(57)【要約】  特定の実施形態によれば、質量分析法は概して、少なくとも１つのインジケータを含む試料を、レーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析に供するステップと、インジケータの相対強度を測定するステップと、インジケータの相対強度を標準インジケータ強度と比較するステップとを含んでもよい。試料をレーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析に供するステップは、周囲条件下で赤外レーザを用いて試料をアブレートしてアブレーションプルームを生成するステップと、エレクトロスプレープルームによってアブレーションプルームを遮断するステップと、質量分析によってインジケータを検出するステップとを含んでもよい。質量分析法は、試料を、標準インジケータ強度に属する又は属さないと分類するステップを含んでもよい。標準インジケータ強度に属さない試料は、その試料が疾患状態を含むと予測されることを示すことができる。
2013525810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インジケータを含む試料をレーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析に供するステップと、
前記インジケータの相対強度を測定するステップと、
前記インジケータの前記相対強度を標準インジケータ強度と比較するステップと
を含む質量分析法。
【請求項２】
前記試料を、前記標準インジケータ強度に属する又は属さないと分類するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インジケータが少なくとも１つのバイオマーカーを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つのバイオマーカーが疾患状態に関連付けられる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記標準インジケータ強度に属さないことが、前記試料が前記疾患状態を含むと予測されることを示す、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記インジケータが複数のインジケータを含み、各々のインジケータの相対強度を測定して試料代謝産物パターンを生成するステップと、前記試料代謝産物パターンを、前記複数のインジケータの各々の標準インジケータ強度を含む標準代謝産物パターンと比較するステップと、前記試料を、前記標準代謝産物パターンに属する又は属さないと分類するステップと、を含む請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記標準代謝産物パターンに属さないことが、前記試料が前記疾患状態を含むと予測されることを示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患状態が、ウイルス感染、細菌感染、及び代謝異常の少なくとも１つに関連付けられる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記インジケータが、代謝産物、脂質、脂質前駆体、脂質成分、核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患状態が、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型、ヒトＴリンパ球向性ウイルス３型の少なくとも１つであり、前記インジケータが、グルタチオン、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、アルギニン、クレアチン、コリン、ホスホコリン、グリセロホスホコリン、グリセロホスホコリン脂質、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ｃＡＭＰ、ドーパミン、ドーパミン代謝産物、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が、単一細胞、細胞、バイオフィルム、及び組織からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記単一細胞が、５μｍ〜５０μｍの最小寸法を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
レーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析に供するステップが、
周囲条件下で赤外レーザを用いて前記試料をアブレートしてアブレーションプルームを生成するステップと、
エレクトロスプレープルームによって前記アブレーションプルームを遮断するステップと、
質量分析によって前記インジケータを検出するステップと
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
レーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析に供するステップが、前記試料をマトリクス材料で前処理するステップを除外する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標準インジケータ強度が、内部標準及び外部標準の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
インジケータを含む試料の代謝状態をその場で決定する方法であって、
周囲条件下で赤外レーザを用いて試料をアブレートしてアブレーションプルームを生成するステップと、
エレクトロスプレープルームによって前記アブレーションプルームを遮断するステップと、
質量分析によって前記インジケータを検出するステップと、
前記インジケータの相対強度を測定するステップと、
前記インジケータの前記相対強度を標準インジケータ強度と比較するステップと、
前記試料を、前記標準インジケータ強度に属する又は属さないと分類するステップと
を含む方法。
【請求項１７】
周囲条件下で赤外レーザを用いて前記インジケータを含む第２の試料をアブレートして第２のアブレーションプルームを生成するステップと、
第２のエレクトロスプレープルームによって前記第２のアブレーションプルームを遮断するステップと、
質量分析によって前記第２の試料のインジケータを検出するステップと、
前記第２の試料のインジケータの相対強度を測定するステップと、
前記第１のインジケータ及び第２のインジケータを、互いに及び前記標準インジケータ強度の少なくとも１つと比較するステップと、
前記第１の試料及び前記第２の試料の少なくとも１つを、前記標準インジケータ強度に属する又は属さないと分類するステップと
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記インジケータが単一細胞由来の細胞内代謝産物を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標準インジケータ強度に属さないことが、疾患状態に関連付けられた前記試料の代謝変化を示す、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記代謝状態が、細胞周期の段階、発生段階、環境、栄養供給、分類単位、遺伝単位、感染及び非感染状態、疾患及び健康状態、並びに病原性の異なる段階からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利益
本発明の一部は、国立科学財団によって供与された助成金番号０４１５５２１及び０７１９２３２のもとで米国政府の支援により行われた。米国政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
本明細書に記載される装置及び方法は、全体的に、質量分析計のためのイオン化源及び質量分析法、より詳細には、レーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析並びにそれを製造及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
感染症及び代謝障害は、世界中で数百万の人々に死亡、身体障害、並びに社会的及び経済的困難を生じさせる。感染症の原因物質の例としては、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ１），）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス２型（ＨＴＬＶ２）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス３型（ＨＴＬＶ３）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ウイルス性脳炎、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、インフルエンザ、及び重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）が挙げられる。代謝異常の例としては、限定されないが、糖尿病、筋ジストロフィー、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、テイサックス病、白質ジストロフィー、リソソーム異常、ウィルソン病、レッシュ・ナイハン症候群、尿素サイクル異常症、アミロイドーシス、脂質蓄積症が挙げられる。ゲノム、プロテオーム、及びメタボローム技術が、感染症及び代謝異常のバイオマーカー及び他のインジケータを識別するために使用されている。細胞又は生物の代謝組成はその実際の生化学的条件を与えるので、メタボロームの迅速な監視はトランスクリプトーム又はプロテオームの監視より有用であり得る。
【０００４】
感染症及び代謝異常は生細胞又は生物の代謝を変化させ得る。つまり、健康な細胞の代謝は、同じ種類の不健康な細胞の代謝とは異なり得る。代謝は一般に生命を支援し、維持する、生細胞又は生物の化学的プロセスを指す。これらの化学的プロセスの産物は一般に代謝産物と称され得る。生細胞又は生物の代謝及び／又は代謝産物は、その生物学的状態、発生段階、履歴、及び／又は環境に依存して変化し得る。例えば、ウイルスは感染細胞の代謝を変化させ得る。ウイルス感染した細胞及び同じ種類の非感染細胞の代謝及び／又は代謝産物は異なり得る。代謝産物の識別及び分析は、感染症及び代謝異常の検出、予防、及び／又は治療を容易にし得る。
【０００５】
質量分析は、定性的及び定量的分析のために化学、生物、及び他の分野において成功裏に使用されている分析技術である。質量分析の従来の方法による代謝産物の識別及び分析は問題があり得る。例えば、マトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）及びエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）は、時間がかかり、複雑な試料調製に悩まされる場合があり、試料のその場分析が困難になり得る。大気圧質量分析法、例えば、リアルタイム直接分析（ｄｉｒｅｃｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ）（ＤＡＲＴ）、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）、大気圧赤外線マトリクス支援レーザ脱離イオン化（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＡＰ  ＩＲ−ＭＡＬＤＩ）、脱離大気圧化学イオン化（ＤＡＰＣＩ）、マトリクス支援レーザ脱離エレクトロスプレーイオン化（ＭＡＬＤＥＳＩ）、及びエレクトロスプレーレーザ脱離イオン化（ＥＬＤＩ）は、限定されないが、複雑且つ時間がかかる分離技術であること、分析し得る試料の範囲が狭いこと、検出限界がより高いこと、表面特性に対する感受性があること、サンプリング誤差、並びに／又は画像化及び量子化能力が欠如していることを含む、他の制限に悩まされる場合がある。質量分析は、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー及びキャピラリー電気泳動などの分離技術と組み合わせてもよいが、それらの技術は分析時間及び／又は費用を増加させ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、より効率的及び／又は費用効果が高い質量分析計並びにそれを製造及び使用する方法が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特定の実施形態において、より効率的及び／又は費用効果が高い質量分析計並びにそれを製造及び使用する方法が記載される。
