(57)【要約】  本発明は、異常なグルコースホメオスタシスに関連する疾患、例えば、２型糖尿病及び２型糖尿病に関連する疾患の治療に優れた予想外の利点を有する安定に架橋されたインスリン分泌促進ポリペプチドを提供する。このような利点は、これに限定されないが、対応する非改変ポリペプチドと比べて、延長されたポリペプチド半減期、増強されたα螺旋性、改善された熱安定性及びプロテアーゼ耐性、増大した機能活性及び薬理学的特性、いずれの経路で投与した場合でも改善されたバイオアベイラビリティー、並びに経口送達されたときの改善されたバイオアベイラビリティー並びに胃腸管吸収を包含する。本発明は、本発明のポリペプチドを投与するための組成物を、更に本発明のポリペプチドを製造及び評価する方法も提供する。
2013532172.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α螺旋及び１つ又はそれ以上の分子鎖を含んでなり、それぞれの分子鎖が当該ペプチドのα螺旋上に存在している残基の１対と共有結合で結合しており、それによりインスリン分泌促進ポリペプチドを構造的に強化する、構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項２】
インスリン分泌促進ポリペプチドが、エクセナチド、ＧＩＰＰ、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１前駆体、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−１（７〜３７）、ＧＬＰ−１（７〜３６）、リラグルチド、タスポグルチド、アルビグルチド又はＬＹ２１８９２６５である、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項３】
インスリン分泌促進ポリペプチドがエクセナチドである、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項４】
分子鎖の数が、１〜２、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９又は２〜１０の間である、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも１つの残基対がポリペプチドのＮ−末端半分内にある、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項６】
少なくとも１つの残基対がポリペプチドのＣ−末端半分内にある、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドのＣ−末端半分内にある少なくとも１つの結合残基対及びポリペプチドのＮ−末端半分内にある別の結合残基を含んでなる、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項８】
ポリペプチドが、配列番号２又は１５〜３８のうち何れか１つで表わされる配列を有しているエクセナチドに対応している、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドが、配列番号３９〜６２のうち何れか１つで表わされる配列を有しているＧＬＰ−１に対応している、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項１０】
ポリペプチドのα螺旋の残基位置に対して位置（ｉ、ｉ＋３）、又は（ｉ、ｉ＋４）又は（ｉ、ｉ＋７）に位置している第１分子鎖を含んでなる、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドのα螺旋の残基位置に対して位置（ｉ、ｉ＋３）、又は（ｉ、ｉ＋４）又は（ｉ、ｉ＋７）に位置している第１分子鎖、及びポリペプチドのα螺旋の残基位置に対して位置（ｉ、ｉ＋３）、又は（ｉ、ｉ＋４）又は（ｉ、ｉ＋７）に位置している第２分子鎖を含んでなるが、第１分子鎖と第２分子鎖が同一位置に位置していない、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項１２】
強化されたポリペプチドが、強化されていない対応するポリペプチドの半減期より少なくとも２倍長い半減期を保有している、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項１３】
強化されたポリペプチドが、強化されていない対応するポリペプチドの半減期より少なくとも３倍長い半減期を保有している、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項１４】
強化されたポリペプチドが、強化されていない対応するポリペプチドの半減期より少なくとも８倍長い半減期を保有している、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項１５】
強化されたポリペプチドが、強化されていない対応するポリペプチドのインビボにおけるキモトリプシンに対する耐性より少なくとも２倍大きいインビボにおけるキモトリプシンに対する耐性を保有している、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項１６】
強化されたポリペプチドが、強化されていない対応するポリペプチドのインビボにおけるキモトリプシンに対する耐性より少なくとも３倍大きいインビボにおけるキモトリプシンに対する耐性を保有している、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項１７】
強化されたポリペプチドが、強化されていない対応するポリペプチドのインビボにおけるキモトリプシンに対する耐性より少なくとも８倍大きいインビボにおけるキモトリプシンに対する耐性を保有している、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項１８】
強化されたポリペプチドが、強化されていない対応するポリペプチドのインビボにおけるペプシンに対する耐性より少なくとも６倍大きいインビボにおけるペプシンに対する耐性を保有している、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項１９】
強化されたポリペプチドが、強化されていない対応するポリペプチドのインビボにおけるペプシンに対する耐性より少なくとも１３倍大きいインビボにおけるペプシンに対する耐性を保有している、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項２０】
強化されたポリペプチドが、強化されていない対応するポリペプチドのインビボにおける血清プロテアーゼに対する耐性より少なくとも２倍大きいインビボにおける血清プロテアーゼに対する耐性を保有している、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項２１】
強化されたポリペプチドが、強化されていない対応するポリペプチドのインビボにおける血清プロテアーゼに対する耐性より少なくとも５倍大きいインビボにおける血清プロテアーゼに対する耐性を保有している、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項２２】
強化されたポリペプチドが、強化されていない対応するポリペプチドのインビボにおける血清プロテアーゼに対する耐性より少なくとも１０倍大きいインビボにおける血清プロテアーゼに対する耐性を保有している、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１〜２２の何れか一項に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド及び１つ又はそれ以上の薬学的に許容される賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
【請求項２４】
ポリペプチド鋳型が、配列番号２で表わされる配列のエクセナチド又はその機能的断片或いは誘導体である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２２の何れか一項に記載のインスリン分泌促進ポリペプチドの治療有効量を投与することを含んでなる、糖尿病を治療又は予防する方法。
【請求項２６】
ポリペプチドがエクセナチド又はその機能的断片或いは誘導体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２３に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含んでなる、糖尿病を治療又は予防する方法。
【請求項２８】
ポリペプチドがエクセナチド又はその機能的断片或いは誘導体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
α螺旋及び１つ又はそれ以上の分子鎖を含んでなり、それぞれの分子鎖が当該ポリペプチドのα螺旋上に存在している非天然アミノ酸残基の１対と共有結合で結合している、構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチドの治療有効量を投与することを含んでなる、糖尿病を治療又は予防する方法。
【請求項３０】
インスリン分泌促進ポリペプチドが、エクセナチド、ＧＩＰＰ、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１前駆体、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−１（７〜３７）、ＧＬＰ−１（７〜３６）、リラグルチド、タスポグルチド、アルビグルチド或いはＬＹ２１８９２６５、又はこれらの機能的断片或いは誘導体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
インスリン分泌促進ポリペプチドが、エクセナチド又はその機能的断片或いは誘導体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
インスリン分泌促進ポリペプチドを経口送達経路を介して投与する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
インスリン分泌促進ポリペプチドを注射による経路を介して投与する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
インスリン分泌促進ポリペプチドを経口送達経路を介して投与し、ここで経口送達される生体利用可能なポリペプチドのレベルが静脈注射で送達される生体利用可能なポリペプチドのレベルとほぼ同等である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
連続して配置され縫い合わせられた配置にあり、それによって第１分子鎖の末端と第２分子鎖の始点がポリペプチド中の共通残基を起源としている、少なくとも２つの分子鎖を含んでなる、請求項１に記載の構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への参照及び参照による取り込み）
本出願は、２０１０年７月９日に出願された、米国仮特許出願第６１／３６３，０９７号の優先権を主張する。本出願は、２００９年１月２３日に出願されて発明の名称が「ウィルス感染症を治療する組成物及び方法」である、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０００４３８号、及び２０１０年６月１８日に出願されて発明の名称が「構造化ウィルスペプチド組成物及び使用方法」である、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３９２２３号（これは２００９年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／２１８，２０９号の優先権を主張している）とも関連している。それぞれの上記出願はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。
【０００２】
米国又は外国の特許又は公開された特許出願、国際特許出願、更には製造会社の使用説明書を含む、非特許文献の何れもを含んでいる本特許出願の明細書で引用されているありとあらゆる文献は参照により本明細書に明確に取り込まれている。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病は、多種の要因に由来して上昇した血中グルコース濃度（すなわち、高血糖）を特徴とする、異常なグルコースホメオスタシスをもたらす疾患の過程を示す。持続している或いはコントロールされていない高血糖は増大したそして早すぎる死亡率及び死亡と関係がある。多くの場合、異常なグルコースホメオスタシスは、脂質、リポプロテイン及びアポリポプロテイン代謝の変化、並びにその他の代謝及び血行動態疾患とも直接的にそして間接的に関連している。従って、２型糖尿病の患者は、冠動脈性心疾患、卒中、末梢血管疾患、高血圧、腎症、神経症、及び網膜症を含む、大血管及び小血管合併症のリスクが特に増大している。従って、グルコースホメオスタシス、脂質代謝及び高血圧の治療的コントロールが、糖尿病の臨床管理及び治療に非常に重要である。
【０００４】
糖尿病には一般に認められている２つの形態がある。１型糖尿病、又はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）では、患者はグルコースの利用を調節するホルモンである、インスリンを殆ど産生しない。２型糖尿病、又はインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）では、多くの場合、患者は非糖尿病対象と比べて同じか或いはさらに上昇している血漿インスリン濃度を有している；しかしながら、これらの患者は筋肉、肝臓及び脂肪組織である、主要なインスリン感受性組織におけるグルコースに対するインスリン及び脂質得代謝の刺激効果に耐性を生じていて、血漿インスリン濃度は上昇しているのに、顕著なインスリン耐性に打ち勝つのに不十分である。
【０００５】
インスリン抵抗は、減少した数のインスリン受容体が主な原因ではなく、ポストインスリン受容体結合不全が原因でありこれは未だ解明されていない。このインスリン反応性に対する耐性は筋肉におけるグルコースの摂取、酸化及び保管の不十分なインスリン活性化、並びに脂肪組織における脂肪分解及び肝臓におけるグルコース生産及び分泌の不適切なインスリン抑制をもたらす。
【０００６】
２型糖尿病に対する利用可能な治療には広く認められている限界がある。運動及びカロリーの摂食低減は糖尿病疾患を劇的に改善するのに対して、この治療のコンプライアンスは、広く定着した運動不足のライフスタイル及び過剰な食物、特に飽和脂肪酸を大量含有している食物の摂取のために芳しくない。主な投与法である注射を圧倒的な患者が承諾することがないので、各種公知の抗糖尿病薬のコンプライアンスに関する問題も存在する。
【０００７】
２型糖尿病では、膵臓のβ細胞を刺激してより多くのインスリンを分泌する、スルホニルウレア（例えば、トルブタミド及びグリピジド）又はメグリチニドの投与、及び／又はスルホニルウレア又はメグリチニドが無効の場合のインスリンの注射によるインスリンの増大した血漿濃度が、まさにインスリン耐性組織を刺激するのに十分高いインスリン濃度をもたらす。しかし、危険なほどに低い血漿グルコース濃度が、インスリン又はインスリン分泌促進剤（スルホニルウレア又はメグリチニド）の投与によって引き起こされる得る。そして、それでも高い血漿インスリンレベルによる増大したインスリン耐性レベルが起こり得る。ビグアニド類はインスリン感受性を増大して高血糖をかなり改善する。しかし、２つのビグアニド、フェンホルミン及びメトホルミンは、乳酸アシドーシス及び嘔吐／下痢を誘発する。メトロホルミンはフェンホルミンに比べて殆ど副作用を有していないので２型糖尿病の治療に頻繁に処方される。
【０００８】
これらの公知の治療にもかかわらず、２型糖尿病のグルコースレベルにおいて本質的に正常な変動を保持する、一般に適用できそして一貫して有効な手段はない。別の治療介入（例えば、ＧＬＰ−１−受容体作動薬及びＤＰＰ−４阻害剤のような、インクレチンによる治療）を含む疾患治療のさらなる方法及び薬剤使用及びコンプライアンスを改善するための医薬投与の改善された方法（例えば、舌下、鼻腔内、気管内、吸入、及び経口投与）は未だ開発中である。
【０００９】
インクレチンシステム−糖尿病治療への医療介在についての認められている可能性のあるポイント−はグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）及びグルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド（ＧＩＰ）（「インクレチン」）を包含し、これらは一緒になって、膵臓によるインスリン分泌及び肝臓によるグルコース産生の調節に重要な役割を果たす。また、インクレチンは膵臓のβ細胞集団及び分化の維持、β細胞アポトーシスの阻止、グルカゴン分泌の減少、胃内容排出の減速、及び体重減少をもたらす早期満腹の促進に重要な役割を果していると広く認められている。
【００１０】
血中の正常なグルコース濃度は、ある程度、インスリン（血中グルコースの減少をもたらす）とグルカゴン（肝臓にグルコースの生産を伝達する）の作用のバランスによって調節される。これら２つのホルモンの間のバランスのとれた作用は血漿のグルコース濃度に応答して膵臓β細胞によるインスリンとグルカゴンの生産を介して正常個人において維持されている。インクレチンは、食物摂取時に引き起こされるグルコース濃度を調節する更なる層を提供する。ＧＬＰ−１及びＧＩＰは食物が摂取されると腸の細胞から放出されて、膵臓細胞上のＧＬＰ−１及びＧＩＰ受容体を介するインスリン分泌を刺激して、ＧＬＰ−１の場合は、膵臓からのグルカゴン分泌も阻害し、それによって肝臓によるグルコース生産を減少して、全体として血中グルコース濃度を低下する。
【００１１】
しかし、２型糖尿病では、インクレチンシステムが大きく低下している。具体的には、ＧＬＰ−１及びＧＩＰのインスリン分泌促進及びグルカゴン減少効果が２型糖尿病を有する個人において正常に機能していない。この認識がリラグルチド及びその他のような、ＧＬＰ−１受容体作動薬、エキセナチドのような、インクレチン模倣薬を包含する、インクレチンによる治療の最近の開発を導いていて、これは、ＧＬＰ−１受容体及びインクレチンシステムの他の受容体と相互作用してインスリンの放出を促進してグルカゴン分泌を阻害することによって、全体として血漿グルコース濃度を低下する。Gutniak, M., et al. N. Engl. J. Bled. 1992; 326:1316-1322; Grossman, S., “Differentiating incretin therapies based on structure, activity, and metabolism: Focus on Liraglutide,” Pharmacotherapy, 2009; 29(12):25S-32S を参照されたい。
【００１２】
開発中の１つのインクレチンによる治療薬は、ＧＬＰ−１の断片であって、グルカゴン様インスリン分泌促進ペプチド（ＧＬＩＰ）である、ＧＬＰ−１受容体作動薬及びＧＬＰ−１類縁体を包含する。Gutniak et al., 1922。正常な対象では、ＧＬＩＰの注入が、食事に関連する血中グルコース濃度、及びインスリン及びグルカゴンの血漿濃度を有意に低下する。ＮＩＤＤＭの患者では、この治療がインスリンに対する必要を８倍減少した。ＩＤＤＭの患者では、ＧＬＩＰ治療が必要なインスリンを半分に減少した。このグルコース依存活性は、低血糖副作用の合併を避けて２型糖尿病を治療するために用いることができる治療剤に対して非常に望ましい特性である。
【００１３】
つい最近開発された２型糖尿病を治療するためのインクレチンによる治療剤はエクセナチドであって、これはその日の最初と最後の食事の３０〜６０分前に腹部、大腿部又は腕の皮下注射（皮下に）として、食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認された。エクセナチド−エキセンディン−４の合成型、１９９２年に Dr. John Eng（Eng, J. et al.,J. Biol. Chem. 267:742-7405 (1992））によって最初に単離され、アメリカドクトカゲの唾液中に発見されたホルモン（米国特許第５，４２４，２８６号（Eng）に記載される）−は、ＧＬＰ−１受容体におけるその作動薬的作用を介してグルコース代謝の調節剤としてそしてインスリン分泌促進剤（すなわち、インスリンの放出を増大する）として機能する、ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）活性を示す。
【００１４】
ＦＤＡ添付文書によると、エクセナチドは膵臓β細胞によるグルコース依存性インスリン分泌を増強し、不適切に上昇したグルカゴン分泌を抑制して、食物の胃からの流出を遅らせるが、作用機序は未だ研究中である。エクセナチドは３９アミノ酸のペプチドであって、ＧＬＰ−１と同様な親和性及び能力で膵臓ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）と結合して活性化することによってインスリン分泌を促進してグルコース依存的にグルカゴン分泌を阻害する、糖調節効能を有するインスリン分泌促進剤である。エクセナチドの効能は、食物の胃からの流出を遅らせること、食物摂取量及び体重の減少及び膵臓β細胞量及び機能の増大を包含すると報告されている。更に、これは、インクレチン（ＧＬＰ−１及びＩＰ）の除去に関与する正常な分解酵素である−ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による分解の基質として本質的に弱い。エクセナチドは、他の経口抗糖尿病薬（例えば、メトホルミン、スルホニルウレア類、チアゾリジンジオン類）ではうまくコントロールされなかった糖尿病を有する患者に対して２００５年４月２８日にＦＤＡによって承認された。
【００１５】
エクセナチドはインスリン濃度をすぐに上げ（投与の約１０分以内に）、このインスリン濃度はその後１又は２時間をこえると実質的に低下する。食後の服用は、事前に摂取したものより血糖に対する効果は非常に弱い。血糖に対する効果は６〜８時間で消失する。この薬剤は２つの用量：５ｍｃｇ及び１０ｍｃｇで入手できる。治療は通常５ｍｃｇ用量で開始し、副作用が有意でない場合はこれを増大する。
【００１６】
エクセナチド及びその他のインクレチンによるポリペプチド抗糖尿病治療薬に対する２つの重要な制限は潜在的に（１）タンパク分解による投与後の比較的短い半減期（例えば、承認されている静脈内経路で送達したとき、エクセナチドの２．５時間半減期）及び（２）十分なバイオアベイラビリティーをもたらす代替え投与経路（例えば、経口、舌下、又は経鼻）では、効果は欠如するが、侵襲性は少ない（のでより多くの患者に適合する）を包含する（Gedulin et al., “Pharmacokinetics and pharmacodynamics of exenatide following alternative routes of administration,” Int’l J Pharmaceuticals, 356 (2008) 231-238）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、優れた安定性、プロテアーゼ耐性、及び薬理学的特性を付与されている、最適化されたエクセナチドのような、最適化されたインクレチンに基づく、或いはその他のインスリン分泌促進ペプチド治療剤の開発、更には、代替えの、より患者に適合した送達経路（例えば、エクセナチドの経口送達形態）によって十分に送達できる（例えば、改善されたバイオアベイラビリティー、胃腸吸収及び薬理学的特性を達成できる）ような治療薬の開発は技術における大幅な進歩となるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、その一部分が、インクレチンホルモン（例えば、グルカゴン様ペプチド−１）、インクレチン類縁体（例えば、リラグルチド）又はインクレチン模倣体（例えば、エクセナチド）を包含する、インスリン分泌活性を有するポリペプチドを安定に架橋結合(crosslinking)することが、異常なグルコースホメオスタシスに関連する疾患、例えば、２型糖尿病及び２型糖尿病に関連する疾患の治療において優れた予想外の恩恵をもたらすという意外な発見に基づいている。このような利益は、これに限定されないが、非架橋対応物質と比較した、延長された半減期、増強されたα螺旋性、改善された熱安定性及びプロテアーゼ耐性、増大した機能活性及び薬理学的特性、如何なる経路で投与しても改善されたバイオアベイラビリティー、並びに経口で送達したときの改善されたバイオアベイラビリティー及び胃腸吸収を包含する。従って、本発明は以前は得られなかった又は入手不可能であった利益をもたらすインスリン分泌促進ポリペプチドを投与する新規且つ有利な方法を提供する。従って、本発明は注射による経路で送達されたインスリン分泌促進ポリペプチドの改善された半減期（及びそれによる、バイオアベイラビリティー、有効性など）を可能にする。更に、本発明は、経口、経鼻、及び舌下経路を包含する、非注射経路を介するインスリン分泌促進ポリペプチド薬剤（例えば、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、エクセナチド、リラグルチド、タスポグルチド、又はアルビグルチド）の有効量を送達することを可能にする（すなわち、送達により生物利用が可能である）ので、優れた患者コンプライアンスの機会及び使用容易性を改善する。
【００１９】
従って、一態様では、本発明は、２型糖尿病及び２型糖尿病に関連している疾患の治療又は予防に用いるための、インクレチンホルモン（例えば、グルカゴン様ペプチド−１）、類縁体（例えば、リラグルチド）又は模倣体（例えば、エクセナチド）を包含する、構造強化したインスリン分泌促進ポリペプチド薬剤を提供し、ここで当該薬剤は延長された半減期、増強されたα螺旋性、改善された熱安定性及びプロテアーゼ耐性、増大した機能活性及び薬理学的特性、並びに如何なる経路で投与されても改善されたバイオアベイラビリティーを保有している。
【００２０】
別の態様では、本発明は、延長された半減期、増強されたα螺旋性、改善された熱安定性及びプロテアーゼ耐性、増大した機能活性及び薬理学的特性、並びに如何なる経路で投与されても改善されたバイオアベイラビリティーを付与するために、インクレチンホルモン、類縁体及び模倣体を包含する、インスリン分泌促進ポリペプチド薬剤を構造強化する方法及び組成物を提供する。
【００２１】
更に別の態様では、本発明のインスリン分泌促進ポリペプチド薬剤の治療有効量を何れかの経路で（例えば、注射用又は経口用薬剤として）投与することによる２型糖尿病又は２型糖尿病に関連している疾患を治療又は予防するための治療方法を提供する。本発明のインスリン分泌促進ポリペプチド薬剤は、全長のインクレチンホルモン、類縁体又は模倣体、或いは生物活性を保持しているそれらの適切な機能的断片又は変異体を包含する化合物又はこれに基づいている。
