(57)【要約】本発明は、分解性ポリマーネットワークの製造方法に関する。本発明の分解性ポリマーネットワークの製造方法は、ａ）２０℃〜２００℃の温度で環状カーボネートおよび／または環状エステルおよび／または直鎖状カーボネートおよび／または直鎖状エステルおよび／または環状エーテルおよび／または直鎖状ヒドロキシカルボン酸のモノマーを含むポリマー組成物を調製する工程と、ｂ）少なくとも１つの二重または三重のＣ−Ｃ結合を含む架橋試薬および／または架橋ラジカル開始剤を添加する工程と、ｃ）前記ポリマー組成物（前記架橋試薬を含むもの）を所望の形状に加工する工程と、ｄ）前記混合物を照射により架橋させる工程とを含む。また、本発明は分解性ポリマーネットワークも関する。さらに、本発明は分解性ポリマーネットワークの使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分解性ポリマーネットワークの製造方法であり、
ａ）２０℃〜２００℃の温度で環状カーボネートおよび／または環状エステルおよび／または環状エーテルおよび／または直鎖状カーボネートおよび／または直鎖状エステルおよび／または直鎖状エーテルおよび／または直鎖状ヒドロキシカルボン酸から得られるモノマーの重合によってポリマー組成物を調製する工程と、
ｂ）少なくとも１つの二重または三重のＣ−Ｃ結合を含む架橋試薬および／または架橋ラジカル開始剤を添加する工程と、
ｃ）前記ポリマー組成物を所望の形状に加工する工程と、
ｄ）前記混合物を照射により架橋させる工程
とを含む方法。
【請求項２】
前記架橋試薬が、アクリレート、メタクリレート、マルチアクリレート、マルチメタクリレート、フマレート、マルチフマレート、マレエート、マルチマレエート、マレイン酸無水物、イタコネート、マルチイタコネートまたはそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記架橋試薬が、エチレンジアクリレート、エチレングリコールジアクリレート、テトラエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、アクリレート官能化されたポリ（トリメチレンカーボネート）ベースのオリゴマー、メタクリレート官能化されたポリ（トリメチレンカーボネート）ベースのオリゴマー、フマレート官能化されたポリ（トリメチレンカーボネート）ベースのオリゴマー、アクリレート官能化されたポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）ベースのオリゴマー、メタクリレート官能化されたポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）ベースのオリゴマー、フマレート官能化されたポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）ベースのオリゴマー、アクリレート官能化されたポリ（Ｌ−ラクチド）ベースのオリゴマー、メタクリレート官能化されたポリ（Ｌ−ラクチド）ベースのオリゴマー、フマレート官能化されたポリ（Ｌ−ラクチド）ベースのオリゴマー、アクリレート官能化されたポリ（ε−カプロラクトン）ベースのオリゴマー、メタクリレート官能化されたポリ（ε−カプロラクトン）ベースのオリゴマー、フマレート官能化されたポリ（ε−カプロラクトン）ベースのオリゴマー、アクリレート官能化されたポリ（エチレングリコール）ベースのオリゴマー、メタクリレート官能化されたポリ（エチレングリコール）ベースのオリゴマー、フマレート官能化されたポリ（エチレングリコール）ベースのオリゴマーまたはそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記架橋試薬が、前記ポリマー組成物の総重量に基づく重量パーセンテージで０．０１重量％〜１５重量％、好ましくは０．１重量％〜１０重量％、より好ましくは０．５重量％〜８重量％、最も好ましくは１重量％〜５重量％の架橋試薬を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程ａ）のモノマーが、トリメチレンカーボネート、エチレンカーボネート、ジエチレングリコール−ビス−アリル−カーボネートおよびそれらの誘導体からなる群から選択される環状カーボネートから得られる請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程ａ）のモノマーが、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、Ｄ，Ｌ−ラクチド、ε−カプロラクトン、ジオキサノン、グリコリドおよびそれらの誘導体からなる群から選択される環状エステルから得られる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程ａ）のモノマーが、ジエチルカーボネートまたはジフェニルカーボネートからなる群から選択される直鎖状カーボネートから得られる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記工程ａ）のモノマーが、フマル酸モノエチルエステル、フマル酸ジエチルエステル、ジメチルテレフタレート、ジエチルテレフタレートからなる群から選択される直鎖状エステルから得られる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程ａ）のモノマーが、ポリエチレングリコールからなる群から選択される直鎖状エーテルから得られる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程ａ）のポリマー組成物が、全コポリマーに基づくモルパーセンテージで４０モル％〜８５モル％、好ましくは５０モル％〜７０モル％、より好ましくは６０モル％〜７０モル％の含有量で環状または直鎖状のカーボネートを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記架橋ラジカル開始剤が、光開始剤、熱開始剤、レドックス開始剤からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程ｂ）がさらに前記ポリマー組成物の総重量に基づく重量パーセンテージで０．００１重量％〜０．１重量％、好ましくは０．００５重量％〜０．０７５重量％、より好ましくは０．０１重量％〜０．０５重量％、最も好ましくは０．０２５重量％の前記架橋ラジカル開始剤を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程ｂ）が溶媒を含み、前記溶媒が、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、エチレンカーボネート、プロピレンカーボネート、ジメチルスルホキシド、トルエン、ベンゼン、テトラヒドロフランまたは１，４−ジオキサンである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程ｄ）の照射が、紫外線、可視光、赤外線、マイクロ波またはガンマ線の照射である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ガンマ線の照射が、１０〜１５０ｋＧｙ、好ましくは２０〜１２０ｋＧｙ、より好ましくは２５〜１００ｋＧｙでの放射を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程ｄ）のポリマー組成物の所望の形状が、２０℃〜２００℃の温度での圧縮成形、押出成形、射出成形または注型成形によって得られる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程ｃ）での所望の形状がフィルムであり、その厚みが１μｍ〜１０００μｍ、好ましくは１０μｍ〜７５０μｍ、より好ましくは５０μｍ〜６００μｍである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマー組成物の調製が開環重合および／または重縮合を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマー組成物の調製が１００℃〜１６０℃、より好ましくは１２０℃〜１５０℃の温度で行われる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法によって得られる、分解性ポリマーネットワーク。
【請求項２１】
熱絶縁物および／または抗酸化絶縁物用の保護層としてのコーティング表面あるいは包装材料を製造するための請求項２０に記載の分解性ポリマーネットワークの使用。
【請求項２２】
インプラントの製造、組織工学、細胞培養または薬物送達における請求項２０に記載の分解性ポリマーネットワークの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分解性ポリマーネットワークを製造（または形成）する方法に関する。また、本発明は、分解性ポリマーネットワークにも関する。さらに、本発明は、分解性ポリマーネットワークの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの学問領域にわたる分野での組織工学（またはティッシュエンジニアリング）の開発によって、一連の新しい組織置換パーツやインプリメンテーションのストラテジーがもたらされている。生体材料、幹細胞、成長因子および分化因子ならびに生態模倣（バイオミメティック）の環境における科学の進歩によって、人工細胞外マトリックス（「スキャホールド」）と、細胞と、生物学的に活性な分子とを組み合わせることで研究室にて組織を作製するというユニークな機会が作り出されている。従って、これらスキャホールド材料の物理学的、化学的および生物学的な特徴は、組織工学において非常に重要である。細胞挙動はその細胞が培養される基体の剛性の影響を受ける。軟部組織の作製（工学）では、スキャホールドは、機械的な刺激を細胞および組織に伝達し、かつインビボにて繰り返されるダイナミックな負荷（ダイナミックローディング）に耐えるべきである。また、これは、細胞を播種した組織工学スキャホールドの機械的な刺激が細胞培養の間に人工組織の発達およびその機能を高めるので、インビトロでも要求され得る。このような観点から、細胞の付着および増殖が可能であり、可撓性があり（または可撓性がない）、形状が安定していて吸収が可能なエラストマー性のある（またはエラストマー性のない）ポリマーネットワークに多大な関心が寄せられている。また、かかるポリマーネットワークは、非晶質または半結晶性のポリマー材料を含む。かかる特性を有する架橋されたポリマー材料が本発明の目的である。
【０００３】
ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）は、生体適合性かつ生分解性のポリマーであり、これは約−１７℃のガラス転移温度（Ｔｇ）を有する。この非晶質かつ可撓性のポリマーは不活性雰囲気下での照射により架橋されて耐クリープ性および形状安定性を有するネットワークを形成することができる。かかるエラストマー性ポリマーは、特に、軟部組織の作製（工学）用のスキャホールディング材料として、または制御放出系（コントロールドリリースシステム）のデポとして、または抗接着性膜もしくは人工血管などのインプラントの設計において使用される。耐クリープ性および形状安定性が望ましい特性である。インビボにおいて、ＰＴＭＣは酸性の分解物を放出することなく表面からの侵食（またはエロージョン）によって比較的迅速に分解する。このポリマーの利用可能性を広げるためには、調節可能な低い侵食速度を有するトリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）に基づく材料の開発が必要である。
【０００４】
ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）は、生体適合性かつ生分解性のポリマーであり、吸収性の縫糸、薬物制御放出系または組織工学用スキャホールドの製造に使用されるものである。ＰＤＬＬＡはガラス質の非結晶性の脂肪族ポリエステルであり、インビボでは大量（バルク）の加水分解で分解するものである。照射の際、ＰＤＬＬＡの分子量の低下が観察される。（Ｄ，Ｌ）−ラクチドはモノマーであり、ＰＤＬＬＡの調製に使用され得るものである。
【０００５】
ＴＭＣとＤＬＬＡのコポリマーは、ＰＴＭＣの物理特性とＰＤＬＬＡの物理特性の中間の物理特性を示し、コポリマーの組成に応じて、ガラス転移温度、弾性モジュラス（弾性係数）の値、引張強さ、および分解速度を調整することができる。これにより、かかるポリマーは様々な生物医学的な用途に適するようになる。しかし、非晶質の架橋されていないコポリマーは、生理学的な温度よりも低いガラス転移温度を有し、体温では形状安定性に乏しい。従って、かかるコポリマーから製造される医療デバイスの滅菌方法としては、架橋後にオートクレーブ処理を使用することができる。
【０００６】
ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）は生分解性のポリエステルであり、約６０℃の低い融点と約−６０℃のガラス転移温度とを有する。このポリマーは、その加工特性およびエンドユース特性（例えば、耐衝撃性）を向上させるために樹脂用添加剤として使用されることがよくある。
【０００７】
ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）は、生分解性の熱可塑性の脂肪族のポリエステルであり、コーンスターチまたはサトウキビなどの再生可能な資源から誘導されるものである。ＰＬＬＡはＬ，Ｌ−ラクチド（Ｌ−ラクチドとしても知られている）の重合から得られる生成物である。ＰＬＬＡは５０〜８０℃のガラス転移温度と１７０〜２００℃の融点とを有する。現在、ＰＬＬＡは、縫糸、ステント、透析媒体および薬物送達デバイスなど、多くの生物医学的用途で使用されている。また、ＰＬＬＡは組織工学用の材料としても評価されている。ＰＬＬＡおよびＰＤＬＬＡは、ポリマーソームの小胞膜を形成するために使用される両親媒性の合成ブロックコポリマーの疎水性ブロックとして使用されている。ＰＬＬＡおよびＰＤＬＬＡは、石油化学製品の持続可能な代替物である。なぜなら、ＰＬＬＡおよびＰＤＬＬＡが最終的に製造されるラクチド類が農業副産物（例えば、コーンスターチまたは他の炭水化物が豊富な物質（メイズ、砂糖または小麦等））の発酵から誘導され得るからである。
【０００８】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）はポリエーテル化合物であり、産業上の製造から医薬まで、多くの用途を有する。これはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られている。ＰＥＧ、ＰＥＯまたはＰＯＥはエチレンオキシドのオリゴマーまたはポリマーを指す。ポリエチレングリコールは、エチレンオキシドと、水、エチレングリコールまたはエチレングリコールのオリゴマーとの相互作用によって製造される。反応は酸性または塩基性の触媒によって触媒される。これは多数の緩下剤（例えばマクロゴール含有製品）および多くのスキンクリームの基礎となるものである。
【０００９】
ＰＴＭＣ、非晶質かつ半結晶性のポリ（ラクチド）、ＰＣＬおよびＰＥＯポリマーについて、これらが架橋される場合には、オートクレーブ処理により滅菌を実施してもよい。これは、その各モノマーに基づくコポリマーの場合にもあてはまる。
【００１０】
高エネルギー照射は、ポリマーの架橋を可能とし得るフリーラジカル、イオンまたは励起状態の形成によって、ポリマー構造の化学変化を引き起こすことが知られている。照射の際に架橋が一部のポリマーには有効であるが、他のポリマーでは鎖の切断が顕著になる。生物医学的用途においてガンマ線および電子線の照射は、ポリマー生体適合材料（バイオマテリアル）の表面特性やバルク特性を改質し、かつ経済的な方法でそれらを滅菌するために広く使用されている。
【００１１】
ガンマ線照射は、（ポリマーの）生体適合材料を経済的に滅菌する方法として広く用いられる。高エネルギーガンマ線は、フリーラジカル反応またはイオン反応を開始することができ、それによって滅菌されている材料の表面特性やバルク特性の変化をもたらす。いくつかのポリマーに関しては、ガンマ線の照射の間に架橋が観察されるが、他のものについては、照射により鎖の切断または開裂反応および分子量の低下がもたらされる。このように分子量が低下すると、組織工学スキャホールド、骨折固定用デバイスまたは縫糸などの吸収性ポリマーインプラントの有効寿命が、機械強度の急速な低下およびデバイスの分解が原因で限定され得る。また、生分解性ポリマーから調製された薬物放出マトリックスのインプランテーションの場合、分子量の低下は質量損失の早期の開始をもたらし得、薬物放出特性に影響を与え得る。ガンマ線照射によってＰＴＭＣの耐クリープ性および形状安定性が顕著に向上する。ガンマ線の照射によりＰＴＭＣの架橋の効率を上昇させることによって、ネットワークの引張特性への照射の悪影響を防止することができる。得られる高いゲル含有量およびネットワーク密度によって耐クリープ性がさらに向上し、かつ分解および侵食をもスローダウンさせる。分解はポリマー主鎖の結合の開列によるポリマー鎖の切断の過程（またはプロセス、工程）である。これによりポリマー鎖の長さが短くなる。侵食はポリマーマトリックスの質量損失であり、これはモノマー、オリゴマー、ポリマー鎖またはそれらの一部の損失に起因し得る。侵食は生物学的、化学的または物理学的な影響の結果であってもよい。従って、ポリマーの分解はポリマー侵食過程（またはプロセス、工程）の一部であると理解され得る。
【００１２】
分解性オリゴマーから調製されるマクロマーのラジカル重合および架橋など、別のタイプの重合および架橋にも関心が寄せられている。これらのプロセスは共に周囲温度で有効な吸収性ポリマーネットワークの形成に使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
先行技術において、生体適合性かつ分解性のポリマーネットワークを形成するさらなる方法の開発が依然として必要である。
【００１４】
本発明の目的は、なかでも特に非晶質構造および低いガラス転移温度を有していて可撓性であり生体適合性かつ分解性のポリマーネットワーク、とりわけ、低いガラス転移温度および調節可能な分解特性を有していて形状が安定でかつ耐クリープ性の材料である分解性ポリマーネットワークの提供である。また、本発明は、向上した形状安定性を有し、かつオートクレーブ処理または熱処理による滅菌に適した材料の調製が可能となる様々な可撓性および様々な弾性モジュラス（弾性係数）の値を有するポリマーネットワークの形成を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば、この目的は、なかでも特に、以下の工程を含む分解性ポリマーネットワークの製造方法によって達成される。
ａ）２０℃〜２００℃の温度で環状カーボネートおよび／または環状エステルおよび／または直鎖状（または線状）カーボネートおよび／または直鎖状（または線状）エステルおよび／または環状エーテルおよび／または直鎖状（または線状）ヒドロキシカルボン酸のモノマーを含むポリマー組成物を調製する工程、
ｂ）少なくとも１つの二重または三重のＣ−Ｃ結合を含む架橋試薬および／または架橋ラジカル開始剤を添加する工程、
ｃ）前記ポリマー組成物（前記架橋試薬を含むもの）を所望の形状に加工する工程、
ｄ）前記混合物を照射により架橋させる工程。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】減圧下でのガンマ線の照射により架橋されたＰＴＭＣフィルムにおける初期（最初）のポリマー分子量および照射量のゲル含有量への影響（Ａ）およびクロロホルム中での膨潤率への影響（Ｂ）。
【図２】種々の初期分子量のＰＴＭＣフィルムへのガンマ線の照射により形成されたネットワークについてのＣｈａｒｌｅｓｂｙ−Ｐｉｎｎｅｒのプロット（Ａ）、ならびに初期ポリマー分子量による鎖の切断と架橋との放射線化学収量の比（（Ｇ（ｓ）／Ｇ（ｘ））への影響および得ることができる最大のゲルパーセンテージ（（１−ｓ）ｍａｘ）への影響（Ｂ）。
【図３】様々な初期分子量のＰＴＭＣポリマーの２５ｋＧｙでの照射により形成されたＰＴＭＣネットワークにおけるＰＥＴＡを配合することによるゲル含有量への影響（Ａ）およびクロロホルム中での平衡膨潤率（Ｂ）。
【図４】初期分子量、照射量およびＰＥＴＡ含有量によるＰＴＭＣフィルムの弾性モジュラス（Ａ）、降伏強度（Ｂ）、破壊応力（Ｃ）および永久変形（パーマネントセット）（Ｄ）の値への影響。
【図５】ガンマ線の照射、ＰＥＴＡ含有量、エタノール抽出によるＰＴＭＣ８８（Ａ）およびＰＴＭＣ４４３（Ｂ）の応力−ひずみ（ストレス−ストレイン）挙動への影響（曲線はオフセットして明確にしている）。
【図６】ＴＭＣネットワークに直接または間接的に接触させて培養した繊維芽細胞の生存性。５重量％のＰＥＴＡの存在下、様々な分子量のＰＴＭＣフィルムに照射を行ってネットワークを形成した。最初の２本の棒グラフは、それぞれ、ブランク（培養培地のみ）およびポジティブコントロールの細胞生存性を示す。
【図７】ＰＥＴＡの存在下（５重量％）または非存在下でガンマ線を照射したＰＴＭＣ４４３フィルムのコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）水溶液中での侵食。この図は、時間とともに、相対厚み（Ａ）と相対質量（Ｂ）を示し、さらに相対厚みと相対質量との関係（Ｃ）を示す。
【図８】コポリマーの組成およびＰＥＴＡの配合による、Ｐ（ＴＭＣ−ＤＬＬＡ）コポリマーフィルムのガンマ線の照射（２５ｋＧｙ）により形成されたネットワークのゲル含有量（Ａ）および膨潤率（Ｂ）への影響。
【図９】抽出されていないコポリマーネットワークに直接または間接的に接触させて培養した繊維芽細胞の生存性。５重量％のＰＥＴＡの存在下、コポリマーフィルムを２５ｋＧｙで照射することでネットワークを形成した。最初の２本の棒グラフは、それぞれ、ブランク（培養培地のみ、ネガティブコントロール）およびポジティブコントロールの細胞生存性を示す。
【図１０】ＳＥＭ顕微鏡写真であり、照射していないＰ（ＴＭＣ−ＤＬＬＡ）コポリマーフィルム（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｉ）および５％ＰＥＴＡを含むコポリマーフィルムにガンマ線を照射して形成して抽出を施していないネットワークフィルム（Ｂ，Ｄ，Ｆ，Ｈ，Ｊ）のマクロファージが媒介する侵食を示す（１５日間の培養後）。
【図１１】照射を施していない種々のＰ（ＴＭＣ−ＤＬＬＡ）コポリマーフィルム（Ａ）および５％ＰＥＴＡを含むコポリマーフィルムにガンマ線を照射することにより調製して抽出を施していないネットワークフィルム（Ｂ）でのマクロファージの密度（１４日間の培養後）。
【図１２】５重量％のＰＥＴＡと０．０２５重量％の光開始剤とを含み２５４ｎｍのＵＶ光に曝露したＰＴＭＣホモポリマーフィルムのゲル含有量（Ａ）およびクロロホルム中での膨潤率（Ｂ）へのＵＶ照射時間および初期ポリマー分子量の影響。各値は平均±標準偏差で示す（ｎ＝３）。
【図１３】ＰＴＭＣポリマーのヒステリシス挙動およびサイクル引張試験におけるネットワークへの光架橋の影響。曲線は、ＰＥＴＡおよび光開始剤の存在下、３００分間のＵＶ曝露による光架橋の前後において、様々な分子量のＰＴＭＣホモポリマー（ＰＴＭＣｘ）に５０％のひずみを反復して（２０サイクル）適用したことを示す（Ａ，Ｂ，Ｃ）。図Ｄは、光架橋されたブレンドのダイナミックローディングでの挙動を示す。
【図１４】光架橋およびブロックコポリマーのブレンドによるＰＴＭＣ３７３に基づくネットワークのインビトロでの酵素による浸食への影響。時間とともに相対質量が低下し（Ａ）、かつ時間とともに相対厚みが低下する（Ｂ）。
【図１５】ＰＴＭＣ３７３から調製され光架橋された多孔性のスキャホールドのＳＥＭ顕微鏡写真。ＡおよびＢはスキャホールドの上面を示す。繊維のミクロ多孔性をＣに示す。スキャホールドの断面をＤに示す。
