(57)【要約】  公知の成分の既定量を含む多成分混合物標準物を提供するステップ、多成分混合物標準物に対してラマン分光分析を実施するステップ、バイオプロセス操作から多成分試験混合物を提供するステップ、多成分試験混合物に対してラマン分光分析を実施するステップおよび多成分試験混合物を特徴付けるために多成分混合物標準物と多成分試験混合物の分析を比較するステップを含む、バイオプロセス操作において使用するための多成分混合物を特徴付ける方法。一実施形態では、多成分混合物標準物および多成分試験混合物はいずれも多糖（例えば、スクロースまたはマンニトール）、アミノ酸（例えば、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンまたはＬ−オルニチン）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）およびｐＨ緩衝液（例えば、クエン酸塩製剤）の１種以上、少なくとも２種、少なくとも３種、またはそれぞれを含む。
2013541711.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオプロセス操作において使用するための多成分混合物を特徴付ける方法であって、
（ａ）公知の成分の既定量を含む多成分混合物標準物を提供するステップ、
（ｂ）多成分混合物標準物に対してラマン分光分析を実施するステップ、
（ｃ）バイオプロセス操作から多成分試験混合物を提供するステップ、
（ｄ）多成分試験混合物に対してラマン分光分析を実施するステップおよび
（ｅ）多成分試験混合物を特徴付けるためにステップ（ｄ）の分析をステップ（ｂ）の分析と比較するステップを含む、方法。
【請求項２】
多成分混合物標準物および多成分試験混合物がいずれも多糖、アミノ酸およびｐＨ緩衝液の１種以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多成分混合物標準物および多成分試験混合物がいずれも多糖、アミノ酸およびｐＨ緩衝液の少なくとも２種を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
多糖がマンニトールである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｐＨ緩衝液がヒスチジンおよびクエン酸塩製剤から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
多成分混合物標準物および多成分試験混合物がさらに界面活性剤を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
界面活性剤がポリソルベート８０である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ランダムに選択された公知の成分の既定量を含む一連の多成分混合物標準物を提供するステップおよび一連の多成分混合物標準物に対してラマン分光分析を実施するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
一連の多成分混合物標準物に対するラマン分光分析の偏最小２乗回帰分析に基づいて多成分試験混合物を特徴付けるためのモデルを作成することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
多成分混合物が、動物対象に投与するために適切な製剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
対象がヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
製剤が生物学的活性剤と組み合わされるものであり、生物学的活性剤および製剤が組み合わされて規制機関によって承認される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
多成分混合物標準物および多成分試験混合物が、モノクローナル抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ウイルス、ウイルスサブユニット、ペプチドおよびワクチンから選択される作用物質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
多成分混合物標準物および多成分試験混合物がモノクローナル抗体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
多成分試験混合物に対するラマン分光分析がバイオプロセスからのオンライン試料で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ラマン分光分析が、品質管理手順の一部として定期的な間隔で実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
バイオプロセスが濾過または精製操作である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
多成分混合物標準物の少なくとも一部が多成分試験混合物に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
多成分試験混合物が、トニサイザー（ｔｏｎｉｃｉｚｅｒ）、界面活性剤、キレート剤、塩およびアルコールの少なくとも１種をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
モノクローナル抗体がアダリムマブである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオプロセス操作のプロセスのモニタリングおよび制御のためにラマン分光法を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオプロセス操作の典型的なモニタリングおよび制御は、ｐＨ、伝導率、タンパク質濃度および浸透圧などのインプロセス試験またはＥＬＩＳＡもしくはＨＰＬＣをベースにした方法などの分析技術を含む。これらの方法は、一般的すぎるかまたは面倒すぎて時間がかかりすぎる傾向がある。生物製剤プロセス中間体の化学的組成は、バイオプロセス操作の一貫性または質を制御および／または改善するために欠かせないことが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
品質および組成をリアルタイムまたは準リアルタイムで保証するために、生物製剤プロセス中間体のこのような多成分混合物を迅速で正確に試験する方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
