(57)【要約】  本発明は、中間精製およびポリッシングの工程を少なくとも含む、バイオリアクターにおいて生成されたタンパク質混合物からの抗体の精製方法であって、その中間およびポリッシング工程は、インラインのフロースルー様式でのアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）クロマトグラフィー工程およびカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）クロマトグラフィー工程をいずれかの順序で含む、方法に関する。本発明はさらに、アニオン交換クロマトグラフィー部分およびカチオン交換クロマトグラフィー部分の両方をいずれかの順序で連続的に連結して含む単一操作ユニットであって、当該ユニットは、第１のイオン交換クロマトグラフィー部分の上流端において入口を含みかつ第２のイオン交換クロマトグラフィー部分の下流端において出口を含み、当該ユニットはまた、第１のイオン交換クロマトグラフィー部分と第２のイオン交換クロマトグラフィー部分との間にも入口を含む、単一操作ユニットに関する。
2013540787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中間精製およびポリッシングの工程を少なくとも含む、バイオリアクターにおいて生成された細胞ブロスからの抗体の精製方法であって、前記新規精製工程は、合わせた連続的インラインのＡＥＸおよびＣＥＸクロマトグラフィーを含む、方法。
【請求項２】
分離混合物をフロースルー画分として生成する前記アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー工程が最初に行われ、続いて連続的インラインで、精製抗体調製物をフロースルー画分として生成するカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー工程が行われ、前記精製抗体調製物は、少なくとも１つのさらなる精製工程に供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分離混合物をフロースルー画分として生成する前記カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー工程が最初に行われ、続いて連続的インラインで、精製抗体調製物をフロースルー画分として生成するアニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー工程が行われ、前記精製抗体調製物は、少なくとも１つのさらなる精製工程に供される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記連続的インラインのＡＥＸおよびＣＥＸクロマトグラフィー工程が、単一ユニット操作として行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第２のイオン交換工程前の前記分離混合物に、前記第２のイオン交換クロマトグラフィー工程において最適な性能が得られるようにｐＨおよび導電率を調整するために適量の溶液が補充される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＣＥＸクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、適量の酸性溶液が補充される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ＣＥＸクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、クエン酸（またはその一塩基性もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）、リン酸（またはその一塩基性もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）、酢酸、塩酸または硫酸を含有する適量の溶液が補充される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＡＥＸクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、適量のアルカリ性溶液が補充される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
ＡＥＸクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、水酸化ナトリウムもしくはカリウム、（またはその一もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含有する適量の溶液が補充される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アニオン交換クロマトグラフィー部分およびカチオン交換クロマトグラフィー部分の両方を連続的に連結して含む請求項２に記載の方法において使用され得る単一操作ユニットであって、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の出口は、前記カチオン交換クロマトグラフィー部分の入口に連結されており、前記ユニットは、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の上流端において入口を含みかつ前記カチオン交換クロマトグラフィー部分の下流端において出口を含み、前記ユニットはまた、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分と前記カチオン交換クロマトグラフィー部分との間にも入口を含む、単一操作ユニット。
【請求項１１】
カチオン交換クロマトグラフィー部分およびアニオン交換クロマトグラフィー部分の両方を連続的に連結して含む請求項３に記載の方法において使用され得る単一操作ユニットであって、前記カチオン交換クロマトグラフィー部分の出口は、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の入口に連結されており、前記ユニットは、前記カチオン交換クロマトグラフィー部分の上流端において入口を含みかつ前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の下流端において出口を含み、前記ユニットはまた、前記カチオン交換クロマトグラフィー部分と前記アニオン交換クロマトグラフィー部分との間にも入口を含む、単一操作ユニット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、抗体の単一ユニット精製のための方法および本方法において使用され得る装置に関する。
