(57)【要約】  本発明は、以下のステップ：（a）サブミクロンの水中油型エマルションの調製、（b）無菌グレードフィルターによる水中油型エマルションの事前ろ過、及び（c）ステップ（b）に従ってろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）のフィルターと別の無菌グレードのフィルターによるろ過、を含む、サブミクロンの水中油型エマルションの生産のためのプロセスを提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（a）サブミクロンの水中油型エマルションの調製、
（b）無菌グレードのフィルターによる水中油型エマルションの事前ろ過、及び
（c）ステップ（b）に従ってろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）のフィルターと別の無菌グレードのフィルターによるろ過、
を含む、サブミクロンの水中油型エマルションの生産のためのプロセス。
【請求項２】
以下のステップ：
（a）水中油型エマルションの調製、
（b）無菌グレードのフィルターによる水中油型エマルションの事前ろ過、
（c）ステップ（b）に従って事前ろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）のフィルターと別の無菌グレードのフィルターによるろ過、並びに、
（d）ステップ（c）に従ってろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）又は（c）のフィルターと別のフィルターによるろ過、
を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
以下のステップ：
（a）水中油型エマルションの調製、
（b）水中油型エマルションの事前ろ過、
（c）ステップ（b）に従って事前ろ過した水中油型エマルションの、無菌グレードのフィルターによるろ過、
（d）ステップ（c）に従ってろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）又はステップ（c）のフィルターと別のフィルターによるろ過、並びに、
（e）ステップ（d）に従ってろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）、（c）、及び／又は（d）のフィルターと別の無菌グレードフィルターによるろ過、
を含む、請求項2に記載のプロセス。
【請求項４】
一以上のフィルターの膜がポリエーテルスルホン、例えば親水性ポリエーテルスルホンを含む、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項５】
無菌グレードフィルターの孔径が約0.2μm、例えば0.22μmである請求項1〜4のいずれかに記載のプロセス。
【請求項６】
ステップ（c）において用いられるフィルターの孔径が、無菌グレードから約2μm、例えば、約2μm、約1.5μm、約1μm、約0.9μm、約0.8μm、約0.7μm、約0.6μm、約0.5μm、約0.45μm、又は無菌グレード、例えば約0.2μm、例えば0.22μmである請求項2、4又は5のいずれかに記載のプロセス。
【請求項７】
ステップ（b）及び／又はステップ（d）において用いられるフィルターの孔径の範囲が、無菌グレードフィルター（約0.2μm）から約2μm、特に無菌グレードフィルターから約1μmであり、例えば、約2μm、約2.5μm、約1μm、約0.9μm、約0.8μm、約0.7μm、約0.6μm、約0.5μm、約0.45μm、又は無菌グレード、例えば約0.2μm、例えば0.22μmである、請求項3〜5のいずれかに記載のプロセス。
【請求項８】
各フィルターの差圧が約1bar〜約1.5bar、例えば約1barである、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項９】
ろ過を、15℃〜30℃、16℃〜29℃、17℃〜28℃、16℃〜27℃、16℃〜28℃、又は約22℃±4℃で行う、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１０】
水中油型エマルションが2%〜15%（v/v）の油を含む、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１１】
サブミクロンの水中油型エマルションが4%〜6%（v/v）の油を含む、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１２】
水中油型エマルションが8%〜12%（v/v）の油を含む、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１３】
サブミクロンの水中油型エマルションがスクアレン及び一以上の界面活性剤を含む、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１４】
サブミクロンの水中油型エマルションがスクアレン、トコール及び界面活性剤を含む、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１５】
トコールがα−トコフェロールである請求項14に記載のプロセス。
【請求項１６】
界面活性剤がモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（TWEEN 80／ポリソルベート80）である請求項13〜15のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１７】
サブミクロンの水中油型エマルションがスクアレン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（TWEEN 80）及びトリオレイン酸ソルビタン（SPAN 85）を含む請求項16に記載のプロセス。
【請求項１８】
