(57)【要約】保存領域全体または保存領域アミノ酸の挿入により作出された１つ以上の中断された可変領域を有する髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス）ＰｏｒＡ構築物が提供される。ＰｏｒＡの高免疫原性の可変領域は、広範囲の保護的でない株特異的免疫応答の誘発を担うので、可変領域の中断は、免疫応答を保存領域エピトープに対して指向させ、より広いスペクトルの髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）株に対して有効に免疫化する。コーディング核酸、遺伝子構築物、ＰｏｒＡ構築物を発現する宿主細胞ならびに髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス）感染を検出および治療するための組成物、キットおよび方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス）のＰｏｒＡタンパク質のアミノ酸配列を含む単離タンパク質であって、前記ＰｏｒＡタンパク質の１つ以上の可変領域が、１つ以上のＰｏｒＡ保存領域、または１個以上の保存領域アミノ酸を含むことにより中断されている単離タンパク質。
【請求項２】
前記１つ以上の可変領域が、ＶＲ１領域；ＶＲ２領域；ＳＶＲ１領域；およびＳＶＲ２領域からなる群から選択される、
請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項３】
前記１つ以上の可変領域が、ＶＲ１領域；およびＶＲ２領域からなる群から選択される、
請求項２に記載の単離タンパク質。
【請求項４】
前記ｐｏｒＡ保存領域が、ループ２、ループ３、ループ７またはループ８のアミノ酸配列であるか、またはループ２、ループ３、ループ７またはループ８のアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む、
請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項５】
前記１つ以上の可変領域、または前記１つ以上の可変領域の１個以上のアミノ酸が不存在である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
【請求項６】
前記１つ以上の可変領域が、その領域に挿入された１つ以上のＰｏｒＡ保存領域、または１個以上の保存領域アミノ酸を含む、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
【請求項７】
配列番号５〜２２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
【請求項８】
配列番号１１〜２２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する、その変異体である単離タンパク質であって、野生型ＰｏｒＡタンパク質でない単離タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離タンパク質の誘導体である単離タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離タンパク質の少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む断片であるか、またはその断片を含む単離タンパク質。
【請求項１２】
対応する野生型ＰｏｒＡタンパク質により誘発されるよりも株特異的でない免疫応答を誘発し得る、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
【請求項１３】
前記免疫応答が、髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）の複数の株に対する保護を提供する、
請求項１２に記載の単離タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離タンパク質を含む外膜タンパク質小胞（ＯＭＶ）。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項１６】
配列番号２６〜４３のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む、
請求項１５に記載の単離核酸。
【請求項１７】
配列番号３２〜４３のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む、
請求項１５に記載の単離核酸。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性のヌクレオチド配列を含む単離核酸。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の単離核酸；および１つ以上の付加ヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞。
【請求項２１】
細菌である、
請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）である、
請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
組換えタンパク質を産生する方法であって、
（ｉ）請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の宿主細胞を、前記組換えタンパク質が前記宿主細胞中で発現されるように培養する工程；および
（ｉｉ）前記組換えタンパク質を単離する工程
を含む方法。
【請求項２４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離タンパク質に結合し、またはその単離タンパク質に対して生成された抗体または抗体断片。
【請求項２５】
哺乳動物において髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）を検出する方法であって、
（ｉ）請求項２４に記載の抗体または抗体断片を、哺乳動物から得られた生体試料と合わせる工程；および
（ｉｉ）前記試料中における、前記抗体または抗体断片と髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）またはＰｏｒＡタンパク質とを含む複合体の存在または不存在を決定する工程
を含み、前記複合体の存在が前記髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）を示す方法。
【請求項２６】
髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）ＰｏｒＡタンパク質に対する抗体を検出する方法であって、
（ｉ）哺乳動物から得られた生体試料を、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離タンパク質と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記試料中の前記単離タンパク質および髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）ＰｏｒＡ抗体を含む複合体の存在または不存在を決定する工程
を含む方法。
【請求項２７】
髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）に対する殺菌性抗体を検出する方法であって、
（ｉ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離タンパク質により免疫化された哺乳動物から得られた生体試料を、髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記試料中の前記殺菌性抗体の存在または不存在を決定する工程
を含む方法。
【請求項２８】
髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）を検出する方法であって、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の単離核酸を使用して、哺乳動物から得られた生体試料中の前記髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）の存在を示す核酸配列を検出する工程を含む方法。
【請求項２９】
前記生体試料がヒトから得られる、
請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）感染を検出するためのキットであって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離タンパク質；請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の単離核酸；および／または請求項２４に記載の抗体もしくは抗体断片；ならびに場合により１つ以上の他の試薬を含むキット。
【請求項３１】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離タンパク質；請求項１４に記載の外膜小胞（ＯＭＶ）；請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の単離核酸；請求項１９に記載の遺伝子構築物；請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の宿主細胞；請求項２４に記載の抗体または抗体断片；および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３２】
ワクチンである、
請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
外膜タンパク質小胞（ＯＭＶ）中の単離タンパク質を含む、
請求項３１または３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
染色体に組み込まれた遺伝子構築物を含む細菌を含む、
請求項３２または３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記細菌が、髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス）である、
請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
哺乳動物において髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）感染を予防または治療する方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離タンパク質；請求項１４に記載の外膜小胞；請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の単離核酸；請求項１９に記載の遺伝子構築物；請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の宿主細胞；請求項２４に記載の抗体もしくは抗体断片；および／または請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与し、それにより前記哺乳動物において前記髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）感染を予防または治療する工程を含む方法。
【請求項３７】
前記宿主細胞が、染色体に組み込まれた遺伝子構築物を含む細菌である、
請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細菌が、髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス）である、
請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記単離タンパク質が、外膜タンパク質小胞（ＯＭＶ）中に存在する、
請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記哺乳動物が、ヒトである、
請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
哺乳動物における髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）感染の予防または治療において使用される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離；請求項１４に記載の外膜小胞；請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の単離核酸；請求項１９に記載の遺伝子構築物；請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の宿主細胞；請求項２４に記載の抗体または抗体断片。
【請求項４２】
染色体に組み込まれた遺伝子構築物を含む細菌である、
請求項４１に記載の使用される宿主細胞。
【請求項４３】
前記細菌が、髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス）である、
請求項４２に記載の使用される宿主細胞。
【請求項４４】
外膜タンパク質小胞（ＯＭＶ）中に存在する、
請求項３１に記載の使用される単離タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））のＰｏｒＡタンパク質の改変形態を構成する新規タンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸、ならびに治療および予防方法、組成物、特にワクチンにおけるそれらの使用に関する。さらに特定すると、ＰｏｒＡの表面ループ中の非保存アミノ酸を中断することにより、本発明は、対応する野生型ＰｏｒＡタンパク質から予期されるよりも広いスペクトルの髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））株に対して有効に免疫化するワクチンにおいて有用であり得るタンパク質およびコーディング核酸を提供する。
【背景技術】
【０００２】
髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））はグラム陰性細菌であり、髄膜炎菌性髄膜炎および敗血症の原因因子である。その唯一の公知の宿主はヒトであり、人口の約１０％により無症状で保有され得る（非特許文献１）。
【０００３】
髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））は、多糖莢膜を発現し得、このことにより、発現される莢膜の性質による細菌の分類が可能となる。髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）の少なくとも１２の血清学的グループ：Ａ、Ｂ、Ｃ、２９−Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｗｌ３５、Ｘ、ＹおよびＺが存在し、そのうち血清学的グループＡ、Ｂ、およびＣは、髄膜炎菌性疾患の９０％を引き起こす（非特許文献２）。血清学的グループＡおよびＣに対して指向されたワクチンが利用可能であるが、血清学的グループＢ莢膜多糖は、免疫原性が不十分であり、ヒトにおける保護を誘導しない。
【０００４】
したがって、他の膜および細胞外構成成分がワクチン中の包含についてのそれらの好適性について試験されている。例には、クラス１、２および３（ポーリン；ｐｏｒ遺伝子によりコードされる）ならびにクラス４（Ｒｍｐ）および５（不透明（Ｏｐａｃｉｔｙ）タンパク質；ｏｐａおよびｏｐｃ遺伝子によりコードされる）の外膜タンパク質が含まれる。しかしながら、髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）は、抗原性および相可変性により免疫応答を回避するのに極めて有効である。例えば、Ｏｐｃタンパク質は、その発現が相可変性（非特許文献３）であるにもかかわらず、経路変更（高免疫原性移動標的、特にＰｏｒＡに対する免疫応答の発生）により高度に免疫原性（非特許文献４）であるアドヘシン／インベイシン（非特許文献５）である。
【０００５】
ＰｏｒＡは株間で非常に多様性が高く、患者および無症状保有者の両方で免疫応答を、それが株同定のためのマーカとして使用される程度に発生させ、そのことは血清亜型系を表す（非特許文献６）。ＰｏｒＡは重要な抗原であり、これまでの有効で登録されたワクチン配合物中で使用されており、有効な殺菌性抗体を誘発するための理想的な抗原とみなされる。しかしながら、表面ループの株間多様性は多様性標的をもたらし、ワクチンは、典型的にはＰｏｒＡ型特異的である。最大６つの異なるＰｏｒＡ型をカバーする多価ＰｏｒＡワクチンを発生させるための試みがなされている（非特許文献７）が、この標的は、過剰に多様性があると判断されており、近年のワクチン開発は主としてその理由のためにこの抗原から遠ざかっている。
【０００６】
ＰｏｒＡモノマートポロジーの現行モデルは、８つの細胞外ループを示す（非特許文献８）；（非特許文献９）。最長ループ（１および４）は最も多様性が高く、したがって可
