(57)【要約】  本明細書は、Ｆｂｘｏ４０の発現、レベルもしくは活性を減少させる治療有効量のＦｂｘｏ４０のアンタゴニストを使用して、患者における筋肉疲労関連障害を処置することに関する。Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストは、患者における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止、限定もしくは減少する。Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストは、低分子量（ＬＭＷ）化合物、タンパク質、抗体または阻害核酸、例えば、ｓｉＲＮＡであり得る。本明細書はまた、Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストについてスクリーニングする方法、および筋肉量維持、喪失または増加のレベルを診断またはモニタリングする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止、限定もしくは減少する能力について組成物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該個体由来の細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を確認する、
（ｂ）所望により、該細胞をＦｂｘｏ４０に対するアンタゴニストを含む組成物で処理する、および
（ｃ）所望により、再び該細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を確認する
ことを含み、コントロールと比較してＦｂｘｏ４０の上昇したレベルが、対象が筋肉疲労障害を有するか、または発症する危険性があることの指標であり、Ｆｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を低下する該組成物の能力は、個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止する能力と相関する、方法。
【請求項２】
個体が、悪液質、癌、腫瘍誘導体重減少、敗血症、慢性心不全、リウマチ性関節炎、後天性免疫不全症候群、サルコペニア、糖尿病、高血圧、高レベルの血清コレステロール、高レベルのトリグリセリド、パーキンソン病、不眠症、薬物中毒、疼痛、不眠症、低血糖、肝臓機能障害、肝硬変症、胆嚢障害、舞踏病、運動障害、腎臓障害および／または尿毒症から選択される筋肉疲労関連障害に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アンタゴニストが、Ｆｂｘｏ４０のレベル、発現もしくは活性を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
個体における筋肉量増加もしくは維持または喪失の減少のレベルを診断またはモニタリングする方法であって、
（ａ）該個体由来の細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を確認する、
（ｂ）所望により、該細胞をＦｂｘｏ４０に対するアンタゴニストを含む組成物で処理する、および
（ｃ）所望により、再び該細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を確認する
ことを含み、コントロールと比較してＦｂｘｏ４０の上昇したレベルが、対象が筋肉疲労障害を有するか、または発症する危険性があることの指標であり、Ｆｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を低下する該組成物の能力は、個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止する能力と相関する、方法。
【請求項５】
個体が、悪液質、癌、腫瘍誘導体重減少、敗血症、慢性心不全、リウマチ性関節炎、後天性免疫不全症候群、サルコペニア、糖尿病、高血圧、高レベルの血清コレステロール、高レベルのトリグリセリド、パーキンソン病、不眠症、薬物中毒、疼痛、不眠症、低血糖、肝臓機能障害、肝硬変症、胆嚢障害、舞踏病、運動障害、腎臓障害および／または尿毒症から選択される筋肉疲労関連障害に罹患している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アンタゴニストが、Ｆｂｘｏ４０のレベル、発現もしくは活性を減少させる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
治療有効量のＦｂｘｏ４０のアンタゴニストを個体に投与することを含む、該個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を維持もしくは防止する方法。
【請求項８】
個体が、悪液質、癌、腫瘍誘導体重減少、敗血症、慢性心不全、リウマチ性関節炎、後天性免疫不全症候群、サルコペニア、糖尿病、高血圧、高レベルの血清コレステロール、高レベルのトリグリセリド、パーキンソン病、不眠症、薬物中毒、疼痛、不眠症、低血糖、肝臓機能障害、肝硬変症、胆嚢障害、舞踏病、運動障害、腎臓障害および／または尿毒症から選択される筋肉疲労関連障害に罹患している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
理学療法、栄養物、電気刺激、ＮＭＥＳの電気神経筋刺激因子、筋肉への神経投入；および／またはステロイド、ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質；イブタモレンメシル酸塩（ＭＫ−６７７）、イチョウ抽出物、フラボングリコシド、ギンコライド、アミノ酸栄養補助食品、ロイシン、アミノ酸前駆体、ロイシン前駆体、ピルビン酸およびピルビン酸代謝産物、ベータ−ヒドロキシ−ベータ−メチルブチレート、アルファ−ケトイソカプロン酸、分枝鎖アミノ酸、エリスロポエチン、アヘン剤、スコポラミン、インスリン、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ１）および／またはテストステロン；および／またはアルドステロン、アルファ受容体、アンジオテンシンＩＩ、ベータ受容体、カテプシンＢ、キマーゼ、エンドセリン受容体、真核生物開始因子２−アルファ（ｅＩＦ２−アルファ）、イミダゾリン受容体、インターフェロン、ＭＡＦｂｘ（筋萎縮Ｆ−ｂｏｘ）、ＭｕＲＦ１（筋肉リングフィンガー１）、ミオスタチン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）および／またはその受容体、タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）、ＲＮＡ依存性セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）および／またはキサンチンオキシダーゼの阻害剤の１つ以上を投与することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
アンタゴニストがＦｂｘｏ４０の発現、レベルもしくは活性を減少させる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストが低分子量化合物である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
アンタゴニストがポリペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストがＦｂｘｏ４０をコードする核酸に結合するｓｉＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
ｓｉＲＮＡが平滑末端である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストがＦｂｘｏ４０に結合する抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
アンタゴニストがＦｂｘｏ４０の発現、レベルもしくは活性を減少させ、筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止、限定もしくは減少する、Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストを含む組成物。
【請求項１７】
ステロイド、ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質；イブタモレンメシル酸塩（ＭＫ−６７７）、イチョウ抽出物、フラボングリコシド、ギンコライド、アミノ酸栄養補助食品、ロイシン、アミノ酸前駆体、ロイシン前駆体、ピルビン酸およびピルビン酸代謝産物、ベータ−ヒドロキシ−ベータ−メチルブチレート、アルファ−ケトイソカプロン酸、分枝鎖アミノ酸、エリスロポエチン、アヘン剤、スコポラミン、インスリン、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ１）および／またはテストステロン；および／またはアルドステロン、アルファ受容体、アンジオテンシンＩＩ、ベータ受容体、カテプシンＢ、キマーゼ、エンドセリン受容体、真核生物開始因子２−アルファ（ｅＩＦ２−アルファ）、イミダゾリン受容体、インターフェロン、ＭＡＦｂｘ（筋萎縮Ｆ−ｂｏｘ）、ＭｕＲＦ１（筋肉リングフィンガー１）、ミオスタチン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）および／またはその受容体、タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）、ＲＮＡ依存性セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）および／またはキサンチンオキシダーゼの阻害剤の１つ以上を投与することをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
アンタゴニストがＦｂｘｏ４０の発現、レベルもしくは活性を減少させる、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストが低分子量化合物である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
アンタゴニストがポリペプチドである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストがＦｂｘｏ４０をコードする核酸に結合するｓｉＲＮＡである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２２】
ｓｉＲＮＡが平滑末端である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストがＦｂｘｏ４０に結合する抗体である、請求項１６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本明細書は、Ｆｂｘｏ４０の発現、レベルもしくは活性を減少させる治療有効量のＦｂｘｏ４０のアンタゴニストを使用して、筋肉疲労関連障害を処置する方法に関する。Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストは、筋肉疲労関連障害を有するか、または発症する危険性がある患者における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止、限定もしくは減少する。Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストは、低分子量（ＬＭＷ）化合物、タンパク質、抗体および／または阻害核酸、例えば、ｓｉＲＮＡを含むことができる。本明細書はまた、Ｆｂｘｏ４０をアンタゴナイズし、個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止する能力について組成物をスクリーニングする方法を含む。本明細書はさらに、上昇したレベルが筋肉疲労障害またはその危険性と関連するＦｂｘｏ４０を検出するための診断方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
筋力低下、疲労または萎縮は、多数の異なる障害と関連する。サルコペニアは加齢筋力低下である。悪液質は、体重減少、食欲不振、無力症、貧血および筋肉疲労と関連する重度の身体疲労である。筋肉量および完全性の減少はまた、ＡＩＤＳ消耗性症候群、脱神経、損傷、癌および種々の他の障害と関連する。
【０００３】
処置のいくつかの型、例えば、タンパク質合成および筋肉肥大に至るＩＧＦ１シグナル経路の成分に関するものは、筋肉量を増加することが示唆されている。しかしながら、該経路における働き手の多くはまた、他の経路において機能するか、または筋肉組織以外の組織に分布する。これは、これらの成分をアンタゴナイズする薬物の開発を困難にさせ得る。
【０００４】
筋力低下に対する新規の標的特異的処置の必要性が存在する。このような治療は、単独で、または利用できる治療と共に施すことができる。
【発明の概要】
【０００５】
発明の簡単な概要
本明細書は、必要とする個体における筋肉量を増加するためのＦｂｘｏ４０に対するアンタゴニストの使用を提供する。本明細書はまた、Ｆｂｘｏ４０をアンタゴナイズし、筋肉量を増加もしくは維持するか、またはその喪失を防止、限定もしくは減少する能力について、組成物をスクリーニングするための方法を提供する。本明細書はさらに、Ｆｂｘｏ４０を検出するための診断方法を含み、Ｆｂｘｏ４０の上昇したレベルは、筋肉疲労障害またはその危険性と関連する。
【０００６】
図１に示されるとおり、Ｆｂｘｏ４０は、筋肉肥大を促進するＩＧＦ１シグナル伝達経路における働き手である。受容体を介してＩＧＦ１は、種々の工程を介してタンパク質合成および筋肉成長を誘導するＩＲＳ１（インスリン受容体基質１）を活性化する。Ｆｂｘｏ４０は、ＩＲＳ１のユビキチン化および分解を促進することにより該機能をアンタゴナイズする。Ｆｂｘｏ４０の阻害は、筋肉肥大を増強するＩＧＦ１およびＩＲＳ１の継続活性を可能にする。
【０００７】
ＩＧＦ１経路の他の成分の多くと違って、Ｆｂｘｏ４０は、この１つの経路にのみ参加することが知られている。加えて、多数の他のＩＧＦ１経路の働き手と違って、Ｆｂｘｏ４０は、心筋および骨格筋においてのみ高度に発現される。したがって、Ｆｂｘｏ４０の阻害は、筋肉量を増加するための特異的標的アプローチを提供する。さらに、Ｆｂｘｏ４０の阻害は該経路を持続させ、したがって、筋肉成長を促進するＩＧＦ１の能力を強化する。要するに、Ｆｂｘｏ４０阻害剤の投与は、筋肉肥大の促進において、単独で、または他の治療（限定はしないが、ＩＧＦ１の投与を含む）と共に作用することができる。
【０００８】
１つの特定の態様において、本明細書は、筋肉成長を改善するか、またはその喪失を防止、限定もしくは減少するＦｂｘｏ４０に対するアンタゴニストに関する方法および組成物を含む。
【０００９】
１つの特定の態様において、本明細書は、Ｆｂｘｏ４０に対するアンタゴニストを含む組成物を同定する方法であって、該組成物は筋肉量を改善もしくは維持するか、またはその喪失を防止、限定もしくは減少するために有用である方法を含む。
【００１０】
別の特定の態様において、本明細書はまた、Ｆｂｘｏ４０を検出するための診断方法であって、Ｆｂｘｏ４０の上昇したレベルが筋肉疲労障害またはその危険性と関連する方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、タンパク質合成および筋肉肥大を引き起こすＩＧＦ１シグナル伝達経路を示す。
【００１２】
【図２】図２は、ＩＲＳ１およびＳＣＦＦｂｘｏ４０複合体の物理的配置を示す図である。複合体は、Ｆｂｘｏ４０、Ｓｋｐ１、Ｃｕｌｌｉｎ１およびＲｂｘ１を含む。リン酸化ＩＲＳ１へのＦｂｘｏ４０結合は、ＩＲＳ１を複合体に持ち込み、Ｒｂｘ１によりユビキチン化される。
【００１３】
【図３】図３は、Ｆｂｘｏ４０が心筋および骨格筋に高度に発現するが、脂肪、膀胱、脳、頸部、大腸、食道、腎臓、肝臓、肺、卵巣、胎盤、前立腺、小腸、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺または気管組織において高度に発現しないことを示す。
【００１４】
【図４】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｅは、Ｃ２Ｃ１２筋管において、ＩＲＳ１がＩＧＦ１処理で破壊されることを証明する。４Ｃおよび４Ｄは、Ｃ２Ｃ１２筋管において、ＩＲＳ１がユビキチン化され、該ユビキチン化がＩＧＦ１処理で増加することを証明した。
【００１５】
【図５】図５Ａから５Ｇは、ＩＲＳ１がＳｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ１−Ｒｂｘ１複合体により標的化されるが、Ｃｕｌｌｉｎ２含有複合体により標的化されないことを示す。
【００１６】
【図６】図６Ａから６Ｄは、Ｆｂｘｏ４０がＳｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ１−Ｒｂｘ１複合体と結合し、分解のためにＩＲＳ１を標的化することを示す。
【００１７】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、Ｒｂｘ１の部分的ノックダウンが、Ｃ２Ｃ１２筋管におけるＩＧＦ１の肥大作用を強化することを示す。
【００１８】
【図８】図８Ａは、Ｆｂｘｏ４０発現が分化の後期に検出可能であることを示す。
【００１９】
【図９】図９Ａは、Ｆｂｘｏ４０のノックダウンが、さらなるＩＧＦ１処理なしでさえ、劇的に大きい筋管の産生をもたらすことを示す。図９Ｂは、Ｆｂｘｏ４０のノックダウン後の筋管直径の定量化を示す。図９Ｃは、ＩＲＳ１をＦｂｘｏ４０と共にノックダウンさせたとき、筋管直径において約２０％の増加が起こることを示す。図９Ｄは、ＩＲＳ１タンパク質が、ｓｉＣＯＮサンプルよりも、ｓｉＲｂｘ１およびｓｉＦｂｘｏ４０でエレクトロポレーションされたサンプルにおいて高いことを示す。図９Ｅは、より大きな筋繊維がまた、ｓｉＣＯＮでエレクトロポレーションされた対側脚と比較して、Ｆｂｘｏ４０ノックダウンで観察されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本明細書は、Ｆｂｘｏ４０をアンタゴナイズすることが筋肉量を増加する、および／または筋肉量の喪失を防止、限定もしくは減少するという考えに基づく。本発明者らは、本明細書において、サルコペニア、悪液質および他の筋力低下関連障害、例えば、本明細書に記載されているもの、および当分野で知られているか、知られるようになるものを処置するために使用することができるＦｂｘｏ４０アンタゴニストを提供する。該アンタゴニストは、低分子量化合物（ＬＭＷ）、抗体または阻害核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、またはＦｂｘｏ４０をアンタゴナイズするあらゆる他の組成物であり得る。Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストは、筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止、限定もしくは減少する。Ｆｂｘｏ４０に対するアンタゴニストは、単独で、または他の治療と共に投与することができる。本明細書はまた、Ｆｂｘｏ４０をアンタゴナイズし、筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止、限定もしくは減少する能力について組成物をスクリーニングする方法を含む。本明細書はまた、Ｆｂｘｏ４０を検出するための診断方法であって、Ｆｂｘｏ４０の上昇したレベルが筋肉疲労障害またはその危険性と関連する方法を含む。
【００２１】
筋肉疲労関連障害を有するヒト患者は、直接的または間接的にＦｂｘｏ４０アンタゴニストを投与する結果として、筋肉量を維持することができるか、または筋肉量および／または強度のより高いレベルを有することができる。アンタゴニストはまた、筋肉量を増加するために、非ヒト動物、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、イヌ、ネコおよび他の動物に投与することができる。
【００２２】
特定の理論に限定されることは望まないが、本発明者らは、Ｆｂｘｏ４０が、図２において示されるとおり、ＩＲＳ１（インスリン受容体基質１）との直接接触を介して活性を媒介することを示唆する。ＩＧＦ１シグナル伝達経路において、ＩＲＳ１活性化は筋肉成長を引き起こす。Ｆｂｘｏ４０は、該活性をアンタゴナイズする。Ｆｂｘｏ４０は、ＩＲＳ１をＳＣＦＦｂｘｏ４０複合体（Ｆｂｘｏ４０、Ｓｋｐ１、Ｃｕｌｌｉｎ１およびＲｂｘ１を含む）と結合させる。該複合体において、Ｒｂｘ１は、ＩＲＳ１をユビキチン化し、それを分解のためにマークする。Ｆｂｘｏ４０の阻害は、ＩＲＳ１のユビキチン化を防止し、ＩＲＳ１に筋肉成長を活性化させ続ける。
【００２３】
したがって、１つの特定の態様において、本明細書は、治療有効量のＦｂｘｏ４０のアンタゴニストを個体に投与することを含む、該個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止する方法を含む。１つの態様において、本明細書は、病理学的疾患の治療における使用のための、または処置における使用のための薬物としてＦｂｘｏ４０アンタゴニストを提供する。
【００２４】
１つの特定の態様において、本明細書は、個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止、限定もしくは減少する能力について組成物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該個体由来の細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を確認する、
（ｂ）所望により、該細胞をＦｂｘｏ４０に対するアンタゴニストを含む組成物で処理する、および
（ｃ）所望により、再び該細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を確認する、
ことを含み、コントロールと比較してＦｂｘｏ４０の上昇したレベルが、対象が筋肉疲労障害を有するか、または発症する危険性があることの指標であり、Ｆｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を低下させる該組成物の能力は、個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止、限定もしくは減少する能力と相関する方法を含む。
【００２５】
この方法の１つの態様において、個体は、悪液質、癌、腫瘍誘導体重減少、敗血症、慢性心不全、リウマチ性関節炎、後天性免疫不全症候群、サルコペニア、糖尿病、高血圧、高レベルの血清コレステロール、高レベルのトリグリセリド、パーキンソン病、不眠症、薬物中毒、疼痛、不眠症、低血糖、肝臓機能障害、肝硬変症、胆嚢障害、舞踏病、運動障害、腎臓障害および／または尿毒症から選択される筋肉疲労関連障害に罹患している。
【００２６】
この方法の１つの態様において、アンタゴニストは、Ｆｂｘｏ４０のレベル、発現もしくは活性を減少させる。
【００２７】
１つの特定の態様において、本明細書は、個体における筋肉量増加もしくは維持のレベルを診断またはモニタリングする方法であって、
（ａ）該個体由来の細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を確認する、
（ｂ）所望により、該細胞をＦｂｘｏ４０に対するアンタゴニストを含む組成物で処理する、および
（ｃ）所望により、再び該細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を確認する、
ことを含み、コントロールと比較してＦｂｘｏ４０の上昇したレベルが、対象が筋肉疲労障害を有するか、または発症する危険性があることの指標であり、Ｆｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を低下する該組成物の能力は、個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止、限定もしくは減少する能力と相関する方法を含む。
【００２８】
この方法の１つの態様において、個体は、悪液質、癌、腫瘍誘導体重減少、敗血症、慢性心不全、リウマチ性関節炎、後天性免疫不全症候群、サルコペニア、糖尿病、高血圧、高レベルの血清コレステロール、高レベルのトリグリセリド、パーキンソン病、不眠症、薬物中毒、疼痛、不眠症、低血糖、肝臓機能障害、肝硬変症、胆嚢障害、舞踏病、運動障害、腎臓障害および／または尿毒症から選択される筋肉疲労関連障害に罹患している。
【００２９】
この方法の１つの態様において、アンタゴニストは、Ｆｂｘｏ４０のレベル、発現もしくは活性を減少させる。
【００３０】
１つの特定の態様において、本明細書は、治療有効量のＦｂｘｏ４０のアンタゴニストを個体に投与することを含む、該個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止する方法を含む。
【００３１】
この方法の１つの態様において、個体は、悪液質、癌、腫瘍誘導体重減少、敗血症、慢性心不全、リウマチ性関節炎、後天性免疫不全症候群、サルコペニア、糖尿病、高血圧、高レベルの血清コレステロール、高レベルのトリグリセリド、パーキンソン病、不眠症、薬物中毒、疼痛、不眠症、低血糖、肝臓機能障害、肝硬変症、胆嚢障害、舞踏病、運動障害、腎臓障害および／または尿毒症から選択される筋肉疲労関連障害に罹患している。
【００３２】
この方法の１つの態様において、該方法は、理学療法、栄養物、電気刺激、ＮＭＥＳの電気神経筋刺激因子、筋肉への神経投入；および／またはステロイド、ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質；イブタモレンメシル酸塩（ＭＫ−６７７）、イチョウ抽出物、フラボングリコシド、ギンコライド、アミノ酸栄養補助食品、ロイシン、アミノ酸前駆体、ロイシン前駆体、ピルビン酸およびピルビン酸代謝産物、ベータ−ヒドロキシ−ベータ−メチルブチレート、アルファ−ケトイソカプロン酸、分枝鎖アミノ酸、エリスロポエチン、アヘン剤、スコポラミン、インスリン、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ１）および／またはテストステロン；および／またはアルドステロン、アルファ受容体、アンジオテンシンＩＩ、ベータ受容体、カテプシンＢ、キマーゼ、エンドセリン受容体、真核生物開始因子２−アルファ（ｅＩＦ２−アルファ）、イミダゾリン受容体、インターフェロン、ＭＡＦｂｘ（筋萎縮Ｆ−ｂｏｘ）、ＭｕＲＦ１（筋肉リングフィンガー１）、ミオスタチン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）および／またはその受容体、タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）、ＲＮＡ依存性セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）および／またはキサンチンオキシダーゼの阻害剤の１つ以上を投与することをさらに含む。
【００３３】
この方法の１つの態様において、アンタゴニストはＦｂｘｏ４０の発現、レベルもしくは活性を減少させる。
この方法の１つの態様において、Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストは低分子量化合物である。
この方法の１つの態様において、アンタゴニストはポリペプチドである。
【００３４】
この方法の１つの態様において、Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストはＦｂｘｏ４０をコードする核酸に結合するｓｉＲＮＡである。
この方法の１つの態様において、ｓｉＲＮＡは平滑末端である。
この方法の１つの態様において、Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストはＦｂｘｏ４０に結合する抗体である。
【００３５】
１つの特定の態様において、本明細書は、アンタゴニストがＦｂｘｏ４０の発現、レベルもしくは活性を減少させ、筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止、限定もしくは減少する、Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストを含む組成物を含む。
【００３６】
本組成物の１つの態様において、組成物は、ステロイド、ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質；イブタモレンメシル酸塩（ＭＫ−６７７）、イチョウ抽出物、フラボングリコシド、ギンコライド、アミノ酸栄養補助食品、ロイシン、アミノ酸前駆体、ロイシン前駆体、ピルビン酸およびピルビン酸代謝産物、ベータ−ヒドロキシ−ベータ−メチルブチレート、アルファ−ケトイソカプロン酸、分枝鎖アミノ酸、エリスロポエチン、アヘン剤、スコポラミン、インスリン、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ１）、および／またはテストステロン；および／またはアルドステロン、アルファ受容体、アンジオテンシンＩＩ、ベータ受容体、カテプシンＢ、キマーゼ、エンドセリン受容体、真核生物開始因子２−アルファ（ｅＩＦ２−アルファ）、イミダゾリン受容体、インターフェロン、ＭＡＦｂｘ（筋萎縮Ｆ−ｂｏｘ）、ＭｕＲＦ１（筋肉リングフィンガー１）、ミオスタチン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）および／またはその受容体、タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）、ＲＮＡ依存性セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）および／またはキサンチンオキシダーゼの阻害剤の１つ以上をさらに含む。
【００３７】
本組成物の１つの態様において、アンタゴニストはＦｂｘｏ４０の発現、レベルもしくは活性を減少させる。
本組成物の１つの態様において、Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストは低分子量化合物である。
本組成物の１つの態様において、アンタゴニストはポリペプチドである。
本組成物の１つの態様において、Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストはＦｂｘｏ４０をコードする核酸に結合するｓｉＲＮＡである。
本組成物の１つの態様において、ｓｉＲＮＡは平滑末端である。
【００３８】
本組成物の１つの態様において、Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストはＦｂｘｏ４０に結合する抗体である。
したがって、本明細書のＦｂｘｏ４０アンタゴニストは、筋肉疲労関連障害、限定はしないが、例えば、糖尿病、脱神経、損傷、心臓血管疾患、神経退化および種々の癌を処置するために有用であり得る。
【００３９】
定義
明細書および特許請求の範囲の明確な理解を提供するために、以下の定義を好都合に提供される。
【００４０】
「Ｆｂｘｏ４０」は、Ｆｂｏｘファミリーメンバーの遺伝子およびタンパク質である遺伝子またはタンパク質を意味し、これのヒトホモログはＧｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．  ＮＭ＿０１６２９８により示される。この遺伝子の動物ホモログは、数種類において知られている：マウス（ハツカネズミ）：ＮＭ＿００１０３７３２１；ラット（ドブネズミ）：ＸＭ＿３４４０２３；チンパンジー(Chimpanzee)（チンパンジー(Pan troglodytes)）：ＮＣ＿００６４９０．２；アカゲザル(Rhesus macaque)（アカゲザル(Macaca mulatta)）：ＮＣ＿００７８５９．１；ゼブラフィッシュ（ゼブラ・ダニオ）：ＢＸ３２２５７７．１１（偽遺伝子）またはＸＰ＿６９４７０８．３；イノシシ(Wild boar)（イノシシ(Sus scrofa)）：ＥＵ７４３７４２；ニワトリ(Chicken)（ニワトリ(Gallus gallus)）：ＸＰ＿４２４０００．２；およびイヌ(Dog)（イヌ(Canis lupus familiaris）：ＸＰ＿５４５１２６．２。
【００４１】
Ｆｂｘｏ４０の典型的なヒトホモログは、限定はしないが、以下のアミノ酸配列（配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．  ＮＭ＿０１６２９８）を含む。
【表１】
2013519869.tif 000002
【００４２】
ヒトＦｂｘｏ４０のｍＲＮＡ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿０１６２９８（配列番号：２）で容易に入手できる。
【表２】
2013519869.tif 000003
【表３】
2013519869.tif 000004
【表４】
2013519869.tif 000005
【００４３】
この配列のための参照として、Needら 2009 Hum. Mol. Genet. 18 (23), 4650-4661; Yeら 2007 Gene 404 (1-2), 53-60 (2007); Jinら 2004 Genes Dev. 18 (21), 2573-2580 (2004)。
【００４４】
Ｆｂｘｏ４０は、タンパク質−タンパク質相互作用を介在する約５０個のアミノ酸のタンパク質構造モチーフである少なくとも１つのＦ−ｂｏｘモチーフをそれぞれ含むＦ−ｂｏｘタンパク質のファミリーメンバーである。例えば、Baiら 1996 Cell 86: 263-74; Kipreosら 2000 Genome Biol. 1(5): REVIEWS3002; Craigら 1999 Prog. Biophys. Mol. Biol. 72: 299-328;およびYeら 2007 Gene 404:53-60参照。Ｆｂｘｏ４０のＦ−ｂｏｘモチーフは、タンパク質Ｓｋｐ１と直接相互作用する。
【００４５】
