(57)【要約】  胎盤細胞、例えば、本明細書に記載の胎盤幹細胞、及びそのような胎盤細胞の集団を用いる、骨関連癌の細胞、例えば、多発性骨髄腫又は軟骨肉腫細胞の増殖及び成長の抑制方法が本明細書で提供される。骨関連癌の細胞を有する個体を治療する方法も本明細書で提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨関連癌の細胞の増殖を抑制する方法であって、胎盤幹細胞と接触していない複数の該骨関連癌の細胞と比べて、該胎盤幹細胞が該骨関連癌の細胞の増殖を抑制するのに十分な時間、該骨関連癌の細胞を複数の胎盤幹細胞と接触させることを含み、
ここで、該胎盤幹細胞は、組織培養プラスチックに接着し、フローサイトメトリーによって検出可能なCD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+であり、かつ栄養芽層でも、細胞栄養芽層でも、骨髄由来間葉系幹細胞でもない、前記方法。
【請求項２】
前記骨関連癌の細胞が多発性骨髄腫細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記骨関連癌の細胞が軟骨肉腫細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記骨関連癌の細胞が、骨癌細胞、神経芽腫細胞、骨肉腫細胞、ユーイング肉腫細胞、脊索腫細胞、骨の悪性線維性組織球腫の細胞、前立腺癌細胞、又は骨の線維肉腫の細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記骨関連癌の細胞が前立腺癌細胞ではない、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記胎盤細胞が、フローサイトメトリーによって検出可能なCD34-、CD45-、CD10+、CD90+、CD105+、及びCD200+である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記胎盤細胞が、フローサイトメトリーによって検出可能なCD34-、CD45-、CD10+、CD80-、CD86-、CD90+、CD105+、及びCD200+である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記接触させることが、インビトロで行なわれる、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記接触させることが、インビボで行なわれる、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記接触させることが、前記胎盤幹細胞を、前記骨関連癌の細胞を含むヒト個体に投与することを含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記接触させることが、前記胎盤幹細胞を、前記骨関連癌によって生じる骨病変又はその近くで該個体に投与することを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記接触させることが、少なくとも1×108個の前記胎盤幹細胞を前記個体に投与することを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
前記胎盤細胞が、前記骨関連癌の細胞の増殖を、該胎盤細胞の非存在下での同等数の骨関連癌の細胞の増殖と比べて少なくとも50％抑制する、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
骨関連癌を有するヒト個体を治療する方法であって、該個体に、胎盤幹細胞の治療有効量を、該胎盤幹細胞が該骨関連癌の1以上の症状を改善するか、又は該骨関連癌の進行を軽減するのに十分な時間、投与することを含み、
ここで、該胎盤幹細胞は、組織培養プラスチックに接着し、フローサイトメトリーによって検出可能なCD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+であり；栄養芽層でも、細胞栄養芽層でも、骨髄由来間葉系幹細胞でもなく、かつ骨形成細胞又は軟骨形成細胞に分化する能力を有する、前記方法。
【請求項１５】
前記骨関連癌が多発性骨髄腫である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記骨関連癌が軟骨肉腫である、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
前記骨関連癌が、骨癌、神経芽腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、前立腺癌、又は骨の線維肉腫である、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
前記骨関連癌の細胞が前立腺癌細胞ではない、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
前記胎盤幹細胞が、フローサイトメトリーによって検出可能なCD34-、CD45-、CD10+、CD90+、CD105+、及びCD200+である、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
前記胎盤幹細胞が、フローサイトメトリーによって検出可能なCD34-、CD45-、CD10+、CD80-、CD86-、CD90+、CD105+、及びCD200+である、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
前記胎盤幹細胞が、前記個体に静脈内投与される、請求項14記載の方法。
【請求項２２】
前記胎盤幹細胞が、前記骨関連癌によって生じる骨病変又はその近くで前記個体に投与される、請求項14記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも1×108個の胎盤細胞を前記個体に投与することを含む、請求項14記載の方法。
【請求項２４】
前記胎盤細胞が、該胎盤細胞の非存在下での同等数の前記骨関連癌細胞の増殖と比べて、該骨関連癌の細胞の増殖を少なくとも50％抑制する、請求項14記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その各々が全体として引用により本明細書中に組み込まれている、2010年1月26日に出願された米国仮特許出願第61／298,517号；2010年2月24日に出願された米国仮特許出願第61／307,821号；及び2010年6月8日に出願された米国仮特許出願第61／352,768号の恩典を主張するものである。
（1.分野）
組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞（本明細書では、PDACと呼ばれる）、及び／又は骨髄由来間葉系幹細胞（BM-MSC）を用いて、骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫を治療し、骨関連癌の細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞又は軟骨肉腫細胞の増殖を抑制し、かつ骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫、軟骨肉腫、及び他の骨関連癌、例えば、腫瘍の成長を抑制する方法が本明細書で提供される。
【背景技術】
【０００２】
（2.背景）
多発性骨髄腫（MM、骨髄腫、形質細胞骨髄腫、又はカーレル病としても知られる）は、抗体産生免疫系細胞である形質細胞の癌の一種である。多発性骨髄腫の症状としては、骨痛、感染症、腎不全、貧血、及び骨病変が挙げられる。この疾患は治療不能と考えられており、レナリドミド（REVLIMID（登録商標））などのごくわずかの治療しか利用可能でなく、また、有望でもない。したがって、多発性骨髄腫の新しい治療に対する必要性が存在する。これまで、骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫の成長を抑制するか、又は骨関連癌の細胞の増殖を抑制する非造血系の、組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞の能力を記載したものはいない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（3.概要）
一態様では、骨関連癌を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞（本明細書ではPDAC（胎盤由来接着細胞）とも呼ばれる）、そのような胎盤幹細胞の単離された集団、もしくは該胎盤幹細胞を含む細胞の単離された集団；及び／又は単離された骨髄由来間葉系幹細胞（BM-MSC）もしくはBM-MSCを含む骨髄の治療有効量を投与することを含む、方法が本明細書で提供される。
【０００４】
一実施態様では、骨関連癌を有する個体を治療する方法であって、該個体に胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量を投与することを含み、ここで、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量は、該骨関連癌の1以上の症状を改善する、例えば、検出可能に改善するか、又は該骨関連癌の進行を低下させる、例えば、検出可能に低下させる、方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、該骨関連癌は、多発性骨髄腫である。具体的な実施態様では、該骨関連癌は、軟骨肉腫である。他の実施態様では、該骨関連癌は、骨癌、神経芽腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、前立腺癌、又は骨の線維肉腫である。具体的な実施態様では、該骨関連癌は、前立腺癌ではない。他の実施態様では、該骨関連癌は、固形腫瘍を含む。別の実施態様では、該個体は、哺乳動物である。別の実施態様では、該個体は、ヒトである。別の実施態様では、該胎盤幹細胞を該投与することは、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞を投与することよりも大きい、例えば、検出可能に大きい、該1以上の症状の改善をもたらす。特定の実施態様では、該骨髄由来間葉系幹細胞は、CD34-、CD45-、CD73+、及び／又はCD105+のうちの1つ又は複数である。
【０００５】
特定の実施態様では、該個体は、骨病変、例えば、該骨関連癌によって生じる骨病変、例えば、X線写真で見ることができる骨病変を示す。他の実施態様では、該個体は、骨病変、例えば、該骨関連癌によって生じる骨病変、例えば、X線写真で見ることができる骨病変を示さない。他の実施態様では、該投与することは、骨病変、例えば、該骨関連癌によって生じる骨病変、例えば、X線写真で見ることができるもの、又は癌の治療によって生じる骨病変の出現又は発症の遅延をもたらす。
【０００６】
特定の実施態様では、該胎盤幹細胞、及び／又は該BM-MSCは、該個体に静脈内投与される。他の実施態様では、治療方法は、細胞の総数に関して、少なくとも約1×107個、5×107個、1×108個、5×108個、1×109個、5×109個、1×1010個、5×1010個、又は1×1011個の胎盤幹細胞、及び／又はBM-MSCを該個体に投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞、該BM-MSC、又は両方は、該投与することの前に、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30回以下の集団倍加の間、インビトロで増殖させたものである。別の実施態様では、該胎盤幹細胞、及び／又はBM-MSCは、骨病変、例えば、該骨関連癌によって生じる骨病変又はその近くで該個体に投与される。別の実施態様では、治療方法はさらに、1種以上の抗癌化合物を該個体に投与することを含む。本明細書における実施態様のいずれかの別の実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、凍結保存され、かつ該投与することの前に解凍されたものである。
【０００７】
一実施態様では、治療方法は、（1）該個体内の骨病変の数もしくは程度；（2）該個体内の破骨細胞前駆体の数；又は（3）該個体内の多発性骨髄腫細胞の数のうちの1つ又は複数を、該投与することの前に1回もしくは複数回、及び／又は該投与することの後に1回もしくは複数回、例えば、該投与の前に少なくとも1回、及び該投与の後に少なくとも1回、決定することを含むことができる。特定の実施態様では、該胎盤幹細胞、及び／又はBM-MSCの治療有効量は、例えば、骨密度測定法もしくはX線によって決定可能な、該個体内の該骨病変の数、もしくは重症度を低下させる、例えば、検出可能に低下させるか、又は例えば、骨密度測定法もしくはX線によって決定可能な、該個体内の該骨病変の数、もしくは重症度の増加速度を低下させる。他の実施態様では、該胎盤幹細胞、及び／又はBM-MSCの治療有効量は、例えば、該個体の末梢血又は骨髄中の破骨細胞前駆体を検出するために、例えば、破骨細胞前駆体に特異的な抗体を用いて決定可能な、該個体内の破骨細胞前駆体の数を低下させる、例えば、検出可能に低下させる。他の実施態様では、該胎盤幹細胞、及び／又はBM-MSCの治療有効量は、例えば、そのような細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞もしくは形質細胞に特異的な抗体、例えば、細胞マーカーCD28もしくはCD138に特異的な抗体を用いる、該個体由来の有核血液細胞の細胞計数（例えば、フローサイトメトリーによる）、もしくは抗体染色によって決定可能な、又は該個体由来の血液中のMタンパク質のレベルを評価することによって決定可能な、該個体内の骨関連癌細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞の数を低下させる。他の実施態様では、該胎盤幹細胞、及び／又はBM-MSCは、該胎盤幹細胞の投与前の該細胞の数と比べて、該骨関連癌、又は該破骨細胞前駆体の細胞の数を、少なくとも、例えば、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％低下させる。
【０００８】
別の実施態様では、個体は軟骨肉腫を有し；例えば、骨関連癌は軟骨肉腫である。特定の実施態様では、治療方法は、該投与することの前に1回もしくは複数回、及び／又は該投与することの後に1回もしくは複数回、個体内の軟骨肉腫細胞の数、又は個体内の骨病変（例えば、軟骨肉腫によって生じる塊）の数のうちの1つ又は複数を決定することを含む。
【０００９】
別の態様では、骨関連癌の細胞の増殖を抑制する方法であって、例えば、該骨関連癌細胞の数の低下、例えば、検出可能な低下、又は該骨関連癌細胞の数の増加の検出可能な低下によって決定可能なように、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCと接触していない複数の該骨関連癌の細胞と比べて、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCが該骨関連癌の細胞の増殖を抑制する、例えば、検出可能に抑制するのに十分な時間、該骨関連癌の細胞を複数の胎盤幹細胞、及び／又はBM-MSCと接触させることを含む、方法が本明細書で提供される。特定の実施態様では、該骨関連癌の細胞は、多発性骨髄腫細胞である。本方法の別の実施態様では、該骨関連癌の細胞は、軟骨肉腫細胞である。他の実施態様では、該骨関連癌の細胞は、骨癌細胞、神経芽腫細胞、骨肉腫細胞、ユーイング肉腫細胞、脊索腫細胞、骨の悪性線維性組織球腫の細胞、又は骨の線維肉腫の細胞である。別の具体的な実施態様では、該骨関連癌の細胞は、固形腫瘍の一部である。
【００１０】
本方法の特定の実施態様では、該接触させることは、インビトロで行なわれる。特定の他の実施態様では、該接触させることは、インビボで行なわれる。特定の実施態様では、該接触させることは、該骨関連癌の細胞を含む個体、例えば、該細胞によって引き起こされる疾患を有する個体で行なわれる。他の実施態様では、該接触させることは、多発性骨髄腫細胞を含む個体、例えば、多発性骨髄腫を有する個体で行なわれる。特定の実施態様では、該個体は、哺乳動物、例えば、ヒトである。別の具体的な実施態様では、該接触させることは、該胎盤幹細胞を該個体に静脈内投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該接触させることは、該胎盤幹細胞、及び／又はBM-MSCを、該個体の骨病変又はその近くで該個体に投与することを含む。
【００１１】
別の実施態様では、骨関連癌の細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法はさらに、該骨関連癌の細胞を、1種以上の抗癌化合物、例えば、1種以上の抗癌化合物の治療有効量と接触させることを含む。別の実施態様では、本方法は、少なくとも約1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、又は1×1010個の胎盤幹細胞、及び／又はBM-MSCを該個体に投与することを含む。特定の実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC、及び／又はBM-MSCは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30回以下の集団倍加の間、インビトロで増殖させたものである。他の実施態様では、該胎盤幹細胞、及び／又はBM-MSCは、例えば、該骨関連癌細胞の数の検出可能な低下、もしくは該骨関連癌細胞の数の増加の検出可能な低下によって決定可能なように、又は該癌細胞を有する個体の骨病変の数及び／もしくは重症度の検出可能な減少によって決定可能なように、該骨関連癌の細胞の増殖を、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの非存在下での同等数の該骨関連癌細胞の増殖と比べて、少なくとも、例えば、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％抑制する。
【００１２】
他の実施態様では、該胎盤幹細胞もしくはBM-MSC、又は両方は、凍結保存され、かつ該接触させることの前に解凍されたものである。別の実施態様では、本方法は、該接触させることの前に、該胎盤幹細胞が該骨関連癌の細胞の試料の増殖を抑制する、例えば、検出可能に抑制することを決定することを含む。
【００１３】
別の実施態様では、破骨細胞前駆体の破骨細胞への成熟を低下させる方法であって、該破骨細胞前駆体を複数の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCと接触させることを含み、ここで、該複数の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、例えば、該接触させることの結果としての破骨細胞の数の検出可能な低下、又は破骨細胞の数の増加の欠如によって決定可能な、該破骨細胞前駆体からの破骨細胞成熟を低下させる、例えば、検出可能に低下させるのに十分な数の細胞である、方法が本明細書で提供される。別の実施態様では、破骨細胞前駆体のアポトーシスを増大させる方法であって、該破骨細胞前駆体を複数の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCと接触させることを含み、ここで、該複数の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、破骨細胞前駆体のアポトーシスを増大させる、例えば、検出可能に増大させるのに十分な数の細胞である、方法が本明細書で提供される。特定の実施態様では、該破骨細胞前駆体のアポトーシスの増大は、該個体由来の破骨細胞前駆体のアネキシンV及び／又はヨウ化プロピジウム染色の検出可能な増加によって検出される。特定の実施態様では、破骨細胞前駆体は、個体、例えば、骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫、軟骨肉腫、又は本明細書に記載の他の骨関連癌の1つを有する個体内にある。特定の他の実施態様では、本方法は、該破骨細胞前駆体をレナリドミドと接触させること、例えば、該破骨細胞前駆体を有する個体にレナリドミドを投与することを含む。
【００１４】
上記の方法の特定の実施態様では、該接触させることは、インビトロで行なわれる。他の実施態様では、該接触させることは、インビボで行なわれる。別の実施態様では、該接触させることは、ヒトで行なわれる。別の実施態様では、該接触させることは、骨関連癌を有する個体、例えば、骨関連癌の細胞、又はそのような細胞によって引き起こされる疾患を有する個体で行なわれる。別の実施態様では、該個体は、多発性骨髄腫又は多発性骨髄腫細胞を有する個体である。別の実施態様では、該個体は、多発性骨髄腫の少なくとも1つの症状を有する。別の実施態様では、該個体は、多発性骨髄腫によって生じる少なくとも1つの骨病変を有する。
【００１５】
上記の方法のいずれかの特定の実施態様では、該胎盤幹細胞は、以下のうちの1つ又は複数である：（1）組織培養プラスチックに接着する；（2）フローサイトメトリーによって検出可能な、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+である；並びに／或いは（3）例えば、インビトロもしくはインビボのいずれか、又は両方で、骨形成細胞又は軟骨形成細胞に分化する能力を有する。別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、組織培養プラスチックに接着し；フローサイトメトリーによって検出可能な、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+であり；かつ例えば、インビトロもしくはインビボのいずれか、又は両方で、骨形成細胞又は軟骨形成細胞の1以上の特徴、例えば、骨細胞又は軟骨細胞の特徴を有する細胞に分化する能力を有する。他の実施態様では、該胎盤幹細胞はさらに、神経細胞又は神経形成細胞の1以上の特徴、例えば、ニューロンの特徴；グリア細胞の1以上の特徴、例えば、グリア又は星状細胞の特徴；脂肪細胞系細胞（adipocytic cell）の1以上の特徴、例えば、脂肪細胞（adipocyte）の特徴；膵臓細胞の1以上の特徴；及び／又は心臓細胞の1以上の特徴を有する細胞に分化する能力を有する。本明細書における胎盤幹細胞の実施態様の各々の具体的な実施態様では、胎盤幹細胞は、単離された胎盤幹細胞である。
【００１６】
別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+、並びにCD44+、CD45-、CD90+、CD166+、KDR-、又はCD133-のうちの1つ又は複数である。より具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞は、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+、CD44+、CD45-、CD90+、CD166+、KDR-、及びCD133-である。別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+、並びにHLA ABC+、HLA DR、DQ、DP-、CD80-、CD86-、CD98-、又はPD-L1+のうちの1つ又は複数である。より具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞は、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+、HLA ABC+、HLA DR、DQ、DP-、CD80-、CD86-、CD98-、及びPD-L1+である。別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、フローサイトメトリー及び／又はRT-PCRによって検出可能な、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+、並びにCD38-、CD45-、CD80-、CD86-、CD133-、HLA-DR、DP、DQ-、SSEA3-、SSEA4-、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、HLA-A、B、C+、PDL1+、ABC-p+、及び／又はOCT-4+のうちの1つ又は複数である。別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能な、CD34-、CD45-、CD10+、CD90+、CD105+、及びCD200+である。別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能な、CD34-、CD45-、CD10+、CD80-、CD86-、CD90+、CD105+、及びCD200+である。別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能な、CD34-、CD45-、CD10+、CD80-、CD86-、CD90+、CD105+、及びCD200+、並びにさらにCD29+、CD38-、CD44+、CD54+、SH3+、又はSH4+のうちの1つ又は複数である。別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能な、CD34-、CD38-、CD45-、CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD73+、CD80-、CD86-、CD90+、CD105+、及びCD200+である。
【００１７】
別の実施態様では、該CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+胎盤幹細胞はさらに、CD3-、CD9-、CD117-、CD133-、CD146+、CD166+、KDR-（VEGFR2-）、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、もしくはプログラム死-1リガンド（PDL1）+のうちの1つもしくは複数、又はそれらの任意の組合せである。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能な、CD3-、CD9-、CD34-、CD38-、CD45-、CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD73+、CD80-、CD86-、CD90+、CD105+、CD117-、CD133-、CD146+、CD166+、CD200+、KDR-（VEGFR2-）、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、又はプログラム死-1リガンド（PDL1）+である。
【００１８】
別の実施態様では、本明細書に記載の胎盤幹細胞はいずれもさらに、フローサイトメトリーによって検出可能なABC-p+、又は例えば、RT-PCRによって決定可能なOCT-4+（POU5F1+）であり、ここで、ABC-pは、胎盤特異的ABC輸送体タンパク質（乳癌耐性タンパク質（BCRP）及びミトキサントロン耐性タンパク質（MXR）としても知られる）である。別の実施態様では、本明細書に記載の胎盤幹細胞はいずれもさらに、例えば、フローサイトメトリーによって決定可能なSSEA3-又はSSEA4-であり、ここで、SSEA3はステージ特異的胚抗原3であり、かつSSEA4はステージ特異的胚抗原4である。別の実施態様では、本明細書に記載の胎盤幹細胞はいずれもさらに、SSEA3-及びSSEA4-である。
【００１９】
本明細書に記載の方法の別の実施態様では、本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞の胎盤幹細胞集団はいずれもさらに、MHC-I+（例えば、HLA-A、B、C+）、MHC-II-（例えば、HLA-DP、DQ、DR-）、又はHLA-G-のうちの1つ又は複数である。別の実施態様では、本明細書に記載の胎盤幹細胞はいずれもさらに、MHC-I+（例えば、HLA-A、B、C+）、MHC-II-（例えば、HLA-DP、DQ、DR-）、及びHLA-G-の各々である。
【００２０】
別の実施態様では、CD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞はさらに、CD3-、CD9-、CD29+、CD38-、CD44+、CD54+、CD80-、CD86-、CD146+、CD166+、SH3+、又はSH4+のうちの1つ又は複数である。別の実施態様では、CD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞はさらに、CD44+である。別の実施態様では、CD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞はさらに、CD3-、CD9-、CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH3+（CD73+）、SH4+（CD73+）、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+（CD105+）、CD106／VCAM+、CD117-、CD144／VE-カドヘリンlow、CD184／CXCR4-、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-（VEGFR2-）、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、HLA-G-、又はプログラム死-1リガンド（PDL1）+のうちの1つもしくは複数、又はそれらの任意の組合せである。別の実施態様では、CD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞はさらに、CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54／ICAM+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH3+（CD73+）、SH4+（CD73+）、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+（CD105+）、CD106／VCAM+、CD117-、CD144／VE-カドヘリンdim、CD146+、CD166+、CD184／CXCR4-、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-（VEGFR2-）、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、HLA-G-、及びプログラム死-1リガンド（PDL1）+である。
【００２１】
本明細書に開示されている方法の他の実施態様では、単離された胎盤幹細胞は、CD200+及びHLA-G-；CD73+、CD105+、及びCD200+；CD200+及びOCT-4+；CD73+、CD105+、及びHLA-G-；CD73+及びCD105+；もしくはOCT-4+；又はそれらの任意の組合せである。
【００２２】
本明細書に開示されている方法の特定の実施態様では、胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT-4+、MHC-I+、又はABC-p+のうちの1つもしくは複数であり、ここで、ABC-pは、胎盤特異的ABC輸送体タンパク質（乳癌耐性タンパク質（BCRP）及びミトキサントロン耐性タンパク質（MXR）としても知られる）である。別の実施態様では、胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、及びOCT-4+である。別の実施態様では、胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD45-、CD54+、SH2+、SH3+、及びSH4+である。別の実施態様では、胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD45-、CD54+、SH2+、SH3+、SH4+、及びOCT-4+である。別の実施態様では、胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、MHC-1+、SH2+、SH3+、SH4+である。別の実施態様では、胎盤幹細胞は、OCT-4+及びABC-p+である。別の実施態様では、胎盤幹細胞は、SH2+、SH3+、SH4+、及びOCT-4+である。別の実施態様では、胎盤幹細胞は、OCT-4+、CD34-、SSEA3-、及びSSEA4-である。具体的な実施態様では、該OCT-4+、CD34-、SSEA3-、及びSSEA4-胎盤幹細胞はさらに、CD10+、CD29+、CD34-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、及びSH4+である。別の実施態様では、胎盤幹細胞は、OCT-4+及びCD34-、かつSH3+又はSH4+のいずれかである。別の実施態様では、胎盤幹細胞は、CD34-かつCD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、又はOCT-4+のいずれかである。特定の実施態様では、胎盤幹細胞は、CD10+、CD34-、CD105+、及びCD200+である。
【００２３】
別の実施態様では、胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54／ICAM-、CD62-E-、CD62-L-、CD62-P-、CD80-、CD86-、CD103-、CD104-、CD105+、CD106／VCAM+、CD144／VE-カドヘリンdim、CD184／CXCR4-、β2-ミクログロブリンdim、MHC-Idim、MHC-II-、HLA-Gdim、及び／又はPDL1dimのうちの1つもしくは複数である。特定の実施態様では、そのような胎盤幹細胞又は単離された胎盤幹細胞の集団は、少なくともCD29+及びCD54-である。別の実施態様では、そのような胎盤幹細胞は、少なくともCD44+及びCD106+である。別の実施態様では、そのような胎盤幹細胞は、少なくともCD29+である。
【００２４】
上記の特徴のいずれかの特定の実施態様では、細胞マーカー（例えば、分化抗原群（cluster of differentiation）又は免疫学的マーカー）の発現は、フローサイトメトリーによって決定される。特定の他の実施態様では、細胞マーカーの発現は、RT-PCRによって決定される。
【００２５】
別の実施態様では、胎盤幹細胞、例えば、該CD10+、CD34-、CD105+、CD200+細胞、例えば、凝集体中の細胞は、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも高いレベル、例えば、検出可能に高いレベルで1種以上の遺伝子を発現し、ここで、該1種以上の遺伝子は、ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、及びZC3H12Aのうちの1つもしくは複数、又は全てであり、かつ該骨髄由来間葉系幹細胞は、該単離された胎盤幹細胞が経た継代数と同等の培養継代数を経たものである。特定の実施態様では、該1種以上の遺伝子の該発現は、例えば、RT-PCR、又は例えば、U133-Aマイクロアレイ（Affymetrix）を用いるマイクロアレイ解析によって決定される。別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、60％DMEM-LG（例えば、Gibco製）及び40％MCDB-201（例えば、Sigma製）；2％胎仔ウシ血清（例えば、Hyclone Labs.製）；1×インスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）；1×リノール酸-ウシ血清アルブミン（LA-BSA）；10-9Mデキサメタゾン（例えば、Sigma製）；10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート（例えば、Sigma製）；上皮成長因子10ng／mL（例えば、R&D Systems製）；並びに血小板由来成長因子（PDGF-BB）10ng／mL（例えば、R&D Systems製）を含む培地中で、例えば、約3〜約35回の範囲の集団倍加の間、培養したときに、該1種以上の遺伝子を発現する、例えば、示差発現する。別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、60％DMEM-LG（例えば、Gibco製）及び40％MCDB-201（例えば、Sigma製）；2％胎仔ウシ血清（例えば、Hyclone Labs.製）；1×インスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）；1×リノール酸-ウシ血清アルブミン（LA-BSA）；10-9Mデキサメタゾン（例えば、Sigma製）；10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート（Sigma）；上皮成長因子10ng／mL（例えば、R&D Systems製）；並びに血小板由来成長因子（PDGF-BB）10ng／mL（例えば、R&D Systems製）を含む培地中で、約3〜約35回の集団倍加の間、培養したときに、該1種以上の遺伝子を発現する、例えば、示差発現する。
【００２６】
特定の実施態様では、胎盤幹細胞は、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞（BM-MSC）よりも高いレベル、例えば、検出可能に高いレベルで、CD200及びARTS1（1型腫瘍壊死因子のアミノペプチダーゼ調節因子）；ARTS-1及びLRAP（白血球由来アルギニンアミノペプチダーゼ）；IL6（インターロイキン-6）及びTGFB2（形質転換成長因子、β2）；IL6及びKRT18（ケラチン18）；IER3（即初期応答3）、MEST（中胚葉特異的転写産物ホモログ）及びTGFB2；CD200及びIER3；CD200及びIL6；CD200及びKRT18；CD200及びLRAP；CD200及びMEST；CD200及びNFE2L3（核因子（赤血球由来2）-様3）；又はCD200及びTGFB2を発現し、ここで、該骨髄由来間葉系幹細胞は、該胎盤幹細胞が経た継代数と同等の培養継代数を経たものである。他の実施態様では、胎盤幹細胞は、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞BM-MSCよりも高いレベル、例えば、検出可能に高いレベルで、ARTS-1、CD200、IL6、及びLRAP；ARTS-1、IL6、TGFB2、IER3、KRT18、及びMEST；CD200、IER3、IL6、RT18、LRAP、MEST、NFE2L3、及びTGFB2；ARTS-1、CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3、及びTGFB2；又はIER3、MEST、及びTGFB2を発現し、ここで、該骨髄由来間葉系幹細胞は、該胎盤幹細胞が経た継代数と同等の培養継代数を経たものである。
【００２７】
様々な実施態様では、本明細書に開示されている方法において有用な該胎盤幹細胞は、その細胞の少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％が該胎盤幹細胞である細胞の集団内に含まれる。特定の他の実施態様では、該細胞の集団内の胎盤幹細胞は、母親の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず；例えば、該集団内の胎盤幹細胞の少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、胎児の遺伝子型を有する、すなわち、胎児起源のものである。特定の他の実施態様では、該胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、母親の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず；例えば、該集団内の細胞の少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、胎児の遺伝子型を有する、すなわち、胎児起源のものである。特定の他の実施態様では、該胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、母親の遺伝子型を有する細胞を含み；例えば、該集団内の細胞の少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、母親の遺伝子型を有する、すなわち、母親起源のものである。
【００２８】
本明細書における胎盤幹細胞の実施態様のいずれかの実施態様では、胎盤幹細胞は、該単離された胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団内での1以上の胚様体様体の形成を、該集団が、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養されたときに、例えば、増殖条件下で培養されたときに促進する。
【００２９】
本明細書に開示されている胎盤幹細胞又はBM-MSCのいずれかの特定の実施態様では、細胞は、哺乳動物、例えば、ヒトのものである。
【００３０】
特定の実施態様では、本明細書に記載の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCはいずれも、レシピエント、例えば、骨関連癌を有する個体、例えば、多発性骨髄腫を有するか、又は骨関連癌の症状、例えば、多発性骨髄腫の症状を有する個体にとって自己のものである。特定の他の実施態様では、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、レシピエント、例えば、骨関連癌を有する個体、例えば、多発性骨髄腫を有するか、又は骨関連癌の症状、例えば、多発性骨髄腫の症状を有する個体にとって同種異系のものである。
【００３１】
本明細書に開示されている骨関連癌細胞増殖の治療方法又は抑制方法の特定の実施態様では、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、該投与することの前に凍結保存される。別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、細胞バンク、例えば、胎盤幹細胞バンクから得られる。別の実施態様では、該BM-MSCは、骨髄由来間葉系幹細胞のバンクから得られる。
【００３２】
本明細書における胎盤幹細胞の実施態様のいずれにおいても、胎盤幹細胞は、通常、成長培地、すなわち、増殖を促進するように調合された培地中で培養する間、例えば、成長培地中での増殖の間、分化しない。別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、増殖するためにフィーダー層を必要とせず、例えば、成長培地中で培養されるとき、増殖するためにフィーダー層を必要としない。別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、単にフィーダー細胞層の非存在下での培養の結果として、培養で分化しない。
【００３３】
本明細書における単離されたBM-MSCの実施態様のいずれにおいても、細胞は、通常、成長培地、すなわち、増殖を促進するように調合された培地中で培養する間、例えば、成長培地中での増殖の間、分化しない。別の実施態様では、該単離されたBM-MSCは、増殖するためにフィーダー層を必要とせず、例えば、成長培地中で培養されるとき、増殖するためにフィーダー層を必要としない。別の実施態様では、該単離されたBM-MSCは、単にフィーダー細胞層の非存在下での培養の結果として、培養で分化しない。
【００３４】
特定の実施態様では、該胎盤幹細胞は、血液が抜かれ、かつ残留血液を取り除くように灌流されているか；血液は抜かれているが、残留血液を取り除くように灌流されていないか；又は血液が抜かれておらず、残留血液を取り除くように灌流されてもいない分娩後の胎盤の灌流によって得られる。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞は、胎盤組織の物理的及び／又は酵素的破壊によって得られる。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞は、胎盤の一部を培養し、該胎盤幹細胞を該胎盤の一部から増殖させることによって得られる。
【００３５】
本明細書で提供される方法において有用な胎盤幹細胞に特徴的な細胞表面マーカー、分子マーカー、及び遺伝子マーカーは、以下の第5.2節で詳細に記載されている。
【００３６】
本方法の別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量は、骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫の1以上の症状の消失、検出可能な改善、重症度の軽減、又は進行の緩徐化をもたらす細胞の数である。具体的な実施態様では、該骨関連癌の症状、例えば、該多発性骨髄腫の症状は、骨病変である。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量は、例えば、密度測定法で測定される、該細胞を受容する個体の少なくとも1つの骨の骨ミネラル密度（BMD）、又は例えば、密度測定法で測定される骨ミネラル量（BMC）を増大させる、例えば、検出可能に増大させる。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量は、例えば、X線、MRI、又はCATスキャンなどで見ることができる、該骨関連癌によって生じる骨病変、例えば、少なくとも1つの骨病変を低下させる、例えば、検出可能に低下させる。
【００３７】
別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫を有する個体に対して、該骨関連癌によって生じる骨病変又はその近くで、すなわち、病変内に投与される。上記の方法の別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、ボーラス注射で投与される。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、静脈内注入で投与される。具体的な実施態様では、該静脈内注入は、約1〜約8時間かかる静脈内注入である。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、頭蓋内投与される。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、腹腔内投与される。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、動脈内投与される。治療方法の別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、筋肉内、皮内、皮下、又は眼内に投与される。
【００３８】
上記の方法の別の実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、例えば、骨関連癌によって生じる骨病変又はその近くでの、該細胞を含む物質の組成物の該個体への外科的移植によって投与される。具体的な実施態様では、該物質の組成物は、マトリックス又はスキャフォールドである。別の具体的な実施態様では、該マトリックス又はスキャフォールドは、ハイドロゲルである。別の具体的な実施態様では、該マトリックス又はスキャフォールドは、脱細胞化組織である。別の具体的な実施態様では、該マトリックス又はスキャフォールドは、合成された生体分解性組成物である。別の具体的な実施態様では、該マトリックス又はスキャフォールドは、発泡体である。別の具体的な実施態様では、該マトリックス又はスキャフォールドは、生理的に許容し得るセラミック材料、例えば、モノリン酸カルシウム、ジリン酸カルシウム、トリリン酸カルシウム、α-トリリン酸カルシウム、β-トリリン酸カルシウム、及びテトラリン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムマグネシウム、生体活性ガラス（例えば、BIOGLASS（登録商標））、又はそれらのいずれかの組合せである。別の具体的な実施態様では、該マトリックス又はスキャフォールドは、多孔性の生体適合性セラミック材料（例えば、SURGIBONE（登録商標）、ENDOBON（登録商標）、CEROS（登録商標）など）、又は石灰化コラーゲンの骨移植用製品（例えば、HEALOS（商標）、VITOSS（登録商標）、RHAKOSS（商標）、及びCORTOSS（登録商標）など）である。
