(57)【要約】  インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、それを含む組成物、それを含むワクチン、及びその使用方法が本明細書で提供される。【選択図】図１Ａ
2013526849.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって:
a.HA1のN末端ステムセグメントが1〜50の異種残基のリンカーに共有結合し、それがさらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合したものを含むインフルエンザ血球凝集素HA1ドメイン
を含み;該HA1ドメインが、
b.インフルエンザ血球凝集素HA2ドメイン
と三次結合又は四次結合している、前記ポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドであって:
a.HA1のN末端の長いステムセグメントが1〜50の異種残基のリンカーに共有結合し、それがさらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合したものを含むインフルエンザ血球凝集素HA1ドメイン
を含み;該HA1ドメインが、
b.インフルエンザ血球凝集素HA2ドメイン
と三次結合又は四次結合している、前記ポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドであって:
a.HA1のN末端ステムセグメントが1〜50の異種残基のリンカーに共有結合し、それがさらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合したものを含むインフルエンザ血球凝集素HA1ドメイン
を含み;該HA1ドメインが、
b.インフルエンザ血球凝集素HA2ドメイン
と三次結合又は四次結合しており、
ここで、該HA1のN末端ステムセグメントのアミノ酸配列は、配列番号550〜552のアミノ酸配列の1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であり、該HA1のC末端ステムセグメントのアミノ酸配列は、配列番号553〜554のアミノ酸配列の1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であり、かつここで、該HA2ドメインのアミノ酸配列は、配列番号160のアミノ酸配列の1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である、前記ポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドであって:
a.以下の順序で連結された:HA1のN末端ステムセグメント、1〜50の異種残基の第一のリンカー、HA1の中間ステムセグメント、1〜50の異種残基の第二のリンカー、及びHA1のC末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素HA1ドメイン
を含み;該HA1ドメインが、
b.インフルエンザ血球凝集素HA2ドメイン
と三次結合又は四次結合しており、
ここで、該HA1のN末端ステムセグメントのアミノ酸配列は、配列番号555のアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であり、該HA1の中間ステムセグメントのアミノ酸配列は、配列番号556のアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であり、該HA1のC末端ステムセグメントのアミノ酸配列は、配列番号557のアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であり、かつここで、該HA2ドメインのアミノ酸配列は、配列番号160のアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である、前記ポリペプチド。
【請求項５】
前記HA1ドメインが前記HA2ドメインと接触している、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記HA1のC末端の短いステムセグメントが、前記HA2ドメインと共有結合している、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記HA1のC末端の長いステムセグメントが、前記HA2ドメインと共有結合している、請求項2記載のポリペプチド。
【請求項８】
1RUZの対応するポリペプチドの三次構造又は四次構造から0〜5ÅのRMS偏差を有する三次構造又は四次構造を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項９】
インフルエンザ血球凝集素に結合することができる中和抗血清に選択的に結合する、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記HA1ドメインのアミノ酸配列が、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、又はH16 A型インフルエンザ由来のHA1の対応するドメインのアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記HA2ドメインのアミノ酸配列が、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、又はH16 A型インフルエンザ由来のHA2のアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記HA2ドメインのアミノ酸配列が、H3 A型インフルエンザ由来のHA2のアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記HA2ドメインのアミノ酸配列が、H1 A型インフルエンザ由来のHA2のアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記HA1のN末端ステムセグメントのアミノ酸配列が、H3 A型インフルエンザ由来のHA1の残基1〜52と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である配列からなる、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記HA1のC末端の短いステムセグメントのアミノ酸配列が、H3 A型インフルエンザ由来のHA1の残基305〜326と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である配列からなる、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記HA1のN末端ステムセグメントのアミノ酸配列が、H1 A型インフルエンザ由来のHA1の残基1〜46と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である配列からなる、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記HA1のC末端の短いステムセグメントのアミノ酸配列が、H1 A型インフルエンザ由来のHA1の残基306〜327と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である配列からなる、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記HA1のN末端の長いステムセグメントのアミノ酸配列が、H3 A型インフルエンザ由来のHA1の残基1〜97と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である配列からなる、請求項2記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記HA1のC末端の長いステムセグメントのアミノ酸配列が、H3 A型インフルエンザ由来のHA1の残基253〜326と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である配列からなる、請求項2記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記HA1のN末端の長いステムセグメントのアミノ酸配列が、H1 A型インフルエンザ由来のHA1の残基1〜94と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である配列からなる、請求項2記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記HA1のC末端の長いステムセグメントのアミノ酸配列が、H1 A型インフルエンザ由来のHA1の残基254〜327と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である配列からなる、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記HA1のN末端ステムセグメントが、前記HA1のC末端の短いステムセグメントのシステイン残基にジスルフィド架橋を介して共有結合しているシステイン残基を含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記HA1のN末端ステムセグメントが、アミノ酸配列A17-A18-(Xaa)n-A38(配列番号146)を含み、ここで、
A17は、Y又はHであり;
A18は、H、L、又はQであり;
(Xaa)nは、18〜20アミノ酸残基の配列を表し;かつ
A38は、H、S、Q、T、又はNである、
請求項1〜2のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記HA1のC末端ステムセグメントが、アミノ酸配列A291-A292を含み、ここで、
A291は、T、S、N、D、P、又はKであり;かつ
A292は、L、M、K、又はRである、
請求項2のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記HA2ドメインが、アミノ酸配列A18-A19-A20-A21を含み、ここで、
A18は、V又はIであり;
A19は、D、N、又はAであり;
A20は、Gであり、かつ
A21は、Wである、
請求項1〜2のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記HA2ドメインが、アミノ酸配列
【化１】
2013526849.tif 000140
を含み、ここで、
A38は、K、Q、R、L、又はYであり;
A39は、任意のアミノ酸残基であり;
A40は、任意のアミノ酸残基であり;
A41は、Tであり;
A42は、Qであり;
A43は、任意のアミノ酸残基であり;
A44は、Aであり;
A45は、Iであり;
A46は、Dであり;
A47は、任意のアミノ酸残基であり;
A48は、I、V、又はMであり;
A49は、T、Q、又はNであり;
A50は、任意のアミノ酸残基であり;
A51は、Kであり;
A52は、V又はLであり;
A53は、Nであり;
A54は、任意のアミノ酸残基であり;
A55は、V、I、又はLであり;かつ
A56は、V又はIである、
請求項1〜2のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記リンカーが、1〜40、1〜30残基、1〜20残基、1〜10残基、1〜5残基、1〜4残基、1〜3残基、1〜2残基、又は1残基である、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記リンカーが、
【化２】
2013526849.tif 000141
及び直接結合からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項２９】
請求項1〜28のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３０】
請求項29記載の核酸を発現する細胞。
【請求項３１】
請求項29記載の核酸を発現するように改変されたゲノムを含むウイルス。
【請求項３２】
請求項1〜28のいずれか一項記載のポリペプチドを含むウイルス。
【請求項３３】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項31又は32記載のウイルス。
【請求項３４】
A型インフルエンザウイルスである、請求項32記載のウイルス。
【請求項３５】
B型インフルエンザウイルスである、請求項33記載のウイルス。
【請求項３６】
前記ウイルスが、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、又はレトロウイルスである、請求項31又は32記載のウイルス。
【請求項３７】
不活化されているか又は分割されている、請求項32記載のウイルス。
【請求項３８】
不活化されているか又は分割されている、請求項33記載のウイルス。
【請求項３９】
請求項1〜28のいずれか一項記載のポリペプチドを含むウイルス様粒子。
【請求項４０】
請求項1〜28のいずれか一項記載のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項４１】
請求項31記載のウイルス及び医薬として許容し得る担体を含む免疫原性組成物。
【請求項４２】
請求項31記載のウイルス及び医薬として許容し得る担体を含む免疫原性組成物。
【請求項４３】
請求項33記載のウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項４４】
請求項35記載のウイルス及び医薬として許容し得る担体を含む免疫原性組成物。
【請求項４５】
請求項36記載のウイルス及び医薬として許容し得る担体を含む免疫原性組成物。
【請求項４６】
アジュバントをさらに含む、請求項44記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
アジュバントをさらに含む、請求項46記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
請求項39記載のウイルス様粒子及び医薬として許容し得る担体を含む免疫原性組成物。
【請求項４９】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項40記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項５０】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項42記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項５１】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項43記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項５２】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項44記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項５３】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項45記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項５４】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項45記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項５５】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項47記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項５６】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項48記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項５７】
前記対象がヒトである、請求項49記載の方法。
【請求項５８】
前記対象がヒトである、請求項50記載の方法。
【請求項５９】
前記対象がヒトである、請求項51記載の方法。
【請求項６０】
前記対象がヒトである、請求項52記載の方法。
【請求項６１】
前記対象がヒトである、請求項53記載の方法。
【請求項６２】
前記対象がヒトである、請求項54記載の方法。
【請求項６３】
前記対象がヒトである、請求項55記載の方法。
【請求項６４】
前記対象がヒトである、請求項56記載の方法。
【請求項６５】
前記免疫原性組成物が、前記対象に筋肉内又は鼻腔内投与される、請求項50記載の方法。
【請求項６６】
インフルエンザウイルス疾患を予防する方法であって、請求項40記載の免疫原性組成物の有効量を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項６７】
インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患を治療する方法であって、請求項40記載の免疫原性組成物の有効量を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項６８】
インフルエンザウイルス疾患を予防する方法であって、請求項43記載の免疫原性組成物の有効量を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項６９】
インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患を治療する方法であって、請求項43記載の免疫原性組成物の有効量を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項７０】
前記対象がヒトである、請求項66記載の方法。
【請求項７１】
前記対象がヒトである、請求項67記載の方法。
【請求項７２】
前記対象がヒトである、請求項68記載の方法。
【請求項７３】
前記対象がヒトである、請求項69記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2010年3月30日に出願された米国仮特許出願第61/319,137号の優先権の利益を主張し、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)(NIH)の国立アレルギー感染症研究所(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)からの助成番号RC1 AI086061、NIHからの助成番号U54 AI057158、米国保健社会福祉省(United States Department of Health and Human Services)からの助成番号HHSN266200700010C、及びNIHからの助成番号U01 AI070469の下で米国政府による支援を受けて行なわれた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
(1.序論)
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、それを含む組成物、それを含むワクチン、及びその使用方法が本明細書で提供される。
【背景技術】
【０００４】
(2.背景)
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)のファミリーに属するエンベロープ型のRNAウイルスである(Palese及びShawの文献(2007, オルトミクソウイルス科:ウイルス及びその複製(Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication), 第5版.フィールズのウイルス学(Fields' Virology), B.N. Fields, D. M. Knipe、及びP.M. Howley編. Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, USA, p1647-1689))。インフルエンザウイルスの自然宿主は鳥類であるが、インフルエンザウイルス(鳥類起源のものを含む)は、ヒト及び他の動物宿主(イヌ、ブタ、ウマ、海洋哺乳動物、及びイタチ類)に感染し、疾病を引き起こすこともできる。例えば、アジアで広がっているH5N1鳥インフルエンザウイルスは、中国及びインドネシアのブタで発見されており、その宿主範囲を広げて、A型インフルエンザに感染しやすいと一般に考えられていなかったネコ、ヒョウ、及びトラを含むようになってもいる(CIDRAP-鳥インフルエンザ:農業及び野生生物での注意事項(Avian Influenza: Agricultural and Wildlife Considerations))。動物におけるインフルエンザウイルス感染の出現は、ヒトパンデミックインフルエンザ株を発生させる可能性がある。
【０００５】
A型及びB型インフルエンザウイルスは、主要なヒト病原体であり、不顕性感染から死をもたらすこともある原発性ウイルス肺炎まで重症度が異なる呼吸器疾患を引き起こす。感染の臨床的効果は、インフルエンザ株の病原性、並びに宿主の曝露、病歴、年齢、及び免疫状態によって様々である。季節性インフルエンザに起因する累積罹患率及び死亡率は、比較的高い発病率のためにかなり高い。通常の季節では、インフルエンザは、全世界で300万〜500万症例の重症疾患及び最大500,000人の死亡を引き起こすことができる(世界保健機構(2003)インフルエンザ:概説(Influenza: Overview); http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/;2003年3月)。米国では、インフルエンザウイルスは、人口のおよそ10〜15％に感染し(Glezen及びCouch RBの文献(1978)1974〜76年のヒューストン地区のパンデミック間期インフルエンザ(Interpandemic influenza in the Houston area, 1974-76.)(N Engl J Med 298:587-592);Foxらの文献(1982)1975〜1979年のシアトルの家族におけるインフルエンザウイルス感染。II.病気に侵された家庭における感染パターン、並びに年齢及び事前抗体と感染及び関連疾病の発生との関係(Influenza virus infections in Seattle families, 1975-1979. II. Pattern of infection in invaded households and relation of age and prior antibody to occurrence of infection and related illness.)(Am J Epidemiol 116:228-242)、毎年約30,000人の死亡と関連する(Thompson WWらの文献(2003)米国におけるインフルエンザ及び呼吸器合胞体ウイルスと関連する死亡(Mortality Associated with Influenza and Respiratory Syncytial Virus in the United States.)(JAMA 289:179-186);Belshe(2007)ワクチンに関するトランスレーショナルリサーチ:インフルエンザを一例として(Translational research on vaccines: influenza as an example.)(Clin Pharmacol Ther 82:745-749)。
【０００６】
毎年の流行に加え、インフルエンザウイルスは、たまに起こるパンデミックの原因である。例えば、A型インフルエンザウイルスは、1918年、1957年、1968年、及び2009年に発生したようなパンデミックを引き起こすことができる。主要なウイルス抗原である血球凝集素(HA)に対する予め形成された免疫がないために、パンデミックインフルエンザは、単年で人口の50％よりも多くに影響を及ぼすことができ、しばしば流行性インフルエンザよりも重い疾患を引き起こす。明確な例は、およそ5000万人〜1億人が死亡した、1918年のパンデミックである(Johnson及びMuellerの文献(2002)説明の更新:1918〜1920年の「スペイン風邪(Spanish)」による全世界の死亡者数(Updating the Accounts: Global Mortality of the 1918-1920 "Spanish")(Influenza Pandemic Bulletin of the History of Medicine 76:105-115)。1990年代後半の高病原性鳥H5N1インフルエンザウイルス(Claasらの文献(1998)高病原性鳥インフルエンザウイルスと関連するヒトA型インフルエンザH5N1ウイルス(Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus.)(Lancet 351:472-7)の出現以降、それが次のパンデミックウイルスとなるかも知れないという懸念がある。
【０００７】
インフルエンザウイルス感染を防御する有効な方法は、ワクチン接種によるものである;しかしながら、現在のワクチン接種手法は、循環している株とワクチン製剤に含まれる分離株との間で良好な一致が得られることを当てにしている。そのような一致は、因子の組合せのために得るのが困難であることが多い。第一に、インフルエンザウイルスは絶えず変化を遂げている:3〜5年ごとに、A型インフルエンザウイルスの優勢株は、既存の抗体応答を避けるのに十分な抗原連続変異(antigenic drift)を経た変異体に取って代わられる。そのため、ワクチン製剤に含まれるべき分離株は、世界保健機関(WHO)の共同研究センターの集中的な監視努力に基づいて、毎年選択されなければならない。第二に、ワクチンの製造及び流通に十分な時間を与えるために、株は、インフルエンザシーズンの開始の約6カ月前に選択されなければならない。ワクチン株選択委員会の予測が不正確で、ワクチン接種の有効性が大幅に低下することもある。
【０００８】
A型インフルエンザウイルスの新規亜型がヒト集団に侵入する可能性も、現在のワクチン接種戦略にとって大きな課題となっている。インフルエンザウイルスのどの亜型及び株が次のパンデミックをもたらすかを予測することは不可能なので、現在の株特異的手法を用いて、パンデミックインフルエンザワクチンを調製することはできない。
【発明の概要】
【０００９】
(3.概要)
一態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、本明細書に記載の球状ヘッドドメインを欠いている。
【００１０】
任意の特定の作動理論に束縛されることを意図するものではないが、インフルエンザ血球凝集素の球状ヘッドドメインは、1以上の高免疫原性領域を含むと考えられている。これらの高免疫原性領域は、宿主免疫応答を生じさせることができる。しかしながら、高免疫原性領域は、インフルエンザウイルスの株によって異なることもある。本明細書で提示される実施態様は、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインの残基が比較的保存され、かつ免疫原性であり、また、この領域に結合する抗体が中和性であり得るという発見に一部基づく。インフルエンザ血球凝集素の球状ヘッドドメインの全て又は実質的に全てを欠いているインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを用いて、ステムドメインポリペプチドの1以上の保存されたエピトープに対する免疫応答を生じさせることができる。球状ヘッドドメインの高免疫原性領域の除去は、ステムドメインポリペプチドの1以上のエピトープを宿主免疫系に曝露させることができる。さらに、ある実施態様では、その中に存在するグリコシル化部位の改変によるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインのグリコシル化の除去は、ステムドメインの保存領域を宿主免疫応答にとってより接近しやすいものにすることができる。
【００１１】
ステムドメインポリペプチドの1以上のエピトープが球状ヘッドドメインの高免疫原性領域よりも免疫原性が低い場合、ステムドメインポリペプチドにおける球状ヘッドドメインの不在は、ステムドメインポリペプチドの1以上のエピトープに対する免疫応答が発生するのを可能にし得る。有利には、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのアミノ酸配列は、ウイルス亜型にわたって保存又は高度に保存され得るので、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドに対する免疫応答は、ステムドメインポリペプチドに対応する亜型以外の1以上のウイルス亜型と交差反応することができる。したがって、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、複数のインフルエンザウイルス株に対する免疫応答を生じさせることができる免疫原性組成物(例えば、ワクチン)に有用であることができる。
【００１２】
任意の理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、インフルエンザ血球凝集素の球状ヘッドドメインを欠き、インフルエンザ血球凝集素の融合前立体構造の安定性を維持するポリペプチドの本発明者らによる発見に一部基づく。一態様では、任意の理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、図1のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドにおいてAp及びAqとして特定されているシステイン残基の維持が、インフルエンザ血球凝集素の軸領域の安定性に寄与することを発見した。別の態様では、任意の理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの融合前立体構造を維持するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが、対象で防御的効果を誘導するのにより効果的であることを発見した。ある態様では、融合前立体構造の安定性は、特定の残基、例えば、HA1 H17Y(H3付番)にアミノ酸置換を導入することによって付与することができる。
【００１３】
(3.1  用語)
アミノ酸位置に関して用いられるときの、用語「約(about)」又は「約(approximately)」は、配列中の特定のアミノ酸位置、又はそのアミノ酸位置からN末端方向もしくはC末端方向に、5、4、3、2、もしくは1残基以内にある任意のアミノ酸を指す。
【００１４】
本明細書で用いられるように、数字と一緒に用いられる場合、用語「約(about)」又は「約(approximately)」は、言及された数字の1、5、又は10％以内の任意の数字を指す。
【００１５】
用語「アミノ酸配列同一性」は、1対の整列されたアミノ酸配列間の、通常パーセンテージとして表される同一性又は類似性の程度を指す。同一性パーセントは、配列を整列させ、かつ最大の配列相同性パーセントを達成するために、必要に応じてギャップを導入した後の、ペプチド中の対応するアミノ酸残基と同一である(すなわち、アラインメント中の所与の位置のアミノ酸残基が同じ残基である)か、又は類似する(すなわち、アラインメント中の所与の位置のアミノ酸置換が、以下で論じるような、保存的な置換である)候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージである。配列の同一性及び類似性のパーセンテージを含む配列相同性は、周知の配列アラインメント技術、好ましくは、この目的のために設計されたコンピュータアルゴリズムを用いて、該コンピュータアルゴリズムのデフォルトパラメータ、又はそれを含むソフトウェアパッケージを用いて決定される。コンピュータアルゴリズム及びそのようなアルゴリズムを組み込んでいるソフトウェアパッケージの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。BLASTファミリーのプログラムは、2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの特定の非限定的な例を例示する(例えば、Karlin及びAltschulの文献(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)(Karlin及びAltschulの文献(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)のように修正されている)、Altschulらの文献(1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)(NBLAST及びXBLASTを記載している)、Altschulらの文献(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)(Gapped BLAST及びPSI-Blastを記載している)。別の特定の例は、Myers及びMillerの文献(1988 CABIOS 4:11-17)のアルゴリズムであり、これは、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれ、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部として入手可能である。また、Wisconsin Sequence Analysis Packageの一部として入手可能な、FASTAプログラム(Pearson W.R.及びLipman D.J.の文献(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988))も特別である。さらなる例としては、以下のものが挙げられる。BESTFIT、これは、Smith及びWatermanの文献(Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981)の「局所相同性」アルゴリズムを用いて、2つの配列間で最良の単一の類似性領域を見出すものであり、比較されている2つの配列の長さが異なる場合に好ましい;並びにGAP、これは、Neddleman及びWunschの文献(J. Mol. Biol. 48:443-354, 1970)のアルゴリズムに従って「最大類似性」を見出すことによって2つの配列を整列させるものであり、2つの配列がおよそ同じ長さであり、アラインメントが全長にわたって予想される場合に好ましい。
【００１６】
「保存的置換」は、あるクラスのアミノ酸の同じクラスの別のアミノ酸との交換を指す。特定の実施態様では、保存的置換は、ポリペプチドの構造もしくは機能、又は両方を変化させない。保存的置換の目的のためのアミノ酸のクラスには、疎水性のもの(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性で親水性のもの(Cys、Ser、Thr)、酸性のもの(Asp、Glu)、塩基性のもの(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、立体構造を破壊するもの(conformation disrupters)(Gly、Pro)、及び芳香族のもの(Trp、Tyr、Phe)が含まれる。
【００１７】
本明細書で用いられるように、用語「疾患」及び「障害」は、互換的に用いられ、対象の状態を指す。いくつかの実施態様では、状態はウイルス感染である。具体的な実施態様では、用語「疾患」は、細胞もしくは対象におけるウイルスの存在に起因するか、又はウイルスによる細胞もしくは対象への侵入による病理学的状態を指す。ある実施態様では、状態は対象での疾患であり、その重症度は、免疫原性組成物の投与によって対象の免疫応答を誘導することによって低減される。
【００１８】
本明細書で用いられるように、対象への療法の投与との関連における用語「有効量」は、予防及び/又は治療効果(複数可)を有する療法の量を指す。ある実施態様では、対象への療法の投与との関連における「有効量」は、以下の効果のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、又はそれより多くを達成するのに十分である療法の量を指す:(i)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の重症度を軽減もしくは改善する;ii)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の持続期間を短縮する;(iii)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の進行を予防する;(iv)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の退行をもたらす;(v)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の発症もしくは開始を予防する;(vi)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の再発を予防する;(vii)1つの細胞から別の細胞、1つの組織から別の組織、もしくは1つの器官から別の器官へのインフルエンザウイルスの伝播を低減もしくは予防する;(ix)1つの対象から別の対象へのインフルエンザウイルスの伝播を予防もしくは低減する;(x)インフルエンザウイルス感染と関連する器官不全を低減する;(xi)対象の入院を減少させる;(xii)入院期間を短縮する;(xiii)インフルエンザウイルス感染もしくはそれと関連する疾患を有する対象の生存を増加させる;(xiv)インフルエンザウイルス感染もしくはそれと関連する疾患を消失させる;(xv)インフルエンザウイルスの複製を阻害もしくは低減する;(xvi)宿主細胞(複数可)へのインフルエンザウイルスの侵入を阻害もしくは低減する;(xviii)インフルエンザウイルスゲノムの複製を阻害もしくは低減する;(xix)インフルエンザウイルスタンパク質の合成を阻害もしくは低減する;(xx)インフルエンザウイルス粒子の会合を阻害もしくは低減する;(xxi)宿主細胞(複数可)からのインフルエンザウイルス粒子の放出を阻害もしくは低減する;(xxii)インフルエンザウイルス力価を低下させる;及び/又は(xxiii)別の療法の予防もしくは治療効果(複数可)を増強又は改善する。
【００１９】
ある実施態様では、有効量はインフルエンザウイルス疾患からの完全な防御をもたらすのではなく、未処置の対象と比較してより低い力価又は少ない数のインフルエンザウイルスをもたらす。ある実施態様では、有効量は、未処置の対象と比べて、0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、もしくは1,000倍、又はそれより大きいインフルエンザウイルスの力価の低下をもたらす。いくつかの実施態様では、有効量は、未処置の対象と比べて、約1log以上、約2log以上、約3log以上、約4log以上、約5log以上、約6log以上、約7log以上、約8log以上、約9log以上、約10log以上、1〜3log、1〜5log、1〜8log、1〜9log、2〜10log、2〜5log、2〜7log、2〜8log、2〜9log、2〜10log、3〜5log、3〜7log、3〜8log、3〜9log、4〜6log、4〜8log、4〜9log、5〜6log、5〜7log、5〜8log、5〜9log、6〜7log、6〜8log、6〜9log、7〜8log、7〜9log、又は8〜9logのインフルエンザウイルスの力価の低下をもたらす。インフルエンザウイルスの力価、数、又は総負荷量の低下の利点としては、重症度がより低い感染症状、より少ない感染症状、及び感染と関連する疾患の長さの短縮が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
「血球凝集素」及び「HA」は、当業者に公知の任意の血球凝集素を指す。ある実施態様では、血球凝集素は、インフルエンザ血球凝集素、例えば、A型インフルエンザ血球凝集素、B型インフルエンザ血球凝集素、又はC型インフルエンザ血球凝集素である。典型的な血球凝集素は、シグナルペプチド(本明細書では任意)、ステムドメイン、球状ヘッドドメイン、内腔ドメイン(本明細書では任意)、膜貫通ドメイン(本明細書では任意)、及び細胞質ドメイン(本明細書では任意)を含む、当業者に公知のドメインを含む。ある実施態様では、血球凝集素は、単一のポリペプチド鎖、例えば、HA0からなる。ある実施態様では、血球凝集素は、4次結合した2以上のポリペプチド鎖、例えば、HA1及びHA2からなる。当業者は、未成熟なHA0が切断されてシグナルペプチド(約20アミノ酸)を放出し、成熟した血球凝集素HA0を生じさせることができることを認識しているであろう。血球凝集素HA0は、別の部位で切断されて、HA1ポリペプチド(約320アミノ酸、球状ヘッドドメインとステムドメインの一部とを含む)及びHA2ポリペプチド(約220アミノ酸、ステムドメインの残り、内腔ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む)を生じさせることができる。ある実施態様では、血球凝集素は、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む。ある実施態様では、血球凝集素は、シグナルペプチドを欠く、すなわち、血球凝集素は成熟した血球凝集素である。ある実施態様では、血球凝集素は、膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメイン、又は両方を欠く。本明細書で用いられるように、用語「血球凝集素」及び「HA」は、翻訳後プロセシング、例えば、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合形成、グリコシル化(例えば、N結合型グリコシル化)、プロテアーゼ切断、及び脂質修飾(例えば、S-パルミトイル化)によって修飾される血球凝集素ポリペプチドを包含する。
【００２１】
「HA1のN末端ステムセグメント」は、インフルエンザ血球凝集素HA1ポリペプチドのステムドメインのアミノ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、HA1ドメインのアミノ酸HA1N-termからApまでにほぼ対応するアミノ酸残基からなる。HA1N-termは、当業者によって認識されているようなHA1のN末端アミノ酸である。Apは、HA1のC末端ステムセグメント中のシステイン残基とジスルフィド結合を形成するか、又はそれを形成することができる、HA1のN末端ステムセグメント中のシステイン残基である。残基Apは、図1のA型インフルエンザ血球凝集素ポリペプチド中で特定されている。例示的なHA1のN末端ステムセグメントが本明細書に記載されている。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、H3血球凝集素由来のHA1のアミノ酸1〜52にほぼ対応するアミノ酸残基からなる。この付番体系では、1は、シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タンパク質のN末端アミノ酸を指すことに留意されたい。
【００２２】
「HA1のC末端ステムセグメント」は、インフルエンザ血球凝集素HA1ポリペプチドのステムドメインのカルボキシ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、HA1ドメインのアミノ酸AqからHA1C-termまでにほぼ対応するアミノ酸残基からなる。HA1C-termは、当業者によって認識されているようなHA1ドメインのC末端アミノ酸である。残基Aqは、図1のA型インフルエンザ血球凝集素ポリペプチド中で特定されている。例示的なHA1のC末端ステムセグメントが本明細書に記載されている。ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、H3血球凝集素由来のHA1のアミノ酸277〜346にほぼ対応するアミノ酸残基からなる。この付番体系では、1は、シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タンパク質のN末端アミノ酸を指すことに留意されたい。
【００２３】
「HA1のC末端の短いステムセグメント」は、インフルエンザ血球凝集素HA1ポリペプチドのステムドメインのカルボキシル末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントは、HA1ドメインのアミノ酸BqからHA1C-termまでにほぼ対応するアミノ酸残基からなる。残基Bqは、図1のA型インフルエンザ血球凝集素ポリペプチド中で特定されている。例示的なHA1のC末端の短いステムセグメントが本明細書に記載されている。ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントは、H3血球凝集素由来のHA1のアミノ酸305〜346にほぼ対応するアミノ酸残基からなる。この付番体系では、1は、シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タンパク質のN末端アミノ酸を指すことに留意されたい。
【００２４】
「HA1のN末端の長いステムセグメント」は、インフルエンザ血球凝集素HA1ポリペプチドのステムドメインのアミノ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、HA1ドメインのアミノ酸HA1N-termからCpまでにほぼ対応するアミノ酸残基からなる。Cpは、HA1のC末端の長いステムセグメント中のアラニン残基に連結しているか、又はそれに連結することができるHA1のN末端の長いステムセグメント中のシステイン残基である。残基Cpは、図1のA型インフルエンザ血球凝集素ポリペプチド中で特定されている。例示的なHA1のN末端の長いステムセグメントが本明細書に記載されている。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、H3血球凝集素由来のHA1のアミノ酸1〜97にほぼ対応するアミノ酸残基からなる。この付番体系では、1は、シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タンパク質のN末端アミノ酸を指すことに留意されたい。
【００２５】
「HA1のC末端の長いステムセグメント」は、インフルエンザ血球凝集素HA1ポリペプチドのステムドメインのカルボキシル末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、HA1ドメインのアミノ酸CqからHA1C-termまでにほぼ対応するアミノ酸残基からなる。Cqは、HA1のN末端の長いステムセグメント中のシステイン残基に連結しているか、又はそれに連結することができるHA1のC末端の長いステムセグメント中のアラニン残基である。残基Cqは、図1のA型インフルエンザ血球凝集素ポリペプチド中で特定されている。例示的なHA1のC末端の長いステムセグメントが本明細書に記載されている。ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、H3血球凝集素由来のHA1のアミノ酸252〜346にほぼ対応するアミノ酸残基からなる。この付番体系では、1は、シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タンパク質のN末端アミノ酸を指すことに留意されたい。
【００２６】
「HA2」は、当業者に公知のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのHA2ドメインに対応するポリペプチドドメインを指す。ある実施態様では、HA2は、ステムドメイン、内腔ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインからなる(例えば、Scheiffleらの文献(2007, EMBO J. 16(18):5501-5508)を参照されたく、その内容は、引用によりその全体が組み込まれる)。ある実施態様では、HA2は、ステムドメイン、内腔ドメイン、及び膜貫通ドメインからなる。ある実施態様では、HA2は、ステムドメイン及び内腔ドメインからなり;そのような実施態様では、HA2は可溶性であることができる。ある実施態様では、HA2はステムドメインからなり;そのような実施態様では、HA2は可溶性であることができる。
【００２７】
本明細書で用いられるように、ポリペプチド、核酸、又はウイルスとの関連における用語「異種」は、通常天然で見られないか、又は通常天然で関心対象のポリペプチド、核酸、もしくはウイルスと関連していないポリペプチド、核酸、又はウイルスをそれぞれ指す。例えば、「異種ポリペプチド」は、異なるウイルス、例えば、異なるインフルエンザ株もしくは亜型、又は無関係なウイルスもしくは異なる種に由来するポリペプチドを指すことができる。
【００２８】
本明細書で用いられるように、対象への2以上の療法の投与との関連における用語「併用」は、2以上の療法(例えば、2以上の予防剤及び/又は治療剤)の使用を指す。用語「併用」の使用は、療法が対象に投与される順序を制限しない。例えば、第一の療法(例えば、第一の予防剤又は治療剤)は、対象への第二の療法の投与の前に(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間前に)、それと同時に、又はその後に(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間後に)投与することができる。
【００２９】
本明細書で用いられるように、用語「感染」は、細胞又は対象におけるウイルスの侵入、その増殖、及び/又は存在を意味する。一実施態様では、感染は、「活動性」感染、すなわち、ウイルスが細胞又は対象で複製している感染である。そのような感染は、ウイルスが最初に感染した細胞、組織、及び/又は器官から、他の細胞、組織、及び/又は器官へのウイルスの伝播を特徴とする。感染はまた、潜伏性の感染、すなわち、ウイルスが複製していない感染であってもよい。ある実施態様では、感染は、細胞もしくは対象におけるウイルスの存在に起因するか、又は細胞もしくは対象へのウイルスの侵入による病理学的状態を指す。
【００３０】
本明細書で用いられるように、用語「インフルエンザウイルス疾患」は、細胞又は対象におけるインフルエンザ(例えば、A型もしくはB型インフルエンザウイルス)ウイルスの存在、又は細胞もしくは対象へのインフルエンザウイルスの侵入に起因する病理学的状態を指す。具体的な実施態様では、この用語は、インフルエンザウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患を指す。
【００３１】
本明細書で用いられるように、語句「IFN欠損システム」又は「IFN欠損基体」は、IFNを産生しないか、又は低レベルのIFNを産生する(すなわち、同じ条件下のIFNコンピテントなシステムと比較して、5〜10％、10〜20％、20〜30％、30〜40％、40〜50％、50〜60％、60〜70％、70〜80％、80〜90％、もしくはそれより大きいIFN発現の低下)か、IFNに応答しないか、もしくはそれにあまり効率的には応答せず、かつ/又はIFNによって誘導される1以上の抗ウイルス遺伝子の活性が欠損している、システム、例えば、細胞、細胞株、及び動物、例えば、ブタ、マウス、ニワトリ、七面鳥、ウサギ、ラットなどを指す。
【００３２】
本明細書で用いられるように、数値用語「log」は、log10を指す。
【００３３】
本明細書で用いられるように、語句「感染多重度」又は「MOI」は、感染細胞当たりの感染性ウイルス粒子の平均数である。MOIは、添加した感染性ウイルス粒子の数(添加したml×PFU/ml)を、添加した細胞の数(添加したml×細胞/ml)で割ることによって決定される。
【００３４】
本明細書で用いられるように、用語「核酸」は、DNA分子(例えば、cDNA又はゲノムDNA)及びRNA分子(例えば、mRNA)及びヌクレオチド類似体を用いて作製されたDNA又はRNAの類似体を含むことが意図される。核酸は、一本鎖又は二本鎖であることができる。
【００３５】
当業者に公知であるように、「ポリペプチド」は、アミド結合によって連結されたアミノ酸のポリマーを指す。本明細書で用いられるように、この用語は、共有アミド結合で連結された単一のポリペプチド鎖を指すことができる。この用語は、非共有結合的相互作用、例えば、イオン接触、水素結合、ファンデルワールス接触、及び疎水性接触によって会合する複数のポリペプチド鎖を指すこともできる。当業者は、この用語が、例えば、翻訳後プロセシング、例えば、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合形成、グリコシル化(例えば、N結合型グリコシル化)、プロテアーゼ切断、及び脂質修飾(例えば、S-パルミトイル化)によって修飾されているポリペプチドを含むことを認識しているであろう。
【００３６】
本明細書で用いられるように、インフルエンザウイルス疾患を予防するための対象への療法(複数可)の投与との関連における用語「予防する」、「予防すること」、及び「予防」は、療法又は療法の組合せの投与から得られる以下の効果のうちの1つ又は複数を指す:(i)インフルエンザウイルス疾患又はその症状の発症又は開始の阻害;(ii)インフルエンザウイルス疾患又はそれと関連する症状の再発の阻害;並びに(iii)インフルエンザウイルスの感染及び/又は複製の低減又は阻害。
【００３７】
本明細書で用いられるように、天然源、例えば、細胞から得られるポリペプチド(抗体を含む)との関連で用いられる場合の用語「精製された」及び「単離された」は、天然源由来の夾雑物質、例えば、土壌粒子、鉱物、環境由来の化学物質、並びに/又は天然源由来の細胞性物質、例えば、限定するものではないが、細胞破片、細胞壁物質、膜、オルガネラ、細胞内に存在する核酸、炭水化物、タンパク質、及び/もしくは脂質の大部分を実質的に含まないポリペプチドを指す。したがって、単離されたポリペプチドには、細胞性物質及び/又は夾雑物質の(乾燥重量で)約30％、20％、10％、5％、2％又は1％未満を有するポリペプチド調製物が含まれる。本明細書で用いられるように、化学合成されるポリペプチド(抗体を含む)との関連で用いられる場合の用語「精製された」及び「単離された」は、ポリペプチドの合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まないポリペプチドを指す。具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは化学合成される。別の具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは単離される。
【００３８】
本明細書で用いられるように、ウイルスとの関連における用語「複製」、「ウイルスの複製」、及び「ウイルス複製」は、ウイルスの増殖をもたらすウイルスの生活環の段階のうちの1つもしくは複数、又は全てを指す。ウイルスの生活環の段階には、宿主細胞表面へのウイルス付着、宿主細胞への貫入又は侵入(例えば、受容体介在性エンドサイトーシス又は膜融合によるもの)、脱外被(ウイルスカプシドがウイルス酵素又は宿主酵素によって除去及び分解され、それにより、ウイルスゲノム核酸が放出される過程)、ゲノム複製、ウイルスメッセンジャーRNA(mRNA)の合成、ウイルスタンパク質合成、並びにゲノム複製のためのウイルスリボ核タンパク複合体の会合、ウイルス粒子の会合、ウイルスタンパク質の翻訳後修飾、及び溶解又は出芽による宿主細胞からの遊離、及び埋め込まれたウイルス糖タンパク質を含むリン脂質エンベロープの獲得が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、用語「複製」、「ウイルスの複製」、及び「ウイルス複製」は、ウイルスゲノムの複製を指す。他の実施態様では、用語「複製」、「ウイルスの複製」、及び「ウイルス複製」は、ウイルスタンパク質の合成を指す。
【００３９】
「ステムドメインポリペプチド」は、血球凝集素のステムドメインを構成する1以上のポリペプチド鎖を含む血球凝集素ポリペプチドの誘導体、例えば、改変された誘導体を指す。ステムドメインポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖、2つのポリペプチド鎖、又はより多くのポリペプチド鎖であり得る。通常、ステムドメインポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖(すなわち、血球凝集素HA0ポリペプチドのステムドメインに対応する)又は2つのポリペプチド鎖(すなわち、血球凝集素HA2ポリペプチドと関連している血球凝集素HA1ポリペプチドのステムドメインに対応する)である。ある実施態様では、ステムドメインポリペプチドは、インフルエンザ血球凝集素に由来する。改変されたステムドメインポリペプチドは、下記のような1以上のリンカーを含むことができる。
【００４０】
