(57)【要約】本発明は汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンに関する。より具体的には、本発明は、ほとんどのＨ５Ｎ１系列の間でヘマグルチニンの中和エピトープにおいて全変異株をカバーする３種類のＨ５Ｎ１株の同定に関する。本発明はさらに、その３種類のＨ５Ｎ１株を含む、またはこれらの３種類の株のそれぞれのヘマグルチニンペプチドを含む汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンに関する。【選択図】図１
2013525428.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予防的に有効な量の第１免疫原性薬剤または前記の第１免疫原性薬剤をコードする核酸、予防的に有効な量の第２免疫原性薬剤または前記の第２免疫原性薬剤をコードする核酸、予防的に有効な量の第３免疫原性薬剤または前記の第３免疫原性薬剤をコードする核酸、および医薬的に許容できるキャリヤーを含み、その第１免疫原性薬剤がウイルス株Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）のヘマグルチニンまたはその抗原性ペプチドを含み、その第２免疫原性薬剤がウイルス株Ａ／ベトナム１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）のヘマグルチニンまたはその抗原性ペプチドを含み、その第３免疫原性薬剤がウイルス株Ａ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）のヘマグルチニンもしくはその抗原性ペプチドまたは前記の第３免疫原性薬剤をコードする核酸を含む、汎用Ｈ５Ｎ１ワクチン組成物。
【請求項２】
その第１、第２および第３免疫原性薬剤のそれぞれがヘマグルチニンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
その第１、第２および第３免疫原性薬剤のそれぞれがヘマグルチニンの抗原性ペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
その第１、第２および第３免疫原性薬剤のそれぞれがヘマグルチニンをコードする核酸を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
その第１、第２および第３免疫原性薬剤のそれぞれがヘマグルチニンの抗原性ペプチドをコードする核酸を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
その第１、第２および第３免疫原性薬剤のそれぞれがヘマグルチニンを提示する、または示すウイルスを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
それぞれのウイルスがバキュロウイルスである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
その第１、第２および第３免疫原性薬剤のそれぞれがヘマグルチニンの抗原性ペプチドを提示する、または示すウイルスを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
それぞれのウイルスがバキュロウイルスである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
予防的に有効な量の請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象においてトリインフルエンザウイルスに対する免疫応答を調節するための方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を対象に投与することを含む、トリインフルエンザウイルスと関係する疾患を処置または予防するための方法。
【請求項１２】
対象において免疫応答を調節するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
対象においてトリインフルエンザウイルスと関係する疾患を処置または予防するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
医薬品における使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
対象における免疫応答の調節における使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
対象におけるトリインフルエンザウイルスと関係する疾患の処置または予防における使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
対象において免疫応答を調節するための医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１８】
対象においてトリインフルエンザウイルスと関係する疾患を処置または予防するための医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
[0001]  本出願は、２０１０年４月３０日に出願された米国仮特許出願一連番号６１／３２９，８０２に関連し、およびそれに対して優先権を主張し、それを本明細書に援用する。
【０００２】
配列の提出
[0002]  本出願は、電子フォーマットでの配列リストと共に出願されている。その配列リストは2577-201PCT_ST25.txtという名前であり、２０１１年１月１３日に作成され、大きさは５４ｋｂである。その配列リストの電子フォーマットでの情報は本出願の一部であり、それをそのまま本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  本発明は、汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンに関する。より具体的には、本発明は、ほとんどのＨ５Ｎ１系列の間でヘマグルチニンの中和エピトープにおいて全変異株をカバーする３種類のＨ５Ｎ１株の同定に関する。本発明はさらに、その３種類のＨ５Ｎ１株を含む、またはこれらの３種類の株のそれぞれのヘマグルチニンペプチドを含む汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンに関する。
【０００４】
[0004]  本明細書において本発明の背景を明らかにする、またはその実施に関する追加の詳細を提供するために用いられる刊行物または他の資料を援用し、便宜のために参考文献一覧においてそれぞれ分類する。
【０００５】
[0005]  インフルエンザウイルスは、その抗原決定基、例えばヘマグルチニンの球状頭部領域に存在する主要な中和エピトープをランダムに変化させることにより免疫系を回避する。感染の際に、宿主応答は主にそのような中和エピトープに対する抗体の誘導により特性付けられ、それはウイルスのヘマグルチニンの標的細胞受容体への付着を妨害する。しかし、ＨＡのこれらの中和エピトープ内の相当なアミノ酸の変異は、抗原的に異なるインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスの出現につながる。事実、季節性インフルエンザウイルスは抗原連続変異によりヒトの集団においてワクチンに誘導される免疫から効率的に逃れることができたことが報告されている。さらに、ＨＡ１可変領域中の少数の重要なアミノ酸の変異は、ワクチンに誘導される抗体応答からのウイルスの回避を可能にするのに十分である。モノクローナル抗体による中和から逃れた変異株のＨＡ配列内のアミノ酸置換を同定するための以前の試みは、ＨＡの中和エピトープ部位を明らかにした(Kaverin et al., 2002; Kaverin et al., 2007)。
【０００６】
[0006]  ランダムに変異し、多様な抗原決定基を有する新型へと進化するインフルエンザウイルスの性質は、インフルエンザ感染の制御における重要な課題である(Plotkin et al., 2002)。これは最近のＨ５Ｎ１トリインフルエンザの大流行および現在のＨ１Ｎ１ブタ由来インフルエンザＡウイルス（Ｓ−ＯＩＶ）による世界的流行の状況により明白に認識されてきた。実際、Ｈ５Ｎ１が主に変異事象の発生によりヒト組織に感染する能力を獲得したということは、文献において十分に裏付けられてきた(Ayora-Talavera et al., 2009)。高病原性トリインフルエンザ（ＨＰＡＩ）Ｈ５Ｎ１は、インフルエンザに対する免疫性の主要な決定基であるヘマグルチニン（ＨＡ）配列における違いのために抗原的に識別可能であり、それは結果としてＨ５Ｎ１の異なる系列またはクレードをもたらす(Lam et al., 2008; WHO, 2005)。現在のＨ５Ｎ１ワクチンによる感染の制御は、部分的にはそのＨＡ配列中の、特にその中和エピトープ領域内の変異のため、Ｈ５Ｎ１の異種の株または系統的に異なるクレードに対しては有効でないようである。現在のワクチンはこれらのエピトープに対する中和抗体の誘導のみに基づいているため、これらの配列における違いは現行のワクチンを世界的なインフルエンザの予防に関して不適当なものにする可能性がある。実際、現行のＨ５Ｎ１ワクチン候補は対応するクレード内のほとんどの分離株の優れた抗原的保護範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を提供し続けており、最近クレード１、２．２および２．３自体内の一部のウイルスが抗原的異種性の証拠を示していることが認識されている。
【０００７】
[0007]  そのような限界を克服するため、および世界中でワクチンの可能性を完全に実現するため、保存されたウイルスタンパク質に基づく汎用ワクチンの概念が最近提案されてきた。インフルエンザウイルスの高度に保存されたイオンチャンネルタンパク質（Ｍ２）または核タンパク質（ＮＰ）が交差防御的細胞性免疫およびウイルス排除の誘導に関して評価されてきた(Wu et al., 2007; Chen and Subbarao, 2009)。そのヘマグルチニンの保存された融合ペプチドを用いた類似のアプローチは、ウイルスの宿主細胞膜への融合を阻害するための別の選択肢である(Gerhard et al., 2006)。これらの保存されたタンパク質に対して生成された抗体は、ウイルスの蔓延を低減させ、インフルエンザからの回復を加速する可能性がある。しかし、これらのタンパク質に特異的な抗体は免疫原性が乏しく、感染を許容することが分かっている。従って、そのインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに基づくワクチンの開発は、ＨＰＡＩ、例えばＨ５Ｎ１による感染を予防するための唯一の実行可能な選択肢であるように思われる。それでもなお、そのＨ５亜型の間での主要な抗原性中和エピトープ領域内のアミノ酸の変異は、異なるＨ５Ｎ１系列に対するそのような汎用ワクチンの開発を制限する。
【０００８】
[0008]  従って、異なるＨ５Ｎ１系列に対するある程度の防御免疫を提供する汎用ワクチンを開発することが望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kaverin et al., 2002
【非特許文献２】Kaverin et al., 2007
【非特許文献３】Plotkin et al., 2002
【非特許文献４】Ayora-Talavera et al., 2009
【非特許文献５】Lam et al., 2008; WHO, 2005
【非特許文献６】Wu et al., 2007
【非特許文献７】Chen and Subbarao, 2009
【非特許文献８】Gerhard et al., 2006
【発明の概要】
【００１０】
[0009]  本発明は汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンに関する。より具体的には、本発明は、ほとんどのＨ５Ｎ１系列の間でヘマグルチニンの中和エピトープにおいて全変異株をカバーする３種類のＨ５Ｎ１株の同定に関する。本発明はさらに、その３種類のＨ５Ｎ１株を含む、またはこれらの３種類の株のそれぞれのヘマグルチニンペプチドを含む汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンに関する。
