(57)【要約】  測定キュベットを使用して流体中に分散した粒子の光学特性を測定するための構成であって、前記キュベットの中心部の内部空間を通って、分散した粒子が流れるようになっており、レーザ光線が前記内部空間を透過するように照射されるようになっている構成において、本発明により、前記キュベットの前記内部空間を、互いに対して９０°向きをオフセットした二つのレーザ光線により照らすことが提案される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定キュベットを使用して流体中に分散した粒子の光学特性を測定するための構成であって、前記測定キュベットの中心部の内部空間を通って分散粒子が流れるようになっており、レーザ光線が前記内部空間を透過するように照射されるようになっており、前記キュベットから外に出た光が、光検出器と呼ばれる感光性のセンサに導かれるようになっている、構成において、
前記キュベット（３，１９）の前記内部空間が、互いに対して９０°向きをオフセットした二つのレーザ光線（１，２）により照らされることを特徴とする、構成。
【請求項２】
前記レーザ光線（１，２）の両方が同じレーザから生成されるように、一つの共通レーザが備えられて、そのビームが光学手段により分けられることを特徴とする、請求項１に記載の構成。
【請求項３】
前記レーザ光線（１，２）の両方が、同じビームエネルギとビームジオメトリを有することを特徴とする、請求項１または２に記載の構成。
【請求項４】
前記測定キュベット（３，１９）と前記光検出器（７）との間に開口数が高い収束レンズ（５，８，９）が配置されていることを特徴とする、請求項３に記載の構成。
【請求項５】
前記測定キュベット（１９）と光検出器（７）との間それぞれに、開口数が高い二つの収束レンズ（８，９）が配置されること、そして
前記収束レンズ（８，９）両方の光軸が、互いに９０°オフセットされていること
を特徴とする、請求項４に記載の構成。
【請求項６】
前記測定キュベット（１９）の横断面が、前記レーザビーム（１，２）両方の入射方向のいずれに対しても９０°以外の角度を成すように向けられた傾斜面（２０）を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の構成。
【請求項７】
前記傾斜面（２０）が、前記レーザビーム（１，２）両方のいずれに対しても４５°の角度で向けられていることを特徴とする、請求項６に記載の構成。
【請求項８】
前記収束レンズ（５）の前側の面が前記傾斜面（２０）に対して平行に延びることを特徴とする、請求項６または７に記載の構成。
【請求項９】
前記測定キュベット（３，１９）と前記光検出器（７）との間に、前方散乱光ないしは負の吸収光を検出するように構成された収束レンズ（８，９）が、前記レーザビーム（１，２）の両方に直接向けて配置されていることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の構成。
【請求項１０】
前記測定キュベット（３，１９）と前記光検出器（７）との間に、励起されたレーザビーム（１，２）の光を遮るように構成されたレーザ帯域消去フィルタ（６，１０，１１）が配置されていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の構成。
【請求項１１】
粒子測定構成に粒子選別用の装置が後置されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の構成。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分散した粒子の光学特性を測定するための構成／配設／装置設備に関する。