特定の実施形態によれば、質量分析法は概して、少なくとも１つのインジケータを含む試料をレーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析に供するステップと、前記インジケータの相対強度を測定するステップと、前記インジケータの相対強度を標準インジケータ強度と比較するステップとを含んでもよい。
【０００８】
本明細書に記載される種々の実施形態は、添付の図面と併せて以下の説明を考慮することによってより良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本明細書に記載される種々の実施形態に係る質量分析計のためのＬＡＥＳＩイオン源の図を含む。
【図２】本明細書に記載される種々の実施形態に係る質量分析計のためのＬＡＥＳＩイオン源の図を含む。
【図３】本明細書に記載される種々の実施形態に係るアブレーションプルーム（ＬＡ）及びエレクトロスプレープルーム（ＥＳ）を示す写真を含む。
【図４】本明細書に記載される種々の実施形態に係る質量分析法を示すフローチャートを含む。
【図５】本明細書に記載される種々の実施形態に係る質量分析法を示すフローチャートを含む。
【図６Ａ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る質量分析法からの代表的なデータを記載している表を含む。
【図６Ｂ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る質量分析法からの代表的なデータを記載している表を含む。
【図７Ａ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る質量分析法からの代表的なデータを記載している表を含む。
【図７Ｂ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る質量分析法からの代表的なデータを記載している表を含む。
【図７Ｃ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る質量分析法からの代表的なデータを記載している表を含む。
【図８Ａ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る代表的な質量スペクトルを含む。
【図８Ｂ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る代表的な質量スペクトルを含む。
【図９Ａ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る代表的な質量スペクトルを含む。
【図９Ｂ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る代表的な質量スペクトルを含む。
【図９Ｃ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る代表的な質量スペクトルを含む。
【図９Ｄ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る代表的な質量スペクトルを含む。
【図１０Ａ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る代表的な質量スペクトルを含む。
【図１０Ｂ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る代表的な質量スペクトルを含む。
【図１０Ｃ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る代表的な質量スペクトルを含む。
【図１１】プトレシン、スペルミジン、及びスペルミンに関与する代謝経路を示すフローチャートを含む。
【図１２】本明細書に記載される種々の実施形態に係るＣＥＭ及びＣ８１細胞を比較するチャートを含む。
【図１３Ａ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る代表的な質量スペクトルを含む。
【図１３Ｂ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る代表的な質量スペクトルを含む。
【図１４Ａ】本明細書に記載される種々の実施形態に係るＣＥＭ及びＣ８１細胞を比較するチャートを含む。
【図１４Ｂ】本明細書に記載される種々の実施形態に係るＣＥＭ及びＣ８１細胞を比較するチャートを含む。
【図１４Ｃ】本明細書に記載される種々の実施形態に係るＣＥＭ及びＣ８１細胞を比較するチャートを含む。
【図１５】本明細書に記載される種々の実施形態に係る質量分析法からの代表的なデータを記載している表を含む。
【図１６】本明細書に記載される種々の実施形態に係る質量分析法からの代表的なデータを記載している表を含む。
【図１７】Ｔリンパ球におけるクレアチン及びポリアミド生合成経路を示すフローチャートを含む。
【図１８Ａ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る代表的な質量スペクトルを含む。
【図１８Ｂ】本明細書に記載される種々の実施形態に係る代表的な質量スペクトルを含む。
【図１９】Ｔリンパ球における脂質代謝経路を示すフローチャートを含む。
【図２０Ａ】本明細書に記載される種々の実施形態に従って検出された代謝産物を示すフローチャートを示す。
【図２０Ｂ】本明細書に記載される種々の実施形態に従って検出された代謝産物を示すフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
Ａ．定義
通常、本明細書で使用する場合、「から実質的になる」及び「からなる」という用語は、「含む」という用語に包含される。
【００１１】
通常、本明細書で使用する場合、他に示されていない限り、「１つの（ｏｎｅ）」、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」物品は、「少なくとも１つ」又は「１つ若しくは複数」を指す。
【００１２】
通常、本明細書で使用する場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「有する」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味する。
本明細書で使用する場合、「ＬＡＥＳＩ」及び「ＬＡＥＳＩ−ＭＳ」という用語は、レーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析を指す。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「感染」という用語は、細胞、組織、器官及び／又は生物におけるウイルス又は細菌の増殖及び／又は存在による侵入を指す。
本明細書で使用する場合、「代謝異常」という用語は、生物の代謝異常の変化から生じる細胞、組織、器官及び／又は生物におけるいずれかの病的状態を指す。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「メタボローム」という用語は、特定時点での細胞、組織、器官及び／又は生物における代謝産物の全て又は部分的なセットを指す。感染及び／又は代謝異常により、特定の代謝産物が上方制御又は下方制御され得る。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「パターン」という用語は、代謝産物のセット及び診断的方法によって測定されるそれらの強度を指す。代謝産物のセットは、特定時点での細胞、組織、器官及び／又は生物における代謝産物の全て又は部分的なセットを指す。
【００１６】
通常、本明細書で使用する場合、「約」及び「およそ」という用語は、測定の性質又は精度を考慮して、測定された量についての誤差の許容程度を指す。典型的な例示的な誤差の程度は、所与の値又は値の範囲の２０％、１０％、又は５％の範囲内であり得る。あるいは、特に生物学的システムにおいて、「約」及び「およそ」という用語は、一桁分の範囲内、潜在的には所与の値の５倍又は２倍の範囲内の値を指す。
【００１７】
本明細書に記載される全ての数量は、他に記載されていない限り、近似であり、「約」という用語が明確に記載されていない場合も推定され得ることを意味する。本明細書に開示される数量は、列挙された正確な数値に厳密に制限されないと理解されるべきである。代わりに、他に記載されていない限り、各数値は、列挙された値及びその値周囲の機能的に同等の範囲を意味すると意図される。最低限でも、特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する意図ではないが、各数値パラメータは、少なくとも、報告されている有効数字及び通常の丸め法を適用することを鑑みて解釈されなければならない。本明細書に記載される数量の近似値にも関わらず、実際の測定値の特定の例に記載される数量は可能な限り正確に報告される。
【００１８】
本明細書に記載される全ての数値範囲は、そこに包含される全ての部分範囲を含む。例えば、「１〜１０」の範囲は、列挙された最小値１と列挙された最大値１０の間、及びそれらを含む、全ての部分範囲を含むものと意図する。本明細書に列挙されたあらゆる最大の数値限定は、全てのより小さい数値限定を含むものと意図する。本明細書に列挙されたあらゆる最小の数値限定は、全てのより高い数値限定を含むものと意図する。
【００１９】
以下の説明において、特定の詳細は、質量分析計並びにそれを製造及び使用する方法の種々の実施形態のより良い理解を提供するために記載している。しかしながら、当業者は、本明細書に記載される実施形態がそれらの詳細を用いずに実施されてもよいことを理解するだろう。他の例において、質量分析計に関連する周知の構造及び方法並びに質量分析法は、本開示の実施形態の不必要な曖昧な説明を回避するために詳細に示され又は記載されていない場合もある。
【００２０】
本開示は、質量分析計並びにそれを製造及び使用する方法の種々の実施形態の種々の特徴、態様、及び利点を記載している。しかしながら、本開示は、当業者が有用であると見出し得るもののいずれかの組み合わせ又は部分的組み合わせにおいて本明細書に記載される種々の実施形態の種々の特徴、態様、及び利点のいずれかを組み合わせることによってなされ得る多数の代替の実施形態を包含することは理解される。
Ｂ．概説
細胞又は生物の感染は、遺伝子、タンパク質、及び代謝産物レベルにおいて広範な変化を引き起こす。それらの変化の後、通常、遺伝子発現プロファイリング及びプロテオーム解析が行われる。ウイルスは、例えば、生存及び複製のためのそれらの細胞宿主の代謝ネットワークに頼る。ウイルス感染の代謝結果を検証することにより、ウイルス感染の原因及び／又は治療に対する洞察が与えられ得る。そのような研究によって得られた洞察は、標的試料、治療手順、及び使用される検出技術に依存し得る。通常、血液及び尿などの生物流体は感染後の代謝変化を追跡するために使用されるが、多くの場合、それらは、異なる細胞種類の変化のプール及び個体間の変異に起因して分析を複雑にし得る。結局のところ、試料の直接分析が、感染の部位内及び部位における実際の疾患関連代謝変化を理解するためのより容易な方法である。そのような場合、直接検出技術が重要な利点を提供できる。
