(57)【要約】本発明の実施形態は、一般に、ポックスウイルス構築物を生成および発現するための方法、組成物および使用を開示する。いくつかの実施形態において、構築物は、インフルエンザウイルス遺伝子セグメントを含み得る。特定の実施形態において、方法は、一般に、構築物の組成物を作製および使用することに関連し、この組成物としては、ポックスウイルスワクチン組成物が挙げられるが、これに限定されない。他の実施形態において、ワクチン組成物は、被験体において使用することが報告されている。
2013511552.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体に投与するための組成物であって、
該組成物は、１つまたはそれより多くの構築物を含み、
該構築物は、少なくとも１つの非ポックスウイルスペプチドに結合する少なくとも１つのポックスウイルス分泌シグナル配列を含み、
ここで、該１つまたはそれより多くのペプチドは、被験体において免疫応答を生み出すことが可能である、
組成物。
【請求項２】
前記非ポックスウイルスペプチドが、細菌、ウイルス、哺乳動物、真菌類、原生生物、非病原性生物、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記非ポックスウイルスペプチドが、ウイルスを含み、該ウイルスの非ポックスウイルスペプチドが、インフルエンザ遺伝子セグメントを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記インフルエンザ遺伝子セグメントが、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（Ｎ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス（Ｍ）ポリメラーゼ（Ｐ）、またはそれらのフラグメント、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記フラグメントが、インフルエンザ遺伝子セグメントの少なくとも６、または少なくとも８、または少なくとも１０の連続したアミノ酸を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポックスウイルス分泌シグナル配列が、Ｃ１３、Ｂ８Ｒ、または任意の他のポックスウイルス分泌シグナル配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記構築物が、改変されたワクシニアをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
１つまたはそれより多くの翻訳調節配列をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポックスウイルスが弱毒化または改変されたポックスウイルスを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
被験体に投与するためのワクチン組成物を作製するための方法であって、
該方法は、
ポックスウイルスの１つまたはそれより多くの構築物を得る工程；および
少なくとも１つの非ポックスウイルスペプチドに結合する少なくとも１つのポックスウイルス分泌シグナル配列を、該構築物に導入する工程
を含み、
ここで、該ワクチン組成物は、該被験体において免疫応答を誘導することが可能である、
方法。
【請求項１１】
前記非ポックスウイルスペプチドが、細菌、ウイルス、哺乳動物、真菌類、原生生物、非病原性生物、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記非ポックスウイルスペプチドのうちの少なくとも１つが、インフルエンザ遺伝子セグメントを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記インフルエンザ遺伝子セグメントが、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（Ｎ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス（Ｍ）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
被験体において免疫応答を誘導するための方法であって、
該方法は、該被験体に組成物を投与する工程を含み、
該組成物は、少なくとも１つのポックスウイルス分泌シグナル配列、および少なくとも１つの非ポックスウイルスペプチドを含み、
ここで、該組成物は、該被験体において免疫応答を誘導することが可能である、
方法。
【請求項１５】
前記ポックスウイルスが、ワクシニアウイルスを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ワクシニアウイルスが、改変されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
被験体において免疫応答を誘導するための方法であって、
該方法は、
該被験体に第一の組成物を投与する工程であって、該第一の組成物は、１つまたはそれより多くのポックスウイルス構築物を含む、工程、および
該被験体に第二の組成物を投与する工程であって、該第二の組成物は、少なくとも１つのポックスウイルス分泌シグナル配列および少なくとも１つの非ポックスウイルスペプチドを含む、１つまたはそれより多くのポックスウイルス構築物を含む、工程
を含み、
ここで、該組成物は、該被験体において免疫応答を誘導することが可能である、
方法。
【請求項１８】
前記第一の組成物における前記ポックスウイルスが、ワクシニアウイルスを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ワクシニアウイルスが、改変されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記非ポックスウイルスペプチドが、細菌、ウイルス、哺乳動物、真菌類、原生生物、非病原性生物、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記第一の組成物が、前記第二の組成物の６ヶ月前と該第二の組成物のすぐ前との間に前記被験体に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ポックスウイルスへの事前の曝露を有する被験体において免疫応答を誘導するための方法であって、
該方法は、該被験体に組成物を投与する工程を含み、該組成物は、ポックスウイルスおよび少なくとも１つの非ポックスウイルスペプチドに結合する少なくとも１つのポックスウイルス分泌シグナルを含む、１つまたはそれより多くのポックスウイルス構築物を含み、ここで、該ワクシニアウイルスが、改変されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を含み、
該組成物は、ポックスウイルスへの事前の曝露を有する該被験体において免疫応答を誘導することが可能である、方法。
【請求項２３】
前記組成物の第二投与の６ヶ月前と該組成物の第二投与のすぐ前との間に、該組成物のブーストを投与する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物の投与が、皮内投与を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ワクチンキットであって、該ワクチンキットは：
少なくとも１つのポックスウイルスワクチン組成物であって、ここで該ワクチン組成物は、少なくとも１つのポックスウイルス分泌シグナル配列および少なくとも１つの非ポックスウイルスペプチドを有するポックスウイルス構築物を含む、少なくとも１つのポックスウイルスワクチン組成物；ならびに
少なくとも１つの容器を含む、
ワクチンキット。
【請求項２６】
前記非ポックスウイルスペプチドのうちの少なくとも１つが、１つまたはそれより多くのインフルエンザウイルス遺伝子セグメントを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
被験体への投与のための組成物であって、
該組成物は、１つまたはそれより多くの構築物を含み、
該構築物は、１つまたはそれより多くのポックスウイルス；および
少なくとも１つの非ポックスウイルスペプチドに結合する少なくとも１つのポックスウイルス分泌シグナル配列を含み、
ここで、該１つまたはそれより多くのペプチドは、被験体において免疫応答を生み出すことが可能である、
組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本ＰＣＴ出願は、２００９年１１月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／２６３，３２７号の利益を主張する。米国特許法１１９条（ｅ）に従って、この先の出願は、すべての目的のために、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
分野
本発明の実施形態は、ワクチン組成物を生成するための方法、組成物および使用を報告する。いくつかの実施形態において、ポックスウイルスエレメントは、ウイルス構築物（例えば、ワクチンでの使用の構築物）において使用され得る。いくつかの実施形態において、ポックスウイルスエレメントは、分泌シグナルであり得る。特定の実施形態において、ワクチン調製物のための構築物を作製および使用するための方法であって、この方法としては、異なる生物に由来するペプチドを発現し得る弱毒化または改変されたワクシニアウイルスベクターを使用することが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、構築物は、インフルエンザに対するワクチン接種での使用のために生成され得る。さらに他の実施形態において、組成物および方法は、被験体にワクチンを投与する前に、上記被験体を構築物組成物に予め曝すことを本明細書中において報告する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ウイルス感染症に対して保護するためのワクチンは、ヒト疾患の発生を低減するために有効に使用されてきた。ウイルスワクチンについての最も成功した技術の１つは、弱められた、または弱毒化されたウイルスの株（「生の弱毒化されたウイルス」）で動物またはヒトを免疫することである。免疫処置後の限定された複製に起因して、上記弱毒化された株は、疾患を引き起こさない。しかし、上記限定されたウイルス複製は、ウイルス抗原の完全なレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を発現するのに十分であり、そのウイルスに対して効力があって長期にわたる免疫応答を生成する。従って、上記ウイルスの病原性株に対する引き続きの曝露の際に、免疫された個体は、疾患から保護される。これらの生の弱毒化されたウイルスワクチンは、公衆衛生において使用される最も成功したワクチンの中の１つである。
【０００４】
インフルエンザは、３つの属（Ａ型、Ｂ型、およびＣ型）を有するオルトミクソウイルスである。上記型は、核タンパク質の抗原性によって区別される。インフルエンザＢは、ヒトウイルスであり、動物保菌生体（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）において存在しないと思われる。Ａ型ウイルスは、ヒトおよび動物集団の両方において存在し、重要な鳥類およびブタの保菌生体を伴う。
【０００５】
年間のインフルエンザＡウイルス感染症は、ヒトの生命に関して重大な影響を及ぼし、世界中で毎年、５００，０００人から１，０００，０００人が死亡し、経済的影響が、感染している間の生産性の直接的および間接的な損失からもたらされる。さらにより大きな関心事は、集団内での急速および致命的な蔓延が可能であるウイルスの出現をもたらし得る、天然または操作された遺伝子変化を経るインフルエンザＡウイルスの能力である。
【０００６】
インフルエンザの歴史における最も劇的な事象のうちの１つは、１９１８年〜１９１９年のいわゆる「スペイン風邪」の世界的流行であった。１年未満に、２０００万人から４０００万人がインフルエンザで死亡し、見積もって世界人口の５分の１が感染した。米国軍は、第一次世界大戦の終わり近くに、このウイルスによって打ちのめされ、１９１８年から１９１９年の米国軍隊の死者の８０％がインフルエンザ感染症に起因した。そのウイルスが容易に伝染する、主として空気伝搬の病原体であること、そのウイルスが新規の形態へと遺伝子操作される潜在力が存在することに起因して、インフルエンザＡは、深刻なバイオディフェンスの関心事を代表する。
【０００７】
インフルエンザ、ポックスウイルス、または他の病原性もしくは非病原性ウイルスの、可能性のある世界的流行株の出現に対する、現在の公的および科学的関心事は、有効な予防的手段を必要としている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施形態は、新規のワクチン組成物を生成するための方法、組成物、および使用を報告する。いくつかの実施形態において、ポックスウイルスエレメントは、ワクチン構築物において使用され得る。他の実施形態において、ワクチンを受ける前にポックスウイルスエレメントを投与するための組成物および方法が、例えば、ポックスウイルスエレメントに予め曝すことからの干渉を回避するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ポックスウイルスエレメントは、分泌シグナルまたは他のポックスウイルスエレメントであり得る。特定の実施形態において、ワクチン調製物のための構築物を作製および使用するための方法であって、この方法としては、被験体において免疫応答を誘導するためのウイルス−細菌のペプチド、原生生物のペプチド、真菌類のペプチド、または哺乳動物のペプチドを発現する、弱毒化または改変されたワクシニアウイルスベクター使用することが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、構築物は、感染性疾患に対して保護するワクチンでの使用、または療法（例えば、がん、糖尿病、アルツハイマー病などに対する）として使用されるワクチンでの使用のために生成され得る。いくつかの実施形態は、被験体における医学的状態に対する治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）として、または予防薬として有用である。他の実施形態において、構築物は、ウイルス疾患に対するワクチン接種での使用のために生成され得る。さらなる実施形態において、構築物は、インフルエンザから保護するためのワクチンでの使用のために生成され得る。