【００３９】
上記の方法の別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、該個体に1回投与される。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、2回以上の個別投与で該個体に投与される。別の具体的な実施態様では、該投与することは、例えば、該個体のキログラム当たり約1×104〜1×105個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該投与することは、該個体のキログラム当たり約1×105〜1×106個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該投与することは、該個体のキログラム当たり約1×106〜1×107個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該投与することは、該個体のキログラム当たり約1×107〜1×108個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを投与することを含む。他の具体的な実施態様では、該投与することは、該個体のキログラム当たり約1×106〜約2×106個の胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSC；該個体のキログラム当たり約2×106〜約3×106個の胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSC；該個体のキログラム当たり約3×106〜約4×106個の胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSC；該個体のキログラム当たり約4×106〜約5×106個の胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSC；該個体のキログラム当たり約5×106〜約6×106個の胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSC；該個体のキログラム当たり約6×106〜約7×106個の胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSC；該個体のキログラム当たり約7×106〜約8×106個の胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSC；該個体のキログラム当たり約8×106〜約9×106個の胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSC；又は該個体のキログラム当たり約9×106〜約1×107個の胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSCを投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該投与することは、該個体のキログラム当たり約1×107〜約2×107個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを該個体を投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該投与することは、該個体のキログラム当たり約1.3×107〜約1.5×107個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを該個体を投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該投与することは、該個体のキログラム当たり最大約3×107個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを該個体を投与することを含む。具体的な実施態様では、該投与することは、約5×106〜約2×107個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを該個体を投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該投与することは、約20ミリリットルの溶液中の約150×106個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを該個体を投与することを含む。
【００４０】
上記の方法の特定の実施態様では、該BM-MSCは、該胎盤幹細胞の場合よりも、通常少なくとも50％多い細胞の量、数で用いられる。
【００４１】
具体的な実施態様では、該投与することは、約5×106〜約2×107個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを該個体に投与することを含み、ここで、該細胞は、10％デキストラン、例えば、デキストラン-40、5％ヒト血清アルブミン、及び任意で免疫抑制剤を含む溶液中に含まれる。
【００４２】
別の具体的な実施態様では、該投与することは、約5×107〜3×109個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを静脈内投与することを含む。具体的な実施態様では、該投与することは、約9×108個の胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSC、又は約1.8×109個の胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSCを静脈内投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該投与することは、約5×107〜1×108個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを病変内投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該投与することは、約9×107個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを病変内投与することを含む。
【００４３】
治療方法の別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫の診断、又は骨関連癌の1以上の症状の発症から21〜30日、例えば、21日以内に；7日以内に；48時間以内に；又は24時間以内に、該個体に投与される。
【００４４】
特定の実施態様では、本明細書で提供される方法で用いられる胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、骨関連癌の細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞の成長又は増殖を抑制する1種以上のタンパク質を産生するように遺伝子操作することができる。例えば、特定の実施態様では、該1種以上のタンパク質は、オステオプロテゲリン、1種以上の骨形成タンパク質（BMP）；1種以上のコネキシン、例えば、コネキシン26（Cx26）及び／又はコネキシン43（Cx43）；オステオコンチン；又はアクチビンAを含むことができる。他の実施態様では、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、該腫瘍細胞を、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCと接触させたとき、外因性IFN-β又はIL-2を発現しないそのような細胞と比べて、例えば、より大きい、例えば、検出可能により大きい腫瘍細胞増殖の抑制をもたらす量で、外因性IFN-β又はIL-2を発現するように人為操作されている。骨関連癌細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞の成長もしくは増殖を抑制する際に用いるための、又は骨関連癌細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞を有する個体を治療するための、そのような遺伝子操作された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを含む医薬組成物も本明細書で提供される。
【００４５】
（3.1  定義）
本明細書で使用されるように、記述された数値に言及するときの「約」という用語は、該記述された数値の±10％以内の値を示す。
【００４６】
本明細書で使用されるように、骨関連癌の文脈における「骨病変」は、骨関連癌によって生じるか、又は骨関連癌の症状である、骨の成長又は構造の異常を意味する。非限定的な例では、多発性骨髄腫は、通常、骨の脱石灰化によって生じる骨の空洞部分である溶解性骨病変を生じさせる。別の非限定的な例では、軟骨肉腫は、通常、石灰化し得る軟骨性腫瘍（growth）を一般に含む1以上の骨の腫瘍（growth）を特徴とする病変を生じさせる。
【００４７】
本明細書で使用されるように、BM-MSCとも呼ばれる「骨髄由来間葉系幹細胞」は、骨髄から得られるか、又は骨髄から得られる間葉系幹細胞から培養される間葉系幹細胞、例えば、その開示が、引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第5,486,359号に開示されている細胞を指す。
【００４８】
本明細書で使用されるように、「骨関連癌」という用語は、疾患の任意の段階で、該癌を有する個体の1以上の骨を侵すか、又はそれに転移する癌を指す。例えば、多発性骨髄腫は、該癌が骨を侵し；多発性骨髄腫の一態様が、少なくとも一部は、多発性骨髄腫細胞によって分泌されるサイトカインによって生じる破骨細胞活性の上方調節による骨病変の発症であるので、骨関連癌である。
【００４９】
本明細書で使用されるように、胎盤幹細胞を骨関連癌の細胞と接触させる文脈における「接触させること」は、該細胞を、それらが（例えば、マルチウェルプレートなどの中での共培養下で）互いに実際に物理的に接触するような近さに置くこと、及び該細胞を、同じ空間内に、実際の物理的接触はないが、例えば、TRANSWELL（登録商標）培養系で、同じ空間内に置くこと、又は個体、例えば、ヒトへの投与を包含するが、それを要求するものではない。本明細書で使用される「接触させること」は、胎盤幹細胞と骨関連癌細胞を、インビトロで、例えば、単一容器（例えば、培養ディッシュ、フラスコ、バイアルなど）の中で一緒にすることを包含する。「接触させること」は、胎盤幹細胞と腫瘍細胞を一緒にするか、又はインビボで、例えば、同じ個体（例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ヒトなど）の中に置くことも包含する。例えば、胎盤幹細胞は、該胎盤幹細胞を骨関連癌を有する個体に静脈内投与することによるか、又は腫瘍の部位、例えば、骨関連癌によって生じる骨病変への直接注射によるか、又は同様の方法によって、骨関連癌細胞と接触させることができる。胎盤幹細胞は、該胎盤幹細胞及び骨関連癌細胞を、例えば、実験動物に静脈内投与することによって、骨関連癌細胞と接触させることができる。
【００５０】
本明細書で使用されるように、「SH2」という用語は、細胞マーカーCD105上のエピトープに結合する抗体を指す。したがって、SH2+と表される細胞は、CD105+である。
【００５１】
本明細書で使用されるように、「SH3」及び「SH4」という用語は、細胞マーカーCD73上に存在するエピトープに結合する抗体を指す。したがって、SH3+及び／又はSH4+と表される細胞は、CD73+である。
【００５２】
胎盤は、その中で発生する胎児の遺伝子型を有するが、妊娠中、母親の組織とも密接に物理的に接触している。そのため、本明細書で使用されるように、「胎児の遺伝子型」という用語は、胎児を身ごもった母親の遺伝子型に対立するものとして、胎児の遺伝子型、例えば、本明細書に記載されている、特定の単離された胎盤幹細胞が得られる胎盤と関連している胎児の遺伝子型を意味する。本明細書で使用されるように、「母親の遺伝子型」という用語は、胎児、例えば、本明細書に記載されている、特定の単離された胎盤幹細胞が得られる胎盤と関連している胎児を身ごもった母親の遺伝子型を意味する。
【００５３】
本明細書で使用されるように、幹細胞、例えば、胎盤幹細胞は、例えば、該幹細胞の回収及び／又は培養時に、該幹細胞が天然に関連している他の細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は少なくとも99％が、該幹細胞から取り除かれる場合、「単離された」ものとなる。
【００５４】
本明細書で使用されるように、細胞に言及するときの「多能性」は、該細胞が、いくつかの、しかし、全てではないタイプの体の細胞、又はいくつかの、しかし、全てではないタイプの体の細胞の特徴を有する細胞、又は3胚葉のうちの1つもしくは複数の細胞に分化する能力を有することを意味する。特定の実施態様では、神経形成細胞、軟骨形成細胞、及び／又は骨形成細胞の特徴を有する細胞に分化する能力を有する、例えば、以下の第5.2節に記載されているような、単離された胎盤幹細胞（PDAC）は、多能性細胞である。
【００５５】
本明細書で使用されるように、「単離された細胞の集団」という用語は、組織、例えば、該細胞の集団が由来するか又は該細胞の集団が単離される胎盤の他の細胞から実質的に分離されている細胞の集団を意味する。特定の実施態様では、該細胞の集団は、組織、例えば、該細胞の集団が由来するか又は該細胞の集団が単離される胎盤の他の細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％から分離されている。
【００５６】
本明細書で使用されるように、「胎盤幹細胞」という用語は、該細胞が、初代細胞であるか、初代細胞培養物の一部であるか、又は初代培養後に継代されたものであるかを問わず、初代単離株又は培養細胞のいずれかとしての、例えば、以下に記載されているような、哺乳動物の胎盤に由来する幹細胞又は前駆細胞を指す。細胞、例えば、「胎盤幹細胞」は、該細胞が、1種類以上の幹細胞と関連するマーカー又は遺伝子発現プロファイル；培養下で少なくとも10〜40回複製する能力；及び3胚葉のうちの1つ又は複数の分化した細胞の特徴を示す細胞に分化する能力のうちの1つ、2つ、又は3つ全てを示す場合、「幹細胞」とみなされる。本明細書で特に注記しない限り、「胎盤」という用語は、臍帯を含む。本明細書に開示されている、単離された胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞は、特定の実施態様では、分化条件下にインビトロで分化するか、インビボで分化するか、又は両方である。
【００５７】
本明細書で使用されるように、細胞又は細胞の集団は、そのマーカーが、例えば、抗体を介する検出又は核酸を介する検出によって、バックグラウンドを超えて検出可能であるとき、特定のマーカーに対して陽性である。特定のマーカーの検出は、例えば、抗体の使用によるか、又は該マーカーをコードする遺伝子もしくはmRNAの配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマーによるかのいずれかで達成することができる。例えば、胎盤幹細胞は、例えば、CD73が（例えば、抗体アイソタイプ対照と比較して）バックグラウンドよりも大きい、例えば、検出可能に大きい量で、胎盤幹細胞に検出されるので、CD73陽性である。また、細胞は、そのマーカーを用いて、該細胞を少なくとも1つの他の細胞型と区別することができるか、又は該細胞によって提示もしくは発現されるときに、そのマーカーを用いて、該細胞を選択もしくは単離することができる場合、マーカー陽性である。例えば、抗体を介する検出との関連において、特定の細胞表面マーカーが存在することを示す「陽性」は、該マーカーが、そのマーカーに特異的な抗体、例えば、蛍光標識抗体を用いて検出されることを意味し；「陽性」は、例えば、サイトメーターにおいて、バックグラウンドを上回る、例えば、検出可能に上回るシグナルを発生させる量のマーカーを示す細胞も指す。例えば、細胞は、該細胞が、CD200に特異的な抗体で標識され、例えば、検出可能に標識され、かつ該抗体からのシグナルが、対照（例えば、バックグラウンド又はアイソタイプ対照）のシグナルよりも高い、例えば、検出可能に高い場合、「CD200+」である。例えば、細胞又は細胞の集団は、該細胞又は細胞の集団由来のRNA中に検出されるOCT-4 RNAの量が、例えば、RT-PCR、スロットブロットなどのようなRNAの検出方法で決定したとき、バックグラウンドよりも検出可能に大きい場合、OCT-4+であると決定することができる。特定の実施態様では、OCT-4がRT-PCRを用いて検出される場合、OCT-4は存在すると決定され、かつ細胞は「OCT-4+」である。本明細書で特に注記しない限り、分化抗原群（「CD」）マーカーは、抗体を用いて検出される。HLA-Gに関して、胎盤幹細胞の集団は、特定の実施態様では、該集団内の細胞の5％よりも多くがHLA-G陽性である場合、例えば、HLA-Gに対する抗体で検出可能に染色される場合、HLA-G陽性である。
【００５８】
HLA-Gを除く全てのマーカーについて本明細書で使用されるように、胎盤幹細胞は、細胞マーカーが、例えば、対照（例えば、バックグラウンドもしくはアイソタイプ対照）と比べて、そのマーカーに特異的な抗体を用いて検出可能でないか、又は核酸に基づく検出方法、例えば、RT-PCRを用いて検出可能でない場合、特定の細胞マーカーについて「陰性」である。例えば、細胞は、該細胞が、対照（例えば、バックグラウンド又はアイソタイプ対照）よりも大きい程度に、CD34に特異的な抗体で再現性良く検出可能に標識されない場合、「CD34-」である。マーカー、例えば、抗体を用いて検出されないか、又は検出可能でないマーカーは、その他の、例えば、核酸を介する検出方法を用いて、適切な対照を用いて、同様のやり方で陽性又は陰性と決定することができる。本明細書で特に注記しない限り、分化抗原群（「CD」）マーカーは、抗体を用いて検出される。HLA-Gに関して、胎盤幹細胞の集団は、特定の実施態様では、該集団内の細胞の5％以下がHLA-G陽性であり、例えば、HLA-Gに対する抗体で検出可能に染色される場合、HLA-G陰性である。
【００５９】
本明細書で使用されるように、フローサイトメトリーによって検出可能なマーカーの発現に言及するときの「low」又は「dim」という記号表示は、該マーカーが、試験した細胞の10％未満によって発現されていること、又は例えば、フローサイトメトリーでの、該マーカーに起因する蛍光が、バックグラウンドを超えて1対数未満であることを意味する。
【００６０】
本明細書で使用されるように、「治療する」は、疾患、障害、もしくは病気、又はそれらの任意のパラメータもしくは症状の治癒、矯正、改善、その重症度の軽減、或いはその時間経過の減少を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
（4.図面の簡単な説明）
【図１】胎盤幹細胞は、実験用ラットの骨欠損の修復を改善する。Y軸：面積で評価した場合の頭蓋骨欠損閉鎖の程度。X軸 - 条件：HEALOS（登録商標）のみ；骨形成タンパク質-2（BMP-2）と組み合わせたHEALOS（登録商標）；HEALOS（登録商標）及び胎盤幹細胞；HEALOS（登録商標）及び骨髄由来間葉系幹細胞（BM-MSC）；又は修復なし（何も入っていない）。アステリスクは、対照と比べた、骨形成タンパク質-2（BMP-2）と組み合わせたHEALOS（登録商標）；胎盤幹細胞と組み合わせたHEALOS（登録商標）；及びBM-MSCと組み合わせたHEALOS（登録商標）における欠損の修復の有意な（p＜0.05）改善を示す。
【００６２】
【図２】胎盤幹細胞は、破骨細胞前駆体の分化を抑制する。X軸：破骨細胞（OC）；胎盤幹細胞、又は骨髄由来間葉系幹細胞（BM-MSC）と共培養していない破骨細胞前駆体。Y軸：形成された成熟破骨細胞の数。
【００６３】
【図３】胎盤幹細胞は、異なる個体由来の腫瘍細胞の成長を低下させる。多発性骨髄腫細胞（細胞株BN、JB、ARP1、U266、Dn、及びHale）に、ルシフェラーゼをコードする遺伝子をトランスフェクトし、（左から右に各々の条件で）胎児間葉系幹細胞（FB-MSC）、患者骨髄由来間葉系幹細胞（Pt-MSC）、又は胎盤幹細胞と共培養した。数週間後の多発性骨髄腫細胞成長の低下は、FB-MSCと共培養した多発性骨髄腫細胞によるルシフェラーゼ発現と比べた、胎盤幹細胞又はPt-MSCと共培養した多発性骨髄腫細胞におけるルシフェラーゼ発現の倍数値として表した。
【００６４】
【図４】胎盤幹細胞又は間葉系幹細胞を膜の下側で培養し、多発性骨髄腫細胞を該膜の上側で培養する、TRANSWELL（登録商標）実験の略図。
【００６５】
【図５】胎盤幹細胞（PDAC）及び胎児骨髄由来間葉系幹細胞（胎児MSC）による6人の異なる患者（X-軸）由来の多発性骨髄腫細胞の抑制。Y-軸：胎盤幹細胞の非存在下で培養した骨髄腫細胞と比べた生存率。
【００６６】
【図６】胎盤幹細胞は、SCID-rab／SCID-huマウスにおける多発性骨髄腫細胞成長を低下させる。多発性骨髄腫細胞の数は、ELISAで評価される、マウス由来の血清中に存在するヒト抗体の力価によって評価した。反応前：骨髄腫細胞の投与前のヒト抗体の力価。2週、4週：単独で（対照）、又は胎盤幹細胞とともに、多発性骨髄腫細胞を投与してから2週間及び4週間後のヒト抗体の力価。
【００６７】
【図７】X線で評価される、SCID-rab／SCID-huマウスにおける骨移植物の骨量密度の変化。BMD：骨ミネラル密度。
【００６８】
【図８−９】骨髄腫骨疾患及び腫瘍成長に対する胎盤幹細胞効果は、用量依存的であり、かつ胎児MSCと同程度である。患者2の骨髄腫細胞を移植したSCID-rabマウス。（A〜C）高い腫瘍負荷が確立されたとき、宿主に、ビヒクルを病変内注射したか、0.1、0.5、及び1×106個の胎盤幹細胞を病変内注射したか、又はHyStem-Cハイドロゲル担体を用いて5×106個の胎盤幹細胞を皮下移植した（詳細については、方法を参照されたい）（6〜7匹のマウス／群）。
【００６９】
【図８】胎盤幹細胞による処置の前（反応前）、処置の2週間後及び4週間後のヒト免疫グロブリン（Ig）の変化。IL＝0.1、0.5、又は1×106細胞の病変内投与。SC＝細胞の皮下投与。CONT＝対照（細胞なし）。
【００７０】
【図９】移植した骨髄腫性骨の処置前レベルからの骨ミネラル密度の変化。IL＝0.1、0.5、又は1×106細胞の病変内投与。SC＝細胞の皮下投与。CONT＝対照（細胞なし）。
【００７１】
【図１０】宿主に、ビヒクルを病変内注射したか、又は1×106個の胎盤幹細胞もしくはMSCを病変内注射した。図10は、移植した骨髄腫性骨の処置前レベルからの骨ミネラル密度の変化を示す。左の条件：対照（細胞なし）；真ん中の条件：胎盤幹細胞；右の条件：骨髄由来間葉系幹細胞。
【００７２】
【図１１】宿主に、ビヒクルを病変内注射したか、又は1×106個の胎盤幹細胞もしくはMSCを病変内注射した。図11は、処置前（反応前）及び実験終了時のヒトIgの変化を示す。左の条件：対照（細胞なし）；真ん中の条件：胎盤幹細胞；右の条件：骨髄由来間葉系幹細胞。
【００７３】
【図１２】培養又は共培養5日目の、胎盤幹細胞の存在下又は非存在下での1ウェル当たりの多発性骨髄腫細胞株の細胞（U-266、RPMI-8226、L363、及びOMP-2）の平均数の比較（n＝3）。P値は、対照及び各々の多発性骨髄腫細胞株の実験条件について提供されている。
【００７４】
【図１３Ａ−１３Ｃ】多発性骨髄腫細胞株H929（図13A）、OPM-2（図13B）、及びLP1（図13C）のセリン780（S780）、又はセリン807及び811（S807／S811）における網膜芽細胞腫（Rb）タンパク質のリン酸化の低下。D2：共培養2日目。D4：共培養4日目。GM：Rbリン酸化の増加／減少の幾何平均。Δ：幾何平均の変化。
【００７５】
【図１４】1μMのレナリドミドの存在下で培養したときに形成された破骨細胞の数。太い横線は、対照ウェル中に形成された破骨細胞の数を表す。
【００７６】
【図１５】胎盤幹細胞（PDAC）のみ、骨髄由来間葉系幹細胞（BM-MCS）、又はPDACとレナリドミドの組合せと共培養したときに形成された破骨細胞の数。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
（5.詳細な説明）
（5.1  単離された胎盤幹細胞及び／又は間葉系幹細胞を用いる骨関連癌の治療）
骨関連癌を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞、特に、本明細書でPDAC（胎盤由来接着細胞）とも呼ばれる、以下の第5.2節で詳細に記載されている単離された胎盤幹細胞、及び／又は骨髄由来間葉系幹細胞（BM-MSC）、例えば、該細胞のどちらか又は両方の治療有効量を投与することを含む方法が本明細書で提供される。骨関連癌としては、限定するものではないが、多発性骨髄腫、骨癌、神経芽腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、前立腺癌、及び骨転移と特徴とする任意の形態の転移性癌が挙げられる。特定の実施態様では、骨関連癌は、前立腺癌を含まない。特定の実施態様では、単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与は、骨関連癌と関連する1以上の症状、例えば、個体内の1以上の骨に対する該癌の影響によって引き起こされるか、それと関連する（associated with）か、又はそれに関連する（related to）症状、例えば、骨関連癌に起因する骨欠損を低下させるか、改善するか、又は逆転させるのに治療的に有効である。本明細書で提供される胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCによる骨関連癌の治療は、以下に論じるように、第2の抗癌療法の前に、その後に、又はそれと同時に行なうことができる。したがって、一実施態様では、骨関連癌の症状である骨欠損を、該癌を第2の抗癌療法で治療する前に治療する。別の実施態様では、骨関連癌の症状である骨欠損を、該癌を第2の抗癌療法で治療するのと同時、又はほぼ同時に治療する。別の実施態様では、骨関連癌の症状である骨欠損を、該癌を第2の抗癌療法で治療した後に治療する。
【００７８】
一態様では、骨関連癌を有する個体を治療する方法であって、該個体に胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量を投与することを含む、方法が本明細書で提供される。一実施態様では、骨関連癌を有する個体を治療する方法であって、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCが、該骨関連癌の1以上の症状を改善する、例えば、検出可能に改善するか、又は該骨関連癌の進行を低下させる、例えば、検出可能に低下させるのに十分な時間、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量を該個体に投与することを含む、方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、該骨関連癌は、多発性骨髄腫である。別の具体的な実施態様では、該骨関連癌は、肉腫である。他の具体的な実施態様では、該骨関連癌は、骨癌、神経芽腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、又は骨の線維肉腫である。別の具体的な実施態様では、該骨関連癌は、固形腫瘍を含む。別の具体的な実施態様では、該骨関連癌は、前立腺癌ではない。
【００７９】
本明細書で使用されるように、「十分な時間投与する」及び同様の語句は、例えば、細胞、例えば、ある単位の細胞の投与、それに続く、1以上の症状の何らかの変化を決定するのに十分な時間にわたる、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、もしくは23時間にわたる、又は1、2、3、4、5、もしくは6日にわたる、又は1、2、3、もしくは4週間、又は同様の期間にわたる、骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫の1以上の症状の評価を包含する。変化が検出されない場合、1回以上の細胞の後続投与を行なうことができる。
【００８０】
特定の実施態様では、骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫の治療は、単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCのある量、例えば、治療有効量を、骨関連癌細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞を有する個体に投与することを含み、ここで、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの少なくとも一部は、該骨関連癌細胞の少なくとも一部と直接的に接触しており、例えば、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの少なくとも一部と、該骨関連癌細胞の少なくとも一部との間に直接的な細胞間接着がある。特定の他の実施態様では、骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫の治療は、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCのある量、例えば、治療有効量を、骨関連癌細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞を有する個体に投与することを含み、ここで、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCはどれも又は実質的にどれも、該骨関連癌細胞と直接的に接触しておらず、例えば、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCのほとんど又は全てと、該骨関連癌細胞との間には、直接的な細胞間接着がない、又は実質的にない。
【００８１】
特定の実施態様では、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、骨関連癌によって生じる1以上の骨病変に対して病変内に、例えば、直接、又はその近く（例えば、約1〜5cm以内）に投与される。特定の実施態様では、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、マトリックス、例えば、注射可能なマトリックスと組み合わせて投与される。特定の他の実施態様では、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、アルギネートと組み合わせて、又は血小板が豊富な血漿とともに骨関連癌を有する個体に投与される。特定の他の実施態様では、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、固体マトリックス、例えば、代用骨、以下の第5.7.4節に記載のマトリックス又は代用骨と組み合わせて、骨関連癌を有する個体に投与される。
【００８２】
特定の他の実施態様では、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、個体に静脈内投与される。胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、任意の容器から、及び流体、例えば、細胞を含む流体の個体への送達に医学的に好適な任意の送達系によって投与することができる。そのような容器は、例えば、滅菌されたプラスチックバッグ、フラスコ、瓶、又は胎盤幹細胞もしくはBM-MSCを容易に分注することができる他の容器であることができる。例えば、容器は、血液バッグ、又はレシピエントへの液体の静脈内投与に好適な医療用に許容し得る他のプラスチックバッグであることができる。
【００８３】
病変内又は静脈内投与は、単一用量中に、例えば、約、少なくとも、又は1×105以下、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、又はそれより多くの単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを含むことができる。特定の実施態様では、BM-MSCの用量は、胎盤幹細胞、例えば、PDACの用量よりも約50％多い細胞を含む。
【００８４】
一実施態様では、病変内又は静脈内投与は、単一用量中に、約2×108個の胎盤幹細胞を含むことができる。別の実施態様では、病変内又は静脈内投与は、単一用量中に、約8×108個の胎盤幹細胞を含むことができる。単離された胎盤幹細胞は、一連の治療の間、1回、又は2回以上投与されてもよい。好ましくは、投与される胎盤幹細胞は、少なくとも50％以上の生存細胞を含む（すなわち、胎盤幹細胞の集団内の胎盤幹細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、又は99％が機能的であるか又は生きている）。好ましくは、該集団内の細胞の少なくとも約60％が生存している。より好ましくは、医薬組成物中の該集団内の細胞の少なくとも約70％、80％、90％、95％、又は99％が生存している。
【００８５】
骨関連癌の症状、例えば、骨病変などの、多発性骨髄腫の症状の治療に加えて、単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与は、骨関連癌の細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞の増殖又は成長を抑制することができる。増殖の抑制は、例えば、腫瘍細胞の成長もしくは増殖速度を低下させるか、又は腫瘍細胞の一部もしくは全てを死滅させることを包含することができる。したがって、別の態様では、骨関連癌の細胞の増殖を抑制する方法であって、例えば、治療後のそのような細胞の数の検出可能な低下、治療後のそのような細胞の数の増加の検出可能な低下などによって決定可能なように、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCと接触していない複数の該骨関連癌の細胞と比べて、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCが、該骨関連癌の細胞の増殖を抑制する、例えば、検出可能に抑制するのに十分な時間、該複数の腫瘍細胞を複数の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCと接触させることを含む、方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、該骨関連癌の細胞は、多発性骨髄腫細胞、骨癌細胞、神経芽腫細胞、骨肉腫細胞、ユーイング肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、脊索腫細胞、骨の悪性線維性組織球腫の細胞、骨に転移する癌の細胞、前立腺癌細胞、又は骨の線維肉腫の細胞である。別の具体的な実施態様では、該骨関連癌の細胞は、固形腫瘍の細胞又は固形腫瘍内の細胞である。別の具体的な実施態様では、該骨関連癌の細胞は、前立腺癌細胞ではない。
【００８６】
別の具体的な実施態様では、該接触させることは、インビトロで行なわれる。別の具体的な実施態様では、該接触させることは、インビボで、例えば、骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫又は軟骨肉腫の細胞を有する個体への細胞の投与によって行なわれる。別の具体的な実施態様では、該個体は、哺乳動物である。別の具体的な実施態様では、該哺乳動物は、ヒトである。別の具体的な実施態様では、該接触させることは、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを該個体に静脈内投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該接触させることは、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを、該個体に対して、該骨関連癌によって生じる骨病変又はその近くに、例えば、病変内又は骨内に投与することを含む。
【００８７】
別の実施態様では、骨関連癌の細胞を胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCと接触させることによって、骨関連癌の細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法はさらに、該骨関連癌の細胞を1種以上の抗癌化合物、例えば、第5.1.3節中の1種以上の抗癌化合物と接触させること、例えば、1種以上の該抗癌化合物を該個体に投与することを含む。
【００８８】
別の実施態様では、本方法は、細胞の総数で、少なくとも1×107個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを該個体に投与することを含む。別の具体的な実施態様では、本方法は、細胞の総数で、少なくとも1×108個の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを該個体に投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、投与前に30回以下の集団倍加の間、インビトロで増殖させたものである。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、10回以下の集団倍加の間、インビトロで増殖させたものである。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、凍結保存され、該接触させることの前に解凍されたものである。
【００８９】
本方法の別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、例えば、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの非存在下での同等数の骨関連癌の細胞の増殖と比べて、該骨関連癌の細胞の増殖を、例えば、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、又は90％抑制する。特定の実施態様では、増殖の低下率は、例えば、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与前と投与後の、骨関連癌を有する個体由来の組織（例えば、血液）試料中の骨関連癌細胞の数を比較することによって評価することができる。別の具体的な実施態様では、本方法は、該接触させることの前に、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCが、該骨関連癌の細胞の試料の増殖を抑制する、例えば、検出可能に抑制することを決定することを含む。そのような実施態様では、例えば、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、例えば、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの集団の試料（例えば、幹細胞バンク由来の単位又はロット由来の試料など）を採取することにより、該骨関連癌の細胞の試料の増殖を抑制するものであると決定することができる。
【００９０】
本明細書に開示されている方法、例えば、本明細書に開示されている、治療方法、腫瘍成長を抑制する方法、又は破骨細胞成熟を抑制する方法のいずれにおいても、胎盤幹細胞、例えば、PDAC、又はBM-MSCは、単独で用いられてもよく、又は該胎盤幹細胞及びBM-MSCは、組み合わせて用いられてもよい。組み合わせて用いられる場合、これらの細胞は、同時に、例えば、同じ細胞単位で投与可能であるように組み合わされてもよく；又は別々に投与可能であってもよく、例えば、別々の細胞単位で、例えば、別々の血液型バッグに維持されてもよい。組み合わせて用いられる場合、胎盤幹細胞及びBM-MSCの投与は、同時に行なわれることもあるし、又は別々に行なわれることもある。
【００９１】
破骨細胞前駆体の破骨細胞への成熟を低下させる方法であって、該破骨細胞前駆体を複数の単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）と接触させることを含み、ここで、該複数の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、該破骨細胞前駆体からの破骨細胞成熟を低下させる、例えば、検出可能に低下させるのに十分な数の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCである、方法が本明細書でさらに提供される。具体的な実施態様では、該接触させることは、インビトロで行なわれる。別の具体的な実施態様では、該接触させることは、インビボで行なわれる。別の具体的な実施態様では、該接触させることは、哺乳動物、例えば、ヒトで行なわれる。別の具体的な実施態様では、該接触させることは、多発性骨髄腫を有するか、又は多発性骨髄腫細胞を含むか、又は多発性骨髄腫の1以上の症状を有する個体で行なわれる。別の具体的な実施態様では、該多発性骨髄腫の1以上の症状は、1以上の骨病変、又は破骨細胞活性に起因する骨痛を含む。
【００９２】
別の実施態様では、破骨細胞前駆体のアポトーシスを増大させる方法であって、該破骨細胞前駆体を複数の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）と接触させることを含み、ここで、該複数の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、破骨細胞前駆体のアポトーシスを増大させる、例えば、検出可能に増大させるのに十分な数の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCである、方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、該接触させることは、インビトロで行なわれる。別の具体的な実施態様では、該接触させることは、インビボで行なわれる。別の具体的な実施態様では、該接触させることは、ヒトで行なわれる。別の具体的な実施態様では、該接触させることは、多発性骨髄腫を有するか、又は多発性骨髄腫細胞を含むか、又は多発性骨髄腫の1以上の症状を有する個体で行なわれる。別の具体的な実施態様では、該多発性骨髄腫の1以上の症状は、1以上の骨病変、又は破骨細胞活性に起因する骨痛を含む。別の具体的な実施態様では、該破骨細胞前駆体のアポトーシスの増大は、該個体由来の破骨細胞前駆体のアネキシンV及びヨウ化プロピジウム染色の検出可能な増加によって検出される。
【００９３】
上記の実施態様のいずれにおいても、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、遺伝子操作された胎盤幹細胞、例えば、以下の第5.7.2節に記載の遺伝子操作された細胞であることができる。
【００９４】
本明細書に開示されている方法のいずれにおいても、該個体は哺乳動物である。具体的な実施態様では、該哺乳動物はヒトである。
【００９５】
本明細書に開示されている方法のいずれにおいても、BM-MSCは、単離された骨髄由来間葉系幹細胞、例えば、培養されたもしくは市販供給源から購入されたBM-MSCであることができるか、又は骨髄、例えば、骨髄穿刺液、粗骨髄などに含まれるBM-MSCであることができる。
【００９６】
（5.1.1  多発性骨髄腫の治療）
多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを投与することを含み、ここで、該単離された胎盤幹細胞は、以下の第5.2節に記載の特徴の任意の組合せ、又は全てを有する、方法が本明細書で提供される。
【００９７】
多発性骨髄腫は、免疫系の抗体産生細胞である形質細胞の癌である。この疾患は、通常、3つの主な特徴：その発症が、骨痛及び血中カルシウムの上昇をもたらし得る骨病変；貧血；並びに腎不全を示す。
【００９８】
特定の実施態様では、1以上の多発性骨髄腫関連疾患もしくは状態、又はそれらの症状を有する個体を治療する方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、該多発性骨髄腫関連疾患又は状態は、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（MGUS）、くすぶり型骨髄腫（例えば、くすぶり型多発性骨髄腫）、孤立性形質細胞腫、良性単クローン性免疫グロブリン血症、無症候性単クローン性免疫グロブリン血症、非骨髄腫性単クローン性免疫グロブリン血症、不連続性単クローン性免疫グロブリン血症、特発性単クローン性免疫グロブリン血症、潜伏性単クローン性免疫グロブリン血症、痕跡性単クローン性免疫グロブリン血症、免疫グロブリン異常血症、無症候性パラ免疫グロブリン血症、又は特発性パラプロテイン血症である。特定の実施態様では、くすぶり型骨髄腫を有する人は、血液異常タンパクを示すが、多発性骨髄腫の他のいかなる症状も示さない。
【００９９】
特定の実施態様では、症状は以下の通りである。
【０１００】
骨病変及び骨痛 - 骨髄腫細胞は、破骨細胞活性化因子を分泌する。この因子は、破骨細胞を活性化して、骨を破壊し、疼痛性骨病変を生成させるサイトカインである。例えば、X線写真で見ることができる、これらの骨病変は、溶解性の性質であり、通常、骨が存在しないか、又は「型抜きされている」ように見える1以上の領域として現われる。骨髄腫による骨痛は、通常、背骨及び肋骨を侵し、かつ活動によって悪化する。持続性の限局痛が存在する場合があり、また、病的骨折を示すこともある。脊椎の障害は、脊髄圧迫をもたらす場合がある。骨の破壊はまた、血中へのカルシウムの放出をもたらし、高カルシウム血症及びその関連症状をもたらす。
【０１０１】
貧血 - 骨髄腫に見られる貧血は、通常、正球性かつ正色素性であり、浸潤性腫瘍細胞による正常骨髄の置換、及びサイトカインによる正常赤血球産生（造血）の阻害によって生じる。
【０１０２】
腎不全 - 多発性骨髄腫は、急性と慢性の両方で発症し得る腎不全を引き起こす傾向もある。多発性骨髄腫における腎不全は主に、破骨細胞が既存の骨を破壊するにつれて発症する高カルシウム血症に起因する。腎不全はまた、ファンコーニ症候群（II型尿細管性アシドーシス）として発現することがある、ベンス・ジョーンズタンパク質と呼ばれる軽鎖の排泄による尿細管障害が原因で起こる。他の原因としては、アミロイドの糸球体沈着、高尿酸血症、再発性感染症（例えば、腎盂腎炎）、及び腫瘍細胞の局所浸潤が挙げられる。腎不全は、血清クレアチニンのレベルの上昇と関連することもある。
【０１０３】
多発性骨髄腫は、以下のような他の症状を示すこともある。
【０１０４】
感染症 - 多発性骨髄腫の別の一般的症状は、免疫系が破壊された場合の感染症である。感染症のリスクの増加は、広範性低ガンマグロブリン血症によって生じる免疫不全によるものであり、広範性低ガンマグロブリン血症は、正常な抗体の産生の減少及び破壊の増加に起因する。最も一般的な感染症は、肺炎及び腎盂腎炎である。多発性骨髄腫患者で疾患を引き起こす一般的な肺炎病原体としては、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、及び肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）が挙げられ、一方、腎盂腎炎を引き起こす一般的な病原体としては、大腸菌（Escherichia coli）が挙げられる。通常、感染症は、化学療法の開始後、最初の数カ月のうちに発生する。