【００２１】
代謝産物は、それらの識別及び分析を困難にする、大いに異なる存在レベルを有する様々な生理化学特性を有する低分子である。典型的には、フーリエ変換赤外分光法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）などの光学的分光分析、並びにガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びキャピラリー電気泳動などの分離技術と組み合わせた質量分析技術が、メタボローム研究に使用されている。質量分析（ＭＳ）は、クロマトグラフ分離と組み合わされ、高い選択性及び感受性、並びに広範なダイナミックレンジを有する複合試料の定性的及び定量的分析を与えることができる多目的技術である。しかしながら、従来の質量分析法は時間がかかり、広範な試料調製を伴う。フローインジェクションエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）などの直接サンプリング方法の適用はクロマトグラフ分離を回避できるが、試料の完全性に影響を及ぼし得、一部の場合、代謝産物分解を引き起こし得る広範な試料調製を回避できない。従って、これらの技術は一般的に、試料の選択を制限し、それらのその場分析を妨げる。
【００２２】
これらの問題の一部は大気圧イオン源の使用により軽減され得る。リアルタイム直接分析（ＤＡＲＴ）、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）、大気圧赤外線マトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＡＰ  ＩＲ−ＭＡＬＤＩ）、及びレーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化（ＬＡＥＳＩ）などの大気圧イオン源の最近の進歩により、広範な試料調製を必要とせずに細胞及び組織試料の直接分析が可能となる。ＤＡＲＴ、ＤＥＳＩ、及びＭＡＬＤＩ技術を用いる細胞、細胞培養物、及び細胞抽出物の分析は、検体の適用範囲、表面のみのサンプリング、及び定量制限などのそれら自体の欠点を有し得る。特定の実施形態によれば、ＬＡＥＳＩ−ＭＳは、その場の細胞及び組織分析のために提供でき、組織画像化及び定量能を用いて代謝産物及び脂質成分について細胞の全体積をサンプリングできる。
【００２３】
ウイルス感染の以前の研究により、解糖、クエン酸（ＴＣＡ）回路、ピリミジンヌクレオチド生合成、及び脂質代謝が、一般的に、ウイルス感染に伴って主に代謝変化することが示されている。これらの経路の代謝中間体は、感染に対する反応（例えば、より迅速なグルコース及びグルタミンの取り込み、クエン酸塩のより多くの蓄積、並びに感染細胞における乳酸塩及びグルタミン酸塩の排出の増加）を増加し得る。感染細胞からの流出物はヌクレオチド及び脂肪酸生合成に関連する代謝産物中で豊富になり得る。感染細胞における脂肪酸生合成は抗ウイルス反応を考慮され得る。ＨＩＶ感染細胞の以前の研究により、グルタチオンレベルの減少、脂質代謝の変化、及びポリアミンプール（プトレシン、スペルミジン及びスペルミン）が示されている。しかしながら、これらの研究は、試料抽出及びクロマトグラフ分離の両方を含む、従来のＭＳベースの技術を用いて行われた。特定の実施形態によれば、ＬＡＥＳＩ−ＭＳは、ＨＴＬＶ１感染Ｔリンパ球の代謝変化の迅速且つ直接的な識別を提供し、広範な試料調製の必要性を低減及び／又は除外する。
【００２４】
デルタレトロウイルスサブファミリーのメンバーである、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ１）は、発見された最初のヒト病原性レトロウイルスであった。ＨＴＬＶ１は癌発生の原因となり得る。ＨＴＬＶ１による感染の結果として、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）、ＣＤ４＋Ｔリンパ球増殖性悪性腫瘍の発生を生じる場合がある。世界中のＨＴＬＶ１感染を見積もると、１５００万から２５００万の間の個体となり得る。しかしながら、感染した個体は、長い潜伏期間の後、３〜５％の発生率でＡＴＬを発症する。ＨＴＬＶ１による感染の結果として、多発性筋炎、ブドウ膜炎、及びリンパ球性肺胞炎を含む、ＨＴＬＶ１関連脊髄症／熱帯性痙性不全対麻痺（ＨＡＭ／ＴＳＰ）及びいくつかの炎症性疾患を生じる場合がある。ＨＴＬＶ１感染によるＡＴＬの発症は、ウイルスタンパク質Ｔａｘに起因する初期の形質転換を有する多ヒット型の発生であり得る。最近の研究により、インターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）に対するモノクローナル抗体を含む、新規治療並びにインターロイキン−アルファ（ＩＦＮ−α）及びジドブジン（ＡＺＴ）の併用療法の使用が、ＡＴＬ患者のごく一部であるが、効果的であることが示されている。従って、ＡＴＬ、特に、ＨＴＬＶ１感染を治療するための新規療法が望まれる。
【００２５】
特定の実施形態によれば、感染及び／又は代謝異常の発症後の細胞、組織、及び／又は生物の代謝プロファイルの変化を識別及び分析するための質量分析計及び質量分析法である。ウイルス感染した細胞及び組織の代謝変化は、高スループットメタボローム及び相補的なトランスクリプトーム及び本明細書に記載されているＬＡＥＳＩ−ＭＳなどのプロテオーム技術を用いて監視できる。特定の実施形態において、ＬＡＥＳＩ−ＭＳは、ＨＴＬＶ１感染、ＨＴＬＶ３感染、Ｔａｘ１発現、及びＴａｘ３発現並びにＨＴＬＶ３分子クローン又はＴａｘ３及びＨＴＬＶ１形質転換細胞のいずれかでトランスフェクトした細胞及び組織の代謝プロファイルの比較の後に、細胞、組織、及び／又は生物の代謝プロファイルの変化を識別及び分析するために使用され得る。代謝及び細胞周期制御において、タンパク質などの重要な調節因子を不安定化するＴａｘの役割を理解することは、ＡＴＬ発症の原因となり、新規治療ストラテジーを規定する分子マーカーを識別するのに役立ち得る。特定の実施形態は感染細胞のその場の代謝産物プロファイリングを含む。特定の実施形態は宿主細胞の生化学プロセスにおけるウイルス感染による撹乱の識別を容易にするステップを含む。
【００２６】
本明細書に記載される質量分析計並びにそれを製造及び使用する方法の特定の実施形態は、他の質量分光分析のアプローチよりも特定の利点を与えることができる。その利点としては、限定されないが、その場分析、多数試料の同時検出、アブレーション条件及びイオン化条件の独立最適化、使用され得る試料のより広範なダイナミックレンジ、周囲条件下での作動、より簡単な試料調製、最小試料の操作、最小試料の分解、改良したサンプリング時間、位置感度、表面特性に対する改良した感受性、及び／又は改良した検出限界が挙げられる。
Ｃ．レーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析
特定の実施形態によれば、レーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析のための質量分析計は、全体として、レーザシステム、エレクトロスプレー装置、及び質量分析計を備えてもよい。レーザシステムは、レーザ、並びに光ファイバ、組みレンズ、及び／又は集束レンズを含む集束系、並びに試料マウントを有するｘ−ｙ−ｚ並進ステージを備えてもよい。レーザは、Ｅｒ：ＹＡＧレーザ、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ駆動の光学パラメータ式発振器及び自由電子レーザからなる群から選択されてもよい。エレクトロスプレー装置は、電源及びシリンジポンプを有するエレクトロスプレーイオン化エミッタを備えてもよい。質量分析イオン源は固体カメラを備えてもよい。質量分析イオン源は、試料を包囲するためのシュラウド、試料ホルダ、及び／又はエレクトロスプレーエミッタを備えてもよい。並進ステージ及び試料環境は制御された温度及び／又は制御された雰囲気であってもよい。これにより、試料の完全性が維持され、環境からの水分の凝縮が回避できる。雰囲気は周囲雰囲気を含んでもよい。温度は−１０℃〜６０℃の範囲であってもよい。相対湿度は１０％〜９０％の範囲であってもよい。
【００２７】
特定の実施形態において、雰囲気及び／又はエレクトロスプレー溶液は、試料の特定の構成物質のイオン化及び／又はフラグメンテーションを促進する反応成分を含んでもよい。例えば、エレクトロスプレー溶液は、衝突誘起解離実験において構造特異的フラグメンテーションを誘発することによって脂質の構造上の識別を容易にするＬｉ２ＳＯ４を含んでもよい。反応ガスの例としては、限定されないが、アンモニア、ＳＯ２、及びＮＯ２が挙げられる。
【００２８】
図１を参照すると、特定の実施形態において、ＬＡＥＳＩイオン源を含む質量分析計は、全体として、エレクトロスプレーキャピラリー２、ポンプ４を有する任意選択の液体供給、高電圧電源６、対電極８、オシロスコープ１０、記録装置１２、例えばパーソナルコンピュータ、Ｅｒ：ＹＡＧレーザ又はＮｄ：ＹＡＧレーザ駆動の光学パラメータ式発振器などのレーザ１４、ビームステアリング装置１６、例えばミラー、集束装置１８、例えばレンズ又は先鋭化光ファイバ、ｘ−ｙ−ｚ位置決めステージを有する試料ホルダ２０、質量分析計２２、及び記録装置２４、例えばパーソナルコンピュータを備えてもよい。
【００２９】
図２を参照すると、特定の実施形態において、ＬＡＥＳＩイオン源を含む質量分析計は、全体として、エレクトロスプレーキャピラリー（Ｅ）、ポンプを有する任意選択の液体供給（ＳＰ）、高電圧電源（ＨＶ）、Ｅｒ：ＹＡＧレーザ又はＮｄ：ＹＡＧレーザ駆動の光学パラメータ式発振器などのレーザ、ビームステアリング装置、例えばミラー（Ｍ）、集束装置、例えばレンズ又は先鋭化光ファイバ、ｘ−ｙ−ｚ位置決めステージを有する試料ホルダ（ＴＳ）、長距離ビデオ顕微鏡（ＦＭＭ）、第２のビデオ顕微鏡（ＣＳＭ）、及び質量分析計を備えてもよい。特定の実施形態において、ＬＡＥＳＩイオン源を含む質量分析計は、エレクトロスプレープルームにより遮断され、質量分析計（ＭＳ）によりサンプリングされたイオンを形成するために後でイオン化され得る中赤外アブレーション生成物を生成するためのエッチングされた光ファイバ先端（Ｆ）、ファイバ先端と試料表面（Ｓ）との間の一定距離を維持するための長距離ビデオ顕微鏡（ファイバモニタ、ＦＭＭ）、３軸並進ステージ上に置かれた試料（ＴＳ）、及び試料を標的にするための第２のビデオ顕微鏡（細胞スポッティング顕微鏡（ｃｅｌｌ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、ＣＳＭ）を備えてもよい。エレクトロスプレーは、高電圧（ＨＶ）をキャピラリーエミッタ（Ｅ）に印加することによって、及びシリンジポンプ（ＳＰ）による一定の溶液流量を維持することによって生成され得る。レーザからのパルスは、２つのＡｕコーティングミラー（Ｍ）及びＣａＦ２レンズ（Ｌ）を用いて、ファイバチャック（Ｃ）及び５軸ファイバマウント（ＦＭ）によって調節された、光ファイバに結合され得る。ＬＡＥＳＩ−ＭＳ装置は、記録装置、例えばパーソナルコンピュータを備えてもよい。ＬＡＥＳＩイオン源を含む質量分析計は、単一細胞分析のために構成されてもよい。単一細胞のためのＬＡＥＳＩ−ＭＳ法は、マイクロマニピュレータを用いるステップ及びレーザスポットサイズを５μｍ〜２００μｍに低減させるステップを含んでもよい。
【００３０】
