(57)【要約】  非定型成長条件を特定するための、また、注目する細胞の属性またはソースを特定するためのＤＮＡ遺伝子座群を特定する方法に関する。当該方法は、異なる由来および／または遺伝子型の細胞において複数の非定型成長条件を特定するＤＮＡ遺伝子座の複数の群を特定することを含むことができる。また、ＤＮＡ遺伝子座群とその使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルが受けてきた曝露の診断および特性明瞭化のために生物のゲノムＤＮＡ内に位置する標的ＤＮＡ配列群をコンパイルするための方法であって、および／または組織（または複数の組織）または細胞（または複数の細胞）の属性または由来とに関連し、前記方法は、メチル化状態を有するＤＮＡ配列を選択することを含み、前記メチル化状態はサンプル間でばらつきがあるが、生体サンプルが受けた単一の曝露のみを、または組織（または複数の組織）および／または細胞（または複数の細胞）の属性と由来とを、個別的に診断付けるわけではない、方法。
【請求項２】
組織（または複数の組織）または細胞（または複数の細胞）の属性または由来の診断および特性明瞭化のために生物のゲノムＤＮＡ内に位置する標的ＤＮＡ配列群をコンパイルするための方法であって、
(i)  既知であるが異なる属性または由来の細胞の二つ以上のサンプルからＤＮＡを単離する工程と；
(ii)  各サンプルの前記単離したＤＮＡ中のメチル化可能な遺伝子座のメチル化状態を特定する工程と；
(iii)  各サンプルからの単離したＤＮＡの前記メチル化状態を比較する工程と；
(iv)  遺伝子座のサブセットを選択する工程であって、前記サブセットは各遺伝子座のメチル化状態によって特徴が明瞭化され、前記メチル化状態はサンプル間でばらつきがあるが単一の属性または由来を個別的に診断付けるわけではない、工程と、
を含む方法。
【請求項３】
非定型成長条件（ストレス）を特定するためのＤＮＡ遺伝子座（ストレスセンチネル）群を特定する方法であって、
(i)  対照成長条件下で、注目する細胞のサンプルを成長させる工程と；
(ii)  工程(i)の注目する細胞と同じ細胞の少なくとも一つのサンプルを、少なくとも一つの非定型成長条件のある環境で成長させる工程と；
(iii)  工程(i)および(ii)の各細胞サンプルからＤＮＡを単離する工程と；
(iv)  前記工程(iii)の単離したＤＮＡ中の、メチル化できる遺伝子座の、メチル化状態を特定する工程と；
(v)  前記工程(i)および(ii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する工程と；
(vi)  遺伝子座のサブセットを選択する工程であって、前記サブセットは、前記工程(ii)からの単離したＤＮＡにおいて前記工程(i)からの単離したＤＮＡとは遺伝子座のメチル化状態が異なっていることが特徴であり、かつ、前記サブセットの中の各遺伝子座は、ある非定型成長条件に応答してメチル化状態を変化させるが、他の非定型成長条件に対してはそうしない、工程と
を含む方法。
【請求項４】
(i)前記遺伝子座を選択するためには使用されなかった、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせと、(ii)前記遺伝子座を選択するために使用された、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせとを、選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態が集団的に診断付ける、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記方法は、前記遺伝子座のサブセットを選択するために、異なるストレス、組織型または細胞型を、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、またはそれ以上使用することを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子座のサブセットの中の各遺伝子座、または、各選択されたＤＮＡ配列は、
(i)  同一器官からの同一組織型については、同一のストレスに対して同様に応答してメチル化状態を再現可能に変化させる；
(ii)  同一時に同一個体からの同一組織から採取された複製サンプル間でのメチル化状態に、ばらつきを示さないか、好適には２０％未満のばらつきをしめす；
(iii)  容易に検出される異なるストレス状態、または、細胞（複数の細胞）および／または組織（複数の組織）の属性または由来と関連した定性的メチル化変化を生む；
(iv)  容易に検出される異なるストレス状態、または、細胞（複数の細胞）および／または組織（複数の組織）の属性または由来と関連した顕著な定量的メチル化変化を生む；
(v)  あるストレスに対して応答してメチル化状態を変化させるが、ほかのストレスについてはそうしない（好適には、ストレスの１５〜８５％について、より好適には、ストレスの２５〜７５％について、最も好適には、ストレスの４０〜６０％について変化させる）；
(vi)  (a)生物のストレス応答経路、(b)細胞（複数の細胞）および／または組織（複数の組織）のタイプの、好適には大部分を、理想的にはすべてを表す、メチル化に基づく遺伝子座を含む；
(vii)  生物の各組織／器官型について別々に組み立てられる；
(viii)  特定の組織、器官、または発生段階に対しての使用のみを意図していない限り、組織／発生段階の間でばらつきが無く、好適にはばらつきが１０％未満である、
という特徴のうち一つ以上、たとえば二つ以上、三つ以上、四つ以上、五つ以上、六つ以上、七つまたは八つを有する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子座のサブセットの各遺伝子座、または各選択されたＤＮＡ配列は、前記遺伝子座の選択に使用されたストレスまたはサンプル源のほぼ半数に現れ、ストレスまたはサンプルを相補的に分離する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
