(57)【要約】  癌患者の生存を延長させる細胞ベースのワクチンである。このワクチンは、ＨＬＡ  Ａ１及びｇｐ９６−Ｉｇ（小胞体保持シグナルＫＤＥＬが、ヒトＩｇＧ１のＦｃ−部分で置き換えられているヒトｇｐ９６）で形質導入された、照射され培養された肺腺癌細胞（ＡＤ  １００）を含み、進行し、再発し、又は転移性のＮＳＣＬＣに冒された患者に内皮注射された。ワクチンの投与により、患者の平均生存時間はプラセボで処置された同様な患者に比較して増大した。更に、ワクチンに対する患者の免疫応答（Ｔ細胞による抗原誘導されたインターフェロン−γの産生）は、生存時間と相関した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験者における癌を治療するための複数のホスト細胞を含むワクチンの使用において、前記ホスト細胞のそれぞれにおいて、少なくとも１つの腫瘍抗原と、前記ホスト細胞のそれぞれから分泌されるように改変された熱ショック蛋白質を共発現することを特徴とする使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用において、前記被験者の生存時間が、癌の同一のタイプ及びステージを有する他の被験者に関し予測された生存時間を超えて増加されることを特徴とする使用。
【請求項３】
請求項１に記載の使用において、前記ホスト細胞が癌細胞であることを特徴とする使用。
【請求項４】
請求項３に記載の使用において、前記ヒト被験者における前記癌が肺癌であり、並びに前記ホスト細胞が肺癌細胞であることを特徴とする使用。
【請求項５】
請求項４に記載の使用において、前記肺癌が非小細胞肺癌であり、並びに前記ホスト細胞が非小細胞肺癌細胞であることを特徴とする使用。
【請求項６】
請求項１に記載の使用において、前記ホスト細胞が、被験者に対して同種異系であることを特徴とする使用。
【請求項７】
請求項１に記載の使用において、前記ホスト細胞が照射されていることを特徴とする使用。
【請求項８】
請求項１に記載の使用において、前記ワクチンが皮内投与されることを特徴とする使用。
【請求項９】
請求項８に記載の使用において、前記ワクチンが、１日以内に被験者の皮膚の複数の部位にて投与されることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体を本明細書に組み込んだものとする、２０１０年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／３４７，３３６号の優先権を主張するものである。
【０００２】
政府委託研究としての記載条項
本発明は、国立衛生研究所から授与された登録番号ＰＯ１  ＣＡ１０９０９４号の下で政府の支持を得て行われた。合衆国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般的には医薬品、腫瘍学及び免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明は、細胞ベースのワクチンを使用する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者の生存期間を延長させる組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
多くの進歩にかかわらず、先進国において、癌は主要死亡疾病原因のうちの１つである。腫瘍形成の分子的メカニズムの多くが明らかになったが、最も攻撃的な腫瘍の標準的治療は、外科的切除、化学療法、及び放射線量であることが続いている。効果が示されつつはあるが、これらの治療のそれぞれは、種々の望ましくない副作用を未だに引き起こす。多種多様のタイプの癌では、ＮＳＣＬＣは最も一般的かつ致死的な癌の１つである。
【０００５】
合衆国におけるＮＳＣＬＣの年間発症率は、１３５，０００件を超えている（全てのタイプの肺癌の合計１７０，０００人の患者のうち）。ＮＳＣＬＣは、転移又は再発後に、ほとんどの場合５％未満の生存率で死の転帰をとる。肺腫瘍からの年間死亡率は、大腸癌、乳癌及び前立腺癌を合わせた年間死亡率よりも高い。ＮＳＣＬＣ疾患のための化学療法による治療結果は、不良である。第ＩＩＩ相試験は、典型的には１年未満の生存中間値で、１５％〜３０％の奏効率を立証した。転移ＮＳＣＬＣ患者を最善の補助療法と化学療法間に無作為割付した臨床研究の最近のメタ分析は、平均生存可能増加は、わずか６週間であることを結論付けた。多くの新薬及び併用療法がＮＳＣＬＣで報告されているが、これらの治療法は、１０％未満の患者での完全寛解並びに生存へ及ぼす最小からわずかな影響をもたらすだけである。