(57)【要約】  リンゴの皮由来のフェノール組成物を本明細書に記載する。特に、リンゴの皮抽出物から得られるフラボノイドに富む画分を本明細書に記載する。本組成物は、特定の神経変性疾患を含む、酸化ストレスおよび／または炎症に関連する症状の予防および治療に有用である。また、本組成物の製造方法も記載する。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化ストレスまたは炎症に関連する疾患または症状の予防または治療に使用される組成物において、リンゴの皮由来のフェノール抽出物またはその画分を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記フェノール抽出物またはその画分が、フラボノール成分、アントシアニン成分、ジヒドロカルコン成分、フェノール酸成分、およびフラバン−３−オール成分を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物において、前記フラボノール成分が、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドまたはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項２または３に記載の組成物において、前記アントシアニン成分が、シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを含むことを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の組成物において、前記ヒドロカルコン成分が、フロリジン、フロリチンまたはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１項に記載の組成物において、前記フェノール酸成分が、クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれか１項に記載の組成物において、前記フラバン−３−オール成分が、エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンまたはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物において、前記抽出物またはその画分が、フラボノールを約６０．０％〜約９５．０％含むことを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物において、前記抽出物またはその画分が、フラバン−３−オールを約１．０％〜約２０．０％含むことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物において、前記抽出物またはその画分が、フェノール酸を約１．０％〜約２０．０％含むことを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物において、前記抽出物またはその画分が、ジヒドロカルコンを約０．５％〜約１０．０％含むことを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物において、前記抽出物またはその画分が、シアニジン−Ｏ−ガラクトシドを約０．５％〜約１０．０％含むことを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物において、前記フェノール抽出物またはその画分が、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシドおよびＱ−３−Ｏ−ラムノシドを含むフラボノール成分；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを含むアントシアニン成分；
フロリジンおよびフロリチンを含むジヒドロカルコン成分；
フェノール酸成分  クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびイソフェルラ酸；ならびに
エピガロカテキン、カテキンおよびエピカテキンを含むフラバン−３−オール成分；
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物において、前記抽出物またはその画分が、
Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシドを約１０．０％〜約６０．０％、約１５．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約３５．０％、約２０．０％〜約３０．０％、約２０．０％〜約２５．０％；
Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドを約１０．０％〜約６０．０％、約１５．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約４０．０％、約２０．０％〜約３５．０％、約２０．０％〜約３０．０％、約２０．０％〜約２５．０％、約３０．０％〜約３５．０％；
Ｑ−３−Ｏ−ルチノシドを約１．０％〜約２０．０％、約５．０％〜約１５．０％、約７．０％〜約１３．０％、約５．０％〜約１０．０％、約１０．０％〜約１５．０％；
Ｑ−３−Ｏ−グルコシドを約１．０％〜約２０．０％、約５．０％〜約１５．０％、約７．０％〜約１３．０％、約１０．０％〜約１５．０％、約１０．０％〜約１５．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約０．５％〜約１０．０％、約０．５％〜約５．０％、約０．５％〜約２．５、約０．５％〜約２．０％、約１．０％〜約２．０％、約２．０％〜約６．０％、約３．５％〜約５．５％、約４．０％〜約５．０％；
フロリジンを約０．５％〜約１０．０％、約１．０％〜約１０．０％、約２．０％〜約１０．０％、約１．０％〜約５．０％、約１．５％〜約４．５％、約３．５％〜約７．５％、約３．０％〜約６．０％、約３％、約５％；
クロロゲン酸を約１．０％〜約２０．０％、約２．０％〜約１５．０％、約５．０％〜約１５．０％、約２．５％〜約６．５％、約８％〜約１２．０％、約４％または約１０％；および
エピカテキンを約１．０％〜約２０．０％、約１．０％〜約１５．０％、約５．０％〜約１５．０％、約２．５％〜約１０．０％、約２．５％〜約６．５％、約５．０％〜約１０．０％、約８．０％〜約１０．０％；
含むことを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物において、
Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシドを約２０．０％〜約３０．０％；
Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドを約２０．０％〜約３０．０％；
Ｑ−３−Ｏ−ルチノシドを約１０．０％〜約１５．０％；
Ｑ−３−Ｏ−グルコシドを約１０．０％〜約１５．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約２．０％〜約６．０％；
フロリジンを約１．０％〜約５．０％；
クロロゲン酸を約８％〜約１２．０％；および
エピカテキンを約５．０％〜約１０．０％；
含むことを特徴とする組成物。
【請求項１６】
請求項１４に記載の組成物において、
Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシドを約２０．０％〜約３５．０％；
Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドを約２０．０％〜約３５．０％；
Ｑ−３−Ｏ−ルチノシドを約５．０％〜約１５．０％；
Ｑ−３−Ｏ−グルコシドを約５．０％〜約１５．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約０．５％〜約２．５；
フロリジンを約１．０％〜約５．０％；
クロロゲン酸を約５．０％〜約１５．０％；および
エピカテキンを約５．０％〜約１０．０％；
含むことを特徴とする組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の組成物において、前記フェノール抽出物またはその画分が、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシドおよびＱ−３−Ｏ−ラムノシドを含むフラボノール成分；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを含むアントシアニン成分；
フロリジンおよびフロリチンを含むジヒドロカルコン成分；
フェノール酸成分  クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびイソフェルラ酸；ならびに
エピガロカテキン、カテキンおよびエピカテキンを含むフラバン−３−オール成分；
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物において、前記フェノール抽出物が次の工程、すなわち、
リンゴの皮のサンプルを得る工程；
フェノール化合物の分解を抑制するために前記皮を処理する工程；
任意選択により前記皮を脱水し、前記皮を粉末状にする工程；
前記皮を１回以上、エタノールなどの食品用溶剤で抽出する工程；
任意選択により抽出中に前記皮を音波処理する工程；
固形分を除去してフェノール抽出物を得る工程；
任意選択により前記フェノール抽出物を濃縮する工程；
任意選択により前記フェノール抽出物から糖分を除去する工程；
任意選択により前記フェノール抽出物を濃縮、乾燥および／または凍結する工程；
を有する水抽出法で得ることができることを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物において、前記フェノール抽出物が精製されることを特徴とする組成物。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の組成物において、前記画分は、適した溶出剤を使用して前記フェノール抽出物を分画した後、高フェノール含有量、特に、高フラボノール含有量を有する画分を選択することにより得ることができることを特徴とする組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物において、前記溶出剤がエタノールであり、前記クロマトグラフィーが、Ｃ１８カラムを用いポリマー吸着剤を使用するフラッシュクロマトグラフィーであることを特徴とする組成物。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の組成物において、前記画分が約４０％〜約６０％エタノール中に溶出されることを特徴とする組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物において、前記画分が約４５％〜約５０％エタノール中に溶出されることを特徴とする組成物。
【請求項２４】
請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の組成物において、前記画分が次のフェノール特性、すなわち、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノール約６０．０％〜約９５．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシド約０．５％〜約１０．０％；
フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコン約１．０％〜約１０．０％；
クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸約１．０％〜約２０．０％；ならびに
エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オール約１．０％〜約２０．０％；
を有し、
前記パーセンテージが前記画分のフェノール含有量の全重量に基づき、前記合計が１００％を超えないことを特徴とする組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組成物において、前記画分が次のフェノール特性、すなわち、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノール約７０．０％〜約９０．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシド約０．５％〜約５．０％；
フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコン約２．０％〜約１０．０％；
クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸約２．０％〜約１５．０％；ならびに
エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オール約１．０％〜約１５．０％；
を有することを特徴とする組成物。
【請求項２６】
請求項２４に記載の組成物において、前記画分が、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノールを約８０．０％〜約９０．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約０．５％〜約２．５％；
フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコンを約３．５％〜約７．５％；
クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸を約２．５％〜約６．５％；ならびに
エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オールを約２．５％〜約６．５％；
含むことを特徴とする組成物。
【請求項２７】
請求項２４に記載の組成物において、前記画分が、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノールを約７０．０％〜約８０．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約２．０％〜約６．０％；
フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコンを約１．５％〜約４．５％；
クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸を約８．０％〜約１２．０％；ならびに
エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オールを約８．０％〜約１２．０％；
含むことを特徴とする組成物。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物において、薬学的に許容される医薬品添加物をさらに含むことを特徴とする組成物、。
【請求項２９】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物において、前記酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状が、老化現象、自己免疫障害、神経変性障害、代謝障害または血管障害であることを特徴とする組成物。
【請求項３０】
請求項２９に記載の組成物において、前記血管障害が卒中であることを特徴とする組成物。
【請求項３１】
請求項２９に記載の組成物において、前記神経変性疾患が多発性硬化症、血管性痴呆、パーキンソン病、またはアルツハイマー病であることを特徴とする組成物。
【請求項３２】
酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状を予防または治療する方法において、対象に請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物を有効量投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状を予防または治療する方法において、対象にリンゴの皮由来のフェノール抽出物またはその画分を有効量投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法において、前記フェノール抽出物またはその画分が、フラボノール成分、アントシアニン成分、ジヒドロカルコン成分、フェノール酸成分、およびフラバン−３−オール成分を含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法において、前記フラボノール成分がケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドまたはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載の方法において、前記アントシアニン成分がシアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法において、前記ジヒドロカルコン成分がフロリジン、フロリチンまたはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法において、前記フェノール酸成分がクロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の方法において、前記フラバン−３−オール成分が、エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンまたはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法において、前記フェノール抽出物またはその画分が、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシドおよびＱ−３−Ｏ−ラムノシドを含むフラボノール成分；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを含むアントシアニン成分；
フロリジンおよびフロリチンを含むジヒドロカルコン成分；
フェノール酸成分  クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびイソフェルラ酸；ならびに
エピガロカテキン、カテキンおよびエピカテキンを含むフラバン−３−オール成分；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の方法において、前記フェノール抽出物が、次の工程、すなわち、
リンゴの皮のサンプルを得る工程；
フェノール化合物の分解を抑制するために前記皮を処理する工程；
任意選択により前記皮を脱水し、前記皮を粉末状にする工程；
前記皮を１回以上、エタノールなどの食品用溶剤で抽出する工程；
任意選択により抽出中に前記皮を音波処理する工程；
固形分を除去し、固形分非含有フェノール抽出物を得る工程；
任意選択により前記フェノール抽出物を濃縮する工程；
任意選択により前記フェノール抽出物から糖分を除去する工程；および
任意選択により前記フェノール抽出物を濃縮、乾燥および／または凍結する工程；
を有する水抽出法により得ることができることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法において、前記フェノール抽出物を精製することを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項４０または４１に記載の方法において、前記画分は、クロマトグラフィーカラムで適した溶出剤を使用して前記フェノール抽出物を分画した後、高フェノール含有量、特に、高フラボノール含有量を有する画分を選択することにより得ることができることを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法において、前記溶出剤がエタノールであり、前記クロマトグラフィーが、Ｃ１８カラムを用いポリマー吸着剤を使用するフラッシュクロマトグラフィーであることを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４３または４４に記載の方法において、前記画分が約４０％〜約６０％エタノール中に溶出されることを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法において、前記画分が約４５％〜約５０％エタノール中に溶出されることを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項３４〜４７のいずれか１項に記載の方法において、前記画分が次のフェノール特性、すなわち、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノール約６０．０％〜約９５．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシド約０．５％〜約１０．０％；
フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコン約１．０％〜約１０．０％；
クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸約１．０％〜約２０．０％；ならびに
エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オール約１．０％〜約２０．０％；
を有し、
前記パーセンテージが前記画分のフェノール含有量の全重量に基づき、前記合計が１００％を超えないことを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法において、前記画分が次のフェノール特性、すなわち、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノール約７０．０％〜約９０．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシド約０．５％〜約５．０％；
フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコン約２．０％〜約１０．０％；
クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸約２．０％〜約１５．０％；ならびに
エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オール約１．０％〜約１５．０％；
を有することを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４７に記載の方法において、前記画分が、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノールを約８０．０％〜約９０．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約０．５％〜約２．５％；
フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコンを約３．５％〜約７．５％；
クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸を約２．５％〜約６．５％；ならびに
エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オールを約２．５％〜約６．５％；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４７に記載の方法において、前記画分が、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノールを約７０．０％〜約８０．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約２．０％〜約６．０％；
フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコンを約１．５％〜約４．５％；
クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸を約８．０％〜約１２．０％；および
エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オールを約８．０％〜約１２．０％；
含むことを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項３４〜５０のいずれか１項に記載の方法において、前記対象が、関連する疾患または症状に罹りやすいまたは罹っていることを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項３４〜５１のいずれか１項に記載の方法において、前記酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状が、老化現象、自己免疫障害、神経変性障害、代謝障害または血管障害であることを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法において、前記血管障害が卒中であることを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５２に記載の方法において、前記神経変性疾患が多発性硬化症、血管性痴呆、パーキンソン病、またはアルツハイマー病であることを特徴とする方法。
【請求項５５】
請求項３４〜５４のいずれか１項に記載の方法において、前記フェノール抽出物またはその画分が対象に複数の用量で投与されることを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項３４〜５５のいずれか１項に記載の方法において、前記フェノール抽出物またはその画分が経口投与されることを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項３４〜５６のいずれか１項に記載の方法において、前記フェノール抽出物またはその画分が、濃縮物、液剤、散剤、乳剤、懸濁剤、ペースト剤、ゲル剤、フィルム剤、ガム剤、ドロップ剤、錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、食品添加物の形態で投与されることを特徴とする方法。
【請求項５８】
水抽出法により得ることができるフェノール性のリンゴの皮抽出物の画分であって、クロマトグラフィーカラムで、適した溶出剤を使用して前記抽出物を分画し、高フェノール含有量を有する画分を選択することにより得ることができる画分において、フラボノール成分、アントシアニン成分、ジヒドロカルコン成分、フェノール酸成分、およびフラバン−３−オール成分を含むことを特徴とする画分。
【請求項５９】
請求項５８に記載の画分において、前記フラボノール成分が、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドまたはこれらの組み合わせを含み；
前記アントシアニン成分がシアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを含み；
前記ジヒドロカルコン成分が、フロリジン、フロリチンまたはこれらの組み合わせを含み；
前記フェノール酸成分がクロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸またはこれらの組み合わせを含み；
前記フラバン−３−オール成分が、エピガロカテキン、カテキンおよびエピカテキンを含むことを特徴とする画分。
【請求項６０】
次のフェノール特性、すなわち、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノール約６０．０％〜約９５．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシド約０．５％〜約１０．０％；
フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコン約１．０％〜約１０．０％；
クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸約１．０％〜約２０．０％；ならびに
エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オール約１．０％〜約２０．０％；
を有する請求項５８に記載の画分において、
前記パーセンテージが前記画分のフェノール含有量の全重量に基づき、前記合計が１００％を超えないことを特徴とする画分。
【請求項６１】
請求項５８に記載の画分において、次のフェノール特性、すなわち、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノール約７０．０％〜約９０．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシド約０．５％〜約５．０％；
フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコン約２．０％〜約１０．０％；
クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸約２．０％〜約１５．０％；ならびに
エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オール約１．０％〜約１５．０％；
を有することを特徴とする画分。
【請求項６２】
請求項５８に記載の画分において、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノールを約８０．０％〜約９０．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約０．５％〜約２．５％；
フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコンを約３．５％〜約７．５％；
クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸を約２．５％〜約６．５％；ならびに
エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オールを約２．５％〜約６．５％；
含むことを特徴とする画分。
【請求項６３】
請求項５８に記載の画分において、
ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノールを約７０．０％〜約８０．０％；
シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約２．０％〜約６．０％；
フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコンを約１．５％〜約４．５％；
クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸を約８．０％〜約１２．０％；ならびに
エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オールを約８．０％〜約１２．０％；
含むことを特徴とする画分。
【請求項６４】
請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の画分において、約４０％〜約６０％エタノール中に溶出することにより得ることができることを特徴とする画分。
【請求項６５】
請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の画分において、約４５％〜約５０％エタノール中に溶出することにより得ることができることを特徴とする画分。
【請求項６６】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物または請求項５８〜６５のいずれか１項に記載の画分を含むことを特徴とする、酸化ストレスによる損傷を予防または低減するための栄養補助食品または天然健康製品。
【請求項６７】
請求項６８に記載の栄養補助食品または天然健康製品において、濃縮物、液剤、散剤、乳剤、懸濁剤、フィルム剤、ペースト剤、ゲル剤、ガム剤、ドロップ剤、錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、または食品添加物の形態であることを特徴とする栄養補助食品または天然健康製品。
【請求項６８】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物または請求項５８〜６５のいずれか１項に記載の画分を含むことを特徴とする機能性食品または飲料。
【請求項６９】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物または請求項５８〜６５のいずれか１項に記載の画分を、薬学的に許容される医薬品添加物と共に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項７０】
請求項６９に記載の医薬組成物において、経腸投与、局所投与、非経口投与、肺内投与または経鼻投与用に製剤化されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７１】
請求項７０に記載の医薬組成物において、前記経腸投与が経口投与であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７２】
請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の医薬組成物において、酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状の予防または治療に使用されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７３】
請求項７２に記載の医薬組成物において、前記酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状が、老化現象、自己免疫障害、神経変性障害、代謝障害または血管障害であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７４】
請求項７３に記載の医薬組成物において、前記血管障害が卒中であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７５】
請求項７３に記載の医薬組成物において、前記神経変性疾患が多発性硬化症、血管性痴呆、パーキンソン病、またはアルツハイマー病であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７６】
酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状を治療または予防する医薬を製造するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３２〜５７のいずれか１項に記載の画分の使用。
【請求項７７】
酸化ストレスに関連する疾患または症状を治療または予防するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物または請求項３２〜５７のいずれか１項に記載の画分の使用。
【請求項７８】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物または請求項３２〜５７のいずれか１項に記載の画分を栄養補助食品または天然健康製品として使用するための使用説明書と共に含むことを特徴とする市販のパッケージ。
【請求項７９】
請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の栄養補助食品または天然健康製品を健康促進に使用するための使用説明書と共に含むことを特徴とする市販のパッケージ。
【請求項８０】
請求項６９〜７５のいずれか１項に記載の医薬組成物を、酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状の治療または予防に使用する際の使用説明書と共に含むことを特徴とする市販のパッケージ。
【請求項８１】
請求項５８〜６５のいずれか１項に記載の画分を含むことを特徴とする食品添加物。
【請求項８２】
請求項５８〜６５のいずれか１項に記載の画分を含むことを特徴とする化粧品。
【請求項８３】
前述の本発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１０年５月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／３３３，０９１号明細書の優先権の利益を主張し、参照によりその全体を本明細書に援用する。
【０００２】
本開示は、リンゴの皮由来のフェノール組成物、ならびに酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患および症状の予防および治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
天然植物性フェノール化合物（フラボノイド類など）はその強力な抗酸化特性のために多くの注目を集めてきた。フェノール化合物は、果物、野菜、および多くのハーブ植物または芳香植物などの多くの植物源に存在する。その強力な抗酸化活性のため、植物性フェノール化合物は２０年以上にわたり健康促進物質として研究が行われてきた。
【０００４】
リンゴは、優れた食物性フェノール化合物源である。リンゴの果皮は、リンゴの果肉よりもフラボノイド含有量が３倍〜６倍高く、果肉中には見られないケルセチン配糖体などの特有のフラボノイド類を有する（Ｗｏｌｆｅ，Ｗｕ  ＆  Ｌｉｕ，２００３；Ｗｏｌｆｅ  ＆  Ｌｉｕ，２００３）。
【０００５】
リンゴ果皮抽出物は、強力なフリーラジカル補足活性を有することが分かった（Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。様々なリンゴ果皮抽出物およびその製造方法が、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１４７７２３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１７２０１２Ａ１号明細書、米国特許第６，４４０，４１０Ｂ１号明細書、欧州特許出願第０６５９３４７Ａ１号明細書、およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００５に記載されている。ＰＣＴ出願、国際公開第２００９／０７６７７７６Ａ１号パンフレット（Ｒｕｐａｓｉｎｇｈｅら）は、リンゴ果皮由来の粗抽出物、および食品中の多不飽和脂肪酸または脂質の酸化防止におけるその使用を開示している。
【０００６】
反応性酸素種により誘導される酸化ストレスは、ヒトの多くの症状および疾患に関連付けられる。従って、植物由来の抗酸化物質は、特定の神経変性疾患を含む、このような多くの疾患の予防または治療に有用な食物性モジュレーターを提供することができる（Ｋａｕｒ  ａｎｄ  Ｋａｐｏｏｒ，２００１；Ｈｅｏ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。偏在するフラボノイドであるケルセチン−３−Ｏ−グルコシド（Ｑ３Ｇ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経保護効果を有することが最近示唆された（Ｓｏｕｎｄａｒａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏでの神経細胞の直接的治療は有望な治療方法ではなく、リンゴ由来の抽出物がｉｎ  ｖｉｖｏで何らかの治療効果を有するということは示されていない。
【０００７】
神経変性障害に伴う費用は、北米で毎年２００億ドルを越える。現在、これらの神経変性障害を防ぐという栄養機能表示（ｈｅａｌｔｈ  ｃｌａｉｍｓ）を有する天然物の登録はない。人口全体の老齢化に伴い、健康を維持したいという要望と共に、天然源または生物源由来の代替医薬品を使用したいという要望が高まっている。酸化ストレスによって生じる症状および疾患（神経変性障害を含む）を治療する、予防する、またはそのリスクを低減する安全且つ有効な天然物の発見および開発が必要とされている。
【０００８】
リンゴの果皮は、多くの国ではリンゴ加工業の廃棄物であり、従って、付加価値のある健康促進製品の魅力的な供給源である。粗抽出物は製造されてきたが、強力な抗酸化特性を有する、より精製された組成物が必要とされている。フェノール化合物は厳しい抽出条件では容易に酸化され、分解するため、植物源からフェノール化合物を抽出することは困難である。
【発明の概要】
【０００９】
リンゴの皮から生物活性フェノール化合物に富む組成物を得、そのフェノール含有量と特性を分析した。本明細書に記載のフェノール組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは神経細胞死を防ぐ効果があり、ｉｎ  ｖｉｖｏでは酸化ストレスに関連する脳損傷および身体障害を防ぐ効果があることが実証された。本明細書に記載のフェノール組成物は、酸化ストレスに関連する疾患または症状（特定の神経変性疾患を含む）の治療および／または予防に有用であると期待される。様々な非限定的態様および実施形態を下記に記載する。
【００１０】
一態様では、酸化ストレスによって生じる疾患または症状の予防または治療に使用される組成物を提供し、本組成物はリンゴの皮由来のフェノール抽出物（ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔ）またはその画分を含む。幾つかの実施形態では、フェノール抽出物またはその画分は、フラボノール成分、アントシアニン成分、ジヒドロカルコン成分、フェノール酸成分、およびフラバン−３−オール成分を含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、フラボノール成分は、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド（ｐａｌｔｏｓｉｄｅ）、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドまたはこれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、アントシアニン成分は、シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを含む。幾つかの実施形態では、ジヒドロカルコン成分は、フロリジン、フロリチン（ｐｈｌｏｒｉｔｉｎ）またはこれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、フェノール酸成分は、クロロゲン酸、コーヒー酸（ｃａｆｅｉｃ  ａｃｉｄ）、フェルラ酸、イソフェルラ酸、またはこれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、フラバン−３−オール成分は、エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンまたはこれらの組み合わせを含む。
【００１２】
一実施形態では、フェノール抽出物またはその画分は、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシドおよびＱ−３−Ｏ−ラムノシドを含むフラボノール成分；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを含むアントシアニン成分；フロリジンおよびフロリチンを含むジヒドロカルコン成分；フェノール酸成分、クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびイソフェルラ酸；ならびに、エピガロカテキン、カテキンおよびエピカテキンを含むフラバン−３−オール成分；を含む。
【００１３】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシドを約１０．０％〜約６０．０％、約１５．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約３５．０％、約２０．０％〜約３０．０％、約２０．０％〜約２５．０％；Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドを約１０．０％〜約６０．０％、約１５．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約４０．０％、約２０．０％〜約３５．０％、約２０．０％〜約３０．０％、約２０．０％〜約２５．０％、約３０．０％〜約３５．０％；Ｑ−３−Ｏ−ルチノシドを約１．０％〜約２０．０％、約５．０％〜約１５．０％、約７．０％〜約１３．０％、約５．０％〜約１０．０％、約１０．０％〜約１５．０％；Ｑ−３−Ｏ−グルコシドを約１．０％〜約２０．０％、約５．０％〜約１５．０％、約７．０％〜約１３．０％、約１０．０％〜約１５．０％、約１０．０％〜約１５．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約０．５％〜約１０．０％、約０．５％〜約５．０％、約０．５％〜約２．５、約０．５％〜約２．０％、約１．０％〜約２．０％、約２．０％〜約６．０％、約３．５％〜約５．５％、約４．０％〜約５．０％；フロリジンを約０．５％〜約１０．０％、約１．０％〜約１０．０％、約２．０％〜約１０．０％、約１．０％〜約５．０％、約１．５％〜約４．５％、約３．５％〜約７．５％、約３．０％〜約６．０％、約３％、約５％；クロロゲン酸を約１．０％〜約２０．０％、約２．０％〜約１５．０％、約５．０％〜約１５．０％、約２．５％〜約６．５％、約８％〜約１２．０％、約４％または約１０％；および、エピカテキンを約１．０％〜約２０．０％、約１．０％〜約１５．０％、約５．０％〜約１５．０％、約２．５％〜約１０．０％、約２．５％〜約６．５％、約５．０％〜約１０．０％、約８．０％〜約１０．０％含む。
【００１４】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシドを約２０．０％〜約３０．０％；Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドを約２０．０％〜約３０．０％；Ｑ−３−Ｏ−ルチノシドを約１０．０％〜約１５．０％；Ｑ−３−Ｏ−グルコシドを約１０．０％〜約１５．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約２．０％〜約６．０％；フロリジンを約１．０％〜約５．０％；クロロゲン酸を約８％〜約１２．０％；およびエピカテキンを５．０％〜約１０．０％含む。
【００１５】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシドを約２０．０％〜約３５．０％；Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドを約２０．０％〜約３５．０％；Ｑ−３−Ｏ−ルチノシドを約５．０％〜約１５．０％；Ｑ−３−Ｏ−グルコシドを約５．０％〜約１５．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約０．５％〜約２．５；フロリジンを約１．０％〜約５．０％；クロロゲン酸を約５．０％〜約１５．０％；エピカテキンを約５．０％〜約１０．０％含む。
