(57)【要約】TLR3活性を刺激するためのTLR3アゴニスト化合物、組成物、および方法を提供する。該組成物は、他の治療的および/または予防的化合物および/または組成物と組み合わせて、TLR3と結合し、それを活性化するオリゴヌクレオチドベースの化合物も含み得る。TLR3活性を刺激し、TLR3活性の調節が有益である疾病または障害を予防または治療するための該化合物および組成物の使用方法を提供する。
2013532976.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)  構造：5’-ドメインA-ドメインB-3’を有する第１オリゴリボヌクレオチド、および
ii)構造：5’-ドメインC-ドメインD-3’を有する第２オリゴリボヌクレオチドを含む合成TLR3アゴニストであって、
ドメインAが第１相補的ドメインであり、ドメインBがポリリボイニノシンドメインであり、ドメインCが第２相補的ドメインであり、ドメインDがポリリボシチジンドメインであり；ドメインAおよびドメインCが互いに相補的であり、
該第１オリゴリボヌクレオチドおよび該第２オリゴリボヌクレオチドが
(i)遊離ポリリボイニノシンドメインおよび遊離ポリリボインシチジンドメインを脱離する該相補的ドメイン間、または
(ii)遊離第１相補的ドメインおよび遊離第２相補的ドメインを脱離するポリリボイニノシンとポリリボシチジンドメイン間、の分子間水素結合を介して互いに結合し、
さらなる第１および/または第２オリゴリボヌクレオチドは、遊離相補的および/またはポリリボイノシンまたはポリリボシチジンドメインと結合してオリゴリボヌクレオチドの鎖を生成することができる、合成TLR3アゴニスト。
【請求項２】
i)構造：5’-ドメインB-ドメインA-3’を有する第１オリゴリボヌクレオチド；および
ii)構造：5’-ドメインD-ドメインC-3’を有する第２オリゴリボヌクレオチドを含む合成TLR3アゴニストであって、
ドメインAが第１相補的ドメインであり、ドメインBがポリリボイニノシンドメインであり、ドメインCが第２相補的ドメインであり、ドメインDがポリリボシチジンドメインであり、
ドメインAとドメインCが互いに相補的であり、
該第１オリゴリボヌクレオチドおよび該第２オリゴリボヌクレオチドが
(i)遊離ポリリボイニノシンドメインおよび遊離ポリリボインシチジンドメインを脱離する該相補的ドメイン間、または
(ii)遊離第１相補的ドメインおよび遊離第２相補的ドメインを脱離するポリリボイニノシンとポリリボシチジンドメイン間
の分子間水素結合を介して互いに結合し、
さらなる第１および/または第２オリゴリボヌクレオチドが、遊離相補的および/またはポリリボイノシンまたはポリリボシチジンドメインと結合し、オリゴリボヌクレオチドの鎖を生成することができる、合成TLR3アゴニスト。
【請求項３】
請求項１または２に記載のTLR3アゴニスト、および生理学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項４】
TLR3を、請求項１または２に記載のTLR3アゴニストまたは請求項３に記載の組成物と接触させることを含むTLR3活性を刺激する方法。
【請求項５】
哺乳動物に、請求項１または２に記載のTLR3アゴニストまたは請求項３に記載の組成物を投与することを含む哺乳動物のTLR3活性を刺激する方法。
【請求項６】
哺乳動物に、請求項１または２に記載のTLR3アゴニストまたは請求項３に記載の組成物を投与することを含む哺乳動物におけるTLR3介在性免疫反応を刺激する方法。
【請求項７】
哺乳動物に、請求項１または２に記載のTLR3アゴニストまたは請求項３に記載の組成物を投与することを含む、治療がTLR3により仲介されることができる疾病または障害を有する哺乳動物の治療方法。
【請求項８】
哺乳動物に、請求項１または２に記載のTLR3アゴニストまたは請求項３に記載の組成物を投与することを含む疾病または障害に罹患/発現するリスクのある哺乳動物において、予防がTLR3により仲介されることができる疾病または障害の予防方法。
【請求項９】
請求項３に記載の組成物、およびさらに抗原を含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願）本願は、米国仮出願No.61/358,543（出願日：２０１０年６月25日）、米国仮出願No.61/419,488（出願日：２０１０年１２月3日）、および米国仮出願No.61/435,434（出願日：２０１１年１月24日）（これらの内容は本明細書の一部を構成する。）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、免疫系の調節に関する。具体的には、本発明は、Toll様レセプター(TLR3)と結合し、活性化することにより免疫反応を選択的に刺激するオリゴヌクレオチドベースの化合物、ならびにTLR3活性の調節が有効である疾患を治療または予防するための、その単独または他の薬剤と組み合わせた使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
Toll様レセプター(TLR)は、免疫系の多くの細胞に存在し、先天性免疫反応に関与することが示されている(Hornung、V. et al.、(2002) J. Immunol. 168:4531-4537)。TLRは、哺乳動物が外来分子を認識し、それに対する免疫反応を開始する鍵となる手段であり、先天性免疫と獲得免疫を結びつける手段も提供する(Akira、S. et al.(2001) Nature Immunol. 2:675-680；Medzhitov、R.(2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145)。脊椎動物では、このファミリーは、細菌、真菌、およびウイルス由来の病原体関連分子パターン(PAMP)を認識し、多くの転写因子により仲介される免疫反応を誘導することが知られている、TLR1〜TLR11と呼ばれる少なくとも１１種のタンパク質からなる。
【０００４】
あるTLRは、細胞表面に位置し、細胞外病原体を検出し、それに対する反応を引き起こし、他のTLRは、細胞内部に位置し、細胞内病原体を検出し、それに対する反応を引き起こす。表１に、TLR、その既知のアゴニスト、およびTLRを含むことが知られている細胞種を示す(Diebold、S.S. et al.(2004) Science 303:1529-1531；Liew、F. et al.(2005) Nature 5:446-458；Hemmi H et al.(2002) Nat Immunol 3:196-200；Jurk M et al.、(2002) Nat Immunol 3:499；Lee J et al.(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6646-6651)；(Alexopoulou、L.(2001) Nature 413:732-738)。
【０００５】
表１
2013532976.tif 000003
【０００６】
リガンドとTLR間の相互作用により仲介される情報伝達経路は、TLRファミリーのほとんどのメンバー間で共有されており、toll/IL-1 レセプター(TIRドメイン)、骨髄分化マーカー88(MyD88)、IL-1R関連キナーゼ(IRAK)、インターフェロン調節因子(IRF)、TNF-レセプター関連因子(TRAF)、TGFβ活性化キナセル、IκBキナーゼ、IκB、およびNF-κBを含む(例えば、Akira、S.(2003) J. Biol. Chem. 278:38105、およびGeller at al.(2008) Curr. Drug Dev. Tech. 5:29-38参照)。より詳細には、TLR1、2、4、5、6、7、8、9、および11では、この情報伝達カスケードは、エンドソーム膜または細胞表面にホモダイマーとして存在する膜結合TLRと相互作用し、それを活性化するPAMPリガンドで始まる。活性化後、該レセプターは、TLR3を除くすべてのTLR情報伝達経路で共通なアダプタータンパク質であるTIRドメイン含有タンパク質MyD88の動員を可能にする（立体）構造変化を受ける。MyD88は、IRAK1をリン酸化し、活性化するIRAK4を動員する。活性化IRAK1は、TRAF6と結合し、ポリユビキチンのTRAF6上への付加を触媒する。ユビキチンの付加は、TAK/TAB複合体を活性化し、順次IRFをリン酸化し、NF-kBの放出と核への輸送をもたらす。核中のNF-kBは、炎症性遺伝子の発現を誘導する(例えば、トリnchieri and Sher(2007) Nat. Rev. Immunol. 7:179-190参照)。
【０００７】
TLR3情報伝達は、ホモダイマーとして存在するTLR3と相互作用し、それを活性化するRLR3リガンドで始まるMyD88非依存性経路を介して生じる。活性化後、TLR3はTANK結合キナーゼ１(TBK1)を活性化する、TIR-ドメイン含有アダプター誘導インターフェロン-β(TRIF)の動員を可能にする構造変化を受ける。TBK1は、IRF-3をリン酸化して活性化し、インターフェロンαおよびβの活性化をもたらし、最終的に炎症性免疫反応を生じさせる(例えば、Ｍｉｇｇｉｎ  ａｎｄ  Ｏ’Ｎｅｉｌｌ（２００６）  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  ８０：２２０−２２６参照)。
【０００８】
炎症反応の調節に関与する結果として、TLRは、自己免疫、感染性疾患、および炎症を含む多くの疾患の病因に役割を果たすことがわかってきた(Papadimitraki et al.(2007) J. Autoimmun. 29：310-318；Sun et al.(2007) Inflam. Allergy Drug Targets 6:223-235；Diebold(2008) Adv. Drug Deliv. Rev. 60:813-823；Cook、D.N. et al.(2004) Nature Immunol. 5:975-979；Tse and Horner(2008) Semin. Immunopathol. 30:53-62；Tobias & Curtiss(2008) Semin. Immunopathol. 30:23-27；Ropert et al.(2008) Semin. Immunopathol. 30:41-51；Lee et al.(2008) Semin. Immunopathol. 30:3-9；Gao et al.(2008) Semin. Immunopathol. 30:29-40；Vijay-Kumar et al.(2008) Semin. Immunopathol. 30:11-21)。
【０００９】
TLRの選択的局在とそれから生じる情報伝達は、免疫反応におけるその役割への洞察を与える。免疫反応は、該反応に関与する細胞のサブセットに基づいて先天性反応および獲得反応の両方を含む。例えば、古典的細胞介在機能、例えば遅延型過敏症、および細胞障害性Tリンパ球（CTL）の活性化に関与するTヘルパー(Th)細胞は、Th1細胞である。この反応は、抗原（例えば、ウイルス感染、細胞内病原体、および腫瘍細胞）に対する身体の先天性応答であり、IFN-γの分泌とCTLの同時活性化をもたらす。
【００１０】
TLR3は、細胞内部のエンドソームに局在することが知られており、核酸(DNAおよびRNA)、および低分子、例えばヌクレオシドおよび核酸代謝物を認識する。TLR3は、二重鎖RNA(dsRNA)ウイルスを認識して反応することが知られている(Diebold、S.S.、et al.、(2004) Science 303:1529-1531)。さらに、低分子干渉RNA(siRNA)分子および非標的化dsRNA分子は、TLR3を非特異的に活性化することができることがわかっている(Alexopoulou et al.(2008) Nature 413:732-738)。しかしながら、TLR3のこの非特異的活性化は、MyD88経路に依存することがわかり、そのようなdsRNA分子がTLR3に特異的でない免疫反応を生じる可能性があることを示す。
【００１１】
