(57)【要約】【課題】患者に苦痛を与えることなく、簡単かつ便利に骨髄の間葉系幹細胞を分離し作製する骨形成剤及び製造方法を提供する。【解決手段】サブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞を有効成分として含有することを特徴とする骨形成剤及びその製造方法。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞を有効成分として含有することを特徴とする骨形成剤。
【請求項２】
投与が静脈注射によるものである請求項１に記載の骨形成剤。
【請求項３】
間葉系幹細胞がサブスタンスＰの投与後３日目に採取した血液から分離されたものである請求項１に記載の骨形成剤。
【請求項４】
サブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞を分離するステップを含むことを特徴とする骨形成剤の製造方法。
【請求項５】
投与が静脈注射によるものである請求項４に記載の骨形成剤の製造方法。
【請求項６】
間葉系幹細胞がサブスタンスＰの投与後３日目に採取した血液から分離されたものである請求項４に記載の骨形成剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サブスタンスＰ（Substance-P）の投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cells）を有効成分として含有する骨形成剤、及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
サブスタンスＰは、感覚ニューロン、マクロファージ、好酸球、内皮細胞、上皮細胞及び角膜細胞（例えば、角膜実質細胞と肉芽組織（granulation tissue））で発現される１１個のアミノ酸からなるニューロペプチドである。サブスタンスＰが造血調節に対する神経−免疫コミュニケーションに関与していることがいくつか報告されている。サブスタンスＰ神経繊維は骨髄基質に分布しており、サブスタンスＰは骨髄基質細胞の表面受容体ＮＫ−１を通して骨髄基質細胞を刺激して、骨髄基質細胞が供給者として造血促進に有効な幹細胞因子及びインターロイキン−１を生産する。
【０００３】
骨髄の間葉系幹細胞は骨、軟骨への分化が可能な細胞であり、骨形成を必要とする疾患研究に利用されている。従来の方法によると、間葉系幹細胞は患者の骨髄から直接分離されており、過程が複雑であった。また、そのような方法は頻繁に遂行することができなく、患者の痛みを伴う処置である。創傷のない正常な生理状態で、間葉系幹細胞は脂肪組織と翼状片（pterygium）のような骨髄以外の組織では検出されるが、末梢血液からはほとんど検出されない。
【０００４】
本発明者らの先行出願である韓国特許第１０−２００６−００３７１７６号公報（特許文献１）は、サブスタンスＰが骨髄から間葉系幹細胞を動員または増殖することができることを明らかにし、サブスタンスＰ及び／又はサブスタンスＰ処理により骨髄から動員された間葉系幹細胞を有効成分として含有する創傷治癒剤を開示している。
【０００５】
しかし、今まで、サブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞を分離し、これを骨形成剤として使用する用途については報告されたことがない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国特許第１０−２００６−００３７１７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明者らは、既存の患者の骨髄から間葉系幹細胞を直接分離する方法に代えて、患者に苦痛を与えることなく、簡単に且つ便利に骨髄の間葉系幹細胞を分離する方法について鋭意研究を行ってきた。その結果、サブスタンスＰを投与する場合、骨髄の間葉系幹細胞が血中に動員され、動員された間葉系幹細胞を血液から容易に分離し、前記分離した間葉系幹細胞を骨形成剤の有効成分として使用する場合、骨形成または骨再生に優れた効果を示すことを見出し、本発明の完成に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明の第１の目的は、サブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞を有効成分として含有する骨形成剤を提供することである。
【０００９】
