(57)【要約】  １つ以上の位置でアミノ酸配列を変化させることによって多様化されているＷＷドメインペプチド配列に由来するナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーが提供される。前記ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーは、第ＩＶ群ＷＷドメインペプチド由来であってよい。前記ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーを作成するための方法および前記ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーを使用して標的リガンドに結合する改変ＷＷドメインペプチドを選択するための方法も提供される。さらに、所望の標的リガンドに結合する改変ＷＷドメインペプチド、そのようなペプチドを含む医薬組成物およびそのようなペプチドのための使用も開示される。前記改変ＷＷドメインペプチドは、それらが由来する未改変ＷＷドメインペプチドの結合特性に比して変化した、改良された、または相違する標的リガンド結合特性を有する。
2013537417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の位置でアミノ酸配列を変化させることによって多様化されているＷＷドメインペプチド配列に由来するコンセンサス配列を有し、ここで、前記コンセンサス配列は少なくとも３つの不変トリプトファン残基を有するナイーブＷＷドメインペプチドライブラリー。
【請求項２】
実質的に全部の機能的メンバーは、三本鎖βシート折り畳みを有する請求項１に記載のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリー。
【請求項３】
第ＩＶ群ＷＷドメインペプチド配列、好ましくはＰｉｎ１に由来する請求項１または２に記載のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリー。
【請求項４】
前記コンセンサス配列は、アミノ酸配列ＷＸ３ＷＸ１６−３２Ｗ、ＷＸ３ＷＸ１６−１８ＷまたはＷＸ３ＷＸ１８−３２Ｗを含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリー。
【請求項５】
配列番号１の６〜３８位のアミノ酸配列に由来する請求項１〜４のいずれか一項に記載のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリー。
【請求項６】
前記コンセンサス配列は、（ｉ）配列番号１の１１および３４位のトリプトファン、および１３、１５、２１、２２、２４、２５および３９位の１つ以上の位置での少なくとも１つ以上の追加のトリプトファン、および／または１１および３４位のトリプトファンおよび２６位のアスパラギンを含む請求項５に記載のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリー。
【請求項７】
配列番号１の配列は、（ｉ）１７〜２０位（ループ１）の間の少なくとも１つのアミノ酸の欠失および１５位のメチオニンからトリプトファンへの置換、（ｉｉ）１７〜２０位（ループ１）の間の少なくとも１つのアミノ酸の付加および１５位のメチオニンからトリプトファンへの置換、（ｉｉｉ）１７〜２０位（ループ１）の間の少なくとも１つのアミノ酸の欠失、２７〜３０位（ループ２）の間の少なくとも１つのアミノ酸の付加、および１５位のメチオニンからトリプトファンへの置換、および（ｉｖ）１７〜２０位（ループ１）の間の少なくとも１つのアミノ酸の付加、２７〜３０位（ループ２）の間の少なくとも１つのアミノ酸の付加、および１５位のメチオニンからトリプトファンへの置換、から選択される少なくとも１つの変異を含む請求項５または６に記載のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリー。
【請求項８】
１２、１４、２３、２５、２７および３０位、および／または１７、１８および３２位、および／または１６、２０、２１、２８および２９位から選択される配列番号１の１つ以上のアミノ酸を変異させることによってさらに多様化される請求項５〜７のいずれか一項に記載のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリー。
【請求項９】
配列番号１の６〜３８位のアミノ酸の配列への下記変化、（ｉ）１７〜２０位の間の１つのアミノ酸の欠失、（ｉｉ）１５位のメチオニンからトリプトファンへの置換、および（ｉｉｉ）１７、１８および３２位のアミノ酸の１つ以上、および／または１２、１４、２３、２５、２７および３０位のアミノ酸の１つ以上の変異を含む請求項５〜８のいずれか一項に記載のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリー。
【請求項１０】
前記１２、１４、２３、２５、２７および３０位のアミノ酸は、（ｉ）任意の天然型もしくは非天然アミノ酸、及び（ｉｉ）２０個の天然型アミノ酸のいずれかから無作為に選択される請求項５〜９のいずれか一項に記載のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリー。
【請求項１１】
前記１７、１８および３２位のアミノ酸は、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｔ、Ｓ、Ｐ、ＨおよびＱからなる群のいずれかのアミノ酸から無作為に選択される請求項５〜１０のいずれか一項に記載のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリー。
【請求項１２】
ＫＬＰＰＧＷＸ１ＫＸ２ＷＳＸ３Ｘ４ＸａＧＲＶＸ５ＹＸ６ＮＸ７ＩＴＸ８ＡＸ９ＱＷＥＲＰ（配列番号３１）、ここで、Ｘ１〜Ｘ９は任意のアミノ酸を表し、Ｘａは場合により任意のアミノ酸であるか、または存在しない、およびＫＬＰＰＧＷＸ１ＫＸ２ＷＳＸ３Ｘ４ＧＲＶＸ５ＹＸ６ＮＸ７ＩＴＸ８ＡＸ９ＱＷＥＲＰ（配列番号３２）、ここで、Ｘ１〜Ｘ９位のアミノ酸は任意のアミノ酸から無作為に選択される、から選択される配列を含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリー。
【請求項１３】
Ｘ３、Ｘ４およびＸ９位のアミノ酸は、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｔ、Ｓ、Ｐ、ＨおよびＱからなるアミノ酸の群の１つから無作為に選択される請求項１２に記載のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリー。
【請求項１４】
アミノ酸配列を１つ以上の位置で変化させることによって多様化されている野生型ＷＷドメインペプチド配列に由来する改変ＷＷドメインペプチドであって、前記野生型配列のアミノ酸の５０％以下が変化させられていることを前提に、前記改変ＷＷドメインペプチドはそれが由来する前記野生型ＷＷドメインペプチドによっては結合されない標的リガンドに結合する改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項１５】
アミノ酸配列ＷＸ３ＷＸ１６−３２Ｗ、ＷＸ３ＷＸ１６−１８ＷまたはＷＸ３ＷＸ１８−３２Ｗを含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項１４に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項１６】
（ｉ）第ＩＶ群ＷＷドメイン配列、または（ｉｉ）ヒトＷＷドメイン配列、および／または配列番号１の６〜３８位のアミノ酸を含み、および配列番号１の前記配列への１つ以上の変異を含むＰｉｎ１  ＷＷドメインペプチド配列に由来する請求項１４または１５に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項１７】
１１および３４位のアミノ酸はトリプトファンであり、２６位のアミノ酸はアスパラギンである請求項１６に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項１８】
（ｉ）１７〜２０位の間で少なくとも１つのアミノ酸が欠失し、および／または１５位のメチオニンはトリプトファンに変化している、（ｉｉ）１７〜２０位（ループ１）の間で少なくとも１つのアミノ酸が挿入され、および／または１５位のメチオニンはトリプトファンに変化している、（ｉｉｉ）１７〜２０位（ループ１）の間で少なくとも１つのアミノ酸が欠失し、２７〜３０位（ループ２）の間で少なくとも１つのアミノ酸が挿入され、および／または１５位のメチオニンがトリプトファンへ変化している、または（ｉｖ）１７〜２０位（ループ１）の間で少なくとも１つのアミノ酸が挿入され、２７〜３０位（ループ２）の間で少なくとも１つのアミノ酸が挿入され、および／または１５位のメチオニンがトリプトファンへ変化させられている請求項１６または１７に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項１９】
１２、１４、２３、２５、２７および３０位、および／または１７、１８および３２位、および／または１６、２０、２１、２８および２９位から選択される配列番号１の１つ以上のアミノ酸での変異を含む請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項２０】
１２、１４、１７、１８、２３、２５、２７、３０および３２位から選択される配列番号１の３つ以上、５つ以上、７つ以上または９つのアミノ酸での変異を含む請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項２１】
前記１２、１４、２３、２５、２７および３０位のアミノ酸は２０個の天然型アミノ酸のいずれか１つから選択され、前記１７、１８および３２位の前記アミノ酸はＡ、Ｇ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｔ、Ｓ、Ｐ、ＨおよびＱからなる群のアミノ酸のいずれか１つから選択される請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項２２】
（ｉ）非リン酸化標的リガンド、（ｉｉ）ペプチドもしくはタンパク質標的リガンド、（ｉｉｉ）細胞外標的リガンド、および／または（ｉｖ）解離定数（Ｋｄ）が１μＭ未満、５００ｎｍ未満、２００ｎＭ未満または１００ｎＭ未満で前記標的リガンドに結合する請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項２３】
標的リガンドはＶＥＧＦＲ２またはβ−ＮＧＦである請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項２４】
配列番号１の番号付けに基づいて、配列番号１５〜２０または２６〜２９のいずれか１つの６〜３８位のアミノ酸配列を含む請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項２５】
前記アミノ酸配列は、Ｓｅｒ１６Ｇｌｙ、Ｖａｌ２２Ｌｅｕ、ＩＩｅ２８Ｖａｌ、Ｔｈｒ２９ＩＩｅ、Ａｌａ３１Ｓｅｒ、Ｇｌｕ３５Ｇｌｙ、およびＳｅｒ３８ＧｌｕまたはＳｅｒ３８Ａｓｐから選択される１つ以上の変異をさらに含む請求項２４に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項２６】
非ＷＷドメイン部分にコンジュゲートしている請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項２７】
前記非ＷＷドメイン部分は、抗体もしくは抗体フラグメント、およびＤＮＡ結合ドメインから選択される請求項２６に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項２８】
環状ペプチドであり、選択的に前記ペプチドは配列番号１の６位のアミノ酸と３８位のアミノ酸との間、または４位のアミノ酸と２９位のアミノ酸との間で共有結合もしくは連結を有する請求項１４〜２７のいずれか一項に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項２９】
細胞外標的リガンドの機能に拮抗させる際に、または前記機能を作動させる際に使用するための請求項１４〜２８のいずれか一項に記載の改変ＷＷドメインペプチド。
【請求項３０】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の前記ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーまたは請求項１４〜２９のいずれか一項に記載の改変ＷＷドメインペプチドをコードする核酸。
【請求項３１】
配列番号１のアミノ酸の少なくとも５０％を含み、そして、少なくとも１つのアミノ酸の変化を含むペプチド、ここで、１２、１４、２３、２５、２７および３０位の前記アミノ酸をコードする前記コドンは配列ＮＮＢ、但し、ＮはＡ、Ｃ、ＧもしくはＴであり、ＢはＣ、ＧもしくはＴである、をコードする請求項３０に記載の核酸。
【請求項３２】
１７、１８および３２位のアミノ酸をコードする前記コドンは、配列ＶＶＭを有し、ここで、ＶはＡ、ＣまたはＧであり、ＭはＡまたはＣである、請求項３０または３１に記載の核酸。
【請求項３３】
医薬品に使用するため、または癌、網膜の変性疾患もしくは疼痛から選択される疾患または状態を治療する際に使用するための請求項１４〜２９のいずれか一項に記載の改変ＷＷドメインペプチドまたは請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３４】
癌、網膜の変性疾患または疼痛から選択される疾患を治療、予防、または緩和する方法であって、それを必要とする被験者に治療有効量の請求項１４〜２９のいずれか一項に記載の改変ＷＷドメインペプチドまたは請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の核酸を投与する工程を含む方法。
【請求項３５】
請求項１４〜２９のいずれか一項に記載の改変ＷＷドメインペプチドまたは請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の核酸を含む医薬組成物。
【請求項３６】
改変ＷＷドメインペプチドをナイーブＷＷドメインペプチドディスプレイライブラリーから単離するための方法であって、前記ライブラリーはディスプレイされた改変ＷＷドメインペプチドをコードする複数の核酸配列を含み、
（ａ）複数の核酸構築物を発現させる工程であって、ここで、各核酸構築物は、前記複数の核酸構築物の発現が複数のペプチド−核酸複合体の形成を生じさせるように前記核酸配列へ機能的に連結したプロモーター配列を含み、各複合体は前記ディスプレイされたペプチドをコードする対応の前記核酸構築物と会合する少なくとも１つのディスプレイされた改変ＷＷドメインペプチドを含む工程、
（ｂ）前記複数のペプチド−核酸複合体を少なくとも１つの標的リガンドへ曝露させ、そして、適切には前記標的リガンドへディスプレイされた改変ＷＷドメインペプチドを結合させることによって、前記ペプチド−核酸複合体を前記リガンドと会合させる工程、
（ｃ）前記標的リガンドと会合していないままである任意のペプチド−核酸複合体を取り除く工程、および、
（ｄ）任意の標的リガンド会合性ペプチド−核酸複合体を回収する工程を含む方法。
【請求項３７】
（ｅ）任意の回収されたリガンド会合性ペプチド−核酸複合体の前記核酸配列によってコードされたペプチドを標的リガンド結合改変ＷＷドメインペプチドであると特徴付ける工程をさらに含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの標的リガンドは、固体支持体、例えばポリスチレンアガロースビーズにカップリングさせられる請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｃ）は、遠心分離および／または洗浄によって標的リガンドと会合しないままとなるペプチド−核酸複合体を分離する工程を含む請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的リガンドは、セリンまたはトレオニンアミノ酸でリン酸化されていないタンパク質もしくはペプチド配列である請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的リガンドは、ＶＥＧＦＲ２またはβ−ＮＧＦである請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記改変ＷＷドメインペプチドは、長さが２０〜１００残基、長さが２０〜５０残基、長さが２２〜４５残基、長さが２４〜４０残基、または長さが２６〜３９残基のアミノ酸配列を含む請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ナイーブＷＷドメインペプチドディスプレイライブラリーは、（ｉ）ヒトＷＷドメイン、および／または（ｉｉ）第ＩＶ群ＷＷドメイン、および／または（ｉｉｉ）Ｐｉｎ１  ＷＷドメインに由来する請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所望の機能、例えば標的リガンドへの結合親和性を有するポリペプチドを選択するための新規なポリペプチドスカフォールド、および前記スカフォールドを使用する方法ならびに結果として生じたポリペプチドに関する。詳細には、本発明は、ＷＷドメインに基づくナイーブ（ｎａｉｖｅ）ライブラリー、前記ライブラリーから新規な結合成分を選択する方法および機能的改変ＷＷドメインペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、相互に、および他の分子と相互作用して天然シグナリング事象および酵素反応を指令する様々な形状で存在する。多数のタンパク質は、データベース内に分類されている規定された三次元構造に折り畳まれる（非特許文献１）。一部のタンパク質（およびタンパク質ファミリー）は、変化した活性、およびそこで新規な使用を生成するために広範に遺伝子組み換え操作を受けてきた。典型的には、タンパク質の選択領域だけが改変されるので、プロテイン・エンジニア（タンパク質工学技術者）は天然タンパク質の所望の特性、例えば折り畳み、および所定の機能性を保持することができる。改変されていない領域（すなわち、定常領域）は、このため天然タンパク質のバックボーン、スカフォールドまたはフレームワークを表すと考えられる。これらの未改変野生型領域が、そのようなタンパク質（またはペプチド）の形状／立体構造を維持して機能的変異タンパク質を作成する最高の機会を提供できるように、該タンパク質の三次元折り畳みを決定する領域であれば有益であることが多い。該タンパク質の構造にとって余り重要ではない該タンパク質内の領域、ドメインまたはループは、後に該野生型タンパク質の機能性を変化させ、そしてできれば新規の有用な特性を得るために改変または無作為化することさえできる。
【０００３】
タンパク質「スカフォールド」を使用する、および活性を変化させるために該スカフォールド内のループまたは領域の遺伝子組み換えの技術は、可変領域またはループの天然レパートリーを有する抗体および抗体フラグメントの分野に関して最も顕著である。抗体の可変ループは、公知のリガンドへの改良された結合（例、親和性および／または特異性）を有するペプチドを生成するために、およびさらに特定の抗体フレームワークのための結合基質を拡大するために広範に遺伝子組み換えされてきた（例えば、非特許文献２および特許文献１）。非抗体フレームワークの遺伝子組み換えは、例えば、非特許文献３によって調査されてきた。
【０００４】
ＷＷドメインは、極めて大きなタンパク質の一部として天然に見いだされる小さなペプチドドメインである。ＷＷドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用に関係する直鎖ペプチド配列に結合することが証明されている（概説については、非特許文献４を参照されたい）。ＷＷドメインは相当に小さな構造であるので、ＷＷドメインは、小さなβシートタンパク質の折り畳み活力を理解するための良好な対象として役立ってきた。単一または対のＷＷドメインの幾つかの構造については、結合リガンドを用いた場合と用いない場合の両方で決定されており（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）、これらは該ドメインがコップ状結合表面を備える逆平行三本鎖βシート（または「βメアンダー」）を採用することを証明している。名称「ＷＷドメイン」は、この構造を形成するために１対の保存トリプトファン（Ｗ）残基が必須であることが公知であるという事実に由来する。しかしこれまでと同様に、この規則にはまれな例外があり、フェニルアラニンまたはチロシンが該トリプトファン残基の１つと置換することが見いだされている。
【０００５】
ＷＷドメインの結合特異性は、これらのドメインをリガンド配列に依存して５つの群への分類を導いた。第Ｉ群ドメインはリガンド内のＰＰＸＹモチーフを認識する、第ＩＩ群ドメインはＰＰＬＰモチーフを認識する、第ＩＩＩ群ドメインはメチオニンおよびグリシン内のプロリンリッチストレッチに結合する（ＰＧＭモチーフ）、第ＩＶ群ドメインはホスホセリンおよびホスホトレオニン残基に結合する、ならびに第Ｖ群ドメインはアルギニン内でリッチであるプロリンのストレッチに結合する（非特許文献９）。最近になって、４２個のＷＷドメインがＮＭＲおよびペプチドライブラリースクリーンを用いて研究され、これによりそれらのプロリンおよびホスホセリンおよびトレオニンペプチドモチーフの認識に基づいて、３２個のＷＷペプチドは６群へ分類された。６００個の潜在的チロシン、セリンおよびトレオニンキナーゼ標的配列を備える第ＩＶ群ドメインであるヒトＰｉｎ１  ＷＷドメインに関する詳細な分析は、このドメインがリン酸化セリン／トレオニン標的（ｐｏＳ／ｐｏＴ）へ排他的に結合し、ホスホチロシンペプチドまたは非リン酸化標的配列には結合しないことを証明した（非特許文献１０）。実際に、結合は配列φφｐｏＴＰＰ（ここでφは疎水性残基であり、Ｐはプロリンである）のｐｏＴペプチドを用いると最強であることが見いだされた。
【０００６】
