(57)【要約】  本発明はヒトＣＳＦ−１Ｒ（抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体）に対する抗体、それらの産生のための方法、該抗体を含む薬学的組成物、及びそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体であって、ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４（配列番号６５）とヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（配列番号６４）に１：５０か又はそれ以下の比率で結合することを特徴とする抗体。
【請求項２】
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号７で、軽鎖可変ドメインが配列番号８であり；
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号１５で、軽鎖可変ドメインが配列番号１６であり；
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号７５で、軽鎖可変ドメインが配列番号７６であり；
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号８３で、軽鎖可変ドメインが配列番号８４であり；
またはそれらのヒト化型であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号２３で、軽鎖可変ドメインが配列番号２４である；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号３１で、軽鎖可変ドメインが配列番号３２である；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号３９で、軽鎖可変ドメインが配列番号４０である；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号４７で、軽鎖可変ドメインが配列番号４８である；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号５５で、軽鎖可変ドメインが配列番号５６であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、及び配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、及び配列番号６のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号１７のＣＤＲ３領域、配列番号１８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２０のＣＤＲ３領域、配列番号２１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号２５のＣＤＲ３領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、及び配列番号３０のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号３５のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３６のＣＤＲ３領域、配列番号３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号３８のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｆ）重鎖可変ドメインが配列番号４１のＣＤＲ３領域、配列番号４２のＣＤＲ２領域、及び配列番号４３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４４のＣＤＲ３領域、配列番号４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号４６のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｇ）重鎖可変ドメインが配列番号４９のＣＤＲ３領域、配列番号５０のＣＤＲ２領域、及び配列番号５１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号５２のＣＤＲ３領域、配列番号５３のＣＤＲ２領域、及び配列番号５４のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｈ）重鎖可変ドメインが配列番号６９のＣＤＲ３領域、配列番号７０のＣＤＲ２領域、及び配列番号７１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号７２のＣＤＲ３領域、配列番号７３のＣＤＲ２領域、及び配列番号７４のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｉ）重鎖可変ドメインが配列番号７７のＣＤＲ３領域、配列番号７８のＣＤＲ２領域、及び配列番号７９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号８０のＣＤＲ３領域、配列番号８１のＣＤＲ２領域、及び配列番号８２のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものであるか又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものであることを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１から５に記載の抗体を含有することを特徴とする薬学的組成物。
【請求項７】
癌の治療のための請求項１から５に記載の抗体。
【請求項８】
骨量減少の治療のための請求項１から５に記載の抗体。
【請求項９】
転移の予防又は治療のための請求項１から５に記載の抗体。
【請求項１０】
炎症性疾患の治療のための請求項１から５に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体が請求項２又は３に記載の可変ドメインを含むことを特徴とする、ＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体の重鎖をコードする核酸。
【請求項１２】
原核生物又は真核生物の宿主細胞において、請求項１から５に記載の抗体を発現させるために、請求項１１に記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクタ−。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含む、原核生物又は真核生物の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１から５に記載の組換え抗体を産生するための方法であって、原核生物又は真核生物の宿主細胞において請求項１１に記載の核酸を発現させ、該抗体を該細胞から又は該細胞培養上清から回収することを特徴とする方法。
【請求項１５】
癌の治療のための医薬の製造のための請求項１から５に記載の抗体の使用。
【請求項１６】
骨量減少の治療のための医薬の製造のための請求項１から５に記載の抗体の使用。
【請求項１７】
転移の治療のための医薬の製造のための請求項１から５に記載の抗体の使用。
【請求項１８】
炎症性疾患の治療のための医薬の製造のための請求項１から５に記載の抗体の使用。
【請求項１９】
患者に請求項１から５に記載の抗体を投与することを特徴とする、癌に罹患した患者の治療のための方法。
【請求項２０】
患者に請求項１から５に記載の抗体を投与することを特徴とする、骨量減少に罹患した患者の治療のための方法。
【請求項２１】
患者に請求項１から５に記載の抗体を投与することを特徴とする、転移に罹患した患者の治療のための方法。
【請求項２２】
患者に請求項１から５に記載の抗体を投与することを特徴とする、炎症性疾患に罹患した患者の治療のための方法。
【請求項２３】
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号７で、軽鎖可変ドメインが配列番号８であり；
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号１５で、軽鎖可変ドメインが配列番号１６であり；
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号７５で、軽鎖可変ドメインが配列番号７６であり；
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号８３で、軽鎖可変ドメインが配列番号８４であり；
またはそれらのヒト化型であることを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体。
【請求項２４】
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号２３で、軽鎖可変ドメインが配列番号２４である；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号３１で、軽鎖可変ドメインが配列番号３２である；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号３９で、軽鎖可変ドメインが配列番号４０である；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号４７で、軽鎖可変ドメインが配列番号４８である；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号５５で、軽鎖可変ドメインが配列番号５６であることを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体。
【請求項２５】
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、及び配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、及び配列番号６のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号１７のＣＤＲ３領域、配列番号１８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２０のＣＤＲ３領域、配列番号２１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号２５のＣＤＲ３領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、及び配列番号３０のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号３５のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３６のＣＤＲ３領域、配列番号３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号３８のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｆ）重鎖可変ドメインが配列番号４１のＣＤＲ３領域、配列番号４２のＣＤＲ２領域、及び配列番号４３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４４のＣＤＲ３領域、配列番号４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号４６のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｇ）重鎖可変ドメインが配列番号４９のＣＤＲ３領域、配列番号５０のＣＤＲ２領域、及び配列番号５１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号５２のＣＤＲ３領域、配列番号５３のＣＤＲ２領域、及び配列番号５４のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｈ）重鎖可変ドメインが配列番号６９のＣＤＲ３領域、配列番号７０のＣＤＲ２領域、及び配列番号７１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号７２のＣＤＲ３領域、配列番号７３のＣＤＲ２領域、及び配列番号７４のＣＤＲ１領域を含み；又は
ｉ）重鎖可変ドメインが配列番号７７のＣＤＲ３領域、配列番号７８のＣＤＲ２領域、及び配列番号７９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号８０のＣＤＲ３領域、配列番号８１のＣＤＲ２領域、及び配列番号８２のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体であることを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体。
【請求項２６】
抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする、請求項２３から２５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
請求項２３から２６に記載の抗体を含有することを特徴とする薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣＳＦ−１Ｒ（抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体）に対する抗体、それらの産生の方法、該抗体を含む薬学的組成物、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトＣＳＦ−１Ｒレセプター（ＣＳＦ−１Ｒ；コロニー刺激因子１レセプター）；同義語：Ｍ−ＣＳＦレセプター；マクロファージコロニー刺激因子１レセプター、Ｆｍｓ癌原遺伝子、ｃ−ｆｍｓ、配列番号６２）は１９８６年から知られている(Coussens, L., et al., Nature 320 (1986) 277-280)。ＣＳＦ−１Ｒは、増殖因子であり、ｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子でコードされる(総説は例えば、in Roth, P., and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-67)。
【０００３】
ＣＳＦ−１ＲはＣＳＦ−１（マクロファージコロニー刺激因子１、またはＭ−ＣＳＦ、マクロファージコロニー刺激因子とも呼ばれる）のレセプターであり、このサイトカインの生物学的作用を媒介する(Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676)。コロニー刺激因子１レセプター（ＣＳＦ−１Ｒ）（またはｃ−ｆｍｓとも呼ばれる）のクローニングは最初にRoussel, M.F., et al., Nature 325 (1987) 549-552に記述された。その出版物において、ＣＳＦ−１ＲがＣｂｌを結合し、それによってレセプターの下方制御を制御する阻害性チロシン９６９のリン酸化の消失を含む、タンパク質のＣ末端部の変化に依存した形質転換能を有することが示された(Lee, P.S., et al., Embo J. 18 (1999) 3616-3628)。近年、インターロイキン３４（ＩＬ−３４）と命名されたＣＳＦ−１Ｒの第二のリガンドが同定された(Lin, H., et al, Science 320 (2008) 807-811)。
【０００４】
サイトカインであるＣＳＦ−１（コロニー刺激因子１、Ｍ−ＣＳＦ、マクロファージとも呼ばれる）はジスルフィド結合したホモダイマーとして細胞外に見いだされる(Stanley, E.R. et al., Journal of Cellular Biochemistry 21 (1983) 151-159; Stanley, E.R. et al., Stem Cells 12 Suppl. 1 (1995) 15-24)。
【０００５】
ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の主要な生物学的作用は、造血前駆細胞のマクロファージ系統（破骨細胞を含む）への分化、増殖、遊走、および生存である。ＣＳＦ−１Ｒの活性化は、そのリガンドのＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦ）およびＩＬ−３４により媒介される。ＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦ）のＣＳＦ−１Ｒへの結合は、ホモダイマーの形成及びチロシンリン酸化によるキナーゼの活性化を誘導する(Li, W. et al, EMBO Journal.10 (1991) 277-288; Stanley, E.R., et al., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 4-10)。
【０００６】
生物学的に活性なホモダイマーＣＳＦ−１は、ＣＳＦ−１レセプターの細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）のサブドメインＤ１からＤ３内で、ＣＳＦ−１Ｒに結合する。ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤは５つの免疫グロブリン様サブドメイン（Ｄ１からＤ５と命名）を包含する。細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）のサブドメインのＤ４からＤ５は、ＣＳＦ−１の結合に関与していない。(Wang, Z., et al Molecular and Cellular Biology 13 (1993) 5348-5359)。サブドメインＤ４は２量体化に関与している(Yeung, Y-G., et al Molecular & Cellular Proteomics 2 (2003) 1143-1155; Pixley, F. J., et al., Trends Cell Biol 14 (2004) 628-638)。
【０００７】
更なるシグナル伝達は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路及びＲａｓ／ＭＡＰＫ経路へとそれぞれ接続するＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニット及びＧｒｂ２により媒介される。これらの２つの重要なシグナル伝達経路は、増殖、生存およびアポトーシスを調節することができる。ＣＳＦ−１Ｒのリン酸化された細胞内ドメインを結合する他のシグナル伝達分子は、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＰＬＣｙ、及びＣｂｌを含む(Bourette, R.P. and Rohrschneider, L.R., Growth Factors 17 (2000) 155-166)。
【０００８】
ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達は、免疫応答、骨のリモデリング及び生殖系において生理的役割を担っている。ＣＳＦ−１ (Pollard, J.W., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 54-61)又はＣＳＦ−１Ｒ(Dai, X.M., et al., Blood 99 (2002) 111-120)のどちらかをノックアウトした動物は、大理石骨病表現型、造血系表現型、組織マクロファージ表現型、及び生殖表現型（それぞれの細胞型におけるＣＳＦ−１Ｒの役割と一致する）を有することが示されている。
【０００９】
Sherr, C.J., et al., Blood 73 (1989) 1786-1793は、ＣＳＦ−１活性を阻害するＣＳＦ−１Ｒに対する幾つかの抗体に関連している(Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793を参照)。Ashmun, R.A., et al., Blood 73 (1989) 827-837は、ＣＳＦ−１Ｒ抗体に関する。Lenda, D., et al., Journal of Immunology 170 (2003) 3254-3262は、ＣＳＦ−１欠損マウスにおいて、マクロファージの補充、増殖及び活性化の減少が、腎臓の炎症時の尿細管アポトーシスの減少をもたらすことに関する。Kitaura, H., et al., Journal of Dental Research 87 (2008) 396-400 は、歯の矯正移動を妨げる抗ＣＳＦ−１抗体に関する。国際公開第２００１／０３０３８１号は、アンチセンスヌクレオチド及び抗体を含むＣＳＦ−１活性阻害剤を述べているが、ＣＳＦ−１アンチセンスヌクレオチドのみ開示している。国際公開第２００４／０４５５３２号は、ＣＳＦ−１による転移及び骨量減少の予防及び転移性癌の治療に関し、アンタゴニストとして抗ＣＳＦ−１抗体のみ開示している。国際公開第２００５／０４６６５７号は、抗ＣＳＦ−１抗体による炎症性腸疾患に治療に関する。米国特許出願公開第２００２／０１４１９９４号はコロニー刺激因子の阻害剤に関する。国際公開第２００６／０９６４８９号は抗ＣＳＦ−１抗体による関節リウマチの治療に関する。国際公開第２００９／０２６３０３号及び国際公開第２００９／１１２２４５号は、細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）の最初の３つのサブドメイン（Ｄ１からＤ３）内でＣＳＦ−１Ｒへ結合する所定の抗ＣＳＦ−１抗体に関する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、ヒトＣＳＦ−１Ｒへの抗体結合を含み、抗体がヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４（配列番号６５）及びヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（配列番号６４）に、１：５０か又はそれ以下の比率で結合することを特徴とする。
【００１１】
本発明は、以下を特徴とする本発明による抗体を更に含む。
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８である；
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号１５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号１６である；
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号７５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号７６である；
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号８３であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８４である；
またはそれらのヒト化型。
【００１２】
本発明は、以下を特徴とする本発明による抗体を更に含む。
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８である；
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号１５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号１６である；
またはそれらのヒト化型。
【００１３】
一実施態様において、本発明による抗体は以下を特徴とする。
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号２３であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号２４である；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号３１であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号３２である；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号３９であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４０である；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号４７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４８である；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号５５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号５６である。
【００１４】
本発明は、以下を特徴とする本発明による抗体を更に含む。
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、及び配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、及び配列番号６のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号１７のＣＤＲ３領域、配列番号１８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２０のＣＤＲ３領域、配列番号２１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号２５のＣＤＲ３領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、及び配列番号３０のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号３５のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３６のＣＤＲ３領域、配列番号３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号３８のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｆ）重鎖可変ドメインが配列番号４１のＣＤＲ３領域、配列番号４２のＣＤＲ２領域、及び配列番号４３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４４のＣＤＲ３領域、配列番号４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号４６のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｇ）重鎖可変ドメインが配列番号４９のＣＤＲ３領域、配列番号５０のＣＤＲ２領域、及び配列番号５１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号５２のＣＤＲ３領域、配列番号５３のＣＤＲ２領域、及び配列番号５４のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｈ）重鎖可変ドメインが配列番号６９のＣＤＲ３領域、配列番号７０のＣＤＲ２領域、及び配列番号７１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号７２のＣＤＲ３領域、配列番号７３のＣＤＲ２領域、及び配列番号７４のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｉ）重鎖可変ドメインが配列番号７７のＣＤＲ３領域、配列番号７８のＣＤＲ２領域、及び配列番号７９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号８０のＣＤＲ３領域、配列番号８１のＣＤＲ２領域、及び配列番号８２のＣＤＲ１領域を含む。
