(57)【要約】本発明は、哺乳類樹状細胞の分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害する樹状細胞調節タンパク質を提供する。本発明は、そのようなタンパク質に確認される保存モチーフを含むタンパク質、および樹状細胞調節タンパク質およびその相同体および活性フラグメントを含む医薬組成物、それに対する抗体、およびそのようなタンパク質、相同体、フラグメントおよび抗体を利用する治療の方法も提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞（ＤＣ）調節タンパク質であって、前記タンパク質が哺乳類ＤＣの分化および成熟を調節し、かつ：
ｉ）ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、２５または２８（ＲａＡ）；ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、２６または２９（ＲａＢ）；またはｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、２４または２７（Ｒｓｌ）；のうちいずれか１つのアミノ酸配列；
ｉｉ）ｉ）に定義されるタンパク質と少なくとも４０％の同一性を有するその相同体；または
ｉｉｉ）上記ｉ）に定義されるタンパク質または上記ｉｉ）に定義される相同体の活性フラグメントを含むことを特徴とする前記タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記ＤＣ調節タンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４または６のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質が前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列に対して少なくとも４７％の同一性を有する前記タンパク質。
【請求項４】
請求項１または２に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質が前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列に対して少なくとも５３％の同一性を有する前記タンパク質。
【請求項５】
請求項１または２に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質が前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列に対して少なくとも８１％の同一性を有する前記タンパク質。
【請求項６】
請求項１または２に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって前記タンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、１０、１２、１４、または１６のうちいずれの１つのアミノ酸配列も持たないことを特徴とする前記タンパク質。
【請求項７】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質が１つまたはそれ以上の位置でグリコシル化されることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質が配列Ｃ−（Ｘ）２−Ｗ−（Ｘ）１２−１６−Ｎ−Ｚ−（Ｓ／Ｔ）−（Ｘ）３−５−Ｃを含むグリコシル化部位を含むことを特徴とし、かつＸが任意のアミノ酸でありかつＺがプロリン以外の任意のアミノ酸であることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項９】
請求項８に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質が配列Ｃ−（Ｘ）２−Ｗ−（Ｘ）１２−１６−Ｎ−Ｚ−（Ｓ／Ｔ）−（Ｆ／Ｙ）−（Ｘ）２−４−Ｃを含むグリコシル化部位を含むことを特徴とし、かつＸが任意のアミノ酸でありかつＺがプロリン以外のアミノ酸であることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項１０】
請求項８に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質が配列Ｃ−（Ｘ）２−Ｗ−（Ｘ）７−１１−（Ｉ／Ｌ）−Ｐ−（Ｘ）３−Ｎ−Ｚ−（Ｓ／Ｔ）−（Ｘ）３−５−Ｃを含むグリコシル化部位を含むことを特徴とし、かつＸが任意のアミノ酸でありかつＺがプロリン以外の任意のアミノ酸であることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項１１】
請求項８に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質がグリコシル化部位配列Ｃ−（Ｘ）２−Ｗ−（Ｘ）７−１１−（Ｉ／Ｌ）−Ｐ−（Ｘ）３−Ｎ−Ｚ−（Ｓ／Ｔ）−（Ｆ／Ｙ）−（Ｘ）２−４−Ｃを含むことを特徴とし、かつＸが任意のアミノ酸でありかつＺがプロリン以外の任意のアミノ酸であることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項１２】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質がリポカリンであることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項１３】
請求項１２に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質がシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８２−９１−Ｃ−（Ｘ）２−Ｗ−（Ｘ）１９−２３−Ｃ−（Ｘ）１０−１２−Ｃを含むことを特徴とし、かつＸが任意のアミノ酸であることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項１４】
請求項７〜１３のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質がシステイン分布パターンかつグリコシル化部位配列Ｃ−（Ｘ）８２−９１−Ｃ−（Ｘ）２−Ｗ−（Ｘ）１２−１６−Ｎ−Ｚ−（Ｓ／Ｔ）−（Ｘ）４−Ｃ−（Ｘ）１０−１２−Ｃを含み、かつＸが任意のアミノ酸でありかつＺがプロリン以外の任意のアミノ酸であることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項１５】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質がモチーフＣＸＸＷを含み、かつＸが任意のアミノ酸であることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項１６】
請求項１５に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質がモチーフＣＸＬＷを含み、かつＸが任意のアミノ酸であることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質がモチーフＣＳＬＷまたはＣＥＬＷを含むことを特徴とする前記タンパク質。
【請求項１８】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質が脂質と複合体化されることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項１９】
請求項１８に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記脂質がステロイドまたはステロールであることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項２０】
請求項１８に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記脂質がコレステロール、またはビタミンＤ３またはデキサメタゾンなどのコレステロール代謝物であることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項２１】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質がヒトＤＣ分化および成熟を調節することを特徴とする前記タンパク質。
【請求項２２】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質がＤＣ分化および成熟を阻害することを特徴とする前記タンパク質。
【請求項２３】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、吸血性節足動物から分離される前記タンパク質。
【請求項２４】
請求項２３に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質がマダニから分離されることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項２５】
請求項２４に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記マダニが群イクソデス（Ixodes）、ボトリオクロトニナエ（Bothriocrotoninae）、アンブリヨミナエ（Amblyomminae）、ハエマフィサリナエ（Haemaphysalinae）、リピセファリナエ（Rhipicephalinae）（ヒアロミナエHyalomminaeを含む)、ヌタリエリダエ（Nuttalliellidae）、アルガシナエ（Argasinae）、オトビナエ（Otobinae）、アントリコリナエ（Antricolinae）、ノトホアスピナエ（Nothhoaspinae）およびオルニトドリナエ（Ornithodorinae）より選択されることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項２６】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質がＴリンパ球活性化を阻害することを特徴とする前記タンパク質。
【請求項２７】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質がＴリンパ球分極化を調節することを特徴とする前記タンパク質。
【請求項２８】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質が免疫抑制剤であることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項２９】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、ＤＣの外膜上に存在する受容体と結合する前記タンパク質。
【請求項３０】
請求項２９に記載の前記ＤＣ調節タンパク質であって、Ｃ型レクチン受容体と結合する前記タンパク質。
【請求項３１】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載のＤＣタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項３２】
請求項３１に記載の前記核酸分子であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１、３、または５のうちいずれか１つを含む前記核酸分子。
【請求項３３】
請求項３１または３２に記載の核酸分子と高厳格性ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子。
【請求項３４】
請求項３１〜３３のうちいずれか１つに記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載の前記ベクターまたは請求項３１〜３３のうちいずれか１つに記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項３６】
請求項１〜３０のうちいずれか１つに記載のＤＣ調節タンパク質を調製する方法であって、請求項３５に記載の宿主細胞をそれにより前記タンパク質が発現される条件下で培養すること、およびそのように生成された前記タンパク質を回収することを含む前記方法。
【請求項３７】
請求項１〜３０のうちいずれか１つに記載の、前記ＤＣ調節タンパク質と結合する抗体。
【請求項３８】
ＤＣを調節する方法であって、前記ＤＣを請求項１〜３０のうちいずれか１つに記載のＤＣ調節タンパク質、請求項３１〜３３のうちいずれか１つに記載の前記核酸、請求項３４に記載の前記ベクター、請求項３５に記載の前記宿主細胞または請求項３７に記載の前記抗体と接触させることを含む前記方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の前記方法を用いて生成された調節ＤＣ。
【請求項４０】
請求項１〜３０のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質、請求項３１〜３３のうちいずれか１つに記載の前記核酸、請求項３４に記載の前記ベクター、請求項３５に記載の前記宿主細胞または請求項３７に記載の前記抗体または請求項３９に記載の前記ＤＣおよび医薬品として許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項４１】
請求項４０に記載の前記医薬組成物であって、１つまたはそれ以上の追加的治療薬をさらに含む前記医薬組成物。
【請求項４２】
請求項４１に記載の前記医薬組成物であって、前記の１つまたはそれ以上の追加的治療薬が抗炎症剤、免疫調節剤、免疫抑制剤、サイトカイン、サイトカイン模倣またはサイトカイン結合タンパク質を含むことを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項４３】
請求項４０〜４２のうちいずれか１つに記載の前記医薬組成物であって、前記の１つまたはそれ以上の治療薬が疾患関連要素を含む前記医薬組成物。
【請求項４４】
治療における使用を目的とした請求項１〜３０のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質、請求項３１〜３３のうちいずれか１つに記載の前記核酸、請求項３４に記載の前記ベクター、請求項３５に記載の前記宿主細胞、請求項３７に記載の前記抗体、請求項３９に記載の前記ＤＣまたは請求項４０〜４３のうちいずれか１つに記載の前記医薬組成物。
【請求項４５】
自己免疫疾患、移植片拒絶などの移植片反応、急性および慢性炎症性疾患、アレルギーまたは過敏症などの他の免疫関連過敏症の治療または予防における使用を目的とした請求項１〜３０のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質、請求項３１〜３３のうちいずれか１つに記載の前記核酸、請求項３４に記載の前記ベクター、請求項３５に記載の前記宿主細胞、請求項３７に記載の前記抗体請求項３９に記載の前記ＤＣまたは請求項４０〜４３のうちいずれか１つに記載の前記医薬組成物。
【請求項４６】
マダニ媒介性疾患を含む感染症の治療または予防における使用を目的とした請求項１〜３０のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質、請求項３１〜３３のうちいずれか１つに記載の前記核酸、請求項３４に記載の前記ベクター、請求項３５に記載の前記宿主細胞、請求項３７に記載の前記抗体、請求項３９に記載の前記ＤＣまたは請求項４０〜４３のうちいずれか１つに記載の前記医薬組成物。
【請求項４７】
癌の治療または予防における使用を目的とした請求項１〜３０のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質、請求項３１〜３３のうちいずれか１つに記載の前記核酸、請求項３４に記載の前記ベクター、請求項３５に記載の前記宿主細胞、請求項３７に記載の前記抗体、請求項３９に記載の前記ＤＣまたは請求項４０〜４３のうちいずれか１つに記載の前記医薬組成物。
【請求項４８】
自己免疫疾患、移植片拒絶などの移植片反応、急性および慢性炎症性疾患、アレルギーまたは過敏症などの他の免疫関連過敏症を患う動物を治療する方法であって、前記動物に対して請求項１〜３０のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質、請求項３１〜３３のうちいずれか１つに記載の前記核酸、請求項３４に記載の前記ベクター、請求項３５に記載の前記宿主細胞、請求項３７に記載の前記抗体、請求項３９に記載の前記ＤＣまたは請求項４０〜４３のうちいずれか１つに記載の前記医薬組成物を医薬品として有効な量で投与することを含む前記方法。
【請求項４９】
マダニ媒介性疾患を含む感染症を患う動物を治療する方法であって、前記動物に対して請求項１〜３０のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質、請求項３１〜３３のうちいずれか１つに記載の前記核酸、請求項３４に記載の前記ベクター、請求項３５に記載の前記宿主細胞、請求項３７に記載の前記抗体、請求項３９に記載の前記ＤＣまたは請求項４０〜４３のうちいずれか１つに記載の前記医薬組成物を医薬品として有効な量で投与することを含む前記方法。
【請求項５０】
癌を患う動物を治療する方法であって前記動物に対して請求項１〜３０のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質、請求項３１〜３３のうちいずれか１つに記載の前記核酸、請求項３４に記載の前記ベクター、請求項３５に記載の前記宿主細胞、請求項３７に記載の前記抗体、請求項３９に記載の前記ＤＣまたは請求項４０〜４３のうちいずれか１つに記載の前記医薬組成物を医薬品として有効な量で投与することを含む前記方法。
【請求項５１】
請求項４８〜５０のうちいずれか１つに記載の前記方法または請求項４４〜４７のうちいずれか１つに記載の前記ＤＣ調節タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体、ＤＣまたは医薬組成物であって、前記ＤＣ調節タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体、ＤＣまたは医薬組成物が疾患関連要素と組み合わせて投与されることを特徴とする前記方法、ＤＣ調節タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体、ＤＣまたは医薬組成物。
【請求項５２】
請求項５１に記載の前記方法、または請求項５１に記載の前記ＤＣ調節タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体ＤＣまたは医薬組成物であって、前記疾患関連因子が：感染因子；アレルゲン；アレルギー以外の過敏性反応と関連する非自己成分；自己免疫疾患に関連する自己成分；移植抗原；血液型抗原；および腫瘍抗原から選択されることを特徴とする前記方法、ＤＣ調節タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体、ＤＣまたは医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は樹状細胞（ＤＣ）調節タンパク質に関する。具体的には、本発明は哺乳類ＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害するタンパク質、およびその構造および機能にとって重要でありうるそのようなタンパク質のモチーフおよび形質の同定に関する。そのようなタンパク質は節足動物の唾液、およびより具体的にはマダニの唾液より分離することができる。本発明は、そのようなタンパク質の治療における使用、および具体的には自己免疫疾患、アレルギー、自己炎症疾患および過敏性疾患としても知られるその他の免疫関連過敏症、移植片拒絶および移植片対宿主疾患などの移植片反応、マダニが媒介するものを含む感染症、血液悪性腫瘍を含む癌、および前述の疾患と関連する炎症を含む急性および慢性炎症性疾患を治療する際のそのようなタンパク質の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類、および具体的にはヒトの免疫系は２種類の部分、先天免疫系および適応免疫系より構成される。先天免疫系の細胞は、感染因子を包括的に認識し、かつこれに応答する。先天免疫系は感染に対する生体の直接的障壁であるものの、侵入する病原体などの異物に対する特異的で長期持続的な防御を付与しない。対照的に、適応免疫系の細胞は特異的異物を認識し、かつ宿主におけるこれらの特異的実体についての免疫的記憶を誘導する。
【０００３】
ＤＣは、病原体による感染の直後に先天免疫系の構成要素と相互作用し、かつ哺乳類の適応免疫応答の中心的構成要素を形成する。ＤＣは前駆細胞から幼若ＤＣに分化する。幼若ＤＣは全身に存在し、かつ、免疫系の他の細胞もこの役割に参加するものの、主としてＴ細胞活性化を引き起こすその能力により適応免疫応答の開始を担う主要な細胞種である。
【０００４】
幼若ＤＣは、病原体表面上など異物上にある特異的な化学シグナルを認識するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）といったパターン認識受容体（ＰＲＲ）により、周囲環境のウイルス、細菌および寄生虫などの感染因子を絶えずサンプリングする。一旦病原体などの実体が異物として特定されると、幼若ＤＣはその実体またはそのフラグメントを内部化し、さらにタンパク質および脂質抗原をペプチドおよび糖ペプチドまたは脂質フラグメントに分解し、これをＤＣの表面に提示する。
【０００５】
幼若ＤＣは、異物の認識および／または細胞の環境内部のシグナル（例：炎症サイトカインなど）に応答し、集合的に「成熟」と呼ばれるいくつかの変化を受け、さらに成熟ＤＣへの発育を開始する。成熟するＤＣは、異物由来のペプチドおよび糖ペプチド、および脂質または糖脂質とそれぞれ結合する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）およびＣＤ１などのＭＨＣ関連分子の発現をアップレギュレートし、かつそれらをＤＣの表面に提示させる。同時にＤＣは、Ｔリンパ球活性化の補助受容体として作用するＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０を含む共刺激分子と呼ばれる細胞表面受容体の発現をアップレギュレートする。さらにＤＣは、化学走性シグナルに従ってリンパ節および／または脾臓などのリンパ系組織への移動を開始する。ＤＣは、リンパ節内にあれば異物由来のペプチドおよび糖ペプチドまたは脂質フラグメントをＴリンパ球に提示し、かつ適切な共刺激シグナルを送達することによりそれらを活性化する。そのような活性化Ｔリンパ球は適応免疫応答の伝播を担う。異物は病原体、アレルゲン、主要移植片抗原または非主要移植抗原（minor transplant antigen ）などの移植抗原、血液型抗原、または、自己免疫応答の場合は身体によって誤って異物と認識される自己抗原であり得る。
【０００６】
成熟ＤＣは、抗原提示および共刺激によってＴ細胞の活性化を引き起こす役割を有するのみならず、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１，Ｔｈ２，Ｔｈｌ７，または免疫調節（Ｔｒｅｇ）細胞への分極化、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化、およびＴ細胞のたとえば皮膚または腸および他の粘膜部位へのホーミングの調節などのＴ細胞制御に関与する。
【０００７】
ＤＣが適応免疫応答において果たす中心的な役割は、治療を目的としたＤＣ機能の調節に対する関心につながり、かつＤＣ調節物質は自己免疫疾患および他の炎症性疾患の治療において有用となり得るという動物モデルからの指摘がある（Subklewe et al, Human Immunology, 2007, 68(3), 147-155）。ＤＣ調節物質は癌の治療において有用となり得ることも示唆されている（Banchereau, J.et al, Ann N Y Acad Sci, 2003, 987, 180-187およびFigdor, C. G. et al, Nature medicine, 2004, 10(5), 475-480）。
【０００８】
マダニおよび他のいくつかの吸血性節足動物は、ヒトなどの哺乳類を含むその宿主に付着し、長時間にわたって摂食する。吸血性動物が宿主に送達する、唾液の成分を含む成分は、宿主の免疫応答を誘発する可能性がある。そのような応答は節足動物にとって有害となり得るので、節足動物はそれらの抑制を必要としうる。免疫の開始におけるＤＣの中心的役割からすると、その機能を阻害するタンパク質を生成することは節足動物にとって有利となり得る。
【０００９】
吸血性節足動物、および具体的にはマダニは、多様な抗炎症性および免疫調節性成分を宿主に接種することによって宿主の免疫系を阻害しうる（Ribeiro et al, Infectious Agents and Disease, 1992, 4(3), 143-152）。
【００１０】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の相同体（Jaworski et al, Insect Molecular Biology, 2001, 10(4), 323-331）、ヒトマクロファージ、単球および好中球より分泌される白血球エラスターゼ阻害物質の相同体（Leboulle et al, The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277 (12), 10083-10089）、マウス脾臓細胞のマイトジェン発動インビトロ増殖を抑制すると考えられている糖化タンパク質ｐ３６（Bergman et al, Journal of Parasitology, 2000, 86, 516-525）、Ｂ細胞阻害タンパク質（ＢＩＰ）（Hannier et al, Immunology, 2004, 113, 401-408）、およびＢ細胞阻害因子（（ＢＩＦ）（Yu et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 343, 585-590）などを含むマダニ唾液中の免疫調節分子がいくつか同定されている。
【００１１】
Ｓａｌｐｌ５はマダニの唾液に存在し、幼若ヒトＤＣに作用することが確認されている（Anguita et al,Immunity,2002,16,849-859およびHovius et al, Vector borne and Zoonotic diseases, 2007, 7(3),296-302）。しかし、免疫刺激存在下での幼若ヒトＤＣとＳａｌｐｌ５のインキュベーションを包含する分析法により、Ｓａｌｐｌ５は共刺激分子（例：ＣＤ８６など）のアップレギュレーションを阻害しないことが示されている。したがって、Ｓａｌｐｌ５はヒトＤＣの成熟を阻害しない。
【００１２】
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、幼若マウスＤＣの活性を調節しうるマダニ唾液中に存在する非タンパク分子であるが、これらのマウスＤＣの成熟に対し最小限の効果を有する（Sa-Nunes et al, The Journal of Immunology, 2007, 179, 1497-1505）。ＰＧＥ２はヒトＤＣの成熟を促進することができるが、ヒトＤＣの分化および成熟を阻害するよう作用することができるというエビデンスはない。
【００１３】
マダニの唾液および唾液腺抽出物（ＳＧＥ）はマウスＤＣの分化および成熟を調節する能力を有することも示唆されている（Cavassani et al, Immunology, 2005, 114, 235-245、およびSkallova et al, Journal of Immunology, 2008, 180, 6186-6192）。
【００１４】
マダニ（リピセファルス・アペンジクラツス：Rhipicephalus appendiculatus）よりＤＣ調節分子が分離されており、かつ哺乳類ＤＣの分化および成熟を調節することが示されている（国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００２２１９明細書）。具体的には、この分子はＤＣへの分化のシグネチャであるＣＤ１ａのアップレギュレーションおよびＣＤ１４のダウンレギュレーションを阻害することにより分化培養の発育を変化させ、かつＴ細胞の増殖を阻害することが示されている。この分子はジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）と呼ばれ、またわずかな数のジャパニン相同体も他のマダニ種より同定されている（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、１２、１４および１６）。治療を目的としたＤＣ調節物質として作用するジャパニンの相同体をさらに同定することは有益であろう。そのようなＤＣ調節タンパク質の機能を担うその重要モチーフおよび形質を同定することも有益であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開番号第８４／０３５６４号
【特許文献２】国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００２２１９明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Anguita, J., Ramamoorthi, N., Hovius, J.,Das, S., Thomas, V., Persinski, R., Conze, D., Askenase, P., Rincon, M., Kantor, F., Fikrig, E. (2002) Salpl5, an Ixodes scapularis salivary protein inhibits CD4+ T cell activation Immunity 16, 849-859.
