(57)【要約】本発明は、核酸、好ましくはゲノムＤＮＡを、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、単離および精製するためのクロマトグラフィーデバイス、このデバイスおよびこのデバイスを含むキットを用いて、核酸、好ましくはゲノムＤＮＡを単離および精製するための方法に関する。本発明の目的は、処理された生物学的サンプルから、好ましくは細胞含有生物学的サンプルから得られた溶解産物から、核酸を単離および精製するためのデバイスおよび方法であって、ここで夾雑物質（例えば、タンパク質、特にヌクレアーゼ、および他の細胞構成要素）から精製された核酸を単離するのに必要とされるステップの数は、公知の方法と比較して低減されており、その一方、さらに、ＰＣＲのような技術による直接的なその後の分析に適した、高品質の核酸を保証する、デバイスおよび方法を提供することである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
好ましくはＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡを含む核酸を、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、夾雑物質から単離および精製するためのクロマトグラフィーデバイスであって、該デバイスは、少なくとも１つのクロマトグラフィーユニットを含み、該ユニットは、
１．入り口（２）および出口（３）を有する中空本体（１）であって、好ましくはゲルベッドを形成する、固体マトリックス（４）を含む、中空本体（１）、
２．好ましくは任意のサイズの核酸が通るのを可能にし、該固体マトリックス（４）を該クロマトグラフィーユニット内に保持するように、該出口（３）と該固体マトリックス（４）との間に置かれる有孔のフリット、フィルター、フリース、または膜（５）、
３．好ましくは非有孔の環（６）であって、該有孔のフリット、フィルター、フリース、または膜（５）と該マトリックス（４）との間に置かれて、該フリット、フィルター、フリース、または膜（５）の外側領域を塞いで、移動相が該マトリックス（４）を通ることなく該フリット（５）に入ることを防ぐ、非有孔の環（６）、
４．必要に応じて、該クロマトグラフィーユニットの該入り口（２）および／または出口（３）を塞ぐための少なくとも１つの取り外し可能な閉鎖デバイス（７）、および
５．必要に応じて、該マトリックス（４）を通過後の該移動相（溶出液）を収集するための少なくとも１つの収集管を含み、
ここで該固体マトリックスは、１５０ｂｐ〜５００ｂｐ、好ましくは２００ｂｐ〜４００ｂｐ、および最も好ましくは２５０ｂｐ〜３００ｂｐのサイズ排除限界を有するゲル形成ポリマーである、
デバイス。
【請求項２】
前記ゲル形成ポリマーが、デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、またはそれらの混合物の群から選択され、好ましくは、デキストランとポリアクリルアミドとの混合物である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記取り外し可能な閉鎖デバイスが、ふた用ホイル、シール、およびブレークアウェイ末端を含む群から選択される使い捨ての閉鎖デバイス、またはスクリューキャップ、およびスナップオンキャップを含む群から選択される再閉鎖可能な閉鎖デバイスである、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記クロマトグラフィーユニットの前記入り口および前記出口は、取り外し可能な閉鎖デバイスで塞がれ、前記固体マトリックスは、水、有機溶媒と水との均一混合物、または水性バッファーを含む群から選択される溶媒中で前もって膨張させた、ゲルの形態で供給され、ここで該溶媒は、使用直前に該クロマトグラフィーユニットからパージされ、遠心分離によって該マトリックス（ベッド）が確立される（前もって回転させるステップ）、請求項１〜３のいずれかに記載のデバイス。
【請求項５】
好ましくはマルチウェルプレートの形態での、並行様式の複数のクロマトグラフィーユニットを含み、ここで該マルチウェルプレートの各ウェルは、１つの別個のクロマトグラフィーユニットを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のデバイスを用いる、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、好ましくはＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡを含む核酸を精製するための方法であって、該方法は、
１．精製されるべき核酸を含むサンプルを提供するステップであって、ここで該サンプルは、溶液の形態、または液体溶離剤、好ましくは水性溶離剤中の懸濁物の形態である、ステップ、
２．該クロマトグラフィーユニット中のマトリックスを、好ましくは遠心分離によって確立するステップ（前もって回転させるステップ）、
３．該サンプルを、該マトリックスの上部表面にのせるステップ、
４．好ましくは、遠心分離によって該クロマトグラフィーユニットから該核酸を溶出し、同時に溶出液を収集するステップ、
を含む、方法。
【請求項７】
前記サンプルが、新鮮および凍結された組織、血液、他の体液、およびグラム陰性細菌からなる群から選択される、生物学的サンプルから、好ましくは、細胞含有生物学的サンプルから得られる溶解産物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記前もって回転させるステップが、５００〜９００×ｇで１分間〜７分間、好ましくは７００×ｇで２分間〜５分間、および最も好ましくは７００×ｇで３分間、前記デバイスを遠心分離することによって実施される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
１つのクロマトグラフィーユニット当たりのマトリックスベッドの体積が、１００μＬ〜２ｍＬの範囲、好ましくは５００μＬ〜１ｍＬの範囲、および最も好ましくは８００μＬである、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
６００μＬ〜８００μＬのマトリックスベッド当たりの前記サンプル体積が、１０μＬ〜１００μＬの範囲にある、請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記クロマトグラフィーユニットから前記核酸を溶出する前記ステップは、５００〜９００×ｇで１分間〜７分間、好ましくは７００×ｇで２分間〜５分間、および最も好ましくは７００×ｇで３分間、前記デバイスを遠心分離することによって実施される、請求項６〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが、先行する溶解手順によって得られる細胞含有生物学的サンプルの溶解産物であり、該溶解手順が、
１．該細胞含有サンプルを溶解バッファーと混合するステップ、
２．混合物をインキュベートして、少なくともＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質を含む溶解産物を得るステップ、
３．必要に応じて、該溶解産物に含まれる該ＲＮＡを崩壊させるステップ、
４．必要に応じて、ＤＮＡ以外の溶質を選択的に沈殿させるステップ、
を含む、請求項６〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
核酸、好ましくはゲノムＤＮＡの単離および精製のためのキットであって、該キットは、
１．請求項１〜５のいずれかに記載のデバイス、
ならびに
２．溶解バッファー、
３．アルカリ金属の一価イオンおよび／またはアルカリ土類金属の二価イオンの供給源、および
４．１つまたはそれより多くの標的核酸の直接増幅のためのプライマー
を含む群から選択される、１つまたはそれより多くの成分を含む、
キット。
【請求項１４】
ゲノムＤＮＡの単離および精製のための、請求項１〜６のいずれかに記載のクロマトグラフィーデバイスの使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
高品質の核酸の単離は、例えば、分子診断の分野において使用される、現代分子生物学における多くの異なる技術（例えば、ＰＣＲ増幅、ブロッティング分析、およびゲノムライブラリー構築）に必須である。特に、核酸が細胞材料を含む生物学的サンプルから得られる場合、それらを、これらの後の適用（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）において使用される制限酵素、リガーゼ、および／または耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに他の方法で干渉し得るタンパク質、脂質、および他の細胞構成要素のような夾雑物質から分離することが必要である。さらに、生物学的サンプルに存在する、ＲＮＡヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）および特にＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）は、ＤＮＡの分解を防ぐために除去されなければならない。
【０００２】
種々の異なる方法が、細胞成分を含む生物学的サンプルからゲノムＤＮＡを単離するために開発されている。これらの方法の全ては、細胞膜を壊して、その内容物を溶液に放出ことによる、出発材料を破壊し、溶解させるステップを含む。得られた溶液は溶解産物と呼ばれる。以下のステップにおいて、タンパク質、特にヌクレアーゼ、ならびに他の夾雑物質は、上記溶解産物から除去され、最終的に（多かれ少なかれ）精製されたＤＮＡは、回収されなければならない（概要は「ゲノムＤＮＡの精製」についてのＱＩＡＧＥＮ小冊子において見出すことができる）。ＤＮＡを精製するステップは、夾雑物質（例えば、塩、洗剤、有機溶媒、特にフェノールおよびエタノール）の繰越し汚染がしばしば後の適用におけるＤＮＡのパフォーマンス（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を阻害するので、最も重要である。
【０００３】
細胞溶解産物からゲノムＤＮＡを単離するための非常にシンプルで迅速な技術は、上記細胞溶解産物を高温で（例えば、９０℃で）、約２０分間インキュベートすること、または追加のプロテアーゼ消化後に上記溶解産物を直接使用することである。しかし、これらの溶解産物は、通常、酵素を阻害する夾雑物質（例えば、高塩負荷）を含み、従って、これらの方法は、間に合わせの（ｑｕｉｃｋ  ａｎｄ  ｄｉｒｔｙ）技術と見なされ、これらは限られた範囲の適用にのみ適している。
【０００４】
いわゆる、塩析方法であって、ここでタンパク質および他の夾雑物質が、高濃度の塩（例えば、酢酸カリウム、または酢酸アンモニウム）を含む溶液を加えることによって、粗製細胞溶解産物から沈殿する、塩析方法は、細胞溶解産物に存在する他の細胞成分からＤＮＡを分離するための周知の技術である。形成される沈殿物は、次に、遠心分離によってＤＮＡを含む溶液から除去され、そのＤＮＡは、さらなるステップにおいて、アルコールでの沈殿によって上清から回収される。これらの方法において、タンパク質、特にヌクレアーゼ、および他の夾雑物質の除去は、非常に効率が悪いことが多く、追加のＲＮアーゼ処理、透析および／またはアルコールによる繰り返しの沈殿が、後の適用において使用されるのに十分純粋なＤＮＡを得るために必要であり、このことは、その方法を冗長で時間のかかるものにする。
【０００５】
細胞溶解産物に存在する他の化合物からＤＮＡを分離する別の可能性は、有機溶媒を用いて上記溶解産物から夾雑物質を抽出するというものである。第一のステップにおいて、細胞は、代表的に、洗剤を用いて溶解され、その溶解産物は、次に、溶媒（例えば、フェノール、クロロホルム、およびイソアミルアルコール）を用いて抽出されて、夾雑物質が除去される。使用する溶媒の毒性は、これらの方法の１つの欠点である。さらに、夾雑物質の大部分が有機相に抽出され、他方、ＤＮＡは、水相内に残っていることを確実にするために、ｐＨおよび塩濃度に特別の注意を払わなければならない。そのＤＮＡを次に、アルコール沈殿によって、水相から回収する。有機抽出方法は、非常に時間がかかるものであるが、これらの方法を用いて単離されるＤＮＡは、しばしば残留のフェノールおよび／またはクロロホルムを含み、それらは、後の適用（例えば、ＰＣＲ）において阻害剤として働く。さらに、有害（ｈａｚａｒｄｏｕｓ）廃棄物ガイドラインに従って処理されなければならない毒性の廃棄物が生成する。
【０００６】
近年、イオン交換、親和性、および／または疎水性相互作用に基づく収着手順が、精製の間にＤＮＡ分解を最小限にするために開発されている。これらの収着手順において、ＤＮＡは、ＤＮＡと固相との間の特異的な相互作用に起因して、樹脂またはマトリックスを含む固定固相（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ）に、多かれ少なかれ特異的に「収着」され（すなわち、吸着、吸収、または化学結合されるかのいずれか）、他方、夾雑物質は、ＤＮＡが相互作用するのと同じ程度、固相と相互作用せず、従って、収着されたＤＮＡから、例えば、洗浄ステップによって分離され得る。一旦夾雑物質が除去されると、ＤＮＡは、通常、固相とＤＮＡとの間の相互作用を最小限にする化合物を含む溶液（移動相）で固相をすすぎ、従って、固相からＤＮＡを除くステップを含む溶出ステップによって、固相から回収されなければならない。ＤＮＡ（溶出液）を含む移動相は、次に収集される。これらの固相ベースの方法は、ＤＮＡ単離および精製のプロセスの自動化を可能にする。さらに、幾分微量なＤＮＡも、これらの方法を用いて、確かに処理され得る。
