(57)【要約】  本明細書では、肺癌に関するバイオマーカーを提供する。本明細書において同定された唾液バイオマーカー（ＣＣＮＩ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ９、ＧＲＥＢ１タンパク質、ＬＺＴＳ、ＢＲＡＦ、ＦＲＳ２、ＡＮＸＡ  １、ハプトグロビンＨｐ２、亜鉛α２−糖タンパク質、カルプロテクチン、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Stre’ptocococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡ）が、感度及び特異性を備える肺癌検出バイオアッセイの基盤となる。所見を検証するため複数のバイオマーカーを用いて生成されたデータを評価する手段及び方法、さらに、臨床、診断及び治療用途における多重肺癌アッセイの使用も含まれる。【選択図】図１
2013521763.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における肺癌状態の診断方法であって、
ａ）前記対象からの唾液試料を、ＣＣＮＩ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ９、ＧＲＥＢ１タンパク質、ＬＺＴＳ、ＢＲＡＦ、ＦＲＳ２、ＡＮＸＡ１、ハプトグロビンＨｐ２、亜鉛α２−糖タンパク質、カルプロテクチン、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡからなる群から選択されるバイオマーカーを特異的に検出するアッセイで分析する工程と、
ｂ）前記バイオマーカーが前記試料において対照と違いを有して発現するか否かを決定し；それにより肺癌状態を提供する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも２種のバイオマーカーが測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも２種のバイオマーカーのうちの一方がポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡであり、前記少なくとも２種のバイオマーカーのうちの一方がカンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも３種のバイオマーカーが測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも３種のバイオマーカーのうちの一つがＧＲＥＢ１であり、前記少なくとも３種のバイオマーカーのうちの一つがＣＣＮＩであり、前記少なくとも３種のバイオマーカーのうちの一つがＦＲＳ２である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも３種のバイオマーカーのうちの一つがハプトグロビン２であり、前記少なくとも３種のバイオマーカーのうちの一つがアネキシンＡ１であり、前記少なくとも３種のバイオマーカーのうちの一つが亜鉛α２−糖タンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記アッセイが、少なくとも１種のバイオマーカーをコードする核酸を検出し、前記核酸が、質量分析、ＰＣＲ、マイクロアレイハイブリダイゼーション、熱的シーケンシング、キャピラリーアレイシーケンシング、又は固相シーケンシングにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アッセイが、少なくとも１種のバイオマーカーのポリペプチドを検出し、前記ポリペプチドが、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、免疫組織化学、又は質量分析により検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
対象に対する治療の効力を評価する方法であって、
（ａ）前記対象からの第１の唾液試料を、ＣＣＮＩ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ９、ＧＲＥＢ１タンパク質、ＬＺＴＳ、ＢＲＡＦ、ＦＲＳ２、ＡＮＸＡ１、ハプトグロビンＨｐ２、亜鉛α２−糖タンパク質、カルプロテクチン、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡからなる群から選択されるバイオマーカーを特異的に検出するアッセイで分析し、それにより第１の発現プロファイルを提供する工程と、
（ｂ）前記対象に対して治療を遂行する工程と、
（ｃ）前記対象からの第２の唾液を、ＣＣＮＩ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ９、ＧＲＥＢ１タンパク質、ＬＺＴＳ、ＢＲＡＦ、ＦＲＳ２、ＡＮＸＡ１、ハプトグロビンＨｐ２、亜鉛α２−糖タンパク質、カルプロテクチン、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡからなる群から選択される少なくとも２種のバイオマーカーを特異的に検出するアッセイで分析し、それにより第２の発現プロファイルを提供する工程と、
（ｅ）前記第１の発現プロファイルと前記第２の発現プロファイルとを比較し、それにより治療の効力を評価する工程と、
を含む方法。
【請求項１０】
固体担体を含むキットにおいて、前記固体担体が、ＣＣＮＩ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ９、ＧＲＥＢ１タンパク質、ＬＺＴＳ、ＢＲＡＦ、ＦＲＳ２、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡからなる群から選択されるバイオマーカーに対して選択的な捕捉結合プローブを含む、キット。
【請求項１１】
第１の固体担体及び第２の固体担体を含むキットにおいて、前記第１の固体担体が、ＣＣＮＩ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ９、ＧＲＥＢ１タンパク質、ＬＺＴＳ、ＢＲＡＦ、ＦＲＳ２、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡからなる群から選択される少なくとも２種のバイオマーカーに対して選択的な捕捉結合プローブを含み、及び前記第２の固体担体が、ＡＮＸＡ１、ハプトグロビンＨｐ２、亜鉛α２−糖タンパク質、カルプロテクチンに対する捕捉結合リガンドを含む、キット。
【請求項１２】
前記捕捉結合リガンドが抗体である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
ＣＣＮＩ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ９、ＧＲＥＢ１タンパク質、ＬＺＴＳ、ＢＲＡＦ、ＦＲＳ２、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡからなる群から選択される少なくとも２種のバイオマーカーを選択的に増幅するための１つ以上のプライマーを含むキットであって、前記プライマーの各々が、任意選択により検出可能な標識を含む、キット。
【請求項１４】
対象における肺癌状態の診断方法であって、
ａ）前記対象からの唾液試料を、前記唾液試料中において少なくとも１７種のバイオマーカーを特異的に検出するアッセイで分析する工程であって、前記少なくとも１７種のバイオマーカーが、ＣＣＮＩ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ９、ＧＲＥＢ１タンパク質、ＬＺＴＳ、ＢＲＡＦ、ＦＲＳ２、ＡＮＸＡ１、ハプトグロビンＨｐ２、亜鉛α２−糖タンパク質、カルプロテクチン、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡからなる群から選択される、工程と、
ｂ）前記少なくとも１７種のバイオマーカーが前記試料において対照と違いを有して発現するか否かを決定し；それにより肺癌状態を提供する工程と、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、全体として参照により本明細書に援用される２０１０年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／３０３，２０５号に対する優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府の助成による研究又は開発に基づき行われた発明の権利に関する記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（National Institutes of Health）から交付される助成金番号第ＤＥ０１６２７５号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
アメリカ国立衛生研究所によれば、肺癌は癌による死亡原因の第一位である（ハイパーテキスト転送プロトコル：//www.cancer.gov/cancertopics/types/lung）。２００８年、米国だけで約２１万５０００人の新規肺癌患者が診断された。そのうち約８７％の患者が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有し得る。
【０００４】
肺癌の主因としては、喫煙、特にタバコの喫煙が群を抜いている。米国では、現在喫煙習慣を有する４５００万人及び過去に喫煙歴を有する４５００万人が、肺癌を発症するリスクがあると推定される。肺癌は、今後少なくとも５０年間にわたり重大な健康問題であり続けることが予想される。
【０００５】
肺癌症例の７５％超が末期に診断され、これは、リスクを有する人を多量にスクリーニングする実用的な方法が未だないためである。早期発見は、治癒率の向上に有望である。
【０００６】
肺癌を発症するリスクが高い人の特定及び分類並びに早期発見が試みられている。当初、喀痰細胞診（spectum cytology）及び胸部Ｘ線撮影法がスクリーニング手段として使用された。残念ながら、これらの手法によって根治可能な症例数が増加することはなかった。
【０００７】
これらの手法は、胸部Ｘ線撮影法より感度が高いコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンに取って代わられた。残念ながら、リスクを有する集団のＣＴスクリーニングの広範囲な適用は、偽陽性が多いこと（良性肺小結節の検出）、及び中心腫瘍の特定能力が低いことを含め、いくつかの欠点を伴う。ほぼ５０％に達するほど偽陽性率が高いため、ＣＴスクリーニングによって予防される肺癌死１例に対し、２件の不必要な侵襲手技が行われ得ることが推定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、肺癌の検出に有用な方法、特に、初期の疾患を検出することができ、且つ概して非侵襲性のバイオマーカーが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一部の実施形態において、検査対象において肺癌が存在又は発生する可能性を決定する方法が提供される。開示される本方法は、対象からの唾液試料を、唾液試料中においてバイオマーカーを特異的に検出するアッセイで分析する工程を含み、バイオマーカーは、ＣＣＮＩ（サイクリンＩ）（配列番号１）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）（配列番号２）、ＦＧＦ９（線維芽細胞成長因子１９）（配列番号３）、ＧＲＥＢ１タンパク質（配列番号４）、ＬＺＴＳ（ロイシンジッパー、推定抑制因子（putative suppresor）Ｉ）（配列番号５）、ＢＲＡＦ（ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（配列番号６）、ＦＲＳ２（線維芽細胞成長因子受容体基質２）（配列番号７）、ＡＮＸＡ１（アネキシンＡ１）（配列番号８）、Ｈｐ２（ハプトグロビン２）（配列番号９）、亜鉛α２−糖タンパク質（配列番号１０）、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡの群から選択される。バイオマーカーの相対出現率が決定され、対照と比較され、それにより検査対象の肺癌状態を決定することが可能になる。
【００１０】
一部の実施形態では、検査対象において肺癌が存在又は発生する可能性を決定する方法が提供され、本方法は、唾液試料中における少なくとも２種のバイオマーカーの検出を伴う。他の実施形態では、検査対象において肺癌が存在又は発生する可能性を決定する方法が提供され、本方法は、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ及びカンプリロバクター・ショウアエ（Camplylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡの検出を伴う。例えば、これらの例におけるこれらのバイオマーカー又はこれらのバイオメーカー（biomaker）及びその他の相対出現率が決定され、及び対照と比較され、それにより検査対象の肺癌状態を決定することが可能となる。
【００１１】
一部の実施形態では、検査対象において肺癌が存在又は発生する可能性を決定する方法が提供され、本方法は、唾液試料中における少なくとも３種のバイオマーカーの検出を伴う。他の実施形態では、検査対象において肺癌が存在又は発生する可能性を決定する方法が提供され、本方法は、ＧＲＥＢ１、ＣＣＮＩ及びＦＲＳの検出を伴う。他の実施形態では、検査対象において肺癌が存在又は発生する可能性を決定する方法が提供され、本方法は、検出を伴う。例えば、これらの例におけるこれらのバイオマーカー又はこれらのバイオメーカー及びその他の相対出現率が決定され、及び対照と比較され、それにより検査対象の肺癌状態を決定することが可能となる。
【００１２】
他の実施形態では、検査対象において肺癌が存在又は発生する可能性を決定する方法は、少なくとも１種のバイオマーカーをコードする核酸を検出するアッセイを含む。核酸は、例えば、質量分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マイクロアレイハイブリダイゼーション、熱的シーケンシング(thermal sequencing)、キャピラリーアレイシーケンシング、又は固相シーケンシングにより検出することができる。
【００１３】
他の実施形態では、検査対象において肺癌が存在又は発生する可能性を決定する方法は、少なくとも１種のバイオマーカーをコードするポリペプチドを検出するアッセイを含む。ポリペプチドは、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、免疫組織化学、又は質量分析により検出することができる。
【００１４】
本発明の他の実施形態において、治療の効力の評価方法が開示される。この方法は、対象からの第１の唾液試料を、バイオマーカーを特異的に検出するアッセイで分析する工程を含み、バイオマーカーは、ＣＣＮＩ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ９、ＧＲＥＢ１タンパク質、ＬＺＴＳ、ＢＲＡＦ、ＦＲＳ２、ＡＮＸＡ１、Ｈｐ２、亜鉛α２−糖タンパク質、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡからなる群から選択される。この第１の分析が、第１の発現プロファイルを提供する。治療が対象に適用される。対象からの第２の唾液試料の分析は、ＣＣＮＩ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ９、ＧＲＥＢ１タンパク質、ＬＺＴＳ、ＢＲＡＦ、ＦＲＳ２、ＡＮＸＡ１、Ｈｐ２、亜鉛α２−糖タンパク質、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡからなる群から選択される少なくとも２種のバイオマーカーを特異的に検出するアッセイで行われ、それにより第２の発現プロファイルが提供される。治療の効力を評価するため、第１の発現プロファイルと第２の発現プロファイルとが比較される。
【００１５】
