(57)【要約】  対象へのPEGヒアルロナン分解酵素の全身投与の有害作用を緩和するための方法が、ここに提供される。本方法では、PEG化ヒアルロナン分解酵素、特にPEG化ヒアルロニダーゼ、例えば動物または細菌ヒアルロニダーゼのいずれかが、対象に全身投与され、有害作用を緩和するのに十分な量のコルチコステロイドが投与される。単剤療法または併用療法のための、ヒアルロナン関連疾患または状態を処置する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ヒアルロナン剤による処置に関連する有害副作用を緩和するための医薬の製剤化を目的とするコルチコステロイドの使用。
【請求項２】
抗ヒアルロナン剤による処置に関連する有害副作用を緩和するのに使用するためのコルチコステロイドを含む医薬組成物。
【請求項３】
有害作用が筋骨格副作用である、請求項1に記載の使用または請求項2に記載の医薬組成物。
【請求項４】
有害作用が筋骨格副作用であり、筋・関節痛、上肢のこわばり、下肢のこわばり、痙攣、筋炎、全身の筋痛および圧痛、脱力、疲労、ならびに膝関節および肘関節における可動域の減少の中から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項５】
コルチコステロイドがグルココルチコイドである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項６】
グルココルチコイドが、コルチゾン類、デキサメタゾン類、ヒドロコルチゾン類、メチルプレドニゾロン類、プレドニゾロン類およびプレドニゾン類の中から選択される、請求項5に記載の使用または医薬組成物。
【請求項７】
グルココルチコイドがデキサメタゾンである、請求項5または請求項6に記載の使用または医薬組成物。
【請求項８】
コルチコステロイドが経口投与用に製剤化されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項９】
コルチコステロイドが、0.1〜20mg、0.1〜15mg、0.1〜10mg、0.1〜5mg、0.2〜20mg、0.2〜15mg、0.2〜10mg、0.2〜5mg、0.4〜20mg、0.4〜15mg、0.4〜10mg、0.4〜5mg、0.4〜4mg、1〜20mg、1〜15mgもしくは1〜10mgまたはその前後の範囲にある量の1回量投与用に製剤化されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項１０】
抗ヒアルロナン剤がヒアルロナン分解酵素であるか、ヒアルロナン合成を阻害する作用剤である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項１１】
ヒアルロナン分解酵素がポリマーにコンジュゲートされている、請求項10に記載の使用または医薬組成物。
【請求項１２】
ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するために0.5μg〜1450μgもしくは150単位（U）〜45,000単位またはその前後の範囲にある量で医薬として製剤化されているヒアルロナン分解酵素組成物の使用であって、ヒアルロナン分解酵素がポリマーへのコンジュゲーションによって修飾されており、組成物が直接投与用に製剤化されている使用。
【請求項１３】
ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するために0.5μg〜1450μgもしくは150単位（U）〜45,000単位またはその前後の範囲にある量でヒアルロナン分解酵素を含む医薬組成物であって、ヒアルロナン分解酵素がポリマーへのコンジュゲーションによって修飾されており、組成物が直接投与用に製剤化されている医薬組成物。
【請求項１４】
組成物が1回量を与える、請求項12または請求項13に記載の使用または医薬組成物。
【請求項１５】
ヒアルロナン関連疾患または障害を処置するための医薬の製造におけるヒアルロナン分解酵素の使用であって、
医薬が、0.5μg〜1450μgもしくは150単位（U）〜45,000単位またはその前後の範囲にある量で、少なくとも4週間のサイクルにわたって少なくとも週に1回の頻度で、対象にヒアルロナン分解酵素を直接投与するために製剤化されており、かつ
ヒアルロナン分解酵素が、ポリマーへのコンジュゲーションによって修飾されている、
使用。
【請求項１６】
頻度が少なくとも週に2回または週に1回である、請求項15に記載の使用。
【請求項１７】
サイクルが複数回繰り返される、請求項15または請求項16に記載の使用。
【請求項１８】
ポリマーがPEGであり、ヒアルロナン分解酵素がPEG化されている、請求項12〜17のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項１９】
量が、0.75μg〜1125μg；3.75μg〜750μg；56μg〜565μg；もしくは75μg〜225μgまたはその前後の範囲にある、請求項12〜18のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２０】
量が、24単位（U）〜36,000U；120U〜24,000U；1500U〜18,000U；もしくは2400U〜7200Uまたはその前後の範囲にある、請求項12〜18のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２１】
ポリマーにコンジュゲートされたヒアルロナン分解酵素が、少なくとも20,000U/mg、25,000U/mg、30,000U/mg、31,000U/mg、32,000U/mg、33,000U/mg、34,000U/mg、35,000U/mg、36,000U/mg、37,000U/mg、38,000U/mg、39,000U/mg、40,000U/mg、45,000U/mg、50,000U/mg、55,000U/mg、60,000U/mgまたはその前後もしくはそれ以上の比活性を有する、請求項12〜20のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２２】
ヒアルロナン分解酵素組成物が、経口投与、静脈内（IV）投与、皮下投与、筋肉内投与、腫瘍内投与、皮内投与、外用投与、経皮投与、直腸投与、または表皮下投与用に製剤化されている、請求項12〜21のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２３】
組成物が全身投与用または局所投与用に製剤化されている、請求項12〜22のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２４】
組成物が静脈内投与用に製剤化されている、請求項22または請求項23に記載の使用または組成物。
【請求項２５】
組成物が、腫瘍内投与、動脈投与、腹腔内投与、または膀胱内投与の中から選択される局所投与用に製剤化されている、請求項23に記載の使用または組成物。
【請求項２６】
ヒアルロナン関連疾患または状態が、高い間質液圧に関連するもの、がん、浮腫、椎間板圧迫、および炎症性疾患の中から選択される、請求項12〜25のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２７】
疾患または状態が浮腫であり、浮腫が臓器移植、脳卒中または脳外傷によって引き起こされる、請求項26に記載の使用または医薬。
【請求項２８】
炎症性疾患が、関節リウマチ、強皮症、歯周炎、乾癬、アテローム性動脈硬化、慢性創傷、クローン病、潰瘍性大腸炎、および炎症性腸疾患の中から選択される、請求項26に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２９】
疾患または状態ががんであり、がんが腫瘍である、請求項26に記載の使用または医薬組成物。
【請求項３０】
疾患または状態が固形腫瘍である、請求項29に記載の使用または医薬組成物。
【請求項３１】
腫瘍が、同じ組織タイプの非がん性組織と比較して、または同じ腫瘍タイプの非転移性腫瘍と比較して、増加したヒアルロナンの細胞および/または間質発現を有する、請求項30に記載の使用または医薬組成物。
【請求項３２】
疾患または状態が、末期がん、転移がんおよび未分化がんのいずれか1つ以上の中から選択される、請求項26に記載の使用または医薬組成物。
【請求項３３】
疾患または状態が、卵巣がん、上皮内癌（ISC）、扁平上皮細胞癌（SCC）、前立腺がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、脳がん、および大腸がんのいずれか1つ以上の中から選択される、請求項26または32に記載の使用または医薬組成物。
【請求項３４】
ヒアルロナン分解酵素がヒアルロニダーゼである、請求項1〜33のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項３５】
ヒアルロニダーゼがPH20または可溶性PH20である、請求項34に記載の使用または医薬組成物。
【請求項３６】
ヒアルロニダーゼが、C末端グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）付加部位またはGPI付加部位の一部を除去するためにトランケートされた可溶性PH20である、請求項35に記載の使用または医薬組成物。
【請求項３７】
ヒアルロニダーゼが中性活性であり、かつN-グリコシル化されており、
（a）完全長PH20であるか、PH20のC末端トランケート型である、ヒアルロニダーゼポリペプチド、ここで完全長PH20は、配列番号2に示すアミノ酸の配列を含む；または
（b）配列番号2に示すアミノ酸の配列のポリペプチドまたはトランケート型と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むヒアルロニダーゼポリペプチド；または
（c）ヒアルロニダーゼポリペプチドが、配列番号2に示すポリペプチドと、またはその対応するトランケート型と、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するようにアミノ酸置換を含む、（a）または（b）のヒアルロニダーゼポリペプチド
から選択される、請求項34〜36のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項３８】
投与された抗ヒアルロナン剤による対象における有害作用を緩和または防止するための方法であって、有害作用を緩和するのに十分な量のコルチコステロイドを対象に投与することを含む方法。
【請求項３９】
コルチコステロイドがグルココルチコイドである、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
グルココルチコイドが、コルチゾン類、デキサメタゾン類、ヒドロコルチゾン類、メチルプレドニゾロン類、プレドニゾロン類およびプレドニゾン類の中から選択される、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
グルココルチコイドがデキサメタゾンである、請求項39または請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
コルチコステロイドが経口投与される、請求項38〜41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
有害作用が筋骨格副作用である、請求項38〜42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
有害作用が筋骨格性であり、筋・関節痛、上肢のこわばり、下肢のこわばり、痙攣、筋炎、全身の筋痛および圧痛、脱力、疲労、ならびに膝関節および肘関節における可動域の減少の中から選択される、請求項38〜43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
有害作用が抗ヒアルロナン剤の用量制限毒性（DLT）をもたらす、請求項38〜44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
コルチコステロイドが、コルチコステロイドの非存在下での抗ヒアルロナン剤のDLTを排除するか、DLTをもたらす用量を増加させる量で投与される、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
有害作用が毒性尺度でグレード3であり、コルチコステロイドが、そのグレードをグレード1またはグレード2に低減するか、コルチコステロイドの投与後数時間以内に解消するグレード3に低減する量で投与される、請求項38〜46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
コルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤の投与に先だって投与されるか、抗ヒアルロナン剤の投与と同時に投与されるか、抗ヒアルロナン剤の投与と共に断続的に投与されるか、または抗ヒアルロナン剤の投与の後に投与される、請求項38〜47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
コルチコステロイドが抗ヒアルロナン剤と共投与される、請求項38〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
コルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤の投与に先だって投与される、請求項38〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
コルチコステロイドの投与が、抗ヒアルロナン剤の投与の少なくとも1時間前またはその前後もしくはそれ以上前である、請求項38〜50のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
コルチコステロイドが抗ヒアルロナン剤の投与の後に投与される、請求項38〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
コルチコステロイドの投与が、抗ヒアルロナン剤の投与の少なくとも8時間〜12時間後である、請求項38〜48および52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
コルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤の投与前および抗ヒアルロナン剤の投与後に投与される、請求項38〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
投与されるコルチコステロイドの量が、0.1〜20mg、0.1〜15mg、0.1〜10mg、0.1〜5mg、0.2〜20mg、0.2〜15mg、0.2〜10mg、0.2〜5mg、0.4〜20mg、0.4〜15mg、0.4〜10mg、0.4〜5mg、0.4〜4mg、1〜20mg、1〜15mgもしくは1〜10mgまたはその前後である、請求項38〜54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
投与されるコルチコステロイドの量が0.4〜20mgまたはその前後である、請求項38〜55のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
抗ヒアルロナン剤がヒアルロナン分解酵素であるか、ヒアルロナン合成を阻害する作用剤である、請求項38〜56のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
抗ヒアルロナン剤が、ヒアルロナン合成を阻害する作用剤であり、HAシンターゼに対するセンスまたはアンチセンス核酸分子から選択されるか、小分子薬物である、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
抗ヒアルロナン剤が、4-メチルウンベリフェロン（MU）もしくはその誘導体またはレフルノミドもしくはその誘導体から選択される小分子薬物である、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
小分子薬物が、6,7-ジヒドロキシ-4-メチルクマリンまたは5,7-ジヒドロキシ-4-メチルクマリンから選択される4-メチルウンベリフェロン（MU）の誘導体である、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
抗ヒアルロナン剤がヒアルロナン分解酵素であり、ヒアルロナン分解酵素がポリマーへのコンジュゲーションによって修飾されている、請求項57に記載の方法。
【請求項６２】
ポリマーがPEGであり、ヒアルロナン分解酵素がPEG化されている、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
有害作用が投与される抗ヒアルロナン剤の量または投与レジームに起因する、請求項38〜62のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
抗ヒアルロナン剤が、週に数回、週に2回、週に1回、21日ごと、または1ヶ月に1回、投与される、請求項38〜63のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
抗ヒアルロナン剤が、ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するために投与される、請求項38〜64のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
抗ヒアルロナン剤の投与が、経口的、静脈内（IV）的、皮下的、筋肉内的、腫瘍内的、皮内的、外用的、経皮的、直腸的、または表皮下的に達成される、請求項38〜65のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
対象ががんを有し；かつ
有害副作用がPEG化ヒアルロナン分解酵素の全身投与に起因する、
請求項38〜66のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
有害副作用が、約0.00005mg/kg〜5mg/kg（投与を受ける対象の重さ）またはその前後であるPEG化ヒアルロナン分解酵素の単回用量の静脈内投与に起因する、請求項38〜67のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
有害副作用が、0.0001mg/kg、0.0005mg/kg、0.0006mg/kg、0.0007mg/kg、0.0008mg/kg、0.0009mg/kg、0.001mg/kg、0.0016mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.016mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg.kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mg/kg、9mg/kg、9.5mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg（投与を受ける対象の重さ）またはその前後である量のPEG化ヒアルロナン分解酵素の投与に起因する、請求項38〜68のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
有害作用が、0.3単位/kg〜320,000単位/kg、1単位/kg〜800,000単位/kg、10〜100,000単位/kg、16〜16,000単位/kg、500〜5000単位/kg、1単位/kg〜1000単位/kg、1単位/kg〜500単位/kgもしくは10単位/kg〜50単位/kgまたはその前後の範囲にある量のPEG化ヒアルロナン分解酵素の投与に起因する、請求項38〜69のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
有害副作用が、10単位/kg（U/kg）、16U/kg、32U/kg、64U/kg、100U/kg、200U/kg、300U/kg、400U/kg、500U/kg、600U/kg、700U/kg、800U/kg、900U/kg、1,000U/kg、2,000U/kg、3,000U/kg、4,000U/kg、5,000U/kg、6,000U/kg、7,000U/kg、8,000U/kg、9,000U/kg、10,000U/kg、12,800U/kg、20,000U/kg、32,000U/kg、40,000U/kg、50,000U/kg、60,000U/kg、70,000U/kg、80,000U/kg、90,000U/kg、100,000U/kg、120,000U/kg、140,000U/kg、160,000U/kg、180,000U/kg、200,000U/kg、220,000U/kg、240,000U/kg、260,000U/kg、280,000U/kg、300,000U/kg、320,000U/kg、350,000U/kg、400,000U/kg、450,000U/kg、500,000U/kg、550,000U/kg、600,000U/kg、650,000U/kg、700,000U/kg、750,000U/kg、800,000U/kg（投与を受ける対象の重さ）またはその前後である量のPEG化ヒアルロナン分解酵素の投与に起因する、請求項38〜70のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
有害作用が、0.3単位/kg〜320,000単位/kg（対象の重さ）またはその前後である量のPEG化ヒアルロナン分解酵素の投与に起因し、投与されるコルチコステロイドの量が、0.4〜20mgまたはその前後である、請求項38〜71のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
がん処置の投与をさらに含む、請求項38〜72のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
がん処置が、外科手術、放射線、化学療法剤、生物学的作用剤、ポリペプチド、抗体、ペプチド、小分子、遺伝子治療ベクター、ウイルスおよびDNAの中から選択される、請求項73に記載の方法。
【請求項７５】
がん処置が、アシビシン類；アビシン類；アクラルビシン類；アコダゾール類；アクロニン類；アドゼレシン類；アルデスロイキン類；アレムツズマブ類；アリトレチノイン類（9-シス-レチノイン酸類）；アロプリノール類；アルトレタミン類；アルボシジブ類；アンバゾン類；アンボマイシン類；アメタントロン類；アミフォスチン類；アミノグルテチミド類；アムサクリン類；アナストロゾール類；アナキシロン類；アンシタビン類；アントラマイシン類；アパジコン類；アルギメスナ類；三酸化ヒ素類；アスパラギナーゼ類；アスペルリン類；アトリムスチン類；アザシチジン類；アゼテパ類；アゾトマイシン類；バノキサントロン類；バタブリン類；バチマスタット類；BCG生菌；ベナキシビン類；ベンダムスチン類；ベンゾデパ類；ベキサロテン類；ベバシズマブ；ビカルタミド類；ビエタセルピン類；ビリコダル類；ビサントレン類；ビサントレン類；ジメシル酸ビスナフィド類；ビゼレシン類；ブレオマイシン類；ボルテゾミブ類；ブレキナル類；ブロピリミン類；ブドチタン類；ブスルファン類；カクチノマイシン類；カルステロン類；カネルチニブ類；カペシタビン類；カラセミド類；カルベチマー類；カルボプラチン類；カルボコン類；カルモフール類；カルムスチン類とポリフェプロサン類；カルムスチン類；カルビシン類；カルゼレシン類；セデフィンゴール類；セレコキシブ類；セマドチン類；クロラムブシル類；シオテロネル類；シロレマイシン類；シスプラチン類；クラドリビン類；クランフェヌル類；クロファラビン類；クリスナトール類；シクロホスファミド類；シタラビンリポソーム製剤；シタラビン類；ダカルバジン類；ダクチノマイシン類；ダルベポエチンアルファ類；ダウノルビシンリポソーム製剤；ダウノルビシン類/ダウノマイシン類；ダウノルビシン類；デシタビン類；デニロイキンジフチトクス類；デクスニグルジピン類；デキソンナプラチン類；デクスラゾキサン類；デザグアニン類；ジアジコン類；ジプロスピジウム類；ジエノゲスト類；ジナリン類；ジセルモリド類；ドセタキセル類；ドフェキダル類；ドキシフルリジン類；ドキソルビシンリポソーム製剤；ドキソルビシンHCL；ドキソルビシンHCLリポソーム注射剤；ドキソルビシン類；ドロロキシフェン類；プロピオン酸ドロモスタノロン類；デュアゾマイシン類；エコムスチン類；エダトレキセート類；エドテカリン類；エフロルニチン類；エラクリダル類；エリナフィド類；エリオットB溶液類；エルサミトルシン類；エミテフル類；エンロプラチン類；エンプロマート類；エンザスタウリン類；エピプロピジン類；エピルビシン類；エポエチンアルファ類；エプタロプロスト類；エルブロゾール類；エソルビシン類；エストラムスチン類；エタニダゾール類；エトグルシド類；リン酸エトポシド類；エトポシドVP-16類；エトポシド類；エトプリン類；エクセメスタン類；エクシスリンド類；ファドロゾール類；ファザラビン類；フェンレチニド類；フィルグラスチム類；フロクスウリジン類；フルダラビン類；フルオロウラシル類；5-フルオロウラシル類；フルオキシメステロン類；フルロシタビン類；ホスキドン類；ホストリエシン類；ホストリエシン類；ホトレタミン類；フルベストラント類；ガラルビシン類；ガロシタビン類；ゲムシタビン類；ゲムツズマブ類/オゾガミシン類；ゲロキノール類；ギマテカン類；ギメラシル類；グロキサゾン類；グルフォスファミド類；酢酸ゴセレリン類；ヒドロキシ尿素類；イブリツモマブ類/チウキセタン類；イダルビシン類；イホスファミド類；イルモホシン類；イロマスタット類；メシル酸イマチニブ類；イメキソン類；インプロスルファン類；インジスラム類；インプロクォン類；インターフェロンアルファ-2a類；インターフェロンアルファ-2b類；インターフェロンアルファ類；インターフェロンベータ類；インターフェロンガンマ類；インターフェロン類；インターロイキン-2類および他のインターロイキン類（組換えインターロイキン類を含む）；イントプリシン類；イオベングアン類［131-I］；イプロプラチン類；イリノテカン類；イルソグラジン類；イクサベピロン類；ケトトレキサート類；L-アラノシン類；ランレオチド類；ラパチニブ類；レドキサントロン類；レトロゾール類；ロイコボリン類；ロイプロリド類；リューロプロレリン類（リュープロレリド類）；レバミソール類；レキサカルシトール類；リアロゾール類；ロバプラチン類；ロメトレキソール類；ロムスチン類/CCNU類；ロムスチン類；ロナファルニブ類；ロソキサントロン類；ラルトテカン類；マフォスファミド類；マンノスルファン類；マリマスタット類；マソプロコール類；メイタンシン類；メクロルエタミン類；メクロルエタミン類/ナイトロジェンマスタード類；酢酸メゲストロール類；メゲストロール類；メレンゲストロール類；メルファラン類；メルファラン類/L-PAM類；メノガリル類；メピチオスタン類；メルカプトプリン類；6-メルカプトプリン；メスナ類；メテシンド類；メトトレキサート類；メトキサレン類；メトミデート類；メトプリン類；メツレデパ類；ミボプラチン類；ミプロキシフェン類；ミソニダゾール類；ミチンドミド類；ミトカルシン類；ミトクロミン類；ミトフラキソン類；ミトギリン類；ミトグアゾン類；ミトマルシン類；マイトマイシンC類；マイトマイシン類；ミトナフィド類；ミトキドン類；ミトスパー類；ミトタン類；ミトキサントロン類；ミトゾロミド類；ミボブリン類；ミゾリビン類；モファロテン類；モピダモール類；ムブリチニブ類；ミコフェノール酸類；フェンプロピオン酸ナンドロロン類；ネダプラチン類；ネルザラビン類；ネモルビシン類；ニトラクリン類；ノコダゾール類；ノフェツモマブ類；ノガラマイシン類；ノラトレキセド類；ノルトピキサントロン類；オクトレオチド類；オプレルベキン類；オルマプラチン類；オルタタキセル類；オテラシル類；オキサリプラチン類；オキシスラン類；オキソフェナルシン類；パクリタキセル類；パミドロネート類；パツビロン類；ペガデマーゼ類；ペガスパルガーゼ類；ペグフィルグラスチム類；ペルデシン類；ペリオマイシン類；ペリトレキソール類；ペメトレキセド類；ペンタムスチン類；ペントスタチン類；ペプロマイシン類；ペルホスファミド類；ペリホシン類；ピコプラチン類；ピナフィド類；ピポブロマン類；ピポスルファン類；ピルフェニドン類；ピロキサントロン類；ピクサントロン類；プレビトレキセド類；プリカミシド・ミトラマイシン類；プリカマイシン類；プロメスタン類；プロメスタン類���ポルフィマーナトリウム類；ポルフィマー類；ポルフィロマイシン類；プレドニムスチン類；プロカルバジン類；プロパミジン類；プロスピジウム類；プミテパ類；ピューロマイシン類；ピラゾフリン類；キナクリン類；ラニムスチン類；ラスブリカーゼ類；リボプリン類；リトロスルファン類；リツキシマブ類；ログレチミド類；ロキニメクス類；ルホクロモマイシン類；サバルビシン；サフィンゴール類；サルグラモスチム類；サトラプラチン類；セブリプラチン類；セムスチン類；シムトラゼン類；シゾフィラン類；ソブゾキサン類；ソラフェニブ類；スパルフォセート類；スパルホス酸類；スパルソマイシン類；スピロゲルマニウム類；スピロムスチン類；スピロプラチン類；スピロプラチン類；スクアラミン類；ストレプトニグリン類；ストレプトバリシン類；ストレプトゾシン類；スホスファミド類；スロフェヌル類；リンゴ酸スニチニブ；6-チオグアニン（6-TG）；タセジナリン類；タルク類；タリソマイシン類；タリムスチン類；タモキシフェン類；タリキダル類；タウロムスチン類；テコガラン類；テガフール類；テロキサントロン類；テモポルフィン類；テモゾロミド類；テニポシド類/VM-26類；テニポシド類；テロキシロン類；テストラクトン類；チアミプリン類；チオグアニン類；チオテパ類；チアミプリン類；チアゾフリン類；チロミソール類；チロロン類；チムコダル類；チモナシック類；チラパザミン類；トピキサントロン類；トポテカン類；トレミフェン類；トシツモマブ類；トラベクテジン類（エクテイナシジン743）；トラスツズマブ類；トレストロン類；トレチノイン類/ATRA；トリシリビン類；トリロスタン類；トリメトレキセート類；四硝酸トリプラチン類；トリプトレリン類；トロホスファミド類；ツブロゾール類；ウベニメクス類；ウラシルマスタード類；ウレデパ類；バルルビシン類；バルスポダル類；バプレオチド類；ベルテポルフィン類；ビンブラスチン類；ビンクリスチン類；ビンデシン類；ビネピジン類；ビンフルニン類；ビンホルミド類；ビングリシネート類；ビンロイシノール類；ビンロイロシン類；ビノレルビン類；ビンロシジン類；ビントリプトール類；ビンゾリジン類；ボロゾール類；キサントマイシンA類（グアメシクリン類）；ゼニプラチン類；ジラスコルブ類［2-H］；ジノスタチン類；ゾレドロネート；ゾルビシン類；およびゾスキダル類の中から選択される、請求項74に記載の方法。
【請求項７６】
対象に、20μg/kg（対象の重さ）未満である投薬量で、ヒアルロナン分解酵素を投与することを含み、ヒアルロナン分解酵素がポリマーへのコンジュゲーションによって修飾されている、ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するための方法。
【請求項７７】
ヒアルロナン分解酵素が0.01μg/kg（対象の重さ）〜15μg/kgまたはその前後の投薬量範囲量で投与される、請求項76に記載の方法。
【請求項７８】
ヒアルロナン分解酵素が、0.05μg/kg〜10μg/kg、0.75μg/kg〜7.5μg/kgもしくは1.0μg/kg〜3.0μg/kgまたはその前後の投薬量範囲量で投与される、請求項76または請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
投与の頻度が、週に2回、週に1回、14日ごとに1回、21日ごとに1回、または毎月1回である、請求項76または77に記載の方法。
【請求項８０】
ヒアルロナン分解酵素が、投与のサイクルが1週間、2週間、3週間、または4週間である投薬レジームで投与される、請求項76〜79のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
投与のサイクルが複数回繰り返される、請求項80に記載の方法。
【請求項８２】
1サイクルの投与後に、所定の期間、投与が中断され、次に、後続の投与サイクルにおいて投与が再開される、請求項80に記載の方法。
【請求項８３】
第1投与サイクルにおける投与の頻度が、後続の投与サイクルにおける投与の頻度と同じであるか、または異なる、請求項76〜82のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
ヒアルロナン分解酵素が、第1投与サイクルでは週に2回投与され、後続の投与サイクルでは週に1回投与される、請求項76〜83のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
投与のサイクルが4週間である、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
対象からの試料におけるヒアルロナン発現が処置前に測定される、請求項76〜85のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
ヒアルロナン関連疾患または状態が、高い間質液圧に関連するもの、がん、浮腫、椎間板圧迫および炎症性疾患の中から選択される、請求項65〜86のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
疾患または状態が浮腫であり、浮腫が臓器移植、脳卒中または脳外傷によって引き起こされる、請求項87に記載の方法。
【請求項８９】
炎症性疾患が、関節リウマチ、強皮症、歯周炎、乾癬、アテローム性動脈硬化、慢性創傷、クローン病、潰瘍性大腸炎、および炎症性腸疾患の中から選択される、請求項87に記載の方法。
【請求項９０】
疾患または状態ががんであり、がんが腫瘍である、請求項87に記載の方法。
【請求項９１】
疾患または状態が固形腫瘍である、請求項90に記載の方法。
【請求項９２】
腫瘍が、同じ組織タイプの非がん性組織と比較して、または同じ腫瘍タイプの非転移性腫瘍と比較して、増加したヒアルロナンの細胞および/または間質発現を有する、請求項91に記載の方法。
【請求項９３】
疾患または状態が、末期がん、転移がん、および未分化がんのいずれか1つ以上の中から選択される、請求項87に記載の方法。
【請求項９４】
疾患または状態が、卵巣がん、上皮内癌（ISC）、扁平上皮細胞癌（SCC）、前立腺がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、脳がん、および大腸がんのいずれか1つ以上の中から選択される、請求項87または93に記載の方法。
【請求項９５】
PEG部分が分岐している、請求項62〜94のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
PEG部分が、mPEG-SBA（5kD）、mPEG-SBA（20kD）、mPEG-SBA（30kDa）、mPEG-SMB（20kD）、mPEG-SMB（30kD）、mPEG-ブチルアルデヒド（30kD）、mPEG-SPA（20kD）、mPEG-SPA（30kD）、mPEG2-NHS（10kDa分岐）、mPEG2-NHS（20kDa分岐）、mPEG-NHS（40kDa分岐）、mPEG2-NHS（60kDa分岐）、PEG-NHS-ビオチン（5kDaビオチン化）、PEG-p-ニトロフェニル-カーボネート（30kDa）およびPEG-プロピオンアルデヒド（30kDa）の中から選択されるPEG試薬との反応に由来する、請求項62〜95のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
ヒアルロナン分解酵素が全身投与される、請求項57または61〜96に記載の方法。
【請求項９８】
ヒアルロナン分解酵素が静脈内投与される、請求項97に記載の方法。
【請求項９９】
ヒアルロナン分解酵素が局所投与される、請求項57または61〜96のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
ヒアルロナン分解酵素が、腫瘍内投与、動脈注射、腹腔内投与、または膀胱内投与によって投与される、請求項99に記載の方法。
【請求項１０１】
ヒアルロナン分解酵素がヒアルロニダーゼである、請求項57または61〜100のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
ヒアルロニダーゼが可溶性ヒアルロニダーゼである、請求項101に記載の方法。
【請求項１０３】
ヒアルロニダーゼがPH20である、請求項101または請求項102に記載の方法。
【請求項１０４】
ヒアルロニダーゼが、C末端グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）付加部位またはGPI付加部位の一部を除去するためにトランケートされた可溶性PH20である、請求項101〜103のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
ヒアルロニダーゼが、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ラット、マウスまたはモルモットPH20から選択される、請求項101〜104のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
ヒアルロニダーゼが動物由来のヒアルロニダーゼである、請求項101〜105のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
動物由来のヒアルロニダーゼが、精製ウシ精巣ヒアルロニダーゼまたは精製ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼの中から選択される、請求項106に記載の方法。
【請求項１０８】
ヒアルロニダーゼがヒトPH20である、請求項101〜106のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
ヒアルロニダーゼが中性活性であり、かつN-グリコシル化されており、
（a）完全長PH20であるか、PH20のC末端トランケート型である、ヒアルロニダーゼポリペプチド、ここで完全長PH20は、配列番号2に示すアミノ酸の配列を含む；または
（b）配列番号2に示すアミノ酸の配列のポリペプチドまたはトランケート型と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むヒアルロニダーゼポリペプチド；または
（c）ヒアルロニダーゼポリペプチドが、配列番号2に示すポリペプチドと、またはその対応するトランケート型と、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するようにアミノ酸置換を含む、（a）または（b）のヒアルロニダーゼポリペプチド
の中から選択される、請求項101〜108のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
ヒアルロニダーゼが、ポリペプチドのアスパラギン残基に共有結合した少なくとも1つのN-結合型糖部分を含有する中性活性可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドである、請求項101〜109のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
ヒアルロニダーゼが少なくとも2つの部位でグリコシル化されている、請求項101〜110のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
ヒアルロニダーゼが、配列番号2に示すポリペプチドのC末端トランケート型であって、配列番号2に含まれているアミノ酸の配列、または配列番号2に含まれているアミノ酸の配列と少なくとも約91％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含み；かつ
トランケート型が、配列番号1の少なくともアミノ酸残基36〜464を含む、
請求項101〜111のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
トランケート型が、配列番号1のアミノ酸残基467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499および500の中から選択されるC末端アミノ酸残基を有する、請求項112に記載の方法。
【請求項１１４】
ヒアルロニダーゼポリペプチドが、配列番号49に示すヌクレオチドの配列を有する核酸分子によってコードされる、請求項101〜113のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
ヒアルロニダーゼポリペプチドがCHO細胞において分泌される、請求項101〜114のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
PH20がrHuPH20と呼ばれる組成物を含む、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１１７】
PH20が、哺乳動物細胞において生産され分泌されるC末端トランケート型である、請求項108〜116のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
哺乳動物細胞がCHO細胞である、請求項117に記載の方法。
【請求項１１９】
コルチコステロイドを投与することをさらに含む、請求項76〜118のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
コルチコステロイドがグルココルチコイドである、請求項119に記載の方法。
【請求項１２１】
グルココルチコイドが、コルチゾン類、デキサメタゾン類、ヒドロコルチゾン類、メチルプレドニゾロン類、プレドニゾロン類およびプレドニゾン類の中から選択される、請求項120に記載の方法。
【請求項１２２】
投与されるコルチコステロイドの量が、0.1〜20mg、0.1〜15mg、0.1〜10mg、0.1〜5mg、0.2〜20mg、0.2〜15mg、0.2〜10mg、0.2〜5mg、0.4〜20mg、0.4〜15mg、0.4〜10mg、0.4〜5mg、0.4〜4mg、1〜20mg、1〜15mg、または1〜10mgまたはその前後である、請求項119〜121のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
ヒアルロナン分解酵素がPEG化PH20酵素（PEGPH20）であり、コルチコステロイドがデキサメタゾンである、請求項57または61〜75および119〜122のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
がん処置の投与をさらに含む、請求項76〜123のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
がん処置が、外科手術、放射線、化学療法剤、生物学的作用剤、ポリペプチド、抗体、ペプチド、小分子、遺伝子治療ベクター、ウイルスおよびDNAの中から選択される、請求項124に記載の方法。
【請求項１２６】
がん処置が、アシビシン類；アビシン類；アクラルビシン類；アコダゾール類；アクロニン類；アドゼレシン類；アルデスロイキン類；アレムツズマブ類；アリトレチノイン類（9-シス-レチノイン酸類）；アロプリノール類；アルトレタミン類；アルボシジブ類；アンバゾン類；アンボマイシン類；アメタントロン類；アミフォスチン類；アミノグルテチミド類；アムサクリン類；アナストロゾール類；アナキシロン類；アンシタビン類；アントラマイシン類；アパジコン類；アルギメスナ類；三酸化ヒ素類；アスパラギナーゼ類；アスペルリン類；アトリムスチン類；アザシチジン類；アゼテパ類；アゾトマイシン類；バノキサントロン類；バタブリン類；バチマスタット類；BCG生菌；ベナキシビン類；ベンダムスチン類；ベンゾデパ類；ベキサロテン類；ベバシズマブ；ビカルタミド類；ビエタセルピン類；ビリコダル類；ビサントレン類；ビサントレン類；ジメシル酸ビスナフィド類；ビゼレシン類；ブレオマイシン類；ボルテゾミブ類；ブレキナル類；ブロピリミン類；ブドチタン類；ブスルファン類；カクチノマイシン類；カルステロン類；カネルチニブ類；カペシタビン類；カラセミド類；カルベチマー類；カルボプラチン類；カルボコン類；カルモフール類；カルムスチン類とポリフェプロサン類；カルムスチン類；カルビシン類；カルゼレシン類；セデフィンゴール類；セレコキシブ類；セマドチン類；クロラムブシル類；シオテロネル類；シロレマイシン類；シスプラチン類；クラドリビン類；クランフェヌル類；クロファラビン類；クリスナトール類；シクロホスファミド類；シタラビンリポソーム製剤；シタラビン類；ダカルバジン類；ダクチノマイシン類；ダルベポエチンアルファ類；ダウノルビシンリポソーム製剤；ダウノルビシン類/ダウノマイシン類；ダウノルビシン類；デシタビン類；デニロイキンジフチトクス類；デクスニグルジピン類；デキソンナプラチン類；デクスラゾキサン類；デザグアニン類；ジアジコン類；ジプロスピジウム類；ジエノゲスト類；ジナリン類；ジセルモリド類；ドセタキセル類；ドフェキダル類；ドキシフルリジン類；ドキソルビシンリポソーム製剤；ドキソルビシンHCL；ドキソルビシンHCLリポソーム注射剤；ドキソルビシン類；ドロロキシフェン類；プロピオン酸ドロモスタノロン類；デュアゾマイシン類；エコムスチン類；エダトレキセート類；エドテカリン類；エフロルニチン類；エラクリダル類；エリナフィド類；エリオットB溶液類；エルサミトルシン類；エミテフル類；エンロプラチン類；エンプロマート類；エンザスタウリン類；エピプロピジン類；エピルビシン類；エポエチンアルファ類；エプタロプロスト類；エルブロゾール類；エソルビシン類；エストラムスチン類；エタニダゾール類；エトグルシド類；リン酸エトポシド類；エトポシドVP-16類；エトポシド類；エトプリン類；エクセメスタン類；エクシスリンド類；ファドロゾール類；ファザラビン類；フェンレチニド類；フィルグラスチム類；フロクスウリジン類；フルダラビン類；フルオロウラシル類；5-フルオロウラシル類；フルオキシメステロン類；フルロシタビン類；ホスキドン類；ホストリエシン類；ホストリエシン類；ホトレタミン類；フルベストラント類；ガラルビシン類；ガロシタビン類；ゲムシタビン類；ゲムツズマブ類/オゾガミシン類；ゲロキノール類；ギマテカン類；ギメラシル類；グロキサゾン類；グルフォスファミド類；酢酸ゴセレリン類；ヒドロキシ尿素類；イブリツモマブ類/チウキセタン類；イダルビシン類；イホスファミド類；イルモホシン類；イロマスタット類；メシル酸イマチニブ類；イメキソン類；インプロスルファン類；インジスラム類；インプロクォン類；インターフェロンアルファ-2a類；インターフェロンアルファ-2b類；インターフェロンアルファ類；インターフェロンベータ類；インターフェロンガンマ類；インターフェロン類；インターロイキン-2類および他のインターロイキン類（組換えインターロイキン類を含む）；イントプリシン類；イオベングアン類［131-I］；イプロプラチン類；イリノテカン類；イルソグラジン類；イクサベピロン類；ケトトレキサート類；L-アラノシン類；ランレオチド類；ラパチニブ類；レドキサントロン類；レトロゾール類；ロイコボリン類；ロイプロリド類；リューロプロレリン類（リュープロレリド類）；レバミソール類；レキサカルシトール類；リアロゾール類；ロバプラチン類；ロメトレキソール類；ロムスチン類/CCNU類；ロムスチン類；ロナファルニブ類；ロソキサントロン類；ラルトテカン類；マフォスファミド類；マンノスルファン類；マリマスタット類；マソプロコール類；メイタンシン類；メクロルエタミン類；メクロルエタミン類/ナイトロジェンマスタード類；酢酸メゲストロール類；メゲストロール類；メレンゲストロール類；メルファラン類；メルファラン類/L-PAM類；メノガリル類；メピチオスタン類；メルカプトプリン類；6-メルカプトプリン；メスナ類；メテシンド類；メトトレキサート類；メトキサレン類；メトミデート類；メトプリン類；メツレデパ類；ミボプラチン類；ミプロキシフェン類；ミソニダゾール類；ミチンドミド類；ミトカルシン類；ミトクロミン類；ミトフラキソン類；ミトギリン類；ミトグアゾン類；ミトマルシン類；マイトマイシンC類；マイトマイシン類；ミトナフィド類；ミトキドン類；ミトスパー類；ミトタン類；ミトキサントロン類；ミトゾロミド類；ミボブリン類；ミゾリビン類；モファロテン類；モピダモール類；ムブリチニブ類；ミコフェノール酸類；フェンプロピオン酸ナンドロロン類；ネダプラチン類；ネルザラビン類；ネモルビシン類；ニトラクリン類；ノコダゾール類；ノフェツモマブ類；ノガラマイシン類；ノラトレキセド類；ノルトピキサントロン類；オクトレオチド類；オプレルベキン類；オルマプラチン類；オルタタキセル類；オテラシル類；オキサリプラチン類；オキシスラン類；オキソフェナルシン類；パクリタキセル類；パミドロネート類；パツビロン類；ペガデマーゼ類；ペガスパルガーゼ類；ペグフィルグラスチム類；ペルデシン類；ペリオマイシン類；ペリトレキソール類；ペメトレキセド類；ペンタムスチン類；ペントスタチン類；ペプロマイシン類；ペルホスファミド類；ペリホシン類；ピコプラチン類；ピナフィド類；ピポブロマン類；ピポスルファン類；ピルフェニドン類；ピロキサントロン類；ピクサントロン類；プレビトレキセド類；プリカミシド・ミトラマイシン類；プリカマイシン類；プロメスタン類；プロメスタン類���ポルフィマーナトリウム類；ポルフィマー類；ポルフィロマイシン類；プレドニムスチン類；プロカルバジン類；プロパミジン類；プロスピジウム類；プミテパ類；ピューロマイシン類；ピラゾフリン類；キナクリン類；ラニムスチン類；ラスブリカーゼ類；リボプリン類；リトロスルファン類；リツキシマブ類；ログレチミド類；ロキニメクス類；ルホクロモマイシン類；サバルビシン；サフィンゴール類；サルグラモスチム類；サトラプラチン類；セブリプラチン類；セムスチン類；シムトラゼン類；シゾフィラン類；ソブゾキサン類；ソラフェニブ類；スパルフォセート類；スパルホス酸類；スパルソマイシン類；スピロゲルマニウム類；スピロムスチン類；スピロプラチン類；スピロプラチン類；スクアラミン類；ストレプトニグリン類；ストレプトバリシン類；ストレプトゾシン類；スホスファミド類；スロフェヌル類；リンゴ酸スニチニブ；6-チオグアニン（6-TG）；タセジナリン類；タルク類；タリソマイシン類；タリムスチン類；タモキシフェン類；タリキダル類；タウロムスチン類；テコガラン類；テガフール類；テロキサントロン類；テモポルフィン類；テモゾロミド類；テニポシド類/VM-26類；テニポシド類；テロキシロン類；テストラクトン類；チアミプリン類；チオグアニン類；チオテパ類；チアミプリン類；チアゾフリン類；チロミソール類；チロロン類；チムコダル類；チモナシック類；チラパザミン類；トピキサントロン類；トポテカン類；トレミフェン類；トシツモマブ類；トラベクテジン類（エクテイナシジン743）；トラスツズマブ類；トレストロン類；トレチノイン類/ATRA；トリシリビン類；トリロスタン類；トリメトレキセート類；四硝酸トリプラチン類；トリプトレリン類；トロホスファミド類；ツブロゾール類；ウベニメクス類；ウラシルマスタード類；ウレデパ類；バルルビシン類；バルスポダル類；バプレオチド類；ベルテポルフィン類；ビンブラスチン類；ビンクリスチン類；ビンデシン類；ビネピジン類；ビンフルニン類；ビンホルミド類；ビングリシネート類；ビンロイシノール類；ビンロイロシン類；ビノレルビン類；ビンロシジン類；ビントリプトール類；ビンゾリジン類；ボロゾール類；キサントマイシンA類（グアメシクリン類）；ゼニプラチン類；ジラスコルブ類［2-H］；ジノスタチン類；ゾレドロネート；ゾルビシン類；およびゾスキダル類の中から選択される、請求項125に記載の方法。
【請求項１２７】
対象がヒトである、請求項38〜126のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
静脈内投与用に製剤化されたヒアルロナン分解酵素を含む第1組成物；および
コルチコステロイドを含む第2組成物
を含む組合せ。
【請求項１２９】
コルチコステロイドがグルココルチコイドである、請求項128に記載の組合せ。
【請求項１３０】
グルココルチコイドが、コルチゾン類、デキサメタゾン類、ヒドロコルチゾン類、メチルプレドニゾロン類、プレドニゾロン類およびプレドニゾン類の中から選択される、請求項129に記載の組合せ。
【請求項１３１】
グルココルチコイドがデキサメタゾンである、請求項129または請求項130に記載の組合せ。
【請求項１３２】
ヒアルロナン分解酵素がヒアルロニダーゼである、請求項128〜131のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１３３】
ヒアルロニダーゼがPH20または可溶性PH20である、請求項132に記載の組合せ。
【請求項１３４】
ヒアルロニダーゼが、C末端グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）付加部位またはGPI付加部位の一部を除去するためにトランケートされた可溶性PH20である、請求項133に記載の組合せ。
【請求項１３５】
ヒアルロニダーゼが中性活性であり、かつN-グリコシル化されており、
（a）完全長PH20であるか、PH20のC末端トランケート型である、ヒアルロニダーゼポリペプチド、ここで完全長PH20は、配列番号2に示すアミノ酸の配列を含む；または
（b）配列番号2に示すアミノ酸の配列のポリペプチドまたはトランケート型と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むヒアルロニダーゼポリペプチド；または
（c）ヒアルロニダーゼポリペプチドが、配列番号2に示すポリペプチドと、またはその対応するトランケート型と、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するようにアミノ酸置換を含む、（a）または（b）のヒアルロニダーゼポリペプチド
から選択される、
請求項132〜134のいずれか一項に記載の組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
米国仮特許出願第61/399,993号（発明の名称「ADVERSE SIDE-EFFECT ASSOCIATED WITH ADMINISTRATION OF PEGYLATED HYALURONIDASE AND METHODS FOR AMELIORATING OR PREVENTING THE SIDE-EFFECTS」；出願日2010年7月20日；発明者Harold Michael Shepard、Curtis Thompson、Ziaoming LiおよびGregory I. Frost）および米国仮特許出願第61/455,260号（発明の名称「ADVERSE SIDE-EFFECTS ASSOCIATED WITH ADMINISTRATION OF ANTI-HYALURONAN AGENT AND METHODS FOR AMELIORATING OR PREVENTING THE SIDE-EFFECTS」；出願日2010年10月14日；発明者Harold Michael Shepard、Curtis Thompson、Ziaoming LiおよびGregory I. Frost）に基づく優先権の利益を主張する。
【０００２】
本願は、米国仮特許出願第61/399,993号および同第61/455,260号に基づく優先権を主張する、本願と同日出願の米国特許出願第13/135,817号（発明の名称「ADVERSE SIDE-EFFECTS ASSOCIATED WITH ADMINISTRATION OF ANTI-HYALURONAN AGENTS AND METHODS FOR AMELIORATING OR PREVENTING THE SIDE-EFFECTS」）に関連する。上記関連出願の内容は、引用により、その全てが本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本願は、米国仮特許出願第61/124,278号、同第61/130,357号および同第61/195,624号に基づく優先権を主張する米国特許出願第12/386,222号（出願日2009年4月14日；公開番号US2010003238）に関連する。本願は、同じく米国仮特許出願第61/124,278号、同第61/130,357号および同第61/195,624号に基づく優先権を主張するPCT国際出願PCT/US2009/002352（出願日2009年4月14日；公開番号WO2009128917）にも関連する。
【０００４】
上述した出願のそれぞれの内容は、引用により、その全てが本明細書に組み込まれる。
【０００５】
［電子形式で提出された配列表の引用による組込み］
本願と共に電子形式の配列表を提出するが、その内容は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。電子ファイルは、サイズが824キロバイトであり、ファイル名は3084seqPC1.txtである。
【０００６】
［発明の分野］
単剤療法または併用療法のための、ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤の使用に関連する方法を提供する。
【背景技術】
【０００７】
［背景］
ヒアルロナン（ヒアルロン酸；HA）は、多くの組織の細胞外マトリックスに、特に軟部結合組織に、見いだされる多糖である。HAは、哺乳動物の皮膚、軟骨、および滑液にも、優勢に見いだされる。ヒアルロナンは眼の硝子体の主要構成成分でもある。HAは、水分ホメオスタシスおよび血漿タンパク質ホメオスタシスなどのさまざまな生理学的過程に役割を持っている（Laurent TCら（1992）FASEB J 6:2397-2404）。一定の疾患および障害は、ヒアルロナンの発現および/または生産に関連している。ヒアルロニダーゼはヒアルロナンを分解する酵素である。ヒアルロニダーゼは、HAの分解を触媒することにより、HAまたは他のグリコサミノグリカンの蓄積に関連する疾患または障害を処置するために、単独で、または他の治療剤と組み合わせて使用することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
［概要］
投与された抗ヒアルロナン剤による、対象における有害作用を、その対象に、有害作用を緩和するのに十分な量のコルチコステロイドを投与することによって、緩和または防止するための方法を、ここに提供する。コルチコステロイドはグルココルチコイドであることができる。例えばグルココルチコイドは、コルチゾン類、デキサメタゾン類、ヒドロコルチゾン類、メチルプレドニゾロン類、プレドニゾロン類およびプレドニゾン類であることができ、特にデキサメタゾンである。ある例では、コルチコステロイドが経口投与される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ここに提供される方法のいくつかの例では、有害作用が筋骨格副作用である。例えば有害作用は、筋・関節痛（muscle and joint pain）、上肢のこわばり、下肢のこわばり、痙攣、筋炎、全身の筋痛（muscle soreness）および圧痛（tenderness）、脱力、疲労、および膝関節または肘関節における可動域の減少である。典型的には、有害作用は抗ヒアルロナン剤の用量制限毒性（DLT）をもたらすものである。本方法では、コルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤のDLTを排除するか、抗ヒアルロナン剤のDLTをもたらす用量を増加させるような量で投与される。もう一つの例では、有害作用が毒性尺度でグレード3であり、コルチコステロイドが、そのグレードをグレード1またはグレード2に低減するか、コルチコステロイドの投与後数時間以内に解消するグレード3に低減するような量で投与される。
【００１０】
本方法では、投与される抗ヒアルロナン剤が、経口投与、静脈内（IV）投与、皮下投与、筋肉内投与、腫瘍内投与、皮内投与、外用投与、経皮投与、直腸投与または表皮下投与される。一般に抗ヒアルロナン剤は、ヒアルロナン分解酵素であるか、またはヒアルロナン合成を阻害する作用剤である。例えば、抗ヒアルロナン剤は、ヒアルロナン合成を阻害する作用剤、例えばHAシンターゼに対するセンスまたはアンチセンス核酸分子であるか、または小分子薬である。例えば抗ヒアルロナン剤は、4-メチルウンベリフェロン（MU）もしくはその誘導体、またはレフルノミドもしくはその誘導体である。そのような誘導体には、例えば、6,7-ジヒドロキシ-4-メチルクマリンまたは5,7-ジヒドロキシ-4-メチルクマリンである4-メチルウンベリフェロン（MU）の誘導体が含まれる。別の例では、抗ヒアルロナン剤が、ポリマーへのコンジュゲーションによって修飾されているヒアルロナン分解酵素である。ポリマーはPEGであることができ、抗ヒアルロナン剤は、PEG化ヒアルロナン分解酵素であることができる。
【００１１】
対象へのPEGヒアルロナン分解酵素の全身投与の有害作用を緩和するための方法が、ここに提供される。本方法では、PEG化ヒアルロナン分解酵素、特にPEG化ヒアルロニダーゼ、例えば動物または細菌ヒアルロニダーゼのいずれかが、対象に全身投与され、有害作用を緩和するのに十分な量のコルチコステロイドが投与される。ここに提供される方法の一例では、コルチコステロイドが経口投与される。もう一つの例では、PEG化ヒアルロナン分解酵素が静脈内投与される。コルチコステロイドおよび/またはPEG化ヒアルロナン分解酵素の投与は、任意の適切な経路により、例えば静脈内経路、経口経路または筋肉内経路などによって、全身性に達成することができる。
【００１２】
ここに提供される方法では、PEG化ヒアルロナン分解酵素の投与に関連する有害作用が筋骨格副作用である。筋骨格副作用には、例えば筋・関節痛、上肢および下肢のこわばり、痙攣、筋炎、全身の筋痛および圧痛、脱力、疲労および/または膝関節および肘関節における可動域の減少が含まれる。
【００１３】
いくつかの例では、コルチコステロイドがグルココルチコイドである。例えばコルチコステロイドは、コルチゾン類、デキサメタゾン類、ヒドロコルチゾン類、メチルプレドニゾロン類、プレドニゾロン類およびプレドニゾン類の中から選択されるグルココルチコイドである。ある特定例では、グルココルチコイドがデキサメタゾンである。
【００１４】
ここに提供される方法では、コルチコステロイドが、PEG化ヒアルロナン分解酵素の投与に先だって投与されるか、PEG化ヒアルロナン分解酵素の投与と同時に投与されるか、PEG化ヒアルロナン分解酵素の投与と共に断続的に投与されるか、またはPEG化ヒアルロナン分解酵素の投与の後に投与される。本方法のある実施形態では、コルチコステロイドがPEG化ヒアルロナン分解酵素と共投与される。例えばコルチコステロイドは、PEG化ヒアルロナン分解酵素の投与に先だって投与される。この例では、PEG化ヒアルロナン分解酵素の投与の0.5分前、1分前、2分前、3分前、4分前、5分前、6分前、7分前、8分前、9分前、10分前、15分前、20分前、25分前、30分前、45分前、1時間前、2時間前、3時間前、4時間前、5時間前、6時間前、7時間前、8時間前、9時間前、10時間前、11時間前、12時間前、18時間前、24時間前、36時間前またはその前後もしくはそれ以上前に、コルチコステロイドが投与される。ある特定例では、コルチコステロイドの投与が、PEG化ヒアルロナン分解酵素の投与の少なくとも1時間前またはその前後もしくはそれ以上前である。
【００１５】
本方法のもう一つの実施形態では、コルチコステロイドが、PEG化ヒアルロナン分解酵素の投与の後に投与される。例えばコルチコステロイドは、PEG化ヒアルロナン分解酵素の投与の0.5分後、1分後、2分後、3分後、4分後、5分後、6分後、7分後、8分後、9分後、10分後、15分後、20分後、25分後、30分後、45分後、1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後、6時間後、7時間後、8時間後、9時間後、10時間後、11時間後、12時間後、18時間後、24時間後またはその前後もしくはそれ以上後に投与される。もう一つの例では、コルチコステロイドの投与が、PEG化ヒアルロナン分解酵素の投与の少なくとも8時間ないし12時間後である。
【００１６】
本方法のさらにもう一つの実施形態では、コルチコステロイドが、PEG化ヒアルロナン分解酵素の投与の前および後に投与される。例えば、コルチコステロイドは、PEG化ヒアルロナン分解酵素の投与の1〜5分前およびPEG化ヒアルロナン分解酵素の投与の8時間後に投与される。もう一つの例では、コルチコステロイドが、PEG化ヒアルロナン分解酵素の投与の1時間前およびPEG化ヒアルロナン分解酵素の投与の8〜12時間後に投与される。ここに提供される方法では、コルチコステロイドの投与の時間がPEG化ヒアルロナン分解酵素の投与に関連する1つ以上の副作用を緩和するものである限り、任意の投与レジームが考えられる。
【００１７】
本方法のいくつかの実施形態では、コルチコステロイドが、0.1〜20mg、0.1〜15mg、0.1〜10mg、0.1〜5mg、0.2〜20mg、0.2〜15mg、0.2〜10mg、0.2〜5mg、0.4〜20mg、0.4〜15mg、0.4〜10mg、0.4〜5mg、0.4〜4mg、1〜20mg、1〜15mgもしくは1〜10mgまたはその前後の量で投与される。ある特定実施形態では、コルチコステロイドが、0.4〜20mgまたはその前後の量で投与される。コルチコステロイドの例示的用量は、PEG化ヒアルロナン分解酵素の投与に関連する1つ以上の副作用を緩和する任意の用量である。
【００１８】
本発明のある実施形態では、PEG化ヒアルロナン分解酵素が、0.0005mg/kg、0.0006mg/kg、0.0007mg/kg、0.0008mg/kg、0.0009mg/kg、0.001mg/kg、0.0016mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.016mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mg/kg、9mg/kg、9.5mg/kgもしくは10mg/kg（投与を受ける対象の重さ）またはその前後の量で投与される。
【００１９】
本発明のもう一つの実施形態では、PEG化ヒアルロナン分解酵素が、10単位/kg（U/kg）、16U/kg、32U/kg、64U/kg、100U/kg、200U/kg、300U/kg、400U/kg、500U/kg、600U/kg、700U/kg、800U/kg、900U/kg、1,000U/kg、2,000U/kg、3,000U/kg、4,000U/kg、5,000U/kg、6,000U/kg、7,000U/kg、8,000U/kg、9,000U/kg、10,000U/kg、12,800U/kg、20,000U/kg、32,000U/kg、40,000U/kg、50,000U/kg、60,000U/kg、70,000U/kg、80,000U/kg、90,000U/kg、100,000U/kg、120,000U/kg、140,000U/kg、160,000U/kg、180,000U/kg、200,000U/kg、220,000U/kg、240,000U/kg、260,000U/kg、280,000U/kg、300,000U/kg、320,000U/kg、350,000U/kg、400,000U/kg、450,000U/kg、500,000U/kg、550,000U/kg、600,000U/kg、650,000U/kg、700,000U/kg、750,000U/kg、800,000U/kg（投与を受ける対象の重さ）またはその前後の量で投与される。
【００２０】
本発明の、ある特定実施形態では、PEG化ヒアルロナン分解酵素が、10〜320,000単位/kg（対象の重さ）またはその前後の量で投与され、コルチコステロイドが0.4〜20mgまたはその前後の量で投与される。
【００２１】
本方法のいくつかの実施形態では、本方法において使用されるPEG化ヒアルロナン分解酵素が、ヒアルロニダーゼ、例えば任意の動物または細菌ヒアルロニダーゼである。いくつかの例では、ヒアルロニダーゼが可溶性ヒアルロニダーゼである。例えばヒアルロニダーゼは、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ラット、マウスまたはモルモットPH20の中から選択される可溶性PH20ヒアルロニダーゼである。ある特定例では、ヒアルロニダーゼがヒトPH20である。別の例では、ヒアルロニダーゼが、動物由来のヒアルロニダーゼである。例えばヒアルロニダーゼは、精製ウシ精巣ヒアルロニダーゼまたは精製ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼの中から選択される動物由来のヒアルロニダーゼである。本方法の、ある特定態様では、PEG化ヒアルロナン分解酵素がPEG化PH20（PEGPH20）であり、コルチコステロイドがデキサメタゾンである。
【００２２】
ある実施形態では、ここに提供される方法において使用されるヒアルロニダーゼが、中性活性であり、N-グリコシル化されている。いくつかの態様では、中性活性N-グリコシル化ヒアルロニダーゼポリペプチドが、完全長PH20またはC末端トランケート型のPH20であり、ここで、完全長PH20は配列番号1に示すアミノ酸の配列を有する。別の態様では、中性活性N-グリコシル化ヒアルロニダーゼポリペプチドが、配列番号1に示すアミノ酸の配列のポリペプチドまたはそのトランケート型と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有する。さらにもう一つの態様では、中性活性N-グリコシル化ヒアルロニダーゼポリペプチドが、アミノ酸置換を有し、それによって、ヒアルロニダーゼポリペプチドが、ポリペプチド配列番号1または対応するそのトランケート型と、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有する、完全長PH20またはC末端トランケート型のPH20である。いくつかの態様では、ここに提供される方法において使用されるヒアルロニダーゼポリペプチドが、配列番号49に示すヌクレオチドの配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの態様では、ここに提供される方法において使用されるヒアルロニダーゼポリペプチドが、CHO細胞において分泌される。ある特定例では、PH20がrHuPH20と呼ばれるものである。
【００２３】
本発明のある実施形態では、ヒアルロニダーゼが、少なくとも1つのN-結合型糖部分を含有する中性活性可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドである。ある特定態様では、N-結合型糖部分がポリペプチドのアスパラギン残基に共有結合で取り付けられている。別の態様では、ヒアルロニダーゼが、少なくとも2つの部位でグリコシル化されている。
【００２４】
いくつかの態様では、ここに提供される方法において使用されるヒアルロニダーゼ、可溶性ヒアルロニダーゼが、配列番号1に含まれるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号1に含まれるアミノ酸の配列と少なくとも約91％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有するものであって、そのヒアルロニダーゼは可溶性であり、C末端が、配列番号1のアミノ酸残基467と483（両端を含む）の間にあるアミノ酸残基またはそれと約91％の配列同一性を有するポリペプチド中の対応する残基においてトランケートされている。ある特定例では、ヒアルロニダーゼが、配列番号1のアミノ酸1〜482または配列番号1のアミノ酸36〜482をコードする核酸分子によってコードされる。別の例では、可溶性ヒアルロニダーゼが、配列番号1の少なくともアミノ酸残基36〜464を含む。別の例では、ヒアルロニダーゼが、アミノ酸残基467もしくはアミノ酸残基483であるアミノ酸残基またはアミノ酸残基467〜483の間にあるアミノ酸残基においてトランケートされている、配列番号1に示すアミノ酸の配列を含む。例えば、ヒアルロニダーゼは、アミノ酸残基467、477、478、479、480、481、482および483の中から選択されるアミノ酸残基においてトランケートされている、配列番号1に示すアミノ酸の配列を含むことができる。別の例では、ヒアルロニダーゼが、アミノ酸残基467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499および500の中から選択される残基においてトランケートされている、配列番号1に示すアミノ酸の配列を含む。いくつかの態様では、ここに提供される方法において使用されるヒアルロニダーゼポリペプチドが、哺乳動物細胞において生産され分泌されるC末端トランケート型である。ある特定例では、哺乳動物細胞がCHO細胞である。
【００２５】
ここに提供される方法では、ヒアルロナン分解酵素がPEG化されている。ある特定例では、PEG部分が分岐している。いくつかの例では、PEG部分が、mPEG-SBA（5kD）、mPEG-SBA（20kD）、mPEG-SBA（30kD）、mPEG-SMB（20kD）、mPEG-SMB（30kD）、mPEG-ブチルアルデヒド（30kD）、mPEG-SPA（20kD）、mPEG-SPA（30kD）、mPEG2-NHS（10kDa分岐）、mPEG2-NHS（20kDa分岐）、mPEG-NHS（40kDa分岐）、mPEG2-NHS（60kDa分岐）、PEG-NHS-ビオチン（5kDaビオチン化）、PEG-p-ニトロフェニル-カーボネート（30kDa）およびPEG-プロピオンアルデヒド（30kDa）の中から選択される。
【００２６】
この方法において、有害作用は、ヒアルロナン関連疾患または状態の抗ヒアルロナン剤による処置の結果であることができる。ある例では、ヒアルロナン関連疾患または状態が、高い間質液圧、がん、浮腫、椎間板圧迫（disc pressure）および炎症性疾患に関連するものである。例えば、浮腫である疾患または状態は、臓器移植、脳卒中または脳外傷によって引き起こされうる。もう一つの例では、炎症性疾患または炎症状態に、関節リウマチ、強皮症、歯周炎、乾癬、アテローム性動脈硬化、慢性創傷、クローン病、潰瘍性大腸炎および炎症性腸疾患が含まれる。
【００２７】
さらなる一例では、有害作用が、腫瘍、例えば固形腫瘍であるがんの抗ヒアルロナン剤による処置の結果である。腫瘍は、同じ組織タイプの非がん性組織と比較して、または同じ腫瘍タイプの非転移性腫瘍と比較して、ヒアルロナンの細胞および/または間質発現が増加しているものであることができる。ある例では、がんが、末期がん、転移がんおよび未分化がんである。もう一つの例では、がんが、卵巣がん、上皮内癌（ISC）、扁平上皮細胞癌（SCC）、前立腺がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、脳がんまたは大腸がんである。
【００２８】
抗ヒアルロナン剤による処置に関連する有害作用を緩和するための、コルチコステロイドの使用およびコルチコステロイドを含有する組成物も、ここに提供される。
【００２９】