本明細書で用いられるように、用語「対象」又は「患者」は互換的に用いられ、動物(例えば、鳥、爬虫類、及び哺乳動物)を指す。具体的な実施態様では、対象は鳥である。別の実施態様では、対象は、非霊長類(例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス)並びに霊長類(例えば、サル、チンパンジー、及びヒト)を含む哺乳動物である。ある実施態様では、対象は非ヒト動物である。いくつかの実施態様では、対象は家畜又はペットである。別の実施態様では、対象はヒトである。別の実施態様では、対象はヒト乳児である。別の実施態様では、対象はヒト小児である。別の実施態様では、対象はヒト成人である。別の実施態様では、対象はヒト高齢者である。別の実施態様では、対象はヒト早産児である。
【００４１】
本明細書で用いられるように、用語「ヒト早産児」は、妊娠37週未満で生まれるヒト乳児を指す。
【００４２】
本明細書で用いられるように、用語「ヒト乳児」は、新生児から1歳までのヒトを指す。
【００４３】
本明細書で用いられるように、用語「ヒト小児」は、1歳から18歳までのヒトを指す。
【００４４】
本明細書で用いられるように、用語「ヒト成人」は、18歳以上のヒトを指す。
【００４５】
本明細書で用いられるように、用語「ヒト高齢者」は、65歳以上のヒトを指す。
【００４６】
用語「三次構造」及び「四次構造」は、当業者によって理解される意味を有する。三次構造は、単一のポリペプチド鎖の三次元構造を指す。四次構造は、複数のポリペプチド鎖を有するポリペプチドの三次元構造を指す。
【００４７】
本明細書で用いられるように、用語「療法(複数)」及び「療法」は、ウイルス感染又はそれと関連する疾患もしくは症状の予防または治療において用いることができる任意のプロトコル(複数可)、方法(複数可)、化合物(複数可)、組成物(複数可)、製剤(複数可)、及び/又は薬剤(複数可)を指すことができる。ある実施態様では、用語「療法(複数)」及び「療法」は、当業者に公知のウイルス感染又はそれと関連する疾患もしくは症状の予防または治療において有用な生物学的療法、支持療法、及び/又は他の療法を指す。いくつかの実施態様では、用語「療法」は、インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸、インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド、又はインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドもしくはインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする該核酸を含むベクターもしくは組成物を指す。いくつかの実施態様では、用語「療法」は、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド又はインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドに特異的に結合する抗体を指す。
【００４８】
本明細書で用いられるように、用語「治療する」、「治療」、及び「治療すること」は、対象への療法(複数可)の投与との関連において、療法又は療法の組合せの有益な又は治療的な効果を得るためにインフルエンザウイルス疾患を治療することを指す。具体的な実施態様では、そのような用語は、療法又は療法の組合せの投与から得られる以下の効果のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又はそれより多くを指す:(i)インフルエンザウイルス感染、又はそれと関連する疾患もしくは症状の重症度の軽減又は改善;(ii)インフルエンザウイルス感染、又はそれと関連する疾患もしくは症状の持続時間の短縮;(iii)インフルエンザウイルス感染又はそれと関連する疾患もしくは症状の退行;(iv)インフルエンザウイルスの力価の低減;(v)インフルエンザウイルス感染又はそれと関連する疾患と関連する器官不全の低減;(vi)対象の入院の減少;(vii)入院期間の短縮;(viii)対象の生存の増加;(ix)インフルエンザウイルス感染、又はそれと関連する疾患もしくは症状の消失;(x)インフルエンザウイルス感染又はそれと関連する疾患もしくは症状の進行の阻害;(xi)細胞、組織、器官、又は対象から別の細胞、組織、器官、又は対象へのインフルエンザウイルスの伝播の予防;(xii)宿主細胞(複数可)へのインフルエンザウイルスの侵入の阻害又は低減;(xiii)インフルエンザウイルスゲノムの複製の阻害又は低減;(xiv)インフルエンザウイルスタンパク質の合成の阻害又は低減;(xv)宿主細胞(複数可)からのインフルエンザウイルス粒子の放出の阻害又は低減;並びに/或いは(xvi)別の療法の治療効果の増強又は改善。
【００４９】
本明細書で用いられるように、いくつかの実施態様では、ウイルスとの関連における語句「野生型」は、一般的であり、自然に循環しており、かつ疾患の典型的な発生をもたらすウイルスの型を指す。他の実施態様では、ウイルスとの関連における用語「野生型」は、親ウイルスを指す。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
(4.図面の簡単な説明)
【図１】A型インフルエンザウイルス血球凝集素の16の亜型の代表的な配列(それぞれ、配列番号1〜16)のCLUSTALWによる配列アラインメントを示す。
【００５１】
【図２】A型インフルエンザHK68-H3N2血球凝集素(配列番号3)及びPR8-H1N1血球凝集素(配列番号1)と整列させたB型インフルエンザウイルス血球凝集素の代表的な配列(配列番号17)のCLUSTALWによる配列アラインメントを示す。
【００５２】
【図３】本明細書に記載の様々なN末端及びC末端ステムセグメント並びに中間ステムセグメントの境界を成すアミノ酸を記載した、B型インフルエンザウイルス血球凝集素(配列番号17)の配列表を示す。
【００５３】
【図４】HK68-H3N2血球凝集素タンパク質に基づくA型インフルエンザHAステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。図4Aは、HK68-H3N2血球凝集素タンパク質、HA1のN末端ステムセグメント配列番号36、及びC末端ステムセグメント配列番号52に基づくA型インフルエンザHAステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。図4Bは、HK68-H3N2血球凝集素タンパク質、HA1のN末端ステムセグメント配列番号36、及びC末端の短いステムセグメント配列番号352に基づくA型インフルエンザHAの短いステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。図4Cは、HK68-H3N2血球凝集素タンパク質、HA1のN末端の長いステムセグメント配列番号417、及びC末端の長いステムセグメント配列番号433に基づくA型インフルエンザHAの長いステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。
【００５４】
【図５】PR8-H1N1血球凝集素タンパク質に基づくA型インフルエンザHAステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。図5Aは、PR8-H1N1血球凝集素タンパク質、HA1のN末端ステムセグメント配列番号18、及びC末端ステムセグメント配列番号34に基づくA型インフルエンザHAステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。図5Bは、A型インフルエンザHAの短いステムドメインポリペプチド、HA1のN末端ステムセグメント配列番号18、及びC末端の短いステムセグメント配列番号350の推定上の構造を提供する。図5Cは、PR8-H1N1血球凝集素タンパク質、HA1のN末端の長いステムセグメント配列番号414、及びC末端の長いステムセグメント配列番号430に基づくA型インフルエンザHAの長いステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。
【００５５】
【図６】B型インフルエンザHAステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。図6Aは、B/香港/8/73血球凝集素タンパク質に基づく部分的に頭部のないHA分子を提供する。この分子中では、HAのHA1ドメインの最初の94アミノ酸が保持されており(配列番号550)、かつCys94が、リンカー架橋によって、HA1ドメインのCys143に直連結されている(配列番号553)。図6Bは、B/香港/8/73血球凝集素タンパク質に基づく部分的に頭部のないHA分子を示す。この分子中では、HAのHA1ドメインの最初の178アミノ酸が保持されており(配列番号551)、かつCys178が、リンカー架橋によって、HA1ドメインのCys272に直連結されている(配列番号554)。図6Cは、B/香港/8/73血球凝集素タンパク質に基づく頭部のないHA分子を示す。この分子中では、HAのHA1ドメインの最初の94アミノ酸が保持されており(配列番号555)、かつCys94が、リンカー架橋によって、HA1ドメインのCys143に直連結されている。HA1ドメインのアミノ酸143〜178がさらに保持されており(配列番号556)、かつCys178が、リンカー架橋によって、HA1ドメインのCys272に直連結されている(配列番号557)。図6Dは、B/香港/8/73血球凝集素タンパク質に基づく頭部のないHA分子を示す。この分子中では、HAのHA1ドメインの最初の54アミノ酸が保持されており(配列番号552)、かつCys54が、リンカー架橋によって、HA1ドメインのCys272に直連結されている(配列番号554)。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
(5.詳細な説明)
(5.1  ポリペプチド)
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。任意の特定の作動理論に束縛されることを意図するものではないが、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、複数のインフルエンザ株と交差反応が可能である免疫応答を生じさせるために、宿主免疫系に1以上の比較的保存された抗原性領域を提示するのに有用であると考えられている。該1以上の抗原性領域はインフルエンザ血球凝集素亜型にわたってよく保存されているので、そのような免疫応答は、全長インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのいくつかの亜型と交差反応することができる。
【００５７】
全長インフルエンザ血球凝集素は、その球状ヘッドドメインでいくつかの高抗原性セグメントを提示すると考えられている。これらの高抗原性セグメントは、宿主免疫系にとってより接近しやすいか、又は構造がより免疫原性であるか、又はその両方であることができる。宿主免疫系は、インフルエンザ血球凝集素のステムドメイン中の1以上のエピトープと比較して、これらの高免疫原性セグメントに優先的に応答すると考えられている。さらに、インフルエンザ血球凝集素の球状ヘッドドメインは亜型及びウイルス株間で様々に異なり得るので、1つの球状ヘッドドメイン亜型に対する免疫応答は、その球状ヘッドドメインの特定の高抗原性セグメントに限定されることができる。異なる球状ヘッドドメインを有する株は、同じ免疫応答と交差反応しない可能性がある。したがって、血球凝集素ポリペプチドを提示するワクチンの有効性は、ワクチンで提示される特定の株に限定され得る。それゆえ、所与の従来のインフルエンザワクチンは、所与のインフルエンザシーズン中に病原性であることが予測されるインフルエンザ株に対してだけ有効である可能性が高い。
【００５８】
有利には、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、複数のインフルエンザ株に対して免疫応答を生じさせるのに有用であることができる。インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、通常、従来のインフルエンザワクチンポリペプチドの高抗原性で、可変性の球状ヘッドドメインを含まない。したがって、それらは、球状ヘッドドメインの可変セグメントに限定される免疫応答を生じさせるはずがない。代わりに、それらは、インフルエンザ血球凝集素の比較的保存されたステムドメイン中の1以上のエピトープを提示する。したがって、それらを用いて、比較的保存されたエピトープを有する複数のインフルエンザ株に対する宿主免疫応答を生じさせることができる。したがって、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、以下で詳細に記載される組成物、ワクチン、及び方法で抗原としての用途を有する。インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、任意の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは16の公知のA型インフルエンザ血球凝集素亜型、又は後に同定されるA型インフルエンザ血球凝集素亜型に対する宿主免疫応答を生じさせるのに有用であることができる。インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、現在公知であるか又は後に同定される任意のB型インフルエンザ血球凝集素亜型に対する宿主免疫応答を生じさせるのにも有用であることができる。
【００５９】
一般に、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインを含むか又はそれから本質的になるポリペプチドである。インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、当業者によって一般に認識されるステムドメインである。
【００６０】
当業者に公知であるように、全長インフルエンザ血球凝集素は、通常、HA1ドメイン及びHA2ドメインを含む。ステムドメインは、HA1ドメインの2つのセグメント及びHA2ドメインの大部分又は全てによって形成される。HA1ドメインの2つのセグメントは、一次配列において、球状ヘッドドメインにより分離されている。
【００６１】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインをほとんど又は全く含まない。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、当業者によって好適であると考えられる任意の技術によってその球状ヘッドドメインが欠失させられているインフルエンザ血球凝集素である。
【００６２】
ある実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、図1のAp及びAqとしてインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド中で特定されているシステイン残基を維持している。ある実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、野生型インフルエンザウイルスの血球凝集素よりも低いpH(例えば、5.2未満、5.1未満、5.0未満、又は4.9未満、例えば、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4.、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8などのpH)でより高い安定性を有する。特定の実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、野生型インフルエンザウイルスの血球凝集素よりも低いpHで、融合前立体構造から融合立体構造への立体構造変化を経る。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、低いpH(例えば、4.9〜5.2、4.5〜3.5、3.5〜2.5、2.5〜1.5、1.5〜0.5のpH)でポリペプチドの安定性を増大させる1以上のアミノ酸置換、例えば、HA1 H17Y(H3付番)を含む。インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの安定性は、例えば、Thoennesらの文献(2008, Virology 370: 403-414)に記載されているような、トリプシン消化に対する血球凝集素分子の感受性などの、当技術分野で公知の技術を用いて評価することができる。
【００６３】
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、下記の技術を含む、当業者に好適であると考えられる任意の技術に従って調製することができる。ある実施態様では、ステムドメインポリペプチドは単離される。
【００６４】
いくつかの実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの一次構造は、以下の順序で:HA1のN末端ステムセグメント、リンカー、HA1のC末端ステムセグメント、及びHA2を含む。いくつかの実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの一次構造は、以下の順序で:HA1のN末端ステムセグメント、リンカー、HA1のC末端の短いステムセグメント、及びHA2を含む。いくつかの実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの一次構造は、以下の順序で:HA1のN末端の長いステムセグメント、リンカー、HA1のC末端の長いステムセグメント、及びHA2を含む。いくつかの実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、以下の順序で:HA1のN末端ステムセグメント、リンカー、HA1の中間ステムセグメント、第二のリンカー、HA1のC末端ステムセグメント、及びHA2を含む。
【００６５】
一次配列は、単一のポリペプチドによって形成されることができるか、又はそれは、複数のポリペプチドによって形成されることができる。通常、単一のポリペプチドは、当業者によって好適であると考えられる任意の技術によって発現される。単一のポリペプチドの実施態様では、HA1セグメントとHA2は三次結合している。当業者に公知であるように、単一のHAポリペプチドは、例えば、プロテアーゼによって、適当な発現条件下で切断され、四次結合した2つのポリペプチドを生じさせることができる。切断は、通常、HA1のC末端ステムセグメントとHA2の間である。ある実施態様では、複数のポリペプチド、例えば、2つのポリペプチドのインフルエンザ血球凝集素ステムドメインが本明細書で提供される。複数のポリペプチドの実施態様では、HA1セグメントとHA2は四次結合している。
【００６６】
ある実施態様では、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは単量体である。ある実施態様では、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは多量体である。ある実施態様では、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは三量体である。当業者は、天然のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドがインビボで三量体化することができること、及び本明細書で提供される特定のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが三量体化することができることを認識しているであろう。下記の特定の実施態様では、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、三量体化を容易にする三量体化ドメインを含む。
【００６７】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。通常、シグナルペプチドは、ポリペプチドの発現及び翻訳時又はその後に切断され、成熟したインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを生じさせる。シグナルペプチドは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの発現に有利であることができる。ある実施態様では、シグナルペプチドを欠く成熟インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドも本明細書で提供される。
【００６８】
インフルエンザ血球凝集素HA2は、通常、ステムドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む。ある実施態様では、HA2ステムドメイン、HA2内腔ドメイン、HA2膜貫通ドメイン、及びHA2細胞質ドメインを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。そのようなインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、膜結合型抗原として発現されることができる。ある実施態様では、HA2ステムドメイン、HA2内腔ドメイン、及びHA2膜貫通ドメインを含むが、典型的な細胞質ドメインの一部又は全てを欠くインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。そのようなインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、膜結合型抗原として発現されることができる。ある実施態様では、HA2ステムドメイン及びHA2内腔ドメインを含むが、HA2膜貫通ドメインとHA2細胞質ドメインの両方を欠くインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。そのようなインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、可溶性ポリペプチドとして有利に発現されることができる。ある実施態様では、HA2ステムドメインを含むが、HA2内腔ドメイン、HA2膜貫通ドメイン、及びHA2細胞質ドメインを欠くインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。そのようなインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、可溶性ポリペプチドとして有利に発現されることができる。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、当業者に公知のインフルエンザHA2ステムドメインとの少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するHA2ステムドメインを含む。公知のA型インフルエンザ及びB型インフルエンザ血球凝集素由来の例示的な公知のHA2ステムドメインは、下の表に提供されている。
【００６９】
最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基がHA2ステムドメインの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA2ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドも本明細書で提供される。最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と保存的に置換されている改変型のHA2ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書でさらに提供される。欠失した及び改変されたHA2ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドがさらに提供される。
【００７０】
いくつかの実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの一次構造は、以下の順序で:HA1のN末端ステムセグメント、リンカー、HA1のC末端ステムセグメント、及びHA2を含む。HA1のN末端ステムセグメントは、本明細書で提供される定義に基づいて当業者により認識される任意のHA1のN末端ステムセグメントであることができる。通常、HA1のN末端ステムセグメントは、成熟したHA1(すなわち、シグナルペプチドを欠くHA1)のN末端アミノ酸からHA1の約52番目の残基の配列に位置するシステイン残基までからなるポリペプチドに対応する。本明細書でApと称される、このシステイン残基は、通常、HA1のC末端ステムセグメント中のシステイン残基とジスルフィド架橋を形成することができる。16個の代表的なA型インフルエンザ血球凝集素の配列が図1に示されており、残基Apが各々で特定されている。
【００７１】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、Ap(例えば、H3血球凝集素由来のHA1サブユニットのCys52)で正確に終わるのではなく、配列上及び構造上Apに近い残基で終わる。例えば、ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、Ap-1、Ap-2、Ap-3、又はAp-4で終わる。他の実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、Ap+1、Ap+2、Ap+3、Ap+4、又はAp+5で終わる。HA1のN末端ステムセグメントの終点は、得られる連結されたHA1ステムドメインが、下記のように、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインに類似した三次元構造を形成することができるように、HA1のC末端ステムセグメント及びリンカーの終点との関連で選択されるべきである。
【００７２】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、当業者に公知のインフルエンザHA1のN末端ステムセグメントとの少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するHA1のN末端ステムセグメントを含む。例示的な公知のHA1のN末端ステムセグメントは、下の表に提供されている。
【００７３】
最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基がHA1のN末端ステムセグメントの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA1のN末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドも本明細書で提供される。ある実施態様では、1つ、2つ、又は3つの残基が、HA1のN末端ステムセグメントのC末端に付加されており;これらの付加された残基が、HA1のN末端ステムセグメントに隣接する球状ヘッドドメインのアミノ酸配列に由来し得る、伸張型のHA1のN末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と保存的に置換されている改変型のHA1のN末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書でさらに提供される。欠失した及び改変されたHA1のN末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドがさらに提供される。
【００７４】
HA1のC末端ステムセグメントは、本明細書で提供される定義に基づいて当業者により認識される任意のHA1のC末端ステムセグメントであり得る。通常、HA1のC末端ステムセグメントは、HA1の約277番目の残基(H3付番を使用)の配列に位置するシステイン残基からHA1のC末端アミノ酸までからなるポリペプチドに対応する。本明細書でAqと称される、このシステイン残基は、通常、HA1のN末端ステムセグメント中のシステイン残基Apとジスルフィド架橋を形成することができる。16個の代表的なA型インフルエンザ血球凝集素の配列が図1に示されており、残基Aqが各々で特定されている。
【００７５】
ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、Aq(例えば、H3血球凝集素由来のHA1サブユニットのCys277)から始まるのではなく、配列上及び構造上Aqに近い残基から始まる。例えば、ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、Aq-1、Aq-2、Aq-3、又はAq-4から始まる。他の実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、Aq+1、Aq+2、Aq+3、Aq+4、又はAq+5から始まる。HA1のN末端ステムセグメントの終点は、得られるHA1ステムドメインが、下記のように、インフルエンザ血球凝集素に類似した三次元構造を形成することができるように、HA1のC末端ステムセグメント及びリンカーの始点との関連で選択されるべきである。
【００７６】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、当業者に公知のインフルエンザHA1のC末端ステムセグメントとの少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するHA1のC末端ステムセグメントを含む。例示的な公知のHA1のC末端ステムセグメントは、下の表に提供されている。
【００７７】
ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-1であり、C末端ステムセグメントの始点はAq-1である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-2であり、C末端ステムセグメントの始点はAq-2である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-3であり、C末端ステムセグメントの始点はAq-3である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-4であり、C末端ステムセグメントの始点はAq-4である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-5であり、C末端ステムセグメントの始点はAq-5である。
【００７８】
ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+1であり、C末端ステムセグメントの始点はAq+1である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+2であり、C末端ステムセグメントの始点はAq+2である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+3であり、C末端ステムセグメントの始点はAq+3である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+4であり、C末端ステムセグメントの始点はAq+4である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+5であり、C末端ステムセグメントの始点はAq+5である。
【００７９】
ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-1であり、C末端ステムセグメントの始点はAq+1である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-2であり、C末端ステムセグメントの始点はAq+2である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-3であり、C末端ステムセグメントの始点はAq+3である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-4であり、C末端ステムセグメントの始点はAq+4である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-5であり、C末端ステムセグメントの始点はAq+5である。
【００８０】
ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+1であり、C末端ステムセグメントの始点はAq-1である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+2であり、C末端ステムセグメントの始点はAq-2である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+3であり、C末端ステムセグメントの始点はAq-3である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+4であり、C末端ステムセグメントの始点はAq-4である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+5であり、C末端ステムセグメントの始点はAq-5である。
【００８１】
最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基がHA1のC末端ステムセグメントの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA1のC末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドも本明細書で提供される。ある実施態様では、1つ、2つ、又は3つの残基が、HA1のC末端ステムセグメントのN末端に付加されており;これらの付加された残基が、HA1のC末端ステムセグメントに隣接する球状ヘッドドメインのアミノ酸配列に由来し得る、伸張型のHA1のC末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。特定の実施態様では、1つの残基がC末端ステムセグメントに付加される場合、1つの残基がN末端ステムセグメントに付加され;2つの残基がC末端ステムセグメントに付加される場合、2つの残基がN末端ステムセグメントに付加され;3つの残基がC末端ステムセグメントに付加される場合、3つの残基がN末端ステムセグメントに付加される。最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と保存的に置換されている改変型のHA1のC末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書でさらに提供される。欠失した及び改変されたHA1のC末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドがさらに提供される。
【００８２】
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意のインフルエンザ血球凝集素に基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、A型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、以下で詳細に記載されるように、B型インフルエンザ血球凝集素に基づく。
【００８３】
HA1のN末端ステムセグメントは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意のHA1のN末端ステムセグメントに基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、A型インフルエンザHA1のN末端ステムセグメントに基づく。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、各々1つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、各々2つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、各々3つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、各々4つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、各々5つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、配列番号177〜224から選択される。
【００８４】
HA1のC末端ステムセグメントは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意のHA1のC末端ステムセグメントに基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、A型インフルエンザHA1のC末端ステムセグメントに基づく。ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、配列番号50〜65から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、各々1つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号50〜65から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、各々2つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号50〜65から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、各々3つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号50〜65から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、各々4つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号50〜65から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、各々5つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号50〜65から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、配列番号226〜273から選択される。
【００８５】
HA2ステムドメインは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意のHA2ステムドメインに基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様では、HA2ステムドメインは、A型インフルエンザHA2ステムドメインに基づく。ある実施態様では、HA2ステムドメインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、HA2ステムドメインは、配列番号66〜97から選択される。
【００８６】
シグナルペプチドを含む実施態様では、シグナルペプチドは、当業者に公知の任意のインフルエンザウイルスシグナルペプチドに基づくことができる。ある実施態様では、シグナルペプチドは、A型インフルエンザシグナルペプチドに基づく。ある実施態様では、シグナルペプチドは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、シグナルペプチドは、当業者に有用であると考えられる任意のシグナルペプチドであることができる。ある実施態様では、シグナルペプチドは、配列番号18〜33から選択される。
【００８７】
内腔ドメインを含む実施態様では、内腔ドメインは当業者に公知の任意のインフルエンザ内腔ドメインに基づくことができる。ある実施態様では、内腔ドメインは、A型インフルエンザ内腔ドメインに基づく。ある実施態様では、HA2内腔ドメインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、内腔ドメインは、当業者に有用であると考えられる任意の内腔ドメインであることができる。ある実施態様では、内腔ドメインは、配列番号98〜113から選択される。
【００８８】
膜貫通ドメインを含む実施態様では、膜貫通ドメインは当業者に公知の任意のインフルエンザ膜貫通ドメインに基づくことができる。ある実施態様では、膜貫通ドメインは、A型インフルエンザ膜貫通ドメインに基づく。ある実施態様では、HA2膜貫通ドメインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、膜貫通ドメインは、当業者に有用であると考えられる任意の膜貫通ドメインであることができる。ある実施態様では、膜貫通ドメインは、配列番号114〜129から選択される。
【００８９】
細胞質ドメインを含む実施態様では、細胞質ドメインは当業者に公知の任意のインフルエンザ細胞質ドメインに基づくことができる。ある実施態様では、細胞質ドメインは、A型インフルエンザ細胞質ドメインに基づく。ある実施態様では、HA2細胞質ドメインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、細胞質ドメインは、当業者に有用であると考えられる任意の細胞質ドメインであることができる。ある実施態様では、細胞質ドメインは、配列番号130〜145から選択される。
【００９０】
ある実施態様では、血球凝集素ステムドメイン中のグリコシル化部位の1つ又は複数を、これらの部位でのグリコシル化がポリペプチドのプロセシング及び成熟の間に生じないように、改変するか又は欠失させる。当業者は、インフルエンザHAが、通常、1以上のグリコシル化配列(例えば、Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys、ここで、XaaはPro以外の任意のアミノ酸である)を含むことを認識しているであろう。ある実施態様では、グリコシル化配列中の1以上のアミノ酸残基を、グリコシル化配列を分断するアミノ酸残基と保存的に置換する。ある実施態様では、グリコシル化配列中の1以上のアミノ酸残基を、グリコシル化配列を分断する任意のアミノ酸残基と置換する。ある実施態様では、グリコシル化配列中の1以上のアスパラギン残基をアラニンと置換する。特定の実施態様では、H3血球凝集素の位置38のアスパラギンをアラニンに変化させる。
【００９１】
下の表1は、A型インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのシグナルペプチド、HA1のN末端ステムセグメント、HA1のC末端ステムセグメント、及びHA2ドメインを特定している。これらのシグナルペプチド、ステムセグメント、及びドメインは、本明細書に記載のポリペプチド及び方法において有用である。
【表１】
2013526849.tif 000003
2013526849.tif 000004
2013526849.tif 000005
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【００９２】
下の表1Aは、本明細書に記載のポリペプチド及び方法のための有用なHA1のN末端ステムセグメント及びHA1のC末端ステムセグメントを特定している。
【表２】
2013526849.tif 000011
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2013526849.tif 000013
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【００９３】
下の表2は、HA2ポリペプチドの推定上のステムドメイン、内腔ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを特定している。
【表３】
2013526849.tif 000020
2013526849.tif 000021
2013526849.tif 000022
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【００９４】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの三次構造又は四次構造中に1以上の免疫原性エピトープを含む。
【００９５】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、アミノ酸配列A17-A18-(Xaa)n-A38(配列番号146)を含み、ここで、
A17は、Y又はHであり;
A18は、H、L、又はQであり;
(Xaa)nは、18〜20アミノ酸残基の配列を表し;かつ
A38は、H、S、Q、T、又はNである。
【００９６】
ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、アミノ酸配列A291-A292(配列番号147)を含み、ここで、
A291は、T、S、N、D、P、又はKであり;かつ
A292は、L、M、K、又はRである。
【００９７】
ある実施態様では、HA2ドメインは、アミノ酸配列A18-A19-A20-A21(配列番号148)を含み、ここで、
A18は、V又はIであり;
A19は、D、N、又はAであり;
A20は、Gであり、かつ
A21は、Wである。
【００９８】
ある実施態様では、HA2ドメインは、アミノ酸配列
【化１】
2013526849.tif 000025
を含み、ここで、
A38は、K、Q、R、L、又はYであり;
A39は、任意のアミノ酸残基であり;
A40は、任意のアミノ酸残基であり;
A41は、Tであり;
A42は、Qであり;
A43は、任意のアミノ酸残基であり;
A44は、Aであり;
A45は、Iであり;
A46は、Dであり;
A47は、任意のアミノ酸残基であり;
A48は、I、V、又はMであり;
A49は、T、Q、又はNであり;
A50は、任意のアミノ酸残基であり;
A51は、Kであり;
A52は、V又はLであり;
A53は、Nであり;
A54は、任意のアミノ酸残基であり;
A55は、V、I、又はLであり;かつ
A56は、V又はIである。
【００９９】
ある実施態様では、インフルエンザステムドメインポリペプチドは、配列番号146〜149から選択される2つのアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、インフルエンザステムドメインポリペプチドは、配列番号146〜149から選択される3つのアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、インフルエンザステムドメインポリペプチドは、配列番号146〜149から選択される4つのアミノ酸配列を含む。
【０１００】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、B型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、下の表3に示す配列番号154〜157から選択される。
【０１０１】
ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、B型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、下の表3に示す配列番号158〜159及び553〜554から選択される。
【０１０２】
ある実施態様では、HA2ステムドメインは、B型インフルエンザ血球凝集素に基づく。B型インフルエンザ血球凝集素のN末端ステムセグメントの終点及びC末端ステムセグメントの終点の例示的な残基を図2に示す。ある実施態様では、HA2ステムドメインは、下の表3及び4に示す配列番号160によるものである。
【０１０３】
特定の実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントとB型インフルエンザウイルスHA1のC末端セグメントの境界は、6対のアミノ酸残基:Arg50及びSer277;Ala66及びTrp271;Lys80及びSer277;Cys94及びCys143;Cys178及びCys272、並びにCys54及びCys272に関して定義される。これら6対の残基の位置は図3でも強調されている。残基番号は、タンパク質データバンク受託番号3BT6に記載のB型インフルエンザウイルス由来のB-HAの付番に基づく。タンパク質データバンク受託番号3BT6のB-HAタンパク質のX線結晶構造に対応するアミノ酸配列を代表的なH1及びH3アミノ酸配列と整列させ、それを図2に示す。
【０１０４】
ある実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントは、残基1(PDBファイル3BT6と同様に、B型インフルエンザウイルスHA1サブユニットの付番に基づく)から始まり、Arg50で終わる。ある実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントは、残基1から始まり、Ala66で終わる。いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントは、残基1から始まり、Lys80で終わる。いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスN末端ステムセグメントは、残基1から始まり、Arg80で終わる。いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスN末端ステムセグメントは、残基1から始まり、Cys54で終わる。いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスN末端ステムセグメントは、残基1から始まり、Cys94で終わる。いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスN末端ステムセグメントは、残基1から始まり、Cys178で終わる。
【０１０５】
いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントは、表3に示すような、配列番号154〜157及び550〜552のいずれか1つによるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントは、配列番号154〜157又は550〜552のいずれか1つのアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０６】
いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜50に対応するアミノ酸配列配列番号154と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０７】
いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜66に対応するアミノ酸配列配列番号155と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０８】
いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜80に対応するアミノ酸配列配列番号156と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０９】
いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントは、位置80のリジンがアルギニンに置き換えられているB型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜80に対応するアミノ酸配列配列番号157と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１１０】
いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜94に対応するアミノ酸配列配列番号550と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１１１】
いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜178に対応するアミノ酸配列配列番号551と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１１２】
いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜54に対応するアミノ酸配列配列番号552と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１１３】
いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端ステムセグメントは、Ser277、Trp271、Cys143、Cys272、又は他のB型インフルエンザウイルスHA亜型の対応する残基から始まるアミノ酸配列を有する。
【０１１４】
いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端ステムセグメントは、表3に示すような、配列番号158〜159又は553〜554のいずれか1つによるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基277〜344に対応する配列番号158と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基271〜344に対応する配列番号159と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基137〜344に対応する配列番号553と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基272〜344に対応する配列番号554と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１１５】
いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端ステムセグメントは、残基276、残基275、残基274、残基273、又は残基272から始まる。他の実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端ステムセグメントは、残基278、残基279、残基280、残基281、又は残基282から始まる。
【０１１６】
ある実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA2ドメインは、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端セグメント、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端セグメント、又は両方を通して、B型インフルエンザウイルスHA1ドメインと三次結合又は四次結合している。
【０１１７】
いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端セグメントとB型インフルエンザウイルスHA2サブユニットは、共有結合している。例えば、そのC末端で(例えば、第二の配列の末端残基で)、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端セグメントは、そのような実施態様のB型インフルエンザウイルスHA2ドメインに共有結合している。いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端セグメントとB型インフルエンザウイルスHA2ドメインは、連続ポリペプチド鎖を形成する。
【０１１８】
いくつかの実施態様では、B型インフルエンザウイルスHA2ドメインは、表3又は4に示すような、配列番号160又は161のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、HA2ドメインのアミノ酸配列は、配列番号160〜161のいずれか1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である。
【０１１９】
ある実施態様では、B型インフルエンザステムドメインポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、本明細書に記載の任意のシグナルペプチドを含む、当業者に好適であると考えられる任意のシグナルペプチドであることができる。ある実施態様では、シグナルペプチドは、配列番号150〜153のいずれかと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である。ある実施態様では、シグナルペプチドは、配列番号150〜153のいずれかによるものである。
【０１２０】
