(57)【要約】本発明は、発酵による超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の生産方法に関するものであって、該方法は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．における異種遺伝子の発現を可能にする調節エレメントの制御下でヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする前記異種遺伝子を含むＹａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の組換え株を培養するステップを含む。また、本発明は、この組換え型Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の組換え株であって、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．における異種遺伝子の発現を可能にする調節エレメントの制御下でヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする前記異種遺伝子を含む組換え株。
【請求項２】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子が、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする植物種の遺伝子、その機能的相同体およびフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の組換え株。
【請求項３】
植物種の遺伝子が、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ、Ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｅａｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ、およびＢｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ由来のヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子から選択される、請求項２に記載の組換え株。
【請求項４】
植物種の遺伝子がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の遺伝子ＰＡＳ２である、請求項３に記載の組換え株。
【請求項５】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の菌株がＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ属に属する、請求項１〜３のいずれか一つに記載の組換え株。
【請求項６】
菌株が、脂肪酸のβ酸化に関与する少なくとも一つの遺伝子の欠失を含む、請求項１〜５のいずれか一つに記載の組換え株。
【請求項７】
グルコース−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子および／または遺伝子ＰＯＸ１〜６の欠失を含む、請求項６に記載の組換え株。
【請求項８】
発酵による超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の生産方法であって、適切な培養培地内で請求項１〜７のいずれか一つに記載の組換え株を培養するステップと、菌株および／または培地からＶＣＬＡを回収するステップとを含む生産方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により得られる、ＶＬＣＦＡ組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵による超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の生産方法に関するものであり、該方法は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．における異種遺伝子の発現を可能にする調節エレメントの制御下でヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする前記異種遺伝子を含むＹａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の組換え株を培養するステップを含む。
【０００２】
本発明は、この組換え型Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．にも関するものである。
【背景技術】
【０００３】
生命体は、複合脂質内に取り込まれるおびただしい種類の異なる脂肪酸を合成する。これらの複合脂質は、主要な構造的構成要素膜であると同時に、植物および動物の両方における主要な貯蔵物質である。
【０００４】
超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）は真核細胞の構成要素であり、炭素２０個以上の長さで構成されている（すなわち  ＞Ｃ１８）。ＶＬＣＦＡは、異なる生物内で多くの異なる生理学的機能に関与している。これらは、脳（ミエリン）または植物種子（貯蔵トリアシルグリセロール、ＴＡＧ）などの一部の組織の豊富な構成成分である。ＶＬＣＦＡは、皮膚の脂質バリアおよび植物のクチクラワックスの構成要素である。一部のＶＬＣＦＡの長いアシル鎖は、例えば核孔内に見られる高い膜湾曲に必要なものである。同様に、ＶＬＣＦＡは、タンパク質輸送およびＧＰＩ脂質アンカー合成のための分泌経路にも関与する。最後に、ＶＬＣＦＡは、膜構成成分であると同時にシグナル伝達分子でもあるスフィンゴ脂質の構成要素である。
【０００５】
ＶＬＣＦＡは、Ｃ１８より長いアシル鎖を有する脂肪酸である。多価不飽和ＶＬＣＦＡは、主としてエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のように人間の食生活に重要な栄養成分とみなされている。国際公開第２００５／１１８８１４号パンフレットは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける多価不飽和脂肪酸の産生を改善する方法を開示している。不飽和ＶＬＣＦＡは、洗浄剤または潤滑剤としても作用することから、工業的にも有益である。
【０００６】
ＶＬＣＦＡは、四つの相異なる酵素（ＫＣＳ、ＫＣＲ、ＨＣＤおよびＥＣＲ）を含む膜結合酵素複合体であるエロンガーゼ複合体という名称のタンパク質複合体の内部で小胞体内に集められた四つの連続する酵素反応を通して、二個の炭素の逐次的付加によって合成される。脂肪伸長の第一のステップは、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳまたは縮合酵素）による、マロニル−ＣｏＡを用いた長鎖アシル−ＣｏＡの縮合である。結果として得られた３−ケトアシル−ＣｏＡは、次に３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）により還元されて、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを生成する。第三のステップは３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＨＣＤ）により３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡをトランス−２，３−エノイル−ＣｏＡへと脱水するステップであり、このトランス−２，３−エノイル−ＣｏＡは最終的にトランス−２，３−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）により還元されて二炭素伸長されたアシル−ＣｏＡを生成する。最後の三つの酵素は、アシル−ＣｏＡの特異性に関与しないことから、コア酵素と呼ばれる。アシル−ＣｏＡがひとたびエロンガーゼ複合体から伸長されると、これらは、リン脂質、トリアシルグリセロール、スフィンゴ脂質、および植物エピクチクラワックスなどの特異的脂質といった異なる脂質クラスの中に取り込まれ得る。
【０００７】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、この酵母がその乾燥重量の５０％超を脂質として蓄積できるだけでなく、炭素源として脂質を効率良く使用することもできることから、油性酵母とみなされている（Ｂｅｏｐｏｕｌｏｓら、２００９）。そのゲノムの完全な配列決定ならびにこの酵母についての分子遺伝学的手段の開発によって、この生物は脂質蓄積の機序の研究用モデルとなったばかりでなく、油脂化学バイオテクノロジーのための細胞工場にもなった。近年になって、β−酸化に関与するＰＯＸ１〜６遺伝子とグルコース−３−ホスフェートデヒトロゲナーゼＧＵＴ２の組合せ欠失が、脂質、主として遊離脂肪酸のきわめて高い蓄積を導くことが示された（Ｂｅｏｐｏｕｌｏｓら、２００８、ＦＲ０８５４７８６；１１  ２００８年７月１１日）。この肥満菌株は、それぞれグルコースまたはオレイン酸上で成長させた場合に野生型に比べて二倍および三倍多い脂肪酸を蓄積した。興味深いことに、これらの脂質は、単一の大きな脂肪体に蓄積した。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、主として長鎖脂肪酸ｃ１８：２、ｃ１８：１（ｎ−９）、ｃ１６：１（ｎ−７）およびｃ１６：０を蓄積する。しかしながら、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）については、わずかな情報しかない。
【０００８】
現在、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．、特にＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいてヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子を発現させることで、菌株による脂肪酸およびＶＬＣＦＡの産生に対して、品質および／または量の観点において直接的影響が及ぼされることが発見されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．におけるヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子の発現を可能にする調節エレメントの制御下で、前記異種遺伝子を含む、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の組換え株に関するものである。