【００１６】
幾つかの実施形態では、フェノール抽出物は、次の工程、すなわち、リンゴの皮のサンプルを得る工程；フェノール化合物の分解を抑制するために皮を処理する工程；任意選択により皮を脱水し、皮を粉末状にする工程；皮を１回以上、エタノールなどの食品用溶剤で抽出する工程；任意選択により抽出中に皮を音波処理する工程；固形分を除去してフェノール抽出物を得る工程；任意選択によりフェノール抽出物を濃縮する工程；任意選択によりフェノール抽出物から糖分を除去する工程、および任意選択によりフェノール抽出物を濃縮、乾燥および／または凍結する工程；を有する水抽出法で得ることができる。
【００１７】
幾つかの実施形態では、画分は、適した溶出剤を使用してフェノール抽出物を画分した後、高フェノール含有量を有する画分を選択することにより得ることができる。幾つかの実施形態では、高フラボノール含有量を有する画分を選択する。
【００１８】
幾つかの実施形態では、画分は、約４０％〜約６０％エタノール中に溶出される。幾つかの実施形態では、画分は、約４５％〜約５０％エタノール中に溶出される。
【００１９】
幾つかの実施形態では、画分は、次のフェノール特性、すなわち、ケルセチン（Ｑ）、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノール約６０．０％〜約９５．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシド約０．５％〜約１０．０％；フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコン約１．０％〜約１０．０；クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸約１．０％〜約２０．０％；ならびに、エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オール約１．０％〜約２０．０％を有し、パーセンテージは画分のフェノール含有量の全重量に基づき、合計は１００％を超えない。
【００２０】
幾つかの実施形態では、画分は、次のフェノール特性、すなわち、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノール約７０．０％〜約９０．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシド約０．５％〜約５．０％；フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコン約２．０％〜約１０．０％；クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸約２．０％〜約１５．０％；ならびにエピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オール約１．０％〜約１５．０％を有する。
【００２１】
幾つかの実施形態では、画分は、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノールを約８０．０％〜約９０．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約０．５％〜約２．５％；フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコンを約３．５％〜約７．５％；クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸を約２．５％〜約６．５％；ならびに、エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オールを約２．５％〜約６．５％含む。
【００２２】
幾つかの実施形態では、画分は、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノールを約７０．０％〜約８０．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約２．０％〜約６．０％；フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコンを約１．５％〜約４．５％；クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸を約８．０％〜約１２．０％；ならびにエピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オールを約８．０％〜約１２．０％含む。
【００２３】
幾つかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される医薬品添加物をさらに含む。
【００２４】
幾つかの実施形態では、酸化ストレスまたは炎症に関連する疾患または症状は、老化現象、肥満、自己免疫疾患（関節炎、糖尿病、狼瘡、大腸炎およびクローン病など）、心疾患、アテローム性動脈硬化症、卒中、心筋梗塞、網膜変性、難聴、脆弱Ｘ症候群、慢性疲労症候群、外傷性脳損傷、脊髄損傷、頭部損傷、脱髄疾患（多発性硬化症、デヴィック病（ｄｅｖｉｃ’ｓ）、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、白質ジストロフィー、シャルコー・マリー・トゥース、およびギラン・バレー症候群（ｇｕｉｌｌｉａｎ−ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）など）、または酸化ストレスにより誘発される神経変性疾患（多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病など）および血管性痴呆である。本明細書に記載の組成物は、酸化ストレスによって生じる特定の希少疾患（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性進行性ＭＳ、シャルコー・マリー・トゥース病および脊髄性筋萎縮症など）の治療または予防にも有用な可能性がある。
【００２５】
別の態様では、対象に本明細書に記載の組成物を有効量投与することを含む、酸化ストレスによって生じる疾患または症状の予防または治療方法を提供する。
【００２６】
別の態様では、対象にリンゴの皮由来のフェノール抽出物またはその画分を有効量投与することを含む、酸化ストレスによって生じる疾患または症状の予防または治療方法を提供する。
【００２７】
幾つかの実施形態では、フェノール抽出物またはその画分は、複数の用量で対象に投与される。
【００２８】
幾つかの実施形態では、フェノール抽出物またはその画分は経口投与される。
【００２９】
幾つかの実施形態では、フェノール抽出物またはその画分は、濃縮物、液剤、散剤、乳剤、懸濁剤、ペースト剤、ゲル剤、フィルム剤、ガム剤、ドロップ剤、錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、食品添加物の形態で投与される。
【００３０】
別の態様では、フェノール性のリンゴの皮抽出物の画分を提供し、抽出物は水抽出法で得ることができ、画分は、クロマトグラフィーカラムで適した溶出剤を使用して抽出物を分画し、高フェノール含有量を有する画分を選択することにより得ることができ、画分は、フラボノール成分、アントシアニン成分、ジヒドロカルコン成分、フェノール酸成分、およびフラバン−３−オール成分を含む。画分は前述の特徴を有する。
【００３１】
別の態様では、本明細書に記載の画分を含む、酸化ストレスによる損傷を予防または低減するための栄養補助食品または天然健康製品を提供する。
【００３２】
別の態様では、本明細書に記載の画分を含む、機能性食品または飲料を提供する。
【００３３】
別の態様では、本明細書に記載の画分を薬学的に許容される医薬品添加物と共に含む、医薬組成物を提供する。
【００３４】
幾つかの実施形態では、医薬組成物は、経腸投与、局所投与、非経口投与、肺内（ｉｎｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙ）投与または経鼻投与用に製剤化される。幾つかの実施形態では、経腸投与は経口投与である。
【００３５】
幾つかの実施形態では、医薬組成物は、酸化ストレスに関連する疾患または症状の予防または治療に使用される。
【００３６】
幾つかの実施形態では、医薬組成物は、炎症に関連する疾患または症状の予防または治療に使用される。
【００３７】
別の態様では、酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状を治療または予防する医薬を製造するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
【００３８】
別の態様では、酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状を治療または予防するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
【００３９】
別の態様では、本明細書に記載の組成物を、栄養補助食品または天然健康製品として使用するための使用説明書と共に含む市販のパッケージを提供する。
【００４０】
別の態様では、本明細書に記載の栄養補助食品または天然健康製品を、健康促進に使用するための使用説明書と共に含む市販のパッケージを提供する。
【００４１】
別の態様では、本明細書に記載の医薬組成物を、酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状の治療または予防に使用する際の使用説明書と共に含む市販のパッケージを提供する。
【００４２】
別の態様では、本明細書に記載の画分を含む食品添加物を提供する。
【００４３】
別の態様では、本明細書に記載の画分を含む化粧品を提供する。
【００４４】
本発明の他の態様および特徴は、以下の本発明の特定の実施形態の説明を添付の図面と共に検討すれば、当業者には明らかになるであろう。
【００４５】
ここで、本発明の実施形態を単に例示の目的で、添付の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、ロータロッドで評価した場合、Ｆ５で処置したマウスの低酸素性虚血性（ＨＩ）脳損傷の方が、溶媒で処置した対照マウスと比較して、運動機能が良好であったことを示す図である。
【図２】図２は、Ｆ５で処置したマウスは、溶媒で処置したマウスと比較して、半球損失によって起こるＨＩ脳損傷から保護されたことを示す図である。
【図３】図３は、Ｆ５処置では、溶媒処置と比較して、ＨＩ脳損傷後の線条体中の生きたニューロンの数が増加したことを示す図である。
【図４】図４は、１回のＦ５処置では、溶媒対照群と比較して、ＨＩ脳損傷後の海馬中の細胞損失が有意に予防されなかったことを示す図である。
【図５】図５は、ＨＩ脳損傷後の溶媒（水）処置マウスとＦ５処置マウスの脳容積を示す顕微鏡写真である。
【図６】図６は、ＨＩ脳損傷後の溶媒（水）処置マウスとＦ５処置マウスの線条体損傷を示す顕微鏡写真である。
【図７】図７は、Ｆ４、Ｆ４成分、およびＦ４代謝物の比較において、Ｆ４が、酸素・グルコース欠乏処理（ｏｘｙｇｅｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）された一次皮質ニューロン（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ）の死を低減したことを示す図である。
【図８】図８は、ＨＩにより誘発される海馬ニューロン損失が、Ｆ４の経口（ｐ．ｏ．）投与により用量依存的に低減したことを示す図である。
【図９】図９は、ＨＩにより誘発される海馬損傷が、精製リンゴ画分Ｆ４により用量依存的に低減したことを示す図である。
【図１０】図１０は、ＨＩにより誘発される線条体ニューロン損失が、Ｆ４により用量依存的に低減したことを示す図である。
【図１１】図１１は、ＨＩにより誘発される線条体ニューロン損失が、Ｆ４により用量依存的に低減したことを示す図である。
【図１２】図１２は、ＨＩの前にＦ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を１用量投与しても線条体ニューロン損失を低減できなかったことを示す図である。
【図１３】図１３は、ＨＩの前にＦ４（２５ｍｇ／ｋｇ／日、ｐ．ｏ）を３用量投与することにより線条体ニューロン損失が低減したことを示す図である。
【図１４】図１４は、ＨＩの前にＦ４を７用量（２５ｍｇ／ｋｇ／日、７日間、ｐ．ｏ．）投与することにより線条体ニューロン損失が低減したことを示す図である。
【図１５】図１５は、ＨＩの前にＦ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を１用量投与しても海馬損傷が低減しなかったことを示す図である。
【図１６】図１６は、ＨＩの前にＦ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を３用量投与すると海馬組織損失が低減したことを示す図である。
【図１７】図１７は、ＨＩの前にＦ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を７用量投与すると海馬組織損失が低減したことを示す図である。
【図１８】図１８は、最初にＥＡＥの臨床徴候が現れた２４時間後にＦ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）の経口投与を開始することにより、水を投与された動物と比較して、疾患の進行が低下したことを示す図である。
【図１９】図１９は、Ｆ４（５０ｍ／ｋｇ）を経口投与すると、ＨＩを施したマウスのＬＰＳにより刺激された全血中の炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の産生が低減することを示す図である。Ａ、ＬＰＳにより誘導されるＴＮＦ−α放出は、水またはＦ４を経口投与された偽処置動物（脳損傷なし）の全血中で同じであった。Ｂ、ＬＰＳにより誘導されるＴＮＦ−α放出は、Ｆ４を投与されたマウスと比較して、水を経口投与されたＨＩ動物（脳損傷）の全血中の方が多かった。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
リンゴ、特にリンゴの皮は、強力な抗酸化能力を有するフラボノイド類などのフェノール化合物を豊富に含む供給源である。リンゴの皮は、多くの国ではリンゴ加工業（例えば、アップルソース、アップルパイなど）の廃棄物であり、通常、高品質且つ低費用で入手可能である。従って、リンゴの皮から単離されるフェノール化合物は、食品、天然健康製品、製薬および化粧品業界用の理想的な天然抗酸化物質源である。原材料は低費用で容易に入手可能であるため、経済的利益が実現され、これを消費者に還元することができ、それにより医療費が減少する可能性がある。
【００４８】
本開示は、リンゴの皮由来のフェノール組成物、特にフェノール抽出物およびその画分、ならびに酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状の予防または治療におけるそれらの使用に関する。また、リンゴの皮からフェノール組成物を製造する方法も本明細書に開示する。フェノール組成物は、天然由来の、消費者に優しい組成物であり、それにより天然健康製品または栄養補助製品（ｎｕｔｒｉｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、栄養補助食品および機能性食品などの天然の健康促進製品に対する要望の高まりに応える。本組成物は、強力な抗酸化性および抗炎症性を有するため、それらは医薬および化粧品用途に使用するのにも適している。
【００４９】
後述する結果に基づき、本明細書に記載のフェノール組成物は、酸化ストレスまたは炎症に関連する様々な症状および疾患の予防または治療に有用となることが期待される。酸化ストレスに関して、この仮説は、フリーラジカルの発生がヒトの多くの障害および症状に関与することが示されており、またフラボノイドが優れたフリーラジカル捕捉剤であることに裏付けられている。酸化ストレスは一般にフリーラジカルの過剰生成を指し、これは、組織損傷、炎症および興奮毒性などの多くの異なる原因に起因することがある。２種類の例示的な組成物、即ちＦ４またはＦ５の有益な効果は、ビタミンＣの抗酸化濃度の１／１０未満の濃度で見られたため、本明細書に開示される組成物の有益な効果は、全部が抗酸化効果によるものではない可能性がある。フラボノイド類、およびそれらのｉｎ  ｖｉｖｏ代謝物は、プロテインキナーゼおよび脂質キナーゼシグナル伝達経路に対する作用により細胞中で調節作用を発揮する可能性があるという見解が浮上している。フラボノイド類、より最近ではそれらの代謝物は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）、Ａｋｔ／プロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ／ＰＫＢ）、チロシンキナーゼ、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）のシグナル伝達カスケードに対して作用することが報告された。これらの経路に対する阻害または促進作用は、標的分子のリン酸化状態を変化させることにより、および遺伝子発現を調節することにより細胞機能に大きな影響を及ぼす可能性がある（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。従って、フラボノイド類は、ラジカル捕捉剤であることに加えて、細胞ストレスおよび細胞死に関与する様々なキナーゼ経路を調節することもできる。炎症に関して、本明細書に示す結果は、本開示のフェノール組成物がホスホジエステラーゼおよび炎症性サイトカインの産生を抑制できることも例証し、組成物が有効な抗炎症剤でもあることを示す。本明細書に記載の組成物は特有のフェノール特性を有し、所与の画分中に存在する特定の成分間の相乗効果がそれらの強力な治療効果に寄与している可能性があると考えられる。
【００５０】
本明細書に開示されるフェノール組成物は、酸化ストレスまたは炎症に関連する１つ以上の症状または疾患を予防または治療する可能性を有し、アポトーシス、壊死、脳血管系の損傷、神経炎症、および興奮毒性等に関連する成分を有するものを含む。酸化ストレスおよび／または炎症に関連する例示的な疾患および症状としては、老化現象、慢性疲労症候群、神経変性障害、自己免疫障害、代謝障害、および血管障害が挙げられるが、これらに限定されるものではない。神経変性障害としては、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、網膜変性、難聴、脆弱Ｘ症候群、慢性疲労症候群、外傷性脳損傷、脊髄損傷、頭部損傷および脱髄疾患が挙げられる。脱髄疾患としては、例えば、多発性硬化症、デヴィック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、白質ジストロフィー、シャルコー・マリー・トゥース病、およびギラン・バレー症候群が挙げられる。自己免疫障害としては、例えば、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、狼瘡、大腸炎およびクローン病が挙げられる。血管障害としては、例えば、卒中、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞および血管性痴呆が挙げられる。卒中、ＭＳおよび血管性痴呆などにおけるフラボノイド類の有益な効果は、少なくとも一部、脳血管系および微小血管系の保護により得られる可能性がある。代謝障害としては、例えば、肥満、ＩＩ型糖尿病、および脂質異常症（高コレステロール血症など）が挙げられる。本明細書に記載の組成物は、酸化ストレスによって生じる特定の希少疾患（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性進行性ＭＳ、シャルコー・マリー・トゥース病、および脊髄性筋萎縮症など）の治療または予防に有用な可能性もある。酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患および症状は、前述の２種類以上のカテゴリーに入る場合があることが分かるであろう。
【００５１】
次のセクションで、本明細書全体を通して使用される様々な用語および表現について定義する。
【００５２】
「フェノール（ｐｈｅｎｏｌｉｃ）」という用語は、一般に、少なくとも１個のフェノール基を有する、植物中に見られる天然の化学化合物を指す。本明細書で使用する場合、「フェノール」とは、リンゴ由来のポリフェノール化合物、特にリンゴの皮に存在するフラボノイド類を指す（例えば、表２ａおよび表２ｂを参照）。フラボノイド類としては、フラボノール類（例えば、ケルセチンおよびその様々な配糖体）、アントシアニジン類、ジヒドロカルコン類、フェノール酸類、およびフラバン−３−オール類（または、カテキン類）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。フラボノイド類は、フリーラジカルを捕捉すること、様々なキナーゼ類を阻害すること、脂質の過酸化を低減すること、アポトーシスを抑制すること、血小板凝集を防止すること、および抗炎症効果を示すことが知られている。
【００５３】
本明細書で使用する場合、抽出物またはその画分の「フェノール含有量」とは、フェノールモノマー含有量を指し、表２ａおよび表２ｂに記載のフェノールモノマー化合物に基づき、各化合物のパーセンテージは、組成物のフェノールモノマー含有量の全重量に基づいて算出される。フェノール含有量の全パーセンテージは１００％を超えない。組成物は、表２ａおよび表２ｂに記載されていないその他のフェノール化合物を含んでもよいが、これらは本明細書で使用するパーセンテージの算出には含まれない。
【００５４】
「高フェノール含有量」とは、単離された他の画分と比較して、または粗抽出物と比較して、フェノール含有量が比較的高い画分の選択を指す。例えば、表２ａおよび表２ｂの分析された１５の画分のうち、画分Ｆ４およびＦ５は、他の画分と比較して、フェノールモノマー含有量が比較的高い。特に、Ｆ４およびＦ５は、他の画分と比較して、フラボノール含有量が比較的高い。「高フラボノール含有量」とは、他の画分と比較してまたは粗抽出物と比較してフラボノール類に富む画分を指す。ある画分は、分画法などの方法により、それが得られる／得られた粗抽出物よりも高いフラボノール含有量（全フェノール含有量中のフラボノール％）を有する場合がある。
【００５５】
「フェノール抽出物またはその画分」とは、リンゴの技術の抽出により製造されるフラボノイドに富む抽出物、またはそれから単離される高濃度の画分である。例えば、カラムクロマトグラフィーを使用して、所望の画分を単離してもよい。抽出物またはその画分は、任意の所望の形態にさらに加工処理されてもよく、例えば、液体、懸濁液、乳濁液、溶液、または固体（粉末または凍結乾燥品など）の形態であってもよい。従って、抽出物または画分という用語は、必ずしも液体の形態の抽出物または画分を指すものではないことが分かるであろう。
【００５６】
本明細書で使用する場合、抽出物または画分の「フェノール特性（ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅ）」とは、抽出物または画分中のフェノール化合物、特にフラボノイド類の特定の組み合わせおよびそれらの相対的な量を指す。
【００５７】
