(57)【要約】  本発明は、スルホン化光学色素組成物、特にインビトロでの生物学的用途及びインビボイメージングのために適した色素に関する。望ましくない新たに同定された不純物の抑制を可能にする改良色素組成物及び中間体が提供される。また、生物学的ターゲティング分子とのコンジュゲートの製造における改良色素組成物の使用も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式Ｉの第四級化合物及び次の式ＩＩのスルホネートエステルを含んでなる前駆体組成物であって、式ＩＩのスルホネートエステルを３％未満含むことを特徴とする前駆体組成物。
【化１】
2013532220.tif 000021
（式中、
Ａはフェニル環又はナフチル環を完成するために必要な原子を表し、
Ｙ1は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ1−又は−ＣＲ2Ｒ3−であり、
Ｙ2はＲ基であって、式ＩＩ中のすべての位置で同一であり、
各Ｍ1は独立にＨ又はＢc（ここで、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）であり、
Ｒ1はＲ基であり、
Ｒ2及びＲ3は独立にＣ1-3アルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
各Ｒは独立にＣ1-5アルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
ｑは１〜４の値を有する整数であり、
ｘは１〜４の値を有する整数であり、ｙは０〜３の値を有する整数であって、ｘ及びｙは（ｘ＋ｙ）＝ｑとなるように選択される。）
【請求項２】
Ｙ1が−ＣＲ2Ｒ3−である、請求項１記載の前駆体組成物。
【請求項３】
ｑが１又は２である、請求項１又は請求項２記載の前駆体組成物。
【請求項４】
第四級化合物が次の式ＩＡを有し、スルホネートエステルが次の式ＩＩＡを有する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の前駆体組成物。
【化２】
2013532220.tif 000022
（式中、
ｚは１又は２であり、
ｆは０又は１であり、ｇは１又は２であって、（ｆ＋ｇ）＝ｚである。）
【請求項５】
ｚが１である、請求項４記載の前駆体組成物。
【請求項６】
次の式ＩＶの非対称シアニン色素並びに次の式ＶＩ及び式ＶＩＩの対称シアニン色素を含んでなる色素組成物であって、式ＶＩ及び式ＶＩＩの対称色素を合計で８％未満含むことを特徴とする色素組成物。
【化３】
2013532220.tif 000023
（式中、
Ａ1及びＡ2は独立に請求項１乃至請求項５のいずれか１項で定義したＡ基であり、
Ｍ1a及びＭ1bは独立に請求項１で定義したＭ1基であり、
Ｙ1a及びＹ1bは独立に請求項１乃至請求項５のいずれか１項で定義したＹ1基であり、
Ｙ2a及びＹ2bは独立に請求項１乃至請求項５のいずれか１項で定義したＹ2基であり、
ａ及びｂは独立に請求項１又は請求項３で定義したｑ基であり、
Ａ1、Ｙ1a及びＹ2aの少なくとも１つはそれぞれＡ2、Ｙ1b及びＹ2bと異なる。）
【請求項７】
次の式Ｖのアミド及び次の式Ｘのポリエン塩を含んでなる中間体組成物であって、ポリエン塩Ｘを１％未満含むことを特徴とする中間体組成物。
【化４】
2013532220.tif 000024
（式中、Ａ1、Ｍ1a、Ｙ1a及びＹ2aは請求項６で定義した通りである。）
【請求項８】
さらに次の式ＩＩＩの対称シアニン色素を１％未満含む、請求項７記載の中間体組成物。
【化５】
2013532220.tif 000025
（式中、Ａ、Ｍ1、Ｙ1、Ｙ2及びｑは請求項１乃至請求項５のいずれか１項で定義した通りである。）
【請求項９】
請求項６記載の色素組成物の製造方法であって、請求項７又は請求項８記載の中間体組成物を適当な溶媒中で請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の前駆体組成物の１モル当量と反応させることを含んでなり、前記前駆体組成物に関しては第四級化合物が次の式ＩＢを有しかつスルホネートエステルが次の式ＩＩＢを有する、方法。
【化６】
2013532220.tif 000026
（式中、
Ａ2、Ｍ1b、Ｙ1b、Ｙ2b及びｂは請求項６で定義した通りであり、
ｘは１〜４の値を有する整数であり、ｙは０〜３の値を有する整数であって、ｘ及びｙは（ｘ＋ｙ）＝ｂとなるように選択される。）
【請求項１０】
請求項７に記載した式ＩＩＩの対称シアニン色素製造方法であって、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の前駆体組成物を適当な溶媒中で請求項７に記載した式Ｘのポリエン塩の２モル当量以上と反応させることを含んでなる方法。
【請求項１１】
スルホン化色素の合成、或いは請求項７又は請求項８記載の色素中間体組成物の合成における、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の前駆体組成物の使用。
【請求項１２】
スルホン化色素の合成における請求項７又は請求項８記載の中間体組成物の使用。
【請求項１３】
スルホン化色素が請求項８に記載した式ＩＩＩの対称シアニン色素又は請求項６に記載した式ＩＶの非対称シアニン色素である、請求項１１又は請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
請求項６記載の色素組成物を哺乳動物への投与に適した無菌形態で生体適合性キャリヤー媒質中に含んでなる医薬組成物。
【請求項１５】
式ＩＶの非対称色素と生物学的ターゲティング部分又は合成巨大分子とのコンジュゲートの製造における、請求項６記載の色素組成物又は請求項１４記載の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
生物学的ターゲティング部分が、
（ｉ）３〜１００量体ペプチド、
（ｉｉ）酵素基質、酵素アンタゴニスト又は酵素阻害剤、
（ｉｉｉ）レセプター結合化合物、
（ｉｖ）オリゴヌクレオチド、及び
（ｖ）オリゴＤＮＡ又はオリゴＲＮＡフラグメント
から選択される、請求項１５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スルホン化光学色素の分野、特にインビトロでの生物学的用途及びインビボイメージングのために適した色素に関する。望ましくない新たに同定された不純物の抑制を可能にする改良色素組成物及び中間体が提供される。
【背景技術】
【０００２】
スルホネート（−ＳＯ3Ｈ又は−ＳＯ3-）置換基の導入による色素のスルホン化は、色素の水溶性を高めるための確立された方法である。
【０００３】
国際公開第０１／４３７８１号は、新しい種類の対称ヘプタメチンシアニン色素の合成法を開示し、また蛍光イメージング方法も提供している。
【０００４】
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ［Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ，６１，１０３−１０７（２００４）］は、ヘプタメチンシアニン色素の合成法及びＳｉＯ2ゾル−ゲル中でのその分光特性を開示している。
【０００５】
国際公開第２００５／０４４９２３号及び米国特許出願公開第２００７／０２０３３４３号は、生物学的分子の標識及び検出のために有用な新しい種類のスルホン化ペンタメチン及びヘプタメチンシアニン色素の合成法を開示している。非対称シアニン色素Ｃｙ７及びそのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルの合成法が含まれている。
【０００６】
【化１】
2013532220.tif 000002
国際公開第２００５／１２３７６８号は、スルホン化シアニン色素とＲＧＤペプチドとのコンジュゲート及び診断用光学イメージング技法における該コンジュゲートの使用を開示している。