【００１０】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子は、詳細には、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする植物種の遺伝子、その機能的相同体およびフラグメントからなる群から選択される。植物種の遺伝子は、有利には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ、Ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｅａｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ、およびＢｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ由来のヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子から選択され、より詳細には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の遺伝子ＰＡＳ２である。
【００１１】
本発明は同様に、発酵による超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の生産方法にも関するものであり、該方法は、適切な培養培地内で本発明の組換え株を培養するステップと、菌株および／または培地からＶＣＬＦＡを回収するステップとを含む。
【００１２】
前記方法により生産される脂肪酸も、同じく本発明の一部である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の組換え株に関するものであり、該組換え株は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．におけるヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子の発現を可能にする調節エレメントの制御下にある、前記異種遺伝子を含む。
【００１４】
組換え株
本発明によると、菌株は、それが遺伝子置換またはプラスミド導入などの細胞生物学的手段によって遺伝的に修飾されている場合に、組換え型となる。これは、遺伝子内に新しい遺伝子もしくは変異もしくは新しい調節エレメントを導入するため、または内因性遺伝子を欠失させるための定方向突然変異誘発により得られるであろう。組換え型微生物は、ランダム突然変異誘発の唯一の結果ではない。
【００１５】
新しい遺伝子が菌株内に導入される場合、それは、発現プラスミドと共に導入されてよく、あるいは、その菌株のゲノム内に組込まれてもよい。
【００１６】
菌株のゲノム内に組込まれる場合、遺伝子は、相同的組換え技術などの公知の遺伝子置換方法によって特異的部位にまたは無作為に組込まれてよい。
【００１７】
異種遺伝子は、導入される場合、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．におけるこの異種遺伝子の発現を可能にする調節エレメントの制御下のコード配列を含むことができる。代替的には、異種遺伝子は、既存の内因性調節エレメントの制御下で微生物のゲノム内に導入されて、欠失させられる対応する内因性コード配列から置き換わる、コード配列を含むことができる。
【００１８】
特に新しい遺伝子を導入するかまたは遺伝子を欠失させるためのＹａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の修飾方法は、当該技術分野において公知であり、ＢａｒｔｈおよびＧａｉｌｌａｒｄｉｎ（１９９６）ならびにＦｉｃｋｅｒｓら、（２００３）がある。
【００１９】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子
「ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ」（ＨＣＤ）という用語は、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡをトランス−２，３−エノイル−ＣｏＡに脱水する反応を触媒する酵素を意味する。それは、ヒドロリアーゼのファミリーに属する。この酵素は、エロンガーゼ複合体の一部を成し、植物内のＶＬＣＦＡの合成のみに関与し、その分解には関与しない。
【００２０】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子は、異種遺伝子である。本発明によると、遺伝子は、天然の菌株中で同一のものが発見されない場合、異種である。それは、異種調節エレメントの制御下の天然コード配列であるかまたは天然調節エレメントの制御下の異種コード配列であり得る。それは同様に、修飾されるべき菌株中には見られるものの未修飾菌株中に同じ遺伝子が発見されないプラスミド上またはゲノム内遺伝子座には見られない天然の構成要素を有する遺伝子でもあり得る。
【００２１】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子は、特に、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする植物種の遺伝子由来のコード配列を含む遺伝子、その機能的相同体およびフラグメントからなる群から選択される。
【００２２】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする植物種の遺伝子は、当該技術分野において公知であり、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ＣＡＮ６４３４１．１仮想タンパク質をコードする）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（ＣＡＤ３９８９１．２、ＥＡＹ７２５４８．１仮想タンパク質ＯｓＩ＿０００３９５、ＥＡＺ３００２５．１仮想タンパク質ＯｓＪ＿０１３５０８およびＢＡＤ６１１０７．１チロシンホスファターゼ様）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ（ＡＡＺ６６９４６．１）、Ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（ＡＡＴ０８７４０．１タンパク質チロシンホスファターゼ）、Ｏｓｔｒｅａｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ（ＸＰ＿００１４２０９９７．１推定タンパク質およびＸＰ＿００１４２２８９８．１推定タンパク質）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（ＥＤＰ０１０５５．１推定タンパク質）、および同様にＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ由来の遺伝子の中から特に選択されたものを含む。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、異種遺伝子は、ＵｎｉＧｅｎｅデータバンクにＮＰ＿１９６６１０．２の番号で登録済であり、Ｆ１２Ｂ１７．１７０、Ｆ１２Ｂ１７＿１７０、ＰＡＳＴＩＣＣＩＮＯ  ２、ＰＥＰ、およびＰＥＰＩＮＯとしても同様に知られている、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の遺伝子ＰＡＳ２（Ｂａｃｈら、２００８）である。
【００２４】
本発明の別の具体的実施形態において、異種遺伝子は、遺伝子データバンクにＮＰ＿０１２４３８．１の番号で登録済である、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＰＨＳ１遺伝子（Ｄｅｎｉｃら、２００７）、その機能的相同体およびフラグメントである。
【００２５】
異種遺伝子のコード配列が別のものに由来する場合、このコード配列は実際、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．について公知の好ましいコドン使用頻度でこれを再度コードすることができる。当業者であれば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．において使用される好ましいコドンおよびこのような再コードされたコード配列の調製方法を知っている。
【００２６】
本発明によると、「機能的相同体」とは、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子と相同性を共有する遺伝子、または、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子によりコードされるタンパク質と相同性を共有するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２７】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子によりコードされるタンパク質と相同性を共有するタンパク質は、植物から得られるか、または、植物に由来する天然タンパク質のバリアントもしくは機能的フラグメントであってよい。
【００２８】
「天然タンパク質のバリアントまたは機能的フラグメント」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列が、天然に観察される配列に厳密に限定されなくてよく、追加のアミノ酸を含んでいてよい、ということを意味する。「フラグメント」という用語は、ポリペプチドの配列が、もとの配列よりもアミノ酸を少なく含むがヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性を付与するのに充分なアミノ酸を依然として含んでいてよいことを意味する。ポリペプチドが、その酵素活性を保持しながら、一つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失および／または付加により修飾可能であることは、当該技術分野において周知である。例えば、タンパク質の機能的特性に影響を及ぼさない、化学的に等価のアミノ酸による所与の位置にある一つのアミノ酸の置換が一般的である。本発明に関しては、置換は、以下の群のうちの一つの中での交換として定義される：
・小さい脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