一つ以上の非定型成長条件を特定するためのＤＮＡ遺伝子座群を特定する方法であって、
(i)  対照成長条件下で、注目する細胞のサンプルを成長させる工程と；
(ii)  工程(i)の注目する細胞と同じ細胞のサンプルを、少なくとも一つの非定型成長条件のある環境で成長させる工程と；
(iii)  工程(i)および(ii)の各細胞サンプルからＤＮＡを単離する工程と；
(iv)  前記工程(iii)の単離したＤＮＡ中の、メチル化できる遺伝子座の、メチル化状態を特定する工程と；
(v)  前記工程(i)および(ii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する工程と；
(vi)  遺伝子座のサブセットを選択する工程であって、前記サブセットは、前記工程(ii)からの単離したＤＮＡにおいて前記工程(i)からの単離したＤＮＡとは遺伝子座のメチル化状態が異なっていることが特徴であり、好適には前記サブセットの中の各遺伝子座は、ある非定型成長条件に応答してメチル化状態を変化させるが、他の非定型成長条件に対してはそうしない、工程と
(vii)  前記工程(vi)で選択された遺伝子座のサブセットを特定する工程と、
(viii)  前記選択されたサブセット遺伝子座のメチル化状態を前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）および／または注目する細胞サンプルに関連させる工程と、
を含む方法。
【請求項９】
非定型成長条件を特定するための複数のＤＮＡ遺伝子座群を特定する方法であって、
(i)  対照成長条件下で、注目する細胞の複数のサンプルを成長させる工程であって、前記複数の注目する細胞は異なる遺伝子型を有する、工程と；
(ii)  工程(i)のように注目する細胞の複数のサンプルを成長させる工程であって、前記細胞は少なくとも一つの非定型成長条件のある環境にある、工程と；
(iii)  工程(i)および(ii)の各細胞サンプルからＤＮＡを単離する工程と；
(iv)  前記工程(iii)の単離したＤＮＡ中の、メチル化できる遺伝子座の、メチル化状態を特定する工程と；
(v)  前記工程(i)および(ii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する、または、前記工程(i)および(iii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する、もしくは前記工程(ii)および(iii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する工程と；
(vi)  遺伝子座のサブセットを選択する工程であって、前記サブセットは、前記工程(ii)からの単離したＤＮＡにおいて前記工程(i)または(iii)からの単離したＤＮＡとは遺伝子座のメチル化状態が異なっていること；および／または前記工程(iii)からのＤＮＡにおいて前記工程(i)からの単離したＤＮＡとは遺伝子座のメチル化状態が異なっていること、が特徴であり、好適には前記サブセットの中の各遺伝子座は、ある非定型成長条件に応答してメチル化状態を変化させるが、他の非定型成長条件に対してはそうしない、工程と；
(vii)  前記工程(vi)で選択された遺伝子座のサブセットを特定する工程と、
(viii)  前記遺伝子座のサブセットとそのメチル化状態を、前記遺伝子座を選択するために使用された前記非定型成長条件および／または注目する細胞サンプルに関連させる工程と、
を含む方法。
【請求項１０】
複数の非定型成長条件を特定するためのＤＮＡ遺伝子座群を特定する方法であって、
(i)  対照成長条件下で、注目する細胞のサンプルを成長させる工程と；
(ii)  工程(i)の注目する細胞と同じ細胞の複数のサンプルを、少なくとも一つの非定型成長条件のある環境で成長させる工程であって、各サンプルは異なる非定型成長条件中で成長させられる、工程と；
(iii)  工程(i)および(ii)の各細胞サンプルからＤＮＡを単離する工程と；
(iv)  前記工程(iii)の単離したＤＮＡ中の、メチル化できる遺伝子座の、メチル化状態を特定する工程と；
(v)  前記工程(i)および(ii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する工程と；
(vi)  遺伝子座のサブセットを選択する工程であって、前記サブセットは、前記工程(ii)の各サンプルからの単離したＤＮＡにおいて前記工程(i)からの単離したＤＮＡとは遺伝子座のメチル化状態が異なっていることが特徴であり、好適には、前記サブセット中の各遺伝子座は、ある非定型成長条件に応答してメチル化状態を変化させるが、他の非定型成長条件に対してはそうしない、工程と；
(vii)  前記工程(vi)で選択された遺伝子座のサブセットを特定する工程と；
(viii)  前記遺伝子座のサブセットとそのメチル化状態とを、前記工程(ii)の異なる非定型成長条件に関連させる工程と；
を含む方法。
【請求項１１】
(ix)  前記選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態を、前記遺伝子座を選択するためには使用されなかった、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせと関連させる工程を、
必要に応じてさらに含む、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
(ix)  前記遺伝子座のサブセットとそのメチル化状態を、前記細胞サンプル、または前記細胞サンプルが得られた組織、器官、または生物中の表現型および／または生理学的応答と関連させる工程を、必要に応じてさらに含む、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記工程(ii)における複数のサンプルは、１〜１０，０００個のストレスであり、１０〜５００個のストレスおよび／または３０〜１００個のストレスを含む、請求項８〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
