(57)【要約】癌の浸潤能を決定するためのインビトロでの診断方法であって、該方法は、癌細胞サンプル中のＭＬＫ４遺伝子発現を測定することを含み、ここでＭＬＫ４遺伝子の過剰発現は、浸潤性の癌、好ましくは結腸直腸、膀胱、乳房、胃、黒色腫、肺、卵巣またはＧＭＢ癌の指標である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでの診断方法であって、患者の腫瘍細胞サンプル材料中のＭＬＫ４遺伝子発現を測定することを含み、ここで前記腫瘍細胞サンプル材料中でＭＬＫ４遺伝子が過剰発現されているという測定結果は、前記腫瘍の浸潤能を示す指標であることを特徴とする、上記診断方法。
【請求項２】
前記ＭＬＫ４遺伝子発現の測定が、ＭＬＫ４タンパク質発現、および／または、ＭＬＫ４をコードする核酸、好ましくはＲＮＡの発現を測定することを含む、請求項１に記載のインビトロでの診断方法。
【請求項３】
前記腫瘍細胞サンプル材料が、生検サンプルである、請求項１または請求項２に記載のインビトロでの診断方法。
【請求項４】
前記生検サンプルが、前記腫瘍細胞サンプル材料の浸潤部分に相当する部分である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のインビトロでの診断方法。
【請求項５】
前記ＭＬＫ４遺伝子発現の測定が、野生型および／または突然変異ＭＬＫ４遺伝子発現を測定することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインビトロでの診断方法。
【請求項６】
前記突然変異ＭＬＫ４遺伝子が、アミノ酸レベルで、Ｈ２６１Ｙ、Ｈ２６１Ｑ、Ｇ２９１Ｅ、Ａ２９３Ｅ、Ｗ２９６Ｓｔｐ、Ｒ４７０Ｃ、Ｒ５５３Ｓｔｐ、Ｒ５５５Ｓｔｐ、Ｎ５９６Ｉ、Ｋ６２９Ｅ、Ｐ８４３Ｓ、Ｈ８９０Ｐ、および、Ｍ８９４Ｔ突然変異から選択される少なくとも１つの体細胞変異を含む、請求項５に記載のインビトロでの診断方法。
【請求項７】
前記突然変異ＭＬＫ４遺伝子が、核酸レベルで、Ｃ７８１Ｔ、Ｃ７８３Ｇ、Ｇ８７２Ａ、Ｃ８７８Ａ、Ｇ８８８Ａ、Ｃ１４０８Ｔ、Ｃ１６５７Ｔ、Ｃ１６６３Ｔ、Ａ１７８７Ｔ、Ａ１８８５Ｇ、Ｃ２７８８Ｔ、Ａ２６６９Ｃ、Ｔ２６８１Ｃ突然変異から選択される少なくとも１つの体細胞変異を含む、請求項５に記載のインビトロでの診断方法。
【請求項８】
前記ＭＬＫ４遺伝子発現の測定が、ＭＬＫ４タンパク質および／またはＭＬＫ４をコードする核酸に選択的に結合することができる試薬を用いて行われ、ここで前記試薬は、直接的または間接的に検出可能な物質で標識されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載のインビトロでの診断方法。
【請求項９】
前記試薬が、ＭＬＫ４タンパク質および／またはそれらの一部に特異的な抗体、または、ＭＬＫ４核酸および／またはそれらのフラグメントに特異的な核酸プローブである、請求項９に記載のインビトロでの診断方法。
【請求項１０】
前記方法が、前記腫瘍細胞サンプル材料中の少なくとも１種のＫＲＡＳ遺伝子の分子の変更を測定することをさらに含み、ここで前記少なくとも１種のＫＲＡＳ遺伝子の変更を測定することは、ＫＲＡＳタンパク質および／またはＲＮＡの発現、および／または、ＫＲＡＳ遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を測定することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のインビトロでの診断方法。
【請求項１１】
（原文脱落）
【請求項１２】
前記腫瘍が、結腸直腸、膀胱、乳房、胃、黒色腫、肺、卵巣またはＧＭＢの腫瘍である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のインビトロでの診断方法。
【請求項１３】
前記突然変異ＭＬＫ４遺伝子の過剰発現を測定することにより、前記患者が、ＥＧＦＲ特異的な結合因子、好ましくはＥＧＦＲ特異的な抗体を用いた治療に対して不応性かどうかの予測が可能になる、請求項５〜１２のいずれか一項に記載のインビトロでの診断方法。
【請求項１４】
ＭＬＫ４のＲＮＡもしくはタンパク質発現の低減または阻害、または、ＭＬＫ４酵素活性阻害剤の使用を含む、ＫＲＡＳ遺伝子におけるヌクレオチド配列に突然変異が含まれる腫瘍を有する患者を治療するための、治療的アプローチ。
【請求項１５】
腫瘍が、ＫＲＡＳ遺伝子によってコードされたタンパク質中に少なくとも１つの突然変異を有し、ここで前記ＫＲＡＳ遺伝子によってコードされたタンパク質の少なくとも１つの突然変異は、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３ＡおよびＧ１３Ｄから選択される、腫瘍の治療に使用するためのＭＬＫ４発現および／またはＭＬＫ４酵素活性のアンタゴニストおよび／または阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の開示は、新規の癌診断および予後マーカーの同定に関する。より具体的に言えば、このような新規のマーカーは、混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）ファミリーに属する。
このマーカーは、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ遺伝子に突然変異を有する腫瘍の治療に関する診断、予後および応答において中心的な役割を果たす。このような腫瘍は、極めて悪い予後と治療応答の欠如を特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
脱制御されたプロテインキナーゼを標的化することは、複数の癌種に有効であることが証明されている。我々はこれまで、キナーゼ遺伝子のハイスループットの突然変異プロファイリングを用いて結腸直腸の腫瘍（ＣＲＣ）における混合系統キナーゼ４（ＭＬＫ４）の体細胞変異を同定した（１）。ＭＬＫ４は、複数種の細胞内シグナル伝達経路を活性化すると考えられれているＭＬＫセリン−スレオニンキナーゼファミリーに属する。これらは、アミノ末端のＳＲＣ−相同ドメイン（ＳＨ３）、それに続いてキナーゼドメイン、ロイシンジッパー領域およびＣｄｃ４２／Ｒａｃ相互作用結合（ＣＲＩＢ）モチーフを有することを特徴とする。全てのＭＬＫのカルボキシル末端はプロリンリッチであるが、上記ファミリーに属する様々なもののなかでも顕著に多様化しており、これは、これらの領域が様々な調節機能に作用する可能性があることを示す。ＣＲＣにおけるＭＬＫ４体細胞変異の発見は、このキナーゼが腫瘍の発生と発達と関連する可能性があることを示す。現在のところ、正常な細胞や新生細胞におけるＭＬＫ４の生化学的および細胞的な特性は何もわかっていない。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の目的は、新規の癌診断および予後マーカーの提供である。
【０００４】
本発明によれば、前記目的は、以下に記載される請求項で具体的に述べられた特徴を有する解決手段によって達成される。従って、特許請求の範囲は、本明細書において本発明に関して提供される技術的な教示の不可欠な部分を形成する。
【０００５】
この目的を達成するために、本発明者等は、癌細胞サンプル材料中のＭＬＫ４遺伝子発現、より具体的にはＭＬＫ４遺伝子の過剰発現を測定することによるインビトロでの診断方法により、癌浸潤の可能性を決定することができることを開発した。
【０００６】
一実施態様において、本発明の開示は、ＭＬＫ４タンパク質発現および／またはＭＬＫ４をコードする核酸、好ましくはＲＮＡの発現を測定することに関する。
【０００７】