【非特許文献２】Banchereau, J. et. al. Ann N Y Acad Sci, 2003, 987, 180-187.
【非特許文献３】Bergman, D., Palmer, M, Caimano, M, Radolf, J., Wikel, S. (2000) Isolation and molecular cloning of a secreted immunosuppressant protein from Dermacentor andersoni salivary Gland The Journal of Parasitology 86(3), 516-525.
【非特許文献４】Cavassani, K., Aliberti, J., Dias, A., Silva, J., Ferreira, B. (2005) Tick saliva inhibits differentiation, maturation and function of murine bone-marrow-derived dendritic cells Immunology 114, 235 - 245.
【非特許文献５】コリガン他、『最新免疫学プロトコル１（２）』第５章（１９９１年）
【非特許文献６】Figdor, C.G. et al. Nature medicine, 2004, 10 (5), 475-480.
【非特許文献７】Hannier, S., Liversidge, J., Sternberg, J., Bowman, A. (2004) Characterisation of the B-cell inhibitory protein factor in Ixodes ricinus tick saliva: a potential role in enhanced Borrelia burgdoferi transmission Immunology 1 13, 401-408.
【非特許文献８】Hovius, J., Ramamoorthi, N., Veer, C, Groot, K., Nijhof, A., Jongejan, F., Dam, A., Fikrig, E. (2007) Identification of Salpl5 homologues in Ixodes ricinus ticks Vector-bourne and Zoonotic Diseases 7(3), 296 - 302.
【非特許文献９】Jaworski, D., Jasinskas, A., Metz, C, Bucala, R., Barbour, A. (2001) Identification and characterisation of a homologue of the pro-inflammatory cytokine Macrophage Migration Inhibitory Factor in the tick, Amblyomma americanum Insect Molecular Biology 10(4), 323-331.
【非特許文献１０】Leboulle, G., Crippa, M., Decrem, Y., Mejri, N., Brossard, M., Bollen, A., Godfroid, E. (2002) Characterization of novel salivary immunosuppressive protein from Ixodes ricinus ticks The Journal of Biological Chemistry 88(12), 10083-10089.
【非特許文献１１】Ribeiro J.M.C. (1995) Blood-feeding arthropods: live syringes or invertebrate pharmacologists? Infectious Agents & Disease 4, 143-152.
【非特許文献１２】Ｊ．サンブルック他（2000年）分子クローニング：実験マニュアル  コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、ニューヨーク
【非特許文献１３】Sa-Nunes, A., Bafica, A., Lucas, D., Conrads, T., Veenstra, T., Andersen, J., Mather, T., Ribeiro, J., Francischetti, I. (2007) Prostaglandin E2 is a major inhibitor of dendritic cell maturation and function in Ixodes scapularis saliva The journal of Immunology 179, 1497-1505.
【非特許文献１４】Skallova, A., Iezzi, G., Ampenberger, F., Kopf, M., Kopecky, J. (2008) Tick saliva inhibits dendritic cell migration, maturation, and function while promoting development of Th2 responses Journal of Immunology 180, 6186-6192.
【非特許文献１５】Subklewe, N., Sebelin-Wulf, K., Beier, C, Lietz, A., Mathas, S., Dorken, B., Pezzutto, A. (2007) Dendritic cell maturation stage determines susceptibility to the proteasome inhibitor bortezomib. Human Immunology 68(3), 147-155.
【非特許文献１６】Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680.
【非特許文献１７】Yu, D., Liang, J., Yu, H., Wu, H, Xu, C, Lu, J., Lai, R. (2006) A tick B-cell inhibitory protein from salivary glands of the hard tick, Hyalomma asiaticum asiaticum Biochemical and Biophysical research communications 343, 585-590.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
驚くべきことに、発明者らは、ジャパニンと相同であり、機能を保持していることが示唆されるさらなるマダニタンパク質を現在数多く同定している。これらのタンパク質の同定により、発明者らは、ＤＣ調節におけるその機能にとって重要となり得るＤＣ調節タンパク質のモチーフおよび形質を判定することができている。
【００１８】
したがって本発明は、ＤＣ調節タンパク質が哺乳類ＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害し、かつ好ましくは、数多くのそのようなタンパク質に共通して同定され、かつそのようなタンパク質の機能にとって重要であると考えられている数多くの保存モチーフおよび形質のうち少なくとも１つを含むことを特徴とする前記タンパク質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明のタンパク質）
第１の態様において本発明は、ＤＣ調節タンパク質であって、前記タンパク質がＤＣ分化および／または成熟を調節し、かつ：
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＲａＡ）、４（ＲａＢ）または６（Ｒｓｌ）のうちいずれか１つのアミノ酸配列；
ｉｉ）ｉ）に定義されるところのタンパク質と少なくとも２０％の同一性を有するその相同体；または
ｉｉｉ）上記ｉ）に定義されるタンパク質または上記ｉｉ）に定義される相同体の活性フラグメントを含むことを特徴とする前記タンパク質を含む。
【００２０】
さらなる態様において本発明は、樹状細胞（ＤＣ）調節タンパク質であって、前記タンパク質が哺乳類ＤＣの分化および成熟を調節し、かつ：
ｉ）ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、２５または２８（ＲａＡ）；ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、２６または２９（ＲａＢ）；またはｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、２４または２７（Ｒｓｌ）のうちいずれか１つのアミノ酸配列；
ｉｉ）ｉ）に定義されるところのタンパク質と少なくとも４０％の同一性を有するその相同体；または
ｉｉｉ）上記ｉ）に定義されるタンパク質または上記ｉｉ）に定義される相同体の活性フラグメントを含むことを特徴とする前記タンパク質を提供する。
【００２１】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質はａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、２５または２８（ＲａＡ）；ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、２６または２９（ＲａＢ）；またはｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、２４または２７（Ｒｓｌ）のうちいずれか１つのアミノ酸配列から構成されうる。１つの実施形態においては、本発明のタンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，４または６のうちいずれか１つのアミノ酸配列から構成されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＲａＡのＤＮＡおよびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２）を示す。
【図２】ＲａＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）との配列比較を示す。ＲａＡとジャパニンの配列比較は、以下のオプションによるｃｌｕｓｔａｌＷを用いて得られた：ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．１；ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．０；ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ＝ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ；ｍａｔｒｉｘ＝ｇｏｎｎｅｔ。配列を形成する１３１残基のうち、６１残基（４６．５６％）は同一［＊で示す］、２６残基（１９．８５％）は強い類似［：］および（２２残基）１６．７９％は弱い類似［．］である。
【図３】ＲａＢのＤＮＡおよびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４）を示す。
【図４】ＲａＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）との配列比較を示す。ＲａＢとジャパニンの配列比較は以下のオプションによるｃｌｕｓｔａｌＷを用いて得られた：ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．１；ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．０；ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ＝ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ；ｍａｔｒｉｘ＝ｇｏｎｎｅｔ。配列を形成する１３８残基のうち、７３残基（５２．９％）は同一［＊で示す］、３０残基（２１．７４％）は強い類似［：］および１２残基（８．７％）は弱い類似［．］である。
【図５】ＲｓｌのＤＮＡおよびアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および６）を示す。
【図６】Ｒｓｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）のジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）との配列比較を示す。Ｒｓｌとジャパニンの配列比較は、以下のオプションによるｃｌｕｓｔａｌＷを用いて得られた：ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．１；ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．０；ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ＝ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ；ｍａｔｒｉｘ＝ｇｏｎｎｅｔ。配列を形成する１３１残基のうち、１０５残基（８０．１５％）は同一［＊で示す］、１２残基（９．１６％）は強い類似［：］および７残基（５．３４％）は弱い類似［．］である。
【図７】ＲａＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）とＲａＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、Ｒｓｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）の配列比較を示し、かつ保存モチーフと形質の位置を表示する。ＣＸＸＷモチーフはイタリックで示し、保存システイン残基は太字で示し、またグリコシル化部位含有配列のアスパラギン残基にはアンダーラインを付した。以下のオプションを用いた：ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．２；ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．０；ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ＝ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ；ｍａｔｒｉｘ＝ｇｏｎｎｅｔ．
【図８】ＲａＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）とＲａＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、Ｒｓｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の配列比較を示し、かつ保存モチーフと形質の位置を示す。ＣＸＸＷモチーフはイタリックで示し、保存システイン残基は太字で示し、またグリコシル化部位含有配列のアスパラギン残基にはアンダーラインを付した。以下のオプションを用いた：ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．２；ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．０；ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ＝ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ；ｍａｔｒｉｘ＝ｇｏｎｎｅｔ．
【図９】Ｒｓ、ＲａＡおよびＲａＢがＣＨＯトランスフェクタント上清中に存在することを示す。
【図１０Ａ】ＬＰＳで処理されていない樹状細胞におけるＣＤ８６発現に対するＲｓｌ、ＲａＡおよびＲａＢトランスフェクタント上清の効果を示す。
【図１０Ｂ】Ｒｓｌ、ＲａＡおよびＲａＢトランスフェクタント上清がＬＰＳ処理樹状細胞においてＣＤ８６を阻害することを示す。
【図１１】ＬＰＳ処理樹状細胞におけるＲｓｌ、ＲａＡおよびＲａＢトランスフェクタント上清に応答するＢ７−Ｈ１アップレギュレーションの促進を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（本発明のタンパク質の活性）
本発明のタンパク質は、哺乳類ＤＣの分化および／または成熟を「調節」すなわち変化させるか、または「阻害」すなわち減少させる。一部の実施形態においては、本発明のタンパク質は、哺乳類ＤＣの分化および成熟の両方を「調節」すなわち変化させるか、または「阻害」すなわち減少させる。１つの実施形態においては、これらはヒトＤＣでありうる。さらなる実施形態においては、本発明のタンパク質は哺乳類ＤＣと同様に爬虫類および／または魚類ＤＣの分化および／または成熟をさらに調節または阻害しうる。ＤＣ分化および成熟の調節または阻害を評価するための適切な分析法は以下に記載される。分化および成熟の調節または阻害の評価を目的とした本明細書に記載のマーカーは例示によってのみ提供され、制限的であることを意図しないことは、当業者にとって明白となるであろう。１つの実施形態においては、本発明のタンパク質はＤＣ分化および成熟の両方を、たとえば以下の分析法によって測定するとき少なくとも２０％低下させる。さらなる実施形態においては、ＤＣ分化および／または成熟の阻害は３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上でありうる。
【００２４】
「ＤＣ分化」が意味するのは、骨髄由来始原細胞または血液単球などの細胞前駆体の幼若ＤＣへの発育である。ＤＣ分化の調節、たとえば阻害は、技術上周知である標準的な分析法を用いて表現型により、また最終的には機能により評価することができる。これらは、ＤＣ分化時に制御されるＣＤ１４およびＣＤ１ａ発現の評価を含む。ＤＣ分化の阻害を評価するためのさらなる方法は当業者に周知となるであろう。
【００２５】
前駆細胞から幼若ＤＣへの表現型分化の阻害は、前駆細胞が幼若ＤＣに分化するにつれてその発現が変化する細胞マーカーを用いて評価することができる。たとえば、単球はＣＤ１４陽性かつＣＤ１ａ陰性であるＤＣ前駆細胞である。幼若ＤＣはＣＤ１４が低く、また一部の実施形態においてはＣＤ１４陰性であり、かつＣＤ１ａ陽性である。したがって、単球の幼若ＤＣへの分化はＣＤ１４の低下およびＣＤ１ａの上昇によって検出しうる。本発明のタンパク質による前駆細胞から幼若ＤＣへの分化の阻害は、高ＣＤ１４であり、および一部の実施形態においてはＣＤ１４陽性かつＣＤ１ａ陰性である前駆細胞の存在の持続的によって検出しうる。
【００２６】
前駆細胞および発育したＤＣの機能分化は、前駆細胞と分化ＤＣをその活性に基づいて識別する任意の分析法を用いて評価することができる。たとえば発育したＤＣは、前駆細胞とは異なり、具体的には以下に記載するような刺激の後はインビトロ分析法においてＴ細胞の増殖を引き起こすことができる。典型的なＴ細胞増殖分析法は同種異系混合白血球反応（ＭＬＲ）および酸化的有糸分裂誘発を含む。
【００２７】
「ＤＣ成熟」が意味するのは、前駆細胞が幼若ＤＣに分化した後に起こるプロセスである。具体的には、この用語は分化した幼若ＤＣが刺激と遭遇し、かつ成熟ＤＣに変換される際に生じる変化に関連する。刺激は、ＴＬＲなどのＲＲＲを介して感知される病原体などの感染因子、サイトカイン受容体を経て作用するある種のサイトカイン、および／または活性化Ｔ細胞のＣＤ１５４などのような他の細胞種の特化した細胞表面分子などでありうる。幼若ＤＣの成熟に関連した変化は、たとえばＣＤ８０およびＣＤ８６などの共刺激分子の発現のアップレギュレーション、および病原体由来成分に由来する抗原のＤＣ表面への、典型的にはペプチド−ＭＨＣおよび脂質ＣＤ１−の複合体としての提示を典型的に含む。幼若ＤＣの成熟は、ＤＣの二次的リンパ系組織への遊走と関連しうる。
【００２８】
本発明のタンパク質は、幼若ＤＣの成熟と関連したこれらの変化のうちのいずれかを調節または阻害するよう作用する。したがって、本発明の分子が幼若ＤＣの成熟を阻害する能力は、ＣＤ８６および／またはＣＤ８０および／またはＭＨＣ分子の発現を低下させるその能力によって評価しうる。本発明のタンパク質が幼若ＤＣの成熟を阻害する能力は、ＴＮＦαの発現および／または分泌を低下させるその能力によって評価しうる。本発明のタンパク質がＤＣの成熟を調節する能力は、Ｂ７ホモログ１（Ｂ７−ＨまたはＣＤ２７４）の発現レベルを低下させるその能力によって評価しうる。本発明のタンパク質がＤＣの成熟を阻害する能力は、任意にポリ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳまたはＩＦＮγ刺激後に評価しうる。本発明のタンパク質がＤＣの成熟を阻害する能力は、任意にＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮαまたはＴＬＲ７またはＴＬＲ８リガンド（例：ＣＬ０９７など）の刺激後に評価しうる。幼若ＤＣの分化の阻害を評価するためのさらなる方法は当業者に周知となるであろう。
【００２９】
上述のように、本発明のタンパク質は前駆細胞の幼若ＤＣへの分化を調節、および好ましくは阻害し、およびその後の幼若ＤＣから成熟ＤＣへの成熟を調節、および好ましくは阻害するよう作用する。分化および成熟の両方のそのような調節または阻害は、以下に詳細に記載するように、免疫系全体に対して下流調節効果を有する可能性がある。
【００３０】
Ｔリンパ球は、抗原提示細胞による活性化を受ける前は「ナイーブ」と呼ばれる。各Ｔリンパ球は特定の１抗原に対して特異的であり，この同族抗原を提示するＤＣなどの「特化した」抗原提示細胞によってのみ活性化することができる。通常のＴリンパ球は、αおよびβ鎖を含むヘテロ二量体構造であるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により抗原−ＭＨＣ複合体を認識する。しかし共刺激非存在下においては、ＴＣＲを経たシグナリングは抗原不応答状態またはアネルギー、または活性化不全および細胞死をもたらす。したがって、成熟プロセスの間に幼若ＤＣの表面でアップレギュレートされ、かつＴリンパ球表面のＣＤ２８（ＣＤ８０およびＣＤ８６の場合）またはＣＤ１５４（ＣＤ４０の場合）などの受容体分子によって認識される共刺激分子は、Ｔリンパ球の活性化にとって不可欠である。
【００３１】
本発明の１つの態様においては、本発明のタンパク質によって提供されるＤＣ分化および／または成熟の阻害は、Ｔリンパ球活性化の低下をもたらす。「Ｔリンパ球活性化」が意味するのは、Ｔｈ１，Ｔｈ２，Ｔｈｌ７またはＴｒｅｇ細胞を含むヘルパーＴ細胞の活性化、および任意に、事前のヘルパーＴ細胞活性化に依存することの多い細胞傷害性Ｔ細胞の活性化である。
【００３２】
Ｔ細胞活性化の低下は技術上周知の方法によって評価しうる。一例としてかつ制限としてではなく、Ｔ細胞活性化はサイトカイン分泌［例：インターロイキン（ＩＬ）−２生成］またはＤＣによって引き起こされるＴ細胞増殖（例：同種異系ＭＬＲまたは酸化的有糸分裂促進）のインビトロ分析法によっても、または抗原再刺激の前後にエクスビボで分離されたＴ細胞に対する同様の分析法を用いた正常またはトランスジェニック動物におけるモデル抗原（例：卵白アルブミン）に対するＴ細胞応答のインビボ分析法によっても評価しうる。
【００３３】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、ＤＣ分化および／または成熟阻害タンパク質の非存在下における標準的分析法と比較してＴリンパ球活性化を少なくとも約２０％減少させるであろう。さらなる実施形態においては、ＤＣの分化および成熟の阻害はＴリンパ球活性化を少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減少しうる。
