(57)【要約】  本発明は生命科学および医学の分野に関する。具体的には、本発明は癌治療に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターならびに前記ベクターを含む細胞および医薬組成物に関する。本発明はまた、被験者の癌を治療するための前記ベクターおよび被験者の癌を治療するための方法にも関する。さらにまた、本発明は、細胞内でCD40Lを産生させ、被験者の腫瘍特異的免疫応答およびアポトーシスを増強する方法ばかりでなく、細胞内でCD40Lを産生させ、被験者の腫瘍特異的免疫応答およびアポトーシスを増強すると同時に被験者の腫瘍関連免疫抑制を軽減するための本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用にも関する。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
1)カプシド改変を含むアデノウイルス血清型5(Ad5)核酸主鎖、
2)E1領域の上流の、腫瘍特異的ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)プロモーターをコードする核酸配列;および
3)E3領域の欠失アデノウイルス遺伝子gp19k/6.7Kの代わりに、ヒトCD40Lをコードする核酸配列
を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項２】
E2、E4および後期領域からなる群から選択される1以上の領域をさらに含む、請求項1に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項３】
以下の領域:左ITR、部分的E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分的E3、L5、E4および右ITRを含む、請求項1または2に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項４】
領域が5'から3'方向に順次に配置される、請求項3に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項５】
野生型領域がE1領域の上流に位置する、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項６】
E1領域がウイルスパッケージングシグナルを含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項７】
CD40Lをコードする核酸配列がウイルスE3プロモーターの制御下にある、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項８】
CD40Lをコードする核酸配列が、野生型ヒト配列と1ヌクレオチド異なる、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項９】
E4領域が野生型である、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項１０】
カプシド改変が、Ad5/3キメリズム、インテグリン結合性(RGD)領域の挿入および/または繊維へのヘパリン硫酸結合性ポリリジン改変である、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項１１】
カプシド改変がAd5/3キメリズムである、請求項10に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項１２】
カプシド改変がRGD-4C改変である、請求項10に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項１３】
少なくとも1つの発現カセットを含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項１４】
ただ1つの発現カセットを含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項１５】
ベクターが、テロメラーゼを発現する細胞内で選択的に複製することができる、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項１６】
請求項1〜15のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターを含む細胞。
【請求項１７】
請求項1〜15のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターを含む医薬組成物。
【請求項１８】
in situ癌ワクチンとして機能する、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物。
【請求項１９】
被験者の癌を治療するための、請求項1〜15のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２０】
被験者の癌を治療する方法であって、請求項1〜15または17のいずれか1つに記載のベクターまたは医薬組成物の被験者への投与を含む前記方法。
【請求項２１】
癌が、上咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、脳腫瘍、咽頭癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明癌、カルチノイド、消化管カルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頚癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頚部癌、腎癌、ウイルムス腫瘍、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃癌からなる群から選択される、請求項19〜20に記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
【請求項２２】
被験者がヒトまたは動物である、請求項19〜21に記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
【請求項２３】
投与が、腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸腔内、膀胱内、腔内もしくは腹膜注射であるか、または経口投与である、請求項19〜22のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
【請求項２４】
腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物が、治療期間中に数回投与される、請求項19〜23のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
【請求項２５】
以前の治療のベクターと比較して異なるカプシドの繊維ノブを有する腫瘍溶解性アデノウイルスベクターが被験者に投与される、請求項19〜24のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
【請求項２６】
方法が、被験者への同時放射線治療または同時化学療法の投与をさらに含む、請求項19〜25のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
【請求項２７】
方法が、被験者における、べラパミルまたは他のカルシウムチャネル遮断薬;オートファジー誘導剤;テモゾロマイド;制御性T細胞をダウンレギュレートすることができる物質;シクロホスファミド;およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される助剤の被験者への投与をさらに含む、請求項19〜26のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
【請求項２８】
方法が、中和抗体を遮断するための化学療法または抗CD20治療または他のアプローチの投与をさらに含む、請求項19〜27のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。
【請求項２９】
細胞内でCD40Lを産生する方法であって、
a)請求項1〜15のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを細胞に運び、
b)細胞内で前記ベクターのCD40Lを発現させること
を含む前記方法。
【請求項３０】
被験者の腫瘍特異的免疫応答を増強する方法であって、
a)請求項1〜15のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを標的細胞または組織に運び、
b)細胞内で前記ベクターのCD40Lを発現させ、
c)前記標的細胞または組織内の細胞傷害性T細胞および/またはナチュラルキラー細胞の量または活性を増加させること
を含む前記方法。
【請求項３１】
細胞内でCD40Lを産生するための、請求項1〜15のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用。
【請求項３２】
被験者において、腫瘍特異的免疫応答であるTh1->Th2スイッチを増強するかまたは免疫抑制を軽減するための、請求項1〜15のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用。
【請求項３３】
標的細胞または組織内でナチュラルキラー細胞および/または細胞傷害性T細胞の量が増加するか、またはサプレッサー細胞(例えば制御性T細胞)が減少する、請求項32に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生命科学および医学の分野に関する。具体的には、本発明は癌治療に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターならびに前記ベクターを含む細胞および医薬組成物に関する。本発明はまた、被験者の癌を治療するための前記ベクターおよび被験者の癌を治療する方法のための前記ベクターにも関する。さらにまた、本発明は、細胞内でCD40Lを産生させ、被験者の腫瘍特異的免疫応答およびアポトーシスを増強する方法ばかりでなく、細胞内でCD40Lを産生させ、被験者の腫瘍特異的免疫応答およびアポトーシスを増強するための腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、手術、ホルモン療法、化学療法、放射線治療および/または他の治療で治療することができる。しかしながら、多くの場合、癌はしばしば進行病期を特徴とし、現在の治療では治すことができない。従って、癌細胞を標的とする新規なアプローチ、例えば遺伝子治療が求められている。
【０００３】
過去20年の間に、遺伝子導入技術は集中的に研究がなされてきた。癌遺伝子治療の目的は、腫瘍細胞に治療遺伝子を導入することである。標的細胞に導入されるこれらの治療遺伝子によって、例えば、変異遺伝子を矯正するか、活性癌遺伝子を抑制するか、または細胞に追加の性質を生じさせることができる。適切な外因性治療遺伝子は、限定するものではないが、免疫療法遺伝子、抗血管新生遺伝子、化学保護遺伝子および“自殺”遺伝子を含み、それらは、改変ウイルスベクターまたは、エレクトロポレーション、遺伝子銃および、脂質もしくはポリマーコーティングを含む非ウイルス法を利用することにより細胞に導入することができる。
【０００４】
最適のウイルスベクターの必要条件は、特定の標的細胞を見出し、その標的細胞内でウイルスゲノムを発現させるのに有効な能力を含む。さらにまた、最適のベクターは、標的組織または細胞内で活性を維持しなければならない。これらのすべてのウイルスベクターの性質は、この10年の間に開発されてきており、例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターは生物医学において広く研究されてきた。
【０００５】
抗腫瘍効果の腫瘍浸透および局所増幅をさらに改善するために、選択的腫瘍溶解剤、例えば、条件複製型(conditionally replicating)アデノウイルスが構築された。腫瘍溶解性アデノウイルスは、癌の治療に有望なツールであり、臨床試験において、優れた安全性およびある程度の有効性が示された。腫瘍細胞は、腫瘍溶解性アデノウイルスが、腫瘍細胞内でそのウイルスの複製を行うことにより死滅する。複製の最終段階で、周囲の腫瘍組織への大量のビリオンの放出が起こり、効果的な腫瘍浸透および脈管再感染が行われる。非腫瘍細胞内での複製を妨げる、ウイルスゲノム内の操作された改変によって、腫瘍細胞はウイルスの複製を許容するが、正常細胞はそれを免れる。
【０００６】
アデノウイルスE1領域に部分欠失を作成するか、または組織もしくは腫瘍特異的プロモーター(TSP)を用いるかのいずれかによって複製を腫瘍組織に限定することができる。このようなプロモーターの挿入によって、標的細胞におけるベクターの効果を高めることができ、また組換えアデノウイルスベクターにおいて、外因性組織または腫瘍特異的プロモーターの使用は一般的である。
【０００７】
以前の研究において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)プロモーターは大部分の腫瘍および不死化細胞株において高い活性を示すが、正常な体細胞型においては不活性であることが示された。hTERTはテロメラーゼの触媒サブユニットであり、染色体複製中にテロメアの長さを安定させるように機能する。アデノウイルス初期領域遺伝子を制御するためにhTERTプロモーターを用いる腫瘍溶解性アデノウイルスは、以前に記載されている(例えば、Huang, TG, et al., Gene Therapy 2003；10, 1241-1247； Ryan, PC. et al., Cancer Gene Therapy 2004；11, 555-559; Irving et al., Cancer Gene Therapy 2004; 11, 174-185; Bauerschmitz GJ, et al., Cancer Res 2008;68:5533-9 を参照のこと)。しかしながら、 テロメラーゼは、腫瘍細胞以外にも、無制限の増殖能力を有する他の ヒト細胞、例えば 幹細胞内でも発現される。
【０００８】
大部分の 臨床試験は、アデノウイルス5型 (Ad5) に基づく初期世代 アデノウイルスを用いて行われた。腫瘍溶解性 アデノウイルスの抗腫瘍 効果は、それらの遺伝子送達能力に依存する。 残念なことに、大部分の 腫瘍は、主Ad5 受容体の発現が低いため、Ad5 カプシドに改変が導入された。例えば、血清型 3 ノブでのカプシド 改変により、卵巣癌において、感染性の改善および優れた有効性が示された(Kanerva A, et al., Clin Cancer Res 2002;8:275-80; Kanerva A, et al., Mol Ther 2002;5:695-704; Kanerva A, et al., Mol Ther 2003;8:449-58)。同様に、Ad ベクターの繊維 および ペントン基部は、細胞侵入 機構の鍵メディエーターであるため、これらの カプシドタンパク質の遺伝子改変によって、組換え Ad ベクターのターゲッティングを達成することができる(Dmitriev I., et al. 1998, Journal of Virology, 72, 9706-9713)。現在、大部分の臨床用途の腫瘍溶解性ウイルスは、重要なウイルス遺伝子のいくつかの欠失によって、複製に関して高度に弱毒化されている。これらのウイルスは優れた安全記録を示したが、抗腫瘍効果は限定されていた。
【０００９】
しかしながら、武装していない腫瘍溶解性ウイルスでの治療は、十分に免疫刺激性ではないため、持続的な抗腫瘍性治療的免疫応答をもたらさないことを臨床結果および前臨床結果は示している。この点において、腫瘍溶解性ウイルスは、より免疫刺激性であるように武装されている。さらに、腫瘍内でのウイルス複製および免疫調節タンパク質の発現は、サイトカイン産生を誘導し、腫瘍抗原を放出することによって免疫系を増強する(Ries SJ, et al., Nat Med 2000;6:1128-33)。
【００１０】