【０１０５】
神経学的症状 - 多発性骨髄腫の症状は、広範囲の神経学的状態を含み、これには、パラプロテイン（下記参照）の性質による血液の過粘稠性の結果であり得る、高カルシウム血症性頭痛による脱力感、意識障害、及び易疲労感、視覚変化、並びに網膜症が含まれる。他の神経学的症状としては、神経根痛、腸又は膀胱の制御の喪失（例えば、脊髄圧迫をもたらす脊髄の障害によるもの）、及び手根管症候群、並びに他の神経障害（例えば、アミロイドによる末梢神経の浸潤によるもの）が挙げられる。多発性骨髄腫は、後に提示する例において、対まひを生じる場合がある。
【０１０６】
パラプロテインの存在 - 多発性骨髄腫の診断的症状は、単クローン性タンパク質（Mタンパク質）、例えば、形質細胞のクローン性増殖によって産生される免疫グロブリン軽鎖、又は免疫グロブリン断片である、パラプロテインの血液及び／又は尿中での存在である。パラプロテインの存在は、アガロースゲル電気泳動によるか、又は免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖に対する1以上の抗体を用いる免疫固定によって、個体からの尿及び／又は血清由来のタンパク質を解析することにより、決定することができる。
【０１０７】
症候性多発性骨髄腫は、特定の実施態様では、以下の症状又は兆候が存在するときに診断される：骨髄生検標本上の細胞の10％強を占めるか、又は他の組織（例えば、形質細胞腫）由来の生検標本中の任意の量のクローン性形質細胞；血清中又は尿中のいずれかのパラプロテイン；末端臓器障害（関連臓器又は組織障害）、例えば、高カルシウム血症（例えば、血液1デシリットル当たり約12mgを上回るか、又は血液中約2.75mmolを上回る補正カルシウム値）、骨髄腫に起因する腎機能不全、＜10g／dL血液のヘモグロビンと定義される貧血、骨病変（例えば、圧迫骨折を伴う溶解性病変又は骨粗鬆症）、頻発性の重症感染症（1年に3回以上）、他の臓器のアミロイドーシス（アミロイドタンパク質の沈着）、及び過粘稠度症候群（血液の粘稠度の増大）、例えば、1.8センチポイズを超える血液粘稠度、例えば、少なくとも2、3、4、又は5センチポイズの血液粘稠度の証拠。
【０１０８】
多発性骨髄腫を有する個体は、特定の実施態様では、以下の群のうちの1つに含まれる。一実施態様では、多発性骨髄腫を有する個体は、この疾患の治療を一度も受けたことがない。別の実施態様では、該個体は、応答性骨髄腫；すなわち、治療に応答している多発性骨髄腫を有する。具体的な実施態様では、そのような個体は、治療の結果として少なくとも50％のMタンパク質（パラプロテイン）の減少を示す。別の具体的な実施態様では、該個体は、治療の結果として25％〜50％のMタンパク質の減少を示す。別の実施態様では、該個体は、安定な多発性骨髄腫を有し、これは、治療に応答していない（例えば、Mタンパク質の減少が50％に達していない）が、進行も悪化もしていない骨髄腫を指す。別の実施態様では、該個体は、進行性多発性骨髄腫を有し、これは、悪化している（例えば、Mタンパク質を増加させ、かつ臓器もしくは組織機能障害又は末端臓器障害を悪化させている）活動性骨髄腫を指す。別の実施態様では、該個体は、再発性多発性骨髄腫を有し、これは、最初は治療に応答したが、その後、再び進行し始めた骨髄腫疾患を指す。具体的な実施態様では、該個体は、初期治療後に再発しているか、又は後続治療後に再発している。別の実施態様では、該個体は、難治性多発性骨髄腫を有する。具体的な実施態様では、難治性多発性骨髄腫は、初期治療に応答しなかった多発性骨髄腫である。別の具体的な実施態様では、難治性多発性骨髄腫は、後続治療に応答しなかった再発性多発性骨髄腫である。別の具体的な実施態様では、難治性多発性骨髄腫は、非応答性の進行性難治性疾患であり、これは、進行している難治性疾患を指す。別の具体的な実施態様では、難治性多発性骨髄腫は、非応答性の非進行性難治性疾患であり、これは、悪化していない難治性疾患を指す。
【０１０９】
したがって、一実施態様では、多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）を投与することを含み、ここで、該投与は、多発性骨髄腫の1以上の症状、例えば、限定するものではないが、本明細書に記載の多発性骨髄腫の症状のいずれか1つ又は複数の進行の検出可能な低下、その悪化の検出可能な軽減、及び／又はその検出可能な改善をもたらす、方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、該1以上の症状は、正常と比べた血中もしくは尿中カルシウムの上昇、骨病変、貧血、又は腎不全の存在を含む。別の具体的な実施態様では、該1以上の症状は、形質細胞、例えば、骨髄生検標本上の細胞の10％強を占めるか、又は他の組織（例えば、形質細胞腫）由来の生検標本中の任意の量のクローン性形質細胞；血清中又は尿中のいずれかのパラプロテイン；及び／又は末端臓器障害の証拠を含む。別の具体的な実施態様では、該1以上の症状は、約2.75mmol／Lを上回る血中カルシウム濃度、腎機能不全、血液1デシリットル当たり約10g未満のヘモグロビン、骨病変の存在、又は骨髄以外の1以上の臓器のアミロイドーシスである。
【０１１０】
別の具体的な実施態様では、該症状は、感染症、例えば、高ガンマグロブリン血症によって引き起こされる感染症である。特定の実施態様では、感染症は、肺炎又は腎盂腎炎である。特定の実施態様では、感染症は、化学療法、例えば、該多発性骨髄腫を治療するための化学療法の開始後、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12カ月以内に発生する。
【０１１１】
別の具体的な実施態様では、該症状は、神経学的症状である。他の具体的な実施態様では、該神経学的症状は、脱力感、意識障害、易疲労感、頭痛、視覚変化、網膜症、神経根痛、腸もしくは膀胱の制御の喪失、手根管症候群、及び／又は対まひである。
【０１１２】
具体的な実施態様では、多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）を投与することを含み、ここで、該投与は、該個体の1以上の臓器又は組織における多発性骨髄腫細胞、例えば、クローン性多発性骨髄腫細胞の数の検出可能な低下をもたらす、方法が本明細書で提供される。
【０１１３】
具体的な実施態様では、多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）を投与することを含み、ここで、該投与は、該個体の血液中のヘモグロビンの検出可能な増加、例えば、正常限度内への増加をもたらす、方法が本明細書で提供される。正常ヘモグロビンレベルは、下の表1Aに示すように、個体の年齢及び性別によって異なる：
【表１】
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【０１１４】
したがって、別の具体的な実施態様では、多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）を投与すること含み、ここで、該投与は、該個体の血中ヘモグロビンレベルの11g／dL血液〜20g／dL血液への増加をもたらす、方法が本明細書で提供される。別の具体的な実施態様では、該投与は、該個体の血中ヘモグロビンレベルの11g／dL血液〜13g／dL血液への増加をもたらす。別の具体的な実施態様では、該投与は、該個体の血中ヘモグロビンレベルの12g／dL血液〜16g／dL血液への増加をもたらす。別の具体的な実施態様では、該投与は、該個体の血中ヘモグロビンレベルの14g／dL血液〜18g／dL血液への増加をもたらす。別の実施態様では、貧血を有する、例えば、血液1デシリットル当たり約10g未満のヘモグロビンを有する個体を治療する方法であって、該個体に胎盤幹細胞の治療有効量を投与することを含み、ここで、該貧血は、多発性骨髄腫によって引き起こされ、かつ該治療有効量は、該個体由来の血中ヘモグロビンの1デシリットル当たり約10グラム以上への上昇をもたらすのに十分な量である、方法が本明細書で提供される。
【０１１５】
別の実施態様では、多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞、単離された胎盤幹細胞の集団、又は単離された胎盤幹細胞を含む細胞の集団を投与することを含み、ここで、該投与は、該個体由来の血液又は尿中のパラプロテインのレベルの検出可能な低下をもたらす、方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、該投与することは、該個体の血液又は尿中のパラプロテインの検出不可能なレベルへの低下をもたらす。別の実施態様では、個体の血液中にパラプロテインを有する個体を治療する方法であって、該個体に胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量を投与することを含み、ここで、パラプロテインの存在は、多発性骨髄腫によって引き起こされ、かつ該治療有効量は、該個体の血液中のパラプロテインの検出可能な低下をもたらすのに十分な量である、方法が本明細書で提供される。
【０１１６】
別の実施態様では、該個体由来の骨髄生検標本又は血液試料中の全ての有核細胞のうち、10％を上回る数のクローン性形質細胞を有する個体を治療する方法であって、該個体に胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量を投与することを含み、ここで、該数のクローン性形質細胞は、多発性骨髄腫が原因で生じ、かつ該治療有効量は、骨髄生検標本又は血液試料中の該数のクローン性形質細胞の10％未満への検出可能な低下をもたらすのに十分な量である、方法が本明細書で提供される。
【０１１７】
別の実施態様では、高カルシウム血症を有する個体を治療する方法であって、該個体に胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量を投与することを含み、ここで、該高カルシウム血症は、多発性骨髄腫によって引き起こされ、かつ該治療有効量は、該個体由来の血液中のカルシウムの検出可能な低下をもたらすのに十分な量である、方法が本明細書で提供される。別の実施態様では、高血中カルシウムレベル（例えば、血液1デシリットル当たり約12mgを上回るか、又は約2.75mmolを上回る補正カルシウム値）を有する個体を治療する方法であって、該個体に胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量を投与することを含み、ここで、該高血中カルシウムレベルは、多発性骨髄腫によって引き起こされ、かつ該治療有効量は、該血中カルシウムレベルの検出可能な低下、例えば、該血中カルシウムレベルの血液1デシリットル当たり約12mg未満への低下、又は約2.75mmol未満への低下をもたらすのに十分な量である、方法が本明細書で提供される。
【０１１８】
別の実施態様では、貧血（ここで、該貧血は、多発性骨髄腫によって引き起こされ、該貧血は、10g／dL血液未満の血中ヘモグロビンと定義される）を有する個体を治療する方法であって、該個体に胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量を投与することを含み、ここで、該治療有効量は、該個体由来の血液中のヘモグロビンの検出可能な増加をもたらすのに十分な量である、方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、該治療有効量は、個体由来の血中ヘモグロビンの10g／dL以上への増加をもたらす量である。
【０１１９】
別の実施態様では、血液過粘稠度症候群（ここで、該血液は、1.8センチポイズを超える粘稠度を有し、該血液過粘稠度症候群は、多発性骨髄腫によって引き起こされる）を有する個体を治療する方法であって、該個体に胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量を投与することを含み、ここで、該治療有効量は、該個体由来の血液の粘稠度の検出可能な減少をもたらすのに十分な量である、方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、該治療有効量は、該個体の血液の粘稠度の5、4、3、2、又は1.8センチポイズ未満への減少をもたらす量である。
【０１２０】
別の実施態様では、該個体の骨髄中に、例えば、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、又は20％を上回る形質細胞を有する個体を治療する方法であって、該個体に胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量を投与することを含み、ここで、該治療有効量は、該個体由来の骨髄中の形質細胞のパーセンテージの検出可能な減少をもたらすのに十分な量である、方法が本明細書で提供される。
【０１２１】
別の実施態様では、多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）を投与することを含み、ここで、該投与は、例えば、骨のスキャン又はラジオグラフィーによって決定可能な、該個体内の多発性骨髄腫によって生じる骨病変の重症度及び／又は数の検出可能な低下をもたらす、方法が本明細書で提供される。別の実施態様では、多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを投与することを含み、ここで、該投与は、該個体内の骨量もしくは骨ミネラル量の喪失の検出可能な低下、骨量もしくは骨ミネラル量の喪失の中断、又は骨量もしくは骨ミネラル量の増加をもたらす、方法が本明細書で提供される。
【０１２２】
治療方法の別の具体的な実施態様では、該多発性骨髄腫の1以上の症状は、骨痛、骨溶解性病変（例えば、X線もしくは磁気共鳴イメージング（MRI）で見ることができるもの）、骨粗鬆症、貧血、高カルシウム血症もしくは高カルシウム血症に起因する症状、又は腎不全である。他の具体的な実施態様では、該個体は、多発性骨髄腫の治療を一度も受けたことがないか；該個体は、多発性骨髄腫の治療を受けたことがあり、かつ非胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSC療法に応答するか；該個体は、多発性骨髄腫の治療を受けたことがあり、かつ非胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSC療法に応答していないが、該個体内の多発性骨髄腫の経過は進行していないか；又は該個体は、進行性の多発性骨髄腫を有する。
【０１２３】
別の実施態様では、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）の投与は、該個体内の骨形成の1種以上のマーカーの検出可能な増加をもたらすのに十分である。例えば、骨形成は、例えば、該個体由来の血清試料中の骨特異的アルカリホスファターゼ（BSAP）及び／又は無傷の血清I型プロコラーゲンN末端ペプチド（PINP）のレベルの解析によって評価することができる。多発性骨髄腫を有する個体への胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与後の血清BSAP及び／又はPINPの検出可能な増加は、骨形成の増加を示すものである。したがって、別の実施態様では、多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを投与することを含み、ここで、該投与することは、該個体由来の血清中のBSAP又はPINPのいずれかの検出可能な増加をもたらす、方法が本明細書で提供される。
【０１２４】
別の実施態様では、単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与は、骨再吸収の1種以上のマーカーの検出可能な減少をもたらすのに十分である。例えば、骨再吸収は、血清C末端I型コラーゲンテロペプチド（CTX）及び／又は血清酒石酸耐性酸ホスファターゼアイソフォーム-5b（TRACP-5b）のレベルの解析によって評価することができる。多発性骨髄腫を有する個体への胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与後のCTX又はTRACP-5bの検出可能な減少は、骨再吸収の減少を示すものである。したがって、別の実施態様では、多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）を投与することを含み、ここで、該投与することは、該個体由来の血清中のCTX又はTRACP-5bの検出可能な減少をもたらす、方法が本明細書で提供される。
【０１２５】
別の実施態様では、I期多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）の治療有効量を投与することを含み、ここで、該I期多発性骨髄腫は、（i）10g／dL以上のヘモグロビンレベル；（ii）X線写真で見られる、正常骨、又はわずか1〜2個の病変；（iii）12mg／dL未満の血中カルシウム；及び検出可能なレベルのパラプロテインを特徴とし；ここで、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの該治療有効量は、該症状のうちの1つもしくは複数の改善、及び／又は該個体由来の血液中の形質細胞の数の検出可能な低下をもたらすのに十分な量である、方法が本明細書で提供される。
【０１２６】
別の実施態様では、II期多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）の治療有効量を投与することを含み、ここで、該II期多発性骨髄腫は、以下の症状：（i）8.5g／dL未満の血中ヘモグロビン；（ii）12mg／dLを超える血中カルシウムレベル；（iii）X線写真で見られる、3カ所以上の骨病変；及び（iv）高レベルのパラプロテインを特徴とし；ここで、該単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの該治療有効量は、該症状のうちの1つもしくは複数の改善、及び／又は該個体由来の血液中の形質細胞の数の検出可能な低下をもたらすのに十分な量である、方法が本明細書で提供される。
【０１２７】
別の実施態様では、I期多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）の治療有効量を投与することを含み、ここで、該I期多発性骨髄腫は、3.5mg／L未満の血清β2ミクログロブリン及び3.5g／dL以上の血清アルブミンレベルを特徴とし、かつ該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの該治療有効量は、該個体において、血清β2ミクログロブリンのレベルを低下させる、例えば、検出可能に低下させるか、又は血中アルブミンレベルを増大させる、例えば、検出可能に増大させる量である、方法が本明細書で提供される。
【０１２８】
別の実施態様では、II期多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）の治療有効量を投与することを含み、ここで、該II期多発性骨髄腫は、任意のレベルの血清アルブミンを伴う、約3.3mg／L〜5.5mg／Lの血清β2ミクログロブリン、又は約3.5g／dL未満の血清アルブミンレベル及び約3.5g／L未満の血清β2ミクログロブリンを特徴とし、かつ該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの該治療有効量は、該個体において、血清β2ミクログロブリンのレベルを、例えば、約3.3mg／L未満に低下させる、例えば、検出可能に低下させるか、又は血中アルブミンレベルを増大させる、例えば、検出可能に増大させるのに十分な量である、方法が本明細書で提供される。
【０１２９】
別の実施態様では、III期多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）の治療有効量を投与することを含み、ここで、該III期多発性骨髄腫は、任意のレベルの血清アルブミンを伴う、5.5mg／Lを上回る血清β2ミクログロブリンを特徴とし、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの該治療有効量は、該個体の血液又は血清中の血清β2ミクログロブリンの量を、例えば、約5.5mg／L未満、又は約3.5mg／L未満に低下させる、例えば、検出可能に低下させるのに十分な量である、方法が本明細書で提供される。
【０１３０】
上記のいずれかの特定の他の具体的な実施態様では、多発性骨髄腫を有する個体は、1以上の非細胞性多発性骨髄腫療法、例えば、メルファラン（プレドニゾロンを伴う又は伴わない）、シクロホスファミド（プレドニゾロンを伴う又は伴わない）、アルキル化剤、VAD（ビンクリスチン、アドリアマイシン、及び高用量デキサメタゾン）、ABCM（ビンクリスチン、アドリアマイシン、プレドニゾロン、及びカルムスチン）、高用量デキサメタゾン、サリドマイド、ビホスホネート（biphosphonate）などに反応しない。
【０１３１】
別の態様では、多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法であって、該多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する、例えば、検出可能に抑制するように、該多発性骨髄腫細胞を、単離された胎盤幹細胞、例えば、以下の第5.2節に記載の単離された胎盤幹細胞、そのような単離された胎盤幹細胞の集団、又は該単離された胎盤幹細胞を含む細胞の集団、及び／又は単離されたBM-MSCもしくはBM-MSCを含む骨髄と接触させることを含む、方法が本明細書で提供される。特定の実施態様では、インビボで多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法であって、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量を、多発性骨髄腫細胞を含む個体に投与することを含み、ここで、該投与することは、該多発性骨髄腫細胞の増殖を低下させる、例えば、検出可能に低下させる、方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、該投与することは、多発性骨髄腫の1以上の症状もしくは兆候を軽減する、例えば、検出可能に軽減する（例えば、改善する）か、又は該多発性骨髄腫の1以上の症状もしくは兆候の悪化を低減する。胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与後の多発性骨髄腫細胞の増殖の低下は、例えば、形質細胞又は多発性骨髄腫細胞に特異的な1種以上の抗体、例えば、CD28又はCD138に対する抗体を用いて、例えば、多発性骨髄腫を有する個体の血液又は骨髄由来の形質細胞の数の低下を検出することによって評価することができる。
【０１３２】
別の態様では、例えば、多発性骨髄腫を有する個体内の多発性骨髄腫細胞の数を低下させる方法であって、該個体内の多発性骨髄腫細胞の数を、該接触させることの後に抑制する、例えば、検出可能に抑制するように、該多発性骨髄腫細胞を、単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）と接触させることを含む、方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、該接触させることは、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを該個体に投与することによって行なわれる。別の具体的な実施態様では、該投与することは、多発性骨髄腫の1以上の症状もしくは兆候を軽減する、例えば、検出可能に軽減する（例えば、改善する）か、又は該多発性骨髄腫の1以上の症状もしくは兆候の悪化を低減する。投与前と比べたときの、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与後の多発性骨髄腫細胞の数の低下は、例えば、形質細胞又は多発性骨髄腫細胞に特異的な1種以上の抗体、例えば、CD28又はCD138に対する抗体を用いる、例えば、多発性骨髄腫を有する個体の血液又は骨髄由来の形質細胞の数の低下の検出によって評価することができる。
【０１３３】
通常、多発性骨髄腫の1以上の症状を示す個体は、例えば、多発性骨髄腫の診断に至るために実施される検査の一部として、多発性骨髄腫の最終的な診断の前に少なくとも1回、多発性骨髄腫について評価される。また、通常、多発性骨髄腫と診断された個体は、この疾患の進行を判断するために、多発性骨髄腫の診断の後、少なくとも1回、通常2回以上、多発性骨髄腫の症状について評価される。そのような評価は、例えば、X線解析、磁気共鳴イメージング（MRI）、コンピュータ断層撮影（CT）スキャニング、陽電子放出撮影（PET）スキャニングなどを用いる骨病変の程度及び／又は数の決定；血液中のカルシウムレベルの決定；血液又は尿中のMタンパク質（抗体又は抗体の断片）のレベルの決定などを含むことができる。多発性骨髄腫の治療の有効性、例えば、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを投与することの有効性は、多発性骨髄腫のそのような症状のいずれか1つ、又は複数によって、例えば、多発性骨髄腫のそのような症状のいずれか1つ、又は複数の改善によって評価することができる。有効性は、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与前及び投与後の、該個体の血液又は骨髄中の多発性骨髄腫細胞の数を決定することによって評価することもできる。
【０１３４】
したがって、具体的な実施態様では、上記の方法はいずれも、該投与することの前に1回又は複数回、及び任意で、該投与することの後に1回又は複数回、（1）該個体内の骨病変の数もしくは程度；（2）該個体由来の血液もしくは尿中のMタンパク質（パラプロテイン）のレベル；（3）該個体由来の血液中のカルシウムのレベル；及び／又は（4）該個体由来の血液もしくは骨髄中の多発性骨髄腫細胞の数のうちの1つ又は複数を決定することを含む。特定の実施態様では、該個体由来の血液中のカルシウムのレベル、又は該個体由来の血液もしくは尿中のMタンパク質のレベルが、投与前のレベルと比べて、単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与後に低下する、例えば、検出可能に低下する場合、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、治療的に有効である。同様に、特定の実施態様では、該個体内の骨病変の数、又は骨病変の重症度が、該投与前の骨病変の数、又は骨病変の重症度と比べて、該投与後に低減される場合、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与は、治療的に有効である。特定の他の実施態様では、例えば、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与が、該個体の血液もしくは尿中のMタンパク質のレベルの増加の低減、又は該個体の血液中のカルシウムのレベルの増加の低減、又は該個体内の骨病変の数もしくは重症度の増加の低減をもたらす場合も、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与は、治療的に有効である。特定の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与後の、該個体内の骨病変の数又は重症度、該個体の血液もしくは尿中のMタンパク質のレベル、又は該個体内の血中カルシウムのレベルに検出可能な変化がない場合、胎盤幹細胞、BM-MSC、又は両方ののいずれかの投与を繰り返す。
【０１３５】
単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与の有効性は、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCのある量、例えば、治療有効量が、投与後の個体内の破骨細胞前駆体又は多発性骨髄腫細胞の数を低下させる、例えば、検出可能に低下させることを決定することによって評価することもできる。該個体内の破骨細胞前駆体の数の低下は、任意の医療として許容し得る方法によって決定することができる。例えば、破骨細胞前駆体の数は、例えば、個体の末梢血又は骨髄の試料中の破骨細胞前駆体を検出するための、破骨細胞前駆体に特異的な抗体を用いて決定することができ；標識された細胞の数は、例えば、細胞診、顕微鏡下での細胞の計数、標識された細胞のフローサイトメトリーによる選別などによって評価することができる。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの治療有効量は、例えば、多発性骨髄腫細胞又は形質細胞に特異的な抗体、例えば、細胞マーカーCD28又はCD138に特異的な抗体を用いる、該個体由来の有核血液細胞の細胞計数（例えば、フローサイトメトリーによる）、又は抗体染色によって決定可能な、該個体内の多発性骨髄腫細胞の数を低下させる。
【０１３６】
本明細書に記載されている、多発性骨髄腫を治療するか、多発性骨髄腫の症状を治療するか、又は多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法のいずれにおいても、多発性骨髄腫細胞は、第4番染色体から第14番染色体にかけての遺伝物質の転座（例えば、t（4：14）転座）を示す。他の実施態様では、多発性骨髄腫細胞は、t（14：16）転座、t（11：14）転座、及び／又は未知の染色体パートナーとの非正統的なIgH再編成を示す。特定の他の実施態様では、多発性骨髄腫細胞は、検出可能な量の免疫グロブリンを分泌しない。特定の他の実施態様では、多発性骨髄腫細胞は、軽鎖免疫グロブリン、例えば、κ（カッパ）軽鎖、λ（ラムダ）軽鎖、もしくは両方のみ、又は実質的にそれらのみを分泌する。特定の他の実施態様では、多発性骨髄腫細胞は、重鎖及び軽鎖を含む免疫グロブリンを分泌する。他の実施態様では、多発性骨髄腫細胞は、IgG免疫グロブリン、IgA免疫グロブリン、又は両方を産生する。
【０１３７】
上記の実施態様のいずれにおいても、単離された胎盤幹細胞は、例えば、以下に記載される遺伝子操作された胎盤幹細胞であることができる。上記の実施態様のいずれにおいても、BM-MSCは、遺伝子操作されたBM-MSCであることができる。BM-MSCは、第5.7.2節に記載されている、胎盤幹細胞の遺伝子操作について記載された任意の方法で遺伝子操作することができる。
【０１３８】
特定の実施態様では、多発性骨髄腫を有する個体は、化学療法化合物、例えば、以下の第5.1.3節に記載の抗癌化合物、例えば、1種以上の該抗癌化合物を用いて、並びに胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを用いてさらに治療される。多発性骨髄腫を治療するために、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、例えば、化学療法、例えば、該多発性骨髄腫を治療するための化学療法の開始と同時に、又は化学療法の開始後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12カ月以内に該個体に投与することができる。他の実施態様では、該抗癌化合物は、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与後、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12カ月以内に投与される。
【０１３９】
（5.1.2  軟骨肉腫の治療）
別の態様では、軟骨肉腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）を投与することを含む、方法が本明細書で提供される。本明細書中の別所にあるように、該単離された胎盤幹細胞は、以下の第5.2節に記載の特徴の任意の組合せ、又は全てを有することができる。さらに該BM-MSCは、単離されていても、又は例えば、BM-MSCを含む骨髄中に存在していてもよい。
【０１４０】
したがって、一実施態様では、軟骨肉腫を有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを投与することを含み、ここで、該投与は、軟骨肉腫の1以上の症状の進行の検出可能な低下、その悪化の検出可能な低減、及び／又はその検出可能な改善をもたらす、方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、該症状としては、骨痛、例えば、X線で見ることができる1以上の骨病変、例えば、腫瘍の部位での骨の腫脹、又は1以上の骨の肥大が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
具体的な実施態様では、軟骨肉腫は、明細胞軟骨肉腫である。別の具体的な実施態様では、軟骨肉腫は、良性軟骨肉腫（内軟骨腫）である。別の具体的な実施態様では、軟骨肉腫は、低悪性度軟骨肉腫（グレードIの軟骨肉腫；正常な軟骨に似ている腫瘍と特徴とする；腫瘍は、層板骨の部分を取り囲み、かつ／又は二核細胞を含む異型細胞を示す場合がある）である。別の具体的な実施態様では、軟骨肉腫は、中間の悪性度の軟骨肉腫（グレードIIの軟骨肉腫；多くの異型細胞を含む顕著な細胞充実度を特徴とし、この異型細胞の多くは、過染色症（核内の大量の濃く染まるDNA）、及びグレードIと比べて増大した核サイズを有する）である。別の具体的な実施態様では、軟骨肉腫は、高悪性度軟骨肉腫（グレードIII軟骨肉腫；際立った多形性の部分、顕著な過染色症を示す大きな細胞、時折見られる巨大な細胞、及び大量の壊死を特徴とする）である。別の具体的な実施態様では、軟骨肉腫は、脱分化した軟骨肉腫（グレードの高い非軟骨性肉腫の近くに高分化型軟骨腫瘍（内軟骨腫又はグレードIIもしくはIIの軟骨肉腫）を含む軟骨肉腫）である。別の具体的な実施態様では、軟骨肉腫は、間葉系軟骨肉腫である。
【０１４２】
特定の実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、軟骨肉腫のいかなるさらなる治療も伴わずに、個体に投与される。特定の他の実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、軟骨肉腫腫瘍の一部もしくは全てを摘出するか、又は軟骨肉腫によって侵された骨の一部もしくは全てを摘出する手術の後に、個体に投与される。特定の他の実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、軟骨肉腫腫瘍の一部もしくは全てを摘出するか、又は軟骨肉腫によって侵された骨の一部もしくは全てを摘出する手術の前、或いは該手術の時に、個体に投与される。特定の他の実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、個体に、例えば、個体内の軟骨肉腫の部位以外の部位又は経路で；例えば、静脈内、動脈内、腹腔内などに全身投与される。特定の他の実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、該軟骨肉腫の部位（該腫瘍が摘出されていない場合）、例えば、個体内の軟骨肉腫の部位もしくはその近くに、又は外科的摘出が行なわれた場合は、軟骨肉腫が摘出された部位もしくはその近くに投与される。
【０１４３】
（5.1.3  併用療法）
骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫、軟骨肉腫、又は本明細書に記載の他の骨関連癌のうちの1つの治療は、癌を有する個体への、第2の療法と組み合わせた胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC（例えば、単離されたBM-MSCもしくは骨髄中のBM-MSC）の投与を含むことができる。様々な実施態様では、第2の療法は、該胎盤細胞と同じ一連の治療において該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCと同時に、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCが投与された後に（例えば、胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSCを投与することを含む一連の治療の終了後に）、又は胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSCの投与前に（例えば、胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSCを投与することを含む一連の治療の開始前に）投与される。特定の実施態様では、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC、並びに第2の療法は、例えば、同じ包装又は容器から投与されるように一緒に処方される。特定の他の実施態様では、胎盤幹細胞及び／又はBM-MSC、並びに第2の療法は、個別投与のために各々処方される。
【０１４４】
したがって、別の態様では、骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫もしくは軟骨肉腫、又は本明細書に記載の他の骨関連癌のうちの1つを有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを、1以上の他の抗癌療法、例えば、1以上の化学療法又は化学療法化合物と組み合わせて投与することを含む、方法が本明細書で提供される。そのような他の抗癌療法を、該胎盤幹細胞及び／もしくはBM-MSCの投与と同時に、該投与と同じ一連の治療の間に、又は該投与とは別に、該個体に投与することができる。具体的な実施態様では、該1以上の抗癌療法は、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与と連続して投与される。別の具体的な実施態様では、該他の抗癌療法又は抗癌療法は、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与前に、該個体に投与され；例えば、一連のそのような他の抗癌療法は、該個体への胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与前に、該個体に投与されて、終了する。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、該他の抗癌療法の投与前に該個体に投与され；例えば、一連の胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、該他の抗癌療法の投与前に該個体に投与され、該個体への該他の抗癌療法又は抗癌療法の投与前に終了する。
【０１４５】
本明細書で使用されるように、「抗癌剤」又は「抗癌療法」は、例えば、臨床研究、前臨床研究、又は科学的研究（事例研究を含む）において、1種類以上の腫瘍又は癌細胞に対する腫瘍増殖抑制効果又は殺腫瘍効果を有することが確認された薬剤又は療法である。
【０１４６】
具体的な実施態様では、抗癌剤は、メルファラン（L-フェニルアラニンマスタード又はL-PAM；商標名Albertanとしても知られる）である。したがって、一実施態様では、多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法は、該個体にメルファラン、例えば、メルファラン（例えば、ALKERAN（登録商標））の治療有効用量（単数又は複数）を投与することを含む。投与は、通常、経口又は静脈内である。別の具体的な実施態様では、抗癌剤は、サリドマイドである。別の具体的な実施態様では、抗癌剤は、アミノ置換サリドマイド類似体又はアミノ置換イミダゾールである。別の具体的な実施態様では、抗癌剤は、ポマリドマイド（ACTIMID（登録商標）という商標名で市販されている）；レナリドミド（REVLIMID（登録商標）という商標名で市販されている）；又はデキサメタゾンと組み合わせたレナリドミドである。別の具体的な実施態様では、抗癌剤治療は、ボルテゾミブ（例えば、VELCADE（登録商標））である。別の具体的な実施態様では、抗癌剤は、（別々に又は一緒に投与される）メルファラン、プレドニゾン、及びサリドマイドの組合せを含む。別の具体的な実施態様では、抗癌剤は、（別々に又は一緒に投与される）ボルテゾミブ、メルファラン、及びプレドニゾンの組合せである。他の具体的な実施態様では、抗癌剤は、シクロホスファミド（例えば、CYTOXAN（登録商標））、ビンクリスチン（例えば、ONCOVIN（登録商標）、VINCASAR PFS（登録商標））、ドキソルビシン（例えば、ADRIAMYCIN RDF（登録商標）、ADRIAMYCIN PFS（登録商標））、又はリポソーム性ドキソルビシン（例えば、DOXIL（登録商標））のうちの1つ又は複数である。
【０１４７】
他の抗癌剤が当技術分野で周知である。したがって、他の具体的な実施態様では、抗癌剤としては、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ジメシル酸ビスナフィド；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；セレコキシブ（COX-2阻害剤）；クロランブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン（eflomithine）塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシウレア；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモホシン；イプロプラチン；イリノテカン；イリノテカン塩酸塩；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；マイトカルシン；マイトクロミン；マイトジリン；マイトマルシン；マイトマイシン；マイトスパー；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニ��リン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；タキソテール；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシナート；硫酸ビンレウロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；及びゾルビシン塩酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
他の抗癌薬としては、20-エピ-1,25ジヒドロキシビタミンD3；5-エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ALL-TKアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストD；アンタゴニストG；アンタレリックス；抗背側化形態形成タンパク質-1；抗アンドロゲン剤、前立腺癌；抗エストロゲン剤；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；グリシン酸アフィディコリン；アポトーシス遺伝子調整因子；アポトーシス調節因子；アプリン酸；アラ-CDP-DL-PTBA；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン1；アキシナスタチン2；アキシナスタチン3；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンIII誘導体；バラノール；バチマスタット；BCR／ABLアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；βラクタム誘導体；β-アレチン；ベタクラマイシンB；ベツリン酸；bFGF阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンA；ビゼレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンC；カンプトテシン誘導体；カペシタビン；カルボキサミド-アミノ-トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；CaRest M3；CARN 700；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ICOS）；カスタノスペルミン；セクロピンB；セトロレリックス；クロリンス（chlorlns）；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス-ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンA；コリスマイシンB；コンブレタスタチンA4；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン816；クリスナトール；クリプトフィシン8；クリプトフィシンA誘導体；クラシンA；シクロペンタアントラキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；シトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンB；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンB；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ-5-アザシチジン；9-ジヒドロタキソール；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンSA；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルニシン塩酸塩；ホルフェニメクス；ホルメスタン；���ストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イマチニブ（例えば、GLEEVEC（登録商標））、イミキモド；免疫賦活ペプチド；インスリン様成長因子−１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；ヨーベングアン；ヨードドキソルビシン；4-イポメアノール；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンB；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドF；三酢酸ラメラリン-N；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病抑制因子；白血球αインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；ロイプロレリン；レバミソール；リアロゾール；線状ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド7；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；細胞溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンA；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシン阻害剤；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；MIF阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；メトナフィド；ミトトキシン線維芽細胞成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；Erbitux、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリル脂質A＋ミオバクテリウム細胞壁sk；モピダモール；マスタード抗癌剤；ミカペルオキシドB；ミコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；N-アセチルジナリン；N-置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素調整因子；ニトロキシド酸化防止剤；ニトルリン；オブリマーセン（GENASENSE（登録商標））；O6-ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導物質；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；多硫酸ペントサンナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニルアセタート；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンA；プラセチンB；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金−トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンJ2；プロテアソーム阻害剤；プロテインA系免疫調整因子；タンパク質キナーゼC阻害剤；微細藻類タンパク質キナーゼC阻害剤；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；rafアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ras阻害剤；ras-GAP阻害剤；脱メチル化レテリプチン；エチドロン酸レニウムRe186；リゾキシン；リボザイム；RIIレチンアミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビギノンB1；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；SarCNU；サルコフィトールA；サルグラモスチム；Sdi 1模倣体；セムスチン；老化由来阻害剤1；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプタートナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンD；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン1；スクアラミン；スチピアミド；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポイエチン；トロンボポイエチン模倣体；チマルファシン；サイモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；スズエチルエチオプルプリン；チラパザミン；二塩化チタノセン；トプセンチン；トレミフェン；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；UBC阻害剤；ウベニメクス；泌尿生殖洞由来成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンB；ベラレソール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；及びジノスタチンスチマラマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