【図１６】顕微鏡写真であって、ＰＴＭＣ３７３（Ａ，Ｂ，Ｃ）、ＰＴＭＣ３７３／ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣ（Ｄ，Ｅ，Ｆ）、ＰＴＭＣ３７３／ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣ（Ｇ，Ｈ，Ｉ）から調製され、かつ立体的（３Ｄ）に作製され光架橋されたスキャホールドの上／中に生存する細胞を示す（細胞播種後（Ａ，Ｄ，Ｇ）、ｈＭＳＣ培養の５日後（Ｂ，Ｅ，Ｈ）および１０日後（Ｃ，Ｆ，Ｉ））。各スキャホールドの断面写真を挿図で示す。
【図１７】ＳＥＭ顕微鏡写真であって、ＰＴＭＣ３７３（Ａ，Ｂ，Ｃ）、ＰＴＭＣ３７３／ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣ（Ｄ，Ｅ，Ｆ）、ＰＴＭＣ３７３／ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣ（Ｇ，Ｈ，Ｉ）から調製され、かつ立体的（３Ｄ）に作製され光架橋されたスキャホールドの上／中のｈＭＳＣを示す（ｈＭＳＣ培養の５日後（Ａ，Ｄ，Ｇ）および１０日後（上面Ｂ，Ｅ，Ｈ、断面Ｃ，Ｆ，Ｉ）。
【図１８】立体的（３Ｄ）に作製して光架橋されたＰＴＭＣベース（または系）のスキャホールドにおいて培養したｈＭＳＣによるグルコースの消費およびラクテートの産生。
【図１９】合成した２本腕（アーム）のＰＴＭＣマクロマー（ＤＭＡＣ）（Ａ）、３本腕（アーム）のＰＴＭＣマクロマー（ＴＭＡＣ）（Ｂ）、および直鎖状（または線状）のＰＴＭＣポリマー（Ｃ）の化学構造。
【図２０】Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９光開始剤の濃度によるＰＴＭＣフィルムへの１２０分間のＵＶ照射により得られるネットワークのゲル含有量および膨潤率への影響。
【図２１】照射時間および使用する架橋試薬による光架橋ＰＴＭＣネットワークのゲル含有量（Ａ）および膨潤率（Ｂ）への影響。すべてのＰＴＭＣフィルムにおいて、ＰＩ／（ポリマー中のＴＭＣ繰り返し単位）の比は１／１０００であった。ＰＴＭＣ−ＰＩフィルムは光開始剤のみを含み、ＰＴＭＣマクロマーは含まない。ＤＭＡＣおよびＴＭＡＣを含むＰＴＭＣフィルムに関しては、メタクリレート／（ポリマー中のＴＭＣ繰り返し単位）の比は１／５０であった。
【図２２】示す曲線は、直鎖状（または線状）および光架橋され抽出されたＰＴＭＣネットワークのフィルムの応力−ひずみ（ストレス−ストレイン）挙動を示す。すべてのＰＴＭＣフィルムにおいて、ＰＩ／（ポリマー中のＴＭＣ繰り返し単位）の比は１／１０００であった。ＰＴＭＣ−ＰＩフィルムは光開始剤のみを含み、ＰＴＭＣマクロマーは含まない。ＤＭＡＣまたはＴＭＡＣを含むＰＴＭＣフィルムに関しては、メタクリレート／（ポリマー中のＴＭＣ繰り返し単位）の比は１／５０であった。曲線はオフセットして明確にしている。
【図２３】直鎖状（または線状）ＰＴＭＣおよびＵＶ架橋（１２０分）され抽出されたＰＴＭＣネットワークフィルム（光開始剤のみを含む、または光開始剤およびＰＴＭＣマクロマーを含む）のヒステリシス挙動。すべてのＰＴＭＣネットワークフィルムにおいて、ＰＩ／（ポリマーのＴＭＣ繰り返し単位）の比は１／１０００であった。ＰＴＭＣ−ＰＩネットワークフィルムは光開始剤のみを含み、ＰＴＭＣマクロマーは含まない。ＤＭＡＣまたはＴＭＡＣを含むＰＴＭＣネットワークフィルムに関しては、メタクリレート／（ポリマー中のＴＭＣ繰り返し単位）の比は１／５０であった。曲線はオフセットすることで明確にしている。
【図２４】ＳＥＭ（左）およびＣＬＳＭ（右）の顕微鏡写真であって、１２０分間のＵＶ照射により架橋されたＰＴＭＣ−ＰＩ−ＴＭＡＣ（メタクリレート／（ポリマー中のＴＭＣ繰り返し単位）＝１／５０）のフィルムで培養した２８日後のｈＭＳＣを示す。ＰＩ／（ポリマー中のＴＭＣ繰り返し単位）の比は１／１０００であった。図において、核は青色に染色され、アクチン細胞骨格は緑色に染色されている。
【図２５】ＳＥＭ顕微鏡写真であって、直鎖状（または線状）のＰＴＭＣから調製されたフィルム（Ａ，Ｂ）と、様々なメタクリレート／（ポリマー中のＴＭＣ繰り返し単位）の比を有し、かつ光架橋され（１２０分）抽出されたフィルム（ＰＴＭＣ−ＰＩ（Ｃ，Ｄ）、ＰＴＭＣ−ＰＩ−ＴＭＡＣ（１／２００）（Ｅ，Ｆ）、ＰＴＭＣ−ＰＩ−ＴＭＡＣ（１／１００）（Ｇ，Ｈ）、ＰＴＭＣ−ＰＩ−ＴＭＡＣ（１／５０）（Ｉ，Ｊ）でのネットワークフィルム）でのマクロファージが媒介する侵食を示す。すべてのＰＴＭＣネットワークフィルムにおいて、ＰＩ／（ポリマー中のＴＭＣ繰り返し単位）の比は１／１０００であった。ＰＴＭＣ−ＰＩネットワークフィルムは光開始剤のみを含み、ＰＴＭＣマクロマーは含まない。
【図２６】直鎖状（または線状）のＰＴＭＣから調製されたフィルム、および様々なメタクリレート／（ポリマー中のＴＭＣ繰り返し単位）の比を有し、かつ光架橋され（１２０分）抽出されたネットワークフィルムにおいて、マクロファージを１４日間培養した後の密度。すべてのＰＴＭＣネットワークフィルムにおいて、ＰＩ／（ポリマーのＴＭＣ繰り返し単位）の比は１／１０００であった。ＰＴＭＣ−ＰＩフィルムは光開始剤のみを含み、ＰＴＭＣマクロマーは含まない。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ポリマーネットワークは、一方のポリマー鎖を他方のポリマー鎖と連結する結合を有するポリマーである。かかる結合は共有結合であってもイオン結合であってもよい。また、用語「架橋（された）ポリマー」はポリマーネットワークにおいても使用され得る。ポリマーは、典型的には共有化学結合によって接続される繰り返し構造単位からなる大きな分子である（マクロ分子と呼ぶ場合もある）。ポリマーを形成する化合物はモノマーと呼ばれる。
【００１８】
モノマーは、１またはそれよりも多く、２またはそれよりも多く、３またはそれよりも多くの環状カーボネートおよび／または環状エステルおよび／または環状エーテルおよび／または直鎖状（または線状）カーボネートおよび／または直鎖状（または線状）エステルおよび／または直鎖状（または線状）ヒドロキシカルボン酸である。
【００１９】
カーボネートは、炭化水素中に少なくとも１つのカーボネート基（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）を有する炭化水素類であり、１個のカーボネート基、２個のカーボネート基、３個のカーボネート基を有するものなどがある。
【００２０】
エステルは、炭化水素中に少なくとも１つのエステル基（−ＣＯＯ−）を有する炭化水素類であり、１個のエステル基、２個のエステル基、３個のエステル基を有するものなどがある。
【００２１】
ヒドロキシカルボン酸は、カルボン酸（有機官能基−ＣＯＯＨ）を有し、かつ第２の有機基として水酸基（−ＯＨ）を含む炭化水素類である。
【００２２】
環状分子は、アリール、すなわち芳香環などの環構造を有する。直鎖状分子はアルカンなどの炭化水素鎖である。
【００２３】
本発明のポリマー組成物は、不活性雰囲気下でのモノマーまたはモノマー混合物の反応によって、工程ａ）で調製されてもよい。反応は、窒素、アルゴンまたは減圧下であってもよい。反応は均質になるまで機械的な撹拌下で行われる。均質になるまで撹拌するとは、目視により均質な混合物が形成されるまで撹拌することである。撹拌は任意の他の種類の撹拌または混合によって行うことができる。
【００２４】
本発明の分解性ポリマーは吸収性ポリマーおよび／または生分解性ポリマーである。本発明のポリマーネットワークは、非晶質、半結晶性または結晶性であってよい。
【００２５】
架橋試薬は、架橋剤または架橋助剤であってもよい。より良好なポリマーネットワークの形成にのみ役立つ場合、架橋試薬は架橋助剤である（なお、架橋試薬なしでもネットワークは形成される）。架橋試薬が存在する場合にのみネットワークが形成される場合、架橋試薬は架橋剤である。より良好なネットワークは、より高いゲル含有量を有するネットワーク、より良好な耐クリープ性を有するネットワーク、より良好な弾性を有するネットワークであってよい。
【００２６】
架橋試薬は少なくとも１つの二重または三重のＣ−Ｃ結合を含み、例えば、１またはそれよりも多く、２またはそれよりも多く、３またはそれよりも多く、４またはそれよりも多くの二重または三重のＣ−Ｃ結合を含む。また、二重または三重のＣ−Ｃ結合はそれぞれｓｐ２−ｓｐ２炭素−炭素結合またはｓｐ−ｓｐ炭素−炭素結合とも呼ばれる。Ｃ−Ｃ結合は炭素−炭素結合として理解されるべきである。
【００２７】
本発明の材料の架橋は、例えば、分解性ポリマーネットワークからなるデバイス、または分解性ポリマーネットワークでコーティングされたデバイスのオートクレーブ処理または熱処理による昇温下での滅菌を可能とする。
【００２８】
ラジカル開始剤は、照射、光、温度変化または電気化学反応への曝露などの条件下でラジカル種を発生し得る化学物質である。特定の種類のラジカル開始剤が光開始剤、熱開始剤またはレドックス開始剤であってよい。これらはそれぞれ光への曝露、温度変化または電気化学反応への曝露の際にラジカル種を発生する化学物質である。
【００２９】
照射は物品を放射に曝す工程（またはプロセス）である。放射は典型的には電子ビーム処理、Ｘ線またはガンマ線などのイオン化放射であってもよい。しかし、この用語は、可視光、紫外光または赤外光のスペクトル領域での光放射またはマイクロ波などの非イオン化放射にもあてはまる。適切なレベルで処理されるのであればこれらの形態の放射の全てが物品の滅菌に使用できる。すなわち、これは医療用の機器およびシリンジなどの使い捨て器具の製造ならびに食品の消毒および滅菌に使用される技術である。
【００３０】
工程ａ）における温度範囲は、２０℃〜２００℃、例えば２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、１００℃、１０５℃、１１０℃、１１５℃、１２０℃、１２５℃、１３０℃、１３５℃、１４０℃、１４５℃、１５０℃、１５５℃、１６０℃、１６５℃、１７０℃、１７５℃、１８０℃、１８５℃、１９０℃、１９５℃、２００℃、好ましくは１００℃〜２００℃である。
【００３１】
架橋試薬はポリマーネットワークの形成を援助する化合物である。架橋試薬は一方のポリマー鎖を他方のポリマー鎖と接続する結合を生み出す。かかる結合は共有結合であってもよい。用語「架橋」とは、通常、ポリマーの物理特性の差異を助長する橋かけの使用について言及する場合に用いる。
【００３２】
本発明によると、架橋試薬は、アクリレート、メタクリレート、マルチアクリレート、マルチメタクリレート、フマレート、マルチフマレート、マレエート、マルチマレエート、マレイン酸無水物、イタコネートまたはマルチイタコネートからなる群から選択される。アクリレートおよびマルチアクリレートはそれぞれ１個またはいくつかのアクリレート単位を含む。アクリレート単位は、１個のビニル基と１個のエステル基とを含む。また、これはプロペノエートとも呼ばれ、式：Ｃ３Ｈ３Ｏ２を有する。メタクリレート（ＣＨ２＝ＣＭｅＣＯＯ−）はメタクリル酸の塩またはエステルである。メタクリレートはメチルビニル基を含む。すなわち、２個の炭素原子が互いに二重に結合してカルボニル炭素に直接結合していて、かかるビニル基が非末端メチル基で置換されている。マルチメタクリレート化合物は、幾つかのメタクリレート基を含む。フマレートは、一般式：Ｏ２ＣＣＨ＝ＣＨＣＯ２を有していて、アルキルまたはアシルで置換されていてもよい。マルチフマレートは、いくつかのフマレート基を含む。マレエートは、対応するフマレートのシス異性体である。マルチマレエートは、いくつかのマレエート基を含む。マレイン酸無水物（シスブテン二酸無水物またはトキシル酸無水物またはジヒドロ−２，５−ジオキソフランと呼ばれる場合もある）は、式：Ｃ２Ｈ２（ＣＯ）２Ｏを有する有機化合物である。イタコネートはイタコン酸のエステルである。イタコン酸、すなわちメチレンコハク酸は無毒であり容易に生分解することができる。また、イタコネートは、２−メチリデンブタンジオエートの名称で呼ばれることもあり、２個のエステル（−ＣＯＯ−）と、２位にｓｐ２（二重Ｃ−Ｃ結合）のメチル置換を含む。マルチイタコネートは、いくつかのイタコネート基を含む。
【００３３】
本発明によれば架橋試薬は、アクリレート官能化されたポリ（トリメチレンカーボネート）ベース（または系）のオリゴマー、メタクリレート官能化されたポリ（トリメチレンカーボネート）ベース（または系）のオリゴマー、フマレート官能化されたポリ（トリメチレンカーボネート）ベース（または系）のオリゴマー、アクリレート官能化されたポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）ベース（または系）のオリゴマー、メタクリレート官能化されたポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）ベース（または系）のオリゴマー、フマレート官能化されたポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）ベース（または系）のオリゴマー、アクリレート官能化されたポリ（Ｌ−ラクチド）ベース（または系）のオリゴマー、メタクリレート官能化されたポリ（Ｌ−ラクチド）ベース（または系）のオリゴマー、フマレート官能化されたポリ（Ｌ−ラクチド）ベース（または系）のオリゴマー、アクリレート官能化されたポリ（ε−カプロラクトン）ベース（または系）のオリゴマー、メタクリレート官能化されたポリ（ε−カプロラクトン）ベース（または系）のオリゴマー、フマレート官能化されたポリ（ε−カプロラクトン）ベース（または系）のオリゴマー、アクリレート官能化されたポリ（エチレングリコール）ベース（または系）のオリゴマー、メタクリレート官能化されたポリ（エチレングリコール）ベース（または系）のオリゴマー、フマレート官能化されたポリ（エチレングリコール）ベース（または系）のオリゴマー、エチレンジアクリレート、エチレングリコールジアクリレート、テトラエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレートおよびそれらの誘導体からなる群から選択される。
【００３４】
メチルメタクリレート（ＭＭＡ）は、メチル２−メチルプロペ−２−エノエートであり、線形の式：Ｃ５Ｈ８Ｏ２を有する。エチレンジアクリレートは、式：Ｃ８Ｈ１０Ｏ４を有する。ペンタエリスリトールトリアクリレート（ＰＥＴＡ）は、２−プロペン酸２−（ヒドロキシメチル）−２−［［（１−オキソ−２−プロペニル）オキシ］メチル］−１，３−プロパンジイルエステルとも呼ばれ、線形の式：（Ｈ２Ｃ＝ＣＨＣＯ２ＣＨ２）３ＣＣＨ２ＯＨを有する。架橋試薬としてペンタエリスリトールトリアクリレートを含む照射ＰＴＭＣフィルムは、このようにして形成されたＰＴＭＣネットワークのゲル含有量を非常に高めるだけでなく、エラストマー特性をも優れたものとする（引張試験において、試験片が低いモジュラスの値、高い強度および破断伸びを示した）。サイクル負荷（サイクリックローディング）による恒久的な変形は非常に低いものであった。さらにこのような架橋は、ネットワークの酵素による侵食速度が低下するという結果をもたらした。トリメチロールプロパントリアクリレート（ＴＭＰＴＡ）は、線形の式：（Ｈ２Ｃ＝ＣＨＣＯ２ＣＨ２）３ＣＣ２Ｈ５を有する。トリメチロールプロパントリメタクリレートは、線形の式：［Ｈ２Ｃ＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ２ＣＨ２］３ＣＣ２Ｈ５を有する。ペンタエリスリトールテトラアクリレートは、式：（Ｈ２Ｃ＝ＣＨＣＯ２ＣＨ２）４Ｃを有し、エチレングリコールジメタクリレートは、式：Ｃ１０Ｈ１４Ｏ４を有し、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２としても示され、テトラエチレングリコールジメタクリレートは、式：Ｃ１４Ｈ２２Ｏ６を有する。ポリエチレングリコールは、エチレンオキシドと水との縮合ポリマーであり、一般式：Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨを有し、式中のｎはオキシエチレン基の平均の繰り返し数である。
【００３５】
任意の有機基および／またはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールで置換された上記架橋試薬が誘導体として理解される。
【００３６】
最も好ましい実施形態において、工程ｂ）は、前記ポリマー組成物の総重量に基づく重量パーセンテージで０．０１〜１５重量％、好ましくは０．１重量％〜１０重量％、より好ましくは０．５重量％〜８重量％、最も好ましくは１重量％〜５重量％の架橋試薬を含む。
【００３７】
本発明の方法によると、工程ａ）のモノマーは、トリメチレンカーボネート、エチレンカーボネート、ジエチレングリコール−ビス−アリル−カーボネートおよびそれらの誘導体からなる群から選択される環状カーボネートから得られる。トリメチレンカーボネートは、１，３−ジオキサン−２−オンと呼ばれ、式：Ｃ４Ｈ６Ｏ３を有する。エチレンカーボネートは、式：Ｃ３Ｈ４Ｏ３を有し、１，３−ジオキソラン−２−オンと呼ばれる。ジエチレングリコール−ビス−アリル−カーボネートは、式：Ｃ１２Ｈ１８Ｏ７を有する。
【００３８】
本発明の方法によると、工程ａ）のモノマーは、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、Ｄ，Ｌ−ラクチド、ε−カプロラクトン、ジオキサノン、ポリエチレングリコール、グリコリドおよびそれらの誘導体からなる群から選択される環状エステルから得られる。Ｌ−ラクチドはＬ形のラクチドのエナンチオマーであり、Ｄ−ラクチドはＤ形のエナンチオマーであり、Ｄ，Ｌ−ラクチドはラセミ混合物である。ε−カプロラクトン（あるいは単にカプロラクトン）は環状エステルであり、ラクトン類に属するものであり、７員環を有していて、式：（ＣＨ２）５ＣＯ２を有する。ジオキサノンはジオキサン誘導体（メチレン基の代わりにカルボニルを有するもの）であり、式：Ｃ４Ｈ６Ｏ３を有する。グリコリド、すなわち１，４−ジオキサン−２，５−ジオンは、式：Ｃ４Ｈ４Ｏ４を有する。
【００３９】
本発明の方法によると、工程ａ）のモノマーは、ジエチルカーボネートおよびジフェニルカーボネートからなる群から選択される直鎖状カーボネートから得られる。ジエチルカーボネートは、式：Ｃ５Ｈ１０Ｏ３を有し、ジフェニルカーボネートは、式：Ｃ１３Ｈ１０Ｏ３を有する。
【００４０】
本発明の方法によると、工程ａ）のモノマーは、フマル酸モノエチルエステル、フマル酸ジエチルエステル、ジメチルテレフタレートおよびジエチルテレフタレートからなる群から選択される直鎖状エステルから得られる。フマル酸モノエチルエステルは、ジメチル（Ｅ）−ブテンジオネートとも呼ばれ、式：Ｃ６Ｈ８Ｏ４を有する。フマル酸ジエチルエステルは、（Ｅ）−２−ブテン二酸ジエチルエステルとも呼ばれ、式：Ｃ８Ｈ１２Ｏ４を有する。ジメチルテレフタレートおよびジエチルテレフタレートは、それぞれ式：Ｃ１２Ｈ１４Ｏ４を有する。
【００４１】
本発明の方法によると、工程ａ）のモノマーは、ポリエチレングリコールおよびその誘導体からなる群から選択される直鎖状エーテルから得られる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られていて、エチレンオキシドのオリゴマーまたはポリマーを指す。
【００４２】
任意の位置でアルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、シクロアルキル、シクロアルキニルで置換されたモノマーは、誘導体として理解されるべきである。置換基は有機基を有していてもよい。
【００４３】
低いガラス転移温度（Ｔｇ）を有する吸収性ポリマーネットワークおよび非晶質オリゴマーは、トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）、Ｄ，Ｌ−ラクチド（ＤＬＬＡ）およびε−カプロラクトン（ＣＬ）のモノマーおよびポリ（グリセロールセバケート）に基づくものであってよく、いくつかのグループによって開発されていて、エラストマー特性を示す。これら比較的小さい分子量のポリマーの（メタ）アクリレート基またはフマレート基による末端の官能基化によって、光開始剤の存在下でのＵＶ照射あるいは熱または酸化還元によるラジカル重合の開始によるネットワークの形成を可能とする。このようにして得られる可撓性ネットワークの最大の引張強さ及び破断伸びの値は、マクロマーの分子量の増加および架橋間の分子量の増加とともに、顕著に増加する。
【００４４】
本発明の方法によると、工程ａ）のポリマー組成物は、環状または直鎖状のカーボネートのモノマーを、全コポリマーに基づくモルパーセンテージで４０モル％〜８５モル％、好ましくは５０モル％〜７０モル％、より好ましくは６０モル％〜７０モル％の含有量で含む。カーボネートはトリメチレンカーボネートであってもよい。
【００４５】
本発明の方法によると、架橋ラジカル開始剤は、光開始剤、熱開始剤、レドックス開始剤からなる群から選択される。ラジカル開始剤は任意の市販の入手可能な開始剤であってもよい。
【００４６】
本発明のより好ましい実施形態では、当該方法は、工程ｂ）において、前記ポリマー組成物の総重量に基づく重量パーセンテージで０．００１重量％〜０．１重量％、好ましくは０．００５重量％〜０．０７５重量％、より好ましくは０．０１重量％〜０．０５重量％、最も好ましくは０．０２５重量％のラジカル開始剤を含む。
【００４７】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、工程ｂ）は溶媒を含み、かかる溶媒はアセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、エチレンカーボネート、プロピレンカーボネート、ジメチルスルホキシド、トルエン、ベンゼン、テトラヒドロフランまたは１，４−ジオキサンである。アセトンは、式：ＣＨ３ＣＯＣＨ３を有し、ジクロロメタンは、式：ＣＨ２Ｃｌ２を有し、クロロホルムは、ＣＨＣｌ３であり、四塩化炭素は、ＣＣｌ４である。エチレンカーボネートおよびプロピレンカーボネートは、それぞれエチレングリコールまたはプロピレングリコールとカルボン酸とのエステルである。それぞれ式：Ｃ３Ｈ４Ｏ３、Ｃ４Ｈ６Ｏ３を有する。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、有機硫黄化合物であり、式：（ＣＨ３）２ＳＯを有する。ベンゼンおよびトルエンは、芳香族炭化水素類であり、それぞれ式：Ｃ６Ｈ６、Ｃ７Ｈ８を有する。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は、式：Ｃ４Ｈ８Ｏを有する。１，４−ジオキサンは、式：Ｃ４Ｈ８Ｏ２を有する。
【００４８】
本発明の方法によると、工程ｄ）の照射は、紫外線、可視光、赤外線、マイクロ波またはガンマ線の照射である。紫外線の照射では、波長が１〜４００ｎｍであり、可視光の照射では、波長が４００〜８００ｎｍであり、赤外線の照射では、波長が０．８μｍ〜３００μｍである。マイクロ波の照射では、周波数が３００ＭＨｚ（０．３ＧＨｚ）〜３００ＧＨｚである。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、ガンマ線の照射は、１０〜１５０ｋＧｙ、好ましくは２０〜１２０ｋＧｙ、より好ましくは２５〜１００ｋＧｙでの放射を含む。ｋＧｙは、キログレイ（ＫｉｌｏＧｒａｙ）（放射の測定単位）を意味する。照射源はコバルト６０あるいは任意の他のガンマ線源であってもよい。
【００５０】