腫瘍溶解性ウイルスを武装することによって、従来の遺伝子送達の利点と複製コンピテント剤の有効性が組み合わされる。ウイルスの武装の目的の1つは、ウイルス複製を許容する細胞に対する免疫反応の誘導である。上記のように、ウイルス複製単独では、免疫原性ではあるものの、通常は、有効な抗腫瘍免疫を誘導するのには十分ではない。治療的免疫の誘導を増強するために、抗原提示細胞、例えば樹状細胞への腫瘍抗原の導入の簡便化ならびにそれらの刺激および/または成熟のための刺激タンパク質、例えばサイトカインでウイルスが武装された。免疫療法遺伝子の腫瘍細胞への導入ならびに、さらに、それらのタンパク質の翻訳は、免疫応答の活性化およびより効率的な腫瘍細胞の破壊をもたらす。この点において、最も関連性のある免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞(NK)および細胞傷害性CD8+T細胞である。
【００１１】
CD40リガンド(CD40L)は、腫瘍壊死因子ファミリーに属するII型膜貫通タンパク質である。CD40Lは、CD154またはgp39としても知られ、CD4+T細胞上に主に発現され、抗原提示細胞(APC)の膜表面上のCD40受容体に結合する(Grewal IS and Flavell RA., Ann Rev Immunol 1998;16:111-35; Roy M, et al., J Immunol 1993;151:2497-510)。CD40は、マクロファージおよび樹状細胞(DC)上で発現され、CD40Lによるその活性化により抗原提示およびサイトカイン産生が誘導され、次いでT細胞プライミングおよび強い自然免疫応答がもたらされる(van Kooten C and Banchereau J., J Leukoc Biol 2000;67:2-17)。CD40Lとその受容体であるCD40との相互作用により、Tリンパ球増殖を引き起こす重要な共刺激シグナルが生じ(Grewal IS and Flavell RA, 1998, Annu Rev Immunol 1998;16:111-35)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の抗腫瘍免疫応答への関与に必要なIL-12産生が増加する(Loskog AS, et al., Clin Cancer Res 2005;11:8816-21; Mackey MF, et al., J Immunol 1998;161:2094-8)。以前の観察から、組換え可溶性タンパク質CD40L(rsCD40L)は、in vitro (Eliopoulos AG, et al., Oncogene 1996;13:2243-54; Tong AW, et al., Clin Cancer Res 2001;7:691-703)およびin vivo(Eliopoulos AG, et al., Mol Cell Biol 2000;20:5503-15; Hirano A, et al., Blood 1999;93:2999-3007)で、腫瘍細胞増殖抑制の直接効果を有することが明らかである。rsCD40Lの他の直接効果は、生存シグナル伝達経路(PI3キナーゼおよびERK/MAPK)の刺激および癌細胞におけるアポトーシスの誘導(Eliopoulos, AG., et al., Mol Cell Biol 2000;20:5503-15; Davies CC, et al., J Biol Chem 2004;279:1010-921)である。
【００１２】
最近のいくつかの研究で、CD40Lで武装されたアデノウイルスは、腫瘍増殖の抑制と共に、腫瘍部位におけるアポトーシス事象の増加を誘導することができることが示された(Loskog AS, et al., Clin Cancer Res 2005;11:8816-21; Fernandes MS, et al., Clin Cancer Res 2009;15:4847-56; Loskog AS, et al., J Immunol 2004;172:7200-5)。同様に、リンパ球浸潤の増加および細胞傷害性T細胞-CD8+の存在による抗腫瘍免疫応答に関する根拠もある(Hanyu K, et al., Anticancer Res 2008;28:2785-9; Iida T, et al., Cancer Sci 2008;99:2097-10324, 25)。
【００１３】
アデノウイルスは、中程度のサイズ(90〜100nm)の、エンベロープを持たない二十面体ウイルスであり、タンパク質カプシド内に約36000塩基対の二本鎖線状DNAを有する。このウイルスカプシドは、標的細胞へのウイルスの接着に関与する繊維構造を有する。最初に、標的細胞の受容体(例えばCD46またはコクサッキーウイルスアデノウイルス受容体(CAR))に繊維タンパク質のノブドメインが結合し、2番目に、ウイルスがインテグリン分子と相互作用し、3番目にウイルスが標的細胞内にエンドサイトーシスされる。次いで、エンドソームから核にウイルスゲノムが輸送され、ウイルスの用途のためにも標的細胞の複製機構が同様に用いられる(Russell W.C., J General Virol 2000;81:2573-2604)。
【００１４】
アデノウイルスゲノムは、初期遺伝子(E1〜E4)、中期遺伝子(IXおよびIVa2)ならびに後期遺伝子(L1〜L5)を有し、これらは順次に転写される。初期遺伝子産物は、宿主細胞の防御機構、細胞周期および細胞代謝に作用する。中期および後期遺伝子は、新規ビリオンの産生のためのウイルス構造タンパク質をコードする(Wu and Nemerow, Trends Microbiol 2004;12:162-168; Russell W.C., J General Virol 2000;81;2573-2604; Volpers C. and Kochanek S. J Gene Med 2004;6, suppl 1: S164-71; Kootstra N.A. and Verma I.M. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2003;43: 413-439)。
【００１５】
ヒトにおいて、50を超える異なるアデノウイルスの血清型が見出されている。血清型は、6つのサブグループA〜Fに分類され、異なる血清型は、異なる疾患、すなわち呼吸器疾患、結膜炎および胃腸炎と関連していることが知られている。アデノウイルス血清型5(Ad5)は呼吸器疾患を引き起こすことが知られており、遺伝子治療の分野で研究された最も一般的な血清型である。最初のAd5ベクターにおいて、E1および/またはE3領域が欠失され、このベクターへの異種DNAの挿入が可能となった(Danthinne X, Imperiale MJ., Gene Therapy. 2000;7:1707-1714)。さらにまた、他の領域の欠失ならびにさらなる変異によって、ウイルスベクターに追加の性質が付与された。実際、有効な抗腫瘍効果を達成するために、アデノウイルスの種々の改変が示唆されている。
【００１６】
US2010047208 A1は、改変hTERTプロモーターで腫瘍標的化が達成され、免疫刺激タンパク質、例えばGM-CSFで武装されることができるノブ改変アデノウイルスベクターを開示している。
【００１７】
それにもかかわらず、より効率的かつ正確な遺伝子導入ばかりでなく、遺伝子治療の特異性の増加および十分な腫瘍致死能力が求められている。治療ベクターの安全記録もまた優れたものでなければならない。本発明は、新規で創意に富む方法でアデノウイルスの腫瘍溶解性および免疫療法性の両方を利用することによる、これらの前述の性質を有する癌治療ツールを提供する。
【発明の概要】
【００１８】
本発明の目的は、アデノウイルスの前記の性質を獲得し、それと共に従来の癌治療の問題を解決するための新規方法およびツールを提供することである。より具体的には、本発明は、遺伝子治療のための新規方法およびツールを提供する。
【００１９】
本願は、組換えウイルスベクターの構築および前記ベクターに関連する方法を開示し、また、腫瘍細胞株、動物モデルおよび癌患者における前記ベクターの使用を開示する。
【００２０】
本発明は、
1)カプシド改変、好ましくはアデノウイルス血清型3(Ad3)ノブでのカプシド改変(Ad5/3カプシドキメリズム（chimerism）)を含むアデノウイルス血清型5(Ad5)核酸主鎖（backabone）、
2)E1領域の上流の、腫瘍特異的ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)プロモーターをコードする核酸配列;および
3)E3領域の欠失アデノウイルス遺伝子gp19k/6.7Kの代わりに（in the place of）、ヒトCD40Lをコードする核酸配列
を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに関する。
【００２１】
本発明はさらに、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含む細胞に関する。
【００２２】
本発明はまた、本発明のアデノウイルスベクターを含む医薬組成物に関する。
【００２３】
本発明はまた、被験者の癌を治療するための本発明のアデノウイルスベクターに関する。
【００２４】
本発明はまた、被験者の癌を治療する方法であって、癌、特に従来の化学療法薬および/または放射線治療に難治性の癌を患っている被験者への本発明のベクターまたは医薬組成物の投与を含む前記方法に関する。
【００２５】
さらに、本発明はまた、細胞内でCD40Lを産生する方法であって、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを細胞に運び、細胞内で前記ベクターのCD40Lを発現させることを含む前記方法に関する。
【００２６】
さらに、本発明はまた、被験者の腫瘍特異的免疫応答を増強する方法であって、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを標的細胞または組織に運び、細胞内で前記ベクターのCD40Lを発現させ、前記標的細胞または組織内で細胞傷害性T細胞および/またはナチュラルキラー細胞の量を増加させ、腫瘍微小環境において、細胞傷害性抗腫瘍活性の増強のためにTh2->Th1スイッチを誘導することを含む前記方法に関する。
【００２７】
さらに、本発明はまた、細胞内でCD40Lを産生するための、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用に関する。
【００２８】
さらに、本発明は、細胞内でCD40Lを産生するための、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに関する。
【００２９】
さらに、本発明はまた、被験者の腫瘍特異的免疫応答を増強するための、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用に関する。
【００３０】
さらに、本発明は、被験者の腫瘍特異的免疫応答を増強するための、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに関する。
【００３１】
本発明は、癌、特に現行の治療的アプローチに難治性または不治の癌の治療のための新規ツールを提供する。また、多くの他の治療と比較して、治療に適する腫瘍タイプに関する制限がほとんどない。実際、提案された本発明ですべての固形腫瘍を治療することができる。処置は、腫瘍内、腔内、静脈内に行うことができ、これらの組み合わせで行うこともできる。本アプローチは、局所注射にもかかわらず全身有効性を示すことができる。本アプローチはまた、癌源細胞として提案された細胞(“癌幹細胞”)を根絶することもできる。
【００３２】
目的とする部位にベクターを輸送することを可能にすること以外にも、本発明のベクターは、導入遺伝子の発現および持続性をも確実にする。本発明は、従来の治療に対する治療抵抗性に関連する問題を解決する。さらにまた、本発明は、健常組織への毒性または損傷を示さない選択的治療のためのツールおよび方法を提供する。本発明の利点はまた、他の処置と比較して、異なった、かつ低減した副作用を含む。重要なことには、本アプローチは、化学療法および放射線治療を含む多くの他の形態の治療と相乗的に作用し、従って併用レジメンで使用することができる。
【００３３】
武装していないアデノウイルスの複製を許容する細胞に対する免疫反応の誘導は、通常は、治療的腫瘍免疫の発現をもたらすのに十分には強くない。この弱点を克服するために、本発明は、抗腫瘍免疫の強力な誘導物質であり、しかも腫瘍組織における局所的なアポトーシスを誘導するCD40Lで武装されたアデノウイルスを提供する。
【００３４】
特に、CD40Lは非複製的ウイルスベクターと共に、T細胞のTh2ケモカインパターンをTh1型に変換することによってエフェクター細胞(CD8+T細胞)の活性を増強する相乗効果を有することが示されている(Loskog et al 2004, J Immunol 172: 7200-5; Bendriss-Vermare et al 2005, J Leucocyte Biol 78: 954-66)。Th2は抗体の産生を促進するのに対し、Th1は細胞傷害を促進し、腫瘍細胞を殺すようにT細胞を導くことを試みる場合、後者はより好都合である可能性がある。本特許明細書において、この現象は、前臨床データおよびヒトデータによって証明されているように、腫瘍溶解性アデノウイルスに関連して特に有力である。
【００３５】
腫瘍溶解性アデノウイルスによるCD40Lの産生もまた重要である。なぜなら、それによって、腫瘍にナチュラルキラー細胞が動員され、ナチュラルキラー細胞の抗腫瘍活性を増強することができるからである(Nakajima et al 1998 J Immunol 161:1901-7)。さらにまた、CD40Lは、抗原提示細胞の機能を増強することができる(Nakajima et al 1998 J Immunol 161:1901-7)。最後に、CD40/CD40L相互作用は、抑制性細胞、例えば制御性T細胞に強力な抑制シグナルを提供し、それによって抗腫瘍免疫反応の強力な刺激をもたらすことができる(Guiducci et al 2005 Eur J Immunol 35:557-67)。
【００３６】
さらに、強力な、転写的に標的化するプロモーターであるhTERTの使用によってウイルス複製が標的細胞に限定される。腫瘍特異的プロモーターhTERTは、実際上すべての進行性固形腫瘍に活性であるが、これはまた、癌患者の胸水試料中に見出されている推定上の癌開始細胞に対する腫瘍溶解性アデノウイルスのターゲッティングを媒介することもできる(Bauerschmitz et al Cancer Res 2008 68: 5533-9)。本明細書において提示される臨床データは、生命を脅かす有害事象が生じないため、正常組織の幹細胞に対して毒性がないことを示している。
【００３７】
T細胞、マクロファージおよび樹状細胞(DC)の増殖および活性化を含むヒト免疫応答を活性化する種々の異なる機構と組み合わされた、ビリオンによって生じる腫瘍溶解(oncolysis)によって腫瘍細胞が破壊され、次いでサイトカイン産生が行われ、今度はそれが腫瘍に対する細胞傷害性T細胞の攻撃の追加の刺激のためのTh1型免疫反応を誘導する癌治療を本発明は達成する。さらに、CD40L誘導性アポトーシスは、腫瘍量の減少を促進する。
【００３８】
先行技術のアデノウイルスツールと比較して、本発明は、癌治療のための、より単純な、より有効な、安価な、無毒のおよび/または安全なツールを提供する。さらにまた、ヘルパーウイルスまたは組換え分子の共投与を必要としない。
【００３９】
本発明は、以前のウイルスの優れた安全性を保持し、高レベルの有効性をもたらす、感染性が増強された高度に有効な新世代のアデノウイルスを提供する。重要なことに、本発明は、腫瘍溶解性ウイルスの有効性に関して重要な免疫性因子を提供する腫瘍溶解性アデノウイルスを開示する。
【００４０】