・極性の、負荷電残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
・極性の、正荷電残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
・大きい脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
・大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００２９】
したがって、一つの負荷電残基での別の残基の置換（例えばグルタミン酸でアスパラギン酸を置換）または一つの正荷電残基での別の残基の置換（例えばリジンでアルギニンを置換）を結果としてもたらす変化が、機能的に等価の生成物を生成すると予想することができる。
【００３０】
アミノ酸配列内の、アミノ酸が修飾される位置および修飾を受けるアミノ酸の数は、特に限定されない。当業者であれば、タンパク質の活性に影響を及ぼすことなく導入可能な修飾を認識することができる。例えば、タンパク質のＮまたはＣ末端部分での修飾は、一部の状況下でタンパク質の活性を改変しないものと予想され得る。
【００３１】
「バリアント」という用語は、もとの酵素活性をなおも保持しながら、以上で定義したような修飾に付されたポリペプチドを意味する。
【００３２】
本発明によると、ヒドロアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素活性を有するポリペプチドは、ＰＡＳ２の配列と少なくとも３０％の相同性、好ましくは少なくとも５０％の相同性、そしてより好ましくは少なくとも７０％の相同性を有する配列を含んでいてよい。
【００３３】
二つのタンパク質配列間の相同性百分率の決定方法は、当業者にとって公知である。例えば、これは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／のウェブサイト上で入手可能なソフトウェアＣＬＵＳＡＴＡＬＷを、このウェブサイト上に記されたデフォルトパラメータと共に使用することによって、配列のアラインメントの後に行なうことができる。残基の総数と比較した同じ位置における同一の残基の数を記録することにより、アラインメントから同一性百分率を容易に計算することができる。代替的には、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／のウェブサイト上で入手可能なＢＬＡＳＴプログラムをそのウェブサイト上に記されたデフォルトパラメータと共に使用することによって、自動計算を行なうことも可能である。
【００３４】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．における異種遺伝子の発現を可能にする調節エレメント
このような調節エレメントは、当該技術分野において周知であり、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ２由来のＰＯＸ２プロモーター、イソシトレートデヒドロゲナーゼ由来のＩＣＬプロモーター、プロモーターＨｐ４ｄ、プロモーターＧＰＤおよびＧＰＭ、プロモーターＦＢＰ、ならびにプロモーターＸＰＲ２を含む。前記複数のプロモーターは当該技術分野において公知であり、なかでもＪｕｒｅｔｚｅｋら（２０００）、Ｍａｄｚａｋら（２００４）、Ｍａｄｚａｋら（２０００）、米国特許第７２５９２５５号明細書、米国特許第７２０２３５６号明細書およびＢｌａｎｃｈｉｎ−Ｒｏｌａｎｄら（１９９４）中で開示されている。
【００３５】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．
本発明によると、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の任意の菌株を形質転換し、本発明の方法において使用してよい。好ましくは、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の菌株はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ属に属する。
【００３６】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ属の菌株は、この菌株の形質転換方法と同様、当該技術分野において周知である。対象となるコード領域を含む構築物を、任意の標準的技術により宿主細胞中に導入してよい。これらの技術には、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７（１９９１）））、原形質融合、遺伝子銃衝撃、電気穿孔法、マイクロインジェクション、または対象となる遺伝子を宿主細胞内に導入する任意の他の方法が含まれる。油性酵母（すなわちＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に適用可能なより具体的な教示としては、米国特許第４８８０７４１号明細書および米国特許第５０７１７６４号明細書が含まれる。
【００３７】
参照として本明細書に援用されている、脂質、主として遊離脂肪酸の非常に高い蓄積を有する菌株（仏国特許出願第０８／５４７８６号明細書；２００８年７月１１日）のように、改良された脂肪酸生産のために修飾された菌株も同様に開示されている。このような菌株は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子を用いて本発明にしたがってさらに修飾されてよい。
【００３８】
また、本発明の組換え株は、脂肪酸のβ−酸化に関与する少なくとも一つの遺伝子の欠失、特にアシルＣｏＡオキシダーゼをコードする遺伝子ＰＯＸ１〜ＰＯＸ６のうちの一つの欠失、特に六つのアシルＣｏＡオキシダーゼをコードする六つの遺伝子ＰＯＸ１〜６ならびに／または脂肪酸およびＴＡＧ合成の経路に関与する一つの遺伝子の欠失、特にグリセロール３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失も含み得る。
【００３９】
組換え株の培養
脂肪酸、特にＶＬＣＦＡは、適切な培養培地内で発酵によって組換え株を培養する場合に生産される。
【００４０】
発酵による培養とは、微生物が培養培地で発育させられ、培養培地の炭素源を形質転換することによって、この培養ステップ中にＶＬＣＦＡを産生することを意味する。ＶＬＣＦＡは、バイオマスと共に、細胞内および／または培地内に蓄積される。
【００４１】
発酵は、酵素変換プロセスでさらに使用される、酵素を生産するために培養を用いる生物変換反応とは全く異なるものである。
【００４２】
適切な培養培地
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．のための培養培地は、ＢａｒｔｈおよびＧａｉｌｌａｒｄｉｎ（１９９６）、Ｎｉｃａｕｄら（２００２）およびＭａｕｅｒｓｂｅｒｇｅｒおよびＮｉｃａｕｄ（２００２）を含め、当該技術分野において周知である。発酵に関して規定された培地は、Ｌｅｂｌｏｎｄら（２００９）および韓国特許第２００９／００２９８０８号公報中で詳細に開示されている。
【００４３】
スクロース培地は、Ｎｉｃａｕｄら（１９８９）において詳細に開示されている。
【００４４】
適切な培養培地は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．が成長でき、かつ菌株の成長およびＶＬＣＦＡの産生を可能にする全ての栄養素、特に炭素源を含む培地である。
【００４５】
炭素源は、スクロースまたは他の炭水化物などの、任意の炭素源であってよい。
【００４６】
菌株および／または培地からのＶＣＬＦＡの回収
ＶＣＬＦＡは、バイオマスと共に菌株中および／または培養培地内に蓄積される。ＶＣＦＬＡの回収には、一般に、細胞溶解、濾過および培地からの回収というステップが含まれる。脂肪酸バイオプロダクションの当業者は、本発明の方法に、バイオマスからの脂肪酸の通常の回収方法をいかに適応させるべきかを知っている。
【００４７】
本発明の方法を用いて生産されたＶＣＦＬＡは、そのままの状態で、本発明の菌株により産生された脂肪酸の混合物中で使用されてよい。これらをさらに精製し単離することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ発現のために最適化された合成ＰＡＳ２を表わす。（Ａ）ＰＡＳ２Ｙｌの遺伝子およびタンパク質の配列。（Ｂ）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＰＡＳ２ＡｔとＰＡＳ２Ｙｌのアラインメント。
【図２】使用または創出された、異なる菌株の概略図と共に、ＹａｒｒｏｗｉａにおけるＰＡＳ２発現を表わす。
【図３】ＹａｒｒｏｗｉａにおけるＰＡＳ２発現の効果を表わす。（Ａ）ＪＭ１３６７およびＪＭ１７８１菌株中でのナイルレッドを用いた脂肪体の染色。（Ｂ）Ｐｏ１ｄおよびＪＭ１７７７における細胞一個あたりの脂肪体の数。分布を比較するために、多項回帰を適用した。（Ｃ）ＪＭ１３６７およびＪＭ１３８１における細胞一個あたりの脂肪体の数。分布を比較するために、多項回帰を適用した。
【図４】ＹａｒｒｏｗｉａにおけるＰＡＳ２発現を伴う、生産されたＬＣＦＡ／ＶＬＣＦＡの比を示す。
【図５】ＹａｒｒｏｗｉａにおけるＰＡＳ２発現を伴う、修飾されたＬＣＦＡおよびＶＬＣＦＡの含有量を示す。（Ａ）ＬＣＦＡ含有量。（Ｂ）ＶＬＣＦＡ含有量。
【図６】ＹａｒｒｏｗｉａにおけるＰＡＳ２発現を伴う、修飾されたＶＬＣＦＡのプロファイルを示す。
【実施例】
【００４９】
材料と方法
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン使用頻度にしたがって、合成ＰＡＳ２遺伝子（ＰＡＳ２Ｙｌ）を合成して、プラスミドＪＭＥ１１０７を得た。ＰＡＳＹｌをプラスミドＪＭＰ６２−ＰＯＸ２−ＵＲＡ３ｅｘ（ＪＭＥ８０３）内そしてプラスミドＪＭＰ６２−ＴＥＦ−ＵＲＡ３ｅｘ（ＪＭＥ１０１２）内に以下の通りにクローニングした：プラスミドＪＭＥ１１０７をＢａｍＨＩ−ＡｖｒＩＩにより消化し、ＰＡＳ２遺伝子を担持する対応するフラグメントを、プラスミドＪＭＥ１０１２およびＪＭＥ１１０７の対応する部位でクローニングして、それぞれプラスミドＪＭＥ１１０８（ＰＯＸ２−ＰＡＳ２）およびＪＭＥ１１１０（ＴＥＦ−ＰＡＳ２）を得た。プラスミドをＮｏｔＩで消化し、発現カセットを担持するフラグメントを、酢酸リチウム法によるＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの形質転換（Ｇ．ＢａｒｔｈおよびＧａｉｌｌａｒｄｉｎの概説：すなわち「Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（Ｗｏｌｆ，Ｋ．、Ｅｄ．）、Ｖｏｌ．１、１９９６、ｐｐ．３１３−３８８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ中のＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに記載されている）のために使用した。形質転換体をＹＮＢｃａｓａ上で選択した。典型的には、フラグメント１μｇあたり約５×１０３個の形質転換体が得られた。それぞれＰＯＸ２−ＰＡＳ２およびＴＥＦ−ＰＡＳ２を含むクローンのためのプライマー対６１ｓｔａｒｔ／６１ｓｔｏｐおよびＴＥＦｓｔａｒｔ／６１ｓｔｏｐを用いたＰＣＲにより、４〜８個の形質転換体を分析した。ＰＣＲ産物をさらに、ＰＡＳ２遺伝子内のＡｖａＩ固有の制限部位により消化した。
