(57)【要約】  核酸を増幅する方法は、内部に空間（３２）を有するマイクロ流体デバイス（１０）を提供するステップを含む。空間（３２）はゲル媒体（５２）で充填される。ＰＣＲ反応を行うための試薬が、空間（３２）内のゲル媒体（５４）のマトリックス内に担持される。核酸を含むサンプルがゲル媒体（５４）と接触する。サンプルは、核酸を細胞の他の成分から事前に分離することなく、細胞全体または細胞溶解物を含む。サンプルからの核酸のＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ試薬を用いて空間内で行われる。【選択図】図２
2013537043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を増幅する方法において、
内部に空間があるマイクロ流体デバイスを提供するステップであって、前記空間がゲル媒体で充填され、ＰＣＲ反応を行うための少なくとも１種の試薬が、前記空間内の前記ゲル媒体のマトリックス内に担持される、ステップと、
核酸を含むサンプルを前記ゲル媒体と接触させるステップと、
少なくとも１種の試薬を用いて、前記空間内で前記サンプルから核酸のＰＣＲ増幅を行うステップと、
を含み、
前記ゲル媒体と接触した前記サンプルが、前記核酸を細胞の他の成分から事前に分離することなく、前記細胞全体または細胞溶解物を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記マイクロ流体デバイス内で前記ＰＣＲ増幅の核酸生成物を分析するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、前記分析するステップが、前記ＰＣＲ生成物の電気泳動分離を行うことを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種の試薬が、ヌクレオシド三リン酸、プライマー核酸、および前記ＰＣＲ反応を行うためのポリメラーゼのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法において、前記ゲル媒体が均一組成を有することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法において、前記少なくとも１種の試薬が、前記ゲル媒体を通して均質に分散されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法において、前記サンプルが口腔綿棒サンプルであることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法において、前記サンプルが血液サンプルであることを特徴とする方法。
【請求項９】
核酸の増幅用のマイクロ流体デバイスにおいて、
ゲル媒体で充填された空間であって、ＰＣＲ反応を行うための少なくとも１種の試薬も収容し、前記少なくとも１種の試薬が前記ゲル媒体のマトリックス内に担持される、空間と、
前記マイクロ流体デバイスの外面から前記空間内の前記ゲル媒体まで延在する開口部と、
を具備し、
前記開口部に、他の細胞成分から核酸を分離するいかなる手段もないことを特徴とするマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
請求項９に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、前記空間と流体連通している流路をさらに具備し、前記流路が、ＰＣＲ反応の核酸生成物を分離する分離媒体を収容することを特徴とするマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
前記少なくとも１種の試薬が、ヌクレオシド三リン酸、プライマー核酸、および前記ＰＣＲ反応を行うためのポリメラーゼのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項９または１０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、前記ゲル媒体が均一組成を有することを特徴とするマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、前記少なくとも１種の試薬が、前記ゲル媒体を通して均質に分散されることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、流路および前記外面から前記流路まで延在するウェルと、前記流路内に提供されかつ任意選択的に部分的に前記ウェル内に広がるゲルと、液体を受け入れる前記ゲルのない液体空間であって、少なくとも部分的に前記ウェル内に位置し、前記液体空間を充填する液体が前記ゲルに接触するように前記ゲルまで広がる液体空間と、少なくとも部分的に前記液体空間にあるように前記ウェル内に受入れ可能である電極とを具備することを特徴とするマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