TLR3の天然および合成dsRNAリガンドに加えて、他の合成オリゴヌクレオチド類似体は、TLR3を活性化することが示された。ウイルスdsRNAを模倣して設計された合成二重鎖RNA分子であるポリイノシン酸ポリシチジル酸複合体（ポリ(I:C))は、長鎖ポリ（C）とアニールした長鎖ポリ（I）からなる。長鎖を必要とするので、ポリ(I:C)化合物は酵素的方法を用いて常套的に合成される。酵素的合成の結果として、ポリ(I:C) 化合物のサイズおよび製造は、0.2kb〜8kbの範囲で変化することが知られている(Field et al.(1968) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 61:340)。この発見に次いで、ポリ(I:C)がTLR3の活性化を通してインターフェロンを誘導し、dsRNA分子と比べてポリ(I:C)はTLR3により選択的に認識されることがわかった(Alexopoulou et al.(2001) Nature 413:732-738；Okahira et al.(2005) DNA Cell Biol. 24:614-623)。ポリ(I:C)のインターフェロン誘導特性およびそのTLR3との選択的結合は、ポリ（I:C）をin vivoでインターフェロンを誘導するために用いるのに望ましい分子にする。しかしながら、ポリ（I:C）は、長鎖の核酸として存在し、望ましくないヘリックス-ループ（helix-with-loop）構造を形成し(Ichikawa et al.(1967) Bul. Chem. Soc. Japan 40:2272-2277)、in vivoで投与すると毒性があることが示されている(Absher and Stinebring(1969) Nature 223:1023；Lindsay et al.(1969) Nature 223:717；Adamson and Fabro(1969) Nature 223:718；Leonard et al.(1969) Nature 224:1023)。すなわち、ポリ（Ｉ：Ｃ）の医学的、治療的、および予防的治療は限られる。
【００１２】
毒性を減少させながら、免疫刺激特性を保持するポリ（Ｉ：Ｃ）の構造の修飾が試みられてきた(WO2008109083)。これら化合物は、該二重鎖分子全体の特定の位置のシトシンをウラシルで置換することによりポリ(I:C)鎖内にミスマッチを挿入する。該化合物は、ポリ(I:C12U)と呼ばれる。しかしながら、これら化合物は、そのin vivo効果に疑問があり、米国食品医薬品局により拒絶されているので治療的成功は限られている。
【００１３】
すなわち、現在利用可能なポリ(I:C)、ポリ(I:C12U)、およびdsRNA化合物の効果の欠如、望ましくない酵素的合成、ヘリックス−ループ構造、および毒性なしにポリ(I:C)のオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性および治療的活性を保持する選択的TLR3アゴニストが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
(発明の要約）
本発明は、TLR3アゴニスト化合物、該化合物を含む組成物、およびそのTLR3介在免疫反応を刺激するための使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第１の局面において、本発明は、第１相補的ドメインおよびポリ-イノシン酸ドメインを有する第１オリゴリボヌクレオチド、および第２相補的ドメインおよびポリ-シチジル酸ドメインを有する第２オリゴリボヌクレオチドを含む新規合成TLR3アゴニストであって、
該第１オリゴリボヌクレオチドの該相補的ドメインが該第２オリゴリボヌクレオチドの該相補的ドメインと相補的であり、該第１および第２オリゴヌクレオチドの相互のハイブリダイゼーションが、該相補的ドメインまたはポリ-イノシン酸およびポリ-シチジル酸ドメインが遊離であり、さらなる第１オリゴリボヌクレオチドおよびさらなる第２オリゴリボヌクレオチドが、遊離ポリ-イノシン酸または遊離ポリ-シチジル酸または遊離相補的ドメインとハイブリダイズすることができる、新規合成TLR3アゴニストを提供する。
【００１６】
第２の局面において、本発明は、本発明のTLR3アゴニストおよび生理学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００１７】
第３の局面において、本発明は、TLR3活性を刺激する方法を提供する。この方法において、本発明のTLR3アゴニストは、in vitro、in vivo、ex vivo、または細胞内でTLR3と特異的に接触するかまたは結合する。
【００１８】
第４の局面において、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおいてTLR3活性を刺激する方法であって、本発明のTLR3アゴニストを該哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
第５の局面において、本発明は、哺乳動物のTLR3介在性免疫反応を刺激する方法であって、医薬的有効量の本発明のTLR3アゴニストを哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
第６の局面において、本発明は、TLR3活性化またはTLR3介在性免疫刺激により治療可能な疾患を有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、医薬的有効量の本発明のTLR3アゴニストまたはその組成物を哺乳動物、特にヒトに投与することを含む方法を提供する。本発明は、本明細書に記載の疾病および疾患の治療方法において疾病および疾患の治療に用いるための、ワクチンアジュバントとして用いるためのTLR3アゴニストおよびその組成物にも関する。
【００２１】
第７の局面において、本発明は、TLR3の活性化または免疫反応のTLR3介在性刺激により予防可能な疾病または障害に罹患するかまたはそれらが発現するリスクのある哺乳動物、特にヒトにおけるワクチンアジュバントの使用方法または疾患または障害の予防方法を提供する。この局面において本発明の方法は、有効量の本発明のTLR3アゴニストまたはその組成物を哺乳動物に投与することを含む。
【００２２】
第８の局面において、本発明のTLR3アゴニストおよびその組成物は、細胞またはコントロール哺乳動物もしくはTLR3、または免疫刺激もしくは免疫抑制関連疾患に罹患した哺乳動物におけるTLR3の機能を試験するのにも有用である。該細胞または哺乳動物に本発明の第１または第２の局面にしたがってTLR3アゴニストを投与し、TLR3の活性を試験する。
（図面の簡単な説明）
【００２３】
図1Aは、本発明のTLR3アゴニストの線形合成のための合成反応式である。DMTr＝4,4'-ジメトキシトリチル；CE＝シアノエチル。
【００２４】
図1Bは、本発明のTLR3アゴニストの平行合成のための合成反応式である。DMTr＝4,4'-ジメトキシトリチル；CE＝シアノエチル。
【００２５】
図２Ａおよび２Ｂ、および表６は、ヒトTLR3発現HEK293細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性を示す。簡単には、該HEK293細胞を本発明のTLR3アゴニストで１８時間処理し、次いで産生されたNF-κBのレベルを、SEAP(分泌型のヒト胎児アルカリホスファターゼ)アッセイを用いて測定した。データは、実施例２に従って培養し、処理したHEK293細胞における用量依存性にTLR3活性を刺激する本発明の典型的TLR3アゴニストの能力を示す。より一般的には、これらのデータは本発明のTLR3アゴニストがTLR3を活性化し、免疫反応を生じることができることを示す。
【００２６】
図3、および表7、8、9、10、および11は、天然にTLR3を含むJ774マクロファージ細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性を示す。簡単には、該J774細胞を本発明のTLR3アゴニストで18時間処理し、次いで産生されたIL-12のレベルをELISAを用いて測定した。データは、実施例２に従って培養し、処理したJ774細胞における用量依存性にTLR3活性を刺激する本発明の典型的TLR3アゴニストの能力を示す。より一般的には、これらのデータは、本発明のTLR3アゴニストが、TLR3を活性化し、免疫細胞における免疫反応を生じることができることを示す。
【００２７】
図4は、天然にTLR3を含むJ774マクロファージ細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性のグラフ表示である。簡単には、該J774細胞を本発明のTLR3アゴニストで18時間処理し、次いで産生されたIL-６のレベルをELISAを用いて測定した。データは、実施例２に従って培養し、処理したJ774細胞における用量依存性にTLR3活性を刺激する本発明の典型的TLR3アゴニストの能力を示す。より一般的には、これらのデータは、本発明のTLR3アゴニストが、TLR3を活性化し、免疫細胞における免疫反応を生じることができることを示す。
【００２８】
図5は、天然にTLR3を含むJ774マクロファージ細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性のグラフ表示である。簡単には、該J774細胞を本発明の選択したTLR3アゴニストで18時間処理し、次いで産生されたIFN-βのレベルをELISAを用いて測定した。データは、実施例２に従って培養し、処理したJ774細胞における用量依存性にTLR3活性を刺激する本発明の典型的TLR3アゴニストの能力を示す。より一般的には、これらのデータは、本発明のTLR3アゴニストが、TLR3を活性化し、免疫細胞における免疫反応を生じることができることを示す。
【００２９】
図6は、天然にTLR3を含むJ774マクロファージ細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性のグラフ表示である。簡単には、該J774細胞を本発明のTLR3アゴニストで18時間処理し、次いで産生されたIL-６のレベルをELISAを用いて測定した。データは、実施例２に従って培養し、処理したJ774細胞における用量依存性にTLR3活性を刺激する本発明の典型的TLR3アゴニストの能力を示す。より一般的には、これらのデータは、本発明のTLR3アゴニストが、TLR3を活性化し、免疫細胞における免疫反応を生じることができることを示す。
【００３０】
図7は、天然にTLR3を含むJ774マクロファージ細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性のグラフ表示である。簡単には、該J774細胞を本発明のTLR3アゴニストで18時間処理し、次いで産生されたIFN-βのレベルをELISAを用いて測定した。データは、実施例２に従って培養し、処理したJ774細胞における用量依存性にTLR3活性を刺激する本発明の典型的TLR3アゴニストの能力を示す。より一般的には、これらのデータは、本発明のTLR3アゴニストが、TLR3を活性化し、免疫細胞における免疫反応を生じることができることを示す。
【００３１】
図8および表１４は、C57BL/6マウス(n=3)における実施例３に従って処理し、分析した2時間後の血清サイトカイン誘導を示す。簡単には、C57BL/6マウスに用量0mg/kgまたは25mg/kgのTLR3アゴニストを皮下注射し、該アゴニストを投与して２時間後の血清の免疫刺激サイトカインレベルを分析し、IL-12レベルを示す。データは、本発明のTLR3アゴニストのin vivo投与が明確なTLR3介在性in vivoサイトカインプロフィールを生じることを示す。
【００３２】
図9は、C57BL/6マウス(n=3)における実施例３に従って処理し、分析した2時間後の血清サイトカイン誘導のグラフ表示である。簡単には、C57BL/6マウスに用量0mg/kgまたは25mg/kgのTLR3アゴニストを皮下注射し、該アゴニストを投与して２時間後のサイトカインおよびケモカインレベルを分析し、IL-1b、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IP-10、KC、MCP-1、MIG、MIP-1α、TNFαレベルを示す。データは、本発明のTLR3アゴニストのin vivo投与が明確なTLR3介在性in vivoサイトカインおよびケモカインプロフィールを生じることを示す。
【００３３】