「有効量」という用語は、対象に所望の結果を達成するのに十分な量である。治療に関して、有効量は治療有効量である。治療有効量は、例えば、疾患、障害、または、疾患もしくは障害の症候、疾患、障害、または疾患もしくは障害の症候の重症度、治療される患者の年齢、体重、もしくは健康状態、および処方する医師の判断に応じて変わり得る。どのような場合でも適切な治療有効量は、当業者により確定されることもあれば、または通常の実験により決定可能なこともある。場合によっては、治療有効量は、対象に全フェノール含有量を少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１５００ｍｇ／ｋｇ／日、または１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日、または約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約５００ｍｇ／ｋｇ／日、または約２５ｍｇ／ｋｇ／日〜約２００ｍｇ／ｋｇ／日、または約１０ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、提供するのに十分な量である。予防に関して、有効量は予防有効量である。有効量は、良好な健康状態を促進するのに十分な量であってもよい。有効量は、少なくとも一部、フェノール組成物の特定の用途（例えば、栄養補助食品、機能性食品、天然健康製品または医薬品）および所望の結果に依存することになる。
【００５８】
「酸化ストレス」という用語は、一般に、反応性酸素種の産生と、その反応性中間体を容易に解毒するまたはその結果生じる損傷を容易に修復する生物系の能力との不均衡を指す。ヒトでは、酸化ストレスは、老化現象、関節炎、糖尿病、心疾患、アテローム性動脈硬化症、卒中、心筋梗塞、血管性痴呆、網膜変性、難聴、脆弱Ｘ症候群、慢性疲労症候群および神経変性疾患などの多くの症状および疾患に関与することが示されている。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「疾患または症状」という用語は、疾患、障害、症状、病変、または、これらのいずれかの症候を指す。「疾患」という用語は、通常、生物の身体に影響を及ぼす異常な症状を指す。それは、特定の症候および徴候を伴う医学的症状であると解釈されることが多い。本明細書で使用する場合、「症状（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、治療または予防されるのが望ましいが、通常は疾患とは見なされない状態（例えば、老化現象など）を指す。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「治療する」または「治療」という用語は、一時的にもしくは永久に症候を軽減するもしくはなくすこと、または疾患もしくは症状の症候の発現を緩徐化すること、または疾患もしくは症状の進行を緩徐化すること、または疾患もしくは症状に関連する症候もしくは負の事象が再発するまでの期間を延長することを意味する。治療行為により症候が全部はなくならない場合もあるが、非治療と比較して対象に何からの緩和または改善が得られるものとする。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「予防する」または「予防」という用語は、例えば、疾患または症状に罹りやすいと考えられる母集団における、疾患もしくは症状、または疾患もしくは症状の症候の発症を予防することを意味する。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「医薬品添加物」とは、薬理活性を実質的に有していない担体、希釈剤および添加剤等を指す。医薬品添加物は、好ましくは「薬学的に許容される」ものであり、これは、医薬品添加物が、対象に所望の効果を提供するのに十分な量で投与されたとき無毒であり、フェノール抽出物またはその画分の生物活性を損なわないことを意味する。
【００６３】
本明細書で訴訟する場合、「対象」とは、哺乳動物、特に、ヒト、飼い馴らされた動物（例えば、ペット）、実験動物、および家畜類を指す。
【００６４】
「用量」とは、所与の１単位（以上）の剤形で対象に投与される活性物質（ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）の量を指す。効能を達成するのに必要な用量は、例えば、治療される疾患または症状、剤形、および投与経路に応じて変わり得る。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「食物」とは、例えば、栄養、健康または楽しみのために、ヒトまたは動物が摂取可能などのようなものも包含し、食物と飲料の両方を含む。
【００６６】
「実質的に」、「約」および「ほぼ」などの程度を表す用語は、本明細書で使用する場合、最終結果が著しく変化しないような被修飾語の適正な偏倚量を意味する。
【００６７】
本明細書で使用する場合、数値または数の範囲に関連する「約」という用語は、＋／−５％のばらつきを指す。
【００６８】
本明細書に開示される要素を導入する場合、冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」および「前記（ｓａｉｄ）」は、その要素が１つ以上存在することを意味するものとする。
【００６９】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、オープンエンドであるものとし、列挙される要素以外の追加の要素が存在してもよいことを意味する。
【００７０】
ここで、本開示の実施形態を詳細に参照する。開示される実施形態は、特許請求の範囲を限定するものではない。それと反対に、特許請求の範囲は、代替形態、変更形態、および均等物を含むものとする。
【００７１】
１つの広範な態様において、本明細書では酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状の予防または治療に使用される組成物を提供する。組成物は、リンゴの皮由来のフェノール抽出物またはその画分を含む。
【００７２】
フラボノイドに富むフェノール抽出物またはその画分は、フラボノール成分、アントシアニン成分、ジヒドロカルコン成分、フェノール酸成分、およびフラバン−３−オール成分を含む。これらの成分は、抽出物またはその画分の全フェノール含有量の測定に使用される。
【００７３】
フラボノール成分は、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドまたはこれらの組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、フラボノール成分は、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシドおよびＱ−３−Ｏ−ラムノシドを含む。
【００７４】
アントシアニン成分は、シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを含んでもよい。
【００７５】
ジヒドロカルコン成分は、フロリジン、フロリチンまたはこれらの組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、ジヒドロカルコン成分はフロリジンおよびフロリチンを含む。
【００７６】
フェノール酸成分は、クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸またはこれらの組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、フェノール酸成分は、クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびイソフェルラ酸を含む。
【００７７】
フラバン−３−オール成分は、エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンまたはこれらの組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、フラバン−３−オール成分は、エピガロカテキン、カテキンおよびエピカテキンを含む。
【００７８】
一実施形態では、フェノール抽出物またはその画分は、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシドおよびＱ−３−Ｏ−ラムノシドを含むフラボノール成分；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを含むアントシアニン成分；フロリジンおよびフロリチンを含むジヒドロカルコン成分；フェノール酸成分、クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびイソフェルラ酸；ならびに、エピガロカテキン、カテキンおよびエピカテキンを含むフラバン−３−オール成分；を含む。
【００７９】
フェノール抽出物は、水抽出法により得ることができる。例示的な方法は、次の工程、すなわち、リンゴの皮のサンプルを得る工程；フェノール化合物の分解を抑制するために皮を処理する工程；任意選択により皮を脱水し、皮を粉末状にする工程；皮を１回以上、エタノールなどの食品用溶剤で抽出する工程；任意選択により抽出中に皮を音波処理する工程；固形分を除去してフェノール抽出物を得る工程；任意選択によりフェノール抽出物を濃縮する工程；任意選択によりフェノール抽出物から糖分を除去する工程、および任意選択によりフェノール抽出物を濃縮、乾燥および／または凍結する工程；を有する。
【００８０】
幾つかの実施形態では、例えば、カラムクロマトグラフィー（例えば、Ｃ１８カラムクロマトグラフィー）を使用して、抽出物をさらに精製する。粗抽出物からその他の成分（例えば、高親油性成分など）を除去するために精製を行ってもよい。エタノールまたは別の適した食品用溶剤、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％エタノールを溶出剤として使用することができる。
【００８１】
幾つかの実施形態では、抽出物（粗抽出物または精製抽出物）を分画して、溶出画分を得る。カラムクロマトグラフィーなどの任意の適した方法を使用して、分画化を行ってもよい。好ましくは、選択される画分は、単離される可能性がある他の画分と比較して、フェノール含有量が比較的高い。溶出画分は、粗抽出物と比較して、および他の画分と比較して、個々の成分の特有の組み合わせおよび／または濃度（即ち、特有のフェノール特性）を含むことがある。従って、異なる画分は、異なる生物学的効果を示すことがある。さらに、調製された各画分は、生物活性に寄与し得る未同定の活性化合物を含有することがある。活性成分間に相乗効果が認められることがある。幾つかの実施形態では、フラボノール類に富む画分が選択される。
【００８２】
幾つかの実施形態では、画分は、クロマトグラフィーカラムで適した溶出剤を使用して、フェノール抽出物を分画することにより得ることができる。ある実施形態では、画分は、クロマトグラフィーカラムで適した溶出剤を使用して、フェノール抽出物を分画することにより得ることができる。例えば、エタノールまたは別の適した食品用溶出剤などの任意の適した溶出剤を使用してもよい。幾つかの実施形態では、使用するクロマトグラフィーは、Ｃ１８カラムを用いポリマー吸着剤を使用するフラッシュクロマトグラフィーである。
【００８３】
幾つかの実施形態では、分画工程に続いて、画分の分析、および高フェノール含有量を有する１つ以上の画分の選択を行う。フェノール含有量は、任意の適した手段で測定してもよい。幾つかの実施形態では、フェノール含有量は、実施例１に記載のように測定する。幾つかの実施形態では、選択される画分は、溶出量８００ｍｌに基づき、約７０００ｍｇ／ｍｌより高い、約９０００ｍｇ／ｍｌより高い、約１００００ｍｇ／ｍＬより高い、約１１０００ｍｇ／ｍＬより高い、約１２０００ｍｇ／ｍＬより高い、または約１３０００ｍｇ／ｍＬより高い、高フェノール含有量を有する。
【００８４】
幾つかの実施形態では、選択される画分は、高フラボノール含有量、例えば、画分の全フェノール含有量に基づき、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％より高いフラボノール含有量を有する。フラボノール含有量は、他の画分と比較して、および／または粗抽出物と比較して、比較的高くてもよい。
【００８５】
幾つかの実施形態では、選択される画分は、実施例１に記載のように、約４０％〜約６０％エタノール中に溶出する１つまたは複数の画分である。例えば、約４０％〜約６０％エタノールに溶出する１つ以上の画分を回収する前に、エタノール濃度に溶出する１つ以上の画分を除去してもよい。幾つかの実施形態では、約４５％〜約５０％エタノール中に画分を溶出させる。一実施形態では、約４５％エタノール中に画分を溶出させる。別の実施形態では、約５０％エタノール中に画分を溶出させる。
【００８６】
幾つかの実施形態では、組成物は表２ａの画分Ｆ４またはＦ５を含み、任意選択により、それを使用前に希釈、濃縮、または乾燥してもよい。幾つかの実施形態では、Ｆ４とＦ５を組み合わせて、約４５％〜約５０％エタノールに溶出するフラボノールに富む単一の画分を形成する。
【００８７】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、フラボノールを約６０．０％〜約９５．０％、約７０．０％〜約９０．０％、約７０．０％〜約８０．０％、約８０．０％〜約９０．０％含む。幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、フラボノールを約６０．０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５．０％より多く含む。これは粗抽出物（粗抽出物はフラボノール濃度が約５０％に過ぎないことが分かった）よりも高い。幾つかの実施形態では、フラボノールは、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００８８】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシドを約１０．０％〜約６０．０％、約１５．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約３５．０％、約２０．０％〜約３０．０％、約２０．０％〜約２５．０％含む。
【００８９】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドを約１０．０％〜約６０．０％、約１５．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約４０．０％、約２０．０％〜約３５．０％、約２０．０％〜約３０．０％、約２０．０％〜約２５．０％、約３０．０％〜約３５．０％含む。
【００９０】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシドを約１．０％〜約２０．０％、約５．０％〜約１５．０％、約７．０％〜約１３．０％、約５．０％〜約１０．０％、約１０．０％〜約１５．０％含む。
【００９１】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、Ｑ−３−Ｏ−グルコシドを約１．０％〜約２０．０％、約５．０％〜約１５．０％、約７．０％〜約１３．０％、約１０．０％〜約１５．０％、約１０．０％〜約１５．０％含む。
【００９２】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約０．５％〜約１０．０％、約０．５％〜約５．０％、約０．５％〜約２．５、約０．５％〜約２．０％、約１．０％〜約２．０％、約２．０％〜約６．０％、約３．５％〜約５．５％、約４．０％〜約５．０％含む。
【００９３】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、ジヒドロカルコンを約０．５％〜約１０．０％、約１．０％〜約１０．０％、約２．０％〜約１０．０％、約１．５％〜約４．５％、約３．５％〜約７．５％、約３．０％〜約６．０％、約３％、約５％含む。幾つかの実施形態では、ジヒドロカルコンは、フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、フロリジンは、組成物中のジヒドロカルコンの大部分を占め、例えば、フロリジンは９９％より多い（３００：１、５００：１、７００：１）。
【００９４】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、フロリジンを約０．５％〜約１０．０％、約１．０％〜約１０．０％、約２．０％〜約１０．０％、約１．５％〜約４．５％、約３．５％〜約７．５％、約３．０％〜約６．０％、約３％、約５％含む。
【００９５】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、フェノール酸を約１．０％〜約２０．０％、約２．０％〜約１５．０％、約２．５％〜約６．５％、約８％〜約１２．０％含む。幾つかの実施形態では、フェノール酸は、クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、クロロゲン酸は、組成物中のフェノール酸の大部分、例えば、８５％より多く、９０％より多く、９５％より多くを占める。
【００９６】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、クロロゲン酸を約１．０％〜約２０．０％、約２．０％〜約１５．０％、約２．５％〜約６．５％、約８％〜約１２．０％、約４％または約１０％含む。
【００９７】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、フラバン−３−オールを約１．０％〜約２０．０％、約１．０％〜約１５．０％、約２．５％〜約６．５％、約８．０％〜約１２．０％含む。幾つかの実施形態では、フラバン−３−オールは、エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００９８】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、エピカテキンを約１．０％〜約２０．０％、約１．０％〜約１５．０％、約２．５％〜約１０．０％、約２．５％〜約６．５％、約８．０％〜約１０．０％含む。
【００９９】
幾つかの実施形態では、画分は、次のフェノール特性、すなわち、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノール約６０．０％〜約９５．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシド約０．５％〜約１０．０％；フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコン約１．０％〜約１０．０％；クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸約１．０％〜約２０．０％；ならびに、エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オール約１．０％〜約２０．０％を有し、パーセンテージは画分のフェノール含有量の全重量に基づき、合計は１００％を超えない。
【０１００】
一実施形態では、画分は、次のフェノール特性、すなわち、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノール約７０．０％〜約９０．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシド約０．５％〜約５．０％；フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコン約２．０％〜約１０．０％；クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸約２．０％〜約１５．０％；エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オール約１．０％〜約１５．０％を有する。
【０１０１】
一実施形態では、画分は、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノールを約８０．０％〜約９０．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約０．５％〜約２．５％；フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコンを約３．５％〜約７．５％；クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸を約２．５％〜約６．５％；エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オールを約２．５％〜約６．５％含む。これは、例えば、表２ａの画分Ｆ５を包含する。
【０１０２】
一実施形態では、画分は、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノールを約７０．０％〜約８０．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約２．０％〜約６．０％；フロリジン、フロリチンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるジヒドロカルコンを約１．５％〜約４．５％；クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸、イソフェルラ酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフェノール酸を約８．０％〜約１２．０％；ならびに、エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラバン−３−オールを約８．０％〜約１２．０％含む。これは、例えば、表２ａ中の画分Ｆ４を包含する。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシドを約１０．０％〜約６０．０％、約１５．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約３５．０％、約２０．０％〜約３０．０％、約２０．０％〜約２５．０％；Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドを約１０．０％〜約６０．０％、約１５．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約５０．０％、約２０．０％〜約４０．０％、約２０．０％〜約３５．０％、約２０．０％〜約３０．０％、約２０．０％〜約２５．０％、約３０．０％〜約３５．０％；Ｑ−３−Ｏ−ルチノシドを約１．０％〜約２０．０％、約５．０％〜約１５．０％、約７．０％〜約１３．０％、約５．０％〜約１０．０％、約１０．０％〜約１５．０％；Ｑ−３−Ｏ−グルコシドを約１．０％〜約２０．０％、約５．０％〜約１５．０％、約７．０％〜約１３．０％、約１０．０％〜約１５．０％、約１０．０％〜約１５．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約０．５％〜約１０．０％、約０．５％〜約５．０％、約０．５％〜約２．５、約０．５％〜約２．０％、約１．０％〜約２．０％、約２．０％〜約６．０％、約３．５％〜約５．５％、約４．０％〜約５．０％；フロリジンを約０．５％〜約１０．０％、約１．０％〜約１０．０％、約２．０％〜約１０．０％、約１．０％〜約５．０％、約１．５％〜約４．５％、約３．５％〜約７．５％、約３．０％〜約６．０％、約３％、約５％；クロロゲン酸を約１．０％〜約２０．０％、約２．０％〜約１５．０％、約５．０％〜約１５．０％、約２．５％〜約６．５％、約８％〜約１２．０％、約４％または約１０％；および、エピカテキンを約１．０％〜約２０．０％、約１．０％〜約１５．０％、約５．０％〜約１５．０％、約２．５％〜約１０．０％、約２．５％〜約６．５％、約５．０％〜約１０．０％、約８．０％〜約１０．０％含む。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシドを約２０．０％〜約３０．０％；Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドを約２０．０％〜約３０．０％；Ｑ−３−Ｏ−ルチノシドを約１０．０％〜約１５．０％；Ｑ−３−Ｏ−グルコシドを約１０．０％〜約１５．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約２．０％〜約６．０％；フロリジンを約１．０％〜約５．０％；クロロゲン酸を約８％〜約１２．０％；および、エピカテキンを約５．０％〜約１０．０％含む。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、抽出物またはその画分は、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシドを約２０．０％〜約３５．０％；Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドを約２０．０％〜約３５．０％；Ｑ−３−Ｏ−ルチノシドを約５．０％〜約１５．０％；Ｑ−３−Ｏ−グルコシドを約５．０％〜約１５．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約０．５％〜約２．５；フロリジンを約１．０％〜約５．０％；クロロゲン酸を約５．０％〜約１５．０％；および、エピカテキンを約５．０％〜約１０．０％含む。