【０００２】
薬学的用途における使用のための、細胞培養によって産生されるモノクローナル抗体の精製は、多数の工程を要するプロセスである。こうした抗体は、基本的に、あらゆる潜在的に有害な汚染物質（例えば、抗体を産生する細胞に由来するタンパク質およびＤＮＡ）、培地成分（例えば、インスリン、ＰＥＧエーテルおよび消泡剤）ならびに存在する可能性のあるあらゆる感染因子（例えば、ウイルスおよびプリオン）から分離されるべきものである。
【０００３】
抗体をこれらのタンパク質を産生する細胞の培養物から精製するための典型的なプロセスは、ＢｉｏＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｕｎｅ  １，２００５，“Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｆｒｏｍ  Ｈｉｇｈ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｉｔｙ”に記載されている。
【０００４】
抗体は細胞（例えば、ハイブリドーマ細胞または形質転換宿主細胞（チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ：ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫由来ＮＳ０細胞、ベビーハムスター腎臓（Ｂａｂｙ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｋｉｄｎｅｙ）細胞およびヒト網膜由来ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞など））により産生されるので、粒状細胞物質が、精製プロセスの好ましくは初期に、細胞ブロスから除去されなければならないであろう。プロセスのこの部分は、本明細書において、「清澄化」として示される。その後にまたは清澄化工程の一部として、抗体は、およそ少なくとも約８０％まで、通常は結合と溶出のクロマトグラフィー工程（ＩｇＧの場合はしばしば固定化プロテインＡを使用）を用いて、精製される。本明細書において「捕捉」として示されるこの工程は、抗体の最初のかなりの精製をもたらすだけでなく、体積のかなりの減少、したがって生成物の濃縮ももたらし得る。代替的な捕捉方法は、例えば、膨張床吸着（Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｂｅｄ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ：ＥＢＡ）、二液相分離（２−ｐｈａｓｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）（例えばポリエチレングリコールを使用）またはリオトロピック塩（例えば、硫酸アンモニウム）による分画沈殿である。
【０００５】
清澄化および捕捉に続いて、抗体は、さらに精製される。一般的に、少なくとも２つのクロマトグラフィー工程が、残留不純物を十分に除去するために、捕捉後に必要とされる。捕捉に続くクロマトグラフィー工程は、しばしば中間精製工程と呼ばれ、最後のクロマトグラフィー工程は、一般にポリッシング工程と呼ばれる。一般的に、これらの工程は、各々、バッチ方式で単一ユニット操作として行われ、これらの工程のうちの少なくとも１つは、結合と溶出の様式で実施される。さらに、それぞれのクロマトグラフィー工程は、例えばｐＨ、導電率などに関して、特異的な負荷条件を必要とする。したがって、負荷物（ｌｏａｄ）を要求条件に合うように調整するために、追加の処理が、それぞれのクロマトグラフィー工程に先立って行われなければならない。この上述の全てにより、プロセスが複雑かつ時間のかかるものとなっている。これらの工程の間に一般に実質的に除去される不純物は、プロセス由来の汚染物質（例えば、宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸、培地成分（存在する場合）、プロテインＡ（存在する場合）、菌体内毒素（存在する場合）、および微生物（存在する場合））である。抗体のそのような精製のための多くの方法が、最近の特許文献において記載されている。
【０００６】
国際公開第２０１０／０６２２４４号パンフレット。この発明は、モノクローナル抗体などのタンパク質の単離および精製のための水性二相抽出強化沈殿法（ａｑｕｅｏｕｓ  ｔｗｏ  ｐｈａｓｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｓｓ）に関するものである。その後の抗体のさらなる精製について、２つの選択肢、すなわち、（１）結合および溶出の様式でのカチオン交換クロマトグラフィーと、それに続くフロースルー様式でのアニオン交換、または（２）最初のフロースルー様式でのマルチモードクロマトグラフィーと、それに続くフロースルー様式でのアニオン交換が記載されている。
【０００７】
国際公開第２０１０／０４８１８３号パンフレット。この発明は、連続した酸性ｐＨでのイオン交換とＨＩＣクロマトグラフィーとによる、抗体からのＨＣＰの除去に関するものである。
【０００８】
国際公開第２００９／１３８４８４号パンフレット。一読したところ、この発明は、明細書および特許請求の範囲からは明確でない。この発明は、プロテインＡ（誘導体）カラムでの抗体の捕捉およびその後のこのカラムからの抗体の放出による、混合物からの抗体の精製に関するものである。この後者の抗体含有物質は、例えば連続したアニオンクロマトグラフィーとカチオンクロマトグラフィーとにより、さらに精製され得る。
【０００９】
欧州特許出願公開第２０２７９２１号明細書。この発明は、ポリマー第一級アミンベースの膜イオン交換クロマトグラフィー用媒体、および、例えば抗体の精製における、その使用に関するものである。
【００１０】
国際公開第２００５／０４４８５６号パンフレットは、ヒドロキシアパタイト樹脂を任意選択でアニオン交換クロマトグラフィーと組み合わせて用いる、抗体調製物からの高分子量凝集体の除去に関するものである。
【００１１】
国際公開第２００８／１４５３５１号パンフレットは、共にフロースルー様式である、連続するアニオン交換クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーについて記載している。
