(57)【要約】  肺サンプルにおけるプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥ）活性が、肺サンプルと、−Ｐ−Ｘ−（または、−Ｘ−Ｐ−、−Ｐ−Ｘ−Ｐ−）のＰＥ認識部位（式中、Ｐはプロリルバイオアイソスター（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）であり、Ｘは、プロリルバイオアイソスターでない残基であるか、または、プロリルバイオアイソスターでない残基がその両側のそれぞれの側に配置されるプロリルバイオアイソスターであり、かつ、「−」はアミド結合である）を含むプローブとを、サンプルのＰＥ活性が認識部位のアミド結合を特異的に加水分解して、光学的シグナルを生じさせる条件のもとで接触させること；および（ｂ）シグナルを検出することによって検出される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺サンプル中のプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥ）活性を検出する方法であって、
（ａ）前記サンプルを、−Ｐ−Ｘ−または−Ｐ−Ｘ−Ｐ−のＰＥ認識部位（式中、Ｐはプロリルバイオアイソスター（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）であり、Ｘは、プロリルバイオアイソスターでない残基であるか、または、プロリルバイオアイソスターでない残基がその両側のそれぞれの側に配置されるプロリルバイオアイソスターであり、かつ、「−」はアミド結合である）を含むプローブと、前記サンプルのＰＥ活性が前記認識部位のアミド結合を特異的に加水分解して、光学的シグナルを生じさせる条件のもとで接触させること；および
（ｂ）前記シグナルを検出すること
を含む方法。
【請求項２】
前記プローブが−Ｐ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−のＰＥ認識部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｘが、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、ＨまたはＧである、請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
Ｘが、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、ＨまたはＧがその両側のそれぞれの側に配置されるプロリルバイオアイソスターである、請求項１に記載のプローブ。
【請求項５】
前記プロリルバイオアイソスターが、置換されていてもよいプロリン、ホモプロリン、ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、アミノプロリン、５，６−ベンゾホモプロリン、アルキルプロリン、Ｎ−メチルアミノ酸およびデカヒドロイソキノリンカルボキシラートから選択される、請求項１に記載のプローブ。
【請求項６】
Ｘがアミノルシフェリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブがさらに親水性成分を含み、かつ、前記プローブが水溶性である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブが内部で消光される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記認識部位の一方の末端が第１の発色団に機能的に連結され、かつ、前記認識部位の反対側の末端が、前記第１の発色団を消光する第２の発色団に機能的に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記認識部位の一方の末端がＦＲＥＴドナーに機能的に連結され、かつ、前記認識部位の反対側の末端がＦＲＥＴアクセプターに機能的に連結され、かつ、前記ドナーおよびアクセプターが、グリシン、セリン、セリンおよび／またはグリシンのペプチド、ミニＰＥＧ（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸または１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン酸）、あるいは、線状脂肪族アルファ−アミノ酸であるリンカーを介して独立して機能的に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブのタンパク質分解により、基質が生じ、かつ、前記サンプルをさらに、前記基質と反応して前記シグナルを生じさせる酵素と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが、肺疾患を有する患者の気管支肺胞洗浄液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記肺が、真菌感染症、細菌感染症、寄生虫感染症またはウイルス感染症である肺感染症である疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記肺が、非感染性の炎症性疾患である疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記肺が、浸襲性アスペルギスル症である疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記接触させる工程および検出する工程が、異なるＰＥプローブを用いて繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触させる工程および検出する工程が、肺サンプル毎に異なるＰＥプローブを用いて繰り返され、前記サンプルの間でのＰＥ活性における１つまたはそれ以上の違いが検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
複数の生物学的サンプルまたは生理学的サンプルのそれぞれにおけるプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥ）活性を検出する方法であって、
（ａ）それぞれのサンプルを、−Ｐ−Ｘ−または−Ｐ−Ｘ−Ｐ−のＰＥ認識部位（式中、Ｐはプロリルバイオアイソスター（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）であり、Ｘは、プロリルバイオアイソスターでない残基であるか、または、プロリルバイオアイソスターでない残基がその両側のそれぞれの側に配置されるプロリルバイオアイソスターであり、かつ、「−」はアミド結合である）をそれぞれのプローブが含む一連の異なるプローブと、前記サンプルのＰＥ活性が前記認識部位のアミド結合を特異的に加水分解して、光学的シグナルを生じさせる条件のもとで接触させること；および
（ｂ）それぞれのサンプルから生じたシグナルを検出し、比較して、前記サンプルの間でのＰＥ活性における違いを検出すること
を含む方法。
【請求項１９】
−Ｐ−Ｘ−または−Ｐ−Ｘ−Ｐ−のＰＥ認識部位（式中、Ｐはプロリルバイオアイソスター（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）であり、Ｘは、プロリルバイオアイソスターでない残基であるか、または、プロリルバイオアイソスターでない残基がその両側のそれぞれの側に配置されるプロリルバイオアイソスターであり、かつ、「−」はアミド結合である）を含み、前記認識部位の一方の末端が第１の発色団に機能的に連結され、かつ、前記認識部位の反対側の末端が第２の発色団に機能的に連結され、前記認識のアミド結合がＰＥにより加水分解されることにより、光学的シグナルが生じる、プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥ）活性のための内部消光型蛍光発生プローブ（ＩＱＦＰ）。