【０１０６】
抽出物またはその画分中のフェノール化合物のパーセンテージは、抽出物またはその画分中の定量化されたフェノールモノマー化合物の全重量に基づき、１００％を超えない。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、フェノール含有量は、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、およびＱ−３−Ｏ−ラムノシドからなる群から選択されるフラボノールを約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌ；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約１〜約１０００ｍｇ／Ｌ；フロリジンおよびフロリチンからなる群から選択されるジヒドロカルコンを約１００〜約１０００ｍｇ／Ｌ；クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびイソフェルラ酸からなる群から選択されるフェノール酸を約１００〜約２０００ｍｇ／Ｌ；ならびに、エピガロカテキン、カテキンおよびエピカテキンからなる群から選択されるフラバン−３−オールを約１００〜約２０００ｍｇ／Ｌ含む。これには、例えば、実施例１に開示される方法に従って製造される様々な組成物が含まれる。量は、実施例１に記載のように、元の溶出量８００ｍＬに基づく。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、フェノール含有量は、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、およびＱ−３−Ｏ−ラムノシドからなる群から選択されるフラボノールを約８０００〜約１３０００ｍｇ／Ｌ；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約８０〜約７００ｍｇ／Ｌ；フロリジンおよびフロリチンからなる群から選択されるジヒドロカルコンを約３００〜約９００ｍｇ／Ｌ；クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびイソフェルラ酸からなる群から選択されるフェノール酸を約４００〜約１６００ｍｇ／Ｌ；ならびに、エピガロカテキン、カテキンおよびエピカテキンからなる群から選択されるフラバン−３−オールを約５００〜約１５００ｍｇ／Ｌ含む。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、フェノール含有量は、ケルセチン、Ｑ−３−Ｏ−パルトシド、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、およびＱ−３−Ｏ−ラムノシドからなる群から選択されるフラボノールを約１００００〜約１２０００ｍｇ／Ｌ；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約１００〜約２００ｍｇ／Ｌ；フロリジンおよびフロリチンからなる群から選択されるジヒドロカルコンを約７００〜約８００ｍｇ／Ｌ；クロロゲン酸、コーヒー酸、フェルラ酸およびイソフェルラ酸からなる群から選択されるフェノール酸を約５００〜約６００ｍｇ／Ｌ；ならびに、エピガロカテキン、カテキンおよびエピカテキンからなる群から選択されるフラバン−３−オールを約６００〜約７００ｍｇ／Ｌ含む。
【０１１０】
質量分析から、例示的な画分Ｆ４およびＦ５の主なフラボノイド成分は、ケルセチン−３−Ｏ−グルコシド、ケルセチン−３−Ｏ−ガラクトシド、ケルセチン−３−Ｏ−ラムノシド、ケルセチン−３−Ｏ−ルチノシド、エピカテキン、クロロゲン酸およびフロリジンであることが分かる。
【０１１１】
幾つかの実施形態では、フェノール含有量は、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノールを約８０．０％〜約９０．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約１．０％〜約２．０％；フロリジンを約４．５％〜約６．５％；クロロゲン酸を約２．５％〜約４．５％；および、エピカテキンを約２．５％〜約５．５％含む。幾つかの実施形態では、これには、例えば、表２ａの画分Ｆ５が含まれる。
【０１１２】
一実施形態では、画分は、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシド、Ｑ−３−Ｏ−ガラクトシド、Ｑ−３−Ｏ−グルコシド、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるフラボノールを約７０．０％〜約８０．０％；シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドを約４．０％〜約６．０％；フロリジンを約２．０％〜約４．０％；クロロゲン酸を約８．０％〜約１２．０％；および、エピカテキンを約６．０％〜約１０．０％含む。幾つかの実施形態では、これには、例えば、表２ａの画分Ｆ４が含まれる。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、組成物は、１種類以上の医薬品添加物、好ましくは生理学的に許容されるまたは薬学的に許容される医薬品添加物をさらに含む。適した医薬品添加物は当業者に公知であり、製造される剤形（ｄｏｓａｇｅ  ｆｒｏｍ）に依存することになる（例えば、天然健康製品か医薬品か）。組成物中に、食品原料成分および他の医薬などの他の有効成分が含まれてもよいことが分かるであろう。
【０１１４】
抽出物またはその画分は、所望の治療効果、予防効果、または健康促進効果を達成することになる任意の適した量で、組成物または剤形中に存在してもよい。例えば、抽出物またはその画分は、組成物の約０．１ｗｔ％〜約９９．９ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約８５ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約６０ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約５０ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約４０ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約３０ｗｔ％、約５ｗｔ％〜約６５ｗｔ％、約５ｗｔ％〜約３０ｗｔ％、約１０ｗｔ％〜約３０ｗｔ％の量で存在してもよい。
【０１１５】
別の態様では、リンゴの皮からフェノール化合物を抽出して粗抽出物を得、さらに粗抽出物を分画して、特有のフェノール特性を有する組成物を得る方法を提供する。
【０１１６】
フェノール抽出物は、次の工程、すなわち、リンゴの皮のサンプルを得る工程；フェノール化合物の分解を抑制するために皮を処理する工程；任意選択により皮を脱水し、皮を粉末状にする工程；皮を１回以上、エタノールなどの食品用溶剤で抽出する工程；任意選択により抽出中に皮を音波処理する工程；固形分を除去してフェノール抽出物を得る工程；任意選択によりフェノール抽出物を濃縮する工程；任意選択によりフェノール抽出物から糖分を除去する工程、および任意選択によりフェノール抽出物を濃縮、乾燥および／または凍結する工程；を有する水抽出法により得ることができる。このような方法により、粗抽出物を得ることができる。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、例えば、カラムクロマトグラフィー、例えば、Ｃ１８カラムを使用し、エタノール（例えば、８０〜１００％エタノール）を溶出剤として用いたクロマトグラフィーを使用して、粗フェノール抽出物を精製する。他の溶出剤を訴訟（ｓｕｅｄ）してもよい。
【０１１８】
クロマトグラフィーカラムで適した溶出剤を使用して、または他の適した方法でフェノール抽出物を分画し、それに続いて高フェノール含有量、特に高フラボノール含有量を有する画分を選択することにより、１つ以上の画分を得ることができる。従って、幾つかの実施形態では、本方法は、粗抽出物を分画して溶出画分を得る工程；および、任意選択により画分を濃縮、乾燥および／または凍結する工程をさらに含む。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、溶出剤はエタノールであり、クロマトグラフィーは、Ｃ１８カラムを用いポリマー吸着剤を使用するフラッシュクロマトグラフィーである。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、高フェノール含有量、特に高フラボノール含有量を有する画分は、約４０％〜約６０％エタノール中に溶出される。一実施形態では、画分は、約４５％〜約５０％エタノール中に溶出される。一実施形態では、画分は、例えば、表２ａの画分Ｆ４のように、約４５％エタノール中に溶出される。一実施形態では、画分は、例えば、表２ａの画分Ｆ５のように、約５０％エタノール中に溶出される。
【０１２１】
フェノール化合物の分解を抑制するために皮を処理する工程は、任意の適した方法、例えば、ブランチングまたは塩処理により実施されてもよい。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、フェノール化合物の分解を抑制するために皮を処理する工程は、果実を剥皮した直後に、例えば、剥皮して１０分以内に、皮（脱水されていても、または脱水されていなくてもよい）を塩溶液、例えば、１〜１０％塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）溶液、または１％〜５％ＣａＣｌ２、例えば、２％ＣａＣｌ２中で処理することにより実施され、それにより、皮の中に存在する抗酸化化合物を維持する。幾つかの実施形態では、皮を約４０℃〜約１００℃、５０℃〜約７０℃の温度の、特に約５５℃の塩溶液に、約５〜約６０分間、例えば、１０分間浸漬する。
【０１２３】
塩溶液に浸漬された果皮は、直接抽出されてもよく、または、貯蔵および／または輸送するために凍結乾燥されてもよい。
【０１２４】
例えば、Ｕｒｓｈｅｒ  Ｍｉｌｌを使用して、皮をスラリーに粉砕してもよい。幾つかの実施形態では、果皮を脱水する。例えば、塩浸漬されたリンゴ果皮を空気循環型のオーブンで、約５０℃〜約７０℃の温度で、特に、約６０±２℃で、少なくとも約２４時間、または約２４〜７２時間、例えば、約４８時間乾燥させてもよい。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、脱水された果皮を、例えば、コーヒーグラインダーまたは工業用の均等物などの機械的粉砕手段を使用して微粉末にする。粉末状の皮を直接使用してもよく、または後で使用するために凍結してもよい。
【０１２６】
食品用溶剤を使用して、皮を抽出する。４０％〜１００％メタノールまたはエタノール（例えば、９５％〜１００％）を含む任意の適した溶剤を使用してもよいが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態では、溶剤は９５％〜１００％エタノールである。
【０１２７】
好ましくは、抽出工程に補助として音波処理または皮を破壊する類似の機構を用いる。溶剤中にフェノール化合物を抽出する条件は、溶剤中にフェノール化合物を放出するのに十分な時間、例えば、約５分間〜２時間、または約１０分間〜約３０分間、例えば、１０分間または１５分間、音波処理することを含んでもよい。超音波処理浴等を使用してもよい。
【０１２８】
必要に応じて、抽出工程を繰り返してもよい。幾つかの実施形態では、抽出工程を２回行う。
【０１２９】
抽出後、任意の適した方法、例えば、遠心分離またはろ過により固形分を除去してもよい。
【０１３０】
粗抽出物を任意選択により、例えば、元の容量の約１％〜約５０％に、約５％〜約２０％、例えば、約１０％に濃縮してもよい。幾つかの実施形態では、粗抽出物を乾燥するまで減少させて固体濃縮物を得てもよく、それを後で適した媒体で還元し、使用または分画してもよい。
【０１３１】
フェノール化合物を含む粗抽出物を任意選択により、糖化合物を除去する条件で処理してもよい。糖類は、例えば、クロマトグラフィー、例えば、フラッシュカラムクロマトグラフィーで除去してもよい。カラムは、例えば、水で１回以上、例えば、２回または３回、水で通液洗浄し、糖類を除去してもよい。別の実施形態では、カラム中の固体担体または固定相は、Ｃ１８樹脂、または疎水性化合物を吸収する他の任意の担体（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ  １６またはＳｏｒｂｅｎｔ  ＳＰ２０７−０５）である。粗抽出物からの糖の除去は、例えば、屈折率計を使用して洗浄水のブリックス値を測定することにより監視してもよい。幾つかの実施形態では、ブリックス値が５％未満、例えば、１％未満に達するまでブリックス値を監視した後、洗浄工程を終了する。
【０１３２】
フェノール化合物を含む粗抽出物を、任意選択により脂質、カロチノイド、クロロフィルおよび／またはプロアントシアニジンを除去する条件で処理してもよい（適した方法は、例えば、Ｈｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｒｕｐｈａｓｉｎｇｈｅ，２００９に記載されている）。
【０１３３】
次いで、粗抽出物を分画し、フェノール化合物の特有の組み合わせ、または特有のフェノール特性を有する溶出画分を得てもよい。画分は、フェノール化合物以外に他の作用物質を含有してもよい。使用する方法、試薬および条件は個々の画分の構成に影響を及ぼす可能性があり、望ましい画分を得た後、ばらつきがないようにバッチ毎に調整しなければならない。
【０１３４】
例えば、ポリマー吸着剤を使用するフラッシュクロマトグラフィーを使用して、分画を行ってもよい。適したポリマー吸着剤の一例には、Ｓｏｒｂｅｎｔ  ＳＰ２０７−０５  Ｓｅｐａｂｅａｄｓ樹脂臭素化スチレン系吸着剤；粒径２５０μｍ、表面積６３０ｍ２／ｇがある。幾つかの実施形態では、カラムには、約５００〜約８００ｇ、例えば、６００ｇの吸着剤が入る。
【０１３５】
任意の適した溶剤および溶出プロトコルを使用して、フェノール化合物を溶出してもよい。幾つかの実施形態では、メタノール、エタノールまたはプロパノールなどの低級アルコールを使用してフェノール化合物を溶出させる。幾つかの実施形態では、溶出剤は、食品用低級アルコールである。幾つかの実施形態では、エタノールのステップグラジエントを使用して、フェノール化合物を溶出させる（表１を参照）。溶出画分を任意選択により乾燥、希釈または濃縮してもよい。例えば、２０℃〜６０℃、例えば、４５℃で回転蒸発することなどの蒸発法を使用して、溶出画分を濃縮してもよい。溶出画分を、元の溶出量の約５％未満、例えば、約２．５％まで蒸発させてもよい。濃縮または乾燥したサンプルを後で適した媒体（水または他の水性媒体など）に再懸濁させてもよい。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、製造方法は、リンゴの皮のサンプルを得る工程；フェノール化合物の分解を抑制するために、剥皮直後に（例えば、１０分以内に）皮をＣａＣｌ２溶液で処理する工程；皮を脱水し、乾燥した皮を粉末に粉砕する工程；粉末を少なくとも２回エタノールで抽出し、各抽出工程中に懸濁液を音波処理する工程；遠心分離または同等の方法で固形分を除去し、粗フェノール抽出物を得る工程；粗抽出物を元の容量の約１０％まで濃縮する工程；ブリックス値が約１％未満になるまで、濃縮した粗抽出物から糖類を除去する工程；粗抽出物を、Ｃ−１８クロマトグラフィーカラムでエタノールを用いて下記のスケジュールに従いステップグラジエントで分画し、溶出画分を得る工程、すなわち、
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溶出画分Ｆ４および／またはＦ５を選択する工程；および、任意選択により選択される画分を使用前に濃縮または乾燥させる工程を含む。幾つかの実施形態では、高フェノール含有量を有する画分を選択する。幾つかの実施形態では、高フラボノール含有量、特に、高ケルセチン配糖体を有する画分を選択する。
【０１３７】
幾つかの実施形態では、Ｆ４を選択する。
【０１３８】
幾つかの実施形態では、Ｆ５を選択する。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、処理工程は、皮を５５℃のＣａＣｌ２水溶液（ｗ／ｖ）に約１０分間曝すことを含む。ＣａＣｌ２溶液は、例えば、約１％〜約１０％、約１％〜約５％、または約２％ＣａＣｌ２であってもよい。
【０１４０】
幾つかの実施形態では、粉末に粉砕する前に、皮を約６０℃±２℃で約４８時間、または乾燥するまで乾燥させる。
【０１４１】
幾つかの実施形態では、抽出工程は、粉末２００ｇ対エタノール１Ｌの比で１５分間２回、１０分の間隔を空けて粉末を音波処理することより実施し、その結果、粉末２００ｇ対エタノール２Ｌの比を有する粗抽出物を得る。
【０１４２】
幾つかの実施形態では、回転蒸発装置を使用して、元の容量が約１０％に減少するまで粗抽出物を濃縮する。
【０１４３】
幾つかの実施形態では、ポリマー吸着剤を使用するフラッシュクロマトグラフィーを使用して分画を行う。
【０１４４】
幾つかの実施形態では、カラムから流出する水のブリックス値を監視しながら、カラムを吸着床の２〜３倍の容量の水で洗浄することにより糖類を除去する。
【０１４５】
幾つかの実施形態では、ステップグラジエントによる分画は、各画分に対してエタノール溶液８００ｍｌで行う。
【０１４６】
幾つかの実施形態では、選択された画分を元の溶出量の約２．５％まで濃縮する。
【０１４７】
幾つかの実施形態では、組成物は、任意選択により希釈、乾燥、または濃縮されてもよい溶出画分Ｆ５を含む。
【０１４８】
幾つかの実施形態では、組成物は溶出画分Ｆ４を含み、これは任意選択により希釈、乾燥、または濃縮されてもよい。
【０１４９】
別の態様では、本明細書に記載のフェノール組成物を含む、酸化ストレスを低減または予防する栄養補助食品または天然健康製品を提供する。幾つかの実施形態では、栄養補助食品または天然健康製品は、濃縮物、液剤、散剤、乳剤、懸濁剤、フィルム剤、ペースト剤、ゲル剤、ガム剤、ドロップ剤、錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、または食品添加物の形態である。
【０１５０】
また、本明細書に記載の画分を含む、酸化ストレスによる損傷を予防または低減する栄養補助食品または天然健康製品も提供する。
【０１５１】
別の態様では、本明細書に記載のフェノール組成物を含む機能性食品または飲料を提供する。様々な機能性食品および飲料形態が当業界で公知である。
【０１５２】
別の態様では、酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状を予防または治療する方法を提供し、本方法は、リンゴの皮由来のフェノール抽出物またはその画分を含む本明細書に記載の組成物を有効量、対象に投与することを含む。
【０１５３】
本明細書に記載の組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酸素・グルコース欠乏処理によるニューロン死を低減し、酸化ストレスおよび炎症により生じる疾患および症状の動物モデルのｉｎ  ｖｉｖｏでの脳損傷および身体障害（神経炎症、興奮毒性、アポトーシス、壊死および／または自己免疫、例えば、卒中および多発性硬化症を含む）を低減することが分かった。従って、本明細書に開示される組成物は、酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状（神経炎症、興奮毒性、アポトーシス、壊死および／または自己免疫を含む）の予防または治療に有用であると考えられる。本明細書に開示される組成物は、また、酸化ストレス、神経炎症、興奮毒性、アポトーシス、壊死および／または自己免疫による神経細胞死の予防または治療に有用であると考えられる。
【０１５４】
理論に拘束されることを望むものではないが、実施例から少なくとも次のことが分かる。皮質ニューロンでの酸素・グルコース欠乏処理（ＯＧＤ）実験に関して、グルタミン酸拮抗薬は保護効果があることが分かっている。従って、Ｆ４は、興奮毒性および酸化ストレスを予防することにより、おそらくは、カルシウム過負荷（ｏｖｅｒｌｏａｄ）を安定化することによってこのような神経細胞死の原因に対する耐性を増加することによりＯＧＤの有害な作用を低減した可能性がある。ＥＡＥ（ＭＳの動物モデル）に関して、自己免疫機構により生じる神経炎症が麻痺の主因であり、従って、Ｆ４はこの種の損傷を防止する可能性がある。低酸素虚血（ＨＩ）により誘発される脳損傷では、神経炎症、興奮毒性、ならびに酸化ストレスが全て関与している。本明細書に開示される組成物は、また、ホスホジエステラーゼＩＶおよび炎症性サイトカイン産生を抑制することも分かった。従って、本明細書に開示される組成物はまた、神経炎症および酸化ストレスを低減すること、ならびにホスホジエステラーゼＩＶを阻害し、記憶の固定に必要なｃＡＭＰ濃度を増加することにより認知を改善することもできる。
【０１５５】
幾つかの実施形態では、酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患または症状としては、老化現象、慢性疲労症候群、神経変性障害、自己免疫障害、代謝障害および血管障害が挙げられるが、これらに限定されるものではない。神経変性障害としては、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、網膜変性、難聴、脆弱Ｘ症候群、外傷性脳損傷、脊髄損傷、頭部損傷および脱髄疾患が挙げられる。脱髄疾患としては、例えば、多発性硬化症、デヴィック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、白質ジストロフィー、シャルコー・マリー・トゥース病、およびギラン・バレー症候群が挙げられる。自己免疫障害としては、例えば、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、狼瘡、大腸炎およびクローン病が挙げられる。血管障害としては、例えば、卒中、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞および血管性痴呆が挙げられる。卒中、ＭＳ、および血管性痴呆などにおいて、フラボノイド類の有益な効果は、少なくとも一部、脳血管系および微小血管系の保護により得られる。代謝障害としては、例えば、肥満、ＩＩ型糖尿病、および脂質異常症（高コレステロール血症など）が挙げられる。本明細書に記載の組成物はまた、特定の酸化ストレスにより生じる希少疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性進行性ＭＳ、シャルコー・マリー・トゥース病、および脊髄性筋萎縮症などの治療または予防に有用な可能性もある。酸化ストレスおよび／または炎症に関連する疾患および症状は、前述の２つ以上のカテゴリーに入る可能性があることが分かるであろう。
