(57)【要約】ドを使用する。これらは、少なくとも１つの炭素原子および少なくとも２つの有機ペルオキシド基を含む。前記不活化剤は、理想的にはヒドロペルオキシドである。本発明は、ウイルスワクチンの調製中に特に有用である。具体的な一実施形態において、上記の不活化剤は、（ｉ）少なくとも１つの炭素原子またはバックボーンと（ｉｉ）少なくとも２つのペルオキシド基、すなわち、２つの酸素原子間に単結合−Ｏ−Ｏ−を含有する少なくとも２つの基とを含む。
2013528586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物含有試料を処理するためのまたは微生物を含有する危険のある試料を処理するためのプロセスであって、該試料を多官能性有機ペルオキシドと接触させる工程を包含する、プロセス。
【請求項２】
核酸を含有する試料を処理するためのプロセスであって、該試料を多官能性有機ペルオキシドと接触させて該核酸を分解する工程を包含する、プロセス。
【請求項３】
薬学的組成物を調製するための方法であって、該方法は、（ｉ）微生物含有試料と多官能性有機ペルオキシドとを接触させて、該試料中の微生物を不活化する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の生成物から薬学的組成物を調製する工程を包含する、方法。
【請求項４】
多官能性有機ペルオキシドの水溶液であって、該多官能性有機ペルオキシドが（ａ）１重量％未満または（ｂ）５重量％〜７０重量％の間のいずれかの濃度で存在するものである水溶液。
【請求項５】
（ｉ）不活化された微生物と（ｉｉ）１重量％未満の多官能性有機ペルオキシドとを含む水性組成物。
【請求項６】
微生物と多官能性有機ペルオキシドとの反応生成物を含む水性組成物。
【請求項７】
前記試料が、容器の表面または作業場の表面である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記微生物含有試料が、溶解状態の核酸も含む、請求項１に記載のプロセスまたは請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が、細胞培養物から得られ、および前記核酸が、該細胞培養物からの細胞ＤＮＡである、請求項２もしくは請求項８に記載のプロセスまたは請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料がウイルスを含有する、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項１１】
前記試料が、無エンベロープＤＮＡウイルスを含有する、請求項１０に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項１２】
前記多官能性有機ペルオキシドが、−Ｏ−Ｏ−Ｈ基を含む、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項１３】
前記多官能性有機ペルオキシドが、ジェミナルペルオキシドである、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項１４】
前記多官能性有機ペルオキシドが、２つ、３つまたは４つのペルオキシド基を有する、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項１５】
前記多官能性有機ペルオキシドが、ジェミナルビスヒドロペルオキシドである、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項１６】
前記多官能性有機ペルオキシドが、ホモ二官能性である、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項１７】
前記多官能性有機ペルオキシドが、水溶性である、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項１８】
前記多官能性有機ペルオキシドが、ハロゲンを含まない、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項１９】
前記多官能性有機ペルオキシドが、炭素、水素および酸素のみから成る、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項２０】
前記多官能性有機ペルオキシドが、３００未満の分子量を有する、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項２１】
前記多官能性有機ペルオキシドが、式Ｉ：
【化８】
2013528586.tif 000030
を有し、式中、
Ｒ１ａは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２ａは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール、−（ＣＲ４Ｒ５）ｎＣＲ６（ＯＯＨ）２であるか、あるいはＲ２ａは、ＬによってＲ２ｂに連結されており；
Ｒ３は、ＨまたはＣ（ＯＯＨ）Ｒ１ｂＲ２ｂであり、
Ｒ１ｂは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２ｂは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであるか、あるいはＲ２ｂは、ＬによってＲ２ａに連結されており；
Ｒ４は、各出現時、ＨまたはＣ１−３アルキル、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ１−３−アルコキシ、Ｃ２−４−アルケニルオキシ、Ｃ１−３−アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−３アルキル化アミノカルボニル、Ｃ１−３−チオアルキル、Ｃ１−３−アルキルスルフィニル、Ｃ１−３−アルキルスルホニル、Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルおよびジ−Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルから選択され；
Ｒ５は、各出現時、ＨまたはＣ１−３アルキル、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ１−３−アルコキシ、Ｃ２−４−アルケニルオキシ、Ｃ１−３−アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−３アルキル化アミノカルボニル、Ｃ１−３−チオアルキル、Ｃ１−３−アルキルスルフィニル、Ｃ１−３−アルキルスルホニル、Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルおよびジ−Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルから選択され；
Ｌは、Ｃ１−８アルキレンであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ｎは、１〜８である、
前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項２２】
前記多官能性有機ペルオキシドが、式ＩＩ：
【化９】
2013528586.tif 000031
を有する、請求項２１に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項２３】
Ｒ１ａが、ＨまたはＣＨ３であり；およびＲ２ａが、ＣＨ３、Ｅｔまたはｎ−Ｐｒである、請求項２２に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項２４】
前記多官能性有機ペルオキシドが、式ＩＩＩ：
【化１０】
2013528586.tif 000032
を有する、請求項２１に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項２５】
Ｒ１ａが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ａが、ＣＨ３、Ｅｔ、もしくはｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ａが、ＬによってＲ２ｂに連結されており；Ｒ１ｂが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ｂが、ＣＨ３、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ｂが、ＬによってＲ２ａに連結されており；およびＬが、−（ＣＨ２）３−である、請求項２４に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項２６】
前記多官能性有機ペルオキシドが、式ＩＶ：
【化１１】
2013528586.tif 000033
を有する、請求項２１に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項２７】
Ｒ１ａが、Ｈであり；Ｒ１ｂが、Ｈであり；およびｎが、３である、請求項２６に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項２８】
Ｒ１ａおよびＲ２ａが、同一である；および／または
Ｒ１ａおよびＲ２ｂが、同一である；および／または
Ｒ２ａおよびＲ２ｂが、同一である、
請求項１７〜２３のいずれか一項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項２９】
●Ｒ１ａが、ＨもしくはＣ１−４アルキルである；および／または
●Ｒ２ａが、ＨもしくはＣ１−４アルキルもしくは−（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＯＯＨ）２であるか、またはＬによってＲ２ｂに連結されている；および／または
●Ｒ１ｂが、ＨもしくはＣ１−４アルキルである；および／または
●Ｒ２ｂが、Ｃ１−４アルキルであるか、もしくはＬによってＲ２ａに連結されている。従ってＲ２ｂが、ＣＨ３、Ｅｔもしくはｎ−Ｐｒであり得る；および／または
●各Ｒ４が、ＨもしくはＣＨ３である；および／または
●各Ｒ５が、ＨもしくはＣＨ３である；および／または
●Ｌが、Ｃ２−５アルキレンである；および／または
●Ｒ６が、ＨもしくはＣ１−４アルキルである；および／または
●ｎが、２〜６である、
請求項２１〜２８のいずれか一項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項３０】
Ｒ１ａが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ａがＣＨ３、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒもしくは−（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＯＯＨ）２であるか、またはＲ２ａが、ＬによってＲ２ｂに連結されており；Ｒ３が、ＨまたはＣ（ＯＯＨ）Ｒ１ｂＲ２ｂであり；Ｒ１ｂが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ｂが、ＣＨ３、Ｅｔもしくはｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ｂが、ＬによってＲ２ａに連結されており；Ｌが、−（ＣＨ２）３−であり；およびｎが、３である、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項３１】
前記多官能性有機ペルオキシドが、図１に示す式を有する、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項３２】
前記多官能性有機ペルオキシドが、２，２’−ジヒドロペルオキシ−２，２’−ジブチルペルオキシド；２，２−ジヒドロペルオキシブタン；１，１−ジヒドロペルオキシメタン；１，１−ジヒドロペルオキシプロパン；１，１−ジヒドロ−ペルオキシブタン；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジプロピルペルオキシド；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジブチルペルオキシド；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジエチルペルオキシド；１，１，５，５−テトラヒドロペルオキシペンタン；３，７−ビス−ヒドロペルオキシ−１，２−ジオキセパン；および１，１−ジヒドロペルオキシエタンから成る群より選択される、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項３３】
前記多官能性有機ペルオキシドが、０．０１％〜０．２５％の間の濃度で使用される、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項３４】
前記多官能性有機ペルオキシドが、０℃〜５０℃の間の温度で使用される、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項３５】
前記多官能性有機ペルオキシドが、０．２５時間〜７２時間にわたり、不活化のために使用される、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
【請求項３６】
残存するまたは過剰なペルオキシドが、前記試料の処理後に除去される、前記いずれかの請求項に記載のプロセス。
【請求項３７】
除去が、還元剤を用いるものである、請求項３６に記載のプロセス。
【請求項３８】
前記還元剤が、アスコルビン酸または還元糖である、請求項３７に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国仮出願第６１／３９５，１１７号（２０１０年５月６日出願）（この完全な内容は、全ての目的のために参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、微生物の不活化におよび／または核酸の分解に（および特に、ＤＮＡの分解に）有用である化合物の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
ウイルスおよび細菌を不活性にするためのそれらの処理は、廃水または下水の衛生化を含む様々な領域において、およびワクチンなどの非経口薬の分野においても重要である。例えば、多くのワクチンは微生物に基づいており、これらの微生物は、生感染性物質が最終ワクチンに存在しないことを確実にするように不活化される。ポリオウイルスの不活化が失敗した１９５０年代の「カッター（Ｃｕｔｔｅｒ）事件」から公知であるように、不活化の失敗は、深刻な安全性リスクをもたらし得る。
【０００４】
不活化処理は、代表的に化学的手段に基づく。化学的処理としては、洗剤、ホルムアルデヒド（通常はホルマリンとして）、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、グルタルアルデヒド、エチレンイミン、フェノールなどの使用が挙げられる。これらの不活化剤は、長年にわたって使用されている。例えば参考文献１（非特許文献１）を参照のこと。
【０００５】
これらの不活化剤の一部は、核酸の分解にも有用である。この分解は、ウイルスまたは細菌自体の不活化において役割を果たすことができるが、成長中に使用されてきた任意の細胞基質から残存核酸を無くすことにも有用であり得る。例えば、ウイルスを細胞培養で成長させて、ワクチンを調製するための材料を得ることができ、および製造中に、細胞培養基質からの一切の残存核酸を分解する工程を含むことは通例であり、それによって潜在的に発癌性の材料を除去する。参考文献２（特許文献１）には、ウイルスの不活化と宿主細胞ＤＮＡの分解の両方のためのＢＰＬの使用が記載されている。
【０００６】
特定の微生物に応じてその最良の不活化剤は様々である。例えば、ウイルスの形態（サイズ、カプシド化（ｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）、エンベロープなど）の相違は、不活化感度の相違につながる。例えば、参考文献３（非特許文献２）の付録２を参照のこと。一部の処理（例えば、非常に苛酷な加熱、消毒剤、強いＵＶ線または放射線）は、普遍的に微生物を不活化することができるが、これらは免疫原性も破壊し、そのため有効なワクチンの調製には不適切である。その代りとして、ワクチン免疫原性を保ちながら問題の微生物に対して有効であるような不活化処理が選択される。それ故、残念なことに、この処理は活性形態の汚染因子を残すことがあり、ことによると、頑丈な感染性因子によるワクチン汚染につながる。従って、ターゲット微生物と潜在的汚染物質の両方を不活化する広域スペクトルの不活化剤が必要とされている。そのような不活化剤は、ウイルス不活化が推奨されるウシ血清またはトリプシンなどの製品［４（非特許文献３）］の処理にも有用であるだろう。
【０００７】
一部の不活化剤に伴うもう１つの難点は、それらの安定性である。ホルムアルデヒドは、特に高温で有効な不活化剤であるが、それは非常に安定であり、そのため不活化後に残留物が残存する。これらの残留物は、残留活性微生物についての下流の試験に干渉することがある。従って、これらの試験では高希釈物が使用されるが、これはそれらの感度を低減する。さらに、それらの残留物は、最終ワクチンにおける免疫応答に干渉することがあり、例えば、参考文献５（非特許文献４）は、ホルマリン不活化ワクチンは過敏症を引き起こす危険がより高いだろうことを示唆している。
【０００８】
最後に、ホルムアルデヒドでの不活化は、いくつかの状況では可逆的であり得る［６、７］。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００７／０５２１６３号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍａｙｒら編、Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｓｃｈｕｔｚｉｍｐｆｕｎｇｅｎ  ｉｎ  ｄｅｒ  Ｔｉｅｒｍｅｄｉｚｉｎ  Ｖｅｒｌａｄ  Ｐａｕｌ  Ｂａｒｅｙ（１９８４年）
【非特許文献２】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  Ｖｉｒａｌ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；  ＩＣＨ  Ｑ５Ａ  （ＣＰＭＰ／ＩＣＨ／２９５／９５）
【非特許文献３】Ｎｏｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／１７９３／０２
【非特許文献４】Ｍｏｇｈａｄｄａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００６）１２：９０５〜７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、新規の改善された微生物不活化剤が必要とされている。これらは、頑丈なものを含めて様々な微生物に対して、所望の免疫原性を除去することなく、有用であらねばならない。それらはまた、干渉するまたは有害な残留物を殆どまたは全く残してはならず、その不活化は、可逆的であってはならない。理想的には、それらは、核酸の分解にも適したものであらねばならず、水性媒体の存在下であってもそれらの活性を示さねばならない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、微生物不活化剤として、および／または核酸を分解するために、多官能性有機ペルオキシドを使用する。これらの不活化剤は、（ｉ）少なくとも１つの炭素原子またはバックボーンと（ｉｉ）少なくとも２つのペルオキシド基、すなわち、２つの酸素原子間に単結合−Ｏ−Ｏ−を含有する少なくとも２つの基とを含む。前記不活化剤は、理想的にはヒドロペルオキシドであり、すなわち、基−Ｏ−Ｏ−Ｈを含有する。そのような化合物は、当該技術分野において既知であるが、今般、それらが、免疫原性に負の影響を及ぼすことなく不活化を達成することができる微生物（レオウイルスなどの安定していることで知られているウイルスを含む）の強力な不活化剤であることを示す。さらに、それらは、高水溶性であり得、毒性分解生成物を生成せず（例えば、酢酸、プロピオン酸または酪酸などの単純なカルボン酸しか生成せず）、ならびに広範なｐＨおよび温度にわたって活性である。さらに、それらは、水性条件で驚くべき安定性を示すことができ、および細胞ＤＮＡの分解に有効である。
【００１３】