さらなる実施態様において、本発明の開示は、生検サンプル中のＭＬＫ４遺伝子の過剰発現を測定することに関し、ここで該生検サンプルは、癌細胞サンプル材料の浸潤部分に相当する。
【０００８】
さらなる実施態様において、本発明の開示は、野生型ＭＬＫ４および／または突然変異ＭＬＫ４遺伝子の発現を測定することに関し、ここで突然変異ＭＬＫ４遺伝子は、ｉ）アミノ酸レベルで、Ｈ２６１Ｙ、Ｈ２６１Ｑ、Ｇ２９１Ｅ、Ａ２９３Ｅ、Ｗ２９６Ｓｔｐ、Ｒ４７０Ｃ、Ｒ５５３Ｓｔｐ、Ｒ５５５Ｓｔｐ、Ｎ５９６Ｉ、Ｋ６２９Ｅ、Ｐ８４３Ｓ、Ｈ８９０Ｐ、および、Ｍ８９４Ｔ突然変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異をコードする少なくとも１つの体細胞変異、または、ｉｉ）核酸レベルで、Ｃ７８１Ｔ、Ｃ７８３Ｇ、Ｇ８７２Ａ、Ｃ８７８Ａ、Ｇ８８８Ａ、Ｃ１４０８Ｔ、Ｃ１６５７Ｔ、Ｃ１６６３Ｔ、Ａ１７８７Ｔ、Ａ１８８５Ｇ、Ｃ２７８８Ｔ、Ａ２６６９Ｃ、Ｔ２６８１Ｃ突然変異から選択される少なくとも１つの体細胞変異を含む。
【０００９】
さらにその他の実施態様において、本発明の開示は、インビトロでの診断方法に関し、ここでＭＬＫ４遺伝子発現の測定は、直接的または間接的に検出可能な物質で標識された、ＭＬＫ４タンパク質および／またはＭＬＫ４をコードする核酸に選択的に結合することができる試薬を用いて行われる。
【００１０】
さらなる実施態様において、本発明の開示は、インビトロでの診断方法に関し、ここでＭＬＫ４遺伝子発現の測定は、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異および発現の測定と組み合わせて行われる。
【００１１】
さらなる実施態様において、本発明の開示は、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異を有する腫瘍を治療的に処置するための手段として、ＭＬＫ４タンパク質発現またはその生化学的な機能を不活性化することに関する。
【００１２】
以下、本発明を添付の図を参照しながら非限定的な例を挙げることによりいくつかの好ましい実施態様に関して詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１は、ヒト腫瘍におけるＭＬＫ４の解析を示す。Ａ）ＣＲＣおよびグリア芽腫におけるＭＬＫ４遺伝子で同定された体細胞変異を示す。Ｂ）中程度に分化した浸潤性結腸直腸癌を示す。サイズと形状が様々な腫瘍の腺状構造をいくつか観察することができる。外側縁（矢印で示される）において、腫瘍細胞は、浸潤を示す膜および膜下の強い染色を示す。矢の先端は、間質に浸潤した腫瘍細胞における強いＭＬＫ４発現がみられる領域を示す。ここで非浸潤細胞は、陰性であるか、または、弱い頭頂部の染色しか示さないことに留意すべきである。Ｃ）Ｂで提示された断片を高倍率で示したものである。Ｄ）所属リンパ節におけるＣＲＣの転移を示す。リンパ節周辺の脂肪組織が転移細胞で浸潤されている。Ｅ）Ｃで提示された断片をより高倍率で示したものである。Ｆ）結腸直腸癌の肝臓への転移を示す。転移性の小節（右側）の外縁にある細胞だけが免疫染色されている。
【図１Ｂ】図１は、ヒト腫瘍におけるＭＬＫ４の解析を示す。Ａ）ＣＲＣおよびグリア芽腫におけるＭＬＫ４遺伝子で同定された体細胞変異を示す。Ｂ）中程度に分化した浸潤性結腸直腸癌を示す。サイズと形状が様々な腫瘍の腺状構造をいくつか観察することができる。外側縁（矢印で示される）において、腫瘍細胞は、浸潤を示す膜および膜下の強い染色を示す。矢の先端は、間質に浸潤した腫瘍細胞における強いＭＬＫ４発現がみられる領域を示す。ここで非浸潤細胞は、陰性であるか、または、弱い頭頂部の染色しか示さないことに留意すべきである。Ｃ）Ｂで提示された断片を高倍率で示したものである。Ｄ）所属リンパ節におけるＣＲＣの転移を示す。リンパ節周辺の脂肪組織が転移細胞で浸潤されている。Ｅ）Ｃで提示された断片をより高倍率で示したものである。Ｆ）結腸直腸癌の肝臓への転移を示す。転移性の小節（右側）の外縁にある細胞だけが免疫染色されている。
【図１Ｃ】図１は、ヒト腫瘍におけるＭＬＫ４の解析を示す。Ａ）ＣＲＣおよびグリア芽腫におけるＭＬＫ４遺伝子で同定された体細胞変異を示す。Ｂ）中程度に分化した浸潤性結腸直腸癌を示す。サイズと形状が様々な腫瘍の腺状構造をいくつか観察することができる。外側縁（矢印で示される）において、腫瘍細胞は、浸潤を示す膜および膜下の強い染色を示す。矢の先端は、間質に浸潤した腫瘍細胞における強いＭＬＫ４発現がみられる領域を示す。ここで非浸潤細胞は、陰性であるか、または、弱い頭頂部の染色しか示さないことに留意すべきである。Ｃ）Ｂで提示された断片を高倍率で示したものである。Ｄ）所属リンパ節におけるＣＲＣの転移を示す。リンパ節周辺の脂肪組織が転移細胞で浸潤されている。Ｅ）Ｃで提示された断片をより高倍率で示したものである。Ｆ）結腸直腸癌の肝臓への転移を示す。転移性の小節（右側）の外縁にある細胞だけが免疫染色されている。
【図１Ｄ】図１は、ヒト腫瘍におけるＭＬＫ４の解析を示す。Ａ）ＣＲＣおよびグリア芽腫におけるＭＬＫ４遺伝子で同定された体細胞変異を示す。Ｂ）中程度に分化した浸潤性結腸直腸癌を示す。サイズと形状が様々な腫瘍の腺状構造をいくつか観察することができる。外側縁（矢印で示される）において、腫瘍細胞は、浸潤を示す膜および膜下の強い染色を示す。矢の先端は、間質に浸潤した腫瘍細胞における強いＭＬＫ４発現がみられる領域を示す。ここで非浸潤細胞は、陰性であるか、または、弱い頭頂部の染色しか示さないことに留意すべきである。Ｃ）Ｂで提示された断片を高倍率で示したものである。Ｄ）所属リンパ節におけるＣＲＣの転移を示す。リンパ節周辺の脂肪組織が転移細胞で浸潤されている。Ｅ）Ｃで提示された断片をより高倍率で示したものである。Ｆ）結腸直腸癌の肝臓への転移を示す。転移性の小節（右側）の外縁にある細胞だけが免疫染色されている。
【図１Ｅ】図１は、ヒト腫瘍におけるＭＬＫ４の解析を示す。Ａ）ＣＲＣおよびグリア芽腫におけるＭＬＫ４遺伝子で同定された体細胞変異を示す。Ｂ）中程度に分化した浸潤性結腸直腸癌を示す。サイズと形状が様々な腫瘍の腺状構造をいくつか観察することができる。外側縁（矢印で示される）において、腫瘍細胞は、浸潤を示す膜および膜下の強い染色を示す。矢の先端は、間質に浸潤した腫瘍細胞における強いＭＬＫ４発現がみられる領域を示す。ここで非浸潤細胞は、陰性であるか、または、弱い頭頂部の染色しか示さないことに留意すべきである。Ｃ）Ｂで提示された断片を高倍率で示したものである。Ｄ）所属リンパ節におけるＣＲＣの転移を示す。リンパ節周辺の脂肪組織が転移細胞で浸潤されている。Ｅ）Ｃで提示された断片をより高倍率で示したものである。Ｆ）結腸直腸癌の肝臓への転移を示す。転移性の小節（右側）の外縁にある細胞だけが免疫染色されている。
【図１Ｆ】図１は、ヒト腫瘍におけるＭＬＫ４の解析を示す。Ａ）ＣＲＣおよびグリア芽腫におけるＭＬＫ４遺伝子で同定された体細胞変異を示す。Ｂ）中程度に分化した浸潤性結腸直腸癌を示す。サイズと形状が様々な腫瘍の腺状構造をいくつか観察することができる。外側縁（矢印で示される）において、腫瘍細胞は、浸潤を示す膜および膜下の強い染色を示す。矢の先端は、間質に浸潤した腫瘍細胞における強いＭＬＫ４発現がみられる領域を示す。ここで非浸潤細胞は、陰性であるか、または、弱い頭頂部の染色しか示さないことに留意すべきである。Ｃ）Ｂで提示された断片を高倍率で示したものである。Ｄ）所属リンパ節におけるＣＲＣの転移を示す。リンパ節周辺の脂肪組織が転移細胞で浸潤されている。Ｅ）Ｃで提示された断片をより高倍率で示したものである。Ｆ）結腸直腸癌の肝臓への転移を示す。転移性の小節（右側）の外縁にある細胞だけが免疫染色されている。