【０１５６】
一実施形態では、疾患または症状は、卒中などの血管疾患である。
【０１５７】
幾つかの実施形態では、疾患または症状は、多発性硬化症、パーキンソン病、またはアルツハイマー病などの神経変性疾患である。
【０１５８】
組成物は、任意の適した剤形で投与されてもよい。剤形は、有効量の抽出物またはその派閥を送達する量で投与されてもよい。有効量は、治療有効量、予防有効量、または良好な健康状態を全身的に促進する量であってもよい。
【０１５９】
投与要件は、使用される特定の製剤および剤形、投与経路、現れる症候の重症度および治療される特定の対象によって変わる。治療は、一般に、化合物の最適用量より少ない低投与量で開始されることになる。その後、その状況で最適な効果が達せられるまで投与量を増加させる。投与する医師が、治療される個々の対象に関する経験に基づき、正確な治療投与量を決定してもよい。一般に活性物質は、最も望ましくは、一般に有害なまたは為害性のある副作用を引き起こすことなく、有効な結果をもたらす濃度で投与され、一単位の用量として投与されてもよく、または必要に応じて投与量は１日を通して適切な時間に都合のよい部分単位に分割されてもよい。
【０１６０】
さらに、任意選択により、最適投与量範囲の特定を助けるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用してもよい。例えば、有益な血中組成物濃度範囲が達せられるように、動物モデルで用量を定めてもよい。また、初期用量は、当該技術分野で公知の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏデータ、例えば、動物モデルから推定されてもよい。このような情報を使用して、ヒトに有用な用量をより正確に決定することができる。当業者は、動物データに基づいて、ヒトへの投与を最適化してもよい。
【０１６１】
投与されるフェノール化合物の量は、他の要因の中でもとりわけ、対象、対象の体重、対象の健康状態、治療される疾患、病気の重症度、投与経路、活性物質の効力、および処方する医師の判断に依存する可能性がある。
【０１６２】
本明細書に開示される特定の疾患、障害、または症状の治療に有効となる活性物質の量は、疾患、障害、または症状の性質に依存し、当該技術分野で公知の標準的臨床技術で決定することができる。
【０１６３】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、複数の用量で投与されてもよい。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、複数日、例えば、２日、３日、４日、５日、７日、１０日、１５日、２０日、３０日、または４０日以上にわたって投与されてもよい。本明細書に記載の実施例から、組成物の保護効果は複数の用量では（例えば、抗うつ剤と同様に）増加する可能性があり、従って、場合によっては持続的なまたは慢性的な投与が好ましいことが示唆される。理論に拘束されるものではないが、複数の用量では、より良好な結果が認められることから、下流遅延効果（ｄｅｌａｙｅｄ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｅｆｆｅｃｔｓ）、例えば、遺伝子転写に対する効果がある可能性がある。
【０１６４】
場合によっては、本明細書に記載の疾患または症状の１つ以上に罹りやすい対象、例えば、老齢化母集団または特定の疾患もしくは症状（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病もしくはＭＳ）に対する遺伝的素因を有する母集団、または本明細書に記載の疾患または症状（例えば、卒中）の１つ以上に関連する症候もしくは事象を以前起こした対象では、持続的投与が勧告される。
【０１６５】
幾つかの実施形態では、本方法は、本明細書に開示される組成物を対象に毎日投与することを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、本明細書に開示される組成物を対象に１日２回投与することを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、本明細書に開示される組成物を対象に１日３回投与することを含む。
【０１６６】
投与される用量は、中毒量未満である。本明細書に記載の組成物の毒性は、細胞培養または実験動物での標準的な薬学的方法により、例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％に致死的な用量）またはＬＤ１００（母集団の１００％に致死的な用量）を求めることにより判定することができる。毒性作用対治療効果の用量比は治療係数である。特定の実施形態では、医薬組成物は高い治療係数を示す場合がある。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトに使用するのに毒性のない投与量範囲を定めるのに使用してもよい。
【０１６７】
試験から、ケルセチンを３０００ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量で２８日間投与した場合、マウスで高い忍容性が認められることが分かった（Ｒｕｔｚ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ヒトでは、ケルセチンを１日１ｇ、１ヶ月間投与しても安全である（Ｇｕｇｌｅｒ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）。従って、本明細書に開示される組成物を高用量投与しても同様に忍容性が認められる可能性がある。
【０１６８】
治療中、用量および投与計画は、疾患または症状を予防または治療する十分なまたは定常状態の全身濃度の治療有効量のフラボノイド類を提供することができる。特定の実施形態では、投与する用量を漸増してもよい。
【０１６９】
目的のまたは所望の効果を得るのに必要な長さだけ間隔を空けて、組成物を投与してもよい。
【０１７０】
本明細書に記載のフェノール組成物を、自分で自分の健康促進効果のために使用してもよく、または他の医薬と併用してもよい。場合によっては、必要な医薬の量を低減することが可能な場合もあり、それにより治療の費用または副作用が減少する可能性がある。
【０１７１】
別の態様では、本明細書に記載のフェノール組成物を、担体または希釈剤などの薬学的に許容される医薬品添加物と共に含む医薬組成物を提供する。通常、医薬用途では、組成物は、疾患または症状を治療または予防するために投与される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、前述のような酸化ストレスまたは炎症に関連する疾患または症状の治療および／または予防に使用される。医薬組成物は少なくとも１種類の医薬品添加物、好ましくは製薬用医薬品添加物を含み、任意の適した剤形に製剤化されてもよい。
【０１７２】
医薬組成物は、任意選択により薬物などの追加の有効成分を含んでもよい。
【０１７３】
幾つかの実施形態では、医薬組成物は、経腸投与、局所投与、非経口投与、または経鼻投与用に製剤化される。経腸投与は、例えば、経口投与を含んでもよい。
【０１７４】
非経口投与は、例えば、静脈内投与、動脈内投与、脳内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、心臓内投与、または骨内投与を含んでもよい。幾つかの実施形態では、非経口投与は静脈内投与である。
【０１７５】
別の態様では、酸化ストレスまたは炎症に関連する疾患または症状を治療および／または予防するための医薬の製造における本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
【０１７６】
別の態様では、酸化ストレスまたは炎症に関連する疾患または症状を治療および／または予防するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
【０１７７】
幾つかの実施形態では、酸化ストレスまたは炎症に関連する疾患または症状。
【０１７８】
別の態様では、本明細書に記載のフェノール組成物は食品添加物（または食品原料成分）として使用され、様々な多様な食品に添加され、その食品にリンゴの皮由来のフェノール化合物をかなりの量、提供してもよい。フェノール組成物はその健康促進効果のために添加することができるが、幾つかの実施形態では、フェノール組成物は食品中の酸化性化合物（多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）および／または脂質など）の酸化を抑制または防止することもできる。食品は、例えば、固体、半固体（例えば、プディング、ヨーグルト）、または液体（例えば、飲料）の食品であってもよい。食品は、例えば、ヒトが摂取するためのものであっても、または動物が摂取するためのものであってもよい。
【０１７９】
別の態様では、本明細書に記載のフェノール組成物を含む化粧品を提供する。フェノール組成物は、その有益な抗酸化特性のために添加することができ、化粧料組成物中の酸化性化合物（多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）および／または脂質など）の酸化を抑制または防止することもできる。化粧品は、例えば、クリーム、ゲル、ペースト、ローション、乳液、軟膏、またはマイクロカプセル化製品であってもよい。
【０１８０】
別の実施形態では、本明細書に開示される画分を含む機能性食品または飲料を提供する。
【０１８１】
他の態様では、本明細書に記載の組成物を使用説明書と共に含む市販のパッケージを提供する。
【０１８２】
任意の適したリンゴ栽培品種を本開示に従って使用してもよい。
【０１８３】
幾つかの実施形態では、リンゴは、生食用および生食・加工両用のリンゴ、例えば、アダムス・ペアペアメイン（Ａｄａｍｓ  Ｐｅａｒｍａｉｎ）、アルクメネ（Ａｌｋｍｅｎｅ）、アンブロシア（Ａｍｂｒｏｓｉａ）、アントノフカ（Ａｎｔｏｎｏｖｋａ）、アルレット（Ａｒｌｅｔ）、アリアン（Ａｒｉａｎｅ）、アーカンソー・ブラック（Ａｒｋａｎｓａｓ  Ｂｌａｃｋ）、アシュミーズ・カーネル（Ａｓｈｍｅａｄ’ｓ  Ｋｅｒｎｅｌ）、オーロラ・ゴールデン・ガラ（Ａｕｒｏｒａ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｌａ）、ボールドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ）、ベン・デイビス（Ｂｅｎ  Ｄａｖｉｓ）、ブレニム（Ｂｌｅｎｈｅｉｍ  Ｏｒａｎｇｅ）、ビューティ・オブ・バス（Ｂｅａｕｔｙ  ｏｆ  Ｂａｔｈ）、ベル・ドゥ・ボスコップ（Ｂｅｌｌｅ  ｄｅ  Ｂｏｓｋｏｏｐ）、ボヘミア（Ｂｏｈｅｍｉａ）、ブレイバーン（Ｂｒａｅｂｕｒｎ）、ブリーナ（Ｂｒｉｎａ）、カメオ（Ｃａｍｅｏ）、クライビア（Ｃｌｉｖｉａ）、コーニッシュ・ジリフラワー（Ｃｏｒｎｉｓｈ  Ｇｉｌｌｉｆｌｏｗｅｒ）、コートランド（Ｃｏｒｔｌａｎｄ）、コックス・オレンジ・ピピン（Ｃｏｘ’ｓ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｐｉｐｐｉｎ）、クリップス・ピンク（Ｃｒｉｐｐｓ  Ｐｉｎｋ）（ピンク・レディー（Ｐｉｎｋ  Ｌａｄｙ））、デルバレスティヴェール（登録商標）デルコルフ（Ｄｅｌｂａｒｅｓｔｉｖａｌｅ（登録商標）ｄｅｌｃｏｒｆ）、デルバーディヴァイン（登録商標）デルフローガ（Ｄｅｌｂａｒｄｉｖｉｎｅ（登録商標）ｄｅｌｆｌｏｇａ）、ディスカバリー（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）、エコレット（Ｅｃｏｌｅｔｔｅ）、エグレモント・ラセット（Ｅｇｒｅｍｏｎｔ  Ｒｕｓｓｅｔ）、エルスター（Ｅｌｓｔａｒ）、エンパイア（Ｅｍｐｉｒｅ）、エソプス・スピッツェンバーグ（Ｅｓｏｐｕｓ  Ｓｐｉｔｚｅｎｂｕｒｇ）、ふじ（Ｆｕｊｉ）、ガラ（Ｇａｌａ）、ジンジャー・ゴールド（Ｇｉｎｇｅｒ  Ｇｏｌｄ）、ゴールデン・オレンジ（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｏｒａｎｇｅ）、ゴールデン・デリシャス（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｄｅｌｉｃｉｏｕｓ）、グラニー・スミス（Ｇｒａｎｎｙ  Ｓｍｉｔｈ）、生娘（Ｇｒａｖｅｎｓｔｅｉｎ）、玉霰（Ｇｒｉｍｅｓ  Ｇｏｌｄｅｎ）、ハーラルソン（Ｈａｒａｌｓｏｎ）、ハニークリスプ（Ｈｏｎｅｙｃｒｉｓｐ）、アイダレッド（Ｉｄａｒｅｄ）、ジェームス・グリーブ（Ｊａｍｅｓ  Ｇｒｉｅｖｅ）、ジャズ（Ｊａｚｚ）、ジャージー・ブラック（Ｊｅｒｓｅｙ  Ｂｌａｃｋ）、ジョナゴールド（Ｊｏｎａｇｏｌｄ）、ジョナサン（Ｊｏｎａｔｈａｎ）、ジュナルスカ（Ｊｕｎａｌｕｓｋａ）、カルミン・ドゥ・ソンナビル（Ｋａｒｍｉｊｎ  ｄｅ  Ｓｏｎｎａｖｉｌｌｅ）、ノブド・ラセット（Ｋｎｏｂｂｅｄ  Ｒｕｓｓｅｔ）、リバティ（Ｌｉｂｅｒｔｙ）、マクーン（Ｍａｃｏｕｎ）、旭（ＭｃＩｎｔｏｓｈ）、陸奥（Ｍｕｔｓｕ）、ニュータウン・ピピン（Ｎｅｗｔｏｗｎ  Ｐｉｐｐｉｎ）、ニッカジャック（Ｎｉｃｋａｊａｃｋ）、ニコラ（Ｎｉｃｏｌａ）、ノバスパイ（Ｎｏｖａｓｐｙ）、ノバマック（Ｎｏｖａｍａｃ）、ポーラ・レッド（Ｐａｕｌａ  Ｒｅｄ）、ピンク・パール（Ｐｉｎｋ  Ｐｅａｒｌ）、パイノバ（Ｐｉｎｏｖａ）、ラジカ（Ｒａｊｋａ）、ロールス・ジェネット（Ｒａｌ���ｓ  Ｇｅｎｅｔ）、ランボー（Ｒａｍｂｏ）、レッド・デリシャス（Ｒｅｄ  Ｄｅｌｉｃｉｏｕｓ）、ロード・アイランド・グリーニング（Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｉｎｇ）、リブストン・ピピン（Ｒｉｂｓｔｏｎ  Ｐｉｐｐｉｎ）、ローム（Ｒｏｍｅ）、ロイヤル・ガラ（Ｒｏｙａｌ  Ｇａｌａ）、ロックスバリー・ラセット（Ｒｏｘｂｕｒｙ  Ｒｕｓｓｅｔ）、ルーベンス（Ｒｕｂｅｎｓ）（シブニ（Ｃｉｖｎｉ））、サンタナ（Ｓａｎｔａｎａ）、サターン（Ｓａｔｕｒｎ）、世界一（Ｓｅｋａｉ  Ｉｃｈｉ）、スパータン（Ｓｐａｒｔａｎ）、ステイマン（Ｓｔａｙｍａｎ）、スターマー・ピピン（Ｓｔｕｒｍｅｒ  Ｐｉｐｐｉｎ）、サマーフリー（Ｓｕｍｍｅｒｆｒｅｅ）、タリアフェロ（Ｔａｌｉａｆｅｒｒｏ）、トパーズ（Ｔｏｐａｚ）、ウスター・ペアマン（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ  Ｐｅａｒｍａｉｎ）、ヨーク・インペリアル（Ｙｏｒｋ  Ｉｍｐｅｒｉａｌ）またはゼスター（Ｚｅｓｔａｒ）である。
【０１８４】
幾つかの実施形態では、リンゴは、例えば、ブラムリー（Ｂｒａｍｌｅｙ）、カルビル・ブランク・ディベール（Ｃａｌｖｉｌｌｅ  Ｂｌａｎｃ  ｄ’ｈｉｖｅｒ）、チェルムズフォード・ワンダー（Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ  Ｗｏｎｄｅｒ）、フラワー・オブ・ケント（Ｆｌｏｗｅｒ  ｏｆ  Ｋｅｎｔ）、ゴールデン・ノーブル（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｎｏｂｌｅ）、ノーフォーク・ビフィン（Ｎｏｒｆｏｌｋ  Ｂｉｆｆｉｎ）または君が袖（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｓｐｙ）から選択される調理用リンゴである。
【０１８５】
幾つかの実施形態では、リンゴは、例えば、ブラウン・スナウト（Ｂｒｏｗｎ  Ｓｎｏｕｔ）、ダビネット（Ｄａｂｉｎｅｔｔ）、フォックスウェルプ（Ｆｏｘｗｈｅｌｐ）、ハリソン・サイダー・アップル（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｃｉｄｅｒ  Ａｐｐｌｅ）、キングストン・ブラック（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  Ｂｌａｃｋ）、レッドストリーク（Ｒｅｄｓｔｒｅａｋ）またはスタイア（Ｓｔｙｒｅ）から選択されるサイダー用リンゴである。
【０１８６】
幾つかの実施形態では、リンゴはクラブアップル（ｃｒａｂａｐｐｌｅ）である。
【０１８７】
幾つかの実施形態では、リンゴは君が袖（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｓｐｙ）である。
【０１８８】
本開示を説明し、読者の本開示の理解を助けるために、以下の非限定的な実施例を記載する。
【実施例】
【０１８９】
実施例１．リンゴの皮抽出物のフラボノイドに富む画分の調製
リンゴ栽培品種、君が袖（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｓｐｙ）のリンゴの皮を、パイ製造業者、Ａｐｐｌｅ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｆｏｏｄｓ  Ｉｎｃ．，Ｋｅｎｔｖｉｌｌｅ，ＮＳ，Ｃａｎａｄａから収集した。フェノール化合物の分解を防止するために、剥皮直後に皮を５５℃±５℃の２％ＣａＣｌ２水溶液（ｗ／ｖ）で１０分間処理した。余分な水分を切った後、ＣａＣｌ２処理して３時間以内に、リンゴの皮をプラスチック容器に入れてＮｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ（ＮＳＡＣ）に輸送した。リンゴの皮を清浄なプラスチックトレーに入れて、空気循環型の対流式オーブン（Ｍｉｌｎｅｒ  Ａｇｉｎｃｏｕｒｔ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用して６０±２℃で４８時間乾燥させた。乾燥した皮を、１ｍｍの篩分スクリーンを有するＷｉｌｌｅｙミル（Ｍｏｄｅｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈｅａｖｙ  Ｄｕｔｙ，Ａｒｔｈｕｒ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を使用して微粉末に粉砕し、後で使用するために冷凍庫（−８０℃）で保存した。リンゴの皮の粉末１００グラムを秤量して２Ｌのフラスコに入れ、無水エタノール１Ｌを使用して１５分間２回、１０分の間隔を空けて音波処理した。次いで、懸濁液を５０ｍＬのコーニングチューブに移し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上記抽出の２回分の上清（エタノール２Ｌ中、リンゴの皮合計２００ｇ）を回収し、４５℃の回転蒸発装置（Ｒｏｔａｖａｐ（登録商標）Ｒ−２００，Ｂｕｃｈｉ，Ｆｌａｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して蒸発させ、２００ｍＬの濃縮物を製造した。
【０１９０】
上記の濃縮されたリンゴの皮抽出物を分画するために、ポリマー吸着剤（Ｓｏｒｂｅｎｔ  ＳＰ２０７−０５  Ｓｅｐａｂｅａｄｓ樹脂臭素化スチレン系吸着剤；粒径２５０μｍ、表面積６３０ｍ２／ｇ）を使用するフラッシュクロマトグラフィーを使用した。６００ｇの吸着剤が入ったクロマトグラフィーカラム（３．８×４５ｃｍ、Ｓａｔｉ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｄｏｒｖａｌ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）を脱イオン水で調整し、リンゴの皮抽出物をカラムの上部に添加した。カラムに吸着床の容量の２〜３倍の水を通液することにより、カラムを水で直ぐに洗浄した。屈折率計を使用して洗浄水のブリックス値を測定することにより、粗抽出物からの糖の除去を監視した。ブリックス値が１％未満になると、洗浄工程を終了した。エタノールのステップグラジエント（表１、各溶出につき８００ｍＬ）を使用して、カラム内に吸着保持されたフェノール化合物を溶出させ、４５℃のロータリーエバポレータ（Ｒｏｔａｖａｐ（登録商標）Ｒ−２００，Ｂｕｃｈｉ，Ｆｌａｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、溶出液を２０ｍＬに濃縮した。
2013526487.tif 000004
【０１９１】
Ｃ−１８画分中のフェノール化合物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析。
【０１９２】
Ｒｕｐａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）により報告された手順に従い、１５のリンゴ果皮画分（表２ａおよび表２ｂ）中に存在する主要な個々のフェノール化合物の分析を行った。リンゴ果皮画分にはＦ１〜Ｆ１５の番号が付けられている。
【０１９３】
分析は全て、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ｍｉｃｒｏ  ＡＰＩ  ＭＳ／ＭＳシステムと連動し、Ｍａｓｓｌｙｎｘ  Ｖ４．０データ解析システム（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）で制御されるＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５分離モジュール（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して行った。使用したカラムは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘ−Ｔｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ１８ガードカラムを備えるＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、５μｍ）であった。フラボノール、フラバン−３−オール、フェノール酸およびジヒドロカルコン化合物を分離するために、０．１％ギ酸水溶液（溶媒Ａ）および０．１％ギ酸アセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を用いて、０．３５ｍＬ／分の流速でグラジエント溶出を行った。時間ｔ（分）で次の溶媒Ａの割合を適用する直線濃度勾配プロファイルを使用した；（ｔ、Ａ％）：（０、９４％）、（９、８３．５％）、（１１．５、８３％）、（１４、８２．５％）、（１６、８２．５％）、（１８、８１．５％）、（２１、８０％）、（２９、０％）、（３１、９４％）、（４０、９４％）。５％ギ酸水溶液（溶媒Ａ）および５％ギ酸メタノール溶液（溶媒Ｂ）の移動相を使用し、０．３５ｍＬ／分の流量でシアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドの分析を行った。使用した直線濃度勾配プロファイルは次の通りであった；（ｔ、Ａ％）：（０、９０％）、（１０、７０％）、（１７、６０％）、（２１、４８．８％）、（２６、３６％）、（３０、１０％）、（３１、９０％）、（３７、９０％）。
【０１９４】
