(57)【要約】本発明は、発芽誘導物質と抗菌剤とを含む消毒組成物であって、前記発芽誘導物質が、前記抗菌剤からの攻撃に対する病原体の感受性を増加させ、かつ、前記抗菌剤が、前記発芽誘導物質を阻害しない、消毒組成物、を提供する。本発明は、そのような消毒組成物を含む消毒ワイプ、ハンドウォッシュまたは塗布剤、および、そのような組成物を用いて表面を滅菌する方法、も提供する。
2013519720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発芽誘導物質と抗菌剤とを含む消毒組成物であって、前記発芽誘導物質が、前記抗菌剤からの攻撃に対する病原体の感受性を増加させ、かつ、前記抗菌剤が、前記発芽誘導物質を阻害しない、消毒組成物。
【請求項２】
前記発芽誘導物質が、タウロコール酸塩と少なくとも２種類のアミノ酸とを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タウロコール酸塩が、タウロコール酸ナトリウムであり、かつ、前記少なくとも２種類のアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グリシンおよびバリンである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記細菌性病原体が、Ｃ．ディフィシル（C. difficile）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus；ＭＲＳＡ）、大腸菌（E. coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）から選択される病原体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗菌剤が、塩化ベンジルコニウム（benzylkonium chloride）とベンジルアルコー
ルとを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記発芽誘導物質が、最終組成物を基準に、１から１０ｍＭまでの量で提供され、かつ、前記抗菌剤が、０．０１％から２％までの量で提供される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
液体、ゲル、泡、スプレーまたは錠剤の形の、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物をしみ込ませた織物、メッシュまたはガーゼタイプの材料を含む、消毒ワイプ。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物を含む、消毒ハンドウォッシュ、または非生物表面をコーティングするための塗布剤もしくはラッカー。
【請求項１０】
本質的に病原体フリーとなるよう表面を滅菌する方法であって、前記表面を、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物または請求項８に記載の消毒ワイプもしくは請求項８に記載の塗布剤と、前記病原体が発芽し殺傷されるのに十分な時間にわたり接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性を有する組成物およびかかる組成物を用いて表面を殺菌する方法に関する。より詳細には、本発明は、芽胞形成病原体に対し、効果的な抗菌活性を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えばＣ．ディフィシル（C. difficile）などの芽胞形成病原体は重要な感染性因子である。Ｃ．ディフィシルは、英国では院内下痢症の主要原因であり、英国の病院におけるかなりの数の死の原因となっている。最近の数字は、Ｃ．ディフィシル感染における症例数の減少を示している。しかしながら、この減少にもかかわらず、Ｃ．ディフィシルの症例はそれでもＭＲＳＡに比べるとほぼ１０倍も多くある。ＰＣＲリボタイプ０２７は、現在、Ｃ．ディフィシル患者から単離される最も一般的なリボタイプであり、その後にリボタイプ１０６および００１が続く。
【０００３】
