(57)【要約】  本発明は、ＭＥＣＰ２関連障害、例えば、レット症候群を処置するための、シスタミン、システアミン、もしくはそれらの塩、またはカルシニューリンインヒビターの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるＭＥＣＰ２関連障害を処置することにおける使用のための、シスタミンもしくはシステアミンまたはその塩。
【請求項２】
ＭＥＣＰ２関連障害が、レット症候群、自閉症、広汎性発達障害、非症候性知的障害、特発性新生児脳症および特発性脳性まひからなる群から選択される、請求項１に記載のＭＥＣＰ２関連障害を処置することにおける使用のためのシスタミンまたはシステアミン。
【請求項３】
ＭＥＣＰ２関連障害がレット症候群である、請求項２に記載のＭＥＣＰ２関連障害を処置することにおける使用のためのシスタミンまたはシステアミン。
【請求項４】
別の薬学的に活性な化合物と組み合わせて使用するための、請求項１から３のいずれかに記載のＭＥＣＰ２関連障害を処置することにおける使用のためのシスタミンまたはシステアミン。
【請求項５】
ヒト患者におけるＭＥＣＰ２関連障害を処置することにおける使用のための、カルシニューリンインヒビター。
【請求項６】
マクロライドである、請求項５に記載のＭＥＣＰ２関連障害を処置することにおける使用のためのカルシニューリンインヒビター。
【請求項７】
カルシプレシン(calcipressin)、タクロリムスおよびタクロリムス類似体、シクロスポリンＡおよびシクロスポリンＡ類似体、ＬｘＰＶタンパク質、２，６−ジアリール−置換ピリミジン誘導体およびＦＫ５０６−結合タンパク質からなる群から選択される、請求項５または６に記載のＭＥＣＰ２関連障害を処置することにおける使用のためのカルシニューリンインヒビター。
【請求項８】
カルシプレシン１、カルシプレシン２、カルシプレシン３、タクロリムス、アスコマイシン、シロリムス、ピメクロリムス、シクロスポリンＡ、ボクロスポリン(voclosporine)、ＬｘＰＶｃ１、ＬｘＰＶｃ２、ＬｘＰＶｃ３、６−（３，４−ジクロロ−フェニル）−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルチオ）−２−フェニル−ピリミジンおよびＦＫ５０６−結合タンパク質８からなる群から選択される、請求項７に記載のＭＥＣＰ２関連障害を処置することにおける使用のためのカルシニューリンインヒビター。
【請求項９】
タクロリムスである、請求項８に記載のＭＥＣＰ２関連障害を処置することにおける使用のためのカルシニューリンインヒビター。
【請求項１０】
シクロスポリンＡである、請求項８に記載のＭＥＣＰ２関連障害を処置することにおける使用のためのカルシニューリンインヒビター。
【請求項１１】
ＭＥＣＰ２関連障害が、レット症候群、自閉症、広汎性発達障害、非症候性知的障害、特発性新生児脳症および特発性脳性まひからなる群から選択される、請求項５から９のいずれかに記載のＭＥＣＰ２関連障害を処置することにおける使用のためのカルシニューリンインヒビター。
【請求項１２】
ＭＥＣＰ２関連障害がレット症候群である、請求項１１に記載のＭＥＣＰ２関連障害を処置することにおける使用のためのカルシニューリンインヒビター。
【請求項１３】
別の薬学的に活性な化合物と組み合わせて使用するための、請求項５から１２のいずれかに記載のＭＥＣＰ２関連障害を処置することにおける使用のためのカルシニューリンインヒビター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ＭｅＣＰ２発現欠損と関連する神経発達および／または神経障害を処置するために有用な化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
メチル−ＣｐＧ−結合タンパク質−２（ＭｅＣＰ２）遺伝子は、メチル化ＤＮＡを結合し、標的遺伝子の転写を調節することができるタンパク質をコードする。ＭｅＣＰ２欠損または過剰発現は、ヒトにおいて重度の神経発達および／または神経学的疾患を引き起こす。
【０００３】
それらは、ＭｅＣＰ２発現欠損と関連する神経発達および／または神経障害のいくつかの形態である。レット症候群、自閉症、広汎性発達障害、非症候性知的障害、特発性新生児脳症および特発性脳性まひは、このような障害の典型的な例である。
【０００４】
レット症候群は、ほぼ例外なく女性に影響を及ぼすＸ−関連優性障害である。一般的に、罹患した少女は、６から１８月齢のある時点まで正常に発達し、ある時点で、発達の進行が中断されるか、または後退が始まる。彼女らは、目的のある手の使用およびあらゆる後天的な言語技能（認識および表現の両方）を失い、頭の成長が遅延し、反復の手の動きが発生する。他の特徴、例えば、運動失調、歩行失行、発作、呼吸のリズム障害(dysrhythmias)（無呼吸または過呼吸）および自閉症的行動もまた現れ得る。彼女らはまた、身体成長の低下および消耗を引き起こす。迅速な悪化の該期間後、患者は安定し、次にいくつかの技能が回復し得る。生存は、通常、成人にまで達する。現在、９０％を超えるレット症候群の原因が、ＭＥＣＰ２遺伝子における変異によることと推定される。レット症候群は、１２歳で生存している女性の約１２，５００人に１人において診断される。
【０００５】
自閉症は、一般的に生後３年間に現れる複合発達障害である。それは、脳の機能に影響する神経障害の結果である。少女よりも少年において４倍多く見られることが発見されている。一般的に、自閉症の子供および成人は、言語的および非言語的コミュニケーション、社会的交流ならびにレジャーもしくは遊び活動において困難性を有する。多数の子供が行うように自然環境から学ぶことができず、自閉症の子供は一般的に、周りの世界または人々にあまり興味を示さない。自閉症を有する子供の中には正常に発達し、高度なスキルさえ獲得するが、多数は広範な行動の問題を示す。自閉症は、個人が他人を理解し、他人とコミュニケートし、他人と関わる方法に影響する。自閉症は、当初、主に精神状態であると考えられていた。しかしながら、さらなる研究は、遺伝および環境因子が自閉症の病因に関与することを示した。
【０００６】
広汎性発達障害（ＰＤＤ）は、一連の根本的な遺伝的または環境的／生物学的原因を有し得る脳発達の異常から、または遺伝子環境相互作用から生じる神経発達障害を特徴とする包括的用語である。ＰＤＤは、多数の基本的機能の発達において、通常、社会化およびコミュニケーションを含む子どもの発達において、遅延を引き起こす。ＰＤＤは、早ければ乳幼児期で示すこともあり、通常３歳までに明らかとなる。ＰＤＤの症状は、コミュニケーションの問題、例えば、言語の使用および理解の困難性；人々、対象および事象と関わる困難性；玩具および他の対象での普通でない遊び；日常的なまたは慣れた環境における変化の困難性；ならびに反復身体的動作または行動パターンを含み得る。ＰＤＤを有する子供は、能力、知能および行動において大きく異なる。子供のなかには、全く話さない者もあり、限定された言葉または会話において話す者もあり、なかには比較的正常な言語発達を有する者もある。
【０００７】
知的障害は、７０未満の知的機能レベル（ＩＱ）、２つ以上の適応能力領域における有意な制限、および幼年時代（１８歳以下として定義される）から存在する状態により定義される。遺伝的病因は、知的障害の場合の約３分の２において見られる。神経分化およびシナプス可塑性、シナプス小胞循環および遺伝子発現制御に関与する生物学的プロセスは、知的障害の原因において重要であると考えられる。多数の患者は、随伴形態学的、放射線学的および代謝的特徴が存在しないことにより特徴付けられる非症候群型の障害を有する。
【０００８】
特発性新生児脳症は、未知の原因による脳症の産科的形態である。脳症は、単一の疾患を示さず、むしろ広範囲の脳機能障害の症候群を示す。脳症の特徴は精神状態変化である。脳症の型および重症度に依存して、一般的な神経学的症状は、認知機能の喪失、微妙な人格変化、集中力の欠如、無気力および意識低下である。他の神経学的徴候は、ミオクローヌス（筋肉または筋肉群の不随意的けいれん）、アステリクシス（迅速に回復される筋緊張の突然の喪失）、眼振（迅速な眼球の固視微動）、振戦、発作、輾転反側（重度の感染に特有の、落ち着きなくつつく行為）、および呼吸異常、例えば、チェーン・ストークス呼吸（一回換気量の周期的増大および低下）、持続性吸息呼吸、および高炭酸ガス後の無呼吸を含み得る。
【０００９】
特発性脳性まひは、ヒト発達において、主に種々の領域の身体的動作において身体障害を引き起こす、未知の原因の非進行性かつ非感染性運動状態のグループを含む。脳性まひは、発達中の脳の運動調節中枢への損傷により引き起こされ、妊娠中、出産中または出産後約３歳まで起こり得る。結果として生じる動作および姿勢における制限は、活動の制限を引き起こし、しばしば、感覚障害、奥行き知覚および他の視覚ベースの知覚問題、コミュニケーション能力の障害、およびときどき認識力の障害でさえ伴う；ときどき、脳性まひの形態は癲癇を伴い得る。たとえどの型であろうとも、脳性まひは、しばしば、根本的な語源の結果として生じる続発性筋骨格問題を伴う。
【００１０】
ＭｅＣＰ２と関連する神経発達および／または神経障害の多くの型のなかで治療法が知られるものはない。薬物は、特定の行動の問題を扱うために使用される；神経発達および／または神経障害を有する子供に対する治療は通常、その子供の特定の要求にしたがって特化される。
