(57)【要約】  本発明は、疾患の臨床症候の発症前に、特異抗体上の交差イディオタイプエピトープの検出を使用して、その抗体を生成する細胞を検出することにより、特異抗体に関連した疾患を早期診断および処置するための方法および組成物を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に関連したクリオグロブリン血症性血管炎およびＢ細胞悪性腫瘍の発症リスクがある対象を同定する方法であって、
ＨＣＶに感染した対象から検体を準備するステップと、
前記検体においてＷＡ交差イディオタイプ（Ｘｉｄ）＋Ｂ細胞を検出するステップと、
それによって、ＨＣＶに関連したクリオグロブリン血症性血管炎およびＢ細胞悪性腫瘍の発症リスクがある対象を同定するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記ＷＡ  Ｘｉｄ＋Ｂ細胞が、クローン拡大Ｂ細胞集団に由来する免疫グロブリン核酸配列を同定することにより検出され、前記免疫グロブリン核酸配列が、ＷＡ  Ｘｉｄに関連していることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記ＷＡ  Ｘｉｄ＋Ｂ細胞が、単離した抗ＷＡ  Ｘｉｄ抗体を用いて検出されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記対象が、早期に同定されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記早期に同定される対象が、初期ＨＣＶ感染の後であるが、クリオグロブリン血症性血管炎またはＢ細胞リンパ腫に関連した症候の発現に先立って同定されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記検体が、全血を含む体液であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項２に記載の方法において、ＷＡ  Ｘｉｄに関連した前記免疫グロブリン核酸配列が、ＩｇＨ  Ｖ１−６９もしくはＩｇＨＶ  Ｖ３−７または関連生殖細胞系列遺伝子、ＶＫ３２５もしくはＶＫ３２８、ＪＨ４もしくはＪＨ３、Ｊｋ１、および配列番号１（コンセンサス１）もしくは配列番号２（コンセンサス２）を含むＤ領域コンセンサス配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記配列番号１（コンセンサス１）が、アミノ酸配列ＥＧ−−−−−−−ＮＰを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法において、前記配列番号２（コンセンサス２）が、アミノ酸配列ＧＤＹＹＤ−Ｓ−Ｇ−ＹＩＤＡを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の方法において、前記単離した抗ＷＡ  Ｘｉｄ抗体が、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識およびフィコエリトリン（ＰＥ）標識からなる群から選択される標識を結合していることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項３に記載の方法において、前記ＷＡ  Ｘｉｄ＋Ｂ細胞が、フローサイトメトリー分析により検出されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項３に記載の方法において、前記方法が、抗ＣＤ１１ｃ抗体を用いて前記検体においてＣＤ１１Ｃ＋細胞を検出することをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
Ｃ型肝炎ウイルス感染（ＨＣＶ）に関連したクリオグロブリン血症性血管炎またはＢ細胞悪性腫瘍の発症リスクがある対象を同定する方法であって、
ＨＣＶ感染患者のクローン拡大Ｂ細胞から核酸検体を準備するステップと、
前記検体において、ＷＡ  Ｘｉｄに関連した免疫グロブリン核酸配列を含む配列を検出するステップであって、前記配列が、ＩｇＨ  Ｖ１−６９もしくはＩｇＨＶ  Ｖ３−７または関連生殖細胞系列遺伝子、ＶＫ３２５もしくはＶＫ３２８、ＪＨ４もしくはＪＨ３、Ｊｋ１、および配列番号１（コンセンサス１）もしくは配列番号２（コンセンサス２）を含むＤ領域コンセンサス配列を含む検出するステップと、
前記ＷＡ  Ｘｉｄ配列および前記配列番号１（コンセンサス１）または配列番号２（コンセンサス２）が前記ＨＣＶ感染患者由来の核酸中に存在する場合に、ＨＣＶ感染に関連したクリオグロブリン血症性血管炎またはＢ細胞悪性腫瘍の発症を予後診断するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
対象におけるＨＣＶに関連したクリオグロブリン血症性血管炎およびＢ細胞悪性腫瘍を処置する方法であって、
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した対象から検体を準備するステップと、
ＷＡ  Ｘｉｄ＋Ｂ細胞が前記検体において検出される場合に、前記対象に抗ＷＡ抗体を投与するステップと、
それによって、前記対象における前記クリオグロブリン血症性血管炎またはＢ細胞悪性腫瘍を処置するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記患者が、クリオグロブリン血症性血管炎の臨床症候もＢ細胞悪性腫瘍の臨床症候も有さないことを特徴とする方法。
【請求項１６】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に関連した悪性腫瘍の発症リスクがある対象を同定する方法であって、
ＨＣＶに感染した対象から検体を準備するステップと、
前記検体において非ＷＡ交差イディオタイプ陽性（非ＷＡ  Ｘｉｄ＋）Ｂ細胞を検出するステップと、
それによって、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に関連した悪性腫瘍の発症リスクがある対象を同定するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記非ＷＡ  Ｘｉｄ＋Ｂ細胞が、クローン拡大Ｂ細胞集団に由来する免疫グロブリン核酸配列を同定することにより検出され、前記免疫グロブリン核酸配列が、特定の非ＷＡ  Ｘｉｄに関連していることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記特定の非ＷＡ  Ｘｉｄ＋Ｂ細胞が、単離した抗非ＷＡ  Ｘｉｄ抗体を用いて検出されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法において、前記診断が、早期診断であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、前記早期診断が、初期ＨＣＶ感染の後であるが、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連した徴候または症候の発現に先立ってなされることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の方法において、前記検体が、全血を含む体液であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