【００３４】
本発明の１つの態様においては、本発明のタンパク質によりもたらされるＤＣ分化および／または成熟の調節または阻害は、Ｔリンパ球制御の調節をもたらす。具体的には、本発明のタンパク質はＴリンパ球のＴｈ１対Ｔｈ２対Ｔｈｌ７対調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）または濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｈｆ）への分極を調節しうる。本発明のタンパク質によるＴリンパ球分極の調節は、インビトロ分析法において各種類のＣＤ４およびＣＤ８  Ｔリンパ球と典型的に関連するＴリンパ球由来サイトカインを測定することにより評価しうる。これらは、Ｔｈｌ細胞についてはＩＦＮ−γを含み；Ｔｈ２細胞についてはＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３；Ｔｈｌ７細胞についてはＩＬ−１７；およびＴｒｅｇ細胞についてはＩＬ−１０およびＴＧＦβを含む。ＣＤ４細胞の各種類も、それぞれＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＲＯＲ−γ−ｔまたはＲＯＲ−γ−ｃおよびＦｏｘＰ３の発現を測定することにより、またはＴｈｆ細胞についてはＢｃｌ６の発現を測定することにより分析することができる。代替的に、各細胞の表現型は、たとえば細胞が発現するケモカイン受容体および他の表現型マーカーなどによって表現型的に評価することができる。
【００３５】
Ｔリンパ球は、哺乳類の免疫応答の主要な推進役の１つである。したがって、本発明のタンパク質によるＴリンパ球の活性化の低下またはそのようなＴリンパ球の分極の変化は、上述のように、免疫応答の全体的な調節、かつ具体的には免疫応答に関連するサイトカインのレベルの変化をもたらす。たとえば、本発明のタンパク質は全般的な免疫抑制効果を有しうる。
【００３６】
免疫抑制効果などの免疫応答における調節は、技術上周知である多様な方法のうち任意の１つを用いて測定することができることは、当業者にとって明らかとなるであろう。全般的な免疫応答の低下、または調節は、たとえばインターロイキン−１および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロン−α、インターフェロン−βなどのＴＬＲ刺激に応答して最も迅速に生成される炎症誘発性サイトカイン、またはＩＬ−６またはＩＬ−１２などの感染後の中間的な時間において典型的に生成されるサイトカインのレベルの低下を探求することによって測定することができる。本発明のタンパク質は、たとえばＩＬ−１０またはＴＧＦ−βなどの抗炎症制サイトカインのレベルの上昇にもつながりうる。
【００３７】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、ＤＣ分化および／または成熟阻害タンパク質の非存在下における標準的分析法と比較して、少なくとも約２０％炎症誘発性サイトカインのレベルを減少させるか、または抗炎症性サイトカインのレベルを上昇させるであろう。さらなる実施形態においては、ＤＣの分化および／または成熟の阻害は、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上炎症誘発性サイトカインのレベルを減少させるか、または抗炎症性サイトカインのレベルを上昇しうる。
【００３８】
免疫抑制効果は、たとえば炎症の限局的減少または生成された抗原特異性ＴおよびＢ細胞プールのサイズまたは活動性の減少などの他の多様な方法によって評価してもよい。
【００３９】
（本発明のタンパク質を分離することのできる節足動物）
本発明のタンパク質は節足動物より分離しうる。「節足動物」は、節足動物門に属する動物と定義され、かつ昆虫類、甲殻類およびクモ類を含む。節足動物は、分節化した身体およびキチンから作られる硬い外骨格によって特徴付けられる。
【００４０】
本発明の１つの態様においては、本発明のタンパク質は吸血性節足動物から分離しうる。用語「吸血性節足動物」は、適切な宿主より血液を摂取するすべての節足動物を含む。これはマダニ、コダニ、およびシラミ、ノミおよびカなどの昆虫を含む。それらは一般的に血液摂取節足動物と呼ばれ、本明細書を通じて互換的に用いられるであろう。
【００４１】
本発明のさらなる態様においては、分離された吸血性節足動物はマダニでありうる。用語「マダニ」は、吸血性節足動物に含まれるマダニ上科の小型のクモ類に与えられる一般名である。マダニは外部寄生虫であり、哺乳類、鳥類および爬虫類の血液を主食とする。マダニは両生類の血液も主食としうる。
【００４２】
全世界で確認されるマダニは約９００種ある。各マダニ種はその優先環境およびその地理的分布によって特徴付けられる。マダニ種の大半はヒトを含む多様な宿主種から摂食することができる。上述のように、節足動物、および特にマダニは、宿主に多様な抗炎症性および免疫調節性成分を接種することによって宿主の免疫系を阻害しうる。
【００４３】
本発明のＤＣ調節タンパク質は、イクソジナエ属（Ixodinae）、ボトリオクロトニナエ属（Bothriocrotoninae）、アンブリヨミナエ属（Amblyomminae）、ハエマフィサリナエ属（Haemaphysalinae）、リフィセファリナエ属（Rhipicephalinae）、ヒアロミナエ属（Hyalomminae）、ヌタリエリダエ属（Nuttalliellidae）、アルガシナエ属（Argasinae）、オトビナエ属（Otobinae）、アントリコリナエ属（Antricolinae）、ノトアスピナエ属（Nothoaspinae）およびオルニトドリナエ属（Ornithodorinae）の群の種、たとえば以下のマダニ種：リピセファルス・アペンジヅラクラツス（rhipicephalus appendiculatus）、リピセファルス・サンギネウス（Rhipicephalus sanguineus）、リピセファルス・ブルサ（Rhipicephalus bursa）、アンブリヨマ・アメリカヌム（Amblyomma americanum）、アンブリヨマ・カジェネンセ（Amblyomma cajennense）、アンブリヨマ・ヘブラエウム（Amblyomma hebraeum）、アンブリヨマ・バリエガツム（Amblyomma variegatum）、リピセファルス・（ボーフィルス）・ミクロプルス（Rhipicephalus (Boophilus) microplus、リピセファルス・(ボーフィルス)・アヌラツス（Rhipicephalus (Boophilus) annulatus、リピセファルス・（ボーフィルス）・デコロラツス（Rhipicephalus (Boophilus) decoloratus）、デルマセントル・レチクラツス（Dermacentor reticulatus）、デルマセントル・アンデルソニ（Dermacentor andersoni）、デルマセントル・マルギナツス（Dermacentor marginatus）、デルマセントル・バリアビリス（Dermacentor variabilis）、ハエマフィサリス・イネルミス（Haemaphysalis inermis）、ハエマフィサリス・レアキー（Haemaphysalis leachii）、ハエマフィサリス・プンクタタ（Haemaphysalis punctata）、ヒアロマ・アナトリクム・アナトリクム（Hyalomma anatolicum anatolicum）、ヒアロマ・ドロメダリー（Hyalomma dromedarii）、ヒアロマ・マルギナツム・マルギナツム（Hyalomma marginatum marginatum）、イクソデス・リキヌス（Ixodes ricinus）、イクソデス・ペルスルカツス（Ixodes persulcatus）、イクソデス・スカプラリス（Ixodes scapularis）、イクソデス・ヘキサゴヌス（Ixodes hexagonus）、アルガス・ペルシクス（Argas persicus）、アルガス・レフレクスス（Argas reflexus）、オルニトドロス・エラチクス（Ornithodoros erraticus）、オルニトロドロス・モウバタ・モウバタ（Ornithodoros moubata moubata）、オルニトドロス・モウバタ・ポルシヌス（Ornithodoros moubata porcinus）、およびオルニトドロス・サビグニ（Ornithodoros savignyi）のうちいずれか１つなどを含む任意の既知のマダニ種より分離しうる。
【００４４】
（相同体）
本発明は、ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、２５または２８（ＲａＡ）；ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、２６または２９（ＲａＢ）；またはｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、２４または２７（Ｒｓｌ）；のうちいずれか１つのアミノ酸配列を有するタンパク質の相同体および活性フラグメントを含む。本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，４または６のうちいずれか１つのアミノ酸配列を有するタンパク質の相同体および活性フラグメントを含む。
【００４５】
用語「相同体」は、ＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害する能力を保持するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４および６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、２５、２６、２７、２８または２９に開示される本発明のタンパク質のパラログおよびオルソログへの言及を含むことを意図している。相同体は、上述のように、ＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害し、Ｔリンパ球の活性化の低下またはＴリンパ球の分極の調節をもたらす能力を有しうる。
【００４６】
１つの実施形態においては、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，２５または２８のうちいずれか１つと少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれより構成されるタンパク質を含む。他の実施形態においては、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，２５または２８のうちいずれか１つの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれより構成されるタンパク質を含む。１つの実施形態においては、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれより構成されるタンパク質を含む。他の実施形態においては、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の少なくとも４０％、４７％、４８％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれより構成されるタンパク質を含む。本明細書で言及するところの同一性百分率は、以下のオプションによるｃｌｕｓｔａｌＷを用いて判定されるところのものである：ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．１  ；ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．０；ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ＝ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ；ｍａｔｒｉｘ＝ｇｏｎｎｅｔ。代替的に、同一性百分率値は、ＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）が規定するデフォルトパラメータ［Ｂｌｏｓｕｍ  ６２  ｍａｔｒｉｘ；ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝ｌ  ｌ  ａｎｄ  ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝ｌ］を用いたＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を用いて判定することができる。
【００４７】
１つの実施形態においては、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、２６または２９と少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれより構成されるタンパク質を含む。他の実施形態においては、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、２６または２９の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれより構成されるタンパク質を含む。
【００４８】
１つの実施形態においては、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれより構成されるタンパク質を含む。他の実施形態においては、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の少なくとも４０％、５０％、５３％、５４％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれより構成されるタンパク質を含む。
【００４９】
１つの実施形態においては、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、２４または２７と少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれより構成されるタンパク質を含む。他の実施形態においては、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、２４または２７のうちいずれか１つの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれより構成されるタンパク質を含む。
【００５０】
１つの実施形態においては、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６と少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれより構成されるタンパク質を含む。他の実施形態においては、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれより構成されるタンパク質を含む。
【００５１】
本発明のタンパク質の相同体は、ＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害する能力が保持されていれば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、２４、２５、２６、２７、２８または２９の配列およびそのフラグメントに由来するアミノ酸置換、挿入または欠失を含有する突然変異体も含む。突然変異体は、上述のように、ＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害し、Ｔリンパ球の活性化の低下またはＴリンパ球分極の調節をもたらす能力を有しうる。さらなる実施形態においては、突然変異体は、上述のように、ＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害し、免疫応答の阻害をもたらす能力を有しうる。
【００５２】
したがって、突然変異体はタンパク質の機能または活性に有害に作用しない保存的アミノ酸配列を含有するタンパク質を含む。この用語は天然の生物学的変異体（例：本発明の分離節足動物タンパク質が由来する種内の対立遺伝子変異体および地理的変異体）を含むことも意図している。ＤＣの分化および／または成熟の調節または阻害における活性が野生型タンパク質配列のそれと比較して改善されている突然変異体は、タンパク質配列における特定の残基の体系的なまたは指向された突然変異によっても設計しうる。
【００５３】
相同体は、リピセファルス・アペンジクラツス（Rhipicephalus appendiculatus）を含むがこれに限定されない、リピセファルス・サンギネウス（Rhipicephalus sanguineus）、リピセファルス・ブルサ（Rhipicephalus bursa）、アンブリヨマ・アメリカヌム（Amblyomma americanum）、アンブリヨマ・カジェネンセ（Amblyomma cajennense）、アンブリヨマ・ヘブラエウム（Amblyomma hebraeum）、アンブリヨマ・バリエガツム（Ambylomma variegatum）、リケファルス・（ボーフィルス）・ミクロプルス（Rhicephalus (Boophilus) microplus）、リケファルス・（ボーフィルス）・アヌラツス（Rhicephalus (Boophilus) annulatus）、リケファルス・ボーフィルス）・デコロラツスRhicephalus (Boophilus) decoloratus、デルマセントル・レチクラツス（Dermacentor reticulatus）、デルマセントル・アンデルソニ（Dermacentor andersoni）、デルマセントル・マルギナツス（Dermacentor marginatus）、デルマセントル・バリアビリス（Dermacentor variabilis）、ハエマフィサリス・イネルミス（Haemaphysalis inermis）、ハエマフィサリス・レアキー（Haemaphysalis leachii）、ハエマフィサリス・プンクタタ（Haemaphysalis punctata）、ヒアロマ・アナトリクム・アナトリクム（Hyalomma anatolicum anatolicum）、ヒアロマ・ドロメダリー（Hyalomma dromedarii）、ヒアロマ・マルギナツム・マルギナツム（Hyalomma marginatum marginatum）、イクソデス・リキヌス（Ixodes ricinus）、イクソデス・ペルスルカツス（Ixodes persulcatus）、イクソデス・スカプラリス（Ixodes scapularis）、イクソデス・ヘキサゴヌス（Ixodes hexagonus）、アルガス・ペルシクス（Argas persicus）、アルガス・レフレクス（Argas reflexus）、オルニトドロス・エラチクス（Ornithodoros erraticus）、オルニトドロス・モウバタ・モウバタ（Ornithodoros moubata moubata）、オルニトドロス・モウバタ・ポルシヌス（Ornithodoros moubata porcinus）、およびオルニトドロス・サビグニ（Ornithodoros savignyi）を含むマダニ種に由来しうる。相同体は、クレクス（Culex）、アノフェレス（Anopheles）およびアエデス（Aedes）属のもの、具体的にはクレクス・クウィンクェファスキアツス（Culex quinquefasciatus）、アエデス・アエギプチ（Aedes aegypti）およびアノフェレス・ガンビアエ（Anopheles gambiae）を含むカ種；クテノケファリデス・フェリス（Ctenocephalides felis）（ネコノミ）などのノミ種；アブ；スナバエ；ブユ；ツェツェバエ；シラミおよびダニに由来しうる。
【００５４】
一般に相同体は、たとえばイクソジナエ属（Ixodinae）、ボトリオクロトニナエ属（Bothriocrotoninae）、アンブリヨミナエ属（Amblyomminae）、ハエマフィサリナエ属（Haemaphysalinae）、リピセファリナエ属（Rhipicephalinae）（ヒアロミナエ属（Hyalomminae）を含む）、ヌタリエリダエ属（Nuttalliellidae）、アルガシナエ属（Argasinae）、オトビナエ属（Otobinae）、アントリコリナエ属（Antricolinae）、およびオルニトドリナエ属（Ornithodorinae）属内の種などの、任意の既知のマダニ種に由来しうる。
【００５５】
本発明のタンパク質の相同体を同定するための方法は当業者にとって周知となるであろう。たとえば、相同体は、公的および民間の配列データベースの相同体検索によって同定することができる。簡便には公的利用可能なデータベースを用いうるが、民間のまたは商用利用可能なデータベースは、特に公的データベースに提示されていないデータを収容する場合、同等に有用となる。一次データベースは一次ヌクレオチドまたはアミノ酸配列データ保管サイトであり、かつ公的あるいは商用利用が可能である。公的利用可能な一次データベースの例は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、ＥＭＢＬデータベース（http://www.ebi.ac.uk/）、ＤＤＢＪデータベース（http://www.ddbj.nig.ac.jp/）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質データベース（http://expasy.hcuge.ch/）、ＰＩＲ（http://pir.georgetown.edu/）、ＴｒＥＭＢＬ（http://www.ebi.ac.uk/）、ＴＩＧＲデータベース（http://www.tigr.org/tdb/index. htmlを参照）、ＮＲＬ−３Ｄデータベース（http://www.nbrfa.georgetown.edu）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（http://www.rcsb.org/pdb）、ＮＲＤＢデータベース（ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README）、ＯＷＬデータベース（http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsrn/dbbrowser/OWL/）、および二次データベースであるＰＲＯＳＩＴＥ（http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html）、ＰＲＩＮＴＳ（http://iupab.leeds.ac.uk.bmb5dp/prints.html）、Ｐｒｏｆｉｌｅｓ（http://ulrec3.unil.ch/software/PFSCAN_form.html）、Ｐｆａｍ（http://www.sanger.ac.uk.software/pfam）、Ｉｄｅｎｔｉｆｙ（http://dna.stanford.edu/identify/）およびＢｌｏｃｋｓ（http://www.blocks.fhcrc.org）を含む。商用利用可能なデータベースまたは民間データベースの例はＰａｔｈｏＧｅｎｏｍｅ（Genome Therapeutics Inc.）およびＰａｔｈｏＳｅｑ（Incyte Pharmaceuticals Inc.）を含む。
【００５６】