マイクロ流体デバイスにおいて、流路および前記デバイスの外面から前記流路まで延在するウェルと、前記流路内に提供されかつ任意選択的に部分的に前記ウェル内に広がるゲルと、液体を受け入れる前記ゲルのない液体空間であって、少なくとも部分的に前記ウェル内に位置し、前記液体空間を充填する液体が前記ゲルに接触するように前記ゲルまで広がる液体空間と、少なくとも部分的に前記液体空間内にあるように前記ウェル内に受入れ可能である電極とを具備することを特徴とするマイクロ流体デバイス。
【請求項１６】
マイクロ流体デバイスを操作する方法において、
ゲルを収容する流路を有するマイクロ流体デバイスを提供するステップと、
前記流路に沿って動電学的移動をもたらすように電極を用いて電圧を印加するステップと、
を含み、
前記電極が、前記ゲルのない空間内の導電性液体と接触し、前記液体が前記ゲルと接触することを特徴とする方法。
【請求項１７】
検出装置およびマイクロ流体デバイスを具備するシステムにおいて、前記検出装置が検出手段を有し、前記マイクロ流体デバイスが分析領域を有し、前記検出装置が、少なくとも１つの固定位置決め体と弾性的な付勢に対して移動可能な少なくとも１つの位置決め体とを有し、前記位置決め体が前記マイクロ流体デバイスと接触し、少なくとも１つの付勢された前記位置決め体が、前記マイクロ流体デバイスを前記検出装置に対して所定位置に位置付けるように、前記少なくとも１つの固定位置決め体に対して前記マイクロ流体デバイスを付勢する状態で、前記マイクロ流体デバイスが前記検出装置によって保持可能であり、前記マイクロ流体デバイスが前記の通り保持される時、前記検出手段および前記分析領域が、前記分析領域において検出手段を操作するために相互に位置決めされることを特徴とするシステム。
【請求項１８】
請求項１７に記載のシステムにおいて、前記マイクロ流体デバイスが基礎面を有し、前記検出装置が支持面を有し、前記マイクロ流体デバイスが前記の通り保持される時、前記基礎面が前記支持面に接して位置することを特徴とするシステム。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載のシステムにおいて、前記マイクロ流体デバイスが、矩形状に配置された４つの側縁を有し、前記検出装置が、少なくとも２つの前記固定位置決め体と少なくとも２つの前記弾性的に付勢された位置決め体とを有し、前記マイクロ流体デバイスが前記の通り保持される時、前記少なくとも２つの固定位置決め体が前記側縁のうちの２つの隣接するものに接触し、前記少なくとも２つの弾性的に付勢された位置決め体が、前記４つの側縁のうちの異なる２つの隣接するものと接触することを特徴とするシステム。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のシステムにおいて、前記分析領域が流路を有し、前記流路内で、分析物が前記検出手段によって放出されるビームを用いて検出され、前記ビームの幅が前記流路の幅より大きく、前記マイクロ流体デバイスが前記検出装置によって前記の通り保持される時、前記検出装置に対する前記マイクロ流体デバイスの位置の変動が、前記ビームおよび前記流路の相対的な幅に関して十分に小さく、それにより、前記位置変動が前記流路内の前記分析物の検出に影響を与えないことを特徴とするシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を増幅する方法およびマイクロ流体デバイスと、改善されたマイクロ流体デバイスおよびマイクロ流体デバイスを操作する方法と、検出装置およびマイクロ流体デバイスを備えたシステムとに関する。
【０００２】
国際公開第２０１０／０４１０８８号パンフレットは、マイクロ流体デバイスおよびマイクロ流体デバイスを操作する方法を記載している。マイクロ流体デバイスは、ＰＣＲ反応が行われる反応チャンバを有している。反応チャンバはゲルで充填され、ＰＣＲ反応を行うために必要な試薬は、マイクロ流体デバイスが使用されるまでゲルのマトリックス内に保持される。マイクロ流体デバイスを、使用前に安定形態の試薬とともに保管することができる。マイクロ流体デバイスは、自動化の用途にも適している。マイクロ流体デバイスには、他の細胞成分から増幅対象のＤＮＡを分離するための分離チャンバが設けられている。