【００２２】
更に別の実施態様では、本発明は、エクセナチドのアミノ酸１〜３９を有していて構造的に拘束されているポリペプチドを提供する。
ある特定の実施態様では、エクセナチドペプチドのアミノ酸１〜３９はペプチドの第一次配列における連続アミノ酸でよい。
ある特定の実施態様では、アミノ酸は互いに隣接していて、例えば、アミノ酸は、全長ポリペプチドの状況でペプチド配列の少なくとも１つの天然状態において、螺旋の同じ面に存在している。例えば、隣接アミノ酸は螺旋内の単一積み重ねカラム中に或いは構造化螺旋の単一面におけるアミノ酸の隣接する積み重ね中に存在していてよい。
実施態様では、構造的に拘束されているポリペプチドは、炭化水素架橋(staple)、アミノ酸突然変異、及び非天然アミノ酸の取り込みからなる群からの少なくとも１つの改変を含んでいる。
ある特定の実施態様では、構造的に拘束されているポリペプチドは、２、３、４、５又はそれ以上の改変を含んでいる。
ある特定の実施態様では、拘束されているポリペプチドは、これに限定されないが、Ｓ５−Ｓ５対（すなわち、ｉ、ｉ＋４）、Ｓ５−Ｒ８対（すなわち、ｉ、ｉ＋７）、Ｓ８−Ｒ５対（すなわち、ｉ、ｉ＋７）、Ｒ３−Ｓ６対（すなわち、ｉ、ｉ＋３）、Ｒ６−Ｓ３対（すなわち、ｉ、ｉ＋３）、Ｒ３−Ｓ５対（すなわち、ｉ、ｉ＋３）、Ｒ５−Ｓ３対（すなわち、ｉ、ｉ＋３）、又はペプチド配列内の対の組合わせからなる群より選ばれる対を包含する多種の炭化水素架橋を含んでいる。
【００２３】
別の実施態様では、エクセナチドのアミノ酸１〜３９は、少なくとも３個の連続アミノ酸、又は螺旋上の単一面にある少なくとも２個のアミノ酸、又は少なくとも２個の相互作用面アミノ酸；或いはそれらの同類置換を含んでいる。螺旋の単一面は、１個、２個、３個、又は４個のアミノ酸の積み重ねカラムを含んでいて、ここでアミノ酸の積み重ねカラムは、２回転当り７アミノ酸を有するα螺旋（ここでアミノ酸は連続して一連に位置ａ〜ｇを割り当てられている）中の位置ａ、ｄ、及びｇ；位置ｂ及びｅ；又は位置ｃ及びｆ；によって（例えば、図３を参照されたい）；そして２回転あたり２個のアミノ酸を有している３１０螺旋中（ここでアミノ酸は連続して一連に位置ａ〜ｆを割り当てられている）中の位置ａ及びｄ；位置ｂ及びｅ；又は位置ｃ及びｆ；又はそれらの同族体によって規定されている。
【００２４】
本発明は別の実施態様で、本発明で用いるためのエクセナチド及びその他の生物活性インスリン分泌促進ポリペプチドを提供する。本発明の構造的に拘束されているエクセナチドペプチドは、位置２４と２８の間（すなわち、図７ＢのＳＡＨ−Ｅｘ（Ｂ））に炭化水素架橋を、そして任意に位置１０と１４の間（すなわち、図７ＢのＳＡＨ−Ｅｘ（Ｂ））に炭化水素架橋、並びに少なくとも３個の連続アミノ酸、又は少なくとも２個のアミノ酸を螺旋の単一面上に、或いはＧＬＰ−１の少なくとも２個の相互作用面アミノ酸（図２Ａを参照されたい）又はこれらの同族体を含んでいる。本発明の構造的に拘束されるペプチドはエクセナチド又はＧＬＰ−１配列のみ、又はＣ末端、又はＮ−末端、或いは両方の側面に位置するエクセナチド又はＧＬＰ−１配列を包含できる。本発明で提供されるペプチドは、ペプチドを構造的に拘束する改変に加えて、非アミノ酸改変を更に包含できる。例えば、インビボにおけるペプチドの標的化のため、或いはペプチドの薬物動態及び／又は薬力学的特性を変えるために官能基を包含できる。このような改変は当該技術分野で公知である。
【００２５】
アミノ酸の積み重ねカラムを構成するアミノ酸の位置を、配列番号１で示されるペプチド配列の螺旋輪上の位置に対応する位置で定義できる（図３を参照されたい）。構造的に拘束されているペプチドの配列を、ＧＩＰＰ、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１前駆体、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、リラグルチド、タスポグルチド、及びアルビグルチドを包含する、その他の同族インスリン分泌促進ペプチドの配列と位置合わせすることができる。配列位置合わせを実施する方法は当業者に公知である。更に、螺旋中の対応アミノ酸を多数の市販コイル決定プログラムの何れかを用いて決定できる。配列番号１で示される配列に関して、アミノ酸の積み重ねカラムは図３に描かれているものを包含できる。
【００２６】
本発明は、配列番号１で表されるエクセナチドポリペプチド配列又はその同族体に由来する、少なくとも３個の相互作用面アミノ酸又は相互作用面アミノ酸の同類置換を有するポリペプチドも提供する。このポリペプチドの相互作用面はペプチドの単一面であって、ここで相互作用面アミノ酸は、Ｈ１、Ｄ９、Ｆ２２、Ｉ２３及びＬ２６のような、配列番号１由来のアミノ酸に対応する位置、又は構造決定（ＰＤＢ ＩＤ ３Ｃ５Ｔ）及び／又は配列番号１のアラニンスキャニングによって特定された、Ｇ４、Ｆ６、Ｔ１７、Ｇ３０、Ｐ３１、Ｐ３６、Ｐ３７、Ｐ３８のような、生物活性に対して重要であることが知られているその他の重要な残基に対応する位置から選択される。本発明で提供される構造的に拘束されるペプチドはエクセナチド由来のその他の配列又はその他のインスリン分泌促進ポリペプチド由来の配列の何れかの、更なるアミノ酸配列を包含できる。更なるアミノ酸配列は構造的に拘束されてもされていなくてもよい。本発明は、エクセナチド、或いはエクセナチド又は同族ペプチドの少なくとも３連続アミノ酸、或いはエクセナチド又は同族ペプチドの螺旋の単一面上の少なくとも２個のアミノ酸、或いはエクセナチド又は同族ペプチドの少なくとも２個の相互作用面アミノ酸；或いはそれらの同類置換を有する同族配列の使用を提供する。エクセナチド又は同族ペプチドの螺旋の単一面は、１個、２個、３個、又は４個の隣接するアミノ酸の積み重ねカラムを包含し、ここではアミノ酸の積み重ねカラムは、α螺旋中の、位置ａ、ｄ、及びｇ；位置ｂ及びｅ；又は位置ｃ及びｆによって定義され、ここで位置ａは螺旋中のアミノ酸であって、アミノ酸はα螺旋；又はその同族体中で連続的に順にａからｇの文字を割り当てられている。
【００２７】
例えば、ペプチドのα螺旋及びアミノ酸の積み重ねカラムは、配列番号１又はその同族体の位置１、４、５、８、１１、１２、１５、１８、１９、２２、２５、２６、２９、３２、及び３３；又は位置２、５、６、９、１２、１３、１６、１９、２０、２３、２６、２７、３０、３３、及び３４；又は位置３、６、７、１０、１３、１４、１７、２０、２１、２４、２７、２８、３１、及び３４；又は位置４、７、８、１１、１４、１５、１８、２１、２２、２５、２８、２９、３２、及び３５；又は位置５、８、９、１２、１５、１６、１９、２２、２３、２６、２９、３０、及び３３；又は位置６、９、１０、１３、１６、１７、２０、２３、２４、２７、３０、３１、及び３４；又は７、１０、１１、１４、１７、１８、２１、２４、２５、２８、３１、３２、及び３５として定義される。本明細書で提供される、α螺旋構造を有するペプチドの単一面は、１個、２個、３個、又は４個の隣接するアミノ酸の積み重ねカラムを包含できる。
【００２８】
本発明は更に、エクセナチド又は同族ペプチドの相互作用面アミノ酸を有するペプチドを提供する。相互作用面は、本発明によって提供される螺旋ペプチド上の１つの面の例である。相互作用面のアミノ酸は配列番号１のＨ１、Ｇ２、Ｔ５、Ｓ８、Ｄ９、Ｋ１２、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｖ１９、Ｒ２０、Ｆ２２、Ｉ２３、Ｉ２６、Ｋ２７のような位置に対応するアミノ酸を包含するか、又は配列番号１上の位置Ｈ１、Ｄ９、Ｆ２２、Ｉ２３及びＬ２６に対応するアミノ酸に更に限定されてもよい。
【００２９】
更なる実施態様では、本発明は薬学的に許容される担体中にある本発明の構造的に拘束されるペプチドの何れかを提供する。本発明は更に、単位剤形中の薬学的に許容される担体中にある本発明のペプチドを提供する。本発明は機能的に担体に結合している本発明の構造的に拘束されているペプチドを提供する。
ある特定の実施態様では、担体は、構造的に拘束されるペプチドの薬物動態及び／又は薬物動態特性を変えるタンパク質又は脂質を包含している。
ある特定の実施態様では、組成物の構造的に拘束されるペプチドは担体タンパク質と部位特異的連結(linkage)によって確立される特定の方位に機能的に結合している。
【００３０】
更なる実施態様では、本発明は、本発明の構造的に拘束されるペプチドの治療有効量を対象に投与することによって、例えば、対象の１型又は２型糖尿病を予防、改善、又は治療する方法を提供する。方法は更に、糖尿病の予防、改善又は治療が必要であるかについて対象を１つ又はそれ以上確認すること、又は糖尿病の予防、改善又は治療について対象を観察することの１つ又はそれ以上を包含する。
ある特定の実施態様では、本発明は糖尿病を予防、改善、及び治療する方法を提供し、そこではインスリン放出を増強することによる血糖正常値を促進することの少なくとも１つを包含している。
【００３１】
本発明は、注射、吸入、又は経口で送達されて正常血糖値を促進する、本発明の構造的に拘束されるペプチドを包含している薬剤の製剤を提供する。薬剤は糖尿病の予防及び／又は治療のためになる。
【００３２】
ある特定の実施態様では、本発明は少なくとも１つの構造的に拘束される本発明のペプチド及び使用説明書を包含しているキットを提供する。
【００３３】
一態様では、本発明は、α螺旋及び１つ又はそれ以上の分子鎖を含んでいる構造的に強化されたインスリン分泌促進ポリペプチドを提供し、ここではそれぞれの分子鎖が当該ポリペプチドのα螺旋上に存在している残基の１対を共有結合して、それによりインスリン分泌促進ポリペプチドを構造的に強化している。
【００３４】
別の態様では、本発明は、本発明の構造的に強化したインスリン分泌促進ポリペプチド及び１つ又はそれ以上の薬学的に許容される担体を含んでいる医薬組成物を提供する。
【００３５】
更なる態様では、本発明は、本発明の構造的に強化したインスリン分泌促進ポリペプチドの治療有効量、又は本発明の構造的に強化したインスリン分泌促進ポリペプチドを含んでいる組成物を投与することを含んでなる、糖尿病を治療又は予防する方法を提供する。
【００３６】
一実施態様では、本発明の構造的に強化したインスリン分泌促進ポリペプチドはエクセナチド、ＧＩＰＰ、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１前駆体、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−１（７〜３７）、ＧＬＰ−１（７〜３６）、リラグルチド、タスポグルチド、アルビグルチド又はＬＹ２１８９２６５であってよい。
【００３７】
別の実施態様では、本発明の構造的に強化したインスリン分泌促進ポリペプチドはエクセナチドであってよい。
【００３８】
更に別の実施態様では、ポリペプチド当りの分子鎖の数は１〜２、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９又は２〜１０の間であってよい。
【００３９】
更に別の実施態様では、少なくと１つの残基対はポリペプチドのＮ−末端半分内に存在している。
【００４０】
少なくと１つの残基対はポリペプチドのＣ−末端半分内に存在できる。
【００４１】
少なくと１つの残基対はポリペプチドに沿うどの位置に存在していてもよい。
【００４２】
更に別の実施態様では、ポリペプチドのＣ−末端半分以内にポリペプチドは少なくとも１つの結合した残基対を、そしてポリペプチドのＮ−末端半分以内に別の結合した残基を含んでいる。
【００４３】
更に別の実施態様では、ポリペプチドは、配列番号２又は１５〜３８で表される配列の何れか１つを有しているエクセナチドに対応している。
【００４４】
更なる実施態様では、ポリペプチドは、配列番号３９〜６２で表される配列の何れか１つを有しているＧＬＰ−１に対応している。
【００４５】
更なる実施態様では、ポリペプチドは、ポリペプチドのα螺旋の残基位置に対して位置（ｉ、ｉ＋３）、又は（ｉ、ｉ＋４）又は（ｉ、ｉ＋７）に位置する第１分子鎖を有している。ポリペプチドは、ポリペプチドのα螺旋の残基位置に対して位置（ｉ、ｉ＋３）、又は（ｉ、ｉ＋４）又は（ｉ、ｉ＋７）に位置する第２分子鎖を有していてもよいが、第１及び第２分子鎖は同一位置には位置していない。
【００４６】
ある特定の実施態様では、少なくとも２つの分子鎖を用いる場合は、少なくとも２つの分子鎖を「縫い合わせた（ｓｔｉｔｃｈｅｄ）」配置に構成できる。縫い合わされた分子鎖とは、連続的に配置されている結合が共通の起源から作られていることを示す。すなわち、「縫い合わせた」架橋の使用は、そこでは二重連結が共通の起源（例えば、Ｘ１、Ｘ５、及びＸ９、ここでＸ５は両架橋のアンカーポイントである）から作られていることである。従って、本発明は、配列を更に安定化するかあるいは、より長いポリペプチド伸張の構造安定性、タンパク質分解耐性、熱安定性、酸安定性、薬理学的特性、及び生物活性増強を促進するためにポリペプチド配列内に１つ又はそれ以上の架橋の組み込みを包含している。図５Ｂは、「縫い合わせ」の配置にある複数の架橋又は分子鎖を有しているポリペプチドの実施態様を示している。
【００４７】
従って、一実施態様では、本発明の連結されているポリペプチドは、縫い合わせ配置にある１対の分子鎖を含んでよく、それによって第１分子鎖の末端と第２分子鎖の開始点はポリペプチド中の共通残基に由来している。
【００４８】
更に別の実施態様では、強化したポリペプチドは、強化していない対応ポリペプチドの半減期より少なくとも２倍、又は３倍、或いは８倍も長い半減期を有している。
【００４９】
更に別の実施態様では、強化したポリペプチドは、強化していない対応ポリペプチドのインビトロにおけるキモトリプシンへの耐性の、少なくとも２倍、又は３倍、或いは８倍も大きいインビトロにおけるキモトリプシンへの耐性を有している。
【００５０】
更に別の実施態様では、強化したポリペプチドは、強化していない対応ポリペプチドのインビトロにおけるキモトリプシンへの耐性の、少なくとも６倍、又は１３倍大きいインビトロにおけるキモトリプシンへの耐性を有している。
【００５１】
更に別の実施態様では、強化したポリペプチドは、強化していない対応ポリペプチドのインビボにおける血清プロテアーゼへの耐性の、少なくとも２倍、又は５倍、又は１０倍大きいインビボにおける血清プロテアーゼへの耐性を有している。
【００５２】
ある特定の実施態様では、本発明の糖尿病を治療する方法は、経口送達経路を介して本発明のポリペプチドを投与することを含んでいる。
【００５３】
ある特定の別の実施態様では、本発明の糖尿病を治療する方法は、注射による送達経路を介して本発明のポリペプチドを投与することを含んでいる。
【００５４】
本発明の別の実施態様は、以下に提供した開示に基づいて理解できるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
以下の詳細な説明は、一例として提供されているが、記載されている特定の実施態様に本発明を限定することを意図するものではなく添付の図面を併用すると理解できるだろう。
【００５６】
【図１】図１（Ａ）は、インスリン分泌促進ポリペプチド薬剤である、エキセンジン−４、エクセナチド、胃抑制ポリペプチド前タンパク質（Gastric Inhibitory Polypeptide Preprotein; ＧＩＰＰ）、胃抑制ペプチド（Gastric Inhibitory Peptide；ＧＩＰ）、グルカゴン様ペプチド−１前駆体（ＧＬＰ−１Ｐ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、ＧＬＰ−１の断片、リラグルチド、タスポグルチド、アルビグルチド及びＬＹ２１８９２６５のポリペプチド配列を提供する。これらは炭化水素架橋によって構造強化するための本発明の多種の実施態様において鋳型として用いることができるインスリン分泌促進ポリペプチドの例である。  図１（Ｂ）は、ヒトグルカゴンペプチドのサブファミリーの配列アラインメントを提供し、ＧＬＰ−１受容体と相互作用する重要なアミノ酸残基及び保存残基を強調表示している。ＧＬＰ−１Ｒと相互作用するエキセンジン−４の残基（９〜３９）を青色で着色した（すなわち、１５Ｅ、１９Ｖ、２０Ｋ、２２Ｆ、２３Ｉ、２６Ｌ、２７Ｋ、３２Ｓ）。保存残基を黄色で着色した（すなわち、４、６、２１、２４、２５位の残基）。わずか４残基が保存されている位置を緑色で着色した（すなわち、１、５、８、９、１１位）。（Runge S et al. 2008 J Biol Chem 283:11340-11347）。
【図２】図２Ａは、エクセナチドのα螺旋領域（ＰＤＢ ＩＤ ３Ｃ５Ｔ）と複合体を形成したＧＬＰ−１受容体の構造を示し、球状及び棒状で示した相互作用面の残基を包含しているアミノ酸を強調表示している。これらは機能活性に対して特に重要であることがアラニンスキャンによって確認された（Runge, S. et al., 2008, J. Biol. Chem., 283: 11340-11347）。コアエクセナチドα螺旋の非相互作用面上の非天然アミノ酸挿入のための置換部位の例も二重架橋エクセナチドペプチドの設計を実証するために空間充填方式で示した。図は更に、エキセンジン−４のアミノ酸配列及びエキセンジン−４の残基９〜３３を提供し、エクセナチドの相互作用面のアラニンスキャンで確認して上記重要アミノ酸（オレンジ色、下線及び「＊」で印して示した）、及び炭化水素架橋の結合点を印したアミノ酸残基（赤紫色、下線及び「∧」で印して示した）を強調して示した。  図２（Ｂ）は、ＧＬＰ−１（７〜３７）のアミノ酸配列を提供して、機能活性に対して重要なアミノ酸残基を示した（下線で）。（Contillo et al. Proceedings of the 16th American Peptide Symposium June 26-July 1, 1999, Minneapolis, Minnesota, U.S.A.）。
【図３】図３は、エクセナチドのα螺旋領域の螺旋輪の描写を示し、ＧＬＰ−１受容体と相互作用するエクセナチド螺旋の面の位置を強調している。架橋挿入用の置換部位を、α螺旋構造、受容体結合親和性、及び機能活性を増強するために螺旋の非相互作用面に局在させることができる。炭化水素架橋の結合部位の形成に関わる非相互作用面側の特定残基位置には制限がなく、Ｎ−末端、Ｃ−末端、又はポリペプチド端部の間の何れかの位置に位置している残基を包含できる。
【図４】図４は、炭化水素鎖（例えば、オレフィン鎖）を有する非天然アミノ酸をどのようにペプチド配列内に挿入して単一架橋されたペプチド作成するかを示す。鎖は、ペプチド螺旋の長さに沿って（Ａ）（ｉ、ｉ＋３）、（Ｂ）（ｉ、ｉ＋４）、及び（Ｃ）（ｉ、ｉ＋７）位置に位置付けることができ、望ましい生物物理学的及び生物学的特性のための最適な位置決めを確認するための単一架橋ペプチド（すなわち、「架橋スキャン」）のライブラリーを作成できる。（Ｄ）は、目的のポリペプチド薬剤（例えば、エクセナチド）の望ましい生物物理学的、生物学的、及び薬理学的特性を達成するための最適な架橋位置（複数も）を確認する架橋スキャンニングをさらに説明している。架橋スキャンニングはペプチド配列鋳型の長さ方向に沿った架橋位置の順次評価を含む。Ｎ−末端から開始しているｉ、ｉ＋４架橋スキャンを示している。
【図５Ａ】図５Ａは、同一又は異なった組成の複数架橋をどのようにα螺旋の長さに沿って挿入して、二重、三重又は多重の架橋ペプチドを作成するかを示している。架橋は、ペプチド螺旋の長さに沿った（ｉ、ｉ＋３）、（ｉ、ｉ＋４）、及び（ｉ、ｉ＋７）位置に位置させて、望ましい生物物理学的及び生物学的特性のための最適な位置決めを確認するための複数架橋ペプチド（すなわち、「架橋スキャン」）のライブラリーを作成できる。（Ａ〜Ｆ）は、ｉ、ｉ＋３、ｉ、ｉ＋４、及びｉ、ｉ＋７架橋の各種組合わせを用いる複数架橋ペプチドの例である。（Ｇ、Ｈ）望ましい生物物理学的、生物学的、及び薬理学的特性を達成するための最適架橋位置を架橋スキャンニングによって確認でき、これはペプチド配列鋳型の長さ方向に沿った個々の架橋位置を組合わせた順次評価を含んでいる。（Ｇ）Ｎ−末端及びＣ−末端から開始した二重ｉ、ｉ＋４架橋スキャン；（Ｈ）ペプチド配列の中央部並びにＮ−末端及びＣ−末端架橋の間に位置している第３架橋の各種位置決めを含んでいる三重ｉ、ｉ＋４架橋スキャン。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｎ−及びＣ−末端架橋がα、α位置内に２つのオレフィン側鎖変化を有している非天然アミノ酸の中央で結合できるように連続挿入される架橋を用いる構造的に安定化したインスリン分泌促進ペプチドの更なる例を示す。配置は連続ｉ、ｉ＋３（Ｉ）、ｉ＋４（Ｊ）及びｉ＋７（Ｋ）架橋、及び直列ｉ、ｉ＋３／ｉ、ｉ＋４（Ｌ）、ｉ、ｉ＋３／ｉ、ｉ＋７（Ｍ）、ｉ、ｉ＋４／ｉ、ｉ＋３（Ｎ）、ｉ、ｉ＋４／ｉ、ｉ＋７（Ｏ）、ｉ、ｉ＋７／ｉ、ｉ＋３（Ｐ）、及びｉ、ｉ＋７／ｉ、ｉ＋４（Ｑ）架橋のような、これらの組合わせを包含する。図５Ａに上記するように、望ましい生物物理学的、生物学的、及び薬理学的特性を達成するための最適架橋の位置決めは架橋スキャンニングよって特定でき、これは矢印で示したように、ペプチド配列鋳型の長さ方向に沿って個々の直列架橋（Ｉ〜Ｑ）の連続配置を包含する。
【図６】図６（Ａ）は、ｉ、ｉ＋３架橋の作成に用いられたオレフィン非天然アミノ酸を合成する合成化学概要図である。図６（Ｂ）はオレフィン非天然アミノ酸の例を描写している。
【図７】図７（Ａ）は、エクセナチドの安定化α螺旋（「ＳＡＨ」）（ＳＡＨ−Ｅｘ）及びＧＬＰ−１の安定化α螺旋（ＳＡＨ−ＧＬＰ１）の組成である。エクセナチドの突然変異構築物（Ｍｅｔ１４ＮｏｒＬｅｕ）を一重及び二重架橋ＳＡＨ−Ｅｘペプチドの構築のための鋳型として用いた。図７（Ｂ）は、生物物理学、生物学、及び薬理学研究に用いた一重及び二重ＳＡＨ−Ｅｘペプチドの例である。Ｘ、架橋結合非天然アミノ酸；Ｂ、ノルロイシン。
【図８】図８は、一重及び二重螺旋ＳＡＨ−Ｅｘペプチドの増強されたα螺旋性を明らかにしている、鋳型（Ａ）及びＳＡＨ−Ｅｘ（Ｂ〜Ｄ）ポリペプチドの広い温度範囲にわたる円二色性スペクトルを提供する。（Ｅ）は、一重及び二重架橋ＳＡＨ−Ｅｘペプチドの増強された熱安定性を明らかにしている、鋳型及びＳＡＨ−Ｅｘペプチドについての温度溶解度曲線を提供する。具体的には、（Ａ）〜（Ｄ）はＥｘ（Ｍｅｔ１４ＮｏｒＬｅｕ）、ＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ）、ＳＡＨ−Ｅｘ（Ｂ）、及びＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ、Ｂ）の円二色性スペクトルを示し、広い温度範囲にわたる（５℃〜８３℃）一重及び二重架橋ペプチドの増大したα螺旋性を強調している。（Ｅ）は、Ｅｘ（Ｍｅｔ１４ＮｏｒＬｅｕ）、ＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ）、ＳＡＨ−Ｅｘ（Ｂ）、及びＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ、Ｂ）の円二色性温度溶解度プロットを示し、対応する非架橋鋳型ペプチドと比較して一重及び二重架橋ペプチドの増強された熱安定性を明らかにしている。
【図９】図９は、鋳型エクセナチドペプチド（ＳＡＨ−Ｅｘ）の一重及び二重架橋によるプロテアーゼ耐性の増強を明らかにしている。具体的には、一重及び二重架橋したＳＡＨ−Ｅｘペプチドは、非改変エクセナチド鋳型ペプチドと比較してキモトリプシン（ｐＨ７）に対してより耐性がある。この例では、一重架橋ペプチドが鋳型ペプチドと比較して２〜３倍増強したキモトリプシン耐性を示したのに対して、二重架橋ペプチドは鋳型ペプチドと比較して８倍の増強を、そして対応する一重架橋ペプチドと比較して２．７〜４倍の増強を示した。
【図１０】図１０は、一重及び二重架橋したＳＡＨ−Ｅｘペプチドは非改変エクセナチド鋳型ペプチドと比較すると、ペプシン（ｐＨ２）に対してより耐性があることを明らかにしている。この例では、ＳＡＨ−Ｅｘ（Ｂ）は鋳型ペプチド比較して６倍に増強されたペプシン耐性を示すのに対して、二重架橋ペプチドは鋳型ペプチドと比較して１３倍の増強をそして一重架橋ペプチドと比較して２〜１３倍の増強を示す。
【図１１】図１１は、本発明の架橋ＳＡＨ−Ｅｘの検出のためのＥＬＩＳＡによるアッセイの結果を説明している。具体的には、エクセナチドのＥＬＩＳＡによるアッセイキットは連続希釈した非改変Ｅｘ（Ｍｅｔ１４ＮｏｒＬｅｕ）及び二重架橋ＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ、Ｂ）ポリペプチドを検出することをグラフが明らかにしている。（Exendin-4 (Heloderma suspectum), EIA Kit Phoenix Pharmaceuticals, Inc. EK-070-94）。明らかにされたように、エクセナチドのＥＬＩＳＡアッセイは鋳型突然変異エクセナチドペプチド及びその二重架橋誘導体を認識し、血漿中のＳＡＨ−Ｅｘ濃度の測定を可能にする。
【図１２】図１２は、経口強制投与又は静脈内注射の何れかで処置されたマウスの血漿中の全長二重架橋ＳＡＨ−Ｅｘペプチドの検出を明らかにしている。両方の投与経路について同レベルの全長ＳＡＨ−Ｅｘペプチドが検出された。担体のみで処置したマウスを陰性対照として供した。
【図１３】図１３は、炭化水素架橋の挿入によってもたらされるタンパク分解耐性のメカニズムを明らかにしている。（Ａ）架橋せずに２対のオレフィン非天然アミノ酸の挿入（例えば、ｇｐ４１の非架橋α螺旋：ＵＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｂ））はキモトリプシンのタンパク分解からの有意な保護をもたらさない。しかし、オレフィンメタセシスにより、対応する二重架橋類縁体、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｂ）は、ＵＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｂ）より８倍長い半減期を示して、架橋それ自体が著しいプロテアーゼ耐性をもたらすのに必要であることを示唆している。（Ｂ）ＵＡＨ−及びＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｂ）は、それぞれ２７℃及び２２℃のＴｍ値を有して、同様な円二色性溶解プロファイルを示した。温度依存性のアンフォールディングは、重複反復溶解度曲線から明らかなように、両ペプチドに対して可逆的であった。これらのデータは全体的なα螺旋安定性（これは２つの構築物に対して同様である）は、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｂ）の顕著なプロテアーゼ耐性の主要原因ではないことを明らかにしている。また、アンフォールディングの可逆性は、ペプチド凝集が無いことを強調していて、これも同様にＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｂ）の顕著なプロテアーゼ耐性の主要原因ではない。（Ｃ）非改変、一重架橋、二重架橋、及び４ヶ所が置換されているが架橋されていないペプチドの競合的キモトリプシン分解パターン。これらのデータはＮ−末端架橋が、架橋が配置されている切断部位のタンパク分解性加水分解を、ＬＣ／ＭＳ分析で観察される対応するＭ＋１８種を伴わずに、独自に阻害することを明らかにしている。Ｃ−末端架橋は、完全に阻害するよりはむしろ、架橋の上流部位におけるタンパク質分解を遅らせた。４ヶ所が置換されているが架橋されていない誘導体、ＵＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｂ）は、非天然アミノ酸のＮ−末端対が配置されている位置におけるタンパク質分解を阻害できず、Ｃ−末端一重架橋ペプチドのように有効にタンパク分解の速度を遅らせることもできなかった（ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ｂ）についてＴ１／２は７７分；ＵＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｂ）についてＴ１／２は３６分）。二重架橋ペプチドＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｂ）は、Ｎ−末端及びＣ−末端架橋の両方の抗タンパク質分解特性から相乗的に恩恵を得ていた。（Ｄ）ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｂ）と対応する非改変鋳型ペプチド、Ｔ６４９ｖの比較１Ｈ ＮＭＲ分析。Ｔ６４９ｖの２つのＮ−末端トリプトファン残基に対応するインドールプロトン（〜１０．６ｐ.ｐ.ｍ）がＴ６４９ｖにおける２つのはっきりしたピークで表され、複数配座間の速い変換と一致した。対照的に、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６〜６６２）（Ａ、Ｂ）の１Ｈ ＮＭＲスペクトル中のインドールプロトンピークは広がって分裂し、ペプチド架橋の結果である別々に構築されたＮ−末端を反映した。この機械的な解離は二重架橋ＨＩＶ−関連ポリペプチドに特異的に関与しているが、同様の抗タンパク質分解及び構造補強の結果が本発明の二重架���インスリン分泌促進ポリペプチドに関しても得られた（図８〜１０）。