【０００９】
本発明の実施形態は、一般に、免疫応答を刺激するためのペプチド（例えば、ポックスウイルス関連ペプチド、および非ポックスウイルスペプチド）を発現させるための方法、組成物、および使用に関する。いくつかの実施形態において、本明細書中で示されるウイルスペプチド処方物は、被験体のワクチン接種前、被験体のワクチン接種の間、および／または被験体のワクチン接種後に、上記被験体において免疫応答を高めるため、または上記被験体において以前から存在している免疫（例えば、以前のポックスウイルス曝露）を圧倒するために使用され得る。特定の実施形態は、病原体に曝されている、または曝される可能性のある被験体を処置または保護するために本発明の構築物を作製および使用することを報告する。これらの実施形態に従って、病原体としては、細菌病原体、ウイルス病原体、原生生物病原体、または真菌類病原体が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、病原体はインフルエンザウイルスであり得る。
【００１０】
本明細書中に開示される実施形態に従って、構築物としては、細菌関連遺伝子セグメント、ウイルス関連遺伝子セグメント、真菌類関連遺伝子セグメント、原生生物関連遺伝子セグメント（例えば、非ポックスウイルスペプチド）を発現する弱毒化または改変されたワクシニアウイルスベクターが挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、特定の方法および組成物は、構築物を有する組成物を作製および使用することを報告し、この構成物としては、被験体において、上記インフルエンザに対する免疫応答を誘導するための、インフルエンザ関連遺伝子セグメントを発現する弱毒化または改変されたワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。特定の組成物は、インフルエンザに由来し、ポックスウイルス関連エレメントに結合する、またはポックスウイルス関連エレメントと組み合わせられる、抗原またはペプチドを有する構築物を報告する。インフルエンザ遺伝子または遺伝子セグメントとしては、血球凝集素（ＨＡ遺伝子セグメント）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ遺伝子セグメント）、核タンパク質（ＮＰ遺伝子セグメント）、マトリックスタンパク質（Ｍ遺伝子セグメント）、ポリメラーゼ（Ｐ）、およびそれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態は、被験体において、ポックスウイルスおよび／またはインフルエンザウイルスへの曝露によって引き起こされる感染を低減または防ぐことが可能であるワクチン組成物を報告する。いくつかの実施形態は、１つまたはそれより多くのインフルエンザ遺伝子セグメントのフラグメント（例えば、フラグメントとしては、インフルエンザ遺伝子セグメントの、少なくとも６、または少なくとも８、または少なくとも１０、または少なくとも１５、または少なくとも２０などの連続したアミノ酸が挙げられ得る（上記遺伝子セグメントの全長まで））を使用することに関係する。
【００１１】
いくつかの局面において、ワクチン組成物としての使用の構築物は、分泌シグナル配列単独、または翻訳調節領域配列と組み合わせた分泌シグナル配列を含み得る。これらの実施形態に従って、上記分泌シグナル配列は、ポックスウイルス由来の１つまたはそれより多くのシグナル配列であり得る。他の実施形態において、上記分泌シグナル配列としては、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）リーダー配列、補因子リーダー配列、プレプロインスリンリーダー配列、インベルターゼリーダー配列、免疫グロブリンＡリーダー配列、オボアルブミンリーダー配列、およびＰ−グロブリンリーダー配列、または他のプロリーダー配列、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
特定の実施形態において、構築物で予めブースト（ｐｒｅ−ｂｏｏｓｔ）して、被験体において、引き続きのワクチン接種に対してより大きな免疫応答を誘導し得る。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルス由来の遺伝子配列は、被験体を予めブーストするために使用され得る。これらの実施形態に従って、予めブーストする構築物は、改変されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）を含み得る。これらの予めブーストするものが、任意の方法によって被験体へと投与され得ることが企図される。例えば、上記予めブーストするものは、筋肉内に、または皮内に、あるいは別の方法によって導入され得る。さらに、予めブーストするものは、被験体へと投与されて、その後、上記被験体は、病原体由来の、または上記被験体における免疫応答を高めるための状態に関連する、１つまたはそれより多くのエレメントを有する構築物を導入され得る。特定の例において、予めブーストするものは、ワクチン接種の６ヶ月またはそれより少ない月数前、または５ヶ月またはそれより少ない月数前、または４ヶ月またはそれより少ない月数前、または３ヶ月またはそれより少ない月数前、または１ヶ月またはそれより少ない月数前、または数週間前、またはワクチンを被験体へ投与する直前であり得る。投与レジメンは、感染症または状態に対して被験体にワクチン接種をすることに関連する、予めのブースト（ｐｒｅ−ｂｏｏｓｔ）、ブーストおよび後のブースト（ｐｏｓｔ−ｂｏｏｓｔ）について、当業者によって容易に決定され得る。
【００１３】
他の実施形態は、開示される組成物を作製または使用するためのキットに関係する。キットは、改変されたワクシニアウイルスベクターおよび１つまたはそれより多くの腸内細菌抗原を有する構築物を含み得ることが報告されている。
【００１４】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、特定の実施形態をさらに実証するために含まれる。いくつかの実施形態は、これらの図面のうちの１つまたはそれより多くを単独でまたは提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、参照することによって、より良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の種々の構築物をマウスに対して筋肉内（ＩＭ）または皮内（ＩＤ）へ導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおけるパラメーターの例示的なプロットを表す。Ａ）体重の減少、およびＢ）チャレンジ後４日目の肺におけるウイルスタイター。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の種々の構築物をマウスに対して筋肉内（ＩＭ）または皮内（ＩＤ）へ導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおけるパラメーターの例示的なプロットを表す。Ａ）体重の減少、およびＢ）チャレンジ後４日目の肺におけるウイルスタイター。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、マウスが種々のインフルエンザチャレンジ濃度で皮内（ＩＤ）にワクチン接種され、次にワクチン接種後６３日目に検査された、実験の例示的なプロットを表す。体重減少曲線は、構築物のいくつかについて表される。Ａ）ＭＶＡ／ＩＲＥＳ／ｔＰＡ／ＨＡ、Ｂ）ＭＶＡ／ＩＲＥＳ／Ｃ１３Ｌ／ＨＡ、およびＣ）ＭＶＡ／ＨＡネイティブ。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、マウスが種々のインフルエンザチャレンジ濃度で皮内（ＩＤ）にワクチン接種され、次にワクチン接種後６３日目に検査された、実験の例示的なプロットを表す。体重減少曲線は、構築物のいくつかについて表される。Ａ）ＭＶＡ／ＩＲＥＳ／ｔＰＡ／ＨＡ、Ｂ）ＭＶＡ／ＩＲＥＳ／Ｃ１３Ｌ／ＨＡ、およびＣ）ＭＶＡ／ＨＡネイティブ。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、マウスが種々のインフルエンザチャレンジ濃度で皮内（ＩＤ）にワクチン接種され、次にワクチン接種後６３日目に検査された、実験の例示的なプロットを表す。体重減少曲線は、構築物のいくつかについて表される。Ａ）ＭＶＡ／ＩＲＥＳ／ｔＰＡ／ＨＡ、Ｂ）ＭＶＡ／ＩＲＥＳ／Ｃ１３Ｌ／ＨＡ、およびＣ）ＭＶＡ／ＨＡネイティブ。
【図３】図３は、ウイルス性障害（ｖｉｒａｌ  ｉｎｓｕｌｔ）に対するマウスにおける長期にわたる免疫保護についての種々の構築物および作用を説明する例示的なプロットを表す。
【図４】図４は、種々のウイルス由来抗原を用いて交差クレード保護（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｄｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を説明する例示的なプロットを表す。
【図５】図５は、本明細書中に記載される特定の構築物で試験したマウスに、続いてウイルスチャレンジした、上記マウスの例示的なプロットを表す。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の種々の構築物をマウスに対して筋肉内（ＩＭ）へ導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおけるパラメーターの例示的なプロットを表す。Ａ）体重の減少、およびＢ）チャレンジ後の生存率。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の種々の構築物をマウスに対して皮内（ＩＤ）へ導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおけるパラメーターの例示的なプロットを表す。Ａ）体重の減少、およびＢ）チャレンジ後の生存率。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の種々の構築物をマウスに対して（Ａ）筋肉内（ＩＭ）または（Ｂ）皮内（ＩＤ）へ導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおけるパラメーターの例示的なプロットを表す。
【図９】図９は、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の種々の構築物をマウスに対して導入後、インフルエンザでチャレンジした後の肺におけるウイルスタイターを説明する例示的なプロットを表す。
【００１６】
【図９−１】図９−１は、表１であり、表１は、ＭＶＡインフルエンザトランスファーベクター、および構築物を表す。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物（各構築物においてＨＡ遺伝子セグメントを有する）を導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける体重変化（％）の例示的なプロットを表す。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物を導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける体重変化（％）の例示的なプロットを表す。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物を種々の濃度で導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける体重変化（％）の例示的なプロットを表す。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物を種々の濃度で導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける生存率の例示的なプロットを表す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物を種々の濃度で導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける生存率の例示的なプロットを表す。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物を種々の濃度で導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける生存率の例示的なプロットを表す（ｄｐｉは、感染後の日数を表す）。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物を種々の濃度で導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける臨床スコア（例えば、物理的および生理学的パラメーター）の例示的なプロットを表す。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物を種々の濃度で導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける臨床スコア（例えば、物理的および生理学的パラメーター）の例示的なプロットを表す。
【図１８】図１８は、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の構築物を種々の濃度で導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける臨床スコア（例えば、物理的および生理学的パラメーター）の例示的なプロットを表す。
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂは、ワクシニアに予め曝されたマウスにおいて、異なった構築物の導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける体重変化（％）（Ａ）および評価された臨床スコア（Ｂ）の例示的なプロットを表す。