ヒアルロナン関連疾患または状態を処置する際に使用するための、処置の方法およびポリマーコンジュゲートヒアルロナン分解酵素（すなわちポリマーへのコンジュゲーションによって修飾されたヒアルロナン分解酵素）の使用も、ここに提供される。そのような方法または使用では、ヒアルロナン分解酵素が、0.01μg/kg（対象の重さ）〜15μg/kgの間またはその前後の投薬量範囲または量で投与される。例えば、ここに提供される方法では、ヒアルロナン分解酵素が、0.05μg/kg〜10μg/kg、0.75μg/kg〜7.5μg/kg、または1.0μg/kg〜3.0μg/kgの間またはその前後の投薬量範囲量で投与される。投与の頻度は、週に2回、週に1回、14日ごとに1回、21日ごとに1回、または毎月1回である。特定の例では、投与のサイクルが1週間、2週間、3週間または4週間である投薬レジームで、ヒアルロナン分解酵素が投与される。投与のサイクルは、複数回繰り返すことができる。また、いくつかの例では、1サイクルの投与後に、所定の期間、投与が中断され、次に、後続の投与サイクルにおいて投与が再開される。いくつかの例では、第1投与サイクルにおける投与の頻度が、後続の投与サイクルにおける投与の頻度と同じであるか、または異なる。ある特定例では、ヒアルロナン分解酵素が、第1投与サイクルでは週に2回投与され、後続の投与サイクルでは週に1回投与される。そのような例において投与のサイクルは4週間である。
【００３０】
例えばヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するために、0.5μｇ〜1450μgもしくは150単位（U）〜45,000単位またはその前後の範囲にある量の1回量（single dosage）投与に使用され、またはそのために製剤化される。そのような方法および使用では、ヒアルロナン分解酵素を、0.5μg〜1450μgまたは150単位（U）〜45,000単位の1回量として、少なくとも4週間のサイクルにわたって少なくとも週に1回の頻度で、投与することができる。特定例では、1回量投与または単位用量（unit dose）が、0.75μg〜1125μg；3.75μg〜750μg；56μg〜565μg；もしくは75μg〜225μgまたはその前後の範囲にある量である。別の例では、1回量投与または単位用量が、24単位（U）〜36,000U；120U〜24,000U；1500U〜18,000U；または2400U〜7200Uまたはその前後の範囲にある。
【００３１】
この方法または使用のいずれにおいても、特にヒアルロナン関連疾患または状態を処置するための方法および使用のいずれにおいても、処置に先だって、対象からの試料におけるヒアルロナン発現が測定される。ヒアルロナン関連疾患または状態は、高い間質液圧、がん、浮腫、椎間板圧迫または炎症性疾患に関連する。例えば疾患または状態は、臓器移植、脳卒中または脳外傷によって引き起こされる浮腫であることができる。別の例では、疾患または状態が、関節リウマチ、強皮症、歯周炎、乾癬、アテローム性動脈硬化、慢性創傷、クローン病、潰瘍性大腸炎または炎症性腸疾患である炎症性疾患である。特定例では、疾患または状態ががんであり、がんが腫瘍である。例えば疾患または状態は固形腫瘍である。腫瘍は、同じ組織タイプの非がん性組織と比較して、または同じ腫瘍タイプの非転移性腫瘍と比較して、ヒアルロナンの細胞および/または間質発現が増加しているものであることができる。疾患または状態ががんである場合、がんは、末期がん、転移がんまたは未分化がんである。例えば、がんは、卵巣がん、上皮内癌（ISC）、扁平上皮細胞癌（SCC）、前立腺がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、脳がん、または大腸がんである。
【００３２】
本明細書に記載するまたは当技術分野において知られているヒアルロナン分解酵素はいずれも、ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するための方法または使用に、使用することができる。いくつかの例では、さらにコルチコステロイドを投与することができる。例えば、コルチコステロイドはグルココルチコイドである。例えば、コルチコステロイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロンまたはプレドニゾンであるグルココルチコイドである。ある特定例では、グルココルチコイドがデキサメタゾンである。
【００３３】
ここに提供される方法のいくつかの実施形態では、本方法がさらに、第2の作用剤または処置を投与するステップを伴う。いくつかの態様では、第2の作用剤または処置が、がん処置、例えば外科手術、放射線、化学療法剤、生物学的作用剤、ポリペプチド、抗体、ペプチド、小分子、遺伝子治療ベクター、ウイルスまたはDNAなどである。特定例では、第2の作用剤が、アシビシン類；アクラルビシン類；アコダゾール類；アクロニン類；アドゼレシン類；アルデスロイキン類；アレムツズマブ類；アリトレチノイン類（9-シス-レチノイン酸類）；アロプリノール類；アルトレタミン類；アルボシジブ類；アンバゾン類；アンボマイシン（Ambomycin）類；アメタントロン類；アミフォスチン類；アミノグルテチミド類；アムサクリン類；アナストロゾール類；アナキシロン類；アンシタビン類；アントラマイシン類；アパジコン類；アルギメスナ類；三酸化ヒ素類；アスパラギナーゼ類；アスペルリン類；アトリムスチン類；アザシチジン類；アゼテパ類；アゾトマイシン類；バノキサントロン類；バタブリン類；バチマスタット類；BCG生菌（BCG Live）；ベナキシビン類；ベンダムスチン類；ベンゾデパ類；ベキサロテン類；ベバシズマブ；ビカルタミド類；ビエタセルピン類；ビリコダル類；ビサントレン類；ビサントレン類；ジメシル酸ビスナフィド類；ビゼレシン類；ブレオマイシン類；ボルテゾミブ類；ブレキナル類；ブロピリミン類；ブドチタン類；ブスルファン類；カクチノマイシン類；カルステロン類；カネルチニブ類；カペシタビン類；カラセミド類；カルベチマー類；カルボプラチン類；カルボコン類；カルモフール類；カルムスチン類とポリフェプロサン類；カルムスチン類；カルビシン類；カルゼレシン類；セデフィンゴール類；セレコキシブ類；セマドチン類；クロラムブシル類；シオテロネル類；シロレマイシン（Cirolemycin）類；シスプラチン類；クラドリビン類；クランフェヌル類；クロファラビン類；クリスナトール類；シクロホスファミド類；シタラビンリポソーム製剤；シタラビン類；ダカルバジン類；ダクチノマイシン類；ダルベポエチンアルファ類；ダウノルビシンリポソーム製剤；ダウノルビシン類/ダウノマイシン類；ダウノルビシン類；デシタビン類；デニロイキンジフチトクス類；デクスニグルジピン類；デキソンナプラチン（Dexonnaplatin）類；デクスラゾキサン類；デザグアニン類；ジアジコン類；ジプロスピジウム類；ジエノゲスト類；ジナリン類；ジセルモリド類；ドセタキセル類；ドフェキダル類；ドキシフルリジン類；ドキソルビシンリポソーム製剤；ドキソルビシンHCL；ドキソルビシンHCLリポソーム注射剤；ドキソルビシン類；ドロロキシフェン類；プロピオン酸ドロモスタノロン類；デュアゾマイシン類；エコムスチン類；エダトレキセート類；エドテカリン類；エフロルニチン類；エラクリダル類；エリナフィド類；エリオットB溶液（Elliott's B Solution）類；エルサミトルシン類；エミテフル類；エンロプラチン類；エンプロマート類；エンザスタウリン類；エピプロピジン類；エピルビシン類；エポエチンアルファ類；エプタロプロスト類；エルブロゾール類；エソルビシン類；エストラムスチン類；エタニダゾール類；エトグルシド類；リン酸エトポシド類；エトポシドVP-16���；エトポシド類；エトプリン類；エクセメスタン類；エクシスリンド類；ファドロゾール類；ファザラビン類；フェンレチニド類；フィルグラスチム類；フロクスウリジン類；フルダラビン類；フルオロウラシル類；5-フルオロウラシル類；フルオキシメステロン類；フルロシタビン類；ホスキドン類；ホストリエシン類；ホストリエシン類；ホトレタミン類；フルベストラント類；ガラルビシン（Galarubicin）類；ガロシタビン類；ゲムシタビン類；ゲムツズマブ類/オゾガミシン類；ゲロキノール類；ギマテカン類；ギメラシル類；グロキサゾン類；グルフォスファミド類；酢酸ゴセレリン類；ヒドロキシ尿素類；イブリツモマブ類/チウキセタン類；イダルビシン類；イホスファミド類；イルモホシン類；イロマスタット類；メシル酸イマチニブ類；イメキソン類；インプロスルファン類；インジスラム類；インプロクォン類；インターフェロンアルファ-2a類；インターフェロンアルファ-2b類；インターフェロンアルファ類；インターフェロンベータ類；インターフェロンガンマ類；インターフェロン類；インターロイキン-2類および他のインターロイキン類（組換えインターロイキン類を含む）；イントプリシン類；イオベングアン類［131-I］；イプロプラチン類；イリノテカン類；イルソグラジン類；イクサベピロン類；ケトトレキサート類；L-アラノシン類；ランレオチド類；ラパチニブ類；レドキサントロン類；レトロゾール類；ロイコボリン類；ロイプロリド類；リューロプロレリン類（リュープロレリド(Leuprorelide）類）；レバミソール類；レキサカルシトール類；リアロゾール類；ロバプラチン類；ロメトレキソール類；ロムスチン類/CCNU類；ロムスチン類；ロナファルニブ類；ロソキサントロン類；ラルトテカン類；マフォスファミド類；マンノスルファン類；マリマスタット類；マソプロコール類；メイタンシン類；メクロルエタミン類；メクロルエタミン類/ナイトロジェンマスタード類；酢酸メゲストロール類；メゲストロール類；メレンゲストロール類；メルファラン類；メルファラン類/L-PAM類；メノガリル類；メピチオスタン類；メルカプトプリン類；6-メルカプトプリン；メスナ類；メテシンド類；メトトレキサート類；メトキサレン類；メトミデート類；メトプリン類；メツレデパ類；ミボプラチン類；ミプロキシフェン類；ミソニダゾール類；ミチンドミド類；ミトカルシン類；ミトクロミン類；ミトフラキソン類；ミトギリン（Mitogillin）類；ミトグアゾン類；ミトマルシン類；マイトマイシンC類；マイトマイシン類；ミトナフィド類；ミトキドン類；ミトスパー（Mitosper）類；ミトタン類；ミトキサントロン類；ミトゾロミド類；ミボブリン類；ミゾリビン類；モファロテン類；モピダモール類；ムブリチニブ類；ミコフェノール酸類；フェンプロピオン酸ナンドロロン類；ネダプラチン類；ネルザラビン類；ネモルビシン類；ニトラクリン類；ノコダゾール類；ノフェツモマブ（Nofetumomab）類；ノガラマイシン類；ノラトレキセド類；ノルトピキサントロン類；オクトレオチド類；オプレルベキン類；オルマプラチン類；オルタタキセル類；オテラシル類；オキサリプラチン類；オキシスラン類；オキソフェナルシン類；パクリタキセル類；パミドロネート類；パツビロン（Patubilone）類；ペガデマーゼ類；ペガスパルガーゼ類；ペグフィルグラスチム類；ペルデシン類；ペリオマイシン（Peliomycin）類；ペリトレキソール類；ペメトレキセド類；ペンタムスチン（Pentamustine）類；ペントスタチン類；ペプロマイシン類；ペルホスファミド類；ペリホシン類；ピコプラチン類；ピナフィド類；ピポブロマン類；ピポスルファン類；ピルフェニドン類；ピロキサントロン類；ピクサントロン類；プレビトレキセド類；プリカミシド・ミトラマイシン（Plicamycid Mithramycin）類；プリカマイシン類；プロメスタン類；プロメスタン類；ポルフィマーナトリウム類；ポルフィマー類；ポルフィロマイシン類；プレドニムスチン類；プロカルバジン類；プロパミジン類；プロスピジウム類；プミテパ類；ピューロマイシン類；ピラゾフリン類；キナクリン類；ラニムスチン類；ラスブリカーゼ類；リボプリン類；リトロスルファン類；リツキシマブ類；ログレチミド類；ロキニメクス類；ルホクロモマイシン（Rufocromomycin）類；サバルビシン（Sabarubicin）類；サフィンゴール類；サルグラモスチム類；サトラプラチン類；セブリプラチン類；セムスチン類；シムトラゼン類；シゾフィラン類；ソブゾキサン類；ソラフェニブ類；スパルフォセート類；スパルホス酸類；スパルソマイシン類；スピロゲルマニウム類；スピロムスチン類；スピロプラチン類；スピロプラチン類；スクアラミン類；ストレプトニグリン類；ストレプトバリシン（Streptovarycin）類；ストレプトゾシン類；スホスファミド類；スロフェヌル類；リンゴ酸スニチニブ；6-チオグアニン（6-TG）；タセジナリン類；タルク類；タリソマイシン類；タリムスチン類；タモキシフェン類；タリキダル類；タウロムスチン類；テコガラン類；テガフール類；テロキサントロン類；テモポルフィン類；テモゾロミド類；テニポシド類/VM-26類；テニポシド類；テロキシロン類；テストラクトン類；チアミプリン（Thiamiprine）類；チオグアニン類；チオテパ類；チアミプリン（Tiamiprine）類；チアゾフリン類；チロミソール類；チロロン類；チムコダル類；チモナシック類；チラパザミン類；トピキサントロン類；トポテカン類；トレミフェン類；トシツモマブ類；トラベクテジン類（エクテイナシジン743）；トラスツズマブ類；トレストロン類；トレチノイン類/ATRA；トリシリビン類；トリロスタン類；トリメトレキセート類；四硝酸トリプラチン類；トリプトレリン類；トロホスファミド類；ツブロゾール類；ウベニメクス類；ウラシルマスタード類；ウレデパ類；バルルビシン類；バルスポダル類；バプレオチド類；ベルテポルフィン類；ビンブラスチン類；ビンクリスチン類；ビンデシン類；ビネピジン類；ビンフルニン類；ビンホルミド（Vinformide）類；ビングリシネート（Vinglycinate）類；ビンロイシノール類；ビンロイロシン類；ビノレルビン類；ビンロシジン類；ビントリプトール類；ビンゾリジン（Vinzolidine）類；ボロゾール類；キサントマイシンA類（グアメシクリン類）；ゼニプラチン類；ジラスコルブ類［2-H］；ジノスタチン類；ゾレドロネート；ゾルビシン類；およびゾスキダル類の中から選択されるがん処置である。
【００３４】
ここに提供される例示的ヒアルロナン分解酵素は、可溶性ヒアルロニダーゼおよびその調製物を含めて、例えば米国公開番号US20040268425、US20050260186、US20060104968、US20090123367、US20090181013、US20090181032、US20090214505、US20090253175およびUS20100143457ならびに米国特許第7,767,429号に記載されている。
【００３５】
ここに提供される方法では、PEG化ヒアルロナン分解酵素を投与される対象がヒト対象である。本方法のある特定態様では、対象ががんを有し、処置が、PEG化ヒアルロナン分解酵素を全身投与することを含む。
【００３６】
ポリマーにコンジュゲートされたヒアルロナン分解酵素を用いる、ここに提供される方法または使用のいずれにおいても、比活性は、少なくとも約20,000U/mg、25,000U/mg、30,000U/mg、31,000U/mg、32,000U/mg、33,000U/mg、34,000U/mg、35,000U/mg、36,000U/mg、37,000U/mg、38,000U/mg、39,000U/mg、40,000U/mg、45,000U/mg、50,000U/mg、55,000U/mg、60,000U/mgまたはその前後もしくはそれ以上であることができる。
【００３７】
さらに、静脈内投与用に製剤化されたヒアルロナン分解酵素を含有する第1組成物と、コルチコステロイドを含む第2組成物とを含む組合せが、ここに提供される。特に、ここに提供される組合せでは、ヒアルロナン分解酵素がPEG化ヒアルロナン分解酵素、例えばPEG化PH20（例えばPEGPH20）である。ここに提供される組合せの別の例では、コルチコステロイドが、デキサメタゾンなどのグルココルチコイドである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
［詳細な説明］
概要
A．定義
B．概観
1．抗ヒアルロナン剤ならびにヒアルロナンに関連する疾患、状態および/または障害
2．抗ヒアルロナン剤による処置に関連する有害作用
3．抗ヒアルロナン剤の有害作用を緩和するためのコルチコステロイドの使用
C．抗ヒアルロナン剤
1．ヒアルロナン合成を阻害する作用剤
2．ヒアルロナン分解酵素
a．ヒアルロニダーゼ
i．哺乳動物型ヒアルロニダーゼ
PH20
ii．細菌ヒアルロニダーゼ
iii．ヒル、他の寄生虫および甲殻類からのヒアルロニダーゼ
b．他のヒアルロナン分解酵素
c．可溶性ヒアルロナン分解酵素
i．可溶性ヒトPH20
ii．rHuPH20
d．ヒアルロナン分解酵素のグリコシル化
e．修飾（ポリマーコンジュゲート）ヒアルロナン分解酵素
PEG化可溶性ヒアルロナン分解酵素
D．ヒアルロナン分解酵素の核酸およびコードされているポリペプチドを生産する方法
1．ベクターおよび細胞
2．発現
a．原核細胞
b．酵母細胞
c．昆虫細胞
d．哺乳動物細胞
e．植物
3．精製技法
4．ヒアルロナン分解酵素ポリペプチドのPEG化
E．コルチコステロイド
F．抗ヒアルロナン剤の有害作用を緩和するためのコルチコステロイドの使用
1．医薬組成物および製剤
2．投薬量および投与
a．コルチコステロイド
b．抗ヒアルロナン剤
i．レフルノミドおよび誘導体
ii．ヒアルロナン分解酵素
3．併用処置
抗がん剤および他の処置
4．包装および製品
Ｇ．抗ヒアルロナン剤およびコルチコステロイドの活性および作用を評価する方法
1．副作用を評価するための方法
2．抗ヒアルロナン活性
a．ヒアルロナン分解酵素の活性を評価するためのアッセイ
b．動物モデルにおけるアッセイ
c．ヒトにおけるアッセイ
d．薬物動態
H．ヒアルロナンに関連する状態、疾患および障害の処置における抗ヒアルロナン剤の使用
1．処置対象の選択および処置効果の評価
a．ヒアルロナン関連疾患マーカーを検出するためのアッセイ
b．対照試料と比較したヒアルロナン関連マーカーの検出
2．がんの処置における使用
I．実施例
【００３９】
A．定義
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解されているものと同じ意味を有する。本明細書の開示全体にわたって言及される特許、特許出願、出願公開および刊行物、Genbank配列、データベース、ウェブサイトおよび他の公表された資料はいずれも、別段の注記がある場合を除き、引用により、その全てが本明細書に組み込まれる。用語に関する定義が本明細書に複数存在する場合は、このセクションにおける定義が優先される。URLまたは他の同様の識別子もしくはアドレスに言及する場合、そのような識別子は変更されることがあり、インターネット上の特定情報は移り変わることもあるが、インターネットを検索することによって等価な情報を見つけ出すことができると理解される。それらへの言及は、そのような情報が入手可能であること、および公に流布されていることを証明している。
【００４０】
本明細書にいう「有害作用」または「副作用」は、対象に抗ヒアルロナン剤、例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素、例えばPEGPH20を投与することの有害な、有毒な、かつ/または望ましくない作用を指す。副作用の代表例は筋骨格副作用である。副作用または有害作用は毒性に基づいて類別され、各グレードに定義を与えるさまざまな毒性尺度が存在する。そのような尺度の代表例は、米国国立がん研究所共通毒性規準第2.0版（National Cancer Institute Common Toxicity Criteria version 2.0）、世界保健機関の毒性尺度、または有害事象共通用語規準（Common Terminology Criteria for Adverse Events）（CTCAE）尺度である。一般に尺度は次のとおりである：グレード1＝軽症（mild）の副作用；グレード2＝中等症（moderate）の副作用；グレード3＝重症（severe）の副作用；グレード4＝生命を脅かすまたは活動不能を引き起こす副作用；グレード5＝致命的。重症度（severity）のグレードの割り当ては、医師その他の医療専門家が経験するところである。
【００４１】
本明細書にいう用量制限毒性（DLT）は、それ以上高い用量を与えることを妨げるほど重症の副作用を生じる薬物の用量を指す。処置プロトコール、処置される疾患、投薬レジーム、および処置されるその患者に応じて、DLTを割り当てまたは決定することは、熟練した医師の技術水準内にある。抗ヒアルロナン剤処置による（コルチコステロイドの非存在下または存在下における）処置に関するDLTの例示的定義は、観察される有害事象または副作用が、抗ヒアルロナン処置に関連するものであって、毒性尺度上で少なくともグレード3またはそれ以上と定義され、かつ非血液学的毒性であるか、または処置の間は解消し得ない進行中もしくは持続性のグレード2毒性であり、かつそのプロトコル治療に服するという患者の能力を制限するもの、または任意のグレード4もしくは遷延性グレード3血液学的毒性であるような用量である。DLTには、予防的制吐治療なしで起こった悪心または嘔吐であって、そのような治療で効果的に処置できるもの、または数時間もしくは24時間以内に自然に解消する副作用は含まれない。
【００４２】
本明細書にいう「筋骨格作用」または「筋骨格副作用」は、筋、腱、靱帯、骨、関節および関連組織の系に対する作用を指す。筋骨格副作用には、筋・関節痛、上肢および下肢のこわばり、痙攣、筋炎、全身の筋痛および圧痛、脱力、疲労、ならびに膝関節および肘関節における可動域の減少が含まれる。観察または測定された筋骨格副作用の重症度のグレードを毒性尺度に基づいて割り当てることは、熟練した医師の技術水準内にある。観察された筋骨格副作用にDLTを割り当てることも、熟練した医師の技術水準内にある。
【００４３】
本明細書において使用する、副作用または有害事象を「緩和する」または「低減する」という表現、またはその変形は、永続的であるか一時的であるか、持続するか一過性であるかを問わず、有害作用または副作用を減少させることを指す。本明細書に関して、投与された抗ヒアルロナン剤の副作用、例えば筋骨格副作用は、あるコルチコステロイドの存在下で、その非存在下と比較して、副作用に関する毒性尺度で測定される重症度のグレードに低減または減少があれば、そのコルチコステロイドによって緩和されたとみなされる。ある例では、投与された抗ヒアルロナン剤の観察または測定される毒性（1回量投与後に、または複数回量投与後に、またはその投薬レジームによって観察されるもの）が、グレード3またはそれ以上から、あるコルチコステロイドの存在下で、グレード1またはグレード2に低減される場合に、副作用は緩和されるという。もう一つの例では、投与された抗ヒアルロナン剤のDLTが、コルチコステロイドの投与後に排除されるか、または増加する場合に、副作用は緩和されるという。例えば、投与された抗ヒアルロナン剤による0.05mg/mLのDLTが、対象へのコルチコステロイドの投与によって排除されるか、または増加することにより、副作用を低減させつつ同じ用量またはより高用量の抗ヒアルロナン剤を投与することができるようになる場合に、またはDLTが0.05mg/mLより高い値、例えば0.5mg/mLに増加する場合に、副作用は緩和されるという。
【００４４】
本明細書にいう、副作用を「防止する」とは、副作用が顕在化するリスクを低減しまたは減少させることを意味し、予防的である。したがって本明細書に記載する副作用を防止するために、何らかの副作用が顕在化する前に、すなわち抗ヒアルロナン剤の投与前に、またはその投与と共に、処置（例えばコルチコステロイド）が投与される。
【００４５】
本明細書にいう「静脈内投与」は、静脈中への直接的な治療薬の送達を指す。
【００４６】
本明細書にいう抗ヒアルロナン剤は、ヒアルロナン（HA）の合成または分解を調整することによって組織または細胞におけるヒアルロナンレベルを改変する任意の作用剤を指す。ここでは、抗ヒアルロナン剤は、その作用剤の非存在下と比較して、組織または細胞におけるヒアルロナンレベルを低減する。そのような作用剤には、HAシンターゼ（HAS）およびヒアルロナン代謝に関与する他の酵素または受容体をコードする遺伝物質の発現を調整する化合物、またはヒアルロナンを合成または分解するタンパク質（HAS機能またはHAS活性を含む）を調整する化合物が含まれる。この作用剤には、小分子、核酸、ペプチド、タンパク質または他の化合物が含まれる。例えば、抗ヒアルロナン剤には、アンチセンスまたはセンス分子、抗体、酵素、小分子阻害剤およびHAS基質類似体が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００４７】
本明細書にいうヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンポリマー（ヒアルロン酸またはHAともいう）を切断して、より低分子量のフラグメントにする反応を触媒する酵素を指す。ヒアルロナン分解酵素の代表例は、ヒアルロニダーゼ、ならびにヒアルロナンを脱重合する能力を有する特定のコンドロイチナーゼおよびリアーゼである。ヒアルロナン分解酵素である例示的コンドロイチナーゼには、コンドロイチンABCリアーゼ（コンドロイチナーゼABCとも呼ばれている）、コンドロイチンACリアーゼ（コンドロイチン硫酸リアーゼまたはコンドロイチン硫酸エリミナーゼとも呼ばれている）およびコンドロイチンCリアーゼが含まれるが、これらに限るわけではない。コンドロイチンABCリアーゼは2つの酵素、コンドロイチン硫酸ABCエンドリアーゼ（EC 4.2.2.20）およびコンドロイチン硫酸ABCエキソリアーゼ（EC 4.2.2.21）を含む。例示的コンドロイチン硫酸ABCエンドリアーゼおよびコンドロイチン硫酸ABCエキソリアーゼには、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）およびフラボバクテリウム・ヘパリナム（Flavobacterium heparinum）に由来するものが含まれるが、これらに限るわけではない（プロテウス・ブルガリスのコンドロイチン硫酸ABCエンドリアーゼを配列番号98に示す；Satoら（1994）Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46）。例示的な細菌由来コンドロイチナーゼAC酵素には、フラボバクテリウム・ヘパリナムに由来するもの、配列番号99に示すビクチバリス・バデンシス（Victivallis vadensis）に由来するもの、およびアルスロバクター・アウレッセンス（Arthrobacter aurescens）に由来するものが含まれるが、これらに限るわけではない（Tkalecら (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35；Ernstら (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444）。例示的な細菌由来コンドロイチナーゼC酵素には、ストレプトコッカス（Streptococcus）およびフラボバクテリウムに由来するものが含まれるが、これらに限るわけではない（Hibiら (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4；Michelacciら (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8；Tsudaら (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133）。
【００４８】
本明細書にいうヒアルロニダーゼは、ヒアルロナン分解酵素の一種を指す。ヒアルロニダーゼには、細菌ヒアルロニダーゼ（EC 4.2.2.1またはEC 4.2.99.1）、ヒル、他の寄生虫および甲殻類に由来するヒアルロニダーゼ（EC 3.2.1.36）、および哺乳動物型ヒアルロニダーゼ（EC 3.2.1.35）が含まれる。ヒアルロニダーゼには、非ヒト由来のもの、例えば限定するわけではないが、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、トリ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚、カエル、細菌由来のもの、ならびにヒル、他の寄生虫、および甲殻類に由来するものが、いずれも包含される。例示的非ヒトヒアルロニダーゼには、ウシ由来のヒアルロニダーゼ（配列番号10、11、64およびBH55（米国特許第5,747,027号および同第5,827,721号）、イエロージャケット・スズメバチ（yellow jacket wasp）（配列番号12および13）、ミツバチ（配列番号14）、ホワイトフェイス・スズメバチ（white-face hornet）（配列番号15）、アシナガバチ（配列番号16）、マウス（配列番号17〜19、32）、ブタ（配列番号20〜21）、ラット（配列番号22〜24、31）、ウサギ（配列番号25）、ヒツジ（配列番号26、27、63および65）、チンパンジー（配列番号101）、アカゲザル（配列番号102）、オランウータン（配列番号28）、カニクイザル（配列番号29）、モルモット（配列番号30）、アルスロバクター属（FB24株）（配列番号67）、デロビブリオ・バクテリオボラス（Bdellovibrio bacteriovorus）（配列番号68）、アクネ菌（Propionibacterium acnes）（配列番号69）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）（（配列番号70）；18RS21（配列番号71）；血清型Ia型（配列番号72）；血清型III型（配列番号73）、黄色ブドウ球菌（Staphlococcus aureus）(COL株（配列番号74）；MRSA252株（配列番号75および76）；MSSA476株（配列番号77）；NCTC8325株（配列番号78）；ウシ（bovine）RF122株（配列番号79および80）；USA300株（配列番号81）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）（（配列番号82）；ATCC BAA-255/R6株（配列番号83）；血清型2型D39/NCTC7466株（配列番号84）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）（血清型M1型）（配列番号85）；血清型M2型MGAS10270株（配列番号86）；血清型M4型MGAS10750株（配列番号87）；血清型M6型（配列番号88）；血清型M12型MGAS2096株（配列番号89および90）；血清型M12型MGAS9429株（配列番号91）；血清型M28型（配列番号92）；ブタレンサ球菌（Streptococcus suis）（配列番号93〜95）；ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）（ATCC700601/ES114株（配列番号96））に由来するヒアルロニダーゼ、およびストレプトミセス・ヒアルロノリチカス（Streptomyces hyaluronolyticus）のヒアルロニダーゼ酵素（これはヒアルロン酸に特異的であり、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸を切断しない（Ohya, T.およびKaneko, Y. (1970) Biochim.Biophys.Acta 198:607）が含まれる。ヒアルロニダーゼにはヒト由来のものも含まれる。例示的ヒトヒアルロニダーゼには、HYAL1（配列番号36）、HYAL2（配列番号37）、HYAL3（配列番号38）、HYAL4（配列番号39）、およびPH20（配列番号1）がある。ヒアルロニダーゼには、ヒツジおよびウシPH20、可溶性ヒトPH20および可溶性rHuPH20などの可溶性ヒアルロニダーゼも含まれる。市販されているウシまたはヒツジ可溶性ヒアルロニダーゼの例には、Vitrase（登録商標）(ヒツジヒアルロニダーゼ）、Amphadase（登録商標）(ウシヒアルロニダーゼ）およびHydase（商標）（ウシヒアルロニダーゼ）が含まれる。
【００４９】
本明細書にいう「精製ウシ精巣ヒアルロニダーゼ」は、ウシ精巣抽出物から精製されたウシヒアルロニダーゼを指す（米国特許第2,488,564号、同第2,488,565号、同第2,806,815号、同第2,808,362号、同第2,676,139号、同第2,795,529号、同第5,747,027号および同第5,827,721号参照）。市販の精製ウシ精巣ヒアルロニダーゼの例には、Amphadase（登録商標）およびHydase（商標）、ならびにSigma Aldrich、Abnova、EMD Chemicals、GenWay Biotech, Inc.、Raybiotech, Inc.、およびCalzymeから入手することができるもの（ただしこれらに限るわけではない）を含むウシヒアルロニダーゼが含まれる。組換え生産されたウシヒアルロニダーゼ、例えば限定するわけではないが、配列番号190〜192のいずれかに示す核酸分子の発現によって生成するものも含まれる。
【００５０】
本明細書にいう「精製ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼ」は、ヒツジ精巣抽出物から精製されたヒツジヒアルロニダーゼを指す（米国特許第2,488,564号、同第2,488,565号および同第2,806,815号ならびにPCT国際出願WO2005/118799参照）。市販の精製ヒツジ精巣抽出物の例には、Vitrase（登録商標）、およびSigma Aldrich、Cell Sciences、EMD Chemicals、GenWay Biotech, Inc.、Mybiosource.comおよびRaybiotech, Inc.から入手することができるもの（ただしこれらに限るわけではない）を含むヒツジヒアルロニダーゼが含まれる。組換え生産されたヒツジヒアルロニダーゼ、例えば限定するわけではないが、配列番号66および193〜194のいずれかに示す核酸分子の発現によって生成するものも含まれる。
【００５１】
本明細書にいう「PH20」は、精子中に存在し、中性活性である、ヒアルロニダーゼの一タイプを指す。PH20は精子表面上およびリソソーム由来の先体（この場合は先体内膜に結合している）中に存在する。PH20には、ヒト、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、マウス、ウシ、ヒツジ、モルモット、ウサギおよびラット由来のもの（ただしこれらに限るわけではない）を含む任意の起源に由来するものが含まれる。例示的PH20ポリペプチドには、ヒト（配列番号1）、チンパンジー（配列番号101）、アカゲザル（配列番号102）、カニクイザル（配列番号29）、ウシ（例えば配列番号11および64）、マウス（配列番号32）、ラット（配列番号31）、ウサギ（配列番号25）、ヒツジ（配列番号27、63および65）およびモルモット（配列番号30）に由来するものが含まれる。
【００５２】
ヒアルロナン分解酵素への言及には、前駆体ヒアルロナン分解酵素ポリペプチドおよび成熟ヒアルロナン分解酵素ポリペプチド（例えばシグナル配列が除去されているもの）、活性を有するそのトランケート型が含まれ、アレル変異体および種変異体、スプライス変異体によってコードされる変異体、および他の変異体、例えば配列番号1および10〜48、63〜65、67〜102に示す前駆体ポリペプチドまたはその成熟型に対して、少なくとも40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドなどが含まれる。例えば、ヒアルロナン分解酵素への言及には、配列番号50〜51に示すヒトPH20前駆体ポリペプチド変異体も含まれる。ヒアルロナン分解酵素には、化学修飾または翻訳後修飾を含有するものも、化学修飾または翻訳後修飾を含有しないものも含まれる。そのような修飾には、PEG化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および当技術分野において知られている他のポリペプチド修飾が含まれるが、これらに限るわけではない。トランケート型PH20ヒアルロニダーゼは、その任意のC末端短縮型、特にトランケート型であってN-グリコシル化された時に中性活性であるものである。
【００５３】
本明細書にいう「可溶性PH20」は、生理的条件下で可溶性である任意の形態のPH20を指す。可溶性PH20は、例えば、37℃におけるTriton（登録商標）X-114溶液の水相へのその分配によって同定することができる（Bordierら, (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7）。GPI固定型PH20を含む脂質固定型PH20などの膜固定型PH20は、洗浄剤が豊富な相に分配されるが、ホスホリパーゼCによる処理後は、洗浄剤が少ない相または水相に分配されることになる。可溶性PH20には、膜へのPH20の固定に関連する1つ以上の領域が除去または修飾されている膜固定型PH20であって、その可溶型がヒアルロニダーゼ活性を保持しているものが含まれる。可溶性PH20には、組換え可溶性PH20および例えばヒツジまたはウシからの精巣抽出物などといった自然源に含有されるもの、またはそのような自然源から精製されたものも含まれる。そのような可溶性PH20の代表例は可溶性ヒトPH20である。
【００５４】
本明細書にいう可溶性ヒトPH20またはsHuPH20には、発現した時にポリペプチドが生理的条件下で可溶性になるように、C末端にあるグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー配列の全部または一部を欠いている、PH20ポリペプチドが含まれる。可溶性は、生理的条件下での可溶性を実証する任意の適切な方法で評価することができる。そのような方法の代表例は、水相への分配を評価する、上述の、そして実施例でも説明する、Triton（登録商標）X-114アッセイである。加えて、可溶性ヒトPH20ポリペプチドは、CHO-S細胞などのCHO細胞中で生産すると、発現して細胞培養培地中に分泌されるポリペプチドである。ただし、可溶性ヒトPH20ポリペプチドは、CHO細胞中で生産されたものに限定されるわけではなく、任意の細胞中で、または組換え発現およびポリペプチド合成を含む任意の方法で、生産することができる。CHO細胞による分泌への言及は、定義上のことである。したがって、あるポリペプチドがCHO細胞によって発現されかつ分泌されうると考えられ、可溶性であるならば、すなわちTriton（登録商標）X-114で抽出した場合に水相に分配するのであれば、それは、そのように生産されたかどうかとは関わりなく、可溶性PH20ポリペプチドである。sHuPH20ポリペプチドの前駆体ポリペプチドは、異種シグナル配列または非異種（すなわちネイティブ）シグナル配列などのシグナル配列を含むことができる。前駆体の代表例は、シグナル配列、例えばアミノ酸位置1〜35のネイティブ35アミノ酸シグナル配列（例えば配列番号1のアミノ酸1〜35参照）を含むものである。
【００５５】
本明細書にいう「伸張型可溶性PH20」または「esPH20」には、esPH20が生理的条件下で可溶性になるような形で、GPIアンカー付加シグナル配列までの残基とGPIアンカー付加シグナル配列からの1つ以上の連続残基とを含有する、可溶性PH20ポリペプチドが含まれる。生理的条件下での可溶性は、当業者に知られている任意の方法によって決定することができる。例えば、上述の、そして実施例でも説明する、Triton（登録商標）X-114アッセイによって評価することができる。加えて、上述のように、可溶性PH20は、CHO-S細胞などのCHO細胞中で生産すると、発現して細胞培養培地中に分泌されるポリペプチドである。ただし、可溶性ヒトPH20ポリペプチドは、CHO細胞中で生産されたものに限定されるわけではなく、任意の細胞中で、または組換え発現およびポリペプチド合成を含む任意の方法で、生産することができる。CHO細胞による分泌への言及は、定義上のことである。したがって、あるポリペプチドがCHO細胞によって発現されかつ分泌されうると考えられ、可溶性であるならば、すなわちTriton（登録商標）X-114で抽出した場合に水相に分配するのであれば、それは、そのように生産されたかどうかとは関わりなく、可溶性PH20ポリペプチドである。ヒト可溶性esPH20ポリペプチドは、残基36〜490に加えて、結果として生じるポリペプチドが可溶性であるような形で、配列番号1のアミノ酸残基491（この残基を含む）からの1つ以上の連続アミノ酸を含む。例示的ヒトesPH20可溶性ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸36〜491、36〜492、36〜493、36〜494、36〜495、36〜496および36〜497に対応するアミノ酸残基を有するものである。これらの代表例は、配列番号151〜154および185〜187のいずれかに示すアミノ酸配列を有するものである。アレル変異体および他の変異体、例えば配列番号151〜154および185〜187の対応するポリペプチドと40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有し、中性活性を保持しており、かつ可溶性である、任意の変異体も含まれる。配列同一性への言及はアミノ酸置換を有する変異体を指す。
【００５６】
本明細書における「esPH20」への言及には、前駆体esPH20ポリペプチドおよび成熟esPH20ポリペプチド（例えばシグナル配列が除去されているもの）、そのトランケート型であって、酵素活性を有し（完全長型の少なくとも1％、10％、20％、30％、40％、50％またはそれ以上を保持し）かつ可溶性であるものが含まれ、アレル変異体および種変異体、スプライス変異体によってコードされる変異体、および他の変異体、例えば配列番号1および3に示す前駆体ポリペプチドまたはその成熟型に対して、少なくとも40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドなどが含まれる。
【００５７】
本明細書における「esPH20」への言及には、化学修飾または翻訳後修飾を含有するものも、化学修飾または翻訳後修飾を含有しないものも含まれる。そのような修飾には、PEG化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および当技術分野において知られている他のポリペプチド修飾が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００５８】
本明細書にいう「可溶性組換えヒトPH20（rHuPH20）」は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞中で組換え発現され分泌される可溶型のヒトPH20を含有する組成物を指す。可溶性rHuPH20は、配列番号49に示す、シグナル配列を含む核酸分子によってコードされる。可溶性rHuPH20をコードする核酸を、成熟ポリペプチドを分泌するCHO細胞で発現させる。培養培地中に生産された状態ではC末端に不均一性が存在するので、生成物は、配列番号4〜9の任意の1つ以上をさまざまな存在比で含みうる分子種の混合物を含む。
【００５９】
同様に、他の形態のPH20、例えばesPH20の場合も、組換え発現ポリペプチドおよびそれらの組成物は、C末端が不均一性を示す複数の分子種を含みうる。例えば、アミノ酸36〜497を有するesPH20をコードする配列番号107のポリペプチドの発現によって生産される組換え発現esPH20の組成物は、アミノ酸数が少ない形態、例えば36〜496、36〜495などを含みうる。
【００６０】
本明細書にいう「N-結合部分」は、ポリペプチドの翻訳後修飾によってグリコシル化されうる、ポリペプチドのアスパラギン（N）アミノ酸残基を指す。ヒトPH20の例示的N-結合部分には、配列番号1に示すヒトPH20のアミノ酸N82、N166、N235、N254、N368およびN393が含まれる。
【００６１】
本明細書にいう「N-グリコシル化ポリペプチド」は、少なくとも3つのN-結合アミノ酸残基の（例えば配列番号1のアミノ酸残基N235、N368およびN393に対応するN-結合部分の）オリゴ糖結合を含有する、PH20ポリペプチドまたはそのトランケート型を指す。N-グリコシル化ポリペプチドには、N-結合部分のうちの3つ、4つ、5つ、そして最大で全部がオリゴ糖に連結されているポリペプチドを含めることができる。N-結合型オリゴ糖には、オリゴマンノース型、複合型、混成型、もしくは硫酸化型オリゴ糖、またはオリゴ糖および単糖を含めることができる。
【００６２】
本明細書にいう「N-部分グリコシル化ポリペプチド」は、少なくとも3つのN-結合部分に連結されたN-アセチルグルコサミングリカンを最低限含有するポリペプチドを指す。部分グリコシル化ポリペプチドには、単糖型、オリゴ糖型、および分岐糖型を含むさまざまなグリカン型、例えばEndoH、EndoF1、EndoF2および/またはEndoF3によるポリペプチドの処理によって形成されるものなどを含めることができる。
【００６３】
本明細書にいう「脱グリコシル化PH20ポリペプチド」は、グリコシル化されている部位が考えうる全てのグリコシル化部位よりは少ないPH20ポリペプチドを指す。脱グリコシル化は、例えば、グリコシル化を除去するか、グリコシル化を防止するか、またはグリコシル化部位が排除されるようにポリペプチドを修飾することによって達成することができる。特定のN-グリコシル化部位が活性にとって必要でないのに対し、他のN-グルコシル化部位は活性にとって必要である。
【００６４】
本明細書にいう「PEG化」は、典型的にはヒアルロナン分解酵素の半減期を増加させるために行われる、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素への、ポリエチレングリコール（PEG化部分PEG）などのポリマー分子の共有結合による取り付けまたは他の安定な取り付けを指す。
【００６５】
本明細書にいう「コンジュゲート」は、1つ以上の他のポリペプチドまたは化学部分に直接的または間接的に連結されたポリペプチドを指す。そのようなコンジュゲートには、融合タンパク質、化学コンジュゲートによって作成されるもの、および他の任意の方法によって作成されるものが含まれる。例えばコンジュゲートは、コンジュゲートがヒアルロニダーゼ活性を保持しているという条件の下に、少なくとも1つの可溶性PH20ポリペプチドが、もう一つのポリペプチドまたは化学部分に直接的または間接的に連結されている、1つ以上の他のポリペプチドまたは化学部分に直接的または間接的に連結された可溶性PH20ポリペプチドを指す。
【００６６】
本明細書にいう「融合」タンパク質は、ある核酸分子からのコード配列ともう一つの核酸分子からのコード配列とを含有し、融合コンストラクトが宿主細胞中で転写され翻訳された場合に、前記2つのタンパク質を含有するタンパク質が生産されるように、それらのコード配列が同じ読み枠にある核酸配列によってコードされるポリペプチドを指す。2つの分子はコンストラクト中で隣り合っていてもよいし、1、2、3個またはそれ以上の、ただし典型的には10、9、8、7、または6個より少ないアミノ酸を含有するリンカーポリペプチドによって分離されていてもよい。融合コンストラクトによってコードされるタンパク質産物を融合ポリペプチドという。
【００６７】
本明細書にいう「ポリマー」は、ポリペプチドにコンジュゲート（すなわち直接的に、またはリンカーを介して間接的に、安定に連結）される、任意の高分子量天然または合成部分を指す。そのようなポリマーは典型的には血清中半減期を増加させ、限定するわけではないが、シアル酸部分、PEG化部分、デキストラン、および糖、ならびに他の部分、例えばグリコシル化が、これに含まれる。例えば、可溶性PH20またはrHuPH20などのヒアルロニダーゼを、ポリマーにコンジュゲートすることができる。
【００６８】
本明細書にいうヒアルロニダーゼ基質は、ヒアルロニダーゼ酵素によって切断および/または脱重合される基質（例えばタンパク質または多糖）を指す。一般にヒアルロニダーゼ基質はグリコサミノグリカンである。例示的ヒアルロニダーゼ基質はヒアルロナン（HA）である。
【００６９】
本明細書にいう、ヒアルロナンに関連する疾患、障害または状態は、ヒアルロナンレベルが上昇していて、それが、その疾患または状態における原因であるか、帰結であるか、または他の理由で観察されている、任意の疾患または状態を指す。ヒアルロナン関連疾患および状態は、組織または細胞における上昇したヒアルロナン発現、増大した間質液圧、低下した血管容積、および/または組織中の増加した含水量に関連する。ヒアルロナンに関連する疾患、障害または状態は、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素、例えば可溶性ヒアルロニダーゼを含有する組成物を、単独で、または他の処置および/または作用剤と組み合わせて、もしくはそれらに追加して投与することによって、処置することができる。例示的疾患および状態には炎症性疾患および高ヒアルロナン（hyaluronan-rich）がんが含まれるが、これらに限るわけではない。高ヒアルロナンがんには、例えば、末期がん、転移がん、未分化がん、卵巣がん、上皮内癌（ISC）、扁平上皮細胞癌（SCC）、前立腺がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、大腸がんおよび他のがんなどといった固形腫瘍を含む腫瘍が含まれる。上昇した間質液圧と関連する疾患、例えば椎間板圧迫と関連する疾患、および浮腫、例えば臓器移植、脳卒中、脳外傷または他の傷害によって引き起こされる浮腫も、ヒアルロナン関連疾患および状態の代表例である。例示的ヒアルロナン関連疾患および状態には、上昇した間質液圧、低下した血管容積、および/または組織中の増加した含水量に関連する疾患および状態、例えばがん、椎間板圧迫および浮腫などが含まれる。ある例では、ヒアルロナンに関連する状態、疾患または障害の処置に、増加した間質液圧（IFP）、低下した血管容積、および組織中の増加した含水量のうち、1つ以上の緩和、低減、またはそれら1つ以上に対する他の有益な作用が含まれる。
【００７０】
本明細書にいう上昇したヒアルロナンレベルは、疾患または状態に応じた特定組織、体液または細胞におけるヒアルロナンの量を指す。例えば、血液、尿、唾液および血清などの体液、および/または腫瘍組織もしくは腫瘍細胞におけるヒアルロナン（HA）レベルは、高ヒアルロナン腫瘍が存在する結果として上昇しうる。レベルは、標準または他の適切な対照、例えばHA関連疾患を有さない対象からの比較しうる試料などと比較することができる。
【００７１】
本明細書にいう比活性は、タンパク質1mgあたりの活性の単位数を指す。ヒアルロニダーゼのミリグラム数は、モル吸光係数が約1.7（単位はM-1cm-1）であると仮定して、280nmにおける溶液の吸収によって定義される。
【００７２】
本明細書にいう上昇したヒアルロナンレベルは、疾患または状態に応じた特定組織、体液または細胞におけるヒアルロナンの量を指す。例えば、血液、尿、唾液および血清などの体液、および/または腫瘍組織もしくは腫瘍細胞におけるヒアルロナン（HA）レベルは、高ヒアルロナン腫瘍が存在する結果として上昇しうる。レベルは、標準または他の適切な対照、例えばHA関連疾患を有さない対象からの比較しうる試料などと比較することができる。
【００７３】
本明細書にいう「活性」は、完全長（完全）タンパク質に関連するポリペプチドまたはその一部の1または複数の機能的活性を指す。例えば、ポリペプチドの活性フラグメントは、完全長タンパク質の活性を示すことができる。機能的活性には、生物学的活性、触媒活性または酵素活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体に結合する能力または抗ポリペプチド抗体への結合に関してポリペプチドと競合する能力）、免疫原性、多量体を形成する能力、およびポリペプチドの受容体またはリガンドに特異的に結合する能力が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００７４】
本明細書にいう「ヒアルロニダーゼ活性」は、ヒアルロン酸の切断を酵素的に触媒する能力を指す。ヒアルロニダーゼに関する米国薬局方（USP）XXIIアッセイでは、酵素をHAと37℃で30分間反応させた後に残存している高分子量ヒアルロン酸、すなわちヒアルロナン（HA）基質の量を測定することによって、ヒアルロニダーゼ活性が間接的に決定される（USP XXII-NF XVII (1990) 644-645、米国薬局方協会、メリーランド州ロックビル）。任意のヒアルロニダーゼの相対的活性をその単位数で確かめるために、アッセイには参照標準溶液を使用することができる。可溶性PH20およびesPH20を含むPH20などのヒアルロニダーゼのヒアルロニダーゼ活性を決定するためのインビトロアッセイは、当技術分野では知られており、本明細書でも説明する。例示的アッセイには、切断されていないヒアルロン酸が血清アルブミンと結合した時に形成される不溶性沈殿物を検出することによってヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の切断を間接的に測定する微小濁度アッセイや、マイクロタイタープレートウェルに非共有結合的に結合している残存ビオチン化ヒアルロン酸をストレプトアビジン-セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートと発色性基質とを使って検出することにより、ヒアルロン酸の切断を間接的に測定するビオチン化ヒアルロン酸アッセイが含まれる。例えば、試験されるヒアルロニダーゼの活性をその単位数で決定するための標準曲線を作成するために、参照標準を使用することができる。
【００７５】
本明細書にいう「中性活性」は、中性pH（例えばpH7.0またはその前後）においてヒアルロン酸の切断を酵素的に触媒するというPH20ポリペプチドの能力を指す。一般に、中性活性可溶性PH20、例えばC末端トランケート型またはN-部分グリコシル化型PH20は、C末端トランケート型でないまたはN-部分グリコシル化型でない対応する中性活性PH20のヒアルロニダーゼ活性と比較して、約30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％またはその前後もしくはそれ以上の活性を有する。
【００７６】
本明細書にいう「GPIアンカー付加シグナル配列」は、ERの内腔内で、ポリペプチドへの、予め形成されているGPIアンカーの付加を指令する、C末端のアミノ酸配列である。GPIアンカー付加シグナル配列は、GPIアンカー型PH20ポリペプチドなどのGPIアンカー型ポリペプチドの前駆体ポリペプチド中に存在する。C末端GPIアンカー付加シグナル配列は、典型的には、ω部位、またはGPIアンカー付加部位のすぐ下流にある8〜12アミノ酸の親水性スペーサー領域に後続する、8〜20アミノ酸の主に疎水性の領域を含有する。GPIアンカー付加シグナル配列は当技術分野において周知の方法を使って同定することができる。これには、ExPASyプロテオミクスツールサイト（例えばワールドワイドウェブサイトexpasy.ch/tools/）などのバイオインフォマティクスのウェブサイトで、すぐに利用できるものを含む、インシリコ法およびアルゴリズム（例えばUdenfriendら (1995) Methods Enzymol. 250:571-582、Eisenhaberら (1999) J. Biol. Chem. 292: 741-758、Fankhauserら (2005) Bioinformatics 21:1846-1852、Omaetxebarriaら (2007) Proteomics 7:1951-1960、Pierleoniら (2008) BMC Bioinformatics 9:392参照）が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００７７】
本明細書にいう「核酸」には、DNA、RNA、およびその類似体、例えばペプチド核酸（PNA）、ならびにその混合物が含まれる。核酸は一本鎖または二本鎖であることができる。プローブまたはプライマー（これは、場合によっては、蛍光ラベルまたは放射性ラベルなどの検出可能なラベルなどによって標識されている）については、一本鎖分子が考えられる。そのような分子は、通例、ライブラリーをプローブまたはプライミングするために、それらの標的が統計的にユニークであるか、または低いコピー数（通例、5未満、一般的には3未満）のものであることになるような長さを有する。一般にプローブまたはプライマーは、関心対象の遺伝子と相補的なまたは同一な配列の少なくとも14、16または30個の連続するヌクレオチドを含有する。プローブおよびプライマーは10、20、30、50、100核酸長（nucleic acids long）またはそれ以上の長さであることができる。
【００７８】
本明細書にいうペプチドは長さが2アミノ酸以上かつ長さが40アミノ酸以下であるポリペプチドを指す。
【００７９】
本明細書では、本明細書に記載するさまざまなアミノ酸配列中に存在するアミノ酸を、その公知の三文字記号または一文字記号（表1）に従って特定する。さまざまな核酸フラグメント中に存在するヌクレオチドは、当技術分野において常用されている標準的一文字表記で指定される。
【００８０】
本明細書にいう「アミノ酸」は、アミノ基とカルボン酸基とを含有する有機化合物である。ポリペプチドは2つ以上のアミノ酸を含有する。本明細書に関して、アミノ酸には、20種の天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体（すなわちα-炭素が側鎖を有するアミノ酸）が含まれる。
【００８１】
本明細書にいう「アミノ酸残基」は、ポリペプチドがそのペプチド結合において化学的に消化（加水分解）された時に形成されるアミノ酸を指す。本明細書に記載するアミノ酸残基は「L」異性体型であると考えられる。「D」異性体型の残基はそのように表記され、所望の機能的性質がそのポリペプチドによって保持されるのであれば、任意のLアミノ酸残基の代わりに、それを使用することができる。NH2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。COOHは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシル基を指す。J.Biol.Chem., 243:3552-3559 (1968)に記載され、37C.F.R.§1.821〜1.822で採用された標準的ポリペプチド命名法に従って、アミノ酸残基の略号を表1に示す。
［表1］対応表
【表１】
2013540103.tif 000002
【００８２】
本明細書において式によって表されるアミノ酸残基配列は、全て、左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシル末端へと至る通常の向きを有する。また、「アミノ酸残基」という表現は、対応表（表1）に列挙したアミノ酸ならびに修飾アミノ酸および異常アミノ酸、例えば37C.F.R.§1.821〜1.822において言及され引用により本明細書に組み込まれるものを包含すると、定義される。さらにまた、アミノ酸残基配列の最初または最後にあるダッシュ記号は、1つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合、アミノ末端基（例えばNH2）またはカルボキシル末端基（例えばCOOH）へのペプチド結合を示すことに注意すべきである。
【００８３】
本明細書にいう「天然α-アミノ酸」は、ヒトにおけるアミノアシルtRNA分子とそのコグネートmRNAコドンとの特異的認識によってタンパク質中に組み込まれる、自然界に見いだされる20のα-アミノ酸の残基である。したがって非天然アミノ酸には、例えば、それら20の天然アミノ酸以外のアミノ酸または類似体が含まれ、限定するわけではないが、アミノ酸のD-立体異性体が含まれる。例示的非天然アミノ酸は本明細書に記載され、当業者にも知られている。
【００８４】
本明細書にいうDNAコンストラクトは、DNAのセグメントが自然界には見いだされない形で組み合わされ隣接して配置されている一本鎖または二本鎖の線状または環状DNA分子である。DNAコンストラクトは、人為的操作の結果として存在し、操作された分子のクローンその他のコピーを含む。
【００８５】
本明細書にいうDNAセグメントは、指定された属性を有する、より大きなDNA分子の一部である。例えば、指定されたポリペプチドをコードするDNAセグメントは、プラスミドまたはプラスミドフラグメントなどといった、より長いDNA分子の一部であって、5'から3'に向かう方向に読んだ場合に、指定されたポリペプチドのアミノ酸配列をコードするものである。
【００８６】
本明細書において使用する用語ポリヌクレオチドは、5'端から3'端に向かって読み取られるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドにはRNAおよびDNAが含まれ、自然源から単離するか、インビトロで合成するか、天然分子と合成分子の組合せから調製することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、本明細書では、ヌクレオチド数（「nt」と略記）または塩基対数（「bp」と略記）で記載される。ヌクレオチドという用語は、文脈に合わせて、一本鎖分子および二本鎖分子に使用される。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全長を表すために使用され、塩基対という用語と等価であると理解されるであろう。二本鎖ポリヌクレオチドの2本の鎖の長さがわずかに異なる場合があること、およびそれらの末端がずれている場合があること、したがって二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対合しているとは限らないことは、当業者には理解されるであろう。そのような非対合末端は、一般に、20ヌクレオチド長を超えないであろう。
【００８７】
本明細書にいう、2つのタンパク質または核酸間の「類似性」とは、タンパク質のアミノ酸配列間または核酸のヌクレオチド配列間の類縁性を指す。類似性は、残基の配列およびそこに含有される残基の同一性および/または相同性の度合いに基づくことができる。タンパク質間または核酸間の類似性の度合いを評価するための方法は、当業者には知られている。例えば、配列類似性を評価する方法の一つでは、2つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を、それらの配列間の同一性が最大レベルになるようにアラインメントする。「同一性」とは、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が不変である程度を指す。アミノ酸配列のアラインメントでは（また、ある程度はヌクレオチド配列のアラインメントでも）、アミノ酸（またはヌクレオチド）の保存的相違および/または頻繁な置換も考慮することができる。保存的相違とは、関与する残基の物理化学的性質が保存されている相違である。アラインメントはグローバル（配列の全長にわたり、全ての残基を含む、比較配列のアラインメント）またはローカル（配列のうち、最も類似する1または複数の領域だけを含む部分のアラインメント）であることができる。
【００８８】
「同一性」そのものは、当技術分野で認められている意味を持ち、公表された技法を使って算出することができる（例えば「Computational Molecular Biology」Lesk,A.M.編、Oxford University Press、ニューヨーク、1988；「Biocomputing: Informatics and Genome Projects」Smith,D.W.編、Academic Press、ニューヨーク、1993；「Computer Analysis of Sequence Data, Part I」Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、Humana Press、ニュージャージー、1994；「Sequence Analysis in Molecular Biology」von Heinje,G.、Academic Press、1987；および「Sequence Analysis Primer」Gribskov,M.およびDevereux,J.編、M Stockton Press、ニューヨーク、1991）参照）。2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性を測定するための方法はいくつか存在し、「同一性」という用語は当業者にはよく知られている（Carillo,H.およびLipton,D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)）。
【００８９】
本明細書にいう相同（核酸および/またはアミノ酸配列に関して）は、約25％以上の配列相同性、典型的には、25％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上または95％以上の配列相同性を意味し、必要であれば正確なパーセンテージを指定することができる。本明細書に関して、「相同性」および「同一性」という用語は、別段の表示がある場合を除き、しばしば可換的に使用される。一般に、相同性パーセンテージまたは同一性パーセンテージを決定するには、最も高水準な一致が得られるように配列がアラインメントされる（例えば「Computational Molecular Biology」Lesk,A.M.編、Oxford University Press、ニューヨーク、1988；「Biocomputing: Informatics and Genome Projects」Smith,D.W.編、Academic Press、ニューヨーク、1993；「Computer Analysis of Sequence Data, Part I」Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、Humana Press、ニュージャージー、1994；「Sequence Analysis in Molecular Biology」von Heinje,G.、Academic Press、1987；および「Sequence Analysis Primer」Gribskov,M.およびDevereux,J.編、M Stockton Press、ニューヨーク、1991；Carilloら (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照）。配列相同性では、保存されているアミノ酸の数が標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムで決定され、これは各供給者によって設定されたデフォルトギャップペナルティで使用することができる。実質的に相同な核酸分子は、典型的には、中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーにおいて、目的の核酸の全長にわたってハイブリダイズするであろう。ハイブリダイズする核酸分子中のコドンの代わりに縮重コドンを含有する核酸分子も考えられる。
【００９０】
任意の2分子が、少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％「同一」または「相同」であるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するかどうかは、「FASTA」プログラムなどの公知コンピュータアルゴリズムを使用し、例えばPearsonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444に記載されているようなデフォルトパラメータを使って決定することができる（他のプログラムには、GCGプログラムパッケージ（Devereux,J.ら, Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA（Atschul,S.F.ら, J Molec Biol 215:403 (1990))、「Guide to Huge Computers」Martin J.Bishop編、Academic Press、サンディエゴ、1994、およびCarilloら (1988) SIAM J Applied Math 48:1073などがある）。例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センターデータベースのBLAST機能を使って同一性を決定することができる。他の市販プログラムまたは公に利用可能なプログラムには、DNAStarの「MegAlign」プログラム（ウィスコンシン州マディソン）およびUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group（UWG）の「Gap」プログラム（ウィスコンシン州マディソン）などがある。タンパク質分子および/または核酸分子の相同性パーセントまたは同一性パーセントは、例えば、GAPコンピュータプログラム（例えばNeedlemanら (1970) J. Mol. Biol. 48:443、SmithおよびWaterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482による改訂版）を使って配列情報を比較することなどによって、決定することができる。簡単に述べると、GAPプログラムは、類似性を、アラインメントさせた記号（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）のうち、類似しているものの数を、それら2つの配列の短い方の配列中の記号の総数で割ったものと定義する。GAPプログラムのデフォルトパラメータには、（1）SchwartzおよびDayhoff編「ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE」National Biomedical Research Foundation、353〜358頁（1979）に記載されているように、単項比較マトリックス（unary comparison matrix）（一致に対して1の値を、不一致に対して0の値を含んでいる）およびGribskovら (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745の加重比較マトリックス（weighed comparison matrix）；（2）各ギャップに対して3.0のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対して0.10の追加ペナルティ；ならびに（3）エンドギャップ（end gap）に対するペナルティなしを含めることができる。
【００９１】
したがって、本明細書において使用する「同一性」または「相同性」という用語は、試験ポリペプチドまたは試験ポリヌクレオチドと参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドの間の比較を表す。本明細書において使用する「〜に少なくとも90％同一」という用語は、そのポリペプチドの参照核酸配列または参照アミノ酸配列に対する90〜99.99％の同一性パーセントを指す。90％以上のレベルの同一性とは、例えば、比較される試験ポリペプチドと参照ポリペプチドの長さが100アミノ酸であるとした場合に、参照ポリペプチド中のアミノ酸と異なる試験ポリペプチド中のアミノ酸が10％（すなわち100個中10個）を上回らないという事実を示す。同様の比較を、試験ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドの間でも行うことができる。そのような相違は、ポリペプチドの全長にわたってランダムに分布する点突然変異として現れる場合も、許容される最大値までの、例えば100個中10個のアミノ酸相違（約90％の同一性）までの、さまざまな長さを持つ1つ以上の位置にクラスターを形成する場合もありうる。相違は、核酸またはアミノ酸の置換、挿入または欠失と定義される。約85〜90％を上回る相同性または同一性のレベルでは、結果が、プログラムにも、設定されたギャップパラメータにも、依存しないはずであり、そのような高レベルの同一性は、多くの場合、ソフトウェアに頼らなくても手作業でのアラインメントによって、容易に評価することができる。
【００９２】
本明細書にいう、アラインメントされた配列とは、相同性（類似性および/または同一性）を使った、ヌクレオチドの配列中またはアミノ酸の配列中の対応する位置のアラインメントを指す。典型的には、50％以上類縁する2つ以上の配列がアラインメントされる。アラインメントされた一組の配列とは、対応する位置でアラインメントさせた2つ以上の配列を指し、RNAに由来する配列、例えばESTおよび他のcDNAを、ゲノムDNA配列とアラインメントさせたものを含みうる。
【００９３】
本明細書にいう「プライマー」は、適当な条件下（例えば4つの異なるヌクレオシド三リン酸、およびDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合剤の存在下）、適当な緩衝液中、適切な温度で、テンプレートに基づく（template-directed）DNA合成の開始点として作用することができる核酸分子を指す。一定の核酸分子が「プローブ」としても「プライマー」としても役立ちうることは理解されるであろう。ただしプライマーは伸長のために3'ヒドロキシル基を持つ。プライマーは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、逆転写酵素（RT）-PCR、RNA PCR、LCR、マルチプレックスPCR、パンハンドル（panhandle）PCR、キャプチャ（capture）PCR、発現（expression）PCR、3'および5'RACE、インサイチューPCR、ライゲーションによる（ligation-mediated）PCR、および他の増幅プロトコールなどを含む、さまざまな方法で使用することができる。
【００９４】
本明細書にいう「プライマー対」は、（例えばPCRによって）増幅されるべき配列の5'端にハイブリダイズする5'（上流）プライマーと、増幅されるべき配列の3'端の相補鎖にハイブリダイズする3'（下流）プライマーとを含む、一組のプライマーを指す。
【００９５】
本明細書にいう「特異的にハイブリダイズする」とは、ある核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）が相補的塩基対合によって標的核酸分子にアニーリングすることを指す。特異的ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすインビトロおよびインビボパラメータ、例えばその特定分子の長さおよび組成などは、当業者にはよく知られている。インビトロハイブリダイゼーションにとって特に関係の深いパラメータには、さらに、アニーリング温度および洗浄温度、緩衝液組成および塩濃度が含まれる。非特異的に結合した核酸分子を除去するための例示的洗浄条件は、高ストリンジェンシーでは0.1×SSPE、0.1％SDS、65℃であり、中ストリンジェンシーでは0.2×SSPE、0.1％SDS、50℃である。等価なストリンジェンシー条件が当技術分野では知られている。当業者は、ある核酸分子がある特定用途に適した標的核酸分子に特異的にハイブリダイズするように、これらのパラメータを容易に調節することができる。2つのヌクレオチド配列に関して相補的とは、それら2つのヌクレオチド配列が、ハイブリダイズする能力を有し、相対するヌクレオチド間のミスマッチが通例、25％、15％または5％未満であることを意味する。必要であれば、相補性の百分率が指定されるであろう。通例、2つの分子は、それらが高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするように選択される。
【００９６】
本明細書において、ある物品と実質的に同一であるとは、十分に類似しているので、目的の性質が十分に不変であり、したがってその物品の代わりに実質的に同一な物品を使用することが可能であることを意味する。
【００９７】
また、本明細書で使用される「実質的に同一」または「類似する」という用語も、関連技術分野の当業者には理解されるとおり、文脈によってさまざまであると理解される。
【００９８】