【００１２】
上記の方法の不利点は、長い操作時間、高い変動費（例えば、結合と溶出の工程に本来的に必要とされる大きいカラム容量の必要性、したがって費用がかさむ多量の樹脂が必要とされることによる）および高い固定費（人件費による）である。
【００１３】
本発明の１つの実施形態によれば、細胞培養産生抗体からの残留不純物の非常に効率的な除去は、共にフロースルー様式でありかつ好ましくは１つの単一ユニット操作として動作する、連続的インラインのアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）およびカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を使用することによって達成され得る。したがって、ＡＥＸ後かつＣＥＸクロマトグラフィー工程前の好適な緩衝液のインライン混合が、ｐＨおよび導電率に関してＣＥＸクロマトグラフィーに適した条件を整えるために使用され得る。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態によれば、細胞培養産生抗体からの残留不純物の非常に効率的な除去は、共にフロースルー様式でありかつ好ましくは１つの単一ユニット操作として動作する、連続的インラインのカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）およびアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を使用することによって達成され得る。したがって、ＣＥＸ後かつＡＥＸクロマトグラフィー工程前の好適な緩衝液のインライン混合が、ｐＨおよび導電率に関してＡＥＸクロマトグラフィーに適した条件を整えるために使用され得る。
【００１５】
この新規方法の利点は、操作時間および人件費の大きな削減、したがってより低い操作費用である。また、十分な結合容量を不純物に対してのみ必要とし生成物に対しては必要としないフロースルー様式で全てのユニットを操作するので、より小さい（したがってより費用がかさまない）クロマトグラフィーユニットが必要とされる。
【００１６】
したがって、本発明は、中間精製およびポリッシングの工程を少なくとも含む、バイオリアクターにおいて生成された細胞ブロスからの抗体の精製方法であって、その新規精製工程が、合わせた連続的インラインのＡＥＸおよびＣＥＸクロマトグラフィーを含む、方法として定義され得る。これは、２つの代替的な方法のいずれか、すなわち、（１）分離混合物をフロースルー画分として生成するアニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーと、連続的インラインで、それに続く、精製抗体調製物をフロースルー画分として生成するカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーとして、または（２）分離混合物をフロースルー画分として生成するカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーと、連続的インラインで、それに続く、精製抗体調製物をフロースルー画分として生成するアニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーとして実施され得、これらの代替的な方法のうちのいずれかの結果として生じる精製抗体調製物は、少なくとも１つのさらなる精製工程に供される。
【００１７】
国際公開第２００８／１４５３５１号パンフレットもまた、共にフロースルー様式である、任意の順序での、連続するアニオン交換クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーについて記載している。しかしながら、その開示内容は、第１の分離工程からの分離混合物を第２の分離工程に向けて整えるためのその分離混合物のコンディショニングがオフラインで実施される点で本発明とは異なる。本発明によれば、両方のクロマトグラフィープロセスの統合が両方のイオン交換プロセス流れが互いに調整され得るようにうまく行われ得たと同時に、凝集体の完全な除去が達成されるほどに的確な第２のクロマトグラフィー工程のための緩衝液条件の調整が実施され得たことは、驚くべきことである。
【００１８】
本発明の文脈において、「分離混合物」は、本発明に従う第１のイオン交換工程の結果として生じる溶液であり、「精製抗体調製物」は、本発明に従う第２のイオン交換工程の結果として生じる溶液である。本出願の全体にわたってこの用語法に従うことが意図される。
【００１９】
概してバイオリアクターにおいて生成された細胞ブロスは、第１のイオン交換クロマトグラフィー工程に先立って、清澄化される（すなわち、あらゆる細胞物質（例えば、全細胞および細胞破片）から分離される）であろう。
【００２０】
また、第１のイオン交換クロマトグラフィー工程に先立って、ｐＨおよび導電率についてこの第１のイオン交換工程に最適な条件を確保するために、コンディショニング溶液が、細胞ブロスにまたは抗体含有溶液に添加され得る。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明に従う方法は、ＡＥＸおよびＣＥＸによる合わせたクロマトグラフィーを、単一ユニット操作として行うことを含む。
【００２２】
本明細書において、「フロースルー画分」により、実質的に溶出流体と同じ速度でクロマトグラフィーカラムから出て行く、負荷された抗体含有画分の少なくとも一部が意味される。この画分は、溶出の間、カラムには実質的に保持されない。したがって、条件は、抗体ではなく不純物が、アニオン交換材料およびカチオン交換材料に結合されるように選択される。
【００２３】
アニオン交換およびカチオン交換相互作用クロマトグラフィーでのタンパク質混合物の連続クロマトグラフィーを使用したタンパク質の分離は、例えば上述の国際公開第２００９／１３８４８４号パンフレットに開示されている。そこにおいて、その２つのイオン交換工程は、２つの別個の工程として実施された。
【００２４】
大規模生産目的のために、本発明に従う（フロースルー様式を用いた）方法は、結合および溶出を用いた先行開示された方法よりもはるかに速い、所望の抗体の分離を提供することが見出された。
【００２５】
有利には、抗体を含有する分離混合物に、本発明に従う第２のイオン交換クロマトグラフィー工程において最適な性能が得られるようにｐＨおよび導電率を調整するために適量の溶液が補充される。
