(57)【要約】１つ又は複数のアンプリコンを温度較正物質として使用することが開示される。ゲノム超保存エレメント及び／又は合成とすることができる較正物質を用いて、増幅又は融解分析が実行されるマイクロ流体チャネルの温度を較正することができる。アンプリコン（複数の場合もある）は既知の、又は予想融解温度（複数の場合もある）を有する。較正物質は調査対象のプライマーに追加することができるか、又は調査対象のプライマーの前又は後にチャネル内に導入することができる。アンプリコン（複数の場合もある）は増幅及び融解することができ、アンプリコン（複数の場合もある）が融解した温度（複数の場合もある）を求めることができる。測定された温度（複数の場合もある）を、アンプリコン（複数の場合もある）が融解すると予想された既知の温度と比較することができる。測定された温度と予想される温度との差（複数の場合もある）を用いて、チャネルの温度を制御及び／又は検出するために用いられる１つ又は複数の温度制御素子を較正／調整することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コントローラーを備えるマイクロ流体システム内に存在するマイクロ流体チャネルの温度を較正する方法であって、
（ａ）前記マイクロ流体チャネルに１つ又は複数のアンプリコンを含む試薬を導入することと、
（ｂ）前記１つ又は複数のアンプリコンを融解するとともに、該１つ又は複数の各アンプリコンの融解温度を求めることと、
（ｃ）前記１つ又は複数の各アンプリコンの前記求められた融解温度を該１つ又は複数の各アンプリコンのそれぞれの予想融解温度と比較することと、
（ｄ）前記１つ又は複数の各アンプリコンの前記求められた融解温度と該１つ又は複数の各アンプリコンのそれぞれの前記予想融解温度との前記比較に基づいて前記コントローラーを調整することとを含む、コントローラーを備えるマイクロ流体システム内に存在するマイクロ流体チャネルの温度を較正する方法。
【請求項２】
前記１つ又は複数のアンプリコンのうちの１つ又は複数は合成ＤＮＡから生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ又は複数のアンプリコンのうちの１つ又は複数はゲノムＤＮＡから生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試薬は２つ以上のアンプリコンを含み、
前記融解するとともに求めることは、前記２つ以上のアンプリコンを融解するとともに、該２つ以上の各アンプリコンの融解温度を求めることを含み、
前記比較することは、前記２つ以上の各アンプリコンの前記求められた融解温度を該２つ以上の各アンプリコンのそれぞれの予想融解温度と比較することを含み、
前記調整することは、前記２つ以上の各アンプリコンの前記求められた融解温度と該２つ以上の各アンプリコンのそれぞれの前記予想融解温度との前記比較に基づいて前記コントローラーを調整することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記２つ以上のアンプリコンは５℃以上離れた既知の融解温度を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記２つ以上のアンプリコンは１０℃以上離れた既知の融解温度を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記２つ以上のアンプリコンは１５℃以上離れた既知の融解温度を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記２つ以上のアンプリコンは２０℃以上離れた既知の融解温度を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記２つ以上の各アンプリコンは合成アンプリコンである、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記２つ以上のアンプリコンのうちの１つはＲＦＣＡＬ−１００である、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記２つ以上のアンプリコンのうちの１つはＲＦＣＡＬ−２００である、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記２つ以上のアンプリコンのうちの別のものはＲＦＣＡＬ−１００である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ又は複数のアンプリコンのうちの１つはＲＦＣＡＬ−１００である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ又は複数のアンプリコンのうちの１つはＲＦＣＡＬ−２００である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ又は複数のアンプリコンのうちの１つ又は複数は超保存エレメントからの配列である、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ又は複数のアンプリコンのうちの１つは、ヒト染色体１７ＵＣＥ配列からの２０７ｂｐ配列から生成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記コントローラーは前記マイクロ流体チャネルの前記温度を制御及び／又は検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
マイクロ流体システム内に存在するマイクロ流体チャネル内の熱融解の温度を較正する方法であって、
（ａ）前記マイクロ流体チャネルにヒトゲノムＤＮＡを含む試験サンプルと、対象となる１つ又は複数の核酸のための少なくとも一対のプライマーと、較正物質のための一対のプライマーとを含む試薬を導入することであって、該較正物質はゲノムＤＮＡにおいて見いだされる、導入することと、
（ｂ）前記ゲノムＤＮＡを増幅することであって、較正用アンプリコンと、対象となる前記１つ又は複数の核酸のアンプリコンとを生成する、増幅することと、
（ｃ）前記アンプリコンを融解するとともに、該各アンプリコンの融解温度を求めることと、
（ｄ）前記較正用アンプリコンの前記求められた融解温度を前記較正用アンプリコンの予想融解温度と比較することと、
（ｅ）前記較正用アンプリコンの前記融解温度に基づいて、前記対象となる１つ又は複数の核酸の前記アンプリコンの前記融解温度を較正することとを含む、マイクロ流体システム内に存在するマイクロ流体チャネル内の熱融解の温度を較正する方法。
【請求項１９】
前記較正物質は超保存エレメントからの配列である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記較正物質はヒト染色体１７配列からの２０７ｂｐ配列である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記較正用アンプリコンの前記融解の融解曲線の導関数は単一のピークを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
行われた増幅を検証する対照として前記較正用アンプリコンの前記融解曲線を用いることを更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記較正物質のための前記一対のプライマーは前記対象となる１つ又は複数の核酸の増幅に影響を及ぼさない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記較正用アンプリコンの前記求められた融解温度と該較正用アンプリコンの前記予想融解温度との前記比較を用いて、前記対象となる１つ又は複数の核酸の増幅を検証することを更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記検証は、前記マイクロ流体チャネル温度が理想的な温度設定値に達したか否かを判断することを更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記各アンプリコンの前記融解温度を前記求めることは、
サビツキーゴーレイフィルターを用いて前記各アンプリコンの前記融解の融解曲線の導関数を得ることと、
前記融解曲線の前記導関数の最大の負の導関数における温度を見つけることとを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記アンプリコン較正物質の前記融解温度を前記求めることは、
基準融解曲線の導関数のピークと前記アンプリコン較正物質の前記融解の融解曲線の導関数のピークとの相互相関をとることと、
最も高い相関を有する温度を前記アンプリコン較正物質の前記融解温度として選択することとを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アンプリコン較正物質の前記求められた融解温度を前記アンプリコン較正物質のそれぞれの予想融解温度と前記比較することは、前記アンプリコン較正物質の前記予想融解温度を用いて、傾き補正因子及び切片補正因子を計算することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
マイクロ流体チャネルの温度を較正する方法であって、
前記マイクロ流体チャネルにおいて既知の熱融解温度を有する少なくとも１つのアンプリコンの熱融解分析を実行することと、
既知の値からの前記熱融解温度の導出に基づいて熱制御素子を調整することとを含む、マイクロ流体チャネルの温度を較正する方法。
【請求項３０】
ＲＦＣＡＬ−１００を含む熱較正物質。
【請求項３１】
ＲＦＣＡＬ−２００を含む熱較正物質。
【請求項３２】
ＲＦＣＡＬ−１００を更に含む、請求項３１に記載の熱較正物質。
【請求項３３】
ゲノムＤＮＡを含む試験サンプルと、対象となる１つ又は複数の核酸のための少なくとも一対のプライマーと、較正物質のための一対のプライマーとを含む試薬。
【請求項３４】
前記較正物質は前記ゲノムＤＮＡ内に含まれる、請求項３３に記載の試薬。
【請求項３５】
前記較正物質は超保存エレメントからの配列である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記超保存エレメントからの前記配列はヒト染色体１７ＵＣＥ配列からの配列である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記較正物質は合成配列である、請求項３３に記載の試薬。
【請求項３８】
既知の融解温度を有する第１のアンプリコンと第２の既知の融解温度を有する第２のアンプリコンとを含む熱較正物質システム。
【請求項３９】
マイクロ流体システム内に存在するマイクロ流体チャネルの温度を較正する方法であって、
（ａ）１つ又は複数の較正用アンプリコンを融解するとともに、該各アンプリコン較正物質の融解温度を求めることと、
（ｂ）前記１つ又は複数の各アンプリコン較正物質の前記求められた融解温度を該１つ又は複数の各アンプリコン較正物質のそれぞれの予想融解温度と比較することと、
（ｃ）前記２つ以上の各アンプリコンの前記求められた融解温度と該２つ以上の各アンプリコンのそれぞれの前記予想融解温度との前記比較に基づいて、前記マイクロ流体チャネルの温度を較正することとを含む、マイクロ流体システム内に存在するマイクロ流体チャネルの温度を較正する方法。
【請求項４０】
前記融解するとともに求めることは、２つ以上のアンプリコン較正物質を融解するとともに、該各アンプリコン較正物質の融解温度を求めることを含み、
前記比較することは、前記２つ以上の各アンプリコンの前記求められた融解温度を該２つ以上の各アンプリコンのそれぞれの予想融解温度と比較することを含み、
前記較正することは、前記２つ以上の各アンプリコンの前記求められた融解温度と該２つ以上の各アンプリコンのそれぞれの前記予想融解温度との前記比較に基づいて前記マイクロ流体チャネルを較正することを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記２つ以上の各アンプリコン較正物質の前記融解温度を前記求めることは、
サビツキーゴーレイフィルターを用いて前記２つ以上のアンプリコンの前記融解の融解曲線の導関数を得ることと、
前記融解曲線の前記導関数の最大の負の導関数における温度を見つけることとを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記２つ以上の各アンプリコン較正物質の前記融解温度を前記求めることは、
基準融解曲線の導関数のピークと前記２つ以上のアンプリコン較正物質の前記融解の前記融解曲線の導関数のピークとの相互相関をとることと、
最も高い相関を有する温度を前記２つ以上のアンプリコン較正物質の前記融解温度として選択することとを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記２つ以上の各アンプリコン較正物質の前記求められた融解温度を前記２つ以上の各アンプリコン較正物質のそれぞれの予想融解温度と前記比較することは、前記２つ以上の各アンプリコン較正物質のそれぞれの前記予想融解温度を用いて、傾き補正因子及び切片補正因子を計算することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記較正することは、前記計算された傾き補正因子及び前記計算された切片補正因子を用いて調整済み温度を計算することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記１つ又は複数のアンプリコン較正物質の前記融解の融解曲線の導関数は単一のピークを示す、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記１つ又は複数のアンプリコン較正物質を前記融解することは、該１つ又は複数のアンプリコン較正物質の第１の融解と、該１つ又は複数のアンプリコン較正物質の第２の融解とを含み、