【請求項２０】
前記発色団が、グリシン、セリン、セリンおよび／またはグリシンのペプチド、ミニＰＥＧ（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸または１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン酸）、あるいは、線状の脂肪族アルファ−アミノ酸（例えば、６−アミノキセキサノン酸（ａｍｉｎｏｘｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））であるリンカーを介して前記認識部位に独立して機能的に連結される、請求項１９に記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本研究はＮＩＡＩＤからの補助金番号Ｒ２１ＡＩ０８５４０２によって援助された。政府は本発明において一定の権利を有する。
本出願は米国特許出願第６１／３８２，３１５号（２０１０年９月１３日出願）の優先権を主張する。
本発明の分野はプロリルエンドペプチダーゼプローブおよび使用方法である。
【背景技術】
【０００２】
不良な診断は、感染性疾患に苦しむ患者のための処置選択肢を決めるときには大きな問題である。既存の病原体および出現した病原体を確実に検出するための高感度かつ特異的なアッセイが求められている。
【０００３】
本発明は、感染患者の生物学的サンプルに加えられたとき、シグナル生成（例えば、蛍光）をもたらすペプチド型プローブを使用することに関する。本発明は、シグナチャーとなるタンパク質分解活性をヒト宿主の生物学的流体において検出するために蛍光に基づくアッセイにおいて使用することができる特異的なペプチド型蛍光発生プローブの特定および調製を可能にする。本発明者らは、タンパク質分解活性を、個体の健康状態を迅速かつ正確に評価するためのバイオマーカーとして立証している。
【０００４】
本発明は、様々な感染性疾患を高い感度および特異性により検出するための全く新しいクラスのインビトロ診断を提供する。医療提供者はそれらの診断基盤の一部として本発明を効果的に使用することができる。本発明のプローブはまた、治療をモニターするために使用することができ、この場合、早期の診断および処置により、死亡率を多くの感染性疾患について半減させことができるであろう。
【０００５】
本開示の様々な態様が、本発明者らによって、Ｗａｔｓｏｎ他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５１、９５〜１０４（２０１１年８月）、および、Ｗａｔｓｏｎ他、ＰＬｏｓ  ＯＮＥ（２０１１年６月）、６、６（ｅ２１００１）において公開された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗａｔｓｏｎ他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５１、９５〜１０４（２０１１年８月）
【非特許文献２】Ｗａｔｓｏｎ他、ＰＬｏｓ  ＯＮＥ（２０１１年６月）、６、６（ｅ２１００１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥ）活性を肺サンプルにおいて検出する方法を提供する。
【０００８】
１つの実施形態において、本方法は下記の工程を含む：（ａ）サンプルと、−Ｐ−Ｘ−（または−Ｘ−Ｐ−または−Ｐ−Ｘ−Ｐ−）のＰＥ認識部位（式中、Ｐはプロリルバイオアイソスター（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）であり、Ｘは、プロリルバイオアイソスターでない残基であるか、または、プロリルバイオアイソスターでない残基がその両側のそれぞれの側に配置されるプロリルバイオアイソスターであり、かつ、「−」はアミド結合である）を含むプローブとを、サンプルのＰＥ活性が認識部位のアミド結合を特異的に加水分解して、光学的シグナルを生じさせる条件のもとで接触させる工程；および（ｂ）シグナルを検出する工程。
【０００９】
特定の実施形態において：
プローブは、−Ｐ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−または−Ｐ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−Ｐ−のＰＥ認識部位を含み、特にこの場合、Ｘは、プロリルバイオアイソスターでない残基である；
Ｘが、キラルな（Ｇ以外の）アミノ酸である；
Ｘが、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、ＨまたはＧである。
【００１０】
Ｘが天然型または非天然型のＬ型またはＤ型のアミノ酸（好ましくは、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＨ）である；
Ｘが、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、ＨまたはＧがその両側のそれぞれの側に配置されるプロリルバイオアイソスターである；
Ｘが、天然型または非天然型のＬ型またはＤ型のアミノ酸（好ましくは、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＨ）がその両側のそれぞれの側に配置されるプロリルバイオアイソスターである；
プロリルバイオアイソスターが、プロリン、デヒドロプロリン、ホモプロリン、Ｎ−メチルアミノ酸およびデカヒドロイソキノリンカルボキシラート（ただし、これらのそれぞれが置換されていてもよい）から選択される；
Ｘがアミノルシフェリンである；
プローブはさらに親水性成分を含み、かつ、プローブは水溶性である：
プローブは内部で消光される；
認識部位の一方の末端が第１の発色団（例えば、ＦＲＥＴドナーまたは蛍光団など）に機能的に連結され、かつ、認識部位の反対側の末端が第２の異なる発色団（例えば、ＦＲＥＴアクセプターまたは消光成分など）に機能的に連結され、特にこの場合、これらの発色団は、グリシン、セリン、セリンおよび／またはグリシンのペプチド、ミニＰＥＧ（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸または１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン酸）、あるいは、線状脂肪族アルファ−アミノ酸であるリンカーを介して認識部位に独立して機能的に連結される；
プローブのタンパク質分解により、基質が生じ、かつ、サンプルがさらに、この基質と反応して上記シグナルを生じさせる酵素と接触させられる；
サンプルが、肺疾患（具体的には、真菌感染症、細菌感染症、寄生虫感染症またはウイルス感染症）を有する患者の気管支肺胞洗浄液である；
肺が、慢性または急性の炎症性疾患を含めて、非感染性の炎症性疾患である疾患を有する；および／または
接触させる工程および検出する工程が、異なるＰＥプローブを用いて、具体的には、肺サンプル毎に異なるＰＥプローブを用いて繰り返され、ただし、この場合、本方法により、サンプルの間でのＰＥ活性における１つまたはそれ以上の違いが求められる；
