーション産物を用いてエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂを形質転換することにより、ライブラリーの理論的な多様性（２×１０７）を９９％超網羅する１０８種の形質転換体が産生された。１に特異的なミューテーション体の選択を、アセチル−リジンに特異的な合成酵素の進化について記載されている通り行った（Neumann, H.; Peak-Chew, S. Y.; Chin, J. W. Nat. Chem. Biol. 2008, 4, 232-234）。
【０１０４】
以前に記載されている通り（Neumann, H.; Peak-Chew, S. Y.; Chin, J. W. Nat. Chem. Biol. 2008, 4, 232-234、Chin, J. W.; Martin, A. B.; King, D. S.; Wang, L.; Schultz, P. G. Proc. Natl. Acad. Sci. 2002, 99, 11020-11024）、大腸菌において、このライブラリーに対する陽性の選択及び陰性の選択を交互に３ラウンド実施した。選択で残存したクローンを、許容的な位置にアンバーコドンを有するクロラムフェニコール耐性遺伝子をコードするプラスミドを用いて形質転換した。最良のクローンでは、１（１ｍＭ）の存在下で、３００μｇ／ｍｌに至るまでのクロラムフェニコールを含有する培地において細胞が残存することが可能になったが、１の非存在下では、５０μｇ／ｍｌで残存しなかった。これは、選択された合成酵素が１に対して高い特異性を有し、共通の２０アミノ酸のいずれも組み入れないことを実証している。最も活性な合成酵素は、野生型ＭｂＰｙｌＲＳに対してミューテーションＭ２４１Ｆ、Ａ２６７Ｓ、Ｙ２７１Ｃ、及びＬ２７４Ｍを含有した。この合成酵素を光ケージドＬｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰＣＫＲＳ）と名付け、さらに特徴付けた（全ての単離されたＭｂＰｙＩＲＳ配列については表１を参照されたい）。
【実施例３】
【０１０５】
インビトロにおけるミオグロビンにおける３６５ｎｍの光を照射した際のデケージングの実証
１．ミオグロビンの発現及び精製
非天然アミノ酸を組み入れたミオグロビンを発現させるために、我々は、大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を、pBKamp-PCKRS及びpMyo4TAGPylT-his6を用いて形質転換した。細胞を、３７℃で１時間、１ｍｌのＬＢ培地中に回収した後、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びテトラサイクリン（２５μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ１００ｍＬ中でインキュベートした（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．で１６時間）。この一晩培養物２０ｍＬを使用して、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、テトラサイクリン（１２μｇ／ｍＬ）及び２ｍＭの１を補充したＬＢ１Ｌに接種した。細胞を培養させ（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．）、ＯＤ６００〜０．６において、アラビノースを最終濃度０．２％まで加えることによってタンパク質の発現を誘導した。誘導の３時間後に細胞を回収した。タンパク質を４℃で超音波処理によって抽出した。抽出物を遠心分離によって澄ませ（２０分、２１，０００ｇ、４℃）、Ｎｉ２＋−ＮＴＡビーズ（Qiagen社製）３００μｌを抽出物に加え、混合物を４℃で１時間、撹拌しながらインキュベートした。遠心分離によって（１０分、１０００ｇ）ビーズを採取した。ビーズを２回、洗浄緩衝液５０ｍＬに再懸濁させ、１０００ｇで遠心沈澱させた。その後、ビーズを洗浄緩衝液２０ｍｌに再懸濁させ、カラムに移した。タンパク質を、２５０ｍＭのイミダゾールを補充した洗浄緩衝液１ｍｌ中に溶出させ、次いで、セファデックス（Sephadex）Ｇ２５カラムを用いて２０ｍＭの炭酸水素アンモニウムに対して再緩衝した。
【０１０６】
１４５位のアンバーコドンに応じて非天然アミノ酸（ＢｏｃＫ又は１）を組み入れるｓｆＧＦＰ−ｈｉｓ６（psfGFP145TAGPylT-his6）を同じプロトコールに従って発現させ、精製した。
【０１０７】
２．タンパク質の質量分析
ＬＣＴ飛行時間型質量分光計においてエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ，electrospray ionization、Micromass社）を用いてタンパク質の総質量を決定した。タンパク質を２０ｍＭの炭酸水素アンモニウムに再緩衝し、ギ酸（メタノール／Ｈ２Ｏ＝１：１中１％）と１：１で混合した。試料を１分当たり１０μｌで注入し、ウマ心臓ミオグロビンを使用して陽イオンモードで較正を実施した。６０のスキャンを平均し、ＭａｓｓＬｙｎｘバージョン４．１（Micromass社製）を使用して、多重荷電したタンパク質の質量スペクトルについて、畳み込みを解くことによって分子質量を得た。野生型タンパク質の理論的質量を、Protparam（http://us.expasy.org/tools/protparam.html）を使用して算出し、タンパク質を含有する非天然アミノ酸についての理論的質量を手動で調整した。
【０１０８】
ｓｆＧＦＰ（１４５−１）のＭＳ／ＭＳ分析のために、ゲルバンドを洗浄し、アルキル化し、トリプシンを用いてゲル内消化した。消化物混合物１μｌをＣＨＣＡマトリックス（６０％のＭｅＣＮ／０．１％のＴＦＡ中３ｍｇ／ｍｌ）１μｌと予備混合し、１μｌをステンレス鋼の標的に塗布した。Ultraflex III TOF/TOF質量分光計（Bruker Daltonics社、Bremen、Germany）を用いてスペクトルを取得した。さらにＭＳ／ＭＳ断片化するために、１で修飾したペプチドと一致するｍ／ｚ２１４５．９７２の断片を手動で選択した。一連の断片化イオンにより、ペプチドＬＥＹＮ（１）ＮＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫの同一性及び修飾部位が確認された。
【０１０９】
アンケージングプロセスを分析するために、高出力ＬＥＤ供給源モジュール（Black-led-365、Prizmatix社製）を３６５ｎｍで用いて、精製したミオグロビンを３６５ｎｍで光分解した。次いで、タンパク質の総質量を上記の通り決定した。
【０１１０】
ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡの存在下でのｍｙｏ４ＴＡＧｈｉｓ６（Neumann, H.; Peak-Chew, S. Y.; Chin, J. W. Nat. Chem. Biol. 2008, 4, 232-234、Chin, J. W.; Martin, A. B.; King, D. S.; Wang, L.; Schultz, P. G. Proc. Natl. Acad. Sci. 2002, 99, 11020-11024）の発現は効率的であり、１の添加に依存した。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ，Electrospray ionization mass spectrometry）及びＭＳ−ＭＳ配列決定により、単一の遺伝的にコードされた部位に１が組み入れられることが確認される（図３）。インビトロで３６５ｎｍの光を照射すると、１を含有するミオグロビンが効率的に脱ケージングされることが確認された（図３Ｅ）。
【実施例４】
【０１１１】
直交性のＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対がヒト細胞において機能的であることの実証
ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対がヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞において機能的であることを実証するために、我々は、１の存在下、及び非存在下で、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＡＧ−ｅｇｆｐ−ｈａ（このレポーターは、Ｎ末端のｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子、アンバー終止コドンを含有するリンカー、Ｃ末端の高感度ＧＦＰ遺伝子、及びＨＡタグコード配列を含有する）、ＰＣＫＲＳ及びＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡを含有する細胞の赤色の蛍光及び緑色の蛍光を検査した。
【０１１２】
プロトコール
１．培養、トランスフェクション及び免疫ブロット分析
接着性のヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ，human embryonic kidney）−２９３細胞を、３７℃、５％のＣＯ２雰囲気下、１０％のＦＢＳ及び１×pen-strep溶液を補充したＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ−１培地（Gibco社製）中で培養した。細胞を、Genejuice（Novagen社製）を製造者のプロトコールに従って用いて一過性にトランスフェクトした。二重のトランスフェクションを、両方のプラスミドを等量用いて実施した。トランスフェクトする前に、培地を、必要な場合、非天然アミノ酸を補充した新鮮な抗生物質を含まない培地に交換した（濃度については図の説明文を参照されたい）。トランスフェクトした２４時間後に細胞を分析した。ウエスタンブロット分析のために、細胞を低温のＰＢＳで洗浄し、次いで普遍的な溶解緩衝液（Roche社製）を用いて４℃で１０分間溶解した。ＨＡタグ（Sigma社製）、Ｆｌａｇタグ（Cell signaling社製）、Ｄｓ−Ｒｅｄ（Clontech社製）又はｐ５３（Abcam社製）に対する抗体を使用してウエスタンブロットを実施した。
【０１１３】
２．質量分析
１００ｍｍのペトリ皿中のＨＥＫ２９３細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＡＧ−ｅｇｆｐ−ｈａ及びＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡでトランスフェクトし、２ｍＭの１の存在下で２４時間培養させた。細胞を溶解し、ProFound（商標）Mammalian HA Tag IP/Co-IP Kit（Pierce社製）を製造者のプロトコールに従って使用して、全長のｍＣｈｅｒｒｙ−１−ＥＧＦＰ−ＨＡをプルダウンした。タンパク質試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製した。所望のタンパク質バンドをクーマシーブルー染色したゲルから切除し、洗浄し、アルキル化し、トリプシンを用いてゲル内消化した。ゲル内消化ペプチド混合物の一部を、ナノスケールの液体クロマトグラフィー（Dionex社製）によって、逆相Ｃ１８カラム（１５０×０．０７５ｍｍ  ＩＤ、流速０．２μｌ／分）で分離した。溶出液をLTQ-Orbitrap-XL(Thermo Scientific社製)質量分光計に直接導入した。社内のMASCOT ＭＳ／ＭＳイオン検索（www.matrixscience.com）を使用して、タンパク質配列ＡＱＡＳＰＷＨ１ＱＬＡＭＶＳＫ（ｍＣｈｅｒｒｙ−１−ＥＧＦＰ−ＨＡの残基２４３〜２５７）に対してスペクトルを検索した。一連の断片化を手動で検査することによって同一性及び修飾部位を確認した。
【０１１４】
顕微鏡
ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＡＧ−ＥＧＦＰ−ＨＡを発現している細胞をイメージングするために、２４ウェルプレートに細胞を播種し、トランスフェクトした。レーザー走査型共焦点顕微鏡検査を、Plan Fluor ELWD 20×/0.45対物レンズを備えたNikon Eclipse TE300倒立顕微鏡に搭載したBio-Rad Radiance 2100システムを使用して実施した。ＥＧＦＰについては５１５〜５３０ｎｍの蛍光発光を測定し（励起波長：４８８ｎｍ）、ｍＣｈｅｒｒｙについては５６０ｎｍ超の蛍光発光を測定した（励起波長：５４３ｎｍ）。
【０１１５】
生細胞をイメージングするために、μ−Ｄｉｓｈ（Ibidi社製）に細胞を播種し、トランスフェクトした。室温で、Plan Apochromat 63×/1.4油浸対物レンズを備えたZeiss LSM 710レーザー走査顕微鏡を用いて生細胞をイメージングした。EXFO X-Cite120 XLシステムを用いて、ＵＶフィルター（フィルターの設定−励起Ｇ３６５、ビームスプリッターＦＴ３９５、発光ＢＰ４４５／５０）を備えた１２０ワットのハロゲン化金属ランプを使用して、細胞を１〜５秒間照明し（力：１.２ｍＷ／ｃｍ２）、室温でイメージングした（励起：４８８ｎｍ、放出：５００〜５６０ｎｍ）。顕微鏡の設定：細胞画像については、スキャン解像度５１２×５１２、平均化８、スキャンズーム３×、スキャンスピード１０；リアルタイムイメージングについては、スキャン解像度５１２×５１２、平均化１、スキャンズーム５×又は３×、スキャンスピード８。平均の核蛍光強度（Ｆｎ）及び細胞質の蛍光強度（Ｆｃ）を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて数量化して、次式に従ってＦ（ｎ／ｃ）比を決定することを可能にした：Ｆ（ｎ／ｃ）＝（Ｆｎ−Ｆｂ）／（Ｆｃ−Ｆｂ）、Ｆｂは平均バックラウンド蛍光強度である。
【０１１６】
プラスミド
哺乳動物の細胞においてヒトＴｙｒ−ｔＲＮＡＣＵＡを発現させるためのプラスミドpCR2.1/htRNATyrCUAは、Ashton Cropp（University of Maryland）からの好意の寄贈品であった。哺乳動物の細胞において発現させるためにコドン最適化したＭｂＰｙＩＲＳ遺伝子及びＭｍＰｙＩＲＳ遺伝子は、GeneArt社から購入した。
【０１１７】
１．pMbPylRS-mCherry-TAG-EGFP-HA及びpPCKRS-mCherry-TAG-EGFP-HAの構築