【００１１】
[0010]  従って、第１観点において、本発明は対象における疾患の予防のための汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンを提供し、ここでその疾患はトリインフルエンザウイルスのＨ５Ｎ１亜型と関係している。１態様において、その汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンは予防的に有効な量の第１免疫原性薬剤、予防的に有効な量の第２免疫原性薬剤および予防的に有効な量の第３免疫原性薬剤を含む。別の態様において、それぞれの免疫原性薬剤はヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分またはヘマグルチニンもしくはそれの抗原性部分をコードする核酸を含む。追加の態様において、その抗原性部分にはヘマグルチニンのエピトープが含まれる。さらなる態様において、その対象はヒト、飼いならされた動物（イヌ、ネコ、サル等）；家畜（ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等）、野鳥（野生のガン、野生のカモ等）および飼いならされたトリ（ニワトリ、アヒル、ガチョウ等）であってよい。１態様において、免疫原性薬剤はヘマグルチニンを含むウイルスである。別の態様において、そのウイルスは不活化されている。追加の態様において、そのウイルスは弱毒化ウイルスである。別の態様において、そのウイルスはビロソームの形である。さらなる態様において、そのウイルスは卵由来または細胞培養由来である。別の態様において、その免疫原性薬剤はヘマグルチニンを含むスプリットウイルスまたはスプリットウイルス抗原性製剤である。１態様において、その免疫原性薬剤はヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分である。別の態様において、そのヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分は単離されたものである。追加の態様において、そのヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分は発現系により生成されたものである。１態様において、その発現系はあらゆる発現系、例えばウイルス発現ベクターであり、ここでそのヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分はそのウイルスの表面上に提示される、または示される。１態様において、そのウイルス発現ベクターはあらゆるウイルス発現ベクター、例えば改変ワクシニアウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、ポックスウイルス発現ベクター、バキュロウイルス発現ベクターおよび同様のものである。１態様において、その発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターであり、そのヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分を提示する、または示すウイルスはバキュロウイルスである。別の態様において、その免疫原性薬剤は対象において発現することができるヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分をコードする核酸である。
【００１２】
[0011]  第２観点において、本発明は、対象に予防的に有効な量の汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンを投与することを含む、トリインフルエンザウイルスに対する防御免疫を生成するための方法を提供する。その汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンは上記で記述した通りのものである。
【００１３】
[0012]  第３観点において、本発明は、対象に予防的に有効な量の汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンを投与することを含む、トリインフルエンザウイルスと関係する疾患の予防または処置のための方法を提供する。その汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンは上記で記述した通りのものである。
【００１４】
[0013]  第４観点において、本発明は、トリインフルエンザウイルスに対する免疫応答を刺激するための汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンの使用を提供する。その汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンは上記で記述した通りのものである。
【００１５】
[0014]  第５観点において、本発明は、トリインフルエンザウイルスと関係する疾患の予防のための汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンの使用を提供する。その汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンは上記で記述した通りのものである。
【００１６】
[0015]  第６観点において、本発明は、医薬品における使用のための汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンを提供する。
[0016]  第７観点において、本発明は、対象における免疫応答の調節における使用のための汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンを提供する。
【００１７】
[0017]  第８観点において、本発明は、対象におけるトリインフルエンザウイルスと関係する疾患の処置または予防における使用のための汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンを提供する。
[0018]  第９観点において、本発明は、対象における免疫応答の調節のための医薬の製造のための汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンの使用を提供する。
【００１８】
[0019]  第１０観点において、本発明は、対象においてトリインフルエンザウイルスと関係する疾患を処置または予防するための医薬の製造のための汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】[0020]  図１は血清血球凝集阻止力価を示す。マウスのグループを、Ｔｒｉ−ＢａｃＨＡ（ＢａｃＨＡ−ｍｉｘ）またはＢａｃＨＡのＭｏｎｏ−ＢａｃＨＡ（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１））（ＢａｃＨＡ−ＶＮ）または不活化した全ウイルスワクチン（ＷＴ−Ｈ５Ｎ１）で０日目および２８日目において２回皮下免疫した。それぞれの点は、算術平均値（ｎ＝１０）±ＳＤを表す。
【図２】[0021]  図２Ａおよび２Ｂは、マウスにおけるクレードをまたぐ血清マイクロ中和を示す。マウスのグループを、ＢａｃＨＡ（Ｔｒｉ−ＢａｃＨＡ）またはＢａｃＨＡの単一株（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１））（Ｍｏｎｏ−ＢａｃＨＡ）または不活化全Ｈ５Ｎ１ウイルスワクチン（ＷＴ−Ｈ５Ｎ１）で０日目および２８日目において２回皮下免疫した。クレード１．０（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１））、クレード２．１（Ａ／インドネシア／ＣＤＣ１０３１／２００７（Ｈ５Ｎ１））、クレード２．２  Ａ／シチメンチョウ／トルコ１／０５＊（Ｈ５Ｎ１）、クレード４．０（クレード４．０  Ａ／ガン／貴陽／３３７／０６（Ｈ５Ｎ１））、クレード７．０（Ａ／ニワトリ／陜西／２／０６（Ｈ５Ｎ１））およびクレード８．０（Ａ／ニワトリ／河南／１２／０４（Ｈ５Ｎ１））からのウイルスをこの試験に関して用いた。クレード１、２．１および２．２を図２Ａにおいて示し、クレード４、７および８を図２Ｂにおいて示す。ピーク応答の日（最終免疫処置後１４日目）からの血清をそのアッセイに関して用いた。それぞれの点は、算術平均値（ｎ＝１０）±ＳＥを表す。
【図３】[0022]  図３は、致死的Ｈ５Ｎ１ウイルス負荷からのマウスの保護を示す。マウスのグループを、ＢａｃＨＡの３種類の株（Ｔｒｉ−ＢａｃＨＡ）またはＢａｃＨＡの単一株（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１））（Ｍｏｎｏ−ＢａｃＨＡ）または不活化全Ｈ５Ｎ１ウイルスワクチン（ＷＴ−Ｈ５Ｎ１）で０日目および２８日目において２回皮下免疫した。最後のワクチン接種の３週間後に、マウスに５ＭＬＤ５０（マウス致死用量５０％）のクレード１．０（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１））ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１株を鼻腔内に感染させた。マウスを１４日間の観察期間全体を通して生存に関して監視した。その結果をパーセント生存に換算して示す。
【図４】[0023]  図４は、致死的Ｈ５Ｎ１ウイルス負荷からのマウスの保護を示す。マウスのグループを、ＢａｃＨＡの３種類の株（Ｔｒｉ−ＢａｃＨＡ）またはＢａｃＨＡの単一株（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１））（Ｍｏｎｏ−ＢａｃＨＡ）または不活化全Ｈ５Ｎ１ウイルスワクチン（ＷＴ−Ｈ５Ｎ１）で０日目および２８日目において２回皮下免疫した。最後のワクチン接種の３週間後に、マウスに５ＭＬＤ５０（マウス致死用量５０％）のクレード２．１（Ａ／インドネシア／ＴＬＬ０１３／２００６（Ｈ５Ｎ１））ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１株を鼻腔内に感染させた。マウスを１４日間の観察期間全体を通して生存に関して監視した。その結果をパーセント生存に換算して示す。
【図５】[0024]  図５は、致死的Ｈ５Ｎ１ウイルス負荷からのマウスの保護を示す。マウスのグループを、ＢａｃＨＡの３種類の株（Ｔｒｉ−ＢａｃＨＡ）またはＢａｃＨＡの単一株（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１））（Ｍｏｎｏ−ＢａｃＨＡ）または不活化全Ｈ５Ｎ１ウイルスワクチン（ＷＴ−Ｈ５Ｎ１）で０日目および２８日目において２回皮下免疫した。最後のワクチン接種の３週間後に、マウスに５ＭＬＤ５０（マウス致死用量５０％）のクレード７．０（Ａ／ニワトリ／陜西／２／０６（Ｈ５Ｎ１））ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１株を鼻腔内に感染させた。マウスを１４日間の観察期間全体を通して体重減少に関して監視した。その結果を（その試験の開始時の）パーセント体重に換算して示す。
【図６】[0025]  図６は、致死的Ｈ５Ｎ１ウイルス負荷からのマウスの保護を示す。マウスのグループに、ＢａｃＨＡの３種類の株（Ｔｒｉ−ＢａｃＨＡ）またはＢａｃＨＡの単一株（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１））（Ｍｏｎｏ−ＢａｃＨＡ）または不活化全Ｈ５Ｎ１ウイルスワクチン（ＷＴ−Ｈ５Ｎ１）を０日目および２８日目において２回皮下免疫した。最後のワクチン接種の３週間後に、マウスに５ＭＬＤ５０（マウス致死用量５０％）のクレード７．０（Ａ／ニワトリ／陜西／２／０６（Ｈ５Ｎ１））ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１株を鼻腔内に感染させた。そのマウスを１４日間の観察期間全体を通して生存に関して監視した。その結果をパーセント生存に換算して示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