サブミクロンの水中油型エマルションがスクアレン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン界面活性剤及び疎水性非イオン界面活性剤を含む、請求項13に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サブミクロンの水中油型エマルションの生産、特に、サブミクロンの水中油型エマルションのろ過のための改善されたプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
製造方法は、Ott et al., 2000 (The Adjuvant MF59: A 10-year Perspective. Vaccine Adjuvants: Preparation methods and Research Protocols [Methods in Molecular medicine, Vol. 42, Chapter 12, p211-228]）、Ott et al., 1995 (MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines: Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach [Pharmaceutical Biotechnology volume 6] eds. Powell & Newman）、 WO06/100110A1、及び、Lidgate et al., 1992 (Sterile Filtration of a Parenteral Emulsion. Pharmaceuticals Research 9(7): 860-863)に開示されている。
【０００３】
水中油型エマルションは、ワクチン／免疫原性組成物において、アジュバントとして用いることができる。これらのエマルションはヒトに投与されるので、エマルションが無菌であることが必要である。アジュバントとして用いられる水中油型エマルションはサブミクロンのエマルションであり、その油滴は、0.2μmのフィルターで無菌ろ過するのに、十分に小さい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO06/100110A1
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ott et al., 2000 (The Adjuvant MF59: A 10-year Perspective. Vaccine Adjuvants: Preparation methods and Research Protocols [Methods in Molecular medicine, Vol. 42, Chapter 12, p211-228]）
【非特許文献２】Ott et al., 1995 (MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines: Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach [Pharmaceutical Biotechnology volume 6] eds. Powell & Newman）
【非特許文献３】Lidgate et al., 1992 (Sterile Filtration of a Parenteral Emulsion. Pharmaceuticals Research 9(7): 860-863)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的はサブミクロンの水中油型エマルションの生産、特に、水中油型エマルションのろ過のためのプロセスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明はサブミクロンの水中油型エマルションの生産、特に、サブミクロンの水中油型エマルションのろ過のためのプロセスに関する。
【０００８】
本発明は以下のステップ：
（a）サブミクロンの水中油型エマルションの調製、
（b）無菌グレードのフィルターによる水中油型エマルションの事前ろ過、及び
（c）ステップ（b）に従ってろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）のフィルターと別の無菌グレードのフィルターによるろ過
を含む、サブミクロンの水中油型エマルションの生産のためのプロセスを提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
水中油型エマルション、特にサブミクロンの水中油型エマルションは、免疫学的アジュバントとして用いることができる。インフルエンザ抗原等の抗原と併せて前記水中油型エマルションを含むワクチン組成物は、非経口的に投与されるので、水中油型エマルションが無菌であることが必要である。本発明者は、無菌のサブミクロンの水中油型エマルションを生産するには、エマルションを単一の無菌グレードのフィルターでろ過するだけでは不十分であることを示した。本発明者は、無菌の水中油型エマルションを製造するには、無菌グレードのフィルターによるろ過に先立って、水中油型エマルションを事前ろ過する事が必要であることを示した。
【００１０】
したがって本発明は、以下のステップ：
（a）サブミクロンの水中油型エマルションの調製、
（b）無菌グレードのフィルターによる水中油型エマルションの事前ろ過、及び
（c）ステップ（b）に従ってろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）のフィルターと別の無菌グレードのフィルターによるろ過
を含む、サブミクロンの水中油型エマルションの生産のためのプロセスを提供する。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、以下のステップ:
（a）サブミクロンの水中油型エマルションの調製、
（b）無菌グレードのフィルターによる水中油型エマルションの事前ろ過、