【０００３】
本発明の第１態様によれば、核酸を増幅する方法であって、内部に空間があるマイクロ流体デバイスを提供するステップであって、空間がゲル媒体で充填され、ＰＣＲ反応を行うための少なくとも１種の試薬が、空間内のゲル媒体のマトリックス内に担持される、ステップと、核酸を含むサンプルをゲル媒体と接触させるステップと、少なくとも１種の試薬を用いて、空間内でサンプルから核酸のＰＣＲ増幅を行うステップとを含み、ゲル媒体と接触したサンプルが、核酸を細胞の他の成分から事前に分離することなく、細胞全体または細胞溶解物を含む、方法が提供される。
【０００４】
好ましくは、本方法はまた、マイクロ流体デバイス内のＰＣＲ増幅の核酸生成物を分析するステップを含む。たとえば、核酸生成物を、ＰＣＲ生成物の電気泳動分離を行うことによって分析することができる。
【０００５】
サンプルは、口腔綿棒サンプルでも血液サンプルでもよい。
【０００６】
本発明の第２態様によれば、核酸の増幅用のマイクロ流体デバイスであって、ゲル媒体で充填された空間であって、ＰＣＲ反応を行うための少なくとも１種の試薬も収容し、少なくとも１種の試薬がゲル媒体のマトリックス内に担持される空間と、マイクロ流体デバイスの外面から空間内のゲル媒体まで延在する開口部とを備え、開口部に、他の細胞成分から核酸を分離するいかなる手段もない、マイクロ流体デバイスが提供される。
【０００７】
好ましくは、本マイクロ流体デバイスは、空間と流体連通している流路を備え、流路は、ＰＣＲ反応の核酸生成物を分離する分離媒体を収容する。
【０００８】
本発明の第１態様および第２態様の両方に対して、ゲル媒体は、ゲルマトリックス内にヌクレオシド三リン酸、プライマー核酸およびポリメラーゼ酵素のうちの少なくとも１つを含むことができる。好ましくはこれらの試薬のすべてが、ゲル媒体のマトリックス内に担持される。
【０００９】
本発明の第１態様および第２態様の両方に対して、ゲル媒体は、好ましくは均一組成を有する。さらに、ゲル媒体のマトリックス内のＰＣＲ試薬は、好ましくはゲル媒体内で均質に分散される。
【００１０】
本発明の第２態様の特に好ましい実施形態では、本マイクロ流体デバイスは、流路および外面から流路まで延在するウェルと、流路内に提供されかつ任意選択的に部分的にウェル内に広がるゲルと、液体を受け入れる、ゲルのない液体空間であって、少なくとも部分的にウェル内に位置し、液体空間を充填する液体がゲルに接触するようにゲルまで広がる液体空間と、少なくとも部分的に液体空間にあるようにウェル内に受入れ可能である電極とを備える。
【００１１】
本発明の第３態様によれば、マイクロ流体デバイスであって、流路およびデバイスの外面から流路まで延在するウェルと、流路内に提供されかつ任意選択的に部分的にウェル内に広がるゲルと、液体を受け入れるゲルのない液体空間であって、少なくとも部分的にウェル内に位置し、液体空間を充填する液体がゲルに接触するようにゲルまで広がる液体空間と、少なくとも部分的に液体空間内にあるようにウェル内に受入れ可能である電極とを備えるマイクロ流体デバイスが提供される。
【００１２】
本発明の第４態様によれば、マイクロ流体デバイスを操作する方法であって、ゲルを収容する流路を有するマイクロ流体デバイスを提供するステップと、流路に沿って動電学的移動をもたらすように電極を用いて電圧を印加するステップとを含み、電極が、ゲルのない空間内の導電性液体と接触し、液体がゲルと接触する、方法が提供される。
【００１３】
動電学的移動は、電気浸透移動あるいは電気泳動移動または２つの混合を含むことができる。
【００１４】
本発明の第５態様によれば、検出装置およびマイクロ流体デバイスを備えるシステムであって、検出装置が検出手段を有し、マイクロ流体デバイスが分析領域を有し、検出装置が、少なくとも１つの固定位置決め体（ｌｏｃａｔｏｒ）と弾性的な付勢に対して移動可能な少なくとも１つの位置決め体とを有し、位置決め体がマイクロ流体デバイスと接触し、少なくとも１つの付勢された位置決め体が、マイクロ流体デバイスを検出装置に対して所定位置に位置付けるように、少なくとも１つの固定位置決め体に対してマイクロ流体デバイスを付勢する状態で、マイクロ流体デバイスが検出装置によって保持可能であり、マイクロ流体デバイスが上記の通り保持される時、検出手段および分析領域が、分析領域において検出手段を操作するために相互に位置決めされる、システムが提供される。