【図１４】図１４は、構造的に安定化されてプロテアーゼ耐性があるＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ）及びＳＡＨ−ＧＬＰ１（Ｂ）ペプチドは、単離した膵島からのグルコースの刺激を受けたインスリン放出を刺激することを明らかにしている。これらのデータは、ＳＡＨ−Ｅｘ及びＳＡＨ−ＧＬＰ１ペプチドの炭化水素架橋は、構造安定性及びプロテアーゼ耐性を最大化し、薬理学的に最適化されたインスリン分泌促進剤を産出しながら、機能活性を保存することを強調している。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明は、インクレチンホルモン（例えば、グルカゴン様ペプチド−１）、インクレチン類縁体（例えば、リラグルチド）又はインクレチン模倣体（例えば、エクセナチド）を含む、インスリン分泌促進活性を有するポリペプチドを安定に架橋することが、異常なグルコースホメオスタシスに関連する疾患、例えば、２型糖尿病及び２型糖尿病に関連している疾患の治療において優れた予期しない利益をもたらすという予期しない発見に関連している。このような利益は、これに限定されないが、架橋されていない対応物と比較して、延長された半減期、増強されたα螺旋性、改善された熱安定性及びプロテアーゼ耐性、増大した機能活性及び薬理学的特性、何れかの経路で投与したときの改善されたバイオアベイラビリティー、並びに経口で送達されたときの改善されたバイオアベイラビリティー及び胃腸吸収を包含する。従って、本発明は以前は得られなかったか又は入手可能ではなかった、利益をもたらすインスリン分泌促進ポリペプチドを投与する新規且つ有益な手法を提供する。従って、本発明は注射による経路で送達されたインスリン分泌促進ポリペプチドの改善された半減期（及びこれによるバイオアベイラビリティー、有効性、など）を可能にする。更に、本発明は、経口、経鼻及び舌下経路を包含する、非注射経路を介して、インスリン分泌促進ポリペプチド薬剤（例えば、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、エクセナチド、リラグルチド、タスポグルチド、又はアルビグルチド）の有効量を送達する（すなわち、これは送達されて生物学的に利用可能となる）ことを可能にし、それによってよりよい患者のコンプライアンスの可能性及び使いやすさを改善する。
【００５８】
従って、本発明は、異常なグルコースホメオスタシスを伴う疾患、例えば、２型糖尿病及び２型糖尿病に関連する疾患の治療及び／又は予防に用いるための、構造的に拘束されているインクレチンホルモン（例えば、グルカゴン様ペプチド−１）、インクレチン類縁体（例えば、リラグルチド）又はインクレチン模倣体（例えば、エクセナチド）を包含する、構造的に拘束されているインスリン分泌促進ポリペプチドを使用及び／又は製造する組成物、キット並びに方法を対象としている。
【００５９】
本発明は、少なくともその一部が、炭化水素で架橋されたα螺旋エクセナチドペプチド及びその機能的変異体が、α螺旋構造強化、中性及び酸性プロテアーゼ耐性、熱安定性、及び経口吸収、長いペプチド治療剤の従来の欠点の改善を包含する、強化された薬理学的特性示すことを明らかにしている本明細書で提供された結果に基づいている。その結果、このペプチドはその非改変対応物と比較してインビボにおける優れた薬理学的特性を有し、非改変ポリペプチド配列と比較して投与が必要な構造的に拘束されたペプチドの頻度及び量を低減する。さまざまな実施態様では、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの分子鎖、例えば炭化水素架橋、で安定化されている１つ又はそれ以上のα螺旋ドメインを含んでいるが、２つ、３つ又はそれ以上のこのような炭化水素架橋を含んでもよい。複数の炭化水素架橋を包含することは長さが２０又はそれ以上のアミノ酸であるα螺旋ペプチドに特に適している。１つ以上（ペプチドの長さにより、例えば、２、３、４、５つ）の炭化水素架橋の包含は、改変したポリペプチドの優れた構造、中性及び酸性プロテアーゼ耐性、及び熱安定性をもたらし、インビボにおける際立って改善された薬理学的特性を有する生物活性ペプチドを産生する。
【００６０】
本明細書で明らかにしたように、本発明の架橋したインスリン分泌促進ポリペプチド（例えば、架橋したエクセナチド）安定化されたα螺旋性、タンパク質分解及び熱に対する安定性、及び相当する構造的に拘束されていないポリペプチドより、より望ましい薬物動態及びバイオアベイラビリティー特性を明らかにしている。重要なことは、本明細書で更に明らかにされるように、本発明の架橋されたポリペプチドは経口送達及び胃腸管暴露の間中プロテアーゼ作用に耐えることができて、これは特定のＦＤＡに承認されている静脈内投与用インスリン分泌促進薬剤（例えば、エクセナチド又はリラグルチド）には不可能なことである。
【００６１】
（定義）
本発明は本明細書に記載されている特定の物質及び方法に限定されないことを理解されたい。本明細書で用いられている専門用語は特定の態様を記載することが目的であって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されたい。
【００６２】
別に定義されていない限り、本明細書で用いられている全ての技術及び科学用語は本発明が属する技術分野の当業者によって普通に理解されている意味を有している。本明細書で言及されている全ての刊行物は、細胞株、プロトコル、試薬及びベクターを記載及び開示することを目的として引用されていて、これらは刊行物中に報告されていて本発明に関連して用いることができる。本明細書中にはこのような引用文献が先行技術であることを承認すると解釈されるものは何もない。
【００６３】
本明細書で用いられているような、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が他のものを明確に指示していない限り複数への言及を含んでいる。例えば、「宿主細胞、a host cell」への言及は、当業者に公知の複数のこのような宿主細胞を含んでいる。
【００６４】
「薬剤」は、治療効果のある化合物又は潜在的に治療効果のある化合物を包含すると本明細書では理解されている。薬剤は以前に公知であるか又は未知である化合物である。本明細書で用いられるような、薬剤は細胞に基づいていない化合物であるが、薬剤は生物学的治療薬剤、例えば、ポリペプチド（例えば、インスリン分泌促進ポリペプチド）又は核酸治療剤、サイトカイン、抗体、等を含むことができる。薬剤は一重又は多重架橋されたインスリン分泌促進ポリペプチド（例えば、エクセナチド）、及び機能的な同族体、断片、類縁体、誘導体又はその模倣体を含むことができる。
【００６５】
本明細書で用いられる用語「機能的断片」は、インクレチンホルモン（例えば、グルカゴン様ペプチド−１）、インクレチン類縁体（例えば、リラグルチド）、又はインクレチン模倣体（例えば、エクセナチドを包含する、本発明の何れかのインスリン分泌促進ポリペプチドのポリペプチド断片を示し、これはその対応する元のインスリン分泌促進ポリペプチド、例えば、エクセナチド又はＧＬＰ−１の生物学的又は薬理学的活性又は特性の少なくとも約１０％、又は約２０％又は３０％、又は４０％、又は５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％、又は９０％以上、又は少なくとも９９％又はそれ以上を保持している。断片はそれが基になっているポリペプチドのアミノ酸の任意の連続領域であってよい。断片は、共に結合して断片を形成している、基になっているポリペプチドのアミノ酸の２つ又はそれ以上の異なった連続領域のキメラ配列の形態であってもよい。本発明の関連において、天然のインスリン分泌促進ポリペプチド（例えば、ＧＬＰ−１）の断片の１例は、ＧＬＰ−１の残基１〜２０である（これはＧＬＰ−１１〜２０と、或いは当業者に明らかな命名法を用いて同様に表示できる）。
【００６６】
本明細書で用いられる用語「類縁体、analog 又は analogue」は、Ｘの機能活性に必要なＸの化学構造を保持しているが、Ｘとは異なるある特定の化学構造も含んでいる、化合物Ｘ（例えば、ポリペプチド、ペプチド又はアミノ酸）を示す。本発明の関連において、天然のインスリン分泌促進ポリペプチドの類縁体の１例は、１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸、例えば、本発明の炭化水素架橋に関与しているアミノ酸交換のようなもの、を含んでいるＧＬＰ−１ポリペプチドである。本発明の類縁体は、その対応する元のインスリン分泌促進ポリペプチド、例えば、エクセナチド又はＧＬＰ−１の生物学的又は薬理学的活性又は特性の少なくとも約１０％、又は約２０％又は３０％、又は４０％、又は５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％、又は９０％以上、又は少なくとも９９％又はそれ以上を保持していることが好ましい。
【００６７】
本明細書で用いられるような、化合物Ｘの「模倣体」は、Ｘの機能活性に必要であるＸの化学構造が、Ｘの配座を模倣している別の化学構造と置き換わっている化合物を示す。ペプチド模倣体の例は、ペプチド骨格が１つ又はそれ以上のベンゾジアゼピン分子で置換されているペプチド化合物（例えば、James, G. L. et al. (1993) Science 260:1937-1942 を参照されたい）、全てのＬ‐アミノ酸が対応するＤ−アミノ酸で置換されているペプチド、及び「逆−インベルソ」ペプチド（米国特許第４，５２２，７５２号（Sisto）公報を参照されたい）を包含する。本発明の関連において、模倣体はそれを比較する対応ポリペプチドと殆ど又は全く配列相同性を有しておらず非常に異なった長さであってもよい天然又は合成ポリペプチドも包含してもよく、よって模倣体はこれと比較される対応ポリペプチドの生物学的又は薬理学的活性又は特性の少なくとも約１０％、又は約２０％又は３０％、又は４０％、又は５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％、又は９０％以上、又は少なくとも９９％又はそれ以上を有している。例えば、エクセナチドはＧＬＰ−１の模倣体であって、全体の配列（５３％の同一性）及び伸張したＣ−末端領域を殆ど有していないが、ＧＬＰ−１受容体でＧＬＰ−１の生物活性を共有している。
【００６８】
本明細書で用いられるような、化合物Ｘ（例えば、ペプチド又はアミノ酸）の「誘導体」は、化合物上の１つ又はそれ以上の反応基が置換基で誘導体化されているＸの一形態を示す。ペプチド誘導体の例は、そのアミノ酸側鎖、ペプチド骨格、又はアミノ−又はカルボキシ−末端が誘導体化されているペプチド（例えば、メチル化アミド結合を有するペプチド化合物）を包含する。
【００６９】
本明細書で用いられる用語「機能的エクセナチド変異体」、「エクセナチド様ペプチド」、「エクセナチド同族体」、又は「その（エクセナチドの）機能的変異体」は、エクセナチドと類似の又は同種の配列を有していて、エクセナチド活性をアッセイする適切な方法の何れかで測定して、配列番号１で表わされるエクセナチドペプチドの活性の少なくとも５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％、又は９０％、又は９５％、或いは９９％又はそれ以上を有している何れかのペプチドを参照することを意味している。
【００７０】
本明細書で用いられる用語「インスリン分泌促進ポリペプチド」又は「インスリン分泌促進剤」は、インスリン分泌促進活性を有しているポリペプチド又は小分子或いはその他の化合物を示す。本明細書で用いられるような、「インスリン分泌促進活性」を有しているポリペプチドは、インスリンの産生（例えば、発現、放出、分泌、形成、等）及び／又は活性及び／又は量を、直接的あるいは間接的に、刺激するか又はこれに影響を及ぼすものであると定義される。例えば、インスリン分泌促進ポリペプチドは、直接的あるいは間接的に、膵臓のβ細胞からインスリンの放出を引き起こし、そして／又は、直接的あるいは間接的に、血漿中のインスリン濃度の増大を引き起こすものを示すことができる。インスリン分泌促進ポリペプチドは、天然又は合成ポリペプチドを包含でき、更にそれらの機能的断片、誘導体、変異体、同族体、又は模倣体の何れも包含できる。インスリン分泌促進ポリペプチドは、インクレチン系の成分（例えば、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ）及びそれらの類縁体、機能的断片、誘導体又は模倣体の何れも包含できる。インスリン分泌促進活性はグルコース依存性又はグルコース非依存性であってよい。本発明のインスリン分泌促進ポリペプチドはその上に更なる又はその他の活性を有していてよく、この用語は、どんな方法によっても、そのような別の活性を限定することを意味していない。例えば、本発明のインスリン分泌促進ポリペプチド、例えば、エクセナチド又はＧＬＰ−１は、直接的あるいは間接的に、グルカゴンの生産を阻害又は最小化することもできる。用語「インスリン分泌促進活性」は、特定の作用メカニズムの何れかと結び付けることを意味していない。例えば、ＤＰＰ−ＩＶは、ＧＬＰ−１及びＧＩＰの正常な分解酵素として機能するインクレチン系の調節分解酵素である。突然変異ＤＰＰ−ＩＶは、その分解活性が、ＧＬＰ−１及びＧＩＰ（両者はインスリンの生産を刺激する）の有効量が増大するように阻害されるか又は減少すると、インスリン分泌促進性になれる。従って、このような突然変異ＤＰＰ−ＩＶは、間接的にインスリンの量を増大するので、インスリン分泌促進性である。
【００７１】
当然のことながら、インスリン分泌促進剤又はポリペプチド（すなわち、インスリン分泌促進活性を有している）は、「糖調節」又は「血糖調節」活性を有する薬剤又はポリペプチドと見なすことができる。従って、本発明は、糖調節又は血糖調節活性を有しているポリペプチドも意図している。本明細書で用いられる用語「糖調節」又は「血糖調節活性」は直接的又は間接的に関与している活性が体内のグルコースの代謝に応答するか又はこれを調節することを示している。従って、本発明はインスリン分泌促進活性を有するポリペプチドに限定されず、代わりに糖を調節するか又は血糖調節活性を有するポリペプチドの何れかまで広げることができ、これは例えば、直接的或いは間接的に、グルコース、インスリン、又はグルカゴン等の産生（例えば、発現、放出、分泌、形成等）及び／又は活性及び／又は量に影響を及ぼすポリペプチドの何れかを包含できる。
【００７２】
本明細書で用いられる「改善」又は「治療」は、特定の病気又は疾患、例えば、２型糖尿病又はそれに関連する疾患の少なくとも１つの前兆、症状、兆候、影響を低下又は減少すること意味すると理解される。例えば、２型糖尿病の改善又は治療は、血中のグルコース濃度を安定化することでよい。改善又は治療は薬剤の１以上の用量を単独で又は他の治療薬及び治療介入と組合わせて投与することを必要とすることができる。改善又は治療は疾患が治ることを必要としない。
【００７３】
本明細書で用いられる用語「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基の両方を含有している分子を示す。適切なアミノ酸は、限定されないが、ペプチド中で見出せる２０個の通常の天然アミノ酸（例えば、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ（１文字略号として知られている））のＤ−及びＬ−異性体の両方、並びに有機合成又はその他の代謝経路で製造されて、化学的多様性、機能性、結合能力、構造擬態、及び安定性を増大するような特定な用途に適用できるβアミノ酸を含む天然又は非天然アミノ酸を包含する。
【００７４】
本明細書で用いられる用語「アミノ酸側鎖」または「アミノ酸のＲ基」は、アミノ酸のα炭素に結合している部分を示す。例えば、アラニンのアミノ酸側鎖又はＲ基はメチル基でであり、フェニルアラニンのアミノ酸側鎖はフェニルメチルであり、システインのアミノ酸側鎖はチオメチルであり、アスパラギン酸のアミノ酸側鎖はカルボキシメチルであり、チロシンのアミノ酸側鎖は４−ヒドロキシフェニルメチルである、等である。その他の非天然アミノ酸側鎖も、例えば、天然のもの（例えば、アミノ酸代謝物）又は合成的に作られたもの（例えば、αジ置換アミノ酸、βアミノ酸）含まれる。
【００７５】
本発明の構造的に拘束されているペプチドと組成物中で用いる「担体タンパク質」は、拘束されているペプチド結合したときにインスリン産生の増大を引き起こすタンパク質又は液体のようなその他の物質であると理解される。担体複合体の例は当該技術分野で公知であって、例えば、一重又は多重架橋されたエクセナチドペプチド又はその同族体を標的にして適切な受容体にする分子を包含する。
【００７６】
本明細書で用いられる「コントロールサンプル又は対象と比較して変化した」は、正常な、未処置の又はコントロールサンプル由来のサンプルとは統計的に異なっているレベルで検出される被分析物或いは診断又は治療指標のレベルを有していると理解される。コントロールサンプルは、例えば、培養物中の細胞、１つ又はそれ以上の実験動物、１人又はそれ以上のヒト対象を包含する。コントロールサンプルを選択して試験する方法は当業者の能力の範囲内である。被分析物は細胞又は有機体（例えば、抗体）により特徴的に発現又は生産される天然物質又はレポータ構築物（例えば、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼ）によって生産される物質であってよい。検出に用いた方法によって、変化の量及び計量は変化する。コントロール参照サンプルと比較して変化したものはリガンドの受容体、例えば膵臓ＧＬＰ−１受容体への、抗体、拮抗剤、又はその他の阻害剤の存在下での、減少した結合も包含できる。統計的有意性の決定は当業者の能力の範囲内である。
【００７７】
本明細書で用いられる用語「併用投与」は、薬剤が対象内で同時に存在して作用するように１つ又はそれ以上のの薬剤を対象に投与することであると理解される。併用投与は薬剤の混合剤を調剤すること及び薬剤の同時投与を必要としない。
【００７８】
本明細書で用いられる用語「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した側鎖を有しているアミノ酸残基で置き換えられていることである。例えば、類似した側鎖を有しているアミノ酸残基のファミリーが当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは塩基性の側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含する。その他の同類アミノ酸置換は、ペプチドの電荷を修正するためにアスパラギン酸をアスパラギンで置換する場合のような、アミノ酸側鎖ファミリーを越えて生じてもよい。よって、エクセナチドポリペプチド（配列番号１）にある予測非必須アミノ酸残基を、例えば、同じ側鎖ファミリー又はファミリーを越えた同族体（例えば、アスパラギン酸をアスパラギンに、グルタミン酸をグルタミンに）由来の別のアミノ酸残基で置き換えることができる。同類変更は更に、化学的に同族である非天然アミノ酸の置換（すなわち、ロイシンの代わりに合成非天然疎水性アミノ酸を、トリプトファンの代わりに合成非天然芳香族アミノ酸を）を含むことができる。
【００７９】
本明細書で用いられる用語「細胞を接触させる」は、薬剤又は単離された細胞が試験細胞又は処置する細胞と相互作用するように、試験細胞又は処置される細胞に取り込まれる可能性のあるように、及び試験細胞又は処置される細胞に効果を及ぼすように、薬剤を試験細胞、例えば、培養液中で又は動物体内で試験される細胞に提供することであると理解される。薬剤又は単離された細胞は細胞に直接送達されるか（例えば、薬剤の培養培地への添加によって、又は目的の細胞又は組織内への注射によって）、或いは血液循環、リンパ循環、又はその他の方法で細胞へ送達するための投与の経腸又は非経口経路による生体への送達によるものでよい。
【００８０】
本明細書で用いられる「検出すること」、「検出」等は、サンプル中の特定の被分析物、サンプル中のレポータ構築物由来の産物、又はサンプル中の薬剤の活性（例えば、結合阻害、合胞体の形成の阻害、伝染性阻害）を確認するために実施されるアッセイであると理解される。検出は、ＥＬＩＳＡキット又はＬＣ／ＭＳ分析による血中の架橋ペプチドの濃度、血清グルコース濃度、血清インスリン濃度又はヘモグロビンＡ１Ｃパーセントのような生理学的情報による架橋ペプチドの機能的効果の確定を包含できる。被分析物の量又はサンプル中で検出された活性は、特定のアッセイに関する検出、アッセイ又は方法の検出のゼロ、又は低いレベルの範囲内に入る。
【００８１】
本明細書で用いられる用語「診断」とは、病気、障害、又は疾患の少なくとも１つの兆候又は症状の存在に基づいて病気、障害、又は疾患を有している対象を確認するための観察、試験又は状況に基づく対象の疾患の臨床的又はその他の評価を示す。典型的には、本発明の方法を用いる診断は、病気、障害、又は疾患、例えば、２型糖尿病のその他の兆候又は症状についての対象の観察を包含している。
【００８２】
用語「有効量」、又は「有効用量」或いは「治療有効量又は用量」は、意図された薬理学、治療又は予防結果を生じるための薬剤のその量を示す。薬理学的有効量は２型糖尿病又は関連疾患の１つ又はそれ以上の兆候又は症状の改善をもたらす。例えば、治療有効量は、好ましくは、治療されないコントロール対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上までに、血中のグルコース濃度を減少する治療剤の量を示す。量が有効量であるか否かの評価は、血中グルコース濃度の変化、血清インスリンの増大した濃度、減少したヘモグロビンＡ１Ｃパーセント（すなわち、長期の血糖状況及び糖尿病コントロール）を測定することを包含する、糖尿病の領域における当業者に公知の標準的な試験の何れかを用いて行うことができる。薬剤の１用量以上が有効用量をもたらすのに必要であろう。
【００８３】
本明細書で用いられる用語「効果がある」及び「有効性」は、薬理学的有効性と生理学的安全性の両方を含んでいる。薬理学的有効性は患者に所望の生物学的効果をもたらすその治療剤の能力を示す。生理学的安全性は、その治療の投与がもたらす細胞、臓器及び／又は生命体レベルにおける毒性、又はその他の有害な生理作用（副作用と言われることが多い）のレベルを示す。
一方、用語「効果がない」は、少なくとも無成層群において、有害作用は存在しなくても、治療が治療的に有用であるほど十分な薬理学的効果をもたらさないことを意味している。（このような治療は、発現プロファイル又は複数プロファイルで確認できるサブグループにおいて無効であろう）。「効果が弱い」は、薬理学的有効性の有意に低いレベル及び／又は有害な生理作用、例えば、肝毒性の治療的に高いレベルをもたらす治療を意味する。
【００８４】
従って、薬剤の投与に関連して、病気又は疾患に「対して有効」である薬剤は、臨床的に適切な方法による投与が、症状の改善、治癒、疾患の兆候又は症状の減少、余命の延長、生活の質の改善、或いは病気又は疾患の特殊なタイプの治療に通じている医師によって一般に肯定的に認識されているその他の効果のような、有益な効果を、少なくとも統計的に有意な数の患者にもたらすということを意味している。
【００８５】
本明細書で用いられる、螺旋、例えば、α螺旋又は３１０螺旋の「面」は、螺旋が垂直に配置されたときに、単面にあるアミノ酸が他のものの頂部にあるものとして表わされるように、タンパク質の螺旋に積み重ねられているアミノ酸と理解される（例えば、図３を参照されたい）。例えば、α螺旋は１回転当たり約３．６個のアミノ酸を有している。従って、配列ａｂｃｄｅｆｇａ’ｂ’ｃ’ｄ’ｅ’ｆ’ｇ’を有しているペプチドがα螺旋を形成するときは、４番目と５番目のアミノ酸（ｉ＋３及びｉ＋４）、すなわち、アミノ酸ｄ及びｅは、１番目のアミノ酸上に「積み重なり」（位置１＋〜３．６アミノ酸）、そして８番目のアミノ酸である、アミノ酸ａ’（ｉ＋７）はアミノ酸ａの上に積み重なって螺旋の面を形成してアミノ酸ａ’と新しい回転を開始する（例えば、図３を参照されたい）。α螺旋において、２番目のアミノ酸である、アミノ酸ｂは５番目と６番目のアミノ酸、すなわち＋３と＋４位でアミノ酸ｅ及びｆ、及び＋７位でアミノ酸ｂ’と「積み重なって」螺旋の面を形成する。アミノ酸ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇで始まる螺旋の面は上記の開示に基づいて容易に確認できる。更に、螺旋の面は、２つの隣接した、３つの隣接した或いは４つの隣接した「積み重なった」残基のカラムを包含できる。
【００８６】