他の実施態様では、併用療法は、破骨細胞の阻害剤、例えば、破骨細胞形成又は破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化の阻害剤と組み合わせた、個体への胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与を含む。具体的な実施態様では、破骨細胞阻害剤は、RANKLの阻害剤、例えば、デノスマブである。別の具体的な実施態様では、破骨細胞阻害剤は、インテグリン又はカテプシンKの阻害剤である。
【０１５０】
別の実施態様では、併用療法は、ビスホスホネートと組み合わせた胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与を含む。具体的な実施態様では、ビスホスホネートは、アレンドロネート（aledronate）（例えば、1日当たり約5mg〜約10mg、又は1週間に1回、約35mg〜約70mgの投薬量；ビタミンD添加の有無を問わない）、イバンドロネート、リセドロネート、クロドロネート、及び／又はパミドロネートである。別の実施態様では、併用療法は、カルシトニン、エストロゲン、副甲状腺ホルモン（例えば、テリパラチド、例えば、FORTEO（登録商標））、又はラロキシフェンのうちの1つ又は複数と組み合わせた胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの投与を含む。
【０１５１】
別の実施態様では、骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫、軟骨肉腫、又は本明細書に記載の他の骨関連癌のうちの1つを有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを、アクチビンアンタゴニスト又はアクチビン受容体RIIa（ActRIIa）アンタゴニスト活性を有する化合物、例えば、ActRIIaアンタゴニストと組み合わせて投与することを含む、方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、該ActRIIaアンタゴニストは、可溶性アクチビン受容体タイプIIA IgC-Fc融合タンパク質（例えば、ACE-011（登録商標））である。例えば、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許出願公開第2009／0142333号を参照されたい。
【０１５２】
別の実施態様では、骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫、軟骨肉腫、又は本明細書に記載の他の骨関連癌のうちの1つを有する個体を治療する方法であって、該個体に単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCを放射線療法と組み合わせて投与することを含む、方法が本明細書で提供される。特定の実施態様では、放射線療法は、骨関連癌に侵されている、骨関連癌を有する個体内の臓器又は組織にX線を投与することを含む。具体的な実施態様では、例えば、該放射線療法、例えば、X線は、多発性骨髄腫によって生じた骨病変、又は軟骨肉腫によって生じた骨病変に投与される。他の具体的な実施態様では、該放射線療法、例えば、X線は、該骨関連癌に侵されている個体の体の半分に投与される。他の具体的な実施態様では、該放射線療法、例えば、X線は、侵された個体の体の全体に投与される。他の実施態様では、該放射線療法は、骨関連癌に侵されている、骨関連癌を有する個体内の臓器又は組織に陽子ビーム又は電子ビームを投与することを含む。特定の他の実施態様では、該放射線療法は、造血幹細胞置換療法（例えば、個体の既存の造血系を死滅させるための放射線療法）に備えて投与される。
【０１５３】
別の実施態様では、単離された胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、例えば、骨関連癌によって生じる骨病変又はその近くでの投与によって、例えば、骨関連癌と関連する骨病変を治療するための代用骨と組み合わされる。具体的な実施態様では、該代用骨は、生理的に許容し得るセラミック材料、例えば、モノリン酸カルシウム、ジリン酸カルシウム、トリリン酸カルシウム、α-トリリン酸カルシウム、β-トリリン酸カルシウム、及びテトラリン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムマグネシウム、生体活性ガラス（例えば、BIOGLASS（登録商標））、又はそれらのいずれかの混合物である。別の具体的な実施態様では、該代用骨は、多孔性の生体適合性セラミック材料（例えば、SURGIBONE（登録商標）、ENDOBON（登録商標）、CEROS（登録商標）など）、又は石灰化コラーゲンの骨移植用製品（例えば、HEALOS（商標）、VITOSS（登録商標）、RHAKOSS（商標）、及びCORTOSS（登録商標）など）である。
【０１５４】
（5.2  胎盤幹細胞）
骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫を有するか、又は骨関連癌の細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞を有する個体の治療において有用な単離された胎盤幹細胞は、胎盤又はその部分から得ることができ、組織培養基材（例えば、コーティングしていない組織培養プラスチック）に接着し、かつ多能性細胞又は幹細胞の特徴を有する細胞である。特定の実施態様では、本明細書に開示されている方法において有用な単離された胎盤幹細胞は、1以上の非胎盤細胞型に分化する能力を有する。本明細書に開示されている方法において有用な胎盤幹細胞は、本明細書に、並びに例えば、その開示がその全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,486,276号、及び米国特許出願公開第2007／0275362号に記載されている。胎盤幹細胞は、それらの細胞が当業者に理解されているように、栄養芽層でも、細胞栄養芽層でも、胚性生殖細胞でも、胚性幹細胞でもない。
【０１５５】
本明細書に開示されている方法において有用な単離された胎盤幹細胞は、胎児起源のもの又は母親起源のもののいずれかであることができる（すなわち、それぞれ、胎児又は母親のいずれかの遺伝子型を有することができる）。好ましくは、単離された胎盤幹細胞及び単離された胎盤幹細胞の集団は、胎児起源のものである。単離された胎盤幹細胞、又は単離された胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、もっぱら胎児起源のもの又は母親起源のものである単離された胎盤幹細胞を含むことができるか、又は胎児起源と母親起源の両方の単離された胎盤幹細胞の混合集団を含むことができる。本明細書に記載の胎盤幹細胞のいずれかの特定の実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、非母親起源のものである。特定の他の実施態様では、該胎盤幹細胞は、母親細胞を実質的に含まず；例えば、該細胞の少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、非母親起源のものである。
【０１５６】
単離された胎盤幹細胞、及び単離された胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、以下で論じられている形態的特性、マーカー特性、及び培養特性によって同定及び選択することができる。特定の実施態様では、本明細書に記載の胎盤幹細胞はいずれも、レシピエント、例えば、骨関連癌、又は骨関連癌の細胞、例えば、多発性骨髄腫もしくは多発性骨髄腫細胞、又は軟骨肉腫もしくは軟骨肉腫細胞、又は別の骨関連癌もしくは別の骨関連癌の細胞を有する個体にとって自己由来である。特定の他の実施態様では、本明細書に記載の胎盤幹細胞はいずれも、レシピエント、例えば、骨関連癌、又は骨関連癌の細胞、例えば、多発性骨髄腫もしくは多発性骨髄腫細胞、又は軟骨肉腫もしくは軟骨肉腫細胞、又は別の骨関連癌もしくは別の骨関連癌の細胞を有する個体にとって異種である。
【０１５７】
特定の実施態様では、本発明の方法において有用な胎盤幹細胞、例えば、本明細書に記載の胎盤幹細胞は、満期胎盤、すなわち、分娩後の哺乳動物、例えば、ヒトの胎盤から得られる。特定の他の実施態様では、本発明の方法において有用な胎盤幹細胞、例えば、本明細書に記載の胎盤幹細胞は、出産前の哺乳動物、例えば、ヒトの胎盤から得られる。
【０１５８】
（5.2.1  物理的及び形態的特性）
本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞（PDAC）は、初代培養又は細胞培養で培養したとき、組織培養基材、例えば、組織培養容器表面（例えば、組織培養プラスチック）、又はラミニン、コラーゲン（例えば、天然物もしくは変性物）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、及び細胞外膜タンパク質（例えば、MATRIGEL（登録商標）（BD Discovery Labware, Bedford, Mass.））などの細胞外マトリックスもしくはリガンドをコーティングした組織培養表面に接着する。培養下の単離された胎盤幹細胞は、通常、線維芽細胞のような星状の外観をしており、いくつかの細胞質突起が中央の細胞体から伸びている。しかしながら、単離された胎盤幹細胞は、線維芽細胞よりも多くのそのような突起を示すので、これらの細胞は、同じ条件下で培養された線維芽細胞と形態的に区別することができる。形態的には、単離された胎盤幹細胞は、造血幹細胞からも区別することができ、造血幹細胞は、通常、培養下では、より丸みを帯びた、又は敷石状の形態をとり、かつ組織培養プラスチックに接着しない。形態的に、該胎盤幹細胞は、栄養芽層又は細胞栄養芽層からも区別することができ、栄養芽層又は細胞栄養芽層は、丸みを帯びているか又は上皮細胞のように見える傾向があり、かつ細胞栄養芽層の場合、単核胎盤幹細胞と比べて多核である。胎盤幹細胞は単細胞性であり、かつ培養中及び複数回の継代にわたって単細胞性であり続け、例えば、培養下、例えば、大気下、成長培地中での培養下、又は95％大気／5％CO2下、成長培地中での培養下で、多核細胞を形成しない。
【０１５９】
特定の実施態様では、本明細書に開示されている方法、例えば、治療方法、又は骨関連癌細胞の成長を抑制するか、もしくは破骨細胞前駆体の破骨細胞への分化を抑制する方法において有用な単離された胎盤幹細胞は、成長培地中で培養したときに、胚様体様体を発生させる。胚様体様体は当技術分野で周知であり、かつ増殖している単離された胎盤幹細胞の接着層の最上部で成長することができる不連続な細胞塊である。該細胞塊が、胚性幹細胞の培養物から成長する細胞塊である胚様体に似ているので、「胚様体様」という用語が用いられる。胚様体様体が、単離された胎盤幹細胞の増殖する培養物中に発生することができる成長培地としては、例えば、DMEM-LG（例えば、Gibco製）；2％胎仔ウシ血清（例えば、Hyclone Labs.製）；1×インスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）；1×リノール酸-ウシ血清アルブミン（LA-BSA）；10-9Mデキサメタゾン（例えば、Sigma製）；10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート（例えば、Sigma製）；上皮成長因子10ng／mL（例えば、R&D Systems製）；及び血小板由来成長因子（PDGF-BB）10ng／mL（例えば、R&D Systems製）を含む培地が挙げられる。
【０１６０】
（5.2.2  細胞表面マーカー、分子マーカー、及び遺伝子マーカー）
単離された胎盤幹細胞は、多能性細胞又は幹細胞の特徴を有し、かつ幹細胞を含む細胞、又は幹細胞を含む細胞の集団を同定及び／又は単離するために用いることができる複数のマーカーを発現する組織培養プラスチック接着性ヒト胎盤幹細胞である。単離された胎盤幹細胞には、胎盤、又はその一部から直接得られる細胞及び胎盤幹細胞含有細胞集団が含まれる。単離された胎盤幹細胞集団には、培養下の単離された胎盤幹細胞の集団（すなわち、2個以上の単離された胎盤幹細胞）、及び容器、例えば、バッグの中の集団も含まれる。本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞は、骨髄由来間葉系細胞でも、脂肪由来間葉系幹細胞でも、臍帯血、胎盤血、又は末梢血から得られる間葉系細胞でもない。本明細書に記載の方法及び組成物において有用な胎盤幹細胞は、例えば、その開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,311,904号；第7,311,905号；及び第7,468,276号；並びに米国特許出願公開第2007／0275362号に記載されている。本明細書に記載の胎盤幹細胞の実施態様のいずれかの具体的な実施態様では、細胞は、哺乳動物、例えば、ヒトのものである。
【０１６１】
特定の実施態様では、単離された胎盤幹細胞は、単離された胎盤幹細胞である。特定の他の実施態様では、単離された胎盤細胞は、単離された胎盤多能性細胞である。一実施態様では、本明細書に記載の方法において有用な単離された胎盤幹細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能なCD34-、CD10+、及びCD105+である。本明細書で使用されるように、「によって検出可能な」、「によって決定可能な」などの語句は、細胞が「単離された」ものとなるために、細胞が、列挙されたマーカーの発現について評価される必要があることを示すものではないし、細胞が、該マーカーを用いて単離される必要があることを示すものでもない。別の具体的な実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+胎盤幹細胞は、例えば、インビトロもしくはインビボのいずれか、又は両方で、神経表現型の細胞、骨形成表現型の細胞、及び／又は軟骨形成表現型の細胞に分化する潜在能力を有する。別の具体的な実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+胎盤幹細胞はさらに、CD200+である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD34-、CD10+、CD105+胎盤幹細胞はさらに、CD45-又はCD90+である。別の具体的な実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+胎盤幹細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出可能なCD45-及びCD90+である。別の具体的な実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出可能なCD90+又はCD45-である。具体的な実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞はさらに、CD44+、CD45-、CD90+、CD166+、KDR+、又はCD133-のうちの1つ又は複数である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞はさらに、CD44+、CD45-、CD90+、CD166+、KDR+、及びCD133-である。別の具体的な実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出可能なCD90+及びCD45-であり、すなわち、該胎盤幹細胞は、CD34-、CD10+、CD45-、CD90+、CD105+、及びCD200+である。別の具体的な実施態様では、該CD34-、CD10+、CD45-、CD90+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞はさらに、CD44+、CD80-、及び／又はCD86-である。別の具体的な実施態様では、該CD34-、CD10+、CD44+、CD45-、CD90+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞はさらに、CD80-、CD86-、CD117-、CD133-、サイトケラチン+、KDR+、HLA-A、B、C+、HLA-DR、DP、DQ-、及びHLA-G-のうちの1つ又は複数である。別の具体的な実施態様では、該CD34-、CD10+、CD105+胎盤幹細胞はさらに、SSEA1-、SSEA3-、及び／又はSSEA4-のうちの1つ又は複数である。別の具体的な実施態様では、該CD34-、CD10+、CD105+胎盤幹細胞はさらに、SSEA1-、SSEA3-、及びSSEA4-である。
【０１６２】
別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+、かつCD44+、CD45-、CD90+、CD166+、KDR-、又はCD133-のうちの1つ又は複数である。より具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞は、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+、CD44+、CD45-、CD90+、CD166+、KDR-、及びCD133-である。別の実施態様では、該胎盤幹細胞は、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+、かつHLA ABC+、HLA DR、DQ、DP-、CD80-、CD86-、CD98-、又はPD-L1+のうちの1つ又は複数である。より具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞は、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+、HLA ABC+、HLA DR、DQ、DP-、CD80-、CD86-、CD98-、及びPD-L1+である。特定の実施態様では、該胎盤幹細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能な、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+、かつCD3-、CD9-、CD38-、CD45-、CD80-、CD86-、CD133-、HLA-DR、DP、DQ-、SSEA3-、SSEA4-、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、HLA-A、B、C+、PDL1+、ABC-p+、及び／又はOCT-4+のうちの1つ又は複数である。他の実施態様では、上記のCD34-、CD10+、CD105+胎盤幹細胞はいずれもさらに、CD29+、CD38-、CD44+、CD54+、SH3+、又はSH4+の1つ又は複数である。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞はさらに、CD44+である。上記の単離されたCD34-、CD10+、CD105+胎盤幹細胞のいずれかの別の具体的な実施態様では、細胞はさらに、CD117-、CD133-、KDR-（VEGFR2-）、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、もしくはプログラム死-1リガンド（PDL1）+のうちの1つもしくは複数、又はそれらの任意の組合せである。
【０１６３】
別の実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+胎盤幹細胞はさらに、CD3-、CD9-、CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH3+（CD73+）、SH4+（CD73+）、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+（CD105+）、CD106／VCAM+、CD117-、CD144／VE-カドヘリンlow、CD146+、CD166+、CD184／CXCR4-、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-（VEGFR2-）、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、HLA-G-、もしくはプログラム死-1リガンド（PDL1）+のうちの1つもしくは複数、又はそれらの任意の組合せである。別の実施態様では、CD3-、CD9-、CD34-、CD10+、CD105+胎盤幹細胞はさらに、CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54／ICAM+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH3+（CD73+）、SH4+（CD73+）、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+（CD105+）、CD106／VCAM+、CD117-、CD144／VE-カドヘリンlow、CD146+、CD166+、CD184／CXCR4-、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-（VEGFR2-）、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、HLA-G-、及びプログラム死-1リガンド（PDL1）+である。
【０１６４】
別の具体的な実施態様では、本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞はいずれも、フローサイトメトリーによって検出可能なABC-p+、及び／又はRT-PCRによって決定可能なOCT-4+（POU5F1+）であり、ここで、ABC-pは、胎盤特異的ABC輸送体タンパク質（乳癌耐性タンパク質（BCRP）及びミトキサントロン耐性タンパク質（MXR）としても知られる）であり、かつOCT-4は、オクタマー-4タンパク質（POU5F1）である。別の具体的な実施態様では、本明細書に記載の胎盤幹細胞はいずれもさらに、フローサイトメトリーによって決定可能なSSEA3-又はSSEA4-であり、ここで、SSEA3はステージ特異的胚抗原3であり、かつSSEA4はステージ特異的胚抗原4である。別の具体的な実施態様では、本明細書に記載の胎盤幹細胞はいずれもさらに、SSEA3-及びSSEA4-である。
【０１６５】
別の具体的な実施態様では、本明細書に記載の胎盤幹細胞はいずれも、MHC-I+（例えば、HLA-A、B、C+）、MHC-II-（例えば、HLA-DP、DQ、DR-）、又はHLA-G-のうちの1つ又は複数である。別の具体的な実施態様では、本明細書に記載の胎盤幹細胞はいずれも、MHC-I+（例えば、HLA-A、B、C+）、MHC-II-（例えば、HLA-DP、DQ、DR-）、及びHLA-G-のうちの1つ又は複数である。
【０１６６】
本明細書に開示されている方法及び組成物において有用である、単離された胎盤幹細胞を含む、例えば、単離された胎盤幹細胞が濃縮されている細胞の集団も本明細書で提供される。好ましい細胞の集団は、単離された胎盤幹細胞を含み、ここで、該細胞の集団内の細胞の少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は98％は、単離されたCD10+、CD105+、及びCD34-胎盤幹細胞である。具体的な実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+胎盤幹細胞はさらに、CD200+である。別の具体的な実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出可能なCD90+又はCD45-である。別の具体的な実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出可能なCD90+及びCD45-である。別の具体的な実施態様では、上記の単離されたCD34-、CD10+、CD105+胎盤幹細胞はいずれもさらに、CD29+、CD38-、CD44+、CD54+、SH3+、又はSH4+のうちの1つ又は複数である。別の具体的な実施態様では、単離されたCD34-、CD10+、CD105+胎盤幹細胞、又は単離されたCD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞はさらに、CD44+である。上記の単離されたCD34-、CD10+、CD105+胎盤幹細胞を含む細胞の集団のいずれかの具体的な実施態様では、単離された胎盤幹細胞はさらに、CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH3+（CD73+）、SH4+（CD73+）、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+（CD105+）、CD106／VCAM+、CD117-、CD144／VE-カドヘリンlow、CD184／CXCR4-、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-（VEGFR2-）、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、HLA-G-、もしくはプログラム死-1リガンド（PDL 1）+のうちの1つもしくは複数、又はそれらの任意の組合せである。別の具体的な実施態様では、CD34-、CD10+、CD105+細胞はさらに、CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54／ICAM+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH3+（CD73+）、SH4+（CD73+）、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+（CD105+）、CD106／VCAM+、CD117-、CD144／VE-カドヘリンlow、CD184／CXCR4-、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-（VEGFR2-）、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、HLA-G-、及びプログラム死-1リガンド（PDL1）+である。
【０１６７】
特定の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT-4+、及びABC-p+のうちの1つもしくは複数、又は全てであり、ここで、該単離された胎盤幹細胞は、胎盤組織の物理的及び／又は酵素的破壊によって得られる。具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、OCT-4+及びABC-p+である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、OCT-4+及びCD34-であり、ここで、該単離された胎盤幹細胞は、以下の特徴のうちの少なくとも1つ、又は全てを有する：CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH3+、SH4+、SSEA3-、及びSSEA4-。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、OCT-4+、CD34-、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH3+、SH4+、SSEA3-、及びSSEA4-である。別の実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、OCT-4+、CD34-、SSEA3-、及びSSEA4-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、OCT-4+及びCD34-であり、かつSH2+又はSH3+のいずれかである。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、OCT-4+、CD34-、SH2+、及びSH3+である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、OCT-4+、CD34-、SSEA3-、及びSSEA4-であり、かつSH2+又はSH3+のいずれかである。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、OCT-4+及びCD34-であり、かつSH2+又はSH3+のいずれかであり、かつCD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SSEA3-、又はSSEA4-のうちの少なくとも1つである。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、OCT-4+、CD34-、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SSEA3-、及びSSEA4-であり、かつSH2+又はSH3+のいずれかである。
【０１６８】
別の実施態様では、本明細書に開示されている方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、SH2+、SH3+、SH4+、及びOCT-4+である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、CD34-、CD45-、SSEA3-、又はSSEA4-である。別の実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、及びSSEA4-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、及びSSEA4-、CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、OCT-4+、CD34-、又はCD45-である。
【０１６９】
別の実施態様では、本明細書に開示されている方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD34-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、及びSH4+であり；ここで、該単離された胎盤幹細胞はさらに、OCT-4+、SSEA3-、又はSSEA4-のうちの1つ又は複数である。
【０１７０】
特定の実施態様では、本明細書に開示されている方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、CD200+又はHLA-G-である。具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、CD200+及びHLA-G-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞はさらに、CD73+及びCD105+である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞はさらに、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞はさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、及びCD105+である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200+又はHLA-G-胎盤幹細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、該単離された胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団内での胚様体様体の形成を促進する。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、幹細胞でも多能性細胞でもない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
【０１７１】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、CD200+、HLA-G-胎盤幹細胞を含む、例えば、CD200+、HLA-G-胎盤幹細胞が濃縮されている細胞の集団である。具体的な実施態様では、該集団は、胎盤細胞の集団である。様々な実施態様では、該細胞集団内の細胞の少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、又は少なくとも約60％は、単離されたCD200+、HLA-G-胎盤幹細胞である。特定の実施態様では、該細胞集団の細胞の少なくとも約70％は、単離されたCD200+、HLA-G-胎盤幹細胞である。特定の他の実施態様では、該細胞の少なくとも約90％、95％、又は99％は、単離されたCD200+、HLA-G-胎盤幹細胞である。該細胞集団の具体的な実施態様では、該単離されたCD200+、HLA-G-胎盤幹細胞は、CD73+及びCD105+でもある。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200+、HLA-G-胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、又はCD45-でもある。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200+、HLA-G-胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、及びCD105+でもある。別の具体的な実施態様では、該細胞集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200+、HLA-G-胎盤幹細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
【０１７２】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、CD73+、CD105+、及びCD200+である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、HLA-G-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、単離された胎盤幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
【０１７３】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離されたCD73+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞を含む、例えば、単離されたCD73+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞が濃縮されている細胞の集団である。様々な実施態様では、該細胞集団の細胞の少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、又は少なくとも約60％は、単離されたCD73+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞である。別の実施態様では、該細胞の集団内の該細胞の少なくとも約70％は、単離されたCD73+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞である。別の実施態様では、該細胞の集団内の細胞の少なくとも約90％、95％、又は99％は、単離されたCD73+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞である。該集団の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、HLA-G-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞はさらに、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞はさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞はさらに、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G-である。別の具体的な実施態様では、該胎盤細胞の集団は、幹細胞でない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離されている。
【０１７４】
特定の他の実施態様では、単離された胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT-4+、HLA-G-、又はABC-p+のうちの1つ又は複数である。具体的な実施態様では、単離された胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、及びOCT-4+である。別の具体的な実施態様では、単離された胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD45-、CD54+、SH2+、SH3+、及びSH4+である。別の具体的な実施態様では、単離された胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD45-、CD54+、SH2+、SH3+、SH4+、及びOCT-4+である。別の具体的な実施態様では、単離された胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、HLA-G-、SH2+、SH3+、SH4+である。別の具体的な実施態様では、単離された胎盤幹細胞は、OCT-4+及びABC-p+である。別の具体的な実施態様では、単離された胎盤幹細胞は、SH2+、SH3+、SH4+、及びOCT-4+である。別の実施態様では、単離された胎盤幹細胞は、OCT-4+、CD34-、SSEA3-、及びSSEA4-である。具体的な実施態様では、単離されたOCT-4+、CD34-、SSEA3-、及びSSEA4-胎盤幹細胞はさらに、CD10+、CD29+、CD34-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、及びSH4+である。別の実施態様では、単離された胎盤幹細胞は、OCT-4+及びCD34-であり、かつSH3+又はSH4+のいずれかである。別の実施態様では、単離された胎盤幹細胞は、CD34-、かつCD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、又はOCT-4+のいずれかである。
【０１７５】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、CD200+及びOCT-4+である。具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、CD73+及びCD105+である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、HLA-G-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+、及びHLA-G-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離されている。
【０１７６】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、CD200+、OCT-4+胎盤幹細胞を含む、例えば、CD200+、OCT-4+胎盤幹細胞が濃縮されている細胞の集団である。様々な実施態様では、該細胞集団の細胞の少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、又は少なくとも約60％は、単離されたCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞である。別の実施態様では、該細胞の少なくとも約70％は、該単離されたCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞である。別の実施態様では、該細胞集団の細胞の少なくとも約80％、90％、95％、又は99％は、該単離されたCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞である。該単離された集団の具体的な実施態様では、該単離されたCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞はさらに、CD73+及びCD105+である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞はさらに、HLA-G-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞はさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞はさらに、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+、及びHLA-G-である。別の具体的な実施態様では、該細胞集団は、単離されたCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
【０１７７】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、CD73+、CD105+、及びHLA-G-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73+、CD105+、及びHLA-G-胎盤幹細胞はさらに、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞はさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞はさらに、OCT-4+である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞はさらに、CD200+である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞はさらに、CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+、及びCD200+である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞は、該単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
【０１７８】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離されたCD73+、CD105+、及びHLA-G-胎盤幹細胞を含む、例えば、単離されたCD73+、CD105+、及びHLA-G-胎盤幹細胞が濃縮されている細胞の集団である。様々な実施態様では、該細胞の集団内の細胞の少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、又は少なくとも約60％は、単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞である。別の実施態様では、該細胞の集団内の細胞の少なくとも約70％は、単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞である。別の実施態様では、該細胞の集団内の細胞の少なくとも約90％、95％、又は99％は、単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞である。上記の集団の具体的な実施態様では、該単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞はさらに、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞はさらに、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞はさらに、OCT-4+である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞はさらに、CD200+である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞はさらに、CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+、及びCD200+である。別の具体的な実施態様では、該細胞集団は、CD73+、CD105+、HLA-G-胎盤幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