【図２−１】図２は、形質転換、腫瘍増殖および治療応答における腫瘍形成性ＲＡＳとＭＬＫ４との機能的な相互作用を示す。Ａ）ＭＬＫ４野生型および変異対立遺伝子の相対的なキナーゼ活性を示す。相対的なキナーゼ活性を、ＭＬＫ４タンパク質の総量とＡＴＰ消費量との比率計算した。結果を野生型ＭＬＫ４の相対活性を用いて標準化した。Ｂ）野生型および突然変異ＭＬＫ４対立遺伝子でトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞における病巣形成分析を示す。ポジティブコントロールとしてＲａｓ（Ｖ１２）を使用した。＊＊ｐ値≦０．０１；エラーバーは標準偏差を示す。Ｃ）突然変異Ｒａｓ（Ｖ１２）と野生型／突然変異ＭＬＫ４対立遺伝子とでコトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞における病巣形成分析を示す。＊＊ｐ値≦０．０１；エラーバーは標準偏差を示す。
【図２−２】図２続き。Ｄ）指定されたＭＬＫ４変異体を発現するＨＫＥ３癌細胞の生化学的な確認を示す。Ｅ）指定されたＭＬＫ４変異体を発現する異種移植片を有するマウスモデルにおけるＨＫＥ３癌細胞の腫瘍形成を示す。ヌードマウスの体側に細胞を注入し、指定されたタイムポイントで腫瘍増殖を測定した。エラーバーは標準誤差を示す。Ｆ）指定されたＭＬＫ４変異体を発現するＤＫＯ３癌細胞の生化学的な確認を示す。Ｇ）指定されたＭＬＫ４変異体を発現する異種移植片を有するマウスモデルにおけるＤＫＯ３癌細胞による腫瘍形成を示す。ヌードマウスの体側に細胞を注入し、指定されたタイムポイントで腫瘍増殖を測定した。エラーバーは標準誤差を示す。
【図３−１】図３は、ＭＬＫ４突然変異対立遺伝子の浸潤、腫瘍形成および転移能を示す。Ａ）Ａ５４９癌細胞系に、野生型または２種の突然変異ＭＬＫ４を発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。空のベクターまたは指定されたコンストラクトで形質導入された細胞の溶解産物へのウェスタンブロッティングによってＭＬＫ４発現レベルを評価した。浸潤能は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）での刺激がない条件で、または、それで刺激した際にマトリゲルでコーティングされた膜を通過して移動するかどうかによって評価された。＊ｐ値≦０．０５；＊＊ｐ値≦０．０１；エラーバーは標準偏差を示す。Ｂ）異種移植マウスモデルにおける野生型または２種の突然変異ＭＬＫ４を発現するＡ５４９癌細胞による腫瘍形成を示す。ヌードマウスの体側に細胞を注入し、指定されたタイムポイントで腫瘍増殖を測定した。エラーバーは標準誤差を示す。Ｃ）殺す際に、墨を気道潅流することによって肺を標識し、実体顕微鏡下で表面の転移をカウントした。＊＊ｐ値≦０．０１；エラーバーは標準誤差を示す。Ｄ）形質導入されたＤＬＤ１腫瘍細胞系の浸潤能を示す。Ａと同じようにして実験を行った。＊ｐ値≦０．０５；＊＊ｐ値≦０．０１；エラーバーは標準偏差を示す。
【図３−２】図３続き。Ｅ）異種移植マウスモデルにおける野生型または２種の突然変異ＭＬＫ４を発現するＤＬＤ１癌細胞による腫瘍形成を示す。Ｂと同じようにして実験を行った。エラーバーは標準誤差を示す。Ｆ）ＤＬＤ１から誘導された肺表面における転移の解析を示す。Ｃと同じようにして実験を行った。＊＊ｐ値≦０．０１；エラーバーは標準誤差を示す。
【図４−１】図４は、ＭＬＫ４発現のダウンレギュレーションまたは阻害は、ヒト癌細胞の形質転換能および浸潤能を損なうことを示す。Ａ）ＭＬＫ４遺伝子を標的とする２種の独立したＳｈＲＮＡを、異なる腫瘍タイプ由来の複数種の細胞系において（Ａ５４９、Ｃｏｌｏ２０５、ＤＬＤ１、ＨＣＴ１１６）ＭＬＫ４発現をダウンレギュレートするのに使用した。ＭＬＫ４タンパク質の発現レベルをウェスタンブロッティングによって評価した。足場非依存性増殖（軟寒天）分析を、親細胞およびＭＬＫ４ノックダウン／ノックアウト細胞に行った。＊ｐ値≦０．０５；＊＊ｐ値≦０．０１；エラーバーは標準偏差を示す。Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞系のゲノムからＭＬＫ４遺伝子をノックアウトするのに使用したベクターの概略図である。両方のＭＬＫ４対立遺伝子をノックアウト（ＫＯ）するのに連続的ターゲティング法を使用した。Ｌ−ＩＴＲ：左側の逆位末端配列、Ｐ：ネオマイシンプロモーター、Ｎｅｏ：ネオマイシン耐性カセット、ｐＡ：ポリアデニル化配列、Ｒ−ＩＴＲ：右側の逆位末端配列。Ｃ）親細胞およびノックアウトＨＣＴ１１６細胞におけるウェスタンブロッティングによって評価されたＭＬＫ４タンパク質の発現レベルを示す。
【図４−２】図４続き。Ｄ）親細胞およびＭＬＫ４ノックダウンまたはＫＯ細胞の浸潤能は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）での刺激がない条件で、または、それで刺激した際にマトリゲルでコーティングされた膜を通過して移動するかどうかによって評価された。＊ｐ値≦０．０５；＊＊ｐ値≦０．０１；エラーバーは標準偏差を示す。Ｅ）コントロールおよびＭＬＫ４ノックダウンＤＬＤ１癌ヌードマウスの体側に細胞を注入し、指定されたタイムポイントで腫瘍増殖を測定した。エラーバーは標準誤差を示す。Ｆ）コントロールおよびＭＬＫ４ノックアウトＨＣＴ１１６癌ヌードマウスの体側に細胞を注入し、指定されたタイムポイントで腫瘍増殖を測定した。エラーバーは標準誤差を示す。
【図５−１】図５は、ＭＬＫ４阻害のＫＲＡＳ−ＥＲＫシグナル伝達経路に与える作用を示す。Ａ）親細胞およびＭＬＫ４ノックアウト細胞において、血清の非存在または存在下でＣ−ＲＡＦのＲＡＳ結合ドメインを用いたプルダウン分析によって評価された「活性」（ＧＴＰ結合）ＲＡＳの測定を示す。サンプルローディングのためにトータルＲＡＳを参照として用いた。Ｂ）ＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／２キナーゼリン酸化レベルの生化学解析を示す。細胞溶解産物を指定された抗体を使用したウェスタンブロッティングで処理した。
【図５−２】図５続き。Ｃ）ｐ３８、ＳＡＰＫ／ＪＮＫおよびＡＫＴキナーゼリン酸化レベルの生化学解析を示す。細胞溶解産物を指定された抗体を使用したウェスタンブロッティングで処理した。Ｄ）親細胞、ＭＬＫ４ノックアウトおよび突然変異ＫＲＡＳノックアウトＨＣＴ１１６細胞における、ＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／２キナーゼリン酸化レベルの比較を示す。Ｅ）親細胞およびＭＬＫ４ノックアウトＨＣＴ１１６細胞においてウエスタンブロット解析によって検出されたＳＨＣおよびＧｒｂ２アダプタータンパク質の発現レベルの解析を示す。
【図６】Ａ）野生型および突然変異ＭＬＫ４で形質導入されたＡ５４９およびＤＬＤ１細胞の細胞増殖速度を示す。エラーバーは標準偏差を示す。Ｂ）親細胞およびＭＬＫ４ＫＯＨＣＴ１１６癌細胞の細胞増殖率を示す。＊ｐ値≦０．０５；＊＊ｐ値≦０．０１；エラーバーは標準偏差を示す。Ｃ）この研究に係るＭＬＫ４シグナル伝達経路の概略図を示す。
【図７】結腸直腸癌細胞系ＤｉＦｉに、野生型または２種の突然変異ＭＬＫ４およびＲＡＳＶ１２を発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。指定された細胞系を、０．１μｇ／ｍｌのセツキシマブ（エルビタックス）で７２時間処理し、その後、細胞生存率をＡＴＰ分析によって評価した。示された結果は、未処理細胞に標準化した値である；＊＊＊ｐ値≦０．００１；エラーバーは標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ここで、いくつかの好ましい実施態様に関して非限定的な例を挙げながら本発明を詳細に説明する。
【００１５】