螺旋の「面」の例は、螺旋の「相互作用面」を包含する（例えば、図３は、ＧＬＰ−１受容体と結合することが知られているエクセナチドのような相互作用面を示す）。「相互作用面」のアミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から変化したときに、受容体と接触して（例えば、図２及び３を参照されたい）、ポリペプチドの機能活性を無効或いは実質的に無効にする残基である。実質的に無効にすることとは、適切なアッセイ（例えば、受容体結合アッセイ、第２メッセンジャーのシグナル伝達又は受容体シグナル伝達の下流エフェクターのリン酸化状態の変化を観察する機能アッセイ、或いはインビトロ又はインビボにおけるグルコース濃度又はグルコース刺激インスリン放出を観察するアッセイ）で野生型ペプチドの約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満まで、エクセナチド又は機能的に同族のペプチドの機能活性を減少させることであると理解される。エクセナチド及びエクセナチド様ペプチドの相互作用面のアミノ酸残基は、図２に描かれているように、ＧＬＰ−１受容体及びエクセナチドの小断片（アミノ酸９〜３３）について報告されているような、構造確認及びアラニンスキャンニングのような、当該技術分野で周知の方法によって容易に確認できる。本明細書で用いられる用語「相互作用面」アミノ酸残基は、配列の機能を妨害しない相互作用面アミノ酸の同類置換を包含する。一般に「相互作用面」アミノ酸残基はα螺旋の相互作用面で見られる（コアエクセナチドα螺旋に関する図２及び３で定義されているように）。
【００８７】
いくつかのインスリン分泌促進ポリペプチド（例えば、エクセナチド）又はそれらの機能的同族体残基は置換されにくいのに対して、他のものは、本明細書で更に記載されているような、例えば、アラニン又は架橋スキャンニングによって確認できるような、変化をより受けやすい。エクセナチド、ＧＬＰ−１、及びリラグルチドのようなインスリン分泌促進ポリペプチドは、当業者により、配列に基づく相同性、構造的相同性及び／又は機能的相同性により容易に確認できる同族の配列及びα螺旋を含んでいる。このような方法は当該技術分野で周知であって、対残基相関に基づく生物情報学プログラム（例えば、ch.embnet.org/software/COILS_form.html）を包含し、これはタンパク質配列及びそれらの構造モデルからコイルドコイルを認識する能力がある（Lupas, A., et al. Science 1991. 252(5009); p. 1162-1164 を参照されたい）。
【００８８】
本明細書で用いられる用語「炭化水素架橋化(stapling)」は、ポリペプチドの生来の二次構造を配座的に与えるのを助ける少なくとも２つの改変アミノ酸を有するポリペプチドを安定に架橋結合する工程を示す。炭化水素架橋化は、螺旋二次構造、例えば、α螺旋二次構造を有しやすいペプチドの螺旋二次構造を促進又は保持して、その生来のα螺旋配座を得るか或いは保持する。この二次構造はポリペプチドのタンパク分解的切断及び熱に対する耐性を増大し、そして疎水性も増大する。「炭化水素架橋化」を示すために用いられる代替え命名は、「炭化水素鎖化(tethering)又は架橋化(crosslinking)」、「分子鎖化(tethering)」、「残基内架橋化(stapling)、鎖化(tethering)、又は架橋結合化(crosslinking)」、「ペプチド内架橋化、鎖化又は架橋結合化」等を包含する。
【００８９】
炭化水素架橋は、α螺旋構造を熱力学的に促すペプチド内のα螺旋二次構造を促進して保持する。述べたように、ポリペプチドの二次構造の強化はポリペプチドのタンパク分解的切断（例えば、キモトリプシン又は胃腸管内のその他のプロテアーゼによる）及び熱に対する耐性を増大し、そしてポリペプチドの疎水性も増大することができる。従って、炭化水素架橋された（そしてその結果、構造的に拘束及び強化された）本明細書に記載されているような本発明のポリペプチドは、対応する炭化水素で架橋されていない（構造的に拘束されていない）ポリペプチドと比較して、何れかの経路で投与したときの延長された半減期、増大したα螺旋性、改善された熱安定性及びプロテアーゼ耐性、増大した機能活性及び薬理学的特性、並びに改善されたバイオアベイラビリティーを含む、改善された生物学的活性を有している。
【００９０】
炭化水素で架橋されたポリペプチドは、２つの非天然アミノ酸の間に１つ又はそれ以上の鎖（結合）を含むことができ、この鎖(複数も)はポリペプチドの螺旋二次構造を有意に増強する。一般に、螺旋構造を促進するために、鎖を１つ又は２つの螺旋回転の長さ（すなわち、約３〜３．６又は約７アミノ酸）にわたり広がっている。従って、ｉ及びｉ＋３：ｉ及びｉ＋４；又はｉ及びｉ＋７に位置するアミノ酸は、化学修飾及び架橋のために理想的な候補である。従って、例えば、ペプチドが配列Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９．．．を有していて、アミノ酸Ｘがそれぞれの位置で独立して選択される場合は、Ｘ１とＸ４の間、又はＸ１とＸ５の間、又はＸ１とＸ８の間の架橋結合は、Ｘ２とＸ５の間、又はＸ２とＸ６の間、又はＸ２とＸ９の間等の架橋結合と同様に有用である。多数の架橋結合の使用（例えば、２、３、４又はそれ以上）も意図されている。多数の架橋結合の使用はペプチド、インスリン分泌促進性エクセナチド及びエクセナチド様ペプチドのようないくつかの非常に長いペプチドの場合と同様に、特に長さが伸びたペプチドでは、ペプチドの安定化及び最適化に効果的である。従って、本発明はポリペプチド配列内へ１つ以上の架橋を取り込むことを包含している。多数の架橋の使用は、ペプチド、特に長さが伸びているペプチドを安定化及び最適化するのに有効である。本発明はポリペプチド配列内に１つ又はそれ以上の架橋の取り込みも包含しており、ここでは架橋は「縫い合わせた」配置内で形成され、すなわち、２つの連続的に発生している架橋（架橋結合）が共通の起源残基から生じている（例えば、図５Ｂに描かれているように）。
【００９１】
本発明で用いられている用語「架橋スキャン」又は「架橋スキャンニング」は、ペプチド配列鋳型の長さ方向に沿った架橋位置のシーケンス評価に関与していることを示している。一実施態様では、架橋スキャンニングは架橋ペプチドライブラリーの合成によって達成でき、これによってｉとｉ＋３；ｉとｉ＋４；及びｉとｉ＋７単一又は複数縫合（縫い合わせ配置にある）の位置をペプチド配列の長さにそって順に置いて、全ての可能な位置にサンプリングして架橋又は縫合構築物について所望の又は最適な特性及び活性を確認する。
【００９２】
分子内鎖、例えば炭化水素架橋を形成する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００６／００１４６７５Ａ１号、同第２００６／０００８８４８Ａ１号、同第２００４／０１７１８０９Ａ１及び米国特許第７，７２３，４６９号、同第７，１９２，７１３号、及び同第７，０８４，２４４号公報に見出せ、これらはそれぞれ参照により本明細書に取り込まれている。分子内鎖は１つ又はそれ以上のエーテル、チオエーテル、エステル、アミン又はアミド部分を包含できる。ある場合では、天然のアミノ酸側鎖を鎖内に組み込むことができる。例えば、鎖を例えば、セリン中のヒドロキシル、システイン中のチオール、リジン中の１級アミン、アスパラ酸又はグルタミン酸中の酸或いはアスパラギン又はグルタミのアミドのような官能基と結合できる。従って、２つの非天然アミノ酸を結合して作られた鎖を用いるよりむしろ、天然のアミノ酸を用いて鎖を作成することが可能である。１つの非天然アミノ酸を天然のアミノ酸と共に用いることも可能である。
【００９３】
鎖の長さは変更可能であることが更に想定されている。例えば、二次α螺旋構造に対して比較的高度の拘束を与えることが望ましい場合は、より短い鎖を用いることができ、それに対してと同様に、特にある場合は、二次α螺旋構造に低い拘束を与えることが望ましいので、より長い鎖が望まれる。
【００９４】
また、主にα螺旋の単一面にある鎖を供給するようにアミノ酸ｉからｉ＋３、ｉからｉ＋４；及びｉからｉ＋７に渡る鎖の例を記載したが、多数のアミノ酸の組合わせの何れかに渡るように鎖を合成することができる。
【００９５】
場合によっては、αジ置換アミノ酸を、α螺旋二次構造の安定性を改善するためにポリペプチド中で用いる。しかし、αジ置換アミノ酸は必要ではなく、そしてモノα置換体（例えば、連結されたアミノ酸において）を使用する例も想定されている。
【００９６】
本明細書で用いられる用語「同一性」又は「同一性パーセント」は、２つの高分子、例えば、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチドの間のサブユニット配列類似性を示す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットでしめられている場合、例えば、２つのペプチドのそれぞれ内のある位置がセリンで占められているなら、これらはその位置で同一である。２つの配列間の同一性は、マッチングした或いは同一位置の数の一次関数である。例えば、２つのペプチド又は化合物配列の半分（例えば、長さが１０サブユニットポリマー中で５つの位置）が同一なら、２つの配列は５０％同一であり、位置の９０％、例えば、１０のうち９がマッチしているならば、２つの配列は９０％の配列同一性を共有している。２つの配列間の同一性はマッチング又は同一の位置の数の一次関数である。従って、参照配列の一部が特定のペプチド中で欠失している場合は、欠失部分は配列同一性を算出する目的ではカウントしない。同一性は配列分析ソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰ (www.ncbi.nih.gov/BLAST で入手できる)を用いて測定するることが多い。ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）によって２つの配列を比較するための初期設定パラメータ（例えば、互いに２つの配列を「Blast」-ing ）は、マッチ＝１、ミスマッチに対するペナルティー＝−２、オープンギャップ＝５、エクステンションギャップ＝２とする。タンパク質配列のためにＢＬＡＳＴＰを用いる場合は、初期設定パラメータを、マッチ＝０、ミスマッチに対するペナルティー＝０、オープンギャップ＝１１、及びエクステンションギャップ＝１とする。更に、同一性を確認するためのコンピュータプログラムは当該技術分野で公知である。
【００９７】
本明細書で用いられる、ポリペプチドを参照して用いるときの「単離された」又は「精製された」は、天然のポリペプチド又はタンパク質が正常な生理環境から取り除かれているか（例えば、血漿又は組織から単離されたタンパク質）又は非天然環境で合成された（例えば、インビトロの翻訳系で又は化学合成を用いて人工的に合成された）ことを意味する。従って、「単離された」又は「精製された」ポリペプチドは、無細胞溶液中に或いは異なった細胞環境に置くことができる（例えば、異種細胞型内で発現される）。用語「精製された」は、そのポリペプチドが存在する唯一のポリペプチドであることを意味しないが、自然にそれに付随している細胞又は有機物質を本質的に含まない（約９０〜９５％、９９〜１００％純粋である）ので、天然のポリペプチドと区別される。同様に、単離された核酸はその正常な生理環境から除去されている。細胞に関連して用いられる「単離された」は、
初代細胞又は細胞株の細胞が、細胞培養又は臓器培養の何れかで、培養中である（動物内には無い）といことを意味する。細胞は、正常動物、形質転換動物、自然発症遺伝子変化を有する動物、及び／又は遺伝性及び／又は誘導性の病気又は疾患を有する動物から単離できる。
【００９８】
本明細書で用いられる「キット」は、本発明の方法で用いる、少なくとも１つの基準外の実験用試薬を含んでいると理解される。例えば、キットは、少なくとも１つの改変用ペプチド、１つ又はそれ以上のペプチドの改変用アルデヒド分子、及び使用説明書ののうち少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つを、その全てを適切な包装中に含むことができる。キットは、乾燥粉末、濃縮溶液、又はすぐに使える溶液のような、本発明の方法を実施するのに必要なその他の成分の何れかを更に含むことができる。ある実施態様では、キットは本発明の方法で用いる試薬を含有する１つ又はそれ以上の容器を含んでいて；このような容器は箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、又は当該技術分野で公知の適切な容器形態であってよい。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイル、又は試薬を保持するのに適切なその他の物質から作ることができる。
【００９９】
「非必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から、その機能的活性及び／又は二次構造（α螺旋構造）を無効にしないか或いは実質的に変更しないで、変えることができる残基である。
【０１００】
「得ること」は製造すること、入手すること、又はその他の方法で手に入れることと本明細書では理解される。
【０１０１】
本明細書で用いられる「操作可能に結合した」は、操作可能に結合した部分の活性を実施例に提供されている方法の少なくとも１つを用いてアッセイすることができ、そして検出可能な活性を有することができるように、操作可能に結合した２つ又はそれ以上の成分がそれらの最初の活性を保持しているか、又は結合によって活性を得ているという形式で、結合している、好ましくは共有結合により、例えば、１つのペプチドのアミノ末端と別のペプチドのカルボキシ末端が結合していると理解される。
【０１０２】
語句、「薬学的に許容される担体」は当該技術分野で認識されていて、本発明の化合物を哺乳動物に投与するのに適している、薬学的に許容される物質、組成物又は賦形剤を包含する。担体は、１つの臓器又は身体の部分から別の臓器又は身体の部分へ対象薬剤を輸送又は移送することに関わる、液体又は固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又は封入材料を包含する。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合して患者に有害ではないという意味で、「許容可能」でなくてはならない。例えば、細胞の投与のための薬学的に許容される担体は、典型的に、注射による送達に許容可能な担体であって、送達する細胞を損傷させ得る洗浄剤又はその他の化合物などの薬剤を包含していない。薬学的に許容される担体として働く物質のいくつかの例は：乳糖、ブドウ糖及び蔗糖のような糖類；トウモロコシ澱粉及びジャガイモ澱粉のような澱粉類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースのようなセルロース及びその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター及び坐薬ワックスのような賦形剤；落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油のような油類；プロピレングリコールのようなグリコール類；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールのようなポリオール類；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルのようなエステル類；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；発熱因子を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；及び医薬製剤中で用いられるその他の非毒性の適合可能物質を包含する。
【０１０３】
湿潤剤、乳化剤並びにラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような、滑沢剤、更に着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味、着香及び芳香剤、保存料並びに抗酸化剤も組成物中に存在させることができる。
【０１０４】
薬学的に許容される抗酸化剤の例は：アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような、水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロール等のような、油溶性抗酸化剤；並びにクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート化剤を包含する。
【０１０５】
本発明の製剤は、経口、経鼻、局所、経皮、皮下、口腔、舌下、吸入、筋肉内、腹腔内、直腸内、膣内及び／又は非経口投与に適しているものを包含する。製剤は便宜上単回剤形で存在してもよく、医薬品の技術分野で周知の何れかの方法で製造できる。担体物質と組合わせて単回剤形を生産できる活性成分の量は一般に、治療効果をもたらす化合物の量であろう。
【０１０６】
本明細書で用いられる「複数」は１つ以上を意味すると理解される。例えば、複数は少なくとも２、３、４、５、又はそれ以上を示す。
【０１０７】
本明細書で用いられる用語「ペプチド」、「ペプチド化合物」及び「ペプチド構造」は、天然のＬ−アミノ酸からなるペプチド、更に天然のＬ−アミノ酸構造のペプチド誘導体、ペプチド類縁体及びペプチド模倣体を包含するように意図されている。本明細書で用いられる用語「ペプチド類縁体」、「ペプチド誘導体」及び「ペプチド模倣体」は、ペプチドの化学構造を模倣していてペプチドの機能特性（例えば、ＧＬＰ−１受容体に結合する能力）を保持している分子を包含するように意図されている。ペプチド類縁体、誘導体及び模倣体を設計する方法は当該技術分野で公知である。例えば、Farmer, P. S. in Drug Design (E. J. Ariens, ed.) Academic Press, New York, 1980, vol. 10, pp. 119-143; Ball. J. B. and Alewood, P. F. (1990) J. Mol. Recognition 3:55; Morgan, B. A. and Gainor, J. A. (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243;及びFreidinger, R. M. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10:270を参照されたい。
【０１０８】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」は、２つ又はそれ以上の独立して選ばれた共有結合（例えば、ペプチド結合）で結合した天然又は非天然のアミノ酸と理解される。ポリペプチドは、ペプチド結合で連結している２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又はそれ以上の天然又は非天然アミノ酸を含有できる。本明細書に記載されているポリペプチドは全長タンパク質（例えば、十分に処理されたタンパク質）を、更により短いアミノ酸配列（例えば、天然タンパク質の断片又は合成ポリペプチド断片）を包含する。本発明のポリペプチドの例は、本明細書に記載されている疎水性の架橋されたインスリン分泌促進ポリペプチド、及びその何れかの断片、類縁体、又は模倣体を包含する。
【０１０９】
本明細書で用いられる「予防」は、発病の速度又は程度を制限し、減少し、或いは病気又は疾患の少なくとも１つの兆候又は症状の進展を阻害すると理解される。予防は薬剤又は治療法の少なくとも１つの用量の投与を必要とする。
【０１１０】
本明細書で用いられる「サンプル」は、その環境（例えば、動物由来の血液又は組織、細胞、或いは組織培養由来の調製済み培地）から単離された生体材料で、ウィルス、抗体、又はレポータ構築物由来の産物のような被分析物を含有していることが疑われているか又は含有していることが知られているか、或いは、本発明のように、送達された架橋ペプチドの濃度又はインスリン及び／又はグルコースのような機能的に読み取れる被分析物の濃度が測定可能である。サンプルは、組織又は体液の部分的に精製された分画であってもよい。参照サンプルは、病気又は疾患体液を有していない提供者由来の、又は病気又は疾患を有している対象の正常組織（例えば、非感染組織対感染組織）由来の「正常」サンプルであってよい。参照サンプルは非処置提供者、又は活性薬剤で処置されていない（非処置又は賦形剤のみ投与）細胞培養由来でもよい。参照サンプルは細胞又は対象を試験薬剤と接触させる前の「０時点」に採取することもできる。
【０１１１】
２つ又はそれ以上のポリペプチド配列に関連している「類似性」又は「類似性パーセント」は、同一であるか又はアミノ酸残基の特定パーセント又はそれらの同類置換を有している、２つ又はそれ以上の配列又はサブ配列を示し、これは以下の配列比較アルゴリズムを用いて又は目視検査で測定して、最大一致について比較及び整列したときに同一である。
【０１１２】
ポリペプチドに関して本明細書で用いられている用語「安定な」又は「安定化した」は、螺旋構造を促進及び／又は保持し、そして／又はプロテアーゼ耐性を改善し、そして／又は酸安定性を改善し、そして又は熱安定性を改善し、そして又は薬理学的特性を改善するために炭化水素架橋されているポリペプチドを示す。安定化されたポリペプチドは一種の構造的に拘束されているポリペプチドである。ポリペプチドは本明細書に記載されている方法に従って、同一又は異なった炭化水素架橋で一重に、二重に、三重に、又は多重に架橋できる。
【０１１３】
本明細書で用いられている「構造的に拘束されているポリペプチド」（又は「構造的に強化されている」）等は、構造的に拘束されているペプチドが非改変ペプチドより限られた数の構造を導入するように、幾らかの（すなわち、少なくとも１つの）化学修飾、例えば、元の又は天然の配列の天然又は非天然アミノ酸による突然変異；分子鎖を組み込む化学修飾；ジスルフィド架橋の形成を促進する化学修飾；等を有する改変ポリペプチドを包含すると理解される。構造的に拘束されているポリペプチドは、天然の、野生型配列と比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又はそれ以上の突然変異を包含できる。例えば、分子鎖は安定な螺旋構造、特にα螺旋及び３１０構造の形成を促進する炭化水素架橋、又は鎖の末端の位置と鎖の長さに応じたねじれを包含できる。天然又は非天然アミノ酸を、ねじれ（例えば、２つの隣接している構造間の可変角によって確定されるような構造中の屈曲）又はその他の好ましい配座を促進するために使用できる。例えば、天然アミノ酸、プロリンはアミノ酸Ｒ基の構造及び水素結合供与体の欠如によって、ペプチドにねじれを誘導できる。非天然アミノ酸、特に大きくてそして／又は荷電したＲ基、或いはＮ−メチル化アミド、Ｎ−置換グリシン、環状α，αジ置換、環状Ｎ，Ｎ−ジ置換を有するもの、及びβアミノ酸は特定の、望ましい配座を促進できる。溶液中の「構造的に拘束されている」ペプチドの集団は全て常に望ましい配座を有しているとは限らないということが理解される。かわりに、溶液中の構造的に拘束されているペプチドの集団において、化学修飾以前の溶液中の天然又は元のペプチド配列より、その時点で望ましい配座が、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上存在している。溶液中のペプチドの集団の配座は、これに限定されないが、円偏光２色性及びＮＭＲ分光法を包含する、当業者に公知の多種の方法によって確認できる。結晶形態にすると、拘束されているペプチドの構造を確認するためにＸ線結晶学を適用できる。
【０１１４】
本明細書で用いられる「小分子」は、化合物、典型的に、約１５００Ｄａ、１０００Ｄａ、７５０Ｄａ、又は５００Ｄａより大きくない分子量を有している有機化合物であると理解される。一実施態様では、小分子は天然のアミノ酸及び／又はヌクレオチドのみを含有しているポリペプチド又は核酸を包含しない。
【０１１５】
非特異的化合物、又は非特異的化合物のプールと比較して、少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも５００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、好ましくは少なくとも５０００倍、好ましくは少なくとも１０，０００倍優先的に標的分子を結合させる場合に、薬剤、抗体、ポリペプチド、核酸又はその他の化合物は、標的分子、例えば、抗原、ポリペプチド、核酸又はその他の化合物と「特異的に結合する」。特異的に結合するとは、物理学的に関連する構造を有する２つ又はそれ以上の関連化合物のうちの１つと結合することに関して用いることができる。絶対的又は相対的な、結合優先性及び親和性は、例えば、それぞれの対について個別に親和性を確認して、或いは競合アッセイ又は当業者に公知のその他の方法によって、確認できる。
【０１１６】
本明細書で用いられる「対象」は生きている有機体を示す。ある特定の実施態様では、生きている有機体は動物である。ある特定の好ましい実施態様では、対象は哺乳動物である。ある特定の実施態様では、対象は家畜である。対象の例は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ、及びヒツジを包含する。ヒト対象を異常なグルコースホメオスタシス疾患、例えば、２型糖尿病を有しているか、又は２型糖尿病を発症する恐れがある患者をも示す。
【０１１７】
特定の病気、疾患、又は症候群「に罹っているか又は罹る恐れがある」対象は、対象が病気、疾患、又は症候群に罹っていると知識のある人間が診断又は疑いを持つような、十分な数の危険因子を有しているか、或いは病気、疾患、又は症候群の兆候又は症状の十分な数又はこれらの組み合わせを有している。２型糖尿病のような疾患に罹っているか又は罹る恐れのある対象を識別する方法は当該技術分野に属するものの能力の範囲内である。特定の病気、疾患、又は症候群に罹っている対象と罹る恐れがある対象は必ずしも２つの異なった群ではない。
【０１１８】
医薬品は好都合に単位剤形で投与でき、医薬分野における周知の方法の何れか、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1985)に記載されているような方法で製造できる。非経口投与用の製剤は、滅菌水又は食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール類、植物由来の油類、水素化ナフタレン類等のような一般的な賦形剤を含有することができる。特に、生体適合性があり、生物分解性があるラクチド重合体、ラクチド／グリコリド共重合体、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体はある特定の薬剤の制御放出に有用な賦形剤であろう。ある特定の実施態様では、経口的に送達できる製剤を、医薬製剤に関するその他の論文のなかでも、とりわけRemington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1985)に記載されているものを包含する、公知の方法に基づいて製造することができる。
【０１１９】
当然のことながら、所定の治療法で用いられる活性化合物の実際の好ましい量は、例えば、用いられる特定の化合物、製剤化された特定の組成物、投与方法及び対象の特徴、例えば対象の人種、性別、体重、全体的な健康及び年齢によって変化するだろう。投与の所定プロトコールに対する最適な投与速度は、前記ガイドラインに関して実施される従来の用量確認試験を用いて当業者が容易に確定できる。
【０１２０】