【０００７】
Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ［Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，４８，５８２５−５８２９（２００７）］は、可溶性支持体としてポリ（エチレングリコール）を用いて非対称水溶性シアニン色素を合成するための効率的なアプローチを開示している。
【０００８】
国際公開第２００８／１３９２０７号は、特定の種類の非対称ペンタメチンシアニン色素の合成法及びインビボ光学イメージング用イメージング剤としてのその使用を開示している。
【０００９】
しかし、先行技術の色素合成法、特に非対称シアニン色素合成法は、試料装填の点から考えてミリグラムスケールに最も適する複雑で労働集約的な精製方法（例えば、分取ＨＰＬＣ）の使用による低い収量に欠点がある。生物学的用途、特にインビボ光学イメージングのために使用する場合、かかる色素は不要の不純物を抑制しながら医薬品グレードにおいてグラム単位の量で得られることが必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０１／４３７８１号
【特許文献２】国際公開第２００５／０４４９２３号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／０２０３３４３号
【特許文献４】国際公開第２００５／１２３７６８号
【特許文献５】国際公開第２００８／１３９２０７号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Wang et al, Dyes and Pigments, 61, 103-107 (2004)
【非特許文献２】Jiang et al, Tet. Lett., 48, 5825-5829 (2007)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、スルホン化光学色素の合成において有用な組成物であって、以前には認識されなかった不純物が同定されかつ抑制される組成物を提供する。かかる不純物の同定及び制御は、医薬品製造品質管理基準（ＧＭＰ）にとって重要である。非対称光学色素の合成において有用な色素中間体組成物、並びに主要不純物の抑制によって改良された色素組成物を与える色素製造方法も提供される。
【００１３】
本発明は、不要の不純物を抑制しながら医薬品グレードにおいてグラム単位の量でスルホン化色素を製造することを可能にする。本組成物及び方法は、生物学的用途、特にインビボ光学イメージングのためのかかるスルホン化色素を製造する場合に特に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
第１の態様では、本発明は、次の式Ｉの第四級化合物及び次の式ＩＩのスルホネートエステルを含んでなる前駆体組成物であって、式ＩＩのスルホネートエステルを３％未満含むことを特徴とする前駆体組成物を提供する。
【００１５】
【化２】
2013532220.tif 000003
式中、
Ａはフェニル環又はナフチル環を完成するために必要な原子を表し、
Ｙ1は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ1−又は−ＣＲ2Ｒ3−であり、
Ｙ2はＲ基であって、式ＩＩ中のすべての位置で同一であり、
各Ｍ1は独立にＨ又はＢc（ここで、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）であり、
Ｒ1はＲ基であり、
Ｒ2及びＲ3は独立にＣ1-3アルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
各Ｒは独立にＣ1-5アルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
ｑは１〜４の値を有する整数であり、
ｘは１〜４の値を有する整数であり、ｙは０〜３の値を有する整数であって、ｘ及びｙは（ｘ＋ｙ）＝ｑとなるように選択される。
【００１６】
かかる前駆体組成物では、Ａ、Ｙ1及びＹ2は式Ｉ及び式ＩＩ中において同一である。第１の態様の前駆体組成物は、本発明の以後の態様で記載されるようなスルホン化色素の合成において有用である。
【００１７】
本発明の組成物を用いて製造できる「色素」には、シアニン色素がある。かかる色素はスルホン化されている。「スルホン化されている」という用語は、前記色素が１個以上のスルホン酸置換基を有することを意味する。「スルホン酸置換基」という用語は式−ＳＯ3Ｍ1の置換基を意味し、式中のＭ1はＨ又はＢc（ここで、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）である。−ＳＯ3Ｍ1置換基は炭素原子に共有結合しており、かかる炭素原子はアリール（例えば、式Ｉ中のＡ基）又はアルキルであり得る。「生体適合性陽イオン」（Ｂc）という用語は、イオン化して負に帯電した基（この場合にはスルホネート基）と共に塩を形成する正に帯電した対イオンを意味する。ここで、前記正に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳動物体（特に人体）への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの例には、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンがある。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。
【００１８】
式ＩＩにおいて、−ＳＯ2−ＯＹ2置換基は「スルホネートエステル」と呼ばれる。それは、Ｙ2及びＲの定義により、−ＳＯ2−ＯＣ−エステル共有結合が存在することが要求されるからである。
【００１９】
式Ｉ及び式ＩＩにおいて、Ａがフェニル環を完成するために必要な原子である場合には、式ＩＡ及び式ＩＩＡ（下記）に示される環系に対応するインドール環が生成される。Ａがナフタレン環を完成するために必要な原子である場合には、式ＩＡ又は式ＩＩＡに類似した環構造であって、その中のフェニル環に追加のフェニル環が縮合したものが表される。第１の態様の組成物が式Ｉ／ＩＩ中にナフタレン環を含む場合、スルホネート置換基及びスルホネートエステル置換基はナフタレン環の任意の位置に存在し得る。式Ｉ／ＩＩにおいて、フェニル環又はナフタレン環は追加の置換基で任意に置換されていてよい。
【００２０】
「スルホネートエステルを３％未満含む」という用語は、組成物が式ＩＩのスルホネートエステルを３．０モル％未満含むことを意味する。前駆体組成物がスルホネートエステルを３％未満含む場合、残部は好適には９０モル％以上の式Ｉの第四級化合物である。
【００２１】
式ＩＩのスルホネートエステルは、式Ｉの化合物を含む組成物中において以前には知られていない不純物である。これらは、式Ｉの第四級化合物の合成時における所望のＮ−アルキル化に加えて、望ましくないＯ−アルキル化から生じる。前駆体組成物中における前記スルホネートエステルの抑制は重要である。それは、これらが存在すると、次の合成段階（即ち、第２の実施形態の式Ｖのアミドの製造或いは対称又は非対称色素の製造）においてさらに反応するからである。その結果、不要のスルホン化エステル不純物が色素組成物生成物中にまで持ち越され、かかる不純物をその段階で分離することは困難になろう。
【００２２】
「含む」という用語は、本願全体を通してその通常の意味を有していて、組成物は記載された成分を有していなければならないが、それに加えて他の明記されない化合物又は化学種が存在してもよいことを意味する。「含む」という用語は、好ましい部分集合として、組成物が他の化合物又は化学種の存在なしに記載された成分を有することを意味する「から本質的になる」を包含する。
【００２３】
好ましい態様