変領域１（ＶＲ１）および可変領域２（ＶＲ２）と称される。ループ５および６においては多様性が低く（それぞれ、半変異ＳＶＲ１および２）、残りのループにおいては本質的には多様性が見られない。ループ３は、ＰｏｒＡトリマーのそれぞれのサブユニットにより形成される細孔中で「プラグ」を形成すると予測される。ＶＲ１およびＶＲ２内でさえ、多様性のほとんどは、それぞれのループのチップを形成することが予測される残基に制限される。実際、マウスおよび免疫化ヒト被験者の両方で、エピトープマッピングは、抗体応答の大多数が、株間で多様性の高い領域ループ１および４の「頂部」に指向されることを示し（非特許文献１０）、抗ＰｏｒＡ応答の株特異性が推定的に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】カウガント（Ｃａｕｇａｎｔ）ら，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２  ３２３
【非特許文献２】プールマン（Ｐｏｏｌｍａｎ）ら，１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓ．４  １３
【非特許文献３】サルカリ（Ｓａｒｋａｒｉ）ら，１９９４，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３  ２０７−１７
【非特許文献４】ヴィエルス（Ｗｉｅｒｔｚ）ら，１９９６，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ６４  ２９８−３０４
【非特許文献５】ヴァージ（Ｖｉｒｊｉ）ら，１９９５，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８  ７４１−５４
【非特許文献６】マクギネス（ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ）ら，１９９０，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７１  １８７１−８２
【非特許文献７】ヴァンデルフォールト（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｏｏｒｔ）ら，１９９６，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６４  ２７４５−５１
【非特許文献８】デリック（Ｄｅｒｒｉｃｋ）ら，１９９９，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７  ２４０６−１３
【非特許文献９】ヴァンデルレイ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙ）ら，１９９１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９  ２９６３
【非特許文献１０】ヴァンデルフォールト（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｏｏｒｔ）ら，１９９７，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７  １３９−４８
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の単離タンパク質の実施形態と比較した野生型ＰｏｒＡのアミノ酸配列の一覧を示す図。太字下線は、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙモデルループ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙら，１９９１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９  ２９６３）を示す。イタリックはＶＲ１およびＶＲ２を示す。−はアラインメントを達成するための空間の挿入を示す。野生型ＭＣ５８株ＰｏｒＡアミノ酸配列（配列番号１）；ｐＰｏｒＤＥＬＬ１（配列番号２）；ｐＰｏｒＤＥＬＬ４（配列番号３）；ｐＰｏｒＤＥＬＬ１−４（配列番号４）；ｐＰｏｒＤＥＬＬ１−４−５（配列番号５）；ｐＤＥＬＶＲ１（配列番号６）；ｐＤＥＬＶＲ２（配列番号７）；ｐＤＥＬＶＲ１−２（配列番号８）；ｐＤＥＬＶＲ１−２−５（配列番号９）；ｐＤＥＬＶＲ１−２−５−６（配列番号１０）；ｐＶＲ２−７（配列番号１１）；ｐＶＲ２−８（配列番号１２）；ｐΔＶＲ１ＶＲ２−７（配列番号１３）；ｐΔＶＲ１ＶＲ２−８（配列番号１４）；ｐＶＲ１−７ＶＲ２−８（配列番号１５）；ｐＶＲ１−７ＶＲ２−８Δ５（配列番号１６）；ｐＰＯＲ７ｉｎ１；（配列番号１７）；ｐＰｏｒ８ｉｎ４（配列番号１８）およびｐＰＯＲ７ｉｎ１、８ｉｎ４（配列番号１９）。
【図２Ａ−１】本発明の単離タンパク質の実施形態のアミノ酸配列（配列番号２〜１８；図１参照）および以下のコーディングヌクレオチド配列を示す図：ｐＰｏｒΔＬ１（配列番号２３）；ｐＰｏｒΔＬ４（配列番号２４）。
【図２Ａ−２】本発明の単離タンパク質の実施形態のアミノ酸配列（配列番号２〜１８；図１参照）および以下のコーディングヌクレオチド配列を示す図：ｐＰｏｒΔＬ１−４（配列番号２５）；ｐＰｏｒＤＥＬ１−４−５（配列番号２６）。
【図２Ａ−３】本発明の単離タンパク質の実施形態のアミノ酸配列（配列番号２〜１８；図１参照）および以下のコーディングヌクレオチド配列を示す図：ｐＤＥＬＶＲ１（配列番号２７）；ｐＤＥＬＶＲ２（配列番号２８）。
【図２Ａ−４】本発明の単離タンパク質の実施形態のアミノ酸配列（配列番号２〜１８；図１参照）および以下のコーディングヌクレオチド配列を示す図：ｐＤＥＬＶＲ１−２（配列番号２９）；ｐＤＥＬＶＲ１−２−５（配列番号３０）。
【図２Ａ−５】本発明の単離タンパク質の実施形態のアミノ酸配列（配列番号２〜１８；図１参照）および以下のコーディングヌクレオチド配列を示す図：ｐＶＲ２−７（配列番号３２）；ｐＶＲ２−８（配列番号３３）。
【図２Ａ−６】本発明の単離タンパク質の実施形態のアミノ酸配列（配列番号２〜１８；図１参照）および以下のコーディングヌクレオチド配列を示す図：ｐΔＶＲ１ＶＲ２−７（配列番号３４）；ｐΔＶＲ１ＶＲ２−８（配列番号３５）。
【図２Ａ−７】本発明の単離タンパク質の実施形態のアミノ酸配列（配列番号２〜１８；図１参照）および以下のコーディングヌクレオチド配列を示す図：ｐＶＲ１−７ＶＲ２−８（配列番号３６）；ｐＶＲ１−７ＶＲ２−８Δ５（配列番号３７）。
【図２Ａ−８】本発明の単離タンパク質の実施形態のアミノ酸配列（配列番号２〜１８；図１参照）および以下のコーディングヌクレオチド配列を示す図：ｐＶＲ１−７ＶＲ２−８Δ５（配列番号３７）；ｐＤＥＬＶＲ１−２−５−６（配列番号３１）；ｐＰＯＲ７ｉｎ１（配列番号３８）。
【図２Ａ−９】本発明の単離タンパク質の実施形態のアミノ酸配列（配列番号２〜１８；図１参照）および以下のコーディングヌクレオチド配列を示す図：ｐＰＯＲ７ｉｎ１（配列番号３８）；ｐＰｏｒ８ｉｎ４（配列番号３９）。
【図２Ａ−１０】本発明の単離タンパク質の実施形態のアミノ酸配列（配列番号２〜１８；図１参照）および以下のコーディングヌクレオチド配列を示す図：ｐＰＯＲ７ｉｎ１−８ｉｎ４（配列番号４０）。野生型ＭＣ５８株ｐｏｒＡヌクレオチド配列も提供される（配列番号４４）。
【図２Ｂ−１】ＶＲ１および／またはＶＲ２領域が欠失され、保存ループ７またはループ８アミノ酸により置き換えられた本発明の単離タンパク質のさらなる実施形態のアミノ酸配列およびコーティング核酸を示す図。ＡＡ配列ｐＶＲ１−７ＶＲ２−７（配列番号２０）；ＶＲ１８ＶＲ２８（配列番号２１）；ＤＮＡ配列ｐＶＲ１−７ＶＲ２−７（配列番号４１）；ＤＮＡ配列ｐＶＲ１−８ＶＲ２−８（配列番号４２）。
【図２Ｂ−２】ＶＲ１および／またはＶＲ２領域が欠失され、保存ループ７またはループ８アミノ酸により置き換えられた本発明の単離タンパク質のさらなる実施形態のアミノ酸配列およびコーティング核酸を示す図。ＡＡ配列ｐＶＲ１−８ＶＲ２−７（配列番号２２）；およびＤＮＡ配列ｐＶＲ１−８ＶＲ２−７（配列番号４３）。
【図３Ａ】ＭＣ５８ならびにＶＲ１、ＶＲ２、ＳＶＲ１およびＳＶＲ２の１つ以上における異なる配列を有する２つの他のＰｏｒＡ野生型の部分アミノ酸配列の一覧を示す図（配列番号８５〜８７）。太字下線は、ＭＣ５８  ＰｏｒＡのｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙモデル（非特許文献９）ループを示す。イタリックはＭＣ５８  ＰｏｒＡのＶＲ１およびＶＲ２を示す。−はアラインメントを達成するための空間の挿入を示す。アラインメント下部の＊は３つ全ての配列における同一残基を示し、点は配列間の保存アミノ酸を示す。
【図３Ｂ】株ＭＣ５８、ＢＺ１３３、ＢＺ２３２、および４００からのＰｏｒＡ配列のアラインメントならびにコンセンサスを示す（配列番号１および８８〜９０）。ループ１、４、５、６、７、および８を強調し、それらは非特許文献９、または非特許文献８のモデルにより記載されるものである。アラインメントにおいて、．はＭＣ５８  ＰｏｒＡと同一の配列を示し、−は配列アラインメントにおけるギャップを示す。コンセンサスにおいて、＊はそれらの配列の全てにおいて保存されたアミノ酸を示す。：は保存残基を示す。．は半保存残基を示す。
【図４】ＰｏｒＡタンパク質構築物のウエスタンブロッティング検出を示す図。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のデオキシコレートＯＭＶをプレキャスト８〜１２％Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ポリアクリルアミドゲル上で分離し、クーマシーブルーにより染色し（左写真）、またはウエスタンブロットした（右写真）。抗ＰｏｒＡポリクローナル抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．））を使用してＰｏｒＡを検出した。レーン１：分子量マーカ（見かけのサイズをｋＤａで左側に示した）。レーン２：¢９  ＯＭＶ、レーン３：９−Ｆｉｘ  ＯＭＶ、レーン４：９−１  ＯＭＶ、レーン５：１７２８−２  ＯＭＶ、レーン６：０２７−３、レーン７：０２８−１０  ＯＭＶ、レーン８：１４５−５  ＯＭＶ。株を表５に記載する。
【図５】ｐｏｒＡタンパク質構築物のウエスタンブロッティング検出を示す図。異なるＰｏｒＡ血清亜型の４つの株およびそれらのアイソジェニックｐｏｒＡ：：ｔｅｔ変異体からのサルコシル（登録商標）抽出により膜タンパク質を調製し、電気泳動により分離してクーマシー染色（上部写真）またはウエスタン免疫ブロッティング（下部写真）を行った。ウエスタンブロットにおけるタンパク質を、株１７２８−２からのデオキシコレートＯＭＶによりワクチン接種された１０匹のマウスからのプール血清により検出した。
【図６】組換えＰｏｒＡ構築物を発現する株由来のＯＭＶによりワクチン接種されたマウスの血清のＥＬＩＳＡ分析：ヘテロロガスなＰｏｒＡの表面エピトープに対する交差反応性の検出を示す図。幾何平均力価データ（３重ウェルから）の逆数を実験１（Ａ）および実験２（Ｂ）について示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明者らは、ＰｏｒＡの高免疫原性の表面ループが、髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）の特定株由来のＰｏｒＡタンパク質を包含するワクチンがその特定株に対して優先的に免疫化する傾向があるといったように、広範囲の保護ではない株特異的免疫応答の誘発を担うことを発見した。結果として、本発明者らは、野生型ＰｏｒＡにより誘発されるほど株特異的でない免疫応答を誘発するＰｏｒＡタンパク質を産生することを追求した。免疫応答を主として保存エピトープに対して指向することにより、単離タンパク質を含むワクチンは、野生型ＰｏｒＡによる免疫化後に予期されるよりも広いスペクトルの髄膜炎菌（Ｎ．メニンギティディス）株に対して有効に免疫化するはずである。
【００１０】
第１の態様において、本発明は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＰｏｒＡタンパク質のアミノ酸配列を含む単離タンパク質であって、前記ＰｏｒＡタンパク質の可変領域の１個以上のアミノ酸が中断されている単離タンパク質を提供する。
【００１１】
好適には、前記ＰｏｒＡタンパク質の可変領域の１個以上のアミノ酸が、１つ以上のＰｏｒＡ保存領域、または１個以上の保存領域アミノ酸を含むことにより中断されている（例えば、野生型ＰｏｒＡタンパク質と比較して）。好ましくは、保存領域は、保存ループ２、保存ループ３、保存ループ７および／または保存ループ８のアミノ酸配列であり、またはそのアミノ酸配列を含む。
【００１２】
好適には、可変領域は、ＶＲ１；ＶＲ２；ＳＶＲ１；およびＳＶＲ２領域からなる群から選択される。
好ましくは、可変領域は、ＶＲ１；およびＶＲ２領域からなる群から選択される。
【００１３】
可変領域および保存領域は、同一または異なるＰｏｒＡタンパク質のもの、そのタンパク質由来であり、またはそのタンパク質起源であり得る。
好適には、本発明の単離タンパク質は、免疫応答を誘発し得る。
【００１４】
好ましくは、免疫応答は、対応する野生型ＰｏｒＡタンパク質により誘発されるよりも株特異的でない。
より好ましくは、前記免疫応答は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の１つ以上の株、またはよりいっそう好ましくは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の複数の株に対する保護を提供する。
【００１５】
この態様の単離タンパク質の特定の実施形態は、この態様の単離タンパク質の具体例に提供され、図１および２に提供される（配列番号１１〜２２）。好ましくは、単離タンパク質は、配列番号１１〜２２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
好ましくは、単離タンパク質の中断された可変領域は、ＶＲ１および／またはＶＲ２領域の欠失（例えば配列番号２〜４に記載のもの）からなることはない。
第１の態様による本発明は、本発明の単離タンパク質のホモログ、断片、変異体および誘導体を含む。
【００１７】
この態様の１つの特定の実施形態において、単離タンパク質は、外膜タンパク質小胞（ＯＭＶ）中に存在する。
第２の態様において、本発明は、第１の態様によるポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。
【００１８】
この態様の単離核酸の具体例は、図２に提供される（配列番号２３〜４３）。好ましくは、単離核酸は、配列番号３２〜４３のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む。
第２の態様による本発明は、本発明の単離核酸のホモログ、断片、変異体および誘導体を含む。
【００１９】
第３の態様において、本発明は、第２の態様による単離核酸および１つ以上の付加ヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を提供する。
好ましい形態において、遺伝子構築物は、発現ベクターおよび第２の態様による単離核酸を含む発現構築物であって、前記単離核酸が前記発現ベクター中の１つ以上の調節核酸に作動的に連結された発現構築物である。
【００２０】
第４の態様において、本発明は、第３の態様による遺伝子構築物を含む宿主細胞を提供する。
１つの好ましい実施形態において、宿主細胞は、染色体に組み込まれた発現構築物を含む細菌である。
【００２１】
好ましくは、細菌は髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）である。
本発明の第５の態様において、第１の態様による組換え単離タンパク質を産生する方法であって、
（ｉ）第３の態様による発現ベクターを含有する宿主細胞を、前記ポリペプチドが前記宿主細胞中で発現されるように培養する工程；および
（ｉｉ）前記組換えポリペプチドを単離する工程
を含む方法が提供される。
【００２２】
第６の態様において、本発明は、本発明の単離タンパク質、その断片、変異体または誘導体に結合し、またはそれらに対して生成された抗体または抗体断片を提供する。
第７の態様において、本発明は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を検出する方法であって、
（ｉ）第６の態様の抗体または抗体断片を、哺乳動物から得られた生体試料と合わせる工
程；および
（ｉｉ）前記試料中の前記抗体または抗体断片と髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および／または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＰｏｒＡタンパク質とを含む複合体の存在または不存在を決定する工程
を含み、前記複合体の存在が前記髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を示す方法を提供する。
【００２３】
第８の態様において、本発明は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＰｏｒＡタンパク質に対する抗体を検出する方法であって、