（c）ステップ（b）に従って事前ろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）のフィルターと別のフィルターによるろ過、並びに、
（d）ステップ（c）に従ってろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）又は（c）のフィルターと別の無菌グレードのフィルターによるろ過
を含む、サブミクロンの水中油型エマルションの生産のためのプロセスを提供する。
【００１２】
この特定の実施形態では、ステップ（c）において用いるフィルターは、その孔径の範囲が、無菌グレードフィルター（すなわち約0.2μm）から約2μmであることができる。特に、上記実施形態では、ステップ（c）で用いるフィルターの孔径の範囲は、無菌グレードのフィルターのサイズから約1μmのサイズである。例えば、ステップ（b）において用いられるフィルターの孔径は、約2μm、約2.5μm、約1μm、約0.9μm、約0.8μm、約0.7μm、約0.6μm、約0.5μm、0.45μm、又は無菌グレード、例えば約0.2μm、例えば0.22μmである。
【００１３】
サブミクロンの水中油型エマルションは、液滴の平均サイズが1μmより小さい水中油型エマルションである。液滴サイズの測定方法は当業者によく知られており、例えば動的光散乱法がある。サブミクロンの水中油型エマルションは、当業者に知られる方法、例えばマイクロフルイダイザーを用いて、高圧均質化等の方法によって製造することができるが、これらに限定されるものではない。本発明の特定の実施形態では、サブミクロンの水中油型エマルションの平均油滴サイズは、約220nm（0.2μm）より小さく、特に約120nm〜約180nmである。
【００１４】
「無菌グレードのフィルター」は、1×107／cm2（有効ろ過面積）と同等又はそれ以上の接種レベルの微生物の接種後に、無菌溶出液を調製できるフィルターを意味する。無菌グレードのフィルターは当業者によく知られており、約0.2μmの孔径を有し、孔径約0.22μmのフィルターを含む。
【００１５】
フィルターの膜は、当業者に知られるいずれの適した材料、例えば、酢酸セルロース、ポリエーテルスルホン（PES）、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）から作られても良いが、これらに限定されるものではない。本発明の特定の実施形態では、本発明の一以上又は全てのフィルターの膜が、ポリエーテルスルホン、例えば親水性ポリエーテルスルホンを含む。
【００１６】
本発明の別の実施形態では以下のステップ：
（a）サブミクロンの水中油型エマルションの調製、
（b）水中油型エマルションの事前ろ過、
（c）ステップ（b）に従って事前ろ過した水中油型エマルションの、無菌グレードのフィルターによるろ過、
（d）ステップ（c）に従ってろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）又はステップ（c）のフィルターと別のフィルターによるろ過、並びに、
（e）ステップ（d）に従ってろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）、（c）、及び／又は（d）のフィルターと別の無菌グレードフィルターによるろ過
を含む、本明細書に記載のプロセスを提供する。
【００１７】
この特定の実施形態では、ステップ（b）及び／又はステップ（d）で用いられるフィルターはその孔径の範囲が、無菌グレードのフィルター（約0.2μm）から約2μm、特に、無菌グレードのフィルターから約1μmであって良い。例えば、ステップ（b）及び／又は（d）において用いられるフィルターの孔径は、約2μm、約2.5μm、約1μm、約0.9μm、約0.8μm、約0.7μm、約0.6μm、約0.5μm、0.45μm、又は無菌グレード、例えば約0.2μm、例えば0.22μmである。ステップ（b）及び（d）において用いられるフィルターは互いに同じ多孔度を有していても良いし、互いに異なる孔径を有していても良い。
【００１８】
本発明の特定の実施形態では、各フィルターの差圧が約1bar〜約1.5bar、例えば約1barである本発明のプロセスを提供する。
【００１９】
別の実施形態では、ろ過を、約15℃〜約30℃、約16〜約29℃、約17℃〜28℃、約16℃〜約27℃、又は約16℃〜約28℃、又は22℃±4℃の温度で行う本発明のプロセスを提供する。
【００２０】
本発明の一実施形態では、サブミクロンの水中油型エマルションは、油を、約2%〜約15%、約4%〜約12%、約5%〜約10%、約4%〜約6%、約8%〜約12%、例えば約5%又は10%（v/v）含む。
【００２１】
水中油型組成物がヒトへの投与に適しているためには、油相は代謝可能な（すなわち生分解性の）油を含む必要がある。油は、被験者にとって毒性でなく、代謝によって変換可能ないずれの植物油、魚油、動物油又は合成油であっても良い。木の実、種及び穀物は植物油の一般的な原料である。合成油もまた好適である。したがって，本発明の水中油型エマルションは代謝可能な油を含み、特定の実施形態では本発明の水中油型エマルションはスクアレン（例えば約4%〜6%（v/v））を含む。
【００２２】
本発明の水中油型エマルションは、トコールもまた含んで良い。トコールは本分野でよく知られており、EP0382271に記載されている。特に、トコールはα−トコフェロール、又はその誘導体のα−トコフェロールコハク酸エステル（ビタミンEコハク酸エステルとしても知られる）等である。
【００２３】
本発明の特定の実施形態では、スクアレン（例えば約5%（v/v））及びα−トコフェロール（例えば約5%（v/v））を含む本発明の水中油型エマルションを提供する。
【００２４】