本発明の第２の目的は、サブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞を分離するステップを含む骨形成剤の製造方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係るサブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞を有効成分として含有する骨形成剤及びその製造方法は、既存の患者の骨髄から間葉系幹細胞を直接分離する方法と違って、患者に苦痛を与えることなく、簡単に且つ便利に骨髄の間葉系幹細胞を分離することができる。また、既存の骨髄から直接分離した間葉系幹細胞と同等の骨形成能を示すので、血液から分離した細胞によっても骨形成または骨再生が可能であることを初めて明らかにした。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ウサギへのサブスタンスＰの静脈注射後、血液から分離された間葉系幹細胞をヌードマウスに移植し、１０週後に分離した移植物の骨形成を観察した写真である（ピンク：コラーゲン（骨基質）、Ａ：脂肪組織、Ｈ：骨髄組織、濃紫色：繊維組織）。
【図２】図２は、図１の高解像度写真である。
【図３】図３は、ウサギへのサブスタンスＰの静脈注射後、血液から分離した間葉系幹細胞をヌードマウスに移植し、１０週後に分離した移植物にウサギのコラーゲンと反応する抗体を処理し、染色した結果を示す写真である。
【図４】図４は、ウサギのコラーゲンと反応する抗体をマウスの正常皮膚組織に処理し、染色した結果を示す写真である（青色：コラーゲン、赤色：細胞質）。
【図５】図５は、ウサギ骨髄から直接分離した間葉系幹細胞をヌードマウスに移植し、１０週後に分離した移植物の骨形成可否を観察した写真である（ピンク色：コラーゲン（骨基質）、薄紫色：残留ＨＡ−ＴＣＰ）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第１の態様は、サブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞を有効成分として含有する骨形成剤に関するものである。
【００１３】
本発明の第２の態様は、サブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞を分離するステップを含む骨形成剤の製造方法に関するものである。
【００１４】
本発明者らは、以前の研究（韓国特許第１０−２００６−００３７１７６号公報）で、実験動物に創傷（例えば、角膜熱傷）を負わせずにサブスタンスＰを静脈注射した場合にも、多くのＣＤ２９＋間葉系幹細胞が末梢血液へ動員されていることを見出した。また、本発明者らは、間葉系幹細胞の骨髄からの放出メカニズムを明らかにするもの、即ち、試験管内３−Ｄコラーゲンゲル内でサブスタンスＰが基質分解酵素を誘導してこれらの阻害剤を阻害することによって骨髄から間葉系幹細胞の放出を促進することを明らかにした。
【００１５】
具体的には、本発明者らは創傷微小環境で見つけられた他の因子らとは別にサブスタンスＰの全身的影響を調べるために、サブスタンスＰを創傷のないマウスに静脈注射し、ＣＤ２９＋間葉系幹細胞の末梢血液への動員を調べた。その結果、サブスタンスＰを静脈注射したマウスでは、注射しないマウスに比べて約１５倍多くのＣＤ２９＋間葉系幹細胞が末梢血液へ動員されたことが確認された。その結果から、本発明者らはサブスタンスＰが創傷治癒過程の初期に発現されて、間葉系幹細胞を骨髄から血中に動員させ、最終的に角膜創傷部位に供給して、角膜修復を促進する役割を担うと結論づけた。
【００１６】
以降の研究を通して、本発明者らはサブスタンスＰ投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞を血液から分離し、ヌードマウスの背中の皮下に移植した。その結果、本発明者らはコラーゲンからなる骨基質が実際に生成されたことを確認した。即ち、本発明は、血液から分離した間葉系幹細胞によって骨形成または骨再生が可能であることを初めて明らかにした。
【００１７】
本発明において、骨髄から間葉系幹細胞を血中に動員させるためのサブスタンスＰの投与は、静脈注射、皮下注射、内皮注射、又は筋肉注射などの注射が好ましく、特に静脈注射により投与されるのが最も好ましい。
【００１８】
本発明において、骨髄から間葉系幹細胞を血中に動員させるのに有効なサブスタンスＰの投与量は、０．１〜１０００μｇ／ｋｇ、好ましくは、０．１〜１００μｇ／ｋｇである。しかし、本発明はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００１９】
また、本発明において、サブスタンスＰの投与後、骨髄の間葉系幹細胞が血中に動員される時期は、投与後２日目〜４日目であり、好ましくは、投与後３日目である。それ故に、この時血液を採取し、間葉系幹細胞を分離することが好ましい。
【００２０】
本発明の骨形成剤は、有効成分としてサブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞を含有し、更に、代用骨（骨格）を含有していてもよい。一具体例で、間葉系幹細胞は代用骨に接着またはロードされた状態で使用することができる。本発明で使用できる代用骨は市販のものであってもよい。特に、セラミック系材料が好ましい。セラミック系材料の例は、リン酸三カルシウムヒドロキシアパタイト（（hydroxyapatite  tricalcium phosphate）ＨＡ−ＴＣＰ）である。
【００２１】