本発明はまた、プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥ）活性を複数のサンプルのそれぞれにおいて検出する方法を提供する。１つの実施形態において、本方法は下記の工程を含む：（ａ）それぞれのサンプルと、−Ｐ−Ｘ−（または−Ｐ−Ｘ−Ｐ−）のＰＥ認識部位（式中、Ｐはプロリルバイオアイソスターであり、Ｘは、プロリルバイオアイソスターでない残基であるか、または、プロリルバイオアイソスターでない残基がその両側のそれぞれの側に配置されるプロリルバイオアイソスターであり、かつ、「−」はアミド結合である）をそれぞれのプローブが含む一連の異なるプローブとを、サンプルのＰＥ活性が認識部位のアミド結合を特異的に加水分解して、光学的シグナルを生じさせる条件のもとで接触させる工程；および（ｂ）それぞれのサンプルから生じたシグナルを検出し、比較して、サンプルの間でのＰＥ活性における違いを求める工程。
【００１１】
本発明はまた、上記方法に適合化されるプローブを提供する。１つの実施形態において、本発明は、−Ｐ−Ｘ（または−Ｐ−Ｘ−Ｐ−）のＰＥ認識部位（式中、Ｐはプロリルバイオアイソスターであり、Ｘは、プロリルバイオアイソスターでない残基であるか、または、プロリルバイオアイソスターでない残基がその両側のそれぞれの側に配置されるプロリルバイオアイソスターであり、かつ、「−」はアミド結合である）を含み、認識部位の一方の末端がＦＲＥＴドナーに機能的に連結され、かつ、認識部位の反対側の末端がＦＲＥＴアクセプターに機能的に連結され、認識のアミド結合がＰＥにより加水分解されることにより、光学的シグナルが生じる、プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥ）活性のための内部消光型蛍光発生プローブ（ＩＱＦＰ）を提供する。
【００１２】
特定の実施形態において、ドナーおよびアクセプターは、グリシン、セリン、セリンおよび／またはグリシンのペプチド、ミニＰＥＧ（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸または１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン酸）、あるいは、線状脂肪族アルファ−アミノ酸であるリンカーを介して独立して機能的に連結される。
【００１３】
本発明はまた、上記プローブを作製し、開示された方法（診断方法、特徴づけ方法およびスクリーニング方法を含む）において使用する方法を提供する。
【００１４】
本発明は、列挙された特定の実施形態のすべての組合せおよび部分的組合せを、それぞれの組合せおよび部分的組合せが具体的かつ別個に列挙されていたかのように提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】浸襲性アスペルギスル症を検出するための蛍光発生プローブの一般構造である。
【図２】ＢＡＬＦのＩＱＦＰアッセイ（ＰＮＰ）である。
【図３】ＢＡＬＦのＩＱＦＰアッセイ（ＰＹＰ）である。
【図４】ＢＡＬＦアッセイ（ＰＹＰ）である。
【図５】ＢＡＬＦ対血清である。
【図６】感染対非感染である。
【図７】図７Ａは、ＢＡＬＦによって切断される配列のアミノ酸分布である。図７Ｂは、血清によって切断される配列のアミノ酸分布である。図７Ｃは、ＢＡＬＦによって切断されるモチーフである。図７Ｄは、血清によって切断されるモチーフである。図７Ｅは、ＢＡＬＦプロテアーゼ切断部位の分布である。図７Ｆは、ＢＡＬＦ血清切断部位の分布である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１つの実施形態において、本発明は、特異的な配列を有し、かつ、３個〜１０個のアミノ酸からなるプロテアーゼ基質を含むペプチド型プローブを提供する。このペプチド配列のどちら側にも、発色団および／または蛍光団が位置する。このプローブは、健康な患者の生物学的流体に加えられたときには光学的に沈黙したままであり、しかし、感染患者の生物学的流体に加えられたときには、典型的には３００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲における放射を伴う蛍光シグナルを放射する。アッセイ可能な生物学的流体には、血清および気管支肺胞洗浄液、同様にまた、尿、血液、血漿および唾液が含まれる。肺由来のサンプルを、生検サンプル、ＢＡＬＦなどから得ることができる。本発明のプローブは、真菌性疾患（例えば、浸襲性アスペルギスル症など）、同様にまた、細菌性疾患（例えば、結核、ＭＲＳＡなど）、寄生虫性疾患（例えば、リーシュマニア症、シャーガス病）およびウイルス性疾患（例えば、Ｈ１Ｎ１、ＳＡＲＳ）を検出するために使用することができる。
【００１７】
本発明は一般には、インビトロ診断産業において適用可能である。具体的には、一連の複数の蛍光発生プローブを、様々な病原性状態を並行して検出するために使用することができる。これらのプローブはまた、感染のレベル（例えば、侵入対局在化）、抗菌剤に対する応答（例えば、回復）を検出するために、また、個体の一般的健康状態を診断するために使用することができる。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明は、プロテアーゼ活性をルミネセンスによって検出することを、感染の診断または他の使用のために、例えば、感染患者の生物学的流体に加えられ、その後、組換え酵素（例えば、ルシフェラーゼなど）が連続して加えられたときにはルミネセンスの生成をもたらすペプチド型プローブを使用する感染の診断または他の使用のために提供する。このペプチド型プローブは、特異的な配列を有し、かつ、３個〜１０個のアミノ酸からなるプロテアーゼ基質からなる。本プローブは、発光性基質（例えば、アミノルシフェリンなど）を基質配列内に、あるいは、Ｎ末端またはＣ末端での隣接領域においてそのどちらかで含有する。基質が１つまたは複数のプロテアーゼによって切断されることにより、発光性基質の遊離が生じ、この場合、この発光性基質は組換え酵素によって化学修飾され、これにより、光の生成をもたらす。このプローブは、健康な患者の生物学的流体に加えられたときには光学的に沈黙したままであり、しかし、感染患者の生物学的流体に加えられたときには、３００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲のどこかで放射を伴う発光シグナルを放射する。本発明のプローブは、真菌性疾患（例えば、浸襲性アスペルギスル症など）、同様にまた、細菌性疾患（例えば、結核、ＭＲＳＡなど）、寄生虫性疾患（例えば、リーシュマニア症、シャーガス病）およびウイルス性疾患（例えば、Ｈ１Ｎ１、ＳＡＲＳ）を検出するために有用である。
【００１９】