ＩｇＨ  Ｖ１−６９もしくはＩｇＨ  Ｖ３−７または関連生殖細胞系列遺伝子、ＶＫ３２５もしくはＶＫ３２８、ＪＨ４もしくはＪＨ３、Ｊｋ１、および配列番号１（コンセンサス１）もしくは配列番号２（コンセンサス２）を含む、ＷＡ  Ｘｉｄに関連した免疫グロブリン核酸配列の検出に基づいて、ＨＣＶ感染に関連したクリオグロブリン血症性血管炎およびＢ細胞悪性腫瘍を予後診断するための第１プライマーおよび第２プライマーのセットならびに説明書を含むキットであって、第１プライマーおよび第２プライマーの前記セットが、Ｉｇをコードする転写物中の、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を挟む第１プライマーおよび第２プライマー、ＶＨ−Ｄ−ＪＨ配列を挟む第１プライマーおよび第２プライマー、ならびにＶＫ−ＪＫ配列を挟む第１プライマーおよび第２プライマーを含むことを特徴とする、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は２０１０年３月１日に出願された米国仮特許出願第６１／３０９，１６１号明細書の優先権の利益を主張するものであり、その内容全体を参照によって本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
本発明は、一般に、Ｃ型肝炎ウイルス感染に関連した疾患の早期診断および処置のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染のまれな症状は、ＩＩ型クリオグロブリン血症（クリオグロブリン血症性血管炎）に関連した全身性血管炎であり、患者の５〜１０％でＢ細胞悪性腫瘍に移行する増殖性Ｂ細胞疾患である。クリオグロブリン血症性血管炎の発症に必要なＨＣＶ感染期間については、十分な記載がないが、１０年以上と思われる。感染者の大多数は、クリオグロブリン血症性血管炎（ｃｒｙｏｂｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉｃ  ｖａｓｃｕｌｉｔｓ）の症候の発現に先だって、この長期間、何ら症候を経験しないので、クリオグロブリン血症血管炎または関連Ｂ細胞悪性腫瘍の早期診断がなされることはめったにない。症候を示す前にＣ型肝炎患者が処置される可能性は低いので、ＨＣＶ感染患者のクリオグロブリン血症性血管炎および関連Ｂ細胞悪性腫瘍の早期診断の助けとなる予後マーカーの発見が当技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、疾患の臨床症候の発症前に、特異抗体上の交差イディオタイプエピトープの検出を使用して、その抗体を生成する細胞を検出することにより、特異抗体に関連した疾患を早期診断および処置するための方法を含む。具体的には、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染患者が感染合併症を発症する前に、感染患者のＢ細胞クローン拡大（ＢＣＥ）の解析を使用して、ＩＩ型クリオグロブリン血症に関連したクリオグロブリン血症性血管炎またはＢ細胞悪性腫瘍を早期診断するための方法を提供する。さらに、検出される交差イディオタイプ抗原の抗体を使用する処置方法も本明細書に記載する。本発明は、無症候性ＨＣＶ感染患者におけるＷＡ  Ｂ細胞の検出が、クリオグロブリン血症性血管炎および関連Ｂ細胞悪性腫瘍の発症マーカーになるという驚くべき発見に基づいている。
【０００５】
ＨＣＶに関連したクリオグロブリン血症性血管炎およびＢ細胞悪性腫瘍の発症リスクがある対象を同定するための方法を本明細書に記載する。最初に、ＨＣＶに感染した対象から検体を準備する。適切な検体は全血を含む体液である。ＷＡ交差イディオタイプ陽性（Ｘｉｄ＋）Ｂ細胞を検体中に検出する場合、その対象は、ＨＣＶに関連したクリオグロブリン血症性血管炎およびＢ細胞悪性腫瘍の発症リスクがある対象であると同定する。一態様では、対象は早期に同定される。早期に同定される対象は、初期ＨＣＶ感染の後であるが、クリオグロブリン血症性血管炎またはＢ細胞悪性腫瘍に関連した症候の発現に先立って同定されることが好ましい。
【０００６】
一態様では、ＷＡ  Ｘｉｄ＋Ｂ細胞は、クローン拡大Ｂ細胞集団から、ＷＡ  Ｘｉｄに関連した免疫グロブリン核酸配列を同定することにより検出する。ＷＡ  Ｘｉｄに関連した免疫グロブリン核酸配列は、ＩｇＨ  Ｖ１−６９もしくはＩｇＨＶ  Ｖ３−７または関連生殖細胞系列遺伝子、ＶＫ３２５もしくはＶＫ３２８、ＪＨ４もしくはＪＨ３、Ｊｋ１、および配列番号１（コンセンサス１）もしくは配列番号２（コンセンサス２）を含むＤ領域コンセンサス配列を含む。
【０００７】
あるいは、ＷＡ  Ｘｉｄ＋Ｂ細胞は単離した抗ＷＡ  Ｘｉｄ抗体を用いて検出する。場合によっては、単離した抗ＷＡ  Ｘｉｄ抗体を標識化する。一態様では、この標識はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識またはフィコエリトリン（ＰＥ）標識である。免疫染色またはフローサイトメトリー分析によってＷＡ  Ｘｉｄ＋Ｂ細胞を検出する。一態様では、この方法は抗ＣＤ１１ｃ抗体を用いて検体中のＣＤ１１Ｃ＋細胞を検出することをさらに含む。
【０００８】
ＨＣＶ感染に関連したクリオグロブリン血症性血管炎またはＢ細胞悪性腫瘍の発症リスクがある対象を同定するための方法をさらに提供する。最初に、ＨＣＶ感染患者のクローン拡大Ｂ細胞から核酸検体を準備し、ＷＡ  Ｘｉｄに関連した免疫グロブリン核酸配列を検出する。前記配列は、ＩｇＨ  Ｖ１−６９もしくはＩｇＨ Ｖ３−７または関連生殖細胞系列遺伝子、ＶＫ３２５もしくはＶＫ３２８、ＪＨ４もしくはＪＨ３、およびＪｋ１を含む。続いて、配列番号１または配列番号２を含む配列を、検体中に検出する。ＷＡ  Ｘｉｄに関連したＩｇＨおよびＶＫの配列を含有するＨＣＶ感染患者由来の核酸中に、配列番号１または配列番号２が存在する場合、ＨＣＶ感染に関連したクリオグロブリン血症性血管炎またはＨＣＶ感染に関連したＢ細胞悪性腫瘍の発症が予後診断される。一態様では、患者には、クリオグロブリン血症性血管炎の臨床症候もＢ細胞悪性腫瘍の臨床症候もない。
【０００９】
本発明はまた、対象におけるＨＣＶに関連したクリオグロブリン血症性血管炎およびＢ細胞悪性腫瘍の早期処置の方法を提供する。最初に、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した対象から検体を入手する。適切な検体は全血を含む体液である。検体がＷＡ  Ｘｉｄ＋Ｂ細胞を含有する場合、抗ＷＡ抗体を対象に投与し、それによって、対象におけるＨＣＶに関連したクリオグロブリン血症性血管炎およびＢ細胞悪性腫瘍を処置する。早期処置は、初期ＨＣＶ感染の後であるが、クリオグロブリン血症性血管炎またはＢ細胞悪性腫瘍に関連した症候の発現に先立ってなされることが好ましい。
【００１０】
本発明はまた、ＷＡ  Ｂ細胞から発生するもの以外のＢ細胞悪性腫瘍の発症リスクがある対象の早期発見および処置のための方法を提供する。最初に、ＨＣＶに感染した対象から検体を準備する。適切な検体は全血を含む体液である。非ＷＡ交差イディオタイプ陽性（非ＷＡＸｉｄ＋）Ｂ細胞を検体中に検出することにより、その対象を、ＨＣＶに関連したクリオグロブリン血症性血管炎およびＢ細胞悪性腫瘍の発症リスクがある対象と同定する。一態様では、非ＷＡ  Ｘｉｄ＋Ｂ細胞は、クローン拡大Ｂ細胞集団から、特定の非ＷＡ  Ｘｉｄに関連した免疫グロブリン核酸配列を同定することにより検出する。場合によっては、特定の非ＷＡ  Ｘｉｄ＋Ｂ細胞は、単離した抗非ＷＡ  Ｘｉｄ抗体を用いて検出する。一態様では、対象は早期に同定される。早期に同定される対象は、初期ＨＣＶ感染の後であるが、クリオグロブリン血症性血管炎またはＢ細胞悪性腫瘍に関連した症候の発現に先立って同定されることが好ましい。
【００１１】