別の実施形態では固体担体が提供され、ここで固体担体は、ＣＣＮＩ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ９、ＧＲＥＢ１タンパク質、ＬＺＴＳ、ＢＲＡＦ、ＦＲＳ２、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡの群から選択される少なくとも２種のバイオマーカーに対して選択的な捕捉結合プローブを含む。一部の実施形態では、第１及び第２の固体担体が提供され、ここで第１の固体担体は、ＣＣＮＩ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ９、ＧＲＥＢ１タンパク質、ＬＺＴＳ、ＢＲＡＦ、ＦＲＳ２、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡからなる群から選択されるバイオマーカーに対して選択的な捕捉結合プローブを含み、及び第２の固体担体は、ＡＮＸＡ１、Ｈｐ２、亜鉛α２−糖タンパク質、及びカルプロテクチンから選択されるバイオマーカーに対して選択的な捕捉結合リガンドを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、キットの捕捉結合リガンドは抗体である。別の実施形態では、キットは、バイオマーカーを選択的に増幅するための１つ以上のプライマーを提供し、ここでバイオマーカーは、ＣＣＮＩ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ９、ＧＲＥＢ１タンパク質、ＬＺＴＳ、ＢＲＡＦ、ＦＲＳ２、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡの群から選択される。一部の実施形態では、プライマーの１つ以上が検出可能な標識を有する。
【００１７】
本発明の一部の実施形態において、検査対象において肺癌が存在又は発生する可能性を決定する方法が提供される。開示される本方法は、対象からの唾液試料を、唾液試料中において少なくとも１７種のバイオマーカーを特異的に検出するアッセイで分析する工程を含む。バイオマーカーは、ＣＣＮＩ（サイクリンＩ）（配列番号１）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）（配列番号２）、ＦＧＦ９（線維芽細胞成長因子１９）（配列番号３）、ＧＲＥＢ１タンパク質（配列番号４）、ＬＺＴＳ（ロイシンジッパー、推定抑制因子Ｉ）（配列番号５）、ＢＲＡＦ（ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（配列番号６）、ＦＲＳ２（線維芽細胞成長因子受容体基質２）（配列番号７）、ＡＮＸＡ１（アネキシンＡ１）（配列番号８）、Ｈｐ２（ハプトグロビン２）（配列番号９）、亜鉛α２−糖タンパク質（配列番号１０）、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びグラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡの群から選択される。少なくとも１７種のバイオマーカーの相対出現率が決定され、及び対照と比較され、それにより検査対象の肺癌状態を決定することが可能になる。
【００１８】
検査対象において肺癌が存在又は発生する可能性を決定する方法における上記の任意の実施形態において、使用されるバイオマーカーの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又はそれ以上であり得る。
【００１９】
これらの及び他の実施形態、特徴及び潜在的な利点は、以下の説明及び図面を参照することで明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】唾液採取プロトコルの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
序論
肺癌の早期発見は、より平易な治療（より小規模な手術、より軽い放射線療法又は化学療法）及び生存の向上に有望である。従来のスクリーニング（ＣＴ、Ｘ線、喀痰細胞診）は、感度及び特異性が望ましいとはいえない。従って肺癌の検出には、非侵襲的に採取された検体を使用してバイオマーカーを同定する高感度アッセイが理想的である。
【００２２】
バイオマーカーは、健常人により産生されたものであれ、又は特定の全身性疾患に罹患した人により産生されたものであれ、健康状態、疾患発症、治療応答性、及び転帰をモニタするためのテルテール（tell-tale）分子として使用することができる。
【００２３】
唾液は、容易に利用可能なバイオマーカー源である。臨床診断用生体液として、唾液には多くの利点がある；試料採取が単純で非侵襲的であり、患者側に不安感をもたらすことがない。唾液の使用はまた、大規模なスクリーニングのための費用対効果の高い手法を提供する。
【００２４】
本発明は、７種の細菌株の指標となる１６Ｓ  ｒＲＮＡの検出を含め、１７種の唾液バイオマーカーの診断上／予後判定上の意義を開示する。肺癌の検出におけるこれらのバイオマーカーには、ＣＣＮＩ（サイクリンＩ）（配列番号１）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）（配列番号２）、ＦＧＦ９（線維芽細胞成長因子１９）（配列番号３）、ＧＲＥＢ１タンパク質（配列番号４）、ＬＺＴＳ（ロイシンジッパー、推定抑制因子Ｉ）（配列番号５）、ＢＲＡＦ（ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（配列番号６）、ＦＲＳ２（線維芽細胞成長因子受容体基質２）（配列番号７）、ＡＮＸＡ１（アネキシンＡ１）（配列番号８）、Ｈｐ２（ハプトグロビン２）（配列番号９）、亜鉛α２−糖タンパク質（配列番号１０）、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、グラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。唾液中におけるこれらの及び他のバイオマーカーの検出は、肺癌の診断及び予後判定に有用である。
【００２５】
唾液バイオマーカー（タンパク質及び核酸）の検出方法には、単独での、又は他のマーカーとの組み合わせでの、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、例えばＲＴ−ＰＣＲ又は質量分析などの技法が含まれる。検出には、任意の特異的プローブ、例えば、抗体、受容体、リガンド、ＲＴ−ＰＣＲ等を使用することができる。質量分析はタンパク質の検出にも使用することができる。従って、本発明を単独で、又は従来の抗原分析を補足するものとして用いることで、肺癌及び他の癌の診断が促進され得る。
【００２６】
定義
ＣＣＮＩ（サイクリンＩ）（配列番号１）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）（配列番号２）、ＦＧＦ９（線維芽細胞成長因子１９）（配列番号３）、ＧＲＥＢ１タンパク質（配列番号４）、ＬＺＴＳ（ロイシンジッパー、推定抑制因子Ｉ）（配列番号５）、ＢＲＡＦ（ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（配列番号６）、ＦＲＳ２（線維芽細胞成長因子受容体基質２）（配列番号７）、ＡＮＸＡ１（アネキシンＡ１）（配列番号８）、Ｈｐ２（ハプトグロビン２）（配列番号８）、亜鉛α２−糖タンパク質（配列番号９）、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、グラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）１６Ｓ  ｒＲＮＡは、本明細書に記載される参照核酸又はアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドに対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００のアミノ酸、又はそれ以上のアミノ酸の領域にわたり、約６０％より高いアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する核酸、例えば、遺伝子、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、及びポリペプチド、多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、及び種間相同体を指す。本発明の核酸及びタンパク質には、天然に存在する分子又は組換え分子の双方が含まれる。核酸配列又はタンパク質配列は、例えば配列番号１〜９に提供される。
【００２７】
ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Granulicatella adiacens）は、細菌株を指す。これらの菌株及びその他は、いくつもの方法を用いて試料中に検出することができ、それらの方法には、例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ（リボ核酸又はデオキシリボ核酸）の検出、染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡの検出、又は試料からの細菌を適切な成長培地において適切な成長条件下で培養することによる検出が含まれる。
【００２８】
「癌」は、ヒト癌及び癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病等、例えば、固形癌及びリンパ系癌、腎癌、乳癌、肺癌、腎癌、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、脳癌、頭頸部癌、皮膚癌、子宮癌、精巣癌、食道癌、及び肝細胞癌を含む肝癌、非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、小細胞リンパ腫、及び大細胞リンパ腫）及びホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、白血病、並びに多発性骨髄腫を指す。
【００２９】
「療法的処置」及び「癌療法」は、化学療法、ホルモン療法、放射線療法、及び免疫療法を指す。
【００３０】
用語「過剰発現する」、「過剰発現」、又は「過剰発現した」は、同義的に、通常は癌細胞において、正常細胞と比較して検出可能な程度により高いレベルで転写又は翻訳されるタンパク質を指す。この用語は、転写、転写後プロセシング、翻訳、翻訳後プロセシング、細胞局在（例えば、細胞小器官、細胞質、核、細胞表面）、並びにＲＮＡ及びタンパク質の安定性に起因した、正常細胞と比較したときの過剰発現を含む。過剰発現は、ｍＲＮＡを検出するための従来技術（すなわち、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション）又はタンパク質を検出するための従来技術（すなわち、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的技法、質量分析）を用いて検出することができる。過剰発現は、正常細胞と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上であり得る。ある場合には、過剰発現は正常細胞と比較して１倍、２倍、３倍、４倍又はそれ以上高い転写又は翻訳レベルである。
【００３１】
用語「癌関連抗原」又は「腫瘍特異的マーカー」又は「腫瘍マーカー」は、同義的に、正常細胞と比較して、細胞内で発現するか、癌細胞の表面上に発現するか、又は癌細胞により分泌される分子（典型的にはタンパク質又はＲＮＡなどの核酸）であって、癌の診断、予後の提供、及び癌細胞に対する薬理作用物質の選択的ターゲティングに有用な分子を指す。多くの場合に、癌関連抗原は正常細胞と比較して癌細胞で過剰発現し、例えば正常細胞と比較して約１．２倍の過剰発現、約２倍の過剰発現、約３倍の過剰発現又はそれ以上である。多くの場合に、癌関連抗原は癌細胞において不適切に合成される細胞表面分子、例えば、正常細胞で発現する分子と比較して欠失、付加、又は変異を含む分子である。多くの場合に、癌関連抗原は癌細胞の細胞表面でのみ発現し、正常細胞の表面では合成されない、又は発現しないものであり得る。例示的な細胞表面腫瘍マーカーには、乳癌に対するタンパク質ｃ−ｅｒｂＢ−２及びヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）、前立腺癌に対すＰＳＭＡ、並びに乳癌、卵巣癌及び結腸直腸癌を含む数々の癌における炭水化物ムチンが含まれる。
【００３２】
当業者は、マーカーが、本明細書に開示される用途のいずれか、例えば肺癌の診断又は予後判定に、単独でも、又は他のマーカーとの組み合わせでも用いられ得ることを理解するであろう。
【００３３】
２つ以上の核酸配列又はポリペプチド配列との関連における用語「同一」又はパーセント「同一性」は、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ  ２．０配列比較アルゴリズムを以下に記載するデフォルトパラメータで使用して測定するか、又は手動アラインメント及び目視検査により測定したとき（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトハイパーテキスト転送プロトコル：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/などを参照のこと）、同じであるか、又は特定の割合の同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する（すなわち、比較ウィンドウ又は指定した領域に関して比較して、最大一致となるように整列させたとき、特定の領域に関して約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の同一性の）２つ以上の配列又は部分配列を指す。このときかかる配列は「実質的に同一である」と言える。この定義はまた、検査配列の相補体も指し、又はそれにも適用され得る。この定義はまた、欠失及び／又は付加を有する配列、並びに置換を有する配列も含む。以下に記載するとおり、好ましいアルゴリズムはギャップなどを考慮し得る。好ましくは、同一性は少なくとも約２５アミノ酸長又はヌクレオチド長である領域にわたり、又はより好ましくは５０〜１００アミノ酸長又はヌクレオチド長である領域にわたり存在する。
【００３４】
配列比較について、典型的には１つの配列が参照配列として働き、それに対して検査配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる際には、検査配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要であれば部分配列の座標が指定され、かつ配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。好ましくは、デフォルトのプログラムパラメータが用いられ得るか、又は代替パラメータが指定され得る。次に配列比較アルゴリズムが、参照配列と比べた検査配列のパーセント配列同一性をプログラムパラメータに基づき計算する。
【００３５】
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用されるとき、２０〜６００、通常では約５０〜約２００、さらに通常では約１００〜約１５０からなる群から選択されるいずれか一つの連続する位置の数のセグメントに対する参照を含み、このセグメントにおいて、ある配列が同数の連続する位置の参照配列と、それらの２つの配列を最適に整列させた後に比較され得る。比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野において公知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムによるか、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによるか、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性探索法によるか、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した処理系（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によるか、又は手動アラインメント及び目視検査により実行することができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel et al., eds. 1987-2005, Wiley Interscience）を参照のこと）。
【００３６】