前記１つ又は複数の各アンプリコン較正物質の前記融解温度を前記求めることは、（ｉ）前記１つ又は複数のアンプリコン較正物質の前記第１の融解の前記融解曲線の導関数のピークに対応する第１の温度を求めることと、（ｉｉ）前記１つ又は複数のアンプリコン較正物質の前記第２の融解の前記融解曲線の導関数のピークに対応する第２の温度を求めることとを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記較正することは、前記第１の温度及び前記第２の温度の線形補間を用いて温度調整を計算することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記マイクロ流体チャネルに、対象となる１つ又は複数の核酸のための少なくとも一対のプライマーと較正物質のための一対のプライマーとを含む試薬を前記導入することは、別々の流体セグメントにおいて導入される前記対象となる１つ又は複数の核酸のための前記少なくとも一対のプライマーと前記較正物質のための一対のプライマーとを用いて行われる、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイクロ流体デバイス内の１つ又は複数のチャネルの温度を較正するための方法、デバイス及びシステムに関する。より詳細には、本発明の態様は、既知の、又は予想される熱融解温度を有するアンプリコンを用いて、マイクロ流体デバイス内のマイクロ流体チャネルの温度を制御するために用いられる熱センサー及び／又は熱制御素子を較正するための方法、デバイス及びシステムに関する。また、本発明は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネル内の熱融解の温度を較正するための方法、デバイス及びシステムに関する。より詳細には、本発明の態様は、試験サンプル内に存在する較正物質を使用し、較正物質を増幅して、較正用アンプリコンを生成するための方法、デバイス及びシステムに関し、その較正用アンプリコンは、対象となる核酸のアンプリコンの融解温度を較正するための既知の、又は予想される熱融解温度を有する。また、本発明はサンプルの増幅が生じたか否かを判断するための対照として試験サンプル内に存在する較正物質を使用することにも関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は２０１０年８月３１日に出願の米国仮特許出願第６１／３７８，９２７号に対する優先権の恩典を主張し、その開示全体は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。加えて、本出願は２０１０年８月３１日に出願の米国仮特許出願第６１／３７８，５９１号に対する優先権の恩典を主張し、その開示全体は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００３】
［配列表提出］
本出願は配列表とともに電子形式において出願されている。その配列表は、３４００２３３ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと題し、２０１１年８月３０日に作成され、サイズ１１Ｋｂであった。配列表の電子形式の情報は、本出願の一部であり、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００４】
背景の説明
化学的、生物学的又は他の反応を実行するためのデバイス（例えば、ＤＮＡ分子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実行するためのマイクロ流体デバイス、又は患者サンプルにおいてＰＣＲを実行し、その後、高分解能融解分析を実行することによって遺伝子型を同定するためにそのＰＣＲ産物を使用するマイクロ流体分子診断プラットフォーム）は多くの場合に、反応物を所望の熱プロファイルにかけるために用いられる１つ又は複数の熱制御素子を備えている。ＰＣＲ増幅の説明、並びにＰＣＲ増幅及び熱融解分析のための熱制御素子を含む１つの実現可能なマイクロ流体デバイスの一例が米国特許出願公開第２００９／０２４８３４９号及び第２０１１／００５６９２６号に与えられており、その開示全体は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００５】
そのようなマイクロ流体デバイスの数多くの応用形態（例えば、ＰＣＲ及び／又は熱融解分析）において、それらのデバイスの熱制御素子は正確に較正されなければならない。すなわち、熱制御素子の温度と熱制御素子の電気的特性との間の対応が正確に特定されなければならない。例えば、抵抗温度検出器及び／又はヒーターの場合、温度と抵抗との間の対応が正確に特定されなければならない。更なるタイプの熱制御素子は、プラチナ抵抗ヒーター、サーミスター、ダイオード温度センサー、熱電対又は任意の他の適切な温度測定デバイスを含むことができる。温度に対応する、熱制御素子の更なる電気的特性は、素子のキャパシタンス又はインダクタンス、信号の周波数、パルス幅若しくは振幅、又は当該技術分野において既知である他のセンサー特性を含むことができる。
【０００６】
マイクロ流体デバイスにおいて生じる可能性がある数多くの変動の中でも、チャンバ間の温度変動が特に重要である。マイクロ流体デバイス又はチップ内のチャネル間で正確で、均一な温度を確保することが、信頼性があり、かつ一貫性があるＰＣＲ及び熱融解分析につながる。さらには、目標配列の増幅及び融解に成功することが、正確なサンプル遺伝子型同定につながる場合があり、それにより、遺伝的障害、遺伝的素因又は薬物代謝の効率に関して患者を特徴付けることにつながる場合がある。
【０００７】
上記で言及されたように、チップ内のマイクロ流体チャネルがＰＣＲ及び熱融解分析反応中に同じ温度を示すことを確実にする結果として、信頼性及び一貫性が改善される。しかしながら、そのような小さな素子及びそのような少量の試薬の場合、複数のチャネルを試験し、それらのチャネルが同時に同じ最適な温度条件下でＰＣＲと、それに加えて熱融解とを実行していることを証明することは非常に難しい。
【０００８】
マイクロ流体デバイスの熱制御素子を較正する方法は多くの場合に、ルックアップテーブル又は較正式を定義する一連の係数、すなわち、熱制御素子の温度を電気的特性に関連付けるルックアップテーブル又は式を生成することを含む。
【０００９】
較正は、正確な測定を行うために第三者の研究機関にデバイスを送り、ルックアップテーブル又は一連の係数を生成することによって実行することができる。しかしながら、この手順は一般的に費用及び時間がかかる。さらに、多くのデバイス（例えば、多くの一般的なマイクロ流体デバイス）の場合に、数多くの熱制御素子（例えば、数十、更には数百のヒーター及びセンサー）が存在する場合があり、それぞれが正確な較正を必要とするので、第三者による較正が非現実的である場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、当該技術分野において、マイクロ流体デバイス又はチップ内の１つ又は複数のマイクロ流体チャネルの温度を較正するのに有用である信頼性のある較正物質が必要とされている。同様に、正確であり、ダウンタイムを短縮し、かつ高スループットを保持することができる、熱センサー及び／又はヒーターのロバストな較正が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、本発明は、コントローラーを備えるマイクロ流体システム内に存在するマイクロ流体チャネルの温度を較正する方法を提供する。該方法は、
（ａ）前記マイクロ流体チャネルに１つ又は複数のアンプリコンを含む試薬を導入することと、
（ｂ）前記１つ又は複数のアンプリコンを融解するとともに、該１つ又は複数の各アンプリコンの融解温度を求めることと、
（ｃ）前記１つ又は複数の各アンプリコンの前記求められた融解温度を該１つ又は複数の各アンプリコンのそれぞれの予想融解温度と比較することと、
（ｄ）前記１つ又は複数の各アンプリコンの前記求められた融解温度と該１つ又は複数の各アンプリコンのそれぞれの前記予想融解温度との前記比較に基づいて前記コントローラーを調整することとを含むことができる。
【００１２】
幾つかの実施の形態において、１つ又は複数のアンプリコンのうちの１つ又は複数が合成によって準備され、その後、マイクロ流体チャネル内に導入される。幾つかの実施の形態において、ゲノムＤＮＡから１つ又は複数のアンプリコンを準備することができる。幾つかの実施の形態では、超保存エレメント（ＵＣＥ）からアンプリコンを準備することができる。他の実施の形態では、鎌状細胞コード配列のような任意のコード配列からアンプリコンを準備することができる。他の実施の形態では、任意の合成ＤＮＡから１つ又は複数のアンプリコンを準備することができる。更なる実施の形態では、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡの両方から１つ又は複数のアンプリコンを準備することができる。幾つかの実施の形態では、１つ又は複数のアンプリコンのうちの１つはＲＦＣＡＬ−１００から準備することができる。他の実施の形態では、１つ又は複数のアンプリコンのうちの１つはＲＦＣＡＬ−２００から準備することができる。更なる実施の形態では、アンプリコンはＲＦＣＡＬ−１００及びＲＦＣＡＬ−２００の両方から準備することができる。コントローラーは、マイクロ流体チャネルの温度を制御及び／又は検出することができる。
【００１３】
一実施の形態では、前記試薬は２つ以上のアンプリコンを含むことができ、前記融解するとともに求めることは、前記２つ以上のアンプリコンを融解するとともに、該２つ以上の各アンプリコンの融解温度を求めることとを含むことができ、前記比較することは、前記２つ以上の各アンプリコンの前記求められた融解温度を該２つ以上の各アンプリコンのそれぞれの予想融解温度と比較することを含むことができ、前記調整することは、前記２つ以上の各アンプリコンの前記求められた融解温度と該２つ以上の各アンプリコンのそれぞれの前記予想融解温度との前記比較に基づいて前記コントローラーを調整することを含むことができる。前記２つ以上のアンプリコンは５℃以上離れた既知の融解温度を有することができる。前記２つ以上のアンプリコンは１０℃以上離れた既知の融解温度を有することができる。前記２つ以上のアンプリコンは１５℃以上離れた既知の融解温度を有することができる。前記２つ以上のアンプリコンは２０℃以上離れた既知の融解温度を有することができる。
【００１４】
幾つかの実施の形態では、前記２つ以上の各アンプリコンの前記融解温度を前記求めることは、サビツキーゴーレイフィルターを用いて前記２つ以上の各アンプリコンの前記融解の融解曲線の導関数を得ることと、前記融解曲線の前記導関数の最大の負の導関数における温度を見つけることとを含むことができる。前記２つ以上の各アンプリコンの前記融解温度を前記求めることは、基準融解曲線の導関数のピークと前記２つ以上アンプリコンの前記融解の融解曲線の導関数のピークとの相互相関をとることと、最も高い相関を有する温度を前記２つ以上のアンプリコンの前記融解温度として選択することとを含むことができる。前記２つ以上の各アンプリコンの前記求められた融解温度を前記２つ以上の各アンプリコンのそれぞれの予想融解温度とを前記比較することは、前記２つ以上の各アンプリコンのそれぞれの前記予想融解温度を用いて、傾き補正因子及び切片補正因子を計算することを含むことができる。前記コントローラーを調整することは、前記計算された傾き補正因子及び前記計算された切片補正因子を用いて、調整済み温度を計算することを含むことができる。
【００１５】
一実施の形態では、１つ又は複数のアンプリコンの融解の融解曲線の導関数が、例えば、１つのみのアンプリコンが使用された場合、単一のピークを示すことができる。前記１つ又は複数のアンプリコンを前記融解することは、該１つ又は複数のアンプリコンの第１の融解と、該１つ又は複数のアンプリコンの第２の融解とを含むことができる。前記１つ又は複数の各アンプリコンの前記融解温度を前記求めることは、（ｉ）前記１つ又は複数のアンプリコンの前記第１の融解の前記融解曲線の導関数のピークに対応する第１の温度を求めることと、（ｉｉ）前記１つ又は複数のアンプリコンの前記第２の融解の前記融解曲線の導関数のピークに対応する第２の温度を求めることとを含むことができる。前記コントローラーを調整することは、前記第１の温度及び前記第２の温度の線形補間を用いて温度調整を計算することを含むことができる。
【００１６】
別の態様では、本発明は、マイクロ流体システム内に存在するマイクロ流体チャネル内の熱融解の温度を較正する方法を提供する。該方法は、
（ａ）前記マイクロ流体チャネルにヒトゲノムＤＮＡを含む試験サンプルと、対象となる１つ又は複数の核酸のための少なくとも一対のプライマーと、較正物質のための一対のプライマーとを含む試薬を導入することであって、該較正物質はゲノムＤＮＡにおいて見いだされる、導入することと、
（ｂ）前記ゲノムＤＮＡを増幅することであって、較正用アンプリコンと、対象となる少なくとも１つの前記核酸のアンプリコンとを生成する、増幅することと、
（ｃ）前記アンプリコンを融解し、前記アンプリコンのそれぞれの融解温度を求めることと、
（ｄ）前記較正用アンプリコンの前記求められた融解温度を前記較正用アンプリコンの予想融解温度と比較することと、
（ｅ）前記較正用アンプリコンの前記融解温度に基づいて、前記対象となる少なくとも１つの核酸の前記アンプリコンの前記融解温度を較正することとを含むことができる。
【００１７】