本発明の新規製品は、癌治療におけるさらなる改善を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図1は、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-CMV-hCD40LおよびAd5/3-CMV-mCD40Lの概略図を示す。複製コンピテントAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lは、E1領域の上流に腫瘍特異的ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)プロモーターをコードする核酸配列(配列番号1)を含み、E3領域のgp19k/6.7KがヒトCD40LのcDNA配列(配列番号2)と置換されている(図1a)。複製欠損性Ad5/3-CMV-hCD40L(図1b)およびAd5/3-CMV-mCD40L(図1c)は、E1A領域の代わりに、それぞれhCD40LおよびmCD40Lを含み、天然E1AプロモーターはCMVプロモーターに置換されている。ADPは、アデノウイルス細胞死タンパク質のことを言う。
【図２】図2aは、10VP/細胞での感染24時間後の、293細胞株におけるhCD40L発現のフローサイトメトリー分析結果を示す。図2bは、マウス血清におけるCD40Lタンパク質のin vivo発現を示す。Ad5/3-CMV-hCD40Lで処置したマウスからの血清におけるhCD40Lの分析に関しては、腫瘍増殖が速く、8日目には動物を殺さなければならなかったので、血液は2回のみ(4日目および8日目)採取した。図2cは、複製コンピテントアデノウイルスAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lによって発現されるhCD40Lの機能性を示す。ルシフェラーゼをコードするNf-κB5-ELAMプロモーターを特徴とするプラスミドをEJ細胞にトランスフェクトし、Ad5/3-hTERT-hCD40Lに感染したA549細胞からの上清を加えた。モック値(非感染)を差し引いた。Nf-κB活性はルシフェラーゼ発現の増加倍数(相対発光量、RLU)で表される。CD40L(Ad5/3-hTERT-E1A)なしで、ヒト組換えCD40L(hCD40L)を有する腫瘍溶解性ウイルスに感染した細胞からの上清を対照として用いた。このアッセイを3回行い、毎回3連で評価した。データを平均値±SEM;***、P<0.001で示す。図2dもまた、hCD40Lの機能性を示す。ヒトBリンパ球細胞株(Ramos-Blue)は、NF-κB/AP-1誘導性SEAPレポーター遺伝子を安定的に発現する。ウイルス感染細胞から採取した上清はRamos-Blue細胞を刺激するために用い、細胞活性化のサロゲートとしてQUANTI-Blueアッセイ試薬(InvivoGen、サンディエゴ、CA、米国)でSEAP産生を測定した。データは、平均値±SEM;***、P<0.001で示す。
【図３】図3は、CD40陽性(EJ)またはCD40陰性(A549)細胞株におけるAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの腫瘍溶解能を示す。本発明のアデノウイルスの腫瘍溶解能を評価するために、A549(CD40-)(図3a)およびEJ(CD40+)(図3b)細胞株を0,1、1、10、100および1000VP/細胞の用量でAd5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-hTERT-E1A、Ad5/3-CMV-hCD40LおよびAd5/3Luc1に感染させ、細胞生存率をMTSアッセイによって測定した。EJおよびA549細胞単層をAd5/3-hTERT-E1A-hCD40L(図3c)またはAd5/3-hTERT-E1A(図3d)のいずれかで感染させた。本アッセイは、感染後7日目で停止し、MTSアッセイによって細胞生存率を測定した。***、P<0.001。
【図４】図4は、マウスにおけるベクターAd5/3-CMV-hCD40LおよびAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの抗腫瘍効果を示す。皮下にA549(CD40-)(図4a)またはEJ(CD40+)(図4b)腫瘍を移植したマウスの腫瘍内に、3つの日(0、2および4、n=5マウス/群)に、108VP/腫瘍の用量で複製欠損性アデノウイルスAd5/3-CMV-hCD40Lを注射し、腫瘍増殖を経過観察した。この実験は、CD40LがCD40+細胞に抗腫瘍活性を有することを示す。A549(図4c)またはEJ(図4d)細胞株のいずれかでマウスに腫瘍を移植し、3つの日(0、2および4、n=5マウス/群)に108VP/腫瘍の用量で複製コンピテントアデノウイルスAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lおよび対照ウイルスAd5/3-hTERT-E1Aを注射し、腫瘍体積を最初のサイズに対してプロットした。この実験は、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの腫瘍溶解能を証明しているが、hCD40はマウスに活性ではないため、CD40Lの免疫学的活性は考慮に入れない。データは平均値±SEMで示す。*、P<0.05;**、P<0.01;***、P<0.001。
【図５】図5は、CD40+腫瘍におけるカスパーゼ-3発現を示す。EJ(CD40+)腫瘍を移植したマウスの腫瘍内に、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-hTERT-E1A、Ad5/3-CMV-hCD40LおよびAd5/3-Luc1(モック)を3回注射した。26日後、動物を殺し、腫瘍を採取し、パラフィンブロックに包埋した(n=5マウス/群)。アポトーシスの誘導を試験するために、カスパーゼ-3に関する免疫組織化学を行った。陽性染色を褐色で示す。
【図６】図6は、Ad5/3-CMV-mCD40Lが免疫適格動物モデルにおいて腫瘍増殖を抑制することを示す。腫瘍溶解の効果による交絡を回避してCD40Lの免疫学的効果を試験するために、皮下にMB49(マウス膀胱癌細胞株)腫瘍を移植したC57Blackマウスに、0日目、2日目および4日目に3x108VP/腫瘍の用量で複製欠損性アデノウイルスAd5/3-CMV-mCD40Lまたは対照Ad5/3-Luc1を腫瘍内に注射した(n=6マウス/群)。腫瘍サイズを経過観察し、0日目のサイズに対してプロットした。データを平均値±SEM、***、P<0.001(図6a)で示す。図6bは、Ad5/3-CMV-mCD40LまたはAd5/3-Luc1で処置した腫瘍におけるアポトーシス(活性カスパーゼ-3)の免疫組織学的解析を示す。活性カスパーゼ-3の発現は褐色で示す。
【図７】図7は、同系のマウスモデルにおける宿主の免疫応答を示す。図7aは、Ad5/3Luc1(黒色)またはAd5/3-CMV-mCD40L(白色)で処置したマウスの脾細胞におけるIL-12、IFN-γ、TNF-αおよびRantesのサイトカイン分析を示す。脾細胞は24、48または72時間培養した。IL-12は抗原提示細胞の活性化のしるしであるが、その他はTh1型免疫応答のマーカーである。免疫組織学的分析のために、ウイルス注射後16日目にMB49腫瘍を採取した。異なるマーカーに関して、免疫組織化学によって、4μmの腫瘍切片を染色した。図7bは、マクロファージ(F4/80)、白血球(CD45)およびBリンパ球(CD19)染色を示す。図7cにおいて、ヘルパーT細胞(CD4+)および細胞傷害性(CD8+)T細胞(褐色)に関して腫瘍切片を染色した。
【図８】図8は、治療効果の予測のための腫瘍試料の治療前分析を示す。Ad5-カプシドおよびキメラAd5/3カプシド(Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lに相当するカプシド)を有する腫瘍溶解性アデノウイルスならびに非腫瘍溶解性アデノウイルスで、乳癌を患っている患者(R73)の新鮮治療前癌性胸水に関して細胞致死アッセイ(MTS-アッセイ)を行った。
【図９】図9は、腫瘍溶解性アデノウイルスAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lでの処置後のアデノウイルス認識T細胞の誘導を示す。全PBMCを単離し、アデノウイルス5型ペントン由来ペプチドプールでパルスして、インターフェロンγELISPOTでアデノウイルス特異的細胞傷害性Tリンパ球の活性化を評価した(図9)。
【図１０】図10は、製造業者の使用説明書に従って、Becton-Dickinsonサイトカインマルチプレックスビーズアレイシステム(BD FACSArray;BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州)を用いて、Th1誘導サイトカイン:インターフェロン-γ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)およびインターロイキン-2(IL-2)またはTh2サイトカイン:インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-5(IL-5)およびインターロイキン10(IL-10)のいずれかに関して患者の血清試料を分析した結果を示す。図10の左側にTh1誘導サイトカインを示し、右側にTh2誘導サイトカインを示す。前=ウイルスが投与される前に採取された血清試料;1ヶ月=ウイルス処置後1ヶ月で採取された血清試料;2か月=ウイルス処置後2ヶ月で採取された血清試料。
【図１１】図11は、製造業者の使用説明書に従って、Becton-Dickinsonサイトカインマルチプレックスビーズアレイシステム(BD FACSArray;BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州)を用いて、Th1誘導サイトカイン:インターフェロン-γ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)およびインターロイキン-2(IL-2)ならびにTh2サイトカイン:インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-5(IL-5)およびインターロイキン10(IL-10)に関して患者の血清試料を分析した結果を示す。ベースラインレベルを1としたときのベースラインレベルに対するサイトカインレベルを記録し、各時点のTh1/Th2比を算出した。1ヶ月=ウイルス処置後1ヶ月で採取した血清試料;2ヶ月=ウイルス処置後2ヶ月で採取した血清試料。
【図１２】図12は、予備刺激なしでの、インターフェロンγELISPOTを用いた、アデノウイルス特異的(12A)および腫瘍特異的(12B)細胞傷害性Tリンパ球の活性化の評価の結果を示す。星印は、ウイルス投与の日数を示す。PBMCは、ウイルス注射の直前に採取した。
【図１３】図13は、処置の前後に評価したIL-6(13A)、IL-8(13B)、IL-10(13C)、IL-12(13D)、TNF-α(13E)およびINF-γ(13F)の血清レベルを示す。データは中央値±SDで示す。
【図１４】図14は、抗腫瘍および抗アデノウイルス免疫に関する効果を示す。予備刺激したクローン展開PBMCを、腫瘍由来ペプチドプール(腫瘍型に従って各患者に指定された)またはアデノウイルス由来ペプチドプールのいずれかでパルスした。TNF-α/INF-γ二重陽性腫瘍特異的CD8+T細胞(14A)、腫瘍特異的CD4+T細胞(14B)およびアデノウイルス-特異的CD4+T細胞(14C)の相対数を細胞内サイトカイン染色で評価した。星印はウイルス投与の日数を示す。PBMCはウイルス注射の直前に採取した。
【図１５】図15は、悪性腹水における可溶性CD40L(sCD40L;15A)およびRANTES(15B)の局所レベルを、これらのサイトカインの全身レベルと比較して示す。ウイルス処置後28日目に、悪性腹水(15C)および腹水(15D)から単離された細胞において高いウイルス量が観察されたが、同じ日に、血清においてはウイルスは検出されなかった。
【図１６】図16は、前(ベースライン)および処置後のいくつかの時点での9名の癌患者の血清におけるsCD40LおよびRANTES濃度の評価を示す。データは、中央値±SDで示す。
【図１７】図17は、カプランマイヤー分析による、腫瘍溶解性アデノウイルスAd5/3-hTERT-E1A-hCD40L(図17ではCGTG-401と呼ぶ)治療された患者の生存期間(A、p=0.007)および無増悪生存期間(B、p=0.146)を示す。ヒストリカル・コントロールは、同様な組み入れおよび除外基準を有し、同じカプシドを有するが導入遺伝子を欠く腫瘍溶解性アデノウイルス(Ad5/3-cox2L-D24)で処置した。
【００４２】
発明の詳細な説明
アデノウイルスベクター
他のアデノウイルスの場合と同様に、Ad5において、二十面体カプシドは、3つの主要タンパク質:ヘキソン(II)、ペントン基部(III)およびノブ付き繊維(IV)ならびに微量タンパク質:VI、VIII、IX、IIIaおよびIVa2からなる(Russell W.C., J General Virol 2000;81:2573-2604)。タンパク質VII、小ペプチドmuおよび末端タンパク質(TP)がDNAに結合している。タンパク質Vは、タンパク質VIを介してカプシドに構造的な結合を提供している。構造タンパク質の一部のプロセシングには、ウイルスによってコードされるプロテアーゼが必要である。
【００４３】
本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、カプシド改変、例えばアデノウイルス血清型3(Ad3)ノブを含むアデノウイルス血清型5(Ad5)核酸主鎖(Ad5/3カプシドキメリズム)、E1領域の上流の、腫瘍特異的ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)プロモーター(配列番号1)をコードする核酸配列;およびE3領域の欠失gp19k/6.7K配列(965塩基対)部位の、ヒトCD40L(配列番号2)をコードする核酸配列に基づく(図1a)。本発明の好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターはヒトアデノウイルスに基づく。本明細書において用いられるCD40L配列は、ヒト試料からの検出を容易にするために、ヒトゲノム配列(NG_007280.1)とは異なる。従って、本発明は、唯一の配列バリアントOF CD40Lを開示する。
【００４４】
Ad5ゲノムは、初期遺伝子(E1〜4)、中期遺伝子(IXおよびIVa2)ならびに後期遺伝子(L1〜5)を含み、左右にDNAの複製に必要な配列を含む逆向き末端反復配列(それぞれLITRおよびRITR)を有する。このゲノムはまた、パッケージングシグナル(ψ)および主要後期プロモーター(MLP)も含む。
【００４５】
初期遺伝子E1Aの転写により複製サイクルが開始され、次いでE1B、E2A、E2B、E3およびE4が発現される。E1タンパク質は、細胞がウイルス複製を許容するように細胞代謝を調節する。例えば、E1タンパク質はNF-κB、p53およびpRb-タンパク質を阻害する。E1AおよびE1Bは、協力してアポトーシスの阻害に機能する。E2(E2AおよびE2B)ならびにE4遺伝子産物はDNA複製を媒介し、E4産物もウイルスのRNA代謝をもたらし、宿主のタンパク質合成を妨げる。E3遺伝子産物は、宿主免疫系に対する防御、細胞溶解の促進およびウイルス子孫の放出に関与する(Russell W.C.,J General Virol2000;81:2573-2604)。
【００４６】
中期遺伝子IXおよびIVa2は、ウイルスカプシドの微量タンパク質をコードする。ウイルス構造成分の産生、カプシド形成および核におけるウイルス粒子の成熟をもたらす後期遺伝子L1〜5の発現はMLPによって影響される(Russell W.C., J General Virol 2000;81:2573-2604)。
【００４７】
野生型アデノウイルスゲノムと比較して、本発明のアデノウイルスベクターは、E1領域、具体的にはE1A領域の上流にhTERTプロモーターを含み、E3領域におけるgp19kおよび6.7Kを欠き、ウイルスの繊維におけるカプシド改変を含む。本発明の好ましい実施形態において、改善された/部分的領域E1およびE3に加えて、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、E2、E4および後期領域からなる群から選択される1以上の領域をさらに含む。本発明の好ましい実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、以下の領域:左ITR、部分的E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分的E3、L5、E4および右ITRを含む。これらの領域は、任意の順序でベクター中に配置されることができるが、本発明の好ましい実施形態において、領域は5'から3'方向に順次に配置される。オープンリーディングフレーム(ORF)は、同じDNA鎖に配置されることもできるし、異なるDNA鎖に配置されることもできる。本発明の好ましい実施形態において、E1領域はウイルスパッケージングシグナルを含む。
