(57)【要約】  本明細書に開示されるのは、遺伝子操作された切断ハーフドメイン；これらの遺伝子操作された切断ハーフドメインを含む融合ポリペプチド；遺伝子操作された切断ハーフドメインおよび融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびにこのポリヌクレオチドおよび／または融合タンパク質を含む細胞である。また、例えば、ゲノム配列の標的化切断のために、これらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いる方法も開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作されたＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含むポリペプチドであって、前記遺伝子操作された切断ハーフドメインが：アミノ酸残基４８６、４９９および４９６における変異；アミノ酸残基４８７および４９６における変異；アミノ酸残基４８７、４９９、および４９６における変異；アミノ酸残基４８３および５３７における変異；アミノ酸残基４９０および５３７における変異；アミノ酸残基４９０、５３７および５３８における変異；アミノ酸残基４８３および５３８における変異；アミノ酸残基４８７、４９９および４９６における変異；ならびにアミノ酸残基４８３、５３８および５３７における変異からなる群より選択される変異を含み、前記アミノ酸残基は、全長野性型ＦｏｋＩに対してナンバリングされている、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、前記遺伝子操作された切断ハーフドメインが、４８６位で前記野性型Ｇｌｎ（Ｑ）残基が、Ｇｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられ、４９９位で野性型Ｉｓｏ（Ｉ）残基が、Ｌｅｕ（Ｌ）残基で置き換えられ、そして４９６位で野性型Ａｓｎ（Ｎ）残基がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられている、ポリペプチドを含む、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドであって、前記遺伝子操作された切断ハーフドメインが、４９０位で野性型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３８位で野性型Ｉｓｏ（Ｉ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、そして５３７位で野性型Ｈｉｓ（Ｈ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換えられているポリペプチドを含む、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドであって、前記遺伝子操作された切断ハーフドメインが、４９０位で野性型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３７位で野性型Ｈｉｓ（Ｈ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換えられている、ポリペプチドを含む、ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドであって、前記遺伝子操作された切断ハーフドメインが、４８７位で野性型Ａｒｇ（Ｒ）残基がＡｓｐ（Ｄ）残基で置き換えられ、そして４９６位で野性型Ａｓｎ（Ｎ）残基がＡｓｐ（Ｄ）残基で置き換えられる、ポリペプチドを含む、ポリペプチド。
【請求項６】
さらに、前記４９９位で野性型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＡｌａ（Ａ）で置き換えられる、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドであって、前記遺伝子操作された切断ハーフドメインが、４８３位で野性型Ａｓｐ（Ｄ）残基がＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換えられているポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが：
（ｉ）５３８位の野性型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＶａｌ（Ｖ）残基で置き換えられている変異と；
（ｉｉ）５３７位の野性型Ｈｉｓ（Ｈ）残基がＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換えられている変異と；
（ｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせと
からなる群より選択される少なくとも１つの追加の変異を含む、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドであって、４１８、４３２、４４１、４８１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２３、５２７、５３７、５３８および５５９位のうちの１つ以上で追加のアミノ酸変異をさらに含んでいる、ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の第一の遺伝子操作された切断ハーフドメインと、第二の遺伝子操作された切断ハーフドメインとを含むヘテロ二量体。
【請求項１０】
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜８または１０のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１〜８もしくは１０のいずれかに記載のポリペプチドを含む単離された細胞。
【請求項１３】
目的の領域においてゲノム細胞クロマチンを切断するための方法であって、前記方法は：
（ａ）目的の領域において第一のヌクレオチド配列を選択することと；
（ｂ）第一のジンクフィンガー結合ドメインが第一の配列に結合するように遺伝子操作することと；
（ｃ）細胞中で第一の融合タンパク質を発現することであって、前記第一の融合タンパク質は、遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメインおよび請求項１〜８のいずれかに記載の遺伝子操作された切断ハーフドメインを含むことと；
（ｄ）細胞中で第二の融合タンパク質を発現することであって、前記第二の融合タンパク質が第二のヌクレオチド配列に結合するように遺伝子操作された第二のジンクフィンガー結合ドメインと第二の遺伝子操作された切断ハーフドメインとを含むことと；
を含み、
前記第一の融合タンパク質は、第一のヌクレオチド配列に結合し、第二の融合タンパク質は、第一のヌクレオチド配列から２ヌクレオチドと５０ヌクレオチドとの間に位置する第二のヌクレオチド配列に結合し、前記第一および第二の遺伝子操作された切断ドメインが目的の領域で細胞クロマチンを切断するヘテロ二量体を形成する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記細胞と第三のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとを接触させることをさらに包含し、ここで前記第三のヌクレオチド配列が前記第一のヌクレオチド配列と相同であるが同一ではなく；前記目的の領域内の細胞のクロマチンの切断は、第一のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列との間の相同組み換えを容易にし、それによって第一のヌクレオチド配列の変更を生じる、方法。
【請求項１５】
ゲノム細胞クロマチンにおける少なくとも２つの標的部位を切断する方法であって、前記方法は：
ゲノム細胞クロマチンにおける少なくとも第一および第二の標的部位を切断する工程であって、ここで各々の標的部位が一対のジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて切断され、さらにここで各々のジンクフィンガーヌクレアーゼが、請求項１〜８のいずれかに記載の遺伝子操作されたＦｏｋＩ切断ドメインを含む工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年２月８日出願の米国特許仮出願第６１／３３７，７６９号、および２０１０年９月２３日出願の同第６１／４０３，９１６号の利益を主張し、これらの開示の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の支援する研究のもとでなされた本発明に対する権利に関する陳述
適用なし。
【背景技術】
【０００３】
技術分野
本開示は、ポリペプチドおよびゲノム工学、ならびに相同組み換えの分野にある。
【０００４】
背景
人工的ヌクレアーゼ、例えば、ゲノムＤＮＡの標的化切断のためのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ジンクフィンガードメインと切断ドメインとの融合）が記載されている。このような標的化切断事象は、例えば、標的化突然変異を誘導するため、細胞ＤＮＡ配列の標的化欠失を誘導するため、ならびに所定の染色体遺伝子座での標的化組み換えを容易にするために用いられ得る。例えば、これらの開示が全ての目的のために全内容が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００６００６３２３１号；および国際公開第０７／０１４２７５号を参照のこと。
【０００５】
特異性を増大させるため、各々がジンクフィンガー結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む一対の融合タンパク質を用いて、標的ゲノムＤＮＡを切断してもよい。切断は、切断ハーフドメインが会合して機能的な二量体を形成しない限り生じないので、この配列は、特異性を増大する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
オフターゲット切断事象をさらに減少させるため、遺伝子操作された切断ハーフドメイン、例えば、偏性ヘテロ二量体を形成するドメインも開発された。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１３１９６３号を参照のこと。しかし、活性が増大し、オフターゲット切断活性が低下した追加の遺伝子操作された切断ハーフドメインが依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
本開示は、野性型切断ドメインおよび／または以前に記載された遺伝子操作された切断ハーフドメインと比較して増強された活性および特異性を示す遺伝子操作された切断ハーフドメインを提供する。また記載されるのは、これらの遺伝子操作された切断ハーフドメインを含む複合体（例えば、ヘテロ二量体）および融合タンパク質である。本開示はまた、目的の領域における細胞クロマチンの標的化切断のためのこれらの組成物、および／または相同組み換えを細胞の目的の所定の領域で用いる方法を提供する。
【０００８】
従って、一態様では、本明細書に記載されるのは、遺伝子操作された切断ハーフドメインであって、それが由来する親の野性型切断ドメインに比較して２つ以上の変異を含んでいる遺伝子操作された切断ハーフドメインである。特定の実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、ＦｏｋＩ由来であり、アミノ酸残基４１８、４３２、４４１、４８１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２３、５２７、５３７、５３８および／または５５９（野性型ＦｏｋＩ切断ハーフドメインに対してナンバリングした）のうちの２つ以上において変異を含む。一実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、野性型ＦｏｋＩ切断ドメイン由来であり、アミノ酸残基４８６、４９９および４９６（野性型ＦｏｋＩに対してナンバリングした）において変異を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、アミノ酸残基４９０、５３８および５３７（野性型ＦｏｋＩに対してナンバリングした）において変異を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、野性型ＦｏｋＩ切断ドメイン由来であり、かつアミノ酸残基４８７、４９９および４９６（野性型ＦｏｋＩに対してナンバリングした）において変異を含む。一実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、野性型ＦｏｋＩ切断ドメイン由来であり、アミノ酸残基４８３、５３８および５３７（野性型ＦｏｋＩに対してナンバリングした）において変異を含む。なおさらなる実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、アミノ酸残基４９０および５３７において変異を含む。
【０００９】
本明細書に記載される遺伝子操作された切断ハーフドメインは、野性型切断ハーフドメイン、および／または他の遺伝子操作された切断ハーフドメインとヘテロ二量体を形成し得る。特定の実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、４８６、４９９および４９６位（野性型ＦｏｋＩに対してナンバリングした）の変異、例えば４８６位で野性型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異、４９９位で野性型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、ならびに４９６位で野性型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、４９０、５３８および５３７位（野性型ＦｏｋＩに対してナンバリングした）での変異、例えば４９０位で野性型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位で野性型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および５３７位で野性型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、４９０および５３７位（野性型ＦｏｋＩに対してナンバリングした）での変異、例えば、４９０位で野性型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、ならびに５３７位で野性型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。なおさらなる実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、４８７および４９６位（野性型ＦｏｋＩに対してナンバリングした）での変異、例えば、４８７位で野性型Ａｒｇ（Ｒ）残基をＡｓｐ（Ｄ）残基で、および４９６位で野性型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）で置き換える変異（「ＤＤ」とも呼ばれる）および／または４８３および５３７位（野性型ＦｏｋＩに対してナンバリングした）での変異、例えば、４８３位で野性型Ａｓｐ（Ｄ）残基をＡｒｇ（Ｒ）残基で、および５３７位で野性型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（「ＲＲ」とも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、４８７、４９９および４９６位（野性型ＦｏｋＩに対してナンバリングした）での変異、例えば、４８７位で野性型Ａｒｇ（Ｒ）残基をＡｓｐ（Ｄ）残基で、ならびに４９９位で野性型Ｉｌｅ（Ｉ）残基をＡｌａ（Ａ）で、および４９６位で野性型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）残基で置き換える変異（「ＤＡＤ」とも呼ばれる）、および／または４８３、５３８および５３７位（野性型ＦｏｋＩに対してナンバリングした）での変異、例えば、４８３位で野性型Ａｓｐ（Ｄ）残基をＡｒｇ（Ｒ）残基で、ならびに５３８位で野性型Ｉｌｅ（Ｉ）残基をＶａｌ（Ｖ）残基で、および５３７位で野性型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（「ＲＶＲ」とも呼ばれる）を含む。
【００１０】
別の態様では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、二量体化ドメイン以外のＦｏｋＩのドメイン中に変異を含むようにさらに遺伝子操作されてもよい。例えば、４１８、４３２、４４１、４８１、５２３、５２７および５５９位の変異は、野性型ＦｏｋＩドメインの触媒活性を増大することが示された。詳細には、Ｐｒｏ（Ｐ）が野性型Ｓｅｒ（Ｓ）残基を４１８位で置き換える変異、およびＧｌｕ（Ｅ）残基が、野性型Ｌｙｓ（Ｋ）残基を４４１位で置き換える変異（「ＰＥ」として公知、または「Ｓｈａｒｋｅｙ」としても公知）は、触媒活性を増強することが示された（Ｇｕｏら（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，ｄｏｉ：１０．１０１ｂ／ｊ．ｊｍｂ．２０１０．０４．０６０）。別の態様では、Ｐｒｏ（Ｐ）が野性型Ｓｅｒ（Ｓ）を４１８位で置き換え、Ｌｅｕ（Ｌ）が野性型Ｐｈｅ（Ｆ）を４３２位で置き換え、Ｇｌｕ（Ｅ）が野性型Ｌｙｓ（Ｋ）を４４１位で置き換え、Ｈｉｓ（Ｈ）が野性型Ｇｌｎ（Ｑ）を４８１位で置き換え、Ｔｙｒ（Ｙ）が野性型Ｈｉｓ（Ｈ）を５２３位で置き換え、Ａｓｐ（Ｄ）が野性型Ａｓｎ（Ｎ）を５２７位で置き換え、Ｇｌｎ（Ｑ）が野性型Ｌｙｓ（Ｋ）を５５９位で置き換える変異（「Ｓｈａｒｋｅｙ」として公知、Ｇｕｏら（同書）を参照のこと）。従って、一実施形態では、変異体ＦｏｋＩドメインは、４１８、４４１、４８６、および４９９位で変異を含んでもよい。別の実施形態では、変異体ＦｏｋＩドメインは、４１８、４４１、４９０、および５３８位で変異を含んでもよい。さらなる実施形態では、野性型ＦｏｋＩドメインは、４１８、４４１、４８６、４９６および４９９位、および／または４１８、４４１、４９０、５３７、および５３８位で変異を含むように変異されてもよい。他の実施形態では、野性型ＦｏｋＩドメインは、４１８、４３２、４４１、４８１、４８６、４９６、４９９、５２３、５２７および５５９位および／または４１８、４３２、４４１、４８１、５２３、５２７、５５９、４９０、５３８および５３７位で変異されてもよい。詳細には、この変異は、４８６位でＧｌｕ（Ｅ）による野性型Ｇｌｎ（Ｑ）の変異、４９９位でＬｅｕ（Ｌ）による野性型Ｉｌｅ（Ｉ）の変異、４９６位でＡｓｐ（Ｄ）による野性型Ａｓｎ（Ｎ）の変異、４１８位でＰｒｏ（Ｐ）による野性型Ｓｅｒ（Ｓ）の変異、および４４１位でＧｌｕ（Ｅ）による野性型Ｌｙｓ（Ｋ）の変異（「ＥＬＤ−Ｓ」または「ＥＬＤ  Ｓｈａｒｋｅｙ」としても公知）および／または４９０位でＬｙｓ（Ｋ）による野性型Ｇｌｕ（Ｅ）の変異、５３８位でＬｙｓ（Ｋ）による野性型Ｉｌｅ（Ｉ）の変異、５３７位でＬｙｓ（Ｋ）またはＡｒｇ（Ｒ）による野性型Ｈｉｓ（Ｈ）の変異、４１８位でＰｒｏ（Ｐ）による野性型Ｓｅｒ（Ｓ）の変異、ならびに４４１位でＧｌｕ（Ｅ）残基による野性型Ｌｙｓ（Ｋ）の変異（ＫＫＫ−ＳもしくはＫＫＲ−Ｓ、またはＫＫＫ−ＳｈａｒｋｅｙもしくはＫＫＲ−Ｓｈａｒｋｅｙとしても公知）を挙げることができる。さらなる実施形態は、Ｓ４１８Ｐ：Ｆ４３２Ｌ：Ｋ４４１Ｅ：Ｑ４８１Ｈ：Ｑ４８６Ｅ：Ｎ４９６Ｄ：Ｉ４９９Ｌ：Ｈ５２３Ｙ：Ｎ５２７Ｄ：Ｋ５５９Ｑ（ＥＬＤ−Ｓｈａｒｋｅｙ’としても公知）、およびＳ４１８Ｐ��Ｆ４３２Ｌ：Ｋ４４１Ｅ：Ｑ４８１Ｈ：Ｅ４９０Ｋ：Ｈ５２３Ｙ：Ｎ５２７Ｄ：Ｈ５３７ＫまたはＲ：Ｉ５３８Ｋ：Ｋ５５９Ｑ（ＫＫＫ−Ｓｈａｒｋｅｙ’またはＫＫＲ−Ｓｈａｒｋｅｙ’としても公知）を包含する。
【００１１】
別の態様では、条件付き活性化を示す（例えば、細胞が維持される条件に依存して）遺伝子操作された切断ハーフドメインが提供される。いくつかの実施形態では、条件付きの遺伝子操作された切断ハーフドメインは、低下した温度条件下で活性の低下を示す。いくつかの実施形態では、条件付きの遺伝子操作された切断ハーフドメインは、上昇した温度条件下で活性の低下を示す。
【００１２】
さらに別の態様では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、非正準ジンク配位残基（例えば、正準のＣ２Ｈ２の立体配置ではなくＣＣＨＣ、米国特許出願公開第２００３−０１０８８８０号を参照のこと）を含むジンクフィンガーヌクレアーゼに組み込まれてもよい。
【００１３】
