(57)【要約】本発明は、特に、疎水性コアおよび親水性キャップを含む官能化発色性ポリマードット、ならびにその生物共役体を提供する。官能化発色性ポリマードットを製造するための改良された方法も提供される。in  vivo画像処理および分子標識のための方法も開示される。一態様では、本発明は、疎水性コアおよび親水性キャップを有する官能化発色性ポリマードットを提供する。一実施形態では、官能化Ｐドットは、発色性ポリマー、ならびに疎水性部分および反応性官能基と結合される親水性部分を有する両親媒性分子を含み、発色性ポリマーがＰドットの疎水性コア内に包埋され；そして両親媒性分子の一部分がＰドットのコア内に包埋されて、反応性官能基が親水性キャップ中に位置する。好ましい一実施形態では、発色性ポリマーは半導電性ポリマーである。【選択図】図１
2013511700.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアおよびキャップを含む官能化発色性ポリマードット（Ｐドット）であって、前記コアが発色性ポリマーを含み、前記キャップが１つ以上の官能基を保有する官能基化剤を含むが、但し、キャップのすべてが有機ケイ酸塩というわけではないポリマードット。
【請求項２】
疎水性コアおよび親水性キャップを有する請求項１記載の官能化発色性ポリマードット（Ｐドット）であって、前記Ｐドットが、以下の：
（ａ）発色性ポリマー；ならびに
（ｂ）疎水性部分および反応性官能基と結合される親水性部分を有する両親媒性分子
を含み、
前記発色性ポリマーが前記Ｐドットの疎水性コア内に包埋され；そして
前記両親媒性分子の一部分が前記Ｐドットのコア内に包埋されて、前記反応性官能基が親水性キャップ中に位置する
ポリマードット。
【請求項３】
前記ポリマードットが発色性ポリマーの配合物を含む請求項１または２記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項４】
前記発色性ポリマーが半導電性ポリマーである請求項１〜３のいずれか一項に記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項５】
前記ナノ粒子が半導電性ポリマーの配合物を含む請求項４記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項６】
前記半導電性ポリマーの配合物がＰＦ−ＴＢＴ半導電性ポリマーを包含する請求項５記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項７】
前記ＰＦ−ＴＢＴ半導電性ポリマーがＰＦ−０．１ＴＢＴである請求項６記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項８】
前記両親媒性分子対発色性ポリマーの重量比が約１％〜約５０％である請求項１〜７のいずれか一項に記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項９】
前記両親媒性分子対発色性ポリマーの重量比が約５％〜約２５％である請求項８記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項１０】
前記両親媒性分子の親水性部分がポリアルキレングリコールを含む請求項２〜８のいずれか一項に記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項１１】
前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項１０記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項１２】
前記両親媒性分子が両親媒性ポリマーである請求項１〜１１のいずれか一項に記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項１３】
前記両親媒性ポリマーが両親媒性櫛型ポリマーである請求項１２記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項１４】
前記両親媒性ポリマーがポリエチレングリコール−グラフト化ポリスチレンである請求項１２または１３記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項１５】
前記両親媒性ポリマーのポリエチレングリコール部分が１つ以上のカルボキシル基と結合される請求項１４記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項１６】
前記両親媒性ポリマーがポリ（スチレン−コ−無水マレイン酸）である請求項１２または１３記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項１７】
前記両親媒性ポリマーが半導電性ポリマーである請求項１２または１３記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項１８】
前記両親媒性ポリマーが非半導電性ポリマーである請求項１２または１３記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項１９】
前記両親媒性ポリマーの親水性部分が１つ以上の反応性官能基と結合される請求項２〜１８のいずれか一項に記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項２０】
前記反応性官能基が、カルボキシル、アミノ、メルカプト、アジド、アルキン、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボニル、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、シアネート、スクシンイミジルエステル、歪みアルキン、アジド、ジエン、アルケン、テトラジン、歪みアルケン、シクロオクチン、ホスフィン基、およびその誘導体からなる群から選択される請求項１〜１８のいずれか一項に記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項２１】
前記反応性官能基が、アルキン、アジド、歪みアルキン、ジエン、アルケン、テトラジン、歪みアルケン、シクロオクチン、ホスフィン、または生体直交型反応を介して分子と共役され得るその他の部分である請求項２０記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項２２】
前記生体直交型反応がクリックケミストリー反応である請求項２１記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項２３】
前記ポリマードットが、蛍光染料、無機発光物質、磁気物質、およびナノ粒子のコア内に包埋された金属からなる群から選択される構成成分をさらに含む請求項１〜２２のいずれか一項に記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項２４】
生物学的分子がポリマードットの表面の反応性官能基と共役される請求項１〜２３のいずれか一項に記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項２５】
前記生物学的分子が、合成または天然タンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、核酸、炭水化物、脂質、脂肪酸およびその組合せからなる群から選択される分子を含む請求項２４記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項２６】
前記生物学的分子がポリペプチドまたは核酸である請求項２５記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項２７】
前記生物学的分子が抗体である請求項２５記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項２８】
前記生物学的分子がアプタマーである請求項２５記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項２９】
前記ポリマードットが１つ以上の非反応性化学基とさらに共役される請求項１〜２８のいずれか一項に記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項３０】
前記非反応性化学基が水溶性ポリマーである請求項２９記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項３１】
前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである請求項３０記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項３２】
前記ポリマードットが約７００ｎｍ〜約１５００ｎｍのピーク発光を示す請求項１〜３１のいずれか一項に記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項３３】
前記ポリマードットが約６００ｎｍ〜約７００ｎｍのピーク発光を示す請求項１〜３１のいずれか一項に記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項３４】
前記ポリマードットが感温染料と共役される請求項１〜３３のいずれか一項に記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項３５】
前記ポリマードットがｐＨ感受性染料と共役される請求項１〜３３のいずれか一項に記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項３６】
前記ポリマードットがカルシウム感受性染料と共役される請求項１〜３３のいずれか一項に記載の官能化発色性ポリマードット。
【請求項３７】
官能化発色性ポリマードットの製造方法であって、発色性ポリマーと非プロトン溶媒中で溶媒和化される反応性官能基と結合される両親媒性分子との混合物をプロトン溶媒を含む溶液中に導入するステップを包含する方法。
【請求項３８】
以下の：
（ａ）発色性ポリマーと非プロトン溶媒中の反応性官能基と結合される両親媒性分子との混合物を調製するステップ；
（ｂ）混合物の全部または一部をプロトン溶媒を含む溶液中に注入し、それにより前記発色性ポリマーおよび前記両親媒性分子を潰してナノ粒子にするステップ；ならびに
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された混合物から前記非プロトン溶媒を除去し、それにより官能化発色性ポリマードットの懸濁液を生成するステップ
をさらに包含する請求項３７記載の方法であって、前記両親媒性分子の一部分が前記ポリマードットのコア内に包埋され、前記反応性官能基が前記ポリマードットの表面に位置する方法。
【請求項３９】
以下の：
（ｄ）前記懸濁液を濾過して、特定サイズのポリマードットの集団を単離するステップ
をさらに包含する請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記非プロトン溶媒の沸点が前記プロトン溶媒の沸点より低く、窒素ストリッピングによりステップ（ｂ）で生成された前記混合物から前記非プロトン溶媒が除去される請求項３８または３９記載の方法。
【請求項４１】
前記プロトン溶媒が水である請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記発色性ポリマーが半導電性ポリマーである請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記両親媒性ポリマーがさらに、プロトン溶媒を含む溶液中に混合物を導入する前に反応性官能基を介してエフェクター分子と共役される請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
生物学的分子を官能化発色性ポリマードットと共役するための方法であって、生物学的分子を官能化発色性ポリマードットと共役するのに適した条件下で、遮断剤を含有する溶液中で、官能化発色性ポリマードットを生物学的分子とともにインキュベートすることを包含する方法であり、溶液中の遮断剤の存在がポリマードットの表面への生物学的分子の非特異的吸着を低減する方法。
【請求項４５】
前記遮断剤がポリアルキレングリコールである請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記遮断剤が洗剤である請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
前記洗剤がトリトンＸ−１００である請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記遮断剤が炭水化物である請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
前記炭水化物がデキストランである請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
官能化発色性ポリマードットが、以下の：
（ａ）発色性ポリマー；および
（ｂ）反応性官能基と結合される両親媒性分子
を含み、前記両親媒性分子の一部分が前記ポリマードットのコア内に包埋され、前記反応性官能基がポリマーの表面に位置する請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記発色性ポリマーが半導電性ポリマーである請求項５１記載の方法。
前記両親媒性ポリマーが１つ以上の反応性官能基と結合される請求項５１または５２記載の方法。
【請求項５３】
前記官能基がカルボキシル基である請求項４４〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
生物学的試料中の標的分子を標識するための方法であって、生物学的試料を生体共役化発色性ポリマードットと接触させることを包含する方法であり、生体共役化発色性ポリマードットが、以下の：
（ａ）発色性ポリマー；および
（ｂ）反応性官能基を介して標的部分と結合される両親媒性分子
を含み、前記両親媒性分子の一部分が前記ポリマードットのコア内に包埋され、前記標的部分が前記ポリマードットの表面に位置する方法。
【請求項５５】
前記発色性ポリマーが半導電性ポリマーである請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記両親媒性ポリマーが１つより多い反応性官能基と結合される請求項５４または５５記載の方法。
【請求項５７】
前記標的分子が細胞の表面に存在する受容体である請求項５４または５５記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞が癌細胞である請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記標的部分がポリペプチドまたは核酸である請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記標的部分が抗体である請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記標的部分がアプタマーである請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
細胞性標的の生体直交型標識のための方法であって、生体直交型反応に関与し得る第一表面曝露官能基を有する細胞性標的を官能化発色性ポリマードットと接触させることを包含する方法であり、官能化発色性ポリマードットが、以下の：
（ａ）半導電性ポリマー；および
（ｂ）生体直交型反応において第一官能基と反応し得る第二官能基と結合される両親媒性分子
を含み、前記両親媒性分子の一部分が前記ポリマードットのコア内に包埋され、第二官能基が前記ポリマードットの表面に位置する方法。
【請求項６３】
前記両親媒性ポリマーが１つより多い反応性官能基と結合される請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記生体直交型反応がクリックケミストリー反応である請求項６２または６３記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞性標的がその側鎖中にアルキン基を保有する非天然アミノ酸を含有するポリペプチドである請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞性標的がその側鎖中にアジド基を保有する非天然アミノ酸を含有するポリペプチドである請求項６２または６４記載の方法。
【請求項６７】
前記第二官能基が、アルキン、アジド、歪みアルキン、アジド、ジエン、アルケン、テトラジン、歪みアルケン、シクロオクチンおよびホスフィン基からなる群から選択される請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記第二官能基がアルキン基である請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
前記第二官能基がアジド基である請求項６７記載の方法。
【請求項７０】
半導電性ポリマーの配合物を含む発色性ポリマーであって、前記半導電性ポリマーの１つがＰＦＴＢＴコポリマーである発色性ポリマードット。
【請求項７１】
前記半導電性ポリマーの配合物がＰＦＢＴおよびＰＦ−０．１ＴＢＴを含む請求項７０記載の発色性ポリマードット。
【請求項７２】
前記ＰＦＢＴ対ＰＦ−０．１ＴＢＴの比が多くても１９：１である請求項７１記載の発色性ポリマードット。
【請求項７３】
前記ＰＦＢＴ対ＰＦ−０．１ＴＢＴの比が多くても９：１である請求項７２記載の発色性ポリマードット。
【請求項７４】
前記発色性ポリマードットが反応性官能基と結合される両親媒性分子をさらに含み、前記両親媒性分子の一部分が両親媒性分子ポリマードットのコア内に包埋され、両親媒性分子反応性官能基が両親媒性分子ポリマードットの表面に位置する請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の発色性ポリマードット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互引照
本出願は、米国特許仮出願第６１／２５９，６１１号（２００９年１１月９日出願）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）の利益を主張する。
連邦政府後援の研究開発の下でなされた発明の権利に関する声明
【０００２】
本発明は、ＮＩＨにより与えられた認可番号Ｒ２１ＡＧ０２９５７４、Ｒ２１ＣＡ１４７８３１およびＲ０１ＮＳ０６２７２５下で、米国政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
コンパクトディスクで添付により提出された「配列表」、表またはコンピュータープログラムリストへの参照
該当なし
【０００３】
蛍光プローブは、現代細胞生物学および医療診断学において重要な役割を果たしてきた。有機小染料分子が、蛍光ベースの技法、例えば蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、ならびに万能蛍光検定およびセンサーに一般的に用いられる。歴史的に、一般蛍光体は、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよびシアニン等の誘導体である。より新しい世代の蛍光体、例えばアレクサ・フルオル（Alexa  Fluor）は、一般的により光安定性である。しかしながら、多くの画像処理作業および超感受性検定に関して、それらの輝度および光安定性は、細胞内の種々の自己蛍光および散乱過程に関連したバックグラウンドを克服するのに十分なシグナルを提供し得ない。他の因子、例えば明滅および飽和発光速度も、高速および高処理量蛍光検定を難しくし得る。
【背景技術】
【０００４】
蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、万能生物学的検定およびバイオセンサーによって、生体系の理解が進歩してきた（Pepperkok,  R.;  Ellenberg,  J.  Nat.  Rev.  Mol.  Cell  Biol.  2006,  7,  690-696；Giepmans,  B.  N.  G.;  Adams,  S.  R.;  Ellisman,  M.  H.;  Tsien,  R.  Y.  Science  2006,  312,  217-224）。これらの実験アプローチは、プローブとしての有機染料分子の広範な使用をもたらす。しかし、慣用的染料の固有の限界、例えば低吸収性および貧光安定性は、高感受性画像処理技術および高処理量検定のさらなる開発を非常に難しくしてきた（Resch-Genger,  U.;  Grabolle,  M.;  Cavaliere-Jaricot,  S.;  Nitschke,  R.;  Nann,  T.  Nat.  Methods  2008,  5,  763-775；Fernandez-Suarez,  M.;  Ting,  A.  Y.  Nat.  Rev.  Mol.  Cell  Biol.  2008,  9,  929-943）。
【０００５】
その結果、より明るく且つより光安定性の蛍光プローブの開発に少なからぬ関心が認められてきた。例えば、無機半導電性量子ドット（Ｑドット）が開発進行中であり、目下、Life  Technologies（Invitrogen）から市販されている。Ｑドットは、その広範な励起帯域ならびに狭く可変性の発光ピークのため、多重標的検出のための理想的プローブである。それらは、慣用的有機染料を上回る改良された輝度および光安定性を示す（Bruchez,  M.;  Moronne,  M.;  Gin,  P.;  Weiss,  S.;  Alivisatos,  A.  P.  Science  1998,  281,  2013-2016；Chan,  W.  C.  W.;  Nie,  S.  M.  Science  1998,  281,  2016-2018；Wu,  X.  Y.;  Liu,  H.  J.;  Liu,  J.  Q.;  Haley,  K.  N.;  Treadway,  J.  A.;  Larson,  J.  P.;  Ge,  N.  F.;  Peale,  F.;  Bruchez,  M.  P.  Nat.  Biotechnol.  2003,  21,  452-452；およびMichalet,  X.;  Pinaud,  F.  F.;  Bentolila,  L.  A.;  Tsay,  J.  M.;  Doose,  S.;  Li,  J.  J.;  Sundaresan,  G.;  Wu,  A.  M.;  Gambhir,  S.  S.;  Weiss,  S.  Science  2005,  307,  538-544）。しかしながら、Ｑドットは、その低発光速度、明滅、ならびに非蛍光ドットの有意の画分のため、多数の光子欠乏適用のために十分に明るいわけではない（Yao,  J.;  Larson,  D.  R.;  Vishwasrao,  H.  D.;  Zipfel,  W.  R.;  Webb,  W.  W.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  2005,  102,  14284-14289）。非明滅性Ｑドットを開発するための近年の研究があるが（Wang,  X.  Y.;  Ren,  X.  F.;  Kahen,  K.;  Hahn,  M.  A.;  Rajeswaran,  M.;  Maccagnano-Zacher,  S.;  Silcox,  J.;  Cragg,  G.  E.;  Efros,  A.  L.;  Krauss,  T.  D.  Nature  2009,  459,  686-689）、しかし重金属イオンの浸出により引き起こされるそれらの毒性は、in  vivo適用のためには依然として重大な問題である。
【０００６】
量子ドットは、２〜３ナノメートルの範囲の異なるサイズを有する同一物質の無機半導体ナノ結晶（例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳドット）である。それらは、量子閉じ込め効果によるサイズ可変性発光色を示す。慣用的染料と比較した場合、量子ドットは、２０倍明るく、１００倍安定であると見積もられる。しかしながら、これらのナノ粒子は、典型的には、必要レベルの水溶性および生体適合性に達して、３〜６ｎｍに過ぎない蛍光体粒子サイズに関して１５〜３０ｎｍのオーダーの特定直径を生じるために、厚い封入層を要する。相対的に大きいサイズの封入量子ドットが、生体分子の生物学的機能および輸送を有意に変更し得る。量子ドットは広範な帯域吸収を示し、大きな吸収部分がＵＶ領域にあるが、これは、ほとんどのレーザーベースの適用には適していない。量子ドットプローブに伴う別の重大な問題は、重金属Ｃｄ２＋イオンの浸出によるそれらの毒性である。ＵＶ照射のエネルギーは、ＣｄＳｅナノ結晶の共有的化学結合エネルギーのものに近い。その結果、粒子は、光分解として既知のプロセスで、溶解されて、細胞または細胞下環境中に毒性カドミウムイオンを放出し得る。毒性問題が注意深く検査された後に、腫瘍または血管画像処理におけるそれらの適用がヒト臨床目的のために認可されなければならない。さらに、低発光速度、明滅、ならびに非蛍光ドットの有意画分も、特に単一分子／粒子画像処理適用に関する潜在的問題を引き起こす。
【０００７】
代替的蛍光ナノ粒子は、色素ドープラテックス球であり、これは、粒子当たりの多重色素分子および保護ラテックスマトリックスのために、単一蛍光分子と比較して、改良された輝度および光安定性を示す（Wang,  L.;  Wang,  K.  M.;  Santra,  S.;  Zhao,  X.  J.;  Hilliard,  L.  R.;  Smith,  J.  E.;  Wu,  J.  R.;  Tan,  W.  H.  Anal.  Chem.  2006,  78,  646-654）。しかしながら、色素負荷ビーズに伴う多数の制限、例えば自己消光による色素負荷濃度限定（２〜３％）ならびに相対的に大きい粒子サイズ（＞３０ｎｍ）も存在し、これらは分析物濃度を報告するためのエネルギー転移の使用を伴う感知スキームを排除する。
【０００８】
発光ポリマーは、２０年前のそれらの発見以来、圧倒的興味を引きつけてきた。これらの物質は、ポリマーの加工適性および顕著な機械的特質と半導体の易適合性電子的および光学的特性とを併有し、したがって、発光ダイオード、電界効果トランジスタ、太陽電池およびその他の光電子デバイスにおいて広範な用途を見出す。蛍光ポリマードットは、一光子および二光子励起の両方の下で、異常に高い蛍光輝度を示す（非特許文献１；非特許文献２）。蛍光ポリマードットは、半導電性ポリマー分子の多数の好ましい特質、例えばそれらの高吸収横断面、高放射速度、高有効発色団密度および最小レベルの凝集誘導性蛍光消光のために、今までのところ、任意のナノ粒子の最高傾向輝度／容積比をほぼ間違いなく保有する。蛍光プローブとしての蛍光ポリマードットの使用は、他の有用な利点、例えば溶液中に浸出する重金属イオンの欠如も付与する。しかしながら、生物学的画像処理または感知用途においてこれらのプローブを適用するためには、重要な問題が解決されないままであり、すなわち、表面官能化および生体共役の問題が依然として存在する。
したがって、生物学的系でプローブを使用させる表面に官能基を有する蛍光ポリマードットを開発する必要性が依然として存在する。表面官能化は、疎水性ポリマードットの蛍光輝度または光安定性を保持するかまたは増強し、水性環境でのドットのサイズおよび長期単分散性を変えず、一連の型の生体分子とのさらなる共役を可能にし、他の生体分子との非特異的結合を防止するかまたは最小にし、そして費用効果方式で商業的規模でポリマードットを産生させるべきである。本発明は、特に、安定官能化発色性ポリマードット（Ｐドット）およびその生物共役体を提供することにより、このような要求を満たす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Wu,  C.;  Szymanski,  C.;  Cain,  Z.;  McNeill,  J.  J.  Am.  Chem.  Soc.  2007,  129,  12904-12905
【非特許文献２】C.  Wu,  B.  Bull,  C.  Szymanski,  K.  Christensen,  J.  McNeill,  ACS  Nano  2008,  2,  2415-2423
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
一態様において、本発明は官能化発色性ポリマードットに関する。官能化発色性ポリマードットは、発色性ポリマーのコア、ならびに１つ以上の官能基を保有する官能化剤のキャップを有する。
【００１１】
一態様では、本発明は、疎水性コアおよび親水性キャップを有する官能化発色性ポリマードットを提供する。一実施形態では、官能化Ｐドットは、発色性ポリマー、ならびに疎水性部分および反応性官能基と結合される親水性部分を有する両親媒性分子を含み、発色性ポリマーがＰドットの疎水性コア内に包埋され；そして両親媒性分子の一部分がＰドットのコア内に包埋されて、反応性官能基が親水性キャップ中に位置する。好ましい一実施形態では、発色性ポリマーは半導電性ポリマーである。
【００１２】
別の態様では、ポリマードットの生物共役体が開示される。生物共役体は、生体分子を、発色性ポリマードットの１つ以上の官能基と結合することにより形成される。
【００１３】
さらに別の態様では、官能化発色性ポリマードットの製造方法が開示される。当該方法は、発色性ポリマーと官能化剤（１つ以上の官能基を保有する）の混合物を含有する非プロトン溶液中にプロトン溶媒を導入することを包含する。
【００１４】
一態様では、本発明は、官能化発色性ポリマードットの製造方法であって、（ａ）発色性ポリマーと非プロトン溶媒中の反応性官能基と結合される両親媒性分子との混合物を調製するステップ；（ｂ）混合物の全部または一部をプロトン溶媒を含む溶液中に注入し、それにより発色性ポリマーおよび両親媒性分子を潰してナノ粒子にするステップ；ならびに（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された混合物から非プロトン溶媒を除去し、それにより官能化発色性ポリマードットの懸濁液を生成するステップを包含する方法を提供するが、この場合、両親媒性分子の一部分はナノ粒子のコア内に包埋され、反応性官能基はナノ粒子の表面に位置する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、生物学的分子を官能化発色性ポリマードットと共役させるための方法であって、生物学的分子を官能化発色性ポリマードットと共役させるのに適した条件下で、ポリエチレングリコールを含有する溶液中で、官能化発色性ポリマードットを生物学的分子とともにインキュベートする方法を提供するが、この場合、溶液中のポリエチレングリコールの存在は、ポリマードットの表面への生物学的分子の非特異的吸着を低減する。
【００１６】
さらに別の態様では、本発明は、生物学的試料中の標的分子の標識方法であって、生物学的試料を、標的分子を特異的に結合する標的部分と共役される発色性ポリマードットと接触させることを包含する方法を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、細胞性標的の生体直交型標識のための方法であって、生体直交型化学反応に関与し得る第一表面曝露官能基を有する細胞性標的を発色性ポリマードットと接触させることを包含する方法を提供する。特定の一実施形態では、生態直交型反応は、このような反応に関与し得る反応性官能基を保有するＰドットを用いて実施されるクリックケミストリー反応である。
【００１８】
さらに別の実施形態では、本発明は、赤方偏移発光ピークを有する発色性ポリマードットを提供する。一実施形態では、赤方偏移Ｐドットは、遠赤外領域でピーク発光を有する。他の実施形態では、赤方偏移Ｐドットは、近ＩＲ領域でピーク発光を有する。一実施形態では、赤方偏移Ｐドットは、ＰＦＴＢＴポリマーを含む。ある実施形態では、ポリマードットは、２つ以上の異なる発色性ポリマーの、を含む。例えば、一実施形態では、ＰドットはＰＦＢＴおよびＰＦＴＢＴポリマーの、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の官能化発色性ポリマードットおよびそれらの生体分子共役体の調製に関する模式図を示す。一般的発色性ポリマーＰＦＢＴおよび両親媒性官能化ポリマーＰＳＰＥＧ−ＣＯＯＨの化学構造を、スキームに図示する。
【図２Ａ】（Ａ）本発明の方法に従って調製した官能化発色性ＰＦＢＴドットの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を示す。（Ｂ）ＡＦＭ画像から得た粒子高ヒストグラムを示す。
【図２Ｂ】（Ａ）本発明の方法に従って調製した官能化発色性ＰＦＢＴドットの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を示す。（Ｂ）ＡＦＭ画像から得た粒子高ヒストグラムを示す。
【図３】本発明の方法に従って調製した官能化発色性ＰＦＢＴドットの吸収および発光スペクトルを示す。
【図４Ａ】（Ａ）一次抗ＥｐＣＡＭとともに、次に、二次抗マウスＩｇＧ抗体と共役させた発色性ＰＦＢＴドットとともにインキュベートしたＳＫ−ＢＲ−３癌細胞の蛍光共焦点画像を示す。（Ｂ）二次抗マウスＩｇＧ抗体と共役させた発色性ＰＦＢＴドットとともにインキュベートしたＳＫ−ＢＲ−３癌細胞の蛍光共焦点画像を示す。一次抗体は、対照（Ｂ）では用いられない。
【図４Ｂ】（Ａ）一次抗ＥｐＣＡＭとともに、次に、二次抗マウスＩｇＧ抗体と共役させた発色性ＰＦＢＴドットとともにインキュベートしたＳＫ−ＢＲ−３癌細胞の蛍光共焦点画像を示す。（Ｂ）二次抗マウスＩｇＧ抗体と共役させた発色性ＰＦＢＴドットとともにインキュベートしたＳＫ−ＢＲ−３癌細胞の蛍光共焦点画像を示す。一次抗体は、対照（Ｂ）では用いられない。
【図５Ａ】（Ａ）抗チューブリンビオチン一次抗とともに、次いで、ストレプトアビジンと共役させた発色性ＰＦＢＴドットとともにインキュベートしたＭＣＦ−７癌細胞の蛍光共焦点画像を示す。（Ｂ）ビオチン抗チューブリン一次抗体、次いで、裸ＰＦＢＴドットとともにインキュベートしたＭＣＦ−７癌細胞の蛍光共焦点画像を示す。ストレプトアビジン共役を伴わないＰＦＢＴドットを、対照として用いる。
【図５Ｂ】（Ａ）抗チューブリンビオチン一次抗とともに、次いで、ストレプトアビジンと共役させた発色性ＰＦＢＴドットとともにインキュベートしたＭＣＦ−７癌細胞の蛍光共焦点画像を示す。（Ｂ）ビオチン抗チューブリン一次抗体、次いで、裸ＰＦＢＴドットとともにインキュベートしたＭＣＦ−７癌細胞の蛍光共焦点画像を示す。ストレプトアビジン共役を伴わないＰＦＢＴドットを、対照として用いる。
【図６Ａ】（Ａ）コアが半導電性ポリマー、非半導電性発色団含有ポリマー（例えば染料、金属錯体等）、光学的不活性ポリマーまたは無機機能性物質を有する半導電性ポリマー、あるいはその組合せであり；キャップが官能基を保有する小分子、官能基を保有する界面活性剤、官能基を保有する脂質または官能基を保有するポリマーであり得る本発明の汎化ＣＰドットを示す。キャップおよびコアは、化学結合により、または物理的会合により、一緒に保持され得る。（Ｂ）コアが半導電性ポリマー、非半導電性発色団含有ポリマー（例えば染料、金属錯体等）、光学的不活性ポリマーまたは無機機能性物質を有する半導電性ポリマー、あるいはその組合せであり；キャップが疎水性部分および親水性部分を有する両親媒性ポリマーを含む本発明の好ましいＣＰドットを示す。疎水性部分は、物理的会合により、または化学結合によりコア中に包埋され、そして生体共役のための官能基を保有する親水性部分は、生体共役のために外に延びる。
【図６Ｂ】（Ａ）コアが半導電性ポリマー、非半導電性発色団含有ポリマー（例えば染料、金属錯体等）、光学的不活性ポリマーまたは無機機能性物質を有する半導電性ポリマー、あるいはその組合せであり；キャップが官能基を保有する小分子、官能基を保有する界面活性剤、官能基を保有する脂質または官能基を保有するポリマーであり得る本発明の汎化ＣＰドットを示す。キャップおよびコアは、化学結合により、または物理的会合により、一緒に保持され得る。（Ｂ）コアが半導電性ポリマー、非半導電性発色団含有ポリマー（例えば染料、金属錯体等）、光学的不活性ポリマーまたは無機機能性物質を有する半導電性ポリマー、あるいはその組合せであり；キャップが疎水性部分および親水性部分を有する両親媒性ポリマーを含む本発明の好ましいＣＰドットを示す。疎水性部分は、物理的会合により、または化学結合によりコア中に包埋され、そして生体共役のための官能基を保有する親水性部分は、生体共役のために外に延びる。
【図７】（Ａ）官能化ＰＦＢＴドットの典型的ＡＦＭ画像。（Ｂ）官能化ＰＦＢＴドットのＡＦＭ画像で得た粒子高のヒストグラム。（Ｃ）ＥＤＣ触媒共有結合による生体共役を立証するためのビオチンシリカビーズを用いた検定。（Ｄ）６ヶ月保存後の１×ＰＢＳ緩衝溶液中のＰＦＢＴドットストレプトアビジン生体共役体の吸収および蛍光スペクトル。差込図は、室内照明（左図）およびＵＶ照明（右図）下でのＰドット生体共役体の写真を示す。
