(57)【要約】  本発明は、新規α−１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする／に相当する、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）およびバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からの核酸およびアミノ酸配列に関する。本発明はまた、例えばオリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質など、特に３−フコシルラクトースなど、フコシル化産物を生成させるためのα−１，３−フコシルトランスフェラーゼを使用するための用途および方法も提供する。
2013541952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、
ａ）添付の配列リストの配列番号１、３または５；
ｂ）配列番号１、３または５に相補的な核酸配列；
ｃ）ａ）およびｂ）で定められる核酸配列またはそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列からなる群から選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
α−１，３フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号１、３または５からなる、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
α−１、３フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする請求項１または２に記載の核酸配列を含有するベクターであって、該ベクターで形質転換された宿主細胞により認識される配列を制御するために該核酸配列が操作可能に連結される、ベクター。
【請求項４】
（ａ）配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１、３または５で示される核酸分子の逆鎖にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる、配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体の、アミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、３または５で示される核酸分子の逆鎖にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる、配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列のオルソログの、アミノ酸配列；および
（ｄ）少なくとも１０連続アミノ酸を含む、配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列の断片からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する単離ペプチド。
【請求項５】
請求項３に記載のようなベクターを含有する宿主細胞。
【請求項６】
酵母を含む真菌、細菌、昆虫、動物および植物細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞であることを特徴とする、請求項５または６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、個々の細胞のコドン使用に適応させられていることを特徴とする、請求項５から７の１項に記載の宿主細胞。
【請求項９】
フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質の生成のための、請求項１または２の何れかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項３に記載のベクターまたは請求項４に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１０】
前記フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質の生成が、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドの異種または同種発現により行われることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
該フコシル化オリゴ糖が３−フコシルラクトースであることを特徴とする、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
ａ．請求項４に記載のα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性があるポリペプチドを提供し、
ｂ．該ポリペプチドが、ドナー基質からアクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒し、それによりフコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質が生成する条件下で、フコース残基を含むドナー基質と、単糖またはオリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を含むアクセプター基質と、を含む混合物と、段階ａのα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性のあるポリペプチドを接触させる段階を含む、フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および（糖）脂質を生成させるための方法。
【請求項１３】
ａ．フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質の生成可能なおよびα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現可能な適切な栄養条件下で、請求項５から８に記載のような宿主細胞を培養し；
ｂ．段階ａと同時にまたは連続して、フコース残基を含むドナー基質と、単糖もしくはオリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を含むアクセプター基質と、を提供して、該α−１，３−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドが該ドナー基質から該アクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒し、それにより、フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を生成させるようにし；
ｃ．該宿主細胞またはその増殖培地から、前記フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質を単離する段階を含む、フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および（糖）脂質を生成させるための方法。
【請求項１４】
ドナー基質がＧＤＰ−フコースであることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
該ＧＤＰ−フコースが、該宿主細胞で同時発現される酵素によるかまたは該宿主細胞の代謝により提供されることを特徴とする、請求項１２から１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項９から１１の何れかに記載の使用によるか、または請求項１２から１５の何れかに記載の方法により得られる、フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規フコシルトランスフェラーゼおよびそれらの適用に関する。
【０００２】
多くの（糖）タンパク質、（糖）脂質またはオリゴ糖は、特定の生物学的活性を示すために、特定のフコシル化構造の存在を必要とする。例えば、多くの細胞間認識機構は、フコシル化オリゴ糖を必要とし、例えば、Ｌ−セレクチンなど、細胞接着分子を結合させるために、特異的な細胞構造にはフコシル化炭水化物が含まれねばならない。生物学的機能を有するフコシル化構造に対する別の例は、ＡＢＯ血液型系を形成する構造である。さらに、治療用（糖）タンパク質は、薬物動態学的特性および安定性がそれらのグリカンに帰する、最も急速に成長しているクラスの医薬的試薬に相当する。
【０００３】
それらの複雑な性質および固有の化学的特性ゆえに、複合糖質の化学合成は大きな課題であり、相当な困難が伴う。自動合成装置が市販されているタンパク質および核酸とは異なり、一般的な市販の系を用いて、複合糖質は言うまでもなく、グリカンを合成することは（まだ）できない。立体化学を制御する必要以外に、特異的な結合の形成は未だに困難である。
【０００４】
複合糖質の化学的または複合的な酵素的／化学的合成に伴う複雑性を考慮し、最近のアプローチは、オリゴ糖残基を含む（糖）タンパク質および（糖）脂質を酵素的に合成するために、グリコシルトランスフェラーゼを使用してきた。
【０００５】