この態様の具体的な一例がプローブ配列ＧＧＧＰＡｌｕｃＰＧＧＫＫである（式中、Ａｌｕｃはアミノルシフェリンに対応し、すべての他の文字は一文字コードによる天然型アミノ酸に対応する）。この配列がエンドペプチダーゼによって切断されることにより、ペプチドフラグメントＡｌｕｃＰＧＧＫＫが生じる。プロテアーゼによるその後の切断により、Ａｌｕｃ成分が遊離し、この場合、このＡｌｕｃ成分はルシフェラーゼ酵素の添加によってアミノオキシルシフェリンに変換され、これにより、光の生成をもたらす。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明は、肺の感染または炎症を、標的化された治療または手術を容易にするために、例えば、肺内の感染または炎症の具体的領域をインビボで特定するための画像化技術を使用して、プロテアーゼ基質プローブにより画像化することを提供する。本発明は、レポーター成分に結合されるプロテアーゼ基質配列を含む造影剤を提供する。基質配列は、特定の感染（例えば、浸襲性アスペルギスル症など）または炎症状態（例えば、嚢胞性線維症など）の期間中に存在するプロテアーゼに対応する。造影剤は肺経路または静脈内経路によって投与される。基質配列が特異的プロテアーゼの存在下で切断されることにより、結合しているレポーターの活性化がもたらされる。レポーター様式の例としては、とりわけ、蛍光、ルミネセンス、ＰＥＴ、ＭＲＩおよびＳＰＥＣＴが挙げられる。この態様は、肺内の感染または炎症の具体的な局在化部位を、肺炎、気管支拡張症、肺気腫、結核、線維症、慢性閉塞性肺疾患および喘息を含めて多くの疾患について明らかにするために有用である。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明は、配列Ｘ−Ｐ−Ｘ−Ｐ−Ｘのペプチドを感染または炎症のためのバイオマーカーとして提供する。本発明者らは、プロリン−グリシン−プロリンの配列を有するペプチドを生じさせるプロテアーゼが肺の炎症状態（例えば、浸襲性アスペルギスル症および嚢胞性線維症など）において上昇することを見出している。これらのプロテアーゼによって生じる短いペプチドフラグメントの存在により、疾患の存在または程度についての有用なバイオマーカーが提供される。有用なペプチドは、Ｘ−Ｐ−Ｘ−Ｐ−Ｘを含む配列を含む（式中、Ｐはプロリンに対応し、Ｘは天然型アミノ酸または非天然型アミノ酸の任意の配列に対応する）。
【００２２】
１つの態様において、本発明は、下記の工程を含む、プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥ）活性を肺サンプルにおいて検出する方法を提供する：（ａ）サンプルと、−Ｐ−Ｘ−（または−Ｘ−Ｐ−または−Ｐ−Ｘ−Ｐ−）のＰＥ認識部位（式中、Ｐはプロリルバイオアイソスターであり、Ｘは、プロリルバイオアイソスターでない残基であるか、または、プロリルバイオアイソスターでない残基がその両側のそれぞれの側に配置されるプロリルバイオアイソスターであり、かつ、「−」はアミド結合である）を含むプローブとを、サンプルのＰＥ活性が認識部位のアミド結合を特異的に加水分解して、光学的シグナルを生じさせる条件のもとで接触させる工程；および（ｂ）シグナルを検出する工程。
【００２３】
特定の実施形態において、プローブは、−Ｐ−Ｘ−、−Ｘ−Ｐ−、−Ｐ−Ｘ−Ｐ−、−Ｐ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−または−Ｐ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−Ｐ−の認識部位を含み、ただし、式中、Ｘは、プロリルバイオアイソスターでない残基であり、好ましくは、プロリン以外の天然型アミノ酸（特に、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、ＨまたはＧ）である。Ｘはまた、隣接するアミド結合を介してペプチドに組み込まれ得る残基が可能である。そのようなアミノ酸代替物は、その安定性、溶解性または他の機能性を調節するために使用することができる。特定の実施形態において、上記残基はシグナルに寄与し、例えば、シグナル生成酵素基質を提供するなどし、例えば、アミノルシフェリンである。
【００２４】
プロリルバイオアイソスターは、プロリンの十分に確立された構造的かつ機能的なアナログであり（例えば、Ｓａｍｐｏｇｎａｒｏ他、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．、２０１０年９月１日；２０（１７）：５０２７〜３０）、本明細書中で使用されるプロリルバイオアイソスターは、プロリルエンドペプチダーゼのためのペプチドプローブにおいてプロリンの代わりに使用され得る。プロリルバイオアイソスターは、代替となり得る足場から作製することができ、例えば、プロリン、シクロペンテン、シクロヘキサン、ピロリジン、ピロリジノン、炭素環式基、非環式基および４−フェニル−２−カルボキシ−ピペラジンなどから作製することができる（例えば、Ｎｉｌｓｓｏｎ他、Ｊ  Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ、２００１年１１月／１２月、３（６）：５４６〜５３；Ｔｈｏｒｓｔｅｎｓｓｏｎ、２００５、Ｌｉｎｋｏｅｐｉｎｇ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、学位論文第９９０号）。特定の実施形態において、プロリルバイオアイソスターは、プロリン、ホモプロリン、ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、アミノプロリン、５，６−ベンゾホモプロリン（Ｓｈｕｍａｎ他、Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ、１９９０、５５、７３８〜４１）、アルキルプロリン、Ｎ−メチルアミノ酸およびデカヒドロイソキノリンカルボキシラートから選択され、ただし、これらのそれぞれが、ヒドロキシ、ハロゲン、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアルケニル、置換または非置換のアルキニル、置換または非置換のアリールアルキル、置換または非置換のアミン、置換または非置換のアルキルアミン、置換または非置換のジアルキルアミン、置換または非置換のアルコキシ、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール、置換または非置換のアリールオキシ、置換または非置換のアルコキシ、置換または非置換のハロアルキル、ベンゾ、ＮＯ２、ＣＦ３、アリール、カルボキシル、シアノ、イソシアナートあるいはアルコキシカルボニルにより置換され得ることがある。
【００２５】
好適なプロリルバイオアイソスターの例としては、下記のものが挙げられる：
【００２６】
【表１】
2013540435.tif 000002
2013540435.tif 000003
2013540435.tif 000004
特定の実施形態において、プローブはさらに、その安定性、溶解性または他の機能性を調節するために、１つまたは複数のさらなる隣接配列を含む。特定の実施形態において、プローブは、水溶性を増大させるために、親水性成分（例えば、ポリリシン（例えば、ＫＫＫ）など）を含む。
【００２７】
特定の実施形態において、プローブは内部で消光され、ただし、特にこの場合、認識部位の一方の末端が蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ドナー（または蛍光団）に機能的に連結され、かつ、認識部位の反対側の末端がＦＲＥＴアクセプター（または消光成分）に機能的に連結される。他の実施形態において、認識部位の一方の末端が第１の発色団に機能的に連結され、かつ、認識部位の反対側の末端が第２の発色団に機能的に連結され、この場合、一方の発色団の蛍光放射がもう一方の発色団によって消光され、ただし、この消光は、ＦＲＥＴ、凝集、あるいは、接触または非接触の消光の他の機構によるものであり得る。特定の実施形態において、ドナーおよびアクセプター（または、蛍光団および消光成分、または、第１および第２の発色団）は、グリシン、セリン、セリンおよび／またはグリシンのペプチド、ミニＰＥＧ（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸または１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン酸）、あるいは、線状脂肪族アルファ−アミノ酸（例えば、６−アミノキセキサノン酸（ａｍｉｎｏｘｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））であるリンカーを介して独立して機能的に連結される。様々な代替となり得るＦＲＥＴ構造を、プローブのシグナル変換または他の機能性を調節するために組み込むことができる；例えば、特定の実施形態において、プローブは複数のドナーおよび／または複数のアクセプターを含む。