感染患者は、大量のＣ．ディフィシル芽胞および細胞を、感染巣としての機能を果たす環境中へと排出する。したがって、患者は、通常、この生物を、この汚染環境からのその芽胞の摂取により獲得する。ひとたび摂取されれば、それら芽胞は、胃の酸性環境を生き抜き、胃腸管へと通過することができ、そこでそれらが発芽して栄養細胞となり、感受性の高い患者において疾患を引き起こし得るトキシンＡおよびＢを産生する。
【０００４】
芽胞の発芽は不可逆的プロセスであり、そこでは、耐性の高い休眠芽胞が、代謝的に活性な細胞へと変わる。発芽は、いくつかの段階を経て起こる。まず初めに、細胞膜上の発芽誘導物質受容体の結合により活性化される。次いで、この後に、耐熱性の減少、ならびに、カリウム、水素およびナトリウムならびにカルシウムとジピコリン酸（ＤＰＡ）との複合体などの種々の陽イオンの減少が続く。これは、結果として芯部の部分的再水和をもたらすが、しかしながら、この生物は、その皮層が分解されるまで、完全には水和されない。皮層が加水分解するにつれ、小さい酸性の可溶性タンパク質が分解され、細胞の代謝活性が再開される。
【０００５】
Ｃ．ディフィシルはグリシンとタウロコール酸塩との組み合わせを含む発芽溶液への曝露により刺激されて芽胞形成し得る、とのことが当該分野において知られている。芽胞状態からの遷移によって、これらの病原体は、例えばクロルヘキシジンなどの抗細菌剤からの攻撃に感受性となる。先行技術の目的は、発芽の後の病原体の感受性を利用する、発芽／駆除プロトコルをデザインすることであった。そのプロトコルを図１に示す。具体的に言えば、先行技術においては、発芽を刺激し、かつ、その発芽した病原体を攻撃するための抗細菌剤を有する抗細菌性溶液をデザインする、という試みがなされてきた。しかしながら、こうしたアプローチで用いられる抗細菌剤は発芽用溶液に対して阻害効果を有するため、発芽／駆除アプローチは臨床現場における成功を制限するものであった。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、これらの課題を克服し、かつ、臨床的に重要な病原体に対して効果的である、代替的な抗菌性組成物を提供することである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の発明者らは、アミノ酸（複数）とタウロコール酸ナトリウムとの組み合わせを含む特定の組成物が、グリシンのみとタウロコール酸塩とを組み合わせた先行技術組成物に比べて、向上した芽胞形成活性を有する、とのことを見出した。さらに、発明者らは、特定の抗菌剤が、その組成物中で防腐剤としての機能を果たしながらも、発芽した芽胞を
効果的に殺傷することができる、とのことを発見した。これらの薬剤は、発芽／駆除アプローチにおいて用いられる先行技術抗菌剤において観察された、病原体の発芽に対する阻害効果を有しない。
【０００８】
さらに、本発明の発明者らは、本発明の組成物が、Ｃ．ディフィシルの芽胞からの栄養細胞の形成を刺激するだけでなく、Ｃ．ディフィシルの栄養細胞の芽胞形成の妨げをもする、とのことを見出した。これは臨床環境において特に有利である。入院患者の排泄物中には多数の栄養細胞（芽胞も同様）が排出される。これら栄養細胞は最終的には芽胞形成することとなり、そうなると、それら芽胞は、疾患を伝播させる媒介体としての機能を果たす。これらの細胞を栄養型に保つことが好ましい。これは、これらが、偏性嫌気性であるために空気によって、または、病院において使用される一般的な硬質表面殺菌剤によって、自然に殺菌されることとなるからである。したがって、本発明の組成物には、二通りの攻撃がある。すなわち、第一に、芽胞（pores）を栄養細胞へと変えること、および、
第二に、栄養細胞を栄養型に保持すること、である。
【０００９】
第一の態様においては、本発明は、発芽誘導物質と抗菌剤とを含む消毒組成物であって、前記発芽誘導物質が、前記抗菌剤からの攻撃に対する病原体の感受性を増加させ、かつ、前記抗菌剤が、前記発芽誘導物質を阻害しない、消毒組成物、を提供する。
【００１０】