図10は、実施例２に従って処理し、分析した、ヒトTLR７発現HEK293細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性のグラフ表示である。簡単には、該HEK293細胞を本発明のTLR3アゴニストで１８時間処理し、次いで産生されたNF-κBのレベルを、SEAP(分泌型のヒト胎児アルカリホスファターゼ)アッセイを用いて測定した。データは、1本鎖RNA分子と反応するTLRであることが知られている、TLR7介在性NF-κBを刺激しない本発明の典型的TLR3アゴニストの特異性を示す。より一般的には、これらのデータは本発明のTLR3アゴニストがTLR3特異的免疫反応を誘導することを示す。
【００３４】
図11は、実施例２に従って処理し、分析した、ヒトTLR８発現HEK293細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性のグラフ表示である。簡単には、該HEK293細胞を本発明のTLR3アゴニストで１８時間処理し、次いで産生されたNF-κBのレベルを、SEAP(分泌型のヒト胎児アルカリホスファターゼ)アッセイを用いて測定した。データは、1本鎖RNA分子と反応するTLRであることが知られている、TLR８介在性NF-κBを刺激しない本発明の典型的TLR3アゴニストの特異性を示す。より一般的には、これらのデータは本発明のTLR3アゴニストがTLR3特異的免疫反応を誘導することを示す。
【００３５】
図12および13は、実施例５に従って処理し、分析した２時間後のC57BL/6マウス(n=2)における血清サイトカイン誘導を示す。簡単には、C57BL/6マウスに用量10mg/kgのTLR3アゴニストを皮下注射し、該アゴニスト投与２時間後の血清の免疫刺激サイトカインレベルを分析し、IL-12レベルを示す。データは、本発明のTLR3アゴニストのin vivo投与が明確なTLR介在性in vivoサイトカインプロフィールを生じること示す。
【００３６】
表3および表12は、実施例２に従って処理し、分析したヒトPBMCからのサイトカインおよびケモカイン濃度を示す。簡単には、PBMCを新鮮健康ヒトボランティア血液から単離し、250μg/mlの本発明の典型的TLR3アゴニストを24時間培養し、次いで上清を回収し、Luminex多重アッセイによりサイトカインおよびケモカインレベルを分析した。データは、本発明のTLR3アゴニストのがヒト免疫細胞における明確なTLR3介在性サイトカインおよびケモカインプロフィールを生じることを示す。
【００３７】
表４は、実施例２に従って単離し、処理し、分析したヒト形質細胞様樹状細胞(pDC)からのサイトカインおよびケモカイン濃度を示す。簡単には、pDCを新鮮健康ヒトボランティア血液PBMCから単離し、用量250μg/mlの本発明のTLR3アゴニストと２４時間培養し、上清を回収し、Luminex多重分析によりサイトカインおよびケモカインレベルを分析した。データは、本発明のTLR3アゴニストの投与がヒト免疫細胞における明確なTLR3介在性サイトカインおよびケモカインプロフィールを生じることを示す。
【００３８】
表5A、5B、5C、および5Dは、本発明のTLR3アゴニストの好ましい構造を持たない、実施例２に従って単離し、処理し、分析したTLR3アゴニストの免疫刺激活性を示す。簡単には、HEK293細胞を本発明のTLR3アゴニストの好ましい構造を持たないTLR3アゴニストで１８時間処理し、次いで産生されたNF-κBのレベルを、SEAP(分泌型のヒト胎児アルカリホスファターゼ)アッセイを用いて測定した。データは、本発明のTLR3アゴニストの好ましい構造を持たない該化合物がtTLR3介在性免疫反応を誘導しないことを示す。
【００３９】
表13は、実施例２に従って単離し、処理し、分析したヒト骨髄樹状細胞(mDC)からのサイトカインおよびケモカイン濃度を示す。簡単には、pDCを新鮮健康ヒトボランティア血液PBMCから単離し、用量300μg/mlの本発明のTLR3アゴニストと１８時間培養し、上清を回収し、Luminex多重分析によりサイトカインおよびケモカインレベルを分析した。データは、本発明のTLR3アゴニストの投与がヒト免疫細胞における明確なTLR3介在性サイトカインおよびケモカインプロフィールを生じることを示す。
【００４０】
表15は、実施例４に従って処理し、分析した２時間後のC57BL/6マウス(n=３)における血清サイトカイン誘導を示す。簡単には、C57BL/6マウスに用量0mg/kgまたは10mg/kgのTLR3アゴニストを皮下注射し、該アゴニスト投与２時間後の血清の免疫刺激サイトカインレベルを分析し、IL-12レベルを示す。データは、本発明のTLR3アゴニストのin vivo投与が明確なTLR3介在性in vivoサイトカインプロフィールを生じることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】本発明のTLR3アゴニストの線形合成のための合成反応式である。
【図１Ｂ】本発明のTLR3アゴニストの平行合成のための合成反応式である。
【図２Ａ】ヒトTLR3発現HEK293細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性を示す。
【図２Ｂ】ヒトTLR3発現HEK293細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性を示す。
【図３】天然にTLR3を含むJ774マクロファージ細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性を示す。
【図４】天然にTLR3を含むJ774マクロファージ細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性のグラフ表示である。
【図５】天然にTLR3を含むJ774マクロファージ細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性のグラフ表示である。
【図６】天然にTLR3を含むJ774マクロファージ細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性のグラフ表示である。
【図７】天然にTLR3を含むJ774マクロファージ細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性のグラフ表示である。
【図８】C57BL/6マウス(n=3)における実施例３に従って処理し、分析した2時間後の血清サイトカイン誘導を示す。
【図９】C57BL/6マウス(n=3)における実施例３に従って処理し、分析した2時間後の血清サイトカイン誘導のグラフ表示である。
【図１０】実施例２に従って処理し、分析した、ヒトTLR７発現HEK293細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性のグラフ表示である。
【図１１】実施例２に従って処理し、分析した、ヒトTLR８発現HEK293細胞における本発明の典型的TLR3アゴニストの免疫刺激活性のグラフ表示である。
【図１２】実施例５に従って処理し、分析した２時間後のC57BL/6マウス(n=2)における血清サイトカイン誘導を示す。
【図１３】実施例５に従って処理し、分析した２時間後のC57BL/6マウス(n=2)における血清サイトカイン誘導を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
（好ましい態様の詳細な説明）
本発明は、TLR3アゴニスト化合物、該化合物を含む組成物、およびそれらのTLR3介在性免疫反応を刺激するための使用に関する。本発明のTLR3アゴニストは、安定で、特異的に先天性免疫反応を活性化することができ、TLR3アゴニストを製造するための以前に試みられていたアプローチの問題を克服する。本発明の化合物を含む医薬組成物および他の組成物も提供する。さらに、細胞または組織と１またはそれ以上のTLR3アゴニスト化合物またはその組成物を単独または他の予防的または治療的化合物または組成物と組み合わせて接触させることを含む、細胞または組織におけるTLR3介在性免疫反応を刺激する方法を提供する。
【００４３】
本発明は、TLR3を特異的に強く刺激するように設計したTLR3アゴニスト化合物を提供する。これらのTLR3アゴニストは、TLR3と選択的に結合するユニークな構造を持ち、TLR3介在性免疫反応の最適な刺激をもたらす。
【００４４】
本発明のTLR3アゴニストは、種々のin vitroおよびin vivo実験モデルにおける免疫反応を刺激する。したがって、本発明のTLR3アゴニストまたはその組成物は、免疫系を研究し、種々の動物種、例えばヒトおよびマウスの免疫系を比較するための手段として有用である。
【００４５】
さらに、治療的または予防的有効量の１またはそれ以上の本発明のTLR3アゴニストまたは組成物を投与することによる、TLR3介在性免疫刺激が有効な疾患または病状を有するか、有する疑いがあるか、または発現しやすい動物、特にヒトの治療方法を提供する。該方法は、免疫療法的適用、例えば限定されるものではないが、癌、喘息、アレルギー、気道感染、炎症性疾患、自己免疫疾患、皮膚疾患、病原体によって生じる疾患、および感染性疾患の治療、および成人および小児のワクチンアジュバントとして、ならびに獣医学的適用に用いることができる。
【００４６】
さらに、本発明のTLR3アゴニストオリゴヌクレオチドは、単独で、または他の薬剤または予防もしくは治療用組成物、例えば、DNAワクチン、抗原、抗体、およびアレルゲン、TLRアンタゴニスト、例えばTLR7および/またはTLR8アンタゴニスト、および/または他のTLRアゴニストと組み合わせるかまたは同時に投与することにより、ならびに化学療法剤、例えば疾病の予防および治療用の伝統的化学療法および現代的標的化療法と組み合わせて、種々の疾病を予防および/または治療するのに有用である。
【００４７】
本明細書に記載の特許および刊行物は、当該分野の知識水準を反映し、本明細書の一部を構成する。これら特許および刊行物と本明細書の開示のあらゆる不一致は、本明細書を支持するように解決される。
【００４８】
本発明自体、ならびに本発明の前記および他の目的、その種々の特徴は、添付した図面と組み合わせて以下の説明からより完全に理解することができよう。
【００４９】
用語「2'-O-置換」は、ペントース部分の2'位が、1〜6個の飽和または不飽和炭素原子を含む-O-低級アルキル基(例えば、限定されるものではないが、2’-O-メチル)、または2〜6個の炭素原子を有する-O-アリールまたはアリル基（ここで、該アルキル、アリールまたはアリル基は非置換でも置換されていてもよい(例えば、2’-O-エトキシ-メチル、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、またはアミノ基で)；またはヒドロキシ、アミノ、またはハロ基で（2'-H基は除く）で置換されていることを意味する。ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドには、5'末端が2'-O-アルキル化された４〜５個のリボヌクレオチド（すなわち、5' 2-O-アルキル化リボヌクレオチド)、および/または3'末端が2'-O-アルキル化された４〜５個のリボヌクレオチド（すなわち、3' 2-O-アルキル化リボヌクレオチド)が含まれる。典型的態様において、合成オリゴヌクレオチドの該ヌクレオチドは、少なくとも１のホスホロチオエートヌクレオチド間結合により結合している。ホスホロチオエート結合は、RpおよびSpエナンチオマー混合物であるか、またはRp型またはSp型の立体規則性または実質的に立体規則性でありうる(Iyer et al.(1995) Tetrahedron Asymmetry 6:1051-1054参照)。
【００５０】
用語「3'」は、一方向に用いる場合、一般的に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの別の領域または位置からポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド3'(該ヌクレオチドの3'末端に向かう)の領域または位置を表す。
【００５１】
用語「5'」は、一方向に用いる場合、一般的に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの別の領域または位置からポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド5'(該ヌクレオチドの5'末端に向かう)の領域または位置を表す。
【００５２】
用語「約」は、一般的に、正確な数字が重要でないことを意味する。すなわち、ヌクレオシド残基が１または２個少ないか、または１〜数個のさらなるヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは上記態様のそれぞれにおいて等価であると考えられる。