【００４８】
本明細書において、語句“アデノウイルス血清型5(Ad5)核酸主鎖”は、Ad5起源の部分的E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分的E3、L5およびE4からなる群から選択される1つまたはいくつかの領域を含むAd5のゲノムまたは部分的ゲノムのことを言う。好ましい実施形態において、本発明のベクターは、Ad3の一部(例えば、カプシド構造の一部)を含むAd5の核酸主鎖を含む。
【００４９】
本明細書において、語句“部分的”領域は、対応する野生型領域と比較して任意の部分を欠く領域のことを言う。例えば“部分的E3”は、gp19k/6.7Kを欠くE3領域のことを言う。
【００５０】
本明細書において、語句“VA1”および“VA2”は、ウイルス結合性RNA1および2を指し、これらはアデノウイルスによって転写されるが翻訳されない。VA1およびVA2は細胞防御機構と戦う役割を有する。
【００５１】
本明細書において、語句“ウイルスパッケージングシグナル”は、一連のATリッチ配列からなり、カプシド形成プロセスを制御するウイルスDNAの一部のことを言う。
【００５２】
E3領域は、in vitroでのウイルス複製に必須ではないが、E3タンパク質は、宿主の免疫応答の制御、すなわち自然免疫応答および特異的免疫応答の両方の抑制に重要な役割を有する。E3におけるgp19k/6.7K欠失とは、アデノウイルスE3A領域からの965塩基対の欠失のことを言う。得られたアデノウイルス構築物において、gp19kおよび6.7K遺伝子の両方が欠失している(Kanerva A et al., Gene Therapy 2005；12： 87-94)。gp19k遺伝子産物は、小胞体における主要組織適合遺伝子複合体I(MHC1)分子に結合して隔離し、細胞傷害性Tリンパ球による感染細胞の認識を妨げることが知られている。多くの腫瘍はMHC1を欠損しているので、gp19kの欠失はウイルスの腫瘍選択性を増加させる(ウイルスは、野生型ウイルスよりも早く正常細胞から除去されるが、腫瘍細胞においては差異はない)。6.7Kタンパク質は細胞表面に発現され、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)受容体2のダウンレギュレーションに関与する。
【００５３】
本発明において、CD40L導入遺伝子は、E3プロモーター下に、gp19k/6.7kが欠失されたE3領域に配置される。これによって、ウイルスの複製およびその後のE3プロモーターの活性化を許容する腫瘍細胞に導入遺伝子発現が限定される。E3プロモーターは、当該技術分野で公知の任意の外因性または内因性プロモーターであることができるが、好ましくは内因性プロモーターである。本発明の好ましい実施形態において、CD40Lをコードする核酸配列はウイルスE3プロモーターの制御下にある。
【００５４】
gp19k欠失は、CD40L発現の視点から特に有用である。なぜなら、それによって、この能力を保持する腫瘍において腫瘍エピトープのMHC1提示を増強することができるからである。ここでは、CD40LによるAPCおよびT細胞の刺激によって、最適の利益を得ることができる。
【００５５】
CD40Lは、細胞傷害性T細胞であるナチュラルキラー(NK)細胞の動員、抗原提示細胞(APC)の刺激および抑制性細胞、例えば制御性T細胞のダウンレギュレーションを含む種々の機構を介して作用することによって免疫応答を増強する。次いで、APCは、T細胞を動員し、活性化し、腫瘍に向かわせることができる。CD40Lをコードするヌクレオチド配列は、治療される被験者に応じて任意の動物、例えばヒト、類人猿、ラット、マウス、ハムスター、イヌまたはネコに由来することができるが、好ましくは、ヒトの治療の視点から、CD40Lはヒト配列によってコードされる。CD40Lをコードするヌクレオチド配列は、CD40Lの効果を改善するために改変されることもできるし、未改変、すなわち野生型のものであることもできる。本発明の好ましい実施形態において、CD40Lをコードする核酸配列は、ヒト試料からの特異的検出を可能にするために、野生型配列から1ヌクレオチド改変されている。
【００５６】
外因性エレメントの挿入によって、標的細胞におけるベクターの効果を増強することができる。外因性の組織または腫瘍特異的プロモーターの使用は、組換えアデノウイルスベクターにおいては一般的である。E1A領域を制御するhTERTまたはhTERTのバリアントの使用によって、ウイルス複製は標的細胞に限定される。本発明の好ましい実施形態において、hTERTはE1Aの上流に配置されるが、これに加えて、あるいはこれに変えて、他の遺伝子、例えばE1BまたはE4もまた制御されることができる。“上流”とは、発現方向のE1領域の直前のことを言う。外因性絶縁体、すなわち非特異的エンハンサーに対するブロッキングエレメント、左ITR、天然E1Aプロモーターまたはクロマチンタンパク質もまた組換えアデノウイルスベクターに含ませることができる。場合により、本発明のベクターに必須ではない任意の追加の成分または改変を用いることができる。
【００５７】
本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、カプシド改変を含む。大部分の成人は、最も広く使用されているアデノウイルス血清型Ad5に暴露されており、従って、その免疫系はアデノウイルス血清型Ad5に対して急速に中和抗体(NAb)を産生することができる。実際、抗Ad5NAb抗体保有は50%に達する可能性がある。アデノウイルスカプシドの複数の免疫原性タンパク質の大部分に対してNAbを誘導することができることが明らかにされたが、他方では、Ad5繊維ノブにおける小さな変化であっても、カプシド特異的NAbを回避することが可能であることも明らかにされた。従って、ヒトにおけるアデノウイルスの使用に関して、ノブの改変は、遺伝子送達を維持し、増強する上で重要である。
【００５８】
さらにまた、Ad5は、繊維のノブ部分を介してCARと呼ばれる受容体に結合することが知られており、このノブ部分または繊維の改変によって、標的細胞への侵入を改善し、多くのまたは大部分の癌において腫瘍溶解の増強を引き起こすことができる(Ranki T. et al., Int J Cancer 2007;121:165-174)。実際、カプシド改変アデノウイルスは、癌細胞への改善された遺伝子送達のために好都合なツールである。
【００５９】
本明細書において、“カプシド”とは、ヘキソン、繊維およびペントン基部タンパク質を含むウイルスのタンパク質シェルのことを言う。腫瘍細胞へのウイルスの送達を改善する、当該技術分野で公知の任意のカプシド改変、すなわちヘキソン、繊維および/またはペントン基部タンパク質の改変を本発明に用いることができる。改変は、遺伝的改変および/または物理的改変であることができ、限定するものではないが、特定の細胞受容体を認識するおよび/または天然受容体結合を遮断するリガンドを組み込むための改変、アデノウイルスベクターの繊維またはノブドメインと他のアデノウイルスのノブとの置換のための改変(キメリズム)および特定の分子(例えば、線維芽細胞増殖因子-2、FGF2)のアデノウイルスへの添加のための改変を含む。従って、カプシド改変は、限定するものではないが、小ペプチドモチーフ(単数または複数)、ペプチド(単数または複数)、キメリズム(単数または複数)または変異(単数または複数)の繊維(例えば、ノブ、テールまたはシャフト部分)、ヘキソンおよび/またはペントン基部への組み込みを含む。本発明の好ましい実施形態において、カプシド改変は、Ad5/3キメリズム、インテグリン結合性(RGD)領域の挿入および/または繊維へのヘパリン硫酸結合性ポリリジン改変である。本発明の特定の実施形態において、カプシド改変はAd5/3キメリズムである。
【００６０】
本明細書において、カプシドの“Ad5/3キメリズム”は、繊維のノブ部分がAd血清型3由来であり、繊維の残りの部分がAd血清型5由来であるキメリズムのことを言う。
【００６１】
本発明のベクターはまた、他の改変、例えばE1B領域の改変を含むことができる。
【００６２】
本明細書において、“RGD”とは、ペントン基部上に露出され、アデノウイルスの内在化を支援する細胞α-v-β-インテグリンと相互作用するアルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)モチーフのことを言う。本発明の好ましい実施形態において、カプシド改変はRGD-4C改変である。“RGD-4C改変”とは、異種インテグリン結合性RGD-4Cモチーフの繊維ノブドメインのHIループへの挿入のことを言う。4Cとは、RGD-4Cにおいて硫黄架橋を形成する4つのシステインのことを言う。RGD-4Cペプチドを有する繊維をコードする組換えAd5ファイバー遺伝子の構築は、例えばDmitriev I.らの論文(Journal of Virology 1998;72:9706-9713)で詳細に説明されている。
【００６３】
本明細書において、“ヘパラン硫酸結合性ポリリジン改変”とは、繊維ノブC末端への7つのリジンからなるストレッチの付加のことを言う。
【００６４】
発現カセットは、ベクターを利用することにより、標的内、例えば細胞内で導入遺伝子を発現するために用いられる。本明細書において、語句“発現カセット”とは、cDNAまたは遺伝子をコードするヌクレオチド配列および、前記cDNAまたは遺伝子の発現を調節および/または制御するヌクレオチド配列を含むDNAベクターまたはその一部のことを言う。同様のまたは異なる発現カセットを1つのベクターまたはいくつかの異なるベクターに挿入することができる。本発明のAd5ベクターは、いくつかまたは1つの発現カセットを含むことができる。しかしながら、ただ1つの発現カセットが適切である。本発明の好ましい実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは少なくとも1つの発現カセットを含む。本発明の好ましい実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターはただ1つの発現カセットを含む。
【００６５】
本発明のアデノウイルスベクターを含む細胞は、任意の細胞、例えば真核細胞、細菌細胞、動物細胞、ヒト細胞、マウス細胞などであることができる。細胞は、in vitro、ex vivoまたはin vivo細胞であることができる。例えば、細胞は、in vitro、ex vivoまたはin vivoでアデノウイルスベクターを製造するために用いることができるし、細胞は、アデノウイルスベクターに感染した標的、例えば腫瘍細胞であることもできる。
【００６６】
細胞内でCD40Lを産生する方法において、本発明のベクターを含むビヒクルが細胞に運ばれ、CD40L遺伝子が発現され、タンパク質が翻訳され、パラクリン的に分泌される。“ビヒクル”とは、任意のウイルスベクター、プラスミドまたは他のツール、例えば本発明のベクターを標的細胞に送達することができる粒子であることができる。ベクターを細胞に送達するために、当該技術分野で公知の任意の慣用法を用いることができる。
【００６７】
本発明によって、被験者における腫瘍特異的免疫応答を増強させることができる。CD40L発現の結果として、細胞傷害性T細胞および/またはナチュラルキラー細胞が刺激され、腫瘍領域に動員される。本発明の好ましい実施形態において、ナチュラルキラー細胞および/または細胞傷害性T細胞の量が標的細胞または組織において増加する。本発明の効果を経過観察または試験するために、免疫応答の種々のマーカー(例えば炎症マーカー)を測定することができる。最も一般的なマーカーは、限定するものではないが、炎症性サイトカイン、腫瘍もしくはアデノウイルス特異的細胞傷害性T細胞の増加、抗原提示細胞の動員および活性化または局所リンパ節のサイズの増加を含む。これらのマーカーのレベルは、抗体、プローブ、プライマーなどを用いる方法、例えばELISPOTアッセイ、四量体分析、五量体分析および、血中または腫瘍における異なる細胞型の分析を含むが限定されない当該技術分野で公知の任意の慣用法に従って研究することができる。
【００６８】
癌
本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターが、ヒトテロメラーゼの触媒サブドメインであるヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)を発現する細胞内での複製能のために構築された。hTERT遺伝子およびそのプロモーターの発現をアップレギュレートすることが見出されている細胞には、85%を超えるヒト腫瘍が含まれるが、大部分の正常な成人体細胞はテロメラーゼを欠くかまたはこの酵素を一過性に大変低レベルで発現する(Shay and Bacchetti 1997、Eur J Cancer 33:787-791)。
【００６９】
悪性腫瘍および良性腫瘍ばかりでなく原発腫瘍および転移も含む任意の癌または腫瘍は、それらがhTERTを発現する限りは遺伝子治療の標的であることができる。本発明の特定の実施形態において、癌は任意の固形腫瘍である。本発明の好ましい実施形態において、癌は、上咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、脳腫瘍、咽頭癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明癌、カルチノイド、消化管カルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頚癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頚部癌、腎癌、ウイルムス腫瘍、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌、および扁桃癌からなる群から選択される。
【００７０】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明のベクターの少なくとも1つのタイプを含む。さらにまた、本組成物は、本発明の少なくとも2つ、3つまたは4つの異なるベクターを含むことができる。本発明のベクターに加えて、医薬組成物はまた、任意の他のベクター、例えば他のアデノウイルスベクター、例えばUS2010166799 A1に記載されているもの、他の治療上有効な薬剤、任意の他の薬剤、例えば薬学的に許容される担体、緩衝液、賦形剤、アジュバント、防腐薬、充填剤、安定化剤、増粘剤および/または対応する製品に通常みられる任意の成分を含むことができる。
【００７１】
医薬組成物は、投与に適した任意の形態、例えば固体形、半固体形または液体形であることができる。製剤は、限定するものではないが、溶液、エマルション、懸濁液、錠剤、ペレットおよびカプセルからなる群から選択されることができる。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物はin situ癌ワクチンとして機能する。本明細書において、“in situ癌ワクチン”とは、腫瘍細胞を殺すとともに腫瘍細胞に対する免疫応答を増強させる癌ワクチンのことを言う。ウイルス複製は免疫系(Th1型応答に必要)に対する強力な危険シグナルであり、CD40Lによって媒介されるAPCの成熟および活性化ならびにNK細胞の動員のための強力な共刺激因子として機能する。この点において、調節性細胞の抑制もまた役に立つ。腫瘍細胞溶解もまたAPCへの腫瘍断片およびエピトープの提示に役立ち、さらに炎症によって共刺激が生じる。従って、各腫瘍に関連してエピトープに依存しない(すなわち、HLA拘束性ではない)応答が生じ、従ってin situで起こる。標的細胞において腫瘍特異的免疫応答が活性化され、その後、被験者の全身レベルで、例えば遠隔転移において抗腫瘍作用が発揮されることが可能になる。ベクターの有効量は、治療を必要とする被験者、腫瘍型、腫瘍の位置および腫瘍のステージを含む多くの因子に左右される。用量は、例えば、約108ウイルス粒子(VP)〜約1014VP、好ましくは約5x109VP〜約1013VP、より好ましくは約8x109VP〜約1012VPであることができる。本発明の特定の一実施形態において、用量は約5x1010〜5x1011VPの範囲である。