我々は、どちらもＣＭＶプロモーターの制御下にあるＭｂＰｙＩＲＳ又はＰＣＫＲＳ（Ｎ末端のＦｌａｇタグを有する）を発現させることができる単一のプラスミドを、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＡＧ−ＥＧＦＰ（Ｃ末端のＨＡタグを有する）を用いて構築した。これを行うために、最初に、鋳型としてpEGFP-N1（Clonetch社製）、及びプライマーｍＧＦＰＨｉｎｄａｍｆ／ＡＧ２７を用いてＰＣＲによってＥＧＦＰ−ＨＡ配列を生成することによって、及び、次いで、HindIII制限部位及びBamHI制限部位を用いてＰＣＲ産物をpmCherry-C1（Clontech社製）に導入することによって、プラスミドpmCherry-TAG-EGFP-HA（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＡＧ−ＧＦＰ−ＨＡの発現を可能にする）を造った。次いで、プライマー３３６７ｂｋｆ／３３６７ｂｋｒ用いてベクターの骨格を増幅することによって、及び、次いでＰＣＲ産物をSacllで消化し、再ライゲーションし、プラスミドpMCS-mCherry-TAG-EGFP-HAをもたらすことによって、pmCherry-TAG-EGFP-HAのＣＭＶプロモーターの上流に多重クローニング部位（ＭＣＳ，multiple cloning site）を導入した。次いで、上流のＣＭＶプロモーター及びポリＡ部位を含有する下流の配列に隣接するＦｌａｇ−ＭｂＰｙＩＲＳの配列を、プライマーＫｐｎｐｖｕＫＳｆ／ＡｇｅｓａｃＫＳｒを用いて、及び鋳型として、Ｆｌａｇ−ＭｂＰｙＩＲＳ遺伝子（哺乳動物の細胞での発現のためにコドン最適化した）をpCDNA4/TO（Invitrogen社製）のBamHI部位及びHindIII部位に導入することによって最初に造ったプラスミドを使用して、ＰＣＲによって増幅した。次いで、生じた断片を、pMCS-mCherry-TAG-EGFP-HA内のPvul部位とSacll部位の間でライゲーションし、プラスミドpMbPylRS-mCherry-TAG-EGFP-HAをもたらした。Ｆｌａｇ−ＭｂＰｙＩＲＳの代わりにＦｌａｇ−ＰＣＫＲＳを含有するプラスミドpPCKRS-mCherry-TAG-EGFP-HAを、Ｆｌａｇ−ＰＣＫＲＳ遺伝子（哺乳動物の細胞での発現のためにコドン最適化した）をpMbPylRS-mCherry-TAG-EGFP-HAのAfIII部位及びEcoRI部位にクローニングすることによって生成した。ＰＣＫＲＳ内のミューテーションをＰＣＲによって導入した：２つの断片を、プライマーＡＧ４０／ＡＧ４３及びＡＧ４２／ＡＧ４１、及び鋳型としてＭｂＰｙｌＲＳ遺伝子を使用して生成し、次いで、オーバーラップＰＣＲによって、プライマーＡＧ４０／ＡＧ４１を使用して組み立てた。
【０１１８】
２．p4CMVE-U6-PylTの構築
我々は、哺乳動物の細胞におけるＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡの発現を可能にするプラスミドp4CMVE-U6-PylTを構築した。発現は、上流のＣＭＶエンハンサーを有するＵ６プロモーターによって駆動される。最初に、pmCherry-C1（Clontech社製）のＣＭＶプロモーター由来のＣＭＶエンハンサー配列（ＣＭＶＥ，CMV enhancer sequence）（１〜４８４）を、プライマーＡＧ１６／ＡＧ１７を用いてＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物を、BamHI及びBgIIIを用いて消化し、消化産物を、BgIII部位を用いてpSIREN-Shuttle（Clontech社製）にライゲーションしてpCMVE-U6をもたらした。次いで、５’−リーダー、5'-AGATCTTCTAGACTCGAA-3'、及び３’−トレーラー、5'-GACAAGTGCGGTTTTT-3'に隣接するＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡのＤＮＡ配列からできた配列、5'-GGAAACCTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGCCGGG TTAGATTCCCGGGGTTTCCG-3'を、プライマーＡＧ３０／ＡＧ２０及び鋳型としてＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ配列を含有するプラスミドを使用してＰＣＲによって生成した。次いで、ＰＣＲ産物をBamHI及びMfeIを用いて消化し、BamHI部位及びEcoRI部位を用いてpCMVE-U6にライゲーションしてpCMVE-U6-PylTをもたらした。次いで、pCMVE-U6-PylT由来のＣＭＶ−Ｕ６−ＰｙｌＴ配列をSpel及びEcoRIを用いて切断することによって、次いで、生じた断片をpCMVE-U6-PylTのNheI部位及びEcoRI部位にライゲーションすることによって２倍のＣＭＶＥ−Ｕ６−ＰｙｌＴのクラスターを生成し、p2CMVE-U6-PylTをもたらした。４倍のＣＭＶＥ−Ｕ６−ＰｙｌＴのクラスターを含有するプラスミドp4CMV-U6-CMVを、p2CMVE-U6-PylT内の２倍のＣＭＶＥ−Ｕ６−ＰｙｌＴのクラスターをSpel及びEcoRIによって切断することによって、次いで、生じた断片をp2CMVE-U6-PylTのNheI部位及びEcoRI部位にライゲーションすることによって生成した。
【０１１９】
結果
予測通り、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は１ありで、又は１なしで検出されたが、ＥＧＦＰ蛍光は、１（１ｍＭ）を加えた際にのみ観察された（図４）。これにより、哺乳動物の合成酵素は、ヒト細胞においてＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡを目に見えるほどにアミノアシル化しないこと（Mukai, T.; Kobayashi, T.; Hino, N.; Yanagisawa, T.; Sakamoto, K.; Yokoyama, S. Biochem.  Biophys. Res. Commun. 2008, 371, 818-822）が確認され、またこれは、１を用いたＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対によるアンバーコドンの抑制と一致する。ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ又はＰＣＫＲＳを欠く対照実験により、アミノ酸の組み入れにはその両方が必要であることが実証されている（図５）。ウエスタンブロット分析（図４Ｃ）により、ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対を用いた１の組み入れの効率は、内在性のヒトチロシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって効率的にアミノアシル化されるヒトチロシル−ｔＲＮＡＣＵＡ（ｈＴｙｒｔＲＮＡＣＵＡ）を用いたチロシンの組み入れの効率に匹敵することが示されている。ＭｂＰｙＩＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対及びＰｙｌＲＳ（Mukai, T.; Kobayashi, T.; Hino, N.; Yanagisawa, T.; Sakamoto, K.; Yokoyama, S. Biochem.  Biophys. Res. Commun. 2008, 371, 818-822、Nguyen, D. P.; Lusic, H.; Neumann, H.; Kapadnis, P. B.; Deiters, A.; Chin, J. W. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 8720-8721）の公知の基質であるε−Ｂｏｃ−保護されたリジンを用いて同様の結果が得られた（図６）。哺乳動物の細胞において１がｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＧＦＰ−ＨＡに部位特異的に組み入れられることを、さらに、ＭＳ／ＭＳ配列決定によって確認した（図４Ｄ）。
【実施例５】
【０１２０】
核内移入プロセスの試験におけるケージドリジンによる光化学的な制御の有用性の実証
哺乳動物の細胞における機能的研究に対する１の適用性を実証するために、我々は、まず、核内移入プロセスを光化学的に制御することに対するその有用性を調査した。詳細には、核質の古典的な二分核定位シグナル（ＮＬＳ）（Robbins, J.; Dilworth, S. M.; Laskey, R. A.; Dingwall, C. Cell 1991, 64, 615-623）によって駆動される核内移入の動態を、インポーチン−αの結合に関与するリジン残基の１つをケージングすることによって調査した（図７Ａ）。Ｎ末端の野生型ＮＬＳを有するＧＦＰ−ＨＡ（ｎｌｓ−ｇｆｐ−ｈａ）の発現を可能にする構築物、標的のリジンをアラニンに置き換えたＮＬＳミュータントを有するＧＦＰ−ＨＡ（ｎｌｓ−Ａ−ｇｆｐ−ｈａ）の発現を可能にする構築物、及び標的リジンをアンバーコドンに置き換えたＮＬＳミュータントを有するＧＦＰ−ＨＡ（ｎｌｓ−＊−ｇｆｐ−ｈａ）の発現を可能にする構築物を生成した。
【０１２１】
プロトコールは、上記に従い、以下にも従った：
pPCKRS−NLS−GFP−HA、pPCKRS−NLS−GCC−GFP−HA、pPCKRS−NLS−TAG−GFP−HAの構築
プラスミドを、ＮＬＳ−ＧＦＰ−ＨＡ、ＮＬＳ−ＧＣＣ−ＧＦＰ−ＨＡ又はＮＬＳ−ＴＡＧ−ＧＦＰ−ＨＡについてのＰＣＲ断片を、pPCKRS-p53-EGFP-HAのNheI部位及びBsshI部位にライゲーションすることによって得た（実施例６を参照されたい）。鋳型としては、Murray Stewart（MRC Laboratory of Molecular Biology社、Cambridge UK）によって提供された、ＧＦＰと融合した核質ＮＬＳを含有するプラスミドを使用した。ＮＬＳ−ＧＦＰ−ＨＡのＰＣＲ断片を、プライマーＡＧ９５／ＡＧ９６を使用することによって得た。ＮＬＳ−ＧＣＣ−ＧＦＰ−ＨＡのＰＣＲ断片を、プライマーＡＧ９５／ＡＧ９６を使用して、オーバーラップＰＣＲによって２つの断片（プライマーＡＧ９５／ＡＧ９８及びＡＧ９９／ＡＧ９６を用いて生成した）を組み立てることによって得た。ＮＬＳ−ＴＡＧ−ＧＦＰ−ＨＡのＰＣＲ断片を、プライマーＡＧ９５／ＡＧ９６を使用して、オーバーラップＰＣＲによって２つの断片（プライマーＡＧ９５／ＡＧ９７及びＡＧ９９／ＡＧ９６を用いて生成した）を組み立てることによって得た。
【０１２２】
結果
ｎｌｓ−＊−ｇｆｐ−ｈａ由来の全長のＮＬＳ−ＧＦＰ−ＨＡタンパク質の発現は、ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対及び１の添加に依存し、これは、アンバーコドンに応じて１が組み入れられることを実証している（図７Ｂ）。我々は、次に、蛍光イメージングによって、光ケージドリジン１が、アラニンミューテーションと同じくらい効率的にＮＬＳ機能を遮断し、ＧＦＰ融合物の、細胞質への部分的な再局在化を導くことを確認した（図７Ｃ）。ＧＦＰは、受動的な拡散が原因で依然として核内に存在する。ＮＬＳ−＊−１−ＧＦＰ−ＨＡを光分解（１秒；３６５ｎｍ；１.２ｍＷ／ｃｍ２）すると、脱ケージング及びその後のＧＦＰの核内移入の結果として、細胞質のＧＦＰの核内移入が観察された（図７Ｃ、Ｄ）。２７個の代表的な細胞について数量化することにより、光分解した後に細胞質内のタンパク質に対する核内のタンパク質の比が３．７５倍上昇したことが示されている（図７Ｄ）。光分解した後のリアルタイム蛍光顕微鏡検査により、細胞質ゾル内のＧＦＰの移入について約２０秒の半減時間を測定することが可能になった（図７Ｅ）。ＮＬＳ−Ａ−ＧＦＰ−ＨＡを発現している細胞に照射することにより、いかなるＧＦＰ再局在化も導かれなかった（図７Ｃ）。ｈＴｙｒｔＲＮＡＣＵＡを有するｎｌｓ−＊−ｇｆｐ−ｈａにおけるアンバーコドンが抑制されている場合に同様の結果が得られた（示されていない）。これらの結果は、再局在化が急速であり、また、光分解した際に１が特異的に脱ケージングされることに起因することを実証している。
【実施例６】
【０１２３】
多数の経路によって調節されるより複雑な核内移入プロセスの試験におけるケージドリジンによる光化学的な制御の有用性の実証
次に、より複雑な系における光ケージング手法の有用性の調査を始めるため、及び多数の経路によって調節される系内の１つのリジンをケージングすることの効果を調査するために、我々は、光ケージドリジン１を使用して腫瘍抑制因子ｐ５３の核内移入を制御した。ｐ５３の核内移入は二分核定位シグナル（ＮＬＳ）によって行われ、Ｋ３０５が核への局在化の重大な決定因子である（(a) Liang, S. H.; Clarke, M. F. J. Biol. Chem. 1999, 274, 32699-32703; (b) O'keefe, K.; Li, H. P.; Zhang, Y. P. Mol. Cell. Biol. 2003, 23, 6396-6405）（図８Ａ）。
【０１２４】
我々は、Ｃ末端のＥＧＦＰ−ＨＡ  ＴＡＧを有するｐ５３（ｐ５３−ｅｇｆｐ−ｈａ）の発現を可能にする構築物、ミューテーションＫ３０５Ａを有するｐ５３ミュータント（ｐ５３−Ｋ３０５Ａ−ｅｇｆｐ−ｈａ）の発現を可能にする構築物、又はアンバーコドンを有するｐ５３ミュータント（ｐ５３−Ｋ３０５＊−ｅｇｆｐ−ｈａ）の発現を可能にする構築物を生成した。上記と同じプロトコールを使用し、以下も使用した：
pPCKRS-p53-EGFP-HA、pPCKRS-p53-305GCC-EGFP-HA、pPCKRS-p53-305TAG-EGFP-HA及びpMbPyIRS-p53-305TAG-EGFP-HAの構築
p53-EGFP-HA、p53-305GCC-EGFP-HA又はp53-305TAG-EGFP-HAについてのＰＣＲ断片を、pPCKRS-mCherry-TAG-EGFP-HA又はpMbPylRS-mCherry-TAG-EGFP-HAのNheI部位及びMfeI部位にライゲーションすることによって、プラスミドを得た。ｐ５３−ＥＧＦＰ−ＨＡのＰＣＲ断片を、プライマーＡＧ５２／ＡＧ５５を使用してオーバーラップＰＣＲによって２つの断片を組み合わせることによって得た：ｐ５３断片（プライマーＡＧ５２／ＡＧ５３、及び鋳型としてｐ５３  ｃＤＮＡを使用して生成した）及びＧＦＰ−ＨＡ断片（プライマーＡＧ５４／ＡＧ５５、及び鋳型としてpmCherry-TAG-EGFP-HAを使用して生成した）。ｐ５３−Ｋ３０５Ａ−ＥＧＦＰ−ＨＡのＰＣＲ断片を、プライマーＡＧ５２／ＡＧ５５を使用して、オーバーラップＰＣＲによって３つの断片：ｐ５３由来の２つの断片（プライマーＡＧ５２／ＡＧ５８及びＡＧ５６／ＡＧ５３、及び鋳型としてｐ５３  ｃＤＮＡを使用して生成した）及び上記のＧＦＰ−ＨＡ断片を組み合わせることによって得た。ｐ５３−３０５ＴＡＧ−ＧＦＰ−ＨＡのＰＣＲ断片は、ＡＧ５８の代わりにプライマーＡＧ５７を用いて同じ戦略によって得た。
