(57)【要約】  哺乳動物の免疫化のために抗原を鼻腔内送達するための組成物および方法を開示する。抗原として、ペプチド、タンパク質、ペプチドミメティクス、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物およびリン脂質が挙げられる。組成物は、少なくとも１つの抗原および浸透増強剤を含有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
経鼻免疫化のための医薬組成物であって、大環状浸透増強剤、液体キャリア、乳化剤および治療有効量の抗原を含み、前記大環状浸透増強剤が、以下の構造を有するＨｓｉｅｈ増強剤である医薬組成物：
【化１】
2013528623.tif 000007
式中、ＸおよびＹは、酸素、硫黄、または
【化２】
2013528623.tif 000008
もしくは＝Ｎ−Ｒの構造のイミノ基であり、ただし、Ｙがイミノ基である場合、Ｘはイミノ基であり、Ｙが硫黄である場合、Ｘは硫黄またはイミノ基であり、Ａは、
【化３】
2013528623.tif 000009
の構造を有する基であり、
式中、ＸおよびＹは上記に定義した通りであり、ｍおよびｎは１〜２０の値を有する整数であり、和ｍ＋ｎは２５以下であり、ｐは０または１の値を有する整数であり、ｑは０または１の値を有する整数であり、ｒは０または１の値を有する整数であり、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立に、水素、または直鎖状もしくは分枝状であってよい１〜６個の炭素原子を有するアルキル基（ただし、Ｒ1〜Ｒ6のうちの１つのみがアルキル基であり得る）であり、ただし、ｐ、ｑおよびｒが０の値を有し、Ｙが酸素である場合、ｍ＋ｎは少なくとも１１であり、さらに、Ｘがイミノ基であり、ｑが１であり、Ｙが酸素であり、ｐおよびｒが０である場合、ｍ＋ｎは少なくとも１１である。
【請求項２】
前記Ｈｓｉｅｈ増強剤が、３−メチルシクロペンタデカノン、９−シクロヘプタデセン−１−オン、シクロヘキサデカノン、シクロペンタデカノン、オキサシクロヘキサデカン−２−オン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗原が、タンパク質またはペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質が炭疽感染防御抗原である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原が炭水化物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原がＤＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
結晶化阻害剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
酵素阻害剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記酵素阻害剤が、ロイペプチンおよびアプロチニンからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
哺乳動物を免疫化する方法であって、以下のステップを含む方法：
大環状浸透増強剤、液体キャリア、乳化剤および治療有効量の抗原を含む組成物を配合するステップであって、前記大環状浸透増強剤が、以下の構造を有するＨｓｉｅｈ増強剤であるステップと；
【化４】
2013528623.tif 000010
［式中、ＸおよびＹは、酸素、硫黄、または
【化５】
2013528623.tif 000011
もしくは＝Ｎ−Ｒの構造のイミノ基であり、ただし、Ｙがイミノ基である場合、Ｘはイミノ基であり、Ｙが硫黄である場合、Ｘは硫黄またはイミノ基であり、Ａは、
【化６】
2013528623.tif 000012
の構造を有する基であり、
式中、ＸおよびＹは上記に定義した通りであり、ｍおよびｎは１〜２０の値を有する整数であり、和ｍ＋ｎは２５以下であり、ｐは０または１の値を有する整数であり、ｑは０または１の値を有する整数であり、ｒは０または１の値を有する整数であり、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立に、水素、または直鎖状もしくは分枝状であってよい１〜６個の炭素原子を有するアルキル基（ただし、Ｒ1〜Ｒ6のうちの１つのみがアルキル基であり得る）であり、ただし、ｐ、ｑおよびｒが０の値を有し、Ｙが酸素である場合、ｍ＋ｎは少なくとも１１であり、さらに、Ｘがイミノ基であり、ｑが１であり、Ｙが酸素であり、ｐおよびｒが０である場合、ｍ＋ｎは少なくとも１１である］
前記組成物を経鼻投与により前記哺乳動物に投与するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記Ｈｓｉｅｈ増強剤が、３−メチルシクロペンタデカノン、９−シクロヘプタデセン−１−オン、シクロヘキサデカノン、シクロペンタデカノン、オキサシクロヘキサデカン−２−オン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原が、タンパク質またはペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が炭疽感染防御抗原である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原が炭水化物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原がＤＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
結晶化阻害剤をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
酵素阻害剤をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵素阻害剤が、ロイペプチンおよびアプロチニンからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
経鼻免疫化のための医薬組成物であって、大環状浸透増強剤、液体キャリア、乳化剤および治療有効量の抗体を含み、前記大環状浸透増強剤がＨｓｉｅｈ増強剤である医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年６月４日出願の米国特許出願第１２／７９４，６２９号に対する優先権を主張し、当該米国特許出願第１２／７９４，６２９号は、２００７年６月７日出願の米国出願第１１／８１１，３０４号の一部継続出願であり、当該米国出願第１１／８１１，３０４号は現在、米国特許第７，２４４，７０３号である、２００４年３月５日出願の米国出願第１０／８９５，４６５号の継続出願であり、当該米国出願第１０／８９５，４６５号は、２００３年１２月１８日出願の米国出願第１０／４８１，３０９号の一部継続出願であり、当該米国出願第１０／４８１，３０９号は、２００２年６月２４日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／１９８４９号の国内段階への移行であり、当該国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／１９８４９号は、２００１年６月２２日出願の米国仮出願第６０／３００，２９３号に対する優先権を主張し、それらのそれぞれの開示の全体が、参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、哺乳動物の免疫化のために鼻粘膜を通して抗原を送達するための組成物および方法に関する。抗原として、ペプチド、タンパク質、ペプチドミメティクス、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物およびリン脂質が挙げられる。
【背景技術】
【０００３】
注射は、ワクチン、およびインスリン等のタンパク質治療剤をヒトに投与するために最も一般に使用される方法である。しかし、注射療法は、患者にとって不快であること、患者の服薬遵守が芳しくないこと、および訓練を受けた技術者による投与を必要とすること等の多数の欠点を有する。
【０００４】
免疫化の望まれる代替方法は、治療有効量の抗原を含有する組成物の鼻腔内投与であろう。鼻腔内経路は、送達システムが平易であり、使用が簡便であり、侵襲性が最低限であることを考えると、集団ワクチン接種に適切であり得る。多くの病原体が、呼吸器粘膜を介して感染し、したがって、これらの粘膜部位における免疫化が、注射による免疫化よりも効能を示し得る。
【０００５】
しかし、その多くがペプチドまたはタンパク質等の巨大分子である抗原の鼻腔内送達の成功が制限されてきたが、これは、抗原が、鼻孔粘膜に侵入するのに特に有効であるとは限らず、いくつかの浸透剤には、それらの膜を刺激する傾向があるからである。
【０００６】
炭疽は、胞子形成細菌のバチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）が引き起こす感染である。炭疽は、吸入、経口摂取または皮下への曝露により身体に入り、感染を引き起こすことができる。最近、バイオテロリズムの可能性が強く認識されるようになることで、Ｂ．アントラシスまたは関連株が、新たに出現するものでも、または遺伝子工学的に作製されるものでも、生物兵器として使用される懸念が高まっている。炭疽感染防御抗原（ＰＡ）が、液体としてマウス内に鼻腔内投与されており、マウスモデルにおいてエアロゾルチャレンジに対して防御をもたらしている。Ｆｌｉｃｋ−Ｓｍｉｔｈら、Ｍｕｃｏｓａｌ  ｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎｔｈｒａｘ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００２；７０：２０２２〜８。Ｇａｕｒら、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｎａｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎｔｈｒａｘ  ｔｏｘｉｎ、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００２；２０：２８３６〜９。Ｂｏｙａｋａら、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ａｎｔｈｒａｘ：  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｎａｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｇｅｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７０：５６３６〜４３。
【０００７】
炭疽に対する免疫をより少ない用量で有効にもたらす有効かつ安全なワクチンが依然として求められている。
【０００８】
浸透増強剤を使用することによって、本発明は、炭疽を含めた、種々の抗原に対する効率的な経鼻免疫化のための組成物および方法を提供する。鼻腔内送達後に防御を付与する能力は、バイオテロリズム事件の状況においては、特に魅力的であるが、これは、そうした送達により、集団ワクチン接種のプロセスが大いに平易になるからである。また、本発明は、一般に治療目的でペプチド、ペプチドミメティクスおよびタンパク質を鼻腔内から送達する方法もその範囲内に含む。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、経鼻免疫化のための医薬組成物であって、大環状浸透増強剤、液体キャリア、乳化剤および治療有効量の抗原を含み、前記大環状浸透増強剤がＨｓｉｅｈ増強剤である組成物を提供する。Ｈｓｉｅｈ増強剤は、３−メチルシクロペンタデカノン、９−シクロヘプタデセン−１−オン、シクロヘキサデカノン、シクロペンタデカノン、オキサシクロヘキサデカン−２−オン、またはそれらの混合物であり得る。抗原は、タンパク質もしくはペプチド（炭疽感染防御抗原等）、炭水化物、またはＤＮＡであり得る。組成物は、結晶化阻害剤、ならびに／またはロイペプチンおよびアプロチニン等の酵素阻害剤をさらに含んでもよい。
【００１０】
さらに、本発明は、哺乳動物を免疫化する方法であって、（ａ）大環状浸透増強剤、液体キャリア、乳化剤および治療有効量の抗原を含む組成物を配合するステップであって、前記大環状浸透増強剤がＨｓｉｅｈ増強剤であるステップと、（ｂ）組成物を経鼻投与により哺乳動物に投与するステップとを含む方法を提供する。
【００１１】
経鼻免疫化のための医薬組成物であって、大環状浸透増強剤、液体キャリア、乳化剤および治療有効量の抗体を含み、前記大環状浸透増強剤がＨｓｉｅｈ増強剤である組成物も本発明によって包含される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、経鼻免疫化のための医薬組成物を提供し、この組成物は、有効な免疫応答を誘発することが可能である。医薬組成物は、鼻腔内送達に適している剤型をとり、治療有効量の抗原および浸透増強剤を含有する。本発明の組成物および方法と共に使用することができる抗原は、免疫応答、例えば、液性（抗体）応答および／または細胞性免疫応答を発生させる任意の物質であってよい。抗原は、アレルゲンまたは微生物（もしくは微生物の一部）であり得る。特定の免疫化製剤の調製およびプロトコールは、使用しようとする抗原のタイプに依存する。しかし、製剤化とプロトコールの両方の開発は当業者の能力範囲に十分に属する。また本発明によって包含される医薬組成物は、鼻腔内送達に適している剤型をとり、治療有効量の抗体および浸透増強剤を含有する。
【００１３】
提示する組成物中で使用することができる抗原として、これらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬（合成ペプチド）、炭水化物（単糖、二糖、オリゴ糖および多糖を含む）、脂質、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、ならびにそれらのコンジュゲート／混合物が挙げられる。核酸抗原は、ＤＮＡまたはＲＮＡの断片、プラスミド等のベクター中に組み込まれたＤＮＡ断片、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを含む。ポリヌクレオチド含有抗原の例として、例えば、（ａ）ポリペプチド含有抗原を直接的にコードする核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ分子）、ならびに（ｂ）ポリペプチド含有抗原を間接的にコードするベクター構築物、例えば、ポリペプチド含有抗原をコードする異種の核酸配列を発現するベクター構築物（例えば、ＤＮＡベクター構築物およびＲＮＡベクター構築物）が挙げられる。抗原は、微生物の部分（例えば、コート、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛および毒素）であり得る。また、抗原は、弱毒化生存微生物または不活性化微生物であってもよい。微生物として、これらに限定されないが、ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＡＩＤＳウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス等）、細菌（例えば、バチルス・アントラシス、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ブドウ球菌、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等）、真菌（例えば、クリプトコッカス、アスペルギルス等）、原生動物（例えば、マラリア等）、その他の微生物および毒素、昆虫（例えば、ダニ等）の死体、花粉等が挙げられる。本発明の組成物のために使用可能な抗原は、抗原が有効な免疫応答をもたらす限り、特に制限されない。特定の実施形態では、免疫応答は、鼻腔内ＩｇＡ抗体価の増加および血液ＩｇＧ抗体価の増加、ならびにワクチン接種対象内で抗原または微生物に対する防御を示すことを含む。