特定の実施形態では、本発明で開示した主題は、公知の成分の既定量を含む多成分混合物標準物を提供するステップ、多成分混合物標準物に対してラマン分光分析を実施するステップ、バイオプロセス操作から１つまたは複数の多成分試験混合物を提供するステップ、多成分試験混合物に対してラマン分光分析を実施するステップおよび多成分試験混合物を特徴付けるために多成分混合物標準物と多成分試験混合物の分析を比較するステップを含む、バイオプロセス操作において使用するための多成分混合物を特徴付ける方法を提供する。例えば、多成分試験混合物を特徴付けるために多成分混合物標準物と多成分試験混合物の分析を比較するステップは、キャリブレーションモデルを得るために多成分混合物標準物から得られたデータを統計学的方法によって当てはめること、その後多成分試験混合物において濃度を測定するためにキャリブレーションモデルを使用することを含む。
【０００５】
特定の実施形態では、多成分混合物標準物および多成分試験混合物はいずれも糖（例えば、マンニトール）、アミノ酸（例えば、Ｌ−アルギニン、メチオニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−オルニチン、プロリン、アラニン、ｌ−アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、リシン、ヒスチジンおよびグルタミン酸）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｗｅｅｎ（商標）およびｐＨ緩衝液（例えば、クエン酸塩製剤、トリス緩衝液または酢酸塩緩衝液）の１種以上、少なくとも２種、少なくとも３種、またはそれぞれを含む。これらの製剤混合物は、抗菌剤（例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェノール、ｍ−クレゾール）またはＥＤＴＡなどのキレート剤またはポリオール、ＰＥＧなどのその他の成分またはＢＳＡなどのタンパク質または塩化ナトリウム、コハク酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムおよび塩化カルシウムなどの塩またはエタノールなどのアルコールなどのその他の成分を含有することができる。
【０００６】
特定の実施形態では、公知の成分の既定量を含む一連の多成分混合物標準物は、ランダムに選択されることが可能で、一連の多成分混合物標準物のラマン分光分析が実施される。データプロセシング法および主要成分法は、確実に信頼性のある予測をすることができる。例えば、ラマン分光分析の偏最小２乗回帰分析は、モデル（例えば、検量線）を作成するために一連の多成分混合物標準物について実施され得る。
【０００７】
特定の実施形態では、多成分混合物は、動物対象（例えば、ヒト対象）に投与するために適した製剤である。例えば、多成分混合物は、生物学的活性剤（例えば、モノクローナル抗体）と組み合わせるように企図された製剤緩衝液であってもよい。ある種のこのような実施形態では、多成分混合物（生物学的活性剤を含むまたは含まない）は、規制機関（例えば、米国食品医薬品局）に従い、規制認可を得た。特定の実施形態では、生物学的活性剤は、モノクローナル抗体（例えば、アダリムマブ）である。
【０００８】
特定の実施形態では、多成分試験混合物に対するラマン分光分析は、オンライン、オフラインまたはアットラインのいずれかのバイオプロセス操作（例えば、濾過または精製操作）から得られる。例えば、特定の実施形態では、試料は、品質管理手順の一部として定期的に入手され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】アミノ酸、ｐＨ緩衝液種および糖を含む３成分（アルギニン／クエン酸／トレハロース）緩衝系のラマンスペクトルを示した図である。このプロットは、Ｕｍｅｔｒｉｃｓ  ＳＩＭＣＡ  Ｐ＋Ｖ１２．０．１．０を使用して作成されている。Ｘ軸はデータ点数である。各データ点は、ラマンシフト波数である。Ｘ軸上にラマンシフト波数（ｃｍ−１）を再プロットすることができた。データは、波数１８００（＝Ｎｕｍ０）から開始して８００（＝Ｎｕｍ１０００）までである。ラマンスペクトルの生データは、（散乱した光子の数に関連する）強度の単位である。この図は、（水中における）３種類の個々の成分の平均センタリングされたスペクトルデータを示している。スペクトルの平均値は０である。その他の値は、おそらく平均からの標準偏差で、このスペクトルデータと比較される。
【図２】ランダムな値を有する３成分緩衝系（アルギニン／クエン酸／トレハロース）の実際濃度対予測濃度の比較を示した図である。この図は、新規溶液の濃度を予測するために、既存のモデルを使用して作成された。ｘ軸およびｙ軸は濃度（ｍＭ）である。
【図３】個々の成分による３成分緩衝系（アルギニン／クエン酸／トレハロース）の実際濃度対予測濃度の比較を示した図である。
【図４】４成分緩衝系（マンニトール／メチオニン／ヒスチジン／Ｔｗｅｅｎ（商標））の純粋成分の生スペクトルを示した図である。ｙ軸はスペクトル強度で、ｘ軸は波数ｃｍ−１である。
【図５】４成分緩衝系（マンニトール／メチオニン／ヒスチジン／Ｔｗｅｅｎ（商標））の純粋成分の生スペクトルを示した図である。ｙ軸はスペクトル強度で、ｘ軸は波数ｃｍ−１である。図５は、図４で示したスペクトルのより詳細な図で、「フィンガープリント」領域が拡大されている。
【図６】４成分緩衝系（マンニトール／メチオニン／ヒスチジン／Ｔｗｅｅｎ（商標））の純粋成分のＳＮＶ／ＤＹＤＸ／平均センター（Ｍｅａｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）スペクトルを示した図である。図６で示したデータは、全ての前処理：強度正規化のための標準正規変数（ＳＮＶ）、ベースライン正規化のための１次導関数およびスケーリングのための平均センタリングを行った後の、図４−５で示したものと同じデータに基づいている。
【図７】ランダムな値を有する４成分緩衝系（マンニトール／メチオニン／ヒスチジン／Ｔｗｅｅｎ（商標））の実際濃度対予測濃度の比較を示した図である。これは、新規溶液の濃度を予測するために、既存のモデルを使用して作成された。
【図８】個々の成分による３成分緩衝系（マンニトール／メチオニン／ヒスチジン／Ｔｗｅｅｎ（商標））の実際濃度対予測濃度の比較を示した図である。
【図９】タンパク質を含む３成分緩衝系（マンニトール／メチオニン／ヒスチジン／アダリムマブ）の純粋成分の生スペクトルを示した図である。生スペクトルは、ラマン強度を示している。
【図１０】タンパク質を含む３成分緩衝系（マンニトール／メチオニン／ヒスチジン／アダリムマブ）の純粋成分の生スペクトルを示した図で、フィンガープリント領域（８００−１７００ｃｍ−１）を詳細に示している。
【図１１】純粋成分のＳＮＶ／ＤＹＤＸ／平均センター−タンパク質を含む３成分緩衝系を示した図である。図１１で示したデータは、全ての前処理：強度正規化のための標準正規変数（ＳＮＶ）、ベースライン正規化のための１次導関数およびスケーリングのための平均センタリングを行った後の、図９−１０で示したものと同じデータに基づいている。
【図１２】個々の成分によるタンパク質を含む３成分緩衝系の実際濃度対予測濃度の比較を示した図である。
【図１３】プロセスおよび／または品質制御の一部としてラマン分光法を使用するアダリムマブ精製プロセスを示した図である。