流体のセグメントをマイクロ流体チャネルに順次に追加できることは本発明の範囲内にある。各流体セグメントは、その流体セグメントに直接隣接するセグメントとは異なる組成からなることができる。一実施の形態では、対象となる１つ又は複数の核酸のための少なくとも一対のプライマー（「アッセイ流体セグメント」）とは別の流体セグメント（「較正用流体セグメント」）においてマイクロ流体チャネルに較正物質のためのプライマー対を加えることができる。幾つかの実施の形態では、複数のアッセイ流体セグメントがマイクロ流体チャネルに加えられる前に、マイクロ流体チャネルに１つ又は複数の較正用流体セグメントを加えることができる。他の実施の形態では、複数のアッセイ流体セグメントがマイクロ流体チャネルに加えられる前に、１つ又は複数の較正用流体セグメントをマイクロ流体チャネルに加えることができ、アッセイ流体セグメント後に、１つ又は複数の較正用流体セグメントを加えることができる。他の実施の形態では、各アッセイ流体セグメントの両側に較正用流体セグメントが隣接するように、較正用流体セグメントはアッセイ流体セグメントと交互に配置することができる。それゆえ、本明細書全体を通して、マイクロ流体チャネルへの対象となる１つ又は複数の核酸のための少なくとも一対のプライマーの導入、及び較正物質のためのプライマー対の導入は、同じ流体セグメント内、又は異なる流体セグメント内で行うことができ、別の流体セグメントは任意の順序で、又は交互に、又は順次に、又は複数の流体セグメントの最初及び最後において導入できることに留意されたい。
【００１８】
幾つかの実施の形態では、マイクロ流体チャネル試薬は、対象となる１つの核酸のための一対のプライマーを含む。本明細において用いられるときに、対象となる核酸は、試験サンプル内でその存否が判断されることになる核酸を指している。他の実施の形態では、マイクロ流体チャネル試薬は、対象となる２つ以上の各核酸の一対のプライマーを含む。幾つかの実施の形態では、ゲノムＤＮＡ内に見られる較正物質は、ヒトゲノムＤＮＡのような、対象となる全てのゲノムＤＮＡ内に存在することが知られているＤＮＡセグメントである。他の実施の形態では、較正物質はＵＣＥである。幾つかの実施の形態では、マイクロ流体チャネル試薬は、較正物質のための一対のプライマーを含むことができる。或る特定の実施の形態では、マイクロ流体試薬の増幅は較正用アンプリコンを生成する。或る特定の実施の形態では、較正物質の増幅は、対象となる１つ又は複数の核酸の増幅に影響を及ぼさない。
【００１９】
幾つかの実施の形態では、前記各アンプリコンの前記融解温度を前記求めることは、サビツキーゴーレイフィルターを用いて前記アンプリコンの前記融解の融解曲線の導関数を得ることと、前記融解曲線の前記導関数の最大の負の導関数における温度を見つけることとを含むことができる。前記各アンプリコンの前記融解温度を前記求めることは、基準融解曲線の導関数のピークと、前記アンプリコンの前記融解の融解曲線の導関数のピークとの相互相関をとることと、最も高い相関を有する温度を前記アンプリコンの前記融解温度として選択することとを含むことができる。前記較正用アンプリコンの前記求められた融解温度を前記較正用アンプリコンのそれぞれの予想融解温度と前記比較することは、前記較正用アンプリコンのそれぞれの予想融解温度を用いて、傾き補正因子及び切片補正因子を計算することを含むことができる。前記対象となる核酸の各アンプリコンの前記融解温度を較正することは、前記較正用アンプリコンの前記計算された傾き補正因子及び前記計算された切片補正因子を用いて、調整済み温度を計算することを含むことができる。
【００２０】
前記方法は、前記較正用アンプリコンの前記求められた融解温度と該較正用アンプリコンのそれぞれの予想融解温度との前記比較を用いて、前記対象となる１つ又は複数の核酸の前記１つ又は複数のアンプリコンの増幅を検証することを含むことができる。該検証は、前記対象となる核酸の前記アンプリコンの補正済み融解温度を求めることを含むことができる。
【００２１】
前記方法は、行われた増幅を検証する対照として前記較正用アンプリコンの前記融解曲線を用いることも含むことができる。較正物質のための融解曲線を得ることは、ゲノムＤＮＡの増幅を妨げることになる、試薬の汚染、又は他の異常が生じていないことを実証するための陽性対照としての役割を果たすことができる。
【００２２】
別の態様では、本発明は、マイクロ流体チャネルの温度を較正する方法を提供する。該方法は、
前記マイクロ流体チャネルにおいて既知の熱融解温度を有する少なくとも１つのアンプリコンの熱融解分析を実行することと、
既知の値からの前記熱融解温度の導出に基づいて熱制御素子を調整することとを含むことができる。
【００２３】
更に別の態様では、本発明は、ＲＦＣＡＬ−１００を含む較正物質を提供することができる。
【００２４】
更に別の態様では、本発明は、ＲＦＣＡＬ−２００を含む較正物質を提供することができる。較正物質は、ＲＦＣＡＬ−１００を更に含むことができる。
【００２５】
別の態様では、本発明は、（ａ）ヒトゲノムＤＮＡ内に存在し、（ｂ）その増幅が、ヒトゲノムＤＮＡ内に存在する場合がある対象となる１つ又は複数の核酸の増幅と干渉しない、既知の融解温度を有するアンプリコンを生成する、較正物質を提供する。
【００２６】
本発明の上記の態様及び特徴並びに他の態様及び特徴、並びに本発明の種々の実施形態の構造及び用途を、添付図面を参照して以下で説明する。
【００２７】
本明細書に組み込まれて、本明細書の一部をなす添付図面は、本発明の様々な実施形態を示す。図面中、同様の参照符号が同一の要素又は機能が類似する要素を示す。さらに、参照符号の一番左側の数字は、その参照符号が最初に現れた図面を識別する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の態様を具現化するマイクロ流体デバイスを示す図である。
【図２】本発明の態様を具現化するマイクロ流体デバイスを使用するためのシステムの機能ブロック図である。
【図３Ａ】本発明の一実施形態による、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの温度を較正するためのプロセスを示す流れ図である。
【図３Ｂ】本発明の一実施形態による、マイクロ流体システム内に存在するマイクロ流体チャネル内の熱融解の温度を較正するためのプロセスを示す流れ図である。
【図４】３つの異なるゲノムＤＮＡを示すマイクロ流体機器における本発明の一実施形態による例示的な超保存エレメント（ＵＣＥ）較正物質の熱融解曲線を示す図である。
【図５】７つの異なるゲノムＤＮＡを示すロシュライトサイクラー（登録商標）４８０（ＬＣ４８０）サイクラープラットフォーム上の本発明の一実施形態による例示的なＵＣＥ較正物質の熱融解曲線を示す図である。
【図６】調査対象のプライマーの３つの異なる遺伝子型を示す熱融解曲線を示す図である。
【図７】本発明の一実施形態によるＵＣＥ産物を示す熱融解曲線を示す図である。
【図８】３つの異なる遺伝子型を示す熱融解曲線を示す図である。
【図９】本発明の一実施形態による、ＵＣＥ増幅産物を示す熱融解曲線を示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態による、ＵＣＥプライマー及び調査対象のプライマーの増幅産物を示す熱融解曲線を示す図である。
【図１１】調査対象のプライマーのみの増幅産物を示す熱融解曲線を示す図である。
【図１２】本発明の一実施形態による合成配列に関するｐＧＯｖ４ベクターマップを示す図である。
【図１３】本発明の一実施形態による、ＬＣ４８０サイクラープラットフォーム上の較正器の産物増幅を示すグラフである。
【図１４】本発明の一実施形態による、ＬＣ４８０サイクラープラットフォーム上の較正器の産物融解を示すグラフである。
【図１５】本発明の一実施形態による、マイクロ流体に基づく分析プラットフォーム上のＲＦＣＡＬ−１００の結果を示すグラフである。
【図１６】本発明の一実施形態による、マイクロ流体に基づく分析プラットフォーム上のＲＦＣＡＬ−２００の結果を示すグラフである。
【図１７】本発明の一実施形態による、Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＨＲ−１高分解能融解装置上のＲＦＣＡＬ融解プロファイルを示すグラフである。
【図１８Ａ】ワルファリンＣｙＰ２Ｃ９＊２の場合の蛍光対温度融解曲線を示す図である。
【図１８Ｂ】ワルファリンＣｙＰ２Ｃ９＊２の場合の温度融解曲線に対する蛍光の導関数を示す図である。
【図１９Ａ】ウェルプレートに基づくシステム上の本発明の一実施形態による較正物質の場合の蛍光対温度融解曲線を示す図である。
【図１９Ｂ】ＵＣＥ較正物質の場合の温度融解曲線に対する蛍光の導関数が単一のピークを示すことを示す図である。
【図２０Ａ】マイクロ流体チャネルに基づくシステム上の本発明の一実施形態による較正物質の場合の蛍光対温度融解曲線を示す図である。
【図２０Ｂ】較正物質の場合の温度融解曲線に対する蛍光の導関数が２つのピークを示すことを示す図である。
【図２１Ａ】本発明の一実施形態による、較正済みの機器からの基準較正物質に対する実験較正物質の相対的な温度シフトの計算を示す図である。
【図２１Ｂ】本発明の一実施形態による、実験較正物質における温度シフトを、基準較正物質との相関を最大にするために必要とされるシフトとして計算することを示す図である。
【図２２Ａ】７つの異なるチャネルから収集された、同じ遺伝子型及び織り交ぜられたＵＣＥのアッセイの融解温度を示すプロット図である。
【図２２Ｂ】図２２Ａの７チャネルにわたって同時に融解されたアッセイの標準偏差を示すプロット図である。
【図２２Ｃ】直前のＵＣＥ及び直後のＵＣＥを用いて補間されたＵＣＥ融解温度に対するアッセイの融解温度の変化を示すプロット図である。
【図２２Ｄ】図２２Ｃに示される融解温度の変化の対応する標準偏差を示すプロット図である。
【図２２Ｅ】最初と最後のＵＣＥのみを用いて補間されたＵＣＥ  Ｔｍに対するアッセイの融解温度の変化を示すプロット図である。
【図２２Ｆ】図２２Ｅに示されるアッセイの融解温度の変化の対応する標準偏差を示すプロット図である。
【図２３Ａ】較正済みの機器からの基準二重ピーク熱融解曲線を示すプロット図である。
【図２３Ｂ】較正外れ二重ピーク実験熱融解曲線を示すプロット図である。
【図２３Ｃ】図２３Ａに示される基準二重ピーク熱融解曲線と整列した図２３Ｂに示される較正外れ二重ピーク実験熱融解曲線を示すプロット図である。
【図２３Ｄ】独立した較正検査融解の後続の融解曲線を示すプロット図である。
【図２３Ｅ】本発明の一実施形態による、自動較正手順の機能を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
図１は、本発明の態様を具現化するマイクロ流体デバイス１００を示す。本明細書で述べるように、マイクロ流体デバイス１００は、反応チップ又はＵ−チップとして交換可能に呼ばれる場合がある。示す実施形態では、マイクロ流体デバイス１００は、基板１０１にわたって延在する幾つかのマイクロ流体チャネル１０２を含む。各チャネル１０２は、１つ又は複数の入口ポート１０３（示す実施形態は、チャネル１０２について２つの入口ポート１０３を示す）及び１つ又は複数の出口ポート１０５（示す実施形態は、チャネル１０２について１つの出口ポート１０５を示す）を含む。例示的な実施形態では、各チャネルは、ＰＣＲ熱ゾーン１０４（以下で述べる）を通して延在する第１の部分及び熱融解ゾーン１０６（以下で述べる）を通して延在する第２の部分に細分することができる。
【００３０】
一実施形態では、マイクロ流体デバイス１００は、マイクロ流体チャネル１０２に関連する薄膜抵抗加熱器１１２の形態の熱制御素子を更に含む。１つの非限定的な実施形態では、薄膜抵抗加熱器１１２は、その抵抗が、それらの各温度を制御するために測定されるプラチナ抵抗加熱器とすることができる。図１に示す実施形態では、各加熱器素子１１２は、２つの加熱器セクション、すなわち、ＰＣＲゾーン１０４内のＰＣＲ加熱器１１２ａセクション及び熱融解ゾーン１０６内の熱融解加熱器セクション１１２ｂを備える。
【００３１】
一実施形態では、マイクロ流体デバイス１００は、種々の薄膜加熱器１１２ａ及び１１２ｂに接続された複数の加熱器電極１１０を含む。非限定的な実施形態では、加熱器電極１１０は、ＰＣＲセクションリード線１１８、１つ又は複数のＰＣＲセクション共通リード線１１６ａ、熱融解セクションリード線１２０、及び１つ又は複数の熱融解セクション共通リード線１１６ｂを含むことができる。本発明の一実施形態によれば、別個のＰＣＲセクションリード線１１８が、薄膜ＰＣＲ加熱器１１２ａのそれぞれに接続され、別個の熱融解セクション共通リード線１２０が、薄膜熱融解加熱器１１２ｂのそれぞれに接続される。
【００３２】
図２は、一実施形態による、マイクロ流体デバイス１００を使用するためのシステム２００の機能ブロック図を示す。ＤＮＡサンプルは、調製ステージ２０２からマイクロ流体チップ１００に注入（input）される。本明細書で述べるように、調製ステージ２０２は、ピペッターシステム又はプレＫステージ（pre-K stage）と交換可能に呼ばれる場合がある。調製ステージ２０２は、サンプル２０４を調製し、１つ又は複数の試薬２０６をサンプルに添加するための適切なデバイスを備えることができる。サンプルが、例えば注入ポート１０３にて、マイクロ流体チップ１００内に注入されると、サンプルは、チャネル１０２を通って、ＰＣＲが起こるＰＣＲゾーン１０４に流入する。すなわち、以下でより詳細に述べるように、サンプルがＰＣＲゾーン１０４を通ってチャネル１０２内に流れるため、サンプルは、ＰＣＲ温度サイクルに複数回暴露されて、ＰＣＲ増幅をもたらす。次に、サンプルは、高分解能熱融解プロセスが起こる熱融解ゾーン１０６内に流入する。マイクロ流体チップ１００内へのサンプルのフローは、フローコントローラー２０８によって制御することができる。フローコントローラーは、システム２００の制御システム２５０の一部とすることができる。制御システム２５０は、フローコントローラー２０８、ＰＣＲゾーン温度コントローラー２１０、ＰＣＲゾーンフローモニター２１８、熱融解ゾーン温度コントローラー２２４、及び／又は熱融解ゾーン蛍光測定システム２３２を備えることができる。
【００３３】