第二の態様においては、本発明は、本発明の組成物をしみ込ませた織物、メッシュまたはガーゼタイプの材料を含む、消毒ワイプを提供する。第三の態様においては、本発明は、消毒ハンドウォッシュ、または非生物表面上のコーティングのための塗布剤であって、本発明の組成物を含むハンドウォッシュまたは塗布剤、を提供する。
【００１１】
第四の態様においては、本発明は、本質的に病原体フリーとなるよう表面を殺菌する方法であって、前記表面を、本発明の組成物または本発明の組成物を含む抗菌ワイプもしくは塗布剤と、前記病原体が発芽し殺傷されるのに十分な時間にわたり接触させることを含む方法、を提供する。
【００１２】
本発明の消毒組成物は、抗菌剤と組み合わせた発芽誘導物質を含む。この発芽誘導物質は、少なくとも２種類のアミノ酸から選択される。好ましくは、これらのアミノ酸は、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グリシンの組み合わせである。より好ましくは、アミノ酸の組み合わせは、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グリシンおよびバリンである。この特定の組み合わせのアミノ酸は、細菌芽胞に対する発芽効果が増加するため特に有利であるとのことが発明者らにより示されている。
【００１３】
発芽誘導物質は、芽胞の効率的芽胞形成を刺激するのに適した量で提供される。好ましくは、発芽誘導物質は、最終組成物を基準に、１から１０ｍＭまでの量で提供される。発芽誘導物質溶液内の成分であるアミノ酸は、５０ｍＭ（ヒスチジン）、５０ｍＭ（グリシン）、５０ｍＭ（アルギニン）、５０ｍＭ  １：５０（バリン）および５０ｍＭ（アスパラギン酸）という量で提供されてもよい。
【００１４】
抗菌剤は、病原体が観察される表面とのその接触に際して病原微生物を殺傷するのに効果的である薬剤である。好ましくは、抗菌剤は、病原体が芽胞形成の後の発芽状態にあるときに、効果的なものであるか、または、病原体を殺傷するものである。抗菌剤は、また、芽胞を形成しない病原体を殺傷するのに効果的なものであってもよい。
【００１５】
好ましくは、抗菌剤は、塩化ベンザルコニウムとベンジルアルコールとの組み合わせである。当該消毒組成物における、塩化ベンザルコニウムのベンジルアルコールに対する比は、１：５０である。抗菌剤は、（消毒組成物中の抗菌剤の総量に対して）０．０１％か
ら２％までの量で提供される。
【００１６】
当該消毒組成物は、臨床環境において表面を殺菌するための使用に必要な形で提供されてもよい。好ましくは、かかる表面は非生物表面である。あるいは、この表面は、患者、医師または介護者の皮膚であってもよい。好ましくは、当該組成物は、処理を必要とする表面に都合よく適用することができる、液体、ゲル、泡またはスプレーの形で提供される。さらなる一実施形態では、当該消毒組成物をしみ込ませた織物、メッシュまたはガーゼタイプの材料を含む、抗菌ワイプが提供される。当該組成物は、また、錠剤の形で提供されてもよい。このような錠剤の形は、適切な量の水に溶解してもよく、また、その結果として生じる溶液は、例えば広い表面積を清掃するなどの際に、病院の清掃員により殺菌剤として使用されてもよい。当該表面が人間の皮膚である実施形態の場合には、当該消毒組成物は、ハンドウォッシュまたはワイプの形であってもよい。好ましくは、当該消毒組成物は、処理しようとする表面に塗布することができる、塗布剤の形である。ひとたび乾燥すると効果的がなくなり、また、ある特定の長さの時間を経た後に抗菌剤によって発芽用物質の阻害へと導かれる先行技術消毒薬に比べると、このような塗布剤は、ひとたび乾燥すれば、より長期間にわたり病原体を殺傷するのに効果的であるため、特に有利である。さらにより好ましくは、この消毒薬は、それが適用された表面において硬質フィルムを形成し、容易には拭き取られない、ラッカーの形である。
【００１７】
本発明の消毒組成物は、通常、広範囲の病原体から表面を衛生的にすることができる。この組成物は、芽胞形成細菌に対して特に効果的である。そのような芽胞形成細菌の一例がＣ．ディフィシルである。しかしながら、この組成物は、例えばＭＲＳＡ、緑膿菌（P.