【図１４】緩衝液、糖およびアミノ酸（メチオニン／マンニトール／ヒスチジン）の３成分混合物に関するダイアフィルトレーションプロセスのオンラインラマン濃度予測を示した図である。
【図１５】緩衝液、糖およびアミノ酸（メチオニン／マンニトール／ヒスチジン）の３成分混合物に関する反復ダイアフィルトレーションプロセスを示した図である。解像度を高めるために、データ点が追加して含まれている。
【図１６】糖（マンニトール）／タンパク質（アダリムマブ）溶液のラマンキャリブレーションを示した図である。
【図１７】糖／タンパク質（マンニトール／アダリムマブ）溶液を形成するために、水に溶かした抗体がマンニトール溶液と置換されるダイアフィルトレーション緩衝液交換プロセスの、オンラインラマン濃度予測を示した図である。交換された緩衝液では、その後タンパク質濃縮される。
【図１８】タンパク質濃縮相が１８０ｇ／Ｌまで拡張された、図１７の実験の反復を示した図である。
【図１９】ヒスチジンおよびアダリムマブ溶液のラマンキャリブレーションを示した図である。
【図２０】水に溶かしたタンパク質がヒスチジン溶液と置換される、ダイアフィルトレーション緩衝液交換プロセスのオンラインラマン濃度予測を示した図である。交換されたヒスチジンでは、その後アダリムマブ濃縮される。
【図２１Ａ】個々の成分によるタンパク質を含む２成分緩衝系の実際濃度対予測濃度の比較を示した図である。トリス濃縮。
【図２１Ｂ】個々の成分によるタンパク質を含む２成分緩衝系の実際濃度対予測濃度の比較を示した図である。酢酸塩濃縮。
【図２１Ｃ】個々の成分によるタンパク質を含む２成分緩衝系の実際濃度対予測濃度の比較を示した図である。アダリムマブ濃縮。
【図２２Ａ】個々の成分によるタンパク質を含む１成分緩衝系の実際濃度対予測濃度の比較を示した図である。Ｔｗｅｅｎ（商標）濃縮。
【図２２Ｂ】個々の成分によるタンパク質を含む１成分緩衝系の実際濃度対予測濃度の比較を示した図である。アダリムマブ濃縮。
【図２３】２種類の抗体（Ｄ２Ｅ７およびＡＢＴ−８７４）が、未修飾タンパク質の光誘導性架橋（ＰＩＣＵＰ）を使用して別々に凝集したとき使用された条件を示した図である。抗体は、凝集光源に０−４時間曝露された。
【図２４】図２３で概略を示した架橋のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示した図である。
【図２５】Ｄ２Ｅ７試料の主要成分分析を使用したラマン分光法およびモデル化されたスペクトルを示した図で、凝集した試料が明確な主要成分スコアを有し、ラマン分光法を使用して凝集から区別され得ることを示している。
【図２６】ＡＢＴ−８７４試料の主要成分分析を使用したラマン分光法およびモデル化されたスペクトルを示した図で、凝集した試料が明確な主要成分スコアを有し、ラマン分光法を使用して凝集から区別され得ることを示している。
【図２７Ａ】Ｄ２Ｅ７試料の偏最小２乗回帰分析を使用したラマン分光法およびモデル化されたスペクトルを示した図で、ラマン分光法の結果とＳＥＣ測定の間にいくらかの相関が示されている。
【図２７Ｂ】ＡＢＴ−９７４試料の偏最小２乗回帰分析を使用したラマン分光法およびモデル化されたスペクトルを示した図で、ラマン分光法の結果とＳＥＣ測定の間にいくらかの相関が示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
制約のためではなく明瞭化のために、本発明の詳細な説明は以下の小区分に分けられる：
（ｉ）定義
（ｉｉ）適用可能なプロセスおよび系、ならびに
（ｉｉｉ）ラマン分光器具および技術。
【００１１】
（ｉ）  定義
本明細書で使用したように、「糖」という用語は、一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎの化合物およびそれらの誘導体を含み、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類、糖アルコール、還元糖、非還元糖などをさらに含む。本明細書では糖の非限定的な例は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、デキストラン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、シリトール（ｓｙｌｉｔｏｌ）、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレチトース、ラフィノース、マンノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、グルシトール、マルチトール、ラクチトール、イソマルツロースなどを含む。
【００１２】
本明細書で使用したように、「界面活性剤」という用語は、表面活性剤を意味する。一実施形態では、界面活性剤は、非イオン性表面活性剤である。界面活性剤の例は、限定はしないが、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０）、ポロクサマー（例えば、ポロクサマー１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−またはステアリル−スルホベタイン、ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−またはステアリル−サルコシン、リノレイル−、ミリスチル−またはセチル−ベタイン、ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノレアミドプロピル−、ミリストアミドプロピル−、パルミドプロピル−またはイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）、ミリストアミドプロピル−、パルミドプロピル−またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン、メチルココイルタウレートナトリウムまたはメチルオレイルタウレート２ナトリウムならびにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコールならびにエチレンおよびプロピレングリコールのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）、ＰＦ６８（商標）など）などを含む。
【００１３】
本明細書で使用したように、「ｐＨ緩衝液」という用語は、その酸−塩基共役成分の作用によって、ｐＨの変化に対抗する緩衝化溶液を意味する。ｐＨを制御するｐＨ緩衝液の例は、トリス、トロラミン、リン酸塩、ビス−トリスプロパン、ヒスチジン、酢酸塩、コハク酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、グリシルグリシンおよびその他の有機酸緩衝液を含む。
【００１４】