本明細書にいうアレル変異体またはアレル変異は、同じ染色体座を占める遺伝子の2つ以上の代替的形態のいずれかを指す。アレル変異は突然変異によって自然に発生し、集団内の表現型多型をもたらしうる。遺伝子突然変異はサイレント（コードされるポリペプチドを変化させない）であるか、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。「アレル変異体」という用語は、本明細書では、ある遺伝子のアレル変異体によってコードされるタンパク質を表すためにも使用される。通例、参照型の遺伝子は、ある集団から得られるまたはある種の単一の参照メンバーから得られるポリペプチドの野生型および/または優勢型をコードする。通例、アレル変異体（2種間および3種以上の間での変異体を含む）は、同じ種から得られる野生型および優勢型と、典型的には少なくとも80％、90％またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する。また、同一性の度合いは、遺伝子に依存し、比較が種間比較であるか種内比較であるかにも依存する。一般に、種内アレル変異体は、野生型および/または優勢型と少なくとも約80％、85％、90％または95％またはそれ以上の同一性（野生型および/または優勢型のポリペプチドと96％、97％、98％、99％またはそれ以上の同一性を含む）を有する。本明細書におけるアレル変異体への言及は、一般に、同じ種内のメンバー間でのタンパク質中の変異を指す。
【００９９】
本明細書にいう「アレル」は、本明細書では「アレル変異体」と可換的に使用され、遺伝子またはその一部の代替型を指す。アレルは相同染色体上の同じ座または位置を占める。ある対象がある遺伝子について2つの同一アレルを持っている場合、その対象はその遺伝子またはアレルに関してホモ接合であるという。ある対象がある遺伝子について2つの異なるアレルを持っている場合、その対象はその遺伝子についてヘテロ接合であるという。ある特定遺伝子のアレルは互いに1個のヌクレオチドが異なる場合または数個のヌクレオチドが異なる場合があり、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入などといった修飾を含む場合がある。ある遺伝子のアレルは、突然変異を含有する形態の遺伝子であることもできる。
【０１００】
本明細書にいう種変異体は、異なる種間（マウスとヒトなどといった異なる哺乳動物種間を含む）でのポリペプチドの変異体を指す。例えばpH20の場合、ここに提供される種変異体の代表例は、霊長類PH20、例えば限定するわけではないが、ヒト、チンパンジー、マカクおよびカニクイザルなどである。一般に、種変異体は、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％またはそれ以上の配列同一性を有する。2つまたは3つ以上の種変異体の間の対応する残基は、一致するヌクレオチドまたは残基の数が最大になるように、例えば配列間の同一性が95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上になるように、配列を比較しアラインメントすることによって決定することができる。次に、目的の位置に、参照核酸分子において割り当てられた数字が与えられる。アラインメントは、手作業でまたは目視で達成することができ、配列同一性が80％を超える場合は特にそうである。
【０１０１】
本明細書にいうヒトタンパク質は、ヒトのゲノム中に存在する核酸分子、例えばDNAによってコードされているものであり、あらゆるアレル変異体およびその保存的変異を含む。タンパク質の変異体または修飾は、その修飾がヒトタンパク質の野生型配列または主要配列に基づくものであるならば、ヒトタンパク質である。
【０１０２】
本明細書にいうスプライス変異体は、2タイプ以上のmRNAをもたらすゲノムDNAの一次転写産物の差異的プロセシングによって生成する変異体を指す。
【０１０３】
本明細書にいう修飾は、ポリペプチドのアミノ酸配列または核酸分子中のヌクレオチド配列の修飾に関し、これには、それぞれアミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入および置き換え（例えば置換）が含まれる。修飾の代表例はアミノ酸置換である。アミノ酸置換が施されたポリペプチドは、アミノ酸置換を含有しないポリペプチドに対して、65％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％またはそれ以上の配列同一性を示すことができる。アミノ酸置換は保存的または非保存的であることができる。一般に、ポリペプチドに加えられる修飾はいずれも、ポリペプチドの活性を保持する。ポリペプチドを修飾する方法は、組換えDNA法を用いる方法など、当業者にとってはルーチンである。
【０１０４】
本明細書にいう、アミノ酸の適切な保存的置換は、当業者には知られており、一般に、結果として生じる分子の生物学的活性を変化させずに行うことができる。一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に変化させないと、当業者には認識されている（例えばWatsonら「Molecular Biology of the Gene」第4版、1987、The Benjamin/Cummings Pub. Co.の224頁参照）。そのような置換は以下の表2に示すものに従って行うことができる。
［表2］
【表２】
2013540103.tif 000003
【０１０５】
他の置換も許容され、それらは経験的に決定することができるか、既知の保存的置換に合致しうる。
【０１０６】
本明細書において使用するプロモーターという用語は、RNAポリメラーゼの結合と転写の開始に備えたDNA配列を含有する、遺伝子の一部分を意味する。プロモーター配列は、常にというわけではないが、一般的には遺伝子の5'非コード領域中に見いだされる。
【０１０７】
本明細書にいう単離されたまたは精製されたポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物学的活性部分は、そのタンパク質が得られる細胞または組織に由来する細胞材料または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成される場合は化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まない。当業者が純度を評価するために使用する薄層クロマトグラフィー（TLC）、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの標準的分析方法で決定した場合に容易に検出できる不純物を調製物が含まないと思われるか、または調製物が十分に純粋であって、さらなる精製を行ってもその物質の物理的および化学的性質（例えば酵素活性および生物学的活性）が検出できるほどには変化しないであろう場合に、その調製物は不純物を実質的に含まないと決定することができる。実質的に化学的に純粋な化合物を製造するために化合物を精製する方法は、当業者に知られている。ただし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であることができる。そのような場合は、さらなる精製によって化合物の比活性が増加するかもしれない。
【０１０８】
したがって、実質的に精製されたポリペプチド、例えば実質的に精製された可溶性PH20への言及は、細胞材料を実質的に含まないタンパク質の調製物を指し、これには、タンパク質の調製物であって、そのタンパク質が、それを単離したまたは組換え生産した細胞の細胞構成要素から分離されているものが含まれる。ある実施形態において、細胞材料を実質的に含まないという用語には、約30％未満（乾燥重量で）の非酵素タンパク質（ここでは夾雑タンパク質ともいう）、一般的には約20％未満の非酵素タンパク質または約10％未満の非酵素タンパク質または約5％未満の非酵素タンパク質を有する酵素タンパクの調製物が含まれる。酵素タンパク質が組換え生産される場合、それは培養培地も実質的に含まない。すなわち培養培地は、酵素タンパク質調製物の体積の約20％、10％もしくは5％またはそれ未満に相当する。
【０１０９】
本明細書において使用する、化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まないという用語には、タンパク質がそのタンパク質の合成に関与した化学的前駆体または他の化学薬品から分離されている酵素タンパク質の調製物が含まれる。この用語には、化学的前駆体または非酵素化学薬品もしくは構成要素が約30％未満（乾燥重量で）、20％、10％、5％またはそれ以下である、酵素タンパク質の調製物が含まれる。
【０１１０】
本明細書において、例えば合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドなどに関していう合成とは、組換え法および/または化学合成法によって製造される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。
【０１１１】
本明細書において、組換え手段による生産または組換えDNA法を使った生産とは、クローン化されたDNAによってコードされるタンパク質を発現させるために、分子生物学の周知の方法を使用することを意味する。
【０１１２】
本明細書にいうベクター（またはプラスミド）は、異種核酸をその発現またはその複製を目的として細胞中に導入するために使用される不連続な要素を指す。ベクターは典型的には、エピソームであり続けるが、ゲノムの染色体への遺伝子またはその一部の組込みが達成されるように設計することもできる。酵母人工染色体および哺乳類人工染色体などの人工染色体であるベクターも考えられる。そのような媒体の選択と使用は当業者にはよく知られている。
【０１１３】
本明細書にいう発現ベクターには、当該DNAフラグメントを発現させることができるプロモーター領域などの調節配列に作動的に連結されたDNAを発現する能力を有するベクターが含まれる。そのような追加セグメントはプロモーター配列およびターミネーター配列を含むことができ、場合によっては、1つまたはそれ以上の複製起点、1つまたはそれ以上の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルを含むことができる。発現ベクターは一般にプラスミドまたはウイルスDNAから誘導されるか、または両方の要素を含有することができる。したがって、発現ベクターとは、適当な宿主細胞に導入された時にクローン化されたDNAの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターなどの組換えDNAまたはRNAコンストラクトを指す。適当な発現ベクターは当業者にはよく知られており、それらには、真核細胞および/または原核細胞中で複製可能なものや、エピソームであり続けるもの、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれるものが含まれる。
【０１１４】
本明細書にいうベクターには「ウイルスベクター」または「ウイルス系ベクター」も含まれる。ウイルス系ベクターは（媒体またはシャトルとして）細胞中に外来遺伝子を導入するためにそれら外来遺伝子に作動的に連結された改変ウイルスである。
【０１１５】
本明細書において、DNAセグメントに関して「作動可能に連結」または「作動的に連結」という場合、それは、複数のセグメントが、その意図された目的のために協調して機能するように、例えば転写がプロモーターの下流かつ転写されるどの配列よりも上流で開始するように、配置されていることを意味する。プロモーターは通常、転写装置がそこに結合して転写を開始し、コードセグメントに沿ってターミネーターまで進行するドメインである。
【０１１６】
本明細書において使用する用語「評価する」には、試料中に存在するタンパク質、例えば酵素、またはそのドメインの活性について絶対値を得るという意味での、そしてまた活性のレベルを示す指数、比、パーセンテージ、可視要素または他の値を得るという意味での、定量的および定性的決定が含まれるものとする。評価は直接的または間接的であることができる。例えば、実際に検出される化学種は、もちろん、酵素的切断生成物そのものである必要はなく、例えばその誘導体または他の何らかの物質であることができる。例えば、切断生成物の検出は、蛍光部分などの検出可能部分であることができる。
【０１１７】
本明細書にいう生物学的活性とは、化合物のインビボ活性、または化合物、組成物もしくは他の混合物をインビボ投与した時に起こる生理学的応答を指す。したがって生物学的活性には、そのような化合物、組成物および混合物の治療効果および薬理活性が包含される。生物学的活性は、そのような活性を試験または使用するために設計されたインビトロ系で観察することができる。したがって、本明細書に関して言えば、ヒアルロニダーゼ酵素の生物学的活性とは、その酵素によるヒアルロン酸の分解である。
【０１１８】
本明細書において、2つの核酸配列に関して、等価という場合、それは、問題の2つの配列が同じアミノ酸の配列または等価なタンパク質をコードすることを意味する。2つのタンパク質またはペプチドに関して等価という場合、それは、それら2つのタンパク質またはペプチドが実質的に同じアミノ酸配列を有し、アミノ酸置換はそのタンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に変化させないものだけであることを意味する。等価が性質を指す場合、その性質は同程度に存在する必要はない（例えば2つのペプチドは同じタイプの酵素活性を異なる速度で示すことができる）が、それらの活性は通常は実質的に同じである。
【０１１９】
本明細書にいう「調整する」および「調整」または「変化させる」は、タンパク質などの分子の活性の変化を指す。代表的な活性には、シグナル伝達などの生物学的活性があるが、これに限るわけではない。調整には、活性の増加（すなわちアップレギュレーションまたはアゴニスト活性）、活性の低下（すなわちダウンレギュレーションまたは阻害）または活性の他の任意の改変（例えば周期性、頻度、持続時間、反応速度または他のパラメータの変化）が含まれうる。調整は文脈に依存する場合があり、典型的には、調整は、指定された状態、例えば野生型タンパク質、構成的状態におけるタンパク質、または指定された細胞タイプもしくは条件において発現されるタンパク質と比較される。
【０１２０】
本明細書にいう組成物は任意の混合物を指す。それは、水性、非水性またはその任意の組合せである溶液、懸濁液、液体、粉末、ペーストであることができる。
【０１２１】
本明細書にいう組合せは、2つまたはそれ以上のアイテムの間の任意の関連を指す。組合せは、2つまたはそれ以上の別々のアイテム、例えば2つの組成物または2つの集合体であるか、それらの混合物、例えば、それら2つまたはそれ以上のアイテムの単一混合物であるか、それらの任意の変形であることができる。組合せの要素は、一般に、機能的に関連または類縁する。
【０１２２】
本明細書にいう「疾患または障害」は、感染、後天的状態、遺伝的状態（ただしこれらに限るわけではない）を含む原因または状態に起因し、同定可能な症状を特徴とする、ある生物における病理学的状態を指す。本明細書における目的の疾患および障害は、ヒアルロナン関連疾患および障害である。
【０１２３】
本明細書において、ある疾患または状態を有する対象を「処置する」とは、処置後に、その対象の症状が部分的にまたは完全に軽減されること、または静的状態を保っていることを意味する。したがって、処置は、予防、治療および/または治癒を包含する。予防とは、潜在的疾患の防止および/または疾患の症状の悪化または疾患の進行の防止を指す。
【０１２４】
本明細書にいう医薬有効剤には、任意の治療剤または生物活性剤、例えば限定するわけではないが、化学療法剤、麻酔薬、血管収縮薬、分散剤、従来の治療薬（小分子薬および治療用タンパク質を含む）が含まれる。
【０１２５】
本明細書にいう処置は、ある状態、障害もしくは疾患または他の適応の症状を、緩和するか、他の有益な形で変化させる、任意の方法を意味する。
【０１２６】
本明細書にいう治療効果は、疾患または状態の症状を変化（典型的には、改善または緩和）させるか、疾患または状態を治癒させる、対象の処置に起因する効果を意味する。治療有効量とは、対象への投与後に治療効果をもたらす、組成物、分子または化合物の量を指す。
【０１２７】
本明細書において使用する「対象」という用語は、ヒトなどの哺乳動物を含む動物を指す。
【０１２８】
本明細書にいう患者は、疾患または障害の症状を示すヒト対象を指す。
【０１２９】
本明細書にいう、ほぼ同じとは、当業者が同じであるとみなすかまたは許容できる誤差範囲内にあるとみなすであろう量を意味する。例えば、典型的には、医薬組成物の場合、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％または10％以内であれば、ほぼ同じとみなされる。そのような量は、特定組成物の変動に対する対象の認容性に依存して変動しうる。
【０１３０】
本明細書にいう投与レジームは、作用剤、例えば可溶性ヒアルロニダーゼなどの抗ヒアルロナン剤を含有する組成物、または他の作用剤の投与量と、投与の頻度を指す。投与レジームは、処置される疾患または状態に依存し、それゆえに変動しうる。
【０１３１】
本明細書にいう投与の頻度は、連続的な処置投与の時間間隔を指す。例えば、頻度は数日、数週間または数ヶ月であることができる。例えば頻度は、週に1回を超える頻度、例えば週に2回、週に3回、週に4回、週に5回、週に6回または毎日であることができる。頻度は1、2、3または4週間であることもできる。特定の頻度は、処置される特定の疾患または状態に依存する。一般に頻度は週に1回を上回り、一般的には週に2回である。
【０１３２】
本明細書にいう「投与のサイクル」は、連続投与に際して繰り返される、酵素および/または第2作用剤の投与の、投与レジームの反復スケジュールを指す。例えば、例示的な投与のサイクルは、週に2回、3週間にわたる投与に続いて1週間の投与中断を行う、28日サイクルである。
【０１３３】
本明細書において、対象1kgあたりのmg数に基づく投薬量に関して、平均ヒト対象は約70kg〜75kg、例えば70kgの重さを有するとみなされる。
【０１３４】
本明細書において、処置による、例えば医薬組成物または他の治療薬の投与による、特定の疾患または障害の症状の緩和とは、永続的であるか一時的であるか、持続するか一過性であるかを問わず、症状の、または状態の有害作用の、任意の減少、例えばPEG化ヒアルロニダーゼなどの抗ヒアルロナン剤の投与に関連する、またはその投与時に起きる有害作用の低減などを指す。
【０１３５】
本明細書にいう防止または予防は、疾患または状態が発生するリスクの低下を指す。
【０１３６】
本明細書にいう「治療有効量」または「治療有効用量」は、少なくとも、治療効果をもたらすのに十分な、作用剤、化合物、材料、または化合物を含有する組成物の量を指す。したがってこれは、疾患または障害の症状を防止し、治癒させ、緩和し、抑止し、または部分的に抑止するのに必要な量である。
【０１３７】
本明細書にいう単位用量型は、当技術分野において知られているように、ヒトおよび動物対象に適し、個別に包装された、物理的に不連続な単位を指す。
【０１３８】
本明細書にいう1回量製剤は、単回量（unit dose）としての製剤を指す。
【０１３９】
本明細書にいう直接投与用の製剤とは、その組成物が、投与のためのさらなる希釈を必要としないことを意味する。
【０１４０】
本明細書にいう「製品」は、製造され、販売される物品である。本願の全体にわたって使用されるこの用語は、包装物に包まれている、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素、および第2作用剤組成物を包含するものとする。例えば第2作用剤はコルチコステロイドである。
【０１４１】
本明細書にいう流体は、流動しうる任意の組成物を指す。したがって流体は、半固形、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよび他のそのような組成物の形態をとる組成物を包含する。
【０１４２】
本明細書にいう組合せ、例えばここに提供される組成物の組合せは、その組合せの要素の関連を指す。
【０１４３】
本明細書にいう「キット」は、本明細書に記載する組成物と、もう一つのアイテム、例えば限定するわけではないが再構成、活性化などを目的とするものと、送達、投与、診断および生物学的活性または性質の評価のための機器/器具との組合せなどといった、構成要素の組合せを指す。キットは、場合によっては、使用説明書を含む。
【０１４４】
本明細書にいう細胞抽出物または細胞溶解物とは、溶解または破壊された細胞でできた調製物または画分を指す。
【０１４５】
本明細書にいう動物には、任意の動物、例えば限定するわけではないが、ヒト、ゴリラおよびサルを含む霊長類；マウスおよびラットなどの齧歯類；ニワトリなどの家禽；ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジなどの反芻動物；ブタおよび他の動物が含まれる。非ヒト動物には、想定される動物としてヒトは含まれない。ここに提供されるヒアルロニダーゼは、任意の供給源、動物、植物、原核生物および真菌に由来する。大半の酵素は動物由来（哺乳動物由来を含む）である。一般にヒアルロニダーゼはヒト由来である。
【０１４６】
本明細書にいう抗がん処置には、がんを処置するための薬物および他の作用剤の投与が含まれ、外科手術および放射線などの処置プロトコールも含まれる。抗がん処置には、抗がん剤の投与が含まれる。
【０１４７】
本明細書にいう抗がん剤は、抗がん処置に使用される任意の作用剤、または化合物を指す。それらには、単独でまたは他の化合物と組み合わせて使用した場合に、腫瘍およびがんに関連する臨床症状または診断マーカーを軽減、低減、緩和、防止、またはその寛解状態をもたらすもしくは維持することができ、ここに提供される組合せおよび組成物において使用することができる、任意の作用剤が含まれる。例示的抗がん剤には、単独で、もしくは組み合わせて使用され、かつ/または化学療法剤、ポリペプチド、抗体、ペプチド、小分子または遺伝子治療ベクター、ウイルスもしくはDNAなどの他の抗がん剤と組み合わせて使用される、抗ヒアルロナン剤、例えばここに提供されるPEG化ヒアルロナン分解酵素が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１４８】
本明細書にいう対照は、それが試験パラメータで処理されていない点を除けば、またはそれが血漿試料であるなら、それが目的の状態に冒されていない正常ボランティアに由来しうる点を除けば、試験試料と実質的に同一である試料を指す。対照は内部対照であることもできる。
【０１４９】
本明細書において使用する「ある」「一つの」および「その」という単数形には、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示物が含まれる。したがって、例えば「（ある）細胞外ドメイン」を含むまたは含有する化合物への言及は、1つまたは複数の細胞外ドメインを有する化合物を包含する。
【０１５０】
本明細書において、範囲および量は、特定の値または範囲の「前後（または約）」と表現する場合がある。この「前後（または約）」には、その量そのものも含まれる。したがって「5塩基前後（約5塩基）」は「5塩基前後（約5塩基）」を意味すると共に「5塩基」も意味する。
【０１５１】
本明細書にいう「随意の」（optional）または「場合によっては」（optionally）は、それに続けて述べられる事象または状況が起こることまたは起こらないこと、およびその説明には、該事象または状況が起こる場合と起こらない場合とが含まれることを意味する。例えば、場合によっては置換されている基とは、その基が無置換であるか、または置換されていることを意味する。
【０１５２】
本明細書において使用する、任意の保護基、アミノ酸および他の化合物の略号は、別段の表示がある場合を除き、その一般的使用法、広く認識されている略号、またはIUPAC-IUB生化学命名委員会（(1972) Biochemistry 11:1726参照）に従う。
【０１５３】
B．概観
1．抗ヒアルロナン剤、ならびにヒアルロナンに関連する疾患、状態および/または障害
炎症性疾患やがんなど、一定の疾患は、ヒアルロナンの発現および/または生産に関連する。HAは、そのような疾患の進行に関わるさまざまな生物学的過程に関連づけられている（例えばItanoら (2008) Semin Cancer Biol 18(4):268-274；Tammiら (2008) Semin Cancer Biol 18(4):288-295参照）。例えばHAは、上皮間葉移行およびp53腫瘍抑制因子経路などといった、腫瘍進行に関連する生物学的過程に関連づけられている。また、HAは、腫瘍などの疾患組織における水分摂取および間質液圧（IFP）の増加にも関与し、それによって圧迫された腫瘍脈管構造をもたらす。例えば、炎症の部位または腫瘍病巣では、ヒアルロナンその他のマトリックス構成要素および水が迅速に蓄積する。この迅速な蓄積ゆえに、疾患部位はその環境との平衡状態に達することができず、それゆえに正常組織より高い間質液圧を有することになる。
【０１５４】
抗ヒアルロナン剤は、ヒアルロン酸の合成を妨害するか、ヒアルロン酸の分解を増加させることによって、ヒアルロン酸（HA；本明細書ではヒアルロナンともいう）レベルを低減する。例えば、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロン酸（HA）を妨害し、分解する。ヒアルロナンを分解するかヒアルロナン合成を阻害する作用剤、例えばヒアルロナン分解酵素による処置は、ヒアルロナンを低減するので、組織は収縮し、血管は拡張し、より多くの血液がその部位を流れることが可能になる。
【０１５５】
加えて、HAの蓄積を伴う大半の固形腫瘍および他の疾患組織では、IFPが上昇していて、効率のよい薬物送達にとって障壁になる（Heldinら (2004) Nat Rev Cancer 4(10):806-813）。したがって、ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤は、組織部位におけるIFPおよび含水量を減少させ、それに伴って血管灌流量を増加させることに加えて、同時投与された治療薬の活性を強化することもできる。例えば、ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤は、腫瘍への化学療法剤の送達を強化することができる。
【０１５６】
したがって、ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤は、ヒアルロナン（ヒアルロン酸、HA）の蓄積を示す疾患および状態の単剤療法または併用療法にとって有用な性質を示す。ヒアルロナンが関連する疾患、状態および/または障害には、がんおよび炎症性疾患が含まれる。高ヒアルロナンがんには、固形腫瘍を含む腫瘍、例えば末期がん、転移がん、未分化がん、卵巣がん、上皮内癌（ISC）、扁平上皮細胞癌（SCC）、前立腺がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、大腸がんおよび他のがんが含まれるが、これらに限るわけではない。ヒアルロニダーゼは、腫瘍からHAを除去し、その結果として、腫瘍体積の低減、腫瘍内間質圧の低減、腫瘍細胞増殖の緩徐化をもたらし、共投与された化学療法薬および生物学的作用剤の効力を、腫瘍浸透の増加を可能にすることによって強化することが示されている（例えば米国特許出願公開第20100003238号およびPCT国際出願公開WO2009/128917参照）。
【０１５７】
PEG化は、身体における治療用タンパク質の半減期を増加させ、よって全身処置プロトコールにおけるそれらの使用を可能にするために使用される、確立された技術である。ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼのPEG化は、身体におけるその半減期を1分未満からおよそ48〜72時間へと延ばし、HAに富む腫瘍の全身処置を可能にする（例えば米国特許出願公開第20100003238号およびPCT出願国際公開番号WO2009/128917参照）。非PEG化ヒアルロニダーゼと比較して増加した半減期は、HAの除去を可能にするばかりでなく、血漿におけるその継続的存在およびそのHA分解能力ゆえに、腫瘍などの疾患組織内でのHAの再生の程度を低減しまたは低下させる。血漿中酵素レベルの維持は、腫瘍HAなどのHAを除去すると共に、HA再合成に対抗することもできる。
【０１５８】
2．抗ヒアルロナン剤による処置に関連する有害作用
抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の使用が副作用を伴うという知見が得られたことは、今までなかった。にもかかわらず、本明細書において述べるように、ヒトを含むいくつかの種は、PEG化ヒアルロニダーゼの投与後に、筋骨格副作用を発症することが、前臨床試験でも臨床試験でも観察された（以下に説明し、実施例6〜7でも述べる）。筋骨格副作用には、こわばり、筋・関節痛、ならびに膝関節および肘関節における可動域の減少が含まれた。
【０１５９】
0.05mg/kgのPEGPH20の単回静脈内投与を受けたヒトは、投与のおよそ6時間後に有害筋骨格症状を顕在化させた。有害作用には、以下に挙げる作用の1つ以上が含まれた：筋・関節痛/上肢および下肢のこわばり、痙攣、筋、筋炎、全身の筋痛および圧痛、脱力および疲労。症状は、有害事象共通用語規準（CTCAE）尺度でグレード3に達すると観察された。有害作用は、処置を中断すれば、数日かけて解消された。実施例6はさらに、さまざまな投薬レジーム、用量および投与頻度で、PEGPH20で処置されたヒト患者の試料に生じる有害事象を例示している。筋骨格事象の重症度は、PEGPH20の用量と投与頻度の組合せによって左右されるようである。例えば、PEGPH20の用量が高いほど、また投与スケジュールが頻繁であるほど、症状は重症であるように見える。
【０１６０】
PEGPH20の投与を受けたサルは、活動性低下、嗜眠、失見当識、背弯姿勢および肢関節角度の低下を示した。PEGPH20で週2回のIV投与を4週間行うと、膝関節および肘関節における可動域の低下が起こった。投与を中断した後に、部分的ないし完全な回復が観察された。
【０１６１】
0.08mg/kgのPEGPH20または0.3mg/kgのPEGPH20の単回投与を受けたビーグル犬は、翌日に、歩行能力の低減、起立困難、活動性の低下、ならびに首、背中および四肢の筋の緊張を示した。投与の中断後4日目までに動物は完全に回復した。
【０１６２】
3．抗ヒアルロナン剤の有害作用を緩和するためのコルチコステロイドの使用
抗ヒアルロナン剤による処置または抗ヒアルロナン剤の投与に関連する筋骨格副作用などの有害作用を、コルチコステロイドの前投薬または共投薬によって、緩和または防止するための方法および使用が、ここに提供される。例えば、本明細書において示すとおり、PEG化ヒアルロニダーゼの全身投与で観察される筋骨格副作用は、コルチコステロイド（例えばデキサメタゾンなどのグルココルチコイド）の前投薬および/または共投薬によって、緩和および/または排除することができる。その結果、より高いPEGPH20用量と投与頻度の組合せの認容性が改善される。したがって、本明細書において述べるとおり、ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するための単独療法または併用療法PH20処置に関連する有害事象を、コルチコステロイドの存在下で達成することができる。
【０１６３】
したがって、ヒアルロナンの蓄積を示す疾患および状態の単剤療法または併用療法のためのPEG化ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤の使用に関連する有害作用を緩和するための方法が、ここに提供される。この方法では、PEG化ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤による処置の有害筋骨格副作用を緩和するために、コルチコステロイド、例えばグルココルチコイドを使用する。いくつかの例では有害副作用が低減される。別の例では、有害副作用が排除される。コルチコステロイドは、典型的には経口投与されるが、任意のコルチコステロイド投与方法が考えられる。典型的には、グルココルチコイドが、1回あたり、0.4〜20mgまたはその前後、例えば0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.75mg、0.8mg、0.9mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mgもしくは20mgまたはその前後の量で投与される。
【０１６４】
コルチコステロイドは、PEG化ヒアルロニダーゼなどの抗ヒアルロナン剤の前または後に投与するか、抗ヒアルロナン剤と同時に投与することができる。いくつかの例では、コルチコステロイドが、PEG化ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤の投与に先だって投与される。例えば、コルチコステロイドは、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）の投与の0.5分前、1分前、2分前、3分前、4分前、5分前、6分前、7分前、8分前、9分前、10分前、15分前、20分前、25分前、30分前、45分前、1時間前、2時間前、3時間前、4時間前、5時間前、6時間前、7時間前、8時間前、9時間前、10時間前、11時間前、12時間前、18時間前、24時間前、36時間前またはその前後もしくはそれ以上前までに投与することができる。別の例では、コルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）の投与と同時に投与される。この例では、コルチコステロイドを抗ヒアルロナン剤と別々にまたは一緒に投与することができる。典型的には、コルチコステロイドは、抗ヒアルロナン剤とは別個に投与される。別の例では、コルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）の投与後に投与される。例えば、コルチコステロイドは、PEG化ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤の投与の0.5分後、1分後、2分後、3分後、4分後、5分後、6分後、7分後、8分後、9分後、10分後、15分後、20分後、25分後、30分後、45分後、1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後、6時間後、7時間後、8時間後、9時間後、10時間後、11時間後、12時間後、18時間後、24時間後、36時間後またはその前後もしくはそれ以上後までに投与することができる。
【０１６５】
いくつかの例では、ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するために抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）が単独で投与される投与レジメンにおいて、コルチコステロイドが使用される。別の例では、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）が、疾患または障害を処置するための1つ以上の追加作用剤および/または処置、例えばがんを処置するための化学療法剤、抗体、ベクターまたは核酸などといった抗がん剤と組み合わせて投与される投与レジメンにおいて、コルチコステロイドが使用される。この例では、第2の処置または作用剤を、抗ヒアルロナン剤と別個にまたは一緒に投与することができる。例えば、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素または他の修飾ヒアルロナン分解酵素）は、追加の作用剤または処置の前または後に投与されるか、追加の作用剤または処置と共に投与される。したがって抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素、特にPEG化可溶性ヒアルロニダーゼなどの修飾ヒアルロナン分解酵素は、治療剤として、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与することができる。
【０１６６】
C．抗ヒアルロナン剤
HAは、ヒアルロン酸、ヒアルロネートまたはヒアルロナンとも呼ばれ、反復二糖単位（D-グルクロン酸にβ1,4結合したβ1,3N-アセチル-D-グルコサミン）を含有する高分子量線状グリコサミノグリカンである。ヒアルロナンは結合組織、上皮組織および神経組織の至るところに広く分布している。これは、神経外マトリックスの主要構成要素および間質障壁の構成成分でもある。例えば軟骨の細胞外マトリックスは少量のHAを含有する。HAは、発生時の組織リモデリングおよび正常組織ホメオスタシスにおいて役割を果たし、おそらく細胞の接着および移動にも関与する。HAは関節内の生物学的潤滑剤としても機能し、運動時と静止状態のどちらにおいても重要である（例えばEngstrom-Laurent (1997) J. Intern. Med., 242:57-60；Jiangら (2007) Ann. Rev. Cell Dev. Biol., 23:435-61参照）。HAは、それ自体、疾患を調整するために、例えば関節疾患の処置において、眼科手術器具、または創傷治癒において使用することができる。
【０１６７】
HAは疾患にも関与する。ヒアルロナンの代謝、分布および機能の改変などによるHA蓄積は、関節炎、免疫障害および炎症性障害、肺疾患および血管疾患、ならびにがんに関連する（Morohashiら (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345:1454-1459）。そのような疾患は、HA合成を阻害するかHAを分解することによって処置することができる（例えばMorohashi 2006；米国特許出願公開第20100003238号およびPCT出願国際公開番号WO2009/128917参照）。例えば、ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤は、腫瘍およびがんまたは炎症性の疾患もしくは状態を含む、ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するために使用することができる。本明細書において開示するように、細胞および組織上のヒアルロナンレベルを低減するそのような処置は、筋骨格副作用などの有害副作用を伴いうる。ここで述べるように、これらの有害作用は、コルチコステロイドによる前処置または共処置によって軽減または緩和することができる。
【０１６８】
したがってコルチコステロイドは、疾患状態におけるHAの蓄積または上昇を阻害、分解または低減する任意の作用剤の筋骨格副作用などの有害副作用を低減するための方法において使用することができる。そのような作用剤は当業者に知られているか、または同定することができる。例えば、HAの合成または分解に対する作用剤の効果（用量および投与経路の作用を含む）は、当業者に知られているさまざまなアッセイ、例えば限定するわけではないが、本明細書に記載するものまたは当技術分野において知られているもの、例えばヒアルロナン分解を測定するインビトロアッセイ（例えばFrostおよびStern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269参照）、組織または他の試料を、例えばHA結合タンパク質または他の抗HA試薬を使って、HAに関して染色すること（例えばNishidaら (1999) J. Biol. Chem., 274:21893-21899参照）、粒子排除アッセイ（Nishidaら 1999；Morohashiら (2006) Biochem Biophys. Res. Comm., 345:1454-1459）；has遺伝子に関してHAS mRNA発現を測定または評価すること（Nishidaら 1999）などにおいて、評価することができる。そのような抗ヒアルロナン剤の代表例は、ヒアルロナン合成を阻害するかヒアルロナンを分解する作用剤である。
【０１６９】
1．ヒアルロナン合成を阻害する作用剤
HAは、has-1、has-2およびhas-3と呼ばれる、HAシンターゼと同定された3つの類縁哺乳動物遺伝子の産物である、3つの酵素によって合成されうる。異なる細胞タイプは異なるHAS酵素を発現し、HAS mRNAの発現はHA生合成と相関する。腫瘍細胞におけるHAS遺伝子のサイレンシングは腫瘍の成長と転移を阻害することが知られている。抗ヒアルロナン剤には、HAシンターゼの発現またはレベルを阻害し、低減しまたはダウンレギュレートする任意の作用剤が含まれる。そのような作用剤は当業者に知られているか、同定することができる。
【０１７０】
例えば、HASのダウンレギュレーションは、HASをコードする1つ以上の核酸分子と特異的にハイブリダイズするか、他の形で相互作用するオリゴヌクレオチドを提供することによって達成することができる。例えば、ヒアルロナン合成を阻害する抗ヒアルロナン剤には、has遺伝子に対するアンチセンス分子またはセンス分子が含まれる。そのようなアンチセンス阻害またはセンス阻害は、典型的には、少なくとも1つの鎖またはセグメントが切断、分解その他の形で作動不能になるような、オリゴヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチドセグメントの水素結合ベースのハイブリダイゼーションに基づく。別の例では、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）、RNAi、リボザイムおよびDNAザイムを使用することができる。HAS1（配列番号195に示す）、HAS2（配列番号196に示す）またはHAS3（配列番号197または198に示す）の配列に基づくそのようなコンストラクトを作製することは、当業者の技術水準内にある。アンチセンス化合物またはセンス化合物の配列が、特異的にハイブリダイズできるそのターゲット核酸に対して100％相補的である必要はないことは、当技術分野では理解されている。さらにまた、オリゴヌクレオチドは、介在セグメントまたは隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないような形（例えばループ構造またはヘアピン構造）で、1つまたはそれ以上のセグメントにハイブリダイズすることもできる。一般に、アンチセンス化合物またはセンス化合物は、ターゲット核酸内のターゲット領域に対して少なくとも70％の配列相同性、例えば75％〜100％、例えば75％、80％、85％、90％、95％または100％の相補性を有する。例示的センス分子またはアンチセンス分子は当技術分野において知られている（例えばChaoら (2005) J. Biol. Chem., 280:27513-27522；Simpsonら (2002) J. Biol. Chem., 277:10050-10057；Simpsonら (2002) Am. J Path., 161:849；Nishidaら (1999) J. Biol. Chem., 274:21893-21899；Edwardら (2010) British J Dermatology, 162:1224-1232；Udabageら (2005) Cancer Res., 65:6139；および米国特許出願公開第20070286856号参照）。
【０１７１】
HA合成阻害剤であるもう一つの例示的抗ヒアルロナン剤は、4-メチルウンベリフェロン（4-MU；7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン）またはその誘導体である。4-MUは、HA合成に必要なUDP-GlcUA前駆体プールを低減することによって作用する。例えば哺乳動物細胞では、HAが、HASにより、UDP-グルクロン酸（UGA）前駆体とUDP-N-アセチル-D-グルコサミン前駆体を使って合成される。4-MUは、UGAが生成する過程を妨害し、よってUGAの細胞内プールを枯渇させ、HA合成の阻害をもたらす。4-MUは抗腫瘍活性を有することが知られている（例えばLokeshwarら (2010) Cancer Res., 70:2613-23；Nakazawaら (2006) Cancer Chemother. Pharmacol., 57:165-170；Morohashiら (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345-1454-1459参照）。B16黒色腫モデルでは、600mg/kg/日の4-MUの経口投与が転移を64％低減する（Yoshiharaら (2005) FEBS Lett., 579:2722-6）。4-MUの構造を以下に示す。4-MUの誘導体、特に6,7-ジヒドロキシ-4-メチルクマリンおよび5,7-ジヒドロキシ-4-メチルクマリンも、抗がん活性を示す（例えばMorohashiら (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345-1454-1459参照）。
4-メチルウンベリフェロン（4-MU；C10H8O3）
【化１】
2013540103.tif 000004
【０１７２】
さらなる例示的抗ヒアルロナン剤は、レフルノミド（Arava）、ゲニステインまたはエルブスタチンなどのチロシンキナーゼ阻害剤である。レフルノミドはピリミジン合成阻害剤でもある。レフルノミドは、関節リウマチ（RA）を処置するための公知薬物であり、同種移植片ならびに異種移植片の拒絶を処置するのにも有効である。HAは、HAの直接的または間接的一因になることが知られている（例えばStuhlmeier (2005) J Immunol., 174:7376-7382参照）。チロシンキナーゼ阻害剤はHAS1遺伝子発現を阻害する（Stuhlmeier 2005）。
【０１７３】
2．ヒアルロナン分解酵素
抗ヒアルロナン剤にはヒアルロナン分解酵素が含まれる。ヒアルロナンは細胞外マトリックスの必須構成要素であり、間質障壁の主要構成成分である。ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンの加水分解を触媒することにより、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それによって組織透過性を増加させ、非経口投与された流体の吸収速度を増加させる。そこで、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、例えば、他の作用剤、薬物およびタンパク質と一緒に、それらの分散および送達を強化するために、展着剤（spreading agent）または分散剤（dispersing agent）として使用されてきた。
【０１７４】
ヒアルロナン分解酵素は、交互にβ-1→4グリコシド結合とβ-1→3グリコシド結合で連結された繰返し二糖単位D-グルクロン酸（GlcA）およびN-アセチル-D-グルコサミン（GlcNAc）で構成されるヒアルロナンポリマーを切断することによって、ヒアルロナンを分解するように作用する。ヒアルロナン鎖は、約25,000二糖リピートまたはそれ以上の長さに達することができ、ヒアルロナンのポリマーはサイズがインビボで約5,000Daから20,000,000Daに及びうる。したがって、ここに提供する使用および方法のためのヒアルロナン分解酵素には、ヒアルロナン二糖鎖またはヒアルロナンポリマーの切断を触媒する能力を有する任意の酵素が含まれる。いくつかの例では、ヒアルロナン分解酵素がヒアルロナン鎖またはヒアルロナンポリマー中のβ-1→4グリコシド結合を切断する。別の例では、ヒアルロナン分解酵素がヒアルロナン鎖またはヒアルロナンポリマー中のβ-1→3グリコシド結合の切断を触媒する。
【０１７５】
したがって、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、細胞外マトリックスの必須構成要素であり間質障壁の主要構成成分であるヒアルロン酸を分解する酵素のファミリーである。ヒアルロナン分解酵素は、間質障壁の主要構成成分であるヒアルロン酸の加水分解を触媒することにより、ヒアルロン酸の粘度を低下させ、それによって組織透過性を増加させる。そこで、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、例えば、他の作用剤、薬物およびタンパク質と一緒に、それらの分散および送達を強化するために、展着剤または分散剤として使用されてきた。ヒアルロナン分解酵素は、他の注射薬の吸収および分散を増加させるためのアジュバントとして皮下注入（皮下流体投与）にも使用され、また放射線不透過剤の再吸収を改善するために、皮下尿路造影法における補助剤としても使用されている。ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼは、例えば眼科外科手術に先立つ局所麻酔における眼球周囲ブロックおよびテノン嚢下ブロックなど、眼科術の適用において使用することができる。ヒアルロニダーゼは、例えば眼瞼形成術やフェイスリフトなどの美容外科における瞬目麻酔を促進することなどにより、他の治療的および美容的使用にも、使用することができる。
【０１７６】
ヒアルロニダーゼを含むさまざまな形態のヒアルロナン分解酵素が調製され、ヒトを含む対象における治療的使用について承認されている。ここに提供される組成物および方法は、これらおよび他の治療的使用により、ヒアルロナン関連疾患および状態を処置するために使用することができる。例えば、動物由来のヒアルロニダーゼ調製物には、精製ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼであるVitrase（登録商標）（ISTA Pharmaceuticals）、ウシ精巣ヒアルロニダーゼであるAmphadase（登録商標）（Amphastar Pharmaceuticals）、およびウシ精巣ヒアルロニダーゼであるHydase（商標）（Prima Pharm Inc.）が含まれる。ここに提供される方法および使用には任意の動物由来ヒアルロニダーゼ調製物を使用することができると理解される（例えば米国特許第2,488,564号、同第2,488,565号、同第2,676,139号、同第2,795,529号、同第2,806,815号、同第2,808,362号、同第5,747,027号および同第5,827,721号ならびにPCT国際出願WO2005/118799参照）。Hylenex（登録商標）（Halozyme Therapeutics）は、rHuPH20と呼ばれる可溶型のPH20をコードする核酸を含有する遺伝子改変チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞によって生産されるヒト組換えヒアルロニダーゼである。
【０１７７】
ここに提供される組成物および方法におけるヒアルロナン分解酵素の代表例は可溶性ヒアルロニダーゼである。他の例示的ヒアルロナン分解酵素には、ヒアルロナンを切断する能力を有する特定のコンドロイチナーゼおよびリアーゼが含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１７８】
以下に述べるように、ヒアルロナン分解酵素は膜結合型として、または細胞から分泌される可溶型として存在する。ここでの目的には、本明細書に記載する方法、使用、組成物または組合せにおいて使用するために、可溶性ヒアルロナン分解酵素が提供される。したがって、ヒアルロナン分解酵素にグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーが含まれる場合、および/またはヒアルロナン分解酵素が他の何らかの膜アンカー型または不溶性である場合、そのようなヒアルロナン分解酵素は、ここでは、その酵素を分泌型かつ可溶性にするためのGPIアンカーのトランケーションまたは欠失により、可溶型で提供される。したがってヒアルロナン分解酵素には、トランケート変異体、例えばGPIアンカーの全部または一部が除去されるようにトランケートされたものが含まれる。ここに提供されるヒアルロナン分解酵素には、可溶性ヒアルロナン分解酵素のアレル変異体もしくは種変異体または他の変異体も含まれる。例えば、ヒアルロナン分解酵素は、その一次配列に、アミノ酸の置換、付加および/または欠失などといった1つ以上の変異を含有することができる。ヒアルロナン分解酵素の変異体は、一般に、変異を含有しないヒアルロナン分解酵素と比較して、少なくとも60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはその前後もしくはそれ以上の配列同一性を示す。ここでの目的には、酵素がヒアルロニダーゼ活性を保持している限り、例えば（当技術分野においてよく知られており、本明細書にも記載する、インビトロおよび/またはインビボアッセイでの測定で）変異を含有しないヒアルロナン分解酵素の活性の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％またはその前後もしくはそれ以上を保持している限り、ヒアルロナン分解酵素には任意の変異を含めることができる。
【０１７９】
ここに提供される方法および使用が、可溶性ヒアルロニダーゼの使用について述べる場合は、それに応じて任意のヒアルロナン分解酵素、一般的には可溶性ヒアルロナン分解酵素を使用することができる。ここに提供される方法および使用では、任意のヒアルロニダーゼを使用することができると理解される（例えば米国特許第7,767,429号ならびに米国公開番号US20040268425および同US20100143457）。
【０１８０】
a．ヒアルロニダーゼ
ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナン分解酵素の大きなファミリーのメンバーである。ヒアルロニダーゼには3つの一般クラス、すなわち哺乳動物型ヒアルロニダーゼ、細菌ヒアルロニダーゼ、ならびにヒル、他の寄生虫、および甲殻類に由来するヒアルロニダーゼがある。ここに提供される組成物、組合せおよび方法では、そのような酵素を使用することができる。
【０１８１】
i．哺乳動物型ヒアルロニダーゼ
哺乳動物型ヒアルロニダーゼ（EC3.2.1.35）は、ヒアルロナンのβ1→4グリコシド結合を例えば四糖および六糖などのさまざまなオリゴ糖長に加水分解するエンド-β-N-アセチル-ヘキソサミニダーゼである。これらの酵素は加水分解活性とトランスグリコシダーゼ活性の両方を有し、ヒアルロナンおよびコンドロイチン硫酸（CS）、一般的にはC4-SおよびC6-Sを分解することができる。このタイプのヒアルロニダーゼには、例えばウシ（ウシ属）（配列番号10、11および64ならびにBH55（米国特許第5,747,027号および同第5,827,721号）、配列番号190〜192に示す核酸分子）、ヒツジ（Ovis aries）（配列番号26、27、63および65、配列番号66および193〜194に示す核酸分子）、イエロージャケット・スズメバチ（配列番号12および13）、ミツバチ（配列番号14）、ホワイトフェイス・スズメバチ（配列番号15）、アシナガバチ（配列番号16）、マウス（配列番号17〜19、32）、ブタ（配列番号20〜21）、ラット（配列番号22〜24、31）、ウサギ（配列番号25）、オランウータン（配列番号28）、カニクイザル（配列番号29）、モルモット（配列番号30）、チンパンジー（配列番号101）、アカゲザル（配列番号102）に由来するヒアルロニダーゼ、およびヒトヒアルロニダーゼ（配列番号1〜2、36〜39）が含まれるが、これらに限るわけではない。ここに提供される組成物、組合せおよび方法におけるヒアルロニダーゼの代表例は、可溶性ヒアルロニダーゼである。
【０１８２】
哺乳動物ヒアルロニダーゼは、主に精巣抽出物に見いだされる中性活性であるものと、主に肝臓などの臓器に見いだされる酸性活性であるものとに、さらに細分することができる。例示的中性活性ヒアルロニダーゼにはPH20が含まれ、これにはヒツジ（配列番号27、63および65）、ウシ（配列番号11および64）およびヒト（配列番号1）などのさまざまな種に由来するPH20が含まれるが、これらに限るわけではない。ヒトPH20（SPAM1または精子表面タンパク質PH20とも呼ばれる）は、一般に、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーを介して形質膜に取り付けられる。これは本来、精子-卵子接着に関与し、ヒアルロン酸を消化することにより、精子が卵丘細胞の層に浸透するのを助ける。
【０１８３】
ヒトゲノムには、ヒトPH20（SPAM1とも呼ばれる）の他に、5つのヒアルロニダーゼ様遺伝子、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4およびHYALP1が同定されている。HYALP1は偽遺伝子であり、HYAL3（配列番号38）は既知のどの基質に対しても酵素活性を有することが示されていない。HYAL4（配列番号39に示す前駆体ポリペプチド）はコンドロイチナーゼであり、ヒアルロン酸に対してはほとんど活性を示さない。HYAL1（配列番号36に示す前駆体ポリペプチド）はプロトタイプの酸性活性酵素であり、PH20（配列番号1に示す前駆体ポリペプチド）はプロトタイプの中性活性酵素である。HYAL1およびHYAL2（配列番号37に示す前駆体ポリペプチド）などの酸性活性ヒアルロニダーゼは、一般に、中性pH（すなわちpH7）における触媒活性を欠いている。例えばHYAL1はpH4.5を上回るとインビトロで触媒活性をほとんど有さない（Frostら (1997) Anal Biochemistry 251:263-269）。HYAL2はインビトロで極めて低い比活性を有する酸性活性酵素である。ヒアルロニダーゼ様酵素は、一般にグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーによって形質膜に取り付けられるもの、例えばヒトHYAL2およびヒトPH20（Danilkovitch-Miagkovaら (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-5）と、一般に可溶性であるもの、例えばヒトHYAL1（Frostら (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5）とによって特徴づけることもできる。
【０１８４】
PH20
PH20は、他の哺乳類ヒアルロニダーゼと同様に、ヒアルロン酸のβ1→4グリコシド結合を例えば四糖および六糖などのさまざまなオリゴ糖長に加水分解するエンド-β-N-アセチル-ヘキソサミニダーゼである。これらは加水分解活性とトランスグリコシダーゼ活性の両方を有し、ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸、例えばC4-SおよびC6-Sを分解することができる。PH20は、本来、精子-卵子接着に関与し、ヒアルロン酸を消化することにより、精子が卵丘細胞の層に浸透するのを助ける。PH20は精子表面上およびリソソーム由来の先体中（この場合は先体内膜に結合している）に位置する。形質膜PH20が中性pHでしかヒアルロニダーゼ活性を有さないのに対して、先体内膜PH20は中性pHでも酸性pHでも活性を有する。PH20はヒアルロニダーゼであるだけでなく、HAが誘発する細胞シグナリングの受容体、および卵母細胞を取り囲む透明帯の受容体でもあるらしい。
【０１８５】
例示的PH20タンパク質には、ヒト（配列番号1に示す前駆体ポリペプチド、配列番号2に示す成熟ポリペプチド）、チンパンジー（配列番号101）、アカゲザル（配列番号102）、ウシ（配列番号11および64）、ウサギ（配列番号25）、ヒツジPH20（配列番号27、63および65）、カニクイザル（配列番号29）、モルモット（配列番号30）、ラット（配列番号31）およびマウス（配列番号32）PH20ポリペプチドが含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１８６】
ウシPH20は553アミノ酸の前駆体ポリペプチド（配列番号11）である。ウシPH20とヒトPH20とのアラインメントは、ウシポリペプチドにGPIアンカーが存在しないため、アミノ酸470からそれぞれのカルボキシ末端までに複数のギャップが存在し、弱い相同性しか示さない（例えばFrost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4:427-440参照）。実際、ヒトを除く他の多くのPH20種には、明確なGPIアンカーが予想されない。したがって、ヒツジおよびウシから生産されるPH20ポリペプチドは、天然に、可溶型として存在する。ウシPH20は形質膜に非常に緩く取り付けられた状態で存在するが、ホスホリパーゼ感受性アンカーによって固定されているわけではない（Lalancetteら (2001) Biol Reprod. 65(2):628-36）。ウシヒアルロニダーゼのこのユニークな特徴が、可溶性ウシ精巣ヒアルロニダーゼ酵素を抽出物として臨床用途に使用することを可能にしている（Wydase（登録商標）、Hyalase（登録商標））。
【０１８７】
ヒトPH20 mRNA転写産物は、通常、翻訳されて、35アミノ酸のシグナル配列をN末端（アミノ酸残基位置1〜35）に含有し、19アミノ酸のグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー付加シグナル配列をC末端（アミノ酸残基位置491〜509）に有する、509アミノ酸の前駆体ポリペプチド（配列番号1）を生成する。したがって成熟PH20は配列番号2に示す474アミノ酸のポリペプチドである。前駆体ポリペプチドがERに輸送され、シグナルペプチドが除去された後、C末端のGPI付加シグナルペプチドが切り離されて、配列番号1に示す前駆体ポリペプチドの位置490に相当するアミノ酸位置での、新しく形成されたC末端アミノ酸へのGPIアンカーの共有結合的付加が促進される。こうして、配列番号2に示すアミノ酸配列を有する474アミノ酸のGPIアンカー型成熟ポリペプチドが生産される。
【０１８８】
ヒトPH20は中性pHでも酸性pHでもヒアルロニダーゼ活性を示す。ある態様では、ヒトPH20が、一般にGPIアンカーによって形質膜に固定されるプロトタイプの中性活性ヒアルロニダーゼである。もう一つの態様では、PH20が先体内膜上に発現し、この場合は、中性pHでも酸性pHでもヒアルロニダーゼ活性を有する。PH20はポリペプチドの異なる領域、すなわちペプチド1領域およびペプチド3領域に、2つの触媒部位を含有するようである（Cherrら (2001) Matrix Biology 20:515-525）。配列番号2に示す成熟ポリペプチドのアミノ酸位置107〜137および配列番号1に示す前駆体ポリペプチドの位置142〜172に相当するPH20のペプチド1領域は、中性pHにおける酵素活性に必要であることを示す証拠がある。この領域内にある（配列番号2に示す成熟PH20ポリペプチドにおいて）位置111および113のアミノ酸は、活性にとって重要であると思われる。というのも、アミノ酸の置き換えによる突然変異導入は、野生型PH20と比較してそれぞれ3％のヒアルロニダーゼ活性を有するPH20ポリペプチド、または検出可能なヒアルロニダーゼ活性を伴わないPH20ポリペプチドをもたらすからである（Armingら (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814）。
【０１８９】
配列番号2に示す成熟ポリペプチドのアミノ酸位置242〜262および配列番号1に示す前駆体ポリペプチドの位置277〜297に相当するペプチド3領域は、酸性pHにおける酵素活性にとって重要であると思われる。この領域内では、成熟PH20ポリペプチドの位置249および252にあるアミノ酸が活性にとって必須であると思われ、どちらか一方に突然変異を導入すると、本質的に活性を持たないポリペプチドがもたらされる（Armingら (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814）。
【０１９０】
PH20は、触媒部位の他に、ヒアルロナン結合部位も含有する。この部位は、配列番号1に示す前駆体ポリペプチドのアミノ酸位置205〜235および配列番号2に示す成熟ポリペプチドの位置170〜200に相当するペプチド2領域内に位置することを示す実験的証拠がある。この領域はヒアルロニダーゼ間で高度に保存されており、ヘパリン結合モチーフに似ている。（配列番号2に示す成熟PH20ポリペプチドにおいて）位置176にあるアルギニン残基のグリシンへの突然変異は、野生型ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の約1％の活性しかもたないポリペプチドをもたらす（Armingら (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814）。
【０１９１】
ヒトPH20には、配列番号1に例示されるポリペプチドのN82、N166、N235、N254、N368、N393、N490に、7つの潜在的N結合型グリコシル化部位がある。配列番号1のアミノ酸36〜464が最小活性ヒトPH20ヒアルロニダーゼドメインを含有すると思われるので、N結合型グリコシル化部位N490は適正なヒアルロニダーゼ活性にとって必要でない。ヒトPH20には6個のジスルフィド結合がある。2つのジスルフィド結合は、配列番号1に例示されるポリペプチドのシステイン残基C60とC351およびC224とC238（それぞれ配列番号2に示す成熟ポリペプチドの残基C25とC316およびC189とC203に相当する）の間に形成される。さらに4つのジスルフィド結合が、配列番号1に例示されるポリペプチドのシステイン残基C376とC387；C381とC435；C437とC443；およびC458とC464（それぞれ配列番号2に示す成熟ポリペプチドの残基C341とC352；C346とC400；C402とC408；およびC423とC429に相当する）の間に形成される。
【０１９２】
ii．細菌ヒアルロニダーゼ
細菌ヒアルロニダーゼ（EC4.2.2.1またはEC4.2.99.1）はヒアルロナンを分解し、コンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸をさまざまな程度に分解する。細菌から単離されるヒアルロナンリアーゼは、ヒアルロニダーゼ（他の供給源に由来するもの、例えばヒアルロノグルコサミニダーゼ、EC3.2.1.35）とは、その作用様式が異なる。これらは、ヒアルロナンのN-アセチル-β-D-グルコサミン残基とD-グルクロン酸残基の間のβ1→4グリコシド結合の（加水分解ではなく）脱離反応を触媒して、3-(4-デオキシ-β-D-グルカ-4-エンウロノシル)-N-アセチル-D-グルコサミン四糖および六糖、ならびに二糖最終生成物を与える、エンド-β-N-アセチルヘキソサミニダーゼである。この反応は、不飽和ヘキスロン酸残基をその非還元末端に有するオリゴ糖の形成をもたらす。
【０１９３】
ここに提供される組成物、組合せおよび方法において使用するための例示的な細菌由来のヒアルロニダーゼには、例えば、アルスロバクター属、デロビブリオ属、クロストリジウム属（Clostridium）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、ストレプトコッカス属、ペプトコッカス属（Peptococcus）、プロピオン酸菌属（Propionibacterium）、バクテロイデス属（Bacteroides）、およびストレプトミセス属（Streptomyces）の株を含む微生物中のヒアルロナン分解酵素が含まれるが、これらに限るわけではない。そのような株および酵素の特定例には、アルスロバクター属（FB24株）（配列番号67）、デロビブリオ・バクテリオボラス（配列番号68）、アクネ菌（配列番号69）、ストレプトコッカス・アガラクチア（（配列番号70）；18RS21（配列番号71）；血清型Ia型（配列番号72）；血清型III型（配列番号73）、黄色ブドウ球菌（COL株）（配列番号74）；MRSA252株（配列番号75および76）；MSSA476株（配列番号77）；NCTC8325株（配列番号78）；ウシRF122株（配列番号79および80）；USA300株（配列番号81）、肺炎レンサ球菌（（配列番号82）；ATCC BAA-255/R6株（配列番号83）；血清型2型D39/NCTC7466株（配列番号84）、化膿レンサ球菌（血清型M1型）（配列番号85）；血清型M2型MGAS10270株（配列番号86）；血清型M4型MGAS10750株（配列番号87）；血清型M6型（配列番号88）；血清型M12型MGAS2096株（配列番号89および90）；血清型M12型MGAS9429株（配列番号91）；血清型M28型（配列番号92）；ブタレンサ球菌（配列番号93〜95）；ビブリオ・フィシェリ（ATCC700601/ES114株（配列番号96））、およびストレプトミセス・ヒアルロノリチカスのヒアルロニダーゼ酵素（これはヒアルロン酸に特異的であり、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸を切断しない（Ohya,T.およびKaneko,Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607））が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１９４】
iii．ヒル、他の寄生生物および甲殻類に由来するヒアルロニダーゼ
ヒル、他の寄生生物、および甲殻類に由来するヒアルロニダーゼ（EC3.2.1.36）は、四糖および六糖最終生成物を生成するエンド-β-グルクロニダーゼである。これらの酵素は、ヒアルロネート中のβ-D-グルクロネート残基とN-アセチル-D-グルコサミン残基の間の１→3結合の加水分解を触媒する。例示的なヒル由来のヒアルロニダーゼには、ヒルド科（Hirudinidae）（例えばヒルド・メディシナリス（Hirudo medicinalis））、イシビル科（Erpobdellidae）（例えばネフェロプシス・オブスキュラ（Nephelopsis obscura）およびエルポデラ・パンクタタ（Erpobdella punctata））、グロシフォニ科（Glossiphoniidae）（例えばデセロデラ・ピクタ（Desserobdella picta）、ヌマビル（Helobdella stagnalis）、ヒラタビル（Glossiphonia complanata）、プラコデラ・オルナタ（Placobdella ornata）およびテロミゾン属（Theromyzon sp.））およびヘモピ科（Haemopidae）（ヘモピス・マルモラタ（Haemopis marmorata））に由来するヒアルロニダーゼが含まれるが、これらに限るわけではない（Hovinghら (1999) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 124(3):319-26）。ヒルヒアルロニダーゼと同じ作用機序を持つ細菌由来の例示的なヒアルロニダーゼは、藍色細菌シネココッカス属（Synechococcus sp.）（RCC307株）に由来するもの（配列番号97）である。
【０１９５】
b．他のヒアルロナン分解酵素
ここに提供される組成物、組合せおよび方法では、ヒアルロニダーゼファミリーに加えて、他のヒアルロナン分解酵素も使用することができる。例えば、ヒアルロナンを切断する能力を有する酵素、例えば特定のコンドロイチナーゼおよびリアーゼを、使用することができる。ヒアルロナンを分解することができる例示的コンドロイチナーゼには、コンドロイチンABCリアーゼ（コンドロイチナーゼABCとも呼ばれている）、コンドロイチンACリアーゼ（コンドロイチン硫酸リアーゼまたはコンドロイチン硫酸エリミナーゼとも呼ばれている）およびコンドロイチンCリアーゼが含まれるが、これらに限るわけではない。ここに提供される組成物、組合せおよび方法において使用するためのそのような酵素を製造および精製するための方法は、当技術分野では知られている（例えば米国特許第6,054,569号；Yamagataら (1968) J. Biol. Chem. 243(7):1523-1535；Yangら (1985) J. Biol. Chem. 160(30):1849-1857）。
【０１９６】
コンドロイチンABCリアーゼには、コンドロイチン硫酸タイプおよびデルマタン硫酸タイプのさまざまなグルコサミノグリカンを分解する2つの酵素、コンドロイチン硫酸ABCエンドリアーゼ（EC4.2.2.20）およびコンドロイチン硫酸ABCエキソリアーゼ（EC4.2.2.21）が含まれる（Hamaiら (1997) J Biol Chem. 272(14):9123-30）。コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンおよびデルマタン硫酸は、コンドロイチン硫酸ABCエンドリアーゼの好ましい基質であるが、この酵素はヒアルロナンにも、より低い速度で、作用することができる。コンドロイチン硫酸ABCエンドリアーゼは、コンドロイチン硫酸タイプおよびデルマタン硫酸タイプのさまざまなグリコサミノグリカンを分解して、最終的にはΔ4-不飽和四糖および二糖に分解されるさまざまなサイズのΔ4-不飽和オリゴ糖の混合物を生成する。コンドロイチン硫酸ABCエキソリアーゼも同じ基質特異性を有するが、これは、コンドロイチン硫酸ポリマーの非還元末端と、コンドロイチン硫酸ABCエンドリアーゼによって生成したそれらのオリゴ糖フラグメントの非還元末端との両方から、二糖残基を除去する（Hamai, A.ら (1997) J. Biol. Chem. 272:9123-9130）。例示的コンドロイチン硫酸ABCエンドリアーゼおよびコンドロイチン硫酸ABCエキソリアーゼには、プロテウス・ブルガリスおよびフラボバクテリウム・ヘパリナムに由来するものが含まれるが、これらに限るわけではない（プロテウス・ブルガリス・コンドロイチン硫酸ABCエンドリアーゼを配列番号98に示す（Satoら (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46）。
【０１９７】
コンドロイチンACリアーゼ（EC4.2.2.5）はコンドロイチン硫酸AおよびC、コンドロイチンならびにヒアルロン酸に対して活性であるが、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸B）には活性でない。細菌に由来する例示的コンドロイチナーゼAC酵素には、それぞれ配列番号99および100に示すフラボバクテリウム・ヘパリナムおよびビクチバリス・バデンシス、ならびにアルスロバクター・アウレッセンスに由来するものが含まれるが、これらに限るわけではない（Tkalecら (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35；Ernstら (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444）。
【０１９８】
コンドロイチナーゼCは、コンドロイチン硫酸Cを切断して、四糖と、不飽和6-硫酸二糖（ΔDi-6S）とを生成する。これはヒアルロン酸も切断して、不飽和非硫酸化二糖（ΔDi-OS）を生成する。細菌に由来する例示的コンドロイチナーゼC酵素には、ストレプトコッカスおよびフラボバクテリウムに由来するものが含まれるが、これらに限るわけではない（Hibiら (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4；Michelacciら (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8；Tsudaら (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133）。
【０１９９】
c．可溶性ヒアルロナン分解酵素