ある実施態様では、B型インフルエンザステムドメインポリペプチドは、内腔ドメインを含む。内腔ドメインは、本明細書に記載の任意の内腔ドメインを含む、当業者に好適であると考えられる任意の内腔ドメインであることができる。ある実施態様では、内腔は、配列番号162と少なくとも60％又は80％同一である。ある実施態様では、内腔ドメインは、配列番号162によるものである。
【０１２１】
ある実施態様では、B型インフルエンザステムドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、本明細書に記載の任意の膜貫通ドメインを含む、当業者に好適であると考えられる任意の膜貫通ドメインであることができる。ある実施態様では、膜貫通ドメインは、配列番号163と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である。ある実施態様では、膜貫通ドメインは、配列番号163によるものである。
【０１２２】
ある実施態様では、B型インフルエンザステムドメインポリペプチドは、細胞質ドメインを含む。細胞質ドメインは、本明細書に記載の任意の細胞質ドメインを含む、当業者に好適であると考えられる任意の細胞質ドメインであることができる。ある実施態様では、細胞質ドメインは、配列番号164と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である。ある実施態様では、細胞質ドメインは、配列番号164によるものである。
【表４】
2013526849.tif 000026
2013526849.tif 000027
2013526849.tif 000028
【０１２３】
表4は、B型インフルエンザ由来のHAの推定上のステムドメイン、内腔ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを提供する。
【表５】
2013526849.tif 000029
【０１２４】
図1及び2に示すように、HA1のN末端ステムセグメントは、A型インフルエンザとB型インフルエンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有する。同様に、HA1のC末端ステムセグメントも、A型インフルエンザとB型インフルエンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有する。さらに、HA2ドメインも、A型インフルエンザとB型インフルエンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有する。
【０１２５】
いくつかの実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、以下の順序で:HA1のN末端ステムセグメント、リンカー、HA1の中間ステムセグメント、第二のリンカー、HA1のC末端ステムセグメント、及びHA2を含む。いくつかの実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、表5に示すような、配列番号555と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。配列番号555は、B型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜94に対応する。いくつかの実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントは、表5に示すような、配列番号557と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。配列番号557は、B型インフルエンザウイルスHA1の残基272〜344に対応する。いくつかの実施態様では、HA1の中間セグメントは、表5に示すような、配列番号556と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。配列番号556は、B型インフルエンザウイルスHA1の残基143〜178に対応する。いくつかの実施態様では、HA2ドメインは、本明細書に記載されるような、配列番号160と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、第一及び第二のリンカーは、本明細書に記載のリンカーを含むが、これに限定されない、当業者に公知の任意のリンカーであることができる。
【表６】
2013526849.tif 000030
【０１２６】
いくつかの実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、複数のインフルエンザ株又は亜型由来のセグメント及び/又はドメインを含むか又はそれらから本質的になるハイブリッドポリペプチドである。例えば、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、異なるA型インフルエンザウイルスHA亜型由来のHA1のN末端ステムセグメント及びHA1のC末端ステムセグメントを含むことができる。いくつかの実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、A型インフルエンザウイルス由来のものであるが、HA1のC末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルス由来のものである。同様に、HA2は、A型インフルエンザウイルス由来のものでもあり得るが、HA1のN末端ステムセグメント及び/又はC末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルス由来のものである。
【０１２７】
表1〜4に記載の配列エレメント又はその変異体の任意の組合せを用いて、本発明の血球凝集素HAステムドメインポリペプチドを形成させることができることが理解されるであろう。
【０１２８】
本明細書で提供されるインフルエンザステムドメインポリペプチドにおいて、リンカーは、HA1のN末端ステムセグメントをHA1のC末端ステムセグメントに共有結合で連結させる。ある実施態様では、リンカーは直接結合である。ある実施態様では、リンカーは、1つのアミノ酸残基、2以下のアミノ酸残基、3以下のアミノ酸残基、4以下のアミノ酸残基、5以下のアミノ酸残基、10以下のアミノ酸残基、15以下のアミノ酸残基、20以下のアミノ酸残基、30以下のアミノ酸残基、40以下のアミノ酸残基、又は50以下のアミノ酸残基を含むペプチドである。ある実施態様では、リンカーペプチドは、50以上のアミノ酸残基を含む。ある実施態様では、リンカーは、球状ヘッドドメインを実質的に欠く。つまり、リンカーは、インフルエンザ球状ヘッドドメインのアミノ酸配列由来の、10、9、8、7、6、5、又は4以下の隣接する連続したアミノ酸残基を含む。ある実施態様では、リンカーは、
【化２】
2013526849.tif 000031
以外である。ある実施態様では、リンカーは、
【化３】
2013526849.tif 000032
以外である。ある実施態様では、リンカーは、
【化４】
2013526849.tif 000033
以外である。
【０１２９】
ある実施態様では、リンカーは、一方の末端で、HA1のN末端ステムセグメントのC末端に共有結合で連結されている。リンカーペプチドはまた、もう一方の末端で、HA1のC末端ステムセグメントのN末端に共有結合で連結されている。ある実施態様では、共有結合のうちの1つはアミド結合である。ある実施態様では、両方の共有結合がアミド結合である。
【０１３０】
リンカーは、当業者によって好適であると考えられる任意のリンカーであることができる。ある実施態様では、リンカーは、HA1のN末端ステムセグメント及びHA1のC末端ステムセグメントに基づいて選択される。これらの実施態様では、リンカーは、両方ともAccelrys製のInsightII及びQuantaなどの分子モデリングプログラムを用いて選択され得る。ある実施態様では、リンカーは、当業者によって認識される血球凝集素ステムドメインの構造と一致する、HA1のN末端ステムセグメント及びHA1のC末端ステムセグメントの構造アラインメントを可能にする構造モチーフである。ある実施態様では、リンカーは、候補リンカーのライブラリーから選択される。ある実施態様では、ライブラリーは、欧州分子生物学研究所(European Molecular Biology Laboratory)(EMBL)又は欧州バイオインフォマティクス研究所(European Bioinformatics Institute)(EBI)のタンパク質データバンク(PDB)又は巨大分子構造データベースなどの公開データベース中の三次元ポリペプチド構造を含む。ある実施態様では、ライブラリーは、両方ともAccelrys製のInsightII及びQuantaなどの市販プログラムに付随する独占所有権のある三次元ポリペプチド構造を含む。さらに、タンパク質構造又は構造エレメントの任意のデータベース又はコレクションを用いて、リンカーを選択することができる。タンパク質構造エレメントの例示的なデータベース又はコレクションとしては、タンパク質の構造分類(Structural Classification of Proteins)(SCOP、Cambridge Universityによって維持され、提供される);タンパク質ファミリーのデータベース(database of protein families)(Pfam、Wellcome Trust Sanger Instituteによって維持され、提供される);汎用タンパク質資源(Universal Protein Resource)(UniProt、UniProt Consortiumによって維持され、提供される);タンパク質ファミリーの総合資源(Integrated resource for protein families)(InterPro;EMBL-EBIによって維持され、提供される);クラス構造トポロジー相同スーパーファミリー(Class Architecture Topology Homologous superfamily)(CATH、University College LondonのInstitute of Structural and Molecular Biologyによって維持され、提供される);及び構造的に類似したタンパク質のファミリー(families of structurally similar proteins)(FSSP、EBIによって維持され、提供される)が挙げられるが、これらに限定されない。限定するものではないが、SCOP、CATH、及びFSSPによって用いられるものを含む、当業者によって好適であると考えられる任意のアルゴリズムを用いて、リンカーを選択することができる。有用な例としては、Pymol(Delano Scientific LLC)、InsightII及びQuanta(両方ともAccelrys製)、MIDAS(University of California, San Francisco)、SwissPDB viewer(Swiss Institute of Bioinformatics)、TOPOFIT(Northeastern University)、CBSU LOOPP(Cornell University)、並びにSuperPose(University of Alberta, Edmonton)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
ある実施態様では、リンカーは直接結合である。ある実施態様では、リンカーは、Gly、Gly-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly、及びGly-Gly-Gly-Gly-Glyからなる群から選択される。ある実施態様では、リンカーは、Gly-Pro及びPro-Glyからなる群から選択される。ある実施態様では、リンカーは、例えば、配列
【化５】
2013526849.tif 000034
を有する281ターンループである。
【０１３２】
ある実施態様では、リンカーはグリコシル化配列を含む。ある実施態様では、リンカーはAsn-Xaa-Ser/Thrによるアミノ酸配列を含み、ここで、Xaaはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ser/Thrはセリン又はトレオニンである。ある実施態様では、リンカーはアミノ酸配列Asn-Ala-Serを含む。ある実施態様では、リンカーはグリコシル化配列である。ある実施態様では、リンカーはAsn-Xaa-Ser/Thrによるアミノ酸配列であり、ここで、Xaaはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ser/Thrはセリン又はトレオニンである。ある実施態様では、リンカーはアミノ酸配列Asn-Ala-Serである。
【０１３３】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、天然のインフルエンザ血球凝集素のステムドメインの三次元構造に類似している三次元構造を形成することができる。構造類似性は、当業者によって好適であると考えられる任意の技術に基づいて評価することができる。例えば、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと、天然のインフルエンザ血球凝集素を認識する中和抗体又は抗血清との、例えば、非変性条件下での反応は、構造類似性を示すことができる。有用な中和抗体又は抗血清は、例えば、Suiらの文献(2009, Nat. Struct. Mol. Biol. 16(3):265-273)、Ekiertらの文献(2009年2月26日、Science[DOI: 10.1126/science. 1171491])、及びKashyapらの文献(2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(16):5986-5991)に記載されており、その内容は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。ある実施態様では、抗体又は抗血清は、血球凝集素の三次構造又は四次構造によって形成される非隣接(すなわち、一次配列で隣接していない)エピトープと反応する抗体又は抗血清である。
【０１３４】
ある実施態様では、構造類似性は、分光技術、例えば、円二色性、ラマン分光法、NMR、3D NMR、及びX線結晶学によって評価することができる。X線結晶学で決定された公知のインフルエンザ血球凝集素構造は、限定するものではないが、1HGJ(HA H3N2株)及び1RUZ(HA H1N1株)を含む、タンパク質データバンクファイルの構造座標に記載されている。
【０１３５】
ある実施態様では、構造類似性は、2つの構造の対応する重畳部分間のRMS偏差によって評価される。意味のある重畳を生じさせるために、ある実施態様では、少なくとも20個の対応する原子、25個の対応する原子、30個の対応する原子、40個の対応する原子、50個の対応する原子、60個の対応する原子、70個の対応する原子、80個の対応する原子、90個の対応する原子、100個の対応する原子、120個の対応する原子、150個の対応する原子、200個の対応する原子、又は250個の対応する原子の座標を用いて、RMS偏差を計算する。
【０１３６】
ある実施態様では、アミノ酸骨格中の全ての対応する原子の座標を用いて、RMS偏差を計算する。ある実施態様では、アミノ酸骨格中の全ての対応するアルファ炭素原子の座標を用いて、RMS偏差を計算する。ある実施態様では、側鎖を含む全ての対応する同一残基の座標を用いて、RMS偏差を計算する。
【０１３７】
ある実施態様では、HA1のN末端セグメント中の対応する原子の全て又は一部の座標を用いて、RMS偏差を計算する。ある実施態様では、HA1のC末端セグメント中の対応する原子の全て又は一部の座標を用いて、RMS偏差を計算する。ある実施態様では、HA1のN末端セグメントとC末端セグメントの両方における対応する原子の全て又は一部の座標を用いて、RMS偏差を計算する。ある実施態様では、HA2ドメイン中の対応する原子の全て又は一部の座標を用いて、RMS偏差を計算する。
【０１３８】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと公知のA型インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイン(例えば、1HGJ又は1RUZ由来)の対応する部分の構造間のRMS偏差は、5Å以下、4Å以下、3Å以下、2.5Å以下、2Å以下、1.5Å以下、1Å以下、0.75Å以下、0.5Å以下、0.3Å以下、0.2Å以下、又は0.1Å以下である。市販又はオープンソースのソフトウェアを用いて、構造的重畳及び/又はRMS偏差の計算を実施してもよい。有用な例としては、Pymol(Delano Scientific LLC)、InsightII及びQuanta(両方ともAccelrys製)、MIDAS(University of California, San Francisco)、SwissPDB viewer(Swiss Institute of Bioinformatics)、TOPOFIT(Northeastern University)、CBSU LOOPP(Cornell University)、及びSuperPose(University of Alberta, Edmonton)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
ある実施態様では、本明細書で提供される任意のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、当業者に好適であると考えられる1以上のポリペプチドドメインをさらに含むことができる。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ
【化６】
2013526849.tif 000035
FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書で提供されるポリペプチドの精製を容易にすることができる。バクテリオファージT4フィブリチン由来のフォルドンドメイン、又は三量体化ドメインは、本明細書で提供されるポリペプチドの三量体化を容易にすることができる。フォルドンドメインは、当業者に公知の任意のフォルドン配列を有することができる(例えば、Papanikolopoulouらの文献(2004, J. Biol. Chem. 279(10):8991-8998)を参照されたく、その内容は引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる)。例としては、
【化７】
2013526849.tif 000036
が挙げられる。フォルドンドメインは、本明細書で提供される可溶性ポリペプチドの三量体化を容易にするのに有用であることができる。切断部位を用いて、ポリペプチドの一部の切断、例えば、精製タグもしくはフォルドンドメイン又は両方の切断を容易にすることができる。有用な切断部位としては、トロンビン切断部位、例えば、配列
【化８】
2013526849.tif 000037
を有するものが挙げられる。
【０１４０】
ある実施態様では、エラスターゼ切断部位を含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが提供される。当業者は、血球凝集素配列中のHA1-HA2切断部位のアルギニン又はリジンの代わりにバリンを用いることによって、HA1とHA2の連結部のトリプシン切断部位をエラスターゼ切断部位に突然変異させることができることを認識するであろう(例えば、Stechらの文献(2005, Nature Med. 11(6):683-689)を参照されたい)。したがって、C末端ステムセグメントのC末端(すなわち、HA1ドメインのC末端)にバリン置換を有するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。特定の実施態様では、配列番号50〜65又は158〜159のいずれかを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、配列番号50〜65又は158〜159のC末端アミノ酸残基、例えば、アルギニン又はリジンは、バリン残基と置換されている。
【０１４１】
ある実施態様では、HA1とHA2の接合部でのプロテアーゼ切断に対して抵抗性があると予測されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。当業者は、HA1とHA2にまたがるArg-Gly配列がトリプシンの認識部位であり、かつ通常、血球凝集素活性化のために切断されることを認識すべきである。本明細書に記載のステムドメインポリペプチドは活性化される必要がないので、プロテアーゼ切断に対して抵抗性があると予測されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1とHA2にまたがるプロテアーゼ部位をプロテアーゼ切断に対して抵抗性がある配列に突然変異させている、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが提供される。ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントのC末端残基がLys又はArg以外の任意の残基である、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが提供される。ある実施態様では、HA2ドメインのN末端残基がプロリンである、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが提供される。ある実施態様では、HA1のC末端ステムセグメントのC末端残基がAlaであり、HA2ドメインのN末端残基もAlaである、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが提供される。
【０１４２】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端ステムセグメントに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０１４３】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０１４４】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０１４５】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０１４６】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０１４７】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０１４８】
ある実施態様では、以下のもの:
【化９】
2013526849.tif 000038
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、Gly、Gly-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly、(Gly)n(ここで、nは、ペプチドリンカーに柔軟性がある限り、任意の数のグリシン残基を示し;ある実施態様では、nは、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は7つのグリシン残基である)、
【化１０】
2013526849.tif 000039
からなる群から選択される。
【０１４９】
ある実施態様では、以下のもの:
【化１１】
2013526849.tif 000040
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化１２】
2013526849.tif 000041
からなる群から選択される。
【０１５０】
ある実施態様では、以下のもの:
【化１３】
2013526849.tif 000042
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化１４】
2013526849.tif 000043
からなる群から選択される。
【０１５１】
ある実施態様では、以下のもの: 
【化１５】
2013526849.tif 000044
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化１６】
2013526849.tif 000045
からなる群から選択される。
【０１５２】
ある実施態様では、以下のもの: 
【化１７】
2013526849.tif 000046
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化１８】
2013526849.tif 000047
からなる群から選択される。
【０１５３】
ある実施態様では、以下のもの:
【化１９】
2013526849.tif 000048
2013526849.tif 000049
2013526849.tif 000050
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化２０】
2013526849.tif 000051
からなる群から選択される。
【０１５４】
ある実施態様では、以下のもの: 
【化２１】
2013526849.tif 000052
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化２２】
2013526849.tif 000053
からなる群から選択される。
【０１５５】
ある実施態様では、以下のもの: 
【化２３】
2013526849.tif 000054
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化２４】
2013526849.tif 000055
からなる群から選択される。
【０１５６】
ある実施態様では、以下のもの: 
【化２５】
2013526849.tif 000056
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化２６】
2013526849.tif 000057
からなる群から選択される。
【０１５７】
ある実施態様では、以下のもの: 
【化２７】
2013526849.tif 000058
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化２８】
2013526849.tif 000059
からなる群から選択される。
【０１５８】
ある実施態様では、以下のもの: 
【化２９】
2013526849.tif 000060
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化３０】
2013526849.tif 000061
からなる群から選択される。
【０１５９】
ある実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、
【化３１】
2013526849.tif 000062
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。ある実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、
【化３２】
2013526849.tif 000063
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。ある実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、
【化３３】
2013526849.tif 000064
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。ある実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、
【化３４】
2013526849.tif 000065
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。ある実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、
【化３５】
2013526849.tif 000066
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。ある実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、
【化３６】
2013526849.tif 000067
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。
【０１６０】
ある実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、抗体C179(ハイブリドーマFERM BP-4517によって産生される;Takara Bio社(Otsu, Shiga, Japan)から販売されているクローン)によっても、抗体AI3C(FERM BP-4516)によっても認識されない。
【０１６１】
(5.1.1  インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチド)
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドの典型的な一次構造は、以下の順序で:HA1のN末端ステムセグメント、リンカー、HA1のC末端の短いステムセグメント、及びHA2を含む。一次配列は、単一のポリペプチドによって形成されることができるか、又はそれは、複数のポリペプチドによって形成されることができる。通常、単一のポリペプチドは、当業者に好適であると考えられる任意の技術によって発現される。単一のポリペプチドの実施態様では、HA1セグメントとHA2は三次結合している。当業者に公知であるように、単一のHAポリペプチドは、例えば、プロテアーゼによって、適当な発現条件下で切断され、四次結合した2つのポリペプチドを生じさせることができる。切断は、通常、HA1のC末端の短いステムセグメントとHA2の間である。ある実施態様では、複数のポリペプチドが本明細書で提供される。複数のポリペプチドの実施態様では、HA1セグメントとHA2は四次結合している。
【０１６２】
ある実施態様では、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは単量体である。ある実施態様では、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは多量体である。ある実施態様では、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは三量体である。当業者は、天然のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドがインビボで三量体化することができること、及び本明細書で提供される特定のインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが三量体化することができることを認識しているであろう。下記の特定の実施態様では、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、三量体化を容易にする三量体化ドメインを含む。
【０１６３】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。通常、シグナルペプチドは、ポリペプチド発現及び翻訳時又はその後に切断され、成熟したインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドを生じさせる。シグナルペプチドは、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドの発現に有利であることができる。ある実施態様では、シグナルペプチドを欠く成熟したインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドも本明細書で提供される。
【０１６４】
インフルエンザ血球凝集素HA2は、通常、ステムドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む。ある実施態様では、HA2ステムドメイン、HA2内腔ドメイン、HA2膜貫通ドメイン、及びHA2細胞質ドメインを含むインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA2ステムドメイン、HA2内腔ドメイン、及びHA2膜貫通ドメインを含むが、典型的な細胞質ドメインの一部又は全てを欠くインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA2ステムドメイン及びHA2内腔ドメインを含むが、HA2膜貫通ドメインとHA2細胞質ドメインの両方を欠くインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA2ステムドメインを含むが、HA2内腔ドメイン、HA2膜貫通ドメイン、及びHA2細胞質ドメインを欠くインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、当業者に公知のインフルエンザHA2ステムドメインとの少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するHA2ステムドメインを含む。公知のA型インフルエンザ及びB型インフルエンザ血球凝集素由来の例示的な公知のHA2ステムドメインは、上の表に提供されている。
【０１６５】
最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基がHA2ステムドメインの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA2ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドも本明細書で提供される。最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と保存的に置換されている改変型のHA2ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書でさらに提供される。欠失した及び改変されたHA2ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書でさらに提供される。
【０１６６】
HA1のN末端ステムセグメントは、本明細書で提供される任意のHA1のN末端ステムであることができる。例示的な公知のHA1のN末端ステムセグメントは、下の表に提供されている。
【０１６７】
HA1のC末端の短いステムセグメントは、本明細書で提供される定義に基づいて当業者により認識される任意のHA1のC末端の短いステムセグメントであることができる。通常、HA1のC末端の短いステムセグメントは、HA1の約305番目の残基(H3付番を使用)の配列に位置するシステイン残基からHA1のC末端アミノ酸までからなるポリペプチドに対応する。本明細書でBqと称される、このシステイン残基は、HA1のN末端ステムセグメント中のシステイン残基Apに連結されることができる。16個の代表的なA型インフルエンザ血球凝集素の配列が図1に示されており、残基Bqが各々で特定されている。
【０１６８】
ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントは、Bq(例えば、H3血球凝集素由来のHA1サブユニットのCys277)から始まるのではなく、配列上及び構造上Bqに近い残基から始まる。例えば、ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントは、Bq-1、Bq-2、Bq-3、又はBq-4から始まる。他の実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントは、Bq+1、Bq+2、Bq+3、Bq+4、又はBq+5から始まる。HA1のN末端ステムセグメントの終点は、得られるHA1ステムドメインが、下記のように、インフルエンザ血球凝集素に類似した三次元構造を形成することができるように、HA1のC末端の短いステムセグメント及びリンカーの始点との関連で選択されるべきである。
【０１６９】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、当業者に公知のインフルエンザHA1のC末端の短いステムセグメントとの少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するHA1のC末端の短いステムセグメントを含む。例示的な公知のHA1のC末端の短いステムセグメントは、下の表に提供されている。
【０１７０】
ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-1であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-1である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-2であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-2である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-3であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-3である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-4であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-4である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-5であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-5である。
【０１７１】
ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+1であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq+1である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+2であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq+2である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+3であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq+3である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+4であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq+4である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+5であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq+5である。
【０１７２】
ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-1であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq+1である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-2であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq+2である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-3であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq+3である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-4であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq+4である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp-5であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq+5である。
【０１７３】
ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はApであり(すなわち、N末端ステムセグメントの終点はシステインであり)、C末端ステムセグメントの始点はAqである(すなわち、C末端ステムセグメントの始点はシステインである)。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+1であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-1である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+2であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-2である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+3であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-3である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+4であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-4である。ある実施態様では、N末端ステムセグメントの終点はAp+5であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-5である。
【０１７４】
最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基がHA1のC末端の短いステムセグメントの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA1のC末端の短いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドも本明細書で提供される。ある実施態様では、1つ、2つ、又は3つの残基が、HA1のC末端の短いステムセグメントのN末端に付加されている伸張型のHA1のC末端の短いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。特定の実施態様では、1つの残基がC末端の短いステムセグメントに付加される場合、1つの残基がN末端ステムセグメントに付加され;2つの残基がC末端の短いステムセグメントに付加される場合、2つの残基がN末端ステムセグメントに付加され;3つの残基がC末端の短いステムセグメントに付加される場合、3つの残基がN末端ステムセグメントに付加される。最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と保存的に置換されている改変型のHA1のC末端の短いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書でさらに提供される。欠失した及び改変されたHA1のC末端の短いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドがさらに提供される。
【０１７５】
インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意のインフルエンザ血球凝集素に基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、A型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、以下で詳細に記載するように、B型インフルエンザ血球凝集素に基づく。
【０１７６】
HA1のN末端ステムセグメントは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意のHA1のN末端ステムセグメントに基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、A型インフルエンザHA1のN末端ステムセグメントに基づく。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、各々1つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、各々2つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、各々3つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、各々4つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、各々5つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、配列番号177〜224から選択される。
【０１７７】
HA1のC末端の短いステムセグメントは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意のHA1のC末端の短いステムセグメントに基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントは、A型インフルエンザHA1のC末端の短いステムセグメントに基づく。ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントは、配列番号350〜365から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントは、各々1つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号350〜365から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントは、各々2つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号350〜365から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントは、各々3つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号350〜365から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントは、各々4つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号350〜365から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントは、各々5つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号350〜365から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントは、配列番号366〜413から選択される。
【０１７８】
HA2ステムドメインは、当業者に公知であるか、後に発見されるか、又は本明細書に記載されている任意のHA2ステムドメインに基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様では、HA2ステムドメインは、A型インフルエンザHA2ステムドメインに基づく。ある実施態様では、HA2ステムドメインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、HA2ステムドメインは、配列番号66〜97から選択される。
【０１７９】
シグナルペプチドを含む実施態様では、シグナルペプチドは、当業者に公知であるか又は本明細書に記載されている任意のインフルエンザシグナルペプチドに基づくことができる。ある実施態様では、シグナルペプチドは、A型インフルエンザシグナルペプチドに基づく。
【０１８０】
内腔ドメインを含む実施態様では、内腔ドメインは、当業者に公知であるか又は本明細書に記載されている任意のインフルエンザ内腔ドメインに基づくことができる。
【０１８１】
膜貫通ドメインを含む実施態様では、膜貫通ドメインは、当業者に公知であるか又は本明細書に記載されている任意のインフルエンザ膜貫通ドメインに基づくことができる。
【０１８２】
細胞質ドメインを含む実施態様では、細胞質ドメインは、当業者に公知であるか又は本明細書に記載されている任意のインフルエンザ細胞質ドメインに基づくことができる。
【０１８３】
ある実施態様では、血球凝集素の短いステムドメイン中のグリコシル化部位の1つ又は複数を、これらの部位でのグリコシル化がポリペプチドのプロセシング及び成熟の間に生じないように、改変するか又は欠失させる。当業者は、インフルエンザHAが、通常、1以上のグリコシル化配列(例えば、Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys、ここで、Xaaは、Pro以外の任意のアミノ酸である)を含むことを認識しているであろう。ある実施態様では、グリコシル化配列中の1以上のアミノ酸残基を、グリコシル化配列を分断するアミノ酸残基と保存的に置換する。ある実施態様では、グリコシル化配列中の1以上のアミノ酸残基を、グリコシル化配列を分断する任意のアミノ酸残基と置換する。ある実施態様では、グリコシル化配列中の1以上のアスパラギン残基をアラニンと置換する。特定の実施態様では、H3血球凝集素の位置38のアスパラギンをアラニンに変化させる。
【０１８４】
下の表6は、A型インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのシグナルペプチド、HA1のN末端ステムセグメント、HA1のC末端の短いステムセグメント、及びHA2ドメインを特定している。これらのシグナルペプチド、ステムセグメント、及びドメインは、本明細書に記載のポリペプチド及び方法において有用である。
【表７】
2013526849.tif 000068
2013526849.tif 000069
2013526849.tif 000070
2013526849.tif 000071
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2013526849.tif 000073
2013526849.tif 000074
2013526849.tif 000075
【０１８５】
下の表6Aは、本明細書に記載のポリペプチド及び方法のための有用なHA1のN末端ステムセグメント及びHA1のC末端の短いステムセグメントを特定している。
【表８】
2013526849.tif 000076
2013526849.tif 000077
2013526849.tif 000078
2013526849.tif 000079
2013526849.tif 000080
2013526849.tif 000081
2013526849.tif 000082
2013526849.tif 000083
【０１８６】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの三次構造又は四次構造中に1以上の免疫原性エピトープを含む。
【０１８７】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、アミノ酸配列A17-A18-(Xaa)n-A38(配列番号146)を含み、ここで、
A17は、Y又はHであり;
A18は、H、L、又はQであり;
(Xaa)nは、18〜20アミノ酸残基の配列を表し;かつ
A38は、H、S、Q、T、又はNである。
【０１８８】
ある実施態様では、HA2ドメインは、アミノ酸配列A18-A19-A20-A21(配列番号148)を含み、ここで、
A18は、V又はIであり;
A19は、D、N、又は  Aであり;
A20は、Gであり、かつ
A21は、Wである。
【０１８９】
ある実施態様では、HA2ドメインは、アミノ酸配列
【化３７】
2013526849.tif 000084
を含み、ここで、
A38は、K、Q、R、L、又はYであり;
A39は、任意のアミノ酸残基であり;
A40は、任意のアミノ酸残基であり;
A41は、Tであり;
A42は、Qであり;
A43は、任意のアミノ酸残基であり;
A44は、Aであり;
A45は、Iであり;
A46は、Dであり;
A47は、任意のアミノ酸残基であり;
A48は、I、V、又はMであり;
A49は、T、Q、又はNであり;
A50は、任意のアミノ酸残基であり;
A51は、Kであり;
A52は、V又はLであり;
A53は、Nであり;
A54は、任意のアミノ酸残基であり;
A55は、V、I、又はLであり;かつ
A56は、V又はIである。
【０１９０】
図1及び2に示すように、HA1のN末端ステムセグメントは、A型インフルエンザとB型インフルエンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有する。同様に、HA1のC末端の短いステムセグメントも、A型インフルエンザとB型インフルエンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有する。さらに、HA2ドメインも、A型インフルエンザとB型インフルエンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有する。
【０１９１】
いくつかの実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、複数のインフルエンザ株又は亜型由来のセグメント及び/もしくはドメインを含むか又はそれらから本質的になるハイブリッドポリペプチドである。例えば、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、異なるA型インフルエンザウイルスHA亜型由来のHA1のN末端ステムセグメント及びHA1のC末端の短いステムセグメントを含むことができる。いくつかの実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルス由来のものであるが、HA1のC末端の短いステムセグメントは、A型インフルエンザウイルス由来のものである。同様に、HA2及びHA1のC末端の短いステムセグメントは、A型インフルエンザウイルス由来のものでもあり得るが、HA1のN末端は、B型インフルエンザウイルス由来のものである。
【０１９２】
表2、4、5に記載の配列エレメント、並びに表3の「シグナルペプチド」、「HA1のN末端ステムセグメント」、及び「HA2ドメイン」の欄に記載の配列又はそれらの変異体の任意の組合せを用いて、本発明の血球凝集素HAステムドメインポリペプチドを形成させることができることが理解されるであろう。
【０１９３】
本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドにおいて、リンカーは、HA1のN末端ステムセグメントをHA1のC末端の短いステムセグメントと共有結合で連結させる。リンカーは、本明細書に記載のリンカーを含むが、これに限定されない、当業者によって好適であると考えられる任意のリンカーであることができる。
【０１９４】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、天然のインフルエンザ血球凝集素のステムドメインの三次元構造と類似する三次元構造を形成することができる。構造類似性は、本明細書に記載の技術を含むが、これに限定されない、当業者によって好適であると考えられる任意の技術に基づいて評価することができる。
【０１９５】
ある実施態様では、本明細書で提供される任意のインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、当業者に好適であると考えられる1以上のポリペプチドドメインをさらに含むことができる。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ
【化３８】
2013526849.tif 000085
FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書で提供されるポリペプチドの精製を容易にすることができる。バクテリオファージT4フィブリチン由来のフォルドンドメイン、又は三量体化ドメインは、本明細書で提供されるポリペプチドの三量体化を容易にすることができる。フォルドンドメインは、当業者に公知の任意のフォルドン配列を有することができる(例えば、Papanikolopoulouらの文献(2004, J. Biol. Chem. 279(10):8991-8998)を参照されたく、その内容は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる)。例としては、
【化３９】