パーセント配列同一性及び配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの例はＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらについては、それぞれAltschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)及びAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０を本明細書に記載されるパラメータで使用して、本発明の核酸及びタンパク質のパーセント配列同一性が決定される。ＢＬＡＳＴ分析を実行するソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ハイパーテキスト転送プロトコル：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公的に利用可能である。このアルゴリズムは、初めに、問い合わせ配列における長さＷの短いワードであって、データベース配列における同じ長さのワードと整列させたときに一致するか、或いは何らかの正値の閾値スコアＴを満たすワードを同定することにより、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.、上記）。これらの初期隣接ワードヒットが、その中に含まれるより長いＨＳＰを見付ける検索を開始する際の種として働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメータＭ（一致する残基ペアに対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチを有する残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリング行列を使用して累積スコアが計算される。それぞれの方向におけるワードヒットの拡張は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、それが達成した最大値から量Ｘだけ減少したとき；１つ以上の負のスコアを有する残基のアラインメントが蓄積したため累積スコアがゼロ以下になったとき；又はいずれかの配列の末端に達したとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）はデフォルトとしてワード長（Ｗ）に１１、期待値（Ｅ）に１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとしてワード長に３、及び期待値（Ｅ）に１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照のこと）アラインメント（Ｂ）に５０、期待値（Ｅ）に１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖比較を使用する。
【００３７】
「核酸」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそのポリマー、並びにその相補体を指す。
【００３８】
特異的に、とは、標的に対して特異的でないリガンドより少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、５００倍、１０００倍、又はそれ以上高い親和性でその標的に結合するリガンドの能力を指す。
【００３９】
特に指示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補配列を、明示的に指示される配列と同様に暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより実現され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドと同義的に用いられる。
【００４０】
特定の核酸配列はまた、暗黙的には「スプライス変異体」及びトランケート型の癌抗原をコードする核酸配列も包含する。同様に、核酸によりコードされる特定のタンパク質は、暗黙的にはスプライス変異体又はトランケート型の当該核酸によりコードされる任意のタンパク質を包含する。「スプライス変異体」は、その名前が示すとおり、遺伝子の選択的スプライシングの産物である。転写後、初期核酸転写物は、異なる（選択的な）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライシングされ得る。スプライス変異体の産生機序は様々であるが、エクソンの選択的スプライシングを含む。リードスルー（read-through)転写による選択的ポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物が、組換え形態のスプライス産物を含め、この定義に含まれる。核酸は、５’末端又は３’末端でトランケートされ得る。ポリペプチドはＮ末端側の末端又はＣ末端側の末端でトランケートされ得る。トランケートされた種類の核酸配列又はポリペプチド配列は、天然に存在し得るか、又は組換え的に作成し得る。
【００４１】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるもの、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシルグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合するα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。かかる類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、一般的なアミノ酸化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能する化学的化合物を指す。
【００４２】
アミノ酸は、本明細書ではIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨されるその一般的に知られる三文字記号又は一文字記号のいずれかにより参照され得る。ヌクレオチドも同様に、一般的に認められた一文字コードにより参照され得る。
【００４３】
「保存的に修飾された変異体」はアミノ酸配列及び核酸配列の双方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一の又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードは縮重しているため、ある所与のタンパク質を、多数の機能的に同一の核酸がコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは、いずれもアミノ酸アラニンをコードする。従って、コドンによってアラニンが指定される位置毎に、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載される対応するコドンのいずれかに変えることができる。かかる核酸の変異は、保存的に修飾された変異の一種である「サイレント変異」である。本明細書におけるポリペプチドをコードする核酸配列はいずれも、その核酸のあらゆる可能なサイレント変異を表す。当業者は、機能的に同一の分子を生じるように核酸の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾し得ることを認識するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、発現産物に関しての、しかし実際のプローブ配列に関してではない、記載される各配列に暗黙的に含まれる。
【００４４】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列の単一のアミノ酸又は小さい割合のアミノ酸を変化させ、付加し、又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個別の置換、欠失又は付加が、「保存的に修飾された変異体」であり、その変化により、あるアミノ酸の、化学的に同様のアミノ酸との置換が生じるものであることを認識するであろう。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存置換表が、当該技術分野において公知である。かかる保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、及び対立遺伝子に対する追加的なもので、それらを排除するものではない。
【００４５】
以下の８群は、各々が互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと）。
【００４６】
「標識」又は「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的な手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、一般にＥＬＩＳＡで使用されるように）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又は例えばペプチドに放射標識を組み込むことによって検出可能にし得るか、若しくはペプチドと特異的反応性を有する抗体の検出に使用し得るハプテン及びタンパク質が含まれる。
【００４７】
用語「組換え」は、例えば細胞、又は核酸、タンパク質、若しくはベクターを参照して使用されるとき、その細胞、核酸、タンパク質又はベクターが、異種の核酸若しくはタンパク質の組込み、又は天然の核酸若しくはタンパク質の改変により修飾されていること、又はその細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、例えば組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内には認められない遺伝子を発現し、又は組換えでない場合には異常に発現するか、発現が不十分であるか、若しくは全く発現しない天然の遺伝子を発現する。
【００４８】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブがその標的部分配列と、典型的には核酸の複合混合物中でハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、状況が異なれば異なり得る。配列が長いほど、特により高温でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲にわたる手引きが、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993)に見出される。概して、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度、ｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低く選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度に基づく）である（標的配列が過剰に存在するとき、Ｔｍにおいて平衡状態でプローブの５０％が使用される）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加して達成することもできる。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションについては、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のとおりであり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、又は５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣ、及び０．１％ＳＤＳ中６５℃での洗浄。
【００４９】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸であっても、コードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、それらの核酸はなお実質的に同一である。これは、例えば、遺伝子コードにより許容される最大のコドン縮重を用いて核酸のコピーが作製される場合に見出される。その場合、核酸は典型的には中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、４０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中３７℃でのハイブリダイゼーション及び１×ＳＳＣ中４５℃での洗浄を含む。陽性のハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替的なハイブリダイゼーション及び洗浄条件を利用して同様のストリンジェンシーの条件を提供し得ることを容易に認識するであろう。ハイブリダイゼーションパラメータの決定についてのさらなる指針は、数多くの参考文献、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.、上記に提供される。
【００５０】
ＰＣＲについては、約３６℃の温度が低ストリンジェンシーの増幅に典型的であるが、アニーリング温度はプライマー長に応じて約３２℃〜４８℃で異なり得る。高ストリンジェンシーのＰＣＲ増幅については約６２℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、プライマーの長さ及び特異性に応じて約５０℃〜約６５℃の範囲であり得る。高ストリンジェンシー及び低ストリンジェンシーの双方の増幅に典型的なサイクル条件は、９０℃〜９５℃で３０秒間〜２分間の変性段階、３０秒間〜２分間続くアニーリング段階、及び約７２℃で１〜２分間の伸長段階を含む。低ストリンジェンシー及び高ストリンジェンシー増幅反応についてのプロトコル及び指針は、例えば、Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.に提供される。
【００５１】
「抗体」は、認められている免疫グロブリン遺伝子の全て又は一部により実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質を意味する。認知されている免疫グロブリン遺伝子、例えばヒトにおけるものには、カッパ（κ）、ラムダ（λ）及び重鎖遺伝子座（これらは共になって無数の可変領域遺伝子を構成する）、及び定常領域遺伝子のミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、イプシロン（ε）及びアルファ（α）（これらはそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＡアイソタイプをコードする）が含まれる。本明細書において抗体とは、完全長抗体及び抗体断片を含むことが意図され、任意の生物由来の天然抗体、改変抗体又は以下にさらに定義するとおりの、実験、治療又はその他を目的として組換え的に生成された抗体を指し得る。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は抗体の他の抗原結合部分配列を含み、及び全抗体の修飾により産生されるもの、又は組換えＤＮＡ技法を用いてデノボ合成されるものを含むことができる。用語「抗体」は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の双方を指す。抗体は、拮抗性、作動性、中和性、阻害性又は刺激性であり得る。
【００５２】
バイオマーカー
バイオマーカーは、疫学的研究、動物試験、病態生理学的考察、及び終末器官実験を起源とし得る。理想的には、バイオマーカーは、有意味な転帰尺度について高い予測性をもつ値を有し、適切に設計された予測試験で検証することができるか又は検証され、代用マーカーの結果が対応して変化することにより治療の成功を反映し、及び診療において評価が容易なものでなければならない。
【００５３】
バイオマーカーは他の診断ツールと併用することも、又は単独で使用することもできる。
【００５４】
用語「代用マーカー」、「生体分子マーカー」、「バイオマーカー」又は「マーカー」（また、ときに本明細書では「標的分析物」、「標的種」又は「標的配列」とも称される）は、その測定値が対象の状態に関する情報を提供する分子を指す。様々な例示的実施形態において、バイオマーカーは病理学的状態の評価に使用される。バイオマーカーの測定値は、対象の状態を決定するために単独で使用されても、又は対象に関して得られる他のデータと組み合わされてもよい。一実施形態においてバイオマーカーは、ある状態の表現型の（例えば、疾患を有する）対象から採取された試料において、別の状態の表現型の（例えば、疾患を有しない）対象と比較したとき「違いを有して（differentially）存在する」。一実施形態においてバイオマーカーは、治療を受けていない、又は一種類の治療を受けている対象から採取された試料において、別の種類の治療を受けている対象と比較したとき「違いを有して存在」する。或いはバイオマーカーは、表現型に違いがなくても「違いを有して存在」することができ、例えばバイオマーカーは無症候性リスクの検出を可能にし得る。