【図２０】図２０は、図１９Ａおよび１９Ｂにおけるものと同じ構築物に対する曝露後に、上でチャレンジされたマウスの生存率の例示的なプロットを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本明細書中で使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」は、項目の１つまたは１つよりも多くを意味し得る。
【００１８】
本明細書中で使用されるとき、「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」または「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」としては、哺乳動物、例えば、ヒトまたは飼い慣らされた、または野生の、哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、他の家庭用ペット（例えば、ハムスター、モルモット、マウス、ラット）、フェレット、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、プレーリードッグ、野生のげっ歯類、または動物園の動物が挙げられ得るが、これらに限定されない。被験体は、成人または子供であり得る。
【００１９】
本明細書中で使用されるとき、「約」は、＋１０％または−１０％を意味し得る。
【００２０】
本明細書中で使用されるとき、「弱毒化されたウイルス」は、被験体（例えば、哺乳動物（例えば、ヒトまたは動物））へ投与されるときに疾患の医学的徴候の低減または疾患の医学的徴候がないことを実証するウイルスを意味し得る。
【００２１】
本明細書中で使用されるとき、「ＭＳＣ」は、複数のクローニング部位を意味し得る。
【００２２】
本明細書中で使用されるとき、「ｄＳＰ」は、多様なワクシニアプロモーターを意味し得る。
【００２３】
本明細書中で使用されるとき、「ＭＶＡ」は、改変されたワクシニアアンカラを意味し得る。
【００２４】
本明細書中で使用されるとき、「ＥＭＣＶ」は、脳心筋炎ウイルスを意味し得る。
【００２５】
本明細書中で使用されるとき、「ＩＲＥＳ」は、脳心筋炎ウイルスまたは他のウイルス由来の内部リボソーム進入部位を意味し得る。
【００２６】
本明細書中で使用されるとき、「ＩＲＥＳ（Ａ７）」は、分岐ループ（ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ  ｌｏｏｐ）において７つのアデノシン残基を有する脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳを意味し得る；供給源−ｐＣＩＴＥ−１。
【００２７】
本明細書中で使用されるとき、「ＩＲＥＳ（Ａ６）」は、分岐ループにおいて６つのアデノシン残基を有するように変異した脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳを意味し得る。
【００２８】
本明細書中で使用されるとき、「ｐＤＩＩＩｇｆｐ」は、ＭＶＡ  ｄｅｌ  ＩＩＩ  ｇｆｐマーカーのトランスファープラスミドを意味し得る。
【００２９】
本明細書中で使用されるとき、「ｐＩ＊」は、トランスファーベクタープラスミドを意味し得る。
【００３０】
本明細書中で使用されるとき、「ｔＰＡ」は、組織プラミノゲン（ｐｌａｍｉｎｏｇｅｎ）活性化因子由来の分泌シグナルを意味し得る。
【００３１】
本明細書中で使用されるとき、「ｓｅ／ｌ」は、合成の最適化された初期後期ポックスウイルスプロモーターを意味し得る。
【００３２】
本明細書中で使用されるとき、「Ｈ６」は、ワクシニア遺伝子Ｈ６初期／後期ネイティブポックスウイルスプロモーターを意味し得る。
【００３３】
本明細書中で使用されるとき、「ｄｅｌ  ＩＩＩ」は、改変されたワクシニアアンカラ欠失領域ＩＩＩを意味し得る。
【００３４】
本明細書中で使用されるとき、「ＧＦＰ」は、強化された緑色蛍光タンパク質を意味し得る。
【００３５】
本明細書中で使用されるとき、「ＣＥＦ」は、ニワトリ胚線維芽細胞を意味し得る。
【００３６】
本明細書中で使用されるとき、「ＲＣＮ」は、アライグマのポックスウイルスを意味し得る。
【００３７】
説明
以下のセクションにおいて、種々の例示的な組成物および方法が、種々の実施形態を詳述するために記載される。種々の実施形態を実施することは、本明細書中で概説される詳細の全てまたはいくつかさえを用いることを必要としないが、むしろ濃度、回数、および他の詳細が、ごく普通の実験法を通して改変され得るということは、当業者に明らかである。いくつかの場合において、周知の方法または構成要素は、本説明において含まれていない。
【００３８】
本発明の実施形態は、新規のワクチン組成物を生成するための方法、組成物、および使用に関係する。いくつかの実施形態において、ポックスウイルスエレメントは、被験体へ導入するためのワクチン構築物、または前免疫（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）構築物において使用され得る。特定の実施形態において、ポックスウイルスエレメントは、ワクチンを受ける前に被験体を前免疫するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ポックスウイルスエレメントは、分泌シグナルまたは他のポックスウイルスエレメントであり得る。他の実施形態は、構築物を作製および使用するための方法に関係し、この構築物としては、ウイルス由来のペプチド、細菌由来のペプチド、原生生物由来のペプチド、真菌類由来のペプチド、または哺乳動物由来のペプチドを発現する弱毒化または改変されたワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、構築物は、被験体において免疫応答を高めるために、感染性疾患に対して保護するワクチンでの使用、または療法（例えば、がん、糖尿病、アルツハイマー病などに対する）として使用されるワクチンでの使用のために生成され得る。いくつかの実施形態は、被験体における医学的状態に対する治療薬として、または予防薬として有用である。他の実施形態において、構築物は、ウイルス疾患に対するワクチン接種での使用のために生成され得る。さらなる実施形態において、構築物は、病原体から保護するためのワクチンでの使用のために生成され得る。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、インフルエンザ感染症に対して保護するため、および／またはインフルエンザ感染症に曝された被験体もしくはインフルエンザ感染症を有する被験体を処置するための構築物に関係する。
【００３９】
インフルエンザウイルス
インフルエンザは、オルトミクソウイルスである。インフルエンザの３つの属（Ａ型、Ｂ型、およびＣ型）が、現在、存在する。Ａ型およびＢ型は、最も臨床的に重要であり、中度から重度の呼吸器疾患を引き起こす。Ａ型ウイルスは、ヒトおよび動物集団の両方において存在し、重要な鳥類およびブタの保菌生体を伴う。比較的非一般的だが、非ヒトインフルエンザＡ株が、それらの天然宿主から飛んでヒトに感染することは可能である。１つの具体的な例において、ヒトにおける１９９７年の非常に致命的な香港でのトリインフルエンザの大流行は、当時の地方の家禽集団における流行であったインフルエンザＡ  Ｈ５Ｎ１ウイルスに起因した。この場合において、上記ウイルスは、感染していることを示した１８人の患者のうち６人を死亡させた。
【００４０】
年間の季節性の、インフルエンザＡウイルス感染症またはインフルエンザＢウイルス感染症は、毎年世界中で５００，０００人〜１，０００，０００人の死亡、および感染している間の生産性の直接的および間接的な損失からもたらされる経済的影響の両方に関して人類に重大な影響を及ぼす。
【００４１】
２００９年にインフルエンザの世界的流行が勃発した。米国における患者から単離されたウイルスは、４つの異なるインフルエンザウイルス（北米メキシコインフルエンザウイルス、北米トリインフルエンザウイルス、ヒトインフルエンザウイルス、および代表的にアジアおよびヨーロッパにおいて見出されるブタインフルエンザウイルス）由来の遺伝子エレメントからできていることが見出された。この新しい株は、サブタイプＨ１Ｎ１の４つの異なる株の全てにおける、ヒトインフルエンザウイルスおよびブタインフルエンザウイルスの再分類の結果であると思われる。
【００４２】
特定の実施形態において、ウイルスとしては、インフルエンザウイルス感染（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、例えば、インフルエンザＡ型、Ｂ型、もしくはＣ型、またはそれらのサブタイプもしくは株が挙げられ得る。いくつかの実施形態は、インフルエンザＡのＨ１Ｎ１サブタイプまたはブタ起源のＨ１Ｎ１および株を含むが、これらに限定されない。他のインフルエンザＡウイルスとしては、１９５７年にアジア風邪を引き起こしたＨ２Ｎ２；１９６８年に香港風邪を引き起こしたＨ３Ｎ２；現在の世界的流行の脅威であるＨ５Ｎ１；異常な人獣共通感染能を有するＨ７Ｎ７；ヒトおよび豚における風土病性のＨ１Ｎ２；Ｈ９Ｎ２；Ｈ７Ｎ２；Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、またはそれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００４３】
インフルエンザＡおよびＢは、ネガティブセンスｓｓＲＮＡの８つのセグメントをそれぞれ含む。Ａ型ウイルスはまた、２つのウイルス表面糖タンパク質、血球凝集素（ＨＡ）、およびノイラミニダーゼ（Ｎ）に基づいて、抗原性サブタイプに分割され得る。現在、１５個の同定されたＨＡサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１５と指定された）、および９個のＮＡサブタイプ（Ｎ１〜Ｎ９）が存在し、これらの全ては、野生の水生の鳥において見出され得る。本発明の実施形態は、当該分野において公知である任意のインフルエンザ遺伝子セグメントサブタイプのうちの１つまたはそれより多くを有する構築物を含み得る。ＨＡとＮＡの、可能性のある（例えば、１３５を超える）全ての組み合わせのうち、４つ（Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、およびＨ３Ｎ２）は、上記ウイルスが１９３３年に初めて単離されて以来、ヒト集団において、広範に循環している。ヒト集団において現在循環しているインフルエンザＡのより一般的なサブタイプのうちの２つは、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１である。
【００４４】
新しい型のインフルエンザＡ株は、そのウイルスの表面上の抗原部位のわずかな変化をもたらし得る遺伝的浮動に部分的に起因して現れる。このシフトは、ヒト集団が、毎年インフルエンザ感染症の流行を経験することをもたらし得る。より劇的な遺伝子変化は、抗原シフト（ＨＡおよび／またはＮＡのサブタイプにおける変化）をもたらし得、感受性集団において急速に蔓延させることが可能である新しいサブタイプをもたらす。
【００４５】
サブタイプは、抗原の挙動に関して、それらを非交差反応性にするには十分異なっており、１つのサブタイプ（例えば、Ｈ１Ｎ１）での以前の感染は、別のもの（例えば、Ｈ３Ｎ２）に対して、免疫をもたらさないことがある。特定の場合において、新規のサブタイプは、免疫学的にナイーブな集団中に蔓延するので、この交差反応性の欠如により、それが世界的流行になるのが可能になる。
【００４６】
比較的非一般的だが、非ヒトインフルエンザＡ株が、それらの「天然」保菌生体からヒトへ移動することは可能である。１つの例において、ヒトにおける１９９７年の非常に致命的な香港でのトリインフルエンザの大流行は、当時の地方の家禽集団における流行であったインフルエンザＡ  Ｈ５Ｎ１ウイルスに起因した。このウイルスは、汚染されたニワトリから他の宿主（例えば、ヒト）へ移動した。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態は、ワクチン組成物を報告し、このワクチン組成物は、ポックスウイルス、および１つまたはそれより多くの非ポックスウイルスペプチドに結合する１つまたはそれより多くのポックスウイルス分泌シグナルを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ワクチン組成物は、１つまたはそれより多くの非ポックスウイルスペプチドに結合する１つまたはそれより多くの分泌ポックスウイルス分泌シグナルに関連する改変または弱毒化されたポックスウイルスを含み得る。他の実施形態において、組換えの改変されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターは、１つまたはそれより多くの非ポックスウイルスペプチドに結合する１つまたはそれより多くのポックスウイルス分泌シグナルに関連した。他の実施形態において、ワクチン組成物は、１つまたはそれより多くのインフルエンザ関連ペプチドに関連する組換えの改変されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターであって、ここで上記１つまたはそれより多くのインフルエンザ関連ペプチドのうちの少なくとも１つが、ポックスウイルス分泌シグナルに結合する、組換えの改変されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含み得る。例えば、ワクチン組成物は、インフルエンザウイルス構成要素を発現する組換えの改変されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含み得る。このワクチン組成物に従って、１つまたはそれより多くのインフルエンザ関連抗原を発現するＭＶＡ構築物は、被験体にインフルエンザに対するワクチン接種をする使用のために生成され得る（例えば、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ、Ｐなど）。ワクチン構築物は、より保存された、または高度に保存された、インフルエンザ遺伝子領域、すなわちインフルエンザ関連ペプチド単独、またはより変異するインフルエンザ関連ペプチドと組み合わせて、含み得ることが企図される。あるいは、本明細書中で企図されるワクチン構築物は、内部インフルエンザ遺伝子領域（例えば、Ｍ）または外部に（例えば、ＨＡ）曝された遺伝子領域の、ペプチドまたはそのセグメント全体を含み得る。