グリコシルトランスフェラーゼの酵素ファミリーに属するフコシルトランスフェラーゼは、脊椎動物、無脊椎動物、植物および細菌において広く発現されている。これらは、ドナー、通常はグアノシン−ジホスフェートフコース（ＧＤＰ−フコース）から、オリゴ糖、（糖）タンパク質および（糖）脂質を含むアクセプターへの、フコース残基の転移を触媒する。したがって、フコシル化アクセプター基質は、様々な生物学的および病理学的プロセスに関与する。
【０００６】
いくつかのフコシルトランスフェラーゼが、例えば、細菌、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）において、哺乳動物、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）およびシストソマ・マンソニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）において、ならびに植物において同定されており、フコース付加の部位に基づき、フコシルトランスフェラーゼはα１，２、α１，３／４およびＯ−フコシルトランスフェラーゼに分類される。
【０００７】
哺乳動物において、デノボ合成およびサルベージ経路を通じて細胞質においてＧＤＰ−フコースが合成される。デノボ合成により、２種類の酵素を介してＧＤＰ−マンノースがＧＤＰ−フコースに変換され、一方でサルベージ経路は、遊離細胞質フコースを基質として利用する。細胞において、ＧＤＰ−フコースは、小胞において濃縮され、ドナー基質としてフコシルトランスフェラーゼにより認識される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
多くの商業的に重要なオリゴ糖、（糖）タンパク質および（糖）脂質の生物学的活性は、特定のフコース残基の有無に依存するので、最先端において、所望のオリゴ糖残基を有する複合糖質を効率的に合成または作製することが必要とされている。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、大量の所望の基質を生成させる、効率的で時間および費用が削減される方法でフコシル化基質が作製され得るツールおよび方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によると、とりわけ、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、次のものからなる群から選択される配列を含むかまたはそれらの配列からなる単離ポリヌクレオチドの提供によって、この目的が解決される：
ａ）添付の配列リストの配列番号１、３または５；
ｂ）配列番号１、３または５に相補的な核酸配列；
ｃ）ａ）およびｂ）で定められる核酸配列またはそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する、核酸配列。
【００１１】
本発明によるポリヌクレオチドは、種アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）およびバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）のフコシルトランスフェラーゼに相当し、配列番号１は、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）の新たに同定されたフコシルトランスフェラーゼのポリヌクレオチド配列を示し、配列番号３および５は、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）の２種類の新たに同定されたフコシルトランスフェラーゼのポリヌクレオチド配列を示す。
【００１２】
新規に同定されたフコシルトランスフェラーゼは、それらを使用することによって天然ではない反応が行われ得るので、驚くべき効果を有する：本発明の範囲内で、上記の同定されたα−１，３フコシルトランスフェラーゼが、基質としてラクトースを使用することができ、特定の３−フコシルラクトースにおいてフコシル化オリゴ糖を生成させることができることが分かった。現在、細菌から単離された既知のα−１，３フコシルトランスフェラーゼの中で、フコシルラクトースの生成のために天然基質としてラクトースを使用することが示されているものはない。したがって、フコシル化オリゴ糖を生成させるために使用しようとする新規に同定されたフコシルトランスフェラーゼの適合性は非常に驚くべきものであり、したがってそれらの使用は、容易に、効率的に、かつ費用を削減して、例えばヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）、例えばフコシルラクトースを生成させるための優れたツールとなる。今日、ＨＭＯに属する８０種類を超える化合物の構造の特徴が分かっており、これらは、プレバイオティクスとして機能する複合オリゴ糖のクラスに相当する。さらに、上皮エピトープに対するＨＭＯの構造的相同性から、細菌病原体に対する予防特性が説明される。小児消化管内で、ＨＭＯは、選択された細菌株の増殖を選択的に促進し、したがって、母乳栄養児において特有の腸内微生物叢の発達を刺激する。
【００１３】
現在まで、これらのオリゴ糖の構造の複雑性ゆえに、それらの合成による生成が妨げられてきたため、ＨＭＯに対する主要な供給源は依然としてヒト乳である。したがって、簡単におよび容易に入手可能なＨＭＯが必要とされており、これは、本明細書中で与えられる驚くべきことに適切なフコシルトランスフェラーゼを使用することによって提供され得る。
【００１４】
本発明によると、「ポリヌクレオチド」という用語は、一般的には、何らかのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これらは、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」としては、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域または１本鎖、２本鎖および３本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、および１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖または、より一般的には２本鎖もしくは３本鎖領域または１本鎖および２本鎖領域の混合物であり得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む３本鎖領域を指す。このような領域における鎖は、同じ分子からまたは異なる分子からのものであり得る。
この領域は、分子の１以上の全てを含み得るが、より一般的にはいくつかの分子のある領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語はまた、１以上の修飾された塩基を含有する上述のようなＤＮＡまたはＲＮＡも含む。したがって、安定するようにまたは他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書中で意図されるとおりの、「ポリヌクレオチド」である。さらに、通常のものではない塩基、例えばイノシン、または修飾された塩基、例えばトリチル化塩基（２例のみ挙げる。）を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドである。当然のことながら、当業者にとって公知の多くの有用な目的を果たすＤＮＡおよびＲＮＡに対して、非常に多岐にわたる修飾が行われてきた。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、このような化学的に、酵素的にまたは代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに、例えば単純および複雑型細胞を含む、ウイルスおよび細胞の特徴となるＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる短いポリヌクレオチドも包含する。
【００１５】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合により互いに連結される２以上のアミノ酸を含む何らかのペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと呼ばれる短い鎖、および通常はタンパク質と呼ばれるより長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、２０種類の遺伝子にコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。「ポリペプチド」は、天然プロセス、例えばプロセシングおよび他の翻訳後修飾、また化学的修飾技術の何れかにより修飾されたものを含む。このような修飾は、基礎的な教科書に、およびより詳細な専門書においてならびに大部の研究文献においてよく記載されており、これらは、当業者にとって周知である。当然のことながら、同じタイプの修飾が、あるポリペプチドのいくつかの部位において、同じまたは様々な程度、存在し得る。また、あるポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含有し得る。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチドの何れの位置でも起こり得る。修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化、トランスファーＲＮＡが介在するタンパク質へのアミノ酸の付加、例えばアルギニン化およびユビキチン化が含まれる。ポリペプチドは、分岐状または、分岐があるかもしくはない環状であり得る。環状、分岐状および分岐型環状ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスの結果生じ得、完全に合成法によっても生成され得る。