【００５５】
バイオマーカーは対照と比べて過剰発現し得る（過剰に多量）か、又は過小発現し得る（不十分な量）。バイオマーカーは、対立遺伝子変異体、トランケート型、又は変異型の野生型核酸又はタンパク質であり得る。バイオマーカーはスプライス変異体であってもよい。
【００５６】
バイオマーカーは、様々な方法で、例えば、異なる表現型の状態の間において異なる群におけるバイオマーカーの平均値又は中央値レベル（特に以下に記載するとおり関連するｍＲＮＡの発現レベル）が統計的に有意であると計算される場合に、「違いを有して存在」することが決定され得る。統計的有意性の一般的な検定には、とりわけ、ｔ検定、ＡＮＯＶＡ、クラスカル−ワリス、ウィルコクソン、マン−ホイットニー、及びオッズ比が含まれる。
【００５７】
本明細書に記載されるとおり、バイオマーカーは、例えば、小分子、分析物若しくは標的分析物、核酸、タンパク質、代謝産物若しくはその任意の誘導体又はこれらの分子のあらゆる組み合わせであってもよく、本発明ではタンパク質及び核酸が、特に有用性を見出される。当業者は理解するであろうとおり、本方法を用いて数多くの分析物を検出し得る；基本的には、以下に記載する結合リガンドをそれに対して作製し得る任意のバイオマーカーが、本発明の方法を用いて検出され得る。
【００５８】
様々な実施形態において、本発明のパネルに使用されるバイオマーカーは、タンパク質として、或いは核酸（例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ転写物）として、任意の組み合わせで検出することができる。様々な実施形態において、タンパク質形態のバイオマーカーが測定される。当業者は理解するであろうとおり、タンパク質アッセイはＥＬＩＳＡアッセイなどの標準的な技術を用いて行われ得る。様々な実施形態において、核酸形態のバイオマーカー（例えば、対応するｍＲＮＡ）が測定される。様々な例示的実施形態において、特定のパネルからの１つ以上のバイオマーカーがタンパク質アッセイを用いて測定され、及び同じパネルからの１つ以上のバイオマーカーが核酸アッセイを用いて測定される。
【００５９】
当業者は理解するであろうとおり、本発明を用いて検出され得る可能なタンパク質性標的分析物及び標的種は多数ある。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」又は「オリゴペプチド」は、１つ以上のペプチド結合によりつなぎ合わされた少なくとも２つ以上のペプチド又はアミノ酸を指す。タンパク質又はアミノ酸は、天然に存在するものであっても、又は非天然に存在するものであってもよく、また類似体、誘導体又はペプチド模倣構造であってもよい。用語「タンパク質」は、野生型配列、野生型配列の変異体及びそれらのうちのいずれかを含む類似体又は誘導体化アミノ酸を指す。様々な実施形態において、スプライス変異体、欠失、付加、置換を含む変異体、断片、プレプロタンパク質、処理されたプレプロタンパク質（例えば、シグナル伝達ペプチドを含まない）、処理されたプロタンパク質（例えば、活性型を生じる）、非ヒト配列及び変異非ヒト配列に基づくタンパク質及び核酸を含めた本明細書に記載される配列の変異体を、バイオマーカーとして用いることができる。
【００６０】
様々な実施形態において、バイオマーカーは核酸である。用語「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は本明細書における文法的に等価な語は、互いに共有結合する少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、概してリン酸ジエステル結合を含むが、以下に概説するとおり、ある場合には、例えば結合リガンドプローブの使用においては、代替の骨格を有し得る核酸類似体が含まれる。
【００６１】
バイオマーカーはまた、細菌の核酸又はタンパク質であってもよい。口腔は大規模な細菌貯蔵所であり、７００を超える種又は系統型を有し、そのうち５０％超は未だ培養されていない。一部の実施形態では、細菌叢の組成及び動的変化を評価することが、肺癌のバイオマーカーである。
【００６２】
最近開発された１６Ｓ  ｒＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（ヒト口腔微生物同定マイクロアレイ（Human Oral Microbe Identification Microarray））により、肺癌を有する患者及び有しない患者における口腔細菌叢のプロファイルを決定することが可能となった。一部の実施形態では、試料中の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡの存在、非存在、又はレベルが、疾患又は病態と相関を有し得る。「細菌」は、約７０Ｓの区画化されていない環状ＤＮＡ及びリボソームを有する小さい原核生物（約１μｍの線寸法）を指す。「１６Ｓ  ＲＮＡ」は、原核生物リボソームの３０Ｓサブユニットの核酸成分；１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子又は１６Ｓ  ｒＲＮＡそれ自体を指す。種又は系統型の細菌株は１６Ｓ  ｒＲＮＡの差が約２％未満である。近縁の種又は系統型は、概して１６Ｓ  ｒＲＮＡの差が約２％〜約４％であり、一方で属は、１６Ｓ  ｒＲＮＡの差が約５％〜約１０％であることが多い。
【００６３】
細菌集団のアイデンティティを決定するため、マイクロアレイ上のプローブを、例えば１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の保存された特徴を利用するように設計することができる。例えば、より保存された特徴の領域と相補的なプローブは、各々が高位の分類群（例えば、ドメイン、門、綱、目、又は科）に対応する系統発生学上の大きい群において種を同定する。より可変的な領域と相補的なプローブは、属及び種を区別する。
【００６４】
バイオマーカーにはマイクロＲＮＡも含まれ得る。「マイクロＲＮＡ」（ｍｉＲ）は、天然に存在する小分子の非コードＲＮＡ（１８〜２４ヌクレオチド）の、遺伝子発現を制御するクラスを指す。多くのマイクロＲＮＡが種間で十分に保存されており、多様な種、すなわち植物、線虫、ショウジョウバエ及びヒトに存在する。マイクロＲＮＡは、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）と部分的に又は完全に相補的な配列を有し、その主要な機能は、遺伝子の発現を負に制御することである。特に、マイクロＲＮＡはｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３−ＵＴＲ）に結合し、それによってｍＲＮＡ切断、翻訳抑制及び脱アデニル化などの様々な方法によるｍＲＮＡの下方制御をもたらす。
【００６５】
様々な実験的手法及び異なる技法を使用して新規マイクロＲＮＡが同定されており、また種々の生物学的過程におけるその発現パターンも研究されている。新規マイクロＲＮＡのクローニング及び同定は、サイズ分画したＲＮＡ試料から、小分子ＲＮＡクローニング手法を用いて成功裏に行われている。他の手法は、推定マイクロＲＮＡとしての、他の種で既に記載がなされているマイクロＲＮＡに対するホモログ、又はコンピュータ手法を単独で、若しくはマイクロアレイ分析及び配列特異的クローニングと組み合わせて用いることである。
【００６６】
マイクロＲＮＡの検出及びプロファイリングに用いられた最初の技法の一つは、ノーザンブロッティングであった。この技法ではゲル分離後、相補的な３２Ｐジゴキシゲニン標識オリゴ又は修飾ロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが行われる。
【００６７】
マイクロＲＮＡを特異的に検出するために開発された他の技法は、改変インベーダーアッセイ（適切なオーバーラップ−フラップ構造の合成オリゴヌクレオチドであるプローブが、構造特異的５＊ヌクレアーゼにより酵素切断される）及びインサイチュハイブリダイゼーション（化学修飾ヌクレオチド、例えばＬＮＡを含む蛍光標識された相補的プローブを使用する）である。マイクロＲＮＡの検出及びプロファイリングに広く用いられている別の技法は、ＤＮＡ捕捉プローブによるか、或いは２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子とをつなぐ追加的な架橋でリボース部分が修飾された修飾ロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドを用いる、オリゴヌクレオチドマイクロアレイベースの検出プラットフォームの使用である。
【００６８】
加えて、定量的リアルタイムＰＣＲ（タックマン（Taqman）又はサイバーグリーン（SYBR green）技法を用いる逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応）が、前駆又は成熟マイクロＲＮＡの検出及びプロファイリングに用いられている。この技法は感度が高く、個別の成熟マイクロＲＮＡの検出に必要な出発物質の量が少ない。ｑＲＴ−ＰＣＲの感度を提供すると同時に、一つの試料中の異なるマイクロＲＮＡの同時検出を可能にするタックマン（Taqman）マイクロＲＮＡアレイが開発されている。
【００６９】
バイオマーカーには代謝産物も含まれ得る。「代謝産物」又は「小分子」は、試料中に存在する有機及び無機分子を指す。この用語には、巨大マクロ分子、例えば、巨大タンパク質（例えば、分子量が２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、又は１０，０００を超えるタンパク質）、巨大核酸（例えば、分子量が２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、又は１０，０００を超える核酸）、又は巨大多糖類（例えば、分子量が２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、又は１０，０００を超える多糖類）は含まれない。
【００７０】
細胞の代謝産物は、概して溶液中に遊離して存在している。「代謝プロファイル」、又は「小分子プロファイル」は、標的の細胞、組織、器官、生物、又はその一部（例えば、細胞内コンパートメント）の中にある小分子の完全な又は部分的なインベントリーを意味する。このインベントリーは、存在する小分子の量及び／又は種類を含み得る。「小分子プロファイル」は、単一の技法を用いて、又は複数の異なる技法を用いて決定され得る。
【００７１】
代謝プロファイルは、例えばＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー質量分析法）及びＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析）などの技法を用いて試料を分析することにより作成され得る。
【００７２】
バイオマーカーパネル
本明細書に記載されるバイオマーカーの任意の組み合わせを使用してバイオマーカーパネルが構築され、これは本明細書に記載されるとおり検出又は測定される。当該技術分野において一般的に理解されるとおり、組み合わせとは、セット全体又はその任意の部分的なセット若しくは部分的な組み合わせを指し得る。用語「バイオマーカーパネル」、「バイオマーカープロファイル」、又は「バイオマーカーフィンガープリント」は、一組のバイオマーカーを指す。本明細書で使用されるとき、これらの用語は、測定される任意の形態のバイオマーカーを指すことができる。従って、ＣＣＮＩがバイオマーカーパネルの一部である場合、ＣＣＮＩの例えばｍＲＮＡ、又は例えばタンパク質のいずれも、そのパネルの一部と見なすことができる。個々のバイオマーカーは診断用薬として有用であるが、バイオマーカーの組み合わせは時に、一つのバイオマーカー単独と比べて特定の状態の決定においてより高い価値をもたらし得る。具体的には、試料中において複数のバイオマーカーを検出することで、試験の感度及び／又は特異性が増加し得る。従って、様々な実施形態において、バイオマーカーパネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又はそれ以上の種類のバイオマーカーを含み得る。様々な例示的実施形態において、バイオマーカーパネルは最小数のバイオマーカーからなり、最大量の情報を生成する。従って、様々な実施形態において、バイオマーカーパネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又はそれ以上の種類のバイオマーカーからなる。バイオマーカーパネルが一組のバイオマーカー「からなる」場合、その一組のもの以外のバイオマーカーは存在しない。例示的実施形態において、バイオマーカーパネルは、本明細書に開示される１種のバイオマーカーからなる。様々な実施形態において、バイオマーカーパネルは、本明細書に開示される２種のバイオマーカーからなる。様々な実施形態において、バイオマーカーパネルは、本明細書に開示される３種のバイオマーカーからなる。様々な実施形態において、バイオマーカーパネルは、本明細書に開示される４種以上のバイオマーカーからなる。
【００７３】
様々な例示的実施形態において、バイオマーカーパネルは、ＣＣＮＩ（サイクリンＩ）（配列番号１）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）（配列番号２）、ＦＧＦ９（線維芽細胞成長因子１９）（配列番号３）、ＧＲＥＢ１タンパク質（配列番号４）、ＬＺＴＳ（ロイシンジッパー、推定抑制因子Ｉ）（配列番号５）、ＢＲＡＦ（ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（配列番号６）、ＦＲＳ２（線維芽細胞成長因子受容体基質２）（配列番号７）、ＡＮＸＡ１（アネキシンＡ１）（配列番号８）、Ｈｐ２（ハプトグロビン２）（配列番号８）、Ｂ鎖、ＭＨｃ様亜鉛α２−糖タンパク質とＰｒｏｌとの間に形成される複合体の結晶構造、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）１６Ｓ  ｒＲＮＡ、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）１６Ｓ  ｒＲＮＡの群から選択されるバイオマーカーを含むか、又はそれからなる。
【００７４】
バイオマーカーはまた、臨床パラメータであってもよい。用語「臨床パラメータ」は、対象の健康状態又は他の特徴、例えば限定なしに、年齢、人種、性別、家族歴、身長、及び体重などについてのあらゆる非試料又は非分析物バイオマーカーを指す。
【００７５】
本発明のバイオマーカーは、肺癌診断において統計的に有意な差を示す。様々な実施形態において、これらのバイオマーカーを単独又は組み合わせで使用する診断検査は、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％及び約１００％の感度及び特異性を示す。
【００７６】
バイオマーカーの測定及び検出
バイオマーカーは、概して、当業者に公知の様々なアッセイ、方法及び検出システムによって測定及び検出することができる。用語「測定する」、「検出する」、又は「測定値をとる」は、実体の特性の定量的又は定性的決定、例えば、分子の濃度の大きさ又は分子の活性レベルを定量化することを指す。用語「濃度」又は「レベル」は絶対量又は相対量を指し得る。分子の測定はまた、分子の非存在又は存在を決定することも含み得る。種々の方法には、限定はされないが、屈折率分光法（ＲＩ）、紫外分光法（ＵＶ）、蛍光分析、電気化学分析、放射化学分析、近赤外分光法（近ＩＲ）、赤外（ＩＲ）分光法、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、光散乱分析（ＬＳ）、質量分析法、熱分解質量分析法、比濁法、分散ラマン分光法、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、質量分析法と組み合わせたガスクロマトグラフィー、質量分析法と組み合わせた液体クロマトグラフィー、質量分析法と組み合わせたマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、質量分析法と組み合わせたイオンスプレー分光法、キャピラリー電気泳動法、比色法及び表面プラズモン共鳴（Biacore Life Sciencesにより提供されるシステムによるなど）が含まれる。国際公開第２００４／０５６４５６号及び国際公開第２００４／０８８３０９号もまた参照のこと。これに関して、バイオマーカーは上述の検出方法を用いて、又は当業者に公知の他の方法を用いて測定することができる。他のバイオマーカーも同様に、それを検出するように特別に設計又は適合された試薬を使用して検出することができる。
