(57)【要約】  単一のヒト細胞においてゲノムワイド単一ヌクレオチド多型をタイピングし、単一細胞又は二重細胞由来の遺伝子型のゲノムワイドハプロタイプを初めて再構築する一般的手法を開発した。原理証明は、ＥＢＶで形質転換したリンパ芽球様細胞及びヒト割球について与えられる。この目的で、単一細胞の多置換増幅ＤＮＡサンプルをAffymetrixの２５０Ｋ  ＳＮＰアレイにハイブリダイズした。種々のアルゴリズム設計を続いて開発して、単一細胞由来のＳＮＰプローブの強度からシンテニー対立遺伝子の配列を評価するとともに、連鎖ベースの手法を用いてゲノム全体にわたる親の相同的組換え部位の大部分を正確に突き止めた。これには、未処理の単一細胞又は二重細胞由来のハプロタイプにおける矛盾する対立遺伝子の割当ての大半を訂正するアルゴリズムの開発が含まれていた。１つ又は２つの細胞のみの分析からゲノムワイドハプロタイプを推測する本方法は、極めて大きな実用的価値を有する。本方法は、診療所内での着床前の体外受精したヒトの胚の遺伝子診断だけでなく、胚レベルでのゲノムワイド量的形質遺伝子座選択を可能にすることによって動物の繁殖計画をも一変させる能力を有する。加えて、本方法は、ハプロタイプ多様性の要因、主に（ヒトの）腫瘍形成時によく起こる減数分裂性の相同的組換え過程及び体細胞性の（相同的）組換え過程を更に精査することを可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一細胞ハプロタイピングの方法であって、
ａ．単一細胞を選抜する工程と、
ｂ．前記単一細胞を溶解する工程と、
ｃ．前記単一細胞のＤＮＡを増幅する工程と、
ｄ．増幅された前記単一細胞ＤＮＡの超並列（ゲノムワイド）遺伝的多型タイピング（＝ジェノタイピング）を行う工程と、
ｅ．全ての遺伝的多型又はその一部を用いて該単一細胞の遺伝子型のハプロタイプを再構築する工程と、
ｆ．近接する遺伝的多型の情報に基づいて、１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当てを再配分する工程と、
を含む、単一細胞ハプロタイピングの方法。
【請求項２】
１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当ての再配分を、或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを再配分することによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分に、前記量の遺伝的多型よりも大きいハプロタイプブロックの祖父母起源を利用する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
或る量の遺伝的多型（閾値）よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分を、該閾値よりも大きい、（該小さなハプロタイプブロックに対して）隣接する最初の左及び右のハプロタイプブロックの祖父母起源を利用することによって行う、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
遺伝的多型の量が或る特定の閾値Ｔ１よりも小さいハプロタイプブロックを、該閾値Ｔ１よりも大きい、該ハプロタイプブロックの左側又は右側の最初のハプロタイプブロックに、これら２つのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ配分する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
二重細胞ハプロタイピングの方法であって、
ａ．２つの細胞を選抜する工程と、
ｂ．前記２つの細胞を溶解する工程と、
ｃ．各細胞について、単一細胞のＤＮＡを増幅する工程と、
ｄ．各細胞について、増幅された該単一細胞ＤＮＡの超並列（ゲノムワイド）遺伝的多型タイピング（＝ジェノタイピング）を行う工程と、
ｅ．２つの別個にジェノタイピングした該単一細胞間で一致する遺伝的多型コールからなる仮想遺伝子型を生成する工程と、
ｆ．前記仮想遺伝子型のハプロタイプを再構築する工程と、
ｇ．近接する遺伝的多型の情報に基づいて、１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当てを再配分する工程と、
を含む、二重細胞ハプロタイピングの方法。
【請求項７】
１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当ての再配分を、或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを再配分することによって行う、請求項６に記載の二重細胞ハプロタイピングの方法。
【請求項８】
或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分に、前記量の遺伝的多型よりも大きいハプロタイプブロックの祖父母起源を利用する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
或る量の遺伝的多型（閾値）よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分を、該閾値よりも大きい、（該小さなハプロタイプブロックに対して）隣接する最初の左及び右のハプロタイプブロックの祖父母起源を利用することによって行う、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝的多型の量が或る特定の閾値Ｔ１よりも小さいハプロタイプブロックを、該閾値Ｔ１よりも大きい、該ハプロタイプブロックの左側又は右側の最初のハプロタイプブロックに、これらの２つのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ配分する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
単一細胞又は二重細胞由来のハプロタイプの解釈を改善する方法であって、或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを再配分することによって、該ハプロタイプブロックを処理することを含む、単一細胞又は二重細胞由来のハプロタイプの解釈を改善する方法。
【請求項１２】
或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分に、前記量の遺伝的多型よりも大きいハプロタイプブロックの祖父母起源を利用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
或る量の遺伝的多型（閾値）よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分を、該閾値よりも大きい、（該小さなハプロタイプブロックに対して）隣接する最初の左及び右のハプロタイプブロックの祖父母起源を利用することによって行う、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝的多型の量が或る特定の閾値Ｔ１よりも小さいハプロタイプブロックを、該閾値Ｔ１よりも大きい、該ハプロタイプブロックの左側又は右側の最初のハプロタイプブロックに、これらの２つのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ配分する、請求項１１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当ての再配分が、画像処理法に基づく、請求項１に記載の単一細胞ハプロタイピングの方法及び請求項６に記載の二重細胞ハプロタイピングの方法。
【請求項１６】
画像処理法が「１Ｄメジアンフィルター」の適用である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝的多型タイピングを単一ヌクレオチド多型タイピング（ＳＮＰタイピング）によって行う、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝的多型タイピングをＤＮＡシークエンシングによって行う、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
単一細胞がヒト又は動物の割球である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その後のハプロタイプ再構築のために高分解能ゲノムワイド遺伝的多型タイピングのプラットフォーム、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）アレイ又は超並列ＤＮＡシークエンサーを用いて、単一又は僅かな（ヒトの）細胞をジェノタイピングする方法に関し、より具体的には単一細胞及び二重細胞のハプロタイピングの方法に関する。開発した包括的方法は、（１）診療所内での体外受精したヒトの胚の着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）、（２）１回の実験で複数の（量的形質）遺伝子座についての胚の選択を可能にすることによる動物の繁殖計画、（３）異なる対立遺伝子構成を有する細胞からなる不均一組織（例えば腫瘍）の遺伝学研究、及び（４）一般に遺伝的多型タイピング（例えば、ＳＮＰタイピング、又はＤＮＡシークエンシングによる遺伝的変異検出）又はハプロタイピングデータを必要とする全ての遺伝学研究について即時の実用的価値を有する。
【背景技術】
【０００２】
ハプロタイプとはシンテニーな一連の対立遺伝子を表し、観察された遺伝子型のデータから統計的方法及び計算法によってコンピュータ内で決定することができる（非特許文献１）。ハプロタイプの推測は、遺伝性疾患とその遺伝的原因との間の関連性を研究すること（非特許文献２）だけでなく、メンデル形質及び量的形質遺伝子座のような複雑な形質の遺伝的構造を解明すること（非特許文献３）、進化及び個体群史、並びに減数分裂性及び有糸分裂性の組換え過程を研究することにも非常に有効であることが証明されている。加えて、シンテニー対立遺伝子の配列の計算を用い、限定された遺伝子座内で連続する相同的組換え部位を探すことによって、ジェノタイピングのエラーを特定することができ（非特許文献４）、同様に失われた遺伝子型コールを推測することができる。最近まで、遺伝子型は主に１回の反応当たり１つ又は少数の多型マーカーを分析することによって決定されていた。マーカー分析のための幾つかのゲノムワイドハイスループット手法の最近の発展によって、１回の実験で数千から数百万の多型マーカーをタイピングすることが可能になっている。例えば、ゲノム全体にわたって単一ヌクレオチド多型を標的とするオリゴヌクレオチドを有するマイクロアレイが、超並列ＳＮＰ再シークエンシングを可能にし、主に連鎖分析及びゲノムワイド関連研究によるヒト及び動物の両方における特定の形質又は疾患の根底にある遺伝的変異の特定を加速させている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献５）。加えて、ＳＮＰタイピングが、これまで他のいかなる技術によっても可能でなかった、多数の急性骨髄性白血病サンプルにおいてゲノムワイド規模でコピー数の正常なヘテロ接合性消失（copyneutral loss of heterozygosity）（ＣＮ-ＬＯＨ）の領域を特定するために使用されている。超並列シークエンシング技法の開発によって、例えばＳＮＰ、挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）、コピー数多型（ＣＮＶ）、並びに平衡及び不平衡の構造遺伝的変異を含む、全領域の遺伝的変異及び多型を１回の実験で検出することが可能になった。ジェノタイピング及びハプロタイピングのためのこれらのシークエンシング技術は生物医学研究を更に促進し、新規の臨床用途を可能にしている