別の態様では、本明細書に記載のようなＤＮＡ結合ドメインおよび遺伝子操作された切断ハーフドメインを含んでいる融合ポリペプチドが提供される。特定の実施形態では、ＤＮＡ−結合ドメインは、ジンクフィンガー結合ドメイン（例えば、遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメイン）である。他の実施形態では、ＤＮＡ−結合ドメインは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ−結合ドメインである。
【００１４】
別の態様では、本明細書に記載のような任意の遺伝子操作された切断ハーフドメインまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１５】
さらに別の態様では、本明細書に記載の任意のポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）および／またはポリヌクレオチドを含む細胞もまた提供される。一実施形態では、細胞は一対の融合ポリペプチドを含み、１つの融合ポリペプチドは、ＥＬＤまたはＥＬＥ切断ハーフドメインを含み、１つの融合ポリペプチドは、ＫＫＫまたはＫＫＲ切断ハーフドメインを含む。別の実施形態では、１つの融合ポリペプチドは、ＤＡＤ切断ハーフドメインを含むが、別の融合ポリペプチドは、ＲＶＲ融合ポリペプチドを含む。他の実施形態では、対になった融合ポリペプチドはさらに、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの他の位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、これらの触媒性ドメイン変異体は、Ｓ４１８ＰおよびＫ４４１Ｅであり、従って、これらの変異体融合ポリペプチドは、下に列挙される変異体ＦｏｋＩドメインを含む：
（ａ）ＥＬ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ
（ｂ）ＫＫ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ
（ｃ）ＥＬＤ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｑ４８６Ｅ：Ｎ４９６Ｄ：Ｉ４９９Ｌ
（ｄ）ＫＫＫ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｅ４９０Ｋ：Ｈ５３７Ｋ：Ｉ５３８Ｋ
（ｅ）ＫＫＲ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｅ４９０Ｋ：Ｈ５３７Ｒ：Ｉ５３８Ｋ
（ｆ）ＤＡ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｒ４８７Ｄ：Ｉ４９９Ａ
（ｇ）ＲＶ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｄ４８３Ｒ：Ｉ５３８Ｖ
（ｈ）ＤＡＤ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｒ４８７Ｄ：Ｎ４９６Ｄ：Ｉ４９９Ａ
（ｉ）ＲＶＲ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｄ４８３Ｒ：Ｈ５３７Ｒ：Ｉ５３８Ｖ
（ｊ）ＤＤ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｒ４８７Ｄ：Ｎ４９６Ｄ
（ｋ）ＲＲ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｄ４８３Ｒ：Ｈ５３７Ｒ。
【００１６】
さらに別の態様では、目的の領域内の細胞クロマチンの標的化切断の方法；細胞中で相同組み換えを生じさせる方法；感染を処置する方法；および／または疾患を処置する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載のような一対の融合ポリペプチド（すなわち、一対の融合ポリペプチドであって、ここで１つの融合ポリペプチドは本明細書に記載のような遺伝子操作された切断ハーフドメインを含む）を発現することによって細胞中で目的の所定の領域で細胞クロマチンを切断することを包含する。
【００１７】
本明細書に記載の遺伝子操作された切断ハーフドメインは、目的の領域での細胞クロマチンの標的化切断のための方法、および／または細胞中での目的の所定の領域での相同組み換えにおいて用いられ得る。細胞としては、培養細胞、生物体中の細胞および処置のために生物体から取り出された細胞が挙げられ、この場合、この細胞および／またはそれらの子孫は、処置後に生物体に戻される。細胞クロマチンの目的の領域は、例えば、ゲノム配列またはその一部であってもよい。組成物は、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメインまたは新規な特異性を有するＴＡＬＥ結合ドメイン）および記載されるような切断ハーフドメインを含む融合ポリペプチドを包含する。
【００１８】
融合タンパク質は、細胞において、例えば、融合タンパク質を細胞に送達することによって、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達することによって発現されてもよく、ここで、このポリヌクレオチドは、ＤＮＡである場合、転写され、そして細胞に送達されたＲＮＡ分子または細胞に送達されたＤＮＡ分子の転写物が翻訳されて、融合タンパク質が生成される。細胞へポリヌクレオチドおよびポリペプチドを送達するための方法は、本開示のいずれかに提示される。
【００１９】
従って、別の態様では、目的の領域で細胞クロマチンを切断するための方法は、（ａ）目的の領域で第一の配列を選択することと；（ｂ）第一のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン）が第一の配列に結合するように遺伝子操作することと；（ｃ）細胞中で第一の融合タンパク質を発現することであって、この第一の融合タンパク質が、本明細書に記載されるような第一のＤＮＡ−結合ドメインおよび第一の遺伝子操作された切断ハーフドメインを含むことと；（ｄ）細胞中で第二の融合タンパク質を発現することであって、この第二の融合タンパク質が、本明細書に記載されるような第二のＤＮＡ結合ドメインおよび第二の切断ハーフドメインを含むことと、を含み、ここでこの第一の融合タンパク質は、第一の配列に結合し、かつ第二の融合タンパク質は、第一の配列から２〜５０ヌクレオチドに位置する第二の配列に結合し、それによってそれらがヘテロ二量体を形成するように、遺伝子操作された切断ハーフドメインを配置し、ここでヘテロ二量体が、目的の領域で細胞のクロマチンを切断する。
【００２０】
他の実施形態では、本明細書に記載される任意の方法は、（ａ）目的の領域で第一および第二の配列を選択することであって、ここでこの第一および第二の配列は、２〜５０ヌクレオチド離れていることと；（ｂ）第一のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン）が第一の配列に結合するように遺伝子操作することと；（ｃ）第二のジンクフィンガー結合ドメインが第二の配列に結合するように遺伝子操作することと；（ｄ）細胞中で第一の融合タンパク質を発現させることであって、この第一の融合タンパク質が本明細書に記載されるような第一のＤＮＡ結合ドメインおよび第一の切断ハーフドメインを含んでいることと；（ｅ）細胞中で第二の融合タンパク質を発現することであって、この第二の融合タンパク質が、本明細書に記載されるような第二のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、遺伝子操作されたジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン）および第二の切断ハーフドメインを含んでいることと；を含み、ここでこの第一の融合タンパク質は、第一の配列に結合し、第二の融合タンパク質は、第二の配列に結合し、それによって、この第一および第二の遺伝子操作された切断ハーフドメインを、それらが目的の領域で細胞クロマチンを切断するヘテロ二量体を形成するように配置する。特定の実施形態では、細胞クロマチンは、融合タンパク質が結合する第一の配列と第二の配列との間で、１つ以上の部位で切断される。
【００２１】
さらなる実施形態では、目的の領域における細胞クロマチンの切断のための方法は、（ａ）目的の領域を選択すること；（ｂ）第一のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン）が目的の領域の第一の配列に結合するように遺伝子操作することと；（ｃ）目的の領域における第二の配列に結合する第二のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン）を提供することであって、ここで第二の配列は、第一の配列から２〜５０ヌクレオチドに位置することと；（ｄ）細胞中で第一の融合タンパク質を発現させることであって、この第一の融合タンパク質が本明細書に記載されるような第一のＤＮＡ結合ドメインおよび第一の切断ハーフドメインを含んでいることと；（ｅ）細胞中で第二の融合タンパク質を発現することであって、この第二の融合タンパク質が、本明細書に記載されるような第二のＤＮＡ結合ドメインおよび第二の切断ハーフドメインを含んでいることと；を含み、ここでこの第一の融合タンパク質は、第一の配列に結合し、第二の融合タンパク質は、第二の配列に結合し、それによって、この第一および第二の切断ハーフドメインを、それらがヘテロ二量体を形成し、かつ細胞クロマチンが目的の領域で切断されるように配置する。
【００２２】
また、例えば、標的化された変異を導入するために、細胞クロマチンのある領域を変更する方法も提供される。特定の実施形態では、細胞クロマチンを変更する方法は、細胞に１つ以上の標的化ヌクレアーゼを導入して、所定の部位での細胞クロマチンの二重鎖断裂、およびこの断裂の領域における細胞クロマチンのヌクレオチド配列に対して相同性を有するドナーポリヌクレオチドを生じることを含む。細胞ＤＮＡの修復プロセスは、二本鎖断裂の存在によって活性化され、そしてドナーポリヌクレオチドは、断裂の修復のためのテンプレートとして用いられ、この結果、細胞クロマチンへのドナーのヌクレオチド配列の全てまたは一部の導入が生じる。従って、細胞のクロマチンにおける配列は、変更されてもよく、特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換され得る。
【００２３】
標的化変更としては、限定するものではないが、点突然変異（ポイントミューテーション）（すなわち、単一の塩基対の異なる塩基対への変換）、置換（すなわち、複数の塩基対の同一長の異なる配列への変換）、１つ以上の塩基対の挿入、１つ以上の塩基対の欠失、および上述の配列変更の任意の組み合わせが挙げられる。
【００２４】
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡであっても、またはＲＮＡであってもよく、直鎖状であっても、または環状であってもよく、一本鎖であっても、または二本鎖であってもよい。ドナーポリヌクレオチドは、細胞へ、裸の核酸として、１つ以上の送達因子（例えば、リポソーム、ポロキサマー）との複合体として送達されてもよいし、または例えば、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のようなウイルス送達ビヒクルに含まれてもよい。ドナー配列は、１０〜１，０００ヌクレオチド（またはその間のヌクレオチドの任意の整数値）またはそれ以上に及んでもよい。
【００２５】
特定の実施形態では、相同組み換えの頻度は、細胞周期のＧ２期において細胞を停止することによって、および／または相同組み換えに関与する１つ以上の分子（タンパク質、ＲＮＡ）の発現を活性化することによって、および／または非相同性末端結合に関与するタンパク質の発現もしくは活性を阻害することによって増強され得る。
【００２６】
本明細書に記載される任意の方法において、第二のジンクフィンガー結合ドメインは、第二の配列に結合するように遺伝子操作され得る。
【００２７】
さらに、本明細書に記載される任意の方法では、融合タンパク質は、単一のポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００２８】
任意の前述の方法について、細胞のクロマチンは、染色体、エピソームまたはオルガネラゲノム中であってもよい。細胞のクロマチンは、限定するものではないが、原生動物細胞および真核生物細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞およびヒト細胞を含む任意の細胞に存在し得る。
【００２９】
いくつかの態様では、この方法は、本明細書に記載される変異を含む条件付きＦｏｋＩ活性を有する融合タンパク質を含む生物体を提供する。いくつかの実施形態では、これらの生物体は、植物である。これらの方法はまた、種子を含むこのような植物の組織に関する。
【００３０】
他の実施形態では、目的の２つ以上の領域で細胞のクロマチンを切断するための方法が提供される。この方法は、（ａ）目的の第一の領域を選択すること；（ｂ）第一のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン）が目的の領域の第一の配列に結合するように遺伝子操作することと；（ｃ）目的の領域における第二の配列に結合する第二のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン）を提供するかまたは遺伝子操作することであって、ここで第二の配列が、第一の配列から２〜５０ヌクレオチドに位置することと；（ｄ）目的の第二の領域を選択すること；（ｅ）第三のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン）が目的の第二の領域の第一の配列に結合するようにすることまたは遺伝子操作することと；（ｆ）目的の第二の領域における第二の配列に結合する第四のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン）を提供するまたは遺伝子操作することであって、ここで第二の配列が、第一の配列から２〜５０ヌクレオチドに位置することと；（ｇ）細胞中で第一の融合タンパク質を発現させることであって、この第一の融合タンパク質が本明細書に記載されるような第一のＤＮＡ結合ドメインおよび第一の切断ハーフドメインを含んでいることと；（ｈ）細胞中で第二の融合タンパク質を発現することであって、この第二の融合タンパク質が、本明細書に記載されるような第二のＤＮＡ結合ドメインおよび第二の切断ハーフドメインを含んでいることと；を含み、ここでこの第一の融合タンパク質は、第一の配列に結合し、第二の融合タンパク質は、第二の配列に結合し、それによって、この第一および第二の切断ハーフドメインを、それらがヘテロ二量体を形成し、かつ細胞クロマチンが目的の第一の領域で切断されるように配置することと、（ｉ）細胞中で第三の融合タンパク質を発現させることであって、この第三の融合タンパク質が本明細書に記載されるような第三のＤＮＡ結合ドメインおよび第三の切断ハーフドメインを含んでいることと；（ｊ）細胞中で第四の融合タンパク質を発現することであって、この第四の融合タンパク質が、本明細書に記載されるような第四のＤＮＡ結合ドメインおよび第四の切断ハーフドメインを含んでいることと；を含み、ここでこの第三の融合タンパク質は、目的の第二の領域における第一の配列に結合し、かつこの第四の融合タンパク質は、目的の第二の領域における第二の配列に結合し、それによって、この第三および第四の切断ハーフドメインを、それらがヘテロ二量体を形成し、かつ細胞クロマチンが目的の第二の領域で切断されるように配置することと、を含む。
【００３１】
さらに、本明細書に記載の任意の方法では、少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、例えば、設計または選択の方法によって、遺伝子操作される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】パネルＡおよびＢは、単離された変異体のある範囲の温度におよぶ、本明細書に記載のような示される切断ドメイン変異体を含んでいるジンクフィンガーヌクレアーゼの切断活性を示す。図１Ａは、酵母レポーター株が単離された変異体ベクターで形質転換され、３つの培養物に分けられ、２２℃、３０℃、および３７℃でインキュベートされた場合の結果を示す。ＺＦＮ誘導後、変異体の活性を決定して、野性型ＺＦＮの画分として報告した。図１Ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウエスタンブロットによってモニターした変異体ＺＦＮ発現を示す。等価なタンパク質ロードを確認するため、抗ヒストン３（抗Ｈ３）抗体ウエスタンブロットを行った。
【図２】パネルＡおよびＢは、５３ＢＰＩ特異的ＺＦＮバックグラウンドにおけるＺＦＮ改変体ＥＬＤ：ＫＫＫおよびＥＬＤ：ＫＫＲの活性を示す。図２Ａは、Ｋ５６２細胞でヌクレオフェクトした（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）５３ＢＰ１−特異的なＺＦＮ改変体の活性を示す。この細胞を、トランスフェクションの３日後に回収した。各々の組み合わせの２つの培養物をアッセイした（例えば、ＥＬ／ＫＫ５および６）。Ｃｅｌ−１アッセイ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標），Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を用いて、各々のレーンの下部で図２Ａに示す、ＺＦＮ誘導性の挿入および欠失の頻度（インデル％）を決定した。ＺＦＮ誘導性のインデルは、ＤＮＡのＺＦＮ切断の結果としての二本鎖断裂（ＤＳＢ）の結果であり、この後に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）プロセスを用いる細胞による修復が続き、これがＤＮＡのごく一部分を修復の間に断裂部位で挿入または欠失し得る。矢印は、Ｃｅｌ−１切断後のバンドの予想サイズを示す。細胞のアリコートをまた、さらに１週間培養して、長期培養（１０日）での改変された細胞の安定性を決定した。図２Ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるウエスタンブロットによってモニターしたＺＦＮ発現を示す。ローディングコントロールとして、抗ＮＦκＢ  ｐ６５を用いた。
【図３】パネルＡおよびＢは、ＫＤＲ−特異的なＺＦＮバックグラウンドにおける変異体の活性を示す。図３Ａは、ヌクレオフェクションの３日後、および２０日後にモニターした、Ｋ５６２細胞におけるＫＤＲ−特異的なＺＦＮ対のＣｅｌ−１活性アッセイの結果を示す。各々のレーンで用いた示したＦｏｋＩ変異体とのＺＦＮ対を、レーンの上に示し、Ｃｅｌ−Ｉアッセイ（図２について上で記載）で検出した活性を下部に示す。ＧＦＰは、陰性のコントロールを示す。ＺＦＮ  ＦｏｋＩ改変体ＥＬＤ：ＫＫＫおよびＥＬＤ：ＫＫＲは、もとの偏性ヘテロ二量体のＺＦＮ（ＥＬ：ＫＫ）よりも活性が高い。図３Ｂは、図１について上で記載されるようなＺＦＮ発現およびタンパク質ローディングのモニタリングを示す。
【図４】ＧＲ−特異的なＺＦＮバックグラウンドにおけるＺＦＮ改変体ＥＬＤ：ＫＫＫおよびＥＬＤ：ＫＫＲの活性を示し、ここで活性は、図２について上で記載されるようなＣｅｌ−Ｉアッセイによって決定する。この図は、各々の条件について２セットのサンプルからの結果を示す。レーン１〜１４は、第一のセットであり、レーン１５〜２６は、第二のセットである。新規な変異体は、もとの偏性ヘテロ二量体のＥＬ：ＫＫよりも活性であり、高度に活性なＺＦＮについてＺＦＮを制限する（レーン８とレーン９および１０、ならびにレーン２０とレーン２１および２２を比較）。漸減量のＧＲ−標的化ＺＦＮ（パネルの上部にそって示す）をＫ５６２にヌクレオフェクトして、細胞をトランスフェクションの３日後に回収して、Ｃｅｌ−１アッセイを用いてＺＦＮ誘導性のインデルの頻度を決定した。
【図５】パネルＡおよびＢは、３つの異なるＲＩＰＫ１−特異的なＺＦＮ対（対Ａ、ＢおよびＣ）における変異体の活性を示す。図５Ａは、Ｋ５６２細胞においてヌクレオフェクトされた、ＲＩＰＫ１遺伝子（ＡおよびＢ）を標的化する２つの異なるＺＦＮ対についてのＣｅｌ−１活性アッセイ（図２について上記される）を示す。細胞をトランスフェクションの３日後に回収して、アッセイを用いて、ＺＦＮ誘導性の挿入および欠失（インデル）の頻度を決定した。インデルのパーセントは、各々のレーンの下部に示す。図５Ｂは、Ｋ５６２細胞を、ＲＩＰＫ１遺伝子を標的化するＺＦＮ発現ベクター（Ｃ）の三番目の対でヌクレオトランスフェクトして、３日間３７℃（左パネル）または３０℃（右パネル）でインキュベートした。