aeurginosa）、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）およびＡ．ニガー（A．niger）などの、他の病原体に対しても効果的であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
以下は、本発明を実施する方法の、単に例を挙げての、添付の図および表を参照しての説明であり、その図および表は次の通りである：
【００１９】
【図１】図１は、先行技術において用いられる発芽／駆除プロトコルを模式的に示す。
【図２】図２は、種々の発芽誘導物質溶液に１時間曝露し、その後、１０分間熱ショックを与えたＣ．ディフィシルＮＣＴＣ１１２０４芽胞のＣＦＵ／ｍＬの対数減少値を示す。
【図３】図３は、各アミノ酸発芽誘導物質溶液への１時間の曝露とその後の７０℃での１０分間の熱ショックの後のＣ．ディフィシルＮＣＴＣ１１２０４芽胞のＣＦＵ／ｍＬの対数減少値を示す。
【図４】図４は、リボタイプ０２７、００１、１０６およびＮＣＴＣ１１２０４株のＣ．ディフィシル芽胞との１時間のインキュベーションの後の、６．９ｍＭタウロコール酸ナトリウムをも含有する発芽誘導物質溶液における、あるアミノ酸の組み合わせ（アルギニン、アスパラギン酸、グリシンおよびヒスチジン）の濃度の効果を示す。
【図５】図５は、種々の発芽誘導物質溶液への１時間の曝露とその後の１０分間の熱ショックの後のＣ．ディフィシルの種々の株の芽胞のＣＦＵ／ｍＬの対数減少値を示す。
【図６】図６は、１０ｍＭアルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジンおよびグリシンならびに６．９ｍＭタウロコール酸ナトリウムを含有するトリス緩衝液におけるＣ．ディフィシルＮＣＴＣ１１２０４芽胞の発芽に対するｐＨの効果を示す。
【図７】図７は、種々の発芽誘導物質溶液への１時間の曝露とその後の熱ショックまたは氷上での冷却のいずれかの後のＣ．ディフィシル芽胞のＣＦＵ／ｍＬの対数減少値を示す（ＡＡ＝アミノ酸、ＳＴ＝タウロコール酸ナトリウム、ＢＺＣ＝塩化ベンザルコニウム、ＢＺＡ＝ベンジルアルコール）。
【図８】図８は、種々の発芽誘導物質溶液への１時間の曝露とその後の熱ショックまたは氷上での冷却のいずれかの後のＣ．ディフィシル芽胞のＣＦＵ／ｍＬの対数減少値を示す（ＣＨＧ＝ジグルコン酸クロルヘキシジン）。
【図９】図９は、ＰＢＳ（コントロール）培養液中のＣ．ディフィシル栄養細胞の細胞数を示す。細胞数のうちの１００％が２４時間後に芽胞である。
【図１０】図１０は、本発明の発芽溶液中のＣ．ディフィシル栄養細胞の細胞数を示す。７２時間後では細胞数のうちの１００％が未だ栄養細胞である。
【図１１】表１は、種々の発芽誘導物質溶液への１時間の曝露とその後の熱ショックまたは氷上での冷却のいずれかの後のＣ．ディフィシル芽胞のＣＦＵ／ｍＬの対数減少値を示す。
【実施例】
【００２０】
実施例１―発芽誘導物質溶液用のアミノ酸の組み合わせ
【００２１】
Ｃ．ディフィシルの株
リボタイプ１０６株（１８５８７）、リボタイプ００１株（８５６５）（健康保護局（Health Protection Agency；ＨＰＡ）、英国北東部）およびＮＣＴＣ１１２０４参考株を、３種類のリボタイプ０２７株；すなわちＲ２０２９１（嫌気レファレンス研究所（Anaerobic Reference Laboratory）、カーディフ）、１８０４０および１５９００（ＨＰＡ、英国北東部）と共に用いた。
【００２２】
Ｃ．ディフィシル芽胞懸濁液の調製
Ｃ．ディフィシルの芽胞を、以前（Shetty et al., 1999）に記載された通りに調製し
た。血液寒天プレートにＣ．ディフィシルの当該株を播種し、嫌気的に（ミニマックス嫌気ワークステーション（MiniMACS anaerobic work station）、ドン・ホイットリー社（Don Whitley）、英国シプリー）、７２時間、３７℃でインキュベートした。次いで、このプレートを移動して、室温で２４時間、空気中に放置し、その後、すべてのコロニーを回収し、１０ｍＬの５０％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ）および５０％メタノール変性アルコール（methylated spirits）の中に入れた。この懸濁液を、ボルテックスで完全に混合し、その後、グラスウールに通して濾過し、使用するまで４℃で保存した。芽胞懸濁液は、各実験の前に、１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、滅菌蒸留水（ＳＤＷ）中に再懸濁した。