本発明はまた、ＩｇＨ  Ｖ１−６９もしくはＶＩｇＨ  Ｖ３−７または関連生殖細胞系列遺伝子、ＶＫ３２５もしくはＶＫ３２８、ＪＨ４もしくはＪＨ３、Ｊｋ１、および配列番号１もしくは配列番号２を含む、ＷＡ  Ｘｉｄに関連した免疫グロブリン核酸配列の検出に基づいて、ＨＣＶ感染に関連したクリオグロブリン血症性血管炎およびＢ細胞悪性腫瘍を予後診断するための第１プライマーおよび第２プライマーのセットならびに説明書を含むキットを提供する。第１プライマーおよび第２プライマーのセットは、Ｉｇをコードする転写物中の、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を挟む第１プライマーおよび第２プライマー、ＶＨ−Ｄ−ＪＨ配列を挟む第１プライマーおよび第２プライマー、ならびにＶＫ−ＪＫ配列を挟む第１プライマーおよび第２プライマーを含む。
【００１２】
本発明の他の特徴および利点は、好ましい実施形態の以下の説明および特許請求の範囲から明らかになる。他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料も、本発明の実施または試験に使用することができるが、以下では適切な方法および材料を記載する。本明細書に記載の刊行物、特許出願、特許、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＮＣＢＩ受託番号およびその他の参考文献はすべて、その内容全体を参照によって組み込むものとする。矛盾がある場合は、本明細書が、定義を含めて、優先するものとする。さらに、材料、方法および実施例は、例示のみを目的とし、限定することを意図するものではない。
【００１３】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、Ｂ細胞クローン拡大分析ゲルのケミルミグラフ（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｇｒａｐｈ）を示す図である。患者のリボ核酸（ＲＮＡ）を増幅した。患者番号を各レーンの上部に示す。患者２７、４５、７１、７２、８０、８４および８８は陽性（白矢印がＢＣＥを示す）、患者１７、５０、８３、８５、８６および８７は陰性と考えられた。これらの分類はゲル像の濃度スキャンにより確認した。
【図２】図２は、患者１２７に関する追加検査の結果を示す図である。図２Ａは、絨毛リンパ球を示す末梢血ライト染色の顕微鏡写真である。図２Ｂは、ＣＤ１１ｃ＋、ＷＡ＋Ｂ細胞集団を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。図２Ｃおよび図２Ｄは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＷＡ  Ｘｉｄ（Ｃ）およびフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＣＤ１１ｃ（Ｄ）を用いて二重染色したＣＤ１１Ｃ単離細胞を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
米国には約４００万人のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染患者がおり、世界中では１億７０００万人を超える感染患者がいる。Ｃ型肝炎ウイルスは、フラビウイルス科に属する、小さく（５０〜６５ｎｍのサイズ）、エンベロープのある陽性センス一本鎖リボ核酸（ＲＮＡ）ウイルスである。Ｃ型肝炎ウイルス粒子は、タンパク質の二十面体保護シェルに取り囲まれ、さらに細胞由来の脂質（脂肪）エンベロープに被覆されている遺伝物質（ＲＮＡ）のコアからなる。２つのウイルスエンベロープ糖タンパク質であるＥ１およびＥ２が脂質エンベロープの中に埋め込まれている。Ｃ型肝炎ウイルスには６つの主要な遺伝子型があり、例えば遺伝子型１、遺伝子型２など数字で示される。
【００１６】
ＨＣＶは、血液間接触、例えば注射薬使用（注射針共有）、汚染血液製剤および性感染を介して伝染し、肝臓を冒す感染症であるＣ型肝炎としてヒトに発現する。大部分の人々は、初期感染後に、たとえあるにしても、わずかな症候しか示さないが、ウイルスは、感染者の約８５％で肝臓に残存する。いったん成立すると、慢性感染症は、肝瘢痕化（繊維症）および高度な瘢痕化（肝硬変）に進行する恐れがあり、これは一般には長年月を経て明らかになる。ある場合には、肝硬変の患者は、肝不全、または肝癌を含む肝硬変の他の合併症を発症する。肝硬変または肝癌を発症する患者は肝移植が必要になることがあるが、Ｃ型肝炎ウイルスは、移植後に例外なく再発する。
【００１７】
急性Ｃ型肝炎はＨＣＶ感染後の最初の６か月を指す。ＨＣＶ感染者の６０％〜７０％では、急性期は無症候性である。急性期症候を経験する少数派の患者では、症候は一般に軽度で非特定的であり、Ｃ型肝炎の特定診断が下されることはめったにない。急性Ｃ型肝炎感染の症候には、食欲減退、疲労、腹痛、黄疸、そう痒およびインフルエンザ様症候が含まれる。
【００１８】
Ｃ型肝炎ウイルスは、通常、感染後１〜３週以内の血液中に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって検出することができ、ウイルスに対する抗体は、一般に、感染の３〜１５週間以内に検出することができる。肝酵素（アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ））における正規化および血漿ＨＣＶ−ＲＮＡクリアランス（自然なウイルスクリアランスとして知られる）によって示されるように、自然なウイルスクリアランス率は極めて変動しやすく、ＨＣＶ感染個体の１０〜６０％（Ｃａｒｕｎｔｕ  ＦＡ  ａｎｄ  Ｂｅｎｅａ  Ｌ，２００６  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ，１５（３）：２４９−２５６）が、急性期にその体内からウイルスを排除する。しかしながら、持続感染が一般的であり、大部分の患者は慢性Ｃ型肝炎、すなわち６か月を超えて持続する感染を発症する（Ｖｉｌｌａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２９（３）：９０８−９１４）。
【００１９】
慢性Ｃ型肝炎は、多くの場合、無症候性（症候なし）であり、大抵偶然に発見される。慢性Ｃ型肝炎の自然経過は、個体ごとに相当変動する。ほとんどすべてのＨＣＶ感染者は、肝生検で炎症の証拠を示すが、肝瘢痕化（繊維症）の進行速度は、個体間で顕著に変動する。ＨＣＶ疾患の進行速度に影響を及ぼすと報告されている要因としては、年齢（疾患進行速度の増加に関連する）、性別（男性は女性よりの迅速な疾患進行を示す）、アルコール消費（疾患進行速度の増加に関連する）、ＨＩＶ同時感染（疾患進行速度の顕著な増加に関連する）および脂肪肝（肝細胞における脂肪の存在は、疾患進行速度の増加に関連する）が挙げられる。
【００２０】
肝臓の実質的な瘢痕化が起こるまで、典型的には、肝疾患を具体的に示唆する症候はない。しかしながら、Ｃ型肝炎は全身性疾患であり、患者は、高度な肝疾患の発症に先立って、無症候から多くの症候がある病気に及ぶ広範な臨床症状を経験し得る。慢性Ｃ型肝炎に関連した一般的な徴候および症候としては、疲労、インフルエンザ様症候、関節痛、そう痒、睡眠障害、食欲変化、悪心およびうつ病が挙げられる。
【００２１】
いったん慢性Ｃ型肝炎が肝硬変に進行すると、肝機能低下または肝循環の圧上昇すなわち門脈圧亢進症として知られる症状のいずれかに一般に起因する徴候および症候が出現することがある。肝硬変の起こり得る徴候および症候としては、腹水（腹部における体液の蓄積）、挫傷および出血の傾向、静脈瘤（特に胃および食道における拡張静脈）、黄疸、および健常肝臓により通常排除されるアンモニアおよび他の物質が蓄積することによる、肝性脳症として知られる認知障害症候群が挙げられる。
【００２２】