従って、本発明は、微生物含有試料（例えば、液体試料）を処理するためのプロセスを提供し、このプロセスは、前記試料と多官能性有機ペルオキシドを接触させる工程を包含する。このプロセスは、結果として、試料中の微生物の不活化を生じさせることができる。
【００１４】
本発明は、核酸（例えば、ＤＮＡ、例えば細胞ＤＮＡ）を含有する試料（例えば、液体試料）を処理するためのプロセスも提供し、このプロセスは、前記試料と多官能性有機ペルオキシドを接触させる工程を包含する。このプロセスは、結果として、試料中の核酸の分解を生じさせることができる。
【００１５】
本発明は、薬学的組成物を調製するための方法も提供し、この方法は、（ｉ）微生物含有試料と多官能性有機ペルオキシドを接触させて、試料中の微生物を不活化する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の生成物から薬学的組成物を調製する工程を包含する。この薬学的組成物は、有用にはワクチン（例えば、ウイルスワクチン）である
本発明は、（ｉ）活性因子、例えばウイルス免疫原、および（ｉｉ）多官能性有機ペルオキシドと還元剤との反応生成物を含む薬学的組成物も提供する。前記還元剤および反応生成物は、非毒性であらねばならず、例えば、両方とも糖であり得る。
【００１６】
本発明は、多官能性有機ペルオキシドの水溶液も提供し、ここで、前記多官能性有機ペルオキシドが（ａ）１重量％未満または（ｂ）５重量％〜７０重量％の間のいずれかの濃度で存在する。この溶液は、特に選択肢（ａ）の場合、微生物も含有することがある。選択肢（ａ）の場合、その濃度は、通常、０．００１％〜０．５％、例えば０．０１％〜０．２５％の間、０．０１％〜０．１％の間、または約０．０５％である。選択肢（ｂ）の場合、その濃度は、６％〜６０％、７％〜５０％、８％〜４０％、９％〜３５％または１０％〜３０％の範囲であり得る。
【００１７】
本発明は、（ｉ）不活化された微生物および（ｉｉ）１重量％未満（例えば、０．００１％〜０．５％の範囲内、例えば、０．０１％〜０．２５％の間、０．０１％〜０．１％の間、または約０．０５％）の多官能性有機ペルオキシドを含む液体組成物も提供する。
【００１８】
本発明は、微生物と多官能性有機ペルオキシドとの反応生成物を含む液体組成物も提供する。
【００１９】
本発明は、多官能性有機ペルオキシドを含む殺菌性組成物も提供する。そのような溶液は、微生物が無いことを除いて上で論じた水溶液を含む。
【００２０】
本発明は、薬物の製造に使用するための、例えばワクチンの製造の際に使用するための、任意の上述の組成物も提供する。同様に、本発明は、薬物を製造するためのプロセスを提供し、このプロセスは、任意の上述の組成物を使用する。
【００２１】
本発明は、微生物不活化剤としての多官能性有機ペルオキシドの使用も提供する。本発明は、微生物不活化剤として使用するための多官能性有機ペルオキシドも提供する。本発明は、微生物不活化剤としての本発明の水溶液の使用も提供する。本発明は、微生物不活化剤として使用するための本発明の水溶液も提供する。
【００２２】
試料
本発明は、微生物含有試料の処理に有用である。これらの試料は、好ましくは液体試料であるが、固体、例えば容器または作業場の表面、であってもよい。そのような試料としては、微生物培養液；血液製剤、血清、血漿、または血液由来製剤（例えば、抗血液凝固薬）；動物由来原料および製品；微生物によって汚染され得る他の原料；ワクチンおよび診断薬生産（例えば、ＥＬＩＳＡ）の際の組換えタンパク質、材料および中間体；微生物剤を利用するプロセスからの廃棄物；廃水、下水；食品（例えばミルク）；などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明は、試料の消毒または滅菌において、および特に、表面上で生きている微生物を破壊するための該表面の消毒のために、さらなる用途を有する。例えば、本発明は、使用前に作業面を消毒するために、使用前に外科用器具もしくはインプラントを滅菌するために、または消毒もしくは滅菌が望ましい任意の他の目的のために、使用することができる。
【００２４】
本発明は、ウイルスと細菌の両方を含む様々なタイプの微生物の不活化に有用である。エンベロープウイルスおよび無エンベロープウイルスに関してそれを使用することができる。ＲＮＡゲノム（一本もしくは二本鎖）またはＤＮＡゲノム（一本もしくは二本鎖）を有するウイルスに関してそれを使用することができ、一本鎖ゲノムは＋センスであってもよいし、−センスであってもよい。分節ゲノムまたは非分節ゲノムを有するウイルスに関してそれを使用することができる。カプシド（単数もしくは複数）を有するウイルス、またはカプシドを有さないウイルスに関してそれを使用することができる。グラム陰性菌またはグラム陽性菌に関してそれを使用することができる。
【００２５】
従って、前記試料は、以下のものの１つ以上を含有し得る：
●  オルトミクソウイルス：インフルエンザＡ型、Ｂ型またはＣ型ウイルスなどの、オルトミクロウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。インフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスは、汎流行間期（ｉｎｔｅｒｐａｎｄｅｍｉｃ）（周年性／流行期性）株である場合もあり、または汎流行アウトブレイクを引き起こす可能性のある株（すなわち、現在循環している株中の赤血球凝集素に比べて新しい赤血球凝集素を有するインフルエンザ株、または鳥類被験体において病原性であり、且つ、ヒト集団において水平伝播する可能性を有するインフルエンザ株、またはヒトに対して病原性であるインフルエンザ株）からのものである場合もある。特定の流行期におよび株の性質に依存して、インフルエンザＡ型ウイルスは、次の赤血球凝集素サブタイプの１つ以上に由来し得る：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６。
●  パラミクソウイルス科ウイルス：ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）およびモルビリウイルス（麻疹）などの、パラミクソウイルス科ウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
●  ニューモウイルス：ニューモウイルスまたはメタニューモウイルス、例えば呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、マウス肺炎ウイルスおよびシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、を不活化するために本発明を使用することができる。好ましくは、前記ニューモウイルスは、ＲＳＶまたはヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）である。
●  パラミクソウイルス：１、２、３または４型パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、流行性耳下腺炎、センダイウイルス、シミアンウイルス５、ウシパラインフルエンザウイルスおよびニューカッスル病ウイルスなどの、パラミクソウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。好ましくは、前記パラミクソウイルスは、ＰＩＶまたは流行性耳下腺炎である。
●  モルビリウイルス：麻疹などのモルビリウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
●  ピコルナウイルス：エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス（Ｈｅｐａｒｎａｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルスおよびアフトウイルスなどの、ピコルナウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
●  エンテロウイルス：１、２または３型ポリオウイルス、１〜２２および２４型コクサッキーＡウイルス、１〜６型コクサッキーＢウイルス、１〜９、１１〜２７および２９〜３４型エコーウイルス（ＥＣＨＯウイルス）ならびにエンテロウイルス６８〜７１などの、エンテロウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。好ましくは、前記エンテロウイルスは、ポリオウイルス、例えば、ＭａｈｏｎｅｙもしくはＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓなどの１型株、ＭＥＦ−Ｉなどの２型株、またはＳａｕｋｅｔｔなどの３型株である。
●  ヘパルナウイルス：Ａ型肝炎ウイルスなどのヘパルナウイルス（へパトウイルスとも呼ばれる）を不活化するために本発明を使用することができる。
●  トガウイルス：ルビウイルス、アルファウイルスまたはアルテリウイルスなどの、トガウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。風疹ウイルスなどのルビウイルスが好ましい。不活化に有用なアルファウイルスとしては、サケ膵臓病ウイルス（ｓａｌｍｏｎ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）および睡眠病ウイルス（ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）などの、水生アルファウイルスが挙げられる。
●  フラビウイルス：ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）、デング熱（１、２、３または４型）、黄熱病、日本脳炎、西ナイル脳炎、セントルイス脳炎、ロシア春夏脳炎、ポワッサン脳炎などの、フラビウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
●  Ｃ型肝炎ウイルス：Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を不活化するために本発明を使用することができる。
●  ペスチウイルス：ウシウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、ブタコレラ（ＣＳＦＶ）またはボーダー病（Ｂｏｒｄｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＢＤＶ）などの、ペスチウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
●  ヘパドナウイルス：Ｂ型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
●  ラブドウイルス：リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ）などの、ラブドウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
●  カリシウイルス科：ノーウォークウイルス、ならびにノーウォーク様ウイルス、例えばハワイウイルス（Ｈａｗａｉｉ  Ｖｉｒｕｓ）および雪山ウイルス（Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｒｕｓ）、ならびにベシウイルス（Ｖｅｓｉｖｉｒｕｓ）、例えばブタ小水疱性発疹ウイルス、などの、カリシウイルス科を不活化するために本発明を使用することができる。
●  コロナウイルス：ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器系コロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（Ａｖｉａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）などの、コロナウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
●  レトロウイルス：オンコウイルス、レンチウイルスまたはスプーマウイルスなどの、レトロウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。オンコウイルスは、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２またはＨＴＬＶ−３であり得る。レンチウイルスは、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２であり得る。
●  レオウイルス：オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルスまたはコルティウイルスなどの、レオウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
●  パルボウイルス：パルボウイルスＢ１９またはボカウイルス（Ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）などの、パルボウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
●  他の肝炎ウイルス：デルタ肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスまたはＧ型肝炎ウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
●  ヒトヘルペスウイルス：単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）などの、ヒトヘルペスウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
●  パポバウイルス：パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスなどの、パポバウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。パピローマウイルスとしては、ＨＰＶ血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３および６５が挙げられる。
●  アデノウイルス科：ヒトアデノウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧのいずれかを含む、アデノウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
●  ボルデテラ属：百日咳菌などのボルデテラ属の細菌を不活化するために本発明を使用することができる。
●  クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）：破傷風菌およびボツリヌス菌などの、クロストリジウム属を不活化するために本発明を使用することができる。
●  コリネバクテリウム科：ジフテリア菌などのコリネバクテリウム属を不活化するために本発明を使用することができる。
●  パスツレラ科：インフルエンザ菌などのパスツレラ属の種を不活化するために本発明を使用することができる。
●  ミコバクテリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｃｅａｅａ）：ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｓｉ）、ウシ結核菌および弱毒化カルメット‐ゲラン杆菌などの、ミコバクテリアを不活化するために本発明を使用することができる。
●  ナイセリア科：髄膜炎菌および淋菌などの、ナイセリア属の種を不活化するために本発明を使用することができる。
●  サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）：チフス菌、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓなどの、サルモネラ属の種を不活化するために本発明を使用することができる。
●  連鎖球菌属（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）：肺炎連鎖球菌（肺炎球菌）、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよび化膿連鎖球菌などの、連鎖球菌を不活化するために本発明を使用することができる。
●  マイコプラスマ科：汚染された細胞培養物または細胞培養由来材料において見つけることができる任意のＭ．種を含めて、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍなどの、マイコプラスマを不活化するために本発明を使用することができる。
【００２６】
微生物に加えて、試料は、溶解状態の核酸、例えば残留細胞ＤＮＡ、も含むことがある。これらの状態は、例えば溶菌ウイルスを細胞培養中に成長させ、細胞を含まない産物を調製したとき、起こり得る。そのような試料の場合、前記多官能性有機ペルオキシドは、微生物を不活化することもでき、溶解状態の核酸を分解することもできるので、ワクチン製造中に、特にウイルスワクチンの製造中に、二重の恩恵をもたらすことができる。従って、本発明による処理のための試料は、微生物および細胞ＤＮＡ（例えば、ＭＤＣＫなどの細胞株からのゲノムＤＮＡ）を含み得る。
【００２７】
試料が、（微生物も含んで、または含まずに）核酸を含む場合、該核酸は、典型的には、ＤＮＡ（例えば細胞ＤＮＡ）を含む。微生物内の（例えば、細菌内の、またはビリオン内の）核酸ではなく、前記核酸は、溶解状態で遊離しているであろう（例えば、細胞内の細胞ＤＮＡではなく溶解状態である細胞ＤＮＡ（すなわち、元々は細胞のものであるが、もはや細胞内に存在しないＤＮＡ））。
【００２８】
前記微生物は、意図的に（例えば、ワクチンを調製するためのウイルス成長後に）存在することもあり、（例えば、下水中の、または汚染された細胞培養培地成分、細胞もしくは培養物からの組換えタンパク質発現後の）汚染物として存在することもある。また、幾つかの実施形態において、試料は、微生物を計画的に含有することがあるが、汚染微生物（単数または複数）も含有することがある。
【００２９】
本発明は、ウイルスの不活化に特に有用であるので、微生物含有試料を処理するためのプロセスは、好ましくは、ウイルス含有試料中のウイルスを不活化するためのプロセスである。
【００３０】
幾つかの実施形態では、必ずしも微生物を含有するとは限らないが微生物を含有する疑いのあるかまたはその危険のある試料を処理するために、本発明を使用することができる。これらの実施形態において、前記処理は必須ではないが、危険回避のために微生物不活化を確実にするために（例えば、消毒に）用いられる。一般に、前記試料は、微生物の成長または存続を支持することができるだろう。
【００３１】
微生物を含むことに加えて、試料は、他の材料、例えば細胞基質またはそれらの残留物、細胞核酸（例えば、ＤＮＡ）、卵タンパク質など、を含有することがある。微生物を不活化することに加えて、有機ペルオキシドは、これらの他の材料と反応することができる。しかし、理想的には、前記試料は、不活化剤との反応について感染性材料と競合する有意な量の非感染性材料を含まない。そのような反応は、不活化剤を浪費する。これらの無駄な反応を被ることがある材料としては、例えば、還元剤（下記参照）が挙げられる。従って、例えば、高レベルの残留グルコースを保持する培養を回避し得る。
【００３２】
本発明による試料の処理後、残存するまたは過剰なペルオキシドを除去および／または破壊することができる。これは、様々な方法で、例えば還元剤の添加によって、達成することができる。適する還元剤としては、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、糖（例えば、グルコースまたはスクロース；好ましくは還元糖）、多糖類、ポリフェノールなどが挙げられるが、これらに限定されない。還元剤（単数または複数）は、代表的に、ペルオキシドに対して（還元基あたりで計算して）モル過剰で、例えば、２：１と４：１の間の化学的不活化剤に対してモル過剰の還元基で添加される。ペルオキシドの初期濃度を遮断するために十分な量で還元剤を添加することができる。しかし、既知の終濃度範囲を用いる十分に標準化されたプロセスについては、使用者は、より低い濃度、例えば不活化後に残存するであろう量のペルオキシドを遮断するために十分な濃度、を添加することを好むだろう。
【００３３】