ＰＣＲゾーン１０４内の温度は、ＰＣＲゾーン温度コントローラー２１０によって制御され得る。プログラム式コンピューター又は他のマイクロプロセッサとすることができるＰＣＲゾーン温度コントローラー２１０は、温度センサー２１４（例えば、ＲＴＤ若しくは薄膜サーミスター又は薄膜熱電対温度計等）によって決定された温度に基づいて加熱器デバイス２１２（例えば、ＰＣＲ加熱器１１２ａ）に信号を送出する。こうして、ＰＣＲゾーン１０４の温度を、所望のレベルに維持することができる。本発明の幾つかの実施形態によれば、ＰＣＲゾーン１０４はまた、ＰＣＲゾーン温度コントローラー２１０によって同様に制御されることができる冷却デバイス２１６によって（例えば、９５℃から５５℃までチャネル温度を迅速に下げるために）冷却することができる。一実施形態では、冷却デバイス２１６は、例えば、ペルチエデバイス、ヒートシンク、又は強制対流空気冷却デバイスとすることができる。
【００３４】
マイクロ流体チャネル１０２を通るサンプルのフローは、ＰＣＲゾーンフローモニタリングシステム２１８によって測定することができる。一実施形態では、フローモニタリングシステムは、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする米国特許出願第７，６２９，１２４号に示されている蛍光色素拡散画像化及び追跡システムとすることができる。本発明の一実施形態によれば、ＰＣＲゾーン内のチャネルは、励起デバイス２２０によって励起されることができ、サンプルから蛍光として発せられた光は、検出デバイス２２２によって検出することができる。画像化システムの一部を形成する考えられる１つの励起デバイス及び検出デバイスの例は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする米国特許出願公開第２００８／０００３５９３号及び米国特許第７，６２９，１２４号に示されている。
【００３５】
熱融解ゾーン温度コントローラー２２４、例えばプログラム式コンピューター又は他のマイクロプロセッサは、熱融解ゾーン１０６の温度を制御するために使用され得る。ＰＣＲゾーン温度コントローラー２１０の場合と同様に、熱融解ゾーン温度コントローラー２２４は、例えばＲＴＤ若しくは薄膜サーミスターであり得る温度センサー２２８によって測定される温度に基づいて加熱構成要素２２６（例えば、熱融解加熱器１１２ｂ）に信号を送出する。さらに、熱融解ゾーン１０６は、冷却デバイス２３０によって独立に冷却することができる。サンプルの蛍光シグネチャは、熱融解ゾーン蛍光測定システム２３２によって測定され得る。蛍光測定システム２３２は、励起デバイス２３４によってサンプルを励起し、サンプルの蛍光は、検出デバイス２３６によって検出することができる。考えられる１つの蛍光測定システムの例は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする米国特許出願公開第２００８／０００３５９３号及び米国特許第７，６２９，１２４号に示されている。
【００３６】
本発明の態様によれば、薄膜加熱器１１２は、加熱器と温度検出器との両方として機能することができる。そのため、本発明の一実施形態では、それらの加熱素子２１２及び２２６並びに温度センサー２１４及び２２８の機能は、薄膜加熱器１１２によって達成することができる。
【００３７】
一実施形態では、システム２００は、ＰＣＲゾーン温度コントローラー２１０又は熱融解ゾーン温度コントローラー２２４によって送出される制御信号に基づいて薄膜加熱器１１２ａ及び／又は１１２ｂに電力を送出し、それにより、それらの薄膜加熱器を加熱させる。制御信号は、例えばパルス幅変調（ＰＷＭ）制御信号とすることができる。加熱器２１２を制御するためにＰＷＭ信号を使用することの利点は、ＰＷＭ制御信号によって、加熱器の両端の同じ電位を、必要とされる種々の温度の全てについて用いることができることである。別の実施形態では、制御信号は、振幅変調又は交流を利用することができる。振幅変調された制御信号を用いて加熱器２１２を制御することが有利とすることができる。その理由は、大きな電圧ステップではなく、電圧の連続した緩やかな変化が、スルーレート限界を回避し、整定時間を改善するからである。振幅変調の更なる論議は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする米国特許出願公開第２０１１／００４８５４７号に見出すことができる。幾つかの実施形態では、加熱器についての所望の温度は、制御信号のデューティサイクルを変更することによって達せられる。例えば、１つの非限定的な実施形態では、ＰＣＲ加熱器において９５℃を達成するための制御信号のデューティサイクルは約５０％とすることができ、ＰＣＲ加熱器において７２℃を達成するための制御信号のデューティサイクルは約２５％とすることができ、ＰＣＲ加熱器において５５℃を達成するための制御信号のデューティサイクルは約１０％とすることができる。他の実施形態では、当業者であれば明らかであるような他のデューティサイクルを用いることができる。
【００３８】
本発明の複数の態様とともにマイクロ流体デバイス１００及びシステム２００を用いることができる。例えば、システム２００は、本発明の態様による、既知の、又は予想される熱融解温度を有するアンプリコンを用いて、マイクロ流体デバイス１００の熱制御素子１１２を較正することができる。しかしながら、既知の、又は予想される熱融解温度を有するアンプリコンを用いて、図１及び図２に示されるマイクロ流体デバイス１００及びシステム２００以外のマイクロ流体デバイス１００及びシステム２００内の熱制御素子を較正することもできる。
【００３９】
システム２００のような高分解能熱融解機器では、温度精度が極めて重要である。例えば、温度に小さな偏り又はシフトがあると、融解曲線を分析する際に、遺伝子型の誤分類が生じる場合がある。蛍光対温度を分析するにしても、温度に対する蛍光の導関数を分析するにしても、単一のヌクレオチド多型及び野生型ＤＮＡサンプルを含むホモ接合ＤＮＡは、同じ形状を有し、わずかな温度シフトだけ異なる。例えば、図１８Ａは、ワルファリンＣｙＰ２Ｃ９＊２の場合の蛍光対温度融解曲線を示し、図１８ＢはワルファリンＣｙＰ２Ｃ９＊２の場合の温度融解曲線に対する蛍光の導関数を示す。図１８Ｂに示されるように、２つのプロファイルの温度差、すなわち、真の融解温度における平均差はわずか０．４℃である。同じ形状を示し、或るシフトだけ異なるそのような遺伝子型の場合、遺伝子型を分類するために、導関数のピーク温度によって推定されるＤＮＡの融解温度、Ｔｍが多くの場合に用いられる。測定された温度に小さなドリフト又は偏りがあると、これらの遺伝子型の誤分類が増加する可能性がある。正の温度シフト又はドリフトがある場合には、ホモ接合変異体が野生型として誤分類される可能性がある。逆に、負の温度シフト又はドリフトがある場合には、野生型がホモ接合変異体として誤分類される可能性がある。
【００４０】
温度シフトは、ウェルプレート内のような温度の空間差（勾配）、又は時間シフト（ドリフト）に起因する場合がある。空間又は時間に関して温度シフト又は測定温度の偏りがない理想的なシステムであれば、特定の遺伝子型の場合の融解温度の分散ははるかに小さくなる。しかしながら、現実の機器では、温度勾配及びドリフトが現実的な現象である。
【００４１】
本発明の一態様は、マイクロ流体デバイス（例えば、デバイス１００）のマイクロ流体チャネル（例えば、チャネル１０２）の温度の較正である。幾つかの実施形態では、その較正は、マイクロ流体チャネルの温度を制御及び／又は検出する１つ又は複数の熱制御素子（例えば、薄膜抵抗ヒーター１１２）を較正することによって実行することができる。幾つかの実施形態では、複数のマイクロ流体チャネル（例えば、チャネル１０２）の温度を較正することができる。幾つかの実施形態では、その較正は、既知の、又は予想される熱融解温度を有する単一のアンプリコンを較正物質として用いて実行することができる。アンプリコンは、マイクロ流体チャネルの熱融解ゾーンに導入され、融解される。一実施形態では、アンプリコンは、ゲノムＤＮＡに由来することができる。１つの特定の実施形態では、アンプリコンは、超保存エレメント（ＵＣＥ）から生成することができる。代替の実施形態では、アンプリコンは、合成ＤＮＡから生成することができる。更なる実施形態では、アンプリコンは、鎌状細胞コード配列のようなコード配列から生成することができる。
【００４２】
幾つかの実施形態では、較正は、それぞれ既知の、又は予想される熱融解温度を有する２つ以上のアンプリコンを用いて実行することができる。特定の実施形態では、２つ以上のアンプリコンは、ゲノムＤＮＡから、又は合成ＤＮＡから、又はゲノムＤＮＡに由来する１つ若しくは複数のアンプリコン及び１つ若しくは複数の合成アンプリコンの組み合わせから生成することができる。さらに、２つ以上のアンプリコンのうちの１つ又は複数はＵＣＥとすることができる。
【００４３】
図３Ａは、本発明の一実施形態による、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの温度を較正するためのプロセス３００ａを示す。プロセス３００ａはステップ３０２において開始することができ、そのステップでは、マイクロ流体チャネルの中にアンプリコンが導入される。好ましい実施形態では、１つ又は複数のアンプリコンはそれぞれ既知の熱融解温度を有する。言い換えると、好ましい実施形態では、１つ又は複数の各アンプリコンが融解すると予想される温度が既知である。一実施形態では、１つ又は複数のアンプリコンは任意の合成配列を含む。
【００４４】
ステップ３０４において、増幅産物に関する熱融解分析を実行することができる。言い換えると、アンプリコンを融解することができ、アンプリコンが融解する温度を測定することができる。このようにして、プロセス３００ａは、マイクロ流体チャネル内の１つ又は複数のアンプリコンがそれぞれ融解した温度を求めることができる。一実施形態では、熱融解分析は、アンプリコンを温度ランプにかけることによって実行することができる。アンプリコンは、マイクロ流体デバイスの熱融解ゾーン（例えば、マイクロ流体デバイス１００の熱融解ゾーン１０６）において温度ランプにかけることができる（例えば、アンプリコンの熱応答プロファイルの特徴に応じた温度を含む温度範囲にわたって、例えば、０．５℃／秒において熱制御素子を加熱する）。熱ランプ中に、アンプリコンの従属変数（例えば、蛍光強度）及び熱制御素子の測定値を監視して、熱応答プロファイルを生成する。その温度は熱融解ゾーン蛍光測定システム（例えば、熱融解ゾーン蛍光測定システム２３２）によって測定することができる。しかしながら、熱融解分析を実行するための任意の既知の方法及び／又はデバイスを用いることができる。
【００４５】
一実施形態では、熱融解分析は、熱変動を受ける溶液（例えば、試薬溶液）に関連する従属変数、すなわち、溶液の温度と従属変数との間の関係の分析とすることができる。幾つかの実施形態では、熱応答プロファイルは、蛍光の量と溶液の温度との間の関係を特定する溶液の融解曲線、すなわち蛍光融解分析とすることができる。幾つかの実施形態では、そのような熱応答プロファイルを生成することは、マイクロ流体チップ（例えば、マイクロ流体チップ１００）をマイクロ流体チップ内の反応を制御するためのシステム（例えば、システム２００）に装填することと、１つ又は複数のアンプリコンを含む、試薬の液滴、プラグ、スラグ又は連続流をチップ（例えば、マイクロ流体チャネル１０２）に装填することと、熱制御素子の温度を監視しながら、かつ増幅産物の従属変数（例えば、融解曲線が得られる場合の蛍光）を監視しながら、アンプリコンに熱を伝達する熱制御素子（例えば、ヒーター１１２）を制御してアンプリコンを加熱することとを含むことができる。
【００４６】
一実施形態では、熱応答プロファイルから、各特徴の見かけの（すなわち、測定された）温度（例えば、各アンプリコンに対応する見かけの融解温度）を識別することができる。幾つかの実施形態では、見かけの温度は、ピークピッキングを用いて導関数プロットから求めることができる。他の実施形態では、見かけの温度は、導関数プロットとアンプリコンごとの既知のテンプレート（すなわち、予想される熱応答プロファイル）との相互相関をとることによって、又は熱応答プロファイルをシフト及び伸長して、所定のテンプレートと照合することによって求めることができる。
【００４７】
ステップ３０６において、１つ又は複数のアンプリコンのアンプリコンごとに、アンプリコンが融解した測定温度がそのアンプリコンのための既知の（すなわち、予想される）熱融解温度と比較される。その比較は、例えば、デジタルコンパレーター又はアナログコンパレーターによって実行することができる。そのコンパレーターは、マイクロ流体システムの制御システム（例えば、システム２００の制御システム２５０）の一部とすることができる。しかしながら、比較を実行するための任意の既知の方法及び／又はデバイスを用いることもできる。
【００４８】
ステップ３０８において、測定融解温度（複数の場合もある）とそれぞれの既知の熱融解温度（複数の場合もある）との比較結果（複数の場合もある）に基づいて、マイクロ流体チャネルの温度が較正される。その較正は、マイクロ流体チャネル（例えば、チャネル１０２）の温度を制御及び／又は検出するコントローラー（例えば、制御システム２５０）及び／又は１つ若しくは複数の熱制御素子（例えば、ヒーター１１２）を調整することによって実行することができる。
【００４９】
幾つかの実施形態では、熱制御素子の較正は、較正式、すなわち、熱制御素子の温度と測定値との間の関係をモデル化する式の係数を求めることを含むことができる。一実施形態では、その測定値は、熱制御素子の電気的特性とすることができる。例えば、抵抗ヒーター１１２のための較正式は、ヒーター１１２の温度とヒーター１１２の抵抗との間の関係をモデル化することができる。この実施形態では、較正式は、式１に示されるように、線形関係をモデル化することができる。
【数１】
2013537968.tif 000003
【００５０】
この場合、Ｔは熱制御素子の温度であり、Ｒは熱制御素子の抵抗であり、ｋ０及びｋ１は較正によって求められることになる定数（すなわち、係数）である。２つの較正係数は、例えば、２つの既知の温度（Ｔ１及びＴ２）において抵抗Ｒを測定することによって求めることができる。本発明の幾つかの態様では、これらの測定値は、１つ又は複数のアンプリコンを含む試薬の液滴、プラグ、スラグ又は連続流と熱的に接触している熱制御素子（例えば、ヒーター１１２）を、（例えば、試薬がヒーター１１２に対応するマイクロ流体チャネル１０２内にある間に）加熱し、アンプリコンの熱応答プロファイルの２つ以上の特徴（例えば、融点）と一致する温度において熱制御素子の抵抗を測定する（例えば、ヒーター１１２の抵抗を測定する）ことによって得ることができる。