以下の説明において、実施態様をより十分に理解するために多数の具体的な詳細を示す。実施態様は、このような具体的な詳細の１またはそれより多くがなくても実施することができ、または、他の方法、構成要素、材料などを用いて実施することもできる。その他の例において、よく知られている構造、材料または操作については、実施態様の曖昧な点を回避するために詳細な図示や説明を省略する。
【００１６】
本明細書で示される項目は単なる便宜上のものであり、実施態様の範囲または意味と解釈されない。
【００１７】
我々は、腫瘍サンプルの分子解析と生化学的および機能的なアプローチとを併用することで、癌細胞におけるＭＬＫ４の役割を評価した。我々は、以下の２つの相補的な方法：（ｉ）野生型および突然変異ＭＬＫ４対立遺伝子の異所性発現（順遺伝学）、および、（ｉｉ）正常な細胞系および癌細胞系における、ＭＬＫ４遺伝子のｓｈＲＮＡ介在ダウンレギュレーションまたは体細胞遺伝子ノックアウト（ＫＯ）を用いたＭＬＫ４発現の標的化（逆遺伝学）を使用した。
【００１８】
膀胱、乳房、胃、黒色腫、肺、卵巣およびグリア芽腫（ＧＢＭ）サンプルなどの複数の腫瘍タイプでＭＬＫ４遺伝子のコード領域の突然変異プロファイリングを行った（表１）。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
我々は、これまで報告されているものに加えて（１）、ＧＢＭにおいてＭＬＫ４遺伝子に影響を与える新規の体細胞変異を見出した（図１Ａ）。全体的にみれば、ＣＲＣおよびＧＢＭにおける突然変異の頻度は、それぞれ９／１９２（５％）および４／１４０（３％）であった。非同義的な突然変異の多くは進化的に保存されたアミノ酸を含み、そのうちいくつかは複数回影響を受けている。加えて、他のプロテインキナーゼにおいて、このような突然変異の一部がこれまでに病因であることがわかっているアミノ酸に発生していた（１）。さらにＣ末端のアルギニンＲ５５３とＲ５５５に影響を与える２つのナンセンス突然変異が同定された。後者の短縮型突然変異は、推定上のＣ末端阻害ドメインが除去されることによってＭＬＫ４の機能に影響を与える可能性がある。最終的に、キナーゼドメインに存在するナンセンス突然変異（Ｗ２９６停止）は、「ドライバー」突然変異ではなく「パッセンジャー」の作用を有する可能性がある。
【００２１】
体細胞変異以外のメカニズムによってＭＬＫ４の脱制御が起こるかどうかを評価するために、我々は２種のポリクローナル抗体を開発し、それらを用いてＣＲＣサンプルにおけるＭＬＫ４の発現パターンを測定した。３８個のＣＲＣパネルに免疫組織化学的（ＩＨＣ）解析を行った。その結果から、ほとんどの腫瘍が、ＭＬＫ４を低いレベルかまたは検出不可能なレベルでしか発現しなかったことが実証された。しかしながら、９つのＣＲＣサンプル（２４％）が明らかなＭＬＫ４陽性を示し、これは、腫瘍の浸潤部分に限定されていることから極めて示差的である（図１Ｂ）。一般的に、強く染色された腫瘍細胞の領域において、間質に浸潤していることが観察された（図１Ｃ）。それに対して、非浸潤細胞は、陰性であるか、または極めて弱い発現シグナルしか示さなかった。１つのサンプルごとに、原発腫瘍に加えてリンパ節転移と肝臓転移を入手した（図１Ｄ〜Ｆ）；その両方においても、ＭＬＫ４発現は腫瘍の浸潤部分に限定されていた。ＤＮＡ配列解析から、発現の増加を示したＣＲＣサンプルにおいてＭＬＫ４遺伝子が体細胞変異したことは排除された。ＭＬＫ４発現パターンから、腫瘍浸潤においてＭＬＫ４が中心的な役割を果たすことが示される。
【００２２】
安定してＭＬＫ４野生型ｃＤＮＡ、および、ＣＲＣ配列解析スクリーンで同定された突然変異対立遺伝子、具体的にはＨ２６１Ｙ、Ｇ２９１ＥおよびＲ４７０Ｃのうちの２種を形質導入するようにレンチウイルスベクターを加工した（表１）。ヒスチジン２６１は２通りに突然変異していることがわかっているため（Ｈ２６１ＹおよびＨ２６１Ｑ）、Ｈ２６１Ｙをさらなる研究のために選択した。Ｇ２９１Ｅ対立遺伝子は複数の腫瘍で見出されるＢＲＡＦＶ６００Ｅ腫瘍形成性突然変異に相当する領域に存在することから、Ｇ２９１Ｅ対立遺伝子を選択した（２）。２つの独立したＣＲＣサンプルにおいてこのＲ４７０Ｃ変異が同定されていることから、Ｒ４７０Ｃ対立遺伝子を選択した（表１）。
【００２３】
野生型および突然変異ＭＬＫ４の触媒活性を評価するために生化学的なインビトロでの分析を使用した。これらの実験のレシピエントとして、我々は、ＭＬＫ４遺伝子が遺伝学的に不活性化され、その結果として内因性ＭＬＫ４タンパク質が欠如している結腸直腸癌細胞を使用した（以下の図４Ｂを参照）。これらの細胞に、野生型またはＨ２６１Ｙ、Ｇ２９１ＥおよびＲ４７０ＣＭＬＫ４変異を形質導入した。突然変異ＭＬＫ４タンパク質は、それに相当する野生型と比較してキナーゼ活性の増加を示した（図２Ａ）。
【００２４】
続いて我々は、順遺伝学的方法と逆遺伝学的方法の両方を用いて、腫瘍形成に関連する細胞表現型におけるＭＬＫ４の役割を確立しようとした。我々はまず、標準的なＮＩＨ３Ｔ３病巣形成分析を使用して野生型および突然変異ＭＬＫ４対立遺伝子の形質転換能を評価した。ポジティブコントロール（ＲＡＳ Ｇ１２Ｖ）は高効率で病巣形成を促進することができるが、野生型または突然変異ＭＬＫ４を使用した場合、作用は観察されなかった（図２Ｂ）。これらの結果から、野生型および突然変異ＭＬＫ４対立遺伝子そのものは細胞の形質転換を支援することができないことが示唆される。それとは逆に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において突然変異ＭＬＫ４をＲＡＳの腫瘍形成性バージョン（Ｇ１２Ｖ）とコトランスフェクションしたところ、病巣形成における顕著な相乗効果が観察された（図２Ｃ）。野生型ＭＬＫ４ではなく２種の突然変異体（Ｇ２９１ＥおよびＲ４７０Ｃ）が、ＲＡＳ Ｇ１２Ｖの形質転換能を高めたことが重要である。
【００２５】
この挙動は、他の腫瘍遺伝子の協力がある状態で評価した場合にだけ形質転換能が検出可能になる他の癌遺伝子（例えばポケモン（Pokemon））を連想させる（３）。
【００２６】
ＫＲＡＳ介在腫瘍形成におけるＭＬＫ４の役割をさらに評価するために、我々は、突然変異ＫＲＡＳ対立遺伝子が相同組換えによって破壊された腫瘍形成性のヒト結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ１１６の同質遺伝子型の変異体（ＨＫＥ３）を使用した（４）。従って、ＨＫＥ３細胞は、突然変異ＭＬＫ４対立遺伝子は、腫瘍形成性ＫＲＡＳの発癌性の表現型を獲得できるかどうかを確立するための適切なモデルである。形質転換分析においてＲＡＳと協同するＨＫＥ３発現野生型または突然変異ＭＬＫ４（Ｇ２９１ＥおよびＲ４７０Ｃ）（図２Ｄ）をヌードマウスの皮下に注射した。空のベクターを発現する細胞をコントロールとして使用した。植え付けから２週間後、空のベクターまたは野生型ＭＬＫ４で形質導入されたＨＫＥ３細胞は、腫瘍を生成しなかった（図２Ｅ）。それとは逆に、Ｇ２９１ＥおよびＲ４７０Ｃ突然変異ＭＬＫ４を植え付けたマウスは、２週間以内に皮下に腫瘍を発達させた。突然変異ＭＬＫ４対立遺伝子は、突然変異ＫＲＡＳが欠失した癌細胞の発癌性の表現型を獲得するという観察から、ＭＬＫ４は同じ経路において重要な役割を果たすという概念が裏付けられる。
【００２７】
我々は、この観察結果を異なる細胞系で確認するために、相同組換えによって突然変異ＫＲＡＳ対立遺伝子が破壊されたその他の高度な腫瘍形成性を有するヒト結腸直腸癌細胞系（ＤＬＤ−１）の同質遺伝子型の変異体（ＤＫＯ３）を使用した。ＭＬＫ４突然変異対立遺伝子で形質導入されたＤＫＯ３細胞で類似のインビボでの実験を行ったところ、それと同様の結果が得られた（図２Ｆ〜Ｇ）。
【００２８】