【００２３】
アミノ酸
次のアミノ酸を、以下に詳述する実験において使用した：グリシン、Ｌ‐イソロイシン、Ｌ‐プロリン、Ｄ‐アラニン、Ｌ‐グルタミン酸、Ｌ‐エリン（L-erine）、Ｌ‐スレオニン、Ｌ‐スパラギン酸（L-spartic acid）、Ｌ‐アルギニン、Ｌ‐バリン、Ｌ‐ロイシン、Ｌ‐グルタミン、Ｌ‐トリプトファンおよびＬ‐アスパラギン（すべて、英国、シグマアルドリッチ社から）、Ｌ‐リシン、Ｌ‐ヒスチジンおよびＬ‐メチオニン（ＢＤＨ社）、Ｌ‐β‐フェニルアラニン（ファイソンズ社（Fisons））ならびにＬ‐システイン（フルカ社（Fluka））。チロシンは、蒸留水中には溶解しなかったため、試験しなかった。
【００２４】
Ｃ．ディフィシルの芽胞に対する共発芽誘導物質としての種々のアミノ酸の有効性
すべての発芽誘導物質溶液は、０．４％（ｗ／ｖ）のアミノ酸（以前の研究（Wheeldon
et al., 2008）において用いられたグリシンの濃度）および１３．８ｍＭ（ｗ／ｖ）タ
ウロコール酸ナトリウム（シグマアルドリッチ社、英国）（十二指腸における生理学的濃度（Leverrier et al., 2003）の二倍）を含有しており、これらは、蒸留水中に溶解させて、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理を行うことにより滅菌した。１３．８ｍＭタウロコール酸ナトリウム（sodium taurocholate；ＳＴ）を含有する、二倍の濃度のチオ
グリコール酸塩培地（Ｏｘｉｄ社、英国）も、他の発芽誘導物質溶液に対する比較のために試験した。次いで、各発芽誘導物質溶液１００マイクロリットルを、１００μＬのＣ．ディフィシル芽胞（１０6ＣＦＵ／ｍＬを含有する）に加え、ボルテックスで完全に混合
した。１時間後、この体積全２００μＬを、９．８ｍＬのウィルキンス‐チャルグレンブロス（Ｏｘｏｉｄ社、英国）に加え、１０分間７０℃に平衡化するかまたは氷上で冷却するかのいずれかを行った。適切な希釈の後に、１ｍＬ試料を滅菌ペトリ皿にそれぞれ入れ、その後、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＴおよび５％（ｖ／ｖ）ウマ脱線維血液を含有する、１５ｍＬの融解した偏性嫌気性細菌用寒天培地（ＦＡＡ）（Ｌａｂ  Ｍ社、英国）を加えた。このプレートは、完全に混合し、その後、４８時間、３７℃で嫌気的にインキュベートした。この方法は、Levinson and Hyatt（1966）を基に改変したものであった。
【００２５】
Ｃ．ディフィシル芽胞の発芽に必要なアミノ酸の最適濃度の決定
アルギニン、アスパラギン酸、グリシンおよびヒスチジンは、１３．８ｍＭのＳＴ（これは、必要な濃度の二倍であるが、これは、実験中にそれらを１：２希釈するからである）と共に、２００、２０、２、０．２および０．０２ｍＭにて調製し、蒸留水中に溶解させた。すべての溶液は、溶解するまで加熱し、また、オートクレーブ処理を行うことにより滅菌した。上記と同じ方法を用いて、Ｃ．ディフィシルＮＣＴＣ１１２０４、リボタイプ０２７（Ｒ２０２９１）、００１および１０６の芽胞に対して種々の濃度の発芽誘導物質溶液を試験した。
【００２６】
Ｃ．ディフィシルの６種類の異なる株の芽胞に対するアミノ酸およびタウロコール酸塩の有効性
アルギニン、アスパラギン酸、グリシンおよびヒスチジン（２０ｍＭ  ｗ／ｖで）は、別々にまたは組み合わせて、１３．８ｍＭ（ｗ／ｖ）ＳＴに加え、加熱することにより蒸留水に溶解させ、その後、オートクレーブ処理を行うことにより滅菌した。上記で記載したのと同じ方法を用いて、Ｃ．ディフィシルリボタイプ００１、１０６、０２７（Ｒ２０２９１、１５９００および１８０４０）およびＮＣＴＣ１１２０４の芽胞に対するこれらのアミノ酸溶液の有効性を決定した。
【００２７】
Ｃ．ディフィシル芽胞の発芽に対する緩衝発芽誘導物質溶液のｐＨの効果