【００７７】
本発明の組成物及び方法において異なる種類のバイオマーカー及びその測定値を組み合わせることができる。様々な実施形態において、タンパク質形態のバイオマーカーが測定される。様々な実施形態において、核酸形態のバイオマーカーが測定される。例示的実施形態において、核酸形態はｍＲＮＡである。様々な実施形態において、タンパク質バイオマーカーの測定値が核酸バイオマーカーの測定値と併せて使用される。
【００７８】
ｍＲＮＡの検出方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、分枝ＤＮＡ、ＮＡＳＢＡ及びその他は、当該技術分野において公知である。バイオマーカー配列についてのデータベースエントリにより提供される配列情報を使用することにより、当業者に公知の技法を用いてバイオマーカー配列の発現を検出し（存在する場合）、測定することができる。例えば、配列データベースエントリの配列又は本明細書に開示される配列を使用して、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション分析又は特異的且つ選択的に特定の核酸配列を量的に増幅する方法でバイオマーカーＲＮＡ配列を検出するためのプローブを作製することができる。別の例として、これらの配列を使用して、例えば、逆転写に基づくポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などの増幅に基づく検出方法でバイオマーカー配列を特異的に増幅するためのプライマーを作製することができる。遺伝子発現の改変が遺伝子増幅、欠失、多型及び突然変異に関連する場合、試験集団及び参照集団における配列比較は、試験細胞集団及び参照細胞集団における検査対象のＤＮＡ配列の相対量を比較することにより行われ得る。ノーザンブロット及びＲＴ−ＰＣＲに加え、ＲＮＡはまた、例えば、他の標的増幅方法（例えば、ＴＭＡ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ）、シグナル増幅方法（例えば、ｂＤＮＡ）、ヌクレアーゼ保護アッセイ、インサイチュハイブリダイゼーションなどを用いて測定することもできる。
【００７９】
本発明における一実施形態には、バイオチップアッセイがある。本明細書において「バイオチップ」又は「チップ」とは、概して、捕捉結合リガンド（吸着剤、親和性試薬又は結合リガンド、又は核酸が測定される場合には捕捉プローブとも称される）が付着していて、それがタンパク質か、核酸か、或いはその双方を結合し得る固体担体又は基板を含む組成物を意味する。概して、タンパク質及び核酸バイオマーカーの測定にバイオチップが使用される場合、タンパク質バイオマーカーは、核酸バイオマーカーの測定に使用されるチップとは別のチップで測定される。核酸の測定に有用なさらなるプラットフォーム及び方法の非限定的な例については、米国特許出願公開第２００６／０２７５７８２号、米国特許出願公開第２００５／００６４４６９号及び独国特許第１０２０１４６３号を参照のこと。様々な実施形態において、バイオマーカーは同じプラットフォーム上、例えば１つのチップ上で測定される。様々な実施形態において、バイオマーカーは異なるプラットフォーム及び／又は異なる実験ランを使用して測定される。
【００８０】
「結合リガンド」、「捕捉結合リガンド」、「捕捉結合種」、「捕捉プローブ」又は本明細書における文法的に等価な語は、標的分析物、標的種又は標的配列（全て同義的に使用される）の存在の検出、又はその相対的若しくは絶対的な定量化に使用される化合物であって、且つ標的分析物、標的種又は標的配列に結合し得る化合物を意味する。概して、捕捉結合リガンド又は捕捉プローブは、本明細書にさらに記載するとおりの検出を目的とした標的種又は標的配列の固体担体との付着を可能にする。標的種の捕捉結合リガンドとの付着は直接的であっても、又は間接的であってもよい。例示的実施形態において、標的種はバイオマーカーである。当業者は理解するであろうとおり、結合リガンドの組成はバイオマーカーの組成に依存し得る。多種多様なバイオマーカーに対する結合リガンドが公知であり、又は公知の技法を用いて容易に見出すことができる。例えば、バイオマーカーがタンパク質である場合、結合リガンドはタンパク質（特に、以下でさらに考察するとおり抗体又はその断片（Ｆａｂ等）を含め）又は小分子を含む。結合リガンドはまた、他の種のタンパク質と交差反応性も有し得る。抗原−抗体対、受容体−リガンド、及び炭水化物とその結合パートナーもまた、好適な分析物−結合リガンド対である。様々な実施形態において、結合リガンドは核酸であってもよい。核酸結合リガンドは、タンパク質が標的であるときに特に有用性が見出される；或いは、本明細書により参照によって援用される米国特許第５，２７０，１６３号；米国特許第５，４７５，０９６号；米国特許第５，５６７，５８８号；米国特許第５，５９５，８７７号；米国特許第５，６３７，４５９号；米国特許第５，６８３，８６７号；米国特許第５，７０５，３３７号及び関連特許に概して記載されるとおり、事実上任意のバイオマーカーに結合するように核酸「アプタマー」を作成することができる。核酸結合リガンドはまた、核酸が結合標的であるときにも特に有用性が見出される。コンビナトリアルケミストリー法に基づく結合パートナーの作成に関しては、広範な文献がある。これらの実施形態において、結合リガンドが核酸である場合、好ましい組成物及び技法が、本明細書により参照によって援用される国際公開第１９９８／０２０１６２号に概説されている。
【００８１】
様々な例示的実施形態において、捕捉結合リガンドは抗体である。このような実施形態は、タンパク質形態のバイオマーカーの検出に特に有用である。
【００８２】
バイオマーカーのレベル（例えば転写レベル）の検出又は測定には、固体担体上でバイオマーカーのｍＲＮＡを検出する場合に概して本明細書において「捕捉プローブ」と称される捕捉結合リガンドとのバイオマーカーの結合が関わる。この意味で、バイオマーカーは標的配列である。用語「標的配列」又は「標的核酸」又は本明細書における文法的に等価な語は、遺伝子の一部分、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｒＲＮＡを含むＲＮＡ、又はその他であってもよい核酸配列を意味する。本明細書に概説するとおり、標的配列は試料由来の標的配列であっても、又はＰＣＲ等の増幅反応産物などの二次標的であってもよい。一部の実施形態では、従って核酸の測定は、核酸の相補体を測定することを指し得る。配列が長いほど特異性が高いという理解のもと、標的配列は任意の長さであってよい。
【００８３】
標的配列はまた、異なる標的ドメインを含んでもよい；例えば、試料標的配列の第１の標的ドメインが第１の捕捉プローブとハイブリダイズしてもよく、第２の標的ドメインが標識プローブとハイブリダイズしてもよい（例えば「サンドイッチアッセイ」フォーマット）等である。標的ドメインは、示されるとおり隣接していても、又は離れていてもよい。指示されない限り、用語「第１」及び「第２」は、標的配列の５’−３’方向に関する配列の向きを与えることを意図するものではない。例えば、標的配列の５’−３’方向を仮定すれば、第１の標的ドメインは第２のドメインの５’側又は第２のドメインの３’側のいずれにも位置し得る。
【００８４】
核酸が標的分析物として使用される場合、本発明のアッセイは数多くの実施形態をとり得る。一実施形態では、アッセイは溶液フォーマットで、いくつもの溶液ベースのフォーマットを用いて行われる。一実施形態では、当該技術分野において公知のとおりエンドポイントＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲフォーマットが用いられる。これらのアッセイは、パネルとして、個別のチューブ又はウェルで行うことも、或いは多重アッセイとして、単一のチューブ又はウェル内で一組のプライマー及び種々の標識を使用して行うこともできる。ＰＣＲに基づく溶液フォーマットに加え、他のフォーマットを利用することができ、そのようなフォーマットには、限定はされないが、例えばＦＲＥＴ色素対を利用するライゲーションに基づくアッセイが含まれる。この実施形態では、標的配列にハイブリダイズした２つ（又はそれ以上）のプローブがライゲートしたときに限り、シグナルが生成される。
【００８５】
多くの実施形態では、アッセイは固体担体上で、表面に会合した捕捉プローブを利用して行われる。本明細書において考察するとおり、捕捉プローブ（又は時に称されるとおりの捕捉結合リガンド）は、例えば、末端が官能基、例えばアミノ基で修飾された、シラン処理ガラスなどの修飾された表面に結合する捕捉プローブを使用することで、表面に共有結合させてもよい。或いは、非共有結合、例えば静電気、疎水性／親水性接着力を利用することができる。当業者が理解し、且つ本明細書で考察するとおり、多様な表面に対する数多くの付着が可能である。
【００８６】
この実施形態において、アッセイは数多くのフォーマットをとり得る。一実施形態では、標的配列は本明細書に記載されるとおり、検出可能標識を含む。この実施形態において、概して標識は標的の増幅中に、２つの方法のうちの一方、すなわち増幅工程中に標識プライマーが利用されるか、又は標識ｄＮＴＰが使用されるかのいずれか（双方とも当該技術分野において公知である）によって標的配列に付加される。標識は、本明細書において考察するとおり一次標識又は二次標識のいずれであってもよい。例えば、一実施形態では、プライマー及び／又はｄＮＴＰ上の標識はフルオロフォアなどの一次標識である。或いは標識は、ビオチン又は酵素などの二次標識であってもよい；例えば、一実施形態では、プライマー又はｄＮＴＰがビオチンで標識され、次にストレプトアビジン／標識複合体が加えられる。一実施形態では、ストレプトアビジン／標識複合体はフルオロフォアなどの標識を含む。代替的実施形態では、ストレプトアビジン／標識複合体は酵素標識を含む。例えば、複合体は西洋ワサビペルオキシダーゼを含むことができ、ＴＭＢを添加すると西洋ワサビペルオキシダーゼの作用によってＴＭＢが沈殿し、光学的に検出可能なイベントが生じる。これには、検出用の光学系に蛍光光度計を使用しなくてもよい点で特定の利益がある。
【００８７】
代替的実施形態では、固相アッセイは、標的分析物が核酸であるとき「標識プローブ」又は「シグナリングプローブ」と称されることもある標識された可溶性捕捉リガンドの使用に頼るものである。このフォーマットでは、アッセイは「サンドイッチ」型のアッセイであり、ここでは捕捉プローブが標的配列の第１のドメインに結合し、及び標識プローブが第２のドメインに結合する。この実施形態においても、標識プローブは一次標識（例えばフルオロフォア）又は二次標識（ビオチン又は酵素）のいずれであってもよい。一実施形態では、本明細書において考察するとおり、標識プローブがビオチンを含み、及びストレプトアビジン／酵素複合体が使用される。上記のとおり、例えば複合体は西洋ワサビペルオキシダーゼを含むことができ、ＴＭＢを添加すると西洋ワサビペルオキシダーゼの作用によってＴＭＢが沈殿し、光学的に検出可能なイベントが生じる。
【００８８】
一部の実施形態における標的種の検出には、様々な方法で組み込むことのできる「標識」又は「検出可能なマーカー」（以下に記載するとおり）が必要である。従って、様々な実施形態において組成物は「標識」又は「検出可能なマーカー」を含む。一実施形態では標的種（又は標的分析物若しくは標的配列）が標識され；従って標的種が結合すると、固体担体の表面に標識が提供される。
【００８９】
本明細書において特に有用性が見出される実施形態では、サンドイッチフォーマットが利用され、ここでは標的種は標識されない。これらの実施形態では、「捕捉」又は「アンカー」結合リガンドが本明細書に記載されるとおりの検出表面に固着され、及び可溶性結合リガンド（多くの場合に本明細書では「シグナリングプローブ」、「標識プローブ」又は「可溶性捕捉リガンド」と称される）が、独立して標的種に結合し、且つ少なくとも１つの標識又は検出可能なマーカーを直接的に、或いは間接的に含む。
【００９０】
本明細書において「標識」又は「標識された」は、化合物に少なくとも１つの分子、元素、同位体又は化学的化合物が結合していることで、その化合物の検出が可能であることを意味する。一般に、標識は４つのクラスに分類される：ａ）同位体標識（これは放射性同位体又は重同位体であってもよい）；ｂ）磁気的、電気的、熱的なもの；ｃ）有色色素又は発光色素；及びｄ）酵素；しかしながら標識には、磁性粒子などの粒子も同様に含まれ得る。色素は発色団又は蛍光体であってもよいが、好ましくは蛍光色素であり、これはそのシグナルが強力であるため、復号に良好な信号対雑音比を提供する。本発明における使用に好適な色素としては、限定はされないが、ユウロピウム及びテルビウムのものを含む蛍光性ランタニド錯体、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー（Cascade Blue）、テキサスレッド（Texas Red）、アレクサ（Alexa）色素及び本明細書により参照によって明示的に援用されるRichard P. Hauglandによる6th Edition of the Molecular Probes Handbookに記載されるその他の色素が含まれる。さらなる標識には、ナノ結晶、又は参照により援用される米国特許第６，５４４，７３２号に記載されるとおりのＱドット（Q-dot）が含まれる。
【００９１】
様々な実施形態において、検出可能な二次標識が使用される。二次標識は、間接的に検出されるものである；例えば二次標識は、検出用の一次標識を結合し、又はそれと反応することができるか、別の産物に作用して一次標識を生成することができるか（例えば酵素）、又は二次標識を含む化合物の非標識材料との分離を可能にし得る。二次標識には、限定はされないが、結合パートナー対の一方；化学修飾された部分；ヌクレアーゼ阻害薬、酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等が含まれる。二次標識にはまた、別の標識も含まれ得る。
【００９２】
様々な実施形態において、二次標識は結合パートナー対である。例えば標識は、その結合パートナーを結合し得るハプテン又は抗原であってもよい。例えば、好適な結合パートナー対には、限定はされないが：抗原（タンパク質（ペプチドを含む）など）及び抗体（その断片（Ｆａｂ等）を含む）；ビオチン／ストレプトアビジンを含むタンパク質と小分子；酵素と基質又は阻害薬；他のタンパク質間相互作用対；受容体−リガンド；及び炭水化物とその結合パートナーが含まれる。核酸間結合タンパク質対もまた有用である。一般に、対のうち小さい方がＮＴＰに結合してプライマーに取り込まれる。好ましい結合パートナー対には、限定はされないが、ビオチン（又はイミノビオチン）及びストレプトアビジン、ジゴキシン及びＡｂ、並びにプロリンクス（Prolinx）（商標）試薬が含まれる。
【００９３】
本発明のサンドイッチフォーマットでは、酵素が二次標識として働き、可溶性捕捉リガンドに結合する。一部の実施形態において特に有用であるのは、西洋ワサビペルオキシダーゼの使用であり、これは３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と組み合わせると有色の沈殿物を形成し、次にそれが検出される。ある場合には、可溶性捕捉リガンドがビオチンを含み、次にそれが酵素−ストレプトアビジン複合体に結合され、ＴＭＢの添加により有色の沈殿物を形成する。
【００９４】
様々な実施形態において、標識又は検出可能なマーカーはコンジュゲートした酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）である。様々な実施形態において、このシステムは反応生成物の沈殿の検出に頼るか、又は検出のために例えば電子特性の変化に頼るものである。様々な実施形態において、いずれの化合物も標識を含まない。
【００９５】
本明細書で使用されるとき、用語「蛍光シグナル生成部分」又は「フルオロフォア」は、ある波長でエネルギーを吸収し、別の波長で再びエネルギーを放出する分子又は分子の一部を指す。測定することのできる蛍光特性には、蛍光強度、蛍光寿命、発光スペクトル特性、エネルギー伝達などが含まれる。