特定の実施形態において、アブレーションプルーム（ＬＡ）はエレクトロスプレープルーム（ＥＳ）と交差してもよい。図３Ａ及び３Ｂを参照すると、エレクトロスプレーされた液滴は、エミッタから下流（左から右）に移動する。エレクトロスプレーされた液滴は、アブレーションプルームから上方に移動する微粒子によって遮断される。アブレーションプルームは１〜３μｍの粒子を含んでもよい。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、２つのプルームの交差点において、アブレートされた粒子の一部は、エレクトロスプレー液滴と融合して、アブレートされた材料の一部を含有する帯電液滴を形成でき、最終的にＥＳＩプロセスにおいてイオンを生成する。エレクトロスプレーエミッタは、パルス状噴霧レジーム及び／又はコーンジェットレジームにおいて操作されてもよい。図３Ａに示されるように、パルス状噴霧レジームは、より低いデューティサイクルを与えることができ、より低いイオン化効率及びＬＡＥＳＩシグナルを生じるより大きなエレクトロスプレー液滴を生成できる。図３Ｂに示されるように、コーンジェットレジームは、より高いイオン化効率及びＬＡＥＳＩシグナルを生じるより小さなエレクトロスプレー液滴を生成できる。
【００３１】
特定の実施形態において、レーザは赤外レーザを含んでもよい。赤外レーザは、２６００ｎｍ〜３４５０ｎｍ、例えば２８００ｎｍ〜３２００ｎｍ、及び２９３０ｎｍ〜２９５０ｎｍの波長で作動できる。レーザは、２６００ｎｍ〜３４５０ｎｍの波長、１Ｈｚ〜１００Ｈｚの繰り返し率、及び０．５ｎｓ〜５０ｎｓのパルス幅で作動する中赤外パルスレーザを含んでもよい。少なくとも１つの実施形態において、レーザは、２９４０ｎｍ、１００Ｈｚ繰り返し率、及び５ｎｓパルス幅で作動するダイオード励起されたＮｄ：ＹＡＧレーザ駆動の光学パラメータ式発振器（ＯＰＯ）（Ｏｐｏｌｅｔｔｅ１００，Ｏｐｏｔｅｋ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含んでもよい。光ファイバは、１μｍ〜５０μｍ、例えば５μｍ〜２５μｍ、及び１０μｍ〜１５μｍの曲率半径にエッチングされたその先端を有する酸化ゲルマニウム（ＧｅＯ２）ベースの光ファイバ（４５０μｍコア径、ＨＰ  Ｆｉｂｅｒ，Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｏｎｇ，ＭＤ）を備えてもよい。少なくとも１つの実施形態において、曲率半径は１５μｍであってもよい。光ファイバはレーザパルスを試料に送達できる。光ファイバに結合する前のレーザパルスのエネルギーは０．１ｍＪ〜６ｍＪであってもよく、従って、パルス間エネルギーは、安定的に通常、２％〜１０％に対応する。少なくとも１つの実施形態において、光ファイバに結合する前のレーザパルスのエネルギーは５５４±２６μＪであってもよく、従って、パルス間エネルギーは、安定的に通常、５％に対応する。レーザシステムは、試料をアブレートするために０．０１秒〜２０秒、１００Ｈｚで作動できる。少なくとも１つの実施形態において、レーザシステムは、試料をアブレートするために、１秒間、１００Ｈｚで作動できる。特定の実施形態において、１〜１００のレーザパルスが分析のために試料に送達されてもよい。
【００３２】
特定の実施形態において、エレクトロスプレー源は、エレクトロスプレー溶液を先細状のステンレス鋼エミッタ（内径５０μｍ，ＭＴ３２０−５０−５−５，Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）に供給するために低ノイズシリンジポンプ（Ｐｈｙｓｉｏ２２，Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を備えてもよい。低ノイズシリンジポンプは１０ｎＬ／分〜１０μＬ／分の速度でエレクトロスプレー溶液を供給できる。少なくとも１つの実施形態において、低ノイズシリンジポンプは２００ｎＬ／分でエレクトロスプレー溶液を供給できる。先細状のステンレス鋼エミッタは、１００μｍ〜５００μｍの外径及び１０μｍ〜２００μｍの内径を有してもよい。電源は、２．５〜５ｋＶの安定な高電圧をエレクトロスプレーエミッタに提供するために、調整電源（ＰＳ３５０，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を含んでもよい。電源は、試料、エレクトロスプレーエミッタ、及び／又は質量分析計の入り口開口部の相対位置を調節することによってＬＡＥＳＩシグナルを最適化するために手動並進ステージに取り付けられてもよい。エレクトロスプレー溶液は、０．１％（ｖ／ｖ）酢酸を含む５０％メタノール、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含む５０％メタノール、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む５０％メタノール、０．１％（ｖ／ｖ）酢酸アンモニウムを含む５０％メタノールのうちの少なくとも１つを含んでもよい。エレクトロスプレー溶液は、０°〜９０°、例えば３０°、４５°、及び６０°の角度で、アブレーションプルームに適用されてもよい。角度は、イオン生成を最適化するために０°〜９０°で調節されてもよい。少なくとも１つの実施形態において、エレクトロスプレー溶液は、直角（９０°）でアブレーションプルームに適用されてもよい。
【００３３】
特定の実施形態において、質量分析計の開口部はＬＡＥＳＩイオン源のエレクトロスプレーエミッタと同じ又は異なる軸上にあってもよい。質量分析計の開口部と、ＬＡＥＳＩイオン源のエレクトロスプレーエミッタとの間の角度は、０°〜９０°、例えば３０°、４５°、及び６０°であってもよい。質量分析計の開口部からエレクトロスプレーエミッタ先端までの距離は１ｍｍ〜２０ｍｍ、例えば５ｍｍ〜１５ｍｍであってもよい。少なくとも１つの実施形態において、質量分析計の開口部からエレクトロスプレーエミッタ先端までの距離は１２ｍｍであってもよい。試料は、予め洗浄された顕微鏡スライドガラス（カタログ番号１２５４９６，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上に置かれてもよい。試料は、ステッピングモータ駆動の３軸精密屈曲ステージ（ＮａｎｏＭａｘ  ＴＳ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＪ）上に置かれてもよい。試料は、スプレー軸の下１ｍｍ〜３０ｍｍ、例えば５ｍｍ〜２５ｍｍ、及び１０ｍｍ〜２０ｍｍにあってもよい。少なくとも１つの実施形態において、試料は、スプレー軸の下１５ｍｍにあってもよい。１つの実施形態において、ＥＳＩが停止した場合、質量分析計によってイオンは検出されず、レーザによって直接誘起されたイオンが収集されなかったことを示す。この観測は、質量分析計の開口部とアブレートされた試料との間の長い（＞１５ｍｍ）距離によって生じ得る。
【００３４】
ＬＡＥＳＩイオン源によって生成された陽イオンは質量分析計によって分析され得る。質量分析計は、直交加速飛行時間型質量分析計（ＱＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ，Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏ．，ＭＡ）を含んでもよい。質量分析計の開口部は、１００μｍ〜５００μｍ、例えば２２５μｍ〜３７５μｍの内径を有してもよい。少なくとも１つの実施形態において、質量分析計の開口部は、１００μｍ〜２００μｍ、例えば１２７μｍの内径を有してもよい。質量分析計の開口部は、その質量分析計の開口部と同様の内径及び２０ｍｍ〜５００ｍｍの長さを有する直線状又は湾曲した拡張チューブにより拡張されてもよい。インターフェースブロック温度は、周囲温度〜１５０℃、例えば２３℃〜９０℃、及び６０℃〜８０℃であってもよい。少なくとも１つの実施形態において、インターフェースブロック温度は８０℃であってもよい。電位は−１００Ｖ〜１００Ｖ、例えば−７０Ｖ〜７０Ｖであってもよい。少なくとも１つの実施形態において、電位は−７０Ｖであってもよい。タンデム質量スペクトルは、１０−６ｍｂａｒ〜１０−２ｍｂａｒの衝突セル圧力、及び１０ｅＶ〜２００ｅＶの衝突エネルギーにて、アルゴン、ヘリウム又は窒素などの衝突ガスを用いて、衝突活性化解離（ＣＡＤ）によって得られ得る。少なくとも１つの実施形態において、衝突ガスはアルゴンであってもよく、衝突セル圧力は４×１０−３ｍｂａｒであってもよく、衝突エネルギーは１０ｅＶ〜２５ｅＶであってもよい。
【００３５】
特定の実施形態において、レーザビームは、金がコーティングされたミラー（ＰＦ１０−０３−Ｍ０１，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＪ）により操作されてもよく、２ｍｍ〜１００ｍｍ、例えば２５ｍｍ〜７５ｍｍ、及び４０ｍｍ〜６０ｍｍの焦点長さを有する平凸のフッ化カルシウムレンズ（Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）により光ファイバの切断端部に結合されてもよい。少なくとも１つの実施形態において、焦点長さは５０ｍｍであってもよい。光ファイバは、むきだしのファイバチャック（ＢＦＣ３００，Ｓｉｓｋｉｙｏｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｔｓ  Ｐａｓｓ，ＯＲ）により保持されてもよい。光ファイバは、５軸変換装置（ＢＦＴ−５，Ｓｉｓｋｉｙｏｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｔｓ  Ｐａｓｓ，ＯＲ）により位置決めされてもよい。
【００３６】
特定の実施形態において、光ファイバは、ＧｅＯ２ベースのガラスファイバ、フッ化物ガラスファイバ、及びカルコゲニドファイバを含んでもよい。光ファイバは、その高いガラス遷移温度に起因する高レーザ損傷閾値を有してもよい。ハイトレル及びポリイミドコーティングは、１−メチル−２−ピロリジノン（１分間、１３０℃〜１５０℃にて）の塗布によってファイバの両方の端部で剥ぎ取られ得る。ハイトレル及びポリイミドコーティングを剥ぎ取った後、ファイバの端部は、サフィアブレード（ＫＩＴＣＯ  Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｂｅａｃｈ，ＶＡ）を用いて、それらの端部を引っ掻き、穏やかに折ることによって開裂され得る。ＧｅＯ２ベースのガラスファイバ先端の化学エッチングは、低いメニスカス曲率を得るために、開裂したファイバ端部の１つを広いビーカー中の２４℃の１％ＨＮＯ３溶液に０．５ｍｍの深さで浸漬することによってなされてもよい。ファイバ端部で形成されたメニスカスは、４５０μｍ直径コアを、１５μｍの曲率半径（Ｒ）を有する鋭い先端に徐々にエッチングできる。使用前に、エッチングされた先端は純水で洗浄されてもよい。特定の実施形態において、損傷又は汚染がないことを示し得るＬＡＥＳＩ技術の実施後、ファイバ先端の目に見える変化は観察できない。
【００３７】
特定の実施形態において、ファイバのエッチングされた端部はマイクロマニピュレータ（ＭＮ−１５１、ナリシゲ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）、東京、日本）に取り付けられて、ファイバのエッチングされた端部を試料により近接するように移動できる。ファイバのエッチングされた端部と試料との距離は接触（０μｍ）から５０μｍであってもよい。少なくとも１つの実施形態において、ｘ−ｙ平面が試料と一致し、ｘ軸がエミッタと平行になり、光ファイバが、２０°〜１６０°の方位角及び２０°〜７０°の天頂角で位置合わせされるように座標系が調整されてもよい。少なくとも１つの実施形態において、方位角は１３５°であってもよく、天頂角は４５°であってもよい。４５°の天頂角は、拡張しているプルームを遮断することによってアブレーションマークの形状とシグナル強度減少との間で許容可能なトレードオフを与えることができる。アブレーション後、薄い試料材料堆積物がファイバ先端上に観測され得る。これらの場合、ファイバは表面から引っ込められてもよく、増加したレーザパルスエネルギーが先端を洗浄するために使用されてもよい。少なくとも１つの実施形態において、ファイバ先端と試料表面（ｈ）との間の距離は２Ｒであってもよい。この結果、２．５Ｒの平均直径を有するアブレーションマークを生じ得る。少なくとも１つの実施形態において、ファイバ先端と試料表面との間の距離は３０μｍであってもよく、３７．５μｍの平均直径を有するアブレーションマークを生じる。アブレーションマークの顕微鏡画像は、反射された又は送信された様式のいずれかにおいて正立顕微鏡（ＢＸ５１，Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）によって、及び倒立顕微鏡によって得られてもよい。