アルギニン、アスパラギン酸、グリシンおよびヒスチジン（２０ｍＭ  ｗ／ｖで）、１３．８ｍＭ（ｗ／ｖ）ＳＴならびに２００ｍＭ（ｗ／ｖ）トリスは、蒸留水中に溶解させ、塩酸を用いてｐＨ５、６、７、８および９へと調整し、その後、濾過（０．２μｍ）またはオートクレーブ処理により滅菌した。上記と同じ方法を用いて、Ｃ．ディフィシルＮＣＴＣ１１２０４の芽胞に対して各緩衝溶液を試験した。
【００２８】
実施例２―Ｃ．ディフィシルに対する、抗菌防腐剤を含有する発芽誘導物質溶液の効果
【００２９】
発芽誘導物質溶液
１００ｍＭ（ｗ／ｖ）グリシン、ヒスチジン、バリン、アスパラギン酸およびアルギニン、１３．８ｍＭ（ｗ／ｖ）タウロコール酸ナトリウム、１００ｍＭ（ｗ／ｖ）トリス緩衝液、０．０４％（ｗ／ｖ）塩化ベンザルコニウム、２％（ｖ／ｖ）ベンジルアルコールを含有する溶液は、蒸留水を用いて必要な体積にメスアップし、塩酸を用いてｐＨ７へと調整した。この溶液を加熱し、完全に混合してすべての成分を溶解させ、その後、滅菌のため、０．２μｍの孔径に通して濾過した（この溶液は、使用濃度の二倍であるが、これは、実験中にこれを１：２希釈するからである）。
【００３０】
Ｃ．ディフィシル芽胞懸濁液の調製
Ｃ．ディフィシル芽胞の調製は、上記で述べた通りに調製した。
【００３１】
中和剤
本中和剤は、Espigares et al.,（2003）を基に改変したものであり、以下のものを含
有していた：１２０ｍＬ（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０、２５ｍＬ（ｖ／ｖ）の４０％メタ重亜硫酸ナトリウム、１５．６９ｇ（ｗ／ｖ）のチオ硫酸ナトリウム五水和物、１０ｇ（ｗ／ｖ）のＬ‐システイン、４ｇ（ｗ／ｖ）のレシチン。これを蒸留水を用いて１０００ｍＬにメスアップした。ｐＨは、７へと調整し、オートクレーブ処理を行って滅菌した。
【００３２】
発芽有効性試験
１００マイクロリットルの発芽誘導物質溶液（上記で記載したもの）を、１００μＬのＣ．ディフィシル芽胞（１０6ＣＦＵ／ｍＬを含有する）に加え、ボルテックスで完全に
混合した。コントロール用に、１００μＬの滅菌蒸留水を、１００μＬのＣ．ディフィシル芽胞懸濁液と混合した。また、芽胞懸濁液は、塩化ベンザルコニウムおよびトリス緩衝液を含有する（アミノ酸またはタウロコール酸塩は含有しない）溶液、トリス緩衝液と共にベンジルアルコールを含有する（アミノ酸およびタウロコール酸塩は含有しない）溶液、ならびに、５種類のアミノ酸およびタウロコール酸塩を含有する（抗菌剤を全く含有しない）溶液と共にインキュベートした。１時間後、この体積全２００μＬを、９．８ｍＬの中和剤（上記で記載したもの）に加え、１０分間７０℃に平衡化する（発芽している細胞を殺傷するための熱ショック）かまたは氷上で冷却する（コントロール）かのいずれかを行った。適切な希釈の後に、１ｍＬ試料を滅菌ペトリ皿にそれぞれ入れ、その後、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＴおよび５％（ｖ／ｖ）ウマ脱線維血液を含有する、１５ｍＬの融解した偏性嫌気性細菌用寒天培地（ＦＡＡ）（Ｌａｂ  Ｍ社、英国）を加えた。このプレートは、完全に混合し、その後、嫌気的に、４８時間、３７℃でインキュベートした（ミニマックス嫌気ワークステーション（miniMACS Anaerobic Workstation）（ドン・ホイットリー・サイエンティフィック社（Don Whitley Scientific Ltd）））。この方法は、Levinson and Hyatt（1966）による以前の研究を基に改変したものであった。
【００３３】
結果および考察
【００３４】
Ｃ．ディフィシルＮＣＴＣ１１２０４の芽胞に対する、グリシンとの共発芽誘導物質としての他のアミノ酸の有効性