【００５０】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ中のＰＡＳ２の安定した発現
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＰＡＳ２遺伝子のオープンリーディングフレームを再コードして、Ｙａｒｒｏｗｉａコドン使用頻度でのその発現を改善した（図１Ａ〜Ｂ）。クローニングを促すため、ＰＡＳ２  ＯＲＦの５’および３’末端に二つの制限部位ＢａｍＨＩおよびＡｖｒＩＩをそれぞれ付加した。ＰＡＳ２Ｙｌと命名し直した、新規の配列を化学的に合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ  ｉｎｃ．）、二つの発現ベクターＪＭＥ１１１０およびＪＭＥ１１０８内にクローニングした。その二つのベクターは、構成的プロモーター（ｐＴＥＦ、ＪＭＥ１１１０）またはオレイン酸誘発性プロモーター（ｐＰＯＸ２、ＪＭＥ１１０８）の下でのＰＡＳ２の発現を可能にする。
【００５１】
野生型菌株Ｐｏ１ｄ（ＪＭＹ１９５）およびΔｇｕｔ２、Δｐｏｘ１−６肥満菌株（ＪＭＹ１３６７）を形質転換するために、両方の構築物を使用した。形質転換体をウラシル上で選択し、発現カセットの組込みをＰＣＲで確認した。さらなる分析のために、複数のクローンを選択し使用した。しかしながら、ＰＯＸ２プロモーターはインデューサーの不在下でも強い発現を可能にすることから、我々は主として、ＪＭＥ１１０８構築物を用いて形質転換体を特徴づけした。菌株ＪＭＹ１７７７およびＪＭＹ１７７８は、ｐＰＯＸ２−ＰＡＳ２で形質転換されたＰｏ１ｄの二つの独立したクローンである。同様に、ＪＭＹ１７８１およびＪＭＹ１７８２は、ｐＰＯＸ２−ＰＡＳ２で形質転換されたＪＭＹ１３６７（Δｇｕｔ  Δｐｏｘ１−６）の二つの独立したクローンである。
【００５２】
ＰＡＳ２発現は細胞の成長を改善し、脂肪体の断片化を導く
複数の異なるＰＳＡ２発現菌株の成長を、グルコースを補足した培地上でそれらの未形質転換相対物と比較した。全ての菌株を、３０ｍｌのＹＰＤ培地中ＯＤ６００＝０．６で植菌した。全ての菌株は、植菌後、４０時間の培養後に静止期の開始に達するまでの間に、約４〜５時間の遅滞期、および９〜１２時間の平担域を伴う二峰性曲線を示した。
【００５３】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、脂肪体内で脂質を蓄積するものとして知られている。肥満菌株ＪＭＹ１３６７はより大きい構造まで脂肪体を融合することを特徴とすることが報告された。こうして、脂肪体の構造に対するＰＡＳ２発現の効果を、ナイルレッドによる複数の異なる菌株の染色によって調べた（図３Ａ）。静止段階は、脂質の高い蓄積度を特徴とすることから、４８時間後に細胞を収集し、細胞一個あたりの脂肪体の総数を定量した（図３Ｂ〜Ｃ）。
【００５４】
Ｐｏ１ｄ内ならびに肥満菌株ＪＭ１３６７内の両方におけるＰＡＳ２の発現は、脂肪体数の減少を導く（図３Ｂ〜Ｃ）。
【００５５】
ＰＡＳ２の発現がＶＬＣＦＡレベルを増強する
成長曲線の三つの異なる時点、すなわち第一成長期の終り（１１時間）、第二成長期の終り（２４時間）および静止期中（４８時間）に、四つの菌株中で、脂肪酸アシルメチルエステル（ＦＡＭＥＳ）の脂質総含有量をガスクロマトグラフィにより分析した。予想通り、肥満菌株ＪＭＹ１３６７は、２４時間後と４８時間後にそれぞれ２２％および４０％という、野生型Ｐｏ１ｄに比べて高い脂肪酸含有量を有する（図４）。ＰＡＳ２の発現は、全ての時点において脂肪酸総含有量を減少させた。最も強い減少は、４８時間後に観察され、Ｐｏ１ｄバックグラウンドで２０％、ＪＭＹ１３６７バックグラウンドで４６％であった。
【００５６】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの最も豊富な脂肪酸に相当する長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）の全量は、ＰＡＳ２発現菌株において１８％および３６％減少した。ＬＣＦＡの分析から、最も豊富なＬＣＦＡの一つであるｃ１８：１が最も影響を受け、肥満菌株ＪＭＹ１３６７バックグラウンドにおいて４８時間後に例えば１２６％の減少であったことを除いて、異なるクラス全てがＰＡＳ２の発現時点で減少したレベルを示していることがわかった（図５）。合計ＬＣＦＡの減少は、成長曲線の始め（１１時間）においてさえ有効であった。
【００５７】
ＶＬＣＦＡは、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるわずかな脂質種に相当するにすぎない（総脂肪酸の２．２〜３．２％）（図４）。三つの主要な種、すなわち、それぞれ４８時間の培養時点で総脂肪酸の０．８６、０．７７および０．３４％（モル％）に相当する２４：０、２０：１および２２：１が有意に蓄積された（図６）。Δｇｕｔ  Δｐｏｘ１−６は、２４時間の培養において倍増した（Ｐｏ１ｄにおいて、３．２３に比べ６．５３μｇ／１０ＯＤ）ことから、ＶＬＣＦＡレベルに対し明らかな効果を有していた。関与した主要なＶＬＣＦＡはｃ２４：０およびｃ２２：１であり、その含有量は総脂肪酸のそれぞれ２．０９％と０．９９％（モル％）に達した。新しいＶＬＣＦＡを、０．４５％に達するｃ２２：０として検出することができた。Ｐｏ１ｄバックグラウンドでのＰＡＳ２の発現は、蓄積したＶＬＣＦＡの量または性質をさほど変化させなかった。しかしながら、肥満菌株ＪＭＹ１３６７バックグラウンドでのＰＡＳ２の発現は、ＶＬＣＦＡの含有量を極めて有意に増大させた。２４時間の培養後、ＪＭＹ１７８１は、１７．３５μｇ／１０ＯＤを蓄積し、これは肥満菌株および野生型Ｐｏ１ｄ株よりそれぞれ２．６５倍および５．３倍多いものであった。蓄積した主要なＶＬＣＦＡは、ｃ２０：０およびｃ２４：０であり、総ＶＬＣＦＡの半分超を占めていた。ＪＭＹ１７８１では、エルカ酸ｃ２２：１、ｃ２２：０、ｃ２０：２も同様に有意に蓄積した。
【００５８】
ＰＡＳ２発現は、新しいモノメチル分岐脂肪酸の蓄積を誘発する
ＦＡＭＥＳの詳細な分析から、ＰＡＳ２発現菌株ＪＭＹ１７８１が新しい脂肪酸を蓄積させることが明らかになった。質量分析は、脂質が偶数または奇数のアシル鎖を有するモノメチル分岐脂肪酸であることを判定した。ＪＭＹ１７８１は、詳細には、ｃｌ４：０（Ｍｅ）、ｃｌ５：０（Ｍｅ）、ｃｌ６：０（Ｍｅ）、ｃｌ７：０（Ｍｅ）、ｃｌ８：０（Ｍｅ）ならびにｃｌ９：０（Ｍｅ）の存在を示した。化合物は、野生型Ｐｏ１ｄ菌株だけでなく肥満菌株ＪＭＹ１３６７においてもほとんど検出不可能であった。テトラデカン酸、１２メチル、メチルエステル、１４：０（Ｍｅ）は、高レベルで蓄積するように思われた（少なくともオクタデカン酸、メチルエステル、ｃ１８：０のレベルまで）。１０．７分、１４．４分、１８．４分および２３分でのピークのように、ＪＭＹ１７８１菌株中に複数の他の生成物が蓄積した。
【００５９】
考察
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来の３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼＰＡＳＴＩＣＣＩＮＯの発現は、油脂化学バイオテクノロジーのための細胞工場としてのこの酵母の使用に関するいくつかの革新的形質を導いた。
【００６０】
１−  ＰＡＳ２Ｙｌの発現は、二つの異なるＹａｒｒｏｗｉａ菌株すなわち野生型Ｐｏ１ｄならびに細胞内部における脂肪酸の高い蓄積を特徴とするΔｇｕｔΔｐｏｘ１−６における油体数を変化させる。脂肪体数の減少によってＶＬＣＦＡの蓄積が損なわれることはない。脂肪体数の減少は、プレス処理を介した油の抽出を改善するかもしれない。可能性としては、ＰＡＳ２は、脂質分泌を変化させ得る。
２−  ＰＡＳ２Ｙｌの発現は、ＶＬＣＦＡ蓄積の非常に有意な増大をひき起こす。工業的生産に直接用いることのできるＶＬＣＦＡのレベルは、当業者により公知のものなどのエロンガーゼ複合体の他の遺伝子をＹａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．中で同時発現させることによって得られるはずである。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子の発現は、ＹａｒｒｏｗｉａにおけるＶＬＣＦＡホメオスタシスを変更するために効果的であることから、我々は、植物由来の他のエロンガーゼ遺伝子を使用することを提案する。
【００６１】
【表１】
2013511972.tif 000002
【００６２】
【表２】
2013511972.tif 000003
【００６３】
参考文献
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・Ｂｅｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．、Ｃｅｓｃｕｔ，Ｊ．、Ｈａｄｄｏｕｃｈｅ，Ｒ．、Ｕｒｉｂｅｌａｒｒｅａ，Ｊ．Ｌ．、Ｍｏｌｉｎａ−Ｊｏｕｖｅ，Ｃ．、およびＮｉｃａｕｄ，Ｊ．Ｍ．（２００９）。「Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｂｉｏ−ｏｉｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４８、３７５−３８７。
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・Ｄｅｎｉｃ  Ｖ、Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＪＳ．（２００７）：「Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｌｉｐｅｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｖｅｒｙ  ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｌｅｎｇｔｈ」、Ｃｅｌｌ．２００７  Ａｕｇ  ２４；  １３０（４）：６６３−７７。