【００９６】
単一の分子からのシグナルは、数多くの検出システムにより生成及び検出することができ、そのような検出システムには、限定はされないが、走査型電子顕微鏡法、近接場走査型光学顕微鏡法（ＮＳＯＭ）、全内部反射蛍光顕微鏡法（ＴＩＲＦＭ）などが含まれる。表面上のナノスケール構造を分析及び検出するためのかかる技法の適用については、参照によって援用される以下の参考文献により明らかなとおり、文献中に十分な指針が見出される：Reimer et al, editors, Scanning Electron Microscopy: Physics of Image Formation and Microanalysis, 2nd Edition (Springer, 1998)；Nie et al, Anal. Chem., 78: 1528-1534 (2006)；Hecht et al, Journal Chemical Physics, 112: 7761-7774 (2000)；Zhu et al, editors, Near-Field Optics: Principles and Applications (World Scientific Publishing, Singapore, 1999)；Drmanac、国際公開第２００４／０７６６８３号；Lehr et al, Anal. Chem., 75: 2414-2420 (2003)；Neuschafer et al, Biosensors & Bioelectronics, 18: 489-497 (2003)；Neuschafer et al、米国特許第６，２８９，１４４号など。
【００９７】
従って、フルオロフォアの検出システムは、上記に考察されるとおりの蛍光特性の測定に使用することができる任意の装置を含む。様々な実施形態において、検出システムは、励起源と、フルオロフォアと、放出光子を励起光子と分離する波長フィルタと、放出光子を記録し、且つ記録可能な出力を、一部の実施形態では電気信号又は写真画像として生成する検出器とを含む。検出装置の例には、限定なしに、分光蛍光光度計及びマイクロプレートリーダー、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナー（例えばマイクロアレイリーダーを含む）及びフローサイトメーターが含まれる。
【００９８】
様々な例示的実施形態において、バイオマーカーの結合リガンドとの結合は特異的又は選択的であり、結合リガンドは結合対の一部である。本明細書においてバイオマーカーを「特異的に結合する」又は「選択的に結合する」又はバイオマーカー「に対して選択的」とは、リガンドがバイオマーカーを、バイオマーカーと検査試料の他の成分又は混入物とを区別するのに十分な特異性で結合することを意味する。
【００９９】
用語「固体担体」又は「基板」は、捕捉結合リガンドを付着又は会合させるのに適切な分散した個別の部位を含むように修飾することができる任意の材料を指す。好適な基板は、金などの金属表面、電極、ガラス及び修飾された又は機能化されたガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン及びスチレンと他の材料との共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロン（Teflon）、これらの誘導体等を含む）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロース、樹脂、マイカ、シリカ又はケイ素及び変性ケイ素を含むシリカベース材料、炭素、金属、無機ガラス、ガラス繊維、セラミック、ゲテク（GETEK）（ポリプロピレンオキシドとガラス繊維の配合物）及び様々な他のポリマーを含む。本発明において特に有用であるのは、以下に記載するClonDiag材料である。
【０１００】
多くの場合に、バイオチップの表面は複数の指定可能な（addressable）位置を含み、その各々が捕捉結合リガンドを含む。本明細書において「アレイ位置」、「指定可能な位置」、「パッド」又は「部位」は、共有結合した捕捉結合リガンドを含む基板上の位置を意味する。本明細書において「アレイ」は、規則正しく並べられた形式、例えば行列状の複数の捕捉結合リガンドを意味する。アレイのサイズはアレイの組成及び最終用途に依存し得る。約２個又はそれ以上乃至何千個、何万個の異なる捕捉結合リガンドを含むアレイを作製することができる。概してアレイは、アレイの最終用途に応じて、３、４、５、６、７種又はそれ以上の種類の捕捉結合リガンドを含み得る。本発明では、アレイは、対照、マーカーの複製物などを含むことができる。例示的な範囲は約３種〜約５０種である。一部の実施形態では、本発明の組成物はアレイ形式でなくてもよい；すなわち一部の実施形態については、単一の捕捉リガンドを含む組成物が同様に作製され得る。加えて、一部のアレイでは、異なる組成か、或いは同じ組成の、複数の基板が使用され得る。従って、例えば大型アレイが複数のそれより小さい基板を含み得る。
【０１０１】
従って、一態様において本発明は、バイオマーカーパネルの各バイオマーカーに対する捕捉結合リガンドを含む固体担体を含む組成物を含む。様々な実施形態において、捕捉リガンドは核酸である。様々な実施形態において、捕捉結合リガンドは抗体である。様々な実施形態において、組成物は、バイオマーカーパネルの各バイオマーカーに対する可溶性結合リガンドをさらに含む。
【０１０２】
当該技術分野において公知のとおりの数多くの異なるバイオチップアレイプラットフォームが用いられ得る。例えば、本発明の組成物及び方法は、GeneChip（登録商標）（Affymetrix）、CodeLink（商標）Bioarray（Amersham）、Expression Array System（Applied Biosystems）、SurePrintマイクロアレイ（Agilent）、Sentrix（登録商標）LD BeadChip又はSentrix（登録商標）Array Matrix（Illumina）及びVerigene（Nanosphere）などのアレイプラットフォームで実現することができる。
【０１０３】
様々な例示的実施形態において、バイオマーカーの検出及び測定では、標的分析物又は標的種の結合の指標を提供するため、比色分析の方法及びシステムが利用される。比色法では、結合した標的種、例えばバイオマーカーが存在すると、１つ又は複数の波長における試料又は基板による吸光度又は光透過率が変化し得る。従ってかかる波長での吸光度又は光透過率を検出することにより、標的種の存在に関する指標がもたらされる。
【０１０４】
比色法の検出システムは、上記に考察されるとおりの比色特性の測定に使用することのできる任意の装置を含む。概して装置は、分光光度計、比色計、又は１つ以上の波長における吸光度又は光透過率を測定する任意の装置である。様々な実施形態において、検出システムは光源；波長フィルタ又はモノクロメータ；キュベット又は反応バイアルなどの試料容器；透過光を記録する光抵抗器などの検出器；及びディスプレイ又はイメージング素子を含む。
【０１０５】
様々な例示的実施形態において、バイオマーカーの比色検出にClonDiagチッププラットフォームが使用される。様々な実施形態において、ClonDiag ArrayTube（ＡＴ）が使用される。ArrayTubeの一つの独自の特徴は、マイクロプローブアレイ（バイオチップ）とマイクロ反応バイアルとの組み合わせである。様々な実施形態において、標的配列が核酸である場合、標的配列の検出は、試料中に含まれる標的配列を増幅及びビオチン化し、任意選択により増幅産物を消化することにより行われる。次に増幅産物を、ClonDiagチップ上に含まれるプローブとハイブリダイズさせる。ストレプトアビジン−酵素コンジュゲートの溶液、例えばポリ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート溶液を、ClonDiagチップに接触させる。洗浄後、ｏ−ジアニシジン基質溶液などの色素溶液をチップに接触させる。色素の酸化により沈殿が生じ、それを比色法で検出することができる。ClonDiagプラットフォームのさらなる説明は、Monecke S, Slickers P, Hotzel H et al., Clin Microbiol Infect 2006, 12: 718-728；Monecke S, Berger-Bachi B, Coombs C et al., Clin Microbiol Infect 2007, 13: 236-249；Ｍonecke S, Leube I and Ehricht R, Genome Lett 2003, 2: 106-118；Monecke S and Ehricht R, Clin Microbiol Infect 2005, 11: 825-833；独国特許第１０２０１４６３号；米国特許出願公開第２００５／００６４４６９号及びClonDiag, ArrayTube (AT) Experiment Guideline for DNA-Based Applications, version 1.2, 2007（全て全体として参照により援用される）に見出される。当業者は、比色変化を生じさせるため、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの、ペルオキシダーゼと反応する数多くの他の色素を利用し得ることを理解するであろう。具体的なアッセイプロトコルに関する情報については、www.clondiag.com/technologies/publications.phpを参照のこと。
【０１０６】
様々な実施形態において、標的種がタンパク質である場合、ArrayTubeバイオチップは抗体などの捕捉結合リガンドを含む。試料をバイオチップと接触させ、試料中に存在する任意の標的種を捕捉結合リガンド抗体と結合させる。可溶性捕捉結合リガンド又は検出化合物、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を標的種と結合させる。次にＴＭＢなどの色素を添加して西洋ワサビペルオキシダーゼと反応させると、沈殿及び色の変化が生じ、その変化が好適な検出装置で検出される。ArrayTubeを使用したタンパク質検出のさらなる説明は、例えば、Huelseweh B, Ehricht R and Marschall H-J, Proteomics, 2006, 6, 2972-2981；及びClonDiag, ArrayTube (AT) Experiment Guideline for Protein-Based Applications, version 1.2, 2007（全て全体として参照により援用される）に見出される。
【０１０７】
透過の検出及び分析はClonDiag ＡＴリーダー機器で実施される。好適なリーダー機器及び検出装置には、ArrayTube Workstation ＡＴＳ及びＡＴＲ  ０３が含まれる。
【０１０８】
ArrayTubeに加え、ClonDiag ArrayStrip（ＡＳ）を使用することができる。ArrayStripは、高容量試験用の９６ウェルフォーマットを提供する。各ArrayStripは、各ウェルの底にマイクロアレイが組み込まれた標準的な８ウェルストリップからなる。最大１２個のArrayStripを１つのマイクロプレートフレームに挿入することができ、最大９６個の試料の並行マルチパラメータ試験が可能となる。ArrayStripはArrayStrip Processor ＡＳＰを使用して処理することができ、これはアレイベースの分析に必要なあらゆる液体操作、インキュベーション、及び検出工程を実行する。様々な実施形態において、タンパク質が検出される場合、ArrayStripを使用したタンパク質の検出方法は、緩衝液又はブロッキング溶液によるＡＳアレイのコンディショニング；ＡＳウェルにおける最大９６個の試料溶液の負荷（それによりタンパク質を結合させる）；３回の洗浄；ＨＲＰに結合した二次抗体とのコンジュゲーション；３回の洗浄；ＴＭＢによる沈殿染色；及びＡＳアレイ画像化及び任意選択のデータ保存を含む。
【０１０９】
当業者は、本明細書に開示される方法の実行に有用であり得る数多くのさらなるイムノアッセイフォーマット及びその変形例に精通しているであろう。概して、E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1980)を参照のこと；また米国特許第４，７２７，０２２号；米国特許第４，６５９，６７８号；米国特許第４，３７６，１１０号；米国特許第４，２７５，１４９号；米国特許第４，２３３，４０２号；及び米国特許第４，２３０，７６７号も参照のこと。
【０１１０】
一般に、本発明に従い実施されるイムノアッセイは均一系アッセイであっても、又は不均一系アッセイであってもよい。均一系アッセイでは、通常は免疫反応に、特異抗体（例えば、抗バイオマーカータンパク質抗体）、標識された分析物、及び対象となる試料が関わる。抗体が標識分析物に結合すると、標識から生じるシグナルが直接的又は間接的に修飾される。免疫反応及びその程度の検出の双方とも、均一溶液中で行われ得る。用いられ得る免疫化学的標識には、遊離基、放射性同位元素、蛍光色素、酵素、バクテリオファージ、又は補酵素が含まれる。
【０１１１】
不均一系アッセイ手法では、試薬は通常、試料、抗体、及び検出可能なシグナルを発生する手段である。上記に記載したとおりの試料が用いられ得る。抗体は、ビーズ（プロテインＡ及びプロテインＧアガロースビーズなど）、プレート又はスライドなどの担体上に固定化し、液相中で抗原を含むことが疑われる検体と接触させることができる。次に担体を液相から分離し、及び検出可能なシグナルについて、かかるシグナルを発生する手段を用いて担体相又は液相のいずれかを調べる。このシグナルは、試料中における分析物の存在に関係している。検出可能なシグナルを発生する手段には、放射性標識、蛍光標識、又は酵素標識の使用が含まれる。例えば、検出する抗原が第２の結合部位を含む場合、当該の部位に結合する抗体を検出可能な基にコンジュゲートし、分離する工程の前に液相反応溶液に加えることができる。固体担体上における検出可能な基の存在が、検査試料中における抗原の存在を示す。好適なイムノアッセイの例には、免疫ブロット法、免疫蛍光法、免疫沈降法、化学発光法、電気化学発光法（ＥＣＬ）又は酵素結合免疫測定法が含まれる。
【０１１２】
抗体は、診断アッセイに好適な固体担体（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧアガロースなどのビーズ、ラテックス又はポリスチレンなどの材料から形成されたマイクロスフェア、プレート、スライド又はウェル）に、受動結合（passive binding）などの公知の技法に従いコンジュゲートすることができる。本明細書に記載されるとおりの抗体は同様に、放射標識（例えば、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、及び蛍光標識（例えば、フルオレセイン、アレクサ（Alexa）、緑色蛍光タンパク質、ローダミン）などの検出可能な標識又は基と、公知の技法に従いコンジュゲートしてもよい。
【０１１３】
本明細書に記載される方法及び組成物のいずれかを使用して試料をアッセイし、バイオマーカーパネルのレベルを決定することができる。従って、一態様において本発明は、患者からの試料をアッセイして試料中におけるバイオマーカーパネルの濃度を決定する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、バイオマーカーパネルの各バイオマーカーに対する捕捉結合リガンド又は捕捉プローブを含む固体担体を含む組成物と、試料を接触させる工程を含む。
【０１１４】