【００１４】
ペプチドは、２つ以上のアミノ酸からなる、アミノ酸の短い鎖を含むタンパク質断片である。タンパク質は一般に、アミノ酸のより長い鎖であるが、どこまでがペプチドであり、どこからがタンパク質であるかについての正確な規則はない。また、一般的なペプチド／タンパク質の命名法は、構造が７３アミノ酸長のペプチドであるインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）等の全分子であるか、または構造がトリプシンペプチドと通常呼ばれるタンパク質のトリプシン切断断片等のタンパク質分子の断片であるかどうかも考慮する。
【００１５】
一般に、本発明において使用するペプチド、ペプチドミメティクスおよびタンパク質は、およそ約１５０〜約２００，０００ダルトン、約１，０００〜約１８０，０００ダルトン、約２，０００〜約１５０，０００ダルトン、約３，０００〜約１００，０００ダルトン、約５０，０００〜約１００，０００ダルトン、約２０，０００〜約５０，０００ダルトン、または約３０，０００〜約５０，０００ダルトンの分子量を有する。一実施形態では、本発明において使用するペプチドは、およそ約１５０〜約３０，０００ダルトンの分子量を有するが、また、三次または四次の構造に起因して、３０，０００ダルトン超である場合があるその他のペプチドも本発明の範囲に属する。特定の実施形態では、本発明において使用するペプチドは、およそ約１５０〜約１０，０００ダルトン、または約１５０〜約７，０００ダルトンの分子量を有する。
【００１６】
タンパク質およびペプチドを、組換え技法により生成することができる。したがって、異なるタンパク質由来の領域を含有するキメラ分子を使用することができる。例えば、Ｂ型肝炎コア抗原のセクションに融合させた熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のマラリアスポロゾイト周囲の反復領域を含有する組換えタンパク質を使用することができる。Ｍｉｌｉｃｈら、Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｏｒｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｍａｌａｒｉａ  ｒｅｐｅａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｏ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ、Ｖａｃｃｉｎｅ．Ｖｏｌｕｍｅ  ２０、Ｉｓｓｕｅｓ  ５〜６、（２００１）７７１〜７８８頁。
【００１７】
本発明の組成物を、１つ以上のタイプの微生物またはアレルゲンに対する免疫化に使用することができる。組成物は、１つ以上のタイプの抗原を含有することができる。
【００１８】
本発明の組成物を、炭疽に対する免疫化に使用することができる。炭疽の感染プロセスを、以下に示す。感染は、胞子が、吸入、経口摂取または皮下への曝露を通して身体により取り入れられる場合に生じる。胞子が、活性な毒性細菌になり、炭疽毒素を発現し、この毒素は、宿主の免疫応答を最終的に停止させ、細胞死を引き起こす。炭疽毒素は、３つの構成成分、すなわち、炭疽感染防御抗原（ＰＡ）、炭疽浮腫因子（ＥＦ）、および炭疽致死因子（ＬＦ）を有する。ＰＡは、宿主細胞表面上の炭疽毒素受容体（ＡＴＲ）に結合する。次いで、ＰＡは、ＰＡを活性化する宿主のプロテアーゼにより切断され、次いで、これがその他の活性なＰＡに結合して、七量体を形成する。次いで、七量体はＥＦまたはＬＦに結合し、複合体全体が、エンドサイトーシスを介して細胞内に引き入れられて、宿主細胞内でエンドソームを形成する。ＥＦまたはＬＦは、エンドソームから細胞の細胞質ゾル内に押し出される。細胞質ゾル内では、ＬＦおよびＥＦが、それらの酵素活性を発揮し、細胞のシグナル伝達を遮断し、細胞を損傷する。ＥＦは、浮腫を最終的に引き起こし、ＬＦは、細胞溶解を最終的に引き起こす。
【００１９】
本発明において炭疽に対して使用するための抗原は、多様なバチルス・アントラシス株から得ることができ、死滅、弱毒化または不活性化させたバチルス・アントラシス、およびサブユニット抗原を含むことができる。抗原は、タンパク質含有種、ペプチド含有種（例えば、防御抗原（ＰＡ））、多糖含有種、および免疫原性のタンパク質またはポリペプチドを発現するポリヌクレオチド含有種を含む。
【００２０】
炭疽抗原は、感染防御抗原（ＰＡ）に基づいた抗原、例えば、Ｂ．アントラシス培養物由来の精製タンパク質もしくは生存−弱毒化胞子ワクチン、ＡＶＡ（ＡＶＡ：Anthrax Vaccine Adsorbed）（吸着炭疽ワクチン、Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．（以前は、Ｂｉｏｐｏｒｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｎｓｉｎｇ、Ｍｉｃｈ．）から市販されている）等の抗毒素ワクチン、またはより最新の、明確に特徴付けられたＰＡ、莢膜に基づいたＰＡもしくはＰＡのコンジュゲートおよび莢膜に基づいたワクチンのうちのいずれをも含む。ＡＶＡは、非病原性非被包型株のＢ．アントラシスＶ７７０−ＮＰ１−Ｒのメンブラン滅菌培養物のろ液からなる。培養物のろ液を、水酸化アルミニウムに吸着させ、塩化ベンゼトニウム（保存剤）およびホルムアルデヒド（安定化剤）と共に製剤化する。任意のタイプの炭疽毒素または莢膜抗原を使用することができる。米国特許公開第２０１００００３２７６号、第２００９０２９７５５６号、第２００８０３１７７８４号。ＰＡ、ＬＦおよび／またはＥＦの自然の機構を標的にする種々のワクチンが論じられている。例えば、米国特許第５，５９１，６３１号および第５，６７７，２７４号は、ＰＡおよび／またはＬＦのドメインを含む融合タンパク質を記載している。別のアプローチでは、米国特許出願第２００４／０１６６１２０号には、ＰＡおよび切断型の非機能性Ｂ．アントラシスＬＦｎを含有して、Ｂ．アントラシス免疫応答を惹起する組成物が記載されたことがある。さらに、米国特許出願第２００３／０００３１０９号は、突然変異ＬＦタンパク質またはＬＦタンパク質の免疫原性断片をコードする配列を有するポリヌクレオチド、およびＰＡまたはＰＡの免疫原性断片をコードする配列を有するポリヌクレオチドを対象に投与するワクチンについて論じている。米国特許出願第２００５／００６３９８６号は、野生型または突然変異型のＰＡ、ＬＦまたはＥＦを含有する組換えＤＮＡ構築物について論じている。追加のアプローチは、ＰＡ、ＬＦまたはＥＦについての発現系としての生存ワクチンに焦点を合わせている。また、特定の試みは、生存サルモネラおよびＢ．アントラシスの使用にも焦点を合わせた。Ｃｏｕｌｓｏｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、ｖｏｌ．１２、Ｎｏ．１５、１３９５〜１４０１（１９９４）。Ｇａｒｍｏｒｙら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１（７）：３８３１〜６（２００３）。Ａｌｏｎｉ−Ｇｒｉｎｓｔｅｉｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７３（７）：４０４３〜５３（２００５）。生存ワクチンの開発の可能性に焦点を合わせた追加の研究もある。米国出願第２００４／０１９７３４３号。さらに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現系（Ｖｏｄｋｉｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３４：６９３〜６９７）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）発現系（Ｃｏｕｌｓｏｎら（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１３９５〜１４０１）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現系（例えば、Ｂａｉｌｌｉｅに対する米国特許第６，２６７，９６６号；Ｉｖｉｎｓら（１９８６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５４：５３７〜５４２；およびＢａｉｌｌｉｅら（１９９４）Ｌｅｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：２２５〜２２７を参照されたい）、ならびに非胞子形成性であるかまたはＬＦもしくはＥＦ毒素を産生することができない、いくつかの組換えバチルス・アントラシス発現系（例えば、Ｍｏｃｋらに対する米国特許第５，８４０，３１２号およびＷｏｒｓｈａｍらに対する米国特許第６，３１６，００６号を参照されたい）を含めた、いくつかの代替の原核（細菌）発現系も、抗原産生のために開発されている。さらに、Ｂ．アントラシスのＰＡ抗原についての完全な遺伝子配列も公知であり（Ｗｅｌｋｏｓら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：２８７〜３００）、公的に入手可能であり、ポリペプチド含有およびポリヌクレオチド含有抗原を含めた、多種多様な抗原の開発および産生が可能である。例えば、米国特許出願第２００４／００８２５３０号は、ＰＡ抗原をコードする配列およびＥＦまたはＬＦ抗原の断片等その他の抗原をコードする配列を含めた、Ｂ．アントラシスから得られたかまたはそれに由来する、ポリペプチド抗原をコードする配列を含有する核酸を記載し、これは公知の技法を使用して適切なベクター構築物内に挿入することができる。
【００２１】
抗原は、組成物中に治療有効量で存在する。一般に、抗原は、組成物の約０．００１〜約５０重量％、組成物の約０．０１〜約３０重量％、約０．１〜約２０重量％、約０．１〜約１０重量％または約０．１〜約２重量％の量で存在する。
【００２２】
本発明の抗原は、かなり未精製な状態で使用してもよく、または使用前に精製してもよい。本発明において、精製には、例えば、ろ過、濃縮、遠心分離、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動等、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物の精製に当技術分野で従来使用されている方法を実施することができる。必要であれば、これらの方法を、適切に組み合わせてもよい。最終的な使用形態に従って、精製した抗原を濃縮または凍結乾燥して、液体または固体を得ることができる。
【００２３】
また、本発明の医薬組成物は、脱感作において使用することもできる。例えば、アレルゲンの用量を増加させて、アレルゲンに対する感受性を示している対象に投与する。脱感作のために使用するアレルゲンの用量の例が、当技術分野で公知であり、例えば、Ｆｏｒｎａｄｌｅｙ（１９９８）Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．３１：１１１〜１２７を参照されたい。
【００２４】
抗原の作用を補助または修飾するために、少なくとも１つの免疫学的アジュバントを本発明の組成物中で使用することができる。免疫学的アジュバントはとりわけ、以下の効果のうちの１以上をもたらすことができる：免疫応答の増加、免疫応答のさらなる多様化、免疫応答の加速、免疫応答のさらなる持続／延長。本発明において使用することができるアジュバントとして、これらに限定されないが、デキストランまたはシクロデキストランおよびサポニン、ポリヌクレオチド含有免疫学的アジュバント（例えば、オリゴデオキシヌクレオチドおよび二本鎖ＲＮＡ等、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ含有免疫学的アジュバント）、ならびにポリマー微小粒子が挙げられる。
【００２５】
アジュバントの非限定的な例として、（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩（ミョウバン）；（２）スクアレン等の代謝可能な油、および１以上のソルビタン誘導体等の乳化剤を含むサブミクロン乳剤、例えば、（ａ）モデル１１０Ｙマイクロ流動化装置（Ｍｉｃｒｏ  ｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）等のマイクロ流動化装置を使用してサブミクロン粒子に製剤化される、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％ＳＰＡＮ８５を含有する（場合により、必要ではないが、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（下記を参照されたい）を含有する）ＭＦ５９（国際公開第ＷＯ９０／１４８３７号；Ｃｈａｐｔｅｒ  １０、Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、（ｂ）マイクロ流動化して、サブミクロン乳剤にするか、またはボルテックスをかけて、より大きな粒子サイズの乳剤を得る、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下記を参照されたい）を含有するＳＡＰ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１以上の細菌の細胞壁構成成分、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＪ）を含有するＲｉｂｉｊアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）（本明細書において使用するのに適切なサブミクロン水中油型乳剤のさらなる考察については、共同所有の１９９８年１月２９日出願の特許出願第０９／０１５，７３６号を参照されたい）；（３）Ｑｕｉｌ  ＡもしくはＱＳ２１（例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎｊ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．））