・Ｆｉｃｋｅｒｓ  Ｐ．、Ｌｅ  Ｄａｌｌ  Ｍ．Ｔ．、Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ  Ｃ．Ｔｈｏｎａｒｔ  Ｐ．Ｎｉｃａｕｄ  Ｊ−Ｍ．（２００３）「Ｎｅｗ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｒｋｅｒ  ｒｅｓｃｕｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ」、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５５／３：７２７−７３７。
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・Ｌｅｂｌｏｎｄ，Ｙ．、Ａ．Ｍａｒｔｙ、Ｎ．Ｍｏｕｚ、およびＪ．Ｌ．Ｕｒｉｂｅｌａｒｒｅａ．２００９、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｐａｓｅ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ｃｅｌｌ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｓａｉｄ  ｌｉｐａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ」。
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・Ｎｉｃａｕｄ  Ｊ−Ｍ．、Ｆａｂｒｅ  Ｅ．、Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ  Ｃ．（１９８９）、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｖｅｒｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ａｓ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒ」、Ｃｕｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：２５３−２６０。
・Ｎｉｃａｕｄ，Ｊ−Ｍ、Ｍａｄｚａｋ，Ｃ．、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｋ，Ｐ．、Ｇｙｓｌｅｒ，Ｃ．、Ｄｕｂｏｃ，Ｐ．、Ｎｉｅｄｅｒｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．、Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ，Ｃ．（２００２）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ」、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２／３：３７１−３７９。
・Ｗｏｌｆ  Ｋ、Ｂｒｅｕｎｉｇ  Ｋ、Ｂａｒｔｈ  Ｇ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ３４３−３５６。（Ｂｕｃｈｂｅｉｔｒａｇ）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００６４】
【特許文献１】仏国特許出願第０８／５４７８６号明細書
【図１（Ａ）−１】
2013511972.tif 000004
【図１（Ａ）−２】
2013511972.tif 000005
【図１（Ｂ）】
2013511972.tif 000006
【図２】
2013511972.tif 000007
【図３Ａ】
2013511972.tif 000008
【図３Ｂ】
2013511972.tif 000009
【図３Ｃ】
2013511972.tif 000010
【図４】
2013511972.tif 000011
【図５】
2013511972.tif 000012
【図６】
2013511972.tif 000013
【配列表】
2013511972000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年10月31日(2012.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵による超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の生産方法に関するものであり、該方法は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．における異種遺伝子の発現を可能にする調節エレメントの制御下でヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする前記異種遺伝子を含むＹａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の組換え株を培養するステップを含む。
【０００２】
本発明は、この組換え型Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．にも関するものである。
【背景技術】
【０００３】
生命体は、複合脂質内に取り込まれるおびただしい種類の異なる脂肪酸を合成する。これらの複合脂質は、主要な構造的構成要素膜であると同時に、植物および動物の両方における主要な貯蔵物質である。
【０００４】
超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）は真核細胞の構成要素であり、炭素２０個以上の長さで構成されている（すなわち  ＞Ｃ１８）。ＶＬＣＦＡは、異なる生物内で多くの異なる生理学的機能に関与している。これらは、脳（ミエリン）または植物種子（貯蔵トリアシルグリセロール、ＴＡＧ）などの一部の組織の豊富な構成成分である。ＶＬＣＦＡは、皮膚の脂質バリアおよび植物のクチクラワックスの構成要素である。一部のＶＬＣＦＡの長いアシル鎖は、例えば核孔内に見られる高い膜湾曲に必要なものである。同様に、ＶＬＣＦＡは、タンパク質輸送およびＧＰＩ脂質アンカー合成のための分泌経路にも関与する。最後に、ＶＬＣＦＡは、膜構成成分であると同時にシグナル伝達分子でもあるスフィンゴ脂質の構成要素である。
【０００５】
ＶＬＣＦＡは、Ｃ１８より長いアシル鎖を有する脂肪酸である。多価不飽和ＶＬＣＦＡは、主としてエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のように人間の食生活に重要な栄養成分とみなされている。国際公開第２００５／１１８８１４号パンフレットは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける多価不飽和脂肪酸の産生を改善する方法を開示している。不飽和ＶＬＣＦＡは、洗浄剤または潤滑剤としても作用することから、工業的にも有益である。
【０００６】
ＶＬＣＦＡは、四つの相異なる酵素（ＫＣＳ、ＫＣＲ、ＨＣＤおよびＥＣＲ）を含む膜結合酵素複合体であるエロンガーゼ複合体という名称のタンパク質複合体の内部で小胞体内に集められた四つの連続する酵素反応を通して、二個の炭素の逐次的付加によって合成される。脂肪伸長の第一のステップは、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳまたは縮合酵素）による、マロニル−ＣｏＡを用いた長鎖アシル−ＣｏＡの縮合である。結果として得られた３−ケトアシル−ＣｏＡは、次に３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）により還元されて、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを生成する。第三のステップは３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＨＣＤ）により３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡをトランス−２，３−エノイル−ＣｏＡへと脱水するステップであり、このトランス−２，３−エノイル−ＣｏＡは最終的にトランス−２，３−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）により還元されて二炭素伸長されたアシル−ＣｏＡを生成する。最後の三つの酵素は、アシル−ＣｏＡの特異性に関与しないことから、コア酵素と呼ばれる。アシル−ＣｏＡがひとたびエロンガーゼ複合体から伸長されると、これらは、リン脂質、トリアシルグリセロール、スフィンゴ脂質、および植物エピクチクラワックスなどの特異的脂質といった異なる脂質クラスの中に取り込まれ得る。
【０００７】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、この酵母がその乾燥重量の５０％超を脂質として蓄積できるだけでなく、炭素源として脂質を効率良く使用することもできることから、油性酵母とみなされている（Ｂｅｏｐｏｕｌｏｓら、２００９）。そのゲノムの完全な配列決定ならびにこの酵母についての分子遺伝学的手段の開発によって、この生物は脂質蓄積の機序の研究用モデルとなったばかりでなく、油脂化学バイオテクノロジーのための細胞工場にもなった。近年になって、β−酸化に関与するＰＯＸ１〜６遺伝子とグルコース−３−ホスフェートデヒトロゲナーゼＧＵＴ２の組合せ欠失が、脂質、主として遊離脂肪酸のきわめて高い蓄積を導くことが示された（Ｂｅｏｐｏｕｌｏｓら、２００８、ＦＲ０８５４７８６；１１  ２００８年７月１１日）。この肥満菌株は、それぞれグルコースまたはオレイン酸上で成長させた場合に野生型に比べて二倍および三倍多い脂肪酸を蓄積した。興味深いことに、これらの脂質は、単一の大きな脂肪体に蓄積した。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、主として長鎖脂肪酸ｃ１８：２、ｃ１８：１（ｎ−９）、ｃ１６：１（ｎ−７）およびｃ１６：０を蓄積する。しかしながら、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）については、わずかな情報しかない。