【００２６】
驚くべきことに、非常に良好な分離結果が、第２のイオン交換工程に入る前の流体のインラインでのコンディショニングにより達成され得ることが見出された。
【００２７】
ＡＥＸクロマトグラフィーが第１の工程である場合、概して、ＡＥＸは、僅かにアルカリ性のｐＨおよび低導電率で実施される。我々は、フロースルー様式でのＣＥＸの性能が、低導電率で僅かに酸性の条件において最良であることを見出した。そこで、したがって、ＡＥＸクロマトグラフィーからのフロースルー生成物に、それがＣＥＸクロマトグラフィーに供される前に、ｐＨを所望の値に低下させかつ最適な導電率を調整または維持する酸性溶液がインラインで補充される。適切なｐＨの低下および導電率の調整をもたらす任意の溶液または緩衝液が、この目的のために使用され得る。好ましくは、ｐＨは、少なくとも約３．５の値、より好ましくは少なくとも約４の値、より好ましくは少なくとも約５の値に修正される。好ましくは、ｐＨは、最大約７のｐＨ値に修正される。導電率は、好ましくは、少なくとも約２ｍＳに維持または修正され、最大約１０ｍＳである。好ましくは、当該溶液は、補充されて生成物の最低限の希釈をもたらすのに少量を必要とする酸性成分を含有する。当該酸性成分は、クエン酸（またはその一塩基性もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）、リン酸（またはその一塩基性もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）、酢酸、塩酸、硫酸などの化合物から選択され得る。
【００２８】
好ましくは、この場合の分離混合物への適量のｐＨおよび導電率調整用溶液の補充は、単一ユニット操作の一部であり、例えば、ＣＥＸクロマトグラフィー工程前のプロセス流れへの（例えば、混合チャンバーへの）上述の酸性溶液のインライン混合による。
【００２９】
本明細書において、「適量の酸性溶液」により、ＣＥＸ材料への関連不純物の大部分の吸着をもたらすのに十分な上述の溶液ではあるが、生成物の結合を引き起こさないほど十分に少ない量が意味される。それぞれの精製プロセスについて、酸性成分の最適な量および好ましい種類が確立されなければならない。
【００３０】
代替的に、ＡＥＸとＣＥＸとの順序が変更され得る。この場合、プロセスは、ＣＥＸクロマトグラフィーユニットから始まり、このＣＥＸクロマトグラフィーからの抗体含有溶液は、最適な精製がこのＣＥＸユニットにおいてフロースルー様式で行われるようなｐＨおよび導電率で事前にコンディショニングされるべきである。概して、これは、僅かに酸性のｐＨおよび低導電率で行われるであろう。その後のＡＥＸ工程は、その特定の工程に最適な精製条件で実施されなければならない。好ましくは、ｐＨは、最大約９の値、より好ましくは最大約９．５の値に修正される。好ましくは、ｐＨは、少なくとも約７のｐＨ値に修正される。導電率は、好ましくは、少なくとも約２ｍＳに維持または修正され、最大約１０ｍＳである。概して、これは、僅かにアルカリ性のｐＨおよび低導電率で行われるであろう。この目的のために、最適なＡＥＸ性能が得られるようにｐＨおよび導電率を調整するために適量の溶液がＣＥＸ後かつＡＥＸクロマトグラフィー前の抗体含有溶液にインラインで補充される。そこで、実際には、分離混合物のｐＨを所望の値に上昇させるためのかつＡＥＸクロマトグラフィーユニットの操作に最適な導電率を調整または維持するアルカリ性溶液が、ＣＥＸクロマトグラフィーからのフロースルー生成物にインラインで補充される。適切なｐＨの低下および導電率の調整をもたらす任意の溶液または緩衝液が、この目的のために使用され得る。好ましくは、当該溶液は、補充されて生成物の最低限の希釈をもたらすのに少量を必要とするアルカリ性成分を含有する。そのようなアルカリ性成分の一部の例は、水酸化ナトリウムもしくはカリウム、（またはその一もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンであるが、当該技術分野において知られている任意の他のアルカリ性成分が、この目的のために使用され得る。
【００３１】
本発明に従うＡＥＸクロマトグラフィーは、樹脂を含有する典型的な充填床カラム、モノリス材料を含有するカラム、適切なクロマトグラフィー媒体を含有するラジアルカラム、吸着膜ユニット、または、アニオン交換体として機能するのに適切な媒体およびリガンドを用いる当該技術分野において知られている任意の他のアニオン交換クロマトグラフィーデバイスによって具現化され得るＡＥＸユニットにおいて行われ得る。ＡＥＸカラムにおいて、クロマトグラフィー材料は、強カチオン性または弱カチオン性リガンドが結合した粒状保持体として存在し得る。膜型アニオン交換体は、強カチオン性または弱カチオン性リガンドが結合した１枚以上のシートの形態の保持体からなる。保持体は、有機材料もしくは無機材料または有機および無機材料の混合物からなり得る。好適な有機材料は、アガロースベースの媒体およびメタクリレートである。好適な無機材料は、シリカ、セラミックおよび金属である。膜形のアニオン交換体は、親水性ポリエーテルスルホン含有ＡＥＸリガンドからなり得る。好適な強ＡＥＸリガンドは、例えば第四級アミン基に基づく。好適な弱ＡＥＸリガンドは、例えば第一級、第二級もしくは第三級アミン基に基づくか、または当該技術分野において知られている任意の他の好適なリガンドである。
【００３２】
本発明に従うＣＥＸクロマトグラフィーは、樹脂を含有する典型的なカラム、モノリス材料ベースのカラム、適切なクロマトグラフィー媒体を含有するラジアルカラム、吸着膜ユニット、または、カチオン交換材料として機能するのに適切なリガンドを用いる当該技術分野において知られている任意の他のカチオン交換クロマトグラフィーデバイスによって具現化され得るＣＥＸユニットにおいて行われ得る。ＣＥＸカラムにおいて、クロマトグラフィー材料は、ＣＥＸリガンドが結合した粒状保持体として存在し得る。膜様のクロマトグラフィーデバイスは、ＣＥＸリガンドが結合した１枚以上のシートの形態の保持体からなる。保持体は、有機材料もしくは無機材料または有機および無機材料の混合物からなり得る。好適な有機保持体は、例えば、親水性炭水化物（例えば、架橋アガロース、セルロースまたはデキストラン）または合成コポリマー材料（例えば、ポリ（アルキルアスパルトアミド）（ｐｏｌｙ（ａｌｋｙｌａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ））、２−ヒドロキシエチルメタクリレートおよびエチレンジメタクリレートのコポリマー、またはアシル化ポリアミン）からなる。好適な無機保持体は、例えば、シリカ、セラミックおよび金属である。膜形のＣＥＸは、親水性ポリエーテルスルホン含有ＣＥＸリガンドからなり得る。ＣＥＸリガンドの好適な例は、スルホン酸、カルボン酸、ホスフィン酸、または、強もしくは弱カチオン交換体として機能することが当該技術分野において知られている任意の他のリガンドである。
