(57)【要約】  本出願のある特定の実施形態は、制御された様式で炭素系電極の活性化を行うための方法を説明し、ここで活性化度は、進行中の該活性化プロセスと同時に観測及び計算される。そのような手法は、電極の再現性を改善することを意図し、電気化学的静電容量、電気化学的移動係数、酵素反応に対する電流応答のパラメータを含み得るがこれらに限定されない。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
センサを製造するための方法であって、
センサ電極及び基準電極を水溶液に暴露するステップ、
該基準電極に対して該センサ電極に電位を印加するステップ、並びに
該センサ電極と該基準電極との間の電気化学的静電容量を測定するステップ、
を含む上記方法。
【請求項２】
所定の電気化学的静電容量値に達したら前記電位を除去するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電位が周期的様式で前記センサ電極に印加される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記周期的様式が、
前記センサ電極が前記水溶液中の電解質とのファラデー反応に実質的に関与する第１の電位レベルに前記電位を設定するステップ、及び
該センサが該水溶液中の電解質とのファラデー反応に実質的に関与しない第２の電位レベルに該電位を設定するステップ、
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記電気化学的静電容量が、前記電位が前記第２の電位レベルにある時に測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記センサ電極が、炭素系電極である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ファラデー型反応を介して前記センサ電極の表面に官能基を導入する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記電位が固定サイクル数印加される方法と比較して、前記センサ電極の前記表面の電気化学的特性の再現性を向上させる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
電気化学的静電容量とは無関係に、電位が固定サイクル数印加される方法と比較して、前記センサ電極の表面の電気化学的特性の再現性を向上させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記電位が周期的様式で前記センサ電極に印加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法により製造されるセンサ。
【請求項１２】
前記センサ電極が、炭素系電極である、請求項１１に記載のセンサ。
【請求項１３】
前記官能基が、前記センサ電極の表面に結合している、請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１４】
前記官能基が、カルボキシル及びキノンの少なくとも一方を含む、請求項１３に記載のセンサ。
【請求項１５】
免疫学的電気化学バイオセンサである、請求項１４に記載のセンサ。
【請求項１６】
制御活性化装置であって、
センサ電極、
基準電極、
該センサ電極及び該基準電極と接触し、その間にある水溶液、並びに
該センサ電極と該基準電極との間の電気化学的静電容量を測定するための手段、
を備える、上記制御活性化装置。
【請求項１７】
前記センサ電極と前記基準電極との間の電気化学的静電容量を測定するための前記手段が、該基準電極への電圧を制御して該センサ電極における電流を測定する、電子測定機器を備える、請求項１６に記載の制御活性化装置。
【請求項１８】
前記センサ電極が、炭素系電極である、請求項１７に記載の制御活性化装置。
【請求項１９】
前記センサ電極の表面に結合した官能基をさらに備える、請求項１８に記載の制御活性化装置。
【請求項２０】