ここに提供される組成物、組合せ、使用および方法では、可溶性ヒアルロニダーゼを含む可溶性ヒアルロナン分解酵素が提供される。可溶性ヒアルロナン分解酵素には、発現時に細胞（例えばCHO細胞）から分泌され可溶型で存在する任意のヒアルロナン分解酵素が含まれる。そのような酵素には、可溶性ヒアルロニダーゼ、例えば非ヒト可溶性ヒアルロニダーゼ（非ヒト動物可溶性ヒアルロニダーゼを含む）、細菌可溶性ヒアルロニダーゼおよびヒトヒアルロニダーゼ、Hyal1、ウシPH20およびヒツジPH20、それらのアレル変異体およびそれらの他の変異体が含まれるが、これらに限るわけではない。例えば、可溶性ヒアルロナン分解酵素には、可溶性になるように修飾された任意のヒアルロナン分解酵素が含まれる。例えば、GPIアンカーを含有するヒアルロナン分解酵素は、そのGPIアンカーの全部または一部のトランケーションおよび除去によって、可溶性にすることができる。ある例では、通常はGPIアンカーを介して膜に固定されているヒトヒアルロニダーゼPH20を、C末端にあるGPIアンカーの全部または一部のトランケーションおよび除去によって、可溶性にすることができる。
【０２００】
可溶性ヒアルロナン分解酵素にも、中性活性および酸性活性ヒアルロニダーゼが含まれる。投与後の酵素の所望する活性レベルおよび/または投与部位など（ただしこれらに限るわけではない）といった因子に応じて、中性活性および酸性活性ヒアルロニダーゼを選択することができる。ある特定例では、本発明の組成物、組合せおよび方法において使用するためのヒアルロナン分解酵素が、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼである。
【０２０１】
可溶性ヒアルロニダーゼの代表例は、任意の種に由来するPH20、例えば配列番号1、2、11、25、27、29〜32、63〜65および101〜102のいずれかに示すもの、またはそのヒアルロニダーゼが可溶性であり（発現時に分泌され）、ヒアルロニダーゼ活性を保持している限りにおいて、C末端GPIアンカーの全部または一部を欠くそのトランケート型である。可溶性ヒアルロニダーゼには、配列番号1、2、11、25、27、29〜32、63〜65および101〜102のいずれかのアレル変異体もしくは他の変異体、またはそのトランケート型も含まれる。アレル変異体および他の変異体は当業者には知られており、これには、配列番号1、2、11、25、27、29〜32、63〜65および101〜102のいずれかに対して60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチド、またはそのトランケート型が含まれる。アミノ酸変異体は保存的突然変異および非保存的突然変異を含む。ヒアルロニダーゼの活性にとって重要であるか、そうでなくても必要とされる残基、例えば上述したもの、または当業者に知られているものは、一般に不変であり、変化させることができないと理解される。これらには、例えば活性部位残基が含まれる。したがって、例えば、ヒトPH20ポリペプチドまたはその可溶型のアミノ酸残基111、113および176（配列番号2に示す成熟PH20ポリペプチド中の残基に対応）は一般に不変であり、改変されない。グリコシル化および適正なフォールディングに必要なジスルフィド結合の形成を与える他の残基も不変でありうる。
【０２０２】
いくつかの例では、可溶性ヒアルロナン分解酵素が、通常はGPIアンカー型（例えばヒトPH20）であり、C末端におけるトランケーションによって可溶性にされる。そのようなトランケーションでは、GPIアンカー付加シグナル配列の全部を除去することもできるし、GPIアンカー付加シグナル配列の一部だけを除去することもできる。ただし、結果として生じるポリペプチドは可溶性である。可溶性ヒアルロナン分解酵素がGPIアンカー付加シグナル配列の一部を保持している例では、そのポリペプチドが可溶性である限り、GPIアンカー付加シグナル配列中の1、2、3、4、5、6、7個またはそれ以上のアミノ酸残基を保つことができる。GPIアンカーのアミノ酸を1つ以上含有するポリペプチドは、伸張型可溶性ヒアルロナン分解酵素と呼ばれる。当業者は、ポリペプチドがGPIアンカー型であるかどうかを、当技術分野において周知の方法を使って決定することができる。そのような方法には、既知のアルゴリズムを使ってGPIアンカー付加シグナル配列およびω部位の存在と位置を予測する方法や、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC）またはD（PI-PLD）による消化の前後に溶解度解析を行う方法が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０２０３】
伸張型可溶性ヒアルロナン分解酵素は、本来GPIアンカー型である任意のヒアルロナン分解酵素に、結果として生じるポリペプチドが可溶性であり、かつGPIアンカー付加シグナル配列に由来する1つ以上のアミノ酸残基を含有するように、C末端トランケーションを施すことによって作製することができる（米国特許出願公開第20100143457号参照）。C末端トランケート型であるがGPIアンカー付加シグナル配列の一部を保持している例示的伸張型可溶性ヒアルロナン分解酵素には、霊長類由来の伸張型可溶性PH20（esPH20）ポリペプチド、例えばヒトおよびチンパンジーesPH20ポリペプチドが含まれるが、これらに限るわけではない。例えば、esPH20ポリペプチドは、配列番号1、2または101に示す成熟もしくは前駆体ポリペプチド、またはそのアレル変異体もしくは他の変異体（その活性フラグメントを含む）のいずれかのC末端トランケーションによって作製することができ、この場合、結果として生じるポリペプチドは可溶性であり、かつGPIアンカー付加シグナル配列由来の1つ以上のアミノ酸残基を保持する。アレル変異体および他の変異体は当業者に知られており、これには、配列番号1または2のいずれかに対して60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。ここに提供されるesPH20ポリペプチドは、結果として生じるesPH20ポリペプチドが可溶性であり、かつGPIアンカー付加シグナル配列に由来する1つ以上のアミノ酸残基を保持している限り、配列番号1、2または101に示す配列を有するポリペプチドなどの野生型ポリペプチドと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上のアミノ酸がC末端でトランケートされていてよい。
【０２０４】
通例、本発明の組成物、組合せおよび方法における使用には、可溶性ヒトPH20などの可溶性ヒトヒアルロナン分解酵素が使用される。他の動物に由来するPH20などのヒアルロナン分解酵素を利用することはできるが、それらは動物性タンパク質であるので、そのような調製物は潜在的に免疫原性である。例えば、かなりの比率の患者が、摂取した食品に続発する事前感作（prior sensitization）を示し、これらは動物性タンパク質であるので、全ての患者に続発的感作（subsequent sensitization）のリスクがある。したがって非ヒト調製物は、慢性的使用には適さないかもしれない。非ヒト調製物が望まれる場合、ここでは、そのようなポリペプチドを免疫原性が低下するように調製することができると考えられる。そのような修飾は当業者の技術水準内にあり、これには、例えば分子上の1つ以上の抗原エピトープの除去および/または置き換えを含めることができる。
【０２０５】
本発明の方法において使用されるヒアルロニダーゼ（例えばPH20）などのヒアルロナン分解酵素は組換え生産するか、自然源から、例えば精巣抽出物などから、精製または部分精製することができる。組換えヒアルロナン分解酵素を含む組換えタンパク質の生産方法は、本明細書に項を改めて記載するが、当技術分野ではよく知られている。
【０２０６】
i．可溶性ヒトPH20
可溶性ヒアルロニダーゼの代表例は可溶性ヒトPH20である。可溶型の組換えヒトPH20は作製されており、本明細書に記載する組成物、組合せおよび方法に使用することができる。そのような可溶型のPH20の作製は、米国特許出願公開第20040268425号、同第20050260186号、同第20060104968号、同第20100143457号およびPCT国際出願WO2009111066に記載されている。例えば可溶性PH20ポリペプチドには、配列番号1のアミノ酸の配列を含む、または配列番号1に含まれるアミノ酸の配列に対して少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％、98％の配列同一性を有し、ヒアルロニダーゼ活性を保持していて、かつ可溶性である、C末端トランケート変異体ポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドには、GPIアンカー付加シグナル配列の全部または一部を完全に欠く可溶性PH20ポリペプチドが含まれる。
【０２０７】
また、GPIアンカーのアミノ酸を少なくとも1つは含有する伸張型可溶性PH20（esPH20）ポリペプチドも含まれる。したがって、これらのポリペプチドは、ERにおいてタンパク質のC末端に共有結合されたGPIアンカーを有していて形質膜の細胞外側層に固定されるのではなく、分泌され、可溶性である。C末端トランケート型PH20ポリペプチドは、完全長野生型ポリペプチド、例えば配列番号1または2に示す配列を有する完全長野生型ポリペプチド、またはそのアレル変異体もしくは種変異体、または他の変異体と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60個またはそれ以上のアミノ酸が、C末端でトランケートされていてもよい。
【０２０８】
例えば可溶型には、配列番号1に示すアミノ酸の配列のC末端アミノ酸残基467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482および483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499または500を有する、配列番号1に示すヒトPH20のC末端トランケート型ポリペプチド、またはそれに対して少なくとも85％の同一性を示すポリペプチドが含まれるが、これらに限るわけではない。ヒトPH20の可溶型には一般に、配列番号1に示すアミノ酸36〜464を含有するものが含まれる。例えば、哺乳動物細胞中で発現させると、35アミノ酸のN末端シグナル配列がプロセシング時に切断されて、成熟型のタンパク質が分泌される。したがって成熟可溶性ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸36〜467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482および483を含有する。表3に、C末端トランケート型可溶性PH20ポリペプチドを含む例示的C末端トランケート型PH20ポリペプチドの非限定的な例を挙げる。下記表3には、前駆体ポリペプチドおよび成熟ポリペプチドの長さ（アミノ酸数）、ならびにそのC末端トランケート型PH20タンパク質の前駆体ポリペプチドおよび成熟ポリペプチドの例示的アミノ酸配列が示されている配列識別子（配列番号）を記載する。比較のために表3には野生型PH20ポリペプチドも含める。特に、可溶性ヒアルロニダーゼの代表例は、442、443、444、445、446または447アミノ酸長の可溶性ヒトPH20ポリペプチド、例えば配列番号4〜9のいずれかに示すもの、またはそのアレル変異体もしくは種変異体もしくは他の変異体である。
［表3］例示的C末端トランケート型PH20ポリペプチド
【表３−１】
2013540103.tif 000005
【表３−２】
2013540103.tif 000006
【０２０９】
グリコシル化はヒアルロニダーゼの触媒活性と安定性にとって重要であるので、一般に、可溶型のPH20は、ポリペプチドが確実に活性を保持するように、正しいN-グリコシル化を助長するタンパク質発現系を使って製造される。そのような細胞には、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞（例えばDG44 CHO細胞）が含まれる。
【０２１０】
ii．rHuPH20
ヒトPH20の組換え可溶型が作製されており、ここに提供される組成物、組合せおよび方法において使用することができる。組換えヒトPH20のそのような可溶型の作製は、例えば米国特許出願公開第20040268425号、同第20050260186号、同第20060104968号、同第20100143457号およびPCT国際出願WO2009111066に記載されている。そのようなポリペプチドの代表例は、アミノ酸1〜482（配列番号3に示すもの）をコードする核酸分子の発現によって生成するものである。そのような例示的核酸分子を配列番号49に示す。翻訳後プロセシングにより、35アミノ酸のシグナル配列が除去されて、447アミノ酸の可溶性組換えヒトPH20（配列番号4）が残る。培養培地中に生産された状態ではC末端に不均一性が存在するので、rHuPH20と呼ばれる生成物は、配列番号4〜9のいずれか1つ以上をさまざまな存在比で含みうる分子種の混合物を含む。通例、rHuPH20は、活性が保持されるように、正しいN-グリコシル化を助長する細胞、例えばCHO細胞（例えばDG44 CHO細胞）中で生産される。
【０２１１】
d．ヒアルロナン分解酵素のグリコシル化
ヒアルロニダーゼを含むいくつかのヒアルロナン分解酵素のグリコシル化（N結合型グリコシル化およびO結合型グリコシル化を含む）は、それらの触媒活性および安定性にとって重要でありうる。糖タンパク質を修飾するグリカンのタイプの改変は、タンパク質の抗原性、構造のフォールディング、溶解性、および安定性に劇的な影響を有しうるが、大半の酵素は最適な酵素活性にグリコシル化を必要とするとは考えられていない。いくつかのヒアルロニダーゼでは、N結合型グリコシル化の除去が、ヒアルロニダーゼ活性のほぼ完全な失活をもたらしうる。したがって、そのようなヒアルロニダーゼの場合、活性な酵素を生成させるには、N結合型グリカンの存在が不可欠である。
【０２１２】
N結合型オリゴ糖はいくつかの主要タイプ（オリゴマンノース型、複合型、混成型、硫酸化型）に分類され、これらは全て、-Asn-Xaa-Thr/Ser-配列（XaaはProではない）に含まれるAsn残基のアミド窒素を介して取り付けられた(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-コアを有している。-Asn-Xaa-Cys-部位におけるグリコシル化は凝固タンパク質Cに関して報告されている。いくつかの例では、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素がN-グリコシド結合とO-グリコシド結合の両方を含有しうる。例えばPH20はN結合型オリゴ糖だけでなくO結合型オリゴ糖も有する。配列番号1に例示されるヒトPH20のN82、N166、N235、N254、N368、N393、N490には、7つの潜在的N結合型グリコシル化部位がある。アミノ酸残基N82、N166およびN254が複合型グリカンで占められているのに対し、アミノ酸残基N368およびN393は、高マンノース型グリカンで占められている。アミノ酸残基N235は、およそ80％の高マンノース型グリカンと20％の複合型グリカンで占められている。上記のように、N490におけるN結合型グリコシル化は、ヒアルロニダーゼ活性にとって必要でない。
【０２１３】
いくつかの例では、ここに提供される組成物、組合せおよび/または方法において使用するためのヒアルロナン分解酵素が、グリコシル化部位の1つまたは全部においてグリコシル化されている。例えばヒトPH20またはその可溶型の場合、配列番号1のアミノ酸N82、N166、N235、N254、N368、およびN393に相当するN-グリコシル化部位のうち、2、3、4、5、または6ヶ所がグリコシル化されている。いくつかの例では、ヒアルロナン分解酵素が1つ以上の天然グリコシル化部位においてグリコシル化されている。別の例では、ヒアルロナン分解酵素が、1つ以上の追加部位でポリペプチドがグリコシル化されるように、1つ以上の非天然グリコシル化部位において修飾されている。そのような例では、追加糖部分の取り付けが、その分子の薬物動態特性（例えば改善された半減期および/または改善された活性）を強化しうる。
【０２１４】
別の例では、ここに提供される組成物、組合せおよび/または方法において使用するためのヒアルロナン分解酵素が、部分的に脱グリコシル化されている（またはN-部分グリコシル化ポリペプチドである）。例えば、完全にグリコシル化されたヒアルロニダーゼのヒアルロニダーゼ活性の全部または一部を保持している部分脱グリコシル化可溶性PH20ポリペプチドは、ここに提供される組成物、組合せおよび/または方法において使用することができる。例示的な部分脱グリコシル化ヒアルロニダーゼには、任意の種に由来する部分脱グリコシル化PH20ポリペプチドの可溶型、例えば配列番号1、2、11、25、27、29〜32、63、65、および101〜102のいずれかに示すもの、またはそのアレル変異体、トランケート変異体、もしくは他の変異体がいずれも含まれる。そのような変異体は当業者には知られており、これには、配列番号1、2、11、25、27、29〜32、63、65、および101〜102のいずれかに対して60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチド、またはそのトランケート型が含まれる。ここに提供される部分脱グリコシル化ヒアルロニダーゼには、ハイブリッド、融合およびキメラ部分脱グリコシル化ヒアルロニダーゼ、ならびに部分脱グリコシル化ヒアルロニダーゼコンジュゲートも含まれる。
【０２１５】
グリコシダーゼ、すなわちグリコシドヒドロラーゼは、グリコシド結合を加水分解して、より小さな糖を2つ生成させる反応を触媒する酵素である。脊椎動物におけるN-グリカンの主要タイプには、高マンノース型グリカン、混成型グリカンおよび複合型グリカンが含まれる。部分的なタンパク質脱グリコシル化だけをもたらすグリコシダーゼは、高マンノース型および混成型グリカンを切断するEndoF1、2分岐型複合型グリカンを切断するEndoF2、2分岐型およびそれ以上に分岐した複合型グリカンを切断するEndoF3、ならびに高マンノース型および混成型グリカンを切断するEndoHなど、いくつかある。可溶性ヒアルロニダーゼ（例えば可溶性PH20）などのヒアルロナン分解酵素を、これらのグリコシダーゼの1つまたは全部で処理すると、部分的な脱グリコシル化だけが起こり、したがってヒアルロニダーゼ活性を保持することができる。
【０２１６】
部分脱グリコシル化可溶性ヒアルロニダーゼなどの部分脱グリコシル化ヒアルロナン分解酵素は、1つ以上のグリコシダーゼ（一般的には全てのN-グリカンを除去するのではなくタンパク質を部分的にのみ脱グリコシル化するグリコシダーゼ）による処理で生産することができる。例えばPH20（例えばrHuPH20と呼ばれる組換えPH20）を上記グリコシダーゼの1つまたは全部（例えばEndoF1、EndoF2および/またはEndoF3）で処理すると、部分脱グリコシル化が起こる。これらの部分脱グリコシル化PH20ポリペプチドは、完全グリコシル化ポリペプチドに匹敵するヒアルロニダーゼ酵素活性を示すことができる。対照的に、全てのN-グリカンを切断するグリコシダーゼであるPNGaseFによるPH20の処理は全てのN-グリカンの完全な除去をもたらし、それによってPH20を酵素的に不活性にする。したがって、全てのN結合型グリコシル化部位（例えば配列番号1に例示するヒトPH20のアミノ酸N82、N166、N235、N254、N368、およびN393にあるものなど）がグリコシル化されていてもよいが、1つ以上のグリコシダーゼで処理することにより、1つ以上のグリコシダーゼで消化されていないヒアルロニダーゼと比較してグリコシル化の程度を低下させることもできる。
【０２１７】
部分脱グリコシル化可溶性PH20ポリペプチドなどの部分脱グリコシル化ヒアルロナン分解酵素は、完全グリコシル化ポリペプチドの10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％または80％のグリコシル化レベルを有することができる。ある例では、配列番号1のアミノ酸N82、N166、N235、N254、N368、およびN393に相当するN-グリコシル化部位のうち、1、2、3、4、5、または6ヶ所が、もはや高マンノース型または複合型グリカンを含有せず、むしろ少なくとも1つのN-アセチルグルコサミン部分を含有するように、脱グリコシル化されている。いくつかの例では、配列番号1のアミノ酸N82、N166およびN254に相当するN-グリコシル化部位のうち、1、2または3ヶ所が脱グリコシル化されている（すなわち、それらは糖部分を含有しない）。別の例では、配列番号1のアミノ酸N82、N166、N235、N254、N368、およびN393に相当するN-グリコシル化部位のうち、3、4、5または6ヶ所が、グリコシル化されている。グリコシル化されたアミノ酸残基は最低限N-アセチルグルコサミン部分を含有している。通例、部分脱グリコシル化可溶性PH20ポリペプチドなどの部分脱グリコシル化ヒアルロナン分解酵素は、完全グリコシル化ポリペプチドが示すヒアルロニダーゼ活性の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％またはそれ以上であるヒアルロニダーゼ活性を示す。
【０２１８】
e．修飾（ポリマーコンジュゲート）ヒアルロナン分解酵素
ある例では、ここに提供される組成物および組合せが、典型的には、例えば対象における長時間にわたる/持続性の処置効果が促進されるように、ヒアルロナン分解酵素の半減期を増加させる目的で、1つ以上のポリマー分子（ポリマー）へのコンジュゲーションによって修飾された、ヒアルロナン分解酵素、特に可溶性ヒアルロニダーゼを含有する。
【０２１９】
ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素へのポリエチレングリコール（PEG化部分（PEG））などのポリマー分子の共有結合による取り付けまたは他の安定な取り付け（コンジュゲーション）は、結果として生じるヒアルロナン分解酵素-ポリマー組成物に有益な性質を付与する。そのような性質には、改善された生体適合性、対象内での血液、細胞および/または他の組織におけるタンパク質（および酵素活性）半減期の延長、プロテアーゼおよび加水分解からのタンパク質の効果的な遮蔽、改善された体内分布、強化された薬物動態および/または薬力学、ならびに増加した水溶性が含まれる。
【０２２０】
ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素にコンジュゲートすることができる例示的ポリマーには、天然および合成ホモポリマー、例えばポリオール（すなわちポリ-OH）、ポリアミン（すなわちポリ-NH2）およびポリカルボン酸（すなわちポリ-COOH）、さらにはヘテロポリマー、すなわち1つ以上の異なるカップリング基、例えばヒドロキシル基およびアミン基を含むポリマーが含まれる。適切なポリマー分子の例には、ポリアルキレンオキシド（PAO）、例えばポリプロピレングリコール（PEG）、メトキシポリエチレングリコール（mPEG）およびポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール（PAG）、PEG-グリシジルエーテル（Epox-PEG）、PEG-オキシカルボニルイミダゾール（CDI-PEG）、分岐ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリ-D,L-アミノ酸、ポリエチレン-co-マレイン酸無水物、ポリスチレン-co-マレイン酸無水物、カルボキシメチル-デキストランなどのデキストラン、ヘパリン、相同アルブミン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース類、キトサンの加水分解物、ヒドロキシエチル-デンプンおよびヒドロキシプロピル-デンプンなどのデンプン類、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンゴム、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸加水分解物および生体ポリマーの中から選択されるポリマー分子が含まれる。
【０２２１】
通例、ポリマーは、デキストラン、プルランなどの多糖類と比較して架橋する能力を有する反応性基が少ないポリアルキレンオキシド（PAO）、例えばPEGなどのポリエチレンオキシド、典型的にはmPEGである。通例、ポリマーは、比較的単純な化学反応を使って、ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素に（例えばタンパク質表面上の取り付け基に）共有結合的にコンジュゲートすることができる無毒性ポリマー分子、例えば(m)ポリエチレングリコール（mPEG）である。
【０２２２】
治療薬のPEG化は、タンパク質分解に対する耐性を増加させ、血漿中半減期を増加させ、抗原性および免疫原性を低下させると報告されている。PEG化の方法の例は当技術分野では知られている（例えばLuおよびFelix, Int. J. Peptide Protein Res., 43:127-138, 1994；LuおよびFelix, Peptide Res., 6:140-6, 1993；Felixら, Int. J. Peptide Res., 46:253-64, 1995；Benharら, J. Biol. Chem., 269:13398-404, 1994；Brumeanuら, J Immunol., 154:3088-95, 1995を参照されたい；また、Calicetiら (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77およびMolineux (2003) Pharmacotherapy 23(8Pt2):3S-8Sも参照されたい）。PEG化はインビボでの核酸分子の送達にも使用することができる。例えば、アデノウイルスのPEG化は、安定性および遺伝子導入を増加させることができる（例えばChengら (2003) Pharm. Res. 20(9):1444-51を参照されたい）。
【０２２３】
ヒアルロニダーゼを含むヒアルロナン分解酵素に取り付けるための適切なポリマー分子には、ポリエチレングリコール（PEG）およびPEG誘導体、例えばメトキシ-ポリエチレングリコール（mPEG）、PEG-グリシジルエーテル（Epox-PEG）、PEG-オキシカルボニルイミダゾール（CDI-PEG）、分岐PEG、およびポリエチレンオキシド（PEO）が含まれるが、これらに限るわけではない（例えばRobertsら, Advanced Drug Delivery Review 2002, 54:459-476；HarrisおよびZalipsky,S編「Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications」ACS Symposium Series 680, 1997；Mehvarら, J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000；Harri, (2003)  Nature Reviews Drug Discovery 2:214-221；およびTsubery, (2004) J Biol. Chem 279(37):38118-24参照）。ポリマー分子は、典型的には約3kDa〜約60kDaの範囲にわたる分子量を有することができる。いくつかの実施形態では、rHuPH20などのタンパク質にコンジュゲートされるポリマー分子が、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60kDaまたは60kDa超の分子量を有する。
【０２２４】
PEG化可溶性ヒアルロナン分解酵素
本発明の方法、組成物および組合せにおいて使用されるヒアルロナン分解酵素は、PEG化可溶性ヒアルロナン分解酵素などのPEG化ヒアルロナン分解酵素であることができる。ある例では、それがPEG化可溶性ヒアルロニダーゼ、例えばPEG化rHuPH20である。当技術分野では、PEGまたはPEG誘導体を共有結合で取り付ける（コンジュゲートする）こと（すなわち「PEG化」）によってポリペプチドを修飾するさまざまな方法が知られている（例えばU.S.2006/0104968；U.S.5,672,662；U.S.6,737,505；およびU.S.2004/0235734参照）。PEG化の技法には、専用のリンカーおよびカップリング化学（例えばRobertsら, Adv. Drug. Deliv. Rev. 54:459-476, 2002参照）、単一のコンジュゲーション部位への複数のPEG部分の取り付け（分岐PEGの使用によるものなど；例えばGuiottoら, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002参照）、部位特異的PEG化および/またはモノPEG化（例えばChapmanら, Nature Biotech. 17:780-783, 1999参照）、ならびに部位特異的酵素的PEG化（例えばSato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002参照）が含まれるが、これらに限るわけではない。当技術分野において記載されている方法および技法により、単一のタンパク質分子に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個の、または10個を上回る、PEGまたはPEG誘導体が取り付けられたタンパク質を製造することができる（例えばU.S.2006/0104968参照）。
【０２２５】
当技術分野ではPEG化のための試薬が数多く記載されている。そのような試薬には、N-ヒドロキシスクシンイミジル（NHS）活性化PEG、スクシンイミジルmPEG、mPEG2-N-ヒドロキシスクシンイミド、mPEGスクシンイミジルα-メチルブタノエート、mPEGスクシンイミジルプロピオネート、mPEGスクシンイミジルブタノエート、mPEGカルボキシメチル3-ヒドロキシブタン酸スクシンイミジルエステル、ホモ二官能性PEG-スクシンイミジルプロピオネート、ホモ二官能性PEGプロピオンアルデヒド、ホモ二官能性PEGブチルアルデヒド、PEGマレイミド、PEGヒドラジド、p-ニトロフェニル-カーボネートPEG、mPEG-ベンゾトリアゾールカーボネート、プロピオンアルデヒドPEG、mPEGブチルアルデヒド、分岐mPEG2ブチルアルデヒド、mPEGアセチル、mPEGピペリドン、mPEGメチルケトン、mPEG「リンカーレス」マレイミド、mPEGビニルスルホン、mPEGチオール、mPEGオルトピリジルチオエステル、mPEGオルトピリジルジスルフィド、Fmoc-PEG-NHS、Boc-PEG-NHS、ビニルスルホンPEG-NHS、アクリレートPEG-NHS、フルオレセインPEG-NHS、およびビオチンPEG-NHSが含まれるが、これらに限るわけではない（例えばMonfardiniら, Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995；Veroneseら, J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997；U.S.5,672,662；U.S.5,932,462；U.S.6,495,659；U.S.6,737,505；U.S.4,002,531；U.S.4,179,337；U.S.5,122,614；U.S.5,324,844；U.S.5,446,090；U.S.5,612,460；U.S.5,643,575；U.S.5,766,581；U.S.5,795,569；U.S.5,808,096；U.S.5,900,461；U.S.5,919,455；U.S.5,985,263；U.S.5,990,237；U.S.6,113,906；U.S.6,214,966；U.S.6,258,351；U.S.6,340,742；U.S.6,413,507；U.S.6,420,339；U.S.6,437,025；U.S.6,448,369；U.S.6,461,802；U.S.6,828,401；U.S.6,858,736；U.S.2001/0021763；U.S.2001/0044526；U.S.2001/0046481；U.S.2002/0052430；U.S.2002/0072573；U.S.2002/0156047；U.S.2003/0114647；U.S.2003/0143596；U.S.2003/0158333；U.S.2003/0220447；U.S.2004/0013637;US 2004/0235734；WO0500360；U.S.2005/0114037；U.S.2005/0171328；U.S.2005/0209416；EP 1064951；EP 0822199；WO01076640；WO0002017；WO0249673；WO9428024；およびWO0187925参照）。
【０２２６】
D．ヒアルロナン分解酵素の核酸およびコードされているポリペプチドを製造する方法
本明細書に記載する可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素のポリペプチドは、タンパク質精製および組換えタンパク質発現のための、当技術分野において周知の方法によって得ることができる。所望の遺伝子をコードする核酸を同定するための、当業者に知られている任意の方法を使用することができる。当技術分野において利用することができる任意の方法を使って、例えば細胞または組織供給源から、ヒアルロニダーゼをコードする完全長（すなわち全コード領域を包含する）cDNAまたはゲノムDNAクローンを得ることができる。修飾型または変異体可溶性ヒアルロニダーゼは、野生型ポリペプチドから、部位特異的突然変異導入法などによって、工学的に製作することができる。
【０２２７】
ポリペプチドは、核酸分子をクローニングまたは単離するための当技術分野において知られている任意の利用可能な方法を使って、クローニングまたは単離することができる。そのような方法には、核酸のPCR増幅およびライブラリーのスクリーニング、例えば核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体に基づくスクリーニング、および活性に基づくスクリーニングが含まれる。
【０２２８】
例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法などといった核酸を増幅するための方法を使って、所望のポリペプチドをコードする核酸分子を単離することができる。核酸含有材料を出発物質として使用して、そこから所望のポリペプチドコード核酸分子を単離することができる。増幅方法では、例えばDNAおよびmRNA調製物、細胞抽出物、組織抽出物、体液試料（例えば血液、血清、唾液）、健常対象および/または疾患対象から得た試料を使用することができる。核酸ライブラリーも出発物質の供給源として使用することができる。所望のポリペプチドが増幅されるようにプライマーを設計することができる。例えば、所望のポリペプチドの生成源である発現配列に基づいて、プライマーを設計することができる。プライマーは、ポリペプチドアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計することができる。増幅によって生成した核酸分子を配列決定し、それが所望のポリペプチドをコードしていることを確認することができる。
【０２２９】
ポリペプチドコード核酸分子には、追加ヌクレオチド配列、例えば合成遺伝子をベクター（例えばタンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コードDNA配列を増幅するために設計されたベクター）中にクローニングするための制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列などを、接合することができる。さらにまた、機能的DNA要素を指定する追加ヌクレオチド配列を、ポリペプチドコード核酸分子に作動的に連結することもできる。そのような配列の例には、細胞内タンパク質発現を助長するために設計されたプロモーター配列、およびタンパク質分泌を助長するために設計された分泌配列、例えば異種シグナル配列が含まれるが、これらに限るわけではない。そのような配列は当業者に知られている。タンパク質結合領域を指定する塩基の配列などの追加ヌクレオチド残基配列も、酵素コード核酸分子に連結することができる。そのような領域には、特異的標的細胞への酵素の取り込みを助長するか、合成遺伝子の産物の薬物動態を他の形で改変する残基の配列、または特異的標的細胞への酵素の取り込みを助長するか、合成遺伝子の産物の薬物動態を他の形で改変するタンパク質をコードする残基の配列が含まれるが、これらに限るわけではない。例えば酵素をPEG部分に連結することができる。
【０２３０】
さらに、例えばポリペプチドの検出またはアフィニティ精製を助けるためなどの目的で、タグまたは他の部分を付加することもできる。例えば、エピトープタグまたは他の検出可能マーカーを指定する塩基の配列などといった追加ヌクレオチド残基配列も、酵素コード核酸分子に連結することができる。そのような配列の代表例には、Hisタグ（例えば6×His、HHHHHH；配列番号54）またはFlagタグ（DYKDDDDK；配列番号55）が含まれる。
【０２３１】
次に、同定され単離された核酸を適当なクローニングベクターに挿入することができる。当技術分野において知られている多数のベクター-宿主系を使用することができる。考えられるベクターには、プラスミドまたは修飾ウイルスが含まれ、これらに限るわけではないが、ベクター系は使用する宿主細胞と適合するものでなければならない。そのようなベクターには、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、またはpCMV4、pBR322もしくはpUCプラスミド誘導体などのプラスミド、またはBluescriptベクター（Stratagene、カリフォルニア州ラホーヤ）が含まれるが、これらに限るわけではない。他の発現ベクターには、本明細書に例示するHZ24発現ベクターが含まれる。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的付着末端を有するクローニングベクター中に、DNAフラグメントをライゲーションすることによって達成することができる。挿入はTOPOクローニングベクター（INVITROGEN、カリフォルニア州カールズバッド）を使って達成することができる。DNAをフラグメント化するために使用される相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合は、DNA分子の末端を酵素的に修飾することができる。あるいは、ヌクレオチド配列（リンカー）をDNA末端にライゲーションすることによって所望する任意の部位を作り出すこともでき、ライゲーションされたこれらのリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化学合成オリゴヌクレオチドを含有することができる。これに代わる方法として、切断されたベクターおよびタンパク質遺伝子を、ホモポリマーテーリングによって修飾することもできる。組換え分子は、例えば形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションおよびソノポレーションなどによって、その遺伝子配列のコピーが数多く生成するように、宿主細胞中に導入することができる。
【０２３２】
具体的実施形態では、宿主細胞を、単離されたタンパク質遺伝子、cDNA、または合成DNA配列を組み込んだ組換えDNA分子で形質転換することにより、その遺伝子のコピーを多数生成させることができる。こうして、形質転換体を成長させ、形質転換体から組換えDNA分子を単離し、必要であれば、単離した組換えDNAから挿入された遺伝子を回収することによって、遺伝子を大量に得ることができる。
【０２３３】
1．ベクターおよび細胞
本明細書に記載する任意のヒアルロナン分解酵素ポリペプチドなどの所望のタンパク質の1つ以上を組換え発現させるために、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全部または一部を含有する核酸を、適当な発現ベクター中に、すなわち挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクター中に、挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは、酵素遺伝子の天然プロモーターおよび/またはそれらの隣接領域によっても供給されうる。
【０２３４】
酵素をコードする核酸を含有するベクターも提供する。ベクターを含有する細胞も提供する。細胞には真核細胞および原核細胞が含まれ、ベクターはそこでの使用に適した任意のベクターである。
【０２３５】
ベクターを含有する原核細胞および真核細胞（内皮細胞を含む）を提供する。そのような細胞には、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞が含まれる。細胞は、コードされているタンパク質が細胞によって発現されるような条件下で上述の細胞を成長させ、発現したタンパク質を回収することにより、そのタンパク質を生産するために使用される。ここでの目的には、例えば酵素を、培地中に分泌させることができる。
【０２３６】
天然または異種シグナル配列にカップリングされたヒアルロン酸分解酵素ポリペプチド（いくつかの例では可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチド）をコードするヌクレオチドの配列ならびにその複数コピーを含有するベクターを提供する。ベクターは酵素タンパク質が細胞中で発現するように選択するか、酵素タンパク質が分泌タンパク質として発現するように選択することができる。
【０２３７】
さまざまな宿主-ベクター系を使って、タンパク質コード配列を発現させることができる。これらには、ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルス）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物；またはバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNAで形質転換された細菌が含まれるが、これらに限るわけではない。ベクターの発現要素はその強さおよび特異性がさまざまである。使用する宿主-ベクター系に応じて、数ある適切な転写および翻訳要素のいずれか1つを使用することができる。
【０２３８】
ベクター中にDNAフラグメントを挿入するための、当業者に知られている任意の方法を使用して、適当な転写/翻訳制御シグナルとタンパク質コード配列とを含むキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えDNAおよび合成技法、ならびにインビボ組換え体（遺伝子組換え）を含めることができる。タンパク質またはそのドメイン、誘導体、フラグメントもしくはホモログをコードする核酸配列の発現は、遺伝子またはそのフラグメントが組換えDNA分子で形質転換された宿主中で発現されるように、第2の核酸配列によって調節することができる。例えば、タンパク質の発現は、当技術分野において知られている任意のプロモーター/エンハンサーによって制御することができる。具体的一実施形態では、プロモーターが、所望するタンパク質の遺伝子にとって天然ではない。使用することができるプロモーターには、SV40初期プロモーター（BernoistおよびChambon, Nature 290:304-310 (1981)）、ラウス肉腫ウイルスの3'末端反復配列に含まれるプロモーター（Yamamotoら Cell 22:787-797 (1980)）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら, Nature 296:39-42 (1982))；原核発現ベクター、例えばβ-ラクタマーゼプロモーター（Jayら (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543）またはtacプロモーター（DeBoerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)；Scientific American 242:79-94 (1980)の「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」も参照されたい；ノパリンシンテターゼプロモーター（Herrara-Estrellaら, Nature 303:209-213 (1984)）またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター（Garderら, Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)）を含有する植物発現ベクター、および光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrellaら, Nature 310:115-120 (1984)）；酵母および他の真菌由来のプロモーター要素、例えばGal4プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、および組織特異性を示し、トランスジェニック動物において使用されてきた、以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞中で活性なエラスターゼI遺伝子制御領域（Swiftら, Cell 38:639-646 (1984)；Ornitzら, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986)；MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987))；膵β細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域（Hanahanら, Nature 315:115-122 (1985)）、リンパ系細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら, Cell 38:647-658 (1984)；Adamsら, Nature 318:533-538 (1985)；Alexanderら, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)）、精巣、乳房、リンパ系細胞およびマスト細胞中で活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Lederら, Cell 45:485-495 (1986)）、肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinckertら, Genes and Devel. 1:268-276 (1987)）、肝臓中で活性なα-フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufら, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985)；Hammerら, Science 235:53-58 (1987)）、肝臓中で活性なα-1アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyら, Genes and Devel. 1:161-171 (1987)）、骨髄系細胞中で活性なβグロビン遺伝子制御領域（Magramら, Nature 315:338-340 (1985)；Kolliasら, Cell 46:89-94 (1986)）、脳のオリゴデンドロサイト細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク���遺伝子制御領域（Readheadら, Cell 48:703-712 (1987)）、骨格筋中で活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域（Shani, Nature 314:283-286 (1985)）、および視床下部の性腺刺激細胞中で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン（gonadotrophic releasing hormone）遺伝子制御領域（Masonら, Science 234:1372-1378 (1986)）が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０２３９】
ある具体的実施形態では、所望のタンパク質またはそのドメイン、フラグメント、誘導体もしくはホモログをコードする核酸に作動的に連結されたプロモーター、1つ以上の複製起点、および場合によっては、1つ以上の選択可能マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）を含有するベクターが使用される。大腸菌（E. coli）細胞を形質転換するための例示的プラスミドベクターには、例えばpQE発現ベクター（Qiagen（カリフォルニア州バレンシア）から入手可能；Qiagenが発行した、この系に関する文献も参照されたい）が含まれる。pQEベクターは、ファージT5プロモーター（大腸菌RNAポリメラーゼによって認識される）と、大腸菌における組換えタンパク質の緻密に調節された高レベル発現をもたらすための二重lacオペレータ抑制モジュール、効率のよい翻訳のための合成リボソーム結合部位（RBS II）、6×Hisタグコード配列、t0およびT1転写ターミネーター、ColE1複製起点、およびアンピシリン耐性を付与するためのβ-ラクタマーゼ遺伝子を有する。pQEベクターは6×Hisタグを組換えタンパク質のN末端またはC末端のいずれかに置くことを可能にする。そのようなプラスミドには、3つ全ての読み枠のためのマルチクローニング部位が用意されていて、N末端が6×Hisタグで標識されたタンパク質の発現をもたらす、pQE32、pQE30、およびpQE31が含まれる。大腸菌細胞を形質転換するための他の例示的プラスミドベクターには、例えばpET発現ベクター（米国特許第4,952,496号；NOVAGEN（ウィスコンシン州マディソン）から入手可能；Novagenが発行した、この系に関する文献も参照されたい）が含まれる。そのようなプラスミドには、pET11a（これは、T7 lacプロモーター、T7ターミネーター、誘導性大腸菌lacオペレーター、およびlacリプレッサー遺伝子を含有する）；pET12a-c（これは、T7プロモーター、T7ターミネーター、および大腸菌ompT分泌シグナルを含有する）；ならびにpET15bおよびpET19b（NOVAGEN、ウィスコンシン州マディソン）（これらは、Hisカラムによる精製において使用するためのHis-Tag（商標）リーダー配列、およびカラムでの精製後に行われる切断を可能にするトロンビン切断部位、T7-lacプロモーター領域およびT7ターミネーターを含有する）が含まれる。
【０２４０】
哺乳動物細胞発現用のベクターの代表例は、HZ24発現ベクターである。HZ24発現ベクターはpCIベクターバックボーン（Promega）から誘導された。これは、β-ラクタマーゼ耐性遺伝子（AmpR）をコードするDNA、F1複製起点、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー/プロモーター領域（CMV）、およびSV40後期ポリアデニル化シグナル（SV40）を含有する。この発現ベクターは、ECMVウイルス（Clontech）由来の配列内リボソーム進入部位（IRES）およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子も有する。
【０２４１】
2．発現
可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドを含むヒアルロナン分解酵素ポリペプチドは、インビボ法およびインビトロ法を含む、当業者に知られている任意の方法によって生産することができる。所望のタンパク質は、要求される量および形態（例えば投与および処置に必要とされる量および形態）のタンパク質を生産するのに適した任意の生物中で発現させることができる。発現宿主には、原核生物および真核生物、例えば大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、哺乳動物細胞（ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含む）が含まれる。発現宿主は、そのタンパク質生産レベルが異なりうると共に、発現したタンパク質上に存在する翻訳後修飾のタイプも異なりうる。発現宿主の選択は、これらの因子および他の因子、例えば規制および安全性の問題、生産コスト、ならびに精製の必要性および精製の方法などに基づいて行うことができる。
【０２４２】
多くの発現ベクターが入手可能であり、当業者に知られており、それらをタンパク質の発現に使用することができる。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって左右されるだろう。一般に発現ベクターは、転写プロモーターを含み、場合によってはエンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写および翻訳終結シグナルを含むことができる。安定形質転換に使用される発現ベクターは、典型的には、形質転換細胞の選択と維持を可能にする選択可能マーカーを有する。複製起点を使用してベクターのコピー数を増幅することができる場合もある。
【０２４３】
可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドなどのヒアルロナン分解酵素ポリペプチドは、タンパク質融合物として利用し、または発現させることもできる。例えば、酵素に付加的機能を加えるために、酵素融合物を作製することができる。酵素融合タンパク質の例には、シグナル配列、タグ、例えば局在化用のタグ、例えばhis6タグもしくはmycタグ、または精製用のタグ、例えばGST融合物、ならびにタンパク質分泌および/または膜会合を指示するための配列の融合物が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０２４４】
a．原核細胞
原核生物、特に大腸菌は、大量のタンパク質を生産するための系になる。大腸菌の形質転換は当業者に周知の簡便で迅速な技法である。大腸菌用の発現ベクターは誘導性プロモーターを含有することができ、そのようなプロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するのに有用であり、宿主細胞に対して何らかの毒性を示すタンパク質を発現させるのにも有用である。誘導性プロモーターの例には、lacプロモーター、trpプロモーター、ハイブリッドtacプロモーター、T7およびSP6 RNAプロモーター、ならびに温度調節型λPLプロモーターが含まれる。
【０２４５】
タンパク質（例えばここに提供される任意のタンパク質）は、大腸菌の細胞質環境中で発現させることができる。細胞質は還元的環境であり、一部の分子にとって、これは不溶性封入体の形成をもたらしうる。タンパク質を再可溶化するにはジチオスレイトールやβ-メルカプトエタノールなどの還元剤およびグアニジン-HClや尿素などの変性剤を使用することができる。代替的アプローチは、酸化的環境ならびにシャペロニン様イソメラーゼおよびジスルフィドイソメラーゼを提供して可溶性タンパク質の生産をもたらすことができる細菌の周辺腔におけるタンパク質の発現である。典型的には、タンパク質をペリプラズムに向かわせるリーダー配列が、発現されるべきタンパク質に融合される。その場合、リーダーは、ペリプラズム内で、シグナルペプチダーゼによって除去される。ペリプラズムターゲティングリーダー配列の例には、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のpelBリーダー、およびアルカリホスファターゼ遺伝子由来のリーダーが含まれる。ペリプラズム発現は、発現したタンパク質の培養培地への漏出を可能にする場合もある。タンパク質の分泌は培養上清からの迅速かつ簡便な精製を可能にする。分泌されないタンパク質は浸透圧溶解によってペリプラズムから得ることができる。細胞質発現と同様に、時には、タンパク質が不溶性になる場合もあり、変性剤および還元剤を使って可溶化および再フォールディングを助長することができる。誘導および成長の温度も、発現レベルおよび溶解性に影響を及ぼすことがあり、典型的には、25℃〜37℃の温度が使用される。典型的には、細菌は非グリコシル化タンパク質を生産する。したがって、タンパク質が機能するためにグリコシル化を要求する場合は、宿主細胞から精製した後に、インビトロでグリコシル化を追加することができる。
【０２４６】
b．酵母細胞
サッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母は、タンパク質（例えば本明細書に記載する任意のタンパク質）の生産に使用することができる周知の酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターで形質転換するか、相同組換えによる安定染色体組込みによって形質転換することができる。典型的には、遺伝子発現を調節するために、誘導性プロモーターが使用される。そのようなプロモーターの例には、GAL1、GAL7およびGAL5、ならびにメタロチオネインプロモーター、例えばCUP1、AOX1、または他のピキア（Pichia）プロモーターもしくは他の酵母プロモーターが含まれる。発現ベクターは、多くの場合、形質転換されたDNAの選択および維持のために、LEU2、TRP1、HIS3およびURA3などの選択可能マーカーを含む。酵母中で発現するタンパク質は可溶性であることが多い。Bipなどのシャペロニン類およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの共発現は、発現レベルおよび可溶性を改善することができる。また、酵母中で発現したタンパク質は、例えばサッカロミセス・セレビシェに由来する酵母接合型α因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合物、およびAga2p接合接着受容体またはアークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）グルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合物を使って、分泌するように指示することもできる。発現したポリペプチドが分泌経路を出た時に、発現したポリペプチドから、融合された配列を除去するために、プロテアーゼ切断部位、例えばKex-2プロテアーゼの切断部位を、工作することができる。酵母はAsn-X-Ser/Thrモチーフにおいてグリコシル化を行う能力も有する。
【０２４７】
c．昆虫細胞
昆虫細胞、特にバキュロウイルス発現を用いるものは、ヒアルロニダーゼポリペプチドなどのポリペプチドを発現させるのに有用である。昆虫細胞は高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物によって使用される翻訳後修飾の大半を行う能力を有する。バキュロウイルスは宿主域が制限されており、それが安全性を向上させ、真核細胞発現に関する規制上の懸念を減少させる。典型的な発現ベクターは、高レベル発現用のプロモーター、例えばバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターを使用する。よく使用されるバキュロウイルス系は、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多核体病ウイルス（AcNPV）およびカイコ（Bombyx mori）核多核体病ウイルス（BmNPV）などのバキュロウイルスと、例えばツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）に由来するSf9、シューダレチア・ユニパンクタ（Pseudaletia unipuncta）（A7S）およびオオカバマダラ（Danaus plexippus）（DpN1）などの昆虫細胞株とを含む。高レベル発現のために、発現すべき分子のヌクレオチド配列が、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合される。哺乳類分泌シグナルは昆虫細胞中で正確にプロセシングされ、これらのシグナルを使用することで、発現したタンパク質を培養培地中に分泌させることができる。加えて、細胞株シューダレチア・ユニパンクタ（A7S）およびオオカバマダラ（DpN1）は、哺乳動物細胞系と類似するグリコシル化パターンを有するタンパク質を生産する。
【０２４８】
昆虫細胞におけるもう一つの発現系は安定形質転換細胞の使用である。発現には、シュナイダー（Schneider）2（S2）細胞およびKc細胞（キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））およびC7細胞（ヒトスジシマカ（Aedes albopictus））などの細胞株を使用することができる。カドミウムまたは銅による重金属誘導の存在下で高レベルの発現を誘導するために、ショウジョウバエ（Drosophila）メタロチオネインプロモーターを使用することができる。発現ベクターは、典型的には、ネオマイシンやハイグロマイシンなどの選択可能マーカーの使用によって維持される。
【０２４９】
d．哺乳動物細胞
哺乳類発現系を使って、可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドなどのヒアルロナン分解酵素ポリペプチドを含むタンパク質を発現させることができる。発現コンストラクトは、アデノウイルスなどのウイルス感染によって、またはリポソーム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランなどの直接的DNA導入によって、また、エレクトロポレーションやマイクロインジェクションなどの物理的手段によって、哺乳動物細胞に導入することができる。哺乳動物細胞用の発現ベクターは、典型的には、mRNAキャップ部位、TATAボックス、翻訳開始配列（コザックコンセンサス配列）およびポリアデニル化要素を含む。選択可能マーカーなどのもう一つの遺伝子との2シストロン性発現が可能になるように、IRES要素も加えることができる。そのようなベクターは、多くの場合、高レベル発現のための転写プロモーター-エンハンサー、例えばSV40プロモーター-エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（RSV）の末端反復配列などを含む。これらのプロモーター-エンハンサーは多くの細胞タイプにおいて活性である。発現には、組織型および細胞型のプロモーターおよびエンハンサー領域も使用することができる。例示的なプロモーター/エンハンサー領域には、エラスターゼI、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳房腫瘍ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α1アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖2、およびゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子コントロールなどの遺伝子に由来するものが含まれるが、これらに限るわけではない。発現コンストラクトを有する細胞を選択し、維持するために、選択可能マーカーを使用することができる。選択可能マーカー遺伝子の例には、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）およびチミジンキナーゼが含まれるが、これらに限るわけではない。例えば、DHFR遺伝子を発現する細胞だけを選択するために、メトトレキサートの存在下で発現を行うことができる。TCR-ζやFcεRI-γなどの細胞表面シグナリング分子との融合により、細胞表面上で活性な状態にあるタンパク質の発現を指示することができる。
【０２５０】
哺乳類発現には、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞、サル細胞、ニワトリ細胞およびハムスター細胞を含む多くの細胞株を利用することができる。例示的細胞株には、CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、マウスNS0（非分泌性）および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8、およびHKB細胞が含まれるが、これらに限るわけではない。細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製を容易にする無血清培地に適応した細胞株も利用することができる。その例にはCHO-S細胞（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド、カタログ番号11619-012）および無血清EBNA-1細胞株（Phamら (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42）が含まれる。発現量が最大になるように最適化された特別な培地での成長に適応した細胞株も利用できる。例えばDG44 CHO細胞は、動物性産物を含まない合成培地における懸濁培養での成長に適応している。
【０２５１】
e．植物
トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物を使って、タンパク質（例えば本明細書に記載する任意のタンパク質）を発現させることができる。発現コンストラクトは、典型的には、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントや、PEGによるプロトプラストへの導入などといった直接的DNA導入を使って、またアグロバクテリウムによる形質転換を使って、植物に導入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結要素および翻訳制御要素を含むことができる。発現ベクターおよび形質転換技法は、通常は、アラビドプシス（Arabidopsis）やタバコなどの双子葉植物宿主と、トウモロコシやイネなどの単子葉植物宿主用とで、分類される。発現に使用される植物プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンテターゼプロモーター、リボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター、ならびにユビキチンーおよびUBQ3プロモーターが含まれる。形質転換細胞の選択と維持が容易になるように、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択可能マーカーが、しばしば使用される。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体（カルス組織）として培養維持するか、全植物体に再生させることができる。トランスジェニック植物細胞には、ヒアルロニダーゼポリペプチドを生産するように工学的に操作された藻類も含めることができる。植物は哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主中で生産されるタンパク質の選択に影響を及ぼしうる。
【０２５２】
3．精製技法
ヒアルロナン分解酵素ポリペプチド（例えば可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチド）または他のタンパク質を含むポリペプチドを宿主細胞から精製するための方法は、選択した宿主細胞と発現系に依存するであろう。分泌される分子の場合、タンパク質は一般に、細胞を除去した後に、培養培地から精製される。細胞内発現の場合は、細胞を溶解し、タンパク質を抽出物から精製することができる。トランスジェニック植物やトランスジェニック動物などのトランスジェニック生物を発現に使用する場合は、組織または臓器を出発材料として使って、溶解細胞抽出物を作ることができる。また、トランスジェニック動物による生産には、乳または卵におけるポリペプチドの生産を含めることができ、それらは、収集し、必要であれば、当技術分野における標準的方法を使って、タンパク質を抽出し、さらに精製することができる。
【０２５３】
可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドなどのタンパク質は、当技術分野において知られている標準的なタンパク質精製技法、例えば限定するわけではないが、SDS-PAGE、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、およびイオン交換クロマトグラフィー、例えばアニオン交換クロマトグラフィーなどを使って精製することができる。アフィニティ精製技法を利用することで、効率および調製物の純度を改善することもできる。例えばアフィニティ精製では、ヒアルロニダーゼ酵素に結合する抗体、受容体および他の分子を使用することができる。発現コンストラクトを工学的に操作して、mycエピトープ、GST融合物またはHis6などのアフィニティタグをタンパク質に付加し、それぞれmyc抗体、グルタチオン樹脂およびNi樹脂を使ってアフィニティ精製することもできる。純度は、ゲル電気泳動、染色および分光測光技法を含む、当技術分野において知られている任意の方法によって評価することができる。ここに提供される精製rHuPH20組成物は、典型的には、少なくとも70,000〜100,000単位/mg、例えば約120,000単位/mgの比活性を有する。比活性は、ポリマーなどで修飾すると、変動しうる。
【０２５４】
4．ヒアルロナン分解酵素ポリペプチドのPEG化
ポリエチレングリコール（PEG）は、生体材料、バイオテクノロジーおよび医学において広く使用されてきたが、それは主として、PEGが典型的には非免疫原性の生体適合性無毒性水溶性ポリマーであるという理由による（ZhaoおよびHarris, ACS Symposium Series 680:458-72, 1997）。薬物送達の領域では、免疫原性、タンパク質分解および腎クリアランスを低減し、溶解性を強化するために、PEG誘導体が、タンパク質への共有結合による取り付け（すなわち「PEG化」）に広く使用されてきた（Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995）。また、PEGは、溶解性を強化し、毒性を低減し、体内分布を改変するために、低分子量の比較的疎水性の薬物にも取り付けられてきた。PEG化薬物は、典型的には、溶液として注射される。
【０２５５】
密接に関連する応用は、薬物送達において使用するための架橋分解性PEGネットワークまたは製剤の合成である。分解性可溶性薬物担体の設計において使用したものと同じ化学の多くを、分解性ゲルの設計にも使用することができるからである（Sawhneyら, Macromolecules 26: 581-87, 1993）。2つの相補的ポリマーの溶液を混合することによって、高分子間複合体を形成させうることも知られている。そのような複合体は、一般に、関与するポリマー間の静電相互作用（ポリアニオン-ポリカチオン）および/または水素結合（ポリ酸-ポリ塩基）によって、かつ/または水性環境におけるポリマー間の疎水性相互作用によって、安定化される（Krupersら, Eur. Polym J. 32:785-790, 1996）。例えば、ポリアクリル酸（PAAc）の溶液とポリエチレンオキシド（PEO）の溶液を適正な条件下で混合すると、主として水素結合に基づく複合体の形成が起こる。生理的条件におけるこれらの複合体の解離が、遊離薬物（すなわち非PEG化物）の送達に使用されている。加えて、相補的ポリマーの複合体は、ホモポリマーからもコポリマーからも形成されている。
【０２５６】
当技術分野ではPEG化のための試薬が数多く記載されている。そのような試薬には、N-ヒドロキシスクシンイミジル（NHS）活性化PEG、スクシンイミジルmPEG、mPEG2-N-ヒドロキシスクシンイミド、mPEGスクシンイミジルα-メチルブタノエート、mPEGスクシンイミジルプロピオネート、mPEGスクシンイミジルブタノエート、mPEGカルボキシメチル3-ヒドロキシブタン酸スクシンイミジルエステル、ホモ二官能性PEG-スクシンイミジルプロピオネート、ホモ二官能性PEGプロピオンアルデヒド、ホモ二官能性PEGブチルアルデヒド、PEGマレイミド、PEGヒドラジド、p-ニトロフェニル-カーボネートPEG、mPEG-ベンゾトリアゾールカーボネート、プロピオンアルデヒドPEG、mPEGブチルアルデヒド、分岐mPEG2ブチルアルデヒド、mPEGアセチル、mPEGピペリドン、mPEGメチルケトン、mPEG「リンカーレス」マレイミド、mPEGビニルスルホン、mPEGチオール、mPEGオルトピリジルチオエステル、mPEGオルトピリジルジスルフィド、Fmoc-PEG-NHS、Boc-PEG-NHS、ビニルスルホンPEG-NHS、アクリレートPEG-NHS、フルオレセインPEG-NHS、およびビオチンPEG-NHSが含まれるが、これらに限るわけではない（例えばMonfardiniら, Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995；Veroneseら, J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997；U.S.5,672,662；U.S.5,932,462；U.S.6,495,659；U.S.6,737,505；U.S.4,002,531；U.S.4,179,337；U.S.5,122,614；U.S.5,324,844；U.S.5,446,090；U.S.5,612,460；U.S.5,643,575；U.S.5,766,581；U.S.5,795,569；U.S.5,808,096；U.S.5,900,461；U.S.5,919,455；U.S.5,985,263；U.S.5,990,237；U.S.6,113,906；U.S.6,214,966；U.S.6,258,351；U.S.6,340,742；U.S.6,413,507；U.S.6,420,339；U.S.6,437,025；U.S.6,448,369；U.S.6,461,802；U.S.6,828,401；U.S.6,858,736；U.S.2001/0021763；U.S.2001/0044526；U.S.2001/0046481；U.S.2002/0052430；U.S.2002/0072573；U.S.2002/0156047；U.S.2003/0114647；U.S.2003/0143596；U.S.2003/0158333；U.S.2003/0220447；U.S.2004/0013637;US 2004/0235734；WO0500360；U.S.2005/0114037；U.S.2005/0171328；U.S.2005/0209416；EP 1064951；EP 0822199；WO01076640；WO0002017；WO0249673；WO9428024；およびWO0187925参照）。
【０２５７】
ある例では、ポリエチレングリコールが約3kD〜約50kDの範囲、典型的には約5kD〜約30kDの範囲の分子量を有する。薬物へのPEGの共有結合による取り付け（「PEG化」と呼ばれている）は既知の化学合成技法によって達成することができる。例えば、タンパク質のPEG化は、NHS活性化PEGを適切な反応条件下でタンパク質と反応させることによって達成することができる。
【０２５８】