【０１７９】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、単離されたHLA-A、B、C+、CD45-、CD133-、及びCD34-胎盤幹細胞である。別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離された胎盤細胞を含む細胞の集団であり、ここで、該単離された細胞の集団内の細胞の少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、又は少なくとも約99％は、単離されたHLA-A、B、C+、CD45-、CD133-、及びCD34-胎盤幹細胞である。具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞又は単離された胎盤幹細胞の集団は、HLA-A、B、C+、CD45-、CD133-、及びCD34-胎盤幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。本明細書に記載の胎盤幹細胞のいずれかの別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、非母親起源のものである。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞の集団は、母親成分を実質的に含まず；例えば、該単離された胎盤細胞の集団内の該細胞の少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、非母親起源のものである。
【０１８０】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、単離されたCD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-、及びCD133-胎盤幹細胞である。別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、該単離された胎盤幹細胞を含む細胞の集団であり、ここで、該細胞の集団内の細胞の少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、又は少なくとも約99％が、該単離されたCD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-、及びCD133-胎盤幹細胞である。具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞又は単離された胎盤幹細胞の集団は、該単離された胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-、及びCD133-胎盤幹細胞は、非母親起源のものである、すなわち、胎児の遺伝子型を有する。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞の集団内の該細胞の少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、非母親起源のものである。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞又は単離された胎盤幹細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離されている。
【０１８１】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、単離されたCD10-、CD33-、CD44+、CD45-、及びCD117-胎盤幹細胞である。別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、該単離された胎盤幹細胞を含む、例えば、該単離された胎盤幹細胞が濃縮されている細胞の集団であり、ここで、該細胞の集団内の細胞の少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、又は少なくとも約99％は、単離されたCD10-、CD33-、CD44+、CD45-、及びCD117-胎盤幹細胞である。具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞又は単離された胎盤幹細胞の集団は、該胎盤幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、非母親起源のものである。別の具体的な実施態様では、該細胞集団の該胎盤幹細胞の少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、非母親起源のものである。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞又は単離された胎盤幹細胞の集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
【０１８２】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、単離されたCD10-、CD13-、CD33-、CD45-、及びCD117-胎盤幹細胞である。別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離されたCD10-、CD13-、CD33-、CD45-、及びCD117-胎盤幹細胞を含む、例えば、単離されたCD10-、CD13-、CD33-、CD45-、及びCD117-胎盤幹細胞が濃縮されている細胞の集団であり、ここで、該集団内の細胞の少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、又は少なくとも約99％は、CD10-、CD13-、CD33-、CD45-、及びCD117-胎盤幹細胞である。具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞又は単離された胎盤幹細胞の集団は、該胎盤幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、非母親起源のものである。別の具体的な実施態様では、該細胞集団の該細胞の少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、非母親起源のものである。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞又は単離された胎盤幹細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離されている。
【０１８３】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、HLA A、B、C+、CD45-、CD34-、及びCD133-であり、かつさらに、CD10+、CD13+、CD38+、CD44+、CD90+、CD105+、CD200+、及び／又はHLA-G-であり、かつ／又はCD117陰性である。別の実施態様では、本明細書に記載の方法において有用な細胞集団は、該単離された胎盤幹細胞を含む細胞の集団であり、ここで、該集団内の細胞の少なくとも約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は約99％は、HLA A、B、C-、CD45-、CD34-、CD133-であり、かつさらに、CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200陽性、並びに／又はCD117及び／もしくはHLA-G陰性である単離された胎盤幹細胞である。具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞又は単離された胎盤幹細胞の集団は、該胎盤幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、非母親起源のものである。別の具体的な実施態様では、該細胞集団の該細胞の少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、非母親起源のものである。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞又は単離された胎盤幹細胞の集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
【０１８４】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、抗体結合によって決定可能なCD200+及びCD10+、かつ抗体結合とRT-PCRの両方によって決定可能なCD117-である。別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、CD10+、CD29-、CD54+、CD200+、HLA-G-、MHCクラスI+、及びβ2-ミクログロブリン+である。別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、少なくとも1つの細胞マーカーの発現が、間葉系幹細胞（例えば、骨髄由来間葉系幹細胞）の場合よりも少なくとも2倍大きい胎盤細胞である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、非母親起源のものである。別の具体的な実施態様では、該細胞集団の該細胞の少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、非母親起源のものである。
【０１８５】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54／ICAM+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、CD80-、CD86-、CD103-、CD104-、CD105+、CD106／VCAM+、CD144／VE-カドヘリンlow、CD184／CXCR4-、β2-ミクログロブリンlow、MHC-Ilow、MHC-II-、HLA-Glow、及び／又はPDL1lowのうちの1つ又は複数である。具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、少なくともCD29+及びCD54+である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、少なくともCD44+及びCD106+である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、少なくともCD29+である。
【０１８６】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離された胎盤幹細胞を含み、ここで、該細胞集団の細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、又は99％は、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54／ICAM+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、CD80-、CD86-、CD103-、CD104-、CD105+、CD106／VCAM+、CD144／VE-カドヘリンdim、CD184／CXCR4-、β2-ミクログロブリンdim、HLA-Idim、HLA-II-、HLA-Gdim、及び／又はPDL1dimのうちの1つ又は複数である単離された胎盤幹細胞である。別の具体的な実施態様では、該細胞集団の細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、又は99％は、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54／ICAM+、CD62-E-、CD62-L-、CD62-P-、CD80-、CD86-、CD103-、CD104-、CD105+、CD106／VCAM+、CD144／VE-カドヘリンdim、CD184／CXCR4-、β2-ミクログロブリンdim、MHC-Idim、MHC-II-、HLA-Gdim、及びPDL1dim胎盤幹細胞である。
【０１８７】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT-4+、及びABC-p+のうちの1つもしくは複数、又は全てであり、ここで、ABC-pは、胎盤特異的ABC輸送体タンパク質（乳癌耐性タンパク質（BCRP）及びミトキサントロン耐性タンパク質（MXR）としても知られる）であり、ここで、該単離された胎盤幹細胞は、臍帯血が抜かれ、かつ残留血液を取り除くように灌流された、哺乳動物、例えば、ヒトの胎盤の灌流によって得られる。
【０１８８】
本明細書に記載の胎盤幹細胞の実施態様のいずれかの別の具体的な実施態様では、該細胞は、テロメラーゼ遺伝子発現が陰性であるか、テロメラーゼ活性が陰性であるか、又は両方である。テロメラーゼ遺伝子発現は、例えば、ドットブロットもしくはスロットブロットなどを用いるテロメラーゼRNAの検出；又はテロメア反復増幅プロトコル（TRAP）アッセイ（例えば、Millipore製のTRAPEZE（登録商標）ELISAアッセイキット、蛍光分析アッセイキット、もしくはゲルベースのアッセイキット）を用いて検出することができる。
【０１８９】
本明細書に記載の胎盤幹細胞の実施態様のいずれかの別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞は、ビメンチン陽性であり、例えば、該胎盤幹細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は98％がビメンチンを発現する。ビメンチンは、例えば、ビメンチンに対する1種以上の抗体、例えば、Abcamから入手可能な抗体を用いるフローサイトメトリーによるか；インサイチュ蛍光染色によるか、又は同様の方法によって検出することができる。
【０１９０】
本明細書に記載の胎盤幹細胞の実施態様のいずれかの別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞は、検出可能な量のヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）を分泌しない。ヒト絨毛性ゴナドトロピンは、例えば、hCGモノクローナル抗体HCG1（Abcam）、又はポリクローナル抗hCG抗体（Abcam, Novus Biologicals）などを用いるELISA又は免疫蛍光によって検出することができる。
【０１９１】
本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞のいずれかの別の実施態様では、該単離された胎盤幹細胞の集団は、ナチュラルキラー細胞ではないCD56+組織培養プラスチック接着性胎盤細胞を含む。具体的な実施態様では、該集団は、CD56-FITC（フルオレセインイソチオシアネート）を用いてフローサイトメトリーによって決定可能な、該単離された胎盤幹細胞の集団内の該CD56+胎盤細胞の約1％〜約30％を含む。別の具体的な実施態様では、該集団は、CD56-APC（アロフィコシアニン）を用いてフローサイトメトリーによって決定可能な、該単離された胎盤幹細胞の集団内の該CD56+胎盤細胞の約16％〜約62％を含む。
【０１９２】
上記の特徴のいずれかの別の具体的な実施態様では、細胞マーカー（例えば、分化抗原群又は免疫学的マーカー）の発現は、フローサイトメトリーによって決定可能であり；別の具体的な実施態様では、該マーカーの発現は、RT-PCRによって決定可能である。
【０１９３】
遺伝子プロファイリングによって、単離された胎盤幹細胞は、他の細胞、例えば、間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞と区別可能であることが確認されている。本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞は、例えば、その発現が、骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、単離された胎盤幹細胞、又は特定の単離された臍帯幹細胞で有意により高い、1種以上の遺伝子の発現に基づいて、間葉系幹細胞と区別することができる。特に、本明細書で提供される治療方法において有用な単離された胎盤幹細胞は、その発現が、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞でよりも、単離された胎盤幹細胞で有意により高い（すなわち、少なくとも2倍高い）1種以上の遺伝子の発現に基づいて、間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞と区別することができ、ここで、該1種以上の遺伝子は、これらの細胞を同等の条件下で成長させたとき、ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HLA-G、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、ZC3H12A、又は前述のもののいずれかの組合せである。例えば、その開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許出願公開第2007／0275362号を参照されたい。特定の具体的な実施態様では、該1種以上の遺伝子の該発現は、例えば、RT-PCR、又は例えば、U133-Aマイクロアレイ（Affymetrix）を用いるマイクロアレイ解析によって決定される。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、DMEM-LG（例えば、Gibco製）；2％胎仔ウシ血清（例えば、Hyclone Labs.製）；1×インスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）；1×リノール酸-ウシ血清アルブミン（LA-BSA）；10-9Mデキサメタゾン（例えば、Sigma製）；10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート（例えば、Sigma製）；上皮成長因子10ng／mL（例えば、R&D Systems製）；及び血小板由来成長因子（PDGF-BB）10ng／mL（例えば、R&D Systems製）を含む培地中で、何回かの集団倍加、例えば、約3〜約35回の範囲の集団倍加の間、培養したときに、該1種以上の遺伝子を発現する。別の具体的な実施態様では、単離された胎盤幹細胞に特異的な遺伝子は、CD200である。通常、特定の遺伝子、例えば、本明細書に記載の遺伝子のいずれかの発現は、胎盤幹細胞の集団内の遺伝子の総発現の解析によって評価されることが理解されるべきである。
【０１９４】
これらの遺伝子に対する特異的な配列は、2008年3月現在、GenBankで、例えば、アクセッション番号NM_001615（ACTG2）、BC065545（ADARB1）、（NM_181847（AMIG02）、AY358590（ARTS-1）、BC074884（B4GALT6）、BC008396（BCHE）、BC020196（C11orf9）、BC031103（CD200）、NM_001845（COL4A1）、NM_001846（COL4A2）、BC052289（CPA4）、BC094758（DMD）、AF293359（DSC3）、NM_001943（DSG2）、AF338241（ELOVL2）、AY336105（F2RL1）、NM_08215（FLJ10781）、AY416799（GATA6）、BC075798（GPR126）、NM_016235（GPRC5B）、AF340038（ICAM1）、BC000844（IER3）、BC066339（IGFBP7）、BC013142（IL1A）、BT019749（IL6）、BC007461（IL18）、（BC072017）KRT18、BC075839（KRT8）、BC060825（LIPG）、BC065240（LRAP）、BC010444（MATN2）、BC011908（MEST）、BC068455（NFE2L3）、NM_014840（NUAK1）、AB006755（PCDH7）、NM_014476（PDLIM3）、BC126199（PKP-2）、BC090862（RTN1）、BC002538（SERPINB9）、BC023312（ST3GAL6）、BC001201（ST6GALNAC5）、BC126160又はBC065328（SLC12A8）、BC025697（TCF21）、BC096235（TGFB2）、BC005046（VTN）、及びBC005001（ZC3H12A）において見出すことができる。
【０１９５】
特定の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、これらの細胞を同等の条件下で成長させたとき、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも高いレベル、例えば、検出可能に高いレベルで、ACTG2、ADARB1、AMIG02、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HLA-G、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、及びZC3H12Aの各々を発現する。
【０１９６】
具体的な実施態様では、胎盤幹細胞は、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞（BM-MSC）よりも高いレベル、例えば、検出可能に高いレベルで、CD200及びARTS1（1型腫瘍壊死因子のアミノペプチダーゼ調節因子）；CD200及びNUAK1、ARTS-1、及びLRAP（白血球由来アルギニンアミノペプチダーゼ）；IL6（インターロイキン-6）及びTGFB2（形質転換成長因子、β2）；IL6及びKRT18（ケラチン18）；IER3（即初期応答3）、MEST（中胚葉特異的転写産物ホモログ）及びTGFB2；CD200及びIER3；CD200及びIL6；CD200及びKRT18；CD200及びLRAP；CD200及びMEST；CD200及びNFE2L3（核因子（赤血球由来2）-様3）；又はCD200及びTGFB2を発現し、ここで、該骨髄由来間葉系幹細胞は、該単離された胎盤幹細胞が経た継代数と同等の培養継代数を経たものである。他の具体的な実施態様では、胎盤幹細胞は、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞BM-MSCよりも高いレベル、例えば、検出可能に高いレベルで、ARTS-1、CD200、IL6、及びLRAP；ARTS-1、IL6、TGFB2、IER3、KRT18、及びMEST；CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3、及びTGFB2；ARTS-1、CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3、及びTGFB2；又はIER3、MEST、及びTGFB2を発現し、ここで、該骨髄由来間葉系幹細胞は、該単離された胎盤幹細胞が経た継代数と同等の培養継代数を経たものである。
【０１９７】
骨髄由来間葉系幹細胞と比べたときの、上に言及した遺伝子の発現、例えば、示差的発現を標準的な技術で評価することができる。例えば、遺伝子（複数可）の配列に基づくプローブを個々に選択し、従来技術で構築することができる。該遺伝子の発現は、例えば、該遺伝子の1つ又は複数に対するプローブを含むマイクロアレイ、例えば、Affymetrix GENECHIP（登録商標）ヒトゲノムU133A 2.0アレイ、又はAffymetrix GENECHIP（登録商標）ヒトゲノムU133 Plus 2.0（Santa Clara, California）で評価することができる。これらの遺伝子の発現は、特定のGenBankアクセッション番号の配列が変更された場合でも評価することができるが、それは、変更された配列に特異的なプローブを、周知の標準的な技術を用いてすぐに作製することができるからである。
【０１９８】
これらの遺伝子の発現のレベルを用いて、単離された胎盤幹細胞の集団の同一性を確認するか、細胞の集団が少なくとも複数の単離された胎盤幹細胞を有することを確認するか、又は同様のことをすることができる。その同一性が確認される単離された胎盤幹細胞の集団は、クローン性のもの、例えば、単一の単離された胎盤幹細胞から拡大された単離された胎盤幹細胞の集団、又は混合された幹細胞集団、例えば、複数の単離された胎盤幹細胞から拡大された単離された胎盤幹細胞を含む細胞の集団、もしくは本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞と少なくとも1種の他の細胞とを含む細胞の集団であることができる。
【０１９９】
これらの遺伝子の発現のレベルを用いて、単離された胎盤幹細胞の集団を選択することができる。例えば、上記の遺伝子のうちの1つ又は複数の発現が、間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞の同等の集団でよりも胎盤幹細胞の集団由来の試料で有意に高い場合、胎盤幹細胞、例えば、クローン性に拡大された胎盤幹細胞の集団を選択することができる。
【０２００】
単離された胎盤幹細胞は、例えば、間葉系幹細胞対照における該1種以上の遺伝子の発現のレベル、例えば、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞における該1種以上の遺伝子の発現のレベルと比べたときの、1種以上のそのような遺伝子の発現のレベルに基づいて選択することができる。一実施態様では、同数の間葉系幹細胞を含む試料における該1種以上の遺伝子の発現のレベルは対照として用いられる。別の実施態様では、特定の条件下で試験される単離された胎盤幹細胞についての対照は、該条件下の間葉系幹細胞における該1種以上の遺伝子の発現のレベルを表す数値である。
【０２０１】
本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞は、特定の実施態様では、初代培養下、又は例えば、DMEM-LG（Gibco）、2％胎仔ウシ血清（FCS）（Hyclone Laboratories）、1×インスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）、1×リノール酸（lenolenic-acid）-ウシ血清アルブミン（LA-BSA）、10-9Mデキサメタゾン（Sigma）、10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート（Sigma）、上皮成長因子（EGF）10ng／ml（R&D Systems）、血小板由来成長因子（PDGF-BB）10ng／ml（R&D Systems）、及び100Uペニシリン／1000Uストレプトマイシンを含む培地中での増殖の間に、上記の特徴（例えば、細胞表面マーカー及び／又は遺伝子発現プロファイルの組合せ）を示す。
【０２０２】
本明細書に開示されている胎盤幹細胞のいずれかの特定の実施態様では、細胞はヒトのものである。本明細書に開示されている胎盤幹細胞のいずれかの特定の実施態様では、細胞マーカー特性又は遺伝子発現特性は、ヒトマーカー又はヒト遺伝子である。
【０２０３】
該単離された胎盤幹細胞又は該単離された胎盤幹細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞又は集団は、拡大したものであり、例えば、少なくとも、約、もしくはわずか1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20回継代したものであるか、又は少なくとも、約、もしくはわずか1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、もしくは40回の集団倍加の間、増殖させたものである。該単離された胎盤幹細胞又は該単離された胎盤幹細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施態様では、該細胞又は集団は、初代単離株である。本明細書に開示されている、該単離された胎盤幹細胞、又は単離された胎盤幹細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、胎児起源のものである（すなわち、胎児の遺伝子型を有する）。
【０２０４】
特定の実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、成長培地、すなわち、増殖を促進するように調合された培地中で培養する間、例えば、成長培地中での増殖の間、分化しない。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、増殖するためにフィーダー層を必要としない。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、フィーダー細胞層の欠如という理由だけで、フィーダー層の非存在下の培養では分化しない。
【０２０５】
別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞は、単離された胎盤幹細胞であり、ここで、複数の該単離された胎盤幹細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイで評価したとき、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）陽性である。そのようなアッセイは当技術分野で公知である（例えば、Bostian及びBettsの文献, Biochem. J., 173, 787,（1978）を参照されたい）。具体的な実施態様では、該ALDHアッセイは、ALDEFLUOR（登録商標）（Aldagen社, Ashland, Oregon）をアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のマーカーとして用いる。具体的な実施態様では、該複数は、該細胞の集団内の細胞の約3％〜約25％である。別の実施態様では、単離された臍帯細胞、例えば、単離された多能性臍帯細胞の集団が本明細書で提供され、ここで、複数の該単離された臍帯細胞は、ALDEFLUOR（登録商標）をアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の指標として用いるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイで評価したとき、アルデヒドデヒドロゲナーゼ陽性である。具体的な実施態様では、該複数は、該細胞の集団内の細胞の約3％〜約25％である。別の実施態様では、該単離された胎盤幹細胞又は単離された臍帯幹細胞の集団は、ほぼ同等数の細胞を有し、かつ同じ条件下で培養された骨髄由来間葉系幹細胞の集団よりも少なくとも3倍、又は少なくとも5倍高いALDH活性を示す。
【０２０６】
本明細書に提供されている方法において有用な胎盤幹細胞の上記の実施態様のいずれかの具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞は、本明細書に記載のフローサイトメトリーマーカー及び／又は遺伝子発現マーカーのいずれか1つ、又は任意の組合せを発現する。特定の実施態様では、本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞の単離された集団内の胎盤幹細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は98％は、本明細書に記載のフローサイトメトリーマーカー及び／又は遺伝子発現マーカーのいずれか1つ、又は任意の組合せを発現する。
【０２０７】
本明細書に記載の該単離された胎盤幹細胞を含む細胞の集団のいずれかの特定の実施態様では、該細胞の集団内の胎盤幹細胞は、母親の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず；例えば、該集団内の胎盤幹細胞の少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、胎児の遺伝子型を有する。本明細書に記載の該単離された胎盤幹細胞を含む細胞の集団のいずれかの特定の他の実施態様では、該胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、母親の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず；例えば、該集団内の細胞の少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、胎児の遺伝子型を有する。
【０２０８】
上記の単離された胎盤幹細胞又は単離された胎盤幹細胞の細胞集団のいずれかの具体的な実施態様では、該細胞、又は該集団内の細胞の少なくとも約95％もしくは約99％の核型は、正常である。上記の胎盤幹細胞のいずれかの別の具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞、又は細胞集団内の細胞は、非母親起源のものである。
【０２０９】
上記のマーカーの組合せのいずれかを有する異なる単離された胎盤幹細胞の集団を任意の比で組み合わせることができる。上記の単離された胎盤幹細胞のうちのいずれか2つ又はそれより多くの集団を組み合わせて、単離された胎盤幹細胞集団を形成させることができる。例えば、単離された胎盤幹細胞の集団は、上記のマーカー組合せのうちの1つによって定義される第1の単離された胎盤幹細胞の集団と、上記のマーカー組合せのうちの別のものによって定義される第2の単離された胎盤幹細胞の集団とを含むことができ、ここで、該第1の集団と第2の集団は、約1：99、2：98、3：97、4：96、5：95、10：90、20：80、30：70、40：60、50：50、60：40、70：30、80：20、90：10、95：5、96：4、97：3、98：2、又は約99：1の比で組み合わされる。同じやり方で、上記の単離された胎盤幹細胞のいずれか3つ、4つ、5つ、又はそれより多くの集団を組み合わせることができる。
【０２１０】
本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞は、例えば、酵素的破壊（第5.3.3節参照）もしくは灌流（第5.3.4節参照）を用いるか、又はこれらを用いない、胎盤組織の破壊によって得ることができる。例えば、胎盤幹細胞を得ることができる単離された胎盤細胞の集団は、臍帯血が抜かれ、かつ残留血液を取り除くように灌流された哺乳動物の胎盤を灌流すること；該胎盤を灌流溶液で灌流すること；及び該灌流溶液を回収すること（ここで、灌流後の該灌流溶液は、単離された胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を含む）；並びに該細胞の集団から複数の該単離された胎盤細胞を単離することを含む方法によって生じさせることができる。具体的な実施態様では、該灌流溶液を臍帯静脈と臍帯動脈の両方に通し、それが胎盤から浸出した後に回収する。別の具体的な実施態様では、該灌流溶液を臍帯静脈に通して、臍帯動脈から回収するか、又は臍帯動脈に通して、臍帯静脈から回収する。
【０２１１】
様々な実施態様では、胎盤の灌流によって得られる細胞の集団内に含まれる単離された胎盤幹細胞は、該胎盤細胞の集団の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、又は少なくとも99.5％である。別の具体的な実施態様では、灌流によって回収される単離された胎盤幹細胞は、胎児の細胞と母親の細胞を含む。別の具体的な実施態様では、灌流によって回収される単離された胎盤幹細胞は、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、又は少なくとも99.5％胎児細胞である。
【０２１２】
別の具体的な実施態様では、灌流によって回収される、本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞の集団を含む組成物が本明細書で提供され、ここで、該組成物は、該単離された胎盤幹細胞を回収するために用いられた灌流溶液の少なくとも一部を含む。
【０２１３】
本明細書に記載の胎盤幹細胞は、該胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を得るための1種以上の組織破壊酵素による胎盤組織の消化、及び該胎盤細胞の残りの部分からの該胎盤幹細胞の単離、又は実質的な単離によって単離することもできる。胎盤の全体又は一部を消化して、本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞を得ることができる。他の具体的な実施態様では、組織破壊酵素は、トリプシン又はコラゲナーゼである。様々な実施態様では、胎盤の消化によって得られる細胞の集団内に含まれる単離された胎盤幹細胞は、該胎盤細胞の集団の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、又は少なくとも99.5％である。
【０２１４】
上記の単離された胎盤幹細胞の集団は、約、少なくとも、又はわずか1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1O11個、又はそれより多くの単離された胎盤幹細胞を含むことができる。本明細書に記載の治療方法において有用な単離された胎盤幹細胞の集団は、例えば、トリパンブルー排出などによって決定可能な、少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％の生存している単離された胎盤幹細胞を含む。
【０２１５】
本明細書で提供される方法において有用な、本明細書に記載の胎盤幹細胞は、初代培養下で、又は60％DMEM-LG（Gibco）、40％MCDB-201（Sigma）、2％胎仔ウシ血清（FCS）（Hyclone Laboratories）、1×インスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）、1×リノール酸（lenolenic-acid）-ウシ血清アルブミン（LA-BSA）、10-9Mデキサメタゾン（Sigma）、10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート（Sigma）、上皮成長因子（EGF）10ng／ml（R&D Systems）、血小板由来成長因子（PDGF-BB）10ng／ml（R&D Systems）、及び100Uペニシリン／1000Uストレプトマイシンを含む培地中での増殖の間に、上記の特徴（例えば、細胞表面マーカー及び／又は遺伝子発現プロファイルの組合せ）を示す。
【０２１６】
（5.2.3  培養下の成長）
本明細書中の第5.2.2節に記載の単離された胎盤幹細胞の成長は、特定の実施態様では、成長用に選択される特定の培地に一部左右される。最適な条件下では、該単離された胎盤幹細胞は、通常、約1〜3日で数が2倍になる。培養の間、本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞は、培養液中の基材、例えば、組織培養容器（例えば、組織培養ディッシュプラスチック、フィブロネクチンコーティングしたプラスチックなど）の表面に接着し、単層を形成する。具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞は、2％胎仔ウシ血清（FCS）（Hyclone Laboratories）、1×インスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）、1×リノール酸（lenolenic-acid）-ウシ血清アルブミン（LA-BSA）、10-9Mデキサメタゾン（Sigma）、10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート（Sigma）、上皮成長因子（EGF）10ng／ml（R&D Systems）、血小板由来成長因子（PDGF-BB）10ng／ml（R&D Systems）、及び100Uペニシリン／1000Uストレプトマイシンが補充された60％DMEM-LG（Gibco）及び40％MCDB-201（Sigma）を含む培地；又は2％〜10％胎仔ウシ血清（FCS）（Hyclone Laboratories）、1×ITS、1×（LA-BSA）、10-9Mデキサメタゾン（Sigma）、10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート（Sigma）、上皮成長因子（EGF）10ng／ml（R&D Systems）、血小板由来成長因子（PDGF-BB）10ng／ml（R&D Systems）、及び100Uペニシリン／1000Uストレプトマイシンが補充されたDMEM-LG（Gibco）を含む培地中、95％大気／5％CO2下、37℃で培養しとき、培養下で2倍になる。
【０２１７】
（5.3  単離された胎盤幹細胞を得る方法）
（5.3.1  細胞回収組成物）
胎盤幹細胞は、生理的に許容し得る溶液、例えば、細胞回収組成物を用いて、哺乳動物の胎盤から得られる。例示的な細胞回収組成物は、その開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、関連米国特許出願公開第2007／0190042号に詳細に記載されている。
【０２１８】
細胞回収組成物は、細胞、例えば、本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞の回収及び／又は培養に好適な任意の生理的に許容し得る溶液、例えば、生理食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クレブス溶液、改変クレブス溶液、イーグル溶液、0.9％NaClなど）、培養培地（例えば、DMEM、H.DMEMなど）などを含むことができる。
【０２１９】
細胞回収組成物は、回収の時点から培養の時点まで、単離された胎盤幹細胞を保存する、すなわち、単離された胎盤幹細胞の死を防止するか、又は該単離された胎盤幹細胞の死を遅延させるか、死滅する細胞の集団内の単離された胎盤幹細胞の数を低下させるなどの傾向がある1種以上の成分を含むことができる。そのような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤又はJNK阻害剤）；血管拡張剤（例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシンもしくは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など）；壊死阻害剤（例えば、2-（1H-インドール-3-イル）-3-ペンチルアミノ-マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、もしくはクロナゼパム）；TNF-α阻害剤；及び／又は酸素担持ペルフルオロカーボン（例えば、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデシルブロミドなど）であることができる。
【０２２０】
細胞回収組成物は、１種以上の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、RNアーゼ、又はDNアーゼなどを含むことができる。そのような酵素としては、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼI、II、III、又はIV、クロストリジウム・ヒストリチカム（Clostridium histolyticum）由来のコラゲナーゼなど）；ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、LIBERASE、ヒアルロニダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２１】
細胞回収組成物は、殺菌又は静菌有効量の抗生物質を含むことができる。特定の非限定的な実施態様では、抗生物質は、マクロライド（例えば、例えば、トブラマイシン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロール、セフィキシム、もしくはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンV）、又はキノロン（例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン、もしくはノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施態様では、抗生物質は、グラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌、例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌などに対して活性がある。一実施態様では、抗生物質は、例えば、培養培地中、約0.005％〜約0.01％（w／v）のゲンタマイシンである。
【０２２２】
細胞回収組成物は、以下の化合物のうちの1つ又は複数を含むこともできる：アデノシン（約1mM〜約50mM）；D-グルコース（約20mM〜約100mM）；マグネシウムイオン（約1mM〜約50mM）；一実施態様では、内皮の完全性及び細胞の生存能力を維持するのに十分な量で存在する、分子量20,000ダルトン超の巨大分子（例えば、合成もしくは天然のコロイド、約25g／l〜約100g／l、もしくは約40g／l〜約60g／lで存在する、デキストランもしくはポリエチレングリコールなどの多糖）；酸化防止剤（例えば、約25μM〜約100μMで存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンC、もしくはビタミンE）；還元剤（例えば、約0.1mM〜約5mMで存在するN-アセチルシステイン）；細胞内へのカルシウムの侵入を防止する薬剤（例えば、約2μM〜約25μMで存在するベラパミル）；ニトログリセリン（例えば、約0.05g／L〜約0.2g／L）；一実施態様では、残留血液の凝固の防止を助けるのに十分な量で存在する抗凝血剤（例えば、約1000ユニット／l〜約100,000ユニット／lの濃度で存在するヘパリンもしくはヒルジン）；又はアミロライド含有化合物（例えば、約1.0μM〜約5μMで存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド、もしくはイソブチルアミロライド）。
【０２２３】
（5.3.2  胎盤の回収及び取扱い）
通常、ヒトの胎盤を、出産後のその娩出後すぐに回収する。好ましい実施態様では、インフォームドコンセント後、及び患者の全病歴を取得して、該胎盤と関連付けた後、胎盤を患者から回収する。好ましくは、この病歴は分娩後も続く。そのような病歴を用いて、胎盤又はそれから採取される単離された胎盤幹細胞の後続的使用を調整することができる。例えば、単離されたヒト胎盤幹細胞は、その病歴を考慮して、該胎盤と関連する幼児のための、又は親、兄弟姉妹、もしくはその幼児の他の血縁者のための個人医療に用いることができる。
【０２２４】