好ましくは、第１の態様の前駆体組成物は式ＩＩのスルホネートエステルを２％未満及び式Ｉの化合物を９４モル％以上含み、最も好ましくは式ＩＩのスルホネートエステルを１％未満及び式Ｉの化合物を９５モル％以上を含む。
【００２４】
前駆体組成物中で、Ｙ1は好ましくは−ＣＲ2Ｒ3−である。Ｙ1が−ＣＲ2Ｒ3−である場合、Ｒ2及びＲ3は好ましくはいずれも独立にＣ1-3アルキルであり、最も好ましくはＲ2＝Ｒ3＝ＣＨ3である。前駆体組成物中で、ｑは好ましくは１又は２であり、最も好ましくは１である。
【００２５】
前駆体組成物中で、好ましくは第四級化合物は次の式ＩＡを有し、スルホネートエステルは次の式ＩＩＡを有する。
【００２６】
【化３】
2013532220.tif 000004
式中、
ｚは１又は２であり、
ｆは０又は１であり、ｇは１又は２であって、（ｆ＋ｇ）＝ｚである。
【００２７】
式ＩＡ／ＩＩＡの前駆体組成物中で、ｚは好ましくは１である。ｚが１である場合、−ＳＯ3Ｍ1置換基は好ましくはインドールＮ原子に対してパラ位にある。式ＩＡ／ＩＩＡ中で、好ましい及び最も好ましいＲ2、Ｒ3及びＹ2基は式Ｉ／ＩＩ（上記）に関して記載した通りである。特に好ましい前駆体化合物は、第四級化合物が次の式ＩＡＡを有しかつスルホネートエステルが次の式ＩＩＡＡを有する場合である。
【００２８】
【化４】
2013532220.tif 000005
式ＩＡＡ／ＩＩＡＡ中で、好ましい及び最も好ましいＹ2基は式Ｉ／ＩＩ（上記）に関して記載した通りである。
【００２９】
第１の態様の前駆体組成物は、適当な溶媒中で次の式Ｂの化合物を式Ｙ2−Ｈａｌ（式中、Ｈａｌはハロゲンであり、Ｙ2は式Ｉ及び式ＩＩに関して定義した通りである。）のアルキル化剤でアルキル化することによって得ることができる。
【００３０】
【化５】
2013532220.tif 000006
Ｙ2−Ｈａｌに関しては、Ｈａｌは好ましくはＣｌ、Ｂｒ又はＩであり、最も好ましくはＢｒである。適当な溶媒は通例はスルホランであり、反応は好適には８０〜１２０℃、好ましくは９０〜１２０℃で６〜１６時間実施される。化合物１（５−スルホ−２，３，３−トリメチルインドレニンナトリウム塩）は、「Ｉｎｔａｔｒａｄｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社」から商業的に入手できる。
【００３１】
一実施形態では、式ＩＩのスルホネートエステル不純物は改良された処理方法によって最小限に抑えられる。即ち、化合物Ｂのアルキル化後、溶媒を真空中で除去し、残留物を１０容の水に溶解し、酢酸エチル（５容）で洗浄した。酢酸エチル洗浄によって微量のアルキル化剤Ｙ2−Ｈａｌが除去されるが、さもないと後続の段階の微酸性条件下でスルホネートエステル不純物の生成をもたらすであろう。化合物３の場合には、式Ｂの化合物のアルキル化後、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、数分間撹拌して濃厚なタール様沈殿を得た。（過剰のアルキル化剤及びスルホランを含む）酢酸エチル層をデカントし、残留物を酢酸エチルで洗浄して酢酸エチル層をデカントすることを繰り返してスルホラン及びアルキル化剤の大部分を除去した。残留物中に捕捉された微量の残留アルキル化剤は、残留物を１０容の水に溶解し、さらに水性層を酢酸エチルで洗浄することで除去した。次いで、水酸化ナトリウムを用いて水性層に加水分解を施した。
【００３２】
化合物３（図１参照）に関しては、このような改良処理方法の結果、組成物中のスルホネートエステル不純物ＩＩのレベルは５〜６％から＜１％に低下し、それによって化合物３の純度は８９％から９６％に上昇した。さらに、化合物３は反応後に常に濃厚で粘着性の塊状物として単離されたが、これは取扱いが難しかった。化合物３の再結晶は大きな問題であった。それは、アセトン、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、酢酸及びＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）のような多くの常用有機溶媒に対する溶解性が非常に悪いことが判明したからである。メタノール及びエタノールのような単純アルコールに対する溶解性は良好であったが、これらは化合物３の対応カルボン酸エステルを不純物として容易に生成するので不適当である。
【００３３】
本発明者らは、アセトンとイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）との混合物が問題を解決し得ることを観察し、アセトン／イソプロピルアルコール（７０／３０比）の混合物と共にトリチュレートすることで化合物３を結晶として単離することに成功した。上述の通り、処理後の化合物３はアセトン及びＩＰＡのような個々の溶媒には不溶であるが、粗化合物をアセトン／ＩＰＡ（７０：３０）の混合物と共にトリチュレートすれば生成物が晶出した。達成された純度は９６％であった。このような劇的な改善をもたらしたのは、極性溶媒の組合せによる不純物の効果的な除去である。再結晶は１又は２時間以内に実施すべきである。それは、イソプロパノールの反応性がメタノール及びエタノールに比べて低く、カルボン酸のイソプロピルエステルの生成は遙かに起こりにくいからである。しかし、化合物３をイソプロパノール／アセトン混合物中に長時間（１６時間）放置した場合には、カルボン酸のイソプロピルエステルを（ＬＣＭＳによって）検出することができた。化合物２は、先行技術［Ｍｕｊｕｍｄａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，４（２），１０５−１１１（１９９３）］に記載されている。化合物２に関しては、アルキル化反応の粗生成物は９０〜９２％の純度を有していた。本発明者らは、化合物２に関し、メタノールからの再結晶によってスルホネートエステルが除去され、純度が９０〜９２％から９８％に向上したことを見出した。
【００３４】
前駆体組成物の純度は、２種の波長（２５４ｎｍ及び２７０ｎｍ）における分析ＨＰＬＣ測定（曲線下の面積）によって評価されている。スルホネート不純物はＬＣＭＳによって特性決定された。
【００３５】
第２の態様では、本発明は、次の式ＩＶの非対称シアニン色素並びに次の式ＶＩ及び式ＶＩＩの対称シアニン色素を含んでなる色素組成物であって、式ＶＩ及び式ＶＩＩの対称色素を合計で８％未満含むことを特徴とする色素組成物を提供する。
【００３６】
【化６】
2013532220.tif 000007
式中、
Ａ1及びＡ2は独立に第１の態様で定義したＡ基であり、
Ｍ1a及びＭ1bは独立に第１の態様で定義したＭ1基であり、
Ｙ1a及びＹ1bは独立に第１の態様で定義したＹ1基であり、
Ｙ2a及びＹ2bは独立に第１の態様で定義したＹ2基であり、
ａ及びｂは独立に第１の態様で定義したｑ基であり、
Ａ1、Ｙ1a及びＹ2aの少なくとも１つはそれぞれＡ2、Ｙ1b及びＹ2bとは異なる。
【００３７】
「式ＶＩ及び式ＶＩＩの対称色素を合計で８％未満含む」という用語は、組成物が該組成物中に存在する［対称色素ＶＩ及び対称色素ＶＩＩ］の合計量を８．０モル％未満含むことを意味する。残部は、好適には９０モル％以上の式ＩＶの非対称シアニン色素である。
【００３８】
第２の態様における様々なＡ、Ｍ1、Ｙ1及びＹ2基の好ましい態様は、第１の態様（上記）に記載した通りである。
【００３９】
第２の態様では、式ＩＶの色素は、好ましくはＲ1基及びＲ基から選択される１個以上（さらに好ましくは１個）のカルボキシアルキル置換基を含んでいる。その結果、さらに別の態様（下記）に記載されるように、色素を生物学的分子に結合するための官能基（カルボキシル）を提供することによって色素は二官能性となる。
【００４０】
式ＩＶの非対称シアニン色素のいくつかは先行技術で知られているものの、第２の態様の非対称シアニン色素組成物は理解されていなかった。それは、主要不純物の正体が知られていなかったからである。かかる不純物を同定することに加えて、本発明は、かかる不純物を制御して第２の態様の改良組成物を与えるための方法を提供する。式ＶＩ及び式ＶＩＩの対称不純物色素は、色素組成物中にまで持ち越されれば、非対称色素ＩＶと同様な化学的特性のために分離して除去することは極めて困難になろう。同様な光学的性質を有するので、これらはインビトロ及びインビボでの式ＩＶの色素の生物学的用途を妨害するであろう。