本明細書で用いられている、特定の病気又は疾患などに「罹りやすい」又は「罹る傾向にある」又は「罹る素因がある」は、遺伝、環境、健康、及び／又はその他の危険因子に基づいて、一般集団より病気又は疾患を発症する可能性が高い個人を示す。疾患、例えば、２型糖尿病を発症する可能性の増大は、約１０％、２０％、５０％、１００％、１５０％、２００％、又はそれ以上の増加であろう。
【０１２１】
以下の化学物質を定義しなければならないと思われる。
【０１２２】
用語「アルケニル」は、１つ又はそれ以上の炭素−炭素二重結合を有している直鎖又は分岐鎖であってよい炭化水素鎖を示す。アルケニル部分は表示された数の炭素原子を含有している。例えば、Ｃ２−Ｃ１０は、その基がそこに２〜１０個（これを含む）の炭素原子を有していいてもよいことを表わす。用語「低級アルケニル」はＣ２−Ｃ８アルケニル鎖を示す。数の指定がない場合は、「アルケニル」はその中に２〜２０個（これを含む）の炭素原子を有している鎖（直鎖又は分岐鎖）である。
【０１２３】
用語「アルキニル」は、１つ又はそれ以上の炭素−炭素三重結合を有している直鎖又は分岐鎖であってよい炭化水素鎖を示す。アルキニル部分は表示された数の炭素原子を含有している。例えば、Ｃ２−Ｃ１０は、その基がそこに２〜１０個（これを含む）の炭素原子を有していいてもよいことを表わす。用語「低級アルキニル」はＣ２−Ｃ８アルケニル鎖を示す。数の指定がない場合は、「アキケニル」はその中に２〜２０個（これを含む）の炭素原子を有している鎖（直鎖又は分岐鎖）である。
【０１２４】
用語「アリール」は、それぞれの環の０、１、２、３、又は４個の原子が置換基で置換されていてもよい、６炭素の単環式又は１０炭素の二環式芳香環系を示す。アリール基の例は、フェニル、ナフチルなどを包含する。用語「アリールアルキル」又は用語「アラルアルキル」はアリールで置換したアルキルを示す。用語「アリールアルコキシ」はアリールで置換したアルコキシを示す。
【０１２５】
本明細書で用いられる用語「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素、好ましくは３〜８個の炭素、さらに好ましくは３〜６個の炭素を有している飽和又は部分飽和の環状炭化水素基を示し、ここでシクロアルキル基はさらに置換されていてもよい。好ましいシクロアルキル基は、これに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル及びシクロオクチルを包含する。
【０１２６】
用語「ハロ」はフッ素、塩素、臭素又はヨウ素の何れかの基を示す。
【０１２７】
用語「アルキル」は、表示されている数の炭素原子を含有している、直鎖又は分岐鎖であってよい炭化水素鎖を示す。例えば、Ｃ１−Ｃ１０は、この基が１〜１０個（これを含む）の炭素原子をその中に有していてもよいことを表わす。数の指定がない場合は、「アルキル」は１〜１０個（これを含む、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個）の炭素原子をその中に有している鎖（直鎖又は分岐鎖）である。用語「アルキレン」は２価のアルキル（すなわち、--Ｒ--）を示す。                        、
【０１２８】
用語「ヘテロアリール」は、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、或いは三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有している、芳香族の５〜８員単環式、８〜１２員の二環式、又は１１〜１４員の三環式の環系を示し、当該ヘテロ原子はＯ、Ｎ、又はＳから選択され（例えば、単環、二環、三環の場合は、それぞれ、炭素原子と１〜３、１〜６、又は１〜９個のＮ、Ｏ、又はＳのヘテロ原子）、ここで各環の０、１、２、３、又は４個の原子は置換基で置換されていてよい。ヘテロアリール基の例は、ピリジル、フリル又はフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニル又はチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリルなどを包含する。用語「ヘテロアリールアルキル」又は用語「ヘテロアラルキル」は、ヘテロアリールで置換されているアルキルを示す。用語「ヘテロアリールアルコキシ」は、ヘテロアリールで置換されているアルコキシを示す。
【０１２９】
用語「ヘテロシクリル」は、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、或いは三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有している、非芳香族の５〜８員単環式、８〜１２員の二環式、又は１１〜１４員の三環式の環系を示し、当該ヘテロ原子はＯ、Ｎ、又はＳから選択され（例えば、単環、二環、三環の場合は、それぞれ、炭素原子と１〜３、１〜６、又は１〜９個のＮ、Ｏ、又はＳのヘテロ原子）、ここで各環の０、１、２、又は３個の原子は置換基で置換されていてよい。ヘテロシクリル基の例は、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニルなどを包含する。
【０１３０】
用語「置換基」は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール基上の、その基の何れかの原子において「置換されている」基を示す。適切な置換基は、これに限定されないが、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルコキシカルボニル、アミド、カルボキシ、アルカンスルホニル、アルキルカルボニル、及びシアノ基を包含する。
【０１３１】
本発明で提供する範囲は、その範囲内の全ての値に対する省略型であると理解される。配列番号の範囲が提供されている場合、これは個々の配列全てを包含している。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０よりなる群からの何れかの数、数の組合わせ、又は下位範囲を含むと理解される。
【０１３２】
明確な記述がない限り或いは文脈から明らかでない限り、本明細書で用いられる用語「又は」は包括的であると理解される。
【０１３３】
明確な記述がない限り或いは文脈から明らかでない限り、本明細書で用いられる用語「約」は、当該技術分野における通常の許容誤差の範囲内、例えば、平均値の２標準偏差
以内であると理解される。約は、定められた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内であると理解される。文脈から明確である場合を除いて、本明細書で提供された全ての数値は用語「約」で改変できる。
【０１３４】
本明細書の可変基の定義の何れかにおける化学基のリストの記述は、１つの基又は列挙された基の組合わせとしてのその可変基の定義を包含する。本明細書の可変基又は態様に関する実施態様の記述は、１つの実施態様の何れか、又は他の実施態様或いはそれらの部分との組合わせとしてのその実施態様を包含している。
記号、
【０１３５】
【化１】
2013532172.tif 000003
【０１３６】
は分子構造の部分として用いられる場合、一重結合又はシス或いはトランス二重結合を示す。
本明細書で提供された組成物又は方法は何れも本明細書で提供された１つ又はそれ以上の他の組成物又は方法の何れかと組合わせることができる。
【０１３７】
（インスリン分泌促進ポリペプチド）
本発明の別の態様は本発明のインスリン分泌促進ポリペプチドを提供し、これは本明細書で概説された方法に従って、本発明ポリペプチドのアミノ酸配列に沿った何れかの位置（複数も）を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の炭化水素架橋で改変できる。本発明は、エクセンジン−４、エクセナチド、胃抑制ポリペプチド前タンパク質（ＧＩＰＰ）、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、グルカゴン様ペプチド−１前駆体（ＧＬＰ−１Ｐ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、ＧＬＰ−１の断片、リラグルチド、タスポグルチド、アルビグルチド及びＬＹ２１８９２６５（これらの全ては炭化水素架橋による構造強化のために本発明の各種実施態様において鋳型として用いることができる例示的なインスリン分泌促進ポリペプチドである（図１を参照されたい）を包含する、天然又は合成起源の、及びインスリン分泌促進特性を有していることが知られているか又は未だ確認されていないポリペプチドを含んでいるかもしれない、特定のインスリン分泌促進ポリペプチドの何れかに限定されない。インスリン分泌促進ポリペプチドは上記のこれらのポリペプチドの何れかの同族体、類縁体、誘導体、機能的な断片又は模倣体も包含できる。
【０１３８】
本発明のインスリン分泌促進ポリペプチド、例えば、エクセナチドの何れかのα螺旋は、本明細書に記載されている炭化水素架橋のための方法を用いるか、又は米国特許出願公開第２００６／００１４６７５Ａ１号、同第２００６／０００８８４８Ａ１号、同第２００４／０１７１８０９Ａ１号及び米国特許第７，７２３，４６９号、同第７，１９２，７１３号、及び同第７，０８４，２４４号公報（これらはそれぞれ参照により本明細書に取り込まれている）に記載の方法教示に従って、少なくとも１つの炭化水素架橋で安定化できる。別の実施態様では、少なくとも２つ、３つ、又は４つも或いは１２まで又はそれ以上も含む、１つ以上の炭化水素架橋を本発明のエクセナチドを安定化するために用いることができる。改変されたポリペプチドの何れかで用いるのに適している炭化水素架橋は、本明細書に、又は米国特許出願公開第２００５／０２５０６８０号公報に或いは米国特許第７，７２３，４６９号公報（「安定化したα螺旋ペプチド及びその使用」）（これらそれぞれはその全てが参照により取り込まれている）に記載されている。炭化水素架橋化は、螺旋二次構造を有する傾向があるポリペプチドが、その生来の螺旋配座を保持してその安定性及び有効性を増大することを可能にする。一実施態様では、円偏光二色性で確認すると、水溶液中の改変ポリペプチドは少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％又はそれ以上の螺旋性を有している。円偏光二色性を確認するアッセイは当該技術分野で公知であって本明細書に記載されている。
【０１３９】
特定の実施態様では、本発明のインスリン分泌促進ポリペプチド、例えば、エクセナチドは、Ｎ−末端の近くに１つの炭化水素架橋を包含できる。別の特定の実施態様では、本発明のインスリン分泌促進ポリペプチド、例えば、エクセナチドは、Ｃ−末端の近くに１つの炭化水素架橋を包含できる。その他の特定の実施態様では、本発明のエクセナチドは配列の中間でＮ−及びＣ−末端の間の何れかの位置に炭化水素架橋を包含できる。更に別の実施態様では、本発明のエクセナチドは１つの炭化水素架橋をＣ−末端の近くに、そして別の炭化水素架橋をＮ−末端の近くに包含できる。更に別の実施態様では、本発明のエクセナチドは１つの炭化水素架橋をＣ−末端の近くにそして別の炭化水素架橋を配列の中間に、或いは１つの炭化水素架橋をＮ−末端の近くにそして別の炭化水素架橋を配列の中間に包含できる。
【０１４０】
更に別の実施態様では、本発明のインスリン分泌促進ポリペプチドは、Ｎ−末端又はＣ−末端の何れかから連続的に、或いは短縮された変異体内に炭化水素架橋を挿入しているＮ−及びＣ−末端から代替え方法で切断できる。
【０１４１】
本発明の架橋されたポリペプチドの例は図７に示されている。
【０１４２】
炭化水素架橋されたポリペプチドは２つのアミノ酸の間に鎖を包含していて、この鎖はポリペプチドの螺旋二次構造を有意に強化する。一般に、この鎖は１つ又は２つの螺旋回転にわたり広がる（すなわち、約３，４又は約７アミノ酸）。従って、ｉとｉ＋３；ｉとｉ＋４；又はｉとｉ＋７に位置しているアミノ酸は化学改変及び架橋結合の理想的な候補である。それにより、本発明の改変されたポリペプチドのアミノ酸残基の何れかを上記に適合させて連結（例えば、架橋結合）できる。適切な鎖は本明細書及び米国特許公開第２００５／０２５０６８０号公報並びに米国特許第７，７２３，４６９号公報（両者は参照により本明細書に取り込まれている）に記載されている。炭化水素架橋のような鎖を別の間隔で位置づけて、螺旋変異体（例えば、異なった傾斜、角度又は回転当りのそれらの残基及び画分を伴い）又は螺旋以外の構造を進展できるということが理解される。
【０１４３】
更なる実施態様では、第１アミノ酸（ｉ）と、第１アミノ酸の３アミノ酸下流にある、第２アミノ酸（ｉ＋３）を結合するように、炭化水素架橋を位置づける。別の実施態様では、第１アミノ酸（ｉ）と、第１アミノ酸の４アミノ酸下流にある、第２アミノ酸（ｉ＋４）を結合するように、炭化水素架橋を位置づける。更に別の実施態様では、第１アミノ酸（ｉ）と、第１アミノ酸の７アミノ酸下流にある、第２アミノ酸（ｉ＋７）を結合するように、炭化水素架橋を位置づける。
【０１４４】
（インスリン分泌促進ポリペプチドの突然変異、切断、及び延長）
本発明は同類又は非同類アミノ酸置換を有するインスリン分泌促進ペプチド（例えば、エクセナチド）を意図している。同類アミノ酸置換は、例えばグルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）に、アスパラギン酸（Ｄ）をアスパラギン（Ｎ）に、そしてグルタミン酸（Ｅ）をグルタミン（Ｑ）にアミノ酸置換するような、１つ又はそれ以上のアミノ酸を電荷、大きさ、及び／又は疎水性特性が類似しているアミノ酸と置き換えることからなる。非同類置換は、例えば、グルタミン酸（Ｅ）をバリン（Ｖ）に置換するような、１つ又はそれ以上のアミノ酸を非類似の電荷、大きさ、及び／又は疎水性特性を保持しているアミノ酸と置き換えることからなる。置換は同類又は非同類の非天然アミノ酸の使用を包含できる。
【０１４５】
アミノ酸挿入は単一のアミノ酸残基又は残基の伸張からなる。挿入は、全長又は切断したエクセナチドペプチドのカルボキシ又はアミノ末端で、さらにはペプチドの内部の位置で行うことができる。このような挿入は一般に長さが２〜１５アミノ酸の範囲である。目的のペプチドのカルボキシ又はアミノ末端の何れかで行われる挿入は、好ましくは約２〜約５０アミノ酸による、広い大きさの範囲のものでよいことが意図されている。１つ又はそれ以上のこのような挿入は、そのような挿入により相当する出発ポリペプチド（例えば、配列番号１で表される改変エクセナチド）の活性を少なくとも約５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％、又は９０％、又は９５％、又は９９％、又はそれ以上未だ示すことのできる改変ペプチドがもたらされる限り、全長又は切断型インスリン分泌促進ポリペプチド（例えば、エクセナチド）に導入することができる。このような変更は、経口投与可能なままであり、そして／又は血液及び組織中での長期に渡る安定性を保持しているエクセナチド変異体ももたらす。
【０１４６】
全長又は切断型エクセナチドペプチドの欠失も本発明の範囲内である。このような欠失は、エクセナチドペプチド；又はエクセナチド変異体から、得られるペプチド配列が４、５、又は６アミノ酸であるという長さの下限つきで、１つ又はそれ以上のアミノ酸を除去することからなる。このような欠失は、ペプチド配列の単一の隣接する或いは１つ以上の別々の位置を含む。このような欠失が、相当する出発ポリペプチド（例えば、配列番号１の改変エクセナチド）の活性を、少なくとも約５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％、又は９０％、又は９５％、又は９９％又はより高く未だ示すことができて、好ましく経口投与可能であり、そして／又は血中及び組織中で長期に渡る安定性を保持しているペプチドをもたらす限り、１つ又はそれ以上のそのような欠失を全長又は切断型インスリン分泌促進ペプチド（例えば、エクセナチド）に導入できる。
【０１４７】
（インスリン分泌促進ポリペプチド（例えば、エクセナチド）の安定化）
本発明の改変したインスリン分泌促進ポリペプチド（例えば、エクセナチド）は構造的に拘束されている（例えば、安定化させた、架橋した）螺旋であり、そして／又は生理学的状況から取り出されたときに生物活性形状を失い得るよう、元来の配列と比べてペプチドの構造的柔軟性を制限する天然及び／又は非天然アミノ酸を取り込むために、元来の（すなわち、野生型の或いは天然の）配列と比べて１つ又はそれ以上のアミノ酸配列の改変を含んでいる。好ましくは、本発明のインスリン分泌促進ポリペプチドは、炭化水素架橋のような、少なくとも１つの分子鎖を含んでいる。炭化水素架橋は米国特許出願公開第２００５／０２５０６８０号公報又は米国特許第７，７２３，４６９号公報（これらはその全てが参照により本明細書に取り込まれている）に、更には Walensky et al. Science, 2004, 305: 1466-70; Walensky et al. Mol. Cell 2006, Oct 20;24(2):199-210; Bernal et al. J Am Chem Soc. 2007 Apr 25;129(16):5298; Danial et al Nat Med 2008,  2008 Feb;14(2):144-53. Epub 2008 Jan 27; Gavathiotis et al Nature 2008, Oct 23;455(7216):1047-9; Stewart et al. Nature Chem Bio 2010 Jun 20 (electronically)に、更には米国特許出願公開第２００６／００１４６７５Ａ１号、同第２００６／０００８８４８Ａ１号、同第２００４／０１７１８０９Ａ１号、並びに米国特許第７，１９２，７１３号、及び同第７，０８４，２４４号（これらはそれぞれ参照により本明細書に取り込まれている）に記載されており、これらは全てが参照により本明細書に取り込まれている。
【０１４８】
ペプチドα螺旋は、比較的大きい接触表面に渡って順序よく正確に配列されている特定のアミノ酸残基を提示することにより非常に重要なタンパク質相互作用に関与している（Chittenden, T., et al., Embo Journal, 1995. 14(22):p. 5589-5996; Kussie, P.H., et al., Science, 1996. 274(5289):p. 948-953; Ellenberger, T.E., et al., Cell, 1992. 71(7):p. 1223-1237）。α螺旋ドメイン及び他のタンパク質構造特性は、タンパク質の残余部分の骨格配列によって安定化されることが多く、これは螺旋構造、例えば、α螺旋構造の形成及び維持を促す。文脈から切り離すと、α螺旋ペプチドのモチーフは広げることができ、生物活性の欠損を誘導する。重大な挑戦は、その天然のα螺旋構造を促進及び／又は維持を含むα螺旋ペプチドを開発すること及びタンパク質分解、酸及び熱分解に耐えて、よってインビボにおいて無傷のままを保つことができるペプチドを製造することである。
【０１４９】
例えば、本発明の構造的に拘束されているペプチドはエクセナチドポリペプチドのα螺旋ドメインを包含できる。ある例では、構造的に拘束されているペプチドはＮ−末端の炭化水素架橋で拘束されている。ある例では、構造的に拘束されているペプチドはＣ−末端の炭化水素架橋で拘束されている。別の例では、構造的に拘束されているペプチドはペプチドの中央にある炭化水素架橋で拘束されている。更に別の例では、構造的に拘束されているペプチドは１つ以上の炭化水素架橋で拘束されていて、例えば、そこでは鎖の少なくとも１つ又は両方がペプチドの末端又はその近くにある（すなわち、ペプチドのＮ−又はＣ−末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５番目の残基から始まる）。特定の実施態様では、エクセナチドペプチドは、Ｎ−及びＣ−末端の両方に又はその近くに鎖を含んでいる（すなわち、ペプチドのＮ−又はＣ−末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５番目の残基から始まる）。炭化水素架橋（多重架橋）の配置は所定のインスリン分泌促進ポリペプチドの長さ方向に沿ってどの位置（又は位置の組合わせ）であってもよいので、炭化水素架橋化についての特定の位置は決して限定されているわけではない。このような位置は、本明細書の図面に記載及び示されている架橋走査方法を用いて過度な実験無しで、経験的に決定及び最適化できる。
【０１５０】
炭化水素架橋されたポリペプチドは、２つのアミノ酸の間に鎖（架橋）を含んでいて、この鎖はポリペプチドの螺旋二次構造を有意に強化する。一般に、鎖は１つ又は２つの螺旋回転にわたり広がっている（すなわち、約３〜３．６又は約７アミノ酸）。従って、ｉとｉ＋３；ｉとｉ＋４；又はｉとｉ＋７に位置するアミノ酸は化学修飾及び架橋のために理想的な候補である。従って、例えば、ペプチドが配列 ...Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９... を有している場合は、Ｘ１とＸ４の間、又はＸ１とＸ５の間、又はＸ１とＸ８の間の架橋は、Ｘ２とＸ５の間、又はＸ２とＸ６の間、又はＸ２とＸ９の間、などの架橋と同様に有用である。複数の架橋（例えば、２、３、４、又はそれ以上）も達成されていて、個々の架橋付加の利点を組合わせている。（例えば、改善された螺旋性及び活性；改善された螺旋性及び熱安定性；改善された螺旋性及び酸安定性；改善された螺旋性と薬理学的特性）。従って、本発明は、更に配列を安定化するためか、或いは構造的安定性、タンパク質分解耐性、熱安定性、酸安定性、薬理学的特性、及びより長いポリペプチドストレッチの生物学的活性増強を促進するために、ポリペプチド配列内に１つ以上の架橋を取り込むことを包含している。本発明は、連続して生じる架橋又は鎖の対を「縫い合わせ」配置中に形成できる、すなわち、ここでは、例えば、図５Ｂに例示したように、最初に生じる鎖の終端を第２の連続して発生する架橋の開始と同じ残基を起源とすることも意図している。
【０１５１】
本発明のある実施態様では、鎖、例えば、炭化水素架橋を螺旋以外の構造を安定化するために用いる。このような場合は、鎖の末端をｉ、ｉ＋３、ｉ＋４、及びｉ＋７以外の間隔で配置させることができる。例えば、ペプチドドメインのねじれ領域を安定化して螺旋のような平坦な連続面ではなく湾曲した表面を産生するために分子鎖を用いることができる。アミノ酸配列及び鎖の端部の配置が、鎖が架けられているアミノ酸の数を決定する。このような検討は当業者によく理解されるだろう。
【０１５２】
一実施態様では、本発明の改変ポリペプチドは式（Ｉ）を有している。
【０１５３】
【化２】
2013532172.tif 000004
【０１５４】
式中の、Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｈ、又はＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、或いはヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アルキニル；［Ｒ４−−Ｋ−−Ｒ４］ｎであり；これらはそれぞれ０〜６個のＲ５で置換されていて；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルであり；
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光性部分、又は放射性同位元素であり；
Ｋは、Ｏ、Ｓ，ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、又は
【０１５５】
【化３】
2013532172.tif 000005
【０１５６】
であり、
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、又は治療薬剤であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｘは、２〜１０の整数であり；
それぞれのｙは、独立して０〜１００の整数であり；
ｚは、１〜１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の整数であり；そして
それぞれのＸａａは、独立してアミノ酸である。
【０１５７】
改変ポリペプチドは、α螺旋を形成して、配列番号１〜４で表わされるアミノ酸配列と３０％又はそれ以上同一であるか、又はこれに由来する７連続アミノ酸を含有しているアミノ酸配列を包含でき、ここでＸは何れかのアミノ酸であって、更に炭化水素架橋によって結合しているアミノ酸残基を特定し、そしてＢはメチオニン又はノルロイシンである。
【０１５８】
鎖は、アルキル、アルケニル、又はアルキニル部分（例えば、Ｃ５、Ｃ８又はＣ１１アルキル或いはＣ５、Ｃ８又はＣ１１アルケニル、或いはＣ５、Ｃ８又はＣ１１アルキニル）を包含できる。連結アミノ酸はαジ置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ３又はメチル）されていてもよい。
【０１５９】
ある例では、ｘが２、３、又は６である。
【０１６０】
ある例では、それぞれのｙが独立して、３と１５の間の整数である。
【０１６１】
ある例では、それぞれのｙが独立して１と１５の間の整数である。
【０１６２】
ある例では、Ｒ１とＲ２がそれぞれ独立して、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１６３】
ある例では、Ｒ１とＲ２がそれぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。
【０１６４】
ある例では、少なくとも１つのＲ１とＲ２がメチルである。例えば、Ｒ１とＲ２の両方がメチルである。
【０１６５】
ある例では、Ｒ３がアルキル（例えば、Ｃ８アルキル）であり、そしてｘが３である。
【０１６６】
ある例では、Ｒ３がＣ１１アルキルであり、そしてｘが６である。
【０１６７】
ある例では、Ｒ３がアルケニル（例えば、Ｃ８アルケニル）であり、そしてｘが３である。
【０１６８】
ある例では、ｘが６であり、そしてＲ３がＣ１１アルケニルである。
【０１６９】
ある例では、Ｒ３が直鎖のアルキル、アルケニル、又はアルキニルである。
【０１７０】
ある例では、Ｒ３が --ＣＨ２--ＣＨ２--ＣＨ２--ＣＨ＝ＣＨ--ＣＨ２--ＣＨ２--ＣＨ２-- である。
【０１７１】
ある特定の実施態様では、α，αジ置換立体中心の両方がＲ配置又はＳ配置である（例えば、ｉ、ｉ＋４架橋）か、或いは一方の立体中心がＲで他方がＳである（例えば、ｉ、ｉ＋７架橋）。従って、ここで式（Ｉ）を
【０１７２】
【化４】
2013532172.tif 000006
【０１７３】
と描く。
例えば、Ｘが３であるときは、Ｃ’及びＣ”ジ置換立体中心は共にＲ配置であるか、或いはこれらは両方がＳ配置にある。ｘが６のときは、Ｃ’ジ置換立体中心はＲ配置にあり、そしてＣ”ジ置換立体中心はＳ配置にある。Ｒ３二重結合はＥ又はＺの立体化学配置であってよい。
【０１７４】
ある実施態様では、Ｒ３が［Ｒ４--Ｋ--Ｒ４］であり、そしてＲ４が直鎖のアルキル、アルケニル、又はアルキニルである。
【０１７５】