【００３３】
本発明の方法に従って精製され得る抗体は、６．０以上、好ましくは７．０以上、より好ましくは７．５以上の等電点ｐＨを有する抗体である。これらの抗体は、Ｇクラス、ＡクラスまたはＭクラスの免疫グロブリンであり得る。抗体は、ヒトもしくは非ヒト（例えば、齧歯類）またはキメラ（例えば、「ヒト化」）抗体であり得るか、上述の免疫グロブリンのサブユニットであり得るか、免疫グロブリン部分と別の（非免疫グロブリン）タンパク質由来のまたはそのような別のタンパク質と同一の部分とからなるハイブリッドタンパク質であり得る。
【００３４】
驚くべきことに、合わせたＡＥＸおよびＣＥＸクロマトグラフィーの結果としてもたらされる抗体材料は、概して、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．９％、さらにより好ましくは少なくとも９９．９９％という、非常に高い純度（タンパク質含有量をいう）を有するであろう。
【００３５】
本発明に従うアニオン交換クロマトグラフィー工程は、好ましくは、中性または僅かにアルカリ性のｐＨで実施される。この工程は、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、プロテインＡ（存在する場合）、ウイルス（存在する場合）、タンパク質培地成分（例えば、インスリンおよびインスリン様成長因子）（存在する場合）などの、負に帯電した不純物を除去するであろう。
【００３６】
カチオン交換クロマトグラフィー工程の間に、主要な残りの大分子不純物（ｌａｒｇｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ）（主として生成物凝集体）が、適切なｐＨ条件および導電率条件を適用すればそれらは生成物が貫流する間にクロマトグラフィーデバイスに結合するという性質を利用して、除去されるであろう。
【００３７】
続いて、あらゆる残留低分子量不純物を除去し、緩衝液を最終製剤緩衝液（ｆｉｎａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）と交換し、所望の最終生成物濃度を調整するために、その（高度に）精製された抗体調製物は、概して、限外濾過およびダイアフィルトレーションによって処理されなければならないであろう。
【００３８】
さらに、その精製された抗体調製物は、概して、存在する可能性のある感染因子（例えば、ウイルスおよび／またはプリオン）の完全な除去を確実なものにするためにも処理されなければならないであろう。
【００３９】
本発明はまた、アニオン交換クロマトグラフィー部分（ＡＥＸ）およびカチオン交換クロマトグラフィー部分（ＣＥＸ）の両方を連続的に連結して含む単一操作ユニットに関する。この単一操作ユニットはさらに、第１のイオン交換クロマトグラフィー部分の上流端において入口を含み、かつ第２のイオン交換クロマトグラフィー部分の下流端において出口を含む。この単一操作ユニットはまた、第１のイオン交換クロマトグラフィー部分と第２のイオン交換クロマトグラフィー部分との間に連結部も含み、これが、分離混合物へのコンディショニング溶液の供給のための入口をさらに含む。
【００４０】
したがって、その１つの実施形態において、本発明は、アニオン交換クロマトグラフィー部分およびカチオン交換クロマトグラフィー部分の両方をこの順序で連続的に連結して含む、本発明に従う方法において使用され得る単一操作ユニットであって、アニオン交換クロマトグラフィー部分の出口は、カチオン交換クロマトグラフィー部分の入口に連結されており、当該ユニットは、アニオン交換クロマトグラフィー部分の上流端において入口を含みかつカチオン交換クロマトグラフィー部分の下流端において出口を含み、当該ユニットはまた、アニオン交換クロマトグラフィー部分とカチオン交換クロマトグラフィー部分との間にも、酸性コンディショニング溶液を分離混合物に供給するための入口を含む、単一操作ユニットに関する。
【００４１】
さらなる実施形態において、本発明は、カチオン交換クロマトグラフィー部分およびアニオン交換クロマトグラフィー部分の両方をこの順序で連続的に連結して含む、本発明に従う方法において使用され得る単一操作ユニットであって、カチオン交換クロマトグラフィー部分の出口は、アニオン交換クロマトグラフィー部分の入口に連結されており、当該ユニットは、カチオン交換クロマトグラフィー部分の上流端において入口を含みかつアニオン交換クロマトグラフィー部分の下流端において出口を含み、当該ユニットはまた、カチオン交換クロマトグラフィー部分とアニオン交換クロマトグラフィー部分との間にも、アルカリ性コンディショニング溶液を分離混合物に供給するための入口を含む、単一操作ユニットに関する。
【００４２】
本発明に従うプロセスの間の液体流れは、任意の市販のデュアルポンプクロマトグラフィーシステム（例えば、ＡＫＴＡエクスプローラー（ＧＥ）、ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳ（ＧＥ）の任意のデュアルポンプＨＰＬＣシステム）または図１もしくは図２の図に従う任意の特製のデバイスによって確立され得る。こうしたクロマトグラフィーデバイスの多くは、単一のクロマトグラフィーユニット（すなわち、カラムまたは膜）を操作するように設計されている。簡単な改造により、追加の連結が、ポンプＡ後かつ混合チャンバー前に第１のイオン交換ユニットを設けるために行われ得る。
【００４３】
図１および図２は、基本構成を示すものである。図１および図２に示されるような位置の任意選択のプレフィルターを加えた２つのクロマトグラフィーデバイスの連続的なインライン連結は、望ましくない圧力増大に繋がり得る。したがって、状況によっては、追加の技術的改良（例えば、ＡＥＸユニット後の追加のポンプおよびＡＥＸユニット前の減圧デバイス）が、この図に含まれなければならないことがあり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、基本構成を示すものである。
【図２】図２は、基本構成を示すものである。
【００４５】
［図面の説明］