本発明の方法によると、工程ｃ）のポリマー組成物の所望の形状は、２０℃〜２００℃、好ましくは１００℃〜１８０℃、より好ましくは１３０℃〜１５０℃、最も好ましくは１４０℃の温度での圧縮成形、押出成形、射出成形または注型成形（キャスティング）によって得られる。圧縮成形によりポリマーフィルムを得ることができる。圧縮成形は、開放され加熱されたモールドキャビティに成形材料（一般には予備加熱されたもの）を最初に配置する成形方法である。上型または蓋部材でモールドを閉じ、圧力を付与して成形材料をモールドの全面積と接触させ、このとき熱及び圧力を維持し、その後、成形材料を硬化させる。押出成形は固定した断面形状（またはプロファイル）の物体を作製するのに使用される方法（またはプロセス）である。所望の断面のダイを通して材料を押し出すか、または引き出す。この方法には他の製造方法よりも２つの大きな利点があり、１つは、非常に複雑な断面が形成できることであり、もう１つは、脆弱なワーク材料が作製できることである。その理由として、かかる材料が圧縮およびせん断応力にのみ晒されることが挙げられる。また、これにより優れた表面仕上げ（フィニッシュ）を有する最終部品が形成される。射出成形はポリマー材料からなる部品を作製する製造方法である。加熱したバレルに材料を供給して混合し、そしてモールドのキャビティに押し付け、冷却してモールドキャビティの形状に材料を硬化する。製品を設計した後、通常は鉄またはアルミニウムのいずれかでモールドを作製し、精密に機械加工して、設計した部品の特徴部分を形成する。射出成形は様々な部品の製造に広く使用される。注型成形（キャスティング）は、溶媒注型成形（ソルベントキャスティング）であってもよい。溶媒注型成形は、熱可塑性物品を形成するための方法であり、樹脂の溶液または分散液中に雄型モールドを浸漬し、溶媒を除去してプラスチックフィルムの層をモールドに付着した状態で残す方法である。
【００５１】
本発明の方法によると、工程ｃ）のポリマー組成物の所望の形状はフィルムであり、その厚みは１μｍ〜１０００μｍ、好ましくは１０μｍ〜７５０μｍ、より好ましくは５０μｍ〜６００μｍである。
【００５２】
好ましい実施形態において、ポリマー組成物の調製は、開環重合および／または重縮合を包含する。
【００５３】
開環重合は、付加重合の１つの形態であり、ポリマーの末端部分が活性中心として作用し、さらに環状モノマーが結合して成長することで、より長いポリマー鎖を形成する。いくつかの環式化合物を開始剤と触媒とともに処理することで環が開裂して重合し、オリゴマーまたはポリマーを形成する。反応は、通常、不活性条件下（アルゴン、窒素または減圧下）かつ加熱下で行われる。
【００５４】
重縮合は、化学的な縮合であり、モノマー分子の結合によるポリマーの形成をもたらし、水などの小分子を放出する。
【００５５】
より好ましい実施形態では、本発明の方法におけるポリマー組成物の調製は１００℃〜１６０℃、より好ましくは１２０℃〜１５０℃の温度で行われる。
【００５６】
別の局面によると、本発明の方法によって、分解性ポリマーネットワークを得ることができる。
【００５７】
本発明のさらに別の局面によると、分解性ポリマーネットワークは、熱絶縁物および／または抗酸化絶縁物用の保護層としてのコーティング表面あるいは包装材料の製造に使用される。
【００５８】
本発明のさらに別の局面によると、分解性ポリマーネットワークは、インプラントの製造、組織工学、細胞培養または薬物送達に使用される。
【００５９】
本発明はさらに添付の図面および以下の実施例にて説明される。図面および実施例は本発明を例証するものであり、本発明がこれらの範囲に限定されることは意図していない。
【００６０】
以下の実施例では添付の図面が参照される。
【実施例】
【００６１】
実施例
実施例１
材料
ポリマーグレードの１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（独国））およびスズオクトアート（Ｓｉｇｍａ（米国））を受け取ったまま使用した。ペンタエリスリトールトリアクリレート（ＰＥＴＡ、Ａｌｄｒｉｃｈ（米国））を受け取ったまま使用した。溶媒（Ｍｅｒｃｋ（独国）またはＢｉｏｓｏｌｖｅ（蘭国））は分析グレードのものであった。
【００６２】
ポリマー合成
触媒としてスズオクトアートを使用し、３日間１３０℃で減圧下、ＴＭＣモノマーの開環重合によりポリ（１，３−トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）のホモポリマーを合成した。分子量を制御するために、様々な量のヘキサンジオールを開始剤として使用した。ポリマーをクロロホルム中に溶解してエタノール中で沈殿させ、新鮮なエタノールで洗浄し、減圧下、室温で乾燥さて精製した。
【００６３】
ポリマーの評価（キャラクタリゼーション）
ＣＤＣｌ３（Ｍｅｒｃｋ（独国））を用いるプロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）分光計（３００ＭＨｚ、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｎｏｖａ（米国））によりモノマーの転化率（コンバージョン）を決定した。
【００６４】
精製したポリマーの数平均分子量および重量平均分子量（それぞれＭｎおよびＭｗ）、多分散指数（ＰＤＩ）ならびに固有粘度（［η］）をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ（米国））で決定した。セットアップされたものは、直列に配置したＶｉｓｃｏＧＥＬ  Ｉ−ｇｕａｒｄ−０４７８、ＶｉｓｃｏＧＥＬ  Ｉ−ＭＢＨＭＷ−３０７８およびＶｉｓｃｏＧＥＬ  Ｉ−ＭＢＬＭＷ−３０７８のカラムと、屈折計、粘度計および光散乱検出器を備えたＴＤＡ  ３０２  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ａｒｒａｙとを備えていた。これにより絶対分子量の決定が可能となる。すべての決定を１．０ｍｌ／分の流速で溶離液としてクロロホルムを用いて３０℃で行った。
【００６５】
ＰＴＭＣフィルムの調製
精製したポリマーを研究用プレス機（Ｆｏｎｔｅｉｊｎｅ  ＴＨＢ００８（蘭国））を用いて、５００μｍ厚のステンレス鋼のモールドを用いて１４０℃で圧縮成形した。フィルムを約２５ｋｇ／ｃｍ２で成形し、冷水を用いて室温まで冷却した。ＰＥＴＡが存在する架橋ＰＴＭＣフィルムについては、精製したポリマーおよびＰＥＴＡ（ポリマーの１または５重量％）をジクロロメタン中に溶解して良好な混合を達成した。溶媒のエバポレーションの後、上記の精製ポリマーと同じ方法で圧縮成形フィルムを調製した。かかるＰＥＴＡ含有ＰＴＭＣフィルムをクロロホルム中に完全に溶解し、かかる条件下では架橋されていなかったことを確認した。
【００６６】
ガンマ線の照射、ネットワークの形成およびネットワークの評価（キャラクタリゼーション）
ラミネート加工されたポリエチレン／ポリアミドのバッグ（Ｈｅｖｅｌ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｂ．Ｖ．（蘭国））に圧縮成形フィルムを減圧下で密封（シール）し、６０Ｃｏ源（Ｉｓｏｔｒｏｎ  Ｂ．Ｖ．エデ（蘭国））からの２５、５０または１００ｋＧｙでのガンマ線照射に曝した。
【００６７】
平衡状態の膨潤率（または膨潤度）およびゲル含有量を決定するために、上記の照射されたフィルムから、ディスク形状の試験片（厚さ５００μｍ、直径１０ｍｍ）を打ち抜いて、１週間にわたって３０ｍＬのＣＨＣｌ３に入れた。溶媒は３日後に一度、新しいものと交換した。この手順を確実に行い、ゾルフラクションを完全に除去した。膨潤したゲルの重量を秤量し、減圧下、室温で一定の重量になるまで乾燥させて、再度、重量を秤量した。ゲルフラクションおよびゾルフラクションは、以下の等式（１）、（２）からそれぞれ計算した。
【数１】
2013526649.tif 000002
式中、ｍｄは、乾燥した（抽出された）サンプルの質量であり、ｍ０は、膨潤前の試験片の質量である。
膨潤率（ｑ）は、以下の等式（３）から計算した。
【数２】
2013526649.tif 000003
式中、ｍｓは、抽出され、かつ膨潤したサンプルの質量であり、ρｓおよびρｐは、それぞれ、クロロホルムの密度（１．４８ｇ／ｃｍ３）、ＰＴＭＣの密度（１．３１ｇ／ｃｍ３）である。
【００６８】
熱特性および機械特性
各ＰＴＭＣフィルムのガラス転移温度（Ｔｇ）を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）で決定した。０または５重量％のＰＥＴＡを含むフィルムを０または２５ｋＧｙで照射した。また、ＰＥＴＡを含み、かつ照射されたフィルムのＴｇを、エタノールを用いたゾルフラクションの抽出後に決定した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｐｙｒｉｓ  １  ＤＳＣを用いて、−５０〜２００℃の温度範囲で１０℃／分の加熱速度でサンプル（５〜１０ｍｇ）を分析した。第１の走査の後、サンプルを３００℃／分で−５０℃まで冷却し、５分後に第２の走査を記録した。この第２の走査から、報告の値を決定した。装置の温度較正（キャリブレーション）に標準物質としてインジウム、鉛およびシクロヘキサンを使用した。
【００６９】
溶融状態で圧縮され、かつ照射されたＰＴＭＣフィルムの機械特性をＡＳＴＭ−Ｄ  ８８２−９１に従って３回で決定した。５００Ｎのロードセルを備えたＺｗｉｃｋ  Ｚ０２０引張試験機（Ｕｌｍ（独国））を５０ｍｍ／分のクロスヘッドスピードで操作した。初期のグリップからグリップまでの離間距離（ｇｒｉｐ−ｔｏ−ｇｒｉｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）は５０ｍｍであり、０．０１Ｎのプリロードを付与した。試験片の変形はグリップ間の離間によってもたらされた。従って、示されるヤング率の値（この値は、応力−ひずみ曲線（ストレス−ストレイン曲線）の初期の傾きから計算される）は、ポリマーの硬さを示すためだけに示されるものである。
【００７０】
ダイナミックローディング条件下でポリマーの挙動を評価するため、サイクル試験にて５０ｍｍ/分で、５０％のひずみ（ストレイン）まで試験片（ｎ＝１）を繰り返し（２０回）引き伸ばした。２時間の回復期間の後、２１回目のサイクルの応力−ひずみの図から、永久変形を概算した。これらの実験において、０．０１Ｎのプリロードが付与され、変形はグリップ間の離間によってもたらされた。これらの値における誤差は約０．５％ひずみである。
【００７１】
フィルムの引裂強度をズボン型の試験片（ｎ＝３）を用いてＡＳＴＭ  １９３８に従って決定した。試験片の寸法は７５×２５×０．５ｍｍであり、試験片の幅の中心に５０ｍｍ長の切れ目を入れた。２５０ｍｍ／分の速度で測定を３回行った。記載の最大引裂強度は試験片の厚みに対して正規化され、Ｎ／ｍｍで示される。
【００７２】
また、比較として、シリコーンエラストマー（Ｓｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８４、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ（米国））のフィルムの機械特性も上記の通り決定した。シリコーンエラストマーのフィルムは厚みが約５００μｍであり、上記製造業者の指示に従ってキャスティングして熱硬化させたものである。
【００７３】
細胞生存性アッセイ
ガンマ線が照射され、かつ抽出されていないＰＴＭＣフィルム（５重量％のＰＥＴＡを含むもの）の潜在的な細胞毒性を直接および間接的にＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム］アッセイを用いて評価した。手短に説明すると、マウスの皮膚の繊維芽細胞（ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞株）を９６ウェルプレート（５０００細胞数／ウェル）およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。
【００７４】
間接的に細胞毒性を評価するために、各フィルムの抽出されていないディスク（ｎ＝３、直径８ｍｍ、厚み５００μｍ）を３７℃、５％ＣＯ２で５００μｌのＤＭＥＭを用いて２４時間インキュベートし、浸出可能な成分をすべて抽出した。３日間の期間にわたる細胞培養の後、培地を、この浸出物を含有するＤＭＥＭ培地と交換した。直接的な細胞毒性のアッセイでは、抽出されていないディスク（ｎ＝３）を培養中の細胞上に直接配置した。両アッセイにて、培養培地に溶解するホルマザンの吸収度を、培養からさらに２日後に測定した。ＤＭＥＭ培地のみでインキュベートした細胞培養物から得られた平均値（ネガティブコントロール）を１００％細胞生存性として標準化した。ラテックスゴム（Ｈｉｌｖｅｒｓｕｍ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｆａｃｔｏｒｙ、ヒルヴァーシュム（蘭国））をポジティブコントロールとして使用した。
【００７５】
インビトロでの酵素による侵食の研究
ブタ膵臓由来のコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）を使用して、ガンマ線を照射したＰＴＭＣフィルムの酵素による加水分解を研究した。０．０２重量％のＮａＮ３（Ｓｉｇｍａ（米国））を殺菌剤として含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）を使用してＣＥ酵素水溶液を２０μｇ／ｍＬの濃度で調製した。未抽出のディスク形状のフィルム（直径１０ｍｍ、厚み約５００μｍ、ｎ＝３／測定時点）を、１ｍｌの酵素溶液を含むバイアル瓶に入れ、３７℃でコンディショニングした。２日毎に一度、培地を新しいものと入れ換えた。ＰＢＳ（ｐＨ７．４、ｎ＝１／測定時点）を用いて酵素を含まないコントロールの実験を行った。所定の時点にて、その表面をリンスし、ブロッティングした後に、湿潤試験片の質量および厚みを決定した。室温、減圧下で重量が一定になるまで試験片を乾燥した後に再び測定を行った。
【００７６】
結果
ガンマ線照射による架橋の挙動への初期ポリマー分子量およびペンタエリスリトールトリアクリレートの含有量の影響ならびに形成されるＰＴＭＣネットワークの物理特性への影響を評価した。開始剤の濃度を０〜０．１モル％に変化させることによって、分子量を８０〜４５０ｋｇ／ｍｏｌの範囲で有するＰＴＭＣポリマーを合成した（各ポリマーの分子量を示す表１を参照のこと）。モノマー転化率はすべての場合において９９％よりも高いものであった。各水酸基がポリマー鎖の成長を開始すると仮定して、モノマーと開始剤との比から、得られたポリマーの分子量は期待され得るものよりも低いものであった。これは、恐らく、水などの不純物を含む水酸基から重合が開始することに起因する。圧縮成形後、わずかに低いＭｎの値およびわずかに高い多分散指数が得られた。
【００７７】
【表１】
2013526649.tif 000004
【００７８】
ガンマ線の照射によるＰＴＭＣの架橋
種々の分子量を有する圧縮成形されたＰＴＭＣフィルムにガンマ線を減圧下で２５、５０または１００ｋＧｙの量で照射した。ゲル含有量およびクロロホルム中での平衡の膨潤率を図１Ａおよび１Ｂに示す。これらの図は、所定の照射量において、初期ＰＴＭＣ分子量が増加すると、より高いゲル含有量、より低い膨潤率を有するネットワークが得られることを示す。２５ｋＧｙではＰＴＭＣ８８およびＰＴＭＣ１５７は全く架橋しなかった。それに対して、ＰＴＭＣ２７７およびＰＴＭＣ４４３は、それぞれ、比較的低いゲル含有量２２±１％、６０±１％を有していた。調査したポリマー分子量の範囲では、１００ｋＧｙの照射量において、ゲル含有量は１５±４％〜７３±１％の間で変動し、膨潤率は３２７±３２〜２２±１の間で変動した。
【００７９】
図１Ａおよび１Ｂでは、所定の分子量において、照射量が増加すると、ゲル含有量が増加し、膨潤率が低下することも見受けられ得る。照射量の増加により、低分子量のＰＴＭＣに対して、より大きな効果が得られた。例えば、ＰＴＭＣ４４３の照射の間に照射量を２５から１００ｋＧｙに増加させることでゲル含有量は６０±１％から７３±１％に増加した。それに対してＰＴＭＣ１５７ではゲル含有量は０％から４２±２％に増加した。それと同時に膨潤率はＰＴＭＣ４４３については４５±１から２２±１に低下し、ＰＴＭＣ１５７については５３７±９（５０ｋＧｙ）から９２±４に低下した。ＰＴＭＣネットワークのゲル含有量および密度は、ポリマーの初期分子量の増加によって、あるいはガンマ線照射量の増加によって増加し得ると結論付けられ得る。
【００８０】
様々な初期分子量のＰＴＭＣポリマーの架橋の挙動を等式（４）に従って評価した。等式（４）は、照射量（ｒ）と形成されるネットワークのゾルフラクション（ｓ）とに関するものであり、これは、鎖の切断と架橋の発生の両方がランダムで生じ、かつそれらの数は照射量に比例するとの仮定に基づく。
【数３】
2013526649.tif 000005
式中、Ｇ（ｓ）およびＧ（ｘ）は、それぞれ、切断、架橋の放射線化学収量であり、１００ｅＶでの切断、架橋の発生数として定義される。各架橋は２本の鎖を含むので、鎖の切断密度と架橋密度との比はＧ（ｓ）／２Ｇ（ｘ）である。ランダムで単峰型（モノモード）の分子量分布を有するポリマーについては、
【数４】
2013526649.tif 000006
と、照射量の逆数との間で線形の関係が得られる。この研究で使用したＰＴＭＣポリマーについて、かかるプロットを図２Ａに示す。
【数５】
2013526649.tif 000007
の初期照射量への外挿によって、等式４に示される架橋に対する切断の放射線化学収量の比の決定が可能となる。ＰＴＭＣ４４３、ＰＴＭＣ２７７およびＰＴＭＣ１５７について決定したＧ（ｓ）／Ｇ（ｘ）の比はそれぞれ２．１、２．０および１．４である。
【００８１】
かかるプロットのゼロのゲル含有量（
【数６】
2013526649.tif 000008
＝２）への外挿により、最小のゲル化の照射量を概算することができる。ＰＴＭＣ４４３、ＰＴＭＣ２７７およびＰＴＭＣ１８７について、最小のゲル化の照射量を決定したところ、それぞれ６．３、１６．７および３６．３ｋＧｙであった。
【００８２】
得ることのできる最大のゲルフラクション（（１−ｓ）ｍａｘ）は、以下の式を用いて決定することができる。
【数７】
2013526649.tif 000009
【００８３】
図２Ｂでは、ＰＴＭＣポリマーの初期分子量が増加するに従って、Ｇ（ｓ）／Ｇ（ｘ）の比が低下し、（１−ｓ）ｍａｘが増加することが明確に見受けられ得る。最も高い分子量を有するポリマーＰＴＭＣ４４３は、架橋に対する鎖の切断の最も低い比（１．４）と、得ることができる最も高いゲル含有量（７７％）を有していた。
【００８４】
電子スピン共鳴（ＥＳＲ）により、ポリエチレンおよび直鎖状脂肪族ポリエステルの照射で形成されるラジカルの性質を調べた。ポリエチレンについては、主鎖の切断も生じ得るが、水素の引き抜きにより形成されたアルキルラジカルが結合して架橋を形成し得る。従って、照射によって、ポリマーネットワーク、分岐構造および低分子量のポリマー鎖の形成が同時にもたらされ得る。アルキルラジカルは、ポリ（ε−カプロラクトン）またはポリ（グリコリド）の照射によっても形成される。しかし、ガス状生成物（一酸化炭素、二酸化炭素および水素）の形成が観察されることから、照射によりＣ−Ｏ結合も切断されることが示唆される。２５ｋＧｙでＰＴＭＣ８８およびＰＴＭＣ１５７をそれぞれ照射すると、Ｍｎの値は４５ｋｇ／ｍｏｌ、１２７ｋｇ／ｍｏｌまで低下し、Ｍｗの値は１７３ｋｇ／ｍｏｌ、３９４ｋｇ／ｍｏｌまで増加した。多分散指数（ＰＤＩ）は、１．８１、１．５１から３．８４、３．１０にそれぞれ増加した。これは分岐したＰＴＭＣ構造の形成を示す。５０ｋＧｙで照射すると、ＰＴＭＣ８８のＰＤＩ値はさらに６．９９まで増加した。
【００８５】
ペンタエリトリトールトリアクリレート（ＰＥＴＡ）の存在下でのガンマ線の照射によるＰＴＭＣの架橋
ガンマ線の照射によりＰＴＭＣが架橋され、非常に大きい分子量を有する高ゲル含有量のポリマーとなることが求められる。我々が合成した最も大きい分子量を有するＰＴＭＣポリマー（４４３ｋｇ／ｍｏｌ）の場合、１００ｋＧｙでのガンマ線照射によって７３％のゲル含有量を有するネットワークが得られた。
【００８６】
推定によると、理論的には、最大のゲルの割合は７７％であることが期待され得ることが示される（図１Ａ、２Ｂおよび等式５）。
【００８７】
一般に、架橋の発生に対する鎖の切断の比を減少させた架橋試薬の存在下では、形成されるネットワークのゲルの割合は、照射によって増加し得る。ガンマ線の照射によるＰＴＭＣのネットワーク形成を促進するため、ＰＥＴＡを架橋試薬として使用した。それだけで、ＰＥＴＡは、２５ｋＧｙでのガンマ線の照射で９９．８±０．１％のゲルの割合を与えた。
【００８８】
２５ｋＧｙで様々な量のＰＥＴＡ（０、１、５重量％）を含む様々な初期分子量のＰＴＭＣにガンマ線を照射することによって形成したネットワークのゲル含有量および平衡の膨潤率を図３Ａおよび３Ｂに示す。ＰＥＴＡの取り込みの効果は顕著に見受けられ得る。得られるＰＴＭＣネットワークのゲル含有量は大幅に増加し、膨潤率は低下した。比較的低い分子量を有するＰＴＭＣにＰＥＴＡを添加した場合に効果は最も現れた。０、１または５重量％でＰＥＴＡを含むＰＴＭＣ８８については、２５ｋＧｙでの照射後のネットワークのゲル含有量は、０％から、３１±１％、７３±１％にそれぞれ増加した。ＰＴＭＣ４４３については、各値は、６０±１％、７６±１％および９６±１％であった。また、ＰＥＴＡの取り込みによって、より蜜に架橋したＰＴＭＣネットワークが得られた。０、１または５重量％のＰＥＴＡを含むフィルムについて、２５ｋＧｙでのＰＴＭＣ４４３の照射後のネットワークの膨潤率はそれぞれ４５±１、２２±１、４．６±０．２であった。
【００８９】
調査したＰＴＭＣポリマーの分子量の範囲にわたって、１または５％のＰＥＴＡを含むフィルムについて、２５ｋＧｙでの照射後に形成されたネットワークのゲル含有量は、それぞれ、３１±１〜７６±１％、７３±１〜９６±１％の範囲であった。これに対応するクロロホルム中での膨潤率は、７５±１〜２２±１、７．１±０．１〜４．６±０．２の範囲であった。これは、ＰＥＴＡの取り込みによって、ガンマ線の照射によるＰＴＭＣの架橋の程度が大きく増加したことを示す。かかるネットワークのゲル含有量およびネットワーク密度は、ＰＥＴＡ含有量を調整することによって容易に変動し得た。
【００９０】
５０または１００ｋＧｙのより高い照射量で５重量％のＰＥＴＡを含むＰＴＭＣフィルムを照射すると、形成されたネットワークのゲル含有量のさらなる低下をもたらした。照射量を２５ｋＧｙから１００ｋＧｙに上昇すると、ＰＴＭＣ４４３を用いて形成したネットワークのゲル含有量は９６％から８７％に減少した。既に２５ｋＧｙで全てのＰＥＴＡが消費されているので、さらなる架橋効率の増加は期待できないようである。確かに、ガンマ線を照射したＰＥＴＡ含有ＰＴＭＣフィルムからの抽出物のＮＭＲスペクトルは、未反応のアクリレート基を含む化合物の存在を示さなかった。
【００９１】
５重量％のＰＥＴＡの存在下でガンマ線を照射することで形成した種々のＰＴＭＣネットワークの膨潤率は４．６〜７．１の範囲であった。これらの値は、分子量が１５００または１７２００ｇ／ｍｏｌである３本腕のＰＴＭＣマクロマーから形成された上述の光架橋ネットワークの値（膨潤率はそれぞれ３．３±０．４、９．８±０．４であった）と同等である。概算によると、５重量％のＰＥＴＡが存在するＰＴＭＣに照射することで形成したネットワークの架橋間で分子量は、約１５００〜３６００ｇ／ｍｏｌの範囲であると期待され得る。
【００９２】
ガンマ線を照射したＰＴＭＣネットワークの熱特性および機械特性
すべてのＰＴＭＣポリマーは室温未満のガラス転移温度（Ｔｇ）を有する非晶質のものであった。圧縮成形され照射されていないＰＴＭＣフィルムのＴｇは、ポリマーの分子量と独立して、−１７．７℃から−１８．５℃まで変動した。ＰＥＴＡをポリマーに添加しなかった場合、２５ｋＧｙでのガンマ線の照射はフィルムのＴｇに対して顕著な影響を与えなかった。５重量％のＰＥＴＡの取り込みは、ガンマ線を照射したＰＴＭＣフィルムのガラス転移温度を増加した。これは、より密なネットワークの形成に起因し得る。抽出の前ではこれらのフィルムのＴｇの値は−１６．２から−１６．７℃の間であったが、これらの値は、エタノールで抽出した後は幾分か高いものであった（−１４．７〜１５．１℃）。これらのフィルムの熱分析によって、調べた温度範囲（−５０〜２００℃）では単一のＴｇのみが示され、これはＰＥＴＡがＰＴＭＣネットワーク内に均一に取り込まれたことが示される。