ヒト癌におけるＫＲＡＳ経路の重要な役割はさらに、ＫＲＡＳが変異した結腸直腸の腫瘍は、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体のセツキシマブ（エルビタックス（Erbitux））およびパニツムマブ（ベクティビックス（Vectibix））には応答しないという発見でさらに確認されている（５、ＷＯ−Ａ−２００８／１１２２７４）。これらの発見はすぐに病院に伝えられ、現在では日常的にセツキシマブ治療が適した患者を選択するのにＫＲＡＳ突然変異の検出が使用されている。我々はこれまで、突然変異したＫＲＡＳおよびＢＲＡＦの異所性発現は、結腸直腸癌細胞のセツキシマブおよびパニツムマブに対する応答を損なうことを報告してきた（６，７）。我々は、ＭＬＫ４がＫＲＡＳ下流で作用する場合、ＭＬＫ４の腫瘍形成が活性化されることによっても、セツキシマブの作用を損なう可能性があることを論証した。
【００２９】
この仮説を試験するために、我々は、ナノモル濃度のセツキシマブで阻害されるＤｉＦｉ結腸直腸癌細胞系を使用した。ＤｉＦｉ細胞において、ＫＲＡＳ経路は、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅／過剰発現によって活性化される。ＤｉＦｉ細胞は、ＭＬＫ４については野生型であり、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＰＴＥＮ突然変異を有することから、我々の実験にとって適切なモデルの一つである。ＤｉＦｉ細胞で野生型または突然変異ＭＬＫ４タンパク質を発現させ、ポジティブコントロールとして突然変異したＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）を使用した。突然変異ＭＬＫ４またはＫＲＡＳ対立遺伝子を発現する細胞をセツキシマブで処理したところ生存率が著しく増加ことから、これらの細胞のこのモノクローナル抗体に対する感受性は低かった（図７）。
【００３０】
これらのデータから、腫瘍形成性のＭＬＫ４の存在は、ＥＧＦＲ標的化療法に対する耐性を付与することにおいてＫＲＡＳ突然変異と置き換えられることが示され、これは、ＫＲＡＳおよびＭＬＫ４は同じシグナル伝達経路に関与するという概念を裏付けるものである（図６Ｄ）。
【００３１】
続いて我々は、浸潤性増殖におけるＭＬＫ４対立遺伝子の役割、転移形成を引き起こす遺伝学的プログラムの評価を試みた。この仮説を正式に試験するため、我々は、野生型または突然変異ＭＬＫ４の異所性発現が癌細胞（Ａ５４９およびＤＬＤ１）の浸潤性に影響を与えるかどうかを評価した。標準的な増殖培地中でのマトリゲルのボイデンチャンバー分析によって測定したところ、野生型および突然変異ＭＬＫ４はどちらも、細胞浸潤に軽度の影響を与えた。続いて我々は、これまでに癌細胞の浸潤性増殖の特性に関連が示されている肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）で刺激を与えた際の侵入を評価した。ＨＧＦの存在下で、突然変異ＭＬＫ４対立遺伝子（Ｇ２９１ＥおよびＲ４７０Ｃ）双方の発現によって、形質導入されていない細胞または野生型ＭＬＫ４を発現する細胞と比較して浸潤が著しく増加した（図３Ａおよび３Ｄ）。ＭＬＫ４によって促進された細胞増殖が増加した浸潤能に寄与したのかかどうかを決定するために、細胞増殖率を解析した。ＭＬＫ４の異所性発現は増殖に影響を与えなかった（図６Ａ）。
【００３２】
ＭＬＫ４突然変異の腫瘍形成能をさらに評価するために、野生型ＭＬＫ４、Ｇ２９１ＥおよびＲ４７０Ｃ突然変異体を発現するＡ５４９およびＤＬＤ１細胞をヌードマウスの皮下に注入した。空のベクターを発現する細胞をコントロールとして使用した。野生型または突然変異ＭＬＫ４細胞を植え付けたマウスは、３週間以内に皮下に腫瘍を発達させた。突然変異ＭＬＫ４で形質導入されたＡ５４９およびＤＬＤ１細胞はいずれも、コントロール細胞と比較してより大きい腫瘍を発生させた（図３Ｂおよび３Ｅ）。続いて、ＭＬＫ４を過剰発現する腫瘍を有するマウスの肺における転移形成を定量した。我々は、Ａ５４９およびＤＬＤ１モデルの両方において、突然変異ＭＬＫ４を発現する腫瘍ではコントロールと比較して転移の数が増加したことを見出した（図３Ｃおよび３Ｆ）。
【００３３】
これらのことを総合して考えると、順遺伝学的アプローチから、突然変異ＭＬＫ４対立遺伝子は、形質転換および浸潤において腫瘍形成性ＫＲＡＳと協力するかまたはそれに置き換わり、転移形成を促進することが示される。
【００３４】
相補的アプローチとして、逆遺伝学を使用して、ＭＬＫ４遺伝子の発現の減少または欠如が癌細胞の腫瘍形成性にどのようにして影響を与えたのかを評価した。我々はまず、ＭＬＫ４配列を標的化してその発現効率的なダウンレギュレーションを引き起こすｓｈＲＮＡを同定した。例えば順遺伝学的アプローチで利用されている細胞形などの結腸および肺癌から誘導された複数種の細胞系におけるＭＬＫ４発現の減少における効率に基づいて、２種の独立したＭＬＫ４ ｓｈＲＮＡを選択した（図４Ａ、上のパネル）。我々はまず、腫瘍性の表現型の主要な特徴である足場非依存性増殖に対するＭＬＫ４ダウンレギュレーションの作用を調査した。全ての癌細胞系の足場非依存性増殖は、有意に減少するかまたはほぼ完全に阻害された（図４Ａ）。
【００３５】
ｓｈＲＮＡ介在ダウンレギュレーションに基づく実験は、非特異的遺伝子を標的化してしまうため誤った結果を生じる可能性がある。従って我々は、ＨＣＴ１１６細胞からエキソン１（ＭＬＫ４キナーゼドメインが存在する）を欠失させて、永久的にＭＬＫ４発現が阻害された細胞を生成するために相同組換えを使用した（図４Ｂ）。二工程での遺伝学的方法を使用して第一のヘテロ接合型を得て、続いてＭＬＫ４遺伝子座の両方の対立遺伝子が正確に標的化される同型接合型細胞を得た。ノックアウト（ＫＯ）細胞は生存可能であったが、ＰＣＲおよび抗ＭＬＫ４抗体を用いた免疫ブロッティングによって確認したところ依然としてＭＬＫ４発現がなかった（図４Ｃ）。ｓｈ介在ＭＬＫ４サイレンシングを用いて得られた結果を立証し確認したところ、ＭＬＫ４ノックアウト細胞の軟寒天での増殖能は著しく損なわれた（図４Ａ）。同様に、ノックダウンおよびノックアウトＭＬＫ４細胞の浸潤能も劇的に損なわれた（図４Ｄ）。
【００３６】
続いて我々は、インビボでの結腸直腸癌細胞における腫瘍形成能へのＭＬＫ４発現の減少または阻害の作用を決定した。この目的を達成するために、我々は、活性化されたＫＲＡＳ腫瘍遺伝子の単一コピーを含むＤＬＤ１およびＨＣＴ１１６という２種の結腸直腸癌細胞系を活用した。ＭＬＫ４ノックダウン細胞とスクランブル化したｓｈＲＮＡを形質導入した該細胞とを異種移植実験における増殖能に関して評価した。ヌードマウスに植え付けた場合、ＤＬＤ１コントロール細胞は急速に固形腫瘍を形成したが、ＭＬＫ４ノックダウン細胞はそうではなかった（図４Ｅ）。これらの結果を独立して確認するために、我々は、ＭＬＫ４が遺伝学的に欠失したＨＣＴ１１６細胞を使用した。異種移植実験によれば、ＭＬＫ４発現が欠如した癌細胞は、実質的には皮下の腫瘍を形成することができないが、それに相当する同質遺伝子型の野生型細胞は迅速に成長し大きい腫瘤を形成することが示された（図４Ｆ）。
【００３７】
ＲＡＳシグナル伝達におけるＭＬＫ４の役割に対するメカニズム的な見識を得るために、我々は、構成的に活性なＫＲＡＳを有する野生型およびＭＬＫ４ノックアウトＨＣＴ１１６細胞を利用した（Ｇ１３Ｄ）。ＭＬＫは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路によってシグナル伝達を調節するセリン／スレオニンプロテインキナーゼであることが報告されていた。我々は、ＭＬＫ４の欠如は、ＫＲＡＳ−ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードの異なる工程に影響を与える可能性があると考察した。我々はまず、「活性」（ＧＴＰ結合）ＫＲＡＳのレベルとその下流エフェクターＭＥＫ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８およびＡＫＴ活性化（リン酸化）のレベルとを解析した。