[0026]  本発明は汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンに関する。より具体的には、本発明は、ほとんどのＨ５Ｎ１系列の間でヘマグルチニンの中和エピトープにおいて全変異株をカバーする３種類のＨ５Ｎ１株の同定に関する。本発明はさらに、その３種類のＨ５Ｎ１株を含む、またはこれらの３種類の株のそれぞれのヘマグルチニンペプチドを含む汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンに関する。
【００２１】
[0027]  別途定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明（単数または複数）が属する技術の当業者により一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書における開示全体を通して参照される全ての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、Ｇｅｎｂａｎｋの配列、ウェブサイトおよび他の出版物を、それらが開示している全てに関してそのまま援用する。
【００２２】
[0028]  現行のＨ５Ｎ１ワクチン候補は対応するクレード内のほとんどの分離株の優れた抗原的保護範囲を提供し続けているが、最近クレード１、２．２および２．３自体内の一部のウイルスが抗原的異種性の証拠を示していることが認識されている。Ｈ５Ｎ１ウイルスは既に多数の亜系列（ｓｕｂｌｉｎｅａｇｅｓ）またはクレードに分かれているため、本発明は、Ｈ５亜型の間の、特に中和エピトープの領域における変異を代表するワクチン株の分析および選択を提供する。本発明に従うそのようなワクチン株の選択は、ほとんどのＨ５Ｎ１系列に対する広い範囲の保護を提供する。
【００２３】
[0029]  本明細書で示したように、完全にインフルエンザのＨＡに基づく汎用ワクチンの開発は、いくつかのＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１クレードの間の中和エピトープの変異または保存を同定することができるならば、実行可能である。そのような中和エピトープの分布パターンを理解することは、そのワクチン組成物中に２種類以上の理想的なＨ５Ｎ１株を組み込むことによる汎用ワクチンの設計を助けた。選択されたウイルス株の中和エピトープは、ほとんどのＨ５Ｎ１亜型に対する広い範囲の防御免疫を獲得するために、ほとんどのＨ５亜型の間の変異をカバーしている。モノクローナル抗体による中和から逃れた変異株のＨＡ配列内のアミノ酸置換を同定する以前の試みは、ＨＡの中和エピトープ部位を明らかにした(Kaverin et al., 2002; Kaverin et al., 2007)。以前の発見に加えて、本発明は中和モノクローナル抗体を用いてそれらのアミノ酸配列を位置付けることによるＨ５Ｎ１の他の主な中和エピトープの同定を提供する。Ｈ５亜型の間の全ての同定された中和エピトープの分布の分析は、ヒトおよびトリ両方の源からのＨ５Ｎ１亜型の抗原決定基内の変異を明らかにした。これらの結果に基づいて、本発明はそのＨ５Ｎ１系列内の全変異株をカバーするＨＡの主な中和エピトープを含む３種類のワクチン株を提供する。インビボで保護の広い範囲を試験して実証するため、選択されたワクチン株のＨＡタンパク質をバキュロウイルスの表面上で発現させ、そのワクチン配合物の有効性を、系統的に異なるＨ５Ｎ１株で負荷をかけたマウスモデルにおいて評価した。
【００２４】
[0030]  本発明に従って、その汎用ワクチン開発戦略は３つの工程を含んでいた：（ｉ）中和モノクローナル抗体（ｎ−ｍＡｂ）を用いるＨ５Ｎ１ウイルスのヘマグルチニンの中和エピトープの位置づけ；（ｉｉ）全てのＨ５Ｎ１系列の間の中和エピトープの分布の分析；および（ｉｉｉ）全Ｈ５Ｎ１ウイルスの中和エピトープ内の変異をカバーする理想的なワクチン株の選択。本発明に従って、５種類のｎ−ｍＡｂ（６Ｂ８、４Ｃ２、２Ｄ９、４Ｆ８および３Ｈ１１）の集団を用いてＨ５Ｎ１ウイルスの中和エピトープを位置付けた。ｎ−ｍＡｂによる中和エピトープの位置付けは、１３８または１５５または１８９または２２３位におけるアミノ酸がＨ５Ｎ１ウイルスのヘマグルチニンの主な中和エピトープの形成に関わっていることを明らかにした。加えて、主な中和エピトープの一部として同定された他のアミノ酸（１４０、１５９、１９４および２１８）(Kaverin et al.、2007)も、それに続く分析に関して考慮に入れた。本明細書で示すように、Ｈ５Ｎ１ウイルスの主な中和エピトープの配列の、インフルエンザ研究データベースとの比較は、全てのヒトおよびトリＨ５Ｎ１ウイルスのヘマグルチニンのエピトープ領域内の変異を明らかにした。下記の表２を参照。
【００２５】
[0031]  本明細書で記述されるエピトープ分布分析に基づいて、集合的に全てのＨ５Ｎ１亜型の間の変異を代表するために、３種類の異なる株、Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）（クレード２．１）、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）（クレード１．０）および安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）（クレード２．３）が選択された。その選択されたワクチン株を、異なる中和ｍＡｂとの反応性パターンに関して、ウイルス中和およびＨＩ力価により確認した。下記の表４Ａおよび４Ｂにおいて示すように、ｎ−ｍＡｂ  ４Ｃ２および４Ｆ８はＡ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）株のみを認識し、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）およびＡ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）株とは反応しなかった。この反応性のパターンは、Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）株は１８９位において“Ａｒｇ”を有し、一方でＡ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）およびＡ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）株では同じ位置に“Ｌｙｓ”が存在するため、おそらく１８９位におけるアミノ酸の変化によるものである可能性がある。一方、ｎ−ｍＡｂ  ６Ｂ８はおそらく１８９位における共通の残基“Ｌｙｓ”の存在のためＡ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）およびＡ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）株の両方と反応する。同様に、１５５位のアミノ酸はＨ５Ｎ１株の抗体認識に重大な影響を有することも分かっている。さらに、下記の表２において示すように、１５０のループは２種類の変異型を有し、ヒトＨ５Ｎ１分離株の６３．４％はこの位置においてアミノ酸“Ｓｅｒ”を有し、残りの３４．４％はアミノ酸“Ａｓｎ”を有する。また、ＨＡの受容体結合部位に位置する１８９位におけるアミノ酸は、全てのＨ５Ｎ１のヒトの株の６４．２６％においてアミノ酸“Ａｒｇ”を含有し、一方で残りの３４．６５％はこの位置においてアミノ酸“Ｌｙｓ”を有する。従って、本発明に従って選択されたワクチン株はヒトおよびトリ両方のウイルスが含まれる全てのＨ５Ｎ１系列のほとんど９９％の主な抗原性エピトープ内の変異を代表するはずであると推測するのは理にかなっている。
【００２６】
[0032]  選択した株のＨＡタンパク質をそれぞれバキュロウイルスの表面上で発現させ、そのワクチン配合物をマウスモデルにおいて評価した。昆虫および哺乳類細胞におけるインフルエンザＨ５ヘマグルチニンの高レベル発現を促進するため、ＷＳＳＶの最初期プロモーター１（ｉｅ１）を有する組み換えバキュロウイルスを構築した。ｉｅ１の最初期プロモーターとしての性質は、そのバキュロウイルスのライフサイクルの初期相におけるそのタンパク質の発現を支持し、結果としてそのバキュロウイルスのエンベロープ上の機能するヘマグルチニンの増進された提示をもたらす。そのタンパク質を獲得するためのバキュロウイルスに関する必要条件として、そのＨＡタンパク質の宿主細胞膜への効率的な輸送のためにオリゴマー化が必要であるため(Copeland et al., 1986)、そのバキュロウイルスの表面上に示されたＨＡはそれらのオリゴマーの形で提示されていたはずであると推定される。従って、このモデルはそのタンパク質の天然の構造を真似るのを助け、そうして野生型インフルエンザウイルスを模倣するであろう。そのバキュロウイルスの表面上に示されたＨＡは、血球凝集活性およびＨＡ０のＨＡ１およびＨＡ２への信頼のおける切断により証明されるように、その天然の構造を保持していた（データは示していない）。バキュロウイルスで発現させたインフルエンザのヘマグルチニン（ＨＡ）は一般に昆虫細胞では切断されないが、その切断部位に多数の塩基性アミノ酸を有する高病原性トリインフルエンザウイルス（例えばＨ５およびＨ７）はトリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼの非存在下でＨＡ１およびＨＡ２サブユニットに切断されることが示されている(Kuroda et al., 1986)。本試験におけるＨＡ０の部分的な切断は、おそらく昆虫細胞におけるサブチリシン様プロタンパク質コンバターゼ類（ＰＣ）の存在によるものである可能性があり(Cieplik et al., 1998)、それの基質特異性および阻害因子プロフィールは哺乳類のＰＣ類と同じである。
【００２７】
[0033]  本明細書で示すように、Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）またはＡ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）からのＨＡを示すそれぞれのバキュロウイルスの抗原性補強した（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）混合物（Ｔｒｉ−ＢａｃＨＡ）の皮下免疫は、それの抗原性補強していない対応物と比較した場合に、血清ＨＩ力価を有意に高める。さらに、抗原性補強したＴｒｉ−ＢａｃＨＡをワクチン接種したマウスのＨＩ力価は、抗原性補強した全ＲＧ−Ｈ５Ｎ１ウイルスまたは抗原性補強したＨ５Ｎ１−Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）のＨＡを示すバキュロウイルス（Ｍｏｎｏ−ＢａｃＨＡ）をワクチン接種したマウスのＨＩ力価（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）に対する）と比較可能であった。加えて、抗原性補強したＴｒｉ−ＢａｃＨＡはより高い中和抗体力価を誘導し、それは抗原性補強していないＴｒｉ−ＢａｃＨＡと比較して様々なクレード（クレード１．０、クレード２．１、クレード２．２、クレード４．０、クレード７．０およびクレード８．０）からの異種のＨ５Ｎ１株の１００  ＴＣＩＤ５０を効率的に中和した。抗原性補強したＭｏｎｏ−ＢａｃＨＡまたは不活化ＲＧ−Ｈ５Ｎ１ワクチンのみを含有するワクチン配合物は、クレード１（同種）、クレード２．１およびクレード８．０を中和することができたが、他のクレード（クレード２．２、クレード４．０およびクレード７．０）からのＨ５Ｎ１ウイルスを効率的に中和しなかった。抗原性補強したＴｒｉ−ＢａｃＨＡワクチン配合物の強いクレードをまたぐ免疫は、Ｈ５Ｎ１系列の中和エピトープ内の変異をカバーしていることによるものである可能性がある。