【００３８】
特定の実施形態において、質量分析計イオン源は可視化システムを含んでもよい。ファイバ先端と試料表面との間の距離は、５×無限遠補正対物レンズ（Ｍ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  ５×、株式会社ミツトヨ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ  Ｃｏ．）、神奈川、日本）を備えた長距離ビデオ顕微鏡（ＩｎＦｏｃｕｓ  Ｍｏｄｅｌ  ＫＣ，Ｉｎｆｉｎｉｔｙ，Ｂｏｕｌｄｅｒ  ＣＯ）によって監視されてもよく、画像はＣＣＤカメラ（Ｍａｒｌｉｎ  Ｆ１３１，Ａｌｌｉｅｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔａｄｔｒｏｄａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってキャプチャされてもよい。狭いμｍ領域における環境振動を用いて、３０μｍ〜４０μｍの近似距離が先端と試料との間に維持されてもよい。類似のビデオ顕微鏡システムが、アブレーションのための試料中の対象の位置の上にファイバ先端を並べるために試料表面に対して直角で使用されてもよい。可視化システムは、１０×無限遠補正長作動距離対物レンズ（Ｍ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  １０×、株式会社ミツトヨ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ  Ｃｏ．）、神奈川、日本）及びＣＣＤカメラ（Ｍａｒｌｉｎ  Ｆ１３１，Ａｌｌｉｅｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔａｄｔｒｏｄａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を取り付けられた、７×精密光学ズーム（Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ，Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＮＪ）を含んでもよい。
【００３９】
特定の実施形態において、試料は、水を含み、限定されないが、細胞、組織、器官、バイオフィルム、水溶液、有機物質、無機物質、合成物質、生物医学試料、法医学試料、生物兵器、及び浸水表面を含む、任意の試料を含んでもよい。例えば、試料は、生体分子（例えば代謝産物、脂質、核酸、タンパク質、ペプチド、及び炭水化物）、有機及び無機分子（例えば薬剤、ポリマー、デンドリマー及び他の高分子）、並びにそれらの混合物からなる群から選択されてもよい。試料は、細胞が互いに及び／又は表面に付着している微生物の集合体を含むバイオフィルムを含んでもよい。試料は、単一細胞、細胞、小さな細胞集団、細胞株、組織を含んでもよい。単一細胞は、１００μｍ未満、例えば５０μｍ未満、２５μｍ未満、及び／又は１０μｍ未満の最小の寸法を有してもよい。単一細胞は、１μｍ〜１００μｍ、例えば５μｍ〜５０μｍ、及び１０μｍ〜２５μｍの最小の寸法を有してもよい。少なくとも１つの実施形態において、単一細胞は１μｍ〜１０μｍの最小の寸法を有してもよい。小さな細胞集団は、１０〜１００万個の細胞、例えば５０個の細胞〜１００，０００個の細胞、及び１００個の細胞〜１，０００個の細胞を含んでもよい。試料はウイルス及び細菌の少なくとも１つに感染した細胞を含んでもよい。試料はウイルス感染した生細胞及び／又は組織を含んでもよい。試料は代謝異常を有する細胞を含んでもよい。
【００４０】
図４を参照すると、特定の実施形態によれば、質量分析法は、インジケータを含む試料をレーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析に供するステップと、インジケータの相対強度を測定するステップと、インジケータの相対強度を標準インジケータ強度と比較するステップと、を全体として含んでもよい。試料をレーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析に供するステップは、周囲条件下で赤外レーザを用いて試料をアブレートしてアブレーションプルームを生成するステップと、エレクトロスプレープルームによってアブレーションプルームを遮断するステップと、質量分析によってインジケータを検出するステップとを含んでもよい。特定の実施形態において、試料をレーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析に供するステップは、試料をマトリクス材料で前処理するステップを除外する。特定の実施形態において、インジケータの相対強度を測定するステップは、複数の荷電状態を含むインジケータの相対強度を測定するステップを含んでもよい。標準インジケータ強度は内部標準及び／又は外部標準を含んでもよい。
【００４１】
特定の実施形態によれば、インジケータは、生体分子、有機分子、分子錯体及び／又は生体異物を含んでもよい。インジケータは、代謝産物、脂質、脂質前駆体、脂質成分、核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。インジケータは、単一細胞由来の細胞内代謝産物を含んでもよい。インジケータは、バイオマーカーを含んでもよい。バイオマーカーは、代謝変化に関連付けられてもよい。バイオマーカーは、疾患状態に関連付けられてもよい。疾患状態は、ウイルス感染、細菌感染、及び／又は代謝異常に関連付けられてもよい。
【００４２】
ウイルスとしては、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ１）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス２型（ＨＴＬＶ２）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス３型（ＨＴＬＶ３）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パラミクソウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ウイルス性脳炎、ヘルペスウイルス、インフルエンザ、及び／又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）が挙げられ得る。細菌としては、限定されないが、炭疽菌（炭疽病の病原体）、ペスト菌（腺ペストの病原体）、結核菌（結核の病原菌）及びコレラ菌（コレラの病原菌）が挙げられ得る。代謝異常は、糖尿病、筋ジストロフィー、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、テイサックス病、白質ジストロフィー、リソソーム異常、ウィルソン病、レッシュ・ナイハン症候群、尿素サイクル異常症、アミロイドーシス及び／又は脂質蓄積症を含んでもよい。特定の実施形態において、疾患状態は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ１）、及び／又はヒトＴリンパ球向性ウイルス３型（ＨＴＬＶ３）並びにＴａｘ１及び／又はＴａｘ３発現細胞を含んでもよく、インジケータは、グルタチオン、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、アルギニン、クレアチン、コリン、ホスホコリン、グリセロホスホコリン、グリセロホスホコリン脂質、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ｃＡＭＰ、ドーパミン、ドーパミン代謝産物、及び／又はいずれかのそれらの組み合わせを含んでもよい。特定の実施形態において、インジケータは、毒素に対する曝露によって引き起こされる代謝変化に関連付けられてもよい。例えば、血液中の酵素ブチリルコリンエステラーゼの活性が、神経剤曝露に対するバイオマーカーとして使用されてもよい。
【００４３】
特定の実施形態によれば、質量分析法は、試料を、標準インジケータ強度に属する又は属さないと分類するステップを含んでもよい。標準インジケータ強度に属さない試料は、その試料が代謝変化を含むことを示すことができる。代謝変化は、ウイルス感染、細菌感染、及び／又は代謝異常に関連付けられてもよい。標準インジケータ強度に属さない試料は、その試料が疾患状態を含むと予測されることを示すことができる。疾患状態は、ウイルス感染、細菌感染、及び／又は代謝異常と関連付けられてもよい。
【００４４】
特定の実施形態において、インジケータは複数のインジケータを含んでもよい。質量分析法は、各インジケータの相対強度を測定して試料代謝産物パターンを形成するステップと、その試料代謝産物パターンを、複数のインジケータの各々の標準インジケータ強度を含む標準代謝産物パターンと比較するステップと、を含んでもよい。質量分析法は、試料を、標準代謝産物パターンに属する又は属さないと分類するステップを含んでもよい。標準代謝産物パターンに属さない試料は、その試料が代謝変化を含むことを示すことができる。標準代謝産物パターンに属さない試料は、その試料が疾患状態を含むと予測されることを示すことができる。
【００４５】
図５を参照すると、特定の実施形態によれば、インジケータを含む試料の代謝状態をその場で測定する方法は、周囲条件下で赤外レーザを用いて試料をアブレートしてアブレーションプルームを生成するステップと、エレクトロスプレープルームによってアブレーションプルームを遮断するステップと、質量分析によってインジケータを検出するステップと、インジケータの相対強度を測定するステップと、インジケータの相対強度を標準インジケータ強度と比較するステップと、試料を、標準インジケータ強度に属する又は属さないと分類ステップとを全体として含んでもよい。標準インジケータ強度に属さない試料は、その試料が代謝変化を含むことを示すことができる。標準インジケータ強度に属さない試料は、その試料が疾患状態を含むと予測されることを示すことができる。代謝変化は、ウイルス感染、細菌感染、及び／又は代謝異常と関連付けられてもよい。
【００４６】
特定の実施形態において、インジケータの相対強度を測定するステップは、複数の荷電状態を含むインジケータの相対強度を測定するステップを含んでもよい。インジケータは複数のインジケータを含んでもよい。質量分析法は、各インジケータの相対強度を測定して試料代謝産物パターンを生成するステップと、その試料代謝産物パターンを、複数のインジケータの各々の標準インジケータ強度を含む標準代謝産物パターンと比較するステップとを含んでもよい。質量分析法は、試料を、標準代謝産物パターンに属する又は属さないと分類するステップを含んでもよい。標準代謝産物パターンに属さない試料は、その試料が代謝変化を含むことを示すことができる。標準代謝産物パターンに属さない試料は、その試料が疾患状態を含むと予測されることを示すことができる。標準インジケータ強度は内部標準及び／又は外部標準を含んでもよい。
【００４７】
特定の実施形態において、代謝状態は、発生段階、例えば細胞周期の段階、環境、栄養供給、分類単位、遺伝単位、感染及び非感染状態、疾患及び健康状態、並びに病原性の異なる段階からなる群から選択されてもよい。
【００４８】