【０１２５】
結果
ｐ５３−Ｋ３０５＊−ｅｇｆｐ−ｈａ由来の全長のｐ５３−ＥＧＦＰ−ＨＡタンパク質の産生は、ＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対及び１の添加に依存し、これは、ｐ５３の３０５位のアンバーコドンＴＡＧに応じて１が組み入れられることを確認している。ウエスタンブロット（図８Ｂ）は、１を含有するｐ５３のレベルが、内在性のｐ５３レベルと同程度であったが、それよりもわずかに低かったことを実証している。
【０１２６】
蛍光イメージングによって、以前報告された通り（(a) Liang, S. H.; Clarke, M. F. J. Biol. Chem. 1999, 274, 32699-32703; (b) O'keefe, K.; Li, H. P.; Zhang, Y. P. Mol. Cell. Biol. 2003, 23, 6396-6405）、ｐ５３−ＥＧＦＰ−ＨＡが核に局在していること、及びｐ５３−Ｋ３０５Ａ−ＥＧＦＰ−ＨＡが 主に細胞質ゾルに局在していることが確認された（図８Ｃ）。１（１ｍＭ）の存在下でｐ５３−Ｋ３０５＊−ｅｇｆｐ−ｈａがＰＣＫＲＳ／ＰｙｌｔＲＮＡＣＵＡ対と一緒に発現している場合、ｐ５３は主に細胞質ゾルに局在していることが観察された（図８Ｄ及び図９）。これは、ｐ５３ＮＬＳシグナルの機能が、単一のケージドリジンの導入によって有効に抑止されていることを実証している。光分解（５秒；３６５ｎｍ；１.２ｍＷ／ｃｍ２）すると、脱ケージング及びその後のｐ５３の核内移入の結果として、細胞質内のｐ５３の進行性の核内移入が観察される（図８Ｄ、図９）。この系が非常に複雑であることと一致して、核質の場合よりも核内移入における細胞間の変動性が大きいことが観察される。対照実験では、我々は、ｐ５３の３０５位のアンバーコドンに応じてε−Ｂｏｃ−保護されたリジン又はチロシンを組み入れた。これらのｐ５３変異体は、光分解した後、細胞質に局在し、核には局在化せず（図８Ｄ、図９）、これは、再局在化が１の特異的な脱ケージングに起因することを確認している。
【０１２７】
結論として、我々は、新しい光ケージドリジン１の合成及びヒト細胞内のタンパク質への部位特異的な遺伝的な組み入れを実証した。このアミノ酸を使用して核局在化シグナルをケージングし、ヒト細胞におけるタンパク質の局在化を、非光損傷性のＵＶ照射の急速なパルスを使用して光化学的に制御することによって核内移入の動態を測定した。
【実施例７】
【０１２８】
生細胞におけるシグナル伝達ネットワークの時間的解析を可能にする、遺伝子工学で操作された光によって活性化されたキナーゼ 
生細胞の内部で、高い時間分解能でユーザー定義のキナーゼを活性化することにより、シグナルトランスダクションについての理解が加速する。我々は、光によって活性化されたキナーゼを創出するための一般的な戦略を報告する。光活性化可能なＭＥＫ１により、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達内のサブネットワークを特異的、急速、且つ受容体非依存的に活性化することが可能になる。微速度顕微鏡により、ＭＥＫ１を光活性化した後に、単一の哺乳動物の細胞におけるＥＲＫ２の移行を高い時間分解能で観察することが可能になった。光活性化されたサブネットワークは、ＥＧＦ刺激した経路よりもはるかに少ない細胞間の変動性を示す。ＥＲＫ２の核内レベルはＥＧＦに曝露させると上昇するが、刺激前のレベルに戻る前に、光活性化されたサブネットワークにより、核内のＥＲＫ２のレベルが持続する。ＭＥＫ１の上流のＭＡＰキナーゼ経路は、ＥＲＫ２の移行前に遅延を導入するが、移行の動態は一度開始されたら制限されない。ＭＥＫ１を光活性化した後の核内へのＥＲＫ２の蓄積は、Ｓ字状（sigmoidal）の時間経過を示し、これは、核内移入に対する律速であるＭＥＫ１による非発展的な（離散的な）ＥＲＫ２の二重リン酸化と一致した。
【０１２９】
緒言
生物体は、複雑なシグナル伝達ネットワークを時間的且つ空間的に調節することによって生存し、発達し、環境の変化に応答する。正常な生理状態及び疾患においてシグナル伝達ネットワークが情報を伝達する動的なプロセスを理解することは、重要な目的である。
【０１３０】
プロテインキナーゼは、ほぼ間違いなく、最も重要なクラスのシグナル伝達タンパク質である。酵素のこの大きなクラス（５００を超えるメンバーを含有する（Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., and Sudarsanam, S. (2002). The protein kinase complement of the human genome. Science 298, 1912-1934））は、ガンマリン酸をＡＴＰから標的タンパク質の特定のチロシン残基、トレオニン残基又はセリン残基に転移させる。代謝プロセス、細胞周期の進行、細胞骨格の再配置、細胞小器官輸送、膜輸送、筋肉収縮、成長、アポトーシス及び分化、免疫並びに学習及び記憶を含めたほとんど全ての生物学的プロセスは、リン酸化によって制御される（Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., and Sudarsanam, S. (2002). The protein kinase complement of the human genome. Science 298, 1912-1934）。
【０１３１】
キナーゼに媒介されるネットワークの接続性についての理解が広がるにつれ（Breitkreutz, A., Choi, H., Sharom, J. R., Boucher, L., Neduva, V., Larsen, B., Lin, Z. Y., Breitkreutz, B. J., Stark, C., Liu, G., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science 328, 1043-1046）、シグナルトランスダクション経路が、クロストークする可能性があり、フィードバックする可能性があり、フィードフォワードする可能性があり、全く異なる速度で作動する基本のステップを含有する可能性がある、複雑で動的な多段階プロセスであることがますます明らかになりつつある。シグナル伝達ネットワークが複雑であることにより、経路の細胞外の入力とその出力との間の事象に分子的な原因及び効果を割り当てることが難しくなっている。我々は、細胞内の単一のキナーゼの活性化を急速に且つ特異的に標的にする能力により、細胞のシグナル伝達ネットワークを、より単純なサブネットワークに分けることが可能になるはずであることを理解した（図１４ａ）。これらのより単純なサブネットワークは、試験をより受けやすい可能性があり、ネットワーク全体の状況では解明されない事象の動態を直接観察することが可能になり得る。
【０１３２】
プロテインキナーゼの活性を制御するためのいくつかの方法が報告されており、それらとしては、二量体化の誘導（Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., and Crabtree, G. R. (1993). Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science 262, 1019-1024）、制御分解（Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., and Wandless, T. J. (2006). A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell 126, 995-1004）、遺伝子工学で操作されたアロステリック活性化（Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., and Hahn, K. M. (2010). Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol 28, 743-747）、不活性化ミューテーションの化学的なレスキュー（Qiao, Y., Molina, H., Pandey, A., Zhang, J., and Cole, P. A. (2006). Chemical rescue of a mutant enzyme in living cells. Science 311, 1293-1297）及び感作されたキナーゼの選択的な阻害（Bishop, A. C., Ubersax, J. A., Petsch, D. T., Matheos, D. P., Gray, N. S., Blethrow, J., Shimizu, E., Tsien, J. Z., Schultz, P. G., Rose, M. D., et al. (2000). A chemical switch for inhibitor-sensitive alleles of any protein kinase. Nature 407, 395-401）が挙げられる。これらの方法は、キナーゼ機能に関する我々の知見に実質的に寄与してきたが（Burkard, M. E., Randall, C. L., Larochelle, S., Zhang, C., Shokat, K. M., Fisher, R. P., and Jallepalli, P. V. (2007). Chemical genetics reveals the requirement for Polo-like kinase 1 activity in positioning RhoA and triggering cytokinesis in human cells. Proc Natl Acad Sci 104, 4383-4388、Choi, D. S., Wei, W., Deitchman, J. K., Kharazia, V. N., Lesscher, H. M., McMahon, T., Wang, D., Qi, Z. H., Sieghart, W., Zhang, C., et al. (2008). Protein kinase Cdelta regulates ethanol intoxication and enhancement of GABA-stimulated tonic current. J Neurosci 28, 11890-11899、Justman, Q. A., Serber, Z., Ferrell, J. E., Jr., El-Samad, H., and Shokat, K. M. (2009). Tuning the activation threshold of a kinase network by nested feedback loops. Science 324, 509-512、Kim, J. S., Lilley, B. N., Zhang, C., Shokat, K. M., Sanes, J. R., and Zhen, M. (2008). A chemical-genetic strategy reveals distinct temporal requirements for SAD-1 kinase in neuronal polarization and synapse formation. Neural Dev 3, 23、Larochelle, S., Batliner, J., Gamble, M. J., Barboza, N. M., Kraybill, B. C., Blethrow, J. D., Shokat, K. M., and Fisher, R. P. (2006). Dichotomous but stringent substrate selection by the dual-function Cdk7 complex revealed by chemical genetics. Nat Struct Mol Biol 13, 55-62、Li, S., Makovets, S., Matsuguchi, T., Blethrow, J. D., Shokat, K. M., and Blackburn, E. H. (2009). Cdk1-dependent phosphorylation of Cdc13 coordinates telomere elongation during cell-cycle progression. Cell 136, 50-61、Ventura, J. J., Hubner, A., Zhang, C., Flavell, R. A., Shokat, K. M., and Davis, R. J. (2006). Chemical genetic analysis of the time course of signal transduction by JNK. Mol Cell 21, 701-710）、これらは、ａ）特異的なキナーゼに限られる場合があり、ｂ）キナーゼを活性化するのではなく、不活性化し、ｃ）キナーゼの触媒活性を、キナーゼが果たし得る他の役割−例えば、足場又はアンカーとして作用することなどと独立して調節することができない場合があり、ｄ）キナーゼの触媒活性を活性化した後の数秒間のうちに起こる急速なプロセスを試験することができない。
【０１３３】