上記および図１に記載されているとおり、Ｆｂｘｏ４０はＩＧＦ１シグナル伝達経路に関与する。この経路において、インスリンおよびＩＧＦ１は、それぞれインスリン受容体（ＩＲ）およびＩＧＦ１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）に結合する。ＩＧＦ１は、両方の受容体に結合し、ＩＧＦ１Ｒに対する非常に高い親和性を有する。該結合は、キナーゼドメインの活性化ループにおけるトリプルチロシンクラスターを自己リン酸化し、ＩＲＳ１をチロシンリン酸化する受容体の内因性チロシンキナーゼ活性を活性化する。リン酸化ＩＲＳ１は、クラスＩＡホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のｐ８５α調節サブユニットに結合し、ＰＩ３Ｋを活性化する。ＰＩ３Ｋは、ミオイノシトール脂質の３−ＯＨ位置のリン酸化を触媒する。ＰＩＰ３（ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸塩）は、ＰＤＫ１によるＡｋｔの後のリン酸化および活性化で、細胞膜にＰＨドメイン含有分子、例えば、ＰＤＫ１（３−ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ−１、マスターキナーゼ）およびＡｋｔ（重要なタンパク質キナーゼ）を補充する。Ａｋｔは、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ３）をリン酸化し、不活性化する。ＧＳＫ３は、グリコーゲン合成酵素、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子、転写因子）およびｅＩＦ２Ｂ（真核生物開始因子２に関するグアニンヌクレオチド交換因子）をリン酸化し、不活性化するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。活性化Ａｋｔはまた、順にｐ７０Ｓ６Ｋを活性化し、ＰＨＡＳ−１（４Ｅ−ＢＰ）を不活性化し、最後にタンパク質合成および筋肉肥大を引き起こすｍＴＯＲ（重要なセリン／スレオニンキナーゼ）を活性化し得る。
【００４６】
ＩＧＦ１誘導ＩＲＳ１リン酸化はまた、ＩＲＳ１を標的化し、ＳＣＦＦｂｘｏ４０によりユビキチン化し、プロテオソームにおいて破壊する。
【００４７】
タンパク質合成および筋肉肥大においてネガティブな影響を有する因子は、ＰＴＰ１ｂ（タンパク質チロシンホスファターゼ）、ＧＳＫ３およびＰＨＡＳ−１である。他の因子、すなわちＰＩ３Ｋ、ＮＦＡＴ、ｅＩＦ２Ｂ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、ＰＤＫ１およびｐ７０Ｓ６Ｋは、タンパク質合成および筋肉肥大においてポジティブな影響を有する。
【００４８】
この経路において、Ｆｂｘｏ４０はＩＲＳ１をアンタゴナイズする。図２に示されているとおり、Ｆｂｘｏ４０はＩＲＳ１に結合し、ＳＣＦＦｂｘｏ４０複合体に取り込む。ＩＲＳ１のリン酸化Ｆｂｘｏ４０への結合に直接関与するとまだ明らかではないが推測されており、取り囲まれている「ｐ」記号はＩＲＳ１がリン酸化されることを示すことに注意する。ＳＣＦＦｂｘｏ４０複合体は、Ｓｋｐ１、Ｃｕｌｌｉｎ１およびＲｂｘ１（ＲＩＮＧ−ｂｏｘタンパク質１）を含む。複合体中に結合すると、ＩＲＳ１はユビキチン化され（「Ｕｂ」）、Ｒｂｘ１による分解のためにマークする。Ｆｂｘｏ４０の阻害は、ＳＣＦＦｂｘｏ４０複合体とＩＲＳ１との結合を防止し、したがって、ＩＲＳ１のユビキチン化および分解を防止する。これは、筋肉成長の促進におけるＩＲＳ１の活性を持続することができる。したがって、Ｆｂｘｏ４０の阻害は筋肉肥大を可能にする。
【００４９】
Ｆｂｘｏ４０と違って、複合体の他の成分（Ｓｋｐ１、Ｃｕｌｌｉｎ１およびＲｂｘ１）はそれぞれ、多数の他の経路に関与する。このことは、Ｆｂｘｏ４０を唯一、標的化に適したものとする。
【００５０】
加えて、ＩＧＦ１と違って、Ｆｂｘｏ４０は、心臓および骨格筋組織においてのみ高度に発現される。Yeら 2007は、Ｆｂｘｏ４０がいくつかの組織型において発現しないことを示した。本発明者らは、Ｆｂｘｏ４０が脂肪、膀胱、脳、頸部、大腸、食道、腎臓、肝臓、肺、卵巣、胎盤、前立腺、小腸、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺または気管組織において発現されない図３におけるさらなるデータを示す。この図において、「Ａ．Ｕ．」は、相対的な恣意的単位を示す。この高い組織特異性はまた、Ｆｂｘｏ４０を筋肉成長の増加のための望ましい標的とさせる。
【００５１】
筋肉および筋肉疲労関連障害
Ｆｂｘｏ４０に対するアンタゴニストは、筋肉疲労関連障害に罹患しているか、または危険性がある個体または患者の筋肉および筋肉組織に直接的または間接的に投与することができ、該アンタゴニストは、このような個体および患者における筋肉量を増加するか、または筋肉量の減少を防止もしくは遅延することができる。
【００５２】
「筋肉」は、あらゆる種々の収縮組織、例えば、骨格、平滑筋および心筋、例えば、随意筋および不随意筋の両方、また遅筋および速筋繊維の両方を意味する。本明細書のアンタゴニストは、特に、心筋および骨格筋の成長を促進するか、または喪失を防止するために有用である。
【００５３】
「筋肉疲労関連障害」は、筋緊張または筋肉量の喪失と関連するあらゆる状態を意味する。これらの状態は、限定はしないが、サルコペニア、悪液質、ＡＩＤＳ消耗性症候群、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー症候群およびベッカー型筋ジストロフィー症候群）、筋萎縮、神経筋疾患、食欲不振、運動ニューロン疾患、神経筋連結部の疾患、炎症性筋疾患、筋肉量の減少と関連する他の状態または疾患、および他の関連疾患を含む。これらの障害はまた、例えば、病気または損傷と関連する、固定化または不活発、または空の旅および宇宙旅行の硬直によって生じ得るような慢性または急性「体調不良」を含む。筋萎縮を含む筋肉疲労はまた、結果として、脱神経、損傷、関節固定化、強制ベッドレスト（廃用性萎縮）、グルココルチコイド処理、敗血症、重量減、癌および加齢となり得る。Jagoeら 2001 Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 4: 183。加えて、重度の疼痛、脱力感、疲労および無力感をもたらすミオパチーの種々の珍しい形態（炭水化物代謝の障害、脂質代謝の障害、リソソーム性ミオパチー、封入体ミオパチー、遠位型ミオパチー、自己免疫性炎症性筋疾患など）がある。
【００５４】
悪液質は、多数の病気、例えば、癌、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、敗血症、慢性心不全、リウマチ性関節炎および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の共通特徴がある。特定の腫瘍は、タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）と呼ばれる２４ｋＤＡの糖タンパク質の生産を介して悪液質を誘導する。米国特許出願第２００９０１０５１２３号。悪液質はまた、特発的に起こり得る。
【００５５】
悪液質は、著しい体重減少、食欲不振、無力症および貧血により特徴付けられる。悪液質はまた、食欲喪失、脱力感、免疫機能低下および電解質不均衡の症状を有し得る。筋肉量の喪失は、多数の因子、例えば、正常な筋肉分解でタンパク質合成の速度の減少、正常な合成で分解の増加、または合成の減少および分解の増加の両方の組合せの結果であり得る。筋肉量の維持は、適当な栄養、神経投入およびホルモン状態に依存する。
【００５６】
サルコペニアは、多くの高齢者を苦しめ、年齢と共に筋肉量の減少として現れる筋肉苦痛である。サルコペニアは、罹患率および死亡率につながる衰弱、骨折および衰退と関連する。Baumgartnerら(1998 Am. J. Epidemiol. 147: 755-63; 149: 1161)は、若年参照グループの平均以下で２つの標準偏差未満である付属肢骨格筋量（ｋｇ／高さ２）とサルコペニアを定義した。
【００５７】
加えて、患者は、アルコール依存症、高レベルの血清コレステロール、舞踏病、糖尿病、薬物中毒、運動障害、胆嚢障害、慢性心不全、高血圧、ハンチントン病、低血糖、感染症（例えば、慢性感染症、例えば、肺炎）、不眠症、腫瘍誘導体重減少、腎臓障害、例えば、尿毒症、肝臓機能障害、例えば、肝硬変症、骨量の減少（例えば、骨粗鬆症）、疾患または損傷、疼痛、パーキンソン病、肺疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患）、リウマチ性関節炎、敗血症、高レベルのトリグリセリドおよび炎症状態（例えば、慢性炎症、例えば、炎症性腸疾患）の１つ以上に罹患していてもよい。
【００５８】
筋肉量の喪失の生化学のいくつかの局面は、調査されている。癌悪液質の原因物質と考えられているカケクチンは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と同一である。サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＩＦＮ、など）がまた、カケクチンと同じ作用を有することを見出されている。したがって、特定の理論により束縛されることなく、出願人は、悪液質が多数の因子の複合作用により誘導され得ることに言及する。
【００５９】
ヒト口腔癌腫由来のＯＣＣ−１細胞系は、癌悪液質に関与する種々の液性因子を生産する。ＯＣＣ−１細胞を埋め込まれたヌードマウスは、悪液質を含む種々の症候群を発症する。Kajimuraら 1996 Cancer Chemother. Pharmacol. 38 Suppl. S48-52; Tanakaら 1996 Jpn. J. Clin. Oncol. 26: 88-94。ヌードマウスに埋め込まれるＯＣＣ−１細胞は、症状を複合的に引き起こすように作用する種々のサイトカイン（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＩＬ−１１およびＰＴＨｒＰ）を生産すると考えられている。
【００６０】
本明細書の組成物で処置することができる筋ジストロフィーの例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（ランドゥジー・デジュリンとしても知られている）、筋強直性ジストロフィー（ＭＭＤ）（シュタイネルト病としても知られている）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）および先天型筋ジストロフィー（ＣＭＤ）を含む。本明細書の組成物で処置することができる運動ニューロン疾患の例は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（ルー・ゲーリック病としても知られている）、乳児進行性脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ、ＳＭＡ１またはＷＨ）（ＳＭＡ１型、ウェルドニッヒ・ホフマンとしても知られている）、中間型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡまたはＳＭＡ２）（ＳＭＡ２型としても知られている）、若年性脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ、ＳＭＡ３またはＫＷ）（ＳＭＡ３型、クーゲルベルク・ウエランダーとしても知られている）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）（ケネディ病およびＸ連鎖ＳＢＭＡとしても知られている）および成人型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を含む。
【００６１】
本明細書の組成物で処置することができる炎症性筋疾患の例は、皮膚筋炎（ＰＭ／ＤＭ）、多発性筋炎（ＰＭ／ＤＭ）および封入体筋炎（ＩＢＭ）を含む。本明細書の組成物で処置することができる神経筋連結部の疾患の例は、重症筋無力（ＭＧ）、ランバート−イートン症候群（ＬＥＳ）および先天性筋無力症候群（ＣＭＳ）を含む。本明細書の組成物で処置することができる内分泌腺異常によるミオパチーの例は、甲状腺機能亢進性ミオパチー（ＨＹＰＴＭ）および甲状腺機能低下性ミオパチー（ＨＹＰＯＴＭ）を含む。本明細書の組成物で処置することができる末梢神経の疾患の例は、シャルコー・マリー・ツース病（ＣＭＴ）、デジェリン・ソッタス病（ＤＳ）およびフリードライヒ失調症（ＦＡ）を含む。本明細書の組成物で処置することができるミオパチーの他の例は、先天性筋緊張症（ＭＣ）、先天性パラミオトニア（ＰＣ）、セントラルコア病（ＣＣＤ）、ネマリンミオパチー（ＮＭ）、ミオチュブラーミオパチー(Myotubular Myopathy)（ＭＴＭまたはＭＭ）および周期性四肢まひ（ＰＰ）を含む。本明細書の組成物で処置することができる筋肉の代謝疾患の例は、ホスホリラーゼ欠損症（ＭＰＤまたはＰＹＧＭ）、酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ）、ホスホフルクトキナーゼ欠損症（ＰＦＫＭ）、脱分枝酵素欠損症（ＤＢＤ）、ミトコンドリア性筋障害（ＭＩＴＯ）、カルニチン欠損症（ＣＤ）、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠損症（ＣＰＴ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症（ＰＧＫ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症（ＰＧＡＭまたはＰＧＡＭＭ）、乳酸デヒドロゲナーゼ欠損症（ＬＤＨＡ）およびミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症（ＭＡＤ）を含む。
【００６２】
本明細書のＦｂｘｏ４０に対するアンタゴニストは、これらの障害および当分野で知られている種々の他の筋肉疲労関連障害を処置するために使用することができる。
【００６３】
筋肉疲労関連障害に対するさらなる処置
Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストは、筋肉量および／または強度を増加するか、または筋肉量の喪失を防止すると知られているか、または推測されている別の薬物または処置と共投与される。このような処置は、筋肉に対する理学療法、栄養、電気刺激（例えば、ＮＭＥＳの電気神経筋刺激因子）および／または神経投入を含む。
【００６４】
種々の薬物が、悪液質、サルコペニアおよび他の筋肉障害、例えば、ステロイド、ホルモン、例えば、成長ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質［例えば、イブタモレンメシル酸塩（ＭＫ−６７７）］、イチョウ抽出物（例えば、フラボングリコシドおよび／またはギンコライド）、アミノ酸栄養補助食品（例えば、ロイシン）、アミノ酸前駆体（例えば、ロイシン前駆体、例えば、ピルビン酸および代謝産物、例えば、ベータ−ヒドロキシ−ベータ−メチルブチレートおよびアルファ−ケトイソカプロン酸）、分枝鎖アミノ酸、エリスロポエチン、アヘン剤、スコポラミン、インスリン、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ１）およびテストステロンを処置するために提供されている。
【００６５】
Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストと共投与され得るさらなる薬物は、悪液質の直接的または間接的原因因子、またはさもなければ筋肉成長に関連する因子である生物学的因子（生物学的薬物）および／または遺伝子の阻害剤を含む。これらの因子、薬物および／または遺伝子は、アルドステロン（例えば、スピロノラクトン、テストラクトン、メスピレノンおよびカンレノ酸）、アルファ受容体（例えば、ドキサゾシン、プラゾシン、テラゾシンおよびイプサピロン）、アンジオテンシンＩＩ、ベータ受容体（アセブトロール、アルプレノロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、カルテオロール、セリプロロール、エスモロール、ラベタロール(labetolol)、レボブノロール(lavobunolol)、メチプラノロール、メトプロロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノロール、ソタロール、ネビボロール、カルベジロール、ブシンドロールおよびチモロール）、カテプシンＢ［例えば、エポキシスクシニルペプチド、例えば、ＣＡ−０７４およびＥ−６４ｃ、ステフィンＡ、シスタチンＣ（内因性阻害剤）、ＣＡ０７４（カテプシンＢの特異的阻害剤）およびＥ−６４（カテプシンＢの天然阻害剤）］、キマーゼ［例えば、アレンドロネート、アプロチニンおよびマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）の組織阻害剤］、エンドセリン受容体、真核生物開始因子２−アルファ（ｅＩＦ２−アルファ）、イミダゾリン受容体［例えば、モキソニジン、クロニジン、リルメニジン、ペンタミジン（１，５−ビス（４−アミジノフェノキシ(amidonophenoxy)）ペンタン）およびアルファメチルドーパ］、インターフェロン、ＭＡＦｂｘ（筋萎縮Ｆ−ｂｏｘ）、ＭｕＲＦ１（筋肉リングフィンガー１）、ミオスタチン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）および／またはその受容体、タンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）、ＲＮＡ依存性セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）およびキサンチンオキシダーゼを含む。１つの特定の態様において、ＩＧＦ１は、Ｆｂｘｏ４０に対するアンタゴニストと共投与される。
【００６６】
参照のため、例えば、米国特許出願第２００９０１０５１２３号参照。米国特許第６，１９４，４０２；７，２３２，５８０；７，４１７，０３８；７，４４２，７０６；および７，４６８，１８４号；および米国特許出願第２００２００２８８３８；２００４０１２２０９７；および２００９０１０５１２３号；およびBodineら 2001; McPherronら 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 12457-61; Williams 2004 N. Engl. J. Med. 351: 1030-1参照。
【００６７】
本明細書の組成物はまた、健常患者における筋肉量の喪失を防止するか、または筋肉量を増加するために使用することができる。
【００６８】
本明細書の別の態様において、組成物は、非ヒト動物に投与することができるＦｂｘｏ４０アンタゴニストを含む。例えば、組成物は、ニワトリ、シチメンチョウ、家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシなど）、ペット（例えば、ネコおよびイヌ）に与えることができるか、または成長を促進する、およびタンパク質／脂質比率を改善するために水産養殖において有用性を有し得る。組成物は、成長を刺激すること、肉生産のために飼育されている動物の飼料効率を増強すること、および枝肉品質を改善することができる。
【００６９】
Ｆｂｘｏ４０に対するアンタゴニストの型および有効性
本明細書において使用される「Ｆｂｘｏ４０アンタゴニスト」などなる用語は、Ｆｂｘｏ４０またはその活性、レベルまたは発現を下方調節するあらゆる部分、化合物、組成物などを示す。このようなアンタゴニストは、とりわけ、低分子量化合物（ＬＭＷ）、抗体および／または阻害核酸［例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）］を含み得る。アンタゴニストは、Ｆｂｘｏ４０活性、レベルおよび／または発現の減少、例えば、遺伝子、ｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルを標的化することによる遺伝子の「ノックダウン」または「ノックアウト」をもたらす。
【００７０】
本明細書において使用される「下方調節する」は、活性および／または発現の完全ブロック（すなわち、完全阻害）を含む、Ｆｂｘｏ４０の生物学的活性および／または発現におけるあらゆる統計的に有意な減少を示す。例えば、「下方調節」は、Ｆｂｘｏ４０活性および／または発現における少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％の減少を示すことができる。アンタゴニストは、例えば、Ｆｂｘｏ４０を阻害もしくは破壊するか、またはＦｂｘｏ４０の活性の破壊もしくは阻害における他の化合物もしくは生物学的成分を手助けすることができる。
【００７１】
本明細書において使用されるＦｂｘｏ４０を「阻害する」または「阻害」なる用語、活性および／または発現の完全ブロックを含む、Ｆｂｘｏ４０の生物学的活性および／または発現におけるあらゆる統計的に有意な減少を示す。例えば、「阻害」は、Ｆｂｘｏ４０活性および／または発現における少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％の減少を示すことができる。本明細書において使用される「阻害する」なる用語は、同様に、あらゆる他の生物学的薬物または組成物の言及について、活性および／または発現における有意な減少を示す。
【００７２】
本明細書のＦｂｘｏ４０アンタゴニストは、Ｆｂｘｏ４０発現、レベルもしくは活性を減少または下方調節する。「発現」は、該アンタゴニストが、遺伝子を発現することに関与する任意の既知の生化学的工程、例えば、ＤＮＡをｍＲＮＡに転写すること、ｍＲＮＡをプロセッシングすること、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳すること、およびタンパク質を翻訳後修飾することを妨げることができることを意味する。例えば、Ｆｂｘｏ４０の発現を妨げるアンタゴニストは、遺伝子が発現することを防止することに関与する。これは、例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡへ結合することにより直接的に、または、例えば、遺伝子を転写するために必要である転写因子または転写補助因子、またはＦｂｘｏ４０  ｍＲＮＡをプロセッシングするために必要である因子を妨げることにより間接的に行うことができる。
【００７３】
「レベル」は、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストが、Ｆｂｘｏ４０の検出可能なレベル、例えば、Ｆｂｘｏ４０  ｍＲＮＡのレベルまたはＦｂｘｏ４０タンパク質のレベルを妨げることができることを意味する。これらのレベルは、ノーザンブロット、サザンブロット、免疫沈降または当分野で知られている任意の種々の技術により検出することができる。
【００７４】
「活性」は、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストが、本明細書に記載されているか、または文献において知られているＦｂｘｏ４０の任意の既知の活性を妨げることができることを意味する。本明細書の１つの局面において、該アンタゴニストは、例えば、別の生物学的成分、例えば、限定はしないがＳｋｐ１またはＩＲＳ１とＦｂｘｏ４０との間接的または直接的相互作用（例えば、結合）を防止または改変することにより、Ｆｂｘｏ４０を直接的にアンタゴナイズするあらゆる部分、化合物などである。非限定的な例として、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストは、例えば、Ｓｋｐ１および／またはＩＲＳ１への結合からＦｂｘｏ４０を立体的に妨害する抗体であり得る。
【００７５】
Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストは、非限定的な例として、低分子量組成物（ＬＭＷ）、タンパク質、抗体または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはそれらの変異体、誘導体もしくは融合体であり得る。
【００７６】
本明細書の種々の態様において、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニスト（限定はしないが、ＬＭＷ、タンパク質または抗体を含む）は、Ｆｂｘｏ４０の任意の既知または推定構造と相互作用することができる。これらのＦｂｘｏ４０構造は、限定はしないが、約ａａ（アミノ酸）５７０−６２４でのＦ−ｂｏｘモチーフおよびａａ５４−９６での亜鉛フィンガーＴＲＡＦ型ドメインを含む（Yeら 2007に記載されている）。別の態様において、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストは、ａａ１４５−３７２の領域に結合しない抗体であり；したがって、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストは、ａａ１−１４３または３７３−７０９の領域に結合する抗体である。
【００７７】
本明細書のさらなる態様において、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストは、Ｆ−ｂｏｘ配列を含む、Ｆｂｏｘファミリーの他のメンバーと比較して保存されているＦｂｘｏ４０のアミノ酸と相互作用する。このＦｂｏｘモチーフに対するコンセンサス配列は、Kipreosら 2000 Genome Biol. 1(5): REVIEWS3002において提供される。Ｆｂｘｏ４０のＦｂｏｘモチーフは、約ａａ５７０から６２４にある。Yeら 2007。
【００７８】
種々の態様において、本明細書は、以下の条件を提供する。Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストは、１つ以上の記載されているいずれかの特定の構造または配列ではないが、Ｆｂｘｏ４０と相互作用する（例えば、物理学的に結合する）；したがって、種々の態様におけるＦｂｘｏ４０アンタゴニストは、ａａ５７０から６２４のＦｂｏｘモチーフではないが、Ｆｂｘｏ４０遺伝子またはタンパク質と相互作用することができるか、または、種々の態様におけるＦｂｘｏ４０アンタゴニストは、ａａ５４から９６の亜鉛フィンガードメインではないがＦｂｘｏ４０遺伝子またはタンパク質と相互作用することができる。
【００７９】
１つの態様において、本明細書は、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストがポリクローナル抗体ではないという条件を有する。別の態様において、本明細書は、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストが、Ｆｂｘｏ４０配列ＣＥＫＡＲＥＳＬＶＳＴＦＲＡＲＰＲＧＲＨＦ（配列番号：３４）に対する、または結合するポリクローナル抗体ではないという条件を有する。
【００８０】
本明細書の１つの態様において、Ｆｂｘｏアンタゴニストは、ＣＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＣＡＡ（配列番号：１９）、ＧＴＧＧＧＡＡＡＧＴＡＴＧＴＴＣＡＧＣＡＡ（配列番号：２０）またはＡＧＣＣＧＴＧＧＡＴＧＣＣＡＡＡＧＡＣＴＡ（配列番号：２１）の配列を標的とするｓｉＲＮＡ（またはＲＮＡ同等物）である。
【００８１】
Ｆｂｘｏ４０に対するアンタゴニストの投与は、筋肉肥大、または筋力低下の防止、限定もしくは減少をもたらす。
【００８２】
「筋肉肥大」、「筋肉成長」などは、筋肉量の増加を意味する。これは、筋繊維の数よりもむしろ、サイズの増加を含むことができる。これらの筋繊維は、心臓および骨格筋、例えば、体重負荷および非体重負荷筋肉を含むことができる。筋肉肥大は、個体筋繊維の平均断面面積を測定することを含む、当分野で知られている種々の方法により測定することができる。筋肉肥大は、インビトロ（例えば、Ｃ２Ｃ１２筋管）またはインビボで測定することができる。
【００８３】
「筋力低下の防止、限定もしくは減少」および同様の句は、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストの投与によって、特定の状態、例えば、悪液質または食欲不振と通常関連する、筋力低下の量または率を防止、限定もしくは減少することを意味する。
【００８４】
非限定的な特定の例として、Ｆｂｘｏ４０に対するアンタゴニストは、低分子量組成物（または化合物）、抗体など、および／または阻害核酸またはｓｉＲＮＡなどを含むことができる。
【００８５】
Ｆｂｘｏ４０に対するアンタゴニストとしての低分子量組成物
Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストは、低分子量組成物（ＬＭＷ）または小分子であり得る。１つの態様において、本明細書の方法において使用されるＦｂｘｏ４０アンタゴニストは小分子である。本明細書において使用される「小分子」なる用語は、当該技術分野の用語であり、約７５００、７０００、６０００、５０００、４０００、３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００または１００分子量未満であり、Ｆｂｘｏ４０活性を阻害する分子を含む。小分子の例は、限定はしないが、低分子有機分子（例えば、Caneら 1998. Science 282: 63）、および天然産物抽出物ライブラリーを含む。別の態様において、化合物は、低分子非ペプチド有機化合物である。抗体のように、これらの小分子阻害剤は、Ｆｂｘｏ４０の活性を間接的または直接的に阻害する。
【００８６】
本明細書の別の態様において、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストは、タンパク質である。
【００８７】
１つの特定の態様において、本明細書は、個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止する能力について組成物をスクリーニングする方法であって、
細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を確認する、
該細胞を組成物で処理する、および
再び該細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を確認する
ことを含み、Ｆｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を低下する該組成物の能力は、個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止する能力と相関する方法を含む。
【００８８】
Ｆｂｘｏ４０を阻害するＬＭＷを得るために、化合物の多数の変異体を含む化合物ライブラリーを創造することができる。化合物ライブラリーは、Ｆｂｘｏ４０の生物学的活性（例えば、ＩＲＳ１またはＳｋｐ１への結合）の特定の阻害について試験される。選択される化合物は、さらなるランダム化および選択のための基礎として使用し、より高い親和性または阻害活性の誘導体を生産することができる。
【００８９】
ＬＭＷライブラリーを開発する方法および標的タンパク質への結合についてそれらをスクリーニングする方法は、当分野で知られている。例えば、米国特許第７，３７７，８９４号は、最大１０，０００個の化合物のライブラリーを構築するための方法を記載しており、これらの大多数は好ましくはわずか３５０グラム／モルである。この技術は、室温で少なくとも約１ｍＭで重水への溶解度を有する化合物を選択することを含み、フロー核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法および勾配分光法（「ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ」）方法での水リガンド観察を使用する。この方法は、ＮＭＲ分光法技術に基づいて標的分子（例えば、タンパク質）に結合する化合物を同定することを含む。このような方法は、一般的に、例えば、標的分子の添加時の試験化合物の共鳴強度における変化（好ましくは、強度の有意な減少）をモニタリングすることを含む、緩和編集技術の使用を含む。好ましくは、緩和編集技術は、一次元、さらに好ましくは、一次元１Ｈ  ＮＭＲ技術である。あるいは、このような方法は、ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹの使用を含むことができる。これは、結合相互作用を検出するためにバルク水からの磁化の移動を含む。ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ技術を使用して、結合化合物は、それらの水リガンド核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）の異符号により、非結合化合物と区別される。
【００９０】
化合物ライブラリーを開発するための他の技術は知られている。米国特許第７，３６７，９３３号は、少なくとも１つの植物種から少なくとも１つの抽出物を抽出することを含む化合物ライブラリーを生産する方法を記載している。
【００９１】
任意のこれらの方法または当分野で知られている他の方法は、Ｆｂｘｏ４０に対する結合およびアンタゴナイズについてスクリーニングすることができるＬＭＷライブラリーを生産するために使用することができる。
【００９２】
標的（この場合、Ｆｂｘｏ４０）への結合について化合物ライブラリーをスクリーニングする方法は、当分野で知られている。
【００９３】
米国特許第７，２３８，４９０号は、分子間結合が、シグナルの即時産生をもたらす「パラトープ」の形成により検出することができるという分子間相互作用および状態のリアルタイム検出に関する。相互作用について試験される物質はデミトープ(demitope)に結合し、該デミトープは、結合したとき、該シグナルを提供するレポーターに結合するパラトープの成分である。該方法において測定される既知の相互作用はまた、相互作用を妨げる化合物についてスクリーニングするために使用することができる。個々の相互作用についての試験に加えて、ライブラリーと化合物との相互作用またはライブラリー  タイム  ライブラリー(library.times.library)相互作用をまた、決定することができ、潜在的に干渉する物質の効果を評価することができる。
【００９４】
化合物ライブラリーを創造およびスクリーニングするための種々の他の方法は、とりわけ、米国特許第６，７６４，８５８；６，７２３，２３５；６，７２０，１９０；６，６７７，１６０；６，６５６，７３９；６，６４９，４１５；６，６３０，８３５；６，６２７，４５３；６，６１７，１１４；６，６１３，５７５；６，６０７，９２１；６，６０２，６８５；６，４４８，７９４；６，４２１，６１２；６，３９５，１６９；６，３８７，２５７；６，３５５，１６３；６，２１４，５６１；６，１８７，９２３；および６，０５４，０４７号に記載されている。
【００９５】
ＬＭＷのライブラリーを創造およびスクリーニングするための任意のこれらの方法または当業者に知られている任意の他の方法は、Ｆｂｘｏ４０に結合し、アンタゴナイズする小分子を得るために使用することができる。
【００９６】
Ｆｂｘｏ４０に対するアンタゴニストとしての抗体など
Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストはまた、抗−Ｆｂｘｏ４０抗体、抗体様分子、および／またはＦｂｘｏ４０に特異的および／または選択的に結合する分子、または、それらの変異体、誘導体または免疫抱合体などであり得る。
【００９７】
本明細書の１つの態様において、本明細書に記載されている治療および診断方法は、（直接的または間接的に）結合し、Ｓｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ１−Ｒｂｘ１複合体へのＦｂｘｏ４０の結合を中断することによりＦｂｘｏ４０活性を阻害し、および／またはＦｂｘｏ４０発現を下方調節する抗体または免疫グロブリン（中和抗体）を使用する。
【００９８】
「抗体」または「免疫グロブリン」などなる用語は、あらゆる全抗体、あらゆる抗原結合部分、あらゆる１つ以上のＣＤＲ領域、フラグメント、またはそれらの一本鎖、および抗体の結合親和性および抗原結合部分を模倣する分子、ならびにそれらの変異体および誘導体を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合により連結された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域を含み、後者は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および１つのドメインＣＬを含む軽鎖定常領域を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存されている領域［フレームワーク領域（ＦＲ）］で分散された超可変性［相補性決定領域（ＣＤＲ）］の領域にさらに分けることができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。定常領域は、宿主組織または因子、例えば、免疫系の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）への抗体の結合を介在し得る。
【００９９】
本明細書の抗Ｆｂｘｏ４０抗体は、限定はしないが、Ｆｂｘｏ４０に結合する抗体のあらゆる誘導体もしくは変異体、抗体様分子、抗体の抗原結合部分、あらゆるモノクローナル、ポリクローナル、組換え、キメラ、ヒト、非ヒト、ヒト化、二重特異性、二機能性、アイソタイプ−スイッチ、非アイソタイプ−スイッチ抗体（またはそれらの変異体もしくは誘導体）を含む。Ｆｂｘｏ４０に対する抗体は好ましくはモノクローナルである。本明細書の抗Ｆｂｘｏ４０抗体はまた、Ｆｂｘｏ４０に結合し、アンタゴナイズするラクダナノボディ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディおよびジ−ダイアボディを含む。
【０１００】
本明細書はまた、Ｆｂｘｏ４０に非競合的に結合することができる２つ以上の抗体、変異体または抗体様分子のセットを含む。好ましくは、分子のセットまたは組合せの親和性は、構成分子のいずれかよりも高い。
【０１０１】
本明細書において使用される抗体の「抗原結合部分」なる用語は、抗原（例えば、Ｆｂｘｏ４０）に特異的に結合する能力を保持する抗体のフラグメントを示す。結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨおよびＶＬドメインを含むｄＡｂ、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント［Wardら 1989 Nature 341, 544-546］、（ｖｉｉ）ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂ、および（ｖｉｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｉｘ）所望により合成リンカーにより結合され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せを含む。これらの組成物はまた、とりわけ、「抗体様分子」なる用語により包含される。Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは組換え方法を使用して、合成リンカーにより結合し、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価の単一のタンパク質鎖を創造することができる。Birdら 1988 Science 242, 423-426;およびHustonら 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883。抗原結合部分は組換えＤＮＡ技術またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的開裂により生産することができる。
【０１０２】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、例えば、Ｆｂｘｏ４０に結合し、アンタゴナイズする、実質的に同種の抗体の集団からの抗体を示す。モノクローナル抗体は、例えば、種々の方法を使用して、製造することができる、例えば、Kohlerら 1975 Nature, 256: 495; Lonbergら 1994 Nature 368: 856-859; 米国特許第4,816,567号; Clacksonら 1991 Nature, 352: 624-628およびMarksら 1991 J. Mol. Biol., 222: 581-597。
【０１０３】
異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製造物と対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に指向する。したがって、モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位またはエピトープに指向する。
【０１０４】
「エピトープ」または「抗原決定因子」なる用語は、抗体が特異的に結合する抗原、例えば、Ｆｂｘｏ４０上の部位を示す。エピトープは、連続アミノ酸またはタンパク質の三次折り畳みによって並列される非連続アミノ酸の両方から形成することができる。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、一般的に変性溶媒へ暴露されても保持されるが、三次折り畳みによって形成されるエピトープは、一般的に、変性溶媒での処理において喪失する。エピトープは、一般的に、ユニークな空間配座における少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間配座を決定する方法は、当該分野の技術および本明細書に記載されているもの、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. 1996参照。
【０１０５】
モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体を含み、天然に生じ得るか、または組換え的に生産され得る。
【０１０６】
「組換え抗体」なる用語は、組換え方法により製造されるか、発現されるか、創造されるか、または単離される抗体、例えば、（ａ）免疫グロブリン遺伝子（例えば、ヒト遺伝子）に対してトランスジェニックまたはトランスクロモソーマル（transchromosomal）である動物（例えば、マウス）またはそれから製造されるハイブリドーマから単離される抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、（ｃ）ファージディスプレイを使用して組換えコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト抗体配列を含む）から単離される抗体、および（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列（例えば、ヒト遺伝子）の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他の任意の方法により製造されるか、発現されるか、創造されるか、または単離される抗体を示す。このような組換え抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有していてもよい。このような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発に付すことができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列配列に由来するが、ヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内にインビボで天然には存在しなくてもよい配列である。
【０１０７】
「キメラ抗体」なる用語は、可変領域が第１の種に由来し、定常領域が第２の種に由来する免疫グロブリンまたは抗体を示す。
【０１０８】
本明細書において使用される「ヒト抗体」なる用語は、フレームワークおよびＣＤＲの両方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。Kabatら (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242。ＣＤＲおよびフレームワークコンセンサス配列はまた、Chothiaら J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)およびMacCallumら J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996);およびChothiaら 1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479に記載されている。好ましくはKabatまたはChothiaであるが、これらのいずれかを、特定の抗体可変領域内のＣＤＲ配列を決定するために使用することができる。
【０１０９】
ヒト抗体は、野生型ヒト生殖細胞系列配列の変異体を含むことができる。
【０１１０】
「ヒト化抗体」なる用語は、定常領域と共に、実質的にヒト抗体に由来する可変領域および実質的に非ヒト抗体に由来するＣＤＲを有する少なくとも１つのヒト化軽鎖または重鎖を含む抗体を示す。「ヒト化可変領域」なる用語は、実質的にヒト抗体に由来する可変フレームワーク領域および実質的に非ヒト抗体に由来するＣＤＲを含む可変領域を示す。
【０１１１】
「二重特異的」または「二重機能性抗体」なる用語は、とりわけ、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体を含む。Songsivilai ら 1990 Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelnyら 1992 J. Immunol. 148: 1547-1553。
【０１１２】
本明細書において使用される「異種抗体」は、トランスジェニック非ヒト生物体または植物が生産するかかる抗体に関して定義される。
【０１１３】
本明細書の抗体は、とりわけ、アイソタイプ−スイッチおよび非−アイソタイプ−スイッチ抗体を含む。
【０１１４】
本明細書において使用される「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧなど）を示す。１つの態様において、抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤまたはＩｇＥ抗体アイソタイプから選択されるアイソタイプのものである。
【０１１５】
本明細書において使用される「アイソタイプスイッチング」は、抗体のクラスまたはアイソタイプが、あるＩｇクラスから他のＩｇクラスの一つに変化することによる現象を示す。
【０１１６】
本明細書において使用される「非スイッチアイソタイプ」は、アイソタイプスイッチングが起こらないときに生産される重鎖のアイソタイプクラスを示す。非スイッチアイソタイプをコードするＣＨ遺伝子は、一般的に、機能的に再配列されたＶＤＪ遺伝子からすぐ下流の最初のＣＨ遺伝子である。
【０１１７】
本明細書の抗Ｆｂｘｏ４０抗体はまた、Ｆｂｘｏ４０に結合し、アンタゴナイズするラクダナノボディ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディおよびジ−ダイアボディを含む。
【０１１８】
新世界メンバー、例えば、ラマ種（アルパカ、ラマおよびビクーナ）を含むラクダおよびヒトコブラクダ（フタコブラクダおよびヒトコブラクダ）ファミリーメンバーから得られる抗体タンパク質は、特徴付けられている。これらに哺乳動物において見出される特定のＩｇＧ抗体は軽鎖を欠き、したがって他の動物由来の抗体と構造的に異なっている。ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０４６７８。ラクダ抗体の小さい単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）は、「ラクダナノボディ」として知られる高親和性低分子量抗体由来タンパク質を生じる。米国特許第５，７５９，８０８号；Stijlemansら 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulinら 2003 Nature 424: 783-788; Pleschbergerら 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozoら 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62;およびLauwereysら 1998 EMBO J. 17: 3512-3520。ラクダ抗体および抗体フラグメントの人工ライブラリーは、利用できる、例えば、Ablynx, Ghent, Belgiumから市販されている。ナノボディは、「ヒト化」でき、ラクダ抗体の本来の低い抗原性をさらに低下させることができる。
【０１１９】
ラクダナノボディは、ヒトＩｇＧ分子の約１０分の１の分子量を有し、わずか数ナノメートルの直径を有する。ラクダナノボディは、大型抗体タンパク質には機能的に見えない抗原部位に結合することができる。
【０１２０】
ラクダナノボディは、熱安定であり、極端なｐＨおよびタンパク質分解消化に対して安定であり、乏しい抗原性である。それらは、循環系から組織へ、血液脳関門を通過するときでさえ容易に移動し、神経組織に影響する障害を処置することができる。ナノボディはさらに、血液脳関門を通過する薬物移動を促進することができる。２００４年８月１９日に公開された米国特許出願第２００４０１６１７３８号。
【０１２１】
本明細書のＦｂｘｏ４０に特異的および／または選択的に結合する抗体、抗体様分子および他の分子はまた、とりわけ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、抗体の機能特性を示すが、それらのフレームワークおよび抗原結合部分は他のポリペプチド（例えば、フィブロネクチンおよびフィブロネクチン様分子）に由来する分子、ならびに任意の、および全ての抗体フラグメントおよび模擬物、例えば、限定はしないが、例えば、ドメイン抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、ＵｎｉＢｏｄｉｅｓ、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ、アプタマー、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ、ＤＡＲＰｉｎｓ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ、Ａｖｉｍｅｒｓ、Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓおよび／またはＳＭＩＰｓＴＭ（Small Modular ImmunoPharmaceuticals-Trubion Pharmaceuticals）を含む。
【０１２２】
ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが同じ鎖の２つのドメイン間で対にするには非常に短いリンカーにより連結される単一のポリペプチド鎖で発現される二価の二重特異性分子である。ＶＨおよびＶＬドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対になり、それにより２つの抗原結合部位を創造する。Holligerら 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljakら 1994 Structure 2: 1121-1123。
【０１２３】
一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、約１５アミノ酸残基のリンカーで、２つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖を連結することにより生産される。Holligerら 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45: 128-30; Wuら 1996 Immunotechnology, 2: 21-36; Pluckthunら1997 Immunotech. 3: 83-105; Ridgwayら 1996 Protein Eng., 9: 617-21。ダイアボディは、Ｆｃと融合させ、「ジ−ダイアボディ」を生成することができる。Luら 2004 J. Biol. Chem., 279: 2856-65。
【０１２４】
本明細書はさらに、抗体の機能特性を示すが、他のポリペプチド由来のフレームワークおよび抗原結合部分に由来するＦｂｘｏ４０結合分子を提供する。これらの結合分子の抗原結合ドメインは、定方向進化プロセスを介して産生することができる。米国特許第７，１１５，３９６号。抗体の可変ドメインと同様の全体の折り畳み（「免疫グロブリン様」折り畳み）を有する分子は、適当なスカフォールドタンパク質である。抗原結合分子を導くために適当なスカフォールドタンパク質は、フィブロネクチンまたはフィブロネクチンダイマー、テネイシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ−受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質色素タンパク質、ミエリン膜接着分子Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２およびＶＣＡＭ−１のＩ−セットドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−セット免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−セット免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−セット免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トウィッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ細胞抗原受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬおよびソーマチンを含む。
【０１２５】
「Ｆｂｘｏ４０抗体」、「Ｆｂｘｏ４０抗体様分子」、「Ｆｂｘｏ４０に特異的および／または選択的に結合する分子」なる用語などはまた、広範に、限定はしないが、抗体フラグメントおよび抗体模擬物を含む。多種多様の抗体フラグメントおよび抗体模擬物技術は知られている。「Ｆｂｘｏ４０抗体」、「Ｆｂｘｏ４０抗体様分子」および「Ｆｂｘｏ４０に特異的および／または選択的に結合する分子」なる用語は、広範に、任意の、および全ての抗体フラグメントおよび模擬物、限定はしないが、例えば、ドメイン抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、ＵｎｉＢｏｄｉｅｓ、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ、アプタマー、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ、ＤＡＲＰｉｎｓ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ、ＡｖｉｍｅｒｓおよびＶｅｒｓａｂｏｄｉｅｓを含むことを意味する。これらの分子のいくつかは、Gill and Damle (2006) 17: 653-658に概説されている。
【０１２６】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、ヒト抗体の重（ＶＨ）鎖または軽（ＶＬ）鎖のいずれかの可変領域に対応する抗体の最小機能性結合ユニットである。Ｄｏｍａｎｔｉｓは、完全ヒトＶＨおよびＶＬｄＡｂの一連の大型のおよび高度に機能性のライブラリーを開発しており、これらのライブラリーを治療標的に特異的であるｄＡｂを選択するために使用する。米国特許第６，２９１，１５８；６，５８２，９１５；６，５９３，０８１；６，１７２，１９７；６，６９６，２４５号；米国シリアスナンバー２００４／０１１０９４１；欧州特許出願第１４３３８４６号および欧州特許第０３６８６８４＆０６１６６４０号；ＷＯ０５／０３５５７２、ＷＯ０４／１０１７９０、ＷＯ０４／０８１０２６、ＷＯ０４／０５８８２１、ＷＯ０４／００３０１９およびＷＯ０３／００２６０９。
【０１２７】
Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓは、天然重鎖抗体のユニークな構造および機能特性を含む抗体由来治療タンパク質である。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）および２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。ＷＯ０４／０４１８６７；米国６，７６５，０８７；ＷＯ０６／０７９３７２。
【０１２８】
ＵｎｉＢｏｄｉｅｓは、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去に基づく抗体フラグメント技術である。この欠失は、従来のＩｇＧ４抗体のサイズの本質的に半分であり、一価の結合領域を有する分子を生産する。ＷＯ２００７／０５９７８２。
【０１２９】
Ａｄｎｅｃｔｉｎ分子は、フィブロネクチンタンパク質の１つ以上のドメインに由来する操作された結合タンパク質である。Wardら callutheran.edu/Academic_Programs/Departments /BioDev/omm/fibro/fibro.htm; Pankov and Yamada (2002) J Cell Sci. 115 (Pt 20): 3861-3, Hohenester and Engel (2002) 21: 115-128、およびLucenaら (2007) Invest Clin.48: 249-262。Ａｄｎｅｃｔｉｎ分子は、２つのベータシート間に分配された多数のベータストランドからなる天然タンパク質を改変することによるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに由来し得る。
【０１３０】
本明細書はまた、広範に、Ｆｂｘｏ４０に特異的および／または選択的に結合するフィブロネクチンまたはフィブロネクチン様分子を含む。フィブロネクチンは、例えば、１Ｆｎ３、２Ｆｎ３、３Ｆｎ３などを示し得る多数のＩＩＩ型ドメインを含み得る。１０Ｆｎ３ドメインはインテグリン結合モチーフを含み、さらに、ベータストランドと連結する３つのループを含む。これらのループは、ＩｇＧ重鎖の抗原結合ループに対応すると考えられ、それらは、Ｆｂｘｏ４０に特異的に結合するように以下で議論されている方法により改変され得る。米国特許出願第２００７００８２３６５号；Ｓｚｏｓｔａｋら、米国特許出願第０９／００７，００５および０９／２４７，１９０号；Ｓｚｏｓｔａｋら、ＷＯ９８９／３１７００；およびRoberts & Szostak (1997) 94: 12297-12302；Ｌｏｈｓｅ、米国特許出願第６０／１１０，５４９号、米国特許出願第０９／４５９，１９０号およびＷＯ００／３２８２３；米国特許第７，１１５，３９６；６，８１８，４１８；６，５３７，７４９；６，６６０，４７３；７，１９５，８８０；６，４１６，９５０；６，２１４，５５３；６６２３９２６；６，３１２，９２７；６，６０２，６８５；６，５１８，０１８；６，２０７，４４６；６，２５８，５５８；６，４３６，６６５；６，２８１，３４４；７，２７０，９５０；６，９５１，７２５；６，８４６，６５５；７，０７８，１９７；６，４２９，３００；７，１２５，６６９；６，５３７，７４９；６，６６０，４７３号；および米国特許出願第２００７００８２３６５；２００５０２５５５４８；２００５００３８２２９；２００３０１４３６１６；２００２０１８２５９７；２００２０１７７１５８；２００４００８６９８０；２００４０２５３６１２；２００３００２２２３６；２００３００１３１６０；２００３００２７１９４；２００３００１３１１０；２００４０２５９１５５；２００２０１８２６８７；２００６０２７０６０４；２００６０２４６０５９；２００３０１００００４；２００３０１４３６１６および２００２０１８２５９７号。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、例えば、１０Ｆｎ３における多様性の産生は、後の選択工程は、当分野で知られている他の方法、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイまたは酵母表面ディスプレイ、例えば、Lipovsekら (2007) Journal of Molecular Biology 368: 1024-1041; Sergeevaら (2006) Adv Drug Deliv Rev. 58: 1622-1654; Pettyら (2007) Trends Biotechnol. 25: 7-15; Rotheら (2006) Expert Opin Biol Ther. 6: 177-187;およびHoogenboom (2005) Nat Biotechnol. 23: 1105-1116を使用して成し遂げられ得る。
【０１３１】
上記方法を介して抗体模倣物を産生するために使用することができるさらなる分子は、限定はしないが、ヒトフィブロネクチン分子１Ｆｎ３−９Ｆｎ３および１１Ｆｎ３−１７Ｆｎ３、ならびに非ヒト動物および原核生物由来の関連Ｆｎ３分子モジュール、および１０Ｆｎ３に対する配列相同性を有する他のタンパク質由来のＦｎ３モジュール、例えば、テネイシンおよびウンデュリン(undulins)を含む。免疫グロブリン様折り畳みを有する他の非抗体タンパク質は、Ｎ−カドヘリン、ＩＣＡＭ−２、チチン、ＧＣＳＦ受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、Ｅ−カドヘリンおよび抗生物質色素タンパク質を含む。関連構造を有するさらなるドメインは、ミエリン膜接着分子Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２およびＶＣＡＭ−１のＩ−セットドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−セット免疫グロブリン折り畳み、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−セット免疫グロブリン折り畳み、テロキンのＩ−セット免疫グロブリン折り畳み、テリキン(telikin)、ＮＣＡＭ、トウィッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、ＧＣ−ＳＦ受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、ベータ−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼおよびトランスグルタミナーゼに由来し得る。あるいは、１つ以上の免疫グロブリン様折り畳みを含む任意の他のタンパク質が、アドネクチン様結合部分を創造するために利用され得る。このようなタンパク質は、例えば、プログラムＳＣＯＰを使用して同定され得る。Murzinら J. Mol. Biol. 247: 536 (1995); Lo Conteら Nucleic Acids Res. 25: 257 (2000)。
【０１３２】
アプタマーは、特異的標的に結合する小分子ヌクレオチドポリマーである。アプタマーは、一本または二本鎖核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。アプタマーは、しばしば、標的に対する親和性を決定する複合体三次元構造を形成する。Ellingtonら 1990 Nature. 346: 818-22; Schneiderら 1992. J Mol Biol. 228: 862-9; Klussmann。アプタマーハンドブック： Functional Oligonucleotides and Their Applications. ISBN: 978-3-527-31059-3; Ulrichら 2006. Comb Chem High Throughput Screen 9: 619-32; Cerchiaら 2007. Methods Mol Biol. 361: 187-200; Iresonら 2006. Mol Cancer Ther. 2006 5: 2957-62；米国特許第５５８２９８１；５８４０８６７；５７５６２９１；６２６１７８３；６４５８５５９；５７９２６１３；６１１１０９５号；および米国特許出願第１１／４８２，６７１；１１／１０２，４２８；１１／２９１，６１０；および１０／６２７，５４３号。ＳＥＬＥＸ方法はアプタマーを産生するために使用することができる。Bugautら 2006. 4(22): 4082-8; Stoltenburgら 2007 Biomol. Eng. 2007 24(4): 381-403;およびGopinath. 2007. Anal. Bioanal Chem. 2007. 387(1): 171-82。本明細書のアプタマーはまた、ヌクレオチドの代わりにペプチドから作られたアプタマー分子を含む。Baines and Colas. 2006. Drug Discov. Today. 11(7-8): 334-41;およびBickleら 2006. Nat. Protoc. 1(3): 1066-91。
【０１３３】
Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子は、ブドウ球菌タンパク質ＡのＩｇＧ−結合ドメインに由来する５８−アミノ酸残基タンパク質ドメインに基づく。このドメインは、コンビナトリアルファージミドライブラリーの構築のためのスカフォールドとして使用されており、これから、所望の分子を標的化する変異体を、ファージディスプレイ技術を使用して選択することができる（Nordら Nat. Biotechnol 1997; 15: 772-7; Ronmarkら Eur J Biochem 2002; 269: 2647-55）。単一の構造および小サイズのＡｆｆｉｂｏｄｙ分子は、多数の適用のために、例えば、検出試薬として（Ronmarkら J Immunol Methods 2002; 261: 199-211）、および受容体相互作用を阻害するために（Sandstormら Protein Eng 2003; 16: 691-7）適当とされる。米国特許第５，８３１，０１２号も参照。
【０１３４】
ＤＡＲＰｉｎｓ（設計されたアンキリン反復タンパク質）は、非抗体ポリペプチドの結合能力利用するために開発された抗体模擬物ＤＲＰ（設計された反復タンパク質）技術の１つの例である。反復タンパク質、例えば、アンキリンまたはロイシンリッチ反復タンパク質は、可変およびモジュール標的結合表面を提示する伸長ドメインを形成するように、互いに積み重ねる反復構造単位を有する普遍的結合分子である。多様な結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを産生することができる。米国特許出願公開第２００４／０１３２０２８号および国際特許出願公開ＷＯ０２／２０５６５。
【０１３５】
Ａｎｔｉｃａｌｉｎは、ヒト組織および体液において発現される低分子量タンパク質ファミリーであるリポカリン由来の抗体模擬物である。リポカリンは、化学的に感受性または不溶性化合物の生理学的輸送および保存と関連する。リポカリンをクローンし、それらのループを、Ａｎｔｉｃａｌｉｎを創造するために操作に付す。構造的に種々のＡｎｔｉｃａｌｉｎのライブラリーが産生されており、Ａｎｔｉｃａｌｉｎディスプレイは、結合機能の選択およびスクリーニング、後の可溶性タンパク質の発現および生産を可能にする。Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓはまた、デュアル標的化タンパク質、いわゆるＤｕｏｃａｌｉｎとして設定することができる。Ｄｕｏｃａｌｉｎは、１つのモノマータンパク質における２つの別々の治療標的に結合する。米国特許第７，２５０，２９７号および国際特許出願公開ＷＯ９９／１６８７３。
【０１３６】
本明細書に対して有用な別の抗体模擬物技術はＡｖｉｍｅｒｓである。Ａｖｉｍｅｒｓは、インビトロエキソン・シャッフリングおよびファージディスプレイによるヒト細胞外受容体ドメインの大型ファミリーから開発され、結合および阻害特性を有するマルチドメインタンパク質を産生する。米国特許出願公開第２００６／０２８６６０３、２００６／０２３４２９９、２００６／０２２３１１４、２００６／０１７７８３１、２００６／０００８８４４、２００５／０２２１３８４、２００５／０１６４３０１、２００５／００８９９３２、２００５／００５３９７３、２００５／００４８５１２、２００４／０１７５７５６号。
【０１３７】
Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓは、本明細書の文脈において使用され得る別の抗体模擬物技術である。Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓは、高いジスルフィド密度スカフォールドを形成する＞１５％のシステインを有する３−５ｋＤａの小分子タンパク質であり、典型的なタンパク質が有する疎水性コアを置換する。米国特許出願公開第２００７／０１９１２７２号。
【０１３８】
