(57)【要約】【課題】創傷治癒及び幹細胞増殖の両方のため、成長因子が豊富なヒト血小板抽出物（ＰＧＦ）に対する関心が高まっている。【解決方法】本発明は、ウイルス不活化成長因子を含有する、且つＰＤＧＦ及びＶＥＧＦ枯渇の血小板ライセートに関し、好ましくは、該血小板ライセートが、ＴＧＦ、ＩＧＦ及びＥＧＦに富んでいる。本発明は、このような血小板ライセートを得るための方法に関し、該方法が、出発血小板濃厚液を溶媒及び／又は界面活性剤と接触させるステップと、該出発血小板濃厚液を該溶媒及び／又は界面活性剤で少なくとも５分間から６時間の期間に、約６．０〜約９．０の範囲内に維持されているｐＨで、２°Ｃ〜５０°Ｃの範囲内の温度で培養するステップ、水性タンパク質相を得るためにオイル抽出によって溶媒及び／又は界面活性剤を選択的に除去するステップ、炭を用いて、溶媒及び／又は界面活性剤で処理した血小板濃厚液、又は水性タンパク質相を培養するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス不活化成長因子を含有する、且つＰＤＧＦ及びＶＥＧＦ枯渇の血小板ライセート。
【請求項２】
成長因子ＴＧＦ−β、ＩＧＦ及びＥＧＦを含有する請求項１記載のウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセート。
【請求項３】
ＰＤＧＦ−ＡＢのレベルは、前記ライセートの１０ｎｇ／ｍｌより低く、より好ましくは前記ライセートの５ｎｇ／ｍｌより低く、より好ましくは前記ライセートの３ｎｇ／ｍｌより低い、及び／又は、
ＶＥＧＦのレベルは、前記ライセートの０．１ｎｇ／ｍｌより低く、より好ましくは、前記ライセートの０．０１ｎｇ／ｍｌより低く、及び／又は
ＴＧＦ−のレベルは、前記ライセートの５０ｎｇ／ｍｌより高く、より好ましくは、前記ライセートの１００ｎｇ／ｍｌより高く、より好ましくは、前記ライセートの１５０ｎｇ／ｍｌより高く、より好ましくは、前記ライセートの２００ｎｇ／ｍｌより高い、より好ましくは、前記ライセートの２５０ｎｇ／ｍｌより高い。
ＥＧＦのレベルは、前記ライセートの０．５ｎｇ／ｍｌより高い、より好ましくは、前記ライセートの１ｎｇ／ｍｌより高い、より好ましくは、前記ライセートの１．５ｎｇ／ｍｌより高い、より好ましくは、前記ライセートの２ｎｇ／ｍｌより高い、より好ましくは、前記ライセートの２．５ｎｇ／ｍｌより高い、及び／又は
ＩＧＦのレベルは、前記ライセートの２０ｎｇ／ｍｌより高い、より好ましくは、前記ライセートの５０ｎｇ／ｍｌより高い、より好ましくは、前記ライセートの１００ｎｇ／ｍｌより高い、
請求項１又は２記載のウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセート。
【請求項４】
ａ）出発血小板濃厚液を溶媒及び／又は界面活性剤と接触させるステップ、
ｂ）前記出発血小板濃厚液を、前記溶媒及び／又は界面活性剤で培養するステップ、
−期間が少なくとも５分から６時間で、
−ｐHが約６．０〜約９．０の範囲に維持され、
−温度が２°Ｃ〜５０°Ｃの範囲内で、
ｃ）オイル抽出によって前記溶媒及び／又は界面活性剤を選択的に除去し、水性タンパク質相を得るステップ、及び
ｄ）炭を用いて、ステップｂ）の前記溶媒及び／又は界面活性剤処理した血小板濃厚液を培養する、又はステップｃ）の前記水性タンパク質相を培養するステップ
を含む、ウイルス不活化成長因子を含有する、且つＰＤＧＦ及びＶＥＧＦ枯渇の血小板ライセートを製造する方法。
【請求項５】
前記溶媒は、ジアルキルホスフェート又はトリアルキルホスフェート、異なるアルキル鎖を有するジアルキルホスフェート又はトリアルキルホスフェートからなる群から選択され、好ましくは、トリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴｎＢＰ）である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記界面活性剤は、脂肪酸のポリオキシエチレン誘導体、ソルビトール無水物の部分エステル、非イオン性界面活性剤、デオキシコール酸ナトリウム及びスルホベタインからなる群から選択され、好ましくは、ＴｒｉｔｏｎＸ−４５、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、又はＴｗｅｅｎ８０である請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
ステップｂ）における前記溶媒及び／又は前記界面活性剤のそれぞれの濃度は、前記出発血小板濃厚液の体積に対して、０．２〜５体積％である請求項４乃至６の何れか１つ記載の方法。
【請求項８】
得られたウイルス不活化成長因子血小板ライセートは請求項１乃至３の何れか１つ記載のウイルス不活化成長因子血小板ライセートである、請求項４乃至７の何れか１つ記載の方法。
【請求項９】
オイル抽出は医薬品グレードのオイルを用いて行われ、血小板濃厚液と溶媒及び／又は界面活性剤との混合物の重量に基づき、前記オイルを２〜２０重量％、又は５〜１５重量％、又は５〜１０重量％の量で使用される、請求項４乃至８の何れか１つ記載の方法。
【請求項１０】
ステップｃ）の前記オイル抽出が行われる場合、ステップｃ）の前記水性タンパク質相に対して炭抽出が行われ、炭が、前記水性タンパク質相の５０〜２５０ｇ／ｌ、好ましくは５５〜２００ｇ／ｌ、又は６０〜１５０ｇ／ｌ、又は６５〜１００ｇ／ｌの量で使用され、及び
オイル抽出が行わない場合、ステップｂ）の前記溶媒及び／又は界面活性剤で処理した血小板濃厚液に抽出が行われ、炭が、前記水性タンパク質相の２５０〜１２５０ｇ／ｌ、好ましくは２７５〜１０００ｇ／ｌ、又は３００〜７５０ｇ／ｌ、又は３２５〜５００ｇ／ｌの量で使用される、
請求項４乃至９の何れか１つ記載の方法。
【請求項１１】
前記活性炭は、活性炭の１００〜５５０ｇ／ｍ２、好ましくは３００〜５００ｇ／ｍ２、又は１００〜３００ｇ／ｍ２の範囲内のメチレンブルーを吸着する請求項４乃至１０の何れか１つ記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップｃ）のオイル抽出後、及び／又はステップｄ）の炭を用いる培養の後に、少なくとも一つの遠心分離ステップをさらに含む請求項４乃至１１の何れか１つ記載の方法。
【請求項１３】
クロマトグラフィー精製及び／又は限外濾過、及び／又はナノろ過のステップｅ）をさらに含む請求項４乃至１２の何れか１つ記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップａ）の前に、出発血小板濃厚液を製造する予備ステップをさらに含み、好ましくは全血からのアフェレーシス又はバフィーコート分離によって製造される請求項４乃至１３の何れか１つ記載の方法。
【請求項１５】
ステップａ）の前記出発血小板濃厚液は、プール血小板濃厚液から得られる請求項４乃至１４の何れか１つ記載の方法。
【請求項１６】
請求項４乃至１５の何れか１つ記載の方法によって得られるウイルス不活化成長因子を含有する、且つＰＤＧＦ及びＶＥＧＦ枯渇の血小板ライセート、又は請求項１乃至３の何れか１つ記載のウイルス不活化成長因子を含有する、且つＰＤＧＦ及びＶＥＧＦ枯渇の血小板ライセートは、化粧品のための使用、骨再生又は再建を促進するための使用、又は骨折した骨を治療するための使用。
【請求項１７】
請求項４乃至１５の何れか１つ記載の方法によって得られるウイルス不活化成長因子を含有する、且つＰＤＧＦ及びＶＥＧＦ枯渇の血小板ライセート、又は請求項１乃至３の何れか１つ記載のウイルス不活化成長因子を含有する、且つＰＤＧＦ及びＶＥＧＦ枯渇の血小板ライセートは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞培養のための使用、好ましくは、幹細胞の骨芽細胞系及び／又は軟骨細胞への分化を促進するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板誘導体の分野、より具体的には、ヒト又は動物由来の血小板から得られた成長因子濃縮物の分野に関する。本発明はまた、このような成長因子含有血小板ライセ−トを製造する方法、またそれらを試験管内（in vitro）で、生体外（ex vivo）での細胞培養（例えば、幹細胞の増殖と分化）への使用、化粧品用途又は臨床用途、例えば骨移植との組み合わせに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオミクス解析によって証明されたように、ヒトの血小板は、重要な生理機能を発揮する無数の分子を含んでおり、そのうち成長因子（GF）は特に重要である。血小板α顆粒内に蓄積するこれらの成長因子は、主に3つの血小板由来成長因子イソ型（PDGF−AA、−AB、及び−BB）、血管内皮成長因子（VEGF）、形質転換成長因子−β（TGF
−β1及びTGF−β2）、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、及び一部のインスリン様成長因子（IGF）を含む。このような成長因子の治療的利益によれば、複雑なヒト血小板成長因子の混合物は、トロンビンによる血小板含有血漿の活性化に起因する単一ドナ−血小板ゲルの生体材料の形で治療用途のために既に使用されている。
【０００３】