【０００７】
陰イオン交換方法は、核酸の負に荷電したリン酸と陰イオン交換キャリア上の正に荷電した表面分子との間の相互作用に基づく（非特許文献１）。溶液中に存在するＤＮＡは、低塩条件下で選択的に固定相に結合し、不純物（例えば、ＲＮＡ、細胞タンパク質、および代謝産物）は、中程度の塩バッファー（ｍｅｄｉｕｍ−ｓａｌｔ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて固定相から洗い流され得る。次のステップにおいて、ＤＮＡは、高濃度の塩を含むバッファーを用いて、固定相から溶出され得る。精製されたＤＮＡは、次に、アルコール沈殿によって、その溶出液から回収される。
【０００８】
シリカベースの方法において、核酸は、高濃度のカオトロピック塩の存在下で選択的にシリカゲル膜に収着される（非特許文献２）。ＲＮＡ、細胞タンパク質、および代謝産物は、上記膜から洗い流され、次にＤＮＡは、低塩バッファーを用いて、上記シリカゲル膜から溶出される。
【０００９】
また、ＤＮＡと固定相としての磁性粒子との間の相互作用に基づく固相方法は、当該分野において公知である（非特許文献３）。
【００１０】
収着方法は、高品質のＤＮＡの単離を可能にするが、これらの「結合−洗浄−溶出」の所定の順序において実施されるべきステップの数は、依然として比較的多く、従って時間のかかるものである。
【００１１】
この理由のため、好ましくはＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡを含む精製された核酸を、処理された生物学的サンプル（例えば、生物学的サンプルから得られる溶解産物（例えば、溶解された組織および血液サンプル）から単離する方法の必要性が存在し、ここで上記精製された核酸を得るためのステップの数は、公知の収着手順（例えば、陰イオン交換およびシリカベースの方法）と比較して、得られる核酸の純度を損ねることなく低減される。このような方法は、使用者が上記核酸を夾雑物質（例えば、タンパク質、特にヌクレアーゼ、脂質、および他の細胞構成要素など）から単離および精製することができるようにすべきである。他方、上記方法は、別の方法で、精製の進行の間に大きなゲノムＤＮＡを断片にする（ｆｒａｇｍｅｎｔ）、核酸の化学的分解または酵素による分解、および機械的せん断応力を最小限にするのに十分に温和である（ｇｅｎｔｌｅ）べきである。さらに、上記方法は、異なる起源の多種多様な生物学的サンプルを適応させることができるべきである。
【００１２】
処理された生物学的サンプルから、特に細胞含有生物学的サンプルから得られた溶解産物から、核酸を単離および精製するための公知の方法の詳細な分析により、これらの方法の全てが、単離および精製の全手順の間に核酸が溶液に残らないという事実に苦しんでいることが明らかになった。代わりに、核酸を沈殿させなければならないか、または単離／精製手順の過程で固体マトリックス上に結合、吸着もしくは吸収させなければならないかのいずれかである。結果として、沈殿物から核酸を再溶解する追加のステップ、または固相からそれを溶出する追加のステップが必要であり、それは上で言及した方法の全てを多かれ少なかれ時間のかかるものにする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｆｏｒｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  ２００５，１０６５（１），１１５−１２０
【非特許文献２】Ｈａｎｓｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｇ  Ｍｅｄ（Ｔｏｋｙｏ）２００３，５  Ｓｕｐｐ．１，Ｓ１４５−Ｓ１４９
【非特許文献３】Ｐｒｏｄｅｌａｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  ２００４，１０５６，４３−４８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、本発明の目的は、処理された生物学的サンプルから、好ましくは細胞含有生物学的サンプルから得られた溶解産物から、核酸を単離および精製するためのデバイスおよび方法であって、ここで夾雑物質（例えば、タンパク質、特にヌクレアーゼ、および他の細胞構成要素）から精製された核酸を単離するのに必要とされるステップの数は、公知の方法と比較して低減されており、その一方、さらに、ＰＣＲのような技術による直接的なその後の分析に適した、高品質の核酸を保証する、デバイスおよび方法を提供することである。
【００１５】
好ましくはＤＮＡおよび特にさらに高品質のゲノムＤＮＡを含む高品質の核酸は、本発明のデバイスおよび方法を用いて、すばやく得られ得ることが、今や驚くべきことに見出されており、そのことは下に詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明に従うクロマトグラフィーデバイスの好ましい実施形態を示す。図１ａは、側面図として上記デバイスを示し、図１ｂは、上部側からの図を示す。
【図２】図２は、アルカリ土類金属の二価金属イオン、およびドデシル硫酸イオンから形成された上記沈殿物を除去するために異なる手順を用いた後の、溶液に存在するＳＤＳの残留量を示す（実施例１を参照のこと）。大過剰の沈殿溶液を用いる利益を見つけることはできない（５０μＬ対２５μＬ）が、濾過ステップ（ｆｉｌｔ）は、上記沈殿物を除去することにおいて、遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆ）よりも常に明確に有効である。上記サンプルを、氷浴（Ｉｃｅ）で１０分間インキュベートして、次に濾過する場合に、最高の結果が得られた。
【図３】図３は、沈殿溶液で前に処理した１０ｍｇのブタの肝臓組織の溶解産物を、ＭｉｎｉＳａｒｔフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、シリカフリット（ｓｉｌｉｃａ  ｆｒｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、シリカ粒子のベッド（ＱｉａＥｘＩＩ，ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはＱＩＡ−ｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通したシンプルな濾過と比較して、異なるゲル濾過樹脂を用いて精製した結果を示す。ｇＤＮＡの量（μｇ）、その溶出液に存在するＳＤＳの量（μｍｏｌ／Ｌ）、および水での希釈後の上記溶出液の伝導度（２０℃の参照温度で、μＳ）に与える精製方法の効果は、実施例２に記載されるように決定された。
【図４】図４は、実施例２に従う、異なるサイズ排除限界（Ｓ２００、Ｓ４００、Ｓ５００、およびＳ１０００）の市販のＳｅｐｈａｃｒｙｌ樹脂による夾雑物質除去の程度を示す。
【図５】図５は、粗製ブタ肝臓組織溶解産物（レーン１）のＰＡＧＥ分析、「沈殿した」粗製ブタ肝臓組織溶解産物（レーン２）、ＱＩＡａｍｐ溶解キットおよびＲＮアーゼを用いてブタ肝臓組織から得られた溶解産物（レーン３）、ＲＮアーゼを加えることなくＱＩＡａｍｐ溶解キットを用いることによってブタ肝臓組織から得られた溶解産物（レーン４）、ＱＩＡＧＥＮプロテアーゼ（レーン５）、ＲＮアーゼＡ（レーン６）、ならびにＱＩＡａｍｐキットを用いて得られた溶出液（レーン１０および１１）と比較して本発明に従って精製された溶出液（レーン７〜９）の、実施例３に従って得られたものとしての結果を示す。レーンＬにおいて、タンパク質標準を分析する。
【図６】図６は、実施例４に従う、ＲＮアーゼを加えることなく得られた２００μＬの粗製ブタ肝臓溶解産物のＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。さらに、ＨＰＬＣの実施（ｒｕｎ）から収集された異なる画分のアガロースゲル分析が示される。
【図７】図７は、ａ）本発明の方法、およびｂ）ＱＩＡａｍｐキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のいずれかを用いて精製した１０ｍｇの新鮮なブタ肝臓のサンプルの溶出液から得られたＨＰＬＣプロフィールの比較を示す（実施例４を参照のこと）。残留夾雑物質の量は、両方のサンプルにおいて同等であるが、本発明の方法によって得られたｇＤＮＡの収量は、較正曲線を用いて決定されるように、ほとんど５０％より高い（９．２μｇ対６．２μｇ）。
【図８ａ】図８は、それぞれ、本発明の方法を用いて（上のスペクトル、図８ａ）、およびＱＩＡａｍｐキットを用いて（下のスペクトル、図８ｂ）、１０ｍｇのブタ肝臓組織を溶解および精製することによって得られるｇＤＮＡ溶出液のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを示す（実施例５を参照のこと）。
【図８ｂ】図８は、それぞれ、本発明の方法を用いて（上のスペクトル、図８ａ）、およびＱＩＡａｍｐキットを用いて（下のスペクトル、図８ｂ）、１０ｍｇのブタ肝臓組織を溶解および精製することによって得られるｇＤＮＡ溶出液のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを示す（実施例５を参照のこと）。
【図９】図９は、本発明の方法を用いて、ラットの尾から単離および精製したサンプルの阻害研究（ｊｕｎアッセイ）を示す（実施例６を参照のこと）。上記サンプルに存在する高濃度のｇＤＮＡに起因して、強い生成物阻害が、希釈していないサンプルにおいて観測され、弱い阻害が１０倍希釈したサンプルにおいてさえも観測されたが、より高い希釈度でのサンプルについては、阻害は観測されなかった。
【図１０】図１０は、本発明の方法を用いて（「単一ステップ」として示される）、およびＴＡＱｍａｎ７７００分析器でのｊｕｎアッセイにおけるＱＩＡａｍｐキットを用いて、実施例６に従って、１０ｍｇのラット肝臓組織から得られる上記溶解産物を増幅させるｑＲＴ−ＰＣＲ反応から得られたＣＴ値を示す。再度、生成物阻害が、希釈していないサンプルにおいて、および本発明の方法で精製された１０倍希釈したサンプルにおいて観測された。しかし、希釈したサンプルでは、本発明の方法に従って得られた溶解産物についてのＣＴ値は、常により低かった。
【図１１】図１１は、本発明の方法によって精製した２つの血液サンプルの、ＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ  ＩＩで染色したアガロースゲルを示す（実施例８を参照のこと）。参考として、ＤＮＡの長さの標準（ＧＩＢＣＯ  １ｋｂプラスＤＮＡラダー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が左側に示される。
【図１２】図１２は、市販のＲＮＡ  ｌａｔｅｒ試薬（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において保存されるか、使用前にドライアイス（−７８℃）上で凍結されるか、または受け取ったまま使用される（新鮮なサンプル）かのいずれかの、肝臓、腎臓、および脾臓の組織サンプルから得られたＲＴ−ＰＣＲ結果の比較を示す。上記サンプルは、実施例９において記載されるように、市販のＤＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（左側）、および本発明の方法（右側、「単一ステップ」として示される）を用いて溶解および精製された。ＲＴ−ＰＣＲ反応において得られたＣＴ値が、両方の方法について同等であることを認めることができる。
【図１３】図１３は、本発明に従って、肝臓および脾臓の組織の溶解および精製から得られた溶出液のアガロースゲルを示す（実施例１０を参照のこと）。
【図１４】図１４は、実施例１１に示されるようなゲル濾過ステップにおいて、溶離剤として水、バッファーＡＥ、および２倍濃縮バッファーＡＥを用いて、本発明に従って、ラットの肝臓組織の溶解および精製から得られた溶出液における、ｇＤＮＡ（μｇ）の量、およびＳＤＳ（μＭ）、ならびに伝導度（希釈後、μＳ）を示す。
【図１５】図１５は、ＦＦＰＥのラットの肝臓組織からの１８Ｓ  ｒＲＮＡについてコードする遺伝子のＲＴ−ＰＣＲのＣＴ値を示す（実施例１２）。ＦＦＰＥブロックからの切片は、市販のキット（１）、ならびに本発明の方法およびデバイス（２および３）を用いて溶解および精製した。
【図１６】図１６は、市販のキット（１）、ならびに本発明の方法およびデバイス（２および３）を用いて、ＦＦＰＥのラットの肝臓組織から得られたｇＤＮＡの量を示す（実施例１２）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明に従って、用語「核酸」は、任意のタイプの（ｏｒ）ＤＮＡまたはＲＮＡの、ならびに任意のタイプの、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。特に、使用される条件およびステップに依存して、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を得ることができるか、またはＲＮＡからも分離された高度に精製されたＤＮＡが調製され得る。以下において、用語「ＤＮＡ」が使用される場合、ＤＮＡ含有の精製された核酸サンプルは、ＲＮＡを含むか、またはＲＮＡからも分離されるかのいずれかを意味する。好ましくは、上記方法の条件により、本質的にＲＮＡを含まない、高度に精製されたＤＮＡをもたらす。