PEG化については数多くの反応が記述されているが、最も広く応用することができるものは、方向性を付与し、温和な反応条件を利用し、毒性の触媒または副生成物を除去するために甚だしい下流工程を必要としない。例えばモノメトキシPEG（mPEG）には反応性末端ヒドロキシルが1つしかないので、これを使用すると、結果として得られるPEGタンパク質生成物混合物の不均一性がある程度限定される。効率のよいタンパク質PEG化を達成するには、誘導体化されたPEGが求核攻撃をより受けやすくなるように、末端メトキシ基の反対側にあるヒドロキシル基を活性化することが、一般に必要である。攻撃する求核剤は、通常はリジン残基のε-アミノ基であるが、他のアミン（例えばN末端αアミンまたはヒスチジンの環アミン）も、局所条件が有利であるなら、反応しうる。リジンまたはシステインを1つだけ含有するタンパク質では、より一層制御された取り付けが可能である。後者の残基は、チオール特異的修飾のためのPEG-マレイミドによって、ターゲティングすることができる。あるいは、PEGヒドラジドを、過ヨウ素酸酸化したヒアルロナン分解酵素と反応させ、NaCNBH3の存在下で還元することもできる。より具体的に述べると、PEG化CMP糖を、適当なグリコシル-トランスフェラーゼの存在下で、ヒアルロナン分解酵素と反応させることができる。技法の一つは、いくつかのポリマー分子を問題のポリペプチドにカップリングする「PEG化」技法である。この技法を使用すると、免疫系は、抗体の形成を担うポリペプチド表面上のエピトープを認識することが困難になり、その結果、免疫応答が低減する。特定の生理学的作用が得られるように人体の循環系に直接導入されるポリペプチド（すなわち医薬）の場合、典型的な潜在的免疫応答はIgGおよび/またはIgM応答であり、一方、呼吸系を介して吸入されるポリペプチド（すなわち産業ポリペプチド）は、潜在的に、IgE応答（すなわちアレルギー応答）を引き起こしうる。免疫応答の低減を説明する理論の一つは、ポリマー分子が抗体形成につながる免疫応答の原因になるポリペプチドの表面上のエピトープを遮蔽するというものである。もう一つの理論または少なくとも部分的要因は、コンジュゲートが重いほど、免疫応答がより強く低減されるというものである。
【０２５９】
典型的には、PEG化ヒアルロニダーゼを含む、ここに提供されるPEG化ヒアルロナン分解酵素を作製するために、PEG部分をポリペプチドに共有結合を介してコンジュゲートする。PEG化の技法には、専用のリンカーおよびカップリング化学（例えばRobertsら, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002）、単一のコンジュゲート部位への複数のPEG部分の取り付け（例えば分岐PEGの使用による方法；例えばGuiottoら, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002参照）、部位特異的PEG化および/またはモノPEG化（例えばChapmanら, Nature Biotech. 17:780-783, 1999参照）、ならびに指定部位の酵素的PEG化（例えばSato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002参照）が含まれるが、これらに限るわけではない。当技術分野において記述されている方法および技法により、単一のタンパク質分子に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上のPEGまたはPEG誘導体が取り付けられているタンパク質を生産することができる（例えばU.S.2006/0104968参照）。
【０２６０】
PEG化ヒアルロニダーゼなどのPEG化ヒアルロナン分解酵素を作製するための例示的方法のPEG化の代表的実例として、PEGアルデヒド、PEGスクシンイミド、およびPEGカーボネートが、PEG部分（典型的にはスクシンイミジルPEG）をrHuPH20にコンジュゲートするために、それぞれ応用されている。例えばrHuPH20は、mPEG-スクシンイミジルプロピオネート（mPEG-SPA）、mPEG-スクシンイミジルブタノエート（mPEG-SBA）、および（「分岐」PEGを取り付けるために）mPEG2-N-ヒドロキシルスクシンイミドを含む例示的スクシンイミジルモノPEG（mPEG）試薬で、コンジュゲートされている。これらのPEG化スクシンイミジルエステルは、PEG基と活性化架橋剤との間にあって長さが相違する炭素バックボーンと、単一のまたは分岐したPEG基とを含有する。これらの相違を使って、例えば、異なる反応速度を与え、コンジュゲーションの過程でrHuPH20へのPEGの取り付けに利用することができる部位を潜在的に制限することができる。
【０２６１】
線状PEGまたは分岐PEGを含むスクシンイミジルPEG（上記のもの）は、rHuPH20にコンジュゲートすることができる。PEGを使って、ヒアルロニダーゼ1分子につき平均で約3〜6個または3〜6個のPEG分子を再現性よく含有するrHuPH20を作製することができる。そのようなPEG化rHuPH20組成物は、およそ25,000または30,000単位/mgタンパク質のヒアルロニダーゼ活性という比活性を有し、非PEG化rHuPH20を実質的に含まない組成物（非PEG化体は5％未満）が得られるように、容易に精製することができる。
【０２６２】
さまざまなPEG試薬を使って、例えばmPEG-SBA（30kD）、mPEG-SMB（30kD）、ならびにmPEG2-NHS（40kD）およびmPEG2-NHS（60kD）に基づく分岐型を使って、例示的形態のヒアルロナン分解酵素、特に可溶性ヒト組換えヒアルロニダーゼ（例えばrHuPH20）を調製することができる。PEG化型のrHuPH20は、NHS化学、ならびにカーボネートおよびアルデヒドを使って、次に挙げる試薬のそれぞれを使って作製されている：mPEG2-NHS-40K分岐型、mPEG-NHS-10K分岐型、mPEG-NHS-20K分岐型、mPEG2-NHS-60K分岐型；mPEG-SBA-5K、mPEG-SBA-20K、mPEG-SBA-30K；mPEG-SMB-20K、mPEG-SMB-30K；mPEG-ブチルアルデヒド；mPEG-SPA-20K、mPEG-SPA-30K；およびPEG-NHS-5K-ビオチン。Dow Chemical Corporationの一部門であるDowpharmaから入手することができるPEG試薬を使って、Dowpharmaのp-ニトロフェニル-カーボネートPEG（30kDa）およびプロピオンアルデヒドPEG（30kDa）でPEG化されたヒアルロニダーゼなどのPEG化ヒアルロニダーゼも調製されている。
【０２６３】
ある例において、PEG化には、可溶性ヒアルロニダーゼへのmPEG-SBA、例えばmPEG-SBA-30K（約30kDaの分子量を有するもの）またはPEGブタン酸誘導体の他のスクシンイミジルエステルのコンジュゲーションが含まれる。PEGブタン酸誘導体のスクシンイミジルエステル、例えばmPEG-SBA-30Kは、タンパク質のアミノ基に容易にカップリングする。例えば、m-PEG-SBA-30KとrHuPH20（これはサイズがおよそ60KDaである）の共有結合によるコンジュゲーションは、次のスキーム1に示すように、rHuPH20とmPEGの間に安定なアミド結合を与える。
スキーム1
【化２】
2013540103.tif 000007
【０２６４】
典型的には、適切な緩衝液（例えば130mM NaCl/10mM HEPES、pH6.8または70mMリン酸緩衝液、pH7）中で、mPEG-SBA-30Kまたは他のPEGを、ヒアルロナン分解酵素（場合によってはヒアルロニダーゼ）に、10：1のPEG：ポリペプチドモル比で加えた後、滅菌（例えば滅菌濾過）し、例えば低温室中、4℃で終夜撹拌することなどによって、コンジュゲーションを続ける。ある例では、コンジュゲートされたPEG-ヒアルロナン分解酵素を濃縮し、緩衝液交換する。
【０２６５】
PEGブタン酸誘導体のスクシンイミジルエステル、例えばmPEG-SBA-30Kをカップリングする他の方法も当技術分野において知られている（例えばU.S.5,672,662；U.S.6,737,505；およびU.S.2004/0235734参照）。例えば、ヒアルロナン分解酵素（例えばヒアルロニダーゼ）などのポリペプチドを、NHS活性化PEG誘導体に、ホウ酸緩衝液（0.1M、pH8.0）中、4℃で1時間の反応により、カップリングすることができる。その結果生じたPEG化タンパク質は限外濾過によって精製することができる。あるいは、ホスファターゼをmPEG-SBAと、0.2Mリン酸ナトリウムおよび0.5M NaCl（pH7.5）を含有する緩衝液中、4℃で30分間、混合することにより、ウシアルカリホスファターゼのPEG化を達成することもできる。未反応のPEGは、限外濾過によって除去することができる。もう一つの方法では、トリエチルアミンを加えてpH7.2〜9に上昇させた脱イオン水中で、ポリペプチドをmPEG-SBAと反応させる。その結果生じる混合物を室温で数時間撹拌することで、PEG化を完了させる。
【０２６６】
例えば動物由来のヒアルロニダーゼおよび細菌ヒアルロナン分解酵素を含むヒアルロナン分解ポリペプチドをPEG化するための方法は、当業者には知られている。例えば、ウシ精巣ヒアルロニダーゼおよびコンドロイチンABCリアーゼのPEG化が記載されている欧州特許EP0400472を参照されたい。また、米国特許出願公開第2006014968号には、ヒトPH20由来のヒトヒアルロニダーゼのPEG化が記載されている。例えば、PEG化ヒアルロナン分解酵素は、一般的には、1分子あたり少なくとも3つのPEG部分を含有している。例えば、ヒアルロナン分解酵素は5：1〜9：1、例えば7：1のPEG対タンパク質モル比を有することができる。
【０２６７】
E．コルチコステロイド
コルチコステロイドは、副腎皮質において産生されるステロイドホルモンの一種である。コルチコステロイドは、ストレス応答、免疫応答および炎症の調節、糖質代謝、タンパク質異化、血中電解質レベル、ならびに挙動などといった幅広い生理系に関与する。これらには、抗炎症剤であり、他の機能も数多く有しているグルココルチコイドと、主に腎臓への作用を介して塩および水分バランスを制御する鉱質コルチコイドが含まれる。
【０２６８】
グルココルチコイドは、グルココルチコイド受容体に結合するステロイドホルモン（例えばコルチコステロイド）の一種である。グルココルチコイドは、グルココルチコイド受容体に結合することによって、その作用を引き起こす。活性化グルココルチコイド複合体は、次に、核における抗炎症タンパク質の発現をアップレギュレートし、細胞質ゾルから核への他の転写因子のトランスロケーションを防止することによって細胞質ゾルにおける炎症誘発性タンパク質の発現を抑制する。
【０２６９】
ここに提供される方法または組合せでは、一般に、任意のコルチコステロイド、例えばグルココルチコイドを使用することができる。グルココルチコイドには、合成および非合成グルココルチコイドが含まれる。例示的グルココルチコイドには、アルクロメタゾン類、アルゲストン類、ベクロメタゾン類（例えばジプロピオン酸ベクロメタゾン）、ベタメタゾン類（例えばベタメタゾン17-吉草酸、酢酸ベタメタゾンナトリウム、リン酸ベタメタゾンナトリウム、吉草酸ベタメタゾン）、ブデソニド類、クロベタゾール類（例えばプロピオン酸クロベタゾール）、クロベタゾン類、クロコルトロン類（例えピバル酸クロコルトロン）、クロプレドノール類、コルチコステロン類、コルチゾン類およびヒドロコルチゾン類（例えば酢酸ヒドロコルチゾン）、コルチバゾール類、デフラザコート類、デソニド類、デスオキシメタゾン類、デキサメタゾン類（例えばデキサメタゾン21-リン酸、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム）、ジフロラゾン類（例えば二酢酸ジフロラゾン）、ジフルコルトロン類、ジフルプレドネート類、エノキソロン類、フルアザコート（fluazacort）類、フルクロロニド類、フルドロフルドロコルチゾン類（例えば酢酸フルドロコルチゾン）、フルメタゾン類（例えばピバル酸フルメタゾン）、フルニソリド類、フルオシノロン類（例えばフルオシノロンアセトニド）、フルオシノニド類、フルオコルチン類、フルオコルトロン類、フルオロメトロン類（例えば酢酸フルオロメトロン）、フルペロロン類（例えば酢酸フルペロロン）、フルプレドニデン類、フルプレドニゾロン類、フルランドレノリド類、フルチカゾン類（例えばプロピオン酸フルチカゾン）、ホルモコータル類、ハルシノニド類、ハロベタゾール類、ハロメタゾン類、ハロプレドン類、ヒドロコルタメート類、ヒドロコルチゾン類（例えばヒドロコルチゾン21-酪酸、アセポン酸ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンブテプレート、酪酸ヒドロコルチゾン、シピオン酸ヒドロコルチゾン、ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンプロブテート、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、吉草酸ヒドロコルチゾン）、エタボン酸ロテプレドノール、マジプレドン類、メドリゾン類、メプレドニゾン類、メチルプレドニゾロン類（アセポン酸メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、ヘミコハク酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム）、モメタゾン類（例えばフロ酸モメタゾン）、パラメタゾン類（例えば酢酸パラメタゾン）、プレドニカルベート類、プレドニゾロン類（例えばプレドニゾロン25-ジエチルアミノ酢酸、リン酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロン21-ヘミコハク酸、酢酸プレドニゾロン；ファルネシル酸プレドニゾロン、ヘミコハク酸プレドニゾロン、プレドニゾロン-21(β-D-グルクロニド）、メタスルホ安息香酸プレドニゾロン、プレドニゾロンステアグレート、テブト酸プレドニゾロン、テトラヒドロフタル酸プレドニゾロン）、プレドニゾン類、プレドニバル（prednival）類、プレドニリデン類、リメキソロン類、チキソコルトール類、トリアムシノロン類（例えばトリアムシノロンアセトニド、ト��アムシノロンベネトニド、トリアムシノロンヘキサアセトニド、トリアムシノロンアセトニド21-パルミチン酸、二酢酸トリアムシノロン）が含まれるが、これらに限るわけではない。これらのグルココルチコイドおよびその塩は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences（A. Osol編, Mack Pub. Co., ペンシルバニア州イーストン（第16版1980年））に詳述されている。
【０２７０】
いくつかの例では、グルココルチコイドが、コルチゾン類、デキサメタゾン類、ヒドロコルチゾン類、メチルプレドニゾロン類、プレドニゾロン類およびプレドニゾン類の中から選択される。ある特定例では、グルココルチコイドがデキサメタゾンである。
【０２７１】
F．抗ヒアルロナン剤の有害作用を緩和するためのコルチコステロイドの使用
PEG化ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤による処置が誘発する有害な筋骨格作用を排除または低減するための、コルチコステロイド、特にグルココルチコイド、例えばデキサメタゾンによる、経口的もしくは静脈内的処置の方法、またはそれらの使用が、ここに提供される。これらの方法では、コルチコステロイドが、ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤の治療効果に影響を及ぼさない投与レジームまたは量で使用される。例えば、ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤は、特にPEG化ヒアルロナン分解酵素などのポリマーコンジュゲート体は、ヒアルロナン関連疾患または状態の単独療法または併用療法に使用することができる（例えば米国特許出願公開第2010003238号および国際出願公開WO2009128917参照）。例えば、コルチコステロイドは、セクションHにおいて述べるようながんなどのヒアルロナン関連疾患またはヒアルロナン関連状態の処置に関連する副作用または有害事象を緩和するために、特に単独療法で、または治療効力を示すことがここで見いだされた低用量PEG化ヒアルロナン分解酵素（例えばPEGPH20）と共に併用療法で、使用することができる。投与された抗ヒアルロナン剤の副作用を緩和または低減するためのコルチコステロイドの医薬組成物、投与スキーム、および投与手段も、ここに提供される。これらの組成物は、別々に提供することも、キットの一部として一緒に提供することもできる。
【０２７２】
1．医薬組成物および製剤
コルチコステロイド、特にデキサメタゾンなどのグルココルチコイドを含有する医薬組成物が、ここに提供される。グルココルチコイドなどのコルチコステロイドは、抗ヒアルロナン剤、例えばPEG化ヒアルロニダーゼによる、ヒアルロナン関連疾患またはヒアルロナン関連障害の処置に関連する有害副作用を緩和するために、PEG化ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤を含有する医薬組成物と共製剤化または共投与することができる。
【０２７３】
抗ヒアルロナン剤、例えばPEG化ヒアルロニダーゼなどのPEG化ヒアルロナン分解酵素の医薬組成物も、ここに提供される。がんなどのヒアルロナン関連疾患またはヒアルロナン関連状態に関連する疾患または障害を処置するための第2の作用剤を含有する医薬組成物も、ここに提供される。そのような作用剤の代表例には、薬物、ポリペプチド、核酸、抗体、ペプチド、小分子、遺伝子治療ベクター、ウイルスおよび他の治療剤を含む抗がん剤が含まれるが、これらに限るわけではない。PEGPH20などのPEG化ヒアルロニダーゼを含むPEG化ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤は、過剰なまたは蓄積したヒアルロナンと関連する体内の所望する部位または組織へのその送達を強化するために、そのような第2作用剤の医薬製剤と共製剤化または共投与することができる。
【０２７４】
医薬上許容される組成物は、規制当局または他の機関の承認を考慮して調製され、動物およびヒトにおける使用に関する一般に認められた薬局方に従って調製される。化合物は、溶液剤、懸濁剤、散剤、または徐放性製剤など、経口投与および静脈内投与のいずれかのための任意の適切な医薬調製物に製剤化することができる。典型的には、化合物は、当技術分野において周知の技法および手法を使って、医薬組成物に製剤化される（例えばAnsel「Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms」第4版, 1985, 126参照）。製剤は投与の様式に適合すべきである。
【０２７５】
ある例では、医薬調製物が、液状、例えば溶液剤、シロップ剤または懸濁剤であることができる。液状で提供する場合、医薬調製物は、使用前に治療有効濃度に希釈される濃縮調製物として提供することができる。そのような液状調製物は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えばレシチンまたはアラビアゴム）；非水性媒体（例えばアーモンド脂、油状エステル、または分画植物油）；および保存剤（例えばメチルもしくはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの医薬上許容される添加剤を使って、従来の手段によって調製することができる。もう一つの例では、使用前に水または他の適切な媒体で再構成するための凍結乾燥型として、医薬調製物を提示することができる。
【０２７６】
医薬調製物は、組成物（例えばコルチコステロイドまたはPEG化ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤）と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体などの担体を含むことができる。適切な医薬担体の例は、E.W. Martin編「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、治療有効量の化合物または作用剤を、一般的には精製された形態または部分精製された形態で、患者に適正に投与するための形態になるように、適切な量の担体と共に含有するだろう。そのような医薬担体は、滅菌された液体、例えば水および油（石油由来、動物由来、植物由来の油または合成油を含む）、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油であることができる。水は典型的な担体である。食塩溶液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液も液状担体として、特に注射用溶液剤に、使用することができる。組成物は、活性成分と共に、希釈剤、例えばラクトース、スクロース、リン酸二カルシウム、またはカルボキシメチルセルロース；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク；ならびに結合剤、例えばデンプン、アラビアゴムなどの天然ゴム、ゼラチン、グルコース、糖みつ、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当業者に知られる他の同様の結合剤を含有することができる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、穀粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールが含まれる。例えば適切な賦形剤は、水、食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールなどである。組成物は、所望であれば、他の微量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、安定剤、溶解促進剤、および他の同様の作用剤、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンおよびシクロデキストリンなども含有することができる。
【０２７７】
非経口調製物に使用される医薬上許容される担体には、水性媒体、非水性媒体、抗微生物剤、等張化剤、緩衝剤、酸化防止剤、局所麻酔薬、懸濁化剤および分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤またはキレート剤、および他の医薬上許容される物質が含まれる。水性媒体の例には、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張性デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロースおよび乳酸加リンゲル注射液が含まれる。非水性非経口媒体には、植物由来の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油およびラッカセイ油が含まれる。複数回用量容器に包装された非経口調製物には、静細菌濃度または静真菌濃度の抗微生物剤（これには、フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、p-ヒドロキシ安息香酸メチルおよびプロピルエステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムが含まれる）を加えることができる。等張化剤には塩化ナトリウムおよびデキストロースが含まれる。緩衝剤にはリン酸塩およびクエン酸塩が含まれる。酸化防止剤には硫酸水素ナトリウムが含まれる。局所麻酔薬には塩酸プロカインが含まれる。懸濁化剤および分散剤にはナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンが含まれる。乳化剤にはPolysorbate 80（TWEEN80）が含まれる。金属イオンの封鎖剤またはキレート剤にはEDTAが含まれる。医薬担体には、水混和性媒体用のエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール、ならびにpH調節用の水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸も含まれる。
【０２７８】
注射剤は、従来の形態で、液状の溶液剤もしくは懸濁剤として、または注射前に液体に溶解または懸濁するのに適した固形、または乳剤として調製することができる。前立腺内投与用の調製物には、すぐに注射できる状態の滅菌溶液剤、使用直前に溶媒と混合する準備ができた状態の滅菌乾燥可溶性製品、例えば凍結乾燥粉末剤（皮下注射用錠剤を含む）、すぐに注射できる状態の滅菌懸濁剤、使用直前に媒体と混合する準備ができた状態の滅菌乾燥不溶性製品、滅菌乳剤が含まれる。溶液剤は水性または非水性であることができる。
【０２７９】
2．投薬量および投与
ここに提供される方法および使用では、投与される抗ヒアルロナン剤の副作用または有害作用を緩和、低減または防止するような量で、コルチコステロイドが投与される。特定の副作用を引き起こすのは、特定の抗ヒアルロナン剤と投与経路との組合せであると、一般に理解されている。抗ヒアルロナン剤を使った処置によって観察される副作用の代表例は筋骨格副作用である。抗ヒアルロナン剤が有害副作用を引き起こす投薬量または投薬レジームを、当業者は、本明細書に記載するように、実験的に決定することができる（例えばセクションG参照）。実施例では、さまざまな対象およびモデルにおける有害事象を評価し、モニタリングするための方法を、PEGPH20の投与を例に挙げて説明する。典型的には、抗ヒアルロナン剤の量は、例えばHA合成の阻害またはHAの分解によって、治療効果を達成する量でもある。投与された抗ヒアルロナン剤に起因する観察された副作用を緩和、低減または防止するコルチコステロイドの量も、実験的に決定することができる。コルチコステロイドの量は、抗ヒアルロナン剤、投与経路、観察または測定された副作用、およびその特定患者または対象の関数である。
【０２８０】
抗ヒアルロナン剤およびコルチコステロイドは、経口、静脈内（IV）、皮下、筋肉内、腫瘍内、皮内、外用（topically）、経皮、直腸または表皮下（ただしこれらに限るわけではない）を含む任意の適切な投与経路によって投与することができる。本明細書において述べるとおり、局所（local）投与も、特に低用量の抗ヒアルロナン剤には、使用することができる。抗ヒアルロナン剤とコルチコステロイドの投与経路は、同じであっても、異なっていてもよい。抗ヒアルロナン剤の投与経路は、抗ヒアルロナン剤および処置すべき疾患または状態に依存する。同様に、コルチコステロイドの投与経路も、その特定コルチコステロイドおよび緩和しようとする副作用に依存する。典型的には、コルチコステロイドおよび抗ヒアルロナン剤の投与経路は、全身作用が達成されるようなものである。例えば、PEG化ヒアルロナン分解酵素は典型的には静脈内投与される。もう一つの例では、グルココルチコイドが、典型的には経口投与される。当業者に知られている任意の経路など、他の投与経路が考えられる。
【０２８１】
コルチコステロイドは、PEG化ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤とは逐次的に、断続的に、同時に、または同じ組成物に入れて投与することができる。組成物は、他の生物学的に活性な第2の作用剤または処置、例えば化学療法剤および生物学的作用剤と共に、逐次的に、断続的に、同時に、または同じ組成物に入れて投与することもできる。投与には放出制御系（放出制御製剤および器具放出制御、例えばポンプを利用するものを含む）も含めることができる。
【０２８２】
さらに、医薬活性剤の濃度は、所望の薬理学的効果をもたらす有効量が投与によって得られるように調節される。正確な用量は、当技術分野では知られているとおり、患者または動物の年齢、体重および状態に依存する。単位用量非経口調製物は、アンプル、バイアルまたは針付きシリンジに包装される。医薬活性剤を含有する液状の溶液剤または再構成された粉末調製物の体積は、疾患の重症度および包装用に選択した具体的製品に依存する。非経口投与用の調製物は全て、当技術分野において知られかつ実践されているように、滅菌状態でなければならない。
【０２８３】
医薬組成物は各投与経路に適した剤形に製剤化することができる。医薬的治療的に活性な作用剤およびその誘導体は、典型的には、1回量剤形または複数回量剤形として製剤化され、投与される。各単位用量は、所望する治療効果を生み出すのに十分な予め決定された量の治療活性剤を、必要な医薬担体、媒体または希釈剤と一緒に含有する。単位用量型の例には、アンプルおよびシリンジ、ならびに個別包装された錠剤またはカプセル剤が含まれる。単位用量型は、それを分割して投与するか、それを何倍かして投与することができる。複数回用量型は、複数の同じ1回量剤形が単一の容器に包装されていて、分離された単位用量型として投与されるものである。複数回用量型の例には、バイアル、錠剤もしくはカプセル剤の瓶、またはパイント瓶もしくはガロン瓶が含まれる。したがって、複数回用量型は、分離されずに包装された複数の単位用量である。一般に、0.005％〜100％の範囲の活性成分を含有し、残りが無毒性担体で構成されている剤形または組成物を、調製することができる。治療剤は、1回量使用または複数回量使用のための医薬組成物として、製剤化することができる。
【０２８４】
a．コルチコステロイド
コルチコステロイドは、PEG化ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤の投与の1つ以上の有害作用（特に有害な筋骨格作用）を緩和または低減するために、治療的に有効な量で投与される。治療有効量は、1つ以上の症状または有害作用を緩和、防止、排除または低減するのに十分な投薬量である。改善または成功した前処置の指標には、CTCAE尺度での関連スコアを顕在化させないことまたはCTCAE尺度での類別もしくは重症度の変化の決定が含まれる。
【０２８５】
コルチコステロイドは治療有効量で与えられる。治療有効濃度は、既知のインビトロ系またはインビボ（例えば動物モデル）系で試験することによって、実験的に決定することができる。例えば、有害作用を緩和するために投与すべき選ばれたコルチコステロイドの量は、標準的臨床技法によって決定することができる。加えて、至適投薬量範囲を同定するのに役立つように、動物モデルを使用することができる。実験的に決定することができる正確な投薬量は、その特定治療調製物、レジームおよび投与スケジュール、投与経路および疾患の重篤度（seriousness）に依存しうる。そのようなパラメータを評価する方法をセクションGで説明し、実施例に例示する。
【０２８６】
組成物における、選ばれた治療剤の濃度は、吸収、不活化および排泄率、物理化学的特徴、投薬スケジュール、および投与される量、ならびに当業者に知られている他の因子に依存する。例えば、正確な投薬量および処置の継続期間は、疾患または状態、処置される組織、患者または対象、および抗ヒアルロナン剤（量および投薬レジームを含む）に依存すると理解される。コルチコステロイドの用量は、患者の年齢および健康状態、抗ヒアルロナン剤投与（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素投与）、コルチコステロイドの力価、および投与経路にも依存して変動しうる。例えば、濃度および投薬量の値は、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）の治療的用量および投薬レジームと共に変動するであろう。さらにまた、コルチコステロイドは、所望の結果を達成するために、日単位、週単位、もしくは月単位で、またはより長い期間にわたって投与することができる。具体的投薬体積はさまざまであり、投薬レジーム、投与の頻度、および所望する投与の速度に依存する。濃度および投薬量の値は処置される個体の年齢によっても変動しうることに留意すべきである。
【０２８７】
正確な投薬量および処置の継続期間は、既知の試験プロトコールを使って実験的に決定するか、インビボまたはインビトロ試験データからの推測によって決定することができる。どの特定対象についても、個々の必要と、製剤を投与する人または製剤の投与を監督する人の判断とに応じて、具体的投薬レジメンを経時的に調節すべきであること、および本明細書に示す濃度範囲が例示に過ぎず、その範囲を限定しようとするものではないことを、さらに理解すべきである。一般に投薬レジメンは毒性を制限するように選ばれ、ここでは有害作用を緩和するように選ばれる。担当医には、毒性あるいは骨髄、肝臓もしくは腎臓または他の組織の機能障害ゆえに治療を終了し、中断し、またはより低い投薬量へと調節する方法およびそうすべき時がわかるであろうということにも、留意すべきである。逆に、担当医には、臨床応答が十分でない（毒性副作用がない）場合に、より高レベルへと処置を調節する方法およびそうすべき時もわかるであろう。治療剤の投与は、米国食品医薬品局によって設定された、または医師用医薬品便覧（Physician's Desk Reference）に公表されている、最大投薬量レベルを超えてはならない。
【０２８８】
異なるコルチコステロイドの間には力価の相違が存在するので、一般に、投与されるコルチコステロイドの用量は、その具体的コルチコステロイドに依存する（下記表4参照）。コルチコステロイドまたはグルココルチコイド、例えばデキサメタゾンは、経口的（錠剤、液体、または液状濃縮物）PO、静脈内的（IV）または筋肉内的に与えることができる。コルチコステロイドは、典型的には、ボーラスとして投与されるが、多くは、その用量が抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼ）の投与に関連する1つ以上の副作用を緩和するのに有効である限り、ある期間にわたって投与される。
［表4］グルココルチコイド投与
【表４】
2013540103.tif 000008
【０２８９】
コルチコステロイドは、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）の投与に関連する1つ以上の副作用を緩和するのに有効な任意の量で投与することができる。したがってコルチコステロイド、例えばグルココルチコイドは、例えば70kgの成人対象に対して1投与あたり、0.1〜100mg、0.1〜80mg、0.1〜60mg、0.1〜40mg、0.1〜30mg、0.1〜20mg、0.1〜15mg、0.1〜10mg、0.1〜5mg、0.2〜40mg、0.2〜30mg、0.2〜20mg、0.2〜15mg、0.2〜10mg、0.2〜5mg、0.4〜40mg、0.4〜30mg、0.4〜20mg、0.4〜15mg、0.4〜10mg、0.4〜5mg、0.4〜4mg、1〜20mg、1〜15mgもしくは1〜10mgまたはその前後の量で投与することができる。典型的には、グルココルチコイドなどのコルチコステロイドは、平均的な成人対象に対して1投与あたり、0.4〜20mgまたはその前後、例えば0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.75mg、0.8mg、0.9mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mgもしくは20mgまたはその前後の量で投与される。
【０２９０】
コルチコステロイドは、典型的には体重約70kg〜75kgの平均的な成人対象に対して、例えば0.001mg/kg（対象の重さ）、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.015mg/kg、0.02mg/kg、0.025mg/kg、0.03mg/kg、0.035mg/kg、0.04mg/kg、0.045mg/kg、0.05mg/kg、0.055mg/kg、0.06mg/kg、0.065mg/kg、0.07mg/kg、0.075mg/kg、0.08mg/kg、0.085mg/kg、0.09mg/kg、0.095mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.45mg/kg、0.50mg/kg、0.55mg/kg、0.60mg/kg、0.65mg/kg、0.70mg/kg、0.75mg/kg、0.80mg/kg、0.85mg/kg、0.90mg/kg、0.95mg/kg、1mg/kg、1.05mg/kg、1.1mg/kg、1.15mg/kg、1.20mg/kg、1.25mg/kg、1.3mg/kg、1.35mg/kgもしくは1.4mg/kgまたはその前後の投薬量で投与することができる。
【０２９１】
投与される投薬量は、そのコルチコステロイドの投与によって、PEG化ヒアルロニダーゼなどの抗ヒアルロナン剤の投与に関連する1つ以上の有害副作用が緩和される限り、さまざまであることができる。ある例では、グルココルチコイド、例えばデキサメタゾンの投薬量が、1処置サイクルごとに、逐次的に低下する投薬量で投与される。したがって、そのような処置レジームでは、コルチコステロイドの用量を漸減させる。例えばデキサメタゾンを抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼ）の投与前に4mgの初回用量で投与し、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼ）の各連続投与時には、用量が、次の抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼ）の投与では3mg、その次は抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼ）の投与1回につき2mg、そして次は、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼ）の投与1回につき1mgになるように、デキサメタゾンの用量を低下させる。コルチコステロイドの用量が抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼ）の投与に関連する1つ以上の副作用を低減するのに有効である限り、任意の用量が考えられる。
【０２９２】
投与の時間は、コルチコステロイドの投与がPEG化ヒアルロニダーゼなどの抗ヒアルロナン剤の投与に関連する1つ以上の有害副作用を緩和する限り、さまざまであることができる。コルチコステロイドは、抗ヒアルロナン剤、例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素とは逐次的に、断続的に、同時に、または同じ組成物に入れて投与することができる。例えば、コルチコステロイドは、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼ）の投与前または投与中に投与するか、抗ヒアルロナン剤の投与と同時に、または抗ヒアルロナン剤）の投与後に、投与することができる。もう一つの例では、コルチコステロイドと抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼ）とが断続的に投与される。一般に、コルチコステロイドは、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼ）の投与前に投与される。例えばコルチコステロイド、例えばデキサメタゾンなどのグルココルチコイドは、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）の投与の0.5分前、1分前、2分前、3分前、4分前、5分前、6分前、7分前、8分前、9分前、10分前、15分前、20分前、25分前、30分前、45分前、1時間前、2時間前、3時間前、4時間前、5時間前、6時間前、7時間前、8時間前、9時間前、10時間前、11時間前、12時間前、18時間前、24時間前、36時間前またはその前後もしくはそれ以上前に投与することができる。
【０２９３】
いくつかの例では、コルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）の投与と同時に投与される。この例では、コルチコステロイドを、抗ヒアルロナン剤、例えばPEG化ヒアルロニダーゼと一緒に、または別々に投与することができる。典型的には、コルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）とは別個に投与される。別の例では、コルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）の投与の0.5分後、1分後、2分後、3分後、4分後、5分後、6分後、7分後、8分後、9分後、10分後、15分後、20分後、25分後、30分後、45分後、1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後、6時間後、7時間後、8時間後、9時間後、10時間後、11時間後、12時間後、18時間後、24時間後、36時間後またはその前後もしくはそれ以上後に投与される。
【０２９４】
ある例では、コルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼ）の投与前に投与される。例えばコルチコステロイド、例えばグルココルチコイド、例えばデキサメタゾンは、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼ）の投与の1時間前に投与される。もう一つの例では、コルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）の投与の5分前に投与される。もう一つの例では、コルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼ）の投与前と投与後の両方に投与される。この例では、デキサメタゾンなどのコルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）の投与の直前（1〜5分前）と、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）の投与の8時間後に投与される。もう一つの例では、デキサメタゾンなどのコルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）の投与の1時間前と抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）の投与の8〜12時間後に投与される。
【０２９５】
コルチコステロイドの投与の時間が、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼ）の投与に関連する1つ以上の副作用を緩和する限り、任意の投与レジームが考えられる。加えて、コルチコステロイドの用量または投与レジームは、ヒアルロナン関連疾患または障害の処置における抗ヒアルロナン剤の治療効果を妨害または低減しないものである。
【０２９６】
b．抗ヒアルロナン剤
本明細書における方法では、抗ヒアルロナン剤に関連する有害事象を緩和または低減するために、コルチコステロイドが投与される。投与される抗ヒアルロナン剤の量は、筋骨格副作用などの有害副作用をもたらすまたは引き起こす量である。典型的には、ヒアルロナン分解酵素の用量は、ヒアルロナン関連疾患または状態の処置において治療効果も達成する用量である。したがって抗ヒアルロナン剤の組成物は、治療上有用な効果を発揮するのに十分な量で含まれている。活性剤を含有する組成物は医薬上許容される担体を含むことができる。抗ヒアルロナン剤の組成物は、第2の作用剤も含むことができる。一般に、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）の投与（量および投与レジーム）が、コルチコステロイド（例えばグルココルチコイド）の投与（量および投与レジーム）を決定することになる。
【０２９７】
抗ヒアルロナン剤の治療有効濃度は、その化合物を、ここに提供されるアッセイのような既知のインビトロ系またはインビボ系で試験することによって、実験的に決定することができる。例えば、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼなどのPEG化ヒアルロナン分解酵素）の濃度は、その複合体の吸収、不活化および排泄率、複合体の物理化学的特徴、投薬スケジュール、および投与される量、ならびに当業者に知られている他の因子に依存する。例えば、正確な投薬量および処置の継続期間は、処置される組織、処置される疾患または状態、投与経路、患者または対象、およびその特定抗ヒアルロナン剤に依存し、既知の試験プロトコールを使って実験的に決定するか、インビボまたはインビトロ試験データからの推測によって決定するか、かつ/またはその特定作用剤の既知の投与レジームから決定することができると理解される。疾患または状態、例えばヒアルロナン関連疾患または状態、例えば高HA腫瘍を処置するために投与すべき抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロニダーゼなどのPEG化ヒアルロナン分解酵素）の量は、標準的臨床技法によって決定することができる。加えて、至適投薬量範囲を同定するのに役立つように、インビトロアッセイおよび動物モデルを使用することができる。実験的に決定することができる正確な投薬量は、その特定酵素、投与経路、処置すべき疾患のタイプおよび疾患の重篤度に依存しうる。
【０２９８】
例えば、ヒアルロナン関連疾患および状態を処置するための作用剤および処置、例えば抗がん剤は、当技術分野においてよく知られている（例えば米国特許出願公開第20100003238号およびPCT出願国際公開番号WO2009/128917参照）。したがって、組成物中のヒアルロナン分解酵素（例えばヒアルロニダーゼ）などの抗ヒアルロナン剤または他の第2作用剤の投薬量は、所与の投与経路におけるその作用剤に関する標準的投与レジームに基づいて選択することができる。また、下記セクションHで述べるように、例えば、はるかに低用量のヒアルロナン分解酵素が、ヒアルロナン関連疾患および状態の処置に治療有効性を示すことが、ここに見いだされる。したがって、低用量のヒアルロナン分解酵素、例えばPEG化PH20などのポリマー修飾ヒアルロナン分解酵素を用いる投薬レジメンを使って、ヒアルロナン関連疾患および状態を処置することができる。本明細書において述べるとおり、そのような投薬量または投薬レジメンは、いずれも、筋骨格副作用などの有害事象に関連する場合があり、その有害事象は、コルチコステロイドの前投薬、同時投与および/または後投薬によって緩和することができる。
【０２９９】
抗ヒアルロナン剤の有効量の例は、体重1kgあたり0.01μg〜100gの範囲の用量である。例えば、抗ヒアルロナン剤の有効量は、体重1kgあたり0.01μg〜100mg、例えば体重1kgあたり0.01μg〜1mg、体重1kgあたり1μg〜100μg、体重1kgあたり1μg〜10μg、または体重1kgあたり0.01mg〜100mgの範囲の用量である。例えば、有効量には、少なくとも0.01μg、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900もしくは1000μg/kg体重または少なくともその前後、あるいは0.01μg、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900もしくは1000μg/kg体重またはその前後が含まれる。有効量の他の例には、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100g/kg体重が含まれる。例えば抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ（例えばPEGPH20などのPEG化ヒアルロニダーゼ）は、0.1μg/kg〜1mg/kg、例えば0.5μg/kg〜100μg/kg、0.75μg/kg〜15μg/kg、0.75μg/kg〜7.5μg/kgもしくは1.0μg/kg〜3.0μg/kgまたはその前後の量で投与することができる。別の例では、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ（例えばPEGPH20などのPEG化ヒアルロニダーゼ）を、1mg/kg〜500mg/kg、例えば100mg/kg〜400mg/kg、例えば200mg/kgまたはその前後の量で投与することができる。一般に、組成物は、0.5mg〜100グラムの抗ヒアルロナン剤、例えば20μg〜1mg、例えば100μg〜0.5mgを含有するか、1mg〜1グラム、例えば5mg〜500mgを含有することができる。
【０３００】
上記の用量または組成物は、1回量投与用または複数回量投与用であることができる。上記の用量または組成物は、単回投与で1回投与するか、週に数回、週に2回、15日、16日、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30日ごと、月に1回、年に数回、または年に1回投与することができる。別の例では、上記の用量または組成物を分割して1回、週に数回、週に2回、15日、16日、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30日ごと、月に1回、年に数回または年に1回投与することができる。抗ヒアルロナン組成物は、液状組成物として製剤化するか、凍結乾燥することができる。組成物は、錠剤またはカプセル剤として製剤化することもできる。
【０３０１】
以下に、本明細書に記載する方法において使用するための例示的抗ヒアルロナン剤の投薬量および投薬レジメンを説明する。抗ヒアルロナン剤は、単剤療法において単独で使用するか、HA関連疾患または状態の処置に使用するための他の作用剤と組み合わせて使用することができる。本明細書において項を改めて説明するように、本明細書における方法および使用の特定例では、その作用剤が、抗ヒアルロナン剤の処置に関連する副作用を緩和するために、コルチコステロイドと組み合わせて投与される。
【０３０２】
i．レフルノミドおよび誘導体
一例として、レフルノミド、またはその誘導体は、一般に、1〜100mgの活性薬、例えば1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90または100mgの薬物を含有する錠剤として入手することができる。ヒアルロナン関連疾患および状態（例えば関節リウマチ）の処置には、1日あたり10〜500mg、典型的には1日あたり100mgの量で投与される。この投薬量を、疾患または状態の処置に必要な限り継続するか、逐次的に低用量になるように投薬量を漸減または低減することができる。例えば、関節リウマチの処置の場合、レフルノミドは、1日あたり100mgの初回負荷量で3日間投与した後、20mg/日の継続量で投与することができる。
【０３０３】
ii．ヒアルロナン分解酵素
例えば、PEG化ヒアルロナン分解酵素（例えばヒアルロニダーゼ）などのヒアルロナン分解酵素は、例えば静脈内（IV）的に、筋肉内的に、または他の任意の全身性経路によって、全身性に投与することができる。特定例では、低用量を局所的に与えることもできる。例えば、ヒアルロナン分解酵素、例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素、例えばPEG化ヒアルロニダーゼ（例えばPH20）の局所投与には、腫瘍内投与、動脈注射（例えば肝動脈）、腹腔内投与、膀胱内投与、および、より低い絶対用量で局所作用を増加させることができるがん治療に使用される他の局所経路が含まれる。
【０３０４】
例示的投薬量範囲は、0.3単位/kg〜320,000単位/kg、例えば10単位/kg〜320,000単位/kgまたはその前後のPEG化ヒアルロニダーゼ、または機能的に等価な量の他のPEG化ヒアルロナン分解酵素である。活性の単位は、標準的活性、例えばヒアルロニダーゼ活性をアッセイする微小濁度アッセイにおいて測定される活性に標準化されると、ここでは理解される。PEG化可溶性ヒアルロニダーゼは、そのようにコンジュゲート化されていない天然可溶性ヒアルロニダーゼと比較して低い総タンパク質1mgあたりの活性を示しうる（すなわち、低い比活性を示す）。例えば、例示的rHuPH20調製物は120,000単位/mgの比活性を示し、PEG化型のrHuPH20は32,000単位/mgまたはその前後の比活性を示す。典型的には、PEG化型のヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばrHuPH20は、約18,000U/mgまたはその前後と45,000U/mgまたはその前後との間の範囲にある比活性を示す。ある例では、PEG-ヒアルロナン分解酵素を、例えば、PEG対タンパク質のモル比が5：1〜9：1、例えば7：1である、112,000U/mLで3.5mg/mL（約32,000U/mg）の保存液として提供するか、またはそれより希釈された形態で提供することができる。ここでは投薬量は単位を基準とすることができる。
【０３０５】
例えば、PEG化ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ、例えばPEGPH20は、週に2回、週に1回、または21日ごとに1回、静脈内投与することができる。典型的には、PEG化ヒアルロナン分解酵素が、週に2回投与される。投与のサイクルは、所定の期間、一般的には3週間または4週間にわたることができる。投与のサイクルは、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、1年を超える期間またはそれ以上にわたる投薬レジームにおいて繰り返すことができる。一般に、投与のサイクルは、処置医の裁量で繰り返され、疾患または状態の寛解、疾患または状態の重症度、有害事象などの因子および他の因子に依存しうる。別の例では、後続の投与サイクルにおいて、頻度を下げてヒアルロナン分解酵素を投与することができる。例えば、第1サイクルでは、ヒアルロナン分解酵素を4週間にわたって週に2回投与し、それ以降の投与サイクルでは、ヒアルロナン分解酵素を週に1回または2週間ごとに1回、3週間ごとに1回（例えば21日ごとに1回）または4週間ごとに1回投与する。本明細書において述べるとおり、コルチコステロイドの用量または投与レジームは、ヒアルロナン分解酵素の投与レジームに依存する。
【０３０６】
投薬量は疾患および患者に依存して変動しうるが、PEG化ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、一般に、0.01μg/kg〜25mg/kg、例えば0.0005mg/kg（0.5μg/kg）〜10mg/kg（320,000U/kg）、例えば0.02mg/kg〜1.5mg/kgの範囲、例えば0.05mg/kgの量、またはその前後の量で投与される。PEG化ヒアルロニダーゼは、典型的には体重約70kg〜75kgの平均的な成人対象に対して、例えば0.0005mg/kg（対象の重さ）、0.0006mg/kg、0.0007mg/kg、0.0008mg/kg、0.0009mg/kg、0.001mg/kg、0.0016mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.016mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg.kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mg/kg、9mg/kg、9.5mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kgまたはその前後もしくはそれ以上の投薬量で投与することができる。特定例では、本明細書のセクションHにおいて述べるように、ヒアルロナン分解酵素が、さらに低量で、例えば20μg/kg未満、例えば0.01μg/kg〜15μg/kg、0.05μg/kg〜10μg/kg、0.75μg/kg〜7.5μg/kgまたは1.0μg/kg〜3.0μg/kgで投与される。
【０３０７】
ここに提供されるPEG化ヒアルロニダーゼ（例えばPH20）などのヒアルロナン分解酵素、例えばPEGPH20は、1単位/kg〜800,000単位/kg、例えば10〜800,000単位/kg、10〜750,000単位/kg、10〜700,000単位/kg、10〜650,000単位/kg、10〜600,000単位/kg、10〜550,000単位/kg、10〜500,000単位/kg、10〜450,000単位/kg、10〜400,000単位/kg、10〜350,000単位/kg、10〜320,000単位/kg、10〜300,000単位/kg、10〜280,000単位/kg、10〜260,000単位/kg、10〜240,000単位/kg、10〜220,000単位/kg、10〜200,000単位/kg、10〜180,000単位/kg、10〜160,000単位/kg、10〜140,000単位/kg、10〜120,000単位/kg、10〜100,000単位/kg、10〜80,000単位/kg、10〜70,000単位/kg、10〜60,000単位/kg、10〜50,000単位/kg、10〜40,000単位/kg、10〜30,000単位/kg、10〜20,000単位/kg、10〜15,000単位/kg、10〜12,800単位/kg、10〜10,000単位/kg、10〜9,000単位/kg、10〜8,000単位/kg、10〜7,000単位/kg、10〜6,000単位/kg、10〜5,000単位/kg、10〜4,000単位/kg、10〜3,000単位/kg、10〜2,000単位/kg、10〜1,000単位/kg、10〜900単位/kg、10〜800単位/kg、10〜700単位/kg、10〜500単位/kg、10〜400単位/kg、10〜300単位/kg、10〜200単位/kg、10〜100単位/kg、16〜600,000単位/kg、16〜500,000単位/kg、16〜400,000単位/kg、16〜350,000単位/kg、16〜320,000単位/kg、16〜160,000単位/kg、16〜80,000単位/kg、16〜40,000単位/kg、16〜20,000単位/kg、16〜16,000単位/kg、16〜12,800単位/kg、16〜10,000単位/kg、16〜5,000単位/kg、16〜4,000単位/kg、16〜3,000単位/kg、16〜2,000単位/kg、16〜1,000単位/kg、16〜900単位/kg、16〜800単位/kg、16〜700単位/kg、16〜500単位/kg、16〜400単位/kg、16〜300単位/kg、16〜200単位/kg、16〜100単位/kg、160〜12,800単位/kg、160〜8,000単位/kg、160〜6,000単位/kg、160〜4,000単位/kg、160〜2,000単位/kg、160〜1,000単位/kg、160〜500単位/kg、500〜5000単位/kg、1000〜100,000単位/kgもしくは1000〜10,000単位/kg（投与を受ける対象の重さ）またはその前後の量で投与することができる。いくつかの例では、ここに提供されるPEG化ヒアルロニダーゼ（例えばPH20）などのヒアルロナン分解酵素、例えばPEGPH20を、1単位/kg〜1000単位/kg、1単位/kg〜500単位/kgもしくは10単位/kg〜50単位/kgまたはその前後の量で投与することができる。
【０３０８】
一般に、PEG化ヒアルロニダーゼの比活性が18,000U/mg〜45,000U/mgまたはその前後である場合は、一般に、対象の重さあたり1単位/kg（U/kg）、2U/kg、3U/kg、4U/kg、5U/kg、6U/kg、7U/kg、8U/kg、8U/kg 10U/kg、16U/kg、32U/kg、64U/kg、100U/kg、200U/kg、300U/kg、400U/kg、500U/kg、600U/kg、700U/kg、800U/kg、900U/kg、1,000U/kg、2,000U/kg、3,000U/kg、4,000U/kg、5,000U/kg、6,000U/kg、7,000U/kg、8,000U/kg、9,000U/kg、10,000U/kg、12,800U/kg、20,000U/kg、32,000U/kg、40,000U/kg、50,000U/kg、60,000U/kg、70,000U/kg、80,000U/kg、90,000U/kg、100,000U/kg、120,000U/kg、140,000U/kg、160,000U/kg、180,000U/kg、200,000U/kg、220,000U/kg、240,000U/kg、260,000U/kg、280,000U/kg、300,000U/kg、320,000U/kg、350,000U/kg、400,000U/kg、450,000U/kg、500,000U/kg、550,000U/kg、600,000U/kg、650,000U/kg、700,000U/kg、750,000U/kg、800,000U/kgまたはその前後もしくはそれ以上が投与される。
【０３０９】
いくつかの態様では、血漿中に少なくとも3U/mLのPEG化ヒアルロニダーゼが維持されるように、PEG化ヒアルロナン分解酵素が製剤化され、投与される（例えば米国特許出願公開第20100003238号および国際特許出願公開番号WO2009128917参照）。例えば、PEG化可溶性ヒアルロニダーゼは、血漿中に少なくとも約3U/mLまたはその前後、一般に3U/mL〜12U/mLまたはそれ以上、例えば4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、11U/mL、12U/mL、13U/mL、14U/mL、15U/mL、16U/mL、17U/mL、18U/mL、19U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、40U/mL、45U/mL、50U/mLのレベルまたは少なくとも前記レベルもしくはその前後もしくはそれ以上を維持するのに十分な量で、全身性投与用に製剤化される。一般に、本発明においては、血漿中に少なくとも3U/mLのヒアルロニダーゼを維持するために、0.02mg/kg（対象の重さ）、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg.kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kgまたはその前後もしくはそれ以上が投与される。一般に、修飾ヒアルロニダーゼの比活性が20,000U/mg〜60,000U/mgまたはその前後、一般に35,000U/mgまたはその前後である場合は、60,000U；70,000U；80,000U；90,000U；100,000U；200,000U；300,000U；400,000U；500,000U；600,000U；700,000U；800,000U；900,000U；1,000,000U；1,500,000U；2,000,000U；2,500,000U；3,000,000U；3,500,000U；4,000,000Uまたはそれ以上が投与される。そのようなレベルを維持するために、投与は毎日、週に数回、週に2回、毎週または毎月であることができる。
【０３１０】
血中に少なくとも3U/mLのヒアルロニダーゼを維持するためのPEG化ヒアルロン分解酵素、例えばPEG化PH20の量を決定することは、当業者の技術水準内にある。十分な量のヒアルロニダーゼが血液中に存在することを保証するために、血中のヒアルロニダーゼのレベルを経時的にモニタリングすることができる。血漿中のヒアルロニダーゼを測定するための当業者に知られている任意のアッセイを行うことができる。例えば、本明細書の実施例において述べる微小濁度アッセイまたは酵素アッセイを、血漿中のタンパク質に対して行うことができる。血漿は通常ヒアルロニダーゼ酵素を含有すると理解される。そのような血漿ヒアルロニダーゼ酵素は、典型的には、酸性pHにおいて活性を有する（米国特許第7,105,330号）。したがって、修飾酵素による処置の前に、ヒアルロニダーゼの血漿レベルを決定し、ベースラインとして使用すべきである。その後の処置後血漿中ヒアルロニダーゼレベルの測定値を、処置前のレベルと比較することができる。あるいは、通常は酸性pHにおいて活性を示す血漿中の内在性リソソームヒアルロニダーゼ活性を抑制するpH条件下で、アッセイを行うこともできる。こうして、修飾可溶性ヒアルロニダーゼが中性pHにおいて活性である場合（例えばヒトPH20）は、修飾中性活性可溶性ヒアルロニダーゼのレベルだけが測定される。
【０３１１】
別の例では、本明細書のセクションHにおいて述べるように、PEG化ヒアルロナン分解酵素は、血中に検出可能なレベルのヒアルロニダーゼが維持されていないヒアルロナン関連疾患または状態を処置するための治療効果を有することがここに見いだされた低用量で、製剤化され、投与される。例えば、PEG化可溶性ヒアルロニダーゼは、20μg/kg未満、例えば0.01μg/kg〜15μg/kg、0.05μg/kg〜10μg/kg、0.75μg/kg〜7.5μg/kgまたは1.0μg/kg〜3.0μg/kg、例えば0.01μg/kg（対象の重さ）、0.02μg/kg、0.03μg/kg、0.04μg/kg、0.05μg/kg、1.0μg/kg、1.5μg/kg、2.0μg/kg、2.5μg/kg、3.0μg/kg、3.5μg/kg、4.0μg/kg、4.5μg/kg、5.0μg/kg、5.5μg/kg、6.0μg/kg、7.0μg/kg、7.5μg/kg、8.0μg/kg、9.0μg/kg、10.0μg/kg、12.5μg/kgもしくは15μg/kgまたはその前後である量で投与される。一般に、修飾ヒアルロニダーゼの比活性が20,000U/mg〜60,000U/mgまたはその前後、一般に35,000U/mgまたはその前後である場合は、200単位〜50,000（U）が投与され、例えば200U、300U；400U；500U；600U；700U；800U；900U；1,000U；1250U；1500U；2000U；3000U；4000U；5,000U；6,000U；7,000U；8,000U；9,000U；10,000U；20,000U；30,000U；40,000U；または50,000Uが投与される。そのようなレベルを維持するために、投与は毎日、週に数回、週に2回、毎週または毎月であることができる。
【０３１２】
典型的には、ここで考えられるPEG化ヒアルロニダーゼの注射体積または注入体積は、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mLまたはその前後もしくはそれ以上である。PEG化ヒアルロナン分解酵素、例えばPEG化ヒアルロニダーゼは、直接使用するために、または使用前に有効濃度に希釈するために、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、400U/mLもしくは500U/mLまたはその前後（または機能的に等価な量）の保存液として提供するか、または、例えば1000U/mL、2000単位/mL、3000U/mL、4000U/mL、5000U/mL、6000U/mL、7000U/mL、8000U/mL、9000U/mL、10,000U/mL、11,000U/mL、12,000U/mL、または12,800U/mLもしくはその前後の、さらに濃縮された形態で提供することができる。投与されるPEG化ヒアルロナン分解酵素、例えばPEG化ヒアルロニダーゼの体積は、要求される投薬量に依存するが、利用可能なヒアルロナン分解酵素（例えば可溶性ヒアルロニダーゼ）貯蔵製剤の濃度に依存してさまざまでありうる。例えば、PEG化ヒアルロニダーゼなどのPEG化ヒアルロナン分解酵素は、約50mLを上回る体積では投与されず、典型的には5〜30mLの体積で、一般的には約10mLを上回らない体積で投与されると、ここでは考えられる。PEG化ヒアルロニダーゼなどのPEG化ヒアルロナン分解酵素は、液状製剤または凍結乾燥製剤として提供することができる。凍結乾燥製剤は、高単位用量のPEG化ヒアルロナン分解酵素の貯蔵には理想的である。
【０３１３】
3．併用処置
抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素、例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素（例えばPEGPH20などのPEG化ヒアルロニダーゼ）は、例えばヒアルロナン関連疾患または状態を処置するために、併用処置において投与することができる。本明細書において述べるとおり、コルチコステロイドは、併用療法において、抗ヒアルロナン剤の副作用または有害事象を緩和するために投与することができる。
【０３１４】
例えば本明細書に記載する抗ヒアルロナン剤の組成物は、さらに、他の治療剤または医薬剤または処置、例えば手法、例えば、ヒアルロナン関連がんなどのヒアルロナン関連疾患または状態を処置するための作用剤または処置と一緒に、その前に、それとは断続的に、またはその後に、共製剤化または共投与することができる。そのような作用剤には、生物製剤、抗がん剤、小分子化合物、分散剤、麻酔薬、血管収縮薬および外科手術、およびそれらの組合せが含まれるが、これらに限るわけではない。疾患または状態の処置に利用することができるそのような他の作用剤および処置は、本明細書において例示するものを全て含めて、当業者には知られているか、または実験的に決定することができる。
【０３１５】
1または複数の第2の作用剤または処置の調製物は、一度に投与するか、いくつかの低用量に分割して、間隔をあけて投与することができる。選択された作用剤/処置調製物は、処置期間中に、例えば数時間、数日間、数週間または数ヶ月にわたって、1回以上投与することができる。いくつかの例では、継続的投与が有用である。正確な投薬量および投与の経過は適応および患者の認容性に依存すると理解される。一般に、ここでの第2作用剤/処置の投与レジームは、当業者に知られている。
【０３１６】
ある例では、抗ヒアルロナン剤、例えばPEG化ヒアルロニダーゼなどのPEG化ヒアルロナン分解酵素は、疾患または状態を処置するために抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）と第2の作用剤または処置とを投与することによる併用療法の一部として投与される。ある例では、PEG化ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤と第2の作用剤または処置は、共製剤化して一緒に投与することができる。もう一つの例では、抗ヒアルロナン剤、例えばPEG化ヒアルロニダーゼなどのPEG化ヒアルロナン分解酵素などが、第2の作用剤または処置調製物の後に、または断続的に、または同時に投与される。一般に、抗ヒアルロナン剤、例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素は、抗ヒアルロナン剤、例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素が、対象の細胞、組織または体液、例えば間質腔、細胞外マトリックス、腫瘍組織、血液または他の組織中のヒアルロン酸を低減または分解することができるように、第2の作用剤または処置調製物の投与前に投与される。例えば抗ヒアルロナン剤、例えば可溶性ヒアルロニダーゼなどのPEG化ヒアルロナン分解酵素は、第2作用剤調製物の投与の0.5分前、1分前、2分前、3分前、4分前、5分前、6分前、7分前、8分前、9分前、10分前、20分前、30分前、1時間前またはそれ以上前に投与することができる。いくつかの例では、抗ヒアルロナン剤、例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素が、第2作用剤調製物と一緒に投与される。当業者には理解されるであろうとおり、望ましい同時投与の近接性は、かなりの部分、その特定組織環境における作用剤の有効半減期および処置されるその特定疾患に依存し、適切なモデル、例えば適切な動物モデルにおいて、さまざまな時間に作用剤を投与した時の効果を試験することによって、容易に最適化することができる。場合によっては、抗ヒアルロナン剤、例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素、例えばPEG化ヒアルロニダーゼの投与の最適なタイミングが、60分を超えるであろう。
【０３１７】
抗がん剤および他の処置
抗がん剤または抗がん処置は、外科手術、放射線、薬物、化学療法剤、ポリペプチド、抗体、ペプチド、小分子または遺伝子治療ベクター、ウイルスまたはDNAであることができる。
【０３１８】