化学的不活化剤に依存して、および使用される還元剤に依存して、不活化された不活化剤が反応溶液中に残存してもよく（例えば、それが無害な場合、例えば、単純な糖の場合）、またはそれを希釈してもよく、またはそれを除去してもよい。除去工程は、関心のある試薬の下流プロセシングの一部として（例えば、不活化された材料からのタンパク質またはウイルス成分の精製中に）行うことができる。従って、除去は、限外濾過／ダイアフィルトレーション、透析、クロマトグラフ精製などを伴うことがある。
【００３４】
多官能性有機ペルオキシド
本発明は、多官能性有機ペルオキシドを使用する。そのような化合物は、少なくとも１つの炭素原子またはバックボーンを含む、すなわち、それらはＨ２Ｏ２とは異なる有機物である。それらは、少なくとも２つの基も含む、すなわち、それらは、過酢酸とは異なる複数の官能性ペルオキシド基を含有する。
【００３５】
前記ペルオキシド化合物は、理想的にはヒドロペルオキシドであり、すなわち、基−Ｏ−Ｏ−Ｈを含有する。それは複数のヒドロペルオキシド基を含有することもある。他の多官能性有機ペルオキシドは、ペルオキシケタール、例えばＣＲ１Ｒ２（ＯＯＲ３）（ＯＯＲ４）またはテトラオキサンであり得るが、炭素原子に結合している少なくとも１つの−Ｏ−Ｏ−Ｈ基を含む化合物が好ましい。
【００３６】
少なくとも１つのペルオキシド基が、有機ペルオキシドを生じさせるように炭素原子に結合しており、および幾つかの実施形態では、各ペルオキシド基中の酸素原子の少なくとも１つが、炭素原子に結合している。
【００３７】
前記ペルオキシド化合物は、理想的には、２つのペルオキシド（またはヒドロペルオキシド）基が同じ炭素原子に結合しているジェミナルペルオキシド（またはヒドロペルオキシド）である。
【００３８】
前記化合物は、理想的には、２つ、３つまたは４つのペルオキシド基を有するが、より多数のペルオキシド基を有する化合物を除外しない。
【００３９】
前記化合物は、ホモ二官能性である場合があり、すなわち、それは、２つの同一のペルオキシド（またはヒドロペルオキシド）官能基を含む；従って、不活化剤は、ジェミナルビスヒドロペルオキシドであることがある。あるいは、不活化剤は、ヘテロ二官能性であることがあり、すなわち、それは、２つの異なるペルオキシド官能基を含み、例えば、それは、ヒドロペルオキシド（−ＯＯＨ）および別のペルオキシド（−ＯＯＲ（式中、Ｒ≠Ｈ））を含むことがある。
【００４０】
好ましい化合物は、水溶性である。これは、ワクチン製造中のそれらの使用を容易にする。
【００４１】
好ましい化合物は、ハロゲンを含まない。なぜなら、そのような化合物は、代表的により有害ではないようであるからである。従って、不活化剤は、炭素、水素、酸素および窒素原子のみから成り得る。特に好ましい化合物は、炭素、水素および酸素原子のみから成る。
【００４２】
好ましい化合物は、５００未満、例えば、＜３００、＜２５０、＜２００、＜１５０、＜１００の分子量を有する。
【００４３】
好ましい化合物は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＯＨ基を含まず、そのため（例えば過酢酸とは異なり）不活化中に非常に酸性のｐＨを生じさせない。そのような条件ｓは、ｐＨ感受性免疫原を破壊する場合があり、不活化プロセスに使用されるデバイスおよび機械類の腐食につながる場合もある。
【００４４】
好ましい化合物は非爆発性であり、例えば、トリアセトントリペルオキシドは好ましくない。
【００４５】
不活化中、前記化合物は、理想的には、元の生成物より動物（ヒトを含む）に対して毒性である反応または分解生成物を形成しない。
【００４６】
好ましい化合物は、（ｉ）感染性力価の≧５、好ましくは≧７  ｌｏｇ１０低減でヒトインフルエンザＡ型ウイルス、および／または（ｉｉ）感染性力価の≧３、好ましくは≧５、および特に好ましい≧７  ｌｏｇ１０低減で３型レオウイルスを不活化することができる。
【００４７】
好ましい化合物は、微生物を、その免疫原性を低減することなく、不活化することができる。特に好ましい化合物は、インフルエンザＡ型ウイルスを、その赤血球凝集素の免疫原性を低減することなく、不活化することができる。
【００４８】
有用な化合物は、式Ｉ：
【００４９】
【化１】
2013528586.tif 000003
を有し、ここで式中、
Ｒ１ａは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２ａは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール、−（ＣＲ４Ｒ５）ｎＣＲ６（ＯＯＨ）２であるか、あるいはＲ２ａは、ＬによってＲ２ｂに連結されており；
Ｒ３は、ＨまたはＣ（ＯＯＨ）Ｒ１ｂＲ２ｂであり、
Ｒ１ｂは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２ｂは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであるか、あるいはＲ２ｂは、ＬによってＲ２ａに連結されており；
Ｒ４は、各出現時、ＨまたはＣ１−３アルキル、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ１−３−アルコキシ、Ｃ２−４−アルケニルオキシ、Ｃ１−３−アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−３アルキル化アミノカルボニル、Ｃ１−３−チオアルキル、Ｃ１−３−アルキルスルフィニル、Ｃ１−３−アルキルスルホニル、Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルおよびジ−Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルから選択され；
Ｒ５は、各出現時、ＨまたはＣ１−３アルキル、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ１−３−アルコキシ、Ｃ２−４−アルケニルオキシ、Ｃ１−３−アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−３アルキル化アミノカルボニル、Ｃ１−３−チオアルキル、Ｃ１−３−アルキルスルフィニル、Ｃ１−３−アルキルスルホニル、Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルおよびジ−Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルから選択され；
Ｌは、Ｃ１−８アルキレンであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；そして
ｎは、１〜８である。
【００５０】
Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のこれらの選択肢に加えて、これらの基のそれぞれは、列挙した選択肢の誘導体である場合もある。
【００５１】
アルキル、アルコキシラジカルのアルキル部分、アルケニル、アルケニルラジカルのアルケニル部分、アルキニルまたはアルキレンは、分岐していてもよく、もしくは非分岐であってもよく、および／または置換されていてもよく、もしくは非置換であってもよい。置換されている場合、各置換基を、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ６−１０−アリール、ベンジル、Ｃ２−６−アルケニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ１−６−アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、場合によりＮ−モノまたはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノまたはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、場合によりＮ−モノまたはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノスルフィニル、Ｃ１−６−チオアルキル、Ｃ１−６−アルキルスルフィニル、Ｃ１−６−アルキルスルホニル、アミノスルホニル、Ｃ１−６−アルキルアミノスルホニルおよびジ−Ｃ１−６−アルキルアミノスルホニルから選択することができる。
【００５２】
Ｒ３が−Ｈでなく、Ｒ１ａがＲ２ａとは異なる場合、これらの化合物は、異なるエナンチオマー形態で存在する場合がある。本発明は、特定のエナンチオマーまたはラセミ混合物を使用することができる。
【００５３】
幾つかの実施形態において、Ｒ１ａおよびＲ２ａは、同一である。他の実施形態において、Ｒ１ａおよびＲ２ａは、異なる。
【００５４】
幾つかの実施形態において、Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、同一である。他の実施形態において、Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、異なる。
【００５５】
幾つかの実施形態において、Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、同一である。他の実施形態において、Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、異なる。
【００５６】
Ｒ１ａは、好ましくはＨまたはＣ１−６アルキルまたはＣ１−４アルキルである。従って、Ｒ１ａは、ＨまたはＣＨ３であり得る。
【００５７】
Ｒ２ａは、好ましくはＨもしくはＣ１−６アルキルもしくはＣ１−４アルキルもしくは−（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＯＯＨ）２であり、またはＬによってＲ２ｂに連結されている。従って、Ｒ２ｂは、ＣＨ３、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒまたは−（ＣＨ２）２−４ＣＨ（ＯＯＨ）２であり得る。
【００５８】
Ｒ１ｂは、好ましくはＨまたはＣ１−６アルキルまたはＣ１−４アルキルである。従って、Ｒ１ｂは、ＨまたはＣＨ３であり得る。
【００５９】
Ｒ２ｂは、好ましくはＣ１−４アルキルであり、またはＬによってＲ２ａに連結されている。従って、Ｒ２ｂは、ＣＨ３、Ｅｔまたはｎ−Ｐｒであり得る。
【００６０】
各Ｒ４（これらは同じであることもあり、または異なることもある）は、好ましくはＨまたは−ＣＨ３またはヒドロキシルである。
【００６１】
各Ｒ５（これらは同じであることもあり、または異なることもある）は、好ましくはＨまたは−ＣＨ３またはヒドロキシルである。
【００６２】
Ｌは、好ましくはＣ２−５アルキレン、例えば−（ＣＨ２）３−、である。
【００６３】
Ｒ６は、好ましくはＨまたはＣ１−６アルキルまたはＣ１−４アルキルである。
【００６４】
ｎは、好ましくは２〜６であり、または２〜４であり、または３である。
【００６５】
１つの実施形態において、Ｒ１ａは、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ａは、ＣＨ３、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒもしくは−（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＯＯＨ）２であるか、またはＲ２ａは、ＬによってＲ２ｂに連結されており；Ｒ３は、ＨまたはＣ（ＯＯＨ）Ｒ１ｂＲ２ｂであり；Ｒ１ｂは、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ｂは、ＣＨ３、Ｅｔもしくはｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ｂは、ＬによってＲ２ａに連結されており；Ｌは、−（ＣＨ２）３−であり；およびｎは、３である。
【００６６】
前記化合物は、式ＩＩ：
【００６７】
【化２】
2013528586.tif 000004
を有することがあり、この式中、好ましい実施形態では、Ｒ１ａは、ＨまたはＣＨ３であり；およびＲ２ａは、ＣＨ３、Ｅｔまたはｎ−Ｐｒである。
【００６８】
前記化合物は、式ＩＩＩ：
【００６９】
【化３】
2013528586.tif 000005
を有することがあり、この式中、好ましい実施形態では、Ｒ１ａはＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ａは、ＣＨ３、Ｅｔもしくはｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ａは、ＬによってＲ２ｂに連結されており；Ｒ１ｂは、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ｂは、ＣＨ３、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ｂは、ＬによってＲ２ａに連結されており；およびＬは、−（ＣＨ２）３−である。
【００７０】
前記化合物は、式ＩＶ：
【００７１】
【化４】
2013528586.tif 000006
を有することがあり、この式中、好ましい実施形態では、Ｒ１ａは、Ｈであり；Ｒ１ｂは、Ｈであり；およびｎは、３である。
【００７２】
適する化合物としては、２，２’−ジヒドロペルオキシ−２，２’−ジブチルペルオキシド；２，２−ジヒドロペルオキシブタン；１，１−ジヒドロペルオキシエタン；１，１−ジヒドロペルオキシプロパン；１，１−ジヒドロ−ペルオキシブタン；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジプロピルペルオキシド；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジブチルペルオキシド；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジエチルペルオキシド；１，１，５，５−テトラヒドロペルオキシペンタン；３，７−ビス−ヒドロペルオキシ−１，２−ジオキセパン；および１，１−ジヒドロペルオキシメタンが挙げられるが、これらに限定されない。１，１−ジヒドロペルオキシエタンが好ましい。これらの化合物のうちの少なくとも幾つかは、当該技術分野において既知であり（例えば、参考文献８〜１０を参照のこと）および／または商業的供給業者から、例えばＦｅｒａｋ  ＡＧ（ドイツ、ベルリン）からまたはＡｒｋｅｍａ  Ｉｎｃ．（米国、フィラデルフィア）から、入手できる。参考文献８〜１０からのまたはこれらの供給業者から入手できる化合物、および特にそれらの水溶性化合物を、本発明で使用することができる。
【００７３】
本発明は、単一の不活化剤化合物を使用することができ、または例えば式Ｉの１つより多くの異なる化合物を含む、化合物の混合物を使用することができる。混合物が２つの異なる有機ペルオキシドを含む場合、これらは、様々なモル比で、例えば１０：１と１：１０の間、５：１と１：５の間、２：１と１：２の間、または実質的に等モル比で存在し得る。混合物中の化合物は、例えば０５６−１と０５８−１の分子間で、環構造を形成するような水素結合を示すことがある。幾つかの化合物は、ダイマーとして存在することがあり、ならびにモノマーとオリゴマーの混合物として存在することもある。
【００７４】
従って、本発明は、式ＩＩの化合物と式ＩＩＩの化合物とを含む混合物を使用することができる。そのような混合物において、Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、式ＩＩと式ＩＩＩの両方において同じであってもよく；および／またはＲ２ａおよびＲ２ｂは、式ＩＩと式ＩＩＩの両方において同じであってもよい。
【００７５】
不活化剤は、関心のある試料中の微生物を不活化するために十分な濃度で、理想的には所望の微生物（またはその成分）の免疫原性を低減することなく、使用される。それらは、一般に、１重量％未満、および通常は０．００１％〜０．５％の範囲内、例えば０．０１％〜０．２５％の間、０．０１％〜０．１％の間、の最終濃度をもたらすように液体試料と混合されるであろう。例えば、添加される多官能性有機ペルオキシド（単数または複数）の全量は、全液体試料の（重量で）約０．７５％、０．５％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０７５％、０．０５％、０．０２５％、０．０１％または０．００５％であり得る。典型的な量は、約０．０５％である。
【００７６】
不活化剤は、広範なＰＨ範囲にわたって、例えば、ｐＨ５と１０の間、ｐＨ６と９の間、またはｐＨ７±０．５で使用することができる。不活化を緩衝液の存在下で行ってもよい（緩衝液が不活化剤と一緒に組成物中に存在してもよい）が、これは、通常、必要ではない。
【００７７】
不活化剤は、任意の特定の状況で望まれる結果のために組み合わせた温度／時間スキームで使用され、実質的に同じ結果を達成しながらこれら２つの因子を変動させることができる。不活化は高温でより速く、そのため不活化期間を短縮することができる。状況に依存して、不活化温度は、例えば、長い不活化時間（例えば数時間もしくは数日）で０℃ほどもの低さに保たれることがあり、または短時間（例えば、ほんの数分間）、６０℃ほどもの高さに保たれることがある。しかし、より高温では、多くの機能性タンパク質または抗原が損なわれるまたは破壊されることとなり、そのため好ましい処理は、通常、より低い温度（例えば、＜３０℃）を長時間用いることとなる。任意の特定の状況でのこれらのパラメータの影響を容易に試験することができる。
【００７８】
不活化剤は、化合物が関心のある試料中の所望の微生物を所望の処理期間にわたって不活化できるようにする温度で使用されるだろう。従って、任意の適する温度で、例えば、０℃〜６０℃の間、１０℃〜５０℃の間、１５℃〜４０℃の間、１５℃〜２５℃の間、１９℃〜２３℃の間などで不活化を行うことができる。不活化は、典型的には実質的に一定の温度、例えば±２℃、±１℃、で行われるだろう。しかし、幾つかの実施形態において、不活化は、異なる温度の相、例えば、低温での第一相（例えば、２℃〜８℃の間、例えば約４℃）およびより高温での、典型的には第一相より少なくとも１０℃高い、第二相（例えば、２５℃〜５０℃の間、例えば約３７℃）、またはより高温の第一相（例えば、２５℃〜５０℃の間、例えば約３７℃）、その後、より低温の第二相（例えば、２℃〜８℃の間、例えば約４℃）を用いる。
【００７９】
二相プロセスは、多官能性ペルオキシドを不活化と核酸分解の両方に使用する場合、特に有用である。典型的なスキームでは、より低温の相はウイルス不活化に好適であり得、これに対してより高温の相は、核酸分解に好適であり得る。
【００８０】
不活化剤は、関心のある試料中の微生物を所望の温度で、理想的には所望の微生物の免疫原性を低減することなく、不活化するために十分な時間、使用される。不活化処理は、典型的には１５分と７２時間の間、例えば、６時間〜４８時間、１２時間〜３６時間、１８時間〜２６時間、または約１６時間もしくは約２４時間、続く。
【００８１】
不活化される微生物の性質および工業上の設定に依存して、当業者は、（ｉ）不活化時間、（ｉｉ）不活化剤の濃度、および（ｉｉｉ）不活化温度の適切な組み合わせを選択することができる。実施において、ワクチン抗原のための不活化処理は、典型的に７２時間まで続くが、実施上の理由のため２４時間までまたはより短いプロセス時間が好ましい。しかし、数週間までのはるかに長い不活化時間が、例えば細菌抗原を無毒化のために、用いられてもいる。頑強な抗原のために、または廃棄物中の微生物の不活化のために、より高い不活化剤濃度およびほんの数分または数時間の短い不活化時間が選択されることもある。
【００８２】
処理の単一ラウンドによって達成されるより高いレベルの分解を達成するまたは確保するために反復を用いて、不活化のまたは核酸分解のプロセスを１回以上行ってもよい（すなわち、多官能性有機ペルオキシドを試料に添加し、試料に作用させ、その後、さらなる多官能性有機ペルオキシドを添加する、など）。例えば、前記プロセスを２回行ってもよい。各ラウンドの時間、温度および濃度を含む条件は、同じであってもよいし、または異なってもよい。異なるラウンドが異なる目的（ｆｏｃｕｓ）（例えば、１つのラウンドは不活化に好適であり、別のラウンドは核酸分解に好適であるなど）を有することができるように、条件を変えることができる。任意の２つのラウンドは、好ましくは、同じ多官能性有機ペルオキシドを使用するが、代替法としてそれらは異なる多官能性有機ペルオキシドを使用することができる。あるプロセスは、多官能性有機ペルオキシドを使用する２つのラウンドの間に、残留多官能性有機ペルオキシドを除去するおよび／または分解する工程を含む場合があるが、幾つかの実施形態では、この除去を伴わずに第二のラウンドが進行する場合がある。
【００８３】
組み合わせ処理