持続性ＨＣＶ感染は、医薬品、例えばペグインターフェロン、リバビリンを用いて処置することができる。感染者の大多数は、その疾患の急性期にまったく症候を経験しないので、「Ｃ型肝炎」の診断が急性期に下されることはめったにない。急性期症候を経験する人が、医学的配慮を求めるほど病的であることはめったにない。慢性期Ｃ型肝炎の診断も、高度な肝疾患（初期感染から数十年後まで起こることがない）が発症するまで症候特異性がない故に、挑戦しがいのある課題である。ＨＣＶワクチンは現在開発中であるが、ＨＣＶに対するワクチンはまだ存在しない。
【００２３】
Ｃ型肝炎の診断は、ＨＣＶに対する抗体を検出するために使用する血清学的血液検査から始まる。抗ＨＣＶ抗体は、曝露後１５週以内に患者の約８０％に、曝露後５か月以内に患者の９０％超に、そして曝露後６か月以内に患者の９７％超に検出することができる。全体として、ＨＣＶ抗体検査はＣ型肝炎ウイルスへの曝露に対して高い陽性的中率を示すが、まだ抗体発現（セロコンバージョン）していない患者、または信頼性のある検出には不十分な抗体レベルしかない患者を見逃す可能性がある。
【００２４】
ＨＣＶ感染のまれな症状は、ＩＩ型クリオグロブリン血症に関連した全身性血管炎（クリオグロブリン血症性血管炎）である。クリオグロブリン血症は、クリオグロブリンと呼ばれる血液中の異常タンパク質を原因とする血液疾患であり、クリオグロブリンは、血液が冷却されると沈殿または凝集し、再度加温されると溶解する。これらのタンパク質は、小血管および中血管の中で沈着することがあり、関節、筋肉および器官への血流が制限されることがある。クリオグロブリン血症は、その原因が完全に理解されているわけではないが、自己免疫疾患（器官に沈着し、炎症を引き起こす複合体を形成する抗体を生成する体内免疫系が原因となる）であると考えられている。原因が不明であったので、本態性混合型クリオグロブリン血症と以前呼ばれたクリオグロブリン血症の大多数は、現在Ｃ型肝炎感染が原因であると知られている。
【００２５】
免疫グロブリンから構成されるクリオグロブリン血症（ｃｒｙｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）は３タイプ（Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩ型）ある。Ｉ型は単一クローン性免疫グロブリンからなる。ＩＩ型およびＩＩＩ型は、多クローン性免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）および免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）からなるので、「混合型クリオグロブリン」と名付けられている。ＩＩ型では、ＩｇＭは単一クローン性であり、ＩＩＩ型では、ＩｇＭは多クローン性である。両型において、ＩｇＭには通常リウマチ因子活性がある。リウマチ因子は、慢性関節リウマチ（関節の炎症を特徴とする慢性自己免疫性疾患）罹患者の血液中に見出される抗体である。クリオグロブリン血症に関連した最も一般的な症候および疾患としては、血管炎、腎（ｒｅｎａｌ）（腎（ｋｉｄｎｅｙ））疾患、関節痛および関節炎、そう痒、疲労、疼痛、リンパ節腫脹、末梢神経障害、胃痛および／または出血性疾患が挙げられる。
【００２６】
クリオグロブリン型、基礎疾患および症候重症度に処置は依存する。自己免疫性疾患または本態性クリオグロブリン血症に関連したより広範な血管炎は、プレドニゾン、シクロホスファミドまたはその両方に応答する可能性がある。Ｃ型肝炎に関連したクリオグロブリン血症の最も有効な処置はまだ決定されていないが、プレドニゾンの短期使用後にインターフェロンαを６か月使用すると、臨床的改善および肝機能検査改善がもたらされる。しかし、インターフェロンα処置が終了すると、多くの場合、肝疾患および血管炎が再燃する。
【００２７】
ＩＩ型クリオグロブリン血症は、多クローン性免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）および単一クローン性ＩｇＭリウマチ因子（ｍＲＦ）からなり、これらは、抗体のＦｃ部分に結合して、疾患進行に寄与する免疫複合体を形成する。ＩＩ型クリオグロブリン血症（クリオグロブリン血症性血管炎）に関連した全身性血管炎は、患者の５〜１０％でＢ細胞悪性腫瘍に移行する増殖性Ｂ細胞疾患である。ｍＲＦ（Ｃａｓａｔｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｂｌｏｏｄ，９０：３８６５−３８７３）は、生殖細胞遺伝子にコードされているので（Ｋｕｎｋｅｌ  ＨＧ，ｅｔ  ａｌ．１９７３  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，３７：３３１−４２）、その８０パーセントがユニークであり、ＨＣＶ感染患者に限定される、「ＷＡ」と名付けられた抗体結合部位交差イディオタイプ（Ｘｉｄ）（Ａｇｎｅｌｌｏ  Ｖ  ａｎｄ  Ｂａｒｎｅｓ  ＪＬ，１９８６  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１６４：１８０９−１４）を有する。免疫グロブリン可変領域は「イディオタイプ」と名付けられた抗原決定基を含有し、これは血清学的手法（Ｍａｃｋｗｏｒｔｈ−Ｙｏｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．１９８７  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，７９：５７２−５８１）により認識することができる。ヒト単一クローン性リウマチ因子（ｍＲＦ）の中の主要な交差イディオタイプであるＷＡ交差イディオタイプ（Ｘｉｄ）は、抗原結合部位に位置する、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方を含む立体的抗原決定基である（Ｋｕｎｋｅｌ  ＨＧ，ｅｔ  ａｌ．１９７３  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１３７：３３１；Ａｇｎｅｌｌｏ  Ｖ  ａｎｄ  ＪＬ  Ｂａｒｎｅｓ，１９８６  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１６４：１８０９）。
【００２８】
ＷＡ交差イディオタイプ（Ｘｉｄ）を有する単一クローン性リウマチ因子が、ＨＣＶ感染患者における大部分のクリオグロブリン血症性血管炎の原因である。ＨＣＶは、ＩＩ型クリオグロブリンにおいて濃縮され（Ａｇｎｅｌｌｏ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．１９９２  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３２７：１４９０−１４９５）、抗ウイルス治療が、ウイルス血症の減退に加えて、クリオグロブリン血症の減退およびＷＡ  ｍＲＦを生成するＷＡ  Ｂ細胞を誘導するので、ＷＡ  ｍＲＦの生成はウイルスにより促進される（Ｍａｚｚａｒｏ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｃａｎｃｅｒ，７７：２６０４−１３；Ｃａｓａｔｏ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｂｌｏｏｄ，９９：２２５９−６１；Ｈｅｒｍｉｎｅ，ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３４７：８９−９４）。
【００２９】