【００１５】
好ましくは、本発明による抗体はヒトＩｇＧ１サブクラス又はヒトＩｇＧ４サブクラスである。
【００１６】
本発明の更なる実施態様は、本発明による抗体を含む薬学的組成物である。
【００１７】
本発明はＣＳＦ−１Ｒ介在性疾患の治療のための医薬の製造のための、本発明による抗体の使用を更に含む。
【００１８】
本発明は、癌の治療のための医薬の製造のための、本発明による抗体の使用を更に含む。
【００１９】
本発明は、骨量減少の治療のための医薬の製造のための、本発明による抗体の使用を更に含む。
【００２０】
本発明は、転移の治療のための医薬の製造のための、本発明による抗体の使用を更に含む。
【００２１】
本発明は、炎症性疾患の治療のための医薬の製造のための、本発明による抗体の使用を更に含む。
【００２２】
本発明は、ＣＳＦ−１Ｒ介在性疾患の治療のための、本発明による抗体を更に含む。
【００２３】
本発明は、癌の治療のための、本発明による抗体を更に含む。
【００２４】
本発明は、骨量減少の治療のための、本発明による抗体を更に含む。
【００２５】
本発明は、転移の治療のための、本発明による抗体を更に含む。
【００２６】
本発明は、炎症性疾患の治療のための、本発明による抗体を更に含む。
【００２７】
本発明の更なる実施態様は、以下を特徴とする本発明による抗体をコードする核酸を含む。
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、及び配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、及び配列番号６のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号１７のＣＤＲ３領域、配列番号１８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２０のＣＤＲ３領域、配列番号２１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号２５のＣＤＲ３領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、及び配列番号３０のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号３５のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３６のＣＤＲ３領域、配列番号３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号３８のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｆ）重鎖可変ドメインが配列番号４１のＣＤＲ３領域、配列番号４２のＣＤＲ２領域、及び配列番号４３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４４のＣＤＲ３領域、配列番号４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号４６のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｇ）重鎖可変ドメインが配列番号４９のＣＤＲ３領域、配列番号５０のＣＤＲ２領域、及び配列番号５１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号５２のＣＤＲ３領域、配列番号５３のＣＤＲ２領域、及び配列番号５４のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｈ）重鎖可変ドメインが配列番号６９のＣＤＲ３領域、配列番号７０のＣＤＲ２領域、及び配列番号７１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号７２のＣＤＲ３領域、配列番号７３のＣＤＲ２領域、及び配列番号７４のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｉ）重鎖可変ドメインが配列番号７７のＣＤＲ３領域、配列番号７８のＣＤＲ２領域、及び配列番号７９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号８０のＣＤＲ３領域、配列番号８１のＣＤＲ２領域、及び配列番号８２のＣＤＲ１領域を含む。
【００２８】
本発明の更なる実施態様は、以下を特徴とする本発明による抗体をコードする核酸を含む。
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８である；
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号１５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号１６である；
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号７５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号７６である；
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号８３であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８４である；
またはそれらのヒト化型。
【００２９】
本発明の更なる実施態様は、以下を特徴とする本発明による抗体をコードする核酸を含む。
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号２３であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号２４である；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号３１であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号３２である；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号３９であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４０である；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号４７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４８である；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号５５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号５６である。
【００３０】
本発明は、原核または真核宿主細胞中で前記核酸を発現することができる本発明による核酸を含有する発現ベクター、および本発明による抗体の組換え産生のためのそうしたベクターを含有する宿主細胞を更に提供する。
【００３１】
本発明は、本発明によるベクターを含有する原核または真核宿主細胞を更に含む。
【００３２】
本発明は、本発明による核酸を、原核または真核宿主細胞中で発現させ、かつ該抗体を該細胞又は細胞培養上清から回収することを特徴とする、本発明による組換えヒト抗体又はヒト化抗体の産生のための方法を更に含む。本発明は、そうした組換え法により得られた抗体を更に含む。
【００３３】
本発明による抗体は、ＣＳＦ−１Ｒ標的療法を必要とする患者に対して利点を示す。本発明による抗体は、リガンド非依存性およびリガンド依存性増殖に対する有効な抗増殖活性を示し、従って、癌および転移の治療において特に有効である。
【００３４】
本発明は、癌に罹患した患者を治療するための方法を更に提供し、そうした疾患を有すると診断された（従ってそのような治療を必要としている）患者に、本発明による抗体の有効量を投与することを包含する。
【００３５】
本発明の更なる実施態様は、癌に罹患した患者を治療するために、本発明による抗体を患者に投与することを特徴とする方法である。
【００３６】
驚くべきことに、ヒトＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤのＤ４サブドメインが欠失したヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４を用いて、本発明による新たな抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が選択され得ることが見いだされた。これらの抗体は、全長の野生型ＣＳＦ−１Ｒ（配列番号６２）又は、変異体ＣＳＦ−１ＲＬ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ（配列番号６３）（変異体ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞はＣＳＦ−１リガンドに依存せずに球状体を形成することができる）の何れかでレトロウイルス性に感染したＮＩＨ ３Ｔ３細胞の優れたリガンド依存的な細胞増殖阻害と同時にＮＩＨ ３Ｔ３細胞のリガンド非依存的な細胞増殖阻害などの有益な性質を示す。
【００３７】
更に、本発明による抗体は、ヒト及びカニクイザル（の両方の）マクロファージ分化を阻害するが、その理由はそれらがヒトの単球及びカニクイザルの単球の生存を阻害するためである。
【００３８】
本発明の詳細な記述
本発明は、ヒトＣＳＦ−１Ｒへの抗体結合を包含し、抗体がヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４（細胞外サブドメインＤ１−Ｄ３及びＤ５を含む）（配列番号６５）及びヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（細胞外サブドメインＤ１−Ｄ５を含む）（配列番号６４）に、１：５０か又はそれ以下の比率で結合することを特徴とする。
【００３９】
本発明は、重鎖可変ドメインＣＤＲ３領域として配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号９、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４７、又は配列番号５５を含むことを特徴とする、本発明による抗体を更に含む。
【００４０】
本発明は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８である；
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号１５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号１６である；
またはそれらのヒト化型を特徴とする本発明による抗体を更に含む。
【００４１】
本発明は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８である；
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号１５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号１６である；
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号７５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号７６である；
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号８３であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８４である；
またはそれらのヒト化型を特徴とする本発明による抗体を更に含む。
【００４２】
本発明は、重鎖可変ドメインが配列番号７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８であり、又はそれらのヒト化型を特徴とする本発明による抗体を更に含む。
【００４３】
一実施態様において、本発明による抗体は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号２３であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号２４である；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号３１であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号３２である；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号３９であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４０である；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号４７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４８である；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号５５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号５６であることを特徴とする。
【００４４】
一実施態様において、本発明による抗体は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号２３であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号２４である；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号３１であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号３２である；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号３９であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４０である；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号４７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４８であることを特徴とする。
【００４５】
一実施態様において、本発明による抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号２３であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号２４であることを特徴とし、又は
一実施態様において、本発明による抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号３１であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号３２であることを特徴とする。
【００４６】
一実施態様において、本発明による抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号３９であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４０であることを特徴とする。
【００４７】
一実施態様において、本発明による抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号４７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４８であることを特徴とする。
【００４８】
本発明は、重鎖可変ドメインが配列番号１５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号１６であり、又はそれらのヒト化型を特徴とする本発明による抗体を更に含む。
【００４９】
本発明は、重鎖可変ドメインが配列番号７５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号７６であり、又はそれらのヒト化型を特徴とする本発明による抗体を更に含む。
【００５０】
本発明は、重鎖可変ドメインが配列番号８３であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８４であり、又はそれらのヒト化型を特徴とする本発明による抗体を更に含む。
【００５１】
本発明は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、及び配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、及び配列番号６のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号１７のＣＤＲ３領域、配列番号１８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２０のＣＤＲ３領域、配列番号２１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号２５のＣＤＲ３領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、及び配列番号３０のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号３５のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３６のＣＤＲ３領域、配列番号３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号３８のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｆ）重鎖可変ドメインが配列番号４１のＣＤＲ３領域、配列番号４２のＣＤＲ２領域、及び配列番号４３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４４のＣＤＲ３領域、配列番号４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号４６のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｇ）重鎖可変ドメインが配列番号４９のＣＤＲ３領域、配列番号５０のＣＤＲ２領域、及び配列番号５１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号５２のＣＤＲ３領域、配列番号５３のＣＤＲ２領域、及び配列番号５４のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする本発明による抗体を更に含む。
【００５２】
本発明は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、及び配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、及び配列番号６のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号１７のＣＤＲ３領域、配列番号１８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２０のＣＤＲ３領域、配列番号２１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号２５のＣＤＲ３領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、及び配列番号３０のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号３５のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３６のＣＤＲ３領域、配列番号３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号３８のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｆ）重鎖可変ドメインが配列番号４１のＣＤＲ３領域、配列番号４２のＣＤＲ２領域、及び配列番号４３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４４のＣＤＲ３領域、配列番号４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号４６のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｇ）重鎖可変ドメインが配列番号４９のＣＤＲ３領域、配列番号５０のＣＤＲ２領域、及び配列番号５１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号５２のＣＤＲ３領域、配列番号５３のＣＤＲ２領域、及び配列番号５４のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｈ）重鎖可変ドメインが配列番号６９のＣＤＲ３領域、配列番号７０のＣＤＲ２領域、及び配列番号７１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号７２のＣＤＲ３領域、配列番号７３のＣＤＲ２領域、及び配列番号７４のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｉ）重鎖可変ドメインが配列番号７７のＣＤＲ３領域、配列番号７８のＣＤＲ２領域、及び配列番号７９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号８０のＣＤＲ３領域、配列番号８１のＣＤＲ２領域、及び配列番号８２のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする本発明による抗体を更に含む。
【００５３】
一実施態様において、本発明による抗体は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号６９のＣＤＲ３領域、配列番号７０のＣＤＲ２領域、及び配列番号７１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号７２のＣＤＲ３領域、配列番号７３のＣＤＲ２領域、及び配列番号７４のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号７７のＣＤＲ３領域、配列番号７８のＣＤＲ２領域、及び配列番号７９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号８０のＣＤＲ３領域、配列番号８１のＣＤＲ２領域、及び配列番号８２のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする。
【００５４】
一実施態様において、本発明による抗体は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号１７のＣＤＲ３領域、配列番号１８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２０のＣＤＲ３領域、配列番号２１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号２５のＣＤＲ３領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、及び配列番号３０のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号３５のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３６のＣＤＲ３領域、配列番号３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号３８のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号４１のＣＤＲ３領域、配列番号４２のＣＤＲ２領域、及び配列番号４３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４４のＣＤＲ３領域、配列番号４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号４６のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号４９のＣＤＲ３領域、配列番号５０のＣＤＲ２領域、及び配列番号５１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号５２のＣＤＲ３領域、配列番号５３のＣＤＲ２領域、及び配列番号５４のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする。
【００５５】
一実施態様において、本発明による抗体は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号１７のＣＤＲ３領域、配列番号１８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２０のＣＤＲ３領域、配列番号２１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号２５のＣＤＲ３領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、及び配列番号３０のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号３５のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３６のＣＤＲ３領域、配列番号３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号３８のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号４１のＣＤＲ３領域、配列番号４２のＣＤＲ２領域、及び配列番号４３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４４のＣＤＲ３領域、配列番号４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号４６のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする。
【００５６】
一実施態様において、本発明による抗体は、
重鎖可変ドメインが配列番号１７のＣＤＲ３領域、配列番号１８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２０のＣＤＲ３領域、配列番号２１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする。