【００３８】
我々は、ＭＬＫ４の非存在下において、活性（ＧＴＰ結合）ＲＡＳの量およびＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化レベルは減少したことを見出した（図５Ａおよび５Ｂ）。ＭＬＫ４の非存在はＪＮＫ、ｐ３８およびＡＫＴのリン酸化レベルに影響を与えなかった（図５Ｃ）。注目すべきことに、ＨＣＴ１１６細胞において、ＭＬＫ４ノックアウトまたは突然変異ＫＲＡＳの欠失は、同様にＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化の減少を引き起こした（図５Ｄ）。興味深いことに、ＭＬＫ４ノックアウト細胞におけるＫＲＡＳ−ＭＡＰＫ活性化の減少は、ＲＡＳシグナル伝達カスケードの２種の既知の増幅因子のＳＨＣの比較的低い発現とそれほどではないがＧｒｂ２の発現を伴う（図５Ｅ）。
【００３９】
腫瘍形成促進におけるＫＲＡＳ−ＭＬＫ４の協力を示す機能的な実験を共に考慮すると、これらの結果から、腫瘍形成性のＫＲＡＳによって活性化された主要なシグナル伝達の軸（ＥＲＫ／ＭＡＰＫカスケード）は、ＭＬＫ４キナーゼの非存在下で損なわれることが示される（図５Ｆ）。
【００４０】
ＭＡＰＫ活性化によって起こる主要な生物学的な結果は、細胞増殖の誘導である。それゆえに我々は、親細胞およびノックアウトＭＬＫ４細胞の増殖速度を評価し、ＭＬＫ４の非存在は、ＨＣＴ１１６細胞の増殖に影響することを見出した（図６Ｂ）。これらの発見は、ＭＬＫ４は突然変異ＫＲＡＳに依存する細胞の増殖に関与するという概念をさらに裏付けるものである。
【００４１】
この研究は、ＣＲＣおよびＧＢＭにおいてＭＬＫ４は体細胞変異しているという発見によって促された。近年、２１％のマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の結腸直腸腫瘍で関連ＭＬＫ３キナーゼの突然変異が検出された（８）。我々がＭＬＫ４エキソンを配列解析したところ、これまで３０ＭＳＩ結腸直腸腫瘍において体細胞変異が検出されていたが、突然変異はまったく発見されなかった。
【００４２】
ＭＬＫ４およびＫＲＡＳの突然変異対立遺伝子は、協力して細胞形質転換を開始させるように作用し、突然変異ＭＬＫ４は、突然変異ＫＲＡＳが欠失した細胞の腫瘍形成能を獲得する。総合的に考察すると、これらの発見は、ＫＲＡＳ介在腫瘍形成におけるＭＬＫ４の関与を示唆している。興味深いことに、ＭＬＫ４のノックダウンまたはノックアウトは、突然変異したＫＲＡＳを有する癌細胞の増殖を阻害する。
【００４３】
我々およびその他の研究者は、これまでＨＣＴ１１６癌細胞において相同組換えによりＭＥＴ、ＫＲＡＳおよびＰＩＫ３ＣＡ腫瘍遺伝子を標的化してきた。これら腫瘍遺伝子のそれぞれを標的化することによりそれぞれ別個の生物学的な表現型が生じるが、腫瘍形成の阻害を起こしたのは突然変異したＫＲＡＳおよびＭＬＫ４の欠失だけである。
【００４４】
結論として、これらのデータによって、ＭＬＫ４キナーゼが、目下創薬的価値があるヒト腫瘍遺伝子であるＫＲＡＳの新規のエフェクターであることが確認される（図６Ｃ）。ＭＬＫ４キナーゼの薬理学的な標的化は容易であり、ＫＲＡＳが突然変異した腫瘍のための新規の治療可能性を提供する。
【実施例】
【００４５】
材料および方法
突然変異解析
ＰＣＲプライマーをプライマー３（Primer 3）（http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/ primer3/primer3_www.cgi）を用いて設計し、インビトロジェン/ライフ・テクノロジーズ社（Invitrogen/Life Technologies, Inc., 英国ペーズリー）によって合成した。表２にＰＣＲおよび配列解析プライマーを列挙した。
【００４６】
表２
【００４７】
【表２】
2013528394.tif 000003
【００４８】
選択されたエキソンとスプライシングドナーおよびアクセプター領域を含む末端のイントロン配列を増幅するＰＣＲプライマーを使用したところ、得られたＰＣＲ産物の長さは平均して３８１ｂｐであった。ＰＣＲは、３８４−および９６ウェルフォーマットの両方で、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌデオキシリボヌクレオチド三リン酸、それぞれ１μｍｏｌ／Ｌのフォワードおよびリバースプライマー、６％ＤＭＳＯ、１×ＰＣＲ緩衝液、１ｎｇ／μＬのＤＮＡ、および、０．０５ユニット／μＬのプラチナムＴａｑ（Platinum Taq）（インビトロジェン（Invitrogen）／ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies））を含むそれぞれ５または１０μＬの反応液体積で行われた。ＰＣＲ増幅にタッチダウンＰＣＲプログラムを使用した（ペルチエ・サーモサイクラー（Peltier Thermocycler），ＰＴＣ−２００，ＭＪリサーチ（MJ Research），バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories, Inc.），イタリア）。ＰＣＲ条件は以下の通りとした：９４℃で２分間；９４℃で１５秒、６４℃で３０秒、７０℃で３０秒を３サイクル；９４℃で１５秒、６１℃で３０秒、７０℃で３０秒を３サイクル；９４℃で１５秒、５８℃で３０秒、７０℃で３０秒を３サイクル；および、９４℃で１５秒、５７℃で３０秒、および、７０℃で３０秒を３５サイクル、続いて７０℃で５分間、および、その後１２℃。ＰＣＲ産物を、ＡＭピュア（AMPure）（アジェンコート・バイオサイエンス社（Agencourt Bioscience Corp.）、ベックマン・コールター社（Beckman Coulter S.p.A），イタリア国ミラノ）を用いて精製した。サイクル配列解析は、ビッグダイ・ターミネーター（BigDye Terminator）ｖ３．１サイクル配列解析キット（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems），カリフォルニア州フォスターシティー）を最初の変性を９７℃で３分、続いて９７℃で１０秒、５０℃で２０秒、および、６０℃で２分を２８サイクルで用いて行われた。
【００４９】
配列解析産物をクリーンセック（CleanSeq）（アジェンコート・バイオサイエンス，ベックマン・コールター）を用いて精製し、３７３０ＤＮＡアナライザー、ＡＢＩキャピラリー電気泳動システム（アプライド・バイオシステムズ）で解析した。配列の痕跡をミューテーョン・サーベイヤー（Mutation Surveyor）ソフトウェアパッケージ（ソフトジェネティクス（SoftGenetics），ペンシルベニア州ステートカレッジ）を用いて解析した。
【００５０】
免疫組織化学解析
パラフィン包埋切片をパラフィンから取り出し、水を加えて、プロテイナーゼＫ（DAKO, デンマーク国グロストルプ）で処理し、標識した高分子検出システム（Bond Polymer Define Detection, ビジョン・バイオシステム（Vision Biosystem），オーストラリア国マウントウェイヴァリー）、および、自動染色装置（BOND-maX, ビジョン・バイオシステム）を用いて免疫染色した。一次ポリクローナル抗体を１：１０００の希釈率で使用した。一次抗血清を緩衝液で置き換えることによりネガティブコントロールを得た。高強度で示された膜を有する腫瘍だけを、ＭＬＫ４を過剰発現しているものと分類した。