本発明の水中油型エマルションは一以上の界面活性剤を含む。好適な界面活性剤は当業者によく知られており、限定するものではないが、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（TWEEN 80、ポリソルベート80）、トリオレイン酸ソルビタン（SPAN 85）、ホスファチジルコリン（レシチン）、ポリオキシエチレン（12）セトステアリルエーテル、及びオクトキシノール−9（TRITON X−100）を含む。本発明の特定の実施形態では、水中油型エマルションは、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（TWEEN 80、ポリソルベート80）を含む。別の実施形態では、本発明の水中油型エマルションは、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（TWEEN 80）及びさらに界面活性剤、特にトリオレイン酸ソルビタン（SPAN 85）を含む。
【００２５】
本発明の特定の実施形態では、水中油型エマルションは、代謝可能な油（例えばスクアレン）、トコール（例えばα−トコフェロール）及び界面活性剤（例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（TWEEN 80、ポリソルベート80））を含む。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、本発明の水中油型エマルションは代謝可能な油（例えばスクアレン）、界面活性剤（例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート80））、及び任意に二つ目の界面活性剤（例えばトリオレイン酸ソルビタン（SPAN 85））を含む。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、本発明の水中油型エマルションは代謝可能な油（例えばスクアレン）、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの親水性非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（12）セトステアリルエーテル）、及び疎水性非イオン性界面活性剤（例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート80）、又はトリオレイン酸ソルビタン（SPAN 85））を含む。
【００２８】
本発明の「ワクチン組成物」に関する本明細書の実施形態は、本発明の「免疫原組成物」に関する実施形態にもまた適用可能であり、逆もまた同様である。
【００２９】
本明細書の用語「含む」、「から成る」、及びそのバリエーション等は、全ての場合において、用語「構成される」及びそのバリエーション等に任意に置換可能であると理解されたい。
【００３０】
数値Xに関する用語「約」はX±5%又は10%を意味する。
【実施例】
【００３１】
方法
乳化プロセス
水相はタンク2で、注射用水、リン酸緩衝生理食塩水及びTWEENを混合して調製した。油相はタンク1で、トコフェロール及びスクアレンを混合して調製した。両相を均一になるまで攪拌した。全装置を、トコフェロールの酸化を防ぐために窒素を流して洗浄した。
【００３２】
膜ポンプによって高圧ホモジナイザーに供給した。両相を必要な流速比で供給した。最初、両相を高せん断ホモジナイザーに通過させ、粗いエマルションを得た。その後、高せん断ホモジナイザーに続いて高圧ホモジナイザーに産物を入れ、微細なエマルションを得た。
【００３３】
混合装置の出口から、産物をタンク3に回収した（最初の通過）。タンク2及び1が空になったら、タンク3からエマルションを混合装置の入り口に送り、2回目の通過を行った。2回目の通過が終わったら、産物はタンク2に回収した。タンク3が空になったら、タンク2からエマルションを混合装置の入り口に送り、3回目の通過を行った。エマルションはタンク3に回収し、窒素下でろ過まで保管した。
【００３４】
ろ過プロセス
ろ過は0.5／0.2μmの膜の組み合わせから成る2つの滅菌フィルターによって、最大圧力1barで、18℃〜26℃の温度で、及び接触時間最大3時間で行う。ろ過プロセスの有効性を明らかにするために、フィルターの膜は、107 CFU／膜cm2の濃度でエマルションに懸濁したB. diminutaの接種を行う必要がある。幾つかの構成を試験して、最適な設定を見出した。
【００３５】
最初の構成では、産物にB. diminuta細菌を107 CFU／膜cm2の濃度で接種し、二つの0.5／0.2μmのフィルターで、最大圧力1bar、及び18℃〜26℃の温度でろ過した。菌を接種した産物とフィルターの接触時間は最大3時間であった。
【００３６】
あるいは、産物は最初に0.5μmの平らな膜で事前ろ過した。その後、産物にB. diminuta細菌を107 CFU／膜cm2の濃度で接種し、0.2又は0.5／0.2又は0.2／0.2μmの平らな膜で、最大圧力1barで、及び18℃〜26℃の温度でろ過した。菌を接種した産物とフィルターの接触時間は最大1.5時間であった。
【００３７】
最後に、産物は0.5μm及び0.2μmのフィルターを含むカプセルで最初に事前ろ過した。その後、産物はB. diminuta細菌を107 CFU／膜cm2の濃度で接種し、0.2μmのカプセルで、最大圧力1barで、及び18℃〜26℃の温度でろ過した。菌を接種した産物とフィルターの接触時間は最大3時間であった。
【００３８】
全ての場合において、フィルターは最後の膜滅菌の後に回収し、全容量を0.45μm回収フィルターでろ過し、B. diminutaの存在を確認した。0.45μmフィルターをTSAプレート上に配置し、7日間30℃でインキュベートした。その後プレートは2日、3日、4日及び7日目に視覚的に観察した。コロニーが認められた場合、カウントし、確認した。
【００３９】
結果
事前ろ過が行われない場合、又は0.5μmの事前ろ過が行われた場合、目詰まり前にフィルターを通過する容量は、107 CFU／cm2のBCT必要量を満たすのに必要な目標保持容量19.14ml/cm2に達するのに必要な最小保持容量よりも少なかった。0.5/0.2μmの膜を含むカプセルが事前ろ過のフィルターとして用いられた場合には、保持容量は19.4ml/cm2まで上昇し、いずれの通過も全く観察されなかった。
【表１】
2013528196.tif 000002