【００５１】
他の実施形態では、較正式は、電流、電位、加えられる電力、抵抗率、導電率又は他の関連する量のような他の電気的因子間の関係をモデル化することができる。幾つかの態様では、その測定値は、熱制御素子の温度に関連する熱制御素子の独立制御される態様とすることができる。他の態様では、測定値は、熱制御素子の温度に関連する任意の因子とすることができる。
【００５２】
幾つかの実施形態では、較正式は、求められることになる更に多くの係数を含むことができる。例えば、測定値が抵抗である場合に、幾つかの較正式は式２に示されるように二次関係をモデル化することができる。
【数２】
2013537968.tif 000004
この場合、全ての係数をより正確に求めるために、その熱応答プロファイル内に３つ以上の特徴を有する試薬から生じる増幅産物が好ましい場合がある。さらに、式３を用いて、この手法が、ｎ個以上の特徴を有する複合較正物の場合に拡張できることは当業者には理解されよう。
【数３】
2013537968.tif 000005
【００５３】
さらに、幾つかの実施形態では、求められることになる係数よりも多くの特徴を有する試薬を利用する（すなわち、温度と熱制御素子の抵抗との間において、存在する係数よりも多くの対応を特定する）ことによって、係数のための更に正確な値を得ることができる。結果として生じる過剰決定系は、例えば、最小二乗法を用いて解くことができる。
【００５４】
幾つかの実施形態では、熱制御素子は、熱応答プロファイルの特徴（例えば、融点）に基づいて求められた１つ又は複数の温度に加えて、周囲温度（すなわち、室温）を用いて較正することができる。例えば、マイクロ流体チャネルの温度の較正は、熱制御素子が既知の周囲温度にある間に、熱制御素子の出力（例えば、ヒーター１１２の抵抗）を求めることを含むことができる。幾つかの実施形態では、例えば、高精度ＲＴＤ又は熱電対のような別の温度測定デバイスを用いて、周囲温度を測定することができる。しかしながら、当業者によって理解されるように、非接触法を含む任意の他の適切な温度測定デバイスも適している。
【００５５】
他の実施形態では、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネル内の温度を較正するために用いられる１つ又は複数のアンプリコンは合成アンプリコン、すなわち、合成配列から生成されるアンプリコンとすることができる。好ましい実施形態では、合成配列に由来するアンプリコン（複数の場合もある）は、臨床サンプルとは干渉せず、ベクターから生成することができる。好ましい実施形態では、合成配列から設計される１つ又は複数の較正物質は、臨床サンプルと干渉せず、ベクターから容易に生成することができる。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の配列は、ヒトゲノムＤＮＡ内に存在しないように選択される。他の実施形態では、１つ又は複数の配列は、哺乳類ゲノムＤＮＡ内に存在しないように選択される。更なる実施形態では、１つ又は複数の配列は、脊椎動物ＤＮＡ内に存在しないように選択される。一実施形態では、１つ又は複数のアンプリコンのうちの１つはＲＦＣＡＬ−１００と呼ばれる。別の実施形態では、１つ又は複数のアンプリコンのうちの１つはＲＦＣＡＬ−２００と呼ばれる。或る特定の実施形態では、１つ又は複数のアンプリコンはベクター内でクローニングされる。その中に合成配列が挿入された、プラスミド、ウイルス等の、当業者に既知の任意の適切なベクターを用いることができる。
【００５６】
本発明の幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネル内の温度を較正するために用いられる１つ又は複数のアンプリコンのうちの１つ又は複数は、ＵＣＥから生成することができる。ＵＣＥは転写調節及び発生初期に関与し、科学者はＵＣＥが進化時に全ての生命体に共通の機能的イントロンであったと考えている。ヒトゲノムには、多くの数のＵＣＥが存在し、それらのＵＣＥは２００塩基対（ｂｐ）よりも長い配列である場合がある。また、ＵＣＥは、脊椎動物のゲノムの中でも保存される。ＵＣＥは、Ｙ及び２１染色体を除く、全てのヒト染色体内に存在する。ＵＣＥは、非常に低い突然変異率を有し、最近３億年以上にわたって全く変化していない。
【００５７】
本発明の態様を用いて、抵抗センサー、サーミスター、ダイオード温度センサー、熱電対又は任意の他の適切な温度測定デバイスを較正することができる。本発明は更に、薄膜プラチナ素子（又はニッケル、銅又は当業者によって理解されるような任意の他の材料）のような、同じく加熱するために用いられる抵抗センサーを較正するために用いることもできる。
【００５８】
本発明の別の態様は、観測可能なパターン又は傾向に従う空間及び／又は時間の温度シフトの場合に、温度補正を適用して、温度補正済み融解曲線を再生及び／又は再描画し、かつ融解温度の偏差を低減することである。言い換えると、本発明の態様は、測定された温度がその真の値により近づくように、温度プロファイルを再較正することができる。したがって、本発明の態様を用いて、遺伝子型を同定する際の誤分類率を低減することができる。幾つかの実施形態では、既知の融解温度の隣接する陽性対照ＤＮＡサンプル（空間及び時間）を用いて、温度補正を計算し、その温度補正を未知の遺伝子型のＤＮＡ融解曲線に適用することができる。幾つかの実施形態では、陽性対照サンプル（すなわち、既知の、又は予想融解温度を有する較正物質又はアンプリコン）は、未知のサンプルの前及び／又は後に、及び／又は同時に融解することができ、それらの融解曲線の導関数は１つ又は２つ以上のピークを示すことができる。
【００５９】
例えば、図１９Ａは、ウェルプレートに基づくシステムにおける、本発明の一実施形態による較正物質（例えば、以下に更に詳細に説明される２０７ｂｐＵＣＥ配列）の場合の蛍光対温度融解曲線を示し、図１９Ｂは、ＵＣＥ較正物質の場合の温度融解曲線に対する蛍光の導関数が単一のピークを示すことを示す。別の例では、図２０Ａは、マイクロ流体チャネルに基づくシステムにおける本発明の別の実施形態による較正物質（例えば、以下に更に詳細に説明されるＲＦＣＡＬ−１００及びＲＦＣＡＬ−２００を含む合成較正物質）の場合の蛍光対温度融解曲線を示し、図２０Ｂは、その較正物質の場合の温度融解曲線に対する蛍光の導関数が２つのピーク（すなわち、約７０℃の１つのピーク及び約９０℃の第２のピーク）を示すことを示す。本発明の態様は、図１９Ｂ及び図２０Ｂに示されるような、１つ又は２つのピークを示す導関数を有する融解曲線を生成する較正物質を使用して、温度補正を較正し、その補正を未知の遺伝子型のＤＮＡ融解曲線に適用することができる。
【００６０】
本発明の一態様は、マイクロ流体システム内に存在するマイクロ流体チャネル内の熱融解の温度を較正する方法である。本方法は、（ａ）マイクロ流体チャネルにヒトゲノムＤＮＡを含む試験サンプルと、対象となる１つ又は複数の核酸のための少なくとも一対のプライマーと、較正物質のための一対のプライマーとを含む試薬を導入することであって、この較正物質はゲノムＤＮＡにおいて見いだされる、導入することと、（ｂ）ゲノムＤＮＡを増幅することであって、較正用アンプリコンと、対象となる１つ又は複数の核酸のアンプリコンとを生成する、増幅することと、（ｃ）アンプリコンを融解するとともに、各アンプリコンの融解温度を求めることと、（ｄ）較正用アンプリコンの求められた融解温度を較正用アンプリコンの予想融解温度と比較することと、（ｅ）較正用アンプリコンの融解温度に基づいて、対象となる少なくとも１つの核酸のアンプリコンの融解温度を較正することとを含むことができる。
【００６１】
図３Ｂは、本発明の一実施形態による、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネル内の熱融解の温度を較正するためのプロセス３００ｂを示す。プロセス３００はステップ３１２において開始することができ、そのステップでは、試薬がマイクロ流体チャネル内に導入される。その試薬は、試験サンプル、対象となる核酸のための一対のプライマー、及び／又は較正物質のための一対のプライマーを含むことができる。幾つかの実施形態では、試薬は、対象となる１つ又は複数の付加的な核酸のための１つ又は複数の付加的なプライマー対も含むことができる。一実施形態では、試験サンプルはヒトゲノムＤＮＡを含むことができる。しかしながら、試験サンプルは、ヒトゲノムＤＮＡに加えて、又はその代わりに、他のタイプのＤＮＡを含むこともできる。幾つかの実施形態では、その較正物質は、例えば、ヒトゲノムＤＮＡのようなゲノムＤＮＡにおいて見られる。１つの非限定的な実施形態では、較正物質はＵＣＥである。しかしながら、他の実施形態では、較正物質は合成較正物質とすることができる。較正物質がＵＣＥである実施形態のような幾つかの実施形態では、較正物質は試験サンプル内に含まれる場合がある。較正物質が合成物である実施形態のような他の実施形態では、その試薬は較正物質を更に含む。幾つかの実施形態では、試薬は１つ又は複数の更なる較正物質のための１つ又は複数の更なるプライマー対を含むことができ、それは試薬に含まれる場合もある。好ましい実施形態では、１つ又は複数の較正物質はそれぞれ既知の熱融解温度を有する。言い換えると、好ましい実施形態では、１つ又は複数の各アンプリコンが融解すると予想される温度は既知である。ステップ３１２は、対象となる核酸のためのプライマーが較正物質のプライマーとは別の流体セグメント内に存在することができるように、試薬が別の流体セグメント内に導入されることを含むことができる。較正物質のためのプライマーを含む流体セグメントは、対象となる核酸のためのプライマーを含む複数の流体セグメントの前後に導入することができるか、又は、較正物質のためのプライマーを含む流体セグメントが対象となる核酸のためのプライマーを含む各流体セグメントの前後に存在することができるように、較正物質のためのプライマーを含む流体セグメントは対象となる核酸のためのプライマーを含む流体セグメントと交互に導入することができる。
【００６２】
ステップ３１４において、試験サンプルと、対象となる１つ又は複数の核酸のための少なくとも一対のプライマーと、１つ又は複数の較正物質のための少なくとも一対のプライマーとを含むことができる試薬が増幅される。ステップ３１４における試薬の増幅は、１つ又は複数の較正用アンプリコンと、対象となる１つ又は複数の核酸のアンプリコンとを含む増幅産物を生成することができる。一実施形態では、ＰＣＲ増幅をもたらすために、試薬を何度もＰＣＲ温度サイクルにかけることによって増幅を実行することができる。試薬は、マイクロ流体デバイスのＰＣＲゾーン（例えば、マイクロ流体デバイス１００のＰＣＲゾーン１０４）においてＰＣＲ温度サイクルにかけることができる。しかしながら、試薬を増幅するための任意の既知の方法及び／又はデバイスを用いることができる。
【００６３】
ステップ３１６において、増幅産物に関する熱融解分析を実行することができる。言い換えると、１つの又は複数の較正用アンプリコン及び対象となる１つ又は複数の核酸のアンプリコンが融解することができ、アンプリコンが融解する温度を測定することができる。このようにして、プロセス３００ｂは、マイクロ流体チャネル内の増幅産物の各アンプリコンが融解した温度を求めることができる。一実施形態では、熱融解分析は、アンプリコンを温度ランプにかけることによって実行することができる。アンプリコンは、マイクロ流体デバイスの熱融解ゾーン（例えば、マイクロ流体デバイス１００の熱融解ゾーン１０６）において温度ランプにかけることができる（例えば、アンプリコンの熱応答プロファイルの特徴に応じた温度を含む温度範囲にわたって、例えば、０．５℃／秒において熱制御素子を加熱する）。熱ランプ中に、アンプリコンの従属変数（例えば、蛍光強度）及び熱制御素子の測定値を監視して、熱応答プロファイルを生成する。その温度は熱融解ゾーン蛍光測定システム（例えば、熱融解ゾーン蛍光測定システム２３２）によって測定することができる。しかしながら、熱融解分析を実行するための任意の既知の方法及び／又はデバイスを用いることができる。
【００６４】
一実施形態では、熱融解分析は、熱変動を受ける溶液（例えば、試薬溶液）に関連する従属変数、すなわち、溶液の温度と従属変数との間の関係の分析とすることができる。幾つかの実施形態では、熱応答プロファイルは、蛍光の量と溶液の温度との間の関係を特定する溶液の融解曲線、すなわち、蛍光融解分析とすることができる。幾つかの実施形態では、そのような熱応答プロファイルを生成することは、マイクロ流体チップ（例えば、マイクロ流体チップ１００）をマイクロ流体チップ内の反応を制御するためのシステム（例えば、システム２００）に装填することと、１つ又は複数のアンプリコンを含む、試薬の液滴、プラグ、スラグ又は連続流をチップ（例えば、マイクロ流体チャネル１０２）に装填することと、熱制御素子の温度を監視しながら、かつ増幅産物の従属変数（例えば、融解曲線が得られる場合の蛍光）を監視しながら、アンプリコンに熱を伝達する熱制御素子（例えば、ヒーター１１２）を制御して、アンプリコンを加熱することとを含むことができる。
【００６５】
一実施形態では、熱応答プロファイルから、各特徴の見かけの（すなわち、測定された）温度（例えば、１つ又は複数の較正用アンプリコンのそれぞれに、及び／又は対象となる１つ又は複数の核酸の各アンプリコンに対応する見かけの融解温度）を識別することができる。幾つかの実施形態では、見かけの温度は、ピークピッキングを用いて導関数プロットから求めることができる。他の実施形態では、見かけの温度は、導関数プロットとアンプリコンごとの既知のテンプレート（すなわち、予想される熱応答プロファイル）との相互相関をとることによって、又は熱応答プロファイルをシフト及び伸長して、所定のテンプレートと照合することによって求めることができる。