ある実施態様では、改変ポリペプチドは、インスリン分泌促進ポリペプチドの少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０個、又はそれ以上の連続アミノ酸を含んでいる。それぞれの［Ｘａａ］ｙは独立して、インスリン分泌促進ポリペプチド、例えば、図１の配列の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５個又はそれ以上の連続アミノ酸を含むことができる。
【０１７６】
改変ポリペプチドは、インスリン分泌促進ポリペプチド、例えば図１、の３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０連続アミノ酸を含有でき、ここで２、３又は６個のアミノ酸により分離されている２つのアミノ酸はＲ３を介して結合しているアミノ酸置換基によって置き換えられている。従って、少なくとも２つのアミノ酸は連結アミノ酸又は連結アミノ酸置換によって置き換えることができる。従って、ここで式（Ｉ）は
【０１７７】
【化５】
2013532172.tif 000007
【０１７８】
と描け、［Ｘａａ］ｙ’及び［Ｘａａ］ｙ”はそれぞれ同一又は異なった７回繰り返し又は７回繰り返し様ドメイン由来の連続ポリペプチド配列を包含できる。
【０１７９】
本発明は、インスリン分泌促進ポリペプチド（例えば、図１の配列）の１０（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又はそれ以上）連続アミノ酸を含有している架橋されたポリペプチドを特徴としており、ここでは２、３又は６個のアミノ酸で分離されている２つのアミノ酸のα炭素がＲ３を介して結合して、２つのα炭素のうちの１つがＲ１で置換され、他方がＲ２で置換されていて、それぞれがペプチド結合を介してさらなるアミノ酸と結合している。
【０１８０】
別の実施態様では、本発明の改変ポリペプチドは式（ＩＩ）を有している。
【０１８１】
【化６】
2013532172.tif 000008
【０１８２】
式中の、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、又はヘテロシクリルアルキルであり；
それぞれのｎは独立して、１〜１５の整数であり；
ｘは、２、３、又は６であり；
それぞれのｙは独立して、０〜１００の整数であり；
ｚは１〜１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の整数であり；
それぞれのＸａａは、独立してアミノ酸である。
【０１８３】
改変ポリペプチドは、α螺旋を形成して、そして配列番号２、１５〜３８（エクセナチド）及び３９〜６２（ＧＬＰ−１（７〜３７））で表わされるアミノ酸配列と３０％又はそれ以上同一であるか、又はこれに由来する７連続アミノ酸を含有していてα螺旋を形成するアミノ酸配列を有することができ、ここでＸは何れかのアミノ酸であって、更に炭化水素架橋によって結合しているアミノ酸残基を特定して、そしてＢはメチオニン又はノルロイシンである。改変ポリペプチドは、α螺旋を形成して、配列番号２、１５〜３８（エクセナチド）及び３９〜６２（ＧＬＰ−１（７〜３７））で表わされる配列を有するアミノ酸配列と少なくとも３０％又はそれ以上同一であるか、又はこれに由来する３連続、好ましくは７連続アミノ酸、或いはペプチドによって形成された螺旋の面からの少なくとも２個のアミノ酸を含有している、アミノ酸配列を包含でき、ここでＸは何れかのアミノ酸であって、更に炭化水素架橋によって結合しているアミノ酸残基を特定し、そしてＢはメチオニン又はノルロイシンである。
【０１８４】
さらに別の実施態様では、本発明の改変ポリペプチドは式（ＩＩＩ）を有している。
【０１８５】
【化７】
2013532172.tif 000009
【０１８６】
式中の、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、又はヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アルキニル、［Ｒ４--Ｋ--Ｒ４］又は天然アミノ酸側鎖であって、これらのそれぞれは０〜６個のＲ５で置換されていて；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルであり；
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光性部分、又は放射性同位元素であり；
Ｋは、Ｏ、Ｓ，ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、又は
【０１８７】
【化８】
2013532172.tif 000010
【０１８８】
であり；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、又は治療薬剤であり；
Ｒ７は、アルキル、アルケニル、アルキニル、［Ｒ４--Ｋ--Ｒ４］又は天然アミノ酸側鎖であって、これらのそれぞれは０〜６個のＲ５で置換されていて；
ｎは、１〜４の整数であり：
ｘは、２〜１０の整数であり；
それぞれのｙは独立して、０〜１００の整数であり；
ｚは、１〜１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の整数であり；そして
それぞれのＸａａは、独立してアミノ酸である。
【０１８９】
改変ポリペプチドは、α螺旋を形成して、配列番号２、１５〜３８（エクセナチド）及び３９〜６２（ＧＬＰ−１（７〜３７））で表わされる配列を有するアミノ酸配列と少なくとも３０％又はそれ以上同一であるか、又はこれに由来する７連続アミノ酸、或いはペプチドによって形成された螺旋の面からの少なくとも２個のアミノ酸を含有している、アミノ酸配列を包含でき、ここでＸは何れかのアミノ酸であって、更に炭化水素架橋によって結合しているアミノ酸残基を特定し、そしてＢはメチオニン又はノルロイシンである。
【０１９０】
炭化水素鎖を記載しているが、別の鎖も想定されている。例えば、鎖は、１つ又はそれ以上のエーテル、チオエーテル、エステル、アミン、又はアミド部分を包含できる。ある場合は、天然アミノ酸側鎖を鎖の中に取り込むことができる。例えば、鎖はセリン中のヒドロキシル、システイン中のチオール、リジン中のアミン、アスパラギン酸又はグルタミン酸中の酸、或いはアスパラギン又はグルタミン中のアミドのような官能基と結合できる。従って、２つの非天然アミノ酸を結合して作られる鎖を用いるよりむしろ、天然アミノ酸を用いて鎖を作ることも可能である。単一の非天然アミノ酸を天然のアミノ酸と共に用いることも可能である。
【０１９１】
鎖の長さは変更可能であるということが更に想定されている。例えば、二次構造に比較的高度な拘束をもたらすことが望ましい場合により短い鎖を用いることができ、一方、ある場合は二次構造に低い拘束を与えることが望ましく、そのためにより長い鎖が望まれるだろう。アミノ酸配列が螺旋を形成する傾向を持たない場合は、アミノ酸配列部位に又はその中への鎖の挿入は螺旋形成をもたらさないということも更に理解できる。
【０１９２】
更に、α螺旋の単一面に主として存在する鎖を提供するために、アミノ酸ｉ〜ｉ＋３、ｉ〜ｉ＋４及びｉ〜ｉ＋７を架橋する鎖の例を記載しているが、α螺旋以外の構造を促進及び／又は保持するためにアミノ酸の数の任意の組み合わせを架橋するように鎖を合成できる。
【０１９３】
当業者には当然のことながら、本明細書に記載されている化合物を合成する方法は当業者には明白であろう。さらに、様々な合成工程を代替え順序又は順番で実施して望ましい化合物を得ることができる。本明細書に記載されている化合物を合成するのに有用な合成化学変換及び保護基の手順（保護及び脱保護）は当該技術分野で公知であって、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); 及び L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、並びにその続版に記載されているようなものを包含する。特定のペプチド合成方法は本発明を限定するものではない。
【０１９４】
（本発明のポリペプチドの合成）
本発明のペプチドは、当業者に周知であって本明細書に記載されている、化学合成方法によって作成できる。例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77 を参照されたい。従って、例えば、Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A 又は 431 或いは the AAPPTEC multichannel synthesizer APEX 396 上で側鎖保護アミノ酸を用いる、ｔ−Ｂｏｃ又はＦ−ｍｏｃ化学の何れかで保護したα−ＮＨ２で固相合成の自動化メリフィールド技術を用いてペプチドを合成できる。
【０１９５】
本明細書に記載されているペプチドを作る１つの方法は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の利用である。Ｃ−末端アミノ酸をリンカー分子を用いて酸に不安定な結合によって架橋ポリスチレン樹脂に結合する。この樹脂は合成用の溶媒に不溶であるので、過剰な試薬及び副産物を比較的容易且つ迅速に洗浄できる。Ｎー末端を、酸に安定であるが、塩基によって除去できる、Ｆｍｏｃ基で保護する。側鎖官能基の何れもを塩基に安定で、酸に不安定な基で保護する。
【０１９６】
より長いペプチドも天然の化学ライゲーションを用いて、個々の合成ペプチドを対等接続することによって作成できる。あるいは、より長い合成ペプチドを周知の組み換えＤＮＡ技術によって合成できる。このような技術は、詳細なプロトコールを有する周知の標準マニュアルに提供されている。本発明のペプチドをコードするコード配列を構築するために、好ましくは遺伝子を発現する有機体に最適なコドンを用いて、アミノ酸配列を逆翻訳してアミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、典型的には、ペプチド及び、必要に応じて、いくつかの調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成して、コード配列を作成する。コード配列を適切なクローニングベクターに挿入して宿主細胞内にトランスフェクトする。更に、炭化水素架橋のための非天然アミノ酸を取り込めるように宿主細胞を操作する。次いで、選択した発現系及び細胞に相応しい適切な条件下でペプチドを発現する。Liu et al. Proc. Nat. Acad. Sci (USA), 94:10092-10097 (1997) を参照されたい。ペプチドを精製して、標準的な方法で特徴付ける。
【０１９７】
ペプチドは、ハイスループットな、コンビナトリアル方法、例えば、Advanced Chemtech/APPTTEC から入手できるような、ハイスループットポリケミカルコンビナトリアル合成器を用いて、作成できる。
【０１９８】
（本発明のインスリン分泌促進ポリペプチドの活性をアッセイする）
本発明の構造的に拘束されているインスリン分泌促進ポリペプチド（例えば、エクセナチド）の、インビトロ、インビボの何れか又は好ましくは両方における、インスリンの産生を増強する能力を評価する方法が本明細書に記載されている。特に、このようなアッセイは以下に及び実施例に記載されている。インスリンを増強するエクセナチドの活性を評価するためのさらなるアッセイは、当該技術分野の当業者に周知である。更に、経口送達されたときの改善されたバイオアベイラビリティー、及び、これに限定されないが、何れかの経路で投与されたときの延長された半減期、その増強されたα螺旋性、その改善された熱安定性及びプロテアーゼ耐性、並びにその増大された機能活性及び薬理学的特性、並びに改善されたバイオアベイラビリティを包含する、本発明のポリペプチドのその他の利点を含む、本発明のインスリン分泌促進ポリペプチド（例えば、エクセナチド）のその他の態様及び特性を評価する方法が本明細書に記載されている。これらの特性の多くは明細書に記載されていて明らかにされている；しかし、当業者は過度の実験をせずに本発明のインスリン分泌促進ポリペプチドにもたらされた改善された特性を公知の方法及びアッセイを用いて確認できるということに留意されたい。例えば、アッセイは、プロテアーゼ耐性のアッセイ、血漿安定性のアッセイ、薬物動態アッセイ、ＧＬＰ−１受容体結合アッセイ、ＧＬＰ−１受容体第２メッセンジャーシグナル伝達アッセイ、グルコース刺激インスリン放出細胞アッセイ、インスリン分泌促進ペプチド処置に応答する血清グルコース及びインスリン濃度のインビボ観察、及び血中のインスリン、グルカゴン又はその他の糖調節成分の量を測定する一般的なＥＬＩＳＡ又は抗体に基づく方法を包含し、これらの全ては本明細書の実施例の文脈において、更には当業者が保有している知識に基づいて理解されるだろう。このようなアッセイ及び測定の全ては過度な実験なしで実施できる。
【０１９９】
特定の例では、インスリン分泌促進活性は、サンプル中のインスリンを検出することによって測定できる。本発明は非改変インスリン分泌促進ポリペプチドのインスリン分泌促進活性を上回るか又はそれと等しい改変インスリン分泌促進ポリペプチドに関する。薬剤のインスリン分泌促進特性は、薬剤を動物細胞に供給するか、又は薬剤を動物に注射して、免疫反応性インスリン（ＩＲＩ）の、それぞれ培地中へ又は動物の循環系への放出を観察することによって確認できる。ＩＲＩの存在はインスリンを特異的に検出できるラジオイムノアッセイの使用によって検出できる。
【０２００】
ＩＲＩの存在を検出できるラジオイムノアッセイはどれも利用できるが、１つの特定方法は、Albano, J. D. M., et al., (Acta Endocrinol. 70:487-509 (1972))のアッセイ方法の改変を使用する。この改変では、ｐＨ７．４のリン酸／アルブミン緩衝液を用いる。５００μＬのリン酸緩衝液、５０μＬのサンプル潅流液又はラット標準インスリンの潅流液、１００μＬの抗インスリン抗血清（Wellcome Laboratories; １：４０，０００希釈）、及び１００μＬの［１２５Ｉ］インスリンを、１０×７５ｍｍの使い捨てガラス管中で総容量７５０μＬにして、連続条件で培養を調製する。４℃で２〜３日培養した後、遊離インスリンを、抗体結合インスリンから活性炭分離で分離する。アッセイの感度は通常１〜２μｌＵ／ｍｌである。組織培養中で細胞生育する細胞培養培地へのＩＲＩの放出を測定するために、プロインスリンへ放射活性標識を取り込むことが好ましい。ポリペプチドを標識できる放射活性標識は何れも使用できるが、プロインスリンの標識を得るために、３Ｈロイシンを使用することが好ましい。標識化はプロインスリン分子の検出可能な標識化プールを形成するために十分である期間の何れでも行うことができるが；しかし、放射活性標識の存在下で６０分間細胞を培養することが好ましい。化合物がインスリン分泌促進効果を有しているか否かを確認するためにインスリンを発現できるどの細胞株も使用できるが、ラットインスリノーマ細胞、特にＲＩＮ−３８ラットインスリノーマ細胞を使用することが好ましい。このような細胞は何れの適切な培地中でも生育できるが；しかし、０．１％のＢＳＡ及び２５ｍＭのグルコースを含有しているＤＭＥ培地を用いることが好ましい。
【０２０１】
本発明の炭化水素架橋されたポリペプチドのインスリン分泌促進特性は膵臓インスリンによっても確認できる。in situ 単離された潅流ラット膵臓調製液は Penhos, J. C., et al. (Diabetes 18:733-738 (1969)) の方法の改変である。このような方法によると、体重３５０〜６５０ｇの、絶食させたラット（好ましくは雄性チャールスリバー系シロネズミ）をアモバルビタール塩（Eli Lilly and Co., １６０ｎｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔する。腎臓、副腎、胃、及び下部結腸の血管を結紮する。十二指腸の約４ｃｍ並びに下行結腸及び直腸以外の全ての腸を切除する。従って、腸のほんの一部分を潅流して、インスリン分泌促進性免疫反応性を有する腸溶性物質による可能性のある妨害を最小化する。潅流液は、４％のデキストランＴ７０及びウシ血清アルブミン（画分Ｖ）を有する改変クレブスリンゲル重炭酸塩緩衝液であってよく、そして９５％のＯ２及び５％のＣＯ２で泡立てることができる。非拍動流、４チャンネルのローラーベアリングポンプ（Buchler polystatic, Buchler Instruments Division, Nuclear-Chicago Corp.）を使用でき、そして一方潅流源から他方への切り替えを三方活栓を切り替えて行える。潅流を実施し、改変し、そして分析する方法は、Weir, G. C., et al., (J. Clin. Investigat. 54:1403-1412 (1974))の方法に従うことができて、これは参照により本明細書に取り込まれている。
【０２０２】
（医薬組成物及び投与経路）
１つ又はそれ以上の本発明の構造的に拘束されているインスリン分泌促進ポリペプチドを、２型糖尿病及び関連疾患を予防及び／又は治療する医薬組成物中で用いることができる。医薬品の併用は糖尿病のような、複雑で危険な疾患の治療によく用いられる。本明細書で提供される治療及び予防方法は構造的に拘束されているインスリン分泌促進ポリペプチドの組み合わせを用いて実施でき、これは耐性の進展を抑えるように選択及び組合わせ可能で、或いは対象の疾患の状態及び特質に基づいて選択又は組合わせることができる。本発明の医薬組成物は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上の構造的に拘束されているポリペプチドを包含できる。構造的に拘束されているペプチドを他の薬剤、例えば、糖尿病を治療するための公知処置剤又は治療剤と併用もできる。
【０２０３】
本明細書で用いられるような、本発明の化合物は、その薬学的に許容される誘導体を包含すると定義される。「薬学的に許容される誘導体」は薬学的に許容される塩、エステル、エステルの塩又は本発明の化合物のその他の誘導体の何れかを意味し、これらは受容者に投与されると、本発明の化合物を（直接又は間接的に）提供可能である。特に好ましい誘導体は、このような化合物を哺乳動物に投与すると、本発明の化合物のバイオアベイラビリティーを増大する（例えば、経口投与された化合物が、より速やかに血中に吸収され、血清安定性を増大し或いは化合物のクリアランス速度を減少できるように）か、又は親化合物の生体区画（例えば、脳又はリンパ系）への送達を親種と比べて増大するようなものである。誘導体は、水溶性又は腸膜を通過する能動輸送を増大する基が本明細書記載されている式の構造に付加している誘導体を包含する。
【０２０４】
選択的な生物学的特性を増強するように適切な官能基を付加させることによって、本発明の化合物を改変できる。このような改変は当該技術分野で公知であって、所定の生体区画（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系、膵臓）内への生物学的浸透を増大する、経口利用可能性を増大する、注射投与を可能にするよう溶解性を増大する、代謝を変える、そして排泄速度を変えるようなものを包含する。本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機及び有機の酸及び塩基に由来するものを包含する。適切な酸塩の例は、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パルモ酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオンサン塩、サルチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩及びウンデカン酸塩を包含する。適切な塩基に由来する塩は、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）、アンモニウム及びＮ−（アルキル)４＋塩を包含する。本発明は本明細書に開示されている化合物の塩基性窒素含有基の何れかの四級化も想定している。水又は油に溶解又は分散可能な産物はこのような四級化で得ることができる。
【０２０５】
本発明の化合物は、例えば、静脈内に、動脈内に、真皮下に、腹腔内に、筋肉内に、又は皮下に注射して；又は経口で、舌下に、経鼻で、経粘膜で、膣内に、子宮頸部に、局所的に、眼科用製剤で、又は吸入で、約０．００１〜約１００ｍｇ／体重ｋｇ、又は特定の薬剤の必要に応じて、及びより好ましくは０．５〜１０ｍｇ／体重ｋｇ範囲の用量を投与できる。本明細書の方法は、望ましい或いは所定の効果を達成するための化合物又は化合物組成物の有効量を投与することを意図している。
【０２０６】
好ましい組成物では、本発明のインスリン分泌促進ポリペプチドが経口投与用に製剤化される。適切な薬学的に許容される賦形剤、担体、溶媒、安定化剤等を本発明のエクセナチドペプチドの経口製剤を得るために用いることができる。経口送達は、錠剤、ピル、懸濁液、速放性ストリップ等によることを包含する、適切な方法の何れかでよい。
【０２０７】
担体物質と混ぜて単回投与剤形を製造してもよい活性成分の量は、治療される宿主及び投与の特定の経路によって変化する。典型的な製剤は約１％〜約９５％（ｗ／ｗ）の活性成分を含有している。或いは、このような製剤は約２０％〜約８０％の活性化合物を含有している。
【０２０８】
上で挙げたものより低いか又は高い用量も必要であろう。特定の患者に対する特定の用量及び治療計画は、用いられる特定化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食習慣、投与時刻、排泄の速度、薬剤の併用、病気、疾患又は症状の重症度及び経過、病気、疾患又は症状に罹りやすい患者の傾向、及び治療医師の判断を含む多種の因子によって決まる。
【０２０９】
患者の疾患が改善されると、必要に応じて、本発明の化合物、組成物又は組み合わせの維持用量が投与されてもよい。続いて、投与の用量又は回数、又は両方を、症状に応じて、改善された疾患が維持されるレベルまで減少できる。しかし、患者は疾患症状の何らかの再発によって長期の間欠治療を必要とするかもしれない。
【０２１０】
本発明の医薬組成物は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩；及び、例えば、これに限定されないが、インスリン、スルホニル尿素類（トルブタミド（Orinase）、アセトヘキサミド（Dymelor）、トラザミド（Tolinase）、クロルプロパミド（Diabinese）、グリピジド（Glucotol）、グリブリド（Diabeta、Micronase、Glynase）、グリメピリド（Anaryl）、及びグリクラジド（Diamicron））、メグリチニド類（レパグリニド（Prandin）、ナテグリニド（Starlix））、ビグアニド類（メトホルミン、フェンホルミン、ブホルミン）、チアゾリジンジオン類、αグルコシダーゼ阻害剤、ＤＰＰ−４阻害剤、非架橋インクレチン模倣体、及びアミリン類縁体を包含する、糖尿病の予防及び／又は治療のための１つ又はそれ以上の治療薬剤を包含する追加の薬剤を含有している。
【０２１１】
用語「薬学的に許容される担体又はアジュバント」は、本発明の化合物と一緒に、患者に投与できる担体又はアジュバントを示し、そしてこれは化合物の治療量を送達するのに十分な用量で投与したときに、その薬理学的活性を失わせず、そして非毒性である。
【０２１２】
薬学的に許容される担体、アジュバント及び賦形剤は、本発明の医薬組成物中で用いることができ、これに限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１００コハク酸塩のような自己乳化型薬物送達システム（ＳＥＤＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）又はその他の類似重合体送達マトリックスのような医薬剤形中で用いられる界面活性剤、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムのような緩衝物質、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩のような塩又は電解質、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースからなる物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂を包含する。α−、β−、及びγ−シクロデキストリンのようなシクロデキストリンも本明細書に記載されている式の化合物の送達を増大するために有利に用いることができる。
【０２１３】
本発明の医薬製剤は、経腸的に、例えば経口投与で、非経口で、吸入スプレーで、局所的に、経直腸で、経鼻で、舌下に、膣内に、又は移植した貯留槽を介して、好ましくは経口又は膣内投与、或いは注射による投与で、投与することができる。本発明の医薬組成物は、通常の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント又は賦形剤の何れも含有できる。ある場合は、製剤のｐＨを、薬学的に許容される酸、塩基、又は緩衝剤を用いて調節して製剤化した化合物又は送達形態の安定性を増大することができる。本明細書で用いられる用語、非経口は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、及び頭蓋内注射、又は輸液技術を包含する。
【０２１４】
剤形の例は、これに限定されないが：錠剤；カプレット；ソフトゼラチンカプセルのような、カプセル；カシェー；トローチ；薬用キャンディー；分散剤；坐剤；軟膏；パップ（湿布）；ペースト；粉剤；包帯剤；クリーム；プラスター；溶液；パッチ；エアゾール剤（例えば、経鼻スプレー又は吸入剤）；ゲル；懸濁液（例えば、水性又は非水性液体懸濁液、又は水中油型エマルジョン、又は油中水型液体エマルジョン）、溶液、及びエリキシル剤を包含する、患者への経口又は粘膜投与に適している液体剤形；患者への非経口投与に適している液体剤形；及び患者への非経口投与に適している液体剤形をもたらすように再構築できる滅菌固体（例えば、結晶又は非結晶固体）を包含する。
【０２１５】
医薬組成物は滅菌注射製剤、例えば、滅菌注射水性又は油性の懸濁液のような形態にできる。この懸濁液は適切な分散及び湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）のような）及び懸濁剤を用いて当該技術分野で公知の技術に従って製剤化できる。滅菌注射製剤も、非毒性で非経口投与に許容される希釈剤又は溶媒中の、例えば、１，３−ブタンジオール溶液のような、滅菌注射用溶液又は懸濁液であってよい。使用可能な許容される賦形剤又は溶媒には、マンニトール、水、リンゲル液及び等張食塩水がある。加えて、滅菌、固定油は溶媒又は懸濁媒体として従来通りに使用できる。この目的のために、合成モノ−又はジ−グリセリドを包含する無菌固定油の何れかを使用できる。オリーブ油又はヒマシ油のような、天然の薬学的に許容される油が、特にそれらのポリオキシエチル化型において有用であるように、オレイン酸のような脂肪酸及びそのグリセリド誘導体は注射剤の製造に有用である。これらの油溶液又は懸濁液は、乳化剤又は懸濁液のような薬学的に許容される剤形の製剤化に通常用いられている長鎖アルコール希釈剤又は分散剤、又はカルボキシメチルセルロース或いは同様の分散剤も含むことができる。その他の通常用いられているツイーン或いはスパンのような界面活性剤及び／又は薬学的に許容される個体、液体、或いはその他の剤形の製造に通常用いられているその他の同様の乳化剤或いはバイオアベイラビリティー増強剤も製剤化の目的で用いることができる。