血小板活性化は、一般的にその中に含まれる成長因子の放出、及びそれらの、フィブリンにフィブリノ−ゲンの同時トロンビン誘発変換によって得られたゲルマトリックス内の捕捉につながる。この生体材料は、一般的に、単独、又は移植片の材料と組み合わせて、組織に適用される。成長因子含有血小板ゲルは、それ故にソフト及びハ−ドの組織の治癒と再生を促進する再生医療で使用されている。血小板から得られた成長因子濃縮物は、in vitro又はex vivoでの細胞培養のための培養基を補充するために使用される。最近では、間葉又は造血幹細胞のex vivo増殖(expansion)のためのウシ胎児血清（FBS）の代替品として、ヒト成長因子が豊富な血小板放出物 （platelet
releasates）を使用する可能性が実証されている。
【０００４】
成長因子が豊富な血小板放出物の、幹細胞を増殖するための使用は、特に注目されており、より具体的には、ウシ胎児血清（FBS）又はウシ胎子血清（FCS）の代替品として、新興の「ユニバ−サルな」細胞として考慮される間葉系幹細胞（MCS）（又は造血幹細胞）を増殖するために特に注目されている。ウシ胎児血清（FBS）又はウシ胎子血清（FCS）がプリオン及びウイルス感染の可能な発生源だけでなく、牛や子牛の血清中に残存ウシタンパク質及び抗原に起因する患者における免疫学的問題の原因として考えられる。
【０００５】
新しいアプロ−チは、最近、従来の発現系における組換え血小板成長因子の製造が開発された。例えば、一部の組換えヒト個体（Rh）成長因子(individual human growth factor)は、治療用途のために使用されている。遺伝子組み換え酵母により発現されるRh−PDGF−BBは、臨床効果を達成するためにこの単一の成長因子の大量投与及び数週間の応用が必要だと示されているが、慢性神経障害性下肢糖尿病性潰瘍の治療のため、特に一部の国で認可されている。同様に、TGF−βス−パ−ファミリ−に属するRh−骨形成タンパク質（BMP） − 2 及び− 7、チャイニ−ズハムスタ−卵巣細胞から製造することができ、一部の骨折手術を癒すためにライセンスされている。ただし、使用可能な組換え成長因子の数は、一つには、これらの成長因子を単離、同定、クロ−ン及び発現が困難であるため、非常に限られているままである。さらに、成長因子の組み合わせの有益な相乗効果が、一部の利用法で達成できるため、血小板由来製剤は、依然として、単一の組換え因子を使用するよりも優れている。
【０００６】
それにもかかわらず、成長因子PDGF及びVEGFが細胞の異常増殖及び/又は分化に直接リンクされていることが示されている（例えば非特許文献１、非特許文献２、及び非特許文献３を参照）。これらの2つの成長因子のそれぞれを用いて治療する際に、癌になりやすくなったため、特にこれらの患者に癌のリスクがあると知られている場合、PDGF及びVEGFを、幹細胞を培養する又は患者を治癒するために用いることは避けられるべきである。
【０００７】
したがって、無ウイルス（virally−safe）としてよく特徴付けられた工業的な成長因子製剤の製造、より具体的には、PDGF及びVEGF枯渇の製剤を可能にする、人間の血小板材料（platelet material）の加工方法を開発する必要がある。
【０００８】
特許文献１は、ヒト血小板の濃縮物が溶媒及び界面活性剤の組み合わせ（S/D）による処理を受けることができ、以下の二重目的：（a）脂質エンベロ−プウイルスの不活化と、（b）血小板α顆粒から成長因子の大規模な放出とを達成することを開示している。次いで、PDGF−AB、−BB、及び−AA、TGF−β、EGF、VEGF及びインスリン様成長因子−β1（IGF−β1）を含む標準化された複雑な血小板成長因子の混合物を、S/D処理、オイル抽出及び疎水性相互作用クロマトグラフィ−（HIC）を組み合わせることによって得ることができる。そのうち、オイル抽出及びHICがPGFとタンパク質含有量に大幅に影響を与えることなく、S/D剤を除去するために使用された。得られた血小板成長因子製剤はin vitroで種々の細胞株を刺激することが示され、リポ吸引した脂肪組織由来の幹細胞の拡張が促進された。また、特許文献１は、HICの代わりに、SP−セファロ−ス陽イオン交換カラムにより、精製したPDGF−VEGFの留分（fraction）の製造を可能にすることを開示している。このアプロ−チでは、PDGF及びVEGFは確かにカラムに吸着されるが、TGF−β、EGF、IGFはウイルス不活化ステップに使用されるS/D剤と共に、画期的に発見された。一方、特許文献１は、DEAE−セファロ−ス−陰イオン交換体でHICを代替することによって、TGF−β及びEGFをある程度まで精製することが可能であることを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特願WO2009/087560
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】「Nature Medicine」、Ferrara et al.、vol. 9、no. 6、2003、669〜676頁
【非特許文献２】EMA/92326/2010、European Medical Agency、2010/2/18
【非特許文献３】「an ongoing safety review of regranex (becaplermin)」、the communicationof the FDA、2008/3/27
【非特許文献４】EL−Ekiabyら、「Solvent−detergentfiltered (S/D−F) fresh frozen plasma and cryoprecipita」、Transfusion medicine、2010、20、48〜61
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
EL−Ekiabyらによる出版物において（非特許文献４）、著者は、輸血用血漿のシングレット又はミニプ−ル及びクリオプレシピテ−トのウイルス不活化処理のために適用されるプロセスを開示し、主なステップとして、TnBP及びTritonX−45の混合物を用いて、新鮮凍結血漿（FFP）、又はクリオプア−血漿（CPP）、又はクリオプレシピテ−トに対するS/D処理、S/D処理した血漿材料のオイル抽出、及び活性炭を含むS/D吸着フィルタ−を通して、オイル抽出した血漿材料のフィルタリングを含む。この出版物で議論されたように、開示された方法は、特に血漿タンパク質の機能活性（例えば、凝固因子など）を保持し、VWFマルチマ−の組成を変化させず、TnBP及びTritonX−45を許容レベルに下回って減少させ、重力によって得られた精製血漿の滅菌濾過を可能にする。この出版物は、それにもかかわらず、もっぱら血漿材料精製に向け、したがって、血小板濃厚液から成長因子を精製するために用いられる方法を開示又は示唆さえしていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
驚いたことに、本発明者らは、集中的な研究の後に、血小板濃厚液のS/D処理、オイル抽出及び炭抽出、又は炭抽出のみを含むステップが、ウイルス不活化の成長因子を含む且つPDGF及びVEGFの両方に枯渇している血小板ライセ−トの簡単、迅速かつ効率的な準備を可能にすることを発見した。前記溶媒及び界面活性剤の濃度は、S/D処理非経口の血液由来の治療用製品に関する規制当局によって承認された制限値を満たしている。
【００１３】
特に、本発明の方法は、主要なタンパク質、例えばアルブミン及び免疫グロブリンの含有量を変更せず、且つ基本的に、例えばTGF−β1、EGF及びIGFなどのPDGF及びVEGF以外の成長因子の濃度に影響しない。
【００１４】
さらに、本発明の方法は、脂質膜の溶解を可能にし、よって、脂質エンベロ−プウイルス、及び他の病原体、例えば、細菌及び寄生虫、例えば原生動物（protozoae）を不活化するとともに、出発血小板濃厚液内に存在する血漿及び血小板脂質を除去する。従って、本発明の方法は、治療法、細胞治療又は細胞培養に使用するための効率的に標準化できるウイルス不活化血小板由来成長因子の混合物を提供することが示される。
【００１５】
最後に、臨床的に数量的又は機能的な血小板減少症の矯正のために静脈内使用時に、一部は細菌汚染及び止血機能活性の喪失のリスクのために、血小板が通常、限られた5日又は7日の保存期限を持っている事実を考えると、通常、5日又は7日以上経過した大量の血小板は、毎年廃棄される。期限切れの血小板ストックを血小板由来濃縮物の製造のために使用できるようにすることで、本発明の方法は、最終的に非常に有望な経済的利害関係を示す。
【００１６】
本発明の目的は、ウイルス不活化成長因子を含有する且つPDGF及びVEGF枯渇の血小板ライセ−トを製造するための方法を提供する。該方法は、出発血小板濃厚液を溶媒及び/又は界面活性剤と接触させるステップ、該出発血小板濃厚液を該溶媒及び/又は界面活性剤で少なくとも5分間から6時間の期間に、約6.0〜約9.0の範囲内に維持されているpHで、2°C〜50°Cの範囲内の温度で、好ましくは25℃〜40℃の範囲で培養するステップ、水性タンパク質相を得るためにオイル抽出によって溶媒及び/又は界面活性剤を除去するステップ、炭を用いて該水性タンパク質相を培養し、又は溶媒及び/又は除去することにより、炭のみで溶媒及び/又は界面活性剤で処理した血小板濃厚液を培養することによって溶媒及び/又は界面活性剤を除去するステップを含む。
【００１７】
好ましい実施形態において、本発明の方法で使用される溶媒は、異なるアルキル鎖を有するジアルキルホスフェ−ト又はトリアルキルホスフェ−ト（trialkyl  phosphates）からなる群から選択され、好ましくは、トリ−n−ブチルホスフェ−ト（TnNBP）である。
【００１８】