【００５７】
一実施態様において、本発明による抗体は、
重鎖可変ドメインが配列番号２５のＣＤＲ３領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、及び配列番号３０のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする。
【００５８】
一実施態様において、本発明による抗体は、
重鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号３５のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３６のＣＤＲ３領域、配列番号３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号３８のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする。
【００５９】
一実施態様において、本発明による抗体は、
重鎖可変ドメインが配列番号４１のＣＤＲ３領域、配列番号４２のＣＤＲ２領域、及び配列番号４３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４４のＣＤＲ３領域、配列番号４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号４６のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする。
【００６０】
一実施態様において、抗体がヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４（配列番号６５）及びヒトＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ（配列番号６４）に対して１：５０又はそれ以下の比率で結合することを特徴とするヒトＣＳＦ−１Ｒへの抗体結合が、ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１−Ｄ３（配列番号６６）へ結合しないことを更に特徴とする。
【００６１】
用語「抗体」は、限定されないが、全抗体、抗体断片、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、Ｔ細胞エピトープ枯渇抗体、及び、本発明に係る特徴的性質が維持される限り更に遺伝子的に改変された抗体を含む様々な形態の抗体を包含する。「抗体断片」は、全長抗体の一部分、好ましくはその可変ドメイン、又は少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例は、ダイアボディ、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88)に記載される。加えて、抗体断片は、ＣＳＦ−１Ｒへ結合するＶＨドメインの特徴を有する、すなわち、ＶＬドメインとともに機能性抗原結合部位に集合することができる単鎖ポリペプチド、又はＣＳＦ−１Ｒへ結合するＶＬドメインの特徴を有する、すなわち、ＶＨドメインとともに機能性抗原結合部位に集合することができる単鎖ポリペプチドを含み、それによって性質を与える。
【００６２】
本明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を言う。
【００６３】
用語「キメラ抗体」とは、通常は組換えＤＮＡ技術により調製された、マウス由来の可変領域、すなわち結合領域、及び異なる起源又は種に由来した定常領域の少なくとも一部分を含むモノクローナル抗体を言う。マウス可変領域とヒト定常領域とを含んでなるキメラ抗体が特に好ましい。そのようなラット／ヒトキメラ抗体は、ラット免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、ヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含んでなる、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明により包含される「キメラ抗体」の別の形態は、クラス又はサブクラスが元の抗体のものから修飾又は変更されているものである。そのような「キメラ抗体」は、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体を作製する方法は、現在当該分野で良く知られた従来の組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を含む。例えばMorrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 ; 米国特許第５２０２２３８号及び米国特許第５２０４２４４号を参照のこと。
【００６４】
用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が親の免疫グロブリンのものと比較して異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含んでなるように変更されている抗体を言う。好ましい実施態様において、マウスＣＤＲがヒト抗体のフレームワーク領域に移植されて「ヒト化抗体」を調製する。例えばRiechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327 ; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照のこと。場合によっては、フレームワーク領域は更なる変異により改変されうる。また、ＣＤＲは、例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327及びQueen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033、その他により記載されるように、分子モデリングにもとずく変異誘発により、一以上の変異により改変され、本発明による抗体を産生する。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体に関する上記の抗原を認識する配列を表わしているものに対応する。「本発明による抗体のヒト化型」（例えばマウス起源である）は、ＶＨおよびＶＬが標準的な技術（ＣＤＲ移植法、及び場合によってはフレームワーク領域及びＣＤＲの所定のアミノ酸の後の変異誘発を含む）によりヒト化されるマウス抗体配列にもとずく抗体を言う。好ましくは、そのようなヒト化型はヒト定常領域によりキメラ化される（例えば、配列番号５７−６１の配列を参照）。
【００６５】
本発明により包含される「ヒト化抗体」の別の形態は、本発明による性質、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関する性質を生みだすために、定常領域がもとの抗体のものから更に改変されるか又は変更されたものである。
【００６６】
以下の実施例において、用語「Ｍａｂ」又は「ｍｕＭａｂ」はマウスモノクローナル抗体、例えばＭａｂ ２Ｆ１１又はＭａｂ ２Ｅ１０を言い、一方用語「ｈＭａｂ」はそうしたマウス抗体のヒト化モノクローナル型、例えば、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｃ１１、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｄ８、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｆ１２等を言う。
【００６７】
本明細書で用いられる用語「ヒト抗体」は、ヒトの生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。ヒト抗体は最新技術において良く知られている(van Dijk, M.A.,及びvan de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。ヒト抗体はまた、内因性の免疫グロブリン産生が無い場合に、免疫感作時に、ヒト抗体の完全なレパートリー又は選択を産生することができる、トランスジェニック動物（例えばマウス）で作成することが可能である。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列をそうした生殖系列変異マウスへ転移すると、抗原曝露によるヒト抗体の産生をもたらし得る(例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40を参照)。ヒト抗体はまたファージディスプレイライブラリーで産生できる(Hoogenboom, H.R.及びWinter, G.J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597)。Cole, et al., 及びBoerner他による技術はまたヒトモノクローナル抗体の調製において利用可能である(Cole, S.P.C., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); and Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95)。本発明によるキメラ抗体及びヒト化抗体について既に述べたように、本発明で用いられる用語「ヒト抗体」はまた、本発明による性質、とりわけ、例えば「クラススイッチ」、すなわちＦｃ部分の変化又は変異（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）による、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関する性質を生みだすために、定常領域において改変された当該抗体をも含む。
【００６８】
本明細書で用いられる用語「組み換えヒト抗体」は、組み換え手段により調製、発現、作製又は単離された全てのヒト抗体を包含するものであり、例えばＮＳ０もしくはＣＨＯ細胞のような宿主細胞から又は宿主細胞中にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使って発現されたヒト免疫グロブリン遺伝子もしくは抗体に対してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体である。そのような組み換えヒト抗体は再配列された形で可変領域及び定常領域を有する。本発明に係る組み換えヒト抗体は、生体内体細胞超変異にされている。よって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ及びＶＬ配列から誘導されそしてそれに関連する配列であり、生体内のヒト抗体生殖細胞系列レパートリーの中には天然に存在しない場合がある。
【００６９】
本発明による抗体は、加えて、本発明による抗体の上述された特性に影響を及ぼさない、または変更しないヌクレオチドおよびアミノ酸配列改変である、「保存的配列改変」を有するような抗体を含む。改変は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発のような、当技術分野において公知である標準的技術によって導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものを含む。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。このように、ヒト抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体において予想される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同一の側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基と置換され得る。
【００７０】
アミノ酸置換は、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327およびQueen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033によって記述されるような、分子モデリングに基づく変異誘発によって行われ得る。
【００７１】
ヒトＣＳＦ−１Ｒレセプター（ＣＳＦ−１レセプター；同義語：Ｍ−ＣＳＦレセプター；マクロファージコロニー刺激因子１レセプター、Ｆｍｓ癌原遺伝子、ｃ−ｆｍｓ、配列番号２２）は、１９８６年から知られている(Coussens, L., et al., Nature 320 (1986) 277-280)。ＣＳＦ−１Ｒは増殖因子であって、ｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子によりコードされる(総説は例えば、in Roth, P. and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-67)。
【００７２】
ＣＳＦ−１ＲはＣＳＦ−１（マクロファージコロニー刺激因子、Ｍ−ＣＳＦとも呼ばれる）及びＩＬ−３４に対するレセプターであり、これらのサイトカインの生物学的作用を媒介する(Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676 (Lin, H., et al., Science 320 (2008) 807-811)。コロニー刺激因子１レセプター（ｃ−ｆｍｓとも呼ばれる）は、最初にRoussel, M.F., et al., Nature 325 (1987) 549-552に記載された。その出版物において、ＣＳＦ−１ＲがＣｂｌを結合し、それによってレセプターのダウンレギュレーションを制御する阻害性チロシン９６９のリン酸化の消失を含む、タンパク質のＣ末端部の変化に依存した形質転換能を有することが示された。
【００７３】
ＣＳＦ−１Ｒは単鎖の膜貫通レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、免疫グロブリン（Ｉｇ）モチーフを含有ＰＴＫのファミリーの一員であり、レセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の５回反復Ｉｇ様サブドメイン、Ｄ１−Ｄ５を特徴とする(Wang, Z., et al Molecular and Cellular Biology 13 (1993) 5348-5359)。ヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）（配列番号６４）は、５つの細胞外Ｉｇ様サブドメイン、Ｄ１−Ｄ５を全て含む。ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４（配列番号６５）は、細胞外Ｉｇ様サブドメイン、Ｄ１−Ｄ３及びＤ５を含むが、Ｄ４サブドメインが欠けている。ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１−Ｄ３（配列番号６６）は、各サブドメインＤ１−Ｄ３を含む。配列はシグナルペプチドのＭＧＳＧＰＧＶＬＬＬ  ＬＬＶＡＴＡＷＨＧＱ  Ｇ（配列番号６７）無しで載せられている。
【００７４】
細胞内タンパク質チロシンキナーゼドメインは、血小板由来増殖因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）、幹細胞増殖因子レセプター（ｃ−Ｋｉｔ）及びｆｉｎｓ様サイトカインレセプター（ＦＬＴ３）を含む、他の関連したＰＴＫクラスＩＩＩファミリーメンバーにも存在する、固有の挿入ドメインで中断される。この増殖因子レセプターのファミリー間の構造的相同性にもかかわらず、それらは異なった組織特異的機能を持っている。
【００７５】
ＣＳＦ−１Ｒは、単球系統の細胞、及び女性生殖器管と胎盤の細胞において主に発現される。加えて、ＣＳＦ−１Ｒの発現は、皮膚のランゲルハンス細胞、平滑筋細胞のサブセット(Inaba, T., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 5693-5699)、Ｂ細胞(Baker, A.H., et al., Oncogene 8 (1993) 371-378)及びミクログリア(Sawada, M., et al., Brain Res. 509 (1990) 119-124)において報告されている。変異型ヒトＣＳＦ−１Ｒ（配列番号２３）を持つ細胞は、リガンド刺激に非依存的に増殖することが知られている。
【００７６】
本明細書で使用されるように、「ヒトＣＳＦ−１Ｒへの結合」又は「ヒトＣＳＦ−１Ｒへの特異的結合」とは、ＫＤ値が３５℃で１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌか又はそれ以下である結合親和性で、一実施態様では、ＫＤ値が３５℃で１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌか又はそれ以下である結合親和性で、ヒトＣＳＦ−１Ｒ抗原に特異的に結合する抗体を言う。結合親和性は、３５℃で標準的な結合アッセイにより、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で決定される。結合親和性のＫＤ値を決定する方法は実施例９に記載される。従って、本明細書で使用されるように、「ヒトＣＳＦ−１Ｒへの抗体結合」は、３５℃でＫＤが１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ又はそれ以下（好ましくは、１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ−１．０ｘ１０−１２ｍｏｌ／ｌ）、好ましくは３５℃でＫＤが１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ又はそれ以下（好ましくは、１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ−１．０ｘ１０−１２ｍｏｌ／ｌ）で、ヒトＣＳＦ−１Ｒ抗原に対する抗体特異的結合を言う。
【００７７】
本明細書で使用される「ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４（配列番号６５）及びヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（配列番号６４）への結合」は、実施例４に記載されるように表面プラズモン共鳴アッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ ａｓｓａｙ）により測定される。ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４（配列番号６５）又はヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（配列番号６４）は、それぞれ、表面に（別々の表面に各々は）捕獲され、（別々の測定で各々に）試験抗体が添加され、それぞれの結合シグナル（応答単位（ＲＵ））が決定された。基準シグナル（ブランク表面）が差し引かれた。試験抗体非結合のシグナルがわずかに０未満であった場合、その値は０として設定された。次いで、それぞれの結合シグナルの比率（ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４への結合シグナル（ＲＵ）／ヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）への結合シグナル（ＲＵ））が決定される。本発明による抗体は、結合シグナル（ＲＵ（ｄｅｌＤ４）／ＲＵ（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）が１：５０又はそれ以下、好ましくは１：１００かそれ以下の比率を有する（下限は０を含む（例えばＲＵが０であれば比率は０：５０又は０：１００である））。
【００７８】
これは本発明によるそうした抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体はヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４に結合せず（ＤＳＭＺにて２００４年８月１８日にＤＳＭ ＡＣＣ ２６８３として寄託された）抗ＣＣＲ５抗体ｍ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３.１Ｃ５と同様に）、抗ＣＣＲ５抗体ｍ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３.１Ｃ５の範囲において、ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４へ結合する結合シグナルを有することを意味し、そのシグナルは実施例４に示された表面プラスモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）アッセイで２０ＲＵ（反応単位）未満、好ましくは１０ＲＵ未満である。
【００７９】
用語「ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１−Ｄ３への結合」とは、表面プラスモン共鳴アッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ ａｓｓａｙ）による結合親和性の決定を言う。試験抗体は表面へ捕獲され、ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１−Ｄ３（配列番号６６）が添加され、それぞれの結合親和性が決定された。「ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１−Ｄ３への非結合」とは、そうしたアッセイにおいて、検出されたシグナルがバックグランドシグナルのわずか１．２倍の領域にあり、従って、有意な結合は検出できず、結合親和性が決定できないことを意味する（実施例１０）。
【００８０】
本発明の一実施態様は、本発明による抗体を選択するためのスクリーニング方法であり、以下の工程を含む：
ａ）ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４（配列番号６５）及びヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）（配列番号６４）に対する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の結合シグナル（反応単位（ＲＵ））を表面プラスモン共鳴アッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ ａｓｓａｙ）により決定する。
ｂ）結合シグナル（ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４／ヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ））の比率が５０：１又はそれ以下である抗体を選択する。
【００８１】
一実施態様において、その決定は２５℃で実施される。
【００８２】
一実施態様において、そのスクリーニング法は更なる工程として、ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１−Ｄ３（配列番号６６）（Ｄ１−Ｄ３）への抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の結合を測定し、前記断片に対する結合を示さない抗体を選択することを含む。
【００８３】
用語「エピトープ」は、抗体への特異的結合が可能であるタンパク質抗原決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性を有する表面配置からなり、かつ、通常、特異的な三次元構造特性、ならびに特異的な電荷特性を有する。コンフォメーションおよび非コンフォメーションエピトープは、前者への結合は変性溶媒の存在下で失われるが、後者への結合は失われないことで識別される。好ましくは、本発明による抗体は、天然型ＣＳＦ−１Ｒ及び変性ＣＳＦ−１Ｒに結合する。
【００８４】
「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、本明細書において使用されるとき、抗体を抗原に結合させることに直接関与する軽鎖および重鎖の対のそれぞれを示す。可変軽鎖および重鎖のドメインは、同一の一般的な構造を有し、および、各ドメインは、配列が広く保存され、３個の「超可変領域」（または、相補性決定領域、ＣＤＲ）によって連結される、４個のフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを採り、および、ＣＤＲは、βシート構造を連結するループを形成してもよい。各鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によって三次元構造に保持され、および、もう一方の鎖由来のＣＤＲとともに抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、およびそのために、本発明の更なる目的を提供する。
【００８５】
用語「抗体の抗原結合部分」とは、本明細書において使用されるとき、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部位は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」領域は、本明細書において定義されるとき、超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。そのため、抗体の軽鎖および重鎖可変鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与し、かつ、抗体を定義する領域である。ＣＤＲおよびＦＲ領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的定義、および／または「超可変ループ」由来の残基によって決定される。
【００８６】
用語「核酸」又は「核酸分子」とは、本明細書において使用されるとき、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むように意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００８７】
用語「アミノ酸」は、本出願にて使用される場合、天然に生じるカルボキシαアミノ酸の群を意味し、アラニン（３文字コード：ａｌａ、一文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、メチオニンイソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、（ｐｒｏ、Ｐ）プロリン、セリン（ｓｅｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む。
【００８８】
一実施態様において、本発明による抗体はＣＳＦ−１のＣＳＦ−１Ｒへの結合を阻害する。一実施態様において、ＩＣ５０が２００ｎｇ／ｍｌ又はそれ以下であり、一実施態様において、ＩＣ５０が５０ｎｇ／ｍｌ又はそれ以下である。ＣＳＦ−１のＣＳＦ−１Ｒへの結合の阻害のＩＣ５０は、実施例２に示されるように決定されうる。
【００８９】
一実施態様において、本発明による抗体はＣＳＦ−１誘導性ＣＳＦ−１Ｒリン酸化を（ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞において）阻害する。
【００９０】
一実施態様において、ＩＣ５０が８００ｎｇ／ｍｌ又はそれ以下であり、一実施態様において、ＩＣ５０が６００ｎｇ／ｍｌ又はそれ以下であり、一実施態様において、ＩＣ５０が２５０ｎｇ／ｍｌ又はそれ以下である。ＣＳＦ−１誘導性ＣＳＦ−１Ｒリン酸化のＩＣ５０は、実施例３に示されるように決定されうる。