ＳＭＩＰｓＴＭ（Small Modular ImmunoPharmaceuticals-Trubion Pharmaceuticals）は、標的結合、エフェクター機能、インビボ半減期および発現レベルを維持および最適化するために操作される。Zhaoら (2007) Blood 110: 2569-77；および米国特許出願第２００５０２３８６４６；２００５０２０２５３４；２００５０２０２０２８；２００５０２０２０２３；２００５０２０２０１２；２００５０１８６２１６；２００５０１８０９７０；および２００５０１７５６１４号。
【０１３９】
本明細書のＦｂｘｏ４０抗体（またはＦｂｘｏ４０に特異的および／または選択的に結合する抗体様分子もしくは分子、またはそれらの変異体もしくは誘導体など）はまた、Ｆｂｘｏ４０に対する特異的結合、および／またはＦｂｘｏ４０抗体の同様のＫＤ、Ｋｏｆｆおよび／またはＥＣ５０を保持する。この変異体、誘導体または抗体様分子は、所望により、同じ、または異なるグリコシル化パターンを有するか、または天然もしくは再配列されていてもよく、修飾、保存または非保存的置換を有することができ、および／またはＦｂｘｏ４０抗体のコンセンサスフレームワークを保持することができる。
【０１４０】
したがって、本明細書において使用されるＦｂｘｏ４０に結合する「Ｆｂｘｏ４０に対する抗体」、「Ｆｂｘｏ４０抗体」、「抗体様分子」などなる用語は、すべて、Ｆｂｘｏ４０に特異的に結合し、特異的および／または選択的に結合する種々の型の抗体、抗体フラグメント、変異体および誘導体、抗体様分子および分子を示す。好ましくは、これらの組成物はまた、Ｆｂｘｏ４０の機能、例えば、本明細書に記載されている機能を阻害する。
【０１４１】
本明細書において使用される「特異的結合」、「選択的結合」などの用語は、抗体または他の分子が、他の抗原およびエピトープではなく特定の抗原またはエピトープ、例えば、他の物質ではなくＦｂｘｏ４０（ただし、抗体または分子がＦｂｘｏ４０に結合しない場合を除く）に対するかなりの親和性を示すことを意味する。「かなりの」または特定の特異的結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１の親和性での結合を含む。１０７Ｍ−１より良い、好ましくは１０８Ｍ−１より良い親和性が好ましい。「有意な交差反応性を示さない」抗体は、望ましくない物質（例えば、望ましくないタンパク質状物質）とあまり結合しないものである。特異的または選択的結合は、当該技術分野において認識されている任意の方法、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析および／または競合的結合アッセイにしたがって決定することができる。
【０１４２】
本明細書において使用される「ＫＤ」なる用語は、特定の抗体抗原相互作用の解離平衡定数または抗原に対する抗体の親和性を示すことを意図する。１つの態様において、本明細書の抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイを使用して測定するとき、５０ｎＭまたはそれより良い（例えば、４０ｎＭまたは３０ｎＭまたは２０ｎＭまたは１０ｎＭ以下）親和性（ＫＤ）で抗原に結合する。
【０１４３】
本明細書において使用される「Ｋｏｆｆ」なる用語は、抗体／抗原複合体から抗体の解離についてのオフ速度定数を示すことを意図する。
【０１４４】
本明細書において使用される「ＥＣ５０」なる用語は、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの中間である、インビトロまたはインビボアッセイのいずれかにおいて応答を誘導する抗体の濃度を示す。
【０１４５】
したがって、本明細書のＦｂｘｏ４０へ特異的および／または選択的に結合する抗体、抗体様分子および他の分子は、限定はしないが、とりわけ、本明細書に記載されているあらゆる型の分子、および当分野で知られている特異的に結合する種々の他の分子を含む。これらの分子は、限定はしないが、本明細書に記載されているものを含む当分野で知られている任意の技術を使用して産生することができる。
【０１４６】
これらの分子を産生するための技術は、代替ポリペプチドベースの技術、例えば、Quiら Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007)に記載されている相補的(complimentary)決定領域の融合、ならびに核酸ベースの技術、例えば、米国特許第５，７８９，１５７、５，８６４，０２６、５，７１２，３７５、５，７６３，５６６、６，０１３，４４３、６，３７６，４７４、６，６１３，５２６、６，１１４，１２０、６，２６１，７７４および６，３８７，６２０号に記載されているＲＮＡアプタマー技術を含む。
【０１４７】
非抗体結合分子を産生するため、クローンのライブラリーは、抗原に結合するスカフォールドタンパク質（例えば、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン様分子）の配列をランダム化して創造することができる。ライブラリークローンは、抗原に対する特異的結合および他の機能（例えば、Ｆｂｘｏ４０の生物学的活性の阻害）について試験する。選択されるクローンは、さらなるランダム化および選択の基礎として使用して、抗原に対するより高い親和性の誘導体を生産することができる。
【０１４８】
高親和性結合分子はまた、例えば、スカフォールドとしてフィブロネクチンＩＩＩの第１０モジュール（１０Ｆｎ３またはＦｎ１０）を使用して産生することができる。ライブラリーは、１０ＦＮ３の３つのＣＤＲ様ループのそれぞれについて残基２３−２９、５２−５５および７８−８７で構築される。米国特許第６，８１８，４１８および７，１１５，３９６号；Roberts and Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 12297；米国特許第６，２６１，８０４号；米国特許第６，２５８，５５８号；およびSzostakらＷＯ９８／３１７００。
【０１４９】
非抗体結合分子は、標的に対する親和性を増加させるために、二量体または多量体として生産することができる。例えば、抗原結合ドメインは、Ｆｃ−Ｆｃ二量体を形成する抗体の定常領域（Ｆｃ）との融合体として発現される。米国特許第７，１１５，３９６号。
【０１５０】
同じまたは重複エピトープを認識する抗体は、日常的な技術、例えば、免疫測定法、例えば、競合的結合アッセイを使用して同定することができる。多くのタイプの競合的結合アッセイが知られている、例えば：固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahliら (1983) Methods in Enzymology 9: 242参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（see Kirklandら (1986) J. Immunol. 137: 3614）；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ（Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press参照）；Ｉ−１２５ラベルを使用する固相直接ラベルＲＩＡ（Morelら (1988) Mol. Immunol. 25(1): 7参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheungら (1990) Virology 176: 546）；および直接標識化ＲＩＡ（Moldenhauerら (1990) Scand. J. Immunol. 32: 77）。
【０１５１】
Ｆｂｘｏ４０に特異的に結合する抗体、抗体様分子および他の結合分子もまた、修飾することができる。これらの修飾は、とりわけ、天然において見出される分子の状態（「天然」状態）からの変化、アミノ酸配列のグリコシル化パターン、再配列、修飾（とりわけ、保存および非保存的置換を含む）における変化、ＣＤＲグラフティング、親和性成熟、Ｆｃ領域またはヒンジ領域の修飾、および／またはペグ化または他の翻訳後修飾における変化などを含む。
【０１５２】
対象に適用して適用されるとき、本明細書において使用される「天然」なる用語は、ある対象が天然に見出すことができることを示す。例えば、生物体（ウイルスを含む）に存在し、天然の供給源から単離でき、そして研究室で人によって意図的に修飾されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然である。
【０１５３】
本明細書において使用される「グリコシル化パターン」は、タンパク質、さらに具体的には、免疫グロブリンタンパク質と共有結合する炭水化物単位のパターンと定義される。
【０１５４】
本明細書において使用される「再配列」なる用語は、Ｖセグメントが、完全なＶＨまたはＶＬドメインをそれぞれ本質的にコードする配座においてＤ−ＪまたはＪセグメントと密接に隣接した位置にある、重鎖または軽鎖免疫グロブリン座の配置を示す。再配列された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系列ＤＮＡとの比較により同定することができる。再配列された座は、少なくとも１つの再結合されたヘプタマー／ノナマーホモロジー要素を有する。
【０１５５】
Ｖセグメントについて、本明細書において使用される「再配列されていない」または「生殖細胞系列配置」なる用語は、Ｖセグメントが、ＤまたはＪセグメントに密接に隣接するように再結合されない配置を示す。
【０１５６】
本明細書において使用される「修飾する」または「修飾」なる用語は、抗体中の１つ以上のアミノ酸を変化することを示すことを意図する。変化は、１個以上の位置でのアミノ酸の付加、置換または欠失により生産することができる。Ｆｂｘｏ４０に特異的および／または選択的に結合する抗体、抗体様分子および他の分子は、保存および非保存的アミノ酸置換を含む修飾を有することができる。
【０１５７】
したがって、本明細書は、「保存的アミノ酸置換」、すなわち、Ｆｂｘｏ４０への抗体の結合を破棄しないヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾を含む。保存的アミノ酸置換は、あるクラスのアミノ酸を同じクラスのアミノ酸で置換することを含む。アミノ酸側鎖の６個の一般的なクラスは、クラスＩ（Ｃｙｓ）、クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）、クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）、クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）、およびクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を含む。Brummellら Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashiら Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999);およびBurksら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: .412-417 (1997)。
【０１５８】
「非保存的アミノ酸置換」なる用語は、あるクラスのアミノ酸の別のクラスのアミノ酸での置換を示す。
【０１５９】
あるいは、別の態様において、変異（保存的または非保存的）を、例えば、飽和変異誘発により、抗体コード配列の全てまたは一部に沿ってランダムに導入することができる。得られる修飾抗体は、結合活性についてスクリーニングすることができる。保存および非保存修飾は、Ｆｂｘｏ４０へ特異的および／または選択的に結合する抗体、抗体様分子または他の分子のコンセンサス配列において生じ得る。
【０１６０】
「コンセンサス配列」は、関連配列のファミリーにおいて最も頻繁に生じるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列である（例えば、Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987）。タンパク質のファミリーにおいて、コンセンサス配列におけるそれぞれの位置は、該ファミリーのその位置で最も頻繁に生じるアミノ酸により占められる。２種のアミノ酸が等しく頻繁に生じるとき、いずれかがコンセンサス配列に含まれ得る。免疫グロブリンの「コンセンサスフレームワーク」は、コンセンサス免疫グロブリン配列のフレームワーク領域を示す。特異的および／または選択的に結合する抗体、抗体様分子および他の分子の他のコンセンサス配列は、当分野で知られている。
【０１６１】
これらの組成物のさらなる修飾版バージョンは、当業者に知られている技術を使用して製造することができる。本明細書の抗体は、出発抗体からの改変された特性を有し得る修飾抗体を操作するために、出発物質として１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を使用して製造することができる。抗体は、１つまたは両方の可変領域内の１つ以上の残基を修飾することにより操作することができる。本明細書のＦｂｘｏ４０抗体は、１つ以上のＣＤＲグラフト、変異アミノ酸、親和性変異配列および／またはＦｃ領域、ヒンジ領域、グリコシル化パターンおよび／またはペグ化パターンの修飾を有することができる。
【０１６２】
実施することができる１つの型の可変領域操作はＣＤＲグラフティングである。１つの抗体のＣＤＲ配列を、異なる特性を有する異なる抗体のフレームワーク上にグラフトされる。Riechmannら 1998 Nature 332: 323-327; Jonesら 1986 Nature 321: 522-525; Queenら 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86: 10029-10033; 米国特許第5,225,539号および米国特許第5,530,101; 5,585,089; 5,693,762および6,180,370号）。ＣＤＲグラフティングの方法および適当な配列は知られている。例えば、www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase; Kabatら 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Dept. of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinsonら 1992  J. Mol. Biol. 227: 776-798; およびCoxら 1994 Eur. J. Immunol. 24: 827-836; 米国特許第5,530,101; 5,585,089; 5,693,762および6,180,370号参照。ＣＤＲはまた、免疫グロブリンドメイン以外のポリペプチドのフレームワーク領域、例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルチノスタチン、シトクロムｂ、ＣＰ１亜鉛フィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメインまたはテンドラミサット（tendramisat）に基づくフレームワークにグラフトすることができる。Nygren and Uhlen, 1997 Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469。
【０１６３】
ＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を、「親和性成熟」として知られる抗体の結合特性を改善するように変異することができる。変異は、アミノ酸置換、付加、欠失、保存もしくは非保存変化、および／または化学的に修飾されたアミノ酸の使用であり得る。修飾は、例えば、抗体の特性を改善するように、例えば、免疫原性を減少するように、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワークに行うことができる。１つのアプローチは、対応する生殖細胞系列配列に１つ以上のフレームワーク残基を「復帰突然変異する」ことである。さらに具体的には、体細胞変異を受けている抗体は、抗体が誘導される生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。体細胞変異は、生殖細胞系列配列に「復帰突然変異」することができる。
【０１６４】
別の型のフレームワーク修飾は、Ｔ細胞−エピトープを除去し、抗体の潜在的な免疫原性を減少する（「脱免疫化する」）ように、１つ以上の残基を変異することを含む。Ｃａｒｒらによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号。
【０１６５】
本明細書の抗体は、例えば、１つ以上の特性、例えば、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞毒性を改変するように、Ｆｃ領域内を修飾することができる。さらに、本明細書の抗体は、化学的に修飾されるか（例えば、１個以上の化学的部分が抗体に結合され得る）、またはグリコシル化を改変するように修飾され、再び、抗体の１つ以上の機能特性を改変され得る。
【０１６６】
１つの態様において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が改変されるように修飾される。米国特許第５，６７７，４２５号。Ｆｃヒンジ領域はまた、抗体の生物学的半減期を改変するように変異することができる。米国特許第６，１６５，７４５号。
【０１６７】
抗体は、その生物学的半減期を増加させるように修飾することができる。米国特許第６，２７７，３７５；５，８６９，０４６および６，１２１，０２２号。
【０１６８】
本明細書の抗体の種々の態様において、１つ以上のアミノ酸は、エフェクター機能、例えば、エフェクターリガンド（例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分）に対する親和性および／または抗原結合能力を改変する、米国特許第５，６２４，８２１および５，６４８，２６０号；Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を改変する、米国特許第６，１９４，５５１号；抗体が補体を固定する能力を改変する、ＷＯ９４／２９３５１；および／または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増加する、および／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加する、ＰｒｅｓｔａによるＷＯ００／４２０７２、ように修飾（置換、付加、欠失、化学的に変化、または保存的に置換）され得る。さらに、ＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位は、マッピングされており、改善された結合を有する変異体が記載されている。Shields, R.Lら 2001 J. Biol. Chem. 276: 6591-6604。
【０１６９】
抗体は、グリコシル化、低グリコシル化、別の炭水化物による修飾またはグリコシル化なしの修飾パターンを有することができる。HangらによるEP 1,176,195; PrestaによるPCT出願WO03/035835; Shields, R.L.ら 2002 J. Biol. Chem. 277: 26733-26740); UmanaらによるWO99/54342; Umanaら 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180。
【０１７０】
抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加するためにペグ化することができる。本明細書において使用される「ポリエチレングリコール」なる用語は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧのあらゆる形態、例えば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを含むことを意図する。１つの態様において、ペグ化される抗体はアグリコシル化(aglycosylated)抗体である。ＮｉｓｈｉｍｕｒａらによるＥＰ  ０  １５４  ３１６およびＩｓｈｉｋａｗａらによるＥＰ  ０  ４０１  ３８４。ペグ化は、非天然アミノ酸の導入によりペグ化を改変することができる。Deitersら J Am Chem Soc 125: 11782-11783, 2003; Wangら Science 301: 964-967, 2003; Wangら Science 292: 498-500, 2001; Zhangら Science 303: 371-373, 2004; 米国特許第7,083,970号。
【０１７１】
したがって、本明細書は、あらゆる、および全ての種類のＦｂｘｏ４０に対する抗体または免疫グロブリン、それらの修飾、フラグメントまたは変異体、または抗Ｆｂｘｏ４０抗体の機能性および／または構造を模倣する分子を含む。本明細書に記載されている全ての文献を、出典明示によりそれらの全体を本明細書に包含させる。
【０１７２】
Ｆｂｘｏ４０に特異的および／または選択的に結合する抗体、抗体様分子および他の分子は、別の部分に抱合される場合、免疫抱合体を作るために使用することができる。
【０１７３】
したがって、別の局面において、本明細書の方法は、Ｆｂｘｏ４０を標的化し、Ｆｂｘｏ４０を阻害または下方調節する免疫抱合体剤、例えば、限定はしないが、細胞毒性剤、抗炎症剤、例えば、ステロイド系もしくは非ステロイド系炎症剤、または細胞毒素代謝アンタゴナイズ剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）を使用する。
【０１７４】
「細胞毒素」または「細胞毒性剤」なる用語は、線維性組織に対して有害である（例えば、殺す）あらゆる薬剤を含む。例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログを含む。
【０１７５】
免疫抱合体は、抗体と適当な治療剤を抱合する（例えば、化学的に連結するか、または組換え的に発現する）ことにより形成することができる。適当な薬剤は、例えば、細胞毒性剤、毒素および／または放射性同位体を含む。使用することができる毒素およびそれらのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、エクソトキシンＡ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アルビンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシナ、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトギリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシンおよびトリコテセンを含む。種々の放射性核種、例えば、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを使用することができる。
【０１７６】
免疫抱合体は、種々の二機能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作成することができる。リシン免疫毒素は製造することができる。Vitettaら Science 238: 1098 (1987)。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドと抗体の抱合のためのキレート化剤の例である（例えば、ＷＯ９４／１１０２６参照）。
【０１７７】
Ｆｂｘｏ４０に特異的および／または選択的に結合し、アンタゴナイズする種々の他の抗体、抗体様分子および他の分子、ならびにそれらの変異体および免疫抱合体は、当業者により製造することができる。
【０１７８】
Ｆｂｘｏ４０をアンタゴナイズするｓｉＲＮＡ、他の阻害核酸など
Ｆｂｘｏ４０のアンタゴニストはまた、阻害核酸、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。１つの態様において、本明細書の方法において使用されるＦｂｘｏ４０アンタゴニストは、Ｆｂｘｏ４０核酸または遺伝子に相補的なｓｉＲＮＡまたは他の核酸（またはそのアンチセンスもしくは部分）、または核酸をコードする組換え発現ベクター（またはそのアンチセンスもしくは部分）である。本明細書において使用される「アンチセンス」核酸は、Ｆｂｘｏ４０タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的（例えば、二本鎖ＤＮＡのコード鎖に相補的、ｍＲＮＡに相補的、または、Ｆｂｘｏ４０遺伝子のコード鎖に相補的）なヌクレオチド配列を含む。種々の文脈において、本明細書において使用される「ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸」などは、あらゆるｓｉＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）またはあらゆる一本鎖ＤＮＡを含むことができる。本明細書において使用される、および以下に詳細に記載されている「ｓｉＲＮＡ」なる用語は、ＲＮＡ干渉を介在することができる二本鎖領域を含むＲＮＡのあらゆる型を含むことができる（例えば、２つの別々の鎖を含む分子、ループ［例えば、ヘアピン］で連結された２つの鎖、１つまたは両方の鎖が一本鎖ニックを含む２つの鎖、修飾ヌクレオチドおよび／またはエンドキャップなどを含む分子）。１つの態様において、Ｆｂｘｏ４０に対するｓｉＲＮＡは、Ｆｂｏｘを示す遺伝子の部分に結合する。別の特定の態様において、Ｆｂｘｏ４０に対するｓｉＲＮＡは、亜鉛フィンガードメインを示す遺伝子の部分に結合する。別の特定の態様において、ｓｉＲＮＡは、Ｆｂｏｘを示さない遺伝子の部分に結合する。別の特定の態様において、ｓｉＲＮＡは遺伝子の一部に結合する。
【０１７９】
細胞中の特定のタンパク質の発現を下方調節するためのアンチセンス核酸の使用は、当分野でよく知られている。Weintraubら Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1 1986; Askariら 1996 N. Eng. J. Med. 334: 316-318; Bennettら 1995 Circulation 92: 1981-1993; Mercolaら 1995 Cancer Gene Ther. 2: 47-59; Rossi 1995 Br. Med. Bull. 51: 217-225; Wagner 1994 Nature 372: 333-335。
【０１８０】
ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸は、別の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）のコード鎖に相補的な配列を含み、水素結合することができる。ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス配列は、コード領域、ｍＲＮＡの５’もしくは３’非翻訳領域および／またはコード領域と非翻訳領域を橋渡しする領域および／またはそれらの部分に相補的であり得る。さらに、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸は、ｍＲＮＡをコードする遺伝子の調節領域、例えば、転写または翻訳開始配列または調節要素に相補的であり得る。好ましくは、アンチセンス核酸は、コード鎖上の開始コドンまたはｍＲＮＡの３’非翻訳領域に先行するかもしくは橋渡しをする領域に相補的であり得る。
【０１８１】
ｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸は、ワトソン・クリック塩基対の規則にしたがって設計することができる。ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸分子は、Ｆｂｘｏ４０  ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、さらに好ましくは、Ｆｂｘｏ４０  ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部にのみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｆｂｘｏ４０  ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺の領域に相補的であり得る。ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸は、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であり得る。
【０１８２】
ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸は、当分野で知られている方法を使用して、化学合成および酵素的ライゲーション反応を使用して構築することができる。例えば、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然ヌクレオチド、または、分子の生物学的安定性を増加するか、またはアンチセンスとセンス核酸間で形成された二本鎖の物理的安定性を増加するように設計された種々の修飾ヌクレオチドを使用して化学的に合成でき、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸を産生するために使用することができる修飾ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキュエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケウオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、偽ウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリンを含む。
【０１８３】
ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸はまた、別の骨格、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）またはグリコール核酸（ＧＮＡ）を有することができ、および／または、それは標識化することができる（例えば、放射性標識されているか、またはタグ化されている）。ＷＯ２００５／０７５６３７；ＷＯ９５１８８２０；Zhangら 2005 J. Am. Chem. Soc. 127: 4174-5; Orgel 2000 Science 290 (5495): 1306-1307; Moulton 2009 Molecules 14: 1304-1323; Summerton 1999 Biochimica et Biophysica Acta 1489: 141-58。
【０１８４】
さらに別の態様において、本明細書の方法により使用されるｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸分子は、αアノマー核酸分子を含むことができる。αアノマー核酸分子は、通常のβユニットに反して、鎖が互いに平行に走る相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する。Gaultierら 1987 Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641。ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoueら 1987 Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoueら 1987 FEBS Lett. 215: 327-330）を含むことができる。
【０１８５】
さらに別の態様において、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、相補的領域を有する一本鎖核酸、例えば、ｍＲＮＡを開裂することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。したがって、リボザイム［例えば、ハンマーヘッドリボザイム（Haselhoffら 1988, Nature 334: 585-591に記載されている）］を、Ｆｂｘｏ４０  ｍＲＮＡ転写産物を触媒的に開裂し、それによりＦｂｘｏ４０  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために使用することができる。
【０１８６】
あるいは、遺伝子発現は、Ｆｂｘｏ４０の調節領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、Ｆｂｘｏ４０遺伝子の転写を防止するトリプルヘリックス構造を形成することにより阻害することができる。一般的に、Helene 1991 Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Heleneら 1992 Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36;およびMaher 1992, Bioassays 14(12): 807-15参照。
【０１８７】
あるいは、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、興味ある標的核酸に対するアンチセンス方向である、以下の小区分においてさらに記載されている）においてサブクローニングされた発現ベクターを使用して、生物学的に生産することができる。
【０１８８】
本明細書のｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸分子は、Ｆｂｘｏ４０をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズし、転写および／または翻訳を阻害することにより発現を阻害するように、一般的に対象に投与されるか、またはｓｉｔｕで産生される。アンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位での直接的注射を含む。あるいは、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸分子を選択される細胞を標的化するように修飾し、次に、全身的に投与することができる。例えば、全身投与のために、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス分子は、例えば、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に核酸分子を連結することにより、選択される細胞表面上で発現される受容体または抗原に特異的に結合するように修飾することができる。核酸分子はまた、当分野でよく知られている、および、例えば、ＵＳ２００７０１１１２３０（この全体の内容を本明細書に包含させる）に記載されているベクターを使用して細胞送達することができる。分子の十分な細胞内濃度をなし遂げるために、核酸分子が強いｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下で置き換えられたベクター構築物が好ましい。