PEG化ヒアルロニダーゼなどのPEG化ヒアルロナン分解酵素の投与の後に、同時に、または前に投与することができる例示的抗がん剤には、次に挙げるものが含まれるが、これらに限るわけではない：アシビシン類；アビシン；アクラルビシン類；アコダゾール類；アクロニン類；アドゼレシン類；アルデスロイキン類；アレムツズマブ類；アリトレチノイン類（9-シス-レチノイン酸類）；アロプリノール類；アルトレタミン類；アルボシジブ類；アンバゾン類；アンボマイシン類；アメタントロン類；アミフォスチン類；アミノグルテチミド類；アムサクリン類；アナストロゾール類；アナキシロン類；アンシタビン類；アントラマイシン類；アパジコン類；アルギメスナ類；三酸化ヒ素類；アスパラギナーゼ類；アスペルリン類；アトリムスチン類；アザシチジン類；アゼテパ類；アゾトマイシン類；バノキサントロン類；バタブリン類；バチマスタット類；BCG生菌；ベナキシビン類；ベンダムスチン類；ベンゾデパ類；ベキサロテン類；ベバシズマブ；ビカルタミド類；ビエタセルピン類；ビリコダル類；ビサントレン類；ビサントレン類；ジメシル酸ビスナフィド類；ビゼレシン類；ブレオマイシン類；ボルテゾミブ類；ブレキナル類；ブロピリミン類；ブドチタン類；ブスルファン類；カクチノマイシン類；カルステロン類；カネルチニブ類；カペシタビン類；カラセミド類；カルベチマー類；カルボプラチン類；カルボコン類；カルモフール類；カルムスチン類とポリフェプロサン類；カルムスチン類；カルビシン類；カルゼレシン類；セデフィンゴール類；セレコキシブ類；セマドチン類；クロラムブシル類；シオテロネル類；シロレマイシン類；シスプラチン類；クラドリビン類；クランフェヌル類；クロファラビン類；クリスナトール類；シクロホスファミド類；シタラビンリポソーム製剤；シタラビン類；ダカルバジン類；ダクチノマイシン類；ダルベポエチンアルファ類；ダウノルビシンリポソーム製剤；ダウノルビシン類/ダウノマイシン類；ダウノルビシン類；デシタビン類；デニロイキンジフチトクス類；デクスニグルジピン類；デキソンナプラチン類；デクスラゾキサン類；デザグアニン類；ジアジコン類；ジプロスピジウム類；ジエノゲスト類；ジナリン類；ジセルモリド類；ドセタキセル類；ドフェキダル類；ドキシフルリジン類；ドキソルビシンリポソーム製剤；ドキソルビシンHCL；ドキソルビシンHCLリポソーム注射剤；ドキソルビシン類；ドロロキシフェン類；プロピオン酸ドロモスタノロン類；デュアゾマイシン類；エコムスチン類；エダトレキセート類；エドテカリン類；エフロルニチン類；エラクリダル類；エリナフィド類；エリオットB溶液類；エルサミトルシン類；エミテフル類；エンロプラチン類；エンプロマート類；エンザスタウリン類；エピプロピジン類；エピルビシン類；エポエチンアルファ類；エプタロプロスト類；エルブロゾール類；エソルビシン類；エストラムスチン類；エタニダゾール類；エトグルシド類；リン酸エトポシド類；エトポシドVP-16類；エトポシド類；エトプリン類；エクセメスタン類；エクシスリンド類；ファドロゾール類；ファザラビン類；フェンレチニド類；フィルグラスチム類；フロクスウリジン類；フルダラビン類；フルオロウラシル類；5-フルオロウラシル類；フルオキシメステロン類；フルロシタビン類；ホスキドン類；ホストリエシン類；ホストリエシン類；ホトレタミン類；フルベストラント類；ガラルビシン類；ガロシタビン類；ゲムシタビン類；ゲムツズマブ類/オゾガミシン類；ゲロキノール類；ギマテカン類；ギメラシル類；グロキサゾン類；グルフォスファミド類；酢酸ゴセレリン類；ヒドロキシ尿素類；イブリツモマブ類/チウキセタン類；イダルビシン類；イホスファミド類；イルモホシン類；イロマスタット類；メシル酸イマチニブ類；イメキソン類；インプロスルファン類；インジスラム類；インプロクォン類；インターフェロンアルファ-2a類；インターフェロンアルファ-2b類；インターフェロンアルファ類；インターフェロンベータ類；インターフェロンガンマ類；インターフェロン類；インターロイキン-2類および他のインターロイキン類（組換えインターロイキン類を含む）；イントプリシン類；イオベングアン類［131-I］；イプロプラチン類；イリノテカン類；イルソグラジン類；イクサベピロン類；ケトトレキサート類；L-アラノシン類；ランレオチド類；ラパチニブ類；レドキサントロン類；レトロゾール類；ロイコボリン類；ロイプロリド類；リューロプロレリン類（リュープロレリド類）；レバミソール類；レキサカルシトール類；リアロゾール類；ロバプラチン類；ロメトレキソール類；ロムスチン類/CCNU類；ロムスチン類；ロナファルニブ類；ロソキサントロン類；ラルトテカン類；マフォスファミド類；マンノスルファン類；マリマスタット類；マソプロコール類；メイタンシン類；メクロルエタミン類；メクロルエタミン類/ナイトロジェンマスタード類；酢酸メゲストロール類；メゲストロール類；メレンゲストロール類；メルファラン類；メルファラン類/L-PAM類；メノガリル類；メピチオスタン類；メルカプトプリン類；6-メルカプトプリン；メスナ類；メテシンド類；メトトレキサート類；メトキサレン類；メトミデート類；メトプリン類；メツレデパ類；ミボプラチン類；ミプロキシフェン類；ミソニダゾール類；ミチンドミド類；ミトカルシン類；ミトクロミン類；ミトフラキソン類；ミトギリン類；ミトグアゾン類；ミトマルシン類；マイトマイシンC類；マイトマイシン類；ミトナフィド類；ミトキドン類；ミトスパー類；ミトタン類；ミトキサントロン類；ミトゾロミド類；ミボブリン類；ミゾリビン類；モファロテン類；モピダモール類；ムブリチニブ類；ミコフェノール酸類；フェンプロピオン酸ナンドロロン類；ネダプラチン類；ネルザラビン類；ネモルビシン類；ニトラクリン類；ノコダゾール類；ノフェツモマブ類；ノガラマイシン類；ノラトレキセド類；ノルトピキサントロン類；オクトレオチド類；オプレルベキン類；オルマプラチン類；オルタタキセル類；オテラシル類；オキサリプラチン類；オキシスラン類；オキソフェナルシン類；パクリタキセル類；パミドロネート類；パツビロン類；ペガデマーゼ類；ペガスパルガーゼ類；ペグフィルグラスチム類；ペルデシン類；ペリオマイシン類；ペリトレキソール類；ペメトレキセド類；ペンタムスチン類；ペントスタチン類；ペプロマイシン類；ペルホスファミド類；ペリホシン類；ピコプラチン類；ピナフィド類；ピポブロマン類；ピポスルファ���類；ピルフェニドン類；ピロキサントロン類；ピクサントロン類；プレビトレキセド類；プリカミシド・ミトラマイシン類；プリカマイシン類；プロメスタン類；プロメスタン類；ポルフィマーナトリウム類；ポルフィマー類；ポルフィロマイシン類；プレドニムスチン類；プロカルバジン類；プロパミジン類；プロスピジウム類；プミテパ類；ピューロマイシン類；ピラゾフリン類；キナクリン類；ラニムスチン類；ラスブリカーゼ類；リボプリン類；リトロスルファン類；リツキシマブ類；ログレチミド類；ロキニメクス類；ルホクロモマイシン類；サバルビシン；サフィンゴール類；サルグラモスチム類；サトラプラチン類；セブリプラチン類；セムスチン類；シムトラゼン類；シゾフィラン類；ソブゾキサン類；ソラフェニブ類；スパルフォセート類；スパルホス酸類；スパルソマイシン類；スピロゲルマニウム類；スピロムスチン類；スピロプラチン類；スピロプラチン類；スクアラミン類；ストレプトニグリン類；ストレプトバリシン類；ストレプトゾシン類；スホスファミド類；スロフェヌル類；リンゴ酸スニチニブ；6-チオグアニン（6-TG）；タセジナリン類；タルク類；タリソマイシン類；タリムスチン類；タモキシフェン類；タリキダル類；タウロムスチン類；テコガラン類；テガフール類；テロキサントロン類；テモポルフィン類；テモゾロミド類；テニポシド類/VM-26類；テニポシド類；テロキシロン類；テストラクトン類；チアミプリン類；チオグアニン類；チオテパ類；チアミプリン類；チアゾフリン類；チロミソール類；チロロン類；チムコダル類；チモナシック類；チラパザミン類；トピキサントロン類；トポテカン類；トレミフェン類；トシツモマブ類；トラベクテジン類（エクテイナシジン743）；トラスツズマブ類；トレストロン類；トレチノイン類/ATRA；トリシリビン類；トリロスタン類；トリメトレキセート類；四硝酸トリプラチン類；トリプトレリン類；トロホスファミド類；ツブロゾール類；ウベニメクス類；ウラシルマスタード類；ウレデパ類；バルルビシン類；バルスポダル類；バプレオチド類；ベルテポルフィン類；ビンブラスチン類；ビンクリスチン類；ビンデシン類；ビネピジン類；ビンフルニン類；ビンホルミド類；ビングリシネート類；ビンロイシノール類；ビンロイロシン類；ビノレルビン類；ビンロシジン類；ビントリプトール類；ビンゾリジン類；ボロゾール類；キサントマイシンA類（グアメシクリン類）；ゼニプラチン類；ジラスコルブ類［2-H］；ジノスタチン類；ゾレドロネート；ゾルビシン類；およびゾスキダル類、例えばアルデスロイキン類（例えばPROLEUKIN（登録商標））；アレムツズマブ類（例えばCAMPATH（登録商標））；アリトレチノイン類（例えばPANRETIN（登録商標））；アロプリノール類（例えばZYLOPRIM（登録商標））；アルトレタミン類（例えばHEXALEN（登録商標））；アミフォスチン類（例えばETHYOL（登録商標））；アナストロゾール類（例えばARIMIDEX（登録商標））；三酸化ヒ素類（例えばTRISENOX（登録商標））；アスパラギナーゼ類（例えばELSPAR（登録商標））；BCG生菌（例えばTICE（登録商標）BCG)；ベキサロテン類（例えばTARGRETIN（登録商標））；ベバシズマブ（AVASTIN（登録商標））；ブレオマイシン類（例えばBLENOXANE（登録商標））；ブスルファン静脈内用（例えばBUSULFEX（登録商標））；ブスルファン経口剤（例えばMYLERAN（登録商標））；カルステロン類（例えばMETHOSARB（登録商標））；カペシタビン類（例えばXELODA（登録商標））；カルボプラチン類（例えばPARAPLATIN（登録商標））；カルムスチン類（例えばBCNU（登録商標）、BiCNU（登録商標））；カルムスチン類とポリフェプロサン類（例えばGLIADEL（登録商標）ウエハー)；セレコキシブ類（例えばCELEBREX（登録商標））；クロラムブシル類（例えばLEUKERAN（登録商標））；シスプラチン類（例えばPLATINOL（登録商標））；クラドリビン類（例えばLEUSTATIN（登録商標）、2-CdA（登録商標））；シクロホスファミド類（例えばCYTOXAN（登録商標）、NEOSAR（登録商標））；シタラビン類（例えばCYTOSAR-U（登録商標））；シタラビンリポソーム製剤（例えばDepoCyt（登録商標））；ダカルバジン類（例えばDTIC-Dome）；ダクチノマイシン類（例えばコスメゲン（登録商標））；ダルベポエチンアルファ類（例えばARANESP（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム製剤（例えばDANUOXOME（登録商標））；ダウノルビシン類/ダウノマイシン類（例えばCERUBIDINE（登録商標））；デニロイキンジフチトクス類（例えばONTAK（登録商標））；デクスラゾキサン類（例えばZINECARD（登録商標））；ドセタキセル類（例えばTAXOTERE（登録商標））；ドキソルビシン類（例えばADRIAMYCIN（登録商標）、RUBEX（登録商標））；ドキソルビシンHCLリポソーム注射剤を含むドキソルビシンリポソーム製剤（例えばDOXIL（登録商標））；プロピオン酸ドロモスタノロン類（例えばDROMOSTANOLONE（登録商標）およびMASTERONE（登録商標）注射剤）；エリオットB溶液類（例えばElliott's B Solution（登録商標））；エピルビシン類（例えばELLENCE（登録商標））；エポエチンアルファ類（例えばEPOGEN（登録商標））；エストラムスチン類（例えばEMCYT（登録商標））；リン酸エトポシド類（例えばETOPOPHOS（登録商標））；エトポシドVP-16類（例えばVEPESID（登録商標））；エクセメスタン類（例えばAROMASIN（登録商標））；フィルグラスチム類（例えばNEUPOGEN（登録商標））；フロクスウリジン類（例えばFUDR（登録商標））；フルダラビン類（例えばFLUDARA（登録商標））；5-FU類を含むフルオロウラシル類（例えばADRUCIL（登録商標））；フ
ルベストラント類（例えばFASLODEX（登録商標））；ゲムシタビン類（例えばGEMZAR（登録商標））；ゲムツズマブ類/オゾガミシン類（例えばMYLOTARG（登録商標））；酢酸ゴセレリン類（例えばZOLADEX（登録商標））；ヒドロキシ尿素類（例えばHYDREA（登録商標））；イブリツモマブ類/チウキセタン類（例えばZEVALIN（登録商標））；イダルビシン類（例えばIDAMYCIN（登録商標））；イホスファミド類（例えばIFEX（登録商標））；メシル酸イマチニブ類（例えばGLEEVEC（登録商標））；インターフェロンアルファ-2a類（例えばROFERON-A（登録商標））；インターフェロンアルファ-2b類（例えばINTRON A（登録商標））；イリノテカン類（例えばCAMPTOSAR（登録商標））；レトロゾール類（例えばFEMARA（登録商標））；ロイコボリン類（例えばWELLCOVORIN（登録商標）、LEUCOVORIN（登録商標））；レバミソール類（例えばERGAMISOL（登録商標））；ロムスチン類/CCNU類（例えばCeeBU（登録商標））；メクロルエタミン類/ナイトロジェンマスタード類（例えばMUSTARGEN（登録商標））；酢酸メゲストロール類（例えばMEGACE（登録商標））；メルファラン類/L-PAM類（例えばALKERAN（登録商標））；6-メルカプトプリン類（6-MP類；例えばPURINETHOL（登録商標））を含むメルカプトプリン；メスナ類（例えばMESNEX（登録商標））；メトトレキサート類；メトキサレン類（例えばUVADEX（登録商標））；マイトマイシンC類（例えばMUTAMYCIN（登録商標）、MITOZYTREX（登録商標））；ミトタン類（例えばLYSODREN（登録商標））；ミトキサントロン類（例えばNOVANTRONE（登録商標））；フェンプロピオン酸ナンドロロン類（例えばDURABOLIN-50（登録商標））；ノフェツモマブ類（例えばVERLUMA（登録商標））；オプレルベキン類（例えばNEUMEGA（登録商標））；オキサリプラチン類（例えばELOXATIN（登録商標））；パクリタキセル類（例えばPAXENE（登録商標）、TAXOL（登録商標））；パミドロネート類（例えばAREDIA（登録商標））；ペガデマーゼ類（例えばADAGEN（登録商標））；ペガスパルガーゼ類（例えばONCASPAR（登録商標））；ペグフィルグラスチム類（例えばNEULASTA（登録商標））；ペントスタチン類（例えばNIPENT（登録商標））；ピポブロマン類（例えばVERCYTE（登録商標））；プリカマイシン/ミトラマイシン類（例えばMITHRACIN（登録商標））；ポルフィマーナトリウム類（例えばPHOTOFRIN（登録商標））；プロカルバジン類（例えばMATULANE（登録商標））；キナクリン類（例えばATABRINE（登録商標））；ラスブリカーゼ類（例えばELITEK（登録商標））；リツキシマブ類（例えばRITUXAN（登録商標））；サルグラモスチム類（例えばPROKINE（登録商標））；ストレプトゾシン類（例えばZANOSAR（登録商標））；リンゴ酸スニチニブ類（例えばSUTENT（登録商標））；タルク類（例えばSCLEROSOL（登録商標））；タモキシフェン類（例えばNOLVADEX（登録商標））；テモゾロミド類（例えばTEMODAR（登録商標））；テニポシド類/VM-26類（例えばVUMON（登録商標））；テストラクトン類（例えばTESLAC（登録商標））；6-チオグアニン（6-TG）を含むチオグアニン類；チオテパ類（例えばTHIOPLEX（登録商標））；トポテカン類（例えばHYCAMTIN（登録商標））；トレミフェン類（例えばFARESTON（登録商標））；トシツモマブ類（例えばBEXXAR（登録商標））；トラスツズマブ類（例えばHERCEPTIN（登録商標））；トレチノイ���類/ATRA（例えばVESANOID（登録商標））；ウラシルマスタード類；バルルビシン類（例えばVALSTAR（登録商標））；ビンブラスチン類（例えばVELBAN（登録商標））；ビンクリスチン類（例えばONCOVIN（登録商標））；ビノレルビン類（例えばNAVELBINE（登録商標））；およびゾレドロネート類（例えばZOMETA（登録商標））。
【０３１９】
4．包装および製品
包装材料、ここに提供される任意の医薬組成物または組合せ、その組成物および組合せが、抗ヒアルロナン剤、例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素の投与に関連する副作用を処置するためおよび/またはヒアルロナン関連疾患または状態を処置するために使用されるものであることを示すラベルを含有する製品も提供される。製品の代表例は単一チャンバ容器および二重チャンバ容器を含む容器である。容器にはチューブ、ボトルおよびシリンジが含まれるが、これらに限るわけではない。容器には、さらに、皮下投与用の針を含めることができる。
【０３２０】
ある例では、医薬組成物がコルチコステロイドを含有し、第2の作用剤または処置を含有しない。もう一つの例では、製品がコルチコステロイドおよび抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）を含有する医薬組成物を含有する。この例では、コルチコステロイドと抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）とを、製品として包装するために、一緒に、または別々に用意することができる。もう一つの例では、製品が、コルチコステロイド、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）および1または複数の第2の作用剤または処置を含有する。この例では、コルチコステロイド、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）および1または複数の第2の作用剤または処置を、製品として包装するために、一緒に、または別々に用意することができる。
【０３２１】
ある例では、医薬組成物が抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）を含有し、第2の作用剤または処置を含有しない。もう一つの例では、製品が、抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）および1または複数の第2の作用剤または処置を含有する。この例では、第2の作用剤および抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素）、例えばPEG化ヒアルロニダーゼの医薬組成物を、製品として包装するために、一緒に、または別々に用意することができる。
【０３２２】
ここに提供される製品は包装材料を含有する。医薬品の包装に使用するための包装材料は当業者にはよく知られている。例えば米国特許第5,323,907号、同第5,052,558号および同第5,033,252号を参照されたい（これらはそれぞれ引用によりそのまま本明細書に組み込まれる）。医薬包装材料の例には、ブリスター包装、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、袋、バイアル、容器、シリンジ、ボトル、ならびに選択した製剤および意図した投与および処置の様式に適した任意の包装材料が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０３２３】
包装の選択は、グルココルチコイドなどのコルチコステロイドおよび他の作用剤に依存すると共に、それらの組成物が一緒に包装されるか、別々に包装されるかにも依存する。一般に、包装は、そこに含有される組成物とは非反応性である。別の例では、構成要素の一部を混合物として包装することができる。別の例では、全ての構成要素を別々に包装する。したがって例えば、投与の直前に混合することでそのまま一緒に投与することができる別々の組成物として、構成要素を包装することができる。あるいは、別々に投与するための別々の組成物として、構成要素を包装することもできる。
【０３２４】
構成要素は容器中に包装することができる。構成要素は、同じ容器中に別々に包装することができる。一般に、そのような容器の例には、グルココルチコイドを含有する閉じられた所定の空間と、他の1または複数の構成要素を含有する別個の閉じられた所定の空間とを有し、その結果生じる領域が容易に除去できる膜で分離されていて、その膜を除去することで、構成要素を混合することが可能になっているものが含まれる。投与前にグルココルチコイドが他の構成要素から隔離されている限り、任意の容器または他の製品が考えられる。適切な実施形態については、例えば米国特許第3,539,794号および同第5,171,081号に記載の容器を参照されたい。
【０３２５】
選択された組成物は、その製品を含めて、キットとして提供することもできる。キットは、本明細書に記載する医薬組成物と、製品として提供される投与のためのアイテムとを含むことができる。キットは、場合によっては、投薬量、投与レジメン、投与の様式に関する指示を含む、適用に関する指示書を含むことができる。キットは、本明細書に記載する医薬組成物と診断のためのアイテムとを含むことができる。
【０３２６】
G．抗ヒアルロナン剤およびコルチコステロイドの活性および効果を評価する方法
投与された抗ヒアルロナン剤に起因する有害作用を緩和および/または排除する目的で、コルチコステロイド、例えばデキサメタゾンなどのグルココルチコイドで、対象を処置するための方法が、ここに提供される。例えば、PEG化ヒアルロニダーゼの全身投与は、例えば筋・関節痛、上肢および下肢のこわばり、痙攣、筋炎、全身の筋痛および圧痛、脱力、疲労、ならびに/または膝関節および肘関節における可動域の減少を含む筋骨格副作用に関連する。上述の方法では、ヒアルロナンの合成を阻害することまたはヒアルロナンを分解することによってヒアルロナンを低減するという抗ヒアルロナン剤の活性を排除することなく、副作用を緩和するために、一般に、コルチコステロイドが投与される。コルチコステロイドがそのような副作用を緩和するかどうかを、PEG化ヒアルロニダーゼなどの抗ヒアルロナン剤の活性を妨害しないことを含めて評価することは、当業者の技術水準内にある。例えば、さまざまな動物モデルおよびヒトにおける臨床試験を行うことができる。副作用の緩和を評価することに加えて、抗ヒアルロナン剤の効力、認容性および薬物動態試験を、さまざまな用量のコルチコステロイドの存在下または非存在下で行うことができる。
【０３２７】
特に、PEG化ヒアルロナンは、単独で、または化学療法薬などの二次的作用剤と組み合わされて、ヒアルロナン関連疾患および状態、特にがんを処置するための治療剤である（例えばUS2010/0003238およびWO09/128917参照）。したがって、コルチコステロイドによるPEG化ヒアルロニダーゼの副作用の緩和は、PEG化ヒアルロニダーゼの全身性（例えば筋骨格）副作用を最小限に抑えつつ、そのような処置においてPEG化ヒアルロニダーゼを使用することを可能にする。PEG化ヒアルロニダーゼの効力を、単独で、または化学療法剤と組み合わせて、かつコルチコステロイド処置の存在下または非存在下で、評価するための試験を、がんなどのヒアルロナン関連疾患の動物モデルにおける試験を含めて行うことができる。
【０３２８】
1．副作用を評価するための方法
筋骨格副作用の緩和または排除に関するコルチコステロイドの効力を評価するために、
インビボアッセイを使用することができる。評価することができる副作用には、例えば筋・関節痛、上肢および下肢のこわばり、痙攣、筋炎、全身の筋痛および圧痛、脱力、疲労および/または膝関節および肘関節における可動域の減少が含まれる。副作用を評価するためのアッセイは、動物モデルを含むことができ、ここでは動物を、低減した運動、挙動または姿勢変化、X線所見、組織病理学的変化および他の注目に値する臨床所見について観察することができる。他のアッセイは、ヒト対象における臨床試験を含むことができ、ここでは、症状に関して患者に質問し、患者を理学的検査、イメージング（例えばMRIまたはPETによるもの）または放射線評価によって評価することができる。抗ヒアルロナン剤の投与によって引き起こされる副作用の緩和は、コルチコステロイドの非存在下と比較して、コルチコステロイドの存在下で、副作用が緩和、排除、減少または低減する場合に観察される。
【０３２９】
そのような例では、抗ヒアルロナン剤および/またはコルチコステロイドの用量を、変動させて、副作用を緩和しつつ活性を達成するのに必要な至適用量または最小用量を同定することができる。そのような試験は、当業者の技術水準内にある。さらに、投薬レジームを変化させることができる。例えば試験は、月1回、2週間に1回、週に1回、週に2回、週に3回、週に4回またはそれ以上の抗ヒアルロナン剤の投薬スケジュールを使って行うことができる。さらに、コルチコステロイドは、抗ヒアルロナン剤の投与の前に、同時に、かつ/または後に投与することができる。動物モデルおよびヒト患者におけるそのような試験を実施例に例示する。
【０３３０】
例えば、抗ヒアルロナン剤投与に関連する副作用を緩和または排除する、デキサメタゾンなどのコルチコステロイドの能力を評価するために、インビボ動物モデルを利用することができる。動物モデルには、カニクイザルまたはアカゲザルなどの非ヒト霊長類、犬、例えばビーグル犬、またはPEG化ヒアルロニダーゼ処置に応答して有害副作用を示す他の任意の動物を含めることができる。動物モデルにはコルチコステロイドの存在下または非存在下で抗ヒアルロナン剤を投与して、筋骨格作用を観察または測定することができる。
【０３３１】
例えば、カニクイザル、ビーグルなどの動物、または観察可能もしくは測定可能な筋骨格事象を起こすことができる他の類似の動物モデルを、コルチコステロイドの存在下または非存在下、抗ヒアルロナン剤で処置することができる。ある例では、動物、例えばカニクイザルまたはビーグルの群に、抗ヒアルロナン剤を単独で、例えばPEG化ヒアルロニダーゼを、例えば静脈内投与などによって投与する。例えば、投与は週に2回であることができる。処置は、肢関節可動域の変化が膝および肘関節において観察されるまで、またはこわばりもしくは低減した可動性が観察されるまで、継続することができる。次に、もう一つの動物群を、抗ヒアルロナン剤と、デキサメタゾンまたは他のコルチコステロイドの経口投与などによって投与されるコルチコステロイド（これは抗ヒアルロナン剤投与と同じ日に与えられる）とで処置することができる。次に動物群を、例えば関節可動域または他の低減した可動性の理学的検査、関節の病理組織診断、こわばりに関する触診、または当業者に知られているイメージングによって比較することで、抗ヒアルロナン剤媒介筋骨格副作用を緩和する、デキサメタゾンなどのコルチコステロイドの能力を評価することができる。用量、投与頻度、投与経路、およびデキサメタゾンなどのコルチコステロイドの投与のタイミングは、コルチコステロイドの有効性が最適化されるように変更することができる。
【０３３２】
もう一つの例では、抗ヒアルロナン剤投与に関連する有害副作用の緩和または排除に関するデキサメタゾンなどのコルチコステロイドの効力を、固形腫瘍を有するヒト患者において評価することができる。例えば、抗ヒアルロナン剤媒介性有害事象、例えば限定するわけではないが、次に挙げるものの任意の1つ以上を緩和および/または排除するコルチコステロイドの能力を調べるために、臨床試験を計画することができる：筋・関節痛/上肢および下肢のこわばり、痙攣、筋、筋炎、全身の筋痛および圧痛、脱力および疲労。患者は、デキサメタゾンなどのコルチコステロイドによる共処置を伴って、または伴わずに、抗ヒアルロナン剤で処置することができる。抗ヒアルロナン剤の投与中および投与後に、両処置群の副作用を評価することができる。医師は、例えば患者の愁訴、バイタルサイン、体重の変化、12誘導ECG、心エコー図、臨床化学、またはイメージング（MRI、PETまたは放射線評価）を含む対象の理学的検査によって、症状の重症度を決定することができる。次に、NCI有害事象共通用語規準（CTCAE）類別システムを使って、症状の重症度を定量化することができる。CTCAEは有害事象（AE）報告に利用される記述用語である。類別（重症度）尺度が、各AE用語について与えられている。CTCAEは、次の一般的指針に基づいて、各有害事象の重症度に関する臨床記述と共に、グレード1〜5を示している：グレード1（軽症AE）；グレード2（中等症AE）；グレード3（重症AE）；グレード4（生命を脅かすまたは活動不能を引き起こすAE)；およびグレード5（AEに関係する死）。抗ヒアルロナン剤の投与に関連する有害副作用を緩和するコルチコステロイドの能力は、抗ヒアルロナンだけで処置された対象と比較して、抗ヒアルロナン剤とコルチコステロイドで処置された対象における1つ以上の有害副作用におけるCTCAE尺度での類別または重症度の低減の観察、すなわち副作用の重症度がグレード3からグレード1またはグレード2に低減することの観察によって測定することができる。これを本明細書の実施例において例示する。
【０３３３】
もう一つの例では、抗ヒアルロナン剤の用量を漸増し、用量制限毒性を評価することによって認容性を評価するために、臨床試験を計画することができる。そのような一例では、コルチコステロイドなどの緩和剤の存在下で認容されうる抗ヒアルロナン剤の最大耐用量を決定することができる。処置レジメンは、用量の段階的増加を含むことができ、ここでは、登録された各患者に、同じ用量レベルのコルチコステロイドで、より高用量の抗ヒアルロナン剤を与える。患者を有害事象についてモニタリングすることで、副作用がもはや認容されなくなる前の、コルチコステロイドと共に投与することができる最も高い抗ヒアルロナン剤の用量を決定することができる。認容性は、処置中および処置後に出現する症状の重症度に基づいて測定することができる。抗ヒアルロナン剤の用量は、有害作用が予め決定されたレベル、例えばグレード3に達するまで、漸増させることができる。コルチコステロイドの継続的必要性と、結果として生じる副作用に関する抗ヒアルロナン剤への順化の可能性とを調べるために、投与レジメンには、投与されるコルチコステロイドの量の漸減を含めることもできる。
【０３３４】
2．抗ヒアルロナン活性
抗ヒアルロナン剤の副作用の緩和に関するコルチコステロイドの効果を評価するためのアッセイに加えて、ヒアルロナン阻害活性またはヒアルロナン分解活性に対するコルチコステロイドの効果を評価するために、他のアッセイを別個にまたは上記のアッセイと共に行うことができる。そのようなアッセイには、組織中または腫瘍生検材料中のヒアルロナンの量または血漿中の可溶性ヒアルロナンの量を測定すること、血中または尿中のヒアルロナン異化産物の測定、血漿中のヒアルロニダーゼ活性の測定、または間質液圧、血管容積もしくは腫瘍中の含水量の測定を含めることができるが、これらに限るわけではない。当業者に周知の方法による薬物動態の測定などといった他のアッセイを、抗ヒアルロナン剤薬物動態パラメータに対するコルチコステロイドの効果を評価するために使用することができる。
【０３３５】
a．ヒアルロナン分解酵素の活性を評価するためのアッセイ
ヒアルロナン分解酵素の活性は、当技術分野において周知の方法を使って評価することができる。例えば、ヒアルロニダーゼに関するUSP XXIIアッセイでは、酵素をHAと37℃で30分間反応させた後に残存する未分解ヒアルロン酸またはヒアルロナン（HA）基質の量を測定することにより、活性が間接的に決定される（USP XXII-NF XVII (1990) 644-645、米国薬局方協会、メリーランド州ロックビル）。アッセイでは、ヒアルロニダーゼ参照標準（USP）または国民医薬品集（National Formulary）（NF）標準ヒアルロニダーゼ溶液を使って、任意のヒアルロニダーゼの活性を単位数として確認することができる。ある例では微小濁度アッセイを使って活性が測定される。これはヒアルロン酸が血清アルブミンと結合した時に起こる不溶性沈殿物の形成に基づく。活性は、ヒアルロニダーゼまたはヒアルロニダーゼを含有する試料、例えば血液または血漿を、ヒアルロン酸ナトリウム（ヒアルロン酸）と共に、設定された時間（例えば10分間）インキュベートした後、酸性化血清アルブミンを添加して未消化のヒアルロン酸ナトリウムを沈殿させることによって測定される。得られた試料の濁度をさらなる発現期間後に640nmにおいて測定する。ヒアルロン酸ナトリウム基質に対するヒアルロニダーゼ活性に起因する濁度の低下が、ヒアルロニダーゼ酵素活性の尺度である。
【０３３６】
もう一つの例では、ヒアルロニダーゼ、またはヒアルロニダーゼを含有する試料、例えば血液または血漿と共にインキュベートした後に、残存ビオチン化ヒアルロン酸を測定するマイクロタイターアッセイを使って、ヒアルロニダーゼ活性が測定される（例えばFrostおよびStern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269、米国特許出願公開第20050260186号を参照されたい）。ヒアルロン酸のグルクロン酸残基上の遊離カルボキシル基をビオチン化し、そのビオチン化ヒアルロン酸基質をマイクロタイタープレートに共有結合させる。ヒアルロニダーゼと共にインキュベートした後、アビジン-ペルオキシダーゼ反応を使って残存ビオチン化ヒアルロン酸基質を検出し、既知の活性を有するヒアルロニダーゼ標準品による反応後に得られるものと比較する。当技術分野ではヒアルロニダーゼ活性を測定するためのアッセイが他にも知られており、それらを本発明の方法において使用することができる（例えばDelpechら, (1995) Anal.Biochem. 229:35-41；Takahashiら, (2003) Anal.Biochem. 322:257-263参照）。
【０３３７】
展着剤または拡散剤として作用する活性ヒアルロナン分解酵素、例えば修飾可溶性ヒアルロニダーゼ（例えばPEG化rHuPH20）の能力も評価することができる。例えばトリパンブルー色素を、ヒアルロナン分解酵素と共に、またはヒアルロナン分解酵素なしで、ヌードマウスの左右の外側皮膚に注射（例えば皮下または皮内注射）することができる。次に、色素面積を、例えばマイクロキャリパーを使って測定することで、展着剤として作用するヒアルロナン分解酵素の能力を決定する（米国特許第20060104968号）。
【０３３８】
上記のアッセイは、コルチコステロイドの存在下または非存在下でヒアルロナン分解酵素を使って行うか、コルチコステロイドの存在下または非存在下でヒアルロニダーゼで処置された患者または動物の血液または血漿を使って行うことができる。
【０３３９】
b．動物モデルにおけるアッセイ
コルチコステロイドの同時投与を伴う、または伴わない、修飾ヒアルロニダーゼまたはPEG化ヒアルロニダーゼなどの抗ヒアルロナン剤の投与のインビボでの影響を評価するために、ヒアルロナンに関連する疾患、障害または状態の動物モデルを利用することができる。活性の評価には化学療法剤などのもう一つの作用剤も含めることができる。適当な動物モデルを利用することができる例示的ヒアルロナン関連疾患には、固形腫瘍、例えば末期がん、転移がん、未分化がん、卵巣がん、上皮内癌（ISC）、扁平上皮細胞癌（SCC）、前立腺がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、大腸がんおよび他のがんが含まれる。炎症性疾患、椎間板圧迫、がんおよび浮腫、例えば臓器移植、脳卒中、脳外傷または他の傷害が引き起こす浮腫も、ヒアルロナン関連疾患および障害の代表例である。
【０３４０】
動物モデルには、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモット、および非ヒト霊長類モデル、例えばカニクイザルまたはアカゲザルを含めることができるが、これらに限るわけではない。いくつかの例では、免疫不全マウス、例えばヌードマウスまたはSCIDマウスにヒアルロナン関連がん由来の腫瘍細胞株を移植することで、そのがんの動物モデルを樹立する。例示的なヒアルロナン関連がん由来の細胞株には、PC3前立腺癌細胞、BxPC-3膵腺癌細胞、MDA-MB-231乳癌細胞、MCF-7乳腫瘍細胞、BT474乳腫瘍細胞、Tramp C2前立腺腫瘍細胞およびMat-LyLu前立腺がん細胞、ならびにヒアルロナン関連である（例えば含有するヒアルロナンのレベルが上昇している）本明細書に記載の他の細胞株が含まれるが、これらに限るわけではない。次に、例えばヒアルロナンのレベルまたは含有量を測定することによって抗ヒアルロナン活性に対するコルチコステロイドの効果を評価するために、デキサメタゾンなどのコルチコステロイドと共に、またはコルチコステロイドなしで、動物に抗ヒアルロナン剤を投与することができる。ヒアルロナン含有量は、腫瘍組織試料を染色することによって、または血漿中の可溶性ヒアルロナンレベルを測定することによって、測定することができる。抗ヒアルロナン活性の他の測定には、腫瘍体積、ハローの形成またはサイズ、間質液圧、含水量および/または血管容積の評価が含まれる。上述したようなアッセイを実施例9において実証する。
【０３４１】
別の例では、ビーグル犬などのイヌを、デキサメタゾンなどのコルチコステロイドの存在下または非存在下で抗ヒアルロナン剤で処置することができる。皮膚組織または骨格筋組織などの組織を生検し、それらをヒアルロナンについて染色し、視覚的に評価する。次に、抗ヒアルロナン剤だけで処置した動物からの組織を、抗ヒアルロナン剤およびコルチコステロイドで処置した動物からの組織と比較することで、抗ヒアルロナン活性に対するコルチコステロイドの効果を測定する。これらのアッセイを実施例8において実証する。
【０３４２】
c．ヒトにおけるアッセイ
抗ヒアルロナン媒介性有害作用を緩和するコルチコステロイドの能力を評価するために行われる上記セクションG1で述べたような臨床試験を同時に使用することで、コルチコステロイドの存在下での抗ヒアルロナン剤の活性をアッセイすることができる。例えば、コルチコステロイドと共に、またはコルチコステロイドなしで、抗ヒアルロナン剤で処置された、固形腫瘍を有する患者（ここでは、抗ヒアルロナン剤の用量を漸増させ、かつコルチコステロイドの量を固定しておくか、抗ヒアルロナン剤の量を固定し、コルチコステロイドの用量を漸減する）における抗ヒアルロナン活性を測定するためのアッセイを行うことができる。これらのアッセイには、処置前、処置中および処置後に腫瘍生検材料を採取する腫瘍組織生検アッセイを含めることができる。投与された抗ヒアルロナン剤の活性を評価するために、組織を染色することで組織中のヒアルロナンレベルを測定する。処置前、処置中および処置後に生検された染色腫瘍組織を比較することで、コルチコステロイドの存在下での抗ヒアルロナン活性を評価することができる。
【０３４３】
もう一つの例では、血液および尿を、患者処置の全体にわたって、さまざまな時点で収集し、ヒアルロナンの異化産物についてアッセイすることができる。異化産物の存在はヒアルロナンの存在を示し、それゆえに、ヒアルロニダーゼの活性の尺度である。血漿酵素も、投与後に経時的に評価し、測定することができる。実施例にこれらのアッセイを例示する。
【０３４４】
抗ヒアルロナン活性を評価する方法には、他にも、組織における水の拡散を評価するアッセイが含まれる。本明細書において項を改めて論じるとおり、ヒアルロナンを蓄積する組織は、付随して水が蓄積されるために、一般に、正常組織より高い間質液圧を有する。したがって、HAを蓄積する組織、例えば腫瘍は、高い間質液圧を有し、それを、当技術分野において知られているさまざまな方法によって測定することができる。例えば、拡散MRI、例えばADC MRIまたはDCE MRIを使用することができる。水の拡散は、これらの手法によって評価することができ、固形腫瘍などの高ヒアルロナン組織の存在と直接相関する（例えばChenevertら (1997) Clinical Cancer Research, 3:1457-1466）。例えば、ヒアルロナンを蓄積する腫瘍は、増加した灌流ゆえに、ADC MRIまたはDCE MRIの識別可能な増加を有する。そのようなアッセイを、抗ヒアルロナン剤の存在下および非存在下に、コルチコステロイドあり、またはコルチコステロイドなしで行い、結果を比較することができる。拡散を測定する方法は、そのような治療後の細胞変化を評価する有用な手段である。
【０３４５】
d．薬物動態
修飾ヒアルロニダーゼなどの修飾ヒアルロナン分解酵素の薬物動態特性にコルチコステロイドの同時投与が及ぼす効果を評価するために、薬物動態試験を動物モデルを使って行うか、患者による臨床試験中に行うことができる。動物モデルには、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモット、および非ヒト 霊長類モデル、例えばカニクイザルまたはアカゲザルが含まれるが、これらに限るわけではない。一部の例では、薬物動態試験が、健常動物を使って行われる。別の例では、試験が、ヒアルロナンによる治療が検討されている疾患の動物モデル、例えば任意のヒアルロナン関連疾患または障害の動物モデルを使って行われる。
【０３４６】
コルチコステロイドの存在下での修飾ヒアルロニダーゼなどの抗ヒアルロナン剤の薬物動態特性は、投与後の最大（ピーク）濃度（Cmax）、ピーク時間（すなわち最大濃度になる時間；Tmax）、最小濃度（すなわち投与間の最小濃度；Cmin）、消失半減期（T1/2）および曲線下面積（すなわち、時間対濃度をプロットすることによって生成する曲線の曲線下面積；AUC）などといったパラメータを測定することによって評価することができる。修飾ヒアルロニダーゼが皮下注射される可能性がある場合には、皮下送達後のヒアルロニダーゼの曲線下面積（AUCsc）を、静脈内送達後のヒアルロニダーゼのAUC（AUCiv）と比較することによって、ヒアルロニダーゼの絶対的バイオアベイラビリティを決定する。絶対的バイオアベイラビリティ（F）は、式：F＝([AUC]sc×用量sc)/([AUC]iv×用量iv）を使って算出することができる。
【０３４７】
投与時にデキサメタゾンなどのコルチコステロイドおよび/または抗ヒアルロナン剤（例えばPEG化rHuPH20）の濃度を増加または低下させることの効果を評価するために、薬物動態試験では、ある範囲の用量を、さまざまな投与頻度で投与することができる。コルチコステロイドの同時投与を行って、または行わずに、抗ヒアルロナン剤の薬物動態特性、例えばバイオアベイラビリティを、評価することもできる。例えば、ビーグルなどのイヌに、1つまたはそれ以上の投与経路を使って、PEG化ヒアルロニダーゼなどの抗ヒアルロナン剤を単独で、またはコルチコステロイドと一緒に投与することができる。そのような試験を行って、コルチコステロイドと抗ヒアルロナン剤との同時投与が薬物動態特性に及ぼす効果を評価することができる。加えて、コルチコステロイドの存在下または非存在下でのヒアルロニダーゼなどの抗ヒアルロナン剤と化学療法剤などのもう一つの作用剤との同時投与が、その作用剤の薬物動態特性および薬力学特性に及ぼす効果も、動物モデルおよび/またはヒト対象を使って、例えば臨床試験の状況下で、上述のようにインビボで評価することができる。
【０３４８】
H．ヒアルロナンに関連する状態、疾患および障害の処置における抗ヒアルロナン剤の使用
PEG化ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤は、ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するために、単独で、または治療剤と組み合わせて、使用することができる。特に、PEGPH20などの修飾ヒアルロナン分解酵素は、単独で、または化学療法剤との組合せで、抗腫瘍活性を有する（例えば米国特許出願公開第20100003238号および国際出願公開番号WO2009128917参照）。
【０３４９】
ここに見いだされたとおり、抗腫瘍活性は、血漿中に検出可能なレベルのヒアルロニダーゼ酵素を達成することも維持することもないと以前は考えられていた用量よりも、はるかに低い用量で観察される。したがって、筋骨格副作用などの有害副作用の程度は、高用量の酵素の場合ほど重症でない。これらの低用量において、この酵素は、腫瘍関連ヒアルロナン（HA）の低減、血漿中ヒアルロナンの上昇、ならびに腫瘍体積および腫瘍発生の好ましい変化と相関する薬物動態特性および薬力学特性を示す。
【０３５０】
したがって、ポリマー修飾ヒアルロナン分解酵素、例えばポリマー修飾ヒアルロニダーゼ、例えばPH20（例えばPEGPH20）を、20μg/kg未満、例えば0.01μg/kg〜15μg/kg、0.05μg/kg〜10μg/kg、0.75μg/kg〜7.5μg/kgまたは1.0μg/kg〜3.0μg/kg、例えば0.01μg/kg（対象の重さ）、0.02μg/kg、0.03μg/kg、0.04μg/kg、0.05μg/kg、1.0μg/kg、1.5μg/kg、2.0μg/kg、2.5μg/kg、3.0μg/kg、3.5μg/kg、4.0μg/kg、4.5μg/kg、5.0μg/kg、5.5μg/kg、6.0μg/kg、7.0μg/kg、7.5μg/kg、8.0μg/kg、9.0μg/kg、10.0μg/kg、12.5μg/kgもしくは15μg/kgまたはその前後の量で患者に投与することによって、がんなどのヒアルロナン関連疾患または状態を処置するための方法または使用が、ここに提供される。例えば、ポリマー修飾ヒアルロナン分解酵素、例えばここに提供されるPEG化ヒアルロニダーゼ（例えばPH20）、例えばPEGPH20は、1単位/kg〜1000単位/kg、1単位/kg〜500単位/kgもしくは10単位/kg〜50単位/kgまたはその前後の量で投与することができる。一般に、修飾ヒアルロニダーゼの比活性が20,000U/mg〜60,000U/mgまたはその前後、一般に、35,000U/mgまたはその前後である場合は、200単位〜50,000（U）が投与され、例えば200U、300U；400U；500U；600U；700U；800U；900U；1,000U；1250U；1500U；2000U；3000U；4000U；5,000U；6,000U；7,000U；8,000U；9,000U；10,000U；20,000U；30,000U；40,000U；または50,000Uが投与される。典型的には、注射または注入の体積は、50mL未満、例えば0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mLもしくは50mLまたはその前後である。
【０３５１】
がんなどのヒアルロナン関連疾患または状態を処置するために、ポリマー修飾ヒアルロナン分解酵素を全身性に、例えば静脈内（IV）に、筋肉内に、または他の任意の全身性経路によって、投与することができる。特定例では、低用量を局所的に与えることができる。例えば、ヒアルロナン分解酵素、例えばPEG化ヒアルロナン分解酵素、例えばPEG化ヒアルロニダーゼ（例えばPH20）の局所投与には、腫瘍内投与、動脈注射（例えば肝動脈）、腹腔内投与、膀胱内投与、および、より低い絶対用量で局所作用を増加させることができるがん治療に使用される他の局所経路が含まれる。がんなどのヒアルロナン関連疾患または状態を処置するための本発明の方法では、酵素を単独で、または治療剤と組み合わせて投与することができる。さらに、本発明の他の方法において規定されるように、ヒアルロナン分解酵素に関連する任意の副作用または有害事象を緩和するために、コルチコステロイドを投与することもできる。
【０３５２】
ヒアルロナン関連疾患または状態を処置する本発明の方法では、上述の量のポリマー修飾ヒアルロナン分解酵素が、ある投与サイクルの間、周期的に投与される。例えば、ポリマー修飾ヒアルロナン分解酵素の周期的投与は週に2回、週に1回または21日ごとに1回であることができる。投与のサイクルの時間の長さは実験的に決定することができ、処置すべき疾患、疾患の重症度、その特定患者、および処置医の技術水準内にある他の考慮事項に依存する。修飾ヒアルロニダーゼ酵素による処置の時間の長さは、1週間、2週間、1ヶ月、数ヶ月、1年、数年またはそれ以上であることができる。例えば、修飾ヒアルロニダーゼ酵素は、1年またはそれ以上の期間にわたって週に2回投与することができる。いくつかの例では、後続の投与のサイクルにおける投与の周期的頻度を、低減することができる。例えば、修飾ヒアルロニダーゼ酵素を、4週間にわたって週に2回投与した後、1年またはそれ以上の期間にわたって週に1回投与する。処置の中断がなくても疾患の症状が持続する場合には、処置をさらに長期間継続し、かつ/または頻繁に投与する期間を増加させることができる。処置の間は、疾患および/または処置関連毒性または副作用の証拠をモニタリングすることができる。副作用が観察されたら、本明細書で述べるように、コルチコステロイド剤を投薬レジームに含めることができる。
【０３５３】
加えて、酵素への曝露からの休止期間を設けるために、投与のサイクルを個別に調整して、処置を中断する期間を加えることもできる。処置の中断の時間の長さは、予め決定された時間とするか、患者の応答の仕方に応じて、または観察される副作用に応じて、実験的に決定することができる。例えば1週間、2週間、1ヶ月または数ヶ月にわたって処置を中断することができる。一般に、処置中断期間は、ある患者のための投与レジームのサイクル中に設けられる。例えば、例示的投与レジームは、28日の処置サイクルであって、最初の3週間、週に2回、修飾酵素を投与した後、1週間は投与を行わない。したがって例えば、28日のサイクルでは、1、4、8、11、15および18日目に修飾酵素を患者に投与した後、処置を1週間中断することができる。上記のように、投与のサイクルは、任意の望ましい期間であることができる。したがって、28日の投与サイクルを、任意の期間にわたって繰り返すことができる。患者および処置すべき疾患に特有の個別の考慮事項に応じて患者の必要に合致する投与のサイクルおよび投与レジームを採用することは、処置医の技術水準内にある。
【０３５４】
特定例では、ポリマー修飾ヒアルロナン分解酵素、例えばここに提供されるPEGヒアルロニダーゼ（例えばPH20）、例えばPEGPH20の1回量投与が、0.5μg〜1450μgもしくは150単位（U）〜45,000単位またはその前後の範囲にある量である。例えば、1回量投与は、0.75μg〜1125μg；3.75μg〜750μg；56μg〜565μg；もしくは75μg〜225μgまたはその前後の範囲にある量の投与である。別の例では、1回量投与が、24単位（U）〜36,000U；120U〜24,000U；1500U〜18,000U；もしくは2400U〜7200Uまたはその前後の範囲にある量の投与である。例えば、0.5μg〜1450μgもしくは150単位（U）〜45,000単位またはその前後の範囲にある量の1回量として、少なくとも週に1回の頻度で、少なくとも4週間のサイクルにわたって対象に投与されるヒアルロナン分解酵素の使用が、ここに提供される。頻度は、少なくとも週に2回または週に1回であることができる。ヒアルロナン関連疾患または状態を処置するための投与のサイクルは、患者の特定ニーズに応じて、複数回繰り返すことができると理解される。
【０３５５】
ここに提供されるいくつかの例では、本発明の方法を使って、コルチコステロイドを、ヒアルロナン関連疾患もしくは状態を処置するための、またはヒアルロナン関連疾患もしくは状態の処置に使用するための、抗ヒアルロナン剤と組み合わせて、進行固形腫瘍を有する患者の処置などにおいて、投与することができる。いくつかの例では、化学療法剤または他の抗がん剤も、治療に使用することができる。以下に述べる治療的使用は例示であって、本明細書に記載する方法の応用を限定するものではない。以下の説明において、本方法では、筋骨格副作用または他の副作用を低減または緩和するために、コルチコステロイド、例えばデキサメタゾンなどのグルココルチコイドを抗ヒアルロナン剤と組み合わせて使用することができると理解される。投薬量および投与経路については上記セクションFにおいて説明した。
【０３５６】
ここに提供される方法には、任意のヒアルロナン関連疾患または状態、例えば限定するわけではないが、高い間質液圧に関連するもの、がん、特に高ヒアルロナンがん、浮腫、椎間板圧迫、または炎症性疾患、およびヒアルロナンに関連する他の疾患を処置するためにヒアルロナン分解酵素を使用する方法が含まれる。ヒアルロナン関連状態および疾患は、ヒアルロナンレベルが上昇していて、それが、その疾患または状態における原因であるか、帰結であるか、または他の理由で観察されているものである、疾患および状態である。いくつかの例では、ヒアルロナン関連疾患および状態が、増加した間質液圧、低下した血管容積、および/または腫瘍などの組織における増加した含水量に関連する。ここに提供される酵素、組成物および方法を使って処置することができる例示的ヒアルロナン関連疾患および状態には、高ヒアルロナンがん、例えば固形腫瘍を含む腫瘍、例えば末期がん、転移がん、未分化がん、卵巣がん、上皮内癌（ISC）、扁平上皮細胞癌（SCC）、前立腺がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、大腸がんおよび他のがんが含まれるが、これらに限るわけではない。
【０３５７】
上昇したヒアルロナンレベルは、炎症を伴う疾患過程の事実上全てを含む数多くの炎症性疾患に関連している。そのような疾患および状態には、関節リウマチ、歯周炎、強皮症、乾癬、アテローム性動脈硬化、慢性創傷、クローン病、潰瘍性大腸炎、および炎症性腸疾患が含まれるが、これらに限るわけではない。これらの上昇したレベルの機序は、IL-1βなどの炎症性メディエーターによるHAシンターゼ遺伝子の調節によるものである（Ducaleら (2005) Am. J. Physiol. Gatrointest. Liver Physiol., 289:G462-G470）。加えて、ヒアルロナンそのものも、種々の白血球と相互作用し、それらを活性化し、よって炎症を増悪させることができる（例えばDucaleら 2005；Jiangら (2007) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 23:435-61参照）。したがって、抗ヒアルロナン剤で処置することができる他のヒアルロナン関連疾患および状態には、炎症性疾患および状態が含まれ、これには、関節リウマチ、強皮症、歯周炎、乾癬、アテローム性動脈硬化、慢性創傷、クローン病、潰瘍性大腸炎、および炎症性腸疾患が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０３５８】
上昇した間質液圧に関連する疾患、例えば椎間板圧迫に関連した疾患、および浮腫、例えば臓器移植、脳卒中、脳外傷または他の傷害が引き起こす浮腫も、ヒアルロナン関連疾患および状態の代表例である。例示的ヒアルロナン関連疾患および状態には、上昇した間質液圧、低下した血管容積、および/または組織における増加した含水量に関連する疾患および状態、例えばがん、椎間板圧迫および浮腫が含まれる。ある例では、ヒアルロナンに関連する状態、疾患または障害の処置に、増加した間質液圧（IFP）、低下した血管容積、および組織における増加した含水量のうち、1つ以上の緩和、低減、またはそれら1つ以上に対する他の有益な作用が含まれる。
【０３５９】
典型的には、ヒアルロナン関連疾患および状態は、組織、細胞または体液（例えば腫瘍組織または腫瘍関連組織、血液または間質腔）における、対照、例えば他の組織、細胞または体液と比較して上昇したヒアルロナン発現に関連する。上昇したヒアルロン発現は、正常な組織、細胞または体液、例えば被験試料と類似しているが異なる対象、例えば正常である対象（すなわち疾患または状態を有さないか、被験対象が有するタイプの疾患または状態を有さない対象）、例えばヒアルロナン関連疾患または状態を有さない対象から単離された組織、細胞または体液と比較して、上昇しているものであることができる。上昇したヒアルロナン発現は、類似する疾患または状態を有するが、その疾患がそれほど重症でなく、かつ/またはヒアルロナン関連ではないか、ヒアルロナンの発現量が比較的低く、したがってヒアルロナンとの関連性が低い別の対象からの類似する組織と比較して、上昇しているものであることができる。例えば、被験対象は、組織、細胞または体液中のHA量が、重症度の低いがん、例えば早期の分化がんまたは他のタイプのがんを有する対象と比較して、相対的に上昇している、ヒアルロナン関連がんを有する対象であることができる。もう一つの例では、細胞、組織または体液が、対照試料、例えばHAの量もしくは相対量が既知である体液、組織、抽出物（例えば細胞抽出物または核抽出物）、核酸調製物もしくはペプチド調製物、細胞株、生検材料、標準試料、または他の試料、比較的低レベルのHAを発現することが知られている試料、例えば腫瘍細胞株、例えば低レベルのHAを発現する本明細書に記載の例示的腫瘍細胞株、例えばHCT116細胞株、HT29細胞株、NCI H460細胞株、DU145細胞株、Capan-1細胞株、ならびにそのような細胞株を使って作成された腫瘍モデルからの腫瘍などと比較して、上昇したレベルのヒアルロナンを含有している（例えば実施例17A参照）。
【０３６０】
典型的には、ヒアルロナン関連疾患または状態は、例えば疾患組織、例えば腫瘍における、増加したHA発現に関連している。ある例では、ハロー（HALO）（ヒアルロナンを含むプロテオグリカンに富む細胞周囲のマトリックス領域）が、対照の組織、例えば疾患組織において形成される。もう一つの例では、ハローの存在が、対象の組織（例えば疾患組織）からの細胞のインビトロ培養において検出される。
【０３６１】
ある例では、ヒアルロナンに関連する状態、疾患または障害が、増加した間質液圧、低下した血管容積、または組織における増加した含水量に関連する。ある例では、ヒアルロナンに関連する状態、疾患または障害の処置に、増加した間質液圧（IFP）、低下した血管容積、および組織中の増加した含水量のうち、1つ以上の緩和、低減、またはそれら1つ以上に対する他の有益な作用が含まれる。治療的使用には、ヒアルロナン関連疾患または状態の処置（がん処置を含む）、腫瘍体積の低減、化学療法または他のがん処置に対する感受性の増加、がん処置剤または他の処置剤のバイオアベイラビリティまたは送達の強化、間質液圧の低下、血管容積の増加、対象中の組織における含水量の低下、および他の処置が含まれる。
【０３６２】
1．処置の対象の選択および処置効果の評価
本方法は、抗ヒアルロナン剤による処置のための対象を選択するためのステップ、および処置効果（例えば処置の効力）を評価するためのステップを含む。そのような方法には、ヒアルロナン関連疾患マーカー（これには、対象がヒアルロナン関連疾患を有すること、対象が抗ヒアルロナン剤による処置に応答しそうであること、および/または対象からの試料、例えば組織、細胞または体液が、上昇したヒアルロナン発現を含有することの、任意の指標が含まれる）を検出するための方法が含まれる。マーカーを検出するためのアッセイを以下に例示するが、これには、対象からの試料におけるHA発現および/または相対的HA発現を測定するためのアッセイ、対象からの試料に対する抗ヒアルロナン剤の効果を分析するためのアッセイ、および一定のヒアルロナン関連疾患/症状に典型的に関連する読出し情報、例えば低いヒアルロニダーゼ発現またはヒアルロニダーゼ活性、高い間質液圧、血管容積および含水量などを測定するためのアッセイが含まれる。一般に、対象からの試料中のタンパク質または核酸を検出するための、または細胞/組織に対する処置の効果をインビトロで評価するための既知のアッセイは、どれでも使用することができる。
【０３６３】
ここに提供される方法において、処置のために選択される対象には、疾患または状態を有さない対象と比較して、または上昇した、異常なまたは蓄積したHAの発現を有さない正常な組織または試料と比較して、上昇した、異常なまたは蓄積したヒアルロナンの発現を有する対象が含まれる。対象からの任意の試料または組織を試験し、正常な試料または組織と比較することができる。ヒアルロナンレベルは、任意の供給源から、例えば組織（例えば生検によるもの）、腫瘍、細胞、または血液、血清、尿もしくは他の体液から測定することができる。例えば、本明細書において項を改めて説明するように、固形腫瘍におけるHA沈着のプロファイルは、一般に、細胞周囲または間質と分類されている。上昇した血漿中HAレベルは、ウィルムス腫瘍、中皮腫および肝臓転移を有する患者に最も顕著に観察されている。したがって疾患または状態に応じて異なる試料を、ヒアルロナンレベルについて測定することができる。試料の選択は当業者の技術水準内にある。
【０３６４】
ヒアルロナンレベルを測定するために使用されるアッセイは疾患または状態に依存し、その特定疾患または状態に基づいて選択することができる。当業者にはヒアルロナンを検出する方法がよく知られており、それらには、下記のセクション（i）で述べるように、免疫組織化学方法、ELISA法が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０３６５】
ある例では、例えば対象が、抗ヒアルロナン剤による処置に服しうるヒアルロナン関連状態または疾患を有するかどうかを決定するために、マーカーを検出するためのステップが、対象を処置する前に行われる。この例では、マーカーが検出されれば（例えば患者からの細胞、組織または体液が上昇したヒアルロナン発現を含有するか、ヒアルロナン分解酵素に応答すると決定されれば）、ヒアルロナン分解酵素を対象に投与する処置ステップが行われる。ある例では、マーカーが検出されない場合に（例えば患者からの細胞、組織または体液が正常なまたは上昇していないヒアルロナン発現を含有するか、抗ヒアルロナン剤に反応しないと決定されれば）、別の処置選択肢を選択することができる。
【０３６６】
もう一つの例では、マーカーを検出するためのステップが、対象の処置後または対象の処置（例えば抗ヒアルロナン剤（例えば可溶性修飾ヒアルロニダーゼ）（共投与される作用剤ありまたはなし）による処置）の経過中に、例えば抗ヒアルロナン剤による処置が疾患または状態の処置に対して効果を有しているかどうかを決定するために行われる。そのような例の一つでは、マーカーが検出されないか、処置前の量/レベルと比較してまたは別の試料と比較して低下した量または相対的レベルで検出され、処置は継続されるか、もう1ラウンドの処置が行われるか、別の処置、例えば併用療法が開始される。もう一つのそのような例において、マーカーが処置前または別の試料と同じレベルで検出されるのであれば、別の処置選択肢を選択することができる。
【０３６７】
a．ヒアルロナン関連疾患マーカーを検出するためのアッセイ
ヒアルロナン関連疾患および状態のマーカーを検出するためのアッセイには、対象の組織、細胞および/または体液、例えば腫瘍における、ヒアルロナンの量（例えば相対量）、HAシンターゼ発現および/またはヒアルロニダーゼ発現を測定するためのアッセイが含まれる。そのようなアッセイには、例えば対象からの試料における、HA発現、ヒアルロナンシンターゼ2（HAS2）発現、ハロー（ヒアルロナンを含むプロテオグリカンに富む細胞周囲のマトリックス領域）の存在、およびヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の存在を検出することができるものが含まれる。
【０３６８】
タンパク質レベルおよび核酸レベルを検出するためのアッセイは当技術分野ではよく知られており、ヒアルロナン、ヒアルロナンシンターゼまたは他のタンパク質および/または核酸発現を測定するために、ここでの方法に使用することができる。そのようなアッセイには、ELISA、SDS-PAGE、ウェスタンブロット、PCR、RT-PCR、免疫組織化学、組織学およびフローサイトメトリーが含まれるが、これらに限るわけではない。例えば、対象からの試料、例えば組織試料（例えば患者または動物モデルからの腫瘍の生検材料、間質試料）、体液（例えば血液、尿、血漿、唾液または他の試料）、細胞もしくは細胞試料、または抽出物、または他の試料を、例えば、組織または試料におけるヒアルロナンの存在または程度を決定するために、固定または凍結組織切片の免疫組織化学（IHC）などといった組織染色を使って、または免疫蛍光細胞染色、プルダウンアッセイ、およびフローサイトメトリーを使って、抗HA抗体で染色することができる。もう一つの例では、HA mRNAの量を評価するために、試料、例えば生検材料を、RT-PCRによってアッセイすることができる。
【０３６９】
がんにおけるヒアルロナン発現を検出するための既知の方法には、膀胱がんを有する対象の尿または膀胱組織抽出物中のHAレベルを測定するためのLokeshwarら, Cancer Res. 57:773-777 (1997）に記載のELISA様アッセイが含まれるが、これに限るわけではない。このアッセイの場合、尿または抽出物をマイクロウェルプレートにコーティングし（標準として使用される臍帯HAもコーティングする）、次に標識（例えばビオチン化）HA結合タンパク質、例えば本明細書に記載するものと共にインキュベーション（例えば16時間、室温）し、洗浄し、ウェルに結合しているHA結合タンパク質を、アビジン-ビオチン検出剤基質を使って定量する。そのような方法は当技術分野ではよく知られている。ある例では、HA関連膀胱がんを有する対象から尿が、正常な患者（健常な対象または他の胃泌尿器（gastrourinary）疾患または状態を有する対象）からの尿/抽出物と比較して2〜9倍上昇したHAレベルを含有していた。したがって、尿中のHAレベルが正常対象と比較して上昇しているならば、例えば正常対象と比較して2倍〜9倍またはその前後、例えば2、3、4、5、6、7、8または9倍またはその前後上昇しているならば、マーカーが検出されるであろう。
【０３７０】
さらなる一例では、上述の方法のいずれか一つを使って、インビトロの腫瘍細胞におけるヒアルロナンの発現および生産を評価することができる。同様に、インビトロ、エクスビボまたはインビボの細胞によるヒアルロナンシンターゼ2（HAS2）の生産および/または発現も、例えばELISA、SDS-PAGE、ウェスタンブロット、PCR、RT-PCR、免疫組織化学、組織学またはフローサイトメトリーによってアッセイすることができる。
【０３７１】
もう一つの例では、対象からの試料における、例えば血液中または血漿中の、ヒアルロニダーゼ活性の量が、例えば濁度アッセイなどによって決定される。
【０３７２】
もう一つの例では、患者から細胞または他の組織、例えば腫瘍細胞などを単離し、それを試験に使用することで、その細胞または組織がインビトロでヒアルロナン分解酵素による処理に応答するかどうかを、例えば腫瘍細胞などの細胞または組織の、処理に呼応した成長、増殖および/または生存を測定するクロノジェニックアッセイまたは他の任意のアッセイを使って決定する。ある例では、対象からのがん細胞を、ある表面に、例えば細胞外マトリックスまたはタンパク質混合物の上に、例えばMatrigel（登録商標）という商標で販売されている混合物（BD Biosciences）の上に、播種する。この例の場合、ヒアルロナン関連マーカーは、ヒアルロナン分解酵素の投与に対する細胞または組織の感受性である。この例では、何らかの性質、例えば細胞の増殖、成長または生存が、ヒアルロナン分解酵素の添加によって阻害またはブロックされたら、その対象は、ヒアルロナン分解酵素含有組成物による処置に服しうる可能性があると決定される。
【０３７３】
処置の対象を選択し、かつ/または処置の効力および/または継続時間を評価するには、ヒアルロナン発現レベルを決定するためのアッセイに加えて、他のアッセイも使用することができる。間質液圧（IFP）は、適当なプローブまたは機器を使って測定することができる。例えば、トランスデューサーチップ付きカテーテルを使って、がん組織または他の目的の組織におけるIFPを測定することができる。カテーテルを外科用縫合針の内孔に通し、次にそれを腫瘍の中心に挿入する。カテーテルを適切な位置に保持しながら、針を引き抜く。次に、適当なデータ収集ユニットを使って、IFP（mmHg）を測定することができる（例えばOzerdemら (2005) Microvasc. Res. 70:116-120参照）。IFPを測定するための他の方法には、ウィック・イン・ニードル（wick-in-needle）法が含まれる（Fadnesら (1977) Microvasc. Res. 14:27-36）。
【０３７４】
血管容積は、例えば超音波イメージングによって測定することができる。この方法では、高エコーのマイクロバブルを使用することで得られる強い超音波反射を検出する。マイクロバブルは、対象または動物モデルに（例えば静脈内）注射されると、そのサイズゆえに、血管腔に捕捉された状態になる。腫瘍組織含水量などの組織含水量を評価するためのアッセイも、当技術分野において知られている。例えば、腫瘍から試料を採集し、水気を吸い取り、計量し、瞬間凍結してから、凍結乾燥することができる。次に、水の重量を、組織湿重量対乾燥（すなわち凍結乾燥）重量の比として報告する。
【０３７５】
インビトロで細胞周囲マトリックス（ハロー）を形成する腫瘍細胞の能力は、粒子排除アッセイを使って評価することができる。小さい粒子（ホルマリン固定された赤血球）を、例えば大きな凝集性コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるアグリカンの存在下で、腫瘍細胞の低密度培養物に加えることができる。粒子が落ち着いた後、400倍の倍率で培養物を観察して、ハローが腫瘍細胞によって形成されたかどうかを決定することができる。これは、粒子が排除されている細胞周囲の領域として可視化することができる。
【０３７６】
b．対照試料と比較したヒアルロナン関連マーカーの検出
どの検出方法についても、マーカー（例えばHA発現、ヒアルロナン分解酵素に対する応答性、HAシンターゼ発現またはヒアルロニダーゼ活性）は、典型的には、対照試料と比較されるので、マーカーの検出は、典型的には、読出し情報が対照試料と比較して上昇または低減していることの決定を含む。
【０３７７】
例えば、対照試料は、別の組織、細胞または体液、例えば正常な組織、細胞または体液であることができる。例えば被験試料と類似しているが、異なる対象、例えば正常である対象（すなわち疾患または状態を有さないか、被験対象が有するタイプの疾患または状態を有さない対象）から単離された組織、細胞または体液を、試験することができる。もう一つの例では、類似する疾患または状態を有するが、その疾患がそれほど重症でなく、かつ/またはヒアルロナン関連ではないか、ヒアルロナンの発現量が比較的低い別の対象からの類似組織を、試験することができる。例えば、試験される細胞、組織または体液が、がんを有する対象である場合は、それを、重症度の低いがん、例えば早期の分化がんまたは他のタイプのがんを有する対象からの組織、細胞または体液と比較することができる。もう一つの例では、対照試料が、HAの量もしくは相対量が既知である体液、組織、抽出物（例えば細胞抽出物または核抽出物）、核酸調製物またはペプチド調製物、細胞株、生検材料、標準試料、または他の試料である。例えばそのような試料には、比較的低レベルのHAを発現することが知られている腫瘍細胞株を含めることができる。低レベルのHAを発現する本明細書に記載のそのような腫瘍細胞株の代表例は、例えばHCT 116細胞株、HT29細胞株、NCI H460細胞株、DU145細胞株、Capan-1細胞株、およびそのような細胞株を使って作成された腫瘍モデルからの腫瘍である。
【０３７８】
特定の変化、例えばHAの増加または低下は、使用するアッセイと測定される試料の供給源とに依存すると理解される。例えば、ELISAでは、特定波長における吸光度またはタンパク質の量（例えば標準曲線を使って決定されるもの）の増加倍率または低下倍率を、対照を基準にして表すことができる。RT-PCRなどのPCRアッセイでは、当業者に知られている方法を使って、例えば標準を使って、対照発現レベルと比較すること（例えば変化倍率として表すこと）ができる。
【０３７９】
例えば、対象からの試料中のヒアルロナンの量を試験する場合、マーカーの検出は、対象からの試料（例えばがん性細胞、組織または体液）中のHAの量が、対照試料、例えば先の段落において述べた対照試料と比較して上昇していることの決定であることができる。ある例では、組織、細胞または体液中のHAの量が、対照試料と比較して約0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍またはその前後もしくはそれ以上、上昇しているならば、そのがんは高ヒアルロナンがんであると決定される。
【０３８０】
いくつかの例では、腫瘍を直接的に生検し、HAの発現に関して染色することができる。別の例では、その特定腫瘍に関連する試料、例えば血液もしくは尿試料、または他の体液試料を、HAについてアッセイすることができる。アッセイのタイプは、腫瘍タイプに依存してさまざまであるだろうが、HAを検出するために2つ以上のアッセイを使用することができると考えられる。特定の腫瘍に関する本明細書におけるそのようなアッセイへの言及は、単なる例示である。例えば、膀胱がんの場合は、尿試料をヒアルロナンについて標準的なELISA手法によってアッセイすることができる。ここでは、正常患者対象からの尿（例えばLokeshwarら (2000) J. Urol., 163:348-56参照）と比較して1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍またはそれ以上のHAを示す対象を選択することができる。もう一つの例では、腫瘍細胞を生検し、それを、例えば免疫組織化学により、HAについて染色することができる（例えばAnttilaら (2000) Cancer Research, 60:150-156；Karvinenら (2003) British J of Dermatology, 148:86-94；Lipponenら (2001) Euro J Can. 37: 849-856)；Auvinenら (2000) American J of Pathology, 156:529参照）。一般に、そのような例では、腫瘍試料または腫瘍細胞は、任意のがん細胞関連HAシグナルが観察されるのであれば、HAに関して陽性であるとみなされる。バックグラウンド染色に関する陰性対照として、細胞をヒアルロニダーゼで予め消化して、細胞関連HAを切断しておくことができる。試料は、同じ対象からの正常な細胞または組織と比較することもできる。加えて、そのような方法では、細胞関連ヒアルロナンのレベルを、低、中または高とスコア化することもできる。例えば、腫瘍領域の30％、35％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％またはそれ以上が、持続的HAシグナルを示したのであれば、HA発現は高または中とみなされる。典型的には、中〜高HAを有する対象の処置が、ここでは考えられる。
【０３８１】
2．がんの処置における使用
上記のように、ヒアルロナンは、がんに関連する過程において役割を果たし、ヒアルロナンレベルは、腫瘍攻撃性ならびに腫瘍攻撃性および予後不良に関するさまざまなマーカーと相関する。したがって、コルチコステロイドと組み合わされた抗ヒアルロナン剤でヒアルロナン関連がんを処置することにより、酵素によって誘発される筋骨格副作用を緩和、低減または減少させる方法が、提供される。がんには、高ヒアルロナンがんおよび上昇した間質液圧に関連するがんが含まれる。
【０３８２】
ヒアルロナンは、発生、再生、修復、胚発生、発生学的発達、創傷治癒、血管新生、および腫瘍形成を含む、細胞運動性に関連する過程において役割を果たす（Toole 1991 Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay編、Plenum Press, ニューヨーク, 1384-1386；Bertrandら 1992 Int. J. Cancer 52:1-6；Knudsonら, 1993 FASEB J. 7:1233-1241）。また、ヒアルロナンレベルは腫瘍攻撃性と相関し（Ozelloら 1960 Cancer Res. 20:600-604；Takeuchiら 1976, Cancer Res. 36:2133-2139；Kimataら 1983 Cancer Res. 43:1347-1354）；ヒアルロナンは、腫瘍の成長、生存、転移および間質液圧（ただしこれらに限るわけではない）を含むいくつかのがん過程を促進する。
【０３８３】
ヒアルロニダーゼは、腫瘍中に注射すると、直接的な抗発がん効果を有する。ヒアルロニダーゼは、マウスに移植された腫瘍の成長を防止し（De Maeyerら, (1992) Int. J. Cancer 51:657-660）、発がん物質に曝露された時の腫瘍形成を阻害する（Pawlowskiら (1979) Int. J. Cancer 23:105-109）。ヒアルロニダーゼは、脳がん（神経膠腫）の処置における単独治療剤として有効である（WO198802261）。上述のように、他の抗ヒアルロナン剤も既知の抗腫瘍活性を有する。
【０３８４】
ヒアルロナン関連がんは、ヒアルロナン発現（典型的には上昇したヒアルロナン発現）に関連するがんであり、このヒアルロナン発現は、上述のように例えば処置前に決定することができる。ここに提供される抗ヒアルロナン剤含有組成物および方法を使って処置することができるヒアルロナン関連疾患および状態の代表例は、がん、特に高ヒアルロナンがん、例えば、上昇した間質液圧に関連する高ヒアルロナンがんである。
【０３８５】
例えば、高ヒアルロナンがんは、がん細胞がインビトロ粒子排除アッセイにおいてハローを生成するがん；ヒアルロナンの発現が上昇しているがん（免疫染色、例えば腫瘍からの切片の組織学的染色によって決定されるもの）；HAS2（ヒアルロナンシンターゼ2）が上昇しているがん；およびインビトロでヒアルロニダーゼ（HYAL1）を生産しないがんであることができる。高ヒアルロナンがんは、本明細書に記載するようなヒアルロナン発現を評価するための任意の方法、およびタンパク質/mRNA発現をアッセイするための他の既知の方法によって、同定することができる。
【０３８６】
いくつかの高ヒアルロナンがんが同定されている。一部の例では、ヒアルロナン発現が予後不良、例えば生存率および/または無再発生存率の低下、転移、血管新生、他の組織/領域へのがん細胞浸潤、および予後不良の他の指標と相関する。そのような相関関係は、例えば卵巣がん、SCC、ISC、前立腺がん、非小細胞肺がん（NSCLC）を含む肺がん、乳がん、大腸がんおよび膵がんを含む高ヒアルロナン腫瘍に観察されている（例えばMaaritら, Cancer Research, 60:150-155 (2000)；Karvinenら, British Journal of Dermatology, 148:86-94 (2003)；Lipponenら, Eur. Journal of Cancer, 849-856 (2001)；Pirinenら, Int. J. Cancer:95:12-17 (2001)；Auvinenら, American Journal of Pathology, 156(2):529-536 (2000)；Ropponenら, Cancer Research, 58:342-347 (1998)参照）。したがって高ヒアルロナンがんは、がんの1つ以上の症状を処置するためにヒアルロニダーゼなどの抗ヒアルロナン剤を投与することによって、処置することができる。高ヒアルロナン腫瘍には、前立腺、乳房、結腸、卵巣、胃、頭頸部その他の腫瘍およびがんが含まれるが、これらに限るわけではない。
【０３８７】