【００１６】
「単離」とは、その天然の状態から「人間の手により」変化させられること、すなわち、それが天然のものである場合、その元の環境から変化させられているかまたは取り除かれているかまたはその両方であることを意味する。例えば、生物において天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から分離されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で単離という用語が使用されるとおり、「単離」されている。同様に、「合成」配列は、その用語が本明細書中で使用される場合、合成により作製され、天然供給源から直接単離されていない、何らかの配列を意味する。「組み換え」とは、ある種からの遺伝子を異種の宿主生物の細胞に移植またはスプライシングすることにより調製された、遺伝子改変ＤＮＡを意味する。このようなＤＮＡは、宿主の遺伝子構造の一部となり、複製される。
【００１７】
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、本発明のポリペプチド、特に配列番号２、４および６に記載のようなアミノ酸配列を有するα−１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。この用語はまた、コードおよび／または非コード配列も含有し得るさらなる領域と一緒に、ポリペプチドをコードする１つの連続領域または非連続領域（例えば、統合されたファージまたは挿入配列またはエディティングが割り込む。）を含むポリヌクレオチドも包含する。
【００１８】
「変異体」は、その用語が本明細書中で使用される場合、それぞれ参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、基本的な特性を保持する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、ヌクレオチド配列が別の参照ポリヌクレオチドとは異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよいし、または変化させなくてもよい。ヌクレオチドの変化の結果、下記に記載のように、参照配列によりコードされるポリペプチドにおける、アミノ酸置換、付加、欠失、融合および短縮が起こり得る。ポリペプチドの典型的な変異体は、アミノ酸配列が、別の参照ポリペプチドとは異なる。一般に、参照ポリペプチドおよび変異体の配列が全体的に近似しており、多くの領域において同一であるように相違が限定される。変異体および参照ポリペプチドは、あらゆる組み合わせの１以上の置換、付加、欠失によってアミノ酸配列が異なり得る。置換されるまたは挿入されるアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされるものであってよいし、そうでなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体など、天然であってもよいし、または天然で知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然の変異体は、突然変異誘発技術により、直接的合成により、および当業者にとって公知の他の組み換え法により、作製され得る。
【００１９】
「α−１，３−フコシルトランスフェラーゼまたはフコシルトランスフェラーゼ」または「α−１，３−フコシルトランスフェラーゼまたはフコシルトランスフェラーゼ」をコードする核酸／ポリヌクレオチドという用語は、ドナー基質からのフコースの転移、例えば、ＧＤＰ−フコースから、α−１，３−結合のアクセプター分子への転移を触媒するグリコシルトランスフェラーゼを指す。アクセプター分子は、炭水化物、オリゴ糖、タンパク質もしくは（糖）タンパク質または脂質もしくは（糖）脂質であり得、例えばＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルラクトサミン、ガラクトース、フコース、シアル酸、グルコース、ラクトースまたはそれらの何らかの組み合わせであり得る。本発明の範囲内で、配列番号１、３または５から選択される核酸によりコードされるポリペプチドまたは配列番号２、４または６から選択されるアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００以上のアミノ酸の領域にわたり、約６０％を超えるアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、核酸／ポリヌクレオチドおよびポリペプチド多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間ホモローグも、これらの用語に含まれる。
【００２０】
さらに、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、その活性を改変するために、ペプチド配列の付加または欠失により変更され得る。例えば、さらなる酵素活性をもたらすために、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドにポリペプチド配列を融合させ得る。あるいは、タンパク質の活性を除去または改変するために、アミノ酸を欠失させ得る。α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ酵素活性を欠くが、その構造的三次元構造を保持するように、タンパク質を修飾し得る。このような修飾は、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドに対する抗体の開発において有用である。
【００２１】
さらに、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物は、機能的に同等な遺伝子産物に相当するタンパク質またはポリペプチドを含み得る。このような同等のα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物は、上述のα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含有し得るが、その結果、サイレントな変化が起こり、したがって機能的に同等なα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物が生成される。含まれる残基の、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性が同様であることに基づき、アミノ酸置換が為され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ；平面型中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられ；正電荷（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ；負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。本発明の内容の中において、「機能的に同等」とは、本明細書中で使用される場合、抗原性、すなわち抗α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ抗体への結合能、免疫原性、すなわちα−１，３−フコシルトランスフェラーゼタンパク質またはポリペプチドに結合可能な抗体を産生させる能力ならびに酵素活性を含むが限定されない多くの基準の何れかにより判定した場合、ポリペプチドが、上述のα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列によりコードされる内因性α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物と実質的に同様のインビボ活性を示すことが可能であることを指す。
【００２２】
翻訳中または翻訳後に異なって修飾されるα−１，３−フコシルトランスフェラーゼタンパク質、ポリペプチドおよび誘導体（断片を含む。）は本発明の範囲内に含まれる。さらに、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼポリペプチド配列への置換または付加として、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を導入することができる。
【００２３】
当技術分野で周知の技術を使用した組み換えＤＮＡ技術によって、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドを生成させ得る。α−１，３−フコシルトランスフェラーゼコード配列および適切な転写翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターを構築するために、当業者にとって周知の方法を使用することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ遺伝子組み換えが含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載の技術を参照。