図１は、アニオン交換クロマトグラフィー部分およびカチオン交換クロマトグラフィー部分の両方を含む単一操作ユニットを示している。緩衝液Ａは、ＡＥＸ工程の最適な操作に適したコンディショニングおよび洗浄用緩衝液である。緩衝液Ｂは、酸性溶液を含有しており、ＣＥＸ工程の操作に最適な条件を得るために必要とされる、負荷物／緩衝液Ａに対する比で混合される。この混合比は、一定の体積混合流量（ｆｉｘｅｄ  ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｍｉｘｉｎｇ  ｆｌｏｗ）を用いて達成され得る、またはフィードバックループによって例えばｐＨ出力に基づき自動制御され得る。ＭＣは、任意の種類の静的混合機を含有し得る、任意選択の混合チャンバーである。
Ｌ＝負荷物
ＰＡ＝ポンプＡ
ＰＢ＝ポンプＢ
ＡＥＸ＝アニオン交換ユニット
ＣＥＸ＝カチオン交換ユニット
ｐＨ＝ｐＨセンサー
σ＝導電率センサー
ＰＦ＝任意選択のプレフィルター
【００４６】
図２は、カチオン交換クロマトグラフィー部分およびアニオン交換クロマトグラフィー部分の両方を含む単一操作ユニットを示している。緩衝液Ａは、ＣＥＸ工程の最適な操作に適したコンディショニングおよび洗浄用緩衝液である。緩衝液Ｂは、アルカリ性溶液を含有しており、ＡＥＸ工程の操作に最適な条件を得るために必要とされる、負荷物／緩衝液Ａに対する比で混合される。この混合比は、一定の体積混合流量を用いて達成され得る、またはフィードバックループによって例えばｐＨ出力に基づき自動制御され得る。ＭＣは、任意の種類の静的混合機を含有し得る、任意選択の混合チャンバーである。
Ｌ＝負荷物
ＰＡ＝ポンプＡ
ＰＢ＝ポンプＢ
ＡＥＸ＝アニオン交換ユニット
ＣＥＸ＝カチオン交換ユニット
ｐＨ＝ｐＨセンサー
σ＝導電率センサー
ＰＦ＝任意選択のプレフィルター
【実施例】
【００４７】
［材料および方法］
全ての実験を、哺乳動物細胞株によって産生されたＩｇＧ１を用いて実施した。
【００４８】
培養を、化学的に規定された培地を用い、ＸＤ（登録商標）培養（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｎｅｗｓ，Ａｐｒ  １  ２０１０  Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．７参照）を適用して実施し、その後、採取物を希釈し、ＺｅｔａＰｌｕｓ  １０Ｍ０２Ｐ、ＺｅｔａＰｌｕｓ  ６０ＺＡ０５およびＳｔｅｒＡｓｓｕｒｅ  ＰＳＡ０２０（全てＣｕｎｏ（３Ｍ）から）の三段デプス濾過フィルター列によって細胞を除去した。
【００４９】
この清澄化した採取物は、およそ４．０ｇ／ＬのＩｇＧを含有するものであり、−２０℃にてアリコートで貯蔵した。これを、プロテインＡ精製に先立って解凍し、室温に平衡させた。
【００５０】
まず、標準的なプロテインＡクロマトグラフィーによる初期精製を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ）を使用し、標準的な手順（清澄化採取物を負荷し、まず２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、次にｐＨ５．５の１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、１００ｍＭ  アセテート緩衝液ｐＨ３．０を用いて溶出させる）を用いて実施した。
【００５１】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ溶出後、溶出ピークを回収し、１時間にわたりｐＨ３．５で維持した。その後、試料を、２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．０を用いてｐＨ７．４に中和し、０．２２μｍで濾過した。
【００５２】
こうして得られた材料を用いて、次の３つの一連の実験を実施した。１．フロースルー様式でのＡＥＸクロマトグラフィーについてのＨＣＰ除去性能を確立する（実験１）。２．フロースルー様式でＣＥＸクロマトグラフィーを使用して最適条件を確立する（実験２）。３．最適化されたＡＥＸ条件およびＣＥＸ条件の両方を１つの単一ユニット操作実験において組み合わせる（実施例１）。
【００５３】
ＨＣＰは、多クローン性抗ＰｅｒＣ６  ＨＣＰを用いてＥＬＩＺＡによって測定した。単量体ＩｇＧおよび凝集体の濃度は、標準的な手順に従って、サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）によって測定した。
【００５４】
［実験１］
［フロースルー様式でのアニオン交換クロマトグラフィーの良好な性能のための条件の確立］
フロースルー様式でのＡＥＸクロマトグラフィーを、上述のアセテートＴｒｉｓ緩衝液中の予備精製したＩｇＧを使用して実施した。以下のＡＥＸ媒体を試験した：Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑコイン（０．３５ｍＬ）（Ｐａｌｌ）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑカプセル（１ｍＬ）およびＣｈｒｏｍａＳｏｒｂカプセル（０．０８ｍＬ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（全て膜吸着体）。
【００５５】
全てのＡＥＸ媒体を、４０床容積／時間でＡＫＴＡエクスプローラーを使用して、フロースルーで実施した。試料を、最終導電率が５ｍＳとなるまで脱塩水で希釈した。コンディショニングおよび洗浄用緩衝液は、１００ｍＭアセテートＴｒｉｓ  ｐＨ７．４であった。各ＡＥＸ媒体上に負荷した生成物の量は、１．５ｇ  ＩｇＧ／ｍＬ膜床容積であった。
【００５６】
ＨＣＰを、クロマトグラフィー工程の前後で測定した。出発物質は、３３０５ｎｇ／ｍｇ  ＩｇＧを含有していた。溶出した物質は、上述したＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＱおよびＣｈｒｏｍａｓｏｒｂ膜について、それぞれ３９、５７および７１ｎｇ／ｍｇ  ＩｇＧを含有していた。これらの結果は、試験した全てのＡＥＸクロマトグラフィー媒体が、適用した条件下でＨＣＰを十分に除去することを明確に示していた。
【００５７】
［実験２］
［フロースルー様式でＣＥＸクロマトグラフィーを使用しての凝集体除去のための条件の確立］