【００１８】
本発明は、好ましくはＤＮＡおよび特にゲノムＤＮＡを含む核酸を、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、夾雑物質から単離および精製するためのクロマトグラフィーデバイスを提供し、上記デバイスは、少なくとも１つのクロマトグラフィーユニットを含み、上記ユニットは、１．入り口（２）および出口（３）を有する中空本体（１）であって、好ましくはゲルベッドを形成する、サイズ排除の特性を提供する固体マトリックス（４）を含む、中空本体（１）；２．上記固体マトリックス（４）を上記クロマトグラフィーユニット内に保持するように、上記出口（３）と上記固体マトリックス（４）との間に置かれる有孔のフリット、フィルター、フリース、または膜（５）、３．好ましくは非有孔の環（６）であって、上記有孔のフリット、フィルター、フリース、または膜（５）と上記マトリックス（４）との間に置かれて、上記フリット、フィルター、フリース、または膜（５）の外側領域を塞いで、移動相が上記マトリックス（４）を通ることなく上記フリット、フィルター、フリース、または膜（５）に入ることを防ぐ、非有孔の環（６）、４．必要に応じて、上記クロマトグラフィーユニットの上記入り口（２）および／または出口（３）を塞ぐための少なくとも１つの取り外し可能な閉鎖デバイス（ｃｌｏｓｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）（７）、および５．必要に応じて、上記マトリックス（４）を通過後の移動相（溶出液）を収集するための少なくとも１つの収集管を含み、ここで上記固体マトリックス（４）は、好ましくは、１５０塩基対（ｂｐ）〜５００塩基対（ｂｐ）、好ましくは２００ｂｐ〜４００ｂｐ、および最も好ましくは２５０ｂｐ〜３００ｂｐのサイズ排除限界（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｌｉｍｉｔ）を有するゲル形成ポリマーである。好ましくは、上記ゲル形成ポリマーは、１０ＫＤａ〜１００００ＫＤａ、より好ましくは２０ｋＤａ〜８０００ｋＤａの相当するサイズ排除限界を有する。
【００１９】
このデバイスを用いて、ＤＮＡのクロマトグラフィーによる精製のために一般的に使用される他のクロマトグラフィーの方法と対照的に、ＤＮＡではなく夾雑物質が、上記固体マトリックスに収着され、従って、１つの単一のすすぐ（ｒｉｎｓｉｎｇ）ステップにおいて、クロマトグラフィーによる精製が実施されるのを可能にする「ネガティブ」クロマトグラフィーは可能である。従って、上記方法は、「単一ステップ」クロマトグラフィー方法と称され得る。本発明のクロマトグラフィーデバイスは、低分子量の夾雑物質を除去することができるだけではなく、上記ゲルベッドには入らず、その上部表面上に残る固体物質のためのデプスフィルターとしても働くことができることが驚くべきことに見出されている。固体物質は通常、ゲルの孔を詰まらせる（ｃｌｏｃｋ）傾向にあり、従ってさらなるクロマトグラフィーを阻止するか、または妨げるので、このことは、さらにもっと驚くべきことである。
【００２０】
従って、本願と同じ出願日を有する同じ出願人の、表題「ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」、および本願と同じ出願日を有する同じ出願人の、表題「ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ  ａｎｉｏｎｉｃ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」を有する同時係属中の出願にそれぞれ記載される、細胞を溶解させ、ドデシル硫酸イオンを除去するための方法が使用されるとき、本発明のデバイスは、サンプルから固体夾雑物質を除去するのに特に適しており、特に溶解産物から沈殿物（例えば、ドデシル硫酸イオンおよび一価のアルカリ金属イオンまたは二価のアルカリ土類金属イオンから形成される沈殿物など）を除去するのに適している。本発明のクロマトグラフィーデバイスを用いて、残留のドデシル硫酸イオンを本質的に含まない、高度に精製された脱塩核酸、好ましくはＤＮＡ、特にｇＤＮＡ、を含む溶出液が得られる。
【００２１】
上記クロマトグラフィーデバイスは特別な形に限定されない。一般的にクロマトグラフィーに使用される任意のデバイスが使用され得る。上記クロマトグラフィーデバイスは、吸引（ｓｕｃｔｉｏｎ）もしくは加圧（ｐｒｅｓｓｕｒｅ）カラムクロマトグラフィーに使用される慣習的なカラム、スピンカラム、またはマルチウェルプレートから選択され得るが、それらに限定されない。一般に、円形の断面を有するいわゆるクロマトグラフィーカラムが使用され、その直径は、その長さに比べて小さい。上記カラムは、例えば、円筒形のもの、もしくは円錐形のもの、またはそれらの組み合わせのものであり得る。
【００２２】
上記クロマトグラフィーデバイスの好ましい実施形態は、図１に描かれ、それは、中空本体（１）が、入り口（２）および出口（３）を有し、固体マトリックス（４）を含み、有孔のフリット（５）、および上記固体マトリックス（４）と上記有孔のフリット（５）の間に置かれる非有孔の環（６）を備えていることを示す。上記クロマトグラフィーデバイスの上記入り口（２）は、好ましくは、取り外し可能なスクリューキャップ（７）で閉じられる。この実施形態における上記マトリックスの上部表面は、固定アングルローターにおいて上記カラムを前もって回転させるプロセスに起因して、上記フリットに対して平行ではないことに留意のこと。
【００２３】
本発明のクロマトグラフィーデバイスは、好ましくは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に使用され得る。有機溶媒が溶離剤（移動相）として使用される場合、ＳＥＣはまた、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）と呼ばれる。本発明において、好ましくは水ベースの移動相（例えば、水）、水性有機溶媒、または水性バッファー／溶液が移動相として使用される。この場合、ＳＥＣはまた、ゲル濾過クロマトグラフィーと称される。サイズ排除クロマトグラフィーは、クロマトグラフィーの方法であり、ここで分子は、それらのサイズに基づいて、より正確には、それらの流体力学上の体積に基づいて分離される。一般的に、水性媒体（例えば、デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、またはそれらの混合物）中に懸濁されるとき、ゲルベッドを形成することができる固体マトリックスは、バッファー中に懸濁され、ガラス、プラスチック、テフロン（登録商標）、または移動相にも検体にも反応しない任意の他の材料で作られたカラムの中空本体に詰められる。精製されるべきサンプルは、次に上記ゲルベッドの上部表面の中央にのせられ、重力によって、または遠心分離もしくは圧力によって強いられるかのいずれかでゲルを通過する。本発明に従って、好ましくは、カラムを下って移動相が移動するように遠心分離力がかけられ、ここで上記カラムは、遠心分離機において回転させられる（いわゆるスピンカラム技術）。上記ゲルにおける架橋に起因して、特定のサイズの孔が上記ゲルの内部に存在する。低分子は、上記孔を透過することができ、従って、カラムを下って通るにつれて保持されて、ゲルベッドをよりゆっくりと移動するが、他方、大きな分子は、上記孔を透過できず、より速く上記カラムを下って移動する。上記カラムを通過後、精製された検体を含む移動相（今や溶出液と称される）は、次に、上記カラムの出口で収集される。上記固体マトリックスを上記カラムの中空本体内に保持するために、有孔のフリット、フィルター、フリース、または膜が、好ましくは上記カラムの出口と上記固体マトリックスとの間に置かれる。上記有孔のフィルター、フリット、フリース、または膜は、好ましくは、あらゆる核酸のサイズとは関わりなく、それらの核酸の、最大でゲノムＤＮＡまでの、および特にゲノムＤＮＡの通過を可能にする。
【００２４】
ＳＥＣにおいて、サイズ排除限界は、分子量を定義し、それより上では、分子は、大きすぎて固定相で捕らえることができない。固体マトリックスのサイズ排除限界は、上記ゲルにおける架橋の度合いによって調整され得る。異なる程度の架橋を有するゲルベッドを形成することができる多種多様な固体マトリックスは、市販されている。他方、サイズ排除は、好ましくは、上記クロマトグラフィーデバイスの上記フリット、フィルター、フリース、または膜によって制限されない。
【００２５】
ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、および特にスピンカラムを用いるゲル濾過クロマトグラフィーにおいてしばしば遭遇する問題は、移動相が上記カラムの内壁に沿って流れ落ちる場合があり、従って上記固体マトリックスを通ることなく上記フリット、フィルター、フリース、または膜に入ることである。これは、精製されるべきサンプル溶液の全てが、ゲルベッドの平らな表面の中央に正確にのせられるとは限らないとき、または上記サンプルがのせられるのが速すぎるとき、特に高スループットの適用について言える。移動相が上記ゲルベッドに入らないとき、クロマトグラフィーによる分離は全く起こらず、汚染された溶出液が得られる。この問題を克服するために、本発明のクロマトグラフィーデバイスは、好ましくは、上記有孔のフリット、フィルター、フリース、または膜と上記マトリックスとの間に置かれる非有孔の環を備えている。この環は、上記フリット、フィルター、フリース、または膜の外側領域を塞いで、従って、移動相が上記マトリックスを通ることなく上記フリット、フィルター、フリース、または膜に入ることを防ぐ。さらに、上記カラム内の移動相の速度は遅くなり、従って選択性を改善する。
【００２６】
上記非有孔の環は、好ましくは、上記中空本体へのその組込みを容易にする可撓性または弾性の材料で作られる。しかし、非可撓性または非弾性の材料も使用され得る。好ましい実施形態において、上記非有孔の環は、必要に応じて１つもしくはそれより多くのさらなる添加物を伴う、ポリオレフィンまたは２つもしくはそれより多くのポリオレフィンの混合物に基づいて作られる。好ましくは、上記環を形成する上記材料は、ポリエチレンまたはポリプロピレンまたはそれらの混合物、最も好ましくは、高密度ポリエチレンを含む。具体的に好ましい実施形態において、上記中空本体の内壁と接触する上記環の一部は、例えば、スロットの形態で、外環（ｏｕｔｅｒ  ｒｉｎｇ）の完全な長さに沿って、または少なくとも上記長さの一部に沿って、少なくとも１つのカットアウト（ｃｕｔ−ｏｕｔ）または凹所を有する。適切な非有孔な環は、Ｂｏｒｅａｌｉｓ  ＡＧからの、高密度ポリエチレンに基づくＭＧ  ９６４１のように市販されている。
【００２７】
必要に応じて、本発明のクロマトグラフィーデバイスは、上記クロマトグラフィーユニットの入り口および／または出口を塞ぐための少なくとも１つの取り外し可能な閉鎖デバイスを含み得る。上記入り口および上記出口の両方が、このような取り外し可能な閉鎖デバイスを備えている場合、上記入り口を塞ぐために使用される上記閉鎖デバイス、および上記出口を塞ぐために使用されるものは、同じであっても、または異なっていてもよい。
【００２８】
本発明のクロマトグラフィーデバイスは、上記マトリックスを通過後の移動相（溶出液）を収集するための少なくとも１つの収集管とさらに組み合わせられ得る。本発明に従って、上記クロマトグラフィーデバイスは、１つのクロマトグラフィーユニット当たり１つの収集管を備え得、すなわち、上記クロマトグラフィーデバイスが、１つのクロマトグラフィーユニットのみを含む場合、好ましくは１つの収集管のみが使用される。他方、上記クロマトグラフィーデバイスが、数個のクロマトグラフィーユニット、例えば、マルチウェルプレートの形態で２４個、４８個、または９６個のクロマトグラフィーユニットを含む場合、次いで、好ましくはまたマルチウェルプレートの形態で、１つ超の収集管がまた使用される。追加の収集管は、前もって回転させる間に上記カラムから排出される液体を収集するために供給され得る。
【００２９】