前記センサ電極が、免疫学的電気化学バイオセンサを備える、請求項１９に記載の制御活性化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる、２００９年１１月２３日出願の米国仮特許出願第６１／２６３，７７４号、名称「炭素系電極の制御された電気化学的活性化（ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＥＬＥＣＴＲＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＣＡＲＢＯＮ−ＢＡＳＥＤ  ＥＬＥＣＴＲＯＤＥＳ）」の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、概して、制御された様式で電極の活性化を行うための装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
電気化学において、電極の活性化は、所与の電極の電気化学的特性を改善するプロセスを指す。例えば、活性化は、電気化学反応速度に影響し得る。炭素系電極に対するそのような活性化のための可能な方法の一つは、電気化学的な方法であり、このプロセスは、基準電極と比較して選択された電位で、液体媒体中に電極を設置することを含む。そのような手順は、電極表面を清浄化するとともに、様々な炭素系材料に対して、ファラデー型反応を介してカルボキシル又はキノンを含み得る官能基を導入することが報告されており、それらの反応は、電解質から電極への電子移動が関与する。
【０００４】
報告されている電気化学的活性化手順には、ガラス状炭素電極、熱分解炭素フィルム、及びスクリーン印刷電極が関与する。従来技術は、電気化学的活性化（以降「活性化」と呼ばれる）プロセスを、ある特定の固定（ｆｉｘｅｄ）電位を固定期間作用電極に印加することとして説明している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、電気化学的活性化が、活性化度を評価することができるいくつかの他の測定技術と組み合わされる、方法及び装置を説明する。
【０００６】
本発明のある特定の実施形態において、所与の活性化プロセスの間に、より電気化学的に活性な表面基が導入されると、電気化学的静電容量値が増加し得るため、該方法は、電気化学的静電容量の測定を用いることができる。活性化プロセスは、ある所定の電極静電容量値であってもよい目標活性化度が達成されるまで継続されてもよい。
【０００７】
本発明のある特定の実施形態において、上述のプロセスを実行するために、新規な電極装置が使用され得る。
【０００８】
本発明のある特定の実施形態は、電極の改善された再現性（ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ）に関して、代替方法に勝る利点を提供できる。例えば、電極の静電容量が、電極の電気化学的に利用可能な面積及び表面官能基の数の両方に依存する場合、その所与の静電容量の分布がより狭い電極は、静電容量値がはるかに広い分布を形成する別の電極のグループと比較して、他の電気化学反応でのより良好な再現性を意味し得る。
【０００９】
本発明のある特定の実施形態において、電極は、炭素系電極であってもよく、一方本発明の他の実施形態において、電極は、異なる導電性材料（例えば、金、白金、パラジウム等）を備えてもよい。
【００１０】
本発明の他の特徴及び利点は、添付の図面及び発明を実施するための形態から明らかとなる。上に開示された実施形態の１つ又は複数が、ある特定の代替例に加えて、添付の図を参照して以下でさらに詳細に説明される。本発明は、開示された任意の特定の実施形態に限定されず、本発明は、センサ用途だけではなく、他の用途においても同様に使用され得る。本明細書で使用される場合、「実質的に」とは、成分の少なくとも４０％が、示された種類のものであることを意味するものとする。
【００１１】
本発明は、添付の図を参照しながら以下の発明を実施するための形態を読むことにより、より良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】本発明のある特定の実施形態による、電極装置及びデバイス製造方法の概略図である。
【図１Ｂ】本発明のある特定の実施形態による、電極装置及びデバイス製造方法の概略図である。
【図１Ｃ】本発明のある特定の実施形態による、電極装置及びデバイス製造方法の概略図である。
【図１Ｄ】本発明のある特定の実施形態による、電極装置及びデバイス製造方法の概略図である。
【図１Ｅ】本発明のある特定の実施形態による、電極装置及びデバイス製造方法の概略図である。
【図２】本発明のある特定の実施形態による活性化プロセス中の、時間の関数としてのセンサ電位のグラフである。