これらの実験のために、予備精製したＩｇＧをｐＨ８．０に調整し、導電率が２ｍＳとなるように希釈した。１６ｃｍの床長さのＰｏｒｏｓ  ５０ＨＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を充填したＶＬ１１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）カラムを、ＡＫＴＡエクスプローラーで使用した。洗浄および平衡用緩衝液は、５．３５ｍｌ／分の流量での５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．４であった。この洗浄後、生成物を、同様の流量で負荷した。負荷の間中、カラムに入る前にｐＨおよび導電率を調整するために、そのカラムの前において、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４の溶液（緩衝液Ｂ）を、第２のポンプを用いてインライン混合した。生成物流れおよび緩衝液Ｂの種々の固定比を、カラムを通る全流量を一定に維持して試験した。フロースルー物の試料をそれぞれの比において採取し、その後、ＵＶシグナルを安定させた。
【００５８】
【表１】
2013540787.tif 000003
【００５９】
これらの試料の分析結果（表１に示す）は、ｐＨを十分に低下させた場合、フロースルー物はＩｇＧを依然として含有しつつもそれは凝集体をもはや含有しないということを明確に示している。
【実施例１】
【００６０】
［１つの単一ユニット操作における最適化されたＡＥＸおよびＣＥＸ条件でのＩｇＧの精製］
ＡＫＴＡエクスプローラーを使用して、ＡＥＸユニットおよびＣＥＸユニットを、図１の図に示されるように、連続的にインライン連結した。ＡＥＸには、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑカプセル（１ｍＬ）を使用し、ＣＥＸには、１６ｃｍの床長さのＰｏｒｏｓ  ５０ＨＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を充填したＶＬ１１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）カラムを使用した。生成物負荷前のコンディショニングには、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４、導電率４．０ｍＳ）を使用した（緩衝液Ａ）。同時に、緩衝液Ｂを、ＡＥＸ膜後かつＣＥＸ樹脂前に、２７．５％の体積比でインライン混合した。緩衝液Ｂは、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４を含有するものであった。ＣＥＸユニットを通る全流量は、５．３５ｍＬ／分であった。
【００６１】
この実験のために、予備精製したＩｇＧを、導電率が２．９８ｍＳとなるように脱塩水で希釈した。予備精製したＩｇＧの負荷は、緩衝液Ａのポンプ輸送を停止している間に、ＩｇＧを緩衝液Ａと同様の流量でポンプ輸送することによって開始した。緩衝液Ｂは、２７．５％の体積比の流量で維持した。１．９６ｇのＩｇＧを含有する６０２．５ｍＬの量を負荷した。負荷の完了後、このシステムから全ての生成物を回収するために、流れを緩衝液Ａに切り替えて戻した（洗浄）。洗浄後、２Ｍ  ＮａＣｌをポンプＡにより添加することによってＡＥＸ−ＣＥＸユニットをストリッピングし、ポンプＢを停止した。ストリッピング物（ｓｔｒｉｐ）は別個に回収した。全試験の間中、ＣＥＸを通る流量は、５．３５ｍＬ／分であった。合計時間（コンディショニング、洗浄およびストリッピングを含む）は、３時間未満であった。負荷物およびフロースルー物の両方を、ＩｇＧ凝集体比、ならびにＨＣＰ含有量およびタンパク質（生成物）含有量（Ａ２８０）について分析した。ＨＣＰ濃度は、出発物質中は２６９７ｎｇ／ｍｇ  ＩｇＧであり、フロースルー物と洗液との画分中は?４７ｎｇ／ｍｇ  ＩｇＧであった。凝集体の量は、付加物（出発物質）においては３．６６％であり、フロースルー物と洗液とにおいては、完全な凝集体除去を示す０．００％であった。ストリッピング物は、３０．４％の凝集体を含有していた。フロースルー物と洗液とにおける全生成物回収率は評価しなかったが、以前に実施した同様の試験において、全生成物回収率は、フロースルー物と洗液とではおよそ８６％であり、フロースルー物と洗液とストリッピング物とでは９２％であった。
【実施例２】
【００６２】
［１つの単一ユニット操作における最適化されたＣＥＸおよびＡＥＸ条件でのＩｇＧの精製］
ＡＫＴＡエクスプローラーを使用して、ＣＥＸユニットおよびＡＥＸユニットを、図２の図に示されるように、連続的にインライン連結する。ＣＥＸには、１６ｃｍの床長さのＰｏｒｏｓ  ５０ＨＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を充填したＶＬ１１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）カラムを使用し、ＡＥＸユニットには、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑカプセル（１ｍＬ）を使用する。生成物負荷前のコンディショニングには、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート緩衝液（ｐＨ６．６、導電率４．０ｍＳ）を使用する（緩衝液Ａ）。同時に、緩衝液Ｂを、ＡＥＸ膜後かつＣＥＸ樹脂前に、２０％の体積比でインライン混合した。緩衝液Ｂは、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．０を含有するものである。ＡＥＸユニットを通る全流量は、５．４ｍＬ／時間である。
【００６３】
この実験のためには、予備精製したＩｇＧのｐＨを、７．４ではなく６．６に調整し、次いで、導電率が４ｍＳとなるように脱塩水で希釈する。このｐＨ６．６に調整した予備精製したＩｇＧの負荷は、緩衝液Ａの流れを停止している間に、ＩｇＧを緩衝液Ａと同様の流量でポンプ輸送することによって開始する。緩衝液Ｂは、２０％の体積比の流量で維持する。１．５ｇのＩｇＧを含有する６００ｍＬの量を負荷する。負荷の完了後、このシステムから全ての生成物を回収するために、流れを緩衝液Ａに切り替えて戻す（洗浄）。洗浄後、２Ｍ  ＮａＣｌをポンプＡにより添加することによってＣＥＸ−ＡＥＸユニットをストリッピングし、ポンプＢを停止する。ストリッピング物は別個に回収する。全試験の間中、ＡＥＸを通る流量は、５．４ｍＬ／時間である。合計時間（コンディショニング、洗浄およびストリッピングを含む）は、３時間未満である。負荷物およびフロースルー物の両方を、ＩｇＧ凝集体比、ならびにＨＣＰ含有量およびタンパク質（生成物）含有量（Ａ２８０）について分析する。