好ましい実施形態において、上記ゲル形成ポリマーは、デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、またはそれらの混合物を含む群から選択され、そしてより好ましくは、デキストランとポリアクリルアミドとの混合物である。異なるサイズ排除限界のこのようなゲル形成ポリマーは、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、またはＳｅｐｈａｒｏｓｅの商標名の下で市販されている。特に好ましい固体マトリックスは、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから市販されているＳ−４００  ＨＲ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ樹脂であり、これは、２７１ｂｐ（２０ｋＤａ〜８０００ｋＤａに相当する）のサイズ排除限界を有する球形の（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）アリルデキストラン／Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドマトリックスである。さらに適切なゲル形成ポリマーは、４０ｋＤａ〜５０００ｋＤａのサイズ排除限界を有する、ヒドロキシル化メタクリルポリマー、例えば、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＰ（前ＴｏｓｏＨａａｓ）から入手可能であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ  ６５のようなメタクリルベース（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ  ｂａｓｉｓ）を有し得る。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、取り外し可能な閉鎖デバイスは、好ましくは、ふた用ホイル（ｌｉｔ  ｆｏｉｌ）、シール、およびブレークアウェイ末端を含む群、好ましくはふた用ホイル、シール、およびブレークアウェイ末端からなる群から選択される使い捨ての閉鎖デバイス、またはスクリューキャップ、およびスナップオンキャップを含む群、好ましくはスクリューキャップ、およびスナップオンキャップからなる群から選択される再閉鎖可能な閉鎖デバイスである。さらなる実施形態において、上記クロマトグラフィーユニットの上記入り口および上記出口の両方は、取り外し可能な閉鎖デバイスで塞がれ、上記固体マトリックスは、水、有機溶媒と水との均一（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）混合物、または水性バッファーを含む群から選択される溶媒中で前もって膨張させた、ゲルの形態で供給される。この実施形態において、上記溶媒は、好ましくは、使用直前に上記クロマトグラフィーユニットからパージされ、他方、遠心分離によって、同時にマトリックスベッドの形態で上記マトリックスを確立する（前もって回転させるステップ）。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態は、好ましくはマルチウェルプレートの形態での、並行様式の複数のクロマトグラフィーユニットを含むクロマトグラフィーデバイスであり、ここで上記マルチウェルプレートの各ウェルは、１つの別個のクロマトグラフィーユニットを含む。
【００３２】
本発明は、本発明に従うクロマトグラフィーデバイスを用いる、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、核酸、好ましくはＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡを精製するための方法をさらに提供し、上記方法は、１．好ましくは少なくとも４００ｂｐ、好ましくは５００ｂｐ、より好ましくは少なくとも６００ｂｐを有する、精製されるべき核酸を含むサンプルを提供するステップであって、ここで上記サンプルは、溶液の形態、または液体溶離剤、好ましくは水性溶離剤中の懸濁物の形態である、ステップ、２．上記クロマトグラフィーユニット中のマトリックス、好ましくはマトリックスベッドを、好ましくは遠心分離によって確立するステップ（前もって回転させるステップ）、３．上記サンプルを、上記マトリックス（ベッド）の上部表面（の中央）にのせるステップ、４．遠心分離によって上記クロマトグラフィーユニットから核酸を溶出し、同時にその溶出液を収集するステップ、を含む。特に好ましい実施形態において、ステップ３と４との間で、さらなるステップを全く含まない。このことは、ステップ３のすぐ後にステップ４が続くことを意味する。
【００３３】
精製されるべきサンプルは、好ましくは、処理された生物学的サンプル、より好ましくは任意の生物学的サンプルから得られた溶解産物である。上記生物学的サンプルは、好ましくは、細胞含有生物学的サンプルであり、より好ましくは、新鮮および凍結された組織、血液、または他の体液、およびグラム陰性細菌からなる群から選択される。
【００３４】
本発明の方法を用いて、原則として、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）のような全ての種類の核酸は、多種多様な処理された生物学的サンプルから単離され得、それには合成の、遺伝子操作された、または天然に存在する一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、制限エンドヌクレアーゼを用いてＤＮＡを一部消化することによって得られるＤＮＡのフラグメント、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ならびにメタゲノム（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡが挙げられ、それらは、小生活圏または群集において見出される全ての微生物から得られるＤＮＡ全体を表す。好ましくは、本発明の方法は、ゲノムＤＮＡを単離および精製するために使用され、このゲノムＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、制限エンドヌクレアーゼの作用によって一部消化されるＤＮＡ、およびメタゲノムＤＮＡと対照的に、本発明の関連において、１つの単一生物から得られる高分子量ＤＮＡであって、この生物の遺伝情報全体を含むものである。この好ましい実施形態において、精製された高分子量ＤＮＡが得られるが、ＤＮＡのより小さなフラグメントは、クロマトグラフィー材料内に保持される。その高分子量および大きなサイズに起因して、無傷の高品質のゲノムＤＮＡは、単離手順の間の機械的応力、特にせん断応力（ｓｈｅｅｒ  ｓｔｒｅｓｓ）によってか、または化学的分解および酵素による分解によってのいずれかでの比較的高いリスクのゲノムＤＮＡの分解が存在するので、単離および精製することが難しい。他方、分解したＤＮＡは、後の分析において、定量誤差および定性誤差の両方をもたらし得る。本発明の方法は、核酸、特にゲノムＤＮＡを、多様な異なる処理された生物学的サンプルから単離および精製するための、迅速で、ロバストで、安全で、扱うのが容易で、しかも穏やかな方法を提供する。
【００３５】
本発明の方法を用いて、核酸、好ましくはＤＮＡ、およびより好ましくはゲノムＤＮＡは、多種多様な処理された出発材料から精製され得、上記出発材料には動物およびヒトの組織（例えば、肝臓、脾臓、肺、心臓、脳、腎臓など）、動物およびヒトの血液、流体、痰、精子、動物およびヒトの細胞の細胞培養物、動物およびヒトの骨髄、酵母、細菌、昆虫、植物、ならびにげっ歯類の尾が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、上記サンプルは、動物およびヒトが起源の処理された細胞含有生物学的サンプルである。別の好ましい実施形態において、上記サンプルは、処理されたグラム陰性細菌を含む。上記サンプルは、その天然の環境から取得された後すぐに溶解されていても（新鮮なサンプル）、溶解される前に、凍結させることによってか、あるいは化学的安定化剤の作用（例えば、ホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ組織）など）またはシトレート、陽イオン界面活性剤（例えば、ＰＡＸｇｅｎｅＴＭ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｇｅｒｍａｎｙ）など）、もしくはヘパリンを含む血液安定化剤の作用によって、安定化されていてもよい。さらにより好ましくは、上記サンプルは、溶解された新鮮または凍結された組織および血液を含む群、最も好ましくは溶解された哺乳類の組織および血液、から選択される。
【００３６】
前もって回転させるステップは、好ましくは、５００〜９００×ｇで１分間〜７分間、好ましくは７００×ｇで２分間〜５分間、および最も好ましくは７００×ｇで３分間、上記デバイスを遠心分離することによって実施される。
【００３７】
上記マトリックスが、マトリックスベッドとして提供される、そのような実施形態において、上記クロマトグラフィーユニットにおける上記マトリックスベッドの体積は、好ましくは、１００μＬ〜２ｍＬの範囲、より好ましくは５００μＬ〜１ｍＬの範囲、および最も好ましくは６００μＬ〜８００μＬであり、ここで８００μＬは、特にゲノムＤＮＡについて好ましい場合がある。上記マトリックスは、好ましくは、水中での上記ゲル形成ポリマーの分散物、塩溶液（例えば、０．９％のＮａＣＬ）、または適切なバッファー（例えば、ＴＥ、ＴＡＥ、ＰＢＳ、または同様のバッファー、もしくは希釈したバッファーにおいて、など）として提供されるが、上記分散物は、上記ゲル形成ポリマーの、好ましくは６０％〜９０％、より好ましくは７０％〜８０％、および特に７５％を含む。上記クロマトグラフィーユニットにおける上記マトリックスベッドの充填レベルは、好ましくは０．５ｃｍ〜２．０ｃｍの範囲、より好ましくは１．０ｃｍ〜１．５ｃｍの範囲にある。標準的な９６ウェルプレートにおいて、上記マトリックスベッドの体積は、好ましくは約０．８ｍＬである。使用されるマトリックスベッドの正確な体積および充填レベルは、カラムによって定義される中空本体のサイズおよび形、ならびに精製されるべきサンプルの種類および量に依存し、そのことは当業者に周知である。
【００３８】
上記マトリックスは、上記サンプルが、その表面にのせられる前に洗浄され得る。洗浄ステップは、水、バッファー、または塩溶液（例えば、水中０．５％〜１％、好ましくは０．９％のＮａＣｌ）を上記マトリックスの表面にのせて、上記クロマトグラフィーデバイスを遠心分離することによって実施され得る。好ましくは、上記マトリックスは、調製のために使用されたのと同量の水、バッファー、または塩溶液、すなわち、１００μｌ〜２ｍｌ、好ましくは５００μｌ〜１ｍｌ、より好ましくは６００μｌ〜８００μｌ、で１回または２回洗浄される。
【００３９】
上記マトリックスにのせられるサンプルの量は、上記マトリックスに使用される体積に依存する。好ましくは、約１００μＬまでのサンプル体積が、６００μＬ〜８００μｌのマトリックスベッドで詰めたカラム、または１．０ｃｍ〜１．５ｃｍの充填レベルのマトリックスベッドで詰めたカラムにのせられる。当業者は、他のマトリックス実施形態について、それに応じて適切なサンプル体積を決定することができる。
【００４０】
上記クロマトグラフィーユニットから核酸を溶出するステップは、好ましくは、５００〜９００×ｇで１分間〜７分間、好ましくは７００×ｇで２分間〜５分間、および最も好ましくは７００×ｇで３分間、上記デバイスを遠心分離することによって実施される。
【００４１】
本発明のデバイスおよび方法を用いて、高度に精製された核酸、例えば、高度に精製されたＤＮＡは、わずか約６分間（３分間の、上記カラムを前もって回転させるステップ、およびクロマトグラフィーによる分離自体のための３分間）で、処理された生物学的サンプルから、例えば、溶解された組織サンプルから得られ得、他方、例えば、ＱＩＡａｍｐキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた同じ量の溶解された組織の精製には、約１８分間が必要である。
【００４２】
ＵＶ／Ｖｉｓ分光法、ゲル電気泳動、伝導度測定法、ＨＰＬＣ分析、ＰＣＲおよびさらなるアッセイによって判定されるような純度および収量に関して、本発明のデバイスおよび方法によって単離された核酸の質および純度は、ベンチスケールの精製のための当該分野の方法（例えば、非常に好結果のＱＩＡａｍｐ技術（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）など）によって得られる核酸の質および純度に等しいか、または多くの場合、それよりもさらに優れている。さらに、本発明の方法によって得られる核酸含有溶出液は、長期保存のために凍結され得るか、または上記溶出液から上記核酸を単離するための任意の追加のステップの必要なく、クロマトグラフィー後すぐに、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、およびＰＣＲなどのような後の適用において処理され得る。上記核酸は、精製プロセスの間、本質的に溶液に残り、有機溶媒（例えば、エタノールなど）の添加によって沈殿することも、固体マトリックス（例えば、シリカ膜）または陰イオン交換樹脂に収着することも結合することもないので、本発明の方法は、当該分野から公知である、核酸を単離および精製するための方法よりもずっと迅速である。さらに、本発明の方法は、完全に自動化され得る。
【００４３】
本発明のデバイスおよび方法を用いて精製されるべきサンプルは、好ましくは溶解産物である。上記サンプルは、好ましくは、先行する溶解手順によって細胞含有生物学的サンプルから得られる溶解産物であり、その溶解手順は、１．上記細胞含有サンプルを溶解バッファーと混合するステップ、２．その混合物をインキュベートして、少なくともＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質を含む溶解産物を得るステップ、３．必要に応じて、上記溶解産物に存在するＲＮＡを崩壊させるステップ、４．必要に応じて、溶解した夾雑物質を上記溶解産物から選択的に沈殿させるステップ、を含み、好ましくはここで上記核酸、特に上記ＤＮＡは、ステップ２〜４の全ての間、本質的に溶液にとどまる。
【００４４】