（ｉ）哺乳動物から得られた生体試料を、第１の態様の単離タンパク質と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記試料中の前記単離タンパク質および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＰｏｒＡ抗体を含む複合体の存在または不存在を決定する工程
を含む方法を提供する。
【００２４】
第９の態様において、本発明は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対する殺菌性抗体を検出する方法であって、
（ｉ）第１の態様の単離タンパク質により免疫化された哺乳動物から得られた生体試料を、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記試料中の前記殺菌性抗体の存在または不存在を決定する工程
を含む方法を提供する。
【００２５】
第１０の態様において、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を検出する方法であって、前記細菌の存在を示す、哺乳動物から得られた生体試料中の第２の態様による核酸配列を検出する工程を含む方法が提供される。
【００２６】
好ましくは、哺乳動物はヒトである。
第１１の態様において、本発明は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染を検出するためのキットであって、第１の態様による単離タンパク質；第２の態様による単離核酸；および／または第６の態様の抗体もしくは抗体断片；ならびに場合により１つ以上の他の試薬を含むキットを提供する。
【００２７】
第１２の態様において、本発明は、第１の態様による単離タンパク質；第２の態様による単離核酸；第３の態様による遺伝子構築物；第４の態様による宿主細胞；および／または第６の態様の抗体もしくは抗体断片；ならびに薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２８】
一実施形態において、医薬組成物は、染色体に組み込まれた発現構築物を含む細菌を含む。
好ましくは、細菌は髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）である。
【００２９】
別の実施形態において、医薬組成物は、外膜タンパク質小胞（ＯＭＶ）中の単離タンパク質を含む。
好適には、医薬組成物は免疫原性組成物である。
【００３０】
好ましくは、医薬組成物はワクチンである。
第１３の態様において、本発明は、哺乳動物において髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染を予防または治療する方法であって、第１の態様による単離タンパク質；第２の態様による単離核酸；第３の態様による遺伝子構築物；第４の態様による宿主細胞
；第６の態様の抗体もしくは抗体断片；および／または第１２の態様による医薬組成物を哺乳動物に投与し、それにより前記哺乳動物において前記髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染を予防または治療する工程を含む方法を提供する。
【００３１】
一実施形態において、本方法は、染色体に組み込まれた発現構築物を含む細菌を投与する。
好ましくは、細菌は髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）である。
【００３２】
別の実施形態において、本方法は、外膜タンパク質小胞（ＯＭＶ）中の単離タンパク質を投与する。
好ましくは、上記態様の哺乳動物はヒトである。
【００３３】
本明細書を通して、文脈が特に要求しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、指定の整数または整数群を包含することを意味するが、任意の他の整数も整数群も除外しないと理解される。
【００３４】
本発明の中心は、野生型ＰｏｒＡタンパク質における非保存アミノ酸を含む表面ループを中断することにより、免疫応答が保存エピトープ配列に対して指向され、それにより髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の複数のヘテロロガスな株に対する保護を提供する免疫応答を免疫化時に誘発することができることの発見であることが認識される。
【００３５】
一態様において、本発明は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＰｏｒＡタンパク質のアミノ酸配列を含む単離タンパク質であって、単離ＰｏｒＡタンパク質が髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の複数の株に対して免疫応答を誘発するように前記ＰｏｒＡタンパク質の１つ以上の可変領域が中断されている単離タンパク質を提供する。好適には、前記ＰｏｒＡタンパク質の可変領域の１個以上のアミノ酸が、１つ以上のＰｏｒＡ保存領域、または１個以上の保存領域アミノ酸を含むことにより中断されている（例えば、野生型ＰｏｒＡタンパク質と比較して）。
【００３６】
本発明の目的のため、「単離された」は、その天然状態から取り出され、またはそうでなければ人間による操作に供された材料を意味する。単離材料は、その天然状態で通常それに伴う構成成分を実質的にも本質的にも有さないことがあり、または、その天然状態で通常それに伴う構成成分と一緒に人工状態になるように操作されることができる。単離材料は、天然（ネイティブ）または組換え形態であり得る。
【００３７】
「タンパク質」は、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、当該技術分野において十分理解されている天然または非天然アミノ酸であり得る。
「ペプチド」は、６０個以下のアミノ酸を有するタンパク質である。
【００３８】
ポリペプチドは、６０個超のアミノ酸を有するタンパク質である。
これに関連して「中断された」は、本発明の単離タンパク質がＰｏｒＡタンパク質（膜貫通および／または細胞内アミノ酸配列を含む）のアミノ酸配列を含む一方、１つ以上の可変領域もしくは１個以上の可変領域アミノ酸が少なくとも部分的に、もしくは完全に不存在であり、１個以上の保存領域アミノ酸により置き換えられていることおよび／または１つ以上の可変領域が、可変領域アミノ酸配列に存在し、もしくは挿入された１個以上の保存領域アミノ酸を有することを意味する。
【００３９】
好適には、可変領域は、ＶＲ１；ＶＲ２；ＳＶＲ１；およびＳＶＲ２領域からなる群か
ら選択される。好ましくは、単離タンパク質の中断された可変領域は、ＶＲ１および／またはＶＲ２領域の欠失（例えば配列番号２〜４に記載のもの）からなることはない。
【００４０】
表１は、ＰｏｒＡ（例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株ＭＣ５８の野生型ＰｏｒＡタンパク質のアミノ酸配列により例示される；配列番号１）の表面または細胞外ループ１〜８を有する、本明細書に記載の可変領域（すなわち、ＶＲ１、ＶＲ２、ＳＶＲ１、ＳＶＲ２）および本明細書に記載の保存領域のアミノ酸配列の比較を提供する。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の多数の株と血清型との間の可変領域アミノ酸配列の多様性を実証する図３Ａおよび３Ｂも参照される。ＶＲ１およびＶＲ２の多様性は、ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｍｌｓｔ．ｏｒｇ／ｎｅｉｓｓｅｒｉａ／ＰｏｒＡ／ｖｒ１．ｓｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｍｌｓｔ．ｏｒｇ／ｎｅｉｓｓｅｒｉａ／ＰｏｒＡ／ｖｒ２．ｓｈｔｍｌを参照して、ならびにラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）ら，２００４，Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１０  ６７４−８に記載のとおり、より詳細に例示される。したがって、本発明は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のいずれの株または血清型のＰｏｒＡにも適用可能であることが認識される。
【００４１】
本発明の単離タンパク質の具体例は、図１および２に提供される（配列番号５〜２２、または好ましくは、配列番号１１〜２２）。
上記可変領域の最も多様性が高いものは、ＶＲ１およびＶＲ２である。ＳＶＲ１およびＳＶＲ２は半可変領域であり、ＳＶＲ１はＳＶＲ２よりも多くの非保存アミノ酸を含む。したがって、好ましくは、中断された可変領域はＶＲ１および／またはＶＲ２領域である。しかしながら、特定の実施形態において、ＳＶＲ１は、単独で、または１つ以上の他の可変領域、例えばＶＲ１および／またはＶＲ２に加えて中断されている。
【００４２】
図３および表１から明らかであるとおり、特に、ループ１、４、５および６は、一般に、本明細書において参照される可変領域と相関する。しかしながら、ＶＲ１は、ループ１の非保存または可変部分配列（例えば、ＡＱＡＡＮＧＧＡＳＧＱＶＫＶＴＫＶＴＫＡ；配列番号４５）であること、およびＶＲ２は、ループ４の非保存または可変部分配列（例えばＹＹＴＫＮＴＮＮＮＬＴＬＶＰ；配列番号４６）であることが認識される。したがって、本発明の単離タンパク質は、ＶＲ１および／またはＶＲ２の中断に加え、ＶＲ１およびＶＲ２の一部でないループ１および／または４の１個以上のアミノ酸の中断を有し得る。
【００４３】
同様に、本発明の単離タンパク質は、ＳＶＲ１および／またはＳＶＲ２の中断に加え、ＳＶＲ１およびＳＶＲ２の一部でないループ１および／または６の１個以上のアミノ酸の中断を有し得る。
【００４４】
ＳＶＲ１およびＳＶＲ２は、クラウディオ（Ｃｌａｕｄｉｏ）ら，１９９８，Ｃｌｉｎ
Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５  ８４５−８５５において、アミノ酸２４７から２６１（ＳＶＲ１）および２９９から３０２（ＳＶＲ２）における株ＭＣ５０（アクセッション番号Ｘ１２８９９）のＰｏｒＡ遺伝子に関連して元々定義された。本明細書に参照されるｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙモデルは、ＬＳＥＮＧＤＫＡＫＴＫＮＳＴＴＥ（配列番号５２；表１参照）を含むループ６を有する。典型的には、排他的ではないが、ＳＶＲ２領域は、図３Ｂに示す一覧のそれらの他の残基の一部に見られる多様性に照らして大多数であるが全てではないループ６アミノ酸、例えばＥＮＧＤＫＴＫＮ（配列番号９１）を含み得る。
【００４５】
上記から理解されるとおり、１つの広範な実施形態において、１つ以上のＰｏｒＡ可変領域全体は、本発明の単離タンパク質中に不存在であり得、または１つ以上のＰｏｒＡ可変領域の１個または複数のアミノ酸が不存在であり得る。ここで、不存在の可変領域または可変領域アミノ酸は、保存ＰｏｒＡアミノ酸、例えばループ２、３、７および／または
８のアミノ酸の１個もしくは複数、または保存ループ全体（例えばループ２、３、７および／または８）により有効に置き換えられる。
【００４６】
特定の実施形態は、配列番号５〜１６および２０〜２２に記載のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態は、配列番号１１〜１６および２０〜２２に記載のアミノ酸配列を含む。
【００４７】
それぞれのＶＲ１、ＶＲ２、ＳＶＲ１および／またはＳＶＲ２領域は、欠失され（例えば配列番号５〜１０）、保存ループ７または８のアミノ酸により置き換えられる（配列番号１１〜１６および２０〜２２）操作が独立して行われ得ることが認識される。このような操作は、可変領域を欠失させることができる一方、別の可変領域を保存ループ７または８のアミノ酸により置き換えるように組み合わされることができ（例えば配列番号１３および１４）、または異なる可変領域がループ７または８のアミノ酸配列により両方置き換えられることができる（例えば配列番号１５、１６および２０〜２２）。
【００４８】
例として、複数の可変領域アミノ酸は、ＶＲ１、ＶＲ２、ＳＶＲ１およびＳＶＲ２を含む任意の可変領域の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２５個以上のアミノ酸であり得る。好適には、アミノ酸は連続している。具体例は表２および３ならびに図１に提供される。
【００４９】
さらに例として、ループ２、３、７または８の複数の保存アミノ酸は、それらのループのいずれか１つの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個以上のアミノ酸であり得る。好適には、アミノ酸は連続している。具体例は表２および３ならびに図１に提供される。
【００５０】
好ましくは、ＶＲ１およびＶＲ２は完全に不存在であり、またはＶＲ１もしくはＶＲ２アミノ酸の１個もしくは複数が不存在である。具体的な実施形態において、ループ７アミノ酸はＶＲ１領域全体を置き換え、および／またはループ８アミノ酸はＶＲ２領域全体を置き換える（配列番号１１〜１６）。他の実施形態において、ＶＲ１領域は不存在であり、保存ループ８またはループ７アミノ酸配列により置き換えられており、および／またはＶＲ１領域は不存在であり、保存ループ７またはループ８アミノ酸配列により置き換えられている（配列番号２０〜２２）。
【００５１】
別の広範な実施形態において、保存アミノ酸（例えばループ２、３、７および／または８アミノ酸）の１個または複数、または保存ループ全体（例えばループ２、３、７および／または８）は、ＶＲ１、ＶＲ２、ＳＶＲ１およびＳＶＲ２を含むＰｏｒＡ可変領域中（またはそうでなければ存在する）に挿入される。好適には、１つまたは複数の可変領域のアミノ酸が存在し、保存ループアミノ酸が可変領域アミノ酸配列中に存在し、または挿入される。
【００５２】
好ましくは、保存ループアミノ酸は、ＰｏｒＡのＶＲ１および／またはＶＲ２領域中に存在し、または挿入される。特定の実施形態は、配列番号１７〜１９に記載のアミノ酸配列を含む。
【００５３】
代替的実施形態において、前記ＰｏｒＡタンパク質の１つ以上の可変領域は、１つ以上のＰｏｒＡ保存領域も１個以上の保存領域アミノ酸も含むことなく中断される（例えば、野生型ＰｏｒＡタンパク質と比較して）。１つ以上のＰｏｒＡ保存領域も１個以上の保存領域アミノ酸も挿入されずまたは存在せずに１つ以上の可変領域が不存在であるこの代替的実施形態の好ましい例は、配列番号５〜１０に提供される。
【００５４】
図１（配列番号１）および表１が髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株ＭＣ５８を指す一方、本発明は髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の任意の株に関して実施することができることも理解される。より具体的には、本発明の単離タンパク質は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の複数の異なる株のアミノ酸配列を含み得る。例にすぎないが、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の２９９６（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ６０１０５．１）株のＰｏｒＡの保存アミノ酸を、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＭ１３３６株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ７０２９７．１）のＰｏｒＡに本質的に由来し、または対応するアミノ酸配列を含むＰｏｒＡタンパク質中に含めることができる。
【００５５】
ＰｏｒＡタンパク質構築物のまとめは、表７に提供される。
１つ以上の可変領域の中断が、単離タンパク質の保存アミノ酸配列の免疫原性の変化、改変またはそうでなければ改善をもたらす（野生型または中断されていないＰｏｒＡタンパク質と比べて）ことが認識される。好適には、本発明の単離タンパク質は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の複数の株に対する免疫応答を誘発する。
【００５６】
本明細書において使用される「免疫応答を誘発する」は、本発明の単離タンパク質の、それが投与される哺乳動物における免疫応答を産生する能力を指し、応答は髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および／または前記タンパク質に指向される。好ましくは、免疫応答は殺菌性抗体の産生を含む。より好ましくは、免疫応答は髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染に対して保護的である。
【００５７】
好適には、誘発された免疫応答は、野生型ＰｏｒＡタンパク質および／または１つ以上の中断された可変領域を有さないＰｏｒＡタンパク質により誘発されるよりも株特異的でなく、または交差反応的である。
【００５８】
「株特異的」は、オートロガスな髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株に指向され、または少なくとも優勢的に指向される免疫応答に関連して本明細書において使用される。