本発明はさらに、医学（診断及び治療を含む）、工業、法医学、及び研究における数多くの用途に対する肺の健康状態又は肺癌状態の決定において使用されるキットを提供する。キットは、１つ以上の容器、例えば、バイアル、チューブ、アンプル、ボトル、ポーチ、包装袋などを、中に密封された状態で有する運搬手段、例えば、箱、段ボール、筒などを含み得る。様々な実施形態において、キットは、１つ以上の培地又は培地成分、及び本明細書に開示される様々なバイオマーカー及びバイオマーカーパネルの測定用試薬から選択される１つ以上の構成成分を含む。例えば、本発明のキットはまた、同じ又は異なる容器内に、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上のプライマー、１つ以上の好適な緩衝液、１つ以上のヌクレオチド（デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及び好ましくは蛍光標識されたｄＮＴＰなど）及び標識用構成成分も含み得る。１つ以上の構成成分は同じ容器内に入れられてもよく、又は別個の容器内にあって、使用前に混合されてもよい。本発明のキットはまた、本発明の方法の実施についての１つ以上の使用説明書又はプロトコルも含み得る。キットはまた、コンピュータ又はコンピュータの構成要素、例えばコンピュータ可読記憶媒体若しくは装置も含み得る。記憶媒体の例には、限定なしに、ＣＤ、ＤＶＤ及びBlu-ray Disc（ＢＤ）などの光ディスク；光磁気ディスク；磁気テープ並びに内蔵ハードディスク及びリムーバブルディスクなどの磁気媒体；ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ及びフラッシュメモリなどの半導体記憶装置；及びＲＡＭが含まれる。コンピュータ可読記憶媒体は、本明細書に開示される様々な治療法及び処置レジメンに対する参照を符号化するソフトウェアを含み得る。ソフトウェアがコンピュータにより解釈されることで、本明細書に提供されるとおりのバイオマーカーの様々な濃度測定値に従う処置が実務者に提供され得る。様々な実施形態において、キットは、リスク閾値の検出を伴うラテラルフロー法に基づくポイントオブケア簡易迅速検査が関わるバイオマーカーアッセイ、又は構成するバイオマーカーについての定量的アッセイを伴うバイオチップを含む。
【０１１５】
診断及び治療方法
本発明の組成物及び方法は、対象における疾患の予後判定、診断及び治療に使用することができる。本発明は、対象からの試料中におけるバイオマーカーを測定するための臨床検査及びポイントオブケア検査用組成物及び方法を提供する。本発明は、概して数多くの異なる疾患に適用することができる。例示的実施形態において、疾患は肺癌である。
【０１１６】
本明細書に開示されるバイオマーカー及びバイオマーカーパネルは、疾患を有する、疾患を有しない、又は疾患を有するリスクがある対象の診断、同定又はスクリーニング方法；疾患の治療を受けている対象のモニタリング方法；新規治療法又は治療法の変更の決定又は提案方法；他の疾患による疾患又は疾患の細分類に含まれる疾患に関連する疾患状態を区別する診断方法；患者における疾患の重症度又は重症度の変化の評価方法；疾患を有する対象の病期診断方法及び疾患を有する対象の治療に用いる治療又はインターベンションの選択又は変更方法で使用することができる。例示的実施形態において、本発明の方法は、疾患に対して無症候性又は前駆症状性の対象の同定及び／又は診断に用いられる。これに関連して、「無症候性」又は「前駆症状性」は、疾患についての従来の症状又は十分な異常を呈しないことを意味する。
【０１１７】
様々な実施形態において、対象における疾患の予後を判定する方法、対象における疾患を診断する方法、又は対象における疾患を治療する方法は、対象からの試料においてバイオマーカーパネルの測定値をとる工程を含む。様々な例示的実施形態において、バイオマーカーパネルは、ＣＣＮＩ（サイクリンＩ）（配列番号１）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）（配列番号２）、ＦＧＦ９（線維芽細胞成長因子１９）（配列番号３）、ＧＲＥＢ１タンパク質（配列番号４）、ＬＺＴＳ（ロイシンジッパー、推定抑制因子Ｉ）（配列番号５）、ＢＲＡＦ（ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１（配列番号６）、ＦＲＳ２（線維芽細胞成長因子受容体基質２）（配列番号７）、ＡＮＸＡ１（アネキシンＡ１）（配列番号８）、Ｈｐ２（ハプトグロビン２）（配列番号８）、Ｂ鎖、ＭＨｃ様亜鉛α２−糖タンパク質とＰｒｏｌとの間に形成される複合体の結晶構造、ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）、カンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）、ストレプトコッカス・サリバリス（Streptococcus salivaris）、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）、キゲラ・オラリス（Kigella oralis）のうちの２つ以上からなる。
【０１１８】
用語「疾患状態」は、無病を含め、疾患の任意の識別可能な徴候を含む。例えば、疾患状態には、限定なしに、疾患の存在又は非存在、疾患を発症するリスク、疾患の病期、疾患の進行状態（例えば、時間の経過に伴う疾患の進行又は疾患の寛解）、疾患の重症度及び疾患の治療に対する有効性又は反応が含まれる。
【０１１９】
本発明との関連において「対象」は、動物、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであってもよく、しかしこれらの例に限定されるものではない。様々な例示的実施形態において、対象はヒトであり、患者と呼ばれ得る。ヒト以外の哺乳動物は、有利には、疾患の動物モデルとなる対象として、又は獣医用途に使用することができる。対象は、過去に疾患を有すると診断又は同定された者であってもよく、及び任意選択により、疾患に対する治療介入を既に受けたか、又は受けているところである。或いは、対象はまた、疾患を有すると過去に診断されたことがない者であってもよい。例えば対象は、疾患についての１つ以上のリスク要因を示す者、又は疾患リスク要因を示さない者、又は疾患について無症候性である者であってもよい。対象はまた、疾患を患っている者、又は疾患を発症するリスクがある者であってもよい。特定の実施形態では、対象は既に治療を受けているところであってもよく、又は治療の適応となる者であってもよい。
【０１２０】
当業者は理解するであろうとおり、バイオマーカーは、より予測性の高い対象及び分析のばらつきを実現するように設計されたいくつかの技法を用いて測定され得る。
【０１２１】
用語「試料」は、対象から得られた検体又は培養物を指し、流体、気体及び例えば組織を含む固体を含む。様々な例示的実施形態において、試料は唾液を含む。当業者は理解するであろうとおり、試料に対して事実上任意の実験操作工程又は試料調製工程が行われていてよい。例えば、洗浄工程及び／又は断片化が試料に適用され得る。様々な実施形態において、バイオマーカーパネルは対象において直接測定され、患者から分離された試料を得る必要はない。
【０１２２】
一態様において、本発明は、疾患について対象を診断する方法を提供し、この方法は、バイオマーカーパネルの測定値をとる工程；及びその測定値を疾患と相関させる工程を含む。用語「相関させる」は、概して、あるタイプのデータと別のタイプのデータとの間の、又はある状態との間の関係を決定することを指す。様々な実施形態において、測定値を疾患と相関させる工程は、測定値を基準バイオマーカープロファイル又は他の何らかの基準値と比較することを含む。様々な実施形態において、測定値を疾患と相関させる工程は、対象が現在疾患状態にあるかどうかを決定することを含む。
【０１２３】
バイオマーカーパネルの数量又は活性測定値は基準値と比較することができる。次に、対象試料におけるバイオマーカーの測定値を基準値と比較した差が同定される。例示的実施形態において、基準値は、以下でさらに記載するとおりのリスク分類によって提供される。
【０１２４】
様々な実施形態において、基準値はベースライン値である。ベースライン値は、１人以上の疾患を有しない対象、疾患に対して無症候性の対象又はある特定のレベルの疾患を有する対象からのバイオマーカーの有効量の複合試料である。ベースライン値はまた、処置又は治療の結果として疾患のリスク要因の改善を示した対象に由来する試料中のバイオマーカーの量も含むことができる。これらの実施形態では、対象由来の試料との比較を行うため、バイオマーカーの量は同じように計算される。基準値はまた、侵襲的又は非侵襲的技法により確認された疾患を有する対象、又は疾患を発症するリスクが高い対象に由来するバイオマーカーの量も含むことができる。任意選択により、疾患を有する、又は疾患を発症するリスクが高まっていると同定される対象は、疾患の進行を遅延させるか、又は疾患を発症するリスクを低減若しくは予防する治療レジメンを受けることが選択される。疾患は、バイオマーカーの量が基準値に対して時間の経過に伴い変化する場合には進行性（又は代替的に、処置が進行を予防しない）と見なされ、一方、時間が経過してもバイオマーカーの量が一定（基準集団と比べて、又は本明細書で使用されるとりの「一定」）にとどまる場合には、疾患は進行性ではない。用語「一定」は、本発明との関連において使用されるとき、基準値に関する経時的な変化を含むように解釈される。
【０１２５】
本発明のバイオマーカーを使用して、ある特定の閾値に従い疾患を有しない対象、疾患を有するリスクがない対象、又は疾患を発症しないものと思われる対象の「基準バイオマーカープロファイル」を作成することができる。本明細書に開示されるバイオマーカーを使用して、疾患を有する対象又は疾患を有するリスクがある対象からとられた「対象バイオマーカープロファイル」も作成することができる。対象バイオマーカープロファイルを基準バイオマーカープロファイルと比較することで、疾患を発症するリスクがある対象を診断又は特定し、疾患の進行、並びに疾患の進行速度をモニタし、及び疾患の治療法の有効性をモニタすることができる。本発明の基準及び対象バイオマーカープロファイルは、機械可読媒体、とりわけ、限定はされないが、ＶＣＲで読み取り可能なものなどのアナログテープ；ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭなどの光媒体；及び固体記憶装置に格納することができる。
【０１２６】
本発明のバイオマーカーパネルの測定は、医師による対象に関する治療に影響を及ぼし得る。従って本発明は、対象における疾患を治療する方法を提供し、この方法は、対象からの試料中におけるバイオマーカーパネルを測定する工程と、対象に関する治療に影響が及ぶ工程とを含む。用語「治療」及び「処置」は同義的に用いられ得る。特定の実施形態では、治療は、限定なしに、治療を開始すること、治療を継続すること、治療を変更すること又は治療を終了することから選択され得る。治療にはまた、疾患を予防するために取られ得る任意の予防的対策も含まれる。
【０１２７】
特定の実施形態では、処置は、対象に疾患修飾性薬物を投与することを含む。この薬物は、疾患であると診断若しくは特定される対象、又はその疾患を有するリスクがある対象に使用される治療薬又は予防薬であり得る。特定の実施形態において、治療の修飾とは、治療の継続期間、頻度又は強度を変更すること、例えば投薬量レベルを変更することを指す。
【０１２８】
様々な実施形態において、治療を遂行する工程は、生活様式の変更、例えば、運動を増やす、食事を変える、減煙又は禁煙等を、対象に行わせること、又はその必要性を対象に伝えることを含む。治療はまた、外科的手術、例えば乳腺切除術も含み得る。
【０１２９】
バイオマーカーレベルの測定により、疾患の処置過程をモニタすることが可能となる。疾患の処置レジメンの有効性は、経時的に対象から得られる試料から有効量で１つ以上のバイオマーカーを検出し、検出されたバイオマーカーの量を比較することによりモニタすることができる。例えば、最初の試料は対象が処置を受ける前に得てもよく、１つ以上の後続の試料は対象の処置後又は処置中に採取される。試料間でのバイオマーカーレベルの変化が、治療の有効性に関する指標を提供し得る。
【０１３０】
特定の対象に適切な治療薬又は薬物を同定するため、対象からの検査試料を治療剤又は薬物に曝露することもでき、１つ以上のバイオマーカーのレベルを決定することができる。バイオマーカーレベルは、処置の、又は治療剤若しくは薬物に対する曝露の前及びその後に対象から得られた試料と比較してもよく、又はかかる処置若しくは曝露の結果として疾患に関する改善を示した１人以上の対象から得られた試料と比較してもよい。従って、一態様において本発明は、対象に関する治療の効力を評価する方法を提供し、この方法は、対象からの第１の試料中におけるバイオマーカーパネルの第１の測定値をとる工程と；対象に関して治療を遂行する工程と；対象からの第２の試料中におけるバイオマーカーパネルの第２の測定値をとり、第１の測定値と第２の測定値とを比較して治療の効力を評価する工程とを含む。
【０１３１】
加えて、対象から得られた試料から有効量でバイオマーカー（２つ以上であり得る）を検出し、及び対象由来の試料を、対象由来の試料中における１つ又は複数のバイオマーカーの量を決定する試験化合物に曝露することにより、特定の対象に対する投与に好適な治療剤又は予防剤を特定することができる。従って、疾患を有する対象又は疾患を発症するリスクがある対象に使用される処置又は治療レジメンを、対象から得られた試料中における、且つ基準値と比較されるバイオマーカーの量に基づき選択することができる。２つ以上の処置又は治療レジメンを並行して評価することで、疾患の発生を遅延させるため、又は疾患の進行を緩徐にするため対象に用いるのにどの処置又は治療レジメンが最も有効かを決定することができる。様々な実施形態において、疾患の処置を開始又は継続すべきかどうかに関する助言が行われる。
【０１３２】
薬物処置
様々な例示的実施形態において、治療を遂行する工程は、疾患修飾性薬物を対象に投与することを含む。対象は、測定されるバイオマーカーの変化したレベルが、疾患に罹患していない集団、病期若しくは型の重篤性がより低い疾患を患っている集団、又は疾患修飾性薬物による処置の結果として疾患バイオマーカーの改善を示す集団において測定されるベースライン値に戻るまで、１つ以上の疾患修飾性薬物で治療され得る。加えて、バイオマーカー又は臨床パラメータのレベルの変化に関連する改善は、疾患修飾性薬物による処置の結果であり得る。
【０１３３】
本発明の方法を用いて対象を治療し、及び進行をモニタするため、疾患修飾性薬物などの数多くの化合物を使用し得る。特定の実施形態では、疾患修飾性薬物は、含む。
【０１３４】
これらの及び他の薬物の有益な作用は、臨床及び検査バイオマーカーの評価により可視化することができる。
【０１３５】
本明細書に開示される任意の薬物又は薬物の組み合わせは、疾患を治療するため対象に投与され得る。本明細書における薬物は、いくつもの方法で、多くの場合には当該技術分野における又は本明細書に開示若しくは参照されるとおりの様々な公知の製剤に従い、製剤化することができる。
【０１３６】
様々な実施形態において、本明細書に開示される任意の薬物又は薬物の組み合わせを対象に投与しないことにより、疾患が治療される。これらの実施形態では、実務者が薬物又は薬物の組み合わせの投与をやめてもよく、対象が薬物又は薬物の組み合わせの投与を受けないことを推奨してもよく、又は対象に薬物又は薬物の組み合わせが投与されることを阻止してもよい。
【０１３７】
様々な実施形態において、推奨される薬物又は投与されたことのある薬物に加えて１つ以上のさらなる薬物が、任意選択により投与されてもよい。さらなる薬物は、典型的にはいかなる推奨されない薬物又は避けるべき薬物でもない。例示的実施形態において、１つ以上のさらなる薬物は、１つ以上の血糖降下薬を含む。
【０１３８】
決定行列
実務者により選択される治療は、試料において決定されるバイオマーカーの濃度に依存し得る。様々な例示的実施形態において、治療は、各バイオマーカーに特有のある範囲のカテゴリーのうちどのカテゴリーに各バイオマーカーの濃度測定値が該当するかに依存する。様々な例示的実施形態において、治療は、バイオマーカーパネルにより示される異なる症状又は疾患リスクレベルの組み合わせに依存する。
【０１３９】
バイオマーカーの濃度測定値に関して、用語「カテゴリー」は、バイオマーカーが有し得る可能な濃度の区分のサブセットを指す。各カテゴリーは、実務者により選択されるラベル又は分類と関連付けられ得る。ラベルは、例えば、個体が疾患状態を有する、又は疾患状態に罹り易いリスクレベルを参照し得る。カテゴリー及びラベルは、現在ある文献から導き出されても、又は実務者の知見に従い導き出されてもよい。
【０１４０】
従ってバイオマーカーパネルの各バイオマーカーは、カテゴリー、例えばリスクカテゴリーの離散集合と関連付けることができる。各バイオマーカーから一つのカテゴリーを組み合わせて「決定点」が形成される。様々な例示的実施形態において、決定点の全体集合は可能な全てのｎ組のカテゴリーを含み、ここでｎは、バイオマーカーパネルにおけるバイオマーカーの数である。この全体集合は、ｍ１×ｍ２×．．．ｍｎ個の可能な決定点を有し、式中ｍｉは、バイオマーカーｉのカテゴリーの数である。
【０１４１】
決定点毎に病態又は疾患状態と関連付けることができ、病態又は疾患状態は必ずしも固有でない。すなわち１つ以上の決定点が同じ疾患状態に関連付けられ得る。可能な全ての決定点の病態又は疾患状態との関連付けは、「疾患分類行列」又は「疾患分類ツリー」と称することができる。従って、バイオマーカーパネルの測定値を決定点と相関させることにより、実務者は患者の病態又は疾患状態を分類することができる。