生物学的サンプルの迅速だが穏やかな溶解について、好ましくは、本願と同じ出願日を有する同じ出願人の、表題「ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」を有する同時係属中の出願に記載される溶解バッファーが使用され、それは陰イオン界面活性剤イオン、好ましくは硫酸イオン、より好ましくはドデシル硫酸イオン（ＤＳ−）の供給源を含むが、錯化剤（ｃｏｍｐｅｘｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）もキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）も本質的に含まない。このような剤についての非限定的な例は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＤＳ（エチレンジアミン二酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、グルコン酸、イソアスコルビン酸、酒石酸、クエン酸、イミノジスクシネート、トリエタノールアミンである。好ましくは、この溶解バッファーは、緩衝剤、Ｈ２ＳＯ４、および界面活性剤イオンの供給源を含むが、錯化剤もキレート剤もＭｇ２＋イオンも本質的に含まず、このことは、上記溶解バッファーが、１０ｍｇ／Ｌ未満のキレート剤およびＭｇ２＋イオン、好ましくは１ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは０．００１ｍｇ／Ｌ未満を含むこと、および最も好ましくは、上記溶解バッファーがキレート剤も錯化剤もＭｇ２＋イオンも全く含まない（０ｍｇ／Ｌ）ことを意味する。上記溶解バッファーは、７．５〜１０のｐＨ、好ましくは８〜９のｐＨ、および最も好ましくは８．５のｐＨを有し、プロテアーゼ（例えば、ＱＩＡＧＥＮプロテイナーゼＫまたはＱＩＡＧＥＮプロテアーゼ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））をさらに含み得る。陰イオン界面活性剤は、例えば、スルフェート（ｓｕｐｈａｔｅ）、スルホネート、およびカルボキシレート、好ましくは、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）、アルカンスルホネート、アルキルベンゼンスルホネート、およびアルキルカルボキシレートである。特に好ましくは、ドデシル硫酸イオン（ＤＳ−）と同様の沈殿挙動を示す界面活性剤イオンを提供する界面活性剤であり、より好ましくは、硫酸イオンを提供する界面活性剤であり、そして最も好ましくは、ドデシル硫酸イオンの供給源を提供する界面活性剤である。一旦水に溶解するとドデシル硫酸イオン（Ｈ３Ｃ（ＣＨ２）１１ＳＯ４−）を溶液に放出する任意の化合物が、ドデシル硫酸イオンの供給源として使用され得る。ドデシル硫酸イオンの供給源は、好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸アンモニウム、およびドデシル硫酸リチウムを含む群から選択され、そして最も好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウムである。上記バッファーにおける界面活性剤イオンの供給源の濃度は、溶解されるべきサンプルに依存するが、好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ、さらにより好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、および最も好ましくは２５ｍｍｏｌ／Ｌである。上記緩衝化物質は、少なくとも７．５のｐＨを提供する任意の適切な緩衝化物質（例えば、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＰＰＳ、または任意のアンモニアバッファーなど）であり得る。好まし���緩衝化物質は、ＴＲＩＳである。上記バッファーにおける上記緩衝化物質の濃度は、好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、より好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ〜７５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、さらにより好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、および最も好ましくは２５ｍｍｏｌ／Ｌである。上記バッファーにおける上記緩衝化物質  対  界面活性剤イオンの供給源の分子比は、好ましくは３：１〜１：３の範囲、より好ましくは２：１〜１：２の範囲、さらにより好ましくは１．２：１〜１：１．２の範囲、および最も好ましくは１：１である。上記溶解バッファーは、安定剤（例えば、アジ化ナトリウム）、可溶化剤、または同様のものを含む群から選択されるさらなる活性成分を含み得る。上記バッファーにおける塩素イオンの濃度は、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ未満、さらにより好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満である。
【００４５】
このバッファーは、低塩溶解条件下で、すなわち低張条件下で、サンプル材料の迅速な溶解を可能にし、これは上記バッファー溶液中の総イオン濃度が、溶解されるべき細胞内の総イオン濃度よりも低いことを意味する。ＮａＣｌの場合、例えば、０．９重量％未満のＮａＣｌ（約３１０μｍｏｌ／Ｌの溶解したイオンに相当する約１５５ｍｍｏｌのＮａＣｌ）を含む水性溶液は低張である。このバッファーを用いると、幾分多量の固体物質を含むサンプル（例えば、組織サンプル）でさえ、例えば、５６℃で４０分未満以内に通常完全に溶解する。溶解は、４５℃〜７０℃の範囲に及ぶ温度、好ましくは５０℃〜６８℃の範囲に及ぶ温度、および最も好ましくは６２℃で実施され得る。好ましくは８０μＬ〜１５０μＬ、より好ましくは８０μＬ〜１２０μＬ、さらにより好ましくは８０μＬ〜１００μＬ、および最も好ましくは８０μＬのバッファー体積が、１０ｍｇのサンプル組織の溶解のために使用される。比（バッファー：サンプル）は、より多量またはより低量のサンプルについてそれに応じて計算され得る。
【００４６】
上記溶解産物に存在するＲＮＡは、必要に応じて、上記サンプルを溶解させた後に崩壊させられ得る。ＲＮＡを崩壊させるステップは、上記溶解産物中に溶解したＲＮＡの量を低減および／またはＲＮＡを不活化および／またはＤＮＡからのその分離を容易にする任意の方法を含み、それには、ＲＮＡを、部分的もしくは完全にのいずれかで、熱によって、化学的に、および／もしくは酵素によって加水分解する、消化する、形質転換する、そして／もしくは分解する、ならびに／または例えば、沈殿手順、収着手順、もしくは同様のものによって、上記溶液からＲＮＡもしくはそのフラグメントを除去する、任意の方法が挙げられる。上記サンプルにおけるＲＮＡを崩壊させるためのシンプルな方法は、崩壊剤のさらなる添加なく、上記サンプルを少なくとも６０℃の温度まで加熱することによるものである。ＲＮＡが上記サンプル中に残される場合、上記サンプルの加熱は、ほんの５８℃まで、好ましくは５６℃までが推奨される。好ましい実施形態において、ＲＮＡの崩壊ステップは、本願と同じ出願日を有する同じ出願人の、表題「ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」を有する同時係属中の出願に記載されるように実施され、ここで上記生物学的サンプルと上記溶解バッファーとの混合物をインキュベートするステップ、および上記溶解産物に存在するＲＮＡを崩壊させる随意選択のステップは、好ましくは上記混合物を、６０℃と等しい、または６０℃より上、好ましくは６０℃〜７０℃、より好ましくは６１℃〜６５℃、および最も好ましくは６２℃の温度まで加熱することによる、単一ステップにおいて実施される。好ましくは、上記混合物は、１０分間（分間（ｍｉｎ））〜８０分間（分間（ｍｉｎ））、より好ましくは１５分間〜６０分間、さらにより好ましくは２０分間〜５０分間、および最も好ましくは３０分間〜４５分間加熱される。
【００４７】
溶解ステップの間、または溶解ステップ後に温度を８０℃まで上昇させることにより、上記サンプル中のタンパク質（例えば、酵素）を、所望されるＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡに影響することなく、さらに変性させる（ｄｅｎａｔｕｒａｔｅ）。この場合、もちろんＲＮＡは得られない。
【００４８】
本発明の方法を用いて１０ｍｇのサンプルから得られるＤＮＡの量は、上記サンプル（例えば、その種類および年数）に依存する。通常約５μｇ〜７０μｇのゲノムＤＮＡが、代表的に、１０ｍｇの異なる組織サンプルから得られる。
【００４９】
約１０ｍｇの量は、分子診断において一般的に分析されるサンプルの量である。しかし、本発明の方法を用いて、例えば、それぞれ、ｇ範囲またはμｇ範囲〜ｎｇ範囲での、より多くの量、またはより少ない量のサンプル材料を処理することも可能であることが理解されるべきである。この場合、試薬、バッファー、固体マトリックスの量、ならびに上記クロマトグラフィーデバイスの寸法は、拡大するか、または縮小することによって調整されなければならず、そのことは当業者に周知である。
【００５０】
上に記載されるように、上記サンプルを溶解させた後、および必要に応じて、上記溶解産物に存在するＲＮＡを崩壊させた後、界面活性剤イオンは、好ましくは沈殿によって、上記溶解産物から除去される。沈殿させるステップは、本願と同じ出願日を有する同じ出願人の、表題「ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ  ａｎｉｏｎｉｃ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」を有する同時係属中の出願に記載されるように、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、もしくはそれらの混合物を含む群、好ましくはＲｂ＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、もしくはそれらの混合物からなる群から選択される、アルカリ金属の一価イオンおよび／またはアルカリ土類金属の二価イオン（それは、界面活性剤イオン、特にドデシル硫酸イオンとの不溶性の沈殿物を形成する）を含む溶液（沈殿溶液）を上記溶解産物に加えることによって、実施される。上記沈殿溶液は、好ましくはＳｒ２＋イオンを含む。上記沈殿溶液は、水に溶解するとアルカリ金属の一価イオンおよび／またはアルカリ土類金属の二価イオンを提供する、アルカリ金属および／またはアルカリ土類金属の水溶性の塩（例えば、ＲｂＣｌ、ＳｒＣｌ２、ＣａＣｌ２、またはＢａＣｌ２など）を含む。上記沈殿溶液における一価および／または二価の金属イオンの濃度は、０．１ｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ〜５ｍｏｌ／Ｌの範囲、より好ましくは０．７５ｍｏｌ／Ｌ〜２．５ｍｏｌ／Ｌの範囲、および最も好ましくは０．９ｍｏｌ／Ｌ〜１．２ｍｏｌ／Ｌの範囲にあるのが好ましい。特定の体積の液体サンプル（溶解産物）に加えられる沈殿溶液の体積は、そのサンプル溶液における界面活性剤イオンの濃度に依存する。好ましい実施形態において、上記液体サンプル  対  沈殿溶液の体積比は、４：１〜１２：１の範囲、好ましくは５：１〜１１：１の範囲、より好ましくは６：１〜１０：１の範囲、および最も好ましくは７：１〜９：１の範囲にある。例えば、８０μＬの液体サンプルが、上に記載されるようにサンプルを溶解させることによって得られる場合、次いで、上記界面活性剤イオンを沈殿させるために、好ましくは１Ｍの沈殿溶液１０μＬが加えられる。
【００５１】
沈殿させるステップという用語は、溶解した核酸および界面活性剤イオンを含む溶液に、上記界面活性剤イオンと反応して、得られた溶液において不溶性である化合物を形成し、従って上記溶液から沈殿させる、物質または物質の混合物を加えるステップとして理解される。必要に応じて、混合物は、好ましくは−１０℃〜１０℃で、好ましくは−５℃〜５℃で、より好ましくは−２．５℃〜２．５℃で、および最も好ましくは−１℃〜１℃で、好ましくは３分間〜６０分間、より好ましくは５分間〜３０分間、および最も好ましくは約１０分間インキュベートして、例えば、氷浴中に上記混合物を静置したままにしておくことによって、沈殿物の形成の完了を確実にし得る。
【００５２】
本発明は、好ましくはＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡを含む核酸の単離および精製のためのキットをさらに提供し、そのキットは、１．本発明に従うクロマトグラフィーデバイス、ならびに２．溶解バッファー、３．アルカリ金属（ａｌｋａｌｉ  ｅａｒｔｈ  ｍｅｔａｌ）の一価イオンおよび／またはアルカリ土類金属の二価イオンの供給源、および必要に応じて、上記溶出液からの１つまたはそれより多くの標的核酸の直接増幅のための１つまたはそれより多くのプライマーからなる群から選択される、１つまたはそれより多くの成分を含む。好ましくは、上記キットは、上に記載される溶解バッファーを含む。特に好ましい実施形態において、上記キットは、使用者によって溶解されるべき水溶性アルカリ土類金属塩の形態で、または使用者によって希釈されるべきストック溶液として、もしくはすぐに使える溶液としてのいずれかで、Ｒｂ＋、Ｃｓ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、もしくはそれらの混合物を含む群、好ましくはＲｂ＋、Ｃｓ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、もしくはそれらの混合物からなる群から選択される、アルカリ金属の一価イオンおよび／またはアルカリ土類金属の二価イオンの供給源をさらに含む。さらに、上記キットは、好ましくは、本発明の単離および／または精製方法のための指示を含む。
【実施例】
【００５３】
実施例
材料および一般実験手順