【０１８９】
別の態様において、本明細書の方法において使用されるｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸は、ＲＮＡｉを介在する（ＲＮＡ干渉）化合物である。ＲＮＡ干渉剤は、限定はしないが、Ｆｂｘｏ４０またはそのフラグメントと同種であるＲＮＡ分子を含む核酸分子、「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）、「低分子ヘアピン」、「低分子ヘアピンＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）、「マイクロＲＮＡ」（ｍｉＲＮＡ）および遺伝子調節またはｍＲＮＡ転写のレベルでＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的遺伝子の発現を調節、妨害または阻害する他の小分子を含む。
【０１９０】
ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用してｄｓＲＮＡと同じ配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を破壊する転写後標的化遺伝子サイレンシング技術である。Zamoreら 2000 Cell 101: 25-33; Fireら 1998 Nature 391: 806; Hamiltonら 1999 Science 286: 950-951; Linら 1999 Nature 402: 128-129; Sharp 1999 Genes & Dev. 13: 139-141; Strauss 1999 Science 286: 886; Sharpら 2000 287: 2431-2432; Tuschlら 1999 Genes Dev. 13: 3191-3197。
【０１９１】
ＲＮＡｉのプロセスは、リボヌクレアーゼＩＩＩ（ダイサー）が長いｄｓＲＮＡをｓｉＲＮＡと呼ばれる短いフラグメントに開裂するとき、起こる。ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）は、一般的に、約２１から２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二本鎖を含む。Bass 2000 Cell 101: 235; Zamoreら 2000 Cell 101: 25-33; Hammondら 2000 Nature 404: 293; Bersteinら 2001 Nature 409: 363; Elbashirら 2001 Genes Dev. 15: 188。次に、小ＲＮＡセグメントは、標的ｍＲＮＡの分解を介在する。
【０１９２】
ダイサーはまた、翻訳調節に関与する保存された構造の前駆体ＲＮＡからの２１−および２２−ヌクレオチドのスモールテンポラル(small temporal)ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切除に関与している。Hutvagnerら 2001, Science, 293, 834。ＲＮＡｉ応答はまた、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的な一本鎖ｍＲＮＡの開裂を介在する、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般的に称されるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とする。標的ＲＮＡの開裂は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖と相補的な領域の中央で起こる。Elbashirら 2001 Genes Dev. 15: 188。
【０１９３】
ＲＮＡｉの合成のためのキットは、例えば、New England BiolabsおよびAmbionから市販されている。
【０１９４】
ＲＮＡｉは、種々の系において研究されている。Fireら 1998 Nature 391: 806; Bahramian and Zarbl 1999 Mol. Cell. Biology 19: 274-283; Wianny and Goetz 1999 Nature Cell Biol. 2: 70; Hammondら 2000 Nature 404: 293; Elbashirら 2001 Nature 411: 494およびTuschlら国際ＰＣＴ公開WO 01/75164は、培養された哺乳動物細胞、例えば、ヒト胚腎臓およびＨｅＬａ細胞における合成２１−ヌクレオチドＲＮＡの二本鎖の導入により誘導されるＲＮＡｉを記載している。
【０１９５】
ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究（Elbashirら 2001 EMBO J. 20: 6877およびＴｕｓｃｈｌら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７５１６４）は、効率的なＲＮＡｉ活性を介在するために必須であるｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成および配列についての特定必要条件を示した。これらの研究は、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二本鎖が、３’−末端ジヌクレオチドオーバーハングを含むとき、非常に活性であることを示した。３’−末端ｓｉＲＮＡオーバーハングヌクレオチドの２’−デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）での置換は許容された。加えて、ｓｉＲＮＡ二本鎖の標的相補鎖上の５’−リン酸は、ｓｉＲＮＡ活性のために必要である。Nykanenら 2001 Cell 107: 309。
【０１９６】
デオキシリボヌクレオチドでの２つのヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡ二本鎖の３’−末端ヌクレオチドのオーバーハングしているセグメントの置換は、ＲＮＡｉ活性に対して悪影響を有さない。ｓｉＲＮＡのそれぞれの末端上にて最大４個のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドでの置換が許容され、デオキシリボヌクレオチドでの完全置換はＲＮＡｉ活性をなくす。Elbashirら 2001, EMBO J., 20, 6877およびTuschlら国際ＰＣＴ公開WO 01/75164。Ｌｉら国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４９１４およびＢｅａｃｈら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／６８８３６は、ｓｉＲＮＡが、リン酸−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかに少なくとも１つの窒素または硫黄ヘテロ原子を含むように修飾を含み得ることを予備的に示唆する。Ｋｒｅｕｔｚｅｒらカナダ特許出願第２，３５９，１８０号はまた、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ、具体的には、２’−アミノまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、および２’−Ｏまたは４’−Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドの活性化を中和するために、ｄｓＲＮＡ構築物における使用のための特定の化学修飾を記載している。
【０１９７】
Parrishら 2000 Molecular Cell 6: 1077-1087は、長い（＞２５ｎｔ）ｓｉＲＮＡ転写産物を使用して、シー・エレガンスにおけるｕｎｃ−２２遺伝子を標的化する特定の化学修飾を試験した。著者らは、Ｔ７およびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼでチオリン酸ヌクレオチドアナログを取り込ませることによるこれらのｓｉＲＮＡ転写産物へのチオリン酸残基の導入を記載しており、２つのホスホロチオエート修飾塩基を有するＲＮＡがまた、ＲＮＡｉとしての有効性において実質的な減少を有することを観察した。さらに、Ｐａｒｒｉｓｈらは、２つ以上の残基のホスホロチオエート修飾が、干渉活性をアッセイすることができないように、インビトロでＲＮＡを非常に不安定化させることを報告した（同上、１０８１）。著者らはまた、長いｓｉＲＮＡ転写産物におけるヌクレオチド糖の２’位での特定の修飾を試験し、リボヌクレオチドに対するデオキシヌクレオチドの置換が、とりわけウリジンからチミジンおよび／またはシチジンからデオキシシチジンへの置換の場合、干渉活性における実質的な減少を生じることを見出した（同上）。加えて、著者らは、例えば、センスおよびアンチセンス鎖における、ウラシルに対するｓｉＲＮＡ、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシルおよび３−（アミノアリル）ウラシル、ならびにグアノシンに対するイノシンの置換を含む特定の塩基修飾を試験した。４−チオウラシルおよび５−ブロモウラシル置換は許容されたように見られるが、Ｐａｒｒｉｓｈは、イノシンが、いずれかの鎖に組み込まれるとき、干渉活性における実質的な減少を生じると報告している。Ｐａｒｒｉｓｈはまた、アンチセンス鎖における５−ヨードウラシルおよび３−（アミノアリル）ウラシルの取り込みが、同様に、ＲＮＡｉ活性における実質的な減少をもたらすと報告している。
【０１９８】
当業者は、当分野で知られている任意の慣用の方法を使用して、所望によりｓｉＲＮＡを合成および修飾することが可能であることを認識している（Henschelら 2004 DEQOR：ｓｉＲＮＡの設計および品質管理のためのウェブベースツール。Nucleic Acids Research 32 (Web Server Issue): W113-W120参照）。さらに、当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現構築物／ベクターに有用である種々の調節配列（例えば、構成的または誘導プロモーター、組織特異的プロモーターまたはその機能性フラグメントなど）があることを認識している。
【０１９９】
当分野において、ヌクレアーゼ安定性および有効性において有意な増強で核酸分子に導入することができる糖、塩基、リン酸および骨格修飾を記載しているいくつかの例がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基修飾での修飾により安定性を増強する、および／または生物学的活性を増強するように修飾される（概説のために、Usman and Cedergren 1992 TIBS. 17: 34; Usmanら 1994 Nucleic Acids Symp. Ser. 31: 163; Burginら 1996 Biochemistry 35: 14090参照）。核酸分子の糖修飾は、当該技術分野において広範囲に記載されている［Ecksteinら国際公開PCTWO92/07065; Perraultら Nature 1990 344: 565-568; PiekenらScience 1991 253: 314-317; Usmanら Trends in Biochem. Sci. 1992 17: 334-339; Usmanら国際公開PCTWO93/15187; Sproat, 米国特許第5,334,711号およびBeigelmanら 1995 J. Biol. Chem. 270: 25702; Beigelmanら国際PCT公開WO97/26270; Beigelmanら米国特許第5,716,824号; Usmanら 米国特許第5,627,053号; Woolfら 国際PCT公開WO98/13526; １９９８年４月２０日に出願されたThompsonら 米国特許出願第60/082,404; Karpeiskyら 1998 Tetrahedron Lett. 39: 1131; Earnshawら 1998 Biopolymers (Nucleic Acid Sciences) 48: 39-55; Verma and Eckstein 1998 Annu. Rev. Biochem. 67: 99-134;およびBurlinaら 1997 Bioorg. Med. Chem. 5, 1999-2010; Iwaseら 2007 Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids 26: 1451-1454; Iwaseら Peptide Science 2003; M. Ueki, ed., The Japanese Peptide Society, Osaka, 2004, pp. 445-446; Elbashirら 2001 Nature 411: 494-498; Dowlerら 2006 Nucl. Acids Res. 34: 1669-1675; Mesmaekerら 1996 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 2790-2794; Roznersら 1997 Nucleosides Nucleotides 16: 967-970; Robinsら 2000 Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 19: 69-86参照;これらの全ての文献は出典明示によりそれら全体を本明細書に包含させる］。有効性を変化または改善するためのｓｉＲＮＡに対する修飾の別の例は、Hohjoh in FEBS Letters 557 (2004) pp. 193-198により記載されている。さらなる修飾および３’−エンドキャップは、ＷＯ２００５／０２１７４９およびＷＯ２００７／１２８４７７において提供される。
【０２００】
Soutschekら 2004 Nature 432: 173-178は、ピロリジンリンカーの手段によるｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端へのコレステロールの抱合、それによる共有および不可逆性抱合体の産生を示している。
【０２０１】
ｓｉＲＮＡの化学修飾（他の分子との抱合を含む）はまた、インビボでの薬物動態学保持時間および効率を改良させ得る。Markら 2006 Molecular Therapy, 13: 644-670。
【０２０２】
ｓｉＲＮＡ修飾を記載している他の一般的な文献は、インビボでの使用のためのｓｉＲＮＡの化学修飾を含む。Behlke 2008 Oligonucleotides 18: 305-19; Wattsら 2008 Drug Discov. Today 13: 842-55; Peekら Curr. Opin. Mol. Ther. 2007 9: 110-8; Chenら 2005 Drug Discov. Today. 10: 587-93。
【０２０３】
より長いｄｓＲＮＡの使用が記載されている。例えば、Ｂｅａｃｈら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／６８８３６は、内因性ｄｓＲＮＡを使用して遺伝子発現を弱めることを記載している。Ｔｕｓｃｈｌら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７５１６４は、ショウジョウバエのインビトロＲＮＡｉシステムおよび特定の機能性ゲノムおよび特定の治療適用のための特定のｓｉＲＮＡ分子の使用を記載している。Ｌｉら国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４９１４は、特定の標的遺伝子の発現を弱めるための、特定の長い（１４１ｂｐ−４８８ｂｐ）、酵素的に合成されたか、またはベクター発現されたｄｓＲＮＡ分子の使用を記載している。Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／３６６４６は、特定の長い（５５０ｂｐ−７１４ｂｐ）、酵素的に合成されたか、またはベクター発現されたｄｓＲＮＡ分子を使用して、哺乳動物細胞における特定の遺伝子の発現を阻害するための特定の方法を記載している。Ｆｉｒｅら国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３２６１９は、線虫における遺伝子発現を阻害することにおける使用のための、細胞に特定の長いｄｓＲＮＡ分子を導入するための特定の方法を記載している。Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／０１８４６は、特定の長いｄｓＲＮＡ分子を使用して細胞における特定の表現型を与えることに関与する特定の遺伝子を同定するための特定の方法を記載している。Ｍｅｌｌｏら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／２９０５８は、ｄｓＲＮＡ介在性ＲＮＡｉに関与する特定の遺伝子の同定を記載している。Ｐａｃｈｕｃｋら国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／６３３６４は、特定の長い（少なくとも２００個のヌクレオチド）ｄｓＲＮＡ構築物を記載している。Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ  Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅら国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／０７４０９は、特定の抗ウイルス剤と組み合わせた特定のｄｓＲＮＡ分子からなる特定の組成物を記載している。Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら国際ＰＣＴ公開９９／５３０５０および1998, PNAS, 95, 13959-13964は、特定のｄｓＲＮＡを使用して植物細胞における核酸の表現型発現を減少させるための特定の方法を記載している。Ｄｒｉｓｃｏｌｌら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／４９８４４は、標的生物体において遺伝子サイレンシングを促進することにおける使用のための特定のＤＮＡ発現構築物を記載している。
【０２０４】
他は、種々のＲＮＡｉおよび遺伝子サイレンシングシステムについて報告している。例えば、Parrishら2000, Molecular Cell 6: 1077-1087は、シー・エレガンスのｕｎｃ−２２遺伝子を標的化する特定の化学的に修飾されたｄｓＲＮＡ構築物を記載している。Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ、国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／３８５５１は、特定のｄｓＲＮＡを使用して、植物におけるポリコーム遺伝子発現を制御するための特定の方法を記載している。Ｃｈｕｒｉｋｏｖら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／４２４４３は、特定のｄｓＲＮＡを使用して、生物体の遺伝的特性を修飾するための特定の方法を記載している。Ｃｏｇｏｎｉら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／５３４７５は、アカパンカビサイレンシング遺伝子を単離するための特定の方法およびその使用を記載している。Ｒｅｅｄら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／６８８３６は、植物における遺伝子サイレンシングのための特定の方法を記載している。Ｈｏｎｅｒら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７０９４４は、特定のｄｓＲＮＡを使用して、パーキンソン病のモデルとしてトランスジェニック線虫を使用する薬物スクリーニングの特定の方法を記載している。Ｄｅａｋら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７２７７４は、ショウジョウバエにおけるＲＮＡｉに関連し得る特定のショウジョウバエ由来の遺伝子産物を記載している。Ａｒｎｄｔら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９２５１３は、ＲＮＡｉを増強する因子を使用することによる遺伝子抑制を介在するための特定の方法を記載している。Ｔｕｓｃｈｌら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４４３２１は、特定の合成ｓｉＲＮＡ構築物を記載している。Ｐａｃｈｕｋら国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／６３３６４およびＳａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／０４３１３は、特定の長い（２５０ｂｐを越える）、ベクター発現されたｄｓＲＮＡを使用して、特定のポリヌクレオチド配列の機能を阻害するための特定の方法および組成物を記載している。Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０２／３８８０５は、ＲＮＡｉを介して同定された特定のシー・エレガンス遺伝子を記載している。Ｋｒｅｕｔｚｅｒら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０５５６９２、ＷＯ０２／０５５６９３およびＥＰ１１４４６２３  Ｂ１は、ｄｓＲＮＡを使用して、遺伝子発現を阻害するための特定の方法を記載している。Ｇｒａｈａｍら国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４９０２９およびＷＯ０１／７０９４９およびＡＵ４０３７５０１は、特定のベクター発現されたｓｉＲＮＡ分子を記載している。Ｆｉｒｅら米国特許第６，５０６，５５９号は、ＲＮＡｉを介在する特定の長いｄｓＲＮＡ（２９９ｂｐ−１０３３ｂｐ）構築物を使用して、インビトロでの遺伝子発現を阻害するための特定の方法を記載している。Martinezら2002, Cell, 110, 563-574は、ＨｅＬａ細胞におけるＲＮＡ干渉を介在する特定の５’−リン酸化一本鎖ｓｉＲＮＡを含む特定の一本鎖ｓｉＲＮＡ構築物を記載している。Harborth ら 2003, Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 13, 83-105は、特定の化学的および構造的に修飾されたｓｉＲＮＡ分子を記載している。Chiu and Rana, 2003, RNA, 9, 1034-1048は、特定の化学的および構造的に修飾されたｓｉＲＮＡ分子を記載している。Ｗｏｏｌｆら国際ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４６２６およびＷＯ０３／��６４６２５は、特定の化学的に修飾されたｄｓＲＮＡ構築物を記載している。
【０２０５】
本明細書のｓｉＲＮＡは、当分野で知られている任意の手段により（例えば、インビトロで細胞に、または患者に）送達することができる。
【０２０６】
組織へのｓｉＲＮＡの送達は、物質が標的臓器に到達しなければならず、また標的細胞の細胞質に入らなければならないという両方の問題がある。ＲＮＡは細胞膜を貫通することができず、だから、裸のｓｉＲＮＡの全身送達は成功しそうにない。ＲＮＡは、血清中のＲＮＡｓｅ活性により迅速に破壊される。これらの理由のため、ｓｉＲＮＡを標的細胞に送達するための他のメカニズムが考案されている。当分野で知られている方法は、安定性を改善するために、限定はしないが、ウイルス送達（レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、ＡＡＶ）；リポソーム（リポフェクタミン、陽イオン性ＤＯＴＡＰ、中性ＤＯＰＣ）またはナノ粒子（陽イオン性ポリマー、ＰＥＩ）、細菌送達（ｔｋＲＮＡｉ）、およびまた、ｓｉＲＮＡの化学修飾（ＬＮＡ）を含む。
【０２０７】
Xiaら 2002 Nat. Biotechnol. 20およびDevroeら 2002. BMC Biotechnol. 2 1: 15は、ウイルスベクターへのｓｉＲＮＡの取り込みを記載している。
【０２０８】
リポソームは、薬物送達（例えば、化学療法の送達）のために以前に使用されている。リポソーム（例えば、陽イオン性リポソーム）は、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／１００４３５Ａ１、ＷＯ０３／０１５７５７Ａ１およびＷＯ０４０２９２１３Ａ２；米国特許第５，９６２，０１６；５，０３０，４５３；および６，６８０，０６８号；および米国特許出願第２００４／０２０８９２１号に記載されている。リポソームを製造する方法はまた、ＷＯ０４／００２４５３Ａ１に記載されている。さらに、中性脂質は、陽イオン性リポソームに取り込まれている（例えば、Farhoodら 1995）。陽イオン性リポソームは、種々の細胞型にｓｉＲＮＡを送達するために使用されている（Sioud and Sorensen 2003；米国特許出願第２００４／０２０４３７７号；Duxburyら 2004；Donze and Picard, 2002）。中性リポソームの使用は、Millerら 1998、および米国特許出願第２００３／００１２８１２号に記載されている。
【０２０９】
脂質ベース、アミンベースおよびポリマーベースの技術を使用する化学的トランスフェクションは、Ambion Inc., Austin, Tex.;およびNovagen, EMD Biosciences, Inc, an Affiliate of Merck KGaA, Darmstadt, Germany)由来の製品; Ovcharenko D (2003) “Efficient delivery of siRNAs to human primary cells.” Ambion TechNotes 10 (5): 15-16)に記載されている。さらに、Ｓｏｎｇら（Nat Med. published online (Fete l 0, 2003) doi: 10.1038/nm828）および他のもの［Caplenら 2001 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 98: 9742-9747;およびMcCaffreyら Nature 414: 34-39］は、肝細胞が哺乳動物の循環系へのｓｉＲＮＡの注射により効率的にトランスフェクトすることができることを記載している。
【０２１０】
種々の分子は、細胞特異的ｓｉＲＮＡ送達のために使用されている。例えば、プロタミンの核酸凝縮特性は、ｓｉＲＮＡを送達するように、特異的抗体と結合されている。Songら 2005 Nat Biotch. 23: 709-717。自己集合ＰＥＧ化ポリカチオンポリエチレンイミン（ＰＥＩ）はまた、ｓｉＲＮＡを凝集および保護するために使用されている。Schiffelersら 2004 Nucl. Acids Res. 32: el49, 141-1 10。
【０２１１】
次に、ｓｉＲＮＡ含有ナノ粒子は、インテグリンを過剰発現する腫瘍新生血管に成功裏に送達された。Hu-Lieskovanら 2005 Cancer Res. 65: 8984-8992。
【０２１２】
ｓｉＲＮＡ送達方法論を記載している他の文献は、Whiteheadら 2009 Nat. Rev. Drug Discov. 8: 129-38; Wullnerら 2009 Recent Pat. Anticancer Drug Discov. 4: 1-8; Aignerら 2008 Curr. Pharm. Des. 14(34): 3603-19; Kimら 2009 Pharm Res. 26: 657-66. Epub 2008 Nov 18; Shenら IDrugs. 2008 Aug; 11(8): 572-8; Reischlら 2009 Nanomedicine. 2009 5: 8-20. Epub 2008 Jul 18; Durcanら 2008 Mol Pharm. 5: 559-66; Sanguinoら 2008 Mini Rev. Med. Chem. 8: 248-55; de Fougerollesら 2008 Hum. Gene Ther. 2008 19: 125-32; Akhtarら 2007 J. Clin. Invest. 117: 3623-32; Zhangら 2007 J. Control. Release 123: 1-10. Epub 2007 Aug 7; Meadeら 2007 Adv. Drug Deliv. Rev. 59: 134-40. Epub 2007 Mar 15; Lewisら 2007 Adv. Drug Deliv. Rev. 59: 115-23. Epub 2007 Mar 15; Sioud 2005 Expert Opin. Drug Deliv. 2: 639-51において見出すことができる。
【０２１３】
特異的ｓｉＲＮＡの設計は、ｍＲＮＡ二次構造の分析を含むことができる。ｍＲＮＡは、インビボで直線でないが、むしろ、それは複雑な様式においてそれ自体で折りたたまれ、二本鎖領域（例えば、ステム）および一本鎖領域（例えば、ループ）を形成する。それはまた、三重領域、擬似からみ(pseudo-knot)および他の構造を形成することができる。したがって、ｍＲＮＡは、多数の対および不対セグメントおよび多種多様のヘアピン構造を有することができる。方法は、ｍＲＮＡのこの二次構造を予測するために提案されている。Zuker 2003 Nucl. Acids Res. 31: 3406-15;およびMathewsら 1999 J. Mol. Biol. 288: 911-940。方法はまた、ｓｉＲＮＡがｍＲＮＡの一本鎖領域に結合するであろうことを予測するために提案されている。ＷＯ２００５／０７５６３７。
【０２１４】
本明細書に特に有用であるｓｉＲＮＡは、Ｆｂｘｏ４０  ｍＲＮＡの領域に特異的に結合することができ、１つ以上の以下の特性を有するものを含む。Ｆｂｘｏ４０のコードセグメントにおける結合；５’非翻訳領域の連結部およびコードセグメントの開始部で、または付近での結合；ｍＲＮＡの翻訳開始部位で、または付近での結合；エキソンおよびイントロンの連結部で、または付近での結合；他の遺伝子のｍＲＮＡへのわずかな、または存在しない結合（わずかな、または存在しない「的外れの効果」）；二本鎖またはステム領域ではない領域における、または付近の、例えば、ループまたは一本鎖部分におけるＦｂｘｏ４０  ｍＲＮＡへの結合；わずかな、または存在しない免疫原性を誘導すること；保存された配列の存在が種々の実験動物を使用する試験を容易にするするため、種々の動物種（ヒト、マウス、ラット、カニクイザルなどを含む）中で保存されているＦｂｘｏ４０  ｍＲＮＡの配列のセグメントにおける結合；ｍＲＮＡの二本鎖領域への結合；ＡＴリッチ領域（例えば、少なくとも約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０％のＡＴリッチ）への結合；および、ｓｉＲＮＡ活性を減少させることが知られているか、または疑われる特定の配列、例えば、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分の分離を減少させ得る５’末端でのＧＧ配列の存在の欠失。
【０２１５】
ｓｉＲＮＡは、内部に、または１つまたは両方の末端に修飾を有し得る。末端での修飾は、血中のヌクレアーゼによる分解から保護することにより、ｓｉＲＮＡを安定化することを手助けすることができる。ｓｉＲＮＡは、所望により、遺伝子のスプライス部位付近と、またはそこと知られているか、または予測されるＦｂｘｏ４０  ｍＲＮＡの領域；例えば、エキソン−イントロン連結部に指向され得る。ｓｉＲＮＡはまた、所望により、知られているか、または予測されるｍＲＮＡの暴露および／または一本鎖領域（例えば、ループ）にアニールするように設計することができる。
【０２１６】
上記のとおり、ヒトＦｂｘｏ４０に関するｍＲＮＡ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿０１６２９８（配列番号：２）で容易に利用できる。いくつかの動物ホモログに関する配列は、マウス（ハツカネズミ）：ＮＭ＿００１０３７３２１；ラット（ドブネズミ）：ＸＭ＿３４４０２３；チンパンジー：ＮＣ＿００６４９０．２；アカゲザル（アカゲザル）：ＮＣ＿００７８５９．１；ゼブラフィッシュ（ゼブラ・ダニオ）：ＢＸ３２２５７７．１１（偽遺伝子）またはＸＰ＿６９４７０８．３；イノシシ：ＥＵ７４３７４２；ニワトリ：ＸＰ＿４２４０００．２；およびイヌ：ＸＰ＿５４５１２６．２を利用できる。
【０２１７】
ｓｉＲＮＡは、Ｆｂｘｏ４０  ｍＲＮＡに結合し、分解を手助けするＦｂｘｏ４０アンタゴニストとして設計することができる。抗Ｆｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、コードセグメントまたは非コードセグメント（例えば、５’または３’非翻訳領域、またはＵＴＲ）に結合するように設計することができる。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡのコードセグメントに結合する。ｓｉＲＮＡは、例えば、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ｂｐの二本鎖領域を有することができる。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、１９または２１ｂｐを含む。ｓｉＲＮＡはまた、０、１または２つのオーバーハングを有することができ、好ましくは、０ｎｔオーバーハングの場合において、それらは平滑末端である。遺伝子のｍＲＮＡ配列は、とりわけコードセグメント内または非翻訳領域におけるゆらぎ位置で、個体から個体で変化し得る。個体はまた、コード配列において互いに異なり得、ｍＲＮＡおよび対応するｓｉＲＮＡ配列におけるさらなる違いをもたらす。ｓｉＲＮＡはまた、免疫原性、望ましくない遺伝子への結合（例えば、「的外れの効果」）を減少させるように、または血中の安定性を増加させるように配列を修飾することができる。（これらの配列変異体は、ｓｉＲＮＡの塩基または５’もしくは３’または他の末端キャップの化学修飾から独立している。）