より良い生存に関連する因子としては、第ＩＩＩ期の腫瘍（第ＩＶ期腫瘍に対して）であること、体重減少がないこと、パフォーマンスステータスが良好であること、ＬＤＨが正常であること、転移部位がより少ないこと、脳、髄膜、骨髄及び肝臓のような生体臓器への転移がないこと、並びに再発までの期間が長いことが挙げられる。明らかに、有効な治療には革新的戦略が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、細胞ベースのワクチンが癌患者の生存を延ばし得並びに疾患の進行を低減し得ることの発見に関する。この発見をする中で、ＨＬＡ  Ａ１及びｇｐ９６−Ｉｇ（小胞体保持シグナルであるＫＤＥＬがヒトＩｇＧ１のＦｃ−部分で置き換えられているヒトｇｐ９６）で形質導入された肺腺癌細胞（ＡＤ１００）の培養された用量を含むワクチンが照射され、並びに進行し、再発した、或いは転移性のＮＳＣＬＣを発症する患者に皮内的に注入された。この結果は、ワクチンの投与が、プラセボで処置された同様の患者のものと比較して、患者の平均生存時間を増加させることを示した。更に、このワクチンに対する患者の免疫応答は、生存時間と相関した。
【０００７】
したがって、一態様では、本発明は、ヒト被験者において癌を治療する方法を特徴とする。この方法は、複数個のホスト細胞を含むワクチンを被験者に投与する工程を含み、このホスト細胞のそれぞれは、少なくとも１つの腫瘍抗原と、このホスト細胞のそれぞれから分泌されるように改変された熱ショック蛋白質とを共発現する。この方法では、被験者の生存時間は、癌の同一の型及びステージを有する他の被験者について予測された生存時間を超えて増加され得る。この方法は、ワクチンの投与前及び／又はワクチン投与後の双方で、被験者の血液中のＣＤ８  Ｔリンパ球を分析する工程を追加的に含んでもよい。
【０００８】
ホスト細胞は、癌細胞であり得る（例えば、被験者の癌と同一の型及び／又は悪性度から生じる細胞系）。ヒト被験者の癌が肺癌である場合、ホスト細胞は肺癌細胞であり得る。一例としては、肺癌が非小細胞肺癌である場合は、ホスト細胞は非小細胞肺癌細胞であり得る。ホスト細胞は、被験者由来の細胞又は被験者に対して同種異系の細胞であり得、並びにワクチンの投与前に照射され得る（例えば、投与後２、３日から数日の間に熱ショック蛋白質分泌を可能にすると同時に、細胞が複製することを防止するために）。このワクチンは皮内的に投与され得る。一例では、ワクチンは、一日以内に患者の皮膚の複数の部位で投与される。
【０００９】
本発明の別の態様は、ヒト被験者の癌を治療するために、複数個のホスト細胞を含むワクチンの使用であり、ここにおいて各ホスト細胞は、少なくとも１つの腫瘍抗原と、各ホスト細胞から分泌されるように改変された熱ショック蛋白質とを共発現する。この使用では、被験者の生存時間が、癌の同一の型及びステージを有する他の被験者について予測された生存時間を超えて増加され得る。ヒト被験者の癌が肺癌である場合、ホスト細胞は肺癌細胞であり得る。一例としては、肺癌が非小細胞肺癌である場合は、ホスト細胞は非小細胞肺癌細胞であり得る。ホスト細胞は、被験者由来の細胞又は被験者に対して同種異系の細胞であり得、並びにワクチンの投与前に照射され得る（例えば、投与後２、３日から数日の間に熱ショック蛋白質分泌を可能にすると同時に、細胞が複製することを防止するために）。更にこのワクチンは皮内的に投与され得、例えば、ワクチンは、一日以内に患者の皮膚の複数の部位で投与される。
【００１０】
別に規定されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常理解される生物学的用語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒら著、Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，第５版，Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＬｅｗｉｎ著，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４に記載されている。
【００１１】