生細胞の内部のタンパク質機能を急速に活性化させるための潜在的に魅力的な戦略は、タンパク質内の重要なアミノ酸をアミノ酸の光ケージドバージョンに置き換え、不活性なタンパク質をもたらすことを含む。タンパク質を照明すると、光ケージが除去され、タンパク質のネイティブな機能が回復する（Deiters, A. Principles and applications of the photochemical control of cellular processes. Chembiochem 11, 47-53、Deiters, A. (2009). Light activation as a method of regulating and studying gene expression. Curr Opin Chem Biol 13, 678-686、Lawrence, D. S. (2005). The preparation and in vivo applications of caged peptides and proteins. Curr Opin Chem Biol 9, 570-575、Lee, H. M., Larson, D. R., and Lawrence, D. S. (2009). Illuminating the chemistry of life: design, synthesis, and applications of "caged" and related photoresponsive compounds. ACS Chem Biol 4, 409-427）。化学的な方法及び酵素的な方法としては、ネイティブな化学的なライゲーション及びインビトロにおける翻訳を使用して光ケージング基をタンパク質にインビトロで導入することが挙げられる（Endo, M., Nakayama, K., Kaida, Y., and Majima, T. (2004). Design and synthesis of photochemically controllable caspase-3. Angew Chem Int Ed 43, 5643-5645、Ghosh, M., Song, X., Mouneimne, G., Sidani, M., Lawrence, D. S., and Condeelis, J. S. (2004). Cofilin promotes actin polymerization and defines the direction of cell motility. Science 304, 743-746、Pellois, J. P., Hahn, M. E., and Muir, T. W. (2004). Simultaneous triggering of protein activity, and fluorescence. J Am Chem Soc 126, 7170-7171）。これらの手法は、ケージドタンパク質を、透過処理によって（Hahn, M. E., and Muir, T. W. (2004). Photocontrol of Smad2, a multiphosphorylated cell-signaling protein, through caging of activating phosphoserines. Angew Chem Int Ed 43, 5800-5803）、又はマイクロインジェクションによって（Pellois, J. P., and Muir, T. W. (2005). A Ligation and photorelease strategy for the temporal and spatial control of protein function in living cells. Angew Chem Int Ed 44, 5713-5717.）真核細胞に導入するために拡張されているが、これらの方法は、難しいままである。ある場合では、出芽酵母（S.cerevisiae）におけるセリンのリン酸化部位を、酵母においてアンバーコドンに応じて光ケージドセリンを組み入れる進化させたロイシル−ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡＣＵＡ対（Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., and Schultz, P. G. (2007). Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol 3, 769-772）を用いてＰｈｏ４に組み込んだ光ケージドセリンを使用して遮蔽したが、キナーゼの活性ではなく基質の利用可能性を調節するこの手法は、哺乳動物の細胞において実証されていない。さらに、この手法は、チロシンのリン酸化、又は、チロシンのリン酸化、トレオニンのリン酸化及びセリンのリン酸化の組み合わせを含めた多重リン酸化によって調節される大多数のプロセスを試験するために使用することができない。
【０１３４】
我々は、最近、哺乳動物の細胞においてアンバー終止コドンに応じて光ケージドアミノ酸１のタンパク質への組み入れを導く（図１４ｃ）（Gautier, A., Nguyen, D. P., Lusic, H., An, W., Deiters, A., and Chin, J. W. (2010). Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc 132, 4086-4088）、Ｍ．バーケリのピロリジル−ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡＣＵＡの進化させた変異体である光ケージドリジル−ｔＲＮＡ合成酵素／ＲＮＡＣＵＡ（ＰＣＫＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ）対を報告した。我々は、このアミノ酸をタンパク質の核局在化配列内に組み入れ、それらの核内移入機能を遮断し、タンパク質を細胞質ゾルに誤って局在化させた。光のパルスを１秒用いて脱ケージングすると、タンパク質上１がリジンに変換された−その核局在化配列が回復した−そして、核への局在化の動態をリアルタイムで追跡することができた（Gautier, A., Nguyen, D. P., Lusic, H., An, W., Deiters, A., and Chin, J. W. (2010). Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc 132, 4086-4088）。
【０１３５】
多くのプロテインキナーゼは、それらの調節ドメインを欠失させることによって、又は、それらのリン酸化（活性化）部位を負に荷電したアミノ酸にミューテーションさせることによって（Cowley, S., Paterson, H., Kemp, P., and Marshall, C. J. (1994). Activation of MAP kinase kinase is necessary and sufficient for PC12 differentiation and for transformation of NIH 3T3 cells. Cell 77, 841-852、Huang, S., Jiang, Y., Li, Z., Nishida, E., Mathias, P., Lin, S., Ulevitch, R. J., Nemerow, G. R., and Han, J. (1997). Apoptosis signaling pathway in T cells is composed of ICE/Ced-3 family proteases and MAP kinase kinase 6b. Immunity 6, 739-749、Mansour, S. J., Matten, W. T., Hermann, A. S., Candia, J. M., Rong, S., Fukasawa, K., Vande Woude, G. F., and Ahn, N. G. (1994). Transformation of mammalian cells by constitutively active MAP kinase kinase. Science 265, 966-970、Minden, A., Lin, A., McMahon, M., Lange-Carter, C., Derijard, B., Davis, R. J., Johnson, G. L., and Karin, M. (1994). Differential activation of ERK and JNK mitogen-activated protein kinases by Raf-1 and MEKK. Science 266, 1719-1723、Raingeaud, J., Gupta, S., Rogers, J. S., Dickens, M., Han, J., Ulevitch, R. J., and Davis, R. J. (1995). Pro-inflammatory cytokines and environmental stress cause p38 mitogen-activated protein kinase activation by dual phosphorylation on tyrosine and threonine. J Biol Chem 270, 7420-7426）構成的に活性化することができるので、キナーゼに活性化ミューテーションを、及び酵素の活性部位に光ケージングに重要な残基を同時に導入することにより、光活性化できる状態になっているキナーゼを創出する可能性があり得ると我々は理解した。
【０１３６】
プロテインキナーゼは、それらのＡＴＰ結合ポケットにほぼ普遍的に保存された、ＡＴＰをつなぎ留め、方向づけるリジン残基を含有する（Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., and Sudarsanam, S. (2002). The protein kinase complement of the human genome. Science 298, 1912-1934）。いくつかのキナーゼの活性部位における保存されたリジンの代わりに１をモデリングすることにより、かさのあるケージング基はＡＴＰの結合を妨げるが、キナーゼの構造をかき乱すことなく活性部位内に収容され得ることが明らかになった（図１４ｂ）。
【０１３７】
ここで、我々は、光を用いて活性化することができるキナーゼを創出するための一般的な戦略を報告し、細胞の増殖、生存、分化、アポトーシス、運動性及び代謝において重要な保存されたＭＡＰキナーゼ経路に新しい洞察をもたらすために我々の手法を適用する。１〜２秒の光のパルスを用いて光活性化可能なＭＥＫ１キナーゼのバージョンを創出し、それによってＭＥＫ１によりトレオニン残基及びチロシン残基の両方のＥＲＫ１／２がリン酸化されるサブネットワークの特異的、急速且つ受容体非依存的な活性化が可能になり、それが、核内へのＥＲＫ１／２の蓄積並びにＰＣ１２細胞における神経の分化に重要な転写因子のリン酸化及び活性化並びに細胞周期への再進入並びに線維芽細胞におけるＤＮＡ合成の開始につながる（Dikic, I., Schlessinger, J., and Lax, I. (1994). PC12 cells overexpressing the insulin receptor undergo insulin-dependent neuronal differentiation. Curr Biol 4, 702-708、Lenormand, P., Sardet, C., Pages, G., L'Allemain, G., Brunet, A., and Pouyssegur, J. (1993). Growth factors induce nuclear translocation of MAP kinases (p42mapk and p44mapk) but not of their activator MAP kinase kinase (p45mapkk) in fibroblasts. J Cell Biol 122, 1079-1088、Traverse, S., Seedorf, K., Paterson, H., Marshall, C. J., Cohen, P., and Ullrich, A. (1994). EGF triggers neuronal differentiation of PC12 cells that overexpress the EGF receptor. Curr Biol 4, 694-701）。
【０１３８】
タイムラプス（time-lapse）顕微鏡により、単一の細胞において、ＭＥＫ１を光活性化した後のＥＲＫ２の核内への蓄積を高い時間分解能で追跡することが可能になった。これらの実験により、光活性化されたサブネットワークがＥＧＦ刺激した経路よりもはるかに少ない細胞間の変動性を示すことが明らかになった。ＥＧＦ刺激により厳密な適応がもたらされ（Cohen-Saidon, C., Cohen, A. A., Sigal, A., Liron, Y., and Alon, U. (2009). Dynamics and variability of ERK2 response to EGF in individual living cells. Mol Cell 36, 885-*893）（ＥＲＫ２の核内レベルがＥＧＦに曝露させると上昇するが、その後刺激前のレベルに戻る現象）、光活性化されたＭＥＫ１のプールは、長期間核内に高レベルのＥＲＫ２を維持する定常の刺激として作用する。我々の結果は、ＭＥＫ１の上流のＭＡＰキナーゼ経路は、ＥＲＫ２の移行前に遅延を導入するが、移行の動態は一度開始されたら制限されないことを示している。ＭＥＫ１を光活性化した後の核内へのＥＲＫ２の蓄積は、時間とともにＳ字状であり、これは非発展的な（離散的な）（Burack, W. R., and Sturgill, T. W. (1997). The activating dual phosphorylation of MAPK by MEK is nonprocessive. Biochemistry 36, 5929-5933、Salazar, C., and Hofer, T. (2009). Multisite protein phosphorylation--from molecular mechanisms to kinetic models. FEBS J 276, 3177-3198）、核内移入に対する律速であるＭＥＫ１によるＥＲＫ２の二重リン酸化と一致した。
【０１３９】
結果
ＭＥＫ−１の光活性化によるＭＡＰキナーゼサブネットワークの制御