【０２１８】
配列番号：２として存在する配列から、１９−ｍｅｒおよびオーバーハングを含むｓｉＲＮＡの適当な配列は、容易に決定することができる。アンチセンス鎖は、上記のとおり、ワトソン−クリック対に基づいて容易に導かれる。オーバーハングは、配列番号：２において上記で提供される完全遺伝子配列に基づいて付加することができる。
【０２１９】
加えて、１つの特定の態様において、Ｆｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、３’末端のいずれか、または両方においてｄＴｄＴのオーバーハングを含む。
【０２２０】
加えて、種々の特定の態様において、Ｆｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、配列番号：１の１５、１６、１７または１８ｎｔの任意の部分を含む二本鎖領域を含む。
【０２２１】
１つの特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖と一緒にｎｔ１から５７０４の位置で開始するｓｉＲＮＡの１９−ｍｅｒ配列からなる。
【０２２２】
別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖と一緒にｎｔ１から５７０４の位置で開始するｓｉＲＮＡの１９−ｍｅｒ配列を含み、加えて、どちらかの鎖にオーバーハングを有する。別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、両方の鎖においてオーバーハングを有する。別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、一本鎖のみにおいてオーバーハングを有する。オーバーハングは、３’または５’末端であり得る。別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、５ｎｔ長未満であるオーバーハングを有する。別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、２ｎｔ長であるオーバーハングを有する。
【０２２３】
別の態様において、Ｆｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、１から５７０９のあらゆる配列で始まるが、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６ｎｔ長であるあらゆるｓｉＲＮＡを含む。１つの特定の態様において、ｓｉＲＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６ｎｔ長の二本鎖領域を含む。１つのとりわけ特定の態様において、Ｆｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、１９または２１ｂｐの二本鎖領域を含む。
【０２２４】
１つの特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、ヒトおよびマウスホモログ間の完全一致を有する１９−ｍｅｒを含む。これは、動物モデルとしてのマウスの使用を容易にする。
【０２２５】
別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、ヒトおよびラットホモログ間の完全一致を有する１９−ｍｅｒを含む。これは、動物モデルとしてのラットの使用を容易にする。
【０２２６】
別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、ヒトおよびイノシシホモログ間の完全一致を有する１９−ｍｅｒを含む。
【０２２７】
別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、ヒトおよびニワトリホモログ間の完全一致を有する１９−ｍｅｒを含む。
【０２２８】
別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、ヒトおよびアカゲザルホモログ間の完全一致を有する１９−ｍｅｒを含む。
【０２２９】
別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、ヒトおよびチンパンジーホモログ間の完全一致を有する１９−ｍｅｒを含む。
【０２３０】
別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、ヒト、ラットおよびアカゲザルホモログ間の配列において一致する。
【０２３１】
別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、ヒト、マウスおよびアカゲザルホモログ間の完全一致を有する１９−ｍｅｒを含む。
【０２３２】
別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、ヒト、マウス、ラット、イノシシ、チンパンジーおよびアカゲザルホモログ間の完全一致を有する１９−ｍｅｒを含む。
【０２３３】
別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、ヒト、マウス、ラットおよびアカゲザルホモログ間の完全一致を有する１９−ｍｅｒを含む。
【０２３４】
本明細書は、記載されている１９−ｍｅｒの部分（例えば、１５、１６、１７または１８ｎｔ長）を示す配列をさらに含む。したがって、例えば、ヒトＦｂｘｏ４０および特定の動物にマッチする配列での１９−ｍｅｒはまた、本明細書において使用することができる種々の１５、１６、１７および１８−ｍｅｒ配列を含む。
【０２３５】
１つの特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、ＣＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＣＡＡ（配列番号：１９）、ＧＴＧＧＧＡＡＡＧＴＡＴＧＴＴＣＡＧＣＡＡ（配列番号：２０）またはＡＧＣＣＧＴＧＧＡＴＧＣＣＡＡＡＧＡＣＴＡ（配列番号：２１）（またはそれらのＲＮＡ同等物）の配列を標的化する。
【０２３６】
別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、ヒトＦｂｘｏ４０遺伝子に唯一である配列（したがって、別のヒト遺伝子において見出されない）を含む。これは、的外れの効果を減少させる。
【０２３７】
別の特定の態様において、選択されるＦｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡは、Ｆｂｘｏ４０  ｍＲＮＡにおける特定の二次構造に結合する。ｍＲＮＡは、二本鎖領域（例えば、ステム）および一本鎖領域（例えば、ループ）を含む複雑な二次構造を形成することが知られている。他の構造（例えば、擬似からみおよび三重領域）もまた可能である。これらの構造は、種々のソフトウェアにより既知の配列から予測することができる。Zuker 2003 Nucl. Acids Res. 31: 3406-15;およびMathewsら 1999 J. Mol. Biol. 288: 911-940。
【０２３８】
非限定的な例として、以下のパラメーターを使用することができる：フォールディング温度：３７℃。ＲＮＡ配列は直線である。イオン条件：１ＭのＮａＣｌ、二価イオンなし。パーセント部分最適性数：５。計算フォールディングの数の上限：５０。ウインドウパラメーター：デフォルト。最大内部／バルジループサイズ：３０。内部／バルジループの最大非対称：３０。塩基対間の最大距離：限定なし。
【０２３９】
特定の理論に縛られることは望まないが、本発明者らは、ｍＲＮＡでの特定の構造がｓｉＲＮＡへの結合に特に適していることに注目する。これらの領域は「ホットスポット」と称される。ｓｉＲＮＡがｍＲＮＡの一本鎖領域に結合することを予測するための方法も提案している。ＷＯ２００５／０７５６３７。
【０２４０】
これらの構造は、一本鎖領域（例えば、ループ）、短いループを含む配列（例えば、ステム領域が散在した１または２つのより短いループを含む１９−または２１−ｎｔ  ｓｉＲＮＡ）、ループに隣接した配列、特にループのすぐ下流の配列（例えば、ｓｉＲＮＡに結合する配列に対して５’側にループを有する）；２つのステム領域にわたる配列を含む。したがって、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストとして有用なｓｉＲＮＡは、１つ以上の一本鎖領域（またはその一部）、１つ以上の二本鎖領域（またはその一部）に結合し得るか、または１つ以上の一本鎖領域に隣接した領域に結合し得る。さらに、種間で高度に保存されている配列はまた、ｓｉＲＮＡに非常に適し得る。加えて、宿主タンパク質による結合されることが知られているｍＲＮＡ配列は、適さないであろう。
【０２４１】
したがって、本明細書のＦｂｘｏ４０アンタゴニストは、限定はしないが、（ａ）Ｆｂｘｏ４０  ｍＲＮＡにおける少なくとも１、２またはそれ以上の予測されるループに対応する（アニールする）（ループの部分または全体に対応またはアニールする）；（ｂ）Ｆｂｘｏ４０  ｍＲＮＡにおける１または２つの予測されるループに隣接している；（ｃ）少なくとも１、２またはそれ以上のステム構造に対応する；および／または、（ｄ）Ｆｂｘｏ４０  ｍＲＮＡの１または２つのステム構造に隣接するｓｉＲＮＡを含むことができる。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個、さらに好ましくは少なくとも約４個、さらに好ましくは少なくとも約６個のヌクレオチドを含むループを含むように予測されたＦｂｘｏ４０  ｍＲＮＡ配列にアニールする。別の特定の態様において、ｓｉＲＮＡは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個、さらに好ましくは少なくとも約４個、さらに好ましくは少なくとも約６個のヌクレオチドを含むループに隣接したＦｂｘｏ４０配列にアニールする。
【０２４２】
本明細書の記載に加えて、当分野で知られている任意の方法または物質を、Ｆｂｘｏ４０をアンタゴナイズすることができる阻害核酸、ｓｉＲＮＡなどを製造するために使用することができる。
【０２４３】
Ｆｂｘｏ４０のアンタゴナイズ
Ｆｂｘｏ４０アンタゴニスト（ＬＭＷ、抗体、ｓｉＲＮＡまたは他の組成物を含もうとなかろうと）は、Ｆｂｘｏ４０の活性、レベルおよび／または発現を減少させる。
【０２４４】
当分野で知られている任意の方法を、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストにより誘導されるＦｂｘｏ４０活性、レベルおよび／または発現における変化を測定するために使用することができる。測定は、アンタゴニストの効果を決定するために、アンタゴニストの投与前、中および後の多数の時点で行うことができる。
【０２４５】
Ｆｂｘｏ４０のレベルまたは発現は、ｍＲＮＡ（例えば、ノーザンブロットまたはＰＣＲを介して）またはタンパク質（例えば、ウェスタンブロット）の評価により測定することができる。Ｆｂｘｏ４０発現におけるアンタゴニストの効果は、Ｆｂｘｏ４０遺伝子の転写速度を測定することにより決定することができる（例えば、ノーザンブロット；または逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応またはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を介して）。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｆｂｘｏ４０のｍＲＮＡレベルが腎臓、膵臓および前立腺において高く、肝臓および脾臓において中程度であることを示すために使用された。Brauner-Osborneら 2001. Biochim. Biophys. Acta 1518: 237-248。直接的測定は、例えば、Ｆｂｘｏ４０が発現される組織、例えば心臓および骨格筋のウェスタンブロットによるＦｂｘｏ４０のレベルからなり得る。
【０２４６】
いくつかの手段は、Ｆｂｘｏ４０活性を測定するために利用できる。Ｆｂｘｏ４０活性は、ＩＲＳ１に結合するＦｂｘｏ４０の能力により測定することができる。あるいは、Ｆｂｘｏ４０活性は、Ｓｋｐ１に結合するタンパク質の能力により測定することができる。
【０２４７】
このような評価は、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストが介在するＦｂｘｏ４０発現、レベルもしくは活性の下方調節を測定することができる。
【０２４８】
個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止、限定もしくは減少する能力について組成物をスクリーニングする方法であって、
細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を確認する、
該細胞を組成物で処理する、および
再び該細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を確認する
ことを含み、Ｆｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を低下する該組成物の能力は、個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止する能力と相関する方法。
【０２４９】
この方法において、Ｆｂｘｏ４０のレベルまたは活性は、インビトロで細胞中で測定することができる。Ｆｂｘｏ４０のレベルまたは発現は、例えば、Ｆｂｘｏ４０のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定する当分野で知られている任意の方法、例えば、上記のものを使用して、測定することができる。Ｆｂｘｏ４０の活性は、例えば、Ｓｋｐ１および／またはＩＲＳ１と相互作用するＦｂｘｏ４０の能力を測定する当分野で知られている任意の方法、例えば、上記のものにより測定することができる。
【０２５０】
次に、細胞を推定Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストで処理することができる。同じ型のいくつかの細胞を、種々のレベルの推定アンタゴニストまたはコントロール（例えば、ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水）で処理することができる。該細胞を、また、あるいは、推定アンタゴニストで複数回で処理することができる。
【０２５１】
次に、細胞を、Ｆｂｘｏ４０レベル、発現もしくは活性について再測定することができる。
【０２５２】
加えて、ｓｉＲＮＡアンタゴニストを送達するためにアデノウイルスを使用するための方法、および、次に筋肉肥大の促進におけるｓｉＲＮＡの有効性を測定するための方法は、当分野で知られている。
【０２５３】
非限定的な例として、ヒトＦｂｘｏ４０に対するｓｉＲＮＡアンタゴニストを発現する高い力価の精製されたアデノウイルスを作製することができる。アデノウイルスは、力価測定することができる。マウス初代筋芽細胞は、以前に記載されているとおりに、単離、増殖および分化される。初代筋芽細胞を、例えば、６−ウェルプレートにおいて８×１０５細胞／ウェルまたは１２−ウェルプレートにおいて４×１０５細胞／ウェルで播種する。次の日にそれらを誘導して分化する。分化２日後、筋管に、示されているとおりに種々のアデノウイルスを形質導入する。細胞を、示されているとおりに、形質導入４８または７２時間後に種々の分析に付す。形質導入のために使用される力価は、例えば、２．５×１０８または１×１０９粒子／ｍｌであり得る。
【０２５４】
アンタゴナイズＦｂｘｏ４０に対するｓｉＲＮＡを送達するアデノウイルスの使用および有効性の試験の非限定的な例は、本明細書に記載されている。初代筋管は、例えば、４８時間で、例えば、アデノウイルスで形質導入することができる。培地を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄する。それらを、例えば、３７℃で２０分間、５％のグルタルアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回洗浄し得る。細胞形態を、例えば、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｏｖｅｒｔ顕微鏡セットを使用して１０×拡大で観察することができる。焦点イメージングを得て、顕微鏡を蛍光イメージングのためのＦＩＴＣに合わせることができる。ランダムイメージングをそれぞれのウェルから得て、分析のために保存することができる。イメージングを、例えば、Ｐｉｐｅｌｉｎｅ  Ｐｉｌｏｔ  Ｗｅｂｐｏｒｔを使用して分析し、筋肉サイズの指標としての筋管の厚さを得ることができる。統計分析は、例えば両側ステューデントｔ検定を使用して、全てのデータにおいて行うことができる。例えば、０．０５未満のｐ値は有意であると考えることができる。
【０２５５】
筋力低下の処置におけるＦｂｘｏ４０アンタゴニストの有効性についてのさらなる試験（単独、または他の処置と組み合わせて）は、筋肉量の測定により決定することができる。このような測定は、当分野で知られている方法により行うことができる。ラットおよび他の実験動物の試験において、脚筋（例えば、ヒラメ筋、前脛骨筋および腓腹筋）を取り出し、試験することができる。ラットにおける脱神経、固定化および重量減は、全て、内側腓腹筋量の喪失の同様の割合をもたらす。Bodineら Science 2001 294: 1704-1707。悪液質はまた、インターロイキン−１（ＩＬ−１）およびグルココルチコイドデキサメタゾンの投与によりラットにおいて誘導することができる。Bodineら 2001。加えて、ＯＣＣ−１細胞を埋め込まれたヌードマウスは、本明細書の種々の組成物を試験するための悪液質に関する有用な動物モデルである。
【０２５６】
ヒト患者において、反復または時限身体活性は、筋肉量を測定するために使用することができる。全付属肢骨格量（ＡＳＭ）はまた、Gallagherら 1997 J. Appl. Physiol. 83: 229-239;およびBaumgartnerら 1998にしたがって測定することができる。患者の中軸骨格筋量は、ｄｘａ（二重エネルギーＸ線吸収測定法）または同様の測定により決定することができる。
【０２５７】
Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストを評価するための１つの戦略は、外傷性破裂後の前十字靱帯（ＡＣＬ）修復で患者を処置することである。これらの患者は、手術後に長期間のひざ上キャスティングを受け、しばしば実質的な大腿四頭筋萎縮となる。対側脚は、試験を確認するためのプラセボ処置グループにおける萎縮に対するコンパレーターとして役立てることができる。中央大腿筋量は、大腿四頭筋伸長によるＤＥＸＡ（二重エネルギーＸ線吸収測定法）および単回反復最大強度評価により評価することができる。さらなる評価は、ふくらはぎの力の測定を含む。ポジティブな結果は、プラセボと比較して、薬物処置グループにおける大腿四頭筋量および強度の統計的に有意な保存を含むことができる。
【０２５８】
インビトロで筋萎縮を試験する別の方法は筋管の使用を含む。筋管は、管状外観を有する発達中の骨格筋線維であり；発達段階中の筋芽細胞の融合により形成される骨格筋線維であり；わずかな筋原線維が周囲で起こり、中核は線維が管状外観を有することができるように核および筋形質により占有される。分化有糸分裂後多核Ｃ２Ｃ１２骨格筋管、例えば、Bainsら 1984 Mol. Cell. Biol. 4: 1449を使用することができる。これらは、萎縮と関連する遺伝子をコードするアデノウイルス（例えば、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）または別のマーカーと一緒にＦｂｘｏ４０）またはコントロール（ＥＧＦＰ単独でのアデノウイルス）に感染させることができる。免疫ブロット法は、感染を確認し、Ｆｂｘｏ４０およびコントロールのタンパク質発現レベルを定量するために使用することができる。適当な時間（例えば、２日間）後、筋管直径を測定し、Ｆｂｘｏ４０遺伝子を有するアデノウイルスに感染した筋管は、より薄いことが見出された。Ｆｂｘｏ４０を有するアデノウイルスに感染した筋管での成長は、Ｆｂｘｏ４０が萎縮介在する能力を抑制することにおけるアンタゴニストの有効性を試験するために使用することができる。
【０２５９】
これらの種々の筋肉量の試験は、筋肉状態を評価する時間にわたって；または、処置レジメンおよび患者応答にしたがって調整されたレジメンの有効性を評価するための処置前後に繰り返され得る。Baumgartnerら 1998は、患者が若年参照グループの平均（ｔ−スコア）以下で２つの標準偏差未満のＡＳＭを有する状態としてサルコペニアを定義した。
【０２６０】
サルコペニアの進行の減速の本明細書の例は、患者が−１．５から−２へｔ−スコアが進む時間を変化させることである；例えば、このような進行が通常５年かかるとき、本明細書において使用される処置は、この変化を１０年に減速することができる。部分的な回復の例は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０単位またはそれ以上のｔ−スコアの減少を含む（例えば、−２のｔ−スコアから−１．９、−１．８、−１．６、−１．５、−１．４、−１．３、−１．２、−１．１などのｔ−スコアへの移動）。サルコペニアの処置はまた、サルコペニアの発症の遅延を含む。例えば、典型的な５０歳の男性が５５歳までにサルコペニアの徴候が見られ始めるとき、本明細書の処置は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年またはそれ以上発症を遅延する。
【０２６１】
ＡＳＭ測定に加えて、測定はまた、体重、脂肪、腹部内臓脂肪、除脂肪量、脚ＡＳＭ、大腿筋ＡＳＭ、体内水分および細胞量および筋肉強度を取ることであり得る。
【０２６２】
Ｆｂｘｏ４０レベル、発現もしくは活性を減少させるアンタゴニストの能力は、個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止するアンタゴニストの能力と相関している。
【０２６３】
Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストに関するスクリーニング
本明細書はまた、Ｆｂｘｏ４０のアンタゴナイズにおける有用性について組成物をスクリーニングする、および患者における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止、限定もしくは減少するための方法を含む。
【０２６４】
１つの特定の態様において、本明細書は、個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止、限定もしくは減少する能力について組成物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該個体由来の細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を確認する、
（ｂ）所望により、該細胞をＦｂｘｏ４０に対するアンタゴニストを含む組成物で処理する、および
（ｃ）所望により、再び該細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を確認する、
を含み、コントロールと比較してＦｂｘｏ４０の上昇したレベルは、対象が筋肉疲労障害を有するか、または発症する危険性があることの指標であり、Ｆｂｘｏ４０のレベルもしくは活性を低下する該組成物の能力は、個体における筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止する能力と相関する方法を含む。
【０２６５】
この方法の１つの特定の態様において、個体は、悪液質、癌、腫瘍誘導体重減少、敗血症、慢性心不全、リウマチ性関節炎、後天性免疫不全症候群、サルコペニア、糖尿病、高血圧、高レベルの血清コレステロール、高レベルのトリグリセリド、パーキンソン病、不眠症、薬物中毒、疼痛、不眠症、低血糖、肝臓機能障害、肝硬変症、胆嚢障害、舞踏病、運動障害、腎臓障害および／または尿毒症から選択される筋肉疲労関連障害に罹患している。
【０２６６】
この方法の１つの特定の態様において、アンタゴニストが、Ｆｂｘｏ４０のレベル、発現もしくは活性を減少させる。
【０２６７】
この方法の種々の態様において、スクリーニングされるアンタゴニストは、本明細書に記載されているか、または当分野で知られている低分子量組成物（ＬＭＷ）、抗体など（例えば、Ｆｂｘｏ４０抗体、Ｆｂｘｏ４０抗体様分子、Ｆｂｘｏ４０に特異的および／または選択的に結合する分子）、および／またはｓｉＲＮＡまたは他の阻害核酸を含むことができる。
【０２６８】
上記のとおり、ＬＭＷの化合物ライブラリーを創造およびスクリーニングするための種々の他の方法は、とりわけ、米国特許第６，７６４，８５８；６，７２３，２３５；６，７２０，１９０；６，６７７，１６０；６，６５６，７３９；６，６４９，４１５；６，６３０，８３５；６，６２７，４５３；６，６１７，１１４；６，６１３，５７５；６，６０７，９２１；６，６０２，６８５；６，４４８，７９４；６，４２１，６１２；６，３９５，１６９；６，３８７，２５７；６，３５５，１６３；６，２１４，５６１；６，１８７，９２３；および６，０５４，０４７号に記載されている。
【０２６９】
ＬＭＷのライブラリーを創造およびスクリーニングするための任意のこれらの方法または当業者に知られている任意の他の方法は、Ｆｂｘｏ４０に結合し、アンタゴナイズする小分子を得るために使用することができる。
【０２７０】
標的、例えば、Ｆｂｘｏ４０に特異的および／または選択的に結合する抗体、抗体様分子および／または分子をスクリーニングする方法はまた、当分野で知られている。
【０２７１】
また、標的、例えばＦｂｘｏ４０に対するｓｉＲＮＡおよび他の阻害核酸をスクリーニングする方法が当分野で知られている。
【０２７２】
個体由来の細胞におけるＦｂｘｏ４０のレベル、活性または発現を確認する方法は、当分野で知られている。これらの方法は、Ｆｂｘｏ４０に対する候補アンタゴニストへの細胞の暴露前後に使用することができる。
【０２７３】
これらのスクリーニング方法は、本明細書に記載されている、および当分野で知られている、Ｆｂｘｏ４０をアンタゴナイズし、筋肉量を増加するか、または筋肉量の喪失を防止する能力について組成物を同定するために有用である。
【０２７４】
Ｆｂｘｏ４０および筋力低下を防止するか、または筋肉量を維持する能力についてアンタゴニストをスクリーニングすることに関する本明細書の態様における種々の用語は、本明細書で定義されている。
【０２７５】
診断方法
本発明はまた、対象が筋肉疲労障害を有するか、または発症する危険性があるか否かを評価するための新規方法を提供する。筋肉疲労障害を有する疑いがある個体は、疾患進行を遅延させる、またはさらに停止もしくは逆転させることができるという、早期検出からの利益がある。該方法は、Ｆｂｘｏ４０を検出することができる試薬と対象由来のサンプルを接触させ、Ｆｂｘｏ４０を検出することを含む、対象が筋肉疲労障害を有するか、または発症する危険性があるか否かを評価することを含み、コントロールと比較してＦｂｘｏ４０の上昇したレベルが対象が筋肉疲労障害を有するか、または発症する危険性がある指標である。
【０２７６】
本発明は、さらに、筋肉疲労障害を処置するための処置レジメンの有効性を決定または予測するための方法を提供する。これらの方法は、対象における筋肉疲労障害を処置するための処置レジメンの有効性を評価することを含み、該方法は、ａ）処置レジメンの少なくとも一部を対象に投与する前に、対象から得られる第１のサンプルとＦｂｘｏ４０を検出することができる試薬を接触させる；ｂ）処置レジメンの少なくとも一部の投与後に、該対象から得られる第２のサンプルとＦｂｘｏ４０を検出することができる試薬を接触させる；および、ｃ）第１および第２のサンプル由来のＦｂｘｏ４０のレベルを比較することを含み、第２のサンプルと比較して第１のサンプルにおいて存在するＦｂｘｏ４０の上昇したレベルは、処置レジメンが対象における筋肉疲労障害を処置するための有効である指標である。
【０２７７】
本明細書において使用される「サンプル」なる用語は、対象由来のあらゆる体液（例えば、血液、リンパ液、婦人科に関する液体(gynecological fluid)、嚢胞液、尿、眼液および腹膜洗浄液により回収される液体）または細胞を含む。通常は、組織または細胞は患者から取り出されるが、インビボ診断も考慮される。他の患者サンプルは、涙滴、血清、脳脊髄液、糞便、唾液および細胞抽出物を含む。
【０２７８】
本明細書において使用される「Ｆｂｘｏ４０を検出することができる試薬」なる用語は、Ｆｂｘｏ４０に特異的に結合し、Ｆｂｘｏ４０を検出可能な部分に変換することができるあらゆる薬物を含む。適当な試薬は、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメントなどを含む。Ｆｂｘｏ４０核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライスされたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）との結合に適当な試薬は、相補的核酸を含む。例えば、核酸試薬は、基質に固定された（標識または非標識）されたオリゴヌクレオチド、基質と結合しない標識オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー対、分子ビーコン(beacon)プローブなどを含み得る。
【０２７９】
本明細書において使用される「コントロール」なる用語は、筋肉疲労障害に罹患していない対象由来のサンプル中のＦｂｘｏ４０のレベルであり得る。試験サンプルと同じ型または異なっている型のサンプルであり得る。例えば、試験される対象由来のサンプルが心臓または筋肉サンプル（例えば、細胞、細胞の回収物または心臓または筋肉生検から得られた組織）であるとき、コントロールサンプルはまた、筋肉疲労障害に罹患していない対象由来の心臓または筋肉サンプルであり得る。あるいは、コントロールサンプルは、異なる型であり得る、例えば、それは、筋肉疲労障害に罹患していない対象由来のサンプルであり得る。他の態様において、コントロールサンプルは、筋肉疲労障害を有さない対象由来のサンプルの回収物または筋肉疲労障害を有さない対象の回収物由来のサンプルであり得る。
【０２８０】
本明細書において使用されるＦｂｘｏ４０の「異常なレベル」は、Ｆｂｘｏ４０のコントロールレベルと異なるＦｂｘｏ４０のあらゆるレベル、例えば、有意に高いまたは上昇したレベルである。
【０２８１】
本明細書において使用されるＦｂｘｏ４０の「高いレベル」、「上昇したレベル」または「増加したレベル」は、適当なコントロールと比較して上昇したレベルを示す。好ましくは、適当なコントロールとの差は、レベルを評価するために使用されるアッセイの標準誤差よりも大きい。さらに、上昇したレベルは、適当なコントロール（例えば、線維症を有さない対象由来のサンプルもしくはいくつかのコントロールサンプルもしくは他の適当なベンチマークにおけるＦｂｘｏ４０の平均レベル）におけるＦｂｘｏ４０のレベルの好ましくは少なくとも２倍、さらに好ましくは３、４、５、６、７、８、９または１０倍である。
【０２８２】
本明細書において使用される「有効である」および「有効性」なる用語は、処置レジメンが対象における筋肉疲労障害を処置する可能性を示す。例えば、処置レジメンは、処置が対象における筋肉疲労障害症状（例えば、筋力低下、食欲の喪失、脱力感、免疫機能低下および／または電解質不均衡）の少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の緩和をもたらすとき、「有効である」と考え、生存可能である治療選択と考える。
【０２８３】
Ａ．アッセイ
対象から得られる生物学的サンプル中のＦｂｘｏ４０の存在、非存在および／またはレベルは、サンプル内でＦｂｘｏ４０を検出および定量することができる部分に変換する任意の多種多様のインビトロおよびインビボ技術および方法により評価され得る。このような方法の非限定的な例は、タンパク質検出のための免疫学的方法、タンパク質精製方法、タンパク質機能または活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション方法、核酸逆転写方法、および核酸増幅方法、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロット法、ウェスタンブロッティング、ノーザンブロット法、電子顕微鏡、質量分析、免疫沈降、免疫蛍光、サザンハイブリダイゼーションなどを使用して、サンプルを分析することを含む。
【０２８４】
１つの態様において、サンプル中のＦｂｘｏ４０の存在、非存在および／またはレベルは、試薬、例えば、抗体（例えば、放射性−標識された、発色団−標識された、フルオロフォア−標識された、または酵素−標識された抗体）、抗体誘導体（例えば、基質またはタンパク質リガンド対（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン）のタンパク質もしくはリガンドと接合した抗体）またはバイオマーカー、例えば、Ｆｂｘｏ４０に特異的に結合し、サンプル中で検出可能な分子に変換する抗体フラグメント（例えば、一本鎖抗体または単離された抗体超可変ドメイン）を使用して評価することができる。
【０２８５】
抗体に関して「標識」なる用語は、検出可能な物質を抗体に結合する（すなわち、物理学的に連結する）ことによる抗体の直接的標識化、ならびに直接標識される別の試薬での反応性による抗体の間接的標識化を含むことを意図する。間接的標識化の例は、蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することができるような、蛍光標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出を含む。
【０２８６】
別の態様において、Ｆｂｘｏ４０の存在、非存在および／またはレベルは、核酸を使用して評価される。例えば、１つの態様において、Ｆｂｘｏ４０の存在、非存在および／またはレベルは、核酸プローブを使用して評価される。
【０２８７】
本明細書において使用される「プローブ」なる用語は、Ｆｂｘｏ４０に選択的に結合することができるあらゆる分子を示す。プローブは、当業者により合成されるか、または適当な生物学的調製物由来であり得る。プローブは、具体的には、標識されるように設計され得る。プローブとして利用することができる分子の例は、限定はしないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機分子を含む。
【０２８８】