【図６】パネルＡおよびＢは、ＣＣＲ−５−特異的なＺＦＮ対（米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号を参照のこと）のＣｅｌ−１活性のアッセイ結果（図２について上記するとおり）を示す。図６Ａは、ＣＣＲ５ヘテロ二量体標的、ＣＣＲ５−Ｌ  ＺＦＮホモ二量体（ＡＢＬＩＭ２）、およびＣＣＲ５−Ｒホモ二量体（ＰＧＣ）オフターゲット部位でのＺＦＮ誘導性のインデルの頻度を決定するためにＣｅｌ−１アッセイを用いて、Ｋ５６２細胞において示されたＦｏｋＩ改変体のヌクレオフェクション後のＣＣＲ５標的化ＺＦＮの強制されたホモ二量体化の活性を示す。図６Ｂは、図１について上記されるようなＺＦＮ発現およびタンパク質ローディングのモニタリングを示す。
【図７】パネルＡおよびＢは、図６に記載されるＣＣＲ５改変体のＣｅｌ−１活性アッセイ結果（図２について上記するとおり）を示す。図７Ａは、漸減量のＣＣＲ５  ＥＬおよびＥＬＤ  ＦｏｋＩ改変体を用いるＣｅｌ−１活性の結果を示す。これらの構築物は、Ｋ５６２でヌクレオフェクトして、Ｃｅｌ−１アッセイを用いて、ＺＦＮ誘導性のインデルの頻度をＣＣＲ５ヘテロ二量体部位で決定した。図７Ｂは、図１について上記されるようなＺＦＮ発現およびタンパク質ローディングのモニタリングを示す。
【図８】パネルＡおよびＢは、ＧＲ−特異的なＺＦＮバックグラウンドにおける変異体の強制されたホモ二量体化のＣｅｌ−１活性のアッセイ結果を示す。図８Ａは、ＧＲヘテロ二量体部位でのＺＦＮ誘導性インデルの頻度を決定するためにＫ５６２細胞において指定のＦｏｋＩ改変体のヌクレオフェクション後のＧＲ標的化ＺＦＮの強制されたホモ二量体化後のＣｅｌ−１の結果を示す。野生型以外のサンプルにおいて、このアッセイでは検出可能なインデルはなかった。図８Ｂは、図１について上記されるようなＺＦＮ発現およびタンパク質ローディングのモニタリングを示す。
【図９】ＤＳＢを標的化するγ−Ｈ２ＡＸに対する抗体で染色したＧＲ標的化ＺＦＮバックグラウンドにおける示した構築物で処理したＫ５６２細胞のフローサイトメトリーデータを示す。陽性細胞のパーセントを示す。全てのＦｏｋＩ変異体対について観察されたＤＳＢの割合は、野生型ＦｏｋＩについてよりもかなり少なかった。
【図１０】パネルＡおよびＢは、初代細胞における新規なＺＦＮ変異体の活性を示す。図１０Ａは、ＰＢＭＣ中でヌクレオフェクトされた漸減量のＣＣＲ５−標的化ＺＦＮを用いるＣｅｌ−１活性アッセイの結果（図２について上で記載するとおり）を示す。細胞は、トランスフェクションの３日後に回収して、Ｃｅｌ−１アッセイを用いて、ＺＦＮ誘導性のインデルの頻度を決定した。図１０Ｂは、ＰＢＭＣ中で二重にヌクレオフェクトされたＰＤ１遺伝子を標的化する、３つの異なる３つの異なるＺＦＮ対（ＺＦＮ  Ａ、ＺＦＮ  Ｂ、およびＺＦＮ  Ｃ、実施例５を参照のこと）で得られた棒グラフの結果を示す。細胞はトランスフェクションの３日後および１０日後に回収して、Ｃｅｌ−１アッセイを用いて、ＺＦＮ誘導性のインデルの頻度を決定した。このグラフは、二重のトランスフェクションからの平均値およびエラーバーを示す。
【図１１Ａ】パネルＡ〜Ｃは、新規なＺＦＮ変異体の活性を示す。図１１Ａは、ＰＢＭＣ中でヌクレオフェクトされた漸減量のＧＲ−標的化ＺＦＮを用いるＣｅｌ−１活性のアッセイ結果を示す。細胞は、トランスフェクションの３日後および１０日後に回収して、Ｃｅｌ−１アッセイを用いて、ＺＦＮ誘導性のインデルの頻度を決定した。図１１Ｂは、ＰＢＭＣ中で６つの独立したトランスフェクションからの、示されるＺＦＮの相対活性の平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ．（標準誤差）を示す棒グラフを示す。Ｐ値は、ＭｉｃｒｏＣａｌ  Ｏｒｉｇｉｎｓバージョン７．５（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ（登録商標））によって算出した２標本Ｔ検定を用い、これは、ＥＬ−ＫＫ改変体に対して示した活性の有意差を示す。図１１Ｃは、ドナー核酸の標的化組み込みを促進するためのＫ５６２細胞においてヌクレオトランスフェクトされたＥＬ／ＫＫおよびＥＬＤ／ＫＫＲのＧＲ−特異的なＺＦＮ対の使用を示す。この実験におけるドナーは、新規なＢａｍＨＩ制限部位を構成し、その結果、ＤＮＡの標的化組み込みの際、標的化領域のＰＣＲ増幅産物は、ＴＩが出現した場合、ＢａｍＨＩ制限酵素によって切断できる。このデータによって、ＥＬＤ／ＫＫＲ  ＦｏｋＩ変異体対は、ＥＬ／ＫＫ  ＦｏｋＩ変異体対よりもＴＩを促進するのに効果的であったことが示される。
【図１１Ｂ】図１１Ａの説明に同じ。
【図１１Ｃ】図１１Ａの説明に同じ。
【図１２】パネルＡおよびＢは、ＧＲまたはＣＣＲ５のいずれかに特異的なＦｏｋＩ変異体の活性を示す。図１２Ａは、Ｋ５６２細胞中でヌクレオフェクトされたＧＲ標的化ＺＦＮのＦｏｋＩ変異体を用いるＣｅｌ−Ｉ活性アッセイ（図２について上記するとおり）の結果を示す。変異したアミノ酸の位置の詳細な説明については表を参照のこと。図１２Ｂは、ＣＣＲ５標的化ＺＦＮの同様の結果を示す。この結果によって、ＤＡ／ＲＶ対が試験された全てのＦｏｋＩ変異体対のうち最小の活性であることが示される。
【図１３】ＦｏｋＩ対の強制的なホモ二量体化が行われる場合に観察される活性を示す。活性は、Ｃｅｌ−１活性アッセイ（図２について上記するとおり）によって測定される。図１３で示されるＺＦＮは、ＧＲに特異的であり、そして図からわかるとおり、ＫＶ  ＦｏｋＩ変異体は、適用可能なホモ二量体化活性を示すこの設定での唯一の変異体である。
【図１４】追加のＦｏｋＩ変異体でさらに改変された、増強されたＤＡ／ＲＶ対で観察されたＣｅｌ−Ｉ活性アッセイ（図２について上記される）によって測定された活性を示す。この図は、ＣＣＲ５−特異的なＺＦＮ対およびＣＸＣＲ４−特異的なＺＦＮ対の両方についての結果を示しており、ここではＦｏｋＩドメインが変更されている。この結果でわかるとおり、追加の変異は、ＤＡ／ＲＶ変異体の活性を約２倍に増大する。
【図１５】ＫＤＲ−特異的なＺＦＮバックグラウンドにおける増強されたＤＡ／ＲＶ対、ＤＡＤ／ＲＶＲのＣｅｌ−Ｉ活性を示す。ＫＤＲ−特異的なＺＦＮ対は、開始するには活性が弱く、このデータによって、ＤＡＤ／ＲＶＲ変異体がまだこのアッセイで検出可能な活性を有さず、そのためＤＡ／ＲＶ対と同様であることが示される。対照的に、ＥＬＤ／ＫＫＲ  ＫＤＲ−特異的なＺＦＮ  ＦｏｋＩ変異体対は、活性を示す（１８〜２１％のインデルが検出された）。
【図１６】ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４に特異的な、２セットのＺＦＮ対によるＫ５６２細胞のヌクレオフェクション後の結果を示す。上部のパネルは、ＣＣＲ５標的のＣｅｌ−Ｉアッセイ結果（図２について上記するとおり）を示し、下部のパネルは、ＣＸＣＲ４標的と同様の結果を示す。この実験を、１セットは３７℃でのみ維持したが、もう一方のセットは３０℃で３日間保持したという点でのみ異なる、２つの平行なインキュベーション条件を用いて行った。この図によって、ＺＦＮの両方の対とも同時に活性であったことが示される。
【図１７】４つの可能性のあるオフターゲット部位（＃３、＃５、＃７および＃１０）を切断活性について分析したこと以外は、図１６について上記のようなＫ５６２細胞でのＣｅｌ−Ｉアッセイ切断結果を示す。この実験は、２つのインキュベーション条件で上記のとおりであった。ＥＬＤ／ＫＫＲ−ＣＣＲ５  ＦｏｋＩ変異体対とＤＡＤ／ＲＶＲ  ＦｏｋＩ変異体ＣＸＣＲ４対との組み合わせは、このアッセイにおけるこれらの４つのオフターゲットに対して検出不能な活性を生じた。
【図１８】Ｃｅｌ−Ｉアッセイを用いて活性についてアッセイされたとおり、Ｓｈａｒｋｅｙ変異体（表４、およびＧｕｏら、（同書））と組み合わせた本発明に記載されるＦｏｋＩ変異体の結果を示す。試験したＦｏｋＩ変異体対は、ＫＤＲ（上部パネル）またはＧＲ（下部パネル）のいずれかに特異的であった。Ｓｈａｒｋｅｙ変異の存在は、他のＦｏｋＩ変異体の活性を増大すると考えられる。
【図１９】Ｃｅｌ−Ｉアッセイを用いて活性についてアッセイされたとおり、Ｓｈａｒｋｅｙ変異体（表４、およびＧｕｏら、（同書））と組み合わせた本発明に記載されるＦｏｋＩ変異体の活性の結果を示す。試験したＺＦＮ  ＦｏｋＩ変異体対は、ＧＲ（下部パネル）に特異的であった。Ｓｈａｒｋｅｙ変異の存在は、他のＦｏｋＩ変異体の活性を増大すると考えられる。図１９Ａは、ＦｏｋＩ変異体の相加的な結果を示し、図１９Ｂは、実施例１に記載されるようなモニタリング発現およびゲルロードの結果を示す。
【図２０】パネルＡ〜Ｄは、種々のＦｏｋＩ変異体＋Ｓｈａｒｋｅｙ  ＦｏｋＩ変異体の活性の結果が、Ｃｅｌ−Ｉアッセイによってアッセイされるとおりホモ二量体化するように強制されることを示す。示したとおり、ＦｏｋＩ変異体は、活性なホモ二量体複合体を形成しない。図２０Ａおよび２０Ｃは、ＦｏｋＩの相加的な結果を示し、そして図２０Ｂおよび図２０Ｄは、実施例１に記載されるような発現およびゲルローディングのモニタリングの結果を示す。
【図２１Ａ】パネルＡおよびＢは、Ｃｅｌ−Ｉアッセイによってアッセイされるような、示したＺＦＮの状況でのＤ：ＲおよびＤＤ：ＲＲ  ＦｏｋＩ変異体の活性の結果を示す。図２１Ｂは、実施例１に記載されるような発現およびゲルローディングのモニタリングの結果を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ａの説明に同じ。
【図２２】パネルＡおよびＢは、Ｃｅｌ−Ｉアッセイによってアッセイされるような、３７℃（図２２Ａ）または３０℃（図２２Ｂ）で、示したＺＦＮの状況での種々のＦｏｋＩ変異体の活性の結果を示す。インデルの割合は、レーンの下に示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
本明細書に開示されるのは、例えば、標的化切断に続く非相同的な末端結合による、または標的化切断に続く外因性ポリペプチド（細胞ヌクレオチド配列と相同性の１つ以上の領域を含む）とゲノム配列との間の相同組み換えによる、細胞クロマチンの標的化切断のためにおよび細胞ヌクレオチド配列の標的化変更のために有用な、遺伝子操作された切断ハーフドメインおよびこれらの遺伝子操作された切断ハーフドメインを含む融合ポリペプチドである。
【００３４】
例示的な遺伝子操作された切断ハーフドメインを、表４に示す。この改変体は、お互いとヘテロ二量体を形成するが、ホモ二量体は形成しないような変異体を含む。これは、ＤＮＡ切断の特異性を増大するか、および／または意図される複合体の濃度を増大する（ホモ二量体との競合を減少または排除することによる）。ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合タンパク質に組み込まれた場合、これらの改変体は、意図される標的で遺伝子改変を誘導する（内因性の遺伝子座で、および組み込まれたＧＦＰレポーターアッセイを用いて試験した場合）が、野性型切断ハーフドメインに比較してゲノムワイドなＤＮＡ切断を有意に減少する。
【００３５】
従って、本明細書に記載される遺伝子操作された切断ハーフドメインは、著しくホモ二量体機能を付与する。なぜなら、同じ改変体の２つのコピーが相互作用して遺伝子操作（改変）を軽減または無効にするように強制するからである。低減されたホモ二量体機能によって、ＺＦＮ発現も減少せず、所望の標的部位の改変を刺激することもなく、インビボでＺＦＮ切断特異性の改善が得られる。
【００３６】
さらに、本明細書に開示されるのは、条件付き活性を有する遺伝子操作された切断ハーフドメインである。これらの条件付き変異体は、そのデザイン次第で、ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかとして機能し得る。特定の実施形態では、条件付き活性とは、温度に基づく切断活性の変化を指す。従って、これらの条件付き変異体は、細胞株または植物のような生物体全体の発達に用いられ得、ここでは切断活性が研究者らによって特定の温度で誘導され得るが、他の温度では停止したままで保持されている。
【００３７】
概略
本明細書で開示される、方法の実践、ならびに組成物の調製および使用は、別段示さない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組み換えＤＮＡ、および関連分野における従来の技術を、当該技術分野の範囲内であるものとして使用する。これらの技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９および第３版，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７および定期改訂版；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，第３版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，編集），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９、ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，編集）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照のこと。
【００３８】
定義
「核酸」「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、線状または環状の高次構造で、一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的に関しては、これらの用語をポリマーの長さに関する限定と解釈すべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート主鎖）内で改変されるヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定ヌクレオチドのアナログは、同一の塩基対形成特異性を有し、すなわち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対を形成する。
【００３９】
「ポリペプチド」「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指して互換可能に用いられる。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは改変誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００４０】
「結合」とは、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的で、非共有結合的な相互作用を指す。結合相互作用が全体として配列特異的であるかぎり、結合相互作用の全ての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基との接触）。そのような相互作用は、一般に、１０-6Ｍ-1以下の解離定数（Ｋd）によって特徴付けられる。「親和性」とは、結合強度を指し：結合親和性の増大は、Ｋdの低下と相関する。
【００４１】
「結合タンパク質」とは、別の分子に非共有結合的に結合することが可能なタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合においては、それは、それ自体に結合する（その結果、ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）ことが可能であり、および／または異なるタンパク質の１つ以上の分子に結合することが可能である。結合タンパク質は、２種類以上の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。
【００４２】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）とは、１つ以上のジンクフィンガー（それは、亜鉛イオンの配位によって安定化される構造を有する結合ドメイン内のアミノ配列の領域である）を通じて配列特異的な形でＤＮＡを結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略称される。
【００４３】
ジンクフィンガー結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合されるように「遺伝子操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」ことができる。ジンクフィンガータンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計（デザイン）および選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、天然に存在しないタンパク質であり、その設計／組成は、主として合理的な基準からもたらされる。設計のための合理的基準としては、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を格納したデータベース中の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用が挙げられる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照のこと；また国際公開第９８／５３０５８号、同第９８／５３０５９号、同第９８／５３０６０号、同第０２／０１６５３６号、および同第０３／０１６４９６号も参照のこと。
【００４４】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質は、天然には見出されないタンパク質であり、その産生は主に、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの実験的プロセスによってもたらされる。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、米国特許第５，９２５，５２３号、米国特許第６，００７，９８８号、米国特許第６，０１３，４５３号、米国特許第６，２００，７５９号、国際公開第９５／１９４３１号、国際公開第９６／０６１６６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第９８／５４３１１号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／６０９７０号、国際公開第０１／８８１９７号、および国際公開第０２／０９９０８４号を参照のこと。
【００４５】
「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、それは、ＤＮＡであっても、またはＲＮＡであってもよく；線状、環状または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。「ドナー配列」という用語は、ゲノム内に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１０，０００長（またはそれらの間もしくはそれ以上の任意の整数）のヌクレオチド、好ましくは、約１００〜１，０００長（またはそれらの間の任意の整数値）のヌクレオチド、より好ましくは、約２００〜５００長のヌクレオチドであってもよい。
【００４６】
「相同的非同一配列」とは、第二の配列とある程度の配列同一性を共有するが、それらの配列が第二の配列の配列とは同一ではない、第一の配列を指す。例えば、変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、変異体遺伝子の配列に対して相同であってかつ非同一である。特定の実施形態においては、２つの配列間の相同性の程度は、通常の細胞機構を利用して、それらの間での相同組み換えを可能とするのに十分である。２つの相同な非同一配列は、任意の長さであってもよく、それらの非相同性の度合は、単一ヌクレオチドという小さなもの（例えば、ゲノム点突然変異を標的化相同組み換えによって修正するため）、または１０キロベース以上の塩基という大きなもの（例えば、染色体中の所定の異所部位に遺伝子を挿入するため）であってもよい。相同非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドが同一の長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外来ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を用いてもよい。
【００４７】
核酸およびアミノ酸の配列同一性を決定するための技術は、当該技術分野において公知である。典型的に、そのような技術としては、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにそれらの配列を第二のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較すること、が挙げられる。ゲノム配列もまた、この方法で決定し、比較することができる。一般に、同一性とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、厳密なヌクレオチド対ヌクレオチド、またはアミノ酸対アミノ酸対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性パーセントを決定することによって比較することができる。２つの配列の同一性パーセントは、核酸またはアミノ酸配列を問わず、２つの整列された配列間の厳密な合致数を短い方の配列の長さで割り、１００をかけたものである。典型的に、配列間の同一性パーセントは、少なくとも７０〜７５％、好ましくは、８０〜８２％、より好ましくは、８５〜９０％、さらに好ましくは、９２％、より一層好ましくは、９５％、最も好ましくは、９８％の配列同一性である。