本明細書に記載されたものと同様な方法及び材料が、本発明の試験の実行で使用され得るが、好適な方法及び材料が以下に記載されている。本明細書で記載された全ての特許文献及び特許公開文献は、参照によりその全体が組み込まれている。矛盾する場合、定義を含める本明細書が優先される。加えて、以下に説明される特定の実施形態は、単に例示のためのものであり、限定するよう意図されたものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、別の研究からの過去のデータに重ねられた臨床研究からの患者生存を示しているＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線のグラフである。チェックマークは、表示された時点で生存している患者を示す。
【図２】図２は、ＡＤ１００細胞に応答する末梢血液ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ生成と全生存率との間の相関性を示すグラフである。
【図３】図３は、ＩＦＮ−γＥＬＩｓｐｏｔｓで検出されたＣＤ８  ＣＴＬ値（左）、血液中のＦｏｘＰ３（＋）ＣＤ４値（中央）、並びに生存期間中央値（右）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、癌治療に関連する方法及び組成物を包含する。以下に記載される好ましい実施形態は、これらの組成物及び方法の適応を例示している。他方、これらの実施形態の説明から、本発明の他の態様が、以下に提供された説明に基づいて実施及び／又は実行され得る。
【００１４】
生物学的方法
従来の免疫学的及び分子生物学的技術を伴う方法が、本明細書に記載されている。免疫学的方法は、当該技術分野において概ね既知であり、並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ編集，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋのような技術的方法論文に記載されている。分子生物学の技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，１−３巻，Ｓａｍｂｒｏｏｋら著，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１年；並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら著，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ編集，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋのような論文に詳細に記載されている。細胞培養技術は当該技術分野において概ね既知であり、並びにＣｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第４版，Ｒ  Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．著，２０００年及びＧｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｍａｕｒｅｅｎ  Ａ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ及びＩａｎ  Ｆ  Ｒａｅ著，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，１９９４年のような技術的方法論文に詳細に記載されている。蛋白質精製の方法は、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８２巻，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  Ｍ  Ｐ著，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ編集，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９０年で説明されている。医学的的処置の一般方法は、ＭｃＰｈｅｅ及びＰａｐａｄａｋｉｓ著，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ２０１０」，第４９版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ，２０１０年及びＦａｕｃｉら著，Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第１７版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，２００８年に記載されている。
【００１５】
新生物疾患の治療