等のサポニンアジュバントを使用し、またはそれらからＩＳＣＯＭ（免疫賦活複合体）等の粒子を生成することができ、ＩＣＯＭＳは、追加の界面活性剤を欠いていてよい、例えば、ＷＯ００／０７６２１；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ０９９／４４６３６）等）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等のサイトカイン；（６）リポ多糖およびリポ糖のホスフェートのアジュバントを含めたリン脂質アジュバント、例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、およびその誘導体３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、例えば、ＧＢ−２２２０２２１、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４（これらは、肺炎球菌糖との使用時（例えば、ＷＯ００／５６３５８）には、場合によりミョウバンが実質的に存在しない）、ならびに米国特許第６，３５５，２５７号に記載されているもの等のアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物；（７）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型乳剤との組合せ、例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、例えば、Ｗ０９９／５２５４９；（９）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）、またはオクトキシノール等の少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）；（１０）サポニンと免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（ＷＯ００／６２８００）；（１１）免疫賦活薬と金属塩粒子、例えば、ＷＯ００／２３１０５；（１２）サポニンと水中油型乳剤、例えば、ＷＯ９９／１１２４１；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（場合により、＋ステロール）、例えば、ＷＯ９８／５７６５９；（１４）コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）の解毒化突然変異体、または大腸菌の熱不安定性毒素（ＬＴ）等の細菌のＡＤＰリボシル化毒素、特に、ＬＴ−Ｋ６３（野生型アミノ酸が６３位においてリジンで置換されている）、ＬＴ−Ｒ７２（野生型アミノ酸が７２位においてアルギニンで置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（野生型アミノ酸が１０９位においてセリンで置換されている）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（野生型アミノ酸が、９位においてリジンで置換されており、１２９位においてグリシンで置換されている）（例えば、国際公開第ＷＯ９３／１３２０２号および第ＷＯ９２／１９２６５号を参照されたい）；（１５）アミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ら；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９９  Ａｕｇ．２；９（１５）：２２７３〜８を参照されたい；（１６）イミキモド（Ｒ−８３７）およびレジキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ−８４８）等のイミダゾキノリン、例えば、Ｖａｓｉｌａｋｏｓ，Ｊ．Ｐ．ら；Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ａｕｇ．２５；２０４（ｌ）：６４〜７４を参照されたい；（１７）Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｌ．Ｄ．ら；Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２００２  Ｆｅｂｒｕａｒｙ；３００（２）：６５５〜６１、および米国特許第６，２９０，９７３号に記載されている非糖リン脂質（例えば、二糖を欠く、単純化リピドＡ類似体）等のリポ多糖模倣物質（モノホスホリルリピドＡ模倣物質を含む）；ならびに（１８）免疫賦活剤として作用して、組成物の有効性を増強するその他の材料が挙げられる。ムラミルペプチドとして、これらに限定されないが、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓ−ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）等が挙げられる。米国特許公開第２００８０３１７７８４号、第２００９０２１４５９６号および第２０１０００９２５２６号。
【００２６】
免疫学的アジュバントの追加の例については、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ、Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５を参照されたい。
【００２７】
また本発明によって包含される医薬組成物は、治療有効量の抗体および浸透増強剤を含有する。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物および方法を受動免疫のために使用することができる。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｐａｓｓｉｖｅ＿ｉｍｍｕｎｉｔｙを参照されたい。
【００２８】
提示する組成物の抗体は、１以上のポリペプチドを含有することができる。抗体は、未変化の抗体であっても、または抗体断片（例えば、Ｆａｂ、ナノボディ）であってもよい。モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはそれらの混合物を、本発明に従って使用することができる。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭタイプ（およびそれらのサブタイプ）であり得、免疫グロブリンの軽鎖は、カッパまたはラムダタイプであり得る。抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトまたは非ヒトの供給源から得ることができる。抗体のフレームワークは、ヒトのフレームワーク、ヒト化フレームワーク、もしくは非ヒトのフレームワーク、例えば、改変して、ヒトにおける抗原性を減少させたマウスのフレームワークであっても、または合成のフレームワーク、例えば、コンセンサス配列であってもよい。
【００２９】
抗体を、ヒトを含めた、動物から得る、単離するもしくは精製することができ、または組換えの手段により調製する、発現させる、生み出すまたは単離することができる。例えば、抗体を、宿主細胞中にトランスフェクトした組換え発現ベクターを使用して発現させること、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離すること、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離すること、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を、その他のＤＮＡ配列にスプライシングさせる任意のその他の手段により、調製する、発現させる、生み出すもしくは単離することができる。そのような組換え抗体は、ヒト化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、キメラ抗体、（例えば、ファージディスプレイにより）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて生成した抗体を含み、場合により、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域を含んでもよい。米国特許第７，７２７，５３２号。
【００３０】
一般に、利用する浸透増強剤は、抗原の鼻粘膜を通しての浸透を増強する浸透増強剤である。浸透増強剤の一般式を、下記に示す。
【化１】
2013528623.tif 000002
【００３１】
［式中、ＸおよびＹは、酸素、硫黄、または
【化２】
2013528623.tif 000003
【００３２】
もしくは＝Ｎ−Ｒの構造のイミノ基であり、ただし、Ｙがイミノ基である場合、Ｘはイミノ基であり、Ｙが硫黄である場合、Ｘは硫黄またはイミノ基であり、Ａは、
【化３】
2013528623.tif 000004
【００３３】
の構造を有する基であり、
式中、ＸおよびＹは上記に定義した通りであり、ｍおよびｎは１〜２０の値を有する整数であり、和ｍ＋ｎは２５以下であり、ｐは０または１の値を有する整数であり、ｑは０または１の値を有する整数であり、ｒは０または１の値を有する整数であり、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立に、水素、または直鎖状もしくは分枝状であってよい１〜６個の炭素原子を有するアルキル基（ただし、Ｒ1〜Ｒ6のうちの１つのみがアルキル基であり得る）であり、ただし、ｐ、ｑおよびｒが０の値を有し、Ｙが酸素である場合、ｍ＋ｎは少なくとも１１であり、さらに、Ｘがイミノ基であり、ｑが１であり、Ｙが酸素であり、ｐおよびｒが０である場合、ｍ＋ｎは少なくとも１１であり、前記化合物が、抗原（または抗体）が身体の膜を越える通過速度を増強する］。以下、これらの化合物を、増強剤と呼ぶ。Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5またはＲ6がアルキルである場合、それは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、アミル、ヘキシル等であってよい。そのような浸透増強剤が、米国特許第５，０２３，２５２号および第５，７３１，３０３号に記載されている。
【００３４】
好ましくは、本発明の浸透増強剤化合物は、環状ラクトン（ＸとＹの両方が酸素である（ｑが１であり、ｒが０である）化合物）、環状ジエステル（ＸとＹの両方が酸素であり、ｑとｒの両方が１である化合物）、ならびに環状ケトン（ｑとｒの両方が０であり、Ｙが酸素である化合物）である。環状ジエステルでは、ｍ＋ｎは、好ましくは、少なくとも３である。環状ケトンでは、ｍ＋ｎは、好ましくは、１１〜１５であり、ｐは、好ましくは、０である。
【００３５】
上記の構造式の増強剤は、本明細書では「Ｈｓｉｅｈ増強剤」と呼び、例えば、上記の米国特許第５，０２３，２５２号および第５，７３１，３０３号（以下、「Ｈｓｉｅｈ特許」）に記載されている。そのような増強剤は、親油性であり、「膜適合性」である。「膜適合性」は、増強剤が本発明の組成物を適用しようとする膜（以下、「標的膜」）に対して損傷を引き起こさないことを意味する。また、そのような増強剤は、標的膜に対する刺激性を、低いレベルで示すかまたは全く示さず、実際には、エモリエント剤としても働く。
【００３６】
本発明において使用するのに好ましい増強剤は、大環状増強剤である。本明細書では、用語「大環状」を使用して、環内に少なくとも１２個の炭素を有する環状化合物を指す。本発明において使用するのに好ましい大環状増強剤の例として、（Ａ）大環状ケトン、例えば、３−メチルシクロペンタデカノン（ムスコン）、９−シクロヘプタデセン−１−オン（シベトン）、シクロヘキサデカノンおよびシクロペンタデカノン（ノルムスコン）；ならびに（Ｂ）大環状エステル、例えば、ペンタデカラクトン、例として、オキサシクロヘキサデカン−２−オン（シクロペンタデカノリド、ω−ペンタデカラクトン）が挙げられる。
【００３７】
オキサシクロヘキサデカン−２−オンおよびシクロペンタデカノンが、とりわけ好ましい。
【００３８】
上記が好ましい浸透増強剤であるが、また、当業者であれば、本教示はその他の浸透増強剤にも適用できるであろうことを認識するであろう。本発明に有用なその他の浸透増強剤の非限定的な例が、種々の薬局方概論において、一般に安全であると認識されている（ＧＲＡＳ）単純な長鎖エステルである。これらは、中位までの長さの鎖を含有する、単純な脂肪族の、不飽和または飽和（しかし、好ましくは、完全飽和）のエステルを含むことができる。そのようなエステルの非限定的な例として、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸オクチル等が挙げられる。こうした増強剤は、医薬組成物中で使用するのに適しているタイプである。また、当業者であれば、粘膜とは不和合性であるかまたは粘膜に対して刺激性である材料は回避すべきであることも理解するであろう。
【００３９】
増強剤は、組成物中に、鼻粘膜を通して送達しようとする薬学的に活性な物質の浸透を増強するのに有効な濃度で存在する。増強剤の使用量の決定においては、種々の考慮すべき事項を考慮に入れるべきである。そのような考慮すべき事項として、例えば、達成される流動量（膜を通る通過速度）、ならびに製剤中の構成成分の安定性および適合性が挙げられる。増強剤は一般に、組成物の約０．００１〜約４０（ｗ／ｗ）％の量で使用する。特定の範囲は、約０．０１％〜約３０（ｗ／ｗ）、約０．１〜約２５％（ｗ／ｗ）、約１％〜約１５％（ｗ／ｗ）、約５〜１０％（ｗ／ｗ）を含む。あるいは、増強剤の量は、約１．０〜約３％（ｗ／ｗ）または約１０〜約２０％（ｗ／ｗ）の範囲に及ぶこともできる。
【００４０】
乳剤を形成する際に、水不溶性の増強剤が通常固体の材料である場合には、増強剤を、適切な溶媒中に溶解させる。増強剤が、水非混和性である、通常液体の材料である場合には、増強剤にとって適切な溶媒を、必要に応じて、使用してもまたは使用しなくてもよい。特定の実施形態では、増強剤を、適切な溶媒（複数可）、例として、アルコール、油、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ヘキサン、アセトン、フレオン、水、その他の極性もしくは非極性の溶媒、または混合物中に溶解、分散、懸濁または可溶化させ、次いで、これを、薬学的担体と混合した有効量の所望の抗原を含む組成物に添加する。場合によっては、増強剤が液体の形態をとる場合には、増強剤の「無希釈」の溶液を直接組み込んで、抗原、薬学的担体および増強剤の混合物を得ることができ、混合物中では、増強剤の濃度が、約０．１％〜約５０％（ｗ／ｗ）の範囲に及ぶ。
【００４１】
薬学的担体は、抗原を溶解、分散、含浸または懸濁させる、適切な無毒性ビヒクル、例として、水またはその他の溶媒、脂肪性の材料、セルロースおよびそれらの誘導体、タンパク質およびそれらの誘導体、コラーゲン、ゼラチン、ポリマー、接着剤、スポンジ、布等、ならびにビヒクル中の薬物のより良好な溶解性または分散をもたらすために添加する賦形剤を含む。そのような賦形剤は、無毒性の界面活性剤、可溶化剤、乳化剤、キレート化剤、結合材料、滑沢剤、柔軟剤等を含むことができる。
【００４２】
液体キャリアが、組成物中に、本発明の組成物のための適切なビヒクルとして働くのに有効な濃度で存在することができる。一般に、担体を、組成物の約４０〜約９８重量％または約５０〜約９８重量％の量で使用する。本発明の組成物は、好ましくは、鼻用スプレーとして送達する。
【００４３】
液体キャリアは、水もしくは任意のその他の適切な液体、溶媒、またはそれらの混合物であり得る。抗原は、治療有効量を液体キャリア中に分散または溶解させることができる。水は適切な緩衝化剤を含有して、特定の抗原を最適に送達するｐＨを得ることができ、または水は、その他の担体、例として、グリセリン、プロピレングリコール、種々のサイズのポリエチレングリコール、アミノ酸改変物質、例として、アルギニン等、および調剤または薬剤学の分野の専門家には公知であるその他の適切な可溶性の賦形剤を含有することができる。
【００４４】
本発明に有用なペプチドの非限定的な例として、抗炎症ペプチド１等の抗炎症ペプチド；抗老化ペプチド；アペリン−１２等のアペリンペプチド；ウロジラチン等の心房性ナトリウム利尿ペプチド；ボンベシンおよびその類似体；脳傷害誘導性ペプチド；カルシトニン；デフェンシン；デルトルフィン、デルモルフィンおよびそれらの類似体（その他のオピオイドペプチド、例として、アセタリン（Acetalin）、ＢＡＭペプチド、アルファ−カゼインエクソルフィン（Exorphin）、ベータ−カゾモルフィン、ダイノルフィン、エンドモルフィン、エンドルフィン、エンケファリン、グルテンエクソルフィン、キョートルフィン、メトルファミド（Metorphamide）、ネオエンドルフィン、シンジファリン、Ｈ−Ｔｙｒ−Ｄ／Ｌ−Ｔｉｃ−ＯＨおよびバロルフィン（Valorphin）を含む）；ダイノルフィンおよび類似体ならびにそれらの配列；エンテロスタチン；グレリン；グルカゴンならびにＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２等のグルカゴン様ペプチド；ゴナドトロピン放出ホルモン；成長ホルモン；成長ホルモン放出ホルモン；インスリン分泌性化合物；キョートルフィン；レプチンおよびその断片；ルテイン；ミエリン塩基性タンパク質断片；フィサレミンおよびその断片；セクレチン；チモシンベータ４等のチモシンおよびそれらの断片；形質転換増殖因子（ＴＧＦ）およびそれらの断片；タフトシン；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および関連ペプチド；さらに、ＶＩＰ、プレプロＶＩＰならびにそれらの類似体および断片が挙げられる。
【００４５】