ゲル濾過媒体をＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得、イオン交換媒体をＭｅｒｃｋ  ＫｇａＡ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。
【００５４】
そうでないと言及されない限り、分析される組織サンプルは、ラットの肝臓組織サンプルであった。
【００５５】
ｇＤＮＡの量および純度の決定：精製されたサンプル（溶出液）中のｇＤＮＡ（ｇＤＮＡの収量）の量を見積もるために、上記サンプルの吸光度を、２６０ｎｍの波長でＵＶ／Ｖｉｓ分光法によって測定した。３２０ｎｍで測定されたバックグラウンド吸収値を、ＯＤ２６０値（２６０ｎｍでの光学濃度）から減算し、その値にＤＮＡの比吸光度係数（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ）である５０、および希釈係数を掛けて、μｇ／μＬでのｇＤＮＡ濃度を得た。さらに、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法をまた、得られたＤＮＡの純度を判定するために使用した。残留固体粒子は、明瞭な吸光度ピークを示さないが、スペクトル全体において、ベースラインの上昇をもたらす。遊離ヘモグロビンは、４１０ｎｍの波長で最大の吸光度を有するが、塩およびアジ化ナトリウムのような保存剤は、２３０ｎｍより下の波長で吸収する。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）９６ウェルプレート光度計を、ＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを記録するために使用した。
【００５６】
得られたｇＤＮＡの量のより正確な決定をＨＰＬＣ分析を用いて実施した。上記スペクトルにおけるｇＤＮＡ含有ピークについての曲線下面積（ＡＵＣ）をソフトウェアによって計算し、ＨＰＬＣ標準曲線と比較して、上記サンプル中のｇＤＮＡの量を決定した。ＨＰＬＣ分析をまた、Ｖｉｓｉｏｎ  ＢｉｏＣａｄワークステーション（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてサンプルの純度を決定するために使用した。イオン交換樹脂ＴＭＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（Ｓ）（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を充填した０．８３ｍＬのＰｅｅｋカラムを使用した。ｐＨ７．２に緩衝化した３５容のカラム体積にわたって、ＣａＣｌ２の勾配を０ｍｍｏｌ／Ｌから始めて３００ｍｍｏｌ／Ｌまで漸増させ、１．５ｍＬ／分の流量で、上記サンプルを分析した。吸光度を２６０ｎｍおよび４１０ｎｍで連続的に監視した。
【００５７】
アガロースゲル電気泳動を、２．５μＬのＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ  ＩＩを含む０．８％のアガロースゲル５０ｍＬを用いて実施した。サンプルを、４０分間の期間、１００ボルトの電圧を用いて泳動した。上記ゲルを、ＢｉｏＲａｄまたはＬＴＦ−Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ（Ｗａｓｓｅｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている装置を用いて分析した。
【００５８】
ＳＤＳ定量化：残留ＳＤＳの濃度を、９６ウェル光度計内で使用されるように適合されたＲｕｓｃｏｎｉらの改変された手順に従って、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法によって決定した（Ｒｕｓｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１，２９５（１），３１−３７）。そのアッセイは、カルボシアニン色素「Ｓｔａｉｎｓ  Ａｌｌ」（４，５，４’，５’−ジベンゾ−３，３’−ジエチル−９−メチルチオカルボシアニンブロミド）とＳＤＳとの特異的な反応に基づいており、それは黄色の形成をもたらす（４３８ｎｍで最大の吸光度）。ＳＤＳは、本実施例において、ドデシル硫酸イオンの供給源として使用されるので、溶液中のＳＤＳの量は、溶液に存在するドデシル硫酸イオンの量と等しいということが理解されるべきである。
【００５９】
上記色素のストック溶液１ｍＬ（５０％のイソプロパノール１．０ｍＬ中１．０ｍｇの「Ｓｔａｉｎｓ  Ａｌｌ」）を１．０ｍＬのホルムアミドおよび１８ｍＬの水で希釈して、上記色素のすぐに使える溶液を得た。上記サンプル中のＳＤＳの量を決定するために、５μＬのサンプル溶液を、マイクロタイタープレートに置き、１００μＬのすぐに使える溶液と混合し、そして４３８ｎｍで上記プレートを読む前に、暗所で室温にて５分間インキュベートした。上記サンプル中のＳＤＳの量を、それぞれ２５０μｍｏｌ／Ｌ、１６７μｍｏｌ／Ｌ、１１１μｍｏｌ／Ｌ、７４μｍｏｌ／Ｌ、４９μｍｏｌ／Ｌ、３２μｍｏｌ／Ｌ、および２１μｍｏｌ／ＬのＳＤＳ濃度を含む溶液の４３８ｎｍでの吸光度を記録することによって確立した較正曲線と比較することによって検索した。
【００６０】
伝導度測定：上記サンプルにおけるイオン強度を決定するために、２０℃に較正したＣｏｎｓｏｒｔ  Ｃ８３１  Ｃｏｎｄｕｃｔｏｍｅｔｅｒ（ＬＴＦ−Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ，Ｗａｓｓｅｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて伝導度測定を実施した。２ｍＬの最小限の体積が、測定に必要であるので、各サンプルの２０μＬのアリコートを、測定前に１９８０μＬの水で希釈した。
【００６１】
ＰＣＲ増幅：リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ２０００または３０００サイクラー（Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）上で５０μＬの規模で、またはＴａｑＭａｎ  ７７００分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）において行った。
【００６２】
ｊｕｎ  ＲＴ−ＰＣＲアッセイについて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からのプライマー／プローブシステム（ＦＡＭ）に基づいて、２０×Ｊｕｎ  ＰＣＲプライマー／プローブ混合物を含む市販のキット（Ｐａｒｔ．Ｎｏ：４３２７１１３Ｆ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの２×ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲユニバーサルマスター混合物と組み合わせて使用した。
【００６３】
ゲノムＤＮＡ標準を、ＱＩＡ−ｓｙｍｐｈｏｎｙプラットフォーム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてラットの尾から精製し、製造者のプロトコル（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、ＱＩＡＧＥＮチップ２５００を用いて、その後の陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によってさらに精製した。上記ｇＤＮＡを、−２０℃にてアリコートで保存し、使用直前に解凍した。
【００６４】
実施例１：ドデシル硫酸イオンおよびストロンチウムイオンから形成される沈殿物の除去
本願と同じ出願日を有する同じ出願人の、表題「ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」、および本願と同じ出願日を有する同じ出願人の、表題「ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ  ａｎｉｏｎｉｃ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」を有する同時係属中の出願は、界面活性剤イオンの供給源を含む新しい溶解バッファー、ならびに例えば、ストロンチウムイオンを加えることによって、ドデシル硫酸イオンのようなイオンおよびＤＮＡを含む溶液から界面活性剤イオンを選択的に沈殿させる方法を記載する。上記溶解産物からのこれらの沈殿物の除去を最適化するために、ＴＲＩＳおよびＳＤＳを、両方が２５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含み、Ｈ２ＳＯ４の添加によってｐＨ８．５に調整した溶解バッファー中で、上記サンプルを６２℃で４０分間インキュベートすることによって、１０ｍｇの組織の溶解から得られた溶解産物に、異なる量の０．５ＭのＳｒＣｌ２水性溶液（それぞれ２５μＬおよび５０μＬ）を加えた。沈殿溶液を加えた後、その混合物を室温または氷浴（約０℃）で１０分間インキュベートした。形成された沈殿物を、次にそれぞれ、遠心分離によってか、または６００μＬのＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓ１０００  ＳＦマトリックス（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で充填された短いゲル濾過カラム上での濾過によって除去した。
【００６５】
結果を図２Ａ（左側）および２Ｂ（右側）に表す：図２Ａは、それぞれ遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆ）およびゲル濾過クロマトグラフィー（ｆｉｌｔ）後の上清／溶出液に存在するＳＤＳの残留量［μｍｏｌ／Ｌ］を示す。上記溶液からＳＤＳを除去することにおいて、ゲル濾過クロマトグラフィーが遠心分離よりもずっと有効であることが分かり得る。上記溶出液における残留ＳＤＳの最も低い量は、上記サンプルが氷浴でインキュベートされるときに見出された。この場合、精製後に上記溶出液において検出される残留ＳＤＳの量に関して、上記溶解産物に加えられる沈殿溶液の量を２倍にするときに利益はなかった。図２Ｂから分かり得るように、塩化ストロンチウムはまた、残留タンパク質を沈殿させることにおいて有効である。沈殿溶液による低いサンプル希釈度を確実にするために、上記沈殿溶液におけるＳｒＣｌ２の濃度を１．０Ｍに調整し、１０μＬのこの沈殿溶液は、８０μＬの上記溶解バッファー中の１０ｍｇの組織をインキュベートすることによって得られる溶解産物から、ドデシル硫酸イオンおよび残留タンパク質の沈殿をもたらすのに十分であった。
【００６６】
実施例２：上記溶解産物からのｇＤＮＡの精製のために使用されるスピンカラムの最適化
実施例１により、ＳｒＣｌ２溶液の添加後に形成される沈殿物の除去において、濾過がシンプルな遠心分離よりも有効であることが明らかになった。従って、ゲル濾過クロマトグラフィーに必要なマトリックスの最小限の量を、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓ１０００  ＳＦマトリックスを用いて決定した。結果を他の濾過方法、特にＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、シリカフリット（Ｍａｔ．Ｎｏ：１０１６８４４，ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、シリカ粒子のベッド（ＱｉａＥｘＩＩ，ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通した濾過、ＭｉｎｉＳａｒｔフィルター（Ｓａｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の０．２μｍ膜を通した滅菌濾過、および市販のＧ２５スピンカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と比較した。
【００６７】
１ＭのＳｒＣｌ２溶液１０μＬを、実施例１において記載されるように得られた８０μＬの溶解産物に加えた。その混合物を氷浴においてインキュベートし、次に異なる濾過デバイスに適用した。移動相を、遠心分離を用いて上記濾過デバイスを通して移動させ、得られた溶出液を収集および分析した。各実験を二重で実施した。各溶出液について、存在する精製されたｇＤＮＡの量を、一般方法に記載されるように決定した。ＳＤＳの量を、一般方法に記載されるプロトコルに従って、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法によって決定した。さらに、上記溶出液におけるイオンの存在を、一般方法に従う伝導度測定によって決定した。結果を図３に表す。ｇＤＮＡの量をμｇで示し、ＳＤＳの量をμｍｏｌ／Ｌで示し、そして２０μＬの溶出液を１．９８０μＬの水で希釈後の伝導度をμＳで示した。
【００６８】
図３から分かり得るように、従来のフリット、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラム、およびＭｉｎｉＳａｒｔフィルターは、ＳＤＳまたは他の塩を除去することにおいて有効ではない。市販のＧ２５スピンカラムは、上記サンプルに存在するＳＤＳの約２／３を除去することができるが、上記溶出液における残留ＳＤＳの量は、上記溶出液をその後のＰＣＲ反応に直接使用するには依然として高すぎる。シリカ粒子のベッドを用いて、再現可能な結果は全く得られず、種々の実験の結果は互いに大きく離れていた。さらに、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラムおよびＭｉｎｉＳａｒｔフィルターを用いて得られる上記溶出液は、黄色を示した。