2013526849.tif 000086
が挙げられる。フォルドンドメインは、本明細書で提供される可溶性ポリペプチドの三量体化を容易にするのに有用であることができる。切断部位を用いて、ポリペプチドの一部の切断、例えば、精製タグもしくはフォルドンドメイン又は両方の切断を容易にすることができる。有用な切断部位としては、トロンビン切断部位、例えば、配列
【化４０】
2013526849.tif 000087
を有するものが挙げられる。
【０１９６】
ある実施態様では、本明細書に記載のエラスターゼ切断部位を含むインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが提供される。特定の実施態様では、配列番号350〜365のいずれかを含むインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、配列番号350〜365のC末端アミノ酸残基、例えば、アルギニン又はリジンは、バリン残基と置換されている。
【０１９７】
ある実施態様では、HA1とHA2の接合部でのプロテアーゼ切断に対して抵抗性があると予測されるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1とHA2にまたがるプロテアーゼ部位を、プロテアーゼ切断に対して抵抗性がある配列に突然変異させている、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが提供される。ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントのC末端残基が、Lys又はArg以外の任意の残基である、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが提供される。ある実施態様では、HA2ドメインのN末端残基がプロリンである、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが提供される。ある実施態様では、HA1のC末端の短いステムセグメントのC末端残基がAlaであり、かつHA2ドメインのN末端残基もAlaである、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが提供される。
【０１９８】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０１９９】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０２００】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０２０１】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０２０２】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０２０３】
ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０２０４】
ある実施態様では、以下のもの:
【化４１】
2013526849.tif 000088
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の短いステムポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、Gly、Gly-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly、(Gly)n (ここで、nは、ペプチドリンカーに柔軟性がある限り、任意の数のグリシン残基であり;ある実施態様では、nは、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は7つのグリシン残基である)、
【化４２】
2013526849.tif 000089
からなる群から選択される。
【０２０５】
ある実施態様では、以下のもの:
【化４３】
2013526849.tif 000090
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の短いステムポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化４４】
2013526849.tif 000091
からなる群から選択される。
【０２０６】
ある実施態様では、以下のもの:
【化４５】
2013526849.tif 000092
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の短いステムポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の短いステムセグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化４６】
2013526849.tif 000093
からなる群から選択される。
【０２０７】
ある実施態様では、以下のもの:
【化４７】
2013526849.tif 000094
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の短いステムポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の短いステムセグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化４８】
2013526849.tif 000095
からなる群から選択される。
【０２０８】
ある実施態様では、以下のもの:
【化４９】
2013526849.tif 000096
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の短いステムポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の短いステムセグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化５０】
2013526849.tif 000097
からなる群から選択される。
ある実施態様では、以下のもの:
【化５１】
2013526849.tif 000098
2013526849.tif 000099
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の短いステムポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の短いステムセグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化５２】
2013526849.tif 000100
からなる群から選択される。
【０２０９】
(5.1.2  インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチド)
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドの典型的な一次構造は、以下の順序で:HA1のN末端の長いステムセグメント、リンカー、HA1のC末端の長いステムセグメント、及びHA2を含む。一次配列は、単一のポリペプチドによって形成されることができるか、又はそれは、複数のポリペプチドによって形成されることができる。通常、単一のポリペプチドは、当業者に好適であると考えられる任意の技術によって発現される。単一のポリペプチドの実施態様では、HA1セグメントとHA2は三次結合している。当業者に公知であるように、単一のHAポリペプチドは、例えば、プロテアーゼによって、適当な発現条件下で切断され、四次結合した2つのポリペプチドを生じさせることができる。切断は、通常、HA1のC末端の短いステムセグメントとHA2の間である。ある実施態様では、複数のポリペプチドが本明細書で提供される。複数のポリペプチドの実施態様では、HA1セグメントとHA2は四次結合している。
【０２１０】
ある実施態様では、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは単量体である。ある実施態様では、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは多量体である。ある実施態様では、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは三量体である。当業者は、天然のインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドがインビボで三量体化することができること、及び本明細書で提供される特定のインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが三量体化することができることを認識しているであろう。下記の特定の実施態様では、本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、三量体化を容易にする三量体化ドメインを含む。
【０２１１】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。ある実施態様では、シグナルペプチドを欠く成熟したインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドも本明細書で提供される。
【０２１２】
ある実施態様では、HA2ステムドメイン、HA2内腔ドメイン、HA2膜貫通ドメイン、及びHA2細胞質ドメインを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA2ステムドメイン、HA2内腔ドメイン、及びHA2膜貫通ドメインを含むが、典型的な細胞質ドメインの一部又は全てを欠くインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA2ステムドメイン及びHA2内腔ドメインを含むが、HA2膜貫通ドメインとHA2細胞質ドメインの両方を欠くインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA2ステムドメインを含むが、HA2内腔ドメイン、HA2膜貫通ドメイン、及びHA2細胞質ドメインを欠くインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、当業者に公知のインフルエンザHA2ステムドメインとの少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するHA2ステムドメインを含む。公知のA型インフルエンザ血球凝集素由来の例示的な公知のHA2ステムドメインは、下の表に提供されている。
【０２１３】
最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基がHA2ステムドメインの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA2ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドも本明細書で提供される。最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と保存的に置換されている改変型のHA2ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書でさらに提供される。欠失した及び改変されたHA2ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書でさらに提供される。
【０２１４】
HA1のN末端の長いステムセグメントは、本明細書で提供される定義に基づいて当業者により認識される任意のHA1のN末端の長いステムセグメントであることができる。通常、HA1のN末端の長いステムセグメントは、成熟したHA1のN末端アミノ酸(すなわち、シグナルペプチドを欠くHA1)からHA1の約97番目の残基(H3付番を使用)の配列に位置するシステイン残基までからなるポリペプチドに対応する。本明細書でCpと称される、このシステイン残基は、通常、HA1のC末端の長いステムセグメント中のシステイン残基Cqに連結されることができる。16個の代表的なA型インフルエンザ血球凝集素の配列が図1に示されており、残基Cpが各々で特定されている。
【０２１５】
ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、Cp(例えば、H3血球凝集素由来のHA1サブユニットのCys97)で正確に終わるのではなく、配列上及び構造上Cpに近い残基で終わる。例えば、ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、Cp-1、Cp-2、Cp-3、又はCp-4で終わる。他の実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、Cp+1、Cp+2、Cp+3、Cp+4、又はCp+5で終わる。HA1のN末端の長いステムセグメントの終点は、得られる連結されたHA1ステムドメインが、下記のように、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインに類似した三次元構造を形成することができるように、HA1のC末端の長いステムセグメント及びリンカーの終点との関連で選択されるべきである。
【０２１６】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、当業者に公知のインフルエンザHA1のN末端の長いステムセグメントとの少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するHA1のN末端の長いステムセグメントを含む。例示的な公知のHA1のN末端の長いステムセグメントは、下の表に提供されている。
【０２１７】
最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基がHA1のN末端の長いステムセグメントの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA1のN末端の長いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドも本明細書で提供される。ある実施態様では、1つ、2つ、又は3つの残基が、HA1のN末端の長いステムセグメントのC末端に付加されており;これらの付加された残基が、HA1のN末端の長いステムセグメントに隣接する球状ヘッドドメインのアミノ酸配列に由来することができる、伸張型のHA1のN末端の長いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と保存的に置換されている改変型のHA1のN末端の長いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書でさらに提供される。欠失した及び改変されたHA1のN末端の長いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドがさらに提供される。
【０２１８】
HA1のC末端の長いステムセグメントは、本明細書で提供される定義に基づいて当業者により認識される任意のHA1のC末端の長いステムセグメントであることができる。通常、HA1のC末端の長いステムセグメントは、HA1の約252番目の残基(H3付番を使用)の配列に位置するアラニン残基からHA1のC末端アミノ酸までからなるポリペプチドに対応する。本明細書でCqと称される、このアラニン残基は、通常、HA1のN末端の長いステムセグメント中のシステイン残基Cpに連結されることができる。16個の代表的なA型インフルエンザ血球凝集素の配列が図1に示されており、残基Cqが各々で特定されている。
【０２１９】
ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、Cq(例えば、H3血球凝集素由来のHA1サブユニットのAla252)から始まるのではなく、配列上及び構造上Cqに近い残基から始まる。例えば、ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、Cq-1、Cq-2、Cq-3、又はCq-4から始まる。他の実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、Cq+1、Cq+2、Cq+3、Cq+4、又はCq+5から始まる。HA1のN末端の長いステムセグメントの終点は、得られるHA1ステムドメインが、下記のように、インフルエンザ血球凝集素に類似した三次元構造を形成することができるように、HA1のC末端の長いステムセグメント及びリンカーの始点との関連で選択されるべきである。
【０２２０】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、当業者に公知のインフルエンザHA1のC末端の長いステムセグメントとの少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するHA1のC末端の長いステムセグメントを含む。例示的な公知のHA1のC末端の長いステムセグメントは、下の表に提供されている。
【０２２１】
ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-1であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq-1である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はAp-2であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq-2である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-3であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq-3である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-4であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq-4である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-5であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq-5である。
【０２２２】
ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+1であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq+1である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+2であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq+2である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+3であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq+3である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+4であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq+4である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+5であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq+5である。
【０２２３】
ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-1であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq+1である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-2であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq+2である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-3であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq+3である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-4であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq+4である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-5であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq+5である。
【０２２４】
ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+1であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq-1である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+2であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq-2である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+3であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq-3である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+4であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq-4である。ある実施態様では、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+5であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq-5である。
【０２２５】
最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基がHA1のC末端の長いステムセグメントの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA1のC末端の長いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドも本明細書で提供される。ある実施態様では、1つ、2つ、又は3つの残基が、HA1のC末端の長いステムセグメントのN末端に付加されており;これらの付加された残基が、HA1のC末端の長いステムセグメントに隣接する球状ヘッドドメインのアミノ酸配列に由来することができる、伸張型のHA1のC末端の長いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。特定の実施態様では、1つの残基がC末端の長いステムセグメントに付加される場合、1つの残基がN末端の長いステムセグメントに付加され;2つの残基がC末端の長いステムセグメントに付加される場合、2つの残基がN末端の長いステムセグメントに付加され;3つの残基がC末端の長いステムセグメントに付加される場合、3つの残基がN末端の長いステムセグメントに付加される。最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と保存的に置換されている改変型のHA1のC末端の長いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書でさらに提供される。欠失した及び改変されたHA1のC末端の長いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドがさらに提供される。
【０２２６】
インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意のインフルエンザ血球凝集素に基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、A型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、以下で詳細に記載するように、B型インフルエンザ血球凝集素に基づく。
【０２２７】
HA1のN末端の長いステムセグメントは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意のHA1のN末端の長いステムセグメントに基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、A型インフルエンザHA1のN末端の長いステムセグメントに基づく。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、配列番号414〜429から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、各々1つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号414〜429から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、各々2つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号414〜429から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、各々3つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号414〜429から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、各々4つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号414〜429から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、各々5つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号414〜429から選択される。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、配列番号446〜493から選択される。
【０２２８】
HA1のC末端の長いステムセグメントは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意のHA1のC末端の長いステムセグメントに基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、A型インフルエンザHA1のC末端の長いステムセグメントに基づく。ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、配列番号430〜445から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、各々1つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号430〜445から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、各々2つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号430〜445から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、各々3つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号430〜445から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、各々4つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号430〜445から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、各々5つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号430〜445から選択される。ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、配列番号494〜541から選択される。
【０２２９】
HA2ステムドメインは、当業者に公知であるか、後に発見されるか、又は本明細書に記載されている任意のHA2ステムドメインに基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様では、HA2ステムドメインは、A型インフルエンザHA2ステムドメインに基づく。ある実施態様では、HA2ステムドメインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様では、HA2ステムドメインは、配列番号66〜97から選択される。
【０２３０】
シグナルペプチドを含む実施態様では、シグナルペプチドは、当業者に公知であるか又は本明細書に記載されている任意のインフルエンザシグナルペプチドに基づくことができる。ある実施態様では、シグナルペプチドは、配列番号18〜33から選択される。
【０２３１】
内腔ドメインを含む実施態様では、内腔ドメインは、当業者に公知であるか又は本明細書に記載されている任意のインフルエンザ内腔ドメインに基づくことができる。ある実施態様では、内腔ドメインは、配列番号98〜113から選択される。
【０２３２】
膜貫通ドメインを含む実施態様では、膜貫通ドメインは、当業者に公知であるか又は本明細書に記載されている任意のインフルエンザ膜貫通ドメインに基づくことができる。ある実施態様では、膜貫通ドメインは、配列番号114〜129から選択される。
【０２３３】
細胞質ドメインを含む実施態様では、細胞質ドメインは、当業者に公知であるか又は本明細書に記載されている任意のインフルエンザ細胞質ドメインに基づくことができる。ある実施態様では、細胞質ドメインは、配列番号130〜145から選択される。
【０２３４】
ある実施態様では、血球凝集素ステムドメイン中のグリコシル化部位の1つ又は複数を、これらの部位でのグリコシル化がポリペプチドのプロセシング及び成熟の間に生じないように、改変するか又は欠失させる。当業者は、インフルエンザHAが、通常、1以上のグリコシル化配列(例えば、Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys、ここで、Xaaは、Pro以外の任意のアミノ酸である)を含むことを認識しているであろう。ある実施態様では、グリコシル化配列中の1以上のアミノ酸残基を、グリコシル化配列を分断するアミノ酸残基と保存的に置換する。ある実施態様では、グリコシル化配列中の1以上のアミノ酸残基を、グリコシル化配列を分断する任意のアミノ酸残基と置換する。ある実施態様では、グリコシル化配列中の1以上のアスパラギン残基をアラニンと置換する。特定の実施態様では、H3血球凝集素の位置38のアスパラギンをアラニンに変化させる。
【０２３５】
下の表7は、A型インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのシグナルペプチド、HA1のN末端の長いステムセグメント、HA1のC末端の長いステムセグメント、及びHA2ドメインを特定している。これらのシグナルペプチド、ステムセグメント、及びドメインは、本明細書に記載のポリペプチド及び方法において有用である。
【表９】
2013526849.tif 000101
2013526849.tif 000102
2013526849.tif 000103
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2013526849.tif 000108
【０２３６】
下の表7Aは、本明細書に記載のポリペプチド及び方法のための有用なHA1のN末端の長いステムセグメント及びHA1のC末端の長いステムセグメントを特定しれている。
【表１０】
2013526849.tif 000109
2013526849.tif 000110
2013526849.tif 000111
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【０２３７】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドの三次構造又は四次構造中に1以上の免疫原性エピトープを含む。
【０２３８】
ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、アミノ酸配列A17-A18-(Xaa)n-A38(配列番号146)を含み、ここで、
A17は、Y又はHであり;
A18は、H、L、又はQであり;
(Xaa)nは、18〜20アミノ酸残基の配列を表し;かつ
A38は、H、S、Q、T、又はNである。
【０２３９】
ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントは、アミノ酸配列A291-A292(配列番号147)を含み、ここで、
A291は、T、S、N、D、P、又はKであり;かつ
A292は、L、M、K、又はRである。
【０２４０】
ある実施態様では、HA2ドメインは、アミノ酸配列A18-A19-A20-A21(配列番号148)を含み、ここで、
A18は、V又はIであり;
A19は、D、N、又はAであり;
A20は、Gであり、かつ
A21は、Wである。
【０２４１】
ある実施態様では、HA2ドメインは、アミノ酸配列
【化５３】
2013526849.tif 000120
を含み、ここで、
A38は、K、Q、R、L、又はYであり;
A39は、任意のアミノ酸残基であり;
A40は、任意のアミノ酸残基であり;
A41は、Tであり;
A42は、Qであり;
A43は、任意のアミノ酸残基であり;
A44は、Aであり;
A45は、Iであり;
A46は、Dであり;
A47は、任意のアミノ酸残基であり;
A48は、I、V、又はMであり;
A49は、T、Q、又はNであり;
A50は、任意のアミノ酸残基であり;
A51は、Kであり;
A52は、V又はLであり;
A53は、Nであり;
A54は、任意のアミノ酸残基であり;
A55は、V、I、又はLであり;かつ
A56は、V又はIである。
【０２４２】
ある実施態様では、インフルエンザステムドメインポリペプチドは、配列番号146〜149から選択される2つのアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、インフルエンザステムドメインポリペプチドは、配列番号146〜149から選択される3つのアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、インフルエンザステムドメインポリペプチドは、配列番号146〜149から選択される4つのアミノ酸配列を含む。
【０２４３】
図1及び2に示すように、HA1のN末端の長いステムセグメントは、A型インフルエンザとB型インフルエンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有する。同様に、HA1のC末端の長いステムセグメントも、A型インフルエンザとB型インフルエンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有する。さらに、HA2ドメインも、A型インフルエンザとB型インフルエンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有する。
【０２４４】
いくつかの実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、複数のインフルエンザ株又は亜型由来のセグメント及び/もしくはドメインを含むか又はそれらから本質的になるハイブリッドポリペプチドである。例えば、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、異なるA型インフルエンザウイルスHA亜型由来のHA1のN末端の長いステムセグメント及びHA1のC末端の長いステムセグメントを含むことができる。いくつかの実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントは、A型インフルエンザウイルス由来のものであるが、HA1のC末端の長いステムセグメントは、B型インフルエンザウイルス由来のものである。同様に、HA2は、A型インフルエンザウイルス由来のものでもあり得るが、HA1のN末端の長いステムセグメント及び/又はC末端の長いステムセグメントは、B型インフルエンザウイルス由来のものである。
【０２４５】
表2〜4、6、6aに記載の配列エレメント、又はその変異体の任意の組合せを用いて、本発明の血球凝集素HAの長いステムドメインポリペプチドを形成させることができることが理解されるであろう。
【０２４６】
本明細書で提供されるインフルエンザステムドメインポリペプチドにおいて、リンカーは、HA1のN末端の長いステムセグメントをHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合で連結させる。リンカーは、本明細書に記載のリンカーを含むが、これに限定されない、当業者によって好適であると考えられる任意のリンカーであることができる。
【０２４７】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、天然のインフルエンザ血球凝集素のステムドメインの三次元構造と類似する三次元構造を形成することができる。構造類似性は、本明細書に記載の技術を含むが、これに限定されない、当業者によって好適であると考えられる任意の技術に基づいて評価することができる。
【０２４８】
ある実施態様では、本明細書で提供される任意のインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、当業者に好適であると考えられる1以上のポリペプチドドメインをさらに含むことができる。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ
【化５４】
2013526849.tif 000121
FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書で提供されるポリペプチドの精製を容易にすることができる。バクテリオファージT4フィブリチン由来のフォルドンドメイン、又は三量体化ドメインは、本明細書で提供されるポリペプチドの三量体化を容易にすることができる。フォルドンドメインは、当業者に公知の任意のフォルドン配列を有することができる(例えば、Papanikolopoulouらの文献(2004, J. Biol. Chem. 279(10):8991-8998)を参照されたく、その内容は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる)。例としては、
【化５５】
2013526849.tif 000122
が挙げられる。フォルドンドメインは、本明細書で提供される可溶性ポリペプチドの三量体化を容易にするのに有用であることができる。切断部位を用いて、ポリペプチドの一部の切断、例えば、精製タグもしくはフォルドンドメイン又は両方の切断を容易にすることができる。有用な切断部位としては、トロンビン切断部位、例えば、配列
【化５６】
2013526849.tif 000123
を有するものが挙げられる。
【０２４９】
ある実施態様では、本明細書に記載のエラスターゼ切断部位を含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが提供される。特定の実施態様では、配列番号430〜445のいずれかを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、配列番号430〜445のC末端アミノ酸残基、例えば、アルギニン又はリジンは、バリン残基と置換されている。
【０２５０】
ある実施態様では、HA1とHA2の接合部でのプロテアーゼ切断に対して抵抗性があると予測されるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。 当業者は、HA1とHA2にまたがるArg-Gly配列がトリプシンの認識部位であり、通常、血球凝集素活性化のために切断されることを認識すべきである。本明細書に記載のステムドメインポリペプチドは活性化される必要がないので、プロテアーゼ切断に抵抗性があると予測されるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1とHA2にまたがるプロテアーゼ部位を、プロテアーゼ切断に対して抵抗性がある配列に突然変異させている、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが提供される。ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントのC末端残基が、Lys又はArg以外の任意の残基である、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが提供される。ある実施態様では、HA2ドメインのN末端残基がプロリンである、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが提供される。ある実施態様では、HA1のC末端の長いステムセグメントのC末端残基がAlaであり、かつHA2ドメインのN末端残基もAlaである、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが提供される。ある実施態様では、HA2ドメインのN末端残基がグリシン以外の任意の残基である、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが提供される。
【０２５１】
ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端の長いステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０２５２】
ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端の長いステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０２５３】
ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端の長いステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０２５４】
ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端の長いステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがトロンビン切断部位、フォルドンドメイン、及びHisタグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０２５５】
ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端の長いステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０２５６】
ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。ある実施態様では、シグナルペプチドがHA1のN末端の長いステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが本明細書で提供される。
【０２５７】
ある実施態様では、以下のもの:
【化５７】
2013526849.tif 000124
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の長いステムポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の長いステムセグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、Gly、Gly-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly、(Gly)n (ここで、nは、ペプチドリンカーに柔軟性がある限り、任意の数のグリシン残基であり;ある実施態様では、nは、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は7つのグリシン残基である)、
【化５８】
2013526849.tif 000125
からなる群から選択される。
【０２５８】
ある実施態様では、以下のもの:
【化５９】
2013526849.tif 000126
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の長いステムポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の長いステムセグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化６０】
2013526849.tif 000127
からなる群から選択される。
【０２５９】
ある実施態様では、以下のもの:
【化６１】
2013526849.tif 000128
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の長いステムポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の長いステムセグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化６２】
2013526849.tif 000129
からなる群から選択される。
【０２６０】
ある実施態様では、以下のもの:
【化６３】
2013526849.tif 000130
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の長いステムポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の長いステムセグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化６４】
2013526849.tif 000131
からなる群から選択される。
【０２６１】
ある実施態様では、以下のもの:
【化６５】
2013526849.tif 000132
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の長いステムポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の長いステムセグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化６６】
2013526849.tif 000133
からなる群から選択される。
【０２６２】
ある実施態様では、以下のもの:
【化６７】
2013526849.tif 000134
2013526849.tif 000135
2013526849.tif 000136
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の長いステムポリペプチドが本明細書で提供され、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の長いステムセグメントは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様では、LLは、直接結合、
【化６８】
2013526849.tif 000137
からなる群から選択される。
【０２６３】
(5.2  インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸)
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸が本明細書で提供される。別の具体的な実施態様では、インフルエンザウイルス血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドをコードする核酸が本明細書で提供される。別の具体的な実施態様では、インフルエンザウイルス血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドをコードする核酸が本明細書で提供される。遺伝暗号の縮重のために、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド(インフルエンザウイルス血球凝集素の短いステムドメインポリペプチド及びインフルエンザウイルス血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドを含む)をコードする任意の核酸が本明細書に包含される。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを産生するために、HA1のN末端ステムセグメント、HA1のC末端ステムセグメント、HA2ドメイン、内腔ドメイン、膜貫通ドメイン、及び/又は細胞質ドメインをコードする天然のインフルエンザウイルス核酸に対応する核酸が用いられる。
【０２６４】
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド(インフルエンザウイルス血球凝集素の短いステムドメインポリペプチド及びインフルエンザウイルス血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドを含む)をコードする核酸にハイブリダイズすることができる核酸も本明細書で提供される。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸の断片にハイブリダイズすることができる核酸が本明細書で提供される。他の実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸の全長にハイブリダイズすることができる核酸が本明細書で提供される。核酸のハイブリダイゼーション条件の一般的なパラメータは、Sambrookらの文献、分子クローニング-実験マニュアル(Molecular Cloning - A Laboratory Manual)(第2版, 1〜3巻, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1989))、及びAusubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)(2巻, Current Protocols Publishing, New York(1994))に記載されている。ハイブリダイゼーションは、高いストリンジェンシー条件、中間のストリンジェンシー条件、又は低いストリンジェンシー条件の下で実施することができる。当業者であれば、低いストリンジェンシー条件、中間のストリンジェンシー条件、及び高いストリンジェンシー条件は、その全てが相互作用する複数の因子に左右され、また、当該核酸によっても決まることを理解するであろう。例えば、高いストリンジェンシー条件は、核酸(複数可)の融点の5℃以内の温度、低い塩濃度(例えば、250mM未満)、及び高い共溶媒濃度(例えば、1〜20％の共溶媒、例えば、DMSO)を含むことができる。他方、低いストリンジェンシー条件は、核酸(複数可)の融点より10℃を超えて低い温度、高い塩濃度(例えば、1000mM超)、及び共溶媒の欠如を含むことができる。
【０２６５】
いくつかの実施態様では、インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸が単離される。ある実施態様では、「単離された」核酸は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子を指す。つまり、単離された核酸は、天然ではそれに関連していない異種核酸を含むことができる。他の実施態様では、「単離された」核酸、例えば、cDNA分子は、組換え技術によって産生されたとき、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まないものであるか、又は化学合成されたとき、化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないものであることができる。用語「細胞物質を実質的に含まない」には、それが単離されるか又は組換えで産生される細胞の細胞成分から核酸が分離されている核酸調製物が含まれる。したがって、細胞物質を実質的に含まない核酸には、(乾燥重量で)約30％、20％、10％、又は5％未満の他の核酸を有する核酸調製物が含まれる。用語「培養培地を実質的に含まない」には、培養培地が調製物の容量の約50％、20％、10％、又は5％未満である核酸調製物が含まれる。用語「化学物質前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」には、核酸の合成に関与する化学物質前駆体又は他の化学物質から核酸が分離されている調製物が含まれる。具体的な実施態様では、そのような核酸調製物は、(乾燥重量で)約50％、30％、20％、10％、5％未満の化学物質前駆体又は関心対象の核酸以外の化合物を有する。
【０２６６】
さらに、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの個々の成分をコードする核酸が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、HA1のN末端ステムセグメント、HA1のC末端ステムセグメント、及び/又はHA2ドメインをコードする核酸が本明細書で提供される。インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの成分をコードする核酸は、当業者に公知の標準的な分子生物学の技術を用いてアセンブルすることができる。
【０２６７】
(5.3  インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの発現)
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸を含む、発現ベクターを含むベクターが本明細書で提供される。具体的な実施態様では、ベクターは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸の発現を導くことができる発現ベクターである。発現ベクターの非限定的な例としては、プラスミド及びウイルスベクター、例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びバキュロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６８】
いくつかの実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの成分(例えば、HA1のN末端ステムセグメント、HA1のC末端ステムセグメント、及び/又はHA2)をコードする発現ベクターが本明細書で提供される。そのようなベクターを用いて、1以上の宿主細胞で該成分を発現させることができ、該成分を、当業者に公知の技術を用いて、単離し、リンカーとコンジュゲートさせることができる。
【０２６９】
発現ベクターは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸を、宿主細胞での核酸の発現に好適な形態で含む。具体的な実施態様では、発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択される、発現させる核酸に機能的に連結された1以上の調節配列を含む。発現ベクターにおいて、「機能的に連結された」とは、関心対象の核酸が、(例えば、インビトロ転写/翻訳系での、又はベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞での)核酸の発現を可能にする様式で調節配列(複数可)に連結されていることを意味するものとする。調節配列には、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)が含まれる。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞で核酸の構成的発現を導くもの、特定の宿主細胞でのみ核酸の発現を導くもの(例えば、組織特異的調節配列)、及び特定の薬剤による刺激によって核酸の発現を導くもの(例えば、誘導可能な調節配列)が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、タンパク質の所望の発現レベルのような因子によって決まり得ることが当業者には理解されるであろう。用語「宿主細胞」は、核酸で形質転換又はトランスフェクトされる特定の対象細胞、及びそのような細胞の子孫又は可能性のある子孫を含むものとする。そのような細胞の子孫は、後続の世代で起こり得る突然変異もしくは環境の影響又は宿主細胞ゲノムへの核酸の組込みのために、核酸で形質転換又はトランスフェクトされる親細胞と同一でなくてもよい。