本発明の組成物は、種々の剤型、例えば、水中油型乳剤、油中水型乳剤および水中油中水型乳剤として存在することができる。本発明の組成物の活性化合物は、化合物が親水性、親油性または両親媒性のいずれであるかに応じて、連続相または分散相または両方の相のいずれかの中に存在することができる。本発明の好ましい実施形態の例では、乳剤は、連続的な水相中に分散させた油滴（これらの油滴中には、親油性増強剤が含有される）と、連続的な水相中に溶解させた水溶性の薬学的に活性な化合物とを含む。油相を活用する好ましい実施形態では、油相中の油の濃度は、結晶化を促さないような濃度である。
【００４６】
また、本発明の組成物は、乳剤の形成を補助するのに使用するために乳化剤を含むこともできる。本質的には、任意の適切な親水コロイド乳化剤、典型的には、固体材料、または２以上のそのような乳化剤の混合物を、本発明の実行手順において使用することができる。親水コロイド乳化剤として、植物からの派生物、例えば、アカシア、トラガント、寒天、ペクチンおよびカラゲナン；動物からの派生物、例えば、ゼラチン、ラノリン、コレステロールおよびレシチン；半合成物質、例えば、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロース；ならびに合成物質、例えば、カルボマー等のアクリル乳化剤が挙げられる。親水コロイド乳化剤は、乳剤の乳化液滴の周囲に、親水コロイド（水和した親液性コロイド）を形成する。親水コロイドは、それぞれの乳化小滴の周囲の保護層として働き、保護層は、その他の小滴を物理的に退け、したがって、オストワルド熟成（乳化小滴の凝集する傾向）を妨害する。対照的に、その他の乳化剤は典型的には、乳化小滴の周囲に液晶層を形成することによって、乳化小滴を保護する。液晶層を形成する乳化剤を利用する組成物においては、安定な乳剤を形成するためには、乳剤の油相の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を、乳化剤のＨＬＢと適合させなければならず、しばしば、乳剤をさらに安定化させるためには、１以上の追加の乳化剤（二次的な乳化剤）を添加しなければならない。また、上記の液晶層は、標的基質との接触時の分散相の化合物の放出も遅らせる。
【００４７】
本発明の組成物中で使用するための親水コロイド乳化剤は、標的膜に対する刺激性を低いレベルで示すかまたは全く示さず、良好な生体接着性および粘膜接着性を有する化合物を含む。そのような特性を示す親水コロイド乳化剤の例として、セルロース由来の乳化剤およびアクリル乳化剤が挙げられ、例えば、約１０〜約５０個の炭素原子を含有するアルキル基を有する乳化剤が含まれる。本発明において使用するのに特に好ましいアクリル乳化剤は、（例えば、Ｓｃｈｌａｔｚｅｒに対する米国特許第３，９１５，９２１号およびＨｕａｎｇらに対する米国特許第４，５０９，９４９号に記載されている）カルボン酸とアクリルエステルとのコポリマーであり、架橋結合されているものがとりわけ好ましい。水中油型乳剤の形成において使用するのにとりわけ好ましいそのような乳化剤の例は、「アクリレート／Ｃ10-30アルキルアクリレートクロスポリマー」、すなわち、アクリル酸と（Ｃ10-30）アルキルアクリレートとの架橋結合ポリマーである。アクリレート／Ｃ10-30アルキルアクリレートクロスポリマーは、Ｎｏｖｅｏｎ，Ｉｎｃ．（以前は、Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ）から入手可能であり、商品名Ｐｅｍｕｌｅｎ．ＲＴＭ．の下で販売されている。アクリレート／Ｃ10-30アルキルアクリレートクロスポリマーは、小さな親油性部分および大きな親水性部分を有し、したがって、このポリマーが水中油型乳剤を形成するための主要な乳化剤として機能することが可能になる。さらに、アクリレート／Ｃ10-30アルキルアクリレートクロスポリマーは、基質、すなわち、生体膜または粘膜との接触時の分散相の化合物の放出が可能であり、再湿潤しない（油相は、水との接触時に再乳化しない）。米国薬局方に列挙されているアクリレート／Ｃ10-30アルキルアクリレートクロスポリマーに関する追加情報が、Ｎｏｖｅｏｎ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ＴＤＳ−１１４、１１７、１１８、１２４、２３２〜３および２３７、ならびにＰＤＳ  Ｐｅｍｕｌｅｎ  １６２２に提供されている。
【００４８】
乳剤を形成する際に、水不溶性の増強剤が通常固体の材料である場合には、増強剤を、適切な溶媒中に溶解させる。増強剤が、水非混和性である、通常液体の材料である場合には、増強剤にとって適切な溶媒を、必要に応じて、使用してもよくまたは使用しなくてもよい。
【００４９】
乳化剤は、組成物中に、所望の液体乳剤を形成するのに有効である濃度で存在する。乳化剤を、一般に、組成物の約０．００１〜約５重量％の量で、より一般に、組成物の約０．０１〜約５重量％の量で、最も一般に、組成物の約０．１〜約２重量％の量で使用する。
【００５０】
本発明の組成物は、任意の成分として、組成物中に分散させた粒子状の固体を含んでもよい。例えば、組成物は、乳剤の液体の連続相中に微結晶性固体またはナノ微粒子の形態で分散させた追加の薬学的に活性な化合物を含むことができる。
【００５１】
親水コロイド乳化剤は、乳化液滴の周囲に保護層を形成し、したがって、安定な乳剤を、オストワルド熟成を妨害することによって形成し、さらなる安定化剤を必要としないが、場合によっては、乳剤の安定性をさらに改善するのが望ましい場合もある。そのような改善は、オストワルド熟成阻害剤および／または界面活性剤の添加により達成することができる。
【００５２】
オストワルド熟成阻害剤は、乳化小滴の、凝集し、より大きな小滴を形成する傾向を低下させる材料である。本質的には、任意の適切なオストワルド熟成阻害剤またはそのような阻害剤の混合物を使用して、乳剤の物理的安定性をさらに改善することができる。好ましいオストワルド熟成阻害剤は、炭化水素および炭化水素のろう等の疎水性物質である。疎水性物質の例は、ワセリン、ヘキサデカン、および長鎖エステル、例えば、パルミチン酸オクチルである。オストワルド熟成阻害剤は、組成物中に、乳化小滴、特に、比較的小さな小滴（例えば、直径１ミクロン）がより大きな小滴に凝集するのを阻止するのに有効な濃度で存在する。凝集により、沈下（材料が底部に沈下する）、またはクリーム分離（油が上部に上昇する）が生じる恐れがある。目安にするために述べると、ほとんどの適用例で、オストワルド熟成阻害剤が、組成物の約０．００１〜約５重量％の量、それどころか、組成物の約０．１〜約１重量％の量で使用されると考えられる。
【００５３】
１つの好ましい実施形態では、浸透増強剤を、抗原を含有する水相中に乳化する。乳化は、１以上の適切な界面活性剤の使用を通して行うことができる。本明細書の教示に基づいて、適切な界面活性剤の選択は、当業者の能力範囲に属するとみなされる。そのような界面活性剤として、例えば、アニオン性、カチオン性および非イオン性界面活性剤が挙げられる。好ましい界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤は、単独にしろ、または１以上のその他の界面活性剤と組み合わせるにしろ、親水性親油性バランスの数（ＨＬＢ）が、約４〜約１８のものが好ましく、７と１４との間のものがより好ましく、９と１３との間のものが最も好ましい。そのような非イオン性界面活性剤の例は、ＰＥＧ−６０トウモロコシグリセリド、ＰＥＧ−２０モノステアリン酸ソルビタン、フェノキシ−ポリ（エチレンオキシ）エタノール、モノオレイン酸ソルビタン等である。米国食品化学物質規格集、米国国民医薬品集、米国薬局方および米国連邦規制基準等の概論に記載されているもの等の概論の界面活性剤が、とりわけ好ましい。乳剤の小滴の平均直径が、約５０ナノメートル（ｎｍ）〜約２０マイクロメートル（μｍ）、より好ましくは、約２００ｎｍ〜約５μｍであることが好ましい。一般に、各界面活性剤は、組成物の約２重量％以下、より一般に、組成物の約１重量％以下の量で存在する。また、好ましくは、界面活性剤の側鎖の性質が二重結合を有さないものであることも重要であり、本発明では、不飽和炭素間結合を有さないものを含むことが最も好ましい。この理由は、不飽和脂肪酸側鎖（「オレフィン性」脂肪酸ともまた呼ばれる）には経時的に酸化する傾向があり、界面活性剤が適さないようになることである。不飽和脂肪酸側鎖を有する界面活性剤は、着色するかまたは黒ずみ、同じ製剤中の重要な抗原と反応する恐れがある中間体を引き起こす傾向を示し、製剤の有用性を低下させ、製剤を規制の観点から適さないものとする（例えば、主要規制機関は、米国内ではＦＤＡであり、その他の国ではそれに対応する機関である）。オレフィンは、刺激性に寄与する追加の不利益を有することが疑われ、刺激性は、鼻腔内適用のためには回避しなければならない。しかし、不飽和側鎖の界面活性剤を、本発明における使用から除外するわけではない。例えば、オレイン酸エステルの一不飽和側鎖を含有するポリソルベート８０は、製剤中のその濃度を、一般に、１％未満に制限して使用することによってか、またはグリセリン等の緩和構成成分を製剤に添加して、そのような望まれない作用を打ち消すことによって、その刺激性の不利益を緩和することができる。
【００５４】
１つの好ましい実施形態では、浸透増強剤を含有する、乳化されたまたは不連続な相は、小滴の形態をとる。一般に、より小さな小滴が、より大きな安定性を付与する。より大きな小滴は、不安定性を引き起こす恐れがあり、有効期間を減少させる恐れがある。好ましい実施形態では、脂質の小滴サイズは、０．０２５ミクロン（２５ｎｍ）〜２０ミクロン、好ましくは、０．１ミクロン〜５ミクロンの範囲に及ぶ。
【００５５】
場合によっては、本発明において使用する浸透増強剤、抗原および／または組成物のその他の構成成分が、室温またはより高い温度で結晶化することがある。そのような結晶化を阻害または予防するために、組成物は、１以上の結晶化阻害剤を含むことができる。結晶化は、進行を許すと、乳剤を不安定にし、有効期間に対する有害作用を示す。好ましい結晶化阻害剤は、関与物質が結晶化する温度を低下させることによって機能する。そのような結晶化阻害剤の例として、天然の油、油性材料、ろう、エステルおよび炭化水素が挙げられる。天然の油または油性材料の例として、ビタミンＥ酢酸エステル、パルミチン酸オクチル、ゴマ油、大豆油、紅花油、アボカド油、パーム油および綿実油が挙げられる。そのような結晶化阻害剤の別の例が、ポリエチレングリコール１０００である。本明細書の教示から、適切な結晶化阻害剤の選択は、当業者の能力範囲に属するとみなされる。
【００５６】
例えば、結晶化阻害剤は、関与物質の結晶化温度を約２５℃未満または約５℃未満まで低下させることが可能である場合がある。オキサシクロヘキサデカン−２−オンの結晶化の阻害において使用するのにとりわけ好ましい結晶化阻害剤の例として、ヘキサデカン、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸オクチル、綿実油、紅花油およびビタミンＥ酢酸エステルが挙げられ、それらのそれぞれは、医薬製剤中で使用することができる。
【００５７】
結晶化阻害剤は、組成物中に、組成物の少なくとも１つの構成成分の結晶化を阻害するのに有効な濃度で存在する。一般に、結晶化阻害剤は、組成物の約０．００１〜約５重量％または約０．０１〜約２重量％の量で存在する。一実施形態では、結晶化阻害剤は、組成物の約０．１〜約１重量％の量で存在する。例えば、好ましくは、増強剤が摂氏約０度超の結晶化温度を有する場合に、結晶化阻害剤を使用する。特に、例えば、増強剤がペンタデカラクトンおよび／またはシクロヘキサデカノンである場合には、これらは室温超で結晶化することから、好ましくは、結晶化阻害剤を使用する。
【００５８】
本発明の組成物は、酵素阻害剤を含有することができる。ペプチドおよびタンパク質の生化学における熟練家に周知であるように、ペプチドは、タンパク質分解酵素等、ペプチドを迅速に分解する酵素の存在に対して、微量で存在する場合であっても非常に敏感である傾向を示す。一般に利用されており、本発明に組み込むことができる典型的な酵素阻害剤として、これに限定されないが、ロイペプチン、アプロチニン等が挙げられる。また、酵素阻害剤は、ヌクレアーゼ阻害剤も含む。
【００５９】
鼻腔内へ送達する方法は、免疫応答、例えば、呼吸器（特に、上気道）の局所粘膜における免疫応答を誘発することができる限り、特に限定されない。呼吸器は、細菌およびウイルス等の多くの免疫原の感染経路である。方法の例として、スプレーする方法、スワブする方法、滴下して添加する方法等が挙げられる。医薬組成物は、これらに限定されないが、鼻腔内スプレーデバイス、アトマイザー、ネブライザー、用量計量型吸入器（ＭＤＩ）、加圧投与型吸入器、注入器、鼻腔内吸入器、鼻用スプレーボトル、単位用量容器、ポンプ、滴下器、スクイズボトルまたは二方向性デバイスを含めた、デバイスにより鼻腔内投与することができる。医薬組成物は、ジェル剤、軟膏剤、鼻用乳剤、ローション剤、クリーム剤、鼻用タンポンまたは生体接着性条片の剤型をとって、鼻腔内投与することができる。鼻から送達するデバイスは、正確な有効投与量を鼻腔に投与するように計量することができる。鼻から送達するデバイスは、単回単位を送達することもまたは複数回単位を送達することもできる。また、本発明の化合物は、チューブ、カテーテル、シリンジ、パックテイル（packtail）、綿球、鼻用タンポンによってかまたは粘膜下注入によって送達することもできる。米国特許公開第２００９０３２６２７５号、第２００９０２９１８９４号、第２００９０２８１５２２号および第２００９０３１７３７７号。
【００６０】
一実施形態では、本発明の組成物を、鼻用スプレーのアプリケーターにより送達する。鼻腔内への適用が望まれる場合、組成物を、鼻腔内スプレー型投与デバイスまたはアトマイザー中に収納することができ、対象の鼻孔内に組成物をスプレーすることによって適用して、鼻孔粘膜に送達することができる。十分な量を適用して、所望の全身性のまたは局部的な抗原レベルを達成する。鼻腔内スプレーについては、最高約２００マイクロリットルを典型的には適用し、約５０〜約１５０マイクロリットルの適用が好ましく、７５〜１２０マイクロリットルが最も好ましい。１以上の鼻孔に投与することができ、適用は、所望される限り頻繁にかまたは必要な限り頻繁に行うことができる。好ましい実施形態では、鼻用スプレーのアプリケーターを、約１０ミクロン〜約２００ミクロンの平均サイズの組成物の小滴をもたらすように選択する。より一般に、小滴サイズは、約３０ミクロン〜約１００ミクロンである。
【００６１】
本発明は、経鼻免疫化のための医薬組成物を提供し、この組成物は、有効な免疫応答を誘発することが可能である。特定の状況では、有効な免疫応答は、防御的であり得る。免疫応答を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて測定することができる。測定可能な免疫応答の例として、これに限定されないが、抗原特異的抗体産生（特異的な抗体のサブクラスの測定を含む）、サイトカインの分泌（これらに限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αを含む）、ヒスタミンの放出、リンパ球集団、例として、ＮＫ細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージ等の活性化または拡大増殖が挙げられる。特異的な抗体応答を測定するための方法は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含み、当技術分野で周知である。ＣＤ4+Ｔ細胞等の特定のタイプのリンパ球の数の測定を、例えば、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて達成することができる。細胞傷害アッセイを、例えば、Ｒａｚら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９５１９〜９５２３の記載に従って実施することができる。サイトカインの血清濃度を、例えば、ＥＬＩＳＡにより測定することができる。免疫原に対する免疫応答を評価するためのこれらおよびその他のアッセイは、当技術分野で周知である。例えば、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８０）ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｕｇｉ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ならびに米国特許第７，６２８，９９０号を参照されたい。