照明すると活性化することができるＭＥＫ１ミュータントを創出するために、我々は、まず、構成的に活性な、残基３０〜４９が欠失しているＭＥＫ１ミュータントであるＡ−ＭＥＫ１−ΔＮ（Ａは活性であることを示す）を構築した（Mansour, S. J., Matten, W. T., Hermann, A. S., Candia, J. M., Rong, S., Fukasawa, K., Vande Woude, G. F., and Ahn, N. G. (1994). Transformation of mammalian cells by constitutively active MAP kinase kinase. Science 265, 966-970）。Ａ−ＭＥＫ１−ΔＮにおける、ＡＴＰの結合及び触媒作用にとって重大なほぼ普遍的に保存されたリジンであるリジンＫ９７を、Ｋ９７のコドンをｍｅｋ１−ΔＮ−９７ＴＡＧを創出するアンバー終止コドンに置き換えること、及び進化させたＰＣＫＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対を用いて、このコドンに応じて１を指向的に組み入れることによって、光ケージドリジン１に置き換えた（Gautier, A., Nguyen, D. P., Lusic, H., An, W., Deiters, A., and Chin, J. W. (2010). Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc 132, 4086-4088）。これにより、Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮが産生され、ここでＣは、触媒の残基Ｋ９７が、アミノ酸１を遺伝的に組み入れることによってケージングされることを示す。
【０１４０】
免疫ブロッティングにより、ｍｅｋ１−ΔＮ−９７ＴＡＧでトランスフェクトされ、１（２ｍＭ）の存在下で培養させるとＰＣＫＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対を発現するヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞におけるＣ−ＭＥＫ１−ΔＮタンパク質のレベルが、１の代わりに、ヒトチロシンアンバーサプレッサーｔＲＮＡＴＹＲＣＵＡを用いてチロシンを組み入れた場合に得られたＣ−ＭＥＫ１−ΔＮタンパク質のレベルに匹敵したことが示された（図１５ａ）。同様に、Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮのレベルは、Ａ−ＭＥＫ１−ΔＮ及びキナーゼの触媒活性を無効にする公知のミューテーション、Ｋ９７Ｍを含有するＤ−ＭＥＫ１−ΔＮミュータント（Ｄは機能しないことを示す）のレベルに匹敵した（図１５ａ及び図２１）。総合すると、これらの知見は、光ケージドキナーゼを野生型キナーゼに匹敵するレベルで産生することができること、及びトランスフェクトされた細胞におけるこれらのタンパク質のレベルが、マイクロモル濃度で細胞に存在する内在性のＭＥＫ１のレベルに匹敵すること（図２１ｂ）を実証している。
【０１４１】
ＭＥＫ１は、下流の細胞外シグナルに調節されるプロテインキナーゼであるＥＲＫ１及びＥＲＫ２に高度に特異的であり、他の公知の基質を有さない（Shaul, Y. D., and Seger, R. (2007). The MEK/ERK cascade: from signaling specificity to diverse functions. Biochim Biophys Acta 1773, 1213-1226）。ＭＥＫ１は、ＥＲＫ１／２における２つの調節残基、どちらも保存されたＴｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ（ＴＥＹ）モチーフの一部であるトレオニン及びチロシンをリン酸化する（Payne, D. M., Rossomando, A. J., Martino, P., Erickson, A. K., Her, J. H., Shabanowitz, J., Hunt, D. F., Weber, M. J., and Sturgill, T. W. (1991). Identification of the regulatory phosphorylation sites in pp42/mitogen-activated protein kinase (MAP kinase). EMBO J 10, 885-892）。光ケージドリジン１を導入することによってキナーゼ活性が妨げられることを検証するために、静止ＨＥＫ２９３ＥＴ細胞において、Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮを高感度緑色蛍光タンパク質と融合したＥＲＫ２（ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２）と同時発現させた。免疫ブロッティングにより、内在性のＥＲＫ１／２及びＥＧＦＰ−ＥＲＫ２のどちらにおいてもＴＥＹモチーフがリン酸化されないことが明らかになり（図１５ａ）、これは、ケージドリジン１により、Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮの触媒活性がＤ−ＭＥＫ１−ΔＮにおけるＫ９７Ｍミューテーションと同じくらい効率的に遮断されることを示している。
【０１４２】
Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮを活性化するために、我々は、培養プレートの下に置いた３６５ｎｍの発光ダイオード（ＬＥＤ，light-emitting diode）ランプを使用してタンパク質を産生している細胞を１分間照明した。この方法により、ウエスタンブロット分析するために十分な数の細胞を、試料を加熱することを回避する単色の光で照明することが可能になった。免疫ブロッティングにより、細胞を照明した１分後にＥＧＦＰ−ＥＲＫ２及び内在性のＥＲＫ２がリン酸化され、照明の１０分後あたりでリン酸化が最大になることが明らかになった（図１５ｂ及び図２２）。リン酸化された内在性のＥＲＫ１／２よりも多くのリン酸化されたＥＧＦＰ−ＥＲＫ２が観察された。これは、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２及びＣ−ＭＥＫ１−ΔＮは、あるサブセットの細胞のみが、トランスフェクションによってそれを含有するが、内在性のＥＲＫ１／２は本質的に全ての細胞が含有するという事実と一致する。これらの知見は、リン酸化が、全ての細胞に影響を及ぼし、ＥＲＫのリン酸化につながる内在性のＭＡＰキナーゼ経路を活性化する照明誘導性の細胞のストレス応答ではなく、アンケージド同時発現Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮに直接起因することを示唆している。Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮを不活性なキナーゼであるＤ−ＭＥＫ１−ΔＮに置き換える対照実験（図１５ｂ及び図２２）又はタンパク質なしの対照実験（図２２）では、照明した後に、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２又は内在性のＥＲＫ１／２の検出可能なリン酸化は導かれなかった。これらの対照実験は、さらに、照明によって内在性のＭＡＰキナーゼ経路は活性化されず、ＥＲＫのリン酸化が導かれることを実証している。トランスフェクトされた細胞におけるＥＧＦＰ−ＥＲＫ２のレベルは、内在性のＥＲＫのレベルよりも低い、又はそれと等しい。
【０１４３】
Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮとＥＧＦＰ−ＥＲＫ２を同時発現している細胞を、時間を増やしながら照明することにより、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２のリン酸化が増え（図１５ｃ）、これは、単に照明する時間を調整することによって、活性なキナーゼの細胞における濃度を高い精度で制御することが可能であることを実証している。
【０１４４】
Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮを光活性化することによってＥＲＫ１／２基質のリン酸化が導かれることを実証するために、我々は、ＥＲＫ１／２の２つの下流の基質であるｐ９０リボソームのＳ６キナーゼｐ９０ＲＳＫ及び転写因子Ｅｌｋ−１のリン酸化の状態を探索した。Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮとＥＧＦＰ−ＥＲＫ２を同時発現している静止細胞を照明することにより、Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮの代わりにＤ−ＭＥＫ１−ΔＮを使用した場合、又はＭＥＫ１阻害剤Ｕ０１２６を加えた場合には観察されなかった、内在性のリン酸化されたｐ９０ＲＳＫ及びＥｌｋ−１が増加した（図１５ｄ）。これらのデータは、Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮを光活性化することにより、細胞において、ＥＲＫ１／２がリン酸化され、その後、ｐ９０ＲＳＫ及びＥｌｋ−１がリン酸化されるＭＡＰキナーゼ経路のサブネットワークを特異的に活性化することが可能になることを実証している。
【０１４５】
ＥＧＦ刺激すると、長い遅滞期の後、高い細胞間の変動性を伴ってＥＲＫの移行が導かれる
細胞全体内のサブネットワークを特異的に活性化することにより、経路全体を活性化した場合には観察することが難しいサブネットワークにおけるプロセスの動態を直接観察することが可能になり得る。活性化因子としてのその役割に加えて、ＭＥＫ１は、ＥＲＫ１／２に対する細胞質のアンカータンパク質としても作用する（Fukuda, M., Gotoh, Y., and Nishida, E. (1997). Interaction of MAP kinase with MAP kinase kinase: its possible role in the control of nucleocytoplasmic transport of MAP kinase. EMBO J 16, 1901-1908、Rubinfeld, H., Hanoch, T., and Seger, R. (1999). Identification of a cytoplasmic-retention sequence in ERK2. J Biol Chem 274, 30349-30352）。二重にリン酸化されると、ＥＲＫ１／２は、ＭＥＫ１及びそれの他の細胞質のアンカーから脱離し、核内に移行し（Khokhlatchev, A. V., Canagarajah, B., Wilsbacher, J., Robinson, M., Atkinson, M., Goldsmith, E., and Cobb, M. H. (1998). Phosphorylation of the MAP kinase ERK2 promotes its homodimerization and nuclear translocation. Cell 93, 605-615、Rubinfeld, H., Hanoch, T., and Seger, R. (1999). Identification of a cytoplasmic-retention sequence in ERK2. J Biol Chem 274, 30349-30352）、そこで、転写因子をリン酸化することによって遺伝子発現を調節する（Brunet, A., Roux, D., Lenormand, P., Dowd, S., Keyse, S., and Pouyssegur, J. (1999). Nuclear translocation of p42/p44 mitogen-activated protein kinase is required for growth factor-induced gene expression and cell cycle entry. EMBO J 18, 664-674、Chen, R. H., Sarnecki, C., and Blenis, J. (1992). Nuclear localization and regulation of erk- and rsk-encoded protein kinases. Mol Cell Biol 12, 915-927、Kim, K., Nose, K., and Shibanuma, M. (2000). Significance of nuclear relocalization of ERK1/2 in reactivation of c-fos transcription and DNA synthesis in senescent fibroblasts. J Biol Chem 275, 20685-20692、Lenormand, P., Sardet, C., Pages, G., L'Allemain, G., Brunet, A., and Pouyssegur, J. (1993). Growth factors induce nuclear translocation of MAP kinases (p42mapk and p44mapk) but not of their activator MAP kinase kinase (p45mapkk) in fibroblasts. J Cell Biol 122, 1079-1088）。核内のＥＲＫ１／２が脱リン酸化されると核に戻る（Ando, R., Mizuno, H., and Miyawaki, A. (2004). Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting. Science 306, 1370-1373、Costa, M., Marchi, M., Cardarelli, F., Roy, A., Beltram, F., Maffei, L., and Ratto, G. M. (2006). Dynamic regulation of ERK2 nuclear translocation and mobility in living cells. J Cell Sci 119, 4952-4963、Volmat, V., Camps, M., Arkinstall, S., Pouyssegur, J., and Lenormand, P. (2001). The nucleus, a site for signal termination by sequestration and inactivation of p42/p44 MAP kinases. J Cell Sci 114, 3433-3443）。