【００９３】
初期分子量およびネットワーク形成によるＰＴＭＣフィルムの弾性モジュラス（Ｅ−モジュラス）、降伏強度および破壊応力の値への影響を図４Ａ、４Ｂおよび８Ｃに示すが、ＰＴＭＣ８８およびＰＴＭＣ４４３の代表的な応力−ひずみ曲線を図５Ａおよび５Ｂにそれぞれ示す。
【００９４】
架橋されていない状態において、Ｅ−モジュラス、降伏強度および破壊応力の値は、ポリマーの分子量の増加にともなって増加した。全てのＰＴＭＣフィルムは可撓性であった。ＰＴＭＣ８８のＥ−モジュラスおよび降伏強度の値はそれぞれ６．３±０．２ＭＰａ、１．２±０．１ＭＰａであり、ＰＴＭＣ４４３についてはこれらの値はそれぞれ７．２±０．１ＭＰａ、２．８ＭＰａであった（図４Ａおよび４Ｂ）。破壊応力は、ＰＴＭＣ８８の０．７±０．１ＭＰａからＰＴＭＣ４４３の２５．２±３．７ＭＰａまで増加した。このようにＰＴＭＣの分子量に物理特性が依存することは以前から観察されていた。２５ｋＧｙで様々なＰＴＭＣフィルムをガンマ線で架橋すると、Ｅ−モジュラスおよび降伏強度の値は、それぞれ、５．５±０．１〜６．７±０．２ＭＰａの範囲の値、０．９±０．１〜２．０±０．１ＭＰａの範囲の値に減少した（図４Ａおよび４Ｂ）。同様に、これら抽出されていないネットワークの破壊応力（０．７±０．１〜１４±０．４ＭＰａの範囲の値）は、架橋されていないフィルムの値よりも低いものであった（図４Ｃならびに図５Ａ、５Ｂ）。これらの値は、Ｅ−モジュラスが２．６±０．２ＭＰａであり、破壊応力（引張強度）が７．３±０．５ＭＰａであるシリコーンエラストマーフィルムのものに近い。
【００９５】
照射量が増加すると、ＰＴＭＣフィルムのＥ−モジュラスおよび降伏強度がさらに低下した。１００ｋＧｙにおいて、フィルムのＥ−モジュラスおよび降伏強度は、それぞれ、２．９±０．２〜４．６±０．２ＭＰａの範囲、０．５〜１．２ＭＰａの範囲であった。また、破壊応力の値はさらに低く、０．５±０．１〜２．７±０．２ＭＰａの範囲であった。また、照射量を増加するとゲル含有量およびネットワーク密度は高くなるが、強度および剛性の低下がもたらされる。これは、ガンマ線の照射の間に架橋と同時に鎖の切断が生じることに起因するようである。
【００９６】
ネットワーク構造がＰＥＴＡを取り込むことによって、Ｅ−モジュラスおよび破壊応力の低下が防止され得る。図４および５において、ガンマ線が照射され５重量％のＰＥＴＡを含むＰＴＭＣネットワーク（抽出されていないもの）のすべてが依然として非常に可撓性であり、ゴム様であったことも見受けられ得る。Ｅ−モジュラスおよび降伏強度の値は、それぞれ、９．５±０．６〜１０．７±０．２ＭＰａの範囲（図４Ａ）、３．１±０．１〜４．９±０．１の範囲（図４Ｂ）であった。ＰＥＴＡ存在下での照射の際、ＰＴＭＣネットワークの破壊応力の大きな増加が観察された。５重量％のＰＥＴＡの存在下、２５ｋＧｙで照射した際、ＰＴＭＣ１５７の破壊応力は１．４±０．１ＭＰａから２５．０±１．８ＭＰａへと非常に顕著に増加した（図４Ｃ）。５重量％のＰＥＴＡの存在下でガンマ線を照射したＰＴＭＣ４４３のフィルムは、例外的に高い３５．３±０．３ＭＰａの最大の引張強度を有していた。これにより、靭帯の組織工学などの強い強度が求められる用途において、かかるフィルムの利用が可能となる。５重量％のＰＥＴＡの存在下で形成したＰＴＭＣネットワークのゾルフラクションのエタノールによる抽出によって、最大引張強度がさらに向上した。ＰＴＭＣ８８の破壊応力は５．５±０．９から１２．４±２．９ＭＰａに増加し（図４Ｃおよび５Ａ）、ＰＴＭＣ４４３の破壊応力は３７．７±１．３ＭＰａに増加した（図４Ｃおよび５Ｂ）。抽出されたネットワークのＥ−モジュラスおよび降伏強度の値は、抽出されていないネットワークの値と同等であった。ＰＴＭＣフィルムの耐クリープ性を実験の部に記載のようにサイクル変形試験で評価した。図４Ｄは、架橋されていないＰＴＭＣフィルムの永久変形（パーマネントセット）は主にポリマーの分子量によって決定され、１１．２％〜１．２％で変動することを示す。最も分子量の高いポリマーは、最も高い耐クリープ性を有する。２５ｋＧｙでのガンマ線の照射により全てのポリマーの永久変形（パーマネントセット）が低下した。照射され、抽出されていないＰＴＭＣ４４３およびＰＴＭＣ２７７のフィルムは、シリコーンラバーと同程度の永久変形（パーマネントセット）の値を有し（１．０％ひずみ）、これら生分解性エラストマーが優れた耐クリープ性を有することを示す。また、ＰＴＭＣ８８を２５ｋＧｙで照射した場合、この抽出されていないフィルムは、ゲル形成が全く観察されなかったにもかかわらず、照射されていないフィルムの永久変形（パーマネントセット）（１１．２％）よりもかなり低い永久変形（パーマネントセット）（３．２％）を有していた。
【００９７】
５重量％のＰＥＴＡの存在下、２５ｋＧｙでガンマ線を照射すると、抽出されていないＰＴＭＣ８８およびＰＴＭＣ１５７の永久変形（パーマネントセット）の値は、それぞれ、１．４％ひずみ、１．６％ひずみにさらに低下した。これは、比較的低い初期分子量のＰＴＭＣポリマーの場合であっても、ガンマ線の照射により優れた耐クリープ性を有するネットワークが得られ得ることを意味する。エタノールで抽出すると、全てのＰＥＴＡ含有ネットワークの永久変形（パーマネントセット）はさらに低いものであった（０．９〜１．２％）。
【００９８】
ガンマ線の照射によるＰＴＭＣ４４３の引裂伝播抵抗への影響を評価した。照射していないＰＴＭＣ４４３フィルムは、１．９±０．２Ｎ／ｍｍの最大引裂強度を有していた。すでにこの値は、シリコーンエラストマーフィルムの値（０．２１±０．０１Ｎ／ｍｍ）よりもかなり高いものであった。５重量％のＰＥＴＡの存在下でガンマ線を照射すると、ＰＴＭＣネットワークの引裂抵抗は４．２±０．２Ｎ／ｍｍの値まで顕著に増加した。エタノールで抽出した後、引裂強度は、よりさらに増加して９．３±２．０Ｎ／ｍｍとなった。
【００９９】
ガンマ線を照射したＰＴＭＣネットワークと接触させた細胞の生存性
２５ｋＧｙでガンマ線を照射したＰＴＭＣフィルム（抽出されていないもの）の潜在的な細胞毒性を５重量％のＰＥＴＡの存在下で直接および間接的に細胞生存性アッセイによって評価した（図６）。両アッセイにおいて、細胞の形態（モルホロジー）への悪影響は観察されなかった。繊維芽細胞をフィルムと直接接触させた場合、細胞生存性の値は非常に高く、８７±１６〜１１７±２６％の範囲の値であった。また、間接アッセイにおいても細胞生存性は非常に高く、９１±８〜１００±７％の範囲の値であった。従って、５重量％のＰＥＴＡの存在下での架橋は細胞生存性への悪影響を及ぼさなかったことが確認される。
【０１００】
ガンマ線が照射されたＰＴＭＣネットワークのインビトロでの酵素による侵食
２５ｋＧｙで照射され抽出されていないＰＴＭＣ４４３フィルムのインビトロでの酵素による侵食を、コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）を用いて調べた。なぜなら、この酵素は恐らくＰＴＭＣの侵食において重量な役割を果たすからである。図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、ＣＥ水溶液中でインキュベートしたフィルムの質量および厚みの変化を時間の関数として示す。５重量％のＰＥＴＡを含み照射されたＰＴＭＣフィルムは、ＰＥＴＡを含まなかったものよりもかなり遅く侵食された。３週間後、ＰＥＴＡを含まなかったフィルムの質量損失は約６４％であり、５％のＰＥＴＡを含むフィルムの質量損失は約１３％であった。また、５重量％のＰＥＴＡを含むフィルムの厚みの減少もＰＥＴＡを含まなかったフィルムのものよりもかなり低いものであった（図７Ｂ）。この酵素溶液において対応する侵食速度は、それぞれ、１２．０±２．９μｍ／日、３．０±１．６μｍ／日であった。両方のポリマーフィルムにおいて、質量の減少は、厚みの減少と同時に生じた（図７Ｃ）。これは、表面侵食プロセスを意味する。図７Ｃにおいて、厚みの減少は、質量の減少よりもいくらか少ないようである（とりわけ、後の時点において）。これは、分解の間に表面が粗面化されることから、フィルムの厚みを決定する際の誤差の結果であってもよい。
【０１０１】
これらの結果は、ＰＥＴＡの存在下でのＰＴＭＣの架橋がＰＴＭＣネットワークの侵食速度を減少させる有効な方法であることを示す。これは、ＰＥＴＡを含むＰＴＭＣ４４３フィルムがより高いゲル含有量およびネットワーク密度を有することに起因し得る。また、ＰＥＴＡ中に水酸基が存在する結果として、ＰＥＴＡ含有ＰＴＭＣネットワークのより多くの水の取り込みが、機能し得る。ＣＥ水溶液中の２１日間のインキュベーションの後、ＰＥＴＡ含有フィルムの水の取り込みは、３．４±０．６％であり、ＰＥＴＡを含まなかったＰＴＭＣ４４３ネットワークの水の取り込みは、１．７±０．４％であった。この酵素は疎水性物質に吸着すると最も活性化されることが知られている。
【０１０２】
結果
高いゲル含有量および高いネットワーク密度を有する可撓性ＰＴＭＣネットワークは、ペンタエリスリトールトリアクリレート（ＰＥＴＡ）が存在する圧縮成形されたＰＴＭＣフィルムのガンマ線の照射により得ることができる。また、この架橋試薬の取り込みも高い引張強さ、ならびに優れた耐引裂性および耐クリープ性を有するネットワークをもたらす。さらに、ＰＴＭＣネットワークの酵素による侵食の速度は、この方法にて減少することができる。直接および間接的なアッセイによると、これらのネットワークは繊維芽細胞の生存性に対する悪影響を全く有していない。従って、エラストマー特性を有する生分解性ＰＴＭＣネットワークを得るためには、ＰＥＴＡ存在下でのガンマ線の照射が非常に有効な方法であると結論付けられ得る。これらゴム様の生分解性ＰＴＭＣネットワークは、軟部組織および心臓血管の組織の工学（作製）ならびに制御放出などの医療用途に十分に適している。
【０１０３】
実施例２
材料
ポリマーグレードの１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（独国））、ポリマーグレードのＤ，Ｌ−ラクチド（ＤＬＬＡ、Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（蘭国））、スズオクトアート（Ｓｉｇｍａ（米国））およびペンタエリスリトールトリアクリレート（ＰＥＴＡ、Ａｌｄｒｉｃｈ（米国））を受け取ったまま使用した。溶媒（Ｍｅｒｃｋ（独国）またはＢｉｏｓｏｌｖｅ（蘭国））は、分析グレートのものであった。Ｊ７７４Ａマクロファージ（ＡＴＣＣ−ＴＩＢ−６７）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。培養培地、ウシ胎児血清、ＧｌｕｔａｍａｘＴＭおよびペニシリン−ストレプトマイシンをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｉｂｃｏ（米国））から入手した。ディスポーザブル培養容器は、Ｎｕｎｃ（米国）およびＧｒｅｉｎｅｒ（独国）からのものであった。
【０１０４】
ポリマーの合成
ポリ（１，３−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）ホモポリマー、およびＴＭＣとＤＬＬＡとのコポリマーを、触媒としてスズオクトアートを用いて３日間にわたって１３０℃で減圧下で対応するモノマー（５０、６０および７０ｍｏｌ％のＴＭＣ）の開環重合によって合成した。ポリマーを、クロロホルム中に溶解し、エタノールまたはイソプロパノール中に沈殿させ、新鮮なアルコールで洗浄し、減圧下で室温で乾燥させて精製した。ＤＬＬＡとのコポリマーは一定重量になるまで窒素下８０℃でさらに乾燥させた。
【０１０５】
ポリマーの評価（キャラクタリゼーション）
ＣＤＣｌ３（Ｍｅｒｃｋ（独国））を用いてプロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）分光計（３００ＭＨｚ、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｎｏｖａ（米国））でモノマー転化率およびコポリマーの組成を決定した。
【０１０６】
コポリマーの数平均分子量および重量平均分子量（それぞれＭｎおよびＭｗ）、多分散指数（ＰＤＩ）および固有粘度（［η］）をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ（米国））で決定した。セットアップされたものは、直列に配置されたＶｉｓｃｏＧＥＬ  Ｉ−ｇｕａｒｄ−０４７８、ＶｉｓｃｏＧＥＬ  Ｉ−ＭＢＨＭＷ−３０７８およびＶｉｓｃｏＧＥＬ  Ｉ−ＭＢＬＭＷ−３０７８のカラムと、屈折計、粘度計および光散乱検出器を備えたＴＤＡ  ３０２  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ａｒｒａｙとを備えていた。これにより、絶対分子量の決定が可能となる。全ての決定は、１．０ｍｌ／分の流速で溶離液としてクロロホルムを用いて３０℃で実施した。
【０１０７】
ポリマーフィルムの調製
精製したポリマーを、研究用プレス機（Ｆｏｎｔｅｉｊｎｅ  ＴＨＢ００８（蘭国））を用いて５００マイクロメーター厚のステンレス鋼モールドにて１４０℃で圧縮成形した。フィルムを約２５ｋｇ／ｃｍ２で成形し、冷水を用いて室温まで冷却した。ＰＥＴＡを含むポリマーフィルムの架橋の実験（以下参照）においては、精製したポリマーおよびＰＥＴＡ（ポリマーの５重量％）をジクロロメタン中に溶解して均一な混合を達成した。溶媒をエバポレーションした後、圧縮成形したフィルムを上記の精製したポリマーと同様にして調製した。
【０１０８】
ガンマ線の照射、ネットワークの形成およびネットワークの評価（キャラクタリゼーション）
ラミネート加工されたポリエチレン／ポリアミドのバッグ（Ｈｅｖｅｌ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｂ．Ｖ．（蘭国））中、減圧下で圧縮成形されたフィルムを密封（シール）し、６０Ｃｏ源（Ｉｓｏｔｒｏｎ  Ｂ．Ｖ．、エデ（蘭国））からの２５ｋＧｙのガンマ線照射に曝した。
【０１０９】
平衡の膨潤率およびゲル含有量を決定するために、上記の照射されたフィルムからディスク形状の試験片（厚み５００μｍ、直径１０ｍｍ）を打ち抜き、１週間にわたって３０ｍＬのＣＨＣｌ３中に入れ、溶媒を３日後に一度、新しいものと入れ替えた。この手順によってゾルフラクションの完全な除去を確保した。次いで、膨潤したゲルの重量を秤量し、減圧下で室温で重量が一定になるまで乾燥し、再び重量を秤量した。ゲルフラクションおよびゾルフラクションをそれぞれ以下の等式（１）および（２）に従って計算した。
【数８】
2013526649.tif 000010
式中、ｍｄは、乾燥サンプル（抽出されたもの）の質量であり、ｍ０は、膨潤前の試験片の質量である。体積膨潤度（ｑ）は、以下の等式（３）に従って計算した。
【数９】
2013526649.tif 000011
式中、ｍｓは、抽出して膨潤したサンプルの質量であり、ρｓおよびρｐは、それぞれ、クロロホルムの密度（１．４８３２ｇ／ｃｍ３）、コポリマーの密度である。コポリマーの密度を、圧縮成形したフィルムの質量および寸法を測定することで決定した。１００％、７２％、６０％、４８％および０％のＴＭＣを含むＴＭＣとＤＬＬＡとのコポリマーの密度は、それぞれ、１．３１、１．２９、１．２７、１．２６および１．２５ｇ／ｃｍ３であった。
【０１１０】
熱特性および機械特性
ＰＥＴＡ（０重量％、５重量％）を含み、溶融圧縮され、かつ照射（０ｋＧｙ、２５ｋＧｙ）されたコポリマーの機械特性を、ＡＳＴＭ−Ｄ  ８８２−９１に従って３回で決定した。抽出された試験片と抽出されていない試験片の両方で測定を実施した。試験片の寸法は、０．５×１０×０．０５ｃｍ３であった。浸出可能な成分の抽出をエタノールで行った。５００Ｎのロードセルを備えたＺｗｉｃｋ  Ｚ０２０引張試験機（Ｕｌｍ（独国））を５００ｍｍ／分のクロスヘッドスピードで操作した。初期のグリップからグリップまでの離間距離は５０ｍｍであり、０．０１Ｎのプリロードを付与した。試験片の変形はグリップからグリップまでの離間距離によってもたらされた。従って、示される弾性モジュラスの値（これは応力−ひずみ曲線の初期の傾きから計算される）は、ポリマーの剛性を示す。
【０１１１】
フィルムの引裂強度は、ＡＳＴＭ  １９３８に従って、ズボン形の試験片を用いて決定した（ｎ＝３）。試験片の寸法は、７５×２５×０．５ｍｍであり、試験片の幅の中央に５０ｍｍ長の切り込みを有していた。測定は２５０ｍｍ／分の速度で３回行った。報告される最大の引裂強度は試験片の厚みに対して正規化され、Ｎ／ｍｍで示される。
【０１１２】
精製したポリマーおよび照射されたポリマーフィルムのガラス転移温度（Ｔｇ）および溶融温度を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）で決定した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｐｙｒｉｓ  １  ＤＳＣを用いて、−１００〜２００℃の温度範囲で１０℃／分の加熱速度でサンプル（５〜１０ｍｇ）を分析した。最初の走査の後、サンプルを３００℃／分で−１００℃に冷却し、２回目の走査を５分後に記録した。報告される値は２回目の加熱走査で決定されたものであった。インジウム、鉛およびシクロヘキサンを温度較正の標準として使用した。
【０１１３】
細胞生存性アッセイ
５重量％のＰＥＴＡを含み、ガンマ線が照射され、かつ抽出されていないコポリマーフィルムの潜在的な細胞毒性を、直接および間接的なＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム］アッセイを用いて評価した。手短に説明すると、マウスの皮膚の繊維芽細胞（ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞株）を９６ウェルプレート（５０００細胞数／ウェル）およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。３７℃、５％のＣＯ２で細胞を３日間インキュベートした。
【０１１４】
間接的な細胞毒性の評価では、各フィルムの抽出されていないディスク（ｎ＝３、直径８ｍｍ、厚み５００μｍ）を５００μｌのＤＭＥＭとともに３７℃、５％のＣＯ２で２４時間インキュベートし、浸出可能な成分をすべて抽出した。３日間の細胞培養の期間の後、培地を上記浸出可能な成分を含むＤＭＥＭ培地と交換した。直接的な細胞毒性アッセイでは、抽出されていないディスク（ｎ＝３）を培養中の細胞上に直接配置した。両方のアッセイにおいて、培養培地に可溶であるホルマザンの吸収度をさらに２日間の培養の後に測定した。ＤＭＥＭ培地のみでインキュベートした細胞培養物について得られた平均値（ネガティブコントロール）を１００％の細胞生存性として標準化した。ラテックスゴム（Ｈｉｌｖｅｒｓｕｍ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｆａｃｔｏｒｙ、ヒルヴァーシュム（蘭国））を細胞毒性のポジティブコントロールとして用いた。
【０１１５】
マクロファージが媒介する侵食の研究
４．５ｇ／ＬのＤ−グルコース、ピルビン酸塩、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１００μｇ／ｍＬの２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘＴＭを含むＤＭＥＭ中でＪ７７４Ａマクロファージを維持した。４〜７日毎に細胞を引っ掻くことで継代した。
【０１１６】
照射されていないコポリマーフィルム（ＰＥＴＡを含まないもの）、およびガンマ線が照射され、かつ抽出されていないコポリマーフィルム（５重量％のＰＥＴＡを含むもの）について、マクロファージが媒介する侵食を、これらのフィルムの表面上にＪ７７４Ａマクロファージを直接培養することで調べた。この試験の試験片は、直径が１５ｍｍであり、厚みが約５００μｍであった。播種密度は約８×１０４細胞数／ｃｍ２であった。７日目、１０日目に新鮮な細胞のアリコートを各ウェルに添加した。培地を一週間に３回交換した。各材料の６つのディスクで細胞を培養した。
【０１１７】
培養の１４日後、各材料の３個の試験片を最初にミリＱ水中に入れて、細胞を溶解し、次いで、徹底的に濯いで重量を秤量した。室温、減圧下で一定の重量になるまでフィルムを乾燥した後、サンプルの重量を再び秤量した。試験片の表面を金でスパッタコートし、次いで、操作電圧５ｋＶの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＸＬ  ３０  ＥＳＥＭ−ＦＥＧ（蘭国））で分析した。
【０１１８】
各材料の残りのディスク（ｎ＝３）を、細胞骨格安定化（ＣＳ）緩衝液（０．１Ｍのピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、１ｍＭのエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ｐＨ＝６．９）中の３．７％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定し、次いで、ＰＢＳに移した。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いる細胞核の蛍光染色およびテトラメチルローダミンイソチオシアニドファロイジン（ＴＲＩＴＣ−ファロイジン）を用いるアクチン細胞骨格の蛍光染色に試験片を使用した。次いで、これらの試験片を共焦点レーザー走査顕微鏡（ＬＥＩＣＡ  ＴＣＳ  ＳＰ２、完全に水に浸漬させた状態での４０倍の対物レンズ（ＮＡ０．８０））で分析した。
【０１１９】
結果
トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）とＤ，Ｌ−ラクチド（ＤＬＬＡ）との高分子量のコポリマー、ならびに、ＰＴＭＣホモポリマーおよびＰＤＬＬＡホモポリマーを開環重合により合成した。モノマーの転化率は９５％よりも高く、配合した組成に近いモノマー組成を有する（コ）ポリマーが、沈殿による精製の後に得られた（表２）。圧縮成形の後でもコポリマーの分子量は非常に高いままであったが、高いＤＬＬＡ含有量を有するコポリマーの分子量は、圧縮成形の際にいくらか低下した。ポリマー分子量の増加に伴って、ガンマ線の照射により架橋の効率が増加することが示されたので、高分子量のポリマーが望ましい。合成されたＴＭＣを含有するコポリマーは、そのガラス転移温度が−１７．９〜１６．５℃の範囲であったので、生理学的な温度ではゴムのようである。
【０１２０】
【表２】
2013526649.tif 000012
【０１２１】
ガンマ線の照射によるＰ（ＴＭＣ−ＤＬＬＡ）コポリマーの架橋
圧縮成形されたコポリマーフィルムの減圧下でのガンマ線照射による架橋の挙動を、最初にＰＥＴＡを含まない状態で調べた。形成されるコポリマーネットワークのゲル含有量および膨潤率を図８に示す。２５ｋＧｙで照射すると、４８％のＴＭＣを含有するコポリマーおよびＰＤＬＬＡは架橋しなかった。これはこれまでの研究と一致する。ＰＤＬＬＡの場合、ＭｎおよびＭｗの値はそれぞれ７８ｋｇ／ｍｏｌ、１１７ｋｇ／ｍｏｌに低下した。コポリマーについて、これらの値はそれぞれ６０ｋｇ／ｍｏｌ、１１１ｋｇ／ｍｏｌであった。より高いＴＭＣ含有量（６０％および７２％）のコポリマーは、ガンマ線の照射により架橋することができ、１２±２％のネットワークおよび３０±１％のゲル含有量を与えた。クロロホルム中での非常に高い膨潤率はこれらのコポリマーネットワークの架橋密度が低いことを示す。ガンマ線を照射したＰＴＭＣフィルムは６０±１％の最も高いゲル含有量を有していた。