好ましい実施形態において、本発明の方法で使用される界面活性剤は脂肪酸のポリオキシエチレン誘導体、ソルビト−ル無水物の部分エステル、非イオン性界面活性剤、デオキシコ−ル酸ナトリウム及びスルホベタインからなる群から選択され、より好ましくは、TritonX−45、TritonX−100、Tween 80及びTween
20により構成される群から選択される。
【００１９】
好ましい実施形態では、溶媒/界面活性剤を用いて血小板濃厚液を培養する培養ステップ間に該溶媒及び/又は該界面活性剤のそれぞれの濃度は、前記出発血小板濃厚液の体積に対して、0.2〜5体積％であり、好ましくは0.2〜2体積で％である。本発明の方法の好ましい実施形態では、出発血小板濃厚液は、血小板濃厚液の体積に基づいて、2％のTnBPのみ、又は1％のTnBP及び1％のTritonX−45に接触する。
【００２０】
また、本発明の好ましい実施形態では、オイル抽出は医薬品グレ−ドのオイルを用いて行われ、溶媒及び/又は界面活性剤と血小板濃厚液の混合物の重量に基づき、オイルを2〜20重量％、又は5〜15重量％、又は5〜10重量％の量で使用されている。
【００２１】
好ましい実施形態では、オイル抽出が活性炭を用いる培養の前に行われる場合、活性炭は、オイル抽出後に回収された水性タンパク質相の50〜250g/l、好ましくは55〜200g/l、又は60〜150g/l、又は65〜100g/lの量で使用されている。
【００２２】
他の実施形態では、活性炭を用いる培養の前にオイル抽出が行われていない場合、活性炭を、一度溶媒及び/又は界面活性剤で処理した血小板濃厚液の250〜1250g/l、好ましくは275〜1000g/l、又は300〜750g/l、又は325〜500g/lの量で使用されている。
【００２３】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、オイル抽出後及び/又は炭を用いて培養後の遠心分離の追加ステップを含む。
【００２４】
本発明の方法は、得られた血小板ライセ−トを、クロマトグラフィ−処理する（chromatographying）、ナノろ過処理する（病原体の除去のため）、及び/又は限外ろ過処理することで構成される追加ステップを更に含む。
【００２５】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、出発血小板濃厚液を製造する予備ステップを含む。該出発血小板濃厚液は、全血からのアフェレ−シス（apheresis）又はバフィ−コ−ト分離によって製造され、新鮮、期限切れの保存液体、又は期限切れの凍結保存状態である。
【００２６】
本発明の別の目的は、ウイルス不活化成長因子を含有する、且つPDGF及びVEGF枯渇の血小板ライセ−ト、又は本発明の方法によって得られた、ウイルス不活化成長因子を含有する、且つPDGF及びVEGF枯渇の血小板ライセ−トである。
【００２７】
好ましい実施形態では、この血小板ライセ−トは、成長因子TGF−b、IGF及びEGFを含む。他の実施形態では、この血小板ライセ−トはさらにbFGFを含む。
【００２８】
好ましい実施形態では、本発明のウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トは、以下のものを含む。
PDGF−ABのレベルは上記ライセ−トの10ng/mlより低い、より好ましくは上記ライセ−トの5ng/mlより低い、より好ましくは上記ライセ−トの3ng/mlより低い、及び/又は、
VEGFのレベルは上記ライセ−トの0.1ng/mlより低い、より好ましくは、上記ライセ−トの0.01ng/mlより低い、及び/又は
TGF−bのレベルは、上記ライセ−トの50 ng/mlより高い、より好ましくは、上記ライセ−トの100ng/mlより高い、より好ましくは、上記ライセ−トの150ng/mlより高い、より好ましくは、上記ライセ−トの200ng/mlより高い、より好ましくは、上記ライセ−トの250ng/mlより高い。
EGFのレベルは、上記ライセ−トの0.5ng/mlより高い、より好ましくは、上記ライセ−トの1ng/mlより高い、より好ましくは、上記ライセ−トの1.5ng/mlより高い、より好ましくは、上記ライセ−トの2ng/mlより高い、より好ましくは、上記ライセ−トの2.5ng/mlより高い、及び/又は
IGF のレベルは、上記ライセ−トの20ng/mlより高い、より好ましくは、上記ライセ−トの50ng/mlより高い、より好ましくは、上記ライセ−トの100ng/mlより高い。
【００２９】
本発明の別の目的は、本発明の方法によって得られた、ウイルス不活化成長因子を含有する、且つPDGF及びVEGF枯渇の血小板ライセ−トの使用、又はウイルス不活化成長因子を含有する、且つPDGF及びVEGF枯渇の血小板ライセ−トを、骨再生又は再建を促進するための使用、又は骨折した骨を治療するための使用である。
【００３０】
本発明の別の目的は、本発明の方法によって得られた、ウイルス不活化成長因子を含有する、且つPDGF及びVEGF枯渇の血小板ライセ−トの使用、又は本発明のウイルス不活化成長因子を含有する、且つPDGF及びVEGF枯渇の血小板ライセ−トをin vitro又はex vivoでの細胞培養のための使用、好ましくは、幹細胞の増殖及び/又は分化を促進するための使用である。好ましい実施形態では、本発明の成長因子を含有する血小板ライセ−トを、幹細胞の骨芽細胞系及び/又は軟骨細胞への分化を促進するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１はTGF−β1にリッチ且つPDGF−AB及びVEGFに枯渇する成長因子混合物の製造プロセスを示す。
【図２】図２は、S/D−PC−O (a)、及び20mLのS/D−PC−O(すなわち、オイル抽出後に回収された水性タンパク質相)ごとに1.5g(b)、3g(c)、3.5g(d)、4g(e)の活性炭で処理後におけるPDGF−AB(A)、VEGF(B)、EGF(C)、IGF−1(D)、TGF−β1(E)の含有量を示す。
【図３】図３は非還元（A）及び還元（B）の条件下でのSDS−PAGE分析を示す。出発PC（レ−ン1）、溶媒−界面活性剤処理後及び一つのオイル抽出後（S/D−PC−O、2）、及び炭吸着後（S/D−PC−OC、3）。Novex鮮明な前染色タンパク質標識（Novex sharp pre−stained protein marker）(M)。a: フィブリノ−ゲン、b:IgG、c: アルブミン、d: フィブリノ−ゲン  サブユニット、e: IgG 重鎖; f: IgG 軽鎖。
【図４】図４は10%(v/v)FBS添加(a)、FBS未添加(b)、1%(c)、3%(d)、5%(e)及び10%(f)S/D−PC−OC添加のMEMで培養されたMG63(A)及びSIRC(B)ラインにおけるMTS増殖デ−タを示す。細胞生存率は培養の5日間後に測定した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の目的は、ウイルス不活化成長因子を含有する、且つPDGF及びVEGF枯渇の血小板ライセ−トを製造するための方法であり、出発血小板濃厚液を溶媒及び/又は界面活性剤と接触させるステップ、約6.0〜約9.0の範囲に維持されているpHで、2°C〜50°Cの範囲内の温度で、該溶媒及び/又は界面活性剤を用いて、該出発血小板濃厚液を少なくとも5分から６時間の期間で培養するステップ、水性タンパク質相を得るために、オイル抽出によって該溶媒及び/又は界面活性剤を除去するステップ、炭を用いて該水性タンパク質相を培養する、又は炭のみを用いて、溶媒及び/又は界面活性剤で処理した血小板濃厚液を培養することによって溶媒及び/又は界面活性剤を除去するステップを含む。
【００３３】
本発明において、「ウイルス不活性化」とは、成長因子を含有する血小板ライセ−トは、感染性ウイルスを実質的に含まない、より具体的には、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV、西ナイルウイルス（WNV）、TTウイルス、デング（熱）ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタイン・バ−ウイルス（EBV）、ヒトヘルペスウイルス−8（HHV−8）、サル泡沫状ウイルス（simian foamy virus）、重症急性呼吸器症候群ウイルス（SARSコロナウイルス）、H1NI及び他のインフルエンザウイルスなどの脂質エンベロ−プウイルスと共に、例えばレトロウイルス、肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、乳酸脱水素酵素ウイルス、ヘルペス群ウイルス、ラブドウイルス、白血病ウイルス、ミクソウイルス、アルファウイルス、アルボウイルス、パラミクソウイルス、アレナウイルス及びコロナウイルスなどのその他の脂質エンベロ−プを実質的に含まないことを意味する。「実質的に含まない」とは、血小板成長因子製剤は、少なくとも、ロバストなウイルスの除去ステップを特徴づけるために必要と規定されている、4log10（欧州医薬品審査庁（EMEA）の欧州医薬品委員会（CPMP）により、「Note for guidance on virus
validation studies」で規定される、基準PMP/ BWP/ 268/95）より大きいウイルスの不活化程度を有することを意味し、好ましくは、5log10より大きい、より好ましくは、6log10より大きい。したがって、脂質エンベロ−プウイルスによる血液媒介性感染症の患者への輸血のために責任を負うことはほとんどない。