流体―気状の流体であっても液状の流体であってもかまわない―中に分散した大量の粒子の光学特性の正確な測定は、細胞学においても、また技術的な問題が提起されているときにも、重要な意味を持つ。今日では、フロー・サイトフォトメータ（”Flow Cytometer”）を利用することにより、毎秒数千個の粒子の測光分析および蛍光光学分析に成功している。それに加えてさらに、所望の粒子または細胞を、先行測定の結果に基づきオンラインで選別できるようにする装置も提示されている。そのようにフロー・サイトメータに細胞選別工程が後置された配列は、例えばＸ染色体およびＹ染色体を保有する精子を分離して、畜産部門でこれをさらに使用するために、利用されるようになっている。
【０００２】
細胞選別については、例えば非特許文献１を参照されたい。
出願人が販売している細胞選別用の装置は、現場では「パーティクル・アンド・セル・ソーターＰＰＣＳ」との名称で知られているが、この装置の作動方式は、非特許文献２に説明されている。
【０００３】
粒子の形状やサイズに著しいばらつきがある場合は、粒子の光学特性を正確に測定するのは困難である。
フロー・フォトサイトメータの重要な導入分野は、バイオテクノロジー、生成プロセスの監視、細胞分析、細胞病理学、および免疫学に多く見受けられる。
そこでは、個々の粒子の速やかな検出とならび、可能な限り正確に個々の粒子を光学的に測定することが課題となっている。前方散乱光および側方散乱光の測定ならびに蛍光励起のために、光源として通例はレーザが利用される。レーザ光は、極めて小さな開き角（小さなビームの開き）で、もしくは平行なレーザビームとして、粒子に作用させることができる。その際には、時には非常に扁平な平面状の物体のように構造化されていることもある、形態学的に複雑な粒子に、レーザビームを、粒子面に対して直角に、または粒子面に対して平行に、いかに到達させるかが、測定技術上の課題となっている。粒子が面状に照射される場合は粒子蛍光の「正しい」測定値が得られ、レーザ光が粒子の縁に当たる場合は「誤った」測定値が得られることになる。
本発明が関するものは、上述の測定誤差を回避した配列である。
【背景技術】
【０００４】
微視的小粒子のフロー・サイトメトリー解析は、測定を非常に高精度で首尾よく行うことができる場合は、経済的に大きな意義を持つ。そのような適用例の一つが、精子のＤＮＡ含有量の測定である。十分な高精度でこの測定に成功した場合は、Ｘ染色体およびＹ染色体を保有する二種類の精子を、フロー・サイトフォトメータに後置された装置により選別して、畜産のために使用することができる。
【０００５】
上述の二種類の精子のＤＮＡ含有量の差異は、例えば牛の場合は１．６％だけにしか過ぎず（細胞あたりのＤＮＳ量：３．３ｐｇ）、両者を区別できるか否かは、細胞の測定がいかに正確に行われるにかかっている。
【０００６】
これを保証するために、蛍光を励起するレーザビームが通過する前に、レーザビームが細胞の主に平面部分に当たるように、細胞を配向することが提唱されている。この配向は、細胞懸濁液を測定地点へと導く細管の面状ないしは楕円状の出口開口部だけにより、多少なりとも達成されるようになっている。
【０００７】
「配向不良」を回避する別の方途として、蛍光励起のために非常に大きな開口数（大きな立体角）で細胞に照射するという手立ても講じられている。しかしそれが首尾よく運ぶのは、これまでは、従来型の光源、例えば放電灯を使用した場合に限られていた。
【０００８】
それにより、それぞれの細胞は、細胞の全ての面をくまなく均一に照射されることになり、その結果、アスペクト比は実質的に度外視されることになる。
このような、大きな開口数で照射するという方策により、確かにアスペクト比の影響は回避されることにはなるものの、しかし細胞のそれ以外の、前方散乱光（粒子サイズ）や側方散乱光（均等度）といった、多くは重要であるパラメータを検出するのは、それによっては不可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bessette, P.H., Daugherty, P.S.(2004), Flow Cytometric Screening of cDNA Expression Libraries for Fluorescent Proteins. Biotechnology Progress, 20:963967.doi:10.1021/bp034308g.