【００４８】
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同性領域の間の安定な二重鎖の形成を可能にする条件下でポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、続いて一本鎖特異的なヌクレアーゼでの消化および消化されたフラグメントのサイズ決定によって決定され得る。２つの核酸、または２つのポリペプチド配列は、その配列が、上記の方法を用いて決定される場合、その分子の既定の長さにわたって、少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、より好ましくは８５％〜９０％、それより好ましくは９２％、なおさらに好ましくは９５％、そして最も好ましくは９８％の配列同一性を示す場合、お互いに対して実質的に相同である。本明細書において用いる場合、実質的に相同なとはまた、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列を指す。
【００４９】
「組み換え」とは、２つのポリヌクレオチド間で遺伝情報が交換されるプロセスを指す。本開示の目的に関して、「相同組み換え（ＨＲ）」とは、例えば、細胞において二本鎖切断の修復中に起こる、そのような交換の特殊な形態を指す。このプロセスには、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖断裂を受けた分子）のテンプレート修復に対して「ドナー」分子を用い、かつそれは、ドナーから標的への遺伝情報の移動をもたらすという理由で、「非交差遺伝子変換（ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」または「ショートトラクト遺伝子変換（ｓｈｏｒｔ  ｔｒａｃｔ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」として、様々な名称で公知である。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、そのような移動は、切断された標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または、標的の一部になる遺伝情報の再合成にドナーが用いられる「合成依存的鎖アニーリング」、および／または関連のプロセスを含み得る。そのような特殊なＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような、標的分子配列の変更をもたらす場合が多い。
【００５０】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が挙げられるが、これらに限定されない、種々の方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方とも可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または互い違いの（スタガード）末端のいずれかの産生を生じ得る。特定の実施形態においては、融合ポリペプチドが、標的化二本鎖ＤＮＡ切断に用いられる。
【００５１】
「切断ハーフドメイン」とは、第二のポリペプチド（同一または異なるいずれか）と併せて、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第一および第二の切断ハーフドメイン」、「＋および−切断ハーフドメイン」および「右および左の切断ハーフドメイン」という用語は相互交換可能に用いて、二量体化する切断ハーフドメインの対を指す。
【００５２】
「遺伝子操作された切断ハーフドメイン」とは、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の遺伝子操作された切断ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように改変された切断ハーフドメインを指す。
【００５３】
「条件付き変異」とは、特定の許容される環境条件下で野生型切断活性、および特定の制限条件下で変異体切断活性を有する、変異である。条件付き変異は、冷温感受性であってもよく、ここでは変異は、低温の方では変更された切断活性を生じるが、より高い温度に曝された際は、切断活性は、おおむね野生型程度までもどる。逆に、条件付き変異は、熱感受性（「熱感受性」と呼ばれる場合が多い）であってもよく、ここでは野生型切断活性が、より低温でみられるが、より高い温度に曝された際に変更される。変更された切断活性は、増大した活性として現れても、または減少した活性として現れてもよい。
【００５４】
「クロマチン」とは、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびに、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含めてタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、そこでは、ヌクレオソームコアが、２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４のうちそれぞれ２つを含む八量体と会合した約１５０塩基対のＤＮＡを含み；そしてリンカーＤＮＡ（生物に依存して長さはさまざま）がヌクレオソームコアの間に延在する。１分子のヒストンＨ１は、一般にリンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的に関して、「クロマチン」という用語は、原核性および真核性の両方のあらゆる種類の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの両方を含む。
【００５５】
「染色体」とは、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、その細胞のゲノムを含む全染色体の集合である、その核型によって特徴付けられる場合が多い。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含んでもよい。
【００５６】
「エピソーム」とは、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製する核酸、核タンパク質複合体、または他の構造である。エピソームの例としては、プラスミドおよび一定のウイルスゲノムが挙げられる。
【００５７】
「アクセス可能領域、接近可能領域」とは、核酸に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子に結合され得る、細胞のクロマチン中の部位である。いかなる特定の理論によっても束縛されることは望まないが、アクセス可能領域とは、ヌムレオソーム構造へパッケージングされない領域であると考えられる。アクセス可能領域の別個の構造は、化学的および酵素的なプローブ例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性によって検出され得る場合が多い。
【００５８】
「標的部位」または「標的配列」とは、結合にとって十分な条件が存在する条件下で結合分子が結合するであろう核酸の一部を規定する、核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
【００５９】
「外因性、外来」分子とは、通常は細胞内に存在しないが、１つ以上の遺伝学的、生化学的、または他の方法によって細胞内に導入することができる分子である。「通常は細胞内に存在」とは、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。従って、例えば、筋の胚発生中のみに存在する分子は、成体筋細胞については外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞については外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全型内因性分子の機能性バージョン、または正常には機能する内因性分子の機能不全型バージョンを含んでもよい。
【００６０】
外因性分子は、とりわけ、低分子、例えば、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成される低分子、または、高分子、例えば、タンパク質、核酸、糖質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の改変誘導体、または１つ以上の上記分子を含む任意の複合体であってもよい。核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられ、それは一本または二本鎖であってもよく、線状、分岐状または環状であってもよく、任意の長さであってもよい。核酸としては、二重鎖を形成できる核酸、ならびに三重鎖形成核酸が挙げられる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質としては、限定するものではないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられる。
【００６１】
外因性分子は、内因性分子と同じの種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞中に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または細胞内に通常は存在しない染色体を含んでもよい。細胞中に外因性分子を導入するための方法は、当業者には公知であり、これには限定するものではないが、脂質媒介移入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入およびウイルスベクター媒介性の移入が挙げられる。
【００６２】
対照的に、「内因性」分子とは、特定の環境条件下で特定の発生段階にある特定の細胞内に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラストもしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含んでもよい。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含んでもよい。
【００６３】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合的に連結されている分子である。サブユニット分子は、同一の化学種の分子であってもよいし、または異なる化学種の分子であってもよい。第一の種類の融合分子の例としては、限定するものではないが、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合物）、および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。第二の種類の融合分子の例としては限定するものではないが、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、およびマイナーグルーブバインダー（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）と核酸との間の融合物が挙げられる。
【００６４】
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞に融合タンパク質を送達することによって、または細胞に融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを送達し、そこで、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて融合タンパク質を生成することによって、生じ得る。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチド連結はまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与することができる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達の方法を、本開示の他所に提示する。
【００６５】
本開示の目的に関して、「遺伝子」とは、遺伝子産物（以下参照のこと）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含み、そのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かは問わない。従って、遺伝子としては、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００６６】
「遺伝子発現」とは、遺伝子産物への遺伝子に含まれる情報の変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは他の任意の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であってもよい。遺伝子産物としてはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって改変（修飾）されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチリル化、およびグリコシル化によって改変（修飾）されたタンパク質が挙げられる。
【００６７】
遺伝子発現の「調節」とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化および遺伝子抑制を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６８】
「真核」細胞としては、限定するものではないが、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞が挙げられる。
【００６９】
「目的の領域」とは、例えば、遺伝子または遺伝子内のもしくはそれに隣接する非コード配列などの、その中で外因性分子と結合することが望ましい細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組み換えの目的のためであってもよい。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、クロロプラスト）、または感染ウイルスゲノム中に存在してもよい。目的の領域は、遺伝子のコード領域内であっても、転写された非コード領域（例えば、リーダ配列、トレーラー配列またはイントロンなど）内であっても、またはコード領域の上流または下流のいずれかにある非転写領域内であってもよい。目的の領域は、長さが単一のヌクレオチド対程度の小さなものから最大２，０００個のヌクレオチド対の長さであっても、または任意の整数値のヌクレオチド対であってもよい。
【００７０】
「作動可能な連結」および「作動可能に連結される」（または「作動可能に連結される」）という用語は、２つ以上の構成要素（例えば、配列エレメント）の並列であって、ここでこの構成要素が、両方の構成要素が正常に機能し、かつその構成要素の少なくとも１つが他の構成要素の少なくとも１つに発揮される機能を媒介し得ることを可能にするように配列されている並列に関して交換可能に用いられる。実例として、転写調節性配列、例えば、プロモーターは、転写調節性配列が、１つ以上の転写調節性因子の有無に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に対して作動可能に連結されている。転写調節性配列は一般には、コード配列とｃｉｓで作動可能に連結されるが、そこに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーとは、たとえ連続していない場合でさえ、コード配列に対して作動可能に連結されている転写調節性配列である。
【００７１】
融合ポリペプチドに関して、「作動可能に連結される」という用語は、それぞれの構成要素が、そのように連結されていない場合に、それが果たすのと同じ機能を他の構成要素に連動して実行するという事実を指し得る。例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して言えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＥＰＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することが可能で、一方で切断ドメインがその標的部位の近傍でＤＮＡを切断することが可能である場合に、作動的連結状態にある。
【００７２】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的なフラグメント」とは、タンパク質、ポリペプチド、または核酸であって、それらの配列が、全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一の機能を保持するものである。機能的フラグメントは、対応する天然分子より多くても、少なくても、または同じ数の残基を有してもよく、および／または１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含んでもよい。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当該技術分野において周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、（上記）を参照のこと）。あるタンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または相補性（遺伝的相補性および生化学的相補性の両方）によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５〜２４６、米国特許第５，５８５，２４５号、およびＰＣＴ国際公開第９８／４４３５０号を参照のこと。
【００７３】
遺伝子操作された切断ハーフドメイン
ホモ二量体化を最小化または妨げる、遺伝子操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも呼ばれる）は、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み込まれる、例えば米国特許出願公開第２００５００６４４７４；同第２００６０１８８９８７号および米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号に記載されている。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミノ酸残基は全て、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。ＦｏｋＩタンパク質におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｗａｈら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１０６５４〜１０５６９による。
【００７４】
本明細書に記載されるのは、前に記載された遺伝子操作されたＦｏｋＩ切断ドメインおよび／または野生型切断ドメインに比較して増大した活性および特異性を示すＦｏｋＩの遺伝子操作された切断ハーフドメインである。例示的な変異体切断ハーフドメインは表３に示す。例示的な遺伝子操作された切断ドメインは、表４に示す。特定の実施形態では、この切断ハーフドメインは、野生型に比較して少なくとも３つのアミノ酸残基の位置で変異を含む。例えば、特定の実施形態では、この切断ハーフドメインは、４８６、４９９および４９６位で変異を含む。他の実施形態では、この切断ハーフドメインは、４９０、５３８および５３７位で変異を含む。
【００７５】