【００１１】
ＭｅＣＰ２は、正常な脳発達のために必須であり、その発現の改変は、ヒトにおいて重度の認識、運動および自律神経機能障害を引き起こす。ＭｅＣＰ２欠損は、軸索および樹状突起の数の減少ならびに樹状突起棘密度の減少をもたらす。（Armstrong, D.D. (2002) Neuropathology of Rett syndrome. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev., 8, 72-76  and Belichenko, P.V., Wright, E.E., Belichenko, N.P., Masliah, E., Li, H.H., Mobley, W.C., Francke, U. (2009) Widespread changes in dendritic and axonal morphology in Mecp2-mutant mouse models of Rett syndrome: evidence for disruption of neuronal networks. J Comp. Neurol., 514, 240-258）。樹状突起および軸索の広範囲の異常は、ＭＥＣＰ２関連障害と関与するようである。
【００１２】
いくつかの特許または出願は、ＭＥＣＰ２関連障害を処置するための種々の治療化合物を記載している。例えば、ＷＯ２００８／１２２０８７は、微小管動態障害を改善することができる薬剤を記載しており、ＥＰ  １  ５５９  ４４７は、微小管にチューブリン重合を引き起こすことにより自閉症を処置するためのエポチロンの使用を記載しており、ＵＳ  ６，７０９，８１７は、チューブリンアセチル化を増加し、ＭＥＣＰ２関連障害を処置することによる小胞輸送を補うためのヒストンデアセチラーゼインヒビターであるトリコスタチンＡの使用を記載している。特許出願ＷＯ２００８／０６０３７５は、脳におけるＢＤＮＦレベルを増強させることによる知的障害の処置を記載している。
【００１３】
脳由来神経栄養因子（Ｂｄｎｆ）は、ＭｅＣＰ２標的の１つである。ＢｄｎｆのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルにおける有意な減少は、ＭｅＣＰ２−欠損マウスにおいて見られる（Chang, Q., Khare, G., Dani, V., Nelson, S., Jaenisch, R. (2006) The disease progression of MeCP2 mutant mice is affected by the level of BDNF expression. Neuron. 49, 341-348）。Ｂｄｎｆは、中枢および末梢神経系におけるニューロンに作用し、存在するニューロンの生存を支持し、新規ニューロンの増殖および分化を引き起こす（Acheson, A., Conover, J.C., Fandl, J.P., DeChiara, T.M., Russell, M., Thadani, A., Squinto, S.P., Yancopoulos, G.D., Lindsay, R.M. (1995) A BDNF autocrine loop in adult sensory neurons prevents cell deah. Nature., 6521, 450-4533）。さらに、Ｂｄｎｆは、脳全体にわたって軸索および樹状突起の分化および成熟における重要な役割を果たす（Huang, E.J., Reichardt, L.F. (2001). Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736）。Ｃｈａｌｏｕｒ  ａｎｄ  ａｌ、２００７は、Ｂｄｎｆがまた、ＭｅＣＰ２機能障害により引き起こされる神経学的疾患、例えば、レット症候群に罹患している患者全てにおいて強く影響される認識、運動および自律神経機能の制御に関与することを示した（Chahrour, M. and Zoghbi, H.Y. (2007) The story of Rett syndrome: from clinic to neurobiology. Neuron. 56, 422-437 and Greenberg, M.E., Xu, B., Lu, B., Hempstead, B.L. (2009) New insights in the biology of BDNF synthesis and release: implications in CNS function. J. Neurosci. 29, 12764-12767）。
【００１４】
先行技術のなかでも、Ｓｕｎら、２００６は、Ｂｄｎｆの異常発現がＭｅＣＰ２の非存在下で起こる一般的な神経学的機能障害に対する原因であるという仮説を立てた（Sun, Y.E., Wu, H. (2006) The ups and downs of BDNF in Rett syndrome. Neuron. 49, 321-3）。Ｃｈａｎｇら、２００６は、Ｂｄｎｆの過剰発現がＭｅＣＰ２−欠損マウスにおいてインビボで観察される機能障害を改良することができることを見出した（Chang, Q., Khare, G., Dani, V., Nelson, S., Jaenisch, R. (2006) The disease progression of MeCP2 mutant mice is affected by the level of BDNF expression. Neuron. 49, 341-348）。これらのデータは、ＢｄｎｆがＭｅＣＰ２機能障害により引き起こされる神経学的表現型の出現において重要な役割を果たすことができることを示唆する。しかしながら、脳におけるＭｅＣＰ２およびＢＤＮＦのレベル変化間の関連は、不明なままであった。
【発明の概要】
【００１５】
発明の概要
本発明の目的は、ＭＥＣＰ２関連障害処置のための新規アプローチを提供することである。
【００１６】
本発明は、ＭｅＣＰ２タンパク質が軸索ＢＤＮＦおよびＡＰＰ（アミロイドタンパク質前駆体）輸送の制御において新規役割を果たすことを同定したことに基づく。さらに正確には、本発明者らは、ＭｅＣＰ２欠損が軸索に沿ってＢＤＮＦおよびＡＰＰ小胞の速度の喪失を引き起こすことを示した。
【００１７】
これらの研究において見出したことに基づいて、本発明者らは、カルシニューリンインヒビターとして作用することにより、小胞輸送のモジュレーターとして知られる薬理学的分子を使用してニューロン全体の小胞輸送を修飾することを提案する。
【００１８】
本発明は、より多くのＢＤＮＦ小胞を局所的に提供し、軸索ＢＤＮＦ輸送を回復させるために、ＢＤＮＦ脳レベルを増加させる化合物を提供する。
【００１９】
第１の局面にしたがって、本発明は、ＭＥＣＰ２関連障害を処置するためのシスタミンまたはシステアミン、またはそれらの塩の使用に関する。
【００２０】
特定の態様において、該シスタミンまたはシステアミンは、レット症候群、自閉症、広汎性発達障害、非症候性知的障害、特発性新生児脳症および特発性脳性まひから選択されるＭＥＣＰ２関連障害を処置するために使用される。
【００２１】
好ましくは、該ＭＥＣＰ２関連障害はレット症候群である。
【００２２】
該シスタミンまたはシステアミンは、単独で、または別の薬学的に活性な化合物と組み合わせて使用され得る。
【００２３】
第１の局面において、本発明は、ヒト患者におけるＭＥＣＰ２関連障害を処置するためのカルシニューリンインヒビターの使用に関する。
【００２４】
特定の態様において、カルシニューリンインヒビターはマクロライドである。
【００２５】
好ましい態様において、該カルシニューリンインヒビターは、カルシプレシン(calcipressin)（カルシニューリン（ＲＣＡＮ）タンパク質のレギュレーターとも称される）、タクロリムスおよびタクロリムス類似体、シクロスポリンＡおよびシクロスポリンＡ類似体、ＬｘＰＶタンパク質、２，６−ジアリール−置換ピリミジン誘導体およびＦＫ５０６−結合タンパク質からなる群から選択される。
【００２６】
さらに好ましい態様において、該カルシニューリンインヒビターは、カルシプレシン１、カルシプレシン２、カルシプレシン３（ＲＣＡＮ１、２および３とも称される）、タクロリムス（ＦＫ５０６またはＦｕｊｉｍｙｃｉｎｅとも称される）、アスコマイシン、シロリムス、ピメクロリムス、シクロスポリンＡ、ボクロスポリン(voclosporine)（ＩＳＡ２４７とも称される）、ＬｘＰＶｃ１、ＬｘＰＶｃ２、ＬｘＰＶｃ３、６−（３，４−ジクロロ−フェニル）−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルチオ）−２−フェニル−ピリミジン（ＣＮ５８５とも称される）およびＦＫ５０６−結合タンパク質８（ＦＫＮＰ８とも称される）からなる群から選択される。
【００２７】
別の好ましい態様において、該カルシニューリンインヒビターはタクロリムスである。
【００２８】
好ましい態様において、該カルシニューリンインヒビターはシクロスポリンＡである。
【００２９】