【図８】同一励起条件下で得られた（Ａ）ＰＦＢＴドット、（Ｂ）ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８および（Ｃ）Ｑドット５６５の単一粒子蛍光画像。ＰＦＢＴドットより有意に薄暗いため、ＩｇＧ−ＡｌｅｘａおよびＱドット５６５はより低い値に設定されなければならない（６０，０００カウントよりむしろ８０００カウント）ということに注目。スケールバーは５μｍを表す。（Ｄ）１ｍＷの同一励起力下で観察される、単一ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８および単一Ｑドットと比較した場合の、単一Ｐドットに関するシグナルおよびバックグラウンド。（Ｅ）４ｍＷの励起力下での３つのプローブに関する単一粒子蛍光の強度分布。Ｐドットは、ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８またはＱドットより〜３０明るい。（Ｆ）単一粒子光褪色軌道。明滅はＰＦＢＴドット（青）に関しては観察されなかったが、一方、頻繁な明滅がＱドット（赤）に関して観察された。
【図９】Ｐドット生体共役体で標識されたヒト乳癌細胞における細胞表面マーカー（ＥｐＣＡＭ）の蛍光画像処理。（Ａ）順次、抗ＥｐＣＡＭ一次抗体およびＰドットＩｇＧ共役体とともにインキュベートした生ＭＣＦ−７細胞の画像処理。底部パネルは、細胞をＰドットＩｇＧ単独（一次抗体なし）とともにインキュベートした対照試料を示す。ノマルスキー（ＤＩＣ）画像を、共焦点蛍光画像の右側に示す。スケールバーは、２０μｍを表す。（Ｂ）順次、抗ＥｐＣＡＭ一次抗体、ビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体およびＰドットストレプトアビジン共役体とともにインキュベートした生ＭＣＦ−７細胞の画像処理。底部パネルは、細胞を抗ＥｐＣＡＭ抗体およびＰドットストレプトアビジン（二次抗体なし）とともにインキュベートした対照試料を示す。ノマルスキー（ＤＩＣ）画像を、共焦点蛍光画像の右側に示す。スケールバーは、２０μｍを表す。
【図１０】蛍光標識癌細胞のフロースルー検出。（Ａ）マイクロ流路型フローサイトメーターによりＰドットストレプトアビジン標識化ＭＣＦ−７細胞を流すことにより得られた蛍光強度分布。レーザー励起を、０．１から０．５〜１ｍＷまで変化させた。（Ｂ）（Ａ）で用いたものと同一実験条件下で得られたＱドット５６５−ストレプトアビジン標識ＭＣＦ−７細胞に関する蛍光強度分布。（Ｃ）ＰドットストレプトアビジンおよびＱドットストレプトアビジンで標識した細胞に関するマイクロ流路型フローサイトメーターを用いて得られた平均蛍光輝度の比較。（Ｄ）（Ａ〜Ｃ）に記載したものと同一の実験および比較を、ＰドットＩｇＧおよびＡｌｅｘａ４８８−ＩｇＧを用いて実行した。
【図１１】（Ａ）マイクロ流路型フローサイトメーターによりＰドットＩｇＧ標識化ＭＣＦ−７細胞を流すことにより得られた蛍光強度分布。レーザー励起を、０．１から０．５〜１ｍＷまで変化させた。（Ｂ）（Ａ）で用いたものと同一実験条件下で得られたＡｌｅｘａ４８８−ＩｇＧ標識ＭＣＦ−７細胞に関する蛍光強度分布。
【図１２Ａ】（Ａ）低開口数広視野顕微鏡で得られたＱドット５６５−ストレプトアビジン標識ＭＣＦ−７細胞に関する蛍光画像。（Ｂ）（Ａ）で用いたものと同一実験条件下で得られたＰドットストレプトアビジン標識ＭＣＦ−７細胞に関する蛍光画像。（Ｃ）Ｑドット標識細胞と比較したＰドット標識細胞の蛍光強度分布。
【図１２Ｂ】（Ａ）低開口数広視野顕微鏡で得られたＱドット５６５−ストレプトアビジン標識ＭＣＦ−７細胞に関する蛍光画像。（Ｂ）（Ａ）で用いたものと同一実験条件下で得られたＰドットストレプトアビジン標識ＭＣＦ−７細胞に関する蛍光画像。（Ｃ）Ｑドット標識細胞と比較したＰドット標識細胞の蛍光強度分布。
【図１２Ｃ】（Ａ）低開口数広視野顕微鏡で得られたＱドット５６５−ストレプトアビジン標識ＭＣＦ−７細胞に関する蛍光画像。（Ｂ）（Ａ）で用いたものと同一実験条件下で得られたＰドットストレプトアビジン標識ＭＣＦ−７細胞に関する蛍光画像。（Ｃ）Ｑドット標識細胞と比較したＰドット標識細胞の蛍光強度分布。
【図１３】ＴＣＳＰＣ設定により測定したＰＦＢＴドットの蛍光減衰寿命（０．６ｎｓ）。青線は実験データを表し、緑線は、反復解析法を用いて得られた適合曲線である。残差を、曲線の下に示す（赤線）。
【図１４】クリックケミストリーによる生体直交型標識のための蛍光半導電性ポリマードットの官能化および共役。コポリマーＰＳＭＡを、蛍光半導電性ポリマー、例えばＰＦＢＴ（緑色糸として示す）と共縮合し、それにより表面カルボキシル基を有するＰドットを生成した。カルボキシル基は、銅（Ｉ）触媒クリック反応のために機能性分子との表面共役をさらに可能にした。生体直交型化学レポーターで代謝的に標識された哺乳動物における新規合成タンパク質または糖タンパク質（青色糸）に対して、官能化Ｐドットを選択的に標的化した。
【図１５】カルボキシル官能化ＰＦＢＴドットの吸収および蛍光スペクトル。
【図１６】ｐＨ４〜９のＨＥＰＥＳ緩衝液中のＰＦＢＴ  Ｐドットの蛍光強度。明白な変化は観察されなかった。
【図１７】官能化Ｐドットの特性化。（ａ）ＵＶ照明下で銅（Ｉ）の存在下でのＰドット対Ｑドットの蛍光写真。（ｂ）異なる表面官能基を有するＰドットの移動帯域。（ｃ）動的光散乱により測定した場合のカルボキシル官能化Ｐドットの流体力学的直径；差込図は、官能化Ｐドットの典型的ＴＥＭ画像を示す。（ｄ）アジド基によるＰドットの上首尾の官能化を立証するためのアルキン−Ａｌｅｘａ５９４を用いた蛍光検定。（ｅ）クリック反応によりアジド−Ｐドットに結合されたアルキン−シリカナノ粒子の単一粒子蛍光画像。スケールバーは５０μｍを表す。
【図１８】ＰドットアルキンプローブでタグされたＡＨＡ処置ＭＣＦ−７細胞における新規合成タンパク質の蛍光画像。（ａ〜ｄ）銅（Ｉ）の存在下での陽性Ｐドット標識化。（ｅ〜ｈ）対照試料におけるＰドット標識化を、（ａ〜ｄ）と同一条件下で、しかし銅（ＩＩ）から銅（Ｉ）を生成する還元剤（アスコルビン酸ナトリウム）の非存在下で実行した。上列は、蛍光画像を示す；緑色蛍光はＰドットからであり、青色蛍光は核染剤Hoechst３４５８０からである。下列は、ノマルスキー（ＤＩＣ）ならびに組合せＤＩＣおよび蛍光画像を示す。スケールバーは２０μｍを表す。
【図１９】図１８ａ〜１８ｄと同一条件下で、しかしＡＨＡに曝露されない細胞で、銅（Ｉ）触媒Ｐドットアルキンタグ化を実施した。この対照では、細胞標識化は観察されなかった。上列は、蛍光画像を示す；青色蛍光は核染剤Hoechst３４５８０からであった；Ｐドットからの蛍光は観察されなかった（上右パネル）。下列は、ノマルスキー（ＤＩＣ）（下左パネル）ならびに組合せＤＩＣおよび蛍光画像（下右パネル）を示す。スケールバーは２０μｍを表す。
【図２０】ＰドットアジドでタグされたＭＣＦ−７細胞における新規合成タンパク質の蛍光標識化。（ａ〜ｄ）ＨＰＧ処置細胞における銅（Ｉ）触媒陽性Ｐドット標識化。（ｅ〜ｈ）対照試料におけるＰドット標識化を、（ａ〜ｄ）と同一条件下で、しかしＨＰＧに曝露されない細胞において、実行した。上列は、蛍光画像を示す；緑色蛍光はＰドットからであり、青色蛍光は核染剤Hoechst３４５８０からである。下列は、ノマルスキー（ＤＩＣ）ならびに組合せＤＩＣおよび蛍光画像を示す。スケールバーは２０μｍを表す。
【図２１】ＰドットアルキンプローブでタグされたＧａｌＮＡｚ処置ＭＣＦ−７細胞における糖タンパク質の蛍光画像化。（ａ〜ｄ）銅（Ｉ）の存在下での陽性Ｐドット標識化。（ｅ〜ｈ）対照試料におけるＰドット標識化を、（ａ〜ｄ）と同一条件下で、しかし銅（Ｉ）の非存在下で、実行した。上列は、蛍光画像を示す；緑色蛍光はＰドットからであり、青色蛍光は核染剤Hoechst３４５８０からである。下列は、ノマルスキー（ＤＩＣ）ならびに組合せＤＩＣおよび蛍光画像を示す。スケールバーは２０μｍを表す。
【図２２】クリックケミストリーによる生体共役に関する３つのスキーム。
【図２３】ポリフルオレンポリマーを基礎にした多色半導電性ポリマードット。発光色を深赤色域に調整し得る一方、高蛍光量子収率を保持するために、主吸収はＵＶ領域である。主ＵＶ吸収は、フルオレン単位の大多数によるものである。左は、これらのポリマーの化学構造を示す。
【図２４】集光性ポリマーＰＦＢＴおよび赤色発光ポリマーＰＦ−０．１ＴＢＴ、ならびに機能性コポリマーＰＳＭＡを共縮合して、表面カルボキシル基を有する高蛍光性ＰＢドットを生成した。カルボキシル基は、腫瘍特異的ペプチドリガンドＣＴＸとの表面共役をさらに可能にする。
【図２５Ａ】（Ａ）ＰＦＢＴおよびＰＦ−０．１ＴＢＴポリマーの化学構造。（Ｂ）集光性ＰＦＢＴドナーポリマーおよび赤色発光ＰＦ−０．１ＴＢＴアクセプターポリマーを含有するＰＢドットの濃度依存性吸収スペクトル（左）および発光スペクトル（右）。０．６（ＰＦ−０．１ＴＢＴ対ＰＦＢＴ）の配合比で、ＰＢドットは、可視領域での広範な吸収およびＰＦＴＢＴからの効率的深赤色発光を示す。上は、ＰＦＢＴおよびＰＦ−０．１ＴＢＴの化学構造を示す。（Ｃ）量子産生（ＱＹ）標準ＤＣＭ染料およびＰＢドットの吸収スペクトル（左）および蛍光発光スペクトル（右）。水中のＰＢドットおよびメタノール中のＤＣＭの両方の吸光度を調整して、０．１とした。同一分光計条件下で、蛍光スペクトルを得た。
【図２５Ｂ】（Ａ）ＰＦＢＴおよびＰＦ−０．１ＴＢＴポリマーの化学構造。（Ｂ）集光性ＰＦＢＴドナーポリマーおよび赤色発光ＰＦ−０．１ＴＢＴアクセプターポリマーを含有するＰＢドットの濃度依存性吸収スペクトル（左）および発光スペクトル（右）。０．６（ＰＦ−０．１ＴＢＴ対ＰＦＢＴ）の配合比で、ＰＢドットは、可視領域での広範な吸収およびＰＦＴＢＴからの効率的深赤色発光を示す。上は、ＰＦＢＴおよびＰＦ−０．１ＴＢＴの化学構造を示す。（Ｃ）量子産生（ＱＹ）標準ＤＣＭ染料およびＰＢドットの吸収スペクトル（左）および蛍光発光スペクトル（右）。水中のＰＢドットおよびメタノール中のＤＣＭの両方の吸光度を調整して、０．１とした。同一分光計条件下で、蛍光スペクトルを得た。
【図２５Ｃ】（Ａ）ＰＦＢＴおよびＰＦ−０．１ＴＢＴポリマーの化学構造。（Ｂ）集光性ＰＦＢＴドナーポリマーおよび赤色発光ＰＦ−０．１ＴＢＴアクセプターポリマーを含有するＰＢドットの濃度依存性吸収スペクトル（左）および発光スペクトル（右）。０．６（ＰＦ−０．１ＴＢＴ対ＰＦＢＴ）の配合比で、ＰＢドットは、可視領域での広範な吸収およびＰＦＴＢＴからの効率的深赤色発光を示す。上は、ＰＦＢＴおよびＰＦ−０．１ＴＢＴの化学構造を示す。（Ｃ）量子産生（ＱＹ）標準ＤＣＭ染料およびＰＢドットの吸収スペクトル（左）および蛍光発光スペクトル（右）。水中のＰＢドットおよびメタノール中のＤＣＭの両方の吸光度を調整して、０．１とした。同一分光計条件下で、蛍光スペクトルを得た。
【図２６】（ａ）ＰＢドットの吸収および発光スペクトル．差込み図は、室内光（左）およびＵＶ光（右）照明下での水性ＰＢドットの写真を示す。（ｂ）Ｑドット６５５ナノ結晶の単一粒子蛍光画像。スケールバー：４μｍ。（ｃ）ＰＢドットの単一粒子蛍光画像。Ｑドット６５５と同一励起条件下で画像を得たが、しかし発光の９０％は、検出器飽和を回避するために減光フィルター（ＯＤ＝１）により遮断された。スケールバー：４μｍ。（ｄ）単一粒子蛍光の強度分布。ＰＢドットは、Ｑドット６５５プローブの〜１５倍明るい。（ｅ）カルボキシル官能化ＰＢドットのＴＥＭ画像。スケールバー：１００ｎｍ。（ｆ）官能化および生体共役化ＰＢドットのゲル電気泳動。異なる生体分子と共役されたＰＢドットは、アガロースゲルにおけるシフト移動帯域を示したが、これは官能化および生体分子共役が上手くいったことを示す。
【図２７】集光性ＰＦＰＶドナーポリマーおよび２つの赤色発光ポリマーＰＦ−０．１ＤＨＴＢＴ、ＰＦ−０．１ＴＢＴをそれぞれ含有するＰＢドットの吸収スペクトル（左）および発光スペクトル（右）。左は、ポリマーの化学構造を示す。
【図２８】時間相関単一光子計数器（ＴＣＳＰＣ）により測定したＰＢドットの蛍光減衰寿命（３．５ｎｓ）。黒線は実験データを表し、赤線は適合曲線である。
【図２９】動的光散乱により測定したＰＦＢＴ  co  ＰＦＴＢＴ  ＰＢドットの粒子サイズ分布（Malvern  Zetasizer  NanoZS）。
【図３０】４〜９の範囲のｐＨを有するＨＥＰＥＳ緩衝液中のＰＦＢＴ  co  ＰＦＴＢＴ  ＰＢドットの蛍光強度。明白な変化は観察されなかった。
【図３１】（ａ）ＥｐＣＡＭ一次抗体、ビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体およびＰＢドットストレプトアビジン共役体とともに順次インキュベートされた生ＭＣＦ−７細胞の共焦点画像。（ｂ）ビオチニル化二次抗体を用いないＰＢドット細胞標識化に関する陰性対照。ａおよびｂはともに、位相画像（左）および組合せ蛍光画像（右）を示す。赤色蛍光はＰＢドットからであり、青色蛍光は中性染剤Hoechst３４５８０からである。スケールバー：４０μｍ。（ｃ）２０分間の連続レーザー走査下で得られた共焦点蛍光画像から抽出した光褪色曲線。（ｄ）ＭｉｌｌＱ水中の生物学的に関連するイオンおよびＲＯＳに対するＲＢドットの蛍光安定性。Ｑドット６５５ナノ結晶を参照として示す。各金属イオンに関する濃度は、５００μＭである。ＲＯＳ安定性試験に関して、Ｈ２Ｏ２および塩素濃度は、それぞれ１×１０−３および４×１０−５である。凝集を防止するために、溶液はＰＥＧを含有する。
【図３２】ＰＳ−ＣＯＯＨ官能化ＰＦＢＴ  Ｐドットを用いたＣｕ２＋およびＦｅ２＋の感知を示す模式図。ＰＦＢＴ  Ｐドットを、先ずＰＳ−ＣＯＯＨで官能化し、これはキレート基として役立った（Ａ）。Ｃｕ２＋および／またはＦｅ２＋を付加することにより、Ｐドットの凝集およびクエンチングを誘導した（Ｂ）。Ｃｕ２＋誘導性凝集は溶液中にＥＤＴＡを導入することにより逆転されるが、一方、Ｆｅ２＋との結合に起因するＰドットの凝集は再分散され得ない（Ｃ）。中央の差込図は、３６５ｎｍの明かりの下での各々の対応する溶液の写真を示す。
【図３３Ａ】Ｃｕ２＋の付加の前（Ａ）および後（Ｂ）のＰＳ−ＣＯＯＨ  co  ＰＦＢＴ  ＰドットのＴＥＭ画像。これは、カルボキシル官能化ＰドットのＣｕ２＋誘導性凝集を例証する。スケールバーは２００ｎｍである。（Ｃ）Ｃｕ２＋の付加の前および後、ならびにＥＤＴＡの付加後のＰドットの動的光散乱測定値。水（□）中およびＣｕ２＋含有溶液（■）中でＤＬＳにより測定した、ならびにＣｕ２＋含有溶液（■）へのＥＤＴＡの付加後のＰＳ−ＣＯＯＨ  co  ＰＦＢＴ  Ｐドットの流体力学的直径。
【図３３Ｂ】Ｃｕ２＋の付加の前（Ａ）および後（Ｂ）のＰＳ−ＣＯＯＨ  co  ＰＦＢＴ  ＰドットのＴＥＭ画像。これは、カルボキシル官能化ＰドットのＣｕ２＋誘導性凝集を例証する。スケールバーは２００ｎｍである。（Ｃ）Ｃｕ２＋の付加の前および後、ならびにＥＤＴＡの付加後のＰドットの動的光散乱測定値。水（□）中およびＣｕ２＋含有溶液（■）中でＤＬＳにより測定した、ならびにＣｕ２＋含有溶液（■）へのＥＤＴＡの付加後のＰＳ−ＣＯＯＨ  co  ＰＦＢＴ  Ｐドットの流体力学的直径。
【図３３Ｃ】Ｃｕ２＋の付加の前（Ａ）および後（Ｂ）のＰＳ−ＣＯＯＨ  co  ＰＦＢＴ  ＰドットのＴＥＭ画像。これは、カルボキシル官能化ＰドットのＣｕ２＋誘導性凝集を例証する。スケールバーは２００ｎｍである。（Ｃ）Ｃｕ２＋の付加の前および後、ならびにＥＤＴＡの付加後のＰドットの動的光散乱測定値。水（□）中およびＣｕ２＋含有溶液（■）中でＤＬＳにより測定した、ならびにＣｕ２＋含有溶液（■）へのＥＤＴＡの付加後のＰＳ−ＣＯＯＨ  co  ＰＦＢＴ  Ｐドットの流体力学的直径。
【図３４】ＰＳ−ＣＯＯＨ  co  ＰＦＢＴ  ＰドットおよびＰＦＢＴ  co  ＰＦＴＢＴ  Ｐドットを含有する溶液の蛍光強度に及ぼす異なるイオン（２０μＭ）の作用。上部の画像は、３６５ｎｍの明かりの下での各試料を示す。
【図３５】（Ａ）ＰＳ−ＣＯＯＨ  co  ＰＦＢＴ  ＰドットおよびＰＦＢＴ  co  ＰＦＴＢＴ  Ｐドットを含有する溶液の蛍光に及ぼす種々の濃度のＣｕ２＋イオンの作用。Ｃｕ２＋の濃度は、０〜３０μＭの範囲であった：黒色線：０、赤色線：１００ｎＭ、桃色線：５００ｎＭ、金色線：１μＭ、暗紫色線：５μＭ、緑色線：１０μＭ、橙色線：２０μＭ、青色線：３０μＭ。（Ｂ）Ｃｕ２＋濃度の一関数としての６２３ｎｍピーク（ＰＦＢＴ  co  ＰＦＴＢＴ  Ｐドットから）を上回る５４０ｎｍピーク（ＰＳ−ＣＯＯＨ  co  ＰＦＢＴ  Ｐドットから）の比率のプロット。赤色線はデータとの線形適合である（Ｒ２＝０．９９２）。（Ｃ）３０μＭのＥＤＴＡの付加により、Ｃｕ２＋イオンによるクエンチ後のＰドットの蛍光強度が回復され得る。
【図３６】（Ａ）５４０ｎｍでのＰＳ−ＣＯＯＨ  co  ＰＦＢＴ  Ｐドットの蛍光に及ぼす種々の濃度のＦｅ２＋の作用；溶液は、内部標準として、ＰＦＢＴ  co  ＰＦＴＢＴ  Ｐドット（６２３ｎｍを中心に発光）も含有した。Ｆｅ２＋の濃度は、０〜４０μＭ：黒色線：０、赤色線：１０μＭ、緑色線：１５μＭ、桃色線：２０μＭ、橙色線：２５μＭ、青色線：４０μＭ。（Ｂ）Ｆｅ２＋濃度の一関数としての６２３ｎｍピーク（ＰＦＢＴ  co  ＰＦＴＢＴ  Ｐドットから）を上回る５４０ｎｍピーク（ＰＳ−ＣＯＯＨ  co  ＰＦＢＴ  Ｐドットから）の比率のプロット。赤色線はデータとの線形適合である（Ｒ２＝０．９９６）。
【図３７】近ＩＲ（ＮＩＲ）色素ドープ化および官能化ＣＰドット（互換的にＰドットと呼ばれる）の調製。発色性ポリマーＰＦＢＴ、両親媒性ポリマーＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨおよびＮＩＲ色素をＴＨＦ中で一緒に混合し、音波処理下で水中に同時沈降させて、ＮＩＲ色素ドープＰドットを生成した。Ｐドットマトリックスは、青色光を吸収して、エネルギーをドープ化ＮＩＲ色素（緑色矢印で示す）に移し、これが次に強力なＮＩＲ蛍光（赤色矢印で示す）を生じる。
【図３８】ＮＩＲドープ化および官能化ＣＰドット（互換的にＰドットと呼ばれる）の特性化。（Ａ）ＮＩＲ色素ドープ化ＰドットのＴＥＭ画像。ＣＰドットの直径は１８ｎｍであった。スケールバー：５０ｎｍ。（Ｂ）ＤＬＳにより測定したＮＩＲ色素ドープ化ＣＰドットの数平均直径。（Ｃ）アガロースゲル電気泳動。裸ＰＦＢＴドット、カルボキシルＰＦＢＴドットおよびＮＩＲ色素ドープ化ＣＰドットを、０．７％アガロースおよび０．２％ＰＥＧを含有するアガロースゲル中に入れて、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ中で１５分間、１０Ｖ／ｃｍの力で動かした。裸ＰＦＢＴドットは、カルボキシル表面を欠いているため、より遅く動いた。カルボキシルＰＦＢＴドットおよびＮＩＲ色素ドープＣＰドットはともに、その表面にカルボキシル基を含有し、より速く動いた。
【図３９】ＰＦＢＴドット、ＮＩＲ色素およびＮＩＲ色素ドープ化ＣＰドット（互換的にＰドットと呼ばれる）の励起および発光スペクトル。上図は、ＰＦＢＴドット（陰影入り黒破線）およびＮＩＲ色素（陰影入り暗黄色破線）の励起スペクトル、ならびにＰＦＢＴドット（青実線）およびＮＩＲ色素（赤実線）の発光スペクトルを示す。下図は、ＮＩＲ色素ドープＣＰドットの励起（陰影入り黒破線）および発光（赤実線）を示す。
【図４０】ＮＩＲ色素ドープＣＰドット（互換的にＰドットと呼ばれる）の蛍光特性。（Ａ）異なるＮＩＲ色素ドーピングによるＮＩＲ色素ドープＣＰドットの蛍光スペクトル。（Ｂ）ＰＦＢＴドット（ドナー）の正規化発光スペクトルおよびＮＩＲ色素（アクセプター）の正規化吸収スペクトル間の重複；ドナーおよびアクセプター対間の算定フォスター半径は３．７ｎｍである。（Ｃ）ＣＰドットの蛍光寿命測定値。裸ＣＰドットの寿命は２．４ｎｓであり（実験データ：緑色ドット、適合：青色実線）、ＮＩＲ色素でのドーピング後に１．２ｎｓに低減される（実験データ：赤色ドット、適合：赤色実線）。黒色実線は、内部参照（ＩＲＦ）を表す。（Ｄ）ＰドットマトリックスにおけるＮＩＲ色素の適用クエンチング作用。色素ドーピングなしの元のＣＰドット（Ｆ０）とＮＩＲ色素ドープ化ＣＰドット（Ｆ）の蛍光強度比は、ドーパントの濃度に比例する（エラーバー付き中空ドット）。データをシュテルン・ヴォルマーの式（実線）に適合させた。（Ｅ）ドーパント濃度を制御することによるＮＩＲ色素ドープＣＰドットのＮＩＲ発光の操作。色素濃度増大は、ＮＩＲ発光の低減をもたらす（赤色カラム）。星印付き黒色カラムは、色素ドーピングなしのＣＰドットの５４６ｎｍ発光を表す。
【図４１】ＣＰドット（互換的にＰドットと呼ばれる）マトリックスの内側のＮＩＲ色素の蛍光増強。（Ａ）４５０ｎｍ（青色カラム）および７６３ｎｍ（黒色模様付カラム）で励起された遊離ＮＩＲ色素およびドープ化ＮＩＲ色素の正規化蛍光ピーク強度。遊離ＮＩＲ色素の蛍光はＴＨＦで測定し、他は２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で測定した。（Ｂ）同一粒子濃度の蛍光ナノ物質の蛍光発光。（Ｃ）粒子濃度により正規化された蛍光ナノ物質のピーク強度。
【図４２】ＮＩＲ色素ドープ化ＣＰドットの漏出試験。７７８ｎｍ（アクセプター）および５４６ｎｍ（ドナー）の蛍光発光間のピーク比を変えることにより、ＮＩＲ色素漏出をモニタリングし得る。（Ａ）２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温で試験した色素漏出。ＮＩＲ発光は７２時間では変化しないままであり（青色中空三角）、アクセプター対ドナー比は、７２時間後にわずかに減少した（赤色中空四角）。（Ｂ）ヒト結晶中で３７℃で試験した色素漏出。血漿中で測定されたデータ（青色中空三角）は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中でのデータ（赤色中空四角）に匹敵する。
【図４３】ＣＰドット温度センサーの調製に関する模式図。
【図４４】ＣＰドット温度センサーのＴＥＭ（Ａ）および動的光散乱（Ｂ）。
【図４５】ＣＰドット温度センサーの吸収および発光スペクトル。
【図４６】異なる温度でのＣＰドット  ＰＦＢＴ−ＲｈＢ（Ａ）およびＰＦＰＶ−ＲｈＢ（Ｂ）センサーの発光スペクトル。
【図４７】ＣＰドット温度センサーに関する強度−温度プロットおよびそれらの線形適合。
【図４８】ＣＰドット温度センサーに関する強度比対温度および線形適合。
【図４９】ＰＰＥ  ＰドットベースのｐＨセンサーの調製のための３つの経路を示す模式図。（Ａ）水中のＰＳ−ＳＨｃｏＰＰＥ  Ｐドットを先ず調製し、次いで、ＦＩＴＣ分子上のイソチオシアネート部分と反応させた。（Ｂ）ＦＩＴＣを先ず、アミン−イソチオシアネート反応によりＰＳ−ＮＨ２ポリマーと共役させて、その結果生じたフルオレセイン標識ＰＳポリマーをＰＰＥポリマーと配合して、ＰＳ−ＮＨ２−ＦＩＴＣｃｏＰＰＥ  Ｐドットを生成した。（Ｃ）ＰＳ−ＳＨｃｏＰＰＥ  Ｐドットを、先ず、（Ａ）と同じ方法で調製したが、しかしその後、フルオレセイン−５−マレイミドと結合させた。ＰＰＥ：ポリ（２，５−ジ（３’，７’−ジメチルオクチル））フェニレン−１，４−エチニレン；ＰＳ：ポリスチレンポリマー；ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート。
【図５０】（Ａ）水中のＰＰＥ  Ｐドット（暗紫色破線）およびＦＩＴＣ（黒色破線）のＵＶ−可視スペクトル；ならびにｐＨ＝７のＨＥＰＥＳ緩衝溶液中のＰＳ−ＳＨｃｏＰＰＥ（赤色実線）、ＰＳ−ＳＨ−ＦＩＴＣｃｏＰＰＥ（青色実線）およびＰＳ−ＮＨ２−ＦＩＴＣｃｏＰＰＥ  Ｐドットの発光スペクトル。上右隅の差込図は、３６５ｎｍＵＶランプ下のＰＳ−ＳＨｃｏＰＰＥ（左）およびＰＳ−ＳＨ−ＦＩＴＣｃｏＰＰＥ  Ｐドット溶液（右）の写真を示す。（Ｂ）ＣＰドットｐＨセンサーの透過型電子顕微鏡画像。（Ｃ）ＣＰドットの寿命の比較。
【図５１】５〜８の範囲の異なるｐＨでの（Ａ）Ｐドット（Ａ）、（Ｂ）Ｐドット（Ｂ）および（Ｃ）Ｐドット（Ｃ）の蛍光スペクトル（黒色線：ｐＨ＝８、赤色線：ｐＨ＝７．５、青色線：ｐＨ＝７、緑色線：ｐＨ＝６．５、金色線：ｐＨ＝６、褐色線：ｐＨ＝５．５、桃色線：ｐＨ＝５）。励起波長は３９０ｎｍであった。
【図５２】３つのフルオレセイン共役ＰドットのｐＨ感受性および可逆性。（Ａ）ｐＨの一機能としてのＰドット（Ａ）（●）、Ｐドット（Ｂ）（■）およびＰドット（Ｃ）（▲）の発光比率（Ｉ５１３ｎｍ／Ｉ４４０ｎｍ）のレイシオメトリックｐＨ較正プロット。青、黒および赤色線は、それぞれＰドット（Ａ）（Ｒ２＝０．９９５）、Ｐドット（Ｂ）（Ｒ２＝０．９９１）およびＰドット（Ｃ）（Ｒ２＝０．９９４）のデータとの線形適合である。Ｐドット（Ａ）、Ｐドット（Ｂ）およびＰドット（Ｃ）に関する勾配は、それぞれ０．３７、０．１８および０．２９である。（Ｂ）ｐＨが５．０と８．０の間で反復的に動かされる場合の、Ｐドット（Ｃ）の強度比（Ｉ５１３ｎｍ／Ｉ４４０ｎｍ）。これはｐＨ感知の可逆性および再現可能性を示す。
【図５３】ドナー（すなわちＰＰＥ）の発光とアクセプター（すなわちＦＩＴＣ）の吸光度との間のスペクトル重複；ならびにそれらの算定フォスター距離Ｒｏの例証。（Ａ）ＰＳ−ＳＨ−ＦＩＴＣｃｏＰＰＥ  Ｐドット（薄緑色破線）の発光スペクトルおよび５〜８の範囲のｐＨでのＦＩＴＣの励起スペクトル。スペクトル重複のより容易な観察のために、曲線下面積を色と適合させた。（Ｂ）異なるｐＨでのＰＰＥ−ＦＩＴＣの対応するフォルター距離を、（Ａ）で示したような重複積分に基づいてプロットした。
【図５４】ＰＰＥ  Ｐドット（Ａ〜Ｃ）およびＰＳ−ＳＨ−ＦＩＴＣｃｏＰＰＥ  Ｐドット（Ｅ〜Ｇ）により標識したＨｅＬａ細胞の共焦点操作顕微鏡画像；ならびにそれぞれ（Ｄ）および（Ｈ）で示されたそれらの対応する明視野画像。４３３〜４４４ｎｍのＰドットのスペクトル領域を統合することにより、（Ａ）および（Ｅ）に示した青色蛍光を生じ、一方、（Ｂ）および（Ｆ）に示した緑色蛍光を５０７〜５１８ｎｍから統合した。画像（Ｃ）および（Ｇ）は、青および緑色蛍光のオーバーレイである。
【図５５】λｅｘｃ＝４０５ｎｍで、Ｐドット（Ｂ）（Ａ〜Ｃ）およびＰドット（Ｃ）（Ｅ〜Ｇ）により標識したＨｅＬａ細胞の共焦点操作顕微鏡画像；それらの対応する明視野画像を、それぞれ（Ｄ）および（Ｈ）で示す。４３３〜４４４ｎｍのスペクトル領域を統合することにより、（Ａ）および（Ｅ）に示した青色蛍光を生じ、一方、（Ｂ）および（Ｆ）に示した緑色チャンネルは５０７〜５１８ｎｍであった。画像（Ｃ）および（Ｇ）は、青および緑色チャンネルのオーバーレイである。差込図は、単一ＨｅＬａ細胞の拡大図である。スケールバーは２０μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
序論
半導電性ポリマーは、種々の光電子工学的用途、例えば発光ダイオード、電界効果トランジスタおよび光起電デバイスのための魅力的な材料である（例えば、Friend,  R.  H.;  Gymer,  R.  W.;  Holmes,  A.  B.;  Burroughes,  J.  H.;  Marks,  R.  N.;  Taliani,  C.;  Bradley,  D.  D.  C.;  Dos  Santos,  D.  A.;  Bredas,  J.  L.;  Loglund,  M.;  Salaneck,  W.  R.  Nature  1999,  397,  121；およびGunes,  S.;  Neugebauer,  H.;  Sariciftci,  N.  S.  Chem.  Rev.  2007,  107,  1324-1338参照；これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される参照）。それらの魅力は、ポリマーのたやすく加工処理できることと組合せた半導体の適合が容易な電子および光学特性に基づいている。水溶性半導電性ポリマーは、高感度バイオセンサーおよび化学センサーとしても実証されている（例えば、Chen,  L.;  McBranch,  D.  W.;  Wang,  H.  L.;  Helgeson,  R.;  Wudl,  F.;  Whitten,  D.  G.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  1999,  96,  12287-12292；Fan,  C.  H.;  Wang,  S.;  Hong,  J.  W.;  Bazan,  G.  C.;  Plaxco,  K.  W.;  Heeger,  A.  J.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  USA  2003,  100,  6297-6301；およびThomas,  S.  W.;  Joly,  G.  D.;  Swager,  T.  M.  Chem.  Rev.  2007,  107,  1339-1386参照；これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）。
【００２１】
半導電性ポリマーナノ粒子についての初期の実証（Szymanski,  C.;  Wu,  C.;  Hooper,  J.;  Salazar,  M.  A.;  Perdomo,  A.;  Dukes,  A.;  McNeill,  J.  D.  J.  Phys.  Chem.  B  2005,  109,  8543-8546；およびWu,  C.;  Szymanski,  C.;  McNeill,  J.  Langmuir  2006,  22,  2956-2960；これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）以来ずっと、例えばその錯体光物理学の特性化（例えば、Palacios,  R.  E.;  Fan,  F.  R.  F.;  Grey,  J.  K.;  Suk,  J.;  Bard,  A.  J.;  Barbara,  P.  F.  Nat.  Mater.  2007,  6,  680-685;  Wu,  C.;  Zheng,  Y.;  Szymanski,  C.;  McNeill,  J.  J.  Phys.  Chem.  C  2008,  112,  1772-1781;  Wu,  C.;  McNeill,  J.  Langmuir  2008,  24,  5855-5861；およびCollini,  E.;  Scholes,  G.  D.  Science  2009,  323,  369-373参照；これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）、ならびに生物学的画像処理および高解像度単一粒子追跡のためのそれらの開発（例えば、Wu,  C.  et  al.,  J.  J.  Am.  Chem.  Soc.  2007,  129,  12904-12905;  Wu,  C.  et  al,.  J.  ACS  Nano  2008,  2,  2415-2423;  Wu,  C.;  et  al,  Chem.  Int.  Ed.  2009,  48,  2741-2745;  Moon,  J.  H.  et  al,  Chem.  Int.  Ed.  2007,  46,  8223-8225；Baier,  M.  C.  et  al,  Am.  Chem.  Soc.  2009,  131,  14267-14273;  Abbel,  R.;  et  al,  J.  Chem.  Commun.  2009,  1697-1699;  Pu,  K.  Y.  et  al,  Chem.  Mater.  2009,  21,  3816-3822；Yu,  J.  et  al,  J.  Am.  Chem.  Soc.  2009,  131,  18410-18414;  Howes,  P.  et  al,  J.  Am.  Chem.  Soc.  2010,  132,  3989-3996；およびKim,  S.  et  al.  Chem.  Commun.  46,  1617-1619  (2010)参照；これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）を含めた当該技術分野における急速な進歩がなされてきた。
【００２２】
本発明の態様は、種々の用途、例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化選別法、免疫蛍光法、免疫組織化学、蛍光多重化、単一分子画像処理、単一粒子追跡、タンパク質折り畳み、タンパク質回転動力学、ＤＮＡおよび遺伝子解析、タンパク質解析、代謝物質解析、脂質解析、ＦＲＥＴベースのセンサー、高処理量スクリーニング、細胞画像処理、in  vivo画像処理、蛍光ベースの生物学的解析、例えばイムノアッセイおよび酵素ベースの解析、ならびに生物学的検定および測定における種々の蛍光技法（これらに限定されない）のための、新規のクラスの官能化発色性ポリマードット（官能化ＣＰドットまたはＰドット）として言及される官能化蛍光プローブ、ならびにそれらの生体分子共役体に関する。
【００２３】
官能化発色性ポリマードットの独特の特性は、高（粒子当たりの）蛍光輝度、大型吸収横断面、高蛍光量子収率、迅速発光速度、高度極性化蛍光、優れた光安定性および易貯蔵性（これらに限定されない）における基礎を有する。適切な生体分子との共役時に、多数の領域で、例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化選別法、免疫蛍光法、免疫組織化学、蛍光多重化、単一分子画像処理、単一粒子追跡、タンパク質折り畳み、タンパク質回転動力学、ＤＮＡおよび遺伝子解析、タンパク質解析、代謝物質解析、脂質解析、ＦＲＥＴベースのセンサー、高処理量スクリーニング、細胞画像処理、in  vivo画像処理、蛍光ベースの生物学的解析、例えばイムノアッセイおよび酵素ベースの解析、ならびに生物学的検定および測定における種々の蛍光技法（これらに限定されない）で、プローブは用いられ得る。
【００２４】
本発明の付加的利点および特徴は、一部は、本説明に記述されており、これは一部はその説明から明らかになるし、あるいは本発明の実行により習得され得る。添付の図面を参照しながら、以下の説明および実施例で例証されるような実験を実施して、本発明を実証する。
【００２５】
Ｐドットは、一光子および二光子励起下でともに、並外れて高い蛍光輝度を示す。それらの輝度は、半導電性ポリマー分子の多数の好ましい特質、例えばそれらの大きな吸収横断面、迅速発光速度、ならびに高蛍光量子収率に由来する。近年の研究は、蛍光プローブとしてのＰドットが光安定性であり、異なる細胞検定では細胞傷害性でない、ということも示している（例えば、Wu,  C.;  Bull,  B.;  Szymanski,  C.;  Christensen,  K.;  McNeill,  J.  ACS  Nano  2008,  2,  2415-2423；Pu,  K.  Y.;  Li,  K.;  Shi,  J.  B.;  Liu,  B.  Chem.  Mater.  2009,  21,  3816-3822；およびRahim,  N.  A.  A.;  McDaniel,  W.;  Bardon,  K.;  Srinivasan,  S.;  Vickerman,  V.;  So,  P.  T.  C.;  Moon,  J.  H.  Adv.  Mater.  2009,  21,  3492-3496参照；これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）。
【００２６】
しかしながら、広範囲の生物学的用途に関して、Ｐドットについての有意の問題、すなわち、それらの表面化学ならびに生物学的分子との共役の制御方法は未だ解決されていない。シリカまたはリン脂質封入に伴う研究努力により、表面官能基を有する複合粒子を生じえた（例えば、Wu,  C.;  Szymanski,  C.;  McNeill,  J.  Langmuir  2006,  22,  2956-2960およびHowes,  P.;  Green,  M.;  Levitt,  J.;  Suhling,  K.;  Hughes,  M.  J.  Am.  Chem.  Soc.  2010,  132,  3989-3996参照）が、しかしＰドットによる細胞標識化に関して今日までに報告された結果は、おそらくは、有機蛍光体およびＱドットに関して確立された標識化方法と比較してはるかに低有効且つ特異的方法であるエンドサイトーシス（例えば、Wu,  C.;  Bull,  B.;  Szymanski,  C.;  Christensen,  K.;  McNeill,  J.  ACS  Nano  2008,  2,  2415-2423；Pu,  K.  Y.;  Li,  K.;  Shi,  J.  B.;  Liu,  B.  Chem.  Mater.  2009,  21,  3816-3822；Howes,  P.;  Green,  M.;  Levitt,  J.;  Suhling,  K.;  Hughes,  M.  J.  Am.  Chem.  Soc.  2010,  132,  3989-3996；およびRahim,  N.  A.  A.;  McDaniel,  W.;  Bardon,  K.;  Srinivasan,  S.;  Vickerman,  V.;  So,  P.  T.  C.;  Moon,  J.  H.  Adv.  Mater.  2009,  21,  3492-3496参照）に基づいている。Ｐドットプローブが有効標識化のための細胞性標的を認識するのに十分に特異的にさえうるか否かは、依然として不明である。したがって、この難題はずっと、生物学的用途におけるＰドットの広範囲の使用を厳しく妨げてきた。
【００２７】
本発明が、Ｐドット生体共役および特異的細胞標的化に関連した難題に関する解決を提供することは、有益である。一態様において、本発明は、特異的抗原−抗体またはビオチン−ストレプトアビジン相互作用により細胞性標的を標識するためにＰドットを生体分子と共有的に結合する新規の共役方法を提供する。この官能化および生体共役戦略は、任意の疎水性、蛍光性の半導電性ポリマーに容易に適用され得る。本明細書中で提供される実施例に示すように、本明細書中で提供される方法により共役されるＰドット生体共役体は、単一粒子画像処理、細胞画像処理およびフローサイトメトリー実験のために用いられ得るし、慣用的有機蛍光体およびＱドットプローブを上回るそれらの利点が実証される。したがって、本研究は、生物学的用途のために種々の高蛍光性、光安定性および非毒性Ｐドット生体共役体を用いるための新規の且つ実用的な道筋を開く。
【００２８】