【０００３】
しかしながら、大抵のジェノタイピング方法及びハプロタイピング方法は、大量のＤＮＡを利用し、したがって生物の多数の細胞から抽出されたＤＮＡを使用する。しかし、多くの用途では、ごく僅か又は更には単一の細胞しか分析に利用可能でない。減数分裂性の組換え過程の研究においては、単一の半数体精細胞をジェノタイピングすることが多い。着床前遺伝子診断においては、ＰＣＲベースの「単純反復配列」（ＳＴＲ）マーカー分析が、単一の割球における小さな遺伝子座を（ハプロ）タイピングするために使用されることが多い（非特許文献６）。加えて、細胞混合物の分析は、異なる対立遺伝子構成を有する種々の亜集団又は細胞の存在を曖昧にする。例えば、がんは累積変化を獲得し、腫瘍ＤＮＡサンプルは多くの場合、正常細胞からのＤＮＡによっても汚染されている。結果として、このように不均一なＤＮＡサンプルの分析は、有益な遺伝情報の消失を引き起こす可能性がある。
【０００４】
開発された本発明の単一細胞及び二重細胞のハプロタイピング方法は、単一細胞に由来するＤＮＡサンプルの遺伝的多型タイピング、例えばＳＮＰタイピングによって、包括的かつゲノムワイドな遺伝子座の遺伝のモニタリングを可能にする。したがって、この方法は現行の着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）を改善し、標準化する能力を有する。ＰＧＤは、子孫への遺伝性疾患の伝達を回避することを望む夫婦のための任意の方法である。ＰＧＤは、通常は体外受精した（ＩＶＦ）胚から受精後３日目に生検した単一又は一対の割球の遺伝子検査によって支持されている。特異的突然変異を有しない胚を、続いて受精後４日目又は５日目に女性の子宮に移すことができる。現在、着床前胚における単一遺伝子病は一般に、単一細胞ＤＮＡ又は多置換増幅（ＭＤＡ）単一細胞ＤＮＡに直接対するマルチプレックス反応において突然変異対立遺伝子及び１つ又は２つの関連単純反復配列（ＳＴＲ）マーカーのＰＣＲ増幅を用いて診断される。しかしながら、この手法には、誤診を回避するために、最小限の対立遺伝子ドロップアウト（ＡＤＯ）（遺伝子座での１つ又は複数の対立遺伝子の増幅の偶発的な失敗を表す）について最適化される、家系特異的な単一細胞マルチプレックスＰＣＲ反応の時間のかかる設計が必要とされる。さらに、ＤＮＡ及びアンプリコンによる汚染、したがって関連多型マーカーの反応への参加を注意深くモニタリングする必要がある。これらの困難を克服するために、非特許文献６は、ＭＤＡ増幅単一細胞ＤＮＡにおける高リスク及び低リスクのハプロタイプの検出を可能にする、遺伝子突然変異に接近して位置する複数の多型マーカーについて家族の成員を試験することに基づく、着床前遺伝子ハプロタイピング（ＰＧＨ）を開発した。複数のマーカーを試験に組み入れることによって、特定の家族に対する無益なマーカー、ＡＤＯ、及び突然変異マーカーと関連マーカーとの間の組換えに関する問題が克服される。しかしながら、この技術は依然として、試験対象の各々の遺伝子座についてのマルチプレックスＰＣＲの開発を必要としている。
【０００５】
本発明の単一細胞及び二重細胞のハプロタイピング方法は、ゲノム全体に広がる数千の多型マーカーからの情報を使用し、家系図内におけるゲノムの任意のセグメントの分離を正確に追跡することを可能にするため、これらの欠点は本方法によって克服される。
【０００６】
単一細胞のためのゲノムワイドなジェノタイピング方法及びハプロタイピング方法は以前に開発されている。
【０００７】
特許文献１は、ＳＮＰアレイを用いたゲノムワイドジェノタイピングのための方法を提供する。しかしながら、この方法は、単一細胞ゲノムを使用した場合にジェノタイピングエラーを起こす傾向がある。これらのエラーは例えば、ＡＤＯ及び対立遺伝子の選択的増幅（ＰＡ）のような単一細胞全ゲノム増幅のアーチファクトに起因し得る。ＳＮＰアレイを用いる際の単一細胞ジェノタイピングエラーは、非特許文献７によっても検出されている。しかしながら、フェージングへの誤りのある単一細胞遺伝子型の使用は、誤った単一細胞ハプロタイプの推定をもたらす。核型を決定する際のジェノタイピングエラーを回避する方法が、特許文献２によって提供されている。この方法は、２つのＳＮＰ対立遺伝子間の二重交差の統計的確率を算出することを伴う。
【０００８】
本発明と比較した場合の非特許文献８のゲノムワイドハプロタイピング方法の欠点は、ハプロタイプブロック（ここで、ブロックとは、同じ対立遺伝子割当てを有する或る量の近接ＳＮＰとして規定される）の誤った対立遺伝子割当てを説明しないということである。これらの誤った対立遺伝子割当ては、例えば以上に記載したもののような単一細胞全ゲノム増幅のアーチファクトに起因し得る単一細胞ジェノタイピングエラーから生じる可能性が最も高い。この場合、生じる主要なエラーは、ヘテロ接合性ＳＮＰがＡＤＯ又はＰＡによってホモ接合性にタイピングされることである。非特許文献８は、単一細胞遺伝子型内でコーリングされるヘテロ接合性ＳＮＰのみを用いることによって、この問題を部分的に解決しているが、この手法は対立遺伝子ドロップイン（drop in）（非特許文献９）、及び本発明において提示されるような単一細胞遺伝子型におけるアルゴリズム的ジェノタイピングエラーを修正しない。
【０００９】
この問題に対する部分的な解決策は、特許文献３の単一細胞ハプロタイピング方法によって与えられる。この方法では、１つ又は複数の細胞のＤＮＡサンプルを複数の画分に分けた後、各々の画分中のＤＮＡサンプルを個別にジェノタイピングする。これらの遺伝子型に基づいて、１つ又は複数の細胞のハプロタイプが構築される。しかし、ＤＮＡサンプルを複数の画分に分け、各々のサンプルを個別にジェノタイピングすることは、煩雑かつ費用のかかる手順である。
【００１０】
本発明の単一細胞及び二重細胞のハプロタイピング方法は包括的であるため、例えばＰＧＤ手法における家系及び遺伝子座に特異的なマルチプレックスＰＣＲ反応の重労働を伴う設計が回避される。加えて、本発明の技術は疾患対立遺伝子を特定するＰＣＲベースの方法だけでなく、子宮内移植に好適な胚を選択するＰＧＤにおける現行のＦＩＳＨベースの手法よりも優れている可能性がある。ＦＩＳＨは、片方の親が平衡転座を保有する夫婦に由来する不平衡転座を有する胚を選択するために適用される。ＦＩＳＨプローブは異なる転座毎に開発し、検証する必要がある。加えて、ＰＧＤに使用される大抵のＦＩＳＨ手法は、平衡転座を保有する胚と転座を保有しない胚とを区別することができない。このため、ＦＩＳＨに基づく子宮内移植に好適な胚の多くが、依然として転座した染色体を保有する。本発明の方法を用いると、不平衡転座及び平衡転座を保有する胚を特定することができる。さらに、Ｘ染色体連鎖劣性欠損症については、女性胚がＦＩＳＨによって選択されることが多い。しかしながら、移植に不可とされた男性胚の半数が疾患原因対立遺伝子を有さず、選択された女性胚の半数が依然として突然変異を保有する。一般に、本発明の方法を用いて遺伝子異常を保有するハプロタイプを知ることによって、男女の両方で障害のある胚と障害のない胚とを分類することが可能となる。
【００１１】
本発明の単一細胞及び二重細胞のハプロタイピング方法はさらに、胚選択の視野を単一のメンデル形質から、遺伝的多型情報に関連する全ての表現型の側面へと広げる。現在、出生後ゲノムワイドＳＮＰタイピングが、一連の障害についての疾患リスクの決定を可能にするために提案されている。ヒトの胚に対するこのようなゲノムから表現型までのスクリーニングは、実用的価値は限定されているが、（大型）動物の胚における量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）選択にとって大きな可能性を有している。家畜及び他の（大型）動物における重要な「能力」形質の大部分は、複数の量的形質遺伝子座の複雑な遺伝パターンによって支持されているため、最良の動物を選択するにはゲノムワイドマーカーによるスクリーニングが必要とされる（非特許文献３）。現在、マーカー利用選抜では、メンデル形質又は量的形質の遺伝子座との連鎖不均衡において検証されたマーカーを用いて新生動物を選択する。しかしながら、十分に検証された関連性を有するマーカーによって標識されたＱＴＬの数が限られているために、育種価を予測するその能力は限られている。複雑な形質の完全な理解を必要としない方法が、参照集団においてタイピングされたゲノム全体に広がるマーカーを使用することによって、動物における遺伝的メリットを予測するために開発されている（非特許文献１０）。このゲノム選択手順は、ゲノムワイドＳＮＰタイピングによって、特定の動物に関する真の育種価と相関し、したがって繁殖計画の速度に多大な影響を与えることが期待されるゲノム育種価を決定することを可能にする。本発明の単一細胞／二重細胞ジェノタイピング方法及びハプロタイピング方法は、この選択プロセスを胚レベルで開始するため、更には不必要な長期の妊娠期間を省くことによって繁殖計画を加速することを可能にする。
【００１２】
加えて、本発明のこの新規の単一細胞／二重細胞ジェノタイピング／ハプロタイピング方法は、ハプロタイプ多様性の要因、腫瘍形成時に高頻度で起こり得る、主として減数分裂性の相同的組換え、更には有糸分裂性組換えの過程の更なる特性化を可能にする。体細胞における染色体間再配置及び染色体内再配置は、シンテニー対立遺伝子の配列を変化させ、潜在的なプロトオンコジーンの活性化及び腫瘍抑制遺伝子の不活性化を引き起こす。したがって、かかる組換えは腫瘍形成を開始し得るが、腫瘍の進行にも寄与する可能性がある。この染色体の不安定性のために、腫瘍内の細胞は不均一となり、更に腫瘍生検は正常な体細胞で汚染される。本発明の方法は、腫瘍成長及び組換えの過程についてのより多くの洞察を得ることを可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４０２５９１００号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８３１８２３５号