【００７３】
医薬組成物は、当該技術分野で公知の任意の従来の方法によって製造されることができ、例えば以下:バッチ、流加および潅流培養モード、カラムクロマトグラフィー精製、CsCl勾配精製ならびに低せん断細胞保持装置での潅流モードのいずれか1つを利用することにより製造されることができる。
【００７４】
投与
本発明のベクターまたは医薬組成物は、植物、動物およびヒトからなる群から選択される任意の真核被験者に投与されることができる。本発明の好ましい実施形態において、被験者はヒトまたは動物である。動物は、ペット、家畜および生産動物からなる群から選択されることができる。
【００７５】
被験者へのベクターまたは組成物の投与のために任意の慣用法を用いることができる。投与経路は、組成物の製剤または形態、疾患、腫瘍の位置、患者、共存症および他の因子によって決まる。本発明の好ましい実施形態において、投与は腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸腔内、膀胱内、腔内もしくは腹膜注射または経口投与によって行われる。
【００７６】
本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、ただ1回の投与だけで治療効果を発揮することができる。しかしながら、本発明の好ましい実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物は治療期間中に数回投与される。腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物は、例えば、最初の2週間、4週間、毎月または治療期間中に1〜10回投与されることができる。本発明の一実施形態において、投与は最初の2週間に3〜7回行われ、次いで4週目に行われ、次いで毎月行われる。本発明の特定の実施形態において、投与は最初の2週間に4回行われ、次いで4週目に行われ、次いで毎月行われる。治療期間の長さは変えることができ、例えば2〜12か月間またはそれ以上続けることができる。
【００７７】
さらに、本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの投与は、好ましくは、他の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター、例えばUS2010166799 A1に記載されているものの投与と併用することができる。投与は同時または順次に行うことができる。
【００７８】
被験者における中和抗体を回避するために、本発明のベクターは、治療間で変えることができる。本発明の好ましい実施形態において、以前の治療のベクターと比較してカプシドの異なる繊維ノブを有する腫瘍溶解性アデノウイルスベクターが被験者に投与される。本明細書において、“カプシドの繊維ノブ”とは、繊維タンパク質のノブ部分のことを言う(図1a)。あるいは、ウイルスの全カプシドが、異なる血清型のカプシドに交換されることもできる。
【００７９】
本発明の遺伝子治療は単独でも有効であるが、任意の他の治療、例えば旧来の治療とアデノウイルス遺伝子治療との併用は、いずれか一方単独よりもより有効であることができる。例えば、併用療法の各薬剤は腫瘍組織において独立して作用することもできるし、アデノウイルスベクターは化学療法または放射線治療に対して細胞を感受性にすることもできるし、かつ/または化学療法剤は、ウイルス複製のレベルを増強することもできるし、標的細胞の受容体状態に作用することもできる。あるいは、併用は、治療の有効性に有益なように被験者の免疫系を調節することができる。例えば、化学療法は、抑制性細胞、例えば制御性T細胞をダウンレギュレートするために使用することができる。併用療法の薬剤は同時または順次に投与することができる。本発明の好ましい実施形態において、治療の免疫学的効果を増強するために、患者に同時シクロホスファミドが投与される。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態において、本方法または使用は、被験者への同時放射線治療の投与をさらに含む。本発明の他の好ましい実施形態において、本方法または使用は、被験者への同時化学療法の投与をさらに含む。本発明のさらに他の好ましい実施形態において、本方法または使用は、被験者への他の腫瘍溶解性アデノウイルスまたはワクシニアウイルスベクターの投与をさらに含む。ベクターの投与は同時または順次であることができる。
【００８１】
本明細書において、“同時”とは、本発明の遺伝子治療の前、後または同時に投与された治療のことを言う。同時治療の期間は、数分から数週間であることができる。好ましくは、同時治療は数時間続けられる。一実施形態において、シクロホスファミドは、メトロノミック(metronomic)療法により静脈内ボーラスおよび経口の両方で投与される。
【００８２】
併用療法に適した薬剤は、限定するものではないが、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テモゾロマイド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを含む。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態において、本方法および使用は、被験者へのべラパミルまたは他のカルシウムチャネル遮断薬の投与をさらに含む。“カルシウムチャネル遮断薬”とは、カルシウムチャネルの伝導を破壊する薬物および天然物質のクラスのことを言い、べラパミル、ジヒドロピリジン、ガロパミル、ジルチアゼム、ミベフラジル、ベプリジル、フルスピリレンおよびフェンジリンからなる群から選択されることができる。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態において、本方法および使用は、被験者へのオートファジー誘導剤の投与をさらに含む。オートファジーは、リソソーム機構による細胞自身の成分の分解を含む異化プロセスのことを言う。“オートファジー誘導剤”とは、オートファジーを誘導することができる薬剤を指し、限定するものではないが、mTORインヒビター、PI3Kインヒビター、リチウム、タモキシフェン、クロロキン、バフィロマイシン、テムシロリムス、シロリムスおよびテモゾロマイドからなる群から選択されることができる。本発明の特定の実施形態において、本方法は、被験者へのテモゾロマイドの投与をさらに含む。テモゾロマイドは、経口または静脈内テモゾロマイドのいずれかであることできる。オートファジー誘導剤は、免疫調節剤と併用されることができる。一実施形態において、CD40Lをコードする腫瘍溶解性アデノウイルスは、テモゾロマイドおよびシクロホスファミドの両方と併用される。
【００８５】
本発明の一実施形態において、本方法または使用は、中和抗体を遮断するための化学療法または抗CD20治療または他のアプローチの投与をさらに含む。“抗CD20治療”とは、CD20陽性細胞を致死させることができる薬剤のことを言い、リツキシマブおよび他の抗CD20モノクローナル抗体からなる群から選択されることができる。“中和抗体を遮断するためのアプローチ”とは、通常、感染から生じる抗ウイルス抗体の生成を抑制することができる薬剤のことを言い、種々の化学療法剤、免疫調節物質、コルチコイドおよび他の薬物からなる群から選択されることができる。これらの物質は、限定するものではないが、シクロホスファミド、シクロスポリン、アザチオプリン、メチルプレニゾロン、エトポシド、CD40L、CTLA4Ig4、FK506(タクロリムス)、IL-12、IFN-γ、インターロイキン10、抗CD8、抗CD4抗体、骨髄破壊および経口アデノウイルスタンパク質からなる群から選択されることができる。
【００８６】
本願に記載のアプローチは、中和抗体を克服することができる分子と併用することもできる。このような薬剤はリポソーム、リポプレックスおよびポリエチレングリコールを含み、これらはウイルスと混合することができる。あるいは、中和抗体は、アデノウイルスカプシドタンパク質からなる免疫血漿瀉血法カラムで除去することもできる。
【００８７】
本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、腫瘍細胞のビリオン媒介腫瘍溶解を誘導し、腫瘍細胞に対するヒト免疫応答を活性化する。本発明の好ましい実施形態において、本方法または使用は、さらに、被験者における制御性T細胞をダウンレギュレートすることができる物質の投与を含む。“制御性T細胞をダウンレギュレートすることができる物質”とは、サプレッサーT細胞または制御性T細胞として同定される細胞の量を減少させる薬剤のことを言う。これらの細胞は、以下の免疫表現型マーカー:CD4+、CD25+、FoxP3+、CD127-およびGITR+の1つまたは多くを特徴づけることによって同定された。サプレッサーT細胞または制御性T細胞を減少させるこのような薬剤は、抗CD25抗体または化学療法剤からなる群から選択されることができる。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態において、本方法または使用は、被験者へのシクロホスファミドの投与をさらに含む。シクロホスファミドは通常の化学療法剤であり、これはまた一部の自己免疫疾患にも用いられる。本発明において、シクロホスファミドはウイルス複製を増強するために、ならびに腫瘍に対する免疫応答の増強のためのNK細胞および細胞傷害性T細胞のCD40L誘導刺激の効果を増強するために用いることができる。シクロホスファミドは、静脈内ボーラスもしくは低用量経口メトロノミック投与またはそれらの併用で投与されることができる。
【００８９】
本発明の任意の方法または使用は、in vivo、ex vivoもしくはin vitro法であることもでき、それらの使用であることもできる。
【００９０】
癌の治療のためのアデノウイルスの使用に関して考えられる制限の1つはそれらの免疫原性である。しかしながら、腫瘍環境の免疫抑制性のために癌患者の免疫系は腫瘍を除去できないので、アデノウイルスの免疫原性は利点となる。本発明において、複製能を保持し、免疫刺激分子であるCD40Lで武装することによって、この効果は増強された。本発明のアデノウイルスベクターは4つの重要な側面を特徴とする。腫瘍への遺伝子導入は、カプシド改変、例えば、それ以外はAd5カプシドにおけるAd3ノブとの血清型キメリズムによって改善される。E1Aの前にhTERTプロモーターを挿入することによって腫瘍選択性が達成される。ウイルスをCD40Lで武装することによって、Th1型細胞傷害性T細胞応答の誘導のための抗原提示細胞の動員および刺激が達成される。最後に、CD40Lは、CD40+腫瘍のアポトーシスを引き起こすこともできる。
【００９１】
本発明のアデノウイルスは、CD40+およびCD40-細胞の両方においてCD40L発現を誘導するのに有効であることが見出された。形質導入された腫瘍細胞が最終的に腫瘍溶解によって死滅させられることを確実にする腫瘍溶解性プラットフォームにおいて、細胞の溶解によるCD40Lの分泌または放出は、近くの腫瘍細胞にアポトーシスによるバイスタンダー効果を引き起こす。しかしながら、CD40Lの主な利点は免疫刺激作用であると考えられる。
【００９２】
腫瘍溶解性アデノウイルスAd5/3-hTERT-E1Aは、野生型Ad5と比較して顕著に高い腫瘍溶解能を有することが明らかにされた(Bauerschmitz GJ, et al., Cancer Res 2008;68:5533-9)。同じ研究において、異なる組織特異的プロモーター、例えばα-ラクトアルブミン、シクロオキシゲナーゼまたは多剤耐性タンパク質を特徴とする腫瘍溶解性アデノウイルスのパネルにおいてhTERT選択性を比較したところ、Ad5/3-hTERT-E1Aはin vitroで最も優れた結果とin vivoで顕著な抗腫瘍効果を示した。従って、Ad5/3-hTERT-E1Aは、本発明のアデノウイルスのための大変有望な対照ウイルスである。
【００９３】
Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lで示される本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスを、武装されていない腫瘍溶解性アデノウイルスAd5/3-hTERT-E1Aと比較したとき、in vivoでの腫瘍溶解能に関しては、両方のウイルスは同等に有効であることが見出された(図4c、4d)。導入遺伝子の発現は、ウイルスの有効性を抑制する場合があり、in vitroではA549細胞に対してAd5/3-hTERT-E1A-hCD40LはAd5/3-hTERT-E1Aよりも遅かったので、これは重要な発見であった。Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lは、in vitroでCD40-A549細胞よりもCD40+EJ細胞に対してより抗腫瘍活性を示したが、Ad5/3-hTERT-E1Aに関してはその反対であった(図s3c、3d)。
【００９４】
本発明の腫瘍溶解性アデノウイルス、例えばAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの大変傑出した有用性は、3つすべての抗腫瘍活性(腫瘍溶解、アポトーシス、免疫刺激)が寄与するCD40+腫瘍に関連している可能性があるが、本発明のアデノウイルスの潜在的な有用性はCD40+腫瘍に限定されないと考えられる。腫瘍がCD40-の場合であっても、CD40Lは抗原提示細胞を活性化することを示す報告がある(Noguchi M, et al., Cancer Gene Ther 2001;8:421-9; Sun Y, et al., Gene Ther 2000;7:1467-76.)。武装していない腫瘍溶解性アデノウイルスであってもヒトにおいて有用性を示したため、hCD40Lを含む腫瘍溶解性アデノウイルスは、腫瘍のCD40状態にかかわらず改善を示すと考えられる。
【００９５】
過去20年間にわたる腫瘍免疫学およびワクチン開発における臨床および前臨床研究により、いくつかのアプローチで、抗腫瘍免疫応答の誘導が達成できることが明らかにされた。しかしながら、残念なことに、進行した高度免疫抑制腫瘍を有する患者のためには、免疫応答の誘導を目指したアプローチはあまり有効ではなかった。その代わりとして、免疫治療学の最初の成功は、訓練され刺激されたT細胞(腫瘍媒介免疫抑制を克服するため)または免疫抑制性をダウンレギュレートすることができる抗体のいずれかを特徴とする(Motohashi et al 2006 Clin Cancer Res 12：6079-86； Hodi et al 2008 Nature Clinical Practice Oncology 5：557-561)。多くの研究者はまた、活性化T細胞のための“スペースを作り(make room)”、免疫抑制性細胞を減少させるための前処理を用いる。従って、重要な教訓は、免疫療法の成功のためには、腫瘍が獲得した免疫学的寛容を打ち破ることが必要とされることである。
【００９６】
しかしながら、本発明のアデノウイルスベクターは、難治性かつ免疫抑制性疾患を有する患者において抗腫瘍応答を示した。これらの効果は免疫の誘導およびTh2からTh1へのスイッチ（Th2 to Th1 switch）に関連した。
【００９７】
結論として、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lを用いる本発明のアデノウイルスベクターを発現する腫瘍溶解性CD40Lを用いれば、顕著な抗腫瘍効果が得られる。この効果の重要な部分はTh1型免疫応答の誘導であり、これにより腫瘍部位における細胞傷害性T細胞の集積およびそれらの活性化が起こる。
【００９８】
本発明を以下の実施例で説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００９９】
動物