【００３４】
本発明において、「PDGF及びVEGF枯渇の」とは、成長因子を含有する血小板ライセ−トは、PDGF（血小板由来成長因子）及びVEGF（血管内皮成長因子）を実質的に含まないことを意味する。
【００３５】
具体的な実施形態では、本発明に係るウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トにおけるPDGF−ABの濃度は、ライセ−トの10ng/mlより低い、好ましくはライセ−トの5ng/mlより低い、より好ましくは、ライセ−トの3ng/mlより低い。
【００３６】
具体的な実施形態では、本発明に係るウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トにおけるVEGFの濃度は、ライセ−トの0.1ng/ml より低い、好ましくは、ライセ−トの0.01ng/mlより低い。
【００３７】
本発明において、「活性炭」（activated charcoal）、「活性炭素」（activated carbon）又は「炭」は、非常に多孔質に加工された炭素の形態を意味する。よって、活性炭は、非常に大きな表面積を有しており、非常に重要な吸着能力を提供する。活性炭は、一般に、ナットシェル、泥炭、木材、コイア、亜炭、石炭及び石油ピッチなどの炭素質原料から製造される。それは物理的な再活性化（ガスを使用して前駆体を活性炭にする）と化学活性化（炭化前に、原料は例えば、酸、強塩基、又は塩などのある種の化学物質で含浸される）を含む様々な処理によって得ることができる。
【００３８】
活性炭はバルクとして使用することができ、又は市販のろ過カ−トリッジに充填することができる。
【００３９】
好ましい実施形態では、本発明に用いられる活性炭は、蒸気及び/又は化学的処理によって得られた粉末活性炭である。炭の多孔性は、ミクロ（<10nmの細孔径範囲）、メソ（10−25nmの細孔径範囲）又はマクロポア（>25nmの細孔径範囲）、又はそれらの組み合わせであることができる。異なるソ−ス及び処理の種類は、最終的に得られる多孔性の種類に影響を与える可能性がある。
【００４０】
好ましい実施形態では、活性炭のグレ−ド及び/又は多孔性は、溶媒、界面活性剤、PDGF及びVEGFを保持するのに適している。本発明の方法に適する活性炭は、様々な供給元、例えば、プレパック炭ろ過カ−トリッジの場合に、3M/CUNO（CUNOからの活性炭）及びポ−ル（活性炭AKS）に由来することができる。
【００４１】
3M/CUNOからの活性炭を使用する場合、（多孔性）グレ−ド5の活性炭が好ましい。また、溶媒、界面活性剤、PDGF及びVEGFの除去は、多孔性2、3、4よりもグレ−ド5の3M/CUNO活性炭の多孔性5がより効率的である。同様に、ポ−ルからの活性炭を使用する場合、AKSグレ−ド6は、溶媒、界面活性剤、PDGF及びVEGFのより良い除去を提供するため、AKS7及びAKS4より好ましい。
【００４２】
好ましい実施形態では、本発明の方法で用いる活性炭は、100〜550g/ｍ２の範囲のメチレンブル−を吸着することが可能であり、一つの実施形態では、300〜500g/ｍ２であり、又は別の実施形態では100〜300g/ｍ２（メチレンブル−が現在活性炭の吸着容量を測定するために標準物質を使用するである）。炭は処理される流体の粘度に応じて選択することもできるが、低粘度の液体（例えば20cp以下の粘度を有する）用に設計される炭が好ましい。
【００４３】
使用できる一つの特殊的な炭はCUNO R55であり、最初の5はろ過度（粘度にリンクしている）、二番目の5はカ−ボングレ−ドを示している。
【００４４】
「溶媒及び/又は界面活性剤を除去する」とは、ウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トにおける溶媒及び/又は界面活性剤のレベルが極めて低い、好ましくは、検出不可能であることを意味している。溶媒及び/又は界面活性剤の高濃度は長期毒性、特に神経学的疾患の発症に直接リンクされていることは、確かに当業者によく知られている（例えば、J.P.R. Pelletier、S. Transue、E.L. Snyder、「Pathogen inactivation
techniques」、Best Practice & Research Clinical
Haematology、Vol. 19、No. 1、205〜242頁、2006、を参照する）。
【００４５】
したがって、溶媒に関する「非常に低い」とは、本発明では、溶媒レベルが100ppm未満であり、好ましくは50ppm未満であり、好ましくは20ppm未満であり、より好ましくは10ppm未満であり、好ましくは5ppm未満であり、さらに好ましくは1ppm未満であることを意味する。
【００４６】
さらに、界面活性剤に関する「非常に低い」とは、本発明では、界面活性剤のレベルが、500ppm未満であり、好ましくは250ppm未満であり、より好ましくは100ppm未満であり、より好ましくは50ppm未満であり、さらに好ましくは10ppm未満であることを意味する。
【００４７】
本発明に係る又は本発明の方法によって得られたウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トは、少なくとも以下の機能成長因子、すなわち、特にTGF−β1及び/又はTGF−β2を含むトランスフォ−ミング成長因子（TGF−β）ス−パ−ファミリ−、インスリン様成長因子（IGF）及び上皮成長因子（EGF）を含む。好ましい実施形態では、本発明の成長因子を含有する血小板ライセ−トは、さらに塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を含む。
【００４８】
具体的な実施形態では、本発明に係るウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トにおけるTGF−β1の濃度は、少なくとも出発血小板濃厚液の濃度と類似しており、好ましくは、ライセ−トの50ng/mlより高い、好ましくは、ライセ−トの100ng/mlより高い、好ましくは、ライセ−トの150ng/ml より高い、好ましくは、ライセ−トの200ng/mlより高い、好ましくは、ライセ−トの250ng/mlより高い。
【００４９】
具体的な実施形態では、本発明に係るウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トにおけるIGFの濃度は、少なくとも出発血小板濃厚液の濃度と類似しており、好ましくはライセ−トの20ng/mlより高い、好ましくは、ライセ−トの50ng/mlより高い、好ましくは、ライセ−トの100ng/mlより高い。
【００５０】
具体的な実施形態では、本発明に係るウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トにおけるEGFの濃度は、ライセ−トの0.5ng/mlより高い、好ましくはライセ−トの1ng/mlより高い、好ましくはライセ−トの1.5ng/mlより高い、好ましくはライセ−トの2ng/mlより高い、好ましくは、ライセ−トの2.5ng/mlより高い。
【００５１】
具体的な実施形態では、本発明に係る又は本発明の方法によって得られたウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トは、血液細胞関連輸血反応につながるものではない。「血液細胞関連輸血反応」とは、このウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トが、インタクトな生細胞（例えば、赤血球、血小板、白血球など）を含有せず、そのため、患者における免疫学的な合併症（例えば同種免疫など）、及び溶血性合併症を含む様々な良く知られている輸血反応を回避することができる（「Platelet transfusions」、Stroncek et Rebulla、The Lancet、August 4、2007;
vol. 370: 427−438、を参照する）。確かに、免疫応答性である受血者は、大抵、ドナ−の血液細胞の抗原に対する免疫応答を示しており、それ故に、関与する血液細胞及び特異抗原に応じる様々な臨床結果をもたらす。最も一般的に関与する抗原は、次のカテゴリに選択される。すなわち、（1）HLAsクラスI、血小板及び白血球によって共有される、（2）HLAsクラスII、一部の白血球に存在している、（3）顆粒球特異抗原、（4）血小板特異抗原（例えば、ヒト血小板抗原HPAなど）、（5）赤血球特異抗原である。
【００５２】
具体的な実施形態では、本発明のウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トは、ABの血液型のドナ−から採取した血小板濃厚液から製造され、それによって抗A又は抗Bヘマグルチニンが含まれておらず、それによって特に受血者における潜在的な溶血反応を回避する。
【００５３】
別の具体的な実施形態では、本発明のウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トは、ドナ−と同じ血液型の患者に使用されるisoグル−プ血液ドナ−（例えばA型又はグル−プBドナ−）から採取した型付き血小板濃厚液から製造される。
【００５４】