本発明の不活化剤をアルキル化剤、すなわち化合物にアルキルラジカルを導入する物質、と組み合わせて使用することができる。適するアルキル化剤としては、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）などのモノアルキル化剤が挙げられる。ＢＰＬは、多くのワクチンの調製の際にウイルスの不活化のために使用されるモノアルキル化剤である［２］。ＢＰＬは、核酸を含む様々な生体分子と反応し、アルキル化およびデプリネイションによって構造上の修飾を生じさせる。
【００８４】
従って、本発明のプロセスが、多官能性有機ペルオキシドを使用する工程を伴う場合、そのプロセスは、アルキル化剤を使用する工程も伴うことができる。多官能性有機ペルオキシドとアルキル化剤を同時に使用するのではなく、これら２つの工程を好ましくは別々に行う。すなわち、多官能性有機ペルオキシドを使用して、後ほどアルキル化剤を使用するか、アルキル化剤を既に使用した後に多官能性有機ペルオキシドを使用する。
【００８５】
従って、例えば、本発明は、微生物含有試料を処理するためのプロセスを提供し、このプロセスは、前記試料を、いずれかの順序で、（ｉ）多官能性有機ペルオキシドおよび（ｉｉ）ＢＰＬなどのアルキル化剤と接触させる工程を包含する。
【００８６】
同様に、本発明は、薬学的組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、（ｉ）微生物含有試料を、いずれかの順序で、多官能性有機ペルオキシドおよびアルキル化剤と接触させる工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の生成物から薬学的組成物を調製する工程を包含する。両方の処理を伴う工程（ｉ）が、微生物の非常に良好な不活化を達成する。
【００８７】
本発明は、（ｉ）微生物と多官能性有機ペルオキシドの反応生成物、（ｉｉ）微生物とアルキル化剤の反応生成物、および／または（ｉｉｉ）微生物と多官能性有機ペルオキシドとアルキル化剤との反応生成物のうちの２つ以上を含む液体組成物も提供する。前記組成物は、β−ヒドロキシプロピオン酸を含むことがある。
【００８８】
本発明は、試料を処理するためのプロセスを提供し、このプロセスは、微生物含有試料とＢＰＬなどのアルキル化剤との反応生成物である前記試料を多官能性有機ペルオキシドと接触させる工程を包含する。逆に、本発明は、試料を処理するためのプロセスも提供し、このプロセスは、微生物含有試料と多官能性有機ペルオキシドの反応生成物である前記試料をＢＰＬなどのアルキル化剤と接触させる工程を包含する。本発明は、これら２つのプロセスのいずれかの結果として得られる処理された試料を使用する工程を含む、薬学的組成物の調製方法も提供する。
【００８９】
上で述べたように、アルキル化剤と組み合わせて使用する場合、処理の少なくとも１つのラウンドは、アルキル化剤によるものであり、処理の少なくとも１つのラウンドは、多官能性有機ペルオキシドによるものである。前記試料を不活化の第一のラウンドにおいてアルキル化剤で、そして不活化の第二のラウンドにおいて多官能性有機ペルオキシドで処理してもよいし、または代替的に、不活化の第一のラウンドにおいて多官能性有機ペルオキシドで、そして不活化の第二のラウンドにおいてアルキル化剤で処理してもよい。不活化のさらなるラウンドをアルキル化剤または多官能性有機ペルオキシドのいずれかで（または任意の他の不活化剤で）行ってもよい。
【００９０】
処理の各ラウンドの時間、温度および濃度を含む条件は、同じであってもよいし、または異なってもよい。ＢＰＬによる処理のための有用な条件を下で説明する：
ＢＰＬを典型的には１体積％未満（例えば、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０７５％、０．０５％、０．０２５％、０．０１％、または０．００５％未満）の最終濃度まで添加する。好ましくは、ＢＰＬを０．１％と０．０１％の間で使用する。
【００９１】
アルキル化剤を好ましくは緩衝化水性試料に添加し、その溶液のｐＨを好ましくは５と１０の間に維持する。さらに好ましくは、前記溶液のｐＨを６と９の間に維持する。さらにいっそう好ましくは、前記溶液のｐＨを７と８の間に維持する。
【００９２】
アルキル化剤による逐次的処理の間に、アルキル化剤除去工程があってもよいが、第一の処理からの残存アルキル化剤を一切除去せずに第二の処理のためにアルキル化剤を添加してもよい。同様に、多官能性有機ペルオキシドを使用した場合には、それをアルキル化剤による処理の前に除去してもよい。
【００９３】
アルキル化剤での、特にＢＰＬでの処理は、異なる温度での相を伴うことがある。例えば、低温での（例えば、２℃〜８℃の間、例えば約４℃での）第一の相、およびより高温での、典型的には第一の相より少なくとも１０℃高い（例えば、２５℃〜５０℃の間、例えば３７℃での）第二の相があってもよい。この二相プロセスは、アルキル化剤を不活化とＤＮＡ分解の両方に使用する場合、特に有用である。典型的なスキームでは、ウイルス不活化をより低温の相の間で行い、ＤＮＡ分解をより高温の相の間に行う。下でより詳細に説明するように、上昇された温度が熱感受性アルキル化剤の除去も助長し得る。
【００９４】
アルキル化剤および任意の残留副生成物を、好ましくは、医薬の最終調合前に除去する。従って、最終組成物は、併せて０．１％未満の遊離プロピオン酸とＢＰＬ（例えば、０．１％、０．０５％、０．０２５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、または０．０１％未満）を含有し得る。好ましくは、最終薬学的組成物は、０．０１％未満のＢＰＬを含有し得る。
【００９５】
ＢＰＬは、加熱して非毒性β−ヒドロキシプロピオン酸への加水分解を生じさせることによって、便利に除去することができる。加水分解に必要な時間の長さは、ＢＰＬの全量および温度に依存する。温度が高いほど、迅速な加水分解が生ずるが、活性なタンパク質性成分を損なわせるほど高く温度を上昇させるべきではない。２時間〜２．５時間、約３７℃への加熱がＢＰＬの除去に適している。ＤＮＡ断片化は、２℃〜８℃でのウイルス不活化工程中ではなく、３７℃でのＢＰＬ加水分解工程中に主として発生する。
【００９６】
薬学的組成物および製品
本発明は、薬学的組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、微生物含有試料（通常は液体試料）を多官能性有機ペルオキシドと接触させてその中の微生物を不活化する第一の工程、続いてその不活化された材料から薬学的組成物を調製する工程を包含する。不活化された材料を医薬の調製に直接使用することができ、またはそれをさらなる処理、例えば希釈、精製、他の活性成分との組み合わせ、不活性医薬成分との組み合わせなど、に供することができる。
【００９７】
例えば、本発明は、ワクチンを調製するための方法を提供し、この方法は、ウイルス含有試料（例えば、液体試料、例えば培養液）を多官能性有機ペルオキシドと接触させてウイルスを不活化する第一の工程、続いてその不活化されたウイルスから薬学的組成物を調製する工程を包含する。不活化されてウイルスをワクチンの調製に直接使用することができ、またはそれをさらなる処理、例えば希釈、ウイルス成分のさらなる精製、他のワクチン抗原（ウイルス性および／もしくは細菌性）との組み合わせ、緩衝液（単数もしくは複数）との組み合わせ、アジュバントとの組み合わせなど、に供することがある。
【００９８】
このプロセスは、微生物含有試料を調製する最初の工程、例えばウイルスまたは細菌培養工程、を含むことができる。
【００９９】
ウイルスを成長させた後、精製ビリオンに対して、例えば、清澄化細胞培養物中に存在するビリオンに対して、またはそのような清澄化細胞培養物から精製されたビリオンに対して、不活化剤を使用することができる。１つの方法は、清澄化による細胞材料の除去、およびその後、その清澄化された細胞培養物からの、例えばクロマトグラフィーによる、ビリオンの精製を伴うだろう。不活化剤を、この様式で生成されたビリオンに対して使用することができ、またはさらなる必要に応じた限外濾過／ダイアフィルトレーション工程後に使用してもよい。上で述べたように、多官能性有機ペルオキシドは、ウイルスを不活化することに加えて、ウイルスを成長させた細胞基質からの一切の残留ＤＮＡを分解することができる。
【０１００】
不活化剤をエンドトキシン除去工程前に使用することができ、またはエンドトキシン除去工程を行った後に使用することができる。
【０１０１】
ワクチン組成物は、例えば不活化インフルエンザウイルスからのスプリットまたは表面抗原ワクチンの調製の場合のように、不活化ウイルスからの免疫原性タンパク質（単数または複数）の精製によって調製することができる。
【０１０２】
不活化のためのウイルスは、任意の適する基質を用いて、例えば、細胞株培養物中、初代細胞培養物中、卵の中、などで、増殖させることができる。細胞培養は、多くの場合、哺乳動物細胞、例えば、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）およびイヌの細胞を使用するだろう。様々な細胞タイプ、例えば腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など、を使用することができる。適するハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名を有する細胞株である。適するサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞、例えばＶｅｒｏ細胞株におけるような腎臓細胞である［１１−１３］。適するイヌ細胞は、例えば、ＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞株におけるような腎臓細胞である。従って、適する細胞株としては、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８；などが挙げられるが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスを成長させるために好ましい哺乳動物細胞としては、メイディン・ダービー・イヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［１４−１７］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞［１８−２０］；またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［２１］が挙げられる。これらの細胞株は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［２２］から、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［２３］から、またはＥｕｒｏｐｉａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から、幅広く入手できる。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７で様々な異なるＶｅｒｏ細胞を供給しており、ならびにカタログ番号ＣＣＬ−３４でＭＤＣＫ細胞を供給している。ＰＥＲ．Ｃ６は、ＥＣＡＣＣから寄託番号９６０２２９４０で入手できる。哺乳動物細胞を使用することと同様に、アヒル（例えば、アヒル網膜）または雌鶏に由来する細胞株、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）など、を含む鳥類細胞または細胞株（例えば、参考文献２４−２６を参照のこと）上でウイルスを成長させることができる。例としては、ニワトリ胚性幹細胞に由来するＥＢｘ細胞株、ＥＢ４５、ＥＢ１４およびＥＢ１４−０７４［２８］を含む、鳥類胚性幹細胞［２４、２７］が挙げられる。
【０１０３】
１つの有用な細胞株は、メイディン・ダービー・イヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ［２９−３１］である。元のＭＤＣＫ細胞株は、ＡＴＣＣからＣＣＬ−３４として入手できる。ＭＤＣＫ細胞の派生物も使用することができる。例えば、参考文献１４は、懸濁培養での成長に適合させたＭＤＣＫ細胞株（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ  ３３０１６」）を開示している。同様に、参考文献３２は、無血清培養で懸濁状態で成長するＭＤＣＫ由来細胞株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）を開示している。参考文献３３は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を開示している。参考文献３４は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２）を含む、感染に対する高い易罹患性を有するＭＤＣＫ細胞株を開示している。これらのＭＤＣＫ細胞株のいずれを使用してもよい。
【０１０４】
ウイルスを懸濁培養（例えば、参考文献１４、３５および３６を参照のこと）で成長させることができ、または付着培養で成長させることができる。懸濁培養のための１つの適するＭＤＣＫ細胞株は、（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された）ＭＤＣＫ３３０１６である。代替法として、マイクロキャリア培養を使用することができる。
【０１０５】
ウイルスを無血清培養培地および／または無タンパク質培地で成長させることができる。培地は、ヒトまたは動物起源の血清からの添加物を含有しない場合、本発明の文脈の中で無血清培地と呼ばれる。無タンパク質は、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除して細胞の増殖（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が生じる培養であるが、ウイルス成長に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどの外因性タンパク質を場合により含むことがある培養を意味すると解される。
【０１０６】
材料であって、それら自体は薬学的組成物ではないが、薬学的組成物の調製中に使用されるものである材料を調製するためにも、本発明を使用することができる。例えば、本発明は、多官能性有機ペルオキシドを使用して既存のまたは可能性のある汚染ウイルスを不活化することによる、発酵培養プロセスからの組換えタンパク質分子などの、安全な医薬製品を製造するための方法を提供する。そのようなプロセスに存在し得るまたは導入される得るウイルスは、例えば、多くの不朽細胞株（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）に、特に、齧歯動物細胞、例えばＣＨＯ（チャイニースハムスター卵巣）細胞、またはマウス骨髄腫細胞、に存在するレトロウイルスである。他の汚染物は、動物由来原料、例えばブタトリプシン、ウシ起源の培地補充物または動物起源のタンパク質水解物に由来する動物ウイルスであり得る。不活化剤を製造プロセスのほぼいずれの工程にでも導入することができる：原料、緩衝液、培地および他の出発物質の前処理にそれを使用してもよいし、バルク原料（例えば、発酵槽回収物）の回収中もしくは後に、または後の濃縮および精製工程中もしくは後にそれを適用してもよい。しかし、実施上の理由から、プロセスを通して活性微生物が持ち越されるのを避けるためにプロセスの早期に不活化を行うことが好まれる。
【０１０７】
薬学的組成物は、通常はそれらの抗原に加えて成分を含み、例えば、典型的には１つ以上の薬学的キャリア（単数もしくは複数）および／または賦形剤（単数もしくは複数）を含む。そのような成分の詳細な論述は、参考文献３７において入手できる。ワクチン組成物は、例えば参考文献３８および３９に開示されているようなアジュバント（例えば、１つ以上のアルミニウム塩を含む、またはサブミクロン水中油型エマルジョンを含むアジュバント）も含むことがある。
【０１０８】
薬学的組成物は、特に投与の時点で、好ましくは水性形態であるが、非水性液体形態でまたは乾燥形態で、例えばゼラチンカプセルまたは凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）などとして、提供することもできる。
【０１０９】
薬学的組成物は、１つ以上の保存薬、例えばチオメルサールまたは２−フェノキシエタノール、を含むことがある。水銀を含まない組成物が好ましく、保存薬を含まないワクチンを調製することができる。
【０１１０】
薬学的組成物は、例えば、張度を制御するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含むことがある。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が典型的であり、これは１ｍｇ／ｍＬと２０ｍｇ／ｍＬの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【０１１１】
薬学的組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、例えば、２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、または２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度を有し得る。
【０１１２】
薬学的組成物は、１つ以上の緩衝液を含むことがある。典型的な緩衝液としては、リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸塩緩衝液；コハク酸塩緩衝液；ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントとともに）；またはクエン酸塩緩衝液が挙げられる。緩衝液は、典型的には５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲で含まれるであろう。
【０１１３】
薬学的組成物は、典型的に、５．０と９．５の間、例えば、６．０と８．０の間のｐＨを有する。
【０１１４】
薬学的組成物は、好ましくは無菌である。
【０１１５】
薬学的組成物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準尺度）、および好ましくは１用量あたり＜０．１ＥＵを含有する。
【０１１６】
薬学的組成物は、好ましくはグルテンを含まない。
【０１１７】
薬学的組成物は、洗剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウム、を含むことができる。洗剤は、痕跡量でのみ存在し得る。
【０１１８】
組成物は、単回投与用の材料を含むことがあるか、または多回免疫化用の材料を含むことがある（すなわち、「多回用量（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ）」キット）。保存薬を含めることは、多回用量の構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において有用である。多回用量組成物に保存薬を含めることの代替法として（またはそれに加えて）、材料の取り出し用の無菌アダプタを有する容器に組成物を収容することができる。
【０１１９】
薬学的組成物および特にワクチンは、典型的には約０．５ｍＬの投薬体積で投与されるが、小児には半分の用量（すなわち、約０．２５ｍＬ）が投与されるだろう。
【０１２０】
薬学的組成物を様々な方法で投与することができる。最も好ましい経路は、筋肉内注射よる（例えば、腕または下肢への）経路であるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻内、経口、皮内、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）などが挙げられる。
【０１２１】
薬学的組成物は、動物（および特にヒト）患者への投与に適しており、従って、人的用途と獣医学的用途の両方を含む。患者における免疫応答を上昇させる方法においてそれらを使用することができ、この方法は、患者に前記組成物を投与する工程を含む。
【０１２２】
これらの方法によって上昇される免疫応答としては、一般に、抗体応答、好ましくは防御的抗体応答が挙げられる。ウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該技術分野において周知である。インフルエンザウイルスについては、例えば、ヒトでの研究により、ＨＡに対する抗体力価は防御と相関することが証明されている。
【０１２３】