本明細書で使用したように、「生物製剤」とは、細胞、分子、細胞器官（天然もしくは合成）または組換え源もしくは天然源いずれかの非合成化学物質由来の生きた生物から得られたその他の物質を意味する。例は、限定はしないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス、ウイルスサブユニット、ウイルス様粒子、ペプチド（合成および天然）、タンパク質を含む。これらの分子のいずれも、測定が可能で、系のモニタリングおよび制御において使用が可能なラマンシグナルを提供することができる。
【００１５】
本明細書で使用したように、「産業規模で実現されている」という用語は、例えば、治療薬または商業的に関心のあるその他の最終生成物の販売または流通から収入を得ることを見込んで、治療薬（例えば、ヒトに投与するためのモノクローナル抗体）またはその他の最終生成物が、長期間にわたって（例えば、少なくとも１週間、または１ヵ月、または１年にわたって）継続的に（維持または向上のために供給停止を必要とすることなく）生産される、バイオプロセスを意味する。産業規模での生産は、実験または調査の限られた期間のためのみに通常維持され、研究目的のために実施され、それによって生産された最終生成物の販売または流通から収入を得ることを期待しない、研究室での「ベンチトップ」生成と区別される。
【００１６】
(ｉｉ）  適用可能なプロセスおよびシステム
本出願の特定の実施形態は、バイオプロセス操作において使用された成分（例えば、多成分混合物）を特徴付けるために、ラマン分光技術を使用する。例えば、特定の実施形態では、ラマン分光法は、生物学的活性剤（例えば、モノクローナル抗体）と一緒にするように企図された製剤を特徴付けるために使用され得る。時々「製剤緩衝液」と呼ばれるこれらの製剤は、通常、生物製剤における賦形剤レベルを測定する多成分混合物である。例えば、このような製剤は一般的に、以下の、ｐＨ緩衝液（例えば、クエン酸塩、トリス、酢酸塩またはヒスチジン化合物）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）、糖および糖アルコール（例えば、マンニトール）および／またはアミノ酸（例えば、Ｌ−アルギニンまたはメチオニン）の１種以上を含む。製剤緩衝液中の誤差はしばしば、バッチ廃棄の原因となり、ひいては深刻な損失を引き起こす。
【００１７】
特定の実施形態では、ラマン分光技術は、タンパク質凝集を確認するために使用され得る。例えば、限定はしないが、本発明のラマン分光技術は、特定の実施形態において、抗体薬剤物質および薬剤製品試料などのタンパク質薬剤物質および薬剤製品試料の凝集を確認することができる。
【００１８】
特定の実施形態では、ラマン分光技術は、薬剤物質および薬剤製品試料中における賦形剤濃度を確かめるために使用され得る。ある種のこのような実施形態では、賦形剤濃度は、一連の分析試験を必要とすることなく、単一の読み取りに基づいた品質制御プロセスの一部として確かめられる。特定の実施形態では、ラマン分光法はまた、製品希釈およびｐＨ調節を必要とするバイオプロセスで使用され得る。
【００１９】
特定の実施形態では、ラマン分光法は、モノクローナル抗体（例えば、アダリムマブ）などの生物学的活性剤が精製される濾過操作などの濾過操作（例えば、限外濾過／ダイアフィルトレーションプロセス）において存在する製剤を試験し、特徴付けるために使用され得る。例えば、限定はしないが、本発明のラマン分光技術は、単一の読み取りにおいて存在する成分の本質および量の両方を把握するためにオンラインまたはオフラインで得られる試料を入手するために使用され得る。特定の実施形態では、タンパク質濃度は、賦形剤濃度に加えて測定され得る。ある種のこのような実施形態では、０から１５０ｍｇ／ｍｌの範囲のタンパク質濃度が分析され得る。
【００２０】
特定の実施形態では、ラマン分光法は、バイオプロセス操作をモニターし、確かめ、試験して、それをもとにして制御するために使用され得る。バイオプロセス操作で使用される単位操作、例えば、クロマトグラフィー、濾過、ｐＨ変化、成分の添加または溶液の希釈による組成変化は全て、有機成分または無機成分および生物学的分子から構成される混合物を生じる。したがって、例えば、ラマン分光法を使用することによって、中間体の組成を迅速および正確に測定することは、操作ならびに生物学的生成物の均一性および品質を改善し、維持する機会を提供する。
【００２１】
特定の実施形態では、ラマン分光法によって混合物中の個々の成分の組成を測定することは、生物学的分子が存在していてもいなくても、このような混合物を正確に調製することを可能にする。例えば、特定の実施形態では、このような測定は、調製物の均一性を改善するまたは緩衝溶液の準リアルタイム調製を提供するという有益性を備えたバイオプロセス操作において幅広く使用されている緩衝溶液の調製において有用である。特定の実施形態では、これは、緩衝溶液の調製、保持および輸送のための複雑な装置の必要性を排除する。特定の実施形態では、ラマン分光法の使用によって、緩衝製剤の潜在的誤差（例えば、化学成分濃度、不適切な化学物質など）が簡単な機器でリアルタイムに検出される緩衝溶液の試験および放出が実施され得ることが可能になる。試験が可能な製剤は、限定はしないが、タンパク質を含まない３成分製剤（緩衝液＋糖＋アミノ酸）、タンパク質および糖製剤、タンパク質および界面活性剤製剤ならびにタンパク質および緩衝液製剤を含む。
【００２２】
特定の実施形態では、溶液組成の正確な測定は、生物学的溶液の調節を可能にし、したがって添加物（陰イオン、陽イオン、疎水性、溶媒など）の適格な標的組成が実現され得る。近年、このような測定は冗長で、リアルタイム使用で実行するために受け入れられにくく、洗練された分析方法が必要とされている。ラマン分光法を測定に使用すると、非常に高い精度の記録作成が可能となり、管理された産業において期待されている。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明の技術は、化学的、物理的または生物学的手段によって実現されるタンパク質−タンパク質反応、タンパク質−低分子反応および／またはタンパク質修飾をモニターおよび制御する能力を可能にする。ある種のこのような実施形態では、反応物（元の状態の生物製剤）および生成物（最終状態の生物製剤）の特有の生化学的特性ならびに天然において化学物質または生物物質のいずれかであるその他の反応物／触媒は、ラマン分光法を使用してモニターされる。反応物（複数可）および生成物（複数可）をこのような方法でモニターすることによって、とりわけ反応条件および反応物量のフィードバック制御が可能である。特定の実施形態では、生成物によって反応を停止する系を設計することおよび／または品質またはこのような系の性能を継続的に最適化、改善または維持することも可能である。
【００２４】
特定の実施形態では、ラマン分光法はまた、クロマトグラフィー操作における生物製剤生成物の単離および精製を可能にする。ある種のこのような実施形態では、生成物／生成物変種／生成物アイソフォームまたは不純物の溶出はモニターされることが可能で、カラム溶出物の分画は、所望する生成物の品質またはプロセスの性能をベースにして実施され得る。特定の実施形態では、限定はしないが、濾過および非クロマトグラフィー分離などのその他の単位操作における画分の単離／濃縮にラマン分光法を適用することも可能である。