【００２８】
特定の実施形態において、サンプルは、肺疾患を有する患者の気管支肺胞洗浄液であり、例えば、肺の感染症または肺の炎症（特に、急性または慢性の健康状態、自己免疫疾患あるいは外傷の結果としての肺の炎症）などを有する患者の気管支肺胞洗浄液であり、また、特に、免疫が損なわれた患者におけるものである。特定の実施形態において、肺および／または患者は、真菌感染症（例えば、浸襲性アスペルギスル症）、細菌感染症（例えば、結核、ＭＲＳＡ）、寄生虫感染症（例えば、リーシュマニア症、シャーガス病）またはウイルス感染症（Ｈ１Ｎ１、ＳＡＲＳ）を有する。他の実施形態において、肺および／または患者は、慢性の炎症性疾患（例えば、慢性閉塞性肺障害、慢性喘息、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、肺線維症）または急性の炎症性疾患（外傷、急性喘息、過敏症）を含めて、非感染性の炎症性疾患である疾患を有する。
【００２９】
プローブのシグナルが、選択されたプローブ構造に依存して、好都合な手段によって検出され、そのような手段には、光学的シグナル検出（例えば、比色アッセイ、発光アッセイまたは蛍光に基づくアッセイ）、質量検出（例えば、質量分析法）または核検出（例えば、ＮＭＲ、ラジオグラフィー）が含まれる。様々なアッセイ形式を用いることができ、これらに、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、クロマトグラフィー、顕微鏡法などが含まれる。
【００３０】
本発明はまた、疾患の特徴づけおよび／または診断を行うためにプローブのライブラリーまたはパネルを使用する方法を提供し、特にこの場合、接触させる工程および検出する工程が、異なるＰＥプローブを用いて、具体的には、肺サンプル毎に異なるＰＥプローブを用いて繰り返され、本方法により、サンプルの間でのＰＥ活性における１つまたはそれ以上の違いが求められる。したがって、本発明は、疾患状態のバイオマーカーとしてのＰＥ活性を特に肺サンプルにおいて特異的に検出するプローブを特定する方法、および、２つ以上の異なったプロリルエンドペプチダーゼ酵素を区別するプローブを特定する方法を提供する。
【００３１】
特定の実施形態において、本発明は、プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥ）活性を複数のサンプルのそれぞれにおいて検出する方法を提供する。１つの実施形態において、本方法は下記の工程を含む：（ａ）それぞれのサンプルと、−Ｐ−Ｘ−（または−Ｐ−Ｘ−Ｐ−）のＰＥ認識部位（式中、Ｐはプロリルバイオアイソスターであり、Ｘは、プロリルバイオアイソスターでない残基であるか、または、プロリルバイオアイソスターでない残基がその両側のそれぞれの側に配置されるプロリルバイオアイソスターであり、かつ、「−」はアミド結合である）をそれぞれのプローブが含む一連の異なるプローブとを、サンプルのＰＥ活性が認識部位のアミド結合を特異的に加水分解して、光学的シグナルを生じさせる条件のもとで接触させる工程；および（ｂ）それぞれのサンプルから生じたシグナルを検出し、比較して、サンプルの間でのＰＥ活性における違いを求める工程。
【００３２】
本発明はまた、上記方法に適合化されるプローブを提供する。１つの実施形態において、本発明は、−Ｐ−Ｘ（または−Ｐ−Ｘ−Ｐ−）のＰＥ認識部位（式中、Ｐはプロリルバイオアイソスターであり、Ｘは、プロリルバイオアイソスターでない残基であるか、または、プロリルバイオアイソスターでない残基がその両側のそれぞれの側に配置されるプロリルバイオアイソスターであり、かつ、「−」はアミド結合である）を含み、認識部位の一方の末端がＦＲＥＴドナーに機能的に連結され、かつ、認識部位の反対側の末端がＦＲＥＴアクセプターに機能的に連結され、認識のアミド結合がＰＥにより加水分解されることにより、光学的シグナルが生じる、プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥ）活性のための内部消光型蛍光発生プローブ（ＩＱＦＰ）を提供する。
【００３３】
特定の実施形態において、ドナーおよびアクセプターは、グリシン、ポリグリシンまたはミニＰＥＧ（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸または１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン酸）、あるいは、線状脂肪族アルファ−アミノ酸（例えば、６−アミノキセキサノン酸）であるリンカーを介して独立して機能的に連結される。
【００３４】
本発明はまた、上記プローブを作製し、開示された方法（診断方法、特徴づけ方法およびスクリーニング方法を含む）において使用する方法を提供する。
【実施例】
【００３５】
実施例１．浸襲性アスペルギスル症を検出するための独特の蛍光発生プローブの具体的な例
浸襲性アスペルギスル症を検出するための独特の蛍光発生プローブの具体的な例としては、図１に示されるような「ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｘｌ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ」の形式での下記の配列が挙げられ、ただし、式において、ＭｅＯＣＧｌｙは７−メチルクマリン−４−アセチルグリシンに対応し、Ｄａｐ（Ｄｎｐ）はジアミノプロプリオニル（ジニトロフェニル）（ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｒｉｏｎｙｌ（ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ））に対応し、Ｘｌ〜Ｘ３は可変の天然型アミノ酸に対応する。すべての他の文字は、標準的な一文字コードによる天然型アミノ酸に対応する：
１）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｓ／Ｔ−Ｉ／Ｌ−Ｆ／Ｙ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
２）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｓ／Ｔ−Ｉ／Ｌ−Ｎ／Ｑ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
３）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｉ／Ｌ−Ｆ／Ｙ−Ｆ／Ｙ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
４）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ａ／Ｖ−Ｉ／Ｌ−Ｉ／Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
５）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ａ／Ｖ−Ｎ／Ｑ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