【００６９】
Ｓ１０００マトリックスを用いた、４００μＬ以下のマトリックス量は、固定アングルローターを用いた遠心分離の間に均一ゲルベッドを形成するのに十分ではなかった。２．５ｃｍのカラムの高さ、および０．８ｃｍ〜０．９ｃｍの内径を有するスピンカラムにおいて、均一ゲルベッド形成を確実にするのに必要なマトリックスの最低限の量は、６００μＬであった。
【００７０】
スピンカラムを用いるゲル濾過クロマトグラフィーにおいて一般的に観測される問題は、溶解産物が上記ゲルベッドに入ることなく上記スピンカラムの内壁を流れ落ちて上記フリットを通過し得るという事実である。これは、幾分大きいサンプル体積がカラムにのせられるとき、または上記サンプルが上記ゲルベッドの中央に厳密にのせられないときに特に言える。結果として、その夾雑物質は、これらのサンプルにおいて除去されない。この問題は、好ましくは、上記有孔のフリット、フィルター、フリース、または膜と上記マトリックスとの間に置かれて、上記フリット、フィルター、フリース、または膜の外側領域を塞いで、移動相が上記マトリックスを通ることなく上記フリットに入ることを防ぐ、非有孔の環を導入することによって克服され得る。
【００７１】
次のステップにおいて、マトリックスベッドの最適なサイズ排除限界を決定した。６００μＬの異なる市販のゲル濾過マトリックス（球形のアリルデキストランおよびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドのマトリックスを含むＳｅｐｈａｃｒｙｌ樹脂）を、密なシリカフリット（Ｍａｔ．Ｎｏ．１０１７４９９，ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、プラスチック環、およびスクリューキャップを備える、図１に記載されるようなスピンカラムに充填した。使用される上記樹脂のサイズ排除限界を表１に示す（示される限り、それぞれ塩基対（ｂｐ）またはｋＤａ）。
【００７２】
【表１】
2013528786.tif 000002
【００７３】
全ての樹脂を使用前に水中で平衡にした：１０ｍＬの樹脂を４０ｍＬの水と混合し、上記樹脂を１０ｍＬの堆積物が得られるまで沈降させ、その上清（水）を捨てた。この手順を３回繰り返した。最終的に、懸濁された樹脂の体積を水の添加によって１０ｍＬに調整した。７００×ｇで３分間の前もって遠心分離するステップ（前もって回転させるステップ）においてゲルベッドを確立することにより、使用のためのカラムを調製した。各カラムについて、上記沈殿物を含む、上に記載されるように１０ｍｇの組織から得られた全溶解産物を、上記ゲルベッドの上部表面の中央にのせた。ＤＮＡを次に、７００×ｇで３分間上記カラムを回転させることによって溶出した。各実験を、少なくとも二重で実施した。上記溶出液に存在するｇＤＮＡおよびＳＤＳの量を上に記載されるように測定した。上記サンプルの伝導度を、プールされたサンプルの希釈した溶液を用いて決定し、ここで、同じ樹脂を用いて精製された全てのサンプルを合わせた。結果を図４に描く。全ての樹脂は、上に述べられる濾過方法と比較して、上記サンプルに存在するＳＤＳおよびさらにイオンの量を著しく低減するのに適している。Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇｅｒら（Ｄ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９５，４，３６８−３７０）によると、サンプルにおける３４５μｍｏｌ／Ｌを超えるＳＤＳ濃度は、完全にＰＣＲ反応を阻害する。リアルタイムＰＣＲ反応について、ＳＤＳの許容できる最大限の量は約２５０μｍｏｌ／Ｌである。Ｓ４００  ＨＲ樹脂を用いて、上記サンプルからＳＤＳを完全に除去することが可能である。この樹脂はまた、ＲＮＡの残留小フラグメントを除去することにおいて有用であることを証明した。
【００７４】
実施例３：上記溶出液のＰＡＧＥ分析
精製プロセスにおけるタンパク質除去の程度を評価するため、およびゲル濾過クロマトグラフィー後に得られる上記溶出液に存在するタンパク質の残留量を決定するために、Ｓ４００  ＨＲ樹脂を用いて実施例２に従って精製されたサンプルを、ＳＤＳを含む市販のＴＲＩＳ／ＨＥＰＥＳ４〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲル（ＬＴＦ−ＬＡＢＯＲＴＥＣＨＮＩＫ）において、ＰＡＧＥ分析によって分析した。上記ゲルを、ＮＯＶＥＸ  ＸＣｅｌｌ  ＩＩシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、供給されたＴＲＩＳ／ＨＥＰＥＳバッファーにおいて、１００ボルトで２５分間泳動した。上記ゲルとともに提供された１５μＬの２×バッファーで、タンパク質サイズマーカーをスパイクした上記サンプル１５μＬを希釈した。その混合物を９５℃まで５分間加熱し、次に氷浴において冷却し、その後、上記ゲルのポケットに載せた。上記ゲルを、Ｇｒａｄｉｐｕｒｅ染料（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に浸すことによって一晩染色し、次に水ですすいだ。結果を図５に表す。「Ｌ」と名付けられたレーンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＳｅａＢｌｕｅタンパク質標準である。レーン１において、上に記載される溶解バッファーを用いて１０ｍｇのブタ肝臓組織から得られた１５μＬの粗製溶解産物を分析した。レーン２において、１５μＬの同じ溶解産物を、上に記載される沈殿溶液の添加後に分析した（濾過ステップなしで）。比較として、レーン３において、ＱＩＡａｍｐ  Ｋｉｔを用いて得られ、１５μＬのＲｎアーゼＡでさらに処理された１５μＬの溶解産物を分析した。レーン４において、ＲＮアーゼを加えずにＱＩＡａｍｐキットを用いて得られた１５μＬの溶解産物を分析した。比較として、ＱＩＡＧＥＮプロテアーゼおよびＲＮアーゼＡを、それぞれレーン５および６において分析した。レーン７〜９のそれぞれにおいて、本発明に従うゲル濾過クロマトグラフィーによる精製後に得られた、上記溶出液のアリコート２０μＬを分析した（全体で１００μＬの溶出液を得た）。レーン１０および１１において、ＱＩＡａｍｐキットを用いることによって得られた、上記溶出液のアリコート２０μＬを分析した（全体で４００μＬの溶出液を得た）。多くの量のタンパク質が、塩化ストロンチウムの添加によって、すでにＳＤＳと一緒に同時沈殿することが分かり得る。タンパク質の残りの量は、本発明に従うゲル濾過クロマトグラフィーによって効率的に除去され得、本発明の方法を用いて得られる結果は、特にＱＩＡａｍｐキットから得られる溶出液の希釈度が４倍高いことを念頭に置くと、市販のＱＩＡａｍｐキットを用いて得られる結果と同等である。肺のサンプルおよびマウスの尾から得られる結果は同等である（データを示さず）。
【００７５】
実施例４：上記溶出液のＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析
微量の残留夾雑物質（例えば、タンパク質およびＲＮＡフラグメント）を検出するために、陰イオン交換（ＡＥＸ）ＨＰＬＣ分析を、ＴＭＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｓ  ＨＰＬＣカラムにおいて、ｐＨ７．２、１．５ｍＬ／分の流量で、ＣａＣｌ２勾配を用いて行った。３５容のカラム体積にわたって、５％のＴＲＩＳ（ｐＨ７．２）を含む、水中０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２の範囲に及ぶ勾配を確立した。注入体積として２００μＬを使用した。
【００７６】
最初の実験において、上に記載されるバッファーを用いてＲＮアーゼの存在なしで１０ｍｇのブタ肝臓組織をインキュベートすることから得られる、２００μＬの粗製溶解産物を分析した。７つの画分をＨＰＬＣから収集し、一般方法に従って色素Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌと反応させ、引き続いてアガロースゲルにおいて分析した。ＨＰＬＣクロマトグラムおよびアガロースゲルのフォトグラムを図６に描く。
【００７７】
画分１および２は、上記色素と反応しなかった。このことは、ＳＤＳおよび核酸の濃度が、２１μｍｏｌ／ＬのＳＤＳの検出限界より下であることを示す。画分３および４は、上記色素を加えると青色を示した。このことは、アガロースゲルにおいてＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ  ＩＩで染色し得ない、ヌクレオチドまたは可溶性タンパク質の存在を示す。画分５および６を、ＲＮＡに代表的である伝導度で溶出し、アガロースゲルにおいて１００ｂｐよりも小さい核酸のかすかなバンドを得たが、画分７は、ゲノムＤＮＡを含んだ。
【００７８】
さらなる実験において、本発明のデバイスおよび方法を用いて精製されたサンプルと、市販のＱＩＡａｍｐキットを用いて精製されたサンプルとを、ＨＰＬＣ分析によって比較した。ゲノムＤＮＡの量を決定するために、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡの漸増量を用いた較正曲線を使用して、ｇＤＮＡ溶出ピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を、上記カラムに載せたｇＤＮＡの量に関連づけた。図７において、本発明を用いて精製したサンプル（ａ）およびＱＩＡａｍｐ  Ｋｉｔを用いて精製したサンプル（ｂ）の重ね合わされたクロマトグラムを表し、両方のトレースを２６０ｎｍの波長で監視した。本発明に従って精製した５０μＬの上記溶出液から得られた収量（図７におけるトレース）は、ＱＩＡａｍｐ  Ｋｉｔを用いて得られた２００μＬの溶出液から得られたｇＤＮＡの量と比較して、著しくより高かった（比較として、図７におけるトレースａおよびｂを、一般的な注入体積に対して正規化した）。これにより、上記溶出液における高濃度のｇＤＮＡが、本発明の精製方法を用いて達成され得ることが実証される。残留タンパク質および他の不純物の量は、ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるそれぞれのピークの統合によって決定されるように、両方のサンプルにおいて同等であった。本発明に従って精製した上記サンプルに存在するｇＤＮＡの量は、較正曲線を用いて決定された９．２μｇであったが、ＱＩＡａｍｐ  Ｋｉｔを用いて得られたｇＤＮＡの量は６．２μｇであった。
【００７９】
実施例５：ＵＶ／Ｖｉｓ分光法を用いた、上記溶出液におけるｇＤＮＡの収量および純度の決定
１０ｍｇのブタ肝臓の１２サンプルを、ゲル濾過ステップにおいて溶離剤として水を用いて本発明の方法に従って溶解および精製し、同じ溶離剤を用いＱＩＡａｍｐカラムを用いて精製した１０ｍｇのブタ肝臓の６サンプルと比較した。結果を図８に示し、それはＨＰＬＣ分析によって得られた結果を支持する。ｇＤＮＡがその最大の吸光度を有する、２６０ｎｍの波長での吸光度は、本発明に従う方法によって精製される上記サンプルにおいて、ＱＩＡａｍｐで精製したサンプルにおけるものよりも常に高かった。さらに、ベースラインは、本発明に従って精製された上記サンプルのスペクトルにおけるベースラインと比較して、上記ＱＩＡａｍｐで精製したサンプルのスペクトルにおいて上昇し、そのことは、上記ＱＩＡａｍｐで精製したサンプルにおいて、より多量の残留固体粒子を示し得る。
【００８０】
実施例６：精製したラットの尾のｇＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析
本発明に従って精製された上記サンプルにおいて、ＰＣＲインヒビターが全く存在しないことを確実にするために、ラットの尾のサンプル２０ｍｇを、上に記載されるように溶解し、上に詳細されるように本発明の方法に従って精製した。これらの精製したサンプルを次に、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅシステム（Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）におけるｊｕｎ−システムを用いて、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）において分析し、ＡＥＸクロマトグラフィーを用いて、ｇＤＮＡを用いて得られた結果と比較した。２０×ｊｕｎ  ＰＣＲプライマー／プローブ混合物を含む市販のプライマー／プローブシステム（ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの２×ＴＡＱｍａｎ  ＰＣＲユニバーサルマスター混合物と組み合わせて使用した。ＲＴ−ＰＣＲを製造者の指示に従って実施した。特に、ポリメラーゼ活性化を、混合物を２０分間、９５℃まで加熱することによって実施し、サイクルを９５℃で１５秒間、二重鎖を融解することによって実施し、アニーリングを６０℃で６０秒間実施した。全体で、４０サイクルを行った。その反応混合物は、２２．５μＬのｇＤＮＡ含有サンプル、２５μＬの上記マスター混合物、および２．５μＬの上記プライマー混合物からなった。本発明に従って精製されたサンプルを、ＰＣＲにおける鋳型として、希釈していない形態で、および水での希釈（係数１０、１００および１０００）後に使用した。上記サンプルにおける高濃度のｇＤＮＡに起因して、希釈していないサンプル（図９における曲線１）は、幾分強い生成物阻害を示したが、希釈係数に関わらず、本発明の方法によって精製された全サンプルの配列を増幅することは可能であった。水で１０倍希釈した上記サンプル（曲線２）は、弱い阻害のみを示した。増幅前に１００倍、または１０００倍に希釈した上記サンプルにおいて、それぞれ阻害を観測しなかった（曲線３および４）。比較として、標的の存在なしで反応がまた行われ（標的反応なし、ＮＴＣ）、ＡＥＸクロマトグラフィーによって精製された３つのサンプルを、同じ条件下でも増幅した。