本明細書に記載された組成物及び方法は、１つ以上の腫瘍関連抗原を発現し、並びに熱ショック蛋白質（例えばｇｐ９６の分泌された形態）を分泌する細胞を含む医薬組成物を被験者に投与することによって、被験者の新生物疾患（例えば癌）を治療するために有用である。ヒト被験者は男性、女性、成人、小人、高齢者（６５歳以上）、及び他の疾患を有するこれらの人々であり得る。特に好ましい被験者は、化学療法、放射線療法、手術、及び／又は生物学的薬剤による治療後に彼らの疾患が進行したような患者である。本技術は肺組織から発生する癌（例えばＮＳＣＬＣ）を治療するために特に有効である（現行の治療様式に比べて）と考えられているが、本明細書で記載されたワクチンによる治療に対して感受性のあるいかなる型の癌も標的になり得る。他の型の癌としては、膀胱、乳房、大腸、直腸、子宮内膜、子宮頚部、腎臓、血液（例えば白血病及びリンパ腫）、皮膚（メラノーマ）、膵臓、前立腺、甲状腺、精巣及び卵巣で発生する癌が挙げられる。
【００１６】
癌患者の治療の成功は、予測された生存時間の延長、抗腫瘍免疫応答の誘導、又は癌の特定の特性の改善として評価され得る。改善される可能性がある癌の特性の例としては、腫瘍サイズ（例えば、Ｔ０、Ｔｉｓ、又はＴ１−４）、転移の状態（例えば、Ｍ０、Ｍ１）、観察可能な腫瘍の数、リンパ節浸潤（例えば、Ｎ０、Ｎ１−４、Ｎｘ）、グレード（すなわち、グレード１、２、３、又は４）、ステージ（例えば０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ）、細胞上又は体液中の特定のマーカーの存在又は濃度（例えば、ＡＦＰ、Ｂ２Ｍ、β−ＨＣＧ、ＢＴＡ、ＣＡ  １５−３、ＣＡ  ２７．２９、ＣＡ  １２５、ＣＡ  ７２．４、ＣＡ  １９−９、カルシトニン、ＣＥＡ、クロモグラニンＡ、ＥＧＦＲ、ホルモン受容体、ＨＥＲ２、ＨＣＧ、免疫グロブリン、ＮＳＥ、ＮＭＰ２２、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、Ｓ−１００、ＴＡ−９０、及びチログロブリン）、及び／又は関連病態（例えば、腹水又は浮腫）若しくは症状（悪液質、発熱、食欲減退、又は痛み）が挙げられる。改善は、パーセントによって測定可能である場合、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％であり得る（例えば、生存、又は腫瘍の体積寸法若しくは線寸法）。
【００１７】
ワクチン組成物
本発明は、１つ以上の腫瘍関連抗原を発現し、並びに熱ショック蛋白質（例えば、ｇｐ９６の分泌された形態）を分泌する細胞を含み又はそれを活性成分として用いる医薬組成物及び医薬品を包含する。この細胞は、患者から体外移植された腫瘍から成長された１つ以上のヒト腫瘍細胞系（例えば、単一腫瘍細胞系、又は同一癌型若しくは異なる癌型の多数の腫瘍細胞系）に由来してもよく、又は癌由来ではないが、１つ以上の腫瘍関連抗原を発現するように操作されたヒト細胞系（例えば、ＨＥＫ２９３）であってもよい。この細胞は、熱ショック蛋白質が少なくとも１、２、３、４、５、６、又は７日の間分泌されることを可能にすると同時に、それら細胞の複製を防止するために照射され得る（例えば、少なくとも２０００、４０００、６０００、８０００、１０，０００又は１２，０００ラド）。これらの細胞はまた、別のマーカー（例えばヒトＭＨＣ蛋白質）を発現するよう操作されてもよい。ワクチンで使用されるための細胞は、冷凍保存され、ＵＳＰグレード生理食塩水又は緩衝塩溶液のような無菌の薬剤学的に許容可能な液体中で、使用の直前に再構成される。薬剤学的に許容可能な担体、並びに医薬品製剤のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、本分野の標準テキスト、及びＵＳＰ／ＮＦで確認することができる。他の物質（例えば、ヒト血清アルブミン及び／又はＤＭＳＯ）が組成物に添加されてもよく、組成物を安定化及び／又は保存するため、並びに／又は組成物の被験者への投与を促進するための処置が取られてもよい。
【００１８】
ワクチン投与
本発明の組成物は、任意の好適な技術によって、動物又はヒトに投与され得る。典型的には、このような投与は、非経口（例えば、皮内、皮下、筋肉内、又は腹腔内導入）であろう。組成物が注射によって投与される場合の実施形態では、細胞の一体性を保護するために、せん断を最小にするように、針サイズが選択されるべきである（例えば、用途に従って、１４、１６、１８、２０、２２、又は２４ゲージよりも大きいサイズ）。組成物は、多数回の注射（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、４０、４５、又は５０回の注射）又は多数部位（少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、又は１４個の部位）での持続性輸注（例えばポンプを使用しての）によって投与されることが好ましい。