【特許文献３】国際公開第２００９１０５５３１号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Gao et al. 2009
【非特許文献２】Altshuler et al. 2008
【非特許文献３】Goddard and Hayes 2009
【非特許文献４】Abecasis et al. 2002
【非特許文献５】Frazer et al. 2009
【非特許文献６】Renwick et al. 2006
【非特許文献７】Iwamoto et al. (2007)
【非特許文献８】Handyside et al. (2009)
【非特許文献９】Johnson et al. 2010
【非特許文献１０】Meuwissen et al. 2001
【発明の概要】
【００１５】
単一細胞又は二重細胞をハプロタイピングする本発明の方法は、好ましくは、
１．単一細胞を選抜する工程と、
２．単一細胞を溶解する工程と、
３．例えば多置換増幅（ＭＤＡ）法を用いることによって単一細胞のＤＮＡを増幅する工程と、
４．増幅された単一細胞ＤＮＡの超並列（ゲノムワイド）遺伝的多型タイピング（＝ジェノタイピング）を行う工程（この工程では、超並列遺伝的多型タイピングを、例えば標識した増幅単一細胞ＤＮＡをAffymetrixの高分解能ＳＮＰアレイにハイブリダイズし、続いてAffymetrixのＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＳＮＰプローブの強度を解釈するためのＤｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｅｌアルゴリズム（Di et al. 2005）を使用することによって行うことができる）と、
５．その後のハプロタイプ再構築のために、計算された単一細胞遺伝子型からヘテロ接合性遺伝的多型のみを選択する任意の工程と、
６．２つの別個にジェノタイピングした単一細胞間で一致する遺伝的多型からなる仮想遺伝子型を生成する任意の工程と、
７．単一細胞の遺伝子型のハプロタイプを再構築する（＝単一細胞ハプロタイピング；任意の工程５を含むか又は含まず、任意の工程６を含まない）か、又は仮想二重細胞の遺伝子型のハプロタイプを再構築する（任意の工程６＝二重細胞ハプロタイピングによる）工程（この工程では、ハプロタイピングは例えばＭＥＲＬＩＮソフトウェアを用いて行うことができる）と、
８．再構築において得られる生成した単一細胞及び／又は二重細胞の「未処理の」ハプロタイプの解釈を、近接する遺伝的多型の情報に基づいて、１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当てを再配分することによって簡略化する工程と、
を含む（図９のフローチャートも参照されたい）。
【００１６】
好ましい実施の形態では、１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当ての再配分を、或る量の遺伝的多型（＝閾値）よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを再配分することによって行う。
【００１７】
別の好ましい実施の形態では、或る量の遺伝的多型（＝閾値）よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分を、該閾値よりも大きい、該小さなハプロタイプブロックの最初の左及び右のハプロタイプブロックの祖父母起源を利用することによって行う。
【００１８】
本発明の好ましい実施の形態では、再配分を以下のように行う：遺伝的多型の量が或る特定の閾値Ｔ１よりも小さいハプロタイプブロックを、該閾値Ｔ１よりも大きい、該ハプロタイプブロックの左側又は右側の最初のハプロタイプブロックに、これらの２つのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ配分する。具体的な実施の形態では、本発明による方法に用いられる遺伝的多型は、以上及び以下に記載のように、超並列（ゲノムワイド）ＳＮＰタイピングからなる。上記の実施の形態では、閾値Ｔ１は２００ＳＮＰに等しい。
【００１９】
別の好ましい実施の形態では、１サイクルを超える上記に記載の再配分手順が、種々のＴ１閾値で行われる。
【００２０】
さらに、本発明の１つの実施の形態では、閾値Ｔ１よりも小さく、染色体のｐ末端又はｑ末端に位置するハプロタイプブロックの祖父母起源を、閾値Ｔ１を下回るｐ末端又はｑ末端のハプロタイプブロックが一括して閾値Ｔｐ−ｑよりも小さい場合に、閾値Ｔ１よりも大きい最初のハプロタイプブロックに合わせて調整する。この場合も、遺伝的多型がＳＮＰタイピングからなる上記実施の形態では、閾値Ｔｐ−ｑを５００ＳＮＰに設定する。
【００２１】
本発明の好ましい１つの実施の形態では、再構築から得られた未処理のハプロタイプデータに対して、以下の３サイクルの手順が行われる：
第１のサイクルでは、（遺伝的多型の量が）或る特定の閾値Ｔ１よりも小さいハプロタイプブロックを、閾値Ｔ１よりも大きい、ハプロタイプブロックの左側又は右側の最初のハプロタイプブロックに、これらのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合に配分する。これが当てはまらない場合には、再配分は行われない。
第１のサイクルから得られるハプロタイプブロックに対して行われる第２のサイクルでは、（遺伝的多型の量が）或る特定の閾値Ｔ２よりも小さいハプロタイプブロックを、閾値Ｔ２よりも大きい、ハプロタイプブロックの左側又は右側の最初のハプロタイプブロックに、これらのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合に配分する。これが当てはまらない場合には、再配分は行われない。
第２のサイクルから得られるハプロタイプブロックに対して行われる第３のサイクルでは、（遺伝的多型の量が）或る特定の閾値Ｔ３よりも小さいハプロタイプブロックを、閾値Ｔ３よりも大きい、ハプロタイプブロックの左側又は右側の最初のハプロタイプブロックに、これらのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合に配分する。これが当てはまらない場合には、再配分は行われない。
【００２２】
単一細胞ゲノムの増幅方法、使用される遺伝的多型タイピングプラットフォームのタイプ、使用されるジェノタイピングアルゴリズム、使用される有益な遺伝的多型のタイプ（例えば、未処理の単一細胞遺伝子型から得られるヘテロ接合性遺伝的多型のみを使用する）に応じて、Ｔ１、Ｔ２及びＴ３は変化し得る。本発明の好ましい実施の形態では、Ｔ２はＴ１及びＴ３よりも小さく、Ｔ１はＴ３に等しかった。
【００２３】
本発明の更に別の実施の形態では、最初及び最後のサイクルにおいて、染色体のｐ末端又はｑ末端に位置する閾値（それぞれＴ１及びＴ３）よりも小さい得られるハプロタイプブロックの祖父母起源は、閾値（それぞれＴ１及びＴ３）を下回るｐ末端又はｑ末端のハプロタイプブロックが一括して閾値Ｔｐ−ｑよりも小さい場合に、閾値（それぞれＴ１及びＴ３）よりも大きい最初のハプロタイプブロックに合わせて調整される。本発明の１つの実施の形態では、閾値（正：thresholdvalue）Ｔｐ−ｑを５００ＳＮＰに設定する。
【００２４】
本発明の好ましい代替的な実施の形態では、１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当ての再配分（代替的工程８）は、ノイズを低減するデジタル画像信号処理法に基づく。本発明の好ましい実施の形態では、「１Ｄメジアンフィルター」（Pratt 1978）を、この非線形平滑化アルゴリズムに適用する。この技法は、スライディングウィンドウ（遺伝的多型の量で表される）、及び各々のウィンドウ内での対立遺伝子割当て（バイナリフォーマットで表される）の調整に頼る。メジアンフィルターの本旨は、二値信号をエントリー毎に調べ、各々のエントリーを近接するエントリーの中央値で置き換えることである。本発明の１つの実施の形態では、Affymetrixの２５０Ｋ  ＮｓｐＩ  ＳＮＰアレイを単一細胞ジェノタイピングに使用した場合に、ウィンドウは１番染色体について４５０ＳＮＰを含む。他の染色体についてのウィンドウは、式：染色体に特異的なウィンドウ＝（特定の染色体におけるＳＮＰの数）／（１番染色体におけるＳＮＰの数）×（１番染色体についてのウィンドウサイズ）によって規定される。各々の染色体について提示したウィンドウサイズの代替案も可能である。
【００２５】
本発明の任意の工程では、アルゴリズムは、得られる平滑化したハプロタイプブロックを元の非平滑化ハプロタイプブロックと比較し、元の非平滑化ハプロタイプブロック内の遺伝的多型の大部分が、平滑化したハプロタイプブロックと同じ対立遺伝子に配分されていることを確認するものである。これが当てはまらない場合には、非平滑化ハプロタイプを更に解釈するのが好ましい場合がある。
【００２６】
本発明の好ましい実施の形態では（工程９）、種々の手法によって計算及び平滑化した単一細胞及び／又は二重細胞のハプロタイプを解釈のために統合する。例えば、単一細胞遺伝子型から、全遺伝的多型及びヘテロ接合性遺伝的多型の両方を独立したハプロタイプ再構築のために選択し、得られる「未処理の」単一細胞ハプロタイプの各々を、続いて両方の方法（「工程８」及び「代替的工程８」に記載される）によって平滑化する。最後に、得られる全てのハプロタイプを一致する領域及び解釈について統合する。
【００２７】
本発明の好ましい実施の形態では、単一細胞及び／又は二重細胞のハプロタイプを、信頼性の高い単一細胞の遺伝子型及びハプロタイプの解釈のために、既存の方法（Vanneste et al. 2009）によって決定される単一細胞ＤＮＡコピー数プロファイルとも統合する。染色体全体又はそのセグメントの異数性は、誤った２倍体遺伝的多型コール（工程４のジェノタイピングアルゴリズムによって生じる）を生じる場合があり、誤ったハプロタイプ予測をもたらす可能性がある。
【００２８】
本発明の好ましい実施の形態では、単一細胞ハプロタイピングの方法は、
ａ．単一細胞を選抜する工程と、
ｂ．前記単一細胞を溶解する工程と、
ｃ．前記単一細胞のＤＮＡを増幅する工程と、
ｄ．増幅された前記単一細胞ＤＮＡの超並列（ゲノムワイド）遺伝的多型タイピング（＝ジェノタイピング）を行う工程と、