ヒアルロニダーゼを含むヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤は、従来の化学療法に対して抵抗性である腫瘍の感受性を増加させるためにも使用することができる。例えば、HYAL1欠損に関連する腫瘍を有する患者に、抗ヒアルロナン剤、例えばrHuPH20などのヒアルロニダーゼを含むヒアルロナン分解酵素を、腫瘍部位周辺での拡散を増加させ（例えば腫瘍部位の中および周辺における化学療法剤の循環および/または濃縮を容易にし）、ヒアルロン酸分解などによって腫瘍細胞の運動性を阻害し、かつ/または腫瘍細胞のアポトーシスしきい値を低下させるのに有効な量で投与することができる。これは、腫瘍細胞をアノイキスの状態にして、それが、化学療法剤の作用に対する腫瘍細胞の感受性を高めることになりうる。ヒアルロニダーゼなどの抗ヒアルロナン剤の投与は、今まで化学療法抵抗性であった膵臓、胃、結腸、卵巣、および乳房の腫瘍の応答性を誘発することができる（Baumgartnerら (1988) Reg. Cancer Treat. 1:55-58；Zankerら (1986) Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390）。
【０３８８】
ある例では、ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤、特にヒアルロニダーゼが、非がん性細胞と比較して内在性ヒアルロニダーゼ活性が低下している転移がんおよび非転移がんの処置に使用される。抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、化学療法剤として単独で、または他の化学療法剤と組み合わせて使用することができる。例示的がんには、肺小細胞癌、肺扁平上皮細胞癌、および乳房、卵巣、頭頸部のがん、または抑圧されたヒアルロニダーゼ活性レベルもしくは低下したヒアルロン酸異化に関連する他の任意のがんが含まれるが、これらに限るわけではない。
【０３８９】
抗ヒアルロナン剤単独（およびコルチコステロイドとの併用）による疾患の処置に加えて、ここに提供される組成物および方法は、化学療法剤または他の抗がん剤もしくは処置と組み合わされた（例えば同時に行われる、または前もって行われる）抗ヒアルロナン剤の投与によってヒアルロナン関連がんを処置するためにも使用することができる。この例では、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素が、典型的には、化学療法剤または他の抗がん剤の固形腫瘍への浸透を強化することによって、疾患を処置する。抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、抗がん剤と共に腫瘍内注射するか、播種性がんまたは到達困難な腫瘍の場合には、静脈内注射することができる。
【０３９０】
抗がん剤は、化学療法剤、抗体、ペプチド、または遺伝子治療ベクター、ウイルスもしくはDNAであることができる。加えて、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、多剤耐性を獲得している今まで化学療法抵抗性であった腫瘍における増感を目的として、腫瘍細胞を細胞周期プールに動員するために使用することもできる（St Croixら, (1998) Cancer Lett September 131(1):35-44）。ヒアルロナン分解酵素などの抗ヒアルロナン剤、例えばrHuPH20などのヒアルロニダーゼは、グリコサミノグリカンを蓄積する腫瘍へのモノクローナル抗体、サイトカインなどの生物製剤および他の薬物の送達を強化することもできる。
【０３９１】
抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素の投与の後、同時または前に投与することができる例示的抗がん剤には、次に挙げるものが含まれるが、これらに限るわけではない：アシビシン類；アクラルビシン類；アコダゾール類；アクロニン類；アドゼレシン類；アルデスロイキン類；アレムツズマブ類；アリトレチノイン類（9-シス-レチノイン酸類）；アロプリノール類；アルトレタミン類；アルボシジブ類；アンバゾン類；アンボマイシン類；アメタントロン類；アミフォスチン類；アミノグルテチミド類；アムサクリン類；アナストロゾール類；アナキシロン類；アンシタビン類；アントラマイシン類；アパジコン類；アルギメスナ類；三酸化ヒ素類；アスパラギナーゼ類；アスペルリン類；アトリムスチン類；アザシチジン類；アゼテパ類；アゾトマイシン類；バノキサントロン類；バタブリン類；バチマスタット類；BCG生菌；ベナキシビン類；ベンダムスチン類；ベンゾデパ類；ベキサロテン類；ベバシズマブ；ビカルタミド類；ビエタセルピン類；ビリコダル類；ビサントレン類；ビサントレン類；ジメシル酸ビスナフィド類；ビゼレシン類；ブレオマイシン類；ボルテゾミブ類；ブレキナル類；ブロピリミン類；ブドチタン類；ブスルファン類；カクチノマイシン類；カルステロン類；カネルチニブ類；カペシタビン類；カラセミド類；カルベチマー類；カルボプラチン類；カルボコン類；カルモフール類；カルムスチン類とポリフェプロサン類；カルムスチン類；カルビシン類；カルゼレシン類；セデフィンゴール類；セレコキシブ類；セマドチン類；クロラムブシル類；シオテロネル類；シロレマイシン類；シスプラチン類；クラドリビン類；クランフェヌル類；クロファラビン類；クリスナトール類；シクロホスファミド類；シタラビンリポソーム製剤；シタラビン類；ダカルバジン類；ダクチノマイシン類；ダルベポエチンアルファ類；ダウノルビシンリポソーム製剤；ダウノルビシン類/ダウノマイシン類；ダウノルビシン類；デシタビン類；デニロイキンジフチトクス類；デクスニグルジピン類；デキソンナプラチン類；デクスラゾキサン類；デザグアニン類；ジアジコン類；ジプロスピジウム類；ジエノゲスト類；ジナリン類；ジセルモリド類；ドセタキセル類；ドフェキダル類；ドキシフルリジン類；ドキソルビシンリポソーム製剤；ドキソルビシンHCL；ドキソルビシンHCLリポソーム注射剤；ドキソルビシン類；ドロロキシフェン類；プロピオン酸ドロモスタノロン類；デュアゾマイシン類；エコムスチン類；エダトレキセート類；エドテカリン類；エフロルニチン類；エラクリダル類；エリナフィド類；エリオットB溶液類；エルサミトルシン類；エミテフル類；エンロプラチン類；エンプロマート類；エンザスタウリン類；エピプロピジン類；エピルビシン類；エポエチンアルファ類；エプタロプロスト類；エルブロゾール類；エソルビシン類；エストラムスチン類；エタニダゾール類；エトグルシド類；リン酸エトポシド類；エトポシドVP-16類；エトポシド類；エトプリン類；エクセメスタン類；エクシスリンド類；ファドロゾール類；ファザラビン類；フェンレチニド類；フィルグラスチム類；フロクスウリジン類；フルダラビン類；フルオロウラシル類；5-フルオロウラシル類；フルオキシメステロン類；フルロシタビン類；ホスキドン類；ホストリエシン類；ホストリエシン類；ホトレタミン類；フルベストラント類；ガラルビシン類；ガロシタビン類；ゲムシタビン類；ゲムツズマブ類/オゾガミシン類；ゲロキノール類；ギマテカン類；ギメラシル類；グロキサゾン類；グルフォスファミド類；酢酸ゴセレリン類；ヒドロキシ尿素類；イブリツモマブ類/チウキセタン類；イダルビシン類；イホスファミド類；イルモホシン類；イロマスタット類；メシル酸イマチニブ類；イメキソン類；インプロスルファン類；インジスラム類；インプロクォン類；インターフェロンアルファ-2a類；インターフェロンアルファ-2b類；インターフェロンアルファ類；インターフェロンベータ類；インターフェロンガンマ類；インターフェロン類；インターロイキン-2類および他のインターロイキン類（組換えインターロイキン類を含む）；イントプリシン類；イオベングアン類［131-I］；イプロプラチン類；イリノテカン類；イルソグラジン類；イクサベピロン類；ケトトレキサート類；L-アラノシン類；ランレオチド類；ラパチニブ類；レドキサントロン類；レトロゾール類；ロイコボリン類；ロイプロリド類；リューロプロレリン類（リュープロレリド類）；レバミソール類；レキサカルシトール類；リアロゾール類；ロバプラチン類；ロメトレキソール類；ロムスチン類/CCNU類；ロムスチン類；ロナファルニブ類；ロソキサントロン類；ラルトテカン類；マフォスファミド類；マンノスルファン類；マリマスタット類；マソプロコール類；メイタンシン類；メクロルエタミン類；メクロルエタミン類/ナイトロジェンマスタード類；酢酸メゲストロール類；メゲストロール類；メレンゲストロール類；メルファラン類；メルファラン類/L-PAM類；メノガリル類；メピチオスタン類；メルカプトプリン類；6-メルカプトプリン；メスナ類；メテシンド類；メトトレキサート類；メトキサレン類；メトミデート類；メトプリン類；メツレデパ類；ミボプラチン類；ミプロキシフェン類；ミソニダゾール類；ミチンドミド類；ミトカルシン類；ミトクロミン類；ミトフラキソン類；ミトギリン類；ミトグアゾン類；ミトマルシン類；マイトマイシンC類；マイトマイシン類；ミトナフィド類；ミトキドン類；ミトスパー類；ミトタン類；ミトキサントロン類；ミトゾロミド類；ミボブリン類；ミゾリビン類；モファロテン類；モピダモール類；ムブリチニブ類；ミコフェノール酸類；フェンプロピオン酸ナンドロロン類；ネダプラチン類；ネルザラビン類；ネモルビシン類；ニトラクリン類；ノコダゾール類；ノフェツモマブ類；ノガラマイシン類；ノラトレキセド類；ノルトピキサントロン類；オクトレオチド類；オプレルベキン類；オルマプラチン類；オルタタキセル類；オテラシル類；オキサリプラチン類；オキシスラン類；オキソフェナルシン類；パクリタキセル類；パミドロネート類；パツビロン類；ペガデマーゼ類；ペガスパルガーゼ類；ペグフィルグラスチム類；ペルデシン類；ペリオマイシン類；ペリトレキソール類；ペメトレキセド類；ペンタムスチン類；ペントスタチン類；ペプロマイシン類；ペルホスファミド類；ペリホシン類；ピコプラチン類；ピナフィド類；ピポブロマン類；ピポスルファ���類；ピルフェニドン類；ピロキサントロン類；ピクサントロン類；プレビトレキセド類；プリカミシド・ミトラマイシン類；プリカマイシン類；プロメスタン類；プロメスタン類；ポルフィマーナトリウム類；ポルフィマー類；ポルフィロマイシン類；プレドニムスチン類；プロカルバジン類；プロパミジン類；プロスピジウム類；プミテパ類；ピューロマイシン類；ピラゾフリン類；キナクリン類；ラニムスチン類；ラスブリカーゼ類；リボプリン類；リトロスルファン類；リツキシマブ類；ログレチミド類；ロキニメクス類；ルホクロモマイシン類；サバルビシン；サフィンゴール類；サルグラモスチム類；サトラプラチン類；セブリプラチン類；セムスチン類；シムトラゼン類；シゾフィラン類；ソブゾキサン類；ソラフェニブ類；スパルフォセート類；スパルホス酸類；スパルソマイシン類；スピロゲルマニウム類；スピロムスチン類；スピロプラチン類；スピロプラチン類；スクアラミン類；ストレプトニグリン類；ストレプトバリシン類；ストレプトゾシン類；スホスファミド類；スロフェヌル類；リンゴ酸スニチニブ；6-チオグアニン（6-TG）；タセジナリン類；タルク類；タリソマイシン類；タリムスチン類；タモキシフェン類；タリキダル類；タウロムスチン類；テコガラン類；テガフール類；テロキサントロン類；テモポルフィン類；テモゾロミド類；テニポシド類/VM-26類；テニポシド類；テロキシロン類；テストラクトン類；チアミプリン類；チオグアニン類；チオテパ類；チアミプリン類；チアゾフリン類；チロミソール類；チロロン類；チムコダル類；チモナシック類；チラパザミン類；トピキサントロン類；トポテカン類；トレミフェン類；トシツモマブ類；トラベクテジン類（エクテイナシジン743）；トラスツズマブ類；トレストロン類；トレチノイン類/ATRA；トリシリビン類；トリロスタン類；トリメトレキセート類；四硝酸トリプラチン類；トリプトレリン類；トロホスファミド類；ツブロゾール類；ウベニメクス類；ウラシルマスタード類；ウレデパ類；バルルビシン類；バルスポダル類；バプレオチド類；ベルテポルフィン類；ビンブラスチン類；ビンクリスチン類；ビンデシン類；ビネピジン類；ビンフルニン類；ビンホルミド類；ビングリシネート類；ビンロイシノール類；ビンロイロシン類；ビノレルビン類；ビンロシジン類；ビントリプトール類；ビンゾリジン類；ボロゾール類；キサントマイシンA類（グアメシクリン類）；ゼニプラチン類；ジラスコルブ類［2-H］；ジノスタチン類；ゾレドロネート；ゾルビシン類；およびゾスキダル類、例えばアルデスロイキン類（例えばPROLEUKIN（登録商標））；アレムツズマブ類（例えばCAMPATH（登録商標））；アリトレチノイン類（例えばPANRETIN（登録商標））；アロプリノール類（例えばZYLOPRIM（登録商標））；アルトレタミン類（例えばHEXALEN（登録商標））；アミフォスチン類（例えばETHYOL（登録商標））；アナストロゾール類（例えばARIMIDEX（登録商標））；三酸化ヒ素類（例えばTRISENOX（登録商標））；アスパラギナーゼ類（例えばELSPAR（登録商標））；BCG生菌（例えばTICE（登録商標）BCG)；ベキサロテン類（例えばTARGRETIN（登録商標））；ベバシズマブ（AVASTIN（登録商標））；ブレオマイシン類（例えばBLENOXANE（登録商標））；ブスルファン静脈内用（例えばBUSULFEX（登録商標））；ブスルファン経口剤（例えばMYLERAN（登録商標））；カルステロン類（例えばMETHOSARB（登録商標））；カペシタビン類（例えばXELODA（登録商標））；カルボプラチン類（例えばPARAPLATIN（登録商標））；カルムスチン類（例えばBCNU（登録商標）、BiCNU（登録商標））；カルムスチン類とポリフェプロサン類（例えばGLIADEL（登録商標）ウエハー）；セレコキシブ類（例えばCELEBREX（登録商標））；クロラムブシル類（例えばLEUKERAN（登録商標））；シスプラチン類（例えばPLATINOL（登録商標））；クラドリビン類（例えばLEUSTATIN（登録商標）、2-CdA（登録商標））；シクロホスファミド類（例えばCYTOXAN（登録商標）、NEOSAR（登録商標））；シタラビン類（例えばCYTOSAR-U（登録商標））；シタラビンリポソーム製剤（例えばDepoCyt（登録商標））；ダカルバジン類（例えばDTIC-Dome）；ダクチノマイシン類（例えばCOSMEGEN（登録商標））；ダルベポエチンアルファ類（例えばARANESP（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム製剤（例えばDANUOXOME（登録商標））；ダウノルビシン類/ダウノマイシン類（例えばCERUBIDINE（登録商標））；デニロイキンジフチトクス類（例えばONTAK（登録商標））；デクスラゾキサン類（例えばZINECARD（登録商標））；ドセタキセル類（例えばTAXOTERE（登録商標））；ドキソルビシン類（例えばADRIAMYCIN（登録商標）、RUBEX（登録商標））；ドキソルビシンHCLリポソーム注射剤を含むドキソルビシンリポソーム製剤（例えばDOXIL（登録商標））；プロピオン酸ドロモスタノロン類（例えばDROMOSTANOLONE（登録商標）およびMASTERONE（登録商標）注射剤）；エリオットB溶液類（例えばElliott's B Solution（登録商標））；エピルビシン類（例えばELLENCE（登録商標））；エポエチンアルファ類（例えばEPOGEN（登録商標））；エストラムスチン類（例えばEMCYT（登録商標））；リン酸エトポシド類（例えばETOPOPHOS（登録商標））；エトポシドVP-16類（例えばVEPESID（登録商標））；エクセメスタン類（例えばAROMASIN（登録商標））；フィルグラスチム類（例えばNEUPOGEN（登録商標））；フロクスウリジン類（例えばFUDR（登録商標））；フルダラビン類（例えばFLUDARA（登録商標））；5-FU類を含むフルオロウラシル類（例えばADRUCIL（登録商標））；フルベ
ストラント類（例えばFASLODEX（登録商標））；ゲムシタビン類（例えばGEMZAR（登録商標））；ゲムツズマブ類/オゾガミシン類（例えばMYLOTARG（登録商標））；酢酸ゴセレリン類（例えばZOLADEX（登録商標））；ヒドロキシ尿素類（例えばHYDREA（登録商標））；イブリツモマブ類/チウキセタン類（例えばZEVALIN（登録商標））；イダルビシン類（例えばIDAMYCIN（登録商標））；イホスファミド類（例えばIFEX（登録商標））；メシル酸イマチニブ類（例えばGLEEVEC（登録商標））；インターフェロンアルファ-2a類（例えばROFERON-A（登録商標））；インターフェロンアルファ-2b類（例えばINTRON A（登録商標））；イリノテカン類（例えばCAMPTOSAR（登録商標））；レトロゾール類（例えばFEMARA（登録商標））；ロイコボリン類（例えばWELLCOVORIN（登録商標）、LEUCOVORIN（登録商標））；レバミソール類（例えばERGAMISOL（登録商標））；ロムスチン類/CCNU類（例えばCeeBU（登録商標））；メクロルエタミン類/ナイトロジェンマスタード類（例えばMUSTARGEN（登録商標））；酢酸メゲストロール類（例えばMEGACE（登録商標））；メルファラン類/L-PAM類（例えばALKERAN（登録商標））；6-メルカプトプリン類（6-MP類；例えばPUPRINETHOL（登録商標））を含むメルカプトプリン；メスナ類（例えばMESNEX（登録商標））；メトトレキサート類；メトキサレン類（例えばUVADEX（登録商標））；マイトマイシンC類（例えばMUTAMYCIN（登録商標）、MITOZYTREX（登録商標））；ミトタン類（例えばLYSODREN（登録商標））；ミトキサントロン類（例えばNOVANTRONE（登録商標））；フェンプロピオン酸ナンドロロン類（例えばDURABOLIN-50（登録商標））；ノフェツモマブ類（例えばVERLUMA（登録商標））；オプレルベキン類（例えばNEUMEGA（登録商標））；オキサリプラチン類（例えばELOXATIN（登録商標））；パクリタキセル類（例えばPAXENE（登録商標）、TAXOL（登録商標））；パミドロネート類（例えばAREDIA（登録商標））；ペガデマーゼ類（例えばADAGEN（登録商標））；ペガスパルガーゼ類（例えばONCASPAR（登録商標））；ペグフィルグラスチム類（例えばNEULASTA（登録商標））；ペントスタチン類（例えばNIPENT（登録商標））；ピポブロマン類（例えばVERCYTE（登録商標））；プリカマイシン/ミトラマイシン類（例えばMITHRACIN（登録商標））；ポルフィマーナトリウム類（例えばPHOTOFRIN（登録商標））；プロカルバジン類（例えばMATULANE（登録商標））；キナクリン類（例えばATABRINE（登録商標））；ラスブリカーゼ類（例えばELITEK（登録商標））；リツキシマブ類（例えばRITUXAN（登録商標））；サルグラモスチム類（例えばPROKINE（登録商標））；ストレプトゾシン類（例えばZANOSAR（登録商標））；リンゴ酸スニチニブ類（例えばSUTENT（登録商標））；タルク類（例えばSCLEROSOL（登録商標））；タモキシフェン類（例えばNOLVADEX（登録商標））；テモゾロミド類（例えばTEMODAR（登録商標））；テニポシド類/VM-26類（例えばVUMON（登録商標））；テストラクトン類（例えばTESLAC（登録商標））；6-チオグアニン（6-TG）を含むチオグアニン類；チオテパ類（例えばTHIOPLEX（登録商標））；トポテカン類（例えばHYCAMTIN（登録商標））；トレミフェン類（例えばFARESTON（登録商標））；トシツモマブ類（例えばBEXXAR（登録商標））；トラスツズマブ類（例えばHERCEPTIN（登録商標））；トレチノイン類/ATRA（例えばVESANOID（登録商標））；ウラシルマスタード類；バルルビシン類（例えばVALSTAR（登録商標））；ビンブラスチン類（例えばVELBAN（登録商標））；ビンクリスチン類（例えばONCOVIN（登録商標））；ビノレルビン類（例えばNAVELBINE（登録商標））；およびゾレドロネート類（例えばZOMETA（登録商標））。
【０３９２】
ある例では、抗ヒアルロナン剤、例えば修飾ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素、例えばPEG化rHuPH20が、ドセタキセル（例えばTAXOTERE（登録商標））、ドキソルビシンリポソーム製剤（例えばDOXIL（登録商標））、リンゴ酸スニチニブ（例えばSUTENT（登録商標））またはベバシズマブ（AVASTIN（登録商標））の1つ以上の投与の後、同時または前に、対象に投与される。この方法では、抗ヒアルロナン剤の投与に起因または関連する筋骨格副作用などの副作用を緩和または防止するために、コルチコステロイドも投与される。
【実施例】
【０３９３】
I．実施例
以下の実施例は、例示を目的として記載するに過ぎず、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０３９４】
［実施例1］
rHuPH20発現細胞株
A．初期可溶性rHuPH20発現細胞株の生成
HZ24プラスミド（配列番号52に示す）を使ってチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞をトランスフェクトした。可溶性rHuPH20を発現させるためのHZ24プラスミドベクターは、pCIベクターバックボーン（Promega）、ヒトPH20ヒアルロニダーゼのアミノ酸1〜482をコードするDNA（配列番号49）、ECMVウイルス由来の配列内リボソーム進入部位（IRES）（Clontech）、およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子を含有する。pCIベクターバックボーンは、ベータ-ラクタマーゼ耐性遺伝子（AmpR）をコードするDNA、f1複製起点、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー/プロモーター領域（CMV）、キメライントロン、およびSV40後期ポリアデニル化シグナル（SV40）も含んでいる。可溶性rHuPH20コンストラクトをコードするDNAは、ヒトPH20のネイティブ35アミノ酸シグナル配列のアミノ酸位置1のメチオニンをコードするDNAの前にNheI部位とコザックコンセンサス配列とを含有し、配列番号1に示すヒトPH20ヒアルロニダーゼのアミノ酸位置482に対応するチロシンをコードするDNAの後に停止コドンを含有し、その後ろに、BamHI制限部位が続いている。それゆえに、コンストラクトpCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa（HZ24）は、CMVプロモーターによって駆動される単一のmRNA種であって、配列内リボソーム進入部位（IRES）によって分離された、ヒトPH20のアミノ酸1〜482（配列番号3に示す）とマウスジヒドロ葉酸レダクターゼのアミノ酸1〜186（配列番号53に示す）とをコードするものをもたらす。
【０３９５】
トランスフェクションの準備として、4mMグルタミンおよび18ml/L Plurionic F68/L（Gibco）を補足したDHFR(-)細胞用のGIBCO変法CD-CHO培地中で成長している非トランスフェクトCHO細胞を、0.5×106細胞/mlの密度でシェーカーフラスコに播種した。細胞を湿潤インキュベータ中、5％CO2下、37℃において、120rpmで振とうしながら成長させた。トランスフェクションに先立ち、対数増殖期の非トランスフェクトCHO細胞を、生存度について調べた。
【０３９６】
非トランスフェクトCHO細胞培養の生細胞6千万個をペレット化し、2×トランスフェクション緩衝液（2×HeBS：40mM Hepes、pH7.0、274mM NaCl、10mM KCl、1.4mM Na2HPO4、12mMデキストロース）0.7mLに、2×107細胞の密度で再懸濁した。再懸濁した細胞の各アリコートに、0.09mL（250μg）の線状HZ24プラスミド（ClaI（New England Biolabs）で終夜消化することによって線状化したもの）を加え、その細胞/DNA溶液を、室温で、間隙0.4cmのBTX（Gentronics）エレクトロポレーションキュベットに移した。陰性対照エレクトロポレーションは、プラスミドDNAを細胞と混合せずに行った。細胞/プラスミド混合物を、330Vおよび960μFまたは350Vおよび960μFのコンデンサ放電でエレクトポレートした。
【０３９７】
細胞をエレクトロポレーション後のキュベットから取り出して、4mMグルタミンおよび18ml/L Plurionic F68/L（Gibco）を補足した5mLのDHFR(-)細胞用変法CD-CHO培地に移し、湿潤インキュベータ中、5％CO2下、37℃において、選択を行わずに、6穴組織培養プレートのウェルで2日間成長させた。
【０３９８】
エレクトロポレーションの2日後に、0.5mLの組織培養培地を各ウェルから取り出し、実施例4に記載する微小濁度アッセイを使って、ヒアルロニダーゼ活性の存在について試験した。最も高レベルのヒアルロニダーゼ活性を発現する細胞を組織培養ウェルから収集し、計数し、1mLあたり1×104〜2×104個の生細胞に希釈した。5枚の96穴丸底組織培養プレートの各ウェルに、細胞懸濁液を0.1mLずつ移した。4mM GlutaMAX（商標）-1サプリメント（GIBCO（商標）、Invitrogen Corporation）を含有しヒポキサンチンおよびチミジンサプリメントを含有しないCD-CHO培地（GIBCO）100マイクロリットルを、細胞が入っているウェルに加えた（最終体積0.2mL）。
【０３９９】
メトトレキサートなしで成長させた5枚のプレートから10個のクローンが同定された。これらのHZ24クローンのうちの6個を拡大培養し、単一細胞懸濁液としてシェーカーフラスコに移した。クローン3D3、3E5、2G8、2D9、1E11、および4D10を、左上のウェルの5000細胞から開始して、細胞をプレートの縦方向に1:2希釈し、プレートの横方向に1:3希釈する二次元無限希釈法を使って、96穴丸底組織培養プレートにプレーティングした。培養の最初の数日に必要な成長因子を提供するために、1ウェルあたり500個の非トランスフェクトDG44 CHO細胞のバックグラウンドにおいて、希釈クローンを成長させた。1サブクローンあたり10枚のプレートを作製して、50nMメトトレキサートを含有するプレートを5枚、メトトレキサートを含有しないプレートを5枚にした。
【０４００】
クローン3D3は、目に見えるサブクローン24個を生成した（メトトレキサート処理なしから13個、および50nMメトトレキサート処理から11個）。それら24個のサブクローンのうち8個からの上清に、有意なヒアルロニダーゼ活性（＞50単位/mL）が測定され、それら8個のサブクローンをT-25組織培養フラスコに拡大培養した。メトトレキサート処理プロトコールから単離されたクローンは、50nMメトトレキサートの存在下で拡大培養した。クローン3D35Mをさらにシェーカーフラスコ中、500nMメトトレキサートで拡大培養したところ、1,000単位/mLを超えるヒアルロニダーゼ活性を生産するクローンが生じた（クローン3D35M；またはGen1 3D35M）。次に、3D35M細胞のマスターセルバンク（master cell bank）（MCB）を調製した。
【０４０１】
B．可溶性rHuPH20を発現する第2世代細胞株の生成
実施例1Aで述べたGen1 3D35M細胞株を、さらに高いメトトレキサートレベルに適応させて、第2世代（Gen2）クローンを作出した。樹立メトトレキサート含有培養から、4mM GlutaMAX-1（商標）および1.0μMメトトレキサートを含有するCD CHO培地に、3D35M細胞を播種した。37℃、7％CO2湿潤インキュベータ中で細胞を成長させ、それらを46日間にわたって9回継代することにより、細胞を、より高いメトトレキサートレベルに適応させた。2.0μMメトトレキサートを含む培地が入っている96穴組織培養プレートでの限界希釈により、増幅された細胞集団をクローンアウト（clone out）した。約4週間後に、クローンを同定し、クローン3E10Bを拡大培養のために選択した。4mM GlutaMAX-1（商標）および2.0μMメトトレキサートを含有するCD CHO培地中で、継代20代にわたって、3E10B細胞を成長させた。3E10B細胞株のマスターセルバンク（MCB）を作製し、凍結し、以後の研究に使用した。
【０４０２】
4mM GlutaMAX-1（商標）および4.0μMメトトレキサートを含有するCD CHO培地中で3E10B細胞を培養することによって、この細胞株の増幅を続けた。12回目の継代後に、細胞をバイアル中で凍結して研究用セルバンク（RCB）とした。RCBのバイアルを1本融解し、8.0μMメトトレキサートを含有する培地中で培養した。5日後に、培地中のメトトレキサート濃度を16.0μMに増加させ、次いで18日後に20.0μMに増加させた。20.0μMメトトレキサートを含有する培地における8回目の継代培養から得た細胞を、4mM GlutaMAX-1（商標）および20.0μMメトトレキサートを含有するCD CHO培地が入っている96穴組織培養プレートでの限界希釈法によってクローンアウトした。5〜6週間後にクローンを同定し、クローン2B2を20.0μMメトトレキサートを含有する培地中での拡大培養のために選択した。11回目の継代後に、2B2細胞をバイアル中で凍結して、研究用セルバンク（RCB）とした。
【０４０３】
結果として生じた2B2細胞は、可溶性組換えヒトPH20（rHuPH20）を発現するジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損性（dhfr-）DG44 CHO細胞である。可溶性PH20は2B2細胞中に、約206コピー/細胞のコピー数で存在する。SpeI消化、XbaI消化およびBamHI/HindIII消化したゲノム2B2細胞DNAを、rHuPH20特異的プローブを使ってサザンブロット解析したところ、以下の制限消化プロファイルが明らかになった：SpeIで消化したDNAでは1本の主要ハイブリダイズバンド約7.7kbと4本の副ハイブリダイズバンド（約13.9、約6.6、約5.7および約4.6kb）；XbaIで消化したDNAでは、1本の主要ハイブリダイズバンド約5.0kbと2本の副ハイブリダイズバンド（約13.9および約6.5kb）；BamHI/HindIIIで消化した2B2 DNAを使うと、約1.4kbの単一ハイブリダイズバンドが観察された。mRNA転写産物の配列解析により、得られたcDNA（配列番号56）は、位置1131における1塩基対の相違（これは予想されるシトシン（C）の代わりにチミジン（T）であると観察された）を除いて、参照配列（配列番号49）と同一であることが示された。これはサイレント突然変異であり、アミノ酸配列には影響しない。
【０４０４】
［実施例2］
rHuPH20の生産および精製
A．300Lバイオリアクター細胞培養におけるGen2可溶性rHuPH20の生産
HZ24-2B2細胞（実施例1B）のバイアルを融解し、20μMメトトレキサートおよびGlutaMAX-1（商標）（Invitrogen）を補足したCD CHO培地（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド）中で、シェーカーフラスコから36Lスピナーフラスコまで拡大培養した。簡単に述べると、細胞のバイアルを37℃の水浴で融解し、培地を加え、細胞を遠心分離した。細胞を、20mLの新鮮培地が入っている125mL振とうフラスコに再懸濁し、37℃、7％CO2のインキュベータに入れた。細胞を125mL振とうフラスコ中で40mLまで拡大培養した。細胞密度が1.5×106細胞/mLを上回る密度に達したら、培養物を125mLスピナーフラスコに100mLの培養体積で拡大した。フラスコを37℃、7％CO2でインキュベートした。細胞密度が1.5×106細胞/mLを上回る密度に達したら、培養物を250mLスピナーフラスコに200mLの培養体積で拡大し、フラスコを37℃、7％CO2でインキュベートした。細胞密度が1.5×106細胞/mLを上回る密度に達したら、培養物を1Lスピナーフラスコに800mLの培養体積で拡大し、37℃、7％CO2でインキュベートした。細胞密度が1.5×106細胞/mLを上回る密度に達したら、培養物を6Lスピナーフラスコに5000mLの培養体積で拡大し、37℃、7％CO2でインキュベートした。細胞密度が1.5×106細胞/mLを上回る密度に達したら、培養物を36Lスピナーフラスコに32Lの培養体積で拡大し、37℃、7％CO2でインキュベートした。
【０４０５】
400Lリアクターを滅菌し、230mLのCD CHO培地を加えた。使用前に、リアクターを汚染についてチェックした。約30Lの細胞を36Lスピナーフラスコから400Lバイオリアクター（Braun）に、1mlあたり4.0×105個の生細胞という接種密度および260Lの総体積で移した。パラメータは温度設定値：37℃；インペラー速度40〜55RPM；容器圧：3psi；空気散布量0.5〜1.5L/分；空気オーバーレイ：3L/分とした。細胞数、pH確認、培地分析、タンパク質の生産および貯留を調べるための試料を、リアクターから毎日採取した。また、運転中に栄養フィードを加えた。120時間（5日目）の時点で、10.4Lの第1フィード培地（4×CD-CHO＋33g/Lグルコース＋160mL/L GlutaMAX-1（商標）＋83mL/Lイーストレート（Yeastolate）＋33mg/L rHuインスリン）を加えた。168時間（7日目）の時点で、10.8Lの第2フィード（2×CD-CHO＋33g/Lグルコース＋80mL/L GlutaMAX-1（商標）＋167mL/Lイーストレート＋0.92g/L酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を36.5℃に変えた。216時間（9日目）の時点で、10.8Lの第3フィード（1×CD-CHO＋50g/Lグルコース＋50mL/L GlutaMAX-1（商標）＋250mL/Lイーストレート＋1.80g/L酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を36℃に変えた。264時間（11日目）の時点で、10.8Lの第4フィード（1×CD-CHO＋33g/Lグルコース＋33mL/L GlutaMAX-1（商標）＋250mL/Lイーストレート＋0.92g/L酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を35.5℃に変えた。フィード培地の添加は生産の最終段階における可溶性rHuPH20の生産を劇的に強化することが観察された。14日時点もしくは15日時点で、または細胞の生存度が40％未満に低下した時に、リアクターからの収穫を行った。このプロセスにより、1200万細胞/mLの最大細胞密度で17,000単位/mlの最終生産能力が得られた。マイコプラズマ、生物汚染度、エンドトキシン、インビトロおよびインビボでのウイルス、透過型電子顕微鏡観察、ならびに酵素活性を調べるための試料を、収穫時に、培養物から採取した。
【０４０６】
それぞれが4〜8μmに分級された珪藻土の層と1.4〜1.1μmに分級された珪藻土の層とを含んでいて、その後にセルロースメンブレンが設けられている、並列した4つのMillistak濾過システムモジュール（Millipore）に、培養物を蠕動ポンプで通し、次に、0.4〜0.11μmに分級された珪藻土の層と、＜0.1μmに分級された珪藻土の層とを含んでいて、その後にセルロースメンブレンが設けられている、2つ目の単独Millistak濾過システム（Millipore）に通し、次に0.22μm最終フィルタを通して、350Lの容量を有する滅菌使い捨てフレキシブルバッグに入れた。収穫された細胞培養液に10mM EDTAおよび10mMトリスをpHが7.5になるように補足した。培養物を、4つのSartoslice TFF 30kDa分子量分画（MWCO）ポリエーテルスルホン（PES）フィルタ（Sartorius）を使用するタンジェンシャルフロー濾過（TFF）装置で10倍濃縮した後、10mMトリス、20mM Na2SO4、pH7.5で10回の緩衝液交換を行い、0.22μm最終フィルタを通して、50L滅菌貯蔵バッグ中に濾過した。
【０４０７】
濃縮しダイアフィルトレーションした収穫物を、ウイルスに関して不活化した。ウイルス不活化に先だって、10％Triton X-100、3％リン酸トリ(n-ブチル)（TNBP）の溶液を調製した。濃縮しダイアフィルトレーションした収穫物を、Qカラムで精製する直前に、36Lガラス反応容器中で、1％Triton X-100、0.3％TNBPに1時間曝露した。
【０４０８】
B．Gen2可溶性rHuPH20の精製
Q Sepharose（Pharmacia）イオン交換カラム（樹脂9L、H＝29cm、D＝20cm）を調製した。pHおよび伝導度の決定ならびにエンドトキシン（LAL）アッセイのために洗浄液試料を収集した。カラムを5カラム体積の10mMトリス、20mM Na2SO4、pH7.5で平衡化した。濃縮しダイアフィルトレーションした収穫物（実施例2A）を、ウイルス不活化後に、100cm/時間の流速でQカラムにローディングした。カラムを、5カラム体積の10mMトリス、20mM Na2SO4、pH7.5および10mM Hepes、50mM NaCl、pH7.0で洗浄した。タンパク質を10mM Hepes、400mM NaCl、pH7.0で溶出させ、0.22μm最終フィルタを通して滅菌バッグ中に濾過した。溶出液試料を生物汚染度、タンパク質濃度およびヒアルロニダーゼ活性について調べた。この交換の最初と最後にA280吸光度を読み取った。
【０４０９】
次にPhenyl-Sepharose（Pharmacia）疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った。Phenyl-Sepharose（PS）カラム（樹脂19〜21L、H=29cm、D＝30cm）を調製した。洗浄液を収集し、pH、伝導度およびエンドトキシン（LALアッセイ）を調べるための試料を採取した。カラムを5カラム体積の5mMリン酸カリウム、0.5M硫酸アンモニウム、0.1mM CaCl2、pH7.0で平衡化した。Q Sepharoseカラムから得たタンパク質溶出液に2M硫酸アンモニウム、1Mリン酸カリウムおよび1M CaCl2保存液を補足して、最終濃度をそれぞれ5mM、0.5Mおよび0.1mMにした。タンパク質を100cm/時間の流速でPSカラムにローディングし、カラム素通り画分を収集した。100cm/時間の5mMリン酸カリウム、0.5M硫酸アンモニウムおよび0.1mM CaCl2 pH7.0でカラムを洗浄し、その洗浄液を、収集した素通り画分に加えた。カラム洗浄液と合わせた素通り画分を0.22μm最終フィルタを通して滅菌バッグに入れた。生物汚染度、タンパク質濃度および酵素活性を調べるための試料を素通り画分から採取した。
【０４１０】
アミノフェニルボロネートカラム（ProMedics）を調製した。洗浄液を収集し、pH、伝導度およびエンドトキシン（LALアッセイ）を調べるための試料を採取した。カラムを5カラム体積の5mMリン酸カリウム、0.5M硫酸アンモニウムで平衡化した。精製タンパク質を含有するPS素通り画分を100cm/時間の流速でアミノフェニルボロネートカラムにローディングした。カラムを5mMリン酸カリウム、0.5M硫酸アンモニウム、pH7.0で洗浄した。カラムを20mMビシン、0.5M硫酸アンモニウム、pH9.0で洗浄した。カラムを20mMビシン、100mM塩化ナトリウム、pH9.0で洗浄した。タンパク質を50mM Hepes、100mM NaCl、pH6.9で溶出させ、滅菌フィルタを通して滅菌バッグに入れた。溶出した試料を生物汚染度、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。
【０４１１】
ヒドロキシアパタイト（HAP）カラム（BioRad）を調製した。洗浄液を収集して、pH、伝導度およびエンドトキシン（LALアッセイ）について調べた。カラムを5mMリン酸カリウム、100mM NaCl、0.1mM CaCl2、pH7.0で平衡化した。アミノフェニルボロネートで精製したタンパク質を、最終濃度が5mMリン酸カリウムおよび0.1mM CaCl2になるように補足し、100cm/時間の流速でHAPカラムにローディングした。カラムを5mMリン酸カリウム、pH7、100mM NaCl、0.1mM CaCl2で洗浄した。次に、カラムを10mMリン酸カリウム、pH7、100mM NaCl、0.1mM CaCl2で洗浄した。タンパク質を70mMリン酸カリウム、pH7.0で溶出させ、0.22μm滅菌フィルタを通して滅菌バッグに入れた。溶出した試料を生物汚染度、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。
【０４１２】
次に、HAPで精製したタンパク質をウイルス除去フィルタに通した。まず、滅菌Virosartフィルタ（Sartorius）を、2Lの70mMリン酸カリウム、pH7.0で洗浄することによって準備した。使用前に、pHおよび伝導度を調べるための試料を、濾過された緩衝液から採取した。HAPで精製したタンパク質を蠕動ポンプで20nMウイルス除去フィルタに通した。70mMリン酸カリウム、pH7.0中の濾過されたタンパク質を0.22μm最終フィルタを通して滅菌バッグに入れた。ウイルス濾過された試料を、タンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖、シアル酸プロファイルについて調べた。試料をプロセス関連不純物についても試験した。
【０４１３】
［実施例3］
PEG化rHuPH20の調製
この実施例では、rHuPH20を、酵素と線状メトキシポリ(エチレングリコール)ブタン酸のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（mPEG-SBA-30K）との反応によって、PEG化した。
【０４１４】
A．mPEG-SBA-30Kの調製
PEGPH20を作製するために、rHuPH20（サイズは約60KDaである）を、およその分子量が30kDaである線状メトキシポリ(エチレングリコール)ブタン酸のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（mPEG-SBA-30K）に、共有結合によってコンジュゲートした。mPEG-SBAの構造を以下に示す（式中、n≒618である）。
【化３】
2013540103.tif 000009
【０４１５】
rHuPH20をPEG化するために使用したmPEG-SBA-30Kを製造するために用いられる方法は、例えば米国特許第5,672,662号に記載されている。簡単に述べると、mPEG-SBA-30Kは、下記の手法に従って製造される。
【０４１６】
ジオキサンに溶解したマロン酸エチル（2当量）の溶液を、窒素雰囲気下の水素化ナトリウム（2当量）およびトルエンに滴下する。mPEGメタンスルホネート（1当量、分子量30kDa、Shearwater）をトルエンに溶解し、上記の混合物に加える。得られた混合物を約18時間還流する。反応混合物を元の体積の半分まで濃縮し、10％NaCl水溶液で抽出し、1％塩酸水溶液で抽出し、水性抽出物を合わせる。収集した水層をジクロロメタンで抽出（3回）し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾固する。得られた残渣を、塩化ナトリウムを含有する1N水酸化ナトリウムに溶解し、その混合物を1時間撹拌する。混合物のpHを6N塩酸の添加によって約3に調節する。その混合物をジクロロメタンで抽出（2回）する。
【０４１７】
有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、冷ジエチルエーテルに注ぎ込む。沈殿物を濾過によって収集し、減圧下で乾燥する。得られた化合物をジオキサンに溶解し、8時間還流した後、濃縮乾固する。得られた残渣を水に溶解し、ジクロロメタンで抽出（2回）し、硫酸マグネシウムで乾燥し、その溶液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、冷ジエチルエーテルに注ぎ込む。沈殿物を濾過によって収集し、減圧下で乾燥する。得られた化合物（1当量）をジクロロメタンに溶解し、N-ヒドロキシスクシンイミド（2.1当量）を加える。その溶液を0℃に冷却し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（2.1当量）のジクロロメタン溶液を滴下する。その溶液を室温で約18時間撹拌する。反応混合物を濾過し、濃縮し、ジエチルエーテル中で沈殿させる。沈殿物を濾過によって収集し、減圧下で乾燥することにより、粉末状のmPEG-SBA-30Kを得て、次にそれを≦-15℃で凍結する。
【０４１８】
B．rHuPH20へのmPEG-SBA-30Kのコンジュゲーション
PEGPH20を製造するために、次に示すように、mPEG-SBA-30Kを、rHuPH20の（1つまたは複数の）アミノ基に、共有結合的コンジュゲーションでカップリングすることにより、rHuPH20とmPEGの間に安定なアミド結合を得た（式中、n≒681である）。
【化４】
2013540103.tif 000010
【０４１９】
コンジュゲーションに先だって、実施例2Bで製造したrHuPH20精製バルクタンパク質を、濾過面積0.2m2の10kDaポリエーテルスルホン（PES）タンジェンシャルフロー濾過（TFF）カセット（Sartorius）を使って10mg/mLに濃縮し、pH7.2の70mMリン酸カリウムに対して緩衝液交換した。次に、濃縮されたタンパク質を使用時まで2〜8℃で保存した。
【０４２０】
rHuPH20をコンジュゲートするために、mPEG-SBA-30K（Nektar）を暗所、室温で、2時間を超えないように融解した。バッチサイズに応じて、滅菌3"撹拌子を1または3リットルのエルレンマイヤーフラスコに入れ、緩衝液交換したrHuPH20タンパク質を加えた。1グラムのrHuPH20につき5グラムの乾燥mPEG-SBA-30K粉末（mPEG-SBA-30K：rHuPH2は10：1のモル比）を減圧フード（vacuum hood）下でフラスコに加え、その混合物を10分間またはmPEG-SBA-30Kが完全に溶解するまで混合した。渦は生じるが泡立たないように撹拌速度を設定した。
【０４２１】
次にその溶液を、クラス100フード下で、溶液を蠕動ポンプにより、0.22μmポリスチレン、酢酸セルロースフィルターカプセル（Corning 50mL Tubetopフィルター）を通して、滅菌3"撹拌子が入っている新しい1または3リットルのエルレンマイヤーフラスコ中に濾過した。PEGPH20反応混合物の体積を、重さで決定し（密度1g/mL）、濾過に使用した0.22μmフィルターを使用後完全性試験で調べた。
【０４２２】
次にその混合物を2〜8℃の撹拌プレートに置き、暗所で20±1時間混合した。ここでも、渦は生じるが泡立たないように撹拌速度を設定した。溶液を光から保護するためにエルレンマイヤー容器全体をホイルで包んだ。混合後に、1Mグリシンを最終濃度が25mMになるように加えることにより、反応をクエンチした。試料を容器から取り出して、pHおよび伝導度を試験した。次に、Q Sepharose精製に移るために、5mMトリス塩基（5.65L/L）および5mMトリス、10mM NaCl、pH8.0（13.35L/L）の溶液を加えることによって、pHおよび伝導度を調節した。
【０４２３】
QFF Sepharose（GE Healthcare）イオン交換カラム（高さ＝21.5〜24.0cm、直径＝20cm）を、5カラム体積（36L）の5mMトリス、10mM NaCl、pH8.0との平衡化によって調製した。このQFFカラムに、コンジュゲーション生成物を95cm/時間の流速でローディングした。次にカラムを、流速95cm/時間の平衡化緩衝液（5mMトリス、10mM NaCl、pH8.0）11Lで洗浄した後、流速268cm/時間の平衡化緩衝液25Lで洗浄した。次に、流速268cm/時間の5mMトリス、130mM NaCl、pH8.0で、タンパク質生成物を溶出させた。得られた精製PEGPH20を、濾過面積0.2m2の30kDaポリエーテルスルホン（PES）タンジェンシャルフロー濾過（TFF）カセット（Sartorius）を使って3.5mg/mLに濃縮し、pH6.5の10mMヒスチジン、130mM NaClに対して緩衝液交換した。得られた材料を、下記実施例4で述べるように酵素活性について試験した。濃度3.5mg/mL（最終酵素活性140,000U/mL）のPEG化rHuPH20材料を、シリコーン処理したブロモブチルゴム製ストッパーとアルミニウム製フリップオフシールが付いている5mLガラスバイアルに、3mLずつ充填し、凍結した（-20℃のフリーザーで終夜凍結した後、長期貯蔵用に-80℃のフリーザーに入れた）。このPEG化rHuHP20は、1モルのrHuPH20につきおよそ4.5モルのPEGを含有していた。
【０４２４】
［実施例4］
可溶性rHuPH20のヒアルロニダーゼ活性の決定
細胞培養、血漿、精製画分および精製溶液などの試料中の可溶性rHuPH20のヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合した時に起こる不溶性沈殿物の形成に基づく比濁アッセイを使用するか、またはプラスチック製マルチウェルマイクロタイタープレートに非共有結合的に結合されたビオチン化ヒアルロン酸（b-HA）基質の消化によって酵素的に活性なrHuPH20もしくはPEGPH20の量を測定するビオチン化ヒアルロン酸基質アッセイを使用して決定した。
【０４２５】
A．微小濁度アッセイ
可溶性rHuPH20のヒアルロニダーゼアッセイは、可溶性rHuPH20を、ヒアルロン酸ナトリウム（ヒアルロン酸）と共に、設定された時間（10分間）インキュベートした後、酸性化血清アルブミンを添加して未消化のヒアルロン酸ナトリウムを沈殿させることによって測定される。得られた試料の濁度を30分間の発現期間後に640nmで測定する。ヒアルロン酸ナトリウム基質に対する酵素活性に起因する濁度の低下が、可溶性rHuPH20ヒアルロニダーゼ活性の尺度になる。この方法は、可溶性rHuPH20アッセイ作業用参照標準の希釈液で作成される検量線を使って行われ、試料活性測定はこの検量線との比較でなされる。
【０４２６】
酵素希釈用溶液中に試料の希釈液を調製した。酵素希釈用溶液は、33.0±0.05mgの加水分解ゼラチンを25.0mLの50mM PIPES反応緩衝液（140mM NaCl、50mM PIPES、pH5.5）と25.0mLの滅菌注射用水（SWFI）とに溶解し、0.2mLの25％ブミネート（Buminate）溶液をその混合物に希釈し、30秒間ボルテックスすることによって調製した。これは使用前2時間以内に行い、必要になるまで氷上に保存しておいた。試料を推定1〜2U/mLに希釈した。一般に、1工程あたりの最大希釈度が1：100を超えることはなく、1回目の希釈のための初期試料サイズが20μL未満になることはなかった。アッセイを行うために必要な最小試料体積は以下のとおりだった：工程内試料、FPLC画分：80μL；組織培養上清：1mL；濃縮物質80μL；精製または最終工程物質：80μL。希釈液は低タンパク質結合性96穴プレートで3つ一組にして作成し、30μLの各希釈液をOptiluxブラック/クリアーボトムプレート（BD BioSciences）に移した。
【０４２７】
標準曲線を作成するために、濃度2.5U/mLの既知可溶性rHuPH20の希釈液を酵素希釈用溶液中に調製し、Optiluxプレートに三つ一組にして加えた。これらの希釈液には、0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1.0U/mL、1.5U/mL、2.0U/mL、および2.5U/mLを含めた。60μLの酵素希釈用溶液が入っている「試薬ブランク」ウェルを陰性対照としてプレートに含めた。次にプレートにカバーをして、ヒートブロック上、37℃で5分間温めた。カバーを取り除き、プレートを10秒間振とうした。振とう後に、プレートをヒートブロックに戻し、MULTIDROP 384液体ハンドリング装置に温かい0.25mg/mLヒアルロン酸ナトリウム溶液（100mgのヒアルロン酸ナトリウム（LifeCore Biomedical）を20.0mLのSWFIに溶解することによって調製したもの。これを、2〜8℃で2〜4時間、または完全に溶解するまで、穏やかに回転および/または揺動することによって混合した）を装填した。反応プレートをMULTIDROP 384に移し、スタートキーを押して30μLのヒアルロン酸ナトリウムを各ウェルに分注することによって、反応を開始させた。次にプレートをMULTIDROP 384から取り出し、10秒間振とうしてから、ヒートブロックに移し、プレートカバーを元に戻した。そのプレートを37℃で10分間インキュベートした。
【０４２８】
反応を停止させるために、血清作業溶液を機械に装填し、体積設定を240μLに変えることによって、MULTIDROP 384の準備をした。（500mM酢酸緩衝溶液75mL中の血清保存液［1体積のウマ血清（Sigma）を9体積の500mM酢酸緩衝溶液で希釈し、pHを塩酸で3.1に調節したもの］25mL）。プレートをヒートブロックから取り出してMULTIDROP 384にのせ、240μLの血清作業溶液をウェルに分注した。プレートを取り出し、プレートリーダー上で10秒間、振とうした。さらに15分経過してから、試料の濁度を640nmで測定し、標準曲線へのあてはめによって各試料のヒアルロニダーゼ活性（単位はU/mL）を決定した。
【０４２９】
ヒアルロニダーゼ活性（U/ml）をタンパク質濃度（mg/mL）で割ることによって比活性（単位/mg）を算出した。
【０４３０】
B．ビオチン化ヒアルロナンアッセイ
ビオチン化ヒアルロン酸アッセイでは、プラスチック製マルチウェルマイクロタイタープレートに非共有結合的に結合された大分子量（約1.2メガダルトン）のビオチン化ヒアルロナン（b-HA）基質の消化によって、生物学的試料中の酵素的に活性なrHuPH20またはPEGPH20の量を測定する。標準および試料中のrHuPH20またはPEGPH20を、b-HAでコーティングされたプレート中、37℃でインキュベートする。一連の洗浄後に、残っている未切断/結合型b-HAを、ストレプトアビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（SA-HRP）で処理する。固定化SA-HRPと発色性基質3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）とが反応することにより、青色の溶液が生じる。酸で反応を停止してから、マイクロタイタープレート分光測光器を使って450nmにおける吸光度を読み取ることにより、可溶性黄色反応生成物の形成を決定する。ビオチン化ヒアルロン酸（b-HA）基質に対する酵素活性に起因する450nmにおける吸光度の低下が、可溶性rHuPH20ヒアルロニダーゼ活性の尺度である。この方法は、可溶性rHuPH20またはPEGPH20参照標準の希釈液で作成される検量線を使って行われ、試料活性測定はこの検量線との比較でなされる。
【０４３１】
試料および較正物質の希釈液をアッセイ希釈剤中に調製した。アッセイ希釈剤は1％v/vプール血漿（適当な種に由来するもの）をHEPS（pH7.4）中の0.1％（w/v）BSAに加えることによって調製した。これは毎日調製し、2〜8℃で保存した。種のタイプならびに予期されるヒアルロニダーゼレベルに応じて、少なくとも1つの試料希釈液が検量線の範囲内に確実に含まれることになるように、単一または複数の希釈液を調製した。試験試料希釈液を選択する際の指針になるように、投与されたヒアルロニダーゼの用量、投与経路、その種のおよその血漿体積、時点に関する既知の情報を使って、ヒアルロニダーゼ活性レベルを推測した。各試料希釈液は、その調製時に短いパルスボルテックスによって混合し、ピペットチップは各希釈ごとに変えた。一般に、希釈は初回の50倍または100倍希釈で開始し、その後、さらなる段階希釈を行った。rHuPH20またはPEGPH20（施行した処置に依存する）の7点検量線を、rHuPH20については0.004〜3.0U/mL、PEGPH20については0.037〜27U/mLの濃度範囲で調製した。100μLの各試験試料希釈液および検量線ポイントを、前もって0.1mg/mLのb-HAを1ウェルあたり100μLずつ使用してコーティングし、PBS中の1.0％（w/v）ウシ血清アルブミン250μLでブロッキングしておいた96穴マイクロタイタープレート（Immulon 4HBX、Thermo）の三つ一組のウェルに適用した。プレートを接着プレートシールで覆い、37℃でおよそ90分間インキュベートした。このインキュベーション期間の最後に、接着シールをプレートから取り除き、試料を吸引し、自動プレート洗浄機（BioTek ELx405 Select CW、プログラム「4HBX1」）を使って、1ウェルあたり300μLの洗浄緩衝液（0.05％（v/v）Tween 20を含む10mMリン酸緩衝液、2.7mM塩化カリウム、137mM塩化ナトリウム、pH7.4、PBST）で、プレートを5回洗浄した。1ウェルあたり100μlのストレプトアビジン-HRPコンジュゲート作業溶液［20mMトリス-HCl、137mM塩化ナトリウム、0.025％（v/v）Tween 20、0.1％（w/v）ウシ血清アルブミン中のストレプトアビジン-HRPコンジュゲート（1：5,000v/v）］を加えた。プレートをシールし、振とうせずに遮光下、周囲温度で、およそ60分間インキュベートした。このインキュベーション期間の最後に、接着シールをプレートから取り除き、試料を吸引し、上述のように1ウェルあたり300μLの洗浄緩衝液で、プレートを5回洗浄した。（周囲温度の）TMB溶液を各ウェルに加え、遮光下、室温で、およそ5分間インキュベートした。次に、TMB停止溶液（KPL、カタログ番号50-85-06）を、1ウェルあたり100μLとして加えた。450nmにおける各ウェルの吸光度を、マイクロタイタープレート分光測光器を使って決定した。各プレート上での検量線の応答を、4パラメータロジスティック曲線フィットを使ってモデル化した。各未知試料のヒアルロニダーゼ活性を、検量線からの内挿によって算出し、試料希釈率について補正し、U/mLの単位で報告した。
【０４３２】
［実施例5］
血漿中の抗rHuPH20抗体を検出するための電気化学発光イムノアッセイ
この実施例では、PEGPH20のアミノ酸部分に対して産生された血漿または血清中の抗体を、電気化学発光（ECL）ブリッジングアッセイ（Mire-Sluisら, Journal of Immunological Methods 289:1-16, 2004参照）を使って測定した。
【０４３３】
A．アッセイ概観
この方法は、典型的には、三段階に分けて行った。第1段階（Tier 1）では、被験試料に対して初回スクリーンを行った。数学的に決定されたカットポイントを上回るECL値を与えた試料を第2段階（Tier 2）において試験し、一方、カットポイントを上回るECLを与えなかった試料は、抗rHuPH20抗体に関して陰性と報告した。第2段階アッセイでは、競合阻害剤として非標識rHuPH20を使用して、第1段階で得た陽性結果を確認し、第3段階アッセイは、依然としてカットポイントを上回っている試料の希釈度を確認するために使用した。第1段階および第2段階の評価は同時に行うことができる。
【０４３４】
B．対照の調製
100μlの2.45mg/mLウサギ抗rHuPH20ポリクローナル抗体を145μlのStartingBlock T20（TBS）ブロッキング緩衝液（Thermo、カタログ番号37543）に希釈することによって、1mg/mLウサギ抗rHuPH20ポリクローナル抗体作業用保存液を作製した。この保存液を十分に混合し、次にそれを使って、100μlの1mg/mLウサギ抗rHuPH20ポリクローナル抗体を900μlのStartingBlock T20（TBS）ブロッキング緩衝液（Thermo、カタログ番号37543）に希釈することにより、第2の作業用保存液（100μg/mL）を作成した。次に、100μg/mL作業用保存液を使って、下記表5に概説するように低、中および高陽性対照を作成した。使用した陰性基礎プールは、ヒトK3-EDTA血漿（Bioreclamation、カタログ番号HMPLEDTA）である。希釈剤はStartingBlock緩衝液とした。陰性対照は、陰性基礎プールヒト血漿のみ（スパイクなし）である。各イヌからのベースライン試料をPEGPH20曝露後試料のための対照として使用した。
［表5］抗rHuPH20アッセイのための陽性および陰性対照
【表５】
2013540103.tif 000011
高、中、低および陰性対照をピペットで100μlずつに小分けし、使用時まで-70℃で保存（調製日から最長1年間）した。
【０４３５】
C．第1段階アッセイ
抗rHuPH20抗体の存在について調べようとする血清試料を収集し、使用時まで-70℃で凍結保存した。試料試験の日に、高、中、低および陰性対照試料（実施例5B）を貯蔵庫から取り出し、試験試料と一緒に、それらが融解するまで周囲温度で、または氷上で、または2〜8℃で融解した。試験試料および対照試料を穏やかに混合し、それぞれ、1試料あたり合計200μlになるように、StartingBlock T20（TBS）ブロッキング緩衝液（Thermo、カタログ番号37543）に1：100希釈した。
【０４３６】
StartingBlock T20（TBS）ブロッキング緩衝液中に250ng/mLのrHuPH20-Bt（組換えヒトヒアルロニダーゼ-ビオチン化体；Millipore、特注）および250ng/mLのrHuPH20-Rt（組換えヒトヒアルロニダーゼ-ルテニウム；Millipore、特注）を含有する10mL溶液を、別途、調製した。この溶液を穏やかに混合し、200μlを、200μlの試料チューブおよび対照試料チューブのそれぞれに加えた。チューブを穏やかにボルテックスし（Vortex Genie、Scientific Industries、カタログ番号14-961-26）、シールし、遮光下に穏やかに揺動しながら（Heidolph Rocking Platform Shaker、型番Polymax 2040）、2〜8℃で16〜24時間インキュベートした。
【０４３７】
インキュベーション中に、ストレプトアビジンコート標準MA2400 96プレート（Meso Scale Discovery、カタログ番号L15SA）を、300μl/ウェルのStartingBlock（TBS）ブロッキング緩衝液（Thermo、カタログ番号37542）を使って、穏やかに振とうしながら周囲温度で1〜4時間ブロッキングした。ブロッキングの完了後に、StartingBlock（TBS）ブロッキング緩衝液を吸引によって除去し、プレートを、Bio-Tek自動プレート洗浄機（型番ELx405）において、300μl/ウェルのTBS-T洗浄緩衝液（25mMトリス、137mM NaCl、2.7mM KCl、0.05％ Tween、pH7.4±0.1、周囲温度）で3回洗浄した。
【０４３８】
洗浄緩衝液を吸引した後、100μl/ウェルの各試料および対照試料（各試料は二つ一組）を、ストレプトアビジンコートプレートのウェルに加え、不透明プレートシール（VWR International、カタログ番号14230-062）でシールした。結合を、遮光下で穏やかに振とうしながら、周囲温度で30±3分間進行させた。
【０４３９】
この30分間のインキュベーション中に、20mLの1×界面活性剤入りリード緩衝液（Read Buffer）T（4×リード緩衝液；Meso Scale Discovery、カタログ番号R92TC）を超純水で調製した。試料インキュベーション期間が完了した後、試料溶液を、プレートから吸引し（Bio-Tek自動プレート洗浄機、吸引高さ3.048mm、水平吸引位置1.372mm、吸引流速3.0mm/秒）、300μl/ウェルのTBS-T洗浄緩衝液によりBio-Tek自動プレート洗浄機でプレートを3回洗浄した（分注流速5、分注高さ15.24mm）。次に、界面活性剤入りリード緩衝液T（1×）を、プレートの各ウェルに加えた（150μl/ウェル）。リード緩衝液Tの添加から30分以内に、Meso Scale Discovery Sectorイメージャ2400でプレートを読み取った。Meso Scale Discoveryソフトウェア（メリーランド州ゲイサーズバーグ）を使ってデータ（電気化学発光単位）をSectorイメージャ2400から収集した。
【０４４０】
（i）データ検証 
アッセイをプレート上で一緒に分析される試料と定義した。最低3つの陰性対照を実行し（プレートの前方付近の1つ、プレートの中央付近の1つ、プレートの後方付近の1つとして配置するか、プレートの前方付近の2つおよびプレートの後方付近の2つとして配置）、各濃度につき2つの陽性対照（高、中、低；プレートの前方付近の1つおよびプレートの後方付近の1つ）を実行した。
【０４４１】
各アッセイについてのシステム適合性仕様を設定し、「試験方法要約書」に記載した。第1段階アッセイでは、以下の条件を満たすのであれば、アッセイは許容されるとした：1）対照の複製試料の応答（ECL単位）の変動係数（％CV）が≦20.0％であること（応答値が＞50ECL単位である場合に限る）；2）陽性対照の≧66.0％のECL応答値が試験方法要約書に明記された予想ECL応答値または指定許容範囲の±50％以内にあること；3）少なくとも1つの陽性対照の平均ECL応答値が、各濃度レベル（すなわち、低、中、高対照）において、試験方法要約書に明記された予想ECL応答値または指定許容範囲の±50％以内であること；4）少なくとも1つの陽性対照の平均ECL応答値が、対照の各セット（プレートの前方対後方）において、各試験方法要約書に明記された予想ECL応答値または指定許容範囲の±50％以内であること；5）陰性対照の平均ECL応答値が、試験方法要約書に明記された指定許容範囲内である；および6）陰性対照の≧66.0％のECL応答値が試験方法要約書に明記された指定許容範囲内であること。
【０４４２】
第2段階アッセイでは、第1段階アッセイに関する上記規準に加えて、アッセイが以下の規準をも満たすのであれば、アッセイは許容されるとした：1）陽性対照の阻害百分率が、各濃度において、陽性対照の少なくとも50.0％について、≧50.0％であること；2）陽性対照の阻害百分率が、各セット（プレートの前方対後方）において、陽性対照の少なくとも50.0％について、≧50.0％であること；および3）阻害百分率が、全陽性対照の≧75.0％について、≧50.0％であること。
【０４４３】
研究試料は、以下の理由のいずれかで、再分析した：1）器材の不調；2）分析処理中に試験試料を失った；3）複製試料ECL値間の％CVが＞20.0％であった（試料複製物の両方のECL応答がアッセイカットポイント未満であるか、試料複製物の両方のECL応答がアッセイカットポイントを上回っている場合は、この規準を適用しなかった。また、この規準は、複製試料ECL応答間の相違が≦50ECL単位である場合にも、適用しなかった）；4）第1段階試験において試料の平均ECL値が≧アッセイカットポイントであった。第2段階試験が同時に行われる場合を除き、試料は推定陽性とみなされ、第2段階試験に供される；および5）研究試料の取扱に関して、記載報告された問題が見いだされた。
【０４４４】
（ii）データ解析
各段階で最低3つの陰性対照を実行した。陰性対照に関する個々の値を使って「浮動カットポイント」を算出した。「浮動カットポイント」は、3つの陰性対照の幾何平均値を1.14の不変規格化因子（検証データのパラメータ解析から導き出したもの）をかけることによって、各プレートから算出した。この浮動カットポイントは「試験方法アッセイ情報シート」によって決定される最大値を持っていた。算出されたカットポイントが「試験方法アッセイ情報シート」に記載の最大カットポイントより大きい場合は、最大ECL単位をカットポイントとして使用した（最大ECL値は陰性基礎プールのロットごとに評価される）。
【０４４５】
カットポイントに基づいて各試料を評価した。カットポイント未満の平均ECLを有する試料は、rHuPH20抗体に関して陰性と報告した。カットポイント以上の平均ECLを有する試料は「推定陽性」と分類し、第2段階試験（これは同時に行うことができる）に付した。カットポイント以上の平均ELC値を有するが、試料体積が不十分で第2段階試験が不可能であった試料は、「推定陽性」と報告したが、さらなる試験は行わなかった。
【０４４６】
D．第2段階アッセイ
第1段階において推定陽性と同定された各試料を第2段階試験に供した。第2段階試験では、標識rHuPH20への推定抗体の結合を阻害するという、過剰の非標識rHuPH20の能力を調べた。
【０４４７】
第2段階試験は、StartingBlock T20（TBS）ブロッキング緩衝液における最初の1：100試料希釈以外は、基本的に第1段階試験（実施例5C）の場合と同じように行った。第2段階では、各試料および対照試料を、StartingBlock T20（TBS）ブロッキング緩衝液（Thermo, カタログ番号37543）に、合計200μLになるように、1：100希釈し、10μg/mLのrHuPH20を含有するStartingBlock T20（TBS）ブロッキング緩衝液（8mLのStartingBlock T20（TBS）ブロッキング緩衝液と濃度10μg/mLのrHuPH20とのマスターミックスとして作成した）にも、合計200μLになるように、1：100希釈した。
【０４４８】
実施例5Cの場合と同様にプレートを読み取った後、阻害百分率を次式に従って算出した：阻害百分率＝100×｛(非阻害試料の平均ECL値)−(阻害試料の平均ECL値）｝/(非阻害試料の平均ECL値）。阻害が50％以上であると確認された試料をいずれも「抗体陽性」とみなし、第3段階試験に供した。阻害が50％未満である試料は「抗体陰性」と記録した。阻害は50％以上であるが、引き続き第3段階に移行するには試料が不十分であるものは、「抗体陽性」と報告したが、第3段階では試験しなかった。
【０４４９】
E．第3段階アッセイ
第2段階において「抗体陽性」と同定された各試料を第3段階におけるタイトレーションに供した。第3段階のタイトレーションおよび試験は、試料をStartingBlock T20（TBS）にまず1：100希釈した後、正常血漿（陰性対照として使用されるもの；陰性基礎プール）に段階希釈した点以外は、第1段階試験（実施例5C）と基本的に同じように行った。
【０４５０】
希釈ステップ後に、希釈液のそれぞれを、（実施例5Cの場合と同様に）StartingBlock T20（TBS）ブロッキング緩衝液にさらに1：100希釈することで、最終アッセイ希釈液を作成した。次にアッセイを第1段階と同じように行った。
【０４５１】
プレートを読み取った後、アッセイカットポイントを上回る平均ECL値を与える力価（最も高い試料希釈度）を決定した。少なくとも1つの希釈度が平均ECL値≧カットポイントであり、1つの値が＜カットポイントであったタイトレーションを「抗体陽性」と記録し、力価を、ECL値がカットポイントを上回っている最終希釈度として報告した。希釈度のすべてが平均ECL値≧カットポイントであるタイトレーションを「抗体陽性」と報告し、さらなる希釈度で試験した。（第1段階と同様に）元の1：100希釈液だけが平均ECL値≧カットポイントであるタイトレーションは「抗体陽性−1：5」と記録した。
【０４５２】
［実施例6］
筋骨格作用に対するPH20の効果
A．カニクイザル
この実施例では、カニクイザルで行われた4週間反復投与毒性試験においてPEGPH20のIV投与後に観察された筋骨格所見を説明する。4群のサル（0.2mg/kg/回のPEGPH20を与えた群（これは各性別につき4匹）を除いて各性別につき6匹）に、媒体、0.2、2.0または10.5mg/kg/回のPEGPH20を、それぞれ、連続4週間にわたって、週に2回IV投与した。週2回のIV投与はサルでは認容性が高かったが、肢関節の変化が観察された。サルは、膝および肘における可動域に用量関連の低下を示し、これは投与の停止後に部分的〜完全な回復を示した。また、放射線検査で観察した単回高用量動物では、軟部組織量（骨格筋）の中等度の低下もあった。これは、ヒアルロナン（HA）とそれに付随する細胞外水分とを組織から除去するPEGPH20の薬理作用と合致している。膝関節または骨格筋に関連する組織病理学的変化（軟骨、腱、靱帯）はなく、可動域は制限されたものの、膝関節そのもののX線所見にも異状はなかった。これらの所見は、PEGPH20の投与が一過性の筋骨格作用を誘発し、またはもたらしうることを示している。
【０４５３】
B．ヒト
この実施例では、血漿において上昇した酵素レベルを維持し、HA基質の回復を制限するための、PEGPH20の投薬量の漸増を評価する、臨床試験（フェーズ1-101）の結果を説明する。患者の中央年齢は61歳（範囲56〜86歳）であり、組織球腫、結腸直腸、膵臓、膀胱、カルチノイドおよび卵巣タイプを含む腫瘍タイプを有した。いずれの場合も、患者は、その現出の状態に関連する鎮痛薬の投薬を受けながら、このプログラムに参加したが、試験薬関連痛に関する鎮痛薬の投薬は受けていなかった。
【０４５４】
1．0.05mg/kg PEGPH20の単回静脈内（IV）投与
まず最初に、2人の患者に、0.05mg/kg PEGPH20の単回静脈内（IV）用量を投与した。この実施例では、どちらの患者も、投与のおよそ6〜10時間後に発症するこわばりと重症の筋・関節痛とを経験したことを説明する。痛みは9日以上持続し、患者は、日常生活動作の妨げになるこわばり、筋・関節痛および脱力を経験した。
【０４５５】
1人目の患者には、4.6mg（0.05mg/kg）のPEGPH20（患者の重さ92kg）を静脈内（IV）投与した。投与のおよそ10時間後に、患者は、両側性股関節痛を報告し、歩行困難と中等症の咽喉痛を伴った。この患者は単回投与後に試験を中止した。2日目に、患者は、上肢および下肢の筋・関節痛およびこわばりゆえにベッドから起き上がることができないと報告した。上肢を動かすことはでき、肘および手首関節の曲げ伸ばしは可能であったが、膝はこわばっていて、完全に伸ばすことはできなかった。筋/関節痛の重症度はグレード3だった。3週間にわたって、患者は、ゆっくりとではあるが着実な、筋骨格作用の改善を示した。
【０４５６】
2人目の患者には、4.9mg（0.05mg/kg）のIV PEGPH20（患者の重さ98kg）をIV投与した。投与の4時間後と8時間後の間に、患者は筋骨格痛を報告した。この患者は単回投与後に試験を中止した。2日目に、患者は、深刻な痛みを、まず最初は膝に、そしてそれだけでなくすべての筋および骨格に報告し、咽喉痛も報告した。筋/関節痛の重症度はグレード3だった。5日目までに、患者は楽になったと報告し、9日目までに、患者は筋骨格痛がかなり改善したと報告した。
【０４５７】
また、患者血漿試料を、46個の異なるサイトカイン、ケモカイン、急性期反応物質その他の血漿炎症バイオマーカーのヒト炎症マルチアナライトプロファイル（MAP）を使って分析した。最初の2人の患者の試料については注目に値する所見は観察されず、全般的な炎症または筋損傷は除外された。
【０４５８】
2．0.5μg/kg PEGPH20での週に2回の静脈内（IV）投与
最初の2人の患者の症状の重症度を考慮して、3人目の患者には、0.0005mg/kg（0.5μg/kg）を週に2回投与した。1日目に、この患者に0.06155mgのPEGPH20をIV投与した。3日目に、患者はその右腓腹に、自然に解消する痙攣を、1〜2分間、経験した。4日目に患者に2回目の0.06155mgのPEGPH20をIV投与した。5日目に、患者は、その足、腓腹、および大腿部に、反復する筋痙攣を報告し、それらはおよそ3〜4分間持続し、その日全体にわたっておよそ6〜8回起こった。痙攣は、全身の筋痛および圧痛を伴ったが、関節の関与はなかった。患者は歩行可能であったが、こわばりがあった。筋/関節痛の重症度はグレード3だった。これらの筋骨格作用ゆえに、患者は用量制限毒性に直面し、これ以上、PEGPH20を投与されなかった。筋圧痛は21日目までに解消し、筋痙攣は43日目までに解消した。
【０４５９】
ヒアルロニダーゼ酵素レベルおよびHA異化産物レベルも、上記実施例6B.1で示したように測定した。0.5μg/kgのPEGPH20を投与した後の平均酵素レベルおよびHA異化産物の要約も、実施例12に示す。
【０４６０】
3．21日ごとの0.5μg/kg PEGPH20の単回静脈内（IV）投与
また、さらに3人の患者を、21日ごとの0.5μg/kg PEGPH20のIV投与で処置した。患者のうち2人には、最初の投与の21日後に、2回目の0.5μg/kg PEGPH20を投与した。どの患者にも断続的グレード1または一過性グレード2の筋骨格副作用だけが観察された。この用量コホートでは用量制限毒性（DLT）は起こらなかった。それでも疾患の進行ゆえに全ての患者が中止した。