上で述べたように、ワクチン組成物は、該組成物を受ける患者において惹起される免疫応答（体液性および／または細胞性）を強化するように機能することができる１つ以上のアジュバント（単数または複数）を含むことができる。有用なアジュバントは、１つ以上のアルミニウム塩を含み得る。もう１つの有用なアジュバントは、水中油型エマルジョンを含み得る。他の有用なアジュバントは、当該技術分野において公知である。
【０１２４】
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントを単独でかまたは組み合わせて使用することができる。これらの名前は従来的であるが、いずれも存在する実際の化合物の正確な記述ではないので、単に便宜上用いられている（例えば、参考文献４０の第９章を参照のこと）。本発明は、アジュバントとして一般に使用される任意の「水酸化物」または「リン酸塩」を使用することができる。患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋濃度は、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ未満、例えば、≦４ｍｇ／ｍＬ、≦３ｍｇ／ｍＬ、≦２ｍｇ／ｍＬ、≦１ｍｇ／ｍＬなどである。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍＬと１ｍｇ／ｍＬの間である。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【０１２５】
様々な有用な水中油型エマルジョンアジュバントが公知であり、それらは典型的には少なくとも１つの油と少なくとも１つの界面活性剤を含み、油（単数または複数）および界面活性剤（単数または複数）は、生体分解性（代謝性）および生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般に、直径が１μｍ未満であり、これらの小さいサイズは、マイクロフルイダイザーを用いて達成され、安定したエマルジョンを提供する。＜２２０ｎｍである平均直径を有する液滴は、濾過滅菌に供することができるので好ましい。有用なアジュバントとしては、スクアレンおよび／またはポリソルベート８０を挙げることができる。使用することができる適するアジュバントとしては、ＭＦ５９およびＡＳ０３として公知のものが挙げられる。
【０１２６】
免疫原性薬学的組成物を単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールによって投与することができる。複数の用量を一次免疫化スケジュールでおよび／または追加免疫化スケジュールで用いることができる。多回用量スケジュールでは、様々な用量を同じ経路または異なる経路、例えば、非経口での初回刺激（ｐｒｉｍｅ）および粘膜での追加刺激（ｂｏｏｓｔ）、粘膜での初回刺激および非経口での追加刺激などによって与えることができる。１用量より多く（典型的には２用量）の投与が免疫原的にナイーブな患者では特に有用である。複数の用量を典型的には少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）隔てて投与する。
【０１２７】
宿主細胞ＤＮＡ
上で述べたように、多官能性有機ペルオキシドを本発明に従って使用して核酸を分解することができる。これは、例えば細胞培養物中でのウイルスの成長後に依然として存在する、宿主細胞ＤＮＡなどのＤＮＡの分解に特に有用である。
【０１２８】
核酸を分解するための多官能性有機ペルオキシドでの処理は、理想的には、核酸が１０８塩基対あたり１０より多くの脱塩基ヌクレオチド残基を含むまで、例えば、それが１０７塩基対あたり１０より多くの脱塩基ヌクレオチド残基、１０６塩基対あたり１０より多くの脱塩基ヌクレオチド残基、または１０５塩基対あたり１０より多くの脱塩基ヌクレオチド残基を含むまで、継続する。脱塩基残基の（および特に、デプリネイション後の）存在は、核酸バックボーンの切断および従って断片化をもたらし得る。
【０１２９】
核酸を分解するための多官能性有機ペルオキシドでの処理は、理想的には、残存ＤＮＡ鎖の平均長が１０００塩基対未満（例えば、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５または５０塩基対未満）になるまで継続する。好ましくは、残存ＤＮＡの長さは、５００塩基対未満であり、さらに好ましくは２００塩基対未満である。いずれの残存ＤＮＡのサイズも、キャピラリーゲル電気泳動または核酸増幅技術を含む、標準的な技術によって測定することができる。これらの残存する短い断片は、それらが機能性タンパク質をコードする可能性が低いもしくはコードすることができない、ヒトレシピエントの染色体に転位される可能性が低いもしくは転位され得ない、または別様にレシピエントＤＮＡ複製機構によって認識される可能性が低いもしくは認識され得ないほど小さい。一般に、機能性タンパク質に翻訳され得るヌクレオチド配列は、プロモーター領域、開始コドン、停止コドン、および機能性タンパク質についての内部コーディング配列を必要とする。ＤＮＡ損傷が、例えば多官能性有機ペルオキシドでの処理によって発生する場合、これらの領域の多くが改変または破壊されるので、転写および／または翻訳はもはや生じ得ない。
【０１３０】
薬学的組成物は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、およびさらに好ましくは１００ｐｇ未満）の残留ＤＮＡを含有するが、痕跡量の宿主細胞ＤＮＡがなお存在することもある。一般に、本発明の組成物から排除されることが最も望ましい宿主細胞ＤＮＡは、２００塩基対より長いＤＮＡである。
【０１３１】
残留宿主細胞ＤＮＡの測定は、今では生物学的薬剤の慣例的規制要件であり、当業者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡを測定するために用いられるアッセイは、典型的には検証されたアッセイであるだろう［４１、４２］。検証されたアッセイの性能特性を数学的な用語および定量可能な用語で説明することができ、その誤差の可能性のある源は同定されているだろう。前記アッセイは、一般に、正確度、精度、特異性などの特性について試験されているだろう。一旦、アッセイを（例えば、宿主細胞ＤＮＡの公知標準量に対して）較正し、試験したら、定量的ＤＮＡ測定を慣例的に行うことができる。ＤＮＡ定量についての３つの原則技術を用いることができる：ハイブリダイゼーション法、例えばサザンブロットまたはスロットブロット［４３］；イムノアッセイ法、例えばＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システム［４４］：および定量的ＰＣＲ［４５］。これらの方法は、すべて当業者によく知られているが、各方法の特性そのものは、問題の宿主細胞、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択などによって左右され得る。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅｓからのＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムは、ピコグラムレベルの全ＤＮＡについての定量的アッセイであり、生物製剤中の汚染ＤＮＡのレベルのモニタリングに使用されている［４４］。典型的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質とウレアーゼ結合体化抗ｓｓＤＮＡ抗体とＤＮＡとの反応複合体の非配列特異的形成を伴う。すべてのアッセイ成分が、その製造業者から入手できる完全Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔに含まれている。様々な商業的製造業者、例えば、ＡｐｐＴｅｃ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（商標）、Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどが、残留宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供している。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡ汚染を測定するための化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと全ＤＮＡ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムの比較は、参考文献４６において見つけることができる。
【０１３２】
特にＭＤＣＫ細胞などのイヌの細胞に関して、ゲノムの分析は、長さが＜５００ｂｐの１３のコーディング配列、＜２００ｂｐの３つの配列および＜１００ｂｐの１つの配列を示す。従って、＜２００ｂｐへのＤＮＡの断片化は、実質的にすべてのコーディング配列を除去し、いずれの断片もその長さ付近の３つの遺伝子（すなわち：８１ｂｐのセクレチン；１０８ｂｐのＰＹＹ；および１３５ｂｐのオステオカルシン）のうちの１つに実際に対応する可能性は非常に低い。
【０１３３】
短い分解ＤＮＡは、長いＤＮＡより容易に組成物から除去することができるので、本発明は、薬学的組成物中の残留ＤＮＡの量の低減に有用である。遊離ＤＮＡを分解するように微生物含有組成物を処理した後、ＤＮＡ分解生成物を場合により除去することができる。従って、ウイルス含有試料については、ＤＮＡ分解生成物をウイルスから分離することができる。小さい可溶性分解ＤＮＡ断片を、例えばアニオン交換クロマトグラフィー、サイズベースの方法、などによって、ウイルスから容易に分離することができる。
【０１３４】
インフルエンザワクチン
本発明は、ワクチン製造中のインフルエンザウイルスの不活化に有用である。インフルエンザウイルス用のワクチンは、ビリオン全体に基づくことがあり、「スプリット」ビリオンに基づくことがあり、または精製表面抗原（赤血球凝集素を含み、通常はノイラミニダーゼも含む）に基づくことがある。本発明をこれらのいずれのタイプのワクチンの製造中にも使用することができる。
【０１３５】
インフルエンザビリオンをウイルス含有流体、例えば尿膜腔液または細胞培養上清、から様々な方法によって回収することができる。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するために洗剤を含む線形スクロース勾配溶液を使用するゾーン遠心分離を伴うことがある。その後、抗原を必要に応じた希釈後にダイアフィルトレーションによって精製してもよい。
【０１３６】
スプリットビリオンは、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分割プロセスを含む、サブビリオン調製物を生成させるための洗剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９など）での精製ビリオンの処理によって得られる。例えばインフルエンザウイルスを分割する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、参考文献４７〜５２などを参照のこと）。ウイルスの分割は、典型的には、感染性であろうと非感染性であろうとウイルス全体を破壊濃度の分割剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）で破壊するかまたは断片化することによって行われる。この破壊は、ウイルスの完全性を改変する、ウイルスタンパク質の完全なまたは部分的な可溶化を生じさせる結果となる。好ましい分割剤は、非イオン性およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤、例えばアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｌｅｎｅ）エステルなどである。１つの有用な分割手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの逐次的作用を用い、最初のビリオン精製中に（例えば、スクロース密度勾配溶液中で）分割を行うことができる。従って、分割プロセスは、ビリオン含有材料の（非ビリオン材料を除去するための）清澄化、回収したビリオンの（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着などの吸着法を使用する）濃縮、非ビリオン材料からのビリオン全体の分離、密度勾配遠心分離工程において分割剤を使用する（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどの分割剤を含有するスクロース勾配を使用する）ビリオンの分割、およびその後、所望していない材料を除去するための濾過（例えば、限外濾過）を伴う場合がある。スプリットビリオンをリン酸ナトリウム緩衝化等張性塩化ナトリウム溶液に有用に再懸濁させることができる。スプリット・インフルエンザ・ワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）製品である。
【０１３７】
精製インフルエンザウイルス表面抗原ワクチンは、表面抗原赤血球凝集素および、典型的には、ノイラミニダーゼも含む。精製形態のこれらのタンパク質を調製するためのプロセスは、当該技術分野において周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）、ＡＧＲＩＰＲＡＬ（商標）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）製品は、インフルエンザ・サブユニット・ワクチンである。
【０１３８】
ＨＡは、現行の不活化インフルエンザワクチンにおける主免疫原であり、ワクチン用量は、典型的にＳＲＩＤによって測定されるＨＡレベルに照らして標準化される。既存のワクチンは、典型的には１株あたり約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば小児には、または汎流行状況では、またはアジュバントを使用するときには、より低い用量を使用することができる。１／２（すなわち、１株あたり７．５μｇ  ＨＡ）、１／４および１／８などの分割量が使用されるのと同様に、より高い用量（例えば、３×用量または９×用量［５３，５４］）も使用される。従って、ワクチンは、１インフルエンザ株あたり０．１μｇと１５０μｇの間、好ましくは、０．１μｇと５０μｇの間、例えば、０．１μｇ〜２０μｇ、０．１μｇ〜１５μｇ、０．１μｇ〜１０μｇ、０．１μｇ〜７．５μｇ、０．５μｇ〜５μｇなどのＨＡを含むことがある。具体的な用量としては、例えば、１株あたり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５などが挙げられる。
【０１３９】
本発明で使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスにおいて見いだされるような天然ＨＡを有することもあり、または修飾ＨＡを有することもある。例えば、ウイルスを鳥種において高病原性にさせる決定因子（例えば、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位周辺の高塩基性領域）を除去するようにＨＡを修飾することは公知である。逆遺伝学の使用は、そのような修飾を助長する。
【０１４０】
ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス株は、流行期ごとに変わる。汎流行間期では、ワクチンは、代表的に２つのインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）と１つのインフルエンザＢ型株とを含み、三価ワクチンが典型的である。本発明は、汎流行ウイルス株（すなわち、ワクチンレシピエントおよび一般ヒト集団が免疫学的にナイーブである株、特にインフルエンザＡ型ウイルス）、例えばＨ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプ株、も使用することができ、汎流行株のためのインフルエンザワクチンは、一価であることもあり、または汎流行株が補足された通常の三価ワクチンに基づくこともある。しかし、流行期に、およびワクチンに含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、ＨＡサブタイプ、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６のうちの１つ以上から防護することができる。本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９のうちの１つ以上から防護することができる。
【０１４１】
本発明の組成物は、インフルエンザＡ型ウイルスおよび／またはインフルエンザＢ型ウイルスを含めて、１つ以上（例えば、１、２、３、４以上）のインフルエンザウイルス株からの抗原（単数または複数）を含むことができる。ワクチンが１つより多くのインフルエンザ株を含む場合、代表的に、異なる株を別々に成長させ、それらを、ウイルスを回収して抗原を調製した後、混合する。従って、本発明のプロセスは、１つより多くのインフルエンザ株からの抗原を混合する工程を含むことがある。２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株からの抗原を含む、三価ワクチンが典型的である。２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および２つのインフルエンザＢ型ウイルス株、または３つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株からの抗原を含む、四価ワクチンも有用である［５５］。
【０１４２】
一旦、インフルエンザウイルスを特定の株について精製したら、それを他の株からのウイルスと組み合わせて、例えば、上で説明したような三価ワクチンを作製することができる。ウイルスを混合し、多価混合物からのＤＮＡを分解するのではなく、各株を別々に処理し、そして一価バルクを混合して最終多価混合物を得ることが好ましい。
【０１４３】
一般
用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含する。例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘから排他的に成ることがあり、または追加の何かを含むことがある（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１４４】
語「実質的に」は、「完全に」を除外しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないもある。必要とされる場合、語「実質的に」は本発明の定義から省略されることがある。
【０１４５】
数値ｘに関連して、用語「約」は、必要に応じたものであり、例えばｘ±１０％を意味する。
【０１４６】
明確に言及されない限り、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、いずれの特定の混合順序も求めない。従って、任意の順序で混合することができる。３成分がある場合には、２成分を互いに併せることができ、その後、その併せたものを第三の成分と併せてもよい、等々。
【０１４７】
動物（および特にウシ）材料を細胞の培養で使用する場合、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）が無いおよび特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）の無い源からそれらを得るべきである。全般的に、動物由来材料がまったく無い細胞を培養することが好ましい。
【０１４８】
化合物を組成物の一部として身体に投与する場合には、代替的にその化合物を適するプロドラッグで置換してもよい。
【０１４９】
細胞基質を（例えば、再集合または逆遺伝学のために）使用する場合、好ましくは、それは、例えば欧州薬局方総則（Ｐｈ  Ｅｕｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｃｈａｐｔｅｒ）５．２．３におけるような、ヒトワクチン生産における使用が認可されているものである。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１は、本発明の様々な不活化剤の構造を示す。
【図２】図２〜４は、時（図２および３では時間；図４では日）の経過につれてのＤＭＥＭ中の薬剤０６９−１の含有率（％）を示す。矢印は、不活化剤（アスコルビン酸またはグルコース）の添加を示す。