発明者らは理論に縛られることを望んでいないが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，４および６のアミノ酸配列は全長配列でないと推定される。したがって本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，４または６のアミノ酸配列を含むタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にさらなるアミノ酸配列が存在しうると規定する。１つの実施形態においては、本発明は配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，４または６のうちいずれか１つの配列のＮ末端および／またはＣ末端における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００個のアミノ酸の付加を含むタンパク質を含む。
【００５７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、２５および２６のアミノ酸配列は全長タンパク質を表すと考えられる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、２８および２９のアミノ酸配列は成熟タンパク質を表すと予測される（これは分泌産物に典型的なシグナル配列を持たないタンパク質を意味する）。本発明は、ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、２５または２８（ＲａＡ）；ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、２６または２９（ＲａＢ）；またはｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、２４または２７（Ｒｓｌ）のアミノ酸配列を含むタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に更なるアミノ酸が存在しうるとも規定する。１つの実施形態においては、本発明はａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、２５または２８（ＲａＡ）；ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、２６または２９（ＲａＢ）；またはｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、２４または２７（Ｒｓｌ）のうちいずれか１つの配列のＮ末端および／またはＣ末端における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００個のアミノ酸の付加を含むタンパク質を含む。
【００５８】
１つの実施形態においては、本発明は本発明のタンパク質の機能的同等物も含む。本明細書において用語「機能的同等物」は、ＤＣの分化および／または成熟を、本発明のタンパク質に対応する様態で調節、および好ましくは阻害する能力を有する任意の分子を記載するために用いられる。これは、合成的に生成されるタンパク質、合成タンパク質変異体、対応する活性を付与する異なる配列のタンパク質分子、対応する活性を有する天然産生非タンパク質分子、および対応する活性を有する合成非タンパク質分子を含む。半合成的に生成されるタンパク質、タンパク質の半合成変異体および対応する活性を有する半合成非タンパク質分子も含む。ＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害する本発明のタンパク質の能力を模倣した抗体も含まれる。
【００５９】
具体的には、本発明のタンパク質の三次構造または活性部位を模倣するよう設計された合成分子は機能的同等物と見なされる。１つの実施形態においては、機能的同等物は、上述のようにＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害し、Ｔリンパ球の活性化の低下またはＴリンパ球の分極の調節をもたらす能力を有する。さらなる実施形態においては、機能的同等物は、上述のようにＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害し、免疫応答の阻害をもたらす能力を有する。
【００６０】
１つの実施形態においては、相同体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４および６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、２５、２６、２７、２８または２９のＤＣ調節タンパク質の保存モチーフまたは形質のうち１つまたはそれ以上を保持しうる。以下に記載するように、これらは配列を含有する保存グリコシル化部位、システイン分布パターン、ＣＸＸＷモチーフ、脂質結合能力、および受容体結合能力を含む。
【００６１】
一定の実施形態においては、本発明のタンパク質またはその相同体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、１０、１２、１４、または１６のうちいずれのアミノ酸配列も持たない。これらの配列は、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００２２１９明細書のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８および１０にそれぞれ相当する。
【００６２】
（フラグメント）
本発明は、本発明のタンパク質の「活性フラグメント」およびこれらの配列の相同体も提供する。この定義には、哺乳類ＤＣ分化および／または調節を調節または阻害する能力を保持するあらゆるフラグメントが含まれる。
【００６３】
そのようなフラグメントにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４および６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、２５、２６、２７、２８または２９のアミノ酸配列のフラグメントのみならず、上述のようなこのタンパク質の相同体のフラグメントも含まれる。そのような相同体のフラグメントは、典型的にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４または６のうちいずれか１つのアミノ酸配列のフラグメントに対して２０％を上回る同一性を有するであろう。
【００６４】
前記の相同体のフラグメントは、典型的にはｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、２５または２８、ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、２６または２９、またはｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、２４または２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列のフラグメントに対して２０％を上回る同一性を有するであろう。
【００６５】
一定の実施形態においては、相同体のフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４または６の分離節足動物タンパク質のフラグメントに対して、それぞれ３０％、４０％、４７％、４８％、５０％、５２％、５３％  ６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、９０％、９５％、９８％または９９％を上回る同一性の程度を示すであろう。
【００６６】
さらなる実施形態においては、相同体のフラグメントはｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、２５または２８、ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、２６または２９またはｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、２４または２７のうちいずれか１つの分離節足動物タンパク質のフラグメントに対して、それぞれ３０％、４０％、４７％、４８％、５０％、５２％、５３％  ６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、９０％、９５％、９８％または９９％を上回る同一性の程度を示すであろう。
【００６７】
本発明のタンパク質フラグメントは、好ましくは上述のようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４または６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、２５、２６、２７、２８または２９およびその相同体のフラグメントである。これらのフラグメントは、好ましくはＤＣの分化および／または成熟を調節、およびより好ましくは阻害する。１つの実施形態においては、本発明のタンパク質のフラグメントは、上述のように、ＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害してＴリンパ球活性化の低下またはＴリンパ球の分極の調節をもたらす。さらなる実施形態においては、本発明のタンパク質のフラグメントは、上述のようにＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害して免疫応答の阻害をもたらす。ＤＣの分化および／または成熟を調節または阻害する際の能力が改善されたフラグメントは、当然ながら、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４または６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、２５、２６、２７、２８または２９のうちいずれか１つのアミノ酸配列の体系的な突然変異または断片化によって合理的に設計しうる。
【００６８】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質またはその相同体のフラグメントは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個またはそれ以上のアミノ酸の長さであり得る。本発明のフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，４または６のうちいずれか１つのアミノ酸配列またはその相同体に由来する少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含んでもよい。
【００６９】
本発明のフラグメントは、ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、２５  または２８、ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：４、２６または２９またはｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、２４または２７のうちいずれか１つのアミノ酸配列、またはその相同体に由来する少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含んでもよい。
【００７０】
本発明のタンパク質フラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、２４、２５、２６、２７、２８および２９のＤＣ調節タンパク質の保存モチーフまたは形質のうち１つまたはそれ以上を保持しうる。１つの実施形態においては、本発明のタンパク質フラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４および６のＤＣ調節タンパク質の保存モチーフまたは形質のうち１つまたはそれ以上を保持しうる。以下に記載するように、これらは配列を含有する保存グリコシル化部位、システイン分布パターン、ＣＸＸＷモチーフ、脂質結合能力、および受容体結合能力を含む。
【００７１】
（グリコシル化）
発明者らは、ＤＣ調節タンパク質が１つまたはそれ以上の位置においてグリコシル化されることを発見している。したがって１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は１つまたはそれ以上の位置においてグリコシル化されうる。１つの実施形態においては、タンパク質は１つ、２つ、３つまたはそれ以上の位置においてグリコシル化されうる。本発明のタンパク質は、１つまたはそれ以上の位置において、好ましくはＮ−グリコシル化されるが（すなわち多糖がアスパラギンアミノ酸残基と結合する）、タンパク質がＯ−グリコシル化されてもよい（すなわちＮ−アセチル−ガラクトースアミンがセリンまたはスレオニン残基と結合する）。１つの実施形態においては、炭水化物部分は１つまたはそれ以上のマンノースまたはフルクトースまたはガラクトース単位を含みうる。
【００７２】
発明者らは、本発明のＤＣ調節タンパク質がグリコシル化部位の近辺にコンセンサス配列を有することも発見している。このコンセンサス配列は、保存された位置においてグリコシル化されるアミノ酸残基を有する。１つの実施形態においては、グリコシル化されるべきアミノ酸残基はアスパラギン残基（Ｎ−グリコシル化の場合）またはセリンまたはスレオニン残基（Ｏ−グリコシル化の場合）である。本発明のタンパク質は、ＲａＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の１１５アミノ酸位，ＲａＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の１１３位、およびＲｓｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の１１６位にアミノ酸残基アスパラギンを有する。さらに、本発明のタンパク質は、ＲａＡタンパク質全長（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）の１５４アミノ酸位，ＲａＢタンパク質全長（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）の１５３位、およびＲｓｌタンパク質全長（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）の１５５位にアミノ酸残基アスパラギンを有する。これらの位置は、ジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のアミノ酸配列の残基１５５に対応する。したがって、１つの実施形態においては、本発明のタンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４または６のうちいずれか１つの配列のアミノ酸位１１０〜１２０のうちいずれか１つに対応する残基に保存アスパラギン残基を有する。他の実施形態においては、本発明のタンパク質は、ＲａＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の１１５アミノ酸位，ＲａＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の１１３位、およびＲｓｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の１１６位に対応する残基に保存アスパラギン残基を有する。他の実施形態においては、本発明のタンパク質はジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のアミノ酸配列の１１５アミノ酸位に対応するアミノ酸位に保存アスパラギン酸残基を有する。
【００７３】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントは、Ｘが任意のアミノ酸でありかつＺがプロリン以外の任意のアミノ酸であることを特徴とする配列Ｎ−Ｚ−（Ｓ／Ｔ）−（Ｘ）３−５−Ｃを含有するグリコシル化部位を含む。
【００７４】
他の実施形態においては、本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントは、Ｘが任意のアミノ酸でありかつＺがプロリン以外の任意のアミノ酸であることを特徴とする配列（Ｘ）１２−１６−Ｎ−Ｚ−（Ｓ／Ｔ）−（Ｘ）３−５−Ｃを含有するグリコシル化部位を含む。
【００７５】
他の実施形態においては、本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントは、Ｘが任意のアミノ酸でありかつＺがプロリン以外の任意のアミノ酸であることを特徴とする配列Ｗ−（Ｘ）１２−１６−Ｎ−Ｚ−（Ｓ／Ｔ）−（Ｘ）３−５−Ｃを含有するグリコシル化部位を含む。
【００７６】
他の実施形態においては、本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントは、Ｘが任意のアミノ酸でありかつＺがプロリン以外の任意のアミノ酸であることを特徴とする配列Ｃ−（Ｘ）２−Ｗ−（Ｘ）１２−１６−Ｎ−Ｚ−（Ｓ／Ｔ）−（Ｘ）３−５−Ｃを含有するグリコシル化部位を含む。
【００７７】
他の実施形態においては、本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントは、Ｘが任意のアミノ酸でありかつＺがプロリン以外の任意のアミノ酸であることを特徴とする配列Ｃ−（Ｘ）２−Ｗ−（Ｘ）１２−１６−Ｎ−Ｚ−（Ｓ／Ｔ）−（Ｆ／Ｙ）−（Ｘ）２−４−Ｃを含有するグリコシル化部位を含む。
【００７８】
他の実施形態においては、本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントは、Ｘが任意のアミノ酸でありかつＺがプロリン以外の任意のアミノ酸であることを特徴とする配列Ｃ−（Ｘ）２−Ｗ−（Ｘ）７−１１−（Ｉ／Ｌ）−Ｐ−（Ｘ）３−Ｎ−Ｚ−（Ｓ／Ｔ）−（Ｘ）３−５−Ｃを含有するグリコシル化部位を含む。
【００７９】
他の実施形態においては、本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントは、Ｘが任意のアミノ酸でありかつＺがプロリン以外の任意のアミノ酸であることを特徴とする配列Ｃ−（Ｘ）２−Ｗ−（Ｘ）７−１１−（Ｉ／Ｌ）−Ｐ−（Ｘ）３−Ｎ−Ｚ−（Ｓ／Ｔ）−（Ｆ／Ｙ）−（Ｘ）２−４−Ｃを含有するグリコシル化部位を含む。
【００８０】
他の実施形態においては、本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントは、Ｘが任意のアミノ酸でありかつＺがプロリン以外の任意のアミノ酸であることを特徴とする配列Ｃ−（Ｘ）２−Ｗ−（Ｘ）１３−１５−Ｎ−Ｚ−（Ｓ／Ｔ）−（Ｘ）４−Ｃを含有するグリコシル化部位を含む。
【００８１】
本発明のタンパク質は自然にグリコシル化されうる。これは、タンパク質が自然に産生され分離される場合、またはその体内で当該タンパク質が自然に産生される生物のグリコシル化パターンを反映する宿主細胞においてタンパク質が組換えにより生成される場合に特に当てはまる。代替的に、本発明のタンパク質を人工的にグリコシル化することが必要であることもある。これは、タンパク質が化学的に合成される場合、またはタンパク質の自然グリコシル化パターンを反映しない生物においてタンパク質が組換えにより生成される場合に特に当てはまる。さらに、タンパク質の特性を変更あるいは改善するために追加的なグリコシル化が起こることもあり得る。
【００８２】
発明者らは、理論に縛られることを望むことなく、ＤＣ調節タンパク質のその受容体との結合に関与するのは本発明のタンパク質の炭水化物部分であるという仮説を立てる。これは、以下の「受容体結合」と題する節においてより詳細に論じる。
【００８３】
上述のように、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４および６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、２５、２６、２７、２８または２９のアミノ酸配列の相同体およびフラグメントを含む。本発明の相同体またはフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、２４、２５、２６、２７、２８または２９の全長配列を含有するグリコシル化部位を保持しうる。一定の実施形態においては、相同体またはフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４および６の全長配列を含有するグリコシル化部位を保持しうる。他の一定の実施形態においては、相同体またはフラグメントは、上述の配列を含有するグリコシル化部位を１つまたはそれ以上保持しうる。
【００８４】
（システイン分布パターン）
本発明のタンパク質と過去に同定されたＤＣ調節タンパク質ジャパニンの間の配列相同性は、本発明のタンパク質がジャパニンと同様にリポカリン、またはリポカリン様分子であることを示す。リポカリンは、類似した構造的フォールドを共有するタンパク質ファミリーである。特徴的なリポカリンフォールドは、８本鎖逆平行βバレルであり、これは大半の場合リガンド結合部位として作用する内部空隙を形成する。一般的に、リポカリンは空隙位置にシステイン残基を含む。一般的に、システイン残基の少なくとも一部は内部ジスルフィド結合を形成し、これはリポカリンフォールドを安定化させうる。
【００８５】
発明者らは、本発明のＤＣ調節タンパク質が保存システイン分布パターンを有することも発見している。このシステイン分布パターンは、本発明のＤＣ調節タンパク質の特異的リポカリンフォールドを形成するために必要とされると考えられ、かつ以下により詳細に述べるように、コレステロールなどの脂質分子とタンパク質の結合を可能とするよう構成されている。システイン分布パターンは特異的リポカリンフォールドを安定化させるためにも必要とされうる。
【００８６】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８２−９２−Ｃ−（Ｘ）２２−２６−Ｃ−（Ｘ）１０−１２−Ｃを含む。
【００８７】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８１−９１−Ｃ−（Ｘ）２２−２６−Ｃ−（Ｘ）１０−１２−Ｃを含む。
【００８８】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８１−９２−Ｃ−（Ｘ）２２−２６−Ｃ−（Ｘ）１０−１２−Ｃを含む。
【００８９】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８２−９２−Ｃ−（Ｘ）２３−２６−Ｃ−（Ｘ）１０−１２−Ｃを含む。
【００９０】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８１−９１−Ｃ−（Ｘ）２２−２７−Ｃ−（Ｘ）１０−１２−Ｃを含む。
【００９１】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８１−９２−Ｃ−（Ｘ）２３−２７−Ｃ−（Ｘ）１０−１２−Ｃを含む。
【００９２】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８２−９２−Ｃ−（Ｘ）２２−２６−Ｃ−（Ｘ）１１−１２−Ｃを含む。
【００９３】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８１−９１−Ｃ−（Ｘ）２２−２６−Ｃ−（Ｘ）１０−１３−Ｃを含む。
【００９４】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８１−９２−Ｃ−（Ｘ）２２−２６−Ｃ−（Ｘ）１０−１３−Ｃを含む。
【００９５】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８２−９２−Ｃ−（Ｘ）２３−２６−Ｃ−（Ｘ）１１−１２−Ｃを含む。