【００９１】
一実施態様において、本発明による抗体は、ヒトＣＳＦ−１Ｒ（配列番号６２）を発現する組換えＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害する。一実施態様において、ＩＣ５０が１０μｇ／ｍｌ又はそれ以下であり、一実施態様において、ＩＣ５０が５μｇ／ｍｌ又はそれ以下であり、一実施態様において、ＩＣ５０が２μｇ／ｍｌ又はそれ以下である。一実施態様において、ＩＣ３０が１０μｇ／ｍｌ又はそれ以下であり、一実施態様において、ＩＣ３０が５μｇ／ｍｌ又はそれ以下であり、一実施態様において、ＩＣ３０が２μｇ／ｍｌ又はそれ以下である。ＩＣ５０の値、ＩＣ３０の値、又は％増殖阻害は実施例５に示されるように決定される。
【００９２】
一実施態様において、本発明による抗体は、変異体ＣＳＦ−１ＲのＬ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ（配列番号６３）を発現する組換えＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害する。一実施態様において、ＩＣ５０が１５μｇ／ｍｌ又はそれ以下であり、一実施態様において、ＩＣ５０が１０μｇ／ｍｌ又はそれ以下である。一実施態様において、ＩＣ３０が１０μｇ／ｍｌ又はそれ以下であり、一実施態様において、ＩＣ５０が５μｇ／ｍｌ又はそれ以下であり；一実施態様において、ＩＣ５０が２μｇ／ｍｌ又はそれ以下である。ＩＣ５０の値、ＩＣ３０の値又は％増殖阻害は実施例５に示されるように決定される。
【００９３】
一実施態様において、本発明による抗体はＢｅＷｏ腫瘍細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−９８）の増殖を６５％かそれ以上（抗体濃度で１０μｇ／ｍｌ；抗体の非存在と比較して）阻害する。％増殖阻害は実施例８に示されるように決定される。例えば、Ｍａｂ ２Ｆ１１は７０％のＢｅＷｏ腫瘍細胞の増殖阻害を示す。
【００９４】
一実施態様において、本発明による抗体は、ヒト及びカニクイザルのマクロファージ分化の両方を阻害する（実施例７及び８に示すように、ヒト及びカニクイザルの単球の生存の阻害により示される）。一実施態様において、本発明による抗体は、ヒト単球の生存をＩＣ５０が０．１５μｇ／ｍｌ又はそれ以下で阻害し、一実施態様において、ＩＣ５０が０．１０μｇ／ｍｌ又はそれ以下で阻害する。ヒト単球の生存の阻害は実施例７に示されるように決定される。一実施態様において、本発明による抗体は、カニクイザルの単球の生存を８０％か又はそれ以上で、一実施態様において９０％か又はそれ以上で（抗体濃度で５μｇ／ｍｌ；抗体の非存在と比較して）、阻害する。ヒト単球の生存の阻害は、実施例８に示されるように決定される。
【００９５】
本発明の更なる実施態様は、ＣＳＦ−１Ｒに対する抗体の産生のための方法であって、本発明によるヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合するヒトＩｇＧ１クラス抗体の重鎖をコードする核酸の配列、前記修飾された核酸及び前記抗体の軽鎖をコードする核酸の配列が発現ベクターへ挿入され、該ベクターが真核生物の宿主細胞に挿入され、コードされたタンパク質が発現され、宿主細胞又はその上清から回収されることを特徴とする。
【００９６】
本発明による抗体は、好ましくは組換え手法により産生される。従って、抗体は好ましくは単離されたモノクローナル抗体である。そのような組換え法は最先端で広く知られており、原核生物及び真核生物におけるタンパク質の発現と、続く抗体ポリペプチドの単離及び通常は薬学的に許容される純度への精製を伴うことを含む。タンパク質発現について、軽鎖及び重鎖またはそれらの断片をコードする核酸は、標準的な方法で発現ベクターへ挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、または大腸菌細胞など適切な原核宿主細胞または真核宿主細胞で行われ、そして抗体は細胞（上清又は溶解後の細胞）から回収される。
【００９７】
抗体の組換え生産は、当技術分野では周知であり、および、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S. et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説論文において記載されている。
【００９８】
抗体は、細胞全体において、細胞溶解物において、または、部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態において存在し得る。他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質を除去するために、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知である他のものを含む標準的技術により、精製を行う。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照。
【００９９】
ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270により記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87により記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.-J. and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83により、およびSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199により記載されている。
【０１００】
例えば原核生物に適する調節配列は、プロモーター、任意的にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【０１０１】
核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関連性をもって配置されるとき、「操作可能な形で連結され」ている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるとき、ポリペプチドに関してＤＮＡと操作可能な形で連結している；プロモーター又はエンハンサーは、それがその配列の転写に影響するとき、コード配列と操作可能な形で連結されている； 又は、リボソーム結合部位は、それが転写を促進するように配置されているとき、コード配列に操作可能な形で連結されている。一般的に、「操作可能な形で連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が隣接し、そして、分泌リーダーの場合は、隣接し、且つ読み枠にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要は無い。連結は、都合の良い制限部位でライゲーションを行うことにより達成される。そのような部位が存在しなければ、通常の慣例に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【０１０２】
モノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等の、従来のイムノグロブリン精製手段により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、従来の手順を用いて、容易に単離され、配列が決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源としての機能を果たし得る。ひとたび単離されると、ＤＮＡは発現ベクターへ挿入され得、次いで、免疫グロブリンタンパク質をそれ以外の場合では産生しない、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又はミエローマ細胞などの宿主細胞へトランスフェクトされ、宿主細胞中に組換えモノクローナル抗体の合成を得る。
【０１０３】
本明細書において使用されるとき、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養」という表現は、交換可能なように使用され、および、そのような名称のすべては、子孫を含む。このように、「形質転換体」および「形質転換された細胞」という単語は、プライマリーの対象細胞および、トランスファーの数に関係なくそれ由来の培養物を含む。意図的または偶然の変異に起因するため、すべての子孫がＤＮＡの内容において正確に同一ではない可能性があることもまた、理解される。当初形質転換された細胞についてスクリーニングされたのと同一の機能または生物活性を有する、変異体子孫が含まれる。
【０１０４】
抗体の「Ｆｃ部分」は、抗原への抗体の結合に直接的には関与していないが、種々のエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は当業者には周知の用語であり、そして抗体のパパインによる切断に基づいて定義される。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体または免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭというクラスに分類され、そしてこれらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分類され得る。重鎖定常領域に従って、異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑへの結合およびＦｃレセプター結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞障害作用）およびＣＤＣ（補体依存性細胞障害作用）に直接的に関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、大半のＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補因子Ｃ１ｑの結合によって開始される。補体系に対する抗体の影響は特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分において規定された結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は当技術分野の水準において公知であり、そして例えばBoakle, R.J. et al., Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T.J. et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917 ; Burton, D.R. et al., Nature 288 (1980) 338-344 ; Thommesen, J.E. et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004 ; Idusogie, E.E. et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184 ; Hezareh, M. et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168 ; Morgan, A. et al., Immunology 86 (1995) 319-324;欧州特許第０３０７４３４号によって記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け、以下を参照されたい）である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３サブクラスの抗体は通常、補体活性化およびＣ１ｑおよびＣ３への結合を示すが、一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、そしてＣ１ｑおよびＣ３に結合しない。
【０１０５】
一実施態様において、本発明による抗体はヒト起源由来のＦｃ部分、好ましくはヒト定常領域の全ての他の部分を含む。本明細書において使用されるとき、用語「ヒト起源由来のＦｃ部分」は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のＦc部分、好ましくはヒトＩｇＧ１サブクラス由来のＦｃ部分、ヒトＩｇＧ１サブクラス由来の変異Ｆｃ部分（好ましくはＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａの変異を伴う）、ヒトＩｇＧ４サブクラス由来のＦｃ部分、又はヒトＩｇＧ４サブクラス由来の変異されたＦｃ部分（好ましくはＳ２２８Ｐの変異を伴う）のいずれかであるＦｃ部分を示す。最も好ましいのは、配列番号５８（ヒトＩｇＧ１サブクラス）、配列番号５９（変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを伴うヒトＩｇＧ１サブクラス）、配列番号６０ ヒトＩｇＧ４サブクラス)、又は配列番号６１（変異Ｓ２２８Ｐを伴うヒトＩｇＧ４サブクラス）のヒト重鎖定常領域である。
【０１０６】
好ましくは、本発明による抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。一実施態様において、本発明による抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。一実施態様において、本発明による抗体はヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。
【０１０７】
一実施態様において、本発明による抗体は、定常鎖がヒト起源のものであることを特徴とする。そのような定常鎖は最先端で良く知られており、例えばＫａｂａｔ,Ｅ.Ａ.に記載されている（例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照）。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号５７のカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
本発明の別の態様は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８である；
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号１５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号１６である；
またはそれらのヒト化型を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１０９】
本発明の別の態様は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８である；
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号１５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号１６である；
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号７５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号７６である；
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号８３であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８４である；
またはそれらのヒト化型を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１１０】
本発明の別の態様は、重鎖可変ドメインが配列番号７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８であり、又はそれらのヒト化型を特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１１１】
本発明の別の態様は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号２３であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号２４である；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号３１であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号３２である；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号３９であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４０である；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号４７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４８である；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号５５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号５６であることを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１１２】
本発明の別の態様は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号２３であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号２４である；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号３１であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号３２である；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号３９であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４０である；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号４７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４８であることを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１１３】
本発明の別の態様は、重鎖可変ドメインが配列番号２３であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号２４であることを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体であり、又は
本発明の別の態様は、重鎖可変ドメインが配列番号３１であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号３２であることを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１１４】
本発明の別の態様は、重鎖可変ドメインが配列番号３９であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４０であることを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１１５】
本発明の別の態様は、重鎖可変ドメインが配列番号４７であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号４８であることを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１１６】
本発明の別の態様は、重鎖可変ドメインが配列番号１５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号１６であり、又はそれらのヒト化型であることを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１１７】
本発明の別の態様は、重鎖可変ドメインが配列番号７５であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号７６であり、又はそれらのヒト化型であることを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１１８】
本発明の別の態様は、重鎖可変ドメインが配列番号８３であり、及び軽鎖可変ドメインが配列番号８４であり、又はそれらのヒト化型であることを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１１９】
本発明の別の態様は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、及び配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、及び配列番号６のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号９のＣＤＲ３領域、配列番号１０のＣＤＲ２領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号１２のＣＤＲ３領域、配列番号１３のＣＤＲ２領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号１７のＣＤＲ３領域、配列番号１８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２０のＣＤＲ３領域、配列番号２１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号２５のＣＤＲ３領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、及び配列番号３０のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号３５のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３６のＣＤＲ３領域、配列番号３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号３８のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｆ）重鎖可変ドメインが配列番号４１のＣＤＲ３領域、配列番号４２のＣＤＲ２領域、及び配列番号４３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４４のＣＤＲ３領域、配列番号４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号４６のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｇ）重鎖可変ドメインが配列番号４９のＣＤＲ３領域、配列番号５０のＣＤＲ２領域、及び配列番号５１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号５２のＣＤＲ３領域、配列番号５３のＣＤＲ２領域、及び配列番号５４のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｈ）重鎖可変ドメインが配列番号６９のＣＤＲ３領域、配列番号７０のＣＤＲ２領域、及び配列番号７１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号７２のＣＤＲ３領域、配列番号７３のＣＤＲ２領域、及び配列番号７４のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｉ）重鎖可変ドメインが配列番号７７のＣＤＲ３領域、配列番号７８のＣＤＲ２領域、及び配列番号７９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号８０のＣＤＲ３領域、配列番号８１のＣＤＲ２領域、及び配列番号８２のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１２０】
本発明の別の態様は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号１７のＣＤＲ３領域、配列番号１８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２０のＣＤＲ３領域、配列番号２１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号２５のＣＤＲ３領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、及び配列番号３０のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号３５のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３６のＣＤＲ３領域、配列番号３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号３８のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号４１のＣＤＲ３領域、配列番号４２のＣＤＲ２領域、及び配列番号４３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４４のＣＤＲ３領域、配列番号４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号４６のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号４９のＣＤＲ３領域、配列番号５０のＣＤＲ２領域、及び配列番号５１のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号５２のＣＤＲ３領域、配列番号５３のＣＤＲ２領域、及び配列番号５４のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１２１】
本発明の別の態様は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号１７のＣＤＲ３領域、配列番号１８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２０のＣＤＲ３領域、配列番号２１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号２５のＣＤＲ３領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、及び配列番号３０のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号３５のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３６のＣＤＲ３領域、配列番号３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号３８のＣＤＲ１領域を含む；又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号４１のＣＤＲ３領域、配列番号４２のＣＤＲ２領域、及び配列番号４３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４４のＣＤＲ３領域、配列番号４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号４６のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１２２】