【０２７０】
発現ベクターは、原核生物細胞(例えば、大腸菌(E. coli))又は真核生物細胞(例えば、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを用いる、例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、Treanorらの文献(2007, JAMA, 297(14):1577-1582)を参照されたい)、酵母細胞、植物細胞、藻類、もしくは哺乳動物細胞)を用いて、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの発現のために設計することができる。哺乳動物宿主細胞の例としては、Crucell Per.C6細胞、Vero細胞、CHO細胞、VERY細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞、MDCK細胞、293細胞、3T3細胞、又はWI38細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施態様では、宿主細胞は、骨髄腫細胞、例えば、NS0細胞、45.6 TG1.7細胞、AF-2クローン9B5細胞、AF-2クローン9B5細胞、J558L細胞、MOPC 315細胞、MPC-11細胞、NCI-H929細胞、NP細胞、NS0/1細胞、P3 NS1 Ag4細胞、P3/NS1/1-Ag4-1細胞、P3U1細胞、P3X63Ag8細胞、P3X63Ag8.653細胞、P3X63Ag8U.1細胞、RPMI 8226細胞、Sp20-Ag14細胞、U266B1細胞、X63AG8.653細胞、Y3.Ag.1.2.3細胞、及びYO細胞である。昆虫細胞の非限定的な例としては、Sf9、Sf21、キンウワバ(Trichoplusia ni)、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)、及びカイコガ(Bombyx mori)が挙げられる。特定の実施態様では、哺乳動物細胞培養系(例えば、チャイニーズハムスター卵巣又はベビーハムスター腎臓細胞)が、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの発現に用いられる。別の実施態様では、植物細胞培養系が、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの発現に用いられる。植物細胞培養系を利用するタンパク質の産生のための植物細胞及び方法については、例えば、米国特許第7,504,560号;第6,770,799号;第6,551,820号;第6,136,320号;第6,034,298号;第5,914,935号;第5,612,487号;及び第5,484,719号、並びに米国特許出願公開第2009/0208477号、第2009/0082548号、第2009/0053762号、第2008/0038232号、第2007/0275014号、及び第2006/0204487号を参照されたい。
【０２７１】
発現ベクターは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術によって宿主細胞に導入することができる。そのような技術としては、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、リポフェクション、及びエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための好適な方法は、Sambrookらの文献(1989, 分子クローニング-実験マニュアル(Molecular Cloning - A Laboratory Manual), 第2版, Cold Spring Harbor Press, New York)、及び他の実験マニュアルに見出すことができる。ある実施態様では、宿主細胞は、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターで一過性にトランスフェクトされる。他の実施態様では、宿主細胞は、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターで安定にトランスフェクトされる。
【０２７２】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについて、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技術によっては、細胞のごく一部だけが外来性DNAをそのゲノムに組み込むことができることが知られている。これらの組込み体を同定及び選択するために、(例えば、抗生物質耐性のための)選択マーカーをコードする核酸が、通常、関心対象の核酸と一緒に宿主細胞に導入される。選択マーカーの例としては、薬剤、例えば、G418、ハイグロマイシン、及びメトトレキセートに対する耐性を付与するものが挙げられる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択によって同定することができる(例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する)。
【０２７３】
宿主細胞を用いるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの組換え発現の代替法として、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを、例えば、T7プロモーター調節配列及びT7ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写及び翻訳することができる。具体的な実施態様では、共役転写/翻訳系、例えば、Promega TNT(登録商標)、又は転写及び翻訳に必要な成分を含む細胞溶解物もしくは細胞抽出物を用いて、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを産生することができる。
【０２７４】
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが産生されると、それは、タンパク質の単離又は精製のための当技術分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、特に、特定の抗原に対する親和性、プロテインAによるもの、及びサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差溶解性、又はタンパク質の単離もしくは精製のための任意の他の標準的な技術によって単離又は精製することができる。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、熱ショックタンパク質(例えば、Hsp10、Hsp20、Hsp30、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、又はHsp100)とともに又はそれなしで、異種タンパク質、例えば、主要組織適合性複合体(MHC)とコンジュゲートさせることができる。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、免疫調節分子、例えば、免疫細胞、例えば、B細胞(例えば、Cd3)又はT細胞にインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをターゲッティングするタンパク質とコンジュゲートさせることができる。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、自然免疫系を刺激するタンパク質、例えば、インターフェロン1型、アルファ、ベータ、もしくはガンマインターフェロン、コロニー刺激因子、例えば、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、腫瘍壊死因子(TNF)-β、TNFα、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40リガンド(CD40L)、及び薬剤誘導性CD40(iCD40)とコンジュゲートさせることができる。
【０２７５】
したがって、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを産生する方法が本明細書で提供される。一実施態様では、本方法は、ポリペプチドが産生されるように、ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を好適な培地中で培養することを含む。いくつかの実施態様では、本方法は、ポリペプチドを培地又は宿主細胞から単離することをさらに含む。
【０２７６】
(5.4  インフルエンザウイルスベクター)
一態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むインフルエンザウイルスが本明細書で提供される。具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをインフルエンザウイルスのビリオンに組み込む。インフルエンザウイルスを、免疫細胞などの特定の細胞型にウイルスをターゲッティングする部分に結合させもよい。いくつかの実施態様では、インフルエンザウイルスのビリオンは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドに加えて、異種ポリペプチドをそれらに組み込んでいるか、又はそれを発現する。異種ポリペプチドは、免疫増強活性を有するか、又は特定の細胞型にインフルエンザウイルスをターゲッティングするポリペプチド、例えば、特定の細胞型の表面の抗原に結合する抗体、又は特定の細胞型の表面の特異的受容体に結合するリガンドであってもよい。
【０２７７】
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むインフルエンザウイルスは、当業者に公知の技術、例えば、リバースジェネティクス及びヘルパーフリープラスミドレスキューを用いて、ビリオンの産生の間にトランスでインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを供給することによって産生することができる。或いは、血球凝集素機能がトランスで提供されているウイルスに感染しやすい細胞でインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するように改変されたゲノムを含む親インフルエンザウイルスの複製は、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む子孫インフルエンザウイルスを産生する。
【０２７８】
別の態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するように改変されたゲノムを含むインフルエンザウイルスが本明細書で提供される。具体的な実施態様では、親インフルエンザウイルスのゲノムは、子孫インフルエンザウイルスによって発現されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードするように改変される。別の具体的な実施態様では、親インフルエンザウイルスのゲノムは、発現されて、子孫インフルエンザウイルスのビリオンに組み込まれるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードするように改変される。したがって、親インフルエンザウイルスの複製によって生じる子孫インフルエンザウイルスは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む。親インフルエンザウイルスのビリオンは、同じ又は異なる型、亜型、又は株のインフルエンザウイルスに由来するインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドをそれらに組み込んでいてもよい。或いは、親インフルエンザウイルスのビリオンは、機能的に、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの活性(例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素の受容体結合及び/又は融合活性)のうちの1つ又は複数を置換することができる部分をそれらに組み込んでいてもよい。ある実施態様では、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの活性のうちの1つ又は複数は、(i)インフルエンザウイルスにとって異種のポリペプチドの細胞外ドメインが(ii)インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの膜貫通ドメイン、又は膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに融合したものを含む融合タンパク質によって提供される。具体的な実施態様では、親インフルエンザウイルスのビリオンは、(i)インフルエンザウイルス以外の感染性病原体の受容体結合性/融合原性ポリペプチドの細胞外ドメインが(ii)インフルエンザウイルス血球凝集素の膜貫通ドメイン、又は膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに融合したものを含む融合タンパク質をそれらに組み込んでいてもよい。インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの1以上の活性を提供する融合タンパク質、及びそのような融合タンパク質を発現するように改変されたインフルエンザウイルスの産生方法の説明については、例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、2007年6月7日に公開された国際特許出願公開WO 2007/064802号を参照されたい。
【０２７９】
いくつかの実施態様では、親インフルエンザウイルスのビリオンは、異種ポリペプチドをそれらに組み込んでいる。ある実施態様では、親インフルエンザウイルスのゲノムは、子孫インフルエンザウイルスによって発現される異種ポリペプチド及びインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードするように改変される。具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、異種ポリペプチド、又は両方は、子孫インフルエンザウイルスのビリオンに組み込まれる。
【０２８０】
異種ポリペプチドは、特定の細胞型にインフルエンザウイルスをターゲッティングするポリペプチド、例えば、特定の細胞型の表面の抗原を認識する抗体、又は特定の細胞型の表面の特異的受容体に結合するリガンドであってもよい。いくつかの実施態様では、ターゲッティングポリペプチドは、ウイルスの標的細胞認識機能を代替する。具体的な実施態様では、異種ポリペプチドは、インフルエンザウイルスが天然で感染するのと同じ細胞型にインフルエンザウイルスをターゲッティングする。他の具体的な実施態様では、異種ポリペプチドは、免疫細胞、例えば、B細胞、T細胞、マクロファージ、又は樹状細胞に子孫インフルエンザウイルスをターゲッティングする。いくつかの実施態様では、異種ポリペプチドは、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞の細胞特異的マーカー(例えば、CD44など)を認識して、それに結合する。一実施態様では、異種ポリペプチドは、樹状細胞にウイルスをターゲッティングするDC-SIGNである。別の実施態様では、異種ポリペプチドは、免疫細胞にウイルスをターゲッティングする抗体(例えば、単鎖抗体)であり、この抗体は、それがインフルエンザウイルスビリオンに組み込まれるように、別のポリペプチド由来の膜貫通ドメインと融合されていてもよい。いくつかの実施態様では、抗体は、CD20抗体、CD34抗体、又はDEC-205に対する抗体である。ターゲッティング機能のあるポリペプチドを発現するようにウイルスを改変する技術は当技術分野で公知である。例えば、Yangらの文献(2006, PNAS103:11479-11484)及び2008年1月24日に公開された米国特許出願公開第20080019998号及び2007年1月25日に公開された第20070020238号を参照されたく、その各々の内容は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０２８１】
別の実施態様では、異種ポリペプチドは、ウイルス付着タンパク質である。その付着タンパク質(複数可)をこの態様で用いることができるウイルスの非限定的な例は、以下の群から選択されるウイルスである:ラッサ熱ウイルス、B型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、例えば、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、及びアウラウイルス(E1、E2、及びE3などの表面糖タンパク質を含む)、ボルナ病ウイルス、ハンターンウイルス、フォーミーウイルス、並びにSARS-CoVウイルス。
【０２８２】
一実施態様では、フラビウイルス表面糖タンパク質、例えば、デングウイルス(DV)Eタンパク質を用いることができる。いくつかの実施態様では、アルファウイルスファミリー由来のシンドビスウイルス糖タンパク質が用いられる(K. S. Wang, R. J. Kuhn, E. G. Strauss, S. Ou, J. H. Straussの文献(J. Virol. 66, 4992(1992))。ある実施態様では、異種ポリペプチドは、NDV HNもしくはFタンパク質;ヒト免疫不全ウイルス(HIV)gp160(又はその産物、例えば、gp41もしくはgp120);B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg);ヘルペスウイルスの糖タンパク質(例えば、gD、gE);或いはポリオウイルスのVP1に由来する。
【０２８３】
別の実施態様では、異種ポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の非ウイルスターゲッティング系に由来する。ある実施態様では、非ウイルス病原体、例えば、細胞内細菌又は細胞内原虫のタンパク質が用いられる。いくつかの実施態様では、細菌ポリペプチドは、例えば、クラミジア(Chlamydia)、リケッチア(Rikettsia)、コクセリア(Coxelia)、リステリア(Listeria)、ブルセラ(Brucella)、又はレジオネラ(Legionella)によって提供される。いくつかの実施態様では、原虫のポリペプチドは、例えば、マラリア原虫(Plasmodia)種、リューシマニア属(Leishmania)の種、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)、又はクルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)によって提供される。他の例示的なターゲッティング系は、その全体が本明細書中に組み込まれている、Waehlerらの文献(2007、「遺伝子治療のための標的ウイルスベクターの改変(Engineering targeted viral vectors for gene therapy)」, Nature Reviews Genetics 8:573-587)に記載されている。
【０２８４】
ある実施態様では、インフルエンザウイルスによって発現される異種ポリペプチドは、免疫増強(免疫賦活)活性を有する。免疫増強ポリペプチドの非限定的な例としては、刺激分子、サイトカイン、ケモカイン、抗体、及び他の作用物質、例えば、Flt-3リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。免疫増強活性のあるポリペプチドの具体的な例としては、以下が挙げられる:インターフェロン1型、アルファ、ベータ、もしくはガンマインターフェロン、コロニー刺激因子、例えば、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、腫瘍壊死因子(TNF)-β、TNFα、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40リガンド(CD40L)及び薬剤誘導性CD40(iCD40)(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、Hanks, B. A.らの文献(2005. Nat Med 11:130-137)を参照されたい。)
【０２８５】
A型及びB型インフルエンザウイルスのゲノムは8本(8)の一本鎖のマイナスセンスセグメントからなる(C型インフルエンザウイルスは7本(7)の一本鎖のマイナスセンスセグメントからなる)ので、親インフルエンザウイルスのゲノムは、組換えセグメント、並びに当業者に公知の技術、例えば、リバースジェネティクス及びヘルパーフリープラスミドレスキューを用いて、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド(及び任意の他のポリペプチド、例えば、異種ポリペプチド)を発現するように改変することができる。一実施態様では、組換えセグメントは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、並びにvRNAの適切な複製、転写、及びパッケージングに必要とされる3'及び5'組込みシグナルをコードする核酸を含む(Fujiiらの文献(2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2002-2007);Zhengらの文献(1996, Virology 217:242-251)、これらは両方とも、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる)。具体的な実施態様では、組換えセグメントは、親インフルエンザウイルスと異なる又は同じ型、亜型、又は株に由来するインフルエンザウイルスのセグメントの3'及び5'非コード及び/又は非翻訳配列を用いる。いくつかの実施態様では、組換えセグメントは、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの3'非コード領域、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの非翻訳領域、及びインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの5'非コード領域を含む。具体的な実施態様では、組換えセグメントは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメント、HA1のC末端ステムセグメント、及び/又はHA2として、インフルエンザウイルス型と同じ型、亜型、又は株であるインフルエンザウイルスのHAセグメントの3'及び5'非コード並びに/又は非翻訳配列を含む。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする組換えセグメントは、親インフルエンザウイルスのHAセグメントを代替することができる。いくつかの実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする組換えセグメントは、親インフルエンザウイルスのNS1遺伝子を代替することができる。いくつかの実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする組換えセグメントは、親インフルエンザウイルスのNA遺伝子を代替することができる。インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現させるために用いることができる例示的なインフルエンザウイルス株としては、アンアーバー/1/50、A/プエルトリコ/8/34、A/サウスダコタ/6/2007、A/ウルグアイ/716/2007、及びB/ブリスベン/60/2008が挙げられる。
【０２８６】
いくつかの実施態様では、親インフルエンザウイルスのゲノムは、二シストロン性である組換えセグメントを用いて、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するように改変することができる。二シストロン性技術は、内部リボソーム侵入部位(IRES)配列の使用により、複数のタンパク質のコード配列の単一mRNAへの改変を可能にする。IRES配列は、RNA分子へのリボソームの内部動員を導き、キャップ非依存的に下流の翻訳を可能にする。簡潔に述べると、1つのタンパク質のコード領域が、第二のタンパク質のオープンリーディングフレーム(ORF)に挿入される。挿入は、IRES並びに適切な発現及び/又は機能に必要な任意の非翻訳シグナル配列に連なる。挿入は、第二のタンパク質のORF、ポリアデニル化、又は転写プロモーターを妨害してはならない(例えば、Garcia-Sastreらの文献(1994, J. Virol. 68:6254-6261)及びGarcia-Sastreらの文献(1994 Dev. Biol. Stand. 82:237-246)を参照されたく、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている)。例えば、米国特許第6,887,699号、米国特許第6,001,634号、米国特許第5,854,037号、及び米国特許第5,820,871号も参照されたく、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。当技術分野で公知又は本明細書に記載の任意のIRESを本発明に従って用いることができる(例えば、BiP遺伝子のIRES、GenBankデータベースエントリーHUMGRP78のヌクレオチド372〜592;又は脳心筋炎ウイルス(EMCV)のIRES、GenBankデータベースエントリーCQ867238のヌクレオチド1430-2115)。したがって、ある実施態様では、親インフルエンザウイルスは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと、別のポリペプチド、例えば、親インフルエンザウイルスによって発現される遺伝子とを発現する二シストロン性RNAセグメントを含むように改変される。いくつかの実施態様では、親インフルエンザウイルス遺伝子は、HA遺伝子である。いくつかの実施態様では、親インフルエンザウイルス遺伝子は、NA遺伝子である。いくつかの実施態様では、親インフルエンザウイルス遺伝子は、NS1遺伝子である。
【０２８７】
当業者に公知の技術を用いて、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むインフルエンザウイルス、及びインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するように改変されたゲノムを含むインフルエンザウイルスを産生することができる。例えば、リバースジェネティクス技術を用いて、そのようなインフルエンザウイルスを産生することができる。簡潔に述べると、リバースジェネティクス技術は、一般に、ウイルスポリメラーゼによる認識及び成熟ビリオンの生成に必要なパッケージングシグナルに必須である、マイナス鎖ウイルスRNAの非コード領域を含む合成組換えウイルスRNAの調製を含む。組換えRNAは、組換えDNA鋳型から合成され、精製されたウイルスポリメラーゼ複合体によってインビトロで再構成されて、細胞をトランスフェクトするために用いることができる組換えリボ核タンパク質(RNP)を形成する。インビトロ又はインビボでの合成RNAの転写の間にウイルスポリメラーゼタンパク質が存在する場合、より効率的なトランスフェクションが達成される。合成組換えRNPは、感染性ウイルス粒子中にレスキューすることができる。前述の技術は、1992年11月24日に出願された米国特許第5,166,057号;1998年12月29日に出願された米国特許第5,854,037号;1996年2月20日に公開された欧州特許公開EP 0702085A1号;米国特許出願第09/152,845号;1997年4月3日に公開された国際特許公開PCT WO 97/12032号;1996年11月7日に公開されたWO 96/34625号;欧州特許公開EP A780475号;1999年1月21日に公開されたWO 99/02657号;1998年11月26日に公開されたWO 98/53078号;1998年1月22日に公開されたWO 98/02530号;1999年4月1日に公開されたWO 99/15672号;1998年4月2日に公開されたWO 98/13501号;1997年2月20日に公開されたWO 97/06270号;及び1997年6月25日に公開されたEPO 780 475A1号に記載されており、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０２８８】
或いは、ヘルパーフリープラスミド技術を用いて、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むインフルエンザウイルス、及びインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するように改変されたゲノムを含むインフルエンザウイルスを産生することができる。簡潔に述べると、プラスミドベクターへのPCR産物の挿入を可能にする独特の制限部位を含むプライマーによるPCRを用いて、ウイルスセグメントの全長cDNAを増幅させる(Flandorferらの文献(2003, J. Virol. 77:9116-9123;Nakayaらの文献(2001, J. Virol. 75:11868-11873;これらは両方とも、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている)。プラスミドベクターは、正確なマイナスの(vRNAセンス)転写物が発現されるように設計される。例えば、正確なマイナスの(vRNAセンス)転写物がポリメラーゼIプロモーターから産生されるように、プラスミドベクターは、切断されたヒトRNAポリメラーゼIプロモーターとデルタ型肝炎ウイルスリボザイム配列の間にPCR産物を配置するように設計することができる。各ウイルスセグメントを含む別個のプラスミドベクター並びに必要なウイルスタンパク質を含む発現ベクターを細胞にトランスフェクトして、組換えウイルス粒子の産生をもたらすことができる。別の実施例では、必要なウイルスタンパク質をコードするウイルスのゲノムRNAとmRNAの両方が発現されるプラスミドベクターを用いることができる。ヘルパーフリープラスミド技術の詳細な説明については、例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、国際公開WO 01/04333号;米国特許第6,951,754号、第7,384,774号、第6,649,372号、及び第7,312,064号;Fodorらの文献(1999, J. Virol. 73:9679-9682);Quinlivanらの文献(2005, J. Virol. 79:8431-8439);Hoffmannらの文献(2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-6113);並びにNeumannらの文献(1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9345-9350)を参照されたい。
【０２８９】
本明細書に記載のインフルエンザウイルスは、本明細書に記載の方法に従うその使用を可能にする力価までウイルスを増殖させる任意の基体中で増殖させることができる。一実施態様では、基体は、対応する野生株ウイルスについて測定される力価と同等の力価までウイルスを増殖させる。ある実施態様では、基体は、インフルエンザウイルスにとって、又はHA機能が由来するウイルスにとって生物学的に適するものである。具体的な実施態様では、例えば、NS1遺伝子中の突然変異による弱毒化インフルエンザウイルスは、IFN欠損基体中で増殖させることができる。例えば、好適なIFN欠損基体は、インターフェロンを産生するか、もしくはそれに応答するその能力に欠陥がある基体であってもよく、又はIFN欠損基体をインターフェロン欠損増殖環境を必要とし得る任意の数のウイルスの増殖のために用いることができる基体である。例えば、2003年6月3日に出願された米国特許第6,573,079号、2005年2月8日に出願された第6,852,522号、及び2009年2月24日に出願された第7,494,808号を参照されたく、これらの文献の各々の内容全体は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０２９０】
本明細書に記載のインフルエンザウイルスは、当業者に公知の任意の方法によって単離及び精製することができる。一実施態様では、ウイルスは、一般に、周知の清澄化手順、例えば、密度勾配遠心分離及びカラムクロマトグラフィーによって細胞培養物から取り出され、細胞成分から分離され、望ましい場合、当業者に周知の手順、例えば、プラークアッセイを用いて、さらに精製することができる。
【０２９１】
ある実施態様では、本明細書に記載されているように用いられるインフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、A型インフルエンザウイルスから得られるか、又はそれに由来する。ある実施態様では、本明細書に記載されているように用いられるインフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、単一のA型インフルエンザウイルスの亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由来する。他の実施態様では、本明細書に記載されているように用いられるインフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、2以上のA型インフルエンザウイルスの亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由来する。
【０２９２】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されているように用いられるインフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、B型インフルエンザウイルスから得られるか、又はそれに由来する。ある実施態様では、本明細書に記載されているように用いられるインフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、単一のB型インフルエンザウイルスの亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由来する。他の実施態様では、本明細書に記載されているように用いられるインフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、2以上のB型インフルエンザウイルスの亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由来する。他の実施態様では、本明細書に記載されているように用いられるインフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、A型インフルエンザウイルスの亜型又は株とB型インフルエンザウイルスの亜型又は株の組合せから得られるか、又はそれに由来する。
【０２９３】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されているように用いられるインフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、C型インフルエンザウイルスから得られるか、又はそれに由来する。ある実施態様では、本明細書に記載されているように用いられるインフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、単一のC型インフルエンザウイルスの亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由来する。他の実施態様では、本明細書に記載されているように用いられるインフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、2以上のC型インフルエンザウイルスの亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由来する。他の実施態様では、本明細書に記載されているように用いられるインフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、C型インフルエンザウイルスの亜型又は株とA型インフルエンザウイルスの亜型もしくは株及び/又はB型インフルエンザウイルスの亜型もしくは株の組合せから得られるか、或いはそれらに由来する。
【０２９４】
A型インフルエンザウイルスの非限定的な例としては、亜型H10N4、亜型H10N5、亜型H10N7、亜型H10N8、亜型H10N9、亜型H11N1、亜型H11N13、亜型H11N2、亜型H11N4、亜型H11N6、亜型H11N8、亜型H11N9、亜型H12N1、亜型H12N4、亜型H12N5、亜型H12N8、亜型H13N2、亜型H13N3、亜型H13N6、亜型H13N7、亜型H14N5、亜型H14N6、亜型H15N8、亜型H15N9、亜型H16N3、亜型H1N1、亜型H1N2、亜型H1N3、亜型H1N6、亜型H1N9、亜型H2N1、亜型H2N2、亜型H2N3、亜型H2N5、亜型H2N7、亜型H2N8、亜型H2N9、亜型H3N1、亜型H3N2、亜型H3N3、亜型H3N4、亜型H3N5、亜型H3N6、亜型H3N8、亜型H3N9、亜型H4N1、亜型H4N2、亜型H4N3、亜型H4N4、亜型H4N5、亜型H4N6、亜型H4N8、亜型H4N9、亜型H5N1、亜型H5N2、亜型H5N3、亜型H5N4、亜型H5N6、亜型H5N7、亜型H5N8、亜型H5N9、亜型H6N1、亜型H6N2、亜型H6N3、亜型H6N4、亜型H6N5、亜型H6N6、亜型H6N7、亜型H6N8、亜型H6N9、亜型H7N1、亜型H7N2、亜型H7N3、亜型H7N4、亜型H7N5、亜型H7N7、亜型H7N8、亜型H7N9、亜型H8N4、亜型H8N5、亜型H9N1、亜型H9N2、亜型H9N3、亜型H9N5、亜型H9N6、亜型H9N7、亜型H9N8、及び亜型H9N9が挙げられる。
【０２９５】
A型インフルエンザウイルスの株の具体的な例としては、A/sw/アイオワ/15/30(H1N1);A/WSN/33(H1N1);A/eq/プラハ/1/56(H7N7);A/PR/8/34;A/マガモ/ポツダム/178-4/83(H2N2);A/セグロカモメ/DE/712/88(H16N3);A/sw/香港/168/1993(H1N1);A/マガモ/アルバータ/211/98(H1N1);A/水鳥/デラウェア/168/06(H16N3);A/sw/オランダ/25/80(H1N1);A/sw/ドイツ/2/81(H1N1);A/sw/ハノーバー/1/81(H1N1);A/sw/ポツダム/1/81(H1N1);A/sw/ポツダム/15/81(H1N1);A/sw/ポツダム/268/81(H1N1);A/sw/フィニステール/2899/82(H1N1);A/sw/ポツダム/35/82(H3N2);A/sw/コートダルモール/3633/84(H3N2);A/sw/ヘント/1/84(H3N2);A/sw/オランダ/12/85(H1N1);A/sw/カレンツァイ(Karrenzien)/2/87(H3N2);A/sw/シュウェリン/103/89(H1N1);A/七面鳥/ドイツ/3/91(H1N1);A/sw/ドイツ/8533/91(H1N1);A/sw/ベルギー/220/92(H3N2);A/sw/ヘント/V230/92(H1N1);A/sw/ライプチヒ/145/92(H3N2);A/sw/Re220/92hp(H3N2);A/sw/バークム/909/93(H3N2);A/sw/シュレースヴィヒ−ホルシュタイン/1/93(H1N1);A/sw/スコットランド/419440/94(H1N2);A/sw/バークム/5/95(H1N1);A/sw/ベスト(Best)/5C/96(H1N1);A/sw/イングランド/17394/96(H1N2);A/sw/イエナ/5/96(H3N2);A/sw/ウーデンローデ/7C/96(H3N2);A/sw/ローネ/1/97(H3N2);A/sw/コートダルモール/790/97(H1N2);A/sw/バークム/1362/98(H3N2);A/sw/イタリア/1521/98(H1N2);A/sw/イタリア/1553-2/98(H3N2);A/sw/イタリア/1566/98(H1N1);A/sw/イタリア/1589/98(H1N1);A/sw/バークム/8602/99(H3N2);A/sw/コートダルモール/604/99(H1N2);A/sw/コートダルモール/1482/99(H1N1);A/sw/ヘント/7625/99(H1N2);A/香港/1774/99(H3N2);A/sw/香港/5190/99(H3N2);A/sw/香港/5200/99(H3N2);A/sw/香港/5212/99(H3N2);A/sw/イル・エ・ヴィレーヌ/1455/99(H1N1);A/sw/イタリア/1654-1/99(H1N2);A/sw/イタリア/2034/99(H1N1);A/sw/イタリア/2064/99(H1N2);A/sw/ベルリン/1578/00(H3N2);A/sw/バークム/1832/00(H1N2);A/sw/バークム/1833/00(H1N2);A/sw/コートダルモール/800/00(H1N2);A/sw/香港/7982/00(H3N2);A/sw/イタリア/1081/00(H1N2);A/sw/ベルチヒ/2/01(H1N1);A/sw/ベルチヒ/54/01(H3N2);A/sw/香港/9296/01(H3N2);A/sw/香港/9745/01(H3N2);A/sw/スペイン/33601/01(H3N2);A/sw/香港/1144/02(H3N2);A/sw/香港/1197/02(H3N2);A/sw/スペイン/39139/02(H3N2);A/sw/スペイン/42386/02(H3N2);A/スイス/8808/2002(H1N1);A/sw/バークム/1769/03(H3N2);A/sw/ビッセンドルフ/IDT1864/03(H3N2);A/sw/エーレン(Ehren)/IDT2570/03(H1N2);A/sw/ゲッシャー/IDT2702/03(H1N2);A/sw/ハーゼリュンネ/2617/03hp(H1N1);A/sw/レーニンゲン/IDT2530/03(H1N2);A/sw/IVD/IDT2674/03(H1N2);A/sw/ノルドキルヒェン/IDT1993/03(H3N2);A/sw/ノルドヴァルデ/IDT2197/03(H1N2);A/sw/ノルデン/IDT2308/03(H1N2);A/sw/スペイン/50047/03(H1N1);A/sw/スペイン/51915/03(H1N1);A/sw/フェヒタ/2623/03(H1N1);A/sw/ヴィズベク/IDT2869/03(H1N2);A/sw/ヴァルタースドルフ/IDT2527/03(H1N2);A/sw/ダム(Damme)/IDT2890/04(H3N2);A/sw/ゲルダーン/IDT2888/04(H1N1);A/sw/グランステット(Granstedt)/IDT3475/04(H1N2);A/sw/グレーフェン/IDT2889/04(H1N1);A/sw/グーテンスベルク/IDT2930/04(H1N2);A/sw/グーテンスベルク/IDT2931/04(H1N2);A/sw/ローネ/IDT3357/04(H3N2);A/sw/ノルトルップ/IDT3685/04(H1N2);A/sw/ゼーセン/IDT3055/04(H3N2);A/sw/スペイン/53207/04(H1N1);A/sw/スペイン/54008/04(H3N2);A/sw/シュトルツェナウ/IDT3296/04(H1N2);A/sw/ヴェーデル/IDT2965/04(H1N1);A/sw/バートグリースバッハ/IDT4191/05(H3N2);A/sw/クロッペンブルク/IDT4777/05(H1N2);A/sw/デートリンゲン/IDT3780/05(H1N2);A/sw/デートリンゲン/IDT4735/05(H1N2);A/sw/エックルハム/IDT5250/05(H3N2);A/sw/ハーケンブレック(Harkenblek)/IDT4097/05(H3N2);A/sw/ヘルツェン(Hertzen)/IDT4317/05(H3N2);A/sw/クローゲル(Krogel)/IDT4192/05(H1N1);A/sw/ラエル/IDT3893/05(H1N1);A/sw/ラエル/IDT4126/05(H3N2);A/sw/メルツェン/IDT4114/05(H3N2);A/sw/ミュスラリンゲン(Muesleringen)-S./IDT4263/05(H3N2);A/sw/オスターホーフェン/IDT4004/05(H3N2);A/sw/シュプレンゲ(Sprenge)/IDT3805/05(H1N2);A/sw/シュタットローン/IDT3853/05(H1N2);A/sw/フォーグラルン(Voglarn)/IDT4096/05(H1N1);A/sw/ヴォーラーシュト(Wohlerst)/IDT4093/05(H1N1);A/sw/バートグリースバッハ/IDT5604/06(H1N1);A/sw/ヘルツラケ/IDT5335/06(H3N2);A/sw/ヘルツラケ/IDT5336/06(H3N2);A/sw/ヘルツラケ/IDT5337/06(H3N2);及びA/イノシシ/ドイツ/R169/2006(H3N2)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９６】
A型インフルエンザウイルスの株の他の具体的な例としては、A/トロント/3141/2009(H1N1);A/レーゲンスブルク/D6/2009(H1N1);A/バイエルン/62/2009(H1N1);A/バイエルン/62/2009(H1N1);A/ブランデンブルク/19/2009(H1N1);A/ブランデンブルク/20/2009(H1N1);A/連邦直轄区(Distrito Federal)/2611/2009(H1N1);A/マトグロッソ/2329/2009(H1N1);A/サンパウロ/1454/2009(H1N1);A/サンパウロ/2233/2009(H1N1);A/ストックホルム/37/2009(H1N1);A/ストックホルム/41/2009(H1N1);A/ストックホルム/45/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-1/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-14/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-2/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-21/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-22/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-23/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-24/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-25/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-3/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-7/2009(H1N1);A/北京/502/2009(H1N1);A/フィレンツェ/10/2009(H1N1);A/香港/2369/2009(H1N1);A/イタリア/85/2009(H1N1);A/サントドミンゴ/572N/2009(H1N1);A/カタロニア/385/2009(H1N1);A/カタロニア/386/2009(H1N1);A/カタロニア/387/2009(H1N1);A/カタロニア/390/2009(H1N1);A/カタロニア/394/2009(H1N1);A/カタロニア/397/2009(H1N1);A/カタロニア/398/2009(H1N1);A/カタロニア/399/2009(H1N1);A/サンパウロ/2303/2009(H1N1);A/秋田/1/2009(H1N1);A/カストロ/JXP/2009(H1N1);A/福島/1/2009(H1N1);A/イスラエル/276/2009(H1N1);A/イスラエル/277/2009(H1N1);A/イスラエル/70/2009(H1N1);A/岩手/1/2009(H1N1);A/岩手/2/2009(H1N1);A/鹿児島/1/2009(H1N1);A/大阪/180/2009(H1N1);A/プエルトモント/Bio87/2009(H1N1);A/サンパウロ/2303/2009(H1N1);A/札幌/1/2009(H1N1);A/ストックホルム/30/2009(H1N1);A/ストックホルム/31/2009(H1N1);A/ストックホルム/32/2009(H1N1);A/ストックホルム/33/2009(H1N1);A/ストックホルム/34/2009(H1N1);A/ストックホルム/35/2009(H1N1);A/ストックホルム/36/2009(H1N1);A/ストックホルム/38/2009(H1N1);A/ストックホルム/39/2009(H1N1);A/ストックホルム/40/2009(H1N1;)A/ストックホルム/42/2009(H1N1);A/ストックホルム/43/2009(H1N1);A/ストックホルム/44/2009(H1N1);A/宇都宮/2/2009(H1N1);A/WRAIR/0573N/2009(H1N1);及びA/浙江/DTID-ZJU01/2009(H1N1)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９７】
B型インフルエンザウイルスの非限定的な例としては、愛知/5/88株、秋田/27/2001株、秋田/5/2001株、アラスカ/16/2000株、アラスカ/1777/2005株、アルゼンチン/69/2001株、アリゾナ/146/2005株、アリゾナ/148/2005株、バンコク/163/90株、バンコク/34/99株、バンコク/460/03株、バンコク/54/99株、バルセロナ/215/03株、北京/15/84株、北京/184/93株、北京/243/97株、北京/43/75株、北京/5/76株、北京/76/98株、ベルギー/WV106/2002株、ベルギー/WV107/2002株、ベルギー/WV109/2002株、ベルギー/WV114/2002株、ベルギー/WV122/2002株、ボン/43株、ブラジル/952/2001株、ブカレスト/795/03株、ブエノスアイレス/161/00株)、ブエノスアイレス/9/95株、ブエノスアイレス/SW16/97株、ブエノスアイレス/VL518/99株、カナダ/464/2001株、カナダ/464/2002株、チャコ/366/00株、チャコ/R113/00株、済州/303/03株、千葉/447/98株、重慶/3/2000株、SA1タイ/2002臨床分離株、SA10タイ/2002臨床分離株、SA100フィリピン/2002臨床分離株、SA101フィリピン/2002臨床分離株、SA110フィリピン/2002臨床分離株)、SA112フィリピン/2002臨床分離株、SA113フィリピン/2002臨床分離株、SA114フィリピン/2002臨床分離株、SA2タイ/2002臨床分離株、SA20タイ/2002臨床分離株、SA38フィリピン/2002臨床分離株、SA39タイ/2002臨床分離株、SA99フィリピン/2002臨床分離株、CNIC/27/2001株、コロラド/2597/2004株、コルドバ/VA418/99株、チェコスロバキア/16/89株、チェコスロバキア/69/90株、ダエク/10/97株、ダエク/45/97株、ダエク/47/97株、ダエク/9/97株、B/Du/4/78株、B/ダーバン/39/98株、ダーバン/43/98株、ダーバン/44/98株、B/ダーバン/52/98株、ダーバン/55/98株、ダーバン/56/98株、イングランド/1716/2005株、イングランド/2054/2005株)、イングランド/23/04株、フィンランド/154/2002株、フィンランド/159/2002株、フィンランド/160/2002株、フィンランド/161/2002株、フィンランド/162/03株、フィンランド/162/2002株、フィンランド/162/91株、フィンランド/164/2003株、フィンランド/172/91株、フィンランド/173/2003株、フィンランド/176/2003株、フィンランド/184/91株、フィンランド/188/2003株、フィンランド/190/2003株、フィンランド/220/2003株、フィンランド/WV5/2002株、福建/36/82株、ジュネーブ/5079/03株、ジェノバ/11/02株、ジェノバ/2/02株、ジェノバ/21/02株、ジェノバ/54/02株、ジェノバ/55/02株、広東/05/94株、広東/08/93株、広東/5/94株、広東/55/89株、広東/8/93株、広州/7/97株、広州/86/92株、広州/87/92株、京幾/592/2005株、ハノーバー/2/90株、ハルビン/07/94株、ハワイ/10/2001株、ハワイ/1990/2004株、ハワイ/38/2001株、ハワイ/9/2001株、河北/19/94株、河北/3/94株)、河南/22/97株、広島/23/2001株、香港/110/99株、香港/1115/2002株、香港/112/2001株、香港/123/2001株、香港/1351/2002株、香港/1434/2002株、香港/147/99株、香港/156/99株、香港/157/99株、香港/22/2001株、香港/22/89株、香港/336/2001株、香港/666/2001株、香港/9/89株、ヒューストン/1/91株、ヒューストン/1/96株、ヒューストン/2/96株、湖南/4/72株、茨城/2/85株、仁川(ncheon)/297/2005株、インド/3/89株、インド/77276/2001株、イスラエル/95/03株、イスラエル/WV187/2002株、日本/1224/2005株、江蘇/10/03株、ヨハネスブルク/1/99株、ヨハネスブルク/96/01株、門真/1076/99株、門真/122/99株、鹿児島/15/94株、カンザス/22992/99株、ハズコフ(Khazkov)/224/91株、神戸/1/2002株、高知/193/99株、ラツィオ/1/02株、リー/40株、レニングラード/129/91株、リスボン/2/90株)、ロサンゼルス/1/02株、ルサカ/270/99株、リヨン/1271/96株、マレーシア/83077/2001株、マプト/1/99株、マルデルプラタ/595/99株、メリーランド/1/01株、メンフィス/1/01株、メンフィス/12/97-MA株、ミシガン/22572/99株、三重/1/93株、ミラノ/1/01株、ミンスク/318/90株、モスクワ/3/03株、名古屋/20/99株、南昌/1/00株、ナッシュビル/107/93株、ナッシュビル/45/91株、ネブラスカ/2/01株、オランダ/801/90株、オランダ/429/98株、ニューヨーク/1/2002株、NIB/48/90株、寧夏/45/83株、ノルウェー/1/84株、オマーン/16299/2001株、大阪/1059/97株、大阪/983/97-V2株、オスロ/1329/2002株、オスロ/1846/2002株、パナマ/45/90株、パリ/329/90株、パルマ/23/02株、パース/211/2001株、ペルー/1364/2004株、フィリピン/5072/2001株、釜山/270/99株、ケベック/173/98株、ケベック/465/98株、ケベック/7/01株、ローマ/1/03株、佐賀/S172/99株、ソウル/13/95株、ソウル/37/91株、山東/7/97株、上海/361/2002株)、滋賀/T30/98株、四川/379/99株、シンガポール/222/79株、スペイン/WV27/2002株、ストックホルム/10/90株、スイス/5441/90株、台湾/0409/00株、台湾/0722/02株、台湾/97271/2001株、テヘラン/80/02株、東京/6/98株、トリエステ/28/02株、ウランウデ/4/02株、イギリス/34304/99株、USSR/100/83株、ビクトリア/103/89株、ウィーン/1/99株、武漢/356/2000株、WV194/2002株、玄武/23/82株、山形/1311/2003株、山形/K500/2001株、アラスカ/12/96株、GA/86株、長崎/1/87株、東京/942/96株、及びロチェスター/02/2001株が挙げられる。