クリオグロブリン血症性血管炎の有病率は、南ヨーロッパおよび米国において、それぞれＨＣＶ感染患者の２〜５％および１％未満と見積もられている（Ｃａｓａｔｏ  Ｍ  ａｎｄ  Ａｇｎｅｌｌｏ  Ｖ，２００２  Ｍｉｘｅｄ  ｃｒｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｔｏ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎ：ＮＯＲＤ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．３ｒｄ  ｅｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｅｄｉｔｏｒ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：５）。ＩＩ型クリオグロブリン血症患者がＢ細胞悪性腫瘍を発症するリスクは、ＨＣＶ感染集団全体に比べてはるかに高くなる。クリオグロブリン血症性血管炎(ｃｒｙｏｇｌｏｂｕｌｉｍｅｍｉｃ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）患者は、その５〜１０パーセントがＢ細胞悪性腫瘍を発症するが（Ｉｎｖｅｒｎｉｚｚｉ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．１９８３  Ａｃｔａ  ｈａｅｍａｔｏｌ，７０：７３−８２）、一方ＨＣＶ感染集団全体は、その０．２〜０．８パーセント（Ｏｈｓａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，８０：２３７−２３９；Ｇｉｏｒｄａｎｏ  ＴＰ，ｅｔ  ａｌ．２００７  ＪＡＭＡ，２９７：２０１１−１７）がＢ細胞悪性腫瘍を発症する。さらに、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の約５０％が、ＷＡ  Ｂ細胞から発生すると考えられる（Ｋｎｉｇｈｔ  Ｇ  ａｎｄ  Ａｇｎｅｌｌｏ  Ｖ，２００１  Ｂｌｏｏｄ，９７：３３１９−２１；Ｋｎｉｇｈｔ  ＧＢ．Ｇａｏ  Ｌ，Ｇｒａｎｇｎａｎｉ  Ｌ，Ｅｌｆａｈａｌ  Ｍ，Ｄｅ  ｒｏｓａ  ＦＧ，Ｇｏｒｄｏｎ  ＦＤ，Ａｇｎｅｌｌｏ  Ｖ．Ｄｅｔｅｃｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＷＡ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＨＣＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：Ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｃｒｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉｃ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｔｓ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ａｒｔｈ  Ｒｈｅｕｍ  ２０１０；６２：２１５２）。
【００３０】
ＨＣＶ感染患者の８０パーセントは症候性疾患を発症しない。そのため、これらの患者のわずかなパーセントのみが抗ウイルス治療で処置される。クリオグロブリン血症性血管炎の発症に必要なＨＣＶ感染期間については、十分な記載がないが、少なくとも１０年と思われる（Ｍｏｎｔｉ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．１９９５  ＱＪＭ，８８：１１５−１６）。したがって、予後マーカーが発見されない限り、これらの患者が、症候性になる前に処置される可能性は低い。以下に詳細に説明されるように、ＷＡ  Ｂ細胞はＩＩ型クリオグロブリン血症および／またはＢ細胞リンパ腫のマーカーになり、早期診断を可能にする。クリオグロブリン血症性血管炎およびＢ細胞悪性腫瘍の罹患率および死亡率の増加を防止することに加えて、これらの患者が血管炎の発現に際して治療に対し大きな抵抗を示すので（Ａｇｎｅｌｌｏ  Ｖ，２０００  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２７：２０６５−７）、症候発現前の患者の早期発見および処置が有益となり得る。
【００３１】
以下に詳細に説明するように、ＷＡ  Ｂ細胞はＢ細胞クローン拡大（ＢＣＥ）の分子分析によって無症候性ＨＣＶ感染患者に検出された。Ｂ細胞増殖の早期検出は、血液中の正常なＢ細胞レパートリーを構成するＩｇ遺伝子再編成を検出するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって確定される。このようにして、例えばＩＩ型クリオグロブリン血症またはＢ細胞悪性腫瘍におけるＢ細胞クローンの過剰発現などのＢ細胞クローンの拡大が検出される。ＷＡ  Ｂ細胞クローン拡大（ＢＣＥ）は、ＷＡ  ｍＲＦをコードするＩｇ遺伝子に対して確立された広範な基準を利用するＢＣＥの配列分析によって同定される（Ｋｎｉｇｈｔ  ＧＢ，ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１７８：１９０３−１１）。
【実施例】
【００３２】
実施例１  無症候性ＨＣＶ感染患者のＷＡ  Ｂ細胞は、クリオグロブリン血症性血管炎および関連Ｂ細胞悪性腫瘍の発症マーカーである
手短に言えば、無症候性ＨＣＶ感染患者、ＨＣＶ陰性患者、ならびにＷＡ  ｍＲＦが陰性および陽性のクリオグロブリン血症性血管炎の対照患者を検査した。ＢＣＥを単離して配列決定し、ＷＡ  ＢＣＥを同定した。以下に詳細に説明するように、ＢＣＥは、クリオグロブリン血症性血管炎の陽性対照患者すべてに検出されたが、ＨＣＶ感染患者のみがＷＡ  ＢＣＥを有していた。３３人の対照ＨＣＶ陰性患者の中でＢＣＥを有する者はいなかった。ＷＡ  ＢＣＥは、無症候性ＨＣＶ患者５５人中４人（７．４％）に検出され、ＨＣＶ感染患者のうち、ＩＩＩ型クリオグロブリン血症および血清ＲＦを有する患者においてそれぞれ１４人中０人および３７人中５人に検出された。ＷＡ  ＢＣＥを有する１人の患者は、絨毛リンパ球を有する無症候性脾リンパ腫に罹患していたが、そのリンパ球はＷＡ  Ｂ細胞であった。
【００３３】
無症候性ＨＣＶ感染患者、ＨＣＶ陰性患者、ならびにＷＡ  ｍＲＦが陰性および陽性のクリオグロブリン血症性血管炎の対照患者を検査した。Ｂ細胞クローン分析用の血液サンプルを、Ｌａｈｅｙ  Ｃｌｉｎｉｃ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の消化器病クリニックの６か月間にわたる研究に同意した、ＨＣＶ感染およびＨＣＶ非感染の無症候性治療継続患者から入手した。ＨＣＶ感染患者は抗ウイルス処置も化学療法も受けていなかった。クリオグロブリン血症性血管炎またはＩＩＩ型クリオグロブリン血症の患者を、Ｌａｈｅｙ  Ｃｌｉｎｉｃの様々な部門から募集した。ＲＦを有するがクリオグロブリン血症ではない無症候性ＨＣＶ感染患者の血液検体を、Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＶＡＭＣ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＨｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃｌｉｎｉｃで実施した２年間の経過観察研究で入手した。患者の個体群統計学的特徴、クリオグロブリン血症性血管炎または他の肝外疾患症状の存在および肝硬変の存在を判定するために、医療記録を調査した。
【００３４】