一実施形態では、４９０における変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し；５３８における変異は、Ｉｌｅ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し；５３７における変異は、Ｈｉｓ（Ｈ）をＬｙｓ（Ｋ）またはＡｒｇ（Ｒ）で置換し；４８６における変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換し；４９９における変異は、Ｉｌｅ（Ｉ）をロイシン（Ｌ）で置換し；４９６における変異はＡｓｎ（Ｎ）をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）で置換する。詳細には、本明細書に記載される遺伝子操作された切断ハーフドメインは、１つの切断ハーフドメインで４９０位（Ｅ→Ｋ）、５３８位（Ｉ→Ｋ）、および５３７位（Ｈ→ＫまたはＨ→Ｒ）を変異することによって調製されて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ：Ｈ５３７Ｋ」（ＫＫＫ）または「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ：Ｈ５３７Ｒ」（ＫＫＲ）と呼ばれる遺伝子操作された切断ハーフドメインが生じ、そして別の切断ハーフドメインでは、４８６位（Ｑ→Ｅ）、４９９位（Ｉ→Ｌ）および４９６位（Ｎ→ＤまたはＮ→Ｅ）を変異することによって、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ：Ｎ４９６Ｅ」（ＥＬＥ）または「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ：Ｎ４９６Ｄ」（ＥＬＤ）と命名される遺伝子操作された切断ハーフドメインが生じる。本明細書に記載される遺伝子操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小化されるかまたは無効にされるが、野生型に比較して活性は維持されている、偏性ヘテロ二量体変異体を形成する。実施例を参照のこと。
【００７６】
他の実施形態では、４８７位の変異は、Ａｒｇ（Ｒ）をＡｓｐ（Ｄ）で置き換え、４９６位のＡｓｎ（Ｎ）は、１つの切断ハーフドメインでは、Ａｓｐ（Ｄ）（Ｒ４８７Ｄ：Ｎ４９６Ｄまたは「ＤＤ」を生じるため）で置き換えられ、そして他の切断ハーフドメインでは、４８３位の野性型Ａｓｐ（Ｄ）のＡｒｇ（Ｒ）への変異、および５３７位の野性型Ｈｉｓ（Ｈ）のＡｒｇ（Ｒ）での変異（Ｄ４８３Ｒ：Ｈ５３７Ｒまたは「ＲＲ」を生じるため）による。さらに他の実施形態では、４８７の変異は、Ａｒｇ（Ｒ）をＡｓｐ（Ｄ）で置き換え；４９９位の変異は、Ｉｌｅ（Ｉ）をＡｌａ（Ａ）で置き換え、そして４９６位では、Ａｓｎ（Ｎ）は、Ａｓｐ（Ｄ）で置き換えられ（１つの切断ハーフドメインで「Ｒ４８７Ｄ：Ｎ４９６Ｄ：Ｉ４９９Ａ」を生じるため）、そして他の切断ハーフドメイン（またはＤＡＤおよびＲＶＲ）では、「Ｄ４８３Ｒ：Ｈ５３７Ｒ：Ｉ５３８Ｖ：」を生じる、４８３（Ｄ−＞Ｒ）、５３８（Ｉ−＞Ｖ）および５３７（Ｈ−＞Ｒ）位での変異による。
【００７７】
他の実施形態では、変異は、他のドメインで、例えば、４１８、４３２、４４１、４８１、５２３、５２７および／または５５９位で行われる。特定の実施形態では、変異は、４１８および４４１位で行われ、例えば、４１８位の野生型Ｓｅｒ（Ｓ）のＰｒｏ（Ｐ）残基での置換、および４４１位の野性型Ｌｙｓ（Ｋ）のＧｌｕ（Ｅ）での置換（「Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ」または「Ｓｈａｒｋｅｙ」として公知）であるか、またはＰｒｏ（Ｐ）が４１８でＳｅｒ（Ｓ）を置き換え、Ｌｅｕ（Ｌ）が４３２でＰｈｅ（Ｆ）を置き換え、Ｇｌｕ（Ｅ）が４４１でＬｙｓ（Ｋ）を置き換え、Ｈｉｓ（Ｈ）が４８１でＧｌｎ（Ｑ）を置き換え、Ｔｙｒ（Ｙ）が５２３でＨｉｓ（Ｈ）を置き換え、Ａｓｐ（Ｄ）が５２７でＡｓｎ（Ｎ）を置き換え、そしてＧｌｎ（Ｑ）が５３９でＬｙｓ（Ｋ）を置き換える（Ｓ４１８Ｐ：Ｆ４３２Ｌ：Ｋ４４１Ｅ：Ｑ４８１Ｈ：Ｈ５２３Ｙ：Ｎ５２７Ｄ：Ｋ５３９ＱまたはＳｈａｒｋｅｙ’として公知）。これらの変異は、例えば、以下のＦｏｋＩ変異体を生じるために上記に列挙されたドメインと任意の方法で組み合されてもよい：
（ａ）ＥＬ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ
（ｂ）ＫＫ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ
（ｃ）ＥＬＤ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｑ４８６Ｅ：Ｎ４９６Ｄ：Ｉ４９９Ｌ
（ｄ）ＫＫＫ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｅ４９０Ｋ：Ｈ５３７Ｋ：Ｉ５３８Ｋ
（ｅ）ＫＫＲ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｅ４９０Ｋ：Ｈ５３７Ｒ：Ｉ５３８Ｋ
（ｆ）ＤＡ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｒ４８７Ｄ：Ｉ４９９Ａ
（ｇ）ＲＶ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｄ４８３Ｒ：Ｉ５３８Ｖ
（ｈ）ＤＡＤ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｒ４８７Ｄ：Ｎ４９６Ｄ：Ｉ４９９Ａ
（ｉ）ＲＶＲ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｄ４８３Ｒ：Ｈ５３７Ｒ：Ｉ５３８Ｖ
（ｊ）ＤＤ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｒ４８７Ｄ：Ｎ４９６Ｄ
（ｋ）ＲＲ−Ｓ：Ｓ４１８Ｐ：Ｋ４４１Ｅ：Ｄ４８３Ｒ：Ｈ５３７Ｒ。
【００７８】
本明細書に記載される遺伝子操作された切断ハーフドメインは、任意の好適な方法を用いて、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号の実施例５、ならびに国際公開第０７／０１４２７５号の実施例５および３８に記載されるような、野生型切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的突然変異誘発法によって調製してもよい。
【００７９】
融合タンパク質
本明細書に記載される遺伝子操作された切断ハーフドメインは、任意の細胞における切断について部位を特異的に標的化するＤＮＡ結合タンパク質との融合タンパク質で有利に用いられる。
【００８０】
特定の実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を含む。標的部位の選択；融合タンパク質（およびこれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法は、当業者に公知であって、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号に詳細に記載される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、植物の病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のＴＡＬエフェクター由来の遺伝子操作されたドメインである（Ｍｉｌｌｅｒら．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃ  ２２［印刷前の電子出版］；Ｂｏｃｈら，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９  Ｏｃｔ  ２００９（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１）ならびにＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９  Ｏｃｔ  ２００９（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１７）を参照のこと）；また、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許仮出願第６１／３９５，８３６号（２０１０年５月１７日出願）；同第６１／４０９，４２１号（２０１０年８月２１日出願）；同第６１／４５，１２１号（２０１０年１０月１３日出願）；同第６１／４５９，８９１号（２０１０年１２月２０日出願）および出願番号未割当（２０１１年２月２日出願）を参照のこと。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を生じる、記載されるとおりのＦｏｋＩ切断に対して融合される。
【００８２】
本明細書に記載されるヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）は、任意の適切な手段によって標的細胞に送達され得る。ジンクフィンガーを含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６０７，８８２号；同第６，６８９，５５８号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号に説明されており、それらの全ての開示は、参照により全内容が本明細書に組み込まれる。
【００８３】
本明細書に記載されるような融合タンパク質ヌクレアーゼはまた、１つ以上のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）をコードする配列を含むベクターを用いて送達され得る。任意のベクター系を用いてもよく、これには限定するものではないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどが挙げられる。また、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号も参照のこと。
【００８４】
従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移入方法は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織において遺伝子操作された切断ドメインを含んでいる、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）をコードする核酸を導入するために用いられ得る。このような方法は、インビトロでこのような核酸を細胞に投与するためにも用いられ得る。特定の実施形態では、１つ以上のヌクレアーゼをコードする核酸が、インビボまたはエキソビボでの遺伝子治療用途のために投与される。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、および、リポソームまたはポロキサマーのような送達ビヒクルと複合された核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソームまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子治療手順の概説に関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）；ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７（１９９３）；ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６（１９９５）；ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａら、ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｅｈｍ（編集）（１９９５）；ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６（１９９４）を参照のこと。
【００８５】
核酸の非ウイルス性の送達の方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロゾーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸の結合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの因子増強性取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００系（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を用いるソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）もまた、核酸の送達に用いられ得る。
【００８６】
追加の例示的な核酸送達システムとしては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）およびＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）によって提供されるシステムが挙げられる。
【００８７】
リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；米国特許第４，９４６，７８７号；および米国特許第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの有効なレセプター認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂肪としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号、国際公開第９１／１６０２４号のものが挙げられる。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に対してであってもよい。
【００８８】
免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４〜４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１〜２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２〜３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７〜６５４（１９９４）；Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０〜７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７〜４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照のこと）。
【００８９】
本明細書に記載されるような遺伝子操作された切断ハーフドメインを含むヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥ）をコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、体内の特定の細胞に対してウイルスを標的化するためおよび核へウイルスペイロードを輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接送達されてもよいし（インビボ）、またはそれらは、インビトロで細胞を処置するために用いられてもよく、改変された細胞が患者に投与される（エキソビボ）。本明細書に記載されるようなヌクレアーゼの送達のための従来のウイルスベースのシステムとしては限定するものではないが、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。宿主ゲノム内の組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入方法を用いて可能であり、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす場合が多い。さらに、高い形質導入効率が多くの異なる細胞種および標的組織で観察されている。
【００９０】
レトロウイルスの指向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み込むことによって変更することができ、それによって、標的細胞の潜在的な標的群を拡張させる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることが可能であり、かつ典型的に、高ウイルス価を産生する、レトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子送達システムの選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外因性配列のパッケージング能力を有する、シス作用の長末端反復から構成される。最小限のシス作用のＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いでそれらを用いて、治療遺伝子を標的細胞内に組み込みんで、永久的な導入遺伝子の発現をもたらす。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組み合わせに基づくベクターが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１〜２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５〜１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８〜５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４〜２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０〜２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号を参照のこと）。
【００９１】
ＺＦＰ融合タンパク質の一過性の発現が好ましい適用では、アデノウイルスベースの系を用いてもよい。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞種で極めて高い形質導入効率であり得、細胞分裂は必要としない。このようなベクターでは、高力価かつ高レベルの発現が得られた。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に産生され得る。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」ベクターがまた、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエキソビボの遺伝子治療手順のために、標的核酸で細胞を形質導入するために用いられる（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；国際公開第９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと）。組み換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ  ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含めて多数の刊行物に記載される。
【００９２】
少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが現在、臨床試験における遺伝子移入のために利用可能であり、これは、形質導入因子を生成するためにヘルパー細胞株中に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性に関与するアプローチを利用する。
【００９３】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓとは、臨床試験で用いられたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８−３０５（１９９５）；Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ  ９４：２２  １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療トライアルで用いされた最初の治療ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７５−４８０（１９９５））。５０％以上の形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターで観察された（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。
【００９４】