【００２４】
「オリゴ糖」は、その用語が本明細書中で使用される場合、および最先端において通常理解されるとおり、少数、一般に３から１０の単純な糖、すなわち単糖を含有する糖ポリマーを指す。
【００２５】
本発明の別の態様によると、上記で与えられるように、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸配列を含有するベクターが提供され、この核酸配列は、そのベクターで形質転換された宿主細胞により認識される調節配列に操作可能に連結される。特定の好ましい実施形態において、本ベクターは発現ベクターであり、本発明の別の態様によると、本ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、リポソームまたはウイルスの形態で存在し得る。
【００２６】
組み換え産生の場合、発現系もしくはその一部または本発明のポリヌクレオチドを組み込むために、宿主細胞を遺伝子改変することができる。Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、上出などの多くの標準的な実験マニュアルに記載の方法によって、宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入を達成し得る。
【００２７】
したがって、本方法によるポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞に安定的に形質転換／形質移入しようとするベクターに含まれ得る。ベクターにおいて、本方法のポリヌクレオチドは、遺伝子／ポリヌクレオチドの発現を特異的に標的とし得るように、および必要に応じて遺伝子をそのようにして過剰発現させ得るように、例えば誘導性プロモーターの調節下にある。
【００２８】
本発明のポリペプチドを生成させるために、多種多様の発現系を使用することができる。このようなベクターとしては、とりわけ、染色体性、エピソーム性およびウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス由来のベクター、およびその組み合わせ由来のベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント由来のものなど、例えばコスミドおよびファージミドなどが挙げられる。発現系コンストラクトは、発現を制御し、生じさせる調節領域を含有し得る。通常、この点で、発現のために、ポリヌクレオチドを維持するか、拡大させるかまたは発現させるおよび／または宿主においてポリペプチドを発現させるために適切な、何らかの系またはベクターを使用し得る。様々な周知のおよび日常的な技術の何れか、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照で示されるものなどによって、適切なＤＮＡ配列を発現系に挿入し得る。
【００２９】
したがって、本発明はまた、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列からなるα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する単離ポリペプチドにも関する：
（ａ）配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１、３または５で示される核酸分子の逆鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる、配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体の、アミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、３または５で示される核酸分子の逆鎖にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる、配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列のオルソログの、アミノ酸配列；および
（ｄ）少なくとも１０連続アミノ酸を含み、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する、配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列の断片。
【００３０】
「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブがその標的配列とハイブリッド形成するが、他の配列とはハイブリッド形成しない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、状況によって異なる。長い配列ほど、高い温度で特異的にハイブリッド形成する。一般的に、ストリンジェントな条件は、定められたイオン強度およびｐＨでの特異的な配列に対する熱融解点（Ｔｍ）よりも約１５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、平衡状態で標的配列と相補的なプローブの５０％が標的配列と（定められたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）ハイブリッド形成する温度である。代表的なストリンジェントなハイブリッド形成条件は、次のとおりであり得る：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、４２℃で温置、または５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃で温置し、６５℃で０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄。
【００３１】
また、本発明は、上記で定められるようなベクターを含有する宿主細胞および特に酵母を含む真菌、細菌、昆虫、動物および植物細胞からなる群から選択される宿主細胞を指す。宿主細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞であれば特に好ましい。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、現在、外来のポリヌクレオチド配列により、形質転換もしくは形質移入されているか、または形質転換もしくは形質移入可能な細胞として定義される。
【００３３】
本発明のα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子コード配列を発現させるために、様々な宿主発現ベクター系を利用し得る。このような宿主発現系は、関心のあるコード配列が産生され得、続いて精製され得る媒体を意味し、さらにまた、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換または形質移入された場合にインシトゥで本発明のα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物を示す細胞をも意味する。
【００３４】
例えばヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）から単離されるフコシルトランスフェラーゼを論じるＷＯ９８／５５６３０（この公表物は本明細書で明らかに参照される。）において、多くの適切な発現系および宿主を見出すことができる。
【００３５】
本発明の別の態様によると、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を、個々の細胞のコドン利用に適応させる。
【００３６】
本発明は、次の段階を含む、フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および（糖）脂質を生成させるための方法に関する：
ａ．本発明によるα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性があるポリペプチドを提供し、
ｂ．このポリペプチドがドナー基質からアクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒し、それによりフコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質が生成する条件下で、フコース残基を含むドナー基質と、単糖またはオリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を含むアクセプター基質と、を含む混合物と、段階ａのα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性のあるポリペプチドを接触させる、段階。
【００３７】
本発明によると、細胞不含の系または細胞を含有する系において、フコシル化オリゴ糖を生成させるための方法を行い得る。酵素産物の形成を可能とするのに十分な時間にわたり、十分な条件下で、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドと基質を反応させるようにする。これらの条件が、基質および酵素の量および純度、その系が細胞不含であるかまたは細胞を利用した系であるかに依存して変動することを理解されたい。これらの可変因子は、当業者により容易に調整される。