本発明のカルシニューリンインヒビターは、レット症候群、自閉症、広汎性発達障害、非症候性知的障害、特発性新生児脳症および特発性脳性まひから選択されるＭＥＣＰ２関連障害を処置するために使用される。
【００３０】
好ましい態様において、該ＭＥＣＰ２関連障害はレット症候群である。
【００３１】
該カルシニューリンインヒビターは、単独で、または別の薬学的に活性な化合物と組み合わせて使用され得る。
【００３２】
さらに、ＭＥＣＰ２関連障害、例えば、レット症候群を処置するための薬物の製造のための、カルシニューリンインヒビターまたはシスタミン、システアミン、またはそれらの塩の使用を記載する。さらに、治療有効量のカルシニューリンインヒビターまたはシスタミン、システアミン、またはそれらの塩を必要とする患者に投与することを含む、ＭＥＣＰ２関連障害を処置するための処置方法を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】このグラフは、Ｍｅｃｐ２−欠損脳において非常に減少したＢＤＮＦ輸送に関与するいくつかの遺伝子の発現を示す。  ＢＤＮＦ輸送に関与する遺伝子のリアルタイム定量ＰＣＲ分析を、Ｐ５５野生型（Ｗｔ、ｎ＝４吻側脳；ｎ＝５  橋または髄質）およびＭｅｃｐ２−欠損マウス（Ｋｏ、ｎ＝４  吻側脳；ｎ＝５  橋または髄質）の吻側脳から単離されたｍＲＮＡに対して行った。Ｂｄｎｆ、Ｈａｐ１、Ｈｔｔ、Ｓｇｋ１、Ｄｃｔｎ１、Ｄｙｎｃ１ｈ１およびＡｈｉ１は全て、Ｂｄｎｆの小胞輸送に関与する機構複合(machinery complex)の一部である。それらの転写産物は全て、重要なことには、Ｍｅｃｐ２−欠損脳において下方調節される。小胞融合および再循環に関与する、ＴｒｋＢ、主なＢｄｎｆ受容体およびＳｙｔ１の発現は、Ｍｅｃｐ２の非存在に影響されない。全ての値は、同じサンプルであるＧａｐｄｈに対して標準化された相対的なｍＲＮＡレベルとして示し、野生型レベルのパーセントとして示す。＊は統計的に有意な差異を示す（ｐ＜０．０５）。
【００３４】
【図２】このグラフは、減少したＭｅｃｐ２−欠損マウスの脳全体でＨａｐ１およびＨｔｔの出生後の発現を示す。マウス脳の３つの領域：吻側脳、橋および延髄におけるハンチンチン−関連タンパク質１（Ｈａｐ１）およびハンチンチン（Ｈｔｔ）ｍＲＮＡの定量化。定量化は、野生型（Ｗｔ、それぞれの年齢でｎ＝４）およびＭｅｃｐ２−欠損マウス（Ｋｏ、それぞれの年齢でｎ＝４）においてＰ３０およびＰ５５で行った。Ｐ３０で、脱制御は観察されなかった。Ｐ５５で、Ｈａｐ１およびＨｔｔ発現は、３つの試験脳領域において強く減少する。全ての値は、同じサンプルでＧａｐｄｈに対して標準化された相対的なｍＲＮＡレベルとして示し、野生型レベルのパーセントとして示す。＊は統計的に有意な差異を示す（ｐ＜０．０５）。
【００３５】
【図３】このグラフは、異常であるＭｅｃｐ２−欠損マウスの線条体および皮質間のＢｄｎｆタンパク質の再区分を示す。Ｂｄｎｆタンパク質は線条体に存在し、皮質から順行性に輸送される。本発明者らは、両方の領域（Ａにおける円）において染色レベルを免疫定量し、線条体および皮質間の比率を計算した（Ｂ）。Ｍｅｃｐ２−欠損脳において、線条体Ｂｄｎｆは皮質Ｂｄｎｆの４５％を示すが、野生型脳において７５％を示す。これは、Ｂｄｎｆの軸索輸送の欠損を示唆する。＊は統計的に有意な差異を示す（ｐ＜０．０５）。
【００３６】
【図４】このグラフは、Ｍｅｃｐ２レベルにより影響されるＢｄｎｆの順行および逆行小胞輸送を示す。  ラット皮質ニューロン培養物を、Ｂｄｎｆ−ｃｈｅｒｒｙ、Ｍｅｃｐ２−発現ベクターまたは空のベクターおよびｓｉ−Ｍｅｃｐ２またはｓｉ−コントロールと電気穿孔し、ガラスカバースリップ上に置いた。インビトロで３日後、Ｂｄｎｆ動態をビデオ顕微鏡により分析し、順行および逆行速度を定量し、４つの条件下でマイクロメーター／分（ｍｍ／分）において示した。＊は統計的に有意な差異を示す（ｐ＜０．０５）。
【００３７】
【図５】このグラフは、Ｍｅｃｐ２レベルにより影響されないＡｐｐ遺伝子発現およびＡｐｐ蛍光強度を示す。本発明者らは、野生型マウスと比較してＭｅｃｐ２欠損の前脳を解剖した。第１に、本発明者らは、リアルタイムＰＣＲによりＡｐｐ  ｍＲＮＡレベルを定量し、有意な変化を見つけられず、第２に、本発明者らは、同じ領域において免疫染色を行い、また有意な変化を見つけられなかった。
【００３８】
【図６】このグラフは、Ｍｅｃｐ２レベルにより影響されるＡｐｐの順行および逆行小胞輸送を示す。  ラット皮質ニューロン培養物を、Ｂｄｎｆ−ｃｈｅｒｒｙ、さらに、空のベクターおよびｓｉ−Ｍｅｃｐ２またはｓｉ−コントロールと電気穿孔し、ガラスカバースリップ上に置いた。インビトロで３日後、Ａｐｐ動態をビデオ顕微鏡により分析し、順行および逆行速度を定量し、４つの条件下でマイクロメーター／分（ｍｍ／分）において示した。＊は統計的に有意な差異を示す（ｐ＜０．０５）。
【００３９】
【図７】図７Ａ。このグラフは、システアミンでの慢性処置がＭｅｃｐ２−欠損マウスの寿命を延長させたことを示す。  Ｍｅｃｐ２−欠損マウスの生存は、水（ビヒクル、ＫＯ  ＶＥＨ）またはシステアミン（ＫＯ  ＣＹＳＴ）で処置された動物において評価した。本発明者らは、システアミン経口処置がＭｅｃｐ２−欠損マウスの生存期間を有意に延長したことを見出した（ビヒクルグループ：６５±２，２日間；システアミン基：７４，８±５，２日間；ｐ＜０．０５、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒログランク検定）。ｎ＝４２  ビヒクル−処置およびｎ＝１７  システアミン−処置Ｍｅｃｐ２−欠損マウス。図７Ｂおよび７Ｃ。これらのグラフは、Ｍｅｃｐ２−欠損マウスの運動能力に対する経口システアミン処置の影響を示す。該グラフは、ビヒクルグループおよびシステアミン処置動物における行動能力を示す（ｎ＝１０  システアミン、ＫＯ  ＣＹＳＴ、ｎ＝１０  ビヒクル、ＫＯ  ＶＥＨ）。図７Ｂ：１５分間のオープンフィールドアリーナ（ａｒｅｎａ）におけるマウスによる総移動距離は、システアミンで処置されたＭｅｃｐ２−欠損マウスにおいて、Ｐ７５から統計的に増加される。図７Ｃ：システアミンで処置されたＭｅｃｐ２−欠損マウスのマウス速度は、Ｐ６５から有意に増加される（＊ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
本発明者らは、ＢＤＮＦ輸送に関与する多くの転写産物がＭｅＣＰ２欠損動物において一貫して脱調節されたことを示した。さらに、本発明者らは、ＭｅＣＰ２欠損動物においてＢＤＮＦ輸送に対する２つの重要な寄与因子のタンパク質（ハンチンチンおよびハンチンチン−関連タンパク質１）のレベルの実質的な減少を見出した。さらに、本発明者らは、ＭｅＣＰ２−欠損軸索におけるＢｄｎｆ含有小胞の速度が変化すること、および表現型がＭｅＣＰ２発現により救済され得ることを観察した。
【００４１】
これらのデータは、ＢＤＮＦ輸送の回復がＭＥＣＰ２関連障害を処置することにおいて有用であることを示す。本発明者らは、今回、ＢＤＮＦ輸送を回復するための２つの方法を示唆する：第１に、シスタミンおよび／またはシステアミンを使用することにより、ＨＳＪ１ｂおよびトランスグルタミナーゼを介してＢＤＮＦレベルを増加させる、第２に、カルシニューリンインヒビターを使用することにより、ニューロン全体で小胞輸送を修飾する。
【００４２】
本発明において、ＭＥＣＰ２関連障害の処置は、治療有効量のシスタミンおよび／またはシステアミンおよび／または治療有効量のカルシニューリンインヒビターの投与を含むことができる。
【００４３】
神経発達および／または神経障害
本発明の文脈において、「対象」または「患者」は、ＭｅＣＰ２と関連する神経発達および／または神経障害を有するあらゆる年齢または性別の哺乳動物、特にヒトを意味する。「具体的に」なる用語は、家畜および一般的な実験哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ラットおよびマウスを含む。好ましくは、処置される患者はヒトであり、子供または若者を含む。
【００４４】
本発明の文脈において、「ＭＥＣＰ２関連障害」は、ＭｅＣＰ２発現欠損、異常または異形および／またはＭｅＣＰ２遺伝子突然変異欠損、異常または異形により引き起こされる神経学的および／または神経発達障害を示す。このような障害の例は、レット症候群、自閉症、広汎性発達障害、非症候性知的障害、特発性新生児脳症および特発性脳性まひを含むが、これらに限定されない。
【００４５】
シスタミンおよびシステアミン化合物
本発明の文脈において、「シスタミン」は、以下の式を有する有機ジスルフィドを示す。
【化１】
2013540789.tif 000002
それらの任意の薬学的に許容される塩、特にジヒドロクロライド塩が使用され得る、
【００４６】
本発明の文脈において、「システアミン」は、以下の式を有する化合物を示す。
【化２】
2013540789.tif 000003
それらの任意の薬学的に許容される塩、ヒドロクロライド塩が使用され得る。
【００４７】
カルシニューリンインヒビター