【００１５】
好ましくは、マイクロ流体デバイスは基礎面を有し、検出装置は支持面を有し、マイクロ流体デバイスが保持される時、基礎面は支持面に接して位置する。
【００１６】
好ましい実施形態では、マイクロ流体デバイスは、矩形状に配置された４つの側縁を有する。検出装置は、固定位置決め体のうちの少なくとも２つと、弾性的に付勢された位置決め体のうちの少なくとも２つとを有している。構成は、マイクロ流体デバイスが検出装置によって保持される時、少なくとも２つの固定位置決め体が側縁のうちの２つの隣接するものに接触し、少なくとも２つの弾性的に付勢された位置決め体が、４つの側縁のうちの異なる２つの隣接するものと接触するようにするものである。
【００１７】
分析領域は流路を有してもよく、その流路内で、分析物が検出手段によって放出されるビームを用いて検出される。この場合、ビームの幅は流路の幅より大きい。マイクロ流体デバイスが検出装置によって保持される時、検出装置に対するマイクロ流体デバイスの位置の変動は、ビームおよび流路の相対的な幅に関して十分に小さく、それにより、位置変動が流路内の分析物の検出に影響を与えない。
【００１８】
以下は、例として、本発明の実施形態のより詳細な説明であり、添付の概略図面を参照している。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、マイクロ流体デバイスの上方からの平面図である。
【図２】図２は、図１の線Ａ−Ａの、図１のマイクロ流体デバイスの断面図である。
【図３】図３は、マイクロ流体デバイスが検出装置によって保持されている間の、図１および図２のマイクロ流体デバイスを示す、上方からの平面図である。
【００２０】
図１に示すように、マイクロ流体デバイス１０は、矩形であり、例えば、長さが約１２０ｍｍ、幅が約６０ｍｍであり得る。図２を参照すると、マイクロ流体デバイス１０は、上部矩形ガラス板１２および下部矩形ガラス板１４から形成されている。上部ガラス板１２の下面１６は、下部ガラス板１４の上面１８に好適な既知の方法によって結合されている。熱結合が好ましい方法である。上部板１２の上面２０は、マイクロ流体デバイス１０の上部外面を形成し、下部ガラス板１４の下面２２は、マイクロ流体デバイス１０の下部外面を形成している。
【００２１】
図２に示すように、上部ガラス板１２の厚さ（図２に示すように高さ）は、下部ガラス板１４の厚さより大きい。例として、上部ガラス板の厚さを３ｍｍとすることができ、下部ガラス板の厚さを１ｍｍとすることができる。
【００２２】
マイクロ流体デバイス１０には、第１ウェル２４、第２ウェル２６、第３ウェル２８および第４ウェル３０が設けられている。ウェル２４、２６、２８、３０の各々は、後により詳細に説明するように、それぞれの電極を受け入れる役割を果たす。図２には、第１ウェル２４が縦（垂直）断面で示されている。図２にもっともよく示すように、各ウェルは、上部板１２の上面２０と下面１６との間を、上部板１２を通して穴あけされた円筒状穴の形態をとっている。第１ウェル２４、第２ウェル２６、第３ウェル２８および第４ウェル３０の各々の直径を約２ｍｍから３ｍｍとしてもよい。
【００２３】
マイクロ流体デバイス１０は、後により詳細に説明するように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅プロセスが行われる内部チャンバ３２も有している。ＰＣＲチャンバ３２は、形状が円柱状であり、上部ガラス板１２および下部ガラス板１４を結合する前に、上部ガラス板１２の下面１６から開始して、円柱状ウェルを上部ガラス板１２内に途中まで穴あけすることによって形成されている。
【００２４】
マイクロ流体デバイス１０はまた、サンプル収集ウェル３４も有している。サンプル収集ウェル３４は、直径が相対的に大きい円柱状上部３６と直径が相対的に小さい円柱状下部３８とを有している。サンプル収集ウェル３４の下部３８は、図２に示すように、上部３６とＰＣＲチャンバ３２との間に延在している。サンプル収集ウェル３４は、最初に、直径が相対的に大きいドリルによって上面２０から上部ガラス板１２内に穴あけすることによって形成される。これにより上部３６が形成される。次に、直径が相対的に小さいドリルを用いて、下部３８を形成するように上部３６とＰＣＲチャンバ３２との間に穴をあける。
【００２５】