【００５９】
本明細書において使用される「交差反応的」は、本発明の単離タンパク質の、１つ以上のヘテロロガスな髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株に指向される免疫応答を誘発する能力を意味する。
【００６０】
本明細書において使用される「交差保護的」は、本発明の単離タンパク質の、免疫応答を誘発し、それにより１つ以上のヘテロロガスな髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株による感染に対する保護を提供する能力を意味する。
【００６１】
本発明はまた、例えば、配列番号２〜２２、または好ましくは配列番号１１〜２２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む本発明の単離タンパク質の断片、ホモログおよび誘導体を提供する。
【００６２】
一実施形態において、タンパク質「断片」は、前記単離タンパク質の１００％未満であるが少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０〜９９％を構成するアミノ酸配列を含む。
【００６３】
別の実施形態において、「断片」は、例えば、少なくとも６個、好ましくは、少なくとも１０、１２、１５個、より好ましくは、少なくとも２０または３０個のアミノ酸長のペプチドである。
【００６４】
好ましい実施形態において、断片は、本明細書に開示の中断された可変領域のアミノ酸配列を含む。好ましくは、断片は、例えば配列番号２〜４に記載のＶＲ１および／またはＶＲ２領域の欠失からなるものではない。
【００６５】
ペプチド断片は、標準的な組換え核酸技術の適用を介して得ることができ、または慣用の液相もしくは固相合成技術を使用して合成することができる。例えば、ニコルソン（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ）により編集され、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）により刊行された標題「合成ワクチン（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」の刊行物に含まれるアサートン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）およびシェファード（Ｓｈｅｐｈａｒｄ）による標題「ペプチド合成（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」の９章に記載の溶液合成または固相合成を例えば参照することができる。あるいは、ペプチドは、プロテアーゼ、例えばｅｎｄｏＬｙｓ−Ｃ、ｅｎｄｏＡｒｇ−Ｃ、ｅｎｄｏＧｌｕ−Ｃおよびブドウ球菌Ｖ８−プロテアーゼによる本発明のポリペプチドの消化により産生することができる。消化断片は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術により精製することができる。
【００６６】
複数の同一または異なる断片を含むより大きいペプチドおよびポリペプチドが企図されることも認識される。
好適には、本発明の単離タンパク質の断片は、１つ以上の抗原決定基またはエピトープを含む。好ましくは、抗原決定基またはエピトープは、複数の髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株に対する免疫応答を誘発し得る。
【００６７】
免疫原性断片は、断片を哺乳動物に投与し；哺乳動物において免疫応答を検出することにより同定することができる。このような応答には、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および／または前記単離タンパク質、変異体または誘導体に特異的に結合する要素の産生、および／または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染に対する保護効果が含まれる。
【００６８】
場合により、上記方法において免疫原性について特定の断片を試験する前に、種々の予測的方法を使用して特定の断片を使用してネイティブ抗原と交差反応する抗体を得ることができるかどうかを推定することができる。これらの予測的方法は、例えばオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（前掲）の１１．１４章に記載のアミノ末端またはカルボキシ末端配列を基本とし得る。あるいは、これらの予測的方法は、例えば参照により本明細書に組み込まれるキート＆ドーリトル（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７  １０５およびホップ＆ウッズ（Ｈｏｐｐ＆Ｗｏｏｄｓ），１９８３，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０  ４８３）により記載された親水性の予測、または例えば参照により本明細書に組み込まれるチョー＆ファスマン（Ｃｈｏｏ＆Ｆａｓｍａｎ），１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７  ２５１）により記載された二次構造の予測をベースとし得る。
【００６９】
さらに、「エピトープマッピング」は、本発明の抗体を使用して交差反応性エピトープを、最初にそれらの交差反応を提供する能力を試験し、次いで前記抗体により認識されるエピトープを同定することにより同定する。例示的方法は、コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）に提供されている。
【００７０】
本明細書において使用されるタンパク質「ホモログ」は、規定可能なヌクレオチドまたはアミノ酸配列関係を本発明の単離タンパク質と共有する。好適には、ホモログは、野生
型ＰｏｒＡタンパク質と比較して中断された可変領域（例えばＶＲ１、ＶＲ２、ＳＶＲ１および／またはＳＶＲ２）の１個以上のアミノ酸を含む。
【００７１】
好適には、ホモログは、野生型ＰｏｒＡタンパク質ではない。好ましくは、変異体は、例えば配列番号２〜４に記載のＶＲ１および／またはＶＲ２領域の欠失からなるものではない。
【００７２】
好ましくは、タンパク質ホモログは、本発明のアミノ酸配列、例として、限定されないが配列番号５〜２２、または好ましくは配列番号１１〜２２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と、７０％または７５％、好ましくは少なくとも８０％または８５％またはより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。
【００７３】
例えば、本明細書において例示されるものとは異なるが、免疫原性であり、好ましくは交差反応性免疫を提供するアミノ酸配列を有するようなホモログが企図される。
本明細書において使用される用語「ホモログ」は、変異体タンパク質を含む。本明細書において使用される本発明の「変異体」タンパク質は、１個以上のアミノ酸が欠失され、または１個以上のアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている。一部のアミノ酸は、ポリペプチドの免疫原性活性を変化することなく置換または欠失され得ることが当該技術分野において十分理解されている（保存的置換）。
【００７４】
免疫原性に対するより実質的な変更は、より保存的でない置換または欠失を導入することにより行うことができる（非保存的置換）。
用語「変異体」は、アレル変異体から産生され、またはその変異体のアミノ酸配列を含む本発明の単離タンパク質も含む。
【００７５】
反応性タンパク質と核酸との配列関係を記載するために本明細書において一般に使用される用語は、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」および「実質的な同一性」を含む。それぞれの核酸／タンパク質はそれぞれ、（１）核酸／タンパク質により共有される完全な核酸／タンパク質配列の１つ以上の部分のみ、および（２）核酸／タンパク質間で相違する１つ以上の部分を含み得るので、配列比較は、典型的には、「比較ウインドウ」にわたり配列を比較して配列類似性の局所領域を同定および比較することにより実施される。「比較ウインドウ」は、典型的には、参照配列と比較される６、９または１２個の連続残基の概念的セグメントを指す。比較ウインドウは、それぞれの配列の最適アラインメントのために参照配列と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウをアラインメントするための配列の最適アラインメントは、アルゴリズムのコンピュータへの実装（インテリジェネティクス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）によるＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム；参照により本明細書に組み込まれるウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ・リリース７．０（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ，ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ），アメリカ合衆国  ウィスコンシン州  マディソン  サイエンスドライブ５７５）、または調査および選択される種々の方法のいずれかにより作成された最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウにわたり最大百分率のホモロジーをもたらす）により実施することができる。例えば参照により本明細書に組み込まれるアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５  ３３８９により開示されたプログラムのＢＬＡＳＴファミリーを参照することもできる。配列分析の詳細な考察は、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  Ｅｄｓ．オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら．（ジョン・ウィリー＆サン
ズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ）ニューヨーク州，１９９５−１９９９）のユニット１．３に見出すことができる。
【００７６】
用語「配列同一性」は、本明細書において、配列が比較のウインドウにわたり同一である程度を考慮して標準的なアルゴリズムを使用する適切なアラインメントを考慮する正確なヌクレオチドまたはアミノ酸一致の数を含むようにその最も広い意味で使用される。したがって、「配列同一性の百分率」は、比較のウインドウにわたり２つの最適にアラインメントされた配列を比較し、同一核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が両配列中に生じる位置の数を決定して一致位置の数を得、その一致位置の数を比較のウインドウ中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）により割り、その結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることにより算出される。例えば、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳ（登録商標）コンピュータプログラム（ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用バージョン２．５；日立ソフトウェアエンジニアリング社，南サンフランシスコ，カリフォルニア州，アメリカ合衆国から入手可能）により算出された「一致百分率」を意味すると理解することができる。
【００７７】
したがって、本発明のタンパク質および核酸ホモログ、例えば上記定義の変異体を組換えＤＮＡ技術により調製することは十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、本発明の核酸は、例えばトランスポゾン変異導入を使用するランダム変異導入、または部位特異的変異導入を使用して変異させることができる。次いで、得られたＤＮＡ断片を好適な発現宿主、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中にクローニングする。
【００７８】
本明細書において使用される「誘導体」タンパク質は、例えば、翻訳後修飾（例えばリン酸化、アセチル化など）、グリコシル化の改変（例えばグリコシル化の付加、除去または変化）および／または当該技術分野において理解される付加アミノ酸配列の包含により他の化学部分とのコンジュゲーションまたは複合体化により変化されている。
【００７９】
付加アミノ酸配列は、融合タンパク質を作出する融合パートナアミノ酸配列を含み得る。例として、融合パートナアミノ酸配列は、単離融合タンパク質の検出および／または精製を支援し得る。非限定的な例には、金属結合（例えばポリヒスチジン）融合パートナ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、蛍光タンパク質配列（例えばＧＦＰ）、エピトープタグ、例えばｍｙｃ、ＦＬＡＧおよびヘマグルチニンタグが含まれる。
【００８０】
他の誘導体には、ポリペプチドを有する単離タンパク質が含まれ、そのポリペプチドを担体タンパク質として作用するオリゴ糖ベースワクチン構成成分に融合することができる。
【００８１】
本発明により企図される他の誘導体には、限定されないが、側鎖への修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成の間の非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の取り込み、ならびに本発明のポリペプチド、断片および変異体に立体配座制約を付与する架橋剤および他の方法の使用が含まれる。
【００８２】
本発明の別の態様は、本発明の単離タンパク質（その単離タンパク質の断片  変異体および誘導体を含む）をコードする単離核酸を提供する。
本明細書において使用される用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖ＤＮＵおよびＲＮＡを指定する。ＤＮＡには、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡが含まれる。ＲＮＡには、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｃＲＮＡおよび自己触媒ＲＮＡが含まれる。核酸は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであってもよい。核酸は、典型的にはＡ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ塩基を含むヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。しかしながら、ヌクレオチ
ド配列は、他の塩基、例えばイノシン、メチリシトシン、メチルイノシン、メチルアデノシンおよび／またはチオウリジンを含み得るが、それらに限定されない。
【００８３】
「ポリヌクレオチド」は、８０個以上の連続ヌクレオチドを有する核酸である一方、「オリゴヌクレオチド」は、８０個未満の連続ヌクレオチドを有する。
「プローブ」は、好適には、例えばサザンまたはノザンブロッティングにおいて相補的配列を検出する目的のために標識された一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。
【００８４】
「プライマー」は、通常、好ましくは１５〜５０個の連続ヌクレオチドを有し、相補的核酸「テンプレート」にアニーリングし得、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）の作用によりテンプレート依存的に伸長され得る一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００８５】
本発明の単離核酸の特定の実施形態は、図２に記載のヌクレオチド配列（配列番号２６〜４３）を含む。
好ましくは、単離核酸は、配列番号３２〜４３のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む。
【００８６】
本発明の別の特定の態様は、本発明の単離タンパク質をコードする単離核酸のホモログを提供する。
一実施形態において、核酸ホモログは、本発明の単離タンパク質のホモログまたは変異体をコードする。
【００８７】
好適には、核酸ホモログは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の野生型ＰｏｒＡタンパク質をコードしない。好ましくは、核酸ホモログは、本明細書に記載のＰｏｒＡの１つ以上の中断された可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