【００４８】
特定の実施形態において、インフルエンザウイルスは、インフルエンザＡ  Ｈ３Ｎ２、インフルエンザＡ  Ｈ１Ｎ１、インフルエンザＡ  Ｈ１Ｎ１（ブタ起源）、トリインフルエンザＡ  Ｈ５Ｎ１、およびインフルエンザＢからなる群から選択される。
【００４９】
本発明の特定の実施形態は、ポックスウイルスに対して指向する構築物を有する組成物を報告する。例えば、ワクチン組成物は、ポックスウイルスまたはインフルエンザウイルスに関連する状態を防ぐこと、または上記状態の発生の低減に関し得る。
【００５０】
ポックスウイルス科
ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科のメンバー）は、科として、脊椎動物および無脊椎動物の両方に感染し得るウイルスである。ヒトに感染し得るポックスウイルスの４つの公知の属が存在する：オルトポックス、パラポックス、ヤタポックス、モルシポックス。オルトポックスとしては、痘瘡（ｖａｒｉｏｌａ）ウイルス、ワクシニアウイルス、ウシポックスウイルス、サルポックスウイルス、および痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）が挙げられるが、これらに限定されない。パラポックスとしては、オルフウイルス、偽ウシポックス（ｐｓｅｕｄｏｃｏｗｐｏｘ）、ウシ丘疹性口内炎ウイルス；ヤタポックス：タナポックスウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。モルシポックスとしては、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）が挙げられるが、これに限定されない。より一般的なポックスウイルス（ｏｉｘｖｉｒｕｓ）は、ワクシニアおよび伝染性軟属腫であるが、サルポックス感染が上昇中のようである。
【００５１】
ポックスウイルス科、ワクシニアウイルスは、痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）ウイルスに対するワクチン接種のため首尾よく使用されている。ワクシニアウイルスはまた、外来のタンパク質発現のための有効な道具として使用されて、宿主の強い免疫応答を引き出す。ワクシニアウイルスは、主に細胞融合によって細胞に入るが、受容体は、現在、知られていない。ウイルスは、ウイルスのＲＮＡポリメラーゼおよび関連する転写因子によって転写される遺伝子の３つのクラス（早期、中間期、および後期）を含む。ポックスウイルによって引き起こされる疾患は、約何百年間も知られている。
【００５２】
オルトポックスウイルス
本発明の特定の実施形態は、ワクチン組成物において、改変または弱毒化された、オルトポックスウイルスまたはオルトポックスウイルス関連遺伝子エレメントまたはペプチドを使用することを含み得る。オルトポックスウイルスは、哺乳動物から単離された多くの病原体（ａｇｅｎｔ）を含むポックスウイルス科の属であり、ワクシニア、サルポックス、ウシポックス、ラクダポックス、アザラシポックスウイルス、スイギュウポックスウイルス、アライグマポックスウイルス、スカンクポックスウイルス、ハタネズミポックスウイルス、およびエクトロメリアウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ポックスウイルス科のメンバーは、大きな線状二本鎖ＤＮＡを有し、ゲノムサイズは、１３０ｋｂｐ〜３００ｋｂｐに範囲が及ぶ。上記属のメンバーのうちの１つは、痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）を引き起こす痘瘡（ｖａｒｉｏｌａ）ウイルスである。痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）は、ワクチンとして、別のオルトポックスウイルスである上記ワクシニアウイルスを用いて以前に根絶された。
【００５３】
改変されたワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）
本発明におけるいくつかの実施形態は、予め決定されたまたは予め構築された、遺伝子または遺伝子セグメントを発現することが可能である弱毒化ポックスウイルスに由来する組換えのワクシニアウイルスを使用する組成物および方法を報告する。当業者は、他の弱毒化ポックスウイルスは、細胞培養における連続継代によって、またはポックスウイルス遺伝子の故意の欠失によって生成され得ることを認識する。特定の実施形態において、予め決定された遺伝子は、ＭＶＡゲノムにおける天然に存在する欠失部位に挿入され得る。他の実施形態において、組換えのＭＶＡウイルスは、例えば、ワクチン組成物を投与された被験体において免疫応答を誘導することが可能である、上記ワクチン組成物に使用する、ポリペプチド（例えば、抗原）の生産のため、または抗原をコードするために使用され得る。
【００５４】
特定の実施形態において、改変または弱毒化されたポックスウイルス（例えば、改変されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、ＮＹＶＡＣ、ＬＣ１６ｍ８、またはＣＶＩ−７８）は、予めのブースト、ブーストまたは後のブーストのワクチン接種のための送達システムとして、被験体における病原体に対する免疫を誘導するために、上記被験体（例えば、哺乳動物（例えば、ヒト））において使用され得る。以前に、ＭＶＡは、１２０，０００人を超える個体に投与され、痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）に対する安全で有効なワクチンであることが証明された。特定の実施形態において、組換えのＭＶＡワクチン候補は、抗原またはペプチドが由来するウイルス、細菌、寄生虫、または腫瘍によって引き起こされる疾患に対する保護の体液性免疫および細胞性免疫を誘導することが示されている。ＭＶＡを適切なベクターとする追加の特徴としては、異なる経路によって投与されるときに保護の免疫応答を誘導する能力、および遺伝子安定特性および物理的安定特性が挙げられる。
【００５５】
翻訳調節配列
いくつかの実施形態は、必要に応じて、エンハンサー、例えば、翻訳調節配列を含み得る。特定の実施形態において、翻訳調節配列としては、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（例えば、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ）が挙げられ得る。ウイルスのＩＲＥＳは、４つの群に分類される：群１（コオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）、チャバネアオカメムシ腸管ウイルス（ＰＳＩＶ）、およびタウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ））；群２（Ｃ型肝炎ウイルス、（ＨＣＶ）、古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、およびブタテッショウウイルス１（ＰＴＶ−１））；群３（脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、およびタイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ））；ならびに群４（ポリオウイルス（ＰＶ）およびライノウイルス（ＲＶ））。他の実施形態において、ウイルスのコード配列に対して５’側に見出されるウイルスの非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳を指揮するために使用され得る。当該分野において公知のウイルス構築物での使用のあらゆる翻訳調節配列が企図される。
【００５６】
分泌シグナル
あるいは、本発明の実施形態は、他のエレメントと組み合わせた１つまたはそれより多くのポックスウイルス分泌シグナル配列を有する構築物を含み得る。翻訳調節配列および／またはポックスウイルス分泌シグナルは、特定のワクチン構築物の効力を増加させることが実証された。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される構築物の１つまたはそれより多くのポックスウイルス分泌シグナル配列としては、ポックスウイルス遺伝子Ｃ１３Ｌ（推定）、Ｂ８Ｒ（可溶性インターフェロンγ受容体）、Ｂ１９Ｒ（インターフェロンａ／ｂ受容体）、Ａ３９Ｒ（セマホリング（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｇ））、Ｍ２Ｌ（推定）、Ｃ１３Ｌ（推定）、Ｃ１９Ｌにおける分泌シグナル配列、または当該分野において公知である他の分泌シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に開示される構築物は、１つまたはそれより多くの分泌シグナル配列を含み得る。
【００５７】
いくつかの実施形態において、タンパク質が発現されるように構築物を設計するとき、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を、その発現されたタンパク質が分泌されることが望まれる最初の核酸領域へと、例えば、切断可能な形態で、組み込むことが必要であり得る。本発明の実施形態を、任意の１つの理論または作用様式に限定することなく、シグナル配列は、分泌されるかまたは膜結合となるかのいずれかの運命にあるタンパク質に存在する、ペプチドであり得る。これらのシグナル配列は、上記タンパク質のＮ末端で見出され得、一般にタンパク質の成熟形態から切断される。上記シグナル配列は、一般に、そのシグナル認識粒子と相互作用し、リボソームを、翻訳に伴った挿入が行われる小胞体へと向ける。上記シグナル配列が切断可能であるところは、一般に、例えば、シグナルペプチダーゼによって除去される。利用されるべきシグナル配列の選択は、特定の状況の必要性に依存し得、当業者によって決定され得る。本明細書中に提供される例示の文脈において、その点で限定されることはないが、ｔＰＡ、Ｃ１３ＬまたはＢ８Ｒ由来のポックスウイルスシグナル配列が、目的のペプチド、タンパク質、または構築物の分泌を容易にするために使用され得る。膜タンパク質が所望される場合、上記タンパク質のアミノ末端における５’側の切断可能なシグナル配列、および上記タンパク質の３’（カルボキシ）末端における切断可能ではない膜アンカーの両方が必要とされ得る。これらは、ベクター内で提供され得るか、または片方もしくは両方が目的のタンパク質のＤＮＡによってコードされ得た。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態は、１つまたはそれより多くの構築物を含む組成物を含むが、これらに限定されない。構築物は、細胞質により保持されるタンパク質、分泌されるタンパク質、または膜結合であるタンパク質を生産するように設計され得る。目的のタンパク質がどのような形態をとる必要があり得るかを決定することは、上記タンパク質の機能的必要性に依存し得る。例えば、目的のタンパク質が細胞表面にアンカーされて発現することにより、特にそのタンパク質が接着細胞型の膜上に発現される場合には、目的のタンパク質またはペプチドと相互作用する分子（例えば、抗体、アンタゴニスト、アゴニストなど）についてスクリーニングするのに都合のよい手法が提供され得る。さらに、タンパク質のさらなる膜アンカー形態は、被験体への投与に、例えば、上記タンパク質に対するモノクローナル抗体を生成するのに、適している場合がある。これは、正しく折りたたまれ、適切な翻訳後修飾（例えば、グリコシレーションおよびジスルフィド結合形成）を有する可能性のある上記タンパクの都合のよい供給源を提供する宿主細胞に起因し得る。さらに、宿主細胞は、特に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）において、アジュバント特性（例えば、レシピエント被験体との抗原の違い）を提供し得る。
【００５９】
あるいは、分泌されたタンパク質は、タンパク質が収集および精製されるべきである場合に適切であり得る。シグナル配列をコードする核酸分子は、当業者によってごく普通の手順として決定され得る、上記構築物における任意の適切な場所に位置させ得る。いくつかの実施形態において、シグナル配列は、目的のペプチド、タンパク質、または構築物をコードする核酸配列に対してすぐ５’側に位置付けされ得る（目的のタンパク質とのすぐ隣接する融合物として発現され得るように）が、シグナル配列の発現がプロモーターの調節下に置かれるように、そのプロモーターに対して３’側に位置させ得る。シグナル配列をコードする核酸配列は、構築物の最初の核酸領域の部分を形成し得る。
【００６０】
開示される構築物およびワクチン組成物が、状態（例えば、糖尿病、アルツハイマー、およびがん）または他の状態に対する療法として使用され得ることが本明細書中で企図される。構築物は、特定の状態（例えば、がん、糖尿病、アルツハイマー病などに対する）に対して保護する、または上記状態に対する療法としての、ワクチンでの使用のために生成され得る。さらに、本明細書中に記載されるワクチン組成物、および予めブーストする組成物は、被験体において、彼らの免疫系を高めるために使用され得る。
【００６１】
腫瘍マーカー