インビトロで、ＭＥＫ１に媒介されるＥＲＫ１／２の２つのリン酸化部位のリン酸化は非発展的（離散的）であり、ＥＲＫ１／２の離散的なリン酸化により、ジリン酸化された（di-phosphorylated）形態を形成する超高感度の、切り換え様の、Ｓ字状の動態が導かれることが公知である（Burack, W. R., and Sturgill, T. W. (1997). The activating dual phosphorylation of MAPK by MEK is nonprocessive. Biochemistry 36, 5929-5933、Ferrell, J. E., Jr., and Bhatt, R. R. (1997). Mechanistic studies of the dual phosphorylation of mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem 272, 19008-19016、Markevich, N. I., Hoek, J. B., and Kholodenko, B. N. (2004). Signaling switches and bistability arising from multisite phosphorylation in protein kinase cascades. J Cell Biol 164, 353-359、Salazar, C., and Hofer, T. (2009). Multisite protein phosphorylation--from molecular mechanisms to kinetic models. FEBS J 276, 3177-3198）。しかし、足場及び他のタンパク質がキナーゼを組織化し、調節し得るインビボでは（Bashor, C. J., Helman, N. C., Yan, S., and Lim, W. A. (2008). Using engineered scaffold interactions to reshape MAP kinase pathway signaling dynamics. Science 319, 1539-1543、Malleshaiah, M. K., Shahrezaei, V., Swain, P. S., and Michnick, S. W. The scaffold protein Ste5 directly controls a switch-like mating decision in yeast. Nature 465, 101-105）、この基本のステップについてのＳ字状の動態が保存されているかどうか、及びこれらのリン酸化、又はＭＥＫの上流のステップが、ＥＲＫ１／２の移行を制御するかどうかは未知である（Lidke, D. S., Huang, F., Post, J. N., Rieger, B., Wilsbacher, J., Thomas, J. L., Pouyssegur, J., Jovin, T. M., and Lenormand, P. (2010). ERK nuclear translocation is dimerization-independent but controlled by the rate of phosphorylation. J Biol Chem 285, 3092-3102）。この経路が、ＥＲＫ応答性の転写因子を制御する重要な調節ステップであるＥＲＫ１／２の移行の動態をどのように制御するかの洞察をもたらす目的で、我々は、ａ）経路全体を、受容体を媒介して刺激した後のＥＲＫ１／２の移行の動態と、ｂ）光活性化したサブネットワークにおけるＥＲＫの移行の動態を比較することを試みた。
【０１４６】
野生型のＭＥＫ１及びＥＧＦＰ−ＥＲＫ２を発現している細胞を１００ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子（ＥＧＦ）で刺激した場合、全体のＭＡＰキナーゼ経路が活性化され、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２が核内に移行する。蛍光微速度顕微鏡画像による数量化により、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核内への蓄積が、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２が急速に核内に蓄積する前に３分の遅滞期を伴うＳ字状の動態を示すことが実証されている（図１６ａ、ｂ）。移入のｔ１／２及び細胞質のＥＧＦＰ−ＥＲＫ２に対する核内のＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の最大の比に相当な細胞間の変動性が観察され、以前報告された通り（Cohen-Saidon, C., Cohen, A. A., Sigal, A., Liron, Y., and Alon, U. (2009). Dynamics and variability of ERK2 response to EGF in individual living cells. Mol Cell 36, 885-*893）、刺激後に観察された核内移入のタイミングの変動性は、核内のＥＲＫ２の画分の変動性よりも少なかった（Cohen-Saidon, C., Cohen, A. A., Sigal, A., Liron, Y., and Alon, U. (2009). Dynamics and variability of ERK2 response to EGF in individual living cells. Mol Cell 36, 885-*893）（図１６ｃ、ｄ）。ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核内への蓄積は、ピークになり、その後、刺激前のレベルにまで消失し、これは、厳密な適応として公知の細胞系における周知の効果である（Cohen-Saidon, C., Cohen, A. A., Sigal, A., Liron, Y., and Alon, U. (2009). Dynamics and variability of ERK2 response to EGF in individual living cells. Mol Cell 36, 885-*893）。この効果は、ＥＧＦシグナル伝達についての分子の詳細では理解されていないが、ＥＧＦ刺激を一部の−今のところは未定義の−経路におけるポイント（複数可）において補償する細胞のプロセスを伴うに違いない。トランスフェクトされた細胞を用いた我々の実験により、内在性のＭＥＫ１を有する安定な細胞系、及び、蛍光でタグを付けた、内在性のプロモーターから内在性のレベルで産生されたＭＥＫ２を用いてＥＧＦ刺激した後の細胞間の変動性に関する以前の観察が再現される（Cohen-Saidon, C., Cohen, A. A., Sigal, A., Liron, Y., and Alon, U. (2009). Dynamics and variability of ERK2 response to EGF in individual living cells. Mol Cell 36, 885-*893）。これにより、内在性の状況を我々の実験が反映することがさらに確認される。
【０１４７】
Ｃ−ＭＥＫ１を光活性化することにより、細胞間で高度に再現性のある急速なＥＲＫの移行が導かれる
ＭＥＫ１を光によって活性化した際のＥＲＫ２の核内移行の動態を特徴付けるために、我々は、新しい光活性化可能なＭＥＫ１が必要であった。Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮは、ＭＥＫ１の細胞質への局在化に関与する核外移出配列（ＮＥＳ，nuclear export sequence、残基３３〜４４）も含有する、ＭＥＫ１を構成的に活性するＮ末端配列（残基３０〜４９）が欠失しているので、ＥＲＫ２を細胞質内に隔離するのに使用することができなかった（Fukuda, M., Gotoh, I., Gotoh, Y., and Nishida, E. (1996). Cytoplasmic localization of mitogen-activated protein kinase kinase directed by its NH2-terminal, leucine-rich short amino acid sequence, which acts as a nuclear export signal. J Biol Chem 271, 20024-20028）。リン酸化された状態を模倣する、通常Ｒａｆによってリン酸化されてＭＥＫ１を活性化するＳｅｒ２１８及びＳｅｒ２２２がＡｓｐ残基で置換されている構成的に活性なＭＥＫ１（Ａ−ＭＥＫ１−ＤＤ）の保存されたリジンＫ９７を光ケージングすることによってＮ末端のＮＥＳを有する新しいケージドＭＥＫ１を創出した（Mansour, S. J., Matten, W. T., Hermann, A. S., Candia, J. M., Rong, S., Fukasawa, K., Vande Woude, G. F., and Ahn, N. G. (1994). Transformation of mammalian cells by constitutively active MAP kinase kinase. Science 265, 966-970）。免疫ブロッティング実験によって、新しい光活性化可能なケージドＭＥＫ１（Ｃ−ＭＥＫ１−ＤＤ）が、Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮと同じくらい効率的に機能することが確認された（図２３）。
【０１４８】
共焦点蛍光イメージングにより、Ｃ−ＭＥＫ１−ＤＤがＥＧＦＰ−ＥＲＫ２を細胞質内に保持することが示され、これは、そのアンカー機能が、その触媒活性が排除されている間維持されることを実証している（図１７ａ）。ＵＶフィルターを備えた顕微鏡のハロゲン化金属ランプで照明すると（２秒、３６５ｎｍ、１ｍＷ／ｃｍ２）、細胞質内にＣ−ＭＥＫ１−ＤＤ及びＥＧＦＰ−ＥＲＫ２を含有する休止状態にある細胞は、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２を核内に急速に蓄積した（図１７ａ、ｂ）。１０分以内に、細胞質のＥＧＦＰ蛍光Ｆ（ｎ／ｃ）に対する核のＥＧＦＰ蛍光Ｆ（ｎ／ｃ）の比に４倍の上昇が観察された（図１７ｂ）。照明する前に１０μＭのＭＥＫ１阻害剤Ｕ０１２６を加えることにより、核内への蓄積が有意に遮断された（図１７ａ、ｂ）。同様に、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２を、野生型ｗｔ−ＭＥＫ１と、又は触媒として機能しないミュータントＤ−ＭＥＫ１−ＤＤと同時発現している休止細胞を照明した場合、核内移行は観察されなかった（図１７ａ、ｂ）。これらの実験は、光によって活性化されたＣ−ＭＥＫ１−ＤＤがリン酸化されると、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２が休止細胞に移行することを示している。さらに、Ｃ−ＭＥＫ１−ＤＤを、リン酸化部位（ＴＥＹ）がＡＡＡにミューテーションしたＥＧＦＰ−ＥＲＫ２ミュータント（ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２−ＡＡＡ）と同時発現させた場合、照明した際にＥＧＦＰ−ＥＲＫ２−ＡＡＡの移行は観察されず（図１７ａ、ｂ）、これは、ＴＥＹモチーフの二重リン酸化によって駆動される核内移行と一致した。これらのデータは、ＭＥＫ１に誘導されるＴＥＹモチーフのリン酸化によるＥＲＫ２の活性化が、ＥＲＫ２の核内移行を誘発するために十分であることを示している。
【０１４９】
ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核内移行のリアルタイム測定により、Ｃ−ＭＥＫ１−ＤＤを光活性化した後のサブネットワークにおける移行プロセスが、経路全体のＥＧＦ刺激による活性化よりもはるかに速く開始されることが示されている（ｔ１／２＝１.５分対４．５分、図１８ｂ）。
【０１５０】
ＥＧＦ刺激とは対照的に、Ｃ−ＭＥＫ１−ＤＤの光活性化により、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核内への蓄積が長い期間にわたって持続される（図１８ａ、ｂ、図１６ｂ）。これは、光活性化されたＣ−ＭＥＫ１−ＤＤのプールが、定常の刺激として作用すること、及び、経路全体のＥＧＦ刺激とは異なり、サブネットワークの活性が厳密な適応を受けないことを示している。これらの知見は、分子標的がＥＧＦ応答において最適に調節されること、及び、これらの標的に対して作用する調節因子が、ＭＡＰＫネットワークにおいてＭＥＫ１とＥＲＫ２の間に位置することができないことを示唆している。
【０１５１】
移行の速度及び核内の蛍光の増加について、Ｃ−ＭＥＫ１−ＤＤを光活性化した場合、野生型ＭＥＫ１をＥＧＦで刺激した場合よりもはるかに少ない細胞間の変動性が観察され（図１８ｃ〜ｆ）、これは、光活性化されたサブネットワークの細胞間の変動性に対する感受性が、外部の刺激によって活性化されたネットワーク全体の細胞間の変動性に対する感受性よりも低いことを示している。そのようなサブネットワークの頑強性は定量的測定に役立つはずである。
【０１５２】