【００５３】
用語「アゴニスト」は、一般的に、細胞のレセプターと結合して反応を誘導する物質を表す。アゴニストは、リガンドなどの天然の物質の作用を模倣することが多い。
【００５４】
用語「気道の炎症」は、一般的に、限定されるものではないが、喘息を含む、アレルゲンによって生じる呼吸器の炎症を含む。
【００５５】
用語「アレルゲン」は、一般的に、対象を暴露するとアレルギー反応を引き起こす抗原、または分子（通常、タンパク質）の抗原性部分を表す。典型的には、該対象は、例えば、膨疹および炎症試験または当該分野で知られたあらゆる方法によりアレルゲンに対してアレルギー性である。分子は、該分子に暴露すると、対象の小サブセットだけがアレルギー（例えばIgE）免疫反応を示す場合でもアレルゲンと呼ばれる。
【００５６】
用語「アレルギー」は、一般的に、限定されるものではないが、植物アレルギー、呼吸器アレルギー、および皮膚アレルギーを含む。
【００５７】
用語「抗原」は、一般的に、抗体またはT細胞抗原レセプターにより認識され、選択的に結合する物質を表す。抗原は、限定されるものではないが、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびその組み合わせを含む。抗原は、天然または合成であってよく、一般的に、該抗原と特異的な免疫反応を誘発する。
【００５８】
用語「アンタゴニスト」は、一般的に、アゴニストの効果を減衰させる物質を表す。
【００５９】
用語「癌」は、一般的に、限定されるものではないが、異常または無制御な細胞増殖および/または分裂により生じるあらゆる悪性増殖または腫瘍を表す。癌は、ヒトおよび/または哺乳動物に生じ、あらゆるすべての組織に生じうる。癌を有する患者の治療には、異常または無制御な細胞増殖および/または分裂、または転移に作用する、本発明の化合物、医薬製剤、またはワクチンの投与が含まれよう。
【００６０】
用語「担体」は、一般的に、賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入、または医薬製剤に用いる当該分野でよく知られた他の物質を含む。担体、賦形剤、または希釈剤の特性は、個々の適用のための投与経路に依存すると理解される。これらの物質を含む医薬的に許容される製剤の製造は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、18版、A. Gennaro編、Mack Publishing Co.、Easton、PA、1990に記載されている。
【００６１】
用語「同時投与」または「同時投与（された）」は、一般的に、免疫反応を調節するために十分に接近した時間で少なくとも２の異なる物質を投与することを表す。同時投与は、同時に投与すること、および単回用量または分離した用量で少なくとも２の異なる物質をあらゆる順番で数日以内の間隔で時間的に間隔を空けて投与することを表す。
【００６２】
用語「〜と組み合わせて」は、一般的に、本発明のTLR3アゴニストまたはその組成物、および患者を治療する課程で該TLR3アゴニストまたはその組成物の活性を消失させない疾病または病状を治療するのに有用な別の薬剤を投与することを意味する。そのような投与は、同時投与、および数秒間〜数日間隔までの時間的間隔のある順序を含むあらゆる順序で行うことができる。そのような組み合わせ治療は、本発明のTLR3アゴニストまたはその組成物および/または独立してその他の薬剤の２回以上の単回投与も含みうる。本発明のTLR3アゴニストまたはその組成物およびその他の薬剤の投与は、同じ経路または異なる経路でありうる。
【００６３】
用語「個々」または「対象」または「脊椎動物」は、ヒトなどの哺乳動物を表す。
【００６４】
用語「線形合成」は、一般的に、オリゴヌクレオチドの一方の末端で始まり、他の末端に線形的に進行する合成を表す。線形合成は、同一または非同一（組み込む長さ、塩基組成、および/または化学修飾に関して）のモノマー単位をオリゴヌクレオチドに組み込むことを可能にする。
【００６５】
用語「哺乳動物」は、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、肉牛、乳牛、ブタ、ヒツジ、およびウサギを含む温血脊椎動物を含むことを明確に意図する。
【００６６】
用語「ヌクレオシド」は、一般的に、糖、通常、リボースまたはデオキシリボース、およびプリンまたはピリミジン塩基からなる化合物を表す。
【００６７】
用語「ヌクレオチド」は、一般的に、糖と結合したリン含有基を含むヌクレオシドを表す。
【００６８】
用語「修飾ヌクレオシド」は、一般的に、修飾複素環塩基、修飾糖部分、またはそのあらゆる組み合わせを含むヌクレオシドである。ある態様において、修飾ヌクレオシドは、本明細書に記載の非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。本発明の目的において、修飾ヌクレオシド、ピリミジンまたはプリン類似体、または非天然ピリミジンまたはプリンは、互換性に用いることができ、非天然塩基および/または非天然糖部分を含むヌクレオシドを表す。本発明の目的において、塩基は、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、またはウラシルでない場合は非天然と考えられ、糖は、β-リボ-フラノシドまたは2'-デオキシリボ-フラノシドでない場合は非天然と考えられる。本発明の目的において、「修飾ヌクレオチド」は、糖と結合したリン含有基を含む修飾ヌクレオシドである。
【００６９】
本明細書で用いている用語「修飾オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２のヌクレオチドが、合成結合、すなわち、あるヌクレオチドの5'末端と別のヌクレオチドの3'末端、またはヌクレオチドの5'末端と5'ヌクレオチドホスフェートがあらゆる数の化学基で置換されている別のヌクレオチドの2'末端の間のホスホジエステル結合以外の結合を介して共有結合しているオリゴヌクレオチドを表す。用語「修飾オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１の修飾ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドも含む。
【００７０】
用語「核酸」は、ゲノム領域またはそれから転写されたRNA分子を含む。ある態様において、該核酸はmRNAである。
【００７１】
用語「ヌクレオチド結合」は、一般的に、隣り合ったヌクレオシド間のリン原子および荷電もしくは中性基（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネート）からなる糖を介して２個のヌクレオシドを結合するための化学結合（例えば、3’-3’、2’-3’、2’-5’、3’-5’)を表す。
【００７２】
本発明の目的において、「非ヌクレオチドリンカー」は、共有結合または非共有結合を介してオリゴヌクレオチドと結合することができるあらゆる部分である。好ましくは、そのようなリンカーは、長さが約２Å〜約２００Åである。好ましいリンカーの例を以下に示す。非共有結合には、限定されるものではないが、静電気的相互作用、疎水性相互作用、π-スタッキング相互作用、および水素結合が含まれる。用語「非ヌクレオチドリンカー」は、２個のヌクレオシドの3'-ヒドロキシル基を直接結合するホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート官能基などの上記ヌクレオシド間結合を表すことを意味しない。
【００７３】
用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合ヌクレオシド単位から形成されたポリヌクレオシドを表す。該ヌクレオシド単位は、ウイルス、細菌、細胞デブリス、またはオリゴヌクレオチドベースの組成物(例えば、siRNAおよびミクロRNA)の部分でありうる。そのようなオリゴヌクレオチドは、ゲノムまたはｃDNAを含む既存の核酸供給源から得ることもできるが、合成法により生成されることが好ましい。ある態様において、各ヌクレオシド単位には、複素環基、およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、2’-デオキシ-2’-置換ヌクレオシド、2’-デオキシ-2’-置換アラビノース、2’-O-置換アラビノース、またはヘキソース糖基が含まれる。該ヌクレオシド残基は、あらゆる多くの既知ヌクレオシド間結合により互いに結合することができる。そのようなヌクレオシド間結合には、限定されるものではないが、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセタミデート（acetamidate）、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間結合が含まれる。用語「オリゴヌクレオチドベースの化合物」には、１またはそれ以上の立体特異的なヌクレオシド間結合(例えば、(RP)-または(SP)-ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル結合)を有するポリヌクレオシドも含まれる。本明細書で用いている用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、リン酸基を含むか含まないあらゆるそのようなヌクレオシド間結合を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを明確に意図する。ある典型的態様において、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート結合、またはその組み合わせでありうる。
【００７４】
用語「ペプチド」は、一般的に、抗体産生やサイトカイン活性などの生物反応に影響を及ぼす、ハプテンであるかまたはない、十分な長さのポリペプチドまたは組成物を表す。用語「ペプチド」は、修飾アミノ酸（天然または非天然の）を含み得る。該修飾には、限定されるものではないが、リン酸化、グリコシル化、ペグ化、脂質化（lipidization）、およびメチル化が含まれうる。
【００７５】
用語「医薬的に許容される」は、本発明の化合物の有効性または本発明の化合物の生物活性と干渉しない無毒性物質を意味する。
【００７６】
用語「生理学的に許容される」は、細胞、細胞培養、組織、または生物などの生物系と適合性の無毒性物質を表す。好ましくは、該生物系は、生体、例えば哺乳動物、特にヒトである。
【００７７】
用語「予防的有効量」は、一般的に、望ましくない生物作用の発現を抑制または減少させるのに十分な量を表す。
【００７８】
用語「治療的有効量」または「医薬的有効量」は、一般的に、限定されるものではないが、疾病または障害の兆候もしくは症状を予防、減弱、改善、または除去することを含む、望ましい生物学的効果、例えば有益な結果に影響を及ぼすのに十分な量を表す。すなわち、医薬組成物または方法におけるの各活性成分の総量は、患者に有意義な利益をもたらすのに十分である。すなわち、「医薬的有効量」は、投与される状況に依存する。医薬的有効量は、１またはそれ以上の予防的または治療的投与で投与することができる。単独で投与する個々の活性成分に適用する場合は、該用語は該成分のみを表す。組み合わせに適用する場合は、該用語は、組み合わせて、連続的に、または同時に投与するかに関わらず、治療効果をもたらす活性成分の組み合わせた量を表す。
【００７９】
用語「治療（処置）」は、一般的に、症状の軽減、または疾病の進行を遅延または改善を含む有益または望む効果を得ることを意図したアプローチを表す。
【００８０】
第１の局面において、本発明は、以下を含む合成TLR3アゴニストを提供する：構造：5’-ドメインA-ドメインB-3’を有する第１オリゴリボヌクレオチドおよび構造：5’-ドメインC-ドメインD-3’を有する第２オリゴリボヌクレオチド、ここで、ドメインAは第１相補的ドメインであり、ドメインBはポリリボイニノシンドメインであり、ドメインCは第２相補的ドメインであり、ドメインDはポリリボシチジンドメインであり、ドメインAおよびドメインCは互いに相補的である。該第１オリゴリボヌクレオチドおよび該第２オリゴリボヌクレオチドは、遊離ポリリボイニノシンドメインおよび遊離ポリリボインシチジンドメインを脱離する相補的ドメイン間、または遊離第１相補的ドメインおよび遊離第２相補的ドメインを脱離するポリリボイニノシンとポリリボシチジンドメイン間の分子間水素結合を介して互いに結合する。さらなる第１および/または第２オリゴリボヌクレオチドは、遊離相補的および/または遊離ポリリボイノシンまたはポリリボシチジンドメインと結合し、オリゴリボヌクレオチドの鎖を生成することができる。