【０４６１】
ヒアルロニダーゼ酵素レベルおよびHA異化産物レベルも、上記実施例6B.1で示したように測定した。0.5μg/kgのPEGPH20を投与した後の平均酵素レベルおよびHA異化産物の要約も、実施例12に示す。
【０４６２】
4．21日ごとの0.75μg/kg PEGPH20の単回静脈内（IV）投与
21日ごとに0.5μg/kgのPEGPH20をIV投与した時の筋骨格作用の減衰を考慮して、PEGPH20の用量を増加した。引き続き、4人の患者に、21日ごとに0.75μg/kgのPEGPH20をIV投与し、このコホートにおける投薬レジメンには、この用量レベルで与えられる最高3回までの投与を含めた。一般に、断続的なグレード1または一過性のグレード2の筋骨格副作用だけが観察された。疾患の進行ゆえに全ての患者が中止した。各患者の結果の要約は次のとおりである。
【０４６３】
1人目の患者は中分化膵腺癌を有し、最初のサイクル2投与の2日後にグレード1の筋骨格痛を経験した。事象重症度は10日後にグレード3に増加した。これは第1サイクル後に起こったので用量制限毒性とはみなさなかった。この事象は合計14日間（グレード1で10日間、グレード3で4日間）持続し、解消した。この患者は、疾患の進行ゆえに、2サイクル後に休薬した。
【０４６４】
このコホートにおける2人目の患者は小腸腸間膜カルチノイド腫瘍を有し、サイクル1投与の7日後にグレード1の手痙攣を経験した。この患者は疾患の進行ゆえに中止した。
【０４６５】
3人目の患者は卵巣腺癌を有し、サイクル1投与と同じ日に骨痛（仙骨、胸骨および膝）および筋疼痛のグレード2の有害事象を経験した。筋疼痛は10日後に解消し、骨痛の重症度はさらに10日後にはグレード1に低下し、合計49日後に解消した。この患者は疾患の進行ゆえに3サイクル後に中止した。この患者では、卵巣がん細胞に正常細胞と比較して上昇したレベルで見いだされるタンパク質であるがん抗原125（CA-125）を測定した。注目すべきことに、CA-125は103U/mL（サイクル1の1日目）から64U/mL（サイクル1の15日目）まで低下した。最後の値が記録されたサイクル3の1日目に、CA125は116.4U/mLだった。
【０４６６】
4人目の患者は結腸腺癌を有し、合計2サイクルの投与を受けた。最初の投与の2日後にグレード1の筋痙直が上背部に起こり、1日続いた。グレード1の両側性の手、膝および肩のこわばりが2回目の投与の9日後に起こった。
【０４６７】
ヒアルロニダーゼ酵素レベルおよびHA異化産物レベルも、上記実施例6B.1で示したように測定した。0.75μg/kgのPEGPH20を投与した後の平均酵素レベルおよびHA異化産物の要約も、実施例12に示す。
【０４６８】
5．21日ごとの1.0μg/kg PEGPH20の単回静脈内（IV）投与
PEGPH20の用量を33％増加し、3人の患者に1.0μg/kg PEGPH20を21日ごとにIV投与した。患者のうち2人は前立腺腺癌を有し、1人は非小細胞肺がん［NSCLC］を有した。用量制限毒性（DLT）は報告されなかった。患者のうち1人だけが、筋骨格症状を報告し、これはグレード1の断続的な筋痙直（肋骨、足、腓腹）、断続的な関節痛および肋骨痛と分類された。症状はいずれもサイクル1投与の1〜3日後に始まった。肋骨痛は9日後に解消し、筋痙直は43〜44日後に解消し、股関節痛は45日後に解消した。
【０４６９】
6．21日ごとの1.5μg/kg PEGPH20の単回静脈内（IV）投与
前立腺腺癌を有する患者1人に、21日ごとに1.5μg/kg PEGPH20をIV投与した。用量制限毒性（DLT）は報告されなかった。
【０４７０】
7．要約
処置した14人の患者のうち、3人は有害事象ゆえに中止した：50.0μg/kgの用量を週に2回投与された1人がグレード4の筋骨格痛による中止、50.0μg/kgの用量を週に2回投与された1人がグレード3の筋骨格痛による中止、そして21日サイクルで0.5μg/kgを投与された1人がグレード3の筋骨格痛による中止。21日サイクルで0.5μg/kgを投与された患者の1人は、2サイクルの治療を完了した後、疾患の進行ゆえに中止した。他の患者は全員、疾患の進行ゆえに中止した。
【０４７１】
［実施例7］
ビーグル犬における筋骨格作用に対するPEGPH20の効果
A．ビーグル犬における認容性および薬物動態、用量範囲試験
IV PEGPH20に応答して起こるサルおよびヒトにおける筋骨格所見を考慮して、これらの筋骨格作用の非臨床モデルを探した。ビーグル犬は従順な気質を有し、手技と評価のための取扱が容易であるので、ビーグル犬（Marshall Farms USA, Inc.（ニューヨーク州ノースローズ）を起源に持つBioTox Sciencesコロニーのイヌを使用するBioTox Sciences Contract Research Organization（カリフォルニア州サンディエゴ））を、PEGPH20投与に応答してヒトに観察されたものと類似の筋骨格症状をモデル化する能力について評価した。ビーグル犬におけるPEGPH20の単回静脈内投与の認容性および薬物動態試験を評価した。用量範囲探索試験を行って、3040〜47500単位/kg（0.08〜1.25mg/kg）のPEGPH20の静脈内（IV）用量を評価した。
【０４７２】
1日目に、1頭の雄ビーグル犬に、3040単位/kg（0.08mg/kg）の初回用量のPEGPH20を、橈側皮静脈の経皮針穿刺により、5mLのボーラス注射で投与した。イヌは、2日目に可動性の低減（歩行能力または起立能力の低減）ならびに触診時の首、背中および四肢の筋の緊張を示すことが観察されるまでは、目視では正常に見えた。投与後48時間の時点で動物の可動性は改善されており、3日目までに、動物はほぼ完全な回復を示した。PEGPH20に対してこれら重症の筋骨格応答が観察されたことから、用量漸増試験は中止した。
【０４７３】
B．ビーグル犬におけるIV PEGPH20に対する筋骨格応答
PEGPH20に対する筋骨格応答を確認しさらに評価するために、3頭の雄ビーグル犬に、80μg/kg（3040U/kg）のPEGPH20を、2頭は静脈内（IV）、1頭は皮下（SC）に投与し、筋骨格応答について視覚的に観察した（表6）。PEGPH20は、5mL/頭のIVまたはSCボーラス注射として投与した。IV投与は橈側皮静脈の経皮針穿刺によって行い、一方、SC投与は、後背部、肩付近への経皮針穿刺によって行った。投与後23時間（2日目）までに、3頭全てのイヌが、可動性の低減（歩行または起立能力の低減）、活動性の総合的低下、ならびに触診時の首、背中および四肢の筋のこわばりを示した。4日目までには、筋骨格応答のそれぞれが解消していた。
［表6］PEGPH20の単回投与IV投与のスケジュール
【表６】
2013540103.tif 000012
【０４７４】
この試験では実施例7Aで述べた試験の筋骨格所見が確認され、ヒトにおいて観察されるものに似たPEGPH20媒介性筋骨格作用の非臨床モデルとしてのビーグル犬が確立された。
【０４７５】
C．ビーグル犬における反復PEGPH20投与
PEGPH20のその後の投与に耐えるようにイヌを慣らすためのPEGPH20の反復投与の実施可能性を調べるために、実施例7Bにおいて投与を行った3頭のイヌに、再び、橈側皮静脈からのIV投与、または後背部、肩近くへの経皮針穿刺による皮下（SC）投与を、表7に示すスケジュールに従って、PEGPH20用量を1520単位/kgから60800単位/kgまで（0.04mg/kgから1.6mg/kgまで）毎日漸増させながら行った。
［表7］PEGPH20の用量を漸増させるPEGPH20の反復投与のスケジュール
【表７】
2013540103.tif 000013
【０４７６】
4〜6日目に、3頭のイヌ全てが、可動性の低減（歩行能力または起立能力の低減）、活動性の総合的低下、および触診時の首、背中および四肢の筋のこわばりを含む、PEGPH20に対する筋骨格応答を示した。4〜6日目における筋骨格応答の発症は、1日目に見られた筋骨格応答（23時間）よりも速かった（数時間）が、4日目から6日目までは、応答の重症度は低下した。加えて、応答からの回復も、1日目の観察（2日）よりも、4日目から6日目までの方が速かった（最長12時間）。7日目から9日目までは3頭のイヌのいずれにも、筋骨格応答は観察されなかった。12日目には、IV投与を受けた1頭のイヌ（イヌ288）が、60800単位/kg（1.6mg/kg）投与の2時間後に可動性の低減を示したが、投与後10時間以内に完全に回復した。このイヌは、10日目の投与後にもレッチングを、また11日目および12日目にもレッチングおよび嘔吐を示した。
【０４７７】
D．ビーグル犬におけるPEGPH20の免疫原性の効果
投与中断後の複数回反復投与を、上記実施例7Cで使用した3頭の雄ビーグル犬において調べた。17、26または33日目に、表8のスケジュールに従って、1頭のイヌに3040単位/kg（0.08mg/kg）のPEGPH20を、橈側皮静脈の経皮針穿刺により、5mLボーラス注射で静脈内投与した。
［表8］PEGPH20投与のスケジュール
【表８】
2013540103.tif 000014
【０４７８】
投与後直ちに、3頭のイヌのそれぞれが、全身性アナフィラキシー様反応を経験していることが観察された。反応には、排尿、排便、身体活動性の低下、歩行困難、レッチングおよび/または嘔吐、ならびに呼吸の頻度および深さの増加が含まれていた。10〜25分以内に顕著な回復が起こり、投与後24時間以内に完全に回復した。その後の投与後時点のいずれにおいても、動物の可動性、活動性または筋緊張のさらなる変化は観察されなかった（次の投与イベントまで動物を1日に2回観察した）。
【０４７９】
上記の反応は投与されたPEGPH20（ヒトタンパク質）の免疫学的応答によって引き起こされた可能性があるので、イヌがPEGPH20に対する体液性免応答を開始していたかどうかを確定するために、17、26または33日目の投与前採血からの血清および51日目の3頭全てからの採血からの血清を、組換えヒトヒアルロニダーゼ（rHuPH20）に対する反応性について試験した。
【０４８０】
17、26または33日目に、投与前（ただし1日目〜12日目の12日間の漸増的PEGPH20曝露の後）の血液を、その日に処置されるイヌから採取した。また、51日目に3頭のイヌ全てから採血した。血液から分離された血清を上記実施例5で述べたように抗rHuPH20抗体の存在について試験した。アッセイの結果を表9に示す。これらの結果は、3頭のイヌは全て、PEGPH20のタンパク質構成要素rHuPH20に対する強い抗体応答を開始したことを裏付け、PEGPH20がビーグル犬において免疫原であることを示している。PEGPH20のタンパク質構成要素はヒトタンパク質であるから、この知見は意外なことではない。
［表9］ビーグル犬における反復投与後の抗rHuPH20血清抗体
【表９】
2013540103.tif 000015
【０４８１】
ビーグル犬における抗体応答が、投与されたPEGPH20の潜在的浄化または中和につながるかどうかを調べるために、PEGPH20の再投与の、骨格筋からヒアルロナンを枯渇させる能力を調べた。
【０４８２】
同じ3頭のイヌ（989、153および288）を、59日目に、3040単位/kg（0.08mg/kg）PEGPH20のIV投与で処置した。投与後直ちに、1頭（イヌ番号288）がレッチングを示し、5分で完全に回復した。その後、どの時点でも、筋骨格作用は観察されなかった。
【０４８３】
投与の24時間後（60日目）に、処置された3頭のイヌのそれぞれと、無処置の対照ビーグル犬から、骨格筋生検材料を採取した。中央半腱様筋/中央半膜様筋を生検の標的とした。生検領域を電動バリカンを使って剃毛し、クロルヘキシジンまたはポピドン-ヨウ素溶液を使ってこすった。局所鎮痛のために、ブピバカインまたはリドカイン（2〜3mg/kg）を、生検領域に皮下注射（SC）した。筋生検材料は直径2mmの生検針を使って収集した。止血のためにガーゼスポンジをわずかに圧力をかけてあてた。痛みを抑制するためにメタカム（メロキシカム）0.2mg/kgをSC注射した。生検試料を、およそ200μLの10％中性緩衝ホルマリン（NBF）と共に、エッペンドルフチューブまたはそれに相当するものに入れた。
【０４８４】
生検した組織試料を、著しく特異的な組織化学的染色法を使って、組織HAについて染色した。このモデルを使って、10％NBF中で48時間固定した組織生検材料をパラフィンに包埋し、薄切し、ビオチン化HA結合タンパク質（HABP；生化学工業株式会社、日本）を使ってHAについてプローブした後、検出用のFITC標識ストレプトアビジン（Vector Labs、カナダ）を使用した。細胞核をDAPI（4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）試薬で対比染色した。次に、Spotイメージングプログラム（Diagnostic Instruments, Inc）と連動させたZeiss顕微鏡（ニューヨーク州ソーンウッド）を使って、顕微鏡像をキャプチャした。
【０４８５】
切片におけるヒアルロナン発現を、存在する緑色蛍光強度のレベルによって視覚的に評価した。3頭のPEGPH20処置動物から採取した骨格筋試料の細胞周囲マトリックスのヒアルロナン染色はいずれも、無処置対照動物からの組織試料におけるヒアルロナン染色と事実上同じ高強度染色であったことから、これらの動物におけるPEGPH20処置は骨格筋試料における細胞外ヒアルロナンを除去しないことが明らかになった。これは、反復PEGPH20投与に応答してビーグル犬において生成する血清抗rHuPH20が、おそらくPH20中和活性を有したことを示している。
【０４８６】
［実施例8］
ビーグル犬におけるPEGPH20に対するデキサメタゾンの効果
ビーグル犬は、PEGPH20投与に応答して、ヒトで報告されているものと、症状ならびに発症および解消のタイミングの点で類似する筋骨格所見を示す種であると同定された。それゆえに、ビーグル犬を、PEGPH20に対するヒト筋骨格応答のモデルとして、また症状の処置を検討するためのモデルとして、さらに探究した。
【０４８７】
A．デキサメタゾンの前投薬レジメン
デキサメタゾンの前投薬レジメンを最適化するための試験を行った。
【０４８８】
ある試験では、4頭のナイーブ雄ビーグル犬に、4mg/回のデキサメタゾンを、PEGPH20投与の日に1日2回、経口投与した。1回目のデキサメタゾンはPEGPH20静脈内（IV）投与の直前に経口（PO）投与した。2回目のデキサメタゾンは約8時間後に経口投与した。1日目に、1頭のイヌに、3040U/kg（0.08mg/kg）のPEGPH20を、デキサメタゾン後に投与した。24時間後（2日目）には、2頭目のイヌに、5700U/kg（0.15mg/kg）のPEGPH20を、デキサメタゾン後に投与した。24時間後（3日目）には、3頭目のイヌに、11400U/kg（0.3mg/kg）のPEGPH20を、デキサメタゾン後に投与した。24時間後（4日目）には、4頭目のイヌに、38000U/kg（1.0mg/kg）のPEGPH20を、デキサメタゾン後に投与した。PEGPH20投与前とPEGPH20投与の0.5時間後、4時間後および24時間後に、血液を収集した。投与前と、投与の0.5時間後、4時間後、8時間後および24時間後に、動物を筋骨格作用について観察した。4頭のイヌはいずれも、どの用量レベルでも、試験したどの時点でも、PEGPH20に対する筋骨格応答を発現しなかったことから、デキサメタゾン前投薬は、PEGPH20の筋骨格作用の発現を阻止することが示された。
【０４８９】
B．PEGPH20誘発性筋骨格所見に対するデキサメタゾンの効果
PEGPH20の筋骨格作用を緩和するデキサメタゾンの能力を、さらなる薬理学的試験において確認した。4つの処置群（各群ビーグル犬3頭）および処置日を下記表10に示す。試験1日目、2日目および/または5日目に、PEGPH20を、橈側皮静脈の経皮針穿刺により、5mLボーラス注射で、IV投与した。PEGPH20注射の直前および注射の8時間後に、デキサメタゾンを経口投与した。再投与を行わなかったPEGPH20単独処置群を除いて、1回目の注射の3日後に、全ての動物に、再投与した。
［表10］デキサメタゾン前投薬レジメンの試験計画
【表１０】
2013540103.tif 000016
【０４９０】
PEGPH20の1回目の投与による処置の直後と、投与後0.5、2、4、7、10、12、16、20、24、48、および72時間の時点で、イヌをPEGPH20に対する筋骨格応答について観察した。2回目の投与後は、2回目の投与の0.5、2、4、7、10、12、16、20、24、48、72、96および120時間後に、動物を観察した。PEGPH20の単回投与だけで処置された動物は、投与の96時間後、120時間後、6、7、8、および9日後に評価した。
【０４９１】
PEGPH20（11400単位/kg；0.3mg/kg）だけを投与されたビーグル犬は、可動性の低減（歩行能力または起立能力の低減）、活動性の総合的低下、ならびに触診時の首、背中および四肢の筋のこわばりを特徴とする重症の筋骨格所見を示した。一般に、これら筋骨格所見の発症は、PEGPH20投与のおよそ10時間後に初めて観察され、PEGPH20投与の12〜20時間後の間に重症度を増し、その後、PEGPH20投与のおよそ72時間後までに完全に解消した。デキサメタゾン前処置は、0.3mg/kgまたは1.0mg/kgのPEGPH20を投与されたイヌにおけるこれらの筋骨格症状を、試験した全ての時点において緩和した。
【０４９２】
C．PEGPH20ヒアルロナン除去に対するデキサメタゾンの影響
デキサメタゾン前処置がPEGPH20誘発性筋骨格応答を緩和することを考慮して、デキサメタゾンがPEGPH20によるヒアルロナンの除去に及ぼす影響を、筋骨格組織および皮膚組織において調べた。
【０４９３】
PEGPH20の1回目のIV投与の24時間前および24時間後に、骨格筋組織および皮膚組織を、表11に概説する各処置群のイヌ3頭のそれぞれから生検した。中央半腱様筋/中央半膜様筋を生検の標的とした。生検領域を電動バリカンを使って剃毛し、クロルヘキシジンまたはポピドン-ヨウ素溶液を使ってこすった。局所鎮痛のために、ブピバカインまたはリドカイン（2〜3mg/kg）を、生検領域に皮下注射（SC）した。筋生検材料は直径2mmの生検針を使って収集した。止血のためにガーゼスポンジをわずかに圧力をかけてあてた。痛みを抑制するためにメタカム（メロキシカム）0.2mg/kgをSC注射した。生検試料を、およそ200μLの10％中性緩衝ホルマリン（NBF）と共に、エッペンドルフチューブまたはそれに相当するものに入れた。
【０４９４】
生検した組織試料を組織HAについて染色した。簡単に述べると、10％NBF中で48時間固定した組織生検材料をパラフィンに包埋し、薄切し、ビオチン化HA結合タンパク質（HABP；生化学工業株式会社、日本）を使ってHAについてプローブした後、検出用のFITC標識ストレプトアビジン（Vector Labs、カナダ）を使用した。細胞核をDAPI（4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）試薬で対比染色した。次に、Spotイメージングプログラム（Diagnostic Instruments, Inc）と連動させたZeiss顕微鏡（ニューヨーク州ソーンウッド）を使って、顕微鏡像をキャプチャした。
【０４９５】
切片におけるヒアルロナン発現を、存在する緑色蛍光強度のレベルによって視覚的に評価した。媒体対照（API緩衝液）で処置した動物からの骨格筋組織および皮膚組織は、処置前試料と処置後試料の両方において、類似するパターンの明るく染色された細胞周囲ヒアルロナンを示した。PEGPH20 (0.3mg/kg）のみ、PEGPH20（0.3mg/kg）＋デキサメタゾン（4mg/回 BID；1日2回）およびPEGPH20（1.0mg/kg）＋デキサメタゾン（4mg/回 BID；1日2回）で処置された動物からの骨格筋組織および皮膚組織は、それぞれ、処置前試料では明るく染色された細胞周囲ヒアルロナンを示したが、これらの処置群のそれぞれからの処置後試料ではヒアルロナン染色が事実上起きないことが明らかになった。これらの知見により、デキサメタゾンはPEGPH20のヒアルロナン分解活性を阻害しないことが示された。
【０４９６】
D．PEGPH20薬物動態に対するデキサメタゾンの影響
デキサメタゾンがPEGPH20の薬物動態に及ぼす影響を調べるために、上記表10に示す実施例8Bの各イヌから血液試料を収集した。血液は、下記表11に従って、PEGPH20または媒体対照の投与後に採取した。 
［表11］薬物動態測定のための採血の時点
【表１１】
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【０４９７】
各時点において、実施例4Bで述べたビオチン化ヒアルロン酸アッセイを使って、血漿ヒアルロニダーゼ活性を測定した。収集した血液試料から血漿を調製し、分析するまで−70℃で凍結保存した。このアッセイの定量の下限は2.90U/mLだった。WinNonlin Proバージョン5.1（Pharsight Corp.、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使って血漿中濃度対時間のデータをノンコンパートメント法およびコンパートメント法で解析した。導き出されたPKパラメータには、AUC、Cmax、およびTmaxが含まれた。AUCおよびCmaxによって規定される全身曝露は、イヌに静脈内投与した場合は、PEGPH20のみとPEGPH20＋デキサメタゾンの間で類似しており、3つのPEGPH20処置群からの全般的PKプロファイルが類似していて、デキサメタゾンはPEGPH20の薬物動態に影響を及ぼさないことが示された。
【０４９８】
HA異化産物も実施例6で述べたように測定した。結果は、PEGPH20による投与後のHA異化産物の出現を示し、それは、デキサメタゾンの存在によって左右されなかった。
【０４９９】
［実施例9］
ヒト前立腺腫瘍またはヒト膵腫瘍異種移植モデルにおけるPEGPH20の抗腫瘍活性またはヒアルロナン分解活性に対するデキサメタゾンの影響
デキサメタゾンがPEGPH20の抗腫瘍活性またはヒアルロナン分解活性を妨害するかどうかを調べるために、ヒト前立腺がんまたはヒト膵がん異種移植モデルを評価した。
【０５００】
A．PC3前立腺がん異種移植モデル
1．PC3前立腺がん異種移植モデルにおける抗腫瘍活性
PC3前立腺癌細胞株からの腫瘍細胞をおよそ80％コンフルエントまで成長させた後、トリプシン処理し、収集し、HBSS（ハンクス平衡塩類溶液、Mediatech Inc.）中で1回洗浄し、次いで、動物に接種する前に、氷上でHBSS中の50％Matrigel（登録商標）に2×107細胞/mLで再懸濁した。無胸腺雄ヌードマウス（Nu/Nu（Ncr）；Taconic Farms；平均体重約20g）に、この細胞懸濁液0.05mLを、左後肢の脛骨周囲に（脛骨骨膜に隣接して）筋肉内（IM）接種した。動物中の移植物を週に2回評価し、およそ500mm3の平均腫瘍体積まで成長させた（-2日目；表12）。実際の腫瘍体積は、VisualSonics Vevo 770高分解能超音波を使用し、2つの垂直な軸寸法を使って決定した。
【０５０１】
動物をランダムに分別し、各群マウス8匹（6匹のマウス＋2匹のサテライトマウス）の6つの群にグループ分けした。処置群は媒体（API緩衝液）、PEGPH20（157,500単位/kg、4.5mg/kg）、低用量デキサメタゾン（1.25mg/kg）、高用量デキサメタゾン（5mg/kg）、PEGPH20（4.5mg/kg）＋低用量デキサメタゾン（1.25mg/kg）、およびPEGPH20（4.5mg/kg）＋高用量デキサメタゾン（5mg/kg）とした。PEGPH20（または媒体）静脈内注射の用量および頻度は、157,500単位/kgまたはおよそ4.5mg/kg、0日目に開始して2日おき（0、3、6、9、12日目）、0.1mLの投与体積で、合計5回とした（Q3D×5）。この投与および頻度レジメンは、以前に、異種移植片腫瘍成長を34〜70％阻害することが示されている。デキサメタゾン腹腔内注射の用量および頻度は、低用量で1.25mg/kg、高用量で5mg/kg、0.1mLの投与体積で、13日目まで1日1回（QD×13）とした。
【０５０２】
VisualSonic超音波システムを使ってイメージをキャプチャし、超音波イメージングソフトウェアプログラムを使って腫瘍体積を算出することにより、全てのマウスの腫瘍体積を、処置前の-2日目（約500mm3の平均腫瘍体積）と、1、6、9、13、16および20日目に測定した（表12）。次の等式によって腫瘍成長阻害百分率（％TGI）を算出した：
[1-(Tn-T0)/(Cn-C0)]×100％
上記の等式において、Tnは、処置後の表示した時点であるそれぞれの日「n」における処置群の平均腫瘍体積であり；T0は処置前の0日目における処置群の平均腫瘍体積であり；Cnは、媒体による処置後の表示した時点であるそれぞれの日「n」における対照群の平均腫瘍体積であり；C0は、処置前の0日目における対照群の平均腫瘍体積である。
【０５０３】
表12のデータは、デキサメタゾン単独には、低用量でも高用量でも、腫瘍成長阻害に対する効果がなかったことを示している。これらの結果は、腫瘍成長に対する効果が、PEGPH20単独で処置した群と、PEGPH20およびデキサメタゾンで処置した群において、類似していたことも示している。このように、PC3前立腺がん異種移植モデルからのデータは、デキサメタゾンが腫瘍成長阻害に対するPEGPH20の効果を妨害しないことを明らかにした。
［表12］PC3前立腺がんモデルにおける腫瘍体積と、PEGPH20、デキサメタゾンの単剤としての、および併用された両剤の、抗腫瘍活性の統計解析
【表１２】
2013540103.tif 000018
【０５０４】
2．PEGPH20血漿中酵素に対するデキサメタゾンの影響
13日目の最終PEGPH20およびデキサメタゾン投与の24時間後に、対照群マウスおよび処置群マウスの個々のPC3腫瘍保持サテライトマウスから、血漿試料も収集した。実施例4Bにおいて説明したビオチン化ヒアルロン酸アッセイを使って、血漿中PEGPH20ヒアルロニダーゼを評価した。PEGPH20、PEGPH20＋低用量デキサメタゾンおよびPEGPH20＋高用量デキサメタゾンで処置した動物は全て類似するレベルの血漿中ヒアルロニダーゼ活性を有し、デキサメタゾンはマウスの血漿におけるPEGPH20活性のレベルと干渉しないことが示された。
【０５０５】
血漿試料をさらに使って、対照群および各処置群における可溶性血漿ヒアルロナンを測定した（R&D SystemsカタログDY3614；ELISAアッセイ）。媒体対照群では、血漿中ヒアルロナンレベルが800,000〜900,000ng/mLの範囲にあった。低用量デキサメタゾン群では血漿中ヒアルロナン濃度の変動性が高い領域にあったが（1つは高濃度、1つは低濃度だが、どちらも測定可能であった）、高用量デキサメタゾン群では血漿中ヒアルロナンレベルが23,000〜42,000ng/mLの範囲にあった。PEGPH20単独またはPEGPH20＋デキサメタゾン（高用量または低用量）で処置されたマウスは、検出可能なヒアルロナンを有さず（定量限界未満）、デキサメタゾンはマウスにおけるPEGPH20血漿活性を変化させないことが実証された。
【０５０６】
このように、これらの結果は、デキサメタゾンが血漿中のPEGPH20活性に影響しなかったことを示している。
【０５０７】
3．PC3前立腺がん異種移植モデルにおけるPEGPH20ヒアルロナン分解活性に対するデキサメタゾンの影響
上記実施例9A.1における6つ全ての処置群の2匹のサテライトマウスから、腫瘍組織を、14日目に組織生検によって収穫し、ヒアルロナンの存在について染色した。腫瘍生検材料を10％NBF中で48時間固定し、パラフィンに包埋し、薄切した。試料を、ビオチン化HA結合タンパク質（HABP）を使ってヒアルロナンについてプローブした後、検出用のFITC標識ストレプトアビジンでプローブした。細胞核をDAPI（4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）試薬で対比染色した。次に、Spotイメージングプログラム（Diagnostic Instruments, Inc）と連動させたZeiss顕微鏡（ニューヨーク州ソーンウッド）を使って、顕微鏡像をキャプチャした。
【０５０８】
切片におけるヒアルロナン発現を、切片中の緑色蛍光強度のレベルによって視覚的に評価した。媒体、高用量デキサメタゾンまたは低用量デキサメタゾンで処置した動物から採取した腫瘍切片には著しい細胞周囲ヒアルロナン染色が存在したが、PEGPH20単独、PEGPH20＋低用量デキサメタゾン、またはPEGPH20＋高用量デキサメタゾンで処置した動物から採取した腫瘍切片には、細胞周囲ヒアルロナン染色が、ほとんど全く存在しなかった。PEGPH20単独で処置した動物からの組織試料におけるヒアルロナン染色は、低用量または高用量デキサメタゾンと組み合わせたPEGPH20で処置した動物からの組織試料におけるヒアルロナン染色と事実上同じであったことから、デキサメタゾンは細胞周囲ヒアルロナンの除去に関するPEGPH20の活性を変化させないことが示された。
【０５０９】
B．BxPC3膵がん異種移植モデル
デキサメタゾンがPEGPH20の抗腫瘍活性またはヒアルロナン分解活性に影響を及ぼすかどうかをさらに調べるために、ヒト膵がん異種移植モデルを評価した。
【０５１０】
1．BxPC3膵がん異種移植モデルにおける抗腫瘍活性
BxPC3膵がん細胞株からの腫瘍細胞をおよそ80％コンフルエントまで成長させ、トリプシン処理し、収集し、HBSS（ハンクス平衡塩類溶液、Mediatech Inc.）中で1回洗浄し、動物に接種する前に、氷上でHBSS中の50％Matrigel（登録商標）に2×107細胞/mLで再懸濁した。無胸腺雌ヌードマウス（平均体重約20g）に、0.05mLの細胞懸濁液を、左後肢の脛骨周囲に（脛骨骨膜に隣接して）筋肉内（IM）接種した。動物中の腫瘍を週に2回評価し、およそ250mm3の平均腫瘍体積まで成長させた（-1日目；表13）。実際の腫瘍体積は、VisualSonics Vevo 770高分解能超音波を使って決定した。
【０５１１】
動物を各群マウス8匹（6匹のマウス＋2匹のサテライトマウス）の6つの群にランダムにグループ分けし、媒体（API緩衝液）、PEGPH20（157,500単位/kg、4.5mg/kg）、低用量デキサメタゾン（1.25mg/kg）、高用量デキサメタゾン（5mg/kg）、PEGPH20（4.5mg/kg）＋低用量デキサメタゾン（1.25mg/kg）およびPEGPH20（4.5mg/kg）＋高用量デキサメタゾン（5mg/kg)で処置した。PEGPH20（または媒体）静脈内注射の用量および頻度は、0、3、7、10、13および17日目に、157,500単位/kgまたはおよそ4.5mg/kg、、0日目から開始して合計6回とした（投与体積0.1mL）。デキサメタゾン腹腔内注射の用量および頻度は、低用量で1.25mg/kg、高用量で5mg/kg、0.1mLの投与体積で、17日目まで1日1回（QD×17）とした。
【０５１２】
VisualSonic超音波システムを使ってイメージをキャプチャし、超音波イメージングソフトウェアプログラムを使って腫瘍体積を算出することにより、全てのマウスの腫瘍体積を、処置前の-4日目および-1日目（約250mm3の平均腫瘍体積）と、4、7、11、14および17日目に測定した（表13）。腫瘍成長阻害百分率（％TGI）を上記実施例9Aで述べたように算出した。
【０５１３】
下記表13のデータは結果を要約したものである。これらの結果は、高用量または低用量のデキサメタゾンとPEGPH20との並行投与が腫瘍体積に及ぼす効果が、PEGPH20を単独で投与した場合の結果と類似していたことを示している。このBxPC3膵がん異種移植モデルからのデータは、デキサメタゾンがPEGPH20媒介性腫瘍成長阻害を妨害しなかったことを示している。
［表13］腫瘍体積と、PEGPH20およびデキサメタゾンの単剤としての、および併用された両剤の、抗腫瘍活性の統計解析
【表１３】
2013540103.tif 000019
【０５１４】
2．PEGPH20血漿中酵素に対するデキサメタゾンの影響
17日目の最終PEGPH20およびデキサメタゾン投与の24時間後に、対照群マウスおよび処置群マウスの個々のPC3腫瘍保持サテライトマウスから、血漿試料も収集した。実施例4で述べた方法を使って、血漿中PEGPH20ヒアルロニダーゼを評価した。PEGPH20、PEGPH20＋低用量デキサメタゾンおよびPEGPH20＋高用量デキサメタゾンで処置した動物は全て類似するレベルの血漿中ヒアルロニダーゼ活性を有し、デキサメタゾンはこれらのマウスの血漿におけるPEGPH20活性のレベルと干渉しないことが示された。
【０５１５】
血漿試料をさらに使って、対照群および各処置群における可溶性血漿ヒアルロナンを測定した（R&D SystemsカタログDY3614；ELISAアッセイ）。媒体対照群では、血漿中ヒアルロナンレベルが2,000〜4,000ng/mLの範囲にあった。高用量デキサメタゾン群では血漿中ヒアルロナン濃度の変動性が高い領域にあったが（1つは高濃度、1つは低濃度だが、どちらも測定可能であった）、低用量デキサメタゾン群では血漿中ヒアルロナンレベルが2,000〜4,000ng/mLの範囲にあって、対照動物と類似していた。PEGPH20単独またはPEGPH20＋デキサメタゾン（高用量または低用量）で処置されたマウスは、検出可能なヒアルロナンを有さず（定量限界未満）、デキサメタゾンはこれらのマウスにおけるPEGPH20血漿活性を変化させないことが実証された。
【０５１６】
BxPC3膵がん異種移植モデルからのデータは、デキサメタゾンが、このモデルでも、血漿中のPEGPH20活性に影響しなかったことを示している。
【０５１７】
3．BxPC3膵がん異種移植モデルにおけるPEGPH20ヒアルロナン分解活性に対するデキサメタゾンの影響
上記実施例9B.1における6つ全ての処置群の2匹のサテライトマウスから、腫瘍組織を、18日目に組織生検によって収穫し、ヒアルロナンの存在について染色した。腫瘍生検材料を10％NBF中で48時間固定し、パラフィンに包埋し、薄切した。試料を、ビオチン化HA結合タンパク質（HABP）を使ってHAについてプローブした後、検出用のFITC標識ストレプトアビジンでプローブした。細胞核をDAPI（4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）試薬で対比染色した。次に、Spotイメージングプログラム（Diagnostic Instruments, Inc）と連動させたZeiss顕微鏡（ニューヨーク州ソーンウッド）を使って、顕微鏡像をキャプチャした。
【０５１８】
切片におけるヒアルロナン発現を、切片中の緑色蛍光強度のレベルによって評価した。媒体対照、高用量デキサメタゾンまたは低用量デキサメタゾンで処置した動物から採取した腫瘍切片には著しい細胞周囲ヒアルロナン染色が存在したが、PEGPH20単独、PEGPH20＋低用量デキサメタゾン、またはPEGPH20＋高用量デキサメタゾンで処置した動物から採取した腫瘍切片には、細胞周囲ヒアルロナン染色が、ほとんど全く存在しなかった。PEGPH20単独で処置した動物からの組織試料におけるヒアルロナン染色は、PEGPH20および低用量または高用量デキサメタゾンで処置した動物からの組織試料における染色と事実上同じであったことから、PC3異種移植モデルにおける結果と同様に、BxPC3異種移植モデルにおいて、デキサメタゾンは、ヒアルロナンの除去に関するPEGPH20の活性を変化させないことが示された。
【０５１９】
［実施例10］
ヒトにおける筋骨格作用に対するデキサメタゾンの効果
この実施例では、ヒトにおけるPEGPH20の投与に起因する有害筋骨格事象の緩和または低減に関するデキサメタゾンの効果を評価する試験を説明する。デキサメタゾンを、PEGPH20投与の筋骨格作用を排除または緩和するための前投薬として投与レジームに加えた。処置サイクルを28日間と定め、PEGPH20は静脈内（IV）投与し、デキサメタゾンは経口投与した。PEGPH20およびデキサメタゾンの投与は、28日サイクルの1、4、8、11、15、18、22および25日目に行われた。各投与日に、PEGPH20の1時間前に4mgのデキサメタゾンの前投薬レジメンを経口投与し、次にPEGPH20投与の8〜12時間後に、4mgデキサメタゾンの2回目の投与を行った。
【０５２０】
A．選択基準および除外基準
患者は、同意説明文書に署名してから試験に登録された。患者は少なくとも1つの確認された進行固形腫瘍を有し；標準的処置に対して不応性であり；RECIST規準によって測定可能な少なくとも1つの腫瘍を有し；カルノフスキー・パフォーマンス・ステータスが≧70％であり；ベースライン時の心エコー図によって決定される駆出率が≧50％であり；少なくとも3ヶ月の平均余命を有し；妊娠中ではなく、避妊の使用に同意し；血液学、肝、腎および凝固ラボラトリーアッセイによって示される臓器機能が許容されるものであった。
【０５２１】
患者はさらに次の除外規準のいずれにも当てはまらなかった：既知の脳転移；医学的治療を必要とするニューヨーク心臓協会クラスIIIまたはIV心疾患、心筋梗塞、または心不整脈；全身性治療を必要とする活動性感染；インスリン治療を必要とする管理されていない糖尿病；ヘパリン治療を必要とする医学的状態；既知のHIV、B型肝炎またはC型肝炎感染；ヒアルロニダーゼに対する既知のアレルギー；重篤（serious）な非悪性疾患；またはデキサメタゾンに対する不耐性。患者は、プロトコールに従うことおよび他のいかなる並行介入治療試験にも参加しないことに同意した。いずれの場合も、患者は鎮痛薬の投薬を受けながら、このプログラムに参加した。例えば、この試験における1人目の患者は、その現出の状態に関連する痛みのために、オキシコドン-アセトアミノフェンおよびオキシコンチンを服用していたが、試験薬関連痛に関する薬は服用していなかった。
【０５２２】
B．投与および評価
1．1人目の患者
最初に、進行固形腫瘍を有し選択/除外基準を満たす1人の患者に、PEGPH20＋デキサメタゾンを週に2回、0.5μg/kgの初期低用量で、28日間投与した。この1人目の患者は、卵巣がんを有する55歳、68.6kgの女性患者であった。
【０５２３】
PEGPH20投与のおよそ1時間前に、デキサメタゾン（4mg）を経口投与した。次に、適当なゲージの針/カテーテルを静脈内に設置し、PEGPH20を、遅い静注として5分間かけて投与した。PEGPH20については、投与を、1日目における患者の実体重に基づいて、μg/kg基準で処方した。PEGPH20は、3.5mg/mLのPEGPH20と10mMヒスチジンおよび130mM NaClとを含有するpH6.5の水溶液として供給された。用量を生理食塩水で最終体積10mLに希釈した。開始用量は、投与レジームによって指定されるとおりに、0.5μg/kg、28日間にわたって、週に2回とした。デキサメタゾンの2回目の投与は8〜12時間後に行った。筋骨格痛が生じた場合は、その処置にNSAID（イブプロフェン）またはシクロベンザプリンを使用した。
【０５２４】
28日サイクル中に、患者は一連の医学的評価および臨床検査的評価を受けた。これらの評価のスケジュールとそれらの時点を表14に示す。各時点において収集したデータの全てを症例報告書に記録した。
［表14］評価のスケジュール
【表１４】
2013540103.tif 000020
a−注入に先だって3日目（最適）または4日目およびサイクル1の最後（25日目の後）に行われる。
b−2日目以降の任意の時点で、可能であれば、HA染色のための投与後腫瘍生検。
c−投与後
d−投与前
e−投与中
F/U−追跡調査
【０５２５】
筋骨格事象および他の有害事象を含む有害事象または副作用を評価した。望ましくない医学的事象はいずれも、その発症が、デキサメタゾンと組み合わされたPEGPH20へのその患者の最初の曝露中または曝露後、ただし最後の投与後30日未満の間に起こったのであれば（それがPEGPH20＋デキサメタゾンに関連するとみなされるかどうかとは関わりなく）、有害事象（AE）とみなした。
【０５２６】
AEは、NCI CTCAEバージョン4.0および下記表15に示す指針を使って、治験担当医師により、重症度（重篤度の尺度ではなく強さの尺度）によって分類された。全てのAEは、そのAEがPEGPH20および/またはデキサメタゾンの投与に関連がある（Related）か、ほぼ確実に関連がある（Probably Related）か、関連があるかもしれない（Possibly Related）か、おそらく関連がない（Unlikely Related）か、または関連がない（Not Related）かによって、治験担当医師により、さらに分類された。
［表15］重症度による有害事象の分類
【表１５】
2013540103.tif 000021
【０５２７】
患者を用量制限毒性（DLT）についてもモニタリングした。DLTと認定するには、有害事象が、PEGPH20＋デキサメタゾン処置に関連するとみなされたことを必要とし、最初の28日間の治療中に発生したものでなければならない。DLTを、任意の米国国立がん研究所（NCI）有害事象共通用語規準（CTCAE）グレード3以上（表15参照）の非血液学的毒性と定義した。その例外には、予防的制吐治療なしで起こった悪心および嘔吐であるが、そのような治療によって効果的に処置されたもの、ならびに容易に処置されてグレード2以下に低下するか24時間以内に解消するグレード3の筋骨格毒性を含めた。DLTを、21日間では解消し得ない進行中および持続性のグレード2毒性であって、プロトコル治療に服すという患者の能力を制限するものとも定義した。最後のDLTの定義には、任意のグレード4または遷延性グレード3血液学的毒性を含めた。
【０５２８】
PEGPH20をデキサメタゾンと組み合わせて1日目および4日目に投与した後に、患者はグレード1の両膝痛を経験した。8日目に3回目の投与を行ったが、合併症はなかった。両膝痛はグレード1であり続け、断続的であり、治療を必要としないか、歩行運動を制限しなかった。膝の理学的検査により、関節の物理的変化または運動の制限はないことが示された。この有害事象はDLTとはみなされなかった。
【０５２９】
患者は、さらなる関連合併症を伴わずに、レジメン（4週間、1、4、8、11、15、22および25日目に週2回の投与）を完了した。加えて、患者は、下痢、腹部膨満（グレード3；関連なし）ならびに両側上腕および前腕に紫外線発疹（グレード2）（グレード2；関連なし）も有した。この患者は、臨床疾患（卵巣がん）の進行ゆえに、試験を中止し、離脱した。
【０５３０】
2．2人目の患者
デキサメタゾンと組み合わせたPEGPH20の投与レジームは1人目の患者において認容性が高かったので、食道がんを有する2人目の患者では、PEGPH20の用量を漸増させた。その71歳の男性患者に、1.6μg/kg PEGPH20＋デキサメタゾンを、週に2回、28日間投与した。用量が高い点を除いて、投薬レジメンは1人目の患者の場合と同じであった。1人目の患者について上述したように、有害事象およびDLTを含む医学的評価および臨床検査的評価を行った。
【０５３１】
グレード1の筋骨格副作用が観察された。有害作用は、全てグレード1であり、腰の軽症疼痛、左臀部の疲労、疼痛および痛み、手および足の筋痙攣が含まれていた。DLTは報告されなかった。この患者には、疲労（グレード1；関連あり）、左臀部疼痛（グレード1；試験薬とは関連がない）；筋痙攣および腰疼痛（グレード1；試験薬と関連があるかもしれない）を含む有害事象があった。
【０５３２】
この患者はサイクル2に進み、サイクル2では週に1回の投与を受けた。この患者は、サイクル2の15日目に、疾患の進行ゆえに、中止した。
【０５３３】
3．3人目の患者
3人目の患者には、5.0μg/kg PEGPH20＋デキサメタゾンで、週に2回、28日間投与した。1回目の投与は合併症を伴わなかった。2回目の投与日には、患者の手にグレード1の筋痙攣があり、これは3回目の投与後には手、脚、足およびつま先のグレード3筋痙攣に進行した。この患者にはさらなる注入を行わず、試験を中止した。
【０５３４】
4．4人目および5人目の患者
5.0μg/kg PEGPH20の3回目の投与後にグレード3の筋痙攣が起こったので、2人の患者では用量を1.6μg/kgに低減し、これらの患者には、それぞれ1.6μg/kg PEGPH20＋デキサメタゾンを週に2回、28日間投与した。
【０５３５】
中分化結腸腺癌を有する4人目の患者は、指、手、足および腓腹にグレード1の両側性痙攣を経験した。注目すべきことに、肝臓の転移病巣の投与後生検は、保存されていた腫瘍生検と比較して、細胞周囲HAの低減を示した（実施例12参照）。患者はサイクル2を完了したが、サイクル3を開始する前に、疾患の進行ゆえに試験から離脱した。
【０５３６】
中分化結腸直腸腺癌を有する5人目の患者は、大腿部に、2回目のPEGPH20投与と同じ日に始まるグレード1の断続的両側性痙攣を報告し、それが継続した。グレード1の断続的左膝痛も、2回目のPEGPH20投与の1日後に1日だけ起こり、これは6回目のPEGPH20を投与した日にグレード1として、もう一度起こった。この患者は、手および下肢の筋にグレード2の断続的両側性痙攣も報告し、これは4回目のPEGPH20投与と同じ日に始まった。
【０５３７】
C．結果の要約
5.0μg/kg未満のPEGPH20をデキサメタゾンと組み合わせて投与した患者の試験では、有害作用が、主として、両側性膝痛、右足筋痙攣、左右手筋痙攣を含む筋骨格性であり、これらは全て試験薬に関連し、全てグレード1であった。5人の患者は疾患の進行ゆえに中止した。1.6μg/kgを週に2回投与された1人の患者は、2サイクルの治療を完了した後、疾患の進行ゆえに中止した。
【０５３８】
つまり、これらの結果は、デキサメタゾン前投薬、すなわち投与日にPEGPH20投与の前および後（PEGPH20投与の1時間前および8〜12時間後）に投与される4mgの使用が、筋骨格事象の重症度を減弱したことを示している。したがって、デキサメタゾンの使用は、デキサメタゾンの非存在下でPEGPH20によって達成されるものより高い用量および投与頻度での認容できるPEGPH20の投与を可能にする。
【０５３９】
［実施例11］
HAの組織化学的検出
HAの組織化学的検出用の試料を、実施例10で述べたように1.6μg/kg PEGPH20＋デキサメタゾンを4週間投与した患者から、前生検腫瘍検体とサイクル1後の転移性肝生検試料とから得た。2007年（PEGPH20試験の3.5年前）に取得され保存されていた投与前生検（前生検）と、PEGPH20サイクル1後（最後の投与の3日後）生検材料（後生検）を、肝転移を有する女性大腸がん患者から入手した。患者処置後生検材料は、週に2回のスケジュールで、デキサメタゾン共処置を伴って1.6μg/kgで行った、1サイクルのPEGPH20処置後に得た。
【０５４０】
簡単に述べると、腫瘍生検材料を中性緩衝ホルマリン（normal buffered formalin；NBF）中で固定し、5μm切片を切り出し、ビオチン標識ヒアルロナン結合タンパク質（HABP-bio）（生化学工業株式会社、日本）を使って染色した。一次試薬を除去するための洗浄後に、標識二次試薬を使用した。DAPI（4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）試薬を使って核を対比染色した。顕微鏡像は、Insight FireWireデジタルカメラ（Diagnostic Instruments、ミシガン州）と連動させたニコンEclipse TE2000U倒立蛍光顕微鏡、または同じイメージングシステムを有するZEISSオーバーヘッドスコープ（Carl Zeiss,Inc.）を使ってキャプチャした。
【０５４１】
ビオチン化HA結合タンパク質による試料の組織化学的染色により、1サイクルのPEGPH20処置後の細胞周囲および間質HAレベルの低下が実証された。結果を表16に要約する。Hスコアは、細胞周囲および間質HAの相対強度を表す。このデータは、腫瘍関連HAを分解するPEGPH20の能力を実証している。
［表16］HAの組織化学的検出
【表１６】
2013540103.tif 000022
**腫瘍関連間質
【０５４２】
［実施例12］
血漿中のヒアルロナン（HA）レベルを見積もるためのHPLC法
この実施例では、血漿中のHA二糖含有量を決定するための方法を述べる。この方法では、コンドロイチナーゼABCによるHAの加水分解を使ってHA二糖を放出させ、それらを2-アミノアクリドン（AMAC）で誘導体化し、蛍光検出と連動させた逆相HPLCで、それらを分析する。HA二糖の定量はHA二糖標準との比較によって行われる。
【０５４３】
1．作業用標準
この方法では、作業用標準溶液を作成した。まず最初に、HA二糖保存液（SS）から希釈保存液（DSS）を作成した。HA二糖SSは、2mgの凍結乾燥粉末が入っているHA二糖（HA-Disac）（V-labs、カタログ番号C3209）のバイアルに1mLの水を加えて均一な懸濁液を作ることによって作成した。希釈保存液を作成するために、1μlのSS溶液を125μlの水で希釈して、DSS1溶液（200pmol/μl HA-Disac；200nmol/ml HA-Disacを含有する）を作成した。水で5倍段階希釈液を作って、まずDSS2（40pmol/μl HA-Disac；40nmol/ml HA-Disacを含有する）を作成し、次にDSS3（8pmol/μl HA-Disac；8nmol/ml HA-Disacを含有する）を作成した。次に、25％ヒト血清アルブミン（HAS）（ABO Pharmaceuticals、カタログ番号1500233）または正常マウス血漿（Bioreclamation、カタログ番号MSEPLEDTA2-BALB-M）中に、表17および18に示すように作業用標準溶液を作成した。
［表17］HSA中の作業用標準溶液
【表１７】
2013540103.tif 000023
［表18］正常マウス血漿中の作業用標準溶液
【表１８】
2013540103.tif 000024
【０５４４】
2．試料の加水分解と誘導体化
次に、試料を加水分解した。およそ100μgのタンパク質をポリプロピレンチューブにとり、水で体積を340μlに調節することによって、試料（例えば血漿）を調製した。試料の体積と等しい希釈緩衝液（1.59g HEPES、5.07g NaCl、1800mLの水、pH7.0）をとり、体積を340μlに調節することによって、マトリックスブランクも調製した。試料とマトリックスブランクの加水分解は、試料チューブおよびマトリックスブランクチューブに60μlのTFAを加えることによって行い、内容物を混合し、100℃で4時間インキュベートした。バイアルを室温まで冷ました。スピードバックを使ってバイアルを蒸発乾固した。次に、300μlの水を各チューブに加え、試料を再懸濁するためにボルテックスした。
【０５４５】
加水分解した試料を誘導体化するために、45μlの各試料（試料、ブランクまたは作業用試料）を、スピードバックで蒸発乾固した。次に、10μlのSASを乾燥した試料、ブランクおよび作業用標準に加えた。次に、50μlのABA/NaCNBH3ラベリング溶液を加えた。チューブをボルテックスし、手短に遠心分離した。次に、440μlの移動相Aを加え、チューブをよく混合した。移動相Aは次のように調製した：132mLの1M酢酸アンモニウム緩衝液（Sigma、カタログ番号A7330）を、1Lメスフラスコに加え、水を加えてフラスコを満たした。誘導体化の後、作業用標準の場合、注入量20μlあたりの名目カラム負荷量は表19に示すとおりである。
［表19］
【表１９】
2013540103.tif 000025
【０５４６】
3．HPLC
HPLCカラムを、表20に概説する初期移動相設定により、1.0mL/分の流速で平衡化した。ベースラインが定常的になるまで系を平衡化させた。HPLC分析は、表20に概説する機器パラメータで行った。
［表20］HPLC機器パラメータ
【表２０】
2013540103.tif 000026
【０５４７】
試料分析のシーケンスは次のとおりとした：カラムコンディショニング/平衡化/検出器ゲイン用にWSS5（1回注入）；水注入（1回注入）；WSS3（3回注入）；WSS1（1回注入）；WSS2（1回注入）；WSS4（1回注入）；WSS5（1回注入）；水（1回注入）；マトリックスブランク（1回注入）；試料1（1回注入）；試料2（1回注入）；WSS3（3回注入）；水（1回注入）。システムは、許容される分離品質があり；WSS1試料中の短い方の単糖ピークについての信号対雑音比が10以上であり；WSS3の6回の注入について各単糖標準の相対標準偏差（RSD）が4％以下であり；相関係数（r）が0.99であり（rは、ソフトウェアを使用して、WSS3標準の最初の3回の注入を使って各作業用標準のピーク面積をカラム負荷量（pmolで表したもの）に対してプロットし、作業用標準に関する傾き、切片および相関係数を線形最小二乗回帰モデルを使って算出することによって測定した）；単糖に対応するピークに関するピーク面積が、WSS5に関して測定されるピーク面積の2％を上回らず；水注入における単糖に対応するピークに関するピーク面積がWSS5に関して測定されるピーク面積の0.5％を上回らなければ、適切であるとみなした。
【０５４８】
4．試料分析
各試料調製物中の各単糖に関する平均補正ピーク面積を決定した。GalNピークには谷から谷までの積分を使った。これを決定するために、作業用標準から生成した線形曲線を使って、各試料調製物について負荷された各単糖の量を算出した。各タイプの単糖について、タンパク質分子あたりの単糖の分子量の平均モル比を各試料について算出した。次に、各試料について、5つの単糖全てについて平均モル比の総合計を決定した。計算は次の事項に基づいて行った：非グリコシル化ヒアルロニダーゼタンパク質の分子量（MW）は51106g/molである；各試料の総体積は500μlであった；試料希釈率は0.15である；各注入の体積は20μlである；mgからpgへの変換係数は109である。計算は、各単糖について次のように行った。
【０５４９】
各調製物についての単糖の量は、次式を使って算出した：
単糖（pmol）＝（ピーク面積−切片）/傾き
タンパク質分子あたりの単糖の数は、次式を使って算出した：
タンパク質あたりの単糖の比＝（単糖（pmol）×MW×500μl）/（0.1mg×109×20μl×0.15）。
【０５５０】
各試料について、各試料の結果を、各単糖についてのタンパク質あたりの単糖の比として、5つの単糖の比の和と共に報告した。
【０５５１】
［実施例13］
デキサメタゾンありまたはデキサメタゾンなしでのPEGPH20の薬物動態
実施例6（PEGPH20）および実施例10（PEGPH20＋デキサメタゾン）で述べたヒトでの試験において、予定の時間に患者から血液試料を収集した。血漿試料を凍結保存し、実施例4で述べたように、改良された比濁アッセイを使ってヒアルロニダーゼ活性を測定することにより、PEGPH20の濃度を決定した。ヒアルロニダーゼ活性の決定に使用したUSP比濁法は、HAが酸性化血清と結合した時に起こる不溶性沈殿物の形成に基づいている。PEGPH20濃度は、検量線から内挿されるヒアルロニダーゼ活性の単位（U/mL）として表した。活性は1U/mL単位の概数で報告するが、この分析方法は、0.3125U/mLという低い血漿中ヒアルロニダーゼ濃度の測定にも応用することができた。
【０５５２】
1．PEGPH20
PEGPH20のIV投与を0.5μg/kg〜50μg/kgの範囲にわたる用量で1〜3回受けた実施例6の患者からの血液試料を、PH20の薬物動態について解析した。
【０５５３】
最初に50μg/kgの単回投与を受けた2人の患者（実施例6B.1）については、経時的な血漿中濃度が類似していた。血漿中の最大PEGPH20濃度は注入後すぐに測定され、時間が経つにつれて循環から着実に消失していった。薬物動態解析は、小さな分布容積、遅い血漿クリアランス、およびおよそ2日の終末相半減期を示した。これらの結果は、まず投与後に、およそ30U/mLの酵素が血漿中に測定されたことを示している。血漿酵素のレベルは時間の経過と共に着実に低下したが、投与の24時間後および48時間後も検出可能であり、投与後72時間の時点で存在するのは、およそ2U/mL未満であった。PKパラメータにより、患者では28〜48時間の血漿中半減期が明らかになった。表21に、最大血漿中濃度（Cmax；U/mL）、絶対/全身クリアランス（CL；mL/時間/kg）、分布半減期（t1/2α）、消失半減期（t1/2β）、および中央コンパートメントの容積（V1；mL/kg）を含むPKパラメータの要約を示す。
［表21］PEGPH20の単回50μg/kg投与後のPKパラメータ
【表２１】
2013540103.tif 000027
【０５５４】
0.5μg/kg〜1.5μg/kgの範囲にわたるPEGPH20の単回投与または複数回投与で処置された、この試験における残り12人の患者については、血漿中濃度が投与後は測定可能であったが（ただし約1.5U/mL以下）、最初の日には濃度が定量限界未満（BQL）に低下した。血漿中濃度が典型的には定量限界近くまたはそれ以下だったので、血漿中濃度の時間経過に関する十分な情報は得られなかった。一般に、0.5μg/kg〜1.5μg/kgの範囲にわたる低用量のPEGPH20のIV投与後、1日目については、全身曝露の用量依存的増加があった。
【０５５５】
実施例6の試験において複数回投与を受けた8人の患者については、測定可能な血漿中濃度が、これら8人中4人の患者において、反復投与後に検出された。これらの血漿中濃度は、0.34〜0.83U/mLと低く、初回投与後に検出されたものと似ていた。
【０５５６】
2．PEGPH20＋デキサメタゾン
用量が0.5μg/kg〜5.0μg/kgの範囲にわたるPEGPH20の投与を複数回受けた実施例10における患者からの血液試料を、PH20の薬物動態に関して解析した。
【０５５７】
上記デキサメタゾンなしでのPEGPH20の薬物動態との比較を容易にするために、血漿中濃度対時間のデータを、PEGPH20の反復投与前に収集した。0.5μg/kgまたは1.6μg/kgで処置された患者については、最大血漿中濃度が、デキサメタゾンなしの試験で観察されたものと合致していた。濃度は1日目には定量限界まで低下した。5.0μg/kg PEGPH20で処置された唯一の患者から測定された最大濃度は、デキサメタゾンなしでの試験において50μg/kgのPEGPH20で処置された患者について検出されたCmax値のおよそ1/10だった。これらの結果は、PEGPH20の血漿薬物動態がデキサメタゾンの存在下または非存在下において類似していることを示している。
【０５５８】
［実施例14］
デキサメタゾンありまたはデキサメタゾンなしでのPEGPH20の薬力学
循環中に存在するヒアルロナンの濃度をモニタリングすることによってPEGPH20の酵素活性を測定した。実施例12で述べた二糖アッセイを使って、実施例6（PEGPH20）および実施例10（PEGPH20＋デキサメタゾン）で述べたヒトにおける試験で予定された時間に患者から収集された連続血漿試料におけるHAおよびその異化産物の濃度を測定した。
【０５５９】
1．PEGPH20
PEGPH20のIV投与を0.5μg/kg〜50μg/kgの範囲にわたる用量で1〜3回受けた実施例6の患者からの血液試料を、HA異化産物について分析した。PEGPH20投与前の血漿中HA濃度は、この試験における全ての患者で、典型的には、1μg/mL未満だった。
【０５６０】
PEGPH20の単回50μg/kg投与を受けた患者については、ヒアルロナンの血漿中濃度が有意に増加した。PEGPH20が相対的に迅速に血漿から消失するにもかかわらず（実施例12.1）、濃度の上昇したHAはゆっくりと蓄積し、2週間を超える期間にわたって（400時間以上）持続するようだった。HA異化作用に対する長期間にわたる効果、すなわち循環中の持続的HA濃度は、末梢コンパートメントまたは血管外組織におけるPEGPH20の酵素活性と合致する。
【０５６１】
0.5μg/kg〜1.5μg/kgの範囲にわたるPEGPH20の単回投与または複数回投与で処置された残り12人の患者については、1週間にわたってHA異化産物レベルが用量依存的に増加した。薬力学応答を定量化するために、各患者について、最大HA濃度（Cmax）および1週間曲線下面積推定値（AUC0-168h）も決定した。これらの結果により、高血漿中濃度または曲線下面積によって測定されるHA異化産物に対する全身曝露は、PEGPH20の用量が増加すると共に増加するようであることが示された。
【０５６２】
2．PEGPH20＋デキサメタゾン
用量が0.5μg/kg〜5.0μg/kgの範囲にわたるPEGPH20の複数回投与を受けた実施例10における患者からの血液試料を、HA濃度について分析した。上記のPH20だけを投与された患者からの試料における治験と合致して、血漿HA濃度対時間のデータは、PEGPH20の投与後に増加した。投与後最初の1週間に測定される血漿中HAの濃度は、PEGPH20の用量の増加と共に増加した。1サイクルの処置を全て完了してPEGPH20の投与を8回受けた3人の患者では、3人のどの患者からの試料においても、持続的な増加したHA濃度が、投与期間中は常に測定されることを、結果は示した。
【０５６３】
［実施例15］
磁気共鳴イメージング
見掛けの拡散係数について、画素ごとの値を推定するために、シングルショットエコーシーケンスを使って拡散強調MRIを行った。ダイナミック造影磁気共鳴イメージング（DCE-MRI）には、造影剤を注入している間のイメージングを含めた。キャリブレーションは内管を含んでいる2パーツファントムおよび氷/水混合物を使って行った。スキャンは処置前と処置後に行った。
【０５６４】
1．見掛け拡散係数磁気共鳴イメージング（ADC-MRI）
見掛け拡散係数磁気共鳴イメージング（ADC-MRI）では、処置前スキャンおよび処置後スキャンから導き出される計算に基づいて細胞膜を横切って移動した水の体積が測定される。実施例6で述べた試験における14人中の合計10人の患者、および実施例10で述べた試験における5人中の4人の患者について、ADC-MRIスキャンを完了した。各患者から取得したイメージの解析は、Imaging Endpoints（アリゾナ州スコッツデール）において放射線診断医によって行われ、ADCの定量的推定値が、各患者における組織について計算された。腫瘍領域に関連するADC-MRI所見の要約を表22に示す。表に示すように、ADC-MRIの増加がPEGPH20投与後に14人中7人（50％）の患者で観察された。ADC値の増加は、PEGPH20の作用機序と合致している。しかし14人中5人の患者ではADC値が変化せず、14人中2人では値が低下した
［表22］ADC-MRI要約
【表２２】
2013540103.tif 000028
【０５６５】
2．ダイナミック造影磁気共鳴イメージング（DCE-MRI）
ダイナミック造影磁気共鳴イメージング（DCE-MRI）では、腫瘍の血管分布の変化を示す血流が測定される。スキャンは、実施例10で述べた試験における5人中の4人の患者で完了した。各患者から取得されたイメージの解析は、Imaging Endpoints（アリゾナ州スコッツデール）において放射線診断医によって行われ、体積移動係数（Ktrans）、血液量（Vp）および細胞外液量分率（Ve）の定量的推定値が、各患者における組織について計算された。腫瘍領域に関連するDCE-MRI所見の要約を表23に示す。Ktransパラメータの有意な増加が、PEGPH20投与の日にスキャンされた2人の患者で観察された。投与後数時間以内のKtransの増加は、PEGPH20が血管減圧および血流の増加を引き起こすことを示す前臨床データと合致している（Thompsonら (2010) Mol. Cancer Ther., 9:3052-64）。
［表23］DCE-MRI要約
【表２３】
2013540103.tif 000029
【０５６６】
［実施例16］
種間スケーリングアルゴリズム
前臨床モデルにおいて、PEGPH20は、単独で、またはゲムシタビンとの組合せにおいて、0.01〜0.1mg/kgという低い用量で腫瘍成長を効果的に阻害することが観察された。これらの用量において、等価なヒト曝露を決定するために、PEGPH20の血漿クリアランスが体重に比例して増減すると仮定する種間スケーリングアルゴリズムを使用した。これに基づいて、0.01〜0.1mg/kgというマウスにおける有効用量は、0.75μg/kg〜7.5μg/kgというヒト等価用量に釣り合うことが見いだされた。マウスはヒトと比べておよそ20倍のHAの循環レベルを有するので、等価な用量のPEGPH20は、相対的により多くの抗腫瘍活性を患者において有することができる。
【０５６７】
変更態様は当業者には明白であるだろうから、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【配列表】
2013540103000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年8月22日(2013.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロナン分解酵素によるヒアルロナン関連疾患または状態の処置に関連する有害副作用を緩和するための医薬の製剤化を目的とするコルチコステロイドの使用。
【請求項２】
ヒアルロナン分解酵素によるヒアルロナン関連疾患または状態の処置に関連する有害副作用を緩和するのに使用するためのコルチコステロイドを含む医薬組成物。
【請求項３】
有害作用が筋骨格副作用である、請求項1に記載の使用または請求項2に記載の医薬組成物。
【請求項４】
有害作用が筋骨格副作用であり、筋・関節痛、上肢のこわばり、下肢のこわばり、痙攣、筋炎、全身の筋痛および圧痛、脱力、疲労、ならびに膝関節および肘関節における可動域の減少の中から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項５】
コルチコステロイドがグルココルチコイドである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項６】
グルココルチコイドが、コルチゾン類、デキサメタゾン類、ヒドロコルチゾン類、メチルプレドニゾロン類、プレドニゾロン類およびプレドニゾン類の中から選択される、請求項5に記載の使用または医薬組成物。
【請求項７】
グルココルチコイドがデキサメタゾンである、請求項5または請求項6に記載の使用または医薬組成物。
【請求項８】
コルチコステロイドが経口投与用に製剤化されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項９】
コルチコステロイドが、0.1〜20mgまたはその前後の範囲にある量の1回量投与用に製剤化されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項１０】
ヒアルロナン分解酵素がポリマーにコンジュゲートされている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項１１】
ポリマーがPEGであり、ヒアルロナン分解酵素がPEG化されている、請求項10に記載の使用または医薬組成物。
【請求項１２】
ヒト対象におけるヒアルロナン関連疾患または状態を処置するために3.75μg〜750μgまたはその前後の範囲にある量で医薬として製剤化されているヒアルロナン分解酵素組成物の使用であって、ヒアルロナン分解酵素がポリマーへのコンジュゲーションによって修飾されており、組成物が直接投与用に製剤化されている使用。
【請求項１３】
ヒト対象におけるヒアルロナン関連疾患または状態を処置するために3.75μg〜750μgまたはその前後の範囲にある量でヒアルロナン分解酵素を含む医薬組成物であって、ヒアルロナン分解酵素がポリマーへのコンジュゲーションによって修飾されており、組成物が直接投与用に製剤化されている医薬組成物。
【請求項１４】
組成物が1回量を与える、請求項12または請求項13に記載の使用または医薬組成物。
【請求項１５】
ポリマーがPEGであり、ヒアルロナン分解酵素がPEG化されている、請求項12〜14のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項１６】
量が、56μg〜565μgもしくは75μg〜225μgまたはその前後の範囲にある、請求項12〜15のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項１７】
ポリマーにコンジュゲートされたヒアルロナン分解酵素が、少なくとも20,000U/mgの比活性を有する、請求項12〜16のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項１８】
組成物が全身投与用または局所投与用に製剤化されている、請求項12〜17のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項１９】
ヒアルロナン分解酵素組成物が、経口投与、静脈内（IV）投与、皮下投与、筋肉内投与、腫瘍内投与、動脈投与、腹腔内投与、膀胱内投与、皮内投与、外用投与、経皮投与、直腸投与、または表皮下投与用に製剤化されている、請求項12〜18のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２０】
組成物が静脈内投与用に製剤化されている、請求項18または請求項19に記載の使用または組成物。
【請求項２１】
ヒアルロナン関連疾患または状態が、高い間質液圧に関連するもの、がん、浮腫、椎間板圧迫、および炎症性疾患の中から選択される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２２】
疾患または状態が浮腫であり、浮腫が臓器移植、脳卒中または脳外傷によって引き起こされる、請求項21に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２３】
炎症性疾患が、関節リウマチ、強皮症、歯周炎、乾癬、アテローム性動脈硬化、慢性創傷、クローン病、潰瘍性大腸炎、および炎症性腸疾患の中から選択される、請求項21に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２４】
疾患または状態ががんであり、がんが腫瘍である、請求項21に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２５】
疾患または状態が固形腫瘍である、請求項24に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２６】
腫瘍が、同じ組織タイプの非がん性組織と比較して、または同じ腫瘍タイプの非転移性腫瘍と比較して、増加したヒアルロナンの細胞および/または間質発現を有する、請求項25に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２７】
疾患または状態が、末期がん、転移がんおよび未分化がんのいずれか1つ以上の中から選択される、請求項21に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２８】
疾患または状態が、卵巣がん、上皮内癌（ISC）、扁平上皮細胞癌（SCC）、前立腺がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、脳がん、および大腸がんのいずれか1つ以上の中から選択される、請求項21に記載の使用または医薬組成物。
【請求項２９】
ヒアルロナン分解酵素がヒアルロニダーゼである、請求項1〜28のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項３０】
ヒアルロニダーゼがPH20または可溶性PH20である、請求項29に記載の使用または医薬組成物。
【請求項３１】
ヒアルロニダーゼが、C末端グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）付加部位またはGPI付加部位の一部を除去するためにトランケートされた可溶性PH20である、請求項30に記載の使用または医薬組成物。
【請求項３２】
ヒアルロニダーゼが中性活性であり、かつN-グリコシル化されており、
（a）完全長PH20であるか、PH20のC末端トランケート型である、ヒアルロニダーゼポリペプチド、ここで完全長PH20は、配列番号2に示すアミノ酸の配列を含む；または
（b）配列番号2に示すアミノ酸の配列のポリペプチドまたはトランケート型と少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むヒアルロニダーゼポリペプチド；または
（c）ヒアルロニダーゼポリペプチドが、配列番号2に示すポリペプチドと、またはその対応するトランケート型と、少なくとも85％の配列同一性を有するようにアミノ酸置換を含む、（a）または（b）のヒアルロニダーゼポリペプチド
から選択される、請求項29〜31のいずれか一項に記載の使用または医薬組成物。
【請求項３３】
トランケート型が、配列番号1のアミノ酸36〜467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482または483を含む、請求項32に記載の使用または医薬組成物。
【請求項３４】
静脈内投与用に製剤化されたヒアルロナン分解酵素を含有する第1組成物、および
コルチコステロイドを含む第2組成物を含む組合せ剤。
【請求項３５】
ヒアルロナン分解酵素がポリマーにコンジュゲートされている、請求項34に記載の組合せ剤。
【請求項３６】
コルチコステロイドがグルココルチコイドである、請求項34または請求項35に記載の組合せ剤。
【請求項３７】
グルココルチコイドが、コルチゾン類、デキサメタゾン類、ヒドロコルチゾン類、メチルプレドニゾロン類、プレドニゾロン類およびプレドニゾン類の中から選択される、請求項35または請求項36に記載の組合せ剤。
【請求項３８】
グルココルチコイドがデキサメタゾンである、請求項36または請求項37に記載の組合せ剤。
【請求項３９】
ヒアルロナン分解酵素がヒアルロニダーゼである、請求項34〜38のいずれか一項に記載の組合せ剤。
【請求項４０】
ヒアルロニダーゼがPH20または可溶性PH20である、請求項39に記載の組合せ剤。
【請求項４１】
ヒアルロニダーゼが、C末端グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）付加部位またはGPI付加部位の一部を除去するためにトランケートされた可溶性PH20である、請求項40に記載の組合せ剤。
【請求項４２】
ヒアルロニダーゼが中性活性であり、かつN-グリコシル化されており、
（a）完全長PH20であるか、PH20のC末端トランケート型である、ヒアルロニダーゼポリペプチド、ここで完全長PH20は、配列番号2に示すアミノ酸の配列を含む；または
（b）配列番号2に示すアミノ酸の配列のポリペプチドまたはトランケート型と少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むヒアルロニダーゼポリペプチド；または
（c）ヒアルロニダーゼポリペプチドが、配列番号2に示すポリペプチドと、またはその対応するトランケート型と、少なくとも85％の配列同一性を有するようにアミノ酸置換を含む、（a）または（b）のヒアルロニダーゼポリペプチド
から選択される、請求項39〜41のいずれか一項に記載の組合せ剤。
【請求項４３】
トランケート型が、配列番号1のアミノ酸36〜467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482または483を含む、請求項42に記載の組合せ剤。
【国際調査報告】
2013540103.tif 000030
2013540103.tif 000031
2013540103.tif 000032
2013540103.tif 000033
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2013540103.tif 000035
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2013540103.tif 000037