別の実施形態において、核酸ホモログは、例えば図２および／または配列番号２６〜４３、または好ましくは、配列番号３２〜４３に例示される本発明の単離核酸と、少なくとも６０％または６５％、好ましくは、少なくとも７０％または７５％、より好ましくは、少なくとも８０％または８５％、よりいっそう好ましくは、少なくとも９０％または９５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。
【００８９】
さらに別の実施形態において、核酸ホモログは、本発明の単離核酸（例えば図２および／または配列番号２６〜４３、または好ましくは、配列番号３２〜４３に例示されるもの）に、少なくとも低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは、少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下で、より好ましくは、高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。
【００９０】
「ハイブリダイズするおよびハイブリダイゼーション」は、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを産生するための少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列の対形成を示すために本明細書において使用される。相補的ヌクレオチド配列を含むハイブリッド配列は、当該技術分野において周知の相補的プリンとピリミジンとの間の塩基対形成を介して生じる。
【００９１】
これに関して、修飾プリン（例えば、イノシン、メチルイノシンおよびメチルアデノシン）および修飾ピリミジン（チオウリジンおよびメチルシトシン）も塩基対形成に関与し得ることが認識される。
【００９２】
本明細書において使用される「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーションの間の温度およびイオン強度条件、ならびにある種の有機溶媒および／または洗浄剤の存在または不存在を指す。ストリンジェンシーが高ければ、ハイブリダイズするヌクレオチド配列間の相補性の要求されるレベルが高くなる。
【００９３】
「高いストリンジェンシー条件」は、高頻度の相補的塩基を有する核酸のみがハイブリダイズする条件を指定する。
本明細書における高いストリンジェンシー条件への参照には、
（ｉ）４２℃における、ハイブリダイゼーションのための少なくとも約３１％ｖ／ｖから少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍの塩、ならびに４２℃における洗浄のための少なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍの塩；
（ｉｉ）６５℃における、ハイブリダイゼーションのための１％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、および６５℃超の温度における、約１時間の洗浄のための（ａ）０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；または（ｂ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ；ならびに
（ｉｉｉ）６８℃以上における、約２０分間の洗浄のための０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
が含まれ、包含される。
【００９４】
一般に、洗浄は、Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％−１２℃において実施される。一般に、二本鎖ＤＮＡのＴｍは、ミスマッチ塩基の数が１％増加するごとに約１℃だけ減少する。
【００９５】
上記にかかわらず、ストリンジェントな条件は当該技術分野において周知であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌら（前掲）の２．９および２．１０章に記載されている。当業者は、種々の要因は、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化するように操作することができることも認識する。最終洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高程度のハイブリダイゼーションを確保するために機能し得る。
【００９６】
典型的には、相補的ヌクレオチド配列は、ヌクレオチドをマトリックス（好ましくは、合成膜、例えばニトロセルロース）上で固定化する工程、ハイブリダイゼーション工程、および典型的には、標識プローブまたは他の相補的核酸を使用する検出工程を含むブロッティング技術により同定される。サザンブロッティングは相補的ＤＮＡ配列を同定するために使用され；ノザンブロッティングは相補的ＲＮＡ配列を同定するために使用される。ドットブロッティングおよびスロットブロッティングは、相補的ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡポリヌクレオチド配列を同定するために使用することができる。このような技術は当業者により周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲）の２．９．１から２．９．２０ページに記載されている。このような方法によれば、サザンブロッティングは、ＤＮＡ分子をゲル電気泳動によりサイズに従って分離し、サイズにより分離されたＤＮＡを合成膜に転写し、膜に結合したＤＮＡを相補的ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることを含む。代替的なブロッティング工程は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー中の相補的核酸を同定する場合に、例えばプラークまたはコロニーハイブリダイゼーションのプロセスを介して使用される。この手順の他の典型例は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（前掲）の８〜１２章に記載されている。
【００９７】
０にハイブリダイズした標識核酸を検出する方法は、当該技術分野における実務者に周知である。このような方法には、オートラジオグラフィ、化学発光、蛍光および比色検出が含まれる。
【００９８】
核酸は、核酸配列増幅技術を使用して単離、検出および／または組換えＤＮＡ技術に供することもできる。
好適な核酸増幅技術は当業者に周知であり、その技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；相補鎖置換増幅（ＳＤＡ）；ローリングサークル複製（ＲＣＲ）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、Ｑ−βレプリカーゼ増幅およびヘリカーゼ依存性増幅が含まれるが、それらに限定されない。
【００９９】
本明細書において使用される「増幅産物」は、核酸増幅により発生した核酸産物を指す。
核酸増幅技術には、特定の定量および半定量技術、例えば当該技術分野において周知のｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲおよび競合的ＰＣＲが含まれ得る。
【０１００】
本発明のさらに別の態様は、本発明の単離核酸および１つ以上の付加ヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を提供する。
好適には、遺伝子構築物は、当該技術分野において十分理解されているプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母または細菌性人工染色体の形態であり、またはその遺伝子構成成分を含む。
【０１０１】
遺伝子構築物は、細菌または他の宿主細胞中での単離核酸の維持および伝播、組換えＤＮＡ技術による操作ならびに／または本発明の核酸もしくはコードされるタンパク質の発現に好適であり得る。
【０１０２】
宿主細胞発現の目的のため、遺伝子構築物は発現構築物である。好適には、発現構築物は、発現ベクター中の１つ以上の付加配列に作動的に連結された本発明の核酸を含む。発現構築物の非限定的な例を表２および表３に提供する。
【０１０３】
「発現ベクター」は、自己複製染色体外ベクター、例えばプラスミド、または宿主ゲノム中に組み込まれるベクターであり得る。
「作動的に連結された」は、前記付加ヌクレオチド配列が、好ましくは、転写を初期化、調節またはそうでなければ制御するように本発明の核酸に対して位置していることを意味する。
【０１０４】
一実施形態において、付加ヌクレオチド配列は調節配列である。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用される宿主細胞に適切である。多数のタイプの適切な発現ベクターおよび好適な調節配列が、種々の宿主細胞について当該技術分野において公知である。
【０１０５】
典型的には、前記１つ以上の調節ヌクレオチド配列には、限定されないが、プロモータ配列、リーダまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベータ配列が含まれ得る。
【０１０６】
当該技術分野において公知の構成的または誘導的プロモータが本発明により企図される。プロモータは、天然プロモータ、または２つ以上のプロモータの要素を組み合わせるハイブリッドプロモータであり得る。
【０１０７】
別の実施形態において、付加ヌクレオチド配列は、形質転換された宿主細胞の選択を可能とする選択可能マーカ遺伝子である。選択可能マーカ遺伝子は当該技術分野において周知であり、使用される宿主細胞によって変動する。
【０１０８】
付加ヌクレオチド配列の１つの特定の実施形態は、改変ポリＧ配列を含む。野生型ｐｏ
ｒＡ遺伝子は、そのプロモータ中に株内および株間で多様性の高いポリＧトラクトを有し、それにより多様な発現レベルがもたらされる。本発明の単離タンパク質の一貫した発現を確保するため、多様性を低減させるようにポリＧトラクトを改変することができる。それというのも、Ｇ１１がＰｏｒＡの最適な発現に関連しているからである。ポリＧトラクトの変化を低減させるため、それがＧ５ＡＧ５により置き換えられるようにそれを改変することができる。
【０１０９】
発現構築物は、本発明の組換えポリペプチドが上記の融合タンパク質として発現されるように融合パートナ（典型的には発現ベクターにより提供される）をコードする付加ヌクレオチド配列も含み得る。
【０１１０】
発現構築物は、発現構築物中に存在する単離核酸の細菌ゲノム中への相同組換えを促進する１つ以上の付加ヌクレオチド配列も含み得る。例にすぎないが、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の内因性ｐｏｒＡ遺伝子を、本発明の単離核酸および付加ヌクレオチド配列を含む発現構築物による形質転換体および相同組換えの選択を可能とする外因性ヌクレオチド配列（例えばｐＬＫ６からのＬａｃＺ−Ｋａｎｒカセット；ザボ（Ｓｚａｂｏ）ら  １９９２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７４  ７２４５−７２５２）またはｐＪＪ２６０からのｓａｃＢ−Ｋａｎｒ−Ｔｅｔｒカセット（ニール（Ｎｅｉｌ）ら，２００９，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．７７  ２２８５−２２９３．）（例えばｐＬＫ６からのＬａｃＺ−ＫａｎｒカセットまたはｐＪＪ２６０からのｓａｃＢ−Ｋａｎｒ−Ｔｅｔｒカセット）により置き換えることができる。他の相同組換えアプローチは当業者に周知である。
【０１１１】
親和性クロマトグラフィーによる融合ポリペプチド精製の特定の目的のため、親和性クロマトグラフィーのための関連マトリックスは、それぞれグルタチオン−、アミロース−、およびニッケル−またはコバルト−コンジュゲート樹脂である。多くのこのようなマトリックスは、「キット」形態、例えば（ＨＩＳ６）融合パートナについて有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）システム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）））およびファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（登録商標））ＧＳＴ精製システムで入手可能である。
【０１１２】
好ましくは、融合パートナは、例えば関連プロテアーゼが本発明の融合ポリペプチドを部分的に消化し、それによりそれから本発明の組換えポリペプチドを遊離させることを可能とする第Ｘａ因子またはトロンビンについてのプロテアーゼ開裂部位も有する。次いで、遊離されたポリペプチドを、後続のクロマトグラフィー分離により融合パートナから単離することができる。
【０１１３】
本発明の単離タンパク質（断片、誘導体およびホモログを含む）は、当業者に公知の任意の好適な手順により調製することができる。好ましくは、単離タンパク質は組換えタンパク質である。
【０１１４】
例にすぎないが、本発明の組換え単離タンパク質は、
（ｉ）１つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動的に連結された本発明の単離核酸を含む発現構築物を調製する工程；
（ｉｉ）好適な宿主細胞を、発現構築物により形質移入または形質転換する工程；
（ｉｉｉ）前記宿主細胞中で組換えタンパク質を発現させる工程；および
（ｉｖ）組換えタンパク質を前記宿主細胞から単離する工程
を含む方法により産生することができる。
【０１１５】
発現に好適な宿主細胞は、原核または真核細胞であり得る。例えば、好適な宿主細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞である。本発明による単
離タンパク質の発現に好ましい１つの宿主細胞は、細菌である。使用される細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）であり得る。
【０１１６】
好ましい実施形態において、宿主細胞は髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）である。好ましくは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）宿主細胞は、内因性ＰｏｒＡもＯｐａもＯｐｃも莢膜多糖も発現せず、所望のリポ多糖表現型を発現するように改変されている。
【０１１７】
宿主細胞（原核と真核を問わず）中への遺伝子構築物の導入は、例えばＣＵＲＲＥＮＴ
ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５−２００９）、特に９および１６章に記載のとおり当該技術分野において周知である。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の形質転換に関連して、このような方法は当該技術分野において周知である。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）は「天然に」形質転換可能であることも認識される。
【０１１８】
組換えタンパク質は、当業者が例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ），１９８９）、特に１６および１７部；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５−２００９）、特に１０および１６章；ならびにＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ  Ｅｄｓ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ら，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５−２００９）、特に１、５および６章に記載の標準的なプロトコルを使用して都合良く調製することができる。
【０１１９】
本明細書に開示の単離タンパク質、断片、ホモログおよび誘導体に対して生成され、それらに結合する抗体および／または抗体断片も提供される。好適には、抗体および／または抗体断片は、野生型ＰｏｒＡタンパク質に結合しない。好ましくは、抗体および／または抗体断片は、中断されたＰｏｒＡ可変領域（例えばＶＲ１、ＶＲ２、ＳＶＲ１またはＳＶＲ２領域）に特異的に結合し、野生型ＰｏｒＡ可変領域（例えばＶＲ１、ＶＲ２、ＳＶＲ１またはＳＶＲ２領域）に結合しない。
【０１２０】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、ネイティブまたは組換えであり得る。抗体産生、精製および使用に適用可能な周知のプロトコルは、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  ＮＹ，１９９１−１９９４）の２章およびハーロー，Ｅ．＆レーン，Ｄ（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．＆Ｌａｎｅ，Ｄ．）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８８に見出すことができ、それらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