【００６６】
ステップ３１８において、１つ又は複数のアンプリコンのアンプリコンごとに、較正用アンプリコンが融解した測定温度が較正用アンプリコンのための既知の（すなわち、予想される）熱融解温度と比較される。その比較は、例えば、デジタルコンパレーター又はアナログコンパレーターによって実行することができる。そのコンパレーターは、マイクロ流体システムの制御システム（例えば、システム２００の制御システム２５０）の一部とすることができる。しかしながら、比較を実行するための任意の既知の方法及び／又はデバイスを用いることもできる。
【００６７】
ステップ３２０において、マイクロ流体チャネルの対象となる１つ又は複数の核酸のアンプリコンの融解温度（複数の場合もある）が１つ又は複数の較正用アンプリコンの測定された融解温度（複数の場合もある）に基づいて較正される。例えば、マイクロ流体チャネルの対象となる１つ又は複数の核酸のアンプリコンの融解温度（複数の場合もある）は、１つ又は複数の較正用アンプリコンの測定された融解温度（複数の場合もある）とそれぞれの既知の熱融解温度（複数の場合もある）との比較結果（複数の場合もある）に基づいて較正される。１つの非限定的な実施形態では、較正は、１つ又は複数の較正用アンプリコンの測定された融解温度（複数の場合もある）とそれぞれの既知の熱融解温度（複数の場合もある）との比較結果（複数の場合もある）に従って、対象となる１つ又は複数の核酸のアンプリコンの融解温度（複数の場合もある）をシフトすることによって実行される。
【００６８】
上述したように、幾つかの実施形態では、マイクロ流体チャネル試薬は、対象となる１つの核酸のための一対のプライマーを含む。本明細書において用いられるときに、対象となる核酸は、試験サンプル内でその存否が判断されることになる核酸を指している。他の実施形態では、マイクロ流体チャネル試薬は、対象となる２つ以上の各核酸の一対のプライマーを含む。幾つかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ内に見られる較正物質は、ヒトゲノムＤＮＡのような、対象となる全てのゲノムＤＮＡ内に存在することが知られているＤＮＡセグメントである。他の実施形態では、較正物質はＵＣＥである。幾つかの実施形態では、マイクロ流体チャネル試薬は、較正物質のための一対のプライマーを含むことができる。或る特定の実施形態では、マイクロ流体試薬の増幅は較正用アンプリコンを生成する。或る特定の実施形態では、較正物質の増幅は、対象となる１つ又は複数の核酸の増幅に影響を及ぼさない。
【００６９】
幾つかの実施形態では、各アンプリコンの融解温度を求めることは、サビツキーゴーレイフィルターを用いてアンプリコンの融解の融解曲線の導関数を求めることと、融解曲線の導関数の最大の負の導関数における温度を見つけることとを含むことができる。各アンプリコンの融解温度を求めることは、基準融解曲線の導関数のピークとアンプリコンの融解の融解曲線の導関数のピークとの相互相関をとることと、最も高い相関を有する温度をアンプリコンの融解温度として選択することとを含むことができる。較正物質アンプリコンの求められた融解温度を較正物質アンプリコンのそれぞれの予想融解温度と比較することは、較正物質アンプリコンのそれぞれの予想融解温度を用いて、傾き補正因子及び切片補正因子を計算することを含むことができる。対象となる核酸の各アンプリコンの融解温度を較正することは、較正用アンプリコンの計算された傾き補正因子及び計算された切片補正因子を用いて、調整済み温度を計算することを含むことができる。
【００７０】
その方法は、較正用アンプリコンの求められた融解温度と較正用アンプリコンのそれぞれの予想融解温度との比較を用いて、対象となる１つ又は複数の核酸の１つ又は複数のアンプリコンの増幅を検証することを含むことができる。その検証は、対象となる核酸のアンプリコンの補正済みの融解温度を求めることを含むことができる。
【００７１】
一実施形態では、熱融解分析は、熱変動を受ける溶液（例えば、試薬溶液）に関連する従属変数、すなわち、溶液の温度と従属変数との間の関係の分析とすることができる。幾つかの実施形態では、熱応答プロファイルは、蛍光の量と溶液の温度との間の関係を特定する溶液の融解曲線、すなわち、蛍光融解分析とすることができる。幾つかの実施形態では、そのような熱応答プロファイルを生成することは、マイクロ流体チップ（例えば、マイクロ流体チップ１００）をマイクロ流体チップ内の反応を制御するためのシステム（例えば、システム２００）に装填することと、試験サンプル及びプライマーを含む、試薬の液滴、プラグ、スラグ又は連続流をチップ（例えば、マイクロ流体チャネル１０２）に装填して、較正物質及び対象となる核酸を増幅することと、熱制御素子の温度を監視しながら、かつ増幅産物の従属変数（例えば、融解曲線が得られる場合の蛍光）を監視しながら、アンプリコンに熱を伝達する熱制御素子（例えば、ヒーター１１２）を制御して、アンプリコンを加熱することとを含む。
【００７２】
一実施形態では、熱応答プロファイルから、各特徴の見かけの（すなわち、測定された）温度（例えば、各アンプリコンに対応する見かけの融解温度）を識別することができる。幾つかの実施形態では、見かけの温度は、ピークピッキングを用いて導関数プロットから求めることができる。他の実施形態では、見かけの温度は、導関数プロットとアンプリコンごとの既知のテンプレート（すなわち、予想される熱応答プロファイル）との相互相関をとることによって、又は熱応答プロファイルをシフト及び伸長して、所定のテンプレートと照合することによって求めることができる。
【００７３】
本発明の幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネル内の熱融解の温度を較正するために用いられる１つ又は複数の較正物質のうちの１つ又は複数はＵＣＥとすることができる。ＵＣＥは全てのゲノムＤＮＡ内に存在するので、ゲノムＤＮＡを用いて増幅が行われるときはいつでも、１つ又は複数の特定の超保存エレメント（ＵＣＥ）ＤＮＡ配列も増幅することができる。
【００７４】
本発明の幾つかの実施形態では、一対のプライマーを設計して、較正物質として用いられる特定のＵＣＥ配列を増幅することができる。ＰＣＲのような増幅プロセスを用いるとき、そのプライマー対を用いて、同じＵＣＥアンプリコンを何度も繰り返し形成することができる。ＵＣＥアンプリコンは、常に、同じ融解温度（ＴＭ）を示すことになる。ＵＣＥアンプリコンが常に同じＴＭを示すという特徴に基づいて、そのＵＣＥアンプリコンを、例えば、１つ又は複数のマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体システム内の融解温度を較正するために用いることができる。
【００７５】
したがって、一態様では、本発明は、較正用アンプリコンを用いて、対象となる核酸のアンプリコンの融解温度を較正するようなＰＣＲ及び熱融解分析デバイスにおいてヒトゲノムＤＮＡ内に見られる較正物質を増幅するために一対のプライマーを用いるための方法、デバイス及びシステムを提供する。一実施形態では、そのＵＣＥプライマーは、ＰＣＲ増幅及び融解中に、対象となる１つ又は複数の核酸のための少なくとも一対のプライマーと同時に用いられ、対象となる核酸から生成されたアンプリコンの融解温度（ＴＭ）は正確である。これは、ＵＣＥプライマー産物が既知のＴＭを有することができるので果たすことができる。
【００７６】
本発明の実施形態は、種々の機器において用いることができるが、in-vitro診断を実行するＰＣＲ及び熱融解システムにおいて特に有用である。本発明の実施形態を用いて、サンプルを熱融解（診断）することを意図したセンサー及びヒーター、並びに全く異なる機能を実行する機器（例えば、サンプル調製及びＰＣＲ）内の他のヒーター及びセンサーを較正することができる。
【００７７】
別の態様では、本発明は多重アンプリコン較正物システムを提供する。言い換えると、２つ以上のアンプリコンを含む試薬を用いて、マイクロ流体チャネルの温度を較正することができる。例えば、二重アンプリコン較正物を用いて、或る特定のマイクロ流体チップに基づくシステムにおいて正確な高分解能の融解を生成することができる。非限定的な実施形態では、多重アンプリコン較正物システム内の複数のアンプリコンのうちの１つ又は複数は超保存エレメント（ＵＣＥ）である。別の非限定的な実施形態では、多重アンプリコン較正物システム内の複数のアンプリコンのうちの１つ又は複数は合成である。別の非限定的な実施形態では、複数のアンプリコンのうちの１つ又は複数はＵＣＥであり、複数のアンプリコンのうちの１つ又は複数は合成である。
【００７８】
上記のように、本発明の一実施形態は２つのアンプリコンを利用することができる。１つの非限定的な例では、一方のアンプリコンは所望のＤＮＡ配列に由来することができ、他方のアンプリコンはＵＣＥアンプリコンとすることができる。一実施形態では、そのＤＮＡ配列は任意のヒトゲノムの配列又は他の配列に由来することができる。用いることができる遺伝子の一例は、鎌状細胞遺伝子である。鎌状細胞遺伝子の配列の一例は、４４４ｂｐフラグメントである。別の実施形態では、ＵＣＥアンプリコンは４１５ｂｐＵＣＥアンプリコンである。鎌状配列のための融解温度Ｔｍは約８４℃であり、ＵＣＥ配列の温度Ｔｍは７４℃である。この非限定的な例では、両方のアンプリコンは、ヒトゲノムＤＮＡを増幅することによって得られた。しかしながら、二重アンプリコン較正物システム内の両方のアンプリコンはヒトゲノムＤＮＡを増幅することによって得られる必要はない。
【００７９】
或る特定の実施形態では、上記の、鎌状遺伝子の４４４ｂｐフラグメント及びＵＣＥの４１５ｂｐフラグメントに由来するアンプリコンを用いる二重較正物質システムには或る特定の制約が存在する場合がある。第一に、２つの較正物が及ぶ範囲は、予想融解温度の全範囲に及ばない場合がある。第二に、そのアンプリコンはゲノムＤＮＡに由来し、それゆえ、潜在的には、後続の増幅反応にとって汚染物質源となる可能性がある。最後に、これらの較正物質の製造には、コリエールＤＮＡバンクのようなＤＮＡバンクから得られたヒトＤＮＡからの増幅を必要とする場合がある。したがって、これらの較正物質は、材料源として製造又は保証するのが容易である材料を表さない場合がある。
【００８０】
本発明の別の態様は、広い温度範囲及び合成配列に由来する２つ以上のアンプリコンを用いる二重アンプリコン較正物システムである。好ましい実施形態では、それらのアンプリコンは、容易に生成することができるような合成配列から設計される。幾つかの実施形態では、ヒトゲノムＤＮＡ内に存在しないような配列が選択される。他の実施形態では、哺乳類ゲノムＤＮＡ内に存在しないような配列が選択される。更なる実施形態では、脊椎動物ＤＮＡ内に存在しないような配列が選択される。幾つかの実施形態では、その配列は、５℃より広く、好ましくは１０℃よりも広く、更に好ましくは２０℃より広いＴＭ範囲を有するアンプリコンを生成するように選択される。一実施形態では、第１のアンプリコンはＲＦＣＡＬ−１００と呼ばれる。別の実施形態では、第２のアンプリコンはＲＦＣＡＬ−２００と呼ばれる。或る特定の実施形態では、２つ以上のアンプリコンがベクター内でクローニングされる。ウイルス等の、当業者に既知の任意の適切なベクターを用いることができる。
【００８１】
非限定的な較正物質例
ゲノムＵＣＥ配列
マイクロ流体デバイスのマイクロチャネルの温度を較正するために用いることができる較正物質の非限定的な例は、２０７塩基対を有するＵＣＥ配列である。開発時に、２０７ｂｐＵＣＥ配列は、bioscience worldのウェブサイトwww.bioscienceworld.caを用いて見つけられた。その後、その配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Tool）データベースに対して照合された。２０７ｂｐ配列（配列番号：１）はヒト染色体１７配列（ジェンバンク受入番号ＡＦ２８７９６７．１）の一部であることがわかった。プライマー３ソフトウェアを用いて、１組の２つのプライマーが設計され（配列番号：２及び配列番号：３）、それらのプライマーは７１ｂｐ産物（配列番号：４）を増幅した。
【００８２】
ＵＣＥプライマー及び異なるゲノムＤＮＡサンプルを用いる実験によれば、全てのサンプルが増幅され、増幅された全てのサンプルが同じＴｍを示すことがわかった。この実験は、ロシュライトサイクラー（商標）４８０（ＬＣ４８０）サイクラープラットフォーム及びマイクロ流体機器を用いて何度か行われた。実験結果が図４及び図５に示される。図４及び図５は、温度に対する蛍光の導関数を温度の関数として示す（例えば、ｄＦ／ｄＴ対Ｔ）を示す、いわゆる「導関数プロット」を示す。図４は、マイクロ流体機器においてＵＣＥプライマーを用いて生成された増幅産物の熱融解曲線を示しており、３つの異なるゲノムＤＮＡを示す。図５は、ＬＣ４８０サイクラープラットフォームにおいてＵＣＥプライマーを用いて生成された増幅産物の熱融解曲線を示しており、７つの異なるゲノムＤＮＡを示す。その実験結果は、融解温度ＴＭに変動がなかったことを実証する。したがって、その実験によれば、ＵＣＥプライマーを用いて、ＵＣＥアンプリコンを増幅することができ、それが温度較正物質としての役割を果たすことがわかる。
【００８３】
第２の実験も行われた。第２の実験では、対象となる核酸を増幅する一対のプライマーがデバイスに装填され、その後、ＵＣＥプライマーがデバイスに装填された。実験はマイクロ流体機器を用いて実行され、その結果が図６及び図７に示される。図６は、調査対象のプライマーの３つの異なる遺伝子型（すなわち、野生遺伝子型（Ｗｔ）、ホモ接合遺伝子型（Ｈｍ）及びヘテロ接合遺伝子型（Ｈｔ））を示す熱融解曲線を示す。図７は、ＵＣＥプライマーのＵＣＥアンプリコンを示す熱融解曲線を示す。
【００８４】