(xi)  細胞のサンプルからＤＮＡを単離する工程であって、前記細胞の成長条件は不明である、工程と；
(xii)  前記工程(xi）の単離したＤＮＡ中の、前記工程(vii)で特定された前記遺伝子座のサブセットのメチル化状態を特定する工程と；
(xiii)  前記工程(xi)の細胞のサンプルが非定型成長条件に曝露されていたかどうかを特定するために、前記工程(xii）で特定された遺伝子座のメチル化状態を、前記工程(viii)の結果と比較する工程と、
を必要に応じてさらに含む、請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
(xi)  細胞のサンプルからＤＮＡを単離する工程であって、一つ以上の非定型成長条件に曝露された時の前記細胞（またはその細胞が得られた組織／生物）の表現型および／または生理学的応答が不明である、工程と；
(xii)  前記工程(xi）の単離したＤＮＡ中の、前記工程(vii)で特定された前記遺伝子座のサブセットのメチル化状態を特定する工程と；
(xiii)  前記細胞（またはその細胞が得られた組織／生物）が、特徴が明瞭または不明瞭な非定型成長条件に対する表現型および／または生理学的応答をしたかどうかを特定するために、前記工程(vi)で特定された遺伝子座のメチル化状態を、前記工程(x)の結果と比較する工程と、
を必要に応じてさらに含む、請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記工程(xiii)は、前記細胞が曝露されていた非定型成長条件のタイプも特定する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程(xiii)は、前記工程(ii)でテストされなかった非定型成長条件に前記細胞が曝露されたことを特定する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ遺伝子座のサブセットは、１〜５０００個の遺伝子座、１０〜１０００個の遺伝子座および／または２０〜１００個の遺伝子座を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記対照成長条件が、前記注目する細胞の生物学的に正常な生体内成長条件と同じである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
工程(ii)における様々な非定型成長条件は相違する、請求項８〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
温度、物理的ストレス（大気圧の増減、対象物に対する指向性圧力、撹拌、重力、物理的緊張を含む）、物理的損傷、養分利用性、化学毒素やホルモン、シグナル伝達分子への曝露、その他の化学薬剤への曝露、可視光線ストレス（スペクトルの質および強度）、地上レベルを超えた非可視光線（たとえば、Ｘ線、ガンマ線、赤外線、紫外線、マイクロ波など）の照射への曝露、病原体または寄生生物への曝露、その他の生物や同じ種のその他の構成体への曝露、他の生物や個体からの浸出液, 前記標的生物に対する他の生物による植食／摂食、水分ストレス（過多、または過少）、前記対象物が休止状態に入るように刺激するシグナルまたは条件への曝露、酸素ストレス、または、過剰または準最適な量の遊離基への曝露から、前記非定型成長条件が選択される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記工程(vii)で選択された前記遺伝子座のサブセットは、細胞ストレス応答経路の成分用の遺伝子または制御領域と関連する、請求項８〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記遺伝子座は、前記注目する細胞の各ストレス応答経路の少なくとも一つの成分についての遺伝子に位置する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記工程(vi)の遺伝子座のサブセットの選択は、コンピュータープログラムにより自動的に行われる、請求項８〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
一つ以上の非定型成長条件を特定するための一つ以上のＤＮＡ遺伝子座群を特定する方法であって、
(a) 同時に、先行するいずれかの請求項の方法を行って、一つ以上のＤＮＡ遺伝子座群を一つ以上の非定型成長条件と関連させる工程か、または
(b)一つ以上の非定型成長条件で一つ以上のＤＮＡ遺伝子座群を特定するために、先行するいずれかの請求項の工程(viii)および(ix)の結果を組み合わせる工程か、
のいずれかの工程を含む、方法。
【請求項２６】
一つ以上の非定型成長条件を特定するためのＤＮＡ遺伝子座群であって、先行するいずれかの請求項で定義されるような、ＤＮＡ遺伝子座群。
【請求項２７】
注目する細胞が曝露されていた一つ以上の非定型成長条件を特定する方法であって、前記方法は、
(i)  注目する細胞からＤＮＡを単離する工程であって、前記細胞の成長条件が不明である、工程と；
(ii)  前記工程(i)の単離したＤＮＡ中の、メチル化できる遺伝子座群のメチル化状態を特定する工程と；
(iii)  前記工程(ii)で特定されたような遺伝子座のメチル化状態を、同一の遺伝子座群についての既知のメチル化状態群と比較する工程であって、前記既知のメチル化状態群は一つ以上のストレスの特徴を示している、工程と；
(iv)  注目する細胞が非定型成長条件（複数の非定型成長条件）に曝露されていたかどうかを特定する工程と
を含む、方法。
【請求項２８】
前記工程(iv)はまた、前記細胞が曝露された非定型成長条件のタイプを特定する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
細胞が曝露されていた非定型成長条件の特定に、請求項２５に記載の、または請求項２７または２８に定義された方法で定義されたＤＮＡ遺伝子座群を使用する、ＤＮＡ遺伝子座群の使用。
【請求項３０】