単離された胎盤幹細胞の回収前に、臍帯血及び胎盤血を除去することが好ましい。特定の実施態様では、分娩後、胎盤内の臍帯血を回収する。胎盤は、従来の臍帯血の回収プロセスに供することができる。通常、針又はカニューレを用い、重力の助けを借りて、胎盤を放血させる（例えば、Andersonの米国特許第5,372,581号；Hesselらの米国特許第5,415,665号を参照されたい）。針又はカニューレを、通常、臍帯静脈内に留置し、胎盤を穏やかにマッサージして、胎盤からの臍帯血の排出を助けることができる。そのような臍帯血の回収は、商業的に、例えば、LifeBank USA, Cedar Knolls, NJにより行なわれてもよい。好ましくは、臍帯血を回収する間の組織破壊を最小限に抑えるために、胎盤を、それ以上操作することなく、重力排出させる。
【０２２５】
通常、臍帯血の回収、及び例えば、灌流又は組織解離による胎盤幹細胞の回収のために、胎盤を、分娩室又は出産室から別の場所、例えば、実験室まで輸送する。例えば、胎盤を、近位臍帯をクランプしたまま、滅菌されたジップロック式プラスチックバッグの中に入れ、その後、このプラスチックバッグを断熱容器内に入れることによって、胎盤を（胎盤の温度を20〜28℃に維持する）滅菌された断熱輸送装置に入れて輸送することが好ましい。別の実施態様では、その開示が引用により本明細書中に組み込まれている、係属中の米国特許第7,147,626号に実質的に記載されているように、胎盤を臍帯血回収キットに入れて輸送する。好ましくは、胎盤を、分娩から4〜24時間後に、実験室に移送する。特定の実施態様では、臍帯血の回収前に、胎盤への挿入部から4〜5cm（センチメートル）以内のところで、近位臍帯をクランプする。他の実施態様では、臍帯血の回収後、しかし、それ以上の胎盤の処理前に、近位臍帯をクランプする。
【０２２６】
胎盤は、細胞回収前に、滅菌条件下、かつ室温又は5〜25℃の温度のいずれかで保存することができる。胎盤を灌流して残留臍帯血を除去する前に、胎盤は、4〜24時間、最大48時間、又は48時間よりも長い時間、保存してもよい。一実施態様では、胎盤は、娩出後、約0時間から約2時間で採取される。胎盤は、5〜25℃の温度で、抗凝血剤溶液に入れて保存することが好ましい。好適な抗凝血剤溶液は当技術分野で周知である。例えば、ヘパリン又はワルファリンナトリウム溶液を用いることができる。好ましい実施態様では、抗凝血剤溶液は、ヘパリン溶液（例えば、1:1000溶液中で1％w／w）を含む。放血された胎盤は、胎盤幹細胞を回収する前に、36時間を超えない時間、保存することが好ましい。
【０２２７】
哺乳動物の胎盤又はその一部は、一般に上記のように回収及び調製されれば、単離された胎盤幹細胞を得るために、任意の当技術分野で公知の方法で処理することができ、例えば、灌流するか、又は破壊する、例えば、1種以上の組織破壊酵素で消化することができる。
【０２２８】
（5.3.3  胎盤組織の物理的破壊及び酵素的消化）
一実施態様では、幹細胞を、哺乳動物の胎盤の一部又は全ての物理的破壊によって、この臓器から回収する。例えば、胎盤、又はその一部を、例えば、圧搾するか、剪断するか、細かく切り刻むか、さいの目状に切るか、みじん切りにするか、液体に浸して柔らかくするか、又は同様に処理することができる。その後、この組織を培養して、単離された胎盤幹細胞の集団を得ることができる。通常、胎盤組織を、例えば、培養培地、生理食塩水溶液、又は幹細胞回収組成物を用いて破壊する（第5.5.1節及び下記を参照されたい）。
【０２２９】
通常、単離された胎盤幹細胞は、胎盤組織の小さなブロック、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、又は約1000立方ミリメートルの体積の胎盤組織のブロックの破壊によって得ることができる。破壊方法が、例えば、トリパンブルー排出によって決定可能な、該臓器内の細胞の複数、より好ましくは大部分、及びより好ましくは、少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、98％、又は99％を生きた状態にとどめるという条件で、任意の物理的破壊方法を用いることができる。
【０２３０】
単離された胎盤幹細胞を、通常、娩出後の最初の約3日以内の任意の時点で、しかし、好ましくは、娩出後、約8時間〜約18時間で、胎盤、又はその一部から回収することができる。
【０２３１】
具体的な実施態様では、破壊された組織を、単離された胎盤幹細胞の増殖に好適な組織培養培地中で培養する（例えば、胎盤幹細胞、例えば、PDACの培養を記載している、下記の第5.6節を参照されたい）。
【０２３２】
別の具体的な実施態様では、胎盤幹細胞を、例えば、一部は、胎盤組織の物理的破壊によって単離し、ここで、該物理的破壊は、1種以上の組織消化酵素の使用によって達成することができる酵素的破壊を含む。胎盤、又はその一部を、1種以上の酵素で物理的に破壊及び消化し、その後、得られた材料を細胞回収組成物に浸漬させるか、又は細胞回収組成物中に混合することもできる。
【０２３３】
好ましい細胞回収組成物は、1種以上の組織破壊酵素を含む。胎盤組織を破壊するために用いることができる酵素としては、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ、例えば、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、又はエラスターゼが挙げられる。セリンプロテアーゼは、血清中のα2ミクログロブリンによって阻害されることがあり、そのため、消化に用いられる培地は、通常、無血清のものである。EDTA及びDNアーゼは、細胞回収効率を増加させるために、酵素消化手順において一般的に用いられる。粘性のある消化液内に細胞が捕捉されることを避けるために、消化物を希釈することが好ましい。
【０２３４】
組織消化酵素の任意の組合せを用いることができる。トリプシンを用いる消化のための典型的な濃度は、0.1％〜約2％トリプシン、例えば、約0.25％トリプシンを含む。胎盤幹細胞を遊離させるために、プロテアーゼを、組み合わせて、すなわち、同じ消化反応で2種以上のプロテアーゼを用いることができるか、又は順次用いることができる。例えば、一実施態様では、胎盤、又はその一部を、まず、約1〜約2mg／mlの適量のコラゲナーゼIで、例えば、30分間消化し、その後、約0.25％の濃度のトリプシンで、例えば、37℃で10分間消化する。セリンプロテアーゼを、他の酵素の使用後に連続して用いることが好ましい。
【０２３５】
別の実施態様では、キレート剤、例えば、エチレングリコールビス（2-アミノエチルエーテル）-N,N,N'N'-四酢酸（EGTA）又はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を、幹細胞を含む幹細胞回収組成物に、又は幹細胞回収組成物で胎盤幹細胞を単離する前に、その中で組織を破壊及び／もしくは消化する溶液に添加することにより、組織をさらに破壊することができる。
【０２３６】
消化後、消化物を、例えば、培養培地で3回洗浄し、洗浄した細胞を培養フラスコ中に播種する。その後、細胞を示差的接着により単離し、例えば、生存能力、細胞表面マーカー、分化などについて特徴付ける。
【０２３７】
胎盤全体、又は胎盤の一部が、胎児細胞と母親細胞の両方を含む場合（例えば、胎盤の一部が、絨毛膜又は胎盤葉を含む場合）、単離された胎盤幹細胞は、胎児起源と母親起源の両方に由来する胎盤幹細胞の混合物を含むことができることが理解されるであろう。胎盤の一部が、母親細胞（例えば、羊膜）を全く、又はごくわずかな数しか含まない場合、それから単離される胎盤幹細胞は、ほとんど胎児性の胎盤幹細胞（すなわち、胎児の遺伝子型を有する胎盤幹細胞）しか含まないことになる。
【０２３８】
胎盤幹細胞、例えば、上の第5.2.2節に記載の胎盤幹細胞を、示差的トリプシン処理（下記の第5.3.5節参照）、その後の、1以上の新しい培養容器における、新鮮な増殖培地中での培養、任意でその後の、第2の示差的トリプシン処理工程によって、破壊された胎盤組織から単離することができる。
【０２３９】
（5.3.4  胎盤灌流）
胎盤幹細胞、例えば、上の第5.2.2節に記載の胎盤幹細胞を、例えば、一部、哺乳動物の胎盤の灌流によって単離することもできる。哺乳動物の胎盤を灌流して胎盤幹細胞を得る方法は、例えば、その各々の開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,045,148号及び第7,255,729号、並びに米国特許出願公開第2007／0275362号及び第2007／0190042号に開示されている。
【０２４０】
胎盤幹細胞を、例えば、細胞回収組成物を灌流溶液として用いる、例えば、胎盤血管系を通した灌流によって、回収する、例えば、単離することができる。一実施態様では、哺乳動物の胎盤を、灌流溶液を臍帯動脈と臍帯静脈のどちらか又は両方に通すことによって灌流する。胎盤を通る灌流溶液の流れを、例えば、胎盤の中への重力流を用いて達成することができる。好ましくは、灌流溶液を、ポンプ、例えば、蠕動ポンプを用いて、胎盤に強制的に通す。臍帯静脈に、例えば、滅菌チューブなどの滅菌された接続装置に接続されている、カニューレ、例えば、TEFLON（登録商標）又はプラスチックカニューレを挿入することができる。この滅菌された接続装置は、灌流マニフォールドに接続されている。
【０２４１】
灌流に備えて、臍帯動脈及び臍帯静脈が胎盤の最も高い位置に配置されるような形で、胎盤を配向させる（例えば、ぶら下げる）ことが好ましい。灌流液を胎盤血管系及び周囲組織に通すことによって、胎盤を灌流することができる。灌流液を臍帯静脈に通し、臍帯動脈から回収するか、又は灌流液を臍帯動脈に通し、臍帯静脈から回収することによって、胎盤を灌流することもできる。
【０２４２】
一実施態様では、例えば、臍帯動脈及び臍帯静脈を、例えば、柔軟なコネクタを介して灌流溶液のリザーバに接続されたピペットに同時に接続する。灌流溶液を、臍帯静脈及び臍帯動脈に通す。灌流溶液は、血管壁から滲出し、かつ／又は血管壁を通って、胎盤の周囲組織中に入り、妊娠中、母親の子宮に付着していた胎盤表面から好適な開放容器中に回収される。灌流溶液を臍帯の開放部に通して導入し、母親の子宮壁と接続している胎盤壁の開口部から流出又は浸出させることもできる。「受け皿（pan）」法と呼ぶことができるこの方法で回収される胎盤幹細胞は、通常、胎児細胞と母親細胞の混合物である。
【０２４３】
別の実施態様では、灌流溶液を臍帯静脈に通し、臍帯動脈から回収するか、又は臍帯動脈に通し、臍帯静脈から回収する。「閉回路」法と呼ぶことができるこの方法で回収される胎盤幹細胞は、通常、ほとんど胎児のものしかない。
【０２４４】
灌流液が胎盤の母親側から滲出した後に灌流液が回収される、受け皿法を用いる灌流は、胎児細胞と母親細胞の混合物をもたらすことが理解されるだろう。結果として、この方法で回収された細胞は、胎児起源と母親起源の両方の、胎盤幹細胞の混合集団を含むことができる。対照的に、灌流液が1つ又は2つの胎盤血管に通され、もっぱら残りの血管（複数可）を通して回収される、もっぱら胎盤血管系を通した閉回路法での灌流は、ほぼ胎児起源のものしかない胎盤幹細胞の集団の回収をもたらす。
【０２４５】
閉回路灌流法を、一実施態様では、次のように実施することができる。出産後胎盤を、出産後、約48時間以内に得る。臍帯をクランプし、クランプの上方で切断する。臍帯は、廃棄することができるか、又は例えば、臍帯幹細胞を回収するために、及び／もしくは生体材料の産生用に臍帯膜を処理するために、処理することができる。羊膜を灌流中保持することができるか、又は例えば、指を用いる鈍的剥離を用いて絨毛膜から分離することができる。羊膜を灌流前に絨毛膜から分離する場合、それを、例えば、廃棄するか、又は例えば、酵素的消化によって幹細胞を得るために、もしくは例えば、羊膜生体材料、例えば、その開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許出願公開第2004／0048796号に記載されている生体材料を産生するために、処理することができる。例えば、滅菌ガーゼを用いて、全ての目に見える血の塊及び残留血液を胎盤から除去した後、例えば、臍帯膜を一部切断して、臍帯の断面を露出させることにより、臍帯血管を露出させる。血管を確認し、それを、例えば、閉じたアリゲータークランプを各々の血管の切断端に通して前進させることによって広げる。その後、装置、例えば、灌流装置又は蠕動ポンプに接続されたプラスチックチューブを胎盤動脈の各々に挿入する。ポンプは、この目的に好適な任意のポンプ、例えば、蠕動ポンプであることができる。その後、滅菌された回収リザーバ、例えば、250mL回収バッグなどの血液バッグに接続されたプラスチックチューブを胎盤静脈に挿入する。あるいは、ポンプに接続されたチューブを胎盤静脈に挿入し、回収リザーバ（複数可）に接続されたチューブを胎盤動脈の一方又は両方に挿入する。その後、胎盤を、ある容量の灌流溶液、例えば、約750mlの灌流溶液で灌流する。その後、灌流液中の細胞を、例えば、遠心分離によって回収する。特定の実施態様では、灌流して胎盤幹細胞を回収する前に残留血液を除去するために、胎盤を、灌流溶液、例えば、100〜300mLの灌流溶液で灌流する。別の実施態様では、灌流して胎盤幹細胞を回収する前に残留血液を除去するために、胎盤を灌流溶液で灌流することはない。
【０２４６】
一実施態様では、灌流中、近位臍帯をクランプし、より好ましくは胎盤への臍帯挿入部から4〜5cm（センチメートル）以内のところで、近位臍帯をクランプする。
【０２４７】
放血プロセスの間の哺乳動物の胎盤からの灌流液の最初の回収物は、通常、臍帯血及び／又は胎盤血の残留赤血球のために色が付いている。該灌流液は、灌流が進み、残留臍帯血細胞が胎盤から洗い流されるにつれて、より無色になっていく。通常、最初に胎盤を放血するためには、30〜100ml（ミリリットル）の灌流液で十分であるが、観察された結果次第で、より多くの又はより少ない灌流液を用いることができる。
【０２４８】
胎盤幹細胞を単離するために用いられる灌流液の容量は、回収しようとする細胞の数、胎盤の大きさ、単一の胎盤から行なわれる回収の回数などによって異なり得る。様々な実施態様では、灌流液の容量は、50mL〜5000mL、50mL〜4000mL、50mL〜3000mL、100mL〜2000mL、250mL〜2000mL、500mL〜2000mL、又は750mL〜2000mLであることができる。通常、放血後、胎盤を700〜800mLの灌流液で灌流する。
【０２４９】
胎盤を、数時間から数日間かけて、複数回灌流することができる。胎盤を複数回灌流しようとする場合、それを、容器（container）又は他の好適な容器（vessel）中、無菌条件下で維持又は培養し、細胞回収組成物、又は抗凝血剤（例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）を含むかもしくは含まない、及び／又は抗微生物剤（例えば、β-メルカプトエタノール（0.1mM）；ストレプトマイシン（例えば、40〜100μg／ml）、ペニシリン（例えば、40U／ml）、アンフォテリシンB（例えば、0.5μg／ml）などの抗生物質を含むかもしくは含まない、標準的な灌流溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（「PBS」）などの生理食塩水溶液）で灌流することができる。一実施態様では、胎盤を、灌流及び灌流液の回収前に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、もしくは24時間、又は2もしくは3日間もしくはそれより長い間、維持又は培養するように、単離された胎盤を、灌流液を回収しないで、しばらくの間、維持又は培養する。灌流された胎盤を、さらにもう1回以上、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、又はそれより長い時間、維持し、例えば、700〜800mLの灌流液で再び灌流することができる。胎盤を、1、2、3、4、5回、又はそれより多く、例えば、1、2、3、4、5、又は6時間に1回、灌流することができる。好ましい実施態様では、回収された有核細胞の数が100細胞／mlを下回るまで、胎盤の灌流、及び灌流溶液、例えば、細胞回収組成物の回収を繰り返す。異なる時点の灌流液をさらに個別に処理して、時間依存的な細胞、例えば、幹細胞の集団を回収することができる。異なる時点からの灌流液をプールすることもできる。好ましい実施態様では、娩出後、約8時間〜約18時間の間に、1回又は複数回で、胎盤幹細胞を回収する。
【０２５０】
胎盤幹細胞を、1種以上のプロテアーゼ又は他の組織破壊酵素を含む溶液での灌流によって、胎盤から単離することができる。具体的な実施態様では、胎盤又はその部分（例えば、羊膜、羊膜と絨毛膜、胎盤小葉もしくは胎盤葉、臍帯、又は前述のもののいずれかの組合せ）を25〜37℃に置き、1種以上の組織破壊酵素とともに、200mLの培養培地中、30分間インキュベートする。灌流液由来の細胞を回収し、4℃に置き、5mM EDTA、2mMジチオスレイトール、及び2mMβ-メルカプトエタノールを含む冷たい阻害剤混合物で洗浄する。数分後、胎盤幹細胞を冷たい（例えば、4℃の）幹細胞回収組成物で洗浄する。
【０２５１】
特定の実施態様では、灌流（受け皿法によるもの又は閉回路法によるものを問わない）を、滅菌フード下、開かれた場所で、例えば、受け皿の中で行なう。特定の他の実施態様では、灌流を閉じた環境、例えば、胎盤を含む滅菌バッグの中で行なう。特定の他の実施態様では、灌流の間、1回又は複数回、胎盤を折り畳む、例えば、半分に、又は実質的に半分に折り畳む。具体的な実施態様では、折り畳みを、手で、又は機械で達成する。
【０２５２】
上記のように行なわれる灌流は、様々な胎盤細胞の不均質な集団を含む溶液である、胎盤灌流液の回収をもたらし、その集団は、上の第5.2.2節に記載の組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞、及び組織培養プラスチック接着性でない、造血胎盤幹細胞、例えば、CD34+胎盤幹細胞を含む。
【０２５３】
（5.3.5  胎盤幹細胞の単離、選別、及び特徴付け）
灌流で得られたものであれ、物理的破壊、例えば、酵素的消化によって得られたものであれ、単離された胎盤幹細胞、例えば、上の第5.2.2節に記載の組織培養プラスチック接着性細胞を、最初に、Ficoll勾配遠心分離によって、他の細胞から純化（すなわち、単離）することができる。そのような遠心分離は、遠心分離速度などについての任意の標準的なプロトコルに従うことができる。一実施態様では、例えば、胎盤から回収された細胞を、室温で15分間、5000×gでの遠心分離によって灌流液から回収し、これにより、細胞は、例えば、夾雑している破片及び血小板から分離される。特定の実施態様では、Ficollを約1.070g／ml〜約1.090g／mL、例えば、約1.073g／mL、1.077g／mL、又は約1.084g／mLの密度で用いる；胎盤幹細胞は、これらの密度の勾配の最上部に集まる。別の実施態様では、胎盤灌流液を、約200mlに濃縮し、Ficoll上で穏やかに層を形成させ、22℃で20分間、約1100×gで遠心分離し、該細胞の低密度界面層をさらなる処理のために回収する。
【０２５４】
細胞ペレットを、新鮮な幹細胞回収組成物、又は細胞維持、例えば、幹細胞維持に好適な培地、例えば、2U／mlヘパリン及び2mM EDTA（GibcoBRL,NY）を含むIMDM無血清培地に再懸濁することができる。全単核細胞画分を、例えば、製造者の推奨手順に従って、Lymphoprep（Nycomed Pharma, Oslo, Norway）を用いて単離することができる。
【０２５５】
灌流又は消化によって得られた胎盤細胞を、例えば、0.2％EDTA（Sigma, St. Louis MO）を含む0.05％トリプシン溶液を用いる示差的トリプシン処理によって、例えば、さらに、又は最初に単離することができる。組織培養プラスチック接着性である単離された胎盤幹細胞は、通常、約5分以内にプラスチック表面から剥がれるが、他の接着性の集団は、通常、20〜30分間を超えるインキュベーションを必要とするので、示差的トリプシン処理が可能である。トリプシン処理、及び例えば、トリプシン中和溶液（TNS、Cambrex）を用いるトリプシン中和後、剥がれた胎盤幹細胞を回収することができる。接着細胞の単離の一実施態様では、一定分量の、例えば、約5〜10×106個の細胞を、いくつかのT-75フラスコ、好ましくは、フィブロネクチンコーティングしたT75フラスコの各々に入れる。そのような実施態様では、該細胞を、市販の間葉系幹細胞成長培地（MSCGM）（Cambrex）を用いて培養し、組織培養インキュベーター（37℃、5％CO2）内に置くことができる。10〜15日後、PBSで洗浄することにより、接着していない細胞をフラスコから除去する。その後、PBSをMSCGMに交換する。
【０２５６】
哺乳動物の胎盤から回収された細胞の数と種類を、例えば、フローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学（例えば、組織特異的もしくは細胞マーカー特異的抗体による染色）、蛍光活性化細胞選別（FACS）、磁気活性化細胞選別（MACS）などの標準的な細胞検出技術を用いて形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することにより、光学顕微鏡もしくは共焦点顕微鏡法を用いて細胞の形態を調べることにより、並びに／又はPCR及び遺伝子発現プロファイリングなどの当技術分野で周知の技術を用いて遺伝子発現の変化を測定することにより、モニタリングすることができる。これらの技術を、同様に、１種以上の特定のマーカーが陽性である細胞を同定するためにも用いることができる。例えば、CD73に対する抗体を用いて、上記の技術を用いて、細胞が検出可能な量のCD73を含むかどうかを決定することができ；もしそうであるならば、細胞はCD73+である。同様に、細胞がRT−PCRで検出されるのに十分なOCT-4 RNA、又は成体（最終分化した）細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）よりも有意に多くのOCT-4 RNAを産生するならば、該細胞は、OCT-4+である。具体的な実施態様では、mRNAが、適切なプライマーペアを用いて、RT-PCRにより、35サイクル以下で、バックグラウンドを超えて増幅されるならば、細胞は特定のmRNAが陽性である。細胞表面マーカー（例えば、CD34などのCDマーカー）に対する抗体及びOCT-4などの幹細胞特異的遺伝子の配列は、当技術分野で周知である。
【０２５７】
胎盤幹細胞、特に、Ficoll分離、示差的接着、又は両方の組合せによって単離された細胞を、例えば、蛍光活性化細胞選別機（FACS）を用いて選別することができる。蛍光活性化細胞選別（FACS）は、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含む粒子を分離する周知の方法である（Kamarchの文献, 1987, Methods Enzymol, 151：150-165）。一実施態様では、細胞表面マーカー特異的抗体又はリガンドを個別の蛍光標識で標識する。細胞をセルソーターに通して処理し、使用された抗体に結合するその能力に基づく細胞の分離を可能にする。FACSで選別された粒子を96ウェル又は384ウェルプレートの個々のウェルに直接に堆積させて、分離及びクローニングをしやすくすることができる。
【０２５８】
１つの選別スキームでは、胎盤幹細胞、例えば、PDACを、マーカーCD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD133、CD166、CD200、及び／又はKDRのうちの1つ又は複数の発現に基づいて選別する；すなわち、胎盤幹細胞を、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、もしくはCD200のうちの1つ又は複数の発現、及び／又はCD34、CD45、CD133、もしくはKDRの発現の欠如に基づいて選別する。これは、そのような細胞を培養下のその接着特性に基づいて選択する手順との関連で達成することができる。例えば、組織培養プラスチック接着の選択を、マーカー発現に基づく選別の前又は後に達成することができる。一実施態様では、例えば、細胞を、まず、そのCD34発現に基づいて選別し；CD34-細胞を保持し、かつさらに、CD73+、CD90+、又はCD200+のうちの1つ又は複数であるCD34-細胞を、他の全てのCD34-細胞から分離する。別の実施態様では、胎盤由来の細胞をそのCD200発現に基づいて選別し；例えば、CD200を提示する細胞をさらなる使用のために単離する。例えば、CD200を発現する細胞を、具体的な実施態様では、そのCD73及び／もしくはCD105、又は抗体SH2、SH3、もしくはSH4によって認識されるエピトープの発現、或いはCD34、CD38、又はCD45の発現の欠如に基づいてさらに選別することができる。例えば、別の実施態様では、胎盤幹細胞を、CD200、CD73、CD105、CD34、CD38、及びCD45の発現、又はその欠如によって選別し、かつCD200+、CD73+、CD105+、CD34-、CD38-、及びCD45-である胎盤幹細胞を、さらなる使用のために他の胎盤細胞から単離する。
【０２５９】
細胞の選別を用いて、胎盤幹細胞の集団の同一性を確認することができる。例えば、本明細書に記載の組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞、例えば、PDACを1継代以上の間培養した後、回収し、試料を、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、及び／又はCD200に対する抗体を用いて特徴付けて、例えば、この培養細胞の70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は98％が、CD34-、CD44+、CD45-、CD73+、CD90+、CD105+、及び／又はCD200+であるかどうかを決定することができる。
【０２６０】
選別された胎盤幹細胞の上記の実施態様のいずれかの具体的な実施態様では、選別後に残存する細胞集団内の細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、又は95％は、該単離された胎盤幹細胞である。胎盤幹細胞を、上の第5.2.2節に記載のマーカーのいずれかの1つ又は複数によって選別することができる。具体的な実施態様では、例えば、（1）組織培養プラスチックに接着性であり、かつ（2）CD10+、CD34-、及びCD105+である胎盤細胞を他の胎盤細胞から選別する（すなわち、単離する）。別の具体的な実施態様では、（1）組織培養プラスチックに接着性であり、かつ（2）CD10+、CD34-、CD105+、及びCD200+である胎盤細胞を他の胎盤細胞から選別する（すなわち、単離する）。別の具体的な実施態様では、（1）組織培養プラスチックに接着性であり、かつ（2）CD10+、CD34-、CD45-、CD90+、CD105+、及びCD200+である胎盤細胞を他の胎盤細胞から選別する（すなわち、単離する）。しかしながら、胎盤幹細胞を、特定の細胞マーカー、又は細胞マーカーのセットによって選別し、「単離された」ものとする必要はない。
【０２６１】
胎盤幹細胞のヌクレオチド配列ベースの検出及び／又は解析に関して、本明細書に記載のマーカーの配列は、GenBank又はEMBLなどの公的に利用可能なデータベースで容易に入手可能である。
【０２６２】
胎盤幹細胞、例えば、胎盤幹細胞又は胎盤多能性細胞の抗体による検出及び選別に関して、特定のマーカーに特異的な任意の抗体を、細胞の検出及び選別（例えば、蛍光活性化細胞選別）に好適な任意のフルオロフォア又は他の標識と組み合わせて用いることができる。特異的マーカーに対する抗体／フルオロフォアの組合せとしては、HLA-Gに対するフルオレセインイソチオシアネート（FITC）コンジュゲートモノクローナル抗体（Serotec, Raleigh, North Carolinaから入手可能）、CD10に対するフルオレセインイソチオシアネート（FITC）コンジュゲートモノクローナル抗体（BD Immunocytometry Systems, San Jose, Californiaから入手可能）、CD44に対するフルオレセインイソチオシアネート（FITC）コンジュゲートモノクローナル抗体（BD Biosciences Pharmingen, San Jose, Californiaから入手可能）、及びCD105に対するフルオレセインイソチオシアネート（FITC）コンジュゲートモノクローナル抗体（R&D Systems社, Minneapolis, Minnesotaから入手可能）；CD44、CD200、CD117、及びCD13に対するフィコエリスリン（PE）コンジュゲートモノクローナル抗体（BD Biosciences Pharmingen）；CD33及びCD10に対するフィコエリスリン-Cy7（PE Cy7）コンジュゲートモノクローナル抗体（BD Biosciences Pharmingen）；アロフィコシアニン（APC）コンジュゲートストレプトアビジン及びCD38に対するアロフィコシアニン（APC）コンジュゲートモノクローナル抗体（BD Biosciences Pharmingen）；ならびにビオチン化CD90（BD Biosciences Pharmingen）が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる他の抗体としては、CD133-APC（Miltenyi）、KDR-ビオチン（CD309、Abcam）、サイトケラチン-Fitc（Sigma又はDako）、HLA ABC-Fitc（BD）、HLA DR、DQ、DP-PE（BD）、β2-ミクログロブリン-PE（BD）、CD80-PE（BD）、及びCD86-APC（BD）が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる他の抗体／標識の組合せとしては、CD45-PerCP（ペリジンクロロフィルタンパク質）；CD44-PE；CD10-F（フルオレセイン）；HLA-G-F及び7-アミノ-アクチノマイシン-D（7-AAD）；HLA-ABC-F；などが挙げられるが、これらに限定されない。このリストは網羅的なものではなく、他の供給業者からの他の抗体も市販されている。
【０２６３】
単離された胎盤幹細胞を、例えば、フィコエリスリン-Cy5（PE Cy5）コンジュゲートストレプトアビジンと、CD117又はCD133に対するビオチンコンジュゲートモノクローナル抗体とを用いてCD117又はCD133についてアッセイすることができる；しかしながら、このシステムを用いると、バックグラウンドが比較的高いために、該細胞は、それぞれ、CD117又はCD133陽性であるように見えることがある。
【０２６４】
単離された胎盤幹細胞を単一のマーカーに対する抗体で標識し、検出及び／選別することができる。胎盤幹細胞を異なるマーカーに対する複数の抗体で同時に標識することもできる。
【０２６５】
別の実施態様では、磁気ビーズを用いて細胞を分離する、例えば、他の胎盤細胞から胎盤幹細胞を分離することができる。磁気ビーズ（直径0.5〜100μm）に結合するその能力に基づいて粒子を分離する方法である、磁気活性化細胞選別（MACS）技術を用いて、該細胞を選別してもよい。特定の細胞表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、種々の有用な修飾を磁気マイクロスフェアに対して行なうことができる。その後、該ビーズを細胞と混合し、結合させておく。その後、細胞を磁場に通して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一実施態様では、その後、これらの細胞を単離し、さらなる細胞表面マーカーに対する抗体と結合した磁気ビーズと再び混合することができる。該細胞を再び磁場に通して、両方の抗体に結合した細胞を単離する。その後、そのような細胞を希釈して、別々のディッシュ、例えば、クローン単離用のマイクロタイターディッデュに入れることができる。
【０２６６】
単離された胎盤幹細胞を、形態及び成長特性に基づいて特徴付け、かつ／又は選別することもできる。例えば、単離された胎盤幹細胞を、例えば、培養下で線維芽細胞様の外観を有するものとして特徴付け、かつ／又は培養下での線維芽細胞様の外観に基づいて選択することができる。単離された胎盤幹細胞を、胚様体様体を形成するその能力を有するものとして特徴付け、かつ／又は胚様体様体を形成するその能力に基づいて選択することができる。一実施態様では、例えば、線維芽細胞様の形状であり、CD73及びCD105を発現し、かつ培養下で1以上の胚様体様体を生じさせる胎盤幹細胞を他の胎盤細胞から単離する。別の実施態様では、培養下で1以上の胚様体様体を生じさせるOCT-4+胎盤幹細胞を他の胎盤細胞から単離する。
【０２６７】
単離された胎盤幹細胞を、（生存を評価するための）トリパンブルー排出アッセイ、フルオレセインジアセテート取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取込みアッセイ；及び（増殖を評価するための）チミジン取込みアッセイ、MTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞増殖アッセイなどの、当技術分野で公知の標準的技術を用いて、生存能力、増殖能力、及び寿命について評価することができる。寿命は、延長された培養下での集団倍加の最大数を決定することなどの、当技術分野で周知の方法によって測定してもよい。
【０２６８】
単離された胎盤幹細胞、例えば、上の第5.2.2節に記載の単離された胎盤幹細胞を、当技術分野で公知の他の技術、例えば、所望の細胞の選択的成長（陽性選択）、望ましくない細胞の選択的破壊（陰性選択）；例えば、ダイズ凝集素を用いる、混合集団における示差的細胞凝集力に基づく分離；凍結−解凍処置；濾過；従来のゾーン遠心分離；遠心洗浄（向流遠心分離）；単位重力分離；向流分配；電気泳動法；などを用いて他の胎盤細胞から分離することもできる。
【０２６９】
（5.4  単離された胎盤幹細胞の培養）
（5.4.1  培養培地）
単離された胎盤細胞、又は胎盤幹細胞が生じる胎盤組織を用いて、胎盤幹細胞の培養物をイニシエートするか、又はそれを播種することができる。通常、細胞を、コーティングされていないか、又はラミニン、コラーゲン（例えば、天然物もしくは変性物）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、及び細胞外膜タンパク質（例えば、MATRIGEL（登録商標）（BD Discovery Labware, Bedford, Mass.））などの細胞外マトリックスもしくはリガンドがコーティングされているかのいずれかの滅菌組織培養容器に移す。同様の手順をBM-MSC培養に用いることができる。
【０２７０】
単離された胎盤細胞、例えば、単離された胎盤幹細胞を、細胞、例えば、幹細胞の培養に許容し得るものとして当技術分野で認識されている任意の培地中及び任意の条件下で培養することができる。好ましくは、培養培地は、血清、例えば、ウシ胎仔血清、ヒト血清などを含む。単離された胎盤幹細胞を、例えば、ITS（インスリン-トランスフェリン-セレン）、LA＋BSA（リノール酸-ウシ血清アルブミン）、デキサメタゾン、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF、IGF-1、及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むDMEM-LG（ダルベッコの改変必須培地、低グルコース）／MCDB 201（ニワトリ線維芽細胞基本培地）；10％胎仔ウシ血清（FBS）を含むDMEM-HG（高グルコース）；15％FBSを含むDMEM-HG；10％FBS、10％ウマ血清、及びヒドロコルチゾンを含むIMDM（イスコフの改変ダルベッコ培地）；1％〜20％FBS、EGF、及びヘパリンを含むM199；10％FBS、GLUTAMAX（商標）、及びゲンタマイシンを含むα-MEM（最小必須培地）；10％FBS、GLUTAMAX（商標）、及びゲンタマイシンを含むDMEMなどの中で培養することができる。
【０２７１】
胎盤幹細胞を培養するために用いることができる他の培地としては、DMEM（高グルコース又は低グルコース）、イーグルの基本培地、ハムのF10培地（F10）、ハムのF-12培地（F12）、イスコフの改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞成長培地（MSCGM）、ライボヴィッツのL-15培地、MCDB、DMEM／F12、RPMI 1640、改良DMEM（Gibco）、DMEM／MCDB201（Sigma）、及びCELL-GRO FREEが挙げられる。
【０２７２】
培養培地には、例えば、血清（例えば、ウシ胎仔血清（FBS）、好ましくは、約2〜15％（v／v）；ウマ（equine）（ウマ（horse））血清（ES）；ヒト血清（HS））；β-メルカプトエタノール（BME）、好ましくは、約0.001％（v／v）；１種以上の成長因子、例えば、血小板由来成長因子（PDGF）、上皮成長因子（EGF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、インスリン様成長因子-1（IGF−1）、白血病抑制因子（LIF）、血管内皮成長因子（VEGF）、及びエリスロポエチン（EPO）；L-バリンを含むアミノ酸；並びに例えば、単独の又は組み合わせた、ペニシリンG、硫酸ストレプトマイシン、アンフォテリシンB、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、微生物汚染を防除するための１種以上の抗生物質及び／又は抗真菌剤を含む１種以上の成分を補充することができる。
【０２７３】
特定の実施態様では、本明細書に記載の方法で用いるのに好適な胎盤幹細胞を、胎仔ウシ血清（FBS、例えば、1.9％FBS v／v）、リノール酸-アルブミン（例えば、0.01％v／v）（Sigma）、インスリン-トランスフェリン-セレン（0.97％v／v）（Invitrogen, Carlsbad, CA）、ゲンタマイシン（例えば、48μg／mL）（Invitrogen）、L-アスコルビン酸2-ホスフェートセスキマグネシウム塩（例えば、97μM）（Sigma）、デキサメタゾン48nM（Sigma）、組換えヒトPDGF-BB（例えば、9.7ng／ml）（Invitrogen）、及び組換えヒトEGF（例えば、9.7ng／ml）（Invitrogen）が補充されたDMEM培地を含む培地中で培養することができる。
【０２７４】
単離された胎盤幹細胞を、標準的な組織培養条件で、例えば、組織培養ディッシュ又はマルチウェルプレート中で培養することができる。単離された胎盤幹細胞を、ハンギングドロップ法を用いて培養することもできる。この方法では、単離された胎盤幹細胞を約5mLの培地に1mL当たり約1×104細胞で懸濁し、この培地の1以上の滴を組織培養容器、例えば、100mLペトリ皿の蓋の内側に置く。この滴は、例えば、単一の滴、又は例えば、マルチチャネルピペッターからの複数の滴であることができる。蓋を慎重にひっくり返し、ある容量の液体、例えば、皿の雰囲気内の水分含量を維持するのに十分な滅菌PBSを含む皿底の上部に置き、胎盤幹細胞を培養する。
【０２７５】
一実施態様では、単離された胎盤幹細胞を、該単離された胎盤幹細胞における未分化な表現型を維持するように作用する化合物の存在下で培養する。この文脈において、「未分化な」は、完全な非分化を要求するものではなく、例えば、終末分化した細胞、又は例えば、終末分化した細胞の1以上の特徴を発現するように分化させられた胎盤幹細胞と比べたときの比較的未分化な表現型を包含する。具体的な実施態様では、該化合物は、置換3,4-ジヒドロピリジモル[4,5-d]ピリミジンである。別の具体的な実施態様では、該化合物は、以下の化学構造を有する化合物である。
【化１】
2013518108.tif 000004
該化合物を、例えば、約1μM〜約10μMの濃度で、単離された胎盤幹細胞と接触させることができる。
【０２７６】
（5.4.2  胎盤幹細胞の拡大及び増殖）
胎盤幹細胞が単離されれば（例えば、該胎盤幹細胞が通常インビボで関連している胎盤細胞の少なくとも50％から分離されれば）、該細胞又は細胞の集団をインビトロで増殖させ、拡大することができる。例えば、単離された胎盤幹細胞を、組織培養容器、例えば、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレートなどの中で、70〜90％コンフルエンスになるまで、すなわち、該細胞及びその子孫が、組織培養容器の培養表面積の70〜90％を占めるまで、該細胞が増殖するのに十分な時間、培養することができる。
【０２７７】
単離された胎盤幹細胞を、細胞成長を可能にする密度で培養容器中に播種することができる。例えば、該細胞を、低密度（約1000〜約5000細胞／cm2）から高密度（例えば、約50,000以上の細胞／cm2）で播種してもよい。好ましい実施態様では、該細胞を、大気中、約0〜約5容積％のCO2の存在下で培養する。いくつかの好ましい実施態様では、該細胞を、大気中、約2〜約25％のO2、好ましくは、大気中、約5〜約20％のO2で培養する。該細胞を、約25℃〜約40℃、好ましくは37℃で培養することが好ましい。該細胞をインキュベーター内で培養することが好ましい。培養培地は、静止状態とするか、又は例えば、バイオリアクターを用いて撹拌することができる。胎盤幹細胞を、特定の実施態様では、（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、N-アセチルシステインなどの添加により）低酸化ストレス下で成長させる。
【０２７８】
100％未満、例えば、70〜90％のコンフルエンスが得られれば、細胞を継代してもよい。例えば、該細胞を、当技術分野で周知の技術を用いて酵素的に処理し、例えば、トリプシン処理し、それらを組織培養表面から分離することができる。該細胞をピペッティングで取り除き、該細胞を計数した後、約10,000〜100,000細胞／cm2を、新鮮な培養培地を含む新しい培養容器に継代する。通常、新しい培地は、単離された胎盤幹細胞が取り除かれた培地と同じ種類である。該単離された胎盤幹細胞を、約、少なくとも、又はわずか1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、もしくは20回、又はそれより多くの回数継代することができる。
【０２７９】
（5.4.3  単離された胎盤幹細胞の集団）
本明細書に記載の方法及び組成物において有用な、単離された胎盤幹細胞の集団、例えば、上の第5.2.2節に記載の単離された胎盤幹細胞も本明細書で提供される。単離された胎盤幹細胞の集団を1以上の胎盤から直接単離することができる；すなわち、該細胞集団は、単離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団であることができ、ここで、該単離された胎盤幹細胞は、灌流液から得られるか、又はその中に含まれるか、或いは破壊された胎盤組織、例えば、胎盤組織消化物（すなわち、胎盤もしくはその部分の酵素的消化によって得られる細胞の集合体）から得られるか、又はその中に含まれる。本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞を培養及び拡大して、単離された胎盤幹細胞の集団を生じさせることもできる。該単離された胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を培養及び拡大して、胎盤幹細胞集団を生じさせることもできる。
【０２８０】
本明細書で提供される治療方法において有用な胎盤幹細胞集団は、単離された胎盤幹細胞、例えば、本明細書中の第5.2.2節に記載された単離された胎盤幹細胞を含む。様々な実施態様では、胎盤細胞集団内の細胞の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は99％は、単離された胎盤幹細胞である。すなわち、単離された胎盤細胞の集団は、例えば、単離された胎盤幹細胞ではない1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％と同程度の量の細胞を含むことができる。
【０２８１】
本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細胞集団を、例えば、酵素的消化によって得られたものであれ、灌流によって得られたものであれ、特定のマーカー及び／又は特定の培養特性もしくは形態特性を発現する単離された胎盤細胞を選択することによって生じさせることができる。様々な実施態様では、例えば、（a）基材に接着し、かつ（b）本明細書中、例えば、上記の第5.2節に記載のフローサイトメトリーマーカー及び／又は遺伝子発現特性のうちのいずれか1つ、又は任意の組合せを発現する胎盤幹細胞を含む胎盤細胞を選択することによって、細胞集団を生じさせる方法が本明細書で提供される。
【０２８２】
別の態様では、胎盤幹細胞、例えば、上の第5.2節に記載されている胎盤幹細胞の集団を、マーカー発現特性と、胎盤幹細胞の集団、例えば、胎盤幹細胞の集団の試料が骨関連癌の細胞の増殖を抑制する、例えば、検出可能に抑制する能力の両方について選択することによって生じさせることができる。様々な実施態様では、骨関連癌の細胞は、多発性骨髄腫細胞、軟骨肉腫細胞、骨癌細胞、神経芽腫細胞、骨肉腫細胞、ユーイング肉腫細胞、脊索腫細胞、骨の悪性線維性組織球腫細胞、前立腺癌細胞、又は骨の線維肉腫細胞である。例えば、有効性に関するある所定の基準を満たす集団を同定するために、そのような選択を、例えば、胎盤幹細胞の様々な集団、例えば、胎盤幹細胞のバッチ又はロットに適用することができる。
【０２８３】
上の第5.2.2節に記載のマーカー組合せのいずれかを有する胎盤幹細胞を含む細胞集団の選択物を同様のやり方で単離するか、又は得ることができる。
【０２８４】
上記の実施態様のいずれにおいても、単離された細胞集団の選択はさらに、ABC-p（胎盤特異的ABC輸送体タンパク質；例えば、Allikmetsらの文献, Cancer Res. 58（23）：5337-9（1998）を参照されたい）を発現する胎盤幹細胞を選択することを含むことができる。該方法は、例えば、間葉系幹細胞に特異的な少なくとも1つの特徴、例えば、CD44の発現、CD90の発現、又は前述のものの組合せの発現を示す細胞を選択することを含むこともできる。
【０２８５】
上記の実施態様では、基材は、細胞、例えば、単離された胎盤幹細胞の培養及び／又は選択を達成することができる任意の表面であることができる。通常、該基材は、プラスチック、例えば、組織培養ディッシュ又はマルチウェルプレートプラスチックである。組織培養プラスチックは、生体分子、例えば、ラミニン又はフィブロネクチンでコーティングすることができる。
【０２８６】
単離された胎盤幹細胞を、細胞選択について当技術分野で公知の任意の手段で選択することができる。例えば、細胞を、例えば、フローサイトメトリー又はFACSにおいて1つ又は複数の細胞表面マーカーに対する1つ又は複数の抗体を用いて選択することができる。抗体を磁気ビーズと組み合わせて用いて、選択を達成することができる。特定の幹細胞関連マーカーに特異的である抗体は当技術分野で公知である。例えば、OCT-4に対する抗体（Abcam, Cambridge, MA）、CD200に対する抗体（Abcam）、HLA-Gに対する抗体（Abcam）、CD73に対する抗体（BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA）、CD105に対する抗体（Abcam；BioDesign International, Saco, ME）など。他のマーカーに対する抗体も市販されており、例えば、CD34、CD38、及びCD45に対する抗体が、例えば、StemCell Technologies又はBioDesign Internationalから入手可能である。
【０２８７】
単離された胎盤幹細胞集団は、幹細胞ではない胎盤細胞、又は胎盤細胞ではない細胞を含むことができる。
【０２８８】