特定の実施形態によれば、代謝状態を測定する方法は、周囲条件下で赤外レーザを用いてインジケータを含む第２の試料をアブレートして第２のアブレーションプルームを生成するステップと、第２のエレクトロスプレープルームによって第２のアブレーションプルームを遮断するステップと、質量分析によって第２の試料のインジケータを検出するステップと、第２の試料のインジケータのプロファイルを測定するステップと、第１のインジケータ及び第２のインジケータを、互い及び／又は標準インジケータ強度と比較するステップと、第１の試料及び第２の試料の少なくとも１つを、標準インジケータ強度に属すか又は属さないと分類するステップとを含んでもよい。標準インジケータ強度に属さない試料は、その試料が代謝変化を含むことを示すことができる。標準インジケータ強度に属さない試料は、その試料が疾患状態を含むと予測されることを示すことができる。代謝変化及び／又は疾患状態は、ウイルス感染、細菌感染、及び／又は代謝異常と関連付けられてもよい。特定の実施形態において、第１のインジケータ及び第２のインジケータを互いに比較するステップは、試料が代謝変化を含むことを示すことができる。特定の実施形態において、第１のインジケータ及び第２のインジケータを互いに比較するステップは、試料が疾患状態を含むと予測されることを示すことができる。
【００４９】
特定の実施形態において、質量分析法は、試料からの時間及び／又は空間情報を測定するステップを含んでもよい。第２の試料は異なる時点の第１の試料を含んでもよい。例えば、第１の試料は細胞及び／又は組織を含んでもよく、所定の期間後又は細胞周期の異なる段階においてなどの後の時点の、第２の試料は同じ細胞及び／又は組織を含んでもよい。第２の試料は第１の試料の異なる部分を含んでもよい。例えば、第１の試料は細胞及び／又は組織の第１の部分を含んでもよく、第２の試料は同じ細胞及び／又は組織の別の部分を含んでもよい。
【００５０】
特定の実施形態によれば、ウイルス感染した細胞／組織の代謝変化はＬＡＥＳＩ−ＭＳを用いて監視されてもよい。特定の実施形態において、代謝産物及び脂質の変化は、非感染Ｔリンパ球、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ１）形質転換細胞、及びヒトＴリンパ球向性ウイルス３型（ＨＴＬＶ３）形質転換細胞、並びにＴａｘ１及びＴａｘ３発現細胞株Ｔリンパ球から直接的に検出されてもよい。非感染及び感染細胞の質量スペクトルは、あらゆる代謝変化を識別するために比較されてもよい。グリセロホスホコリン（ＰＣ）脂質成分は非ＨＴＬＶ１形質転換細胞において優性であり得、ＰＣ（Ｏ−３２：１）及びＰＣ（Ｏ−３４：１）プラズマロゲンは、ＨＴＬＶ１形質転換細胞におけるＰＣ（３０：０）及びＰＣ（３２：０）種と置き換えられてもよい。ＨＴＬＶ１形質転換細胞において、コリン、ホスホコリン、スペルミン及びグルタチオンは、とりわけ、下方制御され得るのに対して、クレアチン、ドーパミン、アルギニン及びＡＭＰは上方制御され得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞における個々の測定は、数秒かかってもよく、ＬＡＥＳＩ−ＭＳを用いてハイスループット研究を可能にする。ＨＴＬＶ３分子クローン又はＴａｘ３のいずれかで形質転換した異なる細胞株の分析は、ＨＴＬＶ１及びＨＴＬＶ３感染細胞と相関する代謝変化を示し得るのに対して、他のものはＨＴＬＶ１に特有であり得る。
【００５１】
特定の実施形態によれば、質量分析法は、ＨＴＬＶ１及びＨＴＬＶ３形質転換細胞のハイスループットのその場の代謝産物プロファイリングによって宿主細胞の生化学プロセスにおけるウイルス誘発性撹乱を識別するステップを含んでもよい。この方法は、ＨＴＬＶ１及びＨＴＬＶ３感染の分子機構をより良く理解するために使用されてもよく、次いでこの結果、薬物開発及び／又は新規治療ストラテジーを得ることができる。
【００５２】
特定の実施形態によれば、質量分析法は、細胞間の代謝的変化を分析するステップ及び／又は細胞周期の異なる段階にて細胞を分析するステップを含んでもよい。特定の実施形態において、質量分析法は、ＨＴＬＶ１及びＴａｘ１形質変換Ｔリンパ球並びにＨＴＬＶ３及びＴａｘ３形質転換腎上皮細胞の代謝変化を識別するステップを含んでもよい。インジケータは、グルタチオン、スペルミン、コリン、ホスホコリン、グリセロホスホコリン、チオアセトアミド、プロリン、タウリン、カルバモイルリン酸、メトキシチラミン及び８−ヒドロキシグアノシン、クレアチン、アルギニン、ドーパミン、ホモバニリン酸及びＡＭＰを含んでもよい。グルタチオン、スペルミン、コリン、ホスホコリン、グリセロホスホコリン、チオアセトアミド、プロリン、タウリン、カルバモイルリン酸、メトキシチラミン及び８−ヒドロキシグアノシンのレベルはＣ８１細胞において下方制御され得る。クレアチン、アルギニン、ドーパミン、ホモバニリン酸及びＡＭＰのレベルは、感染細胞において上方制御され得る。
【００５３】
特定の実施形態において、質量分析法は、Ｈ９−Ｔａｘ１細胞及びＨ９細胞並びにＨＵＴ１０２細胞及びＨ９細胞において検出された代謝変化を比較するステップを含んでもよい。Ｃ８１細胞において検出された重要な代謝変化の一部はまた、Ｈ９−Ｔａｘ１細胞対Ｈ９細胞並びにＨＵＴ１０２細胞対Ｈ９細胞においても観測された。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、これらのインジケータは、例えば、ポリアミン生合成、クレアチン生合成、ＡＭＰ生合成、ドーパミン代謝、脂質代謝、酸化還元反応などの生化学経路に関与する。ＨＴＬＶ１とＨＴＬＶ３形質転換細胞とを比較することにより、代謝反応の一部は類似しているが、ＨＴＬＶ１に特異的ないくつかの変化が存在することが示された。例えば、プトレシン、タウリン、アルギニン及びＡＭＰのレベルの変化はＨＴＬＶ１形質転換細胞の中で一致していた。
【００５４】
本明細書に記載される種々の実施形態は、以下の代表的な実施例と併せて読んだ場合、より良く理解され得る。以下の実施例は例示の目的のために含まれ、限定するものではない。
【実施例】
【００５５】
Ｄ．実施例
非感染Ｔリンパ球（ＣＥＭ及びＨ９）及び腎上皮細胞（２９３Ｔ）、ＨＴＬＶ１感染細胞（Ｃ８１及びＨＵＴ１０２）、並びにＨＴＬＶ１（Ｈ９−Ｔａｘ１）のＴａｘ１で安定にトランスフェクトしたＨ９細胞及びＨＴＬＶ３（２９３Ｔ−ＨＴＬＶ３）に感染させ、Ｔａｘ３（２９３Ｔ−Ｔａｘ３）を発現する２９３Ｔ細胞を、ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に維持した。培地溶液及び緩衝液はＱｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から調達し、溶媒はＡｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｇｅｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から入手可能なＨＰＬＣグレードであった。氷酢酸はＦｌｕｋａ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【００５６】
特定の実施形態によれば、質量分析法は赤外レーザシステムにより実施した。光学パラメータ式発振器（ＯＰＯ）（Ｏｐｏｌｅｔｔｅ  １００、Ｏｐｏｔｅｋ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）は、１００Ｈｚ繰り返し率Ｎｄ：ＹＡＧレーザの出力を、２９４０ｎＭ波長における５ｎｓの継続時間の中赤外パルスに変換した。ビームステアリング及び集束は、金でコーティングしたミラー（ＰＦ１０−０３−Ｍ０１、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＪ）及び１５０ｍｍ焦点距離ＣａＦ２レンズ（Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）によりそれぞれ達成した。スプレーキャプラリーの先端から５〜６ｍｍ下流において、０．３ｍＪ／パルスの平均出力エネルギーを有するレーザビームを、直角（９０°）にて組織試料をアブレートするために使用した。レーザスポットサイズは、印画紙上で生成された熱傷パターンの光学顕微鏡法により測定した。レーザスポットサイズは３００μｍ直径を有した。
【００５７】
特定の実施形態によれば、エレクトロスプレーシステムは、３２０μｍの外径及び５０μｍの内径を有する先細状先端を有するステンレス鋼エミッタ（ＭＴ３２０−５０−５−５、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を介して０．１％（ｖ／ｖ）酢酸を含有する５０％メタノール溶液を供給するために、低ノイズシリンジポンプ（Ｐｈｙｓｉｏ２２、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）から構成された。安定な高電圧（２８００Ｖ）を調整電源（ＰＳ３５０、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって生成した。調整電源はエミッタに直接印加した。サンプリング錐体の開口部は、その先端から１２ｍｍの距離にてエレクトロスプレーエミッタとの軸上にあった。
【００５８】
特定の実施形態によれば、試料をＬＡＥＳＩ−ＭＳに供する前に、対象の細胞を集団まで増殖させて１０６細胞／ペレットを生成した。その細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄して、スピンダウン（２０００ｒｐｍ）によりペレットにした。上清ＰＢＳをペレットを乱さずに除去し、１０μＬのペレットを顕微鏡スライド上に載せ、直接ＬＡＥＳＩ分析のために質量分析計に提供した。細胞ペレットを有する顕微鏡スライドを、周囲条件（周囲温度及び周囲圧力にて空気中）下でスプレー軸の１５ｍｍ下に位置合わせした。顕微鏡スライドを、ラスタリング（ｒａｓｔｅｒｉｎｇ）及び形状最適化のためにコンピュータ制御されたステッピングモータ駆動の３軸精密屈曲ステージ（Ｎａｎｏｍａｘ  ＴＳ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＹ）に取り付けた。
【００５９】
特定の実施形態によれば、イオン源を、Ｑ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）に取り付けた。全スキャン質量スペクトルを、８，０００（ＦＷＨＭ）の分解能にて飛行時間（ＴＯＦ）分析器を用いてｍ／ｚ５０−２，０００の質量範囲にわたって記録した。試料の個々の測定は、通常、数秒かかった。個々の代謝産物の構造識別のために、衝突活性化解離スペクトルを、四重極解析器（伝送窓２Ｄａ）を用いて前駆イオンを選択することによって記録し、生成したイオンをＴＯＦ解析器によって分解した。４×１０−３ｍｂａｒの衝突セル圧力及び５〜２５ｅＶの衝突エネルギー設定にて衝突ガスとしてアルゴンを使用した。内部標準法を用いて精密質量を測定した。グリシン、メチオニン、Ｎ−アセチルフェニルアラニン、ロイシンエンケファリン及びグルフィブリノペプチド（ｇｌｕｆｉｂｒｉｎｏｐｅｐｔｉｄｅ）を、５０μＭ〜２００μＭの濃度までエレクトロスプレー溶液に溶解し、内部標準として使用した。ＬＡＥＳＩスペクトルを得るために使用した細胞の概数は試料のほとんどについてほぼ同じであるように、一定時間、同様の実験的条件下で収集したＬＡＥＳＩスペクトルの平均を考慮した。
【００６０】
ヒトメタボロームデータベース（ＨＭＤＢ；ｗｗｗ．ｈｍｄｂ．ｃａ）、ＭａｓｓＢａｎｋ高分解能質量スペクトルデータベース（ｗｗｗ．ｍａｓｓｂａｎｋ．ｊｐ）、ＮＩＳＴ／ＥＰＡ／ＮＩＨ質量スペクトルライブラリ、及びＭｅｔａＣｙｃデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｔａｃｙｃ．ｏｒｇ）を、代謝産物検索及び識別のために０．１Ｄａ〜０．０１Ｄａの質量許容差範囲で使用した。
【００６１】