【００２５】
特定の実施形態では、ラマン分光法は、非侵襲性の道具として導入されることが可能である。例えば、限定はしないが、ラマン分光測定法は、シグナルを妨害しない材料を通して実施され得る。これは、これらの混合物を含有する容器／器物の完全性を維持することが重要なバイオプロセス操作においてさらに特有の利点となる。
【００２６】
特定の実施形態において、ラマン分光法は、その他の成分を含む溶液の「汚染」を検出する非常に価値のある手段となり得る。ある種のこのような実施形態では、汚染された溶液から得られたラマン分光データは、統計比較技術またはスペクトル比較技術を使用して予測スペクトルと比較され、異なっているならば、バイオプロセスで使用される前に、これらの溶液の製剤における誤差の迅速な検出を可能にすることができる。
【００２７】
特定の実施形態では、概念の実証として以下の実施例によって示したように、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、脂質などを含む細胞培養収集物材料からの不純物を含有する混合物中における抗体の濃度は、ラマン分光法を使用して定量的に測定され得る。このような実施形態では、前記方法は、不純な混合物を含有するバイオプロセス操作の流入液および溶出液をモニターするために使用され得る。例には、限定はしないが、カラム、フィルターおよび非クロマトグラフィー分離装置（膨張床、流動床、２相抽出など）の添加操作および溶出操作を含むことができる。用意された例は、０．１から１ｇ／Ｌの抗体濃度が、合成培地をベースにした細胞培養プロセスから調製された透明な収集溶液が添加されたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムからの未結合画分を含むマトリックスにおいて、定量され得ることを示している。ラマン分光法がインラインで組み込まれているならば、このような測定は、直接モニタリングを可能にし、カラム添加の制御を可能にし、動的結合容量のパーセントまたは静的（平衡）容量のパーセントのいずれかを表す予め定義された結合容量で、カラムの均一で最適な添加を可能にする。
【００２８】
このような技術を前述したような様々なその他の操作に適用することは、当業者には明らかである。
【００２９】
特定の実施形態では、ラマン分光法は、バイオプロセス精製操作における品質制御および／またはフィードバック制御のために（例えば、アダリムマブ精製プロセスのためのインラインでの緩衝液希釈を制御するために）使用され得る。ある種のこのような実施形態では、全体を参照により本明細書に組み込んだＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７７：１２２８−１２３６（２００５）で記載されたように、ラマン分光法は、タンパク質結合反応またはその他の化学反応（例えば、液相ヘック反応）が関与するプロセスにおける品質制御および／またはフィードバック制御のために使用され得る。
【００３０】
本発明で開示した主題の様々な実施形態では、本明細書で開示したラマン分光技術は、前記で定義したように、産業規模で実現されているバイオプロセス操作において使用される。
【００３１】
便宜上、本出願の主題は、主としてバイオプロセス法に関して記載されているが、バイオプロセス自体を実施するための系も提供される（例えば、実施例１３参照）。したがって、本出願の特定の実施形態は、産業規模で実現されているバイオプロセス系を含むバイオプロセス操作を実施するための系であって、それぞれのプロセスからオンラインまたはオフラインによって採取された試料と連絡する液体中にラマンプローブがある系を提供する。系自体に関する情報は、対応するプロセスの説明から得ることができる。
【００３２】
（ｉｉｉ）  ラマン分光器具および技術
ラマン分光法は、単色の入射放射は材料上で特定の様式で反射、吸収または散乱され、これは放射を受容する特定の分子またはタンパク質に左右されるという原理に基づいている。エネルギーの大部分は、同じ波長で散乱し（レイリー散乱）、放射の少量（例えば、１０−７）がいくらか異なる波長で散乱する（ストークスおよびアンチストークス散乱）。この散乱は、回転、振動および電気的レベルの遷移を伴う。散乱した光子の波長の変化は、化学的および構造的情報をもたらす。
【００３３】
特定の実施形態では、ラマン分光法は多成分混合物で実施され、成分の特異性の高い「フィンガープリント」を形成することができる。混合物のラマン分光分析から生じるスペクトルフィンガープリントは、個々の成分それぞれを重ね合わせたものである。バンドのそれぞれの強度は、特定の成分の相対的濃度と相関している。したがって、特定の実施形態では、ラマン分光法は、成分の混合物を定性的および定量的に特徴付けるために使用され得る。
【００３４】
ラマン分光法は、非常に短いシグナル取得時間で、固体、液体、スラリー、ゲル、フィルム、粉末およびいくつかの気体を含むほとんどの試料を特徴付けるために使用され得る。一般的に、試料は、特殊な調製技術を必要とすることなく、問題のバイオプロセスから直接採取され得る。また、入射光および散乱光は、長距離にわたって透過され得るので、遠距離モニタリングが可能である。さらに、水は、弱いラマン散乱のみを与えるので、水性試料は、水から重大な妨害を受けることなく特徴付けられることが可能である。
【００３５】
適用可能なプロセスおよび本明細書で記載した組成物は、市販のラマン分光分析器に基づいて分析され得る。例えば、ＲａｍａｎＲＸ２（商標）分析器またはＫａｉｓｅｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）社から市販されているその他の分析器が使用され得る。あるいは、ラマン分析器は、例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）社、Ｒｅｎｉｓｈａｗ（Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）社およびＰｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｔｒｅｎｔｏｎ、ＮＪ）社から市販されている。市販されているラマン分光分析器の技術的な詳細および操作パラメータは、それぞれの製造業者から入手され得る。
【００３６】
適切な曝露時間、試料サイズおよび試料採取頻度は、例えば、ラマン分光分析器およびこれが使用されるプロセスに基づいて（例えば、ＵＦ／ＤＦバイオプロセス操作のリアルタイムモニタリングを提供するプロセスにおいて）決定され得る。同様に、適切なプローブ設置はまた、分析器および分析器が使用されるプロセスに基づいて決定され得る。例えば、浸漬プローブが適切なシグナルを提供するための試料サイズは、２０ｍＬ未満、または１０ｍＬ未満（例えば、８ｍＬ以下）であることができる。適切なシグナルを提供するための曝露時間は、２分未満、または１分未満（例えば、３０秒）であることができる。
【００３７】