【０００８】
現在、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．、特にＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいてヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子を発現させることで、菌株による脂肪酸およびＶＬＣＦＡの産生に対して、品質および／または量の観点において直接的影響が及ぼされることが発見されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．におけるヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子の発現を可能にする調節エレメントの制御下で、前記異種遺伝子を含む、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の組換え株に関するものである。
【００１０】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子は、詳細には、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする植物種の遺伝子、その機能的相同体およびフラグメントからなる群から選択される。植物種の遺伝子は、有利には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ、Ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｏｓｔｒｅａｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ、およびＢｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ由来のヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子から選択され、より詳細には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の遺伝子ＰＡＳ２である。
【００１１】
本発明は同様に、発酵による超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の生産方法にも関するものであり、該方法は、適切な培養培地内で本発明の組換え株を培養するステップと、菌株および／または培地からＶＣＬＦＡを回収するステップとを含む。
【００１２】
前記方法により生産される脂肪酸も、同じく本発明の一部である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の組換え株に関するものであり、該組換え株は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．におけるヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子の発現を可能にする調節エレメントの制御下にある、前記異種遺伝子を含む。
【００１４】
組換え株
本発明によると、菌株は、それが遺伝子置換またはプラスミド導入などの細胞生物学的手段によって遺伝的に修飾されている場合に、組換え型となる。これは、遺伝子内に新しい遺伝子もしくは変異もしくは新しい調節エレメントを導入するため、または内因性遺伝子を欠失させるための定方向突然変異誘発により得られるであろう。組換え型微生物は、ランダム突然変異誘発の唯一の結果ではない。
【００１５】
新しい遺伝子が菌株内に導入される場合、それは、発現プラスミドと共に導入されてよく、あるいは、その菌株のゲノム内に組込まれてもよい。
【００１６】
菌株のゲノム内に組込まれる場合、遺伝子は、相同的組換え技術などの公知の遺伝子置換方法によって特異的部位にまたは無作為に組込まれてよい。
【００１７】
異種遺伝子は、導入される場合、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．におけるこの異種遺伝子の発現を可能にする調節エレメントの制御下のコード配列を含むことができる。代替的には、異種遺伝子は、既存の内因性調節エレメントの制御下で微生物のゲノム内に導入されて、欠失させられる対応する内因性コード配列から置き換わる、コード配列を含むことができる。
【００１８】
特に新しい遺伝子を導入するかまたは遺伝子を欠失させるためのＹａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の修飾方法は、当該技術分野において公知であり、ＢａｒｔｈおよびＧａｉｌｌａｒｄｉｎ（１９９６）ならびにＦｉｃｋｅｒｓら、（２００３）がある。
【００１９】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子
「ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ」（ＨＣＤ）という用語は、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡをトランス−２，３−エノイル−ＣｏＡに脱水する反応を触媒する酵素を意味する。それは、ヒドロリアーゼのファミリーに属する。この酵素は、エロンガーゼ複合体の一部を成し、植物内のＶＬＣＦＡの合成のみに関与し、その分解には関与しない。
【００２０】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子は、異種遺伝子である。本発明によると、遺伝子は、天然の菌株中で同一のものが発見されない場合、異種である。それは、異種調節エレメントの制御下の天然コード配列であるかまたは天然調節エレメントの制御下の異種コード配列であり得る。それは同様に、修飾されるべき菌株中には見られるものの未修飾菌株中に同じ遺伝子が発見されないプラスミド上またはゲノム内遺伝子座には見られない天然の構成要素を有する遺伝子でもあり得る。
【００２１】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子は、特に、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする植物種の遺伝子由来のコード配列を含む遺伝子、その機能的相同体およびフラグメントからなる群から選択される。
【００２２】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする植物種の遺伝子は、当該技術分野において公知であり、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ＣＡＮ６４３４１．１仮想タンパク質をコードする）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（ＣＡＤ３９８９１．２、ＥＡＹ７２５４８．１仮想タンパク質ＯｓＩ＿０００３９５、ＥＡＺ３００２５．１仮想タンパク質ＯｓＪ＿０１３５０８およびＢＡＤ６１１０７．１チロシンホスファターゼ様）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ（ＡＡＺ６６９４６．１）、Ｈｙａｃｉｎｔｈｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（ＡＡＴ０８７４０．１タンパク質チロシンホスファターゼ）、Ｏｓｔｒｅａｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ（ＸＰ＿００１４２０９９７．１推定タンパク質およびＸＰ＿００１４２２８９８．１推定タンパク質）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（ＥＤＰ０１０５５．１推定タンパク質）、および同様にＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ由来の遺伝子の中から特に選択されたものを含む。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、異種遺伝子は、ＵｎｉＧｅｎｅデータバンクにＮＰ＿１９６６１０．２の番号で登録済であり、Ｆ１２Ｂ１７．１７０、Ｆ１２Ｂ１７＿１７０、ＰＡＳＴＩＣＣＩＮＯ  ２、ＰＥＰ、およびＰＥＰＩＮＯとしても同様に知られている、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の遺伝子ＰＡＳ２（Ｂａｃｈら、２００８）である。
【００２４】
本発明の別の具体的実施形態において、異種遺伝子は、遺伝子データバンクにＮＰ＿０１２４３８．１の番号で登録済である、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＰＨＳ１遺伝子（Ｄｅｎｉｃら、２００７）、その機能的相同体およびフラグメントである。
【００２５】
異種遺伝子のコード配列が別のものに由来する場合、このコード配列は実際、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．について公知の好ましいコドン使用頻度でこれを再度コードすることができる。当業者であれば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．において使用される好ましいコドンおよびこのような再コードされたコード配列の調製方法を知っている。
【００２６】
本発明によると、「機能的相同体」とは、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子と相同性を共有する遺伝子、または、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子によりコードされるタンパク質と相同性を共有するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２７】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子によりコードされるタンパク質と相同性を共有するタンパク質は、植物から得られるか、または、植物に由来する天然タンパク質のバリアントもしくは機能的フラグメントであってよい。
【００２８】