腫瘍マーカーおよび関連する腫瘍ペプチドは、本明細書中に記載される構築物において使用するために企図される。腫瘍に関連する腫瘍マーカーおよびペプチド（例えば、非ポックスウイルスペプチド）は、被験体において、がんを処置、または防ぐためのワクチンを開発するために本明細書中に記載されるエレメントと組み合わせて使用され得る。いくつかの腫瘍マーカーとしては、以下が挙げれるが、これらに限定されない：７０７−ＡＰ＝７０７アラニンプロリン  ＡＦＰ＝アルファ（α）−フェトプロテイン、ＡＲＴ−４＝Ｔ細胞４によって認識される腺癌抗原、ＢＡＧＥ＝Ｂ抗原；ｂ−カテニン／ｍ、β−カテニン／変異した、Ｂｃｒ−ａｂｌ＝切断点クラスター領域−Ａｂｅｌｓｏｎ、ＣＡＭＥＬ＝黒色腫におけるＣＴＬ−認識抗原、ＣＡＰ−１＝癌胎児抗原ペプチド−１、ＣＡＳＰ−８＝カスパーゼ−８、ＣＤＣ２７ｍ＝細胞分裂サイクル、２７（変異した）、ＣＤＫ４／ｍ＝変異したサイクリン依存キナーゼ４、ＣＥＡ＝癌胎児抗原、ＣＴ＝がん／睾丸（抗原）、Ｃｙｐ−Ｂ＝シクロフィリンＢ、ＤＡＭ＝分化抗原黒色腫（ＤＡＭ−６およびＤＡＭ−１０のエピトープは同等であるが、その遺伝子配列は異なる、ＤＡＭ−６およびＤＡＭ−１０、ＥＬＦ２Ｍ＝変異した延長因子２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１＝Ｅｔｓ、バリアント遺伝子６／急性骨髄性白血病１遺伝子ＥＴＳ、Ｇ２５０＝糖タンパク質２５０  ＧＡＧＥ＝Ｇ抗原、ＧｎＴ−Ｖ＝Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ、Ｇｐ１００＝糖タンパク質１００ｋＤ、ＨＡＧＥ＝ヘリカーゼ（ｈｅｌｉｃｏｓｅ）抗原、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ＝ヒト表皮受容体−２／神経学的、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ＝ＨＬＡ−Ａ２遺伝子におけるα２−ドメインのα−へリックスの残基１７０での、アルギニン（Ｒ）からイソロイシン（Ｉ）への交換、ＨＰＶ−Ｅ７＝ヒト乳頭腫ウイルスＥ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ＝変異した熱ショックタンパク質７０−２、ＨＳＴ−２＝ヒト環状体腫瘍−２、ｈＴＥＲＴまたはｈＴＲＴ＝ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ｉＣＥ＝腸カルボキシル（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｒｂｏｘｙｌ）、ステラーゼ（ｓｔｅｒａｓｅ）、ＫＩＡＡ０２０５＝データベースに現れるときの遺伝子の名称、ＬＡＧＥ＝Ｌ抗原、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ＝低密度脂質受容体／ＧＤＰ−Ｌ−フコース：β−Ｄ−ガラクトシダーゼ２−α−Ｌフコシルトランスフェラーゼ、ＭＡＧＥ＝黒色腫抗原、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ＝黒色腫、Ｔ細胞−１によって認識される抗原／黒色腫抗原Ａ、ＭＣ１Ｒ＝メラノコルチン１受容体、Ｍｙｏｓｉｎ／ｍ＝変異したミオシン、ＭＵＣ１＝ムチン、ＭＵＭ−１、−２、−３＝黒色腫、偏在性の変異した１、２、３  ＮＡ８８−Ａ＝患者Ｍ８８のＮＡ  ｃＤＮＡクローン、ＮＹ−ＥＳＯ−１＝ニューヨーク−食道１、Ｐ１５＝タンパク質１５、ｐ１９０小ｂｃｒ−ａｂｌ＝１９０ＫＤのタンパク質、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ＝前骨髄球性白血病／レチノイン酸受容体α、ＰＲＡＭＥ＝黒色腫の優先的に発現される抗原、ＰＳＡ＝前立腺特異的抗原、ＰＳＭ＝前立腺特異的膜抗原、ＲＡＧＥ＝腎臓抗原、ＲＵ１またはＲＵ２＝腎臓の、偏在性１または２、ＳＡＧＥ＝肉腫抗原、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３＝扁平（ｓｑｕａｍｏｕｓ）抗原、腫瘍拒絶１または３、ＴＥＬ／ＡＭＬ１＝トランスロケーションＥｔｓ−ファミリー白血病／急性骨髄性、白血病１、ＴＰＩ／ｍ＝変異したトリオースホスフェートイソメラーゼ、ＴＲＰ−１＝チロシナーゼ関連、タンパク質１、またはｇｐ７５、ＴＲＰ−２＝チロシナーゼ関連タンパク質２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２＝ＴＲＰ−２／イントロン、ＷＴ１＝ウィルムス腫瘍遺伝子、および当該分野において公知である任意の他の腫瘍抗原。特定の実施形態において、ＭＶＡ構築物を有する予めのブーストは、単独で、または腫瘍抗原由来のペプチドを有するワクチンを、それを必要としている被験体に投与する前に使用され得る。
【００６２】
抗微生物ペプチドは、本明細書中に開示される構築物での使用を企図される。抗微生物ペプチドは、記載される構築物において発現され得、感染を処置または防ぐために、単独で、または被験体が前免疫ブーストを投与された後に使用され得る。
【００６３】
選択マーカー
特定の実施形態において、追加の選択マーカーが使用され得、例えば、多様な手法（例えば、目的の分子の精製）でのベクターの使用を容易にするために、例えば、設計され得る任意の数の選択マーカーを挿入し得る。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合システムは、目的の構築物、タンパク質、またはペプチドを収集する都合のよい手段を提供する。任意の１つの理論または作用様式に限定することなく、ＧＳＴ−融合タンパク質は、グルタチオンアガロースビーズを用いて、ＧＳＴタグによって精製され得る。本発明の実施形態は、分泌可能なＧＳＴ−分子融合物をコードする構築物にまで広がることが理解されるべきである。これは、例えば、切断可能なＧＳＴに融合する切断可能なシグナル配列をコードし、次に上記ＧＳＴが目的の分子に融合するような最初の核酸領域の配列を設計することによって達成され得る。別の例において、融合タグが使用され得る。これらの実施形態に従って、融合タグは、プロテインＡ（分泌された産物の精製を可能にする）の３６０ｂｐとβ−ラクタマーゼ（単純な色の反応によって上清の試験を可能にする細菌の酵素）との間であり得る。β−ラクタマーゼは、目的の分子についてのアッセイの非存在下で、目的の分子についてのアッセイの選択を容易にする。プロテインＡ／β−ラクタマーゼ融合物は、切断を容易にするために、切断部位によって目的の分子から分離され得、その結果、分子が精製された後、上記タグは、容易に除去され得る。
【００６４】
本明細書中で開示される実施形態のために使用する、目的の分子または構築物の精製を容易にするために含まれ得た他の融合タグとしては、ブドウ球菌プロテインＡ、ブドウ球菌プロテインＧ、ヘキサヒスチジン、カルモジュリン結合ペプチドおよびマルトース結合タンパク質（例えば、後者はまた、目的の分子の正しい折りたたみを確実にするのを助けるのに有用である）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに別の選択可能なマーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子が挙げられ得る。他の実施形態は、抗生物質耐性遺伝子を含み得る。これらの遺伝子は、上記選択マーカーまたはＨＡＴベースの選択可能なバイシストロニックベクターが使用され得るように、バイシストロニックベクターの状況において、以前に利用されている。
【００６５】
電気泳動
電気泳動は、分子のサイズおよび電荷に基づいて、分子（例えば、タンパク質または核酸のような大分子）を分離するために使用され得る。当該分野において公知である電気泳動の多くのバリエーションが存在する。溶液であって、それを通って上記分子が移動する、溶液は、自由（ｆｒｅｅ）であり得、通常毛管内にあり、または、それはマトリックスに包埋され得る。一般的なマトリックスとしては、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、および濾紙が挙げられる。
【００６６】
タンパク質、ペプチド、および／または抗体もしくはその抗体フラグメントは、部分的に検出され得るか、または完全に精製され得るか、または当該分野において公知である任意の手段によって分析され得る。特定の実施形態において、分子を分離および分析するための方法は使用され得る（例えば、ゲル電気泳動、および溶出クロマトグラフィーもしくはカラムクロマトグラフィー、または他の分離／精製方法）。
【００６７】
抗体または抗体フラグメントのレベルを検出、分析および／または測定するための当該分野において公知である任意の方法は、本明細書中に報告される実施形態において、使用され得る。例えば、抗体または抗体フラグメントについてのアッセイとしては、ＥＬＩＳＡアッセイ、化学発光アッセイ、フローサイトメトリー、電気溶出、および当該分野において公知である他の技術が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６８】
画像化薬剤および放射性同位体
特定の実施形態において、本特許請求の範囲のタンパク質またはペプチドは、基質と接触する際に蛍光産物、発光産物、または着色した産物を生成する、二次結合リガンドに、または酵素（酵素タグ）に連結され得る。適切な酵素の例としては、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（ホースラディシュ）水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ）ペルオキシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼが挙げられる。このような標識の使用および同定は、当業者に周知である。
【００６９】
他の実施形態において、ペプチド、抗原、構築物、抗体、または抗体フラグメントを検出することが可能である標識または分子としては、アプタマーを使用することが挙げられ得る。アプタマーを作製および使用するための方法は、当該分野において周知であり、これらの方法および使用は、本明細書中に企図される。さらに、アプタマーは、本明細書中に開示される構築物エレメントに対して生成され得、任意の目的（例えば、上記構築物の精製、検出、作用を修飾することなど）に使用され得る。
【００７０】
いくつかの実施形態は、本発明のいくつかの実施形態において開示されるワクチン組成物に曝される被験体によって生産されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を検出および／または作製するための方法を含み得る。例えば、被験体に対して受動免疫を誘導することが可能である、生産される抗体は、完全な抗体もしくはそのフラグメント、またはポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体として単離、分析、および／または生産され得る。当該分野において公知であるこれらの抗体または抗体フラグメントを、生産または分析するための任意の手段が企図される。
【００７１】
核酸増幅
増幅のための鋳型として使用される核酸配列は、標準方法に従って、生物学的サンプルに含まれるウイルス、細菌、細胞、または細胞構成要素から単離され得る。核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、または分画されたもしくは全細胞ＲＮＡであり得る。ＲＮＡが使用される場合、上記ＲＮＡを相補ｃＤＮＡに変換することが所望され得る。１つの実施形態において、上記ＲＮＡは、全細胞ＲＮＡであり、増幅のための鋳型として直接的に使用される。核酸分子を増幅するための当該分野において公知である任意の方法が企図される（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、Ｑｂｅｔａレプリカーゼなど）。
【００７２】
発現されたタンパク質またはペプチド
遺伝子は、大量のポリペプチド産物を生成するために任意の数の異なる組換えのＤＮＡ発現システムにおいて発現され得、これは、次に、精製され得、本明細書中に報告される方法および組成物において使用され得る。構築物を生成および使用するための当該分野において公知である任意の方法が企図される。特定の実施形態において、１つまたはそれより多くのポリペプチドをコードする遺伝子または遺伝子フラグメントは、当該分野において公知である標準クローニング技術またはサブクローニング技術によって発現ベクターへ挿入され得る。
【００７３】
ポリペプチドをコードする遺伝子または遺伝子フラグメントを使用する、いくつかの実施形態は、標準サブクローニング技術によって発現ベクターへ挿入され得る。ペプチドまたはタンパク質の迅速な親和性精製を可能にする、融合タンパク質として組換えのポリペプチドを生産する発現ベクターが使用され得る。このような融合タンパク質発現システムの例は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、マルトース結合タンパク質システム（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）、ＦＬＡＧシステム（ＩＢＩ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）、および６ｘＨｉｓシステム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）である。
【００７４】
薬学的組成物および投与経路
本明細書中のいくつかの実施形態の水性の組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体に溶解または分散した、有効量の治療のタンパク質、ペプチド、構築物、エピトープコア領域、刺激薬、インヒビターなどを含み得る。先行するもののいずれかを発現するベクターの水性の組成物はまた、企図される。句「薬学的または薬理学的に受容可能」は、動物またはヒトに適宜投与されるとき、有害な、アレルギー性の、または他の不適当な反応を生成しない分子実体および組成物を指す。
【００７５】
本明細書中のいくつかの実施形態の水性の組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体に溶解または分散した、有効量の治療のタンパク質、ペプチド、構築物、有効量の化合物を含み得る。このような組成物はまた、接種材料と称され得る。本明細書中で使用されるとき、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意の、および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性のある物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性のある成分と不適合である場合を除いて、治療組成物でのその使用が企図される。補足の活性成分はまた、上記組成物に組み込まれ得る。ヒト投与について、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準によって要求されるような、滅菌性、発熱原性、全般的な安全性、および純度の基準を満たすべきである。
【００７６】