本発明の別の態様は、重鎖可変ドメインが配列番号１７のＣＤＲ３領域、配列番号１８のＣＤＲ２領域、及び配列番号１９のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２０のＣＤＲ３領域、配列番号２１のＣＤＲ２領域、及び配列番号２２のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１２３】
本発明の別の態様は、重鎖可変ドメインが配列番号２５のＣＤＲ３領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、及び配列番号２７のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、及び配列番号３０のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１２４】
本発明の別の態様は、重鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３４のＣＤＲ２領域、及び配列番号３５のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３６のＣＤＲ３領域、配列番号３７のＣＤＲ２領域、及び配列番号３８のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１２５】
本発明の別の態様は、重鎖可変ドメインが配列番号４１のＣＤＲ３領域、配列番号４２のＣＤＲ２領域、及び配列番号４３のＣＤＲ１領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号４４のＣＤＲ３領域、配列番号４５のＣＤＲ２領域、及び配列番号４６のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体である。
【０１２６】
本発明は、治療を必要としている患者の治療のための方法を包含し、本発明による抗体の治療的有効量を患者に投与することを特徴とする。
【０１２７】
本発明は、治療のための本発明による抗体の使用を包含する。
【０１２８】
本発明の一つの好ましい実施態様は、「ＣＳＦ−１Ｒ介在性疾患」の治療における使用のための本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体、又は「ＣＳＦ−１Ｒ介在性疾患」の治療における医薬の製造を目的とした使用のための本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体であり、以下のように記載され得る：
ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達が腫瘍の増殖および転移に関与している可能性がある３つの異なるメカニズムがある。第一はＣＳＦリガンド及びレセプターの発現が女性の生殖系に由来する腫瘍細胞（乳癌、卵巣癌、子宮内膜、子宮頸部）で見いだされ(Scholl, S.M., et al., J. Natl. Cancer Inst. 86 (1994) 120-126; Kacinski, B.M., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 71-74; Ngan, H.Y., et al., Eur. J. Cancer 35 (1999) 1546-1550; Kirma, N., et al., Cancer Res 67 (2007) 1918-1926)、その発現が乳癌患者の乳癌異種移植片の増殖並びに予後不良に関連付けられていることである。一研究において、ＣＳＦ−１Ｒに２つの点変異が、急性骨髄性白血病患者、慢性骨髄性白血病患者及び骨髄異形成患者のおよそ１０−２０％に認められ、変異の一つがレセプター代謝回転を妨害ことが判明した(Ridge, S.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87 (1990) 1377-1380)。しかしながら、変異の発生率はその後の研究で確認することができなかった(Abu-Duhier, F.M., et al., Br. J. Haematol. 120 (2003) 464-470)。変異はまた、肝細胞癌(Yang, D.H., et al., Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 3 (2004) 86-89)及び特発性骨髄線維症(Abu-Duhier, F.M., et al., Br. J. Haematol. 120 (2003) 464-470)のいくつかのケースで見いだされた。近年、骨髄単芽球性白血病の患者由来のＧＤＭ−１細胞株で、ＣＳＦ−１ＲのＹ５７１Ｄ変異が同定された(Chase, A., et al., Leukemia 23 (2009) 358-364)。色素性絨毛結節性滑膜炎（ＰＶＮＳ）およびＴｅｎｏｓｙｎｏｖｉａｌ巨大細胞腫瘍（ＴＧＣＴ）は、コラーゲン遺伝子ＣＯＬ６Ａ３へＭ−ＣＳＦ遺伝子を融合する転座の結果として発生する可能性があり、Ｍ−ＣＳＦの過剰発現をもたらす(West, R.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 690-695)。景観効果（landscape effect）は、Ｍ−ＣＳＦを発現する細胞により誘引される単球細胞からなる腫瘤の発生に関与していると提案される。ＴＧＣＴは、最も生じる指から比較的容易に取り除くことが可能な小さな腫瘍である。ＰＶＮＳは大関節で再発する可能性があり、外科的に容易に管理されないものであるため、より侵攻性である。
【０１２９】
第二のメカニズムは、破骨細胞、骨吸収および溶骨性骨病変を誘導する骨の転移部位でＭ−ＣＳＦ／ＣＳＦ−１Ｒを介したシグナル伝達を遮断することに基づく。乳癌、多発性骨髄腫及び肺癌は、骨に転移し、溶骨性骨疾患を引き起こし、骨格の合併症を生じることが見出された癌の例である。腫瘍細胞及び間質から放出されたＭ−ＣＳＦは、核内因子カッパＢリガンドＲＡＮＫＬの受容体活性化因子と共同で、造血骨髄単球前駆細胞の成熟破骨細胞への分化を誘導する。この過程の間、Ｍ−ＣＳＦは破骨細胞に生存シグナルを与えることによって、許容因子として働く (Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 257-263)。抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体による破骨細胞の分化、及び成熟過程におけるＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害は、転移性疾患において溶骨性疾患及び関連した骨格関連事象を引き起こす、破骨細胞の不均衡な活性を妨げる可能性がある。乳癌、肺癌、多発性骨髄腫は、通常、溶骨性病変が生じるのに対し、前立腺癌の骨への転移は、最初は造骨細胞の外観を有し、そこでは骨形成活性の増大が、正常な骨の典型的なラメラ構造とは異なる「線維性骨」を生じる。疾患の進行中に、骨病変は有意な溶骨性成分ならびに骨吸収の高い血清レベルを提示し、抗骨吸収療法が有用であることを示唆している。ビスフォスフォネート製剤は、溶骨性病変の形成を阻害することが示され、ホルモン不応性転移性前立腺癌の男性においてのみ骨関連事象の数を減少させるが、この点で、造骨性病変へのその作用は議論があり、今日までビスフォスフォネート製剤は、骨転移又はホルモン応答性前立腺癌の予防に有益ではなかった。溶骨性／造骨性が混合した前立腺癌における抗骨吸収剤の作用は、なお臨床で毛研究されている(Choueiri, M.B., et al., Cancer Metastasis Rev. 25 (2006) 601-609; Vessella, R.L. and Corey, E., Clin. Cancer Res. 12 (20 Pt 2) (2006) 6285s-6290s)。
【０１３０】
第三のメカニズムは、乳癌、前立腺癌、卵巣癌および子宮頸癌の固形腫瘍に見いだされた腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、予後不良と相関するという最近の見解に基づいている(Bingle, L., et al., J. Pathol. 196 (2002) 254-265; Pollard, J.W., Nat. Rev. Cancer 4 (2004) 71-78)。マクロファージはＭ−ＣＳＦ及び他のケモカインによって腫瘍に補充される。マクロファージは次に、血管新生因子、プロテアーゼ及び他の増殖因子及びサイトカインの分泌を介して腫瘍の増殖の一因となり得、ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の阻害により遮断され得る。最近、Zins ら(Zins, K., et al., Cancer Res. 67 (2007) 1038-1045)は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）、Ｍ−ＣＳＦ又は両方の組合わせのｓｉＲＮＡの発現が、それぞれのｓｉＲＮＡを腫瘍内へ注入後、マウス異種移植モデルにおいて３４％から５０％の間で腫瘍増殖を減少させ得ることを示した。ヒトＳＷ６２０細胞により分泌されたＴＮＦアルファを標的とするｓｉＲＮＡは、マウスのＭ−ＣＳＦレベルを減少させ、腫瘍中のマクロファージの減少へと導いた。更に、ＭＣＦ７腫瘍異種移植片のＭ−ＣＳＦに対する抗原結合断片による治療は、化学療法剤と併用して与えられた場合、４０％の腫瘍増殖阻害をもたらし、化学療法剤に対する耐性を逆転させ、マウスの生存を改善した(Paulus, P., et al., Cancer Res. 66 (2006) 4349-4356)。
【０１３１】
ＴＡＭは、慢性炎症と癌の間の新たな関連性の一例である。炎症と癌との間の関連性の更なる証拠があり、その理由は、多くの慢性疾患が癌のリスクの増大と関連し、癌が慢性炎症の部位で起き、炎症のケミカルメディエーターが多くの癌で発見され；炎症の細胞性メディエーター又はケミカルメディエーターの欠失が実験的な癌の発生を抑制し、抗炎症薬の長期使用がいくつかの癌のリスクを減らすためである。胃癌に対するピロリ菌誘導性胃炎、膀胱癌に対する住血吸虫症、カポジ肉腫に対するＨＨＶＸ、卵巣癌に対する子宮内膜症、前立腺癌に対する前立腺炎など、多くの炎症性疾患について癌に対する相関が存在する(Balkwill, F., et al., Cancer Cell 7 (2005) 211-217)。マクロファージは慢性炎症で鍵となる細胞であり、それらの微小環境に差動的に応答する。機能的な状態の連続における両極端と見なされるマクロファージの２つの型がある：Ｍ１マクロファージは、１型の反応に関与している。これらの反応は、微生物産物による活性化、及び結果として病原性微生物の死滅を伴い、活性酸素中間体を生じる。極度のもう一方の端は、２型反応に関与するＭ２マクロファージであり、細胞増殖を促進し、炎症及び獲得免疫を調整し、組織リモデリング、血管新生および修復を促進する(Mantovani, A., et al., Trends Immunol. 25 (2004) 677-686)。確定した新生組織形成をもたらす慢性炎症は、一般にＭ２マクロファージに関連する。炎症反応を媒介する重要なサイトカインはＴＮＦアルファであり、その名のとおり、高用量では抗腫瘍免疫及び出血性壊死を刺激することができるが、また近年、腫瘍細胞により発現されて、発癌プロモーターとして働くことが見いだされた(Zins, K., et al., Cancer Res. 67 (2007) 1038-1045; Balkwill, F., Cancer Metastasis Rev. 25 (2006) 409-416)。腫瘍に関してマクロファージの特異的な役割は、それらの機能上の空間的および時間的依存性の可能性、及び特異的な腫瘍型に対する関連性を含み、まだよく理解する必要がある。
【０１３２】
従って、本発明の一実施態様は、癌の治療における使用を目的とした本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体である。本明細書で使用されるように用語「癌」は、例えば、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞上皮肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部位の癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン細胞腫、脳室上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮細胞癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病、上記癌の任意の抵抗性のもの、または上記癌の1つ以上の組合せでもよい。好ましくは、そうした癌は、乳癌、卵巣癌、子宮癌、肺癌または前立腺癌である。好ましくはそのような癌は、ＣＳＦ−１又はＣＳＦ−１Ｒの発現又は過剰発現により更に特徴付けられる。本発明の一つの更なる実施態様は、原発性腫瘍及び新規転移の同時治療における使用のための本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体である。
【０１３３】
従って、本発明の別の実施態様は、歯周炎、ヒスチオサイトーシスＸ、骨粗しょう症、骨のパジェット病（ＰＤＢ）、癌治療に起因する骨量減少、プロテーゼ周囲の骨溶解、グルココルチコイド誘発性骨粗しょう症、関節リウマチ、乾癬性(psiratic)関節炎、変形性関節症、炎症性関節炎(arthridities)、及び炎症の治療における使用のための本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体である。Rabello, D., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 347 (2006) 791-796 は、ＣＳＦ１遺伝子のＳＮＰは、悪性歯周炎（歯槽骨の再吸収による歯の喪失を引き起こす歯周組織の炎症性疾患）と明らかな関連を示すことを実証している。
【０１３４】
ヒスチオサイトーシスＸ（ランゲルハンス細胞組織球増加症、ＬＣＨとも呼ばれる）は、骨と余分な骨のＬＣＨ病変中で、破骨細胞へ分化するように見えるランゲルハンス樹状細胞の増殖性疾患である。ランゲルハンス細胞は、循環している単球から派生している。血清および病変中において測定されるＭ−ＣＳＦレベルの増加は、疾患の重篤性と相関することが見いだされた(da Costa, C.E., et al., J. Exp. Med. 201 (2005) 687-693)。その疾患は主に小児科の患者集団で発生し、病気が全身性になるか、または再発性のある場合に、化学療法で治療する必要がある。
【０１３５】
骨粗しょう症の病態は、骨を形成する骨芽細胞の消失、及び破骨細胞依存性の骨吸収の増加によって媒介される。支持するデータはＣｅｎｃｉらにより記載されており、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体の注入は骨密度を維持し、卵巣摘出マウスにおける骨再吸収を抑制することを示している(Cenci, S., et al., J. Clin. Invest. 105 (2000) 1279-1287)。最近、エストロゲン欠乏による閉経後の骨の損失の間につながりがある可能性が同定され、ＴＮＦアルファを産生するＴ細胞の存在が、骨代謝に影響を与えることが見いだされた(Roggia, C., et al., Minerva Med. 95 (2004) 125-132)。可能性のあるメカニズムは生体内におけるＴＮＦアルファによるＭ−ＣＳＦの誘導であろう。ＴＮＦアルファ誘導性破骨細胞におけるＭ−ＣＳＦの重要な役割は、マウスにおいてＴＮＦアルファ誘導性骨溶解を遮断するＭ−ＣＳＦに対する抗体の作用により確かめられ、それによりＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の阻害剤を、炎症性関節炎に対する潜在的標的としている(Kitaura, H., et al., J. Clin. Invest. 115 (2005) 3418-3427)。
【０１３６】
骨のパジェット病（ＰＤＢ）は、骨粗しょう症に次ぐ最も一般的な骨代謝疾患であり、増加した骨代謝回転の限局性異常は、骨の痛み、変形、病的骨折及び難聴などの合併症につながる。４つの遺伝子の突然変異が、通常の破骨細胞機能を調節し、ＰＤＢおよび関連疾患に個体をかかりやすくすることが確認されている：破骨細胞機能の重要な調節因子である核内因子（ＮＦ）カッパＢの受容体活性化因子(ＲＡＮＫ)をコードするＴＮＦＲＳＦ１１Ａの挿入変異、オステオプロテグリン（ＲＡＮＫリガンドのデコイレセプター）をコードするＴＮＦＲＳＦ１１Ｂの不活性化変異、ＮＦカッパＢ経路で重要なスキャフォールドタンパク質をコードするセクエストソーム（ｓｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅ）１遺伝子（ＳＱＳＴＭ１）の突然変異、及びバロシン含有タンパク質（ＶＣＰ）遺伝子の突然変異。この遺伝子は、プロテアソームによる分解に対する、ＮＦカッパＢの阻害剤の標的において役割を有するＶＣＰをコードする(Daroszewska, A. and Ralston, S.H., Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 2 (2006) 270-277)。標的とされたＣＳＦ−１Ｒ阻害剤は、間接的にＲＡＮＫＬシグナル伝達の調節解除を遮断する機会を与え、現在使用されているビスフォスフォネートに対して追加治療の選択肢を加える。
【０１３７】
特に乳癌および前立腺癌患者における癌治療誘発性骨量減少は付加的な適応症であり、標的とされたＣＳＦ−１Ｒ阻害剤が骨量減少を予防することができる可能性がある(Lester, J.E., et al., Br. J. Cancer 94 (2006) 30-35)。早期乳癌にたいする予後の改良に伴い、アジュバント療法の長期的影響はより重要となり、その理由は、化学療法、放射線照射、アロマターゼ阻害剤及び卵巣の切除を含む治療法のいくつかは、骨ミネラル濃度を減少させることにより骨代謝に影響を与え、骨粗しょう症及び関連する骨折のリスク増加をもたらすためである(Lester, J.E., et al., Br. J. Cancer 94 (2006) 30-35)。乳癌におけるアジュバントアロマターゼ阻害剤療法に同等なのは、前立腺癌のアンドロゲン除去治療であり、骨ミネラル濃度の低下につながり、大幅に骨粗しょう症に関連する骨折のリスクを増大させる(Stoch, S.A., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 (2001) 2787-2791)。
【０１３８】
ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の標的とされた阻害は、標的とされた細胞型が破骨細胞及びマクロファージを含む場合、例えば、関節リウマチの結果としての関節置換術に応答した特定の合併症の治療など、別の適応症で同様に有益である可能性がある。人工関節（プロテーゼ）周囲の骨の損失によるインプラントの失敗は人工関節置換の主要な合併症であり、個々の患者や医療システムにおいて高い社会経済的な負担を伴う反復手術を必要とする。今日まで、人工関節周囲の骨溶解を防止または抑制するための承認された薬物療法はない(Drees, P., et al., Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 3 (2007) 165-171)。
【０１３９】
グルココルチコイド誘発性骨粗しょう症（ＧＩＯＰ）は、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節リウマチなどを含む様々な疾患の結果として与えられるグルココルチコイドの長期使用後の骨量減少を、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤が予防しうる別の適応症である(Guzman-Clark, J.R., et al., Arthritis Rheum. 57 (2007) 140-146; Feldstein, A.C., et al., Osteoporos. Int. 16 (2005) 2168-2174)。
【０１４０】
関節リウマチ、乾癬性（psioratic）関節炎および炎症性関節炎は、マクロファージ成分及び様々な程度に骨破壊からなるという点で、それ自体がＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の阻害剤の可能性がある(Ritchlin, C.T., et al., J. Clin. Invest. 111 (2003) 821-831)。変形性関節症及び関節リウマチは、結合組織中のマクロファージの蓄積、及び少なくとも一部はＭ−ＣＳＦにより媒介される関節滑液へのマクロファージの浸潤により引き起こされる炎症性自己免疫疾患である。Campbell, I., K., et al., J. Leukoc. Biol. 68 (2000) 144-150は、Ｍ−ＣＳＦは、インビトロでのヒト関節組織細胞（軟骨細胞、滑膜線維芽細胞）によって産生され、関節リウマチ患者の滑液中に検出されることを実証し、それが滑膜組織の増殖、及び疾患の病因に関連付けられているマクロファージの浸潤に寄与することを示唆している。ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の阻害は、関節のマクロファージの数を調節し、関連した骨破壊の痛みを軽減する可能性がある。副作用の影響を最小限に抑え、これらの適応症におけるＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の影響を更に理解するため、一つの方法は、数多く他のキナーゼ、例えばＲａｆキナーゼなどを標的とせずに、特にＣＳＦ−１Ｒを阻害することである。
【０１４１】
最近の文献報告は、循環するＭ−ＣＳＦの増大を、慢性冠動脈疾患における予後不良およびアテローム性動脈硬化の進行と関連付けている(Saitoh, T., et al., J. Am. Coll. Cardiol. 35 (2000) 655-665; Ikonomidis, I., et al., Eur. Heart. J. 26 (2005) p. 1618-1624)；Ｍ−ＣＳＦは、ＣＳＦ−１Ｒを発現し初期プラークを代表する泡沫細胞（摂取した酸化ＬＤＬによるマクロファージ）の形成を助けることによってアテローム性動脈硬化過程に影響を与える(Murayama, T., et al., Circulation 99 (1999) 1740-1746)。
【０１４２】
Ｍ−ＣＳＦ及びＣＳＦ−１Ｒの発現及びシグナル伝達は活性化ミクログリアで見いだされる。中枢神経系の常駐マクロファージであるミクログリアは、感染および外傷を含む様々な傷害によって活性化することができる。Ｍ−ＣＳＦは、脳内の炎症反応の重要な調節因子と考えられており、Ｍ−ＣＳＦレベルはＨＩＶ−１、脳炎、アルツハイマー病（ＡＤ）および脳腫瘍において増大する。Ｍ−ＣＳＦ／ＣＳＦ−１Ｒによる自己分泌シグナル伝達の結果としての小神経膠細胞症は、例えば実験的な神経損傷モデルを用いて実証されるように、放出される炎症性サイトカインおよび酸化窒素の誘導を生じる(Hao, A.J., et al., Neuroscience 112 (2002) 889-900; Murphy, G.M., Jr., et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 20967-20971)。ＣＳＦ−１Ｒの発現が増大したミクログリアは、アルツハイマー病において、及びアミロイド前駆体タンパク質Ｖ７１７Ｆトランスジェニックアルツハイマー病マウスモデルにおいて、プラークを取り囲むことが見いだされる(Murphy, G.M., Jr., et al., Am. J. Pathol. 157 (2000) 895-904)。一方、脳内のミクログリアが少ないｏｐ／ｏｐマウスは、正常コントロールに比較して、Ａ−ベータの繊維状沈着及びニューロンの欠損を生じ、ミクログリアがＡＤの発症においてｏｐ／ｏｐマウスに欠けている神経保護機能を持つことを示唆している(Kaku, M., et al., Brain Res. Brain Res. Protoc. 12 (2003) 104-108)。
【０１４３】
Ｍ−ＣＳＦ及びＣＳＦ−１Ｒの発現及びシグナル伝達は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連している（国際公開第２００５／０４６６５７号）。用語「炎症性腸疾患」は、消化管の重篤な慢性疾患を言い、消化管内のさまざまな部位での慢性炎症を特徴とし、特に潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病が含まれる。
【０１４４】
本発明は、癌の治療のために、上記のエピトープ結合特性によって、又は代わりに上記のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられる、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体を含む。
【０１４５】
本発明は、骨量減少の治療のために、上記のエピトープ結合特性によって、又は代わりに上記のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられる、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体を含む。
【０１４６】
本発明は、転移の予防又は治療のために、上記のエピトープ結合特性によって、又は代わりに上記のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられる、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体を含む。
【０１４７】
本発明は、炎症性疾患の治療のために、上記のエピトープ結合特性によって、又は代わりに上記のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられる、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体を含む。
【０１４８】
本発明は、癌の治療のために、又は代わりに癌の治療のための医薬の製造のために、上記のエピトープ結合特性によって、又は代わりに上記のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられる、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体を含むことを特徴する抗体の使用を含む。
【０１４９】
本発明は、骨量減少の治療のために、又は代わりに骨量減少の治療のための医薬の製造のために、上記のエピトープ結合特性によって、又は代わりに上記のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられる、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体を含むことを特徴する抗体の使用を含む。