マイクロ流体デバイス１０はまた、サンプル移送流路４０および分離流路４２も有している。
【００２６】
図１にもっともよく示すように、サンプル移送流路４０は、第１ウェル２４からＰＣＲチャンバ３２まで、かつＰＣＲチャンバ３２から第２ウェル２６まで延在している。図２に示すように、サンプル移送流路４０は、第１ウェル２４内に直接通じているとともに、ＰＣＲチャンバ３２内にも直接通じている。図面には示さないが、サンプル移送流路４０は、第２ウェル２６内に直接通じている。サンプル移送流路４０の断面寸法は、概して５００マイクロメートル未満となる（ただし、それより大きい直径を使用してもよい）。たとえば、サンプル移送流路４０は、幅が約１００マイクロメートルであり深さが約２０マイクロメートルであり得る。サンプル移送流路４０は、上部板１２および下部板１４が結合される前に、下部板１４の上面１８に適切な断面および寸法の溝を形成することによって形成される。２つの板１２、１４の結合時、上部板１２の下面１６が溝を閉鎖して、サンプル移送流路４０を形成する。
【００２７】
図１に示すように、分離流路４２は、第３ウェル２８から第４ウェル３０まで延在している。分離流路４２は、第３ウェル２８および第４ウェル３０の両方に直接通じている。分離流路４２は、サンプル移送流路４０に対して同様の寸法であり、同様の方法で形成されている。
【００２８】
サンプル移送流路４０および分離流路４２は、２つの流路４０、４２の間の交差部分４３において互いに流体連通している。
【００２９】
さらに、マイクロ流体デバイス１０には４つの電極プラグ４４が設けられており、それらのうちの１つを図２に示す。４つの電極プラグ４４は、好ましくは互いに同一であるが、そうである必要はない。各電極プラグ４４は、電気的に非導電材料から作製されたキャップ４６と、キャップ４６を貫通する電極４８とから形成されている。図２に示すように、キャップ４６は、気密シールを形成するようにウェル２４、２６、２８、３０のうちの１つに挿入することができるように寸法が決められている。
【００３０】
第１ウェル２４、第２ウェル２６、第３ウェル２８および第４ウェル３０、ＰＣＲチャンバ３２、サンプル収集ウェル３４ならびにサンプル移送チャネ４０および分離流路４２の表面に対し、使用中にガラスに核酸が結合するのを低減するためにシラン処理する。シラン処理は、上部ガラス板１２および下部ガラス板１４が互いに結合された後に行う。マイクロ流体デバイス１０を、水で洗浄し空気で乾燥させた後、９０℃の炉で一晩乾燥させる。その後、デバイス１０を、シラン処理が行われるまで乾燥器（ｄｅｓｓｉｃａｔｏｒ）に保持する。（シラン処理試薬を保持するために使用されるガラス製品を扱うために、同様の措置を行う。）イソオクタン（１０００マイクロリットル）を、トリクロロ（１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ）パーフルオロオクチルシラン（１４５マイクロリットル）と混合する。混合物を、マイクロ流体デバイス１０内に圧送し、流路４０、４２およびウェル／チャンバ２４、２６、２８、３０、３２、３４を通して移送する。５分間放置した後、マイクロ流体デバイス内に空気を圧送することによって混合物を除去する。次いで、マイクロ流体デバイス１０を、イソオクタンによって洗浄した後、空気で乾燥させる。最後に、アセトン、次いで空気、次いで水を、マイクロ流体デバイス１０内に圧送する。マイクロ流体デバイス１０を、炉内で１時間乾燥させた後、後述するようにさまざまなゲルで充填する。
【００３１】
まず、サンプル移送流路４０を、アガロースゲル５０で充填する。アガロースゲル５０を形成するために、低融点アガロースを、核酸を含まない水に溶解し、溶液を７５℃で１０分間加熱する。アガロースの最終的な濃度は１．５％（重量対重量）である。アガロースゲル５０を、以下のようにサンプル移送流路４０内に挿入する。まず、第３ウェル２８および第４ウェル３０とともにサンプル収集ウェル３４の上部３６を、ウェル２８、３０、３６の空間の大部分を占有する密嵌合プラグで塞ぐ。その後、ゲルが形成された時、ただしゲルが依然として溶融形態にある間、ゲルを圧力下、第１ウェル２４を通してサンプル移送流路４０内に注入する。このプロセス中、アガロースゲル５０は、サンプル移送流路４０を通って第２ウェル２６まで移動する。サンプル収集ウェル３４が塞がれているという事実を鑑み得ると、アガロースゲル５０は、ＰＣＲチャンバ３２（サンプル移送流路４０と流体連通している）内に入らないか、またはわずかな程度しか入らない。アガロースゲル５０が第２ウェル２６の基部に達すると、注入を停止する。その後、ゲルはサンプル移送流路４０内で固化することができ、第１ウェル２４および第２ウェル２６からゲルを除去する。