【００１９】
一実施形態では、局所的皮膚反応の範囲を減らすために、多数の身体部位での皮膚注射が実施される。所与のワクチン接種日に、患者は、最も近い隣接する注射からの針の進入で、少なくとも約５ｃｍ（例えば、少なくとも４．５、５、６、７、８、９、又は１０ｃｍ）で間隔をあけられた四肢の各々で、投与量の３〜５つに分けられた皮内注射（例えば、少なくとも０．４ｍｌ、０．２ｍｌ、又は０．１ｍｌ）の１本の注射器から投与される、振り分けられた細胞の合計投与量を受け取る。次のワクチン接種日に、注射部位は、時計回り又は反時計回りの様式で、別の四肢に回される。
【００２０】
ワクチン接種の用量及び数
治療的に有効な量とは、治療された動物又はヒトで、医学的に望ましい結果を生み出すことが可能な量である。本発明の組成物の有効量とは、予測された生存率での増加（同様な患者の平均値と比較して）によって測定されたような、患者における臨床的効果を示す量、或いは上記の１つ以上の癌特性での改善を示す量である。医療技術分野で周知のように、１匹の動物又は１人のヒトのための投与量は、多くの因子に依存し、これらは被験者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の組成、性、投与の時間及び経路、全身の健康状態、及び同時に投与される他の薬剤が挙げられる。好ましい投与毎の用量は、インビトロ培養中熱ショック蛋白質から分泌された量の少なくとも１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、又は９０００ｍｇ／ｍｌ／日を分泌する細胞のそれらの数である。各用量での細胞の数は、１００，０００〜１００，０００，０００の範囲であり得る（例えば、約１００，０００、２５０，０００、５００，０００、７５０，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、２０，０００，０００、５０，０００，０００、又は１００，０００，０００＋／−２０、１０、又は５％）。用量は、例えば、毎時、毎日、半週毎、毎週、隔週毎、三週間毎、又は毎月の間隔で繰り返し投与され得る。
【００２１】
１つの投与プロトコルの一例としては、治療のための来院毎に（毎週又は二週間毎）、癌又は毒性の臨床的評価が実施される。免疫学的評価のための血液サンプルは、ワクチン接種が与えられる前の各過程の１日目に採取される。安定疾患又は対応するＮＳＣＬＣの証拠が認められる患者、及びワクチン接種の第１過程の完了の際に毒性が許容範囲（自己免疫がグレード２未満、及び他の身体系ではグレード２以下）であるような患者は、同一用量及び投与計画で追加過程で治療される。同一用量及び計画での第３過程が、安定疾患又は対応のＮＳＣＬＣの証拠が認められ、並びに第２過程の完了の際に、許容可能な毒性（自己免疫がグレード２未満、及び他の身体系ではグレード２以下）であるような患者に接種される。
【実施例】
【００２２】
実施例Ｉ−薬剤
名称：Ａｄ１００−ｇｐ９６Ｉｇ−ＨＬＡ  Ａ１、短ｇｐ９６−ワクチン（ｇｐ９６−Ｉｇ及びＨＬＡ  Ａ１で形質導入されたＮＳＣＬＣ細胞系）。この薬剤は、米国特許出願第１１／８７８，４６０号明細書に記載されたものである。ヒト肺腺癌細胞系は、肺癌患者の生検から１９９４年に確立され、並びにＡｄ＃１００と命名された。この患者は、１９９３年に腸骨稜の骨浸食による骨盤痛の初期症状と、１次及び転移性肺腺癌の肺腫瘍小結節を呈した、７４歳の白人男性であった。培養のための癌細胞が、骨盤骨破壊の領域からの骨髄吸引によって採取された。患者は、骨盤への放射線療法で治療されたが、診断の１カ月後に死亡した。この患者から誘導された細胞系が、標準培地（以下に記載）中の培養で保持され、マイコプラスマ、ウィルス又は他の外来性因子によって汚染されない状態にある。この細胞系は均一であり、プラスチックに対して接着性であり、約２６時間の分裂速度で増殖する。細胞系は、以下を含まないことを試験され決定された：ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１，ＨＴＬＶ−２，ＨＢＶ，アデノウィルス、ポリオーマウィルス、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６、ＨＣＶ、ＶＺＶ、パルボウィルスＢ１９、ＨＰＶ、及びマイコプラズマ。
【００２３】