【０２９８】
C型インフルエンザウイルスの非限定的な例としては、愛知/1/81株、アンアーバー/1/50株、青森/74株、カリフォルニア/78株、イングランド/83株、ギリシア/79株、広島/246/2000株、広島/252/2000株、兵庫/1/83株、ヨハネスブルク/66株、神奈川/1/76株、京都/1/79株、ミシシッピー/80株、宮城/1/97株、宮城/5/2000株、宮城/9/96株、奈良/2/85株、ニュージャージー/76株、ブタ/北京/115/81株、埼玉/3/2000株)、静岡/79株、山形/2/98株、山形/6/2000株、山形/9/96株、ベルリン/1/85株、イングランド/892/8株、五大湖/1167/54株、JJ/50株、ブタ/北京/10/81株、ブタ/北京/439/82)株、テーラー(TAYLOR)/1233/47株、及びC/山形/10/81株が挙げられる。
【０２９９】
ある実施態様では、本明細書で提供されるインフルエンザウイルスは、弱毒化表現型を有する。具体的な実施態様では、弱毒化インフルエンザウイルスは、A型インフルエンザウイルスに基づく。他の実施態様では、弱毒化インフルエンザウイルスは、B型インフルエンザウイルスに基づく。さらに他の実施態様では、弱毒化インフルエンザウイルスは、C型インフルエンザウイルスに基づく。他の実施態様では、弱毒化インフルエンザウイルスは、A型インフルエンザ、B型インフルエンザ及び/又はC型インフルエンザウイルスの1以上の株又は亜型由来の遺伝子又はゲノムセグメントを含むことができる。いくつかの実施態様では、弱毒化骨格ウイルスは、A型インフルエンザウイルス及びB型インフルエンザウイルス由来の遺伝子を含む。
【０３００】
具体的な実施態様では、ウイルスが少なくとも部分的に感染性を保持し、インビボで複製することができるが、非病原性である不顕性レベルの感染をもたらす低い力価を生じさせることしかできないような、インフルエンザウイルスの弱毒化が望ましい。そのような弱毒化ウイルスは、ウイルス又はその免疫原性組成物が免疫応答を誘発するために対象に投与される、本明細書に記載の実施態様に特に好適である。インフルエンザウイルスの弱毒化は、例えば、化学的突然変異誘発によって作製されるウイルス突然変異体を選択すること、遺伝子操作によるゲノムの突然変異、弱毒化された機能を有するセグメントを含む再集合体ウイルスを選択すること、又は条件的ウイルス突然変異体(例えば、低温適応ウイルス)の選択などの、当技術分野で公知の任意の方法によって達成することができる。或いは、天然に存在する弱毒化インフルエンザウイルスを、インフルエンザウイルスベクターのためのインフルエンザウイルス骨格として用いることができる。
【０３０１】
一実施態様では、インフルエンザウイルスは、親インフルエンザウイルスのHA遺伝子を本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと置換することによって、少なくとも部分的に弱毒化することができる。いくつかの実施態様では、インフルエンザウイルスは、細胞のインターフェロン(IFN)応答に拮抗するウイルスの能力を損なわせる突然変異したNS1遺伝子を発現するようにインフルエンザウイルスを改変することによって、少なくとも部分的に弱毒化することができる。インフルエンザウイルスNS1遺伝子に導入することができる突然変異の種類の例としては、欠失、置換、挿入、及びそれらの組合せが挙げられる。NS1遺伝子全体のどこにでも(例えば、N末端、C末端、もしくはその間のどこか)、及び/又はNS1遺伝子の調節エレメントに、1以上の突然変異を導入することができる。一実施態様では、弱毒化インフルエンザウイルスは、NS1のC末端から5個、好ましくは10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170、もしくは175個のアミノ酸残基からなる欠失、又はC末端から5〜170、25〜170、50〜170、100〜170、100〜160、もしくは105〜160個のアミノ酸残基の欠失をもたらすインフルエンザウイルスNS1遺伝子の突然変異を有するゲノムを含む。別の実施態様では、弱毒化インフルエンザウイルスは、それがアミノ酸残基1〜130、アミノ酸残基1〜126、アミノ酸残基1〜120、アミノ酸残基1〜115、アミノ酸残基1〜110、アミノ酸残基1〜100、アミノ酸残基1〜99、アミノ酸残基1〜95、アミノ酸残基1〜85、アミノ酸残基1〜83、アミノ酸残基1〜80、アミノ酸残基1〜75、アミノ酸残基1〜73、アミノ酸残基1〜70、アミノ酸残基1〜65、又はアミノ酸残基1〜60のNS1タンパク質をコードするように、インフルエンザウイルスNS1遺伝子の突然変異を有するゲノムを含み、ここで、N末端アミノ酸は、1番である。NS1突然変異及び突然変異したNS1を含むインフルエンザウイルスの例については、例えば、米国特許第6,468,544号及び第6,669,943号;並びにLiらの文献(1999, J. Infect. Dis. 179:1132-1138)を参照されたく、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０３０２】
(5.5  非インフルエンザウイルスベクター)
一態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む非インフルエンザウイルスが本明細書で提供される。具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを非インフルエンザウイルスのビリオンに組み込む。非インフルエンザウイルスを、特定の細胞型、例えば、免疫細胞にウイルスをターゲッティングする部分に結合させもよい。いくつかの実施態様では、インフルエンザウイルスのビリオンは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドに加えて、異種ポリペプチドをそれらに組み込んでいるか、又はそれを発現する。異種ポリペプチドは、免疫増強活性を有するか、又は特定の細胞型に非インフルエンザウイルスをターゲッティングするポリペプチド、例えば、特定の細胞型の表面の抗原に結合する抗体、もしくは特定の細胞型の表面の特異的受容体に結合するリガンドであってもよい。そのような異種ポリペプチドの例については、上の第5.4節を参照されたい。
【０３０３】
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む非インフルエンザウイルスは、当業者に公知の技術を用いて、ビリオンの産生の間にトランスでインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを供給することによって産生することができる。或いは、血球凝集素機能がトランスで提供されているウイルスに感染しやすい細胞でインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するように改変されたゲノムを含む親の非インフルエンザウイルスの複製は、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む子孫ウイルスを産生する。
【０３０４】
限定するものではないが、天然に存在する株、変異体、もしくは突然変異体、突然変異させたウイルス、再集合体、及び/又は遺伝子改変ウイルスを含む、任意のウイルス型、亜型、又は株を、非インフルエンザウイルスベクターとして用いることができる。具体的な実施態様では、親の非インフルエンザウイルスは、天然に存在するウイルスではない。別の具体的な実施態様では、親の非インフルエンザウイルスは、遺伝子改変ウイルスである。ある実施態様では、エンベロープ型ウイルスが、本明細書に記載の膜結合型インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの発現に好ましい。
【０３０５】
例示的な実施態様では、非インフルエンザウイルスベクターは、ニューカッスル病ウイルス(NDV)である。別の実施態様では、非インフルエンザウイルスベクターは、ワクシニアウイルスである。他の例示的で、非限定的な実施態様では、非インフルエンザウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、B型肝炎ウイルス、レトロウイルス(例えば、ガンマレトロウイルス、例えば、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)ゲノムもしくはマウス白血病ウイルス(MLV)、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、腫瘍レトロウイルス、もしくはレンチウイルス)、アルファウイルス(例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス)、ラブドウイルス、例えば、水疱性口内炎ウイルスもしくはパピローマウイルス、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、MVA-T7ベクター、もしくは鶏痘)、メタニューモウイルス、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス、又はフォーミーウイルスである。例えば、Lawrie及びTuminの文献(1993, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109)(レトロウイルスベクター);Bettらの文献(1993, J. Virol. 67, 5911)(アデノウイルスベクター);Zhouらの文献(1994, J. Exp. Med. 179, 1867)(アデノ随伴ウイルスベクター);Dubenskyらの文献(1996, J. Virol. 70, 508-519)(ワクシニアウイルス及び鶏痘ウイルスを含むポックスファミリー由来のウイルスベクター並びにアルファウイルス属由来のウイルスベクター、例えば、シンドビスウイルス及びセムリキ森林ウイルスに由来するもの);米国特許第5,643,576号(ベネズエラウマ脳炎ウイルス);WO 96/34625号(VSV);Oheらの文献(1995, Human Gene Therapy 6, 325-333);Wooらの文献、WO 94/12629号;Xiao及びBrandsmaの文献(1996, Nucleic Acids. Res. 24、2630-2622)(パピローマウイルス);並びにBukreyev及びCollinsの文献(2008, Curr Opin Mol Ther. 10:46-55)(NDV)を参照されたく、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０３０６】
具体的な実施態様では、非インフルエンザウイルスベクターは、NDVである。任意のNDV型、亜型、又は株は、限定するものではないが、天然に存在する株、変異体、もしくは突然変異体、突然変異させたウイルス、再集合体及び/又は遺伝子改変ウイルスを含む、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するように改変される骨格の役割を果たすことができる。具体的な実施態様では、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、天然に存在する株である。ある実施態様では、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、溶解性株である。他の実施態様では、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、非溶解性株である。ある実施態様では、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、長潜伏期性株である。いくつかの実施態様では、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、亜病原性株である。他の実施態様では、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、短潜伏期性株である。NDV株の具体的な例としては、73-T株、アルスター株、MTH-68株、イタリアン(Italien)株、ヒックマン(Hickman)株、PV701株、ヒッチナー(Hitchner)B1株、ラソタ(La Sota)株、YG97株、MET95株、及びF48E9株が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様では、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、ヒッチナーB1株である。別の具体的な実施態様では、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、ラソタ株である。
【０３０７】
一実施態様では、非インフルエンザウイルスベクターのための骨格として用いられるNDVは、修飾Fタンパク質を発現するように改変されており、この修飾Fタンパク質中では、該Fタンパク質の切断部位が1つ又は2つの追加のアルギニン残基を含む部位に置き換えられ、この突然変異切断部位がフリンファミリーのユビキタスに発現されるプロテアーゼによって活性化されるようになる。そのような修飾Fタンパク質を発現するNDVの具体的な例としては、rNDV/F2aa及びrNDV/F3aaが挙げられるが、これらに限定されない。突然変異した切断部位を有する修飾Fタンパク質を産生するためにNDVのFタンパク質に導入される突然変異の説明については、例えば、Parkらの文献(2006、「二重特異性を有する改変されたウイルスワクチンコンストラクト:鳥インフルエンザ及びニューカッスル病(Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: Avian influenza and Newcastle disease)」PNAS USA 103:8203-2808))を参照されたい。
【０３０８】
一実施態様では、非インフルエンザウイルスベクターは、ポックスウイルスである。ポックスウイルスベクターは、ワクチンベクターに好適な配列を提供するポックスウイルス科の任意のメンバー、特に、ワクシニアウイルス又はアビポックスウイルス(例えば、カナリア痘ウイルス、鶏痘など)に基づくことができる。具体的な実施態様では、ポックスウイルスベクターは、ワクシニアウイルスベクターである。好適なワクシニアウイルスとしては、コペンハーゲン(VC-2)株(Goebelらの文献(Virol 179:247-266, 1990);Johnsonらの文献(Virol. 196:381-401、1993)、改変コペンハーゲン株(NYVAC)(米国特許第6,265,189号)、WYETH株、及び改変アンカラ(MVA)株(Antoineらの文献(Virol. 244:365-396、1998))が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適なポックスウイルスとしては、望ましい特性を提供し、高度に弱毒化されているALVAC及びTROVACベクターなどの鶏痘株が挙げられる(例えば、米国特許第6,265,189号;AIDS研究レビュー(AIDS Research Reviews)中のTartagliaらの文献(Koffら編, 3巻, Marcel Dekker, N. Y., 1993);及びTartagliaらの文献(1990, Reviews in Immunology 10:13-30、1990)を参照されたい)。
【０３０９】
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現させるために非インフルエンザウイルスを改変する方法は、そのようなウイルスを弱毒化させ、増殖させ、かつ単離及び精製する方法と同様に当技術分野で周知である。NDVベクターに関するそのような技術については、国際公開WO 01/04333号;米国特許第7,442,379号、第6,146,642号、第6,649,372号、第6,544,785号、及び第7,384,774号;Swayneらの文献(2003)(Avian Dis. 47:1047-1050);及びSwayne文献(2001)(J. Virol. 11868-11873)を参照されたく、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。ポックスウイルスに関するそのような技術については、例えば、Picciniらの文献(Methods of Enzymology 153:545-563, 1987);国際公開WO 96/11279号;米国特許第4,769,330号;米国特許第4,722,848号;米国特許第4,769,330号;米国特許第4,603,112号;米国特許第5,110,587号;米国特許第5,174,993号;EP 83 286号;EP 206 920号;Mayrらの文献(Infection 3:6-14, 1975);並びにSutter及びMossの文献(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10847-10851, 1992)を参照されたい。ある実施態様では、非インフルエンザウイルスは弱毒化されている。
【０３１０】
特に、対象への投与のための組成物中で使用するための、非インフルエンザウイルスベクターの選択のための例示的な検討事項は、安全性、低毒性、安定性、細胞型特異性、及び免疫原性、特に、非インフルエンザウイルスベクターによって発現されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの抗原性である。
【０３１１】
(5.6  ウイルス様粒子及びウイロソーム)
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、ウイルス様粒子(VLP)ベクターに組み込むことができる。VLPは、通常、ウイルスの構造タンパク質(複数可)に一般的に由来するウイルスポリペプチド(複数可)を含む。いくつかの実施態様では、VLPは複製することができない。ある実施態様では、VLPはウイルスの完全なゲノムを欠いていてもよく、又はウイルスのゲノムの一部を含んでいてもよい。いくつかの実施態様では、VLPは細胞に感染することができない。いくつかの実施態様では、VLPは、当業者に公知であるか又は本明細書に記載されている1以上のウイルス性標的部分(例えば、ウイルス表面糖タンパク質)又は非ウイルス性標的部分(例えば、抗体もしくはタンパク質)をその表面に発現する。いくつかの実施態様では、VLPは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、及びウイルス構造タンパク質、例えば、HIV gagを含む。具体的な実施態様では、VLPは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、及びHIV gagポリペプチド、例えば、下の第6.2節の実施例2に記載のものを含む。
【０３１２】
組換えで産生されるVLPを産生して特徴付けるための方法は、インフルエンザウイルス(Brightらの文献(2007, Vaccine. 25:3871))、ヒトパピローマウイルス1型(Hagneseeらの文献(1991, J. Virol. 67:315))、ヒトパピローマウイルス16型(Kirnbauerらの文献(Proc. Natl. Acad. Sci.(1992)89:12180))、HIV-1(Hafferらの文献(1990, J. Virol. 64:2653))、及びA型肝炎(Winokurの文献(1991, 65:5029))を含む、いくつかのウイルスに基づいて記載されており、その各々は、その全体が本明細書中に組み込まれている。NDVタンパク質を含むVLPを発現させる方法は、Pantuaらの文献(2006, J. Virol. 80:11062-11073)、及び2009年3月12日に公開された米国特許出願公開第20090068221号で提供されており、その各々は、その全体が本明細書中に組み込まれている。
【０３１３】
具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、ウイロソームに組み込むことができる。インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むウイロソームは、当業者に公知の技術を用いて産生することができる。例えば、ウイロソームは、精製されたウイルスを破壊し、ゲノムを抽出し、ウイルスタンパク質(例えば、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド)及び脂質で粒子を再び組み立てて、ウイルスタンパク質を含む脂質粒子を形成させることによって産生することができる。
【０３１４】
(5.7  細菌ベクター)
具体的な実施態様では、細菌は、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するように改変することができる。インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインの発現のために好適な細菌としては、リステリア、サルモネラ(Salmonella)、赤痢菌(Shigella)の種、ヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、大腸菌、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)、ウシ流産菌(Brucella abortus)、マルタ熱菌(Brucella melitensis)、ライム病ボレリア(Borrelia burgdorferi)、及び野兎病菌(Francisella tularensis)が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するように改変された細菌は、弱毒化されている。異種ポリペプチドを発現するように改変された細菌の産生技術は当技術分野で公知であり、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの発現に適用することができる。例えば、2008年10月9日に公開された米国特許出願公開第20080248066号及び2007年9月6日に公開された米国特許出願公開第20070207171号を参照されたく、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０３１５】
(5.8  植物及び藻類ベクター)
ある実施態様では、植物(例えば、タバコ属の植物)を、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するように改変することができる。具体的な実施態様では、当技術分野で公知の方法を用いるアグロインフィルトレーションによって、植物を本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するように改変することができる。例えば、関心対象の遺伝子、例えば、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする遺伝子をコードする核酸を、アグロバクテリウムの株に導入する。その後、この株を液体培地中で増殖させ、得られる細菌を洗浄し、緩衝溶液に懸濁する。その後、アグロバクテリウムが関心対象の遺伝子を植物細胞の一部に形質転換するように、植物を(例えば、注射又は浸漬によって)本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸を含むアグロバクテリウムに曝露させる。その後、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを該植物によって一過性に発現させ、当技術分野で公知かつ本明細書に記載の方法を用いて単離することができる(具体的な例については、Shojiらの文献(2008, Vaccine, 26(23):2930-2934);及びD'Aoustらの文献(2008, J. Plant Biotechnology, 6(9):930-940))を参照されたい。具体的な実施態様では、植物は、タバコ植物(すなわち、タバコ(Nicotiana tabacum))である。別の具体的な実施態様では、植物は、タバコ植物の近縁種(例えば、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana))である。
【０３１６】
他の実施態様では、藻類(例えば、コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii))を改変して、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現させることができる(例えば、Rasalaらの文献(2010, Plant Biotechnology Journal)(2010年3月7日にオンラインで発表され、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている)を参照されたい)。
【０３１７】
(5.9  インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドに対する抗体の作製)
本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを用いて、インフルエンザに対する、例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの軸領域に対する中和抗体を誘発させることができる。具体的な実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを非ヒト対象(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど)に投与して、抗体の産生を含む免疫応答を誘発させることができ、この抗体は、当業者に公知の技術(例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、遠心分離、沈殿など)を用いて単離することができる。
【０３１８】
或いは、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを用いて、抗体ライブラリーから抗体をスクリーニングすることができる。例えば、単離されたインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを固体支持体(例えば、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、ポリスチレンビーズ、アルミナゲル、又は多糖、磁気ビーズ)に固定し、抗体への結合についてスクリーニングすることができる。代替法として、抗体を固体支持体に固定し、単離されたインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドへの結合についてスクリーニングすることができる。任意のスクリーニングアッセイ、例えば、パニングアッセイ、ELISA、表面プラズモン共鳴、又は当技術分野で公知の他の抗体スクリーニングアッセイを用いて、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドに結合する抗体についてスクリーニングすることができる。スクリーニングされる抗体ライブラリーは、市販の抗体ライブラリー、インビトロで作製されたライブラリー、又はインフルエンザに感染した個体から抗体を同定及びクローニング又は単離することによって得られたライブラリーであることができる。特定の実施態様では、抗体ライブラリーは、インフルエンザウイルス大発生の生存者から作製される。抗体ライブラリーは、当技術分野で公知の方法に従って作製することができる。特定の実施態様では、抗体ライブラリーは、抗体をクローニングし、それをファージディスプレイライブラリー又はファージミドディスプレイライブラリーで用いることによって作製される。
【０３１９】
本明細書に記載の方法で同定される抗体は、当技術分野で公知又は本明細書に記載の生物学的アッセイを用いて、中和活性及び自己反応性の欠如について試験することができる。一実施態様では、非ヒト動物又は抗体ライブラリーから単離された抗体は、2以上のインフルエンザ亜型由来の血球凝集素ポリペプチドを中和する。いくつかの実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドをコードするベクターを用いて誘発又は同定される抗体は、インフルエンザH3ウイルスを中和する。いくつかの実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを用いて誘発又は同定される抗体は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは16種、又はそれより多くのインフルエンザウイルスの亜型又は株を中和する。一実施態様では、中和抗体は1以上のA型インフルエンザウイルス及び1以上のB型インフルエンザウイルスを中和する。特定の実施態様では、中和抗体は、CR6261、CR6325、CR6329、CR6307、CR6323、2A、D7、D8、F10、G17、H40、A66、D80、E88、E90、H98、C179(ハイブリドーマFERM BP-4517によって産生される;Takara Bio社により販売されているクローン(Otsu, Shiga, Japan))、AI3C(FERM BP-4516)、もしくはEkiert DCらの文献(2009)高度に保存されたインフルエンザウイルスエピトープの抗体認識(Antibody Recognition of a Highly Conserved Influenza Virus Epitope)(Science(2009年2月26日にScience Expressで発表された)); Kashyapらの文献(2008)トルコH5N1鳥インフルエンザ大発生の生存者由来のコンビナトリアル抗体ライブラリーは、ウイルス中和戦略を明らかにする(Combinatorial antibody libraries from survivors of the Turkish H5N1 avian influenza outbreak reveal virus neutralization strategies.)(Proc Natl Acad Sci U S A 105: 5986-5991);Suiらの文献(2009)鳥及びヒトA型インフルエンザウイルスの広域スペクトル中和のための構造及び機能的基礎(Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses.)(Nat Struct Mol Biol 16: 265-273);米国特許第5,589,174号、同第5,631,350号、同第6,337,070号、及び同第6,720,409号;国際公開WO 2007/134237として公開された国際出願PCT/US2007/068983号;国際公開WO 2009/036157号として公開された国際出願PCT/US2008/075998号;国際公開WO 2008/028946号として公開された国際出願PCT/EP2007/059356号;及び国際公開WO 2009/079259号として公開された国際出願PCT/US2008/085876号に記載されている任意の他の抗体ではないか、又はそれらと同じエピトープに結合しない。他の実施態様では、中和抗体は、Wangらの文献(2010)「異なる血球凝集素による連続免疫後のH3インフルエンザウイルスに対する広範防御性モノクローナル抗体(Broadly Protective Monoclonal Antibodies against H3 Influenza Viruses following Sequential Immunization with Different Hemagglutinins)」(PLOS Pathogens 6(2):1-9)に記載されている抗体ではない。特定の実施態様では、中和抗体は、Ig VH1-69セグメントを用いていない。いくつかの実施態様では、中和抗体と抗原との相互作用は、重鎖によってのみ仲介されるものではない。
【０３２０】
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを用いて同定又は誘発される抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわち、血球凝集素ポリペプチドに特異的に結合する抗原結合部位を含む分子が含まれる。免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)、又はサブクラスであることができる。抗体には、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Fv(scFv)、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、及び抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本明細書に記載の方法を用いて誘発又は同定される抗体に対する抗Id抗体を含む)、並びに上記のいずれかのエピトープ結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。
【０３２１】
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを用いて誘発又は同定される抗体は、診断的イムノアッセイ、受動免疫療法、及び抗イディオタイプ抗体の作製で用いることができる。受動免疫療法で用いられる前の抗体を修飾することができ、例えば、抗体をキメラ化又はヒト化することができる。キメラ抗体及びヒト化抗体の作製に関する概説については、例えば、米国特許第4,444,887号及び第4,716,111号;並びに国際公開WO 98/46645号、WO 98/50433号、WO 98/24893号、WO 98/16654号、WO 96/34096号、WO 96/33735号、及びWO 91/10741号を参照されたく、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。さらに、血球凝集素ポリペプチドを中和する抗体の能力及び該ポリペプチドに対する抗体の特異性を、受動免疫療法で抗体を用いる前に試験することができる。インフルエンザウイルス感染に起因する疾患の予防又は治療のための中和抗体の使用に関する議論については、下記の第5.11節を参照されたい。
【０３２２】
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを用いて誘発又は同定される抗体を用いて、療法の効果及び/又は疾患の進行をモニタリングすることができる。この目的のために、限定するものではないが、少し例を挙げれば、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイなどの技術を用いる、競合的及び非競合的アッセイ系を含む、当技術分野で公知の任意のイムノアッセイ系を用いることができる。
【０３２３】
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを用いて誘発又は同定される抗体は、抗イディオタイプ抗体の作製で用いることができる。その後、今度は、この抗イディオタイプ抗体を、インフルエンザの特定の抗原、例えば、血球凝集素ポリペプチドの中和エピトープに結合する抗体の亜集団を産生するために、免疫に用いることができる(引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、Jerneの文献(1974, Ann. Immunol.(Paris)125c:373);Jerneらの文献(1982, EMBO J. 1:234))。
【０３２４】
(5.10  インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドによる細胞の刺激)
別の態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドによってエクスビボで細胞を刺激する方法が本明細書で提供される。そのような細胞、例えば、樹状細胞を、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドに対する抗体を作製するためにインビトロで用いることができるか、又はそれ自体を、例えば、当技術分野で公知の養子移入技術によって対象に投与することができる。養子移入技術の説明については、例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、2008年1月24日に公開された米国特許出願公開第20080019998号を参照されたい。ある実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドによってエクスビボで刺激された細胞を対象に投与する場合、該細胞は、哺乳動物細胞(例えば、CB-1細胞)ではない。
【０３２５】
1つの非限定的な例では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するように改変されたベクター、例えば、インフルエンザウイルスベクターを用いて、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現させ、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対して向けられた免疫刺激特性を提示する樹状細胞(DC)を生成させることができる。そのようなDCは、メモリーT細胞を拡大するために用いられることができ、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドに特異的な細胞傷害性Tリンパ球クローンを含む、T細胞の強力なスティミュレーターである。引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、Strobelらの文献(2000, Human Gene Therapy 11:2207-2218)を参照されたい。
【０３２６】
本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、該ポリペプチドを標的細胞、例えば、DCと接触させ、該ポリペプチドを標的細胞に送達する任意の方法で標的細胞に送達することができる。ある実施態様では、本明細書に記載されているように、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを対象に送達する。いくつかのそのような実施態様では、ポリペプチドと接触させた細胞を単離し、増殖させることができる。
【０３２７】
ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをインビトロで標的細胞に送達する。当業者に公知の技術を用いて、標的細胞にポリペプチドを送達することができる。例えば、標的細胞を、組織培養プレート、チューブ、又は他の容器中のポリペプチドと接触させることができる。ポリペプチドを培地に懸濁し、培養プレートのウェル、チューブ、又は他の容器に添加することができる。ポリペプチドを含む培地を、細胞のプレーティングの前に、又は細胞をプレーティングした後に添加することができる。標的細胞は、ポリペプチドを細胞と接触させるのに十分な量の時間、ポリペプチドとともにインキュベートすることが好ましい。ある実施態様では、細胞を、ポリペプチドとともに、約1時間以上、約5時間以上、約10時間以上、約12時間以上、約16時間以上、約24時間以上、約48時間以上、約1時間〜約12時間、約3時間〜約6時間、約6時間〜約12時間、約12時間〜約24時間、又は約24時間〜約48時間インキュベートする。インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドがウイルス中にある、ある実施態様では、標的細胞を接触させることは、細胞をウイルスに感染させることを含む。
【０３２８】
標的細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びモルモットを含む、任意の種由来のものであることができる。いくつかの実施態様では、標的細胞は、健康な対象又は治療を必要とする対象から得られるDCである。ある実施態様では、標的細胞は、ポリペプチドに対する免疫応答を刺激することが望ましい対象から得られるDCである。対象から細胞を得る方法は、当技術分野で周知である。
【０３２９】
(5.11  組成物)
本明細書に記載の核酸、ベクター、ポリペプチド、細菌、抗体、又は細胞(本明細書では「活性化合物」と呼ばれることもある)を組成物に組み込むことができる。具体的な実施態様では、組成物は、医薬組成物、例えば、免疫原性組成物(例えば、ワクチン製剤)である。本明細書で提供される医薬組成物は、組成物を対象に投与することができる任意の形態であることができる。具体的な実施態様では、医薬組成物は、獣医学的投与及び/又はヒトへの投与に好適である。組成物は、インフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法で用いることができる。
【０３３０】
一実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む。別の実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸を含む。別の実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを含む。別の実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むインフルエンザウイルス又は非インフルエンザウイルスを含む。別の実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するように改変されたゲノムを有するインフルエンザウイルス又は非インフルエンザウイルスを含む。別の実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むウイルス様粒子又はウイロソームを含む。別の実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するか、又はそれを発現するように改変された細菌を含む。別の実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドで刺激された細胞を含む。
【０３３１】
いくつかの実施態様では、医薬組成物は、活性化合物に加えて1以上の他の療法を含むことができる。
【０３３２】
本明細書で用いられるように、用語「医薬として許容し得る」は、動物、より具体的にはヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局に承認されているか、又は米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「担体」は、医薬組成物がそれとともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は媒体を指す。食塩水溶液及び水性デキストロース溶液及びグリセロール溶液を、特に注射用溶液のための液体担体として利用することもできる。好適な賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。好適な医薬担体の例は、E. W. Martin著「レミントンの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」に記載されている。製剤は、投与様式に適するべきである。
【０３３３】
具体的な実施態様では、医薬組成物は、対象への意図された投与経路に好適であるように製剤化される。例えば、医薬組成物は、非経口、経口、皮内、経皮、結腸直腸、腹腔内、及び直腸投与に適するように製剤化することができる。具体的な実施態様では、医薬組成物は、静脈内、経口、腹腔内、鼻腔内、気管内、皮下、筋肉内、局所、皮内、経皮、又は肺投与用に製剤化することができる。
【０３３４】
ある実施態様では、生体分解性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリエチレングリコール(PEG化)、ポリメタクリル酸メチルポリマー、ポリラクチド、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を担体として用いることができる。いくつかの実施態様では、活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のように、身体からの速やかな消失からの化合物の保護を増大させる担体を用いて調製される。そのような製剤の調製方法は当業者には明らかであろう。リポソーム又はミセルを医薬として許容し得る担体として用いることもできる。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されているような、当業者に公知の方法によって調製することができる。ある実施態様では、医薬組成物は、1以上のアジュバントを含む。
【０３３５】
具体的な実施態様では、本明細書に記載の免疫原性組成物は一価製剤である。他の実施態様では、本明細書に記載の免疫原性組成物は多価製剤である。一例では、多価製剤は、A型インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現する1以上のベクター、及びB型インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現する1以上のベクターを含む。別の例では、多価製剤は、A型インフルエンザウイルスH3抗原に由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するベクター、及びA型インフルエンザウイルスH1抗原に由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するベクターを含む。別の例では、多価製剤は、A型インフルエンザウイルスH3抗原に由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するベクター、A型インフルエンザウイルスH1抗原に由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するベクター、及びB型インフルエンザウイルスHA抗原に由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するベクターを含む。ある実施態様では、多価製剤は、単一のベクターを用いて発現される1以上の異なるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むことができる。
【０３３６】
ある実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、防腐剤、例えば、水銀誘導体のチメロサールをさらに含む。具体的な実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、0.001％〜0.01％のチメロサールを含む。他の実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、防腐剤を含まない。具体的な実施態様では、チメロサールは、本明細書に記載の医薬組成物の製造時に用いられ、チメロサールは、医薬組成物の生産後の精製工程を通して除去される、すなわち、医薬組成物は、微量のチメロサールを含む(精製後に、1用量当たり＜0.3μgの水銀;そのような医薬組成物は、チメロサール不含製品とみなされる)。
【０３３７】
ある実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、卵タンパク質(例えば、オボアルブミン又は他の卵タンパク質)をさらに含む。本明細書に記載の医薬組成物中の卵タンパク質の量は、1mlの医薬組成物に対して、約0.0005〜約1.2μgの卵タンパク質であることができる。他の実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、卵タンパク質を含まない。
【０３３８】
ある実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、限定するものではないが、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ポリミキシン(例えば、ポリミキシンB)及びカナマイシン、ストレプトマイシンを含む、1以上の抗微生物剤(例えば、抗生物質)をさらに含む。他の実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、いかなる抗生物質も含まない。
【０３３９】
ある実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、ウイルスを不活化するために用いられる1以上の成分、例えば、ホルマリンもしくはホルムアルデヒド、又は界面活性剤、例えば、デオキシコール酸ナトリウム、オクトキシノール9(TritonX-100)、及びオクトキシノール10をさらに含む。他の実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、ウイルスを不活化するために用いられるいかなる成分も含まない。
【０３４０】
ある実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、ゼラチンをさらに含む。他の実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、ゼラチンを含まない。
【０３４１】
ある実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、1以上の緩衝剤、例えば、リン酸緩衝剤及びスクロースホスフェートグルタメート緩衝剤をさらに含む。他の実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、緩衝剤を含まない。
【０３４２】
ある実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、1以上の塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、及びアルミニウム塩(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン(硫酸アルミニウムカリウム)、又はそのようなアルミニウム塩の混合物)をさらに含む。他の実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、塩を含まない。
【０３４３】
具体的な実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、低添加剤インフルエンザウイルスワクチンである、すなわち、該医薬組成物は、インフルエンザウイルスワクチン中に一般に見られる1以上の添加剤を含まない。低添加剤インフルエンザワクチンは記載されている(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、国際公開WO 09/001217号として公開された国際出願PCT/IB2008/002238号を参照されたい)。
【０３４４】
本明細書に記載の医薬組成物は、投与のための説明書と一緒に、容器、パック、又はディスペンサーに含めることができる。
【０３４５】
本明細書に記載の医薬組成物は、使用前に保存することができ、例えば、該医薬組成物は、冷凍して(例えば、約-20℃もしくは約-70℃で)保存するか;冷蔵条件で(例えば、約4℃で)保存するか;又は室温で保存することができる(インフルエンザワクチンを含む組成物を冷蔵しないで保存する方法については、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、国際公開WO 07/110776号として公開された国際出願PCT/IB2007/001149号を参照されたい)。
【０３４６】
ある実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物中の活性化合物が、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するように改変された細胞である場合、該医薬組成物中の細胞は、哺乳動物細胞(例えば、CB-1細胞)ではない。
【０３４７】
(5.11.1  サブユニットワクチン)
具体的な実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むサブユニットワクチンが本明細書で提供される。いくつかの実施態様では、サブユニットワクチンは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、及び1以上の表面糖タンパク質(例えば、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ)、他のターゲッティング部分、又はアジュバントを含む。具体的な実施態様では、サブユニットワクチンは、単一のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む。他の実施態様では、サブユニットワクチンは、2つ、3つ、4つ、又はそれより多くのインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む。具体的な実施態様では、サブユニットワクチンで用いられるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド(複数可)は、膜結合型でない、すなわち、それは可溶性である。
【０３４８】
ある実施態様では、1用量当たり、約10μg〜約60μgの本明細書に記載の1以上のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、約0.001％〜0.01％のチメロサール、約0.1μg〜約1.0μgの鶏卵タンパク質、約1.0μg〜約5.0μgのポリミキシン、約1.0μg〜約5.0μgのネオマイシン、約0.1μg〜約0.5μgのベータプロピオラクトン、及び約0.001〜約0.05w/v％のノニルフェノールエトキシレートを含むサブユニットワクチンが本明細書で提供される。
【０３４９】
具体的な実施態様では、本明細書で提供されるサブユニットワクチンは、45μgの本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド(複数可)、1.0μg以下の水銀(チメロサール由来)、1.0μg以下の鶏卵タンパク質(すなわち、オボアルブミン)、3.75μg以下のポリミキシン、及び2.5μg以下のネオマイシンを含む0.5ml用量を含むか又はそれからなる。いくつかの実施態様では、本明細書で提供されるサブユニットワクチンは、1用量当たり、0.5μg以下のベータプロピオラクトン及び0.015w/v％以下のノニルフェノールエトキシレートをさらに含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施態様では、0.5ml用量のサブユニットワクチンは、充填済み注射器にパックされる。
【０３５０】
具体的な実施態様では、本明細書で提供されるサブユニットワクチンは、45μgの本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド(複数可)、25.0μgの水銀(チメロサール由来)、1.0μg以下の鶏卵タンパク質(すなわち、オボアルブミン)、3.75μg以下のポリミキシン、及び2.5μg以下のネオマイシンを含む5.0mlの多用量バイアル(1用量当たり、0.5ml)からなる。いくつかの実施態様では、本明細書で提供されるサブユニットワクチンは、1用量当たり、0.5μg以下のベータプロピオラクトン及び0.015w/v％以下のノニルフェノールエトキシレートをさらに含むか、又はそれらからなる。
【０３５１】
具体的な実施態様では、サブユニットワクチンは、発育鶏卵で増殖させたインフルエンザウイルスを用いて調製される(すなわち、サブユニットワクチンの成分(例えば、血球凝集素ステムドメインポリペプチド)は、発育鶏卵で増殖させたウイルスから単離される)。別の具体的な実施態様では、サブユニットワクチンは、発育鶏卵で増殖させなかったインフルエンザウイルスを用いて調製される(すなわち、サブユニットワクチンの成分(例えば、血球凝集素ステムドメインポリペプチド)は、発育鶏卵で増殖させなかったウイルスから単離される)。別の具体的な実施態様では、サブユニットワクチンは、哺乳動物細胞、例えば、不死化ヒト細胞(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、国際公開WO 07/045674号として公開された国際出願PCT/EP2006/067566号を参照されたい)、又はイヌ腎臓細胞、例えば、MDCK細胞(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、国際公開WO 08/032219号として公開された国際出願PCT/IB2007/003536号を参照されたい)で増殖させたインフルエンザウイルスを用いて調製される(すなわち、サブユニットワクチンの成分(例えば、血球凝集素ステムドメインポリペプチド)は、哺乳動物細胞で増殖させたウイルスから単離される)。別の具体的な実施態様では、サブユニットワクチン中の血球凝集素ステムドメインポリペプチド(複数可)は、発現ベクター、例えば、ウイルスベクター、植物ベクター、又は細菌ベクターを用いて調製される(すなわち、サブユニットワクチン中の血球凝集素ステムドメインポリペプチド(複数可)は、発現ベクターから得られる/単離される)。