本発明の文脈において、「カルシニューリンインヒビター」は、カルシニューリン阻害活性を有する化合物を示す。カルシニューリンは、細胞内シグナル伝達に関与するカルシウム／カルモジュリン調節タンパク質ホスファターゼである。好ましくは、本発明のカルシニューリンインヒビターはマクロライドである。本発明のカルシニューリンインヒビターは、カルシプレシン（カルシニューリンのレギュレーター（ＲＣＡＮ）タンパク質とも称される）、タクロリムスおよびタクロリムス類似体、シクロスポリンＡおよびシクロスポリンＡ類似体、ＬｘＰＶタンパク質、２，６−ジアリール−置換ピリミジン誘導体およびＦＫ５０６−結合タンパク質からなる群から選択することができる。例えば、本発明のカルシニューリンインヒビターは、カルシプレシン１、カルシプレシン２、カルシプレシン３（ＲＣＡＮ１、２および３とも称される）、タクロリムス（ＦＫ５０６またはＦｕｊｉｍｙｃｉｎｅとも称される）、アスコマイシン、シロリムス、ピメクロリムス、シクロスポリンＡ、ボクロスポリン（ＩＳＡ２４７とも称される）、ＬｘＰＶｃ１、ＬｘＰＶｃ２、ＬｘＰＶｃ３、６−（３，４−ジクロロ−フェニル）−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルチオ）−２−フェニル−ピリミジン（ＣＮ５８５とも称される）およびＦＫ５０６−結合タンパク質８（ＦＫＮＰ８とも称される）であり得る。
【００４８】
本発明の文脈において、「マクロライド」は、活性がマクロライド環の存在に由来する薬物のグループを示す。マクロライド環は、１つ以上のデオキシ糖、通常、クラジノースおよびデソサミンが結合し得る大型大環状ラクトン環である。ラクトン環は、通常１４−、１５−もしくは１６−員である。
【００４９】
用量
本発明の文脈において、「治療有効量」は、所望の結果を生じるために十分な用量を意味する。一般的に、所望の結果は、ＢＤＮＦまたはＡＰＰ輸送および／または利用性の増加および／または回復である。治療有効量の薬剤は、必ずしも障害を治癒する必要はないが、障害または障害の発症を予防するための処置を改善する。当然、「治療有効量」を構成する量は、化合物、障害およびその重症度、処置される患者の年齢に依存して変化し、知識および本明細書を考慮して当業者により日常的に決定することができる。
【００５０】
例えば、カルシニューリンインヒビターまたはシスタミンまたはシステアミンにおける治療有効量は、約０．０１ｍｇ／Ｋｇ／用量から約１００ｍｇ／Ｋｇ／用量であり得る。好ましくは、治療有効量は、約０．０１ｍｇ／Ｋｇ／用量から約２５ｍｇ／Ｋｇ／用量であり得る。さらに好ましくは、治療有効量は、約０．０１ｍｇ／Ｋｇ／用量から約１０ｍｇ／Ｋｇ／用量であり得る。より好ましくは、治療有効量は、約０．０１ｍｇ／Ｋｇ／用量から約５ｍｇ／Ｋｇ／用量であり得る。したがって、本明細書に記載されている投与単位（例えば、錠剤、カプセル、粉末、注射、坐薬、茶さじ単位型など）あたりに含まれる治療有効量の活性成分は、例えば、７０Ｋｇの平均体重を有する、対象に対して約１ｍｇ／日から約７０００ｍｇ／日であり得る。
【００５１】
本発明の文脈において、「ＢＤＮＦ輸送を増加」または「ＢＤＮＦ輸送を回復」は、脳におけるＢＤＮＦの輸送および／または利用性を増加するあらゆる方法／プロセスを示す。これは、カルシニューリンインヒビターとして作用する小胞輸送のモジュレーターの投与および／またはシスタミンおよび／またはシステアミンの投与を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
医薬組成物
本発明の使用のために、カルシニューリンインヒビター、シスタミンおよびシステアミンは、当分野で知られている方法により製剤化することができる。経口、経直腸、非経口または局所適用のための組成物は、錠剤、カプセル、粒状物、坐薬、注入型、滅菌注射可能な水性もしくは油性溶液、懸濁液もしくはエマルジョン、エアロゾル、軟膏、クリーム、またはゲル、遅延調製もしくは遅延注入の形態で調製することができる。カルシニューリンインヒビター、シスタミンおよびシステアミンもまた、移植可能な投与系または潅流により投与され得る。
【００５３】
投与経路
本発明において、カルシニューリンインヒビター、シスタミンおよびシステアミンまたはそれらの医薬組成物は、慣用の任意の投与経路により投与され得、経口、肺内、腹腔内（ｉｐ）、静脈内（ｉｖ）、筋肉内（ｉｍ）、皮下（ｓｃ）、経皮、経口内、経鼻、舌下、眼内、経直腸および膣内を含むがこれらに限定されない。加えて、神経系への直接的投与は、ポンプデバイスを備えた、または備えていない頭蓋内または脊椎内(intravertebral)針またはカテーテルを介する送達による、限定はしないが、脳内、脳室内、脳室内、髄腔内、嚢内、髄腔内または脊髄周囲投与経路を含む。本明細書に記載されている治療効果を提供する投与のあらゆる用量または頻度が本発明における使用のために適当であることは当業者には容易に明らかである。
【００５４】
さらに、標準医薬方法を使用し、作用期間をコントロールすることができる。これらは当分野でよく知られており、制御放出調製物を含み、適当な高分子、例えばポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミンを含むことができる。
【００５５】
以下の実施例は本発明を説明するが、本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【００５６】
実施例
材料および方法
動物
実験は、Ｓｐｒａｇｕｅ  ｄａｗｌｅｙ  ラットおよびＲＴＴに対するＢ６．１２９Ｐ２（Ｃ）−ＭｅＣＰ２  ｔｍ１−１Ｂｉｒｄ  マウスモデルにおいて行った（Guy, J., Hendrich, B., Holmes, M., Martin, J.E., Bird, A. (2001) A mouse Mecp2-null mutation causes neurological symptoms that mimic Rett syndrome. Nat. Genet. 27, 322-326）。マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおいて維持した。ラットはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅから得た。実験処理は、実験動物のケアおよび使用のためのＥｕｒｏｐｅａｎガイドラインを維持して行った（Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ８６／６００９／ＥＥＣ）。マウス実験のために、半接合変異体オス（ＭｅＣＰ２−／ｙ）を、ヘテロ接合体ノックアウトメスとＣ５７ＢＬ／６オスを交配することにより作製した。遺伝子型決定は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙプロトコールおよび以前に記載されているものにしたがって通常のＰＣＲ技術により行った（Viemari, J.C., Roux, J.C., Tryba, A.K., Saywell, V., Burnet, H., Pena, F., Zanella, S., Bevengut, M., Barthelemy-Requin, M., Herzing, L.B., Moncla, A., Mancini, J., Ramirez, J.M., Villard, L., Hilaire, G. (2005) MeCP2 deficiency disrupts norepinephrine and respiratory systems in mice. J. Neurosci. 25, 11521-11530）。
【００５７】
細胞培養（トランスフェクションｓｉＲＮＡ、発現ベクター）およびビデオ顕微鏡
Ｅ１７ラット胎児の皮質を、以前に記載されているとおりに、解剖し、分離した（Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M.E. (1998) Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95, 55-66）。皮質ニューロンを、供給者のマニュアルにしたがってラット  ニューロン  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）キット（Amaxa, Biosystem, Koeln, Germany）で電気穿孔し、ポリ−ｌ−リシン被覆カバー−スリープ(sleep)（Sigma）上に置いた。使用されるプラスミド：ｐｃＤＮＡ３空のベクター（Invitrogen）、Ｂｄｎｆ−ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｇ．  Ｂａｎｋｅｒからの素晴らしい贈り物（Oregon Health and Science University, Portland, Oregon）、ＭｅＣＰ２発現ベクター、Ｎ．  Ｌａｎｄｓｂｅｒｇｅｒからの素晴らしい贈り物（University of Busto Arsizio）、ＧＦＰ（Amaxa, Biosystem, Koeln, Germany）。使用されるＳｉＲＮＡ：ラット  ＭｅＣＰ２（Sigma）、スクランブルＲＮＡコントロール（Eurogentec）。ニューロン培養物を、Ｂ２７およびＧｌｕｔａｍａｘを補ったＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＧＩＢＣＯ）において維持した。