生物学的材料は、適切な場合に、所望されるビヒクルへと、大規模に透析されて、所望されない低分子量分子を取り除き、および／またはより準備のできた処方物について凍結乾燥されるべきである。その活性のある化合物または構築物は、次に、一般に、非経口投与（例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、病変内経路、鼻内経路、またはさらに腹腔内経路を介する注射のために処方される）のために処方される。被験体のワクチン接種またはブーストのために使用される任意の経路が使用され得る。活性のある構成成分または成分を含む水性の組成物の調製は、本開示を考慮して、当業者に公知である。代表的に、このような組成物は、水性の溶液または懸濁物のいずれかとしての注射可能物として調製され得る；注射の前に液体を添加する際に溶液または懸濁物を調製することにおいて使用するのに適した固形はまた、調製され得る；そしてその調製物はまた、乳化され得る。
【００７７】
注射可能な使用に適した薬学的形態は、滅菌の水性の溶液または分散物；ゴマ油、ラッカセイ油、または水性プロピレングリコールを含む調製物；および滅菌の注射可能な溶液または分散物の即時調製のための滅菌粉末を含み得る。全ての場合において、その形態は、滅菌でなければならず、流体でなければならない。それは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば、細菌および真菌類）の汚染作用に対抗して保存されなければならない。
【００７８】
遊離塩基または薬理学的に受容可能な塩としての活性のある化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシルプロピルセルロース）と適切に混合された水において調製され得る。分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物において、ならびに油において調製され得る。保管および使用の、通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含み得る。
【００７９】
本明細書中に開示される処方物または構築物が、被験体における免疫応答を高めるための治療薬として使用される場合、治療剤は、中性または塩の形態で組成物へと処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）、および無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸で形成されるものを含む。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄）およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来し得る。
【００８０】
キャリアはまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散の場合に必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用を防ぐことは、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチメロサールなど）によって成し遂げられ得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖、または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収時間の延長は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、およびゼラチン）の、上記組成物における使用によって成し遂げられ得る。
【００８１】
滅菌の注射可能な溶液は、上記活性のある化合物または構築物を、必要とされる量で、適切な溶媒中に、上に列挙される種々の他の成分と共に組み込み、必要である場合、次に濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、種々の滅菌された活性成分を、基礎の（ｂａｓｉｃ）分散媒体および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む、滅菌ビヒクルへと組み込むことによって調製される。滅菌の注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥技術およびフリーズドライ技術であり、これらの技術により、活性成分と任意の追加の所望される成分からなる粉末を、それについて、先に滅菌濾過された溶液から生じる。直接的な注射のための、より濃縮されたまたは高度に濃縮された溶液の調製物がまた企図され、ここで、溶媒としてのＤＭＳＯの使用により、極度に急速な浸透をもたらし、高濃度の活性薬剤を小さな場へ送達することが想定される。
【００８２】
処方すると、溶液は、投与処方物と適合する様式で、およびその治療上有効であるような量で投与され得る。上記処方物は、多様な剤形（例えば、上に記載される注射可能な溶液の型）で容易に投与されるが、遅延放出カプセルまたはミクロ粒子およびミクロスフェアなども用いられ得る。
【００８３】
水性の溶液での非経口投与について、例えば、上記溶液は、必要である場合、適切に緩衝化されるべきであり、その液体希釈物は、最初に十分な食塩水またはグルコースで等張にされるべきである。これらの特定の水性の溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適している。この関係において、用いられ得る滅菌の水性媒体は、本開示を考慮して、当業者に公知である。例えば、１投与量は、１ｍｌの等張のＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入の流体に添加されるか、または注入の提案された部位に注射され得た（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ  １０３５−１０３８および１５７０−１５８０を参照のこと）。
【００８４】
用語「単位用量」は、被験体における使用に適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、その投与（例えば、適切な経路および処置レジメン）に関連して、上で議論された、所望される応答を生み出すように計算された予め決定された量の上記構築物組成物またはブースト組成物を含む。処置またはワクチン接種の数および単位用量の両方に従って、投与されるべき量は、処置されるべき被験体、その被験体の状態および所望される保護に依存する。投与について責任のある人物は、とにかく個々の被験体に対する適切な用量を決定する。例えば、被験体は、本明細書中に開示される構築物組成物を、必要性または病原性生物への曝露または上記被験体における状態（例えば、がん）に依存して、ある期間毎日または毎週の基準で、または毎月、年に２度（ｂｉ−ｙｅａｒｌｙ）または毎年の基準で投与され得る。
【００８５】
活性のある治療剤は、１用量当たり約０．０００１ミリグラム〜１．０ミリグラム、または約０．００１ミリグラム〜０．１ミリグラム、または０．１ミリグラム〜１．０ミリグラム、またはさらに１０ミリグラムほどを含むように混合物中で処方され得る。あるいは、活性薬剤（例えば、構築物）は、被験体において所望される作用を生み出すことが知られる、１用量当たりの特定の数の構築物を含むように処方され得る。複数回用量はまた投与され得る。
【００８６】
非経口投与（例えば、静脈内注射、皮内注射、または筋肉内注射）のために処方される化合物の他に、他の薬学的に受容可能な形態としては、例えば、錠剤または経口投与のための他の固体；リポソームの処方物；時間放出カプセル剤；生分解性および現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。
【００８７】
鼻内液剤または吸入可能な液剤、またはスプレー剤、エアゾール剤、または吸入剤も使用され得る。鼻用液剤は、点滴剤またはスプレー剤で鼻道に投与されるように設計された水性の液剤であり得る。鼻用液剤は、多くの点で鼻の分泌物に類似するように調製され得る。従って、水性の鼻用液剤は、通常、等張であり、５．５〜６．５のｐＨを維持するためにわずかに緩衝化される。さらに、必要とされる場合、眼用調製物において使用されるものと類似する抗菌保存剤、および適切な薬物安定剤が、上記処方物中に含まれ得る。種々の市販の鼻用調製物は公知であり、例えば、抗生物質、および抗ヒスタミン薬を含み得、喘息予防のために使用される。
【００８８】
投与の他の様式に適した追加の処方物としては、坐剤およびペッサリーが挙げられ得る。直腸のペッサリーまたは坐剤も使用され得る。一般に、坐剤について、慣習的な結合剤およびキャリアは、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み得；このような坐剤は、活性成分を０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で含む混合物から形成され得る。
【００８９】
経口処方物は、賦形剤（例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン（ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｉｎｅ）、セルロース、および炭酸マグネシウムなど）を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出の処方物または散剤の形態をとる。特定の定義された実施形態において、経口の薬学的組成物は、不活性の希釈剤または同化可能な食用のキャリアを含むか、またはハードシェルゼラチンカプセルもしくはソフトシェルゼラチンカプセルに囲まれ得るか、または錠剤へと圧縮され得るか、または食事の食物に直接的に組み込まれ得る。経口の治療上の投与について、上記活性のある化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、およびオブラート剤（ｗａｆｅｒ）などの形態で使用され得る。このような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性のある化合物を含むべきである。上記組成物および調製物の百分率は、もちろん変動し得、慣習的に、単位の重量の約２％〜約７５％の間、または好ましくは２５％〜６０％の間であり得る。このような組成物における活性のある化合物の量は、適した投与量が得られ得るようなものである。
【００９０】
上記錠剤、トローチ剤、丸剤、およびカプセル剤などはまた、以下を含み得る：トラガカントゴム、アラビアゴム（ａｃａｃｉａ）、トウモロコシデンプン、またはゼラチンのような結合剤；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、およびアルギン酸など）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；ならびに甘味料（例えば、スクロース、ラクトース、またはサッカリン）が添加され得、または香味料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーンの油、またはサクランボの香味）。投薬単位形態がカプセル剤のとき、それは上の種類の材料の他に、液体キャリアを含み得る。種々の他の材料は、コーティング剤として、または別の方法で投薬単位の物理的形態を修飾するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック、糖または両方でコーティングされ得る。エリキシル剤のシロップ剤は、上記活性のある化合物、甘味料としてスクロース、保存剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素および香味（例えば、サクランボまたはオレンジフレーバー）を含み得る。
【００９１】
キット
さらなる実施形態は、本明細書中に記載される方法および組成物を用いて使用するためのキットに関係する。いくつかの実施形態は、被験体が病原体を有するもしくは病原体に曝される、または状態を有することを防ぐため、あるいは病原体を有するもしくは病原体に曝された、または状態を有する被験体を処置するために使用する、１つまたはそれより多くのワクチンまたはブースト組成物を有するキットに関係する。特定の実施形態において、病原体としては、ウイルス由来、細菌由来、真菌類由来、または原生生物由来の病原体が挙げられ得る。状態としては、慢性状態またはがんのような状態が挙げられ得る。他の実施形態は、被験体がインフルエンザもしくはポックスウイルスを有するまたはインフルエンザもしくはポックスウイルスに曝されることを防ぐため、あるいはインフルエンザもしくはポックスウイルスを有するまたはインフルエンザもしくはポックスウイルスに曝された被験体を、処置するために使用するワクチン組成物を有するキットに関係する。キットは、携帯型（例えば、遠隔地において、運搬および使用できる）であり得る。他のキットは、ウイルスに曝されている、または病原体（例えば、ウイルス病原体）への曝露のリスクがあることが疑われる被験体を処置するための健康施設（ｈｅａｌｔｈ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）において使用することができる。キットは、病原体に曝される前、病原体に曝されている間、および／または病原体に曝された後に投与され得る１つまたはそれより多くの構築物組成物を含み得る。他のキットは、構築物の半減期を延長するために（例えば、大流行の場合にワクチン接種物（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｓ）を備蓄するため、または遠隔地に処置を提供するために）本明細書中で企図される構築物の脱水された処方物を含み得る。
【００９２】
他の実施形態は、本明細書中に記載される分子構築物を作製および使用するためのキットに関係し得る。特定の実施形態において、組成物は、弱毒化または改変されたＭＶＡおよびポックスウイルス分泌シグナルのうちの１つまたはそれより多くを有する構築物を含み得る。他の構築物はまた、少なくとも１つの分泌シグナル配列を含み得る。さらに他の実施形態は、翻訳調節配列（例えば、ＩＲＥＳ）を含む構築物を有し得る。構築物を作製および使用するための他の試薬が企図される。
【００９３】