より具体的には、本発明の製造方法に関しては、血液細胞（赤血球、白血球、血小板）が溶媒−界面活性剤処理によって破壊/溶解され、それによって、患者を外来抗原と無傷の血液細胞にさらすリスクを低減、好ましくは、防止する。本発明の方法は、それ故に、治療される患者自身から得られた血小板又は同種血小板（allogeneic platelets）のいずれかからウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トを準備することを可能にする。
【００５５】
別の実施形態では、本発明の方法によって得られたウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トは、さらに、例えば、IgG、IgM及び/又はIgAなどの免疫グロブリンを含む。
【００５６】
具体的な実施形態では、本発明に係るウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トにおける免疫グロブリンIgGの濃度は、好ましくは、ライセ−トの5g/Lより高く、好ましくは、ライセ−トの8g/L程度である。
【００５７】
別の実施形態では、本発明の方法によって得られたウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トは、例えばIgG、IgM及び/又はIgAなどの免疫グロブリンを除去するために、さらに、例えば、イオン交換クロマトグラフィ−などの追加の精製ステップに供することができる。
【００５８】
別の実施形態では、本発明に係る又は本発明の方法によって得られたウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トは、アルブミン、フィブリノ−ゲン及びプロトロンビンの少なくとも一つを含む。
【００５９】
具体的な実施形態では、本発明に係るウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トにおけるアルブミンの濃度は、好ましくは、ライセ−トの30g/Lより高い。
【００６０】
別の実施形態では、本発明に係る又は本発明の方法によって得られたウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トは、a1−アンチトリプシン、a2−抗プラスミン、a2−マクログロブリン、トランスフェリン、フィブロネクチン及びC1−INHをさらに含む。
【００６１】
好ましい実施形態では、本発明の方法で行われる、溶媒及び/又は界面活性剤を用いる血小板濃厚液の培養は、2〜4時間で、例えば、pHの範囲がpH
7.0からpH7.5（出発血小板は新鮮な血小板の場合）、又はpHの範囲がpH 6.8からpH 8.2（出発血小板は期限が切れており、及び/又は凍結血小板の場合）の生理的pHで行われる。有利には、培養温度は約31℃である。
【００６２】
本発明の方法に用いられる適切な溶媒しては、ジ−又はトリ−アルキルホスフェ−ト、例えば、トリ−（n−ブチル）ホスフェ−ト、トリ−（t−ブチル）ホスフェ−ト、トリ−（n−ヘキシル）ホスフェ−ト、トリ−（2−エチルヘキシル）ホスフェ−ト、トリ−（n−デシル）ホスフェ−ト、ジ−（n−ブチル）ホスフェ−ト、ジ−（t−ブチル）ホスフェ−ト、ジ−（n−ヘキシル）ホスフェ−ト、ジ−（2−エチルヘキシル）ホスフェ−ト、ジ−（n−デシル）ホスフェ−ト及び異なるアルキル鎖を有するジ−アルキルホスフェ−ト等である。特に好ましいトリ−アルキルホスフェ−トはトリ−（n−ブチル）ホスフェ−ト（TnBP）である。
【００６３】
本発明の方法に用いられる適切な界面活性剤は、脂肪酸のポリオキシエチレン誘導体、ソルビト−ル無水物の部分エステル、例えば商品名「Tween 80」であり、「ポリソルベ−ト80（polysorbate 80）」、「Tween 20」としても知られる製品、及び非イオン性界面活性剤、例えば、「TritonX−100」又は「TritonX−45」の商品名で販売されているオキシエチル化アルキルフェノ−ル等を含む。さらに考えられる界面活性剤は、例えば、N−ドデシル−N、N−ジメチル−2−アンモニオ−1−エタンスルホン酸塩等のデオキシコ−ル酸ナトリウム及びスルホベタインである。特に好ましい界面活性剤は、「TritonX−45」、「TritonX−100」、「Tween 80」及び「Tween
20」である。
【００６４】
本発明の具体的な実施形態では、出発血小板濃厚液は、溶媒及び界面活性剤、好ましくはTnBP及びTritonX−45で培養する。
【００６５】
有利に、溶媒又は界面活性剤の終末濃度、又は溶媒及び界面活性剤のそれぞれの終末濃度は、血小板濃厚液の体積に対して、体積で0.2〜5％の範囲、好ましくは0.2〜2％の範囲である。好ましい実施形態では、出発血小板濃厚液を2％TnBPで培養する。別の好ましい実施形態では、出発血小板濃厚液を1％TnBPと1％TritonX−45で培養する。
【００６６】
溶媒及び/又は界面活性剤は、医薬品グレ−ドのオイルでオイル抽出及び炭抽出、又は炭抽出のみによって、生体液から抽出できる。残りのライセ−トは溶媒及び/又は界面活性剤に枯渇している。
【００６７】
医薬品グレ−ドオイルは、例えば、植物又は動物から抽出された天然に存在する油、又は類似構造の合成化合物であることができる。適切な天然由来の油は、キャスタ−・オイル（別名ヒマシ油として知られている）、大豆油、ひまわり油、綿実油を含む。好ましい合成化合物は合成トリグリセリドである。適切な合成トリグリセリドの例としては、トリオレイン、トリステアリン、トリパルミチン、トリミリスチン及びそれらの組み合わせを含む。
【００６８】
医薬品グレ−ドオイルの量は、少なくとも80％の脂溶性のプロセスケミカルの抽出を可能にする量であり、使用されるオイルの量が、血小板濃厚液の重量に基づいて、2〜20重量％であり、好ましくは5〜15重量％であり、より好ましくは5〜10重量％である。
【００６９】
上述した炭が溶媒及び/又は界面活性剤粒子の吸着及び保持可能であれば、炭抽出は上述の活性炭のいずれかで行うことができる。炭抽出は、バッチで（すなわち、炭はオイル抽出後に回収された水性タンパク質相と混合される）又はカラムで（水性タンパク質相はその後、前置沈降炭（preably sedimented charcoal）を通過する）、又はプレパックコマ−シャル・カ−トリッジを介して行うことができる。好ましい実施形態では、炭抽出はバッチで行われる。
【００７０】
好ましい実施形態では、オイル抽出が活性炭を用いる培養の前に行われる場合、炭抽出は上記水性タンパク質相の50〜250g/l、好ましくは55〜200g/l、又は60〜150 g/l、又は65〜100 g/lの量の活性炭を用いて行われる。さらに好ましい実施形態では、炭抽出は、オイル抽出後に回収された水性タンパク質相の75g/lの量の活性炭を用いて行われる。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、活性炭を用いる培養の前にオイル抽出が行われていない場合、炭抽出は、溶媒及び/又は界面活性剤で処理した血小板濃厚液の250〜1250g/l 、好ましくは275〜1000
g/l、又は300〜750 g/l、又は325〜500 g/lの量の活性炭を用いて行われる。
【００７２】
好ましい実施形態では、オイル及び炭抽出後又は炭抽出のみの後の溶媒レベルは、100ppm未満であり、好ましくは50ppm未満であり、好ましくは20ppm未満であり、より好ましくは10ppm未満であり、5ppm未満であり、さらにより好ましくは1ppm未満である。
【００７３】
好ましい実施形態では、オイル及び炭抽出後又は炭抽出のみの後の界面活性剤のレベルは、500ppm未満であり、好ましくは250未満であり、より好ましくは100ppm未満であり、より好ましくは50ppm未満であり、さらに好ましくは、10ppm未満である。
【００７４】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、オイル抽出後又は炭での培養後に、少なくとも遠心分離の一つのステップを含んでもよい。好ましくは、オイル及び炭抽出、又は炭抽出のみの後に行われる遠心分離ステップは、細胞の破片を除去することを可能にする。有利には、遠心分離ステップは、10から30分間、800〜20000×gで、好ましくは15分間、10000×gで行われる。
【００７５】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、また、クロマトグラフィ−精製及び/又は限外濾過、及び/又はナノろ過、及び/又は滅菌濾過から選択される少なくとも一つの付加的なステップを含むことができる。
【００７６】
可能なクロマトグラフィ−精製は、その後、オイル及び炭抽出に続いて、又は炭抽出に続いて行われる。好ましくは、培養後、炭及びオイル抽出後に回収された水性タンパク質相の混合物、又は炭と、溶媒及び/又は界面活性剤とで処理した血小板濃厚液の混合物を遠心分離する。上清は収集され、特に混合物の成分を分画する、又は一部の成分を除去するクロマトグラフィ−担体上に積まれる。
【００７７】
使用できる適切なクロマトグラフィ−カラムは、逆相（疎水性相互作用）マトリックス、又は例えばイオン交換（陰イオン及び陽イオン）マトリックス及び親和性（例えば、免疫親和性又は固定化ヘパリン）マトリックスなどのタンパク質吸着マトリックス、又は分子篩マトリックスを含む。好ましい実施形態では、血小板ライセ−トに含まれる成長因子は、使用されるクロマトグラフィ−担体上に保持され、さらに適切な溶出緩衝液で溶出される。好ましくは、クロマトグラフ条件は、関心のある成長因子の安定性及び生理機能に適合するpHでクロマトグラフ分離/精製を実行可能にするように選択され、例えば、成長因子の変性を避けることができる、実質的に中性のpHにする。ロ−ディング、洗浄及び溶出条件は、当業者の一般的な知識に基づいて決定される。