【００８１】
さらに、本発明は、構造：5’-ドメインB-ドメインA-3’を有する第１オリゴリボヌクレオチドおよび構造：5’-ドメインD-ドメインC-3’を有する第２オリゴリボヌクレオチドを含む、ドメインAが第１相補的ドメインであり、ドメインBがポリリボイニノシンドメインであり、ドメインCが第２相補的ドメインであり、ドメインDがポリリボシチジンドメインであり、ドメインAおよびドメインCが互いに相補的である、合成TLR3アゴニストを提供する。該第１オリゴリボヌクレオチドおよび該第２オリゴリボヌクレオチドは、遊離ポリリボイニノシンドメインおよび遊離ポリリボインシチジンドメインを脱離する相補的ドメイン間、または遊離第１相補的ドメインおよび遊離第２相補的ドメインを脱離するポリリボイニノシンとポリリボシチジンドメイン間の分子間水素結合を介して互いに結合する。さらなる第１および/または第２オリゴリボヌクレオチドは、該遊離相補的および/またはポリリボイノシンまたはポリリボシチジンドメインと結合し、オリゴリボヌクレオチドの鎖を生成することができる。
【００８２】
さらに、本発明は、構造：5’-ドメインA-3’-3’-ドメインB-5’を有する第１オリゴリボヌクレオチドおよび構造：5’-ドメインC-3’-3’-ドメインD-5’を有する第２オリゴリボヌクレオチドを含む、ドメインAおよびB、およびドメインCおよびDが、該糖の3'位を介して、または修飾糖または修飾ヌクレオ塩基を介してそれらの3'末端と直接ヌクレオチド−ヌクレオチド結合を介して共有結合しており、ドメインAが第１相補的ドメインであり、ドメインBがポリリボイニノシンドメインであり、ドメインCが第２相補的ドメインであり、ドメインDがポリリボシチジンドメインであり、ドメインAとドメインCが互いに相補的である、合成TLR3アゴニストを提供する。該第１オリゴリボヌクレオチドおよび該第２オリゴリボヌクレオチドは、遊離ポリリボイニノシンドメインおよび遊離ポリリボインシチジンドメインを脱離する相補的ドメイン間、または遊離第１相補的ドメインおよび遊離第２相補的ドメインを脱離するポリリボイニノシンとポリリボシチジンドメイン間の分子間水素結合を介して互いに結合する。さらなる第１および/または第２オリゴリボヌクレオチドは、遊離相補的および/またはポリリボイノシンまたはポリリボシチジンドメインと結合し、オリゴリボヌクレオチドの鎖を生成することができる。
【００８３】
ある態様において、該TLR3アゴニストは、該糖の3'位、または修飾糖または修飾核酸塩基を介してその3'末端と直接ヌクレオチド−ヌクレオチド結合を介して、または該糖の3'位、または修飾糖または修飾核酸塩基を介してその3'末端と非ヌクレオチド結合を介して共有結合している、構造：5’-ドメインA-ドメインB-3’を有する少なくとも２の第１オリゴリボヌクレオチド、および構造：5’-ドメインC-ドメインD-3’を有する第２オリゴリボヌクレオチド；ここで、ドメインAが第１相補的ドメインであり、ドメインBがポリリボイニノシンドメインであり、ドメインCが第２相補的ドメインであり、ドメインDがポリリボシチジンドメインであり、ドメインAおよびドメインCが互いに相補的である；を含む。さらなる態様において、該少なくとも２の第１オリゴリボヌクレオチドは、構造：5’-ドメインB-ドメインA-3’を有することができ、該第２オリゴリボヌクレオチドは、構造：5’-ドメインD-ドメインC-3’を含むことができる。
【００８４】
ある態様において、該TLR3アゴニストは、該糖の3'位、または修飾糖または修飾核酸塩基を介してその3'末端と直接ヌクレオチド−ヌクレオチド結合を介して、または該糖の3'位、または修飾糖または修飾核酸塩基を介してその3'末端と非ヌクレオチド結合を介して共有結合している、構造：5’-ドメインA-ドメインB-3’を有する第１オリゴリボヌクレオチドおよび構造：5’-ドメインC-ドメインD-3’を有する少なくとも２の第２オリゴリボヌクレオチド；ここで、ドメインAは第１相補的ドメインであり、ドメインBはポリリボイニノシンドメインであり、ドメインCは第２相補的ドメインであり、ドメインDはポリリボシチジンドメインであり、ドメインAおよびドメインCは互いに相補的である；を含む。さらなる態様において、該第１オリゴリボヌクレオチドは、構造：5’-ドメインB-ドメインA-3’を有することができ、少なくとも２の第２オリゴリボヌクレオチドは、構造：5’-ドメインD-ドメインC-3’を有することができる。
【００８５】
非限定的例として、該リンカーは、3'-ヒドロキシルと結合しうる。そのような態様において、該リンカーは、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネートなどのホスフェートベースの結合によるか、または非ホスフェートベースの結合により3'-ヒドロキシルと結合する官能基を含む。リボヌクレオチドの可能性のある結合部位を下記構造Aで示す
[ここで、Bは、複素環塩基を表し、Pに対する矢印はリンに対するあらゆる結合を示す。]。
2013532976.tif 000004
【００８６】
ある態様において、該非ヌクレオチドリンカーは、限定されるものではないが、ポリペプチド、抗体、脂質、抗原、アレルゲン、およびオリゴ糖を含む低分子、高分子、または生体分子である。ある他の態様において、該非ヌクレオチドリンカーは低分子である。本発明の目的において、低分子は、分子量1,000Da未満の有機部分である。ある態様において、該低分子は分子量750 Da未満である。
【００８７】
ある態様において、該低分子は、所望により、オリゴリボヌクレオチドを連結するかまたはそれに追加された直鎖中に、限定されるものではないが、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、ウレア、またはチオウレアを含む１またはそれ以上の官能基を含む、脂肪族または芳香族炭化水素である。該低分子は環状または非環状でありうる。低分子リンカーの例には、限定されるものではないが、アミノ酸、炭化水素、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテン、および抗体が含まれる。しかしながら、非ヌクレオチドリンカーを説明する目的において、用語「低分子」は、ヌクレオシドを含むことを意図しない。
【００８８】
ある態様において、該非ヌクレオチドリンカーはアルキルリンカーまたはアミノリンカーである。該アルキルリンカーは、分岐または非分岐、環状または非環状、置換または非置換、飽和または不飽和、キラル、非キラルもしくはラセミ混合物でありうる。該アルキルリンカーは、約2〜約18個の炭素原子を有しうる。ある他の態様において、そのようなアルキルリンカーは、約3〜約9個の炭素原子を有する。あるアルキルリンカーは、限定されるものではないが、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、ウレア、およびチオエーテルを含む１またはそれ以上の官能基を含む。そのようなアルキルリンカーは、限定されるものではないが、1,2プロパンジオール、1,2,3プロパントリオール、1,3プロパンジオール、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ポリエチレングリコールリンカー（例えば、[-O-CH2-CH2-]n(n=1〜9))、メチルリンカー、エチルリンカー、プロピルリンカー、ブチルリンカー、またはヘキシルリンカーを含むことができる。ある態様において、そのようなアルキルリンカーにはペプチドまたはアミノ酸が含まれうる。
【００８９】
ある態様において、該非ヌクレオチドリンカーには、限定されるものではないが、以下のものが含まれうる。
【００９０】
2013532976.tif 000005
【００９１】
2013532976.tif 000006
【００９２】
2013532976.tif 000007
【００９３】
2013532976.tif 000008
【００９４】
2013532976.tif 000009
【００９５】
ある態様において、該低分子リンカーは、グリセロールまたは式：HO-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-OHのグリセロール類似体［式中、oおよびpは、独立して１〜約６、１〜約４、または１〜約３の整数である。］である。ある他の態様において、該低分子リンカーは、1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンの誘導体である。あるそのような誘導体は、式：HO-(CH2)m-C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2)m-OHを有する[式中、mは0〜約10、0〜約6、2〜約6、または2〜約4の整数である。]。
【００９６】
本発明のある非ヌクレオチドリンカーは、２個より多いオリゴリボヌクレオチドの結合を可能にする。例えば、該低分子リンカーのグリセロールは、オリゴリボヌクレオチドが共有結合しうる３個のヒドロキシル基を有する。したがって、本発明のあるTLR3アゴニストは、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーと結合した２またはそれ以上のオリゴリボヌクレオチドを含む。そのようなTLR3アゴニストを「分岐」しているという。
【００９７】
いかなる特定の理論にも縛られることを望まないが、本発明の第１および第２オリゴリボヌクレオチドの鎖の形成は、TLR3の特異的アゴニストであるハイブリッドポリ(I:C)をもたらす。具体的には、本発明のハイブリッドポリ(I:C)TLR3アゴニストは、望ましくないヘリックス-ループ（helix-with-loop）構造を形成する能力が低下し、in vivoに投与すると毒性特性がないかまたは効果を欠く、長鎖の核酸として存在しうる。
【００９８】
本明細書で用いている、用語「相補的」は、核酸とハイブリダイズする能力を有することを意味する。そのようなハイブリダイゼーションは、通常、相補的鎖間の水素結合の結果であり、好ましくはWatson-CrickまたはHoogsteen塩基対を形成する。分子間水素結合は、二重鎖核酸分子の形成をもたらす。
【００９９】
本発明のこの局面の態様において、本明細書で用いている第１相補的ドメインは、第２相補的ドメインと適切にアラインメントするとG-C、A-T、A-U、および/またはG-Uゆらぎ対間の分子間塩基対化を形成することができる塩基配列を有するドメインを表す。すなわち、複数の第１および第２オリゴリボヌクレオチドを一緒に用いると、複数の第１オリゴリボヌクレオチドの相補的ドメインと複数の第２オリゴリボヌクレオチドの相補的ドメインは、高ストリンジェント条件化で分子間水素結合を介してハイブリダイズすることができる。例えば、ある態様において、相補性の程度は、少なくとも93％、少なくとも93％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％である。好ましい態様において、相補性度は100％である。さらに、複数の第１および第２オリゴリボヌクレオチドを一緒に用いる場合は、複数の第１オリゴリボヌクレオチドのポリリボイノシンドメインおよび複数の第２オリゴリボヌクレオチドのポリリボシチジンドメインは一緒にハイブリダイズすることができる。
【０１００】
ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェント条件」は、特定の核酸と別の核酸のハイブリダイゼーションを可能にする条件（例えば温度および緩衝剤濃度）を表す専門用語であり、第１核酸は第2核酸と完全に相補的であるか、または第１および第２核酸は完全未満のある程度の相補性を有しうる。核酸ハイブリダイゼーションのための「高ストリンジェント条件」および「中等度のストリンジェント条件」は、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel、F. M. et al.編、Vol.1、増補29までの増補版を含む、1995)の2.10.1〜2.10.16頁（特に2.10.8〜11頁参照）および6.3.1-6頁に記載されている(この内容は本明細書の一部を構成する)。ハイブリダイゼーションは、２個の核酸が、実質的に相補的な配列を含むことを要求するが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じてミスマッチは許容されうる。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当該分野でよく知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。