具体的には、本発明者らは、サブスタンスＰをウサギの静脈に５ｎｍｏｌｅ／ｋｇで、２回注射（１回／日）し、３日目に血液を採取した。パーコール勾配遠心分離を利用して血液中の赤血球を除去した後、分離された単核球細胞を約２週間培養した。培養時間が長くなるにつれて、間葉系幹細胞の数は増えたが、最初に共存していた白血球は全て除去された。２週間後、間葉系幹細胞だけが残った。これら細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで処理して分離した後、細胞数を数えた。
【００２２】
２×１０6個の間葉系幹細胞をＨＡ−ＴＣＰ４０ｍｇが入っているチューブに入れて混合した後、１時間、３７℃で培養した。１時間培養の間、均一に混合されるように１０分に一回ずつチューブを穏やかにたたくか揺すり、細胞がＨＡ−ＴＣＰの表面に付着するようにした。
【００２３】
動物モデルとしてはヌードマウスを用い、マウスの背中の皮下に間葉系幹細胞が付着されたＨＡ−ＴＣＰを移植した。移植物の分離時期（即ち、骨形成有無観察時期）は、移植後８週以上とし、好ましくは１０週以上である。マウスの背中から移植物を分離し、４％パラホルムアルデヒドに入れ、３日間固定した。固定後、カルシウム除去のために０．２５Ｍ  ＥＤＴＡに３週間いれ、ＥＤＴＡは１週間に３回ずつ交換した。カルシウム除去後、組織をパラフィンブロックのように作製し、４μｍの厚さになるように縦方向に切断した。十分に乾燥した後、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ／Ｅ）染色を行い組織学的形態を確認した。
【００２４】
その結果を図１及び図２に示す。具体的には、図１は、分離した移植物の骨形成を観察した写真であり（ピンク色：コラーゲン（骨基質）、Ａ：脂肪組織、Ｈ：骨髄組織、濃紫色：繊維組織）である。図２は、図１の高解像度写真である。ピンク色のコラーゲンの大規模な形成から、骨形成が大幅に起こっていることが分かった。
【００２５】
次いで、生成された骨が実際にウサギ起源細胞によるものであるかを確認した。骨基質が移植された細胞により形成されたものであれば、骨の基質はウサギ抗体と反応するはずである。その他の脂肪組織、骨髄組織、繊維組織等は反応しないはずである。これを確認するために、分離した移植物に、ウサギのコラーゲンと反応する抗体を処理して染色した。その結果を図３に示す。図３で示されるように、骨基質だけがこの抗体により染色され、周辺組織は染色されなかったことを確認することができた。
【００２６】
更に、同じ抗体をマウスの正常皮膚組織に処理して染色した。その結果を図４に示す。図４で示されるように、マウスの正常皮膚組織にはコラーゲンが存在するにもかかわらず（右側写真）、ウサギのコラーゲンと反応する抗体を処理しても当該マウスのコラーゲンとは反応しないことが証明された（左側写真）（青色：コラーゲン、赤色：細胞質）。
【００２７】
このような結果から、図３の染色に用いた抗体は、ウサギにだけ特異的に反応する抗体であることが分かった。更に、分離された移植物の骨基質は移植した細胞から生成されたことが再度確認された。
【００２８】
その上、本発明者らは、本発明に係るサブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞が、既存の骨髄から直接分離した間葉系幹細胞と同等の骨形成能を示すのかを確認するために、ウサギの骨髄から直接間葉系幹細胞を分離し、前記と同様の実験を行った。
【００２９】
具体的には、骨髄洗浄及び吸引によりウサギの脛骨から間葉系幹細胞を分離し、間葉系幹細胞培養培地（ＭＳＣＧＭ）で培養した。前記と同じ方式で、ＨＡ−ＴＣＰと当該間葉系幹細胞を混合し、ヌードマウスの背中の皮下に移植した。移植後１０週後に移植物を分離し、Ｈ／Ｅ染色を行い組織学的形態を確認した。その結果を図５に示す（ピンク色：コラーゲン（骨基質）、薄紫色：残留ＨＡ−ＴＣＰ）。
【００３０】
図１と図５の比較により、サブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞が、既存の骨髄から直接分離した間葉系幹細胞と同等の骨形成能を示すことが分かった。
【００３１】
以上のことから、サブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞は、骨形成剤の有効成分として使用することができる。本発明の骨形成剤において、間葉系幹細胞の有効用量は、代用骨４０ｍｇ当たり２×１０5〜２×１０7細胞であり、好ましくは１×１０6〜３×１０6細胞、最も好ましくは２×１０6細胞である。しかし、これらの用量は患者の骨疾患のサイズ及び程度に応じて、また、体重、年齢、性別などに応じて増減できる。
【００３２】
本発明に係る骨形成剤は各種骨折、骨壊死疾患または骨再生に利用することができる。一具体例では、本発明の骨形成剤を修復しようとする骨疾患と同じ程度に、患者の皮下に移植することができる。移植後、８週、好ましくは１０週後に移植物を分離し、患者の修復しようとする骨疾患部位に挿入することによって骨疾患を效果的に治療するできる。
【００３３】