クリオグロブリン血症性血管炎の診断には、触知可能紫斑病、末梢神経障害、腎疾患、または生検により証明される中血管炎のうちの１つが存在する必要があった。腎疾患基準には、５００ｍｇ／ｄｉｅ超のタンパク尿、ネフローゼ症候群、糸球体腎炎、急性または慢性腎不全、１．５ｍｇ／ｄｌ超の血清クレアチニンのうちの１つが存在することが含まれる。他の疾患（例えば真性糖尿病または全身性エリテマトーデス）による腎疾患は除外した。末梢神経障害は、電気生理学的パラメーターにより確認して、または確認することなく神経学者が診断した。真性糖尿病またはアルコール中毒症などの他の疾患に付随する末梢神経障害は除外した。ＨＣＶ抗体、ＨＣＶＲＮＡの検出および定量、ならびにクリオグロブリンの単離、定量および分類は、以前の記載（Ｄｅ  Ｒｏｓａ  ＦＧ  ａｎｄ  Ａｇｎｅｌｌｏ  Ｖ，２００９  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，３６：１９５３）のように実施した。病因が不明のＨＣＶ陰性クリオグロブリン血症性血管炎の患者については、血清およびクリオグロブリンのＨＣＶ抗体およびＨＣＶ  ＲＮＡを繰り返し検査し、ＨＣＶ感染がないことを確認した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（Ａｌｔ、正常範囲、７〜４０ＩＵ／ｍｌ）およびリウマチ因子（ＲＦ、正常範囲、２０ＩＵ／ｍｌ未満）の検査は、臨床検査室で実施した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、日常的なフィコール密度勾配遠心分離によりヘパリン添加血から単離した。
【００３５】
患者１２７からの検体について追加分析を実施した。血液検査およびリンパ球免疫表現型検査を臨床検査室で実施した。ＣＤ１１ｃ＋リンパ球（絨毛リンパ球に対する表現型マーカー（Ｌｉｕ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｈｕａｚｈｏｎｇ  Ｕｎｉｖ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ，２３：２３６−８）を以下のように単離した。ＰＢＭＣをマウス抗ＣＤ１１ｃ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）と共に４℃で３０分間インキュベートして洗浄し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓヤギ抗マウスＩｇ磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＣＤ１１ｃ＋細胞を磁石により捕捉して洗浄し、３７℃で一晩培養して付着磁気ビーズを解離させた。インキュベーション後に、磁石を用いて細胞からビーズを除去した。単離した細胞を、フルオレセイン（ｆｌｕｏｕｒｏｃｅｉｎ）イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＷＡ  ｍＲＦおよびフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＣＤ１１ｃを用いて染色し、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーにより検査した。
【００３６】
ＢＣＥの検出および分析
免疫グロブリン重鎖遺伝子座はＢ細胞分化の間に再編成されて、重鎖可変部の第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）を構成するＶＨ、ＤおよびＪ領域が並置される。再編成過程の間に、ヌクレオチドの付加および欠失が、ＶＨ−Ｄ（Ｎ）およびＤ−Ｊ（Ｐ）の結合部で起こる。ＣＤＲ３領域重鎖遺伝子の多様性は、この領域を挟むプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲを実施して、ｍＲＮＡで評価した。得られた生成物はシークエンスゲル上で分離され、正常なレパートリーでは、ＣＤＲ３の平均長のまわりで、３ヌクレオチドすなわち１コドンずつ異なる断片長の正規分布を示す。特定のＢ細胞クローンの単一クローン拡大の場合には、ＩＩ型クリオグロブリン血症において起こり得るように、シークエンスゲル上のあるバンドが、過剰発現しているように見える可能性がある。観察されたクローン拡大バンドを、シークエンスゲルから切り取り、直接サイクルシークエンシングに供した。配列をＧｅｎＢａｎｋ中の既知のＩｇ配列と比較した。
【００３７】
ＷＡ  ｍＲＦは、主に、ＩＧＫＶ３−２０（Ｋｖ３２５）軽鎖遺伝子およびＩＧＨＶ１−６９を含むＶＨ１遺伝子および関連生殖細胞遺伝子の生成物であるが、ＶＨ３遺伝子（ＩＧＨＶ３−７）が使用されることもある（Ｋｎｉｇｈｔ  ＧＢ，ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１７８：１９０３−１１）。Ｄ領域配列の特徴は２タイプある。コンセンサス１（配列番号１）は、グルタミン酸で始まりプロリンで終わる、ＩＧＨＶ１−６９遺伝子と通常はＪＨ４とに関連した９〜１１個のアミノ酸領域であるが、ＩＧＨＤ４−１７遺伝子に由来すると考えられる（Ｋｎｉｇｈｔ  ＧＢ，ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１７８：１９０３−１１）。コンセンサス２（配列番号２）は、最初は、ＷＡ  ＲＦを含有するＶＨ３−７、Ｍ７中に見出され（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号，ＵＯ３４００およびＵＯ３４０１）、その後、ＪＨ３およびＩＧＫＶ３−１５（ｋｖ３２８）と結合した他のＶＨ３−７  ＲＦに関連して見出された（Ｂｏｒｒｅｔｚｅｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５５：３６３０−７）。
【００３８】
全細胞ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＲｎｅａｓｙ  ＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いる抽出により末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。ＲＴ−ＰＣＲは、以前の記載どおりに実施した（Ｋｎｉｇｈｔ  ＧＢ，ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１７８：１９０３−１９１１）。ＣＤＲ３多様性を検討するための最初のフィンガープリントスクリーニングは、ＦＷ３の保存領域およびμ−定常領域由来のプライマーを使用して実施した。ＶＨ−Ｄ−ＪＨのＰＣＲ生成物は、定常領域プライマーを用い、ＶＨリーダーから上流のオリゴヌクレオチドおよびＦＷ１領域を使用して得た。ＶＫ−ＪＫ断片は、ＶＫリーダーから上流のオリゴヌクレオチドおよびＫ定常領域から下流のプライマーを使用して増幅した。各ＲＴ−ＰＣＲにおける一方のプライマーを、アンプリコンの単離用にビオチンで標識するか、またはＡＢＩ３７７自動ＤＮＡシークエンサーおよびＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）ソフトウェアを使用する、オリゴクローナルバンドの迅速スクリーニング用に６−ＦＡＭで標識した。ＰＣＲ生成物を、６％シークエンスゲル上で電気泳動的に分離して、毛管転写（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）によりＴｒｏｐｉｌｏｎ−ｐｌｕｓ膜（Ｔｒｏｐｉｘ）に転写し、化学発光により検出した。ケミルミグラフ上で観察されたクローン拡大バンドをシークエンスゲルから切り取り精製した。単一クローン拡大Ｉｇの遺伝子は、Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーターまたはビオチン化学発光（Ｐｈｏｔｏｔｏｐｅ−ｓｔａｒ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、ＡＢＩ３７７自動ＤＮＡシークエンサーを使用する直接サイクルシークエンシングに供した。得られたＩｇ遺伝子の推定アミノ酸配列およびＧｅｎＢａｎｋデータベース中のＩｇ配列を、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーバを使用して比較分析した。