【００６２】
抗原または抗体の治療有効量を、要因、例として、抗原の種類、所望の作用、対象の物理的および医学的状態、例として、年齢、体重等に従って変化させることができる。当業者であれば、抗原または抗体の治療有効量は、過度の実験をせずとも決定することができる。当業者であれば、公知の免疫化投与計画および本明細書の教示に基づいて、特定の対象、または複数の対象のために、投与計画および投与量を選択することができる。有効な免疫応答を誘発する抗原の能力または測定可能なパラメータを阻害する抗体の能力を、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。例えば、例に記載されているように、Ｂ．アントラシスを用いたチャレンジからウサギを防御する炭疽抗原の能力から、ヒトにおける有効性を予測することができる。あるいは、抗原／細胞の相互作用、例えば、結合、感染、病原性等を調節する組成物の能力を、当業者に公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアッセイにより検査することによって、抗原または抗体のこの特性を評価することもできる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアッセイは、ＥＬＩＳＡ、および中和アッセイ等の結合アッセイを含む。
【００６３】
本発明の組成物を投与する対象は、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ウシ、イヌ、ウマ、ヤギ等の哺乳動物、およびニワトリ等の鳥を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物を、１超の経路を介して対象に投与する。例えば、病原性微生物に対する防御免疫応答（例えば、免疫）を有することから利益を得るであろう対象は、粘膜投与（例えば、経鼻投与）を受け、さらに、１以上のその他の経路の投与（例えば、非経口または肺投与）も受けることから利益を得ることができる。いくつかの実施形態では、鼻からの経路を介する投与は、抗原に対して、粘膜免疫と全身免疫の両方を誘発するのに十分である。その他の実施形態では、複数の経路を介する投与が、粘膜免疫と全身免疫の両方をもたらすように働く。
【００６５】
好ましい実施形態は、あらかじめ配合された組成物であるが、また、対象を、あらかじめ配合されていない、上記の記載と下記の記載との組合せを用いて治療することができることも本発明の範囲に属する。すなわち、液体キャリア中の抗原と、増強剤とを、適用時に混合することができ、例として、組成物のスプレー時に、アトマイザー中で混合が生じる。
【００６６】
［実施例］
下記の例は、例示的な本発明の組成物である。組成物を構成する成分の濃度を、組成物の総重量に対する重量パーセントで示す。
【００６７】
例第１および２は、鼻腔内スプレー中で使用するための、本発明の組成物の例である。
【００６８】
例第１および２では、Ａ部の成分を、均一になるまで４０℃で機械的に撹拌することによって混合した。Ｂ部の成分を、均一になるまで４０℃で磁気撹拌することを使用して別個に混合し、次いで、Ａ部に添加した。得られた混合物を激しく撹拌し、Ｃ部を、混合物にゆっくり添加した。Ｃ部の添加の後、Ｄ部を添加し、得られた混合物を、４０℃で４時間撹拌した。混合物を、さらに１８時間撹拌しながら室温まで冷却した。次いで、Ｅ部を振とうしながら添加し、４時間撹拌した。得られた混合物を、「プレミックス」と呼ぶ。
【００６９】
薬学的に活性な化合物の所望の濃度の溶液を、別個に調製した。薬学的に活性な化合物を、水と混合し、均一になるまでかき混ぜることによって水中に溶解させた。次いで、ｐＨ改変剤を添加し、得られた混合物を、ローラーミル上で、１２０ｒｐｍ、室温で転がすことによって、溶液が均一になるまで混合した。
【００７０】
プレミックスを、薬学的に活性な化合物の水溶液に室温で添加し、得られた混合物を、ローラーミル上、１２０ｒｐｍで転がすことによって、最終的な混合組成物が均一になるまで混合した。
【００７１】
例１
この例は、ＧＨＲＰ−６（Ｈ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2）の送達のための鼻腔内スプレーとして使用することができる組成物の調製を記載する。
【表１】
2013528623.tif 000005
【００７２】
得られた組成物は、分散相が液滴からなる、安定な乳剤を含み、液滴は、組成物中に一様に分散しており、結晶化阻害剤およびオストワルド熟成阻害剤を含む溶媒中に溶解している増強剤からなった。連続相は、プロピレングリコール、グリセリン、保存剤および薬学的に活性な化合物の水溶液を含んだ。ｐＨ改変剤は、乳化剤と結合しているとみなされた。１００マイクロリットルの組成物が、およそ１００マイクログラムのＧＨＲＰ−６を含有した。
【００７３】
例２
この例は、オキシコドンの送達のための鼻腔内スプレーとして使用することができる組成物の調製を記載する。オキシコドンは、その遊離塩基の形態で使用し、遊離塩基は、市販されている塩酸塩から、２０部の水および化学量論量の１．０Ｎ水酸化ナトリウム中に溶解させることによって調製した。沈殿物を収集し、水を用いて洗浄した。次いで、沈殿物を、真空ポンプを使用して室温で乾燥した。
【００７４】
オキシコドン鼻腔内調製物
【表２】
2013528623.tif 000006
【００７５】
Ａ部の成分を、ペーストが形成されるまで４０℃で機械的に撹拌することによって組み合わせた。次いで、Ｂ部をＡ部と、均一なペーストが形成されるまで４０℃で機械的に撹拌することによって組み合わせた。次いで、Ｃ部を添加し、得られた混合物を、白色の均一な乳剤が形成されるまで室温で機械的に撹拌した。
【００７６】
オキシコドンの遊離塩基は、水中では不溶性であり、アクリレート／Ｃ10-30アルキルアクリレート乳化剤を使用して形成される乳剤を安定化させるのに十分強力である。このことにより、組成物が粘着性の均一な乳剤の形態をとって存在することが可能になり、無機塩の形成を回避するために、さらなるｐＨ改変剤を使用する必要はない。分散相は、結晶化阻害剤およびオストワルド熟成阻害剤を含む溶媒中に溶解している増強剤からなった。連続相は、グリセリン、保存剤および水からなった。薬学的に活性な化合物は、アクリレート／Ｃ10-30アルキルアクリレートクロスポリマー乳化剤と結合しているとみなされた。
【００７７】
１００マイクロリットルの組成物が、およそ２ミリグラムのオキシコドンを含有した。
【００７８】
例３
組換え炭疽抗原を用いた経鼻免疫化
材料および方法
バチルス・アントラシス由来の炭疽防御抗原、ｒＰａを、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ｗｗｗ．ｅｍｄｃｈｅｍｉｃａｌｓ．ｃｏｍ）から購入する。上記の記載に従って、オキサシクロヘキサデカン−２−オンを含有するプレミックスを調製する。ｒＰＡを含有する溶液を別個に調製する。ｒＰＡを、（ｉ）アジュバントなしで、ＰＢＳ中に配合するか、（ｉｉ）アジュバントとしての水酸化アルミニウム（７０ｍｇの水酸化アルミニウム／１０ｍｇのｒＰＡ）（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ；Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）上に吸着させるか、または（ｉｉｉ）アジュバントとしての非メチル化、ホスホロチオエート連結、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（以下、「ＣｐＧ」；  １０ｍｇのＣｐＧ／１０ｍｇのｒＰＡ）（番号１８２６、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’；Ｐｒｏｌｉｇｏ）と共に配合する。プレミックスを、ｒＰＡを含有する溶液に室温で添加し、得られた混合物を、ローラーミル上、１２０ｒｐｍで転がすことによって、最終的な混合組成物が均一になるまで混合する。当業者であれば、製剤中の各成分の特定の量を、過度の実験をせずとも決定することができる。
【００７９】
動物および免疫化
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、６〜８週齢（１０匹のマウス／群）を、１０μｇのｒＰＡを用いて第０、２１および４２日に免疫化する。鼻腔内送達のために、液体を、麻酔を施したマウスの鼻腔内に滴下注入する（各鼻孔中に１５μＬ）。麻酔を施したマウスから、それらの後眼窩鼻腔を介して第２１、４２および５６日に採血する。
【００８０】
雌のＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅウサギ（Ｍｙｒｔｌｅｓ  Ｒａｂｂｉｔｒｙ）（６〜９匹のウサギ／群）を、５０μｇのｒＰＡを用いて第０、２１および４２日に免疫化する。ｒＰＡを、アジュバントなしで、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（３５０ｍｇの水酸化アルミニウム／５０ｍｇのｒＰＡ）またはＣｐＧ（５０ｍｇのＣｐＧ／５０ｍｇのｒＰＡ）を加えてＰＢＳ中に配合する。Ｐｅｎｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ製鼻用噴霧器を、液体ワクチンの鼻腔内送達のために使用する（単一の鼻孔内へ１００μＬ）。ウサギから、それらの耳翼辺縁静脈を介して第２１、４２および５６日に採血する。
【００８１】
ＥＬＩＳＡ
ｒＰＡ特異的抗体価のＥＬＩＳＡ分析を実施する。Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）を、０．０５モル／Ｌの炭酸コーティング用緩衝液（ｐＨ９．６）中の１ｍｇ／ｍＬのｒＰＡを用いて４℃で一晩コーティングする。プレートを、ブロック用緩衝液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中の５％の脱脂粉乳の粉末）中、３７℃で１．５時間ブロックし、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０を用いて３回洗浄する。試料を、二つ組でプレートにわたりブロック用緩衝液中に２倍段階希釈し、３７℃で１時間インキュベートする。３回の洗浄の後、プレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を加えて３７℃で４５分間インキュベートする。洗浄後、プレートを、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ）を加えて室温で３０分間発色させ、発色を、０．５モル／ＬのＨ2ＳＯ4の添加により停止し、光学密度を４５０ｎｍで読み取る。エンドポイントの力価を、未免疫化対照動物から得られた血清試料について得られたバックグラウンドの少なくとも３倍のＯＤ４５０ｎｍの値をもたらす、試料の最も高い希釈度と定義する。抗体のアイソタイプを、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ1またはＩｇＧ2a抗体およびマウス参照標準物質（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の使用により決定する。
【００８２】
毒素中和抗体（ＴＮＡ）アッセイ
ＴＮＡ力価を、Ｌｉｔｔｌｅら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｌｅｔｈａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｌｅｔｈａｌ  ｔｏｘｉｎ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９０；５８：１６０６〜１３に記載されている方法の改変バージョンの使用により決定する。コンフルエントなＪ７７４Ａ．１細胞を、３７℃および５％ＣＯ2中で、無菌９６ウエル透明底黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）中に蒔く（７×１０4細胞／ウエル）。１００ｎｇ／ｍＬのＬＦ（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および２００ｎｇ／ｍＬのｒＰＡを含有する新鮮な溶液を、三つ組の、等しい体積の希釈試料と混合し、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、培地を、ＬＦ、ＰＡおよび試験試料の希釈溶液１００ｍＬと交換し、これを、５％ＣＯ２中、３７℃で４時間インキュベートする。細胞生存率を、ＡＴＰ含有量により決定し（ＶｉａＬｉｇｈｔ  ＨＳ；Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、未処理の細胞を参照対照として使用する。エンドポイントのＴＮＡ力価を、対照の血清試料の中和の３倍超である、ＰＡ−ＬＴの二成分の毒素による細胞傷害性の（ｔ検定による）有意な中和をもたらす最も高い血清の希釈度の逆数と定義する。
【００８３】
Ｂ．アントラシスのエアロゾルチャレンジ
経鼻免疫化の防御の有効性を決定するために、致死的なチャレンジによる研究を、ウサギにおいて実施する。エアロゾルチャレンジを、Ｐｉｔｔら、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｈｒａｘ、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００１；１９：４７６８〜７３の記載に従って実施する。提示するエアロゾルの用量を、曝露前に実施する呼吸器機能の測定から誘導する毎分換気量（Ｖｍ）の推定値を使用することによって計算して決定する。次いで、提示するエアロゾルの用量を、各動物が吸入する実験の大気（Ｖｔ／Ｖｍ×曝露の長さ）の総体積（Ｖｔ）と、チャンバーからの試料採取から実験的に決定する曝露濃度（Ｃｅ）とを乗じることによって計算する（提示する用量＝Ｃｅ×Ｖｔ）。用量を、１．１×１０5ｃｆｕが１致死用量に等しいことに基づいて、致死用量の倍数として表す。ウサギに、１０３±４５ＬＤ50の平均±ＳＤ吸入用量を投与する。生存率を、フィッシャーの直接確率検定の使用により、倍数の比較のためにブートストラップ調節を用いて比較する。死亡までの時間の比較を、ｔ検定の使用により、倍数の比較のためにブートストラップ調節を用いて行う。
【００８４】
例４
大腸菌抗原を用いた免疫化
毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）は、旅行者下痢症の主要な原因である。ＥＴＥＣは、汚染されている食品および飲料を介して伝染する。ＥＴＥＣは、小腸においてコロニー形成し、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）もしくは熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）、または組合せを分泌し、これらのエンテロトキシンは、分泌性下痢を引き起こす。
【００８５】
ＥＴＥＣ由来の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）を含有する鼻からのワクチンを、鼻腔内から送達して研究する。
【００８６】
抗原
未変性の大腸菌ＬＴを、大腸菌株ＨＥ２２  ＴＰ  ２３５  Ｋｍから産生する。上記の記載に従って、ＬＴをオキサシクロヘキサデカン−２−オンおよびその他の構成成分と混合して、鼻用製剤を調製する。
【００８７】
参加者