キットはまた、適切な容器（例えば、バイアル、管、ミニフュージもしくはマイクロフュージ管（ｍｉｎｉ−  ｏｒ  ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  ｔｕｂｅ）、試験管、フラスコ、びん、注射器、または他の容器）を含み得る。追加の構成要素または薬剤が提供される場合、上記キットは、この薬剤または構成要素が配置され得る１つまたはそれより多くの追加の容器を含み得る。本明細書中でキットはまた、代表的に、市販するために厳密に閉じ込めて（ｃｌｏｓｅ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）、上記薬剤、組成物および任意の他の試薬容器を含むための手段を含む。このような容器としては、射出吹込み成形されたか、またはブロー成形されたプラスチック容器であって、その中に所望されるバイアルが保持されている、射出吹込み成形されたか、またはブロー成形されたプラスチック容器が挙げられ得る。必要に応じて、１つまたはそれより多くの追加の薬剤（例えば、他の抗ウイルス剤、抗真菌剤、または抗菌剤）が記載される組成物（例えば、ワクチンとして使用する組成物）に必要とされ得る。
【００９４】
ワクチン接種の間に使用される用量範囲は、使用される生の弱毒化されたワクチンおよびウイルスベクターの性質に依存して変動し得る。組換えのポックスウイルスについて、これらの用量は、１０５ＰＦＵ〜１０７ＰＦＵの間の範囲に及び得る。本発明の特定の実施形態において、免疫原性用量は、１０２ｐｆｕと同じくらい低いことがある。ワクチン接種の頻度は、ワクチンの性質、被験体の状態、およびまた使用される投与の経路に依存して変動し得る。１つのレジメンは、一次免疫（予備刺激（ｐｒｉｍｅ））に続いて、予備刺激免疫の４週間〜６週間後にブースト投与を含み得る。本発明の特定の実施形態において、抗原の翻訳および発現における改善は、より少ない用量および／またはより低用量が被験体に投与されることを可能にし得る。いくつかの実施形態は、被験体の筋肉内投与および／または皮内ワクチン接種に関係する。
【００９５】
当業者に公知である任意の方法は、組換えのペプチドまたはタンパク質の大規模な生産のために使用され得る。これらの実施形態に従って、ＭＶＡの大規模な生産が使用され得る。例えば、マスターシードストックおよびワーキングシードストックは、ＧＭＰ条件下で適格な（ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）初代ＣＥＦにおいて調製され得る。細胞は、大きい表面積のフラスコに蒔かれ、コンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）近くまで増殖され、選択されたＭＯＩで感染させられ、ワクチンウイルスが精製され得る。細胞は収集され、機械的破壊によって細胞内ウイルスが放出され、細胞の破片が大きな孔の深層濾過によって除去され、宿主細胞ＤＮＡがエンドヌクレアーゼで消化され得る。ウイルス粒子は、引き続いて精製され、タンジェンシャルフロー（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ−ｆｌｏｗ）濾過後、ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって濃縮され得る。結果として生じる濃縮された大量のワクチンは、安定剤を含むバッファーでの希釈によって処方され、バイアルに充填され、凍結乾燥され得る。使用のために、凍結乾燥されたワクチンは、希釈剤の添加によって再形成され得る。
【００９６】
ポックスウイルスは、その安定性について公知である。長期間の室温保管および分配のためにワクシニアを凍結乾燥することができることが、そのワクチンの広範囲にわたった使用および痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）の根絶を可能にする重要な属性のうちの１つであった。最近、６０年代に備蓄されたＤｒｙｖａｘのワクシニアウイルスが、数十年後、依然として、効力があることが実証された。ポックスウイルスの凍結乾燥および保管のための手順は、当該分野において周知であり、本明細書中に開示されるいくつかの実施形態についての組換えのポックスウイルスワクチンに適用され得た。
【００９７】
以下の実施例は、本明細書中に示される特定の実施形態を実証するために含まれる。続く実施例において開示される技術が、本明細書中に開示される実施においてよく機能するように見出された技術を代表することが、当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、開示される特定の実施形態において、多くの変更がなされ得ることを認識すべきであり、依然として、本明細書中の趣旨および範囲から外れることなく、似ているまたは類似の結果を得るべきである。
【実施例】
【００９８】
実施例
本明細書中に記載される多くの構築物を、種々の研究において使用するために、本明細書中に開示される方法（データ示さず）によって生成、分離、および精製した。これらの構築物のうちのいくつかを以下の説明において詳述する。特定の方法において、インフルエンザ遺伝子セグメントおよびペプチドを有する、および有さない構築物を、インフルエンザチャレンジに曝されたマウスモデルにおいて生成および使用した。
【００９９】
実施例１
１つの例示的な方法において、インフルエンザセグメントおよびワクシニア分泌セグメントを含む構築物組成物を、インフルエンザチャレンジに対する免疫保護の誘導について試験した。図１Ａおよび１Ｂは、ワクチン接種され、ウイルスでチャレンジされたマウスモデルを説明する。ここで、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、ＭＶＡ／ＩＲＥＳ／ｔＰＡ／ＨＡ（１０７ｐｆｕ）でワクチン接種し、ワクチン接種後６３日目にＶＮ／１２０３（Ａ／ベトナム／１２０３／０４  （Ｈ５Ｎ１）−１０４  ＴＣＩＤ５０）でチャレンジした。Ａ）体重の減少、およびＢ）チャレンジ後４日目の肺におけるウイルスタイター。インフルエンザセグメントを発現するＭＶＡ構築物は、ウイルスチャレンジに対する保護を引き出した。この研究において試験された全てのＭＶＡベクター化ペストワクチン（ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｐｌａｇｕｅ  ｖａｃｃｉｎｅ）は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて完全に安全であることが示された。ＭＶＡは、もともとの生の弱毒化されたワクシニア株よりも優れた安全性を有する第二世代の痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）ワクチンとして使用するために備蓄されている。従って、組換えのＭＶＡ／ＩＲＥＳ／ｔＰＡ／インフルエンザセグメントワクチンは、痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）およびインフルエンザに対する保護を同時に提供する潜在力を有する。
【０１００】
実施例２
用量節約（ｓｐａｒｉｎｇ）：別の例示的な方法において、種々の構築物を、用量の範囲において試験して、その保護作用を分析およびこれらの用量範囲における限界（ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）のいつくかを試験した。図２Ａ〜２Ｃは、１０５、６または７ｐｆｕを用いてＩＤワクチン接種され、ワクチン接種後６３日目にＶＮ／１２０３でチャレンジされたＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝１０）を表す。体重減少曲線を、Ａ）ＭＶＡ／ＩＲＥＳ／ｔＰＡ／ＨＡ、Ｂ）ＭＶＡ／ＩＲＥＳ／Ｃ１３Ｌ／ＨＡ、およびＣ）ＭＶＡ／ＨＡネイティブについて表す。
【０１０１】
実施例３
長期にわたる保護および交差クレード保護
図３は、本明細書中に示される特定のワクチン構築物が長期にわたる免疫を提供することを説明する。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝７）に１０５（ＨＡ）ｐｆｕおよび／または１０７（ＮＰ）ｐｆｕを用いて皮下に（ＩＤ）ワクチン接種し、ワクチン接種後２８週目にＶＮ／１２０３でチャレンジした。
【０１０２】
実施例４
異種クレード２のチャレンジ：
図４は、交差クレード保護を説明する。ここで、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝７）に、１０５（ＨＡ）ｐｆｕ／マウスまたは１０７（ＮＰ）ｐｆｕ／マウスを用いてＩＤワクチン接種し、ワクチン接種後２８週目にＶＮ／ＵＴでチャレンジした。
【０１０３】
安全性
別の実施例において、ワクチン構築物のうちのいくつかの安全性を評価した。図５は、本明細書中に記載される特定の構築物で試験されるマウスを表す。この実施例において、ＳＣＩＤ／Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝６）に１０８ｐｆｕ／動物のＭＶＡ−インフルエンザ構築物、または１０６ｐｆｕ／動物の野生型ワクシニアを用いてＩＰ接種し、病的状態およびポックス病変について６週間モニターした。
【０１０４】
本明細書中で行われた実験により、組換えのＭＶＡインフルエンザワクチンが安全および効力があることが実証される。単一用量の皮内注射により、致命的なチャレンジからの１００％の保護を提供できることが実証された。さらに、約５×１０５での用量節約導入は、１００％の保護を提供する。特定の実施例において、保護は２８週間まで続くことが実証された。他の実施例は、構築物中にＮＰを含むことが交差クレード保護を提供し得ることを実証する。マウスモデルを用いて、組換えのＭＶＡインフルエンザワクチンがＳＣＩＤマウスにおいて安全であることを実証した。これらの実験により、特に新興のウイルスサブタイプについて、ＭＶＡ構築物ワクチン接種が、慣習的なインフルエンザワクチン接種に対して実行可能な選択肢を提供することが実証される。
【０１０５】
Ｂ８ＲをワクシニアＩＦＮ−γ可溶性受容体として使用した。Ｃ１３Ｌを、セルピンホモログ（ｓｅｒｐｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）であり得る、ワクシニア中の非発現タンパク質と結びつける。示されるように、これらの配列は、ＭＶＡには存在しない。そのシグナルスコアは、同等であるか、またはｔＰＡについてのものよりも良好である。上記スコアは、他の抗原との関係において同様であり、著しくは異ならない。
【０１０６】
推定のワクシニアシグナル配列を分析し、Ｃ１３Ｌシグナルを、本明細書中で生成および使用される構築物に対して効力のあるエレメントとして同定した。Ｂ８Ｒシグナルは、それが公知の分泌されるワクシニアタンパク質の一部であるので、より明白であり得た。
【０１０７】
ポックスウイルスの代替の分泌シグナル
オルトポックスウイルス由来の代替のシグナル配列が同定され、例えば、ＭＶＡからの分泌を強化するために、特定の構築物におけるｔＰＡを置き換えた。この実施例において、ｔＰＡ切断部位は、プログラムシグナルＰ３．０に従って、Ｆ１構築物において、正しく同定される。予測される切断は、ＡＧの後であるＮｇｏＭＩＶ部位。９８．８％の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）スコア。
【０１０８】
実施例５
例示的な分泌シグナル配列および構築物
構築物についてのいくつかのオプションを下に概説する。
【０１０９】
Ｃ１３Ｌ、例示的な分泌シグナル配列
ｉ．ＶＶ−ｃｏｐ：１２５１０−１２３１３（完全なＤＮＡ配列：１２５１０−１１９７１）。
【０１１０】
ｉｉ．未知のタンパク質の機能。セルピンホモログの近くに配置される。
【０１１１】
ｉｉｉ．ＶＶ−ｃｏｐバージョンは、シグナルペプチドに続く欠失を有し、それにより４４ａａ後の終結前の、フレームシフトおよび関連しないタンパク質配列を引き起こす。そのＤＮＡ配列は、オルトポックスのオーソログに匹敵して存在する。最後の１００ｂｐは、逆向きの反復として１７９６７０〜１７９７６７に存在する。完全なコード配列は、ＶＶ−ＷＲ、遺伝子座２０６と同等である。
【０１１２】
ｉｖ．分泌シグナル：
【０１１３】
【化１】
2013511552.tif 000003
２．シグナルペプチドスコア＝１０．３、確率＝６．１×１０−５、ＶＶ−ＷＲ  １．１×１０−３。
【０１１４】
３．Ｆ１における切断は、９９．８％のシグナル確率を有して、ＡＧＡ−ＤＬ（ニューラルネットワーク）またはＳＩＡ−ＳＰＡＧＡＤ（ＨＭＭ）のいずれか。
【０１１５】
Ｂ８Ｒの例示的な分泌シグナル配列
ｉ．ＶＶ−ｃｏｐ：
ｉｉ．ＩＦＮ−γ可溶性受容体遺伝子：
１．Ｂ８Ｒは、細胞から分泌され、宿主ＩＦＮ−γに結合する。
【０１１６】
２．分泌シグナル：
【０１１７】
【化２】
2013511552.tif 000004
ｂ．シグナルペプチドスコア＝１０．５、確率＝４．１×１０−４
３．Ｆ１を伴う切断は、９９．１％のシグナル確率を有して、ＫＡＧ−ＡＤＬ（ニューラルネットワーク）またはＨＡ−ＫＡＧＡＤ（ＨＭＭ）のいずれか。
【０１１８】
【化３】
2013511552.tif 000005
材料および方法
ＭＶＡ組換えワクチンの構築
トランスファープラスミドを、インフルエンザ遺伝子セグメントを発現する組換えのＭＶＡを生成するために使用した。当該分野において公知である任意の方法を、これらの構築物を生成するために使用し得る。
【０１１９】
いくつかの構築物試験群は、種々のネイティブおよび非ＩＲＥＳ構築物（例えば、ＩＲＥＳ、ｔＰＡ、Ｃ１３Ｌ、およびＢ８Ｒ）の存在下、または非存在下で以下を含む。
【０１２０】
１．ＭＶＡ／ＨＡ（ＩＭ）予備刺激
２．ＭＶＡ／ＨＡ（ＩＭ）予備刺激／ブースト
３．ＭＶＡ／ＨＡ（ＩＭ）予備刺激＋ＭＶＡ／フラジェリン（アジュバント）
４．ＭＶＡ／ＨＡ（ＩＤ）予備刺激
５．ＭＶＡ／ＨＡ（ＩＤ）予備刺激／ブースト
６．ＭＶＡ／ＨＡ（ＩＤ）予備刺激＋ＭＶＡ／フラジェリン（アジュバント）
７．ＭＶＡ／ＧＦＰ予備刺激／ブースト（ＩＭ）
８．ＭＶＡ／ＧＦＰ予備刺激／ブースト（ＩＭ）フラジェリン
９．ホルマリン不活性化ＶＮ／１２０３  ５μｇ（ＩＭ）予備刺激／ブースト
これらの構築物のうちのいくつかを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成している。いくつかの構築物を、ＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞、データ示さず）において発現した。いくつかの構築物は、１つまたはそれより多くのインフルエンザ遺伝子セグメント（複数可）（例えば、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｈａｔ、を含む。いくつかの構築物は、ネイティブまたはＩＲＥＳまたは非ＩＲＥＳ構築物を含む。他の構築物は、病原体関連遺伝子セグメントを有する、および有さないネイティブ、Ｃ１３Ｌ、およびＩＲＥＳ／Ｃ１３Ｌ構築物を含む。