一態様では、本発明は、ナノ粒子形成中の疎水性相互作用により駆動される単一ドットへの異種ポリマー鎖の捕捉を包含するＰドットの官能化のための新規の戦略に基づいている。官能基を保有する少量の両親媒性ポリマーは、半導電性ポリマーと共縮合されて、なの粒子表面を改質し、官能化して、その後、生体分子、例えばストレプトアビジンおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と共有的に共役する。Ｐドット生体共役体は、任意の検出可能な非特異的結合を伴わずに、細胞性標的、例えばヒト乳癌細胞中の細胞表面マーカーを有効に且つ特異的に標識し得る。単一粒子画像処理、細胞性画像処理およびフローサイトメトリー実験は、Ａｌｅｘａ色素および量子ドットプローブの場合と比較して、Ｐドットの非常に高い蛍光輝度を示す。これらの超高輝度ナノ粒子の上首尾の生体共役は、万能半導電性ポリマーを現代生物学および生物医学における種々の蛍光測定に適用するための新規の機会を提示する。
【００２９】
一態様では、生体分子との共有的共役を可能にする官能基を有する高蛍光半導電性ポリマードットが提供される。これらのＰドットの官能化のための戦略は、ナノ粒子形成中に疎水性相互作用により駆動されるＰドット粒子中への異種ポリマー鎖の捕捉に基づいている。官能基を保有する少量の両親媒性ポリマーが半導電性ポリマーと共縮合されて、ナノ粒子表面を改質し、官能化し得る、ということが本明細書中で示される。その後、標準カルボジイミドカップリング化学を用いて、ストレプトアビジンおよび抗体のような生体分子との共有的共役が実施された。これらのＰドット生体共役体は、任意の検出可能な非特異的結合を伴わずに、生および固定細胞の両方における細胞表面受容体および細胞下構造を有効に且つ特異的に標識し得る。単一粒子画像処理、細胞性画像処理およびフローサイトメトリーを実施してＰドット性能を実験的に評価し、Ａｌｅｘａ−ＩｇＧおよびＱドットプローブの場合と比較して、それらの高い細胞性標識輝度を実証する。これらの結果は、抗範囲の蛍光ベースの生物学的検出のための高度蛍光性ナノ粒子生態共役体の新規のクラスを提示する。
定義
【００３０】
本明細書中で用いる場合、「発色性ナノ粒子」または「発色性ポリマードット」という用語は、安定なサブミクロンサイズの粒子に潰された１つ以上の発色性ポリマーを含む構造を指す。本明細書中で提供される発色性ナノ粒子は、ポリマーを潰すための当該技術分野で既知の任意の方法、例えば沈降による方法、エマルション（例えばミニまたはマイクロエマルション）の形成による方法、ならびに縮合による方法（これらに限定されない）により形成され得る。好ましい一実施形態では、発色性ナノ粒子はナノ沈降により形成される。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、「ポリマー」は、典型的には共有化学結合により連結される少なくとも２つの反復構造単位からなる分子である。ポリマーは、一般的に、任意にペンダント側鎖基を含有する主鎖を含む延長分子構造を有する。それは、線状ポリマーおよび分枝鎖ポリマー、例えば星型ポリマー、櫛型ポリマー、刷子型ポリマー、ラダーポリマーおよび樹状ポリマーを包含する。
【００３２】
本明細書中で用いる場合、「発色性ポリマー」という用語は、ポリマーの少なくとも一部分が発色性単位を含むポリマーである。「発色団」という用語は、当該技術分野におけるその普通の意味を与えられる。発色団は、ＵＶから近赤外領域間でのある波長を吸収し、そして発光性であり得るし、そうでないこともある。
【００３３】
「発色性単位」としては、本発明においては、非局在化パイ電子を有する構造の単位、小有機染料分子の単位および金属錯体の単位が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、発色性ポリマーの例としては、非局在化パイ電子を有する構造の単位を含むポリマー、例えば半導電性ポリマー、小有機染料分子の単位を含むポリマー、金属錯体の単位を含むポリマー、ならびにその任意の組合せの単位を含むポリマーが挙げられる。
【００３４】
本明細書中で用いる場合、「官能基」という用語は、例えば任意の安定な物理的または化学的会合により、発色性ポリマーと結合され、それにより発色性ポリマードットの表面を共役のために利用可能にさせ得る任意の科学的単位を指す。官能基の非限定例としては、カルボン酸、アミノ、メルカプト、アジド、アルキン、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボニル、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、シアネート、スクシンイミジルエステル、アルキン、歪みアルキン、アジド、ジエン、アルケン、シクロオクチンおよびホスフィン基、その置換誘導体、ならびにその組合せが挙げられる。
【００３５】
本明細書中で用いる場合、「官能化剤」という用語は、例えば任意の安定な物理的または化学的会合により、発色性ポリマードットのコアと結合されて、ポリマードットの表面に官能基を提供し得る任意の分子を指す。
【００３６】
本明細書中で用いる場合、「親水性官能基」という用語は、実際に親水性である官能基を指すか、あるいは親水性側鎖または親水性部分（これが疎水性官能基を実際により親水性にさせて、そして発色性ポリマードットの疎水性コアの内側に埋めさせるというよりむしろ発色性ポリマードット粒子上の疎水性官能基の配列を促す）と結合される疎水性官能基を指す。親水性側鎖または部分との結合によりより親水性にされ得る疎水性官能基の例としては、親水性側鎖、例えばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）と、または任意の他の親水性側鎖と結合されるアルキン、歪みアルキン、アジド、ジエン、アルケン、シクロオクチンおよびホスフィン基（クリック化学に関して）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書中で用いる場合、「生体直交型反応」という用語は、外因的に送達されるプローブとの高選択的反応により生きている系において改質され得る非ネイティブ、非摂動性化学ハンドル間の共役を指す。生体直交型反応スキームについてよく知られているほとんどのものは、クリック化学として既知である。生体直交型反応スキームの再検討に関しては、例えばBest  MD,  Biochemistry.  2009  Jul  21;48(28):6571-84（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）を参照されたい。
【００３８】
本明細書中で用いる場合、「クリック反応」という用語が認知されているが、これは、最も認知された銅触媒アジド−アルキン［３＋２］環状付加のような最高に信頼可能な且つ自律的な有機反応のコレクションを記述する。クリックケミストリー反応の非限定例は、例えばH.  C.  Kolb,M.  G.  Finn,  K.  B.  Sharpless,  Angew.  Chem.  Int.  Ed.  2001,  40,  2004およびE.  M.  Sletten,  C.  R.  Bertozzi,  Angew.  Chem.  Int.  Ed.  2009,  48,  6974（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に見出され得る。
【００３９】
本明細書中で用いる場合、「架橋剤」という用語は、分子を一緒に共有的に結合するために、類似のまたは異類の分子上の分子基間に化学結合を形成し得る化合物を記載するために用いられる。一般架橋剤の例は、当該技術分野で既知である。例えば、Bioconjugate  Techniques  (Academic  Press,  New  York,  1996  またはその後のバージョン)（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）を参照。生体分子と一価発色性ポリマードットとの間接的結合は、「リンカー」分子、例えばアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ビオチン等の分子の使用を介して起こり得る。
【００４０】
本明細書中で用いる場合、「抗体」は、光源を特異的に結合し、認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認識免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはεとして分類され、これらは順次、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ定義する。典型的には、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性および親和性において最も重要である。抗体は、血清由来のポリクローナルまたはモノクローナル、ハイブリドーマであるかまたは組換え的にクローン化され得るし、キメラ、霊長類化またはヒト化もされ得る。
【００４１】
例示的免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、２つの同一対のポリペプチド鎖からなり、各鎖は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を限定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。
【００４２】
抗体は、例えば無傷免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化により産生される多数の十分に特性化された断片として存在する。したがって、例えばペプシンは、抗体をヒンジ領域でジスルフィド結合以下に消化して、Ｆ（ａｂ）’２を産生するが、これは、それ自体がジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１と連結される軽鎖であるＦａｂの二量体である。Ｆ（ａｂ）’２は、低刺激性条件下で還元されて、ヒンジ領域のジスルフィド結合を壊し、それによりＦ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に転化し得る。Ｆａｂ’単量体は、本質的には、ヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（Fundamental  Immunology  (Paul  ed.,  3d  ed.  1993)参照）。種々の抗体断片が無傷抗体の消化に関して限定されるが、このような断片は、化学的にまたは組換えＤＮＡ法を用いてde  novoで合成され得る、と当業者は理解する。したがって、抗体という用語は、本明細書中で用いる場合、全体抗体の修飾により産生さえる抗体断片、あるいは組換えＤＮＡ法を用いてde  novoで合成されるもの（例えば一本鎖Ｆｖ）またはファージ表示ライブラリーを用いて同定されるもの（例えばMcCafferty  et  al.,  Nature,  348:552-554  (1990)参照）も包含する。
官能化発色性ポリマードット
【００４３】
本発明は、一態様において、コアおよびキャップを含む官能化発色性ポリマードットを提供する。「コア」は、少なくとも１つの発色性ポリマーを含有する。「キャップ」は、官能化剤を含む。官能化剤は、物理的会合または化学結合により発色性ポリマーのコアと結合され、そして生体共役のための発色性ポリマー上の表面官能基を提供する。別の実施形態では、官能化発色性ポリマードットは、まさに、生体共役を促す官能基と共有的に結合されるコアを含む。
【００４４】
一態様では、本発明は、コアおよびキャップを含む官能化発色性ポリマードット（Ｐドット）を提供するが、この場合、上記コアは発色性ポリマーを含み、上記キャップは１つ以上の官能基を保有する官能化剤を含むが、但し、上記キャップのすべてが有機ケイ酸塩であるというわけではない。具体的一実施形態では、キャップは有機ケイ酸塩を含まない。
【００４５】
一実施形態では、本発明は、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲のサイズの発色性ポリマーのコア、および両親媒性官能化層を含む官能化発色性ポリマードットを提供し、この場合、疎水性部分は疎水性相互作用によりポリマードットのコアに恒久的に固定され、親水性官能基、例えばカルボン酸はさらなる生体共役のために溶液中に広がる。
【００４６】
具体的一実施形態では、本発明は、疎水性コアおよび親水性キャップを有する官能化発色性ポリマードット（Ｐドット）であって、Ｐドットが、（ａ）発色性ポリマー；ならびに
（ｂ）疎水性部分および反応性官能基と結合される親水性部分を有する両親媒性分子
を含み、発色性ポリマーがＰドットの疎水性コア内に包埋され；そして両親媒性分子の一部分がＰドットのコア内に包埋されて、反応性官能基が親水性キャップ中に位置するポリマードットを提供する。好ましい一実施形態では、発色性ポリマーは半導電性ポリマーである。
【００４７】
本明細書中で提供される発色性ポリマーの一実施形態では、反応性官能基は、カルボキシル、アミノ、メルカプト、アジド、アルキン、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボニル、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、シアネート、スクシンイミジルエステルおよびその誘導体からなる群から選択される。具体的一実施形態では、反応性官能基は、アルキン含有部分、アジド含有部分、またはクリックケミストリー反応により分子と共役され得る他の部分である。
【００４８】
一実施形態では、発色性ポリマーは、半導電性ポリマーである。多数の半導電性ホモポリマーが当該技術分野で既知であり、例としては、フルオレンポリマー、フェニレンビニレンポリマー、フェニレンポリマー、フェニレンエチニレンポリマー、ベンゾチアゾールポリマー、チオフェンポリマー、カルバゾールフルオレンポリマー、ホウ素−ジピロメテンベースのポリマーおよびその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。一般的半導電性ポリマーおよびそれらの略号の一覧を、表１に示す。
【表１】
2013511700.tif 000003
【００４９】
別の実施形態では、発色性ポリマーは、少なくとも２つの異なる発色性単位を含む半導電性コポリマーである。例えば、発色性コポリマーは、所定比で存在するフルオレンおよびベンゾチアゾール発色性単位の両方を含有し得る。半導電性コポリマーを合成するために用いられる典型的発色性単位としては、フルオレン単位、フェニレンビニレン単位、フェニレン単位、フェニレンエチニレン単位、ベンゾチアゾール単位、チオフェン単位、カルバゾールフルオレン単位、ホウ素−ジピロメテン単位およびその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。異なる発色性単位は、ブロックコポリマーにおけるように分離されるか、または混ぜ合わせられ得る。本明細書中で用いる場合、発色性コポリマーは、大発色性種の同一性を書き入れることにより表される。例えば、ＰＦＢＴは、フルオレンおよびベンゾチアゾール単位を一定比率で含有する発色性ポリマーである。いくつかの場合、ダッシュを用いて小発色性種のパーセンテージを、次いで、小発色性種の同一性を示す。例えば、ＰＦ−０．１ＢＴは、９０％ＰＦおよび１０％ＢＴを含有する発色性コポリマーである。
【００５０】
他の実施形態では、発色性ポリマードットは、半導電性ポリマーの、を含む。、は、発色性ホモポリマー、コポリマーおよびオリゴマーの任意の組合せを包含し得る。結果的に生じるポリマードットの特性を調整するために、例えばポリマードットに関する所望の励起または発光スペクトルを達成するために、ポリマードットを生成するために用いられる発色性ポリマー、が選択され得る。
【００５１】
本明細書中で提供される発色性ポリマードットの一実施形態では、官能化剤は両親媒性分子である。ある実施形態では、両親媒性分子は、官能基で修飾された発色性ポリマーである。例えば、一実施形態では、本発明は、疎水性コアおよび親水性キャップを有する官能化発色性ポリマードット（Ｐドット）であって、Ｐドットが（ａ）第一半導電性ポリマー；および（ｂ）反応性官能基と結合される第二半導電性ポリマーを含み、第一半導電性ポリマーがＰドットの疎水性コア内に包埋され、第二半導電性ポリマーの一部分がＰドットのコア内に包埋され、そして反応性官能基が親水性キャップに（すなわち、Ｐドットの表面に）位置する官能化発色性ポリマードットを提供する。
【００５２】
別の実施形態では、両親媒性分子は、非発色性分子、例えば非発色性ポリマー、脂質、炭水化物、または反応性官能基で修飾されるその他の非発色性分子である。例えば、一実施形態では、本発明は、疎水性コアおよび親水性キャップを有する官能化発色性ポリマードット（Ｐドット）であって、Ｐドットが（ａ）半導電性ポリマー；および（ｂ）疎水性部分および反応性官能基と結合される親水性部分を有する両親媒性分子を含み、半導電性ポリマーがＰドットの疎水性コア内に包埋され、両親媒性分子の一部分がＰドットのコア内に包埋され、そして反応性官能基が親水性キャップに（すなわち、Ｐドットの表面に）位置する官能化発色性ポリマードットを提供する。
【００５３】
具体的一実施形態では、両親媒性ポリマーは、両親媒性櫛型ポリマー、例えばポリスチレンベースの櫛型両親媒性ポリマーまたはポリ（メチルメタクリレート）ベースの櫛型ポリマーである。別の具体的実施形態では、両親媒性ポリマーはポリ（スチレン−コ−無水マレイン酸）（ＰＳＭＡ）である。
【００５４】
具体的一実施形態では、両親媒性ポリマーは、ポリスチレンベースの櫛型ポリマーである。ポリスチレンベースの櫛型ポリマーの非限定例としては、ポリスチレングラフトアクリル酸、カルボキシで官能化されるポリスチレングラフトエチレンオキシド、アミンで官能化されるポリスチレングラフトエチレンオキシド、チオールで官能化されるポリスチレングラフトエチレンオキシド、スクシンイミジルエステルで官能化されるポリスチレングラフトエチレンオキシド、アジドで官能化されるポリスチレングラフトエチレンオキシド、アルキンで官能化されるポリスチレングラフトエチレンオキシド、シクロオクチンで官能化されるポリスチレングラフトエチレンオキシド、エステルで官能化されるポリスチレングラフトエチレンオキシド、ホスフィン、ポリスチレングラフトブチルアルコールなどが挙げられる。具体的一実施形態では、両親媒性ポリマーはポリエチレングリコールグラフト化ポリスチレンである。さらに具体的な一実施形態では、両親媒性ポリマーのポリエチレングリコール部分は、１つ以上のカルボキシル基と結合される。別の具体的実施形態では、両親媒性ポリマーはポリ（スチレン−コ−無水マレイン酸）である。
【００５５】
別の実施形態では、両親媒性ポリマーはポリ（メチルメタクリレート）ベースの櫛型ポリマーである。ポリ（メチルメタクリレート）ベースの櫛型ポリマーの非限定例としては、ポリ（メチルメタクリレート）グラフトアクリル酸、カルボキシで官能化されるポリ（メチルメタクリレート）グラフトエチレンオキシド、アミンで官能化されるポリ（メチルメタクリレート）グラフトエチレンオキシド、チオールで官能化されるポリ（メチルメタクリレート）グラフトエチレンオキシド、スクシンイミジルエステルで官能化されるポリ（メチルメタクリレート）グラフトエチレンオキシド、アジドで官能化されるポリ（メチルメタクリレート）グラフトエチレンオキシド、アルキンで官能化されるポリ（メチルメタクリレート）グラフトエチレンオキシド、シクロオクチンで官能化されるポリ（メチルメタクリレート）グラフトエチレンオキシド、エステルで官能化されるポリ（メチルメタクリレート）グラフトエチレンオキシド、ホスフィンで官能化されるポリ（メチルメタクリレート）グラフトエチレンオキシド等が挙げられる。
【００５６】
さらに別の実施形態では、両親媒性ポリマーは、カルボキシル、アミン、チオール、エステル、スクシンイミジルエステル、アジド、アルキン、シクロオクチンおよび／またはホスフィン基を含む櫛型ポリマーである。
【００５７】
いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、両親媒性コポリマー、例えば（１）ポリ（（メト）アクリル酸）ベースのコポリマー、例えば：ポリ（アクリル酸−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸−ｂ−メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ｎ−ブチルアクリレート−ｂ−アクリル酸）、ポリ（アクリル酸ナトリウム−ｂ−メチルメタクリレート）、ポリ（メタクリル酸−ｂ−ネオペンチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート−ｂ−アクリル酸）、ポリ（メチルメタクリレート−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（メチルメタクリレート−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（メチルメタクリレート−ｂ−アクリル酸ナトリウム）、ポリ（メチルメタクリレート−ｂ−メタクリル酸ナトリウム）、ポリ（ネオペンチルメタクリレート−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（ｔ−ブチルメタクリレート−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸−ｂ−アクリル酸）；（２）ポリジエンベースのコポリマー、例えば：ポリ（ブタジエン（１，２付加）−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（ブタジエン（１，２付加）−ｂ−メチルアクリル酸、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−アクリル酸）、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−エチレンオキシド、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−アクリル酸ナトリウム）、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−Ｎ−メチル４−ビニルヨウ化ピリジニウム）、ポリ（イソプレン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（イソプレン−ｂ−エチレンオキシド）およびポリ（イソプレン−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルヨウ化ピリジニウム）；（３）ポリ（エチレンオキシド）ベースのコポリマー、例えば：ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリル酸）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ブチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ε−カプロラクトン）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ラクチド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ラクチド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メチルアクリレート）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メチルメタクリレート）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ニトロベンジルメタクリレート）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−プロピレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ｔ−ブチルアクリレート）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ｔ−ブチルメタクリレート）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−テトラヒドロフルフリルメタクリレート）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−２−エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−２−メチルオキサゾリン）；（４）ポリイソブチレンベースのコポリマー、例えばポリ（イソブチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（イソブチレン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（イソブチレン−ｂ−メタクリル酸）；（５）ポリスチレンベースのコポリマー、例えば  ポリ（スチ��ン−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−セシウムアクリレート）、ポリ（スチレン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（スチレン−ｂ−エチレンオキシド）酸（ブロック接合部で切断可能）、ポリ（スチレン−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（スチレンスルホン酸−ｂ−メチルブチレン）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルヨウ化ピリジニウム）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−メチル−４−ビニルヨウ化ピリジニウム）、ポリ（スチレン−ｂ−プロピルアクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸ナトリウム）、ポリ（スチレン−ｂ−メタクリル酸ナトリウム）、ポリ（ｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（スチレン−コ−ｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（スチレン−コ−ｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−メチルブチレン−コ−イソプレンスルホネート）；（６）ポリシロキサンベースのコポリマー、例えばポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−メタクリル酸）；（７）ポリ（フェロセニルジメチルシラン）ベースのコポリマー、例えばポリ（フェロセニルジメチルシラン−ｂ−エチレンオキシド）；（８）ポリ（２−ビニルナフタレン）ベースのコポリマー、例えばポリ（２−ビニルナフタレン−ｂ−アクリル酸）、（９）ポリ（ビニルピリジンおよびＮ−メチルビニルヨウ化ピリジニウム）ベースのコポリマー、例えばポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−メチルアクリル酸）、ポリ（Ｎ−メチル２−ビニルヨウ化ピリジニウム−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（Ｎ−メチル４−ビニルヨウ化ピリジニウム−ｂ−メチルメタクリレート）、ポリ（４−ビニルピリジン−ｂ−エチレンオキシド）ＰＥＯ末端官能性ＯＨ；（１０）ポリ（ビニルピロリドン）ベースのコポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン−ｂ−Ｄ／Ｌ−ラクチド）等である。
【００５８】
一実施形態では、発色性ポリマーを官能化するために用いられる両親媒性ポリマーの親水性部分は、水溶性ポリマー、例えばポリアルキレングリコール(例えば、ＰＥＧ)、ＰＥＯ、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、デンプン、ポリ−炭水化物、ポリシアル酸等である。一実施形態では、水溶性ポリマーはポリアルキレングリコールである。さらに具体的な一実施形態では、水溶性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００５９】
一実施形態では、発色性ポリマーを官能化するために用いられる両親媒性ポリマーの疎水性部分は、疎水性ポリマーである。用いられ得るポリマーの非限定例としては、ポリ（メト）アクリレートポリマー、ポリアクリルアミドポリマー、ポリイソブチレン、ポリジエン、ポリフェニレン、ポリエチレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリウレタン、そのブロックコポリマー、そのランダムまたは代替コポリマー等が挙げられる。
【００６０】
多数の因子、例えば所望レベルの官能化、所望の分光測光特性、および意図された用途によって、本明細書中で提供されるような官能化発色性ポリマードット中の両親媒性分子対発色性ポリマーの重量比は、約０．０１％〜約５０％の範囲である。好ましい一実施形態では、両親媒性分子対発色性ポリマーの重量比は、約５％〜約２０％である。さらに他の実施形態では、両親媒性分子対発色性ポリマーの重量比は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％または約５０％以下である。具体的一実施形態では、両親媒性分子対発色性ポリマーの重量比は約２５％以下である。
【００６１】
一実施形態では、本明細書中で提供される発色性ポリマーは、蛍光色素、無機発光物質、磁気物質、ならびにポリマードットのコア内に包埋される金属からなる群から選択される構成成分をさらに含む。
【００６２】
さらに他の実施形態では、本明細書中で提供されるような発色性ポリマーは、１つ以上の非反応性化学基とさらに共役され得る。このようにして、ポリマードットの表面の非反応性化学基の存在は、ポリマードットの表面と他の分子、例えばタンパク質との間の非特異的会合を低減し、および／または排除する。一実施形態では、非反応性化学基は、水溶性ポリマー、例えばポリアルキレングリコール(例えば、ＰＥＧ)、ＰＥＯ、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、デンプン、ポリ−炭水化物、ポリシアル酸等である。一実施形態では、水溶性ポリマーはポリアルキレングリコールである。さらに具体的な一実施形態では、水溶性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００６３】
本明細書中に記載される官能化スキームを用いて、ストレプトアビジンおよび／または抗体と、異なる型のＰドット、例えばWu  et  al.  (Wu,  C.;  Bull,  B.;  Szymanski,  C.;  Christensen,  K.;  McNeill,  J.  ACS  Nano  2008,  2,  2415-2423)に記載される５つのＰドットとの共役が首尾よく達成されている。
【００６４】
本発明は、他の態様および実施形態の中でも特に、単一粒子画像処理、細胞性標識およびフローサイトメトリー用途のための官能化ＰＦＢＴドットを提供する。官能化ＰＦＢＴドットは、４６０ｎｍ辺りの相対的に広範な吸収ピークを示し、これは蛍光顕微鏡およびレーザー励起のために好都合な波長領域である。〜１０ｎｍ直径ＰＦＢＴドットからの吸収および蛍光スペクトルの解析は、１．５×１０７Ｍ−１ｃｍ−１のピーク消光係数、ならびに０．３０の蛍光量子収量を示した。ＰＦＢＴドットの光物理学的特性を、Invitrogenから購入した２つの広範に用いられるプローブ：Ｑドット５６５および蛍光ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（〜６色素分子／ＩｇＧ）の特性とともに、表２に要約する。これら２つの市販のプローブが選択されたのは、それらがＰＦＢＴドットの場合と同様の波長領域での発光を示すためであった。Ｐドットが多重エミッターを含有し、したがって、Ｐドットの寿命はＱドットの〜５０分の１であるが、しかしＰドットの発光速度はＱドットより３桁速い、ということに留意することは重要である（同上参照）。
【表２】
2013511700.tif 000004
【００６５】
表２に示したＡｌｅｘａ４８８およびＱドット５６５に関するデータは、Invitrogenにより提供されるプローブ仕様書に従っている。Ａｌｅｘａ４８８のパラメーターは、単一色素分子に関するものである。ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８プローブは、１２ｎｍの流体力学的直径を有し、平均６つの色素分子を含有するが、しかしその輝度は、自己消光のために〜２−４つの色素分子に対応する。ＰＦＢＴドットの蛍光寿命は、ＴＣＳＰＣ設定により測定した。単一ＰＦＢＴドットが多重エミッターを含有ウシ、これは蛍光寿命単独から予測されるものより高い光子発光速度を生じる、ということにも注目。
「コア」
【００６６】
一実施形態では、発色性ポリマードットのコアは、非局在性パイ電子を有する発光半導電性ポリマーを含む。「半導電性ポリマー」という用語は、当該技術分野で認知されている。典型的発光半導電性ポリマーとしては、フルオレンポリマー、フェニレンビニレンポリマー、フェニレンポリマー、フェニレンエチニレンポリマー、ベンゾチアゾールポリマー、チオフェンポリマー、カルバゾールフルオレンポリマー、ホウ素−ジピロメテンベースのポリマー、そのポリマー誘導体、およびその任意の組合せを含むコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、発色性ポリマーは、発光性種としての小有機色素または金属錯体の単位と共有結合される半導電性ポリマーであり得る。このような発光性単位は、発光色を調整して、量子収量を増大し、発色性ポリマードットの光安定性を改良し得る。
【００６７】
好ましい一実施形態では、小有機色素または金属錯体は感知機能を有し、したがって、発色性ポリマードットに、付加的機能性、例えば酸素感知能力、イオン感知能力、グルコース感知能力、神経伝達物質感知能力、薬剤感知能力、代謝物質感知能力、タンパク質感知能力、シグナル伝達分子感知能力、毒素感知能力、ＤＮＡおよびＲＮＡ感知能力等を付加し得る。例えば、プラチナポルフィリンは、半導電性ポリマーと共有的に連結され、その結果生じる発色性ポリマードットは酸素センサーとして用いられ得る。別の実施形態では、発色性ポリマーは、光発色性色素の単位と共有結合される半導電性ポリマーであり得る。光発色性単位は、エネルギー移動アクセプターとして役立ち得る。適切な波長の発光時に、光発色性単位は、異なる吸収スペクトルを有する２つの構造型の間で可逆的転換を受ける。したがって、発色性ポリマードットの発光は、別の波長の光で変調されて、所望の光スイッチング能力を有する発色性ポリマードットを作製し得る。光スイッチングプローブは、当該技術分野で認知されているＰＡＬＭ、ＳＴＯＲＭ等のような超解像度画像処理技術のための特に有用である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、発色性ポリマードットのコアは、小有機色素分子、金属錯体、光発色性色素およびその任意の組合せの単位を含むポリマー、例えば光学的不活性ポリマー、例えば小有機色素、金属錯体、光発色性色素およびその任意の組合せと共有結合されるかグラフト化されるポリスチレンを含有する。これらの色素または金属錯体は感知機能を有し、したがって、発色性ポリマードットに、付加的機能性、例えば酸素感知能力、イオン感知能力、グルコース感知能力、神経伝達物質感知能力、薬剤感知能力、代謝物質感知能力、タンパク質感知能力、シグナル伝達分子感知能力、毒素感知能力、ＤＮＡおよびＲＮＡ感知能力等を付加し得る。
【００６９】
関連実施形態では、本明細書中で提供されるような発色性ポリマードットは、１つ以上のｐＨ感受性色素を含み得る。例えば、フルオレセインは、本明細書中で提供されるポリマードットの表面と共役され得る周知のｐＨ感受性色素である。一旦フルオレセインがポリマードットと共役されると、それは、ポリマードットのコア中に存在する発色性ポリマーとともに蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に加わり得る。溶液中に存在する場合、フルオレセイン共役発色性ポリマードットのＦＲＥＴ発光は、溶液のｐＨによって決まる。これは、本明細書中で提供される実施例３１で実証される。
【００７０】
同様に、一実施形態では、本発明は、溶液のｐＨを決定する方法であって、溶液をｐＨ感受性色素と共役された発色性ポリマードットと接触させるか、あるいはポリマードットのコア中に存在する発色性単位とともにＦＲＥＴに加わり得るポリマードットのコア内に包埋されたｐＨ感受性色素を有し、ポリマードットのコア中の発色性単位を励起して、ｐＨ感受性色素のＦＲＥＴ発光を検出するステップを包含する方法を提供する。
【００７１】
別の関連実施形態では、本明細書中で提供されるような発色性ポリマードットは、１つ以上の温度感受性色素を含み得る。例えば、ローダミンＢは、発色性ポリマードットのコア内に包埋されるか、または表面に官能化され得る周知の温度感受性色素である。一旦ポリマードットの疎水性コア内に包埋されると、それは、ポリマードットのコア中に存在する発色性ポリマーとともに蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に加わり得る。溶液中に存在する場合、ローダミンＢ共役発色性ポリマードットのＦＲＥＴ発光は、溶液の温度によって決まる。これは、本明細書中で提供される実施例３０で実証される。
【００７２】