【図３】本発明のある特定の実施形態による、活性化サイクルの関数としての実験的実施形態の８個全てのパッドの静電容量のグラフである（注：活性化プロセスは、７回目の測定時に開始した）。
【図４Ａ】本発明のある特定の実施形態による、活性化前のパッドの正規化された（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）静電容量を示すグラフである。
【図４Ｂ】本発明のある特定の実施形態による、活性化後のパッドの正規化された静電容量を示すグラフである。
【図５】本発明のある特定の実施形態による、異なるように活性化された８連（８−ｐｌｅｘ）デバイスのＨＲＰに対する応答を示すグラフである。
【図６Ａ】本発明のある特定の実施形態による、例示的リアルタイム活性化データ（制御活性化（図６Ａ））を示すグラフである。
【図６Ｂ】本発明のある特定の実施形態による、例示的リアルタイム活性化データ（固定サイクル数（図６Ｂ））を示すグラフである。
【図７】本発明のある特定の実施形態による、８連デバイスの、異なる濃度のＨＲＰに対する応答（両対数目盛）を示すグラフである（注：０ｎｇ／ｍｌへの応答に対する０．０１ｎｇ／ｍｌへの応答の比は、約１０である）。
【図８】制御活性化プロトコルと固定サイクル数活性化プロトコルとの間の性能比較を示す表である。
【００１３】
異なる図において同じ数字により参照される本発明の特徴、要素及び態様は、本システムの１つ又は複数の実施形態による、同じ、等価又は同様の特徴、要素又は態様を表す。同様又は同一の様式で図中に示される本発明の特徴、要素及び態様は、例えば複数のそのような特徴、要素及び態様が個々に標示されていない場合であっても、同様又は同一となり得ることが、当業者に理解される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のある特定の実施形態による電極装置は、８パッド電極スクリーン印刷センサを備えていた（「８連デバイス」）。このデバイスは、本発明のある特定の実施形態による活性化プロセスを実証するために使用された。
【００１５】
図１Ａを参照すると、８連デバイスは、まず銀インク接触配線１１０をプラスチックフレキシブル基板上にスクリーン印刷することにより製造され得る。
【００１６】
図１Ｂを参照すると、次いで銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）インクをスクリーン印刷して、基準電極１２０を形成することができる。
【００１７】
図１Ｃを参照すると、次いでカーボンインク（例えば専用インク）をスクリーン印刷して、８センサパッド（作用電極、センサ電極）１３０を形成することができる。
【００１８】
図１Ｄを参照すると、次いで絶縁層１４０をスクリーン印刷して、例えば、検出パッド及び基準電極のみが液体に暴露されるようにすることができる。
【００１９】
図１Ｅを参照すると、次いで８個の開口部を有するプラスチック製上面部１５０をプラスチックの頂部に接着し、液体塗布用の８個の隔離されたウェルを形成することができる。
【００２０】
本発明のある特定の実施形態による電極装置、例えば上述のような８連デバイスは、基準電極へのユーザ定義電圧Ｖ（Ｖ）の設定及び個々のパッド電流Ｉ（Ａ）の測定を可能とする、電子測定機器に接続されてもよい。
【００２１】
図２を参照すると、本発明のある特定の実施形態において、制御活性化は以下の手順により表すことができる。まず、センサを水溶液に暴露することができる。本発明の範囲から逸脱せずに、ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びｐＨ５．０のリン酸−クエン酸緩衝液を含むがこれらに限定されない、任意の数の水溶液を使用することができる。次に、センサへの電位を、図２に示されるような周期的様式で印加することができる。
【００２２】
基準電極の電位に対する活性化電位（Ｖａｃｔ）をある特定期間（Ｔａｃｔ）印加した後、センサが通常電解質とのファラデー反応に関与しない値（Ｖｃｏｎｔｒｏｌ）まで電位を戻すことができ、制御静電容量測定が行われる。最後に、そのまま所定期間（Ｔｗａｉｔ）制御電位に維持した後、静電容量を測定する上で必要十分となる期間（Ｔｍｅａｓｕｒｅ）、微小正弦波をＶｃｏｎｔｒｏｌ付近に重ね合わせることができる。所与の測定において、センサ電位Ｖ（ｔ）及び電流Ｉ（ｔ）の両方を記録することができ、各サイクルの終わりに最後の正弦波を分析することができ、その振幅ｌａｍｐｌ、オフセットｌｏｆｓｔ、及び電圧と電流との間の位相シフト（φ）を計算することができる。次いで、以下の等式により静電容量を推定することができる。