【００３８】
細胞不含の系において、水性反応液中での混合によって、本発明によるポリペプチド、アクセプター基質、ドナー基質および、場合によっては、他のグリコシルトランスフェラーゼおよび補助的酵素を含む他の反応混合物成分を合わせる。溶液中で酵素を遊離状態で利用し得るか、またはこれらをポリマーなどの支持体に結合もしくは固定化させることができ、基質を支持体に添加し得る。支持体を例えばカラムに充填し得る。
【００３９】
フコシル化オリゴ糖の合成のための細胞含有系は、組み換えにより修飾を受けた宿主細胞を含み得る。
【００４０】
したがって、本発明はまた、次の段階を含む、フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および（糖）脂質を生成させる方法にも関連する：
ａ．フコシルオリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質の生成が可能な、およびα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現が可能な適切な栄養条件下で、上述のような宿主細胞を培養し；
ｂ．段階ａと同時にまたはこれと連続して、フコース残基を含むドナー基質と、オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を含むアクセプター基質と、を提供して、前記宿主細胞において発現されるα−１，３−フコシルトランスフェラーゼがドナー基質からアクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒し、それにより、フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を生成させるようにし；
ｃ．宿主細胞またはその増殖培地から、前記フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質を単離する、段階。
【００４１】
本発明による方法において、ドナー基質はＧＤＰ−フコースであり得る。ドナー基質がＧＤＰ−フコースである場合、特に好ましい。
【００４２】
本発明のある態様によると、アクセプター基質は、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルラクトサミン、ガラクトース、フコース、シアル酸、グルコース、ラクトースまたはそれらの何らかの組み合わせから選択される。特に、ラクトースはアクセプター基質として好ましい。
【００４３】
「基質」という用語は、本明細書中で使用される場合、フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を生じさせるために本発明のポリペプチドが作用し得る、何らかの物質または様々な物質の組み合わせを意味する。
【００４４】
酵素産物の形成を可能とするのに十分な時間にわたり、十分な条件下で、基質をα−１，３−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドと反応させる。これらの条件は、基質および酵素の量および純度、その系が、細胞不含であるかまたは細胞を利用した系であるかに依存して変動する。これらの可変因子は、当業者により容易に調整される。
【００４５】
本発明による方法のある態様によると、ドナー基質を宿主細胞内で生成させることによって、ドナー基質が段階ｂで提供される。そうすることにおいて、宿主細胞に添加しようとする、例えばフコースをＧＤＰ−フコースに変換する酵素を、宿主細胞において同時に発現させる。この酵素は、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）由来のＦｋｐのような、例えば二機能性フコースキナーゼ／フコース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼまたは、ある個別のフコース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼとある個別のフコースキナーゼの組み合わせ（ホモサピエンス、イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）およびドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）を含むいくつかの種からこれらが知られるように。）であり得る。
【００４６】
あるいは、段階ｂにおいて、培地／宿主細胞にドナー基質を添加してもよいし、または細胞自身の代謝によって生成させてもよい。
【００４７】
またさらなる実施形態において、本発明は、次の段階を含む方法に関する：
ａ）ｉ）同封の配列表からの配列番号１、３または５、ｉｉ）配列番号１、３または５に相補的な核酸配列およびｉｉｉ）適切な栄養条件下で、ｉ）およびｉｉ）またはそれらの相補鎖で定められる核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列から選択される核酸配列を含むように形質転換または形質移入された宿主細胞を培養して、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するペプチドとして、ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）から選択される核酸配列が発現されているようにし；
ｂ）段階ａと同時にまたはこれと連続して、フコース残基を含むドナー基質と、オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を含むアクセプター基質と、を提供して、前記宿主細胞において発現されるα−１，３−フコシルトランスフェラーゼがドナー基質からアクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒し、それにより、フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を生成させるようにし；
ｃ）宿主細胞またはその増殖培地から、前記フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質を単離する、段階。
【００４８】
本発明による方法において、宿主細胞において発現されるペプチドは、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を示し、したがって、ドナー、例えばグアノシン−ジホスフェートフコース（ＧＤＰ−フコース）から、オリゴ糖、（糖）タンパク質および（糖）脂質を含むアクセプターへ、フコース残基を転移させる。したがって、そのように、ベビーフードの補給のための食品添加物として、または治療的もしくは薬学的に活性のある化合物として、フコシル化アクセプター基質を使用し得る。この新規の方法によって、複雑で時間および費用がかかる合成プロセスを必要とせずに、フコシル化産物を容易にかつ効率的に提供することができる。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「単離する」という用語は、本発明によるα−１，３−フコシルトランスフェラーゼにより生成された産物を遺伝子発現系から採取、回収または分離することを意味する。
【００５０】
したがって、本発明はまた、本発明による方法により得られるフコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質ならびに、フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質の生成のための上述のようなポリヌクレオチド、ベクターまたはポリペプチドの使用にも関する。
【００５１】
さらに別の実施形態によると、前記フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質の生成は、α−１，３フコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドの異種または同種（過剰）発現により行われる。
【００５２】
別段の定めがない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、一般的に、本発明が属する技術分野の通常の技術者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書中で使用される用語体系および、細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学および上記および下記のハイブリッド形成における実験法は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。核酸およびペプチド合成に対して標準的技術を使用する。通常、製造者の仕様書に従い、酵素反応および精製段階を行う。
【００５３】
本発明はまた、本明細書中で開示されるポリヌクレオチド配列の断片も包含する。
【００５４】
さらなる長所は、実施形態の記載および添付の図面から得られる。
【００５５】