【０２１６】
本発明の医薬組成物は、これに限定されないが、カプセル、錠剤、乳化剤及び水性懸濁剤、分散剤並びに溶液を包含する、経口投与が許容される何れかの剤形で経口投与できる。経口使用のための錠剤の場合は、通常用いられる担体は乳糖及びコーンスターチを包含する。ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤も一般に加えられる。カプセル形態で経口投与する場合の、有用な希釈剤は乳糖及び乾燥コーンスターチを包含する。水性懸濁液及び／又は乳化剤を経口投与する場合は、活性成分を油層に懸濁又は溶解でき、これを乳化及び／又は懸濁剤と混合する。所望により、ある特定の甘味剤及び／又は着香料及び／又は着色剤を添加してもよい。
【０２１７】
本発明の医薬組成物は、直腸内投与用の坐剤の形態でも投与できる。これらの組成物は、本発明の化合物を、室温では個体であるが直腸の温度では液体であるので直腸内で融解して活性化合物を放出する、適切な非刺激性賦形剤と混合することによって製造できる。このような物質は、これに限定されないが、ココアバター、蜜蝋及びポリエチレングリコールを包含する。
【０２１８】
本発明の医薬組成物は局所に又は膣内に投与できる。この医薬組成物は担体に懸濁又は溶解した活性成分を含んでいる適切な軟膏を用いて製剤化される。本発明の化合物を局所投与するための担体は、これに限定されないが、鉱物油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン  ポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋及び水を包含する。あるいは、医薬組成物は、担体に懸濁又は溶解した活性化合物を含有している適切なローション又はクリームを用いて製剤化できる。更に別の実施態様では、医薬組成物を膣リングとして製剤化される。適切な担体は、これに限定されないが、鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベ−ト６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水を包含する。本発明の医薬組成物は直腸坐薬製剤で、又は適切な注腸製剤で下部腸管に局所適用することもできる。局所経皮パッチ及びイオン導入投与も本発明に含まれる。一実施態様では、本発明の化合物は性行為感染症の予防的治療として膣内に投与される。
【０２１９】
本発明の医薬組成物は鼻エアゾール又は吸入によって投与できる。このような組成物は医薬製剤の技術分野で周知の技術によって製造でき、そしてベンジルアルコール又はその他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティーを増強する吸収促進剤、フッ化炭素類、及び／又は当該技術分野で公知の溶解又は懸濁化剤を用いて、生理食塩水溶液として製造できる。
【０２２０】
本発明の組成物が本明細書に記載されている式の化合物と追加の治療又は予防薬剤との組み合わせを含んでいる場合は、化合物と追加の薬剤の両方を、単独療法計画で通常投与される用量の約１〜１００％の間、好ましくは約５〜９５％間の用量レベルで存在させるべきである。追加薬剤は、複数回投与計画の一部として、本発明の化合物と別に投与できる。あるいは、これらの薬剤を本発明の化合物と共に単一の組成物に混合した、単一剤形の一部にしてもよい。
【０２２１】
本発明の本明細書で標的にしているペプチド又は抗体の投与すべき有効用量は、生物学的半減期、バイオアベイラビリティー、及び毒性のようなパラメータを扱う技術分野の当業者に周知の手順を経て確認できる。
【０２２２】
治療有効用量は、患者の症状の改善又は生存期間の延長をもたらすのに十分な化合物又は抗体の量を示す。
【０２２３】
（治療方法）
本発明は、例えば、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）及び非インスリン依存性糖尿病（２型糖尿病）を包含する、異常或いは基準を外れたグルコースホメオスタシスに関連する疾患に罹るる危険性がある（罹りやすい）或いは疾患を有する対象を治療する予防的及び治療的方法の両方を提供する。本明細書で用いられる用語「治療」は、疾患、疾患の症状又は疾患になりやすい傾向を、治療する、治す、軽減する、改める、修復する、改善する、改良する或いはこれに影響を及ぼす目的で、疾患、疾患の症状又は疾患になりやすい傾向を有する患者への治療薬剤の適用又は投与、或いは患者由来の単離された組織又は細胞株への治療薬剤の適用又は投与であると定義される。治療薬剤は、これに限定されないが、小分子、ペプチド、抗体、リボザイム及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。
【０２２４】
本発明のポリペプチドは、糖尿病、空腹時血糖異常、グルコース耐性異常、高血糖、及び肥満の治療に有用な他の医薬品と併用して用いることもできる。適切な薬剤は、インスリン分泌促進剤、インスリン増感剤、及びメトフォルミンＨＣｌを包含する。
【０２２５】
本発明は糖尿病及び関連する病気及び疾患を治療する方法を包含している。このような方法の１つは、本発明の１つ又はそれ以上の炭化水素架橋インスリン分泌促進ポリペプチドの治療有効量を、これを必要としている対象に投与する段階を含んでいる。
【０２２６】
本発明のポリペプチドは２型糖尿病を包含する、糖尿病のような疾患を治療するために本発明の方法で用いることができる。このような方法は糖尿病及び糖尿病合併症の発症を遅らせることもできる。本発明の方法で本発明のポリペプチドを用いて治療又は予防できる他の病気及び疾患は：若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）（Herman, et al., Diabetes 43:40 (1994)）、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）（Zimmet, et al., Diabetes Med. 11:299 (1994)）、耐糖能障害（ＩＧＴ）（Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp. 1) S5 (1999)）、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）（Charles, et al., Diabetes 40:796 (1991)）、妊娠糖尿病 (Metzger, Diabetes, 40:197 (1991)）、及びメタボリックシンドロームＸを包含する。
【０２２７】
本発明のポリペプチドは糖尿病の第二病因（Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp. 1), S5 (1999)）を治療するために本発明の方法で使用することもできる。このような第二病因は、グルココルチコイド過剰、成長ホルモン過剰、褐色細胞腫、及び薬物誘発性糖尿病を包含する。糖尿病を誘発する可能性がある薬物は、これに限定されないが、ピリミニール、ニコチン酸、グルココルチコイド類、フェニトイン、甲状腺ホルモン、βアドレナリン作動薬、αインターフェロン、及びＨＩＶ感染症の治療に用いられる薬剤を包含する。
【０２２８】
本発明のポリペプチドは、脂質異常症に関連しているもの、及び例えば、コレステロール胆石、癌（例えば、大腸、直腸、前立腺、乳腺、卵巣、子宮内膜、子宮頸部、胆嚢、及び胆管）、生理不順、不妊、多嚢胞性卵巣、変形性関節症、及び睡眠時無呼吸のようなその他の肥満及び過剰体重に関連している合併症を包含している拒食症及び肥満の治療に、更には、食欲及び食物摂取量の調節、脂質異常症、高トリグリセリド血症、心不全のようなアテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、低いＨＤＬレベル、高血圧、心血管系疾患（アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、及び高血圧を含む）、脳血管疾患及び末梢血管疾患のようなこれらに関連するその他の多数の医薬用途に有用である。本発明のポリペプチドは、例えば、インスリン感受性、炎症応答、血漿トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ、及びコレステロール濃度の等の調節に関連する生理学的障害を治療するためにも有用である。
【０２２９】
本発明の方法及びポリペプチドは、単独で或いは糖尿病及び関連疾患の治療における分野の当業者に公知の追加の治療及び／又は化合物と組合わせて用いることができる。あるいは、本明細書に記載されている方法及びポリペプチドを併用療法において、部分的に又は完全に、用いることができる。
【０２３０】
本発明のポリペプチドは糖尿病を治療するために、ＰＰＡＲ作動薬、スルホニル尿素剤、非スルホニル尿素分泌促進剤、αグルコシダーゼ阻害剤、インスリン増感剤、インスリン分泌促進剤、肝臓グルコース生産低下剤、インスリン及び抗肥満薬を包含する、他の公知治療薬と組合わせても投与できる。  このような治療薬は本発明の化合物の投与の前に、同時に、又はそれに続いて投与できる。インスリンは、インスリンの長期間作用型及び短時間作用型の形態及び製剤の両方を含んでいる。ＰＰＡＲ作動薬はＰＰＡＲサブユニット又はそれらの組み合わせの何れかの作動薬を含んでいてよい。例えば、ＰＰＡＲ作動薬は、ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γ、ＰＰＡＲ−δの作動薬、又はＰＰＡＲサブユニットの２つ又は３つの組み合わせの何れかを含むことができる。このようなＰＰＡＲ作動薬は、例えば、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンを包含する。スルホニル尿素剤は、例えば、グリブリド、グリメピリド、クロルプロパミド、及びグリピジドを包含する。本発明の化合物と共に投与すると糖尿病の治療に有用なαグルコシダーゼ阻害剤は、アカルボース、ミグリトール及びボグリボースを包含する。式（Ｉ）の化合物と共に投与すると糖尿病の治療に有用なインスリン増感剤は、チオゾリジンジオン及び非チオゾリジンジオンを包含する。本発明の化合物と共に投与すると糖尿病の治療に有用な肝臓グルコース生産低下剤は、GLUCOPHAGE（登録商標）及びGLUCOPHAGE XR（登録商標）のような、メトホルミンを包含する。本発明の化合物と共に投与すると糖尿病の治療に有用なインスリン分泌促進剤は、スルホニル尿素剤及び非スルホニル尿素剤：ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＰＡＣ／ＶＰＡＣ受容体作動薬、セクレチン、ナテグリニド、メグリチニド、レパグリニド、グリベンカルミド、グリメピリド、クロルプロパミド、グリピジドを包含する。ＧＬＰ−１は、例えば、脂肪酸誘導体化されたＧＬＰ−１及びエクセンジンのような、天然のＧＬＰ−１より長い半減期を有するＧＬＰ−１の誘導体を包含する。本発明の一実施態様では、本発明のポリペプチドは、膵臓β細胞のインスリン分泌促進剤に対する感受性を増大するためにインスリン分泌促進剤と併用して用いられる。
【０２３１】
本発明のポリペプチドは抗肥満薬と併用して本発明の方法で用いることもできる。抗肥満薬は、β−３作動薬；ＣＢ−１拮抗薬；例えば、シブトラミン（MERIDIA（登録商標））のような、食欲抑制剤；及び例えば、オルリスタット（XENICAL（登録商標））のような脂質阻害剤を包含する。
【０２３２】
本発明のポリペプチドは糖尿病患者の脂質異常症を治療するために通常用いられる薬剤と併用して本発明の方法で用いることもできる。このような薬剤は、これに限定されないが、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ニコチン酸、胆汁酸抑制薬、及びフィブリン酸誘導体を包含する。本発明のポリペプチドは、例えば、β‐遮断薬及びＡＣＥ阻害剤のような、抗高血圧薬と併用しても用いることもできる。
【０２３３】
このような併用治療法は、２つ又はそれ以上の薬剤の何れかの組合わせで投与できる（例えば、本発明の化合物をインスリン増感剤及び抗肥満薬と組合わせて）。このような併用治療法は、上記のような医薬組成物の形態で投与できる。
【０２３４】
（キット）
本発明は、包装済みでラベルが貼られている医薬製品又は実験用試薬も包含する。この製造品は密封されている、ガラス製の薬瓶又はその他の容器のような、適切な器又は容器内に適切な使用説明書を含んでいる。医薬品は、例えば、第１容器に単回投与剤形にある本発明の化合物を、そして第２容器内に、注射用滅菌水又はアジュバントを含有することができる。あるいは、単回投与剤形は、経口、経皮、鼻内、膣内、子宮頸部リング、又は局所送達に適している固体であってよい。
【０２３５】
特定の実施態様では、単回投与剤形は、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経口、膣内、子宮頸部に、局所又は皮下送達に適している。従って、本発明は、それぞれの送達経路に適している、好ましくは滅菌した溶液、固体、フォーム、ゲルを包含する。
【０２３６】
別の特定の実施態様では、単回投与剤形は経口投与に適している。従って、本発明は経口経路に適している、好ましくは滅菌した溶液、固体、フォーム、ゲルを包含する。
【０２３７】
何れの医薬品とも同様に、包装材料及び容器は保管及び輸送中に製品の安定性を保護するように設計されている。更に、本発明の製品は、使用説明書又は、医師、技師、又は患者に、問題になっている病気又は疾患を如何に適切に予防又は治療するかについてアドバイスするその他の情報資料を包含する。すなわち、製品は、これに限定されないが、実際の用量、観察方法（例えば、感染の検出及び定量）、及びその他の観察情報を包含する、投与計画を示すか示唆する説明書を包含している。
【０２３８】
具体的には、本発明は、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、吸入器、静脈内（ｉ．ｖ．）バッグ、薬袋などのような、包装材料；及び当該包装材料内に含まれている医薬品の少なくとも１つの単回投与剤形を包含し、ここで当該医薬品は本発明の化合物を含み、そして当該包装材料は、本明細書に記載されるように、特定用量を投与して特定の投与計画を用いることにより、疾患に関連する１つ又はそれ以上の症状を予防、管理、治療、及び／又は改善する、或いは免疫応答を刺激して疾患を予防するために当該化合物を用いることができることを示す指示手段を包含している。
【０２３９】
以下の実施例は本発明の多種の態様の説明としてのみ提供されていて、本発明を限定することを決して意図していない。
【実施例】
【０２４０】
実施例１．材料及び方法
（炭化水素架橋されたα螺旋ポリペプチドの合成）
構造分析と化学合成を組合わせた方法を改変した、構造的に拘束されたペプチドを構築するために適用した。  （Ｒ）−Ｆｍｏｃ−（２’−ペンテニル）アラニン（“Ｒ５”），（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−（２’−ペンテニル）アラニン（“Ｓ５”），（Ｒ）−Ｆｍｏｃ−（２’−オクテニル）アラニン（“Ｒ８”），（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−（２’−オクテニル）アラニン（“Ｒ８”）α，α−ジ置換アミノ酸の不斉合成を先に報告されたように実施した（Schafmeister, C.E., J. Po, and G.L. Verdine, Journal of the American Chemical Society, 2000. 122(24): p. 5891-5892;  Walensky, L.D., et al., Science, 2004. 305(5689): p. 1466-1470）。（Ｒ）又は（Ｓ）Ｆｍｏｃ−（２’−プロペニル）アラニン類縁体の合成を図６に図式化して以下に記載する新しい方法を用いて製造した。
【０２４１】
（Ｒ）プロリンとＫＯＨのイソプロパノール溶液を製造し、そこに塩化ベンジルを加えて室温で３時間撹拌した。酸性を徐々に上げて８９％の収率で沈殿物を単離した。この産物を氷冷した塩化メチレンに溶解し、そこに塩化チオニル及び２−アミノベンゾフェノンを加えて反応混合物を１０時間撹拌して室温まで暖めた。塩基性にして、（Ｒ）−２−［Ｎ−（Ｎ’−ベンジルプロリル）アミノ］ベンゾフェノン（ＢＰＢ）を収率８１％で得た。ＫＯＨのＭｅＯＨ溶液を、不活性ガス雰囲気中、４０℃で撹拌しているＭｅＯＨ中のＢＰＢ、Ｎｉ（ＮＯ３）２−６Ｈ２Ｏ、アラニンの混合物に注入した。得られた混合物を２時間撹拌し、塩基性にしてＡｌａ−Ｎｉ（ＩＩ）−ＢＰＢ−複合体を９１％の収率で得た（Tetrahedron:Asymmetry 9 (1998) 4249-4252）。
【０２４２】
Ａｌａ−Ｎｉ（ＩＩ）−ＢＰＢ−複合体をアセトン中、塩基性条件下で、３−ブロモ−１−プロペンと反応させて、（Ｒ）−ＢＰＢ−（Ｒ）−トランス−（２’−プロペニル）アラニンのシッフ塩基のＮｉ（ＩＩ）複合体［（Ｒ）−２］と（Ｓ）−ＢＰＢ−（Ｓ）−トランス−（２’−プロペニル）アラニンのシッフ塩基のＮｉ（ＩＩ）複合体［（Ｓ）−２］の混合物を６：１の比で得た。
【０２４３】
シリカゲルカラムで分離した後に、ジアステレオマー的に純粋な（Ｒ）−２複合体を収率４４％で得た。（Ｒ）−２複合体を３ＮのＨＣＬ／ＭｅＯＨで分解して、（Ｒ）−（２’−プロペニル）アラニンを、そしてＤＣＭで抽出してキラルリガンドも得た。作成後に、（Ｒ）−（２’−プロペニル）アラニンをＦｍｏｃ−ＯＳｕで保護して（Ｒ）−Ｆｍｏｃ−（２’−プロペニル）アラニンを収率９３％で得た（２工程）。（Tetrahedron 56 (2000) 2577-2582）
【０２４４】
少なくと２つの天然アミノ酸を２、３又は６アミノ酸の何れか離れた位置、すなわちそれぞれ「ｉ、ｉ＋３」、「ｉ、ｉ＋４」又は「ｉ、ｉ＋７」の位置でα，α−ジ置換された非天然アミノ酸と置き換えた。
【０２４５】
非天然アミノ酸及びそれに続く炭化水素架橋（複数も）の位置を、重要なＧＬＰ−１受容体の相互作用を妨げないように、或いはインスリン分泌促進活性にとって重要であることが知られている残基が置き換わらないように注意深く選択した（図２及び３）。
【０２４６】
改変ポリペプチド、ＳＡＨ−Ｅｘ及びＳＡＨ−ＧＬＰ１（図７）を、固相Ｆｍｏｃ化学及びルテニウム触媒化オレフィンメタセシスを用いて生成し、次いでペプチド脱保護及び開裂、逆相高速液体クロマトグラフィーで精製し、そしてＬＣ／ＭＳ質量分析及びアミノ酸分析を用いて化学的に特性化した。
【０２４７】
これに代えて、確立されている断片に基づく手法を遂行できる（[Bray, B.L.. Nature Reviews Drug Discovery, 2003. 2(7): p. 587-593;  MYUNG-CHOL KANG, B.B., et al., Methods and compositions for peptide synthesis, U.S.P.a.T. Office, Editor. January 18, 2000 USA）。この手法では、Ｎ−末端部、中央部、及びＣ−末端部を個別に合成するように、ペプチドを３つの断片に分割する。これらのペプチド断片は超酸開裂樹脂上で固相Ｆｍｏｃ化学及びルテニウム触媒化オレフィンメタセシスを用いて生成しなければならず、これはＮ−末端、及びＣ末端アミド（Ｃ−末端断片について）又は遊離カルボキシレート（中央及びＮ−末端断片について）の何れかがＦｍｏｃを有している完全に保護されているペプチドを生じる。これらの完全保護断片を逆相高速液体クロマトグラフィーで精製し、次いで連続脱保護、カップリング、及び精製すると全長の完全保護ポリペプチドが得られる。全体的な脱保護、次いで逆相高速液体クロマトグラフィーによって最終生成物が得られ、これをＬＣ／ＭＳ質量分析及びアミノ酸分析を用い特性化できるだろう。
【０２４８】
ペプチドを、Ａｐｅｘ３９６（Aapptec）自動ペプチドシンセサイザー上で、ＲｉｎｋアミドＡＭＬＬ樹脂（EMD Biosciences、０．２ミリモル／樹脂）を用い、５０ミリモルスケールで生産した。標準Ｆｍｏｃプロトコールは、２０％のピペリジン／ＮＭＰ中で１０分の脱保護を２回、次いで連続メタノール及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の対の洗浄を採用した。組み込んだ非天然アミノ酸を２０％のピペリジン／ＮＭＰ中での１０分間培養を４回行って完全脱保護を達成した。アミノ酸のカップリングは、Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸の０．４Ｍの原液、０．６７Ｍの２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＣＴＵ）、及び２ＭのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて実施して、１ｍＬの０．２Ｍ活性エステル（４当量）を得た。カップリング頻度及び培養時間は、標準残基に３０分で２回、オレフィン非天然アミノ酸に４５分で２回、非天然アミノ酸に続く残基に４５分で３回であった。オレフィンメタセシスは１，２−ジクロロエタンで樹脂を第１次膨張し、次いで１，２−ジクロロエタン（樹脂置換に基づいて０．２０モル％）中のビス（トリシクロヘキシン）−ベンジリデンルテニウム（ＩＶ）ジクロライド（Ｇｒｕｂｂの第１次生成触媒）１０ｍＭ溶液に２時間、暴露する。架橋反応を２回実施する。次いで、樹脂に結合したペプチドを１，２−ジクロロエタンで３回洗浄して、窒素気流下で乾燥する。完成したペプチドを樹脂から解離し、ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／水（９５％、２．５％、２．５％）のようなトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から作られる開裂カクテルに暴露して脱保護して、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルを用いて沈殿させ、次いで凍結乾燥する。凍結乾燥したＳＡＨＢをＣ１８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣで精製する。陽イオンモード中の電気スプレーによって得られた質量スペクトルを用いる、ＬＣ／ＭＳで化合物を特性化する。定量化は、Ｂｅｃｋｍａｎ６３００高速アミノ酸アナライザーによるアミノ酸分析で達成する。
【０２４９】
（改変ポリペプチドの二次構造及び熱安定性の確認）
架橋化改変ポリペプチドのα螺旋性をその非改変対応物と円偏光２色性によって比較した。ＣＤスペクトルを、以下の標準測定パラメータを用いてＡｒｉｖ分光偏光計上で２０℃で得た：波長、１９０〜２６０ｎｍ；ステップ分解、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；蓄積、１０；応答、１秒；バンド幅、１ｎｍ；路長、０．１ｃｍ。それぞれのペプチドのα螺旋含量は、平均残基楕円率［θ］２２２ｏｂｓをモデル螺旋ペプチドについて報告されている［θ］２２２ｏｂｓで割るか（Forood, B., E.J. Feliciano, and K.P. Nambiar, PNAS, 1993. 90(3): p. 838-842; J. Martin Scholtz, Biopolymers, 1991. 31(13): p. 1463-1470; Lawless, M.K., et al., Biochemistry, 1996. 35(42): p. 13697-13708）、或いは、例えば、異なった５つの二次構造比（螺旋、平行及び逆平行βシート、β回転及びランダムコイル）を推定するためにＢｒｏｈｍによって開発されたＣＤＮＮソフトウェアを用いるＡｒｉｖマシーンを用いて、算出する。Protein Engineering, 1992. 5(3); p. 191-195。熱安定性は、広範囲の温度に渡る円偏光２色性スペクトルを得て、それぞれの拘束されたペプチドの融点を測定して評価する。
【０２５０】
（ハイスループット法で合成された多様な改変ペプチドライブラリーを評価することによる改変ポリペプチドの生物物理学的及び生物化学的特性の最適化）
ハイスループット技術を用いて改変ポリペプチド活性を細胞及びインビボ研究について最適化した。例えば、Ａｐｅｘ３９６マルチチャネルシンセサイザー（AAPPTEC;Louisville,Kentucky）を用いて生物学的評価のためにポリペプチドライブラリーを作り出した。ポリペプチド化合物を、伸張、切断、又は天然アミノ酸及び選択非天然アミノ酸にわたるアミノ酸置換によって多様化し、そして異なった架橋位置を作成して所望の生物物理学的及び生物化学的特性を最大化した。ハイスループット固相Ｆｍｏｃ化学及びルテニウム触媒化オレフィンメタセシス並びにペプチド脱保護及び開裂を用いてライブラリーを作成した。ペプチド精製は逆相Ｃ１８ＨＰＬＣによって行い、生成物をＬＣ／ＭＳ質量分析及びアミノ酸分析によって特性化した。
【０２５１】
（プロテアーゼ耐性のアッセイ）
構造化ペプチドのインビトロでのタンパク質分解を以下のパラメータを用いるＬＣ／ＭＳ（Ａｇｌｉｅｎｔ １２００）で測定した：２０μＬの注入、０．６ｍＬの流速、１０分にわたる水（０．１％ギ酸）から２０〜８０％アセトニトリル（０．０７５％ギ酸）の勾配からなる１５分のランタイム、洗浄から勾配条件の開始に戻るのに４分、そして０．５分のポストタイム。ＤＡＤシグナルを８ｎｍのバンド幅をもたせて２８０ｎｍに設定して、ＭＳＤを、１つのチャンネルが（Ｍ＋２Ｈ）／２、＋１質量単位にあり、そして別のチャンネルが（Ｍ＋３Ｈ）／３、＋１質量単位にあるスキャンモードに設定した。それぞれのＭＳＤシグナルの積分が１０８より大きいカウントの曲線下面積を生じた。反応サンプルは、ＤＭＳＯ（１ｍＭの原液）中のペプチド（５μＬ）及び２ｍＭのＣａＣｌ２を含有しているｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液からなる１９５μＬの緩衝液で構成されていた。０時間時点にサンプルを注入したらすぐ、５０ｎｇ／μＬのキモトリプシン（Sigma）を２μＬ添加して、徐々に連続注入して無傷ペプチドの量を定量した。各ＭＳＤデータ時点を正規化するために、１００μＭの濃度でアセチル化トリプトファンカルボキサミドの内部コントロールを用いた。時間に対するＭＳＤ領域のプロットが指数減衰曲線を生じ、そしてＰｒｉｓｍソフトウェア（GraphPad）を用いる非線回帰分析によって半減期を確認した。アッセイはトリプシン及びペプシンをそれらの適切な緩衝条件中で用いても実施した。
【０２５２】
（血漿安定性及び薬物動態）