Ａｄ１００をプラスミドｃＤＮＡ「Ｂ４５−ｎｅｏ−ｇｐ９６Ｉｇ−ＨＬＡ  Ａ１」で形質導入し、Ｇ４１８で選択した。Ｂ４５は、キャプシドコード化遺伝子Ｌ１及びＬ２の欠失によって、並びに潜在的形質転換遺伝子Ｅ５、Ｅ６及びＥ７の更なる欠失によって、ウシのパピローマウィルスから誘導されたベクターである。このベクターは、真核性ｃＤＮＡの発現のための２つのカセットを封入し、この場合、ＨＬＡ  Ａ１がメタロチオネインプロモーターによって駆動され、ｇｐ９６−Ｉｇがサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される。シャトルベクターはまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での選択のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子及び形質導入されたＡｄ１００細胞のＧ４１８選択のためのチミジンキナーゼプロモーター制御下のネオマイシン耐性遺伝子も封入する。Ｂ４５ベクターのＥ１及びＥ２遺伝子は、プラスミドのエピソーム複製並びにコード化ｃＤＮＡｓの高レベル発現のために必要である２つのウィルス蛋白質をコード化する。ｃＤＮＡｓの高レベル発現は、ヒトβ−グロブリン遺伝子の非コード化部分の封入によって更に増強される。ワクチン細胞系は、形質導入された細胞中でのプラスミド−エピソームの維持を確実にするために、Ｇ４１８中の周期的再選択条件下、永久的に形質導入され（新しい形質導入は必要ない）かつ維持される。
【００２４】
ヒトＨＬＡ  Ａ１の発現を、特異的抗体を使用して、ＦＡＣＳ分析によって決定した。ＨＬＡ  Ａ１を７０％又はそれ以上の細胞で発現する調製液を、ワクチン接種のために使用した。ｇｐ９６−Ｉｇの発現を、ｇｐ９６−Ｉｇ融合蛋白質のＩｇ−部分を検出する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。１０６個の細胞によって２４時間以内にｇｐ９６−Ｉｇの６０ｎｇ以上を産生する細胞をワクチン接種に使用した。
【００２５】
細胞系は、無菌条件下、ＧＭＰ適用施設内で増殖させた。細菌、ウィルス、酵母、及びマイコプラズマの不在並びにエンドトキシンのレベルを、ＦＤＡにより指示されかつ承認されたアッセイによって、各バッチについて決定した。
【００２６】
ＦＣＳ、ＩＭＤＭ、トリプシン、ＥＤＴＡ、ＨＢＳＳ、Ｇ４１８をＧＩＢＣＯから入手し、外来性因子を含まないことを確認した。ＤＭＳＯをＳｉｇｍａから入手し、外来性因子をまた含まないことを確認した。ヒト血清アルブミン及び緩衝生理食塩水は、医薬品グレードであった。細胞のバッチを、組織培養フラスコ中で１〜５×１０９個の細胞まで増殖させて、ＦＡＣＳ及びｇｐ９６ＩｇによるＨＬＡ  Ａ１発現物の存在をＥＬＩＳＡによってテストした。細胞を収穫し、洗浄し、４℃で、緩衝生理食塩水＋１０％ＤＭＳＯ＋０．５％ヒト血清アルブミン中に再懸濁させ、５×１０７／０．５ｍｌに小分けし、コバルト照射機を用いて、４℃にて１２，０００ラドで照射した。サンプルを生物学的分析及び安全性分析のために回収した。残りの部分試料を凍結し、−１３５℃で保存した。
【００２７】
照射後にワクチン細胞系が複製無能であるが、生物学的活性を維持していることを確実にするために、１２，０００ラドでの照射後のＡＤ１００−ｇｐ９６−Ｉｇ−ＨＬＡ  Ａ１細胞系を以下のように試験した：軟寒天培地中のコロニー形成：平板培養された１０８個の照射された細胞から検出不能であること；Ｇｐ９６−Ｉｇ分泌：非照射対照がｇｐ９６−Ｉｇ生成を維持する一方で、放射１４日後に０ｎｇに接近すること；チミジンの取込みが、最初の４８時間で、照射された細胞中で増加する（対照と比較された場合）ことで、これはＤＮＡ修復（１週間照射された細胞は、増殖及びチミジン取込みを続ける対照細胞とは対比的にチミジン取込みを示さない）によるものである；並びにコバルト照射機を、減衰に関してセットアップ時及び年１回の調整時に校正すること、である。コバルト照射機はパノラマ式照射機であり、これは、線量が年１回調整される線源の物理的減衰にのみ依存するものである。
【００２８】
注射されるワクチンは、ＨＬＡ  Ａ１を少なくとも７０％の細胞で発現し、２４時間当たり６０ｎｇ以上のｇｐ９６−Ｉｇを１００万個の細胞で産生し、並びにトリパンブルー分染法による７０％以上の細胞生存能を示す照射されたＡｄ１００細胞を含有する。この細胞を、０．５％ヒト血清アルブミン、１０％ＤＭＳＯを添加された緩衝生理食塩水中に再懸濁した。
【００２９】
実施例ＩＩ−ＣＤ８応答
Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）から入手したＲｏｓｅｔｔｅ−Ｓｅｐキットで、血液１５ｍｌからＣＤ８細胞を精製する。この処置は、ネガティブ選択によって、約８５％の純度の約１５０万個のＤ８細胞を生成し、抗−ＣＤ５６を有するＮＫ細胞もまた排除する。主な汚染細胞はＢ細胞である。ＣＤ８細胞（２０，０００個）に、自己腫瘍細胞、ＡＤ１００−ＨＬＡ  Ａ１−ｇｐ９６Ｉｇ（ワクチン）、ＡＤ１００（非形質導入細胞）、Ｍｅｌ−Ａ１（ＨＬＡ  Ａ１形質導入メラノーマ）、ＳＣＬＣ−Ａ１（Ａ１形質導入された小細胞肺癌）、Ｋ５６２（ＮＫ標的）及び非負荷のそれぞれ１，０００個の細胞を有するＥＬＩ−ｓｐｏｔプレート中、４８時間、三組で負荷試験を行う。適切なＥＬＩ−ｓｐｏｔ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ＆  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、ＩＦＮ−γの分泌、ＩＬ−４の分泌及びグランザイムＢの分泌を決定する。サンプルを三組で実行し、Ｃ．Ｔ．Ｌ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｏｈｉｏ）から入手した自動化ＥＬＩ−ｓｐｏｔリーダーで定量する。
【００３０】
実施例ＩＩＩ−臨床的転帰
投与計画集団によって層別化されたＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって、無進行生存率及び全生存率が推定される。対応する生存期間中央値（９０％信頼限界で）を、登録後６、１２、１８、２４、及び３６ヶ月で生存している患者の累積比率として決定する。可能な限り、比例ハザード回帰分析が、投与計画割り当て、実施された治療（例えば投与総量、ワクチン接種の回数）、ベースライン特性、及び免疫応答種々の測定値（例えばＣＤ８の倍増）に関して無進行生存率及び全生存率を評価するために用いられる。
【００３１】
実施例ＩＶ：複数の前処置療法を有する、ステージＩＩＩＢ／ＩＶの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の患者の第Ｉ相試験
登録された患者集団を定義する特性は、局所的に進行した又は転移性のステージＩＩＩＢ／ＩＶ  ＮＳＣＬＣであること、ＥＣＯＧパフォーマンスステートが０〜２であること、並びに化学療法、放射線療法及び生物学的改変剤療法を含む複数の前処置療法を受けていることである。患者は、３療法（アーム）のうちの１つに配置される。アーム１に登録された患者に、ＡＤ１００−ｇｐ９６−Ａ１の用量を９回、隔週投与し、アーム２に登録された患者に、ＡＤ１００−ｇｐ９６−Ａ１の用量を１８回、週１回投与し、並びにアーム３に登録された患者に、ＡＤ１００−ｇｐ９６−Ａ１の用量を３６回、週２回投与する。ＡＤ１００−ｇｐ９６−Ａ１の総投与量は、３つアームのそれぞれについて治療過程にわたって一定である。いかなる追加のアジュバント又は療法も、ＡＤ１００−ｇｐ９６−Ａ１と同時に与えられない。
【００３２】
実施例Ｖ：１つの時間期間での結果
この研究に登録された最初の１２人の患者のうち、ワクチン接種前に１人が他界し、９人がアーム１（隔週投与）に登録され、１人がアーム２（週１回投与）に登録され、１人がアーム３（週２回投与）に登録された。ワクチンに関連する重篤有害事象（ＳＡＥ）は報告されなかったが、一方全ての患者が、紅斑及び軽症の浮腫が挙げられるワクチン接種部位反応を経験した。１人の患者は、ワクチン投与後１カ月以内に他界したが、この患者に関するＳＡＥ報告は、死亡は疾患の進行によるものであり、ワクチン治療に起因しないことを報告した。ワクチンの少なくとも１種の用量を投与された１２人の患者の全生存率が、図１に図示されている。
【００３３】
図１は、本研究のデータをＭａｓｓａｒｅｌｌｉの研究（Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ３９：５５０６１，２００２年）からの過去のデータと重ね合わせている。Ｍａｓｓａｒｅｌｌｉの研究は、患者が受けた先行療法の数に従う患者の生存及び応答を細分化した唯一の研究の１つであるために、本研究のための優れたコンパレーターである。Ｍａｓｓａｒｅｌｌｉの研究は、４つライン治療を通して進められた患者の生存率データを提供している。図１のデータが誘導された患者は、ＡＤ１００−ｇｐ９６−Ａ１での治療に先行して、平均で５．３ラインの治療（４ライン中央値、手術及び放射線療法は含まれない）で失敗した。
【００３４】