様々な変異誘発試験がＷＷドメインの構造および機能を調査するために実施されてきた。Ｓｍｕｒｆ２  ＷＷドメインの試験では、非標準フェニルアラニン残基はＰＹペプチドに対する親和性を減少させることが見いだされ、ＰＹ尾部とＳｍｕｒｆ２のβ１およびβ１−２ループとの相互作用が結合に寄与することが証明された（非特許文献１１）。他の試験では、ＷＷドメイン内の様々なアミノ酸への変異は改変された特性、例えば以下の特性を提供することが証明されている。（１）改良された安定性  −  非特許文献１２  −  ヒトＹｅｓ会合性ドメイン（ｈＹＡＰ）の本試験では、ドメイン内の３つの位置（Ａ２０Ｒ／Ｌ３０Ｙ／Ｄ３４Ｔ）がＰｉｎ１およびＦＢＰ２８からＷＷドメインの配列を反映するために変異させられた、（２）改良された安定性  −  非特許文献１３  −  本試験では、野生型Ｐｉｎ１配列が単一または１対のトリプトファン残基の導入によって改変され、これはドメインの熱安定性を増加させたが、その天然ペプチドリガンドに対する結合親和性を検出可能限界未満へ下げた、および（３）改良された安定性  −  非特許文献１４  −  Ｐｉｎ１内のループ１の長さは、その天然ループをＦＢＰ  ＷＷドメインからのループ１の配列と置換することによって１アミノ酸短縮された。ドメインの安定性は改良されたが、同様に、天然ペプチドリガンドは結合しなかった、（４）変化した結合特異性  −  非特許文献１５  −  本試験では、Ｎｅｄｄ４．３ドメインのアミノ酸配列（第Ｉ群ＷＷドメイン）はＤ２４、Ｈ３２、Ｔ３７位で変化したので、該ドメインは異なるペプチドモチーフに結合した。
【０００７】
また別の試験では、Ｐｉｎ１ドメインはリン酸化リガンドへの結合を変調させるために変異させられ（特許文献２）、Ｐｉｎ１ドメインはリン酸塩に依存して高い親和性でセリンもしくはトレオニンリンタンパク質またはポリペプチドに結合すると結論付けられた。Ｐｉｎ１はそのリガンドを該リガンドの調節ドメインと相互作用することにより変調させると考えられるが、このとき該調節ドメインは細胞／生物学的工程中に（例えば、リン酸化状態で）変化させられる。
【０００８】
他の遺伝子組換えプロジェクトには、コンセンサスモチーフＰＰＸＹを含有する公知のペプチドリガンドへの改良された結合について選択するために、変異させられてファージ粒子の表面上に提示されているｈＹＡＰ  ＷＷドメイン（第Ｉ群ドメイン）が含まれる（非特許文献１６）。さらに、２９２ＷＷドメインのアミノ酸配列の試験は、共進化接触残基Ｌ４Ｐ５Ｇ６Ｅ８Ｆ２１Ｎ２２Ｈ２３Ｓ２８の同定（非特許文献１７、および非特許文献１８）およびコンセンサスペプチド結合モチーフを含有するペプチドライブラリーへ結合するための新規ドメインのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計をもたらした。第ＩＩまたはＩＶ群ドメイン（Ｐｉｎ１）は同定されなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許第１０２５２１８号明細書
【特許文献２】国際公開公報第２０００／０４８６２１号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｕｒｚｉｎ  Ａ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  ＳＣＯＰ：ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４７，  ５３６−５４０［ｈｔｔｐ：／／ｓｃｏｐ．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｓｃｏｐ／］
【非特許文献２】Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２９６，  ５７−８６
【非特許文献３】Ｈｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，  １５，  １４−２７
【非特許文献４】４Ｓｔａｕｂ  ＆  Ｒｏｔｉｎ，  （１９９６）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ４，  ４９５−４９９
【非特許文献５】Ｗｉｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６，  ２５１５０−２５１５６
【非特許文献６】Ｋａｎｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  １４，  ５４３−５５３
【非特許文献７】Ｗｅｉｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３２４，  ８０７−８２２
【非特許文献８】Ｍａｃｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ５１３，  ３０−３７
【非特許文献９】Ｍａｃｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ５１３，  ３０−３７
【非特許文献１０】Ｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １２，  ４９１−５００
【非特許文献１１】Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２８１，  １７０６９−１７０７５
【非特許文献１２】Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １０，  １４５４−１４６５
【非特許文献１３】Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００７）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １６，  ２３０６−２３１３）
【非特許文献１４】Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  ＰＮＡＳ，  １０３，  １０６４８−１０６５３
【非特許文献１５】Ｋａｓａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ８，  ２３１−２４１
【非特許文献１６】Ｄａｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ９，  ２３６６−２３７６
【非特許文献１７】Ｒｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３７，  ５７９−５８３
【非特許文献１８】Ｓｏｃｏｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３７，  ５１２−５１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＷＷドメインを対象に実施されている早期変異誘発実験の数にもかかわらず、これらの試験はいずれも、ＷＷドメインがこれまで野生型ＷＷドメイン配列によっては認識されていない天然細胞外リガンドに結合するよう遺伝子組換え可能なことを証明していない。しかし変化した結合特異性を有する変異ＷＷドメインに対して、多数の用途を想定することができる。したがって、例えば療法において、または診断用ツールとして使用するためにこれまで認識されていないリガンドに対するｄｅ  ｎｏｖｏ結合特異性を有するＷＷドメインは遺伝子組換え可能であることが望ましいと考えられる。所望の結合特異性および／または親和性を有する新規なリガンド結合ドメインの設計において使用するための、例えば新規および有用な結合ドメインの設計、選択およびスクリーニングのための研究用ツールとして機能するために改変ＷＷドメインフレームワークまたはスカフォールドを提供することは特に有益であろう。
【００１２】
さらに、結合親和性が（例えば、トリプトファン蛍光発光分光法または等温熱量測定法によって）測定および報告された上記の試験の全部において、天然または変異ＷＷドメインいずれかおよびそれらの標的リガンドに対して、親和性は常に１μＭ超であることが見いだされている。例えば、野生型Ｐｉｎ１  ＷＷドメインのその天然標的リガンドに対する親和性は７．７〜１２６μＭで測定された（Ｖｅｒｄｅｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．，  ７，  ６３９−６４３）。そのような結合親和性は、典型的には診断用ツールまたは治療薬として使用するための望ましい結合親和性より低い（弱い）。そこで、新規および野生型リガンドの両方に対する高い親和性を有する改変ＷＷドメイン（ペプチド）−結合ドメインを設計および選択するためのＷＷドメインペプチドスカフォールドおよびスクリーニングシステムを有することもまた有益であろう。さらに、所望の標的リガンドに対するそのような高い結合親和性を有する改変ＷＷドメインペプチドを有することもまた望ましいであろう。
【００１３】
治療薬、診断用ツールなどとして使用するためにＷＷドメインの設計者が想定可能な多数の用途のためには、例えば認識配列内にリン酸化セリンまたはトレオニン残基を有するという制限／要件なしで所望の標的リガンドを選択するより大きな自由があることは有益であろう。さらに、多数の用途のためには、ヒト由来結合ドメインスカフォールドおよび会合結合ドメインを有することは有益であろう。そこで、新規の結合ドメイン、特に遺伝子組換え高親和性Ｐｉｎ１  ＷＷドメイン（例えばほぼ数ｎＭの結合親和性を備える）および、特には非リン酸化リガンドを認識する遺伝子組換えＰｉｎ１  ＷＷドメインを設計および選択するためのＰｉｎ１  ＷＷドメインフレームワークを有することは望ましいであろう。
【００１４】
したがって、本発明は先行技術における１つ以上の課題を克服する、または少なくとも軽減することを目差すものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
大まかに言えば、本発明は、所望の結合特性、例えば新規標的分子に対する親和性および／または公知もしくは新規リガンドに対する高い親和性を有するｄｅ  ｎｏｖｏ結合ドメインを選択するために使用可能な、改変された安定化ＷＷドメインフレームワークまたはスカフォールドを提供する。改変ＷＷドメインフレームワークは相当に小型の自己内蔵型ユニットであり、安定性であって、それらの標的リガンドに対して適切に高い親和性を有し、容易に合成することができ、および／または治療および非治療用途において有用な可能性がある新規結合分子を設計および選択するための汎用テンプレートを提供することができる。例えば、改変ＷＷドメインフレームワークは、遺伝子組換えされた抗体、抗体ペプチドおよび抗体フラグメントの用途と同一または類似の用途を有する可能性がある。さらに本発明は、１つ以上の所望の活性、例えば新規標的分子／リガンド、例えばペプチド配列に対する結合親和性を有する改変ＷＷドメインを選択するための方法に関する。これに加えて、本発明は、上述した所望の活性を有する改変ＷＷドメイン、そのような改変ＷＷドメインを含む組成物ならびに本発明にしたがって同定および／または誘導体化された改変ＷＷドメインを含む治療用および診断用分子および組成物に関する。一部の態様および実施形態では、本発明は、本発明の方法を使用して生成される改変されたＰｉｎ１  ＷＷドメインフレームワークおよび改変されたＰｉｎ１  ＷＷドメインペプチドに関する。
【００１６】
そこで本発明の一態様では、本出願人は、主として野生型アミノ酸残基のフレームワークまたは骨格構造を含む、可変アミノ酸の領域および／または位置を支持するための構造的および機能的テンプレートとして機能する、新規な特性／活性を有するＷＷドメイン、例えば新規なリガンド認識モチーフの選択を提供するＰｉｎ１  ＷＷドメインのライブラリーを作成した。これらの改変フレームワークまたはライブラリーは、特定の所望の活性を有する個別改変ＷＷペプチドドメインを単離するための選択工程にかけることができる。この方法で、非リン酸化標的ペプチド配列に結合し、そしてＰｉｎ１に対する天然リガンドに比較して完全に新規なペプチド配列に結合する、Ｐｉｎ１をベースとする新規なＷＷドメインが同定されている。これらの改変ＷＷドメインペプチドは、治療およびさらには非治療用途におけるそれらの潜在的有用性の点で特に興味深い。多数の公知のペプチド治療用分子と比較して、本発明の改変ＷＷドメインは、それらが相当に短く安定性のペプチドドメインであり、相当に単純な折り畳みを有するために有益である。本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、例えば、治療用および他のｉｎ  ｖｉｖｏ用途のための増加した安定性を提供するために環化させることができ、そのような環化ペプチドは所望の標的結合活性を維持することが証明されている。
【００１７】
したがって、本発明の第一の態様では、１つ以上の位置でアミノ酸配列を変化させることによって多様化されているＷＷドメインペプチド配列に由来するコンセンサス配列を有するナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーが提供される。ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーのフレームワークは、野生型ＷＷドメイン由来であってよい。一実施形態では、コンセンサス配列は、少なくとも３つの不変トリプトファン残基を有する。「不変」は、該トリプトファン残基が該ＷＷドメインライブラリーのフレームワーク（つまり、非可変性）部分内にあることを意味する。不変トリプトファン残基は、親／野生型ＷＷドメインペプチド配列由来であってよい、または人工的に導入されてよい。追加のトリプトファン残基は、該ライブラリーのナイーブ／可変配列内に含まれてよい。適切には、該ライブラリーの実質的に全ての機能的メンバーは、逆平行βシートであってよい三本鎖βシート折り畳みを有する。一部の実施形態では、ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーは第ＩＶ群ＷＷドメイン配列、適切にはヒトＷＷドメイン配列およびより適切にはＰｉｎ１  ＷＷドメインペプチド配列に由来する。特に適切な実施形態では、ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーは、配列番号１の６〜３８位のアミノ酸に由来する。本発明のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーは、それが由来する配列に比較して少なくとも１つのアミノ酸欠失を含む可能性がある。また別の実施形態では、本発明のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーは、それが由来する配列に比較して少なくとも１つのアミノ酸挿入を含む可能性がある。好ましくは、該欠失および／または挿入は、ＷＷドメインのループ領域内にある。最も適切なナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーは、配列番号２の６〜３７位のアミノ酸配列に由来する、このとき、少なくともＸ１〜Ｘ９位のアミノ酸は可変性である。好ましくは、該ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーは、配列番号２の６〜３７位のアミノ酸を含む、このとき、Ｘ１〜Ｘ９位は可変性である。標的リガンドに依存してＸ１〜Ｘ９位で組み込むために好ましいアミノ酸のサブグループについては、実施例の項でさらに提示する。
【００１８】
また別の態様では、本発明は、標的リガンドに対する改変ＷＷドメインペプチドの選択における本発明のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーの使用に関する。適切には、本ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーは、既定標的リガンド特異性を有していない。本発明のこのいずれか他の態様では、本ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーは、１つ以上のアミノ酸位置の野生型ＷＷドメイン配列を変異させることによって引き出すことができる。有益には、このいずれか他の態様では、該標的リガンドは、野生型ＷＷドメインペプチドによっては結合されないリガンドであってよい。
【００１９】
そこで本発明のまた別の態様は、本発明のライブラリーおよび方法から同定された改変ＷＷドメインペプチドに関する。本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、適切には１つ以上の位置でアミノ酸配列を変化させることによって多様化されている野生型ＷＷドメインペプチド配列に由来する。場合により、改変ＷＷドメインペプチドは、それが由来する野生型ＷＷドメインペプチドによっては結合されない標的リガンドに結合する。適切には、野生型配列のアミノ酸の７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下または３０％以下が変化させられる。この方法で、野生型ＷＷドメインフレームワークを容易に同定することができる。一実施形態では、本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、アミノ酸配列ＷＸ３ＷＸ１６−１８Ｗ、ここで、Ｘはいずれかのアミノ酸である、を含むコンセンサス配列を有する。また別の実施形態では、本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、アミノ酸配列ＷＸ３ＷＸ１８−３２Ｗ、ここで、Ｘはいずれかのアミノ酸である、を含むコンセンサス配列を有する。そこで、該コンセンサス配列は、アミノ酸配列ＷＸ３ＷＸ１６−３２Ｗを含むことができる。当然のことながら、本発明の改変ＷＷドメインは、本発明のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーに由来してよいので、それらがナイーブＷＷドメインライブラリーペプチドの特徴のいずれか１つ以上を有する可能性がある。有益には、本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、それが由来するＷＷドメインペプチドによっては結合されない標的リガンドに結合する。または、本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、野生型ペプチドより大きな結合親和性で非改変ＷＷドメインの天然リガンドに結合する。特に適切な実施形態では、改変ＷＷドメインペプチドは非リン酸化リガンドに結合するが、それが由来するＷＷドメインペプチドは非リン酸化リガンドには結合しない。適切には、非リン酸化リガンドはｉｎ  ｖｉｖｏの細胞外標的配列である。有益には、本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、その標的リガンドに解離定数（Ｋｄ）１μＭ未満、２００ｎＭ未満または１００ｎＭ未満で結合する。適切には、本発明の改変ＷＷドメインペプチドのための標的リガンドにはＶＥＧＦＲ２およびＮＧＦが含まれる。本発明の好ましい改変ＷＷドメインペプチドは、配列番号１５〜２０および２６〜２９の６〜３８位のアミノ酸配列を含んでいる（配列番号１の配列にしたがった番号付け）。最も適切な改変ＷＷドメインペプチドは、治療および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ用途のために好ましい可能性がある環状ペプチドを作成するために環化される。
【００２０】
したがって、本発明は、本発明の改変ＷＷドメインペプチドのための治療用および診断用使用を含んでいる。このため本発明の態様および実施形態には、改変ＷＷドメインペプチドを含む調製物、医薬品および医薬組成物が含まれる。一実施形態では、本発明は、医学分野において使用するための改変ＷＷドメインペプチドに関する。より詳細には、標的リガンド、例えば細胞外標的リガンドの機能を拮抗もしくは作動させる際に使用するためである。本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、ヒトまたは動物の身体の様々な疾患および状態、例えば癌、網膜の変性疾患または疼痛の治療に使用することができる。治療は、さらにまた疾患または状態の予防ならびに治療的処置および緩和を含むことができる。
【００２１】
本発明はさらに、核酸、例えば本発明のナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーをコードする発現ベクター、または本発明の改変ＷＷドメインペプチド、または本発明の方法によって入手可能なＷＷドメインペプチドを含んでいる。
【００２２】
本発明のさらにまた別の態様では、ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーを作成する方法であって、（ａ）各々がＷＷドメインペプチドをコードする複数の核酸を提供する工程、（ｂ）改変された核酸によってコードされる複数の前記ＷＷドメインペプチドの該ＷＷドメインペプチド内の１つ以上のアミノ酸残基で多様性を提供する目的で、それにより複数の改変された核酸を作成するために該複数の核酸内に多様性を導入する工程、および（ｃ）それにより配列多様化を含む改変ＷＷドメインペプチドのライブラリーが生成される、前記複数の改変された核酸によってコードされる該ＷＷドメインペプチドを発現させる工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、本方法の工程（ｂ）はさらに、例えばＰＣＲを用いて該核酸配列を増幅させる工程を含むことができる。一実施形態では、本方法は、（ｄ）それに対して工程（ａ）において該ＷＷドメインペプチドが選択されていない標的リガンドに対して該ライブラリーのペプチドを選択する工程をさらに含むことができる。該標的リガンドは、工程（ａ）において（非改変）ＷＷドメインペプチドによって結合されなくてよい。本発明のこの態様の方法は、所望の改変ＷＷドメインを単離する工程をさらに含むことができる。一実施形態では、本方法は、（ｅ）該標的リガンドに解離定数（Ｋｄ）１μＭ未満、２００ｎＭ未満または１００ｎＭ未満で結合するペプチドを単離する工程を含んでいる。
【００２３】