インビトロで３日後、ニューロンをＢｄｎｆ運動アッセイおよび／または免疫蛍光染色のために使用した。運動アッセイのために、ライブビデオ顕微鏡を、以前に列挙されたイメージング系を使用して行った（Gauthier, L.R., Charrin, B.C., Borrell-Pages, M., Dompierre, J.P., Rangone, H., Cordelieres, F.P., De Mey, J., MacDonald, M.E., Lessmann, V., Humbert, S., Saudou, F. (2004) Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138）。細胞を、Ｌｕｄｉｎチャンバーにおいてマウントされたガラスカバースリップ上で増殖させた。顕微鏡およびチャンバーは、３７℃を維持した。０．３μｍのＺ−段階で５−７イメージのスタックを、圧電デバイス（ＰＩ）と結合している１００  Ｘ  ＰｌａｎＡｐｏ  Ｎ．Ａ．  １．４  油浸対物レンズで入手した。イメージは、５０から１５０ｍｓの暴露時間で２  Ｘ  ２  ビニングで合わせた（１スタック／ｓの頻度）Ｍｉｃｒｏｍａｘカメラ（Ｒｏｐｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ｓｔｒｅａｍモードにおいて回収した。全てのスタックを、光学系のＰＳＦを使用する自動バッチ解析により処理した。画像、動画および分析を、ＩｍａｇｅＪ  ソフトウェア（http://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, USA）を使用して作製した。動態を、特別なプラグインと時間の相関関係として細胞中のＧＦＰ小胞の位置を追跡することにより特徴付けた（F.P. Cordelieres, IC, http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html）。追跡中、小胞の中心のデカルト座標を使用して、動態パラメーター（速度、方向性）を計算した。
【００５８】
免疫染色のため、細胞をＰＦＡ  ４％で固定し、標準プロトコールで処理した。使用される抗体：ＭｅＣＰ２（upstate）、チューブリンクローン６−１１Ｂ−１（Sigma）、アセチルチューブリン（Sigma）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５５５に結合させた抗−マウスおよび抗−ウサギ二次抗体を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ（Invitrogen）から購入した。イメージをＬｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡で得て、平均核強度を測定することにより染色強度をＩｍａｇｅＪ  ソフトウェアで分析した（http://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, USA）。
【００５９】
マイクロアレイプロトコールおよび分析
Ｐ５５野生型（ｎ＝３）およびＭｅＣＰ２−欠損（ｎ＝３）マウスを、頸椎脱臼により殺した。延髄を解剖し、即座に−８０℃に置いた。凍結髄質を２ｍｌチューブに液体窒素下に置き、組織を、陶器を使用する粉砕によりホモジェナイズした。全ＲＮＡを、製造業者の指示にしたがってＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を使用して抽出した。ＲＮＡサンプルを、３０分間３７℃で１μｇのＲＮＡに対して０，５単位のＤＮａｓｅ  Ｉ、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ（Qiagen）で処理し、次に、５分間６５℃で酵素不活性化した。ＲＮＡの質および純度を、製造業者の指示にしたがって、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）において分析した。
【００６０】
第１の鎖ｃＤＮＡを、Ｃｙ３またはＣｙ５  ｄＣＴＰのそれぞれの存在下で野生型およびＭｅｃｐ２−欠損脳幹のそれぞれのプール由来の５００ｎｇの全ＲＮＡから調製し、マウス  ６０−ｍｅｒ  オリゴ  マイクロアレイ（Agilent Mouse Development Oligo Microarray 2x22K）にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、Ｃｙ５−ＣＴＰ−標識Ｍｅｃｐ２欠損標的とＣｙ３−ＣＴＰ−標識野生型標的とを比較し、製造業者の指示にしたがってＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（G4121A）を使用して行った。簡潔には、５００ｎｇの処置サンプルｃＲＮＡを５００ｎｇのコントロールｃＲＮＡと混合し、該溶液をフラグメント化（６０℃で３０分）に付し、次に回転オーブン（６５℃、１７時間、１０ＲＰＭ）中でアレイにハイブリダイズした。スライドを取りはずし、製造業者の洗浄バッファーキットの指示にしたがって溶液ＩおよびＩＩで洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ｍｏｄｅｌ  Ｇ２５０５Ｂ（Agilent Technoilogies）でスキャンした。ＬＯＷＥＳＳアルゴリズムを使用して標準化を行い、染色標準化シグナルを使用して、ログ比率を計算した。ネガティブコントロール特性に対するバックグラウンドを＜または＞２ＳＤ超える参照値を有する特性は、欠測値と見なした。本発明者らは、それぞれのプロトコールに対する色素交換を使用して、２つの独立した実験（それぞれの実験においてｎ＝３  Ｋｏおよびｎ＝３  Ｗｔ）において常に脱調節された遺伝子のみを考慮した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）および反復平均化を以前に記載されているとおりに行い（Carter, M.G., Hamatani, T., Sharov, A.A., Carmack, C.E., Qian, Y., Aiba, K., Ko, N.T., Dudekula, D.B., Brzoska, P.M., Hwang, S.S., Ko, M.S. (2003) In situ-synthesized novel microarray optimized for mouse stem cell and early developmental expression profiling. Genome. Res. 13, 1011-1021）、マイクロアレイの有意な分析のために、ｔ−検定アルゴリズムおよびＢｅｎｊａｍｉｎ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を生のデータにおいて適用した。
【００６１】
ＲＮＡ抽出およびＲＮＡ定量化
全ＲＮＡを、Ｐ５５およびＰ３０オールド(old)マウスからの延髄、橋または中脳−後脳サンプルから抽出した。サンプルを２ｍｌチューブに液体窒素下に回収し、組織を、陶器を使用する粉砕によりホモジェナイズした。全ＲＮＡを、製造業者の指示にしたがってＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を使用して抽出した。ＲＮＡサンプルを、３０分間３７℃で１μｇのＲＮＡに対して０，５ＫｕｎｉｔｚのＤＮａｓｅ  Ｉ、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ（Qiagen）で処理し、次に、５分間６５℃で酵素不活性化した。脳橋のＲＮＡサンプルの質および純度を、３０分間３７℃で１μｇのＲＮＡに対して１単位のＤｎａｓｅ  Ｉ（Roche）で処理し、次に、５分間７５℃で酵素不活性化した。５００ｎｇの全ＲＮＡの逆転写を、１２，５ｎｇの  ｄｅ  ｄＮ６、４０ＵのＲｎａｓｅ  インヒビター（Promega）、１０ｍＭのｄＮＴＰおよび２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  逆転写酵素（Invitrogen）を含む２２μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  反応バッファー中で行った。定量ＰＣＲ反応のために、本発明者らはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０システム（Roche）を使用し、本発明者らはＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ  Ｍａｓｔｅｒ  キット（Roche）を選択した。それぞれの反応は、トリプリケートにおける２μｌのｃＤＮＡ（第１の鎖の反応に対して１／２希釈）および２００ｎＭのそれぞれのプライマーにおいて行った。第１に、本発明者らは、マイクロアレイプロトコールにおいて脱調節されると同定された１２個の遺伝子が、リアルタイムＰＣＲを使用して脱調節されるかを確認することを決定した。本発明者らはまた、一対の特異的プライマー転写産物を使用して、Ｂｄｎｆの軸索輸送に関与する主な遺伝子のｍＲＮＡ発現を定量した。内部コントロールとして、Ｇａｐｄｈを、Ｇａｐｄｈに特異的な一対のプライマーを使用するリアルタイム定量ＰＣＲにおいて同じ条件下で測定した。Ｃｔ値は、シグナルが、増幅の指数増殖期間に決定される閾値の関数において、バックグラウンドノイズよりも上になる閾値サイクルである。本発明者らの結果を標準化し、興味ある種々の遺伝子の発現を定量するために、本発明者らは、興味ある遺伝子と内部コントロールとの間のＣｔを比較することにおいてデルタＣｔ（ΔＣｔ）方法を使用した。ΔＣｔ＝Ｃｔ  興味ある遺伝子  −  Ｃｔ  Ｇａｐｄｈ。