【０１０１】
ある態様において、該第１および第２オリゴリボヌクレオチドはヌクレオチドの長さが同数であるが、相補的ドメインは必ずしもポリリボイノシンおよびポリリボシチジンドメインと同じヌクレオチド数ではない。唯一の要件は、第１相補的ドメインと第２相補的ドメインが同じ長さであり、ポリリボイノシンとポリリボシチジンドメインが同じ長さであることである。例えば、第１および第２相補的ドメインは、長さが約10〜約20ヌクレオチドであり、ポリリボイノシンおよびポリリボシチジンドメインは長さが約30〜約40ヌクレオチドである。ある態様において、第１および第２相補的ドメインは長さが約15〜約20ヌクレオチドであり、ポリリボイノシンおよびポリリボシチジンドメインは長さが約30〜約35ヌクレオチドである。ある態様において、第１および第２相補的ドメインは長さが10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドであり、ポリリボイノシンおよびポリリボシチジンドメインは長さが30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40ヌクレオチドである。ある態様において、第１および第２相補的ドメインは長さが20ヌクレオチドであり、ポリリボイノシンおよびポリリボシチジンドメインは長さが30ヌクレオチドである。ある態様において、第１および第２相補的ドメインは長さが15ヌクレオチドであり、ポリリボイノシンおよびポリリボシチジンドメインは長さが35ヌクレオチドである。当業者は、第１および第２オリゴリボヌクレオチドの異なるドメインは該化合物が望ましくないヘリックス-ループ構造と毒性特性を生じさずにTLR3刺激活性を保持する限りより短くても長くてもよいと理解するだろう。
【０１０２】
本発明のこの局面の態様において、第１および第２オリゴリボヌクレオチドは以下の例示的構造を有することができる。
2013532976.tif 000010
当業者が理解するであろうように、第１および第２相補的ドメインの相補的配列および/またはポリリボイノシンおよびポリリボシチジンドメインの相補的性質は、以下の典型的二重鎖構造を有しうる第１および第２オリゴリボヌクレオチド間の分子間水素結合を可能にする。
【０１０３】
式IX（例えば、式IおよびII）
2013532976.tif 000011
さらなる第１および第２オリゴリボヌクレオチドは一緒に結合し、以下の典型的二重鎖構造を有しうる本発明のオリゴリボヌクレオチドの鎖を生成することができる。
【０１０４】
式X(例えば、式IおよびIIの鎖)
2013532976.tif 000012
［ここでｎはあらゆる数である。］
【０１０５】
当業者が認識するであろうように、第１および第２オリゴリボヌクレオチドの二重鎖構造および/または鎖は、式IIIおよびIV、式VおよびVI、ならびに式VIIおよびVIIIを用いて製造することもできる。
【０１０６】
ある態様において、本発明のTLR3アゴニストは、１またはそれ以上の強制的結合部位を含むことができる。強制的結合部位はポリリボイニオシンドメイン中のイノシンを１またはそれ以上のグアノシンで置換することにより達成される。そのような強制的結合部位は、ポリリボイニオシンとポリリボシチジンドメインのアラインメントを改善し、および/またはポリリボイニオシンとポリリボシチジンドメイン間の結合強度を増加させることができる。
【０１０７】
本発明のこの局面のある態様において、第１および/または第２オリゴリボヌクレオチドのある水素原子は、水素-重水素置換(H-DまたはH/D置換ともいう)により重水素原子に置換される。水素原子の重水素原子による置換により、TLR3アゴニストの安定性は改善される。さらに、そのような置換は、酸化および/または分解に対するTLR3アゴニストの抵抗性を増加させる。
【０１０８】
別の態様において、TLR3アゴニストは、その該5’および/または3’末端がエキソヌクレアーゼ分解できないようさせるため、または本発明の別のTLR3アゴニストとハイブリダイゼーションさせるために、TLR3アゴニストの5’および/または3’末端が別の分子(例えば、非ヌクレオチドリンカー)またはそれ自身と結合している5’および/または3’キャップを含み得る。そのようなキャッピングは、TLR3アゴニストをさらに安定化させ、および/または一緒に結合することができる第１および第２オリゴリボヌクレオチドの数を調節することによりTLR3アゴニストが特定のサイズまたは長さを有することを可能にするよう働く。
【０１０９】
さらなる態様において、本発明の第1の局面のTLR3アゴニストは、１またはそれ以上の重水素原子置換を含むことができる。そのような重水素置換は、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増加をもたらし、第１および第２オリゴリボヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの安定性を増加し、および/またはTLR3による結合の安定性を増加させると認識されよう。さらに、そのような重水素化分子は、5’ および/または3’キャップを含み得る。
【０１１０】
さらなる態様において、本発明は、１またはそれ以上の本発明のTLR3アゴニスト、ならびに限定されるものではないが、免疫反応の特異性または大きさを増強する、１またはそれ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、TLRアンタゴニスト、siRNA、miRNA、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、DNAワクチン、アジュバント、もしくはキナーゼ阻害剤、または共刺激分子、例えばサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチドを含むあらゆる他の治療剤または予防剤を含む組成物を提供する。
【０１１１】
第２の局面において、本発明は、本発明の第1の局面のTLR3アゴニストおよび生理学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【０１１２】
ある態様において、該TLR3アゴニストは、哺乳動物に、重大な毒性作用を生じることなく医薬的有効量を送達するのに十分な量で医薬的に許容される担体中に含まれる。医薬的に許容される誘導体の有効用量範囲は、送達すべき親化合物の重量に基づくか、または当業者に知られた他の手段により計算することができる。
【０１１３】
さらなる態様において、本発明の１またはそれ以上のTLR3アゴニスト、および生理学的に許容される担体を含む組成物は、さらに、限定されるものではないが、免疫反応の特異性または大きさを増強する、１またはそれ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、TLRアンタゴニスト、例えば、TLR7および/またはTLR8アンタゴニスト、siRNA、miRNA、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、DNAワクチン、アジュバント、もしくはキナーゼ阻害剤、または共刺激分子、例えばサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチドを含む。好ましい態様において、１またはそれ以上の本発明のTLR3アゴニスト、および生理学的に許容される担体を含む組成物はさらに１またはそれ以上の抗原を含む。
【０１１４】
第３の局面において、本発明は、哺乳動物においてTLR3介在性免疫反応を生じさせる方法を提供する。この方法において、本発明の第１または第２の局面のTLR3アゴニストは、in vitro、in vivo、ex vivo、または細胞中でTLR３と接触するかまたは結合する。本発明の目的において、用語「哺乳動物」は、ヒトおよび動物を含むことを明確に意図する。好ましい態様において、該化合物、組成物、またはワクチンは、免疫刺激を必要とする脊椎動物に投与される。
【０１１５】
さらなる態様において、本発明はワクチンを提供する。この局面のワクチンは、本発明の組成物を含み、さらに抗原を含む。抗原は、特異的免疫反応を生じさせる分子である。そのような抗原には、限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、およびこれらのあらゆる複合体または組み合わせが含まれる。抗原は天然または合成であってよく、一般的に、該抗原に特異的な免疫反応を誘導する。あらゆるそのような抗原は、所望により、免疫原性タンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、コレラ毒Bサブユニット、またはあらゆる他の免疫原性担体タンパク質と結合しうる。
【０１１６】
本発明のワクチンは、さらに、あらゆる多量の、限定されるものではないが、Freund完全アジュバント、KLH、モノホスホリル脂質A(MPL)、アラム、Merckアラムアジュバント(MAA)、およびサポニン（QS-21、イミキモド（imiquimod）、R848、またはその組み合わせを含む）を含む既知のアジュバントを含みうる。
【０１１７】
第４の局面において、本発明は、哺乳動物に本発明の第１または第２の局面のTLR3アゴニストを投与することを含む、哺乳動物におけるTLR3活性を刺激する方法を提供する。好ましい態様において、本発明の第１または第２の局面のTLR3アゴニストは、免疫刺激を必要とする哺乳動物に投与される。
【０１１８】
第５局面において、本発明は、哺乳動物に本発明の第１または第２の局面のTLR3アゴニストを投与することを含む、哺乳動物におけるTLR3介在性免疫反応を刺激する方法を提供する。ある態様において、該哺乳動物はヒトである。好ましい態様において、本発明の第１または第２の局面のTLR3アゴニストは、免疫刺激を必要とする哺乳動物に投与される。
【０１１９】
第６の局面において、本発明は、哺乳動物に医薬的有効量の本発明の第１または第２の局面のTLR3アゴニストを投与することを含む、TLR3活性化またはTLR3介在性免疫刺激により治療可能な疾病または障害を有する哺乳動物の治療方法を提供する。ある態様において、該哺乳動物はヒトである。本発明は、疾病または病状を治療するのに用いるための、またはワクチンアジュバントとして用いるための、疾病または病状の治療方法において本明細書に記載のTLR3アゴニストおよびその組成物にも関する。
【０１２０】
第７の局面において、本発明は、免疫反応のTLR3活性化またはTLR3介在性刺激により予防することができる疾病または障害に罹るかまたは発現するリスクのある哺乳動物、特にヒトにおいて、疾病または障害を予防するための、またはワクチンアジュバントとして用いるための方法を提供する。この局面の方法は、哺乳動物に、予防的有効量の本発明の第１または第２の局面のTLR3アゴニストを投与することを含む。
【０１２１】
第８の局面において、本発明のTLR3アゴニストおよびその組成物は、細胞またはコントロール哺乳動物、またはTLR3またはTLR3を介した免疫刺激に関連する疾患に罹患した哺乳動物におけるTLR3遺伝子の機能を試験するのにも有用である。この局面の態様において、該細胞または哺乳動物に本発明の第１または第２の局面のTLR3アゴニストを投与し、TLR3活性を試験する。
【０１２２】
本発明のTLR3アゴニストの非限定的リストを下記表２に示す。表2において、オリゴヌクレオチドベースのTLR3アゴニスト化合物は、ホスホロチオエート(PS)結合であることを示している場合を除き、すべてホスホジエステル(PO)結合を有する。しかしながら、当業者は、PSおよびPO結合の混合物を用いることができると認識するだろう。不活性コントロールオリゴヌクレオチドのリストは、下記表２の化合物番号8、20〜24、64〜67、119〜121、124、および125で示す。表2において、不活性コントロールオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート(PS)結合であることを示している場合を除き、すべてホスホジエステル(PO)結合を有する。
表2.