さらにまた別の態様では、本発明は、改変ＷＷドメインペプチドをナイーブＷＷドメインペプチドディスプレイライブラリーから単離するための方法であって、該ライブラリーはディスプレイされた改変ＷＷドメインペプチドをコードする複数の核酸配列を含み、（ａ）複数の核酸構築物を発現させる工程であって、各核酸構築物は、該複数の核酸構築物の発現が複数のペプチド−核酸複合体の形成を生じさせるように該核酸配列へ機能的に連結したプロモーター配列を含み、各複合体はディスプレイされたペプチドをコードする対応する核酸構築物と会合する少なくとも１つのディスプレイされた改変ＷＷドメインペプチドを含む工程、（ｂ）該複数のペプチド−核酸複合体を少なくとも１つの標的リガンドへ曝露させ、および適切には該標的リガンドへディスプレイされた改変ＷＷドメインペプチドを結合させることによって、該ペプチド−核酸複合体を該リガンドと会合させる工程、（ｃ）該標的リガンドと会合していないままである任意のペプチド−核酸複合体を取り除く工程、および（ｄ）任意の標的リガンド会合性ペプチド−核酸複合体を回収する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、本方法はさらに、（ｅ）任意の回収されたリガンド会合性ペプチド−核酸複合体の該核酸配列によってコードされたペプチドを標的リガンド結合改変ＷＷドメインペプチドを含んでいると特徴付ける工程を含んでいる。適切には、該ペプチドディスプレイライブラリーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチドディスプレイライブラリー、および最も適切にはＣＩＳ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチドディスプレイライブラリーである。該標的リガンドは、本明細書のどこかに開示したように、例えば本発明の上記の態様のいずれかに関連付けたように規定することができる。本方法は、以下の、（Ａ）工程（ｅ）の１つ以上の標的リガンド結合改変ＷＷドメインペプチドを対応する核酸構築物と会合させ、それにより１つ以上の標的リガンド結合改変ＷＷドメインペプチドのための核酸配列を同定する工程、（Ｂ）該標的リガンドと会合する改変ＷＷドメインペプチドを単離する工程、（Ｃ）該改変ＷＷドメインペプチドの誘導体を形成する工程であって、このとき場合により該誘導体は該改変ＷＷドメインペプチドの１つ以上の特性を改良するための成熟実験を実施することによって形成される工程、（Ｄ）該改変ＷＷドメインペプチドを別の成分、例えば非ＷＷドメイン成分にコンジュゲートさせる工程、（Ｅ）任意の回収された標的リガンド会合性ペプチド−核酸複合体の改変ＷＷドメインペプチドをコードする該核酸構築物を単離し、および場合によりそれを発現ベクターもしくは構築物内に挿入する工程、および／または（Ｆ）本発明の該改変ＷＷドメインペプチドおよび／または本発明の該改変ＷＷドメインペプチドをコードする核酸構築物を含む医薬組成物を調製する工程のうちの１つ以上をさらに含む可能性がある。
【００２４】
当然のことながら、本発明の改変ＷＷドメインペプチドはさらに誘導体化もしくは追加の分子へコンジュゲートさせることができる、およびそのような誘導体およびコンジュゲートは本発明の範囲内に含まれる。
【００２５】
さらに当然のことながら、他に特に規定しない限り、本発明の１つ以上の態様の任意の特徴は本発明の任意の他の態様内に組み込むことができる、および全てのそのような変形は本発明の範囲内に含まれる。
【００２６】
本明細書に引用した全ての文献は、その開示内容全体が参考として援用される。他に特に規定しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味と同一の意味を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本発明をさらに添付の図面によって具体的に説明する。
【図１】推定リガンド結合表面を示している、Ｐｉｎ１のＷＷドメインの高分解能表面構造を示す図である。
【図２】ＶＥＧＦＲ２に結合するように選択された改変ＷＷドメインペプチドのＥＬＩＳＡスクリーンの結果を示す図である。濃灰色のバー、ＶＥＧＦＲ２コーティングウエルへ結合する選択されたペプチドに対して得られたシグナルを示し、薄灰色のバーは未コーティングウエルを用いてコントロールにおいて得られたシグナルを表している。ＥＬＩＳＡシグナルは４５０ｎｍで読み取られた。
【図３】ＥＬＩＳＡによって分析された（図２に図示）、ＶＥＧＦＲ２へ結合するように選択されたＷＷドメインペプチドの配列アラインメントを示す図である。Ｐｉｎ１ペプチドドメイン配列内のＸは、ナイーブＷＷドメインライブラリー内の変異によって多様化された残基を示している。
【図４】ＥＬＩＳＡアッセイによって評価された、ＶＥＧＦＲ２に結合するように選択された改変ＷＷドメインペプチドの特異性を示す図である。改変ＷＷドメインペプチドを複数の標的および非標的リガンドに対して試験した、ＶＥＧＦＲ２（濃灰色のコラム）、ヒトＩｇＧ（細いクロスハッチのコラム）、モノクローナル抗体（斑点状のコラム）、酵素（淡灰色のコラム）、およびヒト血清アルブミン（幅広のクロスハッチのコラム）。白色のコラムは、ブロックされたウエルコントロールである。
【図５】バイオレイヤー干渉法によって測定された、直鎖状ＷＷ−Ｂ１のＶＥＧＦＲ２への結合についての定常状態親和性測定を示す図である。
【図６】化学合成された、選択された改変ＷＷドメインペプチドであるクローンＷＷ−Ｂ１の存在下でのＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合についての競合アッセイを示す図である。
【図７】ＮＧＦに結合するように選択された改変ＷＷドメインペプチドのＥＬＩＳＡスクリーンを示す図である。黒色のバーは、ＮＧＦコーティングウエルへ結合する選択されたペプチドについて得られたシグナルを示し、淡灰色のバーはＨＳＡコーティングウエルを用いてコントロールにおいて得られたシグナルを表している。ＥＬＩＳＡシグナルは４５０ｎｍで読み取られた。
【図８】ＥＬＩＳＡによって分析された（図７に示されている）、ＮＧＦへ結合するように選択されたＷＷドメインペプチドの配列アラインメントを示す図である。Ｐｉｎ１ペプチドドメイン配列内のＸは、ナイーブＷＷドメインライブラリー内の変異によって多様化された残基を示している。
【図９ａ】補正予測質量を示す、６〜３８位（配列番号１にしたがった番号付け）のアミノ酸を通して環化された、環式ＷＷ−Ｂ１ペプチド（Ｇｌｕ３８変異体）についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法結果を示す図である。
【図９ｂ】補正予測質量を示す、６〜３８位（配列番号１にしたがった番号付け）のアミノ酸を通して環化された、環式ＷＷ−Ｂ１ペプチド（Ｇｌｕ３８変異体）についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法結果を示す図である。
【図９ｃ】補正予測質量を示す、６〜３８位（配列番号１にしたがった番号付け）のアミノ酸を通して環化された、環式ＷＷ−Ｂ１ペプチド（Ｇｌｕ３８変異体）についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法結果を示す図である。
【図９ｄ】補正予測質量を示す、６〜３８位（配列番号１にしたがった番号付け）のアミノ酸を通して環化された、環式ＷＷ−Ｂ１ペプチド（Ｇｌｕ３８変異体）についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法結果を示す図である。
【図１０】ＲＰ  Ｃ１８カラムを使用して、６〜３８位（配列番号１にしたがった番号付け）のアミノ酸を通して環化された、環式ＷＷ−Ｂ１ペプチド（Ｇｌｕ３８変異体）の分析的逆相ＨＰＬＣトレースの結果を示す図である。
【図１１】バイオレイヤー干渉法によって測定された、６〜３８位（配列番号１にしたがった番号付け）のアミノ酸を通して環化された、環式ＷＷ−Ｂ１ペプチド（Ｇｌｕ３８変異体）のＶＥＧＦＲ２への結合についての定常状態親和性測定を示す図である。
【図１２】バイオレイヤー干渉法によって測定された、６〜３８位（配列番号１にしたがった番号付け）のアミノ酸を通して環化された、環式ＷＷ−Ｂ１ペプチド（Ｇｌｕ３８変異体）のＶＥＧＦＲ２への結合についての定常状態親和性測定を示す図である。
【図１３ａ】補正予測質量を示す、４〜２９位（配列番号１にしたがった番号付け）のアミノ酸を通して環化された、環式Ｂ１ペプチド（Ｇｌｕ３８変異体）についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法の結果を示す図である。
【図１３ｂ】補正予測質量を示す、４〜２９位（配列番号１にしたがった番号付け）のアミノ酸を通して環化された、環式Ｂ１ペプチド（Ｇｌｕ３８変異体）についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法の結果を示す図である。
【図１４】２０時間までのマウス血漿内でのインキュベーション後にＨＰＬＣによって分析された、ペプチドＷＷ−Ｂ１についての曲線下面積のプロットを示す図である。
【図１５】６〜３８位のアミノ酸を通して環化されたＡ、ＷＷ−Ｂ１、およびＢ、環式ＷＷ−Ｂ１（Ｇｌｕ３８変異体）についての遠紫外線ＣＤスペクトルを示す図である。点線は２５℃で測定されたＣＤスペクトルを表す、実線は９０℃で測定されたＣＤスペクトルを表し、白丸は９５℃に加熱して次に２５℃へ冷却したペプチドのＣＤスペクトルを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の理解を支援するため、複数の用語について以下に規定する。
【００２９】
本明細書で（例えば、ＷＷドメインペプチドフレームワーク／テンプレート／スカフォールドまたは改変ＷＷドメインペプチドの文脈において）使用する用語「ペプチド」は、直鎖もしくは環状鎖に結合された複数のアミノ酸を意味する。用語オリゴペプチドは、典型的には２〜約５０個以上のアミノ酸を有するペプチドを記載するために使用される。約５０超のペプチドは、ポリペプチドもしくはタンパク質と呼ばれることが多い。本発明のためには、用語「ペプチド」は、任意の特定数のアミノ酸には限定されない。しかし好ましくは、ペプチドは約１００個までのアミノ酸、約７０個までの残基または約５０個までの残基を含有している。適切には、本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、約２０〜約５０個のアミノ酸残基およびより適切には約２２〜約４５個の残基を含有している。一部の実施形態では、改変ＷＷドメインフレームワークもしくはペプチドは、約２３〜約４０個のアミノ酸残基もしくは約２６〜約３９個の残基、例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６個のアミノ酸を含有していてよい。当然のことながら、本発明の単離ＷＷドメインフレームワークもしくは改変ペプチドは、上記の数のアミノ酸を含んでいてよい、または上記の数のアミノ酸からなってよい。
【００３０】
本明細書における用語「アミノ酸」は、その最も広い意味で使用され、天然型Ｌα−アミノ酸もしくは残基を含むことが意図されている。本明細書では、天然型アミノ酸に対して一般に使用される１文字および３文字略語を使用する。Ａ＝Ａｌａ、Ｃ＝Ｃｙｓ、Ｄ＝Ａｓｐ、Ｅ＝Ｇｌｕ、Ｆ＝Ｐｈｅ、Ｇ＝Ｇｌｙ、Ｈ＝Ｈｉｓ、Ｉ＝Ｉｌｅ、Ｋ＝Ｌｙｓ、Ｌ＝Ｌｅｕ、Ｍ＝Ｍｅｔ、Ｎ＝Ａｓｎ、Ｐ＝Ｐｒｏ、Ｑ＝Ｇｌｎ、Ｒ＝Ａｒｇ、Ｓ＝Ｓｅｒ、Ｔ＝Ｔｈｒ、Ｖ＝Ｖａｌ、Ｗ＝Ｔｒｐ、およびＹ＝Ｔｙｒ（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ａ．Ｌ．，  （１９７５）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２ｄ  ｅｄ．，  ｐｐ．７１−９２，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。一般用語「アミノ酸」はさらに、Ｄ−アミノ酸、レトロ−インバーソアミノ酸ならびに化学改変アミノ酸、例えばアミノ酸アナログ、通常はタンパク質内に組み込まれない天然型アミノ酸、例えばノルロイシンおよび当該技術分野においてアミノ酸の特徴であることが公知の特性を有する化学合成化合物、例えばβ−アミノ酸をさらに含んでいる。例えば、天然ＰｈｅもしくはＰｒｏと同一のペプチド化合物の構造変化制限を可能にするフェニルアラニンもしくはプロリンのアナログもしくはミメティックは、アミノ酸の定義に含まれる。そのようなアナログおよびミメティックは、本明細書では各アミノ酸の「機能的等価物」と呼ばれる。他のアミノ酸の例は、参考として本明細書で援用されるＲｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｈｏｆｅｒ，  ｅｄｓ．，  Ｖｏｌ．５  ｐ．３４１，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．Ｙ．  １９８３に列挙されている。
【００３１】
本発明の「改変ＷＷドメイン」（ペプチド）は、少なくとも１つの位置で変異（例えば、アミノ酸置換、欠失、付加）させられている野生型ＷＷドメインに基づいている。そこで、改変ＷＷドメインは、便宜的には野生型タンパク質もしくはペプチド配列に由来する。典型的には、改変ＷＷドメインは、野生型タンパク質のフラグメント、例えばＰｉｎ１に由来する。当然のことながら、用途に依存して、本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、それが由来する対応する野生型ペプチド配列と比較してＮおよび／またはＣ末端で追加のペプチド配列を含むことができ、例えば、タンパク質発現および／または核酸クローニングを容易にするためにＮ末端でジペプチド配列ｍｅｔ−ａｌａを含めることができる。該Ｍｅｔ−Ａｌａジペプチドが改変Ｐｉｎ１  ＷＷドメインペプチド配列である該野生型Ｐｉｎ１  ＷＷドメイン配列のＮ末端に指示されている場合、およびＷＷドメインフレームワークの配列内では、当然のことながら、該野生型配列のこのジペプチド部分は本発明の範囲内に含まれるが、Ｍｅｔ−ＡｌａのＮ末端ジペプチドが欠如する対応する配列は含まれないと見なされる。異なる生体由来のＰｉｎドメインのアラインメントは、特に該ドメインのＮ末端でのこのドメイン内の配列の多様性を示している表１に示されている。表１のアラインメントはさらに、Ｐｉｎ１におけるアミノ酸の番号付けを本発明によって使用可能な他のＷＷドメインペプチドの参照として使用可能な方法も示している。
【００３２】
【表１】
2013537417.tif 000003
【００３３】
本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、典型的には天然型アミノ酸残基を含有しているが、場合によっては非天然型アミノ酸残基もまた存在してよい。このため、特定アミノ酸もしくはペプチドの構造を模倣する非アミノ酸化学構造を含むことのできるいわゆる「ペプチドミメティック」および「ペプチドアナログ」もまた、本発明で使用することができる。そのようなミメティックもしくはアナログは、一般には類似の物理的特性、例えばサイズ、電荷もしくは疎水性およびそれらの天然ペプチド対応物において見いだされる適切な空間的な配向性を示すと特徴付けられる。ペプチドミメティック化合物の特定の例は、当該技術分野で周知であるように、例えばその中で１つ以上のアミノ酸間のアミド結合が、例えば炭素−炭素結合または他の非アミド結合によって置換されている化合物である（例えば、Ｓａｗｙｅｒ，  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  ｐｐ．３７８−４２２，  ＡＣＳ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．  １９９５を参照されたい）。そのような改変は、該改変ＷＷドメインの安定性を増加させるため、および／または溶解性、生体内利用率および送達特性（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ用途のため）を改良もしくは改変するために特に有益である可能性がある。
【００３４】
本発明の一態様は、所望の物理的特性および特徴を有する改変ＷＷドメインを同定するためにスクリーニングするための改変ＷＷドメインペプチドのライブラリーを作成するために使用できる、ＷＷドメインフレームワーク、スカフォールドもしくはテンプレート（これらの用語は本明細書では互換的に使用される）に関する。当然のことながら、該ＷＷドメインフレームワークは核酸配列もしくはペプチド配列であってよい。本発明のＷＷドメインフレームワークは、適切な野生型ＷＷドメインペプチド、例えばＰｉｎ１  ＷＷドメインに由来する。そこで、本発明のＷＷドメインフレームワークは、それが由来する野生型ペプチドのアミノ酸残基のコアもしくはバックボーンを対応する野生型配列と比較して様々な位置で複数のアミノ酸変異（例、置換）とともに含んでいる。このため便宜的には、本明細書で使用する「ＷＷドメインフレームワーク」は、該ドメイン内の１つ以上の位置で特定もしくは無作為変異を備える共通コア配列の周囲で相違するが会合するＷＷドメインペプチドに基づくライブラリー（もしくは集団）を含んでいる、およびそれ自体をＷＷドメインフレームワーク（核酸もしくはペプチド）ライブラリーと称することもできる。特定機能性を有するために最適化もしくは選択されていないペプチドもしくは核酸の混合物を有するそのようなライブラリーは、本明細書では「ナイーブ」ライブラリーと呼ぶ。このため本発明のＷＷドメインフレームワークライブラリーから発現した個別ペプチドは、上記で考察したように「改変ＷＷドメインペプチド」であると見なされ、そのコーディング核酸は「改変ＷＷドメイン核酸」であると見なすことができる。排他的ではないが、有益には、改変ＷＷドメインペプチドは、三本鎖βシートもしくはβメアンダーを含むと特徴付けられたＷＷドメインタンパク質折り畳みを採用する。同様に、該ＷＷドメインフレームワークペプチドは、（必ずしも排他的ではないが）標的リガンドを受入れて結合するためのコップ状結合表面を形成する。図１は、ＷＷドメインペプチドのコップ状結合表面を示している（Ｗｉｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ２５１５０−２５１５６によって決定されたＰＤＢ：１ｌ６Ｃ構造から採用した図）。本発明のＷＷドメインフレームワークの潜在的利点は、該特定フレームワークライブラリーの個別メンバーが結合可能な標的リガンドが分子の特定タイプもしくは構造（例えば、直鎖ペプチド）に限定されなくてよいことである。そこで任意の所望のリガンドは、該ＷＷドメインフレームワークライブラリー由来のＷＷドメイン、例えば核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、小さな有機もしくは無機分子、タンパク質もしくはペプチドによって認識（つまり、結合）することができる。適切なリガンドはタンパク質であり、特定の適切なリガンドは、タンパク質のペプチド配列もしくは「エピトープ」である。好ましい標的リガンドは、単離可能な、またはより大きなペプチドもしくはタンパク質分子の一部であってよい直鎖ペプチドである。
【００３５】
本発明のまた別の態様は、特にＷＷドメインフレームワークに基づいて変異ＷＷドメインの集団（もしくはライブラリー）から所望の特性を有する改変ＷＷドメインの同定および特性解析に関する。該ライブラリーは、所望の特性を有する改変ＷＷドメインを同定するために発現させてスクリーニングすることができる複数の核酸配列（例えば、少なくとも１０６、１０８、１０９、１０１２以上の相違するコーディング配列）を含んでいる。
【００３６】
典型的には、該改変ＷＷドメインは、Ｐｉｎ１  ＷＷドメインペプチド配列、つまりヒトＰｉｎ１タンパク質のペプチドフラグメントであるＮ’−ＭＡＤＥＥＫＬＰＰＧＷＥＫＲＭＳＲＳＳＧＲＶＹＹＦＮＨＩＴＮＡＳＱＷＥＲＰＳＧ−Ｃ’（配列番号１）に由来する。該改変ＷＷドメインは、そこで変異Ｐｉｎ１  ＷＷドメインペプチド（または変異Ｐｉｎ１タンパク質のフラグメント）のライブラリーから選択することができる。本発明の選択された改変Ｐｉｎ１  ＷＷドメインは、それが由来する野生型Ｐｉｎ１  ＷＷドメイン配列に比較して１つ以上、適切には３つ以上、５つ以上または７つ以上の変異を含有している。しかし該改変Ｐｉｎ１  ＷＷドメインペプチドが該対応する野生型配列と少なくとも３０％、少なくとも５０％または少なくとも７０％同一であるのが有益である。本発明の改変ＷＷドメインは、最も好ましくは三本鎖βシートである。有益には、該改変ＷＷドメインは少なくとも３つのトリプトファン残基を含んでおり、うち２つは該改変ドメインがそれに由来する野生型配列もしくはライブラリーの位置に対応する位置に所在する（このとき該天然配列は２つのトリプトファン残基を含む）。さらにより好ましくは、該改変ＷＷドメインは、さらにＡｓｎ２６を含んでおり、最小３つのトリプトファン残基を含有している。そこで好ましい実施形態では、野生型Ｐｉｎ１  ＷＷドメインペプチド配列は、１５までのアミノ酸位置、１２までのアミノ酸位置、または１０までのアミノ酸位置を変化させることによって多様化されるが、少なくとも３つのトリプトファン残基を含んでいる。変異の好ましい形態は、アミノ酸置換である。または、改変ＷＷドメインは、ヒトまたは他の動物、例えば哺乳動物および他の真核生物、例えば鳥類、両生類、昆虫類、寄生虫類、真菌、酵母および植物種由来の他のＷＷドメイン含有タンパク質に由来してよい（本発明のスカフォールドを作成するために改変および使用が可能なまた別のＷＷドメインペプチド配列については表２を参照されたい）。特に、少なくとも３つの不変トリプトファン残基を含有するＷＷドメインペプチドフラグメントを、本発明の改変ＷＷドメインを選択するための出発点として使用することもできる。
【００３７】
【表２−１】
2013537417.tif 000004
【表２−２】
2013537417.tif 000005
【００３８】