フラボノール、フラバン−３−オール、フェノール酸およびジヒドロカルコン化合物の分析には、負イオンモードのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ−）を使用した。次の条件を使用した、すなわち、キャピラリー電圧−３０００Ｖ、ネブライザーガス（Ｎ２）温度３７５℃、流量０．３５ｍＬ／分。シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドの分析には、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ＋）を使用した。正イオン実験の設定は次の通りであった、すなわち、キャピラリー電圧３５００Ｖ、ネブライザーガス３７５℃、流量０．３５ｍＬ／分。個々の化合物についてコーン電圧（２５〜５０Ｖ）を最適化した。特定の前駆体／生成物イオン遷移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ）を使用する多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードを使用し、標準と比較して定量化した、すなわち、ケルセチン（Ｑ）ではｍ／ｚ  ３０１→１０５、Ｑ−３−Ｏ−ルチノシドではｍ／ｚ  ６０９→３０１、Ｑ−３−Ｏ−グルコシドおよびＱ−３−Ｏ−ガラクトシドではｍ／ｚ  ４６３→３０１、Ｑ−３−Ｏ−ラムノシドではｍ／ｚ  ４４８→３０１、Ｑ−３−Ｏ−ペルトシドではｍ／ｚ  ５９５→３０１、フロリチンではｍ／ｚ  ２７３→１６７、フロリジンではｍ／ｚ  ４３５→２７３、クロロゲン酸ではｍ／ｚ  ３５３→１９１、コーヒー酸ではｍ／ｚ  １７９→１３５、フェルラ酸およびイソフェルラ酸ではｍ／ｚ  １９３→１３４、シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドではｍ／ｚ  ４４９→２８７、カテキンではｍ／ｚ  ２８９→１０９、エピカテキンではｍ／ｚ  ２９０→１０９、およびエピガロカテキンではｍ／ｚ  ３０５→１２５。ＭＲＭ実験では、四重極は両方とも単位分解能（ｕｎｉｔ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で動作させた。
2013526487.tif 000005
2013526487.tif 000006
【０１９５】
表２ａおよび表２ｂにおいて、括弧内に示す値は、その画分中で測定された全フェノール含有量に対するその成分のパーセンテージを表し、各列の最下部に示す全フェノール量は、その画分の１００％を表す。異なる画分は、画分中の各成分の相対量に基づく異なるフェノール特性を有する可能性があることが分かる。様々な画分は、追加の未同定成分をさらに含有する可能性がある。
【０１９６】
画分Ｆ４およびＦ５はフェノール化合物の濃度が最も高く、溶出画分８００ｍｌ当たりの全フェノール化合物濃度はＦ４が１２１３８．３ｍｇ／Ｌであり、Ｆ５が１３１３８．６ｍｇ／Ｌであることが判明した。
【０１９７】
表２ａおよび表２ｂ中の横列の特定の成分の量（例えば、全フェノール含有量）を見ると、粗抽出物と比較したその成分の相対量を概算することができる。例えば、Ｆ４およびＦ５は、１５の画分の全フェノール含有量のそれぞれ約３０％および３２．５％を含有する。画分Ｆ４およびＦ５はまたフラボノール含有量も最も高い。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの画分はフラボノール含有量が高いため、これらの画分は特に有効であると考えられる。また、画分中の成分間に相互作用が存在する可能性もある。
【０１９８】
実施例２．卒中の動物モデルにおけるＦ５の神経保護効果
Ｆ５処置
リンゴ果皮由来のフェノール組成物Ｆ５（表２ａ）の神経保護能力を、脳損傷の低酸素虚血（ＨＩ）モデルで調べた。表２ａに記載のフェノール化合物に基づき、画分の全フェノール含有量を測定した。抽出物を強制経口投与によりＣ５７／ｂｌ６マウス（６〜８週齢）に３日間連続して、フェノール化合物５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与した。対照群のマウスには溶媒（水）を容量０．０１ｍｌ／ｇ体重で強制経口投与により３日間連続して投与した。抽出物または溶媒を最後に投与して２４時間後に、マウスに低酸素虚血（ＨＩ）を施した。
【０１９９】
１用量（フェノール化合物５０ｍｇ／ｋｇ）では、溶媒処置群と比較して、低酸素虚血によって起こる損傷を有意に防ぐのに十分ではないことが別の試験から分かり（データは示していない）、投与量の増加または複数回の処置が必要であることが示唆された。
【０２００】
低酸素虚血（ＨＩ）により誘発される脳損傷
本来Ｌｅｖｉｎｅ（１９６０）によりラットに関して報告された低酸素虚血（ＨＩ）法を使用して、脳虚血を誘発した。成体マウスの使用に適応するように、手順を僅かに変更した。導入室内でイソフルランを使用して（３Ｌ／分の流量の医療用酸素で３％に気化させた）、マウスに麻酔をかけた。１．５Ｌ／分の流量で流動する酸素で気化させた２％イソフルランで麻酔を維持した。鋏を用いて腹側頸部に小さい正中切開を行い、胸骨舌骨筋および胸鎖乳突筋が露出するまで、下にある組織を鈍的に切開した。左総頸動脈は、胸骨舌骨筋と胸鎖乳突筋が合流する部位の真下に位置する。迷走神経を頸動脈から慎重に分離した。左頸動脈を高温電気焼灼ペンで永久的に閉塞させた。総頸動脈が完全に密封されていないまたは失血が認められる動物は直ぐに安楽死させた。２〜３時間の回復期間の後、６Ｌ／分の流量で流動する酸素濃度８％に調整された窒素で換気されたガラスシリンダーにマウスを入れた。ガラスシリンダーを３６．５℃の水浴中に入れ、体温を維持した。低酸素環境（８％）に５０分間曝露した後、マウスをチャンバから取り出して、ケージに戻した。組織学的分析のために脳組織を採取する前に、マウスをＨＩ後２週間生存させ、同側半球に脳梗塞を発症させた。
【０２０１】
ロータロッド
ロータロッドは、げっ歯類の運動機能を評価する行動試験である。装置は、マウスが歩行する回転シリンダーからなる。回転速度が一定の加速度で増加するため、マウスが歩行し続けることが困難になる。ロッド上で費やす時間（動物がロッドから落下するまでの潜伏期）を機能の尺度として記録したが、時間が長いほど、運動機能が良好であることを示す。ロータロッドの加速度は１００回転／分２に設定した。Ｆ５処置の３日目（ＨＩの２４時間前）とＨＩの２週間後（ＨＩの１４日後）にマウスを試験した。これらの日のそれぞれに、マウスを３回試験し、その日にロータロッド上で費やした平均時間を算出した。ＨＩの１４日後とＨＩの２４時間前の機能の差を求め、２つの処置群間の比較を行った。
【０２０２】
組織学的検査のための組織の準備
ＨＩの２週間後、ペントバルビタールナトリウムを２４０ｍｇ／ｋｇの用量でＩＰ注射することによりマウスを人道的に殺した。マウスに０．９％生理食塩水、次いでｐＨ７．４のリン酸緩衝液中４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を経頭蓋的に灌流した。脳を４％ＰＦＡ中に４８〜７２時間保存することにより、後固定を達成した。０．１Ｍリン酸緩衝液中３０％のショ糖溶液中に２４時間浸漬することにより、組織を凍結保護した。浮動する冠状切片を凍結ミクロトームで３０μｍの厚さで切断し、長期保存のため５％アジ化ナトリウムを有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中に入れた。
【０２０３】
ニッスル染色
３６０μｍ離間した切片をスーパーフロスト（ｓｕｐｅｒｆｏｒｓｔ）スライドガラス上に載せ、終夜乾燥させた。厚さ約３０μｍの連続脳切片を背側海馬の前部および中央部から切断した。段階的に濃度が高くなる一連のエタノール（５０％、７０％、９５％、１００％を２分間）を使用して切片を脱水した後、キシレン中で５分間インキュベートし、続いて段階的に希釈度が高くなる別の一連のエタノール（１００％、９５％、７０％、５０％）を使用して再水和した。次いで、脳切片を水中ですすぎ、１％クレシルバイオレット溶液中で１０〜１５分間インキュベートした。段階的に濃度が高くなる一連のエタノール溶液（５０％、７０％、９５％、１００％）で脱水する前に、切片を１％酢酸中ですすぎ、脱染した。組織をキシレン中で透徹した後、Ｃｙｔｏｓｅａｌを使用して被覆した。１Ｘレンズおよび１０Ｘ対物レンズを用い、ＰｉｘｅＬｉｎｋソフトウェアを使用して切片の画像を取り込んだ。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して画像を解析した。全切片について総頸動脈閉塞と同側の半球の面積と、対側半球の面積を測定し、同側／対側面積比を算出して半球損失を求めた。比が１．０の場合、半球損失がないことを示し、比が１．０未満の場合、損失があることを示す。
【０２０４】
神経細胞核（ＮｅｕＮ）免疫組織化学
免疫組織化学染色を行うための組織を準備するために、脳切片を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ（ＰＢＳ−ＴＸ）を含有するＰＢＳで１０分間、室温で３回すすいだ（後の洗浄についても全て同様）。次いで、１％過酸化水素を含有するＰＢＳ−ＴＸ中に切片を３０分間入れ、内在性ペルオキシダーゼを失活させた。ＰＢＳ−ＴＸ中５％のウマ血清中でインキュベートする前に、組織を再度洗浄した。血清中でインキュベートした後、組織を一次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、次いで４℃で終夜振盪した。一次抗体はマウスの体内で産生されたモノクローナル抗ＮｅｕＮ抗体であり、ＰＢＳ−ＴＸに１：２０００で希釈して使用した。一次抗体中で終夜インキュベートした後、組織を洗浄し、ウマの体内で産生された抗マウス二次抗体（１：５００に希釈して使用）中で１時間インキュベートした。別の一連の洗浄を行い、アビジン−ビオチン複合体をＰＢＳ−ＴＸ中に１：１０００で希釈した溶液中で組織を１時間インキュベートし、二次抗体のシグナルを増幅した。切片を洗浄した後、０．５ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジン（ＤＡＢ）溶液にニッケル、グルコースオキシダーゼ、Ｄ−グルコース、および塩化アンモニウムのＰＢＳ溶液を混合したものに入れた。所望の濃さの染色が達成されるまで、組織をＤＡＢ溶液と５〜１０分間反応させた。次いで、組織をＰＢＳ中で洗浄し、スーパーフロストスライドガラス上に載せ、終夜乾燥させた。次いで、段階的な一連のエタノール（５０％、７０％、９５％、および１００％）中で切片を脱水し、キシレン中で透徹し、Ｃｙｔｏｓｅａｌを使用して被覆した。線条体のブレグマから０．１ｍｍ前方および海馬のブレグマから１．８ｍｍ後方でのＮｅｕＮ免疫反応性を調べるために染色された切片を、光学顕微鏡でＰｉｘｅＬｉｎｋソフトウェアを使用して５０Ｘ（１０Ｘ対物レンズおよび５Ｘレンズ）で取り込んだ。次いで、処置群に関して盲検化された観察者がＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して画像を解析した。まず、画像を８ビットのグレースケールに変換することにより線条体中の細胞数を得た。３Ｘ背景の閾値を上回るピクセルだけが白色の前景に対して黒色となるように、バイナリーツールを選択した。線条体の輪郭を描き、粒子解析機能を使用して、陽性標識（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｌａｂｅｌｌｅｄ）細胞を計数した。同側線条体中のＮｅｕＮ陽性細胞の数を対側線条体中のＮｅｕＮ陽性細胞の数で除することによりニューロン生存指数を算出し、細胞生存率を得た。値が１．０の場合、同側線条体中に損傷がないことを示し、値が１．０未満の場合、ニューロン損失があることを示した。海馬の画像を８ビットのグレースケールに変換し、陽性標識細胞だけが白色の前景に対して黒色となるように、バイナリーツールを選択した。海馬の輪郭を描き、測定機能を用いて標識細胞の面積を測定した。背側海馬の場合、錐体ニューロンの密集は、厚さ３０μｍの切片中の細胞数を除外した。従って、ブレグマの１．８ｍｍ後方で切断された切片の海馬全体でＮｅｕＮ陽性細胞が占める面積を測定することによりニューロン損失を推定した。同側海馬中のＮｅｕＮ陽性ニューロンが占める面積を、対側海馬中のＮｅｕＮ陽性ニューロンが占める面積で除し、この構造のニューロン損失指数を得た。指数が１．０の場合、同側海馬中にニューロン損失がないことを示し、値が１．０未満の場合、ニューロン損失があることを示す。
【０２０５】
結果
図１を参照すると、Ｆ５で処置したマウスは、ロータロッドで評価した場合、溶媒で処置したマウスと比較して運動機能が良好であることが分かる。
【０２０６】
神経学的能力の尺度としてＨＩの前後のマウスの運動機能を評価した。ロータロッドでの機能の差（ＨＩの１４日後−ＨＩの２４時間前）は、Ｆ５で処置した群の方が、水を投与した対照マウスより大きかった。平均して、Ｆ５群のマウスではＨＩ後のスコアが改善され、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）の差が３．７±２．５秒（ｓ）であった。溶媒で処置したマウスではＨＩ後の機能が悪くなり、平均±ＳＥＭの差が−５．７±２．７であった。両側スチューデントｔ検定でこれらの２群間の有意差を判定した（ｔ（４５）＝２．５３；ｐ＝０．０１５）。従って、Ｆ５処置は、溶媒処置と比較してＨＩ後の神経学的結果を改善した。
【０２０７】
図２を参照すると、Ｆ５で処置した（５０ｍｇ／ｋｇ／日、３日間）マウスは、溶媒で処置したマウスと比較して、ＨＩによって起こる半球損失から保護されたことが分かる。
【０２０８】
ＨＩの傷害作用の結果として内頸動脈焼灼と同側の脳半球が損傷し、組織損失が起こることがある。Ｆ５で処置したマウスの方が平均±ＳＥＭ同側／対側比０．９０±０．０３とＨＩ後の半球損失が小さく、溶媒で処置したマウスは平均±ＳＥＭ比が０．８０±０．０３であった。両側スチューデントｔ検定を使用し、群間の差は統計学的に有意であることが分かった（ｔ（４５）＝２．１２；Ｐ＝０．０４０）。従って、リンゴ画分Ｆ５は、ＨＩによって起こる梗塞を防ぐ効果があった。
【０２０９】
図３を参照すると、Ｆ５処置では、溶媒処置と比較して、ＨＩ後の線条体中の生きたニューロンの数が増加したことが分かる。
【０２１０】
ＨＩ後の細胞死は、ＨＩ後に幾つかの脳部位で起こる。ＨＩ後のニューロン死が起こり易い部位の１つは、線条体である。ＨＩ後のニューロン損失を評価するために、脳切片を免疫組織化学マーカーであるＮｅｕＮで染色し、生きたニューロンを分画した。同側線条体と対側線条体の両方の、ブレグマから１．０ｍｍ前方でニューロンの数を計数した。同側／対側比を算出し、ニューロン損失を評価した。Ｆ５抽出物を投与したマウスは平均数±ＳＥＭが０．７３±０．０８となり、溶媒で処置したマウスは平均が０．４７±０．０８であることが分かった。両側スチューデントｔ検定を使用し、２群間の差は統計学的に有意であることが分かった（ｔ（４５）＝２．１２６；Ｐ＝０．０３９）。従って、リンゴ抽出物は、溶媒処置群と比較して、ＨＩ後の線条体中の生きたニューロンの数を増加させることが分かった。
【０２１１】
ニューロン死が起こる別の脳部位は、海馬である。ＨＩ後の海馬中の細胞損失を評価するために、脳切片をＮｅｕＮで免疫組織化学的に染色した。同側海馬と対側海馬の両方の、ブレグマから１．８ｍｍ前方でＮｅｕＮ陽性ニューロンの面積を測定した。同側海馬中のＮｅｕＮ陽性染色の面積を対側半球中の染色の面積で除することにより、比を求めた。図４を参照すると、Ｆ５処置では、溶媒対照群と比較して、海馬中の細胞損失が有意に予防されなかったことが分かる。Ｆ５で処置したマウスは平均±ＳＥＭ比が０．６３±０．０９であり、溶媒対照群は平均±ＳＥＭが０．４５±０．０９であった。２群間の差は有意ではないことが分かり、Ｐ値は０．１７７１であった（両側スチューデントｔ検定で判定）。結果から、試験したパラメータでは、Ｆ５処置は海馬において保護効果がなかったことが示唆される。他の試験で、異なる投与量または治療計画により海馬部位まで保護され得るかどうかを調査する。
【０２１２】
現在までの結果から、ＨＩの前にＦ５を３用量投与すると、組織損失から神経を保護する効果があるだけでなく、ＨＩ後に溶媒処置群のマウスで起こる運動機能障害も防ぐことが示唆される。
【０２１３】
図５および図６に代表的写真を示す。選択した画像は、各群の中央値スコアを有する動物であった。
【０２１４】
実施例３．Ｆ４は、２種類のＦ４成分および３種類のＦ４代謝物と比較した場合、酸素・グルコース欠乏処理された一次皮質ニューロンの死を低減する。
方法
乳酸脱水素酵素は、膜損傷時に壊死細胞により放出される安定な細胞質基質酵素である。Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＫｉｔＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を測定することにより、皮質ニューロンの膜の完全性を評価した。このアッセイキットは、共役酵素反応により、培養上清中に放出されるＬＤＨを検出する。製造業者の使用説明書に従いトリプリケートで陽性（１００％ＬＤＨ放出）および陰性（自発的ＬＤＨ放出）対照を準備した。胚１６日目のＣＤ１マウス胚の大脳皮質から、一次皮質ニューロン培養を準備した。皮質ニューロン培養を、酸素・グルコース欠乏処理（ＯＧＤ）する前に、１２時間、血清非含有条件で溶媒（０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））または１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬもしくは０．０１μｇ／ｍＬの濃度のＦ４に曝露した。１２時間のＯＧＤ中、ニューロンを溶媒、または、１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬもしくは０．０１μｇ／ｍＬのフェノール化合物濃度のＦ４に曝露した。続いて、放出されたＬＤＨを測定するために、細胞培養上清を回収した。参照波長６２０ｎｍで４９０ｎｍの吸光度を測定した。製造業者により提供された使用説明書に従うことにより、全ＬＤＨ放出のパーセンテージを算出した。バックグラウンドを差し引き、各サンプル中のＬＤＨ放出を陽性対照のパーセンテージとして表した。
【０２１５】
図７を参照すると、Ｆ４は、酸素・グルコース欠乏処理された一次皮質ニューロンの死を有意に低減するが、細胞をＦ４の２種類の活性成分（ＱおよびＱ３Ｇ）または３種類の代謝物（Ｑ３’Ｓ、Ｑ３Ｇｌｕ、ＩＲ３ＧｌｃＡ）で処置した場合、有意な低減は見られなかったことが分かる。１μｇ／ｍＬのＦ４に曝露された一次皮質培養は、溶媒処置細胞と比較して、ＯＧＤにより誘発される壊死細胞死から有意に保護された（ｐ＜０．０００１）。Ｆ４は、酸化ストレス下にある皮質ニューロンに対して直接的な神経保護効果を有した。
【０２１６】
結果から、Ｆ４は、少なくとも一部、ニューロンを虚血（無グルコース、無酸素）の損傷作用から直接保護することにより、卒中（低酸素性虚血性脳損傷）の実験モデルで神経細胞損失を低減できることが分かる。
【０２１７】
実施例４．Ｆ４は、ｉｎ  ｖｉｖｏで低酸素性虚血性（ＨＩ）脳損傷を防ぐ効果がある。
低酸素性虚血性（ＨＩ）脳損傷に関する方法、即ちＮｅｕＮ染色、画像解析は、上記の実施例に記載されたのと同じである。
【０２１８】
損傷を受けやすい２つの前脳構造、即ち、背側海馬および線条体におけるＨＩ脳損傷の損傷作用の低減におけるＦ４の最適投与パラメータを調べるために、この試験を行った。この２つの構造について、２５ｍｇ／ｋｇのＦ４の経口（ｐ．ｏ．）用量をＨＩの前に１日１回、３日間投与すると（図８〜１１）、有意で劇的な神経保護が得られた。より低用量（５〜１０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）のＦ４では、２５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）の場合よりも神経保護効果が小さく、５０ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）のＦ４では効果は２５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）の場合以下に留まった。投与頻度に関して、ＨＩの２４時間前にＦ４（２５ｍｇ／ｋｇ）を１回経口投与しても、ＨＩにより誘発される線条体の損傷は減弱されなかった（図６）。３日間、Ｆ４を経口投与（２５ｍｇ／ｋｇ／日）すると、線条体中のニューロン損失が低減した（図７）が、この低減効果は、用量数を７まで増加してもそれ以上向上しなかった（図８）。海馬の場合、Ｆ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を１用量投与しても組織損傷は低減しなかった（図９）。Ｆ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を３用量投与すると、ＨＩにより誘発される海馬萎縮が低減したが、この用量計画では依然として幾らかのニューロン損失が明らかであった（図１０）。しかし、Ｆ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を７用量投与すると、この構造における海馬ニューロンの損失が予防された（図１１）。これらの差は、海馬が線条体よりもＨＩ損傷を受けやすいことを反映している可能性がある。線条体の場合と比較して、長くＦ４で処置すると（２５ｍｇ／ｋｇ／日を３日間ではなく７日間）、海馬の最大の保護が得られる。これらの知見から、Ｆ４により誘導される神経保護に関して、ＨＩにより誘発される脳損傷のこのマウスモデルでは、２５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）を１日１回７日間投与するのが最適な投与計画であったことが分かる。
【０２１９】
図８を参照すると、ＨＩにより誘発される海馬ニューロン損失は、Ｆ４の経口（ｐ．ｏ．）投与により用量依存的に低減することが分かる。水、または複数の増加する用量でリンゴ果皮画分Ｆ４を投与し、５０分間の低酸素虚血（ＨＩ）を施した動物の同側（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ）および対側（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）の海馬のＮｅｕＮ染色を示す。それぞれ７〜９匹の成体雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから構成される５つの群に水（１０ｍｌ／ｋｇ）またはＦ４（５、１０、２５または５０ｍｇ／ｋｇ）を１日１回３日間、経口投与（ｐ．ｏ．）した。動物は全て、水またはＦ４を最後に投与して２４時間後にＨＩを受けた。同側海馬中の組織萎縮およびニューロン損失（ＮｅｕＮ免疫反応性細胞）は、Ｆ４により用量依存的に低減した。Ｆ４を５ｍｇ／ｋｇの用量（ｐ．ｏ．）で投与しても、同側（Ｃ）海馬中のＨＩの損傷作用は低減しなかった。Ｆ５を１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）の用量で投与すると、同側海馬（Ｅ）はＨＩによって生じる脳損傷から部分的に保護された。Ｆ４を２５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）（Ｇ）または５０ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）（Ｉ）投与すると、ＨＩにより誘発される海馬損傷ＨＩからほぼ完全に保護されるように見えた。
【０２２０】
図９を参照すると、ＨＩにより誘発される海馬損傷は、Ｆ４により用量依存的に低減することが分かる。５０分間のＨＩの前に、水（１０ｍｌ／ｋｇ）またはＦ４（５、１０、２５または５０ｍｇ／ｋｇ）を１日１回３日間投与した。ＨＩの２４時間前に最後の投与を行った。Ｆ４により、海馬組織の損失が用量依存的に低減した。一元配置ＡＮＯＶＡの後、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ比較検定を行った。溶媒およびＦ４（５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）群に対して＊ｐ＜０．０５。