本明細書で提供される単離された胎盤幹細胞集団を1以上の非幹細胞又は非胎盤細胞の集団と組み合わせることができる。例えば、単離された胎盤幹細胞の集団を、血液（例えば、胎盤血又は臍帯血）、血液由来幹細胞（例えば、胎盤血又は臍帯血由来幹細胞）、臍帯幹細胞、血液由来有核細胞の集団、骨髄由来間葉系細胞、骨由来幹細胞集団、粗骨髄、成体（体性）幹細胞、組織内に含まれる幹細胞の集団、培養された幹細胞、完全に分化した細胞の集団（例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓細胞など）などと組み合わせることができる。具体的な実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞の集団は、単離された胎盤幹細胞及び単離された臍帯幹細胞を含む。単離された胎盤幹細胞集団内の細胞を、各々の集団内の全有核細胞の数と比べて、約100,000,000：1、50,000,000：1、20,000,000：1、10,000,000：1、5,000,000：1、2,000,000：1、1,000,000：1、500,000：1、200,000：1、100,000：1、50,000：1、20,000：1、10,000：1、5,000：1、2,000：1、1,000：1、500：1、200：1、100：1、50：1、20：1、10：1、5：1、2：1、1：1；1：2；1：5；1：10；1：100；1：200；1：500；1：1,000；1：2,000；1：5,000；1：10,000；1：20,000；1：50,000；1：100,000；1：500,000；1：1,000,000；1：2,000,000；1：5,000,000；1：10,000,000；1：20,000,000；1：50,000,000；又は約1：100,000,000の比で、別の種類の複数の細胞と組み合わせることができる。単離された胎盤幹細胞集団内の細胞を複数の細胞型の複数の細胞と組み合わせることもできる。
【０２８９】
一実施態様では、単離された胎盤幹細胞集団を複数の造血幹細胞と組み合わせる。そのような造血幹細胞は、例えば、未処理の胎盤血、臍帯血、又は末梢血；胎盤血、臍帯血、又は末梢血由来の全有核細胞；胎盤血、臍帯血、又は末梢血由来の単離されたCD34+細胞の集団；未処理の骨髄；骨髄由来の全有核細胞；骨髄由来の単離されたCD34+細胞の集団などに含まれることができる。
【０２９０】
他の実施態様では、本明細書に記載の胎盤幹細胞、例えば、上の第5.2.2節に記載のPDACの集団を、骨形成性胎盤接着細胞（OPAC）、例えば、その開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許出願第2010／0047214号に記載されているOPACと組み合わせる。他の実施態様では、本明細書に記載の胎盤幹細胞、例えば、上の第5.2.2節に記載のPDACの集団を、胎盤灌流液及び／又はナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤灌流液由来のナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、例えば、その開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許出願公開第2009／0252710号に記載されているものと組み合わせる。
【０２９１】
（5.5  胎盤幹細胞の保存）
単離された胎盤幹細胞、例えば、上記の単離された胎盤幹細胞を、保存する、すなわち、長期保存を可能にする条件下、又は例えば、アポトーシスもしくは壊死による細胞死を阻害する条件下に置くことができる。
【０２９２】
胎盤幹細胞を、例えば、その開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、関連米国特許出願公開第2007／0190042号に記載されているアポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、及び／又は酸素担持ペルフルオロカーボンを含む組成物を用いて保存することができる。一実施態様では、細胞、例えば、胎盤幹細胞の集団を保存する方法は、該細胞の集団を、アポトーシスの阻害剤及び酸素担持ペルフルオロカーボンを含む細胞回収組成物と接触させることを含み、ここで、該アポトーシスの阻害剤は、該アポトーシスの阻害剤と接触していない細胞の集団と比べたとき、該細胞の集団のアポトーシスを低下させるか又は防止するのに十分な量で、かつ該細胞の集団のアポトーシスを低下させるか又は防止するのに十分な時間、存在する。具体的な実施態様では、該アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施態様では、該アポトーシスの阻害剤はJNK阻害剤である。別の具体的な実施態様では、該JNK阻害剤は、該細胞の分化又は増殖を調節しない。別の実施態様では、該細胞回収組成物は、分離相中に該アポトーシスの阻害剤及び該酸素担持ペルフルオロカーボンを含む。別の実施態様では、該細胞回収組成物は、エマルジョン中に該アポトーシスの阻害剤及び該酸素担持ペルフルオロカーボンを含む。別の実施態様では、該細胞回収組成物はさらに、乳化剤、例えば、レシチンを含む。別の実施態様では、該アポトーシス阻害剤及び該ペルフルオロカーボンは、該細胞と接触させるときに、約0℃〜約25℃である。別の具体的な実施態様では、該アポトーシス阻害剤及び該ペルフルオロカーボンは、該細胞と接触させるときに、約2℃〜10℃、又は約2℃〜約5℃である。別の具体的な実施態様では、該接触させることは、該細胞の集団の輸送の間に行なわれる。別の具体的な実施態様では、該接触させることは、該細胞、例えば、胎盤幹細胞の集団の凍結及び解凍の間に行なわれる。
【０２９３】
本明細書に記載の方法及び組成物において有用な胎盤細胞の集団を、例えば、該細胞の集団をアポトーシスの阻害剤及び臓器保存化合物と接触させる方法によって保存することができ、ここで、該アポトーシスの阻害剤は、該アポトーシスの阻害剤と接触していない細胞の集団と比べたとき、該細胞の集団のアポトーシスを低下させるか又は防止するのに十分な量で、かつ該細胞の集団のアポトーシスを低下させるか又は防止するのに十分な時間、存在する。具体的な実施態様では、臓器保存化合物は、UW溶液（例えば、米国特許第4,798,824号に記載されており；ViaSpanとしても知られているもの；Southardらの文献, Transplantation 49（2）：251-257（1990）も参照されたい）、又はその開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、Sternらの米国特許第5,552,267号に記載されている溶液である。別の実施態様では、該臓器保存化合物は、ヒドロキシエチルスターチ、ラクトビオン酸、ラフィノース、又はそれらの組合せである。別の実施態様では、細胞回収組成物はさらに、2相状態にあるか又はエマルジョンとしてかのいずれかの酸素担持ペルフルオロカーボンを含む。
【０２９４】
本方法の別の実施態様では、胎盤幹細胞を、灌流の間に、アポトーシス阻害剤及び酸素担持ペルフルオロカーボン、臓器保存化合物、又はそれらの組合せを含む細胞回収組成物と接触させる。別の実施態様では、該細胞を、組織破壊、例えば、酵素的消化のプロセスの間に、接触させる。別の実施態様では、胎盤幹細胞を、灌流による回収の後に、又は組織破壊、例えば、酵素的消化による回収の後に、該細胞回収化合物と接触させる。
【０２９５】
通常、胎盤幹細胞の回収、濃縮、及び単離時に、低酸素及び機械的ストレスによる細胞ストレスを最小限に抑えるか、又はそれらを排除することが好ましい。本方法の別の実施態様では、それゆえ、細胞、又は細胞、例えば、胎盤幹細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離時に、該保存時に6時間未満の間、低酸素状態に曝され、ここで、低酸素状態は、正常な血中酸素濃度を下回る酸素濃度である。別の具体的な実施態様では、該細胞の集団は、該保存時に2時間未満の間、該低酸素状態に曝される。別の具体的な実施態様では、該細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離時に、1時間未満、もしくは30分未満の間、該低酸素状態に曝されるか、又は低酸素状態に曝されない。別の具体的な実施態様では、該細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離時に、剪断ストレスに曝されない。
【０２９６】
胎盤幹細胞を、例えば、小型の容器、例えば、アンプル中の凍結保護培地に入れて凍結保護することができる。好適な凍結保護培地としては、例えば、成長培地、又は細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、C2695、C2639、もしくはC6039（Sigma）をはじめとする培養培地が挙げられるが、これらに限定されない。凍結保護培地は、約2％〜約15％（v／v）、例えば、約10％（v／v）の濃度のDMSO（ジメチルスルホキシド）を含むことが好ましい。凍結保護培地は、さらなる作用物質、例えば、メチルセルロース及び／又はグリセロールを含んでいてもよい。胎盤幹細胞を、凍結保護時に、約1℃／分で冷却することが好ましい。細胞を約-80℃〜約-180℃の温度、好ましくは約-125℃〜約-140℃に置くことにより、凍結保護を達成することができる。凍結保護された細胞を液体窒素に移した後、使用のために解凍することができる。いくつかの実施態様では、例えば、アンプルが約-90℃に達したら、それを液体窒素保存領域に移す。速度制御フリーザーを用いて凍結保護を行なうこともできる。凍結保護された細胞は、約25℃〜約40℃、好ましくは約37℃の温度で解凍することが好ましい。
【０２９７】
骨髄由来間葉系幹細胞も同様に、上記の方法のいずれかによって保存することができる。
【０２９８】
（5.6  単離された胎盤幹細胞を含む組成物）
本明細書中、例えば、第5.2.2節に記載の胎盤幹細胞を、本明細書に記載の方法及び組成物において用いるための任意の生理的に許容し得る又は医学的に許容し得る化合物、組成物、又は装置と組み合わせることができる。特定の実施態様では、該組成物は、医薬として許容し得る組成物、例えば、医薬として許容し得る担体中に胎盤幹細胞を含む組成物である。本明細書に記載の組成物はいずれもさらに、単離された骨髄由来間葉系幹細胞、又はBM-MSC、例えば、米国特許第5,486,359号に記載されているBM-MSCを含む骨髄を含むことができる。
【０２９９】
特定の実施態様では、単離された胎盤幹細胞を含む組成物はさらに、マトリックス、例えば、脱細胞化マトリックス又は合成マトリックスを含む。別の具体的な実施態様では、該マトリックスは、3次元スキャフォールドである。別の具体的な実施態様では、該マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチン、又はビトロネクチンを含む。別のより具体的な実施態様では、該マトリックスは、羊膜又は羊膜由来生体材料である。別の具体的な実施態様では、該マトリックスは、細胞外膜タンパク質を含む。別の具体的な実施態様では、該マトリックスは、合成化合物を含む。別の具体的な実施態様では、該マトリックスは、生体活性化合物を含む。別の具体的な実施態様では、該生体活性化合物は、5,000ダルトン未満の成長因子、サイトカイン、抗体、又は有機分子である。
【０３００】
別の実施態様では、本明細書で提供される治療方法において有用な組成物は、前述の胎盤幹細胞のいずれか、又は前述の胎盤幹細胞集団のいずれかによって馴化された培地を含む。
【０３０１】
（5.6.1  凍結保存された細胞）
本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤幹細胞を、後で使用するために保存する、例えば、凍結保存することができる。幹細胞などの細胞の凍結保存方法は当技術分野で周知である。単離された胎盤幹細胞集団を、個体に容易に投与することができる形態、例えば、医療用途に好適な容器中に含まれる単離された胎盤幹細胞集団として調製することができる。そのような容器は、例えば、注射器、滅菌プラスチックバッグ、フラスコ、瓶、又は単離された胎盤細胞集団を容易に分注することができる他の容器であることができる。例えば、該容器は、血液バッグ又はレシピエントへの液体の静脈内投与に好適な他のプラスチック製の、医療用に許容し得るバッグであることができる。該容器は、単離された胎盤幹細胞の凍結保存を可能にする容器であることが好ましい。
【０３０２】
凍結保存された単離された胎盤幹細胞は、単一のドナー、又は複数のドナーに由来する単離された胎盤細胞を含むことができる。単離された胎盤幹細胞集団は、意図されるレシピエントと完全にHLAが一致するものであることができるか、又は一部もしくは完全にHLAが一致しないものであることができる。
【０３０３】
したがって、一実施態様では、単離された胎盤幹細胞を、本明細書に記載の方法において、容器中に組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞集団を含む組成物の形態で用いることができる。具体的な実施態様では、単離された胎盤幹細胞は凍結保存されている。別の具体的な実施態様では、容器は、バッグ、フラスコ、又は瓶である。別の具体的な実施態様では、該バッグは、滅菌プラスチックバッグである。別の具体的な実施態様では、該バッグは、例えば、静脈内注入による該単離された胎盤幹細胞集団の静脈内投与に好適であるか、該静脈内投与を可能にするか、又は該静脈内投与を容易にする。該バッグは、投与の前又は投与の間に、単離された胎盤幹細胞と１種以上の他の溶液、例えば、薬物との混合を可能にするために相互接続されている複数の内腔又は区画を含むことができる。別の具体的な実施態様では、該組成物は、胎盤幹細胞の凍結保存を容易にする1種以上の化合物を含む。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、生理的に許容し得る水溶液に含まれている。別の具体的な実施態様では、該生理的に許容し得る水溶液は、0.9％NaCl溶液である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、該胎盤幹細胞のレシピエントとHLAが一致する胎盤幹細胞を含む。別の具体的な実施態様では、該組み合わされた細胞集団は、該胎盤幹細胞のレシピエントと少なくとも一部HLAが一致しない胎盤幹細胞を含む。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、複数のドナーに由来する。
【０３０４】
特定の実施態様では、容器中の単離された胎盤幹細胞は、本明細書中の第5.2.2節に記載の単離された胎盤幹細胞のうちのいずれかであり、ここで、該細胞は、凍結保存されているか、又は容器に含まれている。
【０３０５】
前述の凍結保存された単離された胎盤幹細胞のいずれかの具体的な実施態様では、該容器はバッグである。様々な具体的な実施態様では、該容器は、約、少なくとも、又は多くとも1×106個の該単離された胎盤幹細胞、5×106個の該単離された胎盤幹細胞、1×107個の該単離された胎盤幹細胞、5×107個の該単離された胎盤幹細胞、1×108個の該単離された胎盤幹細胞、5×108個の該単離された胎盤幹細胞、1×109個の該単離された胎盤幹細胞、5×109個の該単離された胎盤幹細胞、1×1010個の該単離された胎盤幹細胞、又は1×1010個の該単離された胎盤幹細胞を含む。前述の凍結保存された集団のいずれかの他の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、約、少なくとも、又はわずか5回、わずか10回、わずか15回、又はわずか20回、継代されたものである。前述の凍結保存された単離された胎盤幹細胞のいずれかの別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤幹細胞は、該容器内で拡大されたものである。
【０３０６】
（5.6.2  遺伝子操作された胎盤幹細胞）
胎盤幹細胞が本明細書でさらに提供され、ここで、該胎盤幹細胞は、腫瘍抑制と関連する組換え又は外因性サイトカインを産生するように遺伝子操作されている。例えば、様々な実施態様では、該胎盤幹細胞は、検出可能な量の外因性タンパク質を発現するように操作されており、ここで、該外因性タンパク質は、骨形成タンパク質（BMP）、アクチビンA、オステオネクチン、オステオプロテゲリン、又はコネキシンのうちの1つ又は複数である。アクチビンAをコードする配列は、例えば、GenBankアクセッション番号NM_002191に見出すことができる。オステオネクチンをコードする配列は、例えば、GenBankアクセッション番号NM_003118に見出すことができる。オステオプロテゲリンをコードする配列は、例えば、GenBankアクセッション番号NM_002546に見出すことができる。
【０３０７】
具体的な実施態様では、コネキシンは、コネキシン26（Cx26）又はコネキシン43（Cx43）である。Cx26又はCx43をコードする配列は、それぞれ、例えば、GenBankアクセッション番号NM_004004及びNM_000165に見出すことができる。
【０３０８】
具体的な実施態様では、該骨形成タンパク質は、BMP1（骨形成タンパク質1）、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9（GDF2；成長分化因子-2）、BMP10、BMP11（GDF11）、BMP12（GDF7）、BMP13（GDF6）、BMP14（GDF5）、もしくはBMP15のうちの1つもしくは複数、又はそれらの任意の組合せである。BMPをコードする配列は、例えば、GenBank、例えば、GenBankアクセッション番号NM_001199（BMP1）、NM_001200（BMP2）、NM_001201（BMP3）、NM_001202（BMP4）、NM_021073（BMP5）、NM_021073（BMP6）、NM_001719（BMP7）、NM_181809（BMP8a）、NM_001720（BMP8b）、NM_016204（BMP9／GDF2）、NM_014482（BMP10）、NM_005811（BMP11／GDF11）、NM_182828（BMP12／GDF7）、NM_001001557（BMP13／GDF6）、NM_000557（BMP14／GDF5）、又はNM_005448（BMP15）に見出すことができる。
【０３０９】
他の実施態様では、単離された胎盤幹細胞が本明細書で提供され、ここで、該胎盤幹細胞は、外因性IFN-β又はIL-2を発現するように操作されている。具体的な実施態様では、該胎盤幹細胞は、該腫瘍細胞を該胎盤幹細胞と接触させたときに、外因性IFN-β又はIL-2を発現していない胎盤幹細胞と比べて、より大きい、例えば、検出可能により大きい腫瘍細胞増殖の抑制をもたらす量の外因性IFN-β又はIL-2を発現する。
【０３１０】
例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポリエチレングリコール、又は当業者に公知の他の方法によって、細胞を遺伝子操作する方法を用いることができる。これらは、細胞内に核酸分子を運び、細胞内で核酸分子を発現させる発現ベクターを用いることを含む。（Geoddelの文献；「遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）」（Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.（1990））を参照されたい）。ベクターDNAを、従来の形質転換又はトランスフェクション技術によって、原核生物又は真核生物細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための好適な方法は、Sambrookらの文献、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」（第2版, Cold Spring Harbor Laboratory press（1989））、及び他の実験用教科書に見出すことができる。
【０３１１】
例えば、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、サルウイルス40（SV40）、アデノウイルス、シンドビスウイルス、及びウシパピローマウイルスなどのDNAもしくはRNAウイルスベクターの使用を含むウイルスによる転移；リン酸カルシウムトランスフェクション及びDEAEデキストラントランスフェクション法を含む、化学的転移；例えば、リポソーム、赤血球ゴースト、及びプロトプラストなどのDNAをローディングする膜小胞を用いる、膜融合転移；又はマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、もしくは裸のDNAの転移などの物理的転移技術をはじめとする方法によって、細胞にDNA又はRNA、例えば、目的のタンパク質をコードするDNA又はRNAを導入することにより、胎盤幹細胞を遺伝子操作することができる。外因性DNAの挿入によるか、又は細胞ゲノムのセグメントと外因性DNAとの置換によって、胎盤幹細胞を遺伝子改変することができる。例えば、相同組換えによるか、又は宿主細胞ゲノムへのウイルスの組込みによるか、又はプラスミド発現ベクター及び核局在化配列を用いて、細胞、特に、その核にDNAを取り込ませることによって、外因性DNA配列（複数可）の挿入を達成することができる。DNAは、特定の化学物質／薬物、例えば、テトラサイクリンを用いて、目的のタンパク質の正又は負の発現誘導を可能にする、1以上のプロモーターを含むことができ；該プロモーターは、他の実施態様では、常時存在型であることができる。
【０３１２】
リン酸カルシウムトランスフェクションを用いて、例えば、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドDNAを、細胞、例えば、胎盤幹細胞に導入することができる。特定の実施態様では、DNAを塩化カルシウム溶液と組み合わせ、その後、リン酸緩衝溶液に添加する。沈殿が形成されたら、この溶液を培養細胞に直接添加する。DMSO又はグリセロールによる処理を用いて、トランスフェクション効率を向上させることができ、ビス-ヒドロキシエチルアミノエタンスルホネート（BES）を用いて、安定なトランスフェクタントのレベルを向上させることができる。リン酸カルシウムトランスフェクションシステムは、市販されている（例えば、PROFECTION（登録商標）、Promega社, Madison, Wis.）。DEAE-デキストラントランスフェクションを用いることもできる。
【０３１３】
単離された胎盤幹細胞を、マイクロインジェクションによって遺伝子改変することもできる。特定の実施態様では、ガラスマイクロピペットを光学顕微鏡下で細胞の核に導いて、DNA又はRNAを注入する。
【０３１４】
胎盤幹細胞を、エレクトロポレーションを用いて遺伝子改変することもできる。特定の実施態様では、DNA又はRNAを培養細胞の懸濁液に添加し、DNA／RNA-細胞懸濁液を2本の電極の間に配置し、電気パルスにかけて、膜を横断する孔の出現により明らかになる細胞外膜における一過性の透過性を生じさせる。
【０３１５】
細胞を遺伝子改変するためのDNA又はRNAのリポソーム送達を、任意にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）又はジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）を含むカチオン性リポソーム、例えば、LIPOFECTIN（登録商標）（Life Technologies社）を用いて行なうことができる。他の市販の送達系としては、EFFECTENE（商標）（Qiagen）、DOTAP（Roche Molecular Biochemicals）、FUGENE 6（商標）（Roche Molecular Biochemicals）、及びTRANSFECTAM（登録商標）（Promega）が挙げられる。
【０３１６】
ウイルスベクターを用いて、例えば、標的遺伝子、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、又はリボザイム配列の細胞への送達により、胎盤幹細胞を遺伝子改変することができる。レトロウイルスベクターは、迅速に分裂する細胞に形質導入するのに効果的であるが、DNAを非分裂細胞にも同じく効果的に転移するように、いくつかのレトロウイルスベクターが開発されている。レトロウイルスベクター用のパッケージング細胞株は当業者に公知である。特定の実施態様では、レトロウイルスDNAベクターは、第1のLTRが、マルチクローニング部位にクローニングされた標的遺伝子配列に機能的に連結されるSV40プロモーターの5'に位置し、マルチクローニング部位の後に3'の第2のLTRが位置するように、2つのレトロウイルスLTRを含む。形成されたら、先に記載したようなリン酸カルシウムを介するトランスフェクションを用いて、レトロウイルスDNAベクターをパッケージング細胞株に転移する。ウイルス産生の約48時間後、その時にはもう標的遺伝子配列を含んでいるウイルスベクターを回収する。レンチウイルスベクター、組換えヘルペスウイルス、アデノウイルスベクター、又はアルファウイルスベクターを用いて細胞をトランスフェクトする方法は、当技術分野で公知である。
【０３１７】
標的細胞のトランスフェクション又は形質導入の成功を、当業者に公知の技術において、遺伝子マーカーを用いて示すことができる。例えば、オワンクラゲ（Aequorea victoria）の緑色蛍光タンパク質は、遺伝子改変された造血細胞の同定及び追跡のための効果的なマーカーであることが示されている。別の選択マーカーとしては、β-Gal遺伝子、切断型の神経成長因子受容体、又は薬物選択マーカー（限定するものではないが、NEO、MTX、もしくはハイグロマイシンを含む）を挙げることができる。
【０３１８】
上に開示されている方法のいずれかによって、及び／又は上に開示されている遺伝子のいずれかによって、骨髄由来間葉系幹細胞を遺伝子改変することができる。
【０３１９】
（5.6.3  医薬組成物）
単離された胎盤幹細胞の集団、又は単離された胎盤幹細胞を含む細胞の集団を、インビボで、例えば、本明細書で提供される治療方法において用いるための医薬組成物へと製剤化することができる。そのような医薬組成物は、医薬として許容し得る担体、例えば、生理食塩水溶液又はインビボ投与のための他の認可された生理的に許容し得る溶液中に、単離された胎盤幹細胞の集団、又は単離された胎盤幹細胞を含む細胞の集団を含む。本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞を含む医薬組成物は、本明細書の別所に記載されている単離された胎盤幹細胞のいずれか、又は該胎盤幹細胞の任意の組合せを含むことができる。医薬組成物は、胎児の、母親の、又は胎児と母親の両方の単離された胎盤幹細胞を含むことができる。本明細書で提供される医薬組成物はさらに、単一の個体もしくは胎盤から、又は複数の個体もしくは胎盤から得られた単離された胎盤幹細胞を含むことができる。
【０３２０】
本明細書で提供される医薬組成物は、任意の数の単離された胎盤幹細胞を含むことができる。例えば、単離された胎盤幹細胞の単一ユニット用量は、様々な実施態様では、約、少なくとも、もしくはわずか1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くの単離された胎盤幹細胞、又は1×105〜5×105、5×105〜1×106、1×106〜5×106、5×106〜1×107、1×107〜5×107、5×107〜1×108、1×108〜5×108、5×108〜1×109、1×109〜5×109、5×109〜1×1010、1×10l0〜5×1010、もしくは5×10l0〜1×1011個の単離された胎盤幹細胞を含むことができる。
【０３２１】
本明細書で提供される医薬組成物は、50％以上の生存細胞を含む胎盤幹細胞の集団を含む（すなわち、該集団内の細胞の少なくとも50％は機能的であるか、又は生存している）。好ましくは、該集団内の細胞の少なくとも60％が生存している。より好ましくは、該医薬組成物中の該集団内の細胞の少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％が生存している。
【０３２２】
本明細書で提供される医薬組成物は、例えば、生着を促進する1種以上の化合物（例えば、抗T細胞受容体抗体、免疫抑制剤など）；アルブミン、デキストラン40、ゼラチン、ヒドロキシエチルスターチ、プラズマライトなどの安定化剤などを含むことができる。
【０３２３】
注射用溶液として製剤化される場合、一実施態様では、医薬組成物は、約1％〜1.5％のHSA及び約2.5％のデキストランを含む。好ましい実施態様では、医薬組成物は、5％HSA及び10％デキストラン、任意で、例えば、10mg／kgのシクロスポリンAのような、免疫抑制剤を含む溶液中に、1ミリリットル当たり約5×106細胞〜1ミリリットル当たり約2×107細胞を含む。
【０３２４】
他の実施態様では、医薬組成物、例えば、溶液は、単離された胎盤幹細胞を含み、ここで、該医薬組成物は、1ミリリットル当たり約1.0±0.3×106細胞〜1ミリリットル当たり約5.0±1.5×106細胞を含む。他の実施態様では、医薬組成物は、1ミリリットル当たり約1.5×106細胞〜1ミリリットル当たり約3.75×106細胞を含む。他の実施態様では、医薬組成物は、約1×106細胞／mL〜約50×106細胞／mL、約1×106細胞／mL〜約40×106細胞／mL、約1×106細胞／mL〜約30×106細胞／mL、約1×106細胞／mL〜約20×106細胞／mL、約1×106細胞／mL〜約15×106細胞／mL、又は約1×106細胞／mL〜約10×106細胞／mLを含む。特定の実施態様では、医薬組成物は、目に見える細胞塊を含まない（すなわち、巨大な細胞塊を含まない）か、又はそのような目に見える細胞塊を実質的に含まない。本明細書で使用されるように、「巨大な細胞塊」は、拡大しなくても目に見える、例えば、裸眼で見える、細胞の凝集体を意味し、かつ通常、約150ミクロンよりも大きい細胞凝集体を指す。いくつかの実施態様では、医薬組成物は、約2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、又は10％のデキストラン、例えば、デキストラン-40を含む。具体的な実施態様では、該組成物は、約7.5％〜約9％のデキストラン-40を含む。具体的な実施態様では、該組成物は、約5.5％のデキストラン-40を含む。特定の実施態様では、医薬組成物は、約1％〜約15％のヒト血清アルブミン（HSA）を含む。具体的な実施態様では、医薬組成物は、約1％、2％、3％、4％、5％、65、75、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、又は15％のHSAを含む。具体的な実施態様では、該細胞は、凍結保存され、解凍されたものである。別の具体的な実施態様では、該細胞は、70μM〜100μMのフィルターに通して濾過されたものである。別の具体的な実施態様では、該組成物は、目に見える細胞塊を含まない。別の具体的な実施態様では、該組成物は、106細胞当たり約200個未満の細胞塊を含み、ここで、該細胞塊は、顕微鏡、例えば、光学顕微鏡下でしか目に見えない。別の具体的な実施態様では、該組成物は、106細胞当たり約150個未満の細胞塊を含み、ここで、該細胞塊は、顕微鏡、例えば、光学顕微鏡下でしか目に見えない。別の具体的な実施態様では、該組成物は、106細胞当たり約100個未満の細胞塊を含み、ここで、該細胞塊は、顕微鏡、例えば、光学顕微鏡下でしか目に見えない。
【０３２５】
具体的な実施態様では、医薬組成物は、1ミリリットル当たり約1.0±0.3×106細胞、約5.5％デキストラン-40（w／v）、約10％HSA（w／v）、及び約5％DMSO（v／v）を含む。
【０３２６】
他の実施態様では、医薬組成物は、10％デキストラン-40を含む溶液中に複数の単離された胎盤幹細胞を含み、ここで、該医薬組成物は、1ミリリットル当たり約1.0±0.3×106細胞〜1ミリリットル当たり約5.0±1.5×106細胞を含み、かつ該組成物は、肉眼で見える細胞塊を含まない（すなわち、巨大な細胞塊を含まない）。いくつかの実施態様では、医薬組成物は、1ミリリットル当たり約1.5×106細胞〜1ミリリットル当たり約3.75×106細胞を含む。具体的な実施態様では、該細胞は、凍結保存され、解凍されたものである。別の具体的な実施態様では、該細胞は、70μM〜100μMのフィルターに通して濾過されたものである。別の具体的な実施態様では、該組成物は、106細胞当たり約200個未満の微小な細胞塊（すなわち、拡大したときにだけ目に見える細胞塊）を含む。別の具体的な実施態様では、医薬組成物は、106細胞当たり約150個未満の微小な細胞塊を含む。別の具体的な実施態様では、医薬組成物は、106細胞当たり約100個未満の微小な細胞塊を含む。別の具体的な実施態様では、医薬組成物は、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、もしくは2％未満のDMSO、又は1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、もしくは0.1％未満のDMSOを含む。
【０３２７】
胎盤幹細胞を含む組成物が本明細書でさらに提供され、ここで、該組成物は、本明細書に開示されている方法のうちの1つによって産生される。例えば、一実施態様では、医薬組成物は、細胞、例えば、胎盤幹細胞を含み、ここで、該医薬組成物は、細胞、例えば、胎盤幹細胞を含む溶液を濾過して、濾過された細胞含有溶液を形成させること；該濾過された細胞含有溶液を、例えば、凍結保存前に、第1の溶液で1ミリリットル当たり約1〜50×106、1〜40×106、1〜30×106、1〜20×106、1〜15×106、又は1〜10×106細胞に希釈すること；及び得られた濾過された細胞含有溶液を、デキストランを含むが、ヒト血清アルブミン（HSA）を含まない第2の溶液で希釈して、該組成物を産生することを含む方法によって産生される。特定の実施態様では、該希釈することは、1ミリリットル当たり約15×106細胞以下までとする。特定の実施態様では、該希釈することは、1ミリリットル当たり約10±3×106細胞以下までとする。特定の実施態様では、該希釈することは、1ミリリットル当たり約7.5×106細胞以下までとする。他の特定の実施態様では、希釈前の、該濾過された細胞含有溶液が、1ミリリットル当たり約15×106未満の細胞を含む場合、濾過は任意である。他の特定の実施態様では、希釈前の、該濾過された細胞含有溶液が、1ミリリットル当たり約10±3×106未満の細胞を含む場合、濾過は任意である。他の特定の実施態様では、希釈前の、該濾過された細胞含有溶液が、1ミリリットル当たり約7.5×106未満の細胞を含む場合、濾過は任意である。
【０３２８】
具体的な実施態様では、細胞、例えば、胎盤幹細胞は、該第1の希釈溶液による希釈と該第2の希釈溶液による希釈の間に凍結保存される。別の具体的な実施態様では、第1の希釈溶液は、デキストラン及びHSAを含む。第1の希釈溶液又は第2の希釈溶液中のデキストランは、任意の分子量のデキストラン、例えば、約10kDa〜約150kDaの分子量を有するデキストランであることができる。いくつかの実施態様では、該第1の希釈溶液又は該第2の溶液中の該デキストランは、約2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、又は10％デキストランである。別の具体的な実施態様では、該第1の希釈溶液又は該第2の希釈溶液中のデキストランはデキストラン-40である。別の具体的な実施態様では、該第1の希釈溶液及び該第2の希釈溶液中のデキストランはデキストラン-40である。別の具体的な実施態様では、該第1の希釈溶液中の該デキストラン-40は5.0％デキストラン-40である。別の具体的な実施態様では、該第1の希釈溶液中の該デキストラン-40は5.5％デキストラン-40である。別の具体的な実施態様では、該第2の希釈溶液中の該デキストラン-40は10％デキストラン-40である。別の具体的な実施態様では、該HSAを含む溶液中の該HSAは1〜15％HSAである。別の具体的な実施態様では、該HSAを含む溶液中の該HSAは、約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、又は15％HSAである。別の具体的な実施態様では、該HSAを含む溶液中の該HSAは10％HSAである。別の具体的な実施態様では、該第1の希釈溶液はHSAを含む。別の具体的な実施態様では、該第1の希釈溶液中の該HSAは10％HSAである。別の具体的な実施態様では、該第1の希釈溶液は凍結保護剤を含む。別の具体的な実施態様では、該凍結保護剤はDMSOである。別の具体的な実施態様では、該第2の希釈溶液中の該デキストラン-40は約10％デキストラン-40である。別の具体的な実施態様では、該細胞を含む組成物は、約7.5％〜約9％デキストランを含む。別の具体的な実施態様では、医薬組成物は、1ミリリットル当たり約1.0±0.3×106細胞〜1ミリリットル当たり約5.0±1.5×106細胞を含む。別の具体的な実施態様では、医薬組成物は、1ミリリットル当たり約1.5×106細胞〜1ミリリットル当たり約3.75×106細胞を含む。
【０３２９】
別の実施態様では、医薬組成物を、（a）凍結保存前に、胎盤幹細胞を含む細胞含有溶液を濾過して、濾過された細胞含有溶液を産生すること；（b）該濾過された細胞含有溶液中の細胞を、1ミリリットル当たり約1〜50×106、1〜40×106、1〜30×106、1〜20×106、1〜15×106、又は1〜10×106細胞で凍結保存すること；（c）該細胞を解凍すること；及び（d）該濾過された細胞含有溶液をデキストラン-40溶液で約1：1〜約1：11（v／v）に希釈することを含む方法によって作製する。特定の実施態様では、細胞の数が、工程（a）の前に、1ミリリットル当たり約10±3×106細胞未満である場合、濾過は任意である。別の具体的な実施態様では、工程（b）の細胞を1ミリリットル当たり約10±3×106細胞で凍結保存する。別の具体的な実施態様では、工程（b）の細胞を約5％〜約10％デキストラン-40とHSAとを含む溶液中で凍結保存する。特定の実施態様では、該工程（b）の希釈は、1ミリリットル当たり約15×106細胞以下までとする。
【０３３０】
別の実施態様では、医薬組成物を、（a）10％HSAを含む5.5％デキストラン-40溶液に胎盤幹細胞を懸濁して、細胞含有溶液を形成させること；（b）該細胞含有溶液を70μMフィルターに通して濾過すること；（c）該細胞含有溶液を、5.5％デキストラン-40、10％HSA、及び5％DMSOを含む溶液で、1ミリリットル当たり約1〜50×106、1〜40×106、1〜30×106、1〜20×106、1〜15×106、又は1〜10×106細胞に希釈すること；（d）該細胞を凍結保存すること；（e）該細胞を解凍すること；並びに（f）該細胞含有溶液を10％デキストラン-40で1：1〜1：11（v／v）に希釈することを含む方法によって作製する。特定の実施態様では、該工程（c）の希釈は、1ミリリットル当たり約15×106細胞以下までとする。特定の実施態様では、該工程（c）の希釈は、約10±3×106細胞／mL以下までとする。特定の実施態様では、該工程（c）の希釈は、約7.5×106細胞／mL以下までとする。
【０３３１】
別の実施態様では、細胞を含む組成物を、（a）複数の細胞、例えば、胎盤幹細胞を遠心分離して、該細胞を回収すること；（b）該細胞を5.5％デキストラン-40に再懸濁すること；（c）該細胞を遠心分離して、該細胞を回収すること；（d）該細胞を、10％HSAを含む5.5％デキストラン-40溶液に再懸濁すること；（e）該細胞を70μMフィルターに通して濾過すること；（f）該細胞を、1ミリリットル当たり約1〜50×106、1〜40×106、1〜30×106、1〜20×106、1〜15×106、又は1〜10×106細胞になるまで5.5％デキストラン-40、10％HSA、及び5％DMSOに希釈すること；（g）該細胞を凍結保存すること；（h）該細胞を解凍すること；並びに（i）該細胞を10％デキストラン-40で1：1〜1：11（v／v）に希釈することを含む方法によって作製する。特定の実施態様では、該工程（f）の希釈は、1ミリリットル当たり約15×106細胞までとする。特定の実施態様では、該工程（f）の希釈は、約10±3×106細胞／mL以下までとする。特定の実施態様では、該工程（f）の希釈は、約7.5×106細胞／mL以下までとする。他の特定の実施態様では、細胞の数が、1ミリリットル当たり約10±3×106細胞未満である場合、濾過は任意である。
【０３３２】
細胞産物の投与に好適な他の注射用製剤を使用してもよい。
【０３３３】
本発明の方法において有用な医薬組成物は、本明細書に記載の、例えば、上の第5.2.2節に記載の胎盤幹細胞のいずれかを含むことができる。一実施態様では、医薬組成物は、実質的に、又は完全に非母親起源のものである、すなわち、胎児の遺伝子型を有する単離された胎盤幹細胞を含み；例えば、少なくとも約90％、95％、98％、99％、又は約100％は、非母親起源のものである。特定の実施態様では、医薬組成物は、非限定的な例では、CD10+、CD34-、CD105+、及びCD200+；CD200+及びHLA-G-；CD73+、CD105+、及びCD200+；CD200+及びOCT-4+；又はCD73+、CD105+、及びHLA-G-；又は前述のものの組合せである単離された胎盤幹細胞の集団を含み、ここで、該単離された胎盤幹細胞の少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％は、非母親起源のものである。別の実施態様では、医薬組成物は、CD10+、CD105+、及びCD34-；CD10+、CD105+、CD200+、及びCD34-；CD10+、CD105+、CD200+、CD34-、及びCD90+もしくはCD45-のうちの少なくとも1つ；CD10+、CD90+、CD105+、CD200+、CD34-、及びCD45-；CD10+、CD90+、CD105+、CD200+、CD34-、及びCD45-；CD200+及びHLA-G-；CD73+、CD105+、及びCD200+；CD200+及びOCT-4+；CD73+、CD105+、及びHLA-G-；CD117-、CD133-、KDR-、CD80-、CD86-、HLA-A、B、C+、HLA-DP、DQ、DR-、及び／もしくはPDL1+のうちの少なくとも1つ；又は前述のものの組合せである単離された胎盤幹細胞の集団を含み、ここで、該単離された胎盤幹細胞の少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％は、非母親起源のものである。具体的な実施態様では、医薬組成物はさらに、胎盤から得られていない幹細胞を含む。
【０３３４】
本明細書で提供される、組成物、例えば、医薬組成物中の単離された胎盤幹細胞は、単一のドナーに由来するか、又は複数のドナーに由来する胎盤幹細胞を含むことができる。単離された胎盤幹細胞は、意図されるレシピエントと完全にHLAが一致するものであることができるか、又は一部もしくは完全にHLAが一致しないものであることができる。
【０３３５】
本明細書で提供される医薬組成物は、BM-MSCをさらに含むことができる。特定の実施態様では、胎盤幹細胞及びBM-MSCは、医薬組成物中に、例えば、細胞の数で、99：1、95：5、90：10、85：15、80：20、75：25、70：30、65：35、60：40、55：45、50：50、45：55、40：60、35：65、30：70、25：75、20：80、15：85、10：90、5：95、もしくは1：99、又は細胞の数で99：1〜95：5、95：5〜90：10、90：10〜85：15、85：15〜80：20、80：20〜75：25、75：25〜70：30、70：30〜65：35、65：35〜60：40、60：40〜55：45、55：45〜50：50、50：50〜45：55、45：55〜40：60、40：60〜35：65、35：65〜30：70、30：70〜25：75、25：75〜20：80、20：80〜15：85、10：90〜5：95、もしくは5：95〜1：99の比で存在する。
【０３３６】
（5.6.4  単離された胎盤幹細胞を含むマトリックス）
胎盤幹細胞を含むマトリックス、ハイドロゲル、スキャフォールドなどを含む組成物が本明細書でさらに提供される。そのような組成物を、液体懸濁液中の細胞の代わりに、又はそれに加えて用いることができる。特定の実施態様では、単離された胎盤幹細胞を血小板が豊富な血漿と組み合わせる。他の実施態様では、単離された胎盤幹細胞をアルギネートと組み合わせる。
【０３３７】
本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞を、天然マトリックス、例えば、羊膜材料などの胎盤生体材料に播種することができる。そのような羊膜材料は、例えば、哺乳動物の胎盤から直接解剖された羊膜；固定又は熱処理された羊膜、実質的に乾燥している（すなわち、＜20％H2Oの）羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥している絨毛膜、実質的に乾燥している羊膜と絨毛膜などであることができる。単離された胎盤幹細胞を播種することができる好ましい胎盤生体材料は、その開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、Haririの米国特許出願公開第2004／0048796号に記載されている。
【０３３８】
本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞を、例えば、注射に好適なハイドロゲル溶液に懸濁することができる。そのような組成物のための好適なハイドロゲルは、RAD16などの自己集合ペプチドを含む。一実施態様では、細胞を含むハイドロゲル溶液を、例えば、鋳型中で硬化させて、その中に分散した細胞を有する移植用のマトリックスを形成させることができる。そのようなマトリックス中の単離された胎盤幹細胞を、該細胞が移植前に有糸分裂で拡大されるように培養することもできる。ハイドロゲルは、例えば、共有結合、イオン結合、又は水素結合によって架橋されて、3次元開放格子構造を生成する有機ポリマー（天然物又は合成物）であり、この3次元開放格子構造は、水分子を捕捉してゲルを形成する。ハイドロゲル形成材料としては、イオンによって架橋される、アルギネートなどの多糖類及びその塩、ペプチド、ポリホスファジン、並びにポリアクリレート、又はそれぞれ、温度もしくはpHによって架橋される、ポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのブロックポリマーが挙げられる。いくつかの実施態様では、ハイドロゲル又はマトリックスは生体分解性である。
【０３３９】
いくつかの実施態様では、製剤は、インサイチュで重合可能なゲルを含む（例えば、その開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許出願公開第2002／0022676号；Ansethらの文献, J. Control Release, 78（1-3）：199-209（2002）；Wangらの文献, Biomaterials, 24（22）：3969-80（2003）を参照されたい）。
【０３４０】
いくつかの実施態様では、ポリマーは、荷電側基、又はその一価イオン塩を有する水、緩衝塩溶液、又は水性アルコール溶液などの水溶液に少なくとも一部溶ける。カチオンと反応させることができる酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）、及びスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーである。アクリル酸又はメタクリル酸とビニルエーテルモノマー又はビニルエーテルポリマーの反応によって形成される酸性側基を有するコポリマーを用いることもできる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくは、フッ素化）アルコール基、フェノール性OH基、及び酸性OH基である。
【０３４１】
本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞又はその共培養物を3次元フレームワーク又はスキャフォールドに播種し、インビボに移植することができる。そのようなフレームワークを、任意の1種以上の成長因子、細胞、薬物、又は例えば、組織形成を刺激する他の成分と組み合わせて移植することができる。