【００２３】
等式１：
【数１】
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【００２４】
式中、Ｖａｍｐｌは、印加電位波の振幅であり、ｆは、周波数である。
【００２５】
活性化サイクルは、静電容量がある所定の目標値Ｃｆｉｎａｌ以上となった時に終了することができる。
【００２６】
本発明のある特定の例示的実施形態において、上述のパラメータの好ましい値は、Ｖａｃｔ＝１．５Ｖ、Ｔａｃｔ＝１秒、Ｖｃｏｎｔｒｏｌ＝０．２Ｖ、Ｔｗａｉｔ＝２秒、Ｔｍｅａｓｕｒｅ＝２秒、ｆ＝１０Ｈｚ、Ｖａｍｐｌ＝０．０１５Ｖに設定され得るが、これらに限定されない。
【００２７】
図３を参照すると、Ｃｆｉｎａｌが６００ｎＦ（例えば、パッドは、その最終静電容量としてこの値を目標とする）に設定されたリアルタイム制御活性化データは、本発明のある特定の実施形態の機能的態様を実証している。具体的には、そのような実施形態の主要な利点は、パッドが同時に目標静電容量値に達することがないことであり、個々のパッドそれぞれに対する活性化プロセス制御の潜在的重要性を強調している。
【００２８】
図４を参照すると、リアルタイムデータに加えて、８連デバイスの静電容量を、本発明のある特定の実施形態の活性化プロセス前後で異なる電圧で測定した。次いで、データを、８個のパッド全ての平均静電容量に正規化した。
【００２９】
本発明のある特定の実施形態に対応する実験の分析は、活性化プロセス前の８個のパッドの最小静電容量のデータセットが、約３．１％の変動係数（ＣＶ％）を有していたことを示している。制御活性化手順後、ＣＶ％は０．４％まで低減され、すなわち、その静電容量値の変動において約８倍の改善が見られた。上述の制御活性化プロセスのアルゴリズムにおけるさらなる改善は、例えば、多数の電極間における静電容量の変動のさらにより大きな低減をもたらし得る。
【００３０】
例えば上述したような本発明のある特定の実施形態による制御活性化手順は、炭素系電極を有する所与の免疫学的電気化学バイオセンサの精度を改善するために使用され得る。以下の例示的実施形態は、モデルシステムとして提供されるＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）酵素センサを説明している。
【００３１】
免疫センサの構築
【００３２】
本発明のある特定のさらなる実施形態による免疫センサは、まず、抗ＨＲＰ抗体を含有するＰＢＳ緩衝液１００μＬに、８連デバイスの各パッドを暴露することにより構築した。次に、いくつかのデバイスをパッド当たり１０００ｎＦに制御活性化し、他のいくつかのデバイスをパッド当たり４００ｎＦに制御活性化し、残りは活性化しなかった（「未処理」静電容量は、パッド当たり約１１５ｎＦであった）。１０００ｎＦより高い静電容量値への活性化は、パッドの劣化、及び望ましくないゼロ対照に対するより高い応答をもたらし得るため、不適切であると思われた。その後、全てのデバイスを室温で２時間放置し、抗体をパッド表面に吸着させた。最後に、全てのデバイスを洗浄し、タンパク質系ブロッキング緩衝液で室温で１時間ブロッキングして、非特異的バックグラウンドを防止した。
【００３３】
活性化後の上述の８連デバイスの免疫センサとしての機能性を実証するために、８連デバイスの８個のパッドを、１０ｎｇ／ｍＬ、３．２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．３２ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０３２ｎｇ／ｍＬ、０．０１０ｎｇ／ｍＬ、０ｎｇ／ｍＬのＨＲＰに暴露し、８個目のパッドが陰性（ゼロ）対照として機能するようにした。標的（ＨＲＰ）による室温で４０分間のインキュベーション後、８連デバイスを洗浄し、流体ウェルを、ＨＲＰの存在下で電気化学的に活性な生成物を生成するテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）系基質で満たした。
【００３４】
図５を参照すると、デバイス応答は、本発明のある特定の実施形態において、１０００ｎＦへの制御活性化が、バックグラウンド信号を非活性化デバイスの場合とほぼ同じ程度に低く維持しながら、最善の感度（より大きい傾き）を提供し得ることを示している。この情報に基づき、以下に記載の実験において、Ｃｆｉｎａｌを１０００ｎＦに設定した。