【０１５０】
本発明は、転移の予防及び治療のために、又は代わりに転移の予防又は治療のための医薬の製造のために、上記のエピトープ結合特性によって、又は代わりに上記のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられる、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体を含むことを特徴する抗体の使用を含む。
【０１５１】
本発明は、炎症性疾患の治療のために、又は代わりに炎症性疾患の治療のための医薬の製造のために、上記のエピトープ結合特性によって、又は代わりに上記のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられる、ヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体を含むことを特徴する抗体の使用を含む。
【０１５２】
本発明の更なる実施態様は、ＣＳＦ−１Ｒに対する抗体の生産のための方法であって、本発明によるヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合するヒトＩｇＧ１クラス抗体の重鎖をコードする核酸の配列、該改変された核酸及び該抗体の軽鎖をコードする核酸が発現ベクター中へ挿入され、該ベクターが真核生物宿主細胞へ挿入され、コードされたタンパク質が発現され、宿主細胞又は上清から回収されることを特徴とする。
【０１５３】
本発明による抗体は、好ましくは、組換え手段によって生産される。そのような方法は、当技術分野の最先端において広く公知であり、かつ、その後の抗体ポリペプチドの単離、および、通常薬学的に許容される純度への精製を伴う、原核生物および真核生物細胞におけるタンパク質発現を含む。タンパク質発現のために、軽鎖および重鎖、またはそれらの断片をコードする核酸が、標準的方法によって発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のような、適切な原核生物または真核生物宿主細胞において行われ、および、抗体が細胞（上清または溶解後の細胞）から回収される。
【０１５４】
抗体の組換え生産は、当技術分野の最先端において周知であり、かつ、例えば、Makrides,S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説論文において記述されている。
【０１５５】
抗体は、細胞全体、細胞溶解物、または、部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形態において存在してもよい。精製は、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質を除去するために、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および、当技術分野において周知である他のものを含む、標準的技術によって行われる。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照。
【０１５６】
ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123およびBarnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270によって記述されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9によって記述されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289およびNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87によって記述されている。好ましい一過性発現系（HEK293）は、Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83およびSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199によって記述されている。
【０１５７】
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において公知である様々な方法によって調製される。これらの方法は、天然供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、または、ヒト化抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の以前に調製された変異体または非変異体型のオリゴヌクレオチド媒介（もしくは部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、および、カセット変異誘発による調製を含むが、それらに限定されない。
【０１５８】
本発明による重鎖および軽鎖可変ドメインは、発現ベクターコンストラクトを形成するために、プロモーター、翻訳開始、定常領域、３'非翻訳領域、ポリアデニル化、および転写終結の配列と併用される。重鎖および軽鎖発現コンストラクトは、単一のベクターに結合され得、コトランスフェクションされ得、連続的にトランスフェクションされ得、または、宿主細胞に別々にトランスフェクションされ得、その後、双方の鎖を発現する単一の宿主細胞を形成するように融合される。
【０１５９】
別の態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分の一つまたは組み合わせを含み、薬学的に許容される担体とともに製剤化された、組成物、例えば薬学的組成物を提供する。
【０１６０】
本明細書において使用されるとき、「薬学的に許容される担体」は、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性のある同様のものを含む。好ましくは、担体は、注射または点滴に適する。
【０１６１】
本発明の組成物は、当技術分野において公知である様々な方法によって投与され得る。当業者によって評価されるであろうように、投与の経路および／または形式は、所望の結果に依存して変化するであろう。
【０１６２】
薬学的に許容される担体は、無菌の水性溶液または分散物、および無菌の注射可能な溶液または分散物の調製のための無菌パウダーを含む。薬学的に活性な物質のための、そのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において公知である。担体は、水に加えて、例えば、等張緩衝生理食塩水であり得る。
【０１６３】
選択された投与の経路にかかわらず、適当な水和した形態において使用されてもよい本発明の化合物、および／または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知である通常の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【０１６４】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性であること無く、特定の患者、組成物、および投与の形式について所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るために、変更されてもよい（有効量）。選択された投与量レベルは、使用された本発明の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、使用された特定の化合物、使用された特定の組成物と組み合わせて使用された他の薬物、化合物および／または材料の排出速度、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般健康状態および事前治療歴、ならびに、医療技術分野において周知である同様の因子を含む様々な薬物動態因子に依存するであろう。
【０１６５】
本発明は、癌、とりわけ大腸、肺又は膵臓癌に罹患した患者の治療のために、本発明による抗体の使用を含む。
【０１６６】
本発明はまた、そのような疾患に罹患した患者の治療のための方法をも含む。
【０１６７】
本発明は更に、本発明によるよる抗体の有効量を、薬学的に許容される担体と一緒に含む薬学的組成物の製造の方法、及びそのような方法のための本発明による抗体の使用を提供する。
【０１６８】
本発明は更に、癌に罹患した患者の治療のために、医薬品の製造のために、有効な量での本発明による抗体の使用を、好ましくは薬学的に許容される担体とともに、提供する。
【０１６９】
本発明はまた、癌に罹患した患者の治療のために、医薬品の製造のために、有効な量での本発明による抗体の使用を、好ましくは薬学的に許容される担体とともに、提供する。
【０１７０】
以下の実施例、配列一覧及び図は、本発明の理解を支援するために与えられ、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の精神から逸脱することなく、改変が定められた手順で行われ得ることが理解される。
【０１７１】
配列の説明
配列番号１  重鎖ＣＤＲ３、Ｍａｂ ２Ｆ１１
配列番号２  重鎖ＣＤＲ２、Ｍａｂ ２Ｆ１１
配列番号３  重鎖ＣＤＲ１、Ｍａｂ ２Ｆ１１
配列番号４  軽鎖ＣＤＲ３、Ｍａｂ ２Ｆ１１
配列番号５  軽鎖ＣＤＲ２、Ｍａｂ ２Ｆ１１
配列番号６  軽鎖ＣＤＲ１、Ｍａｂ ２Ｆ１１
配列番号７  重鎖可変ドメイン、Ｍａｂ ２Ｆ１１
配列番号８  軽鎖可変ドメイン、Ｍａｂ ２Ｆ１１
配列番号９  重鎖ＣＤＲ３、Ｍａｂ ２Ｅ１０
配列番号１０  重鎖ＣＤＲ２、Ｍａｂ ２Ｅ１０
配列番号１１  重鎖ＣＤＲ１、Ｍａｂ ２Ｅ１０
配列番号１２  軽鎖ＣＤＲ３、Ｍａｂ ２Ｅ１０
配列番号１３  軽鎖ＣＤＲ２、Ｍａｂ ２Ｅ１０
配列番号１４  軽鎖ＣＤＲ１、Ｍａｂ ２Ｅ１０
配列番号１５  重鎖可変ドメイン、Ｍａｂ ２Ｅ１０
配列番号１６  軽鎖可変ドメイン、Ｍａｂ ２Ｅ１０
配列番号１７  重鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号１８  重鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号１９  重鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号２０  軽鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号２１  軽鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号２２  軽鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号２３  重鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号２４  軽鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号２５  重鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号２６  重鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号２７  重鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号２８  軽鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号２９  軽鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号３０  軽鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号３１  重鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号３２  軽鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号３３  重鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号３４  重鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号３５  重鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号３６  軽鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号３７  軽鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号３８  軽鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号３９  重鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号４０  軽鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号４１  重鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４２  重鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４３  重鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４４  軽鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４５  軽鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４６  軽鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４７  重鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４８  軽鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４９  重鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５０  重鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５１  重鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５２  軽鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５３  軽鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５４  軽鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５５  重鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５６  軽鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５７  ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号５８  ＩｇＧ１由来ヒト重鎖定常領域
配列番号５９  Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａで変異されたＩｇＧ１由来ヒト重鎖定常領域
配列番号６０  ＩｇＧ４由来ヒト重鎖定常領域
配列番号６１  Ｓ２２８Ｐで変異されたＩｇＧ４由来ヒト重鎖定常領域
配列番号６２  ヒト野生型ＣＳＦ−１Ｒ（ｗｔ ＣＳＦ−１Ｒ）
配列番号６３  ヒト変異体ＣＳＦ−１Ｒ Ｌ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ
配列番号６４  ヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン
配列番号６５  ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４
配列番号６６  ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１−Ｄ３
配列番号６７  シグナルペプチド
配列番号６８  プライマー
配列番号６９  重鎖ＣＤＲ３、Ｍａｂ １Ｇ１０
配列番号７０  重鎖ＣＤＲ２、Ｍａｂ １Ｇ１０
配列番号７１  重鎖ＣＤＲ１、Ｍａｂ １Ｇ１０
配列番号７２  軽鎖ＣＤＲ３、Ｍａｂ １Ｇ１０
配列番号７３  軽鎖ＣＤＲ２、Ｍａｂ １Ｇ１０
配列番号７４  軽鎖ＣＤＲ１、Ｍａｂ １Ｇ１０
配列番号７５  重鎖可変ドメイン、Ｍａｂ １Ｇ１０
配列番号７６  軽鎖可変ドメイン、Ｍａｂ １Ｇ１０
配列番号７７  重鎖ＣＤＲ３、Ｍａｂ ２Ｈ７
配列番号７８  重鎖ＣＤＲ２、Ｍａｂ ２Ｈ７
配列番号７９  重鎖ＣＤＲ１、Ｍａｂ ２Ｈ７
配列番号８０  軽鎖ＣＤＲ３、Ｍａｂ ２Ｈ７
配列番号８１  軽鎖ＣＤＲ２、Ｍａｂ ２Ｈ７
配列番号８２  軽鎖ＣＤＲ１、Ｍａｂ ２Ｈ７
配列番号８３  重鎖可変ドメイン、Ｍａｂ ２Ｈ７
配列番号８４  軽鎖可変ドメイン、Ｍａｂ ２Ｈ７
【０１７２】
以下の実施例、配列一覧及び図は、本発明の理解を支援するために与えられ、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の精神から逸脱することなく、改変が定められた手順で行われ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】３次元培養における、異なる抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で処置されたＢｅＷｏ腫瘍細胞の増殖阻害。Ｘ軸：細胞のＡＴＰ含有量に対応する生存率規格化平均相対発光量（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ)。Ｙ軸：試験されたプローブ：最小培地（０．５％ＦＢＳ）、マウスＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１、１０μｇ／ｍｌ）、マウスＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａ １０μｇ／ｍｌ）、ＣＳＦ−１のみ、Ｍａｂ ２Ｆ１１、Ｍａｂ ２Ｅ１０、Ｍａｂ２Ｈ７、Ｍａｂ１Ｇ１０およびＳＣ ２−４Ａ５。ＣＳＦ−１誘導性増殖の最大阻害は本発明による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体で観察された。
【図２ａ】異なる抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の固定化したヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４（細胞外サブドメインＤ１−Ｄ３及びＤ５を含む）（配列番号６５）への結合のビアコアセンサーグラム（ｙ軸：反応単位（ＲＵ）の結合シグナル）、ベースライン＝０ＲＵ、ｘ軸：秒単位（ｓ）の時間）：抗体Ｍａｂ ３２９１およびｓｃ ２−４Ａ５は明らかにこのｄｅｌＤ４断片への結合を示すが、本発明による抗体、例えばＭａｂ ２Ｆ１１およびＭａｂ ２Ｅ１０はＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４へ結合しなかった。コントロールの抗ＣＣＲ５抗体ｍ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３.１Ｃ５もまたＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４へ結合しなかった。
【図２ｂ】異なる抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の固定化したヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）（細胞外サブドメインＤ１−Ｄ５を含む）（配列番号６４）への結合のビアコアセンサーグラム（ｙ軸：反応単位（ＲＵ）の結合シグナル、ベースライン＝０ＲＵ、ｘ軸：秒単位（ｓ）の時間））：：全ての抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体はＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤへの結合を示す。コントロールの抗ＣＣＲ５抗体ｍ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３.１Ｃ５はＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤへ結合しなかった。
【図２ｃ】異なる抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の固定化したヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４（細胞外サブドメインＤ１−Ｄ３，及びＤ５を含む）（配列番号６５）への結合のビアコアセンサーグラム（ｙ軸：反応単位（ＲＵ）の結合シグナル、ベースライン＝０ＲＵ、ｘ軸：秒単位（ｓ）の時間））：Ｍａｂ １Ｇ１０、Ｍａｂ ２Ｈ７及びヒト化ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７はＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４に結合しなかった。コントロールの抗ＣＣＲ５抗体ｍ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３.１Ｃ５もまたＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４に結合しなかった。
【図２ｄ】異なる抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の固定化したヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）（細胞外サブドメインＤ１−Ｄ５を含む）（配列番号６４）への結合のビアコアセンサーグラム（ｙ軸：反応単位（ＲＵ）の結合シグナル、ベースライン＝０ＲＵ、ｘ軸：秒単位（ｓ）の時間））：全ての抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体Ｍａｂ １Ｇ１０、Ｍａｂ ２Ｈ７及びヒト化ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７はＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤへの結合を示した。コントロールの抗ＣＣＲ５抗体ｍ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３.１Ｃ５はＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤへ結合しなかった。
【図２ｅ】異なる抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の固定化したヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４（細胞外サブドメインＤ１−Ｄ３，及びＤ５を含む）（配列番号６５）への結合のビアコアセンサーグラム（ｙ軸：反応単位（ＲＵ）の結合シグナル、ベースライン＝０ＲＵ、ｘ軸：秒単位（ｓ）の時間））：全ての抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体 １.２.ＳＭ、ＣＸＩＩＧ６、ａｂ１０６７６およびＭＡＢ３２９１はＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４への結合を示した。コントロールの抗ＣＣＲ５抗体ｍ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３.１Ｃ５はＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４へ結合しなかった。
【図２ｆ】異なる抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の固定化したヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）（細胞外サブドメインＤ１−Ｄ５を含む）（配列番号６４）への結合のビアコアセンサーグラム（ｙ軸：反応単位（ＲＵ）の結合シグナル、ベースライン＝０ＲＵ、ｘ軸：秒単位（ｓ）の時間））：：全ての抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体 １.２.ＳＭ、ＣＸＩＩＧ６、ａｂ１０６７６及びＭＡＢ３２９１はＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤへの結合を示す。コントロールの抗ＣＣＲ５抗体ｍ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３.１Ｃ５はＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤへ結合しなかった。
【図３ａ−ｄ】本発明による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の異なる投与量を適用した後のカニクイザルにおけるＣＳＦ−１レベル。
【図４】インビボ有効性−乳癌ＢＴ２０異種移植における本発明に係る抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の腫瘍増殖阻害
【実施例】
【０１７４】
実施例１
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の生成
ＮＭＲＩマウスの免疫化の手順
ＮＭＲＩマウスは、エレクトロポレーションを利用することにより、ｈｕＣＳＦ−１Ｒの細胞外ドメインをコードする発現ベクターｐＤｉｓｐｌａｙＴＭ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, ＵＳＡ)で免疫化された。すべてのマウスは１００μｇのＤＮＡで4回免疫した。抗ｈｕＣＳＦ−１Ｒの血清力価が十分であることが判明したとき、マウスは２００μｌのＰＢＳ中の１：１の混合ｈｕＣＳＦ−１Ｒ ＥＣＤ／ｈｕＣＳＦ−１Ｒ ＥＣＤｈｕＦｃキメラを５０μｇで、融合の４日及び３日前に、静脈内投与して一回追加免疫された。
【０１７５】
抗原特異的ＥＬＩＳＡ
免疫したマウスの血清中の抗ＣＳＦ−１Ｒの力価は、抗原特異的ＥＬＩＳＡにより決定した。