ペプチド（５〜１０μｇ）をマウス血漿と共に３７℃で培養し、雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウスに尾静脈内に注入又は経口強制投与した（１０、２０ｍｇ／ｋｇ）。各種時間間隔（例えば、０．５、１、２、４、８、１２時間；ｎ＝３時点当り）のエクスビボ及びインビボサンプル（後眼窩放血によって採取）をＬＣ／ＭＳ分析、又は入手可能なＥＬＩＳＡキット（例えば、Exendin-4 (Heloderma suspectum) EIA Kit Phoenix Pharmaceuticals, Inc. EK-070-94）による定量のために処理した。エクスビボ血清安定性の検討のために、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（GraphPad）を用いてプロットした指数減衰曲線の非線回帰分析によってペプチドの半減期を算出した。示された時点におけるインビボ血清濃度を、血清半減期、血清最高濃度、総血清クリアランス、及び非コンパートメント分析を用いる分配の見掛け容量を算出するために用いる。生成されたプロテアーゼ耐性及びＰＫプロファイルはインビボ適用のために最も安定に構造化されたペプチドを選択するための尺度としての機能を果たす。
【０２５３】
（ＧＬＰ−１受容体結合アッセイ）
高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のＮ−末端と融合している、ヒトＧＬＰ１受容体を安定に発現する組み換えＵ２ＯＳ細胞を製造会社の指示書に従って実施される、ＧＬＰ−１Ｒ Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Thermo Scientific）で用いた。ＧＬＰ−１Ｒアッセイは、ＧＬＰ１Ｒの内在化を最も有利に引き起こす架橋インスリン分泌促進ポリペプチド作動薬をスクリーニングするために用いられる。ＧＬＰ−１はこのアッセイで参照化合物として用いられ、そしてリガンドは、スポット検出画像分析アルゴリズムによって、ＧＬＰ−１内在化を誘発するそれらの能力についてアッセイされる。ＧＬＰ−１Ｒ−ＥＧＦＰの転移は蛍光顕微鏡上に画像化される。フィルターをＨｏｅｃｈｓｔ（３５０／４６１ｎｍ）及びＧＦＰ／ＦＩＴＣ（４８８／５０９ｎｍ）（最大励起及び放射の波長）用に設定する。転移は２０倍又はそれ以上の倍率で撮った画像上で分析する。ＧＬＰ−１Ｒ再分配アッセイにおける最初のアウトプットは細胞質におけるスポットの形成である。従って、データ分析は細胞質におけるスポットの数、領域又は強度に対応しているアウトプットを報告している。
【０２５４】
（ＧＬＰ−１受容体関与の第２メッセンジャーのシグナル伝達アッセイ）
ＧＬＰ−１作動薬は、多数の前臨床モデルにおいて実験的糖尿病を予防或いは改善して、β細胞量を保存するということが既に示されている。従って、賦形剤のみで又は架橋されたインスリン分泌促進ポリペプチドで処理した細胞におけるＥＲストレスへの応答に重要なマーカーの発現を検討できる。ＥＲストレスは、ＡＴＦ−４、ＸＢＰ−１、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＩＦ２ａ Ｓｅｒ５１（Ｐ［Ｓｅｒ５１］−ｅＩＦ２ａ）、及びＣＨＯＰのような多くのシグナル伝達タンパク質のリン酸化に関与する広げられたタンパク質応答によって引き起こされるシグナル伝達経路を活性化する（Druker, et. al., Cell Metabolism, 2006 v4 p391-406）。そのため、ラットＩＮＳ‐１又はマウスＭＩＮ６インスリノーマ細胞を架橋したインスリン分泌促進ポリペプチドの連続希釈の非存在下又は存在下で、賦形剤のみ、タプシガルジン、又はツニカマイシンで最大４時間処置した。あるいは、培養物を、架橋したインスリン分泌促進ポリペプチドの非存在下又は存在下でタプシガルジンで４時間処理する前、又はその間に、培養物を賦形剤のみ、又はＨ８９、Ｕ０１２６、又はＬｙ２９４００２の何れかに２０分間暴露する。総ての細胞抽出物をＡＴＦ−４、ＸＢＰ−１、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＩＦ２ａ Ｓｅｒ５１（Ｐ［Ｓｅｒ５１］−ｅＩＦ２ａ）、及びＣＨＯＰに関して時間に対するイムノブロッティングで分析した。
【０２５５】
（グルコース刺激インスリン放出の細胞アッセイ）
ＩＮＳ−１細胞を、５ｍＭのグルコース及び１０％のウシ胎仔血清を含んでいるダルベッコ変性イーグル培地中、希釈剤のみ又は各種濃度の架橋されたインスリン分泌促進ポリペプチドの存在下で、１晩培養する。３．３ｍＭグルコースの存在下で前培養した後、次いで３ｍＭ又は２０ｍＭの何れかの存在下で細胞を３７℃で４５分間培養する。次いで上澄液を除去し、３００ｇで１０分間遠心分離して、インスリンについてアッセイする。インスリン含量を算定するために、先に記載されているように、細胞を酸／エタノール混合物中で１晩抽出する。次いで、インスリンの量をＥＬＩＳＡで定量する（American Laboratory Products Company, Amin, et., al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2002, v303, p82-88）。
【０２５６】
（インスリン分泌促進ペプチド処置への応答における血清グルコース及びインスリン濃度のインビボ観察）
レプチン受容体を欠損しているｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ−Ｌｅｐｒｄｂ／Ｌｅｐｒｄｂ）及びその同腹子を４週齢で、Jackson Laboratories (Bar Harbor, Mass., USA） から入手する。これらをケージ当り２匹飼育して、不断給餌も行う。試験期間中は同じマウスを一緒にケージに入れた。我々の施設に２日間馴化させた後、後眼窩洞から採取した、全血グルコース濃度を、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ（Bayer, Elkhart, Ind., USA）を用いて確認する。その後（０７：００〜０９：００時）、インスリン分泌促進ポリペプチド（例えば、２４ナノモル／ｋｇのエクセンジン−４を毎日ｉ．ｐ．で）を６匹の糖尿病動物及び６匹の非糖尿病動物に投与して、１０匹の糖尿病動物及び１０匹の非糖尿病動物にＮａＣｌをｉ．ｐ．で与えた。このレジメンを８日間続ける。動物を毎日体重測定して、インスリン及びグルコース濃度の確認のために後眼窩洞から血液サンプルを採取する。レジメンの終わりに、空腹時血液サンプルを得て、これらの濃度及びＥＤＴＡを含有している全血をＨｂＡｌｃ（Greig, et. al., Diabetologia, 1999 v42, p45-50）についてアッセイした。同じ実験をインスリン分泌促進ポリペプチド（非改変コントロール及び架橋した誘導体）の経口強制投与を用いても実施する。
【０２５７】
実施例２．一重及び二重架橋したエクセナチドペプチドは非改変鋳型ペプチドと比べて増強したα螺旋性を示す（図８）。
エクセナチドペプチドのα螺旋構造上の炭化水素架橋化の効果を測定するために、エクセナチド（Ｍｅｔ１４ＮｏｒＬｅｕ）、ＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ）、ＳＡＨ−Ｅｘ（Ｂ）、及びＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ、Ｂ）を円偏光二色性で分析した。非改変エクセナチド鋳型ペプチドはｐＨ７の水溶液中、２１℃で殆どが非構造化されて、２５％より低いα螺旋性を示した。架橋された誘導体の全てが、比較的増大したα螺旋含量を示した。１つ又は２つの炭化水素架橋の何れかの挿入は一貫して、円偏光二色性スペクトルを、２０４ｎｍにある顕著な単一最小値を有するランダムコイルパターンから、２０８及び２２２ｎｍの二重最小値を有するα螺旋カウンターへ変形した。
【０２５８】
実施例３．一重及び二重架橋したエクセナチドペプチドは非改変鋳型ペプチドと比べて増強した熱安定性を示す（図８）。
熱解鎖に対するＳＡＨ−Ｅｘペプチドの耐性を評価するために、全ての構築物について５〜８３℃の温度範囲に渡って円偏光二色性試験を実施した。どのペプチドも温度の上昇に伴う古典的な協同的解鎖を示さなかったが、その代わり温度の関数として漸増溶解を示した。全てのＳＡＨ−Ｅｘペプチドは、全温度範囲に渡って高度のα螺旋性を保持した。エクセナチド（Ｍｅｔ１４ＮｏｒＬｅｕ）、ＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ）、及びＳＡＨ−Ｅｘ（Ｂ）の傾斜は類似していたのに対して、ＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ、Ｂ）はより平坦な傾斜線を有していて、二重架橋したペプチド螺旋のα螺旋性は、温度の上昇に殆ど影響されず、そして強固な熱安定性を反映することを示唆している。
【０２５９】
実施例４．一重及び二重架橋したエクセナチドペプチドは非改変鋳型ペプチドと比べて、中性及び酸性ｐＨにおいて増強したタンパク分解安定性を示す（図９、１０）。
ペプチドの治療薬としての重要な制約は、それらの速いタンパク質分解に対する脆弱性である。長く、部分的に又は大部分が広げられていて、そしてプロテアーゼ部位が豊富であるエクセナチド及びＧＬＰ−１のような生物活性ペプチドは、特に脆弱である。ペプチドのα螺旋性を強化するための共有結合架橋手法の１つの重要な利点は、タンパク質分解から脆弱なアミド結合を保護することである。プロテアーゼは、ペプチドがアミド結合を加水分解するように広がった配座を有していることを必要としているので、炭化水素架橋によって生じた構造の拘束は架橋したペプチドをプロテアーゼ耐性にできる。炭化水素架橋が３９−ｍｅｒエクセナチドペプチドをタンパク質分解から保護できるか否かを確認するために、エクセナチド（Ｍｅｔ１４ＮｏｒＬｅｕ）、並びに一重及び二重架橋誘導体を、インビトロで直接プロテアーゼに暴露した。０．５ｎｇ／μＬのキモトリプシンの存在下で、Ｅｘ４（２５μＭ）は、半減期が３８分の、比較的速い分解を示した。それに引き換え、一重架橋したＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ）及びＳＡＨ−Ｅｘ（Ｂ）化合物は、それぞれ、９４分及び１２８分のより長い半減期を示した。二重架橋ペプチドＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ、Ｂ）は、その一重架橋対応物を最大４倍そしてエクセナチド鋳型ペプチドを８倍上回る、２９５分の半減期を示した。特に、二重架橋ペプチドが対応する一重架橋ペプチドより低いパーセントの螺旋性を有しているにもかかわらず優れたプロテアーゼ耐性を示したので、二重架橋自体が全般的なペプチドα螺旋性に対するよりタンパク質分解に対してより強い影響力を有していた。
【０２６０】
ペプチドは、一部には近位消化管における酸加水分解に起因して低い経口バイオアベイラビリティーを有している。中性ｐＨにおける架橋ＳＡＨ−Ｅｘペプチドの増強したプロテアーゼ耐性が、酸性条件下でのそれらの安定性を検討するように促した。０．５ｎｇ／μＬのペプシンに暴露すると、エクセナチド（Ｍｅｔ１４ＮｏｒＬｅｕ）は、半減期が１３分で、速い分解を示した。Ｎ−末端架橋はこの実験でペプシン耐性を増強しなかったのに対して、ペプチドのＣ−末端部分内の架橋は、非改変鋳型ペプチドより６倍以上の改善を表わす、半減期の８１分への増大をもたらした。ｐＨ７におけるキモトリプシン耐性と同様に、二重架橋ペプチド、ＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ、Ｂ）は、非改変ペプチド鋳型より１３倍の改善を表わす、１７２分の半減期を提示し、ｐＨ２における顕著なペプシン耐性を示した。
【０２６１】
実施例５．二重架橋したエクセナチドペプチドは、静脈内投与であろうと経口強制送達であろうと類似した血清濃度をもたらす（図１１、１２）。
エキセンジン−４ ＥＩＡキット（Phoenix Pharmaceuticals, Inc. EK-070-94）が、血漿中のＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ、Ｂ）の濃度を測定できる、鋳型エクセナチド（Ｍｅｔ１４ＮｏｒＬｅｕ）ペプチド及びその二重架橋誘導体を首尾よく認識した（図１１）。この競合ＥＬＩＳＡにおいて、連続希釈したエクセナチド誘導体を、固定化した抗体に対してビオチン化したコントロールエクセンジン−４ペプチドと競合させる；競合結果は、ストレプタビジン−ＨＲＰによるビオチン化ペプチドの検出を用いて読み出して、効果的な競合は固定化抗体複合体におけるビオチン化エクセンジン−４のＳＡＨ−Ｅｘペプチドによる置換により減少した吸収を反映している。
【０２６２】
インビボ検出検討のために、ＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ、Ｂ）を滅菌５％ブドウ糖水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）に溶解して、８〜１０週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Jackson Laboratory、治療群当り３動物）にボーラス尾静脈注射（４ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｃｇ）又は経口強制投与（４ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｃｇ）によって投与した。マウスの追加群を賦形剤のみで処置した。処置の３０分後に、後眼窩穿刺によって氷上で凝固した後に〜２００μＬの血清を得るのに十分な血液を採取し、次いで２０，０００ｇで１分間４℃で遠心分離した。血清サンプルをＣ１８固相抽出カラム（Phoenix Pharmaceuticals）用い、製造会社のプロトコールに従って精製した。水−アセトニトリル溶出液を１晩凍結乾燥してＥＬＩＳＡキットの緩衝液０．５ｍＬ中で元に戻した。この戻した溶液を引き続き１０倍に連続希釈して製造会社のプロトコールに従ってＥＩＡ分析に付した。際立って、当量のＳＡＨ−Ｅｘ（Ａ、Ｂ）が静脈内又は経口強制投与の何れかで処置したマウスの血清中に検出され、二重架橋化がエクセナチドペプチドを、非改変エクセナチドに対して以前は実現できなかった送達経路である（Gedulin et al., Int’l J Pharmaceuticals, 356 (2008) 231-238）、胃腸系により全身循環へ吸収されるような、経口投与可能な形態へ変換する能力を強調している。陰性コントロールとしての、賦形剤で処置された動物の血清ではＥＩＡによってシグナルが検出されなかった。
【０２６３】
実施例６．架橋したインスリン分泌促進ペプチドの構造確認。
ＧＬＰ−１受容体に結合している架橋したインスリン分泌促進ペプチドの明確な構造を定義付けるために、記述されている（Runge, S et al. 2008 J Biol Chem, 283:11340-11347）ようにしてＸ線結晶方法を適用できるだろう。架橋したインスリン分泌促進ペプチドに対する結晶化条件をフェニックス結晶化ロボットを用いてセットした９６ウェルsitting-drop法用プレート（Crystal Quick, Hampton Research）を用いてスクリーニングする。初期条件はＨＴ Ｉｎｄｅｘ Ｓｃｒｅｅｎ(Hampton Research)、ＪＳＣＧ＋Ｓｕｉｔｅ(Qiagen)及び Ｐｒｏ−Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｓｕｉｔｅ (Qiagen) を包含する。種々のｐＨ並びに塩及び洗浄剤の濃度を包含する、結晶生育に対する最良の条件を特定するために、ベストヒット周辺のスクリーニングを実施する。生成するとすぐに、結晶を取り出し、結晶化緩衝液中で洗浄して、質量分析に付して結晶中のペプチドの存在を確認する。次いで、結晶を抗凍結剤中に浸し、急速冷凍して、液体窒素中で保管する。適切な結晶を Argonne National Laboratory のシンクロトロン施設で試験した。分子置換、それに続くデータ分析及び微調整（Phaser、Phenix、及び Coots ソフトウェア）によって相を得る。
【０２６４】
構造分析のための代替的で補完的なアプローチは１Ｈ−ＮＭＲ分析を利用する。溶液中の架橋したインスリン分泌促進ペプチドのスペクトルは、ｚ−シールド勾配及び三重共鳴クリオプローブを備えたＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＤＲＸスペクトロメーター上６００ＭＨｚで得られる。二次元のＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、及びＮＯＥＳＹスペクトルを１００％Ｄ２Ｏ及び９０％Ｈ２Ｏ／１０％Ｄ２Ｏ中で測定する。ＴＯＣＳＹデータセットは４０及び８０ｍｓの混合時間を用いて、ＮＯＥＳＹスペクトルは７５、１００、１２５及び２００ｍｓの混合時間を用いて得られる。ＮＭＲデータセットは、ＮＭＲＰｉｐｅスペクトル分析パッケージを用いて処理されて、プロトン共鳴の割り当てはＣａｒａを用いて実施する。構造計算は標準プロトコールを用いるプログラムＣＹＡＮＡを用いて実行する。最終構造ファミリーは、最も低い標的機能、並びにプログラムＷＨＡＴＣＨＥＣＫ及びＰＲＯＣＨＥＣＫ＿ＮＭＲで測定したキラリティー及び立体化学に対する最も良い総合的価値を有する２０の構造からなっている。構造はプログラムＰＹＭＯＬ及びＭＯＬＭＯＬを用いて提示し、そして分析した。
【０２６５】
構造データを、架橋したインスリン分泌促進ペプチド構造を、個々に及びＧＬＰ−１Ｒとの複合体として、本明細書に記載されているアッセイで評価した機能活性と関連付けるために用いる。
【０２６６】
実施例７．炭化水素架橋の挿入によってもたらされるタンパク質分解耐性のメカニズム（図１３）。
炭化水素架橋が非常に長いペプチド治療薬にプロテアーゼ耐性をもたらすメカニズムを、ｇｐ４１に由来するＨＩＶ−１融合阻害ペプチド鋳型を用いて検討した。２対のオレフィン非天然アミノ酸の架橋しない挿入（例えば、ｇｐ４１の非架橋α螺旋：ＵＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｂ））はキモトリプシンのタンパク質分解からの有意な保護をもたらさない。しかし、オレフィンメタセシスによって、対応する二重架橋類縁体、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｂ）はＵＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｂ）より８倍長い半減期を示し、著しいプロテアーゼ耐性をもたらすためには、架橋自体が必要であることを示唆している（図１３Ａ）。ＵＡＨ−及びＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｂ）は、それぞれ２７℃と２２℃のＴｍ値を有して、同様な円偏光二色性溶解プロファルを示した。温度依存性のアンフォールディングは、重複している繰り返し溶融曲線（図１３Ｂ）から分かるように、両ペプチドに関して可逆的であった。これらのデータは、全体的なα螺旋安定性が、２つの構造に関して類似していて、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｂ）の顕著なプロテアーゼ耐性の主要因とはならないことを明らかにしている。加えて、アンフォールディングの可逆性はペプチド凝集の非存在を強調しており、これも同様にＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｂ）の顕著なプロテアーゼ耐性の主要因とはならない。
【０２６７】
非改変、一重架橋、二重架橋、及び４ヶ所置換されているが架橋されていないペプチドの競合キモトリプシン分解パターンは、Ｎ−末端架橋がその架橋に隣接する切断部位のタンパク質分解的加水分解を、ＬＣ／ＭＳ分析で観察された対応するＭ＋１８種を伴わずに、固有に阻止したことを明らかにした（図１３Ｃ）。Ｃ−末端架橋は、架橋の上流部のタンパク質分解を完全に遮断した、というよりむしろ遅らせた。４ヶ所置換されているが架橋されていない誘導体ＵＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｂ）は、非天然アミノ酸のＮ−末端対に隣接している位置のタンパク質分解を阻害できず、Ｃ−末端一重架橋ペプチドのように効果的にはタンパク質分解の速度を遅らせることもできなかった（ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ｂ）のＴ１／２は７７分；ＵＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｂ）のＴ１／２は３６分）。二重架橋ペプチド（ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｂ）は、Ｎ−末端及びＣ−末端架橋の両方の抗タンパク質分解特性から相乗的に有利性をもたらされた。
【０２６８】
ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｂ）及び対応する非改変鋳型ペプチド、Ｔ６４９ｖの競合１Ｈ ＮＭＲ分析は、Ｔ６４９ｖの２つのＮ−末端トリプトファン残基に対応するインドールプロトン（〜１０．６ｐ.ｐ.ｍ）が、複数の配座間の速い変換と一致して、Ｔ６４９ｖの２つの鋭いピークによって表わされていることを明らかにした（図１３Ｄ）。対照的に、ＳＡＨ−ｇｐ４１（６２６−６６２）（Ａ、Ｂ）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、ペプチド架橋の結果として個々に構造化されたＮ−末端を反映して、広がって分割されている。纏めると、これらのデータは、ペプチド二重架橋によってもたらされたタンパク質分解の有利性は、プロテアーゼ開裂部位の突然変異生成、α螺旋性のみの最大化、４ヶ所非天然アミノ酸置換、或いはペプチド凝集に由来していないことを示す。かわりに、二重架橋ペプチドの顕著なプロテアーゼ耐性は、（１）α螺旋構造の導入によるタンパク質分解の減少した速度、及び（２）（ｉ、ｉ＋４）架橋部分内またはこれに直接隣接した局部的な部位におけるペプチド開裂の完全な阻害の組み合わせによってもたらされると言うことを確認した
【０２６９】
実施例８．構造的に安定化されてプロテアーゼ耐性のＳＡＨ−Ｅｘ及びＳＡＨ−ＧＬＰペプチドはグルコース刺激インスリン放出（ＧＳＩＳ）を増進する。
ＳＡＨ−Ｅｘ及びＳＡＨ−ＧＬＰペプチドの原液を、凍結乾燥粉末を脱イオン水に１００μＭで溶解して作成した。バッチＧＳＩＳアッセイのために以下の処置溶液を作成した：１．６７ｍＭのグルコース、１６．７ｍＭのグルコース、１．６７ｍＭのグルコース＋１０ｎＭのペプチド、１６．７ｍＭのグルコース＋１０ｎＭのペプチド、全てが１×ＫＲＢ緩衝液、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％ＢＳＡ中。野生型マウスの膵臓から単離した膵島をＫＲＢ緩衝液で３回洗浄して、試験管当り５個の膵島を１．６７ｍＭのグルコースを含有しているＫＲＢ緩衝液中で３０分３７℃で培養した。次いで、膵島をペレット状にして緩衝液を上記の処置溶液に置き換えた。それぞれの実験をｎ＝８で繰り返して実験した。３７℃で１時間培養した後、膵島をペレット状にして、グルコース刺激インスリン放出測定のために上澄液を採取した。ペレットを可溶化して細胞数を正規化するために細胞内インスリン含有量を評価した。インスリンは標準としてマウスインスリンを用いるＥＬＩＳＡで測定した（Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、ｃａｔ．８０−ＩＮＳＭＳ−Ｅ０１、ALPCO）。インスリンのＥＬＩＳＡプロットについては、１．６７ｍＭから１６．７ｍＭのグルコース用量の段階的増大に応答して放出されたインスリンの量に微増がみられる。しかし、インスリン分泌促進性ＥＸ４及びＧＬＰ１、並びに選択したＳＡＨ類縁体に応答して、ＧＳＩＳの実質的な増大がみられる。これらのデータは、Ｅｘ４及びＧＬＰ１の構造安定性、プロテアーゼ耐性、及び薬理学的特性を改善する炭化水素架橋がインクレチンの重要な機能的ＧＳＩＳ活性も保存することを強調している。
【０２７０】
（追加参照文献）
Walensky, L. D., Kung, A. L., Escher, I., Malia, T. J., Barbuto, S., et al. (2004) Activation of apoptosis in vivo by a hydrocarbon-stapled BH3 helix. Science, 305(5689), 1466-1470。
Bird, G. H., Bernal, F., Pitter, K., and Walensky, L. D. (2008) Synthesis and biophysical characterization of stabilized alpha-helices of BCL-2 domains. Methods Enzymol, 446, 369-386。
Gavathiotis, E., Suzuki, M., Davis, M. L., Pitter, K., Bird, G. H., et al. (2008) BAX activation is initiated at a novel interaction site. Nature, 455, 1076-1081。  
【０２７１】
（参照による取り込み）
本明細書で引用された全ての特許、特許出願、ＧｅｎＢａｎｋ／ＰＢＤナンバー、及び公表された文献は、これらが個々に取り込まれているようにその全てが参照により本明細書に取り込まれている。本発明はその好ましい実施態様に関して具体的に示され記載されているが、形態及び詳細の様々な変更が、添付されている特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、そこで実施できるということを当業者は理解できるだろう。
【０２７２】
（均等物）
当業者は、本明細書に記載されている具体的な実施態様の均等物を認識できるか、或いは通常の実験のみを用いて確かめることができるだろう。このような均等物は以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ａ−３】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ−１】
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【図７Ａ−２】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ−１】
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【図１４Ａ−２】
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【図１４Ｂ−１】
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【図１４Ｂ−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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