「〜に由来する」は、関係するペプチドがそれをベースとするペプチドの一次アミノ酸配列と比較して１つ以上の変異を含むことを意味する。そこで本発明の改変ＷＷドメインは、野生型タンパク質／ペプチド配列、例えばＰｉｎ１に由来すると考えられる。同様に、改変ＷＷドメインペプチドの「誘導体」は、選択された所望の活性（例えば、選択された標的リガンドに対する結合親和性）を有するが、さらに本発明の方法によって最初に同定される改変ＷＷドメインの一次アミノ酸配列への１つ以上の変異もしくは改変を含んでいるペプチド配列を意味する。そこで、本発明の改変ＷＷドメインの誘導体は、それが由来する該改変ＷＷドメインに比較して１つ以上（例えば、１、２、３、４、５つ以上）の化学改変アミノ酸側鎖を有していてよい。適切な改変には、ペグ化、シアリル化およびグリコシル化を含むことができる。これらは、非天然アミノ酸を通して、または該天然配列の化学改変を通して組み込むことができる。これに加えて、または代えて、改変ＷＷドメインの誘導体は、選択された改変ＷＷドメインペプチドの一次配列への１つ以上（例、１、２、３、４、５つ以上）のアミノ酸変異、置換もしくは欠失を含有していてよい。したがって、本発明は、最初に同定されたペプチドの１つ以上の特徴を改良または変化させるための改変ＷＷドメインを対象に実施された成熟実験の結果を含んでいる。一例として、選択された改変ＷＷドメインペプチド配列の１つ以上のアミノ酸残基は、当該技術分野において公知の手法を使用して（例えば、該コーディングＤＮＡまたはＲＮＡ配列を改変することによって）無作為に、または特異的に変異（または置換）させることができる。誘導体化ペプチドの結果として生じたライブラリーもしくは集団は、当該技術分野において任意の公知の方法によって、既定の要件、特定標的リガンドに対する改良された特異性、または改良された薬物特性（例えば、安定性、溶解性、生体内利用率、免疫原性など）にしたがって選択することができる。そのような追加もしくは改良された特徴を示すために選択された、および該改変ＷＷドメインが最初にそのために選択された活性を提示するペプチドは、該改変ＷＷドメインの誘導体と見なすことができ、本発明の範囲内に含まれる。
【００３９】
場合によっては、改変ドメインのマルチマー、例えば二量体を作成するために、例えば２つ以上の標的配列へ同時に結合させるために、本発明の改変ＷＷドメインペプチドを１つ以上の改変ＷＷドメインへコンジュゲートさせることが望ましい。標的配列は、同一もしくは異なる分子上のいずれかにあってよく、要件に依存して同一もしくは異なる配列であってよい。
【００４０】
場合によっては、本発明の改変ＷＷドメインペプチドを非ＷＷドメイン部分へコンジュゲートさせることが望ましい。用語「コンジュゲート」は、その極めて広い意味において当該技術分野で公知の付着もしくは接合の方法全てを含むために使用される。例えば、非ＷＷドメイン部分は、改変ＷＷドメインのＣまたはＮ末端のアミノ酸伸長であってよい。このアミノ酸伸長は、無作為ペプチド配列または公知のペプチド配列のいずれかであってよい。さらに、短いアミノ酸リンカー配列は、改変ＷＷドメインと非ＷＷドメイン部分との間にあってよい。本発明は、さらに該改変ＷＷドメインが例えば場合によりリンカー配列による非ＷＷドメイン成分への化学的コンジュゲーションによって結合される分子を提供する。典型的には、該改変ＷＷドメインは、いずれかの部分の活性を妨害しない部位を介して他の部分に連結させられる。用語「コンジュゲートした」は、「連結した」、「結合した」、「会合した」または「付着した」などの用語と互換的に使用される。コンジュゲーションの広範囲の共有結合および非共有結合形は当業者には公知であり、本発明の範囲内に含まれる。例えば、ジスルフィド結合、化学結合およびペプチド鎖は全て、共有結合の形態である。コンジュゲーションの非共有結合手段が好ましい場合、付着の手段は、例えばビオチン−（ストレプト）アビジン結合であってよい。抗体（もしくは抗体フラグメント）−抗原相互作用は、さらにまた本発明の改変ＷＷドメインを非ＷＷドメイン部分へコンジュゲートさせるためにも適切に使用することができる。１つの適切な抗体−抗原対合は、フルオレセイン−抗フルオレセイン相互作用である。
【００４１】
本明細書で使用する「非ＷＷドメイン部分」は、ＷＷドメインフレームワークもしくは折り畳みを含有していない実体を意味する。そこで、非ＷＷドメイン部分は、三本鎖βシートまたはβメアンダーを含んでいない。そのような非ＷＷドメイン部分には、核酸および他のポリマー、ペプチド、タンパク質、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、抗体、抗体フラグメントおよび小分子が含まれる。有益には、非ＷＷドメイン部分は、治療用分子またはターゲティング分子であってよい。
【００４２】
「非標的」は、関係するリガンドが会合ＷＷドメインペプチドによって結合されないことを意味する。例えば、野生型ＷＷドメインが単一の特異的な公知の天然標的リガンドを有する場合、全ての他のペプチド配列は非標的であろう。非標的リガンドは、会合ＷＷドメインによって結合されない。「非結合」、「結合されない」または「認識されない」および同等の記述は、関係するリガンドが、任意の結合が生理学的未満（つまり、生理学的リガンド／ドメイン濃度下で生理学的応答を作り出すことができない）であるように感知できない結合であることを意味する。例えば、該ドメインと該非標的リガンド間で何らかの結合を測定することができれば、解離定数（Ｋｄ）は、１μＭ超、例えば少なくとも１００μＭまたは少なくとも１ｍＭである。しかし天然標的リガンドに対する様々な野生型ドメインの結合親和性はまた別の方法で有意に変動する可能性があることを認識すると、非結合を標的リガンド結合に比較して判定することができる。このため便宜的には、該ドメインおよびその標的リガンド（野生型ＷＷドメインの場合には天然、または改変ＷＷドメインの場合は天然もしくは非天然であるかにかかわらず）についての解離定数は、非標的リガンドに比較してより少なくとも１０倍高い、適切には少なくとも１００倍高い、およびより適切には少なくとも１，０００倍高い。
【００４３】
本発明のＷＷドメインに対するリガンドの文脈における用語「細胞外」は、その天然状態においてはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞外環境において見いだすことができる分子またはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞外環境において見いだされる分子の一部分に当てはまる。例えば、膜結合もしくは膜貫通分子（例えば、膜結合成長因子もしくはホルモン受容体分子もしくは複合体）の細胞外ドメインは、本発明のＷＷドメインに対する細胞外リガンドを提供することができる。
【００４４】
ＷＷドメイン、フレームワークおよびライブラリー
本発明では、本出願者らは、所望の特性、例えば選択された標的リガンドに対する結合親和性についてスクリーニング可能な、改変ＷＷドメインペプチドのライブラリーを生成するために適合するＷＷドメインフレームワークを作成した。
【００４５】
当該技術分野には公知の多数のＷＷドメインが存在しており、これらＷＷドメインのいずれかは、本明細書に記載したように新規な結合分子を選択するためのＷＷドメインフレームワークとして使用するために適合する場合がある。そこで、本発明にしたがって使用するために適合するＷＷドメインには、表２に同定したＷＷドメイン配列を含むポリペプチドが含まれる。好ましくは、適切なＷＷドメイン配列には、野生型配列の一部としてであろうと、または人工的に導入されたものであろうと、該配列内の少なくとも３つの不変トリプトファン残基を備えるドメインが含まれる。
【００４６】
一実施形態では、該ＷＷドメインフレームワークは、野生型Ｐｉｎ１  ＷＷドメインペプチド配列、すなわちホスホセリンおよび／またはホスホトレオニン残基を含有する直鎖ペプチド配列に結合することが唯一証明されている第ＩＶ群ＷＷドメインであるＮ’−ＭＡＤＥＥＫＬＰＰＧＷＥＫＲＭＳＲＳＳＧＲＶＹＹＦＮＨＩＴＮＡＳＱＷＥＲＰＳＧ−Ｃ’（配列番号１）に基づいている。そこで野生型Ｐｉｎ１  ＷＷドメインは、１位にＮ末端メチオニン残基および３９位にＣ末端グリシン残基を備える３９アミノ酸ペプチド配列であると考えられる。しかし当然のことながら、Ｎ末端Ｍｅｔ−Ａｌａジペプチドは場合によりＷＷドメイン配列から削除することができるので、野生型配列のＮ末端Ｍｅｔ−Ａｌａジペプチドを削除しているＷＷドメインフレームワークおよび改変ペプチドおよび核酸配列もまた本発明の範囲内に含まれ、本明細書で開示されたと考えられる。本発明を容易に理解するため、および本明細書で使用するような内部整合性の理由から、Ｐｉｎ１に由来している本発明のＰｉｎ１  ＷＷドメイン、ＷＷドメインフレームワークおよび改変ＷＷドメインペプチド内のアミノ酸位置の番号付けは、他に特に規定しない限り配列番号１（１位でメチオニン、２位でアラニンおよび３９位でグリシンを含んでいる）にしたがっている。そこで、アミノ酸位置が特定配列、例えば配列番号１５〜２０または２６〜２９を参照して示されている場合は、特定配列の番号付けが適用される、他の場合は、番号付けは配列番号１を参照して仮定される。
【００４７】
一実施形態では、本発明のＷＷドメインフレームワークは、１７位（Ａｒｇ）〜２０位（Ｇｌｙ）を含むターン、つまり「ループ１領域」内に１つのアミノ酸欠失を有するので、該フレームワークは３８残基を含んでいる。この欠失はＰｉｎ１  ＷＷドメインのループ１領域内で１つのアミノ酸切断を作り出し、これは該ドメインを熱的に安定化させるのに役立つ可能性がある。また別の実施形態では、配列番号１のＰｉｎ１  ＷＷドメインのＭｅｔ１５はトリプトファンへ変異させられ（Ｍ１５Ｗ）、これもまた該ＷＷドメインを安定化させるのに役立つ可能性がある。適切には、本発明のＷＷドメインフレームワークは、野生型Ｐｉｎ１  ＷＷドメイン、例えば配列番号２に比較して安定性が増したＷＷドメインフレームワークを作成できるように、Ｐｉｎ１配列に比較して１７〜２０位の間のアミノ酸の欠失および変異Ｍ１５Ｗの両方を含んでいる。ループ１領域内の好ましい欠失は、配列番号１内のＳｅｒ１９（または該ＷＷドメインがまた別の起源に由来する場合は同等の位置）の欠失である。この１つのアミノ酸欠失は、例えば配列番号１５〜２０および２６〜２９の配列が配列番号１よりも少なくともアミノ酸１個短いこと、および配列番号１のＳｅｒ３８が配列番号１５〜２０および２６〜２９の３７位に対応することを意味する。
【００４８】
また別の実施形態では、本発明のＷＷドメインフレームワークは、１７〜２０位を含むターン（ループ１）内および／または２７〜３０位を含むターン（すなわちループ２領域）内で少なくとも１つのアミノ酸の挿入を有するため、該フレームワークは３９超の残基を含むことができる。これらの挿入は、また別の多様性およびリガンド認識のための多数のアミノ酸側鎖を提供するために使用可能な伸長したループ領域を作り出す。好ましくは、安定化ループ配列は、伸長したループが構造的安定性を有し、ＷＷドメインの三本鎖βシート構造の折り畳みを阻害もしくは不安定化させないように使用される。一部の実施形態では、ループ配列、例えば抗体（もしくは抗体フラグメント）からの超可変ループ領域は本発明のＷＷドメインへグラフト化させることができる。１つ以上のアミノ酸、例えば１０個まで、８個までまたは５個までのアミノ酸をループ１および／またはループ２領域内で挿入することができる。本発明のナイーブＷＷドメインライブラリーでは、挿入されたアミノ酸は、特定の有用な配列を本発明の方法において該ライブラリーから選択できるように、多様化させることができる（すなわち、それらは可変ライブラリー残基の一部であってよい）。または、該挿入の１つ以上のアミノ酸は、例えば構造的安定性または側鎖特性のために、不変性であってよい。
【００４９】
さらにまた別の実施形態では、該ＷＷドメインフレームワークは、野生型ＷＷドメイン配列の１２、１４、１７、１８、２３、２５、２７、３０および３２位から選択された位置で少なくとも１つの変異を含んでいる。このため該ＷＷドメインフレームワークがＰｉｎ１に由来する場合は、１つ以上の変異はＥ１２、Ｒ１４、Ｒ１７、Ｓ１８、Ｙ２３、Ｆ２５、Ｈ２７、Ｎ３０およびＳ３２位から選択される。これらの位置は、該ＷＷドメインのループ（ループ１およびループ２）ならびにβメアンダーの推定結合／認識表面の両方にわたって広がっている（図１を参照されたい）。適切には、該フレームワークは、配列番号１の１２、１４、１７、１８、２３、２５、２７、３０および３２位のうちの少なくとも３つ、少なくとも５つまたは少なくとも７つのアミノ酸置換を含んでいる。より適切な実施形態では、本発明のフレームワークは、配列番号１の上記に同定した位置の８または９つでアミノ酸置換を含んでいる。有益には、上記の変異に加えて、該ＷＷドメインは、少なくとも３つのトリプトファン残基（上記の表２および表３で強調表示されている）を含有している。
【００５０】
変異した位置各々でのアミノ酸残基は、非選択的に、つまり該特定アミノ酸の各々を他の１９個の天然型アミノ酸のうちの１つと置換することによって無作為化されてよい、または選択的に、つまり該特定アミノ酸の各々を残りの１９個の天然型アミノ酸の既定のサブグループからの１つと置換することによって無作為化されてよい。変異は、さらに非天然アミノ酸も含むことができる。当然のことながら、各々の選択された位置で無作為化アミノ酸を備える変異ペプチドのライブラリーを作成する１つの便宜的方法は、選択されたアミノ酸をコードする対応する核酸配列の核酸コドンを無作為化することである。この場合には、該ライブラリーから発現した任意の個別ペプチドにおいて、２０個の天然型アミノ酸のいずれかを無作為化位置で組み込むことができる。このため、場合によっては（例えば、およそ５％）、野生型アミノ酸残基は偶然に「無作為に」組み込まれる。このため、本発明のＷＷドメインフレームワーク核酸は、上記に規定した位置全９つで無作為化コドンを有していてよく、改変ＷＷドメインペプチドはそれらの選択された位置の１つ以上で野生型アミノ酸を有していてよい。これとは対照的に、該野生型配列の選択されたアミノ酸をアミノ酸の既定のサブグループからの１つで置換することによって（例えば、インテリジェントコドン無作為化によって）、該ライブラリーメンバーのいずれかが偶然に選択された場所で野生型残基を組み込むことができるか否かを規定することができる。または、プレチャージｔＲＮＡを使用すると、変異させる位置のいずれか１つ以上で非天然アミノ酸を導入することができる。非天然アミノ酸を用いたｔＲＮＡアミノアシル化の他の方法には、特定の４つの塩基コドンを有していてよいリボザイムもしくは変異アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）の使用が含まれる（Ｕｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  １０，  １２５−１３４）。
【００５１】
ＷＷドメインフレームワークの一実施形態では、Ｅ１２、Ｒ１４、Ｙ２３、Ｆ２５、Ｈ２７およびＮ３０位は、２０個の天然型アミノ酸のいずれか１つと置換させられ、Ｒ１７、Ｓ１８およびＳ３２位はＡ、Ｇ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｔ、Ｓ、Ｐ、ＨおよびＱの群のアミノ酸のいずれか１つと置換させられる。より適切には、該ＷＷドメインフレームワークは、Ｓｅｒ１９の欠失およびＭｅｔ１５Ｔｒｐの置換の一方または両方をさらに含んでいる。
【００５２】
そこで、本発明のナイーブＷＷドメインフレームワークペプチドライブラリーは、配列、Ｎ’−ＭＡＤＥＥＫＬＰＰＧＷＸ１ＫＸ２ＷＳＸ３Ｘ４ＧＲＶＸ５ＹＸ６ＮＸ７ＩＴＸ８ＡＸ９ＱＷＥＲＰＳＧ−Ｃ’（配列番号２）、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８は２０個の天然型アミノ酸のいずれか１つを表し、Ｘ３、Ｘ４およびＸ９は、アミノ酸Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｔ、Ｓ、Ｐ、ＨおよびＱのいずれか１つを表し、対応する野生型Ｐｉｎ１配列のＭｅｔ１５はＴｒｐで置換されており、野生型Ｐｉｎ１  ＷＷドメインのＳｅｒ１９は欠失している、を有する。該対応するＷＷドメインフレームワーク核酸ライブラリー（ＰｉｎＬｉｂ、配列番号３、と称する）では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８はＮＮＢコドンによってコードさ、ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＴおよびＧの等価の混合物を表し、およびＢはＣ、ＧおよびＴである、ならびにＸ３、Ｘ４およびＸ９はＶＶＭコドンによってコードされ、このときＶはＡ、ＣもしくはＧであり、ＭはＡもしくはＣである。しかし当然のことながら、当該ペプチドの末端領域は本発明のＷＷドメインの折り畳みもしくは結合特異性に有害な影響を及ぼすことなく改変および欠失もしくは付加を受けやすい可能性がある（例えば、ＮおよびＣ末端アミノ酸は標的リガンドとの結合相互作用に直接的に含まれないと考えられる）。そこで、ＷＷドメインペプチドを選択するために好ましいＷＷドメインフレームワークライブラリー、およびそこで本発明の有用なＷＷドメインペプチドは、改変された配列番号１配列のアミノ酸６〜３８または配列番号２のアミノ酸６〜３７の配列のいずれかに対応するアミノ酸配列、ＫＬＰＰＧＷＸ１ＫＸ２ＷＳＸ３Ｘ４ＸａＧＲＶＸ５ＹＸ６ＮＸ７ＩＴＸ８ＡＸ９ＱＷＥＲＰ、ここで、Ｘ１〜Ｘ９は任意のアミノ酸を表し、Ｘａは場合により任意のアミノ酸であるまたは存在しない、（配列番号３１）を含む可能性がある。このため、本発明の最も好ましいＷＷドメインフレームワークライブラリーおよび最も好ましいＷＷドメインペプチドは、アミノ酸配列、ＫＬＰＰＧＷＸ１ＫＸ２ＷＳＸ３Ｘ４ＧＲＶＸ５ＹＸ６ＮＸ７ＩＴＸ８ＡＸ９ＱＷＥＲＰ（配列番号３２）、ここで、Ｘ１〜Ｘ９は任意のアミノ酸を表す、または上記に指示したように規定することができる、を含む可能性がある。標的リガンドに依存して、各Ｘ位置での組み込みのために好ましいアミノ酸のサブグループ（配列番号２に関して）は、実施例の項に報告されており、本発明の範囲内に含まれる。
【００５３】
場合によっては、例えば所望の改変ＷＷドメインペプチドの発現、スクリーニングまたは選択において役立つために、ＷＷドメインフレームワークペプチドを融合タンパク質として発現させるのが有益でありうる。一実施形態では、ＷＷドメインフレームワークペプチドは、ＮもしくはＣ末端でリンカー配列を備えて発現させられる。特に好ましい実施形態では、ＷＷドメインフレームワークペプチドは、Ｃ末端でＧＳＧＳＳ（配列番号３３）アミノ酸リンカーを含んでおり、ＷＷドメインフレームワーク核酸配列は対応する核酸配列を含んでいる。このリンカーは、本発明のＷＷドメインフレームワークペプチドをＣＩＳ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ系における発現および選択のため、ＲｅｐＡタンパク質に融合させるために便宜的である。
【００５４】
上記では主としてＰｉｎ１に由来するＷＷドメインフレームワークに関連付けて記載してきたが、当然のことながら、他のＷＷドメイン、例えば表２または３に列挙したドメインを代りに使用することができる。場合によっては、特定の動物または生体、例えばヒト、霊長類、ブタもしくはマウスに由来するフレームワークを使用するのが望ましい。ハイブリッドＷＷドメインからフレームワークを引き出すことが有益な場合もある。例えば、１つのＷＷドメインの１つ以上のループ配列またはβストランドは特性の様々な（非天然）組み合わせを提供するために相違するＷＷドメインのループもしくはβストランド配列で置換されてもよい。本発明のＷＷドメインフレームワークがそれに由来してよい特に適切なＷＷドメインには、表２に列挙したＷＷドメイン、特にホルミン結合タンパク質４（ＦＮＢＰ４）、アミロイドβＡ４前駆体タンパク質結合ファミリーＢメンバー１、２もしくは３（ＡＰＢＢ１、２、３）、ＰＣＩＦ１、ポリグルタミン結合タンパク質１（ＰＱＢＰ１）、ＰＲＰ４０、ＲＨＧ１２、ＲＨＧ２７、タンパク質サルバドール（ｓａｌｖａｄｏｒ）ホモログ１（ＳＡＶ１）、ＢＣＬ２関連アタノジーン（ａｔｈａｎｏｇｅｎｅ）産物（ＢＡＧ３）、ＳＥＣ２３、Ｔ細胞受容体γタンパク質（ＴＣＲＧ）、ＷＷＣ、ＷＷＯＸまたはＹＦＢタンパク質が含まれる（表３）。
【００５５】
【表３】
2013537417.tif 000006
【００５６】
ライブラリーからのペプチドの発現および特性付け
本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、便宜的にはＷＷドメインフレームワークに由来するペプチドのライブラリーをスクリーニングする工程によって選択することができる。スクリーニングは、当業者には公知の、例えば以下に同定するような任意のライブラリー生成および選択システムを用いて実施することができる。
【００５７】
１つのアプローチは、６〜１０個のアミノ酸ペプチドの無作為化ライブラリーを化学合成することによって候補ペプチドの混合集団を生成することである（Ｊ．  Ｅｉｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．，  １５，  ４８１−４９６、Ｋ．  Ｌａｍ（１９９６）  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．，  １２，  １４５−１６７、およびＭ．  Ｌｅｂｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２８９，  ３３６−３９２）。また別のアプローチでは、候補ペプチドは、はるかに大きなサイズのペプチドをバクテリオファージの表面上で発現可能にする、無作為化オリゴヌクレオチドライブラリーをＦｆ線維状ファージ遺伝子内にクローニングする工程によって合成される（Ｈ．  Ｌｏｗｍａｎ  （１９９７）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．，  ２６，  ４０１−４２４、およびＧ．  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．，  ２１７，  ２２８−２５７）。長さ３８アミノ酸までの無作為化ペプチドライブラリーも作成されており、このシステムを使用するとより長いペプチドが達成可能である。これらの戦略のいずれかを使用して生成されるペプチドライブラリーは、次に典型的には予備選択されたマトリックス結合タンパク質標的と混合される。結合するペプチドは溶出され、それらの配列が決定される。この情報から、新規なペプチドが合成され、それらの生物学的特性を評価することができる。