【００８１】
ＱＩＡａｍｐキットを用いて溶解および精製されたサンプルと比較して、上に記載されるように溶解され、本発明に従って精製された１０ｍｇの凍結肝臓組織に由来するサンプルで同様の結果を得た。図１０は、異なる希釈度の上記精製されたサンプルを用いて、ｊｕｎアッセイにおけるこれらのサンプルのＲＴ−ＰＣＴにおいて得られたＣＴ値の比較を示す。再度、生成物阻害を、本発明によって精製された希釈していないサンプルを用いた反応において観測する。本発明に従って精製された、それぞれ１０倍、１００倍、および１０００倍希釈したサンプルから得られたＣＴ値は、ＱＩＡａｍｐで精製したサンプルを用いて得られたＣＴ値よりも常に低かった。このことは、より多量の、本発明に従って精製された上記サンプルに存在するｇＤＮＡを示す。
【００８２】
実施例７：本発明の方法によって、およびＱＩＡａｍｐキットを用いることによって異なる組織サンプルから得られた、ｇＤＮＡの収量の比較
表２に列挙される異なる組織のサンプルを、上に記載されるように溶解し、ストロンチウムイオンを加えることによって上記溶解産物からＳＤＳを沈殿させるか、または上記サンプルをＱＩＡａｍｐプロトコルに従って溶解した。溶解（および適用可能な場合、ドデシル硫酸イオンの沈殿）後、同じ精製方法によって同じ種類の組織から得られた上記サンプルをプールし、次に１００μＬのアリコートに分けた。これらのアリコートを、本発明の方法に従って、またはＱＩＡａｍｐプロトコルに従って、それぞれ精製した。上記サンプルに存在するｇＤＮＡの量を、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法および／またはＨＰＬＣ分析によって分析した。得られた平均結果を表２に示す。
【００８３】
【表２】
2013528786.tif 000003
【００８４】
実施例８：ヒト血液サンプルの溶解および精製
血液サンプルの高い液体含有量に起因して、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴＲＩＳおよび５０ｍｍｏｌ／ＬのＳＤＳを含み、Ｈ２ＳＯ４の添加によってｐＨ８．５に調整した２倍濃縮溶解バッファー（２×）を、細胞の溶解のために使用した。同じドナーからのヒト血液４０μＬの２つのサンプルを、等量の２×溶解バッファーと混合した。血液タンパク質を次に１０μＬのＱＩＡＧＥＮプロテアーゼ（２．５ＡＵ／ｍｌ）の添加によって枯渇させた。上記サンプルを６２℃で１０分間インキュベートした。ＳＤＳを、上に記載されるように沈殿によって上記溶解産物から除去し、上記サンプルを、本発明のスピンカラムを用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。５μＬおよび１０μＬのアリコートを次に、アガロースゲルにおいて分析した（図１１）。ｇＤＮＡバンドは、分析された全てのサンプルにおいて現われたが、より短いフラグメントは、検出できなかった。
【００８５】
上記サンプル内に存在するｇＤＮＡの量の定量化により、１８Ｓ  ｇＤＮＡプライマーを用いて、上記サンプルにおける６００ｎｇのｇＤＮＡの平均収量が明らかになった（２つのサンプルのそれぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲを二重で実施し、ｇＤＮＡの量を、全ての４つの実験からの平均値として決定した）。
【００８６】
実施例９：異なる動物組織サンプルのＲＴ−ＰＣＲ
上に記載されるように溶解され、本発明の方法を用いて精製された、または市販のＤＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いるＤＮｅａｓｙプロトコルに従って、ラットの肝臓、腎臓、および脾臓の組織から得られた、精製ｇＤＮＡ  ５０ｎｇ（ＵＶ／Ｖｉｓ分光法によって見積もられた通り）を、ＲＴ−ＰＣＲの標的として使用した。新鮮組織サンプルおよび凍結組織サンプル、および市販のＲＮＡｌａｔｅｒ試薬（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において安定化されたサンプルを使用した。上記サンプルを次に、ＴＡＱｍａｎシステムにおけるＳＹＢＲ−ＧｒｅｅｎベースのＲＴ−ＰＣＲ反応において分析した。図１２において分かり得るように、ＲＴ−ＰＣＲ反応において得られたＣＴ値は、分析されたサンプルの種類に関わらず、両方の方法について同等である（それぞれ新鮮、凍結、およびＲＮＡｌａｔｅｒにおいて安定化）。１０ｍｍｏｌ／ＬのＴＲＩＳ／ＨＣｌおよび０．５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含み、ｐＨ９．０に調整したバッファーＡＥを、上に記載される手順に従って、上記スピンカラムを平衡化するために、および溶離剤として、使用した。
【００８７】
実施例１０：肝臓サンプルおよび脾臓サンプルからの高分子量ｇＤＮＡの精製
それぞれ２０ｍｇのラットの肝臓組織および脾臓組織を、上に記載されるように溶解し、本発明に従って精製した。溶解は３０分以内に完了した。各実験を二重で実施した。得られた溶解産物におけるｇＤＮＡの質を、ＰＣＲ反応において、およびエチジウムブロマイド染色したアガロースゲルにおいて分析した（図１３）。上記ゲルは過負荷されたにも関わらず、それは高分子量のｇＤＮＡバンドをはっきりと示す。上記サンプルの、２６０ｎｍの波長での吸光度  対  ２８０ｎｍの波長での吸光度の比によって見積もられた、上記サンプルに存在するｇＤＮＡの量、ならびに純度を表３に表す。反応条件は最終的に最適化されなかったが、良好な純度の多量のｇＤＮＡを得た。
【００８８】
【表３】
2013528786.tif 000004
【００８９】
実施例１１：異なるカラムバッファーの比較
凍結ラット肝臓組織のサンプル１０ｍｇを、それぞれ上に記載されるように溶解した。沈殿剤の添加後、上記サンプルを、それぞれ水およびバッファーＡＥにおいて平衡化した、本発明のカラムを用いるゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。さらに、数個のサンプルを２倍濃縮溶解バッファーに溶解し、バッファーＡＥにおいて平衡化した、本発明のスピンカラムを用いるゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。得られた溶出液をゲル電気泳動によって分析し、ｇＤＮＡの量、およびＳＤＳ、ならびに上記溶出液の伝導度を決定した。ＳＤＳは、２つのサンプルにおいてのみ検出された。結果を図１４に表す。
【００９０】
実施例１２：ＦＦＰＥ−組織サンプルからのｇＤＮＡの単離および精製
ラット肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックからの１０μｍの厚さのサンプルを溶解し、ｇＤＮＡを単離し、そしてａ）市販のＱＩＡａｍｐキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびｂ）本発明に従う方法およびデバイスを用いて精製した。
【００９１】
ａ）ＦＦＰＥブロックからの各１０μｍでの３つの切片を、１ｍＬのキシレンにおいて溶解し、１０秒間のボルテックスによって混合し、２分間、全速（ｆｕｌｌ  ｓｐｅｅｄ）で遠心分離した。上清をピペッティングにより除いた。１ｍＬのＥｔＯＨを各サンプルに加えることによって残留キシレンを抽出し、上記サンプルを１０秒間ボルテックスし、それらを２分間、全速で遠心分離し、上清を除いた。上記サンプルを含む口の開いている管（ｏｐｅｎ  ｔｕｂｅ）を室温で２０分間インキュベートして、残留ＥｔＯＨを蒸発させた。得られたペレットを１８０μＬのバッファーＡＴＬ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁させた。各サンプルに、２０μＬのプロテイナーゼＫ（２．５ＡＵ／ｍｌ）（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加え、上記サンプルをボルテックスによって混合した。上記サンプルを９０℃で１時間インキュベートする前に、それらを５６℃で１時間インキュベートした。上記サンプルを室温まで冷却し、次に１μＬのＲＮアーゼＡ（１０Ｕ／ｍｌ）（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を各サンプルに加えた。２００μＬのバッファーＡＬ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を各溶解産物に加え、上記サンプルをボルテックスによって完全に混合した。２００μＬのＥｔＯＨを次に加え、上記サンプルを再度ボルテックスした。上記溶解産物をＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移し、６０００×ｇで１分間遠心分離した。上記ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムを清潔な２ｍＬの収集管内に置き、フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を捨てた。上記カラムを開け、５００μＬのバッファーＡＷ１（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で洗浄し、６０００×ｇで１分間遠心分離した。上記ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムを清潔な２ｍＬの収集管内に置き、フロースルーを捨てた。上記カラムを再び開け、５００μＬのバッファーＡＷ２（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で洗浄し、６０００×ｇで１分間遠心分離した。上記ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムを清潔な２ｍＬの収集管内に置き、フロースルーを捨てた。ほんのわずかなバッファーを除去するために、膜を全速で３分間遠心分離した。ｇＤＮＡの溶出を、清潔な１．５ｍＬのマイクロ遠心分離管において、ＲＮアーゼを含まない水１００μｌを用いて、室温で１分間インキュベートし、全速で１分間遠心分離することによって行った。
【００９２】
ｂ）ＦＦＰＥブロックからの各１０μｍの厚さを有する３つの切片を、１０μＬのＱＩＡＧＥＮプロテアーゼ（２．５ＡＵ／ｍｌ）（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１μＬのＲＮアーゼＡ（７０００Ｕ／ｍｌ）を補充した、８０μＬの上に記載される溶解バッファー（２５ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ／Ｈ２ＳＯ４、２５ｍｍｏｌ／ＬのＳＤＳ、ｐＨ８．５）に溶解した。上記サンプルをボルテックスによって混合した。３つのサンプルを６２℃で３０分間インキュベートし、次に９０℃で１時間インキュベートし、他方、他の３つのサンプルを９０℃で１時間インキュベートする前に５６℃で１時間インキュベートした。各サンプルに１０μＬの沈殿溶液（１ｍｏｌ／ＬのＳｒＣｌ２）を加え、上記サンプルをボルテックスによって混合し、氷上で１０分間インキュベートした。各サンプルを次に、本発明に従って、前もって回転させたスピンカラム（「単一ステップカラム」）に移し、上記カラムを７００×ｇで３分間遠心分離し、他方、ｇＤＮＡを含む溶出液を収集した。
【００９３】
得られたｇＤＮＡの量および質を評価するために、標的として、１８Ｓ  ｒＲＮＡについてコードする遺伝子を用いて、ＴＡＱｍａｎシステムにおいてＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎベースのＲＴ−ＰＣＲを実施した。結果を図１５および１６に表す。ＲＴ−ＰＣＲにおいて得られたＣＴ値が、両方の方法について同等である（本発明によって精製した上記サンプルはわずかにより低いＣＴ値を有する）が、本発明のデバイスおよび方法を用いることによって得られたｇＤＮＡの量は、市販のキットを用いることによって得られたｇＤＮＡの量よりも約１．５倍〜ほとんど約２倍高い。図１６から分かり得るように、溶解時間を１時間まで伸ばすことは、ＦＦＰＥサンプルから得られるｇＤＮＡの収量に対し有利な効果を有する。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
2013528786.tif 000011
【図８ｂ】
2013528786.tif 000012
【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１】
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【図１１】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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