【図３】図２〜４は、時（図２および３では時間；図４では日）の経過につれてのＤＭＥＭ中の薬剤０６９−１の含有率（％）を示す。矢印は、不活化剤（アスコルビン酸またはグルコース）の添加を示す。
【図４】図２〜４は、時（図２および３では時間；図４では日）の経過につれてのＤＭＥＭ中の薬剤０６９−１の含有率（％）を示す。矢印は、不活化剤（アスコルビン酸またはグルコース）の添加を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１５１】
公知の不活化剤
公知不活化剤（β−プロピオラクトン、エチレンイミン、Ｎ−アセチルエチレンイミン、ホルマリン）を４つのウイルス：（ｉ）エンベロープが無く、ｄｓＲＮＡゲノムを有する、３型レオウイルス；（ｉｉ）エンベロープを有し、ｄｓＤＮＡゲノムを有する、ＨＳＶ−１ヘルペスウイルス；（ｉｉｉ）エンベロープが無く、ｄｓＤＮＡゲノムを有する、アデノウイルス５；および（ｉｖ）エンベロープを有し、ｓｓＲＮＡゲノムを有する、鳥類Ｃ型レトロウイルスについて試験した。レオウイルスは、二重カプシド層を有する小さな無エンベロープウイルスであり、そのようなウイルスは、不活化（それらに勝るのは結核菌および細菌胞子だけである［５６］）に対して非常に耐性である。
【０１５２】
結果を処理後のウイルス力価のｌｏｇ１０低減率（ｌｏｇ１０  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）として表１に表示する：
【０１５３】
【表１】
2013528586.tif 000007
これらのデータは、ヒトワクチンに使用した２つの主要な不活化剤（ＢＰＬおよびホルムアルデヒド）はすべての必要性を満たすことができないことを示す。安定したウイルスの低レベルの感染性でさえ、材料が下流での使用に（例えば、診断試薬として、またはワクチンもしくは他の医薬製品として）安全でない場合があることを意味する。
【０１５４】
新規な不活化剤
その安定性のため、レオウイルスモデルを樹立して、新規不活化剤の活性を評価した。哺乳動物オルトレオウイルス、３型（Ｄｅａｒｉｎｇ株、ＡＴＣＣ  ＶＲ−８２４）をＬ９２９マウス結合組織細胞（ＡＴＣＣ  Ｃｌ−１）において成長させた。感染培養物の細胞を含まない培養上清からウイルスストックを作製し、アリコートに分け、その後、−６０℃未満で保管した。不活化研究のためにウイルスを解凍し、その後、０．０５％不活化剤を添加し（体積で１：２０００）、その混合物を、ある一定の期間、低温（２℃〜８℃）、室温（１９℃〜２３℃と測定された）または３７℃でインキュベートした。ＢＰＬとの比較を可能にするために、（ｉ）不活化反応を一時的に３７℃に上昇させ、（ｉｉ）チオ硫酸ナトリウムを不活化終了時に添加した（１ｍＬの不活化溶液につき２０μＬの１．４Ｍストック溶液）。その後、標準的な力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）により試料を残留感染性ウイルスについて試験した。ウイルス調製物の１０倍系列希釈物をマイクロタイタープレートのＬ９２９培養物に接種した。成長ウイルスは、５〜６日後、顕微鏡により見ることができる細胞変性効果を生じさせる。力価をスピアマン・カーバー法（Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｅｒｂｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）によって計算した［５７］。それを１ｍＬあたりのｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０として表現する。残留力価が検出限界（１ｍＬあたり１．５  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０）より下である場合、それらを、対照試料力価と≦１．５と間の差として表現する。そのような低減を「≧」記号によって示す。
【０１５５】
第二の試験ではインフルエンザウイルスを使用した。それはレオウイルスより安定性が低い。本質的にはレオウイルスについて説明したようにウイルス力価測定を行ったが、Ｌ９２９ではなくＭＤＣＫ細胞を用いた。加えて、そのエンベロープ赤血球凝集素糖タンパク質（重要なワクチン免疫原）の安定性を評価した。赤血球凝集試験によってそれを機能的にアッセイすることができる。定量的ＨＡアッセイのために、ウイルス調製物をＰＢＳで系列希釈（ｌｏｇ２希釈）し、ＰＢＳ中の０．５％ニワトリ赤血球と共にインキュベートした。周囲温度でのインキュベーション後、ＨＡ反応を評価した。明確な赤血球凝集を依然として生じさせる最高ウイルス希釈度の逆数として活性を表現し、不活化前および後の力価として結果を示す。
【０１５６】
図１および／または表１８からの番号付けで、様々な不活化剤を試験した。すべてが０．０５％の濃度であった。混合物を使用したときはこれが総不活化剤濃度である。
レオウイルスでの結果は次のとおりであった（表２）：
【０１５７】
【表２】
2013528586.tif 000008
前の結果でわかるように、ＢＰＬ数値は、レオウイルス不活化が困難であることを裏付ける。複数のペルオキシドを有するすべての不活化剤は、ＢＰＬより（および前の実験でのホルムアルデヒドより）良好な不活化をもたらした。単一のペルオキシドを有する化合物（０７２）は、不良に機能した。より短い鎖長を有する（Ｃ４より低い）化合物は、最良の結果をもたらした。温度が高いほど良好な結果をもたらしたが、３７℃での長いインキュベーションは、良好な熱安定性を有することができない抗原には理想的でない。より高温でより短時間が最適だろう。
【０１５８】
インフルエンザウイルスでの結果は次のとおりであった（表３）：
【０１５９】
【表３−１】
2013528586.tif 000009
このように、検出限界より下へのインフルエンザウイルスの不活化が慣例的に達成された。さらにまた、より短い鎖長を有する化合物は最良の結果をもたらし、長い鎖長を有する分子、例えば０７１−１、０７８および０８０、ほど低い不活化能力を有した。さらに、すべての場合、および不活化温度にかかわらず、赤血球凝集力価は不活化による影響を受けなかった。これは、表面糖タンパク質の抗原性が無損傷のままであることを示す。
【０１６０】
安定した無エンベロープウイルス・細菌での結果は、成功裏の細菌の不活化も期待できることを意味する。１９６８年、Ｓｐａｕｌｄｉｎｇは、化学的不活化および消毒に対する耐性のレベルを定義した［５６］。この格付けによると、細菌（一部のマイコバクテリアおよび胞子を除く）は、裸の（非脂質性）ウイルスより化学的不活化に対する耐性が低い。この格付けは、何十年も前に確立されたが、未だに有効かつ適用可能である［５８］。従って、安定した無エンベロープウイルスに対する効力は、細菌もこれらの化合物によって不活化できることを意味する。
【０１６１】
不活化剤０６９−１の不活化能力をさらなるウイルスに対して試験した。これらの研究では、濃度、時間および温度を変化させて、不活化に適する条件をさらに評価した。力価測定法の検出限界（≦１０１．５  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）より下への完全な不活化が観察された場合、より低い検出限界を有する残留ウイルスについての試験を部分的に行った。ウイルスに関して陰性の場合、そのような「残留ウイルス試験」の結果は、１ｍＬの不活化試料あたりのそれぞれの検出限界を示すことによって得られる。これらの検出限界は、試験培養物に接種される試料体積に依存する。１０ｍＬの試料体積について、１０−１．５  ＴＣＩＤ５０／ｍＬという検出限界を得、１ｍＬの試料体積について、それぞれの検出限界は、１０−０．５  ＴＣＩＤ５０／ｍＬであり、０．１ｍＬの試料体積については、１００．５  ＴＣＩＤ５０／ｍＬであった。
【０１６２】
試験培養物中の残留細胞毒性（試験培養物中の細胞剥離または細胞死の初期徴候によって示される）が、信頼できる力価読み取りを損なわせた場合、それらの力価測定希釈度（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を評価しなかった。したがって、陰性力価測定の場合、適用可能な検出限界は、より高く、例えば、≦１０２．５  ＴＣＩＤ５０／ｍＬであった。不活化剤およびアスコルビン酸の残留物を有する接種材料が、試験培養物上に残っている場合、最低力価測定希釈度で細胞毒性反応がある程度観察された。より大きな試料体積での残留ウイルス試験では、より大きな培養物を使用したので細胞毒性効果は観察されず、３７℃で１時間のウイルスを吸着させた後に接種材料を除去し、中性緩衝液または培地で培養物を洗い流して（ｆｌｕｓｈ）残留化学物質を除去した。
【０１６３】
その後、ｌｏｇ１０低減値を、出発力価（同じ条件に曝露したが、不活化剤なしで緩衝液を添加した「保留試料（ｈｏｌｄ  ｓａｍｐｌｅ）」を用いて測定した）と不活化後の残留力価との差として計算した。「≧」符号を有する不活化率は、適用した方法の検出限界より下への完全な不活化を示す。その記号のない不活化率は、残留ウイルスの存在を示す。
【０１６４】
次の表は、ウイルス力価測定のためにおよびより大きい試料体積を用いる必要に応じた残留ウイルス試験のために使用したウイルスおよび利用した細胞培養物を示す。この表は、細胞およびウイルスの起源についての情報も提供し、細胞培養物接種とウイルス力価決定との間のインキュベーション期間（日）にも言及する。３％〜５％ウシ胎仔血清を補足したＤＭＥＭ（ダルベッコ変性イーグル培地）で細胞培養物を成長させた。５％ＣＯ２および９０％湿度を含有する雰囲気下、３７℃で、試験培養物をインキュベートした。
【０１６５】
【表３−２】
2013528586.tif 000010
不活化剤０６９−１を０．０２５、０．０５または０．１％（体積／体積）最終濃度の濃度で添加し、示した期間にわたってインキュベートした。所定の時点で不活化を停止させるために、０．２％の最終濃度を得るようにＬ＋アスコルビン酸を添加した。この停止剤は、１００ｍＬの蒸留滅菌水中の２０ｇ  Ｌ＋アスコルビン酸を含有する２０％ストック溶液として調製した。その後、その溶液を０．２μｍフィルターに通すことによって濾過滅菌した。
【０１６６】
表４〜１３は、様々な濃度の薬剤０６９−１による、および種々の条件下での、種々のウイルスモデルの不活化を示す。これらのウイルスの大部分は、無エンベロープであり、ならびに化学的不活化剤によって、およびウイルス抗原性を保存するために適用される条件下で、容易に不活化されない安定したウイルスの代表である。二本鎖ウイルス（ヘルペスウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、およびポリオーマウイルス）を選択した。なぜなら、それらは、化学的不活化および他の処理条件に対する耐性がより高いからである。これらのウイルスの大部分は、生物製剤プロセス用のプロセスのプロセス不活化を検証するためのモデルウイルスとして使用されている［５９］。
【０１６７】
ＢＰＬによる種々のウイルスの不活化についてのデータを表１４に提供する。表４〜１３のデータは、０６９−１が、殆どの場合、優れた不活化をもたらすことを示す。
【０１６８】
不活化によって誘導される細胞ＤＮＡ損傷の分析
細胞ＤＮＡに対する薬剤０６９−１の効果を、細胞培養産物またはインフルエンザ感染細胞不含ＭＤＣＫ培養産物（残留細胞ＤＮＡを含有）を該不活化剤に曝露すること、およびその後、市販の「ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を使用して脱塩基部位（ＡＰＳ）について抽出ＤＮＡを分析することによって測定した。このキットは、核酸の脱塩基部位のアルデヒド基と特異的に反応するアルデヒド反応性プローブ（ＡＲＰ）を含有する。未結合ＡＲＰの除去後、ＤＮＡをマイクロタイター・プレート・ウエルに結合させ、ペルオキシダーゼ反応と呈色反応を発現する基質とによって標識部位を染色する。前記試験キットは、検量線の生成に使用するための標準物質も含有する。
【０１６９】
ＤＮＡ抽出は、Ｃｏｍｐｌｅｘ８００＿Ｖ４プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＳＰ自動抽出でＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）Ｖｉｒｓ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して行った。２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸収値（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）に基づきＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（商標）で溶出試料のＤＮＡ濃度を決定した。その後、ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｑａｕｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔのために、すべての試験試料をＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液で０．１μｇ／ｍＬ  ＤＮＡの最終濃度に希釈／調整した。ＴＥ緩衝液は、陰性対照としての役割を果たした。
【０１７０】
ＤＮＡ損傷およびＡＰＳの測定は、前記試験キットの指示に従って行った。標準曲線の定量的試験範囲をはるかに超える強い反応のため、１つの試験試行のすべての標識および洗浄試料を同じ比で希釈することによってこれを補償するよう試みた。それにもかかわらず、信頼できる定量的試験範囲より上の極度の呈色反応は避け難かった。従って、１０５塩基対あたり４０ＡＰＳの上部標準曲線範囲より上のＡＰ部位の値は、それより下のものより信頼性が低いだろう。さらに、操作者による誤差または固有の試験不一致に起因すると考えることができない高い試験変動性も観察された。
【０１７１】
しかし、インフルエンザウイルス感染細胞からのＤＮＡは、種々のウイルス株を感染のために使用したとき特に高い変動性を示した。これは、アポトーシス的損傷ＤＮＡが、正常細胞ＤＮＡとは異なって反応し得ることを示している。それ故、試験を半定量的な比較方法で、ならびに参照およびコンパレーターとしてＢＰＬ不活化試料を含めることによって、試験を適用した。従って、定量的試験結果および絶対値（１０５塩基対あたりのＡＰＳ）は、異なる試験間で比較すべきでなく、１つのおよび同じ試験試行の中で試験した異なる条件を比較するためにのみ使用すべきである。
【０１７２】
下に示すデータセットは、別々の表における１つの比較試験試行によって得られた結果を提供するものであり、同じ表中の異なる試験試行からの混合された結果を提供するものではない。直接比較に必要とされる場合を除き、試験キット・マイクロタイター・プレートへの吸着前の試料希釈を考慮しなかった。従って、異なる試験試行において試験した類似の条件について異なるＡＰＳ値を示すことがある。１より上のＡＰＳ値は、小数点のない丸めた数値として与えた。
【０１７３】
ＢＰＬの一般に適用される０．０５％最終濃度を用いて不活化された試料により、ＢＰＬ不活化からの比較結果を得た。不活化は、常に、ＢＰＬを低温ウイルス調製物に添加することおよび２〜８℃で１６時間インキュベートすることによって適用した。その後、温度を３７℃に上昇させることおよびさらに２時間インキュベートすることによって、不活化を停止させた。３７℃で、最初のうちは不活化が漸増速度で続き、同時にＢＰＬが急速に分解される。従って、その上昇した温度はＤＮＡ損傷にも影響を及ぼすと予想され、および／または部分的に損傷したＤＮＡに対する二次反応に寄与する。
【０１７４】
下の表に示す濃度および温度で１６時間の標準不活化時間を用いて０６９−１での不活化を行った。アスコルビン酸の添加により不活化を停止させた。特定の研究のためおよび直接比較のためだけに、０６９−１での不活化を、ＢＬＰについて用いたようなインキュベーション条件、すなわち２−８℃で１６時間、加えて３７℃で２時間、にも供した。
【０１７５】
表１５は、相対ＡＰＳ値を示す（１は未処理試料である）。３つの異なるインフルエンザ株（Ａ／Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ／１６／１０  ＮＩＢ−７４、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２０１０およびＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９  Ｘ−１７９Ａ）で感染させた細胞上清からのＤＮＡを使用した。Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを除き、ＤＮＡ損傷は、ＢＰＬでより０６９−１でのほうが高く、濃度依存的であった。
【０１７６】
表１６は、インフルエンザ感染細胞ＤＮＡ（Ｂ／ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０株）を、単回の不活化の場合の異なる濃度の０６９−１で処理したときの、または２回の逐次的不活化ラウンドで処理したときの、相対ＡＰＳ値を示す。観察されたＤＮＡ損傷は、より低濃度の０６９−１を使用したときでさえ、ＢＰＬよりも０６９−１でより強く、それらの効果は濃度依存的であった。この２回の不活化は、単回の不活化より強いＤＮＡ損傷を明確に生じさせた。
【０１７７】
表１７は、インフルエンザ感染細胞ＤＮＡ（Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０株）を先ずＢＰＬ（１６時間、２−８℃、その後２時間、３７℃）で処理し、続けて異なる濃度の０６９−１で不活化したときの相対ＡＰＳ値を示す。このシリーズでは、０６９−１も標準ＢＰＬ不活化についてのものと同じ条件下で使用した。この不活化もアスコルビン酸によって停止させた。多少の注意を払うと（二重不活化試料は、すべて、試験の測定可能範囲より高く、従って、試験プレートへの吸着前に１０倍希釈しなければならなかった）、ＤＮＡ損傷は、ＢＰＬおよび０６９−１での二重処理によって明確に増加された。最初の低温相後の０６９−１についての不活化温度を、２時間、３７℃へ上昇させることも、ＤＮＡ損傷を大きく増進させた。明らかに、ＢＰＬによって引き起こされるＤＮＡ損傷を二回のＢＰＬ処理によってのみ増進させることができるわけではなく、ＢＰＬに加えて０６９−１などのヒドロペルオキシド不活化剤を使用することによってもさらにいっそう増進させることができる。
【０１７８】
合成および安定性
ジェミナルジヒドロペルオキシドの一般合成を、理想的には適する触媒の存在下で、次のように行うことができる：
【０１７９】
【化５】
2013528586.tif 000011
この合成は、安定性によって制限され、構造に依存する。非常に高い酸素含有率（例えば、化合物０６９−１は６８％酸素を有する）にもかかわらず、一部の化合物は著しく安定しているが、それらは、取り扱いを間違えると自然爆発または分解する傾向があり得る。この効果は、アルキル側鎖を短くすることによって増加される。安全性考慮のため、それらの化合物を凍結水溶液または凍結固形物として供給するのが最良だろう。
【０１８０】
０５７の不活化能力は、−２０℃での６ヶ月の保管後、喪失することが分かったので、新鮮なものを使用するのが最良である。同じことが他の化合物および／または混合物に言えることがある。
【０１８１】
化合物の安定性をＮＭＲによって評価した。結果は次のとおりである：
【０１８２】
【表３−３】
2013528586.tif 000012
水性条件でのおよび特に培養培地中での０６９−１の安定性を研究するためにＮＭＲも用いた。これらの研究は、最高分解能５００ＭＨｚ  ＮＭＲとＤＭＥＭ中の０．１％０６９−１を用いた。
【０１８３】
図２は、非常に遅い分解を伴う、２５℃での安定性を示す。２４０時間（１０日）後、２５％しか分解されなかった。２４０時間後のアスコルビン酸の添加は、即時分解をもたらし、これは、アスコルビン酸を完全に使い切って分解プロセスにもはや利用できなくなったときに停止した（線が横ばいになる）。２モルより多くのアスコルビン酸を１モルの０６９−１に添加すると、０６９−１の完全分解が観察できるだろう。
【０１８４】
図３は、３７℃での安定性を示す。分解は２５℃よりも速く、５５時間後、５０％が分解された。１４５時間後のアスコルビン酸の添加は、明瞭に観察することができる即時分解を生じさせる結果となる。
【０１８５】
図４は、異なる温度でのおよびグルコースの添加後の安定性を示す。３０日より長い間、ＤＭＥＭ中、５℃においては分解が無い。グルコースの添加（８倍モル過剰）および５℃で５日間のさらなる保管の後、依然として分解を観察することはできなかった。温度を２５℃に上昇させると、分解プロセスがゆっくりと開始したが、約１０％の濃度に下がるためには４０日超をなお必要とする。