同様に、一実施形態では、本発明は、溶液の温度を決定する方法であって、溶液を温度感受性色素と共役された発色性ポリマードットと接触させるか、あるいはポリマードットのコア中に存在する発色性単位とともにＦＲＥＴに加わり得るポリマードットのコア内に包埋された温度感受性色素を有し、ポリマードットのコア中の発色性単位を励起して、温度感受性色素のＦＲＥＴ発光を検出するステップを包含する方法を提供する。
【００７３】
コアは、単に、少なくとも２つの反復構造単位からなる半導電性ホモポリマー、半導電性コポリマーまたは半導電性オリゴマーであり得る。コアはさらにまた、同時に、半導電性ホモポリマー、半導電性コポリマーおよび／または半導電性オリゴマーのうちの２つ以上を含む。半導電性ポリマーまたはオリゴマーは、好ましくは、発光特性を有する。典型的発光ポリマーとしては、フルオレンポリマー、フェニレンビニレンポリマー、フェニレンポリマー、フェニレンエチニレンポリマー、ベンゾチアゾールポリマー、チオフェンポリマー、カルバゾールフルオレンポリマー、ホウ素−ジピロメテンベースのポリマー、そのポリマー誘導体、およびその任意の組合せを含むコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
コアは、偏光発光のような所望の特性を有するよう、他の光学的不活性ポリマー、例えばポリスチレンと物理的に混合されるかまたは化学的に架橋される、活性蛍光団としての半導電性ポリマーも含み得る。光学的不活性ポリマーは、所望の生体分子との共役のために官能基を含有し、したがって、当該生体分子と会合する能力を発色性ポリマーに与え得る。
【００７５】
コアは、付加的機能性、例えば酸素感知能力、イオン感知能力、グルコース感知能力、神経伝達物質感知能力、薬剤感知能力、代謝物質感知能力、タンパク質感知能力、シグナル伝達分子感知能力、毒素感知能力、ＤＮＡおよびＲＮＡ感知能力等を有するために、小有機色素、金属錯体、光発色性色素およびその任意の組合せと共有結合されるかまたはグラフト化される光学的不活性ポリマーのような他の発色性ポリマーと物理的に混合されるかまたは化学的に架橋される半導電性ポリマーも含み得る。コアは、発光色を調整して、量子収量および光安定性を改良し、そして付加的機能性、例えば磁気機能、プラスモン共鳴機能等を有するために、蛍光色素、無機発光物質、磁気物質、金属物質、からなる多の構成成分と物理的に混合されるかまたは化学的に架橋される半導電性ポリマーも含み得る。発色性ポリマードットのコアのサイズは変動し、約１ｎｍから約１０００ｎｍまでのサイズで調整され得る。図１は、フルオレンおよびベンゾチアゾール由来の発色性コポリマーＰＦＢＴの化学構造を示す。
「キャップ」
【００７６】
発色性ポリマードットのキャップは、物理的会合または化学結合により発色性ポリマーのコアと結合される官能化剤を含み、生体共役のために発色性ポリマードット上に表面官能基を提供する。好ましくは、官能化剤はポリマーであり、これは、発色性であり得るし、そうでない場合もある。例えば、官能化は、疎水性部分および１つ以上の官能基を含有する親水性部分を含む両親媒性ポリマーにより提供され得る。一実施形態では、疎水性部分は、疎水性相互作用により発色性ポリマードットのコア中に物理的に包埋され、一方、官能基を含有する親水性部分は生体共役のために溶液中に広がる。別の実施形態では、官能基を含有するポリマーを予備形成発色性ポリマーと化学的に会合して、官能化発色性ポリマードットを生成することが選択され得る。化学的会合は、任意数の化学結合相互作用、例えば共有結合、イオン結合、極性共有結合、水素結合または金属リガンド結合であり得る。
【００７７】
好ましくは、官能化剤は、少なくとも約１週間、凝集を引き起こすことなく、発色性ポリマードットの水溶性および安定性を保持するのを手助けし、さらに好ましくは、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、３年および５年に亘って溶液中で安定にさせる。
【００７８】
一実施形態では、官能化剤は、化学的会合、例えば共有結合、イオン結合、水素結合等により、発色性ポリマーのコアと結合される。官能化剤は、発色性ポリマーの主鎖または側鎖中の反応性部位と化学結合され得る。
【００７９】
別の実施形態では、官能化剤は、物理的会合により、発色性ポリマードットのコアに固定される。物理的会合は、一連の力、例えばファンデルワールス、静電気、パイスタッキング、疎水性、エントロピー力およびその組合せ（これらに限定されない）から生じ得る。好ましい一実施形態では、官能化剤は、疎水性部分および１つ以上の官能基を含有する親水性部分を含み得る。疎水性部分は疎水性相互作用により発色性ポリマードット中に物理的に包埋され、一方、官能基を含有する親水性部分は、生体共役のために溶液中に広がる。特定の一実施形態では、官能化剤は、生物学的存在物と直接または間接的に結合し得るビオチン、葉酸、フォレート、ファロイジン、またはペプチド、核酸、炭水化物等を含む任意の分子であり得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、官能化剤は、カルボン酸またはその塩、アミノ、メルカプト、アジド、アルキン、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボニル、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、シアネート、スクシンイミジルエステル、その置換誘導体またはその組合せのような官能基を含む小有機分子、界面活性剤または脂質分子である。概して、生体共役を可能にする任意の官能基が用いられ得る。このような基は、例えばBioconjugate  Techniques  (Academic  Press,  New  York,  1996  またはその後のバージョン)で、当業者が見出し得る。これらの分子は、発色性ポリマードットのコアと化学的または物理的に結合されて、生体共役のために発色性ポリマードット上に表面官能基を提供する。
【００８１】
別の実施形態では、官能化剤は、カルボン酸またはその塩、アミノ、メルカプト、アジド、アルキン、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボニル、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、シアネート、スクシンイミジルエステル、その置換誘導体またはその組合せのような官能基を含むポリマーである。概して、生体共役を可能にする任意の官能基が用いられ得る。このような基は、例えばBioconjugate  Techniques  (Academic  Press,  New  York,  1996  またはその後のバージョン)で、当業者が見出し得る。官能化ポリマーは、任意の化学結合または物理的力により発色性ポリマードットのコアと会合されて、生体共役のために発色性ポリマードット上に表面官能基を提供する。
【００８２】
好ましい一実施形態では、官能化剤は、疎水性部分、および１つ以上の官能基を含有する親水性部分を含む両親媒性ポリマーである。疎水性部分は疎水性相互作用により発色性ポリマードット中に物理的に包埋され、一方、官能基を含有する親水性部分は生体共役のために溶液中に広がる。
【００８３】
ある実施形態では、両親媒性ポリマーは、親水性官能基で修飾された疎水性発色性ポリマーである。例えば、一実施形態では、官能化発色性ポリマードット（Ｐドット）は疎水性コアおよび親水性キャップを有し、Ｐドットは、（ａ）第一疎水性半導電性ポリマー；および（ｂ）反応性官能基と結合される第二両親媒性半導電性ポリマーを含み、第一疎水性半導電性ポリマーＰドットの疎水性コア内に包埋され；第二半導電性ポリマーの一部分がＰドットのコア内に包埋され、そして反応性官能基が親水性キャップ中に（すなわち、Ｐドットの表面に）位置する。
【００８４】
別の実施形態では、官能化剤が強力な疎水性力によりポリマードットのコアに恒久的に固定され、親水性部分が生体共役のために溶液中に広がる官能基を含むよう、官能化剤は、疎水性部分の多重反復単位および親水性部分の多重反復単位を含む櫛型両親媒性ポリマーである。
【００８５】
両親媒性ポリマーの疎水性部分は、多数の芳香族環からなるポリマードットのコアとの疎水性結合を強化するために、アルキル基、さらに好ましくはアリール基であり得る。適切な親水性部分は、カルボン酸またはその塩、アミノ、メルカプト、アジド、アルキン、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボニル、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、シアネート、スクシンイミジルエステル、その置換誘導体またはその組合せにより官能化されうるポリアルキレングリコールであり得る。概して、生体共役を可能にする任意の官能基が用いられ得る。このような基は、例えばBioconjugate  Techniques  (Academic  Press,  New  York,  1996  またはその後のバージョン)で、当業者が見出し得る。望ましくは、本発明の官能化剤は、アリール基の多重単位およびポリアルキレングリコールと結合されるカルボン酸、アミノ、メルカプト、アジド、アルキン、アルデヒド、スクシンイミジルエステルまたはヒドロキシルの多重単位を含む両親媒性ポリマーである。図１は、カルボン酸で終結されるポリスチレングラフトエチレンオキシド（ＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）のような官能化剤の化学構造を示す。
生体直交型またはクリック型発色性ポリマードット
【００８６】
クリックケミストリーは、迅速、選択的であり、高収率を生じる強力な化学反応組を記述する（H.  C.  Kolb,  M.  G.  Finn,  K.  B.  Sharpless,  Angew.  Chem.  Int.  Ed.  2001,  40,  2004）。これらの反応のうち、最も認知されているのは、銅（Ｉ）触媒アジド−アルキン環状付加であって、これは、材料化学（J.  E.  Moses,  A.  D.  Moorhouse,  Chem.  Soc.  Rev.  2007,  36,  1249）から薬剤発見（H.  C.  Kolb,  K.  B.  Sharpless,  Drug  Discov.  Today  2003,  8,  1128）および化学生物学（Q.  Wang,  T.  R.  Chan,  R.  Hilgraf,  V.  V.  Fokin,  K.  B.  Sharpless,  M.  G.  Finn,  J.  Am.  Chem.  Soc.  2003,  125,  3192；A.  E.  Speers,  G.  C.  Adam,  B.  F.  Cravatt,  J.  Am.  Chem.  Soc.  2003,  125,  4686；J.  A.  Prescher,  C.  R.  Bertozzi,  Nat.  Chem.  Biol.  2005,  1,  13；N.  J.  Agard,  J.  M.  Baskin,  J.  A.  Prescher,  A.  Lo,  C.  R.  Bertozzi,  ACS  Chem.  Biol.  2006,  1,  644；およびE.  M.  Sletten,  C.  R.  Bertozzi,  Angew.  Chem.  Int.  Ed.  2009,  48,  6974）までの範囲の多様な領域に適用されてきた。
【００８７】
生物学的用途に関して、アジドおよびアルキン基はともに、任意のネイティブな生物学的官能基と相互作用しないため、生体直交型化学レポーターであると考えられる。その結果、これらの生体直交型レポーターは、細胞の生合成機構を用いて標的生体分子中に組入れられて、外因性プローブでその後タグ化され得る化学ハンドルを提供し得る。生体直交型化学レポーターは、遺伝的コード化タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と相補性であり、直接的遺伝的コード化を必要とせずに、生体分子をタグするための手段を提供する。これらのレポーターは、タンパク質だけでなくグリカン、脂質および核酸といった多数のクラスの生体分子を可視化するための強力なアプローチを提供する（Prescher  et  al.、上記）。さらに、ＧＦＰと異なり、生体直交型化学レポーターは、細胞の機能をさほど混乱させないと思われる小分子を基礎にしている。
【００８８】
クリックケミストリーによる生体直交型反応は、細胞環境の複雑さにもかかわらず、高感受性で、バックグラウンドノイズは低い。しかしながら、実際、感受性は、標的分子の存在量、化学レポーターの標識効率、ならびに外因性プローブの性能により制約を加えられる。ほとんどすべての場合、特に低存在量生体分子の長期追跡および高感度検出のために、明るく且つ光安定性のプローブが非常に望ましい。
【００８９】
蛍光ナノ粒子は、近年多くの注目を引きつけている。一般によく知られた量子ドット（Ｑドット）は、伝統的蛍光色素を上回る改良された輝度および光安定性を示す。しかしながら、クリックケミストリーの状況では、銅触媒は、Ｑドット蛍光を不可逆的に消光して、銅触媒クリックケミストリーを基礎にした種々の用途におけるそれらの有用性を妨げる（S.  Han,  N.  K.  Devaraj,  J.  Lee,  S.  A.  Hilderbrand,  R.  Weissleder,  M.  G.  Bawendi,  J.  Am.  Chem.  Soc.  2010,  132,  7838）。銅の細胞傷害性のため、銅無含有生体直交型アプローチ、例えばシュタウディンガー結紮および歪促進アジド−アルキン環状付加が、生細胞およびin  vivo用途のために開発されてきた（Agard  et  al.、上記）が、しかしこれらの反応は、時として、冗長な合成のために実行がより困難になり得る（Han  et  al.、上記）。Ｑドットは、銅無含有方法に用いられ得る（A.  Bernardin,  A.  Cazet,  L.  Guyon,  P.  Delannoy,  F.  Vinet,  D.  Bonnaffe,  I.  Texier,  Bioconjug.  Chem.  2010,  21,  583）が、この場合、銅により引き起こされるそれらの不安定性は問題ではない。しかしながら、重金属イオンの浸出により引き起こされるＱドットの固有の毒性は、依然として重大な関心事である。
【００９０】
半導電性ポリマードット（Ｐドット）は、新規クラスの超輝度蛍光プローブを表し、これは、クリックケミストリーベースの用途に関する両問題を克服し得る。従来の研究は、Ｐドットが異なる細胞性検定において細胞傷害性でなく、それらを生体系における研究のための魅力あるものにする、ということを示した。一態様では、本発明は、クリックケミストリーを含めたＰドットの生物学的用途に焦点を合わせる。Ｐドットは、Ｑドットより大層明るい蛍光プローブであり；Ｑドットの千倍速い発光速度を有し；そして光安定性で、「明滅」しない。しかしながら、生物学的用途に関しては、Ｐドットの有意の問題は、それらの表面化学および生物学的分子との共役に関する制御である。これは、生物学的研究におけるＰドットの広範囲に及ぶ採用を妨げてきた有意の難題である。
【００９１】
一態様では、本発明は、Ｐドット表面に官能基を作製することによりこの難題を克服する一般的方法を提供する。Ｐドットの生成は疎水性相互作用により駆動されるため、親水性官能基を有する親水性ポリマーの中にはナノ粒子生成中に単一ドットに共縮合されるものもある。両親媒性ポリマー上の親水性基は、生体分子との共役のためにＰドットを官能化するためのハンドルとして用いられ得る。一般的コポリマーであるポリ（スチレン−コ−無水マレイン酸）（ＰＳＭＡ）は、さらなる表面共役のためにＰドットを上首尾に官能化する、ということが判明した（図１４）。ＰＳＭＡは、抗範囲の分子量および無水マレイン酸含量で市販されているため、Ｐドット官能化のための優れた選択肢を提供する。
【００９２】
実施例１７で示すように、ＰＳＭＡは、高蛍光性半導電性ポリマーであるポリ［９，９−ジオクチルフルオレニル−２，７−ジイル）−コ−１，４−ベンゾ−｛２，１’−３｝−チアジアゾール）］（ＰＦＢＴ）から作られるＰドットを官能化するために用いられたが、しかし、この方法は任意の疎水性蛍光半導電性ポリマーに適用され得る。Ｐドット生成中、ＰＳＭＡ分子の疎水性ポリスチレン単位はＰドット粒子の内側に固定されたが、一方、無水マレイン酸単位はＰドット表面に位置し、水性環境中で加水分解されて、Ｐドット表面にカルボキシル基を生じたと思われる。本明細書中に示すように、カルボキシル基はさらなる表面共役を可能にする。
【００９３】
実施例２１に示すように、小色素分子に関して用いられる一般的濃度（典型的にはμＭ範囲）より低い桁数である非常に低いＰドット濃度（〜５０ｎＭ）が、生物学的標識用途のために用いられ得る。これらの結果は、クリックケミストリーによるＰドットタグ化が非常に特異的であり、すべての対照試料においてバックグラウンド標識を事実上全く伴わない、ということも示した。さらに、Ｐドットプローブは、糖タンパク質、ならびに異なる細胞株３Ｔ３繊維芽細胞で検出される新規合成タンパク質を検出するためにも用いられた。これらすべての場合に、Ｐドットはさらにまた、標的を特異的且つ効果的に標識下が、これは、この戦略が異なる細胞株において等しく効率的且つ上首尾であったことを実証する。
【００９４】
したがって、一実施形態では、本発明は、細胞性標的のクリックケミストリーベースの生体直交型標識化のために官能的分子をＰドットと共有結合する共役のための方法を提供する。これらの官能化Ｐドットは、例えば、生体直交型化学レポーターで代謝的に標識された哺乳動物細胞中の新規合成タンパク質および糖タンパク質を、選択的に標的にし得る。Ｐドットおよびクリックケミストリーを用いた非常に効率的、特異的且つ明るいタンパク質標識化は、種々の細胞性過程を可視化するためのこの方法の可能性を実証する。本明細書に記載される方法および組成物は、広範囲の細胞性研究および蛍光用途にＰドットが用いられるのを可能にする。
【００９５】
一実施形態では、本発明は、分子、好ましくは生体分子が、クリック反応による化学結合によってポリマードットと結合される発色性ポリマードット共役体を提供する。これを達成するために、クリックケミストリー反応に参加し得る第一官能基が、分子（例えば性体分子）中に工学処理される。例えば生体分子中にアジドを組み込むための魅力的アプローチは、代謝的標識化を基礎にしており、それにより、細胞の生合成機構を用いて、アジド含有生合成前駆体が生体分子中に組入れられる。次いで、第一官能基とのクリックケミストリー反応に参加し得る第二の相補的官能基が、本明細書中で提供されるような発色性ポリマードットと結合される。生体分子中の第一官能基とポリマードット上の相補的官能基との間の、クリックケミストリーによる反応は、ポリマードット生体共役体を形成する。
【００９６】
一実施形態では、有機アジドは、生体分子中で連結されるかまたは濃化される官能基として用いられる。相補的官能基としての末端アルキンが、ポリマードットと会合される。図２２（反応ｉ）に示したように、触媒として銅（Ｉ）を用いるアジドとアルキン基との間の［３＋２］環状付加は、ポリマードットと生体分子との間に安定なトリアゾール結合を形成させる。代替的には、アルキンは、環歪みにより活性化され得る。例えばシクロオクチンおよびそれらの誘導体は、触媒を必要とせずに室温でアジドと反応し得る。歪促進[３＋２]環状付加（図２２、反応ｉｉ）による生体共役は、細胞傷害性銅に対する要件を除去し、これは、生細胞およびin  vivo用途に特に適している。別の実施形態では、生体分子は、シュタウディンガー結紮（図２２、反応ｉｉｉ）によりポリマードットと共役され得る。「シュタウディンガー結紮」という用語は、当該技術分野で認知されており、これは、アミド結合を形成するためのホスフィンおよびアジド間の選択的反応を記述する。官能的ホスフィン基は、ポリマードットと会合されるかまたは共有結合される。生体分子におけるホスフィン基とアジド基との反応は、触媒を必要とせずにポリマードット生体共役体も形成する。クリックケミストリーおよびシュタウディンガー結紮は、遊離生体分子をポリマードットと共役させるために用いられ得る。アジド−、シクロオクチン−およびホスフィン官能化ポリマードットは、in  vitroまたはin  vivoでアジド含有生体分子を特異的に標的化するためにも用いられ得る。
【００９７】
したがって、一実施形態では、本発明は、コアおよびキャップを含む官能化発色性ポリマードット（Ｐドット）を提供するが、この場合、上記コアは、発色性ポリマーを含み、上記キャップは、クリックケミストリー反応を介して分子と共役され得る１つ以上の官能基を保有する官能化剤を含むが、但し、上記キャップのすべてが有機ケイ酸塩というわけではない。具体的一実施形態では、官能基は、アルキン、歪みアルキン、アジド、ジエン、アルケン、テトラジン、歪みアルケン、シクロオクチン、ホスフィン基、ならびにクリック反応および他の生体直交型反応のためのその他の基から選択される。
【００９８】
関連実施形態では、本発明は、疎水性コアおよび親水性キャップを有する官能化発色性ポリマードット（Ｐドット）であって、Ｐドットが、（ａ）半導電性ポリマー；ならびに（ｂ）疎水性部分およびクリックケミストリー反応を介して分子と共役され得る反応性官能基と結合される親水性部分を有する両親媒性分子を含み、半導電性ポリマーがＰドットの疎水性コア内に包埋され；そして両親媒性分子の一部分がＰドットのコア内に包埋されて、反応性官能基が親水性キャップ中に位置する官能化発色性ポリマードットを提供する。具体的一実施形態では、官能基は、アルキン、歪みアルキン、アジド、ジエン、アルケン、テトラジン、歪みアルケン、シクロオクチン、ホスフィン基、ならびにクリック反応および他の生体直交型反応のためのその他の基から選択される。
生体共役化発色性ポリマードット
【００９９】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載されるような官能化発色性ポリマードットおよび生体分子を含む生体共役体を提供するが、この場合、生体分子は、任意の適切な手段により直接または間接的にポリマードットと結合される。生体共役体は、生物学的粒子、例えばウイルス、細胞、生物学的または合成小胞、例えばリポソームと物理的または化学的に会合される上記のような官能化発色性ポリマードットも含む。
【０１００】
「生体分子」という用語は、合成または天然タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、アミノ酸、代謝物質、薬剤、毒素、核酸、ヌクレオチド、炭水化物、糖、脂質、脂肪酸等を記述するために用いられる。生体分子は、任意の適切な手段により、例えば任意の安定な物理的または化学的会合により、直接または間接的にポリマードットと結合され得る。望ましくは、生体分子は、１つ以上の共有結合を介して、官能化ポリマードットの親水性官能基と結合される。例えば、ポリマードットの官能基がカルボキシル基である場合、タンパク質生体分子は、タンパク質生体分子のアミン基でカルボキシル基を架橋することにより、ポリマードットと直接的に結合され得る。
【０１０１】
「架橋剤」という用語は、分子を一緒に共有結合するために、類似のまたは異類の分子上の分子基間に化学結合を形成し得る化合物を記述するために用いられる。本発明において、適切な架橋剤は、カルボキシル基をアミン基と結合するもの、例えば１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。一般的架橋剤の他の例は、当該技術分野で既知である。例えば、Bioconjugate  Techniques  (Academic  Press,  New  York,  1996またはその後のバージョン)参照。発色性ポリマードットとの生体分子の間接的結合は、「リンカー」分子、例えばアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ビオチン等の分子の使用により生じ得る。
【０１０２】
したがって、一実施形態では、本発明は、本明細書中で提供されるような疎水性コアおよび親水性キャップを有する官能化発色性ポリマードットを提供するが、この場合、生物学的分子は、親水性キャップ構造中に（すなわち、ポリマードットの表面に）存在する反応性官能基と共役される。
【０１０３】
一般的には、任意の当該生物学的分子は、本明細書中で提供される発色性ポリマードットと共役され、例としては、標的分子、エフェクター分子、阻害剤分子、画像処理分子等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明により提供される発色性ポリマードットと共役され得る例示的生物学的分子としては、合成または天然のタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、核酸、炭水化物、脂質、脂肪酸およびその組合せが挙げられる。
【０１０４】
具体的一実施形態では、本発明は、コアおよびキャップを含む官能化発色性ポリマードット（Ｐドット）を提供するが、この場合、上記コアは発色性ポリマーを含み、上記キャップは生物学的分子と共役される１つ以上の官能基を保有する官能化剤を含むが、但し、上記キャップのすべてが有機ケイ酸塩であるというわけではない。一実施形態では、生物学的分子は、合成タンパク質、天然タンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、核酸、炭水化物、脂質、脂肪酸およびその組合せから選択される。具体的一実施形態では、生物学的分子はポリペプチドである。一実施形態では、ポリペプチドは抗体またはその断片である。別の具体的実施形態では、生物学的分子は核酸である。一実施形態では、生物学的分子はアプタマーである。
【０１０５】
関連態様において、本発明は、疎水性コアおよび親水性キャップを有する官能化発色性ポリマードット（Ｐドット）であって、Ｐドットが、（ａ）半導電性ポリマー；ならびに（ｂ）生物学的分子と共役される反応性官能基を保有する両親媒性分子を含み、半導電性ポリマーがＰドットの疎水性コア内に包埋され；そして両親媒性分子の一部分がＰドットのコア内に包埋されて、反応性官能基および共役化生物学的分子が親水性キャップ中に（すなわち、ポリマードットの表面に）位置する官能化発色性ポリマードットを提供する。
【０１０６】
一実施形態では、生物学的分子を発色性ポリマードットと共役するために用いられる反応性官能基は、クリックケミストリー反応およびその他の生体直交型反応に参加し得る化学部分である。具体的一実施形態では、官能基は、アルキン含有部分、アジド含有部分およびホスフィン含有部分から選択される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、発色性ポリマードットは、「エフェクター部分」と共役される。エフェクター部分は、任意数の分子、例えば標識部分、例えば放射性標識または蛍光標識；ターゲッティング部分、例えば抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチドであり得るし；あるいは治療用部分であり得る。このような治療用部分としては、抗腫瘍薬、毒素、放射性作因、サイトカイン、抗体または酵素が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、本発明の発色性ポリマードットが、プロドラッグを細胞傷害性物質に添加する酵素と連結される実施形態を提供する。
【０１０８】
さらに他の実施形態では、本明細書中で提供されるような官能化発色性ポリマードットは、１つより多い型のエフェクター分子と共役される。例えば、一実施形態では、発色性ポリマードットは、ターゲッティング部分（例えば、抗体またはアプタマー）および治療用部分（例えば、抗腫瘍薬、毒素、放射性作因、サイトカイン、抗体または酵素）の両方と共役される。このようなものとして、本明細書中で提供される官能化発色性ポリマードットは、ポリマードットそれ自体の蛍光および治療用部分により、診断／画像処理ツールの両方として役立ち得る。
in  vivo用途のための発色性ポリマードット
【０１０９】
ナノ粒子ベースの診断および治療用作因は、臨床的腫瘍学およびその他の生物医学的研究に関するそれらの可能性のため、かなりの関心をひきつけてきた。万能ナノ構造は、in  vivo用途、例えば薬剤送達のための脂質および高分子ナノカプセル、磁気共鳴画像処理のための酸化鉄ナノ粒子、Ｘ線コンピューター断層撮影のための金ナノ粒子、蛍光画像処理のための量子ドット（Ｑドット）に関して実証されている。特に、有機分子ベースのナノカプセルは、薬剤封入および送達のための柔軟性小胞を提供する。しかしながら、それらは画像処理明暗比をめったに提供できず、一般的に、蛍光によるin  vivoモニタリングを可能にするための分子タグを必要とする。逆に、無機ナノ粒子は、それらの独特の特性のため、画像処理造影剤として主に用いられる。Ｑドットは、過去１０年間に生物学に転換された興味喚起中のナノテクノロジーの１つを表す。サイズ調整可能な発光はそれらを広範な生物学的標識化、画像処理および感知のための多色蛍光として魅力的にする。しかしながら、in  vivo適用に関しては、Ｑドットの固有の毒性は重大な関心を有し、これが、それらの最終的臨床的転換を妨げ得る。
【０１１０】
近年の際立った論文（Choi,  H.  S.  et  al.  Nature  Biotechnol.  25,  1165-1170  (2007)）において、潜在的臨床的有用性を有するナノ粒子を区別するための３つの判定基準が提唱された：（ｉ）迅速腎クリアランスを可能にするための＜５．５ｎｍの最終流体力学的直径（ＨＤ）；および／または（ｉｉ）完全に非毒性の構成成分を有する処方物；および／または（ｉｉｉ）掃去可能構成成分に対する生分解性。小ＨＤ（＜５．５ｎｍ）は効率的腎クリアランスを生じて、毒性作用を緩和し得る（同上）が、しかしこのようなサイズ限度は大半のナノ粒子系、特に量子ドットに関して大きな難題を有し（Choi,  H.  S.  et  al.  Nature  Nanotechnol.  5,  42-47  (2010))）、この場合、発光はサイズ依存性であり、水溶性のために封入層が必要とされる。したがって、生物学的に優しい材料を用いた明るい蛍光プローブの設計が、ヒト疾患の診断および処置に関連した多くのin  vivo用途のためには非常に望ましい。
【０１１１】
半導電性ポリマーは、有機高分子性を、半導体の独特の光学特性とともに併有する。蛍光ナノ粒子標識として半導電性ポリマーを適合させる動機付けは、多数の好ましい特質、例えば高い粒子当たり輝度、迅速発光速度および優れた光安定性に由来する。さらに、半導電性ポリマードット（Ｐドット）は、本質的に優しく且つ生体適合性である：細胞傷害性は、高濃縮ナノ粒子とともに数日間インキュベートした異なる細胞株で観察されなかった（Moon,  J.  H.  et  al.,  Angew.  Chem.  Int.  Ed.  46,  8223-8225  (2007);  and  Pu,  K.  Y.  et  al.,  Chemistry  of  Materials  21,  3816-3822  (2009)）。開発初期段階では未だであったが、Ｐドットは強い関心を引いてきた（例えば、Pecher,  J.  &  Mecking,  S.  Chem.  Rev.  Article  ASAP  (2010)；およびKaeser,  A.  &  Schenning,  A.  P.  H.  J.  Adv.  Mater.  22,  2985-2997  (2010)参照）。
【０１１２】
合成化学者を含めた研究者等は、発光色の調整（Abbel,  R.,  et  al.,  Chem.  Commun.,  1697-1699  (2009)、この記載内容は参照により本明細書中で援用される）、新規の製造方法の探究（Baier,  M.  C.  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  131,  14267-14273  (2009)、この記載内容は参照により本明細書中で援用される）、粒子表面の工学処理（Howes,  P.  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  132,  3989-3996  (2010)、この記載内容は参照により本明細書中で援用される）、磁気物質の封入（Howes,  P.  et  al.  J.  Am.  Chem.  Soc.  132,  9833-9842  (2010)、この記載内容は参照により本明細書中で援用される）、ならびに見張りリンパ節マッピングのための最初のin  vivo実験（Kim,  S.  et  al.  Chem.  Commun.  46,  1617-1619  (2010)、この記載内容は参照により本明細書中で援用される）といったような、生物医学的研究のためのナノ粒子の万能性および機能を改良するための種々の方法を開発してきた。あらゆる努力にもかかわらず、これらのポリマーベースの新規のプローブがin  vivoで悪性腫瘍に対して特異的に標的化され得るか否かは、依然として不明である。特異的腫瘍ターゲッティングは、任意のさらなる臨床的考察のための第一の必要前提条件である。一態様では、本発明は、in  vivo適用のために有用な発色性ナノ粒子のリガンド共役およびプローブ性能に関連したいくつかの難題を克服する。
【０１１３】
本明細書中で記載されるように、種々の半導電性ポリマーは、蛍光標識としての小Ｐドットを調製するために用いられ得る。特に、ポリフルオレン（ＰＦ）およびそれらの誘導体は、高蛍光量子収量ならびに優れた熱および化学的安定性を示す。ポリマー主鎖中に狭帯域ギャップ単量体を導入して（Hou,  Q.  et  al.  Macromol.  37,  6299-6305  (2004)；およびYang,  R.  Q.  et  al.  Macromol.  38,  244-253  (2005)、この記載内容は参照により本明細書中で援用される）、蛍光プローブを設計するための大きな柔軟性を示すことにより、青色から深赤色領域へのそれらの発光色の調整が有意に達成されてきた。しかしながら、蛍光量子収量は、特に深赤色領域において、狭帯域ギャップ単量体の濃度が増大されると、有意に低下する（上記参照）。交換条件として、少量の狭帯域ギャップ単量体のみがＰＦコポリマー中に組入れられて高蛍光量子収量を保持し、これが、紫外（ＵＶ）領域における相対的Ｐドットの目立った吸収を生じた（図２３）。これは、in  vivo適用のための重大な欠点である。
【０１１４】
上記の制限を克服するために、本発明は、Ｐドット中で起きる効率的粒子内エネルギー移動を利用するドナー・アクセプターポリマー配合物からなるナノ粒子を提供する（例えば、Wu,  C.  et  al.,  J.  Phys.  Chem.  C  112,  1772-1781  (2008)；およびWu,  C.  et  al.,  J.  Phys.  Chem.  B  110,  14148-14154  (2006)参照）。ポリマー配合物ドット（「ＰＢドット」）は、可視光吸収性ポリマー（ＰＦＢＴ）をドナーとして、そして効率的深赤色発光ポリマー（ＰＦ−０．１ＴＢＴ）をアクセプターとして用いることにより、調製された（ポリマー構造を図２４に示す）。ドナーおよびアクセプターポリマーは単一ドット中に密に詰め込まれるため、粒子内エネルギー移動はＰＦＢＴドナーの完全消光を生じ、アクセプターポリマー単独からの有効な蛍光を伴った（図２５Ｂ）。０．６という所定配合比（重量でのＰＦ−０．１ＴＢＴ対ＰＦＢＴ）で、ＰＢドットは、６００ｎｍまで延びる広範な可視吸光度、ならびに０．５２の量子収量を伴う効率的６５０ｎｍ発光を示す（図２５Ｃおよび２６Ａ）。
【０１１５】
配合戦略は、光吸収性ポリマーＰＦＰＶおよび異なる赤色発光ポリマーからなる他のポリマードナー・アクセプター系にも上手く適用されたが（図２７）、これは、Ｐドット特性を調整するためのその一般的適用を示す。近赤外（ＮＩＲ）領域で発光するＰドットは、実施例２９で示されるようなin  vivo画像処理のためにより好ましいが、しかし一般的ＰＢドットは同様のサイズ（直径〜１５ｎｍ）の種々のナノ粒子の間で深赤色領域で最も明るいプローブを表し、これが、生物学的組織におけるバックグラウンド自己蛍光および散乱を有意に克服し得る。
【０１１６】
したがって、一実施形態では、本発明は、深赤色偏移発光を有する発色性ポリマードットを提供する。一実施形態では、発色性ポリマードットは、ポリフルオレンポリマー（ＰＦ）およびフルオレン−ベンゾチアジアゾール−チオフェンコポリマー（ＰＦ−０．１ＴＢＴ）の配合物を含む。青色から深赤色領域に発光色を調整するために、狭帯域ギャップＴＢＴ単量体がポリフルオレン主鎖中に導入される（Hou,  Q.  et  al.  Macromol.  37,  6299-6305  (2004)；およびYang,  R.  Q.  et  al.  Macromol.  38,  244-253  (2005)参照）。ＴＢＴ単量体の濃度は、０．０１から０．５まで変えられ得る。有益であるのは、ＰＦＢＴおよびＰＦ−０．１ＴＢＴを含むこれらのポリマー配合物が、量子収量の有意の損失を伴わずに可視領域および深赤色蛍光における目立った吸収を生じることである。一般的に、配合物は、約２％〜約７５％のＰＦ−０．１ＴＢＴコポリマーを含有する。ある実施形態では、ＰＦ対ＰＦ−０．１ＴＢＴの比は、約５０：１以下、あるいは約４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、３：２、１：１、２：３、１：２または１：３以下である。具体的一実施形態では、ポリマー配合物は、ＰＦＢＴおよびＰＦ−０．１ＴＢＴを含む。好ましい一実施形態では、ポリマードットは、その表面に官能基を含む。
【０１１７】