【００２８】
[0034]  そのワクチンの保護的有効性を、ワクチン接種したマウスにクレード１、クレード２．１およびクレード７からのＨ５Ｎ１株を用いて負荷をかけることにより評価した。本明細書で示すように、抗原性補強したＴｒｉ−ＢａｃＨＡまたはＭｏｎｏ−ＢａｃＨＡまたはクレード１．０およびクレード２．１に対する不活化全ウイルスワクチンをワクチン接種したグループに関して１００パーセントの生存率が得られた。加えて、抗原性補強したＴｒｉ−ＢａｃＨＡは何の感染症状もなくクレード７．０  Ｈ５Ｎ１ウイルスに対して１００％の保護を提供した。しかし、抗原性補強した不活化全ウイルスワクチンおよびＭｏｎｏ−ＢａｃＨＡは、クレード７．０  Ｈ５Ｎ１の感染に対してそれぞれ６６．６  ％および８３．３％の保護しか提供しなかった。また、感染の進行はその異なるグループにおける体重の減少の異なる傾向により示された。抗原性補強したＭｏｎｏ−ＢａｃＨＡまたは抗原性補強した全ウイルスワクチンをワクチン接種したマウスは、クレード７．０に対して６日目において１７％までのより高い体重の減少を示した。これは、単価ワクチンは多様なＨ５Ｎ１亜型に対する保護を与えることができないことを示しており、それは異なるウイルス亜型の抗原決定基（例えば中和エピトープ）内の変異によるものである可能性がある。
【００２９】
[0035]  要約すると、３種類の選択されたワクチン株からのヘマグルチニンを示すバキュロウイルスによるマウスの皮下免疫は全身的な免疫応答を誘導し、何の臨床症状もなしにＨ５Ｎ１ウイルス感染に対する交差保護を示した。また、本発見は、亜型間の中和エピトープ内の変異に基づくワクチン株の選択は新しく生じたＨ５Ｎ１変異体により仲介される感染を防ぐのを助けるであろうことを明らかにした。この試験において用いられたワクチン配合物は、何の生物安全性の懸念もなしに迅速に生成された。ＨＡを示すバキュロウイルスは、世界的流行および世界的流行前の状況におけるワクチンに関する理想的な選択肢として役立ち、高度な生物封じ込め（ｂｉｏｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）施設または退屈なタンパク質精製プロセスを必要としないワクチン技術を促進するであろう。
【００３０】
[0036]  本明細書で用いられる際、用語“処置する”および“処置”は、形はどうであれ病気もしくは症状を治療する、病気もしくは疾患の確立を予防する、またはそうでなければ病気もしくは疾患もしくは他の望ましくない症状の進行を防ぐ、妨げる、遅くする、改善する、もしくは逆転させる、あらゆるおよび全ての使用を指す。
【００３１】
[0037]  本明細書で用いられる際、用語“有効量”または“予防的に有効な量”には、その意味の範囲内に、非毒性であるが十分な量のその望まれる作用を提供するための薬剤または化合物が含まれる。例えば、免疫応答の調節に関する予防的に有効な量は、その対象においてその免疫応答を調節する望まれる作用を提供するその薬剤または化合物の量である。同様に、トリインフルエンザウイルスと関係する疾患の処置または予防に関する予防的に有効な量は、その対象においてその疾患を処置または予防する望まれる作用を提供するその薬剤または化合物の量である。必要とされる正確な量は、処置される種、その対象の年齢および全身状態、処置される病気の重篤さ、投与される個々の薬剤、ならびに投与の方式等のような要因に依存して対象ごとに異なるであろう。従って、正確な“有効量”を具体的に述べるのは不可能である。しかし、あらゆる所与の場合に関して、当業者は適切な“有効量”を型にはまった実験法のみを用いて決定することができる。
【００３２】
[0038]  本明細書で用いられる際、用語“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”は、アミノ酸残基のポリマーを、およびその断片、変種、類似体、オルソログまたは相同体を指して互換的に用いられる。従って、これらの用語は、１個以上のアミノ酸残基が合成による天然起源でないアミノ酸、例えば対応する天然起源アミノ酸の化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然起源アミノ酸ポリマーの両方に適用される。
【００３３】
[0039]  本明細書で用いられる際、用語“ポリヌクレオチド”または“核酸”は互換的に用いられ、１個以上のヌクレオチドを含む分子、またはオリゴヌクレオチド、またはその断片を意味し、それにはＲＮＡもしくはＤＮＡヌクレオチドまたはそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。
【００３４】
[0040]  本明細書で用いられる際、語句“Ｈ５Ｎ１亜型トリインフルエンザウイルスと関係する疾患”は、Ｈ５Ｎ１亜型トリインフルエンザウイルスにより引き起こされる、またはＨ５Ｎ１亜型トリインフルエンザウイルスと関係するあらゆる疾患、疾患状態または障害を意味する。
【００３５】
[0041]  本明細書で用いられる際、用語“調節する”は、免疫応答に関連して用いられる場合、抗原に対する免疫応答を直接的にまたは間接的にのどちらかで増大または減少させることを意味する。ワクチンは典型的には抗原に対する免疫応答を増大させる。
【００３６】
[0042]  従って、第１観点において、本発明は対象における疾患の処置または予防のための汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンを提供し、ここでその疾患はトリインフルエンザウイルスのＨ５Ｎ１亜型と関係している。１態様において、その汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンは予防的に有効な量の第１免疫原性薬剤、予防的に有効な量の第２免疫原性薬剤および予防的に有効な量の第３免疫原性薬剤を含む。別の態様において、その対象はヒト、飼いならされた動物（イヌ、ネコ、サル等）；家畜（ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等）、野鳥（野生のガン、野生のカモ等）および飼いならされたトリ（ニワトリ、アヒル、ガチョウ等）であってよい。
【００３７】
[0043]  １態様において、それぞれの免疫原性薬剤はヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分またはヘマグルチニンもしくはそれの抗原性部分をコードする核酸を含む。本明細書で用いられる際、ヘマグルチニンの抗原性部分はその中和エピトープが含まれるヘマグルチニンの部分を指す。追加の態様において、その抗原性部分にはヘマグルチニンのエピトープが含まれる。さらなる態様において、免疫原性薬剤はヘマグルチニンを含むウイルスである。別の態様において、そのウイルスは不活化されている。追加の態様において、そのウイルスは弱毒化ウイルスである。別の態様において、そのウイルスはビロソームの形である。さらなる態様において、そのウイルスは卵由来または細胞培養由来である。別の態様において、免疫原性薬剤はヘマグルチニンを含むスプリットウイルスまたはスプリットウイルス抗原性製剤である。１態様において、その免疫原性薬剤はヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分である。別の態様において、そのヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分は単離されたものである。追加の態様において、そのヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分は、ウイルス発現ベクターによりそれがそのウイルスの表面上に提示される、または示されるように生成される。１態様において、そのウイルス発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターであり、そのヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分を提示する、または示すウイルスはバキュロウイルスである。別の態様において、そのウイルス発現ベクター、例えば改変ワクシニアウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、ポックスウイルス発現ベクター、および同様のもの。１態様において、その免疫原性薬剤は対象において発現することができるヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分をコードする核酸である。
【００３８】
[0044]  １態様において、その免疫原性薬剤は同じ種類のものであってよく、例えばそれらは全て不活化ウイルスまたはそのヘマグルチニンもしくはそれの抗原性部分を提示する、もしくは示すバキュロウイルスであってよい。別の態様において、その免疫原性薬剤は異なる種類のものであってよく、例えばその第１免疫原性物質は不活化ウイルスであってよく、その第２免疫原性薬剤はヘマグルチニンまたはそれの抗原性部分を提示する、または示すバキュロウイルスであってよく、その第３免疫原性薬剤はこれらの２つの種類の内の１つと同じ種類または異なる種類であってよい。
【００３９】
[0045]  本発明に従って汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンが調製され、ここでその第１免疫原性薬剤はウイルス株Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）のヘマグルチニンまたはその抗原性ペプチドを含み、その第２免疫原性薬剤はウイルス株Ａ／ベトナム１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）のヘマグルチニンまたはその抗原性ペプチドを含み、その第３免疫原性薬剤はウイルス株Ａ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）のヘマグルチニンまたはその抗原性ペプチドを含む。本明細書で記述される場合、それぞれの免疫原性薬剤は、その明記されたウイルスのヘマグルチニンまたはその抗原性ペプチドを含む、またはコードするウイルス、タンパク質、ペプチド、核酸または同様のものであってよい。
【００４０】
[0046]  その免疫原性薬剤は、中性または塩の形として組成物中に配合されてよい。医薬的に許容できる塩類には酸付加塩類（そのペプチドの遊離アミノ基により形成される）が含まれ、それは例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、および同様のもののような有機酸を用いて形成される。その遊離カルボキシル基により形成される塩類は、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または第２鉄のような無機塩基（ｂａｓｉｓ）、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、および同様のもののような有機塩基（ｂａｓｉｓ）に由来してもよい。
【００４１】
[0047]  一般に、適切な組成物は当業者に既知の方法に従って調製されてよく、医薬的に許容できる希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤が含まれてよい。その希釈剤、アジュバントおよび賦形剤は、その組成物の他の成分と適合可能であり、その受容者に有害でない点で“許容でき”なければならない。
【００４２】