【０２２１】
図１０を参照すると、ＨＩにより誘発される線条体ニューロン損失は、Ｆ４により用量依存的に低減することが分かる。水、または複数の増加する用量でリンゴ果皮画分Ｆ４を投与し、５０分間の低酸素虚血（ＨＩ）を施した動物の同側（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ）および対側（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）の線条体のＮｅｕＮ染色を示す。それぞれ７〜９匹の成体雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから構成される５つの群に水（１０ｍｌ／ｋｇ）またはＦ４（５、１０、２５または５０ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、経口投与（ｐ．ｏ．）した。動物は全て、水またはＦ４を最後に投与して２４時間後にＨＩを受けた。同側線条体中の組織萎縮およびニューロン損失（ＮｅｕＮ免疫反応性細胞）は、Ｆ４により用量依存的に低減した。Ｆ４を５ｍｇ／ｋｇの用量（ｐ．ｏ．）で投与しても、同側（Ｃ）線条体中のＨＩの損傷作用は低減しなかった。Ｆ４を１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）の用量で投与すると、同側線条体（Ｅ）はＨＩによって生じる脳損傷から部分的に保護された。Ｆ４を２５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）（Ｇ）または５０ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）（Ｉ）投与すると、ＨＩにより誘発される線条体損傷ＨＩからほぼ完全に保護されるように見えた。
【０２２２】
図１１を参照すると、ＨＩによって誘発される線条体ニューロン損失は、Ｆ４により用量依存的に低減する。５０分間のＨＩの前に、水（１０ｍｌ／ｋｇ）またはＦ４（５、１０、２５または５０ｍｇ／ｋｇ）を１日１回３日間投与した。ＨＩの２４時間前に最後の投与を行った。ＨＩによって誘発される同側線条体中のニューロン損失は、Ｆ４により用量依存的に低減した。一元配置ＡＮＯＶＡの後、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ比較検定を行った。溶媒およびＦ４（５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）群に対して＊ｐ＜０．０５。
【０２２３】
図１２を参照すると、ＨＩの前にＦ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を１用量投与しても、線条体ニューロン損失を低減することができないこと。２群のマウスに水（１０ｍｌ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）または２５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）のＦ４を投与し、２４時間後に５０分間のＨＩを施した。同側線条体中と対側線条体中のＮｅｕＮ陽性ニューロン数の比を定量化することにより、Ｆ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を１用量投与しても線条体損傷を低減できないことが判明した。代表的な脳切片は、水（Ａ、Ｂ）またはＦ４（Ｃ、Ｄ）が投与された動物のＨＩの１４日後の同側（Ａ、Ｃ）および対側（Ｂ、Ｄ）線条体中のＮｅｕＮ免疫反応性を示す。
【０２２４】
図１３を参照すると、ＨＩの前にＦ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を３用量投与することにより、線条体ニューロン損失が低減することが分かる。２群のマウスに水（１０ｍｌ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）または２５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）のＦ５を１日１回、３日間投与した。水またはＦ４を最後に投与して２４時間後に、全ての動物に５０分間のＨＩを施した。同側線条体中と対側線条体中のＮｅｕＮ陽性ニューロン数の比を定量化することにより、Ｆ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を３用量投与すると線条体損傷が低減することが判明した。代表的な脳切片は、水（Ａ、Ｂ）またはＦ４（Ｃ、Ｄ）が投与された動物のＨＩの１４日後の同側（Ａ、Ｃ）および対側（Ｂ、Ｄ）線条体中のＮｅｕＮ免疫反応性を示す。
【０２２５】
図１４を参照すると、ＨＩの前にＦ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を７用量投与することにより線条体ニューロン損失が低減した。２群のマウスに水（１０ｍｌ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）または２５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）のＦ４を１日１回、７日間投与した。水またはＦ４を最後に投与して２４時間後に、全ての動物に５０分間のＨＩを施した。同側線条体中と対側線条体中のＮｅｕＮ陽性ニューロン数の比を定量化することにより、Ｆ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を７用量投与すると線条体損傷が低減することが判明した。代表的な脳切片は、水（Ａ、Ｂ）またはＦ５（Ｃ、Ｄ）が投与された動物のＨＩの１４日後の同側（Ａ、Ｃ）および対側（Ｂ、Ｄ）線条体中のＮｅｕＮ免疫反応性を示す。＊ｐ＜０．０５、マン−ホイットニー検定。
【０２２６】
図１５を参照すると、ＨＩの前にＦ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を１用量投与しても、海馬損傷は有意に低減しなかったことが分かる。２群のマウスに水（１０ｍｌ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）または２５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）のＦ５を投与し、２４時間後に５０分間のＨＩを施した。ＮｅｕＮ免疫反応性を調べるために染色された切片の同側半球と対側半球中のこの構造の面積の比を算出することによりＦ４の海馬組織維持能力を推定した。これらの測定値から、Ｆ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を１用量投与しても海馬損傷を低減できないことが判明した。代表的な脳切片は、水（Ａ、Ｂ）またはＦ５（Ｃ、Ｄ）が投与された動物のＨＩの１４日後の同側（Ａ、Ｃ）および対側（Ｂ、Ｄ）海馬中のＮｅｕＮ免疫反応性を示す。
【０２２７】
図１６を参照すると、ＨＩの前にＦ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を３用量投与することにより、海馬組織損傷が低減したことが分かる。２群のマウスに水（１０ｍｌ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）または２５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）のＦ４を１日１回３日間投与した。水またはＦ４を最後に投与して２４時間後に、全ての動物に５０分間のＨＩを施した。ＮｅｕＮ免疫反応性を調べるために染色された切片の同側半球と対側半球のこの構造の面積の比を算出することによりＦ４の海馬組織維持能力を推定した。これらの測定値から、Ｆ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を３用量投与すると海馬損傷が低減することが判明した。代表的な脳切片は、水（Ａ、Ｂ）またはＦ５（Ｃ、Ｄ）が投与された動物のＨＩの１４日後の同側（Ａ、Ｃ）および対側（Ｂ、Ｄ）海馬中のＮｅｕＮ免疫反応性を示す。
【０２２８】
図１７を参照すると、ＨＩの前にＦ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を７用量投与することにより海馬組織損傷が低減したことが分かる。２群のマウスに水（１０ｍｌ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）または２５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）のＦ４を１日１回７日間投与した。水またはＦ４を最後に投与して２４時間後に、全ての動物に５０分間のＨＩを施した。ＮｅｕＮ免疫反応性を調べるために染色された切片の同側半球と対側半球のこの構造の面積の比を算出することによりＦ４の海馬組織維持能力を推定した。これらの測定値から、Ｆ４（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を７用量投与すると海馬損傷が低減することが判明した。代表的な脳切片は、水（Ａ、Ｂ）またはＦ５（Ｃ、Ｄ）が投与された動物のＨＩの１４日後の同側（Ａ、Ｃ）および対側（Ｂ、Ｄ）海馬中のＮｅｕＮ免疫反応性を示す。＊ｐ＜０．０５、マン−ホイットニー検定。
【０２２９】
２５ｍｇ／ｋｇのＦ４を１用量投与しても有意な保護が認められなかった試験に関して、それより高用量または異なる投与経路で投与することにより、有意な保護効果が得られた可能性がある。それにもかかわらず、これらの結果から、当業者が決定することができる適した用量または投与頻度で投与すると、Ｆ４またはＦ５を用いた処置により有意に保護されることが分かる。
【０２３０】
実施例５．Ｆ４は多発性硬化症の動物モデルで有効である。
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）の広く認容されている動物モデルである。完全フロイントアジュバントと共にアミノ酸３５−５５（ＭＯＧ３５−５５）を含むミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）の一部でマウスを免疫すると、ＭＳに類似する神経病変に伴う麻痺が生じる。ＥＡＥの最初の臨床徴候が現れた後にＦ４を経口投与した場合、疾患の進行が明らかである（尾が鉤状に曲がる）か、等量の水を投与した動物と比較して低減するかを調べるために本試験を行った。後述のようにＥＡＥの臨床徴候（麻痺、歩行障害）を評価することにより、疾患の進行を判定した。
【０２３１】
方法
１Ｘ  ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）を、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）０．５ｍｇを含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と１：１の比で乳化したものに溶解させたＭＯＧ３５−５５（Ｓｈｅｌｄｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＰＱ）で、６〜８週齢の雌性成体Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ；Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＵ）を免疫した。０日目に、ＭＯＧ３５−５５乳剤を尾の付け根の両側に皮下注射（ｓ．ｃ．）した（３００μｇ／マウス）。０日目、および再度２日目に、追加免疫（ｉｍｍｕｎｅ  ｂｏｏｓｔｅｒ）である百日咳毒素（ＰＴＸ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を生理食塩水で希釈し、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した（３００ｎｇ／マウス）。
【０２３２】
５日目に健康診断を行い、マウスを処置群（ｎ＝１０）または水群（ｎ＝１０）に無作為に割り付けた。各個々のマウスの体重および臨床スコアを７日目から毎日３１日間にわたり記録した。臨床徴候が最初に現れると直ぐに薬物（Ｆ４）または水を経口投与し（２５ｍｇ／ｋｇ）、残りの実験期間、毎日投与し続けた。
【０２３３】
次の評価方式を使用して動物に臨床的にスコアを付けた、すなわち、０、臨床徴候なし；０．５、尾が鉤状に曲がる；１、尾が鉤状に曲がり、肢が外側に開く；１．５、尾が弛緩し、肢が外側に開く；２、歩行障害／軽度の運動失調が始まる；２．５、重度の歩行障害；３、重度の歩行障害に加えて骨盤下垂；３．５、片側後肢麻痺；４、両側後肢麻痺；５、瀕死。マウスに粉餌を給餌したが、マウスがもはや餌に到達できない場合にはＮｅｕｔｒｉ−ｃａｌ（登録商標）（Ｅｖｓｃｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ｂｕｅｎａ，ＮＪ）を手で給餌した。マウスのスコアが≧２．５に達した場合、または体重がベースラインより１０％低下した場合、乳酸リンゲル液（５０Ｕ／日）を与えた。臨床スコアは全て、盲検化された記録者が記録した。
【０２３４】
結果
Ｆ４による処置（ｎ＝９）では、水だけでの処置と比較して、臨床的障害が有意に低減した（ｎ＝１０；二元配置ＡＮＯＶＡの後、ボンフェローニ検定、ｐ＜０．０１）。実験とは無関係の健康上の問題から１匹のマウスは試験（Ｆ４群）から排除した。１９日目〜２２日目に、Ｆ４−ＥＡＥ群の平均臨床スコアは約２．５で最高に達したが、水−ＥＡＥ群の疾患重症度の最大増加は約３．５〜４の範囲であった。２群とも緩解したが、Ｆ４群の方がより速く回復し、完全な回復に向かう傾向を示したが、水群は３１日目に再発し始めた。
【０２３５】
Ｆ４がマウスのＥＡＥの重症度を低減できることから、Ｆ４が、ＭＳ治療の重要な側面である多発性硬化症の患者の疾患の進行を停止させる能力を有することが示唆される。
【０２３６】
図１８を参照すると、Ｆ４はＥＡＥの臨床的重症度を有意に寛解することが分かる。０日目に雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、ＭＯＧ３５−５５（３００μｇ／マウス）とＣＦＡを１：１の比で混合したもので免疫し、０日目と２日目に、百日咳毒素注射（３００ｎｇ／マウス）で追加免疫した。各個々のマウスの体重および臨床スコアを７日目から毎日３１日間にわたり記録した。臨床徴候が最初に現れて２４時間後にＦ４（２５ｍｇ／ｋｇ）または溶媒（水、１０ｍｌ／ｋｇ）を経口投与し、残りの実験期間、毎日投与し続けた。１０日目までに全てのマウスに臨床徴候が現れ、それらのそれぞれの処置剤を投与した（下向きの矢印）。次の評価方式を使用して動物に臨床的にスコアを付けた、すなわち、０、臨床徴候なし；０．５、尾が鉤状に曲がる；１、尾が鉤状に曲がり、肢が外側に開く；１．５、尾が弛緩し、肢が外側に開く；２、歩行障害と運動失調が始まる；２．５、重度の歩行障害；３、重度の歩行障害に加えて骨盤下垂；３．５、片側後肢麻痺；４、両側後肢麻痺；５、瀕死。ＥＡＥ−水群（ｎ＝１０）と比較して、ＥＡＥ−Ｆ４動物（ｎ＝９）は重症度の低い臨床スコアを示し、再発しなかった（二元配置ＡＮＯＶＡの後、ボンフェローニ検定、ｐ＜０．０１）。１９日目〜２２日目に、Ｆ４−ＥＡＥ群の平均臨床スコアは約２．５で最高に達したが、水−ＥＡＥ群の疾患重症度の最大増加は約３．５〜４の範囲であった。
【０２３７】
実施例６．Ｆ４は、ＬＰＳによって誘導されるＴＮＦ−α放出を低減する。
方法
それぞれ１５匹の成体雄性Ｃ５７ＢＬ／６（２５ｇ）マウスから構成される２群に、水（０．０１ｍｌ／ｇ）またはＦ４（５０ｍｇ／ｋｇ）を２４時間毎に３日間経口投与した。Ｆ４の水を最後に投与して２４時間後に、これらの２群のそれぞれの動物に偽ＨＩ手術（ｎ＝１０）または５０分間のＨＩ（ｎ＝５）を施した。１６時間後（損傷なし）または６時間後（損傷）に、全てのマウスから全血を採取し、リチウムヘパリン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）が入った微小容器（ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒｓ）の中に入れた。Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）に従い、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のＬＰＳ（リポ多糖類、血清型０１１１：Ｂ４；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（１００μｇ）を使用して、マウス全血中のＴＮＦ−α（炎症誘発性酵素であるホスホジエステラーゼ４の活性化の代理マーカー）の放出を誘導した。新たに調製したＬＰＳは、リン酸緩衝生理食塩水中０．１％のウシ血清アルブミン中５ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、ＬＰＳ１００μｇ／ｍｌ血液の最終濃度に希釈した。５％ＣＯ２を補充した加湿組織培養インキュベータ内で血液を３７℃で４時間インキュベートした。このインキュベート後、血液を１４００ｇで１０分間４℃で遠心分離し、血漿を回収して−８０℃で保存した。ＬＰＳによって誘導される全血中のＴＮＦ−α放出は、ＥＬＩＳＡを使用して評価され、製造業者のプロトコルに従って行われた（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）。簡潔に言えば、固相サンドイッチＥＬＩＳＡ法およびストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ反応を使用し、着色生成物の強度はサンプル中のＴＮＦ−αの量に正比例する。クロマゲンブランクをブランクとして用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取り、組換えマウスＴＮＦ−αを使用して各サンプル中のＴＮＦ−αの量を算出した。
【０２３８】
結果
図１９を参照すると、Ａ、ＬＰＳにより誘導されるＴＮＦ−α放出は、水またはＦ４を経口投与された偽処置動物（脳損傷なし）の全血中で同じであった。Ｂ、ＬＰＳにより誘導されるＴＮＦ−α放出は、Ｆ４を投与したマウスと比較して、水を経口投与したＨＩ動物（脳損傷）の全血中の方が多かった。これらの結果から、Ｆ４は、脳損傷が存在する場合、強力な抗炎症効果を有するが、有利なことには健常な個体では全身性免疫抑制剤として作用しないことが示唆される。
【０２３９】
結論
これらの結果から、Ｆ４は、全血中の炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αの産生を減少させることによりＨＩ脳損傷を低減するが、さもなければ、それは先天性免疫系を動員し、その結果、中枢神経系へのマクロファージおよび好中球などの損傷性免疫細胞の浸潤が起こることが示唆される。ケルセチンなどのフラボノイド類は、ホスホジエステラーゼ４を阻害することが知られている（Ｐｌｅｕｓｏ，２００６）。ＥＡＥの臨床的徴候を予防する用量の選択的ホスホジエステラーゼ４阻害剤阻害用量で処置された動物の全血中では、ＬＰＳにより誘導されるＴＮＦ−αが抑制されるため（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、本結果から、Ｆ４は、この炎症誘発性酵素を阻害することにより、ＨＩおよびＥＡＥモデルにおいて神経変性を低減したことが分かる。
【０２４０】
画分Ｆ４およびＦ５についての結果は、２つの画分を試験した全ての試験で類似していたことに留意すべきである。
【０２４１】
前述の実施形態は、例示の目的で記載するに過ぎない。本開示の範囲から逸脱することなく、当業者が特定の実施形態に代替、変更および変形を行うことも可能であり、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ定義される。
【０２４２】
参考文献：
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Ｐｌｅｕｓｏ  Ｍ．Ｒ．Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２３１：１２８７−１２９９，２００６
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Ｒｕｔｚ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｄｉｅｔａｒｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ｐｔｅｒｏｓｔｉｌｂｅｎｅ  ａｎｄ  ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｔｏ  ｍｉｃｅ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｔｏｘｉｃ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ５７（８）：３１８０−６．
Ｓｏｕｎｄａｒａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ３−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ（ＳＹＨ−ＳＹ５Ｙ）ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｄａｍａｇｅ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＪＢＣ，Ｊａｎｕａｒｙ  ２５，２８３（３４），２２３１−２２４５．
Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｖｏｌｕｍｅ  ３６，Ｉｓｓｕｅ  ７，１  Ａｐｒｉｌ  ２００４，Ｐａｇｅｓ  ８３８−８４９
Ｗｏｌｆｅ  ＫＬ，Ｌｉｕ  ＲＨ  ２００３．Ａｐｐｌｅ  ｐｅｅｌｓ  ａｓ  ａ  ｖａｌｕｅ−ａｄｄｅｄ  ｆｏｏｄ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ．Ｊ  Ａｒｇｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，５１（６），１６７６−８３．
Ｗｏｌｆｅ  Ｋ，Ｗｕ  Ｘ，Ｌｉｕ  ＲＨ  ２００３．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｐｐｌｅ  ｐｅｅｌｓ．Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，５１，６０９−６１４．
【０２４３】
参照文献は全て、その全体が本明細書に援用される。
【図１】
2013526487.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2013526487.tif 000016
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2013526487.tif 000021
【図１６】
2013526487.tif 000022
【図１７】
2013526487.tif 000023
【図１８】
2013526487.tif 000024
【図１９】
2013526487.tif 000025
【国際調査報告】
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2013526487.tif 000027
2013526487.tif 000028
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