例えば、定量が所望され、複数のｐＨ依存イオン化型で存在する成分（例えば、ヒスチジン）について、所与のｐＨ範囲にわたって濃度を予測するために、様々な濃度および／または様々なｐＨでラマンキャリブレーションが実施されることが可能で、したがって、成分（例えば、ヒスチジン）の測定はｐＨに依存しない。例えば、様々なｐＨ依存型のヒスチジンのキャリブレーションモデルは、様々なイオン化型のヒスチジンを測定し定量するために使用されることが可能で、したがって溶液特性が把握され得る。強度修正（例えば、標準正規変数（ＳＮＶ））および／またはベースライン修正（例えば、１次導関数）を含むことができるシグナルプロセシングが実施され得る。
【００３８】
代表的な試験溶液のＣＣＤ飽和を測定し、これらが許容され得る機器範囲（例えば、４０−８０％）内に確実にあることによって、曝露時間は決定され得る。
【００３９】
上記に記載したように、いくつかの実施形態では、ｐＨ制御またはｐＨ範囲モデリングが、特定の成分（例えば、ヒスチジンなどの緩衝液）のために使用される。いくつかの実施形態では、入射光は最小限に抑えられ、これは、例えば、周囲の光源が分光器を妨害するのを遮断する覆い（例えば、アルミホイル）を使用することによって、実現され得る。
【００４０】
特定の実施形態では、例えば、タンパク質（抗体など）は荷電していない種と共に濃縮され、タンパク質は溶液の体積の大部分を占め、大量の溶質を排除する。これは、荷電していない種の濃度の純減を引き起こす。この効果は、「容積排除」と呼ばれ、タンパク質濃度に比例する。
【００４１】
荷電した成分のアッセイが関与する実施形態などの特定の実施形態では、高濃度では、タンパク質の電荷が溶液中における全体の荷電種に著しく関与するようになるので、ドナン効果が生じる。平衡は、膜の片側で確立されることが予測されるので、電気的中性の必要性のため、膜のもう一方の側の正に荷電した種（例えば、緩衝液種）の純減が引き起こされる。この現象は、ドナン効果と呼ばれる。
【００４２】
本出願の特定の実施形態によれば、ＲａｍａｎＲＸ２（商標）分析器が使用される。この分析器は、その他の市販のラマン分析器と同様に、完全なスペクトルを同時に網羅する４チャンネルまでのモニタリング性能を実現する。特定の実施形態では、試料適合性を最大限にするために、標準ＮＩＲレーザー励起が使用される。プログラミング可能な連続的モニタリング形式が、例えば、ＲａｍａｎＲＸ２（商標）分析器によって使用されることが可能で、この器具はプロセス光学に適合しており、発見段階から生産段階まで１種類の分析器が使用されることを可能にする。携帯式密封容器および光ファイバーサンプリングインターフェースは、分析器が複数の位置において使用されるのを可能にする。
【００４３】
本発明で開示した主題の特定の実施形態では、公知の成分の既定量（すなわち、多成分混合物標準物類）を含有する少なくとも１種の多成分混合物標準物は、未知の成分および／または公知の成分または未知の成分の未知の濃度を含む混合物で使用するためのモデル（例えば、検量線）を得るために、ラマン分光法によって特徴付けられる。好ましくは、公知の成分の既定量を含む一連の多成分混合物標準物は、モデルを得る目的のためにラマン分光法によって特徴付けられる。
【００４４】
未知の成分および／または公知の成分または未知の成分の未知の濃度を含む混合物で使用するためのモデルを得るための方法は、当業者によって決定され得る。例えば、多成分試験混合物中に存在することが予測される主要成分に基づく偏最小２乗回帰分析。また、ラマン分光法製造業者から入手可能なソフトウェアプログラムは、多成分混合物標準物を設計するために使用されることが可能で、次に多成分試験混合物と共に使用するためのモデルを開発するために使用されることが可能である。
【００４５】
さらに、「公知の成分の既定量を含む多成分混合物標準物を提供すること」および「多成分混合物標準物に対してラマン分光分析を実施すること」という場合、より一般的に、未知の成分または成分の未知の濃度を含む多成分混合物を特徴付けるためのモデルを作成することはいずれも並行分析（すなわち、「オンサイト」で得られたデータ）を含み、多成分混合物標準物、すなわち公知の濃度の公知の成分を含む多成分混合物の以前に得られた、または以前に記録された結果（例えば、ラマンスペクトルフィンガープリント）の場合も同様であると理解される。例えば、製造業者の製品文献から得られたラマンスペクトルの結果の場合、「公知の成分の既定量を含む多成分混合物標準物を提供すること」および「多成分混合物標準物に対してラマン分光分析を実施すること」が包含される。
【実施例】
【００４６】
本発明は、以下に述べた実施例によってさらに説明される。このような実施例の使用は一例に過ぎず、本発明または例示したいかなる用語の範囲および意味を決して限定しない。同様に、本発明は、本明細書で記載したいかなる特定の好ましい実施形態にも限定されない。実際に、本明細書を読むことによって、当業者には本発明の多くの改変および変更が明らかである。したがって、本発明は、本発明の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲と共に添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【００４７】
［実施例１］  ３成分製剤緩衝液の試験
アルギニン、クエン酸およびトレハロースの既定の混合物を含有する製剤緩衝液は、水溶媒によって調製された。成分は、０から１００ｎＭまで変動させた。
【００４８】
８００から１７００ｃｍ−１の範囲にわたるラマンスペクトルは、ＲＡＭＡＮＲＸＮ２（商標）分析器（２スペクトル／混合物）を使用して、各混合物１５ｍＬずつについて得られた。スペクトルのフィルタリングパラメータは、標準正規分散（ＳＮＶ）による強度正規化に設定し、１次導関数（ｇａｐ）ベースライン修正は１５ポイントスムージング、平均センタリング差スペクトルは平均強度値＝０に設定した。これは、スペクトルフィルターよりもデータスケーリングであると考えられる。スペクトルは、浸漬式プローブを使用し、試料当たり３０秒の曝露時間で収集された。
【００４９】
主成分法は、モデルを作成するために使用された。ＰＬＳ（潜在的構造に対する偏最小２乗回帰分析）モデルは、成分間の相関を測定するために３成分それぞれに適用された。この結果は、スペクトル強度（例えば、１７００−８００ｃｍ−１）を濃度（ａｘ１＋ｂｘ２＋・・・・・・＋ｚｘ９００＝濃度）と解釈する線形モデルである。ここで示したキャリブレーション結果のために使用したソフトウェアは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｇａｌａｃｔｉｃ社のＰＬＳｐｌｕｓ／ＩＱアドインを備えたＧＲＡＭＳ／ＡＩ  Ｖ７．０２であった。図および実験モデル作成の多くには、ＳＩＭＣＡ  Ｐ＋が使用された。試料は、２つの試料を除去することによって交差検定された。成分間相関の誤差閾値が２％を下回るまで相関の試験および公差検定のステップが繰り返されるように、データ分析が実施された。緩衝液成分の正確な定量（例えば、２％以内）は、１回の読み取りで実現することができた。
【００５０】