【００６２】
免疫染色および免疫定量化
成体（Ｐ５５）オスを致死ペントバルビタール注射（１００ｍｇ  ｋｇ−１  ｉ．ｐ．）で麻酔し、経心的に潅流した（１分間、冷却塩水、次に、１０分間、４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ  ０．１Ｍ）。脳を５時間潅流後、２０％のスクロースを含むＰＢＳ中に一晩置き、−８０℃で凍結した。脳の冠状断面（２０μｍ）を、クライオスタット（Microm, France）を使用して切り、全連続５スライスの１つをスライド上に連続的に配置した。断面を透過処理し（０．１５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、７％標準血清（ウサギ）でブロックし、３．５％の血清、０．１５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。断面を洗浄し、３．５％の標準血清、０．１５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で二次抗体とインキュベートし、再洗浄した。次に、スライドを退色防止剤（Thermo Electron）中に置いた。Ｈａｐ１を、それぞれ、アフィニティー−精製マウスモノクローナル抗体（１：５００、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｈ８９７２０）でプローブした。Ｈｔｔを、アフィニティー−精製マウス抗体（１：１０００、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ  ＨＵ−４Ｃ８−Ａｓ）でプローブした。ヤギ−抗−ウサギ  ａｌｅｘａ  ５４６（１：４００）（Molecular Probes, Eugene Oregon）を二次抗体として使用した。免疫標識されたスライドを、ＣｏｏｌＳＮＡＰカメラ（Princeton, Trenton, NJ, USA)を備えたＬｅｉｃａ  ＤＭＲ  顕微鏡（Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）を使用してデジタル化し、記録した。ＨｔｔまたはＨａｐ１タンパク質を免疫定量するために、たとえ、該方法が絶対値を提供しない場合であっても、本発明者らは、野生型とＭｅＣＰ２−／ｙ組織との間の染色の強度を比較することに非常に伸長であった。本発明者らは、異なる組織を同じ日に全ての以下の工程（固定、凍結、切断、染色）で解剖し、最後に像を同じ条件、溶液、時点で両方のグループの組織を交互に行うことによりスキャンした。光強度のあらゆる変化を回避するために、１日の最初にスキャンされた第１のスライスを、最後に再びスキャンした。カメラ応答の直線性をチェックし、本発明者らは、飽和に達さないために、蛍光強度の最小レベルと最高レベルとの範囲を注意深く選択した。全ての像をグレースケールに変換した。染色のデンシトメトリー分析（輝度）を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈからのＩｍａｇｅＪ  ソフトウェア（http://rsb.info.nih.gov）を適用して行った。光学濃度をＯＤ＝ｌｏｇ１０（２５５／輝度）として計算した。
【００６３】
タンパク質単離およびウェスタンブロット分析．
組織を超音波処理により抽出し、次に、タンパク質を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐｈ＝７，５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＧＴＡ、０，１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および完全プロテアーゼインヒビタータブレット（Roche）を含む溶解バッファー中で単離した。タンパク質濃度を、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）方法により決定した。９６℃で５分間の変性工程後、タンパク質（２０μｇ）を８％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、１００Ｖで１時間、液体電気ブロッティング（Bio-Rad）によりＰＶＤＦ膜（Amersham Pharmacia Biotech）上に移した。室温で１時間ＴＢＳ  Ｔｗｅｅｎ  ０，１％中の５％の無脂肪粉乳で膜をプレインキュベートすることにより、非特異的結合をなし遂げた。Ｈａｐ１（１／５０００  マウス、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｈ８９７２０）、Ｈｔｔ抗体（１／５０００、マウス  Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ  ＨＵ−４Ｃ８−Ａｓ）またはＧＡＰＤＨ（１／５０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に対する一次抗体を、４℃で一晩同じ溶液中で希釈し、４℃で一晩インキュベートした。５％の無脂肪粉乳ＴＢＳ  Ｔｗｅｅｎ  ０，１％で膜の広範囲の洗浄後、適当なペルオキシダーゼ−結合抗体と室温で２時間インキュベートした。結合したペルオキシダーゼ−結合抗体を強化化学発光試薬キット（Supersignal West Femto, Pierce）で示した。フィルムをカメラによりデジタル化し、シグナルを、ＮＩＨからのＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して１６−ビットイメージにて定量した。
【００６４】
Ｍｅｃｐ２−欠損マウスのインビボ  システアミン処置
Ｐ３０から、動物に飲料水中システアミン処置を与えた（２２５ｍｇ／ｋｇ／日）（Sigma-Aldrich; St-Quentin, France）。２日毎に、マウスを計量し、システアミン溶液を新しくし、処置消費をチェックした。飲料水へのシステアミンの付加は、水消費に有意に影響を与えなかった（未処置および処置Ｍｅｃｐ２−欠損マウスに対して４．１±０．２および４．２±０．１ｍｌ／日）。７９匹のＭｅｃｐ２欠損マウスを試験した（寿命試験、ｎ＝１７  システアミン処置  およびｎ＝４２  未処置；運動評価  ｎ＝１０  システアミン処置  およびｎ＝１０  未処置）。マウスを、遺伝子型を理解していない治験担当医により、それぞれの実験グループに割り当てた。オープンフィールド活性を、透明なパースペクスで作られた場（３８ｘ３０ｃｍ）において測定した。該試験期間は、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ  ２．３．１９  追跡システム（Noldus Information Technology）を使用して記録されたデータで１５分存続させた。速度（ｃｍ／ｓ）および動いた全距離（ｃｍ）を記録した。この値よりも短い移動が考慮されないようにできるように、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎに対する速度計算を、動いた最小距離（０．６ｃｍ）に合うインプットフィルターを使用して得た。
【００６５】
統計分析
Ｓｔａｔｖｉｅｗ  ソフトウェア（SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）を統計分析のために使用した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【００６６】
実施例１
ＭｅＣＰ２−欠損マウスの延髄における転写プロファイリングは、ＢＤＮＦ輸送に関与する多くの遺伝子の異常発現を示した