０．３μｇ／ｍｌのｈｕＣＳＦ−１Ｒ−ｈｕＦｃキメラ（可溶性細胞外ドメイン）は、０．１ｍｇ／ｍｌのビオチン化抗Ｆｃｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９−０６６−０９８）でストレプトアビジンプレート（ＭａｘｉＳｏｒｂ；ＭｉｃｒｏＣｏａｔ，ＤＥ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１９７４９９８／ＭＣ１０９９）上に捕獲され、ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡ中で１／８００に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合Ｆ（ａｂ’）２ 抗ＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＡ９３１０Ｖ）が添加された。全タップからの血清はＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡ中で１／４０に希釈されて、１／１６３８４００まで連続的に希釈された。希釈された血清はウエルへ添加された。プレタップ血清を陰性コントロールとして用いた。ＣＳＦ−１Ｒ Ｍａｂ３２９１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）の５００ｎｇ／ｍｌから０，２５ｎｇ／ｍｌへの希釈系列を陽性コントロールとして用いた。全ての構成要素を１、５時間一緒にインキュベートした。ウエルはＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０）で６回洗浄し、測定法は、新鮮に調製されたＡＢＴＳ（登録商標）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）（ＡＢＴＳ：２,２'-アジノ ビス（３-エチルベンズチアゾリン-６-スルホン酸）を用いて室温で１０分間にたいして開発された。吸収が４０５ｎｍで測定された。
【０１７６】
ハイブリドーマの生成
ハイブリドーマを生成するため、ＰＥＧベースの標準プロトコルを使用して、マウスリンパ球を単離し、マウス骨髄腫細胞株と融合することができる。得られたハイブリドーマは、その後、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングされる。例えば、免疫したマウスの脾臓由来リンパ球の単一細胞懸濁液が、５０％ＰＥＧとともにＡｇ８非分泌マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８.６５３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１５８０）へ融合される。細胞は平底９６穴マイクロタイタープレート中におよそ１０４蒔かれ、その後選択培地中で約２週間インキュベートされる。個々のウェルは、ヒト抗ＣＳＦ−１ＲモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングされる。一度広範にハイブリドーマの増殖がおきると、抗体を分泌するハイブリドーマが再播種され再びスクリーニングされ、ヒトＩｇＧについてなお陽性であれば、抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体をＦＡＣＳによってサブクローニングすることができる。安定なサブクローンはその後インビトロで培養され、特性評価のための組織培養培地中に抗体を生成する。本発明による抗体は、実施例４に記載のように、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体のヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４への結合、及びヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）への結合の決定、並びに実施例５に記載のように、抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体による処置の下で、野生型ＣＳＦ−１Ｒ（リガンド依存性シグナル伝達）又は変異体ＣＳＦ−１Ｒ Ｌ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ（リガンド非依存性シグナル伝達）でトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖阻害の決定を用いて選択され得る。
【０１７７】
ハイブリドーマの培養
生成されたｍｕＭＡｂハイブリドーマは、２ｍＭのＬグルタミン（ＧＩＢＣＯ−カタログ番号３５０５０−０３８）、１ｍＭのＮａピルビン酸（Ｎａ−Ｐｙｒｕｖａｔ）（ＧＩＢＣＯ−カタログ番号１１３６０−０３９）、１×ＮＥＡＡ（ＧＩＢＣＯ−カタログ番号１１１４０−０３５）、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ−カタログ番号Ａ１５−６４９）、１×Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（Ｒｏｃｈｅ−カタログ番号１０７４４４０）、１×ニュートリドーマＣＳ（Ｒｏｃｈｅ−カタログ番号１３６３７４３）、５０μＭのメルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ−カタログ番号３１３５０−０１０）および５０Ｕ／ｍｌのＩＬ（インターロイキン）６マウス（Ｒｏｃｈｅ−カタログ番号１ ４４４ ５８１）を補充された、ＲＰＭＩ １６４０（ＰＡＮ−カタログ番号（Ｃａｔ．Ｎｏ．）ＰＯ４−１７５００）中、３７℃、５％ＣＯ２で培養された。得られたマウス抗体の幾つかはヒト化され（例えば、Ｍａｂ ２Ｆ１１）、組換えにより発現されてた。
【０１７８】
実施例２
ＣＳＦ−１のＣＳＦ−１Ｒへの結合の阻害（ＥＬＩＳＡ）
アッセイ法をセットアップし、最初に、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体のＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤへの結合を可能にし、その後レセプターへ結合していないリガンドを検出することによって、リガンド置換抗体及び二量体阻害剤抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の両方を試験することができる。試験は３８４穴のマイクロタイタープレート上（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ、ＤＥ、カタログ番号４６４７１８）で室温にて実施された。各インキュベーションの後、プレートはＰＢＳＴで３回洗浄された。
【０１７９】
初めに、プレートは、０．５ｍｇ／ｍｌのヤギＦ（ａｂ’）２、ビオチン化抗Ｆｃｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ．，カタログ番号１０９−００６−１７０）で１時間被覆した。
【０１８０】
その後、ウエルは０．２％のＴｗｅｅｎ(登録商標)-２０および２％ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，ＤＥ）を補充したＰＢＳで０．５時間遮断された。７５ｎｇ／ｍｌのｈｕＣＳＦ−１Ｒ−ｈｕＦｃキメラ（ｈｕＣＳＦ−１Ｒの二量体可溶性細胞外ドメインを形成する）がプレートへ１時間固定された。その後、精製された抗体のＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡによる希釈物を１時間インキュベートした。３ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１（Ｂｉｏｍｏｌ，ＤＥ，カタログ番号６０５３０）、５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化抗ＣＳＦ−１クローンＢＡＦ２１６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）及び１：５０００に希釈されたストレプトアビジンＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，ＤＥ，カタログ番号１１０８９１５３００１）の混合物を１時間で添加後、プレートはＰＢＳＴで６回洗浄された。抗ＣＳＦ−１Ｒ ＳＣ ２−４Ａ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ＵＳ）（これはリガンド−レセプター相互作用を阻害する）が陽性コントロールとして使用された。プレートは新鮮に調製されたＢＭブルー（登録商標）ＰＯＤ基質溶液（ＢＭブルー（登録商標）：３,３´-５,５´-テトラメチルベンジジン、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，ＤＥ，カタログ番号１１４８４２８１００１）により室温で３０分間生育させた。吸光度を３７０ｎｍで測定した。抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が二量体複合体からのＣＳＦ−１の放出を引き起こす場合に、吸光度の減少が見いだされた。全ての抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体は、ＣＳＦ−１のＣＳＦ−１Ｒとの相互作用の著しい阻害を示した（表１を参照）。抗ＣＳＦ−１Ｒ ＳＣ ２−４Ａ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳ、Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793も参照）（リガンド−レセプター相互作用を阻害する）が参照コントロールとして用いられた。
2013513367.tif 000002
【０１８１】
実施例３
ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞におけるＣＳＦ−１誘導性ＣＳＦ−１Ｒリン酸化の阻害
全長ＣＳＦ−１Ｒの発現ベクターでレトロウイルス感染された、４．５ｘ１０３のＮＩＨ３Ｔ３細胞がＤＭＥＭ（ＰＡＡカタログ番号Ｅ１５−０１１）、２ｍＭのＬグルタミン（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｇ７５１３、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸、１０％のＦＫＳ（ＰＡＡ、カタログ番号Ａ１５−６４９）および１００μｇ／ｍｌのＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ４３３３［１０ｍｇ／ｍｌ］）中で、コンフルエントに達するまで培養された。その後、細胞は亜セレン酸ナトリウム［５ｎｇ／ｍｌ］（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｓ９１３３）、トランスフェリン［１０μｇ／ｍｌ］（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｔ８１５８）、ＢＳＡ［４００μｇ／ｍｌ］（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，カタログ番号１０７３５０７８）、４ｍＭのＬグルタミン（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｇ７５１３）、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１１３６０）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ：１１１４０−０３５）、２メルカプトエタノール［０，０５ｍＭ］（Ｍｅｒｃｋ，カタログ番号Ｍ７５２２）、１００μｇ／ｍｌおよびＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ４３３３）を補充された、無血清ＤＭＥＭ培地（ＰＡＡカタログ番号Ｅ１５−０１１）で洗浄され、レセプターの上方制御を可能にするために、同じ培地３０μｌ中で１６時間インキュベートされた。１０μｌの希釈された抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が細胞へ１．５時間添加された。ついで細胞は１０μｌの１００ｎｇ／ｍｌ ｈｕＭ−ＣＳＦ−１（Ｂｉｏｍｏｌカタログ番号６０５３０）で５分間刺激された。インキュベートの後、上清が除かれ、細胞は８０μｌの氷冷されたＰＢＳで２回洗浄され、５０μｌの新鮮に調製された氷冷溶解バッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ／２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５／１ｍＭのＥＤＴＡ／１ｍＭのＥＧＴＡ／１％トリトンＸ−１００／１つのプロテアーゼインヒビターの錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨカタログ番号１ ８３６ １７０）を１０ｍｌのバッファーあたりで／１０μｌ／ｍｌホスファターゼインヒビターカクテル１（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ−２８５０，１００×ストック）／１０μｌ／ｍｌのプロテアーゼインヒビター１（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ−５７２６，１００ｘストック）／１０μｌ／ｍｌ １ＭのＮａＦ）が添加された。氷の上で３０分経過後、プレートは３分間プレートシェーカー上で激しく振とうされ、その後１０分間２２００ｒｐｍで遠心分離された（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ １０）。
【０１８２】
細胞溶解物中のリン酸化された総ＣＳＦ−１レセプターの存在はＥｌｉｓａで分析された。リン酸化レセプターの検出のために、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからのキット（カタログ番号ＤＹＣ３２６８−２）が、供給者の指示に従って用いられた。全ＣＳＦ−１Ｒの検出において、１０μｌの溶解物が、キットに含まれて捕捉抗体の使用によってプレート上に固定化された。その後、１：７５０に希釈されたビオチン化抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ＢＡＦ３２９(Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ)および１：１０００に希釈されたストレプトアビジンＨＲＰコンジュゲートが添加された。６０分後、プレートは新鮮に調製されたＡＢＴＳ（登録商標）溶液で生育され、吸光度が検出された。データは抗体の無い陽性コントロールの％、及びリン酸化／発現された全レセプターの比率値として計算された。陰性コントロールはＭ−ＣＳＦ−１の添加無しで定義された。抗ＣＳＦ−１Ｒ ＳＣ ２−４Ａ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳ、Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793も参照）（リガンド−レセプター相互作用を阻害する）が、参照コントロールとして用いられた。
2013513367.tif 000003
【０１８３】
実施例４
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体のヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４への結合及びヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）への結合の決定
配列番号６４のヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）（細胞外サブドメインＤ１−Ｄ５を含む、ｈＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）の調製
ｐＣＭＶ−ｐｒｅＳ−Ｆｃ−ｈＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ（７８３６塩基対）は、ＣＭＶプロモーターの制御下で、Ｃ末端がＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位に融合し、続いてヒトＩｇＧ１のアミノ酸１００−３３０及び６ｘヒスタグが続く、ヒトＣＳＦ−１Ｒの完全なＥＣＤ（配列番号６４）をコードする。天然のシグナルペプチドは、ＢａｍＨＩ制限酵素部位をつくるために、最初のＭの後にアミノ酸のＧ及びＳを挿入することにより変えられている。
【０１８４】
配列番号６５のヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４（細胞外サブドメインＤ１−Ｄ３、及びＤ５を含む、ｈＣＳＦ−１Ｒ−ｄｅｌＤ４）：
ｈＣＳＦ１Ｒ−ｄｅｌＤ４−Ｖ１−ＰｒｅＳｃ−ｈＦｃ−Ｈｉｓは、ストラタジーン社のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ部位特異的突然変異誘発のプロトコルを用いて、フォワードプライマーとして配列ＣＡＣＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣＣＧＧＴＡＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＡＡＧ（配列番号６８）を有するｄｅｌＤ４−ｆｏｒを使用し、リバースプライマーとして逆相補配列を有するｄｅｌＤ４−ｒｅｖを使用して、ｐＣＭＶ−ｐｒｅＳ−Ｆｃ−ｈＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤからクローニングされた。ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２６（１９９９）６８０に出版されたプロトコールの変法が使用され、ストラタジーン社の正規プロトコルに先行する３つのサイクルにおいて別々反応で両方のプライマーを拡張した。
【０１８５】
２つの独立した５０μｌの反応混合物が製造者のマニュアルに従い設定され、各々は鋳型としてプラスミドｐＣＭＶ−ｐｒｅＳ−Ｆｃ−ｈＣＳＦ１Ｒ−ＥＣＤを１０ｎｇ、プライマーのｄｅｌＤ４−ｆｏｒ又はｄｅｌＤ４−ｒｅｖの一方を１０ｐＭ，及びキットで提供されたＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ含有する。３回のＰＣＲサイクル、９５ｏＣで３０秒／５５ｏＣで６０秒／６８ｏＣで８分が実行され、その後両方の反応混合物の各々２５μｌが新しいチューブに混合され、０．５μｌの新鮮なＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが添加された。ストラタジーン社によってキットのマニュアルに指定された１８の温度サイクルによる正規のＰＣＲプロトコールが実施され、続いてキットに提供されたＤｐｎ１制限酵素で２時間最終の消化を行った。欠失を有するクローンはＣＥＬ ＩＩ及びＮｏｔ Ｉによる消化によって検出され、シークエンシングにより確認された。
【０１８６】
タンパク質は、製造元の仕様に従って、Ｈｅｋ２９３ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ懸濁細胞システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で一過性トランスフェクションによって調製した。１週間後、５００ｍｌの上清が濾過され、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラムへロードされた（０.２ｍｌ／分）。カラムは最初にＰＢＳで洗浄され、その後５０ｍＭのＴｒｉｓ／１５０ｍＭのＮａＣｌ／１ｍＭのＥＤＴＡ／ｐＨ７，３で洗浄された。同じバッファーの３７５μｌに希釈された７５μｌのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥ ＃２７−０８４３−０１）がカラムにロードされて、クローズドカラムは４℃でローリングさせながら一晩インキュベートした。カラムは１ｍｌのＧＳＴｒａｐ ＦＦカラム（ＧＥ ｈｅｌｔｈｃａｒｅ）の上にマウントされ、望みのタンパク質が溶出された（０.２ｍｌ／分，０.２ｍｌフラクション）。プールされたフラクションは、３ｋナノセップ（Ｎａｎｏｓｅｐ）での遠心限外ろ過により、１.８ｍｌから０.４ｍｌへ濃縮され、ＰＢＳ中でＳ２００ ＨＲ ＳＥＣ上でクロマトグラフされた（０.５ｍｌ／分）。
【０１８７】
ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４は２つのフラクションで得られ、二量体分子として（プール１、Ｖ＝１．５ｍｌ；ｃ＝０．３０ｍｇ／ｍｌ；ＳＤＳページでの見かけの質量は８３ｋＤａ，換算質量６２ｋＤａ）、及び単量体として（プール２、Ｖ＝１．４ｍｌ；ｃ＝０．２５ｍｇ／ｍｌ；ＳＤＳページでの見かけの質量は６２ｋＤａ）。二量体形態が全ての実験で使用された。
【０１８８】
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体のヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４への結合及びヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）への結合の決定（反応単位（ＲＵ）としての結合シグナル）：
【０１８９】
計測器：ビアコアＴ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
ソフトウエア：Ｔ１００コントロール、バージョン２．０．１
Ｔ１００エバルエーション、バージョン２．０．２
アッセイ形式チップ：ＣＭ５
温度：２５℃
【０１９０】
ＣＳＦ−１Ｒ断片はアミンカップリングを介して固定された。本発明による抗体による異なる抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の結合を比較するため、試験抗体の一つの濃度が注入された。抗ＣＳＦ−１ＲのＭａｂ３２９１（Ｒ＆Ｄ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＣ ２−４Ａ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳ− Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793も参照）が、参照コントロールとして使用され、抗ＣＣＲ５の＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３.１Ｃ５（２００４年８月１８日にＤＳＭＺにＤＳＭ ＡＣＣ ２６８３として寄託された）が陰性コントロールとして使用され、全ては本発明による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体と同じ条件下で使用された。
【０１９１】
ＣＳＦ−１Ｒ断片のアミンカップリング
製造者の指示に従った標準的なアミンカップリング：ランニングバッファー：ＰＢＳ−Ｔ（Ｒｏｃｈｅ：１１ ６６６ ７８９＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０：１１ ３３２ ４６５）、ＥＤＣ／ＮＨＳの混合物による活性化、ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４（細胞外サブドメインＤ１−Ｄ３及びＤ５を含む）（配列番号６５）及びヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）（細胞外サブドメインＤ１−Ｄ５を含む）（配列番号６４）を６００秒、流速１０μｌ／分で注入；カップリングバッファーＮａＡｃ、ｐＨ５．０、ｃ＝１０μｇ／ｍＬで希釈し；最後に残りの活性化カルボキシル基は、１Ｍのエタノールアミンの注入によってブロックされた。
【０１９２】
＜ＣＳＦ−１Ｒ＞Ｍａｂ２Ｆ１１、Ｍａｂ２Ｅ１０、Ｍａｂ３２９１及びｓｃ２−４Ａ５、及び他の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体のヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４及びヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）への２５℃における結合
【０１９３】
ランニングバッファー：ＰＢＳ−Ｔ（Ｒｏｃｈｅ：１１ ６６６ ７８９＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０：１１ ３３２ ４６５）
【０１９４】
分析物サンプル:
結合は、分析物を濃度ｃ＝１０ｎＭで１回の注入により、３０μＬ／分の流速で測定された。（Ｍａｂ １Ｇ１０、Ｍａｂ ２Ｈ７及びヒト化ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７については第二の実験で）。各注入は７００秒の長さであり、その後１８０秒の分離段階が続いた。最終の再生は、各サイクル後に５０ｍＭのＮａＯＨを用い、接触時間６０秒、流速３０μＬ／分で行われた。
【０１９５】
シグナルは注入終了後１０秒の報告点により測定された。参照シグナル（空の参照フローセル（ＥＤＣ／ＮＨＳ及びエタノールアミンのみで処置）由来のシグナル）が差し引かれて、結合シグナルを（ＲＵとして）与えた。非結合抗体の結合シグナルがわずかに０未満であった場合には（Ｍａｂ ２Ｆ１１＝−３；Ｍａｂ ２Ｅ１０＝−２；Ｍａｂ １Ｇ１０＝−６，Ｍａｂ ２Ｈ７＝−９；及びヒト化ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７＝−７）、値は０に設定された。
2013513367.tif 000004
【０１９６】
Ｍａｂ ２Ｆ１１及びＭａｂ ２Ｅ１０はヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）への結合を示した（図２ｂを参照）；しかし、ＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４に対しては結合は検出されなかった（図２ａ参照）。
【０１９７】
Ｓｃ２−４Ａ５およびＭＡＢ３２９１はＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ及びｄｅｌ Ｄ４への結合を示した（図２ｂ及び２ａを参照）。
【０１９８】
従って、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体Ｍａｂ ２Ｆ１１及びＭａｂ ２Ｅ１０のＣＳＦ１Ｒ断片ｄｅｌＤ４への結合／抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体Ｍａｂ ２Ｆ１１及びＭａｂ ２Ｅ１０のＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤへの結合の比率は明らかに１：５０（＝０．０２）未満であったが、ＭＡＢ３２９１及びＳｃ２−４Ａの結合比率はそれぞれ１．６１及び１．５０であって、１：５０（＝０．０２）を超えて大きかった。陰性コントロール抗体ｍ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３.１Ｃ５はいかなる結合をも示さなかった（予想された通り）。  
【０１９９】
Ｍａｂ １Ｇ１０、Ｍａｂ ２Ｈ７及びヒト化ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７はヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）への結合を示したが（図２ｄを参照）；しかしＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４に対して、結合は検出されなかった（図２ｃを参照）。従って、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体のＭａｂ １Ｇ１０、Ｍａｂ ２Ｈ７及びヒト化ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７のＣＳＦ１Ｒ断片ｄｅｌＤ４への結合／抗ＣＳＦ１Ｒ抗体のＭａｂ １Ｇ１０、Ｍａｂ ２Ｈ７及びヒト化ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７のＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤへの結合の比率は、明らかに１：５０（＝０．０２）未満であった。