【００５８】
そのような先行技術の方法の潜在的欠点は、典型的にはファージディスプレイおよび化学合成の両方を用いて生成されるライブラリーのサイズが１０６〜１０９の範囲内に制限されることである。この制限は、時間のかかる成熟工程が続いて使用されない限り、標的リガンドの相当に低い結合親和性のペプチドの単離が生じる可能性ができる。このライブラリーサイズの制限は、特に、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，  ＆  Ｓｚｏｓｔａｋ  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９４，  １２２９７−１２３０２）、リボソームディスプレイ（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１，  ９０２２−９０２６）、およびＣＩＳディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １０１  ２８０６−２８１０）を含むペプチドライブラリーをｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成するための技術の開発をもたらした。これらのライブラリーは、生成されたライブラリーのサイズがファージディスプレイを用いて可能なサイズより２〜５桁大きいという点で、ファージディスプレイライブラリー（および他のｉｎ  ｖｉｖｏベース法）より優れている可能性がある。これは、ファージディスプレイなどの技術とは相違して、該ライブラリーからの核酸配列のクローニングおよび形質転換を必要とする中間のｉｎ  ｖｉｖｏ工程がないためである。このため、ライブラリーメンバーの発現および選択は、有益にもＷＷドメインフレームワーク由来のペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成ライブラリーのｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイを用いて実施することができる。
【００５９】
本明細書で使用する用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ」、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチドディスプレイ」および「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成ライブラリー」は、ペプチドライブラリーが、該発現したペプチドがそれらをコードする特定核酸と会合する、および該会合が該核酸を用いた細胞もしくは細菌の形質転換に続いて生じない、または必要としない方法で発現させられる系を意味する。したがって、これらの系は「無細胞」と呼ぶことができる。そのような系は、ペプチドとそれらのコードされた核酸との会合が該核酸を用いた細胞もしくは細菌の形質転換に続いて生じるファージディスプレイおよび他の「細胞」もしくは「ｉｎ  ｖｉｖｏディスプレイ」系とは対照的である。本発明の好ましい実施形態では、ＣＩＳディスプレイ系（例えば、国際公開公報第２００４０２２７４６号パンフレット、同第２００６０９７７４８号パンフレットおよび同第２００７０１０２９３号パンフレットに記載されている）は、改変ＷＷドメインを選択するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ系として使用される。
【００６０】
選択された標的リガンドに対する選択された改変ＷＷドメインペプチドの結合親和性は、当業者には公知の技術、例えばトリプトファン蛍光発光分光法、等温熱量測定法、表面プラズモン共鳴法またはバイオレイヤー干渉法を使用して測定することができる。バイオセンサーアプローチは、Ｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  ‘‘Ａ  ｇｌｏｂａｌ  ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ｓｔｕｄｙ  ｕｓｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ’’，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ３８６，１９４−２１６に概説されている。例えば、１つの方法では、ＷＷドメインについての解離定数は、適切なバッファー溶液、例えば１０ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ６．０）中のリガンドに対するドメインの滴定によって決定される。該ドメインおよびリガンドは２分間混合され、トリプトファン蛍光における変化は２９８ｎＭでの励起および３４０もしくは３５０ｎＭでの検出後に監視される。データポイントは、典型的には１０秒間にわたって平均化される。または、化学合成されたＷＷドメインとリガンドとの間のリアルタイム結合アッセイは、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄシステムを用いたバイオレイヤー干渉法（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社、カリフォルニア州メンローパーク）を用いて実施することができる。ビオチン化ＷＷドメインは、ＰＢＳ中濃度５０ｎｇ／μＬでストレプトアビジンバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社）に固定される。会合曲線は、次にＷＷドメイン被覆センサーを様々な濃度のリガンド（例えば、ＰＢＳ中１〜１００ｎＭ）をインキュベートすることによって検出され、解離は、ＰＢＳ中で該センサーをインキュベートすることによって検出される。ＷＷドメイン結合に対する解離定数は、定常状態分析によって決定することができる。
【００６１】
本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、標的リガンドに対するμＭ以上の結合親和性を有する。適切には、本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、その標的リガンドに対するｎＭもしくはｎＭ未満、例えば１μＭ未満、およそ９００ｎＭ未満、およそ７００ｎＭ未満、およそ５００ｎＭ未満またはおよそ３００ｎＭ未満の結合親和性を有する。いっそうより適切な実施形態では、該改変ＷＷドメインペプチド、（適切な解離定数によって測定して）およそ２００ｎＭ未満、およそ１００ｎＭ未満またはおよそ１０ｎＭ未満の親和性を有する。一部の特に好ましい実施形態では、該改変ＷＷドメインペプチドのその標的リガンドに対する親和性は、ｐＭ範囲内にある。
【００６２】
好ましくは、標的リガンドは、リガンドであり、それに該改変ＷＷドメインペプチドが由来する野生型ＷＷドメインの非天然リガンドである。そのような実施形態では、該改変ＷＷドメインペプチドのその（非天然）標的リガンドに対する親和性は、適切には、次に該改変ドメインに対する非標的リガンドであると考えられる、対応する野生型ＷＷドメインの天然リガンドに対する親和性より少なくとも１０倍高い。より適切には、（非天然）標的リガンドに対する親和性は、対応する野生型ＷＷドメインの天然リガンドに対する親和性より少なくとも５０倍、少なくとも１００倍または少なくとも１，０００倍高い。
【００６３】
一部の実施形態では、改変ＷＷドメインに対する標的リガンドは、対応する野生型ＷＷドメインの天然標的リガンドと同一であってよい。これらの実施形態では、該改変ＷＷドメインペプチドの該標的リガンドに対する親和性は、有益には該野生型ＷＷドメインの親和性より少なくとも２倍高い、または少なくとも５倍高い。適切には、該天然リガンドに対する該改変ドメインの親和性の増加は容易に判別可能であり、該野生型ペプチド配列全体への親和性における増加は、該野生型ドメインの親和性より少なくとも１０倍、少なくとも２５倍または少なくとも５０倍高い。一部の特に有益な実施形態では、該改変ＷＷドメインペプチドの該標的リガンドに対する親和性は、該野生型ＷＷドメインの親和性より少なくとも１００倍高い、または少なくとも１，０００倍高い。
【００６４】
ライブラリーからのペプチドのスクリーニングおよび選択
本発明は、ライブラリー（例えば、ナイーブライブラリー）から所望の特性を有するペプチドを生成および選択するためのペプチドスカフォールド／フレームワークの分野およびさらに所望の薬剤学的特性についてのペプチドライブラリーのスクリーニングを可能にすることによる薬剤開発において有意な前進を表す。
【００６５】
本発明のこの態様の一実施形態によると、複数の改変ＷＷドメインペプチドをコードするｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成核酸ライブラリーが合成され、最初にそれらが所望の標的リガンドに結合する能力が選択される。特に有益な方法では、ペプチドは、各改変ＷＷドメインペプチドが、融合タンパク質をコードし、複合体を形成する核酸（ＤＮＡ）分子内の標的配列に結合するＲｅｐＡへの融合タンパク質として発現させられるＣＩＳ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ系内で合成される。この方法で、改変ＷＷドメイン（ペプチド）は、ペプチド−核酸複合体としてそれをコードする（つまり、遺伝子型および表現型がリンクされる）核酸に連結される。
【００６６】
該リガンドは、天然型もしくは非天然型分子、例えば有機もしくは無機小分子、炭水化物、ペプチドまたはタンパク質配列であってよい。該リガンドは、全分子またはより大きな分子の一部（例えば、タンパク質のドメイン、フラグメントまたはエピトープ）であってよく、そして細胞内もしくは細胞外標的分子であってよい。有益な実施形態では、標的は、治療使用のためにより容易にターゲティング可能な細胞外リガンドである。
【００６７】
便宜的には、遊離ＷＷドメインからリガンド結合改変ＷＷドメインペプチドの分離において役立つように、該リガンドは固体支持体と関連付けることができる、さもなければ固体支持体に付着させることができる。例えば、固体支持体はプレート、チューブまたはウエルの表面であってよい。または、固体支持体は、ビーズ、例えば磁気もしくはアガロースビーズであってよい。一実施例では、ビーズは、ポリスチレン被覆磁気ビーズである。固体支持体は、任意の適切な方法を使用して該リガンドで被覆することができる。例えば、リガンドは、適切なバッファー（例えばＰＢＳ）中の磁気ビーズ、例えば、ＴＡＬＯＮ（登録商標）磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）に加えることができ、ある期間インキュベートすることができる。インキュベーションは、便宜的にはロータリーミキサー上で混合しながら室温で実施することができる。使用前に、ビーズは、例えばＰＢＳバッファーを用いて３回洗浄することができる。
【００６８】
リガンド（好ましくは固定された）は、次にＷＷドメインフレームワークペプチドのライブラリーと、典型的には該発現したＷＷドメインペプチドを該リガンドとともにインキュベートすることによって接触させられる。便宜的な一実施形態では、ペプチドライブラリーは、クローニングおよび形質転換工程の使用を必要としないｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合転写および翻訳系内で発現させられる。適切なインキュベーション時間後、磁気ビーズは、例えば、リガンド結合ペプチド−核酸複合体を遊離液／懸濁液中に残留する非会合複合体から分離できるように、重力および／または磁力下でペレット化することができる。
【００６９】
非会合複合体は、吸引によって、および典型的には、適切なバッファーおよび／または界面活性剤を使用する１つ以上の洗浄工程を用いて、または当業者には公知の任意の他の手段によって取り除くことができる。便宜的バッファーはＰＢＳであるが、当該技術分野で公知の他の適切なバッファーも使用することができる。混合物を洗浄することによって、標的リガンドと会合することのできない（または洗浄条件下で会合したままであるには会合が弱過ぎる）ライブラリーメンバーおよび（例えば、解離した複合体からの）遊離核酸分子は選択から除くことができる。
【００７０】
少なくとも１ラウンドの発現、結合および選択は、所望の特徴のために改変ＷＷドメインペプチドの集団（およびそれらの会合核酸）を富化させるために実施される。典型的には、２、３、４、５ラウンド以上の選択を実施することができる。その後の各選択ラウンドでは、所定の基準、特に結合条件は、例えば所望の特性、例えば高い親和性、高い特異性などを有する改変ＷＷドメインペプチドの選択を強化するために改変できる。
【００７１】
各選択ラウンドの終了時および該手法の終了時に、本リガンド会合改変ＷＷドメインペプチドを回収し、該会合核酸をシーケンシングする工程によって個別に特性付けることができる。場合により、本ペプチドは、所望のリガンド結合特性を確認するために該コードされたＷＷドメインを発現させる、または合成することによって特性付けることができる。有益には、本発明の改変ＷＷドメインペプチドおよび／または核酸は単離することができる。しかし改変ＷＷドメインの混合集団は、本発明の方法によって、例えばこのとき２つ以上のペプチド−核酸複合体が該標的リガンドと会合している場合に入手することができる。この事象では、本発明は、標的リガンドに結合する改変ＷＷドメインの混合集団も含んでいる。
【００７２】
動物、例えばヒトにおける治療で用いられる改変ＷＷドメインペプチドに関して意図されている上記の方法の変形では、該改変ＷＷドメインペプチドは、特定プロテアーゼに対する耐性のためにさらに選択するために、標的動物にとって内因性である（例えば、関係する動物の循環血流内にある）１つ以上のプロテアーゼに曝露させることができる。例として、該プロテアーゼは、１つ以上のヒトプロテアーゼ、例えばキモトリプシン、トリプシン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼおよびエラスターゼから選択されてよい。
【００７３】
本発明の選択およびスクリーニング法は、任意の所望の標的リガンドに結合させるために改変ＷＷドメインペプチドの選択に適用することができる。適切なリガンドは、成長因子、受容体、チャネル、豊富な血清タンパク質、ホルモン、微生物抗原を含むことができる。潜在的標的リガンドの特定の例には、ＶＥＧＦＲ２およびＮＧＦが含まれる。
【００７４】
核酸およびペプチド
本発明による改変ＷＷドメインペプチド、および必要に応じて、非ＷＷドメインペプチド成分にコンジュゲートした改変ＷＷドメインペプチドは、組み換えＤＮＡ技術ならびに標準タンパク質発現および精製法によって生成することができる。そこで本発明は、本発明のＷＷドメインペプチドならびにそれらの誘導体をコードする核酸分子、および核酸構築物、例えば本発明によるペプチドおよび誘導体をコードする核酸を含む発現ベクターをさらに提供する。例えば、会合ペプチドをコードするＤＮＡを適切な発現ベクター（例、ｐＧＥＭ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）内に挿入できるが、このとき該ＤＮＡは適切な発現配列に機能的に連結させられ、従来型技術にしたがってタンパク質発現のために適切な宿主細胞へ形質転換させられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）。適切な宿主細胞は、培養中で増殖することができ、細菌、真菌細胞および高等真核生物起源の細胞、好ましくは哺乳動物細胞を含む外因性ＤＮＡを用いて形質転換され易い宿主細胞である。本発明のペプチドを精製するのに役立つよう、本発明のＷＷドメインペプチド（および対応する核酸）は、精製配列、例えばＨｉｓ−ｔａｇを含むことができる。それに加えて、またはそれに代えて、該改変ＷＷドメインペプチドを、例えば、他のタンパク質と融合させて増殖させ、細菌細胞から不溶性封入体として精製することができる。これは特に、合成される改変ＷＷドメインペプチドがその中で発現させられる宿主細胞にとって毒性である可能性がある場合に便宜的である。または、改変ＷＷドメインペプチドは、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ（転写および）翻訳系（例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）Ｓ３０抽出系、Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。
【００７５】
用語「機能的に連結した」は、例えば発現ベクターもしくは構築物中のＤＮＡ配列に使用された場合、該配列が、それらが所定の目的を達成するために協調的に機能するように、つまりプロモーター配列が終止配列に関する限り連結したコーディング配列を通して進行する転写が開始するように配列される。
【００７６】
所望の改変ＷＷドメインペプチドを選択および単離すると、追加の官能基、例えば第２治療用分子を次に任意の適切な手段によって該ＷＷドメインペプチドへ付着させることができる。例えば、改変ＷＷドメインペプチドは、任意の適切な形態の治療用分子、例えば抗体、酵素または小さな化合物へコンジュゲートさせることができる。これは特に、本発明の改変ＷＷドメインペプチドが第２治療用分子によって治療可能な特定の細胞もしくは生体を標的とする、またはそれらと会合させることができる用途において特に有用である。本発明のペプチドまたは核酸に付着または連結させることのできる治療用分子の好ましい形態は、標的細胞においてＲＮＡｉを誘導することができるｓｉＲＮＡである。典型的には、化学的リンカーが、ｓｉＲＮＡ分子をペプチド、例えばＷＷドメインへ連結させるために使用されるであろう。例えば、核酸もしくはＰＮＡは、マレイミド基がペプチド上にありチオールが核酸上にあるマレイミド−チオール結合、または遊離システイン基がペプチド上にありチオール基が核酸上にあるジスルフィド結合を通してＷＷドメインペプチドへ連結させることができる。ＷＷドメインペプチドは、さらにまた宿主の免疫細胞を動員する分子にコンジュゲートさせることもできる。そのようなコンジュゲートＷＷドメインペプチドは、特に癌治療薬としての使用に有用な可能性がある。
【００７７】
さらにまた別の実施形態では、該ＷＷドメインは抗体分子、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ）または他の適切なターゲティング剤に直接的にコンジュゲートすることができるので、該改変ＷＷドメインペプチドおよび任意の追加のコンジュゲート成分は、例えば、２つの別個の細胞を同一ＷＷドメイン−抗体融合によってターゲティングできるように、または２つの別個の受容体を該ＷＷドメイン−抗体融合によって結合できるように二官能バインダーを生成して、所望の治療もしくは診断のために必要とされる特異的細胞集団にターゲティングされる。
【００７８】
治療用組成物
本発明の改変ＷＷドメインペプチドは、動物、好ましくはヒトを治療する際に使用するための医薬組成物中に組み込むことができる。本発明の治療用ペプチド（またはその誘導体）は、ＷＷドメインフレームワークライブラリーから改変ＷＷドメインペプチドを選択するためのリガンドに依存して、１つ以上の疾患または感染症を治療するために使用することができる。または、該治療用ペプチドをコードする核酸を発現構築物中に挿入し、同一目的で医薬製剤／医薬品中に組み込むことができる。
【００７９】
本発明の治療用ペプチドは、特に、例えば動物の循環血もしくはリンパ液中の細胞外でターゲティング（および治療）可能な疾患、状態およびまたは感染を治療するため、およびさらにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ用途のために適合する可能性がある。本発明の治療用核酸は、より好ましくは細胞内でターゲティング（および治療）される疾患、状態および／または感染の治療ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ用途のために特に適合する可能性がある。本明細書で使用する用語「治療薬」および「活性薬剤」は、本発明の治療用改変ＷＷドメインペプチドをコードするペプチドおよび核酸の両方を含んでいる。
【００８０】
本発明の改変ＷＷドメインペプチドおよび核酸のための治療使用および用途には、様々な新生腫瘍および非新生腫瘍疾患および障害、癌／新生腫瘍疾患および関連状態（例えば、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、口腔癌、結腸直腸癌、肝臓癌、卵巣癌、莢膜細胞腫、男化腫瘍、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛性腫瘍、頭頸部癌、上咽頭癌、喉頭癌、肝芽細胞腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽細胞腫、膵臓癌、網膜芽腫、星状細胞腫、膠芽細胞腫、シュワン腫、乏突起膠腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌、母班症に関連する異常血管増殖、浮腫−例えば脳腫瘍およびメーグス症候群に関連する浮腫）、非新生腫瘍状態、例えば頭部外傷、脊髄損傷、急性高血圧、髄膜炎、脳炎、膿瘍、出血、脳マラリア、放射線、多発性硬化症、心停止、出生児仮死、グルタミン酸毒性、脳症、低酸素症、虚血、もしくは腎臓透析、脳卒中、子宮内膜症、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および未熟児網膜症を含む他の増殖性網膜症、糖尿病、糖尿病性黄斑浮腫、後水晶体繊維増殖症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性症、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、角膜および他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水、心膜液貯留（例えば心膜炎に関連する心膜液貯留）ならびに胸水および浮腫を治療するための抗ＶＥＧＦ薬が含まれる。本発明の分子および組成物の他の治療使用には、微生物感染症および関連状態、例えば細菌、ウイルス、真菌または寄生虫感染症の治療が含まれる。