患者の免疫応答を評価するために、ワクチンの投与前及びそれに続いて６週間の間隔で（治療の各「過程」の間で）、末梢血液サンプルを各患者から回収した。次いで、末梢血液リンパ球を、ＡＤ１００ワクチン細胞又は他の無関係の細胞系による刺激に応答するインターフェロン−γ及びグランザイムＢのようなサイトカインの産生について評価した。末梢血液のリンパ球サブセット組成についても、フローサイトメトリーによって分析した。図２を参照すると、アーム１に登録された４人の患者から収集されたデータは、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるインターフェロン−γの産生と全生存率との間の相関性を立証している。
【００３５】
複数の患者は、全治療過程を完了することなく、病変の安定を達成した。１人の患者は、この時点で治療後２０ヶ月を超えて生存し、２番目の患者は治療後１８ヶ月生存した。治療中に測定されたＡＤ１００−ｇｐ９６−Ａ１に特異的なＴ細胞応答の大きさは、増大する生存率を予測するように思われる。
【００３６】
患者１００３は、多量の胸膜滲出液を伴い、臨床試験登録時には局所的に進行かつ悪化した疾患を有した。患者１００６は、気管支分岐部に局所的に浸潤した片方の肺全体にわたる大きな瀰漫性腫瘤を有した。これらの２人の患者は、ステージＩＩＩＢ／ＩＶ  ＮＳＣＬＣのＴ４−胸膜滲出及びＴ４−浸潤性サブタイプに陥った。それぞれの種々のサブタイプでステージＩＩＩＢ／ＩＶ  ＮＳＣＬＣの相対的生存率を比較する現在まで実施された研究（Ｗｉｌｌｉａｍ  ＷＮら著，Ｃｈｅｓｔ  ２００９；１３６）は、改善された全生存率を有するステージＩＩＩＢ／ＩＶ  ＮＳＣＬＣの唯一のサブタイプは、Ｔ４−サテライト疾患を有する患者であることを決定した。Ｔ４−浸潤性又は胸膜滲出を有する患者は、ステージＩＶ疾患を有する患者と識別不能な全生存率を有することが確認された。したがって、これらの患者が、臨床試験で登録された他の患者と比較して、改善された全予後を伴う疾患を有したことを示唆する証拠はない。更に、この少数患者に関して、陽性リンパ節転移又は転移性病巣の数及び部位と全生存率との間の明確な相関性があるようには思われない。患者１０１１は、登録された患者のいずれよりも最も進行した疾患を有したにもかかわらず、安定性疾患を達成し並びに全ての３つの治療過程をほぼ完了した。
【００３７】
実施例ＶＩ：後の時間期間での結果
１９人の患者が登録され、３用量の投与計画：投与計画（ＤＳ−１）９回のワクチン接種（各５×１０７細胞）２週間に１回投与（アーム１）；投与計画（ＤＳ−２）１８回のワクチン接種（各２．５×１０７細胞）毎週投与（アーム２）；並びに投与計画（ＤＳ−３）３６回のワクチン接種（各１．２５×１０７細胞）、１週間に２回投与（アーム３）において、合計で４．５×１０８個のワクチン細胞で、１８週期間にわたってワクチン接種した。免疫応答及び臨床応答を、ベースラインにて、並びに６、１２、及び１８週後に測定した。ワクチンは、最小のワクチン接種部位での予期された副作用で、全ての投与計画で優れた忍容性が認められた。これは、ＩＦＮ−γＥＬＩｓｐｏｔｓで検出された顕著なＣＤ８  ＣＴＬ値を生じ（図３、左側）、幾人かの患者では、血液中のＦｏｘＰ３（＋）ＣＤ４細胞の値が減少する傾向にあった（図３、中央）。生存期間中央値は８．０ヶ月として推定し（９５％ＣＩ：６．７〜１８．２）、これは予想された生存期間推定値の２倍である（図３、左側）。ＤＳ−２及びＤＳ−３の不十分な症例数のために比較は制限されたが、ＤＳ−２（毎週ワクチン接種）の４人の患者のうち２人、並びにＤＳ−３（１週間に２回ワクチン接種）の３人の患者のうち２人が、ＤＳ−１の１１人の患者に関する７．１ヶ月の生存期間中央値よりも長く生存した。特に、８．３ヶ月及び２０ヶ月（それぞれ、ＤＳ−２及びＤＳ−３）で死亡した２人の患者と、９．７ヶ月及び１１．５ヶ月（それぞれＤＳ−３及びＤＳ−２）で生存していた２人の患者がいた。
【００３８】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明に関して記載されてきたが、以上の記述は例示を意図したものであり、本発明の範囲を限定するよう意図しておらず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義されている。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲内に含まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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