【００４０】
結論
これらの結果によって明らかとなったのは、エマルションにおいては、少なくとも0.2μmのフィルターを含む事前ろ過の実施が滅菌フィルターのキャパシティーを改善する事、及び前記実施が無菌溶出液を得たことを示すための必要条件である事である。
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月8日(2013.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（a）サブミクロンの水中油型エマルションの調製、
（b）無菌グレードのフィルターによる水中油型エマルションの事前ろ過、及び
（c）ステップ（b）に従ってろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）のフィルターと別の無菌グレードのフィルターによるろ過、
を含む、サブミクロンの水中油型エマルションの生産のためのプロセスであって、ステップ（b）及び（c）の無菌グレードのフィルターが約0.2μm、例えば0.22μmの孔径を有する、前記プロセス。
【請求項２】
以下のステップ：
（a）サブミクロンの水中油型エマルションの調製、
（b）無菌グレードのフィルターによる水中油型エマルションの事前ろ過、
（c）ステップ（b）に従って事前ろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）のフィルターと別のフィルターによるろ過、並びに、
（d）ステップ（c）に従ってろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）又は（c）のフィルターと別のフィルターによるろ過、
を含む請求項１に記載のプロセスであって、ステップ（b）及び（d）の無菌グレードのフィルターが約0.2μm、例えば0.22μmの孔径を有する、前記プロセス。
【請求項３】
以下のステップ：
（a）サブミクロンの水中油型エマルションの調製、
（b）水中油型エマルションの事前ろ過、
（c）ステップ（b）に従って事前ろ過した水中油型エマルションの、無菌グレードのフィルターによるろ過、
（d）ステップ（c）に従ってろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）又はステップ（c）のフィルターと別のフィルターによるろ過、並びに、
（e）ステップ（d）に従ってろ過した水中油型エマルションの、ステップ（b）、（c）、及び／又は（d）のフィルターと別の無菌グレードフィルターによるろ過、
を含む請求項2に記載のプロセスであって、ステップ（c）及び（e）の無菌グレードのフィルターが約0.2μm、例えば0.22μmの孔径を有する、前記プロセス。
【請求項４】
一以上のフィルターの膜がポリエーテルスルホン、例えば親水性ポリエーテルスルホンを含む、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項５】
ステップ（c）において用いられるフィルターの孔径が、無菌グレードから約2μm、例えば、約2μm、約1.5μm、約1μm、約0.9μm、約0.8μm、約0.7μm、約0.6μm、約0.5μm、0.45μm、又は無菌グレード、例えば約0.2μm、例えば0.22μmである請求項2又は4に記載のプロセス。
【請求項６】
ステップ（b）及び／又はステップ（d）において用いられるフィルターの孔径の範囲が、無菌グレードフィルター（約0.2μm）から約2μm、特に無菌グレードフィルターから約1μmの範囲であることができ、例えば、約2μm、約2.5μm、約1μm、約0.9μm、約0.8μm、約0.7μm、約0.6μm、約0.5μm、0.45μm、又は無菌グレード、例えば約0.2μm、例えば0.22μmである、請求項3又は4に記載のプロセス。
【請求項７】
各フィルターの差圧が約1bar〜約1.5bar、例えば約1barである、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項８】
ろ過を、15℃〜30℃、16℃〜29℃、17℃〜28℃、16℃〜27℃、16℃〜28℃、又は約22℃±4℃で行う、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項９】
水中油型エマルションが、2%〜15%（v/v）の油、例えば4%〜6%（v/v）の油又は8%〜12%（v/v）の油を含む、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１０】
サブミクロンの水中油型エマルションがスクアレン及び一以上の界面活性剤を含む、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１１】
サブミクロンの水中油型エマルションがスクアレン、トコール（例えばα−トコフェロール）及び界面活性剤を含む、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１２】
界面活性剤がモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（TWEEN 80／ポリソルベート80）である請求項9〜11のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１３】
サブミクロンの水中油型エマルションがスクアレン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（TWEEN 80）及びトリオレイン酸ソルビタン（SPAN 85）を含む請求項10に記載のプロセス。
【請求項１４】
サブミクロンの水中油型エマルションがスクアレン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤及び疎水性非イオン性界面活性剤を含む、請求項10に記載のプロセス。
【国際調査報告】
2013528196.tif 000003
2013528196.tif 000004
2013528196.tif 000005