【００７８】
オイル及び炭抽出、又は炭抽出のみによる溶媒及び/又は界面活性剤の除去に続いて、例えば、ナノろ過、より具体的に75−nm、35−nm、20−nm、15−nm、又は10−nmの細孔径のフィルタ−膜を用いるナノろ過によって、例えばパルボウイルスB19、又は場合により、A型肝炎ウイルス（HAV）などの非エンベロ−プ型ウイルスを不活性化又は除去する、さらなるステップを追加しても良い。
【００７９】
具体的な実施形態では、本発明の方法において、出発物質として使用される血小板濃厚液は、単一又はプ−ル標準血小板濃厚液、例えば輸血のために製造された血小板濃厚液に対応する。血小板濃厚液は、全血バフィ−コ−ト分離に由来してもよい。バフィ−コ−ト由来の血小板濃厚液の1単位は、通常30〜50mlに相当する。バフィ−コ−ト由来の血小板は、単一ユニットとして、又は例えば4〜6の単一ユニットのプ−ルに対応する治療ユニットの形式の単一ユニットのプ−ルとして使用することができる（「the Guide to the
preparation, use and quality assurance of blood components」13th
edition (2007), edited by the Council of Europe、を参照する）。
【００８０】
血小板濃厚液はアフェレ−シス、サイタフェレシス又は血小板フェレ−シス標準的な手法（例えば、「the Guide to the
preparation, use and quality assurance of blood components」13th
edition (2007), edited by the Council of Europe、を参照する）により得ることもでき、MCS +（Haemonetics）、Trimaアクセル又はCOBEスペクトル（Gambro）又はアミカス（Baxter）を使用して得ることができる。アフェレ−シス手法は、バフィ−コ−ト分離手法によって得られるものと比べ、一般的にドナ−ごとに大きな体積（300mlの血小板濃厚液に相当）を得る。
【００８１】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、出発血小板濃厚液を製造する予備ステップを含む。有利には、出発血小板濃厚液を製造する方法は、例えば、全血献血からアフェレ−シス又は血小板製剤などの標準的な血液銀行手法と、例えば血液細胞セ−バ−/セパレ−タ又はテ−ブルトップデバイスなどを使用するそれらのポイントオブケア手法を含むが、これらに限定されない。
【００８２】
本発明の方法において、出発物質として用いられる血小板濃厚液は、フレッシュ、すなわち採取後5又は7日間未満、期限切れ、すなわち採取後5又は7日間を超え、又は期限切れ且つ−20℃又はより低い温度に数週間凍結したもので良い。
【００８３】
具体的な実施形態において、本発明の方法用の、出発物質としての血小板濃厚液は、さらに白血球及び/又は赤血球を含んでもよい。出発血小板濃厚液は、よって、例えばリンパ球、好中球顆粒球、単球などのいくつかの分化した且つ非活性化の白血球を含んでもよい。好中球及び単球は、特に、次亜塩素酸と微生物及び菌類に対して毒性を持つ強力な殺菌酸化剤として作用する他の活性酸素誘導体とを生成するために塩化物の酸化を触媒するミエロペルオキシダ−ゼを含有する顆粒に富んでいる。
【００８４】
したがって、出発血小板濃厚液がいくつかの分化した且つ非活性化の白血球を含む場合、本発明の方法によって得られるウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トは、抗菌成分も、白血球由来の様々な成長因子もさらに含む。
【００８５】
具体的な実施形態では、白血球に含まれるプロテア−ゼ及び酸加水分解酵素の炎症誘発効果を回避するように、白血球は出発物質として用いる血小板濃厚液から取り除かれ、好ましくは白血球除去により取り除かれる。白血球除去は可能なプリオン汚染のリスクを軽減することもできる。
【００８６】
健常人の正常な血小板数は、一般的に血液の立方ミリメ−トルごとに15万から40万の血小板、すなわち150〜400×109血小板/Lである。この「正常」な血小板数は、健康な人の約95％にみられ、残りの5％は、統計的に異常な血小板数（非常に低い、又は非常に高い、いずれか一方）を持っている可能性がある。
【００８７】
血小板はアフェレ−シスによって採取される場合、250mlのバッグの血小板数が一般的にミリリットルごとに1.2×109血小板より高くなっており、それによって、バッグ（ユニット）ごとに約3×1011血小板より多い血小板数に対応する。
【００８８】
好ましい実施形態では、出発血小板濃厚液の血小板数は、通常血液中に発見される血小板数よりも3〜10倍高くなっている。
【００８９】
本発明に係る又は本発明の方法によって得られるウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トは、例えばコラ−ゲン、キトサン、セラミックなどで作られたそれらの人工的な足場と、又は血漿由来フィブリン接着剤あるいはフィブリンシ−ラントと、混合することができる。該血漿由来フィブリン接着剤あるいはフィブリンシ−ラントは、例えば治療目的に使用され、すなわち、ヒト及び/又は動物の病気を治療するため、薬理学的、免疫学的又は代謝的効果により、その生理的機能を復元、矯正又は改善するために、治癒的治療又は予防的治療のために使用される。
【００９０】
本発明に係る又は本発明の方法によって得られるウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トは、溶媒及び/又は界面活性剤の両方が除去され、且つウイルス安全であるため、ヒト及び/又は動物の病気を治療するために、及び/又はそれらの身体の浅部を接触させるために、特に適している。
【００９１】
追加の化合物を、ウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トに加えてもよい。該化合物は、化学療法剤、抗生物質及び/又はホルモンを含むが、これらに限定されない。
【００９２】
本発明の別の目的は、本発明に係る又は本発明の方法によって得られるウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トの治療への応用における使用と、in vitro又はex vivoでの細胞培養のための使用である。in vitro又はex vivoでの細胞培養に使用される場合、本発明に係る又は本発明の方法によって得られるウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トは、培養基の体積に対して、1％〜30％、好ましくは2％〜20％、より好ましくは3％〜10％の範囲内で培養基中に存在する。
【００９３】
本発明の別の目的は、本発明に係る又は本発明の方法によって得られるウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トを含む医薬及び/又は化粧品である。
【００９４】
「医薬品」とは、血小板ゲル、血小板接着剤、成長因子に富むフィブリン接着剤及び/又は封止剤、人工的な足場を意味する。
【００９５】
「化粧品」とは、外観を美化、保持、又は変更するため、又は皮膚、髪、爪、唇、目、あるいは歯のクレンジング、着色、コンディショニング、又は保護のために、人体に適用するいくつかの製剤のいずれかを意味する。
【００９６】
本発明の別の目的は、本発明に係る又は本発明の方法によって得られるウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トは、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、ケラチノサイト、幹細胞及び/又は移植細胞のin vitro又はex
vivoでの培養に適している培養基における使用である。本発明の別の目的は、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、ケラチノサイト、幹細胞及び/又は移植細胞のin vitro又はex
vivoでの培養に適し、且つ本発明に係る又は本発明の方法によって得られるウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トを含有する培養基である。
【００９７】
好ましい実施形態では、本発明のウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トの使用は、幹細胞、特に間葉系幹細胞（MSC）の増殖及び/又は分化を促進する。好ましい実施形態では、本発明のウイルス不活化成長因子を含有する血小板ライセ−トの使用は、幹細胞の骨芽細胞又は軟骨細胞系への分化を促進する。
【００９８】
本発明の別の目的は、本発明のウイルス不活化成長因子を含有する且つPDGF及びVEGF枯渇の血小板ライセ−トが、骨再建、骨再生又は創傷治癒を促進するための使用、ならびに化粧品のための使用である。
【００９９】
本発明の上記の及び他の目的、特徴及び利点は、添付の図面を参照し、以下の説明からより明らかになる。
【０１００】
実施例
I−材料及び方法
1−アフェレ−シス血小板採取
出発血小板濃厚液（PCs）は、MCS+複数コンポ−ネントシステム（Haemonetics、 Braintree、USA）を用いて、インフォ−ムドコンセントの後にボランティアドナ−から採取された。全血は、間欠流で、静脈カテ−テルを通して引き抜かれ、すぐにACD−A（citrate