前記非定型成長条件への曝露が続行している、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記非定型成長条件への曝露は過去に起こったことである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
前記非定型成長条件は、症候性または無症候性疾患、後天的な感染症感受性、アレルギー、加齢、医薬品や毒物への曝露、運動能力向上薬への曝露、農薬への曝露、市販細胞株の状態のチェック、生体医療目的で細胞株の生理学的状態を試験すること（合成または分離幹細胞の生存能力、潜在能力、および／または分化全能性を調査すること；移植について皮膚細胞株の潜在能力および能力を評価すること；参照基準に対する標準的細胞株培養の均一な生理学的状態を確保することを含む）、および薬剤の前臨床試験である、請求項２９〜３１のいずれかに記載の使用。
【請求項３３】
癌、代謝異常、ウイルスまたは細菌感染、ストレス関連疾患／障害、寄生生物による感染または侵入、プラダー・ウィリー／アンジェルマン症候群、ＩＣＦ症候群、皮膚線維腫、高血圧、小児神経生物学を含む疾患の診断における、請求項２９〜３１のいずれかに記載の使用。
【請求項３４】
非定型成長条件を特定し識別するための異なるメチル化状態の遺伝子座のサブセットを選択するためのコンピュータープログラム。
【請求項３５】
シロイヌナズナの細胞サンプルが曝露されていた一つ以上の非定型成長条件を特定するためのＤＮＡ遺伝子座群であって、異なるメチル化状態および／または発現の前記遺伝子座は、下記シロイヌナズナ遺伝子のうちの一つ以上、たとえばすべての、内部またはその５ｋｂ上流／下流までに、位置する、ＤＮＡ遺伝子座群。
AT2G15800
AT2G38240
AT5G54720
AT1G76650
AT3G31540
AT3G28820
AT5G02580
AT1G07120
AT1G61800
AT1G48110
AT5G28235
AT5G28430
AT5G28760
AT3G53300
AT5G46200
AT3G57260
AT4G02330
AT3G05400
AT5G25110
AT3G28770
AT5G62750
【請求項３６】
前記遺伝子座群が請求項３５に記載のように定義され、前記遺伝子座は、シロイヌナズナの注目する細胞における前記非定型成長条件または生理学的／表現型応答を特定するために使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記遺伝子座が請求項３５に記載のように定義され、シロイヌナズナ以外の植物種からの注目する細胞における前記非定型成長条件または生理学的／表現型応答を特定するために使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
ヒトの細胞サンプルが曝露されていた一つ以上の非定型成長条件を特定するためのＤＮＡ遺伝子座群であって、異なるメチル化状態および／または発生の前記遺伝子座は、下記ヒト遺伝子または染色体座位のうちの一つ以上、たとえばすべての、内部またはその５ｋｂ上流／下流までに、位置する、ＤＮＡ遺伝子座群。
ZNRF3
SLC7A4
Myosin-18B(MYO18B)
Glycoprotein Ib (platelet), beta polypeptide
RP1-47A17.8
OncostatinM(OSM)
CTA-299D3.6
CTA-941F9.6
Cytohesin-4
PIB5PA
SUSD2
chr 22:35,256,796-35,277,053,NCBI 36
RP3-438O4.2
RP4-756G23.1
Somatostatin receptor type 3 (SSTR3)
Bcl-2 interacting killer (BIK)
GAS2L1
RP3-355C18.2
Gamma-parvin
CARMA 3
TMPRSS6
Platelet-derived growth factor B chain precursor (PDGFB)
CELSR1 Cadherin 
T-box transcription factor (TBX1)
Q6ZRW2_HUMAN
NKG2DL4 (RAET1E)
DAAM2
RP1-47M23.1
RP11-397G17.1
Nesprin-1 (Syne-1)
Myogenic repressor I-mf (MDFI)
RP11-174C7.4
CMAH
PKHD1
Glutathione peroxidase 5
GRIK2
SLC22A1
RP11-235G24.1
TBX18
TGM3
RIN2
SLC24A3
Q9ULE8_HUMAN
C20orf117
Breast carcinoma amplified sequence 4 (BCAS4)
Nuclear factor of activated Tcells (NFATC2)
SCUBE1
JAG1
【請求項３９】
前記実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載されているような方法。
【請求項４０】
前記実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載されているような使用。
【請求項４１】
前記実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載されているようなＤＮＡ遺伝子座群。
【発明の詳細な説明】
【関連出願のクロスリファレンス】
【０００１】
本発明は２０１０年５月１２日に出願された英国特許出願番号1007944.0の優先権を主張する。英国特許出願番号1007944.0の内容は、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、生体サンプルが受けてきた曝露の診断および特性明瞭化のための、生物のゲノムＤＮＡ内に位置する標的ＤＮＡ配列群をコンパイルし使用するための方法に関し、および／または組織（または複数の組織）または細胞（または複数の細胞）の属性または由来に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体サンプル（個々の細胞から複合的な多細胞真核植物および動物まで）はすべて、細胞過程に影響を与える環境要因に継続的に晒されている。これら環境要因は、物理的曝露、化学的曝露、生物的（例えば病害虫）曝露、ウイルスへの曝露、や放射能への曝露など、多数の様々な曝露の形態をとり得る。これら曝露が生物組織の効率的な機能性を減少させる時、それら曝露はストレスと呼ばれる。