【０３４２】
使用することができるスキャフォールドの例としては、不織布マット、多孔質発泡体、又は自己集合ペプチドが挙げられる。グリコール酸と乳酸の吸収性合成コポリマー（例えば、PGA／PLA）（VICRYL, Ethicon社, Somerville, N.J.）から構成される繊維を用いて、不織布マットを形成させることができる。フリーズドライ、又は凍結乾燥などのプロセスによって形成される、例えば、ポリ（ε-カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（PCL／PGA）コポリマーから構成される発泡体（例えば、米国特許第6,355,699号）をスキャフォールドとして用いることもできる。
【０３４３】
別の実施態様では、単離された胎盤幹細胞を、例えば、PGA、PLA、PCLコポリマーもしくはブレンド、又はヒアルロン酸などの生体吸収性材料でできたマルチフィラメント糸から構成されることができるフェルトに播種するか、或いはそれと接触させることができる。
【０３４４】
本明細書で提供される単離された胎盤幹細胞を、別の実施態様では、複合構造物である発泡体スキャフォールドに播種することができる。そのような発泡体スキャフォールドを、特定の構造物の一部、例えば、病変を含む骨の形状などの、有用な形状に成形することができる。いくつかの実施態様では、フレームワークを、例えば、0.1M酢酸で処理し、その後、細胞接着を強化するために、細胞の接種前に、ポリリジン、PBS、及び／又はコラーゲン中でインキュベートする。例えば、マトリックスのプラズマ被覆、又は1種以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパラン硫酸（heparin sulfate）、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸（keratin sulfate）など）、細胞マトリックス、並びに／もしくは限定するものではないが、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロース、及び植物ゴムなどのような他の材料の付加によって、マトリックスの外部表面を修飾し、細胞の接着又は成長、及び組織の分化を改善することができる。
【０３４５】
いくつかの実施態様では、スキャフォールドは、それを抗血栓性にする材料を含むか、又は該材料で処理される。これらの処理及び材料は、内皮成長、移動、及び細胞外マトリックス沈着を促進し、かつ持続させることもできる。これらの材料及び処理の例としては、天然材料、例えば、ラミニン及びIV型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、合成材料、例えば、EPTFE、並びにセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えば、PURSPAN（商標）（The Polymer Technology Group社, Berkeley, Calif）が挙げられるが、これらに限定されない。スキャフォールドは、ヘパリンなどの抗血栓剤を含むこともでき；単離された胎盤幹細胞の播種の前に、スキャフォールドを、表面電荷を変化させるように処理する（例えば、プラズマで被覆する）こともできる。
【０３４６】
本明細書で提供される胎盤幹細胞を、限定するものではないが、モノリン酸カルシウム、ジリン酸カルシウム、トリリン酸カルシウム、α-トリリン酸カルシウム、β-トリリン酸カルシウム、及びテトラリン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムマグネシウム、BIOGLASS（登録商標）などの生体活性ガラス、並びにそれらの混合物をはじめとする、生理的に許容し得るセラミック材料に播種するか、又はそれと接触させることもできる。現在市販されている多孔性の生体適合性セラミック材料としては、SURGIBONE（登録商標）（CanMedica社, Canada）、ENDOBON（登録商標）（Merck Biomaterial France, France）、CEROS（登録商標）（Mathys, AG, Bettlach, Switzerland）、並びにHEALOS（商標）（DePuy社, Raynham, MA）、並びにVITOSS（登録商標）、RHAKOSS（商標）、及びCORTOSS（登録商標）（Orthovita, Malvern, Pa.）などの石灰化コラーゲンの骨移植用製品が挙げられる。フレームワークは、天然材料及び／又は合成材料の混合物、ブレンド、又は複合物であることができる。
【０３４７】
一実施態様では、単離された胎盤幹細胞を、約0.5×106〜約8×106細胞／mLで、好適なスキャフォールドに播種するか、又はそれと接触させる。
【０３４８】
（5.7  不死化胎盤幹細胞）
成長促進タンパク質の産生及び／又は活性が外部因子によって調節可能であるように、骨関連癌の治療、骨関連癌細胞増殖の抑制、又は破骨細胞前駆体成熟の抑制において有用な胎盤幹細胞を、成長促進遺伝子、すなわち、適切な条件下で、トランスフェクトされた細胞の成長を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む任意の好適なベクターによるトランスフェクションによって、条件付きで不死化することができる。好ましい実施態様では、成長促進遺伝子は、限定するものではないが、v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40ラージT抗原、ポリオーマラージT抗原、E1aアデノウイルス、又はヒトパピローマウイルスのE7タンパク質などのオンコジーンである。
【０３４９】
成長促進タンパク質の外部調節は、外部調節可能なプロモーター、例えば、その活性を、例えば、トランスフェクトされた細胞の温度又は該細胞と接触する培地の組成を変更することによって制御することができるプロモーターの制御下に成長促進遺伝子を配置することによって達成することができる。一実施態様では、テトラサイクリン（tet）制御遺伝子発現系を利用することができる（Gossenらの文献, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：5547-5551, 1992；Hoshimaruらの文献, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：1518-1523, 1996を参照されたい）。tetの非存在下で、このベクター中のtet制御性トランス活性化因子（tTA）は、tetオペレーター配列に融合したヒトサイトメガロウイルス由来の最小プロモーターであるphCMV*-1からの転写を強く活性化する。tTAは、大腸菌のトランスポゾン-10由来のtet耐性オペロンのリプレッサー（tetR）と単純ヘルペスウイルスのVP16の酸性ドメインの融合タンパク質である。tetの低い、非毒性濃度（例えば、0.01〜1.0μg/mL）は、tTAによるトランス活性化をほぼ完全に消失させる。
【０３５０】
一実施態様では、ベクターは、選択マーカー、例えば、薬物耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む。細菌のネオマイシン耐性遺伝子（neoR）は、本方法において利用し得るそのようなマーカーの1つである。neoRを有する細胞は、成長培地への、例えば、100〜200μg/mLのG418の添加などの、当業者に公知の手段によって選択することができる。
【０３５１】
トランスフェクションは、限定するものではないが、レトロウイルス感染を含む、当業者に公知の種々の手段のいずれかによって達成することができる。一般に、細胞培養物を、ベクターのプロデューサー細胞株から回収される馴化培地とN2補給剤含有DMEM/F12の混合物とのインキュベーションによってトランスフェクトすることができる。例えば、上記のように調製された胎盤幹細胞培養物を、例えば、5日後にインビトロで、1容量の馴化培地と2容量のN2補給剤含有DMEM/F12中での約20時間のインキュベーションによって感染させることができる。その後、選択マーカーを有するトランスフェクトされた細胞を、上記のように選択することができる。
【０３５２】
トランスフェクション後、細胞を、増殖を可能にする、例えば、24時間の間に細胞の少なくとも約30％を倍加させる表面に継代する。好ましくは、基材は、ポリオルニチン（10μg/mL）及び／もしくはラミニン（10μg/mL）でコーティングされた組織培養プラスチックからなるポリオルニチン／ラミニン基材、ポリリジン／ラミニン基材、又はフィブロネクチンで処理された表面である。その後、培養物に、3〜4日ごとに成長培地を供給する。この成長培地には、1種以上の増殖増強因子が補充されていてもよいし、補充されていなくてもよい。増殖増強因子は、培養物が50％未満のコンフルエントである場合に、成長培地に添加してもよい。
【０３５３】
80〜95％コンフルエントになったとき、条件的に不死化された胎盤幹細胞株を、標準的な技術を用いて、例えば、トリプシン処理によって継代することができる。約20回目の継代までは、いくつかの実施態様では、選択（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含む細胞の場合、G418の添加による）を維持することが有益である。細胞は、長期保存のために液体窒素で凍結することもできる。
【０３５４】
クローン細胞株を、上記のように調製された条件的に不死化されたヒト胎盤幹細胞株から単離することができる。一般に、そのようなクローン細胞株を、標準的な技術を用いて、例えば、限定希釈によるか、又はクローニングリングを用いて単離し、拡大することができる。通常、クローン細胞株に、上記のように栄養を与え、それを継代することができる。
【０３５５】
クローンであってもよいが、その必要はない、条件的に不死化されたヒト胎盤幹細胞株は、通常、分化を促進する培養条件下で成長促進タンパク質の産生及び／又は活性を抑制することによって、分化するように誘導することができる。例えば、成長促進タンパク質をコードする遺伝子が外部調節可能なプロモーターの制御下にある場合、条件、例えば、培地の温度又は組成を変更して、成長促進遺伝子の転写を抑制することができる。上で論じられているテトラサイクリンで制御される遺伝子発現系については、成長促進遺伝子の転写を抑制するためのテトラサイクリンの添加によって、分化を達成することができる。一般に、分化を開始するのに、4〜5日間の1μg／mLのテトラサイクリンで十分である。さらなる分化を促進するために、追加の薬剤を成長培地に含めてもよい。
【０３５６】
上記の方法のいずれかを用いて、BM-MSCを不死化することもできる。
【０３５７】
（5.8  キット）
別の態様では、骨関連癌、例えば、多発性骨髄腫もしくは軟骨肉腫、又は本明細書中の別所に記載されている他の骨関連癌のうちの1つを有する個体の治療に好適なキットであって、残りのキット内容物とは別の容器中に、組織培養プラスチック胎盤幹細胞、例えば、上の第5.2.2節に記載の単離された胎盤幹細胞、及び／又は単離された骨髄由来間葉系幹細胞と、使用説明書とを含む、キットが本明細書で提供される。好ましくは、該胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCは、医薬として許容し得る溶液、例えば、病変内投与に好適な溶液又は静脈内投与に好適な溶液に入れて提供される。
【０３５８】
特定の実施態様では、キットは、個体への胎盤幹細胞及び／又はBM-MSCの送達を容易にする1種以上の構成要素を含む。例えば、特定の実施態様では、キットは、個体への細胞の病変内送達を容易にする構成要素を含む。そのような実施態様では、キットは、例えば、個体への細胞の送達に好適な注射器及び針などを含むことができる。そのような実施態様では、胎盤幹細胞は、バッグに、又は1以上のバイアルに入れて、キットに含まれていてもよい。特定の他の実施態様では、キットは、個体への胎盤細胞の静脈内又は動脈内送達を容易にする構成要素を含む。そのような実施態様では、胎盤幹細胞は、例えば、ボトル又はバッグ（例えば、血液バッグもしくは細胞を含む最大約1.5Lの溶液を含むことができる同様のバッグ）に含まれていてもよく、かつキットは、個体への細胞の送達に好適なチューブ及び針をさらに含む。
【０３５９】
さらに、キットは、個体の疼痛又は炎症を軽減する1種以上の化合物（例えば、鎮痛薬、ステロイド性又は非ステロイド性抗炎症化合物など）を含むことができる。キットは、抗菌化合物又は抗ウイルス化合物（例えば、1種以上の抗生物質）、個体の不安を軽減する化合物（例えば、アルプラゾラム（alaprazolam））、個体の免疫応答を低下させる化合物（例えば、シクロスポリンA）、抗ヒスタミン薬（ジフェンヒドラミン、ロラタジン、デスロラタジン、クエチアピン、フェキソフェナジン、セチリジン、プロメタジン、クロルフェニラミン（chlorepheniramine）、レボセチリジン、シメチジン、ファモチジン、ラニチジン、ニザチジン、ロキサチジン、ラフチジンなど）を含むこともできる。
【０３６０】
さらに、キットは、個体の送達への準備を促進するか、又は胎盤幹細胞の投与の結果としての個体の感染の可能性を低下させる、使い捨て品、例えば、滅菌ワイプ、使い捨て紙製品、手袋などを含むことができる。
【実施例】
【０３６１】
（6.実施例）
（6.1  実施例1：胎盤幹細胞はインビボで骨形成を促進する）
この実施例は、骨形成を促進する単離された組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞の能力を示す。
【０３６２】
胎盤幹細胞を以下のように得た。簡潔に述べると、約1×2×1cmの大きさがある胎盤組織を入手し、細かく切り刻んで約1mm3片にした。これらの片を、コラゲナーゼIA（2mg／ml、Sigma）で30分間消化し、その後、ウォーターバス中、37℃で、トリプシン-EDTA（0.25％、GIBCO BRL）で10分間消化した。得られた溶液を、室温で10分間、400gで遠心分離し、その後、消化溶液を除去した。ペレットを約10容になるようにPBSで再懸濁し、室温で10分間、400gで遠心分離した。組織／細胞ペレットを130mLの培養培地に再懸濁し、フィブロネクチンコーティングしたT-75フラスコ当たり13mlで細胞を播種した。5％CO2の加湿雰囲気にして、細胞を37℃でインキュベートした。本明細書に記載の研究、及び以下の実施例で用いる細胞は、使用前に継代数6になるまで培養した。そのような単離された胎盤幹細胞は、通常、CD34-、CD10+、CD105+、及びCD200+である。CD44及びCD90に対する抗体を用いた検討により、該細胞は、CD34-、CD10+、CD44+、CD90+、CD105+、及びCD200+であることがさらに示された。
【０３６３】
この研究で用いたラットは、研究の時点で約6週齢であった。16匹のラットを各群に割り当てた。96匹の雄Hsd：RH-Foxnrnu無胸腺ラット（Charles River, Wilmington, Massachusetts）において両側性頭蓋欠損（左右；約3mm×5mm）を作出した。簡潔に述べると、両耳の間の中心頭蓋部で、皮膚横切開を行ない、組織拡張器を該切開の吻縁部の中心領域に入れた（スキンフラップ）。該拡張器は切開を広げ、頭蓋を露出させた。切開を行なった後、頭頂骨から骨膜を取り除いた。欠損部位に印を付け、中速のDremelドリルを用いて、両欠損の縁部を、各頭頂骨において約3mm×5mmの面積になるよう、丁寧に切り開いた。欠損の端をチェックし、必要な場合はピンセットを用いて、丁寧に平滑化した。掃除して、余分な流体を除去した後すぐに、欠損を下記のように病変内処置した。その後、頭蓋を覆うように真皮を引き戻し、縫合糸を用いて真皮切開を閉じた。
【０３６４】
処置群は以下の通りであった。ラット1匹当たり1つの欠損を、胎盤幹細胞（500μL中、5×106細胞）、骨髄由来間葉系幹細胞（BM-MSC；新鮮な骨髄穿刺液から得られたもの（AllCells, Emeryville, California））（500μL中、5×106細胞）とともにシーディングしたHEALOS（登録商標）（架橋したコラーゲンとハイドロキシアパタイトを含むスポンジ状の生体模倣マトリックス；DuPuy Spine社, Raynham, Massachusetts）、陰性対照としてのHEALOS（登録商標）のみ、又は陽性対照としての、骨形成タンパク質2（BMP-2）（外植片当たり5μg）が補充されたHEALOS（登録商標）で修復した。他の陰性対照ラットでは、欠損を修復しなかった。各ラットの残りの欠損は、HEALOS（登録商標）のみを用いて修復した。
【０３６５】
移植3週間後、HEALOS（登録商標）＋BMP-2、HEALOS（登録商標）＋胎盤幹細胞、及びHEALOS（登録商標）＋BM-MSCを受容したラットは全て、ほぼ同じレベルの治癒を示し、かつHEALOS（登録商標）のみを受容したラット、又は修復を受けていないラットよりも有意に大きい頭蓋欠損の治癒を示した。図1を参照されたい。
【０３６６】
したがって、PDACは、多発性骨髄腫進行の1つの症状である、骨病変の治癒を促進する能力を有する。
【０３６７】
（6.2  実施例2：胎盤幹細胞は破骨細胞の成熟を抑制する）
この実施例は、組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞（PDAC）が破骨細胞前駆体の成熟を阻害することを示す。破骨細胞前駆体の抑制は、骨髄腫誘発性の破骨細胞過剰産生によって生じた骨病変（及び付随する症状）に苦しむ多発性骨髄腫患者に利益をもたらすであろう。
【０３６８】
EASYSEP（登録商標）ヒトCD14陽性選択キット（Cat# 18058）を用いて、末梢血単核細胞（PBMC）からCD14+細胞を濃縮することによって得られたヒト破骨細胞前駆体を、24ウェルプレート中に調製し、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）及び核因子κBリガンドの受容体活性化因子（RANKL；Yaccobyらの文献, Cancer Research 64（6）：2016-2023（2004）を参照されたい）が補充された培地αMEM中で培養した。実施例1に記載した通りに単離された胎盤幹細胞、又は胎児間葉系幹細胞（MSC）は、該細胞を1μm TRANSWELL（登録商標）（COSTAR（登録商標）；CORNING（登録商標）, New York）（10,000細胞／TRANSWELL（登録商標））に播種し、該胎盤幹細胞又はMSCを破骨細胞前駆体と5〜6日間共培養することによって、非接触条件で破骨細胞前駆体とともに培養した。培養の最後に、TRANSWELL（登録商標）を取り外し、アネキシンV／PIキット（Caltag Labs., Burlingame, California）を用いてアネキシンV及びヨウ化プロピジウム（PI）について染色することによって、破骨細胞前駆体及び／又は破骨細胞をアポトーシスの痕跡について調べた。アネキシンVは、アポトーシス時に形質膜の内側の膜から外側の膜へと輸送されるホスファチジルセリンに結合し；無傷の形質膜を有する細胞は、ヨウ化プロピジウムを排出する。したがって、アネキシン染色は陽性であるが、PI染色は陽性でない細胞は、初期アポトーシス細胞であり；アネキシン染色とPI染色の両方が陽性の細胞は、後期アポトーシス細胞である。
【０３６９】
アネキシンV及びヨウ化プロピジウム染色の増加が示すように、胎盤幹細胞は、多発性骨髄腫細胞を胎盤幹細胞なしで成長させた対照と比べて、アポトーシスを有意に誘導し、破骨細胞前駆体の生存能力を低下させることが分かった。
【０３７０】
TRANSWELL（登録商標）中の細胞をホルマリンで固定し、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP；破骨細胞マーカー）について染色した。TRAPを発現する多核破骨細胞の数を各ウェルで計数した。組織切片中のTRAP染色の減少、及びTRAP陽性破骨細胞の数の有意な（p＜0.05）減少が示すように、実施例1に記載した通りに単離された胎盤幹細胞は、破骨細胞の分化を阻害した（図2）。
【０３７１】
したがって、胎盤幹細胞は、骨病変を修復することができるだけでなく、そのような病変を生成させるか、又はそのような病変の一因となる破骨細胞の数及び活性を減少させることもできる。
【０３７２】
（6.3  実施例3：胎盤幹細胞は多発性骨髄腫細胞の成長を阻害する）
この実施例は、組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞（PDAC）がインビトロとインビボの両方で多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制することができることを示す。
【０３７３】
（6.3.1  PDACによるインビトロでの多発性骨髄腫細胞増殖の抑制）
ヒト多発性骨髄腫細胞株BN、JB、DNC、及びHLE（Liらの文献, Br. J. Haematol. 138（6）：802-11（2007）を参照されたい）、並びにARP1は、アーカンソー医科大学骨髄腫研究治療研究所（Myeloma Institute for Research and Therapy at the University of Arkansas for Medical Sciences）で樹立された。多発性骨髄腫細胞株U266（Nilssonらの文献, Clin. Exp. Immunol. 7：477（1970））は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。細胞同士が接触する条件での胎盤幹細胞の存在下での腫瘍成長の追跡及び解析をしやすくするために、これらの細胞株に、確立された方法（Liらの文献, 同書を参照されたい）でルシフェラーゼ／GFPレンチウイルスコンストラクトをトランスフェクトした。BN、JB、及びDNCは、ストローマ依存性細胞株である。胎盤幹細胞、胎児MSG（FB-MSC）、及び多発性骨髄腫の患者の骨髄から作製されたMSC（Pt-MSC）を、96ウェルプレート中、約10,000細胞／ウェルで培養した。多発性骨髄腫細胞（10,000細胞／ウェル）を、10％FBS及び抗生物質が補充されたRPMI培地中で、胎盤幹細胞又はMSCと1週間共培養した。培養の最後に、多発性骨髄腫細胞の成長をルシフェラーゼ活性の測定により決定することができた。
【０３７４】
この研究の結果を図3にまとめる。この図は、FB-MSC及びPt-MSCの存在下での成長と比べた、胎盤幹細胞の存在下での多発性骨髄腫細胞の成長の成長倍数を示している。胎盤幹細胞の存在下での多発性骨髄腫細胞の成長は、特定の細胞株によって様々に異なっていたが、各細胞株の成長は、胎児MSC又は親MSCと共培養した細胞株よりも胎盤幹細胞と共培養した細胞株で有意に低かった。
【０３７５】
また、骨芽細胞骨形成因子（例えば、アスコルビン酸、βグリセロホスフェート、及びデキサメタゾン）で約3〜3.5週間馴化したDMEM／10％胎仔ウシ血清（FBS）とのインキュベーションによって、MSC、及び実施例1に記載した通りに単離された胎盤幹細胞を誘導して、骨芽細胞に分化させた（Yaccobyらの文献, Haematologica 91（2）：192-199（2006）を参照されたい）。多発性骨髄腫細胞株の成長に対する効果を検討するために、プレートをPBSで洗浄して、骨形成性因子を除去した。FB-MSC又はPt-MSCから発生した骨芽細胞との共培養下での多発性骨髄腫細胞の成長は、FB-MSC又はPt-MSCとの共培養下での多発性骨髄腫細胞の成長と比べて、低下した。胎盤幹細胞の骨芽細胞への分化は、胎盤幹細胞との共培養と比べて、多発性骨髄腫細胞株の成長に全く影響を及ぼさなかったか、又は多発性骨髄腫細胞株の成長をわずかに低下させた。これらの細胞株のほとんどに対して、この実験を3回繰り返した。
【０３７６】
細胞間接着のあり得る効果を調べるために、細胞を、細胞間接着が妨げられているシステムで培養した。特に、MSC（FB-MSCもしくはBM-MSC）、又は実施例1に記載した通りに単離された胎盤幹細胞を、24ウェルのTRANSWELL（登録商標）膜の裏側のTRANSWELL（登録商標）システムで培養し、一方、多発性骨髄腫形質細胞を、TRANSWELL（登録商標）の上部チャンバーで培養した。図4を参照されたい。6人の患者に由来する初代多発性骨髄腫細胞をCD138免疫磁気ビーズ分離を用いて単離し、500,000多発性骨髄腫細胞／ウェルで、MSC又は胎盤幹細胞（100,000細胞／TRANSWELL（登録商標））と6〜10日間共培養した。CD138は、形質細胞のマーカーである。
【０３７７】
多発性骨髄腫細胞の生存率に対する共培養の効果を、トリパンブルー排出、及びMTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイで決定した。MTTアッセイは、MTTをホルマザンに還元して、紫色を生じさせる酵素の活性を測定する比色アッセイである。この還元は、ミトコンドリアのレダクターゼ酵素に活性があるときにのみ起こり、したがって、変換が、生細胞の尺度として用いられることが多い。ある実験では、多発性骨髄腫細胞を、上記の実施例2に記載されているようなアネキシンV／PIフロー解析にも供した。試験した大半の患者由来の骨髄腫細胞について、初代多発性骨髄腫細胞の生存は、胎児MSCとのTRANSWELL（登録商標）共培養下での生存と比べて、胎盤幹細胞とのTRANSWETL（登録商標）共培養下で低下した。図5を参照されたい。
【０３７８】
（6.3.2  胎盤幹細胞による多発性骨髄腫細胞増殖の抑制及びインビボでの骨量増加）
増強型緑色蛍光タンパク質（EGFP）コード配列を含むpLEGFPレトロウイルスベクター（Clontech, Palo Alto, California, USA）で、SuperFect（QIAGEN社, Valencia, California, USA）を用いて、パッケージング細胞株Phoenix Eco（同種指向性）を一過性にトランスフェクトした。EGFPは、哺乳動物細胞でのより明るい蛍光及びより高い発現を求めて最適化された野生型オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質の赤方偏移変異体である。トランスフェクションの24〜48時間後、レトロウイルス粒子を含む上清を回収した。追跡しやすくするために、胎盤幹細胞に、8μg／mlのポリブレンの存在下で12時間、レトロウイルス粒子を感染させ、12時間の時点で、培地を新鮮な培養培地に交換した。いくつかの実験では、細胞を、ウイルス粒子を含む上清にもう一度曝した後、200〜400μg／mlのG418の存在下で細胞を2〜3週間培養することによって選択した。
【０３７９】
初代ヒト骨髄腫のSCID-huモデルにおいてヒト骨組織を用いる代わりとして、ウサギの骨をSCIDマウスに移植し（SCID-rabマウス）、その後、移植された骨に骨髄腫細胞を直接導入する系を用いた。骨髄腫性SCID-rabマウスを先に記載されているように構築した。Yata, K.及びYaccoby, S.らの文献, Leukemia 2004；18：1891-1897を参照されたい。CB.17／Icr-SCIDマウス（6〜8週齢）をHarlan Sprague Dawley（Indianapolis, IN, USA）から、及び妊娠したNew ZealandウサギをMyrtle Rabbitry（Thompson Station, TN, USA）から入手した。3〜4週齢のウサギに高用量のペントバルビタールナトリウムで深く麻酔をかけ、頸椎脱臼で屠殺した。ウサギの大腿骨及び頸骨を、近位端と遠位端を閉じたまま2つに切断する一方、脊椎を小さい断片（1×2cm2）に切断した。
【０３８０】
骨移植のために、SCIDマウスの右側又は左側をアルコールで洗浄し、滅菌ガーゼで拭き取った。ウサギの骨を小さい（5mm）切開を通して皮下に挿入した。その後、この切開を、滅菌した外科用ステープルで閉鎖し、6〜8週間、骨の生着を生じさせておいた。いくつかの実験マウスでは、2本の骨を同じマウスに同時に対側移植した。各実験について、50μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に17±8％の形質細胞（PC）又は3.3±1.6×106個のPCを含む10〜50×106個の分離していないヒト患者由来骨髄腫骨髄細胞を、移植されたウサギの骨に直接注入した。各実験に、少なくとも2匹のマウスを用いた。マウスの尾静脈から定期的に採血し、Mタンパク質アイソタイプの循環ヒト免疫グロブリン（Ig）のレベルの変化を測定した。
【０３８１】
ELISAで見られるような、マウス血清中のヒトモノクローナル免疫グロブリン（hIg）のレベルの増加によって、及びレントゲン写真による溶解性骨病変の評価によって、骨髄腫成長の確立が示された。形質転換の前に、実施例1に記載した通りに単離された、5×105個のEGFP発現胎盤幹細胞を、トリプシン-EDTAを用いて回収し、50μlのPBSに再懸濁した。胎盤幹細胞を、SCID-rabマウスの移植された骨に直接注入した。注入後8〜16週間、実験を継続した。PIXImus DEXA密度計（GE Medical Systems LUNAR, Madison, WI）を用いて、移植された骨の骨ミネラル密度（BMD）の変化を決定した。ELISAで見られるような、マウス血清中のヒトモノクローナル免疫グロブリン（hIg）のレベルを追跡することによって、多発性骨髄腫細胞増殖に対する胎盤幹細胞の効果を決定した。
【０３８２】
ある患者（患者1と表す）由来の多発性骨髄腫細胞は、SCID-rab／SCID-huマウスで成長することが分かり、新たに構築されたSCID-rab／SCID-huマウスに継代することができた；しかしながら、それらは、独立に又はインビトロでストローマ層の上で成長することができなかった。多発性骨髄腫細胞がうまく生着した6匹のSCID-rabマウスに、トランスフェクトされた胎盤幹細胞を病変内投与し、6匹に対照（リン酸緩衝生理食塩水）を投与した。
【０３８３】
ELISAで見られるような、マウス由来血清中のヒトモノクローナル免疫グロブリン（hIg）の検出により、多発性骨髄腫細胞の成長は、胎盤幹細胞を注入してから2週間後及び4週間後に顕著に阻害されるが、PBSでは阻害されないことが分かった（p＜0.007；図6）。生きた動物における生体発光解析によって、これらのマウスにおけるルシフェラーゼ発現胎盤幹細胞が検出され；14日目の生体発光強度は、胎盤幹細胞が投与された全てのマウスで低下した（表1B）。さらに、胎盤幹細胞の投与前及び処置の4週間後に撮影されたX線から、骨髄腫性骨への胎盤幹細胞注入後の骨量の増加が明らかになったが、対照のPBS処置した骨では骨量の減少が明らかになった（図7）。
【０３８４】
【表２】
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【０３８５】
非骨髄腫性骨の骨量密度に対する胎盤幹細胞の効果を検討するために、胎盤幹細胞（1×106細胞／マウス）又はビヒクルを、SCID-rabマウスの移植された非骨髄腫性骨に直接注入した。ビヒクルではなく、胎盤幹細胞の注入は、処置前レベルからの移植された骨のBMDの顕著な増加をもたらした。これらのデータは、胎盤幹細胞の骨髄腫性骨又は非骨髄腫性骨への直接注入が局所的な骨量の増加をもたらしたこと、及び胎盤幹細胞による骨形成の増加が骨髄腫負荷の低下と関連していたことを示している。
【０３８６】
次に、本発明者らは、患者2と表される2人目の患者由来の骨髄腫細胞を利用した。この患者は、分子的には（侵襲性多発性骨髄腫及び予後不良と関連する）ハイリスクのMMSET亜型に分類され、かつ適度なレベルのDKK1を発現している。患者2の骨髄腫細胞は、培養で成長しなかったが、上記のSCID-rabモデルではうまく継代された。骨髄腫成長が十分に確立され、溶骨性病変が明白になったときに処置を開始した。胎盤幹細胞を、移植された骨に病変内注入したか（0.1〜1×106個の胎盤幹細胞／骨、7匹の宿主／群）、又はHyStem-Cハイドロゲル担体を用いて皮下注入した（5×106個の胎盤幹細胞／マウス、6匹のマウス）。処置の4週間後に解析すると、0.5×106個及び1×106個の胎盤幹細胞の病変内注入により、処置前レベルからの移植された骨のBMDの増加（p＜0.01）、又は対照群と比べた骨量減少の防止（p＜0.02）がもたらされた（図8）。1×106個の胎盤幹細胞の注入による骨量の増加はさらに、有意に近いレベルで骨髄腫成長の低下と関連していた（p＜0.08、図9）。
【０３８７】
骨髄腫骨疾患及び腫瘍成長に対する胎盤幹細胞の効果とヒト胎児MSCの効果も比較した。患者2の骨髄腫細胞が生着したSCID-rabマウス（7匹の宿主／群）の移植された骨に、細胞を直接注入した（1×106細胞／マウス）。胎盤幹細胞処置及びMSC処置は、処置前レベルと比べて、移植された骨のBMDの増加をもたらしたが、胎盤幹細胞の効果がより顕著であった（図10）。胎盤幹細胞処置とMSC処置はともに、SCID-rabモデルにおける患者#2の骨髄腫細胞の成長を有意に阻害した（図11）。これらの結果は、MSCと胎盤幹細胞がともに、骨髄腫に罹患した骨のBMDを増加させるのに効果的であるが、胎盤幹細胞は、胎児MSCよりも高い骨同化能を有することを示唆している。
【０３８８】
したがって、この実施例は、胎盤幹細胞が、特に骨髄腫性個体に病変内投与されたとき、多発性骨髄腫細胞の生存率を有意に低下させることができることを示している。胎盤幹細胞はまた、細胞間接着を可能にする条件において、及び細胞間接着を妨げる条件において、多発性骨髄腫細胞のインビトロでの生存率を低下させる。胎盤幹細胞が、骨、例えば、多発性骨髄腫の症状である骨病変を修復する能力、及び多発性骨髄腫関連骨病変の発症の主な原因である、破骨細胞成熟を阻害する能力と併せて、これらの結果は、胎盤幹細胞が有用な抗多発性骨髄腫療法となり得ることを示している。
【０３８９】
（6.4  実施例4：胎盤幹細胞は多発性骨髄腫の細胞周期停止を促進する）
この実施例は、組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞（PDAC）が、多発性骨髄腫細胞の成長を抑制することを示す。
【０３９０】
（6.4.1  胎盤幹細胞は多発性骨髄腫細胞増殖を抑制する）
多発性骨髄腫細胞の成長に対する胎盤幹細胞の効果を調べるために、実施例1に記載した通りに単離された胎盤幹細胞を、U-266（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）カタログ番号 TIB-196）、RPMI-8226（ATCCカタログ番号 CCL-155）、L-363（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSMZ）カタログ番号 ACC49）、H929（Gazdarの文献, Blood 67：1542-1549（1986））、LP-1（DSMZカタログ番号 ACC41）、及びOPM-2（DSMZカタログ番号 ACC-50）と表される、6種の多発性骨髄腫細胞株（MMCL）と共培養した。これらの実験用に選択された4種の多発性骨髄腫細胞株は、免疫グロブリンの産生の違い（表2参照）及び細胞マーカー発現の違い（表3A〜3C参照）から分かる、多発性骨髄腫細胞の不均一性を表している。
【表３】
2013518108.tif 000006
【表４】
2013518108.tif 000007
【表５】
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【表６】
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【０３９１】
実施例1に記載した通りに単離された、継代数6の胎盤幹細胞をDMEM＋10％胎仔ウシ血清（FCS）を用いて解凍した。1ウェル当たり5×104個の胎盤幹細胞を24ウェルプレートにプレーティングした。胎盤幹細胞が成長してコンフルエントになった後、1回だけ培地交換して、1ウェル当たり5×104個のMMCL細胞を胎盤幹細胞の上にプレーティングし、5％CO2下、37℃で4〜5日間インキュベートした。さらなる解析のために、培養してから1、2、及び5日目に、MMCL細胞を回収した。EASYCOUNT（商標）システム（Immunicon）を用いて、細胞を計数した。
【０３９２】
結果は、単独で培養されたこれらの多発性骨髄腫細胞と比べて、胎盤幹細胞が、多発性骨髄腫細胞株U266（p＜0.001、共培養5日目）、RPMI-8226（p＜0.03、共培養5日目）、H929（p＜0.003、共培養4日目）、及びOPM-2（p＜0.01、共培養5日目）の有意な成長阻害を達成することを示した。図12を参照されたい。個別の実験では、L-363細胞と胎盤幹細胞との共培養は、成長の実質的な阻害をもたらし（p＜0.06、共培養5日目）、LP-1細胞と胎盤幹細胞との共培養も、成長の阻害をもたらした。
【０３９３】
（6.4.2  胎盤幹細胞は、NF-κBシグナル伝達及びB細胞活性化において重要な役割を果たすタンパク質をコードする遺伝子の多発性骨髄腫細胞による発現を下方調節する）
多発性骨髄腫細胞株に対する胎盤幹細胞の成長阻害をさらに特徴付けるために、実施例1に記載した通りに単離された胎盤幹細胞を、U-266、RPMI-8226、OPM-2、及びH929細胞と4日間共培養し、その後、胎盤幹細胞と共培養した多発性骨髄腫細胞、又は単独で培養した多発性骨髄腫細胞を、胎盤幹細胞を乱すことなく、穏やかなピペッティングで回収し、その後、RNA調製及び定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）解析を行なった。qRT-PCRは、同時のリアルタイムPCR反応を可能にする384ウェルマイクロフルイディックカード（TAQMAN（登録商標）カスタムアレイ, Applied Biosystems）を用いて行なった。このカードは、B細胞シグナル伝達及びNF-κBシグナル伝達に関与する遺伝子を含む、細胞周期調節、細胞成長及び増殖、並びにホルモン性免疫応答に関与する300個の遺伝子を含んでいた。qRT-PCRは、7900HT高速リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）を用いて行ない、データは、REALTIME STATMINER（登録商標）ソフトウェアを用いて解析した。
【０３９４】
胎盤幹細胞との共培養は、TRAF1（TNF受容体関連因子1）、TRAF6を含む、B細胞活性化の重要な構成要素をコードする遺伝子、並びにTIRAP（Toll-インターロイキン1受容体TIRドメイン含有アダプタータンパク質）；p65／RelA、及びRelBを含む、NF-κBシグナル伝達経路の重要な構成要素をコードする遺伝子を有意に下方調節した。下記の表4を参照されたい。
【０３９５】
多発性骨髄腫細胞によって産生されるタンパク質であるDKK1は、骨芽細胞の活性を阻害し、骨再吸収に有利なように骨芽細胞と破骨細胞のバランスを変える。上記のような胎盤幹細胞との共培養の後、OPM-2細胞におけるDKK1発現も同様に下方調節された。表4を参照されたい。
【０３９６】
【表７】
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【０３９７】
（6.4.3  胎盤幹細胞は、サイクリン及びCDKをコードする遺伝子の多発性骨髄腫細胞による発現を下方調節し、CDK阻害因子をコードする遺伝子を上方調節する）
サイクリン（CCN）及びサイクリン依存性キナーゼ（CDK）の発現に対する実施例1に記載した通りに単離された胎盤幹細胞（PDAC）の効果を、上記のような、細胞周期調節に関与する遺伝子を含む384ウェルマイクロフルイディックカードを用いてqRT-PCRで解析し、かつインジェヌイティパスウェイアナリシス（Ingenuity Pathway Analysis）（INGENUITY（登録商標）システム、www.ingenuity.com）を用いて解析した。胎盤幹細胞は、多発性骨髄腫細胞株での、特定のCCN及びCDKをコードする遺伝子の発現を減少させ、かつ細胞型特異的な様式で特定のCDK阻害因子の遺伝子の発現を増大させることが分かった。例えば、多発性骨髄腫細胞株のOPM-2では、CDK3、CDK5、及びCDK7というCDKが下方調節され；多発性骨髄腫細胞株のRPMI-8226及びU-266では、CDK4が下方調節された。対照的に、多発性骨髄腫細胞株のOPM-2では、CDK阻害因子p16、及びp19、並びにCDK阻害因子3が上方調節され；多発性骨髄腫細胞株のRPMI-8226では、CDK阻害因子p19が上方調節され；多発性骨髄腫細胞株のU266では、p21が上方調節され；かつ多発性骨髄腫細胞株のH929では、p19、p21、及びp27が全て上方調節された。
【０３９８】
細胞周期関連遺伝子の発現の変化のまとめを下の表5A〜5Dに示す。
【０３９９】
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【０４００】
実施例1に記載した通りに単離された胎盤幹細胞は、多発性骨髄腫細胞株において、E2Fファミリーメンバー3、4、5、及び6（G1期からS期への移行において大きな役割を果たすタンパク質）並びにリン酸化Rb（網膜芽細胞腫タンパク）をコードする遺伝子の発現を減少させることも分かった。低リン酸化状態では、Rbは、E2Fファミリーの因子を阻害することにより、腫瘍抑制因子として働くが；リン酸化Rbは、細胞周期進行に対する阻害機能をほとんど持たないので、この知見は重要である。
【０４０１】
多発性骨髄腫細胞増殖に対する胎盤幹細胞の効果をさらに調べるために、網膜芽細胞腫タンパク（Rb）のリン酸化状態を、J146-35モノクローナル抗体（BD Pharmingen, Cat# 558549）及びJ112-906モノクローナル抗体（Cat# 558549, BD）を用いて、フローサイトメトリーで解析した。抗体J146-35は、RbのE2Fへの結合に影響を及ぼす、セリン780でリン酸化されたRb（pS780）を認識し、抗体J112-906は、c-Abl結合及び細胞周期進行を調節する、セリン807及び811でリン酸化されたRb（pS807／pS811）を認識する。胎盤幹細胞と共培養したH929、LP1、及びOPM2は、単独で培養した細胞と比べて、pS780、及びpS807／pS811におけるRBリン酸化の減少を示した。図13A〜13Cを参照されたい。
【０４０２】
多発性骨髄腫細胞株の増殖に対する胎盤幹細胞の効果を、APC BrdUフローキット（Cat# 552598, BD biosciences）を用いて、蛍光色素BrdU及び7-AADを用いてさらにアッセイした。胎盤幹細胞との共培養は、細胞株のRPMI-8226、OPM-2、及びU266について、単独で培養した多発性骨髄腫細胞と比べて、G0／G1期における多発性骨髄腫細胞のパーセンテージの増加、及びS期におけるそのような細胞のパーセンテージの減少をもたらした。表6を参照されたい。
【０４０３】
【表１２】
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【０４０４】
多発性骨髄腫細胞は、異常に高いレベルの免疫グロブリンを分泌する。多発性骨髄腫細胞株による免疫グロブリン産生に対する胎盤幹細胞の効果を調べるために、胎盤幹細胞と共培養したMMCL、又は単独で培養したMMCLによる表面又は細胞内免疫グロブリン産生をフローサイトメトリーで解析した。単独で培養したときの多発性骨髄腫細胞と比べて、免疫グロブリン産生の減少は、胎盤幹細胞と共培養したときの多発性骨髄腫細胞株H929、OPM2、及びLP1から観察された。例えば、単独で培養した細胞と比べて、共培養したH929細胞は、カッパ（κ）免疫グロブリン産生の減少を示し；共培養したOPM2細胞は、ラムダ（λ）産生の減少を示し；かつ共培養したLP1は、表面及び細胞内のラムダ及びIgG産生、並びに細胞内カッパ産生の減少を示した。表7を参照されたい。
【表１３】
2013518108.tif 000016
【０４０５】
胎盤幹細胞が多発性骨髄腫細胞の増殖を低下させることを示す上記の結果は、他の細胞型との胎盤幹細胞共培養の一般的な効果によるものではなく、多発性骨髄腫細胞に特異的なものであった。例えば、胎盤幹細胞は、3つの異なる比（10：1、1：1、及び1：10）で7日間かけて共培養したときに、CD34+造血細胞の拡大を増強することが分かった。
【０４０６】
したがって、上記の研究は、多発性骨髄腫細胞株と共培養したときに、胎盤幹細胞が、多発性骨髄腫細胞の成長速度を低下させ、細胞周期の進行に必要とされる細胞周期タンパク質をコードする多発性骨髄腫細胞株遺伝子の発現を下方調節し、かつ細胞周期進行の阻害因子をコードする遺伝子を上方調節することを示している。したがって、胎盤幹細胞は、インビボでの多発性骨髄腫細胞の増殖の低下に有用である。
【０４０７】
（6.5  実施例5：軟骨肉腫細胞の成長を抑制するための胎盤幹細胞の使用）
この実施例は、胎盤幹細胞（PDAC）が培養下の軟骨肉腫細胞の増殖を抑制することを示す。
【０４０８】
TRANSWELL（登録商標）培養：TRANSWELL（登録商標）共培養系での腫瘍細胞成長に対する実施例1に記載した通りに単離された胎盤幹細胞の効果を調べるために、1×104個又は5×104個のPDACを、600μLの成長培地中、TRANSWELL（登録商標）システムの底部チャンバーに播種し、1×104個の軟骨肉腫細胞（ATCC（登録商標）No. CRL-7891；成長培地中、400μL）を、TRANSWELL（登録商標）（直径3μm）の上部チャンバーに播種した。対照として、軟骨肉腫細胞を胎盤幹細胞なしで単独で培養した。全てのTRANSWELL（登録商標）共培養を24ウェルプレート中に準備し、各々の条件を3つ1組で準備した。5％CO2下、37℃の細胞培養インキュベーター内で7日間培養した後、上部チャンバー上の軟骨肉腫細胞をLeica顕微鏡を用いて調べた。
【０４０９】
軟骨肉腫は、腫瘍細胞周辺の軟骨基質の産生を特徴とする癌である。この症状と一致して、TRANSWELL（登録商標）実験では、軟骨肉腫細胞は、胎盤幹細胞の非存在下で、顕微鏡下にはっきりと見える、明確な凝集体として成長した。両方の比で検討された胎盤幹細胞の存在下では、軟骨肉腫細胞は目に見えてより少なく、これらの細胞は、腫瘍細胞のみの成長を特徴付ける細胞凝集体の完全な欠如を特徴とした。したがって、胎盤幹細胞は、軟骨肉腫細胞の成長を明確に阻害した。
【０４１０】
（6.6  実施例6：レナリドミドを用いた破骨細胞形成の阻害）
この実施例は、小分子レナリドミド（REVLIMID（登録商標）という商標名で市販されている；3-（4-アミノ-1-オキソ1,3-ジヒドロ-2H-イソインドール-2-イル）ピペリジン-2,6-ジオン）を用いて、破骨細胞形成を抑制することができることを示す。
【０４１１】
レナリドミドは、約1μMの濃度で著明な抗破骨細胞形成効果を有し、形成される破骨細胞の数の大幅な減少をもたらす（図14）。実施例1と同様に単離された胎盤幹細胞、及び0.1μM又は1μMのレナリドミドとともに培養した破骨細胞前駆体を、胎盤幹細胞又は骨髄由来間葉系幹細胞（BM-MSC）とともに成長させた破骨細胞と比較すると、レナリドミドは、破骨細胞前駆体から分化する破骨細胞の数をさらに減少させることが分かった。図15。したがって、PDACと約0.1μM〜1μMの濃度のレナリドミドの相乗的又は相加的な抗破骨細胞形成効果がある可能性がある。
【０４１２】
したがって、単独のレナリドミドと、胎盤幹細胞と組み合わせたレナリドミドはともに、破骨細胞前駆体の数を低下させるのに効果的であり、したがって、多発性骨髄腫などの骨関連癌に付随する骨病変の数及び／又は重症度を低下させる上で治療的に効果であるはずである。
【０４１３】
等価物：
本開示は、本明細書に記載の具体的な実施態様によって範囲が限定されるべきではない。実際、記載されたものに加えて、本明細書で提供される対象の様々な変更が、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【０４１４】
様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書で引用されており、その開示は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている。
【図１】
2013518108.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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