具体的一実施形態では、疎水性コアおよび親水性キャップを有する深赤色偏移ポリマードットは、（ａ）ＰＦＢＴおよびＰＦ−０．１ＴＢＴ半導電性ポリマーの配合物；ならびに（ｂ）親水性部分および疎水性部分を有する両親媒性分子（反応性官能基と結合される）を含み、この場合、半導電性ポリマーはＰドットの疎水性コア内に包埋され；そして両親媒性分子の一部分はＰドットのコア内に包埋され、ならびに反応性官能基は親水性キャップ中（すなわち、ポリマードットの表面）に位置する。いくつかの実施形態では、ポリマードットは、エフェクター分子（例えば、ターゲッティング剤）とさらに共役される。一実施形態では、赤方偏移ポリマードットは、約６００ｎｍおよび約７００ｎｍ間（すなわち、深赤色領域）にピーク発光を有する。
【０１１８】
別の実施形態では、疎水性コアおよび親水性キャップを有する深赤色偏移ポリマードットは、（ａ）ＰＦＢＴポリマー；および（ｂ）ＰＦ−０．１ＴＢＴ半導電性ポリマーを含み、この場合、半導電性ポリマーの亜集団は反応性官能基を保有し、反応性官能基を保有しない半導電性ポリマーはＰドットの疎水性コア内に包埋され；そして反応性官能基を保有する半導電性ポリマーの一部分はＰドットのコア内に包埋され、ならびに反応性官能基は親水性キャップ中（すなわち、ポリマードットの表面）に位置する。いくつかの実施形態では、ポリマードットは、エフェクター分子（例えば、ターゲッティング剤）とさらに共役される。
【０１１９】
関連実施形態では、エフェクター分子、例えばターゲッティング部分と共役される深赤色偏移ポリマードットが提供される。一実施形態では、生体共役化発色性ポリマードットは、半導電性ポリマー（例えば、ＰＦ、ＰＦＢＴ、ＰＦＰＶ等）およびＰＦ−０．１ＴＢＴ半導電性ポリマーの配合物を含む。一般的に、配合物は、約２％〜約７５％のＰＦ−０．１ＴＢＴコポリマーを含有する。ある実施形態では、ＰＦ対ＰＦ−０．１ＴＢＴの比は、約５０：１以下、あるいは約４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、３：２、１：１、２：３、１：２または１：３以下である。具体的一実施形態では、ポリマー配合物は、ＰＦＢＴおよびＰＦ−０．１ＴＢＴを含む。別の具体的実施形態では、ポリマー配合物は、ＰＦＰＶおよびＰＦ−０．１ＴＢＴを含む。
【０１２０】
別の態様では、本発明は、近赤外（ＮＩＲ）蛍光発光を有する発色性ポリマードットを提供する。本明細書中で用いる場合、「近赤外発光」は、約７００ｎｍ〜約１５００ｎｍの波長を有する電磁放射を指す。実施例２９で示されるように、ＮＩＲ蛍光発光は、本明細書中で提供される発色性ポリマードットの疎水性コア中にＮＩＲ色素を包埋することにより達成され得る。多数のＮＩＲ蛍光色素が当該技術分野で既知であり、例えば、シアニン色素は、最も一般的に用いられる近ＩＲ蛍光色素である。他のＮＩＲ色素ファミリーとしては、オキサジン、ローダミンおよびフタロシアニン色素が挙げられる。励起後にＮＩＲ発光を達成するために、ＮＩＲ  Ｐドットは、Ｐドットを含む発色性ポリマーと、分子の疎水性コア内に包埋されるＮＩＲ色素との間の効率的分子間ＦＲＥＴを利用する。したがって、ＮＩＲ  Ｐドットの調製のために用いられるべきＮＩＲ色素を選択する場合、重複する発光および励起スペクトルを有する発色団（すなわち、適切な発色性ポリマーＦＲＥＴドナーおよびＮＩＲ色素ＦＲＥＴアクセプター）を選択するよう注意しなければならない。好ましい一実施形態では、ＮＩＲポリマードットは、その表面でさらに官能化される。
【０１２１】
したがって、一実施形態では、ＮＩＲポリマードットはコアおよびキャップを含み、この場合、上記コアは発色性ポリマーおよびＮＩＲ色素を含み、そして上記キャップは１つ以上の官能基を保有する官能化剤を含むが、但し、上記キャップのすべてが有機ケイ酸塩であるというわけではない。一実施形態では、ポリマードットは、エフェクター分子（例えば、ターゲッティング剤）とさらに共役される。
【０１２２】
関連実施形態では、疎水性コアおよび親水性キャップを有するＮＩＲポリマードットは、（ａ）半導電性ポリマー；（ｂ）ＮＩＲ色素；および（ｃ）疎水性部分および反応性官能基と結合される親水性部分を有する両親媒性分子を含み、この場合、半導電性ポリマーおよびＮＩＲ色素はＰドットの疎水性コア内に包埋され；そして両親媒性分子の一部分はＰドットのコア内に包埋され、ならびに反応性官能基は親水性キャップ中に位置する。一実施形態では、ポリマードットは、エフェクター分子（例えば、ターゲッティング剤）とさらに共役される。
発色性ポリマードットの製造方法
【０１２３】
一態様では、本発明は、発色性ナノ粒子（すなわち、発色性ポリマードットまたは「Ｐドット」）の表面を官能化するための新規の方法を提供する。一実施形態では、当該方法は、異種ポリマー鎖が、ナノ粒子形成中に確立される疎水性相互作用により単一Ｐドット中に捕捉される。少量の両親媒性ポリマーがＰドットの半導電性ポリマーと共縮合されて、ナノ粒子表面を改質し、官能化する。
【０１２４】
図１は、官能性、両親媒性、櫛型、ポリスチレンポリマーＰＳＰＥＧ−ＣＯＯＨを用いることによる一例を示すが、しかしながら、異なる官能基を有する他の両親媒性ポリマーも用いられ得る。ＰＳＰＥＧ−ＣＯＯＨは、疎水性ポリスチレン主鎖、ならびにカルボン酸で終結されるエチレンオキシドのいくつかの親水性側鎖からなる。ナノ粒子形成中、疎水性ポリスチレン主鎖はＰドット粒子の内側に包埋されるが、一方、親水性ＰＥＧ鎖および官能基は水性環境中に外側に延びる。したがって、物理的吸着と違って、この方法は、Ｐドット表面にＰＥＧおよび官能基を恒久的に固定するはずである。ＰＥＧ鎖は、非特異的吸収を最小限にする生体適合性層を提供する。ＰＥＧ鎖はナノ粒子凝集に対する立体バリアとしても作用するが、一方、官能性カルボキシル基は、確立されたプロトコールを用いて生体分子と容易に共有結合され得る（例えば、Xing,  Y.;  Chaudry,  Q.;  Shen,  C.;  Kong,  K.  Y.;  Zhau,  H.  E.;  WChung,  L.;  Petros,  J.  A.;  O'Regan,  R.  M.;  Yezhelyev,  M.  V.;  Simons,  J.  W.;  Wang,  M.  D.;  Nie,  S.  Nature  Protoc.  2007,  2,  1152-1165参照、この記載内容は参照により本明細書中で援用される）。
【０１２５】
好ましい一実施形態では、発色性ポリマードットは、沈降により調製される。この技法は、過剰容積の非溶媒（しかし、有機溶媒と混和性）、例えば水または別の生理学的関連水溶液中への希釈発色性ポリマー溶液（例えば、有機溶媒中に溶解された発色性ポリマー）の迅速付加（例えば、音波処理または激しく撹拌することにより助長される）を包含する。例えば、いくつかの実施形態では、疎水性発色性ポリマーは、先ず、溶解度が良好である有機溶媒（良溶媒）、例えばＴＨＦ（テトラヒドロフラン）中に溶解され、その後、ＴＨＦ中の溶解ポリマーは、過剰容積の水または緩衝溶液（これは、疎水性発色性ポリマーに関しては貧溶媒であるが、しかしこれは良溶媒（ＴＨＦ）と混和性である）に付加される。その結果生じる混合物は、音波処理されるかまたは激しく撹拌されて、発色性ポリマードットの形成を助け、次いで、有機溶媒が除去されて、その後に、良好に分散された発色性ナノ粒子が残る。この手法を用いる場合、発色性ポリマーは有機溶媒（例えばＴＨＦ）中に溶解するのに十分に疎水性でなければならない。
【０１２６】
しかしながら、発色性ポリマードットを形成する他の方法も可能であり、例としては、エマルション（例えば、ミニまたはマイクロエマルション）または沈降物または濃縮物を基礎にした種々の方法が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、疎水性官能基は、それらが、例えば生体分子との共役に利用可能であるよう、ポリマードットの表面に位置し得る。一スキームでは、疎水性反応性官能基は、ポリマードットの親水性外面に対して官能基を保有する親水性リンカーと官能基を結合することにより、Ｐドットの表面に置かれる。この後者のアプローチは、疎水性およびクリック型（すなわち、クリックケミストリーのフレームワーク内である化学反応）の両方である官能基、例えばアルキン、歪みアルキン、アジド、ジエン、アルケン、シクロオクチンおよびホスフィン基（これらに限定されない）を用いて、特に良好に働き得る。
【０１２７】
したがって、好ましい一実施形態では、本発明は、半導電性ポリマーと、非プロトン溶媒中で溶媒和化される反応性官能基と結合される両親媒性分子との混合物を、プロトン溶媒を含む溶液中に導入することにより、官能化発色性ポリマードットを調製するための方法を提供する。一実施形態では、当該方法はさらに、懸濁液を濾過して、特定サイズのポリマードットの集団を単離することを包含する。
【０１２８】
具体的一実施形態では、発色性ポリマードットの調製方法は、（ａ）半導電性ポリマーと非プロトン溶媒中の反応性官能基と結合される両親媒性分子との混合物を調製するステップ；（ｂ）混合物の全部または一部をプロトン溶媒を含む溶液中に導入し（例えば、注入によって）、それにより半導電性ポリマーおよび両親媒性分子を潰してナノ粒子にするステップ；ならびに（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された混合物から非プロトン溶媒を除去し、それにより官能化発色性ポリマードットの懸濁液を生成するステップを包含するが、この場合、両親媒性分子の一部分はナノ粒子のコア内に包埋され、反応性官能基はナノ粒子の表面に位置する。一実施形態では、当該方法はさらに、懸濁液を濾過して、特定サイズのポリマードットの集団を単離することを包含する。
【０１２９】
具体的一実施形態では、両親媒性ポリマーはさらに、反応性官能基を介してエフェクター分子と共役された後、プロトン溶媒を含む溶液中に混合物が導入される。このアプローチは、非プロトン溶媒に耐える分子に関して働くが、しかしそうではない他の分子（例えばタンパク質）に関しては良好に働かない。この戦略の実現可能性の実証として、実施例３１は、反応性官能基を含有する両親媒性ポリマーが、先ず、ｐＨ感受性フルオレセインイソチオシアネート色素と共役され、次いで、半導電性ポリマーと配合されて、共役化ポリマードットを形成する場合を提供する。
【０１３０】
非プロトンおよびプロトン溶媒を含む混合物から非プロトン溶媒を除去するために、多数の技法が当該技術分野で既知であり、例としては、蒸留、窒素ストリッピング、ならびに種々のクロマトグラフィー技法（例えば、緩衝液交換クロマトグラフィー）が挙げられるが、これらに限定されない。非プロトン溶媒の沸点がプロトン溶媒の沸点より低い好ましい一実施形態では、非プロトン溶媒は、窒素ストリッピングにより、ステップ（ｂ）で形成された混合物から除去される。好ましい一実施形態では、プロトン溶媒は水である。
発色性ポリマードット生体共役体の調製方法
【０１３１】
本明細書中で記載されるように、本発明により提供される官能化発色性ポリマードットは、抗範囲の診断および実験的検定で用いられ得る安定な非毒性の蛍光プローブ（すなわちＰドット）との生物学的分子の容易な共役を可能にする。このようにして、分子、好ましくは生体分子は、ポリマードットの表面への吸着（例えば、静電または疎水性相互作用により媒介される）により、または直接的化学結合により、発色性ポリマーと結合され得る。
【０１３２】
本明細書中で用いる場合、「生体共役化ＣＰドット」または「生体共役化Ｐドット」は、任意の安定な物理的または化学的会合により安定的に結合される任意の生体分子を伴う発色性ポリマードットを指す。「生体共役」は、本出願においては、任意の安定な物理的または化学的会合により発色性ポリマードットと生体分子を共役する工程を指す。
１．  物理的吸着による生体共役
【０１３３】
生体分子は、物理的吸着により発色性ポリマードットと安定的に会合される。物理的吸着は、一連の力、例えばファンデルワールス、静電気、パイスタッキング、疎水性、エントロピー力およびその組合せ（これらに限定されない）から生じ得る。物理的吸着は、発色性ポリマードット上のキャップ構造、ならびに吸着されている標的分子（例えば、生体分子）の物理的および化学的特性によって媒介される。このようなものとして、親水性キャップを介してポリマードットと結合される官能基は、ポリマードット上に吸着され得る分子の型を決定する。
【０１３４】
したがって、一実施形態では、本発明は、疎水性コアおよび親水性キャップを含む生体共役化発色性ポリマードットを提供するが、この場合、上記コアは発色性ポリマーを含み、そして上記キャップは、生物学的分子が吸着される１つ以上の官能基を保有する官能化剤を含む。
【０１３５】
一実施形態では、生体共役化発色性ポリマードットは、半導電性ポリマーと非プロトン溶媒中で溶媒和化される反応性官能基と結合される両親媒性分子との混合物を、プロトン溶媒を含む溶液中に導入して、官能化発色性ポリマードットを調製し、次いで、ポリマードットの表面に生物学的分子を吸着させることにより調製される。一実施形態では、当該方法は、さらに、懸濁液を濾過して、特定サイズのポリマードットの集団を単離した後、ポリマードット上に生物学的分子を吸着させることを包含する。
【０１３６】
具体的一実施形態では、生体共役化発色性ポリマードットを調製するための方法は、（ａ）半導電性ポリマーと非プロトン溶媒中の反応性官能基と結合される両親媒性分子との混合物を調製するステップ；（ｂ）混合物の全部または一部をプロトン溶媒を含む溶液中に導入し（例えば、注入によって）、それにより半導電性ポリマーおよび両親媒性分子を潰してナノ粒子にするステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された混合物から非プロトン溶媒を除去し、それにより官能化発色性ポリマードットの懸濁液を生成するステップ（この場合、両親媒性分子の一部分はナノ粒子のコア内に包埋され、反応性官能基はナノ粒子の表面に位置する）；ならびに（ｄ）表面上に当該生体分子を吸着するステップを包含する。一実施形態では、当該方法はさらに、懸濁液を濾過して、特定サイズのポリマードットの集団を単離することを包含する。
２．  化学結合による生体共役
【０１３７】
好ましい一実施形態では、分子（例えば、生体分子）は、化学結合によりポリマードットと結合されるが、これは、ポリマードット上で利用可能である官能基、例えばカルボン酸、アミノ、メルカプト、アジド、アルキン、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボニル、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、シアネート、スクシンイミジルエステル、その置換誘導体またはその組合せを要する。概して、生体共役を可能にする任意の官能基が用いられ得る。このような基は、例えばBioconjugate  Techniques  (Academic  Press,  New  York,  1996  または第二版、2008；これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される)で、当業者が見出し得る。その場合、生体共役は、標準生体共役技法（同上）により実行され得る。
【０１３８】
したがって、一実施形態では、コアおよびキャップを含む生体共役化発色性ポリマードットを提供するが、この場合、上記コアは発色性ポリマーを含み、そして上記キャップは生物学的分子が共有結合される１つ以上の官能基を保有する官能化剤を含む。
【０１３９】
具体的一実施形態では、本発明は、疎水性コアおよび親水性キャップを有する生体共役化発色性ポリマードットであって、ポリマードットが（ａ）発色性ポリマー；および（ｂ）反応性官能基を介して生物学的分子と共役される両親媒性分子を含み、この場合、発色性ポリマーがＰドットの疎水性コア内に包埋され；そして、両親媒性分子の一部分がＰドットのコア内に包埋され、ならびに共役化生物学的分子が親水性キャップ中に（すなわち、ポリマードットの表面に）位置する生体共役化発色性ポリマードットを提供する。好ましい一実施形態では、発色性ポリマーは、半導電性ポリマーである。
２ａ．  発色性ポリマーの共有結合的修飾
【０１４０】
官能化ＣＰドットを作製するための一合成戦略は、二段階工程である：第一段階は、カルボン酸、アミノ、メルカプト、アジド、アルキン、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボニル、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、シアネート、スクシンイミジルエステル、その置換誘導体またはその組合せといったような官能基を保有する発色性ポリマーを合成することである。概して、生体共役を可能にする任意の官能基が用いられ得る。このような基は、例えばBioconjugate  Techniques  (Academic  Press,  New  York,  1996  または第二版、2008)で、当業者が見出し得る。官能基は、発色性ポリマーの主鎖または側鎖との共有結合で作製され得る。このような化学的修飾は、当業者に既知である。第二段階では、官能化発色性ポリマーは、ＣＰドット（生体共役のために利用可能な官能基を有する）を調製するための前駆体として用いられる。官能化発色性ポリマーからのＣＰドット調製は、２つの混和性溶媒の混合を基礎にした本出願で提供される方法を用い得る（実施例１）。官能化発色性ポリマーからのＣＰドット調製は、界面活性剤の存在下で、２つの非混和性液相（例えば、水および別の非混和性有機溶媒）を含む混合物を専断することを基礎にしたエマルションまたはミニエマルション法によっても達成され得る。剪断工程、例えば超音波処理は、懸濁液中に官能化発色性ポリマーを含有する安定液滴を作る。有機溶媒の除去後、官能化ＣＰドットが得られるが、これは、典型的には、２〜３ナノメートルからサブミクロンまでのサイズを有する。
【０１４１】
したがって、一実施形態では、本発明は、生体共役化発色性ポリマードットの調製方法であって、疎水性コア、および１つ以上の反応性官能基を保有する発色性ポリマーを伴う親水性キャップを有する発色性ポリマードットを形成すること（この場合、反応性官能基は親水性キャップ中（すなわち、ポリマードットの表面）に位置する）、そして反応性官能基との連結を介して生体分子をポリマードットと共有結合することを包含する方法を提供する。
【０１４２】
官能化ＣＰドットを作製する別の合成戦略は、発色性ポリマーの合成をナノ粒子形成と組合せる工程で実証され得る。発色性ポリマーを合成するための単量体単位および／または終結単位の一部分は、官能基、例えばカルボン酸、アミノ、メルカプト、アジド、アルキン、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボニル、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、シアネート、スクシンイミジルエステル、その置換誘導体またはその組合せを有する。概して、生体共役を可能にする任意の官能基が用いられ得る。このような基は、例えばBioconjugate  Techniques  (Academic  Press,  New  York,  1996  またはその後のバージョン)で、当業者が見出し得る。エマルションまたは他の方法により形成される場合、液滴は、発色性ポリマードットを合成するための単量体、官能性単量体および触媒を含有するマイクロまたはナノリアクターとして役立ち得る。この方法により獲られる発色性ポリマードットは、ナノメートルからミクロンまでのサイズの良好に制御されたサイズを示し、表面官能基、例えばカルボン酸、アミノ、メルカプト、アジド、アルキン、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボニル、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、シアネート、スクシンイミジルエステル、その置換誘導体またはその組合せを有すると予測される。その場合、生体共役は、標準生体共役技法により実行され得る[Bioconjugate  Techniques,  Academic  Press,  New  York,  1996]。
２ｂ．  官能化剤の配合
【０１４３】
代替的には、官能化ＣＰドットは、官能基を保有する１つ以上の両親媒性官能化剤の存在下で、１つ以上の発色性ポリマー（この多くが市販されている）を潰すことにより調製され得る。官能化剤の両親媒性は、分子の疎水性部分を圧潰ポリマードットの疎水性コア中に固定させ、一方、１つ以上の官能基を含有する分子の親水性部分は、ポリマードットの親水性キャップに位置する。ある実施形態では、官能化剤は、官能化された発色性ポリマーであり得る。他の実施形態では、官能化剤は、非発色性分子であり得る。
【０１４４】
本発明の発色性ポリマードットを官能化するために用いられ得る官能化剤の非限定例としては、カルボン酸またはその塩、アミノ、メルカプト、アジド、アルキン、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボニル、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、シアネート、スクシンイミジルエステル、その置換誘導体またはその組合せのような官能基を含む小有機分子、脂質分子およびポリマー分子が挙げられる。概して、生体共役を可能にする任意の官能基が用いられ得る。このような基は、例えばBioconjugate  Techniques  (Academic  Press,  New  York,  1996  または第二版、2008)で、当業者が見出し得る。これらの分子は、発色性ポリマードットのコアと化学結合および／または物理的力により会合されて、生体共役のために発色性ポリマードット上に表面官能基を提供する。
【０１４５】
好ましくは、官能化剤は、疎水性部分および官能基を含有する親水性部分を含む両親媒性ポリマーである。疎水性部分は、疎水性相互作用によりポリマードット中に物理的に包埋され、一方、親水性部分は、溶液中に広がる。ポリマードット中の疎水性部分のこの物理的包埋は、所望により、官能化剤の疎水性部分とポリマードットとの間の化学的会合の使用により、さらに助長され得る。さらに好ましくは、官能化剤が強力な疎水性力によりポリマードットに恒久的に固定され、親水性部分が生体共役のために溶液中に広がる官能基を含むよう、官能化剤は、疎水性部分の多重反復単位および親水性部分の多重反復単位を含む櫛型両親媒性ポリマーである。
【０１４６】
両親媒性官能化分子の疎水性部分は、多数の芳香族環からなる発色性ポリマードットとの疎水性結合を強化するために、例えばアルキル基、さらに好ましくはアリール基であり得る。親水性部分は、例えば、カルボン酸、アミノ、メルカプト、アジド、アルキン、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボニル、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、シアネート、スクシンイミジルエステル、その置換誘導体またはその組合せのような基によりさらに置換され得るポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールであり得る。概して、生体共役を可能にする任意の官能基が用いられ得る。このような基は、例えばBioconjugate  Techniques  (Academic  Press,  New  York,  1996  または第二版、2008)で、当業者が見出し得る。
【０１４７】
発色性ポリマーおよび官能化剤からの官能化ＣＰドットは、２つの混和性溶媒の混合を基礎にした本出願で提供される方法（実施例１）を用いることにより調製され得る。発色性ポリマーおよび官能化剤による官能化ＣＰドットは、界面活性剤の存在下で、２つの非混和性液相（例えば、水および別の非混和性有機溶媒）を含む混合物を専断することを基礎にしたエマルションまたはミニエマルション法によっても調製され得る。剪断工程、例えば超音波処理は、発色性ポリマーおよび官能化剤を含有する安定液滴を作る。有機溶媒の除去後、官能化ＣＰドットが得られるが、これは、典型的には、２〜３ナノメートルからサブミクロンまでのサイズを有する。これらの官能化ＣＰドットは、さらに生体共役され得る。
【０１４８】
したがって、一実施形態では、本発明は、（ｉ）疎水性コアおよび親水性キャップを有する官能化発色性ポリマードットを形成すること(ここで、Ｐドットは、（ａ）発色性ポリマー；ならびに（ｂ）疎水性部分および反応性官能基と結合される親水性部分を有する両親媒性分子を含み、この場合、発色性ポリマーはＰドットの疎水性コア内に包埋され；両親媒性分子の一部分はＰドットのコア内に包埋され、反応性官能基は親水性キャップ中に位置する)；そして（ｉｉ）反応性官能基との連結を介して生体分子をポリマードットと共有結合することによる、生体共役化発色性ポリマードットの調製方法を提供する。好ましい一実施形態では、発色性ポリマーは半導電性ポリマーである。
２ｃ．  非特異的結合の低減
【０１４９】
実施例１１で実証されるように、生体分子の有意の非特異的吸着は、官能化Ｐドットの表面で起こり得る。この非特異的吸着は、標的化分子の共有結合を妨げて、共役反応の生成物を使用不可能にさせる。共役反応への遊離ポリエチレングリコールの付加が当該生物学的分子と官能化Ｐドットとの間の非特異的結合を排除して、共役反応を完了させ得る、ということが判明したことは、有益である。この知見は、本明細書中で提供される実施例１１で実証される。
【０１５０】
したがって、一実施形態では、本発明は、生物学的分子を官能化発色性ポリマードットと共役するための方法であって、生物学的分子を官能化発色性ポリマードットと共役するのに適した条件下で、水溶性ポリマーを含有する溶液中で、官能化発色性ポリマードットを生物学的分子とともにインキュベートすることを包含する方法であり、溶液中の水溶性ポリマーの存在がポリマードットの表面への生物学的分子の非特異的吸着を低減する方法を提供する。一般的に、標的生物学的分子およびポリマードットの表面の非特異的結合を低減する任意の水溶性ポリマーが用いられ得る。水溶性ポリマーの非限定例としては、ポリアルキレングリコール(例えば、ＰＥＧ)、ＰＥＯ、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、デンプン、ポリ−炭水化物、ポリシアル酸等が挙げられる。好ましい一実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリアルキレングリコールである。具体的一実施形態では、水溶性ポリマーはポリエチレングリコールである。
【０１５１】
一実施形態では、官能化発色性ポリマードットは、（ａ）半導電性ポリマー；ならびに（ｂ）反応性官能基と結合される両親媒性分子を含み、この場合、両親媒性分子の一部分はポリマードットのコア内に包埋され、反応性官能基はポリマードットの表面に位置する。
【０１５２】
一実施形態では、本発明は、生物学的分子を官能化発色性ポリマードットと共役するための方法であって、生物学的分子を官能化発色性ポリマードットと共役するのに適した条件下で、遮断剤を含有する溶液中で、官能化発色性ポリマードットを生物学的分子とともにインキュベートすることを包含する方法であり、溶液中の遮断剤の存在がポリマードットの表面への生物学的分子の非特異的吸着を低減する方法を提供する。
【０１５３】
一般的に、遮断剤は、標的生物学的分子およびポリマードットの非特異的結合を低減するかまたは効果的に排除し、したがって適切な共役を進行させる任意の分子であり得る。一実施形態では、、遮断剤は、水溶性ポリマー、例えばポリアルキレングリコール(例えば、ＰＥＧ)、ＰＥＯ、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、デンプン、ポリ−炭水化物、ポリシアル酸等である。別の実施形態では、遮断剤は、洗剤、例えば費イオン性洗剤または界面活性剤である。用いられ得る洗剤の非限定例としては、トリトンＸ−１００、トゥイーン２０、トゥイーン８０、Ｂｒｉｊ洗剤等が挙げられる。さらに別の実施形態では、遮断剤は、炭水化物、例えばデキストラン、アミロース、グリコーゲン等である。
画像処理および分子標識化のための方法
【０１５４】
上記のように、in  vivo画像処理および分子標識化のための蛍光性ポリマーの使用は、一般に用いられている物質、例えばＱドットおよびドープ化ラテックス粒子を上回るいくつかの利点を有する。例えば、蛍光ポリマードットは、高蛍光輝度／容積比を保有し、高吸収横断面、高放射速度、高有効発色団密度、ならびに最小レベルの凝集誘導性蛍光消光を有する。蛍光プローブとしての蛍光ポリマーの使用は、その他の有用な利点、例えば、溶液中に浸出し得る重金属イオンの欠如も付与する。しかしながら、生物学的画像処理または感知用途にこれらのプローブを適用するためには、いくつかの重要な問題、特に表面化学および生体共役がさらに解決されなければならない。
【０１５５】
本明細書中に記載されるように、本発明は、有用な発色性ポリマードット表面化学、官能化および生体共役を提供するための多数の溶液を提供する。したがって、本発明は、本明細書中で提供される官能化発色性ポリマードットの使用を含めた、in  vivo画像処理および分子標識化のための改良された方法を提供する。
【０１５６】
一実施形態では、本発明は、生物学的試料中の標的分子の標識方法であって、生物学的試料を生体共役化発色性ポリマードットと接触させることを包含する方法を提供し、この場合、生体共役化発色性ポリマードットはコアおよびキャップを含み、上記コアは発色性ポリマーを含み、そして上記キャップは反応性官能基を介してターゲッティング部分と結合される官能化剤を含むが、但し、上記キャップのすべてが有機ケイ酸塩であるというわけではない。ターゲッティング剤は、当該標的分子と特異的に結合し得る任意の分子であり得る。好ましい一実施形態では、ターゲッティング剤は、抗体またはその断片である。別の関連実施形態では、ターゲッティング剤はアプタマーである。
【０１５７】
関連実施形態では、生物学的試料中の標的分子を標識するための方法であって、生物学的試料を生体共役化発色性ポリマードットと接触させることを包含する方法が提供されるが、この場合、生体共役化発色性ポリマードットは、（ａ）半導電性ポリマー；ならびに（ｂ）反応性官能基を介してターゲッティング部分と結合される両親媒性分子を含み、ここで、両親媒性分子の一部分はポリマードットのコア内に包埋され、そしてターゲッティング部分はポリマードットの表面に位置する。ターゲッティング剤は、当該標的分子と特異的に結合し得る任意の分子であり得る。好ましい一実施形態では、ターゲッティング剤は、抗体またはその断片である。別の関連実施形態では、ターゲッティング剤はアプタマーである。
【０１５８】
当該標的化分子は、生物体、例えば特定の細胞、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、代謝物質等の内部に見出される任意の分子であり得る。具体的一実施形態では、標的分子は、細胞、例えば癌細胞の表面に存在する分子である。具体的一実施形態では、官能基は、アルキン、歪みアルキン、アジド、ジエン、アルケン、シクロオクチンおよびホスフィン基から選択される。
【０１５９】
別の実施形態では、本発明は、細胞性標的の生体直交型標識化のための方法であって、クリックケミストリー反応に参加し得る第一表面曝露官能基を有する細胞性標的をクリック型発色性ポリマードットと接触させることを包含する方法を提供し、この場合、クリック型発色性ポリマードットはコアおよびキャップを含み、上記コアは発色性ポリマーを含み、そして上記キャップはクリックケミストリー反応において第一官能基と反応し得る第二巻の浮きと結合される官能化剤を含むが、但し、上記キャップのすべてが有機ケイ酸塩であるというわけではない。具体的一実施形態では、官能基は、アルキン、歪みアルキン、アジド、ジエン、アルケン、シクロオクチンおよびホスフィン基から選択される。
【０１６０】
関連実施形態では、本発明は、細胞性標的の生体直交型標識化のための方法であって、クリックケミストリー反応に参加し得る第一表面曝露官能基を有する細胞性標的をクリック型発色性ポリマードットと接触させることを包含する方法を提供し、この場合、クリック型発色性ポリマードットは、（ａ）半導電性ポリマー；ならびに（ｂ）クリックケミストリー反応において第一官能基と反応し得る第二官能基と結合される両親媒性分子を含み、ここで、両親媒性分子の一部分はポリマードットのコア内に包埋され、そして第二官能基はポリマードットの表面に位置する。
【０１６１】
上記のように、当該分子中にクリックケミストリー反応に参加し得る第一官能基を組入れる方法は、当該技術分野で既知である。例えば、生体分子中にアジドを組み込むための魅力的アプローチは、代謝的標識化を基礎にしており、それにより、アジド含有生合成前駆体が、細胞の生合成機構を用いて生体分子中に組入れられる。
発色性ポリマードットを用いるＣｕ２＋およびＦｅ２＋イオンの検出方法
【０１６２】
銅および鉄イオンは、ヒト身体中で最も豊富な３つの遷移金属イオン（亜鉛を含む）のうちの２つである。銅および鉄の推奨摂取量は、正常成人に関しては、それぞれ０．８〜０．９ｍｇ／日および８〜１８ｍｇ／日の範囲である。しかしながら、過剰用量の銅または鉄は、肝硬変、急性中毒、アシドーシス、凝血異常、ならびに急性呼吸窮迫症候群を引き起こすことが知られている。米国環境保護庁（ＥＰＡ）により改訂された飲料水標準および公衆衛生勧告によれば、銅および鉄の量は、それぞれ１．０ｍｇ／Ｌおよび０．３ｍｇ／Ｌに制限されている。その結果、環境および生物系におけるそれらの有意性のために、銅および鉄の検出のためのより良好なセンサーを開発する努力がなされてきた（(Que  E.L.,  et  al.,  Chem.  Rev.,  2008,  108,  1517-1549）。過去１０年間に、その簡易性、良好な感受性および選択性、高信頼性、ならびに相対的に低い経費のため、ナノ粒子ベースのイオンセンサーが強い関心を引きつけて来た。しかしながら、半導電性ポリマーナノ粒子（Ｐドット）ベースの蛍光イオンセンサーの開拓は、未だ探求されていない。
【０１６３】
したがって、一態様では、本発明は、銅および鉄イオンの定量的検出のための戦略を提供する。この戦略は、カルボキシル官能化Ｐドットの凝集により誘導される蛍光消光に基づいている。この方法の実証は、実施例２７に見出され得る。
【０１６４】
一態様において、本発明は、キレート化媒介性Ｐドットセンサーを基礎にしたＣｕ２＋およびＦｅ２＋イオン検出のための高感受性およびレシオメトリックアプローチを提供する。Ｃｕ２＋およびＦｅ２＋の両方に関する線形検出範囲は、生理学的関連濃度範囲内である。しかしながら、この線形範囲は、必要な場合、ＰＳ−ＣＯＯＨ密度および／またはＰドットのサイズを調整することにより、さらに拡大され得る。この簡単な、高感受性の、そして経済的な技法は、半導電性ポリマーナノ粒子の高輝度および光学的調整可能性を利用して、生理学的または環境的分析のためのＣｕ２＋およびＦｅ２＋の迅速決定の一手段を提供する。
【０１６５】
したがって、一実施形態では、溶液中の銅（ＩＩ）および／または鉄（ＩＩ）の検出のための方法であって、（ａ）溶液をカルボキシル官能化半導電性ポリマードットと接触させるステップ；そして（ｂ）溶液中のポリマードットからの蛍光のレベルを検出するステップを包含する方法が提供されるが、ここで、銅（ＩＩ）または鉄（ＩＩ）を含有しない溶液中のポリマードットの蛍光と比較した場合の、溶液中の蛍光の低減は、溶液が銅（ＩＩ）および／または鉄（ＩＩ）を含有することを示す。
【０１６６】
一実施形態では、当該方法はさらに、（ｃ）溶液に二価陽イオンキレート化剤を付加すること；（ｄ）二価陽イオンキレート化剤の付加後に溶液中の蛍光のレベルを検出すること；そして（ｅ）二価キレート化剤の付加の前および後に、溶液中のポリマードットの蛍光の差を確定することにより、溶液中の銅（ＩＩ）のレベルを定量するステップを包含するが、この場合、溶液中の銅（ＩＩ）のレベルは、標準を用いて蛍光の差を比較することにより決定される。
【０１６７】
別の実施形態では、当該方法はさらに、（ｃ）溶液に二価陽イオンキレート化剤を付加すること；（ｄ）二価陽イオンキレート化剤の付加後に溶液中の蛍光のレベルを検出すること；そして（ｅ）二価キレート化剤の付加の後の溶液中のポリマードットの蛍光と、銅（ＩＩ）または鉄（ＩＩ）を含有しない溶液中のポリマードットの蛍光との間の差を確定することにより、溶液中の鉄（ＩＩ）のレベルを定量するステップを包含するが、この場合、溶液中の鉄（ＩＩ）のレベルは、標準を用いて蛍光の差を比較することにより決定される。
【実施例】
【０１６８】
以下の実施例は本発明をさらに説明するために含まれるが、これらは本発明の範囲を限定するためのものではない。
【０１６９】
非プロトン溶液中の発色性ポリマーおよび官能化剤の混合物とプロトン溶媒を混合するステップを包含する、官能化発色性ポリマードットの製造方法を実証する。本発明は、官能化発色性ポリマードットおよび生体分子を含む生体共役体およびその組成物も提供するが、この場合、生体分子は官能基と直接または間接的に結合される。
実施例１：官能化発色性ポリマードットの調製方法
【０１７０】
本実施例は、その後の特性化および生体分子共役のための多量の官能化発色性ポリマードットを得るための方法を提供する。図１は、官能化発色性ポリマードットおよびそれらの生体分子共役体を調製するための模式図を示す。
【０１７１】
水溶液中の官能化発色性ポリマードットを、以下のように調製した。先ず、１ｍｇ／ｍＬの濃度を有するストック溶液を作製するために、不活性大気中で撹拌することにより、発色性ポリマー、例えばＰＦＢＴを、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解した。ＴＨＦ溶液中の一定量の官能化剤、例えばＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを、ＰＦＢＴの希釈溶液と混合して、４０μｇ／ｍＬのＰＦＢＴ濃度および４μｇ／ｍＬのＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ濃度を有する溶液混合物を得た。混合物を撹拌して、均質溶液を生成した。５ｍＬ量の溶液混合物を、混合物を音波処理しながら、１０ｍＬの脱イオン水に迅速に付加した。ＴＨＦを窒素ストリッピングにより除去し、そして連続窒素ストリッピングにより、９０℃のホットプレート上で溶液を４ｍＬに濃縮した後、０．２μフィルターを通して濾過した。その結果生じたナノ粒子分散液は、数ヶ月間透明且つ安定で、凝集の兆候は認められなかった。