【０１２３】
2013532976.tif 000013
【０１２４】
2013532976.tif 000014
【０１２５】
2013532976.tif 000015
【０１２６】
2013532976.tif 000016
【０１２７】
2013532976.tif 000017
【０１２８】
2013532976.tif 000018
【０１２９】
2013532976.tif 000019
【０１３０】
2013532976.tif 000020
I＝イノシン；X＝グリセロール；Y＝1,3-プロパンジオール；C1＝アラ-C；C2＝5-Me-C；C3＝5-メチル-シチジン；G1＝7-デアザ-G；G2＝アラ-G；太字＝ホスホロチオエート結合；下線＝2’-メトキシ-ヌクレオシド；HEG＝ヘキサエチレングリコール。
【０１３１】
本発明のTLR3アゴニストにより形成されうるさらなる構造には、式XI、XII、およびXIIIが含まれる。
式XI
2013532976.tif 000021
式XII
2013532976.tif 000022
式XIII
2013532976.tif 000023
【０１３２】
本発明のあらゆる方法において、TLR3活性の刺激に有効な、治療的または予防的有効量の本発明のTLR3アゴニストを細胞に投与する。この細胞は、細胞培養、血管新生（neovascularized）組織培養の部分であるか、または哺乳動物、例えばヒトまたは他の哺乳動物の部分または全身でありうる。TLR3アゴニストの治療的組成物の投与は、既知の方法を用い、当業者が決定する病状または反応に応じた該疾患の症状または代替マーカーを減少させるのに有効な用量と期間行うことができる。治療的有効量の、１またはそれ以上の本発明の治療的TLR3アゴニストを単回処置として個体に同時または連続的に投与することが望ましいことがある。上記の本発明の方法のある典型的態様において、該TLR3アゴニストは局所および/または全身的に投与される。用語「局所的に投与（される）」は、身体の定義した場所または領域に送達することを表すが、用語「全身投与」は、生物全体に送達することを含むことを意味する。
【０１３３】
本発明のあらゆる方法において、1またはそれ以上のTLR3アゴニストまたはその組成物を単独、または該TLR3アゴニストの免疫刺激作用を減少させない疾患または病状を治療するのに有用なあらゆる他の薬剤と組み合わせて投与することができる。本発明のあらゆる方法において、該疾患または病状を治療するのに有用な薬剤には、限定されるものではないが、免疫反応の特異性や大きさを増加させる、１またはそれ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、TLRアンタゴニスト、siRNA、miRNA、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、DNAワクチン、アジュバントまたはキナーゼ阻害剤、または共刺激分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチドが含まれる。例えば、癌治療において、本発明のTLR3アゴニストまたはその組成物は１またはそれ以上の標的化療法剤および/またはモノクローナル抗体と組み合わせて投与することができると予期される。あるいはまた、該薬剤は、抗原またはアレルゲンをコードするDNAベクターを含むことができる。これらの態様において、本発明のTLR3アゴニストは、直接免疫刺激作用を生じることができる。１またはそれ以上の他の療法と同時に投与する場合、本発明のTLR3アゴニストは、その他の処置と同時に、または連続して投与することができる。
【０１３４】
本発明の種々の方法において、投与経路は、限定されるものではないが、非経口的、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、経鼻、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、または点眼、または口内洗浄液の形を含むあらゆる適切な経路でありうる。
【０１３５】
治療的有効量の本発明のTLR3アゴニストを経口投与する場合は、該TLR3アゴニストは、錠剤、カプセル、粉末、溶液、またはエリキシルの形であろう。錠剤の形で投与する場合は、限定されるものではないが、本発明の医薬組成物は、さらに、固体担体、例えばゼラチン、またはアジュバントを含みうる。錠剤、カプセル、および粉末は、約5〜95％の合成オリゴヌクレオチド、好ましくは約25〜90％の合成オリゴヌクレオチドを含む。液体形で投与する場合は、液体担体は、例えば水、石油、動物または植物由来の油、例えばピーナッツ油、鉱物油、ダイズ油、ゴマ油、または合成油を加えることができる。液体形の医薬組成物は、さらに生理食塩水溶液、デキストロース、または他の糖溶液、またはグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールを含み得る。液体形で投与する場合は、該医薬組成物は、約0.5〜90％（重量）の合成オリゴヌクレオチドまたは約1〜50％の合成オリゴヌクレオチドを含む。
【０１３６】
治療的有効量の本発明のTLR3アゴニストを非経口的、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、経鼻、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、または点眼、または口内洗浄液の形で投与する場合は、該TLR3アゴニストは、発熱物質不含の非経口的に許容される水性溶液の形であろう。pH、等張性、および安定性などに配慮したそのような非経口的に許容される溶液の製造は当該分野の技術の範囲内である。非経口的、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、経鼻、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、または点眼、または口内洗浄液の形のための医薬組成物は、TLR3アゴニストに加えて、等張性ビークル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液注射液、ブドウ糖注射液、ブドウ糖および塩化ナトリウム注射液、乳酸化リンゲル液注射液、または当該分野で知られた他のビークルを含むべきである。本発明の医薬組成物は、安定化剤、保存料、緩衝剤、抗酸化剤、または当業者に知られた他の添加剤も含み得る。
【０１３７】
非経口的、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、経鼻、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、または点眼、または口内洗浄液の形で投与する場合は、0.01％〜10％(重量/容量)の範囲の用量を用いうる。液体形で投与する場合は、液体担体、例えば、水、石油、動物または植物由来の油、例えばピーナッツ油、鉱物油、ダイズ油、ゴマ油、または合成油を加えることができる。局所投与は、リポソームまたは経皮的持続放出パッチによるものでありうる。
【０１３８】
本発明の医薬組成物中のTLR3アゴニストの量は、治療する病状の性質および重症度、および患者が受けた以前の治療の性質に依存するだろう。本発明の方法を実施するのに用いる種々の医薬組成物は、体重または臓器重量1kgあたり約10μg(マイクログラム)〜約20mgの合成オリゴヌクレオチドを含むべきであると予期される。
【０１３９】
本発明の医薬組成物を用いる静脈内療法の持続期間は、治療する疾病の重症度、および各個々の患者の状態および潜在的特異反応に応じて変化するだろう。
【０１４０】
ある疾患には急性治療が役立つが、他の疾患には長期療法が必要である。疾病における急性および長期の介入はいずれも有意義な目標である。TLR3アゴニストの注射は、急性期のある疾患を抑制するのに有効な手段でありうる。しかしながら、数週間、数ヶ月間、または数年間にわたる長期療法については、担体、例えば生理食塩水、徐放性ポリマー、またはリポソームを用いる全身送達（腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内）が考慮されよう。
【０１４１】
ある慢性疾患には、本発明のTLR3アゴニストの全身投与が好ましいかもしれない。注射頻度は、連続注入〜１月に１回であり、１月に数回またはそれ以下の頻度は、疾病の経過およびTLR3アゴニストの生物学的半減期に基づいて決定される。
【０１４２】
本発明のTLR3アゴニストおよび方法は、細胞、またはコントロール哺乳動物、またはTLR3またはTLR3を介した免疫刺激に関連する疾患に罹患した哺乳動物におけるTLR3の機能を試験するのにも有用である。そのような使用において、該細胞または哺乳動物にTLR3アゴニストを投与し、TLR3の活性を試験する。
【０１４３】
いかなる理論またはメカニズムにも限定されるものではないが、一般的に、本発明のTLR3アゴニストの活性は、TLR3アゴニストのTLR3への結合、すなわち、TLR3活性の刺激に依存すると考えられる。生理学的条件下でのそのような刺激は、TLR3の下流活性を観察することにより実際に測定される。すなわち、本発明にしたがって用いる典型的TLR3アゴニストは、TLR3と安定な結合を形成し、TLR3を活性化し、種々の情報伝達分子を介する活性のカスケードを引き起こすことができる。
【０１４４】
以下の実施例は、本発明の典型的製造および実施方法を示すが、同じ結果をうるために代替法を用いることができるので、本発明の範囲を限定することを意味しない。
【実施例１】
【０１４５】
TLR3-アゴニストの合成
免疫調節オリゴリボヌクレオチドを自動DNA/RNA合成装置を用いるホスホラミダイト（phosphoramidite）化学を用いて化学合成した。TAC保護（Uを除く）2’-O-TBDMS RNAモノマー、A、G、C、およびUをSigma-Aldrichから購入した。7-デアザ-G、イノシン、およびロキソリビンモノマーをChemGenes Corporationから購入した。0.25M 5-エチルチオ-1H-テトラゾール、PAC-無水物CapAおよびCapBをGlen Researchから購入した。ジクロロメタン(DCM)中の3％トリクロロ酢酸(TCA)および5％ 3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシド(Beaucage試薬)は社内で製造した。
【０１４６】
免疫調節オリゴリボヌクレオチドは標準的RNA合成プロトコールを用いて１〜２μM規模で合成した。
開裂および塩基脱保護
【０１４７】
免疫調節オリゴリボヌクレオチドを固体支持対から開裂させ、溶液をさらに６５℃で加熱して、エキソサイクリックアミンの保護基を除去した。得られた溶液をSpeedVac中で完全に乾燥させた。
IE HPLC精製
【０１４８】
免疫調節オリゴリボヌクレオチドをイオン交換HPLCで精製した。
カラム：Dionex DNAPac 100 カラム(22X250)
カラムヒーター：ChromTech TL-105 HPLCカラムヒーター（温度を８０℃にセットする）
緩衝液A：20mM トリス-HCl、pH 7.0、20％アセトニトリル
緩衝液B：3.0M NaCl、20mM トリス-HCl、pH7.0、20％アセトニトリル
流速：10ml/min
勾配：
0-2 min：0％ B
2-11 min：0％ B〜35％ B
11-41 min：35％ B〜90％ B
41-45 min：100％ B
【０１４９】
粗免疫調節オリゴリボヌクレオチド溶液をHPLC中に注射した。上記勾配を実施し、分画を回収した。９０％より多い所望の生成物を含むすべての分画を混合し、次いで該溶液をRotoVapで濃縮し、ほぼ乾燥させた。RNアーゼ不含水を加え、最終容量を10mlとした。
C-18逆相脱塩
【０１５０】