[0048]  医薬的に許容できる希釈剤の例は、脱塩水または蒸留水；生理食塩水溶液；植物に基づく油、例えばピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、例えばピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油またはヤシ油；ポリシロキサン類、例えばメチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサンおよびメチルフェニルポリシロキサンが含まれるシリコン油；揮発性シリコン類；鉱油、例えば流動パラフィン、ソフトパラフィンまたはスクアラン；セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース；低級アルカノール類、例えばエタノールまたはイソプロパノール；低級アラルカノール類（ａｒａｌｋａｎｏｌｓ）；低級ポリアルキレングリコール類または低級アルキレングリコール類、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールまたはグリセリン；脂肪酸エステル類、例えばイソプロピルパルミテート、イソプロピルミリステートまたはエチルオレエート；ポリビニルピロリドン；寒天；カラギーナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）；トラガカントガム（ｇｕｍ  ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）またはアカシアガム、およびワセリン（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  ｊｅｌｌｙ）である。典型的には、そのキャリヤー（単数または複数）はその組成物の１重量％から９９．９重量％までを形成するであろう。最も好ましくはその希釈剤は生理食塩水である。
【００４３】
[0049]  注射可能な溶液または懸濁液としての投与に関して、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤またはキャリヤーには、リンガー溶液、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）、等張生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノールおよび１，２  プロピレングリコールが含まれることができる。経口使用のための適切なキャリヤー、希釈剤、賦形剤およびアジュバントのいつくかの例には、ピーナッツ油、流動パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アカシアガム、トラガカントガム、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチンおよびレシチンが含まれる。加えて、これらの経口配合物は適切な香味剤および着色剤を含有していてよい。カプセルの形で用いられる場合、そのカプセルは崩壊を遅らせるグリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートのような化合物でコートされていてよい。
【００４４】
[0050]  アジュバントには典型的には皮膚軟化薬、乳化剤、増粘剤、保存剤、殺菌剤および緩衝剤が含まれる。その組成物の調製において有用なアジュバントまたは免疫賦活性構成要素には、アルミニウム塩類、鉱油、ミコバクテリア製品（例えば完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバント）またはビヒクル、例えば植物配糖体サポニン、コレステロールおよびホスファチジルコリンの混合物が含まれるが、それらに限定されず、それは数コピーのそのタンパク質をかごのような構造上に提示するためのビヒクルを提供する。この明細書の目的に関して、アジュバントは免疫原または抗原に対する免疫応答を強調する、増大させる、加減する、または増進する物質である。アジュバントは典型的には体液性および細胞性免疫応答の両方を増進するが、他方なしでのどちらかへの増大された応答はアジュバントと定義される資格がある。さらに、アジュバントおよびそれらの使用は免疫学者には周知であり、典型的には免疫原の用量が限られている場合、その免疫原の免疫原性が乏しい場合、またはその投与経路が最適以下である場合にその免疫応答を増進するために用いられる。従って、用語“抗原性補強量（ａｄｊｕｖａｔｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ）”は、所与の免疫原または抗原に対する免疫応答を増進することができるアジュバントの量である。“抗原性補強量”と等しい量は様々であると考えられ、その免疫原の特性、投与される免疫原の量、受容者の種、投与経路、およびその免疫原を投与するためのプロトコルが含まれるがそれらに限定されない様々な要因に依存する。その“抗原性補強量”は、特定の状況のセットが与えられれば、型にはまった実験法により容易に定量化することができる。これは十分に当業者の理解の範囲内であり、典型的には様々な量の投与される免疫原およびアジュバントに対する型にはまった用量応答決定の使用が用いられる。応答は、その免疫原に対して生じた血清抗体力価または細胞に仲介される応答を酵素結合免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ）測定法、放射性免疫測定法、血球凝集アッセイおよび同様のものを用いて決定することにより測定される。
【００４５】
[0051]  経口投与のための固体の形は、ヒトおよび獣医学の医薬的実施において許容できる結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈剤、香味料、コーティング剤、保存剤、潤滑剤および／または時間遅延剤（ｔｉｍｅ  ｄｅｌａｙ  ａｇｅｎｔｓ）を含有していてよい。適切な結合剤には、アカシアガム、ゼラチン、トウモロコシデンプン、トラガカントガム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースまたはポリエチレングリコールが含まれる。適切な甘味料には、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテームまたはサッカリンが含まれる。適切な崩壊剤には、トウモロコシデンプン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸または寒天が含まれる。適切な希釈剤には、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウムまたはリン酸二カルシウムが含まれる。適切な香味剤には、ペパーミント油、ウィンターグリーンの油、サクランボ、オレンジまたはラズベリー香味料が含まれる。適切なコーティング剤には、アクリル酸および／またはメタクリル酸および／またはそれらのエステル類のポリマーまたはコポリマー、ろう剤、脂肪アルコール類、ゼイン、シェラックまたはグルテンが含まれる。適切な保存剤には、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ５  アルファ−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは重亜硫酸ナトリウムが含まれる。適切な潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルクが含まれる。
【００４６】
[0052]  経口投与のための液体の形は、上記の薬剤に加えて、液体キャリヤーを含有していてよい。適切な液体キャリヤーには、水、油、例えばオリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、サフラワー油、落花生油、ヤシ油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール類、トリグリセリド類またはそれらの混合物が含まれる。
【００４７】
[0053]  経口投与のための懸濁液は、さらに分散剤および／または懸濁化剤を含んでいてよい。適切な懸濁化剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウムまたはアセチルアルコールが含まれる。適切な分散剤には、レシチン、脂肪酸、例えばステアリン酸のポリオキシエチレンエステル類、ポリオキシエチレンソルビトール  モノ−またはジ−オレエート、−ステアレートまたは−ラウレート、ポリオキシエチレンソルビタン  モノ−またはジ−オレエート、−ステアレートまたは−ラウレート、および同様のものが含まれる。経口投与のためのエマルジョンは、さらに１種類以上の乳化剤を含んでいてよい。適切な乳化剤には、上記で例示したような分散剤または天然ガム類、例えばグアーガム、アカシアガムまたはトラガカントガムが含まれる。
【００４８】
[0054]  非経口的に投与可能な組成物を調製するための方法は当業者には明らかであり、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 第２１版, Ed. D.B. Troy, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, 2006においてより詳細に記述されており、それを本明細書に援用する。
【００４９】
[0055]  その組成物はあらゆる適切な界面活性剤、例えば陰イオン性、陽イオン性または非イオン性界面活性剤、例えばソルビタンエステル類またはそのポリオキシエチレン誘導体を組み込んでよい。懸濁化剤、例えば天然ガム類、セルロース誘導体または無機材料、例えばシリカ性（ｓｉｌｉｃａｃｅｏｕｓ）シリカ類、および他の成分、例えばラノリンも含まれてよい。
【００５０】
[0056]  その組成物の調製は、当業者に既知の型にはまった方法を用いる。典型的には、そのような組成物は液体溶液または懸濁液のどちらかとして注射可能なものとして調製され；注射前の液体中での溶解、または懸濁に適した固体の形が調製されてもよい。その製剤は乳化されていてもよい。その有効免疫原性成分はしばしば、医薬的に許容でき、その有効成分と適合可能である賦形剤と混合される。
【００５１】
[0057]  第２観点において、本発明は、対象に予防的に有効な量の汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンを投与することを含む、トリインフルエンザウイルスに対する免疫応答を調節するための方法を提供する。その汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンは上記で記述した通りのものである。その汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンは単一の組成物として投与されるのが好ましいが、そのワクチンの個々の構成要素を別々に、しかし同時にその対象に投与することができるであろうことも意図されている。
【００５２】
[0058]  本発明の方法に従って、ワクチンおよび組成物はあらゆる適切な経路により、全身的に、局部的にまたは局所的にのいずれかで投与されてよい。あらゆる所与の状況において用いられるべき個々の投与経路は、処置される予定の疾患の性質、その疾患の重篤さおよび程度、送達される予定の個々の化合物の必要とされる投与量、ならびにその望まれるワクチンまたは組成物の可能性のある副作用が含まれるいくつかの要因に依存するであろう。
【００５３】
[0059]  例えば、適切な濃度のその望まれるワクチンまたは組成物がその処置される予定の部位に直接送達されることが必要とされる状況では、投与は全身的ではなく局部的であってよい。局部的投与は、非常に高い局所濃度のその望まれるワクチンまたは組成物をその必要とされる部位に送達する能力を提供し、従って望まれる療法的または予防的作用を達成する一方でその体の他の器官がそのワクチンまたは組成物に曝露されるのを避け、それにより潜在的に副作用を低減するのに適している。例として、本発明の態様に従う投与は、腔内、膀胱内、筋内、動脈内、静脈内、皮下、局所または経口が含まれるあらゆる標準的な経路により達成することができる。腔内投与は腹腔内または胸腔内であってよい。
【００５４】
[0060]  望まれるならば、持続放出または断続放出に適したその免疫原性薬剤を含有する装置または組成物を、そのような物質の体の中への比較的遅い放出のために、事実上体の中に移植する、またはそれに局所的に適用することができるであろう。