単離されたｍＲＮＡは、限定はしないが、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて使用することができる。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの方法は、単離されたｍＲＮＡをＦｂｘｏ４０  ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触することを含む。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡまたはその一部、例えば、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長の、およびストリンジェント条件下でＦｂｘｏ４０  ゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするために十分であるオリゴヌクレオチドであり得る。
【０２８９】
１つの態様において、ｍＲＮＡを固体表面上に固定し、例えば、アガロースゲル上に単離されたｍＲＮＡを流し、ゲルから膜、例えばニトロセルロースにｍＲＮＡを移すことにより、プローブと接触させる。別の態様において、プローブを固体表面上に固定し、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイにおいて、ｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者は、Ｆｂｘｏ４０  ｍＲＮＡのレベルの検出における使用のための既知のｍＲＮＡ検出方法を容易に採用することができる。
【０２９０】
サンプル中のＦｂｘｏ４０  ｍＲＮＡのレベルを決定するための代替方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている実験的態様）、リガーゼ鎖反応（Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193）、自立配列複製（Guatelliら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）、転写増幅システム（Kwohら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Lizardiら (1988) Bio/Technology 6:1197）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，８５４，０３３号）または任意の他の核酸増幅方法による核酸増幅方法、次に、当業者によく知られている技術を使用する増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは、非常に少ない数であるとき、とりわけ核酸分子の検出のために有用である。本発明の特定の局面において、Ｆｂｘｏ４０発現は、定量蛍光ＲＴ−ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ）により評価される。このような方法は、一般的に、Ｆｂｘｏ４０に特異的であるオリゴヌクレオチドプライマーの対を利用する。既知の配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計するための方法は、当分野でよく知られている。
【０２９１】
Ｆｂｘｏ４０  ｍＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（例えば、ハイブリダイゼーション分析、例えば、ノーザン、サザン、ドットなどにおいて使用される）、またはマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズまたは線維（または結合された核酸を含む任意の固体支持体）を使用してモニタリングされ得る。米国特許第５，７７０，７２２、５，８７４，２１９、５，７４４，３０５、５，６７７，１９５および５，４４５，９３４号参照（これらを出典明示により本明細書に包含させる）。Ｆｂｘｏ４０の検出発現はまた、溶液中で核酸プローブを使用することを含み得る。
【０２９２】
本発明の１つの態様において、マイクロアレイは、Ｆｂｘｏ４０発現を検出するために使用される。マイクロアレイは、異なる実験間の再現性により、この目的に非常に合う。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルの同時測定のための１つの方法を提供する。それぞれのアレイは、固体支持体に付着した捕捉プローブの再現性のあるパターンからなる。標識化ＲＮＡまたはＤＮＡは、アレイ上の相補的プローブにハイブリダイズし、次にレーザー走査により検出される。アレイ上のそれぞれのプローブに対するハイブリダイゼーション強度を決定し、相対遺伝子発現レベルを示す定量値に変換する。米国特許第６，０４０，１３８、５，８００，９９２および６，０２０，１３５、６，０３３，８６０および６，３４４，３１６号（これらは出典明示により本明細書に包含させる）参照。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、サンプル中の多くのＲＮＡの遺伝子発現プロフィールを決定するために特に有用である。
【０２９３】
さらに、Ｆｂｘｏ４０の検出のためのインビボ技術は、Ｆｂｘｏ４０に結合し、検出可能な分子に変換するＦｂｘｏ４０に対する標識された抗体を対象に導入することを含む。上記のとおり、対象における検出可能なＦｂｘｏ４０の存在、レベルまたは位置でさえ、標準イメージング技術により検出され、決定され得る。
【０２９４】
別の態様において、質量分析は、サンプル中のＦｂｘｏ４０を検出するために使用することができる。質量分析は、荷電分子（またはそれらのフラグメント）を賛成するために化合物をイオン化し、それらの質量対電荷比を測定することからなる分析技術である。典型的な質量分析方法において、サンプルは対象から得られ、質量分析に充填し、その成分（例えば、Ｆｂｘｏ４０）を種々の方法により（例えば、それらを電子ビームで衝撃を与えることにより）イオン化し、荷電粒子（イオン）の形成をもたらす。次に、粒子の質量対電荷比を、電磁場を通るときのイオンの動きから計算する。
【０２９５】
Ａ．診断アッセイ
Ｆｂｘｏ４０の存在、非存在および／またはレベルは、分子またはタンパク質を検出するための多種多様の既知の方法のいずれかによって評価され得る。このような方法の非限定的な例は、タンパク質の検出のための免疫学的方法、タンパク質精製方法、タンパク質機能または活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション方法、核酸逆転写方法および核酸増幅方法、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット法、ウェスタンブロッティング、ノーザンブロット法、サザンブロット法などを含む。
【０２９６】
１つの態様において、Ｆｂｘｏ４０の存在、非存在および／またはレベルは、バイオマーカー、すなわち、Ｆｂｘｏ４０、例えば、バイオマーカーに対応するオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質またはその正常な翻訳後修飾のすべてまたは一部を受けたタンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、放射線標識化、発色団標識化、フルオロフォア標識化または酵素標識化抗体）、抗体誘導体（例えば、基質またはタンパク質またはタンパク質−リガンド対（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン）のリガンドとの抱合された抗体）または抗体フラグメント（例えば、一本鎖抗体、単離された抗体超可変ドメインなど）を使用して評価される。抗体に関して「標識化」なる用語は、検出可能な物質と抗体との結合（すなわち、物理学的に連結）による抗体の直接標識化、ならびに直接標識化されている別の試薬との反応性による抗体の間接標識化を含むことを意図する。間接標識化の例は、蛍光標識化ストレプトアビジンで検出することができるような、蛍光標識化二次抗体を使用する一次抗体の検出を含む。別の態様において、Ｆｂｘｏ４０の存在、非存在および／またはレベルは、核酸を使用して評価することができる。
【０２９７】
本発明の検出方法は、Ｆｂｘｏ４０、例えば、インビトロならびにインビボでの生物学的サンプルにおけるＦｂｘｏ４０を検出するために使用することができる。例えば、ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術は、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーションおよびＱＰＣＲを含む。Ｆｂｘｏ４０の検出のためのインビトロ技術は、例えば、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を含む。Ｆｂｘｏ４０  ＤＮＡの検出のためのインビトロ技術は、例えば、サザンハイブリダイゼーションを含む。さらに、Ｆｂｘｏ４０の検出のためのインビボ技術は、対象にＦｂｘｏ４０に対する標識された抗体を導入することを含む。本明細書に記載されているとおり、抗体は、標準イメージング技術により対象内での存在および位置が検出することができる放射活性バイオマーカーで標識化することができる。
【０２９８】
さらなる定義
本明細書および特許請求の範囲の明確な理解を提供するために、以下のさらなる定義を、好都合に下記に提供する。
【０２９９】
本明細書は、筋肉疲労関連障害の危険性があるか、または罹患している患者への投与のためのＦｂｘｏ４０のアンタゴニスト（それを作る方法およびその使用）を提供する。本明細書はまた、有効量のアンタゴニストを含む処置を含む。処置は、種々の用量で提供することができ、非限定的な例として、薬学的に許容される塩および／または担体を含むことができる。
【０３００】
「患者」は、筋肉疲労関連障害、筋力低下に関するか、または関連する障害を患っているか、または危険性がある個体、好ましくはヒトを意味する。筋肉量喪失を防止するか、または筋肉量を増加するための薬物を必要とする患者は、筋肉量の喪失と間接的に関連するか、または全く関連しない１つ以上の苦痛のみを患っていてもよい。患者は、筋肉疲労関連障害の危険性があり得（例えば、遺伝的にかかりやすい）、わずかな疾患の症状を示すか、または症状なしであり得る（例えば、障害が無症候であり得る）。この場合、アンタゴニストは、筋力低下の発症を防止するための予防処置として投与することができる。
【０３０１】
患者は、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストでの処置に加えて（前に、同時にまたは後に）、これらの病気のためのあらゆる適当な処置を施すことができる。したがって、患者は、１つ以上のＦｂｘｏ４０アンタゴニスト、所望により筋力低下を改善する１つ以上のさらなる処置または薬物、および別の疾患（例えば、癌、糖尿病またはハンチントン病）のための所望により１つ以上の処置で処置することができる。例えば、糖尿病を有する患者は、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストおよびインスリンを投与することができ；癌患者は、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストおよび抗癌薬物を投与することができる。特に高齢者患者における筋肉疲労障害は、ときどき骨量の減少障害、例えば、骨粗鬆症と関連する。したがって、Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストはまた、骨粗鬆症のための処置、例えば、Ａｃｌａｓｔａ（ゾレドロン酸またはゾレドロネート）またはＤｅｎｏｓｕｍａｂ（ＡＭＧ１６２；ＲＡＮＫＬを標的とする抗体）と共投与することができる。
【０３０２】
本明細書は、患者および個体への投与のためのＦｂｘｏ４０に対するアンタゴニストを含む処置および処置方法をさらに含む。
【０３０３】
「処置」は、予防、治療、治癒または改良または健康状態の悪化の改善もしくは悪化しないことを示す患者の状態における他のあらゆる変化を意味する。「処置」は、筋力低下の処置または患者が有する他のあらゆる病気の処置を意味する。本明細書において使用される「処置」および「処置する」なる用語は、疾患にかかる危険性があるか、または疾患を有する疑いがある患者、ならびにすでに病気であるか、または病気であると診断された患者の処置を含む、予防または防止処置および治癒または疾患修飾処置の両方を示す。「処置」および「処置する」なる用語はまた、疾患に罹患していないが、不健康状態、例えば、窒素平衡失調または筋力低下を発症しやすい個体における健康の維持および／または促進を示す。
【０３０４】
「有効量」または「治療有効量」は、個体の疾患または医学的状態を処置するか、またはさらに一般的に、個体に栄養的、生理学的または医薬的利益を提供する量である。
【０３０５】
本明細書の種々の態様において、患者は、少なくとも約６月齢、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０または７５歳である。種々の態様において、患者は、約１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０または１００歳以下である。種々の態様において、患者は、少なくとも約９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０または４００ポンドの体重を有する。種々の態様において、患者は、約９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０または４００ポンド以下の体重を有する。
【０３０６】
本明細書の種々の態様において、用量は、少なくとも約１、５、１０、２５、５０、１００、２００、２５０、３００、２５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００ｎｇ、１、５、１０、２５、５０、１００、２００、２５０、３００、２５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００マイクログラム、１、５、１０、２５、５０、１００、２００、２５０、３００、２５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００ｍｇであり得る。種々の態様において、用量は、約１０、２５、５０、１００、２００、２５０、３００、２５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００ｍｇ以下であり得る。種々の態様において、用量は、少なくとも１日に２回以上、毎日、１週間に２回以上、１週間毎、２週間毎、１月毎、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２月毎に投与することができる。
【０３０７】
種々の態様において、用量は、個体の体重または表面積と相関する。実際の投与レベルは、特定の患者、組成物および投与経路について、患者に毒性なく有効である活性剤の量を得るように変化され得る。選択される用量は、種々の薬物動態学因子、例えば、使用される特定のアンタゴニストの活性、投与経路、アンタゴニストの排出速度、処置期間、アンタゴニストと組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、年齢、性別、体重、状態、一般的健康および患者の病歴等、および医学分野で既知の因子に依存する。通常の技術を有する医師または獣医は、必要なアンタゴニストの有効量を容易に決定し、次に処方することができる。適当な用量は、治療効果を奏するのに有効な最低用量または副作用を引き起こさずに治療効果を奏するように十分低い用量である量である。
【０３０８】
「薬学的に許容される塩」は、親化合物がそれらの酸性または塩基性塩を作ることにより修飾されている記載されている化合物の誘導体を示す。薬学的に許容される塩の例は、限定はしないが、塩基性残基、例えば、アミンの鉱酸または有機酸塩；酸性残基、例えば、カルボン酸のアルカリまたは有機塩などを含む。薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の慣用の非毒性塩または四級アンモニウム塩を含む。例えば、このような慣用の非毒性塩は、限定はしないが、１，２−エタンジスルホン酸、２−アセトキシ安息香酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、炭酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコリルアルサニル酸、ヘキシルレゾルシン酸、ヒドラバミン酸、臭化水素酸、塩酸、ヒドロアイオダイド、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナプシル酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、ポリガラクツロン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、スバセチック(subacetic)、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸およびトルエンスルホン酸から選択される無機および有機酸から誘導されたものを含む。
【０３０９】
本明細書の薬学的に許容される塩は、慣用の化学的方法により、塩基性または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。一般的に、このような塩は、水または有機溶媒または２つの混合物中で、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を化学量論量の適当な塩基または酸と反応させることができる；一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適当な塩のリストは、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990, p 1445（この明細書を出典明示により本明細書に包含させる）において見出される。
【０３１０】
Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストを含む医薬組成物は、固体形態、例えば、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、ジェルキャップ、ゼラチンカプセル、リポソーム、坐薬、チュアブル形態またはパッチであり得る。Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストを含む医薬組成物はまた、液体形態、例えば、溶液、エマルジョン、懸濁液、エリキシル剤またはシロップで提供され得る。適当な液体支持体は、水中で様々な割合で、例えば、水、有機溶媒、例えば、ポリオール、例えば、グリセロールまたはグリコール、例えば、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール、またはエタノール、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、またはそれらの混合物であり得る。組成物は、アルブミンまたは界面活性剤でコーティングされたナノサイズの非結晶または結晶顆粒を含むことができる。
【０３１１】
適当な支持体は、例えば、抗菌および抗真菌剤、緩衝剤、リン酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、クロロブタノール、ココアバター、着色剤、デキストリン、乳化剤、腸溶コーティング、香味剤、ゼラチン、等張剤、レシチン、ステアリン酸マグネシウム、芳香剤、多価アルコール、例えば、マンニトール、注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチル、パラベン、フェノールソルビン酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリジン、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、保存剤、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、塩化ナトリウム、ソルビトール、種々の糖（限定はしないが、スクロース、フルクトース、ガラクトース、ラクトースおよびトレハロースを含む）、デンプン、坐薬ロウ、タルク、植物油、例えば、オリーブ油およびコーンオイル、ビタミン、ロウおよび／または湿潤剤を含むことができる。ｓｉＲＮＡであるＦｂｘｏ４０アンタゴニストについて、特定の支持体は、デキストランおよび水、例えば、水中で５％のデキストロース（Ｄ５Ｗ）を含む。
【０３１２】
医薬組成物の生物学的に不活性な部分は、所望により層化および／または侵食可能であり、それによりアンタゴニストの持続放出を可能にする。
【０３１３】
Ｆｂｘｏ４０を含む医薬組成物は、バッカル、吸入（吸引および深い吸入を含む）、経鼻、経口、非経口、埋め込み、硬膜外を介する注射または注入、動脈内、関節内、嚢内、心臓内、脳室内、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼窩内、腹腔内、髄腔内、胸骨内、髄腔内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮下、表皮下、経内皮、経気管、経血管、経直腸、舌下、局所および／または膣経路により投与することができる。これは、注射、注入、皮膚パッチまたは当分野で知られているあらゆる他の方法により投与され得る。製剤は、粉末化、噴霧化、エアロゾル化、粒状化またはあるいは送達のために他の方法で適当に調製され得る。投与は、液体の場合、ゆっくりまたはボーラスを介してであってもよいが、当分野で知られているいくつかの環境下において、ボーラス注射は、腎臓を介する物質の喪失を引き起こし得る。
【０３１４】
Ｆｂｘｏ４０アンタゴニストは、当分野で知られている医療デバイスで投与することができる。例えば、特定の態様において、アンタゴニストは、無針皮下注射デバイス、例えば、米国特許第５，３９９，１６３、５，３８３，８５１、５，３１２，３３５、５，０６４，４１３、４，９４１，８８０、４，７９０，８２４または４，５９６，５５６号に記載されているデバイスで投与することができる。本明細書において有用なよく知られているインプラントおよびモジュールの例は以下のものを含む：制御された速度で薬物を分配するための移植可能な微小注入を記載している米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を介して薬物を投与するための治療デバイスを記載している米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを記載している米国特許第４，４４７，２３３号；連続的な薬物送達のための可変流量の移植可能な注入装置を記載している米国特許第４，４４７，２２４号；多重チャンバー区画を有する浸透圧薬送達系を記載している米国特許第４，４３９，１９６号；および浸透圧薬送達系を記載している米国特許第４，４７５，１９６号。多くの他のこのようなインプラント、送達系およびモジュールは、当業者に知られている。
【０３１５】
１つの態様において、アンタゴニストは、インビボでの適切な分布を保証するために製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの親水性の高い化合物を排除する。アンタゴニストがＢＢＢを（所望により）通過することを保証するため、それらは、例えば、リポソーム中で製剤化することができる。リポソームを製造する方法について、例えば、米国特許第４，５２２，８１１；５，３７４，５４８；および５，３９９，３３１号参照。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送される１つ以上の部分を含んでいてよく、したがって、標的薬物送達を増強する（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685参照）。標的部分の例は、葉酸またはビオチン（例えば、Lowらの米国特許第５，４１６，０１６号参照）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038）；抗体（Ｐ.G. Bloemanら (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owaisら (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180）；界面活性剤タンパク質Ａ受容体（Briscoeら (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134）、本明細書の製剤ならびに本発明の分子の成分を含み得る異なる種、ｐ１２０（Schreierら (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090)を含む; K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273も参照。
【０３１６】
種々の態様において、本発明の方法および組成物は本明細書に記載されているとおりであるが、ただし、アンタゴニストは抗体ではない。種々の態様において、本発明の方法および組成物は本明細書に記載されているとおりであるが、ただし、アンタゴニストは抗体様分子ではない。種々の態様において、本発明の方法および組成物は本明細書に記載されているとおりであるが、ただし、アンタゴニストは小分子有機化合物（ＬＭＷ）ではない。種々の態様において、本発明の方法および組成物は本明細書に記載されているとおりであるが、ただし、アンタゴニストはｓｉＲＮＡではない。
【０３１７】
本明細書において使用される「ａ」および「ａｎ」なる冠詞は、冠詞の文法的な目的語の１つまたは１つ以上の（少なくとも１つ）を示す。
【０３１８】
本明細書は以下の実施例によりさらに説明されるが、これはさらなる限定と解釈すべきでない。本出願を通じて引用した全ての図面および全ての文献、特許および公開特許出願の内容は、明確に出典明示により本明細書に包含させる。
【実施例】
【０３１９】
実施例１
ＩＧＦ１処理されると、ＩＲＳ１は、Ｃ２Ｃ１２筋管中で迅速に分解される
ＩＧＦ１は、成体骨格筋において肥大を誘導するために十分であることが証明されている。インスリン受容体基質（ＩＲＳ）は、同種受容体へのＩＧＦ１またはインスリン結合時にチロシンリン酸化され、それにより、多数のＳＨ２ドメイン含有タンパク質とシグナル伝達複合体を形成し、多数の細胞内シグナルを開始することを可能にする。ＩＲＳレベルの変化は、ＩＧＦ１およびインスリンの両方への感受性および応答に影響し得る。多数の種々の細胞モデル系において、ＩＧＦ１またはインスリンへの暴露はＩＲＳレベルの減少をもたらす。
【０３２０】
本実施例において、本発明者らは、内因性ＩＲＳ１がＩＧＦ１処理時に筋肉細胞において分解されるか否かを確認する。分化Ｃ２Ｃ１２筋管を、タンパク質合成阻害剤エメチン（Ｅｍｅ）と一緒に、増大する濃度のＩＧＦ１または筋萎縮を引き起こし得るグルココルチコイドであるデキサメタゾン（ＤＥＸ）で処理する。図４Ａは、Ｃ２Ｃ１２筋管中、用量依存的方法において、ＩＲＳ１がＤＥＸではなくＩＧＦ１処理時に分解されるということを証明する。この結果に基づいて、本発明者らは、さらなる実験のために１０ｎＭのＩＧＦ１を使用することを選択する。Ｃ２Ｃ１２筋管において、ＩＲＳ１は、ＩＧＦ１処理時に約２時間の半減期で迅速に分解される（図４Ｂおよび４Ｅ）。ＩＲＳ１のタンパク質レベルはまた、遅い速度論であるけれども、ＩＧＦ１単独で処理された細胞中でも減少し（図４Ｅ）、それにより、この迅速な分解が活性なタンパク質合成を越えることが示唆されることに留意する。
【０３２１】
ＩＲＳ１は、プロテオソーム依存経路を介して分解される。この結論は、プロテオソーム阻害剤ＭＧ１３２がこのタンパク質を実質的に安定化するという観察に基づく（図４Ｂ）。ユビキチン化タンパク質が細胞中で迅速に分解されるため、図４Ｃに示される実験においてユビキチン化ＩＲＳ１タンパク質を検出するために、Ｃ２Ｃ１２筋管をｈｉｓ−ｍｙｃタグユビキチンを過剰発現するアデノウイルスに感染させ、ＭＧ１３２またはイソペプチダーゼ阻害剤Ｇ５と一緒にＩＧＦ１とインキュベートする。ＩＲＳ１を、ウサギポリクローナル抗−ＩＲＳ１抗体（レーン６、８、１０、１２）またはコントロールとしての非特異的ＩｇＧ（レーン５、７、９、１１）で免疫沈降する。ポリユビキチン化が、ｈｉｓ−ｍｙｃタグユビキチンに対するモノクローナル抗−ｍｙｃ抗体で検出され、ＩＲＳ１で特異的に免疫沈降されることが見られる（図４Ｃ、上のパネル）。興味深いことに、ＩＲＳ１の電気泳動移動度における上へのシフトは、Ｇ５処理で明らかであり（図４Ｃ、下のパネル、レーン１０および１２）、イソペプチダーゼに対するＧ５の阻害的役割と一致する。図４Ｃの上のパネルにおいて、Ｇ５処理がまた、ＭＧ１３２処理単独との比較においてｈｉｓ−ｍｙｃタグユビキチンの上へのシフトを引き起こすことに注意すること（レーン１０をレーン８と比較して）。ＩＧＦ１処理時のＩＲＳ１の誘導分解に一致して、ポリユビキチン化ＩＲＳ１はまた、細胞中のユビキチン化タンパク質の全量が少し減少したにもかかわらず（図４Ｄ、下のパネル）、ＩＧＦ１処理で増加する（図４Ｄ、上のパネル）。
【０３２２】
これらのデータは、ＩＧＦ１がＣ２Ｃ１２筋管におけるＩＲＳ１の迅速な分解をもたらすことを示す。さらに、ＩＲＳ１は、プロテオソーム依存経路を介して分解される。
次に、本発明者らは、何の酵素がこの分解に関与するのか、または関与しないのかを決定する。
【０３２３】
実施例２
Ｃ２Ｃ１２筋管におけるＩＲＳ１の分解は、ＰＩ３−キナーゼおよびｍＴＯＲに対する阻害剤により救うことができない
どのシグナル伝達経路がＣ２Ｃ１２筋管におけるＩＲＳ１分解の活性化において役割を果たすのかを決定するために、筋管を、１０ｎＭのＩＧＦ１およびＰＩ３−キナーゼ（ウォルトマンニン）、Ａｋｔ（ＡＰＩ−２）、ＧＳＫ３（ＬｉＣｌ）、ｍＴＯＲ（ラパマイシン）、ＭＥＫ（ＰＤ９８０５９およびＭＥＫ１／２阻害剤）、ｐ３８およびＪＮＫに対する阻害剤または担体（ＤＭＳＯ）とインキュベートする。データ（示されていない）は、Ｃ２Ｃ１２筋管におけるＩＲＳ１の分解が、ＰＩ３−キナーゼおよびｍＴＯＲに対する阻害剤により救うことができないことを示す。このデータは、リガンド誘導ＩＲＳ１分解がＩＧＦ１ＲによるＩＲＳ１の直接的リン酸化が原因であり得ることを示唆する。
【０３２４】
実施例３
ＩＲＳ１は、Ｓｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ１−Ｒｂｘ１複合体により標的化される
本実施例において、本発明者らは、分解のためにＩＲＳ１をプロテオソームに標的化することに関与するＥ３リガーゼを見出すことを試みる。ＩＲＳ１が、今までに文献において報告されている他のあらゆる細胞型とは異なって調節されるＣ２Ｃ１２筋管における迅速な分解を有するため、本発明者らはＣ２Ｃ１２筋管における研究に焦点を合わせる。
【０３２５】
細胞中には、２つの主な型：Ｒｉｎｇフィンガードメイン（ＲＮＦ）およびＨＥＣＴドメイン含有Ｅ３リガーゼを含む、６００以上のＥ３リガーゼがある［Liら 2008 PLoS One 3: e1487］。ＲＮＦ依存Ｅ３リガーゼは、２つのカテゴリー：単一のポリペプチド鎖  ＲＮＦ  Ｅ３およびマルチサブユニット  Ｃｕｌｌｉｎ−Ｒｉｎｇ  Ｅ３複合体にさらに分けることができる。Ｒｂｘ１は、種々の因子と関連し、マルチサブユニット  Ｃｕｌｌｉｎ−Ｒｉｎｇ  Ｅ３複合体の４つの異なる型を形成することができる一般的な小分子ＲＮＦタンパク質である。ＩＲＳ１を標的化するＥ３リガーゼを迅速に見出すために、本発明者らは、最初に、Ｒｂｘ１をノックダウンすることにより可能性のある標的を絞り込むことを試みる。Ｃ２Ｃ１２筋管を、Ｒｂｘ１を標的化する３つの異なるｓｉＲＮＡでトランスフェクトする。図５Ａに示されるとおり、ｓｉＲｂｘ１＿１およびｓｉＲｂｘ１＿２は、基底レベルの５０％にＲｂｘ１タンパク質をノックダウンし、ＩＧＦ１誘導ＩＲＳ１分解をほとんど完全にブロックするが、ｓｉＲｂｘ１＿３は、タンパク質を有意にノックダウンせず、効果がない（図５Ａ）。さらに、Ｓｋｐ１（図５Ｂ）およびＣｕｌｌｉｎ１（図５Ｃおよび５Ｄ）に対するｓｉＲＮＡは同様の効果を有し、Ｒｂｘ１含有Ｓｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ１−Ｆ−ｂｏｘ（ＳＣＦ）複合体が、プロテオソーム分解のためのＩＲＳ１を標的化するＥ３リガーゼであることを示唆する。コントロールとして、本発明者らはまたは、Ｃｕｌｌｉｎ２ノックダウンの効果を確認し、Ｃｕｌｌｉｎ２が関連しないことを見出す（図５Ｆおよび５Ｇ）。最後に、Ｒｂｘ１はＩＲＳ１と共免疫沈降することができ、これらの２つのタンパク質が１つの複合体において存在することを示唆する（図５Ｅ）。
【０３２６】
これらのデータは、ＩＲＳ１がＳｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ１−Ｒｂｘ１複合体により標的化されることを示す。したがって、１つのＦｂｏｘタンパク質は、ＩＧＦ１誘導ＩＲＳ１分解に関与する。次の工程は、どのＦｂｏｘタンパク質が関与するのかを決定する工程である。
【０３２７】
実施例４
Ｆｂｘｏ４０はＳｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ１−Ｒｂｘ１複合体と結合し、分解のためにＩＲＳ１を標的化する
マウスにおいて今までのところ同定されている約７７個のＦ−ｂｏｘ  タンパク質がある。本発明者らは、ＩＲＳ１を標的化するＦ−ｂｏｘタンパク質についてスクリーニングするために機能性ゲノムアプローチを使用する。Ｃ２Ｃ１２筋管を、ＤｈａｒｍａｃｏｎからのＳＯＣＳ−ｂｏｘおよびＦ−ｂｏｘ含有タンパク質に対するｓｉＲＮＡまたはｓｉＣＯＮを含むマウスユビキチン結合ｓｉＲＮＡライブラリーサブセット２でトランスフェクトする。トランスフェクション４８時間後に、細胞を、１６時間、１０ｎＭのＩＧＦ１で処理する。ＩＲＳ１タンパク質レベルをウェスタンブロッティングにより分析する。このスクリーニングからのポジティブヒットを、異なる供給源Ｑｉａｇｅｎからの３つの異なるｓｉＲＮＡによりさらに確認する。ノックダウン効率を、ポジティブヒットに対する定量リアルタイムＰＣＲにより評価する。いくつかの場合において、全３つのＱｉａｇｅｎ  ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡレベルで標的遺伝子発現を少なくとも７０％サイレントすることができない。この場合において、ＤｈａｒｍａｃｏｎからのＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌをさらなる確認のために使用する。スクリーニングされた６７個のＦ−ｂｏｘタンパク質のうち（残存遺伝子に対するｓｉＲＮＡはライブラリー中に示されなかった）、本発明者らは、１つのポジティブヒットであるＦｂｘｏ４０を同定する。図６Ａは、Ｆｂｘｏ４０をノックダウンすることによるＩＲＳ１の用量依存的レスキューを証明する。Ｆｂｘｏ４０を標的化する３つのｓｉＲＮＡ中の、ｓｉＦｂｘｏ４０＿７はタンパク質レベルを基底レベルの１０％に減少させ、最も良い有効性を有するが、最も少ないノックダウンを引き起こすｓｉＦｂｘｏ４０＿９はコントロールレベルを越えるＩＲＳ１タンパク質のわずかな増加をもたらすのみである。重要なことには、これらの３つのｓｉＲＮＡは、ＩＧＦ１処理なしでＩＲＳ１タンパク質レベルの増加をもたらさなかった（図６Ａ、左のパネル）。