ＥＲＫ１／２を核内移入させるための定常の刺激は、核内でのＥＲＫ１／２の脱リン酸化及びその移出によって打ち消される（Ando, R., Mizuno, H., and Miyawaki, A. (2004). Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting. Science 306, 1370-1373、Costa, M., Marchi, M., Cardarelli, F., Roy, A., Beltram, F., Maffei, L., and Ratto, G. M. (2006). Dynamic regulation of ERK2 nuclear translocation and mobility in living cells. J Cell Sci 119, 4952-4963、Volmat, V., Camps, M., Arkinstall, S., Pouyssegur, J., and Lenormand, P. (2001). The nucleus, a site for signal termination by sequestration and inactivation of p42/p44 MAP kinases. J Cell Sci 114, 3433-3443）。この相殺プロセスを明らかにし、ＥＲＫ２の核外移出を可視化するために、Ｃ−ＭＥＫ１−ＤＤを光活性化することによってＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核内移行を誘導し、次いで、ＭＥＫ１阻害剤Ｕ０１２６を加えることによって、ＭＥＫ１に誘導されるＥＲＫ２の核内移行を遮断した。これにより、ＥＧＦＰの核内の蛍光の急速な喪失が引き起こされ（ｔ１／２が３分未満）（図１９ａ、ｂ、補足の動画Ｓ１）、これは、急速な脱リン酸化に誘導される、移入したＥＲＫ２の核外移出と一致する（Ando, R., Mizuno, H., and Miyawaki, A. (2004). Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting. Science 306, 1370-1373、Costa, M., Marchi, M., Cardarelli, F., Roy, A., Beltram, F., Maffei, L., and Ratto, G. M. (2006). Dynamic regulation of ERK2 nuclear translocation and mobility in living cells. J Cell Sci 119, 4952-4963）。これらのデータは、ＭＥＫ１に対するＵ０１２６の作用が、ＭＡＰキナーゼ経路に対するその効果の要因になるのに十分であることを実証している。
【０１５３】
ＥＲＫの移行の動態は、ＭＥＫ１に媒介されるリン酸化によって調節される
高い時間分解能を有する蛍光微速度顕微鏡検査により、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の移行のＳ字状曲線が示される。ＥＧＦ刺激による移行についてのＳ字状曲線（図１６ｂ）及び光活性化による移行についてのＳ字状曲線（図１８ｇ、ｈ及び補足の動画Ｓ２）は、一度移行が開始されたら、匹敵する傾斜を有する（５０％の正味の移行が生じている時の傾斜によって判断する）が、ＥＧＦ刺激した実験における最初の遅滞期は、光活性化された実験における最初の遅滞期よりもはるかに長い（図１８ｇ、ｈ及び図１６ｂを比較されたい）。これらの知見は、経路内のＭＥＫ１の上流のステップが、移行プロセスを活性化する前に遅延を導入するように機能するが、一度移行が始まれば、移行速度には有意な影響を及ぼさないことを示唆している。したがって、移行の速度は、経路内のＭＥＫ１とＥＲＫ２の間で定められる。サブネットワークについてのＳ字状曲線（図１８ｈ）は、以前はインビトロでのみ観察され、細胞における移行の速度を決定するためにインビボで操作したＭＥＫ１による離散的なＥＲＫ１／２の二重リン酸化と一致する（Ferrell, J. E., Jr., and Bhatt, R. R. (1997). Mechanistic studies of the dual phosphorylation of mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem 272, 19008-19016、Salazar, C., and Hofer, T. (2009). Multisite protein phosphorylation--from molecular mechanisms to kinetic models. FEBS J 276, 3177-3198）。ＬＥＤランプを用いて１分間にわたってサブネットワークを活性化した後、我々は、リン酸化されたＥＲＫ１／２の蓄積をウエスタンブロットによって追跡した。リン酸化されたＥＲＫ１／２は急速に蓄積したが、この方法の時間分解能では、二重にリン酸化された種の形成における遅滞期を直接観察することはできなかった（図２０ｄ、ｅ）。
【０１５４】
ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の移行の正味の動態及びそれらとＥＧＦＰ−ＥＲＫ２のリン酸化の速度との関係をさらに特徴付けるために、我々は、欠失Δ１７４〜１７７を含有し、核内移入速度は変化するが移出速度は変化しないことが報告されているＥＲＫ２−Δ４ミュータントの移行の速度を試験した（Lidke, D. S., Huang, F., Post, J. N., Rieger, B., Wilsbacher, J., Thomas, J. L., Pouyssegur, J., Jovin, T. M., and Lenormand, P. (2010). ERK nuclear translocation is dimerization-independent but controlled by the rate of phosphorylation. J Biol Chem 285, 3092-3102）。このミュータントをＣ−ＭＥＫ１−ＤＤと同時発現している細胞を光活性化した場合、核内移行が観察されたが、動態は遅く（ｔ１／２＝６分）（図２０ａ、ｂ）、核内への蓄積のレベルは低かった（図２０ｃ）。核内への蓄積が遅いことは、この時点で核内移入の速度が移出速度よりもほんのわずかだけ速いことを示唆している。光活性化後の遅延時間及び移入の正味の速度（５０％の正味の移行が生じている時の傾斜によって判断する）はどちらも、野生型の場合から変化した。遅延時間及び移入の正味の速度が連動して変化したことは、野生型の場合のその核内移入において律速ステップになっているＥＲＫ１／２の離散的な二重リン酸化と一致する。我々のデータは、最近提唱された通り、このミュータントの移行が遅いことは、リン酸化が遅いことに起因し得ることを示唆している（Lidke, D. S., Huang, F., Post, J. N., Rieger, B., Wilsbacher, J., Thomas, J. L., Pouyssegur, J., Jovin, T. M., and Lenormand, P. (2010). ERK nuclear translocation is dimerization-independent but controlled by the rate of phosphorylation. J Biol Chem 285, 3092-3102）。移入速度及び移出速度が、それぞれのリン酸化速度及び脱リン酸化速度によって駆動されると考えると、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２−Δ４について観察される核内移入が遅いこと、及び核内への蓄積が減ることは、リン酸化されたＥＧＦＰ−ＥＲＫ２−Δ４の蓄積が遅いこと、及びそれが減ることを伴うはずである。ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２−Δ４及びＣ−ＭＥＫ１−ＤＤを同時発現している細胞について免疫ブロッティングし、ＬＥＤランプで１分間にわたって照明することにより、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２−Δ４のリン酸化の見かけの速度がＥＧＦＰ−ＥＲＫ２より遅いこと、及びＥＧＦＰ−ＥＲＫ２−Δ４のリン酸化の程度がＥＧＦＰ−ＥＲＫ２よりも低いことが明らかになった（図２０ｄ〜ｅ）。この実験により、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２−Δ４の核内への蓄積が遅いこと、及びそれが減ることとリン酸化が遅いことが直接互いに関係づけられ、それにより、ＥＲＫ１／２の核内移行がＭＥＫ１による二重のリン酸化の速度によって制御されることのさらなる証拠がもたらされる。
【０１５５】
考察
結論として、我々は、生きている哺乳動物の細胞において、１〜２秒の光パルスによって活性化することができるキナーゼを創出するための戦略を実証した。我々は、光ケージドリジン１を遺伝的にコードすることによって、ＭＥＫ１触媒活性を、そのアンカー機能を維持しながら不活性することができることを示した。我々は、活性化されたＭＥＫ１の量を、照明の持続時間によって制御することができること、及び我々の方法によってＭＡＰキナーゼシグナル伝達内のサブネットワークを、細胞外の受容体を通じた経路の活性化とは独立してオンにすることができることを実証した。
【０１５６】
我々は、光活性化した際のサブネットワークの活性化の動態は、ＥＧＦに媒介される活性化の動態よりも少ない細胞間の変動性を示すことを実証した。この知見は、多様な細胞外の入力によって生じるシグナルを、追加的なノイズを導入することによってこれらのシグナルを歪めることなく再現性よく伝達することにおけるＭＥＫ１サブネットワークの進化的に保存された役割を反映し得る。そのようなモデルにより、ＥＲＫ１／２が移入すると開始される転写性のプログラムが、細胞外の刺激のレベル及び強度に正確に応答することが可能になり得る。
【０１５７】
ＥＧＦによって活性化された経路とは異なり、サブネットワークは厳密な適応によって制御されない。これは、細胞間の変動がＭＥＫの活性化の上流のプロセスに起因し得ること、及びＭＥＫの下流の経路はＥＧＦ刺激によって引き出されるＥＲＫ２の移行における適応応答を引き出すために十分でないことを示唆している。
【０１５８】
ＥＧＦによる活性化とサブネットワークによる活性化を比較することによって、ＭＥＫ１に先立つステップにより、ＥＧＦ刺激の後、ＥＲＫ１／２の移行の開始に数分間の遅延が創出され、それによりＭＥＫ１の切り換え様の活性化が導かれるが、一度輸送が開始されれば、ＥＲＫ１／２の輸送の動態が劇的に変化することはなく、これは、ＭＥＫ１に先立つステップはＥＲＫ１／２の移行に対する律速ではないことを示していると我々は結論づけた。最終的に、我々は、ＭＥＫ１を光活性化した後のＥＲＫ１／２の移行速度が遅滞期を示すこと、及び、ＥＲＫ１／２のリン酸化に直接影響を及ぼすミューテーションが、ＭＥＫ１が活性化された後のＥＲＫ１／２の核内への蓄積の動態にも直接影響を及ぼすことを示した。これらの結果は、ＭＥＫ１によるＥＲＫ１／２の離散的な二重リン酸化が、このＭＡＰキナーゼ経路におけるＥＲＫの輸送に対する律速であることを示唆している。
【０１５９】
本明細書において提示している方法体系を使用して、細胞における空間的なキナーゼの活性化及び時間的なキナーゼの活性化の効果に取り組むための非常に高い時間分解能及び空間分解能をもたらすことができる（Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., and Voigt, C. A. (2009). Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature 461, 997-1001）。標的のリジン残基の相当な保存に起因して、本明細書において報告される光による活性化の方法は、他のキナーゼの光活性化されたバージョンを創出するために一般に、且つ容易に適用可能であるべきである。さらに、リジンの光ケージングを経路内の各キナーゼに適用することにより、キナーゼネットワークの動態及び個々のキナーゼの基質への正確な定量的洞察が可能になる。特異的且つ急速に活性化された単一の細胞サブネットワークにおけるそのような定量的洞察により、細胞間の変動性及び頑強性及び適応につながる分子経路がさらに明らかになり、シグナルトランスダクションの定量的モデルにおける実験パラメータを速やかに制約することが可能になるはずである（Aldridge, B. B., Burke, J. M., Lauffenburger, D. A., and Sorger, P. K. (2006). Physicochemical modelling of cell signalling pathways. Nat Cell Biol 8, 1195-1203、Asthagiri, A. R., and Lauffenburger, D. A. (2001). A computational study of feedback effects on signal dynamics in a mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway model. Biotechnol Prog 17, 227-239、Barkai, N., and Leibler, S. (1997). Robustness in simple biochemical networks. Nature 387, 913-917、Fujioka, A., Terai, K., Itoh, R. E., Aoki, K., Nakamura, T., Kuroda, S., Nishida, E., and Matsuda, M. (2006). Dynamics of the Ras/ERK MAPK cascade as monitored by fluorescent probes. J Biol Chem 281, 8917-8926）。我々の手法をＮＴＰの結合を利用する広範囲の他のタンパク質に拡張することも可能であろう。これにより、広範囲の生物学的プロセスの時間的な依存及び空間的な依存を操作及び調査することが可能となる。
【０１６０】
材料及び方法
試薬−光ケージドリジン１を以前に記載されている通り調製した（Gautier, A., Nguyen, D. P., Lusic, H., An, W., Deiters, A., and Chin, J. W. (2010). Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc 132, 4086-4088）。ＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）は、Cell Signaling社から購入した。ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６は、Promega社から購入した。組換えヒト上皮成長因子（ＥＧＦ，epidermal growth factor）は、Gibco社から購入した。ウエスタンブロットは、ＨＡタグ（Sigma社製）、Ｆｌａｇタグ（Cell Signaling社製）、ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）（Cell Signaling社製）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）（Ｔ２０２／Ｙ２０４）（Cell Signaling社製）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｌｋｌ（Ｓ３８３）（Cell signaling社製）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ９０ＲＳＫ（Ｓ３８０）（Cell Signaling社製）に対する抗体を使用して実施した。