【００９６】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８１−９１−Ｃ−（Ｘ）２２−２７−Ｃ−（Ｘ）１０−１３−Ｃを含む。
【００９７】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８１−９２−Ｃ−（Ｘ）２３−２７−Ｃ−（Ｘ）１１−１３−Ｃを含む。
【００９８】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８２−９１−Ｃ−（Ｘ）２２−２６−Ｃ−（Ｘ）１０−１２−Ｃを含む。
【００９９】
他の実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするシステイン分布パターンＣ−（Ｘ）８２−９１−Ｃ−（Ｘ）２−Ｗ−（Ｘ）１９−２３−Ｃ−（Ｘ）１０−１２−Ｃを含む。
【０１００】
他の実施形態においては、本発明のタンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸でありかつＺがプロリン以外の任意のアミノ酸であることを特徴とする配列Ｃ−（Ｘ）８２−９１−Ｃ−（Ｘ）２−Ｗ−（Ｘ）１２−１６−Ｎ−Ｚ−（Ｓ／Ｔ）−（Ｘ）４−Ｃ−（Ｘ）１０−１２−Ｃを含むシステイン分布パターンかつグリコシル化部位を含む。
【０１０１】
同定されたタンパク質のシステイン分布パターンは、ＲａＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の１０１アミノ酸位，ＲａＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の１００位、およびＲｓｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の１０２位にアミノ酸残基トリプトファンを有する。これらの位置は、ジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のアミノ酸配列の残基１４１に対応する。したがって、１つの実施形態においては、本発明のタンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４または６のうちいずれか１つの配列のアミノ酸位１００〜１０５のうちいずれか１つに対応する残基に保存トリプトファン残基を有する。他の実施形態においては、本発明のタンパク質は、ＲａＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の１０１アミノ酸位，ＲａＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の１００位、またはＲｓｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の１０２位に対応する残基に保存トリプトファン残基を有する。
【０１０２】
さらに、同定されたタンパク質のシステイン分布パターンは、全長ＲａＡタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）の１４０アミノ酸位、全長ＲａＢタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）の１３９位、および全長Ｒｓｌタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）の１４１位にアミノ酸残基トリプトファンを有する。これらの位置は、ジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のアミノ酸配列の残基１４１に対応する。したがって、１つの実施形態においては、本発明のタンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、２５または２６のうちいずれか１つの配列のアミノ酸位１３７〜１４３のうちいずれか１つに対応する残基に保存トリプトファン残基を有する。他の実施形態においては、本発明のタンパク質は全長ＲａＡタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）の１４０アミノ酸位，全長ＲａＢタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）の１３９位、および全長Ｒｓｌタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）の１４１位に対応する残基に保存トリプトファン残基を有する。他の実施形態においては、本発明のタンパク質はジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のアミノ酸配列の１４１アミノ酸位に対応するアミノ酸位に保存トリプトファン残基を有する。
【０１０３】
上述のように、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４および６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、２５、２６、２７、２８または２９のアミノ酸配列の相同体およびフラグメントを含む。一定の実施形態においては、相同体またはフラグメントは本発明のタンパク質のシステイン分布パターンを保持することがあり、かつ上述のコンセンサス配列を保持することがある。
【０１０４】
（脂質結合特性）
その推定上のリポカリン構造からすると、本発明のタンパク質は脂質または脂質様分子と会合すると考えられる。用語「脂質」は、有機溶媒に可溶性であるが水に不溶性であるあらゆる疎水性または両親媒性分子を包含することを意図している。これは脂肪、油、トリアシルグリセロール、糖脂質、リン脂質およびステロイド、脂肪酸アシル、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、ポリケチド、ステロール脂質およびプレノール脂質を含む。用語「脂質様分子」は、脂質と同様または同一の特性を有するあらゆる分子を包含する。用語「脂質様分子」には非脂質分子と複合体化したあらゆる脂質も含まれる。これは糖脂質、リン脂質、リン糖脂質、標識化脂質およびアセチル化脂質を含む。
【０１０５】
インビボでは、本発明のタンパク質は小胞体におけるフォルディング中またはその直後またはこの位置から排出された後の次の段階において脂質分子と結合しうる。
【０１０６】
本発明の範囲内においては、本発明のタンパク質、またはその相同体またはフラグメントはその生成時に脂質と会合しうる。たとえば、本発明のタンパク質がその自然の供給源より分離されるか、または組換えにより生成される場合、タンパク質は介入を全く必要とすることなく自動的に脂質と会合しうる。代替的に、本発明のタンパク質と脂質の間に複合体形成が起こることを可能とするために、タンパク質を含む組成物に脂質を添加しうる。具体的には、タンパク質が化学的に合成される場合、脂質は複合体形成が発生するようタンパク質を含む組成物に対して外部より添加しうる。
【０１０７】
上述のように、本発明のタンパク質は脂質と「会合」または「複合体化」しうる。これらの用語は、本明細書において脂質と本発明のタンパク質の間の任意の種類の接触と関連させるために互換的に用いられる。具体的には、本発明のタンパク質と脂質の間に相互作用がありうる。１つの実施形態においては、この相互作用は純粋に構造的、すなわち脂質がモザイク状の関係を経てタンパク質内部の結合ポケットに嵌合しうる。他の実施形態においては、脂質は任意の引力を介してタンパク質と物理的に相互作用しうる。そのような引力は静電的相互作用、親水性相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス力、水素結合および共有結合相互作用を含みうる。脂質とタンパク質の間の相互作用は構造的相互作用と引力の組み合わせより形成されうる。
【０１０８】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は脂質と会合しうる。他の実施形態においては、脂質はステロイド、またはたとえばコレステロールのようなステロールでありうる。他の実施形態においては、脂質はたとえばビタミンＤ３またはデキサメタゾンのようなコレステロール代謝物でありうる。したがって本発明は、本発明のタンパク質と、たとえばコレステロールまたはコレステロール代謝物などの脂質を含むか、またはこれらより構成される複合体を提供する。
【０１０９】
上記に論じたように、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４および６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、２５、２６、２７、２８または２９のアミノ酸配列の相同体およびフラグメントを含む。一定の実施形態においては、相同体またはフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４および６の全長配列の脂質結合特性を保持しうる。他の一定の実施形態においては、相同体およびフラグメントはコレステロール、またはビタミンＤ３またはデキサメタゾンなどのコレステロール代謝物と結合する能力を保持しうる。したがって本発明は、本発明のタンパク質の相同体またはフラグメントと、たとえばコレステロールまたはコレステロール代謝物などの脂質を含むか、またはこれらより構成される複合体も含む。
【０１１０】
本発明のＤＣ調節タンパク質はコレステロール結合に関与しているので、発明者らは脂質を担持するよう設計されながらも本発明のＤＣ調節タンパク質の生物学的活性を保持していないタンパク質は、有用な特性を有していると想像した。したがって本発明は、脂質と結合しかつＤＣの表面上の受容体を標的とする担体タンパク質を含む。そのような担体タンパク質それ自体はＤＣの成熟および分化を調節、および好ましくは阻害する生物学的活性を有していない。１つの実施形態においては、担体タンパク質は本発明の調節タンパク質を操作してその生物学的活性を阻害することにより生成しうる。他の実施形態においては、担体タンパク質によって担持される脂質は細胞受容体に結合することにより生物学的機能を付与しうる。上記に用いられた用語「機能的同等物」はしたがって担体タンパク質を含む。
【０１１１】
（ＣＸＸＷモチーフ）
発明者らは、驚くべきことにすべての同定されたＤＣ調節タンパク質が、Ｘが任意のアミノ酸であるＣＸＸＷモチーフを共有していることを発見している。発明者らは、このモチーフはＤＣ調節タンパク質の特異的リポカリン構造の形成に関与している可能性があると仮定している。ＣＸＸＷモチーフは、リポカリンのバレル様構造における、たとえばコレステロールなどの脂質の結合に関与しうる。脂質がこのモチーフの残基の１つと結合するか、あるいはモチーフがバレル構造内での脂質の結合を促進するのに適したサイズの結合ポケットの形成をもたらしうる。
【０１１２】
同定されたタンパク質のＣＸＸＷモチーフは、ＲａＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の９８〜１０１アミノ酸位，ＲａＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の９７〜１００位、およびＲｓｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の９９〜１０２位に存在する。これらの位置は、ジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のアミノ酸配列の残基１３８〜１４１に対応する。したがって、１つの実施形態においては、本発明のタンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４および６のうちいずれか１つの配列のアミノ酸位９５〜１０５のうちいずれか１つに対応する残基に保存ＣＸＸＷモチーフを有する。他の実施形態においては、本発明のタンパク質は、ＲａＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の９８〜１０１アミノ酸、ＲａＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の９７〜１００、およびＲｓｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の９９〜１０２に対応する残基に保存ＣＸＸＷモチーフを有する。さらに、同定されたタンパク質のＣＸＸＷモチーフは、全長ＲａＡタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）の１３７〜１４０アミノ酸位，全長ＲａＢタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）の１３６〜１３９位、および全長Ｒｓｌタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）の１３８〜１４１位に存在する。これらの位置は、ジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のアミノ酸配列の残基１３８〜１４１に対応する。したがって、１つの実施形態においては、本発明のタンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、２５および２６のうちいずれか１つの配列のアミノ酸位１３３〜１４４のうちいずれか１つに対応する残基に保存ＣＸＸＷモチーフを有する。他の実施形態においては、本発明のタンパク質は全長ＲａＡタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）の１３７〜１４０アミノ酸位，全長ＲａＢタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）の１３６〜１３９位、および全長Ｒｓｌタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）の１３８〜１４１位に対応する残基に保存ＣＸＸＷモチーフを有する。他の実施形態においては、本発明のタンパク質はジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のアミノ酸配列の１３８〜１４１アミノ酸に対応するアミノ酸位に保存ＣＸＸＷモチーフを有する。
【０１１３】
１つの実施形態においては、本発明のＤＣ調節タンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするＣＸＸＷモチーフを含みうる。
【０１１４】
他の実施形態においては、本発明のＤＣ調節タンパク質は、Ｘが任意のアミノ酸であることを特徴とするＣＸＬＷモチーフを含みうる。
【０１１５】
さらに他の実施形態においては、本発明のＤＣ調節タンパク質は、モチーフＣＳＬＷまたはＣＥＬＷを含みうる。
【０１１６】
一定の実施形態においては、ＣＸＸＷモチーフにはバリン残基が続きうるので、本発明のタンパク質はモチーフＣＸＸＷＶを含みうる。この実施形態においては、モチーフは残基ＣＸＬＷＶ、ＣＳＬＷＶまたはＣＥＬＷＶを含みうる。
【０１１７】
発明者らは、モチーフはリポカリンのバレル様構造の一部を形成し、かつＣＳＬＷモチーフ中のセリン残基のサイズが小さいことにより、コレステロールなどの脂質分子がバレル内に進入しさらにバレル構造内で結合することを可能とするという仮説を立てている。したがって、好ましい実施形態において本発明のタンパク質はＣＳＬＷモチーフを含む。
【０１１８】
上述のように、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４および６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、２５、２６、２７、２８または２９のアミノ酸配列の相同体およびフラグメントを含む。一定の実施形態においては、相同体またはフラグメントはＣＸＸＷモチーフを保持しうる。他の一定の実施形態においては、相同体またはフラグメントはＣＸＬＷモチーフまたはＣＥＬＷまたはＣＳＬＷモチーフを保持しうる。
【０１１９】
（受容体結合）
本発明のＤＣ調節タンパク質は、Ｃａ２＋依存性受容体と結合すると考えられる。この受容体はレクチン受容体であってもよく、かつ具体的にはＣ型レクチン細胞表面受容体でありえる。これは、これらのタンパク質が標的細胞の表面上の受容体と結合しかつ阻害を引き起こす内部細胞シグナリング経路を開始させることにより、樹状細胞の分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害するよう機能することを示唆する。
【０１２０】
本発明のタンパク質は、ＤＣなどの標的細胞を直接的にも、または間接的にも調節しうる。
【０１２１】
１つの実施形態においては、タンパク質はたとえばＤＣなどの標的細胞の外表面上の受容体と結合しうる。他の実施形態においては、タンパク質は二価陽イオン依存性受容体と結合しうる。他の実施形態においては、タンパク質はＣａ２＋依存性受容体と結合しうる。他の実施形態においては、タンパク質はレクチン受容体と結合し、かつ具体的にはＣ型レクチン受容体と結合しうる。１つの実施形態においては、タンパク質は受容体と結合しかつ受容体に対する天然リガンドを模倣しうる。タンパク質の任意の部分が受容体と結合しうることは当業者に明らかとなるであろう。具体的には、タンパク質がグリコシル化されかつ／または脂質分子と結合する場合、標的細胞上の受容体と結合するのは炭水化物部分または会合した脂質でありうる。
【０１２２】
さらなる実施形態においては、タンパク質は標的細胞の内部にある受容体と結合しうる。たとえば、タンパク質はリソソームまたは他の細胞オルガネラの表面上にある内部受容体と結合しうる。
【０１２３】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質は、そこで中間タンパク質がＤＣを直接的または間接的に調節する１つまたはそれ以上の中間タンパク質（例：血漿タンパク質）と結合することにより、ＤＣ細胞を間接的に調節しうる。たとえば、中間タンパク質はＤＣ受容体と直接的に結合しうる。
【０１２４】
１つの実施形態においては、本発明の範囲には本発明のタンパク質および受容体を含むかまたはこれらより構成される複合体が含まれる。他の実施形態においては、複合体は本発明のタンパク質、たとえばＣ型レクチン受容体といった二価陽イオン依存性受容体などの受容体、およびたとえばコレステロールまたはコレステロールの代謝物などの脂質を含むか、またはこれらより構成されうる。
【０１２５】
（抗体）
本発明は、本発明のタンパク質およびそのフラグメントまたは相同体と結合する抗体も提供する。抗体は、本発明のタンパク質を検出するための試薬として用いうる。ＤＣ分化および／または成熟の調節または阻害する際に本発明のタンパク質の活性を中和するのも抗体であるので、以下に記載するところの治療の目的にとって有用である。本発明のこの態様には、上述のような、本発明の範囲に含まれる相同体またはタンパク質フラグメントのいずれかと結合する抗体が含まれる。
【０１２６】
本発明は、本発明のタンパク質の炭水化物部分と結合する抗体も含む。具体的には、本発明は、本発明のタンパク質およびその相同体およびフラグメントと自然に結合する１つまたはそれ以上の炭水化物部分と結合する抗体を含む。
【０１２７】
１つの実施形態においては、本発明はＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害する本発明のタンパク質の能力を模倣する抗体も含む。
【０１２８】
「アンチカリン」も本発明の範囲に含まれる。これらは特異的なタンパク質エピトープを認識しかつこれと結合するようリポカリンから操作された分子である。一定の実施形態においては、アンチカリンはペプチド、糖ペプチドまたは糖脂質の形態を取り得る。本明細書においては、アンチカリンは用語「抗体」の範囲に含まれる。しかしアンチカリンは、抗体と同様の様態でタンパク質エピトープを認識する非免疫グロブリン由来分子である。
【０１２９】
ポリクローナル抗体が所望される場合は、マウス、ウサギ、ブタ、ヤギまたはウマなどの選択された哺乳類を本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントで免疫してもよい。所望される場合は、タンパク質を担体タンパク質とコンジュゲートすることができる。一般に用いられる担体タンパク質はウシ血清アルブミン、チログロブリンおよびキーホールリンペットヘモシアニンを含む。次に、カップリングしたタンパク質を用いて動物を免疫する。免疫された動物より採取した血清を捕集し、たとえばイムノアフィニティクロマトグラフィなどの既知の手順に従って処理する。
【０１３０】
本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体およびその相同体およびフラグメントも、当業者によって容易に生成されることができる。ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を作成するための一般的な方法論は周知である（たとえばKohler, G. and Milstein, C, Nature 256: 495-497 (1975)； Kozbor et al, Immunology Today 4: 72 (1983)；コール他、『モノクローナル抗体と癌治療』７７〜９６ページ、Alan R. Liss社（１９８５年) などを参照）。
【０１３１】
本明細書で用いるところの用語「抗体」は全長抗体、およびやはり本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントと特異的に結合するＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントなどの抗体のフラグメントを含む。用語「抗体」は、本発明のタンパク質およびその相同体およびフラグメントに対して特異性を有するキメラ抗体およびヒト化抗体分子をさらに含む。キメラ抗体は、非ヒト可変領域がヒト定常領域と結合または融合した抗体である（たとえばLiu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 (1987) を参照）。本明細書で用いるところの用語「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー抗体のＨ鎖および／またはＬ鎖の可変ドメイン内のＣＤＲアミノ酸および選択された他のアミノ酸を、ヒト抗体の同等アミノ酸の位置に置換した抗体分子を指す。したがって、ヒト化抗体はヒト抗体と非常に類似しているが、ドナー抗体の結合能力を有している（Jones et al., Nature, 321, 522 (1986)；Verhoeyen et al., Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al., J. Immunol., 147, 1709 (1991)；Queen et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 10029 (1989)；Gorman et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88, 34181 (1991)；およびHodgson et al, Bio/Technology, 9, 421 (1991) を参照）。このようなヒト化抗体も本発明の範囲に含まれる。
【０１３２】
用語「抗体」は「プラスチック」抗体（分子インプリントポリマー（ＭＩＰ））も含む。
【０１３３】
一部の例においては、たとえば検出を容易にするために、標識基を抗体に結合させることが望ましいこともある。標識は酵素、放射能標識、ビオチンなどの化合物または蛍光色素でありうる。このような標識化抗体も本発明の範囲に含まれる。
【０１３４】
（融合タンパク質）