【０３２８】
Ｆｂｘｏ４０は、除神経筋において上方調節される新規Ｆ−ｂｏｘタンパク質である。Yeら 2007 Gene 404: 53-60。本発明者らは、定量リアルタイムＰＣＲによりＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐａｎｅｌを調査し、Ｆｂｘｏ４０が心臓および筋肉において高度に発現されることを見出す（図３）。さらに、そのｍＲＮＡ（図６Ｂ）およびタンパク質（図８Ａ）はＣ２Ｃ１２細胞の分化中に誘導され、これはＣ２Ｃ１２筋管におけるＩＲＳ１の加速分解と一致する。ＩＲＳ１およびＲｂｘ１は、Ｆｂｘｏ４０に対する抗体と共免疫沈降することができる（図６Ｃ）。Ｆｂｘｏ４０タンパク質レベルがＭＧ１３２とのインキュベーション後に増加し（図６Ｃ、レーン１−３と比較して）、それにより、このタンパク質がまた、細胞で迅速にターンオーバーすることが示されることに注意すること。本発明者らはまた、この免疫沈降されたＦｂｘｏ４０−Ｒｂｘ１複合体を使用してインビトロで組換えＩＲＳ１ユビキチン化し、ＩＲＳ１を時間依存手段においてユビキチン化することができることを見出す（図６Ｄ）。この実験において、本発明者らは、６つのコントロール反応を含む。最初の４つのコントロールは、それぞれＥ１またはＥ２（ＵｂｃＨ５ｃ）またはＨｉｓ６−ビオチン−Ｎ−末端ユビキチンまたは組換えＩＲＳ１を省略して３０℃で９０分間行った反応である。最後の２つのコントロールは、免疫沈降されたＦｂｘｏ４０なしで（ＩｇＧを有さない、または非特異的ウサギＩｇＧを有する溶解物とインキュベートされたビーズと）行った完全反応である。ポリユビキチン化ＩＲＳ１は、６０分または９０分後に３０℃で完全反応において観察することができる。
【０３２９】
これらのデータは、Ｆｂｏｘ４０がＩＧＦ１処理時にＩＲＳ１タンパク質を制御するＥ３リガーゼであるという仮説を支持する。
【０３３０】
実施例５
Ｒｂｘ１の部分的ノックダウンはＣ２Ｃ１２筋管におけるＩＧＦ１の肥大作用を強化する
Ｆｂｘｏ４０の阻害が筋肉肥大を誘導することができるという間接的な証拠として、本発明者らは、Ｆｂｘｏ４０と関連し、かつ、ＩＲＳ１のユビキチン化におけるその機能がＦｂｘｏ４０を必要とするＲｂｘ１を部分的にノックダウンする。
【０３３１】
実験の以下のセットにおいて、本発明者らは、ＱｉａｇｅｎからのｓｉＲＮＡでＲｂｘ１発現をノックダウンする。図５Ａに示されるとおり、ｓｉＲｂｘ１＿１およびｓｉＲｂｘ１＿２はタンパク質発現を基底レベルの約５０％に低下させることができるが、ｓｉＲｂｘ１＿３はわずかに機能することに注意すること。本発明者らは、この実験のためにｓｉＲｂｘ１＿１およびｓｉＲｂｘ１＿２のみを使用した。トランスフェクト細胞を２４時間、２つの異なる用量のＩＧＦ１で処理する。筋管の直径を、それぞれの処理群の１０枚の写真で自動ソフトウェアを使用して測定する。Ｒｂｘ１のノックダウンは、１ｎＭのＩＧＦ１処理でいっそうより大きい筋管の産生をもたらす（図７Ａ）。ｓｉＣＯＮトランスフェクト細胞において、１０ｎＭのＩＧＦ１のみが統計的に有意により厚い筋管を生産する。二元ＡＮＯＶＡを使用する統計分析は、ｓｉＲｂｘ１＿１およびｓｉＲｂｘ１＿２の導入が、ｓｉＣＯＮトランスフェクト細胞よりもＩＧＦ１の肥大作用を有意に強化することを示す（図７Ｂ）。
【０３３２】
実施例６
Ｆｂｘｏ４０のノックダウンは、より厚い筋管および筋肉量の増加をもたらす
本実施例は、Ｆｂｘｏ４０のノックダウンがより厚い筋管をもたらし、筋肉量の増加を示すことを示す。
【０３３３】
ＩＧＦ１が分化後の筋管のサイズを増加することができるため、本実施例は、Ｆｂｘｏ４０ノックダウンのインビボ結果を決定するために設計する。Rommelら 2001 Nat. Cell Biol. 3: 1009-1013; Jacqueminら 2004 Exp. Cell Res. 299: 148-158;およびSemsarianら 1999 Nature 400: 576-581。図６Ａに示されているＦｂｘｏ４０を標的とする３つのｓｉＲＮＡのノックダウン効率に基づいて、本発明者らは、この実験のために２つの最も有効なｓｉＲＮＡであるｓｉＦｂｘｏ４０＿７およびｓｉＦｂｘｏ４０＿８を使用する。Ｆｂｘｏ４０発現が分化の後期に検出可能であるため（図６Ｂおよび８Ａ）、筋管を、分化２日後にｓｉＣＯＮ、ｓｉＦｂｘｏ４０＿７およびｓｉＦｂｘｏ４０＿８でトランスフェクトし；次に、１日後（分化３日後）、筋管を２４時間、ＩＧＦ１の２つの異なる用量のいずれかで処理する。筋管の直径を、それぞれの処理群の１０枚の写真で自動ソフトウェアを使用して測定する。Ｆｂｘｏ４０のノックダウンは、さらなるＩＧＦ１処理なしでいっそう劇的により大きい筋管の産生をもたらす（図９Ａ）。筋管が内因性ＩＧＦ１を生産することに注意すべきである（データは示していない）。ｓｉＦｂｘｏ４０＿７でのノックダウン後の筋管の典型的な写真は図９Ａに示されている。より大きい筋管はまた、トランスフェクション２４時間後に、少し有効なｓｉＲＮＡであるｓｉＦｂｘｏ４０＿８で観察される（データは示していない）。筋管直径の定量化は図９Ｂに示されている。ｓｉＣＯＮトランスフェクトグループ中、１０ｎＭのＩＧＦ１のみが、担体だけで処理された細胞と比較して統計的に有意により厚い筋管を生産する；これらは筋管直径において約１１％の増加を示す。しかしながら、ｓｉＦｂｘｏ４０＿７の導入が、ｓｉＣＯＮトランスフェクト細胞よりも有意により厚い筋管をもたらす。見られる該効果は、筋管直径において極めて大きい約５０％の増加である。さらに、ＩＲＳ１がＦｂｘｏ４０と共にノックダウンされるとき（ｍＲＮＡはｓｉＣＯＮトランスフェクト細胞の６５％に減少する、データは示していない）、本発明者らは、筋管直径において約２０％の増加のみであることを発見し（図９Ｃ）、これは、いくつかの他の可能性のある基質とは対照的に、Ｆｂｘｏ４０がＩＲＳ１の調節を介して筋管直径を調節することをさらに証明する。これらの実験は、Ｆｂｘｏ４０のノックダウンが筋肉量の増加を示すより厚い筋管をもたらすことを示す。
【０３３４】
次に、本発明者らは、Ｆｂｘｏ４０がまた、マウスにおいてＩＲＳ１タンパク質レベルを調節するか否かを確認する。マウス前脛骨筋に、左脚においてｓｉＣＯＮおよび右脚においてｓｉＲｂｘ１＿１またはｓｉＦｂｘｏ４０＿７をエレクトロポレーションする。ｐＣＭＶ−ＬａｃＺプラスミドをｓｉＲＮＡと共注入し、ｓｉＲＮＡ発現を有する線維を同定する手助けとする。２日間回復後、ＩＧＦ１（１回注射あたり１００μｇ）を２日目、５日目および７日目に前脛骨筋に筋肉内注射する。筋肉を８日目に回収し、タンパク質抽出物を調製する。図９Ｄは、ＩＲＳ１タンパク質がｓｉＣＯＮサンプルよりもｓｉＲｂｘ１およびｓｉＦｂｘｏ４０エレクトロポレーションサンプルにおいてより高いことを示す。加えて、より大きい筋繊維はまた、Ｆｂｘｏ４０ノックダウンで観察され、ｓｉＣＯＮエレクトロポレーション対側脚と比較して１８％±５％増加する（図９Ｅ）。
【０３３５】
したがって、筋管においてＦｂｘｏ４０をノックダウンすることによる表現型の結果が何であるかを決定するために実験を行う。本発明者らは、Ｆｂｘｏ４０発現の減少がＩＧＦ１介在肥大を増強するかどうかをＩＧＦ１刺激有りおよび無しで試験する。驚くことに、Ｆｂｘｏ４０のノックダウンは、筋管サイズにおいて劇的な増加をもたらすために十分であり；Ｆｂｘｏ４０ノックダウンは、筋管サイズにおいて５０％増加をもたらす。これは、ＩＧＦ１の相加効果の余地がない。ＩＧＦ１（１０ｎＭ）単独は、ｓｉＣＯＮトランスフェクト細胞の筋管サイズにおいて１１％増加をもたらすことができるのみである。しかしながら、筋管が内因性ＩＧＦ１を生産することに注意すべきである。したがって、Ｆｂｘｏ４０の減少が内因的に生産された成長因子への非コントロール自己分泌介在肥大応答をもたらすようであり、このことはなぜＦｂｘｏ４０がこの自己分泌シグナル伝達を調節するために必要であるかを説明する手助けとなる。これは、Ｆｂｘｏ４０の減少に加えてＩＲＳ１をノックダウンすることにより証明される。
【０３３６】
したがって、データは、Ｆｂｘｏ４０のノックダウンがより厚い筋管および筋肉量の増加をもたらすことを示す。
【０３３７】
実施例７
材料および方法
当業者に知られている材料および方法を、本明細書における作製および使用において使用することができる。以下は例であり、非限定的材料および方法であり、実施例１から６に使用されるものを含む。
【０３３８】
抗体および阻害剤
本試験において、本発明者らは、Cell Signaling Technology (Danvers, MA)からのＡｋｔ、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、ホスホ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）、ホスホ−ＧＳＫ−３α／β（Ｓｅｒ２１／９）、ＩＧＦ１受容体β、ホスホ−ＩＧＦ１受容体β（Ｔｙｒ１１３５／１１３６）、ウサギポリクローナルＩＲＳ１、ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ、ホスホ−ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ホスホ−ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ２４４８）、ｍＴＯＲ、ホスホ−ｐ７０  Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ３８９）、ｐ７０  Ｓ６キナーゼ、ｃ−Ｃｂｌ、ＮＥＤＤ４およびα／β−チューブリン抗体；Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA)からの抗−Ｃｂｌ−ｂマウスモノクローナル抗体；BD Tranduction Laboratories (San Jose, CA)からの抗−Ｓｋｐ１抗体；Millipore (Billerica, MA)からの抗−Ｃｕｌｌｉｎ７およびウサギポリクローナル抗−ＩＲＳ１抗体およびマウスモノクローナル抗−ＩＲＳ１抗体；Abcam (Cambridge, MA)からのウサギポリクローナル抗−Ｒｂｘ１抗体；Invitrogen (Carlsbad, CA)からのマウスモノクローナル抗−ユビキチンおよび抗−ｍｙｃ抗体を使用する。Ｆｂｘｏ４０に対するウサギポリクローナル抗体（Ｆｂｘｏ４０−６９１：７１０：ＣＥＫＡＲＥＳＬＶＳＴＦＲＡＲＰＲＧＲＨＦ（配列番号：３４））は、Open Biosystems (Huntsville, AL)により作製され、アフィニティー精製されている。
【０３３９】
シグナル伝達阻害剤、ラパマイシン（１００ｎＭの最終濃度で使用される）、ＬＹ２９４００２（５０μＭの最終濃度）、ウォルトマンニン（１００ｎＭの最終濃度）、Ａｋｔ阻害剤ＡＰＩ−２（１μＭの最終濃度）、ＧＳＫ３阻害剤ＬｉＣｌ（２０ｍＭの最終濃度）、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤ＳＢ２０２１９０（１０μＭの最終濃度）、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ９８０５９（２５μＭの最終濃度）、ＭＥＫ１／２阻害剤（ＭＥＫ１およびＭＥＫ２の細胞透過性選択的阻害剤、１０μＭの最終濃度）およびＪＮＫ阻害剤Ｖ（２０μＭの最終濃度）は、EMD Chemicals, Inc. (Gibbstown, NJ)から購入する。
【０３４０】
細胞培養
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ）を、以前に記載されているとおりに培養し、分化する。Rommelら 1999 Scence 286: 1738-1741。０日目を、細胞を低血清分化培地に移した日として定義する。
【０３４１】
阻害剤処理およびウェスタンブロッティング
細胞を、温かい無血清ＤＭＥＭで２回洗浄し、中間で新鮮な培地の交換で、無血清ＤＭＥＭ中で４時間飢餓にする。次に、シグナル伝達阻害剤を加え、細胞を３０分間前処理し、さらに５時間、規定されている１０ｎＭのＩＧＦ１（Ｒ３形態、Sigma, St. Louis, MO）または１０μＭのＥｍｅｔｉｎ（Sigma, St. Louis, MO）または２０μＭのＭＧ１３２（Alexis Biochemicals, Carlsbad, CA）を有する新たに調製された阻害剤とインキュベーションする。細胞を氷冷ＰＢＳで２回濯ぎ、１０μＭのＭＧ１３２およびプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤錠剤（Roche, Basel, Switzerland）を有する氷冷ＲＩＰＡバッファー中に回収する。細胞溶解物を４℃で少なくとも１時間回転し、１０分間１６，０００×ｇで微小遠心管中で４℃でスピンする。上清のタンパク質濃度を、BCA Protein Assay Kit (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)により決定する。等量のタンパク質（１０−２０μｇ）を、４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA）上にレーン毎に負荷し、ＰＶＤＦ膜（Millipore, Billerica, MA）に移す。膜をＴＢＳＴ中の１０％（ｗ／ｖ）のミルク中で室温で１時間ブロックし、次に５％のＢＳＡを有するＴＢＳＴ中で４℃で一晩、一次抗体とインキュベーションする。二次抗体を室温で１時間、膜とインキュベートする。免疫反応をＥＣＬにより検出し、フィルムまたはKodak Image Station 4000R(Eastman Kodak Company, Rochester, NY)に暴露する。密度測定を、Kodak Molecular Imaging software, version 4.0を使用して分析する。
【０３４２】
タンパク質安定性の測定
細胞を、温かい無血清ＤＭＥＭで２回洗浄し、中間で新鮮な培地の交換で、無血清ＤＭＥＭ中で４時間飢餓にする。０時に、１０μＭのエメチンまたは１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドまたは１０ｎＭのＩＧＦ１または２０μＭのＭＧ１３２を、規定されている細胞に加える。指示される時間間隔で、細胞をＰＢＳで２回濯ぎ、１０μＭのＭＧ１３２およびプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤を有する氷冷ＲＩＰＡバッファー中に回収する。細胞溶解物を４℃で少なくとも１時間回転し、１０分間１６，０００×ｇで微小遠心管中で４℃で回転させる。上清をウェスタンブロッティングにより分析する。
【０３４３】
インビボでのユビキチン化アッセイおよび免疫沈降
Ｈｉｓ−ｍｙｃ−ユビキチン  アデノウイルス発現構築物を、生産および精製のためにWelgen Inc. (Worcester, MA)に送る。精製されたアデノウイルスを、分化２日後に２ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌの濃度で一晩、Ｃ２Ｃ１２細胞に加える。感染４８時間後に、細胞を飢餓にし、５時間、規定された１０ｎＭのＩＧＦ１または２０μＭのＭＧ１３２または５μＭのＧ５（イソペプチダーゼ阻害剤、EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ）で処理する。次に、細胞をＰＢＳで２回濯ぎ、１０μＭのＭＧ１３２、５μＭのＧ５およびプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤錠剤を有する１０ｃｍ皿毎に８００μｌの氷冷ＲＩＰＡバッファー中に回収する。細胞溶解物を４℃で少なくとも１時間回転し、１０分間１６，０００×ｇで微小遠心管中で４℃で回転させる。上清のタンパク質濃度をＢＣＡ分析により決定する。この物質（１ｍｇの全タンパク質）を、回転させながら４℃で一晩、４０μｌのＭ−２８０ヒツジ抗ウサギＩｇＧ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Invitrogen, Carlsbad, CA）と一緒に、ウサギポリクローナルＩＲＳ１抗体（Cell Signaling, Denvers, MA）および非特異的ウサギＩｇＧ（それぞれ３ｕｇ）とインキュベートする。次に、ビーズをＴｒｉｔｏｎ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡおよび１％のＴｒｉｔｏｎ、ｐＨ７．４）で３回洗浄する。溶離を、１００ｍＭのＤＴＴを有する３０μｌのサンプルバッファー中でビーズを再懸濁し、次に、９５℃で５分間沸騰することにより行う。溶解物のアリコート（２０μｇ）を、１００％の溶出液と共にウェスタンブロッティングにより分析する。
【０３４４】
ＩＲＳ１およびＲｂｘ１共免疫沈降実験において、３日目に、Ｃ２Ｃ１２筋管を、中間で新鮮な培地の交換で、無血清ＤＭＥＭ中で飢餓にする。次に、細胞を、無血清ＤＭＥＭ中の１０ｎＭのＩＧＦ１および２０μＭのＭＧ１３２で１６時間処理する。細胞を氷冷ＰＢＳで２回濯ぎ、１０μＭのＭＧ１３２およびプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤を補った氷冷Ｔｒｉｔｏｎ溶解バッファーに溶解する。細胞溶解物を、１６，０００×ｇで４℃で少なくとも１時間回転する。上清（１ｍｇ）を、回転させながら４℃で一晩、４０μｌのＭ−２８０ヒツジ抗ウサギＩｇＧ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓと一緒に、ウサギポリクローナルＩＲＳ１抗体（細胞シグナル伝達）および非特異的ウサギＩｇＧ（それぞれ３ｕｇ）とインキュベートする。結合したタンパク質を１００ｍＭのＤＴＴを有する３０μｌのサンプルバッファーで溶離する。
【０３４５】
あるいは、Ｆｂｘｏ４０とのＩＲＳ１およびＲｂｘ１共免疫沈降の実験において、３日目に、Ｃ２Ｃ１２筋管を飢餓にし、上記されているとおりに１０ｎＭのＩＧＦ１または２０μＭのＭＧ１３２で処理する。細胞溶解物（１ｍｇ）を、４０μｌのＭ−２８０ヒツジ抗ウサギＩｇＧ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓと一緒に、アフィニティー精製されたＦｂｘｏ４０抗体および非特異的ウサギＩｇＧ（それぞれ３ｕｇ）とインキュベートする。
【０３４６】
インビトロでのユビキチン化アッセイ
インビトロでのユビキチン化アッセイにおいて、酵母Ｅ１、ヒト組換えＵｂｃＨ５ｃ、ヒトＨｉｓ６−ビオチン−Ｎ−末端ユビキチン、ユビキチンアルデヒドおよびエナジーリジェネレーション溶液（ＥＲＳ）を、Boston Biochem, Inc. (Cambridge, MA)から購入する。ラクタシスチンを、Alexis Biochemicals (San Diego, CA)から購入する。精製された組換えＩＲＳ１タンパク質を、Millipore (Billerica, MA)から購入する。
【０３４７】
２日目に、Ｃ２Ｃ１２筋管を、１６時間、完全培地中の１０ｎＭのＩＧＦ１および２０μＭのＭＧ１３２で処理する。細胞を氷冷ＰＢＳで２回濯ぎ、１０μＭのＭＧ１３２、５μＭのＧ５およびプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤を補った氷冷Ｔｒｉｔｏｎ溶解バッファーに溶解する。細胞溶解物を、１６，０００×ｇで４℃で少なくとも１時間回転する。上清（１ｍｇ）、回転させながら４℃で一晩、４０μｌのＭ−２８０ヒツジ抗ウサギＩｇＧ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓと一緒に、抗Ｆｂｘｏ４０抗体または非特異的ウサギＩｇＧ（それぞれ３ｕｇ）とインキュベートする。１つのコントロール条件において、あらゆるＩｇＧを有さない溶解物をビーズとインキュベートする。次に、ビーズを、振動させながら１０分間、Ｔｒｉｔｏｎ溶解バッファーで３回洗浄する。ユビキチン化反応は、４０μｌの全容量中Ｅ１（１２５ｎＭ）、ＵｂｃＨ５ｃ（３．１２５μＭ）、Ｈｉｓ６−ビオチン−Ｎ−末端ユビキチン（５．４μＭ）、１×ＥＲＳ、ユビキチンアルデヒド（５μＭ）、ラクタシスチン（２０μＭ）、組換えＩＲＳ１（４０ｎｇ）および反応バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．６ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．４）をビーズに加えることにより行う。反応は、３０℃で０、３０、６０、９０分間行う。コントロール反応は、３０℃で９０分間、Ｅ１またはＥ２（ＵｂｃＨ５ｃ）またはＨｉｓ６−ビオチン−Ｎ−末端ユビキチンまたはＩＲＳ１の脱落で行う。それぞれの条件は、デュプリケートセットで行う。１つのセットについて、反応は、反応混合物をビーズから分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、加熱することにより終える。別のセットについて、さらなる氷冷Ｔｒｉｔｏｎ溶解バッファー（８００μｌ）を加え、反応を停止する。次に、反応混合物をビーズから分離し、回転させながら４℃で一晩、４０μｌのＭ−２８０ヒツジ抗ウサギＩｇＧと一緒に、ウサギポリクローナル抗−ＩＲＳ１抗体（細胞シグナル伝達）ともう１回免疫沈降に付す。結合したタンパク質を１００ｍＭのＤＴＴを有する３５μｌのサンプルバッファーで溶離する。反応物をＭＯＰＳランニングバッファーを有する４％−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルまたは３％−８％のＴｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に流し、ストレプトアビジン結合セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）での免疫ブロット法のためにＰＶＤＦ膜に移す。
【０３４８】
ｓｉＲＮＡ配列
他に示されていない限り、ｓｉＲＮＡは、Qiagen (Valencia, CA)から購入する。本発明者らは、本発明者らのコントロールｓｉＲＮＡとしてＡｌｌＳｔａｒｓネガティブコントロールｓｉＲＮＡを使用した。ｓｉＲＮＡの標的配列は以下のとおりである。
【表５】
2013519869.tif 000006
【０３４９】
ユビキチン結合に関与するタンパク質を標的化するｓｉＲＮＡライブラリーは、Dharmacon (Dharmacon/Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO)から購入する。このライブラリーは３つのサブセットを含み、これはＥ１、Ｅ２、Ｆ−ｂｏｘおよびＳＯＣＳ  ｂｏｘタンパク質、ｃｕｌｌｉｎ、ＨＥＣＴドメイン含有、ＲＩＮＧフィンガーおよびＲＩＮＧフィンガー様ドメイン含有Ｅ３を含む。それぞれの遺伝子は、４つの個々のｓｉＲＮＡのプールにより標的化される。ＤｈａｒｍａｃｏｎからのＯＮ−ＴＡＲＧＥＴプラス非標的ｓｉＲＮＡプールをネガティブコントロールとして使用する。二本鎖ＲＮＡの一本鎖のみを示す。Ｆｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡ  ｓｉＦｂｘｏ４０＿７は、配列ＣＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＣＡＡ（配列番号：１９）を標的化し；このｓｉＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎカタログナンバーｓｉ０４３９０１６２である。Ｆｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡ  ｓｉＦｂｘｏ４０＿８は、配列ＧＴＧＧＧＡＡＡＧＴＡＴＧＴＴＣＡＧＣＡＡ（配列番号：２０）を標的化し；このｓｉＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎカタログナンバーｓｉ０４３９０１６９である。Ｆｂｘｏ４０  ｓｉＲＮＡ  ｓｉＦｂｘｏ４０＿９は、配列ＡＧＣＣＧＴＧＧＡＴＧＣＣＡＡＡＧＡＣＴＡ（配列番号：２１）を標的化し；このｓｉＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎカタログナンバーｓｉ０４３９０１７６である。
【０３５０】
ＲＮＡｉ
１日目に、Ｃ２Ｃ１２細胞に、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬用のＱｉａｇｅｎプロトコールに記載されているｓｉＲＮＡをトランスフェクトする。簡潔には、該方法は、６−ウェルプレートにおいて培養された細胞について以下に記載されている。最初に、５６μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４μｌのｓｉＲＮＡ（１０μＭのストック）と混合する。次に、４０μｌのＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬をこの混合物に加え、１００μｌの全容量とする。該混合物を室温で１０分インキュベートし、トランスフェクション複合体の形成をする。一方、細胞に６ウェル皿のウェル毎に２ｍｌの新鮮な分化培地を与える。１００μｌの複合体を、１つのウェル中の細胞上に滴下する。プレートを、均質な分配を保証するように穏やかに回転させ、３７℃インキュベーターに戻す。トランスフェクション４８時間、細胞を４時間、無血清ＤＭＥＭ中で飢餓にし、３７℃で１６時間１０ｎＭのＩＧＦ１または２０μＭのＭＧ１３２で処理する。次に、細胞を溶解し、タンパク質を、阻害剤処理およびウェスタンブロッティングのセクションに記載されているウェスタンブロッティングにより分析する。ＲＮＡ発現もまた、トランスフェクション４８時間後に確認する。
【０３５１】
１日目に、１２−ウェルプレートにおいて培養されたＣ２Ｃ１２細胞を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎにより記載されているプロトコールにしたがってＤｈａｒｍａｆｅｃｔ  ３を使用するＤｈａｒｍａｃｏｎ  ｓｉＲＮＡライブラリー（１０μＭのストック溶液）でトランスフェクトする。細胞とインキュベートされるｓｉＲＮＡの最終濃度は１００ｎＭである。細胞を処理し、ＲＮＡを上記トランスフェクション４８時間後に回収する。
【０３５２】
定量リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを、Ｔｒｉ試薬（Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH）を使用して細胞から単離する。それぞれの処理条件について、３つの独立したサンプルがある。ゲノムＤＮＡを、ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ  ｋｉｔ(Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX)の手助けでＲＮＡサンプルから取り出す。ＲＮＡサンプル（１μｇのそれぞれのサンプル）を、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  逆転写キット（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用してｃＤＮＡに逆転写させる。得られるｃＤＮＡサンプルを１：１０に希釈し、９μｌを、7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems)を使用して、以下の表に記載されているＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙで３８４−ウェルプレートにおいてトリプリケートで分析する。データをＳＤＳソフトウェアｖ２．２で分析する。コントロールｓｉＲＮＡトランスフェクトまたは担体処理細胞におけるｍＲＮＡレベルを１に設定する。相対的倍数変化を、それぞれのサンプルについて２−ΔΔＣｔ手段を使用して計算する。３つの独立したサンプルの５７２８平均倍数変化および平均の標準誤差をプロットする。
【０３５３】
【表６】
2013519869.tif 000007
ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｓｕｒｖｅｙ  Ｐａｎｅｌは、Ambion (Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX)から購入する。
【０３５４】
筋管直径の測定
細胞を、処理後、氷冷ＰＢＳで２回濯ぎ、次に、３７℃で１５−３０分間５％のグルタルアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回濯ぐ。Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１  蛍光顕微鏡(Carl Zeiss Inc., thornwood, NY)を使用して１０倍拡大レンズで、１０枚の写真をそれぞれの条件に対して撮る。筋管直径を、Ｎｏｖａｒｔｉｓにより開発された自動ソフトウェアを使用してＴＩＦＦフォーマット写真から決定する。それぞれのトランスフェクショングループにおける未処理コントロール細胞の平均値を１に設定し、特異的ｓｉＲＮＡの導入をもたらし得る複雑化を除去する。相対的平均倍数変化および平均の標準誤差を計算し、プロットする。
【０３５５】
統計分析
図７Ｂおよび９Ｂを除いて、２つの処理条件間の違いを一元ＡＮＯＶＡを使用して分析する。有意性はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔにより決定する。値は、ｐ＜０．０１で有意と考えられる。
【０３５６】
図７Ｂおよび９Ｂにおいて、グループ間の違いを二元ＡＮＯＶＡを使用して分析する。有意性はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔにより決定する。値は、ｐ＜０．０１で有意と考えられる。
【０３５７】
マウス処理
１２−１４週齢のＣ５７ＢＬ／６  Ｊマウス（Taconic Inc, Hudson, NY）を２−３％のイソフルオランで麻酔する。毛を筋肉周辺部から剃る。０日目に、５０μｇのｐＣＭＶ−ＬａｃＺプラスミドと一緒に５００ｐｍｏｌｅのｓｉＣＯＮを左脛骨筋肉に注入する。右脛骨筋肉に５００ｐｍｏｌｅのｓｉＲｂｘ１＿１またはｓｉＦｂｘｏ４０＿７および５０μｇのｐＣＭＶ−ＬａｃＺプラスミドを注入する。注射後即座に、脚に、１２５Ｖ／ｃｍ、３０ｍｓ持続時間、４００ｍｓ時間間隔での５回「ポジティブ」パルス、次に、同じパラメーターの５回「ネガティブ」パルスでパルスを発する。マウスを２日間、それぞれのケージにおいて回復させる。Ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ１（注射毎に１００μｇ）を、２、５、７日目に、脛骨筋肉に筋肉内注射する。８日目に、マウスを殺し、脛骨筋肉を迅速に切り裂き、液体窒素で予冷された２−メチルブタンにおいてスナップ冷凍する。８μＭの厚さの連続横断面を低温切開片にし、正電荷スライドにのせる。切片をι−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）染色する。全組織切片のイメージをＩｍａｇｅｓｃｏｐｅ  （Ａｐｅｒｉｏ）を使用して得、ＬａｃＺ陽性線維の断面積（ＣＳＡ）をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して測定する。脛骨筋肉の残りを液体窒素下で粉砕し、タンパク質を抽出する。全ての動物処理は、Institutional Animal Care and Use Committee of Novartis Institute for Biomedical Researchにより承認されており、Animal Welfare Act Regulations 9 CFR Parts 1, 2 and 3, and US regualtions (Guidelines for the Care and Use of Laboraory Animals, 1995)に従う。
【図１】
2013519869.tif 000008
【図２】
2013519869.tif 000009
【図３】
2013519869.tif 000010
【図４Ａ】
2013519869.tif 000011
【図４Ｂ】
2013519869.tif 000012
【図４Ｃ】
2013519869.tif 000013
【図４Ｄ】
2013519869.tif 000014
【図４Ｅ】
2013519869.tif 000015
【図５Ａ】
2013519869.tif 000016
【図５Ｂ】
2013519869.tif 000017
【図５Ｃ】
2013519869.tif 000018
【図５Ｄ】
2013519869.tif 000019
【図５Ｅ】
2013519869.tif 000020
【図５Ｆ】
2013519869.tif 000021
【図５Ｇ】
2013519869.tif 000022
【図６Ａ】
2013519869.tif 000023
【図６Ｂ】
2013519869.tif 000024
【図６Ｃ】
2013519869.tif 000025
【図６Ｄ】
2013519869.tif 000026
【図７Ａ】
2013519869.tif 000027
【図７Ｂ】
2013519869.tif 000028
【図８】
2013519869.tif 000029
【図９Ａ】
2013519869.tif 000030
【図９Ｂ】
2013519869.tif 000031
【図９Ｃ】
2013519869.tif 000032
【図９Ｄ】
2013519869.tif 000033
【図９Ｅ】
2013519869.tif 000034
【手続補正書】
【提出日】平成24年10月3日(2012.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2013519869000001.app
【国際調査報告】
2013519869.tif 000035
2013519869.tif 000036
2013519869.tif 000037