言うまでもないが、本発明の範囲から逸脱することなく、上述の特性および下記でまだ説明すべき特性を、それぞれ特定の組み合わせだけではなく、他の組み合わせで、またはそれらのみで使用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
図面において本発明のいくつかの実施形態を例示し、次の記述においてさらに詳細に説明する。
【００５７】
図１は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ＤＥ３）でのｐＤＥＳＴ１４−ａｍｕｃ０７６０ｃｏからのＡｍｕｃ０７６０ｃｏの発現を示しており；粗製抽出物からの１５μｇの可溶性タンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシー・ブリリアント・ブルーで染色した。
【００５８】
図２は、ウエスタンブロットを介したＨｉｓ−タグ付加Ａｍｕｃ０７６０ｃｏの検出を示す。
【００５９】
図３は、ｐＤＥＳＴ１４−ａｍｕｃ０７６０ｃｏ、すなわち、Ｇａｔｅｗａｙ−ｒｅａｃｔｉｏｎによってｐＤＥＳＴ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされた新しいα−１，３−フコシルトランスフェラーゼＡｍｕｃ０７６０ｃｏをコードするコドン最適化遺伝子ａｍｕｃ０７６０ｃｏのベクターマップ（Ａ）；ｐＤＥＳＴ１４−ｆｕｃＴ６、すなわち、Ｇａｔｅｗａｙ−ｒｅａｃｔｉｏｎおよび（Ｂ）によって、ｐＤＥＳＴ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローニングされた新しいα−１，３−フコシルトランスフェラーゼＦｕｃＴ６をコードする、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からの遺伝子ｆｕｃＴ６のベクターマップ；およびｐＤＥＳＴ１４−ｆｕｃＴ７、すなわち、Ｇａｔｅｗａｙ−ｒｅａｃｔｉｏｎによってｐＤＥＳＴ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローニングされた、新しいα−１，３−フコシルトランスフェラーゼＦｕｃＴ７をコードする、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からの遺伝子ｆｕｃＴ７のベクターマップ（Ｃ）を示す。
【００６０】
図４は、ｐＡＣＹＣ−ａｍｕｃ０７６０ｃｏ、すなわち、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩを介して）にクローニングされた新しいα−１，３−フコシルトランスフェラーゼＡｍｕｃ０７６０ｃｏをコードするコドン最適化遺伝子ａｍｕｃ０７６０ｃｏのベクターマップ（Ａ）；ｐＡＣＹＣ−ｆｕｃＴ６、すなわち、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩを介してｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＫ）にクローニングされた新しいα−１，３−フコシルトランスフェラーゼＦｕｃＴ６をコードするバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのコドン最適化遺伝子ｆｕｃＴ６のベクターマップ（Ｂ）；およびｐＡＣＹＣ−ｆｕｃＴ７、すなわち、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩを介してｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＫ）にクローニングされた新しいα−１，３−フコシルトランスフェラーゼＦｕｃＴ７をコードするバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのコドン最適化遺伝子ｆｕｃＴ７のベクターマップ（Ｃ）を示す。
【００６１】
図５は、遺伝子ａｍｕｃ０７６０ｃｏおよびタンパク質Ａｍｕｃ０７６０ｃｏのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【００６２】
図６は、遺伝子ｆｕｃＴ６およびタンパク質ＦｕｃＴ６のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【００６３】
図７は、遺伝子ｆｕｃＴ７およびタンパク質ＦｕｃＴ７のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【００６４】
図８は、移動相ブタノール／アセトン／酢酸／水（３５／３５／７／２３）およびジフェニル−アミンアニリン染色溶液（メタノール中、２％ジフェニルアミン、２％アニリン、１０％リン酸）による薄層クロマトグラフィーを用いたＢｉｏＧｅｌ  Ｐ−２ゲル浸透クロマトグラフィーを介した３−フコシルラクトース精製の分析を示す。
【００６５】
図９は、ＨＰＬＣクロマトグラム；溶出液として水を用いたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｒｅｚｅｘ  ＲＣＭ  Ｃａ２＋カラムによる分離（８０℃で３０分間、０．６ｍＬ／分）および屈折率検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）による検出（Ａ）；およびＨＰＬＣクロマトグラム；溶出液として５０ｍＭ  ＮａＯＨを用いたＤｉｏｎｅｘ  ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラムによる分離（３０℃で３０分間、１ｍｌ／分）および電気化学検出器ＤＥＣＡＤＥ  ＩＩ（Ａｎｔｅｃ  Ｌｅｙｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）による検出（Ｂ）を示す。
【実施例】
【００６６】
（実施例）
【００６７】
遺伝子のクローニング
【００６８】
フコシルトランスフェラーゼＡｍｕｃ０７６０をコードする遺伝子は、最適化されたコドンであり、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（ＵＳＡ）により合成された。Ｇａｔｅｗａｙ−Ｃｌｏｎｉｎｇ（５’−配列：ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＡＣＣ（配列番号７）、３’−配列：ＴＡＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＣＣＣＣ（配列番号８））に対するａｔｔＢ−部位をコードする２つのフランキング配列を用いて、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってこれをｐＵＣ５７にクローニングした。供給者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により提供される説明書に従い、ベクター、ｐＤＥＳＴ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）へのＧａｔｅｗａｙ−転移（図３Ａ参照）を行った。プライマー、ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＣＡＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＡＡＡＣＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＧＣＴＴＴＣ（配列番号９）およびＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣ（配列番号１０）を用いて、ｐＵＣ５７−ａｍｕｃ０７６０ｃｏから、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付加Ａｍｕｃ０７６０ｃｏをコードするポリヌクレオチドを増幅させた。プライマー、ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣ（配列番号１１）およびＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣ（配列番号１２）を使用して、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加ａｍｕｃ０７６０ｃｏをコードするポリヌクレオチドをｐＵＣ５７−ａｍｕｃ０７６０ｃｏから増幅させた。
【００６９】
プライマー、ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＣＡＡＣＣＡＴＧＴＧＴＧＡＴＴＧＣＴＴＧＴＣＴＡＴＣＡＴＡＴＴＧ（配列番号１３）／ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＡＴＴＴＴＣＴＡＴＣＡＡＡＣＡＡＴＴＧＡＧＡＡＴＡＡＴＡＴＴＣ（配列番号１４）およびＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＣＡＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＧＡＴＧ（配列番号１５）／ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＡＴＡＴＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＴＡＧＴＴＣＧ（配列番号１６）をそれぞれ用いてバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＮＣＴＣ９３４３のゲノムＤＮＡから、フコシルトランスフェラーゼＦｕｃＴ６およびＦｕｃＴ７をコードする遺伝子を増幅させ、またＧａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＤＥＳＴ１４にクローニングした（図３Ｂおよび３Ｃ参照）。