実施例２：官能化発色性ポリマードットのＡＦＭ特性化
【０１７２】
実施例１で提供された方法に従って調製した官能化発色性ポリマードットを、それらのサイズ、形態および単分散性に関してＡＦＭにより査定した。ＡＦＭ測定のために、１滴のナノ粒子分散液を新たに切断したマイカ基質上に載せた。水の蒸発後、タッピングモードで、マルチモードＡＦＭ（Digital  Instruments）で表面を走査した。図２Ａは、官能化発色性ポリマードットの代表的ＡＦＭ画像を示す。ＡＦＭ画像から得た粒子高ヒストグラムは、ほとんどの粒子が１０〜２０ｎｍの範囲の直径を保有することを示している（図２Ｂ）。外側寸法も、チップ幅を考慮した後、１０〜２０ｎｍの範囲であった。形態およびサイズは、官能化ポリマーを用いずに調製されたポリマードットのものと一致したが、これは、少量の両親媒性ポリマーの存在が粒子のサイズおよび形態に明らかな影響を及ぼさない、ということを示す。実施例１の調製方法に従って、発色性ポリマーの注入濃度を調整することにより、２ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲のサイズを有する官能化発色性ポリマードットを調製し得る。
実施例３．  官能化発色性ポリマードットの光学的特性化
【０１７３】
実施例１で提供された方法に従って調製した官能化発色性ポリマードットを、それらの蛍光特性に関して査定した。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを、１ｃｍ石英キュベットを用いてＤＵ  ７２０分光光度計で記録した。１ｃｍ石英キュベットを用いてＦｌｕｏｒｏｌｏｇ−３蛍光計で、蛍光スペクトルを収集した。官能化発色性ポリマードットは、裸発色性ポリマードットの場合と同様の吸収および発光スペクトルを示すが（図３）、これは、表面官能化がポリマードットの光学特性に影響を及ぼさないことを示す。発色性ポリマー種によって、発色性ポリマードットは、蛍光顕微鏡およびレーザー励起のために便利な波長範囲である３５０ｎｍから５５０ｎｍまでの範囲の吸収帯域を示す。図３は、官能化発色性ポリマーＰＦＢＴの吸収および発光スペクトルを示す。既知の粒子濃度でのＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルの分析は、単一粒子（直径〜１５ｎｍ）のピーク吸収横断面が約２×１０−１３ｃｍで、可視および近ＵＶ範囲におけるＣｄＳｅ量子ドットのおよそ１０〜１００倍大きく、そして典型的有機蛍光色素よりおよそ３桁大きい、ということを示した。
【０１７４】
標準としてエタノール中のクマリン６の希釈溶液を用いて、ＰＦＢＴドットの蛍光量子収率を３０％であると確定した。蛍光輝度は、吸収横断面の生成物および量子収率結果として定義される。確かに、発色性ポリマードットの蛍光輝度は、典型的条件下で同一サイズの任意の他のナノ粒子のものを上回る。粒子ドットのサイズは、吸収および蛍光スペクトルの形状に容易に感知可能な作用を及ぼすとは思われない  −  粒子サイズ増大の主な作用は、吸収横断面および輝度の増大である。この特性は、特定用途の要求を満たすよう粒子サイズおよび輝度の調整を促し、コロイド半導体量子ドットと対比するものである。
実施例４：生体分子と官能化発色性ポリマードットとの共役
【０１７５】
本実施例は、官能化発色性ポリマードットが細胞性構造のその後の画像処理、あるいは任意の他の蛍光ベースの生物学的検出のために生体分子と共役される、ということを実証する。本発明の方法に従って調製される官能化発色性ポリマードットは、第一アミノ官能基を含有する任意の生体分子、例えばタンパク質および抗体と共役され得る。カルボキシル基は、カルボジイミド、例えばＥＤＣの存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と反応して、第一アミン基との架橋のためのカルボキシレート基のアミン反応性エステルを生じ得る。典型的生体共役反応において、２０μＬのＥＤＣ（ＭｉｌｌｉＱ水中５ｍｇ／ｍＬ）および１０μＬのＮＨＳ（ＭｉｌｌｉＱ水中５ｍｇ／ｍＬ）を、１ｍＬの官能化発色性ポリマードット（ＭｉｌｌｉＱ水中４０ｍｇ／ｍＬ）に付加した。上記混合物を、活性化のために３０分間、回転振盪器上に放置した。次いで、２０μＬのポリエチレングリコール（５％ｗ／ｖ  ＰＥＧ）および２０μＬの濃縮ＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ）を付加して、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３中の活性化ポリマードットの溶液を得た。最後に、４０μＬのストレプトアビジンまたはＩｇＧ抗体（１ｍｇ／ｍＬ）を溶液に付加し、反応を室温で４時間継続した。その結果生じた発色性ポリマードット生体共役体を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ＨＲ−３００を媒質として用いたゲル濾過により、生体分子から分離した。
実施例５：生細胞における癌マーカー検出のための発色性ポリマードットＩｇＧ共役体の使用
【０１７６】
本実施例は、ヒト乳癌細胞中の癌マーカーを検出するための発色性ポリマードット生体共役体を用いた実証を提供する。１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したマッコイ５Ａ培地中で、乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３を培養した。１００万個の細胞を培養フラスコから収穫し、洗浄して、１００μＬの標識緩衝液（１×ＰＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ）中に再懸濁した。細胞懸濁液を、暗所で、室温で３０分間、振盪器上で、第一抗ヒトＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）抗体とともにインキュベートし、その後、標識化緩衝液を用いて２回洗浄した。次いで、細胞を、発色性ポリマードット第二ＩｇＧ共役体とともに、暗所で室温で３０分間インキュベートした後、さらに２回洗浄した。１滴の細胞懸濁液をカバーガラス上に載せて、スライドガラスで覆い、蛍光共焦点顕微鏡（ツァイスＬＳＭ５１０）下で直ちに画像処理した。
【０１７７】
図４Ａに示したように、第一抗ＥｐＣＡＭ抗体とともに細胞をインキュベートした後、発色性ポリマードットＩｇＧプローブは、ヒトＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞上のＥｐＣＡＭを首尾よく標識した。第一抗体が存在しない場合、すなわち、細胞をポリマードットＩｇＧ単独とともにインクとした場合、シグナルはほとんどまたは全く検出されなかった（図４Ｂ）が、これは、ポリマードットＩｇＧ共役体が標的に対して特異的であることを示す。
実施例６：細胞成分画像処理のための発色性ポリマードットストレプトアビジン共役体
【０１７８】
本実施例は、細胞成分構造を検出するための発色性ポリマードット生体共役体を用いた実証を提供する。１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したイーグル最小必須培地中で、乳癌細胞株ＭＣＦ−７を培養した。１万個の細胞を２２×２２ｍｍカバーガラス上に載せて、６ウェル中の上記培地を用いて、５０〜７０％集密度になるまで培養した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＰＢＳ中で１５分間、０．２５％トリトン−Ｘ１００で透過処理して、２％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）中で３０分間遮断した。微小管を標識するために、固定およびＢＳＡ遮断ＭＣＦ−７細胞を、順次、ビオチニル化モノクローナル抗αチューブリン抗体とともに１時間、そして発色性ポリマードットストレプトアビジン共役体とともに３０分間インキュベートした。染色細胞を付けたカバーガラスをスライドガラス上に載せて、蛍光共焦点顕微鏡（ツァイスＬＳＭ５１０）で画像処理した。図５Ａに示したように、微小管は、発色性ポリマードットストレプトアビジンで明白に標識された。細胞を発色性ポリマードットストレプトアビジン単独とともにインキュベートした場合、検出されたシグナルは非常に弱いかまたは全く明らかでなかった（図５Ｂ）が、これは、ポリマードットストレプトアビジン共役体が標識化に特異的であることを示す。
実施例７：半導電性ポリマードットの官能化
【０１７９】
蛍光半導電性ポリマー  ポリ［（９，９−ジオクチルフルオレニル−２，７−ジイル）−コ−（１，４−ベンゾ−｛２，１’，３｝−チアジアゾール）］（ＰＦＢＴ、ＭＷ  １５７，０００、多分散性  ３．０）を、ADS  Dyes,  Inc.  (Quebec,  Canada)から購入した。櫛型ポリマー、  ポリスチレン（カルボキシル基で官能化されたエチレンオキシドでグラフト化された）（ＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、主鎖分子量８，５００、グラフト鎖分子量１，２００、総鎖分子量２１，７００、多分散性  １．２５）を、Polymer  Source  Inc.  (Quebec,  Canada)から購入した。別記しない限り、他の試薬はすべて、Sigma-Aldrich  (St.  Louis,  MO,  USA)から購入し、そして実験はすべて、室温で実施した。
【０１８０】
変法ナノ沈降法を用いて、水溶液中の官能化Ｐドットを調製する。先ず、ＰＦＢＴをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解して、１ｍｇ／ｍＬの濃度を有するストック溶液を作製する。ＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨもＴＨＦ中に溶解して、ＰＦＢＴの希釈溶液と混合して、５０μｇ／ｍＬのＰＦＢＴ濃度および０〜１０μｇ／ｍＬの範囲のＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ濃度を有する溶液混合物を得た。混合物を音波処理して、均質溶液を生成した。５ｍＬ量の溶液混合物を、浴音波処理器中のＭｉｌｌｉＱ水  １０ｍＬに迅速に付加した。ＴＨＦを窒素ストリッピングにより除去し、そして連続窒素ストリッピングにより、９０℃のホットプレート上で溶液を５ｍＬに濃縮した後、０．２μフィルターを通して濾過した。その結果生じた官能化Ｐドット分散液は、数ヶ月間透明且つ安定で、凝集の兆候は認められなかった。
実施例８：官能化半導電性ポリマードットの物理的特性化
【０１８１】
一定ＰＦＢＴ濃度および０〜２０重量％の範囲のＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ／ＰＦＢＴ分画を有する前駆体溶液混合物を用いて、官能化ＰＦＢＴドットを調製した。官能化ＰＦＢＴドットのサイズおよび形態を、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ、図７Ａ）により特性化した。ＡＦＭ画像から得た粒子高ヒストグラムは、ＰＦＢＴドットの大多数が１０±３ｎｍの範囲の直径を保有することを示した（図７Ｂ）。非官能化Ｐドットと比較した場合、少量のＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨポリマーの存在（＜２０重量％）は、粒子サイズおよび形態に如何なる顕著な作用も及ぼさなかった。Ｐドットの吸収および発光スペクトルは、サイズに伴って変化せず（Wu,  C.;  Bull,  B.;  Szymanski,  C.;  Christensen,  K.;  McNeill,  J.  ACS  Nano  2008,  2,  2415-2423）、したがって、Ｐドットのこのサイズ非依存的特徴は、ナノ粒子調製におけるサイズ制御に関する拘束を有意に緩和する。さらに、大型サイズは単にプローブの輝度を増大するだけであるため、このサイズ非依存的特徴は、ある種の用途のためのより明るいプローブを得るために有益であり得る。この官能化戦略は、蛍光体密度に関して有効なナノ粒子プローブをもたらした、ということに留意すべきである；例えば半導電性ポリマーナノ粒子のうちの８０％以上が有効な蛍光体であり得る。これに対して、Ｑドットおよび色素負荷球に関しては、厚い封入層（Ｑドットに関する）または色素（色素ドープ球に関する）の自己消光のため、有効蛍光体は、粒子容積または重量の２〜３％に限定される。
実施例９：生体共役化半導電性ポリマードットの光学的特性化
【０１８２】
マイクロ流路型フローサイトメーターを用いて、Ｐドット生体共役体の細胞標識輝度を、市販のＱドット５６５−ストレプトアビジンおよびＡｌｅｘａ−ＩｇＧプローブの輝度とともに、先ず定量した。２０×ＮＡ  ０．４対物レンズ（Nikon  Eclipse  TE  2000-U,  Melville,  NY,  USA）を装備した倒立光学顕微鏡上の幅２００μｍおよび高さ５０μｍの直線チャンネルを有するマイクロ流路型チップを用いて、フロー・スルー実験を実行した。標識化細胞懸濁液（１０，０００／ｍｌ）を、５０μｌ／分で５分までの間、注入ポンプを用いて、長方形チャンネル中に導入した。４８８ｎｍサファイアレーザー（Coherent,  Santa  Clara,  CA）を顕微鏡中に導き入れて、試料を励起した。各試料獲得前に、光の経路でレーザー出力を測定した後、電力測定器を用いる顕微鏡を入れた。５００ｎｍロングパスフィルター（ＨＱ５００ＬＰ；Chroma,  Rockingham,  VT,  USA）により蛍光シグナルを濾過して、単一光子計数モジュール（ＡＰＤ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＳＰＣＭ−ＱＣ９−ＱＴＹ２、Salem,  MA,  USA）により収集した。パソコンおよびＬａｂＶｉｅｗコード化プログラム（National  Instruments  Corporation,  Austin,  TX,  USA）を用いて、１０ｋＨｚのサンプリング周波数で、ＳＰＣＭのシグナルを読取った。各試料に関する生ＡＰＤ数をテキストファイルに保存し、カスタムコードＭａｐｌｅ５．１プログラム（MapleSoft,  Waterloo,  ON,  Canada）を用いて周波数プロットに変換した。
【０１８３】
標識化ＭＣＦ−７細胞の蛍光画像を解析することにより、ＰドットストレプトアビジンおよびＱドット５６５−ストレプトアビジンプローブの細胞標識輝度も定量した。１滴の細胞懸濁液をカバーガラス上に載せて、スライドガラスで覆い、ＡＺ−プランＡｐｏ４×ＮＡ  ０．４対物レンズ(Ｎｉｋｏｎ  ＡＺ１００、Melville,  NY,  USA)を有するアップライト顕微鏡で観察した。ファイバー照明器（１３０Ｗ水銀灯）で励起光を提供し、帯域通過濾波器(Ｓｅｍｒｏｃｋ  ＦＦ０１−４８２／３５−２５、Rochester,  NY  USA)により濾過した。５２０ｎｍロングパスフィルター（ＨＱ５２０ＬＰ；Chroma,  Rockingham,  VT,  USA）により蛍光シグナルを濾過し、ＣＣＤカメラ（Ｐｒｏｓｉｌｉｃａ  ＧＣ１３８０、Newburyport,  MA）で画像処理した。蛍光画像をカスタムコードLabviewプログラムで処理し、シグナル−細胞標識輝度の強度分布を得た（図１２）。
実施例１０：ＰＦＢＴ  Ｐドットの単一粒子画像処理
【０１８４】
ピーク吸収横断面の生成物および蛍光量子収率により、蛍光輝度の有用な概算を得る。光物理的データは、直径〜１０ｎｍのＰＦＢＴドットは、ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８より約３０倍明るく、そしてＱドット５６５プローブは典型的レーザー励起（４８８ｎｍ）以下である、ということを示す。並列輝度比較は、Ｐドットの並外れた輝度のさらなる証拠を提供する。３つのプローブの輝度および光安定性を実験的に評価し、比較するために、単一粒子画像処理を実行した。
【０１８５】
要するに、蛍光試料をＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に希釈し、清浄化バーガラス上で真空乾燥して、蛍光顕微鏡で画像処理した。サファイアレーザー（Coherent,  Santa  Clara,  CA  USA）からの４８８ｎｍレーザー光線を、実験室製ステアリングレンズを用いて、倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００Ｕ、  Melville,  NY,  USA）に向けた。対物レンズ前のノーズピースで、レーザー励起強度を測定した。照明および収光のために用いられる対物レンズは、１．４５  ＮＡ６０×ＴＩＲＦ対物レンズ(Nikon,  Melville,  NY,  USA)であった。蛍光シグナルを５００ｎｍロングパスフィルター（ＨＱ５００ＬＰ；Chroma,  Rockingham,  VT,  USA）により濾過して、ＥＭＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｃａｓｃａｄｅ：  ５１２Ｂ、Tucson,  AZ  USA）で画像処理した。検出基の飽和が図８におけるいくつかのＰドット粒子に関して観察されたため、Ｐドット試料を画像処理する場合、減光フィルター（光学密度  １．５）を発光フィルターと一緒に置いた。Ｐドット粒子の蛍光強度を、減衰係数によって算定し戻した。一連の連続フレームを獲得することにより、単一粒子光褪色測定値を得た。蛍光スポット全体のＣＣＤシグナルを組み込むことにより、所定の粒子に関するフレーム当たりで発光される蛍光強度を概算した。
【０１８６】
図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、同一獲得およびレーザー励起条件下で得られるそれぞれＰＦＢＴドット、ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８およびＱドット５６５の典型的単一粒子落射蛍光画像を示す。４８８ｎｍレーザーからの相対的に低い励起出力（１ｍＷ）を用いて、非常に明るい、近回析限界スポットが、個々のＰＦＢＴに関して明らかに得られた。いくつかのＰドットは実際に検出器を飽和した（図８Ａ）が、一方、ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８およびＱドットは、われわれが用いた低励起出力でカメラによりかろうじて検出される非常に低い強度を示した（図８Ｂ、８Ｃ）。ＰＦＢＴドットは、Ｑドット５６５およびＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８と比較して、シグナル対バックグラウンド比の等級改良を示した（図８Ｄ）。このような顕著な対比は、主に、Ｐドットの高い粒子当たり吸収横断面のためであり、これは、低励起条件を要する蛍光検出に特に適している。プローブ性能をさらに比較するために、Ｑドット５６５およびＩｇＧ−４８８プローブがカメラにより十分に検出され得るよう、レーザー励起出力を４ｍＭに増大した。検出器の飽和がＰドット粒子に関して観察されたため、Ｐドット試料を画像処理する場合、減光フィルター（光学密度  １．５、これは発光された蛍光を９７％遮断する）を発光フィルターと一緒に置いて、減衰係数によってそれらの蛍光強度を算定し戻した。３つのプローブすべてに関して、バックグラウンドを差し引いた。数千個の粒子の蛍光強度分布は、ＰＦＢＴドットがＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８およびＱドット５６５より３０倍より以上明るく（図８Ｅ）、これは、光物理的パラメーターに基づいた輝度比較と一致する、ということを示した。
【０１８７】
単一粒子光褪色測定は、ＰＦＢＴドットの優れた光安定性を示した（図８Ｆ）。多重光褪色軌跡の統計学的分析は、Ｐドット当たり１０９を上回る光子が光褪色前に発光され、これは個々のＱドット５６５およびＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８粒子により発光されるものより２または３桁大きい、ということを示した。さらに、それらの高輝度、短い蛍光寿命、ならびに粒子当たり多重エミッターの存在のため、高獲得率（２０ｍｓ露出当たりＰドット当たりで検出される〜２００，０００の光子）で個々のＰドットから多数の光子が得られた。近年、この特徴を利用して、〜１ｎｍの粒子トラッキング不確実性が得られたが（(Yu,  J.;  Wu,  C.;  Sahu,  S.;  Fernando,  L.;  Szymanski,  C.;  McNeill,  J.  J.  Am.  Chem.  Soc.  2009,  131,  18410-18414）、これは、Ｐドットを、高速単一粒子トラッキング実験において、慣用的蛍光色素およびＱドットよりはるかに優れたものにする。ほとんどのＰＦＢＴドットが如何なる明白な蛍光明滅も伴わずに連続発光行動を示すが、一方、ほとんどのＱドットが顕著な明滅を示す、ということに注目することは有益である（図８Ｆ）。Ｐドットのこの非明滅特徴は、単一分子用途において特に有益である。
実施例１１：官能化Ｐドットの表面との非特異的結合の排除
【０１８８】
Ｐドットを官能化するための最初の試みでは、ほとんどの生物学的標識分子、例えば抗体はビオチンで容易に誘導体化され得るため、ストレプトアビジンを選択した。しかしながら、Ｐドットの相対的に大きい表面積は本来的に疎水性であるため、表面改質はそれをより親水性にしがちであるが、生体分子はＰドット表面に非特異的に吸着される、という問題がある。要するに、カルボキシル官能化Ｐドットを、生物学的分子上のカルボキシル基をアミン基と連結するカップリング試薬の非存在下で、緩衝化溶液中のストレプトアビジンとともにまたは伴わずに混合し、次いで、ビオチンシリカビーズとともにインキュベートした。遠心分離後、ストレプトアビジンとともにインキュベートされていたＰドットは、ビオチンシリカビーズのペレット中に明らかに保有され、ストレプトアビジンなしでインキュベートされたものはビーズとの結合を示さず（図７Ｃ）、したがって、Ｐドット表面へのストレプトアビジンの重度の非特異的吸着を示す。
【０１８９】
この非特異的吸着を克服するために、０．１重量％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する緩衝溶液中でＰドットをストレプトアビジンと混合した。その結果生じたＰドットは、ビオチンシリカビーズとの検出可能な結合を示さず、これは、ＰＥＧの存在が非特異的吸着を有意に低減した、ということを示唆する（図７Ｃ）。したがって、共有的生体共役を、ＰＥＧ含有環漿液中で首尾よく実施した。Ｐドット上のカルボキシル基とストレプトアビジンのアミン基との間のペプチド結合形成は、カルボジイミド、例えば１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）により触媒された。ＥＤＣ触媒Ｐドットストレプトアビジン共役体は、ビオチンシリカビーズとの明らかな結合を示したが、一方、ＥＤＣの非存在下で得られた生成物に関しては結合は観察されなかった（図７Ｃ）。別個の対照において、同一生体共役条件（すなわち、ＰＥＧ含有緩衝液中のストレプトアビジンおよびＥＤＣ）を、裸非官能化Ｐドットとともに用いた。ビオチンビーズ上では結合は観察可能でなく、これは、ストレプトアビジンとＰドットの生体共役が共有的であり、そしてビオチンビーズに対するストレプトアビジン−Ｐドットの標識化は特異的で、如何なる検出可能な非特異的結合も伴わなかった、ということをさらに確証する。
【０１９０】
Ｐドットを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような添加剤でさらに不動態化しうるが、これは、長期コロイド安定性を保持し、疎水性表面を遮断し、そして標識化実験における非特異的結合を低減し得る。ＢＳＡ不動態化Ｐドット生体共役体は、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、トリスおよびホウ酸塩緩衝液中で生理学的ｐＨで、数ヶ月間安定である、ということが見出された。図７Ｄ差込図は、６ヶ月間貯蔵後の１×ＰＢＳ緩衝液中のＰＦＢＴ−ストレプトアビジン共役体の２つの写真を示す。ＰＦＢＴ共役体の懸濁液は、安定で、透明（混濁なし）で、ＵＶ光照明（３６５ｎｍ）下で強力な蛍光を示す。
実施例１２：官能化Ｐドットとの生体分子共役
【０１９１】
ストレプトアビジンおよびヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を、Invitrogen（Eugene,  OR,  USA）から購入した。Ｐドット上のカルボキシル基と生体分子上のアミン基との間のＥＤＣ触媒反応を利用することにより、生体共役を実施した。典型的生体共役反応では、２０μＬのポリエチレングリコール（５％ｗ／ｖ  ＰＥＧ、分子量３３５０）および２０μＬの濃縮ＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ）を、１ｍＬの官能化Ｐドット溶液（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中５０μｇ／ｍＬ）に付加して、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３中のＰドット溶液を生じた。次いで、４０μＬのストレプトアビジンまたはＩｇＧ抗体（１ｍｇ／ｍＬ）を溶液に付加し、渦巻撹拌機で十分に混合した。最後に、２０μＬの新たに調製した１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）溶液（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中５ｍｇ／ｍＬ）を溶液に付加し、上記混合物を、室温で４時間、回転振盪器上に放置した。最後に、その結果生じたＰドット生体共役体を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ＨＲ−３００ゲル媒質を用いたゲル濾過により、遊離生体分子から分離した。
実施例１３：細胞培養
【０１９２】
乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＳＫ−ＢＲ−３を、アメリカ培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ、Manassas,  VA,  USA）から注文した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５０Ｕ／ｍＬペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したイーグル最小必須培地（ＭＣＦ−７用）またはマッコイ５Ａ培地（ＳＫ−ＢＲ−３用）中で、３７℃、５％ＣＯ２で、細胞を培養した。集密に達するまで、実験前に細胞を予備培養した。培地で簡単にすすいで培養フラスコから細胞を収穫し、その後、５ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．２５ｗ／ｖ％トリプシン、０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ）とともに、３７℃で５〜１５分間、インキュベートした。完全に剥離した後、細胞をすすぎ、遠心分離し、標識緩衝液（１×ＰＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＢＳＡ）中に再懸濁した。血球計を用いて顕微鏡により、細胞濃度を確定した。
実施例１４：ＣＤ３２６およびＣＤ３４０細胞マーカーの検出のための発色性ポリマードットＩｇＧ共役体の使用
【０１９３】
おそらくはエンドサイトーシスにより裸Ｐドットが培養細胞中に送達され得る、ということが以前に示された。しかしながら、Ｐドットが細胞表面と非特異的に結合される場合、特定細胞性標的は標識されなかった（例えば、Wu,  C.;  Bull,  B.;  Szymanski,  C.;  Christensen,  K.;  McNeill,  J.  ACS  Nano  2008,  2,  2415-2423；Pu,  K.  Y.;  Li,  K.;  Shi,  J.  B.;  Liu,  B.  Chem.  Mater.  2009,  21,  3816-3822；Howes,  P.;  Green,  M.;  Levitt,  J.;  Suhling,  K.;  Hughes,  M.  J.  Am.  Chem.  Soc.  2010,  132,  3989-3996；およびRahim,  N.  A.  A.;  McDaniel,  W.;  Bardon,  K.;  Srinivasan,  S.;  Vickerman,  V.;  So,  P.  T.  C.;  Moon,  J.  H.  Adv.  Mater.  2009,  21,  3492-3496参照）。したがって、  ｉｔ  ｗａｓ  ｕｎｃｌｅａｒ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅｓｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｈｅｔｈｅｒ  Ｐドットプローブが、実際の用途における有効な標識化のために細胞性標的を認識するのに十分に特異的になり得るか否かは、これらの研究からは確かでなかった。
【０１９４】
細胞標識化実験のために、Ｑドット  ５６５−ストレプトアビジン、Ａｌｅｘａ  ４８８−ＩｇＧおよびＢｌｏｃｋＡｉｄ（商標）遮断緩衝液を、Invitrogen  (Eugene,  OR,  USA)から購入した。上記のような方法を用いて、Ｐドット生体共役体を合成した。
【０１９５】
ＩｇＧ共役体で細胞表面マーカーを標識するために、１００Ｌの標識化緩衝液中の１００万個の細胞を、５μｇ／ｍＬの第一抗ヒトＣＤ３２６抗体（抗−ＥｐＣＡＭ、Biolegend,  San  Diego,  CA,  USA）（ＭＣＦ−７細胞用）または５μｇ／ｍＬの第一抗ヒトＣＤ３４０（抗Ｈｅｒ２、Biolegend,  San  Diego,  CA,  USA）とともに回転振盪器上で、暗所で室温で３０分間インキュベートし、その後、標識化緩衝液を用いて洗浄した。次いで、細胞を、５ｎＭ  ＰドットＩｇＧまたはＡｌｅｘａ  ４８８−ＩｇＧ共役体とともに、振盪器上で、暗所で室温で３０分間インキュベートし、その後、さらに２回洗浄した。ストレプトアビジン共役体で細胞表面マーカーを標識するために、１００μＬの標的化緩衝液中の１００万個のＭＣＦ−７細胞を、順次、５μｇ／ｍＬの第一抗ヒトＣＤ３２６抗体、５μｇ／ｍＬのビオチニル化第二抗マウスＩｇＧ（Biolegend,  San  Diego,  CA,  USA）および５ｎＭ  ＰドットストレプトアビジンまたはＱドット  ５６５−ストレプトアビジン（Invitrogen,  Eugene,  OR,  USA）とともに、各々３０分間インキュベートした後、さらに２回洗浄した。１滴の細胞懸濁液をカバーガラス上に載せて、スライドガラスで覆い、蛍光共焦点顕微鏡（ツァイスＬＳＭ５１０）下で直ちに画像処理した。
【０１９６】
ストレプトアビジンおよびＩｇＧを、細胞性標的の免疫蛍光標識のための生体共役に広範に用いた。ＰドットＩｇＧおよびＰドットストレプトアビジンプローブを作製して、循環腫瘍細胞の検出のために一般に用いられる特異的細胞標識、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３２６、上皮細胞表面マーカーを標識するそれらの能力を調べた。図９Ａは、細胞をモノクローナル第一抗ＥｐＣＡＭ抗体とともにインキュベートした後、ＰドットＩｇＧプローブが、生ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞の表面のＥｐＣＡＭ受容体を首尾よく標識したことを示す。第一抗体の非存在下で、細胞をＰドットＩｇＧ単独とともにインキュベートした場合、細胞標識化は検出されなかった（図９Ａ、下）が、これは、ＰドットＩｇＧ共役体が標的に非常に特異的であることを示す。
【０１９７】
次に、Ｐドットストレプトアビジン共役体を代替的プローブとして用いて、ＥｐＣＡＭを検出した。Ｐドットストレプトアビジンプローブも、第一抗ＥｐＣＡＭ抗体およびビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ第二抗体とともに、生ＭＣＦ−７細胞の表面のＥｐＣＡＭを有効に標識した（図９Ｂ）。細胞を、ビオチン抗マウスＩｇＧの非存在下で、第一抗体およびＰドットストレプトアビジンとともにインキュベートした場合、細胞表面に蛍光は観察されず（図９Ｂ、下）、したがって、これもまた、Ｐドットストレプトアビジンの非常に特異的な結合を実証する。シグナルの欠如は、このビオチン−ストレプトアビジン標識化系における非特異的結合の非存在も示した。
【０１９８】
次に、Ｐドット生体共役体を用いて、異なる細胞株ＳＫ−ＢＲ−３上の別の細胞マーカー、Ｈｅｒ２（抗乳癌薬、ヘセプチンの標的）、ならびに細胞成分構造、例えば固定ＭＣＦ−７細胞中の微小管を標識した（図５）。両方の場合におけるＰドット生体共役体は、標的を特異的且つ有効に標識したが、これは、細胞標識化に対するそれらの包括的適用を実証する。
実施例１５：微小管の標識のための発色性ポリマードットＩｇＧ共役体の使用
【０１９９】
微小管標識のために、１万個のＭＣＦ−７細胞を２２×２２ｍｍカバーガラス上に載せて、６０〜７０％集密度になるまで培養した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＰＢＳ中で１５分間、０．２５％トリトン−Ｘ１００で透過処理して、２％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）中で３０分間遮断した。固定およびＢＳＡ遮断ＭＣＦ−７細胞を、順次、５μｇ／ｍＬビオチニル化モノクローナル抗αチューブリン抗体（(Biolegend,  San  Diego,  CA,  USA）とともに６０分間、そして１０ｎＭ  Ｐドットストレプトアビジン共役体とともに３０分間インキュベートした。染色細胞をスライドガラス上に載せて、蛍光共焦点顕微鏡（ツァイスＬＳＭ５１０）で画像処理した。
実施例１６：フローサイトメトリーにおける発色性ポリマードット共役体の使用
【０２００】
蛍光画像処理のほかに、フローサイトメトリーは、プローブの輝度が重要である別の領域がある。Ｐドット生体共役体の標識輝度を、マイクロ流路型フローサイトメーターを用いて、市販のＱドットストレプトアビジンおよびＡｌｅｘａ−ＩｇＧプローブの輝度と比較した。図１０Ａは、Ｐドットストレプトアビジンで標識したＭＣＦ−７細胞のフロー・スルー検出を示す。用いた最低励起強度（０．１ｍＷ）で、Ｐドット標識化細胞に関する良好に明示された強度ピークが、バックグラウンドのはるか上に現れた。これに対して、Ｑドット標識化細胞に関するピークは、バックグラウンドから明白に分離されなかった（図１０Ｂ）。Ｐドットピークは、励起強度の増大に伴ってより高い強度に動き、０．５ｍＷのレーザー出力で検出器を飽和し始めた。全励起条件において、Ｐドットストレプトアビジンで標識したＭＣＦ−７細胞が、Ｐドットストレプトアビジンと同一標識化濃度を用いたＱドット標識細胞の結果と比較して、非常に高い強度レベルを示した。Ｐドットプローブは、低励起条件で有意に高いシグナルレベルを提供し得たが、これは、血液または厚い組織といったような光学的混濁媒質中での生物学的検出のために非常に有用な利益である。
【０２０１】
マイクロ流路型フローサイトメーターを用いて、ＰドットＩｇＧおよびＡｌｅｘａ４８８−ＩｇＧプローブを用いて、同様の強度比較を実施した（図１１）。フローサイトメトリーデータの定量的分析は、Ｐドット標識化細胞の平均強度が、Ｑドット標識化細胞より〜２５倍明るく（図１０Ｃ）、そしてＡｌｅｘａ−ＩｇＧ標識化細胞より〜１８倍明るい（図１０Ｄ）ということを示した。ＰドットストレプトアビジンまたはＱドットストレプトアビジンで標識したＭＣＦ−７細胞の蛍光画像を解析することにより標識化輝度をさらに定量した。Ｐドット標識化細胞はＱドット標識化細胞より〜２０倍明るく、これはフローサイトメトリーデータと一致する（図１２）。
【０２０２】
これらの細胞標識比較値は、単一粒子画像処理から得たものよりわずかに低い。低い値は、いくつかの因子、例えば個々の粒子と比較した場合のプローブアセンブリーの集合的発光行動における相違；生体共役時の抗体またはストレプトアビジンの結合定数の変化；あるいは励起強度に伴う発光速度の変動（飽和）に起因すると考えられる。ＱドットストレプトアビジンおよびＡｌｅｘａ−ＩｇＧプローブに関する最適化濃度（これはＰドットプローブに関しては最適でないことがある）に従って、細胞標識化を実施した、ということに留意することも有益である。したがって、本発明の比較は、伝統的色素およびＱドット生体共役体を上回るＰドット生体共役体により提供される利点の控えめな概算である。この新規のクラスのＰドットベースのプローブに関しては、生体共役反応を、ならびに標識条件を最適化するためのさらに詳細な研究が必要とされる。それでも、最新の細胞画像処理およびフローサイトメトリー結果は、Ｐドット標識化が、市販のＡｌｅｘａ−ＩｇＧおよびＱドットプローブと比較して、シグナルレベルの有意の改善を提供する、ということを明らかに示している。
実施例１７：クリックケミストリー用途と適合性の調製ならびにアジド−およびアルキン−Ｐドット
【０２０３】
蛍光半導電性ポリマー  ポリ［（９，９−ジオクチルフルオレニル−２，７−ジイル）−コ−（１，４−ベンゾ−｛２，１’，３｝−チアジアゾール）］(ＰＦＢＴ、分子量１５７，０００、多分散性３．０)を、ADS  Dyes,  Inc.  (Quebec,  Canada)から購入した。コポリマー  ポリ（スチレン−コ−無水マレイン酸）（ＰＳＭＡ、クメン末端処理、平均分子量〜１，７００、スチレン含量６８％）を、Sigma-Aldrich  (St.  Louis,  MO,  USA)から購入した。他の試薬はすべて、Sigma-Aldrich  (St.  Louis,  MO,  USA)から購入した。