このように、本発明に係るサブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞を有効成分として含有する骨形成剤及びその製造方法は、既存の患者の骨髄から間葉系幹細胞を直接分離する方法と違って、患者に苦痛を与えることなく、簡単に且つ便利に骨髄の間葉系幹細胞を分離することができる。更に、本発明に係る骨形成剤は既存の骨髄から直接分離した間葉系幹細胞と同じ程度の骨形成能を示し、血液から分離した細胞によっても骨形成または骨再生が可能であること初めて明らかにした。
【００３４】
以下、本発明を下記実施例に基づいてより具体的に説明する。しかし、これらの実施例は本発明に対する理解を助けるためだけの例であり、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１：サブスタンスＰ投与後、血液から間葉系幹細胞の分離及び培養
サブスタンスＰ（Calbiochem）を１月齢ウサギの静脈に、５ｎｍｏｌｅ／ｋｇで２回注射（１回/日）し、３日目に血液を採取した。パーコール勾配遠心分離を利用して血液内の赤血球を除去し、分離した単核球細胞を２週間培養した。培養時間が長くなるにつれて、間葉系幹細胞の数は増えたが、最初に共存していた白血球は全て除去された。２週後、間葉系幹細胞だけが残った。これら細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで処理して分離した後、各細胞数を数えた。
【００３６】
２×１０6個の間葉系幹細胞をＨＡ−ＴＣＰ４０ｍｇが入っているチューブに入れて混合した後、１時間、３７℃で培養した。１時間培養の間、均一に混合されるように１０分に一回ずつチューブを穏やかにたたくか揺すり、細胞がＨＡ−ＴＣＰの表面に付着するようにした。
【００３７】
実施例２：骨形成能の確認
生後６週齢の雌性ヌードマウスを、温度２２±２℃、相対湿度４０〜６０％の飼育条件で、同じ標準飼料と水分を供給し、１週間環境に適応させた後、実験に用いた。マウスの背中の皮下に実施例１で製造された間葉系幹細胞が付着されたＨＡ−ＴＣＰを移植した。移植後１０週目に、骨形成の有無を観察するために、マウスの背中に移植した移植物を分離した。分離した移植物を４％パラホルムアルデヒドに入れ、３日間固定した。固定後、カルシウム除去のために、０．２５Ｍ  ＥＤＴＡに３週間入れ、ＥＤＴＡは１週間に３回ずつ交換した。カルシウム除去後、組織をパラフィンブロックのように作製し、４μｍの厚さになるように縦方向に切断した。十分に乾燥した後、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ／Ｅ）染色を行い組織学的形態を確認した。
【００３８】
その結果を図１及び図２に示す。具体的には、図１は分離した移植物の骨形成可否を観察した写真である（ピンク：コラーゲン（骨基質）、Ａ：脂肪組織、Ｈ：骨髄組織、濃紫色：繊維組織）。図２は図１の高解像度写真である。ピンク色のコラーゲンの大規模な形成から、骨形成が大幅に起こっていることが分かった。
【００３９】
次いで、生成された骨が実際にウサギ起源細胞によるものであるか否かを確認した。骨基質が移植された細胞により形成されたものであれば、骨の基質はウサギ抗体と反応するはずである。その他の脂肪組織、骨髄組織、繊維組織等は反応しないはずである。これを確認するために、分離した移植物に、ウサギのコラーゲンと反応する抗体を処理して染色した。その結果を図３に示す。図３で示されるように、骨基質だけがこの抗体により染色され、周辺組織はそうでないことを確認することができた。
【００４０】
更に、同じ抗体をマウスの正常皮膚組織に処理して染色した。その結果を図４に示す。図４で示されるように、マウスの正常皮膚組織にはコラーゲンが存在するにもかかわらず（右側写真）、ウサギのコラーゲンと反応する抗体を処理してもマウスのコラーゲンとは反応しないことが証明された（左側写真）（青色：コラーゲン、赤色：細胞質）。
【００４１】
このような結果から、図３の染色に用いた抗体は、ウサギにだけ特異的に反応する抗体であることが分かった。更に、分離された移植物の骨基質は移植した細胞から生成されたことを再度確認することができた。
【００４２】
実施例３：骨髄から直接分離した間葉系幹細胞の骨形成能の確認
１月齢ウサギの脛骨から骨髄洗浄及び吸引によりウサギの脛骨から間葉系幹細胞を分離し、間葉系幹細胞培養培地（ＭＳＣＧＭ）で培養した。前記と同じ方法で、前記間葉系幹細胞とＨＡ−ＴＣＰと混合し、ヌードマウスの背中の皮下に移植した。移植後１０週後に移植物を分離し、Ｈ／Ｅ染色を行い組織学的形態を確認した。その結果を図５に示す（ピンク色：コラーゲン（骨基質）、薄紫色：残留ＨＡ−ＴＣＰ）。
【００４３】
図１と図５の比較により、サブスタンスＰの投与により骨髄から血中に動員された間葉系幹細胞が、既存の骨髄から直接分離した間葉系幹細胞と同等の骨形成能を示していることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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