本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイを使用して、対症的  Ｐ５５  ＭｅＣＰ２−欠損（Ｋｏ）（ｎ＝６）および野生型マウス（Ｗｔ）（ｎ＝６）延髄におけるｍＲＮＡ発現パターンを分析した。それぞれのサンプルを独立してハイブリダイズし、色素交換を使用した。本発明者らは、全てのＭｅＣＰ２−欠損サンプルにおいて脱調節された１２個の遺伝子を見出した（表１）。マイクロアレイ結果を確認するために、本発明者らは、新規ＭｅＣＰ２−欠損延髄サンプル（ｎ＝３）を使用し、リアルタイム定量ＰＣＲを使用して転写産物レベルを測定した。１２個の遺伝子のうち１０個の発現が、試験された全てのＭｅＣＰ２−欠損マウスの延髄において脱調節されることを確認した。これらの１０個の遺伝子は、ハンチンチン−関連タンパク質１（Ｈａｐ１）および血清／グルココルチコイド−調節キナーゼ１（Ｓｇｋ１）によるＢｄｎｆのニューロン輸送において積極的な役割を果たすことが知られている２つを含んだ。リアルタイムＰＣＲ実験は、Ｈａｐ１  ｍＲＮＡにおいて３５％減少およびＳｇｋ１  ｍＲＮＡにおいて５５％減少を見出した。Ｈａｐ１は、ハンチンチンタンパク質（Ｈｔｔ）との複合体を形成することができ、該相互作用はＢＤＮＦ輸送に直接的に関与する（Gauthier, L.R., Charrin, B.C., Borrell-Pages, M., Dompierre, J.P., Rangone, H., Cordelieres, F.P., De Mey, J., MacDonald, M.E., Lessmann, V., Humbert, S., Saudou, F. (2004) Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138）。Ｓｇｋ１は、Ｈｔｔをリン酸化、Ｈｔｔ機能を調節することが知られている（Rangone, H., Poizat, G., Troncoso, J., Ross, C.A., MacDonald, M.E., Saudou, F., Humbert, S. (2004) The serum- and glucocorticoid-induced kinase SGK inhibits mutant huntingtin-induced toxicity by phosphorylating serine 421 of huntingtin. Eur. J. Neurosci. 19, 273-279）。本発明者らはまた、タイプ１イノシトール１，４，５−三リン酸塩受容体（Ｉｔｐｒ１）、Ｈａｐ１およびＨｔｔタンパク質を含む複合体との物理的相互作用を介する一般的な軸索輸送プロセスの制御に関与する遺伝子の脱制御を見出した（Tang, T.S., Tu, H., Chan, E.Y., Maximov, A., Wang, Z., Wellington, C.L., Hayden, M.R., Bezprozvanny, I. (2003) Huntingtin and huntingtin -associated protein 1 influence neuronal calcium signaling mediated by inositol-(1,4,5) triphosphate receptor type 1. Neuron. 39, 227-239）。Ｈａｐ１およびＳｇｋ１両方の発現がＭｅＣＰ２−欠損マウスの延髄において減少するが、Ｉｔｐｒ１  ｍＲＮＡレベルは２倍以上である（＋１０９％）。
表１．Ｍｅｃｐ２欠損マウスの延髄における脱調節された遺伝子
【表１】
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【００６７】
実施例２
ＭｅＣＰ２−欠損マウスの脳全体におけるＢＤＮＦ輸送に関与する遺伝子の下方発現
延髄を分析して得られた知見をＭｅｃｐ２−欠損脳の他の領域に拡大することができるかを決定するために、本発明者らは、Ｈａｐ１、Ｓｇｋ１およびＩｔｐｒ１転写産物がＰ５５で脳の異なる領域において異常に発現されるか否かを見るために、新規サンプルを試験した。解剖された脳領域に対してリアルタイム定量ＰＣＲを使用して、本発明者らは、Ｈａｐ１がＭｅＣＰ２−欠損マウスの延髄（−４７％、ｎ＝５）において、また橋（−４２％、ｎ＝４）において、および吻側脳（−４５％、ｎ＝４）において有意に下方調節されることを見出した（図１）。本発明者らは、Ｓｇｋ１が延髄（−５０％、ｎ＝５）において下方調節されることを確認し、橋（−３７％、ｎ＝５）における下方調節を観察した。吻側脳（＋４４％、ｎ＝４）における有意な上方調節を見出した。本発明者らはまた、Ｉｔｐｒ１が延髄（＋１１０％、ｎ＝５）、橋（＋１５０％、ｎ＝５）および吻側脳（＋２２０％、ｎ＝４）において上方調節されることも確認した。本発明者らは、ＭｅＣＰ２−欠損マウスの脳においてＢｄｎｆ  ｍＲＮＡレベルを測定した。本発明者らは、ＢｄｎｆがＭｅＣＰ２−欠損動物の延髄（−４８％、ｎ＝５）、また橋（−５３％、ｎ＝５）および吻側脳（−５１％、ｎ＝４）において下方発現されることを見出した。本発明者らは、Ｂｄｎｆのニューロン輸送に関与することが知られている他の遺伝子：ハンチンチン（Ｈｔｔ）、ダイナクチン１（Ｄｃｔｎ１）、ダイニン細胞質１重鎖１（Ｄｙｎｃ１ｈ１）およびアベルソンヘルパー統合サイト１（Ａｈｉ１）に発現分析を拡大した。該分析のために、本発明者らは、これらの遺伝子の最も高いレベルを含むことが知られているため、吻側脳領域由来のサンプルを使用した（Chan, E.Y., Nasir, J., Gutekunst, C.A., Coleman, S., Maclean, A., Maas, A., Metzler, M., Gertsenstein, M., Ross, C.A., Nagy, A., Hayden, M.R. (2002) Targeted disruption of Huntingtin-associated protein-1 (Hap1) results in postnatal death due to depressed feeding behavior. Hum Mol Genet. 11, 945-959 and Dragatsis, I., Zeitlin, S., Dietrich, P. (2004) Huntingtin-associated protein 1 (Hap1) mutant mice bypassing the early postnatal lethality are neuroanatomically normal and fertile but display growth retardation. Hum Mol Genet. 13, 3115-3125）。本発明者らは、Ｈｔｔ（−７６％、ｎ＝４）、Ｄｃｔｎ１（−６３％、ｎ＝４）、Ｄｙｎｃ１ｈ１（−７３％、ｎ＝４）およびＡｈｉ１（−６５％、ｎ＝４）のｍＲＮＡレベルがＭｅｃｐ２−欠損脳において非常に減少したことを見出した。
【００６８】
実施例３
ＭｅＣＰ２の非存在は、脳全体でＨｔｔおよびＨａｐ１の出生後の段階的な下方発現を引き起こす
ＭｅＣＰ２−欠損マウスは、運動および認識機能障害を徐々に発症する１月齢まで、正常である（Guy, J., Hendrich, B., Holmes, M., Martin, J.E., Bird, A. (2001) A mouse Mecp2-null mutation causes neurological symptoms that mimic Rett syndrome. Nat. Genet. 27, 322-326）。本発明者らは、ＭｅＣＰ２−欠損マウスにおいて観察される進行性の神経学的機能障害が、進行性の出生後のＨａｐ１およびＨｔｔ発現の変化により引き起こされ得、同様に、ＢＤＮＦ輸送の進行性の変化および関連神経学的異常を誘導するという仮説を立てた。本発明者らは、第１の表現型発現の現れるまえに、Ｐ３０で回収した新規Ｍｅｃｐ２−欠損脳サンプル（実験およびコントロールグループの両方においてｎ＝４）を使用した。リアルタイム定量ＰＣＲを使用して、本発明者らは、延髄、橋および吻側脳におけるＨａｐ１およびＨｔｔ  ｍＲＮＡレベルを測定し、Ｈａｐ１およびＨｔｔ発現がＭｅＣＰ２−欠損動物においてＰ３０で影響を与えなかったことを見出した（図２）。Ｐ５５（ｎ＝４）で行われた同じ実験で、全ての３つの領域におけるＨｔｔおよびＨａｐ１の発現の顕著な減少を見出し、表現型発現の出生後の進行を示した（図２）。
【００６９】
実施例４
Ｍｅｃｐ２−欠損脳におけるＨｔｔおよびＨａｐ１タンパク質のレベルの減少
Ｍｅｃｐ２−欠損脳において測定される異常ｍＲＮＡレベルが異常タンパク質レベルと関連するか否かを決定するために、本発明者らは免疫組織蛍光を使用して新規脳サンプル（ｎ＝４）におけるＨｔｔおよびＨａｐ１タンパク質を定量し、染色が、Ｍｅｃｐ２−欠損脳の異なる部分における両方のタンパク質の非常に低いレベルを示した。免疫定量化は、両方のタンパク質が特に豊富であるという理由のために注意深く選択されたいくつかの脳領域において行った（Fujinaga, R., Kawano, J., Matsuzaki, Y., Kamei, K., Yanai, A., Sheng, Z., Tanaka, M., Nakahama, K., Nagano, M., Shinoda, K. (2004) Neuroanatomical distribution of Huntingtin-associated protein 1-mRNA in the male mouse brain. J. Comp. Neurol. 478, 88-109 and Kotliarova, S., Jana, N.R., Sakamoto, N., Kurosawa, M., Miyazaki, H., Nekooki, M., Doi, H., Machida, Y., Wong, H.K., Suzuki, T., Uchikawa, C., Kotliarov, Y., Uchida, K., Nagao, Y., Nagaoka, U., Tamaoka, A., Oyanagi, K., Oyama, F., Nukina, N. (2005) Decreased expression of hypothalamic neuropeptides in Huntington disease transgenic mice with expanded polyglutamine-EGFP fluorescent aggregates. J. Neurochem. 