dextrose solution Formula A）を用いて 1/9の割合で抗凝固処理した。血小板は連続遠心分離により赤血球と他の血液成分から分離され、血漿中に懸濁し、滅菌容器中に集められる。収集したPCの全量は225〜315 mLの体積範囲に達するまで分離サイクルは数回行われ、所定の血小板収率タ−ゲットが3.0×1011と等しい、又はより大きい。 PCは室温で低速混合下に保存され、採取の24〜72時間以内に処理された。
【０１０１】
2−細胞数
出発PCにおける赤血球、血小板、及び白血球の含有量は、セルカウンタ−（ABC Vet automatic blood
counter、ABX Diagnostics、Montpellier、France）を用いて測定した。
【０１０２】
3−出発血小板濃厚液の処理
a−研究デザイン
出発血小板濃厚液は、図1の研究デザインに従って処理した。
簡単に説明すると、PC（300mL）はビニ−ル袋に移され、EP
1685852に記載されているように処理された。血漿濃縮物は、1％（終末濃度）（v/v）のトリ−n−ブチルホスフェ−ト（TnBP、Merck KGaA、Darmstadt、Germany）と、1％（終末濃度）（v/v）のTritonX−45（Sigma、Missouri、USA）との組合せを用いて、室温（RT）で、穏やかに恒常的に攪拌（70rpm、FINEPCR、Seoul、Korea）する条件で、1時間培養した。
【０１０３】
10％（v/v、終末濃度）の大豆油（Sigma、Missouri、USA）は、その後添加され、まず30秒間激しく混合され、その後室温(RT)で、S/D処理されたPC（S/D−PC）を用いて70rpmで、15分間混合される。
【０１０４】
次に、クリアな油性相（上部）、不透明な相（中部）及びクリアな水性タンパク質相（下部）を分離するために、オイル/S/D−PC混合物を45分間デカントした。
【０１０５】
任意の細胞破片又は不溶性の物質をペレットするため、水性タンパク質相（約270mL）を重力によってバッグの底部から回収し、20〜25℃で、6000×gで10分間遠心分離により清澄化した。
【０１０６】
遠心分離後、上清（S/D−PC−O、約265mL）を、1.5 g/20 mLのS/D−PC−Oの比率に対応する活性炭（3M、St. Paul、MN、USA）19.9ｇを用いて、70 rpmで、RT（室温）で、30分間回収して混合した。炭をペレットし、且つクリアな上清（S/D−PC−OC）を回収するため、その後、混合物を（6000×gで、10分間、RTで）遠心分離した。サンプルは、プロセスに送られ、分析まで−80℃に凍結する。示されたデ−タは4又は5回の繰り返しによる平均数値である。
【０１０７】
4−炭比の影響
予備小規模実験は、TnBP及びTritonX−45を除去するために使用される炭の最適量を決定すると共に、GFとタンパク質含有量への影響を評価するために行われた。増加した量の炭（1.5〜4g）を、回転ミキサ−を用いて、RTで、70
rpm、S/D−PC−O（20mL）と30分間混合した。炭をペレットすると共に、評価まで−30℃に凍結したクリアな上清を回収するために、次いで、混合物を（6000×gで、10分間、RTで）遠心分離した。
【０１０８】
5−成長因子測定
手法の各段階で1mlのサンプルを採取した。血小板及び/又は細胞破片をペレットし、血小板由来成長因子測定用の無細胞上清を得るために、これらは、15分間、10000×gで（Microfuge（R）22R、Beckman Coulter、Fullerton、CA）遠心分離した。上清はその後すぐに− 80℃に凍結した。サンプルを37℃で解凍し、高感度で特別な市販のイムノ測定により1時間以内に測定した。スタンダ−ドとサンプルは、重複測定し、その平均値を算出した。結果は、サンプルに適用した希釈係数を掛けた。
【０１０９】
PDGF−AB、TGF−β1、EGF、VEGF及びIGF−1は、具体的に、Quantikineキット（R&D Systems、 Minneapolis、MN）を用いてELISA測定により測定された。
【０１１０】
a−PDGF−AB
PDGF−ABはQuantikine ELISAキット（＃.DHD00B、R&D Systems、Minneapolis、MN）を用いて測定した。サンプルはキャリブレ−タ希釈液（RD6−11）で100倍希釈した。プレ−トは、2時間培養して、洗浄し、室温でさらに3時間、酵素結合したPDGF−AB抗体を用いて培養した。洗浄バッファ−を用いてウェルを洗浄し、その後基質溶媒を室温で20〜30分間添加した。ウェルは光から保護された。停止液を各ウェルに添加し、450nmにおける吸収はマイクロタイタ−プレ−トリ−ダ−を用いて測定した。最小検出量は1.7
pg/mlである。
【０１１１】
b−TGF−β1
TGF−β1はQuantikine ELISAキット（DB100B、R&D Systems）を用いて測定した。サンプルはキャリブレ−タ希釈液（RD5−26）で100倍希釈した。TGF−β1標準液（890207）の希釈シリ−ズは、TGF−B−受容体IIでコ−ティングした96−ウェルマイクロタイタ−プレ−ト内において100 mlの体積で準備された。潜在型TGF−β1を免疫反応型に活性化するため、TGF−β1の分析の前に、酸活性化及び中和が行われた。この目的のため、0.5mlのサンプルを0.1mlの1NのHClと混合し、室温で10分間培養し、シグマ（H−7523）からの、1.2Nの NaOH/0.5MのHEPES（N−[2−ヒドロキシエチル]ピペラジン−N0[2−エタンスルホン酸]）を0.1ml添加することにより中和し、遠心分離を行った。その後、総TGF−β1含有量について上清画分を測定した。アリコ−ト（50ml）をマイクロタイタ−プレ−トに重複して適用し、その次に該マイクロタイタ−プレ−トが覆われ、室温で2時間培養した。その後、ウェルを洗浄し、酵素結合したTGF−β1ポリクロ−ナル抗体を添加し、室温で1.5時間培養を続けた。上記のように測定を完了した。TGF−β1の検出限界は4.61pg/mlであった。
【０１１２】
c−EGF
EGFはQuantikine
ELISAキット（＃.DEG00、R&D Systems、Minneapolis、MN）を用いて測定した。サンプルはキャリブレ−タ希釈液（RD6N）で20倍希釈した。200μlの標準液、コントロ−ル、又はサンプルをウェルに添加した。プレ−トを室温で2時間培養した。各ウェルを吸引し、洗浄バッファ−で充填することにより洗浄した。EGF複合体を各ウェルに加え、室温で2時間培養した。洗浄バッファ−を用いてウェルを洗浄し、基質溶媒（200μl）を各ウェルに添加した。混合物を室温で20分間培養し、且つ光から保護された。停止溶媒（50μl）を各ウェルに添加した。各ウェルの吸光度を450 nmに設定したマイクロプレ−トリ−ダ−（VersaMaxTM microplate reader、Molecular
Devices、 USA）を用いて、30分以内に測定した。最小検出量は0.7 pg/mlである。
【０１１３】
d−VEGF
VEGFはQuantikine
ELISAキット（＃DVE00、R&D Systems、Minneapolis、MN）を用いて測定した。サンプルはキャリブレ−タ希釈液（RD6U）で2倍に希釈した。最小検出量は、製造業者に報告されているように、一般的に9.0 pg/mlより低く、平均MDDは、50 ng/mlである。測定希釈液（RD1W）100μlを各ウェルに添加し、続いて標準液（VEGF標準液）100μlを各ウェルに添加した。プレ−トは接着剤ストリップで覆われ、室温で2時間培養した。ウェルを3回洗浄し、次いで酵素標識VEGFを用いて、室温で2時間培養した。
【０１１４】
e−IGF−1
IGF−1はQuantikine ELISAキット（DG100、R&D Systemsから）を用いて定量した。サンプルはキャリブレ−タ希釈液（RD5−22）で100倍希釈した。最小検出量は、製造業者に報告されているように、0.007〜0.056ng/mlの範囲であり、平均MDDは0.026 ng/mlである。測定希釈液（RD1−53）150μlを各ウェルに添加し、続いて標準液（890775）50μlを各ウェルに添加した。プレ−トは接着剤ストリップで覆われ、2〜8℃で2時間培養した。ウェルを3回洗浄し、次いで酵素標識IGF−1を用いて、2〜8℃で、1時間培養した。上記のように測定を完成した。
【０１１５】
6−P−セレクチン測定
P−セレクチンはQuantikineキット（R&D Systems）を用いてELISA測定によって測定した。
【０１１６】
7−タンパク質及び脂質測定
総蛋白、アルブミン、総コレステロ−ル、及びトリグリセリド（TG）は、オイル抽出後且つ炭吸着後、RocheP800分析器によって出発PCにおいて測定された。IgG、IgM及びIgAは、Cobas Integra 800（Roche COBAS
INTEGRA 800、RocheDiagnostics、Mannheim、 Germany）で、全自動ラテックス増強免疫比濁分析を用いて測定した。
【０１１７】
8−ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）
SDS−PAGEは、4〜12％勾配ゲル、試薬及びインビトロジェン（Invitrogen