【０００４】
広義において、ストレスとは、生物学的組織または個体の効率的な機能性のために最適な生物および非生物条件からのなんらかの乖離と定義できる。
【０００５】
したがって、本発明の文脈で使用される意味でのストレス（または複数のストレス）には、非生物ストレスと、生物および発生ストレス（例えば、病原体媒介疾病や、癌や加齢などの内因性「システムブレークダウン」疾病などに晒されることなどであるが、これらに限定されるわけではない）とがある。
【０００６】
たとえば、何名かの著者は、植物に影響を与える非生物ストレスを多数列挙し、これらストレスにさらされることにより植物中に誘発される物理的な応答を記載してきた。（例えば、Orcutt and Nilsen 2000)；Padmanabh 2005）。同様に、Bijlsma and Loeschcke（1997）が編集した著作では、広範囲の環境的ストレスが記載され、それらの進化過程への影響が調査されている。Goh et al.（2007）は、多大なヒト疾病ストレス群を列挙し、遺伝子発現へのそれらの効力について報告している。ヒト、マウス、およびシロイヌナズナなどのいくつかの動植物の種におけるストレスの広範なリストが、Hruz et al. (2008)によってGenevestigatorというウェブサイト（https://www.genevestigator.com）で提供されている
【０００７】
非生物ストレスの例としては、熱、浸透圧、身体外傷、栄養不足、化学的に誘発されたストレス、および生理学的ストレス、たとえば、有害物質、予防薬、肥料、治療薬剤、または娯楽のための麻薬などがあるが、これらに限定されるわけではない。
【０００８】
生物および発生ストレスの例としては、病原体媒介疾病、寄生生物による侵食、癌などの内因性「システムブレークダウン」疾病などがあるが、これらに限定されるわけではない。
【０００９】
また、標準的なストレスが生物に健康やその他の利益を提供するという例、すなわち、肯定的ストレスもある。肯定的ストレスの多数の例の中には、高山植物の群生中で、個々が近接していると、植物対植物の競争ストレスに通常付随する損失よりもむしろ、それ以上の適合の恩恵をもたらすことを示したCallaway et al. (2002)による研究がある。Dhabhar and McEwen(1998)は、短期間の抑制剤が、ヒトの皮膚の遅延型過敏症を著しく改善することを示し、ストレスによって誘発される白血球の皮膚への輸送が、研究で観察された免疫改善の仲立ちとなると主張した。Poss and Tonegawa（1997）は、マウスのヘムオキシゲナーゼ1(Hmox1)、すなわち、ストレスを与えられた哺乳類の細胞中で古典的に上方制御される遺伝子の、制御および活性を研究した。彼らは、この遺伝子の上方制御が酸化ストレスに対する細胞の保護を提供し、したがってストレス曝露からの肯定的な恩恵を供与していることの証拠を提供した。
【００１０】
なんらかの生物システムの最適な性能に影響を与える多数のパラメータと、ほぼ全ての生物が存在する環境の本来可変な性質とを考えると、各生物の各々がその生存期間中に様々な形態のストレスに遭遇することは避けようがない。
【００１１】
個々の生物は、忍耐（乗り切ることができる準最適なストレスに対して）および／または回避（耐えられないストレス全てに対して、また、動作効率を減少させるストレスの多くに対して）の組み合わせによって、ストレスの効力に対して適合できる。
【００１２】
生物が、回避できないストレスに遭遇する時、そのストレスを克服するためのメカニズムには生物学的適応が含まれ、これは通常、システムの重複を有効利用し、かつ新たな条件下でよりよく機能する経路を採用／強化する代謝経路への変更と、一般的には考えられる（Madlung et al., 2004）。かかる変更は、上流制御領域と遺伝子自身との両方における差次的シトシンメチル化を介した遺伝子の転写制御の調節を含む多数の方法で達成できる（例えば、Aceituno et al., 2008）。
【００１３】
所与のストレスから起こる生理学的変異化は、当初の受容体遺伝子または複数のかかる遺伝子（ストレスを検出するもの）に影響する制御に関する変更に限られず、受容体に対する変更の結果として変更されたその他の遺伝子のカスケード（ストレス応答遺伝子および応答遺伝子経路）をも含む。
【００１４】
様々なストレスエリシターにより採用されたストレス応答遺伝子／経路にはかなりの重複性がある。たとえば、ジャスモン酸経路は、生物ストレスと非生物ストレスとの両方に対するシロイヌナズナの応答に関与する（この相互作用の考察についてはDevoto and Turner 2005ならびにWasternack 2007を参照）。
【００１５】
ＤＮＡメチル化は、植物、哺乳類、鳥類、線形動物などの無脊椎動物を含む多数の真核生物群に広く見られる（Finnegan et al., 1998; Suzuki S et al., 2007; Gupta S, et al., 2006; delGaudio R, et al., 1997)。植物中では、ＤＮＡメチル化は、遺伝子サイレンシング、たとえばシロイヌナズナの遺伝子ＳＵＰ、ＰＡＩ、およびＡＧの高メチル化対立遺伝子における遺伝子サイレンシング（Jacobson and Meyerowitz, 1997, malequist et al., 1999, Jacobson et al., 2000）や、リナリアのＬＣＹＣにおける遺伝子サイレンシング（Cubas et al., 1999）などと関連付けられてきた。しかし、シロイヌナズナの対立遺伝子ＡＰ３およびＦＷＡの低メチル化は、異所発現を呈した（Kinoshita et al., 2004）。植物の発生と細胞型の制御におけるＤＮＡメチル化の役目について示す報告がいくつかある（Finnegan et al., 2000）。