【００３２】
次に、分離流路４２をポリエチレンオキシドゲル５２で充填する。ポリエチレンオキシドゲル５２は、核酸を含まないＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液において長時間の撹拌方法によってポリエチレンオキシドを２．５％（重量対重量）の濃度まで混合することにより作製される。ゲル５２を、凝固する前に分離チャンバ４２内に導入する。ポリエチレンオキシドゲル５２を導入するために、第１ウェル２４および第２ウェル２６ならびにサンプル収集ウェル３４をプラグで塞ぐ。次いで、溶融ゲルを、圧力下で、第３ウェル２８を介して分離流路４２内に導入する。このプロセスを、ポリエチレンオキシドゲルが第４ウェル３０の基部に達するまで継続する。ポリエチレンオキシドゲル５２が凝固した後、ゲルを第３ウェル２８および第４ウェル３０から除去する。
【００３３】
ポリエチレンオキシドゲル５２を分離流路４２に導入する間、サンプル移送流路４０および分離流路４２の交差部分４３から、小量のアガロースゲル５０を取り除く。アガロースゲル５０のこの部分は、第４ウェル３０に搬送され、いかなる目的にも役立たない。
【００３４】
この例では、ＰＣＲチャンバ３２を、ＰＣＲを行うために必要な試薬すべて含むゲル５４で充填する。試薬を、ＰＣＲチャンバ３２内のゲル５４のマトリックス内に保持する。試薬は、周知の通り、ＰＣＲ増幅を行うために使用される標準的な試薬である。このため、ＰＣＲ試薬は、ＰＣＲチャンバ３２内に導入されるサンプル核酸の所定部分を増幅するためにプライマーとして作用する核酸配列を含んでいる。試薬はまた、ヌクレオシド三リン酸およびポリメラーゼ酵素も含んでいる。
【００３５】
好ましくは、試薬は、ＰＣＲ反応で生成される核酸フラグメントに結合する色素を含む。色素は、たとえば、蛍光色素、または比色検出用の強度の吸収ピークを有する色素であり得る。色素を用いて、後述するように、ＤＮＡフラグメントの後続する分離中にＰＣＲ反応において生成されるＤＮＡフラグメントの検出が促進される。
【００３６】
所定の例として、ＰＣＲ試薬は以下の成分を含むことができる。右側の列の濃度は、後述するように、ゲルとの１：１の希釈の前の濃度である。
2013537043.tif 000003
【００３７】
ＰＣＲ試薬を含むゲルを、以下のように形成する。低融点アガロースを、核酸を含まない水に３％の濃度（重量対重量）で溶解し、その後、７５℃で１０分間加熱する。ゲルが形成された時、かつゲルが依然として溶融形態にある間、ゲルを、ＰＣＲチャンバ３２において必要な試薬のすべてを含む等しい体積の溶液と混合する（試薬は、溶液に最終的に必要な濃度の二倍で存在している）。完全な混合の後、依然として溶融しているゲルを、ＰＣＲ試薬とともに、サンプル収集ウェル３４の下部３８を通してＰＣＲチャンバ３２内に注入する。ＰＣＲゲル５４は、サンプル移送流路４０に含まれているアガロースゲル５０と接触する。その後、ＰＣＲゲル５４はＰＣＲチャンバ３２内で凝固することができる。
【００３８】
理解されるように、ＰＣＲゲル５４におけるアガロースの最終的な濃度は１．５％（重量対重量）である。
【００３９】
サンプル収集ウェル３４ならびに第１ウェル２４、第２ウェル２６、第３ウェル２８および第４ウェル３０は空のままである。
【００４０】
上述したように、マイクロ流体デバイス１０にゲルおよび試薬が装填されると、マイクロ流体デバイス１０を使用前に約４週間４℃で冷蔵状態に維持することができる。
【００４１】
以下は、マイクロ流体デバイス１０の１つのあり得る使用の、例としての、説明である。この例では、マイクロ流体デバイス１０を用いて、ＤＮＡプロファイリングの目的で口腔綿棒によって得られたヒト細胞に含まれるＤＮＡを増幅する。ＰＣＲゲル５４に含まれるプライマーは、ＤＮＡプロファイリングに使用されるヒトＤＮＡの所定の座を増幅するように選択される。増幅後、ＰＣＲ反応によって生成されたＤＮＡフラグメントを、電気泳動分離法によって分析する。
【００４２】
まず、第１ウェル２４、第２ウェル２６、第３ウェル２８および第４ウェル３０を、好適な導電性緩衝液で充填する。次いで、各ウェル２４、２６、２８、３０内に電極プラグ４４を、図２に示すようにプラグの電極４８が緩衝液内に位置し、プラグのキャップ４６がウェルを封止するように挿入する。電極４８を用いて、後述するようにウェル２４、２６、２８、３０の間に電圧を印加する。