一般に、本発明の抗体は、本発明の単離タンパク質、断片、ホモログまたは誘導体に結合し、またはそれらとコンジュゲートする。例えば、抗体はポリクローナル抗体であり得る。このような抗体は、例えば本発明の単離タンパク質、断片、変異体または誘導体を、産生種（マウスまたはウサギが含まれ得る）中に注射してポリクローナル抗血清を得ることにより調製することができる。ポリクローナル抗体を産生する方法は、当業者に周知で
ある。使用することができる例示的なプロトコルは、例えばＣｏｌｉｇａｎら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）、およびＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，１９８８（前掲）に記載されている。
【０１２２】
モノクローナル抗体は、例えば参照により本明細書に組み込まれるケーラー＆ミルステイン（Ｋｏｅｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ），１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５による論文に記載の標準的方法を使用して、または例えばＣｏｌｉｇａｎら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）に記載のより近年のその改変により、本発明の単離タンパク質、断片、変異体または誘導体の１つ以上により接種された産生種由来の脾臓または他の抗体産生細胞を不死化させることにより産生することができる。
【０１２３】
本発明はまた、その範囲内に抗体断片、例えば上記参照のポリクローナルまたはモノクローナル抗体のＦｃ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２断片を含む。あるいは、抗体または抗体断片は、本発明のペプチドに対する単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）を含み得る。このようなｓｃＦｖは、例えば米国特許第５，０９１，５１３号明細書、欧州特許第２３９，４００号明細書またはウインター＆ミルステイン（Ｗｉｎｔｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ），１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９  ２９３による論文にそれぞれ記載の方法に従って調製することができる。
【０１２４】
抗体および抗体断片は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染に対する受動免疫化に使用することができる。好ましくは、このような抗体は殺菌性である。
抗体および抗体断片は、上記のエピトープマッピングに使用することができる。
【０１２５】
本発明の抗体および抗体断片は、親和性クロマトグラフィーに使用することができる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）の９．５章に記載の免疫親和性クロマトグラフィー手順を参照することができる。
【０１２６】
抗体および抗体断片は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および／または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＰｏｒＡタンパク質の検出に使用することができる。
【０１２７】
一態様において、哺乳動物において髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を検出する方法は、
（ｉ）本発明の抗体または抗体断片を、哺乳動物から得られた生体試料と合わせる工程；および
（ｉｉ）前記試料中で前記抗体または抗体断片と髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および／または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＰｏｒＡタンパク質とを含む複合体の存在または不存在を決定する工程を含み、前記複合体の存在は前記髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を示す。
【０１２８】
生体試料中の髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の存在または不存在は、哺乳動物から生体試料を得、上記抗体または抗体断片を生体試料と混合し、試料中の髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の存在を示す特異的に結合した抗体または抗体断片を検出することにより決定することができる。典型的には、特異的に結合した抗体または抗体断片は、生体試料中の髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＰｏｒＡタンパク質との複合体を形成する。
【０１２９】
好適には、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＰｏｒＡタンパク質は、前記哺
乳動物に感染する髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来であり、またはその細菌起源である。
【０１３０】
本明細書において使用される用語「生体試料」は、個体、例えば患者から抽出、未処理、処理、希釈または濃縮することができる試料を指す。好適には、生体試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、汗、腹水、腹腔液、滑液、羊水、脳脊髄液、皮膚生検物などからなる群から選択される。
【０１３１】
別の態様において、生体試料中の髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＰｏｒＡタンパク質に対する抗体を検出する方法は、
（ｉ）哺乳動物から得られた生体試料を、本発明の単離タンパク質（例えば配列番号２〜２２または好ましくは配列番号ｌ１〜２２によるもの）と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記試料中の前記単離タンパク質および抗髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＰｏｒＡ抗体を含む複合体の存在または不存在を決定する工程
含む。
【０１３２】
好適には、抗髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＰｏｒＡ抗体は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）による哺乳動物の感染に応答して誘発される内因性抗体である。
【０１３３】
免疫アッセイ、タンパク質アッセイ（タンパク質インサイチューアレイ、ＤＮＡ−タンパク質アレイおよび核酸プログラマブルアレイおよび二次元（２Ｄ）発現プロファイリングを含む）を含むタンパク質検出に好適な任意の技術を使用することができるが、それらに限定されない。免疫アッセイには、限定されないが、当業者に周知の免疫ブロッティング、ウエスタンブロッティングおよびドットブロッティング、ラジオ免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および免疫クロマトグラフィー技術（ＩＣＴ）が含まれ得る。例えば、本発明に従って使用することができる種々の免疫アッセイを開示するＣｏｌｉｇａｎら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前掲）の７章を参照することができる。免疫アッセイには、当該技術分野において理解されている競合的アッセイが含まれ得る。
【０１３４】
好ましい実施形態において、検出は、前記単離タンパク質、断片、ホモログもしくは誘導体、または前記抗体もしくは抗体断片を標識により修飾することにより実施される。一実施形態は、標識タンパク質、断片、ホモログまたは誘導体を免疫アッセイにおいて使用して髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）特異的抗体を検出する。別の実施形態は、標識抗体または抗体断片を免疫アッセイにおいて使用してＰｏｒＡタンパク質を検出する。
【０１３５】
抗体および抗体断片に関して、標識は以下のものを含み得る：
（Ａ）抗体または抗体断片への標識の直接付着；
（Ｂ）抗体または抗体断片への標識の間接付着；すなわち、続いて抗体または抗体断片に結合する別の試薬（例えば二次抗体）への標識の付着；および
（Ｃ）抗体または抗体断片の後続の反応産物への付着。
【０１３６】
標識は、発色体、触媒、酵素、蛍光体、化学発光分子、ランタノイドイオン、例えばユーロピウム（Ｅｕ３４）、放射性同位体および直接可視標識を含む群から選択することができる。直接可視標識の場合、コロイド状金属もしくは非金属粒子、色素粒子、酵素もしくは基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、またはシグナル産生物質を含有する他の小胞などを使用することができる。
【０１３７】
本発明において有用な酵素標識の非限定的な例には、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼなどが含まれる。酵素標識は、単独で、または第２の酵素と組み合わせて溶液中で使用することができる。
【０１３８】
蛍光体の非限定的な例には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フルオレセイン誘導体、例えばＦＡＭおよびＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＬ）、Ｒ−フィコエリスリン（ＲＰＥ）、ＡｌｅｘａおよびＢｏｄｉｐｙ蛍光体が含まれるが、それらに限定されない。
【０１３９】
生体試料中の抗髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）抗体（例えば殺菌性抗体）を検出する方法も提供される。
一態様において、
（ｉ）本発明の単離タンパク質（例えば配列番号２〜２２または好ましくは配列番号１１〜２２によるもの）により免疫化された哺乳動物から得られた生体試料を、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記試料中の前記殺菌性抗体の存在または不存在を決定する工程
含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対する殺菌性抗体を検出する方法が提供される。
【０１４０】
典型的には、殺菌性抗体は、単離タンパク質による免疫化に応答して誘発される。殺菌性抗体を検出する殺菌アッセイの例は実施例に以下提供される。
別の広範な態様において、本発明は、核酸に基づく検出方法を提供する。
【０１４１】
一実施形態において、生体試料中の髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を検出する方法は、生体試料を患者から単離する工程および本発明の単離核酸を使用して試料中のＰｏｒＡタンパク質をコードする核酸配列を検出する工程を含む。核酸の検出は、任意の好適な技術を使用して実施することができる。例えば、当該技術分野において周知のとおり、本発明による標識核酸を患者から得られた核酸抽出物のサザンブロットにおけるプローブとして使用することができる。
【０１４２】
あるいは、本発明による標識核酸は、患者からのＲＮＡまたはｃＤＮＡ抽出物のノザンブロットにおけるプローブとして利用することができる。好ましくは、患者からの核酸抽出物は、本発明の核酸配列のセンスおよびアンチセンス配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーと合わせて、核酸増幅技術、例えばＰＣＲとともに利用されてそれにより増幅産物が産生される。増幅産物は、複数の技術のいずれかにより、例えば上記プローブハイブリダイゼーションにより検出することができる。
【０１４３】
種々の自動化固相検出技術も核酸の検出に適切である。これらの技術には、当該技術分野において十分理解されている巨大スケール固定化プライマーアレイ（ＶＬＳＩＰＳ（商標））、ＰＣＲ増幅産物の磁気ビーズベース捕捉および核酸アレイが含まれる。
【０１４４】
本発明はまた、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染を検出するためのキットを提供する。キットは、生体試料中の髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、内因性髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＰｏｒＡタンパク質もしくはコーディング核酸、または抗体を検出するための１つ以上の検出試薬を含み得る。キットは、用いられる試験法の性質に応じて上記の１つ以上の特定の検出試薬を含有する。これに関連して、キットは、本発明による単離タンパク質、断片、ホモログ、誘導体、抗体、抗体断片または核酸（例えばプライマーまたはプローブ）の１つ以上を含み得る。これらの任意の１
つ以上を上記のとおり標識することができる。キットは、場合により１つ以上の他の試薬、例えば検出試薬、例えば標識二次抗体、比色または生物発光検出のための酵素および／または基質、陽性および／または陰性対照、洗浄溶液、希釈緩衝液、タンパク質または核酸サイズマーカ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑポリメラーゼなども、用いられる検出法に応じて含み得る。
【０１４５】
本発明のさらなる態様は、哺乳動物において髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染を治療するための予防および治療方法ならびに／または医薬組成物を提供する。
１つの特定の態様において、哺乳動物において髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染を予防または治療する方法は、哺乳動物に、
（ｉ）本発明の単離タンパク質（例えば配列番号２〜２２または好ましくは配列番号１１〜２２によるもの（そのホモログ、誘導体および断片を含む）；
（ｉｉ）本発明の単離核酸（例えば配列番号２３〜４３または好ましくは配列番号３２〜４３によるもの）（そのホモログ、誘導体および断片を含む）；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の単離核酸をコードする発現構築物；
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の発現構築物を含む宿主細胞；
（ｖ）本発明の単離タンパク質に結合する抗体または抗体断片；および／または
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の１つ以上を含む医薬組成物
からなる群から選択される免疫原性因子（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）を投与して、それにより前記哺乳動物において前記髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染を予防または治療する工程を含む。
【０１４６】
好適には、免疫原性因子は、野生型ＰｏｒＡタンパク質および／または１つ以上の中断された可変領域を有さないＰｏｒＡタンパク質により誘発されるよりも株特異的でなく、または交差反応的である免疫応答を前記哺乳動物中で誘発する。好ましくは、誘発される免疫応答は保護的免疫応答である。
【０１４７】
好ましくは、哺乳動物はヒトである。
１つの特定の好ましい実施形態において、本発明の単離タンパク質（そのホモログ、誘導体および断片を含む）は、ＯＭＶ中に存在する。
【０１４８】
例えば、フラッシュ，Ｃ．（Ｆｒａｓｃｈ，Ｃ．），Ｌ．ヴァン・アルフェン（Ｌ．ｖａｎ  Ａｌｐｈｅｎ），ら（２００１）．髄膜炎性疾患のための外膜タンパク質小胞ワクチン（Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｖｅｓｉｃｌｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ．）Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ．ポラード（Ａ．Ｐｏｌｌａｒｄ）およびＭ．メイデン（Ｍ．Ｍａｉｄｅｎ）編，ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）．６６：８１−１０７に記載のとおりＯＭＶワクチンを調製する多くの周知の方法が存在する。
【０１４９】
別の特定の好ましい実施形態において、本発明の単離タンパク質（そのホモログ、誘導体および断片を含む）は、染色体に組み込まれた発現構築物を含む細菌により発現される。好ましくは、細菌は髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）である。
【０１５０】
好適には、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む。
「薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤」は、全身投与において安全に使用することができる固体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当該技術分野において周知の種々の担体を使用することができる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースまたはその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、
等張生理食塩水および塩、例えば鉱酸塩、例として塩酸塩、臭化物および硫酸塩、有機酸、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩およびマロン酸塩ならびにパイロジェンフリー水を含む群から選択することができる。
【０１５１】
薬学的に許容可能な担体、希釈剤および賦形剤を記載する有用な参照文献は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（マック出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）ニュージャージー州，アメリカ合衆国，１９９１）である。
【０１５２】
任意の安全な投与経路を本発明の免疫原性因子の投与に用いることができる。例えば、経口、経直腸、非経口、舌下、バッカル、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などを用いることができる。筋肉内および皮下注射は、例えば免疫原性組成物、ワクチンおよびＤＮＡワクチンの投与に適切である。
【０１５３】
剤形には、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、坐剤、エアロゾル剤、経皮貼付剤などが含まれる。これらの剤形には、この目的のために特別に設計された注射または移植用制御放出デバイスまたはこの様式で付加的に作用するように改変された他の形態のインプラントも含まれ得る。治療剤の制御放出は、例えば、それを疎水性ポリマー、例としてアクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸およびある種のセルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースによりコーティングすることにより実施することができる。さらに、制御放出は、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはマイクロスフェアを使用することにより実施することができる。
【０１５４】
経口または非経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、別個単位、例えば、所定量の本発明の１つ以上の治療剤をそれぞれ含有するカプセル剤、サシェ剤または錠剤として、散剤または顆粒剤として、または水性液体、非水性液体、水中油型エマルションもしくは油中水型液体エマルション中の液剤もしくは懸濁剤として提供することができる。このような組成物は、製薬方法のいずれかにより調製することができるが、全ての方法は、上記の１つ以上の免疫原性因子を１つ以上の必須成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般に、組成物は、本発明の免疫原性因子を液体担体もしくは微細固体担体またはその両方と均一に緊密に混合し、次いで必要であれば、産生物を所望の提供物に成形することにより調製される。
【０１５５】
上記組成物は、投薬配合物と適合するように、患者を髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染から保護、または既存の感染を治療するために免疫原性的に有効であるような量で投与することができる。患者に投与される用量は、本発明に関連して、患者において経時的に利益応答、例えば髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のレベルの低減をもたらすために、または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）による感染を阻害するために十分でなければならない。投与すべき免疫原性因子の量は、治療すべき対象（その年齢、性別、体重および全身健康状態を含む）に依存し得る。これに関連して、投与に要求される免疫原性因子の正確な量は、担当医の判断に依存する。
【０１５６】
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対する治療または予防において投与すべき免疫原性因子の有効量の決定において、医師は、循環血漿レベル、疾患の進行、および抗髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）抗体の産生を評価することができる。いずれのイベントにおいても、本発明の免疫原性因子の好適な投薬量は当業者が容易に決定することができる。このような投薬量は、ナノグラムからミリグラムのオーダーの本発明の免疫原性因子であり得る。
【０１５７】
特定の実施形態において、本発明の免疫原性因子は、治療または予防ワクチンとして投与することができる。したがって、本発明は、活性物質として本発明の免疫原性因子の１つ以上を含有するワクチンの産生に及ぶ。種々の適用可能な手順がこのようなワクチンの産生に企図される。例示的な手順には、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＮＥＷ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ（１９９７，レヴァイン（Ｌｅｖｉｎｅ）ら，マーセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）ニューヨーク，バーゼル・香港（Ｂａｓｅｌ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ））に記載のものが含まれる。
【０１５８】
本発明による免疫原性因子は、他の抗原、例として他の抗原のＢまたはＴ細胞エピトープと混合、コンジュゲートまたは融合させることができる。さらに、本発明による免疫原性因子は、下記担体にコンジュゲートさせることができる。
【０１５９】
本発明のハプテン性ペプチドが使用される場合（すなわち、コグネート（同種の）抗体と反応するが、それ自体で免疫応答を誘発し得ないペプチド）、そのペプチドを免疫原性担体とコンジュゲートさせることができる。有用な担体は当該技術分野において周知であり、その担体には、例えば：サイログロブリン；アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；毒素、類毒素または破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）からの毒素の任意の変異体交差反応性材料（ＣＲＭ）；ポリアミノ酸、例えばポリ（リジン：グルタミン酸）；インフルエンザ；ロタウイルスＶＰ６、パルボウイルスＶＰ１およびＶＰ２；Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質；Ｂ型肝炎ウイルス組換えワクチンなどが含まれる。あるいは、担体タンパク質または他の免疫原性タンパク質の断片またはエピトープを使用することができる。例えば、本発明のハプテン性ペプチドを細菌性毒素、類毒素またはＣＲＭのＴ細胞エピトープにカップリングさせることができる。これに関連して、米国特許第５，７８５，９７３号明細書を参照することができる。
【０１６０】
本発明の免疫原性因子は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の抗原、または他の生物（病原性細菌インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、カタル球菌（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などを含む）の抗原と組み合わせて多価サブユニットワクチンとして投与することができる。あるいは、または付加的に、これらは髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のオリゴ糖または多糖構成成分に合わせて投与することができる。
【０１６１】
ワクチンおよび他の免疫原性組成物は、当該技術分野において周知のアジュバントを含み得る。本発明により企図されるアジュバントには、限定されないが、表面活性物質、例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジコクタデシル−Ｎ’，Ｎ’ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニック（登録商標）ポリオール；ポリアミン、例えばピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣカーボポール（登録商標）；ペプチド、例えばムラミルジペプチドおよび誘導体、ジメチルグリシン、タフトシン；油エマルション；ならびにミネラルゲル、例えばリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバン；リンホカイン、ＱｕｉｌＡおよび免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）が含まれる。ＯＭＶ送達に関する実施形態において、これらの小胞はアジュバント、例えばアルミニウム塩を用いてまたは用いずに産生することができる。
【０１６２】
アジュバントの例に関連して、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９９／３６５４４号も参照される。
特定の実施形態において、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染を治療するための組成物および方法（ワクチンおよび免疫化の方法を含む）は、本発明の単離タンパク質をコードするＤＮＡ発現構築物を含み得る。
【０１６３】
例えば、本発明の免疫原性因子は、弱毒化ウイルス宿主により発現させることができる。「弱毒化ウイルス宿主」は、天然に実質的に無毒性であり、または実質的に無毒性とされたウイルスベクターを意味する。ウイルスは、任意の好適な物理的（例えば、熱処理）または化学的手段（例えば、ホルムアルデヒド処理）により実質的に無毒性とすることができる。「実質的に無毒性」は、感染性が破壊されたウイルスを意味する。理想的には、ウイルスの感染性は、ウイルスの免疫原性を担持するタンパク質に影響することなく破壊される。前記のことから、弱毒化ウイルス宿主は生ウイルスまたは不活化ウイルスを含み得ることが認識される。
【０１６４】
本発明によるワクチンにおいて有用であり得る弱毒化ウイルス宿主は、ウイルスベクター（アデノウイルス、サイトメガロウイルスおよび好ましくは、ポックスウイルス、例えばワクシニア（例えば米国特許第４，６０３，１１２号明細書）および弱毒化サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株（例えば、米国特許第４，５５０，０８１号明細書に記載のもの）を含む）を含み得る。生ワクチンは、それらが実質的に長時間持続する免疫を付与し得る長期刺激をもたらすので特に有利である。ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）タンパク質を使用する免疫化に潜在的に好適な種々のウイルスベクター、および送達方法を記載する別の参照文献は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９９／３６５４４号である。
【０１６５】
多価ワクチンは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の異なるエピトープ（例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の他の表面タンパク質またはエピトープ）を発現する１つ以上の微生物から調製することができる。さらに、他の病原性微生物のエピトープをワクチン中に取り込むことができる。例えば、このことは、本発明による核酸配列を発現させるための組換えワクシニアウイルスの構築を含み得る。組換えワクシニアウイルスは、宿主中に導入すると免疫原性因子を発現し、それにより宿主ＣＴＬ応答を誘発する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、免疫化プロトコルにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法を記載する米国特許第４，７２２，８４８号明細書を参照することができる。
【０１６６】
本発明の免疫原性因子による治療的投与または免疫化に有用な広範な他のベクターは、本開示から当業者に明らかである。
本発明を容易に理解し、実施することができるように、特定の好ましい実施形態を以下の非限定的な実施例としてここで記載する。
【０１６７】
実施例
導入
ＰｏｒＡは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の主要なタンパク質である。ＰｏｒＡは、株間で非常に多様性が高く、免疫応答を患者および無症状保有者の両方で、それが株同定のためのマーカとして使用される程度に発生させ、そのことは血清亜型系を表す（非特許文献６）。ＰｏｒＡモノマートポロジーの現行モデルは、８つの細胞外ループを示す。非特許文献８；非特許文献９）。表１にまとめるとおり、最長ループ（１および４）は最も多様性が高く、ループ５および６においては多様性が低く（それぞれ半変異ＳＶＲ１および２）、残りのループにおいては本質的には多様性が見られない。ループ３は、ＰｏｒＡトリマーのそれぞれのサブユニットにより形成される細孔中で「プラグ」を形成することが予測される。ループ１および４内でさえ、株間の多様性の大多数は、ループのチップを形成することが予測される残基に制限される。これらは可
変領域（ＶＲ）１および２として公知である。多くの株のＶＲ１およびＶＲ２配列が同定されている（例えば図３ならびに表３および４；Ｒｕｓｓｅｌｌら，２００４，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１０  ６７４；ｈｔｔｐ：／／ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇ／ｎｍ／ｔｙｐｉｎｇ／ｐｏｒａ／ｖｒ１．ｓｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇ／ｎｍ／ｔｙｐｉｎｇ／ｐｏｒａ／ｖｒ２．ｓｈｔｍｌ参照）。驚くべきことに、ＶＲ１／ＶＲ２の外側の領域も髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対する免疫応答にいかに寄与するかを記載する多くの科学文献が存在する（ジョーダン（Ｊｏｒｄａｎｓ）ら，２００４，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７２  ６５０３−１０；非特許文献７；マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら，２０００，Ｖａｃｃｉｎｅ  １８  ２４７６−８１；ウェッジ（Ｗｅｄｅｇｅ）ら，２００３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１  ３７７５−８１；コテルニコヴァ（Ｋｏｔｅｌｎｉｋｏｖａ）ら，２００５，Ｂｕｌｌ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１３９  ５９３−５；米国特許第７，２３８，３４５号明細書）。
【０１６８】
本発明は、本明細書に例示の２つの広い実施形態を提供する：（１）髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株間で保存されているＰｏｒＡの領域に対して免疫応答を向けるための可変領域の欠失；および（２）保存領域の新規提供が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の保存領域に対する免疫応答を向上させる。
【０１６９】
実施例１
変異ループまたは領域が欠失されたＰｏｒＡアレル、および選択可能マーカを有するｐｏｒＡアレルの作製
ｐｏｒＡ遺伝子およびフランキング配列を髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株ＭＣ５８のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、ｐＧＥＭＴｅａｓｙ中にクローニングしてｐＰｏｒＡを作製した。このプラスミドを、種々のインバースＰＣＲ反応のための、または制限消化を介する組換え構築のためのテンプレートとして使用した。プラスミドをシーケンシングした。このように作製されたプラスミドは、表２および表３に列記される１個以上の欠失および／または中断を有した。付加的なプラスミドを、標準的な分子生物学方法（制限消化、ライゲーション、クローニング）により構築して選択可能マーカにより置き換えられたｐｏｒＡ遺伝子を有するプラスミドを作製した（表２参照）。欠失されたアミノ酸の数は、記載数よりも大きく、または小さいものであり得ることは明らかである。
【０１７０】
実施例２