【００１６】
ＤＮＡメチル化もまた、ヒトなどの哺乳類の遺伝子発現のエピジェネティックな調整において役割を果たすことも知られ、なんらかの組織型と関連付けることができる。注目する特定の遺伝子ＤＮＡ標的領域のメチル化の度合いを判定することは、研究分野において有用である。
【００１７】
ヒトやその他の哺乳類において、メチルシトシンは主にシトシン・グアニン（ＣｐＧ）ジヌクレオチド中に見られる。ゲノムＤＮＡメチル化は遺伝子制御に重要な役割を果たす。癌など、ヒトの悪性腫瘍中で観察される最も初期でかつ一般的な遺伝子変化には、いわゆるＣｐＧアイランド、特に遺伝子の５’制御領域中に位置するＣｐＧアイランドの、非定型的メチル化があり、これはかかる遺伝子の発現を変化させる。
【００１８】
ＤＮＡメチル化と遺伝子制御との関連付けから、発生の進行の特定の状態、細胞、組織または臓器の同定、疾病やその他の形態のストレスの発現またはそれへの曝露を診断するための診断ツールとして、ゲノム中の特定部位におけるＤＮＡメチル化の存在および程度を使用することに、研究の関心が向けられることが多くなった。
【００１９】
ストレス応答経路自体は、メンテナンスまたはハウスキーピング経路中で作用する遺伝子および関連する制御領域のメチル化に影響を与える。多くの様々なストレスが同じストレス応答遺伝子を活性化させうるので、これら遺伝子のいずれかの発現に関連するメチル化変化があるからといって、その活性化を引き起こしたストレスそのものを、個別的に診断づけるわけではない。この文脈から考えると、応答（メチル化または脱メチル化の誘発）に対して、原因（個々のストレス）を直接割り当てる際に、かかる部位はあまり重要ではない。なぜなら、ＤＮＡメチル化の同じ変化が、いくつかの異なるストレスによって引き起こされうるからである。こういうわけで、疾病やその他の形態のストレスを診断するためにＤＮＡメチル化を利用するという試みで中心になっているのは、新たな部位を各疾病またはストレスについて集め、特定の疾病またはストレスを、個別的に、またはまとめて診断づける部位を新たに探し出すことである。
【００２０】
遺伝子または関連する制御領域内の単一または多数の部位のＤＮＡメチル化と、特定のヒトの疾病との間の関連を確定した研究例は数々ある。その中には、白血病；頭頸部癌；ホジキン病；胃癌；前立腺癌；腎癌；膀胱癌；乳癌；バーキットリンパ腫；ウィルムス腫瘍；プラダー・ウィリー／アンジェルマン症候群；ＩＣＦ症候群；皮膚線維腫；高血圧；小児神経生物学；自閉症；潰瘍性大腸炎；脆弱性X症候群；およびハンチントン病などがある。たとえば、下記を参照されたい。
白血病            Aoki E et al. (2000); Nosaka K. et al. (2000); Asimakopoulos F A et al.(1999) ; Fajkusova L et al. (2000); Litz CE et al. (1992)
頭部癌、頸部癌    Sanchez-Cespedes M et al (2000)
ホジキン病        Garcia JF et al. (1999) 
胃癌              Yanagisawi Y et al. (2000)
前立腺癌          Rennie PS et al. (1998-99)
腎癌              Clifford SC et al. (1998)
膀胱癌            Sardi I et al. (1998)
乳癌              Mancini DN et al. (1998); Zrihan-Licht S et al. (1995);  Kass DH et al.(1993) 
バーキットリンパ腫   Tao Q et al. (1998)
ウィルムス腫瘍       Kleymenova EV et al. (1998)
プラダー・ウィリー／アンジェルマン症候群   Zeschnigh et al. (1997); Faang P et al. (1999)
ＩＣＦ症候群      Tuck-Muller et al. (2000) 
皮膚線維腫        Chen TC et al. (2000) 
高血圧            Lee SD et al. (1998) 
小児神経生物学    Campos-Castello J et al. (1999)
自閉症            Klauck SM et al. (1997)
潰瘍性大腸炎      Gloria L et al. (1996)
脆弱性X症候群     Hornstra IK et al. (1993)
ハンチントン病    Ferluga J et al. (1989)
【００２１】
特定部位のメチル化は、また、その他の（非ヒトの）高等生物のゲノム中で、特定のストレスや疾病に関連しているものとして認められてきた。その例には以下のものが含まれる。
【００２２】
タバコ植物（Nicotiana tabacum）では、Ｉ型メチルトランスフェラーゼNtMET1のサイレンシングにより、ゲノム中のメチル化が減少する。Wada et al., (2004)は、約３０個の遺伝子が上方制御され、その半分以上が生物または非生物ストレスへの応答に直接関連していたことを示した。さらに、Choi et al., (2007)は、タバコ植物において、病原応答性遺伝子NtGPDLのメチル化パターンが、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）の人工接種の２４時間以内に変化し、この変化が植物の過敏性反応（ＨＲ）と関連していることを示した。
【００２３】
トウモロコシ（Zea mays）において、低温ストレスは、メチルトランスフェラーゼ転写を減少させ、必然的にＤＮＡメチル化も減少させるように見える（Stewart et al, (2000)）。その後の研究（Stewart et al, (2002)）において、同じグループがHPLC解析を使用して、低温ストレスがグローバルなメチル化における１０％よりも大きい減少を引き起こすが、一見したところＡｃ／Ｄｓトランスポゾンに限定されている、ということを確認した。