【００３５】
図６Ａ及び６Ｂを参照すると、本発明のある特定の実施形態による精度改善を実証するために、まず、８連デバイスの各パッドを、抗ＨＲＰ抗体を含有するＰＢＳ緩衝液１００μＬに暴露することにより免疫センサを構築し、次いで、８連デバイスのいくつかを、各パッドに対してＣｆｉｎａｌを１０００ｎＦに設定した制御活性化手順に供した。他の８連デバイスは、平均８連パッド静電容量１０００ｎＦに到達させるように、個々のパッド制御なしに固定サイクル数活性化した。デバイスを室温で２時間放置し、抗体をパッド表面に吸着させた。その後、デバイスを洗浄し、タンパク質系ブロッキング緩衝液で室温で１時間ブロッキングして、非特異的バックグラウンドを防止した。制御活性化プロトコル及び固定サイクル数活性化プロトコルの両方において、ＨＲＰによる６０分間のインキュベーション後の用量応答は、図８に示される典型的データに極めて類似した。
【００３６】
図７を参照すると、本発明のある特定の例示的実施形態による８連デバイスの、異なる濃度のＨＲＰに対する応答データ（両対数目盛）は、０ｎｇ／ｍｌへの応答に対する０．０１ｎｇ／ｍｌへの応答の比が、約１０であることを示した。
【００３７】
精度改善を評価するために、６個の８連デバイスのグループを、１ｎｇ／ｍｌのＨＲＰに暴露した。６個の例示的デバイスのうち、３個を制御活性化手順に供し、他の３個を固定サイクル数活性化した。結果は図８に要約されるが、制御活性化プロトコルに供したグループの全てのパッドの変動係数（ＣＶ％）は、１５．５６％と比較して約２分の１低い７．４１％であったこと、すなわち、精度が非制御グループと比較して２倍厳密であったことを示している。制御活性化方法に対する追加的修正により、免疫センサの精度をさらに改善することが可能となり得ることが、当業者に理解される。
【００３８】
上述の制御活性化プロセスのより大規模な実施形態は、本発明の範囲内である。例えば、炭素系電極を有する電気化学センサの本発明の実施形態は、以下の手順を含み得るが、これらに限定されない。１組のスクリーン印刷炭素系電極を、制御環境チャンバ（例えば３７℃、相対湿度５０％）内に設置し、各センサを、上述の制御活性化手順を実行し得る電子機器に接続する。次に、生体機能化試薬（例えばＰＢＳ緩衝液中の抗体）を含有する溶液を、センサの上に導入し、各センサに対して制御活性化手順を行う。品質管理（ＱＣ）を同時に行い、センサが活性化サイクルのある特定の範囲内で所定のＣｆｉｎａｌ値に達しない場合、このセンサは不良と判断され、次のステップに使用されない。ＱＣステップに合格したセンサは、非特異的結合ブロッキング、センサ領域の隣への乾燥レポーター抗体の設置、電極とプラスチック試料送達カートリッジとの統合、及び統合されたカートリッジの長期保存のための包装を含み得るがこれらに限定されない、次の製造ステップに供される。
【００３９】
上記において、好ましい特徴及び実施形態を参照しながら本発明を説明した。しかしながら、本発明の範囲から逸脱せずに、これらの好ましい実施形態に変更及び修正を行うことができることが、当業者に認識される。例えば、上記において炭素系電極に関連して例示的実施形態を説明したが、本発明はまた、他の導電性材料（例えば、金、白金、パラジウム等）を有する電極にも適用可能であることが、当業者に認識される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2013511716.tif 000005
【図１Ｃ】
2013511716.tif 000006
【図１Ｄ】
2013511716.tif 000007
【図１Ｅ】
2013511716.tif 000008
【図２】
2013511716.tif 000009
【図３】
2013511716.tif 000010
【図４Ａ】
2013511716.tif 000011
【図４Ｂ】
2013511716.tif 000012
【図５】
2013511716.tif 000013
【図６Ａ】
2013511716.tif 000014
【図６Ｂ】
2013511716.tif 000015
【図７】
2013511716.tif 000016
【図８】
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【国際調査報告】
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