【００５５】
[0061]  発現ベクターまたは宿主細胞の投与には、直接経口摂取、全身性の注入による送達、もしくは選択された組織（単数または複数）もしくは細胞への送達が含まれてよく、または対象もしくは適合性の提供者から分離された細胞への送達により間接的に投与されてよい。核酸に基づく組成物に関して、そのような組成物の全ての送達の方式が本発明により意図されている。
【００５６】
[0062]  その組成物はリポソームの形で投与されてもよい。リポソームは一般にリン脂質または他の脂質物質に由来し、水性媒体中に分散した単または多層状水和液体結晶により形成される。リポソームを形成することができる、あらゆる非毒性の生理的に許容でき、代謝可能な脂質を用いることができる。リポソームの形の中の組成物は、安定剤、保存剤、賦形剤および同様のものを含有していてよい。好ましい脂質は、天然および合成両方のリン脂質およびホスファチジルコリン類（レシチン類）である。リポソームを形成するための方法は当技術において周知である。
【００５７】
[0063]  あらゆる個々の対象に関する投与される化合物の有効な投与レベルは、以下：処置される疾患のタイプおよびその疾患の段階；用いられる化合物の活性；用いられる組成物；その対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；投与の時間；投与経路；化合物の隔離の程度；その処置の期間；その処置と組み合わせて、または同時に用いられる薬物が含まれる様々な要因に、当技術で周知の他の関連する要因と共に、依存するであろう。
【００５８】
[0064]  第３観点において、本発明は、対象に予防的に有効な量の汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンを投与することを含む、トリインフルエンザウイルスと関係する疾患の予防または処置のための方法を提供する。その汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンは、上記で記述した通りのものである。適切な組成物、投与および投与量は、上記で記述した通りである。
【００５９】
[0065]  第４観点において、本発明は、トリインフルエンザウイルスに対する免疫応答を調節するための汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンの使用を提供する。その汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンは、上記で記述した通りのものである。
【００６０】
[0066]  第５観点において、本発明は、トリインフルエンザウイルスと関係する疾患の処置のための汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンの使用を提供する。その汎用Ｈ５Ｎ１ワクチンは、上記で記述した通りのものである。
【００６１】
[0067]  ワクチンを調製および投与するための方法は当技術で周知であり、米国特許第７，５１０，７１９号、第７，５３７，７６８号、第７，６６６，４３９号および第７，６９１，３６８号；米国特許出願公開第２００８／０１８７５５７号、第２００９／０１３６５３２号、第２００９／０２６３４２２号、第２００９／０３０４７３０号、第２０１０／００４７２７１号、第２０１０／００７４９１６号および第２０１０／００８６４８５号；ならびに国際出願公開第ＷＯ  ２００７／１２９９８４号、第ＷＯ  ２００８／０４８９８４号、第ＷＯ  ２００８／１１５３１４号、第ＷＯ  ２００９／０６９４４７号、第ＷＯ  ２００９／１１５９１７号、第ＷＯ  ２０１０／０２１２８９号および第ＷＯ  ２０１０／０３６９４８号により例示されており、それぞれ本明細書に援用する。
【００６２】
[0068]  本発明の実施は、別途示さない限り、化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来の技法を用い、それは当業者の技術の範囲内である。例えば、Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 第２版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー); Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, 第３版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー); Ausubel et al., 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 周期的更新を含む); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, オックスフォード); Russell, 1984, Molecular biology of plants: a laboratory course manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, ニューヨーク, 1992); Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, ニューヨーク, 1991); Harlow and Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., ニューヨーク); Methods In Enzymology, Vols. 154および155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, ロンドン, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 第６版, Blackwell Scientific Publications, オックスフォード, 1988; Fire et al., RNA Interference Technology: From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press, ケンブリッジ, 2005; Schepers, RNA Interference in Practice, Wiley-VCH, 2005; Engelke, RNA Interference (RNAi): The Nuts & Bolts of siRNA Technology, DNA Press, 2003; Gott, RNA Interference, Editing, and Modification: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Human Press, ニュージャージー州トトワ, 2004; Sohail, Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application, CRC, 2004を参照。
【実施例】
【００６３】
[0069]  本発明は以下の実施例への参照により記述され、それは説明として提供されており、決して本発明を限定することを意図していない。当技術で周知の標準的な技法または下記で具体的に記述される技法を利用した。
【００６４】
実施例１
材料および方法
[0070]  ウイルス：クレード２．１  Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６、Ａ／インドネシア／ＴＬＬ０１３／２００６からのＨ５Ｎ１ヒトインフルエンザウイルスおよび１種類のトリの株Ａ／インドネシア／ＴＬＬ０１４／２００６は、インドネシア共和国の保健省（ＭＯＨ）から得た。トリＨ５Ｎ２亜型はシンガポールの農産物・家畜庁（Ａｇｒｉ−Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）から得た。異なる系統的クレード／サブクレードからのＨ５Ｎ１ウイルス（表１）は、逆遺伝学によりレスキューされた［ＷＨＯ，２００４］。簡潔には、クレード１、２．１、２．２、２．３、４、７および８からのＨ５Ｎ１ウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を、ＮＣＢＩインフルエンザデータベースからの配列に基づいて合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，米国）。その合成ＨＡおよびＮＡ遺伝子をインフルエンザＡ逆遺伝学のための二重プロモータープラスミド(Prabakaran et al., 2009)の中にクローニングした。その二重プロモータープラスミドは、疾病管理予防センター（米国ジョージア州アトランタ）から得た。合併結合変異ウイルス（Ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ  ｖｉｒｕｓｅｓ）を、ＨＡおよびＮＡを含有するプラスミドを高増殖マスター株（ｍａｓｔｅｒ  ｓｔｒａｉｎ）Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）由来の残りの６個のインフルエンザ遺伝子と共に共培養された２９３ＴおよびＭＤＣＫ細胞中にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いて形質移入することによりレスキューした。形質移入の７２時間後に、その培地を発育卵またはＭＤＣＫ細胞中に接種した。第２継代からの合併結合変異ウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子を配列決定し、導入したＨＡおよびＮＡ遺伝子が存在することおよび変異が存在しないことを確認した。ストックウイルスを１１日齢の発育卵の尿膜腔中で増殖させ、ウイルスを含有する尿膜腔液を回収し、分割量（ａｌｉｑｕｏｔｓ）で−８０℃において保管した。ウイルス含有量を標準的な血球凝集（ＨＡ）アッセイにより決定した。高病原性ウイルスを用いた全ての実験は、生物安全性レベル３（ＢＳＬ−３）封じ込め施設においてＣＤＣ／ＮＩＨおよびＷＨＯの推奨に従って実施された。
【００６５】
【表１】
2013525428.tif 000003
【００６６】
[0071]  中和モノクローナル抗体（ｎ−ｍＡｂ）：回避変異体の特性付けのために、Ｈ５Ｎ１ウイルスのＨＡに対する５種類の異なる中和ｍＡｂの集団を選択した。簡潔には、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、アジュバント（ＳＥＰＰＩＣ，フランス）と混合した精製したホルマリン不活化Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６またはＡ／インドネシア／ＴＬＬ０１４／２００６またはＡ／ニワトリ／シンガポール／９８  Ｈ５Ｎ２抗原により、２週間間を置いて２回皮下注射により免疫した。マウスは脾臓細胞のＳＰ２／０細胞との融合の３日前に同じウイルス抗原の追加の静脈注射を受けた(Yokoyama, 2004)。
【００６７】
[0072]  ｎ−ｍＡｂを用いることによるＨ５ＨＡ中和エピトープの位置付け：Ｈ５の主な中和エピトープを、回避変異体の５種類の異なる中和モノクローナル抗体（６Ｂ８、４Ｃ２、２Ｄ９、４Ｆ８および３Ｈ１１）による特性付け(Kaverin et al., 2007)により位置付けた。簡潔には、Ｈ５Ｎ１ウイルスを過剰量のｎ−ｍＡｂと共に１時間保温し、その混合物を１１日齢の発育鶏卵中に接種した。その卵を３７℃で４８時間保温した。ウイルスを回収し、発育鶏卵における限界希釈でのクローニングに用いて、回避変異体をプラーク精製した（ｐｌａｑｕｅ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ）。次いでＨＡ遺伝子中の変異を、配列決定して親ウイルスのその配列と比較することにより同定した。
【００６８】