【００４１】
第２の態様の色素組成物では、Ａ1及びＡ2は好ましくはいずれもフェニル環を完成するために必要な原子である。「ａ」及び「ｂ」は好ましくはｚ（ここで、ｚは上記に定義した通りである。）であり、最も好ましくは１である。Ｙ1a及びＹ2aは好ましくはいずれも独立に−ＣＲ2Ｒ3−である。
【００４２】
第２の態様の色素組成物では、組成物はまた、好ましくは色素組成物中にスルホネートエステル不純物を４％未満、さらに好ましくは２％未満、最も好ましくは１％未満含んでいる。前記スルホネートエステルは、−ＳＯ3Ｍ1a及び／又は−ＳＯ3Ｍ1b置換基が−ＳＯ2(ＯＹ2)スルホネートエステルとして存在している式ＩＶ、式ＶＩ及び式ＶＩＩの類似体に相当している。ここで、Ｍ1a、Ｍ1b及びＹ2は第１の態様（上記）に関して定義した通りである。
【００４３】
第２の態様の色素組成物は、第３の態様の中間体組成物及び第４の態様の方法によって得ることができる。
【００４４】
第３の態様では、本発明は、次の式Ｖのアミド及び次の式Ｘのポリエン塩を含んでなる中間体組成物であって、ポリエン塩Ｘを１％未満含むことを特徴とする中間体組成物を提供する。
【００４５】
【化７】
2013532220.tif 000008
式中、Ａ1、Ｍ1a、Ｙ1a及びＹ2a並びにこれらの好ましい態様は第２の態様で定義した通りである。
【００４６】
第３の態様の中間体組成物は、スルホン化色素、特に第２の態様の非対称シアニン色素組成物の合成、又は第５の態様の対称色素製造方法において有用である。非対称シアニン色素が好ましいのは、かかる色素が例えばただ１つのカルボキシアルキル置換基を有し、したがって生物学的分子にコンジュゲートするための二官能性色素誘導体を製造する場合にただ１つの結合点を有し得るからである。
【００４７】
「式Ｘのポリエン塩を１％未満含む」という用語は、組成物が中間体組成物中にポリエン塩を１．０モル％未満含むことを意味する。好ましくは、中間体組成物は式Ｘのポリエン塩を０．５％未満、最も好ましくは０．１％未満含む。
【００４８】
本発明者らは、中間体組成物中におけるポリエン塩Ｘのレベルを抑制することが極めて重要であることを見出した。ポリエン塩Ｘが残留すると、それは第４の態様の方法段階で反応して、上述したような式ＶＩ及び式ＶＩＩの望ましくない対称色素を生成するからである。即ち、本発明者らは、先行技術による非対称シアニン色素化合物４（Ｃｙ７）の合成では、不要の対称色素ＶＩ及びＶＩＩがそれぞれ最大１０〜１５％生成されることを見出した。ひとたび生成されて組成物中に存在すると、これらの不純物色素はもちろん所望の生成物ＩＶと同様な特性を有する。その結果、これらを製造規模でクロマトグラフィーにより分離するのは困難であり、したがって最初にこれらの生成を抑制することが重要である。したがって、第３の態様の中間体組成物は第２の態様の改良色素組成物を得るための重要な手段である。
【００４９】
かかる中間体組成物は、好ましくはさらに１モル％未満、さらに好ましくは０．５％未満、最も好ましくは０．１％未満のアセトアニリドを含んでいる。アセトアニリド［即ち、Ｃ6Ｈ5ＮＨ(Ｃ＝Ｏ)ＣＨ3］は、前駆体組成物とポリエン塩Ｘとの反応の副生物である。本発明者らは、第２の態様の色素組成物中にアセトアニリドが存在する場合、それは分取ＨＰＬＣ上で化合物４と共溶出するので分離して除去するのが困難であり得ることを見出したので、アセトアニリドを除去することは重要である。
【００５０】
かかる中間体組成物は、好ましくはさらに次の式ＩＩＩの対称シアニン色素を１％未満含んでいる。
【００５１】
【化８】
2013532220.tif 000009
式中、Ａ、Ｍ1、Ｙ1、Ｙ2及びｑは第１の態様で定義した通りである。
【００５２】
式Ｘのポリエン塩は、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から商業的に入手できる。
【００５３】
シアニン色素を合成するための標準的な文献方法では、酢酸と無水酢酸との混合物が溶媒として使用され、酢酸カリウムが塩基として使用される。本発明は、許容される溶媒中での規模変更可能な高収率合成法を提供する。したがって、無水酢酸の役割は溶媒から反応体に変更され、有機溶媒の使用量は最小化される。
【００５４】
かくして、第３の態様の中間体組成物は、適当な溶媒中で第１の態様の前駆体組成物を１．２〜１．８当量、好ましくは１．４〜１．６当量、最も好ましくは約１．５当量の（上述した）ポリエン塩Ｘと反応させることで得られる。過剰のポリエン塩Ｘの使用は、中間体組成物中に対称色素不純物の生成が起こらないことを保証するためである。過剰のポリエン塩Ｘは、中間体組成物を第４の態様の色素組成物合成法で使用する前に、酢酸エチルを用いて＜１％まで除去される。
【００５５】
適当な溶媒はアセトン又はアセトニトリルであり得るが、好ましくはアセトニトリルである。ポリエン塩（Ｘ）は、温度に対して非常に敏感であることが判明している。したがって、反応混合物を１１０℃の温度に加熱しようとすると、ポリエン塩（Ｘ）の分解及び損失を引き起こすことが判明した。それはひいては、ポリエン塩に対してインドール前駆体が過剰であるため、式ＩＩＩの対称色素不純物のレベルを増加させた。そのため、反応は室温で実施される。
【００５６】
化合物７（図１参照）に関しては、反応は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１．５当量）及び無水酢酸（５当量）の存在下において、アセトニトリル中２５℃で１時間実施される。反応の完了後、アセトニトリルを真空中２５℃で除去した。低温での溶媒の除去は極めて重要であることが判明した。即ち、それより高い温度（４５℃）でのアセトニトリルの蒸発は、不純物である化合物５の生成をもたらすことが認められた。アセトニトリルの除去後に得られた残留物を、１００容の酢酸エチルと共に３０分間トリチュレートした。これは赤色の結晶質固体の生成をもたらした。固体の化合物７が９０％の収率及び（５５０ｎｍでのＨＰＬＣによれば）９２〜９３％の純度で単離された。アセトアニリド及び過剰のポリエン塩Ｘは、上述したように酢酸エチル及び低温蒸発を使用することで効果的に抑制された。
【００５７】
第４の態様では、本発明は、第２の態様の色素組成物の製造方法であって、第３の態様の中間体組成物を適当な溶媒中で第１の態様の前駆体組成物の１モル当量と反応させることを含んでなり、前記前駆体組成物に関しては第四級化合物が次の式ＩＢを有しかつスルホネートエステルが次の式ＩＩＢを有する方法を提供する。
【００５８】
【化９】
2013532220.tif 000010
式中、
Ａ1、Ａ2、Ｍ1a、Ｍ1b、Ｙ1a、Ｙ1b、Ｙ2a、Ｙ2b、ａ及びｂ並びにこれらの好ましい態様は第２の態様（上記）に記載した通りである。
【００５９】
第４の態様に関しては、Ａ1＝Ａ2及びＹ1a＝Ｙ1bであることが好ましい。「適当な溶媒」及びその好ましい態様は、第３の態様（上記）に記載した通りである。
【００６０】
第４の態様の製法は、化合物４に関してスキーム１に要約されている。反応は、第１の態様の前駆体組成物から出発して２つの段階で実施される。この場合、第四級化合物は化合物３である。第１の段階では、図示されるように前駆体化合物を化合物Ｘと反応させることで、化合物７を含む第３の態様の色素中間体組成物が製造される。中間体組成物は、好ましくは単離及び／又は精製した後に次の段階で使用される。第２の段階では、中間体組成物は、今回は化合物２を含む別の前駆体化合物との反応によって第２の態様の所望非対称組成物に転化される。化合物２前駆体組成物、続いて５当量のＤＩＰＥＡを添加したところ、直ちに化合物４が生成された。１当量未満（好ましくは約０．７５当量）の化合物２を使用した場合、化合物４は微量の対称色素しか含んでいなかった。得られた反応混合物は、主として化合物４を含むと共に、２当量のアセトアニリド並びに６当量を超えるＤＩＰＥＡ及び塩類を含んでいる。