【０１２２】
また、図８は、コポリマーフィルムへの少量のＰＥＴＡの混合により、形成されるネットワークのゲルパーセンテージが顕著に増加したことを明確に示す。これは、おそらく、ガンマ線の照射の過程の間に生じる架橋の発生／鎖の切断の発生の比の増加によるものである。２５ｋＧｙにおいて、８６±５〜９６±１％の範囲の高いゲル含有量を有し、かつ透明で形状が安定なコポリマーネットワークが得られた。興味深いことに、ＰＤＬＬＡであっても、架橋剤としてＰＥＴＡを使用することでガンマ線照射の間に効果的に架橋することができた。形成されたネットワークは密に架橋され、クロロホルム中での膨潤率は４．６±０．２〜１１．０±２．５ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲であった。これは顕著な鎖の切断および機械的特徴の損失なしに、ガンマ線の照射により、かかるコポリマーの滅菌が可能であることを示す。
【０１２３】
これらの実験において、ＰＥＴＡは、溶液中にてコポリマーと均一に混合された。これにより、マルチアクリレート架橋剤による非常に高いゲル含有量を得ることが可能となった。
【０１２４】
また、ネットワーク形成におけるＰＥＴＡの架橋試薬としての可能性をＴＭＣとε−カプロラクトンのコポリマー（ε−カプロラクトンの含有量が４１〜１００ｍｏｌ％の５種類のコポリマーであって、その全てが２００ｋｇ／ｍｏｌを超えるＭｎの値を有するもの）を用いて調べた。ＰＥＴＡもこれらのコポリマーを架橋するのに非常に有効であった。２５ｋＧｙで、８８〜９３％の範囲のゲル含有量および５．４〜７．０ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲の膨潤率を有するネットワークを得た。ＰＥＴＡの含有量は５重量％であった。これは、この向上した架橋方法が他の吸収性ポリマーにも同様に適用できることを示す。
【０１２５】
ガンマ線が照射されたＰ（ＴＭＣ−ＤＬＬＡ）コポリマーネットワークの熱特性および機械特性
架橋されていない状態では、全てのＰ（ＴＭＣ−ＤＬＬＡ）コポリマーは−１７．９〜５２．１℃の範囲のガラス転移温度（Ｔｇ）を有する非晶質の材料であった（表３）。Ｔｇの値はＴＭＣ含有量の増加とともに減少し、コポリマーの組成を調節することによって容易に調整することができた。ＰＥＴＡが存在しない状態でガンマ線を照射するとＴｇの値はわずかに低下するようである。これは、おそらく、鎖の切断が起こることで比較的に短い鎖が形成されることによるものである。ＰＥＴＡが存在する状態で照射すると、Ｔｇの値は、図８Ｂと比べて、密なネットワークの形成に起因して増加した。エタノールを用いて１４．９〜５３．７℃の範囲でネットワークから低分子量の浸出可能なものを除去する際にガラス転移温度はさらに増加した。ＰＥＴＡを含有するネットワークは単一（シングル）のＴｇを示した。これはコポリマーがＰＥＴＡネットワーク内に均一に取り込まれたことを示す。
【０１２６】
また、表３はＰ（ＴＭＣ−ＤＬＬＡ）コポリマーおよびネットワークの引張特性のあらましを示す。コポリマーの組成を調整することにより、５．１±０．１〜２７８０±１１２ＭＰａの範囲の弾性モジュラスの値を有し、かつ照射されていないフィルムが得られ得ることが見受けられ得る。ＰＥＴＡが存在しない状態でガンマ線を照射すると、鎖の切断が原因でコポリマーフィルムの弾性モジュラスおよび破壊応力の値がいくらか低下した。ガンマ線の照射の間におけるコポリマーの機械特性の低下は、ＰＥＴＡの存在下での照射によって防止することができた。より高い弾性モジュラス、降伏強度および破壊応力の値を有するネットワークフィルムが得られる。これは、おそらく、鎖の切断の防止および密なネットワークの形成によるものである。同じ理由で破断伸びの値および降伏ひずみの値は、ＰＥＴＡを含むネットワークの場合、ＰＥＴＡを含まずに照射されたフィルムよりも低かった。引張試験において、架橋された試験片は、その元の寸法に本質的に戻った。そのガラス転移温度が生理学的な温度よりも低いものでなければならないことを考えると、ＴＭＣを含むネットワークは、形状記憶性の材料の使用が有利である最小侵襲手術において有用であるかもしれない。
【０１２７】
ガンマ線の照射の間に形成されたであろう低分子量化合物のエタノール抽出による除去は、ネットワークフィルムの弾性モジュラスおよび破壊応力の値をさらに増加させた。その高い引張強度を保持する一方で、ＰＥＴＡを含むガンマ線を照射したフィルムの弾性モジュラスの値もコポリマーの組成に依存することも見出された。これは、これらのコポリマーネットワークの機械特性が、任意の意図した用途に適するように調節できることを示す。
【０１２８】
縫合されたポリマー生体適合材料（バイオマテリアル）は、通常、インビボでダイナミックな環境を経験するので、ネットワークフィルムの重要な特徴は、その耐引裂性である。線状のＰＴＭＣフィルムについて決定された最大の引裂強度は１．９±０．２Ｎ／ｍｍであった。ＰＥＴＡの存在下でのガンマ線の照射によって、およびコポリマーのＤＬＬＡ含有量の増加によって、形成されたネットワークの引裂伝播抵抗を顕著に改善することができた。１００、７２、６０および４８％のＴＭＣを含有するコポリマーから形成したＰＥＴＡ含有ネットワークの引裂強度は、それぞれ、４．２±０．２、１０．６±１．０、１３．７±１．２および３８．９±６．４Ｎ／ｍｍであった。
【０１２９】
【表３】
2013526649.tif 000013
【０１３０】
ガンマ線が照射されたコポリマーネットワークフィルムの繊維芽細胞との適合性
ＰＥＴＡを含み、ガンマ線が照射され、かつ抽出されていないネットワークと繊維芽細胞との適合性を、直接および間接的なアッセイを用いて調べた。様々なコポリマーネットワークフィルムと共にインキュベートした場合の生存可能な繊維芽細胞のパーセンテージを図９に示す。全てのコポリマーネットワークにおいて、生存可能な繊維芽細胞のパーセンテージは、ネガティブコントロールで得たものと同等であった（１００±１３．５％）。直接アッセイでの細胞生存性は８８±１８〜１０８±１％の範囲であり、間接アッセイでの値は９０±５〜１０２±１０％の範囲であった。両方のアッセイの結果から、これらのＰＥＴＡ含有ネットワークには細胞毒性がないことが確認された。さらにこれらの結果は、精製およびＰＥＴＡの混合に使用する溶媒を、ポリマーマトリクスから効果的に除去できたことを示した。
【０１３１】
マクロファージ培養物中でのコポリマーフィルムおよびネットワークのインビトロでの侵食
インビボでは、マクロファージが、生体適合材料（バイオマテリアル）に対する組織反応において、および多数の物質を分泌することによるそれらの分解において、重要な役割を担う。マクロファージにより分泌され得るスーパーオキシドアニオンラジカルは、直鎖状のＰＤＬＬＡおよびＰＴＭＣネットワークを分解することができる。また、マクロファージによっても分泌される加水分解酵素の一つであるコレステロールエステラーゼが知られていて、ＰＴＭＣネットワークならびにＰ（ＴＭＣ−ＤＬＬＡ）コポリマーを侵食する。
【０１３２】
マクロファージによるインビボでのそれらの侵食挙動への影響およびその生体適合性の最初の評価として、ガンマ線を照射したコポリマーフィルムおよび照射なしのコポリマーフィルム上でマクロファージを直接培養した。Ｐ（ＴＭＣ−ＤＬＬＡ）コポリマーは、生体適合性材料であり、そしてラットの皮下にインプランテーションすると緩やかな炎症応答を引き起こす。１４日間の培養の間において、Ｐ（ＴＭＣ−ＤＬＬＡ）コポリマーネットワークから、またはその分解生成物から、マクロファージの生存性への悪影響は観察されなかった。さらに、これらの表面での培養の際にマクロファージは活性化されなかった。これは、ＰＥＴＡ含有Ｐ（ＴＭＣ−ＤＬＬＡ）ネットワークが生体適合性材料であることを示唆する。
【０１３３】
マクロファージが媒介するフィルムの侵食におけるコポリマーの組成および架橋の影響をＰＥＴＡの存在下で調べた。図１０は、マクロファージ培養の１４日後のコポリマーフィルムの表面を示し、対応する侵食速度を表４に示す。図１０からは照射されていないコポリマーフィルムのすべてがマクロファージ培養の間に侵食されたことが見受けられ得る。ＴＭＣ含有量の減少にともなって、表面侵食の程度が減少するようであった。この観察は、表４に示す質量損失および侵食速度の値によって確認され得る。１４日間での質量損失の値および侵食速度は、それぞれ、５．３５±０．４９〜０％および２７６±２３〜０μｇ／（ｃｍ２×日）の範囲であった。これにより、より高いＴＭＣ含有量のコポリマーがマクロファージ由来の化合物による表面侵食を最も受けやすいことが示される。これは化学構造の差またはその低いガラス転移温度に起因し得るものであった。興味深いことに、ＰＤＬＬＡフィルムであっても侵食の兆候が見られた。明らかに、マクロファージ由来の化合物は、ある程度までＰＤＬＬＡを分解することができる。質量損失は検出することができなかったが、細胞と接触しなかったフィルムの側では侵食の兆候は検出されなかった。
【０１３４】
【表４】
2013526649.tif 000014
【０１３５】
５重量％のＰＥＴＡを含むコポリマーフィルムを照射することによって、その侵食速度を大幅に低減させることができた。ＰＴＭＣホモポリマーから調製されたフィルムでは、侵食速度は２７６±２３から３１±１２μｇ／（ｃｍ２×日）に低下した（図１０Ａと１０Ｂとの比較）。これは、おそらく、密なネットワークの形成によるものである。ガンマ線を照射し、かつＰＥＴＡは含まなかったＰＴＭＣの侵食速度は、比較的低い架橋密度を有し（図１０Ｂ）、２６５±３２μｇ／（ｃｍ２×日）の侵食速度を示した。これは、図４に示す照射されていないＰＴＭＣの侵食速度と同等である。また、ラットの皮下にインプランテーションした場合、ガンマ線を照射したＰＴＭＣネットワークフィルムのインビボでの侵食速度は、照射されていない直鎖状のＰＴＭＣのものと同等である。これは、マクロファージ培養アッセイが生体適合材料（バイオマテリアル）のインビボでの侵食に対する構造が変化するものの影響を最初に評価するのに適したモデルであることを示す。また、７２％または６０％のＴＭＣを含むコポリマーネットワークフィルムについても侵食は観察された（図１０Ｄおよび１０Ｆ）。しかし、４８％または０％でＴＭＣを含むコポリマーネットワークについては質量損失を検出することができなかった。これらのネットワークフィルムでは、数個の侵食されたスポットのみが観察された（図１０Ｈおよび１０Ｊ）。
【０１３６】
それぞれの材料において侵食が異なることは、フィルムの表面に存在するマクロファージの数にも関連し得る。照射なしのＰ（ＴＭＣ−ＤＬＬＡ）フィルムおよびガンマ線が照射されたＰ（ＴＭＣ−ＤＬＬＡ）フィルムのマクロファージ密度を図１１に見ることができる。細胞数は照射されていないコポリマーフィルムと同等であり、３５３７±１３７〜４７７０±６１２細胞数／ｍｍ２の範囲である。ただし７２％のＴＭＣを含むコポリマーフィルムについては例外であり、細胞数はさらに高いものであった（６０１０±４０５細胞数／ｍｍ２）。これらのコポリマーが、接触角が組成物とあまり異ならない疎水性の材料であることから、これは妥当である。ガンマ線を照射したネットワークの場合、この値は非常に近く、３３１７±８１５〜４２±２１５細胞数／ｍｍ２の範囲であった。また、細胞数も架橋によってそれほど影響を受けなかった（ただし、この場合も、７２％のＴＭＣを含むコポリマーは例外であった）。これらの結果は、構造の影響（組成、ガラス転移温度、架橋）が、おそらく、これらの材料のマクロファージが媒介する侵食にさらに大きな影響を及すことを示す。また、ＴＭＣとＤＬＬＡのコポリマー、およびＰＤＬＬＡホモポリマーは、酵素によらないバルクの加水分解によっても分解し、コポリマー組成によるその分解挙動への影響がこれまでに観察されている。５重量％のＰＥＴＡを含むＴＭＣとＤＬＬＡとのコポリマーフィルムに照射することによって形成されたネットワークについて、酵素によらない加水分解による分解の実験は行われなかった。しかし、光架橋され、アクリレート官能化されたＤＬＬＡオリゴマーを直鎖状の高い分子量のＰＤＬＬＡと比べた場合、質量損失の開始が延長されることが他の分解実験により示されている。
【０１３７】
結果
架橋剤／架橋試薬としてペンタエリスリトールトリアクリレートを使用してガンマ線の照射により効果的に架橋Ｐ（ＴＭＣ−ＤＬＬＡ）コポリマーを得ることができる。コポリマーの組成を調整することにより、ネットワークの熱特性および機械特性を容易に変更することができる。インビトロでのアッセイは、これらのＰＥＴＡ含有コポリマーネットワークおよびその分解性生物が細胞に適合し得ることを示した。コポリマーのＤＬＬＡ含有量を増加させることによって、コポリマーフィルムのマクロファージが媒介する侵食を顕著に減少することができた。また、この架橋工程によって、侵食はかなり減少した。この架橋方法を使用してガンマ線の照射によるＴＭＣとＤＬＬＡとに基づく材料の滅菌の間に損傷を最小にすることができ、これにより、特性を幅広く変更できるポリマー材料の調製が可能となる。
【０１３８】
実施例３
材料
ポリマーグレードの１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（独国））および触媒としてスズオクトアート（Ｓｉｇｍａ（米国））を受け取ったまま使用した。ＰＴＭＣの合成において１，６−ヘキサンジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ（独国））を開始剤として使用した。また、市販品として入手可能なα，ω−ジヒドロキシポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）（Ａｌｄｒｉｃｈ（独国））およびポリ（エチレングリコール）モノメトキシエーテル（ｍＰＥＧ）（Ｆｌｕｋａ（独国））（それぞれ１００００ｇ／ｍｏｌ、５８００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量（Ｍｎ）を有するもの）を開始剤として使用してＴＭＣブロックコポリマーを合成した。分子量が４６０００ｇ／ｍｏｌのＰＣＬポリマー（Ａｌｄｒｉｃｈ（独国））を架橋の研究に使用した。ペンタエリスリトールトリアクリレート（ＰＥＴＡ）（Ａｌｄｒｉｃｈ（独国））およびＩｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）−３６９（２−ベンジル−２−ジメチルアミノ−１−（４−モルホリノフェニル）−ブタノン−１）（Ｃｉｂａ（登録商標）（スイス））を架橋剤および光開始剤として使用した。
【０１３９】
酵素による侵食の研究において、ブタ膵臓のコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）（Ｓｉｇｍａ（英国）、５６．２Ｕ／ｍｇ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４、Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ  Ａ．Ｇ．（独国））に溶解した。溶媒（Ｍｅｒｃｋ（独国）またはＢｉｏｓｏｌｖｅ（蘭国））は分析グレードのものであった。細胞の培養にα−最小必須増殖培地（α−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ（米国））を使用した。この培地は、ウシ胎児血清（１０％、Ｂｉｏｗｈｉｔａｋｅｒ（ベルギー））、アスコルビン酸−２−ホスフェート（０．２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ（米国））、ペニシリンＧ（１００ユニット／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国））およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国））、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ（米国））、および塩基性繊維芽細胞成長因子（１ｎｇ／ｍＬ、Ｉｎｓｔｒｕｃｈｅｍｉｅ（蘭国））を含んでいた。
【０１４０】
ポリマーの合成
触媒としてスズオクトアートを使用して３日間にわたって１３０℃で減圧下でＴＭＣモノマーの開環重合によりポリ（１，３−トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）ホモポリマーを合成した。分子量を調整するために、ヘキサンジオールの量を変更して開始剤として使用した。
【０１４１】
また、３日間にわたって１３０℃でのＴＭＣの開環重合によって、モノメトキシポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（トリメチレンカーボネート）（ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣ）ジブロックコポリマーおよびポリ（トリメチレンカーボネート）−ブロック−ポリ（ε−カプロラクトン）−ブロック−ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣ）トリブロックコポリマーも調製した。開始剤としてｍＰＥＧおよびＰＣＬを９０分間にわたって１３０℃の減圧下で乾燥させた。いずれの場合においても添加したＴＭＣの含有量は６０モル％であった。
【０１４２】
クロロホルム中に溶解し、エタノールまたはヘキサン中に沈殿させて、新鮮な非溶媒で洗浄し、かつ減圧下、室温で乾燥させて、すべてのポリマーを精製した。
【０１４３】
ポリマーの評価（キャラクタリゼーション）
ＣＤＣｌ３（Ｍｅｒｃｋ（独国））を用いるプロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）分光計（３００ＭＨｚ、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｎｏｖａ（米国））でコポリマーの残留モノマー含量および組成を決定した。
【０１４４】
１．０ｍｌ／分の流速で溶離液としてクロロホルムを用いるゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ（米国））でＰＴＭＣホモポリマーの数平均分子量および重量平均分子量（それぞれＭｎおよびＭｗ）、多分散指数（ＰＤＩ）および固有粘度（［η］）を決定した。セットアップのものは、直列に配置されたＶｉｓｃｏＧＥＬ  Ｉ−ｇｕａｒｄ−０４７８、ＶｉｓｃｏＧＥＬ  Ｉ−ＭＢＨＭＷ−３０７８およびＶｉｓｃｏＧＥＬ  Ｉ−ＭＢＬＭＷ−３０７８のカラムと、屈折計、粘度計および光散乱検出器を有するＴＤＡ  ３０２  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ａｒｒａｙとを備えていた。これにより、絶対分子量の決定が可能となる。ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣブロックコポリマーの分子量決定にＧＰＣおよびＮＭＲの両方を使用し、ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣの分子量はＮＭＲのみを用いて決定した。
【０１４５】
ポリマーフィルムの調製
精製したＰＴＭＣポリマーを、５００μｍ厚のステンレス鋼モールド（Ｆｏｎｔｅｉｊｎｅ  ＴＨＢ００８研究用プレス機（蘭国））を用いて１４０℃で圧縮成形した。フィルムを約２５ｋｇ／ｃｍ２で成形し、冷水を用いて室温まで冷却した。
【０１４６】
ＰＴＭＣのフィルムおよびＰＴＭＣとブロックコポリマーとの混合物（９：１の重量比）のフィルム（ＰＥＴＡ（５重量％）およびＩｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）３６９（０．０２５重量％）を含む）を、ＤＣＭ中に各成分を溶解し、かかる溶液をペトリ皿に注型成形（キャスティング）して乾燥させることによって調製した。各工程は暗所にて行い、次いで、圧縮成形を上記の通り実施した。
【０１４７】
光架橋およびネットワークの評価（キャラクタリゼーション）
ＰＥＴＡおよび光開始剤を含む圧縮成形フィルムをラミネート加工されたポリエチレン／ポリアミドのバッグ（Ｈｅｖｅｌ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｂ．Ｖ．（蘭国））に減圧下で密封（シール）し、７ｃｍの距離で短波ＵＶ光（ＵｌｔｒａＬｕｍの架橋キャビネット（米国）、波長２５４ｎｍ）に曝した。この試験片の両側を室温で異なる時間で照射した。光パワーメータ（Ｎｅｗｐｏｒｔ  １９１６−Ｃ（米国））で測定したところ、この距離での光の強度は１０〜１４ｍＷ／ｃｍ２であり、ポリエチレン／ポリアミドのバッグにより、この強度は５〜７ｍＷ／ｃｍ２にまで低減した。
光架橋されたフィルムの平衡の膨潤率およびゲル含有量を、クロロホルムを用いて決定した。
【０１４８】
機械特性
溶融圧縮され、かつ光架橋されたＰＴＭＣベース（または系）のネットワークフィルムの引張特性を、エタノールでの抽出の前後でＡＳＴＭ−Ｄ  ８８２−９１に従って３回で決定した。５００Ｎのロードセルを備えたＺｗｉｃｋ  Ｚ０２０引張試験機（独国）を５０ｍｍ／分のクロスヘッドスピードで操作した。初期のグリップからグリップまでの離間距離は５０ｍｍであり、０．０１Ｎのプリロードを付与した。試験片の変形はグリップからグリップまでの離間距離に由来するものであった。従って、示されるヤング率の値（応力−ひずみ曲線の初期の傾きから計算した値）はポリマーの剛性を示すだけのものである。
【０１４９】
そのダイナミックローディング条件下での挙動を調べるために、サイクル試験にて試験片（ｎ＝１）を５０ｍｍ／分で５０％のひずみまで繰り返し（２０回）伸ばした。２時間の回復期間の後、永久変形を２１回目のサイクルの応力−ひずみの図から概算した。これらの実験において、０．０１Ｎのプリロードを付与した。変形はグリップからグリップまでの離間距離に由来するものであった。値の誤差は約０．５％ひずみである。
【０１５０】
湿潤性および水の取り込み
ポリマーのジクロロメタン溶液（約１重量％）をガラス製ディスク（各材料につき８個（ｎ＝８））上に注型成形（キャスティング）し、減圧下で乾燥し、不活性雰囲気下で光架橋することによって調製したフィルムにおいて、接触角の測定を行った。光架橋されたフィルムをエタノールで抽出した後に測定を行った。室温において、各表面上で超純水（ＭｉｌｌｉＱ  Ｐｌｕｓ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（仏国））の静止（static）、前進（advancing）、後退（receding）の接触角を、電子工学シリンジモジュールを備えたビデオベースのシステム（ＯＣＡ  ２０  ＤａｔａＰｈｙｓｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ（独国））を用いて決定した。
圧縮成形され、かつ光架橋されたフィルムの平衡状態での水の取り込みをエタノールでの抽出後に決定した。試験片（ｎ＝４）を１週間にわたって３７℃でＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）でコンディショニングした。水の取り込みは、試験片の質量の増加と定義した。
【０１５１】
インビトロでの酵素による侵食
ブタ膵臓のコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）を使用してＰＴＭＣベース（または系）の光架橋されたフィルムの酵素による加水分解を研究した。殺菌剤として０．０２重量％のＮａＮ３（Ｓｉｇｍａ（米国））を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）を用いて２０μｇ／ｍＬの濃度でＣＥ酵素の水溶液を調製した。エタノールで抽出され、かつディスク状に成形されたフィルム（直径８ｍｍ、厚み約５００μｍ、ｎ＝３／測定時点）を、１ｍｌの酵素溶液を含むバイアル中に配置し、３７℃でコンディショニングした。２日毎に１回、媒体を新しいものにした。酵素を含まないコントロールの実験を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、ｎ＝１／測定時点）を用いて行った。予め決められた時点で、湿潤した試験片の質量および厚みを、その表面を濯いでブロッティングした後に決定した。室温、減圧下で重量が一定になるまで試験片を乾燥させた後に測定を再び行った。