【００５１】
ＤＮＡコンストラクトおよび変異誘発
配列番号４６に記載のＭＬＫ４をコードするｃＤＮＡをまずＴｏｐｏＴＡベクターに挿入し、ＲＴ−ＰＣＲによって合成した。全長ＭＬＫ４ｃＤＮＡをｐＣＥＶ２９．１（１０）またはｐＲＲＬプラスミド（１１）にサブクローニングした。クイックチェンジ（QuikChange）ＩＩ ＸＬ部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン（Stratagene））でテンプレートＤＮＡとしてＭＬＫ４野生型プラスミドを用いて点突然変異を含むＭＬＫ４突然変異体を構築した。以下のオリゴヌクレオチドおよびそれらの逆の相補体を変異誘発プライマーとして使用した：
Ｇ２９１Ｅ、
５’−CTTTGAAGATTACAGATTTTGAGTTGGCGAGGGAATGGCAC−３’（配列番号４７）；
Ｒ４７０Ｃ、
５’−TGAGCAGCAGCTGGCAGAGTGCGAGATCGACGTGCTGGAG−３’（配列番号４８）。
【００５２】
ＤＮＡ配列解析によって適切な突然変異の存在を確認した。
【００５３】
ＭＬＫ４のＧ２９１ＥおよびＲ４７０Ｃ突然変異体の配列はそれぞれ配列番号４９および５０に記載された通りである。
【００５４】
以下の表に、本発明の研究で同定されたＭＬＫ４突然変異の一覧を対応する配列番号と共に記載した。
【００５５】
表３
【００５６】
【表３】
2013528394.tif 000004
【００５７】
抗体
我々は、標準的な免疫化プロトコール（２匹のウサギをエピトープごとに免疫化した）を用いてＭＬＫ４特異的ポリクローナル抗体を開発し、ＭＬＫ４ＮまたはＣ末端のいずれかに対して向けられたポリクローナル抗血清および抗体を生成した。両方の抗体を免疫沈降およびウェスタンブロット実験で試験したところ、これらの抗体は、全ての細胞溶解産物のなかから１１４ｋＤａ（ＭＬＫ４の予想分子量）のタンパク質を検出するのに用いることができることが示された。免疫ブロッティングで用いられる一次抗体は以下の通りである：抗ビンキュリン（シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich））、抗アクチン（サンタ・クルーズ（S. Cruz））、抗ＰＥＲＫ１／２、抗ＥＲＫ１／２、抗Ｐ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、抗ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、抗Ｐ−ＡＫＴ、抗ＡＫＴ、抗Ｐ−ｐ３８および抗Ｐ−３８（セル・シグナリング（Cell Signaling））。
【００５８】
細胞培養
Ａ５４９、Ｃｏｌｏ−２０１およびＨＣＴ１１６をＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）中で培養し、ＮＩＨ３Ｔ３、ＤＬＤ−１およびＨＣＴ１１６−ＨＫＥ−３から誘導されたクローンをＤＭＥＭ（インビトロジェン）中で増殖させた。ＨＴＥＲＴ−ＨＭＥ１を２０ｎｇ／ｍＬＥＧＦ、１０μｇ／ｍｌインスリン、および、１００μｇ／ｍｌヒドロコルチゾンが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２（インビトロジェン）含有増殖培地中で培養し、一方でＤｉＦｉ細胞をＦ−１２（インビトロジェン）中で増殖させた。哺乳動物細胞の培養物を、１０％ウシ胎児血清（シグマ−アルドリッチ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンが補充された適切な培地中で、３７℃で、５％ＣＯ２を含む加湿した空気中で維持した。マウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞をＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１６５８）から入手し、１０％ウシ血清（５６℃で３０分、熱で不活性化した）（インビトロジェン）および２ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＤＭＥＭ中で培養した。全ての細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection; ATCC, 米国マナサス）で公共的に利用可能である。
【００５９】
トランスフェクションおよび形質転換分析
１００ｍｍプレートにＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を２×１０５細胞で植え付けし、２４時間増殖させ、その後、高効率リポソームトランスフェクション法（リポフェクトアミン２０００およびプラス（Plus）試薬；インビトロジェン）を用いてトランスフェクションした。各プレートを、インサート非含有またはＭＬＫ４タンパク質（野生型または突然変異体）をコードするｃＤＮＡを含むｐＣＥＶ２９．１ベクター（４μｇ）のいずれかにでトランスフェクションした。協同実験のために、細胞を異なるＭＬＫ４野生型および突然変異体を含む０．１μｇのＲａｓＶ１２プラスミドおよび４μｇのｐＣＥＶで一時的にコトランスフェクションした。トランスフェクションしてから２日後に、細胞を３つのプレートに分け、５％ウシ血清を含むＤＭＥＭ中で培養し、病巣形成の測定に使用した。トランスフェクションに続いてグルタルアルデヒド１１％およびギムザ染色で固定した後に、増殖巣を２週間スコア付けした。
【００６０】
タンパク質解析
沸騰したＳＤＳ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および、１％ＳＤＳ）中で細胞を可溶化することにより体細胞タンパク質全を抽出した。ＢＣＡタンパク質分析試薬キット（ピアース・ケミカル社（Pierce Chemical Co.））によってタンパク質の量を定量した。抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロースメンブレン（ハイボンド（Hybond）；ＧＥヘルスケア（GE Healthcare)）にトランスファーし、リン酸緩衝生理食塩水、０．１％トゥイーン（Tween）２０、５％ＢＳＡ中でブロッキングした。続いてメンブレンを一次抗体（ＭＬＫ４、ビンキュリン、アクチン、ｐＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐＪＮＫ、ＪＮＫ、ｐＡＫＴ、ＡＫＴ，ｐＰ３８、Ｐ３８のいずれか）、続いて適切なペルオキシダーゼ結合二次抗体（ロバ抗ウサギ，バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）の適切な希釈液と共にインキュベートした。強化された化学発光（ＧＥヘルスケア）によって最終的な検出を行った。免疫沈降のために、４℃で、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび１％トリトンＸ−１００を含む緩衝液８００μｌを用いて、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１００ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、および、１μｇ／ｍｌペプスタチン）の存在下で細胞を溶解させた。１２，０００ｒｐｍ、２０分で抽出物を透明化し、ビシンコニン酸分析で定量した。プロテインＡ−セファロースビーズを一次抗体と共にプレインキュベートし（４℃で１時間）、次に溶解緩衝液で３回洗浄し、その後全細胞タンパク質と共にインキュベートした。抽出物を一次抗体と共に４℃で２時間インキュベートした。プロテインＡ−セファロースを用いて免疫複合体を回収し、溶解緩衝液中で３回洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロッティングをこれまでに述べられたようにして行った。