【０１２１】
免疫およびチャレンジ
マウスの群（例えば、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）は、各ワクチン候補を用いて、後肢への筋肉内注射を介して、一次免疫およびブースター免疫を受けた。次に上記マウスを、保護について本明細書中に開示される種々のウイルスを用いてチャレンジした。
【０１２２】
血清学
血清サンプルを、当該分野において公知である手段によって、一次ワクチン接種後、およびブースト後（チャレンジ前）に回収して、インフルエンザまたはポックスウイルスに対する抗体のタイターを評価した。
【０１２３】
統計解析
スチューデントのｔ−検定およびログランク検定を、データ群を比較するために使用した。全ての統計解析について、０．０５未満の確率値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェア（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、有意であるとみなした。
【０１２４】
本発明の構築物のために使用する、可能性のある分泌シグナル配列
【０１２５】
【化４】
2013511552.tif 000006
特定の実施形態において、ＩＭワクチン接種（例えば、予備刺激／ブーストスキーム）が非常に有効であったこと、予備刺激のみでの罹患率の増加が存在したことが言及された。アジュバントは有効ではないことがあり、特定の実施形態において、上記フラジェリンを用いて、罹患率および死亡率の増加が存在することを観測した。他の実験において、全ての試験されたスキームを用いたＩＤワクチン接種は、予備刺激／ブーストで起こる最小の罹患率を有する完全な保護を提供する。アジュバントは一因となっておらず、アジュバント単独は、保護を提供しない。
【０１２６】
いくつかの用量範囲を、本明細書中に開示される特定の構築物について、マウスモデルにおいて試験した。上記用量範囲のうちのいくつかは、約５×１０５〜約５×１０７であった。試験動物の体重の減少は、試験されるワクチン接種処方物および構築物の有効性をモニターするための１つの手法であった。
【０１２７】
図６Ａおよび６Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の種々の構築物をマウスに対して筋肉内（ＩＭ）へ導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおけるパラメーターの例示的なプロットを表す。Ａ）体重の減少、およびＢ）チャレンジ後の生存率。
【０１２８】
図７Ａおよび７Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の種々の構築物をマウスに対して皮内（ＩＤ）へ導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおけるパラメーターの例示的なプロットを表す。Ａ）体重の減少、およびＢ）チャレンジ／感染後の生存率。
【０１２９】
図８Ａおよび８Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の種々の構築物をマウスに対して（Ａ）筋肉内（ＩＭ）または（Ｂ）皮内（ＩＤ）へ導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおけるパラメーターの例示的なプロットを表す。これらの例示的な実験は、いくつかの臨床指標（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）を評価する。上記指標を、マウスモデルにおいて、０〜４の尺度でグレード化した。０＝疾病の徴候なし、１＝逆立った毛；２＝小穴のある外皮（ｐｉｔｔｅｄ  ｃｏａｔ）、背を曲げた姿勢、震えており、遅い動き；３＝困難な呼吸、食欲不振、ほとんど動かない／全く動かない、および４＝麻痺、瀕死。
【０１３０】
図９は、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の種々の構築物をマウスに対して導入後、インフルエンザでチャレンジした後の肺におけるウイルスタイターを説明する例示的なプロットを表す。マウスを、各群において４日目に犠牲にし（チャレンジ／感染後、１群当たり３匹のマウス）、肺を均質化し、ＭＤＣＫにおいてタイターを決定（ｔｉｔｔｅｒ）した。Ｌｏｇウイルスタイターを表す。
【０１３１】
表１は、生成および試験されたＭＶＡインフルエンザトランスファーベクターおよび構築物のうちのいくつかを表す。
【０１３２】
図１０Ａおよび１０Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物（各構築物においてＨＡ遺伝子セグメントを有する）を導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける体重変化（％）の例示的なプロットを表す。これらの構築物を、異なる用量で投与した（５×１０５〜５×１０７）。
【０１３３】
図１１Ａおよび１１Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物を導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける体重変化（％）の例示的なプロットを表す。Ａ）において、これらの構築物を、異なる用量で投与した（５×１０５〜５×１０７）。Ｂ．において、追跡可能な化合物をＭＶＡ構築物に連結した。
【０１３４】
図１２Ａおよび１２Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物を種々の濃度で導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける体重変化（％）の例示的なプロットを表す。これらの構築物を、異なる用量で投与した（５×１０５〜５×１０７）。
【０１３５】
図１３Ａおよび１３Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物を種々の濃度で導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける生存率の例示的なプロットを表す。これらの構築物を、異なる用量で投与した（５×１０５〜５×１０７）。構築物のうちのいくつかは、追加のエレメント、ｔＰＡおよびＩＲＥＳを含んだ。ＩＲＥＳおよびｔＰＡエレメントを有する構築物を有するマウスが８日目に、構築物中にＭＶＡ／ＨＡのみを有するものよりも、生存率を低減したことを観測した。
【０１３６】
図１４Ａおよび１４Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物を種々の濃度で導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける生存率の例示的なプロットを表す。これらの構築物を、異なる用量で投与した（５×１０５〜５×１０７）。構築物のうちのいくつかは、追加のエレメント、ｔＰＡおよびＩＲＥＳ配列（Ａ）を含んだ。ＩＲＥＳおよびｔｐａエレメントを有する構築物を有するマウスが８日目に、構築物中にＭＶＡ／ＨＡのみを有するものよりも、生存率を低減したことを観測した。上記ｔＰＡエレメントを、別の分泌シグナルＣ１３Ｌと置き換えたとき、生存率は、試験される期間、１００％であった。
【０１３７】
図１５Ａおよび１５Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物を種々の濃度で導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける生存率の例示的なプロットを表す（ｄｐｉは、感染後の日数を表す）。これらの構築物を、異なる用量で投与した（５×１０５〜５×１０７）。
【０１３８】
図１６Ａおよび１６Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物を種々の濃度で導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける臨床スコア（例えば、物理的および生理学的パラメーター、０〜４の上記スコアを参照のこと）の例示的なプロットを表す。これらの構築物を、異なる用量で投与した（５×１０５〜５×１０７）。さらに、検出可能な（ｄｅｔｅｃｔｉｂｌｅ）マーカーに連結されるＭＶＡ構築物をまた、マウスにおいて導入し、追跡した。
【０１３９】
図１７Ａおよび１７Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の２つの異なる構築物を種々の濃度で導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける臨床スコア（例えば、物理的および生理学的パラメーター）の例示的なプロットを表す。これらの構築物を、異なる用量で投与した（５×１０５〜５×１０７）。さらに、検出可能なマーカー（ＧＦＰ）に連結されるＭＶＡ構築物をまた、マウスにおいて導入し、追跡した。
【０１４０】
図１８は、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態の構築物を種々の濃度で導入後、インフルエンザでチャレンジした後のマウスにおける臨床スコア（例えば、物理的および生理学的パラメーター）の例示的なプロットを表す。これらの構築物を、異なる用量で投与した（５×１０５〜５×１０７）。さらに、検出可能なマーカー（ＧＦＰ）に連結されるＭＶＡ構築物をまた、マウスにおいて導入し、追跡した。
【０１４１】
実施例６
分泌シグナル（Ｃ１３Ｌ）を有する、または有さない、血球凝集素および／または核タンパク質を発現するＭＶＡ／ｆｌｕワクチンでの皮内へのワクチン接種の３ヶ月前に、改変されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を用いて、マウスの群（ｎ＝８）に皮内接種した。
【０１４２】
【表２】
2013511552.tif 000007
図１９Ａおよび１９Ｂは、（Ａ）ＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンでのブースターワクチン接種後４週間目にインフルエンザＡ／ベトナム／１２０３−Ｈ５Ｎ１ウイルス（１０４  ＴＣＩＤ５０）でチャレンジされた、免疫されたマウスにおける平均の体重（ｗｅｉｇｈ）変化を表す。マウスは、ワクシニアに対して以前から存在している免疫を有した。血球凝集素抗原を含むＭＶＡ／Ｆｌｕで免疫されたマウスは、体重を落とさなかった；そして（Ｂ）は、ＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンでのブースターワクチン接種後４週間目にインフルエンザＡ／ベトナム／１２０３−Ｈ５Ｎ１ウイルス（１０４  ＴＣＩＤ５０）でチャレンジされたマウスの臨床スコアを表す。マウスは、ＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンで免疫する前にワクシニアに対して以前から存在している免疫を有した。臨床スコア０〜４を、上に詳述した。
【０１４３】
図２０は、ＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンでのブースターワクチン接種後４週間目にインフルエンザＡ／ベトナム／１２０３−Ｈ５Ｎ１ウイルス（１０４  ＴＣＩＤ５０）でチャレンジされた、免疫されたマウス（上の図１９Ａおよび１９Ｂにおけるものと同じ構築物を用いて）の生存率を表す。マウスは、ＭＶＡ／Ｆｌｕワクチンで免疫する前にワクシニアに対して以前から存在している免疫を有した。血球凝集素抗原を含むＭＶＡ／Ｆｌｕで免疫された全てのマウスは、致死量のインフルエンザＡ／ベトナム／１２０３−Ｈ５Ｎ１ウイルスでのチャレンジに耐えた。
【０１４４】
本明細書中に開示される、および請求される、全ての組成物および方法は、本開示を考慮して、過度の実験なく作製および実施され得る。上記組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されるが、本明細書中の概念、趣旨、および範囲から外れることなく、上記組成物および方法、ならびに本明細書中に記載される方法の工程および工程の連続において、バリエーションが適用され得ることが、当業者に明らかである。より具体的には、化学的、および生理学的の両方に関連する特定の薬剤が、本明細書中に記載される薬剤の代わりに用いられ得、他方、同じまたは同様の結果が達成される。当業者に明らかである全てのこのような同様の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような趣旨、範囲、および概念の内にあるとみなされる。
【図１Ａ】
2013511552.tif 000008
【図１Ｂ】
2013511552.tif 000009
【図２Ａ】
2013511552.tif 000010
【図２Ｂ】
2013511552.tif 000011
【図２Ｃ】
2013511552.tif 000012
【図３】
2013511552.tif 000013
【図４】
2013511552.tif 000014
【図５】
2013511552.tif 000015
【図６】
2013511552.tif 000016
【図７】
2013511552.tif 000017
【図８】
2013511552.tif 000018
【図９】
2013511552.tif 000019
【図９−１】
2013511552.tif 000020
【図１０】
2013511552.tif 000021
【図１１】
2013511552.tif 000022
【図１２】
2013511552.tif 000023
【図１３】
2013511552.tif 000024
【図１４】
2013511552.tif 000025
【図１５】
2013511552.tif 000026
【図１６】
2013511552.tif 000027
【図１７】
2013511552.tif 000028
【図１８】
2013511552.tif 000029
【図１９】
2013511552.tif 000030
【図２０】
2013511552.tif 000031
【配列表】
2013511552000001.app
【国際調査報告】
2013511552.tif 000032