健常な成人（１８〜４５歳）を、この研究のために登録する。排除の判断基準は、旅行者下痢症の病歴、過去１２ヵ月間に流行国へ旅行したことがあること、コレラ、ＬＴまたはＥＴＥＣワクチンの以前の使用、顕著な疾病、免疫抑制等を含む。
【００８８】
ワクチン投与
ワクチンを、２回に分けて投与する。第１の用量を第０日に、第２の免疫化を第１５日に投与する。
【００８９】
ワクチン接種後の経過観察
ボランティアを、それぞれの投与後、即時の有害作用の発生について２０分間観察する。ボランティアに、ワクチン接種後に観察される徴候および症状を記録するための日記帳を与える。報告される症状を、軽度（認め得る）、中等度（通常の日々の活動に影響を及ぼす）、または重度（通常の日々の活動を中断させる）に段階付ける。ボランティアを、臨床評価および副作用の可能性の評価について第２４および４８時間時に評価する。ワクチンの皮膚反応の徴候を示すボランティアに、さらなる臨床評価のために第７２時間時に外来を再度訪れるように指示する。次いで、ボランティアを、必要に応じて、副作用が完全に消散してしまうまで追跡する。
【００９０】
ＡＳＣ免疫応答
抗体分泌細胞（ＡＳＣ）のワクチン抗原に対する応答を、この研究についての免疫学的エンドポイントとして選ぶが、これは、以前の研究が、ＡＳＣ応答が腸粘膜の免疫応答と相関することを示しているからである。Ｗｅｎｎｅｒａｓら  １９９２、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ａｆｔｅｒ  ｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｖａｃｃｉｎｅ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：２６０５〜２６１１。静脈血試料を、ボランティアから、免疫化前の第０日、ならびに最初の免疫化後の第７、２８、３５、５６、８４、９１、９８および１１２日に得る。血液標本を、ＥＤＴＡ処理チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、Ｎ．Ｊ．）を使用して収集する。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、血液試料から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）上で勾配遠心分離することによって単離し、ＩｇＡおよびＩｇＧ  ＡＳＣの総数およびワクチンに特異的な数について、酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）の技法によりアッセイする。ニトロセルロース製底部の９６ウエルプレート（Ｍｉｌｌｉｔｉｔｅｒ  ＨＡ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）の個々のウエルを、０．１ｍｌの精製ＣＳ６（２０μｇ／ｍｌ）またはＧＭ１ガングリオシド（０．５μｇ／ｍｌ）を用いてコーティングし、４℃で一晩インキュベートする。ＧＭ１でコーティングしたウエルを、ＰＢＳ洗浄の後、ＬＴ（０．５μｇ／ｍｌ）に３７℃で２時間曝露する。プレートを、ＰＢＳを用いて洗浄した後、５％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を補充した完全ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）を用いてブロックする。ＰＢＭＣを、完全ＲＰＭＩ培地中で、２×１０7個の生存細胞／ｍｌに調節する。最終的なＰＢＭＣ懸濁液０．１ｍｌを、各ウエルに添加し（１ウエル当たり１０6個のＰＢＭＣを添加する）、プレートの内容物を、５．０％ＣＯ2中、３７℃で４時間インキュベートする。プレートを洗浄する。それらの内容物を、明確に異なるアイソタイプ特異性を有する、親和性により精製されているヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体２つの混合物（一方は、アルカリホスファターゼにコンジュゲートさせた抗体（ＩｇＧ）であり、他方は、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗体（ＩｇＡ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａ．）である）を加えて４℃で一晩インキュベートし、適切な色素原−酵素基質（Ｓｉｇｍａ）に曝露する。個々の細胞が分泌した抗体の帯域に対応するスポットを、三つ組のウエル中で、×４０の倍率下で計数し、データを、１０6個のＰＢＭＣ当たりのスポット形成細胞の数として表す。以前の記載に従って（Ｊｅｒｔｂｏｒｎら、２００１、Ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ  ｔｏ  ａｎ  ｏｒａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｖａｃｃｉｎｅ、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：４２４〜４２８）、我々は、ベースラインの試料中のＡＳＣの数が、１０6個のＰＢＭＣ当たり≧０．５である場合には、１０6個のＰＢＭＣ当たりのＡＳＣのベースラインの値と比べた≧２倍の増加と、陽性のＡＳＣ応答を定義する。免疫前のＡＳＣの数が、１０6個のＰＢＭＣ当たり０．５未満である場合には、投与後の、１０6個のＰＢＭＣ当たり＞１．０の値を陽性の応答とみなす。
【００９１】
血清抗体の測定
静脈血試料を、ボランティアから、免疫化前、ならびに各免疫化後の第１４および２８日に得て、血清抗体価を測定する。ＬＴに対するＩｇＡおよびＩｇＧ抗体価を、ＧＭ１−酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の方法により測定する（Ｊｅｒｔｂｏｒｎら、１９９８、Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｖａｃｃｉｎｅ、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：２５５〜２６０）。ＬＴを固相抗原として使用する。ＥＬＩＳＡのために使用するＬＴは、ワクチンの調製のために使用するのと同じロットから得る。個々のマイクロタイターウエル（ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ；Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）を、ＧＭ１ガングリオシド（０．５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温で一晩、３７℃で一晩コーティングする。次いで、ＧＭ１でコーティングしたウエルを、ＰＢＳを用いて洗浄し、０．１ｍｌのＬＴ（０．５μｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で２時間インキュベートする。血清試料を、０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いてブロックした後、３倍段階希釈し（最初の希釈度は、１：５）、次いで、室温で９０分間インキュベートする。結合している抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたウサギ抗ヒトＩｇＡまたはＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、Ｐａ．）の添加により実証し、室温で９０分間インキュベートし、続いて、ｏ−フェニレンジアミン−Ｈ2Ｏ2（Ｓｉｇｍａ）を添加する。バックグラウンドを０．４上回る４５０ｎｍにおける光学密度（４５０ｎｍにおける吸光度）をもたらす、内挿された試料の希釈度としてエンドポイントの力価を割り当てる。力価を、各試験に含めた参照標本に関して調節して、毎日の変動を償う。同じボランティアから得られる投与の前および後の血清試料を、常に並べて試験する。各試料に帰属させる抗体価は、異なる日に実施する二つ組の決定の幾何平均を示した。＜５であるエンドポイントの力価の逆数には、計算のために２．５の値を割り当てる。我々は、有意な応答（血清転換）を、免疫化前と免疫化後との間における、エンドポイントの力価の≧２倍の増加と定義し、免疫化後の力価の逆数が≧１０であることを追加の判断基準とする。Ｇｕｅｒｅｎａ−Ｂｕｒｇｕｅｎｏら、Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ、ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＩＴＹ、２００２、１８７４〜１８８０頁。
【００９２】
例５
炭水化物抗原を用いた免疫化
血液型に関連するＴｎ、Ｔ、シアリル−Ｔｎ、シアリル−Ｔ抗原（Ｔ抗原のファミリー）ならびに糖脂質ＧＭ２、ＧＤ２およびＧＤ３等の炭水化物抗原は、種々の癌と関連がある。Ｌｏ−Ｍａｎｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４：４９８７（２００４）。悪性の形質転換により、グリコシル化の調節不全が生じるように見える。炭水化物に対する抗体を開発することによって、腫瘍に対する攻撃の新しいモードを提供することができる。例えば、ＣＡ−１９−９は、膵臓、胃および結腸直腸を含めた、種々の消化器の腫瘍と関連がある。Ｄｕｆｆｙ  Ｍ．Ｊ．、ＣＡ  １９−９  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８、３５（Ｐｔ３）：３６４〜７０。ＣＡ−１９−９を含有する鼻用製剤を、以下に従って調製する。
【００９３】
抗原
上記の記載に従って、オキサシクロヘキサデカン−２−オンを含有するプレミックスを調製する。ＣＡ−１９−９を含有する溶液を別個に調製する。プレミックスを、ＣＡ−１９−９を含有する溶液に添加し、得られた混合物を、最終的な混合組成物が均一になるまで混合する。
【００９４】
免疫化
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、６〜８週齢（１０匹のマウス／群）を、上記の記載に従って配合した５００μｇ〜２ｍｇのＣＡ−１９−９を用いて、第０、２１および４２日に免疫化する。免疫化を、鼻腔内スプレーデバイスを使用して実施する。
【００９５】
ＥＬＩＳＡ
９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）を、０．０５モル／Ｌの炭酸コーティング用緩衝液（ｐＨ９．６）中の０．２５ｍｇ／ｍＬのＣＡ−１９−９を用いて４℃で一晩コーティングする。プレートを、ウシ血清アルブミンを使用してブロックする。免疫化したおよび対照のマウスから得られた血清試料を、二つ組でプレートにわたりブロック用緩衝液中に２倍段階希釈し、３７℃で１時間インキュベートする。プレートを、洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を加えてインキュベートする。プレートを、洗浄後、テトラメチルベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で３０分間発色させ、反応を停止する。光学密度を４５０ｎｍで読み取る。エンドポイントの力価を、未免疫化対照動物から得られた血清試料について得られたバックグラウンドの少なくとも３倍のＯＤ４５０ｎｍの値をもたらす、試料の最も高い希釈度と定義する。抗体のアイソタイプを、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ抗体およびマウス参照標準物質（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の使用により決定する。
【００９６】
例６
多糖を用いた免疫化
ストレプトコッカス・ニューモニエは、肺炎球菌性肺炎および肺炎球菌性菌血症を引き起こす恐れがある。ストレプトコッカス・ニューモニエに対する肺炎球菌多糖体ワクチンの構成成分となる精製肺炎球菌多糖体を、ＡＴＣＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｃｕｌｔｕｒｅｓａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ／ｐｕｒｉｆｉｅｄｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ／ｔａｂｉｄ／１８５／ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐｘ）から購入する。また、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）２３（肺炎球菌ワクチン、多価）もＭｅｒｃｋから購入することができる。ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）２３は、ストレプトコッカス・ニューモニエの２３種の最も流行性または侵襲性の肺炎球菌のタイプに由来する高度に精製された莢膜多糖体の混合物からなる。肺炎球菌多糖体を含有する鼻用製剤を、以下に従って調製する。
【００９７】
抗原
上記の記載に従って、オキサシクロヘキサデカン−２−オンを含有するプレミックスを調製する。肺炎球菌多糖体を含有する溶液を、別個に調製する。プレミックスを、肺炎球菌多糖体を含有する溶液に添加し、得られた混合物を、最終的な混合組成物が均一になるまで混合する。
【００９８】
免疫化
マウスまたはヒト対象を、肺炎球菌多糖体を含有する製剤を用いて鼻から免疫化し、抗体価を試験する。予防接種の実施に関する諮問委員会（ＡＣＩＰ）が、肺炎球菌性疾患の予防についてのワクチンに特定された勧告を示している。それらは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｍｍｗｒ／ＰＤＦ／ｒｒ／ｒｒ４６０８．ｐｄｆ、およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ｒｅｃｓ／ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｐｎｅｕｍｏ−Ｏｃｔ−２００８−５０８．ｐｄｆから入手可能である。
【００９９】
例７
ＤＮＡワクチンを用いた免疫化
ＤＮＡワクチンは、防御免疫応答を発生させる新規の方法を提供する。上記の例３では、マウスを、バチルス・アントラシス由来の組換えｒＰＡを用いて免疫化した。以下の実験では、マウスを、防御抗原（ＰＡ）の解毒化形態をコードするＤＮＡプラスミドを用いて鼻から免疫化し、抗体価を試験する。
【０１００】
防御抗原をコードする組換えプラスミドを調製し、鼻用製剤を、上記の記載に従って開発する。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、ＰＮＡＳ  １０１（３７）：１３６０１〜１３６０６（２００４）。マウスを組換え防御抗原を含有する製剤を用いて鼻から免疫化し、以前の記載に従って、抗体価を試験する。
【０１０１】
例８
バクテリオファージラムダを送達ビヒクルとして用いるＤＮＡワクチンによる免疫化
ＤＮＡワクチン接種においては、ワクチン遺伝子を真核生物発現カセットの制御下に含有するプラスミドを使用して、宿主にワクチン接種することができる（「裸のＤＮＡ」によるワクチン接種）。また、全バクテリオファージλ粒子も、ＤＮＡワクチンの送達ビヒクルとして使用することができる。この系においては、ワクチン抗原を適切な真核生物発現カセット中でコードする遺伝子を、標準的なλｇｔ１１バクテリオファージ内にクローニングし、バクテリオファージ粒子全体を使用して、宿主に接種する。ＤＮＡを、安定なタンパク質マトリックス内に含有させ、このマトリックスは、ＤＮＡをヌクレアーゼ分解から防御し、併せてまた、ワクチンの抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する標的化も行う。
【０１０２】