特定の実施形態によれば、検証目的のために、製造業社の指示書に従ってＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍアルギナーゼアッセイキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）を用いてアルギナーゼ活性を測定した。ＣＥＭ及びＣ８１細胞溶解物（１０μｇ及び１００μｇ）を３連で測定した。製造業社の指示書に従ってＣａｔｃｈＰｏｉｎｔ環状ＡＭＰ蛍光アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いてｃＡＭＰの濃度を測定した。ＣＥＭ及びＣ８１細胞溶解物（１０μｇ及び１００μｇ）を３連で測定した。製造業社の指示書に従ってグルタチオン還元酵素アッセイキット（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を利用してＣＥＭ及びＣ８１細胞溶解物（１０μｇ及び２００μｇ）由来のグルタチオン還元酵素を測定した。
【００６２】
特定の実施形態によれば、試料は、非感染（ＣＥＭ）及びＨＴＬＶ１感染（Ｃ８１）Ｔリンパ球の集団を含んでもよい。それらの非接着性細胞を、無機塩、糖、アミノ酸、ビタミン及び抗生物質を含有するＲＰＭＩ培地中で増殖させた。ＬＡＥＳＩスペクトルの培地からの干渉ピークを最小化するために、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞ペレットを顕微鏡スライド上に載せた。複数のレーザショットにより細胞を直接アブレートし、１０〜１５スキャンの平均ＬＡＥＳＩスペクトルを使用した。得られた陽イオンスペクトルは、ｍ／ｚ２０〜１５００の範囲において種々の細胞に関連した代謝産物イオンを示したが、また、ＰＢＳからの干渉ピークも含み、培地が細胞ペレットに残存していた。図８を参照すると、特定の実施形態に係る代表的な質量スペクトルが示される。質量スペクトルにおいて観測される代謝産物ピークは、精密質量、アイソトープ分布パターン、及びタンデムＭＳから得られた構造情報に基づいて識別した。バックグラウンド補正スペクトルは、プロトン化され、ナトリウムイオン化され（ｓｏｄｉａｔｅｄ）、及びカリウムイオン化された（ｐｏｔａｓｓｉａｔｅｄ）種からなる細胞から記録した。観測したピークは、小さな代謝産物（＜ｍ／ｚ５００）、脂質（ｍ／ｚ６９０から８５０の間）、及び多価ピーク（ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｐｅａｋ）（ｍ／ｚ７００から１３００の間）に起因し得る。全ての多価ピーク（ｍ／ｚ７１０、８２８、９９３及び１２４１）のデコンボレーションは、恐らくペプチドに関連する４９６０．６の公称分子量を有する一種類と一致した。
【００６３】
Ｔａｘ１発現細胞を用いたＣＥＭ  Ｔリンパ球及びＨＴＬＶ１感染Ｃ８１  Ｔリンパ球のスペクトルは、脂質ピークを除いて、同様のセットのイオンを示したが、一致した相違をそれらの相対的イオン収率で識別した。図６Ａ及び６Ｂを参照すると、細胞特異的代謝産物イオン並びに精密質量及びタンデム質量スペクトルデータ及び構造特異的断片イオンに基づいた、対応するピーク同定の代表的なリストが示される。代謝産物の識別は、それらのタンデム質量スペクトルを、タンデムＭＳデータベースからの対応する標準物質のスペクトルと比較することによって確認した。スペルミン（ｍ／ｚ２０３．２）、グルタチオン（ｍ／ｚ３０８．１）、ホスホコリン脂質（ＰＣ（３４：１）、ｍ／ｚ７６０．６）及びアデノシン一リン酸（ｍ／ｚ３４８．１）は、図９Ａ〜Ｄに示されるタンデム質量スペクトルによって識別した。両方のプロトン化環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）及びナトリウムイオン化グルタチオンは、理論的にｍ／ｚ３３０．０７３８イオンと同定できる。これらの２つのイオンの間の識別は、たとえ両方のイオンが（標準物質で試験したように）ｍ／ｚ３３０に寄与したとしても、ｍ／Δｍ＝１０，０００の利用可能な質量分解能により困難になり得る。図１０を参照すると、ナトリウムイオン化グルタチオンは、Ｔリンパ球由来のｍ／ｚ３３０イオンのタンデム質量スペクトルと２つの標準物質から生成されたｍ／ｚ３３０イオンのタンデム質量スペクトルとを比較することによって識別できる。しかしながら、検出限界における又は検出限界以下のレベルのｃＡＭＰは、ｍ／ｚ３３０イオンの質量スペクトルに寄与し得る。１つの実験において、Ｔリンパ球におけるｃＡＭＰを６ｐｍｏｌｅ／１０７細胞のレベルで測定した。グルタチオンからの干渉は、タンデムＭＳによるｃＡＭＰの存在を確認するのに困難を生じ得る。
【００６４】
プトレシン、スペルミジン及びスペルミンの分解／フラグメンテーション生成物の代表的な質量スペクトルが図１１に示される（分解生成物ａ、ｂ及びｃと指定される）。分解生成物ａ、ｂ及びｃは通し番号２及び１４で図６Ａ及び６Ｂに示される。これらの生成物の形成は、標準的なポリアミンからのＬＡＥＳＩデータを、同様の実験的条件でＴリンパ球において検出されたものと比較することによって確認した。ｍ／ｚ７２イオンは主にプトレシンから得られ、ｍ／ｚ１２９及びｍ／ｚ１１２イオンは、スペルミジン及びスペルミンの両方から形成され、恐らく大部分はそのより高いイオン収率に起因してスペルミンから形成された。非感染細胞と感染細胞との間のこれらの分解生成物の存在度はそれらの前駆体の存在度を追跡する。
【００６５】
特定の実施形態によれば、非ＨＴＬＶ１形質転換細胞及びＨＴＬＶ１形質転換細胞の質量スペクトルにおいて検出されたイオンの相対存在度が、それらの間の代謝変化の程度を決定するために使用されてもよい。ＰＢＳ／培地溶液からのバックグラウンドピークを内部標準として使用した。ＣＥＭ及びＣ８１において検出された各イオンについての相対存在比は図６Ａ及び６Ｂに示される。一部の代謝産物は１つより多いイオン種（すなわち、プロトン化され、ナトリウムイオン化され、カリウムイオン化されている）として検出され得る。例えば、グルタチオンは６つの異なるイオン種として検出された。このような場合、関連した種全ての相対存在度の合計を存在比を計算するために使用した。特定のピークがスペクトルに存在しない場合、バックグラウンド（ベースラインシグナル）を比を計算するために使用した。上方制御は、非ＨＴＬＶ１形質転換細胞に対するＨＴＬＶ１形質転換細胞からのイオンの存在比によって測定できるのに対して、下方制御は、その反比によって測定できる。もしあれば、１の比はわずかな変化を示し得る。特定の実施形態に係る３連の実験からのＣＥＭとＣ８１細胞との間の代謝産物のレベルの変化が図１３に示される。
【００６６】
特定の実施形態によれば、Ｔリンパ球の質量スペクトルは、培地（１１ｍＭ）の主な成分である、グルコース（相対存在度＜３％）からなった。プロトン化されたスペルミン（２０３．２２３６）は、ナトリウムイオン化されたグルコース種（２０３．０５９）のものと近かったが、それらの２つのピークは十分に分離され得る。しかしながら、これは、Ｔリンパ球から検出されたスペクトルに対する培地に関連したピークの可能な寄与の問題を引き起こし得る。培地のみの質量スペクトルは、アルギニン（ｍ／ｚ１７５）、コリン（ｍ／ｚ１０４）、及びグルタチオン（ｍ／ｚ３０８）が、Ｔリンパ球において関連した代謝産物からのシグナルに寄与することを示した。グルタチオン及びコリンピークはグルコースピーク（ｍ／ｚ２０３、ベースピーク）に対して２％未満であるのに対して、アルギニンピークは２５〜３０％であった。これらの比は希釈した培地（１００倍）からの値と一致した。グルコースピークは、単位値に近いｍ／ｚ２０３についての存在比でＣＥＭ及びＣ８１細胞（＜３％）の両方において現れた。ＣＥＭ細胞においてごくわずかであったアルギニンピークはＣ８１細胞におけるグルコースピークより非常に高くなり得る。これにより、培地からのアルギニン干渉がごくわずかであり、アルギニンレベルがＣ８１細胞において実際に上方制御されていることが確認できる。
【００６７】
特定の実施形態によれば、低い質量範囲（＜ｍ／ｚ５００）における相対質量スペクトルは、培地及びエレクトロスプレー関連バックグラウンドに対して補正されてもよい。補正後、４３種のイオンはＴリンパ球にのみ関連し、図６Ａ及び６Ｂに示されるようにそれらのイオンのうち３７種は２１種の代謝産物に対応した。非ＨＴＬＶ１形質転換細胞とＨＴＬＶ１形質転換細胞との間のそれらの相対的存在度の変化を示す同定されていないイオンは、ｍ／ｚ１５８．１５７２（存在比Ｃ８１／ＣＥＭ＝２．５）、２２８．０３６３（存在比Ｃ８１／ＣＥＭ＝２．６）、２６０．０２９８（存在比Ｃ８１／ＣＥＭ＝３．６）、３１１．９２１６（存在比Ｃ８１／ＣＥＭ＝１．５）、３３３．９６０４（存在比Ｃ８１／ＣＥＭ＝２．２）、及び３４６．０６１６（存在比Ｃ８１／ＣＥＭ＝１．２）にあった。図６Ａ及び６Ｂに示されるように、多くの代謝産物（例えばスペルミン、コリン、ホスホコリン、グリセロホスホコリン、及びグルタチオン）は、ＨＴＬＶ１形質転換細胞において下方制御され、多くの他の代謝産物（例えばピロリドン、クレアチン、アルギニン、ドーパミン及びアデノシン一リン酸）は、感染細胞において上方制御された。
【００６８】
特定の実施形態によれば、Ｔリンパ球の代表的な質量スペクトルはグリセロホスホコリン（ＰＣ）脂質を含み得る。図１３を参照すると、脂質存在度及び非ＨＴＬＶ１形質転換細胞とＨＴＬＶ１形質転換細胞との間のタイプにおいて有意な変化を観測した。全ての主な脂質ピークのタンデム質量スペクトルは、ＰＣ脂質を確認するためにｍ／ｚ１８４にて単一の生成イオンを生じた（ｍ／ｚ７６０．６イオンの典型的なスペクトルは図９Ｃに示される）。
【００６９】
図７Ａ〜Ｃに示されるように、脂質ピークを、タンデム質量分析及び精密質量情報に基づいて同定した。図７Ａ〜Ｃは、ジアシルグリセロホスホコリン（ＰＣ（Ｃｎ：ｄｂｎ）、ここでＣｎは炭素の総数を表し、ｄｂｎは２つの脂肪酸側鎖における二重結合の総数を表し、及びアルキルアシル／アルケニルアシルグリセロホスホコリン又はプラズマロゲン、（ＰＣ（Ｏ−Ｃｎ：ｄｂｎ））を表す。図７Ａ〜Ｃはまた、相対存在比の値を含む。非ＨＴＬＶ１形質転換細胞において検出された脂質の大部分はＨＴＬＶ１形質転換細胞において下方制御された。少しの脂質のみがＨＴＬＶ１形質転換細胞において保持され、ＰＣ（３０：０）、ＰＣ（０−３１：２）、ＰＣ（３２：３）、ＰＣ（３２：０）、及びＰＣ（０−３３：３）のレベルは、非ＨＴＬＶ１形質転換細胞に比べて高かった。脂質のインソースフラグメンテーション／分解からの衝突誘起解離（ＣＩＤ）生成物はイオンｍ／ｚ１８４及び１０４において現れた。質量スペクトルが同様の実験的条件下で標準脂質（ＰＣ（１６：０／１８：１））に対して記録される場合、断片イオンｍ／ｚ１０４及び１８４がわずかに観測された（＜０．５％）。これにより、検出されたコリンピークが代謝産物に対応し、ＣＩＤ人工物に対応しないことが確認された。
【００７０】
特定の実施形態によれば、非ＨＴＬＶ１形質転換Ｔリンパ球とＨＴＬＶ１形質転換Ｔリンパ球との間の代謝産物レベルの変化が、関連する代謝経路に関与する酵素又はタンパク質を定量することによってタンパク質レベルにおいて検証されてもよい。ＣＥＭ及びＣ８１細胞におけるｃＡＭＰ、アルギナーゼ、及びグルタチオン還元酵素のレベルは生化学アッセイを用いて測定した。図１４を参照すると、アルギナーゼ及びｃＡＭＰレベルは上方制御され、グルタチオン還元酵素レベルは、非ＨＴＬＶ１形質転換細胞（ＣＥＭ）と比べてＨＴＬＶ１形質転換細胞（Ｃ８１）において下方制御された。このアッセイは、対応する代謝産物におけるＬＡＥＳＩ−ＭＳによって検出される変化と相関する。
【００７１】
特定の実施形態によれば、試料は、他の細胞株、例えば非ＨＴＬＶ１形質転換Ｔリンパ球（Ｈ９）、それらのＴａｘ１−トランスフェクト対応物（Ｈ９−Ｔａｘ１）、及びＨＴＬＶ１形質転換細胞（ＨＵＴ１０２細胞）を含んでもよい。トランスフェクション時の代謝変化は図１６に記載される。図１５を参照すると、代謝産物存在比はＨＴＬＶ１感染Ｔ細胞（Ｃ８１、ＨＵＴ１０２）及びＨＴＬＶ３、Ｔａｘ１又はＴａｘ３形質転換細胞（それぞれ、２９３−ＨＴＬＶ３、Ｈ９−Ｔａｘ１、２９３−Ｔａｘ３）についての上方又は下方制御を示す。これらの細胞における代謝産物をＣＥＭ及びＣ８１細胞と比較した。グルタチオン及びアデノシン一リン酸などの代謝産物の上方制御及び下方制御のパターンはＣＥＭ／８１の場合と同様であった。これらの結果は、ＨＴＬＶ１感染細胞において観測された代謝変化がＴａｘ１発現に部分的に起因し得ることを示唆している。