ｅ．全ての遺伝的多型又はその一部（例えば、単一細胞遺伝子型のヘテロ接合性遺伝的多型のみ）を用いて該単一細胞の遺伝子型のハプロタイプを再構築する工程と、
ｆ．近接する遺伝的多型の情報に基づいて、１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当てを再配分する工程と、
を含む。
【００２９】
別の好ましい実施の形態では、１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当ての再配分を、或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを再配分することによって行う。
【００３０】
更に別の好ましい実施の形態では、或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分に、前記量の遺伝的多型よりも大きいハプロタイプブロックの祖父母起源を利用する。
【００３１】
別の好ましい実施の形態では、或る量の遺伝的多型（閾値）よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分を、該閾値よりも大きい、（該小さなハプロタイプブロックに対して）隣接する最初の左及び右のハプロタイプブロックの祖父母起源を利用することによって行う。
【００３２】
好ましい実施の形態では、遺伝的多型の量が或る特定の閾値Ｔ１よりも小さいハプロタイプブロックを、該閾値Ｔ１よりも大きい、該ハプロタイプブロックの左側又は右側の最初のハプロタイプブロックに、これら２つのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ配分する。
【００３３】
代替的な好ましい実施の形態では、１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当ての再配分は、ノイズを低減するデジタル画像信号処理法に基づく。本発明の好ましい実施の形態では、「１Ｄメジアンフィルター」を適用する。
【００３４】
本発明の別の好ましい実施の形態では、種々の手法によって計算及び平滑化した単一細胞ハプロタイプを解釈のために統合する。本発明の好ましい実施の形態では、単一細胞ハプロタイプを、信頼性の高い単一細胞の遺伝子型及びハプロタイプの解釈のために、既存の方法（Vanneste et al. 2009）によって決定される単一細胞ＤＮＡコピー数プロファイルとも統合する。
【００３５】
本発明の別の態様は、二重細胞ハプロタイピングの方法であって、
ａ．２つの細胞を選抜する工程と、
ｂ．前記２つの細胞を溶解する工程と、
ｃ．各細胞について、単一細胞のＤＮＡを増幅する工程と、
ｄ．各細胞について、増幅された該単一細胞ＤＮＡの超並列（ゲノムワイド）遺伝的多型タイピング（＝ジェノタイピング）を行う工程と、
ｅ．２つの別個にジェノタイピングした該単一細胞間で一致する遺伝的多型コールからなる仮想遺伝子型を生成する工程と、
ｆ．前記仮想遺伝子型（又は前記仮想遺伝子型の一部）のハプロタイプを再構築する工程と、
ｇ．近接する遺伝的多型の情報に基づいて、１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当てを再配分する工程と、
を含む、二重細胞ハプロタイピングの方法に関する。
【００３６】
好ましい実施の形態では、１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当ての再配分を、或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを再配分することによって行う。
【００３７】
別の好ましい実施の形態では、或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分に、前記量の遺伝的多型よりも大きいハプロタイプブロックの祖父母起源を利用する。
【００３８】
更に別の好ましい実施の形態では、或る量の遺伝的多型（閾値）よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分を、該閾値よりも大きい、（該小さなハプロタイプブロックに対して）隣接する最初の左及び右のハプロタイプブロックの祖父母起源を利用することによって行う。
【００３９】
好ましい実施の形態では、遺伝的多型の量が或る特定の閾値Ｔ１よりも小さいハプロタイプブロックを、該閾値Ｔ１よりも大きい、該ハプロタイプブロックの左側又は右側の最初のハプロタイプブロックに、これらの２つのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ配分する。
【００４０】
代替的な好ましい実施の形態では、１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当ての再配分は、ノイズを低減するデジタル画像信号処理法に基づく。本発明の好ましい実施の形態では、「１Ｄメジアンフィルター」を適用する。
【００４１】
本発明の別の好ましい実施の形態では、種々の手法によって計算及び平滑化した二重細胞ハプロタイプを解釈のために統合する。本発明の好ましい実施の形態では、二重細胞ハプロタイプを、信頼性の高い遺伝子型及びハプロタイプの解釈のために、既存の方法（Vanneste et al. 2009）によって決定される単一細胞ＤＮＡコピー数プロファイルとも統合する。
【００４２】
本発明の別の態様は、単一細胞又は二重細胞由来のハプロタイプの解釈を改善する方法であって、或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを再配分することによって、該ハプロタイプブロックを処理することを含む、単一細胞又は二重細胞由来のハプロタイプの解釈を改善する方法を含む。
【００４３】
好ましい実施の形態では、或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分に、前記量の遺伝的多型よりも大きいハプロタイプブロックの祖父母起源を利用する。
【００４４】
別の好ましい実施の形態では、或る量の遺伝的多型（閾値）よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分を、該閾値よりも大きい、（該小さなハプロタイプブロックに対して）隣接する最初の左及び右のハプロタイプブロックの祖父母起源を利用することによって行う。
【００４５】
更に別の好ましい実施の形態では、遺伝的多型の量が或る特定の閾値Ｔ１よりも小さいハプロタイプブロックを、該閾値Ｔ１よりも大きい、該ハプロタイプブロックの左側又は右側の最初のハプロタイプブロックに、これらの２つのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ配分する。
【００４６】
代替的な好ましい実施の形態では、未処理の単一細胞又は二重細胞のハプロタイプブロックからの１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は近接領域の対立遺伝子割当ての再配分は、単一細胞又は二重細胞由来のハプロタイプの解釈を改善するためにデジタル画像処理法を用いる。本発明の好ましい実施の形態では、「１Ｄメジアンフィルター」を適用する。本発明の１つの実施の形態では、メジアンフィルター処理法によって用いられるウィンドウは、１番染色体について４５０ＳＮＰを含む。他の染色体についてのウィンドウは、式：染色体に特異的なウィンドウ＝（特定の染色体におけるＳＮＰの数）／（１番染色体におけるＳＮＰの数）×（１番染色体についてのウィンドウサイズ）によって規定される。
【００４７】
本発明の別の好ましい実施の形態では、種々の手法によって計算及び平滑化した単一細胞及び／又は二重細胞のハプロタイプをハプロタイプの解釈のために統合する。本発明の好ましい実施の形態では、単一細胞及び／又は二重細胞のハプロタイプを、信頼性の高い遺伝子型及びハプロタイプの解釈のために、既存の方法（Vanneste et al. 2009）によって決定される単一細胞ＤＮＡコピー数プロファイルとも統合する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】単一細胞及び二重細胞のハプロタイピング、並びにハプロタイプの平滑化を示す図である。図１Ａ〜図１Ｄは、１人の個体（図１Ｆに示す家系図において矢印で示される）に由来する母系遺伝１番染色体のハプロタイプを示す。祖母及び祖父の染色体に遡る対立遺伝子は、それぞれ薄い灰色及び濃い灰色で示される。各々のパネルの最上レーンは、この個体の複数の細胞から単離されたゲノムＤＮＡに由来する参照対立遺伝子配列を表す。図１Ａ：この個体の単一リンパ芽球様細胞に由来するハプロタイプ。下の３つのレーンは、３つの独立したリンパ芽球様細胞に由来する「未処理の」１番染色体ハプロタイプをそれぞれ示す。図１Ｂ：二重リンパ芽球様細胞に由来するハプロタイプ。下の３つのレーンは、３つの異なる仮想遺伝子型に由来するハプロタイプをそれぞれ示す。仮想遺伝子型は、２つの単一リンパ芽球様細胞の一致するＳＮＰコールからなる。図１Ｃ：平滑化した単一細胞ハプロタイプ。下の３つのレーンは、（図１Ａに示す）３つの独立したリンパ芽球様細胞に由来する平滑化した１番染色体ハプロタイプをそれぞれ示す。図１Ｄ：図１Ｂに示すハプロタイプの平滑化結果。図１Ｅ：ゲノム全体にわたる参照対立遺伝子配列とのハプロタイプの不一致における常染色体ＳＮＰのパーセンテージ。黒色：単一細胞ハプロタイピング、濃い灰色：二重細胞ハプロタイピング、薄い灰色：単一細胞ハプロタイプの平滑化、白色：二重細胞ハプロタイプの平滑化。表示の値は１２回全てのリンパ芽球様細胞の分析の平均（％）（±標準偏差（％））である。図１Ｆ：個体の家系図（Pedigreestructure）。母方の祖母及び祖父の染色体に遡る対立遺伝子は、それぞれ薄い灰色及び濃い灰色で示される。図中英語は以下：SINGLE CELL  単一細胞DUAL CELL  二重細胞
【図２−１】単一細胞及び二重細胞由来のハプロタイプブロックのサイズ分布を示す図である。図２Ａ：参照対立遺伝子配列（濃い灰色）と比較した場合に、一致した（黒色）、不一致の（薄い灰色）及び相同的組換え部位にわたる（白色）単一細胞由来のハプロタイプブロックのサイズのヒストグラム。表示のハプロタイプブロックサイズは、１つのリンパ芽球様細胞の分析によるものである。２００ＳＮＰのカットオフが灰色の点線で示される。図２Ｂ：２００ＳＮＰよりも小さく、参照ハプロタイプと比較した場合に、一致した（黒色）、不一致の（薄い灰色）又は相同的組換え部位にわたる（白色）単一細胞及び二重細胞由来のハプロタイプブロックのパーセンテージ（それぞれ左及び右のバー）。表示の値は１２回全ての単一及び二重のリンパ芽球様細胞の分析の平均（％）（±標準偏差（％））である。図２Ｃ：２００ＳＮＰよりも大きく、参照ハプロタイプと比較した場合に、一致した（黒色）、不一致の（薄い灰色）又は相同的組換え部位にわたる（白色）単一細胞及び二重細胞由来のハプロタイプブロックのパーセンテージ（それぞれ左及び右のバー）。表示の値は１２回全ての単一及び二重のリンパ芽球様細胞の分析の平均（±標準偏差（％））である。