Ｂ型肝炎表面抗原（λ−ＨｂｓＡｇ）等のワクチン挿入部を、λｇｔ１１バクテリオファージのＥｃｏＲＩ部位内へクローニングし、次いで、このバクテリオファージを、大規模に成長させ、精製する。鼻用製剤を上記の記載に従って開発し、これを使用して、ウサギまたはマウスを鼻腔内から免疫化する。抗体価を、以前の記載に従って試験する。
【０１０３】
ファージベクターは、それらの大型のクローニング能力に起因して、全てが単一のバクテリオファージ粒子内に含有される、単一の構築物内の複数のワクチン、大型のイントロン含有真核生物遺伝子の使用、および分子アジュバント（例えば、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５）の同時投与の可能性を提供する。また、ハイブリッドファージワクチンも試験する。ファージλの大型のクローニング能力を、比較的高分子量のタンパク質の多くのコピーをディスプレイするその能力と組み合わせると、同じファージ粒子上でタンパク質ワクチンまたはタンパク質アジュバントと組み合わせたＤＮＡワクチンの送達が可能になる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｉ．ｓａｒｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｄｆ／ｂａｃｔ−ｊｃｌａｒｋ−ｐｏｓｔｅｒ１．ｐｄｆ。Ｃｌａｒｋら、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｈｕｍａｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ？  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００４  Ａｕｇ；３（４）：４６３〜７６。Ｍａｒｃｈら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｕｓｉｎｇ  ｗｈｏｌｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ．２００４  Ａｐｒ  １６；２２（１３〜１４）：１６６６〜７１。Ｃｌａｒｋら、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４  Ｊａｎ  １５；４０（ｌ）：２１〜６。Ｊｅｐｓｏｎら、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ  ｉｓ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ、Ｖａｃｃｉｎｅ．２００４  Ｊｕｎ  ２３；２２（１９）：２４１３〜９。
【０１０４】
例９
不活性化ウイルスを用いた免疫化
この例は、経鼻免疫化のために、不活性化した全Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスを抗原として使用する。
【０１０５】
抗原の調製
Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）を、１０％仔ウシ血清を含有するダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）中に維持する。１０5ｐｆｕのインフルエンザＡ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）を、１０または１１日齢のニワトリの胚発育卵に接種することによって、インフルエンザウイルスのストックを調製する。４０時間のインキュベーション後、卵を４℃に一晩移す。尿膜液を集め、１５００×ｇで２０分間遠心分離して、細胞デブリを除去する。透明な上清を、１２０，０００×ｇで１時間遠心分離して、インフルエンザウイルス粒子をペレット化し、これらを、ＰＢＳ中に再懸濁し、遠心分離により、不連続スクロース勾配（１５％、３０％および６０％）層を使用してさらに精製する。ウイルスの純度を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクマシーブルー染色により分析する。赤血球凝集活性を、以前の記載に従って、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２中で、ニワトリ赤血球（ＲＢＣ）０．５％（ｗ／ｖ）を用いて決定する。Ｃｏｍｐａｎｓ  ＲＷ、Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：ｒａｐｉｄ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９７４；１４（５）：１３０７〜９。Ｎｏｖａｋら、Ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９３；１ｌ（ｌ）：５５〜６０。不活性化のために、精製したウイルスを、１：４０００（ｖ／ｖ）ホルマリンを用いて処理し、３７℃で３日間インキュベートし、次いで、ＰＢＳに対して透析する。ウイルスの不活性化を、１０日齢のニワトリの胚発育卵中へのウイルスの接種およびＭＤＣＫ細胞中でのプラークアッセイにより確認する。Ｓｈａら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４（＋）Ｔ−ｃｅｌｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０００；７４（１１）：４９９９〜５００５。
【０１０６】
上記の記載に従って、オキサシクロヘキサデカン−２−オンを含有するプレミックスを調製する。不活性化ウイルスを含有するミックスを、別個に調製する。プレミックスを、不活性化ウイルスを含有するミックスに添加し、得られた混合物を、最終的な混合組成物が均一になるまで混合する。
【０１０７】
コレラ毒素（ＣＴ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入する。精製マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＡ抗体を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から得る。全てのＥＬＩＳＰＯＴ試薬を、ＢＤ−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから購入する。ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αのためのＥＬＩＳＡ試薬を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のためのＥＬＩＳＡ試薬を、ＢＤ−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから購入する。安定なジアミノベンジジンを、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から得る。受容体破壊酵素ノイラミニダーゼ（ＲＤＥ）を、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入する。
【０１０８】
免疫化
雌のＢａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入し、鼻腔内免疫化のために使用する。我々は、１２匹のマウス／群を使用する（同じ群内の６匹のマウスを、チャレンジ研究のために使用する）。鼻腔内免疫化のために、５０μｇの不活性化インフルエンザウイルスを、５０μｌのＰＢＳ中で希釈したＣＴ（１００μｇ）を加えてまたは加えずに、３回、第０、３および６週において投与する。
【０１０９】
血清、膣洗浄液、肺洗浄液、唾液および糞便の収集
血清を、免疫前試料として予備刺激の４日前に、かつ第１および第３の免疫化の２週間後に収集する。血液を、イソフルラン（Ｎｏｖａｐｌｕｓ）を用いた麻酔後に、後眼窩神経叢から、非ヘパリン処理ミクロキャピラリーを用いて収集する。肺洗浄液は、肺を、ＰＢＳを用いて洗浄することによって収集する。唾液を、分泌を刺激するための２μｇのカルバモイルコリンクロリドの腹腔内注射の後に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中に収集する。膣洗浄液試料は、膣を、２００μｌの無菌のＰＢＳを用いて洗浄することによって収集する。糞便試料を、収集し、秤量し、ＰＭＳＦを有する無菌のＰＢＳ、１ｍｌ中に再懸濁し、これを、均一になるまで激しくボルテックスし、２０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を、収集し、ろ過し、アッセイするまで−２０℃で保存する。全ての試料を、プロテアーゼ阻害剤のフッ化フェニルメチルスルホニル（１ｍＭ）と混合し、アッセイするまで−２０℃で保存する。
【０１１０】
マウスのインフルエンザウイルスを用いたチャレンジおよび肺の力価の測定
感染後の、無処置および免疫化マウスの肺中のインフルエンザウイルス力価を決定するために、動物に対して、最後の免疫化の１１週間後に、２５μｌのウイルス（６００ｐｆｕ）（１×ＬＤ50）の鼻腔内滴下注入によりチャレンジを行う。チャレンジしたマウスを、病的状態の徴候（体重変化、発熱および猫背の姿勢）、ならびに死亡についてモニターする。マウスの体重を、チャレンジの直前に測定し、チャレンジ後は毎日測定する。各群のマウスの半分を、チャレンジ後の第４日および第８日に屠殺する。肺のホモジネートを、血清を含有しないＤＭＥＭ培地中に調製して、肺組織１ｇ当たりで決定されるウイルス力価を評価する。Ｓｈａら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４（＋）Ｔ−ｃｅｌｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０００；７４（１１）：４９９９〜５００５。プラークアッセイのために、我々は、肺上清の段階希釈物を調製し、それらを、コンフルエントなＭＤＣK単層細胞と共にインキュベートし、０．７５％寒天および０．０２５％トリプシンを有するＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）を用いて覆う。３日間の培養の後、細胞を、２０％エタノールを用いて固定し、２０％エタノール中の１％クリスタルバイオレットを用いて染色し、プラークを計数する。
【０１１１】
液性免疫応答の評価
全ての血清および粘膜分泌物中のウイルス特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＡの濃度を、以前の記載に従って、精製不活性化インフルエンザウイルスを用いてコーティングしたＥＬＩＳＡ用プレート中で決定する。Ｓｈａら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４（＋）Ｔ−ｃｅｌｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０００；７４（１１）：４９９９〜５００５。Ｋａｎｇら、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３；７７（６）：３６１５〜２３。Ｋａｎｇら、Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｓｉｍｉａｎ−ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００４；７８（１８）：９６２４〜３２。我々は、以前の記載に従って、赤血球凝集阻害（ＨＩ）および中和抗体価を決定し、これらの両方を、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答の指標として使用する。Ｓｈａら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４（＋）Ｔ−ｃｅｌｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０００；７４（１１）：４９９９〜５００５。Ｎｏｖａｋら、Ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９３；１１（１）：５５〜６０。
【０１１２】
細胞性免疫応答の評価
（１）サイトカインのＥＬＩＳＡ
脾臓または鼠径部リンパ節の細胞（０．２×１０6／２００μｌの完全ＲＰＭＩ培地）を、最後の免疫化後の第２週に免疫化マウスから調製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、不活性化インフルエンザウイルスを用いて完全ＲＰＭＩ培地中、１μｇ／ｍｌの最終濃度で刺激する。Ｓｈａら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４（＋）Ｔ−ｃｅｌｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０００；７４（１１）：４９９９〜５００５。Ｋａｎｇら、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３；７７（６）：３６１５〜２３．Ｋａｎｇら、Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｓｉｍｉａｎ−ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００４；７８（１８）：９６２４〜３２。７２時間後、細胞を遠心分離し、上清を収集し、アッセイするまで−８０℃で保存する。サイトカインの産生（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）を、製造元の指示に従って決定する。
【０１１３】
（２）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
免疫化マウスから単離して間もない脾細胞およびＬＮ細胞（０．５〜１．０×１０6／２００μｌの完全ＲＰＭＩ）を、以前の記載に従って、完全ＲＰＭＩ培地中、１μｇ／ｍｌのホルマリンの存在下で不活性化インフルエンザウイルスと共に３６時間培養する。Ｋａｎｇら、Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｓｉｍｉａｎ−ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００４；７８（１８）：９６２４〜３２。手短に述べると、捕捉抗体ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＬ−１２ｐ７０（炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中、４μｇ／ｍｌ）を使用して、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ９６ウエルろ過用プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を４℃で一晩コーティングする。抗体でコーティングしたプレートを、ＲＰＭＩ１６４０中で１０％ウシ胎仔血清を用いて３７℃で１時間ブロックした後、完全ＲＰＭＩ緩衝液１６４０中の単離して間もない脾細胞またはリンパ球を、二つ組のウエル中の各ウエルに添加する。脾臓細胞（１．０×１０6／２００μｌ）を、不活性化インフルエンザウイルス（１μｇ／ｍｌ）またはペプチド刺激薬と混合し、３６〜４０時間培養する。同様に、ＬＮ細胞（１．０×１０6／２００μｌ）も、不活性化インフルエンザウイルス（１μｇ／ｍｌ）の存在下で培養する。サイトカインに特異的なスポットを検出するために、我々は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＬ−１２に特異的なビオチン化抗マウス抗体、ならびにストレプトアビジン−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を使用する。スポットを、安定なジアミノベンジジン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて発色させ、ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で計数する。