すべての動物プロトコルは、Experimental Animal Committee of the University of Helsinki and the Provincial Government of Southern Finland に審査され承認された。4〜5週齢のC57BlackマウスおよびNMRIヌードマウスはTaconic社(Ejby、デンマーク)から入手し、試験の前に少なくとも1週間隔離した。マウスの健康状態をしばしばモニターし、何らかの痛みまたは苦痛の徴候が明らかになり次第それらを殺した。
【０１００】
細胞株
免疫不全モデルのために、106個のA549細胞(ヒト肺腺癌細胞株、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ATCC、10801 University Boulevard、マナッサス、ヴァージニア州20110-2209、米国から入手できる)またはEJ細胞(ヒト膀胱癌細胞株、Dr. Angelina Loskog、ウプサラ大学、スウェーデンから提供された)を用いた。Ramos-Blue(登録商標)細胞株はInvivoGen社(サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)から入手した。
【０１０１】
免疫適格モデルのために、C57Blackマウス(n=7マウス/群)の剃った脇腹に5x105個のMB49細胞(マウス膀胱癌細胞株、Dr. Angelina Loskog、ウプサラ大学、スウェーデンから提供された)を皮下注射した。腫瘍がおおよそ5x5mmのサイズに達したとき、0日目、2日目および4日目に、3x108VP/腫瘍の用量で腫瘍内にウイルスを3回注射した。
【０１０２】
統計解析
両側スチューデントt検定を用い、0.05未満のP値を有意とみなした。生存データをカプランマイヤー分析で分析した。
【実施例１】
【０１０３】
Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-CMV-hCD40LおよびAd5/3-CMV-mCD40Lのクローニング
一般的なアデノウイルス調製技術を用いてAd5/3-hTERT-E1A-hCD40L(配列番号5)を作成し増幅した(Kanerva A, et al., Mol Ther 2002;5:695-704; Bauerschmitz GJ, et al., Mol Ther 2006;14:164-74; Kanerva A and Hemminki A., Int J Cancer 2004;110:475-80; Volk AL, et al., Cancer Biol Ther 2003;2:511-5)。簡潔に言えば、特異的制限部位SunI/MunIの挿入を特徴とする特異的プライマー(順方向プライマー:TTTAACATCTCTCCCTCTGTGATT;配列番号3および逆方向プライマー:TATAAATGGAGCTTGACTCGAAG;配列番号4)を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってヒトCD40L cDNA(Prof Eliopoulos、クレタ大学、イラクリオン、ギリシャから提供された)を増幅した。次いで、PCR増幅産物をpTHSN(Kanerva A., et al., Gene Ther 2005;12:87-94)にサブクローニングし、続いてpAd5/3-hTERT-E1A(Bauerschmitz GJ, et al., Cancer Res 2008;68:5533-9)と組換えてpAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lを作成した。このプラスミドをPacIで線状化し、増幅およびレスキューのためにA549細胞にトランスフェクトした。
【０１０４】
クローニングのすべての段階をPCRおよび複数の制限酵素処理で確認した。シャトルプラスミドpTHSN-hCD40Lを配列決定した。野生型E1の非存在をPCRにより確認した。最終ウイルスにおいて、配列決定およびPCRを用いてE1領域、導入遺伝子および繊維をチェックした。以前記載したように、野生型組換えのリスクを避けるために、トランスフェクションを含むウイルス産生のすべての段階をA549細胞で行った(Kanerva A et al. 2003, Mol Ther 8, 449-58; Bauerschmitz GJ et al. 2006, Mol Ther 14, 164-74)。hCD40Lは、感染後約8時間で開始される複製関連導入遺伝子発現を引き起こすE3プロモーター(具体的には、内因性ウイルスE3A遺伝子発現調節因子)の制御下にある。E3は、6.7K/gp19Kの欠失を除けば無傷である。図1aにpAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの構造を示す。
【０１０５】
非複製型アデノウイルスAd5/3-CMV-hCD40LおよびAd5/3-CMV-mCD40Lの構築のために、pShuttle-CMVプラスミド(Stratagene社、ラホヤ、カリフォルニア州、米国)の多重クローニング部位にhCD40LまたはmCD40Lのいずれかを含む発現カセットを挿入した。このシャトルプラスミドを、全アデノウイルスゲノムを含むpAdeasy-1.5/3プラスミド(Krasnykh VN, et al., J Virol 1996;70:6839-46)と組換え、得られたレスキュープラスミドを293細胞(ヒト形質転換胎児腎臓細胞株、Microbix社、トロント、オンタリオ州、カナダから入手できる)にトランスフェクトしてAd5/3-CMV-hCD40LおよびAd5/3-CMV-mCD40Lを作成した。図1bおよび1cは、それぞれAd5/3-CMV-hCD40LおよびAd5/3-CMV-mCD40Lの構造およびクローニングを示す。
【０１０６】
対照ベクターAd5/3-Luc1(Kanerva A, et al., Clin Cancer Res 2002;8:275-80) およびAd5/3-hTERT-E1A ( Bauerschmitz GJ, et al., Cancer Res 2008; 68:5533-9) は以前報告されている。Ad5/3-Luc1、Ad5/3-hTERT-E1A、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-CMV-hCD40LおよびAd5/3-CMV-mCD40LのVP対プラーク形成単位比は、それぞれ、25、31、200、138および86であった。
【実施例２】
【０１０７】
in vitroおよびin vivoでの構築されたアデノウイルスの発現および機能性
フローサイトメトリーおよび酵素免疫抗体法(ELISA)を用いてhCD40Lの発現を試験した。フローサイトメトリー分析に関しては、2%ウシ胎児血清(FCS)を含む増殖培地において、10VP/細胞を用いてヒト胎児腎臓293細胞をAd5/3-hTERT-E1A-hCD40LまたはAd5/3-CMV-hCD40Lに感染させた。対照細胞(モック)は2%ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)のみで処置した。24時間後、hCD40L-FITC(555699、BD Biosciences Pharmingen社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)抗体で30分間かまたは、細胞の自己蛍光および非抗原特異的結合からのバックグラウンド蛍光を測定するアイソタイプ対照(IC)のいずれかで細胞を染色した。BDLSR(BD Biosciences社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)でフローサイトメトリー分析を行った。
【０１０８】
ELISA分析に関しては、A549異種植皮および同系のMB49腫瘍を誘導し、上記のAd5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-CMV-hCD40L、またはAd5/3-CMV-mCD40Lのいずれかで処置した。最初のウイルス注射後、4日目、8日目および12日目に血液試料を採取した。Ad5/3-CMV-hCD40Lで処置したマウスからの血清におけるhCD40Lの分析に関しては、腫瘍増殖が速く、8日目には動物を殺さなければならなかったので、血液は2回のみ(4日目および8日目)採取した。血清におけるhCD40LおよびmCD40L濃度は、Human CD40Ligand ELISAキット(ELH-CD40L-001、RayBiotech社、ジョージア州ノークロス、米国)およびMouse sCD40L ELISAキット(BMS6010、Bender Medsytems社、オーストリア)を用い、製造業者のプロトコルに従って測定した。
【０１０９】
図2aに示すフローサイトメトリー結果は、複製コンピテントAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lおよび複製欠損性Ad5/3-CMV-hCD40Lの両方が、in vitroで高いCD40L発現をもたらしたことを示している。
【０１１０】
ELISA分析により、in vivoでもまた、hCD40LおよびmCD40Lの発現が確認された(図2b)。形質導入されたA549細胞はCD40-であり、CD40Lによって殺されないと予想されるため、Ad5/3-CMV-hCD40LはAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lよりも高い血清レベルをもたらした。従って、形質導入された細胞はCD40Lを無限に産生し続けるのに対し、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40LはA549細胞の腫瘍溶解を引き起こし、これによりそれらがCD40Lを産生しなければならない時間が限定される。高濃度に存在する場合、CD40Lは副作用を引き起こす恐れがあるため、安全性の見通しからこのことは好都合であると考えられる。rhCD40Lのヒト最大耐用量は血清濃度2900pg/mlに相当することが報告されており、これはAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lで観察されたものよりは100倍高い。Ad5/3-CMV-mCD40Lは、Ad5/3-CMV-hCD40Lよりも低い血清mCD40Lレベルをもたらしたが、おそらくこれは、mCD40Lがマウス組織および細胞によって代謝されるのに対し、それがマウスにおいては不活性なため、hCD40Lが代謝されないからだと思われる。
【０１１１】
Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lによって発現されるCD40Lの機能性を肺癌細胞(A549)で試験した。細胞株A549単層(5x106細胞/T25フラスコ)を1000VP/細胞のAd5/3-hTERT-E1A-hCD40LおよびAd5/3-hTERT-E1Aに感染させ、1つのフラスコは感染させなかった(モック)。感染後48時間で上清を採取し、0.02μmフィルター(Whatman 6809-1002、メイドストーン・イングランド、イングランド)で濾過した。この上清を2つの機能性アッセイに用いた。
【０１１２】
第1の機能性アッセイにおいて、EJ細胞株単層をプラスミドpNiFty-Luc(InvivoGen社)でトランスフェクトし、終夜培養した。pNiFty-Lucは操作された内皮細胞-白血球接着分子(ELAM)プロモーターが結合した5つのNF-κB部位であり、ルシフェラーゼをコードする。
【０１１３】
A549単層から採取した上清をEJ細胞に加え、12時間培養した。このアッセイのための陽性対照として1μg/mlの組換えhCD40Lタンパク質(Abcam社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)を用いた。この細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した(Luciferase Assay System、Promega社、マディソン、ウィスコンシン州)。モック値を差し引いた。Nf-κB活性は、ルシフェラーゼ発現の増加倍数(相対発光量、RLU)で表される。このアッセイを3回行い、毎回3連で評価した。データを平均値±SEM;***、P<0.001で示す(図2c)。
【０１１４】
第2の機能性アッセイはRAMOS-Blue細胞に関して行った。Ramos-Blue細胞株は、NF-κB/AP-1誘導性SEAPレポーター遺伝子を安定的に発現するヒトBリンパ球細胞株である。刺激すると、これらの細胞は上清にSEAPを産生するが、これはQUANTI-Blueアッセイ試薬(InvivoGen社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)を用いて測定することができる(図2d)。
【０１１５】
これらの機能性アッセイは、このウイルスが生物活性hCD40Lを発現することを示している。ELAMプラスミドでトランスフェクトされたEJ細胞において、複製コンピテントAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lアデノウイルスから発現されるhCD40Lによって、NF-κB活性化において2.3倍の増加が観察され(図2c)、Ramos-Blue細胞において、NF-κB/AP-1における4.5倍の増加が観察された(図2d)。総合すれば、構築されたウイルスが、組換えhCD40Lの使用に基づいてヒトにおいて安全であると予測されるレベルで、in vitroおよびin vivoの両方で完全に機能するCD40Lを発現することが、これらの結果により確認される。
【実施例３】
【０１１６】
構築されたアデノウイルスのin vitroでの腫瘍溶解能の評価
構築されたアデノウイルスの腫瘍溶解能の評価のために、EJ(CD40+)およびA549(CD40-)細胞株を用いた。細胞生存率アッセイにおいて、2%DMEMに浮遊させた種々の濃度(0.1、1、10、100、1000VP/細胞)のAd5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-CMV-hCD40Lならびにそれらの対照ウイルスAd5/3-hTERT-E1AおよびAd5/3-Luc1に96ウェルプレート上の細胞を感染させた。1時間後、細胞を洗浄し、5%FCSを含む増殖培地中で7日間インキュベートした。次いでMTSアッセイ(Cell Titer 96 AQueous One Solution Proliferation Assay、Promega社)を用いて細胞生存率を分析した。
【０１１７】
Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lに関しては、EJ(CD40+)細胞株において、1000ウイルス粒子/細胞(VP/細胞)で完全な細胞致死が見られた(図3b)。A549(CD40-)細胞株において、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの腫瘍溶解能は、対照ウイルスAd5/3-hTERT-E1Aと比較して遅かった(図3a)。Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lを用いて同じ用量で感染させたA549およびEJ細胞株を比較するとき、EJ(CD40+)細胞の細胞致死における有意な増加が見られた(図3c)。同じ細胞株が、対照複製コンピテントアデノウイルスAd5/3-hTERT-E1Aに感染したとき、反対の結果が示され、A549はこのウイルスにより感受性が高かった(図3d)。Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lは対照ウイルスと同等の腫瘍溶解能を有し、陽性対照ウイルスよりもより効率的にCD40+細胞を殺すことをこれらの実験は示している。
【実施例４】
【０１１８】
アデノウイルスを発現するhCD40Lの、マウスにおけるin vivoでの有効性
マウス細胞におけるヒトアデノウイルスの増殖複製の欠如およびマウス組織におけるhCD40Lの不活性は、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの前臨床評価を複雑にする。従って、3つの抗腫瘍機構を3つの異なるマウスモデルに分離することにした。
【０１１９】