【００６１】
本発明者らは、粗化合物４からアセトアニリド及び残留化合物７の両方を除去するためには、反応混合物を過剰の酢酸エチル中に注いで沈殿させるのが有効であることを見出した。ＤＩＰＥＡの酢酸塩を除去するためには、単離された化合物４をアセトン中でトリチュレートすることが有効であった。式ＶＩ及び式ＶＩＩの対称色素不純物は分取ＨＰＬＣによって除去された。別法として、アセトニトリルを蒸発させた後の残留物を水に溶解し、酢酸エチルでの連続抽出によってアセトアニリド及び他の不純物を除去することができる。さらなる詳細は実施例（下記）中に示される。
【００６２】
【化１０】
2013532220.tif 000011
式中、
Ｒa＝(ＣＨ2)5ＣＯ2Ｈ、
Ｒb＝−ＣＨ2ＣＨ3、
ＤＩＰＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン。
【００６３】
第５の態様では、本発明は、第３の態様に記載した式ＩＩＩの対称シアニン色素製造方法であって、第１の態様の前駆体組成物を適当な溶媒中で第３の態様に記載した式Ｘのポリエン塩の２モル当量以上と反応させることを含んでなる方法を提供する。。
【００６４】
「適当な溶媒」及びその好ましい態様は、第３の態様（上記）に記載した通りである。
【００６５】
このように、第１の態様の前駆体組成物は、対称及び非対称色素組成物の両方を製造するために有用である。
【００６６】
第６の態様では、本発明は、スルホン化色素の合成又は第３の態様の中間体組成物の合成における第１の態様の前駆体組成物の使用を提供する。
【００６７】
第７の態様では、本発明は、スルホン化色素の合成における第３の態様の中間体組成物の使用を提供する。
【００６８】
第６又は第７の態様の使用では、スルホン化色素は好ましくは第５の態様の式ＩＩＩの対称シアニン色素又は第２の態様の式ＩＶの非対称シアニン色素である。
【００６９】
第８の態様では、本発明は、第２の態様の色素組成物を哺乳動物への投与に適した無菌形態で生体適合性キャリヤー媒質中に含んでなる医薬組成物を提供する。
【００７０】
「生体適合性キャリヤー媒質」は、１種以上の薬学的に許容される補助剤、賦形剤又は希釈剤を含んでいる。それは、好ましくは、組成物が生理学的に認容されるようにして（即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳動物体に投与できるようにして）式（Ｉ）の化合物を懸濁又は溶解するための流体（特に液体）である。生体適合性キャリヤー媒質は、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、（有利には注射用の最終生成物が等張性又は非低張性になるように平衡させ得る）食塩水のような水溶液、或いは１種以上の張度調整物質（例えば、血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。生体適合性キャリヤー媒質はまた、エタノールのような生体適合性有機溶媒を含んでいてもよい。かかる有機溶媒は、親油性の高い化合物又は配合物を可溶化するために有用である。好ましくは、生体適合性キャリヤー媒質はパイロジェンフリー注射用水、等張食塩水又はエタノール水溶液である。静脈内注射用生体適合性キャリヤー媒質のｐＨは、好適には４．０〜１０．５の範囲内にある。
【００７１】
かかる医薬組成物は、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤、フィラー、安定剤又は重量オスモル濃度調整剤のような追加賦形剤を任意に含むことができる。「抗菌防腐剤」という用語は、潜在的に有害な微生物（例えば、細菌、酵母又はかび）の増殖を阻止する薬剤を意味する。抗菌防腐剤はまた、使用する用量に応じて多少の殺菌性を示すこともある。本発明の抗菌防腐剤の主な役割は、医薬組成物中におけるこのような微生物の増殖を阻止することである。しかし、抗菌防腐剤は、任意には投与に先立って前記組成物を製造するために使用されるキットの１種以上の成分中における潜在的に有害な微生物の増殖を阻止するためにも使用できる。好適な抗菌防腐剤には、パラベン類（即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物）、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌防腐剤はパラベン類である。
【００７２】
「ｐＨ調整剤」という用語は、組成物のｐＨがヒト又は哺乳動物への投与のために許容される範囲（およそｐＨ４．０〜１０．５）内にあることを保証するために有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。好適なかかるｐＨ調整剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］のような薬学的に許容される緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容される塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、ｐＨ調整剤を任意には独立のバイアル又は容器に入れて供給することができ、その結果としてキットのユーザーは多段操作の一部としてｐＨを調整することができる。
【００７３】
「フィラー」という用語は、製造及び凍結乾燥中における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容される増量剤を意味する。好適なフィラーには、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性糖又は糖アルコールがある。
【００７４】
かかる医薬組成物は、無菌製造条件下で（即ち、クリーンルーム内で）製造して所望の無菌で非発熱性の生成物を得ることができる。基本構成部分、特に関連する試薬並びにイメージング剤に接触する装置部品（例えば、バイアル）は無菌であることが好ましい。かかる構成部分及び試薬は、無菌濾過或いは（例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理を用いる）終末滅菌をはじめとする、当技術分野で公知の方法によって滅菌できる。一部の構成部分を予め滅菌しておけば、最小数の操作を実施すれば済むので好ましい。しかし、予防策として、医薬組成物の製造における最終段階として少なくとも無菌濾過段階を含めることが好ましい。
【００７５】
第８の態様の組成物中における色素の好ましい態様は、第２の態様に記載した通りである。
【００７６】
さらに別の態様では、本発明は、式ＩＶの非対称色素と生物学的ターゲティング部分又は合成巨大分子とのコンジュゲートの製造における、第２の態様の色素組成物又は第８の態様の医薬組成物の使用を提供する。
【００７７】
さらに別の態様の使用は、第２の態様の色素組成物又は第８の態様の医薬組成物から出発して前記コンジュゲートを製造する方法を包含する。この態様の色素−ＢＴＭコンジュゲートは、インビトロ及びインビボでの用途を有している。
【００７８】
さらに別の態様の使用では、色素の好ましい態様は第２の態様に記載した通りである。かかる色素は、好ましくは第８の態様の医薬組成物として使用される。
【００７９】
「生物学的ターゲティング部分」（ＢＴＭ）という用語は、投与後、インビボで哺乳動物体の特定部位に選択的に取り込まれるか又は特定部位に局在する化合物を意味する。かかる部位は、例えば、特定の疾患状態に関係するものであるか、或いは器官又は代謝過程がいかに機能しているかを表すものであり得る。
【００８０】
「合成巨大分子」という用語は、分子量２〜１００ｋＤａ、好ましくは３〜５０ｋＤａ、最も好ましくは４〜３０ｋＤａのポリマーを意味する。かかるポリマーは、ポリリシン又はポリグリコール酸のようなポリアミノ酸、或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。「合成」という用語は下記に定義される通りである。