【０１５２】
組織工学スキャホールドの作製
熱溶解積層法を使用して、相互に連結（連通）した孔を有する３次元（３Ｄ）スキャホールドを作製した。ＰＴＭＣホモポリマーあるいはＰＴＭＣとＰＥＴＡを一緒に混合したもの（ブレンド）および光開始剤を暗所でジクロロメタン中に溶解し、８０重量％（ポリマーの総質量を基準とする）のエチレンカーボネート（溶融温度３５〜３８℃）を添加して溶液を調製した。ジクロロメタンのエバポレーションの後、エチレンカーボネート溶液（ポリマー（単数または複数）、ＰＥＴＡおよび光開始剤を含む）を、バイオプロッター（Ｂｉｏｐｌｏｔｔｅｒ）デバイス（Ｅｎｖｉｓｉｏｎｔｅｃ  ＧｍｂＨ（独国））を用いて４ｂａｒの窒素圧で１００〜１２０℃で押出した。
【０１５３】
内側の直径が２６０μｍであるステンレス鋼のニードルを通して押し出された繊維の層（最大２０層、各層の寸法は１２×１２ｍｍ）の積層により３次元スキャホールドを作製（プロッティング）した。プロッティングのパラメータは以下の通りであった。隣り合う繊維の中心間距離：５００μｍ、層の厚み：１３０μｍ。各連続層の後にプロッティング方向を９０°変化させた。繊維の積層速度は１００〜２００ｍｍ／分であった。構築した構造に冷風を吹き付けてエチレンカーボネートを結晶化させた。プロッティングの後、次に使用するまで、スキャホールドを４℃で維持した。
【０１５４】
３００分間のＵＶ照射によりスキャホールドを架橋した。照射の間、架橋チャンバを通して冷たい窒素を吹き付けて約２０℃で温度を維持した。これによりエチレンカーボネートの溶融が防止され、不活性雰囲気が提供される。その後、緩やかに撹拌した４℃のミリＱ水中にスキャホールドを５日間にわたって配置し、エチレンカーボネート（水は１日に２回、新しいものと入れ替えた）を浸出させた。次いで、スキャホールドをエタノールに入れて、他の存在し得る浸出可能なものを除去し、一定重量になるまで減圧下で乾燥した。密度が既知のポリマー（ＰＴＭＣホモポリマーおよびブレンドの密度は、それぞれ、１．３１ｇ／ｃｍ３および１．２９ｃｍ３であった）を用いて、そして、作製したスキャホールドの密度を測定することによって、スキャホールドの多孔度を決定した。
【０１５５】
金でスキャホールドの表面をスパッタコートした後に５ｋＶの操作電圧でスキャホールドの表面および断面を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＸＬ  ３０  ＥＳＥＭ−ＦＥＧ（蘭国））で分析した。
【０１５６】
３次元（３Ｄ）で作製した組織工学スキャホールドでのヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の播種および培養
光架橋され、かつエタノールで抽出された、上記のＰＴＭＣおよびそのブレンドから調製されたスキャホールド（約１ｍｍ厚）を１５分間にわたって７０％のエタノール中に浸漬させることで滅菌した。次いで、スキャホールドを洗浄し、滅菌したＰＢＳで２時間にわたって室温で３回インキュベートした。細胞培養の前にスキャホールドを３７℃で一晩αＭＥＭ増殖培地でインキュベートした。インフォームドコンセントが得られた股関節置換手術を受けたドナーからｈＭＳＣを得た。承認は地方医療倫理委員会から得られた。
【０１５７】
解凍した細胞（継代（パッセージ）２）を１，０００細胞数／ｃｍ２でαＭＥＭ増殖培地中で３００ｃｍ２のＴ−フラスコ（Ｔ−３００フラスコ）に入れた。ｈＭＳＣを１週間にわたって増殖した。このときαＭＥＭ増殖培地を１回新しいものと置き換えた。パーティクルカウントおよび粒度分析器（Ｚ２、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）で細胞数を決定した。ピペットで５×１０５のｈＭＳＣに等しい一定容量の細胞懸濁液（継代（パッセージ）３）を各スキャホールドに載せた。次いで、これらをインキュベータ中の２５ウェルの組織培養処理されていないプレート（Ｎｕｎｃ）のウェルに４時間にわたって配置した。この期間の後にウェル中の培地を２ｍｌの新鮮なαＭＥＭ増殖培地と交換した。５または１０日間の期間にわたって細胞を播種したスキャホールドを培養した。１０日間の培養期間の内に培地を５日目で新しいものと交換した。直接播種した後、５日目、１０日目において、細胞を含む構造物をＰＢＳで洗浄し、細胞を１．５％のグルタルアルデヒド／０．１４Ｍのカコジル酸緩衝液で１５分間かけて固定した。メチレンブルーを使用して生存し得る細胞を染色し、実体顕微鏡を用いて細胞を観察した。
【０１５８】
培地のサンプルを様々なウェルから取り出して（ｎ＝３）、細胞の代謝プロファイルを得た。グルコースおよびラクテートの濃度をＶｉｔｒｏｓ  ＤＴ６０  ＩＩシステム（Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ティルブルグ（蘭国））を用いて決定した。
【０１５９】
結果
エラストマー性の光架橋されたＰＴＭＣベース（または系）のネットワークフィルムおよびスキャホールドを調製するために、ＰＴＭＣホモポリマーならびにＰＴＭＣとｍＰＥＧおよびＰＣＬとのブロックコポリマーを合成した。
【０１６０】
ＰＴＭＣベース（または系）のポリマーの特徴
合成した高い分子量のＰＴＭＣホモポリマーの精製および圧縮成形後の特徴を表５に示す。重合反応において開始剤として使用したヘキサンジオールの量を変えることでポリマーの分子量を調節することができた。圧縮成形後のＰＴＭＣポリマーの分子量は、精製したポリマーとそれほど異なるものではなかった。
【０１６１】
また、表５は、精製後のブロックコポリマーＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣおよびｍＰＥＧ−ＰＴＭＣの特徴を示す。ブロックコポリマー合成でのモノマー転化率は９９％よりも高いものであった。ブロックコポリマー中のＴＭＣ含有量は、その添加量に非常に近いものであった。
【０１６２】
【表５】
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【０１６３】
ＰＴＭＣベースのフィルムのＵＶ架橋
分子量の大きいＰＴＭＣを光架橋するために、ＰＥＴＡおよび光開始剤を含む圧縮成形されたフィルムに短波ＵＶ光（２５４ｎｍ）を照射した。ＵＶ光での照射の後にＰＴＭＣは比較的容易に効果的に架橋することができ、透明なフィルムを与えた。図１２Ａおよび１２Ｂは、光架橋されたＰＴＭＣネットワークのクロロホルムを用いて決定したゲル含有量および膨潤率を照射時間の関数として示す。照射時間が増加するに従って、ゲル含有量は最初、急に増加し、次いで、緩やかに増加した。ゲル含有量が増加するに従って、形成されたネットワークのクロロホルム中での膨潤率は、照射時間が増加するに従って低下した。これは、照射時間が長くなると、より密なネットワークが形成されたことを示す。
【０１６４】
３００分間のＵＶ曝露では、ポリマーの初期の分子量に応じて、ネットワークのゲル含有量は５７±１〜９８±１％の範囲であり、膨潤率は１１．３±０．８〜３．７±０．１の範囲であった。
【０１６５】
また、ＰＴＭＣフィルム中のＰＥＴＡ含有量を調整することによっても、ゲル含有量および膨潤率が変更した光架橋ネットワークの形成が可能となった。例えば、１８０分間にわたって１、３、５％のＰＥＴＡを含むＰＴＭＣ１８３ポリマーを照射することで、それぞれ、ネットワークのゲル含有量が４１、７１および９１％となり、膨潤率が６５、１４、７ｖｏｌ／ｖｏｌとなった。これらの結果は、ＰＥＴＡ含有量、ＵＶ照射時間および初期のポリマー分子量を変えることでネットワークのゲル含有量およびネットワークの密度が調整できることを実証している。光架橋されたＰＴＭＣネットワークは、分子量が０．７〜４０．７ｋｇ／ｍｏｌの３本腕（アーム）のＰＴＭＣ−メタクリレートマクロマーから形成することができる。クロロホルム中でのこれらのネットワークの膨潤率は３．１〜１６．９の範囲であった。上記の結果をこれらＰＴＭＣ−マクロマーに基づくネットワークの膨潤率と比較すると、ＰＴＭＣネットワーク（ＰＥＴＡおよび光開始剤を含み、３００分間にわたってＵＶ光で照射されたもの）の架橋間の分子は、第一次近似について、ポリマーの初期の分子量に依存して、１１００〜７６００ｋｇ／ｍｏｌの範囲であると見積ることができる。
【０１６６】
架橋試薬および光開始剤のみを使用するＰＴＭＣの光架橋は、末端が官能化されたマクロマーであってアームの長さが異なるものを使用して架橋密度の異なるネットワークを形成することよりも、さらに実用的である。さらに、（メタ）アクリレートで末端が官能化されたＰＴＭＣオリゴマーは、ラジカルスカベンジャーの存在下であっても、処理前に早く架橋できることが観察されている（未公開のデータ）。この研究で使用されるＰＥＴＡを含むポリマーフィルムは、圧縮成形後であっても、クロロホルム中に依然として可溶であった。これはＵＶへの暴露の前には架橋が起こらなかったことを意味する。
【０１６７】
興味深いことに、ＰＥＴＡおよびＩｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）３６９を含まなかったＰＴＭＣホモポリマーフィルムをＵＶ光に曝した場合、ポリマーの数平均分子量および重量平均分子量は増加した。３００分間の照射後、ＰＴＭＣ４５、ＰＴＭＣ１８３およびＰＴＭＣ３７３のＭｎの値は、それぞれ、４９、２４４および４３５ｋｇ／ｍｏｌであった。対応のＰＤＩの値は、２．２、１．９および１．３であった。分子量が非常に高いＰＴＭＣへの短波ＵＶ光の照射を延長すると、ポリマーの架橋がもたらされることを観察した。ＰＴＭＣ４４３の圧縮成形されたフィルムに４８時間照射すると、ゲル含有量が５３±１３％であり、クロロホルム中での膨潤率が８４±１０ｖｏｌ／ｖｏｌであるネットワークが形成された。
【０１６８】
Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）−３６９のみを含み、ＰＥＴＡを含まないＰＴＭＣフィルムへの照射によってネットワークの形成がもたらされたが、ゲル含有量はＰＥＴＡおよびＩｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）−３６９の両方を含むフィルムのものよりもはるかに低いものであった。３００分間のＵＶ照射の後、０．０２５重量％の光開始剤のみを含むＰＴＭＣ１８３およびＰＴＭＣ３７３フィルムは、それぞれ、ゲル含有量が２５±３および５０±２％であり、膨潤率が２５３±６および７２±４ｖｏｌ／ｖｏｌであった。
【０１６９】
この光開始剤のみを含むフィルムと、光開始剤とＰＥＴＡの両方を含むフィルムとのゲル含有量の差は、ＰＴＭＣ鎖へのアクリレートネットワークの有効な取り込みに起因し得る。光架橋されたＰＴＭＣフィルムのゾルフラクションの１Ｈ−ＮＭＲ分析は、アクリレートに関連するピークを全く示さなかった。これは、全てのＰＥＴＡが、形成されたネットワークに取り込まれたことを意味する。
【０１７０】
ＰＴＭＣポリマーおよびブレンドだけでなく、ＰＴＭＣフィルムのように同量のＰＥＴＡおよび光開始剤を含むフィルムについて、ＰＣＬフィルムの架橋を調べた。最初の結果は、ＰＣＬもこの方法で光架橋できることを示した。比較的低い分子量（Ｍｎ＝４６ｋｇ／ｍｏｌ）のＰＣＬホモポリマーフィルムのゲルパーセンテージは４１±１であり、クロロホルム中での膨潤率は１１．３±０．７ｖｏｌ／ｖｏｌであった。
【０１７１】
また、ＰＴＭＣ３７３と、ブロックコポリマーＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣまたはｍＰＥＧ−ＰＴＭＣとのブレンド（５重量％のＰＥＴＡおよび光開始剤を含む）を効果的に光架橋することができた。３００分間のＵＶ照射後、ＰＴＭＣ３７３／ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣブレンドおよびＰＴＭＣ３７３／ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣブレンドのゲル含有量は、ぞれぞれ、９６±１および９３±１であった。対応のクロロホルム中での膨潤率は６．３±０．１および６．１±０．６ｖｏｌ／ｖｏｌであった。ＵＶへの曝露の前にこのブレンドは９０重量％のＰＴＭＣ３７３を含んでいた。ネットワークのゾルフラクションの１Ｈ−ＮＭＲ分析によると、ブロックコポリマー含有量が初期のフィルムにおけるよりも高いものであったことを示した。フィルムをＵＶ照射に曝した後、約７５〜８０％のブロックコポリマーがネットワーク内に取り込まれたことを示すことができた。
【０１７２】
光架橋されたＰＴＭＣベースのネットワークの機械特性
ＰＴＭＣポリマーの引張機械特性への光架橋の影響を評価するために、圧縮成形されたＰＴＭＣフィルムであって照射していないもの、ならびにＰＴＭＣフィルムであって、５重量％のＰＥＴＡおよび０．０２５重量％の光開始剤を含み、かつ３００分間にわたってＵＶ光が照射されたもの（この３００分間にわたってＵＶ光が照射されたフィルムは、ＰＴＭＣｘ−３００と略記する）について、測定を行った。架橋されていないＰＴＭＣホモポリマーおよび光架橋されたＰＴＭＣホモポリマー、ならびに光架橋されたＰＴＭＣ３７３／ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣのブレンドおよびＰＴＭＣ３７３／ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣのブレンドの引張機械特性のあらましを表６に示す。
【０１７３】
全てのＰＴＭＣホモポリマーは、弾性モジュラスが３．７±０．１〜７．７±０．３ＭＰａの範囲である可撓性の材料である。その降伏強度、破壊応力および破壊ひずみの値は、ポリマーの分子量の増加にともない増加した。また、光架橋されたＰＴＭＣネットワークフィルムも可撓性の材料であった。しかし、その弾性モジュラスは、架橋されていないＰＴＭＣフィルムよりも高いものであった。その値は７．２±０．２〜９．６±０．３ＭＰａの範囲であった。ＰＴＭＣホモポリマーの降伏強度および極限引張強度は光架橋によって顕著に増加した。初期のポリマーの分子量に依存して、架橋されていないフィルムの破壊応力の値は、０．２±０．１ＭＰａ〜６．７±２．８ＭＰａの範囲であった。架橋によって、フィルムの破壊応力の値は増加し、２．７±０．１〜３０±９ＭＰａの範囲であった。さらに、光架橋されたＰＴＭＣネットワークフィルムを破壊するのに必要なエネルギーは、架橋されていないＰＴＭＣフィルムよりも３〜９倍高いものであった。これは、ＰＴＭＣフィルムの靭性は、ＰＥＴＡ存在下での光架橋によって顕著に向上し得ることを意味する。表６は、初期のＰＴＭＣ分子量に依存して、一定範囲の降伏強度、極限引張強度および靭性を有するＰＴＭＣネットワークを得ることができることを明確に示す。
【０１７４】
また、張力の測定は、ＰＴＭＣネットワークフィルムのゾルフラクションをエタノール（これはＰＴＭＣに対しては比較的に貧しい溶媒である）で抽出した後に行われた。特性の増強は、ＰＴＭＣ４５から調製したネットワークについて最も示された。それは、この抽出されたフィルムが、弾性モジュラス、降伏強度、破壊応力および破壊エネルギーの値がさらに高いものであったためである。ＰＴＭＣ１８３およびＰＴＭＣ３７３から形成されたネットワークの場合、これらの値も僅かに増加するようであった。
【０１７５】
ＰＴＭＣ３７３と比較的に低い分子量のｍＰＥＧ−ＰＴＭＣブロックコポリマーとのブレンドから調製された光架橋フィルムは、ＰＴＭＣ３７３から形成したネットワークであって抽出されていないものよりも、弾性モジュラスおよび降伏強度の値は僅かに低いだけであった。なお、破壊応力および破壊エネルギーの値は同等であった。これは、ＰＴＭＣ３７３と１０％以下のｍＰＥＧ−ＰＴＭＣとのブレンドは、乾燥状態において、引張特性が顕著に悪化しないことを示す。しかし、ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣブロックコポリマーとのブレンドから得られたネットワークの降伏強度、極限引張強度および靭性は、ＰＴＭＣ３７３のみから形成されたネットワークよりも低いものであった。ブレンドから形成したネットワークの引張特性は、エタノールによるゾルフラクションの抽出によってさほど影響を受けなかった。
【０１７６】
【表６】
2013526649.tif 000016
【０１７７】
これらのＰＴＭＣネットワークは、インビトロならびにインビボでの反復ダイナミックローディングに耐えることを意図したものであるので、サイクル試験を行って、ダイナミック条件下でのそのクリープ挙動への光架橋の影響を評価する。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、光架橋の前後でのＰＴＭＣポリマーのヒステリシス挙動を示す。これらの図は、全ての場合において、ＰＥＴＡおよび光開始剤の存在下でのＰＴＭＣの光架橋によりヒステリシスが顕著に減少し、それに伴って各連続サイクルにおいて観察されたクリープの程度が減少したことを明確に実証している。架橋されていない状態では、ＰＴＭＣ４５、ＰＴＭＣ１８３およびＰＴＭＣ３７３のクリープの値は、それぞれ、２０回目のサイクルの終了時で４５、２９、１５％であった。ＰＥＴＡおよび光開始剤の存在下での光架橋では、これらの値は顕著に低下した。ＰＴＭＣ４５−３００、ＰＴＭＣ１８３−３００およびＰＴＭＣ３７３−３００のクリープの値は、それぞれ、２９、１２および８％であった。さらに、ＰＴＭＣフィルムの応力緩和（各サイクルで到達した最大応力の減少）も光架橋により非常にかなり減少した。表６は、２０サイクルで５０％のひずみを付与して、２時間の回復期間の後のこれらのフィルムの永久変形を示す。ＰＴＭＣホモポリマーの永久変形は光架橋によって顕著に低下することが見受けられ得る。エタノール抽出されたＰＴＭＣネットワークは、サイクル試験において、抽出されていないネットワークと同等のクリープ挙動を示したが、永久変形は、抽出されたネットワークフィルムについては、わずかに低いようであった。ＰＴＭＣ３７３の光架橋および抽出の後、永久変形の値は１．０％ひずみ程度で低いものであった。図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび表６の永久変形（またはパーマネントセット）の値の比較によると、ＰＴＭＣ３７３から形成した光架橋されたネットワークが最も小さいヒステリシス、サイクル試験において最も小さい応力緩和および最も小さい永久変形を示したことが示されている。これは、高い初期ＰＴＭＣ分子量によって、比較的低い初期分子量のポリマーから形成されたネットワークよりも良好なエラストマー特性を有するネットワークの形成が可能となることを意味する。
【０１７８】
図１３Ｄおよび表６の永久変形（またはパーマネントセット）の値は、光架橋されたブレンドも優れたエラストマー特性を有することを示す。ＰＴＭＣ３７３とＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣまたはｍＰＥＧ−ＰＴＭＣとのブレンドは、ネットワークのサイクルでのクリープ挙動に悪影響を与えないことが見受けられ得る。
【０１７９】
光架橋されたＰＴＭＣベースのネットワークのインビトロでの酵素による侵食および湿潤性
ＰＴＭＣ３７３に基づく光架橋されたネットワークの酵素による侵食を、コレステロールエステラーゼ水溶液を用いて調べた。この酵素は、マクロファージの分泌物の一つであり、これは、ガンマ線が照射されて光架橋されたＰＴＭＣネットワークを有効に分解することが知られている。インキュベートされたポリマーフィルムの相対的な質量および厚みの経時変化を図１４に示す。直鎖状のＰＴＭＣ３７３ホモポリマーの侵食は、コレステロールエステラーゼ水溶液中で比較的に早いものであった。インキュベーションの１１日目では、ＰＴＭＣ３７３の試験片の質量損失は８４±２．５％であり、これは２．４８±０．４５ｍｇ／（ｃｍ２×日）の質量損失の速度に対応する。
【０１８０】
酵素水溶液中でのインキュベーションの２８日後でのＰＴＭＣ３７３−３００、ＰＴＭＣ３７３／ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣ−３００およびＰＴＭＣ３７３／ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣ−３００の光架橋されたフィルムの質量損失は、それぞれ、２４±２．７、１６±１．８および１．５±０．４％であった（図１４Ａ）。対応の質量損失の速度は０．４１±０．１１、０．２７±０．０７および０．０１７±０．０１ｍｇ／（ｃｍ２×日）であった。ＰＴＭＣ３７３フィルムを光架橋することで侵食速度がなり減少したネットワークが得られ、これにより長期の生物医学的な用途におけるこれらの使用が可能となる。侵食速度の減少は、密なネットワークの形成の結果として、鎖の可動性（モビリティー）が束縛されることに起因し得るものであった。なぜなら、かかる鎖は、酵素の攻撃に対して正確な形状（コンフォーメーション）の適合が必要であるからである。また、これらの結果は、酵素によるＰＴＭＣネットワークの侵食速度が、ブロックコポリマーとともにブレンドして光架橋することで調節できることを示す。特に、ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣブロックコポリマーとブレンドした場合、酵素による侵食は劇的に減少した。ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣ含有ブレンドの表面の特徴によって、酵素のポリマー表面への結合が不可能であったようである。なぜなら、この酵素が親水−疎水の界面で最も活性であることが示唆されたからである。確かに、表７において、光架橋されたネットワークであってｍＰＥＧ−ＰＴＭＣブロックコポリマーを含むものは、光架橋されたネットワークであってＰＴＭＣ３７３ホモポリマーあるいはそのＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣブロックコポリマーとのブレンドから形成されたものよりも接触角が顕著に低く、水の取り込みの値がいくらか高いことが見受けられ得る。光架橋されたＰＴＭＣネットワークの表面の特徴が、親水性−疎水性のブロックコポリマーとのブレンドによって、容易に調整できることは明らかである。
【０１８１】
【表７】
2013526649.tif 000017
【０１８２】
照射されていないＰＴＭＣ３７３フィルムの平均静止接触角は７７．４±０．８であった。興味深いことに、ＵＶを照射したＰＴＭＣ３７３フィルムであってＰＥＴＡおよび光開始剤を含むもの（ＰＴＭＣ３７３−３００）の接触角は、照射していないものよりも顕著に大きいものであった（９８．９±３．４）。ＵＶ照射単独の効果を調べるために、ＰＥＴＡまたは光開始剤を含まないＰＴＭＣ３７３フィルムを照射した。３００分間の照射の後、ＰＴＭＣ３７３の静止、前進および後退の接触角は、それぞれ、８５．３±１．１°、８７．５±０．９°および５２．０±１．４°であった。また、これらは照射していないＰＴＭＣよりも高いものであった。これにより架橋が不活性条件下で行われたことが確認される。なぜなら、大気中での短い波長の紫外線の照射では、ポリマー表面の酸化、および親水性の増加（より低い接触角）がもたらされ得るからである。また、２×１０−４Ｐａの減圧での減圧ＵＶ照射（１２６ｎｍ）によってもＰＭＭＡの接触角が約２０°増加することも報告された。これはポリマー表面での炭素のパーセンテージが増加することに関連した。
【０１８３】