グリシンおよびＳＴを伴う、アルギニン、アスパラギン酸またはヒスチジンとのＣ．ディフィシルＮＣＴＣ１１２０４芽胞のインキュベーションは、熱ショック後に、それぞれ、２．７８（９９．８％）、３．０６（９．９９％）および３．１２（９９．９％）というＣＦＵ／ｍＬの大きな対数減少値をもたらした。バリン（グリシンおよびＳＴを伴う）およびロイシン（グリシンおよびＳＴを伴う）は、それぞれ、１．７２（９８．１％）および１．６２（９７．６％）というＣＦＵ／ｍＬの対数減少値をもたらしたが、これらは、グリシンおよびＳＴのみの場合（１．８５の対数減少値（９８．６％））に類似するものであった。試験した他のすべてのアミノ酸は、グリシンおよびタウロコール酸ナトリウムのみの場合よりも小さい対数減少値をもたらした。
【００３５】
Ｃ．ディフィシルＮＣＴＣ１１２０４の芽胞に対する、グリシンおよびタウロコール酸ナトリウムの、単独でのおよび組み合わせての、共発芽誘導物質の有効性
ＳＴを含有する溶液の中へ、最初のスクリーニングからの最も効果的な４種類のアミノ酸（アルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジンおよびグリシン）を一緒に入れて、Ｃ．ディフィシル芽胞と共にインキュベートした場合には、ＳＴを伴うアルギニン、アスパラギン酸またはヒスチジンのいずれかと共に芽胞をインキュベートした場合（しかし、グリシンなしでは、各溶液によってもたらされたのは１未満の対数減少値であった）と比べて、３．７１（９９．９％）というＣＦＵ／ｍＬのより大きな対数減少値が、熱ショック後に、もたらされた。
【００３６】
Ｃ．ディフィシル芽胞の発芽に必要なアミノ酸の最適濃度の決定
クロストリジウム・ディフィシル芽胞の発芽は、アミノ酸濃度が１０から１００ｍＭまでの間である場合に、試験したすべての株で最適であった。この濃度を下回る場合には、Ｃ．ディフィシル芽胞の発芽は有意に減少し、１未満の対数減少が０．１ｍＭおよびそれ以下において観察された。熱ショックを与えずに芽胞を１００ｍＭのアミノ酸に曝露した場合には、Ｃ．ディフィシルのすべての株でＣＦＵ／ｍＬの有意な減少が観察された。
【００３７】
Ｃ．ディフィシルＰＣＲリボタイプ０２７の種々の株の芽胞に対するアミノ酸およびタウロコール酸ナトリウムの有効性
ＳＴと組み合わせた前記４種類のアミノ酸に曝露したＣ．ディフィシルＰＣＲリボタイプ０２７のすべての株は、芽胞をチオグリコール酸塩培地およびＳＴに曝露した場合にもたらされた対数減少値と類似する対数減少値をもたらした。グリシンおよびタウロコール酸ナトリウムと組み合わせた場合には、アスパラギン酸もヒスチジンも、各リボタイプ０２７株で観察されたＣＦＵ／ｍＬの対数減少値を増加させたが、しかしながら、アルギニンは、グリシンおよびＳＴに加えた場合にＣＦＵ／ｍＬの対数減少値のさらなる増加をもたらさなかった。最も興味深かったのは、２つの臨床株（１８０４０および１５９００）が、ＳＴと組み合わせたチオグリコール酸塩培地または前記４種類のアミノ酸に応答してＲ２０２９１株よりも有意に大きい対数減少値をもたらしたということであった。
【００３８】
Ｃ．ディフィシルの６種類の異なる株の芽胞に対するアミノ酸およびタウロコール酸ナトリウムの有効性
アミノ酸およびチオグリコール酸塩溶液への曝露後のＣ．ディフィシルのＮＣＴＣ１１２０４参考株で、ＣＦＵ／ｍＬの最も大きい対数減少値がそれぞれ観察された。ＰＣＲリボタイプ００１は、試験した種々の組み合わせの発芽誘導物質溶液のそれぞれにおいて、ＰＣＲリボタイプ２０７のＲ２０２９１株に非常によく似た対数減少値をもたらした。例えば、Ｃ．ディフィシルリボタイプ００１および０２７  Ｒ２０２９１では、前記４種類のアミノ酸およびＳＴとのインキュベーションとその後の熱ショックの後に、それぞれ、２．１２（９９．２％）および１．９８（９９％）というＣＦＵ／ｍＬの対数減少値がもたらされた。
【００３９】
Ｃ．ディフィシルＮＣＴＣ１１２０４芽胞の発芽に対する緩衝発芽誘導物質溶液のｐＨの効果
緩衝発芽誘導物質溶液のｐＨは、当該アミノ溶液（およびＳＴ）とのインキュベーションとその後の熱ショックの後にもたらされるＣＦＵ／ｍＬの対数減少値に大きく影響する。酸性のｐＨ５では、この発芽溶液は、ＣＦＵ／ｍＬの対数減少をもたらさなかったが、一方、中性のｐＨ６．９８では、ＣＦＵ／ｍＬの３．３２の対数減少値（９９．９％）が観察され、；これが最適なｐＨであることが分かった。よりアルカリ性のｐＨ８．８１は、観察されたＣＦＵ／ｍＬのこの対数減少値を減少させることとなったが、酸性ｐＨの場合よりずっと小さい程度であった。