【０１８６】
多くのウイルス成長培地が追加のグルコース（または類似の糖）を含有し、これらが不活化剤を分解するかどうかを知ることは重要であったので、グルコースの添加を試験した。少なくともより低温については、これらの糖の存在は問題であるように思われない。
【０１８７】
水性条件での０６９−１の高い安定性は驚くべきことである。なぜなら、ペルオキシ基は非常に不安定であるので、ペルオキシドが一般に（および特に、１−５個しか炭素原子を有さない短鎖ペルオキシドが）急速に分解されやすいまたは爆発さえしやすいことは非常によく知られているからである。薬剤０６９−１は、ＤＭＥＭのような複雑な環境ででさえ種々の温度で溶解状態で予想外に高い安定性を示す。この分子は、６８％酸素を含有するので、２個しか炭素原子を含有しないジェミナルビスヒドロペルオキシドに対して最も顕著で予想外の安定性レベルを保有する。溶解状態での予想分解時間尺度は、ほぼ数分〜数時間程度であったが、図２−４は、２５℃で２５０時間より長くにわたって高い安定性を示す。
【０１８８】
単なる例として本発明を説明したこと、および本発明の範囲および精神の中にとどまりながら変更を行うことができることは、理解されるであろう。
【０１８９】
ＬＲＶの表
【０１９０】
【表４】
2013528586.tif 000013
【０１９１】
【表５】
2013528586.tif 000014
【０１９２】
【表６】
2013528586.tif 000015
【０１９３】
【表７】
2013528586.tif 000016
【０１９４】
【表８】
2013528586.tif 000017
【０１９５】
【表９】
2013528586.tif 000018
【０１９６】
【表１０】
2013528586.tif 000019
【０１９７】
【表１１】
2013528586.tif 000020
【０１９８】
【表１２】
2013528586.tif 000021
【０１９９】
【表１３】
2013528586.tif 000022
【０２００】
【表１４】
2013528586.tif 000023
表中で用いた略語：
ｔＩＡ：不活化時間／持続時間（単位：時間）
ＴＩＡ：不活化温度
ＴＣＩＤ５０／ｍｌ：１ｍＬあたりの５０％組織培養感染単位
ＬＲＶ：ｌｏｇ１０低減値
Ｒｅｓ．ウイルス試験：より大きな試料体積を用いる残留ウイルスについての試験（上の本文参照）
９５％ＣＩ：９５％信頼区画
ＲＴ：１７℃〜２６℃の範囲であった、周囲温度（室温）
ｎ．ｄ．：行われなかった、または決定されなかった
％値は、不活化剤の最終濃度を示す。
【０２０１】
ＤＮＡ損傷の表
【０２０２】
【表１５】
2013528586.tif 000024
【０２０３】
【表１６】
2013528586.tif 000025
【０２０４】
【表１７】
2013528586.tif 000026
本発明で有用な不活化剤（図１も参照のこと）
【０２０５】
【表１８】
2013528586.tif 000027
参考文献
【０２０６】
【化６】
2013528586.tif 000028
【０２０７】
【化７】
2013528586.tif 000029
【図１】
2013528586.tif 000034
【図２】
2013528586.tif 000035
【図３】
2013528586.tif 000036
【図４】
2013528586.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月7日(2012.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
細胞基質を（例えば、再集合または逆遺伝学のために）使用する場合、好ましくは、それは、例えば欧州薬局方総則（Ｐｈ  Ｅｕｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｃｈａｐｔｅｒ）５．２．３におけるような、ヒトワクチン生産における使用が認可されているものである。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
微生物含有試料を処理するためのまたは微生物を含有する危険のある試料を処理するためのプロセスであって、該試料を多官能性有機ペルオキシドと接触させる工程を包含する、プロセス。
（項目２）
核酸を含有する試料を処理するためのプロセスであって、該試料を多官能性有機ペルオキシドと接触させて該核酸を分解する工程を包含する、プロセス。
（項目３）
薬学的組成物を調製するための方法であって、該方法は、（ｉ）微生物含有試料と多官能性有機ペルオキシドとを接触させて、該試料中の微生物を不活化する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の生成物から薬学的組成物を調製する工程を包含する、方法。
（項目４）
多官能性有機ペルオキシドの水溶液であって、該多官能性有機ペルオキシドが（ａ）１重量％未満または（ｂ）５重量％〜７０重量％の間のいずれかの濃度で存在するものである水溶液。
（項目５）
（ｉ）不活化された微生物と（ｉｉ）１重量％未満の多官能性有機ペルオキシドとを含む水性組成物。
（項目６）
微生物と多官能性有機ペルオキシドとの反応生成物を含む水性組成物。
（項目７）
上記試料が、容器の表面または作業場の表面である、項目１に記載のプロセス。
（項目８）
上記微生物含有試料が、溶解状態の核酸も含む、項目１に記載のプロセスまたは項目３に記載の方法。
（項目９）
上記試料が、細胞培養物から得られ、および上記核酸が、該細胞培養物からの細胞ＤＮＡである、項目２もしくは項目８に記載のプロセスまたは項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記試料がウイルスを含有する、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目１１）
上記試料が、無エンベロープＤＮＡウイルスを含有する、項目１０に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目１２）
上記多官能性有機ペルオキシドが、−Ｏ−Ｏ−Ｈ基を含む、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目１３）
上記多官能性有機ペルオキシドが、ジェミナルペルオキシドである、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目１４）
上記多官能性有機ペルオキシドが、２つ、３つまたは４つのペルオキシド基を有する、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目１５）
上記多官能性有機ペルオキシドが、ジェミナルビスヒドロペルオキシドである、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目１６）
上記多官能性有機ペルオキシドが、ホモ二官能性である、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目１７）
上記多官能性有機ペルオキシドが、水溶性である、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目１８）
上記多官能性有機ペルオキシドが、ハロゲンを含まない、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目１９）
上記多官能性有機ペルオキシドが、炭素、水素および酸素のみから成る、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目２０）
上記多官能性有機ペルオキシドが、３００未満の分子量を有する、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目２１）
上記多官能性有機ペルオキシドが、式Ｉ：
【化８】
2013528586.tif 000038
を有し、式中、
Ｒ１ａは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２ａは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール、−（ＣＲ４Ｒ５）ｎＣＲ６（ＯＯＨ）２であるか、あるいはＲ２ａは、ＬによってＲ２ｂに連結されており；
Ｒ３は、ＨまたはＣ（ＯＯＨ）Ｒ１ｂＲ２ｂであり、
Ｒ１ｂは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２ｂは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであるか、あるいはＲ２ｂは、ＬによってＲ２ａに連結されており；
Ｒ４は、各出現時、ＨまたはＣ１−３アルキル、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ１−３−アルコキシ、Ｃ２−４−アルケニルオキシ、Ｃ１−３−アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−３アルキル化アミノカルボニル、Ｃ１−３−チオアルキル、Ｃ１−３−アルキルスルフィニル、Ｃ１−３−アルキルスルホニル、Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルおよびジ−Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルから選択され；
Ｒ５は、各出現時、ＨまたはＣ１−３アルキル、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ１−３−アルコキシ、Ｃ２−４−アルケニルオキシ、Ｃ１−３−アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−３アルキル化アミノカルボニル、Ｃ１−３−チオアルキル、Ｃ１−３−アルキルスルフィニル、Ｃ１−３−アルキルスルホニル、Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルおよびジ−Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルから選択され；
Ｌは、Ｃ１−８アルキレンであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ｎは、１〜８である、
上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目２２）
上記多官能性有機ペルオキシドが、式ＩＩ：
【化９】
2013528586.tif 000039
を有する、項目２１に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目２３）
Ｒ１ａが、ＨまたはＣＨ３であり；およびＲ２ａが、ＣＨ３、Ｅｔまたはｎ−Ｐｒである、項目２２に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目２４）
上記多官能性有機ペルオキシドが、式ＩＩＩ：
【化１０】
2013528586.tif 000040
を有する、項目２１に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目２５）
Ｒ１ａが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ａが、ＣＨ３、Ｅｔ、もしくはｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ａが、ＬによってＲ２ｂに連結されており；Ｒ１ｂが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ｂが、ＣＨ３、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ｂが、ＬによってＲ２ａに連結されており；およびＬが、−（ＣＨ２）３−である、項目２４に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目２６）
上記多官能性有機ペルオキシドが、式ＩＶ：
【化１１】
2013528586.tif 000041
を有する、項目２１に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目２７）
Ｒ１ａが、Ｈであり；Ｒ１ｂが、Ｈであり；およびｎが、３である、項目２６に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目２８）
Ｒ１ａおよびＲ２ａが、同一である；および／または
Ｒ１ａおよびＲ２ｂが、同一である；および／または
Ｒ２ａおよびＲ２ｂが、同一である、
項目１７〜２３のいずれか一項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目２９）
●Ｒ１ａが、ＨもしくはＣ１−４アルキルである；および／または
●Ｒ２ａが、ＨもしくはＣ１−４アルキルもしくは−（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＯＯＨ）２であるか、またはＬによってＲ２ｂに連結されている；および／または
●Ｒ１ｂが、ＨもしくはＣ１−４アルキルである；および／または
●Ｒ２ｂが、Ｃ１−４アルキルであるか、もしくはＬによってＲ２ａに連結されている。従ってＲ２ｂが、ＣＨ３、Ｅｔもしくはｎ−Ｐｒであり得る；および／または
●各Ｒ４が、ＨもしくはＣＨ３である；および／または
●各Ｒ５が、ＨもしくはＣＨ３である；および／または
●Ｌが、Ｃ２−５アルキレンである；および／または
●Ｒ６が、ＨもしくはＣ１−４アルキルである；および／または
●ｎが、２〜６である、
項目２１〜２８のいずれか一項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目３０）
Ｒ１ａが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ａがＣＨ３、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒもしくは−（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＯＯＨ）２であるか、またはＲ２ａが、ＬによってＲ２ｂに連結されており；Ｒ３が、ＨまたはＣ（ＯＯＨ）Ｒ１ｂＲ２ｂであり；Ｒ１ｂが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ｂが、ＣＨ３、Ｅｔもしくはｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ｂが、ＬによってＲ２ａに連結されており；Ｌが、−（ＣＨ２）３−であり；およびｎが、３である、項目２１〜２９のいずれか一項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目３１）
上記多官能性有機ペルオキシドが、図１に示す式を有する、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目３２）
上記多官能性有機ペルオキシドが、２，２’−ジヒドロペルオキシ−２，２’−ジブチルペルオキシド；２，２−ジヒドロペルオキシブタン；１，１−ジヒドロペルオキシメタン；１，１−ジヒドロペルオキシプロパン；１，１−ジヒドロ−ペルオキシブタン；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジプロピルペルオキシド；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジブチルペルオキシド；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジエチルペルオキシド；１，１，５，５−テトラヒドロペルオキシペンタン；３，７−ビス−ヒドロペルオキシ−１，２−ジオキセパン；および１，１−ジヒドロペルオキシエタンから成る群より選択される、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目３３）
上記多官能性有機ペルオキシドが、０．０１％〜０．２５％の間の濃度で使用される、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目３４）
上記多官能性有機ペルオキシドが、０℃〜５０℃の間の温度で使用される、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目３５）
上記多官能性有機ペルオキシドが、０．２５時間〜７２時間にわたり、不活化のために使用される、上記いずれかの項目に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。
（項目３６）
残存するまたは過剰なペルオキシドが、上記試料の処理後に除去される、上記いずれかの項目に記載のプロセス。
（項目３７）
除去が、還元剤を用いるものである、項目３６に記載のプロセス。
（項目３８）
上記還元剤が、アスコルビン酸または還元糖である、項目３７に記載のプロセス。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物含有試料を処理するためのまたは微生物を含有する危険のある試料を処理するためのプロセスであって、該試料を多官能性有機ペルオキシドと接触させる工程を包含し、該多官能性有機ペルオキシドは、式Ｉ：
【化１Ａ】
2013528586.tif 000042
を有し、式中、
Ｒ１ａは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２ａは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール、−（ＣＲ４Ｒ５）ｎＣＲ６（ＯＯＨ）２であるか、あるいはＲ２ａは、ＬによってＲ２ｂに連結されており；
Ｒ３は、ＨまたはＣ（ＯＯＨ）Ｒ１ｂＲ２ｂであり、
Ｒ１ｂは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２ｂは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであるか、あるいはＲ２ｂは、ＬによってＲ２ａに連結されており；
Ｒ４は、各出現時、ＨまたはＣ１−３アルキル、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ１−３−アルコキシ、Ｃ２−４−アルケニルオキシ、Ｃ１−３−アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−３アルキル化アミノカルボニル、Ｃ１−３−チオアルキル、Ｃ１−３−アルキルスルフィニル、Ｃ１−３−アルキルスルホニル、Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルおよびジ−Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルから選択され；
Ｒ５は、各出現時、ＨまたはＣ１−３アルキル、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ１−３−アルコキシ、Ｃ２−４−アルケニルオキシ、Ｃ１−３−アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−３アルキル化アミノカルボニル、Ｃ１−３−チオアルキル、Ｃ１−３−アルキルスルフィニル、Ｃ１−３−アルキルスルホニル、Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルおよびジ−Ｃ１−３−アルキルアミノスルホニルから選択され；
Ｌは、Ｃ１−８アルキレンであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノ、場合によりＮ−モノもしくはＮ−ジＣ１−６アルキル化アミノカルボニル、Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ｎは、１〜８である、
プロセス。
【請求項２】
ウイルス含有試料中またはウイルスを含有する危険のある試料中のウイルスを不活化するためのプロセスであって、該プロセスは、該試料を、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＯＨ基を含まない多官能性有機ペルオキシドと接触させる工程を包含する、プロセス。
【請求項３】