【００８１】
１つ以上の追加の薬学的に許容される担体（例えば、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ））は、医薬組成物中で本発明の治療用ペプチドと結合することができる。適切な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎによる‘‘Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ’’に記載されている。本発明の医薬製剤および組成物は、規制基準に準拠するよう調製されており、経口、静脈内、局所または他の標準経路によって投与することができる。
【００８２】
本発明によると、治療用ペプチドもしくは核酸は、医薬品に製造できる、または医薬組成物に調製することができる。被験者に投与される場合、治療薬は、適切には薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物の成分として投与される。本発明の分子、化合物および組成物は、便宜的経路、例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、膣内、経皮、経直腸、吸入によって、または皮膚へ局所的に投与することができる。投与は、全身性または局所性であってよい。公知である送達系には、例えば、マイクロジェル、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへの封入が含まれ、本発明の化合物を投与するために使用できる。当該技術分野で公知の任意の他の適切な送達系も、本発明の使用に想定されている。
【００８３】
許容される医薬ビヒクルは、液体、例えば水および石油、動物、植物もしくは合成起源の油を含む油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油であってよい。医薬ビヒクルは、食塩液、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであってよい。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤を使用することができる。被験者に投与される場合、薬学的に許容されるビヒクルは、好ましくは無菌性である。水は、本発明の化合物が静脈内投与される場合に適切なビヒクルである。食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、液体ビヒクルとして、特に注射液のために使用することができる。適切な医薬ビヒクルには、さらに賦形剤、例えばデンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。本組成物は、所望であれば、さらに微量の湿潤化もしくは乳化剤または緩衝剤も含有することができる。
【００８４】
本発明の医薬品および医薬組成物は、液体、溶液、懸濁液、ローション剤、ジェル剤、錠剤、丸剤、ペレット剤、粉末剤、放出調節製剤（例えば、徐放性もしくは持続放出性）、坐剤、乳剤、エーロゾル剤、スプレー剤、カプセル剤（例えば、液体もしくは粉末を含有するカプセル剤）、リポソーム剤、微粒子剤または当該技術分野で公知の任意の他の適切な製剤の形態を取ることができる。適切な医薬ビヒクルの他の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  １９ｔｈ  ｅｄ．，  １９９５に記載されており、例えば１４４７〜１６７６ページを参照されたい。
【００８５】
適切には、本発明の治療用組成物もしくは医薬品は、経口投与（より適切には人間のための）に適した医薬組成物としてルーチン方法にしたがって調製される。経口送達のための組成物は、例えば錠剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁剤、顆粒剤、粉末剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤もしくはエリキシル剤の形態にあってよい。そこで一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは、カプセル剤、錠剤または丸剤である。
【００８６】
経口投与される組成物は、薬学的に口当たりのよい調製物を提供するための１つ以上の物質、例えば甘味料、例えばフルクトース、アスパルテームもしくはサッカリン、フレーバー剤、例えばペパーミント、ウィンターグリーンもしくはチェリーの油、着色剤、および保存料を含有することができる。本組成物が錠剤もしくは丸剤の形態にある場合、本組成物は、長時間にわたって活性物質を持続放出できるように、消化管内での分解および吸収を遅延させるためにコーティングされてよい。浸透活性駆動化合物を取り囲む選択的透過膜は、経口投与された組成物にも適合する。これらの投与形態において、流体はカプセルを取り囲んでいる環境から、開口部を通して物質もしくは物質組成物と置換するために膨潤する駆動化合物によって吸収される。これらの剤形は、即時放出性製剤の強化プロファイルとは対照的に本質的にゼロ次送達プロファイルを提供することができる。時間遅延材料、例えばモノステアリン酸グリセロールまたはステアリン酸グリセロールも使用することができる。経口組成物は、標準ビヒクル、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。そのようなビヒクルは、好ましくは医薬品グレードである。経口製剤の放出場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸または回腸）または大腸であってよい。当業者は、胃の中では溶解しないが十二指腸または腸内の他の場所で該物質を放出する調製物を調製することができる。適切には、この放出は胃環境での有害作用を該ペプチド（もしくは誘導体）の保護または胃の環境を越えた、例えば腸内での該ペプチド（もしくは誘導体）の放出のいずれかによって回避する。完全な胃の耐性を保証するために、少なくともｐＨ５．０で不浸透性のコーティングが必須であろう。腸溶コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分の例として、酢酸トリメット酸セルロース（ＣＡＴ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ  ５０、ＨＰＭＣＰ  ５５、ポリ酢酸フタル酸ビニル（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓおよび混合フィルムとして使用可能なシェラックが挙げられる。
【００８７】
治療用物質もしくは核酸（もしくは誘導体）の水性環境内への溶解に役立つように、湿潤剤として界面活性剤を加えることができる。界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウムおよびジオクチルスルホン酸ナトリウムを含むことができる。カチオン性界面活性剤を使用することができ、塩化ベンズアルコニウムまたは塩化ベンゼトミウムを含むことができよう。製剤中に界面活性剤として含むことができる潜在的非イオン性界面活性剤には、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート２０、４０、６０、６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが含まれる。これらの界面活性剤は、使用の際、該ペプチドまたは核酸または誘導体の製剤中に単独でまたは様々な比率の混合物として存在することができよう。
【００８８】
典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌等張性水性バッファーを含んでいる。必要に応じて、本組成物は可溶化剤も含むことができる。
【００８９】
本発明の治療用組成物のまた別の適切な投与経路は、肺または鼻腔送達である。
【００９０】
添加物、例えば脂肪酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸は、本発明の治療用ペプチド（もしくは誘導体）または核酸の細胞取り込みを強化するために含めることができる。
【００９１】
１つの医薬組成物では、本発明の改変ＷＷドメインペプチドもしくは核酸（および場合により任意の関連する非ＷＷドメイン部分、例えば治療用分子もしくはターゲティング部分）は、リポソームの集団（すなわち、脂質小胞もしくは他の人工膜封入区画）と、該治療用物質および場合により非ＷＷドメイン部分を含有する治療用リポソーム集団を作り出すために混合することができる。該治療用リポソーム集団は、次に任意の適切な手段、例えば静脈内注射によって患者に投与することができる。該治療用リポソーム組成物を特に特定の細胞タイプ、例えば特定の微生物種または感染細胞もしくは異常細胞をターゲティングするために必要な場合は、該リポソーム組成物は追加して適切な抗体ドメインなど（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ）または標的細胞タイプを認識するまた別のターゲティング部分とともに調製することができる。そのような方法は当業者には公知である。
【００９２】
本発明の治療用ペプチドもしくは核酸は、被験者の皮膚へ局所投与するための組成物に調製することもできる。
【００９３】
本発明の改変ＷＷドメインペプチドおよび核酸は、非医薬用途、例えば診断検査、イメージングにおいて、精製用の親和性試薬および送達ビヒクルとして有用な可能性もある。
【００９４】
以下では本発明をさらに非限定的実施例によって具体的に説明する。
【実施例】
【００９５】
他に特に指示しない限り、市販の試薬ならびに分子生物学および生化学における標準技術を使用した。
【００９６】
材料および方法
本出願人らが使用した以下の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９上記参照、ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｎ  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅに記載されている。汎用試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（英国ドーセット州プール）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社（英国サフォーク州へーバリル）またはＧｅｎｅｌｉｎｋ社（米国ニューヨーク州ホーソーン）から入手した。アミノ酸およびＳ３０抽出物は、Ｐｒｏｍｅｇａ社（英国ハンプシャー州サウサンプトン）から入手した。酵素およびポリメラーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社（英国ヒッチン）から入手した。Ｆｍｏｃアミノ酸はＡｃｔｉｖｏｔｅｃ社（英国ケンブリッジ）またはＭｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（独国ダルムシュタット）によって供給され、化学薬品および溶媒はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（英国レスターシャー州ラフバラ）から購入した。
【実施例１】
【００９７】
Ａ．  ライブラリーの構築
改変Ｐｉｎ１  ＷＷドメインフレームワークライブラリー（改変Ｐｉｎ１  ＷＷドメインのライブラリーを生成するため）は、変異Ｐｉｎ１ドメインの１つの表面上に置かれた残基を無作為化することによって作成した（図１）。配列番号１は、野生型Ｐｉｎ１  ＷＷドメインのアミノ酸配列を示している。該ペプチドフレームワークは、３段階で構築した。
（１）野生型配列のループ１を１アミノ酸短縮した。
（２）Ｍｅｔ１５をＴｒｐと置換した。
（３）残りのアミノ酸位置の内の９つを無作為に変異させた。
【００９８】
最初の２段階は、野生型Ｐｉｎ１  ＷＷドメイン（配列番号１２）より高い熱安定性を有する特異的に変異したＰｉｎ１  ＷＷドメインフレームワークを生成する。第３段階は、次にそれから所望の特性を有する改変ＷＷドメインを選択することができるナイーブフレームワークライブラリーを作成する。
【００９９】
該フレームワークペプチドライブラリーは、対応する核酸コーディング配列（配列番号３）を変異させるためにＰＣＲを使用して配列番号２におけるＸ１〜Ｘ９位でアミノ酸を無作為化することによって作成する。例示したように、無作為化を生じさせるためには、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８位でアミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレットを、これらの位置で２０個の天然型アミノ酸のいずれかが組み込まれるようＮＮＢ、ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＴおよびＧの等価混合物を表し、ＢはＣ、Ｇ、Ｔであってよい、へ変異させる。配列番号２のＸ３、Ｘ４およびＸ９位をコードするヌクレオチドトリプレットを、１２個のアミノ酸（つまり、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｔ、Ｓ、Ｐ、ＨおよびＱ）のいずれかをコードするＶＶＭコドン、ここで、ＶはＡ、Ｃ、Ｇであり、ＭはＡもしくはＣである、へ変異させた。アミノ酸のこのサブグループの選択は、該ライブラリー内の構造的機能的残基の相対比率を、ターンもしくはループ内に最も適応させられると考えられたアミノ酸側鎖をコードすることによって上げるために行った。当然のことながら、様々なアミノ酸のためのコドン使用のために、各無作為化位置での様々なアミノ酸の表示は同等に分布しない可能性がある。さらに当然のことながら、他のコドンもまた安定性もしくは活性に寄与しうるＸ３、Ｘ４およびＸ９位に適応する可能性がある。
【０１００】
ＣＩＳディスプレイライブラリーにおいて改変Ｐｉｎ１  ＷＷドメインペプチドの各々を発現させるために、該フレームワーク核酸ライブラリーは、ＷＷドメインペプチドのＣ末端（配列番号１４）でＧＳＧＳＳ（配列番号３３）アミノ酸リンカーをコードする３’配列を含んでいる。ＧＳＧＳＳ配列は、該ＷＷドメインのＣ末端をＲｅｐＡタンパク質のＮ末端へ連結させる。
【０１０１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＣＩＳディスプレイ）ライブラリーの構築は、ほぼＯｄｅｇｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １０１  ２８０６−２８１０）に記載のように実施した。酵素は全て、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（ＮＥＢ社、英国ヒッチン）から購入した。ＰＣＲは全て、ＰＣＲ反応液５０μＬ当たり２００ｐｍｏｌの各プライマー、２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、２００μＭの各ｄＮＴＰ（ＮＥＢ社、英国ヒッチン）および１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファーを含有していた。ＰＣＲは、Ｔｅｃｈｎｅ  Ｔｅｃｈｇｅｎｅ  ＰＣＲ機（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、英国ラフバラ）で、９４℃で２分間の１サイクル、その後９４℃で１５秒間、５４℃で２０秒間、７２℃で１〜１．５分間の１５〜２５サイクル、その後７２℃で５分間の最終伸長で実施した。
【０１０２】
オリゴヌクレオチド設計は表４に示し、オリゴヌクレオチドはＳｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社（英国ハーバーヒル）またはＧｅｎｅＬｉｎｋ社（米国ニューヨーク州ホーソーン）によって供給された。ライブラリープライマーは、上述のように該Ｐｉｎ１  ＷＷドメインの適切な配列を変化させるように設計された。ｔａｃ−ＰｉｎＬｉｂ−ＲｅｐＡ−ＣＩＳ−ｏｒｉ  ＰＣＲ構築物は、以下のように調製した。ＲｅｐＡ−ＣＩＳ−ｏｒｉ領域は、プライマー１ＳｔｅｐＲｅｐＦｏｒ（配列番号４）およびＭ１３ｒｅｖ（配列番号５）を使用して、Ｒ１プラスミド［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ００３５１］からのＰＣＲによって増幅させた。第２ＰＣＲはその後ＲｅｐＡ−ＣＩＳ−ｏｒｉ上でＰｉｎ１ドメインをコードする長いプライマーおよびＧＳＧＳＳリンカー（配列番号１３）およびプライマーＤｉｇＬｉｇＲｅｖ（配列番号６）を用いて実施した。この第２ＰＣＲでは、１×ＴｈｅｒｍＰｏｌバッファーを１．５×標準バッファーと置換し、伸長温度は６８℃に設定した。最後に、ｔａｃプロモーターは、プライマー１３１マー（配列番号７）およびＤｉｇＬｉｇＲｅｖを以前のように使用して第３ＰＣＲにおいて核酸フレームワークライブラリーの上流に付加された。ＰＣＲ産物は、Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎｕｐキットを製造業者の推奨方法にしたがって使用し、精製した（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＵＫ社、英国サウスハンプトン）。
【０１０３】
【表４】
2013537417.tif 000007
【０１０４】
ライブラリー配列を検証するために、ライブラリーのほんの一部をＴＯＰＯ−ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内にクローニングし、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０細菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ形質転換させ、単一クローンをシーケンシングによって分析した。配列は、変異した位置で予測された無作為化を示した。
【実施例２】
【０１０５】
Ａ．細胞外標的−ＶＥＧＦＲ２に対する選択
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳は、一般にＯｄｅｇｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １０１，  ２８０６−２８１０）に記載のように実施した。２０μｇの各ライブラリーＤＮＡテンプレート（およそ１０１３のライブラリーメンバーをコードする）を線形テンプレートのためのＳ３０溶解液系（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＵＫ社、英国サウスハンプトン）の２００μＬのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳（ＩＴＴ）混合物に加えた。インキュベーションは、タンパク質−核酸複合体を生成するために、最長６０分間３０℃で実施した。発現後、サンプルは、ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ａ、Ｏｘｏｉｄ社、英国ベイジングストーク）中に２％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、英国ジリンガム）、０．１ｍｇ／ｍＬのニシン精子ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＵＫ社、英国サウスハンプトン）を含有する選択バッファー中で５倍に希釈した。
【０１０６】
ＶＥＧＦＲ２標的リガンドを含む２μｇのＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ融合（ＶＥＧＦＲ２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、英国オックスフォードシャー州アビンドン、配列番号８、表５）をＰＢＳ中で２０μＬのＴＡＬＯＮ（登録商標）磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、英国ペーズリー）上に固定した。被覆されたビーズを１ｍＬのＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて３回、ＰＢＳを用いて２回洗浄した。希釈ＩＴＴ反応液を被覆されたＴＡＬＯＮ（登録商標）磁気ビーズに加え、ロータリーミキサー上で混合しながら室温で１時間インキュベートした。次にビーズを選択バッファーから取り出し、ＰＢＳ−Ｔを用いて４回、ＰＢＳを用いて１回洗浄した（５分間／洗浄１回）。結合したＤＮＡは１００μＬの１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファー（ＮＥＢ社、英国ヒッチン）中で６５℃でのインキュベーションによってビーズから溶出させ、１０分間加熱した。溶出した物質の半量を回収ＰＣＲ反応液に加え、ここでＮ末端ライブラリー領域は表６に示したプライマーＲ１  ＲｅｃＦｏｒ（配列番号９）およびＮｏｔＲｅｃＲｅｖ（配列番号１０）を用いて増幅させた。全ての回収したＰＣＲ産物をＯｄｅｇｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）に記載されたようにライゲーションによりＲｅｐＡ−ＣＩＳ−ｏｒｉに再付着させ、さらにプライマーＲ１ＲｅｃＦｏｒおよびＤｉｇＬｉｇＲｅｖ（表４）を用いて増幅させて次の選択ラウンドのためにインプットＤＮＡを生成した。
【０１０７】
その後の発現、スクリーニングおよび選択ラウンドのために、先行ラウンドから生じたＤＮＡを新鮮ＩＴＴ混合物に加え、選択工程を繰り返した。本実施例では、結合クローンのプールを濃縮するために、この工程を３回繰り返した（つまり、計４ラウンドの発現、スクリーニングおよび選択）。第２ラウンド以降の選択における選択圧力を高め、最も望ましいペプチドに好都合であるよう、選択条件を表６に示すように改変した。本実施例では、第１ラウンドの選択後にＩＴＴで被覆されたビーズのインキュベーション後の洗浄時間を各ラウンドについて増やした。第３ラウンドでは、高親和性バインダーに好都合であるよう標的ＶＥＧＦＲ２リガンド濃度を下げた。