「天然タンパク質のバリアントまたは機能的フラグメント」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列が、天然に観察される配列に厳密に限定されなくてよく、追加のアミノ酸を含んでいてよい、ということを意味する。「フラグメント」という用語は、ポリペプチドの配列が、もとの配列よりもアミノ酸を少なく含むがヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性を付与するのに充分なアミノ酸を依然として含んでいてよいことを意味する。ポリペプチドが、その酵素活性を保持しながら、一つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失および／または付加により修飾可能であることは、当該技術分野において周知である。例えば、タンパク質の機能的特性に影響を及ぼさない、化学的に等価のアミノ酸による所与の位置にある一つのアミノ酸の置換が一般的である。本発明に関しては、置換は、以下の群のうちの一つの中での交換として定義される：
・小さい脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
・極性の、負荷電残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
・極性の、正荷電残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
・大きい脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
・大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００２９】
したがって、一つの負荷電残基での別の残基の置換（例えばグルタミン酸でアスパラギン酸を置換）または一つの正荷電残基での別の残基の置換（例えばリジンでアルギニンを置換）を結果としてもたらす変化が、機能的に等価の生成物を生成すると予想することができる。
【００３０】
アミノ酸配列内の、アミノ酸が修飾される位置および修飾を受けるアミノ酸の数は、特に限定されない。当業者であれば、タンパク質の活性に影響を及ぼすことなく導入可能な修飾を認識することができる。例えば、タンパク質のＮまたはＣ末端部分での修飾は、一部の状況下でタンパク質の活性を改変しないものと予想され得る。
【００３１】
「バリアント」という用語は、もとの酵素活性をなおも保持しながら、以上で定義したような修飾に付されたポリペプチドを意味する。
【００３２】
本発明によると、ヒドロアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素活性を有するポリペプチドは、ＰＡＳ２の配列と少なくとも３０％の相同性、好ましくは少なくとも５０％の相同性、そしてより好ましくは少なくとも７０％の相同性を有する配列を含んでいてよい。
【００３３】
二つのタンパク質配列間の相同性百分率の決定方法は、当業者にとって公知である。例えば、これは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／のウェブサイト上で入手可能なソフトウェアＣＬＵＳＡＴＡＬＷを、このウェブサイト上に記されたデフォルトパラメータと共に使用することによって、配列のアラインメントの後に行なうことができる。残基の総数と比較した同じ位置における同一の残基の数を記録することにより、アラインメントから同一性百分率を容易に計算することができる。代替的には、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／のウェブサイト上で入手可能なＢＬＡＳＴプログラムをそのウェブサイト上に記されたデフォルトパラメータと共に使用することによって、自動計算を行なうことも可能である。
【００３４】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．における異種遺伝子の発現を可能にする調節エレメント
このような調節エレメントは、当該技術分野において周知であり、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ２由来のＰＯＸ２プロモーター、イソシトレートデヒドロゲナーゼ由来のＩＣＬプロモーター、プロモーターＨｐ４ｄ、プロモーターＧＰＤおよびＧＰＭ、プロモーターＦＢＰ、ならびにプロモーターＸＰＲ２を含む。前記複数のプロモーターは当該技術分野において公知であり、なかでもＪｕｒｅｔｚｅｋら（２０００）、Ｍａｄｚａｋら（２００４）、Ｍａｄｚａｋら（２０００）、米国特許第７２５９２５５号明細書、米国特許第７２０２３５６号明細書およびＢｌａｎｃｈｉｎ−Ｒｏｌａｎｄら（１９９４）中で開示されている。
【００３５】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．
本発明によると、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の任意の菌株を形質転換し、本発明の方法において使用してよい。好ましくは、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．の菌株はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ属に属する。
【００３６】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ属の菌株は、この菌株の形質転換方法と同様、当該技術分野において周知である。対象となるコード領域を含む構築物を、任意の標準的技術により宿主細胞中に導入してよい。これらの技術には、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７（１９９１）））、原形質融合、遺伝子銃衝撃、電気穿孔法、マイクロインジェクション、または対象となる遺伝子を宿主細胞内に導入する任意の他の方法が含まれる。油性酵母（すなわちＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に適用可能なより具体的な教示としては、米国特許第４８８０７４１号明細書および米国特許第５０７１７６４号明細書が含まれる。
【００３７】
参照として本明細書に援用されている、脂質、主として遊離脂肪酸の非常に高い蓄積を有する菌株（仏国特許出願第０８／５４７８６号明細書；２００８年７月１１日）のように、改良された脂肪酸生産のために修飾された菌株も同様に開示されている。このような菌株は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種遺伝子を用いて本発明にしたがってさらに修飾されてよい。
【００３８】
また、本発明の組換え株は、脂肪酸のβ−酸化に関与する少なくとも一つの遺伝子の欠失、特にアシルＣｏＡオキシダーゼをコードする遺伝子ＰＯＸ１〜ＰＯＸ６のうちの一つの欠失、特に六つのアシルＣｏＡオキシダーゼをコードする六つの遺伝子ＰＯＸ１〜６ならびに／または脂肪酸およびＴＡＧ合成の経路に関与する一つの遺伝子の欠失、特にグリセロール３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失も含み得る。
【００３９】
組換え株の培養
脂肪酸、特にＶＬＣＦＡは、適切な培養培地内で発酵によって組換え株を培養する場合に生産される。
【００４０】
発酵による培養とは、微生物が培養培地で発育させられ、培養培地の炭素源を形質転換することによって、この培養ステップ中にＶＬＣＦＡを産生することを意味する。ＶＬＣＦＡは、バイオマスと共に、細胞内および／または培地内に蓄積される。
【００４１】
発酵は、酵素変換プロセスでさらに使用される、酵素を生産するために培養を用いる生物変換反応とは全く異なるものである。
【００４２】
適切な培養培地
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．のための培養培地は、ＢａｒｔｈおよびＧａｉｌｌａｒｄｉｎ（１９９６）、Ｎｉｃａｕｄら（２００２）およびＭａｕｅｒｓｂｅｒｇｅｒおよびＮｉｃａｕｄ（２００２）を含め、当該技術分野において周知である。発酵に関して規定された培地は、Ｌｅｂｌｏｎｄら（２００９）および韓国特許第２００９／００２９８０８号公報中で詳細に開示されている。
【００４３】
スクロース培地は、Ｎｉｃａｕｄら（１９８９）において詳細に開示されている。
【００４４】
適切な培養培地は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．が成長でき、かつ菌株の成長およびＶＬＣＦＡの産生を可能にする全ての栄養素、特に炭素源を含む培地である。
【００４５】
炭素源は、スクロースまたは他の炭水化物などの、任意の炭素源であってよい。
【００４６】
菌株および／または培地からのＶＣＬＦＡの回収
ＶＣＬＦＡは、バイオマスと共に菌株中および／または培養培地内に蓄積される。ＶＣＦＬＡの回収には、一般に、細胞溶解、濾過および培地からの回収というステップが含まれる。脂肪酸バイオプロダクションの当業者は、本発明の方法に、バイオマスからの脂肪酸の通常の回収方法をいかに適応させるべきかを知っている。
【００４７】
本発明の方法を用いて生産されたＶＣＦＬＡは、そのままの状態で、本発明の菌株により産生された脂肪酸の混合物中で使用されてよい。これらをさらに精製し単離することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ発現のために最適化された合成ＰＡＳ２を表わす。（Ａ）ＰＡＳ２Ｙｌの遺伝子およびタンパク質の配列。（Ｂ）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＰＡＳ２ＡｔとＰＡＳ２Ｙｌのアラインメント。
【図２】使用または創出された、異なる菌株の概略図と共に、ＹａｒｒｏｗｉａにおけるＰＡＳ２発現を表わす。
【図３】ＹａｒｒｏｗｉａにおけるＰＡＳ２発現の効果を表わす。（Ａ）ＪＭ１３６７およびＪＭ１７８１菌株中でのナイルレッドを用いた脂肪体の染色。（Ｂ）Ｐｏ１ｄおよびＪＭ１７７７における細胞一個あたりの脂肪体の数。分布を比較するために、多項回帰を適用した。（Ｃ）ＪＭ１３６７およびＪＭ１３８１における細胞一個あたりの脂肪体の数。分布を比較するために、多項回帰を適用した。
【図４】ＹａｒｒｏｗｉａにおけるＰＡＳ２発現を伴う、生産されたＬＣＦＡ／ＶＬＣＦＡの比を示す。
【図５】ＹａｒｒｏｗｉａにおけるＰＡＳ２発現を伴う、修飾されたＬＣＦＡおよびＶＬＣＦＡの含有量を示す。（Ａ）ＬＣＦＡ含有量。（Ｂ）ＶＬＣＦＡ含有量。
【図６】ＹａｒｒｏｗｉａにおけるＰＡＳ２発現を伴う、修飾されたＶＬＣＦＡのプロファイルを示す。
【実施例】
【００４９】
材料と方法