組み換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損および非病原性のパルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づいた見込みのある別の遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミド由来である。形質導入された細胞のゲノムへの組み込みに起因する、効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達は、このベクターシステムの重要な特徴である。（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：９１１７  １７０２−３（１９９８），Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。
【００９５】
複製欠損組み換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することが可能であり、かつ多数の異なる細胞種に容易に感染し得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換するように、遺伝子操作され；その後、複製欠損性ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増幅される。Ａｄベクターは、非分裂の分化した細胞、例えば、肝臓、腎臓、および筋肉に見られるものなどを含む、複数の種類の組織をインビボで形質導入し得る。従来のＡｄベクターは、大きな搬送能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注入を用いる抗腫瘍免疫のポリヌクレオチド治療に関与する（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３〜９（１９９８））。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１  ５〜１０（１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７  １０８３〜１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２０５〜１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９７〜６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０７〜５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３〜１０８９（１９９８）が挙げられる。
【００９６】
特定の実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。従って、本明細書に記載されるのは細胞に異種配列（例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮｓ））を導入するためのアデノウイルス（Ａｄ）ベクターである。
【００９７】
本出願で用いられ得るＡｄベクターの非限定的な例としては、組み換え（例えば、Ｅ１−欠失）、条件付き複製コンピテント（例えば、腫瘍崩壊性）および／または複製コンピテントなＡｄベクター（ヒトまたは非ヒト血清型由来）（例えば、Ａｄ５、Ａｄ１１、Ａｄ３５、またはブタアデノウイルス−３）；ならびに／あるいはキメラＡｄベクター（例えば、Ａｄ５／３５）または指向性変更のＡｄベクターであって、遺伝子操作されたファイバー（例えば、ノブ（ｋｎｏｂ）またはシャフト（ｓｈａｆｔ））タンパク質（例えば、ノブタンパク質のＨＩループ内のペプチド挿入）を有するベクターが挙げられる。また有用なのは、ＤＮＡペイロードの免疫原性を低下し、サイズを増大するための、「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」Ａｄベクター、例えば、Ａｄベクター（全てのアデノウイルス遺伝子が除去された）である。これによって、例えば、ＺＦＮおよびドナー配列をコードする配列の同時送達が可能になる。このようなガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）ベクターは特に、ドナー配列が標的化組み込みを介して組み込まれるべき大きい導入遺伝子を含む場合、有用である。
【００９８】
複製欠損組み換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は高力価で産生することが可能で、かつ多数の異なる細胞種に容易に感染し得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換し；その後、複製欠損性ベクターが、１つ以上の欠失した遺伝子機能をトランスで供給する細胞において増幅されるように、遺伝子操作される。例えば、ヒト２９３細胞はＥ１機能を供給する。Ａｄベクターは、非分裂の分化した細胞、例えば、肝臓、腎臓、および筋肉に見出されるものを含めて、複数の種類の組織をインビボで形質導入し得る。従来のＡｄベクターは、大きな搬送能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注入を用いる抗腫瘍免疫のポリヌクレオチド治療に関与する（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３〜１０８９（１９９８））。
【００９９】
臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１  ５〜１０（１９９６）；Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２０５〜１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９７〜６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０７〜５１３（１９９８）が挙げられる。
【０１００】
特定の実施形態では、Ａｄベクターは、２つ以上の異なるアデノウイルスゲノムからの配列を含有する、キメラアデノウイルスベクターである。例えば、Ａｄベクターは、Ａｄ５／３５ベクターであってもよい。Ａｄ５／３５は、１つ以上のＡｄ５のファイバー（繊維）タンパク質遺伝子（ノブ、シャフト、テール、ペントン）をＢ群のアデノウイルス、例えば、Ａｄ３５などからの対応するファイバータンパク質と交換することによって作成される。Ａｄ５／３５ベクターおよびこのベクターの特性は、例えば、Ｎｉら（２００５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１６：６６４−６７７；Ｎｉｌｓｓｏｎら（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：３７７−３８８；Ｎｉｌｓｓｏｎら（２００４）Ｊ．Ｇｅｎｅ．Ｍｅｄ．６：６３１−６４１；Ｓｃｈｒｏｅｒｓら（２００４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３２：５３６−５４６；Ｓｅｓｈｉｄｈａｒら（２００３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１１：３８４−３９３；Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２５６７−２５８３；およびＳｏｖａら（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：４９６−５０９に記載されている。パッケージング細胞を用いて、宿主細胞を感染させることが可能なウイルス粒子を形成する。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするΨ２細胞またはＰＡ３１７が挙げられる。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングするプロデューサー細胞株によって生成される。典型的には、これらのベクターは、パッケージングおよびその後の宿主への組み込みに必要とされる最小限のウイルス配列（適用可能な場合）、発現されるべきタンパク質をコードする発現カセットによって置換されている他のウイルス配列を含む。欠損しているウイルス機能は、パッケージングする細胞株によってトランスで提供される。例えば、遺伝子治療に用いられるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム中へのパッケージングおよび組み込みに必要とされる、ＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠失するヘルパープラスミドを含む細胞株内にパッケージングされる。この細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスで感染させられる。このヘルパーウイルスは、ヘルパープラスミドからＡＡＶベクターの複製、およびＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠失のせいで、有意な量ではパッケージングされない。アデノウイルスの汚染は、例えば、アデノウイルスの方がＡＡＶよりも鋭敏である熱処理によって低減することができる。
【０１０１】
多くの遺伝子治療適用において、遺伝子治療ベクターが高度の特異性で特定の細胞型に送達されることが望ましい。従って、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスコートタンパクとの融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように改変（修飾）することができる。このリガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知のレセプターに対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：９７４７〜９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現させるように修飾することができ、その組み換えウイルスが、ヒト上皮成長因子レセプターを発現する特定のヒト乳癌細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞がレセプターを発現し、ウイルスが細胞表面レセプターのためのリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス標的細胞対にまで及び得る。例えば、線状ファージは、事実上、任意の選択された細胞レセプターに特異的な結合親和性を有する抗体フラグメント（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように遺伝子操作することができる。上記の説明は、主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターは、特異的標的細胞による取り込みを好む、特異的な取り込み配列を含むように遺伝子操作することができる。
【０１０２】
遺伝子治療ベクターは、代表的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内の注入）または局所適用によって、下に記載されるように局所的に、個々の患者への投与によってインビボで送達されてもよい。あるいは、ベクターは、細胞に対して、エキソビボで、例えば、個人の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または万能ドナーの造血幹細胞に送達され、続いて、通常、ベクターを組み込んだ細胞の選択後、この細胞が患者へ再移植されてもよい。
【０１０３】
診断、研究、または遺伝治療のためのエキソビボでの細胞のトランスフェクション（例えば、宿主生物体へのトランスフェクト細胞の再注入を介する）は、当業者には周知である。好ましい実施形態においては、細胞は、被験体生物から単離され、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）でトランスフェクトされ、被験体生物（例えば、患者）内に再注入して戻される。エキソビボトランスフェクションに好適な種々の細胞型は、当業者には周知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版．１９９４）、および患者からの細胞をどのように単離し、かつ培養するかの考察のために本明細書に引用した参考文献を参照のこと）。
【０１０４】
一実施形態においては、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためのエキソビボ手順に用いられる。幹細胞を用いる利点とは、それらがインビトロで他の細胞型に分化することができるか、または哺乳動物（細胞のドナーなど）に導入して、それらの細胞を骨髄内に移植することができるということである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αなどのサイトカインを用いて、ＣＤ３４＋細胞をインビトロで臨床的に重要な免疫細胞型に分化するための方法は、公知である（イナバ（Ｉｎａｂａ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３〜１７０２（１９９２）を参照のこと）。
【０１０５】
幹細胞は、公知の方法を用いて、形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化された抗原提示細胞）などの不要細胞を結合する抗体で骨髄細胞をパンニングすることによって、骨髄から単離される（Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３〜１７０２（１９９２）を参照のこと）。ある場合には、幹細胞とは誘導性の多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【０１０６】
治療用ＺＦＰまたはＴＡＬＥ核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）はまた、インビボでの細胞の形質導入のために、生物体に直接投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、限定するものではないが、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションを含めて、血液または組織細胞との最終接触に分子を導入するために通常用いられる任意の経路による。そのような核酸を投与する適切な方法は、利用可能でかつ当業者に周知であり、２つ以上の経路を用いて特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、別の経路よりも即時的かつ有効な反応を提供し得る場合が多い。
【０１０７】
ＤＮＡを造血幹細胞に導入する方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４+細胞への導入遺伝子の導入に有用なベクターとしては、アデノウイルス３５型が挙げられる。
【０１０８】
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入遺伝子の導入に好適なベクターとしては、非組み込みレンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、Ｏｒｙら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１１３８２〜１１３８８；Ｄｕｌｌら、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３〜８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙら、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３〜９８８０；Ｆｏｌｌｅｎｚｉら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：２１７〜２２２を参照のこと。
【０１０９】
薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的には決定される。従って、下記に説明するように、使用可能な多種多様な適切な薬学的組成物の処方物が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，１９８９を参照のこと）。
【０１１０】
上記のとおり、開示される方法および組成物は、限定するものではないが、原核生物細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞を含む、任意の種類の細胞に用いることができる。タンパク質発現に適切な細胞株は、当業者には公知であり、限定するものではないが、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、昆虫細胞、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（ツマジロクサヨトウ）（Ｓｆ）、および真菌細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｓｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが挙げられる。これらの細胞株の子孫、変種、および誘導体もまた用いられてもよい。
【０１１１】
用途（適用）
開示される切断ドメインは、ＤＮＡを切断し、オフターゲット部位切断を最小化する（野性型を含むＤＮＡ結合ドメインまたはホモ二量体化切断ドメインに比較して）ために、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬ結合ドメイン（それぞれ、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを生じる）などのＤＮＡ結合ドメインと組み合わせて有利に用いられる。切断は、細胞のクロマチンにおける目的の１つ以上の領域で（例えば、変異体または野生型のいずれかの遺伝子における、例えば、ゲノムにおける所望の部位または所定の部位で）であってもよく；ゲノム配列（例えば、細胞クロマチンの目的の領域）を相同な非同一配列で置き換えるためであってもよく（すなわち、標的化組み換え）；ゲノム中の１つ以上の部位でＤＮＡを切断することによってゲノム配列を欠失して、この切断部位を次に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって連結するためであってもよく；相同組み換えを容易にする細胞因子を選択するためであってもよく；および／または野性型配列を変異体配列で置き換えるため、もしくはある対立遺伝子を異なる対立遺伝子に変換するためであってもよい。このような方法は、詳細には、本明細書にその全体が参照により組み込まれる、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号；国際公開第０７／０１４２７５号に記載される。
【０１１２】
従って、開示される遺伝子操作された切断ハーフドメインは、特異的に標的化される切断が所望されるか、および／または任意のゲノム配列を相同な非同一の配列で置き換えるための任意の方法について、任意のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮで用いられ得る。例えば、変異体ゲノム配列は、その野生型の対応物によって置き換えられてもよく、それによって、例えば、遺伝子疾患、遺伝性の障害、癌および自己免疫疾患の処置のための方法が提供される。同様に、ある遺伝子の１つの対立遺伝子は、本明細書に開示される標的化組み換えの方法を用いて異なる対立遺伝子によって置き換えられ得る。実際、特定のゲノム配列に依存する任意の病理学は、任意の方式で、本明細書に開示される方法および組成物を用いて修正または緩和され得る。
【０１１３】