【００６１】
Ｒａｓプルダウン分析
細胞溶解産物をグルタチオン−アガロースビーズ上のＧＳＴ−ＲＢＤと共に４℃で１時間インキュベートした。続いてこれらのビーズを遠心分離で回収し、レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）還元サンプル緩衝液に再懸濁し、８分沸騰させた。抗Ｒａｓ抗体（カルバイオケム（CalBiochem））を用いてウェスタンブロット解析を行った。
【００６２】
キナーゼ分析
免疫沈降したＭＬＫ４を２つの独立した方法で処理した。放射性キナーゼ分析に関して、免疫沈降物をキナーゼ分析緩衝液［５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム］で３回洗浄し、キナーゼ緩衝液で、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含む１５μＭのＡＴＰの存在下で３７℃で３０分インキュベートした。３０μｌのレムリー緩衝液を添加して１分沸騰させることにより反応を止めた。１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてオートラジオグラフィでサンプルを解析した。
【００６３】
ＲＮＡｉによる遺伝子発現の抑制
腫瘍細胞において、ＭＬＫ４転写を特異的に標的化するｓｈＲＮＡのレンチウイルスが介在する発現によりＭＬＫ４発現は抑制された。我々は、生体反応のばらつきを除外するために、ＭＬＫ４配列に対して向けられた４種の異なるｓｈＲＮＡを使用した。ｓｈＲＮＡ配列は、シグマ−アルドリッチのミッション・ライブラリー（Mission library）から登録番号ＮＭ＿０３２４３５（配列１、ＴＲＣＮ００００００３２０９；配列２、ＴＲＣＮ００００００３２１０；配列３、ＴＲＣＮ００００００３２１１；配列４、ＴＲＣＮ００００００３２１３）で入手した。いずれの配列もＭＬＫ４レベルを抑制することができる（ただしコントロールＳｈＣＴＲＬ（ＳＨＣ００２Ｖ）はそうではない）。続いて、様々なレシピエント細胞系のなかから２種の最も効率的なｓｈＲＮＡを選択し、その後の実験に用いた。ｓｈＲＮＡに感染した細胞のウェスタンブロッティング解析から、ＭＬＫ４タンパク質が８０％より多く減少したことが示された。図に示される結果は、配列２および４（それぞれＳｈ１およびＳｈ２とも称される）についてのものである。
【００６４】
ヒト癌細胞におけるＭＬＫ４遺伝子座の標的化された欠失
ＣＲＣ ＨＣＴ１１６細胞におけるＭＬＫ４エキソン１の破壊をこれまでに述べられたようにして行った（１２）。標的化ベクターｐＡＡＶ−Ｎｅｏ−ＭＬＫ４をＰＣＲで構築した；ＤＬＤ１ゲノムを両方の相同性アームのためのテンプレートとして使用した。コンストラクトおよびプライマー配列は、トリノ大学腫瘍科学科（Universita degli Studi di Torino-Dipartimento Scienze Oncologiche, strada Provinciale 142, Candiolo (TO)）において公共的に利用可能である。０．４ｍｇ／ｍｌのＨＣＴ１１６細胞ゲネチシン（インビトロジェン，カリフォルニア州カールスバッド）での選択条件下で２週間増殖させた後、クローンを選択し、続いて選択的な物質の非存在下で増殖させた。相同組換え現象が遺伝子座特異的ＰＣＲスクリーニングで確認された。
【００６５】
足場非依存性増殖分析
５％ＦＢＳ、０．５％シープラーク（Seaplaque）寒天を含む適切な培地中で細胞を５００〜１０００細胞／ｍｌの濃度に希釈した。底に１％寒天を敷いた２４ウェルプレート（１ｍｌ／ウェル）に細胞を植え付け、１週間に３回相当する培地を補充した。植え付けから２週間後にコロニーを撮影してスコア付けした。
【００６６】
浸潤分析
コースター（Costar）の２４ウェルプレートトランスウェルの、それぞれ８μｍ孔サイズのトランスウェル移動プレートまたはマトリゲルマトリックスでコーティングしたポリカーボネートフィルターのいずれかを用いて細胞移動および浸潤分析を行った。下部のウェルは、５％血清（基底状態を測定するため）または１０ｎｇ／ｍｌＨＧＦ（誘導された浸潤を測定するため）が添加された５００μｌの培地を含み、それに対して上部のウェルは、下部のウェルと同じ血清濃度を含む培地中でＨＣＴ１１６については１０５個またはＡ５４９およびＤＬＤ１については５×１０４個の濃度になるように懸濁された１００μｌの細胞を含む。２０時間インキュベートした後、上部のウェル中の細胞／培地を捨て、トランスウェルメンブレンの裏面を移動した細胞をＰＢＳ中のグルタルアルデヒド１１％で固定し、クリスタルバイオレットで染色し、メタモルフ（MetaMorph）画像解析ソフトウェアでカウントした。
【００６７】
薬物を用いた生存率分析
セツキシマブを病院の薬局から得た。９６ウェルプラスチック培養プレートで、１００μｌ培地中に適切な密度で細胞系を植え付けた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、その後細胞の生存率を、セルタイター−グロー（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｒ））発光分析（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いてＡＴＰ含量によって評価した。ＤＴＸ−８８０プレートリーダー（ベックマン−コールター）を用いて発光を検出した。
【００６８】
動物実験
動物を用いた手法はいずれもトリノ大学倫理委委員会（the Ethical Commission of the University of Turin）およびイタリア国厚生省（the Italian Ministry of Health）によって承認済みである。６週齢の免疫無防備状態のＣＤ１−／−ヌード無胸腺雌マウス（チャールス・リバー・ラボラトリーズ（Charles River Laboratories），イタリア国レッコ）の右後方の脇腹に皮下注射した。２日毎に腫瘍の外観をキャリパーを用いて計測した。式Ｖ＝４／３×（ｄ／２）２×（Ｄ／２）を用いて腫瘍体積を計算した（式中ｄは腫瘍の短径であり、Ｄは腫瘍の長径である）。切り出しの前に黒色の墨を気道に流し込むことにより表在性の肺転移にコントラストを付けて、実体顕微鏡下で解剖した肺葉上でカウントした。
【００６９】
９６ウェルプラスチック培養プレートで、１００μｌ培地中に適切な密度で細胞系を植え付けた。プレートをセツキシマブ（エルビタックス）と共に３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、その後細胞の生存率を、セルタイター−グロー（Ｒ）発光分析（プロメガ）を用いてＡＴＰ含量によって評価した。ＤＴＸ−８８０プレートリーダー（ベックマン−コールター）を用いて発光を検出した。
【００７０】
配列表
(省略)
参考文献
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【図１Ｂ−Ｃ】
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【図１Ｄ−Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ａ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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