【図２−２】つづき
【図３】１７５個の相同的組換え部位での単一細胞及び二重細胞由来のハプロタイプのアラインメントを示す図である。平滑化した及び平滑化していない単一細胞及び二重細胞由来のハプロタイプの両方を、４人の個体において特定された１７５個の相同的組換え部位でアラインメントした。参照対立遺伝子配列による正確なハプロタイプに対して推測される交差隣接ＳＮＰの頻度（％）を示す。（各々のパネルの中央の）ラインは、参照対立遺伝子配列からプールした１７５個の交差部位を示す。ＳＮＰハプロタイプ一致頻度を、相同的組換え部位の上流及び下流の５００ＳＮＰについて計算した。図３Ａ：平滑化した単一細胞及び二重細胞由来のハプロタイプによって得られた結果を示す。図３Ｂ：「未処理の」単一細胞及び二重細胞由来のハプロタイプによって得られた結果を示す。
【図４】単一割球及び二重割球のハプロタイピングによって、胚における疾患を媒介する対立遺伝子が特定されることを示す図である。図４Ａ〜図４Ｄは、父系遺伝２２番染色体のハプロタイプを示す。微小欠失内のＳＮＰは分析から除外した（小さな濃い灰色のバー）。祖母及び祖父の染色体に遡る対立遺伝子は、それぞれ薄い灰色及び濃い灰色で示される。図４Ａ：３つの単一割球由来のハプロタイプ。図４Ｂ：３つの異なる仮想遺伝子型にそれぞれ由来する３つの二重細胞ハプロタイプ。仮想遺伝子型は２つの単一割球において一致するＳＮＰコールからなる。図４Ｃ：図４Ａに示すハプロタイプの平滑化の結果。図４Ｄ：図４Ｂに示すハプロタイプの平滑化の結果。図中英語は以下：Blastomere  割球SNPchromosome 22  ２２番染色体のＳＮＰDualblastomere  二重割球
【図５】単一割球及び二重割球のハプロタイピングによって、相同的組換え部位が突き止められることを示す図である。図５Ａ〜図５Ｄは、父系遺伝７番染色体のハプロタイプを示す。祖母及び祖父の染色体に遡る対立遺伝子は、それぞれ薄い灰色及び濃い灰色で示される。図５Ａ：３つの単一割球由来のハプロタイプ。図５Ｂ：３つの異なる仮想遺伝子型にそれぞれ由来する３つの二重細胞ハプロタイプ。仮想遺伝子型は２つの単一割球において一致するＳＮＰコールからなる。図５Ｃ：図５Ａに示すハプロタイプの平滑化の結果。図５Ｄ：図５Ｂに示すハプロタイプの平滑化の結果。図中英語は以下：Blastomere  割球SNPchromosome 7  ７番染色体のＳＮＰDualblastomere  二重割球
【図６−１】単一細胞及び二重細胞のＳＮＰタイピング精度についてのジェノタイピングアルゴリズムの比較を示す図である。Ａ〜Ｃでは、各々のパネルは、ＥＢＶで形質転換した４つのリンパ芽球様細胞株について、参照遺伝子型及びノーコール率（NoCall rate）とともに、単一細胞のホモ接合性及びヘテロ接合性ＳＮＰの平均一致率（±標準偏差（％））を示す。単一細胞（１つの細胞株当たり３つ）を、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｅｌを閾値０．１２で（Ａ）、ＢＲＬＭＭを閾値０．１で（Ｂ）、又はＢＩＲＤＳＥＥＤを閾値０．１で（Ｃ）用いてジェノタイピングした。Ｄ〜Ｆは、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｅｌを閾値０．１２で（Ｄ）、ＢＲＬＭＭを閾値０．１で（Ｅ）、又はＢＩＲＤＳＥＥＤを閾値０．１で（Ｆ）用いて決定した、２つの単一細胞遺伝子型において一致するＳＮＰコールからなる二重細胞由来の遺伝子型についての同様の分析を示す。１つの細胞株当たり３つの異なる二重細胞由来の遺伝子型を評価した。図中英語は以下：single cell  単一細胞
【図６−２】つづき
【図６−３】つづき
【図７−１】４人の個体におけるＳＮＰハプロタイプ不一致率を示す図である。個体毎に、全ての母系遺伝染色体についてのＳＮＰハプロタイプ不一致率（±標準偏差（％））を、単一細胞（ｎ＝３）由来のハプロタイプ、二重細胞（ｎ＝３）由来のハプロタイプ、平滑化した単一細胞（ｎ＝３）由来のハプロタイプ、又は平滑化した二重細胞（ｎ＝３）由来のハプロタイプを用いて示す。Ａ〜Ｄは、それぞれ個体１〜個体４についての結果である。
【図７−２】つづき
【図７−３】つづき
【図７−４】つづき
【図８】割球におけるＳＮＰハプロタイプ不一致率を示す図である。全ての父系遺伝常染色体についてのＳＮＰハプロタイプ不一致率（±標準偏差（％））を、単一割球（ｎ＝３）由来のハプロタイプ（黒色）、二重割球（ｎ＝３）由来のハプロタイプ（白色）、平滑化した単一割球（ｎ＝３）由来のハプロタイプ（薄い灰色）、又は平滑化した二重割球（ｎ＝３）由来のハプロタイプ（濃い灰色）を用いて示す。参照ハプロタイプは、３つの単一割球由来の遺伝子型において一致するＳＮＰコールから計算した。
【図９】本発明のフローチャートを示す図である。単一細胞又は二重細胞をハプロタイピングする本発明の方法は好ましくは、（１）単一細胞を選抜する工程と、（２）単一細胞を溶解する工程と、（３）例えば多置換増幅（ＭＤＡ）法を用いることによって単一細胞ＤＮＡを増幅する工程と、（４）増幅された単一細胞ＤＮＡの超並列ＳＮＰタイピング（＝ジェノタイピング）を行う工程と、（５）その後のハプロタイプ再構築のために、計算された単一細胞遺伝子型からヘテロ接合性ＳＮＰコールのみを選択する任意の工程と、（６）２つの別個にジェノタイピングした単一細胞間で一致するＳＮＰコールからなる仮想遺伝子型を生成する任意の工程と、（７）単一細胞の遺伝子型のハプロタイプを再構築する（＝単一細胞ハプロタイピング；任意の工程５を含むか又は含まず、任意の工程６を含まない）か、又は仮想遺伝子型のハプロタイプを再構築する（任意の工程６＝二重細胞ハプロタイピングによる）工程（この工程では、ハプロタイピングは例えばＭＥＲＬＩＮソフトウェアを用いて行うことができる）と、（８）再構築において得られる生成した単一細胞及び／又は二重細胞の「未処理の」ハプロタイプの解釈を、或る量のＳＮＰ（閾値）よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを再配分すること、又は画像処理法（例えば、１Ｄメジアンフィルター）を用いてハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを再配分することによって簡略化する工程とを含む。単一細胞及び／又は二重細胞のハプロタイプの解釈は、種々の方法及び種々の平滑化方法によって計算された単一細胞及び／若しくは二重細胞のハプロタイプを統合すること、並びに／又は単一細胞コピー数プロファイルとの統合によって更に簡略化することができる。「通常の」ハプロタイピングとは、複数の細胞から抽出されたＤＮＡから出発するハプロタイピング方法を示す。図９の説明：ａゲノムワイドＳＮＰタイピング方法；ｂゲノムワイドハプロタイプ再構築方法（単一細胞若しくは二重細胞の遺伝子型の全てのＳＮＰ、又はその一部を用いる）；ｃ本発明の平滑化アルゴリズム（複数も可）：偽陽性の親の相同的（正：homologous）組換え部位及び誤りのある対立遺伝子割当ての除外；ｄ平滑化したハプロタイプによって可能となる解釈の簡略化。解釈の簡略化は、複数の単一細胞若しくは二重細胞のハプロタイプの計算のハプロタイプデータの統合、及び／又は単一細胞コピー数プロファイルとの統合を更に含み得る。図中英語は以下：genotype  遺伝子型haplotype  ハプロタイプapplysmoothing  平滑化を適用する
【図１０】平滑化アルゴリズムのフローチャートを示す図である。小さなハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを、隣接する大きなハプロタイプブロックの祖父母配分に合わせて再調整する、単一細胞ハプロタイプのための３工程平滑化アルゴリズムを設計した。第１のサイクルでは、このアルゴリズムによって、閾値１よりも大きい２つの隣接ハプロタイプブロック間の潜在的な偽陽性の組換え部位が、それらのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ取り除かれる。さらに、閾値１よりも小さく、染色体のｐ末端又はｑ末端に位置するハプロタイプブロックの祖父母起源が、閾値１を下回るｐ末端又はｑ末端のハプロタイプブロックが一括して５００ＳＮＰよりも小さい場合に、閾値１よりも大きい最初のハプロタイプブロックに合わせて調整される。２００ＳＮＰよりも大きく、異なる祖父母に割り当てられるハプロタイプブロック間の対立遺伝子割当てを精緻化するために、閾値２及び閾値３を、アルゴリズムの第２及び第３のサイクルそれぞれにおいて平滑化されるハプロタイプに対して適用する。図中英語は以下：STEP  工程RAW  未処理SMOOTHED  平滑化Haplotypeblock  ハプロタイプブロックthreshold  閾値Smoothingstep  平滑化工程STEP 2&3  工程２及び３
【図１１】実施例１のフローチャートを示す図である。通常の単一細胞及び二重細胞のハプロタイピング方法を、表示の家族の兄弟姉妹に対して適用した。図１１の説明：ａゲノムワイドＳＮＰタイピング方法；ｂゲノムワイドハプロタイプ再構築方法；ｃ偽陽性の親の相同的組換え部位及び誤りのある対立遺伝子割当ての除外。図中英語は以下：genotype  遺伝子型haplotype  ハプロタイプapplysmoothing  平滑化を適用する
【図１２】非線形平滑化アルゴリズムに対するウィンドウの最適化を示す図である。Ｙ軸は参照ハプロタイプとの単一細胞ハプロタイプの一致を表す。Ｘ軸は、適用した非線形平滑化ウィンドウサイズを表す。３つの単一細胞についての結果を（異なるグレースケールで）示す。図中英語は以下：Single Cell  単一細胞
【図１３】ヒト割球の非線形平滑化ＳＮＰハプロタイプを示す図である。３つのハプロタイピングＭｅｒｌｉｎインプットフォーマット（１．未処理の単一細胞遺伝子型インプット、２．未処理の単一細胞遺伝子型に由来するヘテロ接合性ＳＮＰのみからなるインプット、及び３．仮想二重細胞遺伝子型インプット）から（１Ｄメジアンフィルター手法を用いて）得られたゲノムワイド非線形平滑化ハプロタイプ。Ｘ軸は２２番常染色体を表し、Ｙ軸は各々の染色体についての相対ＳＮＰ位置を表す。異なる単一細胞について推定されるハプロタイプ間、及び異なるＭｅｒｌｉｎインプット遺伝子型セッティング（未処理の単一細胞遺伝子型インプット（上パネル）、単一細胞遺伝子型のヘテロ接合性ＳＮＰインプット（中央パネル）、又は仮想二重細胞遺伝子型インプット（下パネル））から得られるハプロタイプ間で高い一致を見ることができる。図中英語は以下：Blastomeres  割球SNP Position  ＳＮＰ位置Chromosomes  染色体