【００４３】
次に、口腔綿棒によりヒト細胞サンプルを取得する。綿棒のサンプル担持端を、切除してサンプル収集ウェル３４内に挿入する。このため、サンプル収集ウェル３４において綿棒の端部にヒト細胞全体があることになる。その後、好適な細胞溶解液を、サンプル収集ウェル３４内に導入する。たとえば、溶解液は、従来のグアニジン溶解液であり得る。溶解液は、綿棒の端部にある細胞を溶解し、溶解液は、細胞溶解物とともに、サンプル収集ウェル３４の下部３８を介してＰＣＲチャンバ３２のＰＣＲゲル５４内に移動する。ウェル３４を封止するために、かつ溶液および細胞溶解物をＰＣＲゲル５４内に押し込むために、サンプル収集ウェル３４内にキャップを挿入することができる。
【００４４】
このプロセス中、ＰＣＲゲル５４は、フィルタとして作用することができ、比較的大きい細胞フラグメントがＰＣＲゲル５４のマトリックス内に入らないようにする。しかしながら、これは必須ではなく、ＰＣＲゲル５４の物理特性によって決まる。
【００４５】
細胞溶解物がＰＣＲゲル５４内に入ると、ＰＣＲ反応を開始することができる。周知の通り、ＰＣＲ反応は、２つまたは３つの異なる温度の間の循環を伴う。現方法では、ＰＣＲチャンバ３２内の温度を、好適な既知の方法によって循環させる。好適な方法は、たとえば国際公開第２０１０／０４１０８８号パンフレットに記載されている。温度循環は、たとえば、ペルチェヒーターによることも、マイクロ波加熱によることもできる。
【００４６】
所望の回数のＰＣＲ温度循環の完了後、ヒトＤＮＡの所望の座が増幅されたことになる。ＰＣＲ生成物ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲチャンバ３２内に保持する。
【００４７】
その後、わずかな量のＰＣＲ生成物ＤＮＡフラグメントを、分離流路４２においてポリエチレンオキシドゲル５２上に装填する。これを達成するために、ＰＣＲ反応によって生成されたＤＮＡフラグメントを、第１ウェル２４、第２ウェル２６、第３ウェル２８および第４ウェル３０に挿入された電極４８に適切な電圧を印加することにより、サンプル移送流路４０と分離流路４２との間の交差部分４３まで電気泳動的に移動させる。
【００４８】
たとえば、第１ウェル２４、第３ウェル２８および第４ウェル３０が０Ｖで一定に保持されている間に、第２ウェル２６に、１，０００Ｖの正の電圧を１５秒間印加することができる。
【００４９】
次に、ＤＮＡフラグメントを、分離流路４２内でポリエチレンオキシドゲル５２において電気泳動的に分離する。これを達成するために、第３ウェル２８が０Ｖに保持され、第２ウェル２６が５００Ｖで保持され、第１ウェル２４が１０００Ｖで保持されている間に、第４ウェル３０に対して、８，５００Ｖの正の電圧を２５分間印加する。
【００５０】
ＤＮＡフラグメントは、交差部分４３から第４ウェル３０に向かって移動する。ＤＮＡフラグメントを、それらが分離流路４２の事前に定義された箇所を通過する際に、既知の方法により、たとえば蛍光測定法または比色定量分析のいずれかによって検出することができる。たとえば、図３に示すように、ＤＮＡフラグメントを、それらが、第４ウェル３０に隣接して位置している分離流路４２の端部に向かって設けられた分析領域５６を通過する際に検出することができる。
【００５１】
上述した方法を、たとえば図３に示す検出装置５８を用いて、自動化方法で容易に行うことができる。検出装置５８は、電極４８に（上述した通りの）必要な電圧を既知の方法で印加するために好適な電子機器（図示せず）を備えている。検出装置５８はまた、電極４８に対する必要な電圧の印加のタイミングを既知の方法で制御するマイクロコントローラ（図示せず）も備えている。さらに、検出装置５８は、（適用可能な場合は色素に結合されている）ＤＮＡフラグメントを、それらがマイクロ流体デバイス１０の分析領域５６を通過する際に検出する、蛍光光度計または比色計等の検出手段を有している。
【００５２】
図３に示すように、検出装置５８は、マイクロ流体デバイス１０の下面２２が配置される上面６０を有している。
【００５３】