【００２４】
メチル化はまた、高濃度の重金属からのストレスに対する耐性にも関連付けられてきた。たとえば、Lee et al., (1998)は、メチルトランスフェラーゼの増大した活性（したがってより大きなメチル化）を示すハムスター細胞株が、重金属に対する良好な耐性を示したことを提示した。
【００２５】
広範囲な生物においてストレスと関連したメチル化された遺伝子座の考察については、Peng and Zhang (2009)、ならびにHruz et al, (2008)、また、Genevestigatorというウェブサイト（https://www.genevestigator.com）を参照されたい。
【００２６】
従来技術において診断目的のＤＮＡメチル化パターンを解明するために使用される方法が現在目指しているのは、個々の環境曝露、すなわち特定の疾病、発生過程の特定の状態、または特定のストレスの診断用の遺伝子座を特定し解明することである。WO2007/132166は、妊娠した女性において、胎児由来の遺伝子（RASSF1A, APC, CASP8, RARB, SCGB3A1, DAB21P, PTPN6, THY1, TMEFF2,およびPYCARDなど）が高メチル化され、その一方で母性由来の同じ遺伝子はメチル化されていないという発見について記載している。妊娠した女性からの生体サンプル中にこれらメチル化された胎児の遺伝子の一つ以上を検出することが、サンプル中の胎児のＤＮＡの存在の万能指標としてどのように機能するかについて、前記研究が述べている。非侵襲性の解析プロセスでは胎児ＤＮＡの質および量が監視されるが、その陽性対照としてこれら胎児メチル化マーカーが特に有用であると記載されている。
【００２７】
US2006-0183128（WO2005/019477としても公開されている）は、組織を区別するためのエピジェネティックマーカーを特定するゲノムワイドのエピジェネティックマップを記載している。このアプローチは、メチル化可変ＣｐＧ位置（ＭＶＰ）とゲノムＤＮＡサンプル型間の相関関係を含む。前記エピジェネティックマップは、たとえばサンプル型の特定や、サンプル型間の識別など、幅広い有用性を有する。核酸配列の一つまたは一群のエピジェネティック特性の解析は、エピジェネティックマップの文脈において、核酸の由来を判定することのみを可能にし、環境曝露／ストレスのプロファイルの判定を可能にはしない。
【００２８】
US2007-0292866は、ヒトゲノムＤＮＡのメチル化におけるグローバルな変化と、ヒトゲノムの特定の領域のメチル化における変化とを検出する方法に関する。前記方法は、疾病の診断、予後、および治療法の監視、ならびに、食事および／または栄養補助食品の結果であるメチル化の変化の検出、を可能にする。前記ストレスを別々に特定できるにすぎない。
【００２９】
US2004-0029117は、薬物、化学物質および／または医薬組成物の生物学的作用および／または活性を判定するためのマーカーとして利用できる差次的にメチル化されたＤＮＡ遺伝子座の特定を可能にする、包括的発明を記載している。前記薬物、化学物質および／または医薬組成物を、それぞれについてのエピジェネティックマーカーを別々に使用して、個別的に調査できるにすぎない。
【００３０】
したがって、今まで、特定のストレスを特定するためのＤＮＡメチル化の使用は、個々のストレスを一回に一つ調査する際に使用されるマーカーに限られているかまたは、その他には原料物質（例えば、組織／器官／細胞型）を特定する、または生理学的状態を確定するためである。
【００３１】
その結果、様々なストレスを研究する、特に、一つの解析で多数のストレスを検証する、より効率のよいシステムが必要とされている。理想的には、同一の解析が、原料物質や生理学的状態の区別もできるとよい。
【発明の概要】
【００３２】
本発明は、個体、組織、器官または細胞が様々なストレスに曝露されていることを集団的に、かつ繰り返し、同定するために、および／または、サンプルが曝露されていたストレスの一般的な、または特定の性質を診断するために、および／または、生体サンプルの生理学的状態または由来（例えば、細胞型または器官）を診断するために使用できる、ゲノムＤＮＡ内のマーカー群の特定を可能にするシステムを提供する。
【００３３】
本発明のマーカーＤＮＡ配列は、以下、（交換可能に）「ＤＮＡ遺伝子座」、「センチネル」、「ストレスセンチネル」と称され、それらは生体サンプル（個々の生物、器官、組織または細胞を含む）が経験したストレス（または複数のストレス）を特定することができる。ストレスセンチネルはそれぞれ配列モチーフを含むが、前記配列モチーフは、たとえば生物があるストレスに曝露された後であって他のストレスに曝露されている時ではない時に；および／または、細胞がいくつかの細胞型に分化するが、他の方には分化しない場合；および／または、サンプルが採取された器官または組織に応じて；および／または細胞型、組織、器官、または個体の生理学的年齢または発生状態に応じて、そのＤＮＡメチル化状態（通常はシトシン残基であるが、必ずしもそれらに限定されない）を変化させる。このように、ＤＮＡメチル化の総合的なパターンは、ストレスセンチネル群全体にわたって検討されると、以下の特定を可能にする：生体サンプルが一つ以上のストレスの下で作用しているかどうか；または一つ以上のストレスに曝露されてきたかどうか；および／またはサンプルの由来または原料物質の生理学的状態を診断するために使用できるかどうか。サンプルが曝露されてきたストレスは、既知のストレスであっても（すなわち、ストレスセンチネルによって既に特徴が明瞭化されている）、不明のストレスであっても（ストレスセンチネルによって特徴が明瞭化されていない）よい。サンプル（組織、器官、または細胞型）の生理学的状態または由来のソースは、標準的な基準サンプルとの比較によって、一般的に推察されるであろう（例えば、肝細胞からのＤＮＡと関連したＤＮＡメチル化プロファイルとの一致は、サンプルが肝臓サンプルからのものであることを意味する）。
【００３４】