【００８１】
ＢＴＭは合成品又は天然品であり得るが、好ましくは合成品である。「合成品」という用語はその通常の意味を有し、即ち、天然の供給源（例えば、哺乳動物体）から単離されるものではなく人造のものをいう。かかる化合物は、その製造及び不純物プロファイルを完全に制御できるという利点を有している。したがって、天然由来のモノクローナル抗体及びそのフラグメントは、本明細書中で使用する「合成品」という用語の範囲外にある。
【００８２】
ＢＴＭの分子量は、好ましくは３００００ダルトン以下である。さらに好ましくは、分子量は２００〜２００００ダルトンの範囲内にあり、最も好ましくは３００〜１８０００ダルトンの範囲内にあり、４００〜１６０００ダルトンが特に好ましい。ＢＴＭが非ペプチドである場合、ＢＴＭの分子量は好ましくは３０００ダルトン以下、さらに好ましくは２００〜２５００ダルトン、最も好ましくは３００〜２０００ダルトンであり、４００〜１５００ダルトンが特に好ましい。
【００８３】
生物学的ターゲティング部分は、好ましくは、線状ペプチド、環状ペプチド又はこれらの組合せであり得る３〜１００量体ペプチド、ペプチド類似体、ペプトイド又はペプチド模倣体、単一のアミノ酸、酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト（部分アゴニストを含む）又は酵素阻害剤、レセプター結合化合物（レセプター基質、アンタゴニスト、アゴニスト又は基質を含む）、オリゴヌクレオチド、或いはオリゴＤＮＡフラグメント又はオリゴＲＮＡフラグメントからなる。
【００８４】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合（即ち、１つのアミノ酸のアミンを別のアミノ酸のカルボキシルに連結するアミド結合）によって連結された（下記に定義するような）２以上のアミノ酸を含む化合物を意味する。「ペプチド模倣体」又は「模倣体」という用語は、ペプチド又はタンパク質の生物学的活性を模倣するが、化学的性質がペプチド的でない（即ち、いかなるペプチド結合（つまり、アミノ酸間のアミド結合）も含まない）生物学的活性化合物をいう。ここでは、ペプチド模倣体という用語は広い意味で使用され、性質が完全にはペプチド的でない分子（例えば、プソイドペプチド、セミペプチド及びペプトイド）を包含する。「ペプチド類似体」という用語は、下記に記載するような１種以上のアミノ酸類似体を含むペプチドをいう。“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ”，Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ  Ｅ２２ｃ，Ｔｈｉｅｍｅも参照されたい。
【００８５】
「アミノ酸」という用語は、Ｌ−又はＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）或いはアミノ酸模倣体を意味し、これらは天然のもの又は純粋に合成由来のものであってよく、光学的に純粋なもの（即ち、単一の鏡像異性体）、したがってキラルなものであるか、或いは鏡像異性体の混合物であってよい。本明細書中では、アミノ酸に関する通常の三文字略語又は一文字略語が使用される。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋なものである。「アミノ酸模倣体」という用語は、アイソスター（即ち、天然化合物の立体構造及び電子構造を模倣するように設計されたもの）である天然アミノ酸の合成類似体を意味する。かかるアイソスターは当業者にとって公知であり、特に限定されないが、デプシペプチド、レトロ−インベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン又は１，５−二置換テトラゾールを包含する［Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２４，１３７（１９８５）を参照されたい］。放射性標識されたアミノ酸（例えば、チロシン、ヒスチジン又はプロリン）は、有用なインビボイメージング剤であることが知られている。
【００８６】
ＢＴＭが酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト、酵素阻害剤又はレセプター結合化合物である場合、それは好ましくは非ペプチドであり、さらに好ましくは合成品である。「非ペプチド」という用語は、いかなるペプチド結合（即ち、２つのアミノ酸残基間のアミド結合）も含まない化合物を意味する。好適な酵素の基質、アンタゴニスト、アゴニスト又は阻害剤には、グルコース及びグルコース類似体（例えば、フルオロデオキシグルコース）、脂肪酸、或いはエラスターゼ、アンギオテンシンＩＩ又はメタロプロテイナーゼ阻害剤がある。好適な合成レセプター結合化合物には、エストラジオール、エストロゲン、プロゲスチン、プロゲステロン及び他のステロイドホルモン、ドーパミンＤ−１又はＤ−２レセプター用リガンド又はトロパンのようなドーパミン輸送体用リガンド、並びにセロトニンレセプター用リガンドがある。
【００８７】
ＢＴＭは、最も好ましくは３〜１００量体ペプチド又はペプチド類似体である。ＢＴＭがペプチドである場合、それは好ましくは４〜３０量体ペプチドであり、最も好ましくは５〜２８量体ペプチドである。
【００８８】
ＢＴＭが酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト又は酵素阻害剤である場合、本発明の好ましいかかる生物学的ターゲティング分子は合成の薬物様小分子（即ち、医薬品分子）である。その好ましい例は、トロパンのようなドーパミン輸送体リガンド、脂肪酸、ドーパミンＤ−２レセプターリガンド、ベンズアミド類、アンフェタミン類、ベンジルグアニジン類、イオマゼニル、ベンゾフラン（ＩＢＦ）又は馬尿酸である。
【００８９】
ＢＴＭがペプチドである場合、好ましいかかるペプチドには以下のものがある。
−ソマトスタチン、オクトレオチド及び類似体。
−ＳＴレセプターに結合するペプチド（ここで、ＳＴとは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の微生物によって産生される耐熱性毒素をいう。）。
−ボンベシン。
−血管作用性小腸ペプチド。
−ニューロテンシン。
−ラミニンフラグメント、例えばＹＩＧＳＲ、ＰＤＳＧＲ、ＩＫＶＡＶ、ＬＲＥ及びＫＣＱＡＧＴＦＡＬＲＧＤＰＱＧ。
−白血球集積部位をターゲティングするためのＮ−ホルミル走化性ペプチド。
−血小板第４因子（ＰＦ４）及びそのフラグメント。
−例えば血管形成をターゲティングし得るＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）含有ペプチド［Ｒ．Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７  Ｊｕｎ；１５（６）：５４２−６］、［Ｅ．Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９９７  Ｍａｙ；５１（５）：１４１３−７］。
−α2−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、フィブリノーゲン又はトロンボスポンジンのペプチドフラグメント。α2−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、フィブリノーゲン及びトロンボスポンジンのアミノ酸配列は、以下の参考文献中に見出すことができる。α2−抗プラスミン前駆体［Ｍ．Ｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０２，１０３３，（１９８７）］、β−カゼイン［Ｌ．Ｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ，１３９，１９３，（１９９４）］、フィブロネクチン［Ａ．Ｇｕｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０７，１４５，（１９９６）］、トロンボスポンジン１前駆体［Ｖ．Ｄｉｘｉｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８３，５４４９，（１９８６）］、Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３，１９５，（１９８４）。