Corporation、 Carlsbad、California、USA）からの電気泳動システムを用いて非還元及び還元条件下で行った。分子量の評価はNovex（R）鮮明な前染色タンパク質分子量スタンダ−ド（Novex（R） Sharp Pre−Stained Protein Molecular Weight Standard）（Invitrogen）を用いて行った。
【０１１８】
9−TnBP及びTritonX−45測定
残留TnBP及びTritonX−45を測定するためのサンプルの抽出は、以前の説明に従って行われた（19）。TNBPの定量は、ガスクロマトグラフィ−（GC−17A、SHIMADZU、Tokyo、Japan）と水素炎イオン化検出器により行われ、TritonX−45の定量は、リクロスフェア100 RP−18カラム（ID：4mm、長さ：250mm、P/N：724964、Merck KGaA、Darmstadt、Germany）を用いる高速液体クロマトグラフィ−（SHIMADZU）により行われた。
【０１１９】
10−細胞培養
in
vitroでの細胞成長を刺激する及びFBSを代替するS/D−PC−OCの可能性は、以下の細胞株を用いて評価した。つまり、（a）ヒト骨芽細胞MG63（ATCC CRL 1427、Bioresource Collection and Research Center、BCRC、Hsing−chu、Taiwan）と、（b）StatensSeruminstituteウサギ角膜上皮細胞（SIRC）（ATCC CCL−60、BCRC）を用いて評価した。細胞株のメンテナンスは、37℃で、5％CO2を含む制御された雰囲気中であった。これらは、平底96ウェルプレ−ト（Greiner bio−one、Tokyo、Japan）に、ウェルごとに2×103個の細胞の密度で、2.2g のNaHCO3、0.1mM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM L−グルタミン、100 U/mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシンを含む、且つ10％（v/v）FBS（Gibco、Invitrogen）を添加した、最小必須培養基（MEM、Gibco、Invitrogen）を用いて培養した。実験では、細胞は、最初に18時間付着させ、その後、異なるGFサプリメントをテストする前に、無血清培養基で6時間飢餓状態にした。無血清培養基で2回洗浄した後、細胞を異なる濃度（1〜10％）のS/D−PC−OC（それぞれ0.31〜3.1 ng/mlのTGF−βの終末濃度範囲に対応する）を添加した培養基で5日間まで培養した。コントロ−ルとしては、任意のタンパク質/GF添加なし又は10％FBSを添加した細胞培養はまた、実行ごとに行われた。
【０１２０】
11−MTS測定
増殖中の生存細胞は、製造業者の説明書に従って、MTSテトラゾリウム3−(4,5−ジメチルチアゾ−ル−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホナトフェニル)−2H−テトラゾ−ル−3−イウム（3−(4,5−dimethylthiazol−2−yl)−5−(3−carboxymethoxyphenyl)−2−(4−sulfophenyl)−2H−tetrazolium）、inner
(Promega Corporation、Madison、Wisconsin、USA)）を用いて、培養の5日目に測定した。この測定は、MTS及び電子カップリング試薬（フェナジンメトサルフェ−ト）PMSの溶媒を用いる。MTS溶媒は、組織培養基に可溶であるホルマザン産物に細胞によって生体内還元される。ホルマザンにMTSの変換は、代謝的に活性な細胞内に存在する脱水素酵素によって誘導される。490nmにおけるホルマザンの吸光度を96ウェル測定プレ−トから測定され、培養物における生細胞の数に正比例する。製造後、溶媒は光保護のチュ−ブに−20℃に保存される。細胞培養への添加の直前に、20:1（MTS:PMS）の比率でMTSとPMSの検出試薬を混合し、細胞培養への添加の比率は1:5（MTS+PMS/培養基）である。
【０１２１】
12−統計分析
デ−タは平均+/−標準偏差（SD）として報告される。統計比較は、両側ペア−ドスチュ−デントテスト（two−tailed
paired Student test）で行われた。0.05未満のp値は、平均テストパラメ−タの差異の有意性を評価するために用いられた。p<0.05であれば差異が有意であるとみなされた。
【０１２２】
II−結果
1−細胞数
出発PCは1216 +/− 188.6×106血小板/ml（範囲：896〜1388×106/ml）の平均値を有する。平均白血球及び赤血球数は、それぞれ0.32 +/− 0.10（範囲：
0.20〜−0.4）x106/mlと、0.04 +/− 0.01（範囲：0.02〜0.06）x109/mlであった。血液細胞は、S/D処理後のすべての画分に検出不能であった。
【０１２３】
2−炭の最適な比率の確定
予備実験は、テストされた様々な比率で、炭処理がS/D剤を除去したが、PDGF−AB及びVEGFの含有量も著しく減少させたことを示した。よって、増加する量（1.5、3、3.5又は4g）の炭を20mL のS/D−PC−Oに混合してテストを行った。評価したすべての比率において残留TnBPは2ppm未満であったが、残留TritonX−45は、それぞれ9、3、2、及び1.5 ppmであった。図2は、PDGF−AB、TGF−β1、EGF、VEGF、及びIGF−1の含有量に対するS/D−PC−O画分の炭処理の典型的な影響を示している。評価された全ての比率においてPDGF−AB及びVEGFの含有量が著しく減少した一方、TGF−β1、EGF及びIGF−1の濃度は、基本的には変わらなかった。TnBP及びTritonX−45を10ppm未満に減少させることができる、S/D−PC−O 20mLごとに炭1.5gの比率は、したがって、さらなる実験のために選択された。
【０１２４】
3−種々の画分の組成
265
mLのP/D−PC−O抽出物に対して19.9gの炭（選択された1.5g/20mLの比率に相当する）を用いる炭処理の、GF、P−セレクチン、タンパク質、コレステロ−ル、及びTGの含有量に対する影響（4回の実験の平均値）は、表1に示されている。 TGF−β1、IGF、及びEGF濃度は、オイル抽出及び炭吸着後、基本的に一定のままであった（それぞれ約368、55、及び2.4ng/mLである）。S/D−PC−O中に検出された含有量と比べて、S/D−PC−OCにおけるGFの全体的な回収は、TGF−β1、EGF及びIGFに対し、それぞれ81.5、94及び83.8％である。一方、PDGF及びVEGFの平均濃度は、活性炭処理（それぞれ約2.31ng/mL及び<0.009ng/mLである）中に著しく低下し（p<0.01）、小規模実験中に行われた観測を確認した。P−セレクチン含有量が炭処理に大きく影響されず、わずかな減少に伴った。アルブミン、IgG、IgA、IgMの平均濃度は、基本的に変わらないままだったが、フィブリノ−ゲンの含有量の小さな有意な減少が観測された（p<0.05）。平均コレステロ−ル及びTG含有量は安定している。平均TnBPは約738ppm から8.7ppmに低下し、TritonX−45は2628ppmから8.8ppmに低下した（p<0.001）。
【０１２５】
表１  オイル抽出（S/D−PC−O）後、及び活性炭処理（S/D−PC−OC）（N= 4）後のS/D処理した血小板濃厚液の組成
【表１】
2013528173.tif 000002
*
p < 0.05; ** p<0.01; *** p < 0.001
【０１２６】
4−SDS−PAGE
（A）非還元及び（B）還元の条件下でのSDS−PAGE分析（図3）は、出発PC（1）、S/D−PC−O（2）、及びS/D−PC−OC（3）において、非還元フィブリノ−ゲン（a）、非還元IgG（b）及びアルブミン（c）の分子量に対応する主要なタンパク質バンドを証する、タンパク質プロファイルの検出可能な変化を明確に示さなかった。
【０１２７】
5−細胞培養
MTS分析（N=3）の結果は図4A（MG63）とB（SIRC）に示されている。10％（v/v）FBS（a）を添加した培養基で2細胞株を培養した場合、細胞の成長は高かったが、FBS（b）を有さないコントロ−ルにおいて大いに減少した（p<0.05）。両方の細胞株の培養基に1〜10％のS/D−PC−OCを添加した場合、コントロ−ルにおける成長と比べ、成長も著しく高かった（p<0.05）。1％S/D−PC−OCの存在下のMG63細胞のMTS値は、10％FBSの存在下のMTS値より小さいが、3〜10％の間の濃度で同様である。1％S/D−PC−OC及び10％FBSの存在下のSIRC細胞成長は有意な差異がないが、3〜10％の増加量のS/D−PC−OCを用いる場合、SIRC細胞成長は著しく高かった（p<0.05）。10％FBS又は1〜10％S/D−PC−OCの存在下で成長した場合、両方の細胞株の細胞形態は正常であった。
【図１】
2013528173.tif 000003
【図２】
2013528173.tif 000004
【図３】
2013528173.tif 000005
【図４】
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【国際調査報告】
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2013528173.tif 000008
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