【０２０４】
変法ナノ沈降法を用いて、水溶液中の官能化Ｐドットを調製した。実験はすべて、別記しない限り、室温で実施した。典型的調製では、先ず、蛍光半導電性ポリマーＰＦＢＴをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解して、１ｍｇ／ｍＬストック溶液を作製した。コポリマーＰＳＭＡもＴＨＦ中に溶解して、ＰＦＢＴの希釈溶液と混合して、５０μｇ／ｍＬのＰＦＢＴ濃度および２０μｇ／ｍＬのＰＳＭＡ濃度を有する溶液混合物を得た。混合物を音波処理して、均質溶液を生成した。５ｍＬ量の溶液混合物を、浴音波処理器中のＭｉｌｌｉＱ水  １０ｍＬに迅速に付加した。ＴＨＦを窒素ストリッピングにより除去した。連続窒素ストリッピングにより、９０℃のホットプレート上で溶液を５ｍＬに濃縮した後、０．２μフィルターを通して濾過した。ナノ粒子形成中、ＰＳＭＡ分子の無水マレイン酸単位を水性環境中で加水分解して、Ｐドット上にカルボキシル基を生じた。Ｐドット分散液は、数ヶ月間透明且つ安定で、凝集の兆候は認められなかった。
【０２０５】
カルボキシルＰドットとそれぞれのアミン含有分子との間のＥＤＣ触媒反応を利用して、表面共役を実施した。１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミンを用いて、アジド−Ｐドットを形成した。プロパルギルアミンを用いて、アルキン−Ｐドットを生成した。アミン末端処理ポリ（エチレングリコール）を用いて、ＰＥＧ−Ｐドットを生成した。典型的生体共役反応において、６０μＬのポリエチレングリコール（５％  ｗ／ｖＰＥＧ、分子量３３５０）および６０μＬの濃縮ＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ）を３ｍＬのカルボキシルＰドット溶液（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中５０μｇ／ｍＬ）に付加して、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３中のＰドットの溶液を得た。次に、３０μＬのアミン含有分子（１ｍｇ／ｍＬ）を溶液に付加し、渦巻撹拌器で十分に混合した。最後に、６０μＬの新たに調製したＥＤＣ溶液（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中５ｍｇ／ｍＬ）を溶液に付加し、上記混合物を室温で４時間、磁気撹拌した。最後に、その結果生じたＰドット共役体を、BioRad  Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ（登録商標）１０ＤＧカラム（Hercules,  CA,  USA）により、遊離分子から分離した。
実施例１８：クリック型Ｐドットの特性化
【０２０６】
市販のＦｌｕｏｒｏｌｏｇ−３蛍光計（(HORIBA  Jobin  Yvon,  NJ  USA）を用いて、蛍光スペクトルを得た。直径〜１５ｎｍのＰＦＢＴドットに関する吸収スペクトルの解析は、５．０×１０７Ｍ−１ｃｍ−１のピーク消光係数を示した。官能化Ｐドットの蛍光量子収率を、標準としてエタノール中のクマリン６の希釈溶液を用いて、０．２８であると確定した。他の蛍光ナノ粒子と比較した場合、大きい消光係数および高い量子収率は、粒子当たりの輝度が非常に高いことを示す。官能化Ｐドットの単一粒子光褪色試験は、Ｐドット当たり１０９を上回る光子が光褪色の前に発光され、これはそれらの優れた光安定性と一致する、ということを示した（C.  Wu,  B.  Bull,  C.  Szymanski,  K.  Christensen,  J.  McNeill,  ACS  Nano  2008,  2,  2415）。
【０２０７】
０．７％アガロースゲルを用いて、ゲル電気泳動を実施して、Ｐドット表面の異なる官能基の形成を特性かした（図１７ｂ）。非官能化裸Ｐドットと比較して、カルボキシル官能化Ｐドットは、ゲル中での移動度の明らかな増大を示した。要するに、Ｍｕｐｉｄ（登録商標）−ｅｘＵサブマリン電気泳動系を用いて、官能化Ｐドットのアガロースゲル電気泳動を実行した。Ｐドット（３０％グリセロール中）を、０．１％ＰＥＧを含有する０．７％アガロースゲル上に載せた。Ｐドット負荷ゲルを、トリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中で１３５Ｖで２０分間移動させ、次いで、コダック画像ステーション４４０ＣＦ系で画像処理した。
【０２０８】
動的光散乱および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）測定は、裸および官能化Ｐドットがともに、匹敵する粒子サイズを有し、平均直径は〜１５ｍｍである、ということを示した（図１７ｃ）。したがって、ＰＳＭＡ−官能化Ｐドットの高移動度は、Ｐドット表面の負荷電カルボキシル基の形成を示す。ＴＥＭ測定のために、１滴のＰドット分散液を炭素被覆銅格子上に載せた。水を蒸発させた後、透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｆ２０）でナノ粒子を画像処理した。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを、１ｃｍ石英キュベットを用いてＤＵ  ７２０走査分光光度計（Beckman  Coulter,  Inc.,  CA  USA）で記録した。
【０２０９】
異なるアミン含有分子（アミン末端処理ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アジドおよびアルキン）を用いて、表面共役を実施した。共役は小分子を伴うため、共役化Ｐドットの動的光散乱は、粒子サイズの明らかな変化を示さなかった。しかしながら、カルボキシル官能化Ｐドットと比較した場合のＰドット共役体の電荷低減のため、それらは、予測されるようなゲル中のシフト移動帯域を示した。これらの結果は、Ｐドットの上首尾のカルボキシル官能化、ならびにその後の表面改質を明白に示す。
実施例１９：官能化Ｐドットの安定性
【０２１０】
生物学的用途におけるＰドット蛍光のｐＨおよびイオン感受性を、特に銅触媒クリックケミストリーを分析した。Ｐドットの蛍光はほとんどの生物学的関連イオン、例えば鉄、亜鉛および銅（生物学的有機体中で最も豊富なイオンのうちの３つ）による影響を受けない、ということが判明した。Ｐドット蛍光は、４〜９の範囲のｐＨにも非依存性である（図１６）。この事実は、イオン種と如何なる化学的相互作用も示さない傾向があるＰドットの疎水性有機性に起因し得る。これに対して、無機Ｑドットは、銅および鉄イオンにより優位にクエンチされる（H.  Y.  Xie,  H.  G.  Liang,  Z.  L.  Zhang,  Y.  Liu,  Z.  K.  He,  D.  W.  Pang,  Spectrochimica  Acta  Part  A    2004,  60,  2527）。図１７ａに示したように、ＰＦＢＴドットは１ｍＭという高いＣｕ＋濃度を含有するＭｉｌｌｉ−Ｑ水中で高蛍光性を保持したが、一方、Ｑドットは、１μＭという非常に低いＣｕ＋濃度で完全にクエンチされた（S.  Han,  N.  K.  Devaraj,  J.  Lee,  S.  A.  Hilderbrand,  R.  Weissleder,  M.  G.  Bawendi,  J.  Am.  Chem.  Soc.  2010,  132,  7838）。この特性は、銅（Ｉ）触媒クリック反応に基づいた種々の試験においてＰドットを適用するための有意の利点を提供する。銅溶液中のＰドットの自己凝集を防止するために、溶液にＰＥＧを付加した。
実施例２０：クリック型Ｐドットの反応性
【０２１１】
図１７ｄは、銅（Ｉ）触媒クリック反応による末端アルキン基に対するアジド−Ｐドットの反応性を検査する蛍光検定を示す。銅溶液と混合した場合、アジド−Ｐドットは、純Ｐドットと同様の発光強度を示したが、これは、それらの蛍光が銅イオンに対して非感受性である、ということを確証する。強度のわずかな増大がＰドットおよびアルキン−Ａｌｅｘａ５９４の混合物（Ｃｕ（Ｉ）なし）で観察されたが、しかしこれは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により引き起こされる直接的クエンチングというよりむしろ、主に、内部フィルター作用によるものであった。これに対して、Ｃｕ（Ｉ）の存在下でアルキン−Ａｌｅｘａ５９４と直接的に連結される場合、アジド−Ｐドットは、Ａｌｅｘａ色素からの発光ピークを伴う顕著な蛍光クエンチングを示した。この分光学的変化は、密に近接したＰＦＢＴドットからＡｌｅｘａ色素への効率的ＦＲＥＴの直接的結果であり、有効なアジド−アルキンクリック反応を示した。さらに、アルキン官能化知りかナノ粒子上のアジド−Ｐドットもクリックして、光学的不活性シリカ粒子を高蛍光性プローブに転換した。Ｐドット−シリカ共役体は、水銀灯照明低倍率（４倍）蛍光顕微鏡でも、単一粒子レベルで明瞭に可視的であった（図１７ｅ）。
【０２１２】
アルキン−Ａｌｅｘａ５９４色素は、アジド−Ｐドットとのクリック反応のために、Invitrogen（Eugene,  OR,  USA）から購入した。典型的反応において、１ｍＭのＣｕＳＯ４および５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムの存在下で、３０分間、１％ＢＳＡを含有するＭｉｌｌｉ−Ｑ水中の５０ｎＭのアジド−Ｐドットを、５μＭのアルキン−Ａｌｅｘａ５９４色素と混合した後、分光測光的測定を実施した。アジド−Ｐドットとアルキン知りか粒子とのクリック反応のために、シリカコロイド（直径〜２００ｎｍ）を、標準ストーバー法に従って調製した。シリカ粒子に対するアルキン官能化を、以下のように実施した：８０ｍｇのシリカ粒子を無水エタノールで洗浄し、乾燥し、４ｍＬの無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に再懸濁した。８０μＬのＯ−（プロパルギルオキシ）−Ｎ−（トリメトキシシリルプロピル）ウレタンを、ＤＭＦ懸濁液中のシリカに付加し、混合物を９０℃ホットプレート上で２４時間、磁気撹拌した。アルキン官能化シリカナノ粒子をエタノールで十分に洗浄し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中に再懸濁した。典型的クリック反応のために、１％ＢＳＡを含有するＭｉｌｌｉ−Ｑ水中の５０ｎＭアジド−Ｐドット  ０．５ｍＬを、１ｍＭのＣｕＳＯ４および５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムの存在下で、２時間、０．１ｍＬのアルキン−シリカ粒子（２０ｍｇ／ｍＬ）と混合した。次に、Ｐドット−装飾シリカ粒子をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で十分に洗浄した。Ｐドット−装飾シリカ粒子の希釈溶液１滴をカバーガラス上に載せて、ＡＺ−プランＡｐｏ４×対物レンズ(Ｎｉｋｏｎ  ＡＺ１００、Melville,  NY,  USA)を有するアップライト顕微鏡で観察し、励起光源として水銀灯を用いた。
実施例２１：クリック型Ｐドットによる代謝的標識化
【０２１３】
Ｐドットおよびクリックケミストリーによる細胞性標識化を実証するために、生体直交型非標準アミノ酸タグ化（ＢＯＮＣＡＴ）により改質された新規合成タンパク質を可視化した。ＢＯＮＣＡＴ技法では、細胞中の新規合成タンパク質は、アジド−（またはアルキン−）保有人工アミノ酸で代謝的に標識される。人工アミノ酸は、独特の化学的機能性をタンパク質に付与し、これはその後、高選択的方法での検出または単離のために外因性プローブでタグされる（D.  C.  Dieterich,  A.  J.  Link,  J.  Graumann,  D.  A.  Tirrell,  E.  M.  Schuman,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  2006,  103,  9482）。アジドホモアラニン（ＡＨＡ）およびホモプロパルギルグリシン（ＨＰＧ）は、この方法に一般に用いられる２つの人工アミノ酸である。それらは、必須アミノ酸であるメチオニンの有効な代用物である；メチオニンの非存在下で、細胞性合成機構は、直接的にそれらをタンパク質中に組入れる。このアプローチは、放射性アミノ酸３５Ｓ−メチオニンによる伝統的代謝的標識化と操作的に同様である。組入れ後、ＡＨＡおよびＨＰＧは外因性プローブ（本発明の実施例においては、in  situ画像処理のための高蛍光性Ｐドットである）によるタグ化に感受性になる。
【０２１４】
先ず、ＡＨＡ標識化タンパク質を、Ｐドット−アルキンプローブを用いて標的かした。ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を増殖させて集密にした後、メチオニンを欠く無血清培地中に通した。あらゆる残留メチオニンを枯渇させるためにインキュベーション後、細胞培養にＡＨＡを４時間補足した。次いで、細胞を洗浄し、固定した後、ＣｕＳＯ４、還元剤（アスコルビン酸ナトリウム）およびトリアゾールリガンドの存在下で、アルキン−Ｐドットとのクリック反応を実行した。Ｐドットタグ化細胞を、共焦点蛍光顕微鏡で直ちに観察した。同一設定を用いて、Ｐドット標識化細胞および陰性対照から画像を得た。
【０２１５】
要するに、新規合成タンパク質の代謝的標識化のために、ホモプロパルギルグリシン（ＨＰＧ）およびＢｌｏｃｋＡｉｄ（商標）遮断緩衝液を、Invitrogen（Eugene,  OR,  USA）から購入した。アジドホモアラニン（ＡＨＡ）は、Medchem  Source  LLP  (Federal  Way,  WA,  USA)から購入した。ＭＣＦ−７細胞を増殖させて集密にした後、メチオニンを欠く無血清培地中に通した。あらゆる残留メチオニンを枯渇させるために１時間インキュベーション後、培養に０．１ｍＭのＡＨＡまたはＨＰＧを４時間補足した。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、ＢｌｏｃｋＡｉｄ（商標）遮断緩衝液中で遮断した。ＡＨＡまたはＨＰＧ標識化細胞を、１ｍＭのＣｕＳＯ４、５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭのトリス（（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン（ＴＢＴＡ、トリアゾールリガンド）および５０ｎＭのアルキン−Ｐドット（ＡＨＡ標識細胞用）またはアジド−Ｐドット（ＨＰＧ標識細胞用）の混合物とともに１時間インキュベートした。次いで、Ｐドットタグ化細胞を、ヘキスト３４５８０で対比染色して、蛍光共焦点顕微鏡（ツァイスＬＳＭ５１０）で直ちに観察した。
【０２１６】
図１８は、Ｐドット標識細胞および対照試料の共焦点蛍光および明視野画像を示す。クリック反応によりＰドット−アルキンでタグされたＡＨＡ標識細胞に関して、非常に明るい蛍光が観察された（図１８ａ〜１８ｄ）。細胞を同一条件下で、しかし還元剤（アスコルビン酸ナトリウム）（ＣｕＳＯ４から銅（Ｉ）を生成する）の非存在下でインキュベートした場合、Ｐドットによる細胞標識化は観察されなかったが、これは、Ｐドット−アルキンが銅（Ｉ）触媒化反応に関して選択的であることを示す（図１８ｅ〜１８ｈ）。異なる対照において、銅（Ｉ）触媒Ｐドット−アルキンタグ化を、図１８ａ〜１８ｄと同一条件下で、しかしＡＨＡに曝露されない細胞で、実施した。この対照でも、細胞標識化は観察されず（図１９）、これは、Ｐドット−アルキンタグ化が当該細胞性標的に高度に特異的であったことを示す。さらに、Ｐドット−アジドを用いて、ＨＰＧとともにインキュベートしたＭＣＦ−７細胞中の新規合成タンパク質を検出した。この場合、Ｐドット−アジドも標的を特異的に且つ有効に標識した（図２０）。Ｐドット−アルキン標識化（ＡＨＡ処理細胞）と比較した場合、Ｐドット−アジド標識化（ＨＰＧ処理細胞）の蛍光輝度における明白な差異は観察されなかった。これは、ＨＰＧおよびＡＨＡが哺乳動物細胞における発生期タンパク質の合成において非常によく似た活性を示す、という文献結果と一致する。
実施例２２：クリック型Ｐドットによる糖タンパク質標識化
【０２１７】
Ｐドット−アルキンを用いて、種々の生物学的機能に広範に関与するタンパク質の亜組である糖タンパク質を、選択的に標的にした。生体直交型化学反応戦略は、培養細胞上での、ならびに種々の生きている生物体中のグリカンをプローブするために、従来、開発されてきた（例えば、J.  A.  Prescher,  D.  H.  Dube,  C.  R.  Bertozzi,  Nature  2004,  430,  873；D.  H.  Dube,  J.  A.  Prescher,  C.  N.  Quang,  C.  R.  Bertozzi,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  2006,  103,  4819；S.  T.  Laughlin,  C.  R.  Bertozzi,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  2009,  106,  12；およびM.  A.  Breidenbach,  J.  E.  G.  Gallagher,  D.  S.  King,  B.  P.  Smart,  P.  Wu,  C.  R.  Bertozzi,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  2010,  107,  3988参照）。当該方法は、アジド基で官能化され、その後、アジド糖が画像処理プローブで共有的にタグされる単糖前駆体によるグリカンの代謝的標識化を包含する。アジド基を有するＯ連結糖タンパク質を濃化するために、ＭＣＦ−７細胞を、Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｚ）とともに３日間インキュベートした。ＧａｌＮＡｚ処理細胞をクリック反応によりＰドット−アルキンでタグして、その後、共焦点顕微鏡で観察した。Ｐドット−アルキンで陽性タグ化された細胞に関して、明るい細胞表面標識化が観察された（図２１ａ〜２１ｄ）。細胞を還元剤の非存在下でＰドット−アルキンとともにインキュベートした陰性対照では、細胞標識化は観察されなかった（図２１ｅ〜２１ｈ）。付加的対照として、同一条件化で、しかしアジドを欠く細胞において、Ｐドットタグ化を実施した；この場合、細胞標識化は観察されず、これもまた、Ｐドット標識化が当該細胞性標的に高度に特異的であったことを示す。
【０２１８】
要するに、糖タンパク質の代謝的標識化のために、Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｚ）を、Invitrogen（Eugene,  OR,  USA）から購入した。Ｏ連結糖タンパク質中のアジド基を濃化するために、ＭＣＦ−７細胞を、Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｚ）を含有する一般ＥＭＥＭ培地を用いて、３日間培養した。ＧａｌＮＡｚ標識化細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、ＢｌｏｃｋＡｉｄ（商標）遮断緩衝液中で遮断した。次いで、ＧａｌＮＡｚ標識化細胞を、１ｍＭのＣｕＳＯ４、５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭのトリス（（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン（ＴＢＴＡ、トリアゾールリガンド）および５０ｎＭのアルキン−Ｐドットの混合物とともに１時間インキュベートした。次いで、Ｐドットタグ化細胞を、ヘキスト３４５８０で対比染色して、蛍光共焦点顕微鏡（ツァイスＬＳＭ５１０）で直ちに観察した。
実施例２３：赤色発光ＰＢドットの調製および官能化
【０２１９】
以前の報告と同様にして、赤色発光半導電性ポリマーＰＦ−０．１ＴＢＴおよびＰＦ−０．１ＤＨＴＢＴを合成し、特性化した（Hou,  Q.  et  al.  J.  Mater.  Chem.  12,  2887-2892  (2002);  and  Hou,  Q.  et  al.  Macromol.  37,  6299-6305  (2004)）。集光性半導電性ポリマー  ポリ［｛９，９−ジオクチル−２，７−ジビニレン−フルオレニレン｝−アルト−コ−｛２−メトキシ−５−（２−エチルヘキシルオキシ）−１，４−フェニレン｝］（ＰＦＰＶ、分子量２２０，０００、多分散性３．１）およびポリ［（９，９−ジオクチルフルオレニル−２，７−ジイル）−コ−（１，４−ベンゾ−｛２，１’，３｝−チアジアゾール）］(ＰＦＢＴ、分子量１５７，０００、多分散性３．０)を、ADS  Dyes,  Inc.  (Quebec,  Canada)から購入した。両親媒性官能性ポリマー  ポリ（スチレン−コ−無水マレイン酸）（ＰＳＭＡ、クメン末端処理、平均分子量〜１，７００、スチレン含量６８％）を、Sigma-Aldrich  (St.  Louis,  MO,  USA)から購入した。ＰＢドット調製のための他の試薬はすべて、Sigma-Aldrich  (St.  Louis,  MO,  USA)から購入した。
【０２２０】
変法ナノ沈降法を用いて、水溶液中の官能化ＰＢドットを調製した（Wu,  C.,  Peng,  H.,  Jiang,  Y.  &  McNeill,  J.  J.  Phys.  Chem.  B  110,  14148-14154  (2006)；およびWu,  C.,  Bull,  B.,  Szymanski,  C.,  Christensen,  K.  &  McNeill,  J.  ACS  Nano  2,  2415-2423  (2008)）。実験はすべて、別記しない限り、室温で実施した。典型的調製では、先ず、集光性ポリマーＰＦＢＴ、赤色発光ポリマーＰＦ−０．１ＴＢＴおよび両親媒性官能性ＰＳＭＡをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解して、それぞれ１ｍｇ／ｍＬストック溶液を作製した。３つのポリマー溶液をＴＨＦで希釈し、混合して、５０μｇ／ｍＬのＰＦＢＴ濃度、３０μｇ／ｍＬのＰＦ−０．１ＴＢＴ濃度および２０μｇ／ｍＬのＰＳＭＡ濃度を有する溶液混合物を得た。混合物を音波処理して、均質溶液を生成した。５ｍＬ量の溶液混合物を、浴音波処理器中のＭｉｌｌｉＱ水  １０ｍＬに迅速に付加した。ＴＨＦを窒素ストリッピングにより除去した。連続窒素ストリッピングにより、９０℃のホットプレート上で溶液を５ｍＬに濃縮した後、０．２μフィルターを通して濾過した。ナノ粒子形成中、ＰＳＭＡ分子の無水マレイン酸単位を水性環境中で加水分解して、ＰＢドット上にカルボキシル基を生じた。ＰＢドット分散液は、数ヶ月間透明且つ安定で、凝集の兆候は認められなかった。
実施例２４：カルボキシル配合ポリマードット（ＰＢドット）との表面生体共役
【０２２１】
生体分子共役のために、腫瘍特異的ペプチドリガンドであるクロロトキシン（ＣＴＸ）を、Alomone  Labs,  Ltd.  (Jerusalem,  Israel)から購入した。ストレプトアビジンは、Invitrogen  (Eugene,  OR,  USA)から購入した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびアミン末端処理ポリエチレングリコール（メチル−ＰＥＧ８−ＮＨ２）を、Thermo  Fisher  Scientific  (Rockford,  IL,  U.S.A)から購入した。
【０２２２】
カルボキシルＰＢドットとそれぞれのアミン含有生体分子（メチル−ＰＥＧ８−ＮＨ２、クロロトキシンおよびストレプトアビジン）との間のＥＤＣ触媒反応を利用することにより、生体共役を実施した。典型的生体共役反応では、６０μＬのポリエチレングリコール（５％ｗ／ｖ  ＰＥＧ、分子量３３５０）および６０μＬの濃縮ＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ）を、３ｍＬのカルボキシルＰＢドット溶液（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中５０μｇ／ｍＬ）に付加して、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３中のＰＢドット溶液を生じた。次いで、３０μＬのアミン含有分子（１ｍｇ／ｍＬ）を溶液に付加し、渦巻撹拌機で十分に混合した。最後に、６０μＬの新たに調製したＥＤＣ溶液（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中５ｍｇ／ｍＬ）を溶液に付加し、上記混合物を、室温で４時間、磁気撹拌した。最終的に、その結果生じたＰＢドット−ＣＴＸおよびＰＢドット−ＰＥＧ共役体を、Bio-RadＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ（登録商標）１０ＤＧカラム（Hercules,  CA,  USA）により、遊離分子から分離した。ＰＢドット−ストレプトアビジン生体共役体を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ＨＲ−３００ゲル媒質を用いたゲル濾過により分離した。
実施例２５：配合ポリマードット（ＰＢドット）の特性化
【０２２３】
ＰＢドットとＱドット（異なる発色Ｑドットプローブのうちの最も明るいものである６５５ｎｍで発光する)との並列輝度比較を実行するために、単一粒子画像処理を実施した。Ｑドット６５５が合理的に検出されるよう、４８８ｎｍレーザー励起出力を用いて（図２６ｂ）、ＰＢドットの大多数は、同一獲得およびレーザー条件下で、検出器を実際に飽和した。このような顕著な対比は、ＰＢドットの高モル消光係数に起因する（直径〜１５ｎｍのナノ粒子に関しては、４８８ｎｍで〜３．０×１０７ｃｍ−１Ｍ−１）。検出器飽和を回避するために、減光フィルター（光学密度  １；これは発光された蛍光の９０％を遮断する）を発光フィルターと一緒に置いて、ＰＢドットの単一粒子蛍光画像を得た（図２６ｃ）。数千個の粒子を収集し、それらの蛍光強度を減衰係数によって算定し戻した。蛍光強度分布は、ＰＢドットがＱドット６５５より１５倍以上明るいことを示したが（図２６ｄ）、これは、バルクスペクトル解析に基づいた輝度比較と一致する。ＴＣＳＰＣ設定により、ＰＢドットの蛍光寿命を３．５ｎｓであると確定した。単一ＰＢドットが多重エミッターを含有すると言うことに留意することは有益であり、これは、蛍光寿命単独から予測されるものより高い光子発光率を生じる。
実施例２６：共役化ＰＢドットの調製および特性化
【０２２４】
変法ナノ沈降法を用いて、水溶液中の官能化ＰＢドットを調製した（Veiseh,  O.  et  al.,  Cancer  Res.  69,  6200-6207  (2009)；およびChoi,  H.  S.  et  al.,  Nature  Biotechnol.  25,  1165-1170  (2007)）。典型的調製では、集光性ポリマーＰＦＢＴ、赤色発光ポリマーＰＦ−０．１ＴＢＴおよび官能性ポリマーＰＳＭＡをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解して、５０μｇ／ｍＬのＰＦＢＴ濃度、３０μｇ／ｍＬのＰＦ−０．１ＴＢＴ濃度および２０μｇ／ｍＬのＰＳＭＡ濃度を有する溶液混合物を得た。混合物を音波処理して、均質溶液を生成した。５ｍＬ量の溶液混合物を、浴音波処理器中のＭｉｌｌｉＱ水  １０ｍＬに迅速に付加した。ＴＨＦを窒素ストリッピングにより除去した。連続窒素ストリッピングにより、９０℃のホットプレート上で溶液を５ｍＬに濃縮した後、０．２μフィルターを通して濾過した。
【０２２５】
クロロトキシン（ＣＴＸ）（３６−アミノ酸ペプチド）を、神経外胚葉起源の腫瘍に対するその強い親和性のために、腫瘍標的化リガンドとして選択した。ＣＴＸは、神経膠腫、髄芽腫、前立腺癌、肉腫および腸癌と特異的に結合する、ということが示されている。先ず、ＰＢドットを、両親媒性ポリマー  ポリ（スチレン−コ−無水マレイン酸）（ＰＳＭＡ）により官能化した。ＰＳＭＡ分子の疎水性ポリスチレン単位は、ＰＢドット粒子の内側に固定されたが、一方、無水マレイン酸単位はＰＢドット表面に位置し、水性環境中で加水分解されて、カルボキシル基を生じた。カルボキシル基は、標準カルボジイミド化学により表面共役を可能にする（Hermanson,  G.  T.  Bioconjugate  Techniques  (Academic  Press,  San  Diego,  2008)）。
【０２２６】
ＣＴＸのほかに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、タンパク質吸着を低減し、免疫認識を制限し、それによりin  vivoでのナノ粒子血清寿命を増大するために共役され得る。ストレプトアビジンも、別個の対照として生体共役に用いられて、特異的細胞性標識化による共役戦略を立証する。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、裸および官能化ＰＢドットがともに、匹敵する粒子サイズ（直径〜１５ｎｍ）を有することを示した（図２６ｄ）が、これは、動的光散乱結果と一致する（図２９）。異なる分子（ＰＥＧ、ＣＴＸおよびストレプトアビジン）との共役後、ゲル電気泳動は、表面電荷および粒子サイズの変化のため、０．７％アガロースゲル中のＰＢドット共役体のシフト移動帯域を示した。これらの結果は、上首尾のカルボキシル官能化および表面生体共役を明白に示す。
【０２２７】
カルボキシルＰドットとそれぞれのアミン含有生体分子（クロロトキシン、メチル−ＰＥＧ８−ＮＨ２、またはストレプトアビジン）との間のＥＤＣ触媒反応を利用することにより、表面生体共役を実施した。典型的生体共役反応では、６０μＬのポリエチレングリコール（５％ｗ／ｖ  ＰＥＧ、分子量３３５０）および６０μＬの濃縮ＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ）を、３ｍＬのカルボキシルＰＢドット溶液（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中５０μｇ／ｍＬ）に付加して、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３中のＰドット溶液を生じた。次いで、３０μＬのアミン含有分子（１ｍｇ／ｍＬ）を溶液に付加し、渦巻撹拌機で十分に混合した。最後に、６０μＬの新たに調製したＥＤＣ溶液（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中５ｍｇ／ｍＬ）を溶液に付加し、上記混合物を、室温で４時間、磁気撹拌した。最終的に、その結果生じたＰＢドット−ＣＴＸおよびＰＢドット−ＰＥＧ共役体を、Bio-RadＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ（登録商標）１０ＤＧカラム（Hercules,  CA,  USA）により、遊離分子から分離した。ＰＢドット−ストレプトアビジン生体共役体を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ＨＲ−３００ゲル媒質を用いたゲル濾過により分離した。
【０２２８】
長期長期運命およびin  vivo安定性は、in  vivoプローブを設計するための根本的および臨床的意義の両方を有する。ナノプローブの完全性は、主に、生物学的環境におけるイオン種および活性酸素種（ＲＯＳ）に対する素あれらの化学的反応性によって決まる。例えば、Ｑドットは、生理学的濃度での銅イオンおよびＲＯＳのために重度の化学的分解を蒙るが、これは、発光の損失および毒性Ｃｄイオンの放出を引き起こす。ｐＨ、生物学的胃関連イオンおよびＲＯＳに対するＰＢドットの感受性を調べた。ＰＢドットは、４〜９の生理学的ｐＨ範囲において一定の蛍光を示した（図３０）。ＰＢドットの蛍光は、さらにまた、試験下（図３１）の任意の生物学的関連イオン、例えば生物学的有機体における最も豊富なイオンのうちの３つである鉄、亜鉛および銅による影響を受けなかった。さらに、生理学的環境における２つの一般的且つ安定なＲＯＳである次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は、ＰＢドットの蛍光に及ぼす如何なる作用も示さない。これに対して、ストレプトアビジン共役化ポリマー封入Ｑドット６５５プローブは、ＰＢドットに関して用いたものと同じ濃度で、Ｈ２Ｏ２および鉄イオンにより有意にクエンチされ、そしてＨＯＣｌおよび銅イオンにより完全にクエンチされる。ＰＢドットの安定蛍光は、それらの疎水性有機高分子性に起因し得るが、これは、金属イオンおよびＲＯＳとの化学的相互作用を有する傾向はない。この特性は、in  vivoプローブとしてＰＢドットを用いるための有意の利点を提供する。
実施例２７：官能化ＰドットによるＣｕ２＋およびＦｅ２＋イオンの検出
【０２２９】
典型的には、４０μｇのＰＦＢＴおよび８μｇのＰＳＭＡを、５ｍＬのＴＨＦ中に溶解した。次いで、この混合物を、激しい音波処理下で、１０ｍＬの水中に迅速に注入した。次に、９６℃ホットプレート上で１時間、窒素でパージすることによりＴＨＦを除去した。その結果生じたＰドット溶液を、０．２μｍ酢酸セルロース膜フィルターを通して濾過して、調製中に形成されたあらゆる凝集物を除去した。
【０２３０】
高蛍光性半導電性ポリマー  ポリ［９，９−ジオクチルフルオレニル−２，７−ジイル）−コ−１，４−ベンゾ−｛２，１’−３｝−チアジアゾール）］（ＰＦＢＴ）を用いて、ＰＳＭＡポリマー（２０％）をＰＦＢＴマトリックスに付加して、ＰＳ−ＣＯＯＨコＰＦＢＴ  Ｐドットを形成した。無水マレイン酸単位の加水分解によりＰドット上にカルボキシル基を生成し、一方、ポリスチレン部分はＰＦＢＴポリマーの疎水性コアの内側に固定される傾向があった。水性溶液中に良好に分散されたこれらのＰドットならびにカルボキシル部分は、さらなる改質を伴わずに、金属イオンのための選択的配位基として役立った。カルボキシル官能化ＰＦＢＴ  Ｐドットの蛍光は、Ｃｕ２＋およびＦｅ２＋イオンにより選択的にクエンチされることが判明した（図３２）。
【０２３１】
いくつかの異なる型のポリマー、例えばＰＦＢＴおよびポリ［（４−（５−（７−メチル−９，９−ジオクチル−９Ｈ−フルオレン−２−イル）チオフェン−２−イル）−７−（５−メチルチオフェン−２イル）ベンゾ［ｃ］［１，２，５］チアジアゾール）］（ＰＦＴＢＴ）  Ｐドット（ＰＳＭＡと配合されていない）は、緩衝溶液（下記参照）中の種々のイオンに対する優れた安定性（凝集およびクエンチングなし）を示したが、これは、非官能化Ｐドットがこれらの方法において良好な対照として役立ち得る、ということを実証する。
【０２３２】
Ｐドットの凝集および自己クエンチング行動は、Ｐドットの表面のＰＳ−ＣＯＯＨ基と溶液中のＣｕ２＋およびＦｅ２＋との間のキレート化相互作用に起因した。ＰＥＧはＰドットの凝集および自己クエンチング行動を防止し得るため、この実施例で記載した実験では溶液中にＰＥＧを付加しなかった、ということに注目する。この減少は、Ｃｕ２＋の付加の前および後になされた透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）測定によって明示される（図３３ＡおよびＢ）。動的光散乱（ＤＬＳ）測定も、調製したままのＰドットの直径はＣｕ２＋の付加前は平均で〜２１ｎｍであったが、しかしＣｕ２＋の付加後は〜５００ｎｍに増大する、ということを示した（図３３Ｃ）。
【０２３３】
ＰＳ−ＣＯＯＨコＰＦＢＴ  Ｐドットの蛍光に及ぼす種々の他の生理学的に重要な陽イオンの作用も調べた。それらの発光強度は、純水（Ｉブランク）中のＰＳ−ＣＯＯＨコＰＦＢＴ  Ｐドットの発光強度と比較して、他の陽イオンによる影響を受けないかまたは最小度に影響される、ということが判明した（図３４）。
【０２３４】
この試験では、非官能化ＰＦＢＴコＰＦＴＢＴ  Ｐドットを内部標準として用いた。ＰＳ−ＣＯＯＨコＰＦＢＴ  Ｐドットは、４９０ｎｍより低い波長で励起されると、５４０ｎｍで発光するが、一方、ＰＦＢＴコＰＦＴＢＴ  Ｐドットは、同一波長で励起された場合、６２３ｎｍで発光する。発光波長におけるこのシフトは、ＰＦＢＴからＰＦＴＢＴへの効率的エネルギー移動とその後のＰＦＴＢＴからの発光により引き起こされる。内部標準としてのＰＦＢＴコＰＦＴＢＴ  Ｐドットの使用は、２つの蛍光発光強度（５４０ｎｍ／６２３ｎｍ）に基づいたレシオメトリックイオン決定の適用を可能にし、それにより環境からの任意の妨害または機器におけるドリフトを排除した。
【０２３５】
図３５Ａは、Ｃｕ２＋濃度の一関数としてのＰＳ−ＣＯＯＨコＰＦＢＴ  ＰドットおよびＰＦＢＴコＰＦＴＢＴ  Ｐドットを含有する溶液の発光スペクトルを示す。ＰＦＴＢＴ含有Ｐドットの発光強度（６２３ｎｍ）は一定のままであったが、一方、ＰＳ−ＣＯＯＨ含有Ｐドットは、３０μＭまでのＣｕ２＋濃度の増大に伴ってそれらの強度を増大した（５４０ｎｍ）、ということは明白である。３０μＭより高い濃度に関しては蛍光強度のさらなる低下は観察されなかったが、これは、カルボキシル基のすべてが銅イオンにより既に占有されている、ということを示す。この実験組に関しては、１０反復実験からのブランクシグナルの相対的標準偏差は、１．１％であった。〜６％のクエンチングシグナルが、１００ｎＭの銅イオンで観察された。図３５Ｂは、ΔＩ５４０ｎｍ／Ｉ６２３ｎｍの比とＣｕ２＋濃度との間の線形相関を示す（これは、１μＭ〜３０μＭの範囲であった（Ｒ２＝０．９９２））。
【０２３６】