ＵＣＥプライマーのアンプリコンが融解温度ＴＭの変動を示す場合には、調査対象のプライマーの増幅産物も融解温度ＴＭの変動を示す場合がある。これは、ＤＮＡサンプル間の不可能な遺伝子型分化を示す場合がある。ＤＮＡサンプル間の不可能な遺伝子型分化を示す結果の一例が図８及び図９に示される。図８は、３つの異なる遺伝子型（すなわち、野生遺伝子型（Ｗｔ）、ホモ接合遺伝子型（Ｈｍ）及びヘテロ接合遺伝子型（Ｈｔ））を示す熱融解曲線を示す。図９は、ＵＣＥプライマーのＵＣＥアンプリコンを示す熱融解曲線を示す。図９に示されるように、ＵＣＥプライマーのＵＣＥアンプリコンの融解温度ＴＭは変動を示し、図８に示されるように、対象となる核酸のアンプリコンの融解温度は同じ変動を示した。
【００８５】
ＵＣＥプライマーは対象となる核酸の増幅と干渉せず、温度較正物としても役立つことを実証するために、以下の実験が実行された。ＵＣＥプライマー及び対象となる核酸のためのプライマーが一緒に反応混合物成分（すなわち、試薬）を加えられ、９６ウェルプレートのウェルに装填された。ＬＣ４８０サイクラープラットフォームを用いて、ＰＣＲ増幅及び融解分析が実行された。その結果が図１０及び図１１に示される。図１０は、調査対象のプライマーに加えられたＵＣＥアンプリコンを示す熱融解曲線を示す。図１１は、対象となる核酸のアンプリコンを示す熱融解曲線を示す。図１０及び図１１に示される結果は、ＵＣＥプライマーが対象となる核酸の増幅に影響を及ぼさないことを裏付ける。言い換えると、ＵＣＥプライマーが対象となる核酸のプライマーを加えられたか否かにかかわらず、対象となる核酸のアンプリコンの場合に同じ融解温度が得られた。また、その結果は、ＵＣＥアンプリコンが温度較正物として使用できることも示す。
【００８６】
上記で論じられた実験によって示されるように、幾つかの実施形態では、２つ以上のＵＣＥプライマーを用いて、マイクロ流体デバイス又はチップ内のマイクロ流体チャネル内で温度を調べる簡単で、迅速で、かつ信頼性のある手順を提供することができる。また、実験によれば、幾つかの実施形態では、チップ内の調査対象のプライマーの後又は前に追加されるときに、２つ以上のＵＣＥプライマーが温度較正物として良好に機能できることがわかった。この場合、ＵＣＥアンプリコンを用いて、マイクロ流体チャネル温度が理想的な温度設定値に達したか否かを判断することができ、それゆえ、ＵＣＥアンプリコンを用いてＰＣＲ実行を検証することができる。実験によれば、ＬＣ４８０サイクラープラットフォームのような標準的なＰＣＲ機器において用いられるときに、２つの以上のＵＣＥプライマーが同じように良好に機能することが更にわかる。幾つかの実施形態では、ＵＣＥプライマーは調査対象の２つ以上のプライマーを加えられる場合があり、調査対象のプライマーの増幅産物と干渉しない場合がある。
【００８７】
他の実施形態では、ＵＣＥプライマーは、行われた増幅を検証する陽性対照としての役割を果たすことができる。較正物質のための熱応答プロファイル、例えば、融解曲線を得ることは、ゲノムＤＮＡの増幅を妨げることになる、試薬の汚染又は他の異常が生じていないことを実証する陽性対照としての役割を果たすことができる。
【００８８】
合成較正物
マイクロ流体デバイスのマイクロチャネルの温度を較正するために用いることができる１つ又は複数のアンプリコンの非限定的な実施形態では、１つ又は複数のアンプリコンのうちの１つ又は複数は合成アンプリコンとすることができる。例示的な実施形態では、本発明は二重アンプリコン較正物システムを提供する。その二重アンプリコン較正物システムを用いて、較正物性能及び生成を改善することができる。非限定的な例では、高分解能ＤＮＡ融解機器において二重アンプリコン較正物システムを用いて、較正物性能及び生成を改善することができる。しかしながら、これは不可欠ではなく、その二重アンプリコン較正物システムは他のシステムにおいて用いることができる。幾つかの実施形態では、二重アンプリコン較正物システムは、二重システムのために設計された個々の較正物を有することができる。一実施形態では、二重アンプリコン較正物システムの試験が、ＬＣ４８０サイクリングプラットフォーム上で実行され、二重較正物システムの実現可能な調製の非限定的な例が開発された。
【００８９】
１つの非限定的な例では、マイクロ流体デバイス内のマイクロ流体チャネルの温度を較正するために用いることができる２つのアンプリコンは、本明細書において「配列Ａ」及び「配列Ｂ」と呼ばれる。配列Ａは長さが１００塩基対（配列番号：５）であり、配列Ｂは長さが２００塩基対（配列番号：６）である。特定の例が記述されるが、本発明の実施形態において、異なる配列、及び異なる長さを有する配列を用いることもできる。
【００９０】
本発明の実施形態による二重較正物の非限定的な一例の開発では、融解温度ＴＭに具体的に目標設定できるようにするために、２つの較正点のための合成ＤＮＡ構成物が使用された。ＤＮＡテンプレートとして機能するように、２つのＤＮＡ（すなわち、配列Ａ及び配列Ｂ）配列を生成した。それらの配列は、http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/random.htmにおいて市販される「Ｒａｎｄｏｍ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ」と呼ばれるウェブベースのプログラムを用いて生成された。
【００９１】
２つの配列が、ＮＣＢＩからのＢＬＡＳＴプログラム、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&PROG_DEF=blastn&BLAST_PROG_DEF=megaBlast&BLAST_SPEC=blast2seqを用いて類似度を調べられた。データベース上ののいずれの配列とも類似性が見いだされなかった後に、プライマーは、較正物配列の最後の２０又は２２塩基対に絞り込まれた。配列Ａのためのプライマーは配列番号：７及び配列番号：８において記述される配列である。配列Ｂのためのプライマーは配列番号：９及び配列番号：１０において記述される配列である。プライマー特異性を調べるために、カリフォルニア大学サンタクルーズ校（ＵＣＳＣ）ゲノムブラウザー（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=startにおいて利用可能）が使用された。配列Ａ及び配列Ｂのみを増幅するためにプライマーが検証された。
【００９２】
この準備作業が終了した後に、両方の配列を得るために、Ｇｅｎｅ  Ｏｒａｃｌｅクローンサービスを用いて配列が構成され、注文された。各構成物はｐＧＯｖ４ベクター内に別々にクローニングされた。ｐＧＯｖ４はｐＵＣ系ベクターであり、そのベクターはアンピシリン及びカナマイシン耐性である。ｐＧＯｖ４マップが図１２に示される。
【００９３】
それらの配列がベクターに組み込まれた後に、そのベクターは、配列Ａを含むＲＦＣＡＬ−１００及び配列Ｂを含むＲＦＣＡＬ−２００であった。ＲＦＣＡＬ−１００のための配列が配列番号：１１において示されており、ＲＦＣＡＬ−２００のための配列が配列番号：１２において示される。
【００９４】
全てのプライマーが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から２００ｎＭ単位で注文され、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製された。しかしながら、異なる精製及び／又は異なる供給業者からのプライマーを用いることもできる。その後、プライマーは１００μＭのＰＣＲ清浄水内に再懸濁された。ゲノムＤＮＡが対照ＤＮＡとして使用された。例えば、ＰａｒａｇｏｎＤＸ社からのＶＫＯＲＣＩ野生型を対照ＤＮＡとして用いることができる。以下の表は、試薬混合物及び試薬カタログ番号に関する更なる詳細を提供する。
【００９５】
【表１】
2013537968.tif 000006
【００９６】
上記の試薬は、ＤＮＡ試薬混合物、Ｔａｑポリメラーゼ試薬混合物及びプライマー試薬混合物を作製するために以下の表において示される、以下の濃度において使用された。
【００９７】
【表２】
2013537968.tif 000007
【００９８】
【表３】
2013537968.tif 000008
【００９９】
【表４】
2013537968.tif 000009
【０１００】
この例では、９６ウェルプレートのウェル内に３つ全ての試薬混合物を合わせた合計２０μＬが加えられた。各プライマーは２つ組に加えられた。各試薬混合物の体積及びパーセンテージが以下の表に示される。
【０１０１】
【表５】
2013537968.tif 000010
【０１０２】
３つ全ての試薬群が研究所内の貯蔵供給源から注文された。その後、ＤＮＡ及びプライマーがそれぞれの混合物に加えられた。
【０１０３】
この例では、プライマーは２つ組に加えられた。陽性対照（例えば、ＶＫＯＲＣ１プライマー＋対照ＤＮＡ（ＶＫＯＲＣ１））及び陰性対照（例えば、ＶＫＯＲＣ１プライマー＋２ｘＣＵＬＳバッファー）が加えられた。
【０１０４】
試薬がロシュＬＣ４８０サイクリングプラットフォーム上で増幅された。使用されたＰＣＲプロトコルが以下の表に示される。
【０１０５】
【表６】
2013537968.tif 000011
【０１０６】
両方のプライマーセットの場合に３８℃のアニーリング温度が良好に機能した。
【０１０７】
図１３は、ＬＣ４８０サイクラープラットフォームにおける較正物の産物増幅を示すグラフである。図１３に示されるように、サンプルは増幅に成功した。ＲＦＣＡＬ−２００ＤＮＡが非常に強い蛍光値を示した。ＲＦＣＡＬ−１００は配列サイズ及びＧＣ含有量に起因して予想通りに、ＲＦＣＡＬ−２００と比べて低い蛍光値を示した。ＶＫＯＲＣ１がＰＣＲ陽性対照として使用された。
【０１０８】
両方のＤＮＡサンプルの場合の融解ピークを得るのにも成功した。いずれも単一の明確なピークを与え、それらのピークは互いから離れていた。ＲＦＣＡＬ−１００は約７０℃の融解温度ＴＭを有し、ＲＦＣＡＬ−２００は約９０℃の融解温度ＴＭを有する。図１４は、ＬＣ４８０サイクラープラットフォーム上の較正物融解の増幅産物を示す熱融解曲線を示す。
【０１０９】
その後、目標サイズを確認するために、ＰＣＲ産物の一定分量がＡｌｉｇｅｎｔＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００マイクロ流体ベース分析プラットフォームを用いて調べられた。図１５は、ＲＦＣＡＬ−１００の分析結果を示しており、図１６はＲＦＣＡＬ−２００の結果を示す。
【０１１０】
ＲＦＣＡＬ−１００及びＲＦＣＡＬ−２００ＰＣＲ産物のための予想バンドサイズ及び観測バンドサイズが以下に示される。
【０１１１】
【表７】
2013537968.tif 000012
【０１１２】
好ましい実施形態では、ＲＦＣＡＬ−１００はＲＦＣＡＬ−２００よりも低い蛍光値を与えるので、ＲＦＣＡＬ−１００及びＲＦＣＡＬ−２００は２：１の比で加えられる。そうすることによって、ＲＦＣＡＬ−１００及びＲＦＣＡＬ−２００は、最終的な調製において概ね同等の蛍光を達成する。図１７は、ＲＦＣＡＬ−１００対ＲＦＣＡＬ−２００の比が２：１において調製された較正物を用いるＩｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＨＲ−１高分解能融解装置におけるＲＦＣＡＬ−１００及びＲＦＣＡＬ−２００の場合のＲＦＣＡＬ融解プロファイルを示す。図１７に示されるように、ＲＦＣＡＬ−１００及びＲＦＣＡＬ−２００の蛍光値はこれらの比において実質的に同じである。しかしながら、ＲＦＣＡＬ−１００及びＲＦＣＡＬ−２００は概ね同等の蛍光を達成する必要はなく、他の比が用いられる場合もある。
【０１１３】
例示的な実施形態では、２つの構成物及びそれぞれのプライマーが所望のように機能した。それらのプライマーは、予想される産物の増幅に成功したことを実証することができた。それらの増幅産物はそれぞれ融解時に高い蛍光値を有する単一のピークを示した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒマイクロ流体ベース分析プラットフォーム上の予想されるフラグメントサイズの実証によって、産物特異性が確認された。それゆえ、その性能を考えると、ＲＦＣＡＬ−１００及びＲＦＣＡＬ−２００は温度較正のために有用である。
【０１１４】
ＵＣＥ及び合成較正物質の具体的な例がこれまで説明されてきたが、本発明の態様によれば、他の較正物質を用いることもできる。
【０１１５】
本発明の実施形態が添付の図面を参照しながら十分に説明されてきた。本発明はこれらの好ましい実施形態に基づいて説明されてきたが、本発明の趣旨及び範囲内で、上記の実施形態に対して或る特定の変更、変形を加えることができ、かつ代替の構成を形成できることは当業者には明らかであろう。
【０１１６】
非限定的な温度較正／補正例
上記で言及されたように、加熱検知素子の抵抗測定値Ｒから測定された温度Ｔｍｅｓへの計算は一次式の形をとることができる。
【数４】
2013537968.tif 000013
【０１１７】
項ｋ１又はｋ０に誤差があると、真の温度に対して測定温度に偏り又はシフトが生じることになる。較正物質（すなわち、既知の、又は予想融解温度を有する陽性対照ＤＮＡ）を用いて、温度補償を計算し、測定温度を真の値の近くにシフトすることができる。
【０１１８】
補間を用いる単一ピーク温度較正
較正物質（すなわち、陽性対照）として単一ピークアンプリコン（例えば、２０７ｂｐＵＣＥ配列に由来する）が用いられるとき、特定の融解の全ての測定温度の範囲に対して単一の温度シフト（切片ｋ０における補正）を適用することができる。一実施形態では、このシフト補正値ｋ’０は以下のように未知のＤＮＡサンプルに適用することができる。第一に、ＵＣＥ融解前のピーク温度（ＴｍｐｒｅＵＣＥ）及びＵＣＥ融解後のピーク温度（ＴｍｐｏｓｔＵＣＥ）が得られる。第二に、２つのＵＣＥ（すなわち、較正物質）間で実行されるアッセイ融解の調整済み温度が線形補間によって計算される。
【０１１９】