【００６４】
［使用した略語］
Ａ２８０  ２８０ｎｍでの（光）吸収
ＡＥＸ  アニオン交換
ＣＥＸ  カチオン交換
ＣＨＯ細胞  チャイニーズハムスター卵巣細胞
ＥＢＡ  膨張床吸着
ＨＣＰ  宿主細胞タンパク質
ＨＰＬＣ  高圧液体クロマトグラフィー
ＩｇＧ  免疫グロブリンＧ
ＬｏＤ  検出限界
ＴＦＦ  接線流濾過
Ｔｒｉｓ  トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン
【図１】
2013540787.tif 000004
【図２】
2013540787.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成25年6月13日(2013.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中間精製およびポリッシングの工程を少なくとも含む、バイオリアクターにおいて生成された細胞ブロスからの抗体の精製方法であって、前記中間精製工程は、共にフロースルーでありかつ１つの単一ユニット操作として一緒に動作する、合わせた連続的に連結されたインラインのアニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー工程およびカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー工程をいずれかの順序で含み、第１のクロマトグラフィー工程は、分離混合物をフロースルー画分として生成し、前記分離混合物は、第２のクロマトグラフィー工程に直接供され、前記第２の工程は、精製抗体調製物をフロースルー画分として生成し、前記精製抗体調製物は、少なくとも１つのさらなる精製工程に供される、方法。
【請求項２】
分離混合物をフロースルー画分として生成する前記ＡＥＸクロマトグラフィー工程が最初に行われ、続いて連続的インラインで、精製抗体調製物をフロースルー画分として生成するＣＥＸクロマトグラフィー工程が行われ、前記精製抗体調製物は、少なくとも１つのさらなる精製工程に供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分離混合物をフロースルー画分として生成する前記ＣＥＸクロマトグラフィー工程が最初に行われ、続いて連続的インラインで、精製抗体調製物をフロースルー画分として生成するＡＥＸクロマトグラフィー工程が行われ、前記精製抗体調製物は、少なくとも１つのさらなる精製工程に供される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第２のイオン交換工程前の前記分離混合物に、前記第２のイオン交換クロマトグラフィー工程において最適な性能が得られるようにｐＨおよび導電率を調整するために適量の溶液が補充される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＣＥＸクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、適量の酸性溶液が補充される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＣＥＸクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、クエン酸（またはその一塩基性もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）、リン酸（またはその一塩基性もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）、酢酸、塩酸または硫酸を含有する適量の溶液が補充される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＡＥＸクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、適量のアルカリ性溶液が補充される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ＡＥＸクロマトグラフィー前の前記分離混合物に、水酸化ナトリウムもしくはカリウム、（またはその一もしくは二塩基性ナトリウム塩もしくはカリウム塩）またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含有する適量の溶液が補充される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アニオン交換クロマトグラフィー部分およびカチオン交換クロマトグラフィー部分の両方を連続的に連結して含む請求項２に記載の方法において使用され得る単一操作ユニットであって、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の出口は、前記カチオン交換クロマトグラフィー部分の入口に連結されており、前記ユニットは、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の上流端において入口を含みかつ前記カチオン交換クロマトグラフィー部分の下流端において出口を含み、前記ユニットはまた、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分と前記カチオン交換クロマトグラフィー部分との間にも入口を含む、単一操作ユニット。
【請求項１０】
カチオン交換クロマトグラフィー部分およびアニオン交換クロマトグラフィー部分の両方を連続的に連結して含む請求項３に記載の方法において使用され得る単一操作ユニットであって、前記カチオン交換クロマトグラフィー部分の出口は、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の入口に連結されており、前記ユニットは、前記カチオン交換クロマトグラフィー部分の上流端において入口を含みかつ前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の下流端において出口を含み、前記ユニットはまた、前記カチオン交換クロマトグラフィー部分と前記アニオン交換クロマトグラフィー部分との間にも入口を含む、単一操作ユニット。
【国際調査報告】
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