【０３５２】
(5.11.2  生ウイルスワクチン)
一実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む生ウイルスを含む免疫原性組成物(例えば、ワクチン)が本明細書で提供される。別の実施態様では、組成物を投与される対象で産生される子孫ウイルスによって発現されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードするように改変されている生ウイルスを含む免疫原性組成物(例えば、ワクチン)が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、膜結合型である。他の具体的な実施態様では、インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドは膜結合型ではない、すなわち、可溶性である。特定の実施態様では、生ウイルスは、上の第5.4節に記載されているような、インフルエンザウイルスである。他の実施態様では、生ウイルスは、上の第5.5節に記載されているような、非インフルエンザウイルスである。いくつかの実施態様では、生ウイルスは弱毒化されている。いくつかの実施態様では、免疫原性組成物は、2つ、3つ、4つ、もしくはそれより多くの異なるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むか、又はそれらを発現するように改変されている、2つ、3つ、4つ、又はそれより多くの生ウイルスを含む。
【０３５３】
ある実施態様では、1用量当たり、本明細書に記載の1以上のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む約105〜約1010蛍光焦点単位(FFU)の弱毒化生インフルエンザウイルス、約0.1〜約0.5mgのグルタミン酸一ナトリウム、約1.0〜約5.0mgの加水分解ブタ(procine)ゼラチン、約1.0〜約5.0mgのアルギニン、約10〜約15mgのスクロース、約1.0〜約5.0mgの二塩基性リン酸カリウム、約0.5〜約2.0mgのリン酸二水素カリウム、及び約0.001〜約0.05μg/mlの硫酸ゲンタマイシンを含む免疫原性組成物(例えば、ワクチン)が本明細書で提供される。いくつかの実施態様では、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、単一の0.2ml用量を含む充填済み噴霧器としてパックされる。
【０３５４】
具体的な実施態様では、1用量当たり、本明細書に記載の1以上のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む106.5〜107.5FFUの弱毒化生インフルエンザウイルス、0.188mgのグルタミン酸一ナトリウム、2.0mgの加水分解ブタゼラチン、2.42mgのアルギニン、13.68mgのスクロース、2.26mgの二塩基性リン酸カリウム、0.96mgのリン酸二水素カリウム、及び0.015μg/ml未満の硫酸ゲンタマイシンを含む免疫原性組成物(例えば、ワクチン)が本明細書で提供される。いくつかの実施態様では、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、単一の0.2ml用量を含む充填済み噴霧器としてパックされる。
【０３５５】
具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む生ウイルスを、本明細書に記載の免疫原性組成物中でのその使用の前に、発育鶏卵で増殖させる。別の具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む生ウイルスを、本明細書に記載の免疫原性組成物中でのその使用の前に、発育鶏卵で増殖させない。別の具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む生ウイルスを、本明細書に記載の免疫原性組成物中でのその使用の前に、哺乳動物細胞、例えば、不死化ヒト細胞(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、国際公開WO 07/045674号として公開された国際出願PCT/EP2006/067566号を参照されたい)、又はイヌ腎臓細胞、例えば、MDCK細胞(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、国際公開WO 08/032219号として公開された国際出願PCT/IB2007/003536号を参照されたい)で増殖させる。
【０３５６】
対象でのウイルスの増殖は、自然感染で起こるものと同様の種類及び程度の長期刺激をもたらし、そのため、かなりの長期持続性免疫を付与することができるので、対象への投与用の生ウイルスを含む免疫原性組成物が好ましい場合がある。
【０３５７】
(5.11.3  不活化ウイルスワクチン)
一実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む不活化ウイルスを含む免疫原性組成物(例えば、ワクチン)が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは膜結合型である。特定の実施態様では、不活化ウイルスは、上の第5.4節に記載されているような、インフルエンザウイルスである。他の実施態様では、不活化ウイルスは、上の第5.5節に記載されているような、非インフルエンザウイルスである。いくつかの実施態様では、免疫原性組成物は、2つ、3つ、4つ、又はそれより多くの異なるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む、2つ、3つ、4つ、又はそれより多くの不活化ウイルスを含む。ある実施態様では、不活化ウイルス免疫原性組成物は、1以上のアジュバントを含む。
【０３５８】
当業者に公知の技術を用いて、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むウイルスを不活化することができる。一般的な方法は、不活化のためにホルマリン、熱、又は界面活性剤を用いる。例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、米国特許第6,635,246号を参照されたい。他の方法としては、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、米国特許第5,891,705号;第5,106,619号及び第4,693,981号に記載されているものが挙げられる。
【０３５９】
ある実施態様では、免疫原性組成物の各用量が、約15〜約60μgの本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、約1.0〜約5.0mgの塩化ナトリウム、約20〜約100μgの一塩基リン酸ナトリウム、約100〜約500μgのリン酸水素ナトリウム、約5〜約30μgのリン酸二水素カリウム、約5〜約30μgの塩化カリウム、及び約0.5〜約3.0μgの塩化カルシウムを含むような、不活化インフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物(例えば、ワクチン)が本明細書で提供される。いくつかの実施態様では、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、単一の0.25ml又は単一の0.5mlの用量としてパックされる。他の実施態様では、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、多用量製剤としてパックされる。
【０３６０】
ある実施態様では、免疫原性組成物の各用量が、1用量当たり、約15〜約60μgの本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、約0.001％〜0.01％のチメロサール、約1.0〜約5.0mgの塩化ナトリウム、約20〜約100μgの一塩基リン酸ナトリウム、約100〜約500μgのリン酸水素ナトリウム、約5〜約30μgのリン酸二水素カリウム、約5〜約30μgの塩化カリウム、及び約0.5〜約3.0μgの塩化カルシウムを含むような、不活化インフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物(例えば、ワクチン)が本明細書で提供される。いくつかの実施態様では、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、単一の0.25ml又は単一の0.5mlの用量としてパックされる。他の実施態様では、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、多用量製剤としてパックされる。
【０３６１】
具体的な実施態様では、本明細書で提供される免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、単一の0.25ml用量としてパックされ、1用量当たり、22.5μgの本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、2.05mgの塩化ナトリウム、40μgの一塩基リン酸ナトリウム、150μgのリン酸水素ナトリウム、10μgのリン酸二水素カリウム、10μgの塩化カリウム、及び0.75μgの塩化カルシウムを含む。
【０３６２】
具体的な実施態様では、本明細書で提供される免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、単一の0.5ml用量としてパックされ、1用量当たり、45μgの本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、4.1mgの塩化ナトリウム、80μgの一塩基リン酸ナトリウム、300μgのリン酸水素ナトリウム、20μgのリン酸二水素カリウム、20μgの塩化カリウム、及び1.5μgの塩化カルシウムを含む。
【０３６３】
具体的な実施態様では、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、5.0mlのワクチン(1用量当たり、0.5ml)を含むか又はそれからなる多用量製剤としてパックされ、1用量当たり、24.5μgの水銀(チメロサール由来)、45μgの本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、4.1mgの塩化ナトリウム、80μgの一塩基リン酸ナトリウム、300μgのリン酸水素ナトリウム、20μgのリン酸二水素カリウム、20μgの塩化カリウム、及び1.5μgの塩化カルシウムを含む。
【０３６４】
具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む不活化ウイルスを、その不活化及びその後の本明細書に記載の免疫原性組成物中での使用の前に、発育鶏卵で増殖させた。別の具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む不活化ウイルスを、その不活化及びその後の本明細書に記載の免疫原性組成物中での使用の前に、発育鶏卵で増殖させなかった。別の具体的な実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む不活化ウイルスを、その不活化及びその後の本明細書に記載の免疫原性組成物中での使用の前に、哺乳動物細胞、例えば、不死化ヒト細胞(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、国際公開WO 07/045674号として公開された国際出願PCT/EP2006/067566号を参照されたい)、又はイヌ腎臓細胞、例えば、MDCK細胞(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、国際公開WO 08/032219号として公開された国際出願PCT/IB2007/003536号を参照されたい)で増殖させた。
【０３６５】
(5.11.4  スプリットウイルスワクチン)
一実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む免疫原性組成物は、スプリットウイルスワクチンである。いくつかの実施態様では、スプリットウイルスワクチンは、2つ、3つ、4つ、又はそれより多くの異なるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む。ある実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、膜結合型である/あった。ある実施態様では、スプリットウイルスワクチンは、1以上のアジュバントを含む。
【０３６６】
スプリットウイルスワクチンの産生技術は当業者に公知である。非限定的な例として、インフルエンザウイルススプリットワクチンは、界面活性剤で破壊された不活化粒子を用いて調製することができる。本明細書に記載の方法による使用に適合させることができるスプリットウイルスワクチンの一例は、筋肉内使用のためのFluzone(登録商標)インフルエンザウイルスワクチン(ゾーン精製、サブビリオン)であり、それを、発育鶏卵で増殖させたインフルエンザウイルスから調製される滅菌懸濁剤として製剤化する。ウイルス含有液を回収し、ホルムアルデヒドで不活化する。インフルエンザウイルスを、連続フロー遠心分離機を用いて、線形ショ糖密度勾配溶液中で濃縮し、精製する。次に、ウイルスを、非イオン性界面活性剤、オクトキシノール-9(Triton(登録商標)X-100-Union Carbide社の登録商標)を用いて化学的に破壊し、「スプリットウイルス」を生じさせる。次に、このスプリットウイルスを、化学手段によってさらに精製し、リン酸ナトリウム緩衝生理食塩液に懸濁する。
【０３６７】
ある実施態様では、約10μg〜約60μgの本明細書に記載の1以上のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、約0.01〜約1.0mgのオクトキシノール-10(TRITON X-100(登録商標))、約0.5〜0.5mgのα-トコフェリルハイドロジェンスクシネート、約0.1〜1.0mgのポリソルベート80(Tween 80)、約0.001〜約0.003μgのヒドロコルチゾン、約0.05〜約0.3μgの硫酸ゲンタマイシン(gentamcin)、約0.5〜約2.0μgの鶏卵タンパク質(オボアルブミン)、約25〜75μgのホルムアルデヒド、及び約25〜75μgのデオキシコール酸ナトリウムを含むスプリットウイルスワクチンが本明細書で提供される。
【０３６８】
具体的な実施態様では、本明細書で提供されるスプリットウイルスワクチンは、45μgの本明細書で提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド(複数可)、0.085mg以下のオクトキシノール-10(TRITON X-100(登録商標))、0.1mg以下のα-トコフェリルハイドロジェンスクシネート、0.415mg以下のポリソルベート80(Tween 80)、0.0016μg以下のヒドロコルチゾン、0.15μg以下の硫酸ゲンタマイシン、1.0以下の鶏卵タンパク質(オボアルブミン)、50μg以下のホルムアルデヒド、及び50μg以下のデオキシコール酸ナトリウムを含む0.5ml用量を含むか又はそれからなる。いくつかの実施態様では、0.5ml用量のサブユニットワクチンは、充填済み注射器にパックされる。
【０３６９】
具体的な実施態様では、スプリットウイルスワクチンは、発育鶏卵で増殖させたインフルエンザウイルスを用いて調製される。別の具体的な実施態様では、スプリットウイルスワクチンは、発育鶏卵で増殖させなかったインフルエンザウイルスを用いて調製される。別の具体的な実施態様では、スプリットウイルスワクチンは、哺乳動物細胞、例えば、不死化ヒト細胞(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、WO 07/045674号として公開された国際出願PCT/EP2006/067566号を参照されたい)、又はイヌ腎臓細胞、例えば、MDCK細胞(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、WO 08/032219号として公開された国際出願PCT/IB2007/003536号を参照されたい)で増殖させたインフルエンザウイルスを用いて調製される。
【０３７０】
(5.11.5  アジュバント)
ある実施態様では、本明細書に記載の組成物は、アジュバントを含むか、又はそれと併用投与される。本明細書に記載の組成物との併用投与のためのアジュバントは、該組成物の投与前、それと同時、又はその後に投与されてもよい。いくつかの実施態様では、用語「アジュバント」は、本明細書に記載の組成物とともに又はその一部として投与した場合、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドに対する免疫応答を強化、増強、及び/又は亢進するが、その化合物を単独で投与した場合、ポリペプチドに対する免疫応答を生じさせない化合物を指す。いくつかの実施態様では、アジュバントは、ポリペプチドに対する免疫応答を生じさせ、アレルギー又は他の有害反応を生じさせない。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、B及び/又はT細胞の刺激、並びにマクロファージの刺激を含むいくつかの機構によって、免疫応答を増強することができる。
【０３７１】
ある実施態様では、アジュバントは、応答の定性的形態に影響を及ぼすポリペプチドの立体構造変化を引き起こすことなく、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドに対する固有の応答を強化する。アジュバントの具体的な例としては、アルミニウム塩(ミョウバン)(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウム)、3デ-O-アシル化モノホスホリル脂質A(MPL)(GB 2220211号を参照されたい)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、ポリソルベート80(Tween 80;ICL Americas社)、イミダゾピリジン化合物(国際公開WO 2007/109812号として公開された国際出願PCT/US2007/064857号を参照されたい)、イミダゾキノキサリン化合物(国際公開WO 2007/109813号として公開された国際出願PCT/US2007/064858号を参照されたい)、及びサポニン、例えば、QS21(Kensilらの文献、ワクチンの設計:サブユニット及びアジュバント手法(Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach)(Powell及びNewman編, Plenum Press, NY, 1995);米国特許第5,057,540号を参照されたい)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、アジュバントは、フロイントアジュバント(完全又は不完全)である。他のアジュバントは、任意に免疫賦活剤、例えば、モノホスホリル脂質Aと組み合わせた、水中油エマルジョン(例えば、スクアレン又は落花生油)である(Stouteらの文献(N. Engl. J. Med. 336, 86-91(1997))を参照されたい)。別のアジュバントは、CpGである(Bioworld Today, 1998年11月15日)。そのようなアジュバントは、他の特異的免疫刺激剤、例えば、MPLもしくは3-DMP、QS21、重合体もしくは単量体のアミノ酸、例えば、ポリグルタミン酸もしくはポリリジン、又は上の第5.4節に記載されている他の免疫増強剤とともに、又はそれらなしで用いることができる。インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの異なる製剤が、異なるアジュバントを含み得るか、又は同じアジュバントを含み得ることを理解すべきである。
【０３７２】
(5.12  予防的及び治療的使用)
一態様では、活性化合物、すなわち、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプチドで刺激された細胞を利用して、対象の免疫応答を誘導する方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸又はその免疫原性組成物の有効量を投与することを含む。別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸又はその免疫原性組成物の有効量を投与することを含む。別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むかもしくは発現するウイルスベクター、又はその免疫原性組成物の有効量を投与することを含む。さらに別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドで刺激された細胞又はその医薬組成物の有効量を投与することを含む。ある実施態様では、本方法で用いられるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、哺乳動物細胞、植物細胞、又は昆虫細胞に由来する精製されたインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。
【０３７３】
具体的な実施態様では、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のサブユニットワクチンを投与することを含む。別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の生ウイルスワクチンを投与することを含む。特定の実施態様では、生ウイルスワクチンは、弱毒化ウイルスを含む。別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の不活化ウイルスワクチンを投与することを含む。別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のスプリットウイルスワクチンを投与することを含む。別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のウイルス様粒子ワクチンを投与することを含む。別の実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のウイロソームを投与することを含む。別の実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するかもしくは発現するように改変された細菌又はその組成物を投与することを含む。ある実施態様では、本方法で用いられるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、哺乳動物細胞、植物細胞、又は昆虫細胞に由来する精製されたインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。
【０３７４】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの任意の亜型又は株によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、一方のHAグループ(例えば、H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、及びH16を含むグループ1)に属し、もう一方のHAグループ(例えば、H3、H4、H7、H10、H14、及びH15を含むグループ2)に属さないインフルエンザウイルスの亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。例えば、誘導される免疫応答は、H11、H13、H16、H9、H8、H12、H6、H1、H5、及びH2からなるHAグループに属するインフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効であり得る。或いは、誘導される免疫応答は、H3、H4、H14、H10、H15、及びH7からなるHAグループに属するインフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効であり得る。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つの亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、又は15の亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの同じ亜型内の1以上の変異体によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。
【０３７５】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、H1N1とH2N2の両方の亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。他の実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、H1N1とH2N2の両方の亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効でない。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、H1N1、H2N2、及びH3N2の亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、H3N2亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。他の実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、H3N2亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効でない。
【０３７６】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの任意の亜型又は株によって引き起こされるインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療するのに有効である。ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、一方のHAグループに属し、もう一方のHAグループに属さないインフルエンザウイルスの亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療するのに有効である。例えば、誘導される免疫応答は、H11、H13、H16、H9、H8、H12、H6、H1、H5、及びH2からなるHAグループに属するインフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療するのに有効であり得る。或いは、誘導される免疫応答は、H3、H4、H14、H10、H15、及びH7からなるHAグループに属するインフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療するのに有効であり得る。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つの亜型のいずれかによって引き起こされるインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療するのに有効である。ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、又は15の亜型のいずれかによって引き起こされるインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療するのに有効である。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの同じ亜型内の1以上の変異体によって引き起こされるインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療するのに有効である。
【０３７７】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルス疾患/感染に起因する症状を軽減するのに有効である。インフルエンザウイルス疾患/感染の症状としては、体の痛み(特に、関節及び咽喉)、発熱、吐き気、頭痛、ひりひり痛む目、疲労、咽喉炎、赤くなった目又は皮膚、並びに腹痛が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７８】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルス疾患/感染に罹患している対象の入院を減少させるのに有効である。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルス疾患/感染に罹患している対象の入院期間を短縮するのに有効である。
【０３７９】
別の態様では、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター、又はそのようなポリペプチドで刺激された細胞)或いは組成物を利用して、対象のインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療する方法が本明細書で提供される。一実施態様では、対象のインフルエンザウイルス感染を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター、又は上記のいずれか1つの組成物を投与することを含む。具体的な実施態様では、対象のインフルエンザウイルス感染を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、サブユニットワクチン、生ウイルスワクチン、不活化ウイルスワクチン、スプリットウイルスワクチン、又はウイルス様粒子ワクチンを投与することを含む。
【０３８０】
別の態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター、又はそのようなポリペプチドで刺激された細胞を利用して、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療する方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド又はその免疫原性組成物の有効量を投与することを含む。別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸又はその免疫原性組成物の有効量を投与することを含む。別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むかもしくは発現するウイルスベクター、又はその免疫原性組成物の有効量を投与することを含む。さらに別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドで刺激された細胞又はその医薬組成物の有効量を投与することを含む。
【０３８１】
具体的な実施態様では、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載されるサブユニットワクチンを投与することを含む。別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の生ウイルスワクチンを投与することを含む。特定の実施態様では、生ウイルスワクチンは、弱毒化ウイルスを含む。別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の不活化ウイルスワクチンを投与することを含む。別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のスプリットウイルスワクチンを投与することを含む。別の実施態様では、インフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のウイルス様粒子ワクチンを投与することを含む。別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のウイロソームを投与することを含む。別の実施態様では、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するかもしくは発現するように改変された細菌又はその組成物を投与することを含む。
【０３８２】
別の態様では、本明細書に記載の中和抗体を投与することによって、対象でインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療する方法が本明細書で提供される。具体的な実施態様では、対象でインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の中和抗体、又はその医薬組成物の有効量を投与することを含む。特定の実施態様では、中和抗体はモノクローナル抗体である。ある実施態様では、中和抗体は、CR6261、CR6325、CR6329、CR6307、CR6323、2A、D7、D8、F10、G17、H40、A66、D80、E88、E90、H98、C179(FERM BP-4517)、AI3C(FERM BP-4516)、又はEkiert DCらの文献(2009)高度に保存されたインフルエンザウイルスエピトープの抗体認識(Antibody Recognition of a Highly Conserved Influenza Virus Epitope)(Science(2009年2月26日にScience Expressで発表された); Kashyapらの文献(2008)トルコH5N1鳥インフルエンザ大発生の生存者由来のコンビナトリアル抗体ライブラリーは、ウイルス中和戦略を明らかにする(Combinatorial antibody libraries from survivors of the Turkish H5N1 avian influenza outbreak reveal virus neutralization strategies.)(Proc Natl Acad Sci U S A 105: 5986-5991);Suiらの文献(2009)鳥及びヒトA型インフルエンザウイルスの広域スペクトル中和のための構造及び機能的基礎(Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses.)(Nat Struct Mol Biol 16: 265-273);米国特許第5,589,174号、同第5,631,350号、同第6,337,070号、及び同第6,720,409号;国際公開WO 2007/134237として公開された国際出願PCT/US2007/068983号;国際公開WO 2009/036157号として公開された国際出願PCT/US2008/075998号;国際公開WO 2008/028946号として公開された国際出願PCT/EP2007/059356号;及び国際公開WO 2009/079259号として公開された国際出願PCT/US2008/085876号に記載されている任意の他の抗体ではない。他の実施態様では、中和抗体は、Wangらの文献(2010)「異なる血球凝集素による連続免疫後のH3インフルエンザウイルスに対する広範防御性モノクローナル抗体(Broadly Protective Monoclonal Antibodies against H3 Influenza Viruses following Sequential Immunization with Different Hemagglutinins)」(PLOS Pathogens 6(2):1-9)に記載されている抗体ではない。
【０３８３】
ある実施態様では、本明細書で提供される、対象(例えば、ヒト又は非ヒト動物)のインフルエンザウイルス疾患又は感染を予防又は治療する方法は、当業者に公知かつ本明細書に記載のインビボ及びインビトロアッセイで測定したときに、対象でのインフルエンザウイルスの複製の低減をもたらす。いくつかの実施態様では、インフルエンザウイルスの複製は、約1log以上、約2log以上、約3log以上、約4log以上、約5log以上、約6log以上、約7log以上、約8log以上、約9log以上、約10log以上、1〜3log、1〜5log、1〜8log、1〜9log、2〜10log、2〜5log、2〜7log、2log〜8log、2〜9log、2〜10log、3〜5log、3〜7log、3〜8log、3〜9log、4〜6log、4〜8log、4〜9log、5〜6log、5〜7log、5〜8log、5〜9log、6〜7log、6〜8log、6〜9log、7〜8log、7〜9log、又は8〜9log低減される。
【０３８４】
(5.12.1  併用療法)
様々な態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞、又は中和抗体は、1以上の他の療法(例えば、抗ウイルス療法、抗細菌療法、もしくは免疫調節療法)との併用で対象に投与することができる。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物(例えば、免疫原性組成物)は、1以上の療法との併用で対象に投与することができる。1以上の他の療法は、インフルエンザウイルス疾患の治療もしくは予防に有益であることができるか、又はインフルエンザウイルス疾患と関連する症状もしくは状態を改善することができる。いくつかの実施態様では、1以上の他の療法は、鎮痛剤、解熱薬、又は呼吸を楽にするかもしくは助ける療法である。ある実施態様では、療法は、5分未満の間隔、30分未満の間隔、1時間の間隔、約1時間の間隔、約1〜約2時間の間隔、約2時間〜約3時間の間隔、約3時間〜約4時間の間隔、約4時間〜約5時間の間隔、約5時間〜約6時間の間隔、約6時間〜約7時間の間隔、約7時間〜約8時間の間隔、約8時間〜約9時間の間隔、約9時間〜約10時間の間隔、約10時間〜約11時間の間隔、約11時間〜約12時間の間隔、約12時間〜18時間の間隔、18時間〜24時間の間隔、24時間〜36時間の間隔、36時間〜48時間の間隔、48時間〜52時間の間隔、52時間〜60時間の間隔、60時間〜72時間の間隔、72時間〜84時間の間隔、84時間〜96時間の間隔、又は96時間〜120時間の間隔で投与される。具体的な実施態様では、2種以上の療法が、同じ患者(patent)診察時に投与される。
【０３８５】
当業者に周知の任意の抗ウイルス剤を、本明細書に記載の活性化合物又は医薬組成物と併用することができる。抗ウイルス剤の非限定的な例としては、その受容体へのウイルスの付着、細胞内へのウイルスの内在化、ウイルスの複製、又は細胞からのウイルスの放出を阻害及び/又は低減する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質抗体、核酸分子、有機分子、無機分子、及び小分子が挙げられる。特に、抗ウイルス剤としては、ヌクレオシド類似体(例えば、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、及びリバビリン)、フォスカーネット、アマンタジン、ペラミビル、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、α-インターフェロン及び他のインターフェロン、AZT、ザナミビル(Relenza(登録商標))、並びにオセルタミビル(Tamiflu(登録商標))が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗ウイルス剤としては、インフルエンザウイルスワクチン、例えば、Fluarix(登録商標)(GlaxoSmithKline)、FluMist(登録商標)(MedImmune Vaccines)、Fluvirin(登録商標)(Chiron社)、Flulaval(登録商標)(GlaxoSmithKline)、Afluria(登録商標)(CSL Biotherapies社)、Agriflu(登録商標)(Novartis)、又はFluzone(登録商標)(Aventis Pasteur)が挙げられる。
【０３８６】
具体的な実施態様では、抗ウイルス剤は、ウイルス抗原に特異的である免疫調節剤である。特定の実施態様では、ウイルス抗原は、血球凝集素ポリペプチド以外のインフルエンザウイルスポリペプチドである。他の実施態様では、ウイルス抗原は、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドである。
【０３８７】
当業者に公知の任意の抗細菌剤を、本明細書に記載の活性化合物又は医薬組成物と併用することができる。抗細菌剤の非限定的な例としては、アミカシン、アモキシシリン、アモキシシリン-クラブラン酸、アンホテリシンB、アンピシリン、アンピシリン(Ampicllin)-スルバクタム、アプラマイシン、アジスロマイシン、アズトレオナム、バシトラシン、ベンジルペニシリン、カスポファンギン、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セファロチン、セファゾリン、セフジニル、セフェピム、セフィキシム、セフメノキシム、セフォペラゾン、セフォペラゾン-スルバクタム、セフォタキシム、セフォキシチン、セフピロム、セフポドキシム、セフポドキシム-クラブラン酸、セフポドキシム-スルバクタム、セフプロジル、セフキノム、セフタジジム、セフチブテン(Ceftibutin)、セフチオフル、セフトビプロール、セフトリアキソン、セフロキシム、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリナフロキサシン、クリンダマイシン、クロキサシリン、コリスチン、コトリモキサゾール(トリムトプリム/スルファメトキサゾール)、ダルババンシン、ダルフォプリスチン/キノプリスチン、ダプトマイシン、ジベカシン、ジクロキサシリン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エンロフロキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、フルクロキサシリン、フルコナゾール、フルシトシン、ホスホマイシン、フシジン酸、ガレノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、イミペネム、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナゾール、レボフロキサシン、リンコマイシン、リネゾリド、ロラカルベフ、メシルナム(アムジノシリン)、メロペネム、メトロニダゾール、メジオシリン、メズロシリン-スルバクタム、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ムピロシン、ナリジキシン酸、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキサシリン、ペフロキサシン、ペニシリンV、ピペラシリン、ピペラシリン-スルバクタム、ピペラシリン-タゾバクタム、リファンピシン、ロキシスロマイシン、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、スルバクタム、スルファメトキサゾール、テイコプラニン、テラバンシン、テリスロマイシン、テモシリン、テトラサイクリン、チカルシリン、チカルシリン-クラブラン酸、チゲサイクリン、トブラマイシン、トリメトプリム、トロバフロキサシン、タイロシン、バンコマイシン、バージニアマイシン及びボリコナゾールが挙げられる。
【０３８８】
いくつかの実施態様では、併用療法は、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、又は第5.2〜5.7節に記載の1以上のベクターによる能動免疫、及び第5.9節に記載の1以上の中和抗体による受動免疫を含む。いくつかの実施態様では、併用療法は、第5.2〜5.7節に記載の1以上のベクターによる免疫、及び第5.9節に記載の細胞の投与(例えば、養子移入による)を含む。
【０３８９】
いくつかの実施態様では、併用療法は、第5.2〜5.7節に記載の2以上の異なるベクターの投与を含む。一例では、A型インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現する1以上のベクター及びB型インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現する1以上のベクターが併用投与される。いくつかの実施態様では、併用療法は、A型インフルエンザウイルスH3抗原に由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するベクター及びA型インフルエンザウイルスH1抗原に由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するベクターの投与を含む。いくつかの実施態様では、併用療法は、A型インフルエンザウイルスH3抗原に由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するベクター、A型インフルエンザウイルスH1抗原に由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するベクター、及びB型インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現するベクターの投与を含む。
【０３９０】
いくつかの実施態様では、併用療法は、もう一方のHAグループ(例えば、グループ2)の1つ、2つ、3つ、又はそれより多くのHA亜型に対する免疫応答を誘導する活性化合物と併用した、一方のHAグループ(例えば、グループ1)の1つ、2つ、3つ、又はそれより多くのHA亜型に対する免疫応答を誘導する活性化合物による能動免疫を含む。
【０３９１】
いくつかの実施態様では、併用療法は、第5.1.1〜5.1.2節に記載の2以上のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドによる能動免疫を含む。いくつかの実施態様では、併用療法は、第5.1節に記載の2以上のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドによる能動免疫を含む。
【０３９２】
(5.12.2  患者集団)
ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、未感作の対象、すなわち、インフルエンザウイルス感染に起因する疾患を有していないか、又はインフルエンザウイルス感染症に感染したことがなく、かつ現在それに感染していない対象に投与することができる。一実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、インフルエンザウイルス感染を獲得する危険のある未感作の対象に投与される。一実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが免疫応答を誘導する、特定のインフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患を有していないか、又は特定のインフルエンザウイルスに感染したことがなく、かつそれに感染していない対象に投与される。本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドが免疫応答を誘導する、インフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルスの別の型、亜型、もしくは株に感染している対象、及び/或いはそれらに感染したことがある対象に投与することができる。
【０３９３】
ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、インフルエンザウイルス感染と診断された患者に投与される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、症状が現われるか又は症状が重くなる前に(例えば、患者が入院を必要とする前に)、インフルエンザウイルス感染患者に投与される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、その活性化合物又は組成物のHAステムドメインポリペプチドが由来したインフルエンザウイルスの型と異なる型のインフルエンザウイルスに感染しているか、又はそう診断された患者に投与される。
【０３９４】
ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのHAグループと同じHAグループに属するインフルエンザウイルスに感染している可能性があるか、又はそれに感染している患者に投与される。ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの亜型と同じ亜型のインフルエンザウイルスに感染している可能性があるか、又はそれに感染している患者に投与される。
【０３９５】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべき対象は、動物である。ある実施態様では、動物は鳥である。ある実施態様では、動物はイヌである。ある実施態様では、動物はネコである。ある実施態様では、動物はウマである。ある実施態様では、動物はウシである。ある実施態様では、動物は哺乳動物、例えば、ウマ、ブタ、マウス、又は霊長類、好ましくはヒトである。
【０３９６】
ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべき対象は、ヒト成人である。ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべき対象は、50歳を超えるヒト成人である。ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべき対象は、高齢のヒト対象である。
【０３９７】
ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべき対象は、ヒト小児である。ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべき対象は、ヒト乳児である。ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与される対象は、月齢6カ月未満の乳児ではない。具体的な実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべき対象は、2歳以下である。
【０３９８】
具体的な実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべき対象は、月齢6カ月を超える任意の乳児又は小児、及び50歳を超える任意の成人である。他の実施態様では、対象は妊娠個体である。別の実施態様では、対象は、インフルエンザシーズン(例えば、11月から4月)中に妊娠の可能性又はその予定がある個体である。具体的な実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべき対象は、1、2、3、4、5、6、7、又は8週間前に出産した女性である。
【０３９９】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対象は、インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染に起因する疾患の危険が高い任意の個体(例えば、免疫障害又は免疫不全個体)である。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対象は、インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染に起因する疾患の危険が高い個体(例えば、免疫障害又は免疫抑制個体)と密接に接触する任意の個体である。
【０４００】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対象は、インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染に起因する合併症もしくは疾患に対する感受性を高める任意の病気に罹患した個体である。他の実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、インフルエンザウイルス感染によって、個体が罹患するか、又は個体が危険に曝される別の病気の合併症が増加する可能性を有する対象に投与される。特定の実施態様では、インフルエンザウイルス合併症に対する感受性を高める病気、又はインフルエンザウイルスによってその病気と関連する合併症が増加する病気は、例えば、肺を侵す病気、例えば、嚢胞性線維症、気腫、喘息、又は細菌感染症(例えば、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、及びトラコーマ病原体(Chlamydia trachomatus)によって引き起こされる感染症);心血管疾患(例えば、先天性心臓疾患、鬱血性心不全、及び冠動脈疾患);内分泌障害(例えば、糖尿病)、神経学的障害及びニューロン発達障害(例えば、脳、脊髄、末梢神経、及び筋肉の障害(例えば、脳性麻痺、癲癇(発作性疾患)、脳卒中、知的障害(例えば、精神遅滞)、筋ジストロフィー、及び脊髄損傷))である。
【０４０１】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対象は、グループホーム、例えば、老人ホームに在住する個体である。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対象は、グループホーム、例えば、老人ホームで勤務するか、又はそこでかなりの時間を過ごす。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対象は、医療従事者(例えば、医師又は看護士)である。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対象は、喫煙者である。具体的な実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対象は、免疫障害又は免疫抑制を起こしている。
【０４０２】
さらに、本明細書に記載の活性化合物又は組成物を投与することができる、インフルエンザの合併症を発症する危険が高い対象には、以下の者が含まれる:合併症の危険が高い者にインフルエンザウイルスを伝染させることができる個体、例えば、6カ月未満の乳児を含むことになる家族を含む、高リスク個体がいる家族の構成員、6カ月未満の乳児と接触する個体、又は老人ホームもしくは他の長期介護施設に住む個体と接触する個体;長期にわたる肺、心臓、又は循環障害を有する個体;代謝性疾患(例えば、糖尿病)を有する個体;腎臓障害を有する個体;血液障害(貧血又は鎌状赤血球症を含む)を有する個体;弱くなった免疫系(医薬品、悪性腫瘍、例えば、癌、臓器移植、又はHIV感染に起因する免疫抑制を含む)を有する個体;長期アスピリン療法を受けている(そのため、インフルエンザに感染した場合、ライ症候群を起こす可能性が高い)小児。
【０４０３】
他の実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物の投与の対象には、以下の、生後6カ月以上の健康な個体が含まれる:4月から9月にかけて、例えば、熱帯地方及び南半球などの、インフルエンザの大発生が起こり得る外国及び地域に旅行する予定のある者;インフルエンザウイルスが蔓延している世界の地域から来た者を含む可能性がある大きな組織的観光団の一員として旅行する者;学校もしくは大学に通い、寄宿舎に住むか、もしくは施設環境に住む者;又は自分がインフルエンザで病気になる危険を減らしたい者。
【０４０４】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物の投与が禁忌である対象には、インフルエンザワクチン接種が禁忌である以下の任意の個体が含まれる:生後6カ月未満の乳児;及び免疫原性製剤の生産で用いられる卵、卵製品、又は他の成分に対してアナフィラキシー反応(ショックが続発することが多い呼吸困難を引き起こすアレルギー反応)を経験したことがある個体。ある実施態様では、本明細書に記載の活性化合物又は組成物の投与が、免疫原性製剤の生産で用いられる1以上の成分のために(例えば、卵又は卵製品の存在のために)禁忌である場合、該活性化合物又は組成物を、活性化合物又は組成物の投与を禁忌にする成分を含まない方法で生産することができる(例えば、該活性化合物又は組成物を、卵又は卵製品を使用しないで生産することができる)。
【０４０５】