検量線は、ランダム混合物デザイン（Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｄｅｓｉｇｎ）を使用して得ることができる。上記で作成した３成分モデルは、アルギニン、クエン酸およびトレハロースのランダム混合物のスペクトルについて予測を行うために使用された。これらの予測は、モデルの既定の許容限界が±２％であることを確認するために、実際のスペクトルと比較された。結果は図２および３に示されている。測定を行うためにモデルが使用され得ることを確かめるために、ランダム混合物の独立した測定値が得られた。
【００５１】
［実施例２］  ４成分製剤緩衝液の試験
実施例１の方法は、成分がマンニトール、メチオニン、ヒスチジンおよびＴｗｅｅｎ（商標）（ポリソルベート８０）である４成分を含有する製剤緩衝液に適用された。既定の混合物の測定スペクトルは、図４−６に示されている。波数は遠赤外領域から中赤外領域までの範囲である。サファイアカバーによる限界のため、この特定の実施例では１００−８００ｃｍ−１の範囲は無視することができ、キャリブレーションは８００−１８００ｃｍ−１で行われる。
【００５２】
実施例１で得られた３成分モデルと同じように、４成分緩衝系についてモデルが得られた。得られたモデルをベースにした予測は、このモデルが十分に正確であることを確認するために、ランダム混合物の実際のスペクトルに対して比較された。結果は図７および８に示されている。
【００５３】
［実施例３］  タンパク質を含む３成分製剤緩衝液の試験
実施例２の方法は、０から１００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のタンパク質と共に３成分を含有する製剤緩衝液に適用された。成分は、マンニトール、メチオニン、ヒスチジンおよびＤ２Ｅ７（アダリムマブ）であった。既定の混合物の測定スペクトルは、図９−１１に示されている。
【００５４】
実施例２で得られた４成分モデルと同じように、タンパク質を含む３成分緩衝系についてモデルが得られた。得られたモデルをベースにした予測は、このモデルが十分に正確であることを確認するために、ランダム混合物の実際のスペクトルに対して比較された。結果は図１２に示されている。実際のスペクトル対予測されたスペクトルの測定値の係数（Ｒ２）および公差検定値の標準誤差（ＳＥＣＶ）は以下の表１に示されている。
【００５５】
【表１】
2013541711.tif 000003
【００５６】
［実施例４］  アダリムマブＵＦ／ＤＦプロセス
限外濾過／ダイアフィルトレーションプロセス（ＵＦ／ＤＦ）は、アダリムマブの溶液に賦形剤を導入するために確立されており、図１３に示されている。供給ポンプ（１００）は、タンジェンシャルフロー濾過膜を横断するクロスフローを供給し、膜上の貯蔵液中のアダリムマブ含有溶液を送る。ダイアフィルトレーション緩衝液（メチオニン、マンニトールおよびヒスチジンを含有する製剤緩衝液）は、膜の濾過速度（膜の透過側を通る液体流）に合うように貯蔵液中にポンプで送り込まれる（１１０）。供給タンクから出てくる供給流（１２０）は、ポンプ（１３０）によって膜モジュール（１４０）に向けられる。水、分子の大きさが比較的小さい緩衝液成分などを含有する透過流（１５０）は膜モジュールを通過する。濃縮されたアダリムマブを含有する残留流（１６０）は、残留バルブ（１７０）によって制御されて、供給タンクに送り戻される。
【００５７】
Ｋａｉｓｅｒ  Ｏｐｔｉｃａｌｓ社のＲａｍａｎＲＸ２（商標）分析器（１９０）に適合したラマンプローブ（１８０）は、タンクの含量を定期的に特徴付ける能力を実現するために、供給タンク内に設置される。得られたスペクトルは、キャリブレーションファイルを使用して成分濃度に変換され、これをもとにしてダイアフィルトレーションプロセスの進行がモニターされ得る。さらに、タンパク質の濃度増加によって生じる（ドナン効果および電荷排除効果によって引き起こされる）賦形剤濃度の変化は、モニターされ、場合によって制御され得る。ＲａｍａｎＲＸ２（商標）分析器以外のその他のラマン系も、アダリムマブ精製プロセスの品質管理の一部として定期的に、限外濾過／ダイアフィルトレーションプロセスからのオンライン試料を特徴付けるために使用され得る。例えば、ラマン分析の結果は、ダイアフィルトレーションプロセスの完了および最終的な賦形剤濃度の評価に使用され得る。
【００５８】
ヒスチジン、マンニトールおよびメチオニンの混合物は、ＵＦ／ＤＦ膜からダイアフィルトレーションされた。ラマンプローブは、残留貯蔵液中に設置された。ラマンスペクトルは指定された間隔で得られ、各読み取りは曝露時間３０秒毎に行われ、１０回反復された（１０走査）。図１４−１５は、ダイアフィルトレーション中の濃度変化を示している。予測通り、個々の成分の濃度は、ダイアフィルトレーション中に増加して、プラトーに達した。
【００５９】
図１４−１５は、ダイアフィルトレーションプロセスのオンライモニタリングの結果を表す。図１４では、糖、緩衝液およびアミノ酸の濃度が様々なダイアフィルトレーション時間について表されている。図１４および１５で示されたように、アミノ酸はメチオニンであり、濃度（ｍＭ）はｙ軸にプロットされ、糖はマンニトールであり、ｗ／ｖ％はｙ軸にプロットされ、緩衝液はヒスチジンであり、濃度（ｍＭ）はｙ軸に沿ってプロットされている。図１４−１５におけるプロットそれぞれのｘ軸は滞留時間であり、０から８１分までの濃度が測定され、ｘ軸に沿ってプロットされている。
【００６０】
次に、水中に存在する約４０ｍｇ／ｍｌのアダリムマブは、５キロダルトンＵＦ／ＤＦ膜（０．１ｓｑ．ｍ．）から糖溶液中に７ダイアフィルトレーション容量でダイアフィルトレーションされた。ラマンプローブは、残留貯蔵液中に設置された。ラマンスペクトルは指定された間隔で得られ、各読み取りは曝露時間３０秒毎に行われ、１０回反復された（１０走査）。その後、タンパク質は１４０ｇ／Ｌまで濃縮された。
【００６１】
図１６は、ＵＦ／ＤＦ系で使用され、前述の通りに測定された糖／タンパク質系（マンニトール／ アダリムマブ）から得られたキャリブレーションデータを表している。図１６の検量線は、図１７および１８においてマンニトールおよびアダリムマブ濃度を把握するために使用された。図１７および１８は、糖のダイアフィルトレーション中の濃度変化を示している。右のプロットは、ダイアフィルトレーション中およびその後の限外濾過中のタンパク質濃度を示している。図１７および１８において、糖濃度（％）は滞留容量（０から６まで）に対してプロットされ、アダリムマブ濃度（ｇ／ｌ）は滞留容量（０から６まで）に対してプロットされている。
【００６２】
予測通り、糖の濃度は、ダイアフィルトレーション中に増加して、プラトーに達した。タンパク質は、標的濃度に達した。図１７において、５０ｇ／Ｌにキャリブレーションされたモデルが使用された。図１８は、タンパク質１２０ｇ／Ｌおよび糖混合物で得られたキャリブレーションを使用して算出された糖およびタンパク質の濃度を示している。
【００６３】