【発明を実施するための形態】
【００４９】
定義
遺伝子型＝遺伝子座、染色体又はゲノムの任意の対立遺伝子構成
ハプロタイプ＝遺伝子座、染色体又はゲノムのシンテニー対立遺伝子の任意の配列
単一細胞ハプロタイピング＝単一細胞由来の遺伝子型からのシンテニー対立遺伝子の配列の任意の決定
二重細胞ジェノタイピング＝２つの別個にジェノタイピングされる単一細胞における一致する遺伝的多型コールの決定
二重細胞ハプロタイピング＝２つの別個にジェノタイピングされる単一細胞における一致する遺伝的多型コールからのシンテニー対立遺伝子の配列の任意の決定
【００５０】
本発明の方法は、好ましくは、
１．単一細胞を選抜する工程と、
２．単一細胞を溶解する工程と、
３．例えば多置換増幅（ＭＤＡ）法を用いることによって単一細胞のＤＮＡを増幅する工程と、
４．増幅された単一細胞ＤＮＡの超並列遺伝的多型タイピング（＝ジェノタイピング）を行う工程（この工程では、超並列遺伝的多型タイピングを、例えば増幅単一細胞ＤＮＡをAffymetrixの高分解能ＳＮＰアレイにハイブリダイズし、続いてAffymetrixのＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＳＮＰプローブの強度を解釈するためのＤｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｅｌアルゴリズム（Di et al. 2005）を使用することによって行うことができる）と、
５．その後のハプロタイプ再構築のために、計算された単一細胞遺伝子型からヘテロ接合性遺伝的多型のみを選択する任意の工程と、
６．２つの別個にジェノタイピングした単一細胞間で一致する遺伝的多型コールからなる仮想遺伝子型を生成する任意の工程と、
７．単一細胞の遺伝子型のハプロタイプを再構築する（＝単一細胞ハプロタイピング；任意の工程５を含むか又は含まず、任意の工程６を含まない）か、又は仮想二重細胞の遺伝子型のハプロタイプを再構築する（任意の工程６＝二重細胞ハプロタイピングによる）工程（この工程では、ハプロタイピングは例えばＭＥＲＬＩＮソフトウェアを用いて行うことができる）と、
８．設計した平滑化アルゴリズムを用いて生成した単一細胞及び／又は二重細胞の「未処理の」ハプロタイプの解釈を簡略化する工程と、
を含む（第３項における「本発明のフローチャート」も参照されたい）。
【００５１】
種々の工程を下記でより詳細に説明する。
【００５２】
Ａ．単一細胞の溶解、ＤＮＡ増幅及び精製
工程１：単一細胞を、１．５μｌのアルカリ溶解バッファー（ＡＬＢ；２００ｍＭ  ＫＯＨ及び５０ｍＭ  ＤＴＴ）を含有する２００μｌ容ＰＣＲチューブに、７５μｍのストリッパーチップ（MidAtlantic Diagnostics，Mount Laurel，USA）を用いたマウス制御によるピペット操作によって移す。最後の洗浄滴から一定分量を陰性対照として採取する。工程２：サンプルを多置換増幅（ＭＤＡ）反応の前に少なくとも３０分間−２０℃で貯蔵し、更に６５℃で１０分間インキュベートする。工程３：単一細胞（ＳＣ）ＤＮＡを、ＭＤＡ法（Spits et al. 2006）に従い、Ｇｅｎｏｍｉ  Ｐｈｉ  Ｖ２（GEHealthcare，Piscataway，NJ）を用いて増幅する。ＭＤＡ産物を精製し、１００μｌの溶出バッファー（Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Roche，Basel，Switzerland）に再懸濁する。全ての増幅産物を、分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計；Nanodrop Technologies，Rockland，DE）を用いて定量する。２μｇ未満のＤＮＡしか生じないＳＣ増幅は、更に使用しないことが好ましい。
【００５３】
代替案としては、任意の単一細胞の溶解、ＤＮＡ増幅（ＤＯＰ−ＰＣＲ、ＰＥＰ−ＰＣＲ、ライゲーション媒介ＰＣＲ、ａｌｕ−ＰＣＲ、ＰｉｃｏＰｌｅｘ全ゲノム増幅等）及びＤＮＡ精製の方法が挙げられる。
【００５４】
Ｂ．単一細胞のゲノムワイド遺伝的多型タイピング及び二重細胞のジェノタイピング
工程４：単一ヒト細胞のゲノムワイド遺伝的多型タイピング及びその後のハプロタイピングを可能にするために、AffymetrixのＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ２５０Ｋ  ＮｓｐＩアレイを、２５０ｎｇの単一細胞の増幅ＤＮＡを用い、メーカーの使用説明書に従って実行する。得られるＳＮＰプローブの強度を、続いてＳＮＰ信頼性閾値を０．１２に設定したＤｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｅｌアルゴリズムを用いて解釈する（Di et al. 2005）。任意の工程５：単一細胞遺伝子型からのヘテロ接合性ＳＮＰのみを更に適用する。任意の工程６：２つの別個の単一細胞分析からの一致するＳＮＰコールからなる仮想遺伝子型（＝二重細胞由来の遺伝子型）を、例えばＴｉｎｎ−Ｒ  ２．２．０．２及びＲ  ２．８．０を用いて作成する。
【００５５】
代替案としては、メーカーの使用説明書に変更を加えた又は変更を加えていない任意のゲノムワイドＳＮＰタイピングプラットフォーム（Affymetrix製（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ２５０Ｋ  ＳｔｙＩアレイ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ５００Ｋアレイ、Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｈｕｍａｎ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ  ５．０、Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｈｕｍａｎ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ  ６．０、特注のアレイ等）及びIllumina製（例えば、ＨｕｍａｎＯｍｎｉ１−Ｑｕａｄ、Ｈｕｍａｎ１Ｍ−Ｄｕｏ、Ｈｕｍａｎ６６０Ｗ−Ｑｕａｄ、ＨｕｍａｎＣｙｔｏＳＮＰ−１２、特注のアレイ等）のより低分解能及び高分解能のプラットフォームを含む）、及びその後のジェノタイピングソフトウェア（ＲＬＭＭ、ＢＲＬＭＭ、Ｂｉｒｄｓｅｅｄ、ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅ（Illumina）等）が挙げられる。代替案としては、任意の超並列シークエンシング手法、及び単一細胞又は二重細胞のハプロタイピングのための任意のタイプの多型遺伝的変異の使用も挙げられる。
【００５６】
Ｃ．単一細胞及び二重細胞のハプロタイピング
工程７：単一細胞又は二重細胞由来の遺伝子型のゲノムワイドハプロタイプ再構築を、ＭＥＲＬＩＮアルゴリズムによって、最も可能性の高い遺伝子流動パターンというオプション（最良のコマンドラインオプション）を用いて行う（非特許文献４）。「.ped」、「.map」及び「.dat」のファイルを、Ｔｉｎｎ−Ｒ  ２．２．０．２及びＲ  ２．８．０又はＭａｔｌａｂを用いて生成する。ＭＥＲＬＩＮの要件として、それぞれの遺伝的多型が独自の遺伝的距離を有していなくてはならない。ｄｅＣＯＤＥマップ（Kong et al. 2002）から外挿される性平均のＳＮＰ遺伝的距離が使用され、これはＮｅｔＡｆｆｘ注釈ファイルのバージョンＮＡ２７（２００８／１１／２５）に挙げられている。
【００５７】
代替案としては、任意のハプロタイピングソフトウェア（Stephens and Donnelly 2003、非特許文献１、非特許文献８）、並びに任意の性特異的／性平均の遺伝子地図（ｄｅＣＯＤＥマップ（Kong et al. 2002）、Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄマップ（Broman etal. 1998）、Affymetrix及びジョンズ・ホプキンス大学のAravinda Chakravarti博士のグループの未発表のデータによるＳＬＭ１マップ（２０２２個のマイクロサテライトマーカー及び６２０５ＳＮＰについての遺伝子型に基づくものであった）等）の利用、又は所与の民族的背景における既知のハプロタイプ及びハプロタイプ頻度の利用（Frazer et al. 2007）が挙げられる。
【００５８】
Ｄ．単一細胞及び二重細胞の未処理ハプロタイプの平滑化
２倍体の単一細胞のゲノムワイドハプロタイピングは主に、ランダムな対立遺伝子ドロップアウト（ＡＤＯ）及び選択的増幅（ＰＡ）のような単一細胞ＤＮＡ増幅のアーチファクト（工程３）、並びに遺伝的多型検出の誤ったアルゴリズム的解釈（ＡＤＯ及びＰＡ現象に加えて、対立遺伝子ドロップイン（ＡＤＩ）も観察される）（工程４）によって導入される遺伝子型エラーのために妨げられている。ハプロタイピング（工程７）にとって最も問題となる遺伝的多型タイピングエラーは、メンデル不一致をもたらさないため、誤った対立遺伝子割当て及び誤った相同的組換え部位を導入するエラーである。したがって、対立遺伝子ドロップアウト及び選択的増幅に関する問題を、単一細胞由来のヘテロ接合性遺伝的多型のみを使用することによって回避することができる場合であっても、未処理の単一細胞ハプロタイプの解釈（工程８）を確実に解釈するためにアルゴリズム（複数の場合もあり）が必要とされる。
【００５９】
工程８：平滑化アルゴリズムは、ハプロタイプブロックの間違った対立遺伝子割当てを調整することによって、生成された単一細胞及び／又は二重細胞の「未処理の」ハプロタイプの解釈を容易にする。ゲノムワイドスキャン及び下流分析において遺伝的多型を除外又は追加することの容易さ、ゲノムワイド遺伝的多型タイピングにおける実験室、ユーザー及びアルゴリズムによるバイアスの存在を考えると、下記に規定される閾値は絶対的なものではなく、使用される遺伝的多型タイピングのプラットフォーム／アルゴリズム、使用される遺伝的多型の注釈ファイル、実験室、ユーザー等に対して柔軟であり、修正可能であるものと考えるべきである。
【００６０】