【０１１４】
Ｓｋｏｕｎｔｚｏｕら、Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４（２００６）６１１０〜６１１９。
【０１１５】
例１０
偽感染性ウイルスを用いた免疫化
西ナイルウイルス（ＷＮＶ）は、フラビウイルス科のフラビウイルス属に属するポジティブセンス、一本鎖ＲＮＡウイルスである。機能性Ｃ遺伝子を欠く偽感染性のＷＮＶは、ＲｅｐｌｉＶＡＸ  ＷＮと名付けられ、西ナイル脳炎に対するワクチン候補として開発されている。Ｗｉｄｍａｎら、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｓｅｕｄｏｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００８）２６、２７６２〜２７７１。ＲｅｐｌｉＶＡＸ  ＷＮは、ＲｅｐｌｉＶＡＸ  ＷＮの成長をトランスに補足するのに必要であるＣタンパク質を安定に発現するように工学的に作製されたＢＨＫ細胞およびワクチン用に認められているベロ細胞中で、高い力価で安全に増殖することができる。第２世代のＲｅｐｌｉＶＡＸ  ＷＮ（ＲｅｐｌｉＶＡＸ  ＷＮ．２）が近く開発される。
【０１１６】
細胞培養およびウイルス
全ての研究のために使用されたベビーハムスター腎臓細胞、滴定のために使用されたベロ細胞、および盲検法による継代研究が、以前に記載されたことがある。Ｍａｓｏｎら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００６；３５１（２）：４３２〜４３。ワクチン基質のベロ細胞（Ｓ．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を、ＯｐｔｉＰｒｏ無血清培地（ＳＦＭ）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に維持する。所望のフラビウイルス遺伝子をコードするベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン（ＶＥＥｒｅｐ）をもつ細胞株をピューロマイシン（１０μｇ／ｍｌ）により選択することによって、パッケージング細胞株を生成する（下記を参照されたい）。シロフクロウ単離株のＷＮＶ  ＮＹ９９（Ｒ．Ｂ．Ｔｅｓｈ、ＵＴＭＢ）を、全ての動物研究のために使用する。Ｘｉａｏら、Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｏｌｄｅｎ  ｈａｍｓｔｅｒ（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）：ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ、Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００１；７（４）：７１４〜２１。マウスに対して、１０００ｆｆｕのウイルス（８週齢のマウスにおける１０ＬＤ５０に対応する）を用いてチャレンジを行い、ハムスターに対して、１×１０６ｆｆｕを用いてチャレンジを行う。
【０１１７】
抗原
プラスミドの構築、ＲＮＡ転写およびトランスフェクションを本質的には、Ｗｉｄｍａｎら、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｓｅｕｄｏｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００８）２６、２７６２〜２７７１の記載に従って実施する。
【０１１８】
ＢＨＫ（ＶＥＥｒｅｐ／Ｐａｃ−Ｕｂｉ−Ｃ*）細胞内への、合成ＲｅｐｌｉＶＡＸ  ＷＮ  ＲＮＡのエレクトロポレーションから得られるＲｅｐｌｉＶＡＸ  ＷＮ粒子を、続く感染のために使用する。ＲｅｐｌｉＶＡＸ  ＷＮの継代を、１％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび抗生物質を含有するＭＥＭ（維持培地）中、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で実施する。培地を、感染後、２４時間間隔で交換し、第７２時間の試料を、続く感染のために使用する。
【０１１９】
上記の記載に従って、ＲｅｐｌｉＶＡＸ  ＷＮをオキサシクロヘキサデカン−２−オンおよびその他の適切な構成成分と混合して、鼻用製剤を形成する。
【０１２０】
免疫化
１５匹の５週齢の雌のＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）からなる群を、ＲｅｐｌｉＶＡＸ  ＷＮ、ＲｅｐｌｉＶＡＸ  ＷＮ．２、または希釈剤単独（偽）を用いて鼻腔内から免疫化する。動物を、嗜眠および後肢の麻痺を含めた、ワクチンが誘発する副作用についてモニターする。ワクチン接種後の第２１日に、血清を、全ての動物から後眼窩からの採血により収集する。７日後に、動物に対して、１０ＬＤ５０のＷＮＶ  ＮＹ９９を用いてｉ．ｐ．チャレンジを行い、動物を、体重および健康の変化について１４日間モニターする。瀕死とスコア化される動物は、翌日、安楽死させ、「死んだ」とスコア化する。
【０１２１】
１０匹の４週齢の雌のＳｙｒｉａｎハムスター（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）からなる群を、１００μｌの体積の維持培地中のＲｅｐｌｉＶＡＸ  ＷＮまたは希釈剤（偽）を用いてｉ．ｐ．免疫化する。動物を、ワクチンが誘発する副作用について３週間モニターし、ワクチン接種後の第２１日に、血清を全ての動物から得る。７日後に、ハムスターに対して、１００μｌのＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ中で希釈した、１×１０６ｆｆｕのＷＮＶ  ＮＹ９９を用いてｉ．ｐ．チャレンジを行い、体重および健康を３週間モニターする。瀕死とスコア化される動物は、翌日、安楽死させ、「死んだ」とスコア化する。
【０１２２】
ＥＬＩＳＡおよび中和アッセイ
ＷＮＶ  ＥおよびＮＳ１に対する血清抗体価を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定する。Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＭＡ）を、ＶＥＥｒｅｐ担持細胞株（上記を参照されたい）から集めたＮＳ１またはＥタンパク質で感作し、次いで、個々の血清（１：１００に希釈）を加えて１時間インキュベートする。ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート抗体（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を、プレートに１時間添加し、結合したＨＲＰを、ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を加えてインキュベートしてから、１Ｍ  ＨＣｌを用いてクエンチすることによって検出する。反応生成物を、４５０ｎｍで分光光学的に定量し、値を、血清の代わりに希釈剤を加えたウエルから検出されるバックグラウンドの活性について補正する。中和抗体（ｎｅｕｔ）価を、ホタルルシフェラーゼをコードするＷＮＶ  ＶＬＰ（ＷＮＶＬＰ）に感染させたベロ細胞から得られるルシフェラーゼ活性の９０％の低下をもたらす血清の希釈度を測定することによって決定する。これは、古典的なフォーカス減少アッセイ（focus reduction assay）に匹敵することが示されているアッセイである。熱不活性化し、プールした血清試料の２倍段階希釈物を、一定量の、ルシフェラーゼをコードするＷＮＶＬＰを加えて３７℃で１時間インキュベートする。これらのＶＬＰ／血清の混合物を使用して、黒色９６ウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ）中のベロ細胞の単層に２時間感染させ、この時点で、感染用培地を、維持培地と交換し、２４時間インキュベートしておく。２５％Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を有する細胞溶解用緩衝液を含有する溶液を、各ウエルに、培地に対して１：１（ｖ／ｖ）の比で添加する。プレートを、ルミノメーター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）上で読み取り、ＷＮＶＬＰに感染させ、希釈剤のみの中、３７℃でインキュベートした単層から調製する溶解液から得られる活性のパーセントとして、光アウトプットを表す。
【０１２３】
例１１
抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける経粘膜浸透
Ｐｒｏｌｉａ（商標）（デノスマブ）は、ヒトＲＡＮＫＬ（核内因子カッパ−Ｂリガンドの受容体活性化因子）についての親和性および特異性を有するヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体である。Ｐｒｏｌｉａは、ＲＡＮＫＬに結合し、ＲＡＮＫＬは、骨の再吸収に関与する細胞である破骨細胞の形成、機能および生存に必須の膜貫通性または溶解性のタンパク質である。Ｐｒｏｌｉａは、ＲＡＮＫＬが、破骨細胞およびそれらの前駆体の表面上のその受容体ＲＡＮＫを活性化するのを阻止する。ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫの相互作用の阻止は、破骨細胞の形成、機能および生存を阻害し、それによって、皮質骨と海綿骨の両方において、骨の再吸収を減少させ、骨の質量および強度を増加させる。
【０１２４】
デノスマブは、およそ１４７キロダルトンの分子量を有し、遺伝子工学的に作製された哺乳動物（チャイニーズハムスター卵巣）細胞中で産生される。（ｈｔｔｐ：／／ｐｉ．ａｍｇｅｎ．ｃｏｍ／ｕｎｉｔｅｄ＿ｓｔａｔｅｓ／ｐｒｏｌｉａ／ｐｒｏｌｉａ．ｐｉ．ｐｄｆを参照されたい）
上記の記載に従って、デノスマブの鼻用製剤を、オキサシクロヘキサデカン−２−オンを用いて調製する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける浸透研究を、切除したヤギ鼻粘膜を使用して実施する。浸透プロファイルを、ＥＬＩＳＡにより評価する。また、浸透研究の前および後における鼻粘膜の組織学的研究も実施する。
【０１２５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける浸透研究
フランツセルｉｎ  ｖｉｔｒｏ有限投与モデル（Finite Dose Model）は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける薬剤の局所または経鼻粘膜送達および吸収プロファイルを予測するための信頼できる方法を提供している。手短に述べると、フランツセル、ドナーチャンバー、膜（これは、（ヒトまたは動物の）皮膚または鼻粘膜であり得る）、およびレセプターチャンバー。試験製剤を膜上に置き、レセプターチャンバー中の試験薬剤の出現を、種々の時点において測定する。
【０１２６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける浸透研究を、１００ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６、０．１Ｍ）を含有し、切除したヤギ鼻粘膜を使用するフランツ拡散セルを使用して実施する。Ｒａｎｅｙら、３０ｔｈ  ａｎｎｉｖｅｒｓａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｒａｎｚ  ｃｅｌｌ  ｆｉｎｉｔｅ  ｄｏｓｅ  ｍｏｄｅｌ：ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｂａｌｌ  ｏｆ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｔｅｃｈ．２００８、８、７：３２。Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｃｉｓｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｎａｓａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ａｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｎａｓａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２０００；８９：３９６〜４０７。Ｂａｓｕら、Ｓｃｉ  Ｐｈａｒｍ．２００９；７７：８９９〜９１０。ヤギの鼻を地域の屠殺場から得る。鼻を、皮膚を除去した後、氷冷リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．０５Ｍ）上に保存する。中隔を完全に曝露させ、鼻粘膜を、ピンセットおよび外科用ハサミを使用して慎重に取り出す。粘膜組織を、リンゲル液中に直ちに浸漬する。鼻粘膜を、約２〜３ｃｍ2の浸透領域を提示するフランツ拡散セル上にマウントし、デノスマブを含有する鼻用製剤を、その上に置く。研究全体を通して、チャンバー内の緩衝溶液を、フランツ拡散セルを水浴と接続することによって、３７±１℃に維持する。所定の時間間隔で１回に１ｍｌの試料を抜き取り、等しい量のリン酸緩衝液で交換する。
【０１２７】
ＥＬＩＳＡ
９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）を、０．０５モル／Ｌの炭酸コーティング用緩衝液（ｐＨ９．６）中のＲＡＮＫＬを用いて、４℃で一晩コーティングする。プレートを、ウシ血清アルブミンを使用してブロックする。フランツ拡散セルのレセプターチャンバーから得られる試料を、二つ組でプレートにわたりブロック用緩衝液中に段階希釈し、３７℃で１時間インキュベートする。プレートを、洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を加えてインキュベートする。プレートを、洗浄後、テトラメチルベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で３０分間発色させ、反応を停止する。光学密度を４５０ｎｍで読み取る。
【０１２８】
鼻粘膜の組織学的評価
切除した鼻粘膜の組織学的研究を、５時間のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける浸透の後に実施して、いずれかの顕著な組織学的変化が実験の間に生じているかを検出する。鼻粘膜は、浸透研究の後、製剤を一掃し、回転式ミクロトームを用いて切片化し、１０％ホルマリン溶液中で固定する。次いで、切片化した組織を、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色する。別の正常な粘膜を、対照として採取し、同様に処理する。組織切片を、光学顕微鏡下で観察する。
【０１２９】
本明細書において示し、論じる実施形態は、本発明を作製し、使用するための本発明者らに分かっている最良の方法を当業者に教示することのみを意図する。本明細書中のいかなる記載も本発明の範囲を限定するとみなしてはならない。当業者であれば、上記の教示に照らして理解するように、本発明から逸脱することなく、上記記載の本発明の実施形態の改変形態および変更形態が可能である。したがって、特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内で、本発明は、具体的に記載したものとは別の方法で実行することができることを理解されたい。
【０１３０】
本明細書に引用する特許、出願、刊行物、試験方法、文献およびその他の材料は全て、参照により本明細書に組み込まれている。
【配列表】
2013528623000001.app
【国際調査報告】
2013528623.tif 000013