６）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ａ／Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
７）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｋ／Ｒ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
８）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｄ／Ｅ−Ｋ／Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
９）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｄ／Ｅ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
１０）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｎ／Ｑ−Ａ／Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
１１）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｎ／Ｑ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
１２）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｉ／Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
１３）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ／Ｔ−Ａ／Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
１４）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ／Ｔ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
１５）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ／Ｔ−Ｆ／Ｙ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
１６）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｆ／Ｙ−Ａ／Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
１７）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｆ／Ｙ−Ｋ／Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
１８）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｆ／Ｙ−Ｎ／Ｑ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
１９）ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｆ／Ｙ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ
浸襲性アスペルギスル症を検出するための独特の蛍光発生プローブのさらなる具体的な例としては、「ＭｅＯＣＧｌｙ−Ｘ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ」の形式での下記の配列が挙げられ、ただし、式において、ＭｅＯＣＧｌｙは７−メチルクマリン−４−アセチルグリシンに対応し、Ｄａｐ（Ｄｎｐ）はジアミノプロプリオニル（ジニトロフェニル）に対応し、Ｘは、標準的な一文字コードに従って指定されるような天然型アミノ酸の配列に対応する：
１）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＰＧＰＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
２）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＰＦＰＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
３）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＰＹＰＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
４）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＰＮＰＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
５）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＰＱＰＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
６）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＰＨＰＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
７）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＰＳＰＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
８）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＰＤＰＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
９）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＰＰＰＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
１０）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＰＰＦＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
１１）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＰＮＰＮＰＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
１２）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＰＮＰＧＰＮＰＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
１３）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＰＹＰＹＰＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
１４）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＰＹＰＧＰＹＰＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