未処理の単一細胞又は二重細胞由来のハプロタイプの解釈を容易にし、遺伝的交差を未処理のハプロタイプからより正確に突き止めるために、３工程平滑化アルゴリズム（図１０を参照されたい）を単一細胞及び二重細胞のハプロタイプに適用する。本発明の平滑化アルゴリズムによって、閾値１（本発明の好ましい実施形態では、ハプロタイプブロックサイズについての閾値１は２００ＳＮＰに設定される）よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを、閾値１よりも大きい隣接ハプロタイプブロックの祖父母配分に合わせて調整する。このアルゴリズム設計は、閾値１よりも大きい未処理のハプロタイプブロックの大半が正確な対立遺伝子に配分されるという発見に基づく。アルゴリズムの第１の工程では、ハプロタイプブロックサイズについてのユーザーが調節可能な閾値１を設定する（図１０の工程１を参照されたい）。このように、このアルゴリズムは、閾値１よりも大きい２つの隣接ハプロタイプブロック間の潜在的な偽陽性の組換え部位を、それらのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ取り除く。さらに、閾値１よりも小さく、染色体のｐ末端又はｑ末端に位置するハプロタイプブロックの祖父母起源を、閾値１を下回るｐ末端又はｑ末端のハプロタイプブロックが一括して５００ＳＮＰよりも小さい場合に、閾値１よりも大きい最初のハプロタイプブロックに合わせて調整する（閾値１は同様にユーザーによって調節可能であり、任意に規定することができる）。閾値１よりも大きく、異なる祖父母に割り当てられるハプロタイプブロック間の対立遺伝子割当てを精緻化するために（図１０の工程２及び工程３を参照されたい）、閾値２及び閾値３（本発明の好ましい実施形態では、ハプロタイプブロックサイズについての閾値２及び閾値３は、それぞれ５０ＳＮＰ及び２００ＳＮＰに設定される）を、アルゴリズムの第２及び第３の工程それぞれにおいて、（工程１後の）平滑化したハプロタイプに対して適用する。
【００６１】
単一細胞ハプロタイプの平滑化のためのアルゴリズムを、Ｔｉｎｎ−Ｒ  ２．２．０．２及びＲ  ２．８．０において設計した。
【００６２】
工程８の代替的な手法では、非線形平滑化アルゴリズムは、１つ又は複数の遺伝的多型及び／又は中間領域の対立遺伝子割当てを調整することによって、生成された単一細胞及び／又は二重細胞の「未処理の」ハプロタイプの解釈、及び未処理のハプロタイプからの遺伝的交差の特定を容易にする。本発明の好ましい実施形態では、「１Ｄメジアンフィルター」（Pratt 1978）を、この非線形平滑化アルゴリズムに適用する。メジアンフィルターはノイズを低減する画像処理法であるが、ノイズを除去しながらエッジを保持することができる。この非線形平滑化アルゴリズムでは、「１Ｄメジアンフィルター」は、スライディングウィンドウ（遺伝的多型の数で表される）、及び各々のウィンドウ内での対立遺伝子割当て（バイナリフォーマットで表される）の調整を用いる。調整はウィンドウの中央値に応じて行われる。ウィンドウのサイズはユーザーによって規定される。本（current）アルゴリズムの好ましい実施形態では、１番染色体について４５０ＳＮＰのウィンドウを使用した（図１２を参照されたい）。次いで、非線形平滑化アルゴリズムは、各々の染色体における遺伝的多型の数に基づくウィンドウを適用する（非線形平滑化アルゴリズムの好ましい実施形態では、染色体に特異的なウィンドウ＝（特定の染色体中の遺伝的多型の数）／（１番染色体における遺伝的多型の数）×（１番染色体についてのウィンドウサイズ））。最後に、非線形平滑化アルゴリズムは、平滑化したハプロタイプブロックと未処理のハプロタイプブロックとを比較し、未処理のハプロタイプブロックにおける遺伝的多型の大部分が、平滑化したハプロタイプブロックと同じ対立遺伝子に配分されていることを確認する。これが当てはまらない場合には、未処理のハプロタイプを維持した。このアルゴリズムをＭａｔｌａｂにおいて設計した。
【００６３】
さらに、付加的な規則を追加することができる。好ましい実施形態では、種々の手法によって計算し、平滑化した単一細胞ハプロタイプを、ハプロタイプ一致について統合し、解釈を更に簡略化する。本発明の好ましい実施形態では、単一細胞ハプロタイプを、信頼性の高い単一細胞の遺伝子型及びハプロタイプの解釈のために、既存の方法（Vanneste et al. 2009）によって決定される単一細胞ＤＮＡコピー数プロファイルとも統合する。さらに、ハプロタイプブロックサイズを利用する平滑化及び解釈の工程における付加的な規則（例えば、ハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを、減数分裂交差干渉原理、異なる祖父母起源に配分される遺伝的多型の数の比率の算出、及びこの比率のみの対立遺伝子割当ての調整に基づいて調整又は保持するために、遺伝的多型ハプロタイプブロックサイズの閾値を規定することは、ユーザーによって規定される基準を満たす）を、同様に上記に記載の方法に追加することができる。また、異なる民族的背景における既知のハプロタイプ及びハプロタイプ頻度を利用する付加的な工程を追加することができる（Frazer et al. 2007）。最後に、上記に記載の平滑化アルゴリズムに、相同的組換えの既知の（ホット）スポットの情報を付け加えることができる（Frazer et al. 2007）。
【００６４】
本発明の平滑化アルゴリズムは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）アレイ又は超並列ＤＮＡシークエンサーの結果に基づくハプロタイプの解釈を容易にするのに特に有用である。当業者であれば、任意のジェノタイピング方法を全ゲノム増幅（単一細胞）ＤＮＡに対して行い、続いて任意のハプロタイピング方法を行う場合の（単一細胞）ゲノム又は遺伝子座の信頼性の高いハプロタイプ推定にとっての上述の方法の実用的価値を理解するであろう。
【００６５】
平滑化による単一細胞及び／又は二重細胞のハプロタイピングのための本願に記載される方法は、胚選択の目的、異なる対立遺伝子構成を有する細胞からなる不均一組織の遺伝学研究、又は法医学的研究のためにヒト及び動物の細胞に使用／適用することができる。
【実施例】
【００６６】
実施例１：ＥＢＶで形質転換したヒトのリンパ芽球様細胞のハプロタイピング
単一細胞のジェノタイピング
４つの異なる個体にそれぞれ由来する、ＥＢＶで形質転換した４つのリンパ芽球様細胞株を用いて方法を確立した。これらの個体の複数の血球から単離したゲノムＤＮＡ、及び１つの細胞株当たり３つの単一細胞に由来するＭＤＡ−ＤＮＡを、Affymetrixの２５０Ｋ  ＳＮＰアレイにハイブリダイズした。得られたＳＮＰプローブの強度を、ＭＤＡ、対立遺伝子ドロップアウト（ＡＤＯ）、又は選択的増幅（ＰＡ）を受けていない２倍体ゲノムにおけるＳＮＰのタイピングについて最適化した３つの異なるアルゴリズム（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｅｌ（Di et al. 2005）、ＢＲＬＭＭ及びＢｉｒｄｓｅｅｄ）によって解釈した。
【００６７】
ＭＤＡ単一細胞ＤＮＡのＳＮＰタイピング精度は、単一細胞遺伝子型と、対応する非増幅ゲノムＤＮＡから得られる参照遺伝子型とをアラインメントすることによって決定した。種々のアルゴリズムが、単一細胞ホモ接合性ＳＮＰと参照ＳＮＰとの一致に対して軽微な影響を有していたが、ヘテロ接合性ＳＮＰの一致に対して重大な影響が見られた（表１及び図６）。Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｅｌアルゴリズムは、単一ヒト細胞におけるヘテロ接合性ＳＮＰのタイピングについて、ＢＲＬＭＭアルゴリズム及びＢｉｒｄｓｅｅｄアルゴリズムの両方より優れている。Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｅｌアルゴリズムにおいて０．１２というＳＮＰタイピング信頼性閾値を用いることによって、単一細胞において平均して８９．０４％（±５．０％ＳＤ）のホモ接合性ＳＮＰ及び９１．２４％（±６．０％ＳＤ）のヘテロ接合性ＳＮＰが、複数の細胞から単離されたゲノムＤＮＡを用いて決定した対応する遺伝子型と適合した。
【００６８】
さらに、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｅｌアルゴリズム（Di et al. 2005）、ＢＲＬＭＭアルゴリズム又はＢｉｒｄｓｅｅｄアルゴリズムを用いてジェノタイピングすると、非増幅ゲノムＤＮＡサンプルにおいてヘテロ接合性のＳＮＰのうち、平均してそれぞれ２９．３８％（±１１．３０％ＳＤ）、１２．４１％（±４．８１％ＳＤ）及び３２．９１％（±６．３３％ＳＤ）が対応する単一細胞においてホモ接合性である。これらの不一致の一部は、対立遺伝子ドロップアウト、又は単一細胞のゲノムの特定の対立遺伝子の選択的増幅のような全ゲノム増幅のアーチファクトに起因し得る（Spits et al. 2006、非特許文献８）。しかしながら、種々の統計的アルゴリズムが種々のコーリングエラーを導入することが明らかである。
【００６９】
Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｅｌによって計算した単一細胞ＤＮＡフィンガープリントを、ハプロタイプ再構築について更に調査した。
【００７０】
表１：単一細胞ＳＮＰタイピング精度についてのジェノタイピングアルゴリズムの比較
一致
【表１】
2013528391.tif 000002
ａ参照遺伝子型との単一細胞ホモ接合性ＳＮＰの一致
ｂ参照遺伝子型との単一細胞ヘテロ接合性ＳＮＰの一致
ｃデータは平均％（±標準偏差（％））で表す 
【００７１】
参照遺伝子型は、Ｄｙｎａｍｉｃ  ＭｏｄｅｌによってタイピングしたゲノムＤＮＡサンプルである（閾値０．１２）。
【００７２】
単一細胞及び二重細胞のハプロタイピング
単一細胞由来の遺伝子型からハプロタイプを再構築する可能性を調べるために、初めに３つの異なる家族に属する４人の個体について、母系遺伝常染色体及び性染色体の参照対立遺伝子の配列を決定した（図１１）。この目的で、４人の個体、並びに彼らの親及び母方の祖父母のゲノムＤＮＡを２５０ＫのＳＮＰについてタイピングし、ＭＥＲＬＩＮアルゴリズム（非特許文献４）を用いてハプロタイプを計算した。異なる個体それぞれの２つの組換え部位を、ＳＴＲマーカー分析によって検証した（データは示さない）。続いて、ＭＥＲＬＩＮ家系図ファイルにおいて４人の個体の遺伝子型を単一細胞由来の遺伝子型と交換することによって単一細胞由来のハプロタイプを決定した。１個体当たり３つの単一リンパ芽球様細胞をフェージングした。
【００７３】
得られた単一細胞由来のハプロタイプは、参照ハプロタイプ（図１Ａ）と比較した場合に、より小数の連続的なＳＮＰからなる、はるかに多くのハプロタイプブロックを含有していた。これらの偽陽性の組換え部位の結果として、ハプロタイプ不一致における常染色体ＳＮＰの相対量は、計算された単一細胞ハプロタイプ（図１Ｅ、図７）ではおよそ１７．７２％（±５．０％ＳＤ）であるため、単一細胞由来のハプロタイプに基づいて祖父母相同染色体間で母系の遺伝的交差の正確な位置を識別することは困難である。