微生物含有試料を処理するためのまたは微生物を含有する危険のある試料を処理するためのプロセスであって、該プロセスは、該試料を、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＯＨ基を含まない多官能性有機ペルオキシドと接触させる工程を包含し、ここで、該プロセスは、アルキル化剤を使用する工程も包含する、プロセス。
【請求項４】
核酸を含有する試料を処理するためのプロセスであって、該試料を、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＯＨ基を含まない多官能性有機ペルオキシドと接触させて該核酸を分解する工程を包含する、プロセス。
【請求項５】
薬学的組成物を調製するための方法であって、該方法は、（ｉ）微生物含有試料と、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＯＨ基を含まない多官能性有機ペルオキシドとを接触させて、該試料中の微生物を不活化する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の生成物から薬学的組成物を調製する工程を包含する、方法。
【請求項６】
式Ｉを有する多官能性有機ペルオキシドの水溶液であって、該多官能性有機ペルオキシドが（ａ）１重量％未満または（ｂ）５重量％〜７０重量％の間のいずれかの濃度で存在するものである水溶液。
【請求項７】
（ｉ）不活化されたウイルスと（ｉｉ）１重量％未満の、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＯＨ基を含まない多官能性有機ペルオキシドとを含む水性組成物。
【請求項８】
ウイルスと、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＯＨ基を含まない多官能性有機ペルオキシドとの反応生成物を含む水性組成物。
【請求項９】
前記試料が、容器の表面または作業場の表面である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記微生物含有試料が、溶解状態の核酸も含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が、細胞培養物から得られ、および前記核酸が、該細胞培養物からの細胞ＤＮＡである、請求項４もしくは請求項１０に記載のプロセスまたは請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料がウイルスを含有する、請求項１〜５または９〜１１のいずれか一項に記載のプロセスまたは方法。
【請求項１３】
前記試料が、無エンベロープＤＮＡウイルスを含有する、請求項１２に記載のプロセスまたは方法。
【請求項１４】
前記多官能性有機ペルオキシドが、−Ｏ−Ｏ−Ｈ基を含む、請求項１〜４もしくは９〜１３のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記多官能性有機ペルオキシドが、ジェミナルペルオキシドである、請求項１〜４もしくは９〜１４のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記多官能性有機ペルオキシドが、２つ、３つまたは４つのペルオキシド基を有する、請求項１〜４もしくは９〜１５のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記多官能性有機ペルオキシドが、ジェミナルビスヒドロペルオキシドである、請求項１〜４もしくは９〜１６のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記多官能性有機ペルオキシドが、ホモ二官能性である、請求項１〜４もしくは９〜１７のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記多官能性有機ペルオキシドが、水溶性である、請求項１〜４もしくは９〜１８のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記多官能性有機ペルオキシドが、ハロゲンを含まない、請求項１〜４もしくは９〜１９のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記多官能性有機ペルオキシドが、炭素、水素および酸素のみから成る、請求項１〜４もしくは９〜２０のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記多官能性有機ペルオキシドが、３００未満の分子量を有する、請求項１〜４もしくは９〜２１のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記多官能性有機ペルオキシドが、式Ｉを有する、請求項２〜４もしくは９〜２２のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記多官能性有機ペルオキシドが、式ＩＩ：
【化２Ａ】
2013528586.tif 000043
を有する、請求項１もしくは２３に記載のプロセスまたは請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｒ１ａが、ＨまたはＣＨ３であり；およびＲ２ａが、ＣＨ３、Ｅｔまたはｎ−Ｐｒである、請求項２４に記載のプロセスまたは方法。
【請求項２６】
前記多官能性有機ペルオキシドが、式ＩＩＩ：
【化３Ａ】
2013528586.tif 000044
を有する、請求項１もしくは２３に記載のプロセスまたは請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
Ｒ１ａが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ａが、ＣＨ３、Ｅｔ、もしくはｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ａが、ＬによってＲ２ｂに連結されており；Ｒ１ｂが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ｂが、ＣＨ３、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ｂが、ＬによってＲ２ａに連結されており；およびＬが、−（ＣＨ２）３−である、請求項２６に記載のプロセスまたは方法。
【請求項２８】
前記多官能性有機ペルオキシドが、式ＩＶ：
【化４Ａ】
2013528586.tif 000045
を有する、請求項１もしくは２３に記載のプロセスまたは請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
Ｒ１ａが、Ｈであり；Ｒ１ｂが、Ｈであり；およびｎが、３である、請求項２８に記載のプロセスまたは方法。
【請求項３０】
Ｒ１ａおよびＲ２ａが、同一である；および／または
Ｒ１ａおよびＲ２ｂが、同一である；および／または
Ｒ２ａおよびＲ２ｂが、同一である、
請求項１もしくは２３〜２８のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
●Ｒ１ａが、ＨもしくはＣ１−４アルキルである；および／または
●Ｒ２ａが、ＨもしくはＣ１−４アルキルもしくは−（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＯＯＨ）２である、またはＬによってＲ２ｂに連結されている；および／または
●Ｒ１ｂが、ＨもしくはＣ１−４アルキルである；および／または
●Ｒ２ｂが、Ｃ１−４アルキルである、もしくはＬによってＲ２ａに連結されている。従ってＲ２ｂが、ＣＨ３、Ｅｔもしくはｎ−Ｐｒであり得る；および／または
●各Ｒ４が、ＨもしくはＣＨ３である；および／または
●各Ｒ５が、ＨもしくはＣＨ３である；および／または
●Ｌが、Ｃ２−５アルキレンである；および／または
●Ｒ６が、ＨもしくはＣ１−４アルキルである；および／または
●ｎが、２〜６である、
請求項１もしくは２３〜３０のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
Ｒ１ａが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ａがＣＨ３、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒもしくは−（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＯＯＨ）２であるか、またはＲ２ａが、ＬによってＲ２ｂに連結されており；Ｒ３が、ＨまたはＣ（ＯＯＨ）Ｒ１ｂＲ２ｂであり；Ｒ１ｂが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ｂが、ＣＨ３、Ｅｔもしくはｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ｂが、ＬによってＲ２ａに連結されており；Ｌが、−（ＣＨ２）３−であり；およびｎが、３である、請求項１もしくは２３〜３１のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記多官能性有機ペルオキシドが、図１に示す式を有する、請求項１〜４もしくは９〜３２のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記多官能性有機ペルオキシドが、２，２’−ジヒドロペルオキシ−２，２’−ジブチルペルオキシド；２，２−ジヒドロペルオキシブタン；１，１−ジヒドロペルオキシメタン；１，１−ジヒドロペルオキシプロパン；１，１−ジヒドロ−ペルオキシブタン；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジプロピルペルオキシド；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジブチルペルオキシド；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジエチルペルオキシド；１，１，５，５−テトラヒドロペルオキシペンタン；３，７−ビス−ヒドロペルオキシ−１，２−ジオキセパン；および１，１−ジヒドロペルオキシエタンから成る群より選択される、請求項１〜４もしくは９〜３３のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記多官能性有機ペルオキシドが、０．０１−０．２５％の間の濃度で使用される、請求項１〜４もしくは９〜３４のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記多官能性有機ペルオキシドが、０−５０℃の間の温度で使用される、請求項１〜４もしくは９〜３５のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記多官能性有機ペルオキシドが、０．２５−７２時間の間の時間、不活化のために使用される、請求項１〜４もしくは９〜３６のいずれか一項に記載のプロセスまたは請求項５もしくは１０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
残存するまたは過剰なペルオキシドが、前記試料の処理後に除去される、請求項１〜４または９〜３７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３９】
除去が、還元剤を用いるものである、請求項３８に記載のプロセス。
【請求項４０】
前記還元剤が、アスコルビン酸または還元糖である、請求項３９に記載のプロセス。
【請求項４１】
前記試料がウイルスを含有する、請求項６に記載の溶液。
【請求項４２】
前記試料が、無エンベロープＤＮＡウイルスを含有する、請求項４１に記載の溶液。
【請求項４３】
前記多官能性有機ペルオキシドが、−Ｏ−Ｏ−Ｈ基を含む、請求項６もしくは４１〜４２のいずれか一項に記載の溶液または請求項７もしくは８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記多官能性有機ペルオキシドが、ジェミナルペルオキシドである、請求項６もしくは４１〜４３のいずれか一項に記載の溶液または請求項７〜８もしくは４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記多官能性有機ペルオキシドが、２つ、３つまたは４つのペルオキシド基を有する、請求項６もしくは４１〜４４のいずれか一項に記載の溶液または請求項７〜８もしくは４３〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記多官能性有機ペルオキシドが、ジェミナルビスヒドロペルオキシドである、請求項６もしくは４１〜４５のいずれか一項に記載の溶液または請求項７〜８もしくは４３〜４５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記多官能性有機ペルオキシドが、ホモ二官能性である、請求項６もしくは４１〜４６のいずれか一項に記載の溶液または請求項７〜８もしくは４３〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記多官能性有機ペルオキシドが、水溶性である、請求項６もしくは４１〜４７のいずれか一項に記載の溶液または請求項７〜８もしくは４３〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記多官能性有機ペルオキシドが、ハロゲンを含まない、請求項６もしくは４１〜４８のいずれか一項に記載の溶液または請求項７〜８もしくは４３〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記多官能性有機ペルオキシドが、炭素、水素および酸素のみから成る、請求項６もしくは４１〜４９のいずれか一項に記載の溶液または請求項７〜８もしくは４３〜４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記多官能性有機ペルオキシドが、３００未満の分子量を有する、請求項６もしくは４１〜５０のいずれか一項に記載の溶液または請求項７〜８もしくは４３〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記多官能性有機ペルオキシドが、式Ｉを有する、請求項４１〜５１のいずれか一項に記載の溶液または請求項７もしくは４３〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記多官能性有機ペルオキシドが、式ＩＩ：
【化５Ａ】
2013528586.tif 000046
を有する、請求項６もしくは５２のいずれか一項に記載の溶液または請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
Ｒ１ａが、ＨまたはＣＨ３であり；およびＲ２ａが、ＣＨ３、Ｅｔまたはｎ−Ｐｒである、請求項５３に記載の溶液または組成物。
【請求項５５】
前記多官能性有機ペルオキシドが、式ＩＩＩ：
【化６Ａ】
2013528586.tif 000047
を有する、請求項６もしくは５２のいずれか一項に記載の溶液または請求項５２に記載の組成物。
【請求項５６】
Ｒ１ａが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ａが、ＣＨ３、Ｅｔ、もしくはｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ａが、ＬによってＲ２ｂに連結されており；Ｒ１ｂが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ｂが、ＣＨ３、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ｂが、ＬによってＲ２ａに連結されており；およびＬが、−（ＣＨ２）３−である、請求項５５に記載の溶液または組成物。
【請求項５７】
前記多官能性有機ペルオキシドが、式ＩＶ：
【化７Ａ】
2013528586.tif 000048
を有する、請求項６もしくは５２のいずれか一項に記載の溶液または請求項５２に記載の組成物。
【請求項５８】
Ｒ１ａが、Ｈであり；Ｒ１ｂが、Ｈであり；およびｎが、３である、請求項５７に記載の溶液または組成物。
【請求項５９】
Ｒ１ａおよびＲ２ａが、同一である；および／または
Ｒ１ａおよびＲ２ｂが、同一である；および／または
Ｒ２ａおよびＲ２ｂが、同一である、
請求項６もしくは５２〜５７のいずれか一項に記載の溶液または請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
●Ｒ１ａが、ＨもしくはＣ１−４アルキルである；および／または
●Ｒ２ａが、ＨもしくはＣ１−４アルキルもしくは−（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＯＯＨ）２である、またはＬによってＲ２ｂに連結されている；および／または
●Ｒ１ｂが、ＨもしくはＣ１−４アルキルである；および／または
●Ｒ２ｂが、Ｃ１−４アルキルである、もしくはＬによってＲ２ａに連結されている。従ってＲ２ｂが、ＣＨ３、Ｅｔもしくはｎ−Ｐｒであり得る；および／または
●各Ｒ４が、ＨもしくはＣＨ３である；および／または
●各Ｒ５が、ＨもしくはＣＨ３である；および／または
●Ｌが、Ｃ２−５アルキレンである；および／または
●Ｒ６が、ＨもしくはＣ１−４アルキルである；および／または
●ｎが、２〜６である、
請求項６もしくは５２〜５７のいずれか一項に記載の溶液または請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
Ｒ１ａが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ａがＣＨ３、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒもしくは−（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＯＯＨ）２であるか、またはＲ２ａが、ＬによってＲ２ｂに連結されており；Ｒ３が、ＨまたはＣ（ＯＯＨ）Ｒ１ｂＲ２ｂであり；Ｒ１ｂが、ＨまたはＣＨ３であり；Ｒ２ｂが、ＣＨ３、Ｅｔもしくはｎ−Ｐｒであるか、またはＲ２ｂが、ＬによってＲ２ａに連結されており；Ｌが、−（ＣＨ２）３−であり；およびｎが、３である、請求項６もしくは５２〜６０のいずれか一項に記載の溶液または請求項５２〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
前記多官能性有機ペルオキシドが、図１に示す式を有する、請求項６もしくは４１〜６１のいずれか一項に記載の溶液または請求項７〜８もしくは４３〜６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
前記多官能性有機ペルオキシドが、２，２’−ジヒドロペルオキシ−２，２’−ジブチルペルオキシド；２，２−ジヒドロペルオキシブタン；１，１−ジヒドロペルオキシメタン；１，１−ジヒドロペルオキシプロパン；１，１−ジヒドロ−ペルオキシブタン；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジプロピルペルオキシド；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジブチルペルオキシド；１，１’−ジヒドロペルオキシ−１，１’−ジエチルペルオキシド；１，１，５，５−テトラヒドロペルオキシペンタン；３，７−ビス−ヒドロペルオキシ−１，２−ジオキセパン；および１，１−ジヒドロペルオキシエタンから成る群より選択される、請求項６もしくは４１〜６２のいずれか一項に記載の溶液または請求項７〜８もしくは４３〜６２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
前記多官能性有機ペルオキシドが、０．０１−０．２５％の間の濃度で使用される、請求項６もしくは４１〜６３のいずれか一項に記載の溶液または請求項７〜８もしくは４３〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記多官能性有機ペルオキシドが、０−５０℃の間の温度で使用される、請求項６もしくは４１〜６４のいずれか一項に記載の溶液または請求項７〜８もしくは４３〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記多官能性有機ペルオキシドが、０．２５−７２時間の間の時間、不活化のために使用される、請求項６もしくは４１〜６５のいずれか一項に記載の溶液または請求項７〜８もしくは４３〜６５のいずれか一項に記載の組成物。
【国際調査報告】
2013528586.tif 000049
2013528586.tif 000050
2013528586.tif 000051
2013528586.tif 000052