いくつかの実施態様では、以下の患者集団の1つ又は複数に生ウイルスワクチンを投与しないことが望ましい場合がある:高齢者;生後6カ月未満の乳児;妊娠個体;1歳未満の乳児;2歳未満の小児;3歳未満の小児;4歳未満の小児;5歳未満の小児;20歳未満の成人;25歳未満の成人;30歳未満の成人;35歳未満の成人;40歳未満の成人;45歳未満の成人;50歳未満の成人;70歳を超える高齢者;75歳を超える高齢者;80歳を超える高齢者;85歳を超える高齢者;90歳を超える高齢者;95歳を超える高齢者;その年齢層でのアスピリン及び野生型インフルエンザウイルス感染と関連する合併症が理由で、アスピリンもしくはアスピリン含有医薬品を服用している小児及び若者(2〜17歳);喘息又は他の反応性気道疾患の病歴がある個体;重度のインフルエンザ感染の素因となり得る慢性の医学的基礎疾患を有する個体;ギランバレー症候群の病歴がある個体;発熱を伴う急性の重篤な疾患を有する個体;又は中程度もしくは重度の病気である個体。そのような個体については、本明細書に記載の不活化ウイルスワクチン、スプリットウイルスワクチン、サブユニットワクチン、ウイロソーム、ウイルス様粒子、又は非ウイルスベクターの投与が好ましい場合がある。ある実施態様では、生ウイルスワクチンを投与することが好ましい対象には、2〜17歳の健康な小児及び若者、並びに18〜49歳の健康な成人が含まれ得る。
【０４０６】
ある実施態様では、生ウイルスベクターを含む免疫原性製剤は、他の生ウイルスワクチンと同時に投与されない。
【０４０７】
(5.13  投与様式)
(5.13.1  送達経路)
本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、種々の経路によって対象に送達することができる。これらには、鼻腔内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、経皮、静脈内、結膜内、及び皮下経路が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、組成物は、局所投与用に、例えば、皮膚への塗布用に製剤化される。具体的な実施態様では、投与経路は、例えば、鼻スプレーの一部として、鼻腔内へのものである。ある実施態様では、組成物は、筋肉内投与用に製剤化される。いくつかの実施態様では、組成物は、皮下投与用に製剤化される。ある実施態様では、組成物は、注射による投与用には製剤化されない。生ウイルスワクチンのための具体的な実施態様では、ワクチンは、注射以外の経路による投与用に製剤化される。
【０４０８】
例えば、抗原がウイルスベクター、ウイルス様粒子ベクター、又は細菌ベクターである場合、ベクターが由来する骨格ウイルス又は細菌の天然の感染経路から免疫原性組成物を導入することが好ましいと考えられる。或いは、ポリペプチドが由来するインフルエンザウイルスの天然の感染経路からインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを導入することが好ましい場合がある。激しい分泌性及び細胞性免疫応答を誘導する抗原、特に、ウイルスベクターの能力を有利に用いることができる。例えば、ウイルスベクターによる気道の感染は、インフルエンザウイルスからの防御を同時に伴って、例えば、泌尿器系での強い分泌性免疫応答を誘導することができる。さらに、好ましい実施態様では、任意の好適な経路によって医薬組成物を肺に導入することが望ましい場合がある。肺投与は、例えば、吸入器又はネブライザー、及び噴霧剤として用いるためのエアゾール化剤を含む製剤の使用によって利用することもできる。
【０４０９】
具体的な実施態様では、サブユニットワクチンは、筋肉内投与される。別の実施態様では、生インフルエンザウイルス又はNDVワクチンは、鼻腔内投与される。別の実施態様では、不活化インフルエンザウイルスワクチン、又はスプリットインフルエンザウイルスワクチンは、筋肉内投与される。別の実施態様では、不活化NDVウイルスワクチン又はスプリットNDVウイルスワクチンは、筋肉内投与される。別の実施態様では、ウイルス様粒子又はその組成物は、筋肉内投与される。
【０４１０】
いくつかの実施態様では、インビトロでインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドで刺激された細胞は、当業者に公知の技術を用いて対象に導入(又は再導入)することができる。いくつかの実施態様では、該細胞は、真皮内に、真皮下に、又は末梢血流中に導入することができる。いくつかの実施態様では、対象に導入される細胞は、有害な免疫応答を回避するために、その対象に由来する細胞であることが好ましい。他の実施態様では、同様の免疫バックグラウンドを有するドナー宿主に由来する細胞を用いることもできる。有害な免疫原性応答を回避するように設計されたものを含む、他の細胞を用いることもできる。
【０４１１】
(5.13.2  投薬量及び投与頻度)
インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患の治療及び/又は予防で有効である活性化合物又は組成物の量は疾患の性質によって決まり、標準的な臨床技術で決定することができる。
【０４１２】
製剤で使用すべき正確な用量は、投与経路、及び感染又はそれに起因する疾患の重篤度によっても決まり、臨床医の判断及び各対象の状況に従って決定されるべきである。例えば、有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態(年齢、体重、健康を含む)、患者がヒトであるか動物であるかということ、投与される他の医薬品、及び治療が予防的であるか治療的であるかということによって異なってもよい。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物を治療することもできる。治療投薬量は、安全性及び有効性を最適化するために最適に調節される。
【０４１３】
ある実施態様では、最適な投薬量範囲の特定を助けるために、インビトロアッセイが用いられる。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られる、用量応答曲線から推定することができる。
【０４１４】
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする核酸の例示的な用量の範囲は、患者1人当たり、約10ng〜1g、100ng〜100mg、1μg〜10mg、又は30〜300μgの核酸、例えば、DNAである。
【０４１５】
ある実施態様では、(例えば、スプリットウイルスワクチン及びサブユニットワクチン中に提供される)インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの例示的な用量の範囲は、患者1キログラム当たり、約5μg〜100mg、15μg〜50mg、15μg〜25mg、15μg〜10mg、15μg〜5mg、15μg〜1mg、15μg〜100μg、15μg〜75μg、5μg〜50μg、10μg〜50μg、15μg〜45μg、20μg〜40μg、又は25〜35μgである。他の実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの例示的な用量の範囲は、1用量当たり、約1μg〜50mg、5μg〜50mg、1μg〜100mg、5μg〜100mg、15μg〜50mg、15μg〜25mg、15μg〜10mg、15μg〜5mg、15μg〜1mg、15μg〜100μg、15μg〜75μg、5μg〜50μg、10μg〜50μg、15μg〜45μg、20μg〜40μg、又は25〜35μgのインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。
【０４１６】
感染性ウイルスベクターの用量は、1用量当たり、ビリオン数が10〜100個、又はそれより多くまで様々であることができる。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターの好適な投薬量は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、又は1012pfuであり、必要とされるだけの間隔で、1回、2回、3回、又はそれより多くの回数、対象に投与することができる。
【０４１７】
ある実施態様では、VLPの例示的な用量の範囲は、患者1kg当たり、約0.01μg〜約100mg、約0.1μg〜約100mg、約5μg〜約100mg、約15μg〜約50mg、約15μg〜約25mg、約15μg〜約10mg、約15μg〜約5mg、約15μg〜約1mg、約15μg〜約100μg、約15μg〜約75μg、約5μg〜約50μg、約10μg〜約50μg、約15μg〜約45μg、約20μg〜約40μg、又は約25〜約35μgである。他の実施態様では、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの例示的な用量の範囲は、1用量当たり、約1μg〜約50mg、約5μg〜約50mg、約1μg〜約100mg、約5μg〜約100mg、約15μg〜約50mg、約15μg〜約25mg、約15μg〜約10mg、約15μg〜約5mg、約15μg〜約1mg、約15μg〜約100μg、約15μg〜約75μg、約5μg〜約50μg、約10μg〜約50μg、約15μg〜約45μg、約20μg〜約40μg、又は約25〜約35μgのインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドであり、必要とされるだけの間隔で、1回、2回、3回、又はそれより多くの回数、対象に投与することができる。
【０４１８】
一実施態様では、不活化ワクチンは、それが約5μg〜約50μg、約10μg〜約50μg、約15μg〜約100μg、約15μg〜約75μg、約15μg〜約50μg、約15μg〜約30μg、約20μg〜約50μg、約25μg〜約40μg、約25μg〜約35μgのインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むように製剤化される。そのようなワクチンは、1以上の異なるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、例えば、A型インフルエンザウイルス由来の1以上のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドとB型インフルエンザウイルス由来の1以上のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの組合せを含むことができる。いくつかの実施態様では、例えば、A/H1N1、A/H3N2、及びB血球凝集素ポリペプチドに由来するインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、0.5mL用量が各15μgのインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むように製剤化された、三価不活化ワクチン(TIV)に含まれる。一実施態様では、弱毒化生インフルエンザワクチン(LAIV)は、0.2mL用量が少なくとも1つのインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを発現する3種の株に由来する、106.5〜7.5蛍光焦点単位の弱毒化生インフルエンザウイルスを含むように製剤化される。
【０４１９】
ある実施態様では、活性化合物又は組成物は、単一用量として1回、対象に投与される。ある実施態様では、活性化合物又は組成物は、単一用量として、次いで3〜6週間後に2回目の用量として、対象に投与される。これらの実施態様に従って、2回目の接種の後に6〜12カ月間隔で、追加免疫接種を対象に投与することができる。ある実施態様では、追加免疫接種は、異なる活性化合物又は組成物を利用することができる。いくつかの実施態様では、同じ活性化合物又は組成物の投与を繰り返すことができ、投与は、少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なくとも6カ月の間隔を空けることができる。ある実施態様では、活性化合物又は組成物は、単一用量として1年に1回、対象に投与される。
【０４２０】
小児への投与のための具体的な実施態様では、少なくとも1カ月間隔で与えられる、活性化合物又は組成物の2用量が小児に投与される。成人への投与のための具体的な実施態様では、単一用量が与えられる。別の実施態様では、少なくとも1カ月間隔で与えられる、活性化合物又は組成物の2用量が成人に投与される。別の実施態様では、若年小児(6カ月〜9歳)には、1カ月間隔で与えられる2用量の活性化合物又は組成物を初めて投与することができる。特定の実施態様では、その最初のワクチン接種の年に1用量だけ投与された小児には、その翌年に2用量が投与されるべきである。いくつかの実施態様では、インフルエンザワクチン、例えば、本明細書に記載の免疫原性製剤を初めて投与される2〜8歳の小児には、4週間の間隔で投与される2用量が好ましい。ある実施態様では、3歳を超える対象に好ましい可能性がある0.5mlとは対照的に、生後6〜35カ月の小児には、半用量(0.25ml)が好ましい場合がある。
【０４２１】
特定の実施態様では、活性化合物又は組成物は、秋又は冬に、すなわち、各半球のインフルエンザシーズンの前又はその期間中に、対象に投与される。一実施態様では、2回目の用量をインフルエンザシーズンのピークの前に与えることができるように、小児には、該シーズンの初め、例えば、9月下旬又は10月初旬に1回目の用量が投与される。
【０４２２】
抗体による受動免疫について、投薬量の範囲は、患者の体重1kg当たり、約0.0001〜100mg、より一般的には0.01〜5mgである。例えば、投薬量は、体重1kg当たり、1mgもしくは10mg、又は1〜10mgの範囲、つまり、70kgの患者の場合、それぞれ、70mgもしくは700mg、又は70〜700mgの範囲であることができる。例示的な治療レジメンは、1年もしくは数年の間、又は数年間隔で、2週間毎に1回、又は月に1回、又は3〜6カ月毎に1回の投与を必要とする。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する2種以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、その場合、投与される各抗体の投薬量は示された範囲に含まれる。抗体は、通常、複数の機会に投与される。単一の投薬の間隔は、毎週、毎月、又は毎年であることができる。間隔は、患者でインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドに対する抗体の血液レベルを測定することにより示されるように、不規則であることができる。
【０４２３】
(5.14  生物学的アッセイ)
(5.14.1  インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの活性を試験するためのアッセイ)
本明細書に開示されているベクターでインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの発現を試験するためのアッセイは、当技術分野で公知の任意のアッセイを用いて実施することができる。例えば、ウイルスベクターへの組込みについてのアッセイは、この節又は第5.4節もしくは第5.5節に記載されているように、ウイルスを増殖させること、ショ糖クッションに通す遠心分離によってウイルス粒子を精製すること、及び当技術分野で周知の方法を用いるイムノアッセイ、例えば、ウェスタンブロットによるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド発現についてのその後の解析を含む。
【０４２４】
一実施態様では、本明細書に開示されているインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、当技術分野で公知の抗体抗原相互作用についての任意のアッセイを用いて、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド、例えば、該ポリペプチドの軸領域に対する中和抗体に特異的に結合するその能力を試験することにより、適切なフォールディング及び機能性についてアッセイされる。そのようなアッセイで用いられる中和抗体には、例えば、Ekiertらの文献(2009, Science Express, 2009年2月26日);Kashyapらの文献(2008, Proc Natl Acad Sci USA 105: 5986-5991);Suiらの文献(2009, Nature Structural and Molecular Biology, 16:265-273);Wangらの文献(2010, PLOS Pathogens 6(2): 1-9);米国特許第5,589,174号、第5,631,350号、第6,337,070号、及び第6,720,409号;国際公開WO 2007/134237号として公開された国際出願PCT/US2007/068983号;国際公開WO 2009/036157号として公開された国際出願PCT/US2008/075998号;国際公開WO 2008/028946号として公開された国際出願PCT/EP2007/059356号;及び国際公開WO 2009/079259号として公開された国際出願PCT/US2008/085876号に記載されている中和抗体が含まれる。これらの抗体には、とりわけ、CR6261、CR6325、CR6329、CR6307、CR6323、2A、D7、D8、F10、G17、H40、A66、D80、E88、E90、H98、C179(FERM BP-4517)、AI3C(FERM BP-4516)が含まれる。
【０４２５】
別の実施態様では、本明細書に開示されているインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、例えば、NMR、X線結晶学的方法、又は二次構造予測法、例えば、円二色性などの、当技術分野で公知の任意の方法を用いるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの構造又は立体構造の決定により、適切なフォールディングについてアッセイされる。
【０４２６】
(5.14.2  インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを用いて作製された抗体の活性を試験するためのアッセイ)
本明細書に記載の抗体は、当業者に公知の種々の方法(例えば、ELISA、表面プラズモン共鳴ディスプレイ(BIAcore)、ウェスタンブロット、免疫蛍光、免疫染色、及び/又は微量中和アッセイ)で特徴付けることができる。いくつかの実施態様では、抗体は、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド、又は該ポリペプチドを含むベクターに特異的に結合する能力についてアッセイされる。そのようなアッセイは、溶液中で(例えば、Houghtenの文献(1992, Bio/Techniques 13:412 421))、ビーズ表面で(Lamの文献(1991, Nature 354:82 84))、チップ表面で(Fodorの文献(1993, Nature 364:555 556))、細菌を用いて(米国特許第5,223,409号)、胞子を用いて(米国特許第5,571,698号;第5,403,484号;及び第5,223,409号)、プラスミドを用いて(Cullらの文献(1992, Proc Natl. Acad. Sci. USA 89:1865 1869))、又はファージを用いて(Scott及びSmithの文献(1990, Science 249:386 390);Cwirlaらの文献(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378 6382);及びFeliciの文献(1991, J. Mol. Biol. 222:301 310))実施することができる(その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている)。
【０４２７】
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する抗体の特異的結合及び他の抗原との交差反応性は、当技術分野で公知の任意の方法で評価することができる。特異的結合及び交差反応性を解析するために用いることができるイムノアッセイには、少し例を挙げれば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイなどの技術を用いる、競合的及び非競合的アッセイ系が含まれるが、これらに限定されない。そのようなアッセイはルーチンであり、かつ当技術分野で周知である(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、Ausubelら編の文献(1994,分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology), 1巻, John Wiley & Sons社, New York)を参照されたい)。
【０４２８】
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する抗体の結合親和性及び抗体抗原相互作用の解離速度は、競合的結合アッセイによって測定することができる。競合的結合アッセイの一例は、漸増する量の非標識抗原の存在下での標識抗原(例えば、3H又は125I)と関心対象の抗体とのインキュベーション、及び標識抗原に結合した抗体の検出を含むラジオイムノアッセイである。インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する抗体の親和性及び結合解離速度は、スキャッチャードプロット解析によるデータから測定することができる。二次抗体との競合もラジオイムノアッセイを用いて測定することができる。この場合、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、漸増する量の非標識二次抗体の存在下で、標識化合物(例えば、3H又は125I)と結合させた試験抗体とともにインキュベートされる。
【０４２９】
ある実施態様では、抗体結合親和性及び速度定数は、KinExA 3000システム(Sapidyne Instruments、Boise、ID)を用いて測定される。いくつかの実施態様では、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する抗体の結合及び解離速度を測定するために、表面プラズモン共鳴(例えば、BIAcore動態)解析を用いる。BIAcore動態解析は、その表面にインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する抗体が固定されたチップからのインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの結合及び解離を解析することを含む。典型的なBIAcore動態試験は、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドが固定されているセンサーチップ表面への、0.005％のTween20を含むHBS緩衝液中の様々な濃度の250μLの抗体試薬(mAb、Fab)の注入を含む。流速は、75μL/分で一定に保たれる。解離データは、必要に応じて15分間又はそれより長く収集される。各注入/解離サイクルの後、結合抗体は、希酸、通常、10〜100mM HClの短い1分間の投入を用いて、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド表面から除去されるが、状況が許せば、他の再生剤を用いる。より具体的には、結合速度kon及び解離速度koffの測定のために、ポリペプチドを、標準的なアミンカップリング化学、すなわち、EDC/NHS法(EDC＝N-ジエチルアミノプロピル)-カルボジイミド)を用いて、センサーチップ表面に直接固定する。簡潔に述べると、pH4又はpH5の10mM NaOAc中のポリペプチドの5〜100nM溶液を調製し、約30〜50RU相当のポリペプチドが固定されるまで、EDC/NHS活性化表面に流す。この後、1MのEt-NH2を注入して、未反応の活性エステルの「キャップ」を外す。参照目的のために、同一の固定条件下で、ポリペプチドを含まないブランク表面を調製する。適当な表面が調製されたら、抗体試薬のそれぞれの好適な希釈系列をHBS/Tween-20中に調製し、直列につながれたポリペプチドセル表面と参照セル表面の両方に流す。調製される抗体濃度の範囲は、平衡結合定数KDの推定値によって異なる。上記のように、結合した抗体は、適当な再生剤を用いて、各注入/解離サイクル後に除去される。
【０４３０】
抗体の中和活性は、当業者に公知の任意のアッセイを用いて決定することができる。本明細書に記載の抗体は、当業者に公知の技術を用いて、その宿主細胞受容体(すなわち、シアル酸)へのインフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを含む任意の他の組成物(例えば、VLP、リポソーム、もしくは洗剤抽出物)の結合を阻害するその能力についてアッセイすることができる。例えば、インフルエンザウイルス受容体を発現する細胞は、抗体の存在下又は非存在下でインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを含む組成物と接触させることができ、抗原の結合を阻害する抗体の能力は、例えば、フローサイトメトリー又はシンチレーションアッセイで測定することができる。インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを含む組成物、又は抗体は、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを含む組成物と細胞受容体との間の相互作用の検出を可能にするために、検出可能な化合物、例えば、放射性標識(例えば、32P、35S、及び125I)又は蛍光標識(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒド、及びフルオレサミン)で標識することができる。或いは、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドがその受容体に結合するのを阻害する抗体の能力は、無細胞アッセイで決定することができる。例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを含む組成物を抗体と接触させることができ、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを含む組成物が細胞受容体に結合するのを阻害する抗体の能力を決定することができる。具体的な実施態様では、抗体を固体支持体上に固定し、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを含む組成物を検出可能な化合物で標識する。或いは、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを含む組成物を固体支持体上に固定し、抗体を検出可能な化合物で標識する。ある実施態様では、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドが細胞受容体に結合するのを阻害する抗体の能力は、対照(例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドが細胞受容体に結合するのを阻害することが知られている抗体)と比べた、抗体の結合阻害率を評価することによって決定される。
【０４３１】
他の実施態様では、本明細書に記載の方法で用いるのに好適な抗体は、インフルエンザウイルスの受容体結合を阻害しないが、それでもなお本明細書に記載のアッセイで中和することが分かっている。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の方法に従って用いるのに好適な抗体は、当技術分野で公知又は本明細書に記載のアッセイでウイルスと宿主膜との融合を低減又は阻害する。
【０４３２】
一実施態様では、ウイルスと宿主膜との融合は、レポーターを含むインフルエンザウイルスと、ウイルスに感染することができる宿主細胞とを用いるインビトロアッセイでアッセイされる。レポーター活性が、陰性対照(例えば、対照抗体の存在下又は抗体の非存在下でのレポーター活性)と比較して阻害されるか又は低減する場合、抗体は融合を阻害する。
【０４３３】
一実施態様では、ウイルスと宿主膜との融合は、細胞融合のモデル系を用いて検出される。例示的な細胞融合アッセイでは、細胞(例えば、HeLa細胞)をインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするプラスミドでトランスフェクトし、抗体の存在下で血球凝集素ポリペプチド融合機能を可能にする緩衝液(例えば、pH5.0緩衝液)に接触及び曝露させる。抗体は、それが陰性対照(例えば、対照抗体の存在下又は抗体の非存在下でのシンシチウム形成)と比較してシンシチウム形成を低減又は阻害する場合、中和性である。
【０４３４】
他の実施態様では、ウイルスと宿主膜との融合は、インビトロでのリポソームに基づくアッセイを用いてアッセイされる。例示的なアッセイでは、宿主細胞受容体は、レポーターの半分を含むリポソームへと再構築される。インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、レポーターのもう半分を含む別の組のリポソームへと再構築される。2つのリポソーム集団を一緒に混合すると、融合は、レポーターの再構築、例えば、比色定量的に検出することができる酵素反応によって検出される。レポーター活性が、抗体の非存在下又は対照抗体の存在下で行われるアッセイでのレポーター活性と比較して低減するか又は阻害される場合、抗体は融合を阻害する。ある実施態様では、融合を阻害する抗体の能力は、対照の存在下での融合率と比べた、抗体の存在下での融合率を評価することによって決定される。
【０４３５】
(5.14.3  刺激された細胞の活性を試験するためのアッセイ)
本明細書に記載の方法に従って刺激された細胞は、例えば、関心対象のポリヌクレオチド又は遺伝子(複数可)の組込み、転写、及び/又は発現、組み込まれた遺伝子のコピー数、並びに組込みの位置について解析することができる。そのような解析は、いつでも実施することができ、かつ当技術分野で公知の任意の方法によって実施することができる。他の実施態様では、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドによる標的細胞の良好な刺激は、当技術分野で公知又は本明細書に記載の方法を用いて、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドに対する中和抗体の産生を検出することにより決定される。
【０４３６】
ある実施態様では、刺激された細胞、例えば、DCが投与される対象を、細胞の位置、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドをコードする、ベクターによって送達されるポリヌクレオチドもしくは遺伝子の発現、免疫応答の刺激(例えば、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドに対する中和抗体の産生)について解析し、かつ/又は当技術分野で公知もしくは本明細書に記載の任意の方法によって、インフルエンザウイルス感染もしくはそれと関連する疾患と関連する症状についてモニタリングすることができる。
【０４３７】
レポーターアッセイを用いて、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのターゲッティングの特異性を決定することができる。例えば、骨髄細胞の混合集団を対象から得て、インビトロで培養することができる。インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを骨髄細胞の混合集団に投与することができ、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと関連するレポーター遺伝子の発現を培養細胞でアッセイすることができる。いくつかの実施態様では、混合細胞集団中の刺激された細胞の少なくとも約50％、より好ましくは、少なくとも約60％、70％、80％、又は90％、さらにより好ましくは、少なくとも約95％は、樹状細胞である。
【０４３８】
(5.14.4  抗ウイルス活性アッセイ)
本明細書に記載の抗体又はその組成物は、抗ウイルス活性についてインビトロで評価することができる。一実施態様では、抗体又はその組成物は、インフルエンザウイルスの増殖に対するその効果についてインビトロで試験される。インフルエンザウイルスの増殖は、当技術分野で公知又は本明細書に記載の任意の方法で(例えば、細胞培養で)評価することができる。具体的な実施態様では、細胞は、0.0005及び0.001、0.001及び0.01、0.01及び0.1、0.1及び1、もしくは1及び10のMOI、又は0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、もしくは10のMOIで感染させられ、補充された無血清培地とともにインキュベートされる。ウイルス力価は、血球凝集素プラーク又は本明細書に記載の任意の他のウイルスアッセイによって上清中で測定される。ウイルス力価を評価することができる細胞としては、EFK-2細胞、Vero細胞、MDCK細胞、初代ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)、H292ヒト上皮細胞株、及びHeLa細胞が挙げられるが、これらに限定されない。インビトロアッセイには、当技術分野で周知又は本明細書に記載の方法を用いて、インビトロで、培養細胞におけるウイルス複製の変化(例えば、プラーク形成で測定される)、或いはウイルスタンパク質の産生(例えば、ウェスタンブロット解析で測定される)又はウイルスRNAの産生(例えば、RT-PCRもしくはノーザンブロット解析で測定される)を測定するものが含まれる。
【０４３９】
非限定的な例では、標的哺乳動物細胞株の単層を様々な量(例えば、3プラーク形成単位(pfu)又は5pfuの多重度)のウイルス(例えば、インフルエンザ)に感染させ、その後、様々な希釈の抗体(例えば、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、又は10μg/ml)の存在下又は非存在下で培養する。感染した培養物を感染から48時間後又は72時間後に回収し、適当な標的細胞株(例えば、Vero細胞)に対する当技術分野で公知の標準的なプラークアッセイによって力価を測定する。
【０４４０】
血球凝集アッセイの非限定的な例では、細胞を抗体と接触させ、同時に又はその後(例えば、1のMOIで)ウイルスに感染させ、ウイルス複製を可能にする条件下で(例えば、20〜24時間)ウイルスをインキュベートする。抗体は、感染の全過程で存在することが好ましい。次に、ウイルスの複製及びウイルス粒子の放出を、0.5％のニワトリ赤血球を用いる血球凝集アッセイで決定する。例えば、Kashyapらの文献(PNAS USA 105:5986-5991)を参照されたい。いくつかの実施態様では、化合物は、それが、ウイルス力価の約75％低下に相当する少なくとも2ウェルのHAだけウイルスの複製を低減させる場合、ウイルス複製の阻害剤とみなされる。具体的な実施態様では、阻害剤は、このアッセイで、ウイルス力価を50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、又は95％以上低下させる。他の具体的な実施態様では、阻害剤は、対象において、インフルエンザウイルス力価の約1log以上、約2log以上、約3log以上、約4log以上、約5log以上、約6log以上、約7log以上、約8log以上、約9log以上、約10log以上、1〜3log、1〜5log、1〜8log、1〜9log、2〜10log、2〜5log、2〜7log、2log〜8log、2〜9log、2〜10log、3〜5log、3〜7log、3〜8log、3〜9log、4〜6log、4〜8log、4〜9log、5〜6log、5〜7log、5〜8log、5〜9log、6〜7log、6〜8log、6〜9log、7〜8log、7〜9log、又は8〜9logの低下をもたらす。インフルエンザウイルス力価のlog低下は、陰性対照と比較したもの、別の治療と比較したもの、又は抗体投与前の患者における力価と比較したものであることができる。
【０４４１】
(5.14.5  細胞傷害性アッセイ)
当技術分野で周知の多くのアッセイを用いて、活性化合物又はその組成物への曝露後の細胞(感染もしくは未感染)又は細胞株の生存率を評価し、それにより、該化合物又は組成物の細胞傷害性を決定することができる。例えば、細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン(BrdU)の取込み(例えば、Hoshinoらの文献(1986, Int. J. Cancer 38, 369);Campanaらの文献(1988, J. Immunol. Meth. 107:79)を参照されたい)、(3H)チミジンの取込み(例えば、Chen, J.の文献(1996, Oncogene 13:1395-403);Jeoung, J.の文献(1995, J. Biol. Chem. 270:18367 73)を参照されたい)を測定することによるか、直接的な細胞カウントによるか、又は既知の遺伝子、例えば、癌原遺伝子(例えば、fos、myc)もしくは細胞周期マーカー(Rb、cdc2、サイクリンA、D1、D2、D3、Eなど)の転写、翻訳、もしくは活性の変化を検出することによってアッセイすることができる。そのようなタンパク質及びmRNA及び活性のレベルは、当技術分野で公知の任意の方法で測定することができる。例えば、市販の抗体を含む抗体を用いる公知の免疫診断方法、例えば、ELISA、ウェスタンブロッティング、又は免疫沈降によって、タンパク質を定量することができる。当技術分野で周知かつルーチンの方法を用いて、例えば、ノーザン解析、RNアーゼ保護、又は逆転写と関連したポリメラーゼ連鎖反応を用いて、mRNAを定量することができる。細胞生存率は、トリパンブルー染色又は当技術分野で公知の他の細胞生死マーカーを用いて評価することができる。具体的な実施態様では、細胞のATPレベルを測定して、細胞生存率を決定する。
【０４４２】
具体的な実施態様では、細胞生存率は、細胞内ATPレベルを測定する、当技術分野で標準的なアッセイ、例えば、CellTiter-Gloアッセイキット(Promega)を用いて、3日及び7日の期間で測定される。細胞ATPの低下は細胞傷害効果を示す。別の具体的な実施態様では、細胞生存率は、ニュートラルレッド取込みアッセイで測定することができる。他の実施態様では、形態変化の目視観察には、肥大、粒状度、ギザギザの縁を有する細胞、薄膜状の外観、円形化、ウェル表面からの剥離、又は他の変化が含まれ得る。こうした変化には、観察された細胞傷害性の程度に従って、T(100％毒性)、PVH(部分的毒性-非常に強い-80％)、PH(部分的毒性-強い-60％)、P(部分的毒性-40％)、Ps(部分的毒性-わずか-20％)、又は0(毒性なし-0％)という呼称が与えられる。50％細胞阻害(細胞傷害)濃度(IC50)は、これらのデータの回帰分析により決定される。
【０４４３】
具体的な実施態様では、細胞傷害性アッセイで用いられる細胞は、初代細胞及び細胞株を含む動物細胞である。いくつかの実施態様では、細胞はヒト細胞である。ある実施態様では、細胞傷害性は、以下の細胞株のうちの1つ又は複数で評価される:U937、ヒト単球細胞株;初代末梢血単核細胞(PBMC);Huh7、ヒト肝芽細胞腫細胞株;293T、ヒト胚性腎細胞株;及びTHP-1、単球細胞。ある実施態様では、細胞傷害性は、以下の細胞株のうちの1つ又は複数で評価される:MDCK、MEF、Huh 7.5、Detroit、又はヒト気管気管支上皮(HTBE)細胞。
【０４４４】
活性化合物又はその組成物は、動物モデルでインビボ毒性について試験することができる。例えば、活性化合物の活性を試験するために用いられる、本明細書に記載の動物モデル及び/又は当技術分野で公知の他のものを用いて、これらの化合物のインビボ毒性を測定することもできる。例えば、動物に様々な濃度の活性化合物を投与する。その後、この動物を、致死率、体重減少もしくは体重増加失敗、及び/又は組織損傷を示し得る血清マーカーのレベル(例えば、全般的な組織障害の指標としてのクレアチンホスホキナーゼレベル、肝障害の可能性の指標としてのグルタミン酸シュウ酸トランスアミナーゼ又はピルビン酸トランスアミナーゼのレベル)について経時的にモニタリングする。これらのインビボアッセイは、投薬量の他に、様々な投与様式及び/又はレジメンの毒性を試験するように適合させることができる。
【０４４５】
活性化合物の毒性及び/又は効力は、例えば、LD50(集団の50％に致死的な用量)及びED50(集団の50％で治療的に有効な用量)を決定するための、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、それは、比LD50/ED50と表すことができる。大きい治療指数を示す活性化合物が好ましい。毒性のある副作用を示す活性化合物を用いてもよいが、感染していない細胞に対する潜在的な障害を最小限に抑え、それにより、副作用を低下させるために、そのような薬剤を罹患組織の部位にターゲッティングする送達系を設計するよう、注意を払うべきである。
【０４４６】
細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトで用いるための活性化合物の投薬量の範囲を定める際に用いることができる。そのような薬剤の投薬量は、循環濃度の範囲内にあることが好ましく、この範囲には、ほとんど又は全く毒性のないED50が含まれる。投薬量は、利用される剤形及び利用される投与経路によって、この範囲内で異なり得る。本明細書に記載の方法で用いられるどの活性化合物についても、有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量を動物モデルで定めて、循環血漿濃度範囲を得ることができ、この循環血漿濃度範囲には、細胞培養で測定されるIC50(すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度)が含まれる。そのような情報を用いて、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーで測定することができる。投薬量の決定に関するさらなる情報が本明細書で提供される。
【０４４７】
さらに、当業者に公知の任意のアッセイを用いて、例えば、ウイルス感染又はそれと関連する状態もしくは症状を測定することにより、本明細書に記載の活性化合物及び組成物の予防的及び/又は治療的有用性を評価することができる。
【０４４８】
(5.14.6  インビボでの抗ウイルス活性)
活性化合物及びその組成物は、ヒトで用いる前に所望の治療的又は予防的活性についてインビボでアッセイすることが好ましい。例えば、インビボアッセイを用いて、活性化合物又はその組成物及び/又は別の療法を投与することが好ましいかどうかを決定することができる。例えば、インフルエンザウイルス疾患を予防するための活性化合物又はその組成物の使用を評価するために、動物をインフルエンザウイルスに感染させる前に組成物を投与することができる。或いは、又はさらに、動物をインフルエンザウイルスに感染させるのと同時に、活性化合物又はその組成物を動物に投与することができる。インフルエンザウイルス感染又はそれと関連する疾患を治療するための活性化合物又はその組成物の使用を評価するために、動物をインフルエンザウイルスに感染させた後に化合物又は組成物を投与することができる。具体的な実施態様では、活性化合物又はその組成物は、動物に2回以上投与される。
【０４４９】
活性化合物及びその組成物は、限定するものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、モルモットなどを含む動物モデル系で、抗ウイルス活性について試験することができる。具体的な実施態様では、活性化合物及びその組成物は、マウスモデル系で試験される。そのようなモデル系は広く用いられており、かつ当業者に周知である。具体的な実施態様では、活性化合物及びその組成物は、マウスモデル系で試験される。インフルエンザウイルスのための動物モデルの非限定的な例がこの節で提供される。
【０４５０】
一般に、動物をインフルエンザウイルスに感染させ、同時に又はその後に、活性化合物もしくはその組成物、又はプラセボで処置する。或いは、動物を、活性化合物もしくはその組成物、又はプラセボで処置し、その後、インフルエンザウイルスに感染させる。これらの動物から得られる試料(例えば、血清、尿、痰、精液、唾液、血漿、又は組織試料)は、当技術分野で周知の方法、例えば、ウイルス力価の変化(例えば、プラーク形成で測定される)、ウイルスタンパク質の産生(例えば、ウェスタンブロット、ELISA、もしくはフローサイトメトリー解析で測定される)、又はウイルス核酸の産生(例えば、RT-PCRもしくはノーザンブロット解析で測定される)を測定する方法によって、ウイルス複製について試験することができる。組織試料中のウイルスの定量のために、組織試料を、リン酸緩衝食塩水(PBS)中でホモジナイズし、透明になったホモジネートの希釈物を、細胞(例えば、Vero、CEF、又はMDCK細胞)の単層上へ37℃で1時間吸着させる。他のアッセイでは、組織病理学的評価、好ましくは、ウイルスが感染の標的にすることが知られている器官(複数可)の評価を感染後に実施する。ウイルス特異的モノクローナル抗体を用いて、ウイルス免疫組織化学検査を実施することができる。
【０４５１】
活性化合物もしくはその組成物が投与される感染対象におけるウイルスの力価、活性化合物もしくはその組成物が投与される感染対象の生存期間、活性化合物もしくはその組成物が投与される感染対象における免疫応答、活性化合物もしくはその組成物が投与される感染対象における症状の数、持続時間、及び/もしくは重症度、並びに/又は活性化合物もしくはその組成物が投与される感染対象における1以上の症状の開始までの時間が評価されるインビボアッセイを用いて、ウイルスの病原性に対する活性化合物又はその組成物の効果を決定することもできる。当業者に公知の技術を用いて、そのような効果を測定することができる。ある実施態様では、活性化合物又はその組成物は、未処置の対象と比べて、0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、もしくは1,000倍、又はそれより大きいインフルエンザウイルスの力価の低下をもたらす。いくつかの実施態様では、活性化合物又はその組成物は、未処置の対象と比べて、約1log以上、約2log以上、約3log以上、約4log以上、約5log以上、約6log以上、約7log以上、約8log以上、約9log以上、約10log以上、1〜3log、1〜5log、1〜8log、1〜9log、2〜10log、2〜5log、2〜7log、2log〜8log、2〜9log、2〜10log、3〜5log、3〜7log、3〜8log、3〜9log、4〜6log、4〜8log、4〜9log、5〜6log、5〜7log、5〜8log、5〜9log、6〜7log、6〜8log、6〜9log、7〜8log、7〜9log、又は8〜9logのインフルエンザウイルスの力価の低下をもたらす。
【０４５２】
インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス剤の試験用に開発された、インフルエンザウイルス動物モデル、例えば、フェレット、マウス、モルモット、リスザル、マカク、及びニワトリが記載されている。例えば、Sidwellらの文献(Antiviral Res., 2000, 48:1-16);Lowen A.C.らの文献(PNAS., 2006, 103:9988-92);及びMcCauleyらの文献(Antiviral Res., 1995, 27:179-186)及びRimmelzwannらの文献(Avian Diseases, 2003, 47:931-933)を参照されたい。インフルエンザのマウスモデルについて、インフルエンザ感染マウスに投与される活性化合物の抗ウイルス活性をアッセイするために用いることができるパラメータの非限定的な例としては、肺炎関連死、血清α1酸糖タンパク増加、動物体重、血球凝集素によってアッセイされる肺ウイルス、プラークアッセイによってアッセイされる肺ウイルス、及び肺の組織病理学的変化が挙げられる。統計解析を実施して、有意性(例えば、0.05以下のP値)を計算する。
【０４５３】
他のアッセイでは、動物モデル対象の感染後に、組織病理学的評価を行なう。鼻甲介及び気管を、上皮変化及び上皮下炎症について調べることができる。肺を、細気管支上皮の変化、及び大、中、小、又は末端細気管支における細気管支周囲炎症について調べることができる。肺胞を、炎症性変化についても評価する。中細気管支は、以下のように、0〜3+のスコアで等級付けられる:0(正常:繊毛性頂端境界及び基底偽重層核を有する中位から高い円柱状の上皮細胞により裏打ちされている;最小限の炎症);1+(輪郭が円柱状かつ均一で増殖がわずかに増加した上皮層;繊毛がなおも多くの細胞に見られる);2+(減弱から顕著な増殖までの範囲の上皮層における顕著な変化;破壊された細胞及び管腔境界での不規則な層輪郭);3+(著しく破壊され、無秩序になった上皮層、内腔には壊死細胞が見られる;減弱した細気管支もあれば、反応性増殖が顕著な細気管支もある)。
【０４５４】
気管は、以下のように、0〜2.5+のスコアで等級付けられる:0(正常:繊毛性頂端境界、基底偽重層核を有する中位から高い円柱状の上皮細胞により裏打ちされている。頂端境界と核との間に明らかな細胞質。時折見られる扁平上皮細胞の小さな増殖巣);1+(上皮層の限局的扁平上皮化生);2+(上皮層の大部分の広範囲の扁平上皮化生、繊毛は限局的に明白な場合がある);2.5+(明白な繊毛が極めて少ない広範囲の扁平上皮化生)。
【０４５５】
ウイルス免疫組織化学は、ウイルス特異的モノクローナル抗体(例えば、NP-、N-、又はHN-特異的モノクローナル抗体)を用いて行なわれる。染色は、以下のように、0〜3+に等級付けられる:0(感染細胞なし);0.5+(ほとんど感染細胞なし);1+(ほとんど感染細胞なし、広く離れた個々の細胞として);1.5+(ほとんど感染細胞なし、広く離れた単体として、及び小クラスターで);2+(通常、上皮層が裏打ちする細気管支の一部の、又は肺胞内の小さな小葉下病巣(sublobular foci)の、隣接細胞のクラスターを侵す、適度な数の感染細胞);3+(細気管支の上皮層の大部分を侵すか、又は肺胞内の大きな小葉下病巣に広がる、多数の感染細胞)。
【０４５６】
一例では、ウイルス感染の動物モデルで肺病変を誘導し、感染を引き起こす能力を、野生株ウイルス及び模擬ウイルスを用いて比較する。肺病変は、目視検査で健康である肺葉の割合として評価することができる。ペントバルビタールの静脈内投与によって感染5日後に動物を安楽死させ、その肺全体を取り出す。肉眼的病変に侵された各肺葉の表面の割合を目視で見積もる。割合を平均化して、各動物の7つの肺葉についての平均値を得る。他のアッセイでは、鼻スワブを検査して、ウイルス負荷量又は力価を測定することができる。検死時に鼻スワブを採取して、感染後のウイルス負荷量を測定することができる。
【０４５７】
一実施態様では、ウイルスを組織試料中で定量する。例えば、組織試料をリン酸緩衝食塩水(PBS)中でホモジナイズし、透明になったホモジネートの希釈物を、細胞(例えば、MDCK細胞)の単層上へ37℃で1時間吸着させる。次に、感染させた単層に、0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)、0.01％DEAE-デキストラン、0.1％NaHCO3、及び1％寒天を含む最小必須培地の溶液を重層する。プラークを可視化することができるまで、プレートを2〜3日インキュベートする。PR8感染試料由来のウイルスの力価を測定する(titrate)ための組織培養感染量(TCID)アッセイを以下のように実施する。96ウェルプレート中の細胞(例えば、MDCK細胞)のコンフルエントな単層を、培地中の透明になった組織ホモジネートの対数希釈物とともにインキュベートする。接種の2〜3日後に、血球凝集アッセイ(HAアッセイ)で、各ウェルからの0.05mlのアリコートをウイルス増殖について評価する。
【０４５８】
(5.14.6.1.1  ヒトでのアッセイ)
一実施態様では、インフルエンザウイルスの複製を調節する活性化合物又はその組成物を感染ヒト対象で評価する。この実施態様に従って、活性化合物又はその組成物をヒト対象に投与し、ウイルスの複製に対する活性化合物又は組成物の効果を、例えば、生物学的試料(例えば、血清又は血漿)中のウイルス又はウイルス核酸のレベルを解析することにより決定する。ウイルス複製を変化させる活性化合物又はその組成物は、対照で処置した対象又は対象群におけるウイルス複製のレベルを、活性化合物又はその組成物で処置した対象又は対象群におけるウイルス複製のレベルと比較することによって同定することができる。或いは、ウイルスの複製の変化は、活性化合物又はその組成物の投与の前後で対象又は対象群におけるウイルス複製のレベルを比較することによって同定することができる。当業者に公知の技術を用いて、生物学的試料を得て、mRNA又はタンパク質の発現を解析することができる。
【０４５９】
別の実施態様では、インフルエンザウイルス感染/疾患と関連する1以上の症状の重症度に対する活性化合物又はその組成物の効果を感染対象で評価する。この実施態様に従って、活性化合物もしくはその組成物又は対照をインフルエンザウイルス感染に罹患しているヒト対象に投与し、ウイルス感染の1以上の症状に対する活性化合物又は組成物の効果を決定する。1以上の症状を軽減する活性化合物又はその組成物は、対照で処置した対象を活性化合物又は組成物で処置した対象と比較することによって同定することができる。別の実施態様では、活性化合物又はその組成物を健康なヒト対象に投与し、ワクチンとしての効力についてモニタリングする(例えば、対象を、インフルエンザウイルス感染の症状の開始;対象に感染するインフルエンザウイルスの能力;並びに/又はインフルエンザウイルス感染と関連する1以上の症状の軽減/不在についてモニタリングする)。感染性疾患を熟知している医師に公知の技術を用いて、活性化合物又はその組成物がインフルエンザウイルス疾患と関連する1以上の症状を軽減するかどうか決定することができる。
【０４６０】
(5.15  キット)
本明細書に記載の医薬組成物の1以上の成分、例えば、本明細書で提供される1以上の活性化合物を充填した1以上の容器を含む医薬パック又はキットが本明細書で提供される。医薬又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する行政機関によって規定された形式での通知を、そのような容器(複数可)に任意で関連付けることができ、その通知は、この機関による、ヒト投与のための製造、使用、又は販売の承認を示している。
【０４６１】
本明細書に包含されるキットは、上記の方法で用いることができる。一実施態様では、キットは、1以上の容器中に、本明細書に記載の活性化合物、好ましくは1以上のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含む。ある実施態様では、キットは、本明細書に記載のワクチン、例えば、スプリットウイルスワクチン、サブユニットワクチン、不活化インフルエンザウイルスワクチン、又はインフルエンザ生ウイルスワクチンを含む。
【実施例】
【０４６２】
(6.  実施例)
(6.1  実施例1:インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド)
【表１１】
2013526849.tif 000138
2013526849.tif 000139
本実施例は、本明細書に記載の方法に従って調製することができる表8の有用なポリペプチドを提供する。
【０４６３】
本明細書で引用されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物又は特許出願が引用により組み込まれていることが具体的にかつ個別に示されているかのように、引用により本明細書に組み込まれている。上の発明は理解の明快さの目的のために図及び実施例によって少し詳細に記載されているが、本発明の教示に照らし、添付の請求項の精神又は範囲を逸脱することなく、一定の変更及び修正をそれに加えることができることが、当業者には容易に明らかであろう。
【図１Ａ】
2013526849.tif 000142
【図１Ｂ】
2013526849.tif 000143
【図１Ｃ】
2013526849.tif 000144
【図１Ｄ】
2013526849.tif 000145
【図１Ｅ】
2013526849.tif 000146
【図２Ａ】
2013526849.tif 000147
【図２Ｂ】
2013526849.tif 000148
【図３】
2013526849.tif 000149
【図４】
2013526849.tif 000150
【図５】
2013526849.tif 000151
【図６】
2013526849.tif 000152
【手続補正書】
【提出日】平成24年12月4日(2012.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013526849000001.app
【国際調査報告】
2013526849.tif 000153
2013526849.tif 000154