【０１０８】
【表５】
2013537417.tif 000008
【０１０９】
ＰＣＲ産物配列精度の維持に役立つよう、ネステッドフォーワードプライマーを使用することができる。本実施例では、プライマーＲ１ＲｅｃＦｏｒを選択手順の第３および第４ラウンドにおいてＴａｃ６（配列番号１１）で置換した（表５）。
【０１１０】
【表６】
2013537417.tif 000009
【０１１１】
Ｂ．  ＥＬＩＳＡによる結合分析
最終選択ラウンドからの生産物はＮｏｔｌおよびＮｃｏｌを用いて消化し、同様に消化したＭ１３  ｇｐｌｌｌファージミドベクター内へライゲートした。生じたＤＮＡを大腸菌ＴＧ−１細胞へ形質転換させ、２％グルコース、２×ＴＹ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンプレート上にプレーティングした。個々のコロニーは、ヘルパーファージ（Ｍ１３Ｋ０７、ＮＥＢ社、英国ヒッチン）を使用してファージ粒子を生産するために増殖させた。これらの方法は、概してＯｄｅｇｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １０１  ２８０６−２８１０に記載のように実施した。
【０１１２】
次にＥＬＩＳＡを実施して、標的リガンドに結合する改変ＷＷドメインペプチドについてスクリーニングした。ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートは、１ウエル当たり５０ｎｇのＰＢＳ中のＶＥＧＦＲ２を用いて４℃で一晩被覆した。プレートをＰＢＳ、２％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を用いてブロッキングした後、選択されたクローンをディスプレイするファージを加え、ブロッキングバッファー中で希釈し、１時間インキュベートした。ＷＷドメインバインダーは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役抗Ｍ１３抗体（ＧＥ）およびＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｉｎｓｉｇｈｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、英国ミドルセックス）を使用して検出した。そして、ＥＬＩＳＡシグナルは４５０ｎｍで読み取られた。ＶＥＧＦＲ２に対する選択の生産物からクローンの一部を対象とするＥＬＩＳＡスクリーンは、ＶＥＧＦＲ２上で得られたシグナルがＢＳＡでブロックされたマイクロタイタープレート上のシグナルよりはるかに大きいことを証明した（図２）。
【０１１３】
ＶＥＧＦＲ２上の高シグナルを示すクローンの選択は、改変ＷＷドメインペプチド配列を得るために対応する核酸をシーケンシングすることによって分析した（表７および図３）。興味深いことに、クローンＢ１およびＨ１は、同一配列（配列番号１５）を有することが見いだされた。クローンＥ１、Ｅ３、Ｈ３、Ｃ４、Ｅ４、Ｇ４およびＨ６も同一であることが見いだされた（配列番号１６）。クローンＧ３（配列番号１７）、Ｂ４（配列番号１８）、Ｈ４（配列番号１９）およびＡ１（配列番号２０）は独特のものであった。
【０１１４】
【表７】
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【０１１５】
ＶＥＧＦＲ２への結合について選択されたクローンの特異性をＥＬＩＳＡにおいて、上述したように非標的ペプチド／タンパク質の選択に対して分析した。５０ｎｇの様々な標的および非標的タンパク質の各々をＥＬＩＳＡプレート１ウエル当たりに被覆し、改変ＷＷドメインペプチドの各々を加えた。結果は、選択されたペプチドがＶＥＧＦＲ２に対して高度に特異的であることを証明している（図４）。
【０１１６】
表７に示したＷＷクローン配列内で配列番号２内の「Ｘ」（つまり、Ｘ１〜Ｘ９、各々Ｎ〜Ｃ末端）として指示した各位置で選択されたアミノ酸変異体は、各Ｘ位置についての好ましいアミノ酸の規定サブグループを表している。そこで、ＶＥＧＦＲ２への結合について好ましくは、配列番号２に由来する本発明のＷＷドメインペプチドおよびライブラリー内では、Ｘ１位は、アミノ酸残基Ｙ、ＧおよびＣから無作為に選択されてよい、Ｘ２位は、アミノ酸残基Ｍ、ＧおよびＦから無作為に選択されてよい、Ｘ３位は、アミノ酸残基Ｓ、ＰおよびＴから無作為に選択されてよい、Ｘ４位は、アミノ酸残基Ｐ、ＲおよびＡから無作為に選択されてよい、Ｘ５位は、アミノ酸残基Ｌ、ＷおよびＩから無作為に選択されてよい、Ｘ６位は、アミノ酸残基Ｖ、ＴおよびＩから無作為に選択されてよい、Ｘ７位は、アミノ酸残基ＤおよびＲから無作為に選択されてよい、Ｘ８位は、アミノ酸残基Ｈ、ＶおよびＧから無作為に選択されてよい、および／またはＸ９位は、アミノ酸残基Ｈ、ＡおよびＫから無作為に選択されてよい。
【０１１７】
Ｃ．  バイオレイヤー干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）を使用するＶＥＧＦＲ２に対する親和性の決定。
ＷＷ−Ｂ１  ＶＥＧＦＲ２  ＷＷドメインは、化学的に合成した。ペプチドは、標準Ｆｍｏｃ／ｔＢｕプロトコールを使用して合成した。ペプチド鎖は、ｔｅｎｔａｇｅｌ樹脂（Ｉｎｔａｖｉｓ社、独国ケルン、０．２４ｍｍｏｌ／ｇ）上でＨＢＴＵをカップリング試薬として使用して伸長させた。全アミノ酸は、標準保護基（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）およびＨｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｍｅｒｃｋ社、英国ノッティンガム））とともに導入した。最終Ｆｍｏｃ脱保護後、２ｍＬ  ＮＭＰ／ＤＭＦ（１：１）中のビオチン（ペプチジル樹脂に対して１０当量）、ＨＢＴＵ（ペプチジル樹脂に対して１０当量）およびＤＩＰＥＡ（ペプチジル樹脂に対して２０当量）の溶液を１ｍＬの無水ＤＭＦ中のペプチジル樹脂に加え、室温で１．５時間混合した。この溶液を濾過し、ペプチジル樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭを用いて徹底的に洗浄した。５ｍＬの切断混合液（ＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ２Ｏ、９５：２．５：２．５）を該ペプチジル樹脂に加え、室温で２．５時間振とうしながら反応が進行するに任せた。ＴＢＭＥ沈降および洗浄後、粗ペプチドをＨ２Ｏ中に溶解させ、凍結乾燥した。ペプチドの精製は、逆相分析的Ｃ１８カラムおよび２％〜７０％のＢ〜Ａへの勾配を使用しＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＨＰＬＣ上で６０分かけて実施した（Ａ＝１００％  Ｈ２Ｏ、Ｂ＝９５％  アセトニトリル／５％  Ｈ２Ｏ、どちらも０．１％トリフルオロ酢酸を含有している）。ペプチドは、最終凍結乾燥工程後に白色粉末として得られた。
【０１１８】
化学合成されたクローンＷＷ−Ｂ１とＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ融合との間のリアルタイム結合アッセイは、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄシステム（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社、カリフォルニア州メンローパーク）を用いたバイオレイヤー干渉法を用いて実施した。ビオチン化ＷＷ−Ｂ１は、ストレプトアビジンバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社）にＰＢＳ中濃度５０ｎｇ／μＬで固定した。会合曲線（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）は、ＷＷ−Ｂ１被覆センサーを様々な濃度のＶＥＧＦＲ２（ＰＢＳ中１〜１００ｎＭ）とともにインキュベートすることによって検出し、解離は、ＰＢＳ中で該センサーをインキュベートすることによって検出した。ＶＥＧＦＲ２へのＷＷ−Ｂ１結合についての解離定数は、定常状態分析により４４ｎＭ±１．１ｎＭであると決定された（図５）。
【０１１９】
Ｄ．  細胞外標的−ＶＥＧＦＲ２に対する生物学的活性
ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ）への結合が選択された様々な量の改変ＷＷドメインペプチドの存在によって競合される、競合アッセイを実施した。
【０１２０】
ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬの５０ｎｇのヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、英国アビンドン）をＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に１ウエル当たり３７℃で１４０分間被覆した。これらのウエルを次に２％  ＢＳＡを含有する１００μＬ  ＰＢＳを用いて室温で５５分間ブロックした。１．２５ｎｇのＶＥＧＦＲ２は、室温で４５分間５０μＬのＰＢＳ中でマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）へ融合されたＷＷ−Ｂ１とともにプレインキュベートした。ＷＷ−Ｂ１ペプチドの活性は、１０μＭ〜１５６．２５ｎＭの連続希釈率で試験した。ＰＢＳ中の５０μＬの４％  ＢＳＡをＷＷ−Ｂ１−ＭＢＰとともにプレインキュベートしたＶＥＧＦＲ２に加え、次に全混合物をＶＥＧＦ被覆ＥＬＩＳＡプレートへ加え、室温で５５分間インキュベートした。このプレートを次にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回、ＰＢＳ中で２回洗浄した。次に５０μＬ／ウエルのｐｅｎｔａ  Ｈｉｓ−ＨＲＰ（ＱＩＡｇｅｎ社、ＰＢＳ中の２％  ＢＳＡ中で１：５００に希釈した）を加え、この混合液を室温で５５分間インキュベートし、その後上記のように洗浄した。ＥＬＩＳＡシグナルは、ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｉｎｓｉｇｈｔ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、英国ミドルセックス）を使用して４５０ｎｍで検出した。
【０１２１】
コントロールとして、上記の工程をＷＷ−Ｂ１と置換する野生型Ｐｉｎ１  ＷＷドメインペプチドを用いて繰り返した。結果を図６に示す。これらのデータは、ＶＥＧＦＲ２結合性ＷＷドメインペプチドであるＷＷ−Ｂ１が７６ｎＭのＥＣ５０値でＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦへの結合を強力に阻害することを証明している。これとは対照的に、野生型Ｐｉｎ１  ＷＷドメインペプチドは本質的にＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦへの結合に作用を及ぼさずＶＥＧＦＲ２に対する結合親和性をほとんど有していない。
【０１２２】
そこで、これらのデータは、ＷＷドメインが新規な結合ドメインを選択するため、および新規タンパク質−タンパク質相互作用を作成するために有用なスカフォールドであることを示している。さらに、ＷＷドメインはＷＷドメインによって自然には認識されない標的リガンドに結合するよう遺伝子組換可能なこと、さらに、そのような改変ＷＷドメインは、これらの非天然標的リガンドに高い親和性で結合可能なことも証明されている。より詳細には、改変された第ＩＶ群ＷＷドメインペプチドは、非リン酸化および細胞外標的リガンドに結合するよう遺伝子組換可能なことが証明されている。
【実施例３】
【０１２３】
Ａ．  成長因子−β−ＮＧＦに対する選択
クローニング、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳ならびにスクリーニングおよび選択手順は、概して上記の実施例１および２に記載したように実施した。
【０１２４】
つまり、およそ１０１３個のメンバーの初期ＤＮＡテンプレートライブラリーサンプルを、タンパク質−ＤＮＡ複合体を生成するためにＩＴＴ溶液に加えた。発現させた後、サンプルをブロッキングバッファー（ＰＢＳ、２％  ＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのニシン精子ＤＮＡ、１ｍｇ／ｍＬのヘパリン）で希釈した。ブロッキングバッファーおよびＩＴＴ（選択混合液）をＩｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ社）内で３０分間２回インキュベートし、各例において上清を保持した。次に選択混合液を３０分間ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、英国ペーズリー）を用いて２回インキュベートし、任意のストレプトアビジンバインダーを除去するために磁石を用いてビーズを取り除いた。再び、上清を保持した。
【０１２５】
ヒトβ−ＮＧＦ（配列番号２１、表８、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｔｅｍｓ社、英国アビンドン）はカルボキシル基置換によってビオチン化し（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ４６，  ６４１−８）、上記の上清に加えて１μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。この混合液を室温で１時間インキュベートした。この混合液に、１０μＬのストレプトアビジン被覆ビーズを加え、混合しながら室温で１０〜１５分間インキュベートした。これらのビーズを１ｍＬのＰＢＳ−Ｔを用いて４回、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、この方法中に試験管を２回交換した。次にＷＷドメインペプチド結合ビーズを６０μＬのＨＦバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、英国ヒッチン）中に再懸濁させ、７５℃で１０分間加熱した。５μＬの溶出材料およびビーズを５０μＬの反応液中のＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。溶出した材料の半分を回収ＰＣＲ反応液に加え、Ｎ末端ライブラリー領域はプライマーＲ１ＲｅｃＦｏｒおよびＮｏｔＲｅｃＲｅｖを用いて３５サイクルにわたり増幅させた。回収した全ＰＣＲ産物は、ＲｅｐＡ−ＣＩＳ−ｏｒｉへライゲーションによって再付着させ、さらに以前に記載したようにプライマーＴａｃ６（配列番号１１）およびＤｉｇＬｉｇＲｅｖ（配列番号６）を用いて増幅させた。
【０１２６】
【表８】
2013537417.tif 000011
【０１２７】
次にＤＮＡ  ＰＣＲ産物をＩＴＴ溶液に加え、選択工程を３回繰り返して表９に記載した量を使用して結合クローンのプールを濃縮した。第２ラウンドはＴａｃ６（配列番号１１）およびＮｏｔＲｅｃＲｅｖＷＷ１（配列番号２２）プライマーを用いて回収し、Ｔａｃ６（配列番号１１）およびＤｉｇＬｉｇＲｅｖ（配列番号６）プライマーを用いたＲｅｐＡ−ＣＩＳ−ｏｒｉライゲーション後に再増幅させた。第３ラウンドＤＮＡはＴａｃ６−９（配列番号２３）およびＮｏｔＲｅｃＲｅｖＷＷ２（配列番号２４）プライマーを用いて回収し、１１０マー（配列番号２５）およびＤｉｇＬｉｇＲｅｖ（配列番号６）を用いたＲｅｐＡ−ＣＩＳ−ｏｒｉライゲーション後に再増幅させた。第４ラウンドは、Ｒ１  ＲｅｃＦｏｒ（配列番号９）およびＮｏｔＲｅｃＲｅｖＷＷ２（配列番号２２）プライマーを用いて回収した。プライマー配列を表８に示す。
【０１２８】
【表９】
2013537417.tif 000012
【０１２９】
Ｂ．  ＥＬＩＳＡによる結合分析
最終選択ラウンドからの生産物ＤＮＡをＭ１３  ｇｐｌｌｌファージミドベクター内へクローニングし、大腸菌ＴＧ−１細胞へ形質転換し、ファージ粒子を産生するために２％グルコース、２×ＴＹ、１００μｇ／ｍＬアンピシリンプレート上でヘルパーファージ（Ｍ１３Ｋ０７、ＮＥＢ社、英国ヒッチン）を使用してプレーティングし、上述したようにコロニーをスクリーニングした。
【０１３０】
選択された改変ＷＷドメインペプチドの結合特異性は、上記ＶＥＧＦＲと類似の方法でＨＳＡに対する結合親和性と比較することにより分析し、結果を図７に示す。β−ＮＧＦに対する高結合シグナルを示す選択されたクローンを次にシーケンシングによって分析した（表１０、図８）。興味深いことに、改変ＷＷドメインペプチドクローンＮＰ−Ａ１２（配列番号２６）およびＮＰ−Ｈ８（配列番号２７）各々は、それによりＷＷドメインの第１鎖が１アミノ酸短縮される野生型Ｐｉｎ１  ＷＷドメイン配列のアミノ酸１２位で１つのアミノ酸欠失を有した。
【０１３１】
【表１０】
2013537417.tif 000013
【０１３２】
表１０に示すＷＷクローン配列内で配列番号２内の「Ｘ」（つまり、Ｘ１〜Ｘ９、各々Ｎ〜Ｃ末端）として示した各位置で選択されたアミノ酸変異体は、各Ｘ位置についての好ましいアミノ酸の規定サブグループを表している。そこで、β−ＮＧＦへの結合について好ましくは、配列番号２に由来する本発明のＷＷドメインペプチドおよびライブラリー内では、Ｘ１位は、アミノ酸欠失またはアミノ酸残基ＦおよびＧから無作為に選択されてよい、Ｘ２位は、アミノ酸残基Ｖ、ＣおよびＰから無作為に選択されてよい、Ｘ３位は、アミノ酸残基Ｐ、ＲおよびＡから無作為に選択されてよい、Ｘ４位は、アミノ酸残基Ｄ、Ｎ、ＧおよびＲから無作為に選択されてよい、Ｘ５位は、Ｙであってよい、Ｘ６位は、Ｎであってよい、Ｘ７位は、アミノ酸残基ＶおよびＩから無作為に選択されてよい、Ｘ８位は、アミノ酸残基ＳおよびＡから無作為に選択されてよい、および／またはＸ９位は、アミノ酸残基ＲおよびＱから無作為に選択されてよい。
【実施例４】
【０１３３】
Ａ．  改変ＷＷドメインペプチドの環化
治療用物質として使用するため、ならびに他の状況では、オリジナルの直鎖ペプチドの所望の生物学的活性を維持しながら、例えば安定性、プロテアーゼへの耐性などを改良するために改変ＷＷドメインペプチドを環化することが有益な可能性がある。
【０１３４】
２つの環状改変ＷＷドメインペプチド、ビオチン−ＤＥＥＫＬＰＰＧＷＹＫＭＷＳＳＰＧＲＶＬＹＶＮＤＩＴＨＡＨＲＷＥＲＰＥＧ−ＮＨ２（配列番号３０）、およびビオチン−ＤＥＥＫＬＰＰＧＷＹＫＭＷＳＳＰＧＲＶＬＹＶＮＤＩＫＨＡＨＲＷＥＲＰＥＧ−ＮＨ２（配列番号３４）（下線を引いた部分は環化領域を示す）は、実施例２で同定したＷＷ−Ｂ１ペプチドに基づいて生成した。指示したように、環状ペプチドは、親和性分析のためのペプチド補足に役立つよう、それらのＣ末端でアミド化され、それらのＮ末端でビオチン化されている。
【０１３５】
ＷＷ−Ｂ１（配列番号１５）の配列は、ペプチド配列番号３０についての６位のリシンと３８位のグルタミン酸との間で共有結合の形成を可能にするため、３８位のセリンをグルタミン酸（Ｓｅｒ３８Ｇｌｕ）へ置換させるために変異させた。上記のＳｅｒ３８Ｇｌｕ置換の上部での配列番号３４のペプチドについては、２９位のトレオニンがリシンと置換され、この時間は４位のグルタミン酸と２９位のリシンとの側鎖間で共有結合の形成を可能にするためであった。さらにこれらのペプチドは化学的に合成されず、Ｎ末端ジペプチドＭｅｔ−Ａｌａはクローニングまたは発現のために必要とされなかったので、改変環状Ｐｉｎ１  ＷＷドメインペプチド配列は、配列番号１５の３位で始まる。この合成工程は、以下に示すように多数の工程を含んでいた。
【０１３６】
鎖伸長：
ペプチドは、標準Ｆｍｏｃ／ｔＢｕプロトコールを使用して合成した。ペプチド鎖は、ｔｅｎｔａｇｅｌ樹脂（Ｉｎｔａｖｉｓ社、独国ケルン、０．２４ｍｍｏｌ／ｇ）上でＨＢＴＵをカップリング試薬として使用して伸長させた。アミノ酸は、以下の残基とは別に下記の側鎖保護基（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）およびＨｉｓ（Ｔｒｔ））とともに導入した。ペプチド配列番号３０については、配列番号１の番号付けにしたがった６位のリシン残基（配列番号３０内の４位）はＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨを用いて導入し、配列番号１の番号付けにしたがった３８位のグルタミン酸残基（配列番号３０の３５位）はＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡＩＩ）−ＯＨ（Ｍｅｒｃｋ社、英国ノッティンガム）として導入した。ペプチド配列番号３４については、配列番号１の番号付けにしたがった２９位のリシン残基（配列番号３４の２６位）および配列番号１の番号付けにしたがった４位のグルタミン酸残基（配列番号３４の２位）は、アリルをベースとする保護基Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡＩＩ）−ＯＨ（Ｍｅｒｃｋ社、英国ノッティンガム）を用いて導入した。
【０１３７】
ビオチン化：
最終Ｆｍｏｃ脱保護後、ＮＭＰ／ＤＭＦ（１：１）中のビオチン（ペプチジル樹脂に対して１０当量）、ＨＢＴＵ（ペプチジル樹脂に対して１０当量）およびＤＩＰＥＡ（ペプチジル樹脂に対して２０当量）の溶液をペプチジル樹脂に加え、室温で１．５時間混合した。この溶液を濾過し、ペプチジル樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭを用いて徹底的に洗浄した。
【０１３８】
ＯＡＩＩ脱保護：
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（ペプチジル樹脂に対して５当量）を１０ｍＬのＣＨＣｌ３／ＡｃＯＨ／ＮＭＭ（９．２５：０．５：０．２５）中に溶解させた。この溶液をペプチジル樹脂に加え、ペプチド配列番号３０については室温で２．５時間およびペプチド配列番号３４については４５℃で１．５時間攪拌し続けた。ＤＭＦ（０．５％  ｖ／ｖ）中のＤＩＰＥＡを用いた洗浄を行い、この後にＤＭＦ（０．５％  ｗ／ｖ）中のＮａＣＳ２Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２・３Ｈ２Ｏ（ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム）で洗浄し、最終的にＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。