[0073]  エピトープ分布分析：Ｋａｖｅｒｉｎら（２００７）により同定されたＨ５ＨＡの中和エピトープを、この研究において同定された主なエピトープと共に、配列分析に関して考慮に入れた。そのＨ５Ｎ１ウイルスの間のその中和エピトープの分布を分析するため、完全長ＨＡ配列をＮＣＢＩインフルエンザデータベースからのトリおよびヒトＨ５Ｎ１ウイルスと比較した。Ｈ５Ｎ１のタンパク質多型をインフルエンザ研究データベース(Fludb.org)を用いて分析し、３１７種類に及ぶヒトの株および２０２８種類に及ぶトリの株をこの研究において配列比較した。そのエピトープにおける変異を評価するため、それぞれのＨ５Ｎ１ウイルスに関する多数の配列比較から位置的頻度の表を生成した。
【００６９】
[0074]  ワクチン株の選択：ほとんどのＨ５Ｎ１系列の間のＨＡの中和エピトープ内の変異をカバーするため、３種類の異なるＨ５Ｎ１株を選択した。さらに、その選択されたワクチン株の反応性を、適切な中和モノクローナル抗体を用いる血球凝集阻止アッセイおよびマイクロ中和アッセイにより確証した。
【００７０】
[0075]  組み換えバキュロウイルスの生成：組み換えバキュロウイルスベクターの生成のため、前に記述したように、ＷＳＳＶ  ｉｅ１プロモーターで制御されるＨＡ発現カセットをシャトルベクターｐＦａｓｔＢａｃ１の中に挿入し、Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコルに従ってＤＨ１０ＢＡＣ（商標）内のバキュロウイルスゲノムの中に組み込んだ。簡潔には、その完全長ＨＡ遺伝子を３種類の異なるインフルエンザ株から標準的なＰＣＲ法（９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で２分間、を３０サイクル）で増幅した。Ｈ５ＨＡ配列を、プライマーＨ５ＦＳａｌ  ５’  ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣ  ＴＴＣＴ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＨ５ＲＮｏｔ  ５’  ＡＴＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＡ  ＴＴＧ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を用いて以下のＨ５Ｎ１ウイルスから増幅した：Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＣＹ０１４４８１およびＡＢＩ３６４２８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ヌクレオチド配列）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（アミノ酸配列）；Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＥＵ１２２４０４およびＡＢＷ９０１３５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ヌクレオチド配列）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（アミノ酸配列）；ならびにＡ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＤＱ３７１９２８およびＡＢＤ２８１８０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ヌクレオチド配列）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８（アミノ酸配列）。ＷＳＳＶ  ｉｅ１プロモーターをベクターの中にＳｎａｂＩおよびＳａｌＩ部位を用いて挿入し、ＨＡ遺伝子をｐＦａｓｔＢａｃ１ベクターの中にＮｏｔＩ−ＳａｌＩ部位を用いて挿入した。トランスファーベクターのＤＨ１０ＢＡＣ中への形質転換の後、組み換えバクミドをＳｆ９細胞の中に形質移入し、発芽し培地中に放出されたバキュロウイルス粒子を形質移入後の４日目に回収した。
【００７１】
[0076]  ワクチン試験：特定病原体除去（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）をシンガポール国立大学の実験動物センターから得て、テマセク生命科学研究所の動物維持設備（Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）において維持した。それぞれの実験グループあたり２４匹のマウス（ｎ＝２４／グループ）に、１００μｌのＨ５Ｎ１−Ａ／ベトナム／１２０３／２００４のＨＡを示すバキュロウイルスを（Ｍｏｎｏ−ＢａｃＨＡ）、またはＡ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６−Ｈ５Ｎ１、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４−Ｈ５Ｎ１、Ａ／安徽／１／２００５−Ｈ５Ｎ１からのＨＡを示すそれぞれのバキュロウイルスの混合物として（Ｔｒｉ−ＢａｃＨＡ）、アジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５６３（油中水エマルジョン）（ＳＥＰＰＩＣ，フランス）と共に、またはアジュバントなしで、２８日間の通常の間隔で２回皮下にワクチン接種した。また、不活化ＲＧ−Ｈ５Ｎ１ウイルス（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４−Ｈ５Ｎ１）を参照ワクチン対照として用いた。１４、２８日目および４２日目に実験グループあたり１０匹のマウスから血清を集めた。血球凝集阻止アッセイおよび間接ＥＬＩＳＡを実施してＨＡ特異的抗体応答を評価した（ａｓｓｅｓ）。加えて、血清のクレードをまたぐ中和能力をマイクロ中和アッセイにより測定した。そのワクチンの有効性を、異なるクレードからのＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１インフルエンザ株に対する宿主負荷により評価した。全ての動物実験は、国立感染症研究所（ＮＩＩＤ）の動物実験に関する指針に従って実施され、実験プロトコルはテマセク生命科学研究所（シンガポール国立大学、シンガポール）の施設動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により精査され、承認された。
【００７２】
[0077]  血球凝集阻止アッセイ：血球凝集阻止アッセイを以前に記述されたように(Webster et al., 1991)実施した。受容体破壊酵素（ＲＤＥ）で処理した血清を、Ｖ底９６ウェルプレートにおいて系列希釈（２倍）した。おおよそ４ＨＡ単位のウイルス抗原を血清と共に室温で３０分間保温し、続いて１％ニワトリ赤血球（ＲＢＣ）を添加し、室温で４０分間保温した。
【００７３】
[0078]  マイクロ中和アッセイ：以前に記述されたプロトコル(Suguitan et al., 2006)に従ってマイクロ中和試験を実施した。簡潔には、ＭＤＣＫ細胞を９６ウェル培養プレートにまき、３７℃で培養して単層を形成させた。熱非働化（５６℃で４５分間）血清試料の系列２倍希釈物を１００  ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の異なるクレードからのＨ５Ｎ１ウイルスと別々に混合し、室温で１時間保温し、その混合物をＭＤＣＫ細胞の単層に３通り（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）のウェルで添加した。あらゆる細胞変性作用を完全に防いだマウス抗血清の中和力価を、希釈度の逆数（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ）で計算した。
【００７４】
[0079]  Ｈ５Ｎ１ウイルス感染に対する疾患負荷試験：最後のワクチン接種の３週間後、マウスを動物ＢＳＬ３封じ込め施設に移した。グループあたり６匹のマウスを、５ＭＬＤ５０（マウス致死用量５０％）の同種（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）クレード１．０）ならびに異種のクレード２．１（Ａ／インドネシア／ＴＬＬ１３／２００６（Ｈ５Ｎ１））およびクレード７．０（Ａ／ニワトリ／陜西／２／０６）ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１株で鼻腔内に負荷をかけた。鼻腔内負荷実験に必要なインフルエンザウイルスの５０パーセントマウス致死用量（ＭＬＤ５０）は前もって決定された。マウスを毎日観察して体重および死亡率を監視した。監視は全ての動物が死ぬまで、または負荷後１４日目まで続けられた。組織病理学のため、マウスを死体解剖し、肺を１０％（重量／体積）中性緩衝ホルマリン中で保管し、パラフィン中に包埋し、薄切した。切片をヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ／Ｅ）で染色した後、光学顕微鏡検査を行い、肺の病理に関して評価した。全ての負荷実験は生物安全性レベル３の封じ込め施設で実施された。
【００７５】
実施例２
ｎ−ｍＡｂを用いるＨ５ＨＡの中和エピトープの同定および特性付け
[0080]  インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）に対する５種類の異なる中和ｍＡｂ（６Ｂ８、４Ｃ２、２Ｄ９、４Ｆ８および３Ｈ１１）の集団が以前に我々の研究室で生成された。全てのｎ−ｍＡｂはＨ５の立体構造的エピトープを認識し、インビトロでインフルエンザウイルスの感染を中和する能力を有していた。また、これらのｎ−ｍＡｂは血球凝集阻止活性を有することが確認されている（データは示していない）。そのｎ−ｍＡｂのエピトープの形成に関わっているアミノ酸を、ウイルス回避変異体を用いて分析した。多数の回避変異株から分離された完全なＨＡ遺伝子の配列決定を行い、（ａ）ｎ−ｍＡｂ  ６Ｂ８に対するものはアミノ酸位置１８９（ＬｙｓがＡｓｎに）または１５５（ＡｓｎがＡｓｐに）において単一の点変異を有しており、（ｂ）ｎ−ｍＡｂ  ４Ｆ８に対するものはアミノ酸位置１５５（ＡｓｎがＡｓｐに）において単一の点変異を有しており、そして（ｃ）ｎ−ｍＡｂ  ２Ｄ９に対するものはアミノ酸位置１８９（ＡｒｇがＴｒｐに）または２２３（ＳｅｒがＡｒｇに）において単一の点変異を有していた。ｎ−ｍＡｂ  ４Ｃ２に関する同様の分析は、そのエピトープの形成にアミノ酸１５５（ＳｅｒがＩｌｅに）または１８９（ＡｒｇがＬｙｓに）が関わっていることを明らかにし、一方でｎ−ｍＡｂ  ３Ｈ１１に関する同様の分析はアミノ酸位置１３８“Ｌｅｕ”、１３９“Ｇｌｙ”および１４０“Ｓｅｒ”における単一の点変異を有していた。ここで示した全てのアミノ酸位置は、ＨＡのシグナルペプチドを除いたものである。Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）およびＡ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）に関する成熟ＨＡタンパク質のアミノ酸配列に関して、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１１を参照。
【００７６】
実施例３
エピトープ分布分析
[0081]  トリおよびヒトＨ５Ｎ１ウイルスの完全長ＨＡ配列を、国立バイオテクノロジー情報センターにより維持されているインフルエンザウイルスデータベースから得た。ヒトおよびトリＨ５Ｎ１分離株のＨＡ配列を、主な中和エピトープ配列（ＨＡ１領域のアミノ酸位置１３８、１４０、１５５、１８９、１５９、１９４および２１８）と比較した。その結果は、その主な抗原性エピトープ領域のほとんどはヒトおよびトリＨ５Ｎ１系列の間の重要な変異を含有していることを明らかにした（表２）。高度に異なる１４０のループ（１４０  ａａ）の分析は、全てのＨ５Ｎ１ヒト分離株中でこの位置にはアミノ酸“Ｌｙｓ”（２２．５％）および“Ｓｅｒ”（２８．５％）が主に存在し、位置１４０において“Ｔｈｒ”がごくわずかに存在する（６％）ことを示した（表２）。さらに、１５０のループの１５５  ａａは２種類の変異型しか有していなかった（この位置においてヒトＨ５Ｎ１分離株の６３．４％がアミノ酸“Ｓｅｒ”を有し、残りの３４．４％がアミノ酸“Ａｓｎ”を有する）。また、受容体結合部位に位置するインフルエンザヘマグルチニンの１８９位のアミノ酸は、全てのＨ５Ｎ１のヒトの株の６４．２６％においてアミノ酸“Ａｒｇ”を含有し、一方で残りの３４．６５％はこの位置においてアミノ酸“Ｌｙｓ”を有する（表２）。