【００７４】
単一細胞由来のハプロタイプと参照対立遺伝子配列との間の相違は、単一細胞ＭＤＡ−ＤＮＡのジェノタイピングエラーによるものである。より信頼性の高い遺伝子型を導き出すために、同じ個体の２つの単一細胞遺伝子型で一致するＳＮＰコールからなる仮想遺伝子型を作成するアルゴリズムを設計した。この二重細胞分析において、平均して９６．３２％（±２．８８％ＳＤ）のホモ接合性ＳＮＰ及び９８．４６％（±１．１１％ＳＤ）のヘテロ接合性ＳＮＰが参照遺伝子型と適合した（図６）。これらの仮想遺伝子型を用いてハプロタイプを再構築することによって、ハプロタイプブロックの数、偽陽性の組換え部位、及び常染色体ＳＮＰのハプロタイプ不一致が大幅に減少し（８．７７％±４．２４％ＳＤ）（図１Ｂ、図１Ｅ、図７）、シンテニーな真の対立遺伝子配列を視覚的に区別することが可能になった。
【００７５】
ハプロタイプの平滑化
シンテニー対立遺伝子の単一細胞及び二重細胞由来の配列の分析を更に簡略化する手段を開発した。単一細胞の遺伝子型のフェージングは、参照ハプロタイプと適合しない多数の小さなハプロタイプブロックをしばしば生成する。これらの矛盾する対立遺伝子割当ての少なくとも一部を修正するアルゴリズムを生成する可能性を評価するために、参照ハプロタイプと比較してそれぞれ一致した、不一致の、及び相同的組換え部位にわたるハプロタイプブロックのサイズについてのヒストグラムを作成した（図２Ａ）。これにより、参照との適合を有しないハプロタイプブロックの大部分が、連続的な２００ＳＮＰよりも小さいことが明らかになった（図２Ａ〜図２Ｃ）。この観察結果に基づいて、小さなハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを隣接する大きなハプロタイプブロックの祖父母配分に合わせて再調整する、単一細胞ハプロタイプのための３工程平滑化アルゴリズムを設計した。アルゴリズムの第１のサイクルでは、ハプロタイプブロックサイズについてのユーザーが調節可能な閾値を２００ＳＮＰに設定した。このように、このアルゴリズムは、２００ＳＮＰよりも大きい２つの隣接ハプロタイプブロック間の潜在的な偽陽性の組換え部位を、それらのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ取り除く。さらに、閾値よりも小さく、染色体のｐ末端又はｑ末端に位置するハプロタイプブロックの祖父母起源を、閾値を下回るｐ末端又はｑ末端のハプロタイプブロックが一括して５００ＳＮＰよりも小さい場合に、少なくとも２００ＳＮＰにわたる最初のハプロタイプブロックに合わせて調整する。２００ＳＮＰよりも大きく、異なる祖父母に割り当てられるハプロタイプブロック間の対立遺伝子割当てを精緻化するために、５０ＳＮＰ及び２００ＳＮＰという閾値を、アルゴリズムの第２及び第３の工程それぞれにおいて平滑化したハプロタイプに対して適用した。
【００７６】
単一細胞遺伝子型及び二重細胞遺伝子型に由来するハプロタイプを、このアルゴリズムを用いて平滑化した。単一細胞遺伝子型に由来するシンテニー祖父母系対立遺伝子配列の平滑化は、２つの単一細胞遺伝子型間で一致するＳＮＰコールに由来するハプロタイプと比較して、ハプロタイプ不一致におけるより少ないＳＮＰをもたらした（４．４５％±３．８５％ＳＤ）（図１Ｃ、図１Ｅ、図７）。二重細胞由来のハプロタイプの平滑化は、最良の結果をもたらした（ハプロタイプ不一致におけるＳＮＰ：１．８６％±２．１３％ＳＤ）（図１Ｄ〜図１Ｅ、図７）。
【００７７】
平滑化した単一細胞及び二重細胞のハプロタイピングデータを用いて遺伝的交差マッピングの精度を決定するために、４人の個体において検出された１７５個の相同的組換え部位をアラインメントした。参照対立遺伝子配列との、これらのアラインメントした遺伝的交差の周囲の１０００ＳＮＰについてのハプロタイプ一致頻度の計算（図３Ａ）から、平滑化した二重細胞由来のハプロタイプによって、平滑化した単一細胞由来のハプロタイプよりも正確に交差が突き止められることが示された。実際に、平滑化した単一細胞及び二重細胞由来のハプロタイプについて、９０％を超える正確なＳＮＰハプロタイプ推測の頻度に達するには、それぞれ遺伝的交差に隣接するおよそ２５０ＳＮＰ及び５０ＳＮＰの距離を考慮する必要がある。正確な祖父母起源に配分される交差隣接ＳＮＰの頻度は、「未処理の」単一細胞又は二重細胞由来のハプロタイプよりも、平滑化したハプロタイプで高い（図３Ａ及び図３Ｂ）。
【００７８】
結論としては、このアルゴリズムは、単一細胞又は二重細胞の分析に基づいて、遺伝染色分体上で祖父母系染色体間の相同的組換え部位を突き止めることを更に容易にする。
【００７９】
第２の「非線形」平滑化アルゴリズムを同様に開発した。このアルゴリズムは、「１Ｄメジアンフィルター」に基づく。一般に、メジアンフィルターはノイズを低減する画像処理法であるが、ノイズを除去しながらエッジを保持することができる。この非線形平滑化アルゴリズムでは、「１Ｄメジアンフィルター」は、スライディングウィンドウ（ＳＮＰの数で表される）、及び各々のウィンドウ内での対立遺伝子割当て（バイナリフォーマットで表される）の調整を用いる。調整は、ユーザーによってサイズが規定されるウィンドウの中央値に応じて行われる。本アルゴリズムの好ましい実施形態では、１番染色体について４５０ＳＮＰのウィンドウを使用した（図１２を参照されたい）。各々の染色体におけるＳＮＰマーカーの密度と、各々の染色体の未処理のハプロタイプ解釈に最適なウィンドウサイズとの間に相関が存在することが更に観察された。したがって、非線形平滑化アルゴリズムは、各々の染色体におけるＳＮＰの数に基づくウィンドウを計算し、適用する（染色体に特異的なウィンドウ＝（特定の染色体中のＳＮＰの数）／（１番染色体におけるＳＮＰの数）×（１番染色体についてのウィンドウサイズ））。最後に、このアルゴリズムは、平滑化したハプロタイプブロックと未処理のハプロタイプブロックとを比較し、未処理のハプロタイプブロックにおけるＳＮＰの大部分が、平滑化したハプロタイプブロックと同じ対立遺伝子に配分されていることを確認する。これが当てはまらない場合には、未処理のハプロタイプを維持した。非線形平滑化アルゴリズムは優れたハプロタイプ不一致率をもたらした（１個体のＥＢＶ−リンパ芽球様細胞については３．４０％±２．０５％ＳＤ、及び別の個体のＥＢＶ−リンパ芽球様細胞については１．６５％±０．５１％ＳＤ）。
【００８０】
実施例２：ヒト割球のハプロタイピング
リンパ芽球様細胞をハプロタイピングするこの単一細胞及び二重細胞の手法が、ヒト割球に対しても奏功するか否かを試験するために、同じ胚に由来する３つの単一の割球における父系遺伝常染色体上の祖父母系対立遺伝子配列を決定した。この男性胚は、夫婦が彼らの子供への２２ｑ１１欠失の父系伝達を回避することを望むために、着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）に適用される介助生殖技術から得られたものである。２つの更なる割球に対するＦＩＳＨ分析から、この胚が２２ｑ１１欠失を保有することが明らかとなった（データは示さない）。３つの割球における父系遺伝染色体のハプロタイプを再構築することによって、このＦＩＳＨ結果を確認することができた。
【００８１】
２２ｑ１１欠失内に位置するＳＮＰのプローブ強度クラスターグラフ分析によって、欠失は父親の祖母系対立遺伝子上に新たに起こったことが証明された（データは示さない）。３つの単一の割球のＤｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｅｌによる遺伝子型、及び２つの単一の割球において一致するＳＮＰコールから得られる３つの対応する仮想遺伝子型のハプロタイプ再構築から、２２ｑ１１遺伝子座がこれらの割球において祖母系ハプロタイプブロックに組み込まれていることが明らかになった（図４Ａ及び図４Ｂ）。この分析は、既知の２２ｑ１１欠失領域内のＳＮＰを追加及び除外（図４Ａ及び図４Ｂ）することによって行った。欠失内のＳＮＰは正確にタイピングすることができないため、誤った組換え部位が検出され、これは、これらのＳＮＰをハプロタイプ再構築から除外することによって回避された。計算したハプロタイプの平滑化の後、相同的組換え部位は、２２番染色体のこの父系遺伝染色分体上に見られなかった（図４Ｃ及び図４Ｄ）。同様の結果が他の８つの常染色体についても得られたが、残りの遺伝常染色体は祖父母系染色体間での相同的組換えの部位を示した（図５Ａ〜図５Ｄ）。
【００８２】
さらに、この胚の参照ハプロタイプを、３つの単一の割球において一致するＳＮＰコールから計算した。単一の割球に由来するハプロタイプにおいておよそ２０．３％（±３．４％ＳＤ）の常染色体ＳＮＰが、この参照対立遺伝子配列と一致していないことが分かった（図８）。２つずつのこれらの割球の遺伝子型の混合によって、常染色体ＳＮＰのハプロタイプ不一致率が７．５４％（±１．９０％ＳＤ）まで低下したが、単一細胞及び二重細胞由来のハプロタイプの平滑化は、それぞれ７．８４％（±１．６０％ＳＤ）及び６．０８％（±１．２０％ＳＤ）の不一致率をもたらした。複数の細胞から抽出した非増幅ゲノムＤＮＡに由来する参照ハプロタイプはこの胚では欠けているが、これらの結果は単一のＥＢＶで形質転換したリンパ芽球様細胞のハプロタイプ再構築と同程度である。
【００８３】
異なる単一細胞遺伝子型から得られるハプロタイプへの非線形平滑化アルゴリズムの適用は、Ｍｅｒｌｉｎインプットフォーマット戦略（１．未処理の単一細胞遺伝子型インプット、２．未処理の単一細胞遺伝子型に由来するヘテロ接合性ＳＮＰのみからなるインプット、及び３．仮想二重細胞遺伝子型インプット）は、高いゲノムワイドハプロタイプの一致を更に実証し、父系相同染色体間の減数分裂性の組換え事象のゲノムワイド検出も可能にした（図１３）。
【００８４】
結論としては、本発明者らの結果は、ハプロタイプ平滑化と組み合わせた単一割球及び二重割球のハプロタイピングが、胚における遺伝子座の対立遺伝子特異的な遺伝を評価することを可能にするという原理を証明する。
【００８５】
平滑化を用いた又は用いない、本願に記載される単一細胞及び／又は二重細胞のハプロタイピングのための方法は、胚選択の目的、異なる対立遺伝子構成を有する細胞からなる不均一組織の遺伝学研究、又は法医学的研究のためにヒト及び動物の細胞に使用／適用することができる。
【引用文献】
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【図１】
2013528391.tif 000003
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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