１５）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＮＦＡＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
１６）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＮＦＶＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
１７）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＮＹＡＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
１８）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＮＹＶＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
１９）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＱＦＡＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
２０）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＱＦＶＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
２１）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＱＹＡＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
２２）ＭｅＯＣＧｌｙ−ＧＧＱＹＶＧＧＤａｐ（ＤＮＰ）ＫＫ−ＮＨ２
浸襲性アスペルギスル症を検出するための独特の蛍光発生プローブのさらなる具体的な例としては、「５（６）ＦＡＭ−Ｘ−Ｌｙｓ（５（６）ＴＭＲ−Ｋ−Ｋ」の形式での下記の配列が挙げられ、ただし、式において、５（６）ＦＡＭは５（６）−カルボキシフルオレセインに対応し、Ｌｙｓ（５（６）ＴＭＲはリシン（５（６）−テトラメチルローダミン）に対応し、Ｘは、標準的な一文字コードに従って指定されるような天然型アミノ酸の配列に対応する：
１）５（６）ＦＡＭ−ＧＧＧＰＧＰＧＧＬｙｓ（５（６）ＴＭＲ）ＫＫ−ＮＨ２
２）５（６）ＦＡＭ−ＧＧＧＰＦＰＧＧＬｙｓ（５（６）ＴＭＲ）ＫＫ−ＮＨ２
３）５（６）ＦＡＭ−ＧＧＧＰＱＰＧＧＬｙｓ（５（６）ＴＭＲ）ＫＫ−ＮＨ２
４）５（６）ＦＡＭ−ＧＧＧＰＮＰＧＧＬｙｓ（５（６）ＴＭＲ）ＫＫ−ＮＨ２
５）５（６）ＦＡＭ−ＧＧＧＰＹＰＧＧＬｙｓ（５（６）ＴＭＲ）ＫＫ−ＮＨ２
６）５（６）ＦＡＭ−ＧＧＧＰＮＰＮＰＧＧＬｙｓ（５（６）ＴＭＲ）ＫＫ−ＮＨ２
７）５（６）ＦＡＭ−ＧＧＧＰＮＰＧＰＮＰＧＧＬｙｓ（５（６）ＴＭＲ）ＫＫ−ＮＨ２
浸襲性アスペルギスル症を検出するための独特の蛍光発生プローブのさらなる具体的な例としては、「１，５ＥＤＡＮＳ−Ｘ−Ｌｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）−Ｋ−Ｋ」の形式での下記の配列が挙げられ、ただし、式において、１，５ＥＤＡＮＳは５−（２−アミノエチルアミノ）−１−ナフタレンスルホン酸に対応し、Ｌｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）はＬｙｓ（４−（ジメチルアミノアゾ）ベンゼン−４−カルボン酸）に対応し、Ｘは、標準的な一文字コードに従って指定されるような天然型アミノ酸の配列に対応する：
１）１，５ＥＤＡＮＳ−ＧＧＰＮＰＧＧＬｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）ＫＫ−ＮＨ２
２）１，５ＥＤＡＮＳ−ＧＧＰＹＰＧＧＬｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）ＫＫ−ＮＨ２
３）１，５ＥＤＡＮＳ−ＧＧＰＮＰＮＰＧＧＬｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）ＫＫ−ＮＨ２
４）１，５ＥＤＡＮＳ−ＧＧＰＮＰＧＰＮＰＧＧＬｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）ＫＫ−ＮＨ２
浸襲性アスペルギスル症を検出するための独特の蛍光発生プローブのさらなる具体的な例としては、「Ａｂｚ−Ｘ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ｋ−Ｋ」の形式での下記の配列が挙げられ、ただし、式において、Ａｂｚはｏ−アミノ安息香酸に対応し、Ｄａｐ（Ｄｎｐ）はジアミノプロプリオニル（ジニトロフェニル）に対応し、Ｘは、標準的な一文字コードに従って指定されるような天然型アミノ酸の配列に対応する：
１）Ａｂｚ−ＧＧＧＰＮＰＧＧＤａｐ（Ｄｎｐ）ＫＫ−ＮＨ２
２）Ａｂｚ−ＧＧＧＰＹＰＧＧＤａｐ（Ｄｎｐ）ＫＫ−ＮＨ２
３）Ａｂｚ−ＧＧＧＰＮＰＮＰＧＧＤａｐ（Ｄｎｐ）ＫＫ−ＮＨ２
４）Ａｂｚ−ＧＧＧＰＮＰＧＰＮＰＧＧＤａｐ（Ｄｎｐ）ＫＫ−ＮＨ２
浸襲性アスペルギスル症を検出するための独特の蛍光発生プローブのさらなる具体的な例としては、「ＤＡＮＳＹＬ−Ｘ−Ｌｙｓ（５（６）ＦＡＭ−Ｋ−Ｋ」の形式での下記の配列が挙げられ、ただし、式において、ＤＡＮＳＹＬは５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホン酸に対応し、Ｌｙｓ（５（６）ＦＡＭはリシン（５（６）−カルボキシルフルオレセインに対応し、Ｘは、標準的な一文字コードに従って指定されるような天然型アミノ酸の配列に対応する：
１）ＤＡＮＳＹＬ−ＧＧＧＰＮＰＧＧＬｙｓ（５（６）ＦＡＭ）ＫＫ−ＮＨ２
２）ＤＡＮＳＹＬ−ＧＧＧＰＹＰＧＧＬｙｓ（５（６）ＦＡＭ）ＫＫ−ＮＨ２
３）ＤＡＮＳＹＬ−ＧＧＧＰＮＰＮＰＧＧＬｙｓ（５（６）ＦＡＭ）ＫＫ−ＮＨ２
４）ＤＡＮＳＹＬ−ＧＧＧＰＮＰＧＰＮＰＧＧＬｙｓ（５（６）ＦＡＭ）ＫＫ−ＮＨ２
実施例２．浸襲性アスペルギスル症（ＩＡ）を診断するための標的としてのアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（ＡＦ）の分泌型プロテアーゼ
背景：本発明の手法が、ＩＡの迅速かつ正確な診断のために必要とされる。本発明者らは、ＡＦの分泌型プロテアーゼを新規な診断標的として研究中である。ＡＦのゲノムには、最大で１００までの分泌型プロテアーゼがコードされ、それらの多くが感染期間中にインビボで発現される。本発明者らは、真菌プロテアーゼ基質に由来する内部消光型蛍光発生プローブ（ＩＱＦＰ）が、ＡＦプロテアーゼを宿主プロテアーゼと区別するためにＡＦ酵素の特有の耐熱性を利用して、ＡＦプロテアーゼの酵素活性を感染患者の血清および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）において検出するために使用され得ると仮定する。
【００３６】
方法：ＡＦのインビトロ培養上清の基質特異性のプロファイリングを、真菌特異的な基質を特定するためにヒト血清との比較で、コンビナトリアルＩＱＦＰライブラリーを用いて行った。ＩＡの確立されたモルモットモデルを使用して、疾患進行期間中のＢＡＬＦをインビボプロテアーゼ基質プロファイリングのために集めた。
【００３７】