93, 641-653 and Sheng, G., Chang, G.Q., Lin, J.Y., Yu, Z.X., Fang, Z.H., Rong, J., Lipton, S.A., Li, S.H., Tong, G., Leibowitz, S.F., Li, X.J. (2006) Hypothalamic huntingtin-associated protein 1 as a mediator of feeding behavior. Nat. Med. 12, 526-533）。Ｈａｐ１タンパク質レベルは、視床下部（−３７％）、延髄に位置する孤束核（−５３％）、中脳腹側領域（−３５％）および青斑核および橋（−２７％）において有意に減少したことを見出した。Ｈｔｔタンパク質レベルは、視床下部（−３２％）および海馬（−５６％）において有意に減少した。これらの結果を確認するために、本発明者らは、さらなるＭｅＣＰ２−欠損（ｎ＝３）および野生型（ｎ＝４）マウスから興味ある脳領域を顕微解剖し、全タンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロット結果の定量化は、ＭｅＣＰ２−欠損マウスの中脳腹側領域においてＨａｐ１ａ（−７６％）およびＨａｐ１ｂアイソフォーム（−７７％）の低レベルを示した。明らかにＨａｐ１ｂアイソフォームが減少する傾向（−７６％）があったが、高い個体間の可変性のため、視床下部における統計的に有意な差異を見つけることができなかった。皮質において、Ｈａｐ１ａアイソフォームは５１％まで減少した。１つの予期されずに見出したことは、Ｈａｐ１ｂアイソフォームがＭｅＣＰ２−欠損マウスの皮質に全く存在しなかったことであった。Ｈｔｔタンパク質レベルの減少は、皮質（−６８％）、腹側中脳ドーパミン領域（−５５％）および橋（−４２％）において報告された。これらの結果は、ＭｅＣＰ２欠損がマウス脳全体でＨｔｔおよびＨａｐ１タンパク質レベルの全体的な減少を引き起こすことを示す。
【００７０】
実施例５
ＭｅＣＰ２−欠損マウスにおける線条体および皮質間の異常Ｂｄｎｆタンパク質分配
ＭｅＣＰ２−欠損マウスの脳におけるＢｄｎｆ輸送の変化を見出した後、本発明者らは、Ｂｄｎｆ輸送がＭｅＣＰ２−欠損マウスの脳において変化するか否かを決定するためにｉｎ  ｓｉｔｕで研究を続けた。実質的には線条体細胞においてＢｄｎｆ  ｍＲＮＡが存在しないけれども、Ｂｄｎｆが線条体ニューロンの成熟および代謝において重要な役割を果たすことが確立している（Altar, C.A., Cai, N., Bliven, T., Juhasz, M., Conner, J.M., Acheson, A.L., Lindsay, R.M., Wiegand, S.J. (1997) Auterograde transport of brain-derived neurotrophic factor and its role in the brain. Nature., 389,  856-60 and Altar, C.A., DiStefano, P.S. (1998) Neurotrophin trafficking by anterograde transport. Trends Neurosci. 21, 433-437）。Ｂｄｎｆタンパク質は、線条体の外側に移動させられ、脳のこの領域に順行性メカニズムにより能動的に輸送される。したがって、本発明者らは、翻訳部位（皮質）および標的部位（線条体）のＢｄｎｆ染色を定量し、ＭｅＣＰ２の非存在下で、Ｂｄｎｆ染色レベルが皮質（−３０％）および線条体（−４４％）において減少したことを見出した。野生型動物において、線条体Ｂｄｎｆは、皮質におけるＢｄｎｆの７１％を占める。ＭｅＣＰ２−欠損動物において、線条体Ｂｄｎｆは、皮質Ｂｄｎｆの４５％を占め、ＭｅＣＰ２が存在しないとき、Ｂｄｎｆの輸送がインビボにて変化することを示す（図３Ｂ）。
【００７１】
実施例６
ＭｅＣＰ２サイレンシングはＢｄｎｆ小胞の速度を変化する
ラットでの実験は、ＭｅＣＰ２の修飾がインビボでＢｄｎｆ輸送を変化するか否かを決定するために行った。本発明者らは、ＭｅＣＰ２を過小または過剰発現するラット皮質ニューロンにおいてＢｄｎｆ−ｃｈｅｒｒｙ動態をモニタリングした。ラット皮質ニューロンを、不活性化ＭｅＣＰ２  ｓｉＲＮＡ、コントロールスクランブルＲＮＡ、ＭｅＣＰ２−発現ベクターまたは空のベクターと電気穿孔した。培養３日後、Ｍｅｃｐ２レベルを免疫蛍光により評価し、ＭｅＣＰ２シグナルの核強度を定量した。並行して、本発明者らは、高速ビデオ顕微鏡により、ＭｅＣＰ２サイレンシングの効果およびＢｄｎｆ−ｃｈｅｒｒｙ含有小胞の動態における過剰発現を分析した。ＭｅＣＰ２  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、予期されるとおり、Ｍｅｃｐ２レベルにおける減少を引き起こした（−３３．１％）。さらに興味深いことに、ＭｅＣＰ２サイレンシングは、Ｂｄｎｆ−ｃｈｅｒｒｙ含有小胞の順行性（−２０．６％）および逆行（−１７．９％）速度の両方における減少を引き起こした（図４）。ＭｅＣＰ２−発現ベクター単独のトランスフェクションは、Ｂｄｎｆ−ｃｈｅｒｒｙ含有小胞の順行性速度のみにおける減少を引き起こした（−２１．４％）（図４）。ｓｉＲＮＡアプローチの特異性を確認するために、本発明者らは、レスキュー実験においてＭｅＣＰ２  ｓｉＲＮＡおよびＭｅＣＰ２−発現ベクターを共トランスフェクトし、ＭｅＣＰ２タンパク質を発現するプラスミドがトランスフェクションされると、Ｂｄｎｆ−ｃｈｅｒｒｙ含有小胞の速度がコントロールレベルに完全に回復することを見出した（図４）。ＢＤＮＦ輸送の変化が微小管安定化の修飾により間接的に引き起こされ得るか否かを見るために、本発明者らは、チューブリンおよびアセチル化チューブリンを有する微小管を染色し、それらの構造を観察した。本発明者らは、Ｍｅｃｐ２レベルが修飾されるとき、微小管構築に対する影響を何ら示すことができなかった。さらに、本発明者らは、細胞質ＧＦＰとの共エレクトロポレーションにより示されるとおり、ＭｅＣＰ２の過小または過剰発現がトランスフェクトされたニューロンの総体の形態を変化させることを見出すことができなかった。
【００７２】
実施例７
ＭｅＣＰ２サイレンシングはＡｐｐ小胞の速度を変化する
本発明者らは、アミロイド前駆体タンパク質（Ａｐｐ）−ＹＦＰ含有小胞を使用して実施例６のインビボ輸送実験を繰り返した。本発明者らは、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで何ら脱制御が見られなかった、さらに、Ａｐｐ輸送は強くＨｔｔ／Ｈａｐ１−依存性である（McGuireet al, 2006 J. Biol. Chem. 281; Colin, E.ら 2008 EMBO J. 27)ため、Ａｐｐが直接のＭｅｃｐ２標的ではないことを示した（図５）。これらの結果は、Ｍｅｃｐ２のサイレンシングによるインビボＡｐｐ輸送の脱制御を明白に示した（図６）。
【００７３】
実施例８
ＦＫ５０６（タクロリムス）および／またはシスタミンのインビボ投与
ＦＫ５０６および／またはシスタミンが、毎日、慢性的にＭｅＣＰ２−欠損マウスに提供される。何らかの改良があるか否かを決定するために、運動および呼吸評価を異なる発達段階で行う。
−システアミン処置は、Ｍｅｃｐ２−欠損マウスにおける寿命および運動欠損を改善する：
本発明者らは、システアミン経口処置がＭｅｃｐ２−欠損マウスの生存期間を有意に延長することを見出した（ビヒクルグループ：６５±２，２日間；システアミン基：７４，８±５，２日間；ｐ＜０．０５、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ  ログランク検定）（図７Ａ）。したがって、本発明者らは、オープンフィールドアリーナを使用して移動における該処置の影響を評価した（図７Ｂ−Ｃ）。システアミン処置は、総移動距離および速度（とりわけ後期）の両方における統計的改良により示されるとおり、Ｍｅｃｐ２−欠損マウスにおける移動を有意に改善した。システアミン処置は、進行的であり、これらの症状の著しい増加を示すプラセボグループと比較して運動症状の悪化を遅延することに強く効いた。結果として、システアミン処置グループおよびプラセボグループ間の違いは、進行的に増加し、後期の総距離（Ｐ５５：＋３％、Ｐ６５：＋４０％；Ｐ７５：＋１２８％、Ｐ８５：＋４８５％、ｐ＜０．０５）および速度（Ｐ５５：＋１８％、Ｐ６５：＋３３％；Ｐ７５：＋６５％、Ｐ８５：＋７４％、ｐ＜０．０５）の両方において特に明らかであった。これらの結果は、システアミンの慢性投与が、随意運動行動を評価するパラダイムにおいてＭｅｃｐ２−欠損マウスの行動を改善することができることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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