免疫不全モデルに関しては、ヌードマウス(n=5マウス/群)の脇腹に106個のA549細胞を皮下注射した。腫瘍がおおよそ5x5mmのサイズに達したとき、皮下にA549(CD40-)(図4a)またはEJ(CD40+)を移植したマウス(図4b)に、3つの日(0日目、2日目および4日目)に108VP/腫瘍の用量で複製欠損性アデノウイルスAd5/3-CMV-hCD40Lを腫瘍内に注射し、腫瘍増殖を経過観察した。モック動物にはPBSのみを投与した。CD40LはCD40+細胞に抗腫瘍活性を有するが(図4b)、CD40-細胞においてはなんら抗腫瘍活性は見られなかったことをこの実験は示している(図4a)。
【０１２０】
複製コンピテントモデルに関しては、腫瘍に、3つの日(0日目、2日目および4日目)に108VP/腫瘍の用量でAd5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-hTERT-E1Aおよびモックを腫瘍内に注射し、最初のサイズに対して腫瘍体積をプロットした。CD40陰性(図4c)およびCD40陽性腫瘍(図4d)の両方において、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lは陽性対照ウイルスAd5/3-hTERT-E1Aと同等に効果を有することが認められた。この実験はAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの腫瘍溶解能を証明するものであるが、hCD40Lはマウスにおいては活性ではないため、CD40Lの免疫学的活性を考慮に入れるものではない。Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの腫瘍溶解効果は、導入遺伝子発現によって妨げられるものではないことをこの実験はさらに示している(図4c、4d)。
【０１２１】
免疫適格モデルに関しては、C57Blackマウス(n=7マウス/群)の剃った脇腹に5x105個のMB49細胞を皮下注射した。腫瘍がおおよそ5x5mmのサイズに達したとき、0日目、2日目および4日目に、3x108VP/腫瘍の用量で腫瘍内に3回Ad5/3-CMV-mCD40Lウイルスを注射した。腫瘍増殖を経過観察し、実験終了時に臓器/腫瘍を採取した。組織をパラフィン包埋し、組織学および免疫組織化学(以下の実施例5参照)を行った。
【０１２２】
CD40Lによるアポトーシスの誘導と共に腫瘍溶解の効果を試験するために、免疫学的効果による交絡のないCD40+異種植皮モデル(T細胞を欠くヌードマウス)を用いた。CD40L発現はそれ自体で抗腫瘍活性を有し(図4b)、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lは陽性対照ウイルスと同等に有効であった。このことは、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの腫瘍溶解効果が導入遺伝子発現によって妨げられないこと示している(図4d)。
【０１２３】
さらに、ヌードマウスにおいて、CD40+腫瘍におけるアポトーシスをCD40Lが促進することを示すために、EJ(CD40+)腫瘍を移植したマウスに、Ad5/3-Luc1(モック)、Ad5/3-hTERT-E1A、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L、Ad5/3-CMV-hCD40Lを用いて3回腫瘍内に注射した。26日後、動物を殺し、腫瘍を採取し、パラフィンブロックに包埋した(n=5マウス/群)。アポトーシスの潜在的誘導を試験するために、カスパーゼ-3に関する免疫組織化学(詳細については以下の実施例5を参照のこと)を行った。腫瘍溶解性アデノウイルスに関して報告されているように、hCD40L発現およびそのアポトーシス作用によって、Ad5/3-hTERT-E1AおよびAd5/3-CMV-hCD40Lによっていくらかのアポトーシスが誘導されたが、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lによってさらに強力なアポトーシスが見られた(図5)。
【実施例５】
【０１２４】
同系の免疫適格動物におけるmCD40Lの抗腫瘍活性
同系の免疫適格動物モデルにおけるmCD40Lの分析に用いた免疫組織化学は以下のように行った。組織を4%ホルマリンで固定し、パラフィンブロックを作成した。厚さ4μmの組織切片を調製し、表1に示した希釈度で一次抗体と共にインキュベートした。ウサギに関してはLSAB2+ Dako System(DakoCytomation社、カーピンテリア、カリフォルニア州、米国(K0673))を用い、ラットにおいて産生された抗体に関してはIHC Selectキット(DAB150-RT、ミリポア社、マサチューセッツ州、米国)を用いて、これらの切片を検出キットと共にインキュベートした。切片をヘマトキシリンで対比染色し、エタノールで脱水し、キシレンで清澄化し、カナダバルサムで封入した。Axiocam(Zeiss社)を備えたAxioplan2顕微鏡(Carl Zeiss社)で画像を採取した。
【表１】
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【０１２５】
腫瘍溶解の効果による交絡を回避してCD40Lの免疫学的効果を試験するために、皮下にMB49腫瘍を移植したC57Blackマウスに、0日目、2日目および4日目に3x108VP/腫瘍の用量で複製欠損性アデノウイルスAd5/3-CMV-mCD40Lまたは対照Ad5/3-Luc1を腫瘍内に注射した(n=6マウス/群)。腫瘍サイズを経過観察し、0日目のサイズに対してプロットした。データを図6aに示す。Ad5/3-CMV-mCD40Lで処置した群において、抗腫瘍活性に有意な増加がみられる(p=0.001)。
【０１２６】
Ad5/3-CMV-mCD40LおよびAd5/3-Luc1で処置した腫瘍におけるアポトーシス(活性カスパーゼ-3)の免疫組織学的解析のために、最初の処置後16日目に腫瘍を採取し、カスパーゼ-3活性について分析した。結果を図6bに示す。陽性染色、すなわち褐色で示される活性カスパーゼ-3の発現は、抗腫瘍活性が、一部、CD40+MB49細胞に対するmCD40Lの結合によって誘導されるアポトーシスによることを示唆している(図6b)。
【０１２７】
同系のマウスモデルにおける宿主の免疫応答の分析のために、種々のマーカー:マクロファージ(F4/80)、白血球(CD45)およびBリンパ球(CD19)に関する免疫組織化学で4μmの腫瘍切片を染色した(図7a)。腫瘍切片はまた、ヘルパーT細胞(CD4+)および細胞傷害性(CD8+)T細胞(褐色)に関しても染色した(図7c)。
【実施例６】
【０１２８】
抗原提示細胞に対する効果
CD40Lをコードするウイルスの推定上の抗腫瘍活性の重要な部分は、抗原提示細胞に対するそれらの効果である。製造業者のプロトコル(BD Cytometric Bead Array Mouse Flex Sets、BD Biosciences社)に従ってBD FACSArrayを用いて、Ad5/3Luc1またはAd5/3-CMV-mCD40Lで処置したマウスからの培養脾細胞の血清および上清からIL-12、TNF-α、INF-γおよびRANTESに関するサイトカイン分析を行った。脾臓を細かく切り刻み、1%L-グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加した10%DMEM中で脾細胞を培養した。24時間目、48時間目および72時間目に上清を採取し、FACSArrayでサイトカインについて分析した。
【０１２９】
Ad5/3-CMV-mCD40Lで処置した群において、INF-γ、TNF-α、RANTESおよびIL-12の産生が増加したことをFACSArray分析は示している(図7A)。IL-12の誘導は、抗原提示細胞の重要なクラスであるマクロファージの活性化を示唆する。INF-γ、TNF-αおよびRANTESはTh1型免疫の指標であり、細胞傷害性T細胞応答の誘導を示唆する。
【０１３０】
このことを細胞レベルで関連づけるために、Ad5/3-CMV-mCD40L注射後16日目に採取した腫瘍の組織学的切片を分析した。マクロファージ(F4/80)および白血球(CD45)の動員の増強が見られたが、Bリンパ球(CD19)においては、わずかな増強しか見られなかった。このことは、浸潤物が主としてT細胞であったことを示唆している(図7b)。T細胞サブセットの分析により、これらの細胞の大部分はCD8+細胞傷害性T細胞であったことが示されたが、CD4+ヘルパーT細胞においてもわずかな増加が見られた(図7c)。免疫適格動物モデルにおける同系のMB49腫瘍でのmCD40Lの産生は、Th1応答性エレメントを介した抗腫瘍免疫応答および細胞傷害性T細胞浸潤を刺激したことをこれらの所見は示唆している(図7)。
【実施例７】
【０１３１】
ヒト患者における治療効果の予測のための腫瘍試料の治療前分析
1名の患者(R73)について、細胞致死アッセイ(MTS-アッセイ)のために新鮮な治療前癌性胸水を入手することができた。キメラAd5/3カプシド(Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lに相当するカプシド)を有する腫瘍溶解性アデノウイルスは、血清型5カプシドを有する腫瘍溶解性アデノウイルスと比較して患者の胸水細胞のより効率的な致死を示した。興味深いことに、この患者の腫瘍マーカーCa15-3は、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lでの処置後に徐々に減少して、処置の74日後には44%の減少が見られた(表3)。キメラAd5/3カプシドを有するアデノウイルスはヒト腫瘍細胞を効率的に殺し、臨床的有用性の予測の試験にex vivo細胞致死アッセイが興味が持たれることをデータは示唆している。
【実施例８】
【０１３２】
ヒト癌患者におけるAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの安全性と有効性
I.患者
進行性難治性固形腫瘍患者をFinnish Medicines Agency regulated Advanced Therapy Access Program に組み入れた。Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lを投与する患者に関する情報、用量および前治療を表2および3に示す。
【０１３３】
標準治療に難治性な進行性固形腫瘍を有する9名の患者、女性3名(R73、N235、R8)および男性6名(T181、C239、C229、I244、P251、C220)(表2)を、腫瘍内、静脈内または腹腔内へのAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの単回処置(R73)またはAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの連続処置(T181、C239、I244、P251、N235、C220)(表2)で処置した。患者C229には、Ad5-RGD-D24-GMCSF(PCT/FI2009/051025)およびAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lでの連続処置を行い、患者R8には、Ad5-D24-GMCSF、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40LおよびAd3-hTERT-E1(WO2010/086838)での連続処置を行った。選択基準は、従来の治療には難治性の固形腫瘍、WHOパフォーマンススコア3以下および主要臓器機能の不全であった。除外基準は、臓器移植片、HIV、重篤な心血管疾患、代謝疾患、肺疾患または腫瘍溶解性ウイルス処置を妨げる他の症状、所見もしくは疾患であった。医薬品の臨床試験の実施に関する基準(Good Clinical Practice)およびヘルシンキ宣言(Declaration of Helsinki)に基づいて文書でのインフォームド・コンセントを得、処置を行った。
【表２】
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【表３】
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【０１３４】
II.hCD40Lをコードするアデノウイルスベクターでの処置
臨床用のAd5/3-hTERT-E1A-hCD40LおよびAd5-RGD-D24-GM-CSFを製造し、患者の処置を開始した。
【０１３５】
2つの異なる投与スキームを用いた。連続処置の最初のラウンドに関しては、4名の患者(C229、I244、P251、R8)には、用量の5分の4を腫瘍内(または腹膜疾患を有する患者R8に関しては腹腔内)に投与し、5分の1を静脈内に投与したのに対し、他の4名の患者(T181、C239、N235、C220)には、腫瘍内にのみ注射した。処置のその後のラウンドに関しては、すべての患者において腫瘍内に処置した。患者R73には、単回ラウンドの処置を行い、用量の半分を腫瘍内に投与し、半分を腹腔内に投与した。
【０１３６】
ウイルス用量は表2に示してある。用量は、他の腫瘍溶解性ウイルスを用いた本発明者らの以前のデータに基づいて選択した。
【０１３７】
投与時に、適切な条件下で、滅菌生理食塩水にウイルスを希釈した。ウイルス投与後、すべての患者をその病院において終夜モニターし、続いてその後4週間を外来患者としてモニターした。各来院時にフィジカルアセスメントおよび病歴を記録し、臨床的に意味のある検査値を経過観察した。
【０１３８】
処置の副作用を記録し、有害事象共通用語規準v3.0(Common Terminology for Adverse Events v3.0)(CTCAE)に従ってスコアを付けた。多くの癌患者が疾患による症状を有するため、悪化していない場合は既存の症状はスコアしなかった。しかしながら、症状がより重篤になった場合、例えば処置前のグレード1が処置後にグレード2に変化した場合、それをグレード2とスコアした。
【０１３９】
腫瘍サイズは、造影CT(CT)スキャンで評価した。最大腫瘍径を得た。注入された病変および注入されない病変を含むすべての疾患に固形癌の治療効果判定基準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumor)(RECIST1.1)基準を適用した。これらの基準は:有効(partial response)PR(腫瘍径の合計の30%を超える減少)、不変(stable disease)SD(増加減少なし)、進行・増悪(progressive disease)PD(20%を超える増加)である。PRに達しない明確な腫瘍の減少はやや有効(minor response)(MR)とスコアした。ベースラインにおいて上昇しているとき、血清腫瘍マーカーもまた評価し、同じ百分率を用いた。
【０１４０】
製造業者の使用説明書に従って、Becton-Dickinsonサイトカインマルチプレックスビーズアレイシステム(BD FACSArray;BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州)を用いて、Th1型サイトカイン:インターフェロン-γ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)およびインターロイキン-2(IL-2)、ならびにTh2サイトカイン:インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-5(IL-5)およびインターロイキン10(IL-10)の両方に関して患者の血清試料を分析した。試料には、ベースライン、ウイルス処置後1ヶ月またはウイルス処置後2ヶ月を含めた。
【０１４１】
III.癌患者におけるAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの安全性
ウイルス処置中および処置後に記録された有害事象の概略を表4に示す。有害事象共通用語規準v3.0(CTCAE)に従って有害事象のグレードを付けた。
【表４】
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【０１４２】
Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lは、用いた最高用量:5x1011VP/患者まで認容性が良好であった。グレード4〜5の有害事象は認められなかった。Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lでの単回処置で処置した患者にはグレード1症状が認められただけであったが、連続処置患者では、疲労、吐き気および肝臓酵素の一過性上昇を含むグレード1〜3症状が認められた。
【０１４３】
IV.中和抗体力価
患者T181およびC239において、Ad5/3カプシドに対する中和抗体(NAb)を測定した(表5)。96ウェルプレートに1x104細胞/ウェルで293細胞を播種し、終夜培養した。翌日、FCSを含まないDMEMで細胞を洗浄した。補体を不活化するために、ヒト血清試料を56℃で90分間インキュベートした。無血清DMEMで4倍希釈系列(1:1〜1:16 384)を作成した(Sarkioja M et al. 2008, Gene Ther 15(12): 921-9)。Ad5/3luc1を血清希釈液と混合し、室温で30分間インキュベートした。次いで、上記混合物50μl中で、細胞を3連で100VP/細胞に感染させ、1時間後、10%FCSを含む増殖培地100μlを添加した。感染24日後、細胞を溶解し、Topcountルミノメーター(PerkinElmer社、ウォルサム、マサチューセッツ州)を用いて、Luciferase Assay System(Promega社、マディソン、ウィスコンシン州)でルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルスで処置した患者血清における中和抗体の効果を評価するために、Ad5/3luc1単独で達成された遺伝子導入に対してルシフェラーゼ読み取り値をプロットした。
【０１４４】
Ad5/3-luc1(Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lと同一であるカプシド)での293細胞への遺伝子導入の80%抑制を引き起こす血清希釈率としてデータを表5に示す。患者T181は、処置前にすでに高いNAbを有しており、処置中に変化は見られなかった。患者C239は、最初にわずかのNAb力価を示した。最初の処置は高いNAb産生を誘導したが、処置と共に中程度のレベルに低下した。このことは、腫瘍溶解性ウイルスで処置した患者には通例観察されず(通常は力価は継続的に増加する)、Th2->Th1活性の指標となりうる。
【表５】
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【０１４５】
V.有効性の評価
CTのためのRECIST基準(Therasse P et al. 2000, J Natl Cancer Inst 92, 205-16)またはポジトロン断層法CT(PET-CT)のためのPERCIST基準(Wahl et al 2009 J Nucl Med 50 Suppl 1:122S-50S)に従ったAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lの有効性の評価もまた表5に報告する。すべての患者は処置前に進行性の腫瘍を有していた。患者T181は不変(SD)を示し、患者C239は代謝安定状態(SMD)を示し、患者C229は進行・増悪(PD)を示し、患者I244はSMDを示し、患者P251はPDを示し、患者R8はSDを示した。ベースラインにおいてマーカーが上昇していた患者の腫瘍マーカーの評価に関しては、患者R73は著効(CR)を示し、患者T181およびN235は、それぞれ、-56%および-58%の有効を示し、患者R8は、-16%のやや有効(MR)を示し、患者C229は増加減少なしを示したが、患者C239、P251およびC220は腫瘍マーカーにおいて進行・増悪を示した(表5)。患者の生存期間もまた表5に示す。
【０１４６】
全体的に見て、7/9患者において抗腫瘍有効性の徴候が見られた。
【０１４７】
抗腫瘍活性の客観的測定値に加えて、我々はまた、数人の患者において、臨床的かつ/または主観的改善を観察した。患者C229ではパフォーマンスステータスの改善が見られ(ウイルス処置前のWHOは2であり、CGTG-401での連続処置後のWHOは1であった)、患者I244では一般症状の改善が見られた。
【０１４８】
Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40Lで処置された患者の生存解析に関しては、同じカプシドを有する武装していない腫瘍溶解性アデノウイルス(Ad5/3-D24-Cox2L)で処置した癌患者を対照として用いた。生存データをカプラン・マイヤー曲線にプロットし、コホートをログランク検定で比較した。この非無作為化比較において、Ad5/3-hTERT-E1A-hCD40L(図17ではCGTG-401で示す)およびAd5/3-D24-Cox2Lで処置された患者の生存期間中央値は、それぞれ304日および105日であった(p=0.017)(図17)。
【０１４９】
VI.腫瘍溶解性アデノウイルスAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lでの処置後のTh1およびTh2免疫応答ならびに炎症性/毒性関連サイトカイン応答
製造業者の使用説明書に従って、Becton-Dickinsonサイトカインマルチプレックスビーズアレイシステム(BD FACSArray;BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州)を用いて、Th1誘導サイトカイン:インターフェロン-γ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)およびインターロイキン-2(IL-2)またはTh2サイトカイン:インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-5(IL-5)およびインターロイキン10(IL-10)のいずれかに関して患者の血清試料を分析した。図10の左側にTh1誘導サイトカインを示し、右側にTh2誘導サイトカインを示す。前=ウイルスで処置される前に採取された血清試料;1ヶ月=ウイルス処置後1ヶ月で採取された血清試料;2か月=ウイルス処置後2ヶ月で採取された血清試料。
【０１５０】
図11において、ベースラインレベルを1としたときのベースラインレベルに対するサイトカインレベルを示し、各時点のTh1/Th2比を算出した。1ヶ月=ウイルス処置後1ヶ月で採取した血清試料;2ヶ月=ウイルス処置後2ヶ月で採取した血清試料。1より上の比率はTh1型免疫応答の優位を示し、1より下の比率はTh2型免疫応答の優位を示す。
【０１５１】
処置の安全性をさらに評価するために、インターロイキン-6(IL-6)および腫瘍壊死因子-α(TNF-α)の血清レベルを測定した。IL-6およびTNF-αは急性アデノウイルス毒性の高感度マーカーとして示唆されているが、処置後にこれらのサイトカインの有意な増加は観察されなかった(図13)。さらにまた、インターロイキン-8(IL-8)、インターロイキン-10(IL-10)、インターロイキン-12(IL-12)、インターフェロン-γ(IFN-γ)の血清レベルの処置後の増加もまた観察されなかった(図13)。
【０１５２】
VII.腫瘍溶解性アデノウイルスAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lでの処置後のアデノウイルスおよび腫瘍抗原認識T細胞の誘導
腫瘍溶解細胞死によって、免疫系が、腫瘍細胞を認識し致死させる能力を得ることが可能になる。このことは腫瘍根絶に潜在的に有益であり、治癒を容易にすることができる。アデノウイルスは、投与後、比較的短時間で身体から排除される。従って、特異的腫瘍抗原を認識することができる免疫系を刺激し、その処置が患者に持続的に有益な効果をもたらすことができることが極めて重要となる。加えて、抗体が誘導されるかまたは存在する場合、ウイルスは部分的または完全に中和される可能性があり、従って転移に感染し致死させるその有効性を失う恐れがある。しかしながら、腫瘍に対して誘導されたエフェクターT細胞またはNK細胞は自由に循環し、注射された腫瘍から遠く離れた転移をついには致死させる。
【０１５３】
腫瘍溶解性アデノウイルスAd5/3-hTERT-E1A-hCD40Lがアデノウイルス認識T細胞を誘導することができることを明らかにするために、全PBMCを単離し、アデノウイルス5型ペントン由来ペプチドプールでパルスして、インターフェロンγELISPOTでアデノウイルス特異的細胞傷害性Tリンパ球の活性化を評価した(図9)。患者T181は、処置後にアデノウイルス認識T細胞数の減少を示し、患者C239は、処置後にこれらの細胞数の増加を示した。抗ウイルス免疫応答は、腫瘍溶解性ウイルスによって媒介される全般的抗腫瘍効果の重要な部分であることが示唆されている(Alemany 2008, Lancet Oncol 9:507-8; Prestwich et al 2008, Lancet Oncol 9:610-2; Tuve et al 2009, Vaccine 27:4225-39)。
【０１５４】
さらに、アデノウイルスELISPOTのために、患者からの末梢血単核球(PBMC)をHAdv-5ペントンペプチドプール(ProImmune社、オックスフォード、英国)で刺激した。腫瘍抗原ELISPOTのために、BIRC5PONABペプチド、すなわちサバイビンを用いた(ProImmune社)。本アッセイにおいて、PBMCの予備刺激またはクローン増殖は行わなかった。従って、この結果は、血液中のこれらの細胞の実際の頻度を示している。
【０１５５】
評価可能な患者8名の内4名(C239、P251、I244、C220)が抗アデノウイルス免疫の誘導を示唆するアデノウイルス特異的PBMCの全身での増加を示した(図12A)。患者2名(T181、R73)は減少を示したが、これはウイルス濃度が最も高い腫瘍へのこの細胞のトラフィッキングによるものと考えられた。患者N235は、ウイルス注射後5週間でアデノウイルス特異的PBMCの少しの増加を示したが、最初の処置から9週間後には循環アデノウイルス特異的PBMCは認められなかった。R8は、終始、低いかまたは検出できないレベルの循環アデノウイルス特異的PBMCしか示さなかった。
【０１５６】
サバイビン特異的反応に関しては、評価可能な患者8名の内4名(P251、N235、C220、I244)が、処置後にPBMC数の増加を示した(図12B)。患者R73およびR8においては、腫瘍特異的T細胞数の減少が観察されたが、これは腫瘍部位へのトラフィッキングを示唆するものと考えられた。患者T181およびC239は、検出不能なレベルの循環生存特異的PBMCを有していた。
【０１５７】
VIII.患者PBMCの細胞内サイトカインの分析
サバイビンは、大部分の腫瘍によって発現されるため、腫瘍特異的免疫を評価するために有用なプロトタイプ標的である。しかしながら、恐らくはサバイビンは最も免疫原性の高いエピトープではなく、従って、抗サバイビンT細胞は抗腫瘍免疫の誘導を過小評価する恐れがある。抗腫瘍細胞のex vivo増殖に続いて、腫瘍特異的エピトーププールに対する反応性を試験することによって、抗腫瘍免疫に関する別の観点を提供することができ、従って十分な細胞数が入手できる場合は、細胞内サイトカイン分析で腫瘍特異的CD8+細胞およびCD4+T細胞を測定した。
【０１５８】
PBMCは、解凍時に、濃度1μg/mLで、ヘキソンおよびペントンペプチドのhAd5混合物かまたは、癌のタイプによって選択された3〜7のTAA PepMixeの混合物のいずれかでパルス刺激した。刺激後、IL-4およびIL-7(hAd5-パルスした細胞)、またはIL-12およびIL-7(TAA-パルスした細胞;R&D Systems社、ミネアポリス、ミネソタ州)のいずれかを、IL-4に関しては1000U/mLの濃度で、IL-7およびIL-12に関しては10ng/mLの濃度で含み、5%ヒトAB血清(Valley Biomedical社)および2mmol/L L-グルタミン(GlutaMAX TM-I;Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)を添加した、CTL増殖培地RPMI 1640(HyClone社、ローガン、ユタ州)+クリック培地(EHAA;Irvine Scientific社、サンタアナ、カリフォルニア州)1:1を細胞に補給した。培養10日後、共刺激のために前もってCD28およびCD49(0.1μg/ml;BD社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国)を加え、hAd5またはTAAペプチド混合物で細胞を再刺激し、飽和量のCD3およびCD8に対するモノクローナル抗体(Becton Dickinson社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)(5μl)で表面染色した。20μlのFITC-抗IFN-γ抗体またはPe-抗TNF-α抗体(BD Biosciences社)でサイトカインに関して細胞を染色し、Cell Questソフトウェア(BD社、サンディエゴ、カリフォルニア州)を備えたFACSCaliburを用いて分析した。
【０１５９】
処置後のすべての測定値において、患者T181およびC239は腫瘍特異的CD8+T細胞の増加を示した(図14A)。CD4+細胞に関しては、T181およびP251は、ベースラインと比較して増加を示した(図14B)。さらにまた、患者C239について、アデノウイルス認識CD4+T細胞数を試験したところ、ウイルス投与の3週間後に一過性の増加が見られ(図14C)、ELISPOTデータが確認された(VII項を参照のこと)。
【０１６０】
IX.CD40LおよびRANTESの局所および全身レベルの分析
悪性腹水におけるCD40LおよびRANTES(その発現がCD40Lによって部分的に決定される下流分子)の局所レベルを評価するために、その液中の可溶性CD40L(sCD40L)およびRANTES濃度を評価し、これらのサイトカインの全身レベルと比較した(それぞれ図15Aおよび図15B)。ウイルス投与前および投与28日後に患者R8の腹腔から悪性腹水(腹膜腫瘤から得た)を除去し、BD Cytometric Bead Array (CBA) Human Soluble Protein Flex Set (BD社、サンディエゴ、カリフォルニア州)を用いてCD40LおよびRANTES濃度を分析した。腫瘍においてsCD40LおよびRANTESレベルは局所的に増加していたが、全身レベルでは増加は見られなかった。
【０１６１】
さらに、腫瘍部位でのウイルスの複製を評価するために、腹水(図15C)および腹水から単離された細胞(図15D)中のウイルス粒子(VP)の量を分析した。CD40L配列に隣接するE3領域を標的化するプライマーおよびプローブ(順方向プライマー5´-CCGAGCTCAGCTACTCCATC-3´(配列番号6)、逆方向プライマー5´-GCAAAAAGTGCTGACCCAAT-3´(配列番号7)およびプローブonco5´FAM-CCTGCCGGGAACGTACGATG3´MGBNFQ(配列番号8、配列番号9、配列番号10)を用いるqPCRによって分析を行った。ウイルス処置後28日目に、腹水および細胞において、腫瘍における複製を示唆する高いウイルス量が観察されたが、同じ日に、血清においてはウイルスは検出されなかった。
【０１６２】
従って、sCD40LおよびRANTESレベルは共に腫瘍部位において局所的に増加していたが、全身レベルでは増加は観察されなかった。このことは、免疫学的効果が腫瘍部位に限定されていたことを示唆している。
【０１６３】
免疫学的効果が局所に限定されていることをさらに確認するために、ウイルス処置の前後に、9名の患者全部についてsCD40LおよびRANTESの全身レベルを評価した。すべての患者において有意な増加は見られなかったが、このことは、ウイルスの設計によって予測されていたように、免疫学的効果が腫瘍部位に限定されていたことを示唆している(図16)。9名の患者全部に関する血液試料は、前(ベースライン)および処置後のいくつかの時点において採取した。血清中の可溶性CD40L(sCD40L)およびRANTES濃度を評価した。データは中央値±SDで示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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