【００７７】
【表２】
2013525428.tif 000004
【００７８】
実施例４
ワクチン株の選択
[0082]  その中和エピトープ内のアミノ酸配列分析に基づいて、Ｈ５Ｎ１ウイルスの集団（３１７種類のヒトの株および２０２８種類のトリの株）をＨＡの主な中和エピトープ内のアミノ酸変異の頻度に関して分析した。我々は３種類の異なるＨ５Ｎ１株（Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）（クレード２．１）、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）（クレード１．０）およびＡ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）（クレード２．３））を、これらの株の組み合わせがそのＨ５ＨＡの中和エピトープの全ての主なアミノ酸変異をカバーするであろうように選択した（表３）。例えば、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）およびＡ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）株は１５５位において“Ｓｅｒ”を含有しており、一方でＡ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）株は同じ位置に“Ａｓｎ”を有する。さらに、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）およびＡ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）株は１８９位において“Ｌｙｓ”を含有しており、一方でＡ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）株は同じ位置にアミノ酸“Ａｒｇ”を有する（表３）。
【００７９】
【表３】
2013525428.tif 000005
【００８０】
実施例５
ｎ−ｍＡｂによる選択されたワクチン株の差次的認識
[0083]  選択されたワクチン株（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）（クレード１．０）、Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）（クレード２．１）およびＡ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）（クレード２．３））内の変異を、異なるｎ−ｍＡｂによるウイルス中和および血球凝集阻止（ＨＩ）の結果に基づいて確認した。ワクチン株のｎ−ｍＡｂへの曝露は、結果として差次的なｎ−ｍＡｂとの反応性のパターンをもたらした。表４Ａおよび４Ｂにおいて示すように、ｎ−ｍＡｂ  ６Ｂ８はＡ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）およびＡ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）株への優先的な結合を示し、一方で血球凝集阻止およびマイクロ中和アッセイにより示されるようにその同じｎ−ｍＡｂによるＡ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）の中和は存在しない。しかし、ｎ−ｍＡｂ  ４Ｃ２はＡ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）株のみを中和する。認識のパターンにおける類似の違いは他のｎ−ｍＡｂに関しても観察された。これらの発見は、Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）およびＡ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）株の間の強い抗原性の相違の存在も示した（表４ＡおよびＢ）。加えて、ワクチン組成物中にＡ／安徽／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）を含めることは、ワクチン株の１５５位のアミノ酸の変異（Ａｓｎ）をカバーし、それはヒトＨ５Ｎ１分離株の３４％を構成する。
【００８１】
【表４】
2013525428.tif 000006
【００８２】
【表５】
2013525428.tif 000007
【００８３】
実施例６
血清血球凝集阻止（ＨＩ）アッセイ
[0084]  ＨＡ（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１））の機能的能力を阻害するような抗体応答の有効性を測定する血球凝集阻止力価も得た。そのＨＩ力価の結果は、２８および４２日目において、抗原性補強されたＴｒｉ−ＢａｃＨＡで免疫したマウスは抗原性補強されていないＴｒｉ−ＢａｃＨＡと比較した場合に血清ＨＩ力価を有意に高めたことを示した（図１）。
【００８４】
[0085]  さらに、抗原性補強されたＴｒｉ−ＢａｃＨＡをワクチン接種したマウスのＨＩ力価は、抗原性補強されたＲＧ−Ｈ５Ｎ１ウイルスまたは抗原性補強されたＭｏｎｏ−ＢａｃＨＡのどちらかをワクチン接種したマウスのＨＩ力価と比較可能であった（図１）。
【００８５】
実施例７
血清のクレードをまたぐ中和抗体の力価
[0086]  ４２日目における１００  ＴＣＩＤ５０の異なるクレードのＨ５Ｎ１株に対する血清中和抗体力価は、抗原性補強されたＴｒｉ−ＢａｃＨＡによるワクチン接種は抗原性補強されていないＴｒｉ−ＢａｃＨＡをワクチン接種したマウスと比較して異なるクレード（クレード１．０、クレード２．１、クレード２．２、クレード４．０、クレード７．０およびクレード８．０）からのウイルスを有意に中和したことを示した（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００８６】
[0087]  さらに、抗原性補強されたＴｒｉ−ＢａｃＨＡで免疫したマウスは、抗原性補強されたワクチン：ＲＧ−Ｈ５Ｎ１またはＭｏｎｏ−ＢａｃＨＡワクチンをワクチン接種したマウスと比較した場合に、クレード２．２、クレード４およびクレード７に対する中和力価を有意に高めた（図２Ａおよび２Ｂ）。さらに、Ｍｏｎｏ−ＢａｃＨＡまたはＲＧ−Ｈ５Ｎ１を含有するワクチン組成物（両方ともＳｅｐｐｉｃで抗原性補強した）は、クレード１（同種）、クレード２．１およびクレード８．０を中和することができたが、他のクレード（クレード２．２、クレード４．０およびクレード７．０  Ｈ５Ｎ１株）に対する効率的な中和はもたらさなかった。
【００８７】
実施例８
ワクチン接種後の負荷試験
[0088]  最後の免疫処置の３週間後、全てのグループのマウスに５  ＭＬＤ５０のクレード１．０またはクレード２．１またはクレード７．０からのＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１株で鼻腔内に負荷をかけた。抗原性補強したＴｒｉ−ＢａｃＨＡまたはＭｏｎｏ−ＢａｃＨＡまたはＲＧ−Ｈ５Ｎ１で免疫したマウスのグループは、クレード１．０およびクレード２．１に対して１００％の保護を得た（図３および図４）。さらに、抗原性補強したＴｒｉ−ＢａｃＨＡはクレード７．０  Ｈ５Ｎ１感染に対して１００％の保護を提供した。しかし、抗原性補強したＲＧ−Ｈ５Ｎ１ワクチンおよびＭｏｎｏ−ＢａｃＨＡワクチンで免疫したマウスは、クレード７．０  Ｈ５Ｎ１感染に対してそれぞれ６６．６％および８３．３％の保護しかもたらさなかった（図６）。
【００８８】
[0089]  感染の進行は、その異なるグループにおける体重の減少の異なる傾向により示された。Ｈ５Ｎ１クレード７．０（Ａ／ニワトリ／陜西／２／０６（Ｈ５Ｎ１））株で負荷をかけたマウスのグループにおいて、抗原性補強したＴｒｉ−ＢａｃＨＡをワクチン接種したマウスではその負荷の後に体重の有意な減少は観察されなかった（図５）。しかし、Ｍｏｎｏ−ＢａｃＨＡをアジュバントと共にワクチン接種したマウスは体重の１２％までの減少を示したが、その体重は負荷の６日後に徐々に回復している。抗原性補強したＲＧ−Ｈ５Ｎ１ワクチンをワクチン接種したグループは、６日目に１７％までのより高い体重の減少を示し、その後それは負荷後１４日目にゆっくりと回復している（図５）。
【００８９】
[0090]  本発明を記述する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）用語“ａ”および“ａｎ”および“ｔｈｅ”ならびに類似の指示物の使用は、本明細書において別途示さない限り、または文脈により明確に否定されない限り、単数形および複数形の両方を含むものと解釈されるべきである。用語“含む”、“有する”、“含まれる”、および“含有する”は、別途言及しない限り、開放型の用語（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ  ｔｅｒｍｓ）である（すなわち、“含まれるが、それに限定されない”を意味する）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別途示さない限り、単にその範囲内に入るそれぞれの個別の値に個々に言及する省略表現法としての役目を果たすことを意図しており、それぞれの個別の値はあたかもそれが本明細書において個々に列挙されたかのように本明細書中に組み込まれる。例えば、範囲１０〜１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も開示されている。本明細書で記述されている全ての方法は、本明細書において別途示さない限り、またはそうでなければ文脈により明確に否定されない限り、あらゆる適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されたあらゆる、および全ての例、または例示的用語（例えば、“例えば”）の使用は、本発明をよりよく明らかにすることだけを意図しており、別途特許請求しない限り、本発明の範囲を限定しない。本明細書における用語は、いずれかの特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すものと解釈されるべきではない。
【００９０】
[0091]  本発明の方法および組成物は様々な態様の形で組み込むことができ、ごく少数のそれが本明細書において開示されていることは理解されるであろう。この発明の態様は、本発明の実施に関して発明者らに既知の最高の方式を含めて、本明細書において記述されている。上記の記述を読んだ際に、それらの態様の変形が当業者に明らかになる可能性がある。本発明者らは、当業者がそのような変形を必要に応じて用いることを期待しており、本発明者らは本発明が本明細書において具体的に記述した以外のやり方で実施されることを意図している。従って、この発明には、準拠法により許容されるような本明細書に添付された特許請求の範囲において列挙されている主題の全ての修正および均等物が含まれる。さらに、上記で記述した要素のその全ての可能な変形でのあらゆる組み合わせは、本明細書において別途示さない限り、またはそうでなければ文脈により明確に否定されない限り、本発明に含まれる。
【００９１】
参考文献一覧
【００９２】
【化１】
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【００９３】
【化２】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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