結果：インビトロプロテアーゼ基質プロファイリングにより、ＡＦ培養上清によって強く切断され（４倍を超える蛍光増強）、しかし、ヒト血清によって切断されなかった約７５個のＩＱＦＰが特定された。さらなる分析のために選択されたＩＱＦＰのサブセットは、タンパク質分解活性を５０℃まで保持したセリンプロテアーゼに対応した。ＡＦ感染モルモットから得られたＢＡＬＦのプロテアーゼ基質プロファイリングにより、感染期間中に優先的に切断されるプローブで、有望な診断用候補物であるプローブがいくつか明らかにされた。
【００３８】
結論：様々なＩＱＦＰが、プロテアーゼ活性を腫瘍学および炎症においてインビボで画像化するために長く使用されているが、今回は、感染のインビトロ診断のためのプロテアーゼプロファイリングを初めて実証するものであり得る。この技術は、ＩＡおよび他の血液媒介の肺病原体を診断するための有望な代替法を表す。
【００３９】
実施例３．浸襲性アスペルギスル症（ＩＡ）の早期診断
方法：モルモット吸入モデルは、酢酸コルチゾンおよびシクロホスファミド（２日前および３日目）による好中球減少、吸入チャンバーにおける１．２×１０８個／ｍｌの分生子での噴霧ＡＦ、ならびに、所定の時点で得られる血清およびＢＡＬＦを含む（Ｖａｌｌｏｒ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００８、５２）。
【００４０】
結果：プロリン含有標的；ＰＸＰプローブは感染ＢＡＬＦの診断に著しく役立ち（２．０を超える倍数比）、次いで、Ｐ−Ｆ／Ｙ−Ｘ、Ｐ−Ｓ／Ｔ−ＸおよびＰ−Ｘ−Ａ／Ｖである。図１〜図５。
【００４１】
結論：感染後７日目における感染モルモットのＢＡＬＦによるＰ−Ｘ−Ｐ基質の切断は再現可能であり、かつ、非常に有意である。７日目における感度および特異性が既存のアッセイと同等以上である（８１％、９０％）。また、切断が、主にＰ−ＸＰおよびＰＸ−Ｐにおいて生じる（ヒトおよび真菌のプロリルエンドペプチダーゼはＰ−ＸＰにおいて切断する）。
【００４２】
実施例４．肺液および血清における鑑別診断バイオマーカーとしてのプロテアーゼ基質の特定
方法：モルモット吸入モデルは、酢酸コルチゾンおよびシクロホスファミド（２日前および３日目）による好中球減少、吸入チャンバーにおける１．２×１０８個／ｍｌの分生子での噴霧ＡＦ、ならびに、所定の時点で得られる血清およびＢＡＬＦを含む（Ｖａｌｌｏｒ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００８、５２）。
【００４３】
結果：モルモットから得られる血清およびＢＡＬＦのプロテアーゼ基質特異性を求めた。これら２つの体液のタンパク質分解フィンガープリントにおける違いは驚くほどであった。すなわち、血清プロテアーゼは、カチオン性残基およびプロリンを含有する基質を切断し、これに対して、ＢＡＬＦプロテアーゼは、脂肪族残基および芳香族残基を含有する基質を切断した。とりわけ、プロリン含有基質の切断が、健康な非感染モルモットに由来するＢＡＬＦには事実上存在しなかった。図５〜図７。
【００４４】
結論：基質特異性プロファイリングは、複雑なサンプルの間でのプロテアーゼ特異性における違いを評価することにおいて既存のプロテオミクス技術を補完することができる。存在量の測定はそれだけでは、診断標的または治療標的を特定するためには十分でない可能性がある。これは、特定されたプロテアーゼが不活性であり得るか、または、タンパク質分解により分解され得るからである。対象のタンパク質分解特異性が特定されると、関わるプロテアーゼを、活性部位に向けられたプローブで、公知の基質特異性から設計されるプローブを使用することにより特定することができる。本実施例は、複雑な生物学的流体のタンパク質分解特異性をマッピングするための、簡便であるが、ロバストな方法を表す。本方法を使用して特定される基質は、診断目的および画像化目的のためのセンサー、基質および阻害剤の集中した合成のための足場、阻害剤のためのロバストなアッセイの設計におけるプローブ、ならびに、制御された薬物送達のためのトリガーとして役立ち得る。
【００４５】
【表２】
2013540435.tif 000005
【００４６】
【表３】
2013540435.tif 000006
表２の凡例。上位６個のペプチドプローブの可変領域（Ｘａａ−Ｙａａ−Ｚａａ）がすべて、一アミノ酸コードで列挙される；ＡＦ２９３およびＣＥＡ１０は、ＢＡＬＦサンプルが本研究においてスクリーニングされた感染モルモットにおけるアスペルギルス・フミガツスの２つの菌株である。
【００４７】
Ｎは、所与のペプチドプローブに対してスクリーニングされるモルモットＢＡＬＦサンプルの数を表す。非常に低いバックグラウンド値（ｔ＝０時間）および終点値（ｔ＝６時間）を有するモルモットの感染サンプルおよび非感染サンプル（すなわち、ｔ＝０時間と、ｔ＝６時間との間で最大でも１００単位の差を有するサンプル）は統計学的計算のために選択されなかった。
【００４８】
平均倍数変化の値は、様々なそれぞれのペプチドプローブに対してスクリーニングされたそれぞれのモルモットサンプルについて計算される蛍光倍数変化の平均である。蛍光倍数変化の値が下記の式に従って計算される：
倍数変化＝（ｔ＝６時間の時間で測定される蛍光）／（ｔ＝０時間の時間で測定される蛍光）
＊これらのペプチドプローブについての倍数変化の値は終点の値としてｔ＝３時間の時間で計算された。
【００４９】
ＳＤは、それぞれのＢＡＬＦサンプルに対してスクリーニングされた所与のプローブについて計算される標準偏差に対応する。
【００５０】
パーセント蛍光効率（％ＦＥ）が下記のようにそれぞれのプローブについて計算される：
％ＦＥ＝１００＊［（倍数変化感染ＢＡＬＦ−倍数変化非感染ＢＡＬＦ）／倍数変化非感染ＢＡＬＦ］  倍数変化の値はすべて、平均倍数変化の値である。
【００５１】
Ｐ値が、様々なそれぞれの感染ＢＡＬＦサンプルおよび非感染ＢＡＬＦサンプルに対してスクリーニングされたそれぞれのペプチドプローブについて２つのサンプルの不等分散による両側スチューデントｔ検定により計算される。
【００５２】
それぞれのペプチドプローブについてのアッセイの感度および特異性が、下記に示されるように計算された。
【００５３】
感度＝真の陽性／（真の陽性＋偽陰性）
特異性＝真の陰性／（真の陰性＋偽陽性）
真の陽性＝感染モルモットサンプルにおける３以上の倍数変化
真の陰性＝非感染モルモットサンプルにおける３未満の倍数変化
偽陽性＝非感染モルモットサンプルにおける３以上の倍数変化
偽陰性＝感染モルモットサンプルにおける３未満の倍数変化
特定の実施形態および実施例の記載が、限定としてではなく、例示として提供される。本明細書において引用されるすべての刊行物および特許出願、ならびに、それらにおいて引用されるすべての参考文献は、それぞれの個々の刊行物または特許出願あるいは参考文献が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されていたかのように、参照により本明細書中に組み込まれる。上記発明が理解の明快さのために例示および実例として多少詳しく記載されているが、いくらかの変更および改変が、添付された請求項の精神または範囲から逸脱することなく、それらに対して行われ得ることが、本発明の教示に照らして当業者には容易に明らかであろう。
【図１】
2013540435.tif 000007
【図２】
2013540435.tif 000008
【図３】
2013540435.tif 000009
【図４】
2013540435.tif 000010
【図５】
2013540435.tif 000011
【図６】
2013540435.tif 000012
【図７】
2013540435.tif 000013
【国際調査報告】
2013540435.tif 000014
2013540435.tif 000015
2013540435.tif 000016