例示的な遺伝性の疾患としては、限定するものではないが、軟骨形成不全症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損、アデノシン・デアミナーゼ欠損（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、α−１抗トリプシン欠乏、α−セラセミア、アンドロゲン不感性症候群、アペール症候群、催不整脈性右室異形成、異形成、毛細血管拡張性運動失調、バース症候群、β−サラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナヴァン病、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、有痛脂肪症、外胚葉異形成症、ファンコーニ貧血、進行性骨化性線維形成異常症、脆弱性Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、ヘモクロマトーシス、β−グロビン（ＨｂＣ）の６番目のコドンにおけるヘモグロビンＣ突然変異、血友病、ハンチントン病、フルラー症候群、低ホスファターゼ血症、クラインフェルター症候群、クラッペ病、ランガー・ギーディオン症候群、白血病接着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）、大脳白質萎縮症、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪・膝蓋骨症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダーウィリ症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリポ症候群、重度複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュワックマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス・マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少性橈骨欠損症（ＴＡＲ）症候群、トレチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワーデンバーグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）が挙げられる。
【０１１４】
標的化ＤＮＡ切断および／または相同組み換えによって処置され得る追加の例示的な疾患としては、後天性免疫不全症、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病、およびテイ・サックス病）、ムコ多糖症（例えば、ハンター病、ハーラー病）、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球病、ＨｂＣ、α−サラセミア、β−サラセミア）、および血友病が挙げられる。
【０１１５】
このような方法によってまた、遺伝子疾患を処置するための宿主における感染（ウイルスまたは細菌の感染）の処置が可能になる（例えば、ウイルスまたは細菌のレセプターの発現をブロックすること、それによって宿主生物体における感染および／または伝播を予防することによって）。
【０１１６】
感染性または組み込みされたウイルスゲノムの標的化切断を用いて、宿主内のウイルス感染を処置してもよい。さらに、ウイルスのレセプターをコードする遺伝子の標的化切断を用いて、そのようなレセプターの発現をブロックして、それによって、宿主生物体におけるウイルス感染および／またはウイルスの伝播を防止してもよい。ウイルスレセプター（例えば、ＨＩＶのＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４レセプター）をコードする遺伝子の標的化突然変異誘発を用いて、それらのレセプターがウイルスに結合できないようにして、それによって、新たな感染を防止し、かつ既存の感染の伝播を遮断してもよい。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１５９９６号を参照。標的化され得るウイルスまたはウイルスレセプターの非制限な例としては、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２などの単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７が挙げられる。肝炎科のウイルスとしては、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Δ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）が挙げられる。他のウイルスまたはそれらのレセプターとしては限定するものではないが、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスなど）；カリシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デングウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス等）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）；オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスのＡ型、Ｂ型、Ｃ型など）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科；レンチウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても公知）、ＨＩＶ−ＩＩ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトパピロマーウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルス、およびダニ媒介性脳炎ウイルスが標的化され得る。これらおよび他のウイルスの説明については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編集．１９８８）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，編集、１９９１）を参照のこと。ＨＩＶのレセプターには、例えば、ＣＣＲ−５およびＣＸＣＲ−４が挙げられる。
【０１１７】
従って、本明細書に記載されるようなヘテロ二量体切断ドメイン改変体は、遺伝子修飾の適用においてＺＦＮ特異性を改善するための広範な有用性を提供する。これらの改変体切断ドメインは、任意のＺＦＮ二量体のインビボ特異性を改善するための、部位指向性の突然変異誘発またはサブクローニングにいずれかによって、任意の既存のＺＦＮ中に容易に組み込まれ得る。
【０１１８】
上記のように、本明細書に記載される組成物および方法は、遺伝子組み換え、遺伝子修正および遺伝子破壊のために用いられ得る。遺伝子組み換えの非限定的な例としては、相同指向修復（ＨＤＲ）ベースの標的化組み込み；ＨＤＲベースの遺伝子修正；ＨＤＲベースの遺伝子組み換え；ＨＤＲベースの遺伝子破壊；ＮＨＥＪベースの遺伝子破壊および／またはＨＤＲ、ＮＨＥＪ、および／もしくは一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）の組み合わせが挙げられる。一本鎖アニーリング（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）（ＳＳＡ）とは、２つの相補性領域を曝すための５’−３’エキソヌクレアーゼによるＤＳＢの切除によって同じ方向で生じる２つの反復配列の間の二本鎖断裂の修復を指す。２方向のリピートをコードする一本鎖は次にお互いにアニーリングして、アニーリングされた中間体が処理され、その結果一本鎖テール（任意の配列にアニーリングされない一本鎖ＤＮＡの一部）が消化されて、ギャップがＤＮＡポリメラーゼによって埋められ、そしてＤＮＡ末端が再結合される。これによって、直接反復の間に位置する配列の欠失が生じる。
【０１１９】
切断ドメイン（例えば、ＺＦＮ）を含む組成物、および本明細書に記載される方法はまた、種々の遺伝子疾患および／または感染性疾患の処置に用いられてもよい。
【０１２０】
この組成物および方法は、幹細胞ベースの治療に適用されてもよく、これには、限定するものではないが：ショートパッチ遺伝子変換または一遺伝子の遺伝子治療のための標的化組み込みによる体細胞変異の修正；ドミナントネガティブ対立遺伝子の破壊；細胞への病原体の侵入または増殖性感染に必要な遺伝子の破壊；機能的な組織の分化または形成を促進する遺伝子活性を、例えば、調節することによる、組織遺伝子操作の増強；ならびに／あるいは機能的な組織の分化または形成を促進する遺伝子活性の破壊；例えば、幹細胞が特定の系列の経路に分化することを促進するための分化をブロックする遺伝子を、破壊すること、幹細胞分化を刺激し得る遺伝子またはｓｉＲＮＡ発現カセットの標的化挿入、幹細胞分化をブロックし、かつ多能性の良好な拡大および維持を可能にし得る遺伝子またはｓｉＲＮＡ発現カセットの標的化挿入、および／または容易なマーカーで幹細胞の分化状態をスコア付けすること、および培地、サイトカン、増殖条件、遺伝子の発現、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ分子の発現、細胞表面マーカーもしくは薬物に対する抗体の曝露がこの状態をどのように変化するかスコア付けすることを可能にする多能性もしくは分化状態のマーカーである内因性遺伝子とインフレームでのレポーター遺伝子の標的化挿入によって、分化をブロックまたは誘導すること；体細胞核移入であって、例えば、患者自身の体細胞が単離され、意図される標的遺伝子が、適切な方式で改変され得、細胞クローンが生成され（およびゲノムの安全性を保証するために品質管理され）、そしてこれらの細胞由来の核が単離され未受精卵に移入されて、患者特異的なｈＥＳ細胞が生成され、これが患者への移植の前に直接注入または分化されて、それによって組織拒絶が軽減または排除され得る、体細胞移入；ＭＨＣレセプターをノックアウトすること（例えば、免疫学的同一性が減少するかまたは全体として排除された細胞を生成するため）による万能幹細胞；が挙げられる。この手順のための細胞種としては、限定するものではないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、および胚性幹細胞が挙げられる。さらに、患者自身の体細胞からこれも生成される、誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を用いてもよい。従って、これらの幹細胞またはそれらの誘導体（分化した細胞の種類または組織）は、それらの起源にも組織適合性にもかかわらず、任意の人に移植可能であり得る。
【０１２１】
この組成物および方法はまた、体細胞治療（例えば、ＭＨＣまたはウイルスレセプターをノックアウトすることによる（上記を参照）、自己細胞治療および／または万能Ｔ細胞）のために用いられ得、それによって、生物学的特性を増強するために改変されたＴ細胞のストックの産生を可能にする。このような細胞は、Ｔ細胞のドナー供給源およびレシピエントに対するそれらの組織適合性に依存して種々の患者に注入され得る。
【０１２２】
治療適用に加えて、本明細書に記載される改変体によって得られる特異性の増大は、ＺＦＮに用いられる場合、作物の遺伝子操作、細胞株の遺伝子操作および疾患モデルの構築のために用いられ得る。偏性ヘテロ二量体切断ハーフドメインによって、特にホモ二量体活性が有効性を制限する場合、ＺＦＮ特性を改善するための直接的な手段が提供される。
【０１２３】
記載される遺伝子操作された切断ハーフドメインはまた、介在する領域を欠失するか、または２つの特異的な遺伝子座を一挙に変更するかのために、複数の標的で同時切断を要する遺伝子修飾プロトコールで用いられてもよい。２つの標的での切断は、潜在的には１０個の活性なＺＦＮの組み合わせを生じ得る、４つのＺＦＮの細胞発現を要する。このような適用のために、野性型ヌクレアーゼドメインのこれらの新規な改変体の置換は、所望されない組み合わせの活性を排除し、オフターゲット切断の機会を減じる。特定の所望のＤＮＡ標的での切断にＺＦＮ対Ａ＋Ｂの活性を要し、かつ第二の所望のＤＮＡ標的での同時の切断にＺＦＮ対Ｘ＋Ｙの活性を要するならば、本明細書に記載される変異体の使用は、ＡとＡとの対形成、ＡとＸとの対形成、ＡとＹとの対形成などを妨げ得る。従って、これらのＦｏｋＩ変異は、「非正統的な（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）」対形成の結果として非特異的な切断活性を低減し、ＺＦＮのさらに効率的な直交の変異体対の生成を可能にする（共同所有の米国特許出願公開第２００８０１３１９６２号および同第２００９０３０５３４６号を参照のこと）。
【０１２４】
遺伝子操作された切断ハーフドメインについて記載された適用に加えて、本明細書に記載される条件付き変異について多くの適用もまた存在する。特定された低温感受性の変異は、変異をコードする核酸の組み込まれたコピーを担持するトランスジェニック生物を作成するために用いられ得る。このような変異を担持する植物は、切断活性が冷温で休止するような変異体表現型を提示する。より高温にシフトされた際、融合は、活性な切断活性を提示する。これらの変異体生物体は、育種目的のための株を作成するために用いられ得てもよく、ここでは、低温感受性変異を含む系統が特定の標的を担持する系統と交配され得、その結果この交配の子孫がより高温にシフトされた場合、標的の切断が生じる。これによって、このようなプロセスの有効性が増大する。なぜなら、所望の結果を達成するために必要なドナーまたは融合タンパク質のいずれかでの植物の形質転換の数が減少するからである。同じ種類のシナリオがまた熱感受性の条件付き変異体について想定され得る。
【０１２５】
本明細書に言及される全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
明確性および理解の目的のために、図示および実施例によってある程度詳細に開示を行ってきたが、種々の変化および改変が、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、実践され得ることが当業者に明白になる。従って、前述の説明および実施例は、限定と解釈されるべきではない。
「実施例」
【実施例１】
【０１２７】
ＺＦＮの調製
ＣＣＲ５、５３ＢＰ１、ＧＲ、ＫＤＲ、ＲＩＰＫ１、ＣＸＣＲ４およびＰＤ−１に標的化されたＺＦＮは、本質的に、Ｕｒｎｏｖら、（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５（７０４２）：６４６−６５１，Ｐｅｒｅｚら、（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６（７）：８０８−８１６、および米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号に記載のとおり、設計して、プラスミドベクター中に組み込むか、またはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。これらのＺＦＮを構築して、Ｍｉｌｌｅｒら．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：７７８−７８５および米国特許出願公開第２００５００６４４７４および国際公開第２００５／０１４７９１号に記載のようにＥＬＩＳＡおよびＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）Ｃｅｌ−１アッセイ（「Ｃｅｌ−１」）によって試験した。さらに、ＧＲに標的化されるＺＦＮについては、米国特許出願公開第２００８／０１８８０００号、およびＰＤ−１に標的化されるＺＦＮに関しては米国特許仮出願第６１／２８１，４３２号、ＣＣＲ５特異的なＺＦＮに関しては米国特許出願公開第：２００８／０１５９９９６号、およびＣＸＣＲ４−特異的なＺＦＮに関しては、米国特許出願第１２／６６１，５３９号を参照のこと。
【０１２８】
ＲＩＰＫ１、ＫＤＲおよび５３ＢＰ１に標的化されたＺＦＰの特異的な例は、表１に開示される。この表の第一列は、ＺＦＰの内部参照名（数）である。「Ｆ」とは、フィンガーを指し、「Ｆ」に続く数は、どのジンクフィンガーであるかを指す（例えば、「Ｆ１」は、フィンガー１を指す）。表２は、標的遺伝子上の標的結合部位を列挙する。ＺＦＮ認識らせんに接触する認識部位中のヌクレオチドは、大文字で示し；接触しないヌクレオチドは、小文字で示す。
【表１】
2013518586.tif 000003
【表２】
2013518586.tif 000004
【実施例２】
【０１２９】
変異体ＦｏｋＩ  ＺＦＮの遺伝的スクリーニング
モデル系としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いて、本発明者らは、低温で極めて低減されるが、高温では十分な切断活性を有する低温感受性の表現型を示すＺＦＮ変異体を単離した。低温変異体が特に興味深い。なぜなら、歴史的に、それらは、多量体タンパク質複合体のサブユニットをコードする遺伝子中に存在することが示されているからである。これらの変異体は、低温でタンパク質−タンパク質の相互作用に優先的に影響する。従って、このクラスの変異体を単離することによって、二量体化インターフェース内で重要な残基を特定する空でない（ｎｏｎ−ｎｕｌｌ）変異が明らかになった。
【０１３０】
一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）レポーター株および変異体ライブラリー構築は以下のように行った。ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインのランダム突然変異誘発は、変異性（エラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲを用いて行い、および変異体のライブラリーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるギャップ修復によって構築した。要するに、レポーター株は、突然変異誘発のＰＣＲフラグメント（ＦｏｋＩドメイン）およびこのＰＣＲフラグメントの末端でベクターの末端がＤＮＡ配列を共有するように調製した直線化プラスミドベクターで同時形質転換した。ベクターとＰＣＲフラグメントとの間の相同組み換えは、高頻度で生じ、変異したＺＦＮ発現ベクターを含む酵母形質転換体の収集を生じた。ヌクレアーゼのジンクフィンガードメインは、ヒトＣＣＲ−５遺伝子（８２６６と命名）に結合して、詳細には、米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号に記載される。
【０１３１】
次いで、ライブラリーを、本質的に米国特許出願公開第２００９／０１１１１１９号に記載のように、出芽酵母中で目的の表現型についてスクリーニングまたは選択した。要するに、２つの独立したＳＳＡレポーター構築物を出芽酵母のゲノムに組み込んだ。両方のレポーターとも、８２６６ＺＦＮのホモ二量体の結合部位を含む。ＭＥＬ１  ＳＳＡレポーターは、陽性および陰性の両方の選択マーカーを含む。ＵＲＡ３遺伝子は、ｕｒａ−培地中での陽性選択のために、および５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を用いる陰性選択のために用いられる。ＫａｎＭＸカセットは、ジェネティシンに対するドミナント耐性を付与する（Ｇ４１８）。ＳＳＡ後のＭＥＬ１遺伝子の再構成は、発色性基質［ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰＧ）または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ａ−Ｇａｌ）］を用いて検出された。ＰＨＯ５  ＳＳＡレポーターは、ノーセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）（ＮＡＴ）に対してドミナントな耐性を付与する陽性選択カセットＮａｔＭＸを含み。ＰＨＯ５遺伝子の再構成は、発色性基質［ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（ＰＮＰＰ）またはｘ−リン酸ｐ−トルイジン塩（Ｘ−Ｐｈｏｓ）］を用いて検出された。従って、機能的な８２６６ＺＦＮ誘導性のＳＳＡによって誘導されたＤＮＡ二本鎖断裂（ＤＳＢ）は結果として、レポーター遺伝子の再構成、ならびに陽性および陰性の選択マーカーの排除を生じた。
【０１３２】
ＦｏｋＩ変異体の遺伝子スクリーニングは、以下の通り行った。第一に、ＺＦＮのガラクトース誘導性発現を、２２℃という非許容性の温度で行った。回収後、細胞を、Ｋａｎ（Ｇ４１８）、ＮＡＴおよびｕｒａ−培地中でインキュベートして、全ての活性なＺＦＮを排除した。この工程は、潜在的な低温感受性変異体について、同様に不活性なＺＦＮについて選択した。
【０１３３】
第二に、細胞を、３７℃（許容温度）にシフトして、５−ＦＯＡおよびＸ−Ｐｈｏｓを含有する培地上にプレートした。低温感受性ＺＦＮを含有する細胞のみが、青いコロニーを形成した。次いで、これらの細胞由来のプラスミドを単離して、レポーター株に形質転換して、低温感受性の表現型を確認した。得られた変異は、ＦｏｋＩドメインの直接配列決定によって特定された。
【０１３４】
表３は、スクリーニングによって特定された種々の変異体を示す。低温感受性を付与すると予想される変異は、１列目に示す（ＺＦＮ中の二量体境界に対する近接性に基づく）。
【表３】
2013518586.tif 000005
【０１３５】
単離された変異体の低温感受性切断活性の活性（野性型に対して）を図１Ａに示す。レポーター株を単離された変異体ベクターで形質転換して、３つの培養物に分けて、２２℃、３０℃および３７℃でインキュベートした。発現後、変異体の活性を決定して、野性型ＺＦＮの活性の画分として報告した。インキュベーションの温度の増大と関連するＺＦＮ切断活性の増大によって、単離された変異体は低温感受性であることが示される。