ＵＣＥアンプリコン融解前のピーク温度（ＴｍｐｒｅＵＣＥ）及びＵＣＥアンプリコン融解後のピーク温度（ＴｍｐｏｓｔＵＣＥ）は、例えば、図３Ａに示されるマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの温度を較正するためのプロセス３００ａのステップ３０４において、又は図３Ｂに示される熱融解の温度を較正するためのプロセス３００ｂのステップ３１６において求めることができる。他の実施形態では、ＵＣＥアンプリコン融解前のピーク温度（ＴｍｐｒｅＵＣＥ）及びＵＣＥアンプリコン融解後のピーク温度（ＴｍｐｏｓｔＵＣＥ）は、任意の適切な方法を用いて求めることができる。例えば、１つの適切な手法は、（ｉ）所定の窓サイズ、多項式及び温度分解能（例えば、それぞれ２℃、２次及び０．０１℃）を有するサビツキーゴーレイフィルターを用いて、ＵＣＥアンプリコン融解前及びＵＣＥアンプリコン融解後の負の導関数を得て、（ｉｉ）ＵＣＥアンプリコン融解前及びＵＣＥアンプリコン融解後の最大の負の導関数における温度を見つけることによって、ＴｍｐｒｅＵＣＥ及びＴｍｐｏｓｔＵＣＥを求めるピークピッキング手法である。ここで、ＵＣＥアンプリコン融解前及びＵＣＥアンプリコン融解後の最大の負の導関数における温度は、ＴｍｐｒｅＵＣＥ及びＴｍｐｏｓｔＵＣＥである。
【０１２０】
別の実施形態では、ＵＣＥアンプリコン融解前のピーク温度（ＴｍｐｒｅＵＣＥ）及びＵＣＥアンプリコン融解後のピーク温度（ＴｍｐｏｓｔＵＣＥ）は、最大相関手法を用いて求めることができる。最大相関手法では、較正された機器からの較正物質（すなわち、陽性対照）の融解曲線（例えば、図２１Ａにおいて実線で示される）の導関数を、１つ又は複数の後続の実験からの較正物質の融解曲線（例えば、図２１Ａにおいて点線で示される）の導関数がシフトされる基準として用いることによって、ＴｍｐｒｅＵＣＥ及びＴｍｐｏｓｔＵＣＥが求められる。したがって、実験較正物質のためのｙ（ｘ）は種々のｄｘだけシフトされる場合がある。
【数５】
2013537968.tif 000014
【０１２１】
このようにして、図２１Ａに示されるように、基準較正物質（例えば、図２１Ａにおいて実線で示される）の負の導関数を、後続の実験のシフトされた較正物質ｙ’（ｘ）に対して相関をとることができる。最適なシフトは、図２１Ｂに示される相関係数を最大にするｄｘによって与えることができる。図２１Ａにおいて、最適なシフトの結果として破線が生成される。その後、基準ＵＣＥのＴｍから最適なｄｘを減算することによって、ＴｍｐｒｅＵＣＥ及びＴｍｐｏｓｔＵＣＥを計算することができる。Ｔｍのシフトを計算するこの最大相関手法は、ピーク選択肢をピッキングするよりも雑音に対してロバストとすることができるが、いずれの方法も用いることができる。
【０１２２】
ＴｍｐｒｅＵＣＥ及びＴｍｐｏｓｔＵＣＥが得られると、２つのＵＣＥ間において実行されるアッセイ溶解の調整済み温度を、以下のような線形補間によって計算することができる。
【数６】
2013537968.tif 000015
【数７】
2013537968.tif 000016
【０１２３】
したがって、シフト補正値ｋ’0の計算は以下の通りである。
【数８】
2013537968.tif 000017
及び
【数９】
2013537968.tif 000018
【０１２４】
上記の式において、ＴｍｒｅｆｅｒｅｎｃｅＵＣＥは文献から引用されるか、又は較正済みの機器から測定されたＵＣＥの真の既知のＴｍであり、ＴＡｓｓａｙは実験機器によって測定されたアッセイのアッセイ温度ベクトル、又はＴｍであることに留意されたい。式８を用いるシフト補正値の計算は、例えば、図３Ａに示されるマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの温度を較正するためのプロセス３００ａのステップ３０６において、又は図３Ｂに示される熱融解の温度を較正するためのプロセス３００ｂのステップ３１８において行うことができる。式９に示される調整済み温度の計算は、例えば、図３Ａに示されるマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの温度を較正するためのプロセス３００ａのステップ３０８において、又は図３Ｂに示される熱融解の温度を較正するためのプロセス３００ｂのステップ３２０において行うことができる。
【０１２５】
図２２Ａは、７つの異なるチャネルから収集された同じ遺伝子型のアッセイの融解温度（Ｔｍ）（白抜きの丸）と、織り交ぜられたＵＣＥ（線で結ばれた点）とを示すプロットである。図２２Ｂは、７チャネルにわたる同時に融解したアッセイの標準偏差を示すプロットである。図２２Ｃは、直前のＵＣＥ及び直後のＵＣＥを用いて補間されたＵＣＥ融解温度（Ｔｍ）に対するアッセイの融解温度の変化（ΔＴｍ）を示すプロットである。図２２Ｄは、図２２Ｃに示される融解温度の変化（ΔＴｍ）の対応する標準偏差を示すプロットである。図２２Ｅは、最初のＵＣＥ及び最後のＵＣＥのみを用いて補間されたＵＣＥ  Ｔｍに対するアッセイの融解温度の変化（ΔＴｍ）を示すプロットである。図２２Ｆは、図２２Ｅに示されるアッセイの融解温度の変化（ΔＴｍ）の対応する標準偏差を示すプロットである。
【０１２６】
図２２Ａ〜図２２Ｆに示されるように、特定のチャネルの温度にドリフトがあるとき（ＵＣＥのドリフトするＴｍによって示される）、又はチャネル間で測定温度のシフトがある場合には、事前ＵＣＥ及び事後ＵＣＥの補間されたＴｍに対するアッセイの調整済み測定温度を計算することによって、チャネルにわたるアッセイの（同じ遺伝子型の）Ｔｍの標準偏差を小さくするのを助けることができる。このようにして、事前ＵＣＥ及び事後ＵＣＥの補間されたＴｍに対するアッセイの調整済み測定温度を計算することによって、遺伝子型同定の精度を改善することができる。
【０１２７】
上記の単一較正物質／ピークを用いる例示的な方法では、ゲノムＵＣＥ（例えば、上記の２０７ｂｐＵＣＥ配列）を使用する必要はない。代替的には、合成配列（例えば、ＲＦＣＡＬ−１００又はＲＦＣＡＬ−２００）を較正物質として用いることができる。
【０１２８】
二重ピーク温度較正
二重ピーク較正（例えば、ＲＦＣＡＬ−１００及びＲＦＣＡＬ−２００を含む較正物質）が陽性対照として用いられるとき、特定の融解の全ての測定温度の範囲に対して、温度スケーリング及びシフト（勾配ｋ１及び切片ｋ０の補正）を適用することができる。二重ピーク温度較正の説明及び関連する式は、便宜上、用語ＵＣＥを使用する。この用語が任意の較正物質を指していることは理解されたい。このため、二重ピーク陽性対照を用いることによって、測定温度値を更に正確に補償できるようになる。一実施形態では、このスケール補正ｋ’１及びシフト補正値ｋ’０を以下のように未知のＤＮＡサンプルに適用することができる。第一に、実験二重ピーク較正物質（例えば、ＵＣＥ及び／又はゲノム及び／又は合成）融解の低いピーク温度ＴｍＵＣＥｌｏｗ及び高いピーク温度ＴｍＵＣＥｈｉｇｈが得られる。第二に、実験陽性対照後に実行されるアッセイ融解の調整済み温度が得られる。
【０１２９】
実験二重ピーク較正物質（例えば、ＵＣＥ）の低いピーク温度及び高いピーク温度は、例えば、図３Ａに示されるマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの温度を較正するためのプロセス３００ａのステップ３０４において、又は図３Ｂに示される熱融解の温度を較正するためのプロセス３００ｂのステップ３１６において得ることができる。実験二重ピーク較正物質（例えば、ＵＣＥ）融解の低いピーク温度ＴｍＵＣＥｌｏｗ及び高いピーク温度ＴｍＵＣＥｈｉｇｈは任意の適切な手法を用いて得ることができる。例えば、１つの適切な手法は、（ｉ）所定の窓サイズ、多項式及び温度分解能（例えば、それぞれ２℃、２次及び０．０１℃）を有するサビツキーゴーレイフィルターを用いることによって、実験較正物質の融解曲線の導関数を得て、（ｉｉ）二重ピーク較正物質の最大の負の導関数における温度（低及び高）を見つける。ここで、二重ピーク較正物質の最大の負の導関数における温度（低及び高）は、ＴｍｐｒｅＵＣＥ及びＴｍｐｏｓｔＵＣＥである。
【０１３０】
実験二重ピーク較正物質融解の低いピーク温度ＴｍＵＣＥｌｏｗ及び高いピーク温度ＴｍＵＣＥｈｉｇｈを得るための別の適切な手法は、較正された機器から得られた二重ピーク較正物質（すなわち、陽性対照）のための融解曲線の導関数を基準として用いることができる。低い温度ピーク及び高い温度ピークは融解曲線の基準導関数から見いだすことができ（ＴｍＵＣＥｒｅｆｅｒｅｎｃｅｌｏｗ及びＴｍＵＣＥｒｅｆｅｒｅｎｃｅｈｉｇｈ）、窓（例えば、±１．５℃）は各ピークの周囲に配置することができる（図２３Ａの破線の線分によって示される）。
【０１３１】
基準導関数の左側ピーク（約７０℃を中心にした図２３Ａの破線部分）の負の導関数を、図２３Ｂに示される実験較正物質の左側ピークの負の導関数に対して相互相関をとることができる。２つの最も高い相互相関点を得ることができ、第１の（左側の）最も高い相互相関点の温度はＴｍＵＣＥｌｏｗと見なすことができる。基準導関数の右側ピーク（約９０℃を中心にした図２３Ａの破線部分）を、図２３Ｂに示される実験較正物質の右側ピークの負の導関数に対して相互相関をとることができる。２つの最も高い相互相関点を求めることができ、第２の（右側の）最も高い相互相関点の温度はＴｍＵＣＥｈｉｇｈと見なすことができる。
【０１３２】
ＴｍＵＣＥｌｏｗ及びＴｍＵＣＥｈｉｇｈが得られると、実験陽性対照の前又は後に実行されるアッセイ融解の調整済み温度は、以下のように、傾き補正因子及び切片補正因子を計算することによって得ることができる。
【数１０】
2013537968.tif 000019
【数１１】
2013537968.tif 000020
【０１３３】
傾き補正因子及び切片補正因子は、例えば、図３Ａに示されるマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの温度を較正するためのプロセス３００ａのステップ３０６において、又は図３Ｂに示される熱融解の温度を較正するためのプロセス３００ｂのステップ３１８において計算することができる。
【０１３４】
その後、以下のように、傾き補正因子及び切片補正因子から、調整済み温度を計算することができる。
【数１２】
2013537968.tif 000021
【０１３５】
代替的には、以下のように、これらの補正因子を抵抗値にリアルタイムに適用して、再較正済みの温度読み値を得ることができる。
【数１３】
2013537968.tif 000022
【０１３６】
式１２又は式１３に示される調整済み温度の計算は、例えば、図３Ａに示されるマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの温度を較正するためのプロセス３００ａのステップ３０８において、又は図３Ｂに示される熱融解の温度を較正するためのプロセス３００ｂのステップ３２０において行うことができる。
【０１３７】
図２３Ｃに示されるように、較正外れ二重ピーク較正物質（例えば、図２３Ｂに示される二重ピーク融解曲線を生成する較正物質）を用いるとき、上記の再較正手順は、その低いピーク及び高いピークを、較正物の基準融解（例えば、図２３Ａに示される基準融解）からの低いピーク及び高いピークと整列させることができる。図２３Ｄに示されるように、独立した較正検査融解の後続の融解は、この再較正手順が後続の融解において良好に機能することを示す。図２３Ｅは、二重ピーク較正物質を用いる自動較正手順の機能を示す概略図である。
【０１３８】
上記の温度較正例に示されるように、既知の、又は予想融解温度を有し、単一又は二重のピーク融解曲線を生成する較正物質（すなわち、陽性対照ＤＮＡ）を用いて、機器内の較正ドリフトを断続的に相殺することができる。
【図１】
2013537968.tif 000023
【図２】
2013537968.tif 000024
【図３Ａ】
2013537968.tif 000025
【図３Ｂ】
2013537968.tif 000026
【図４】
2013537968.tif 000027
【図５】
2013537968.tif 000028
【図６】
2013537968.tif 000029
【図７】
2013537968.tif 000030
【図８】
2013537968.tif 000031
【図９】
2013537968.tif 000032
【図１０】
2013537968.tif 000033
【図１１】
2013537968.tif 000034
【図１２】
2013537968.tif 000035
【図１３】
2013537968.tif 000036
【図１４】
2013537968.tif 000037
【図１５】
2013537968.tif 000038
【図１６】
2013537968.tif 000039
【図１７】
2013537968.tif 000040
【図１８Ａ】
2013537968.tif 000041
【図１８Ｂ】
2013537968.tif 000042
【図１９Ａ】
2013537968.tif 000043
【図１９Ｂ】
2013537968.tif 000044
【図２０Ａ】
2013537968.tif 000045
【図２０Ｂ】
2013537968.tif 000046
【図２１Ａ】
2013537968.tif 000047
【図２１Ｂ】
2013537968.tif 000048
【図２２Ａ】
2013537968.tif 000049
【図２２Ｂ】
2013537968.tif 000050
【図２２Ｃ】
2013537968.tif 000051
【図２２Ｄ】
2013537968.tif 000052
【図２２Ｅ】
2013537968.tif 000053
【図２２Ｆ】
2013537968.tif 000054
【図２３Ａ】
2013537968.tif 000055
【図２３Ｂ】
2013537968.tif 000056
【図２３Ｃ】
2013537968.tif 000057
【図２３Ｄ】
2013537968.tif 000058
【図２３Ｅ】
2013537968.tif 000059
【配列表】
2013537968000001.app
【国際調査報告】
2013537968.tif 000060