【００３９】
統計分析
個体群統計学的特徴および臨床的特徴を各群について要約し、度数（性別）ならびに平均および標準偏差（連続変数）として提示した。ＢＣＥおよびＷＡ  ＢＣＥを有する患者数も表にし、各拡大型の保有率を、フィッシャー直接検定を使用して、目的のキー群間で比較した。０．０５以下のｐ値を、群間の保有率の差が有意であると結論するための閾値として使用した。
【００４０】
個体群統計学的データおよび検査データを、下記の表１に要約する。ＢＣＥの方法論を、クリオグロブリン血症性血管炎患者１０人に由来する陽性および陰性の対照検体を使用して試験した。陽性および陰性の対照群は、６人のＨＣＶ感染患者（ＨＣＶ＋、ＩＩ型）および４人のＨＣＶ陰性患者（ＨＣＶ−、ＩＩ型）からそれぞれなっていた（表２）。ＢＣＥは、クリオグロブリン血症性血管炎患者について予想されるように、両群のすべての患者で見出された。ＷＡ  ＢＣＥは、検出したＢＣＥの配列分析により同定した（図１、表３）。ＨＣＶ＋、ＩＩ型群の６人の患者のうちの４人がＷＡ  ＢＣＥを有していた。この発見は、クリオグロブリン血症性血管炎を罹患したＨＣＶ感染患者におけるＷＡ  ｍＲＦの以前に報告された保有率と一致していた（Ｃａｓａｔｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｂｌｏｏｄ，９０：３８６５−３８７３）。ＨＣＶ−、ＩＩ型群の中にはＷＡ  ＢＣＥを有する者はおらず、ＷＡ  ｍＲＦがＨＣＶ感染患者に限定されることが確認された。
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【００４１】
無症候性ＨＣＶ感染患者にＷＡ  ＢＣＥを検出することができるか否かを明らかにするために、５５人の無症候性ＨＣＶ感染患者（ＨＣＶ＋）群および３３人のＨＣＶ陰性患者（ＨＣＶ−）群を検査した。ＢＣＥは、ＨＣＶ＋群において９人（１４％）の患者に検出された。この群の４人（７．４％）の患者がＷＡ  ＢＣＥを有していた。クリオグロブリンもＲＦもこれらの患者の血清には検出されなかった。医療記録の調査により、クリオグロブリン血症性血管炎を有する患者も他の肝外症候を有する患者もいないことが確認された。非ＷＡ  ＢＣＥを有する５人の患者のうち、１人の患者はクリオグロブリンもＲＦも有しておらず、１人の患者は、クリオグロブリン血症性血管炎に関連していないＲＦ陰性ＩＩ型クリオグロブリン血症を罹患しており（Ｄｅ  Ｒｏｓａ  ＦＧ  ａｎｄ  Ａｇｎｅｌｌｏ  Ｖ，２００９  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，３６：１９５３）、３人の患者は血清ＲＦが弱い陽性（２１．７、２３．７および４０．９ＩＵ／ｍｌ）であった。ＨＣＶ陰性群では、ＢＣＥを有する患者はいなかった。
【００４２】
ＷＡ  ＢＣＥを有する患者の中に症候性の者はいなかったが、１人の患者（患者１２７、表３）では、絨毛リンパ球が末梢血中に存在し、リンパ腫の臨床的徴候も症候もなかったが、Ｂリンパ球表現型が脾リンパ腫と一致していた。免疫表現型検査により、Ｂ細胞単一クローン集団がＩｇＭ＋、Ｋ＋、ＩｇＤ−、ＣＤ１９＋、ＣＤ５−、ＣＤ１０−、ＣＤ２３−、ＣＤ１１ｃ＋、ＷＡ＋であることが示された。絨毛リンパ球は、末梢リンパ球の５％を構成していた。絨毛リンパ球はＣＤ１１ｃに関連しているので、ＣＤ１１ｃリンパ球を患者（患者１２７）の末梢リンパ球から単離した。フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡検査により、絨毛リンパ球と思われるＷＡ＋、ＣＤ１１ｃ＋Ｂ細胞の単一クローン集団が実証された。この発見は、絨毛リンパ球の一部がＷＡ  Ｂ細胞である可能性を示唆した。
【００４３】
核酸配列解析は２７個のＢＣＥのうちの２２個について実施した（表３）。混入配列のために５個のＢＣＥは分析することができなかった。２２個のＢＣＥのうちの１３個はＷＡ配列を有していた。１０個はコンセンサス１のＤ領域配列を有し、３個はコンセンサス２配列を有していた。後者のうちの２個はＩＧＨＶ３−７ではなくＩＧＨＶ１−６９で再結合されていた。１個のＢＣＥはＩＧＫＶ３−１５軽鎖配列を有し、残りは、ＷＡ  ｍＲＦで最も一般的に見出される軽鎖配列であるＩＧＫＶ３−２０を有していた。ＷＡ以外の配列が７個あった。７個すべてがＤ領域遺伝子を除いてＷＡに類似したＩｇ遺伝子を有していた。既知ＲＦのいずれにも、ＨＣＶ感染において同定された唯一の他の単一クローン性タンパク質である抗ＨＣＶ  Ｅ２エンベロープタンパク質Ｅ２（Ｑｕｉｎｎ  ＥＲ，ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｂｌｏｏｄ，９８：３７４５−４９）にも相同性がなかった。４個は、ＧｅｎＢａｎｋの既知Ｉｇ配列と有意なＤ領域相同性を示さず、１個は、記憶Ｂ細胞で見出されたＩｇ（Ｓｔｅｉｎ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｂｌｏｏｄ，９４：２８００−８）と弱い相同性を示し、２個は、胎児Ｉｇ（Ｚｅｍｌｉｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｂｌｏｏｄ，９７：１５１１−１３）と有意な相同性を示した。
【００４４】
ＨＣＶ感染期間の延長に伴い、多クローン性ＲＦのＩＩＩ型クリオグロブリン（多クローン性ＩｇＧおよび多クローン性ＩｇＭ  ＲＦ）がＩＩ型クリオグロブリンに移行することによりｍＲＦが生じると仮定された（Ｌｕｎｅｌ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０６：１２９１−３００；Ｓｃｈｉｆｆｅｒｌｉ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ａｄｖ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｎｅｃｋｅｒ  Ｈｏｓｐ，２４：１０７−２９）。この「移行」仮説は、ＲＦもクリオグロブリン血症もない患者と比較して、ＲＦを有する患者およびＩＩＩ型クリオグロブリン血症の患者においてＷＡ  ＢＣＥの保有率が増加することを予測する。
【００４５】
ＷＡ  ＢＣＥの保有率がＲＦを有するＨＣＶ感染患者の間で増加するか否かを明らかにするために、血液中にＲＦを有するが、クリオグロブリン血症（ＨＣＶ＋、ＲＦ）ではない３７人の無症候性ＨＣＶ感染患者群を検査した（表２）。この群の７人の患者（１８．９％）がＢＣＥを有し、５人（１３．５％）がＷＡ  ＢＣＥを有していた。ＨＣＶ＋、ＲＦ群におけるＢＣＥおよびＷＡ  ＢＣＥの保有率は、ＨＣＶ＋群よりも有意に高いものではなかった（ＢＣＥおよびＷＡ  ＢＣＥについて、それぞれｐ＝０．７８およびｐ＝０．４８）。
【００４６】
ＢＣＥおよびＷＡ  ＢＣＥの保有率が、ＩＩＩ型クリオグロブリン血症（ＨＣＶ＋、ＩＩＩ型）に罹患したＨＣＶ感染患者の間で増加したか否かを明らかにするために、ＩＩＩ型クリオグロブリンを有する１４人の患者を検査した（表２）。１人のみがＢＣＥ（非ＷＡ  ＢＣＥ）を有していた。ＨＣＶ＋、ＩＩＩ型群におけるＢＣＥおよびＷＡ  ＢＣＥの保有率は、ＨＣＶ＋群よりも有意に高いものではなかった（ＢＣＥおよびＷＡ  Ｂ細胞について、それぞれｐ＝０．６７およびｐ＝０．５８）。
【００４７】