本発明は、１つまたはそれ以上のペプチド、ポリペプチドまたは他の分子と遺伝学的に融合されるかまたは化学的に結合される本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントを含む融合タンパク質も含む。付加ペプチドまたはポリペプチドまたは分子の目的は、タンパク質の検出、発現、分離または生成を補助することでも、またはタンパク質に所望するところの追加的特性を付与することであってもよい。可能な融合の相手はβ−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、ポリヒスチジンタグ、Ｔ７ポリメラーゼフラグメントおよび分泌シグナルペプチドを含む。融合の相手は、たとえばＦｃフラグメントのように、インビボで分子の寿命を延長しうる。
【０１３５】
その他の可能な融合の相手は、特定の疾患を治療するための薬剤として用いるために開発されているタンパク質または他の分子などの、生物学的製剤候補を含む。さらに可能な融合の相手は、本発明のタンパク質にＤＣなどの免疫系内の細胞を標的化させる抗原を含む。たとえば、融合の相手は、インビボでＤＣに送達させるためにタンパク質と融合しうる自己または外来抗原またはアレルゲンを含みうる。さらなる融合の相手は、ＤＣへの送達を促進するＤＣの各細胞表面成分と結合させた分子を含みうる。このような抗原の例は、以下に治療法と関連してより詳細に論じる。ある場合には、複数の融合相手が含まれうる。
【０１３６】
（核酸）
本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子も含む。用語「核酸分子」には、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および混合ＤＮＡ−ＲＮＡ分子が含まれる。さらにこの定義には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子および修飾塩基を含むＲＮＡおよびＤＮＡ分子も含まれる。当業者に明らかとなるように、遺伝子コードの縮重は、本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントの確定したタンパク質配列をコードすることのできる数多くの異なる核酸配列があると規定する。本発明は、上述の融合タンパク質のような融合タンパク質をコードする核酸分子も含む。
【０１３７】
本発明の１つの態様においては、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５またはその縮重配列のうちいずれか１つの核酸配列を含むか、またはこれより構成されうる。本発明のさらなる態様においては、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４２、４３またはその縮重配列のうちいずれか１つの核酸配列を含むか、またはこれより構成されうる。
【０１３８】
本発明は、ハイストリンジェンシー（高厳格性）はハイブリダイゼーション条件下で、上述のような本発明のタンパク質、またはその相同体またはフラグメントをコードする核酸配列を含む核酸分子にハイブリダイズするアンチセンス核酸分子も提供する。高厳格性ハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍＬ変性切断サケ精子ＤＮＡを含む溶液における４２℃で１晩のインキュベート、その後の０．１×ＳＳＣによる約６５℃でのフィルターの洗浄を含む。アンチセンス核酸分子はアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡを含むＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。
【０１３９】
本発明は、本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントをコードする核酸配列を含む核酸分子、または高厳格性ハイブリダイゼーション条件下で前記核酸分子とハイブリダイズするアンチセンス核酸分子を含むベクターも含む。前記ベクターはクローニングおよび発現ベクターを含む。そのような発現ベクターは、たとえばエンハンサーエレメント、プロモータ−オペレーター領域、ターミネーションストップ配列、ｍＲＮＡ安定性配列、開始および終止コドンまたはリボソーム結合部位などの適切な転写および翻訳制御配列を、フレーム内に結合して、本発明の核酸分子に組み入れうる。これらの制御配列は例示的にのみ提供され、限定することを意図していない。
【０１４０】
さらに、組換えタンパク質が一定の宿主から分泌されることは好都合でありえる。したがって、そのようなベクターのさらなる構成要素は分泌、シグナリングおよびプロセシング配列をコードする核酸を含むこともある。
【０１４１】
本発明によるベクターは、プラスミドおよびウイルス（バクテリオファージも真核ウイルスもともに含む）、さらには転位性エレメントまたは相同体組換え技術を用いるものなどの、他の線形または円形ＤＮＡキャリアを含みうる。特に適したウイルスベクターはバキュロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびワクシニアウイルスベースのベクターである。
【０１４２】
本発明は、本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントをコードするベクター、核酸分子またはアンチセンス核酸を含有する宿主細胞も含む。本発明の範囲内では、あらゆる種類の宿主細胞を利用しうる。１つの実施形態においては、宿主細胞は原核宿主細胞でありうる。この実施形態においては、原核宿主細胞は大腸菌（E. coli）宿主細胞でありうる。他の実施形態においては、宿主細胞は真核宿主細胞でありうる。この実施形態においては、真核宿主細胞は真核酵母細胞でありうる。さらなる実施形態においては、宿主細胞は哺乳類宿主細胞でありうる。さらなる実施形態においては、宿主細胞は昆虫細胞であってもよく、またこの実施形態においては、発現系はバキュロウイルス発現系であってもよい。
【０１４３】
本発明のベクターまたは核酸を宿主細胞に導入するために多様な技術を用いうる。適切な形質転換またはトランスフェクション技術は文献に十分に記載されている（Sambrook et al, 1989; Ausubel et al, 1991; Spector, Goldman &Leinwald, 1998）。真核細胞においては、発現系はシステムの必要に応じて一時的（例：エピソームなど）であっても、または恒久的（染色体組み込み）であってもよい。
【０１４４】
本発明のさらなる実施形態においては、本発明のタンパク質、またはその相同体またはフラグメントを調製するための方法であって：
ｉ）それにより本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントが発現される条件下で前記タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを含有する宿主細胞を培養すること；および
ｉｉ）そのように生成された前記タンパク質を回収することを含む方法が提供される。
【０１４５】
本発明のこの態様においては、タンパク質の発現のために必要とされる条件は宿主細胞系、ベクターおよびこれに続くタンパク質回収方法によって異なるであろう。本発明のタンパク質の生成および回収のための具体的なプロセスの一例は、本発明のタンパク質をコードする組換えバキュロウイルスによりＳｆ９昆虫細胞を感染させること、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または硫酸アンモニウムの添加によって培養上清より生成するタンパク質を沈殿させることを含む。そのような条件の変法は当業者に明らかとなるであろう。
【０１４６】
（医薬組成物）
ＤＣの分化および／または成熟の調節、および好ましくは阻害における本発明のタンパク質の活性が同定されていることにより、本発明のタンパク質、核酸、アンチセンス核酸、ベクター、宿主細胞および抗体は治療薬として用いることを意図される。
【０１４７】
本発明は、ＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害するＤＣ調節タンパク質、またはその機能的同等物またはフラグメント、そのようなタンパク質、相同体またはフラグメントをコードする核酸、前記核酸を含有するベクター、前記ベクターを含有する宿主細胞、または前記タンパク質、相同体またはフラグメントと結合する抗体および医薬品として許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１４８】
本明細書で用いるところの用語「医薬品として許容できる担体」は、遺伝子、ポリペプチド、抗体、リポソーム、多糖、ポリ酪酸、ポリグリコール酸、および不活性ウイルス粒子、また賦形剤自体が毒性効果を誘発しないか、または医薬組成物を投与される個体にとって有害な抗体の産生を引き起こさないのであれば実際には他の任意の物質を含む。医薬品として許容できる担体は、さらに水、食塩水、グリセロール、エタノールなどの液状物、または湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質などの補助剤をさらに含有しうる。賦形剤は医薬組成物が錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、または懸濁剤に製剤化されて患者による摂取を促進することを可能としうる。医薬品として許容できる担体についての完全な議論は、レミングトンの『薬剤学』（Mack Pub. Co.、ニュージャージー、１９９１年）で読むことができる。
【０１４９】
１つの実施形態においては、医薬組成物はタンパク質と相互作用する１つまたはそれ以上の脂質分子を含みうる。１つの具体的な実施形態においては、この脂質分子はステロイド、またはたとえばコレステロールまたはビタミンＤ３またはデキサメタゾンといったコレステロールの代謝物などのステロールでありうる。他の実施形態においては、医薬組成物は本発明のタンパク質、およびたとえばコレステロールまたはビタミンＤ３またはデキサメタゾンなどのコレステロール代謝物などの脂質を含むか、またはこれらより構成される複合体を含みうる。さらなる実施形態においては、医薬組成物は本発明のタンパク質、およびたとえばコレステロールまたはビタミンＤ３またはデキサメタゾンなどのコレステロール代謝物などの脂質、およびたとえばＣ型レクチン受容体などの二価陽イオン依存性受容体などの受容体を含むか、またはこれらより構成される複合体を含みうる。
【０１５０】
本発明の１つの態様においては、医薬組成物は１つまたはそれ以上の追加的治療薬も含みうる。本発明のこの態様には、本発明のタンパク質との同時投与に有益であろうと当業者が見なすかもしれない任意の追加的治療薬が含まれる。具体的には、前記の追加的治療薬は抗炎症剤、免疫調節剤、免疫抑制剤、サイトカイン、サイトカイン模倣またはサイトカイン結合タンパク質を含みうる。具体的な実施形態においては、１つまたはそれ以上の追加的治療薬は抗炎症剤を含んでもよい。
【０１５１】
（治療の方法）
本発明は、ＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害するタンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸、アンチセンス核酸、前記核酸またはアンチセンス核酸を含有するベクター、前記ベクターを含有する宿主細胞、前記タンパク質と結合する抗体、または治療における使用を目的とした前記タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞または抗体を含む医薬組成物を提供する。
【０１５２】
本明細書で用いられるところの用語「治療」は、本明細書に記載されるタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物の、ヒトまたは動物患者の利益を目的とした使用を含む。具体的には、この用語は治療処置、予防的治療、診断および予防接種を含む。この一覧は例示的にのみ提供され、限定することを意図していない。
【０１５３】
本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物は任意の動物の治療を目的として使用しうる。一部の実施形態においては、この動物は魚類でありうる。一部の実施形態においては、この動物は哺乳類でありうる。さらなる実施形態おいては、この哺乳類はウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ニワトリなどの鳥類、またはウサギでありうる。さらなる実施形態においては、この哺乳類はヒトでありうる。さらなる実施形態においては、この動物は爬虫類でありうる。
【０１５４】
他の実施形態においては、ＤＣ調節タンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質をコードする核酸と結合することのできるアンチセンス核酸、前記核酸またはアンチセンス核酸を含有するベクター、前記ベクターを含有する宿主細胞、前記タンパク質または核酸分子と結合する抗体、または前記タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞または抗体を含む医薬組成物の、ＤＣ活性に関連する疾患の治療を目的とした医薬品の製造における使用が含まれる。
【０１５５】
本発明は、ＤＣ調節タンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質をコードする核酸と結合することのできるアンチセンス核酸、前記核酸またはアンチセンス核酸を含有するベクター、前記ベクターを含有する宿主細胞、前記タンパク質と結合する抗体、または治療的に有効な量の前記タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞または抗体を含む医薬組成物をＤＣ活性に関連する疾患を患う動物に投与することを含む、前記動物を治療する方法も提供する。
【０１５６】
本発明の範囲内では、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物は、１つまたはそれ以上の任意の投与法を用いて患者に投与しうる。そのような投与方法は技術上周知であり、かつ非経口的注射（例：静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、または組織間腔内）、または直腸内、経口、膣内、局所、経皮、皮内、鞘内、鼻腔内、眼、耳、肺、または他の粘膜投与を含みうる。本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物の経皮投与を目的としてナノパッチを用いうる。本発明の核酸、ベクターまたは医薬組成物の投与を目的として遺伝子銃を用いうる。正確な投与方法は、治療する疾患またな病状によって異なる。
【０１５７】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物は、自己免疫障害、アレルギーまたは他の過敏障害、輸血反応、移植片拒絶および移植片対宿主疾患などの移植片反応を含む移植片反応、および急性および慢性炎症性疾患の治療または予防において用いうる。
【０１５８】
自己免疫障害は、無遊離塩酸自己免疫性慢性活動性肝炎、アジソン病、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリッグ病）、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ腎炎または抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、関節炎、喘息、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、バロー病、ベーチェット病、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳまたは慢性疲労症候群（ＣＦＳ））、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ・シュトラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷アグリチニン症、大腸炎、頭蓋動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、デゴス病、皮膚炎、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、デビック病、１型糖尿病、円板状狼瘡、ダウリング−デゴス病、ドレスラー症候群、好酸球性筋膜炎、後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維筋炎、線維化性肺胞隔炎、胃炎、巨細胞動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー病、グレーヴズ病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ−シュライン紫斑病、肝炎、ヒューズ症候群、特発性副腎萎縮、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、炎症性デミリネーティング多発ニューロパチー、インスリン依存性糖尿病（１型）、過敏性腸症候群、若年性関節炎、川崎病、扁平苔癬、ルー・ゲーリッグ病、リポイド肝炎、ライム病、メニエール病、混合型結合組織病、多発性骨髄腫、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、眼瘢痕性類天疱瘡、骨粗鬆症、扁平部炎、尋常性疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多発内分泌腺症候群、多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、多発筋炎、多発筋炎および皮膚筋炎、先天性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、粘性血症候群（sticky blood syndrome）（またはヒュー症候群）、スティフマン症候群、スティル病、シドナム舞踏病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、ヴェグナー肉芽腫症、およびウィルソン症候群を含むが、これに限定されない。
【０１５９】
アレルギーまたは他の免疫関連過敏症は、ゲル−クームス分類によるＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型またはＩＶ型、およびより判定されることの少ないＶ型過敏性障害を含む任意の既知の過敏性疾患でありうる。そのような障害はアトピー、喘息、胎児エチロブラストーシス、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、血清病、アルツス反応、全身性エリテマトーデス、接触性皮膚炎、ツベルクリン反応検査、慢性移植片拒絶、グレーヴズ病、重症筋無力症、全身性アナフィラキシー、局所性アナフィラキシー、アレルギー性鼻炎、結膜炎、胃腸炎、湿疹、輸血反応、新生児溶血性疾患、関節リウマチ、糸球体腎炎、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、結節性病変、薬剤性溶血性貧血、ループス腎炎、アスペルギルス症、多発筋炎、強皮症、過敏性肺臓炎、ヴェグナー肉芽腫症、１型糖尿病、蕁麻疹／血管性浮腫、または甲状腺の炎症を含むが、これに限定されない。アレルギーまたは過敏性障害は、結核、らい、ブラストミセス症、ヒストプラズマ病、トキソプラズマ病、リューシュマニア病または他の疾患を含むがこれに限定されない感染症と関連しうる。治療しうるアレルギーは、花粉（例：カバノキ、ブタクサ、アブラナ）、食品（例：ナッツ、卵または海産物）、薬剤（例：ペニシリンまたはサリチル酸エステル）、昆虫生成物（例：ミツバチまたはスズメバチ毒またはチリダニ）または動物の毛髪、およびラテックスなどの人工物に対するアレルギー反応を含むが、これに限定されない。治療することのできるアレルギーは節足動物生成物に対するアレルギー反応も含みうる。その他の治療しうる炎症性疾患は、アテローム動脈硬化症または他の心血管系疾患、アルツハイマー病、血管炎、筋炎、脳炎、再灌流傷害、２型糖尿病、脂肪肝疾患、および炎症期、血管新生プロセス、線維血および上皮形成、およびリモデリング期を含む創傷治癒を含む。治療しうる疾患はさらに嚢胞性線維症、気管支拡張症、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む。
【０１６０】
本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物は、多発性鼻腔ポリープ症、子癇前症妊娠高血圧、イールズ病、または急性膵炎の治療または予防においても使用しうる。
【０１６１】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物は、治療または診断手技の過程において、体液または組織が人工物質または非哺乳類物質と接触することにより生じる危険な状態の治療または予防に用いうる。そのような手技は一時的なものでもまたは恒久的なものであってもよく、かつ腎臓または肝臓血液透析、腹膜透析、心肺バイパス、および血液濾過を含む体外循環、血管、膀胱、鞘内腔または他の任意の管腔臓器のいずれかにおけるカテーテル留置、人工関節、心臓弁、血管内ステント、ＣＳＦシャント、血管プロテーゼおよび冠動脈形成カテーテルを含む移植プロテーゼの使用を含むがこれに限定されない。
【０１６２】
本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物は、移植片拒絶などの移植反応を予防する際に有用となり得る治療免疫抑制効果を有する可能性がある。移植片は同一個体間の自家移植片か、遺伝的に適合した個体間の同系移植片、同種の異なる個体間の同種移植片、または異種間の異種移植片でありうる。本発明のタンパク質は、心臓、肺、心肺、腎臓、肝臓、膵臓、腸、手、角膜、顔面再移植および顔面移植を含む皮膚移植片、ランゲルハンス島、骨髄移植片、輸血、血管、心臓弁、骨および皮膚を含むがこれに限定されない幅広い移植片の拒絶を予防する際に有用となり得る。本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物は、骨髄移植後の移植片対宿主疾患の予防を目的として使用しうる。
【０１６３】
発明者らは理論に縛られることを望まないものの、本発明のタンパク質は癌に関与するシグナリング経路に関与すると推定される。本発明のさらなる実施形態においては、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物は癌の治療において使用しうる。本発明は、癌を患う動物に対して、上述のように治療的に有効な量の本発明のタンパク質、核酸、ベクター、抗体または医薬組成物を投与することを含む、前記動物を治療する方法も提供する。そのような治療は、癌における免疫応答の再分極または調節を包含しうる。
【０１６４】
具体的には、癌はリンパ腫または白血病または多発性骨髄腫などの血液の癌でありうる。本発明にしたがって治療しうる白血病は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）およびヘアリー細胞白血病を含む。本発明にしたがって治療しうるリンパ腫は、ホジキン病および非ホジキンリンパ腫を含む。最終的にＡＬＬに進行することのある骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、または骨髄線維症を含む骨髄増殖性疾患、およびＬ鎖病によるアミロイドを含む関連障害も治療しうる。
【０１６５】