【非特許文献２】Particle and Cell Sorter PPCS 付属マニュアル
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のような背景から本発明の課題は、これまでに知られているレーザに基づくフロー・サイトフォトメータにおいて、アスペクト比が測定精度に与える誤りを伴う影響を回避する、または完全に排除する方策を見出すことにある。その結果、測定精度は大幅に向上されることになる。さらにそれに加え、それにより達成される高い測定精度が、前方、側方の両散乱光のパラメータにも結び付けられるようにすることも、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従来型の光源によっては、これらの散乱光を測定するのは不可能である。本発明により、アスペクト比の影響が回避される、レーザ光励起用の装置が提案される。レーザ励起により、高い開口数での励起という長所を兼ね備えた従来型の光源と比べて、格段と高い光エネルギ密度が可能となるが、その結果より正確な測定結果がもたらされることになる（ＳＮ比が向上）。
【００１２】
以下では、あくまでも概略的に示されるに過ぎない図面に基づき、本発明により提案される装置について詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】フロー・サイトメータの概略的な垂直断面図である。
【図２】フロー・サイトロータの第１実施例の上面図である。
【図３】測定対象である二種類の細胞をそれぞれ二通りの向きから見た図である。
【図４】第２実施例の透視図である。
【図５】フロー・サイトメータの第３実施例の上面図である。
【図６】フロー・サイトメータの第４実施例の上面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
図１には、フロー・サイトメータのキュベット部、ならびに、レーザ１を使用する励起ビームパスと、収束レンズ５の形態をとる集光光学系、レーザ光帯域消去フィルタ６および光検出器７を具備した測定ビームパスとから成る配列が、概略的な垂直断面図で示されている。流体中に分散された粒子は、狭い細管２１を通り、この測定キュベット（容器）３に供給される。
【００１５】
この粒子流の周囲には、粒子が含まれていない媒体１４が供給され、それにより、粒子が符号２３で示す測定領域を通過する際には、粒子のセンタリングがもたらされるようにしている。形態がまちまちである粒子に、優先方位はない。
【００１６】
図２ならびに図４ないし６からは、いずれも上面図または透視図で測定キュベット３をはっきりと確認することができる。そこから明らかであるように、レーザ光励起は本発明の提案にしたがって二方向から行われるが、そこではレーザ光線１の入射方向がレーザ光線２に対して９０°オフセットされている。その結果レーザ１は「扁平な」粒子の縁を照らし、レーザ２はこれを面状に、―または、平面状の粒子の流路内の配位によっては、それとは逆に―照らすことになる。粒子はありとあらゆる配位をとり得るために、蛍光を発する材料に達する両レーザ光線１および２の光の合計は常に同じ大きさとなる。
【００１７】
図２の実施例においては、二つのレーザ光線１および２の形態をとるレーザ光により、キュベット３の二つの側面から蛍光が励起されるようになっている。第１の収束レンズ８の形態をとる集光レンズに追加して、この第１の収束レンズ８に対して９０°オフセットされている第２の集光レンズないしは収束レンズ９が取り付けられている。このような検出方式によりそれぞれの粒子から発する光を検出することによって、アスペクト比の影響が以前にも増してさらに回避されることになる。光検出用の両方のビームパスには、収束レンズ８、９の形態をとる開口数が高いレンズ、ならびに励起レーザ光用の帯域消去フィルタ１０、１１および光検出器７、１２が装備されている。
【００１８】
図３には上皮細胞が示されるが、その直径は人間の場合は最大で６０μｍに達することがある。この上皮細胞の縁に照射されるレーザ光は、それが細胞核１６に到達するときには、必ず減衰されてしまっている。この細胞の面と縁とに同時に照射される場合は、照射誤差が帳消しされることになる。
【００１９】
精子を測定する場合は、この減衰の問題がさらに顕著なものとなる。測定対象物質であるＤＮＳは精子頭部１７の中にあり、中片部１８の中には主にＲＮＳがある。レーザ光は、そのような目標物の「縁」に照射される場合、全てのＤＮＡ成分に一様に達することはない。励起光の一部は目標物から「逸れて散乱」する上に、精子頭部１７の内部で光が吸収される結果、全てのＤＮＡ成分が一様に蛍光励起されることはない。
【００２０】