−アンギオテンシンＩＩ：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（Ｅ．Ｃ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９７９，Ｖｏｌ  ２２，９，１０３８−１０４４）及び［Ｓａｒ，Ｉｌｅ］アンギオテンシンＩＩ：Ｓａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（Ｒ．Ｋ．Ｔｕｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７２，１７７，１２０３）のようなアンギオテンシンの基質又は阻害剤であるペプチド。
−アンギオテンシンＩ：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ。
【００９０】
ＢＴＭがペプチドである場合、ペプチドの一方又は両方の末端（好ましくは両方の末端）に代謝阻害基（ＭIG）がコンジュゲートされる。このようにして両方のペプチド末端を保護することは、インビボイメージング用途のために重要である。さもないと、急速な代謝の結果としてＢＴＭペプチドに対する選択的結合親和性が失われると予想されるからである。「代謝阻害基」（ＭIG）という用語は、アミノ末端又はカルボキシ末端におけるＢＴＭペプチドの酵素（特にカルボキシペプチダーゼのようなペプチダーゼ）代謝を阻止又は抑制する生体適合性基を意味する。かかる基はインビボ用途のために特に重要であって、これらは当業者にとって公知であり、好適にはペプチドアミン末端に関してはＮ−アシル化基−ＮＨ(Ｃ＝Ｏ)ＲG（式中、アシル基−(Ｃ＝Ｏ)ＲGはＣ1-6アルキル基及びＣ3-10アリール基から選択されるＲGを有するか、或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位を含む。）から選択される。好ましいかかるアミノ末端ＭIG基はアセチル、ベンジルオキシカルボニル又はトリフルオロアセチルであり、最も好ましくはアセチルである。
【００９１】
ペプチドカルボキシル末端に関して好適な代謝阻害基には、カルボキサミド、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、アミノアルコール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位がある。ＢＴＭペプチドのカルボキシ末端アミノ酸残基にとって好適なＭIG基は、アミノ酸残基の末端アミンをＣ1-4アルキル基（好ましくはメチル基）でＮ−アルキル化したものである。好ましいかかるＭIG基はカルボキサミド又はＰＥＧであり、最も好ましいかかる基はカルボキサミドである。
【００９２】
さらに別の態様では、式ＩＶの色素は、好ましくはＲ1基及びＲ基から選択される１個以上（さらに好ましくは１個）のカルボキシアルキル置換基を含んでいる。その結果、色素をＢＴＭに結合するための官能基（カルボキシル）を提供することによって色素は二官能性となる。
【００９３】
シアニン色素を生物学的分子にコンジュゲートするための一般的方法は、Ｌｉｃｈａ  ｅｔ  ａｌ［Ｔｏｐｉｃｓ  Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５７，１０８７−１１０８（２００５）］によって記載されている。本発明で使用するためのペプチド、タンパク質及びオリゴヌクレオチド基質は、末端位置で標識することができ、或いは別法として１以上の内部位置で標識することもできる。蛍光色素標識試薬を用いるタンパク質標識の総説及び例に関しては、“Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７、及び“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  −  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ａｓｌａｍ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｎｔ，Ａ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．（１９９８）を参照されたい。合成ペプチドにおいて部位特異的標識を達成するためのプロトコルが利用できる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。
【実施例】
【００９４】
以下の非限定的な実施例によって本発明を例証する。実施例１は、化合物３に基づく本発明の前駆体組成物の製造を示している。実施例２は、化合物２に基づく本発明の前駆体組成物の製造を示している。実施例３は、化合物７に基づく本発明の中間体組成物の製造を示している。実施例４は、化合物４（Ｃｙ７）に基づく本発明の色素組成物の製造を示している。実施例５は、第２の態様の色素組成物の分析及び精製を行うためのＨＰＬＣ条件を示している。実施例６は貯蔵安定性データを示している。
【００９５】
略語
ＡＣＮ又はＭｅＣＮ：アセトニトリル
ＡｃＯＨ：酢酸
Ａｃ2Ｏ：無水酢酸
ＤＩＰＥＡ；Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＬＣ−ＭＳ：液体クロマトグラフィー質量分析法
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
図１：本発明の特定の化合物
【００９６】
【化１１】
2013532220.tif 000012
【００９７】
【表１】
2013532220.tif 000013
実施例１：１−（ε−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドレニウム−５−スルホネート（化合物３）の製造
【００９８】
【化１２】
2013532220.tif 000014
５−スルホ−２，３，３−トリメチルインドレニンナトリウム塩（Ｉｎｔａ．Ｔｒａｄｅ社から購入、化合物１、１００ｇ、０．３８１ｍｏｌ）を反応器（３Ｌ）に仕込んだ。スルホラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、４００ｍｌ）をそれに添加した。次いで、エチル−６−ブロモヘキソネート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、１４０ｍｌ、０．７６０ｍｏｌ）を混合物に添加した。内容物を撹拌しながら１１０℃に加熱し、反応混合物をこの温度に１６時間保った。次いで、反応混合物を約２５℃に冷却した。酢酸エチル（１Ｌ）を添加した。混合物を１５分間撹拌し、酢酸エチル層をデカントした。フラスコ内の赤褐色の残留物を酢酸エチル（３００ｍｌ×２）で洗浄した。脱イオン水（１Ｌ）を添加し、混合物を１５分間撹拌して透明な溶液を得た。新鮮な酢酸エチル（５００ｍｌ×２）を用いて溶液を再び洗浄した。得られた溶液から、ロータリーエバポレーター上で微量の酢酸エチルを除去した。
【００９９】