さらなる実施形態においては、癌は固形癌、肉腫、または芽種でありうる。本発明は、乳房、肺、卵巣、膵臓、精巣、皮膚、大腸、脳、肝臓または子宮頸部の癌を含むがこれに限定されない任意の臓器の癌および黒色腫の治療を考慮する。治療または予防しうる癌の１つは組織球腫であり、かつ具体的にはイヌ皮膚組織球腫である。
【０１６６】
本発明のさらなる実施形態においては、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物は感染症治療において使用しうる。具体的には、そのような治療はたとえばＨＩＶ、ＴＢおよびマラリアの原因微生物であるウイルス、細菌および原虫類、および他の寄生虫などの病原体による感染に対する免疫応答の再分極または調節を包含しうる。
【０１６７】
マダニなどの吸血性節足動物は、ダニ媒介性脳炎、クリミア−コンゴ出血熱、ナイロビヒツジウイルス、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）（ライム病の病原体）、およびテイレリア・パルバ（Theileria parva）（東海岸熱の病原体）などの感染病原体の供給源である。本発明のタンパク質はダニ媒介性疾患の伝播を促進するよう作用すると推定されている。したがって、本発明のタンパク質およびその相同体およびフラグメントは、ダニ媒介性疾患を治療または予防するための免疫応答を誘発するための動物への予防接種において有用となりうる。したがって本発明のさらなる実施形態においては、本発明のタンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物を動物に投与することを含む、ダニ媒介性感染症の伝播を予防するかまたはダニ媒介性感染症を治療する方法が提供される。本発明は、ダニ媒介性感染症の伝播を予防するかまたはダニ媒介性感染症を治療する際の使用を目的とした本発明のタンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物も提供する。節足動物は吸血性節足動物でありうる。ダニ媒介性疾患はライム病、ダニ媒介性脳炎、クリミア−コンゴ出血熱、ナイロビヒツジウイルスまたは東海岸熱でありうる。
【０１６８】
本発明のタンパク質およびその相同体およびフラグメントは、吸血性節足動物それ自体、およびそれらが媒介する疾患に対するワクチンとしても有用となりうる。したがって本発明は、本発明のタンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞、抗体、または医薬組成物を動物に投与することを含む、マダニでありうる吸血性節足動物に対する予防接種を前記動物に行う方法をさらに提供する。また本発明は、マダニでありうる吸血性節足動物に対する予防接種を動物に行う際の使用を目的とした、本発明のタンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物も提供する。
【０１６９】
上記に論じたように、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体、または医薬組成物を、抗炎症剤、免疫調節剤、免疫抑制剤、サイトカイン、サイトカイン模倣またはサイトカイン結合タンパク質、または上述の疾患のいずれかの治療を目的として開発されたその他の生物学的製剤などの治療薬のうち１つまたはそれ以上と組み合わせて投与することは有益となり得る。
【０１７０】
望ましくない免疫応答と関連するＤＣの分化および成熟を調節または阻害するために、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞または抗体を、それらをＤＣに標的化させる抗原とともにインビボ投与することも有益となりうる。この実施形態においては、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物の適切なＤＣに対する標的化を促進するために、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物を疾患関連要素と組み合わせて患者に投与しうる。本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞または抗体をＤＣと特異的に結合させることによって、すでにそれらがＤＣを標的としている実施形態においては、疾患関連要素は必要でないこともありうる。
【０１７１】
用語「疾患関連要素」は、患者における疾患に関連するあらゆる要素を包含することを意図している。疾患は、上述のような自己免疫障害、アレルギーおよび他の過敏性反応、移植片拒絶および移植片対宿主疾患などの移植片反応、マダニが媒介するものなどを含む感染症、血液悪性腫瘍を含む癌、および急性および慢性感染症を含みうる。したがって、「疾患関連要素」は：ｉ）ウイルス、微生物、寄生虫および微生物毒素などの感染因子に関連する成分；ｉｉ）アレルギーと関連する非自己分子であるアレルゲン；ｉｉｉ）アレルギー以外の過敏性反応と関連する非自己成分；ｉｖ）自己免疫疾患に関連する自己成分；ｖ）同種の遺伝的に異なる個体に由来する移植抗原（アロ抗原）または異なる種に由来する移植抗原（異種抗原）；およびｖｉ）腫瘍関連抗原および腫瘍特異性抗原を含みうる。
【０１７２】
用語「疾患関連要素」はこれらの疾患関連要素のフラグメントおよび誘導体も包含する。そのような誘導体は、なお本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物を適切なＤＣに指向させるよう作用することができる、解毒化物質、合成ミモトープおよびその構造に置換、付加または欠失を含む抗原を含みうる。
【０１７３】
疾患関連要素を動物に提供することは、疾患に関連するＤＣ分化および成熟の調節または阻害の特異性を改善するであろう。この様態で特定のＤＣを標的とすることは全般的な免疫応答を阻害する必要性を回避するので有益であり、またこれは副作用のプロフィールを減少させうる。
【０１７４】
本発明の１つの態様においては、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物は疾患関連要素と別に投与しうる。この態様において、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物と疾患関連要素は連続して投与しうる。他の実施形態においては、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物は疾患関連要素の前に投与しうる。さらなる実施形態においては、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物は疾患関連要素の後に投与しうる。
【０１７５】
さらなる実施形態においては、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物と疾患関連要素は同時に投与しうる。本発明のこの態様において、本発明のタンパク質または抗体を、たとえば融合タンパク質の形態で疾患関連因子と結合させうる。
【０１７６】
したがって本発明は、本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントおよび疾患関連要素を含む融合タンパク質も提供する。そのような融合タンパク質をコードする核酸も提供される。
【０１７７】
本発明は、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、抗体または医薬組成物、疾患関連因子および医薬品として許容できる担体を含む医薬組成物も提供する。
【０１７８】
上述の方法は、動物においてインビボでＤＣの分化および／または成熟を調節、および好ましくは阻害することを目的とした本発明のタンパク質の動物への投与を包含する。タンパク質は単独で投与するか、または本発明のタンパク質をＤＣに標的化させる疾患関連要素を含む追加的薬剤と組み合わせて投与しうる。
【０１７９】
上述の疾患を治療するための代替的な手法は、標的化療法を目的として本発明のタンパク質をエクスビボで用いることである。この手法は、本発明のタンパク質をインビトロでＤＣに送達してＤＣを調節すること、および治療を必要とする動物に調節ＤＣを送達することを包含する。
【０１８０】
さらなる態様において、本発明は、ＤＣを調節するための方法であって、前記方法がＤＣを本発明のタンパク質、またはその相同体またはフラグメントと接触させることを含む方法を提供する。この方法を用いて生成された調節ＤＣも提供される。
【０１８１】
本発明は、ＤＣ関連疾患を治療または予防することを必要とする動物にそれを行う方法であって、当該方法が上述の方法によって生成された調節ＤＣを動物に投与することを含むことを特徴とする当該方法も提供する。
【０１８２】
ＤＣは治療を必要とする動物より直接分離してもよい。代替的に、治療を必要とする動物より骨髄始原細胞の単球などのＤＣ前駆細胞を分離し、さらに調節ＤＣ細胞を作成するために用いてもよい。本発明のこの態様において、ＤＣまたはＤＣ前駆細胞は、ＤＣを本発明のタンパク質で処理したのちに調節ＤＣを導入する動物にとって自己由来であっても、または同種異系であってもよい。
【０１８３】
ＤＣと関連する疾患は、自己免疫疾患、アレルギーおよび他の過敏性疾患、移植片拒絶および移植片対宿主疾患などの移植片反応、マダニが伝播するものを含む感染症、血液悪性腫瘍を含む癌、および急性および慢性炎症性疾患を含む上述の疾患のうちいずれかでありうる。または移植片に対する無応答性を誘発し、かつこれにより免疫抑制剤を投与する必要性を低下させることを狙いとして、この方法を用いて移植片ドナー由来の調節ＤＣを作成し、意図する移植片のレシピエントに移植前に投与することを考慮する。
【０１８４】
本発明のこの態様において、本発明のタンパク質またはその相同体またはフラグメントを適切なＤＣに標的化させるために、上述のようにＤＣを疾患関連要素と接触させうる。代替的に、調節ＤＣは上述のような疾患関連要素と組み合わせて動物に投与しうる。
【０１８５】
（スクリーニング法）
本発明のタンパク質の同族受容体の同定により、潜在的に治療的またはその他の用途のある何らかの化合物を同定するために、本発明のタンパク質の潜在的な作動物質および拮抗物質を同定するためのスクリーニング法において受容体を用いることが可能となる。
【０１８６】
潜在的な作動性または拮抗性化合物は、たとえば細胞、無細胞標本、化学ライブラリまたは天然産物混合物から分離しうる。そのようなスクリーニング技術の適切な総説として、コリガン他、『最新免疫学プロトコル１（２）』第５章（１９９１年）を参照されたい。
【０１８７】
良好な拮抗物質となる可能性が最も高い化合物は、本発明のタンパク質が誘導する生物学的効果を誘導することなく本発明のタンパク質の同族受容体と結合し、それゆえ本発明のタンパク質の機能を競合的に阻害する分子である。上述のように、本発明のタンパク質の同族受容体は、本発明の受容体と結合すると直後に細胞内シグナリング経路を誘導し、ＤＣの分化および成熟の阻害に至るＣ型レクチン受容体である、二価陽イオン依存性受容体と考えられる。潜在的な拮抗物質は、シグナリング経路を活性化することなく、または負のシグナリング経路を活性化することにより受容体と結合する小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を含む。具体的には、適切な潜在的拮抗物質は炭水化物部分、およびその機能を低下させると同時にその受容体との結合親和性を維持するよう操作されている、本発明のタンパク質に対応する操作された分子を含む。さらなる実施形態においては、潜在的な拮抗物質は、シグナリング経路を活性化させることなく、または負のシグナリング経路を活性化させることにより受容体と結合する小さな合成分子を含む。さらなる適切な化合物は、本発明のタンパク質に対する抗体、および本発明のタンパク質に付随する炭水化物部分に対する抗体、および標的特異性について操作することのできるアンチカリンを含む。
【０１８８】
良好な作動物質として機能する可能性が最も高い化合物は、本発明のタンパク質の同族受容体と結合し、かつ本発明のタンパク質と同じ細胞内シグナリング経路を誘導し、これにより本発明のタンパク質と同様の様態でＤＣの分化および成熟を調節、および好ましくは阻害するよう機能する化合物である。適切な潜在的作動物質の例は、受容体を活性化するその能力および／またはその受容体に対する結合親和性を高めるよう操作されている本発明のタンパク質を含む。適切な潜在的作動物質のさらなる例は、小さな有機分子、合成分子、ペプチド、ポリペプチド融合タンパク質、抗体または抗体フラグメントを含む。
【０１８９】
このようなスクリーニング法における使用のための同族受容体（おそらくはＣ型レクチンである二価陽イオン依存性受容体）は、溶媒において遊離型であるか、固形支持体に添付されているか、細胞表面上に担持されているか、または細胞内に配置しうる。一般に、そのようなスクリーニング手順は結合、または機能的応答の促進または阻害を観察するために、受容体を発現しかつ被験化合物と接触している適切な細胞または細胞膜を用いることを包含しうる。その後、被験化合物と接触する細胞の機能的応答を被験化合物と接触しない対照細胞と比較する。そのような分析法によって、本発明のタンパク質による受容体の活性化によって生成されるものと類似したシグナルの生成が被験化合物によって起こるか否かを、適切な検出系を用いて評価することができる。本発明のタンパク質はＣ型レクチン受容体などの細胞表面二価陽イオン依存性受容体と結合し、さらに細胞内シグナリング経路を誘導することにより機能すると考えられるため、スクリーニング法が細胞表面上の受容体の使用、および化合物の受容体への結合による細胞内シグナルの誘導のモニタリングを包含するならば、最も効果的に機能する可能性がある。
【０１９０】
１つの実施形態においては、本発明のタンパク質の作動または拮抗化合物を特定するための方法は：
（ａ）たとえばＣ型レクチン受容体などの二価陽イオン依存性受容体が化合物との結合に応じて検出可能なシグナルを提供することができることを特徴とする、受容体との結合を可能とする条件下で、受容体をその表面上に発現している細胞をスクリーニングする化合物に接触させること；および
（ｂ）化合物と受容体の相互作用により生成するシグナルのレベルを測定することにより、化合物が受容体と結合しかつこれを活性化または阻害するか否か判定することを含む。
【０１９１】
一定の実施形態においては、スクリーニングされる化合物はリガンドの存在下で受容体と接触しうる。そのようなリガンドは、たとえばコレステロールまたはビタミンＤ３またはデキサメタゾンのようなコレステロール代謝物などの脂質でありうる。
【０１９２】
他の実施形態においては、本発明のタンパク質の拮抗化合物を特定するための方法は： 
（ａ）本発明のタンパク質とその同族受容体との結合を可能とする条件下で、たとえばＣ型レクチン受容体などの二価陽イオン依存性受容体が本発明のタンパク質との結合に応じて検出可能なシグナルを提供することができることを特徴とする、受容体をその表面上に発現している細胞を本発明のタンパク質に接触させること；
（ｂ）本発明のタンパク質と受容体との相互作用によって生成するシグナルのレベルを測定すること；
（ｃ）受容体との結合を可能とする条件下でスクリーニングする化合物を添加すること；および
（ｄ）化合物と受容体の相互作用により生成するシグナルのレベルの変化を測定することにより、本発明のタンパク質の結合に対する化合物の効果を判定することを含む。
【０１９３】
一定の実施形態においては、上に論じたような本発明の任意の相同体またはフラグメントを、上述のスクリーニング法において用いうる。
【０１９４】
さらなる一定の実施形態においては、スクリーニングする化合物および／または本発明のタンパク質はリガンドの存在下で受容体と接触させうる。そのようなリガンドは、たとえばコレステロールまたはコレステロール代謝物などの脂質でありうる。
【０１９５】
上記に示された条件は、培地の存在、生理学的濃度のＣａ２＋を含有する溶液の存在、および／または７〜８のｐＨを含みうる。
【０１９６】
上述の検出可能な信号は、細胞内リン酸化、核移行、遺伝子発現および／またはサイトカイン放出を含みうる。
【０１９７】
上述の方法の一定の実施形態においては、Ｃ型レクチン受容体を担持する表面への被験化合物の付着を、被験化合物と直接的または間接的に関連する標識によって、または標識された競合物質との競合を包含する分析法において検出する単純な結合分析を用いうる。他の実施形態においては、Ｃ型レクチン受容体などの二価陽イオン依存性受容体と結合することのできる中和抗体が、被験化合物と結合について特異的に競合する競合的薬物スクリーニング分析法を用いうる。この様態においては、受容体に対して特異的結合親和性を有する任意の被験化合物の存在を検出するために抗体を用いることができる。
【０１９８】
当業者は、本明細書のタンパク質の同族受容体に作用する化合物を同定するための分析法を開発することができるであろう。受容体に対する適切な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングに提供するために用いうる技法は、当業者によって容易に確定される可能性がある（国際特許出願第８４／０３５６４号を参照）。この方法においては、多数の異なる小分子被験化合物を固形基盤上で合成した後、受容体と反応させ、洗浄しうる。ポリペプチドを固定する１つの方法は、非中和抗体を用いることである。結合受容体はその後技術上周知の方法を用いて検出することができる。精製した受容体分子を、前述の薬物スクリーニング法において用いるためのプレート上に直接コーティングすることもできる。
【０１９９】
本発明は、上述の方法によって同定される作動物質、拮抗物質、およびその他の化合物も含む。これらの作動物質、拮抗物質、およびその他の物質は、上述の医薬組成物の一部を形成し、または上述の治療において用いられ得る。
【０２００】
本発明の多様な態様および実施形態は、これより実施例によってより詳細に記載されるであろう。詳細の変更は本発明の範囲から逸脱することなく行いうることが認識されるであろう。
【実施例１】
【０２０１】
（ＲａＡ、ＲａＢおよびＲｓｌの同定）
ジャパニンと関連するタンパク質ＲａＡ、ＲａＢおよびＲｓｌの不完全なアミノ酸配列は、Ｌａｍｂｄａ  Ｚａｐ  ＩＩ（ストラタジーン）より調製された発現ライブラリのリピセファルス（Rhipicephalus）ｃＤＮＡを増幅することにより得られた。増幅は、変成ジャパニン由来順方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を、ＲａＢの場合はベクター特異的逆方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、またはＲａＡおよびＲｓｌの場合はジャパニン特異的逆方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）のいずれかと組み合わせて用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により実施した。
【実施例２】
【０２０２】
（ジャパニンとＲａＡ、ＲａＢおよびＲｓｌのそれぞれとの配列比較）
以下のオプションによるｃｌｕｓｔａｌＷを用いて、ＲａＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＲａＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）およびＲｓｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）のアミノ酸配列を、それぞれジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）と配列比較した：ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．１  ；ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．０；ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ＝ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ；ｍａｔｒｉｘ＝ｇｏｎｎｅｔ。これらの配列決定の結果はそれぞれ図２、４および６に示す。
【０２０３】
ＲａＡについては、配列を形成する１３１残基のうち、６１残基（４６．５６％）は同一、２６残基（１９．８５％）は強い類似および（２２残基）１６．７９％は弱い類似である。
【０２０４】
ＲａＢについては、配列を形成する１３８残基のうち、７３残基（５２．９％）は同一、３０残基（２１．７４％）は強い類似および１２残基（８．７％）は弱い類似である。
【０２０５】
Ｒｓｌについては、配列を形成する１３１残基のうち、１０５残基（８０．１５％）は同一、１２残基（９．１６％）は強い類似および７残基（５．３４）％は弱い類似である。
【実施例３】
【０２０６】
（ジャパニン、ＲａＡ、ＲａＢおよびＲｓｌの配列比較）
以下のオプションによるｃｌｕｓｔａｌＷを用いて、ＲａＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＲａＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）Ｒｓｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）およびジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のアミノ酸配列を配列比較した：ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．２；ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．０；ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ＝ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ；ｍａｔｒｉｘ＝ｇｏｎｎｅｔ．配列比較の結果を図７に示す。
【実施例４】
【０２０７】
（ジャパニン、ＲａＡ、ＲａＢ、ＲｓＬおよびＤＡの配列比較）
以下のオプションによるｃｌｕｓｔａｌＷを用いて、ＲａＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＲａＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）Ｒｓｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ジャパニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）のアミノ酸配列を配列比較した：ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．２；ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．０；ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ＝ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ；ｍａｔｒｉｘ＝ｇｏｎｎｅｔ．配列比較の結果を図８に示す。
【０２０８】
図８は、これら５つのタンパク質がマダニリポカリンファミリーにおいて特異なクラスタを形成することを示す。その進化的関連性および構造的類似性より機能の保存が示唆される。
【０２０９】
発明者らは、事前に同定されない３つのＤＣ調節タンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列を提供している。配列の相同性および配列比較試験に基づき、発明者らはこのようなタンパク質の構造および機能にとって重要となり得る数多くのモチーフおよび形質を判定することができている。これらの結果より、治療における使用を目的としたさらなるＤＣ調節分子を設計する上で有用となる可能性のあるそのような分子の研究への洞察がもたらされる。