【００７０】
フコシルトランスフェラーゼの発現
【００７１】
発現ベクター、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＫ）に、遺伝子ａｍｕｃ０７６０ｃｏ、ｆｕｃＴ６およびｆｕｃＴ７をさらにクローニングした。ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩでの制限消化と続くライゲーションを介したａｍｕｃ０７６０ｃｏのクローニングの場合、プライマー、ＡＧＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＡＡＡＣＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＧＣＴＴＴＣＴＧ（配列番号１７）およびＡＧＣＴＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＣＧＡＣＧＣＡＧＧＣＧＡＴＴＴＴＴＣ（配列番号１８）を使用し（制限部位に下線を付す。）、得られた産物をｐＡＣＹＣ−ａｍｕｃ０７６０ｃｏと呼んだ（図４Ａ参照）。プライマー、ＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＣＴＴＧＴＣＴＡＴＣＡＴＡＴＴＧ（配列番号１９）およびＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＴＣＴＡＴＣＡＡＡＣＡＡＴＴＧＡＧＡＡＴＡＡＴＡＴＴＣ（配列番号２０）（制限部位に下線を付す。）を用いてＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩを介してｆｕｃＴ６をクローニングし、ｐＡＣＹＣ−ｆｕｃＴ６を得て（図４Ｂ参照）、プライマー、ＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＧＡＴＧＴＧＧ（配列番号２１）およびＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＡＴＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＴＡＧＴＴＣＧＴＧ（配列番号２２）（制限部位に下線を付す。）を用いて、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩを介してｆｕｃＴ７をクローニングし、ｐＡＣＹＣ−ｆｕｃＴ７を得た（図４Ｃ参照）。
【００７２】
上述の適切なプラスミドを用いて、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０９（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｌａｃＺを形質転換した。接種用ループにより５ｍＬの２ＹＴ培地に接種し、３７℃で１８０ｒｐｍにて一晩培養した。一晩培養物から４００ｍＬの２ＹＴに４ｍＬを接種し、３７℃および１８０ｒｐｍでＯＤ６６０が０．５に到達するまで培養した。０．１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって発現を誘発し、２８℃で１８０ｒｐｍにて一晩培養を継続した。細胞を回収し、４ｖ／ｗの、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５＋５ｍＭ  ＭｇＣｌ2または、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（ＨｉｓＰｒｅｐ  ＦＦ  １６／１０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を介した精製に対して使用する場合は４ｖ／ｗ  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５＋５００ｍＭ  ＮａＣｌ＋３０ｍＭイミダゾールの何れかにおいて再懸濁した。細胞ペレットの重量の最大６倍までガラスビーズを添加し、途中で細胞懸濁液を氷上に５分間置きながら、細胞懸濁液を５分間、２回、ボルテックス処理した。破砕後、１５０００ｘｇで１０分間遠心することによって細胞残屑を除去した。得られた上清は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析またはＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦを介した精製に使用した。
【００７３】
ウエスタンブロットを介した検出
【００７４】
上述のように、Ｈｉｓタグ付加Ａｍｕｃ０７６０ｃｏを発現させた。粗製細胞抽出物から、１０％ＳＤＳゲル上で１０ｍｇのタンパク質を分離した。製造者により与えられる説明書に従い、Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔタンク（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＰＶＤＦ膜上にタンパク質をブロットした。販売者により提供される説明書に従い、Ｈｉｓ−Ｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＫ）を用いて、ブロット上でＨｉｓタグ付加Ａｍｕｃ０７６０ｃｏを検出した（図２参照）。
【００７５】
フコシル化化合物の生成
【００７６】
適切なフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を保有するｐＡＣＹＣを用いて、細胞Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｌａｃＺ  ｐＤＥＳＴ１４−ｆｋｐ  ｐＣＯＬＡ−ｌａｃＹ−ｆｕｃＰを形質転換した。適切な抗生物質を用いて２ＹＴプレート上でコロニーを培養した。各株５ｍＬで一晩培養（抗生物質入りの２ＹＴ）を行い、この培養物から、それぞれ３０ｍＬ無機培地に１％になるように接種した。炭素源としてグリセロールを用いて細胞を培養し、ＯＤ６００＝０．２で０．１ｍＭ  ＩＰＴＧにより誘導し、２０ｍＭラクトースおよび２０ｍＭフコースを添加した。ＴＬＣおよびＨＰＬＣ分析によって３−フコシルラクトースの生成を監視した。アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）からのＡｍｕｃ０７６０ｃｏならびにバクテロイド・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのＦｕｃＴ６およびＦｕｃＴ７の発現に対する、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）からのＦｕｔＡの発現によって生成される３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）の量の比較を次の表１で示す。
【００７７】
【表１】
2013541952.tif 000003
【００７８】
表１から見ることができるように、フコシル化産物３−フコシルラクトースの量は、本発明によるα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ、すなわちアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）からのＡｍｕｃ０７６０ｃｏおよびバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのＦｕｃＴ６およびＦｕｃＴ７を用いた場合、従来技術であるヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）からのα−１，３−フコシルトランスフェラーゼＦｕｔＡと比較して、顕著に多かった。
【００７９】
フコシル化生成物の精製
【００８０】
いくつかの段階で、上述のように生成させた３−フコシルラクトースを精製した。最初の段階は、活性炭上での吸着による精製であった。生成段階からの培養上清を活性炭ベッドに載せた。フロースルーを回収し、分析したが、３−フコシルラクトースの残存は検出されなかった。例えば塩およびアミノ酸などの非特異的結合中間化合物の除去のために、蒸留水でベッドを洗浄した（フロースルー中に３−ＦＬなし）。次いで、３−ＦＬおよび残存ラクトースおよびフコースを９６％エタノールで溶出させた。続いて、ロータリーエバポレーター中でエタノールを蒸発させ、１０ｋＤａクロスフロー型モジュール（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ  Ｎａｄｉｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を介して残渣をろ過した。電気透析により残存塩を除去し、その後、クロスフロー型モジュール（Ｐａｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてろ過によってエンドトキシンを除去した。次に、フリット付きの５２０ｍｍｘ４２８ｍｍガラスカラムに充填されたゲル浸透クロマトグラフィー材料Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ−２（ＢｉｏＲａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、グラムスケールでラクトースおよびフコースから３−ＦＬを分離した。薄層クロマトグラフィーによって３−ＦＬの精製を監視した（図８参照）。３−フコシルラクトースのみを含有する分画をプールし、凍結乾燥させた。