【０１６１】
ＤＮＡ構築物−プラスミドp4CMVE-U6-PylT（哺乳動物の細胞においてピロリジルｔＲＮＡＣＵＡの発現を可能にする）及びpPCKRS-mCherry-TAG-EGFP-HAについては前述している（Gautier, A., Nguyen, D. P., Lusic, H., An, W., Deiters, A., and Chin, J. W. (2010). Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc 132, 4086-4088）。哺乳動物の細胞においてヒトチロシンアンバーサプレッサーtRNAＴＹＲＣＵＡを発現させるためのプラスミドpCR2.1/htRNAＴＹＲＣＵＡは、T. Ashton Cropp（University of Maryland）からの好意の寄贈品であった。ＨＡタグと融合したＭＥＫ１ミュータント（ＭＥＫ１−ＨＡ）をコードする遺伝子は、以前報告されたpPCKRS-p53-EGFP-HAプラスミドのNheI部位及びBssHII部位にライゲーションし（Gautier, A., Nguyen, D. P., Lusic, H., An, W., Deiters, A., and Chin, J. W. (2010). Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc 132, 4086-4088）、ＭＥＫ１−ＨＡと光ケージドリジル−ｔＲＮＡ合成酵素ＰＣＫＲＳの同時発現を可能にした。異なるＭＥＫ１ミュータントを発現させるためのプラスミドは、ＰＣＲミューテーション誘発によって得られ、ＤＮＡ配列決定によって配列を検証した。Ａ−ＭＥＫ１−ΔＮは、欠失Δ３０〜４９を含有し；Ｃ−ＭＥＫ１−ΔＮは、欠失Δ３０〜４９及びミューテーションＫ９７ＴＡＧを含有し；Ｄ−ＭＥＫ１−ΔＮは、欠失Δ３０〜４９及びミューテーションＫ９７Ｍを含有し；Ａ−ＭＥＫ１−ＤＤは、ミューテーションＳ２１８Ｄ及びＳ２２２Ｄを含有し；Ｃ−ＭＥＫ１−ＤＤは、ミューテーションＳ２１８Ｄ、Ｓ２２２Ｄ及びＫ９７ＴＡＧを含有し；Ｄ−ＭＥＫ１−ΔＮは、ミューテーションＳ２１８Ｄ、Ｓ２２２Ｄ及びＫ９７Ｍを含有し；ＭＥＫ１−Ｋ９７Ｍ−ＨＡは、ミューテーションＫ９７Ｍを含有する。ＥＲＫ２遺伝子は、pEGFP-C（Clontech社製）の高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子の下流のPstI部位及びKpnI部位にライゲーションした。ＥＲＫ２ミュータントを発現させるためのプラスミドは、ＰＣＲミューテーション誘発によって得られ、ＤＮＡ配列決定によって配列を検証した。ＥＲＫ２−ＡＡＡは、ミューテーションＴ１８５Ａ、Ｅ１８６Ａ及びＹ１８７Ａを含有する。ＥＲＫ２−Δ４は、欠失Δ１７４〜１７７を含有する。
【０１６２】
細胞培養及びトランスフェクション−ヒト胎児由来腎臓２９３ＥＴ細胞を、トランスフェクトする前に、３７℃、５％のＣＯ２雰囲気下、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１×pen-strep溶液を補充したDMEM+GlutaMAX-1培地（Gibco社製）中で２４時間培養させた。細胞に、Genejuice（Novagen社製）を製造者のプロトコールに従って一過性にトランスフェクトした。分析前に、細胞の血清を欠乏させ（０．１％のＦＢＳを伴うDMEM）、２ｍＭの光ケージドリジン１と一緒に２４時間培養させた。光活性化実験の前に培養培地を新鮮な、０．１％のFBSを補充した１を含まないDMEMと置き換えた。
【０１６３】
光活性化−２４ウェルプレートにおいて培養させた細胞を、プレートの下に置いた高出力のＬＥＤ供給源モジュールを用いて、３６５ｎｍで照明し（黒色-led-365、Prizmatix）、次いで免疫ブロッティング分析のために回収した。
【０１６４】
免疫ブロッティング−細胞を、氷冷のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，phosphate buffer saline）で洗浄し、次いで、プロテアーゼ阻害剤反応混液（Roche社製）、１ｍＭのバナジン酸ナトリウム、５ｍＭのフッ化ナトリウム及び１０ｍＭのEDTAを補充した氷冷の普遍的な溶解緩衝液（Roche社製）を用いて溶解した。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した後、適切な抗体を用いて免疫ブロッティングによって分析した。
【０１６５】
生細胞のイメージング−μ−Dish（Ibidi社製）において培養させた生細胞を、室温でPlan Apochromat ６３×／１．４油浸対物レンズを備えた倒立Zeiss LSM710レーザー走査顕微鏡を用いてイメージングした。光活性化を、EXFO X-Cite120 XL Systemを用いて、ＵＶフィルターを伴う１２０Ｗのハロゲン化金属ランプを使用しておよそ２秒（力：１ｍＷ／ｃｍ２）実施した（フィルターの設定−励起Ｇ３６５、ビームスプリッターＦＴ３９５、発光ＢＰ４４５／５０）。ＥＧＦＰを、４８８ｎｍのアルゴンレーザーを用いて励起させ、５００〜５６０ｎｍの発光を収集した。平均の核の蛍光強度（Ｆｎ）及び細胞質の蛍光強度（Ｆｃ）を、ImageJソフトウェアを使用して数量化して、Ｆ（ｎ／ｃ）比を次式によって決定することを可能にした：Ｆ（ｎ／ｃ）＝（Ｆｎ−Ｆｂ）／（Ｆｃ−Ｆｂ）、Ｆｂは平均バックラウンド蛍光強度である。
【０１６６】
［実施例７Ａ］
光によって活性化されたキナーゼにより、生細胞におけるシグナル伝達ネットワークの時間的解析が可能になる
補足の動画の一覧
動画Ｓ１．ＥＲＫ２の核細胞質間往復輸送を明らかにすること。
ＰＣＫＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２及びＣ−ＭＥＫ１−ＤＤをコードするプラスミドを同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、２ｍＭの１及び０．１％のFBSを補充した培地中で培養させた。細胞を、時間ｔ＝０分において３６５ｎｍの光を用いて照明し（２秒、１ｍＷ／ｃｍ２）、８分後にＵ０１２６（１０μＭ）を加えた。右側に、代表的な細胞のＥＧＦＰ蛍光が示されている。左側には、対照として、Ｕ０１２６で処置していない代表的な細胞のＥＧＦＰ蛍光が示されている。グラフは、８分後にＵ０１２６を加えた（黒色）場合及びＵ０１２６を加えていない（灰色）場合の時間に対する正規化されたＦ（ｎ／ｃ）を示している（１０の代表的な実験の平均）。
【０１６７】
動画Ｓ２．ケージドＭＥＫ１を光活性化した際の初期のＥＧＦＰ−ＥＲＫ２の核内移行の動態
ＰＣＫＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡＣＵＡ、ＥＧＦＰ−ＥＲＫ２及びＣ−ＭＥＫ１−ＤＤをコードするプラスミドを同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、２ｍＭの１及び０．１％のFBSを補充した培地中で培養させた。細胞を、時間ｔ＝０秒において３６５ｎｍの光を用いて照明した（２秒、１ｍＷ／ｃｍ２）。代表的な細胞のＥＧＦＰ蛍光を追跡した。スケールバーは１０μｍを表す。右側のグラフは、時間に対する正規化されたＦ（ｎ／ｃ）を示す（１０の代表的な実験の平均）。
【０１６８】
図２１、図２２及び図２３を参照する。
【０１６９】
実施例７の参考文献
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【０１７０】
プライマーリスト
mGFPHindamf
5’-GCTCAAGCTTCACCATGGCACTAGCAATTAGCCATGGTGAGCAAG
GGCGAGGAGCTGTTCACCG-3’
AG27
5’-TCCGGTGGATCCTTATCATTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAC
ATCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’
3367bkf
5’-GAAGGTACCCGATCGCCGCGGACCGGTTTAATTAAGCGGCCGCTA
GTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCC-3’
3367bkr
5’-ATAGCGGCCGCTTAATTAAACCGGTCCGCGGCGATCGGGTACCAT
GCATGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAAC-3’
KpnpvukSf
5’-GAAGGTACCCGATCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCAT
TAG-3’
AgesacKSr
5’-GAAACCGGTCCGCGGAAGCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGC
ATG-3’
AG40
5’-TAAACTTAAGCTTGCCACCATGGACTACAAGGACGAC-3’
AG43
5’-GGCACAGGTTCTTGTCCACCCGGAAAATCTGCTTGGACAGCTCGGTG
TCGTTGTTGATGCCGAACCGCTCCACGTACTC-3’
AG42
5’-GGTGGACAAGAACCTGTGCCTGCGGCCTATGCTGAGCCCCACCCT
GTGCAACTACATGCGGAAACTGGACAGAATC-3’
AG41
5’-ATCTGCAGAATTCCACCACACTGGACTAGTGGATCCTTATC-3’
AG16
5’-ATGCTAGGATCCTTAATTAAACTAGTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG
G-3’
AG17
5’-ATGCTAAGATCTGTCCCGTTGATTTTGGTGCC-3’
AG30
5’-ATGCTAGGATCCAGATCTTCTAGACTCGAAGGAAACCTG-3’
AG20
5’-ATGCTACAATTGCCGCGGGAATTCGCTAGCAAAAACCGCACTTGTC
CGGAAACC-3’
AG52
5’-CAGATCCGCTAGCACCGGTGCGATCGCACCATGGAGGAGCCGCA
GTCAGATCCTAG-3’
AG53
5’-GCTCGAGATCTGAGTCCGGATGGCGCGCCGTCTGAGTCAGGCCCTT
CTG-3’
AG54
5’-GGCGCGCCATCCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGC-3’
AG55
5’-TAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTC-3’
AG58
5’-GTTGTTGGGCAGTGCTCGGGCAGTGCTCCCTGGGGGCAGCTCGTG
GTG-3’
AG56
5’-CGAGCACTGCCCAACAACACCAG-3’
AG57
5’-GTTGTTGGGCAGTGCTCGCTAAGTGCTCCCTGGG-3’
AG95
5’-AGATCCGCTAGCACCGGTGCGATCGCACCATGGCTAGCATGACTG
GTGGACAG-3’
AG96
5’-CGGATGGCGCGCCTTATCATTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGG
TACATCTCGAGGCAGCCGGATCCTTTG-3’
AG97
5’-TTGATCCAGTTTCTTTTTCTACGCCTGGCCC-3’
AG98
5’-TTGATCCAGTTTCTTTTTGGCCGCCTGGCCC-3’
AG99
5’-AAAAAGAAACTGGATCAAG-3’
【０１７１】
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(19) Lusic, H.; Deiters, A. Synthesis 2006, 2147-2150
(20) Neumann, H.; Hancock, S. M.; Buning, R.; Routh, A.; Chapman, L.; Somers, J.; Owen-Hughes, T.; van Noort, J.; Rhodes, D.; Chin, J. W. Molecular Cell 2009, 36, 153-163
(21) Rackham, O.; Chin, J. W. Nat. Chem. Biol. 2005, 1, 159-166
【０１７２】
【表１】
2013521269.tif 000007
【図１】
2013521269.tif 000009
【図２】
2013521269.tif 000010
【図３】
2013521269.tif 000011
【図４】
2013521269.tif 000012
【図５】
2013521269.tif 000013
【図６】
2013521269.tif 000014
【図７】
2013521269.tif 000015
【図８】
2013521269.tif 000016
【図９】
2013521269.tif 000017
【図１０】
2013521269.tif 000018
【図１１】
2013521269.tif 000019
【図１２】
2013521269.tif 000020
【図１３】
2013521269.tif 000021
【図１４ａ】
2013521269.tif 000022
【図１４ｂ−ｃ】
2013521269.tif 000023
【図１５】
2013521269.tif 000024
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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