また、図７Ｂは、架橋されていないＰＴＭＣ３７３フィルム、光架橋されたＰＴＭＣ３７３−３００フィルムおよびＰＴＭＣ３７３／ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣ−３００フィルムの厚みが、酵素分解の間に時間とともに減少したことを示す。これは、これらのポリマーおよびネットワークフィルムが、表面侵食過程（プロセス）で侵食されたことを示す。ＰＴＭＣ３７３／ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣ−３００試験片の厚みは顕著に低下しないことは決定できたが、ＳＥＭ分析は、ある程度の表面点食がこれらのフィルムにあることを示した。これにより、これらの緩やかな表面の侵食が確認された（データは示さない）。
【０１８４】
光架橋されたＰＴＭＣをベースとする組織工学スキャホールド
組織工学（ＴＥ）スキャホールドを作製するために、ポリマー（ＰＴＭＣ３７３ホモポリマー、ＰＴＭＣ３７３／ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣまたはＰＴＭＣ３７３／ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣのブレンド）、ＰＥＴＡ、光開始剤およびエチレンカーボネートの溶液を調製した。光架橋された３次元のＰＴＭＣベースのスキャホールドを、バイオプロッターを用いる上記ポリマー溶液のコンピュータ制御による押出成形、光架橋、およびエチレンカーボネートおよび他の存在し得る浸出可能なものの水およびエタノールでの抽出によって調製した。
【０１８５】
可撓性のＰＴＭＣベースのポリマーから調製したスキャホールドは、７０±６％の高い多孔度を有し、孔は相互に連結（連通）していた。図４は、ＰＴＭＣ３７３ポリマーから調製され、かつ架橋されたスキャホールドのＳＥＭ顕微鏡写真を示す。また、ＰＴＭＣ３７３／ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣまたはＰＴＭＣ３７３／ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣのブレンドを使用した場合にも同様の構造が得られた。図１５Ａおよび１５Ｂからは、ｘまたはｙ方向にプロッティングした繊維間の距離が約２００〜２５０μｍであり、かつ繊維の直径が１００〜１５０μｍの範囲であったことが見受けられ得る。孔の高さ（大きさ）は、５０〜１００μｍの範囲であった（図１５Ｄ）。
【０１８６】
溶媒としてエチレンカーボネート（ＥＣ）を使用することにより、分子量の大きいＰＴＭＣポリマーの１００〜１２０℃での比較的に低い温度での押出成形が可能となった。ＥＣを使用しない場合には、比較的に低い分子量のＰＴＭＣ４５ポリマーの押出成形であっても、２２０℃よりも高い温度が必要となる。さらに、押出した繊維を冷たい窒素で冷却すると、エチレンカーボネートの結晶化が誘発された。ＥＣの結晶化は、押出した非晶質ＰＴＭＣポリマーの繊維に所望の形状安定性を与えただけでなく、ミクロ多孔性を有する繊維の形成をももたらした。これらの繊維のミクロポア（数ミクロンから数十ミクロンの範囲）および繊維の表面の粗さは、特に図１５Ｃにおいて明確に見ることができる。これらＰＴＭＣスキャホールドのミクロ多孔性は、組織工学において有利であってもよい。なぜなら、基体に細胞が結合し、その生存性が表面粗さとともに向上することが示されているからである。また、このミクロ多孔性によって、細胞への養分の輸送および細胞からの廃棄物の除去の向上をもたらすことができた。
【０１８７】
光架橋した（３００分）ＰＴＭＣベースのスキャホールドにヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を播種し、１０日間にわたって培養した。図１６は、メチレンブルーで染色した生存可能な細胞を示す。ＰＴＭＣ３７３およびＰＴＭＣ３７３／ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣから調製したスキャホールドの上および中に存在する細胞の数は、播種の日（図１６Ａ、１６Ｄ）から５日目（図１６Ｂ、１６Ｅ）まで増加したことが見受けられ得る。培養の１０日後には、これらスキャホールドが非常に多数の生存し得る細胞を含んでいた。これは図１６Ｃおよび１６Ｆにおける広範囲の（青色）の染色から知ることができる。ＰＴＭＣ３７３／ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣのブレンドから調製したスキャホールドの上および中の細胞の数は、他の２つの材料よりもはるかに少ないものであった。この材料の親水性の性質は、おそらく、ｈＭＳＣのこれらの表面への接着を妨げる細胞培養培地に存在する細胞結合タンパク質の吸着を許容できなかったであろう。
【０１８８】
これらの観察は、ＳＥＭ（図１７）によって確認された。培養の５日後では、引き延ばされた繊維芽細胞のような形態（モルホロジー）のｈＭＳＣが繊維上に観察された（図１７Ａ、１７Ｄ、１７Ｇ）。図１７Ｂおよび１７Ｅは、増殖したｈＭＳＣ、ならびに、ＰＴＭＣ３７３およびＰＴＭＣ３７３／ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣから調製され、かつ光架橋されたスキャホールドの表面がほどんど完全に細胞で覆われたことを示す。図１７Ｃおよび１７Ｆの断面から、スキャホールドの内側にも細胞が存在していて、細胞外マトリクスが製造されたことが見受けられ得る。これにより、これらの材料がｈＭＳＣに適合したことが示される。また、ＳＥＭにおいても、ＰＴＭＣ３７３／ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣのブレンドから調製されたスキャホールドにも少ない数の細胞が見られた。
【０１８９】
ｈＭＳＣの培養の間、培養培地中のグルコースおよびラクテートの濃度を決定することによって、細胞の代謝プロファイルをモニタリングした。図１８Ａおよび１８Ｂは、５、８および１０日目のグルコースおよびラクテートの濃度を示す（なお、培地は５日目で新しいものにしたことに留意）。全ての培養物において、時間が経過するとともに、グルコース濃度は低下し、ラクテート濃度は増加した。ＰＴＭＣ３７３およびＰＴＭＣ３７３／ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣから調製したスキャホールドであって光架橋されたものにはより多数の細胞が存在したので、これらの細胞を播種したスキャホールドを含むウェルにおいて、グルコースの消費およびラクテートの産生は高いものであった。ＰＴＭＣ３７３／ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣのブレンドから製造したスキャホールドであって細胞を播種したものを含むウェルでは、グルコースの消費およびラクテートの産生は低いものであった。なぜならこれらのスキャホールドでは、細胞が顕著に少ないものであったからである。ＰＴＭＣ３７３−３００、ＰＴＭＣ３７３／ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣ−３００およびＰＴＭＣ３７３／ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣ−３００のスキャホールドを用いた培養物でのグルコースの消費の速度は、それぞれ、２３．３±１．７、２５．０±２．４および９．８±１．５μＭ／ｈであった。対応するラクテートの産生の速度は、６０．８±６．５、６３．２±８．１および３４．１±３．９であった。これらの結果は、ＰＴＭＣ３７３−３００およびＰＴＭＣ３７３／ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣ−３００のスキャホールドは、ＰＴＭＣ３７３／ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣから調製したものよりも、組織工学の用途にさらに適していたことを示唆する。（しかし、ｍＰＥＧ−ＰＴＭＣブロックコポリマーを含むネットワークは、血管グラフトなどの生体適合材料（バイオマテリアル）の血液との適合性を向上させるために使用され得るかもしれない。）
【０１９０】
結果
この研究は、優れたエラストマー特性を有する可撓性で丈夫なＰＴＭＣネットワークならびに酵素による減少した侵食速度が、ＰＥＴＡおよび光開始剤を含むＰＴＭＣフィルムの有効な光架橋によって得られ得ることを示す。湿潤性および酵素による侵食など、これらＰＴＭＣネットワークの特性は、ＰＣＬまたはＰＥＧを含むブロックコポリマーとのブレンドによって容易に調整することができる。孔が相互に連結（連通）され、かつ広範囲のミクロ多孔性を有する組織工学スキャホールドは、熱可塑性ＰＴＭＣポリマーの熱溶解積層法および後続のスキャホールドのＵＶ光架橋によって得ることができる。ＰＴＭＣ３７３ポリマーおよびＰＴＭＣ３７３／ＰＴＭＣ−ＰＣＬ−ＰＴＭＣブレンドから調製されたスキャホールドであって光架橋されたものは、組織工学の用途に適している。なぜなら、これらはヒト間葉系幹細胞の接着および増殖が可能であったからである。この用途の広い架橋方法によって、高分子量ポリマーの容易な架橋、およびこの方法によりその特性を変えることなど、興味深い機会が提供される。
【０１９１】
実施例４
材料
ポリマーグレードの１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（独国））、１，３−プロパンジオール、トリメチロールプロパン、およびスズオクトアート（すべてＳｉｇｍａ（米国または独国）から）を受け取ったまま使用した。メタクリル酸無水物およびヒドロキノンをＡｌｄｒｉｃｈ（独国）から購入した。（±）−α−トコフェロールをＦｌｕｋａ（スイス）から入手した。溶媒（Ｍｅｒｃｋ（独国）またはＢｉｏｓｏｌｖｅ（蘭国））は、分析グレードのものであった。光開始剤として、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９（１−［４［（２−ヒドロキシエトキシ）−フェニル］−２−ヒドロキシ−２−メチル−１−プロパン−１−オン）、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）３６９（２−ベンジル−２−ジメチルアミノ−１−（４−モルホリノフェニル）−ブタノン−１）、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）５００（５０％の１−ヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトン、５０％のベンゾフェノン）（Ｃｉｂａ（登録商標）（スイス））、ベンゾフェノン（Ａｌｄｒｉｃｈ（独国））、およびＤＭＰＡ（２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン）（Ａｌｄｒｉｃｈ（独国））を受け取ったまま使用した。
【０１９２】
Ｊ７７４Ａマクロファージ（ＡＴＣＣ−ＴＩＢ−６７）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。培養培地として、ウシ胎児血清、ＧｌｕｔａｍａｘＴＭおよびペニシリン−ストレプトマイシンをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｉｂｃｏ（米国））から入手した。ディスポーザブル培養容器は、Ｎｕｎｃ（米国）およびＧｒｅｉｎｅｒ（独国）からのものであった。ヒト間葉系幹細胞の培養において、α−最小必須培地（α−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ（米国））を使用した。また、この培地は、ウシ胎児血清（１０％、Ｂｉｏｗｈｉｔａｋｅｒ（ベルギー））、ペニシリンＧ（１００ユニット／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国））およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国））、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ（米国））も含んでいた。ブタ膵臓由来のコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）（Ｓｉｇｍａ（英国）、５６．２Ｕ／ｍｇ）および二酸化カリウム（ＫＯ２、Ｓｉｇｍａ（米国））をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４、Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ  Ａ．Ｇ．（独国））およびＮａＯＨ／ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ＝１３、Ｓｃｈａｒｌａｕ  Ｃｈｅｍｉｅ（スペイン））にそれぞれ溶解した後に使用した。
【０１９３】
ＰＴＭＣポリマーおよびＰＴＭＣマクロマー架橋試薬の合成
直鎖状の分子量の大きいポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）を、触媒としてスズオクトアートを使用して３日間にわたって１３０℃で減圧下でＴＭＣモノマーの開環重合により合成した。ポリマーをクロロホルム中に溶解し、エタノール中に沈殿させ、新鮮なエタノールで洗浄し、減圧下で室温で乾燥することによって精製した。
【０１９４】
開始剤として１，３−プロパンジオール（２０ｍｏｌ％）またはトリメチロールプロパン（１４．３ｍｏｌ％）を使用することによって、開環重合（オリゴマー化）で２本腕（アーム）または３本腕（アーム）の末端が水酸基のＰＴＭＣオリゴマー（図１９を参照のこと）を合成した。合成は、触媒としてスズオクトアートを使用して、４８時間にわたって１３０℃でアルゴン下で行った。メタクリレート官能化されたＰＴＭＣオリゴマー（マクロマー）を得るために、末端が水酸基のオリゴマーを３０ｍｏｌ％過剰のメタクリル酸無水物と８時間にわたって１２０℃で反応させた。この工程の間、未熟の架橋を防止するために、ヒドロキノンおよび（±）−α−トコフェロール（０．０６重量％）を開始剤として使用した。減圧下での蒸留によって、過剰量のメタクリル酸無水物および形成されたメタクリル酸を除去した。さらに、ＰＴＭＣマクロマーをアセトン中に溶解させて、水中に沈殿させて、凍結乾燥して精製した。
【０１９５】
評価（キャラクタリゼーション）
ＣＤＣｌ３を使用するプロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）分光計（３００ＭＨｚ、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｎｏｖａ（米国））でＴＭＣモノマーの転化率を決定した。
【０１９６】
ＰＴＭＣの数平均分子量および重量平均分子量（それぞれＭｎおよびＭｗ）、多分散指数（ＰＤＩ）および固有粘度（［η］）をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ（米国））で決定した。セットアップのものは、直列に配置したＶｉｓｃｏＧＥＬ  Ｉ−ｇｕａｒｄ−０４７８、ＶｉｓｃｏＧＥＬ  Ｉ−ＭＢＨＭＷ−３０７８およびＶｉｓｃｏＧＥＬ  Ｉ−ＭＢＬＭＷ−３０７８のカラムと、屈折計、粘度計および光散乱検出器を備えたＴＤＡ  ３０２  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ａｒｒａｙとを備え、これにより絶対分子量を決定することができた。全ての決定を１．０ｍｌ／分の流速で溶離液としてクロロホルムを用いて、３０℃で行った。
【０１９７】
２本腕（アーム）または３本腕（アーム）のマクロマー（それぞれ、ジメタクリレートオリゴカーボネート（ＤＭＡＣ）、トリメタクリレートオリゴカーボネート（ＴＭＡＣ））の分子量を１Ｈ−ＮＭＲ分光計で決定した。
【０１９８】
ＰＴＭＣフィルムの調製
ＰＴＭＣホモポリマーを様々な量の光開始剤およびマクロマー架橋試薬と混合した。これは暗所でジクロロメタン中に各化合物を溶解および混合することによるものである。溶媒のエバポレーションの後、５００μｍ厚のステンレス鋼モールドおよび研究用プレス機（Ｆｏｎｔｅｉｊｎｅ  ＴＨＢ００８（蘭国））を用いて、圧縮成形されたフィルムを調製した。フィルムを約２５ｋｇ／ｃｍ２、１４０℃で成形し、冷水を用いて室温に冷却した。
【０１９９】
光架橋およびネットワークの評価（キャラクタリゼーション）
マクロマー（ＤＭＡＣまたはＴＭＡＣ）および光開始剤を含む圧縮成形されたフィルムをラミネート加工されたポリエチレン／ポリアミドのバッグ（Ｈｅｖｅｌ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｂ．Ｖ．（蘭国））中に減圧密封（シール）して、短波のＵＶ光（ＵｌｔｒａＬｕｍ架橋キャビネット（米国）、波長２５４ｎｍ）に７ｃｍの距離で曝露した。試験片の両側を異なる期間にわたって室温で照射した。光パワーメータ（Ｎｅｗｐｏｒｔ  １９１６−Ｃ（米国））で測定すると、この距離での光の強度は１０〜１４ｍＷ／ｃｍ２であり、ポリエチレン／ポリアミドバッグによって強度が５〜７ｍＷ／ｃｍ２まで低下した。
【０２００】
平衡の膨潤率およびゲル含有量を決定するために、照射したフィルムからディスク形状の試験片（厚み５００μｍ、直径１０ｍｍ）を打ち抜いて３０ｍＬのＣＨＣｌ３に１週間入れた。溶媒を３日後に一度、新しいものと入れ替えた。この手順によってゾルフラクションの完全な除去を確保した。次いで、膨潤したゲルの重量を秤量し、一定重量になるまで減圧下で室温で乾燥して、再度、重量を秤量した。ゲルフラクションおよびゾルフラクションをそれぞれ等式（１）および（２）に従って計算した。
【数１０】
2013526649.tif 000018
式中、ｍｄは、乾燥した（抽出した）サンプルの質量であり、ｍ０は、膨潤前の試験片の質量である。
【０２０１】
体積膨潤度（ｑ）を等式（３）に従って計算した。
【数１１】
2013526649.tif 000019
式中、ｍｓは、抽出して膨潤したサンプルの質量であり、ρｓおよびρｐは、それぞれ、クロロホルムの密度（１．４８ｇ／ｃｍ３）、ＰＴＭＣの密度（１．３１ｇ／ｃｍ３）である。
【０２０２】
機械特性
光架橋されたＰＴＭＣフィルム（測定寸法：約１００×５×０．５ｍｍ３）の引張特性をＡＳＴＭ−Ｄ  ８８２−９１に従ってエタノールで抽出した後に３回で決定した。５００Ｎのロードセルを備えたＺｗｉｃｋ  Ｚ０２０引張試験機（Ｕｌｍ（独国））を５０ｍｍ／分のクロスヘッドスピードで操作した。初期のグリップからグリップまでの離間距離は５０ｍｍであり、０．０１Ｎのプリロードを付与した。試験片の変形は、グリップからグリップまでの離間距離からもたらされた。従って、示されるヤング率の値（応力−ひずみ曲線の初期の傾きから計算した値）は、ポリマーの剛性を示すだけのものである。
【０２０３】
ダイナミックローディング条件下でこれらの挙動を評価するために、サイクル試験にて、試験片（ｎ＝１）を５０ｍｍ／分で５０％ひずみまで繰り返し（２０回）引き延ばした。２時間の回復期間の後、２１回目のサイクルの応力−ひずみの図から永久変形を概算した。これらの実験において、０．０１Ｎのプリロードを付与した。変形はグリップからグリップまでの離間距離からもたらされた。値の誤差は、約０．５％ひずみである。
【０２０４】
ヒト間葉系幹細胞の培養
ディスク形状であり、光架橋され、かつエタノールで抽出されたＰＴＭＣフィルム（直径１５ｍｍ、厚み約２００μｍ）にてヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を培養した。細胞の培養の前に、フィルムを７０％のエタノール中に１５分間浸漬し、次いで滅菌されたＰＢＳで洗浄することによって滅菌した。インフォームドコンセントが得られた股関節置換手術を受けたドナーからｈＭＳＣを得た。承認は地方医療倫理委員会から得られた。αＭＥＭを使用して５×１０４細胞数／ｃｍ２の初期播種密度で細胞（継代（パッセージ）２）を培養した。培地は、毎週２回、新しいものと交換した。
【０２０５】
４週間の培養の後、フィルム上の細胞を３．７％のパラホルムアルデヒドで固定した。試験片の半数を金でスパッタコートし、その表面を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＸＬ  ３０  ＥＳＥＭ−ＦＥＧ（蘭国））により５ｋＶの操作電圧で分析した。残りの半数を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いた細胞核の蛍光染色に使用した。第１抗体としてマウスのモノクローナルα筋節アクチンを使用し、さらにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でラベリングされたアイソタイプの特定のヤギ抗マウスの第２抗体を使用して細胞のアクチン細胞骨格を染色した。次いで、これらの試験片を共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）で分析した。
【０２０６】
インビトロでの侵食の研究
Ｊ７７４Ａマクロファージは、マクロファージが媒介する侵食の研究に使用されたものであり、４．５ｇ／ＬのＤ−グルコース、ピルビン酸塩、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１００μｇ／ｍＬの２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘＴＭを含むＤＭＥＭ中にて維持された。４日〜７日ごとに細胞を掻き取ることで継代した。
【０２０７】
光架橋され、かつエタノールで抽出したポリマーフィルムのマクロファージ培養物中での侵食を、フィルム表面でＪ７７４Ａマクロファージを直接培養することで調べた。試験片の直径は１５ｍｍであり、厚みは約５００μｍであった。播種密度は約８×１０４細胞数／ｃｍ２であった。各表面で細胞を培養した８日後、細胞の新鮮なアリコートを培養物に添加した。各材料につき６個のディスクで細胞を培養した。一週間に一度、培地を新しいものと交換した。
【０２０８】
培養の１４日後、まず、各材料の３個の試験片をミリＱ水中に入れて細胞を溶解し、次いで徹底的に濯いで重量を秤量した。室温で減圧下で一定重量になるまでフィルムを乾燥した後、サンプルの重量を再び秤量した。試験片の表面の評価を上記で説明した通りＳＥＭで行った。
【０２０９】
各材料の残りのディスク（ｎ＝３）を、細胞骨格安定化（ＣＳ）緩衝液（０．１Ｍのピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、１ｍＭのエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ｐＨ＝６．９）中の３．７％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定し、次いで、ＰＢＳに移した。ＤＡＰＩを使用した細胞核の蛍光染色、およびテトラメチルローダミンイソチオシアニドファロイジン（ＴＲＩＴＣ−ファロイジン）を使用したアクチン細胞骨格の蛍光染色にこれらの試験片を使用した。接着した細胞の深さ方向の可視化を可能とするために、ＣＬＳＭ（４０倍のＮＡ０．８０の完全水中浸漬レンズを備えたＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２）を使用してサンプルを分析した。
【０２１０】