さらに、検出装置５８は、第１固定ペグ６２、第２固定ペグ６３、第３固定ペグ６４および第４固定ペグ６５ならびに第１可動ペグ６６および第２可動ペグ６８を有している。第１可動ペグ６６は、第１固定ペグ６２および第２固定ペグ６３に向かってかつそこから離れるように移動可能であり、第２可動ペグ６８は、第３固定ペグ６４および第４固定ペグ６５に向かってかつそこから離れるように移動可能である。第１可動ペグ６６は、第１固定ペグ６２および第２固定ペグ６３の方向にばねによって荷重されている。第２可動ペグ６８は、第３固定ペグ６４および第４固定ペグ６５の方向にばねによって荷重されている。ペグ６２、６３、６４、６５、６６および６８は、図３に示すようにマイクロ流体デバイス１０をペグの間に配置することができるように、間隔が空けられている。第１可動ペグ６６は、マイクロ流体デバイス１０を第１固定ペグ６２および第２固定ペグ６３に向かって付勢する。第２可動ペグ６８は、マイクロ流体デバイス１０を第３固定ペグ６４および第４固定ペグ６５に向かって付勢する。
【００５４】
このように、マイクロ流体デバイス１０は、検出装置５８の上面６０の所定位置に正確に保持される。マイクロ流体デバイス１０の位置の変動は、非常にわずかな程度しか発生する可能性しかない。
【００５５】
上述したように、マイクロ流体デバイス１０がペグ６２、６３、６４、６５、６６、６８の間に位置する時、検出手段（図示せず）は、マイクロ流体デバイス１０の分析領域５６と位置合せされるように、検出装置５８の上に位置決めされる。
【００５６】
検出手段は、ＤＮＡフラグメントを検出するために、分析領域５６を通して光のビーム（または他の電磁放射線）を放出する。ビームは、分離流路４２の幅より広い。このように、マイクロ流体デバイス１０がペグ６２、６３、６４、６５、６６、６８の間に位置する時の、マイクロ流体デバイス１０の位置の非常にわずかな程度の変動は、分析領域５６を通過するＤＮＡフラグメントの検出に影響を与えない。
【００５７】
上述したマイクロ流体デバイス１０および増幅方法から、多数の利点が結果としてもたらされる。
【００５８】
第１に、マイクロ流体デバイス１０および操作方法は、ＰＣＲチャンバ３２内のＤＡＮ増幅の前に、核酸を他の細胞成分から分離する必要がない（ただし、ＰＣＲゲル５４のマトリックスが比較的大きい細胞フラグメントをろ過によって排除する場合、幾分かの分離が任意選択的に発生する可能性がある）。ＤＮＡ増幅に使用されるさまざまな既知のマイクロ流体デバイスは、ＤＮＡを他の細胞成分から分離するために別個のＤＮＡ分離ステップを使用する。こうした分離ステップをなくすことにより、マイクロ流体デバイスの設計および増幅方法の両方が簡略化し、本方法が、それほど熟練していない操作者による自動化された使用に対してより適したものとなる。
【００５９】
第２に、上述したマイクロ流体デバイス１０では、電極４８は導電性緩衝液に浸漬され、導電性緩衝液は、サンプル移送流路４０および分離流路４２においてゲル５０および５２と接触する。これは、電極自体をゲルに直接挿入することに比較して有利であり、それは、電気的接続を改善するためである。電極がゲルに挿入されると、電極は、（概して非導電性である）ゲル自体に部分的に接触し、ゲルのマトリックスにおける導電性液体に部分的に接触する。こうした構成の全体的な電気的接続は十分でない場合がある。
【００６０】
特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱することなく、上述した例に対して多数の変更を行うことができることが理解されよう。
【００６１】
まず、上述したようにサンプル収集ウェル３４内に溶解液を追加する代りに、ＰＣＲゲル５４が溶解剤を含むことができる。この場合、細胞全体がＰＣＲゲル５４内に入り、ゲル５４において溶解する。
【００６２】
サンプルは、口腔綿棒サンプルである必要はない。サンプルは、たとえば血液サンプルであってもよい。
【００６３】
マイクロ流体デバイス１０の幾何学的形状および／または構造は、上述した通りのものである必要はない。請求項に記載する本発明を行うことができるいかなるマイクロ流体デバイスも使用することができる。
【００６４】
任意の好適なＰＣＲ試薬を使用することができる。
【００６５】
上述した例では、ＰＣＲ反応に必要な試薬のすべてが、ＰＣＲゲル５４のマトリックスに含まれている。しかしながら、これは必ずしもそうである必要はない。たとえば、ＰＣＲ反応に必要な試薬の一部を、ＰＣＲゲル５４に組み込むことができ、他を使用時に追加することができる。追加されるいかなる試薬も、溶解液に、またはＰＣＲゲル５４内に細胞を洗い流すために使用される洗浄液に追加することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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