【０１３９】
Ｍｔｔ脱保護：
ペプチド配列番号３０に対してのみ
ＤＣＭ中の１％  ＴＦＡ、５％  ＴＩＳの溶液をペプチジル樹脂に加え、２分間振とうし、濾過した。この工程を１５〜２０回繰り返し、その後にＤＣＭ洗浄を完了した。
【０１４０】
環化：
ペプチジル樹脂は、無水ＤＭＦ中に１０〜１５分間膨潤させた。ＨＡＴＵ（ペプチジル樹脂に対して５当量）を無水ＤＭＦ内に溶解させ、この溶液をペプチジル樹脂に加えた。ＤＩＰＥＡをこれ（ペプチジル樹脂に対して１０当量）に加え、反応液を室温で１５時間放置した。この溶液を濾過し、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。
【０１４１】
樹脂からの切断：
ＴＦＡ切断混合液（ＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５））を該ペプチジル樹脂に加え、この反応液を室温で２．５時間振とうしながら反応が進行するに任せた。ＴＢＭＥ沈降および洗浄後、粗ペプチドをＨ２Ｏ中に溶解させ、凍結乾燥した。
【０１４２】
精製：
ペプチドの精製は、逆相分析的Ｃ１８カラムおよびＢからＡへの勾配（Ａ＝１００％  Ｈ２Ｏ、Ｂ＝９５％アセトニトリル／５％  Ｈ２Ｏ、どちらも０．１％トリフルオロ酢酸を含有している）を使用してＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ  ＨＰＬＣ上で実施した。ペプチドは、最終凍結乾燥工程後に白色粉末として得られた。
【０１４３】
ペプチドの同一性は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法（Ａｘｉｍａ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、英国ミルトンキーンズ）を用いて確認し、結果を図９（配列番号３０のペプチド）および図１３（配列番号３４のペプチド）に示す。ペプチド配列番号３０については、予想質量は４５４０であり、これは４５４２で見いだされる主要ピークに対応する（図９）。ペプチド配列番号３４については、予想質量は４５７４であり、これは４５７６で見いだされる主要ピークに対応する（図１３）。純度は、分析的ＲＰ  Ｃ１８カラムを使用して評価し、ペプチド配列番号３０について図１０に示したように、＞９０％であることが見いだされた。
【０１４４】
環状ペプチド配列番号３０を上記の実施例２に記載したようにＶＥＧＦＲ２への結合親和性について試験し、配列番号１５の非環化ＷＷ−Ｂ１ドメインペプチドに匹敵する活性を有することが見いだされた。
【０１４５】
Ｂ．  ペプチド上でのバイオレイヤー干渉法
ペプチドとＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ融合との間のリアルタイム結合アッセイは、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄシステムを用いたバイオレイヤー干渉法を用いて実施した（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社、カリフォルニア州メンローパーク）。ＷＷペプチドは、ストレプトアビジンバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社）上でカイネチックバッファー中において濃度２μｇ／ｍＬで固定した。会合曲線は、次に固定したペプチドをストレプトアビジン−ＨＲＰ（カイネチックバッファー中で１〜１００ｎＭ）とともにインキュベートすることによって検出し、解離は、カイネチックバッファー中で該センサーをインキュベートすることによって検出した。親和性成熟からのペプチド全てが、ＷＷ−Ｂ１と類似の親和性でＶＥＧＦＲ２に結合する。
【０１４６】
ＶＥＧＦＲ２への環化ＷＷ−Ｂ１結合についての解離定数は、定常状態分析により３１ｎＭ±４．８ｎＭであると決定された（図１２）。配列番号１の番号付けにしたがった３８位のグルタミン酸を含有する非環化変異体についても試験したところ、ＶＥＧＦＲ２に対して２４ｎＭ±４．０ｎＭの親和性を有していた（図１３）。
【実施例５】
【０１４７】
Ａ．  血漿安定性アッセイ
ペプチドは、分子生物学グレードの水中に濃度３ｍＭで再懸濁させた。ＷＷ−Ｂ１ペプチドを、２５０μＭの最終濃度へ３００μＬのマウス血漿（Ｈａｒｌａｎ社）またはＰＢＳ（コントロール）に加えた（２サンプル）。サンプルは、３７℃でインキュベートした。４０μＬのアリコートをサンプルＡからは０、１２、１４、１６、１８、２０および２２時間後に、およびサンプルＢからは０、２、４、６、８および１０時間後に取り出した。各アリコートを精製するために、１００％エタノールの量（８０μＬ）の２倍を加え、数時間または一晩−２０℃でインキュベートした。サンプルを遠心し、８０μＬの上清を回収した。０．１％  ＴＦＡを含む４０μＬの水を各サンプルに加え、１００μＬをＳｕｎＦｉｒｅ  Ｃ１８  ＨＰＬＣカラムに注入した。
【０１４８】
バッファーＡ（０．１％  ＴＦＡ水溶液）をカラムに通してランさせ、その後１０〜５０％のバッファーＢ（９５％アセトニトリル中の０．１％  ＴＦＡ、５％水）を２０分間ランさせた。カラムからの分画を採取し、ＡＸＩＭＡ質量分析計を使用して分析した。半減期は、Ｐｒｉｓｍでの単相指数関数的減衰方程式（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、図１４を参照）を用いて６．２時間であると計算された。
【実施例６】
【０１４９】
Ａ．  非天然型アミノ酸のＷＷペプチド内への組み込み
本実施例では、非天然型アミノ酸をＷＷドメインペプチド配列内へＣｌｏｖｅｒＤｉｒｅｃｔ（商標）Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ−ＡＦ（アンバー、Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ社、日本国東京）を用いて組み込むことができる方法を記載する。この試薬は、ＣＵＡアンチコドンおよびビオチンを含有する非天然アミノアシル−ｔＲＮＡを有する。
【０１５０】
５０μＬのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応は、ｔａｃプロモーターをコードする１０μＬのＤＮＡテンプレート、ＷＷ−Ｂ１（ＡＴＧメチオニンコドン後にＴＡＧコドンを含有する）、ｒｅｐＡ、ＣＩＳおよびｏｒｉ（２００ｎｇ／μＬ）、２０μＬの２．５×バッファー、１５μＬのＳ３０溶解液ならびに１ｍＭの各アミノ酸、１μＬのＣｌｏｖｅｒＤｉｒｅｃｔ（商標）ビオチン−ＸＸ−ＡＦ（アンバー）および３μＬのヌクレアーゼ非含有水を含有する１μＬの完全アミノ酸混合液を用いて構成した。この混合液を３０℃で６０分間インキュベートし、その後に氷上でインキュベートした。ＣｌｏｖｅｒＤｉｒｅｃｔ（商標）ビオチン−ＸＸ−ＡＦ（アンバー）ｔＲＮＡは、さらに３７℃で５分間５単位のＲＮａｓｅ  ＯＮＥ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＵＫ社、英国サウスハンプトン）とともにインキュベーションすることにより取り除いた。５μＬの反応産物は、ＥＬＩＳＡによって固定したＶＥＧＦＲ２（実施例１Ｂに記載したように）および０．１％  Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ中で１：２０００の希釈率（０．６２５μｇ／ｍＬ）で希釈したビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、英国クラムリントン）のための検出試薬としてのストレプトアビジンＨＲＰコンジュゲートを使用して分析した。これを室温で６０分間インキュベートし、その後上述の洗浄および展開条件にかけた。
【実施例７】
【０１５１】
Ａ．  ＣＤ分析
ペプチドは、分子生物学グレード水または濃度２００μＭ〜１．４ｍＭで１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）に再懸濁させた。遠紫外線スキャンは、Ａｖｉｖ  Ｍｏｄｅｌ  ４１０型分光計上で１秒間の平均時間、１９０〜２６０ｎｍ、０．２ｍｇ／ｍＬのペプチドおよび１ｎｍの帯域幅を使用し、０．５ｎｍ間隔で測定した。各温度で計３回のスキャンを実施し、結果を平均化した。ＣＤスキャンはＡｖｉｖ  ｍｏｄｅｌ  ４．１０ソフトウエアを用いてプロットし、データをモル楕円率（Ｍ−１ｃｍ−１）に変換した。ＷＷ−Ｂ１および環状ＷＷ−Ｂ１はどちらも、２５℃にて２２７〜２３１ｎｍでピークおよび２０２〜２０４ｎｍでトラフを有するＷＷドメインに特徴的なＣＤスペクトルを示した。このピークは、折り畳み立体構造内のペプチドの芳香族含量に帰せることができ、９５℃で顕著に消失し、これはこの温度での折り畳みの展開を証明している。しかし、このペプチドは９５℃へ加熱して２５℃へ冷却した後にその構造を改造することができる。この遠紫外線スペクトルは、他の小さな構造的に特徴付けられたβシート構造が特徴的である（Ｋｏｅｐｆ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ８，  ８４１−８５３、図１５を参照されたい）。
【０１５２】
要約および結論
要するに、これらの試験は、ＷＷドメインがＷＷドメインに基づく新規な結合モジュールを選択するための有用なフレームワーク、テンプレートまたはスカフォールドであることを証明している。従って、本発明のＷＷドメインフレームワークは、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、タンパク質およびペプチド（直鎖もしくは立体配座）および小分子、例えば有機もしくは無機分子を含む任意の可能性のある標的リガンドに対する結合モジュールを選択するための有用なフレームワークである。手短に言えば、本発明のＷＷドメインフレームワークは、遺伝子組換え抗体が以前使用されていた用途を有すると考えられる。特に、本発明のＷＷドメインフレームワークは、タンパク質−タンパク質相互作用のための新規な結合モジュールの選択に使用されるであろう。
【０１５３】
これらの試験では、初めて遺伝子組換え（すなわち、改変）ＷＷドメインは、対応する野生型ＷＷドメインの天然標的ではない、およびそれによっては結合されない標的リガンドに結合可能なことが証明されている。さらに、遺伝子組換えＷＷドメインは、（非天然）標的リガンドに高い結合親和性で、例えばｎＭ範囲内以上で結合可能なことが証明されている、他方、今までにＷＷドメインに対して報告された全ての結合親和性はμＭレンジ内にある。これらの高い結合親和性は、本発明の遺伝子組換えＷＷドメインが治療および非治療用途において用途を有する可能性があることを示しているが、このときｎＭレンジ範囲またはｎＭ未満のレンジ内の結合親和性が好ましい。したがって、本発明は、治療用の遺伝子組換えＷＷドメインペプチドおよびそのようなペプチドをコードする核酸を提供する。
【０１５４】
さらに、本発明の改変第ＩＶ群ＷＷドメインペプチドは、初めて、非天然標的リガンドに結合するだけではなく、野生型第ＩＶ群Ｐｉｎ１  ＷＷドメイン配列によって自然には結合されない非リン酸化標的リガンドにも結合することが証明されている。以前には、遺伝子組換えＰｉｎ１  ＷＷドメインを使用すると非リン酸化ペプチド標的配列を認識することができることは公知ではなかった。これは、ＷＷドメインに対する非天然標的リガンドの潜在的レパートリーを大きく広げる、新規な結合モジュールとしてのＷＷドメインの潜在的多用途性を証明している。
【０１５５】
さらに、ＷＷドメインフレームワークライブラリーは、所望のリガンドをターゲティングするための改変ＷＷドメインペプチドを選択するために構築および発現させることができることが証明されている。さらに一層重要なことに、新規なＷＷドメインフレームワークライブラリーを使用するとＷＷドメインペプチドの特異性を変化させることができるので、該フレームワークライブラリーを使用すると２つ以上の様々な非天然リガンド（例えば相違するペプチド配列）に対して新規な結合分子を選択できることが確立されている。言い換えると、該フレームワークライブラリーは、新規な結合分子の選択に広範囲に適用することができる。特に有用なスクリーニングおよび選択工程は、類似の細胞をベースとする方法とともに現在入手可能であるより大きなライブラリーサイズを提供するので、無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択系である。
【０１５６】
最後に、改変ＷＷドメインペプチドは、対応する非環化改変ＷＷドメインペプチドの新規なリガンド結合活性を保持しながら環化することができ、そのような環化ＷＷドメインペプチドは治療薬の分野およびその他のｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、およびｅｘ  ｖｉｖｏ使用のために特定の用途を有する可能性があることが見いだされている。
【０１５７】
本発明の概念のさらなる表現を以下の条項に設定する。
１．  ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーを作成する方法であって、
（ａ）各々がＷＷドメインペプチドをコードする複数の核酸を提供する工程、
（ｂ）それにより複数の改変された核酸を作成するために、該改変された核酸によってコードされる複数の前記ＷＷドメインペプチドの該ＷＷドメインペプチド内の１つ以上のアミノ酸残基で多様性を提供するために、該複数の核酸内に多様性を導入する工程、および
（ｃ）それにより配列多様化を含む改変ＷＷドメインペプチドのライブラリーが生成される、前記複数の改変された核酸によってコードされる該ＷＷドメインペプチドを発現させる工程を含む方法。
２．  工程（ａ）における複数の核酸は、各々が既定配列のＷＷドメインペプチドをコードし、工程（ｃ）における該改変ＷＷドメインペプチドライブラリーの実質的に全てのメンバーは、該既定配列との少なくとも５０％配列同一性を有する、第１項に記載の方法。
３．  （ｉ）該ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーはヒトＷＷドメインに由来し、工程（ａ）における該複数の核酸はヒトＷＷドメインペプチドをコードし、および／または（ｉｉ）該ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーは第ＩＶ群ＷＷドメインに由来し、工程（ａ）における該複数の核酸は第ＩＶ群ＷＷドメインペプチドをコードし、および／または（ｉｉｉ）該ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーはＰｉｎ１  ＷＷドメインに由来し、工程（ａ）における該複数の核酸はＰｉｎ１  ＷＷドメインペプチドをコードする、第１項または第２項に記載の方法。
４．  該Ｐｉｎ１  ＷＷドメインペプチド配列は配列番号１の６〜３８位でアミノ酸を含み、該ナイーブＷＷドメインペプチドライブラリーはさらにＰｉｎ１  ＷＷドメインペプチド配列内の１つ以上のアミノ酸残基での多様性をさらに含む、第３項に記載の方法。
５．  １１および３４位のアミノ酸はトリプトファンであり、２６位のアミノ酸はアスパラギンである、第４項に記載の方法。
６．  （ｉ）少なくとも１つのアミノ酸は配列番号１から１７〜２０位の間で欠失させられ、および／または１５位のメチオニンはトリプトファンに変化させられる、（ｉｉ）１７〜２０位（ループ１）の間で少なくとも１つのアミノ酸が挿入され、および／または１５位のメチオニンはトリプトファンに変化させられ、（ｉｉｉ）１７〜２０位（ループ１）の間で少なくとも１つのアミノ酸が欠失させられ、２７〜３０位（ループ２）の間で少なくとも１つのアミノ酸が挿入され、および／または１５位のメチオニンがトリプトファンへ変化させられ、または（ｉｖ）１７〜２０位（ループ１）の間で少なくとも１つのアミノ酸が挿入され、２７〜３０位（ループ２）の間で少なくとも１つのアミノ酸が挿入され、および／または１５位のメチオニンがトリプトファンへ変化させられる、第４項または第５項に記載の方法。
７．  多様性は、配列番号１の１２、１４、１７、１８、２３、２５、２７、３０および３２位の１つ以上で導入される、第４〜６項のいずれか一項に記載の方法。
８．  多様性は１７、１８および３２位の１つ以上で導入され、および／または多様性は１２、１４、２３、２５、２７および３０位の１つ以上で導入され、および／または多様性は１６、２０、２１、２８および２９位の１つ以上で導入される、第４〜７項のいずれか一項に記載の方法。
９．  多様性はＶＶＭコドンを使用して１７、１８および３２位で導入されるが、このときＶはＡ、ＣもしくはＧであり、ＭはＡもしくはＣであり、および多様性はＮＮＢコドンを使用して１２、１４、２３、２５、２７および３０位の１つ以上で導入されるが、このときＮはＡ、Ｃ、ＧもしくはＴであり、ＢはＣ、ＧもしくはＴである、第８項に記載の方法。
１０．  多様性は配列番号１の１２、１４、１７、１８、２３、２５、２７、３０および３２位の３つ以上、５つ以上、７つ以上または全部で導入される、第７〜９項のいずれか一項に記載の方法。
１１．  工程（ｂ）は、ＰＣＲを使用するなど核酸配列を増幅させる工程をさらに含む、第１〜１０項のいずれか一項に記載の方法。
１２．  （ｄ）工程（ａ）において該ＷＷドメインペプチドが単離されていない標的リガンドに対する該ライブラリーのペプチドを選択する工程をさらに含む、第１〜１１項のいずれか一項に記載の方法。
１３．  選択はｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択手順を使用して実施される、第１２項に記載の方法。
１４．  該標的リガンドは工程（ａ）において該ＷＷドメインペプチドによっては結合されない、第１２または１３項に記載の方法。
１５．  該標的リガンドは細胞外タンパク質もしくはペプチドである、第１２〜１４項のいずれか一項に記載の方法。
１６．  該標的リガンドは、セリンまたはトレオニンアミノ酸でリン酸化されていないタンパク質もしくはペプチド配列である、第１２〜１５項のいずれか一項に記載の方法。
１７．  該標的リガンドは、非リン酸化ペプチドもしくはタンパク質である、第１６項に記載の方法。
１８．  該標的リガンドはＶＥＧＦＲ２またはＮＧＦである、第１２〜１７項のいずれか一項に記載の方法。
１９．  （ｅ）解離定数（Ｋｄ）が１μＭ未満、５００ｎＭ未満または１００ｎＭ未満で、標的リガンドに結合するペプチドを単離する工程をさらに含む、第１〜１８項のいずれか一項に記載の方法。
２０．  改変ＷＷドメインペプチドをナイーブＷＷドメインペプチドディスプレイライブラリーから単離するための方法であって、該ライブラリーはディスプレイされた改変ＷＷドメインペプチドをコードする複数の核酸配列を含み、
（ａ）複数の核酸構築物を発現させる工程であって、各核散構築物は、該複数の核酸構築物の発現が複数のペプチド−核酸複合体の形成を生じさせるように該核酸配列へ機能的に連結したプロモーター配列を含み、各複合体は該ディスプレイされたペプチドをコードする対応する核酸構築物と会合する少なくとも１つのディスプレイされた改変ＷＷドメインペプチドを含む工程、
（ｂ）該複数のペプチド−核酸複合体を少なくとも１つの標的リガンドへ曝露させ、および適切には該標的リガンドへディスプレイされた改変ＷＷドメインペプチドを結合させることによって、該ペプチド−核酸複合体を該リガンドと会合させる工程、
（ｃ）該標的リガンドと会合していないままである任意のペプチド−核酸複合体を取り除く工程、および
（ｄ）任意の標的リガンド会合性ペプチド−核酸複合体を回収する工程を含む方法。
２１．  該ナイーブＷＷドメインペプチドディスプレイライブラリーは、（ｉ）ヒトＷＷドメイン、および／または（ｉｉ）第ＩＶ群ＷＷドメイン、および／または（ｉｉｉ）Ｐｉｎ１  ＷＷドメインに由来する、第２０項に記載の方法。
２２．  該ナイーブＷＷドメインペプチドディスプレイライブラリーは配列番号１の６〜３８位でアミノ酸の配列を含むＰｉｎ１  ＷＷドメインに由来し、少なくとも１つのアミノ酸は１７〜２０位の間で欠失させられ、および／または１５位のメチオニンがトリプトファンへ変化させられ、およびさらに配列番号１の配列内の１つ以上のアミノ酸残基で多様性を含んでいる、第２１項に記載の方法。
２３．  該ＷＷドメインペプチドディスプレイライブラリーは配列番号１の６〜３８位でアミノ酸の配列を含むＰｉｎ１  ＷＷドメインに由来するが、このとき少なくとも１つのアミノ酸は１７〜２０位の間で挿入され、および／または１５位のメチオニンがトリプトファンへ変化させられ、およびさらに配列番号１の配列内の１つ以上のアミノ酸残基で多様性を含んでいる、第２１項に記載の方法。
２４．  配列番号１の配列内の１つ以上のアミノ酸残基での前記多様性は、該配列の１５個までのアミノ酸残基、１２個までのアミノ酸残基、または１０個までのアミノ酸残基を変化させる工程を含む、第２２または２３項に記載の方法。
２５．  配列番号１の１２、１４、１７、１８、２３、２５、２７、３０および３２位で１つ以上のアミノ酸が変化させられる、第２１〜２４項のいずれか一項に記載の方法。
２６．  １７、１８および３２位の１つ以上、および／または１２、１４、２３、２５、２７および３０位の１つ以上、および／または１６、２０、２１、２８および２９位の１つ以上が変化させられる、第２５項に記載の方法。
２７．  配列番号１の１２、１４、１７、１８、２３、２５、２７、３０および３２位の３つ以上、５つ以上、７つ以上または９つ全部が変化させられる、第２５または２６項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年6月18日(2013.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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