Watersから購入したCC-18 Sep-Pakカートリッジを、最初に10mlのアセトニトリル、次いで10mlの0.5M酢酸ナトリウムで順化させた。10mlの免疫調節オリゴリボヌクレオチド溶液をロードした。次に、15mlの水を用いて塩を洗浄除去した。最後に、免疫調節オリゴリボヌクレオチドを１mlの水中50％アセトニトリルで溶出した。
【０１５１】
該溶液をSpeedVac中に30分間おいた。残存溶液を0.2ミクロフィルターで濾過し、次いで凍結乾燥で乾燥させた。次に、該固体を水に再溶解させて、目的とする濃度にした。最終溶液を０℃以下で保存した。
キャピラリー電気泳動
【０１５２】
装置：Beckman 5010
キャピラリー：62cm ssDNAキャピラリー
試料の調製：0.2ODのSIMRA化合物を200ulのRNアーゼ不含水に溶解した。
注射： 5KVで5秒間、界面動電(electro-kinetic)注射。
操作条件：14KV、30℃で５０分間。
イオン交換HPLC分析
【０１５３】
カラム：Dionex DNAPacガードカラム(22X250)
カラムヒーター：ChromTech TL-105 HPLCカラムヒーター（温度を80℃にセット）
緩衝液A：100mM トリス-HCl、pH8.0、20％アセトニトリル
緩衝液B：2.0M LiCl、100mM トリス-HCl、pH 8.0、20％アセトニトリル
流速：2ml/min
勾配：
0-2 min：0％ B
2-10 min：0％ B〜100％ B
10-15 min：100％ B
PAGE分析
【０１５４】
0.3ODの免疫調節オリゴリボヌクレオチドを20％ポリアクリルアミドゲルにロードし、４ワットの定電力で約５時間操作した。ゲルを短波長のUV光で観察した。
【実施例２】
【０１５５】
HEK293細胞培養
SEAPレポーター遺伝子を含むヒトTLR3およびpNifty-2プラスミドを安定して発現するHEK293細胞をInvivogenから購入した。細胞を、10％ウシ胎児血清(FBS)および10μg/mlブラスチシジンおよび100U/mlペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDulbecco変法Eagle培地中で維持した。
【０１５６】
一過性トランスフェクションアッセイでは、細胞をトリプシン処理し、48ウェルプレート中、FBS(抗生物質なし)含有DMEM中で一夜培養した。翌日、100ngのプラスミドDNAおよび1μlのリポフェクタミンを含むプラスミドDNA/リポフェクタミン2000混合物の２５μl部分標本を、細胞培養プレートの各ウェルに加えた。TLR3アゴニスト化合物を培養に加え、次いで18時間培養を続けた。処理終了時に、20μlの培養上清を各処理から得、次いでSEAPアッセイ(Invivogen)を使用説明書に従って行った。
SEAPアッセイ
【０１５７】
SEAP活性を、Quanti Blue検出基質(Invivogen)を使用説明書に従って用いて定量した。96ウェルプレート中の20μlの培養上清に、150μlのSEAP検出基質を加えた。試料をデュプリケートでアッセイした。プレートを37℃で30〜40分間インキュベーションし、620〜655nmで読んだ。結果を％最大(アゴニスト)NF-κB活性で表す。
J774細胞アッセイ
【０１５８】
ネズミJ774マクロファージ細胞(BIM-67、ATCC)を10％(v/v)FBSおよび抗生物質(100U/mlのペニシリンおよびストレプトマイシン)を添加したDulbecco変法Eagle培地中で維持した。実験用に、細胞を、４８ウェルプレート中に7x105細胞/mlで播き、一夜付着させた。翌日、細胞をアゴニストで18時間処理し、次いで上清を回収し、使用説明書に従ったELISA(IL-6、IL-12、IFNβ)(それぞれBD Biosciences、PBL)によりサイトカイン産生を測定した。
ヒトPBMCおよび骨髄DC培養
【０１５９】
新鮮健康ボランティア血液(Research Blood Components、Brighton、MA)から末梢血単核細胞(PBMC)をFicoll密度勾配遠心分離法により単離した(Ficoll-Paque PLUS、GE Health Care)。
【０１６０】
ヒトCD1c(BDCA-1)＋骨髄樹状細胞を、使用説明書に従って、CD19+B細胞の枯渇およびCD1c(BDCA-1)+細胞(Miltenyi Biotec、Auburn、CA)の正の選択を含む２つの磁性分離工程によりPBMCから単離した。
【０１６１】
アッセイに用いた培養液は以下からなる。1.5mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、50μM 2-メルカプトエタノール、100IU/mlペニシリン-ストレプトマイシン混合物、および10％加熱不活化ウシ胎児血清(Hyclone)を添加したRPMI1640培地。
サイトカイン測定
【０１６２】
PBMC(5 X 106細胞/ml)およびmDCS(1 X 106細胞/ml)を96ウェルプレート中で培養し、次いでアゴニストで24時間刺激した。無刺激細胞をコントロールとして用いた。
【０１６３】
インキュベーション終了時に上清を回収し、Luminex多重技術によりアッセイするまで凍結保存した。10-プレックス ヒトサイトカインビーズキット(Invitrogen)を使用説明書に従って用いた。実施例２で処理した細胞から得られた結果を、図2A、2B、4、5、6、7、10、または11、および表3、4、5A、5B、5C、5D、6、7、8、9 10、11、12、または13に示す。
【０１６４】
表3.
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【０１６５】
表4.
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【０１６６】
表5A.
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【０１６７】
表5B.
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【０１６８】
表5C.
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【０１６９】
表5D.
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【０１７０】
表6.
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【０１７１】
表7.
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【０１７２】
表8.
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【０１７３】
表9.
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【０１７４】
表10.
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【０１７５】
表11.
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【０１７６】
表12.
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【０１７７】
表13.
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【実施例３】
【０１７８】
TLR3アゴニスト化合物で処置したマウスモデルにおけるin vivoサイトカイン分泌
C57BL/6マウス（5〜6週齢）をTaconic Farms、Germantown、NYから得、Idera PharmaceuticalのIACUC承認動物プロトコールに従って維持した。マウス(n=2または3)に、それぞれ本発明のTLR3アゴニスト、5mg/kg、10mg/kg、または25mg/kg（単回用量）を皮下注射した。ナイーブ動物はTLR3アゴニストで処置しなかった。コントロール動物は、25mg/kgポリ(I:C)で処置した。TLR3アゴニスト投与２時間後に後眼窩静脈叢（retro-orbital）から採血して血清を回収し、サイトカインおよびケモカインレベルをELISAまたはLuminex多重アッセイで測定した。表14および図8および9に示す結果は、本発明のTLR3アゴニストのin vivo投与はin vivoでユニークなサイトカインおよびケモカインプロファイルを生じることを示す。サイトカインおよびケモカイン抗体および標準品を含む試薬はすべてPharMingen(San Diego、CA)から購入した。
【０１７９】
表14.
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【実施例４】
【０１８０】
TLR3アゴニスト化合物で処置したマウスモデルにおけるin vivoサイトカイン分泌
C57BL/6マウス（5〜6週齢）をTaconic Farms、Germantown、NYから得、Idera PharmaceuticalのIACUC承認動物プロトコールに従って維持した。マウス(n=3)に、それぞれ本発明のTLR3アゴニスト、5mg/kg、10mg/kg（単回用量）を皮下注射した。ナイーブ動物はTLR3アゴニストで処置しなかった。コントロール動物は、25mg/kgポリ(I:C)で処置した。TLR3アゴニスト投与２時間後に後眼窩静脈叢から採血して血清を回収し、サイトカインレベルをELISAアッセイで測定した。表15に示す結果は、本発明のTLR3アゴニストのin vivo投与はユニークなTLR3刺激を生じ、in vivoでIL-12濃度の誘導をもたらすことを示す。サイトカインおよびケモカイン抗体および標準品を含む試薬はすべてPharMingen(San Diego、CA)から購入した。
【０１８１】
表15.
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【実施例５】
【０１８２】
TLR3アゴニスト化合物で処置したマウスモデルにおけるin vivoサイトカイン分泌
C57BL/6マウス（5〜6週齢）をTaconic Farms、Germantown、NYから得、Idera PharmaceuticalのIACUC承認動物プロトコールに従って維持した。マウス(n=2)に、それぞれ本発明のTLR3アゴニスト、10mg/kg（単回用量）を皮下注射した。ナイーブ動物はTLR3アゴニストで処置しなかった。コントロール動物は、25mg/kgポリ(I:C)で処置した。TLR3アゴニスト投与２時間後に後眼窩静脈叢から採血して血清を回収し、サイトカインレベルをELISAアッセイで測定した。図12および13に示す結果は、本発明のTLR3アゴニストのin vivo投与はユニークなTLR3刺激を生じ、in vivoでIL-12濃度の誘導をもたらすことを示す。サイトカインおよびケモカイン抗体および標準品を含む試薬はすべてPharMingen(San Diego、CA)から購入した。
等価物
【０１８３】
当業者は、本明細書に記載の特定の物質および方法の多くの等価物を認識し、または常套的実験により確認することができよう。例えば、該オリゴヌクレオチドと重複するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができる。そのような等価物は本発明の範囲内であると考えられ、特許請求の範囲により網羅される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年2月21日(2013.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2013532976000001.app
【国際調査報告】
2013532976.tif 000055
2013532976.tif 000056