【００４０】
Ｃ．ディフィシルに対する、抗菌防腐剤を含有する発芽誘導物質溶液の効果
トリス緩衝液中のアミノ酸とタウロコール酸塩との混合物と共にＣ．ディフィシル芽胞を１時間インキュベートし、その後、熱ショックを与えた後に、ＣＦＵ／ｍＬの３を超える対数減少値（９９．９％減少）がもたらされた。しかしながら、熱ショックを与えない場合には、このアミノ酸溶液とのインキュベーション後の残存芽胞の数の減少はほとんどなかった（０．１３の対数減少値）。トリス中に塩化ベンザルコニウムを含有する溶液またはトリス中にベンジルアルコールを含有する溶液とのＣ．ディフィシル芽胞のインキュベーションは、熱ショックがある場合にもない場合にも、０．３未満というＣＦＵ／ｍＬの非常に低い対数減少値を生じさせた。しかしながら、トリス中にアミノ酸、タウロコール酸塩、塩化ベンザルコニウムおよびベンジルアルコールを含有する溶液と共にＣ．ディ
フィシル芽胞をインキュベートした場合には、氷で処理した芽胞ではＣＦＵ／ｍＬの２．７７の対数減少値（９９．８％減少）、また、熱ショックを与えた芽胞ではＣＦＵ／ｍＬの２．９９の対数減少値（９９．９％減少）となった。
【００４１】
ＥＤＴＡおよびクオロロヘキシジン（cholorohexidine）は発芽誘導物質溶液を阻害す
るが、一方、塩化ベンザルコニウムおよびベンジルアルコールは発芽に影響しない、とのことも発明者らは示した。塩化ベンザルコニウム（benzalkonium choloride）およびベンジルアルコールは殺芽胞性のものではなく、また、発芽を開始させるものではなかった。加熱処理されなかった芽胞は、塩化ベンザルコニウム（benzalkonium choloride）、ベンジルアルコール、アミノ酸およびタウロコール酸ナトリウムとの１時間のインキュベーション後に、死滅した。芽胞は、塩化ベンザルコニウムおよびベンジルアルコールを含有する発芽誘導物質溶液でそれらが発芽するがために死滅したように思われる。
【００４２】
当該中和剤は、Ｃ．ディフィシル細胞および他の細菌に対しては毒性がないとのことが分かった。また、当該中和剤は、これら抗菌剤の活性を無効にするするのに効果的であった。したがって、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、アミノ酸およびタウロコール酸ナトリウムとの１時間のインキュベーション後にもたらされるＣＦＵ／ｍＬの減少は、寒天プレートに対するキャリーオーバーの効果の結果である可能性は低い。
【００４３】
本願発明者らは、塩化ベンザルコニウムおよびベンジルアルコールが、発芽誘導物質溶液の有効性に影響しない、とのことも見出した。塩化ベンザルコニウムおよびベンジルアルコールは、それ故に、防腐効果を示し、Ｃ．ディフィシルの発芽している芽胞を殺傷するようである。
【００４４】
芽胞形成に対する発芽溶液の阻害効果
図９および１０に示す結果は、発芽溶液の存在下での培養７２時間後では細胞数のうちの１００％が未だ栄養細胞であり、一方、コントロール（ＰＢＳ中の培養細胞）では細胞数のうちの１００％が２４時間後に芽胞である、とのことを指し示している。これらの結果は、本発明の発芽溶液が、Ｃ．ディフィシルの栄養細胞における芽胞形成を妨げる、とのことを示している。
【図１】
2013519720.tif 000003
【図２】
2013519720.tif 000004
【図３】
2013519720.tif 000005
【図４】
2013519720.tif 000006
【図５】
2013519720.tif 000007
【図６】
2013519720.tif 000008
【図７】
2013519720.tif 000009
【図８】
2013519720.tif 000010
【図９】
2013519720.tif 000011
【図１０】
2013519720.tif 000012
【図１１】
2013519720.tif 000013
【国際調査報告】
2013519720.tif 000014
2013519720.tif 000015
2013519720.tif 000016
2013519720.tif 000017
2013519720.tif 000018