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン使用頻度にしたがって、合成ＰＡＳ２遺伝子（ＰＡＳ２Ｙｌ）を合成して、プラスミドＪＭＥ１１０７を得た。ＰＡＳＹｌをプラスミドＪＭＰ６２−ＰＯＸ２−ＵＲＡ３ｅｘ（ＪＭＥ８０３）内そしてプラスミドＪＭＰ６２−ＴＥＦ−ＵＲＡ３ｅｘ（ＪＭＥ１０１２）内に以下の通りにクローニングした：プラスミドＪＭＥ１１０７をＢａｍＨＩ−ＡｖｒＩＩにより消化し、ＰＡＳ２遺伝子を担持する対応するフラグメントを、プラスミドＪＭＥ１０１２およびＪＭＥ１１０７の対応する部位でクローニングして、それぞれプラスミドＪＭＥ１１０８（ＰＯＸ２−ＰＡＳ２）およびＪＭＥ１１１０（ＴＥＦ−ＰＡＳ２）を得た。プラスミドをＮｏｔＩで消化し、発現カセットを担持するフラグメントを、酢酸リチウム法によるＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの形質転換（Ｇ．ＢａｒｔｈおよびＧａｉｌｌａｒｄｉｎの概説：すなわち「Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（Ｗｏｌｆ，Ｋ．、Ｅｄ．）、Ｖｏｌ．１、１９９６、ｐｐ．３１３−３８８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ中のＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに記載されている）のために使用した。形質転換体をＹＮＢｃａｓａ上で選択した。典型的には、フラグメント１μｇあたり約５×１０３個の形質転換体が得られた。それぞれＰＯＸ２−ＰＡＳ２およびＴＥＦ−ＰＡＳ２を含むクローンのためのプライマー対６１ｓｔａｒｔ／６１ｓｔｏｐおよびＴＥＦｓｔａｒｔ／６１ｓｔｏｐを用いたＰＣＲにより、４〜８個の形質転換体を分析した。ＰＣＲ産物をさらに、ＰＡＳ２遺伝子内のＡｖａＩ固有の制限部位により消化した。
【００５０】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ中のＰＡＳ２の安定した発現
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＰＡＳ２遺伝子のオープンリーディングフレームを再コードして、Ｙａｒｒｏｗｉａコドン使用頻度でのその発現を改善した（図１Ａ〜Ｂ）。クローニングを促すため、ＰＡＳ２  ＯＲＦの５’および３’末端に二つの制限部位ＢａｍＨＩおよびＡｖｒＩＩをそれぞれ付加した。ＰＡＳ２Ｙｌと命名し直した、新規の配列を化学的に合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ  ｉｎｃ．）、二つの発現ベクターＪＭＥ１１１０およびＪＭＥ１１０８内にクローニングした。その二つのベクターは、構成的プロモーター（ｐＴＥＦ、ＪＭＥ１１１０）またはオレイン酸誘発性プロモーター（ｐＰＯＸ２、ＪＭＥ１１０８）の下でのＰＡＳ２の発現を可能にする。
【００５１】
野生型菌株Ｐｏ１ｄ（ＪＭＹ１９５）およびΔｇｕｔ２、Δｐｏｘ１−６肥満菌株（ＪＭＹ１３６７）を形質転換するために、両方の構築物を使用した。形質転換体をウラシル上で選択し、発現カセットの組込みをＰＣＲで確認した。さらなる分析のために、複数のクローンを選択し使用した。しかしながら、ＰＯＸ２プロモーターはインデューサーの不在下でも強い発現を可能にすることから、我々は主として、ＪＭＥ１１０８構築物を用いて形質転換体を特徴づけした。菌株ＪＭＹ１７７７およびＪＭＹ１７７８は、ｐＰＯＸ２−ＰＡＳ２で形質転換されたＰｏ１ｄの二つの独立したクローンである。同様に、ＪＭＹ１７８１およびＪＭＹ１７８２は、ｐＰＯＸ２−ＰＡＳ２で形質転換されたＪＭＹ１３６７（Δｇｕｔ  Δｐｏｘ１−６）の二つの独立したクローンである。
【００５２】
ＰＡＳ２発現は細胞の成長を改善し、脂肪体の断片化を導く
複数の異なるＰＳＡ２発現菌株の成長を、グルコースを補足した培地上でそれらの未形質転換相対物と比較した。全ての菌株を、３０ｍｌのＹＰＤ培地中ＯＤ６００＝０．６で植菌した。全ての菌株は、植菌後、４０時間の培養後に静止期の開始に達するまでの間に、約４〜５時間の遅滞期、および９〜１２時間の平担域を伴う二峰性曲線を示した。
【００５３】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、脂肪体内で脂質を蓄積するものとして知られている。肥満菌株ＪＭＹ１３６７はより大きい構造まで脂肪体を融合することを特徴とすることが報告された。こうして、脂肪体の構造に対するＰＡＳ２発現の効果を、ナイルレッドによる複数の異なる菌株の染色によって調べた（図３Ａ）。静止段階は、脂質の高い蓄積度を特徴とすることから、４８時間後に細胞を収集し、細胞一個あたりの脂肪体の総数を定量した（図３Ｂ〜Ｃ）。
【００５４】
Ｐｏ１ｄ内ならびに肥満菌株ＪＭ１３６７内の両方におけるＰＡＳ２の発現は、脂肪体数の減少を導く（図３Ｂ〜Ｃ）。
【００５５】
ＰＡＳ２の発現がＶＬＣＦＡレベルを増強する
成長曲線の三つの異なる時点、すなわち第一成長期の終り（１１時間）、第二成長期の終り（２４時間）および静止期中（４８時間）に、四つの菌株中で、脂肪酸アシルメチルエステル（ＦＡＭＥＳ）の脂質総含有量をガスクロマトグラフィにより分析した。予想通り、肥満菌株ＪＭＹ１３６７は、２４時間後と４８時間後にそれぞれ２２％および４０％という、野生型Ｐｏ１ｄに比べて高い脂肪酸含有量を有する（図４）。ＰＡＳ２の発現は、全ての時点において脂肪酸総含有量を減少させた。最も強い減少は、４８時間後に観察され、Ｐｏ１ｄバックグラウンドで２０％、ＪＭＹ１３６７バックグラウンドで４６％であった。
【００５６】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの最も豊富な脂肪酸に相当する長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）の全量は、ＰＡＳ２発現菌株において１８％および３６％減少した。ＬＣＦＡの分析から、最も豊富なＬＣＦＡの一つであるｃ１８：１が最も影響を受け、肥満菌株ＪＭＹ１３６７バックグラウンドにおいて４８時間後に例えば１２６％の減少であったことを除いて、異なるクラス全てがＰＡＳ２の発現時点で減少したレベルを示していることがわかった（図５）。合計ＬＣＦＡの減少は、成長曲線の始め（１１時間）においてさえ有効であった。
【００５７】
ＶＬＣＦＡは、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるわずかな脂質種に相当するにすぎない（総脂肪酸の２．２〜３．２％）（図４）。三つの主要な種、すなわち、それぞれ４８時間の培養時点で総脂肪酸の０．８６、０．７７および０．３４％（モル％）に相当する２４：０、２０：１および２２：１が有意に蓄積された（図６）。Δｇｕｔ  Δｐｏｘ１−６は、２４時間の培養において倍増した（Ｐｏ１ｄにおいて、３．２３に比べ６．５３μｇ／１０ＯＤ）ことから、ＶＬＣＦＡレベルに対し明らかな効果を有していた。関与した主要なＶＬＣＦＡはｃ２４：０およびｃ２２：１であり、その含有量は総脂肪酸のそれぞれ２．０９％と０．９９％（モル％）に達した。新しいＶＬＣＦＡを、０．４５％に達するｃ２２：０として検出することができた。Ｐｏ１ｄバックグラウンドでのＰＡＳ２の発現は、蓄積したＶＬＣＦＡの量または性質をさほど変化させなかった。しかしながら、肥満菌株ＪＭＹ１３６７バックグラウンドでのＰＡＳ２の発現は、ＶＬＣＦＡの含有量を極めて有意に増大させた。２４時間の培養後、ＪＭＹ１７８１は、１７．３５μｇ／１０ＯＤを蓄積し、これは肥満菌株および野生型Ｐｏ１ｄ株よりそれぞれ２．６５倍および５．３倍多いものであった。蓄積した主要なＶＬＣＦＡは、ｃ２０：０およびｃ２４：０であり、総ＶＬＣＦＡの半分超を占めていた。ＪＭＹ１７８１では、エルカ酸ｃ２２：１、ｃ２２：０、ｃ２０：２も同様に有意に蓄積した。
【００５８】
ＰＡＳ２発現は、新しいモノメチル分岐脂肪酸の蓄積を誘発する
ＦＡＭＥＳの詳細な分析から、ＰＡＳ２発現菌株ＪＭＹ１７８１が新しい脂肪酸を蓄積させることが明らかになった。質量分析は、脂質が偶数または奇数のアシル鎖を有するモノメチル分岐脂肪酸であることを判定した。ＪＭＹ１７８１は、詳細には、ｃｌ４：０（Ｍｅ）、ｃｌ５：０（Ｍｅ）、ｃｌ６：０（Ｍｅ）、ｃｌ７：０（Ｍｅ）、ｃｌ８：０（Ｍｅ）ならびにｃｌ９：０（Ｍｅ）の存在を示した。化合物は、野生型Ｐｏ１ｄ菌株だけでなく肥満菌株ＪＭＹ１３６７においてもほとんど検出不可能であった。テトラデカン酸、１２メチル、メチルエステル、１４：０（Ｍｅ）は、高レベルで蓄積するように思われた（少なくともオクタデカン酸、メチルエステル、ｃ１８：０のレベルまで）。１０．７分、１４．４分、１８．４分および２３分でのピークのように、ＪＭＹ１７８１菌株中に複数の他の生成物が蓄積した。
【００５９】
考察
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来の３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼＰＡＳＴＩＣＣＩＮＯの発現は、油脂化学バイオテクノロジーのための細胞工場としてのこの酵母の使用に関するいくつかの革新的形質を導いた。
【００６０】
１−  ＰＡＳ２Ｙｌの発現は、二つの異なるＹａｒｒｏｗｉａ菌株すなわち野生型Ｐｏ１ｄならびに細胞内部における脂肪酸の高い蓄積を特徴とするΔｇｕｔΔｐｏｘ１−６における油体数を変化させる。脂肪体数の減少によってＶＬＣＦＡの蓄積が損なわれることはない。脂肪体数の減少は、プレス処理を介した油の抽出を改善するかもしれない。可能性としては、ＰＡＳ２は、脂質分泌を変化させ得る。
２−  ＰＡＳ２Ｙｌの発現は、ＶＬＣＦＡ蓄積の非常に有意な増大をひき起こす。工業的生産に直接用いることのできるＶＬＣＦＡのレベルは、当業者により公知のものなどのエロンガーゼ複合体の他の遺伝子をＹａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．中で同時発現させることによって得られるはずである。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子の発現は、ＹａｒｒｏｗｉａにおけるＶＬＣＦＡホメオスタシスを変更するために効果的であることから、我々は、植物由来の他のエロンガーゼ遺伝子を使用することを提案する。
【００６１】
【表１】
2013511972.tif 000014
【００６２】
参考文献
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【国際調査報告】
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