凝集誘導性蛍光クエンチングは、Ｐドット表面のカルボキシル部分とＣｕ２＋との間の２：１サンドイッチ錯体の形成により引き起こされるため、強力な銅イオンキレート剤であるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）はカルボキシル基より優勢であり、したがって凝集を再分散させる、と予測し得る。この仮説を試験するために、Ｃｕ２＋イオンと同一モル量のＥＤＴＡを凝集Ｐドット溶液に付加し、ＰＳ−ＣＯＯＨコＰＦＢＴ  Ｐドットの蛍光強度が完全に回復されたことを見出した（図３５Ｃ）。
【０２３７】
さらに、溶液中への過剰量のＥＤＴＡの付加は、発光強度の如何なるさらなる増大も引き起こさず、これは、付加的銅イオンがＥＤＴＡによりキレート化され得る、ということを示唆する。ＤＬＳ実験も、凝集ＰドットがＥＤＴＡの付加後に再分散される、ということを実証した（図３３Ｃ）。
【０２３８】
この工程が、最小相対シグナル損失で多数回反復し得る、ということは注目に値するが、これは、このプロトコールが１回だけ使用の検定というよりむしろ、何回も再使用し得る、ということを示す。この可逆性は、Ｃｕ２＋およびＣｄ２＋間の非可逆的陽イオン交換工程のため、量子ドットベース（例えばＣｄＳｅ）のＣｕ２＋センサーでは観察されなかった（Y.-H.  Chan  Y.H.  et  al.,  Anal.  Chem.,  2010,  82,  3671-3678；およびSadtler  B.  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  2009,  131,  5285-5293）。Ｐドットの凝集および再分散の両方に関する応答時間は非常に短く（１分未満）、蛍光強度は反応後数日間変わらないままであった、ということに注目することは有益である。
【０２３９】
凝集および自己クエンチング現象は、図３６に示したように１０〜２５μＭの動的範囲で感知するＦｅ２＋に関しても観察された（Ｒ２＝０．９９６）。ＰＳ−ＣＯＯＨコＰＦＢＴ  Ｐドットの蛍光強度はＦｅ２＋により有意に（７０％）クエンチされたが、しかしこのクエンチングはＥＤＴＡを付加することによって逆転されなかったが、これは、Ｃｕ２＋よりもＦｅ２＋に関するＥＤＴＡの結合定数が非常に低いためであると思われる。
【０２４０】
カルボキシル基をプロトン化しようと努力して、Ｐドット−Ｆｅ２＋混合物のｐＨ値を調整し、次いで、過剰量のＥＤＴＡを溶液中に付加した。しかしながら、実質的発光強度（１０％未満）は、ｐＨ＝１でさえ回復されなかった。その上、これらのＰドットは、ｐＨが２より低いと凝集しがちであった。したがって、Ｃｕ２＋誘導性自己クエンチングからの、ＥＤＴＡの付加による、蛍光の選択的回復は、銅および鉄感知間の弁別を可能にして、それらの濃度を個々に確定し得た。
実施例２８：官能化ＰドットによるＣｕ２＋およびＦｅ２＋イオンの同時検出
【０２４１】
実施例２６に略記した検出方法の適用を実証するために、細胞培地を選択したが、これは、それが複合生理学的流体を刺激し、同時に、良好に制御された溶液として役立つためでもある。ここで、Ｐドットセンサーを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ  Ｄ−５９２１）溶液中に、それぞれ１０μＭおよび１５μＭの銅および鉄イオンを加えることにより、試験試料を調製した。次に、Ｃｕ２＋の濃度がＰドットの回復された発光強度から算定され得るよう、ＥＤＴＡを溶液に付加した。次いで、Ｉブランクを比較することにより、Ｆｅ２＋濃度を概算した。この測定は、銅および鉄イオンの濃度がそれぞれ１０．１７±１．３４μＭおよび１６．１６±１．８２μＭであるということを示したが、これは、加えた値との良好な一致を示した。この実験は、複合試料中の銅および鉄検出のためのこのＰドットベースの感知系の使用の実現可能性を実証する。
実施例２９：近赤外蛍光を有する官能化発色性ポリマードット
【０２４２】
本実施例は、近赤外（ＮＩＲ）色素が官能化発色性ポリマードット（ＣＰドットまたはＰドット）中に混入されて、発色性ポリマードット生体共役体の蛍光特性を調整し得る、という実証を提供する。発色性ポリマードットを記述するために、以下でＣＰドットまたはＰドットを互換的に用いる。
【０２４３】
ＮＩＲ色素混入ＣＰドットの調製および特性化。  典型的手法において、５０μｇ／ｍＬのＰＦＢＴ、５０μｇ／ｍＬのＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨおよび０．２μｇ／ｍＬのＮＩＲ色素  ケイ素２，３−ナフタロシアニンビス（トリヘキシルシリルオキシド）（ＮＩＲ７７５）を含有するＴＨＦ溶液を調製した。次に、混合物の５ｍＬアリコートを、激しく音波処理しながら１０ｍＬの水中に迅速に分散させた。窒素ガスで保護しながら、余分のＴＨＦを高温（１００℃より低い）で蒸発させた。ＴＨＦ無含有ＣＰドット溶液を、０．２μｍのセルロース膜フィルターを通して濾過し、適切な濃度に調整した。ＣＰドットのサイズおよび形態を、透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｆ２０、２００ｋＶ）を用いて調べた。ＣＰドットのサイズを、動的光散乱機器（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＮａｎｏＺＳ）を用いて、水溶液中でも測定した。ＣＰドットおよびＮＩＲ色素のＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを、水中でＤＵ  ７２０走査分光光度計（Beckman  Coulter,  Inc.,  CA  USA）で記録した。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＮａｎｏＺＳを用いて、ゼータ電位を試験することにより、ＣＰドットのカルボキシル表面を立証した。カルボキシル表面を伴うまたは伴わないＣＰドットをともに、ゲル電気泳動実験で試験した。０．７％の通常融点アガロース、０．２％のＰＥＧ（分子量３３５０）および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて、ゲルを調製した。ＣＰドット試料を、３０％グリセロールの助けを駆りながら電気泳動チャンネルに負荷し、Ｍｕｐｉｄ（登録商標）−ｅｘＵサブマリン電気泳動系を用いて、１０Ｖ／ｃｍの電気泳動力下で１５分間、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で移動させた。次に、コダック画像ステーション４４０ＣＦ系を用いて、ゲルを展開した。Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３蛍光計（(HORIBA  Jobin  Yvon,  NJ  USA）を用いて、ＣＰドットおよびＮＩＲ色素の蛍光スペクトルを測定した。時間相関単一光子計数機器（ＴＣＳＰＣ）を用いて、ＮＩＲ色素混入ＣＰドットおよびＰＦＢＴドットの蛍光寿命データを得た。１５０Ｗ  ＣＷキセノンランプからの４５７ｎｍ励起で、積分球（モデルＣ９９２０−０２、Hamamatsu  Photonics）により、ＰＦＢＴドットおよびＮＩＲ色素混入ＣＰドットの蛍光量子収量を収集した。
【０２４４】
ＮＩＲ発光を有する官能化ＣＰドット。  異なる機能を有する３つの構成成分：緑色半導電性ポリマー（ＰＦＢＴ）、ＮＩＲ色素（ＮＩＲ７７５）および両親媒性ポリマー（ＰＳＰＥＧ−ＣＯＯＨ）を用いて、ＮＩＲ色素混入ＣＰドットを処方した（図３７）。ＣＰドットの必須部分として、半導電性ポリマーはＰドットの疎水性マトリックスを形成し、ＮＩＲ色素のための宿主として役立つ。ＮＩＲ７７５色素は、疎水性溶媒中で高蛍光性であるが、一方、それらは、自己凝集のために生理学的環境中では有意に低い。これらの色素をＰドットマトリックスの内側に混入した場合、凝集は回避されるか有意に低減された。ＣＰドットの内側では、ＮＩＲ色素は、半導電性ポリマーマトリックスからのエネルギーを受容するアクセプターとして役立ち、強力なＮＩＲ蛍光を生じる。蛍光画像処理の目的のために、両親媒性ポリマーＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを用いて、カルボキシル基でＣＰドットの表面を改質した。ここで、ポリマーの疎水性部分は、Ｐドットマトリックスと絡まったが、親水性部分は生理学的環境中に引き伸ばされた。Ｐドット加工製造および疎水性色素混入に関する簡易性および高効率性のため、ナノ沈降法を用いてＮＩＲ色素混入ＣＰドットを合成した（図３７）。先ず、ＣＰドットの構成成分すべてを無水ＴＨＦ中に溶解し、混合して、次に、音波処理下で水中に迅速に沈降させた。溶媒環境の突然の変化ならびに強力な音波処理力により、ナノメートルサイズの半導電性ポリマー粒子が生じ、同時に、ＣＰドットマトリックス中に疎水性ＮＩＲ色素（ＮＩＲ７７５）が閉じ込められた。ＣＰドットおよび水の界面で集合された両親媒性ポリマーとして、カルボキシレート表面も生成された。
【０２４５】
ＴＥＭ画像およびＤＬＳ結果はともに、ＮＩＲ色素混入ＣＰドットが１８ｎｍの平均直径を有する単分散粒子であった、ということを示す（図３８Ａおよび３８Ｂ）。これらの粒子において、ＮＩＲ色素は、以下の実験により立証さえるように、首尾よく封入された。先ず、遊離ＮＩＲ色素だけを通過させて、混入物は通さない１００Ｋ分子量カットオフ遠心分離膜を用いて、Ｐドット溶液を濾過した。濾液は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光計でモニタリングした場合、ＮＩＲ色素を含有しなかったが、一方、濾過後のＮＩＲ色素混入ＣＰドットの溶液中で、ＮＩＲ色素の吸収が観察された。この結果は、ＮＩＲ色素がＣＰドット中に完全に混入されたことを示す。両親媒性ポリマーＰＳＰＥＧ−ＣＯＯＨを用いて、カルボキシレート基で、ＣＰドットの表面を官能化した。この表面官能化は、ＣＰドットのゼータ電位を、−３５．４ｍＶ（裸ＰＦＢＴドット）から−４６．０ｍＶ（ＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨコーティングを有するＣＰドット）に有意に低減した。ゲル電気泳動も、正電極方向に、同様のサイズの裸ＰＦＢＴドットよりはるかに速くカルボキシレートＣＰドットが移動した、ということを示した（図３８Ｃ）。ＮＩＲ混入は、カルボキシレートＣＰドットの表面電位に影響を及ぼさなかったが、これは、ＮＩＲ色素がＣＰドットの内側のみに位置して、表面には存在しないことを示唆した。
【０２４６】
ＮＩＲ色素混入ＣＰドットにおけるエネルギー移動媒介性蛍光。  ４５７ｎｍで励起されると、ＮＩＲ色素混入ＣＰドットは２つの蛍光発光を有する：１つはポリマーマトリックスからの可視的発光であり、もう１つは混入ＮＩＲ色素からのＮＩＲ発光である（図３９）。Ｐドットの内側のＮＩＲ色素濃度を操作することにより、２つの蛍光発光を調整した。ＮＩＲ色素は、低濃度でさえ、ＣＰドット蛍光を効率的にクエンチし得る；０．２％〜２％の範囲でＮＩＲ色素濃度を増大することにより、ポリマー蛍光の低減を達成した（図４０）。色素混入の濃度を制御することにより、ＣＰドットのＮＩＲ発光も調整した。ＮＩＲ色素は高濃度でＣＰドット中で自己クエンチし得るため、ＣＰドットマトリックス中により多くのＮＩＲ色素を混入するとＮＩＲ蛍光の低下を生じた（図４０Ｅ）。したがって、ＮＩＲ領域において蛍光を最大にするためには、最適混入濃度が存在する。
【０２４７】
ＰＦＢＴポリマーからＮＩＲ色素への効率的粒子内エネルギー移動が存在する。ＮＩＲ色素は少量（０．２％  ｗ／ｗ）でも、ポリマー系抗を７５％クエンチするのに適している。２％のＮＩＲ色素を混入した場合、９５％より多くのポリマー蛍光がクエンチされた。クエンチング結果は、シュテルン・フォルマー関係により良好に説明された（図４０Ｄ）。ＮＩＲ色素混入の前および後のＣＰドットの蛍光寿命の変化により、Ｐドットマトリックスのクエンチングも明白になった。元は２．４ｎｓであったＰＦＢＴドットの寿命は、Ｐドットマトリックス中への０．２％のＮＩＲ色素の混入後、１．２ｎｓに減少した。５４０ｎｍ発光の蛍光量子収量も、ＮＩＲ色素混入に従って、０．３６８から０．０８に低下した。マトリックスからＮＩＲ色素にエネルギーを移すことにより、ＮＩＲ色素混入ＣＰドットは、受容エネルギーをＮＩＲ発光に効率的に転換し得た。例えば、０．２％ＮＩＲ色素混入ＣＰドットは強力なＮＩＲ発光を示したが、これは、色素混入を伴わないＣＰドットの５４０ｎｍピークに匹敵する。このＮＩＲ発光の量子収量は約０．１１であったが、これは、効率的エネルギー転換を示す。ＮＩＲ色素の蛍光強度は、混入戦略により大いに増強された。水溶液中で４５７ｎｍで励起した場合、混入ＮＩＲ色素は、ＴＨＦ中で７６３ｎｍで励起された等価量の遊離ＮＩＲより４０倍強い蛍光を示した（図４１Ａ）。
【０２４８】
集光効率は、ナノ粒子の蛍光輝度を決定する重要な一パラメーターである。ＣＰドット中へのＮＩＲ色素の混入は、混入色素の集光能力を広範に改善した。ＮＩＲ色素混入ＣＰドットの輝度を、ＮＩＲ量子ドット（Invitrogen,  Inc.からのＱドット８００）と比較する。同一粒子濃度で、ＮＩＲ色素混入ＣＰドットは、Ｑドット８００より約４倍強力であり、そして非常に狭い蛍光発光を示す（図４１Ｂおよび４１Ｃ）。
【０２４９】
色素漏出。  色素漏出を検査するために、ＮＩＲ色素混入ＣＰドットのアクセプター対ドナー蛍光比を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中で７２時間モニタリングした。結果は、アクセプター対ドナー比は、７２時間後、８５％にわずかに減少しただけで、ＮＩＲ蛍光は変化しなかった、ということを示す（図４２Ａ）。この結果は、疎水性ＮＩＲ色素が水溶液中に漏出したようには見えず、ＮＩＲ色素混入ＣＰドットは少なくとも７２時間、おそらくはそれ以上、それらの蛍光特性を持続し得る、ということを示す。ＮＩＲ色素混入ＣＰドットはin  vivo用途に望ましいため、漏出試験を３７℃でヒト血漿中でも実行した。結果は、室温で前者試験と同様の結果を示し、これは、溶液条件の変化が７２時間でＮＩＲ色素混入ＣＰドットの性能を弱めない、ということを示唆する（図４２Ｂ）。色素漏出を完全に克服するために、色素分子を発色性ポリマーマトリックスと共有結合指せて、ＣＰドットを形成し得る。
実施例３０：レシオメトリック温度センサーのための官能化発色性ポリマードット
【０２５０】
本実施例は、官能化発色性ポリマードットを用いて、レシオメトリックナノ粒子温度センサーを形成し得るという実証を提供する。発色性ポリマードットを記述するために、以下でＣＰドットまたはＰドットを互換的に用いる。
【０２５１】
ＣＰドット温度センサーの調製。  先ず、官能性ポリマー、例えばアミン末端処理ポリスチレンポリマーを用いて、温度感知色素ローダミンＢ（ＲｈＢ）と反応させる。ローダミンＢは水溶性色素であるため、官能性疎水性ポリマーとの反応は色素を疎水性にし、したがって、それは疎水性ＣＰドットの内側に閉じ込められ得る。１０ｍＬ丸底フラスコ中に、２００μＬの１０ｍｇ／ｍＬローダミンＢ−イソチオシアネート（無水ＤＭＦ中）および１ｍｇのＮａＨＣＯ３を、２ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ（ＤＭＦ中）アミン末端処理ポリスチレン（ＰＳ−ＮＨ２、分子量１０００、多分散度  １．１）に付加して、図４３Ａに示したようにＮＨ２−イソチオシアネート反応を実施した。Ｎ２の保護下で一晩、混合物を静かに撹拌した。７５℃Ｃで回転蒸発により、ＤＭＦを除去した。次に、その結果生じた赤色固体を１ｍＬのＴＨＦ（無水）中に溶解した。ＴＨＦ中には溶解しなかったので、ＮａＨＣＯ３を２００ｎｍ膜フィルターで濾し取った。次に、ＴＨＦ中に得たＰＳ−ＲｈＢを発色性ポリマー中に混入して、ＣＰドットを作った。
【０２５２】
コポリマー  ポリ［｛９，９−ジオクチル−２，７−ジビニレン−フルオレニレン｝−アルト−コ−｛２−メトキシ−５−（２−エチルヘキシルオキシ）−１，４−フェニレン｝］（ＰＦＰＶ、分子量  ２２０，０００、多分散度  ３．１）およびポリ［（９，９−ジオクチルフルオレニル−２，７−ジイル）−コ−（１，４−ベンゾ−｛２，１’，３｝−チアジアゾール）］（ＰＦＢＴ、分子量  １５０，０００、多分散度  ３．０）を、ＣＰドット温度センサーの調製のために用いた。１０ｍｇの上記ポリマーを、不活性大気下で一晩撹拌しながら、１０ｍＬのＴＨＦ中に溶解した。先ず、２００μＬの１ｍｇ／ｍＬ（ＴＨＦ中）ＰＦＰＶまたはＰＦＢＴおよび１０μＬの２ｍｇ／ｍＬ（ＴＨＦ中）ＰＳ−ＲｈＢを５ｍＬの  ＴＨＦ中で混合し、次に、音波処理下で１０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水中にＴＨＦ溶液中の混合ポリマーを注入することにより、ローダミンＢ混入ＣＰドットを調製した。次いで、部分真空蒸発により、ＴＨＦを除去し、０．２μｍ膜フィルターを通して濾過することにより、小分画の凝集物を除去した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ（登録商標）１０ＤＧカラム（Hercules,  CA,  USA）により、遊離ローダミンＢを除去する。図４３Ｂは、ＣＰドット調製、ならびにナノ粒子内の発色性ポリマーとＲｈＢとの間のエネルギー移動の説明を示す。
【０２５３】
ＣＰドット温度センサーの特性化。  バルク溶液中のＰドットの粒子サイズを、動的光散乱（ＤＬＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＮａｎｏＺＳ）により特性化した。図４４は、Ｐドットに関するＤＬＳデータを示す。その結果生じたＰＦＰＶ−ＲｈＢドットは、直径約２６ｎｍであるが、一方、ＰＦＢＴ−ＲｈＢドットは平均直径１６０ｎｍである。ＣＰドットサイズは、ポリマーの分子量、ポリマー主鎖構造、ならびに発色性ポリマーに対するＰＳ−ＲｈＢの濃度比によって大いに左右される。ＰＦＢＴ−ＲｈＢ系では、２０重量％またはそれ移住のＰＳ−ＲｈＢ濃度がナノ粒子の凝集を引き起こす。ＰＦＢＴ  Ｐドット中の１０％ＰＳ−ＲｈＢは、最良の感受性ならびに相対的に小さいサイズを示す、ということが判明した。ＰＦＰＶ−ＲｈＢ系において、非常に小さいＰドットを得た。１０％ＰＳ−ＲｈＢは、蛍光強度および感受性に基づいた最良混入量であることも確証される。
【０２５４】
ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルをＤＵ７２０分光測光計で記録した。蛍光スペクトルを、Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３蛍光計で収集した。ＰＦＰＶおよびＰＦＢＴは４５０ｎｍ辺りでそれらの吸着ピークを示したため、ＣＰドットはすべて、４５０ｎｍで励起させた。図４５Ａは、室温でのＰＦＢＴ（黒色）およびＰＦＢＴ−ＲｈＢ（赤色）ドットの吸収（破線）および発光（実線）スペクトルを示す。吸収スペクトルでは、付加的小吸収ピークが５４０ｎｍで出現し、ＰＦＢＴ吸収ピークに関する４５０ｎｍから４６０ｎｍへの１０ｎｍ赤方偏移を伴った。５４０ｎｍピークはＲｈＢの吸収に対応するが、一方、ＰＦＢＴの製法偏移は、純ＰＦＢＴドットの〜２０ｎｍから〜１６０ｎｍＰＦＢＴ−ＲｈＢドットにサイズが増大するためである。ＰＦＢＴ−ＲｈＢドットは、２つの発光ピーク：５４０ｎｍでの相対的に弱い発光ピークと５７３ｎｍでの強い発光ピークを示す。後者ピークは、ＲｈＢの発光に対応する。ＰＦＢＴの発光（５４０ｎｍでピーク）およびＲｈＢの吸収（５４０ｎｍでピーク）間の良好な重複、ならびにＰＦＢＴポリマー鎖とローダミンＢ分子との密な近接性のため、効率的エネルギー移動はＲｈＢの強い蛍光を生じたが、一方、純ＲｈＢ色素は４５０ｎｍにより不十分に励起された。
【０２５５】
図４５Ｂは、室温でのＰＦＰＶおよびＰＦＰＶ−ＲｈＢの吸収および発光スペクトルを示す。吸収スペクトルでは、ＰＦＰＶ−ＲｈＢドットはローダミンＢに関して５４０ｎｍで小吸収ピークを示し、一方、４５０ｎｍでのＰＦＰＶピークに関する顕著なシフトは認められなかった。発光スペクトルは、ＰＦＰＶドットに関しては５１０ｎｍおよび５４０ｎｍで２つのピークを示し、一方、ＰＦＰＶ−ＲｈＢドットは、５７３ｎｍで付加的ＲｈＢピークを示す。ＰＦＢＴ−ＲｈＢと同様に、ＰＦＰＶの発光（５４０ｎｍでピーク）およびＲｈＢの吸収（５４０ｎｍでピーク）間の良好なスペクトル重複、ならびにナノ粒子内部のポリマー鎖およびＲｈＢの密な詰め込みのため、ＰＦＰＶおよびＲｈＢ間に強力なＦＲＥＴが認められる。
【０２５６】
蛍光ＣＰドット温度感知。  Ｐドットの温度依存性蛍光を、加熱／冷却系と連結するＦｌｕｏｒｏｌｏｇ−３蛍光計で測定した。溶液中に温度プローブを挿入することにより、デジタル温度計ＴＭ９０２Ｃによって、Ｐドット溶液の絶対温度を測定した。溶液を静かに撹拌して、実験中の均質な冷却および加熱を得た。図４６は、それぞれ１０℃から７０℃および１０℃から６０℃への温度上昇に対するＰＦＢＴ−ＲｈＢ（Ａ）およびＰＦＰＶ−ＲｈＢ（Ｂ）の蛍光スペクトルを示す。右は線（赤色）は５７３ｎｍでのＲｈＢの発光ピークを示し、一方、左は５１０ｎｍで、これはレシオメトリック算定のための内部参照として選択される。図４７は、両方のＰドットに関する温度の一関数としての蛍光強度を示す。蛍光強度は、温度が上がると、ＰＦＢＴ−ＲｈＢに関しては減少する。さらに重要であるのは、強度は、温度変化に比して線形環系を示すことである。温度プローブとしての遊離ローダミンＢまたは他のナノ粒子を上回るこれらのＣＰドットセンサーの独特の特質は、レシオメトリック測定である。図４８は、ＰＦＢＴ−ＲｈＢドット（Ａ）およびＰＦＰＶ−ＲｈＢドット（Ｂ）に関する温度の一関数としてのＩ５７３ｎｍ／Ｉ５１０ｎｍのレシオメトリックプロットを示す。線形適合は感知行動を良好に説明し、したがって、実験で得た所定の蛍光強度比から温度が確定され得る。
実施例３１：レシオメトリックｐＨセンサーのための官能化発色性ポリマードット
【０２５７】
本実施例は、官能化発色性ドットを用いて、レシオメトリックナノ粒子ｐＨセンサーを形成し得るという実証を提供する。発色性ポリマードットを記述するために、以下でＣＰドットまたはＰドットを互換的に用いる。
【０２５８】
ＣＰドットｐＨセンサーの調製。  発色性ポリマー  ポリ（２，５−ジ（３’，７’−ジメチルオクチル）フェニレン−１，４−エチニレン（ＰＰＥ）をポリマードナーとして、そしてｐＨ感受性色素  フルオレセインをアクセプターとして用いて、レシオメトリックＣＰドットｐＨセンサーを形成した。チオール末端処理ポリスチレン（ＰＳ−ＳＨ）またはアミノ末端処理ポリスチレン（ＰＳ−ＮＨ２）を用いて、色素をＣＰドットと共有結合した。
【０２５９】
チオール官能化ＰＰＥドットの調製。  典型的には、４０μｇのＰＰＥおよび１２μｇのＰＳ−ＳＨを５ｍＬのＴＨＦ中に溶解した。次に、混合物を激しく音波処理しながら、水１０ｍＬ中に迅速にこの混合物を注入した。次いで、９６℃ホットプレート上で１時間、窒素でパージすることによりＴＨＦを除去した。その結果生じたＰドット溶液を、０．２μｍ酢酸セルロース膜フィルターを通して濾過して、調製中に形成されたあらゆる凝集物を除去した。
【０２６０】
フルオレセイン共役化ＰＰＥドット（Ｐドット（Ａ）、Ｐドット（Ｂ）およびＰドット（Ｃ））の調製（図４９）。  Ｐドット（Ａ）に関しては、無水ＤＭＳＯ中に溶解した０．２ｍｇのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を、ガラスバイアル中の４ｍＬのＰＳ−ＳＨコＰＰＥ  Ｐドット（２０μｇ／ｍＬ）水溶液に付加した。混合物を室温で１２時間撹拌し、次いで、Bio-RadＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ（登録商標）１０ＤＧカラム（Hercules,  CA,  USA）を通して精製して、遊離ＦＩＴＣ分子から分離した。Ｐドット（Ｂ）の調製のために、５ｍｇＦＩＴＣおよび２０ｍｇＰＳ−ＮＨ２を１ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、混合した。次に、５ｍＬのトリエチルアミンを溶液に付加した。混合物を回転振盪器上に一晩放置した。ＴＨＦ中のＰＰＥ（１ｍｇ／１ｍＬ）０．２ｍＬおよび２７μＬのＰＳ−ＮＨ２−ＦＩＴＣ共役体溶液を５ｍＬのＴＨＦ中で混合した。次いで、この混合物を、激しく音波処理しながら１０ｍＬの水中に迅速に注入した。次に、９６℃ホットプレート上で１時間、窒素でパージすることによりＴＨＦを除去した。その結果生じたＰドット（Ｂ）溶液を、先ず、０．２μｍ酢酸セルロース膜フィルターを通して濾過して、調製中に形成されたあらゆる凝集物を除去し、次いで、Bio-RadＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ（登録商標）１０ＤＧカラムを通して精製して、遊離ＦＩＴＣ分子から分離した。Ｐドット（Ｃ）の調製のために、無水ＤＭＳＯ中の１５μｇのフルオレセイン−５−マレイミド、ならびに６０μＬの濃縮ＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ）を、ガラスバイアル中の新たに調製した４ｍＬのＰＳ−ＳＨコＰＰＥ  Ｐドット（２０μｇ／ｍＬ）水溶液に付加した。混合物を室温で１２時間撹拌し、次いで、Bio-RadＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ（登録商標）１０ＤＧカラムを通して精製して、遊離ＦＩＴＣ分子から分離した。
【０２６１】
発色性ポリマー−フルオレセイン対の選択および最適化。  ＦＲＥＴを基礎にし、単一波長下で励起されるレシオメトリック感知プラットフォームを加工製造するために、第一ステップは、適切なドナー・アクセプター対を選択することである。本明細書中では、その吸収プロフィールおよび発光強度がｐＨに高度に依存性であるため、フルオレセインをＦＲＥＴアクセプターとして選んだ。異なるｐＨでのフルオレセインの吸収プロフィールの変化により、ドナー（発色性ポリマーマトリックス）およびアクセプター（フルオレセイン分子）間のＦＲＥＴ効率を調整し得るが、一方、ｐＨに対する蛍光強度の応答は、プロトン活性のフィードバックを提供する。ＦＲＥＴ効率を最適にするためには、その分光特性に基づいて理想的なドナーポリマーを選択することが重要である。ＰＰＥポリマードットがいくつかの共役経路でフルオレセインへの大きなエネルギー移動を示す、ということが判明した。この現象は、図５０Ａに示したようなＰＰＥポリマーの発光スペクトルとフルオレセインの励起スペクトルとの間の実質的スペクトル重複により説明され得る。
【０２６２】
フルオレセインとＰＰＥ  Ｐドットとの共役。  ＰＰＥ  Ｐドットをポリマーマトリックスとして用いたが、一方、図４９に図示したような３つの異なる経路に基づいてＰＰＥ  Ｐドット上にフルオレセイン色素を固定した。経路ＡおよびＣに関しては、先ず、チオール末端処理ポリスチレンをＰＰＥポリマーに配合して、沈降法により水溶液中にＰＳ−ＳＨコＰＰＥ  Ｐドットを形成することにより、チオール官能化ＰＰＥ  Ｐドットを調製した。その後、ＰＳ−ＳＨコＰＰＥ  Ｐドットをフルオレセインイソチオシアネート（経路Ａ）またはフルオレセイン−５−マレイミド（経路Ｃ）と反応させて、ｐＨ感受性Ｐドット−色素複合体を生成した。アミノ官能化ＰＰＥ  Ｐドットが不安定であることが判明したため、経路Ｂを案出したが、この場合、先ず、有機相下で、フルオレセインイソチオシアネートをアミノ末端処理ポリスチレン（ＰＳ−ＮＨ２）と結合させて、次に、ＰＰＥポリマーと配合し、その後、水溶液中でナノ粒子を沈降させる。次に、ポリマー対色素の比率を操作することにより、各系のレシオメトリック感知能力を調べた。例えば、経路ＡおよびＣでは、ＰＰＥポリマー中のＰＳ−ＳＨの異なる配合パーセンテージを調べ、低い標準偏差を有する高感受性が３０％のＰＳ−ＳＨ混入レベルで得られることが判明した。同様の結果は経路Ｂ系でも観察されたが、この場合、６０％のＰＳ−ＮＨ２−フルオレセイン配合が最良のレシオメトリックｐＨ感受性をもたらした。
【０２６３】
ＰＰＥおよびフルオレセイン間のＦＲＥＴ。  一旦フルオレセイン分子がＰＰＥ  Ｐドット上に結合されると、ＰＰＥからフルオレセインへの効率的エネルギー移動が容易に観察され得た。この効果的ＦＲＥＴは、一部は、図５０Ａに示したように、ＰＳ−ＳＨコＰＰＥ  Ｐドットの発光スペクトル（赤実線）とフルオレセインの励起スペクトル（黒破線）との間のかなりのスペクトル重複に起因する。例えばＰドット（Ａ）は、同一濃度の裸ＰＳ−ＳＨコＰＰＥ  Ｐドットの蛍光スペクトル（色素共役なし、赤実線）と比較した場合、ＰＰＥ  Ｐドット発光の付随的抑制（λ＝４２０−４９０ｎｍ、青実線）に伴う色素の発光の増大（λ＝５１３ｎｍ、青実線）は、ＦＲＥＴがＰドットから色素まで起きた、ということを明らかに実証した。同一濃度での非結合フルオレセインの発光強度は、３９０ｎｍの同一波長により励起された場合、非常に弱かったがこれは、フルオレセインの発光強度がほとんど、蛍光それ自体というよりエネルギー移動から生じたことを意味する、ということに留意すべきである。ＦＲＥＴ現象をさらに確証するために、対照、ＰＳ−ＳＨコＰＰＥ  ＰドットおよびＰドット−色素複合体、Ｐドット（Ａ）に関して、ＰＰＥ  Ｐドットの時間分解蛍光減衰曲線（４４０±２０ｎｍ）を測定した。Ｐドット対照の蛍光じゅみょうは０．３０ｎｓであったが、一方、Ｐドット（Ａ）の寿命は短縮されて０．２１ｎｓであったが、これは、ＰＰＥ  ＰドットからフルオレセインへのＦＲＥＴの発生を示す。Ｐドット−色素複合体の分光行動をよりよく理解するために、下記のような異なるｐＨでのＦＲＥＴ効率の算定の付加的試験を実行した。スペクトル重複のほかに、効率的ＦＲＥＴ行動を保証するためには、Ｐドットのサイズが重要な役割を果たし、この場合、ＦＲＥＴは分子間分離の６乗の逆数によって決まる。動的光散乱（ＤＬＳ）により即ＡされたＰドット−色素複合体のその結果生じた流体力学的直径は、経路Ａ、ＢおよびＣに関してそれぞれ平均で２６ｎｍ、２５ｎｍおよび２６ｎｍである。Ｐドット（Ｃ）の典型的透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像は図５０に示したものと同様であるが、これは、ＤＬＳ測定と一致する。
【０２６４】
ｐＨ感受性および可逆性測定。  蛍光分光測定を各系で実施して、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液中のｐＨに対するレシオメトリック応答を試験した。図５１に示したように、フルオレセインの発光ピークはｐＨ増大に伴って増大したが、一方、ＰＰＥ  Ｐドットの蛍光強度は３つの系のすべて２置いて一定のままであった。ＰＰＥ  Ｐドット単独のｐＨ応答も試験したが、結果は、これもまた、ＰＰＥ  ＰドットがｐＨ＝５．０〜８．０でｐＨ非応答性であり、レシオメトリックｐＨ検出のための良好な参照になる、ということを示唆する。図５２は、フルオレセイン（λ＝５１３ｎｍ）対ＰＰＥ（λ＝４４０ｎｍ）の発光強度比が、これら３つの複合体に関して５．０から８．０までの範囲のｐＨの一関数として線状に変化する、ということを示す。それらの間で、Ｐドット（Ａ）は、最高検出感度を明示し、Ｉ５１３ｎｍ／Ｉ４４０ｎｍはｐＨの単位変化当たりで０．３７変化した。この高感受性は、Ｐドットおよび色素間の最短分離に由来する可能性があり、ＰＰＥからフルオレセインへの効率的エネルギー移動を付加する。それにもかかわらず、チオールとイソチオシアネートとの間のチオカルバモイル単位は、過剰量の有利チオールの存在下で次第に分解して、より複雑な生物学的用途においてＰドット（Ａ）を低実現可能にする傾向がある、ということが知られている。これに対比して、Ｐドット（Ｂ）は、Ｐドットおよび色素間の安定なアミン−イソチオシアネート付加物を提供するが、しかしＰＳ−ＮＨ２の長い側鎖は、低効率的エネルギー移動によってｐＨの単位変化当たり０．１８変動という相対的に低いｐＨ感受性を生じる。上記の障害を克服するために、Ｐドット（Ｃ）が、良好なｐＨ感受性および高い結合安定性を有する補足的系を提供するように仕向けた。Ｉ５１３ｎｍ／Ｉ４４０ｎｍは、Ｐドット（Ｃ）系に関してｐＨの単位変化当たりで０．２９変化した。
【０２６５】
これら３つのナノセンサーはすべて、良好なｐＨ可逆性を示した。例えばＰドット（Ｃ）では、Ｐドット（Ｃ）ナノセンサーを含有する溶液のｐＨを、ｐＨ＝５〜ｐＨ＝８の間で変化させた。フルオレセイン対ＰＰＥ蛍光発光比の良好な再現可能性は、このＰドットベースのｐＨセンサーに関する大きな可逆性および頑健性を示す（図５２）。さらに、センサーのｐＨ応答時間は、Ｐドットの小サイズ（すなわち、大きい表面対容積比）のために慣用的蛍光分光計により測定するには速過ぎる。図５３は、ＰＰＥおよびフルオレセイン間のスペクトル重複、ならびに溶液ｐＨの一関数としての算定フェルスター距離を示す。
【０２６６】
細胞内ｐＨ測定。  細胞内ｐＨ測定のためのこのＦＲＥＴベースのレシオメトリックＰドット−ナノセンサーの適用可能性を実証するために、Ｐドット−フルオレセインナノ粒子を、任意の付加的作用物質を伴わずに、エンドサイトーシス的工程により、生きているＨｅＬａ細胞中に導入した。粒子取込み後、ＰＢＳ緩衝液で広範に洗浄することにより非組入れ粒子を除去した。図５４は、Ｐドット（Ａ）摂取後のＨｅＬａ細胞の共焦点蛍光顕微鏡画像（Ｅ〜Ｇ）を示すが、一方、細胞中の裸ＰＰＥ  Ｐドットは陰性対照として役立てた（Ａ〜Ｃ）。４３３〜４４４ｎｍからの蛍光シグナルを組み込むことにより、青色チャンネル（Ａ＆Ｅ）を得て、５０７〜５１８ｎｍからの蛍光シグナルを組み込むことにより緑色チャンネル（Ｂ＆Ｆ）を得た。５０７〜５１８ｎｍからの平均蛍光シグナルと４３３〜４４４ｎｍからの平均蛍光との間の比をｐＨ較正曲線と比較することにより、細胞内ｐＨを決定した。Ｐドット（Ａ）系を用いた少なくとも５０の細胞を基礎にした平均ｐＨ値は４．９５±０．７０であると概算されたが、これは、早期エンドソーム（ｐＨ〜６．５）およびリソソーム区画（ｐＨ＝４．５〜５．０）の場合と同様に、エンドサイトーシスの酸性経路に関して報告されたｐＨ範囲と良好に一致する。Ｐドット（Ｂ）およびＰドット（Ｃ）プローブを用いて測定されるｐＨ値は、それぞれ４．８１±０．８６および４．９２±０．６４であることが判明した（図５５）が、これもまた、細胞内ｐＨ測定のためのこれらのＰドットベースのナノセンサーの実現可能性を実証した。さらに重要なのは、図５５Ａ〜Ｃの上−右差込図に示したような増幅および上張り画像から、ＰＰＥおよびフルオレセインの両方の蛍光の完全な共局在を明白に示す、ということはさらに重要である。この共局在は、不安定結合破壊の結果としての個々の蛍光体取込みというよりむしろ、ＨｅＬａ細胞によるＰＰＥおよびフルオレセインの同時取込みを示唆する。
【０２６７】
本発明は、好ましい実施形態を強調して記載してきたが、本発明の範囲または精神を逸脱しない限り、種々の修正および変更がなされ得ることは、当業者には明らかである。本発明の他の実施形態は、本明細書中に開示した本発明の明細書および実行について考慮することにより当業者に明らかになる。本明細書および実施例は単なる例に過ぎず、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲により定義されている。
【図２Ａ】
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【図４Ａ】
2013511700.tif 000006
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2013511700.tif 000008
【図５Ｂ】
2013511700.tif 000009
【図９Ａ】
2013511700.tif 000010
【図９Ｂ】
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【図１２Ａ】
2013511700.tif 000012
【図１２Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
2013511700.tif 000015
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２５Ａ】
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【図３２】
2013511700.tif 000020
【図３３Ａ−３３Ｂ】
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【図４３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図１】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
2013511700.tif 000032
【図１１】
2013511700.tif 000033
【図１２Ｃ】
2013511700.tif 000034
【図１３】
2013511700.tif 000035
【図１４】
2013511700.tif 000036
【図１５】
2013511700.tif 000037
【図１６】
2013511700.tif 000038
【図１７】
2013511700.tif 000039
【図２３】
2013511700.tif 000040
【図２４】
2013511700.tif 000041
【図２５Ｂ】
2013511700.tif 000042
【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３３Ｃ】
2013511700.tif 000050
【図３４】
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【図３５】
2013511700.tif 000052
【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
2013511700.tif 000057
【図４１】
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【図４２】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
2013511700.tif 000069
【国際調査報告】
2013511700.tif 000070
2013511700.tif 000071
2013511700.tif 000072