【０２００】
更なる実験にて、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体１.２.ＳＭ（国際公開第２００９０２６３０３号に記載されたリガンド置換ＣＳＦ−１Ｒ抗体）、ＣＸＩＩＧ６（国際公開第２００９／１１２２４５号に記載されたリガンド置換ＣＳＦ−１Ｒ抗体）、ヤギポリクローナル抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ａｂ１０６７６（ａｂｃａｍ）が調べられた。抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体のＭａｂ３２９１（Ｒ＆Ｄ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）が参照コントロールとして用いられた。抗ＣＣＲ５ ｍ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３.１Ｃ５（ＤＳＭＺに２００４年８月１８日にＤＳＭ ＡＣＣ ２６８３として寄託された）が陰性コントロールとして使用された。
2013513367.tif 000005
【０２０１】
１.２.ＳＭ、ＣＸＩＩＧ６、ａｂ１０６７６及びＭＡＢ３２９１は、ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤへ及びｄｅｌ Ｄ４への結合を示した（図２ｆ及び２ｅを参照）。
【０２０２】
１.２.ＳＭ、ＣＸＩＩＧ６、ａｂ１０６７６及びＭＡＢ３２９１の結合比率は１：５０（＝０．０２）を超えて大きかった。陰性コントロール抗体ｍ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３.１Ｃ５はいかなる結合をも示さなかった（予想された通り）。
【０２０３】
実施例５
抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体による処置下での３次元培養におけるＮＩＨ３Ｔ３−ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞の増殖阻害（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ−アッセイ）
【０２０４】
全長の野生型ＣＳＦ−１Ｒ（配列番号６２）又は変異体ＣＳＦ−１Ｒ Ｌ３０１Ｓ Ｙ９６９Ｆ（配列番号６３）の何れかでレトロウイルス性に感染させたＮＩＨ ３Ｔ３細胞が、プラスチック表面への付着を防ぐためにポリ−ＨＥＭＡ（ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート））（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ））でコーティングされたディッシュ上で、２ｍＭのＬ−グルタミン、２ｍｍのピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及び１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充されたＤＭＥＭ高グルコース培地（ＰＡＡ，Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）で培養された。細胞は、血清を５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム、１０ｍｇ／ｍｌトランスフェリン、４００μｇ／ｍｌＢＳＡ及び０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノールで置き換えた培地に播種される。１００ｎｇ／ｍｌのｈｕＣＳＦ−１（Ｂｉｏｍｏｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で処置されると、ｗｔＣＳＦ−１Ｒ発現細胞は３次元的に成長する高密度球状体を形成し、足場非依存性と呼ばれている特性である。これらの球状体はインサイツで固形腫瘍の３次元的な構築と組織化に密接に類似している。変異体ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞はＣＳＦ−１リガンドと無関係な球状体を形成する。球状体培養物はＩＣ５０（細胞生存率の５０パーセント阻害の濃度）を決定するため、異なる濃度の抗体の存在下、３日間インキュベートされた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイは、細胞のＡＴＰ含有量の測定により細胞生存率を検出するために用いられた。
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【０２０５】
参照コントロールのＭａｂ Ｒ＆Ｄ−Ｓｙｓｔｅｍｓ ３２９１は変異体ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞増殖の阻害を示さなかった。
【０２０６】
さらなる実験では、本発明による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７、及び抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体、１.２.ＳＭ（国際公開第２００９０２６３０３号に記載されたリガンド置換ＣＳＦ−１Ｒ抗体）、ＣＸＩＩＧ６（国際公開第２００９／１１２２４５号に記載されたリガンド置換ＣＳＦ−１Ｒ抗体）、ヤギポリクローナル抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体のａｂ１０６７６（ａｂｃａｍ）、及び２−４Ａ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳ− Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793も参照）が調べられた。
【０２０７】
球状体培養物はＩＣ３０（細胞生存率の３０パーセント阻害の濃度）を決定するため、異なる濃度の抗体の存在下、３日間インキュベートされた。最大濃度は２０μｇ／ｍｌであった。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイは、細胞のＡＴＰ含有量の測定により細胞生存率を検出するために用いられた。
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【０２０８】
実施例６
抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体で処置下の３次元培養物におけるＢｅＷｏ腫瘍細胞の増殖阻害（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ−アッセイ)
ＢｅＷｏ絨毛癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−９８）が、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充されたＦ１２Ｋ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で培養された。５ｘ１０４細胞／ウエルが９６穴のポリＨＥＭＡ（ポリ(２−ヒドロキシエチルメタクリレート））でコーティングされた、０．５％ＦＢＳ及び５％ＢＳＡを補充されたＦ１２Ｋ培地を含むプレートに播種された。付随して、２００ｎｇ／ｍｌのｈｕＣＳＦ−１及び１０μｇ／ｍｌの異なる抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体が添加され、６日間インキュベートされた。細胞生存率を、その細胞のＡＴＰ含有量を測定することにより相対発光量（ＲＬＵ）で検出するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイが用いられた。ＢｅＷｏ球状体培養物が別々の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体（１０μｇ／ｍｌ）で処置されると、ＣＳＦ−１誘導性増殖の阻害が観察された。抗体媒介性阻害を計算するために、非刺激ＢｅＷｏ細胞の平均のＲＬＵ値が全てのサンプルから差し引かれた。ＣＳＦ−１刺激細胞の平均のＲＬＵ値は任意で１００％に設定された。ＣＳＦ−１で刺激され、かつ抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体で処置された細胞の平均のＲＬＵ値は、ＣＳＦ−１で刺激されたＲＬＵの％で計算された。表６は、抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体で処置される３次元培養におけるＢｅＷｏ腫瘍細胞の増殖阻害についての計算されたデータを示す；図１ａ及びｂは規格化された平均のＲＬＵ値を表わす。
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【０２０９】
実施例７
抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体による処置下でのヒトマクロファージ分化の阻害（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ−アッセイ)
ヒトの単球がＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭヒト単球濃縮カクテル（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈ．カタログ番号１５０２８）を用いて末梢血から単離された。濃縮された単球個体群は、３７℃、５％のＣＯ２の加湿した大気中で、１０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ−カタログ番号０１１−０９００１４Ｍ），４ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ−カタログ番号２５０３０）及び１ｘＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号１ ０７４ ４４０）を補充された１００μｌのＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ−カタログ番号３１８７０）を含む９６穴のマイクロタイタープレートへ播種された（２．５ｘ１０４細胞／ウエル)。培地に１５０ｎｇ／ｍｌのｈｕＣＳＦ−１が添加されると、接着性マクロファージへの明確な分化が観察された。この分化は抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の添加で阻害された。更に、単球の生存が影響を受けており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（ＣＴＧ）分析により分析することができた。抗体処置による単球の生存の濃度依存性阻害からＩＣ５０が計算された（図７を参照）。
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【０２１０】
別の試験シリーズにおいて、Ｍａｂ ２ Ｆ１１のヒト化型、例えば、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｃ１１、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｄ８、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７、ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｆ１２、は、ＩＣ５０の値として、０．０７μｇ／ｍｌ（ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｃ１１）、０．０７μｇ／ｍｌ（ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｄ８）、０．０４μｇ／ｍｌ（ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７）及び０．０９μｇ／ｍｌ（ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｆ１２）を示した。
【０２１１】
実施例８
抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体による処置下でのカニクイザルマクロファージ分化の阻害（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ−アッセイ)
カニクイザル単球は、ＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓの非ヒト霊長類キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ−カタログ番号１３０−０９１−０９７）を製造者の記述に従って使用して、末梢血から単離された。濃縮された単球個体群は、３７℃、５％のＣＯ２の加湿した大気中で、１０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ−カタログ番号０１１−０９００１４Ｍ），４ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ−カタログ番号２５０３０）及び１ｘＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号１ ０７４ ４４０）を補充された１００μｌのＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ−カタログ番号３１８７０）を含む９６穴のマイクロタイタープレートへ播種された（１−３ｘ１０４細胞／ウエル)。培地に１５０ｎｇ／ｍｌのｈｕＣＳＦ−１が添加されると、接着性マクロファージへの明確な分化が観察された。この分化は抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の添加で阻害された。更に、単球の生存が影響を受けており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（ＣＴＧ）分析により分析することができた。生存率は 5 μg/ml 濃度の抗体処置で分析された（図８を参照）。
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【０２１２】
実施例９
ヒトＣＳＦ−１Ｒへの抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の結合親和性の決定
【０２１３】
計測器：ビアコア（登録商標）Ａ１００
チップ：ＣＭ５（ビアコアＢＲ−１００６−６８）
カップリング：アミンカップリング
バッファー：ＰＢＳ（ビアコアＢＲ−１００６−７２）、ｐＨ７．４、３５℃
【０２１４】
親和性の測定において、３６μｇ／ｍｌの抗マウスＦｃｇ抗体（ヤギ由来、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ ＪＩＲ１１５−００５−０７１）が、ＣＳＦ−１Ｒに対する抗体を捕獲するためにチップ表面へ結合された。ヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）（細胞外サブドメインＤ１−Ｄ５を含む）（配列番号６４）（Ｒ＆Ｄ−Ｓｙｓｔｅｍｓ ３２９−ＭＲ又はサブクローニングされたｐＣＭＶ−ｐｒｅｓＳ−ＨｉｓＡｖｉｔａｇ−ｈＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）が、様々な濃度で溶液に添加された。会合は３５℃で１．５分のＣＳＦ−１Ｒ注入により測定された；解離は３５℃で１０分間、バッファーでチップ表面を洗浄することで測定された。反応速度論的パラメーターの計算についてはラングミュア１：１モデルが使用された。 
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【０２１５】
ＣＳＦ−１Ｒ ＥＣＤを使用する別のビアコア結合アッセイにおいて（データ非公開）、抗体Ｍａｂ ２Ｆ１１及びＭａｂ ２Ｅ１０の抗体Ａｂ ＳＣ−２−４Ａ５との一部の競合が示された。しかし、Ｍａｂ ２Ｆ１１／Ｍａｂ ２Ｅ１０はヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４に結合せず、一方Ａｂ ＳＣ−２−４Ａ５はこのｄｅｌＤ４断片に結合する（実施例４及び図２ａを参照）。従って、Ｍａｂ ２Ｆ１１／Ｍａｂ ２Ｅ１０の結合領域はＡｂ ＳＣ−２−４Ａ５の結合領域とは明らかに異なるが、恐らく近傍領域に位置している。そうした競合アッセイにおいて、抗体Ｍａｂ ２Ｆ１１及びＭａｂ ２Ｅ１０の両方ともＲ＆Ｄ−ＳｙｓｔｅｍｓのＭａｂ３２９１と競合しなかった（データ非公開）。
【０２１６】
実施例１０
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体のヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１−Ｄ３への結合の決定
【０２１７】
計測器：ビアコアＴ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
ソフトウエア：Ｔ１００コントロール，バージョン１．１．１１
Ｂ３０００エバルエーション、バージョン４．０１
スクラバー、バージョン２．０ａ
アッセイ形式チップ：ＣＭ５−Ｃｈｉｐ
【０２１８】
ＣＳＦ−１Ｒに対する抗体は、アミン結合の捕捉分子を介して捕獲された。単一サイクル反応速度論を用い、ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１−Ｄ３(配列番号６６）が、濃度を増加させながら５回注入された。ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１−Ｄ３は、ｐＣＭＶ−ｐｒｅｓＳ−ＨｉｓＡｖｉｔａｇ発現ベクターにサブクローニングされた。
【０２１９】
抗ＣＳＦ−１Ｒ ＳＣ ２−４Ａ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳ；Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793）（リガンド−レセプター相互作用を阻害する）及びＭａｂ３２９１（Ｒ＆Ｄ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）が参照コントロールとして用いられた。
【０２２０】
捕獲分子：本発明による抗体として抗マウスＦｃｇ抗体（ヤギ由来、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ ＪＩＲ１１５−００５−０７１）、及び参照コントロールの抗ＣＳＦ−１Ｒ ＳＣ ２−４Ａ５としてＲ＆Ｄ−ＳｙｓｔｅｍｓのコントロールＭａｂ３２９１及び抗ラットＦｃｇ抗体（ヤギ由来、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ ＪＩＲ１１５−００５−０７１）。
【０２２１】
捕獲分子のアミンカップリング
製造者の指示に従った標準的なアミンカップリング：ランニングバッファー：ＨＢＳ−Ｎバッファー、ＥＤＣ／ＮＨＳの混合物による活性化、リガンド密度２０００ＲＵを目標；捕獲抗体（Ａｂ）はカップリングバッファー、ＮａＡｃ、ｐＨ４．５、ｃ＝１０μｇ／ｍＬで希釈された；最後に、残りの活性化カルボキシル基が１Ｍのエタノールアミンの注入によってブロックされた。
【０２２２】
３７℃におけるＭＡｂｓ＜ＣＳＦ−１Ｒ＞へのヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１−Ｄ３の結合の反応速度論的特性評価
【０２２３】
ランニングバッファー：ＰＢＳ（ビアコアＢＲ−１００６−７２）
【０２２４】
フローセル２から４におけるＭａｂｓ＜ＣＳＦ−１Ｒ＞の捕獲：流速２０μＬ／分、接触時間９０秒、ｃ（Ａｂｓ＜ＣＳＦ−１Ｒ＞）＝５０ｎＭ、ランニングバッファー＋１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで希釈；
【０２２５】
分析物サンプル：
単一サイクル反応速度論が、再生無しで、濃度ｃ＝７．８、３１．２５、１２５ ５００および２０００ｎＭでの５回の連続した注入により、流速３０μＬ／分で測定された。各注入は３０秒の長さであり、その後最初の４回の注入について１２０秒の分離段階が、最終的に最高濃度において（最後の注入）１２００秒の分離段階が続いた。
【０２２６】
最後の再生が各サイクル後、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５（ビアコアＢＲ−１００３−５４）、接触時間６０秒、流速３０μＬ／分を用いて実施された。
【０２２７】
反応速度論パラメーターは、通常の二重の参照（コントロール参照：分析物の捕獲分子への結合；フローセル：ブランクとしてサブドメインＣＳＦ−１Ｒの濃度「０」）及び「ドリフトを考慮した１：１結合の滴定反応速度論」モデルによる計算を使用することにより計算された。
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【０２２８】
抗体のＭａｂ ２Ｆ１１、Ｍａｂ ２Ｅ１０及びＭａｂ １Ｇ１０はヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１−Ｄ３への結合を示さなかった。
【０２２９】
また、参照コントロールのＡｂ ＳＣ−２−４Ａ５はヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１−Ｄ３へ結合しなかった。
【０２３０】
参照コントロールのＭａｂ Ｒ＆Ｄ−Ｓｙｓｔｅｍｓ ３２９１はヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１−Ｄ３への結合を示した。
【０２３１】
実施例１１
カニクイザルにおいてＣＳＦ−１Ｒ阻害の間ＣＳＦ−１レベルは増大する。
血清のＣＳＦ−１レベルは、抗ヒトＣＳＦ−１Ｒ二量体阻害剤ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７のＣＳＦ−１Ｒ中和活性の薬物動態マーカーを提供する。投与グループあたり一匹のオス及び一匹のメスのカニクイザル（１および１０ｍｇ／ｋｇ）に、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７が静脈内投与された。ＣＳＦ−１レベルの分析のために血液サンプルが、処置の前（投与前）の１週間採取され、投与後２、２４、４８、７２、９６、１６８時間、及びその後の２週間について毎週採取された。ＣＳＦ−１レベルは市販のＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ヒトＭ−ＣＳＦ）を使用して、製造業者（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）の指示に従って決定された。サルのＣＳＦ−１レベルは、キットに与えられたＣＳＦ−１の標準的な曲線サンプルと比較して決定された。
【０２３２】
ｈＭａｂ ２Ｆ１１−ｅ７の投与はおよそ１０００倍というＣＳＦ−１の劇的な増大を誘導し、それは４８時間（１ｍｇ／ｋｇ）又は１５日間（１０ｍｇ／ｋｇ）続いて投与された量に依存する。従って、ＣＳＦ−１Ｒの二量体化阻害剤は、リガンド置換抗体とは対照的に、レセプターへの結合について劇的に上方制御されたリガンドと直接的には競合しないという利点を与える。
【０２３３】
実施例１２
インビボでの有効性−ＳＣＩＤベージュマウスにおける乳癌ＢＴ２０の異種移植片腫瘍細胞における抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の腫瘍増殖阻害
ヒト乳癌細胞株ＢＴ−２０はヒトＣＳＦ−１Ｒを発現するが、ＣＳＦ−１の発現を欠いている (Sapi, E. et al Cancer Res 59 (1999) 5578-5585)。ＣＳＦ−１由来のマウスは腫瘍細胞でヒトＣＳＦ−１Ｒを活性化できないため、組換えヒトＣＳＦ−１（Ｂｉｏｍｏｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、連続的なＣＳＦ−１注入速度として２μｇ／日をもたらす浸透圧ミニポンプ（ＡＬＺＥＴ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）を介してを補充された（Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．Ａ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２４（２００３）１３１７−１３２３）。
【０２３４】
リガンド置換ＣＳＦ−１Ｒ抗体によるＣＳＦ−１Ｒの２量体化を妨げる抗体の有効性を直接比較するため、我々は、ＢＴ−２０異種移植モデルにおいて、キメラ抗ＣＳＦ−１Ｒ Ｍａｂ ２Ｆ１１（ＣＳＦ−１Ｒの２量体化を妨げる抗体）及び１.２.ＳＭ（国際公開第２００９０２６３０３号に記載されたリガンド置換ＣＳＦ−１Ｒ抗体）を調べた。
【０２３５】
ＳＣＩＤベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、１ｘ１０７細胞のＢＴ２０細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１９）および１００μｌのマトリゲルを一緒に皮下注射した。動物の治療は、平均的な腫瘍体積が１００ｍｍ３である、無作為の日に開始した。マウスは毎週１回、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０のバファー中のそれぞれの抗体を腹腔内に処置される（図４参照）。腫瘍の寸法は、全治療期間中、診断日と、その後週に２回ノギスで測定される。腫瘍体積はＮＣＩのプロトコールに従って計算される（腫瘍重量＝１／２ａｂ２、ここで「ａ」及び「ｂ」はそれぞれ腫瘍の長径と短径である）。
【０２３６】
腫瘍増殖の分析は図４に示される。キメラ抗ＣＳＦ−１Ｒ Ｍａｂ ２Ｆ１１による腫瘍細胞のヒトＣＳＦ−１Ｒの阻害は、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体１.２.ＳＭ（国際公開第２００９０２６３０３号に記載のＣＳＦ−１Ｒ抗体）よりも、腫瘍増殖阻害の媒介において統計的にさらに有効であった。
【図１ａ】
2013513367.tif 000013
【図１ｂ】
2013513367.tif 000014
【図２ａ】
2013513367.tif 000015
【図２ｂ】
2013513367.tif 000016
【図２ｃ】
2013513367.tif 000017
【図２ｄ】
2013513367.tif 000018
【図２ｅ】
2013513367.tif 000019
【図２ｆ】
2013513367.tif 000020
【図３ａ】
2013513367.tif 000021
【図３ｂ】
2013513367.tif 000022
【図３ｃ】
2013513367.tif 000023
【図３ｄ】
2013513367.tif 000024
【図４】
2013513367.tif 000025
【配列表】
2013513367000001.app
【国際調査報告】
2013513367.tif 000026
2013513367.tif 000027
2013513367.tif 000028
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