【００８１】
生成物の特性確認
【００８２】
１Ｈ−ＮＭＲおよび質量分析によって、本発明で与えられるフコシルトランスフェラーゼを用いて生成させた精製３−フコシルラクトースを分析した。得られたスペクトルは、３−ＦＬに対して予想されるスペクトルと一致した。それに加えて、得られた３−ＦＬの特性を検証するために、異なるＨＰＬＣ法を適用した。一方の方法は、溶出液として水を用いたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｒｅｚｅｘ  ＲＣＭ  Ｃａ２＋カラムを使用した分離（８０℃にて３０分間、０．６ｍＬ／分）および屈折率検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）による検出であった（図９Ａ参照）。他方の方法は、溶出液として５０ｍＭ  ＮａＯＨを用いたＤｉｏｎｅｘ  ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラムを介した分離（３０℃で３５分間、１ｍＬ／分）および電気化学検出器ＤＥＣＡＤＥ  ＩＩ（Ａｎｔｅｃ  Ｌｅｙｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）による検出であった（図９Ｂ参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年4月3日(2013.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）添付の配列リストの配列番号１、３または５；ｂ）配列番号１、３または５に相補的な核酸配列；ｃ）ａ）およびｂ）で定められる核酸配列またはそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列であってα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含むベクターであって、該ベクターで形質転換された宿主細胞により認識される配列を制御するために該核酸配列が操作可能に連結されている、ベクター。
【請求項２】
請求項１に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項３】
宿主細胞が、酵母を含む真菌、細菌、昆虫、動物および植物細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
宿主細胞が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞であることを特徴とする、請求項２または３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、個々の細胞のコドン使用に適応させられていることを特徴とする、請求項２から４の１項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、且つａ）添付の配列リストの配列番号１、３または５；ｂ）配列番号１、３または５に相補的な核酸配列；ｃ）ａ）およびｂ）で定められる核酸配列またはそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチドの、又は請求項１に記載のベクターの、又は（ａ）配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列；ｂ）配列番号１、３または５で示される核酸分子の逆鎖にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる、配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体の、アミノ酸配列；ｃ）配列番号１、３または５で示される核酸分子の逆鎖にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる、配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列のオルソログの、アミノ酸配列；および（ｄ）少なくとも１０連続アミノ酸を含む、配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列の断片からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの、フコシル化オリゴ糖の生成のための使用。
【請求項７】
前記フコシル化オリゴ糖の生成が、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドの異種または同種発現により行われることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
生成されるフコシル化オリゴ糖が３−フコシルラクトースであることを特徴とする、請求項６または７に記載の使用。
【請求項９】
ａ．（ａ）配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列；ｂ）配列番号１、３または５で示される核酸分子の逆鎖にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる、配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体の、アミノ酸配列；ｃ）配列番号１、３または５で示される核酸分子の逆鎖にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸分子によりコードされる、配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列のオルソログの、アミノ酸配列；および（ｄ）少なくとも１０連続アミノ酸を含む、配列番号２、４または６で示されるアミノ酸配列の断片からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性があるポリペプチドを提供し、
ｂ．該ポリペプチドが、ドナー基質からアクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒し、それによりフコシル化オリゴ糖が生成する条件下で、フコース残基を含むドナー基質と、単糖またはオリゴ糖を含むアクセプター基質と、を含む混合物と、段階ａのα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性があるポリペプチドを接触させる段階を含む、フコシル化オリゴ糖を生成させるための方法。
【請求項１０】
ａ．フコシル化オリゴ糖の生成可能なおよびα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現可能な適切な栄養条件下で、請求項５から８に記載のような宿主細胞を培養し；
ｂ．段階ａと同時にまたは連続して、フコース残基を含むドナー基質と、単糖もしくはオリゴ糖を含むアクセプター基質と、を提供して、該α−１，３−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドが該ドナー基質から該アクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒し、それにより、フコシル化オリゴ糖を生成させるようにし；
ｃ．該宿主細胞またはその増殖培地から、前記フコシル化オリゴ糖を単離する段階を含む、フコシル化オリゴ糖を生成させるための方法。
【請求項１１】
ドナー基質がＧＤＰ−フコースであることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
該ＧＤＰ−フコースが、該宿主細胞で同時発現される酵素によるかまたは該宿主細胞の代謝により提供されることを特徴とする、請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該アクセプター基質が、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルラクトサミン、ガラクトース、フコース、シアル酸、グルコース、ラクトース又はこれらのあらゆる組み合わせであることを特徴とする、請求項９から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
生成されるフコシル化オリゴ糖がヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）である、請求項７または６に記載の使用、または請求項９から１３のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
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