図４には、レーザ二重励起系を具備した配列が三次元空間図で示されている。そこにはあくまでも例示のために、収束レンズ５を有する測定光学系、レーザ光帯域消去フィルタ６、および光検出器７だけが図示されている。収束レンズ５は高い開口数を有するために、測定側ではアスペクト比の影響が回避されることになる。この図示される実施例とは異なり、図２の実施例のように、両方のレーザ光線１および２に対して、専用の測定光学系を一つずつ割り当てるようにしてもよい。
【００２１】
図５には、本発明にしたがった測定器のさらにもう一つの構成例が示されている。利用可能なレーザ光帯域消去フィルタ６、１０、１１は、多くの波長で、励起レーザ光を完全にはブロックしないために、図５においては、それぞれのレーザ光線１および２が測定光学系の内部に直接達することができるのを阻止する配列が備えられている。
【００２２】
そのために収束レンズ５の光軸は、両方の励起レーザ光線１、２の照射方向が成す角度の二等分線上に、即ち両方の励起レーザ光線１、２の照射方向に対して４５°ないしは１３５°の角度で配置されている。そのために測定キュベット１９には、横断面図で見て傾斜面２０と呼ばれる第５の面を有する特殊な形状が備えられている。この第５の面により、レーザ励起光が測定ビームパスの中に入り込むことがないように、開口数が高い測定光学系を取り付けられるようにしている。収束レンズ５の前側の面をこの傾斜面２０に対して平行に配向することにより、蛍光が低損失で測定キュベット１９から出て収束レンズ５に入射されることを保証している。
【００２３】
図６には、実質的に図５と同様に構成された、またそのために同じく符号１９が付されている測定キュベットが示されている。傾斜面２０の両側に隣接している二つの面が、互いに９０°の角度で交わるように向けられているが、これを利用して、傾斜面２０と組み合される収束レンズ５に追加して、図２に示される例と同様に、ここでも二つの収束レンズ８、９が互いに対して９０°の角度で配置されるようにするとよい。このような配置方式により、非常に正確な測定結果を得ることができる。
【００２４】
それぞれの収束レンズ８および９に後置される光検出器７を利用して、蛍光ではなく、励起光、すなわちレーザ光線１および２がそれぞれの細胞に当たった後に生じる前方散乱光ないしは負の吸収光が評価される。帯域消去フィルタ２１および２２は、測定キュベット１９と集光レンズ８および９との間に備えられる。これらは望ましくない光成分をブロックして、可能な限り散乱光だけを透過させるようになっている。検出されなければならないのは、散乱光成分だけである、すなわち０°を上回る角度で入射する光成分だけであるために、直接入射するレーザ光は、いわゆるレーザストップ２４によりブロックされるようにしている。
【００２５】
両方の前方散乱光信号から、測定キュベット１９の内部の細胞の向きを計算することができるために、例えば向きが不利である細胞の測定結果を、その後の調査では無視することができる、あるいは、蛍光の測定結果に対して、―測定された細胞の向きに応じて―特定の補正係数を割り当てられるようになる。
【００２６】
図６に示される測定配列においては、レーザ光線１および２が収束レンズ５に向けられていないために、この収束レンズ５を利用して検出されるのは、調査した細胞から発する蛍光だけとなっている。したがってこの配置方式により、レーザ光成分により汚染されていない極めて純粋な測定信号が得られることになる。この理由から、あくまでも模範的な例としてではあるが、傾斜面２０と、これと組み合される光検出器７との間には、レーザ光帯域消去フィルタが一切備えられないようになっている。しかしその代わりに、ここに図示される配列とは異なり、望ましくない散乱光成分を排除するために、図５において備えられているようなレーザ光帯域消去フィルタ６が備えられるようにしてもよい。
【００２７】
図示されるそれぞれの実施例とは異なり、光を測定キュベットから円筒形の反射面を有する円筒体として構成される光学素子に通して光検出器に導くようにしてもよい。その場合この円筒体は、内表面が円筒形の反射面を形成している中空円筒体として構成されたものであっても、あるいは外表面が円筒形の反射面を形成している中実の光を透過する円筒体として構成されたものであってもかまわない。
【符号の説明】
【００２８】
１  レーザ光線
２  レーザ光線
３  測定キュベット
５  収束レンズ
６  レーザ光帯域消去フィルタ
７  光検出器
８  収束レンズ
９  収束レンズ
１０  帯域消去フィルタ
１１  帯域消去フィルタ
１２  光検出器
１４  媒体
１６  細胞核
１７  精子頭部
１８  中片部
１９  測定キュベット
２０  傾斜面
２２  帯域消去フィルタ
２３  測定領域
２４  レーザストップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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