上記の溶液に水酸化ナトリウム（３６ｇ、０．９０ｍｏｌ）を添加し、ｐＨを１０〜１２の範囲内に保った（注意：ｐＨ＞１０は反応の完結のために極めて重要である）。反応混合物を７０℃に１時間加熱した。反応混合物をＨＣｌ（６０ｍｌ）で中和し、ロータリーエバポレーター上で水を蒸発乾固した。この物質を真空中３０℃で１６時間乾燥した。上記の乾燥物質にアセトニトリル（９００ｍｌ）を添加した。撹拌しながら、濃塩酸（１２６ｍｌ）をゆっくりと添加した。混合物を約２５℃で１５分間撹拌した。懸濁液を濾過し、９：１のアセトニトリル／濃ＨＣｌ（１００ｍｌ×２）で洗浄し、乾燥した。
【０１００】
濾液を濃縮して粘稠な塊状物とした（注意：完全に乾燥した物質は結晶化するために長い時間を要し、化合物３のイソプロピルカルボキシレートエステルを生成する危険がある）。得られた残留物をイソプロピルアルコール／アセトン（１５０ｍｌ／３５０ｍｌ）の混合物と共に１５分間トリチュレートした（イソプロピルエステルの生成を回避するために混合物を直ちに濾過すべきである）。懸濁液を濾過し、イソプロピルアルコール／アセトン混合物（３０／７０ｍｌ）で洗浄し、真空下５０℃で８時間乾燥した。収量：９０ｇ（６６％）。ＨＰＬＣ純度：（２７０ｎｍで）９５％。
【０１０１】
実施例２：１−エチル−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（化合物２）の合成
【０１０２】
【化１３】
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化合物１（Ｉｎｔａ．Ｔｒａｄｅ社、５０ｇ、０．１９ｍｏｌ）をスルホラン（３５０ｍｌ）中に懸濁し、９０〜１００℃で３０分間加熱して透明な溶液を得た。上記の透明な溶液にヨウ化エチル（３４ｍｌ、２．２ｍｏｌ）を添加した。反応塊の温度を９０〜１００℃に５〜６時間保った。反応塊を約２５℃に冷却し、次いで撹拌しながら酢酸エチル（１Ｌ）中に注いだ。沈殿した固体を濾別し、酢酸エチル（４００ｍｌ）で洗浄した。得られた固体を２５０ｍｌのアセトニトリルと共に６時間トリチュレートし、濾別し、アセトニトリルで洗浄した。新鮮なアセトニトリル（３００ｍｌ）を固体に添加し、混合物を１時間還流した。懸濁液を濾過し、アセトニトリル（５０ｍｌ）で洗浄し、真空下で乾燥して粗生成物を得た。収量：４０ｇ（７８％）。ＨＰＬＣ純度：（２７０ｎｍで）９０〜９３％。
【０１０３】
粗生成物（４０ｇ）を還流温度でメタノール（２０ｍｌ）に溶解した。次いで、混合物を室温（２５℃）に冷却し、一晩（１６時間）撹拌した。混合物を５℃に冷却し、３０分間撹拌した。得られた固体を濾別し、冷メタノール（４０ｍｌ）で洗浄し、真空中４５℃で８時間乾燥した。収量：２５ｇ（６２％）。ＨＰＬＣ純度：（２７０ｎｍで）９８．７％。
【０１０４】
実施例３：１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−６−（Ｎ−フェニルアセトアミド）ヘキサ−１，３，５−トリエニル）−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム（化合物７）の合成
【０１０５】
【化１４】
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Ｎ−［５−（フェニルアミノ）−２，４−ペンタ−ジエニリデン］アニリン一塩酸塩（化合物Ｘ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、８ｇ、２８．０９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１５０ｍｌ）中に懸濁した。無水酢酸（１０．５ｍｌ）、続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４．８ｍｌ、２９．３９ｍｍｏｌ）を添加し、２５℃で１時間撹拌して透明な溶液を得た。次いで、反応混合物を１５℃に冷却した。化合物３（実施例１、５ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル／酢酸混合物（１０ｍｌ／２０ｍｌ）に溶解した溶液を上記の冷溶液に１５分かけて滴下した。滴下の完了後、冷却浴を取り除き、混合物を２５℃で１時間撹拌した。次いで、ロータリーエバポレーター上でアセトニトリルを除去した。残留物を酢酸エチル（１０ｍｌ）で希釈し、得られた混合物を過剰の酢酸エチル（４５０ｍｌ）を含むフラスコ内にゆっくりと注いだ。次いで、混合物を３０分間撹拌した。赤色の懸濁液を濾過し、酢酸エチルで洗浄し、真空中で２時間乾燥した。収量：７ｇ（９０％）。ＨＰＬＣ純度：９３％（５５０ｎｍ）及び８０％（２７３ｎｍ）。
【０１０６】
実施例４：２−（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−７−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−スルホインドリン−２−イリデン）ヘプタ−１，３，５−トリエニル）−１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム（化合物４、Ｃｙ７）の合成
【０１０７】
【化１５】
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化合物７（実施例３、６ｇ、１０．８８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１５０ｍｌ）に溶解した。化合物２（実施例２、３ｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）を酢酸／アセトニトリル（２０／１０ｍｌ）に溶解した溶液を添加した。反応混合物を１５℃に冷却した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２ｍｌ）を１５分かけて滴下した。滴下の完了後、冷却浴を取り除き、混合物を２５℃で１時間撹拌した。次いで、反応塊を過剰の酢酸エチル（６００ｍｌ）を含むフラスコ内に注いだ。混合物を１時間撹拌し、得られた緑色の生成物を濾別し、酢酸エチル（１００ｍｌ）で洗浄し、真空中で乾燥した。乾燥した物質をアセトン（９０ｍｌ）中に懸濁し、室温で一晩撹拌した。次いで、懸濁液を濾過し、アセトン（５０ｍｌ）、続いて酢酸エチル（５０ｍｌ）で洗浄し、真空中で乾燥することで、生成物を緑色の固体として得た。収量：８ｇ（９０％）。（ピーク面積による）ＨＰＬＣ純度：９８．４％（７５０ｎｍ、０．０８５％の化合物７及び０．１５％の対称色素を含む）、１１０．０％（５５０ｎｍ）及び９９．７％（２７３ｎｍ）。
【０１０８】
実施例５：ＬＣ−ＭＳ精製及び分析方法
各試料は、２〜３ｍｇの試料を水（１ｍｌ）に溶解し、溶液を０．２２ミクロンのナイロンフィルターで濾過することで調製した。使用したクロマトグラフィーカラムは、Ｃｏｌｕｍｎ−Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｚｏｒｂａｘ，Ｃ１８，５μ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）であった。検出はフォトダイオードアレイ検出器によった。
【０１０９】
【表２】
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化合物２及び化合物３の保持時間は、それぞれ１３．４分及び１４．４分であった。
【０１１０】
【表３】
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化合物４及び化合物７の保持時間は、それぞれ４．８８分及び４．５９分であった。
【０１１１】
実施例６：化合物４（Ｃｙ７）の貯蔵安定性
本発明の方法によって製造された化合物７（Ｃｙ７）の凍結乾燥試料を貯蔵安定性に関して調べた。データは、暗所において室温で１２ヶ月以上貯蔵した場合の良好な安定性を示している。
【０１１２】
【表４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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