無症候性ＨＣＶ感染患者においてＷＡ  ＢＣＥが検出されたことにより、ＷＡ  Ｂ細胞が、クリオグロブリン血症性血管炎およびＢ細胞悪性腫瘍の発症マーカーになることが示される。上記のように、この主張を支持して、ＷＡ  Ｂ細胞マーカーが、絨毛リンパ球を有する脾リンパ腫と一致する単一クローン性Ｂ細胞集団を有する患者（患者１２７）に検出された。この患者が臨床的脾リンパ腫に進行したと仮定すると、偶然にこのような患者を発見する確率は、以下の有病率、すなわち米国のＨＣＶ感染（約１％）、ＨＣＶ感染におけるＷＡ  ＢＣＥ保有率（７．５％）、非ホジキンズリンパ腫（ＮＨＬ）の有病率（０．１％）および脾リンパ腫の有病率（ＮＨＬの１５％未満）が独立している場合、約１０００万分の１になる。さらに、血液中の絨毛リンパ球がＷＡ  Ｂ細胞であったので、この患者は情報価値があった。絨毛リンパ球を伴う脾リンパ腫は、ＩＩ型クリオグロブリン血症（ｃｒｙｏｂｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）およびＨＣＶ感染に関連していると仮定される（Ｓａａｄｏｕｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｂｌｏｏｄ，１０５：７４−６）。上に提示した結果は、ＨＣＶ感染患者における脾リンパ腫の一部にある絨毛リンパ球がＷＡ  Ｂ細胞であることを示す。
【００４８】
ＷＡ  ＢＣＥは、ＨＣＶ感染患者に検出されたＢＣＥの約半分を占めた。非ＷＡ  ＢＣＥの配列は同定しなかった。これらの配列は、既知ＲＦのいずれにも有意なＤ領域相同性を示さなかったので、ＲＦとは無関係であった。さらに、これらの配列は、ＨＣＶ感染において同定された、ＷＡ  ｍＲＦ以外の唯一の単一クローン性タンパク質である抗ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ２（Ｑｕｉｎｎ  ＥＲ，ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｂｌｏｏｄ，９８：３７４５−４９）とも無関係であった。Ｄ領域相同性はなかったが、非ＷＡ  ＢＣＥにおける他のＩｇ遺伝子はすべて、ＷＡ遺伝子に類似していた。ＷＡ  ｍＲＦをコードするＩｇ遺伝子は、自然宿主防御免疫グロブリン応答で利用される。これらの遺伝子は、胎児およびＢ細胞記憶Ｉｇレパートリー中にも見出され（Ｋｌｅｉｎ  Ｕ，ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｂｌｏｏｄ，８９：１２８８−９８）、このことは、非ＷＡ  ＢＣＥのうちの３個で見出されたこれらの免疫グロブリンに対する相同性を説明することができる。ＨＣＶ感染におけるＢＣＥの原因に関する最も可能性の高い説明は、この感染において、この疾患の特徴である長期間の感染に伴い、刺激され拡大する多種多様な自然免疫グロブリンが生成されることである。
【００４９】
これまでの研究では、ＢＣＥを有するＨＣＶ感染患者すべての血清中にＲＦが存在したため、著者は、このクローンがＲＦを生成したと結論した（Ｆｒａｎｚｉｎ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ，９０：５４８−５２）。この研究では、ＲＦを有さない患者の血清中にＢＣＥを検出したことおよびＲＦを有する患者においてＲＦに対して有意な相同性がないＢＣＥを検出したことによって、その結論に反証する。さらに、同研究では、ＩＩＩ型クリオグロブリンを有するＨＣＶ感染患者にＢＣＥを検出しなかった。後者の発見は、この研究の発見と共に、ＩＩ型クリオグロブリンがＩＩＩ型クリオグロブリンから生じるという広く保持された考えに反する証拠を提供する。
【００５０】
現在、ＨＣＶ感染患者の約２％が抗ウイルス治療により処置される（Ｖｏｌｋ  ＭＬ，ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｈｅｐａｔｏｌ，５０：１７５０−５５）。クリオグロブリン血症性血管炎またはＢ細胞悪性腫瘍を発症する患者が抗ウイルス治療を受ける確率は、それぞれ５００分の１未満および５０００分の１未満である。自動ハイスループットシークエンサーにより、本明細書に記載の方法論の臨床応用が実行可能になる。例えば、ＨＣＶの日常的な遺伝子型決定は、コスト効率のよいハイスループット配列分析により実施される。さらに、抗ＷＡ  Ｘｉｄ抗体を使用して、ＷＡ  Ｘｉｄを検出する方法（上記に患者１２７について記載しているように）は、より簡便で臨床適用可能な方法論を提供する。
【００５１】
この研究では、ＨＣＶ感染患者に検出されたＢＣＥの５６％がＷＡ  ＢＣＥであり、これは、ＨＣＶ感染患者におけるＷＡ  Ｂ細胞悪性腫瘍の有病率の妥当な評価となる可能性がある。現在、ＷＡ  ＸｉｄのみがＢ細胞悪性腫瘍中に同定され、ＨＣＶ感染に関連したＮＨＬの２５％がＷＡ  Ｂ細胞であった。ＨＣＶ感染に関連した、全部でなければ大部分のＷａｌｌｅｎｓｔｒｏｍのマクログロブリン血症および脾リンパ腫がＷＡ  Ｂ細胞に由来する可能性は高い（Ａｇｎｅｌｌｏ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．１９９２  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３２７：１４９０−５；Ｃａｓａｔｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｂｌｏｏｄ，９９：２２５９−６１）。大集団についてアウトカム研究が実施されると、上記のＸｉｄ分析の方法により、Ｂ細胞悪性腫瘍に進行する他のＢＣＥが同定される。
【００５２】
本明細書に記載の方法は、ＢＣＥを有する無症候性ＨＣＶ患者の同定および処置を可能にする。本明細書に記載の方法はまた、ＷＡ  Ｂ細胞および他のＢ細胞増殖の早期検出も可能にし、この早期検出はＨＣＶ感染患者におけるクリオグロブリン血症性血管炎およびＢ細胞悪性腫瘍の予防および処置に有用である。これらの患者のＢ細胞悪性腫瘍におけるＸｉｄの同定は、代替治療法も提供する。例えば単一クローン性（ｍＡｂ）抗Ｘｉｄは治療薬として使用され、例えば抗ＷＡ  ｍＡｂは抗ウイルス治療に反応しないＷＡ  Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するために使用される。
【００５３】
他の実施形態
本発明はその詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は、例示することを意図するものであり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。他の態様、利点および修正は以下の特許請求の範囲内にある。
【００５４】
本明細書に引用した特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を定める。本明細書に引用した米国特許および公開または未公開の米国特許出願はすべて、参照によって組み込むものとする。本明細書に引用した公開外国特許および特許出願はすべて、参照によって組み込むものとする。本明細書に引用の受託番号により示したＧｅｎｂａｎｋおよびＮＣＢＩの寄託は、参照によって組み込むものとする。本明細書に引用した他の出版された参考文献、文書、論文および科学文献は、参照によって組み込むものとする。
【００５５】
本発明をその好ましい実施形態に関連して具体的に示し、説明してきたが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その形態および細部を様々に変更することができることを、当業者は理解されよう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【国際調査報告】
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