【０２１０】
以下の一般的な実験技法は、実施例５〜８に記載の実験のために用いられた：
【０２１１】
特に記載がない限り、細胞培地および上清はＰＡＡ由来である。
【０２１２】
ＬＰＳは、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）０５５：Ｂ５のトリクロロ酢酸抽出標本であった（シグマ、製品コードＬ４００５）。ヒト樹状細胞（ＤＣ）は、健康成人ドナーより分離した末梢血単球より作成した。簡単に述べると、白血球コーン（国立血液サービス、オックスフォード）をＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含まないリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）と１：３（ｖ／ｖ）で混合し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ  （Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌｄ）上に慎重に層状に重ね、８００ｇで３０分間（２２℃で）遠心分離した。ＰＢＳ／バフィーコート混合物とＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐの接触面に形成された末梢血単球（ＰＢＭＣ）層を注意深く捕集し、ＰＢＳで３回洗浄して血小板を除去した（初回４００ｇ、次に３００ｇ、また最後に２００ｇとして毎回４℃で１０分間遠心分離）。
【０２１３】
単球は、Ｅａｓｙｓｅｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔキット（ステムセル・テクノロジーズ）を用いて、ネガティブセレクションによりＰＢＭＣから分離した。ＰＢＭＣをＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含有しないＰＢＳに再懸濁し、次に製造者の指示にしたがってキットを使用した。精製した単球を、１０％ウシ胎児血清（ＲＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０００Ｕ／ｍＬヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｇｅｎｔａｕｒ）および２５０ｎｇ／ｍＬヒトインターロイキン４（ＩＬ−４）を含有するＤＣ−ＲＰＭＩ：ＲＰＭＩ  １６４０に５×１０５／ｍＬで再懸濁した。３日後、培地の１／３を除去して遠心分離し、１０００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦおよび７５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−４を含有する同体積の新鮮培地にペレットを再懸濁し、その後培養に戻した。５日後、細胞はすぐに使用するかまたは凍結した。細胞を凍結するために、ＨＢＳＳ／２％ＦＣＳで洗浄し、５．５％ヘタスターチ（ジョン・ラドクリフ病院薬局製「Ｖｏｌｕｖｅｎ」／４．８％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（シグマ社製Ｈｙｂｒｉｍａｘ等級））／３．８％ＦＣＳの等張食塩水溶液に再懸濁した後、制御冷凍装置（１℃／分）の−８０℃冷凍庫内に留置した。
【実施例５】
【０２１４】
（相同体の５’配列のＰＣＲクローニング）
Ｒｓｌ、ＲａＡおよびＲａＢの欠損Ｎ末端アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２、４および６で表される部分配列を得るために用いたリピセファルス（Rhipicephalus）発現増幅ライブラリよりｃＤＮＡを増幅することによって得た。
【０２１５】
増幅は、遺伝子特異的逆方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、２１または２２）をベクター特異的順方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）と組み合わせて用い、かつＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム）を製造者の指示にしたがって用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施した。ＰＣＲ生成物は、製造者の指示にしたがってｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯクローニングベクター（インビトロジェン）にクローニングし、さらに連結されたプラスミドをＴＯＰ  １０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（インビトロジェン）の形質転換に用い、その後これをＬＢ寒天に蒔いた。その後、個々のコロニーを取り出して液状ＬＢ培地で培養し、さらにＱＩＡｐｒｅｐシステム（キアゲン）を用いてそれらよりプラスミドＤＮＡを調製した。これらのプラスミドの配列決定より、Ｒｓｌ、ＲａＡおよびＲａＢの５’ｃＤＮＡ配列が提供された（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、４５および４６に示す）。
【実施例６】
【０２１６】
（相同体の３’配列のＰＣＲクローニング）
ＲｓｌおよびＲａＡの欠損Ｃ末端アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４および６で表される部分配列を得るために用いたリピセファルス（Rhipicephalus）発現増幅ライブラリよりｃＤＮＡを増幅することによって得られた。ＲａＢのＣ末端配列の確認には同じ手法を用いた（先に決定済み；実施例１，ＳＥＱ  ＩＤ４を参照）。
【０２１７】
増幅は、遺伝子特異的順方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、４８または４９）をベクター特異的逆方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）と組み合わせて用い、かつＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム）を製造者の指示にしたがって用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施した。ＰＣＲ生成物は、製造者の指示にしたがって、Ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  Ｂｌｕｎｔクローニングキット（ノバジェン）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅクローニングベクターにクローニングし、かつ連結されたプラスミドをＴＯＰ  １０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（インビトロジェン）の形質転換に用い、その後これをＬＢ寒天に蒔いた。個々のコロニーを取り出して液状ＬＢ培地で培養し、さらにＱＩＡｐｒｅｐシステム（キアゲン）を用いてそれらよりプラスミドＤＮＡを調製した。これらのプラスミドの配列決定により、Ｒｓｌ、ＲａＡおよびＲａＢの３’ｃＤＮＡ配列が提供され、またこれを事前に作成した配列と合わせて全長ヌクレオチドｃＤＮＡ配列（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４２および４３で表される）を、またこれによりコードされるペプチド配列（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２４、２５および２６）を得た。ＳｉｇｎａｌＰ（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）を用いてタンパク質の中のシグナルペプチドである可能性の高い部分が同定され、成熟分泌タンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、２８および２９に示すアミノ酸配列を有することが示唆された。
【実施例７】
【０２１８】
（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における相同体の発現）
相同体の活性を試験するために、それらをＣＨＯ細胞に発現させた。それぞれをコードする合成遺伝子を哺乳類発現ベクター（ｐＣＤＮＡ３．１）にサブクローニングし、これらの発現構築体を用いてＣＨＯ細胞をトランスフェクトし、さらにウェスタンブロッティングによりトランスフェクタント上清中の組換えタンパク質の存在を確認した。
【０２１９】
（ａ．合成遺伝子）
ＣＨＯ細胞発現用に最適化した合成遺伝子は、ＤＮＡ２．０によって作成した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、３１および３２）。それらは相同体の全長ペプチド配列をコードし、またＣ末端延長はリンカー部分（ＧＧ）、および検出および精製を容易にするポリヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）をコードする。それらは、真核細胞発現を可能にする）５’−Ｋｏｚａｋ配列を含む非コーディングＤＮＡ（およびサブクローニングを促進する制限酵素部位：５’ＢａｍＨＩｓｉｔｅおよび３’Ｎｏｔｌｓｉｔｅも含む。
【０２２０】
（ｂ．ｐＣＤＮＡ３．１へのサブクローニング）
合成遺伝子はクローニングベクターにおいて提供されるので、それらを発現ベクターに導入して組換えタンパク質を生成する必要があった。ＣＨＯ細胞内での発現を目的として、我々はｐＣＤＮＡ３．１哺乳類発現ベクターを選択し、そこにおいて、すなわちＣＭＶプロモータにより発現を実行した。
【０２２１】
ｐＣＤＮＡ３．１は、親ｐＣＤＮＡ３．１−ｖ５−ｈｉｓ  Ｃ（インビトロジェン）より、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔｌ制限酵素（ニューイングランドバイオラボ）で複数のクローニング領域を切断し、ＦａｓｔＡＰアルカリホスファターゼ（フェルメンタス：Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で処理してベクターの細胞連結を低下させ、さらにＱＩＥｘ  ＩＩシステム（キアゲン）を用いてゲルによりベクターバックボーンを精製して調製した。合成遺伝子は、そのキャリアプラスミドより、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔｌ制限酵素で相同体コード領域（Ｋｏｚａｋ配列およびポリヒスチジンタグを含む）を切断し、さらにＱＩＥｘ  ＩＩシステムを用いてゲルによりそれらを精製して調製した。
【０２２２】
ｐＤＮＡ３．１相同体構築物は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（フェルメンタス）を用いて切断した合成遺伝子を調製したｐＤＮＡ３．１に連結することにより作成した。連結したＤＮＡを用いて競合Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、その後ＬＢ寒天上に蒔き、液体培養用に個々のコロニーを選別することを可能とした。ＱＩＡｐｒｅｐｓｙｓｔｅｍ（キアゲン）を用いてこれらの培養よりプラスミドＤＮＡを抽出し、配列決定によりその同一性を確認した。その後、合成遺伝子を取り込んだＤＮＡをトランスフェクションに用いた。
【０２２３】
（ｃ．ＣＨＯ細胞のトランスフェクション）
ＣＨＯ細胞は、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地内で、標準的な細胞培養条件下で培養した。トランスフェクションのために、２４ウェルプレートに推定３０〜４０％で細胞を播種し、一晩培養した。次に、８０〜９５％コンフルエントのウェルをトランスフェクション用に選択した。細胞を、ｐＣＤＮＡ３．１−相同体構築物、ｐＣＤＮＡ３．１−ジャパニン−ｈｉｓ（ポジティブコントロールとして）、ｐＣＤＮＡ３．１−ｌａｃＺ−ｈｉｓ（トランスフェクションに対するポジティブコントロールかつＤＣ調節活性に対するネガティブコントロールとして）またはトランスフェクション試薬のみ（モックトランスフェクションコントロール）でトランスフェクトした。トランスフェクションは、ＴｒａｎｓＩＴ２０２０試薬（マイラス）により、１ウェルにつき試薬１．５μＬおよびプラスミドＤＮＡ  ５００ｎｇを製造者の指示にしたがって用いて実施した。７２時間後に上清を回収し、速やかに分析または凍結した。
【０２２４】
（ｄ．発現を確認するためのウェスタンブロッティング）
ポリヒスチジンタグタンパク質の発現は、ウェスタンブロッティングにより確認した。
【０２２５】
ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）ローディングバッファー（インビトロジェン）に、トランスフェクタント上清６．５μＬをジチオスレイトール（ＤＴＴ）（最終濃度５０ｍＭ）とともに添加し、７０℃で１０分間加熱してタンパク質を変性させた。調製したサンプルを４〜２０％アクリルアミドＰｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎプレキャストゲル（サーモフィッシャー）上で電気泳動させ、その後Ｔｏｗｂｉｎバッファー中でのウェット転写により、ニトロセルロース膜に４００ｍＡの定常電流で１時間転写した。
【０２２６】
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｔ２０（ＰＢＳ）ブロッキングバッファー（サーモフィッシャー）により膜を室温で３０分ブロッキングし、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０ですすぎ、その後ＰＢＳ／３％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１／１０００希釈したａｎｔｉ−ｐｅｎｔａｈｉｓ−ｂｉｏｔｉｎ  （キアゲン）において６℃で一晩インキュベートした。その後ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で徹底的に洗浄し、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１／２００００希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（ジャクソン・イムノリサーチ）において３０分間室温でインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０洗浄をさらに実施し、またＥＣＬ基質（ＧＥライフサイエンス）を適用した後、Ｘ腺フィルムを膜に感光させた。
【０２２７】
現像したフィルムは、トランスフェクタント上清中の各ポリヒスチジンタグジャパニン相同体の存在を明らかにした（図９を参照）。
【実施例８】
【０２２８】
（相同体トランスフェクタント上清の樹状細胞調節活性）
（ａ  刺激に応答したＣＤ８６のアップレギュレーションの阻害）
ＤＣ調節活性のスクリーニングは、前述の方法で作成されたヒト単球由来ＤＣを用いて実施した。９６−ウェル平底組織培養プレート（コーニング）中で、スクリーニングするサンプルを添加したＤＣ−ＲＰＭＩ内でＤＣを培養した。トランスフェクタント上清を総体積の１０％添加し、同時に精製ジャパニンを５００ｎｇ／ｍＬで用いた。２４時間培養した後、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）を添加してＤＣを刺激した。さらに１８から２４時間培養した後、フローサイトメトリーでＣＤ８６発現レベルを評価し、その後１／５０希釈した抗ヒトＣＤ８６−ＰＥ、クローンＩＴ２．２（イーバイオサイエンス）で染色した。フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ベクトン・ディキンソン）を用いて実施した。３つの相同体のそれぞれでトランスフェクトした細胞の上清は、ＬＰＳ処理および未処理ＤＣのいずれにおいても、ジャパニントランスフェクタント由来の上清と匹敵する程度にＣＤ８６発現を低下させることが確認された（図１０参照）。
【０２２９】
（ｂ  刺激に応答したＢ７−Ｈ１のアップレギュレーションの促進）
ＤＣは、トランスフェクタント上清およびＬＰＳで上記４．１に記載の方法により処理した。次に、フローサイトメトリーでＢ７−Ｈ１（ＣＤ２７４）のレベルを評価した後、１／１００希釈した抗ヒトＢ７Ｈｌ−ＰＥＣｙ７、クローンＭＩＨ１（イーバイオサイエンス）で染色した。フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ベクトン・ディキンソン）を用いて実施した。
【０２３０】
３つの相同体のそれぞれまたはジャパニンによりトランスフェクトとされた細胞は、ＬＰＳ単独による誘導よりも、Ｂ７−Ｈ１発現のレベルを促進することが確認された（図１１参照）。
【０２３１】
これにより、相同体（およびジャパニン）はＤＣを調節型表現型に誘導し、（Ｔ細胞共刺激性）ＣＤ８６のレベルを低下させ、同時に（Ｔ細胞「共阻害性」）Ｂ７−Ｈ１のレベルを高めることが示唆される。
【配列表フリーテキスト】
【０２３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１はＲａＡのヌクレオチド配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２はＲａＡのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３はＲａＢのヌクレオチド配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４はＲａＢのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５はＲｓｌのヌクレオチド配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６はＲｓｌのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７はジャパニンのヌクレオチド配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８はジャパニンのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９はＤＡのヌクレオチド配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０はＤＡのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１はＲＭのヌクレオチド配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２はＲＭのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３はＡＭのヌクレオチド配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４はＡＭのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５はＲａＣのヌクレオチド配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６はＲａＣのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７は変成ジャパニン由来順方向プライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８はベクター特異的逆方向プライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９はジャパニン特異的逆方向プライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０はＲｓｌ特異的逆方向プライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１はＲａＡ特異的逆方向プライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２はＲａＢ特異的逆方向プライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３はベクター特異的順方向プライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４はＲｓｌの全長アミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５はＲａＡの全長アミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６はＲａＢの全長アミノ酸配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７はＲｓｌの予測成熟ペプチド配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８はＲａＡの予測成熟ペプチド配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９はＲａＢの予測成熟ペプチド配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０はＲｓｌ合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１はＲａＡ合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２はＲａＢ合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３〜４０はＣＸＸＷモチーフを示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１はＲｓｌの全長ＤＮＡ／コード配列である（終止コドンを含む）。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２はＲａＡの全長ＤＮＡ／コード配列である（終止コドンを含む）。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３はＲａＢの全長ＤＮＡ／コード配列である（終止コドンを含む）。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４はＲｓｌ５’ＤＮＡ配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５はＲａＡ５’ＤＮＡ配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６はＲａＢ５’ＤＮＡ配列である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７はＲｓｌ特異的順方向プライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８はＲａＡ特異的順方向プライマーである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９はＲａＢ特異的順方向プライマーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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