ブタ膵臓由来のコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）を使用して、架橋されていないＰＴＭＣフィルムおよび光架橋されたＰＴＭＣフィルムの酵素による加水分解を研究した。０．０２重量％のＮａＮ３（Ｓｉｇｍａ（米国））を殺菌剤として含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）を使用して２０μｇ／ｍＬの濃度のＣＥ酵素の水溶液を調製した。エタノールで抽出したディスク形状のフィルム（直径８ｍｍ、厚み約５００μｍ、ｎ＝８）を、１ｍｌの新たに調製した酵素溶液を含むバイアル中に入れて、３７℃でコンディショニングした。２日毎に１回、培地を新しいものと入れ替えた。１４日間のインキュベーションの後、湿潤した試験片の質量を、その表面を濯いでブロッティングした後に決定した。室温、減圧下で一定重量になるまで試験片を乾燥させた後に測定を再び行った。
【０２１１】
また、ＮａＯＨ／ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ＝１３）を用いて調製したＫＯ２水溶液［５Ｍ］中でインキュベーションすることによって、寸法が同一のＰＴＭＣ（ネットワーク）フィルムのインビトロでの侵食も調べた。１ｍＬの新たに調製したスーパーオキシド溶液を含むバイアル中に試験片（ｎ＝４）を入れた。この溶液は毎日新しいものと入れ替えた。３７℃での１週間のインキュベーションの後、質量損失を上記で説明した通りに決定した。
【０２１２】
湿潤性および水の取り込み
ジクロロメタン中のポリマー溶液（約１重量％）をガラス製ディスクに注型成形（キャスティング）して、減圧下で乾燥し、不活性雰囲気下で光架橋することにより調製したフィルム（各材料につき６個（ｎ＝６））で接触角の測定を行った。室温において、様々な表面での超純水（ＭｉｌｌｉＱ  Ｐｌｕｓ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（仏国））の静止、前進および後退の接触角を、電子工学シリンジモジュールを備えたビデオベースのシステム（ＯＣＡ  ２０  ＤａｔａＰｈｙｓｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ（独国））を用いて決定した。
【０２１３】
圧縮成形され、かつ光架橋したフィルムの平衡状態での水の取り込みを、エタノールでの抽出の後に決定した。試験片（ｎ＝４）を１週間にわたって３７℃でＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中でコンディショニングした。水の取り込みを、試験片の質量の増加と定義した。
【０２１４】
結果
直鎖状の高い分子量のＰＴＭＣ（Ｍｎ＝２９１ｋｇ／ｍｏｌ）をＴＭＣの開環重合により合成した。少量の１，３−プロパンジオールまたはトリメチロールプロパンでＴＭＣの開環重合を開始し、続く２本腕（アーム）または３本腕（アーム）のオリゴマーとメタクリル酸無水物との反応によって、ＰＴＭＣマクロマーを調製した。ＵＶ光を用いた高い分子量のＰＴＭＣの照射の間に、メタクリレート官能化されたＤＭＡＣまたはＴＭＡＣのマクロマーを架橋試薬として使用した。
【０２１５】
１Ｈ−ＮＭＲ分析によって、開環重合（オリゴマー化）反応において、ＴＭＣの転化率は９５％よりも高いものであったこと、ならびにマクロマーではヒドロキシル末端基の９９％よりも多くがメタクリレートに転化されたことが示された。また、精製したＤＭＡＣまたはＴＭＡＣのマクロマーの数平均分子量もＮＭＲで決定され、その値は、それぞれ、８１０ｇ／ｍｏｌ、１１００ｇ／ｍｏｌ（あるいは２．９または２．５ＴＭＣ単位／腕（アーム））であった。
【０２１６】
光開始剤を使用したＰＴＭＣフィルムの光架橋
予備実験において、様々な光開始剤（ＰＩ）を含む直鎖状の分子量の大きいＰＴＭＣのフィルムを調製し、３０〜１２０分間にわたって短波ＵＶ光を照射した（ＰＩ：ポリマー中のＴＭＣの繰り返し単位のモル比は１：１０００であった）。驚くべきことに、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商業）５００またはベンゾフェノンをＰＩとして使用した場合、ゲル含有量の高いＰＴＭＣネットワークが得られることが見出された。これらのＰＩに関して、８４〜８７％のゲルを有するネットワークが１２０分の照射後に得られた。ＤＭＰＡまたはＩｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）３６９を含むＰＴＭＣフィルムを１２０分間にわたって照射した場合、ゲル含有量はそれぞれ６２％、０％とかなり低いものであった。
【０２１７】
また、ポリエチレンおよびポリ（エチレンオキシド）も、ベンゾフェノンのようにノリッシュＩＩ型の光分解を受ける光開始剤の存在下でのＵＶ照射で架橋し、そして水素引き抜き剤として作用することが示されている。両方のポリマーに対して、２つのマクロラジカル種の結合によって架橋が起こり、Ｈ型架橋を形成することが提案された。さらに、ポリ（エチレンオキシド）もノリッシュＩ型光分解（α−開裂）を受ける光開始剤の存在下で架橋できたが、その効果は少なかった。これはＰＴＭＣを用いた実験の場合にも当てはまり、ノリッシュＩ型光分解を受ける光開始剤（ＤＭＰＡおよびＩｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）３６９）は、ネットワークの最も低いゲル含有量を与えた。
【０２１８】
Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９はベンゾフェノンと同じくらい有効であり、広範囲の哺乳動物の細胞型との良好な適合性を有すると考えられるので、これをさらなる実験においてＰＩとして使用した。
【０２１９】
ゲル含有量およびネットワーク密度へのＰＩ濃度の影響を、量を変えてＩｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９を含むＰＴＭＣフィルムに３０分から最大３００分の範囲の継続時間（デュレーション）で照射することで評価した。全ての照射時間（３０、６０、１２０、１８０、２４０および３００分間）において、ＰＴＭＣフィルムのＰＩ含有量が増加すると、最初に、形成されたＰＴＭＣネットワークのゲル含有量が増加し、膨潤率が低下した。図２０は、１２０分間の照射時間において、このことを示す。全ての照射時間において、最適のＰＩ／ＴＭＣの比（最も高いゲル含有量および最も低い膨潤率が得られる場合）は、１／１０００であることがわかった。１／１０００よりも高いＰＩ濃度でのゲル含有量の低下は、おそらく量子収量の低下が原因である。これは競合反応に起因し得る。すなわち、光開始性ラジカルはＰＴＭＣ鎖と反応し得るか、あるいは、光開始性ラジカルは、互いにまたはＰＴＭＣマクロラジカルと反応し得る。全てのＰＩ濃度において、１２０分未満でフィルムを照射することで、ネットワークのより低いゲル含有量およびより高い膨潤率が得られた。照射時間を１２０分を超えて増加させることで、さらに高いゲル含有量またはさらに高いネットワーク密度を有するネットワークは得られなかった。
【０２２０】
光開始剤としてＩｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９、架橋試薬としてＰＴＭＣマクロマーを使用するＰＴＭＣフィルムの光架橋
フィルムの架橋特性を調べるために、様々な量のＩｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９光開始剤および様々な量のＰＴＭＣマクロマーを含む分子量の大きいＰＴＭＣフィルムをＵＶ光に曝露した。全ての場合において、ＵＶを照射すると、透明なＰＴＭＣネットワークが形成された。
【０２２１】
一定濃度のＰＴＭＣマクロマー（１／５０のメタクリレート／ポリマー中のＴＭＣ繰り返し単位）では、ＰＩ濃度が増加するにつれて（１／８０００、１／４０００、１／２０００、１／１０００のＰＩ／ポリマー中のＴＭＣ繰り返し単位）、形成されるネットワークのゲル含有量は増加し、膨潤率が低下した。これはＤＭＡＣおよびＴＭＡＣの両方が架橋試薬として使用される場合に観察された。例えば、ＤＭＡＣ含有フィルムが３０分間照射された場合、ＰＩ／ＴＭＣの比が１／８０００から１／１０００に増加するにつれて、形成されるネットワークのゲル含有量は５３±２％から８９±１％に増加した。対応するクロロホルム中での膨潤率は２３．２±０．６および１３．９±０．２ｖｏｌ／ｖｏｌであった。従って、最も高いＰＩ／ＴＭＣの比である１／１０００をさらなる実験で使用した。ＰＴＭＣフィルムを６０分間または１２０分間照射した場合、同じ傾向が観察された。照射時間を長くすることによっても、より高いゲル含有量およびより低い膨潤率のネットワークが得られた。
【０２２２】
ＰＴＭＣネットワークフィルムのゲル含有量および膨潤率に対する照射時間および使用する架橋試薬の影響を図２１に示す。ＰＴＭＣフィルムのＰＩ／ＴＭＣの比は１／１０００であり、ＤＭＡＣまたはＴＭＡＣを含むフィルムにおいて、メタクリレート／ＴＭＣの比は１／５０であった。ＰＴＭＣフィルムから形成したネットワークであってＰＴＭＣマクロマーを含まないもの（ＰＴＭＣ−ＰＩ）のゲル含有量および膨潤率は、ＵＶの照射時間に応じて、それぞれ、６４±３〜８７±２％、４８±１〜１４．６±１．２ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲であった。ＰＴＭＣマクロマーを含むフィルムから形成したネットワークに関して、ゲル含有量は、ＰＴＭＣ−ＰＩ−ＤＭＡＣでは８９±１〜９５±１％の範囲であり、ＰＴＭＣ−ＰＩ−ＴＭＡＣでは９１±１〜９４±１％の範囲であった。重要なことには、これらのネットワークの密度は、高いゲル含有量を維持する一方で、照射時間を調節することにより調製できた。クロロホルム中の膨潤率は、１３．９±０．２〜８．５±０．１ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲であった。
【０２２３】
また、図２からは、架橋試薬としてＰＴＭＣマクロマーをフィルムに使用することで、架橋の割合が顕著に増加し、光開始剤のみを含むＰＴＭＣフィルムよりもかなり速く、高いゲル含有量および低い膨潤率が得られることが見受けられ得る。３０分間のＵＶ照射の後では、ＰＴＭＣ−ＰＩ、ＰＴＭＣ−ＰＩ−ＤＭＡＣおよびＰＴＭＣ−ＰＩ−ＴＭＡＣのゲル含有量は、それぞれ、６４±３、８９±１、９１±１％であった。対応の膨潤率は、４８±１、１３．９±０．２、１２．２±０．３ｖｏｌ／ｖｏｌであった。ジメタクリレートまたはトリメタクリレートの架橋試薬を含むＰＴＭＣフィルムから形成されたネットワークの特徴の違いは、最小限であった。しかし、ＴＭＡＣネットワークフィルムは、わずかにより密に架橋されるようであった。
【０２２４】
また、フィルムのマクロマー含有量のＰＴＭＣネットワーク形成への影響も調べた。ＰＩ／ＴＭＣの比を一定（１／１０００）にして、フィルムのＴＭＡＣ含有量を変更した。このような方法でも同様に、これらのフィルムのネットワーク密度を容易に変更することができた。メタクリレート／ＴＭＣの比が０、１／２００、１／１００、１／５０の場合、ネットワークの膨潤率は、それぞれ、１４．６±１．２、１２．４±０．３、１１．４±０．３、８．５±０．１ｖｏｌ／ｖｏｌであった。上記に記載したネットワークはすべて８７±２〜９４±１％の範囲の高いゲル含有量を有していた。
【０２２５】
観察された高いゲル含有量およびネットワーク密度によって、マクロマーがＰＴＭＣネットワークに取り込まれたことが示唆される。
【０２２６】
光架橋されたＰＴＭＣネットワークの機械特性
直鎖状のＰＴＭＣから調製され、かつ圧縮成形されたフィルム、ならびに、光架橋され、かつ抽出されたＰＴＭＣネットワークフィルムの引張特性を表７に示す。また、代表的な応力−ひずみ曲線を図２２に示す。ＰＴＭＣの光架橋は、顕著にさらに高い破壊応力の値をもたらしたが、破壊ひずみの値は非常に高いままであった。光架橋によって、さらにより高い靭性を有するフィルムをもたらす。分子量の大きいＰＴＭＣフィルムから調製されたＰＴＭＣネットワークであって架橋試薬としてＴＭＡＣを含むものは、２４±３ＭＰａ程度の高い破壊応力の値を有していた。さらに、ＰＴＭＣの可撓性の性質は、架橋によってそれほど影響を受けなかった。直鎖状のＰＴＭＣから調製されたフィルムのＥ−モジュラスの値は、６．６±０．５ＭＰａであった。対して、光架橋されたＰＴＭＣフィルムについての値は７．１±０．１〜７．５±０．２の範囲であった。これは最も重要である。なぜなら、これらのネットワークは、軟部組織に関する医療用途に使用されることが意図されているからである。
【０２２７】
組織工学スキャホールドにて細胞を培養する場合にはバイオリアクターをよく使用する。なぜなら、これにより、インビボでのダイナミックな条件にしっかりと適合させることが可能となるからである。従って、かかる用途に使用され得る材料は、反復して付与されるサイクルでの応力に耐え、かつ、そこから回復し得るべきである。５０％ひずみの２０サイクルの伸張を加えることでネットワークフィルムの耐クリープ性を評価した。様々な材料について、かかる２０サイクルを示す応力−ひずみ曲線を図２３に示す。照射していないＰＴＭＣフィルムの２０サイクル後のクリープは最も高いものであった（１５．３％）。２時間の回復期間の後、その永久変形（パーマネントセット）は１．６％ひずみであった（表７）。光架橋されたネットワークフィルムは顕著に向上した弾性挙動を示し、これはサイクル試験においてかなり少ないクリープを伴うものであった。２０回目のサイクルの後、ＰＴＭＣ−ＰＩ、ＰＴＭＣ−ＰＩ−ＤＭＡＣおよびＰＴＭＣ−ＰＩ−ＴＭＡＣのクリープの値は、それぞれ、９．９、７．５および７．６％ひずみであった。これらのネットワークの永久変形（パーマネントセット）の値は、０．６％ひずみ程度の低いものであった。
【０２２８】
サイクル試験で観察されるもう一つの現象は、負荷（ローディング）サイクルの最後に到達する最大応力値の減少であり、これは応力の緩和に起因する。応力の緩和は望ましいものではない。なぜなら、繰り返し応力が付与される場合、これにより、血管組織工学スキャホールドおよびグラフトなどの構成の膨張および破損がもたらされ得るからである。また、光架橋により、ＰＴＭＣの応力緩和を減少することができた。架橋されていないＰＴＭＣでは、最大応力は、３．２ＭＰａから２．４ＭＰａに低下した。一方で、光架橋したフィルムの場合には、この減少は、わずか０．３〜０．４ＭＰａであった。
【０２２９】
【表８】
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【０２３０】
ヒト間葉系幹細胞の培養
光架橋され、かつ抽出されたＰＴＭＣネットワークの細胞との適合性を評価するために、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）をＰＴＭＣ−ＰＩ−ＴＭＡＣ（１／５０のメタクリレート／ポリマー中のＴＭＣ繰り返し単位）の表面で培養した。ｈＭＳＣは、培養中、生存可能のままであった。図２４は、４週間後のフィルム表面でのｈＭＳＣを示す。この時点で、引き延ばされた形態（モルホロジー）のｈＭＳＣが密集した個体群（ポピュレーション）がネットワークフィルムに存在した。この初期のアッセイによって、これら光架橋されたＰＴＭＣネットワークは、組織工学スキャホールドの製造に適した材料であることが示された。なぜなら、ｈＭＳＣは、長期間にわたって、これらの表面で生存可能であり、かつ健康な状態のままであったからである。これらＰＴＭＣベースのネットワークフィルムでのｈＭＳＣの分化は、さらなる研究の主題（トピック）である。
【０２３１】
光架橋されたＰＴＭＣネットワークのインビトロでの侵食および湿潤性
吸収性ポリマーのインプランテーションの後、マクロファージは、組織と生体適合材料（バイオマテリアル）の界面において優性細胞となる。マクロファージは、異物反応の事象ならびに生体適合材料の分解および侵食の事象に従事し得るものである。マクロファージの培養は、分解性ポリマーの生体適合性および生分解についての初期のインビトロアッセイとして使用されている。かかるアッセイでは、短鎖のポリ（３−ヒドロキシ酪酸）の小さな結晶性の粒子によって、用量に依存する様式でマクロファージにダメージが引き起こされ得ることが示され、これは、生分解性ポリマーの生体適合性における分解物およびその分解速度の重要性を示している。光架橋されたＰＴＭＣネットワークの侵食挙動を評価するために、抽出されたネットワークフィルム上でマクロファージを培養し、その侵食を直鎖状のＰＴＭＣフィルムのものと比較した。全てのネットワークフィルムは１／１０００のＰＩ／ＴＭＣ繰り返し単位を含み、ＴＭＡＣの量を変更して（メタクリレート／ＴＭＣ繰り返し単位：０、１／２００、１／１００、１／５０）、１２０分間のＵＶ照射により光架橋した。
【０２３２】
１４日間のマクロファージの培養後、全てのＰＴＭＣフィルムが侵食されたことがわかった。それらの質量は低下し、フィルムの表面にピットの形成が観察された。これはマクロファージ培養の間での表面の侵食を示す（図２５）。マクロファージ培養でのフィルムの侵食速度のあらましを表８に示す。価値あることに、注目すべきは、培養期間中、使用したＰＴＭＣベースの材料からも、またその分解物からも、マクロファージへの細胞毒性の影響はともに観察されなかったことである。さらに、かかる材料およびその分解物の両方ともがマクロファージの活性化を誘発しなかった。これは、かかる材料の生体適合性を示すものであり、間葉系幹細胞による観察を確認するものである。
【０２３３】
【表９】
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【０２３４】
マクロファージは、直鎖状のＰＴＭＣから調製したフィルムに最も有効であった。これらのフィルムの侵食速度は、１５９±８（μｇ／（ｃｍ２×日））であった。これは、３．８±０．２％の質量損失に対応する。ＳＥＭによって、表面が広範囲に侵食されたことが示された（図２５Ａおよび２５Ｂ）。ＰＴＭＣフィルムの侵食は、光架橋により減少させることができた。なぜなら、ＰＴＭＣ−ＰＩネットワークフィルムの侵食は、架橋されていないＰＴＭＣフィルムのものよりもかなり少なかったからである。これは、大きな重要性を有する。なぜなら、直鎖状または軽く架橋されたＰＴＭＣフィルムはインビボにおいて比較的迅速に侵食され、その長期にわたる生物医学的な用途での使用が妨げられるからである。侵食速度は、架橋試薬としてＰＴＭＣマクロマーを使用することによって、さらに低下させることができた。メタクリレート／ＴＭＣの比が０、１／２００、１／１００および１／５０であるフィルムの侵食速度は、それぞれ、２８±４、１６±４、１２±１、１１±３（μｇ／ｃｍ２×日）であった（これは０．７〜０．３％の範囲の質量損失に対応する）。図２５Ｃ〜２５Ｊにおいて、架橋試薬の量が増加すると、フィルムの侵食の程度が低下することが非常に明確である。従って、フィルム表面のピットは、かなり浅いものとなった。
【０２３５】
マクロファージが媒介する光架橋フィルムの浸食において観察された減少は、（より密な）ネットワークの形成に起因し得るものであり、これにより、かかる結合は（酵素による）加水分解にアクセスしにくい（近づきにくい）ものとなる。かかるネットワークのクロロホルム中での膨潤率は１４．６±１．２〜８．５±０．１ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲であった。別の理由としては、様々な表面でのマクロファージの接着および増殖に差があったことが挙げられ得る。１４日間の培養の後、様々なネットワークフィルムで細胞の数を決定した。図２６からは、架橋試薬としてＴＭＡＣを含むネットワークフィルムが、架橋されていないＰＴＭＣフィルム（５６５７±７５５細胞数／ｍｍ２）またはＰＴＭＣ−ＰＩネットワークフィルム（６５７４±１４３３細胞数／ｍｍ２）におけるよりも少ない数のマクロファージを有していた（２６０７±１０３３〜４０８２±６８１の範囲）ことが見えてくる。しかし、各表面での細胞数の減少は、各フィルムの侵食の減少よりもかなり少ないものであった。従って、細胞数に対する侵食速度の正規化（標準化）の後であったとしても、架橋によるＰＴＭＣフィルムの侵食速度の減少は明らかであった。
【０２３６】
生体適合材料（バイオマテリアル）への細胞の接着の大部分は、タンパク質の接着に依存し、これは生体適合材料の表面特性によって決定される。架橋されていないＰＴＭＣフィルムおよび光架橋されたＰＴＭＣフィルムの大気中での水の接触角および水の取り込み量を表９に示す。値は、ＰＴＭＣおよびそのネットワークが疎水性であることを示す。１週間にわたるＰＢＳ中でのインキュベーションによって、全てのフィルムは、約１重量％増えた。架橋およびＴＭＡＣの量が増加することによって、接触角は８０°から９７°に増加した。ＴＭＡＣ含有ネットワークフィルムの非常に高い疎水性は、おそらく、直鎖状のＰＴＭＣと比べて、フィルム表面へのより程度の低いマクロファージの接着をもたらす。なぜなら、非常に疎水性の表面あるいは非常に親水性の表面では、細胞の接着は促進されないからである。
【０２３７】
【表１０】
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【０２３８】
さらに、光架橋されたＰＴＭＣネットワークの侵食を本発明に従ってコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）水溶液およびＫＯ２水溶液を用いて調べた。表８は、これらの溶液中でのインキュベーションによって決定された非架橋ＰＴＭＣフィルムおよび光架橋ＰＴＭＣフィルムの侵食速度を示す。
【０２３９】
コレステロールエステラーゼ水溶液中にてインキュベーションすると、架橋されていないＰＴＭＣフィルムは、時間とともに直線的に（比例して）侵食された。架橋されていないＰＴＭＣ試験片の表面侵食は、２１６０±６００（μｇ／ｃｍ２×日）の速度で進行し、１４日間で８７．９±１．６％質量損失の質量損失をもたらした。この場合、光架橋は、マクロファージが媒介した侵食において観察されたものよりも、さらに劇的な影響をＰＴＭＣの酵素による侵食に与えた。ＣＥ溶液中での１５日間のインキュベーションの後、メタクリレート／ＴＭＣの比が０〜１／５０であるネットワークフィルムの質量損失は、６．６±１．８％〜０．６±０．２％の範囲であった（これは１３７±３８〜１５±３（μｇ／ｃｍ２×日）の速度に対応する）。
【０２４０】
スーパーオキシドアニオンラジカルを含む緩衝液中にてインキュベーションすると、架橋されていないＰＴＭＣフィルムおよび架橋されたＰＴＭＣフィルムの質量は、一定の速度で減少した。これは、これらの媒体において、その表面が侵食されたことを意味する。架橋さていないＰＴＭＣの侵食速度は２０４０±３６０（μｇ／ｃｍ２×日）であった。これは、これらのフィルムをＣＥ溶液中でインキュベートした場合に観察される速度（２１６０±６１０（μｇ／ｃｍ２×日））と同等である。ＫＯ２水溶液中での１週間のインキュベーションの後、架橋されていないフィルムの質量損失は、４８．７±８．５％であった。また、酸化力のある化学種によるＰＴＭＣの分解も、光開始剤のみの存在下での光架橋によって減少した。１週間インキュベーションすると、ＰＴＭＣ−ＰＩネットワークの質量損失は、３０．８±３．７％であり、ＰＴＭＣ−ＰＩ−ＴＭＡＣネットワークの質量損失は、約１６±０．５％であった。
【０２４１】
結論
分子量の大きいＰＴＭＣは、架橋試薬として低分子量のＰＴＭＣマクロマーおよびＩｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９光開始剤を用いて光架橋することができる。形成されたネットワークの特徴（ネットワーク特性、機械特性、インビトロ侵食挙動、水の接触角および湿潤性）は、取り込まれる架橋試薬の量を調節することで調整することができる。かかる表面侵食性エラストマー性のＰＴＭＣネットワークは、優れた機械特性を有する。さらに、初期のインビトロアッセイによって、これらの材料およびその分解物が生体適合性であることが示された。これらの材料は、（軟部）組織工学、および生物学的に活性な化合物の制御放出など、生物医学的な用途に非常に最も適している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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