水中に存在する約２０ｍｇ／ｍｌのアダリムマブは、５キロダルトンＵＦ／ＤＦ膜（０．１ｓｑ．ｍ．）からヒスチジン溶液（５０ｍＭ）中に７ダイアフィルトレーション容量でダイアフィルトレーションされた。ラマンプローブは、残留貯蔵液中に設置された。ラマンスペクトルは指定された間隔で得られ、各読み取りは曝露時間３０秒毎に行われ、１０回反復された（１０走査）。その後、タンパク質は５０ｇ／Ｌまで濃縮された。図１９は、緩衝液（ヒスチジン）／タンパク質（アダリムマブ）系から得られたキャリブレーションデータを表している。これは、ヒスチジン／アダリムマブ混合物のタンパク質５０ｇ／Ｌまでのキャリブレーションモデルである。図２０は、緩衝液／タンパク質系における低濃度の緩衝液およびタンパク質について、ヒスチジン濃度（ｎＭ）およびアダリムマブ濃度（ｇ／ｌ）に対するダイアフィルトレーション容量（ダイアフィルトレーション容量０から６）のプロットを表している。
【００６４】
このプロットは、ヒスチジンのダイアフィルトレーション中の濃度変化を示している（ｎＭ）。右のプロットは、ダイアフィルトレーション中およびその後の限外濾過中のタンパク質濃度（ｇ／ｌ）を示している。予測通り、糖の濃度はダイアフィルトレーション中に増加して、プラトーに達した。タンパク質は、標的濃度に達した。このプロット（図１９）において、５０ｇ／Ｌにキャリブレーションされたモデルが使用された。プロット中の濃度は、モデルの限界のため、予測より低く、ヒスチジンのイオン化に関連することが後に確認された。モデルは、ヒスチジンのイオン化状態を実際の全ヒスチジン濃度および溶液特性と相関させることができる。
【００６５】
このデータは、タンパク質およびその他の単一成分の低および高濃度ＵＦ／ＤＦ操作をモニターする性能を示している。濃度は、３分毎に読み取ることができ、したがって、リアルタイム（または準リアルタイム）で濃度をモニターする能力を実現する。糖／タンパク質系において、タンパク質の濃度全てに対して非常に高い精度の糖が得られた。緩衝液／タンパク質系において、高い緩衝液濃度および低いタンパク質濃度で緩衝液の高い精度が得られた。容積排除効果およびドナン効果を検出し測定する能力もリアルタイム（または準リアルタイム）で実現されている。したがって、ラマン分光法は、タンパク質溶液における賦形剤濃度測定の道具として有用で、プロセス制御を実現するために賦形剤濃度に加えてタンパク質濃度を測定する能力も実現する。
【００６６】
［実施例５］  タンパク質を含む２成分製剤緩衝液の試験
実施例１の方法は、２成分、トリスおよび酢酸塩、ならびにタンパク質、アダリムマブを含有する製剤緩衝液に適用された。これらの成分には、以下の範囲、トリス５０−１６０ｍＭ；酢酸塩３０−１３０ｍＭおよびアダリムマブ４−１５ｇ／Ｌが含まれていた。
【００６７】
検量線は、実施例１で概略を示したように得ることができる。前記のように作成されたモデルは、表２の濃度に従って調製された試料において、トリス、酢酸塩およびアダリムマブの混合物のスペクトルについて予測を行うために使用された。
【００６８】
【表２】
2013541711.tif 000004
【００６９】
これらの予測は、モデルが既定の許容限界にあることを確認するために、実際のスペクトルと比較された。この結果は図２１Ａ−Ｃに示されている。
【００７０】
［実施例６］  タンパク質を含む細胞培養収集物の試験
実施例１の方法は、１成分、Ｔｗｅｅｎ（商標）およびタンパク質、アダリムマブを含有する製剤緩衝液に適用された。細胞培養培地は、細胞培養バッチから収集され、濾過され、プロテインＡカラムに添加された。プロテインＡカラム流出液はプールされ、その後、滅菌濾過してから保存および試験された。
【００７１】
この方法は、プロテインＡカラム添加の終点を測定するために使用される。濾過された細胞培養収集物は、捕捉カラム（典型的には、プロテインＡ）に添加される。カラム添加溶出をモニターする現在の方法は、Ａ２８０吸収を使用している。しかし、培養収集物は、２８０ｎｍで光を吸収する多くの構成物を含有する。Ａ２８０吸収は通常飽和しており、Ａ２８０法はカラム添加相中に出現する抗体を測定することができなくなっている。
【００７２】
ラマン分光器は、捕捉カラム添加溶出流（カラムの溶出液）中における抗体の特異的測定を実現する。この試験は、プロテインＡ溶出プール中に様々な濃度の精製抗体ＡＰＩ薬剤物質（例えば、アダリムマブ）を添加することによって、推奨のオンライン抗体測定をシミュレートする。添加実験に使用されたＡＰＩ試料は、０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）を含有している。直接添加実験中、Ｔｗｅｅｎ（商標）濃度は抗体と正比例して変化するので、ラマンスペクトルキャリブレーション中、抗体と間違われる可能性がある。これを回避するため、Ｔｗｅｅｎ（商標）は追加的成分と考えられ、抗体濃度と独立して添加された。したがって、これらの成分は、以下の範囲、Ｔｗｅｅｎ（商標）０．１％−１．０％およびアダリムマブ０．１−１．０ｇ／Ｌで含められた。
【００７３】
検量線は、実施例１で概略を示したように得ることができる。上記で作成されたモデルは、表３の濃度に従って調製された試料において、Ｔｗｅｅｎ（商標）およびアダリムマブの混合物のスペクトルについて予測を行うために使用された。
【００７４】
【表３】
2013541711.tif 000005
【００７５】
これらの予測は、モデルが予め測定された許容限界にあることを確認するために、実際のスペクトルと比較された。これらの結果は図２２Ａ−Ｂに示されている。
【００７６】
［実施例７］    抗体凝集検出の試験
２種類の抗体（Ｄ２Ｅ７およびＡＢＴ−８７４）は、未修飾タンパク質の光誘導性架橋（ＰＩＣＵＰ）を使用して別々に凝集した。これらの抗体は凝集光源に０−４時間曝露され（図２３および２４）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって凝集は定量された。試料は、ラマン分光法によって測定され、スペクトルは主要成分分析（ＰＣＡ）（図２５および２６）および偏最小２乗回帰分析（ＰＬＳ）（図２７Ａおよび２７Ｂ）を使用してモデル化された。図２５および２６は、凝集した試料が明確な主要成分スコアを有し、ラマン分光法を使用して凝集から区別され得ることを示している。図２７Ａおよび２７Ｂは、ラマン分光法の結果とＳＥＣ測定の間にいくらか相関があることを示している。
【００７７】
様々な出版物が本明細書では引用されているが、それらの内容は全体を参照により本明細書に組み込む。
【００７８】
本出願は、２０１０年９月１７日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／３８４，１３１および２０１１年３月１５日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／４５２，９７８の優先日の利益を主張し、いずれも全体を参照により本明細書に組み込む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【国際調査報告】
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