【００７２】
特定の実施形態によれば、試料は、ＨＴＬＶ１形質転換に対して観測される代謝産物の変化の特異性を決定するために他の細胞株、例えば非感染２９３Ｔ腎上皮細胞、並びにＨＴＬＶ３及びＴａｘ３トランスフェクト２９３Ｔ細胞上で含んでもよい。ＨＴＬＶ１形質転換時の代謝変化及びＴａｘ３の存在は図１５に記載される。図１５を参照すると、代謝産物が２９３Ｔ、２９３Ｔ−ＨＴＬＶ３及び２９３Ｔ−Ｔａｘ３細胞において検出され、それらの存在比はＨＴＬＶ３トランスフェクション又はＴａｘ３の存在に起因する上方及び下方制御を示す。図１５及び１６に示されるように、２９３Ｔ細胞は、ＣＥＭ、Ｃ８１、Ｈ９及びＨＵＴ１０２細胞において検出されなかった種々のイオンを示したが、これらの細胞全てに共通した一部の代謝産物が存在した。ＨＴＬＶ３及びＴａｘ３トランスフェクト２９３Ｔ細胞について観測された変化は、ＨＴＬＶ１形質転換細胞において見出されたものと一致しなかった。図１８Ａ及び１８Ｂに示されるように、ＨＴＬＶ１形質転換細胞における顕著な変化を示した脂質ピークがＨＴＬＶ３／Ｔａｘ３感染２９３Ｔ細胞において変化しないことが見出された。
【００７３】
特定の実施形態によれば、グルタチオンの複数の豊富なイオン種が、高濃度を反映する非ＨＴＬＶ１形質転換Ｔリンパ球において検出され得るのに対して、ＨＴＬＶ１形質転換細胞において、それらの存在度が２〜５分の１に減少し得る。グルタチオン（ＧＳＨ）の還元形態は１２ｍＭ以下の濃度で哺乳動物細胞に最も多く存在しているチオールであり得る。ＧＳＨは、抗酸化物質（酸化的ストレスに対する防御）、異性化反応における補因子、システインの輸送及び貯蔵形態、並びに細胞内酸化還元状態の調節因子、細胞増殖及びアポトーシスなどのいくつかの重要な機能を果たし得る。生物学的に、酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）は、酵素であるグルタチオン還元酵素によってＧＳＨに変換され得る。ＧＳＨとＧＳＳＧの比は細胞の抗酸化容量の代表的なインジケータとして機能し得る。細胞のＧＳＨ濃度は、タンパク質栄養不良、酸化的ストレス、及び他の病的状態に反応して低下し得る。細胞内のＧＳＨレベルはＴリンパ球の機能を調節でき、ＧＳＨの欠損はＨＩＶ感染に関連し得る。
【００７４】
特定の実施形態によれば、ＨＴＬＶ１形質転換Ｔリンパ球におけるＧＳＨレベルは減少した。非ＨＴＬＶ１形質転換細胞及びＨＴＬＶ１形質転換細胞の両方におけるグルタチオン還元酵素のレベルは酵素アッセイを用いて測定し、ＧＳＨはＨＴＬＶ１形質転換細胞において低下し、ＧＳＨはＨＴＬＶ３形質転換２９３Ｔ細胞において低下した。
【００７５】
特定の実施形態によれば、試料は、ポリアミンと命名されているポリカチオン性化合物に属する、スペルミン、スペルミジン及びプトレシンを含んでもよい。これらのポリアミンは、ＤＮＡ合成及び遺伝子発現などの遺伝プロセスに関与することができ、細胞増殖、細胞分化、及びプログラム細胞死において重要な役割を果たす。図１６を参照すると、ポリアミンの生合成は細胞において厳重に調節され、尿素サイクルにおけるオルニチンはそれらの前駆体である。それらのポリアミンのレベルは、細胞がウイルスに感染しているか否かを示す、細胞の実際の状態を示すことができる。１つの実験において、スペルミンレベルは、ＨＵＴ１０２の場合を除いて全ての形質転換細胞において高く、プトレシンレベル及びスペルミジンレベル、スペルミンの前駆体は、ＨＴＬＶ１形質転換細胞において上方制御された。スペルミジンはまた、２９３Ｔ−ＨＴＬＶ３及び２９３Ｔ−Ｔａｘ３細胞株においても上方制御された。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、これにより、ウイルス及びＴａｘ形質転換は、細胞におけるポリアミンの厳重に調節された生合成に影響を与え、それ故、遺伝プロセスにおいて障害を引き起こすことが示され得る。個々のアミンの傾向はＨＴＬＶ１形質転換細胞の中で完全に一致していないが、ポリアミン生合成全体に対するウイルスの効果が反映される。１つの実験において、尿素サイクルにおけるポリアミンの前駆体である、オルニチンに変換されたアルギニンは、ＨＴＬＶ１形質転換細胞において上方制御され、特にＨＵＴ１０２において高かった。スペルミン、スペルミジン及びプトレシンは、ポリアミンの正電荷のアンモニア基と核酸の負電荷のリン酸塩との間の静電相互作用に起因して核酸と会合できる。
【００７６】
特定の実施形態によれば、ＨＴＬＶ１形質転換細胞におけるアルギニンレベルは増加した。酵素アッセイによって確認され得る、感染細胞におけるアルギナーゼの転写上方制御は、ウイルス感染時のアルギニンの向上したレベルと一致した。アルギニンの役割は、酸化的ストレスの間の内皮細胞の生存において役割を果たすことができる。アルギニンの欠乏は細胞機能において深刻な障害を引き起こす場合があり、アポトーシスを高める。アルギニン利用可能性は、癌におけるＴリンパ球機能の調節に寄与し得る。図１７を参照すると、アルギニンは、クレアチニンの生合成における前駆体であり、エネルギー供給における重要な分子であり得る。ＨＴＬＶ２感染患者の血液は、異常なクレアチンホスホキナーゼレベルを有し得る。クレアチン及びアルギニン代謝に関連する酵素は、悪性細胞において顕著に上方制御することを見出した。従って、ＨＴＬＶ１形質転換細胞におけるアルギニンレベルの上方制御の発見は他の生物系と一致する。
【００７７】
特定の実施形態によれば、Ｔリンパ球細胞及び腎上皮細胞の質量スペクトルにより、コリンを含有する代謝産物、例えばコリン、ホスホコリン、グリセロホスホコリン、及びいくつかのグリセロホスホコリン脂質は、ＨＵＴ１０２の場合を除いて、非形質転換細胞と比較して、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ３、Ｔａｘ１又はＴａｘ３による形質転換時に下方制御され得ることが示される。図１９を参照すると、コリンを含有する代謝産物は脂質代謝において役割を有し得る。コリンは種々の代謝産物の前駆体であり得、その種々の代謝産物経路、リン酸化、酸化、及びアセチル化に対するコリンの細胞内経路は細胞特異的であり得る。コリン及びコリン代謝産物は、いくつかの経路を介するコリンリン脂質の制御された分解により再生され得る。コリンを含有する代謝産物の増加は、悪性細胞増殖を含む、多くの障害と関連し得る。ＨＩＶ及びＨＣＭＶ感染細胞における脂質レベルの変化は、それぞれ、プロテオーム及びメタボロームプラットフォームを用いて検出できる。感染細胞における脂肪酸生合成もまた、抗ウイルス反応とみなされ得る。コリンを含有する代謝産物のレベルの増加は、多くの障害、例えば、ＨＣＭＶ感染線維芽細胞における脂肪酸合成の十分な上方制御と関連し得る。
【００７８】
生体内ＮＭＲ分光法は、コリンを含有する代謝産物を監視するために使用できるが、しかし、特定の代謝産物が変化するかを決定することは困難であり得る。特定の実施形態によれば、コリンを含有する代謝産物は、特定の代謝産物が変化するかを決定するためにＬＡＥＳＩ−ＭＳに直接供されてもよい。非形質転換細胞及び形質転換細胞の質量スペクトルは、前駆体及び脂質成分についての情報を同時に与えることができる。１つの実験において、ＨＴＬＶ１形質転換細胞におけるグリセロホスホコリン脂質含有量の減少により、脂肪酸を生成するために増加した脂質異化が確認された。ＨＴＬＶ１形質転換細胞において高いレベルのままである少しの脂質（ＰＣ（３０：０）、ＰＣ（３２：５）、ＰＣ（３２：３）、ＰＣ（３２：０）、及びＰＣ（３４：６）は別として、非ＨＴＬＶ１形質転換細胞において存在する大部分のグリセロホスホコリン脂質はＨＴＬＶ１形質転換細胞において下方制御された。
【００７９】
ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰを含む、リン酸化アデノシンヌクレオチドのレベルは生細胞におけるエネルギー状態を規定し得る。個々のアデニンヌクレオチドの定量は細胞のエネルギー状態を評価するために使用できる。身体における外因性ＡＴＰのレベルは種々の炎症及びショック状態において増加し得る。細胞外ＡＴＰは細胞間伝達にとって、及び免疫系において重要であり得る。１つの実験において、ＡＭＰは、ＬＡＥＳＩ−ＭＳに供された細胞から直接検出された。顕著に向上したＡＭＰ存在度がＨＴＬＶ１及びＴａｘ１形質転換細胞において観測された。図１９Ａを参照すると、ＡＭＰは、ＡＴＰ／ＡＤＰの脱リン酸化により、又はｃＡＭＰの加水分解により形成され得る。ＡＴＰの分解生成物は別として、ＡＭＰは、哺乳動物細胞において偏在的に発現されるＡＭＰ活性化キナーゼ（ＡＭＰＫ）系を活性化させ得る。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、それは、細胞エネルギーホメオスタシスを乱す種々の代謝ストレスに対する反応に関与し得る。
【００８０】
特定の実施形態によれば、試料はｃＡＭＰを含んでもよい。ｃＡＭＰは二次メッセンジャーであり、重要な生化学プロセスに関与し得るいくつかのタンパク質キナーゼを活性化する。Ｔリンパ球に存在することが知られているｃＡＭＰの量は６ｐｍｏｌ／１０７細胞である。１つの実験において、グルタチオンはｃＡＭＰの検出を妨げた。図１４を参照すると、ｃＡＭＰは免疫学的検定により測定した。図２０Ａを参照すると、ｃＡＭＰレベル（アデニリルシクラーゼ活性）は、非ＨＴＬＶ１形質転換細胞と比較してＨＴＬＶ１形質転換細胞において増加した。ｃＡＭＰレベルの変化が、ＨＩＶ及びＨＴＬＶ１感染Ｔリンパ球において示し得る。
【００８１】
特定の実施形態によれば、試料は、Ｔリンパ球において、ドーパミン、神経修飾物質、及びその代謝産物、メトキシチラミン並びにホモバニリン酸を含んでもよい。ドーパミンは、カテコールアミンの群に属し、神経免疫学的ネットワークに関与し得る。Ｔリンパ球は、極めて重要な機能を誘発し得る神経伝達物質受容体を介して神経伝達物質により活性化され得る。カテコールアミンはマウスリンパ球において合成され得る。高いレベルのカテコールアミンは活性化状態を示し得る。図２０Ｂに示されるように、ドーパミンは、チロシンから身体において生合成され得、代謝経路に関連し得る。１つの実験において、ドーパミン及びホモバニリン酸レベルは上方制御され、メトキシチラミンはＨＴＬＶ１形質転換細胞において下方制御された。
【００８２】
本明細書に引用される全ての文献は、関連部分において、参照として本明細書に組み込まれるが、組み込まれる資料は、本明細書に示されている既存の定義、記述事項、又は他の文献と矛盾しない程度にのみ組み込まれる。この文献における用語のあらゆる意味又は定義は、参照によって組み込まれる文献における同じ用語のあらゆる意味又は定義と矛盾する範囲について、この文献におけるその用語に割り当てられた意味又は定義が優先される。あらゆる文献の引用はこの文献に関する先行技術であると認めると解釈されるべきではない。
【００８３】
質量分析計並びにその製造及び使用方法の特定の実施形態を例示し、記載しているが、種々の他の変更及び修飾が本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずになされてもよいことは当業者に明らかであろう。当業者は、わずかに慣用の実験だけを用いて、代替、可変、付加、欠失、修飾、及び置換を含む、本明細書に記載される特定の装置及び方法に対する多数の等価物を理解するか、又は確認できるだろう。従って、添付の特許請求の範囲を含む本開示は、本発明の範囲内である全てのこのような変更及び修飾を包含することを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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