【実施例３】
【０１３６】
新規な遺伝子操作されたＦｏｋＩ切断ハーフドメインの設計（デザイン）
Ｍｉｌｌｅｒら．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（７）：７７８−８５に記載のＺＦＮ構造モデルを用いて、本発明者らは、実施例２で試験した変異体の位置をマッピングして、変異した残基のうち２つ（Ｎ４９６およびＨ５３７）が二量体の境界上でお互いに面しており、近接して見出されることを見出した。これらの変異体のモデル化によってまた、Ｈ５３７ＲおよびＮ４９６Ｄ変異が塩架橋を形成して、二量体化境界を強くする可能性が高いことが示された。表４は、試験した種々の変異体の命名法を示す。
【表４】
2013518586.tif 000006
【０１３７】
３重変異体の種々の一対の組み合わせ（例えば、ＥＬＤ：ＫＫＫ、ＥＬＤ：ＫＫＲ、ＥＬＥ：ＫＫＫおよびＥＬＥ：ＫＫＲ）を、ＥＬ：ＫＫ対（ＥＬ：ＫＫ変異体は、米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２に記載）に対する切断活性について、種々のＺＦＮバックグラウンドで比較した。ＺＦＮ含有プラスミドを次にＫ５６２細胞またはＰＭＢＣ細胞中にヌクレオフェクトした。適切な遺伝子座でＺＦＮ活性を決定するために、Ｃｅｌ−１ミスマッチアッセイを、本質的に製造業者の指示（Ｔｒａｎｇｅｎｏｍｉｃ  ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標））に従って行った。細胞を回収して、染色体ＤＮＡをＱｕｉｃｋｅｘｔｒａｃｔ（商標）Ｋｉｔを用いて製造業者の指示（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標））に従って調製した。標的化遺伝子座の適切な領域を、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ（商標）Ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応物は、９４℃まで加熱し、徐々に室温まで冷却した。約２００ｎｇのアニーリングされたＤＮＡを０．３３μＬのＣｅｌ−１酵素と混合して、４２℃で２０分間インキュベートした。反応生成物を、１×Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液中でポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【０１３８】
図２〜５に示されるとおり、三重変異体の種々の組み合わせは、もとの偏性ヘテロ二量体のＺＦＮ（ＥＬ：ＫＫ）よりも活性である。詳細には、図２は、Ｋ５６２細胞へのＺＦＮのトランスフェクションの３日後および１０日後における、５３ＢＰ１に対して標的化されたＺＦＮでのＺＦＮ改変体ＥＬＤ：ＫＫＫ、ＥＬＤ：ＫＫＲ、ＥＬＥ：ＫＫＫ、ＥＬＥ：ＫＫＲ、ＥＬＤ：ＫＩＫ、ＥＬＤ：ＫＩＲ、ＥＬＥ：ＫＩＫおよびＥＬＥ：ＫＩＲのＣｅｌ−１アッセイ結果を示す。図３は、ＫＤＲに標的化されたＺＦＮおよびＫ５６２細胞へのＺＦＮのトランスフェクション２０日後のＺＦＮ改変体ＥＬＤ：ＫＫＫおよびＥＬＤ：ＫＫＲのＣｅｌ−１アッセイ結果を示す。図４は、Ｋ５６２細胞でのＧＲ特異的ＺＦＮの状況におけるＥＬＤ；ＫＫＲおよびＥＬＤ：ＫＫＫ  ＦｏｋＩ遺伝子操作切断ドメインのＣｅｌ−１アッセイ結果を示す。図４はまた、トランスフェクションのための漸減量（４００ｎｇ〜１６ｎｇ）の発現プラスミドを用いる切断活性を示し、ここでは２つの異なるセットのサンプルがある（レーン１〜１４およびレーン１５〜２６）。これらの結果、８０ｎｇの発現プラスミドを入れれば、ＥＬＤ：ＫＫＲおよびＥＬＦ：ＫＫＫ変異体は両方ともＥＬ：ＫＫ変異体よりも活性であったことが示される（レーン８とレーン９および１０、ならびにレーン２０とレーン２１および２２を比較する）。
【０１３９】
図５は、３つの異なるＲＩＰＫ１−特異的なＺＦＮバックグラウンドにおけるＥＬＤ：ＫＫＲおよびＥＬＤ：ＫＫＫ変異体の切断活性を示す。新規な変異体は両方ともＲＩＰＫ１対ＡおよびＲＩＰＫ１対ＢにおけるＥＬ：ＫＫ変異体よりも活性であった。図５Ｂでは、対Ｃのバックグラウンドにおける新規な変異体を、３７℃および３０℃の両方で試験して、全てのＺＦＰ対の活性が３０℃で増大することを見出した（米国特許出願公開第２００９／０１１１１１９号を参照のこと）。
【実施例４】
【０１４０】
ホモ二量体としての遺伝子操作された切断ドメインの活性
新規な変異体をまた、強制されたホモ二量体としてＤＮＡを能動的に切断する能力について試験した。これらのアッセイでは、ジンクフィンガー結合ドメインを、対の両方のメンバーで同じであるＦｏｋＩ切断ドメインに融合する。従って、任意の活性を観察するために、ＦｏｋＩドメインは、それ自体とホモ二量体化しなければならない（「強制されたホモ二量体化」）。ＣＣＲ５−標的化ＺＦＮの強制されたホモ二量体化は、Ｋ５６２細胞におけるＦｏｋＩ改変体のヌクレオフェクション（図６を参照のこと）によってアッセイし、Ｃｅｌ−１アッセイを用いて、ＣＣＲ５ヘテロ二量体標的、ＣＣＲ５−Ｌ  ＺＦＮホモ二量体（ＡＢＬＩＭ２）、およびＣＣＲ５−Ｒホモ二量体（ＰＧＣ）オフターゲット部位でのＺＦＮ誘導性のインデルの頻度を決定した。これらの実験のために、変異をＣＣＲ５−特異的な８２６６および８１９６ｚの対で作製し、次いで試験した。従って、「ＷＴ」と表示したレーンでは、８２６６／８１９６ｚ対を用いた。次いで、試験した各々の変異体対について、示した変異と同様の対を作製し、そのためＥＬ：ＥＬレーンは、８２６６−ＥＬおよび８１９６ｚ−ＥＬなどを含む対を示す。
【０１４１】
図６からわかるように、ＫＫ、ＫＫＫおよびＫＫＲホモ二量体は、ＣＣＲ５ヘテロ二量体標的部位で検出可能な切断活性を示さないが、ＥＬ：ＥＬおよびＥＬＤ：ＥＬＤホモ二量体によって切断は制限される。ＥＬＤ：ＥＬＤ改変体はＥＬ：ＥＬに比較して約１．５倍小さい活性を有し、このことは、特異性の増大を示す。重要なことに、公知のオフターゲット部位ＡＢＬＩＭ２およびＰＧＣの試験では、いかなる変異体によっても検出可能な切断活性は示されない。
【０１４２】
ＥＬＤ切断ドメインの特異性の改善をさらに確認するために、これらの同じ強制されたホモ二量体をＫ５６２細胞中で、漸減濃度で試験した。図７からわかるとおり、試験した全てのＤＮＡ濃度で、ＥＬＤ：ＥＬＤは、ＥＬ：ＥＬと比較して低いホモ二量体活性を示す。強制されたＧＲ−特異的なＺＦＮホモ二量体も試験し（図８を参照のこと）、検出可能な切断活性はなかった。いくつかの実施形態では、Ｉ４９９Ａ変異体を用いて、Ｉ４４９Ｌ変異を置き換え、任意の潜在的なＥＬＤホモ二量体化をさらに減じた。この場合、ＥＡＤ  ＣＣＲ５特異的なＺＦＮの強制されたホモ二量体化で、検出可能な切断活性は生じなかった。
【０１４３】
さらに、これらの細胞をまた、ゲノムにおいてＤＳＢ部位で蓄積するγ−Ｈ２ＡＸに特異的な抗体を用いてＤＳＢについて試験した。染色された細胞を、フローサイトメトリーによって分別して、その結果を図９に示す。この図からわかるとおり、ＷＴ対を除けばごくわずかな染色しかなく、このことは、変異したＦｏｋＩドメインを含むＺＦＮ対の存在下ではゲノム中のＤＳＢが低レベルであることを示す。
【実施例５】
【０１４４】
初代細胞における遺伝子操作されたハーフドメインの活性
この構築物をまた、初代細胞で試験した。示した変異を含む漸減量のＣＣＲ５−標的化ＺＦＮ構築物を、Ｐｅｒｅｚら、（同書）に記載のようにＰＢＭＣ中にヌクレオフェクトした。この細胞を、トランスフェクション３日後に回収して、Ｃｅｌ−１アッセイを用いてＺＦＮ誘導性のインデルの頻度を決定した。図１０Ａからわかるとおり、ＥＬＤ：ＫＫＫおよびＥＬＤ：ＫＫＲ変異体は、低濃度でさえこれらの細胞中で完全に活性であった。同様の研究をＰＤ−１に対して標的化したＺＦＮで行って、図１０Ｂに示す。遺伝子操作されたハーフドメイン構築物は、ＰＤ−１−特異的なＺＦＮの３つの対で作製し、ここでは対Ａは対１２９４２と１２９７４とから構成され、対Ｂは対１２９４２と２５０１６とから構成されるが、対Ｃは、対１２９４２と２５０２９とから構成される（米国特許仮出願第６１／２８１，４３２を参照のこと）。その結果は、図１０Ｂにグラフ形式で示しており、これによって、ＥＬＤ：ＫＫＲおよびＥＬＤ：ＫＫＫ変異体が、ＷＴ対およびＥＬ：ＫＫ対の両方に比べて優れた活性を有したことが示される。
【０１４５】
ＧＲ−特異的なＺＦＮバックグラウンドで作製された変異体をまた、図１１Ａに示すように活性についてＰＢＭＣで試験した。この実施例では、漸減量の変異体をトランスフェクションの３日後および１０日後に試験した。新規な変異体は、ＥＬ：ＫＫ対に比較して活性の増大を有することが見出された。図１１Ｂでは、ＰＢＭＣでの６つの独立したトランスフェクションで繰り返した実験の平均値を示す。この値は、ＥＬ−ＫＫ対に比較して相対活性の平均の平均＋／−標準誤差である。Ｐ値は、２標本Ｔ検定を用いて、これらの結果の再現性を示す。
【実施例６】
【０１４６】
ＤＳＢへの標的化組み込み、ＥＬ：ＫＫとＥＬＤ：ＫＫＲとの比較
ＥＬ：ＫＫおよびＥＬＤ：ＫＫＲ  ＦｏｋＩ変異体ＺＦＮをまた、標的化組み込み（ＴＩ）を促進するのにおけるそれらの使用について比較した。この実験については、新規なＢａｍＨＩ制限部位を含むドナー核酸を作製した。首尾よいＴＩの後、ＺＦＮ標的部位を囲む領域をＰＣＲによって増幅し、次いでＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ制限に供して、新規に導入された制限部位を切断した。ドナーＤＮＡの配列を下に示す：
【表５】
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【０１４７】
この配列では、ＺＦＮ結合部位を大文字で示し、導入されたＢａｍＨＩ制限部位には下線を付している。これらの実験について、ＦｏｋＩ変異体を、ＧＲ−特異的なＺＦＮバックグラウンドで試験して、図１１Ｃに示しており、これは、ヌクレオフェクション工程の間に、２つの異なるＺＦＮコードプラスミド濃度を用いて行った。図１１Ｃでわかるように、ＥＬＤ／ＫＫＲ対は、試験した両方の濃度で、ＥＬ／ＫＫ対よりもドナーの導入を生じるのに効率的であった。
【実施例７】
【０１４８】
ＤＡ：ＲＶ  ＦｏｋＩ変異体対、ＥＬＤ：ＫＫＲまたはＥＬＤ：ＫＫＫの活性の比較
ＧＲ−特異的なおよびＣＣＲ５−特異的なＺＦＮバックグラウンドの両方において、ＦｏｋＩ変異を含むＺＦＮの対を構築した。次いで、これらを、上記の様に、Ｋ５６２細胞でのそれらの内因性の標的に対して試験して、上記のように、Ｃｅｌ−Ｉミスマッチアッセイを用いて切断活性についてアッセイした。実験の各々の設定では、ＺＦＮをコードする８０ｎｇのＤＮＡを、ヌクレオフェクション工程に用いた。形質導入後３日で、Ｃｅｌ−Ｉアッセイを行って、結果を図１２に示しており、これは、ＧＲ−特異的な切断およびＣＣＲ５−特異的な切断の結果を示している。このデータによって、ＤＡ：ＲＶＦｏｋＩの対は、ＥＬ：ＫＫ、ＥＬＤ：ＫＫＫおよびＥＬＤ：ＫＫＲの対よりもかなり少ない活性を示したことが示される。しかし、ＥＡ：ＫＶの対は、このアッセイで活性を示した。
【０１４９】
次に、種々のＺＦＮを、それらが強制されたホモ二量体化によってホモ二量体化する能力について試験した（実施例４を参照のこと）。典型的には、２つのＦｏｋＩ変異体ドメインがホモ二量体化する能力を有することは望ましくない。なぜなら、これは、望ましくないオフターゲット切断の可能性を増大し得るからである。この実験は、４００ｎｇのＺＦＮ含有プラスミドを各々のヌクレオフェクションの用いたこと以外は上記のとおり行った。その結果を図１３に示しており、これによって、ＫＶ  ＦｏｋＩ変異体がかなりの程度までホモ二量体化する能力を有することが示される。従って、ＥＡ：ＫＶの対は、このＣｅｌ−ＩアッセイでＥＬＤ：ＫＫＲの対に匹敵する活性を有することが見出された（図１２を参照のこと）が、ＫＶ  ＦｏｋＩ変異体がホモ二量体化して、切断活性を示すことができたという事実によって、これは、オフサイト切断のリスクの増大のせいであまり望ましくなくなる。
【実施例８】
【０１５０】
ＤＡ：ＲＶ  ＦｏｋＩ変異体の活性の増強
次いで、ＤＡ：ＲＶ  ＦｏｋＩ変異体を検査して、それらを他のＦｏｋＩ変異と組み合わせることによってそれらの活性を増大することが可能か否かを確認した。従って、ＤＡ：ＲＶ対を、Ｎ４９６ＤおよびＨ５３７Ｒ変異を含むように作製して、ＤＡＤ：ＲＶＲの対を得た。これらの変異体を含むＣＣＲ５−特異的なおよびＣＸＣＲ４−特異的な対についてのＣｅｌ−Ｉ活性のアッセイ結果を、図１４に示す。実験は、一形質転換あたり８０ｎｇのプラスミドを用いて、前に記載のとおり行った。図からわかるとおり、Ｎ４９６ＤおよびＨ５３７Ｒ変異の付加によって切断活性は増大した。同様の結果がまた、ＧＲ−特異的なＺＦＮバックグラウンドにおけるこれらの変異を用いて見出された（図１４）。
【０１５１】
ＤＡ：ＲＶ＋Ｎ４９６ＤおよびＨ５３７Ｒの組み合わせをまた、活性の低いＺＦＮ対バックグラウンドにおいて試験した。この実験では、ＫＤＲ−特異的なＺＦＮを選択して、Ｃｅｌ−Ｉアッセイの結果を図１５に示す。この図では、ＤＡ：ＲＶおよびＤＡＤ：ＲＶＲの両方の変異体の活性は検出できなかった。従って、Ｎ４９６ＤおよびＨ５３７Ｒ変異の付加は、いくつかのＺＦＮでは有益であるが、弱いか検出不能な活性を有するＺＦＮの対をレスキューすることはできない。
【実施例９】
【０１５２】
同時の特異的な二重切断のための直交対の試験
ゲノム内の２つの標的部位で同時切断を行うことが所望され得る。追加された特異性に関しては、所望の遺伝子座で切断するＺＦＮ対のみが生産的に二量体化することが可能で、その結果活性な対が所望の特異性を有する場合が最高であろう。この目的を達成するために、対は、ホモ二量体化するか、またはトランスヘテロ二量体化して活性な対を作成できてはならない。言い換えれば、標的１がＺＦＮ対Ａ＋Ｂによって切断され、そして、標的２がＺＦＮ対Ｘ＋Ｙによって切断される場合、Ａ＋Ａ（ホモ二量体）、Ａ＋ＸおよびＡ＋Ｙ（トランスヘテロ二量体）の対形成は、例えば、望ましくない。従って、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４に特異的なＥＬＤ／ＫＫＲ＋ＤＡＤ／ＲＶＲ対を、ＣＣＲ５−特異的なＥＬＤハーフ切断ドメインが、ＣＸＣＲ５−特異的なＤＡＤまたはＣＸＣＲ４−特異的なＲＶＲハーフドメインのいずれかとトランスヘテロ二量体化できないという期待とあわせて試験した。さらに、ＥＬＤ／ＫＫＲ対の改変体を作製し、その結果、ＥＬＤ変異体の４９６位のＤ変異およびＫＫＲの５３７位のＲ変異体は交換されて、ＲＥＬ／ＤＫＫ対（Ｈ５３７Ｒ＋Ｑ４８６Ｅ＋Ｉ４９９Ｌ／Ｎ４９６Ｄ＋Ｅ４９０Ｋ＋Ｉ５３８Ｋ）が形成された。さらに、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４に特異的なＥＬＤ／ＫＫＲ＋ＤＤ／ＲＲ対もまた一緒に試験した。
【０１５３】
Ｃｅｌ−Ｉ活性のアッセイ結果を、図１６および２２に示す。この実験では、試験した条件は、両方とも標準の３７℃インキュベーションおよび３０℃インキュベーションであった（共同所有の米国特許出願第１２／８００，５９９号を参照のこと）。要するに、形質導入後、細胞を、３７℃で３日間、または３０℃で３日間保持した。３日間インキュベーションした後、Ｃｅｌ−Ｉアッセイを行って、両方の標的が切断されたか否かを確認し、ここではＣＣＲ５−特異的なＣｅｌ−Ｉアッセイは、図１６の上部に示し、そしてＣＸＣＲ４−特異的なＣｅｌ−Ｉアッセイを下に示す。
【０１５４】
これらの結果、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４標的の両方での切断は、直交性の変異体のこれらの対を用いて単一工程で達成可能であったことが示される。
【０１５５】
変異体をさらに試験して、可能性のあるオフターゲット切断を検査した。インシリコの分析を行って、非正統的なＣＣＲ５−ＣＸＣＲ４トランスヘテロ二量体ＺＦＮ対によって認識され得る標的を模倣し得る、可能性のあるオフターゲット部位を特定した。これらの実験では、オフターゲット切断のための４つのトップ候補をＣｅｌ−Ｉアッセイによって検査し、ここではオフターゲット部位の配列は、表５に下に列挙する。
【表６】
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【０１５６】
形質導入は、３７℃および３０℃の両方のインキュベーション条件を用いて上記のように試験して、結果を図１７および２２で示す。図１７で示されるとおり、ＥＬＤ／ＫＫＲ  ＣＸＣＲ４対と組み合わせたＥＬＤ／ＫＫＲ  ＣＣＲ５対は、オフターゲット＃３、＃５および＃１０である程度の切断をもたらす。ＲＥＬ／ＤＫＫ  ＣＸＣＲ４対とのＥＬＤ／ＫＫＲ  ＣＣＲ５対の組み合わせもまた、部位＃３、＃５および＃１０である程度の切断をもたらした。しかし、ＤＡＤ／ＲＶＲ  ＣＸＣＲ４対と組み合わせたＥＬＤ／ＫＫＲ  ＣＣＲ５対は、これらのオフターゲット部位で検出可能な切断をもたらさなかった。さらに、図２２に示されるとおり、ＤＤ／ＲＲ  ＣＸＣＲ４対と組み合わされたＥＬＤ／ＫＫＲ  ＣＣＲ５対は、これらのオフターゲット部位で検出可能な切断をもたらさなかった。
【０１５７】
これらの結果、これらのＦｏｋＩ変異体は、２つ以上の標的部位の同時切断を可能にする設定で用いられ得るが、望ましくないオフターゲット切断を減少することが示される。
【実施例１０】
【０１５８】
Ｓｈａｒｋｅｙ変異体とペアリングされたＦｏｋＩ変異体の評価
ＦｏｋＩ変異体の設定は、記載されており、これは、Ｓｈａｒｋｅｙ（Ｓ４１８Ｐ＋Ｋ４４１Ｅ）およびＳｈａｒｋｅｙ’（Ｓ４１８Ｐ＋Ｆ４３２Ｌ＋Ｋ４４１Ｅ＋Ｑ４８１Ｈ＋Ｈ５２３Ｙ＋Ｎ５２７Ｄ＋Ｋ５５９Ｑ）ＦｏｋＩ変異体として公知であり、ＤＮＡ切断の効率を向上すると考えられる（ｓｅｅ  Ｇｕｏら，（同書））。従って、Ｓｈａｒｋｅｙ変異体を、本明細書に記載の種々のＦｏｋＩ変異体と組み合わせて試験して、切断活性が、Ｓｈａｒｋｅｙ変異の存在によってさらに増強され得るか否かを確認した。変異体組み合わせは、ＧＲ−特異的なおよびＫＤＲ−特異的なＺＦＮバックグラウンドで行い、上記のようなＣｅｌ−Ｉアッセイを用いて切断活性について試験した。結果は、図１８に示し、これによって、変異の活性が付加であると思われることが示される。例えば、３日目のパネルでのレーン１０および１１とレーン１２および１３との比較によって、検出されたＮＨＥＪ活性（インデル）が、ＥＬＤ／ＫＫＲ  ＧＲ−特異的な対についての１１〜１２からＥＬＤ−Ｓ／ＫＫＲ−Ｓ対についての２０％インデルまでいったことが示される。同様に、３日目のＫＤＲ特異的なＺＦＮについてレーン１０および１１とレーン１２および１３の比較は、検出可能な約２６〜２８％インデルから検出可能な４８〜５０％インデルまでいった。
【０１５９】
さらに、Ｓｈａｒｋｅｙ  ＦｏｋＩ変異体は、ＧＲ−特異的なＺＦＮバックグラウンドにおいてＤＡ／ＲＶおよびＤＡＤ／ＲＶＲ  Ｆｏｋ１変異体と組み合わされて、Ｃｅｌ−Ｉ活性アッセイを用いて活性について試験された。この結果は、図１９Ａに示しており、ここで、ＦｏｋＩ変異は、活性に関して相加的であることが示される。（レーン４および５とレーン６および７とを比較する）。
【０１６０】
変異体組み合わせもまた試験して、Ｓｈａｒｋｅｙ変異の存在が、実施例４において上記されるような強制されたホモ二量体化アッセイにおけるホモ二量体化切断の量を増大するか否かを確認した。図２０は、付加されたＳｈａｒｋｅｙ変異の有無による、ＧＲ−特異的な変異体の結果を示す。この図からわかるように、変異体は、ホモ二量体化能力において検出可能な変更はなかった。同様に、ＤＡ−Ｓ／ＲＶ−ＳおよびＤＡＤ−Ｓ／ＲＶＲ−Ｓ変異体もまた試験して、ＧＲ−特異的なＺＦＮバックグラウンドにおけるホモ二量体化の増大があったか否かを確認した。その結果を図２１Ａに示し、ここでは、生産的なホモ二量体化の増大がなかったことが示される。図２１Ｂは、全てのレーンの等しいローディングを示す。
【実施例１１】
【０１６１】
Ｄ：Ｒ  ＦｏｋＩ変異体の活性の増強
Ｄ：Ｒ  ＦｏｋＩ変異体（Ｒ４８７Ｄ：Ｄ４８３Ｒ）（例えば、米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号および同第２００９／０３０５３４６号を参照のこと）を検査して、それらを他のＦｏｋＩ変異と組み合わせることによってそれらの活性の増大が可能になるか否かを確認した。要するに、Ｎ４９６ＤおよびＨ５３７Ｒ変異を含み、上記で記載されるように行われるＤＤ：ＲＲ対およびＣｅｌ−Ｉアッセイを生じるようにＤ：Ｒの対を作製した。
【０１６２】
図２１で示すとおり、Ｎ４９６ＤおよびＨ５３７Ｒ変異の追加によって、切断活性は増大された。
【０１６３】
まとめると、これらの結果によって、本明細書に記載されるＦｏｋＩ変異体は、ここで示されるデータ（新規な変異体が前に記載されたＦｏｋＩ変異体よりも活性であって、オフサイト切断活性を示す程度が低いことを示す）であることが示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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