可変領域を置き換える保存領域を有するプラスミド
プラスミドｐＤＥＬＶＲ１−２、およびｐＰｏｒＡをテンプレートとして使用してＰＣＲおよび他の標準的分子生物学技術により、ｐｏｒＡのＶＲ１およびＶＲ２コーディング領域が、表３および図１に記載のループ７および８の配列により置き換えられ、または改変されたいくつかのＰｏｒＡアレルを作製した。ＰｏｒＡの他の保存アミノ酸配列、例えば「ループ２」と定義される配列、ＶＳＶＧＧＧＡＴＱＷＧＮＲ（配列番号４８）または任意の他の保存ＰｏｒＡペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を、ヒトまたは動物免疫系に対する提供の向上のためにループ１および／または４中に取り込むことができることは明らかであるはずである。
【０１７１】
記載されたＭＣ５８および組換えＰｏｒＡ配列の一覧を図１に提供する。
実施例３
組換えＰｏｒＡを発現する遺伝子による野生型ＰｏｒＡの置き換え
表２、表３ならびに図１および図２に記載のＰｏｒＡヌクレオチド配列を有するプラスミドを、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）中に、天然形質転換により形質転換することができ、相同組換えは、組換え配列による野生型ｐｏｒＡの置き換えをもたらす
。あるいは、組換えｐｏｒＡアレルを上記組換えｐｏｒＡアレルを包含するプラスミドから増幅することができ、これらの増幅プライマーを使用して髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を形質転換することができる。形質転換体の同定を促進するため、ｐｏｒＡ遺伝子が欠失され、ｐＬＫ６遺伝子からのＬａｃＺ−Ｋａｎｒカセット、またはｐＪＪ２６０からのｓａｃＢ−Ｋａｎｒ−Ｔｅｔｒカセットにより置き換えられたレシピエント髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株を調製した（表２参照）。株¢３はレシピエント株（非特許文献５）であった。株¢０９（非特許文献５）も、ｐＰｏｒＤｅｌ：ＬａｃＺｋａｎにより形質転換し、Ｘ−ｇａｌを含有する培地上での増殖後にブルーコロニーを選択した。続いて、¢０２：ｄｅｌＰｏｒＡＳａｃｂの染色体ＤＮＡを¢０９：ｄｅｌＰｏｒＡＬａｃＺ中に形質転換し、Ｘ−Ｇａｌに基づき選択し、ホワイトコロニーを選択して¢０９ｄｅｌＰｏｒＡＳａｃｂを作製した。この後者の株を、変異体ｐｏｒＡアレルを含有するプラスミドによる形質転換のためのレシピエントとして使用した。１０％スクロースを含有する培地上での増殖により、ｐｏｒＡ：ｓａｃＢアレルを変異体ＰｏｒＡ遺伝子により置き換えたクローンについての選択を可能とした。こうして、ループ１、４、および５が欠失され、またはループ７および８によりそれぞれ置き換えられ、もしくは改変されたＶＲ１およびＶＲ２を有するＰｏｒＡを発現する髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の株を作製した。組換えｐｏｒＡ遺伝子を他のプロモータに転写的に連結させ、相同組換えにより髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の染色体中に挿入することができることは明らかである。
【０１７２】
実施例４
細菌発現を改善するためのポリＧトラクトの改変
野生型ｐｏｒＡ遺伝子は、そのプロモータ中に株内および株間で多様性の高いポリＧトラクトを有し、それにより多様な発現がもたらされる。ＰｏｒＡおよび変異体の一貫した発現を確保するため、多様性を低減させるようにポリＧトラクトを改変した。それというのも、１１個のＧがＰｏｒＡの最適な発現に関連しているからである。ポリＧトラクトの変化を低減させるため、それがＧ５ＡＧ５により置き換えられるようにそれを改変することができる。この配列はＧ１１と同一の長さであるが、Ｇ１１ホモポリマートラクトよりも長さの変化が低頻度である。この目的のため、約３３０個のヌクレオチドをｐｏｒＡの上流に包含し、改変領域がネイティブポリＧトラクトに代えてＧ５ＡＧ５を含む配列を合成した。この配列は、ＰｏｒＡの最初の３８個のアミノ酸をコードするヌクレオチドを含み、ｐＪＪ２６０のカナマイシン耐性遺伝子の部分も取り込む。この配列をＤＮＡ２．０により合成し、プラスミドベクター中にクローニングした。これをＳｐｈＩ１およびＲｓｒＩＩにより切断し、ｐＰｏｒＤｅｌ：ＳａｃＢのＳｐｈＩ−ＲｓｒＩＩ断片を置き換えるために使用した。得られたプラスミドｐＰｏｒＤｅｌＳａｃＦｉｘＧを髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の株¢９（非特許文献５）中に形質転換し、株¢３−Ｆｉｘをもたらした。このようなレシピエントは、ｐｏｒＡプロモータの全部または一部を置き換え得る。¢３−Ｆｉｘ（後続の形質転換に使用される）は、プロモータ中の１１個のＧを含有する。組換えｐｏｒＡを包含するＤＮＡによる後続の形質転換は、変異体ｐｏｒＡアレルによるＴｅｔＲＳａｃＢＫａｎ領域の置き換えをもたらす。こうして、プラスミドＤＮＡ、またはＰＣＲ増幅プライマー（プライマーＰｏｒＡＦ１：５’ＧＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＣＣＧＡＴＡＡ−３’（配列番号５４）およびＯＭＷＦ５’−ＧＧＧＧＴＡＴＡＡＴＴＧＡＡＧＡＣＧＴＡＴＣＧＧ−３’（配列番号９２）により増幅される、またはゲノムＤＮＡは、１０％スクロースを含有する培地上で選択して、組換えｐｏｒＡの発現を有する株の同定を可能とした。配列分析は、プロモータ中のＧ残基の数をさらに同定した（表５）。組換えｐｏｒＡ遺伝子を他のプロモータに転写的に連結させ、相同組換えにより髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の染色体中に挿入することができることは明らかである。例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのｐｏｒＢ遺伝子のプロモータおよびナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）のｏｐａ遺伝子のプロモータを、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）または淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ
ｅ）のゲノムＤＮＡから増幅し、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）中への組換えアレルの形質転換前に増幅プライマーを使用して表３に記載のプラスミドのいずれかのｐｏｒＡプロモータを置き換える。例えば、アクセッションＡＥ００２０９８．２のヌクレオチド２１５７４５９〜２１５７５２８は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株ＭＣ５８のｐｏｒＢ遺伝子のプロモータ（５’−ＴＡＡＡＴＧＣＡＡＡＧＣＴＡＡＧＣＧＧＣＴＴＧＧＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＧＧＣＴＴＡＡＡＴＴＴＣＴＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＧＣＡ−３’；配列番号９３）を包含する。同様に、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）株ＭＳ１１のｏｐａＡのプロモータを、ベランド（Ｂｅｌｌａｎｄ）ら１９９７，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３：１２３−３５により記載されたプライマーを使用するＰＣＲにより増幅することができる。
【０１７３】
実施例５
組換えＰｏｒＡはヘテロロガスなＰｏｒＡのエピトープに対する交差反応性を誘発する
本発明のＰｏｒＡタンパク質を含有する外膜小胞（ＯＭＶ）は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から調製し、ワクチンとして投与することができる。Ｆｒａｓｃｈら（２００１），髄膜炎性疾患のための外膜タンパク質小胞ワクチン，Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ．ＰｏｌｌａｒｄおよびＭ．Ｍａｉｄｅｎ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．６６：８１−１０７に記載のとおり、ＯＭＶワクチンを調製する多くの周知の方法、およびアジュバント、例えばアルミニウム塩を用い、または用いないそれらの調製が存在する。
【０１７４】
手短に述べると、ＯＭＶタンパク質をデオキシコレート法により単離し、タンパク質濃度をＢＣＡアッセイにより評価してから水酸化アルミニウムゲル（シグマ（Ｓｉｇｍａ））に吸着させた。１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群に０．１〜１０μｇの全タンパク質を０、２１および２８日目に注射し、次いでワクチンの最終投与１４日後に最終的な全採血により血液を回収した。血清を周知の方法により血液から調製することができる。手短に述べると、血液を室温において１〜２時間凝固させ、４℃において一晩インキュベートした。血清を４℃における５分間の１０，０００×ｇにおける遠心分離１０分後に上澄みとして回収した。血清をＰＢＳ中で希釈し、４つの株およびそれらのアイソジェニックΔｐｏｒＡ：：ｔｅｔ変異体のサルコシル（登録商標）不溶性タンパク質に対するウエスタン免疫ブロットにおいて使用した。二次抗体はヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）であり、結合をＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ）を使用して比色的に検出した。このことは、株１７２８−２（ループ７により置き換えられたＶＲ１およびループ８により置き換えられたＶＲ２を有するＰｏｒＡ；配列番号１５を発現する）からの単離タンパク質を含むＯＭＶによりワクチン接種されたマウスからの血清が、全ての株からのＰｏｒＡを認識することを示した（表５および図５参照）。使用した株（およびそれらの関連ＰｏｒＡ血清亜型）は、ＭＣ５８（Ｐ１．７，１６−２）、ＢＺ１３３（Ｐ１．１８−１，３）、ＢＺ２３２（Ｐ１．５−２，２−２）および４００（Ｐ１．１９，１５）であった。
【０１７５】
実施例６
組換えＰｏｒＡタンパク質は、ＥＬＩＳＡによるヘテロロガスなＰｏｒＡの表面エピトープに対する交差反応性を誘発する
固体培地（ＢＨＩ寒天）上での一晩培養からの細菌を４時間継代培養してからＡ６００ｎｍ＝０．１まで再懸濁し、加熱死（５６℃、３０分間）させてから平底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｐ）をコーティングした。血清を、実施例５に記載のＯＭＶとして調製された０．１〜０．５μｇのタンパク質によりワクチン接種されたマウスから回収した。ワクチン接種マウスからの血清を、それらの細菌細胞認識能についてこのアッセイにおいて試験した。二次抗体はヤギ抗マウス免疫グロブリンＨＲＰコンジュゲート（ＤＡＫＯ  Ｐ  ０４４７、マウス免疫グロブリン、主としてＩｇＧに対して生成
されたもの）であった。逆数幾何平均力価を図６Ａおよび６Ｂに報告し、表６は、読みが陰性対照を超えた（陰性対照ＯＤの平均に３ＳＤを加えたものとして定義）最終希釈である。それぞれの場合、血清を親株（４００、ＢＺ１３３、およびＢＺ２３２）およびそれぞれのアイソジェニックＰｏｒＡ変異株に対して試験した。驚くべきことに、株１７２８−２（ループ７により置き換えられたＶＲ１およびループ８により置き換えられたＶＲ２を有するＰｏｒＡ；配列番号１５を発現する）および株Ｄ１４５（ループ１、４、および５が欠失されたＰｏｒＡ；配列番号５を発現する）からのＯＭＶは、３つの試験ＰｏｒＡ変異株よりも高い力価で３つの試験株を認識する抗体を誘発した。逆に、株¢９（ＰｏｒＡ  Ｐ１．７，１６−２を発現する）、株０２７−３（配列番号１３のＰｏｒＡを発現する）および株０２８−１０（配列番号１４のＰｏｒＡを発現する）からのＯＭＶは、この実験においてＰｏｒＡ変異株よりも良好に野生株を認識するマウス抗体を一貫して誘発しなかった。
【０１７６】
実施例７
変異体ＰｏｒＡを有するＯＭＶの、オートロガスまたはヘテロロガスな株を標的化する能力を評価するための殺菌アッセイ
このアッセイは、フーゲルホウト（Ｈｏｏｇｅｒｈｏｕｔ）ら１９９５  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６３：３４７３−３４７８）により記載された方法の改変により実施する。手短に述べると、細菌をＢＨＩプレート上で３７℃において５％ＣＯ２中で一晩増殖させる。この一晩培養からの細菌を、同一条件下で４〜６時間継代培養してから１ｍＬのＰＢＳ中で懸濁する。細菌懸濁液をＰＢＳ中で約１０５ｃｆｕ／ｍＬに調整する。試験すべき血清を５６℃において４５分間熱不活化する。幼齢ウサギ補体を商業的供給業者（例えばペルフリーズ（ＰｅｌＦｒｅｅｚ））から得る。アッセイは、無菌ポリスチレン平底９６ウェルマイクロタイタープレート中で実施する。それぞれのウェルの全容量は２４μＬであり、１２μＬのＰＢＳ中２倍段階希釈血清および６μＬの細菌懸濁液（３００〜９００の細菌を含有する）を含む。血清および細菌を室温において１０分間インキュベートしてから６μＬのＰＢＳ中８０％補体（最終濃度２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ））を添加した。対照は、ａ）ＰＢＳ、細菌および補体、ｂ）ＰＢＳ、細菌および血清である。全ての補体の添加および混合後、それぞれの対照ウェルからの７μＬアリコートをＢＨＩ寒天プレートに移す。マイクロタイタープレート中を３７℃において５％ＣＯ２中で６０分間インキュベートする。このインキュベーション後、それぞれのウェルからの７μＬアリコートをＢＨＩ寒天プレートに移す。全てのＢＨＩプレートを３７℃において５％ＣＯ２中で１４〜１８時間インキュベートし、細菌コロニーを計数する。血清殺菌死滅を、細菌の少なくとも９０％が死滅する最大逆数希釈として報告する。それぞれの場合、個々のまたはプールしたマウス血清をＭＣ５８、ＭＣ５８ｐｏｒ：：ｔｅｔに対して、およびヘテロロガスなＰｏｒＡおよびそれらのＰｏｒＡ変異体を発現する株に対して試験する（ＭＣ５８  ＰｏｒＡはＰ１．７，１６．２である一方、株２９９６およびＭ９９０は、例えばそれぞれＰ１．５．１，２−２およびＰ１．１８，２５である；図３Ａ参照）。
【０１７７】
本明細書を通して、本発明をいずれか１つの実施形態または特徴の具体的な集合に限定することなく、本発明の好ましい実施形態を記載することを目的とした。したがって、当業者により、本開示に照らして、本発明の範囲を逸脱することなく種々の改変および変更を例示された特定の実施形態において行うことができることが認識される。
【０１７８】
本明細書に参照された全てのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７９】
【表１】
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【０１８０】
【表２】
2013541322.tif 000003
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【０１８１】
【表３】
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【０１８２】
【表４】
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【０１８３】
【表５】
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【０１８４】
【表６】
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【０１８５】
【表７】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ａ−３】
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【図２Ａ−４】
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【図２Ａ−５】
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【図２Ａ−６】
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【図２Ａ−７】
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【図２Ａ−８】
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【図２Ａ−９】
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【図２Ａ−１０】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013541322.tif 000035
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