【０１４２】
決定点毎に特定の治療と関連付けることもでき、治療は必ずしも固有でない。すなわち１つ以上の決定点が同じ治療に関連付けられ得る。可能な全ての決定点の１つ以上の治療との関連付けは、「治療決定行列」又は「治療決定ツリー」と称することができる。
【０１４３】
各決定点を２種類以上の情報と関連付けることができる。例えば、ある決定点によって疾患状態及び治療の双方を指示することができる。
【０１４４】
冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、本明細書で使用されるとき、文脈上特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を排除しない。接続詞「又は」は、文脈上特に明確に指示されない限り、相互排他的ではない。用語「〜を含む」は非限定的な例を指して用いられる。
【実施例】
【０１４５】
以下の例は本発明を例示するために提供され、限定するためではない。
【０１４６】
実施例１：唾液トランスクリプトームのプロファイリング及び分析
唾液採取
刺激されていない全唾液試料を、既に確立されているプロトコルによって採取した。対象には、採取前の少なくとも３０分間は食事、飲酒、喫煙、又は口腔清掃行為を控えるよう依頼した。口紅は拭き取り、及び対象は普通の水で口を１回ゆすいだ。典型的には、患者は約５〜１０ｍｌの唾液を提供した。次に試料を４℃で１５分間、２，６００ｇで遠心した。次に上清を使用時まで−８０℃で保存した。留意すべきこととして、唾液試料１ｍｌにつき、１μｌのアプロチニン、１０μｌのＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリド）及び３μｌのオルトバナジウム酸ナトリウム（全てSigma, St. Louis, Mo.からのもの）を含むプロテアーゼ阻害薬カクテルを添加した。
【０１４７】
ｍＲＮＡの単離及び分析
３３０μｌの唾液上清から、MagMax（商標）ウイルスＲＮＡ単離キット（Ambion, Austin, TX）を使用してＲＮＡを単離した。このプロセスは、KingFisher（登録商標）mL技術（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を使用して自動化し、続いてTURBO（商標）ＤＮアーゼ処理（Ambion, Austin, TX）により混入しているＤＮＡを除去した。９０μｌの（１００μｌから）抽出したＲＮＡを１１μｌに濃縮し、RiboAmp（登録商標）ＲＮＡ増幅キット（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して線形増幅した。精製後、ｃＤＮＡを転写し、インビトロ転写標識用GeneChip（登録商標）Expression 3’-Amplification試薬（Affymetrix, Santa Clara, CA）を使用してビオチン化した。続いて約２０μｇの標識されたＲＮＡを、Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayを使用してGeneChip（登録商標）分析にかけた。チップハイブリダイゼーション及び走査を実施した。
【０１４８】
遺伝子アレイ統計分析
全データベースのＣＥＬファイルを、Bioconductor 2.2（ハイパーテキスト転送プロトコル：//www.bioconductor.orgを使用して統計Ｒ  ２．７．０（ハイパーテキスト転送プロトコル：//www.r-project.org）にインポートした。各マイクロアレイデータセットについてバックグラウンド補正及び分位数正規化（quantile normalization）を行った後、Probe Logarithmic Intensity Error Estimation（ＰＬＩＥＲ）発現尺度を計算した。全試料にわたるプローブセットレベルでの分位数正規化を実行し、全データセット間でエフェクトサイズが同様になるようにした。最後に、プローブセット毎に２標本ｔ検定を適用して発現差異を特定した。各プローブセットの推定量及びｐ値を得た後、偽発見率（ＦＤＲ）について各プローブセットのｐ値を補正した。０．０５のＦＤＲレベルで、及び癌エフェクトサイズを、癌と正常試料との間の変化が＞２倍として、遺伝子を選択した。
【０１４９】
バイオマーカー候補のスクリーニング
マイクロアレイプロファイリングにより生成されたバイオマーカー候補を、マイクロアレイ分析に使用したものと同じ試料セットに関してリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるさらなるスクリーニングに供した。これを達成するため、逆転写酵素及び遺伝子特異的プライマーを使用して、以下の熱サイクリング条件を用いて全ＲＮＡを逆転写した：６０℃で１分間、５０℃で３０分間、９５℃で２分間、続いて９５℃で１５秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１０秒間を１５サイクル。これらの工程に続いて７２℃で５分間の最終伸長を行い、次に４℃に冷却した。事前増幅産物をExoSAP-IT（USB Corporation）を用いて清浄にし、水で１／４０希釈した。２μｌのｃＤＮＡをｑＰＣＲに使用した。
【０１５０】
ABI 7500HT Fast Real Time PCRシステム（Applied Biosystems, Foster City, CA）において、初期変性に９５℃で１５分間、続いて９５℃で３０秒間及び６０℃で３０秒間を４０サイクルのｑＰＣＲを、９６ウェルプレートにおいて１０μｌの反応容量で、power SYBR（登録商標）-Green Master Mix（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用して実行した。いずれのｑＰＣＲも、全候補ｍＲＮＡについてデュプリケートで実施した。各遺伝子の融解曲線によりＰＣＲの特異性を確認し、平均閾値サイクル（Ｃｔ）を調べた。
【０１５１】
アンプリコン長は、事前増幅に使用した外側プライマー対について約１００〜１３０ｂｐ及びｑＰＣＲに使用した内側プライマー対について６０〜８０ｂｐであった。ＲＴ−ｑＰＣＲプライマーはPrimer Express 3.0ソフトウェア（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用して設計した。いずれのプライマーもSigma-Genosys（Woodlands, TX）により合成し、アンプリコンについて可能であればいつでもイントロンスパニングを行った。
【０１５２】
バイオマーカーＣｔ値からＧＡＰＤＨ  Ｃｔ値を減じることによりΔＣｔを生成してローデータを正規化した。群間バイオマーカー比較にはマンホイットニー順位和検定を使用した。
【０１５３】
ＧＡＰＤＨを基準遺伝子として使用する場合、２−Ｃｔ法を用いてｑＰＣＲのデータ分析を実施した。ノンパラメトリックのウィルコクソン検定を使用して２つの群間のｑＰＣＲに基づく遺伝子発現値を比較した。ＲＮＡ入力について正規化するため、ＧＡＰＤＨについてもｑＰＣＲを実施した。マーカーＣｔ値からＧＡＰＤＨ  Ｃｔ値を減じることによりΔＣｔを提供してローデータを正規化し、次にＲ  ２．７．０のパッケージ（ワールドワイドウェブ.r-project.org）及びBioconductor 2.2のＲＯＣパッケージ（ワールドワイドウェブ.bioconductor.org）を利用してstatsで分析した。対照群と膵癌群との２つの異なる分布を考慮して、マンホイットニーＵ検定を用いて統計的比較を行った。被験者群間を区別するバイオマーカー（Ｐ値＜０．０５）を同定し、曲線下面積（ＡＵＣ）値を比較した。ＡＵＣは、１−特異性に対して感度をプロットする受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線の作成に基づく。ＡＵＣ値はＲＯＣ曲線の数値積分法により計算される。この値の範囲は０．５〜１．０であり得る。０．５の値は、バイオマーカーがコイン投げ同然であることを示し、一方、１．０は比較的最良の診断精度を示す。
【０１５４】
肺癌被験者と対照被験者との間で発現が異なったものとして、７つのｍＲＮＡバイオマーカーが同定された。３つのｍＲＮＡバイオマーカー（ＧＲＥＢ１、ＣＣＮＩ、及びＦＲＳ２）の組み合わせによるロジスティック回帰モデルで肺癌患者が対照被験者と区別され、約９１％の感度及び約８８％の特異性で約０．９１のＲＯＣプロットＡＵＣ値が得られた。
【０１５５】
実施例２：唾液プロテオームのプロファイリング及び分析
タンパク質の単離及び分析
１０人の健康対照被験者及び１０人の肺癌被験者から唾液を採取し、４℃で１５分間、２６００ｇで遠心した。１０人の健康対照被験者及び１０人の肺癌被験者からの唾液上清をプールして、プロテオームプロファイリング用の対照試料及び癌試料を形成した。プールした唾液試料中の２５０μｇのタンパク質をメタノール沈殿させ、次に２−Ｄ細胞溶解緩衝液（３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素及び４％ＣＨＡＰＳ界面活性剤を含有）に再懸濁した。肺癌及び対照の各プール試料の全タンパク質を、それぞれシアニン色素Ｃｙ２及びＣｙ５で標識した。次に２つの標識した試料セットを組み合わせ、二次元ディファレンスゲル電気泳動に供した。標識した試料を負荷後、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）（ｐＨ３〜１０）を、Amersham BioSciencesにより提供されるプロトコルに従い実行した。ＩＰＧストリップをＳＤＳ−ゲル泳動緩衝液でリンスした後、１３．５％ＳＤＳ−ゲルに移した。色素の前縁がゲルからはみ出るまで、ＳＤＳ−ゲルを１５℃で泳動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの直後にTyphoon TRIO（商標）（Amersham BioSciences）を使用してゲル画像を走査した。タンパク質発現レベルのフォールドチェンジをゲル内DeCyder（商標）分析から得た。
【０１５６】
ゲル上のフォールドチェンジが１．５より大きいスポットを切り取り、次に何回か洗浄して染色色素及び他の化学物質を除去した。ゲルスポットを乾燥させて、最大量の消化緩衝液を吸収させた。乾燥した２Ｄゲルスポットを、配列決定等級の修飾トリプシン（Promega, USA）を含む消化緩衝液で再度含水させた。タンパク質を３７℃で一晩、ゲル内消化した。消化したペプチドを、ＴＦＡ抽出緩衝液で振盪しながらゲルから抽出した。消化したトリプシンペプチドを、C-18 Zip-tips（Millipore）を使用して脱塩した。脱塩したペプチドをＣＨＣＡマトリックス（α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）と混合し、MALDI-TOF MS（ABI4800）同定用のMALDIプレートのウェルにスポットした。タンパク質の同定は、ペプチドフィンガープリント質量マッピング（ＭＳスペクトルを使用）及びペプチド断片化マッピング（ＭＳ／ＭＳスペクトルを使用）に基づいた。組み合わせたＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＭＡＳＣＯＴ検索エンジンを備えたGPS Explorerソフトウェアを使用してデータベース検索にかけ、一次配列データベースからタンパク質を同定した。
【０１５７】
バイオマーカー候補のスクリーニング
４つのタンパク質（アネキシンＡ１、ハプトグロビンＨＰ２、インターロイキン１受容体拮抗薬、亜鉛α２−糖タンパク質）。市販のＥＬＩＳＡキットによりカルプロテクチンを検証した。癌群及び対照におけるハプトグロビンＨＰ２、亜鉛α２−糖タンパク質及びカルプロテクチンの分布は、それぞれ０．００９０３、０．０５、及び０．０４８のｐ値で有意差を示す。
【０１５８】
２−Ｄゲル分析で同定された４つのタンパク質（上記）を、元の試料セットに関してウエスタンブロット分析に供した。還元タンパク質試料（レーン当たり１５μｇの総タンパク量）を１０％ビス−トリスゲルに負荷し、ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液において１時間、１５０Ｖで泳動した。着色されたタンパク質標準（Invitrogen）を使用してタンパク質の移動を追跡した。iBlot（登録商標）（Invitrogen）を使用することにより、タンパク質をニトロセルロース膜に移した。次に１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１％（ｖ／ｖ）のTween（登録商標）-20（Sigma-Aldrich）を含む洗浄緩衝液で膜を洗浄した後、５％脱脂粉乳を含む洗浄緩衝液で１時間ブロックした。さらに洗浄緩衝液で洗浄した後、膜を一次抗体（マウス抗アネキシンＡ１（Abcam））、マウス抗ハプトグロビン（Lifespan Bioscience）、マウス抗ＺＡＧ（Santa Cruz Biotech）、マウス抗アクチン（Sigma-Aldrich）と共に、全て製造者の指示に従い、ブロック緩衝液中室温で２時間インキュベートした。次に膜を洗浄した後、二次抗体（ヒツジ由来の抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ結合種特異的完全抗体、GE Healthcare）を、製造者の指示に従い室温で１時間適用した。最後に、膜を洗浄し、ECL Plus（商標）検出キット（GE Healthcare）を使用して可視化した。Image Jソフトウェア（NIH, Bethesda, MD, USA）を使用してバンドのシグナル強度を測定した。正規化のため、目的のタンパク質に相当するバンドの強度を、同じブロットにおけるβアクチン発現に対応するバンドの強度で除した。
【０１５９】
製造者の指示（Cell Sciences）に従いカルプロテクチンのＥＬＩＳＡを行った。全ての唾液試料を試料希釈剤で１００倍希釈した。全ての試料をデュプリケートで負荷した。
【０１６０】
実施例３：唾液微生物バイオマーカー
１０人の健康対照被験者及び１０人の肺癌被験者から唾液を採取し、４℃で１５分間、２６００ｇで遠心した。上清をデカントし、ペレットをＤＮＡ単離に使用した。
【０１６１】
そのペレットから、UltraClean（登録商標）微生物ＤＮＡ単離キット（MO Bio Laboratories）を製造者の指示に従い使用して、ＤＮＡを抽出した。次に単離したＤＮＡを、微生物分析のためForsyth Institute（Cambridge, MA, USA）に提出し、そのHuman Oral Microbe Identification Microarrayサービスを使用した。対照被験者及び肺癌被験者からのマイクロアレイプロファイルに基づき、１１種の微生物が２つの被験者群間で違いを有して存在するものとして同定された。
【０１６２】
リアルタイムＰＣＲを使用して、元のＤＮＡ試料中における細菌株の量を決定した。全ての種について特異的プライマーを設計してリアルタイムＰＣＲを実施することにより、肺癌試料と対照試料との間で細菌量を定量化した。リアルタイムＰＣＲにより、試料群間で違いを有して存在するものとして７種の細菌が同定された。ポルフィロモナス・カトニエ（Porphyromonas catoniae）及びカンピロバクター・ショウアエ（Campylobacter showae）の２つの細菌が、対照と比べて肺癌被験者により豊富なものとして同定された。
【０１６３】
実施例４：スクリーニング方法
日常的に歯の手入れを行っている患者を来院時にスクリーニングする。例えば、６２歳の女性患者であって喫煙歴を有する者に対し、口内検査前に唾液試料の提供を依頼する。唾液試料を採取して、ポイントオブケアで分析するか、或いは参照試験所による分析に出す。本発明のバイオマーカー及び任意選択により他のバイオマーカーについて唾液試料が試験される。分析の結果は歯科医療従事者に提供され、肺癌を有するかどうかに関して患者に通知される。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【０１６４】
本明細書に引用される全ての参考文献、刊行物、特許出願、発行済みの特許、受託記録及びデータベースは、任意の付属書類を含め、あらゆる目的から全体として参照により援用される。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013521763.tif 000026
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