ストレスセンチネルの重要な特性は、どのひとつのセンチネルも何らかの一つのストレス、原料物質、または生理学的状態を個別に診断付けはしないこと、および、センチネルは一つのストレス（または原料物質または生理学的状態）を使用して特定できるけれども、別のストレス（または原料物質または生理学的状態）に曝露されたサンプルに適用される時にもなお診断特性を保持しているということである。既存のシステムは、広範囲の比較対照状態に対して判断される標的状態の調査に基づいて、ストレス／組織／発生の状態を個別的に診断づけるメチル化マーカーを特定することを目指しているが、これに対して上述した特性は顕著な改善を提供する。既存のアプローチは、広範囲なサンプリングによって、以前に標的条件を診断づけると考えられていたのと同じメチル化状態を異なる状態／組織／細胞型が共有することが明らかになると、役に立たなくなりがちであるという弱点を有する。対照的に、センチネルマーカーはこの事態を包含し、幅広いサンプリングにより役に立たなくなる可能性が格段に低く、（既存のシステムと異なり）これまでに特徴が明瞭化されていなかった応答を違うものとして診断づけることができる。
【００３５】
センチネル自体は、コード領域、制御領域、またはイントロンに関連するＤＮＡからのものであっても、そうでなくてもよく、遺伝子発現における既知の変化に関連していてもしていなくてもよい。さらに、センチネル部位は、その部位でのメチル化状態への変化がストレスの間で一貫し、かつ確実であれば、遺伝子発現に関連しない非コード領域に存在してもよい。
【００３６】
本発明は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、マウス（Mus）、ヒトにおけるセンチネルＤＮＡメチル化マーカー群（またはそれらが起こりうる証拠）を参照してこの特性を例示しているが、これらセンチネルＤＮＡメチル化マーカー群は、一つのストレス群に応答する差次的メチル化（またはメチル化変化に感度が高いと知られている遺伝子の差次的発現に基づいた推定差次的メチル化）に基づいて選択され、マーカー選択過程において使用されていないストレス（または組織型）に曝露されたサンプルを特定できることが示されている。
【００３７】
これらマーカーから生成される二成分プロファイルに基づいた関連またはクラスターを判定するための確立された方法を、新規のストレス（すなわち未訓練ストレス）が属する広義のストレスカテゴリーについて何らかの指針を提供するために使用することができる。それには、主座標分析、診断決定木、決定木などの多変量解析が含まれるが、これらに限定されるわけではない（たとえば、Analysing Ecological data (2007), Springer (NY) Ch 15 pp259-264, ISBN 978-0-387-45967-7参照）。
【００３８】
さらには、センチネルマーカー群が記載されているが、これらセンチネルマーカーは、少なくとも７８個の異なるストレス型を識別可能である発現パターン（したがって、メチル化状態）を有する、シロイヌナズナの、メチル化制御ストレス応答遺伝子の制御領域に由来する。このアプローチの感度がよいであろうことは、ストレスのいくつかが非常に軽微である（７８個の調査された遺伝子のうち５個未満において変化を誘発した）という事実が示している。
【００３９】
さらに、シロイヌナズナの当初の前記７８個の遺伝子マーカー群から一連の４０個の遺伝子マーカーのサブセットを使用し、かつ、新規のストレスをユニークな（すなわち訓練用群とは異なる）もの、対照とは異なるが既存のストレスと同じ（すなわち、訓練用群の中にある）もの、または対照と同じもの（偽陰性）、と特定される頻度を定量するためにこれらマーカーを使用して、シロイヌナズナの遺伝子座を訓練することにより、センチネルの原理を例証する。また、異なる組織内で差次的にメチル化されると知られているヒトの遺伝子座の群を使用して組織型を特定するセンチネルの能力も示される。組織の限定された群に対してセンチネルを選択し使用することにより、センチネルの特定には使用されていない組織の診断を可能にすることが示されている。この文脈において、診断とは、細胞、組織、器官、または生物の生理学的および表現型の状態の特定、またはそれらにおける変化の特定を意味する。
【００４０】
本明細書中では、明瞭かつ簡潔な明細書が記載できるような方法で実施形態が記載されるが、前記実施形態は本発明から乖離することなく様々に組み合わせられたり分割されたりしてもよいことが意図されており、そのように理解されるであろう。
【００４１】
本明細書中で、「約」という用語は、プラスまたはマイナス２０％を意味し、より公的にはプラスまたはマイナス１０％を意味し、さらに好適にはプラスまたはマイナス５％を意味し、最も好適にはプラスまたはマイナス２％を意味する。
【００４２】
本明細書中で、「成長」という用語を使用することは、細胞、組織、または生物が見いだされる、置かれる、または培養される生活環境を意味する。たとえば、前記用語は、成長や、生活、環境的および／または発生状況に関していてもよい。「成長させる」および「成長」という用語は、期間、研究、または注目する期間における、細胞、組織、または生物の生存および／または繁殖を意味する。
【００４３】
本発明の第一の態様において、非定型成長条件（ストレス）を特定するためのＤＮＡ遺伝子座（ストレスセンチネル）群を特定する方法が提供され、前記方法は、
(i)  対照成長条件下で、注目する細胞のサンプルを成長させる工程と；
(ii)  工程(i)の注目する細胞と同じ細胞のサンプルを、少なくとも一つの非定型成長条件のある環境で成長させる工程と；
(iii)  工程(i)および(ii)の各細胞サンプルからＤＮＡを単離する工程と；
(iv)  前記工程(iii)の単離したＤＮＡ中の、メチル化できる遺伝子座の、メチル化状態を特定する工程と；
(v)  前記工程(i)および(ii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する工程と；
(vi)  遺伝子座のサブセットを選択する工程であって、前記遺伝子座のサブセットは、前記工程(ii)からの単離したＤＮＡにおいて前記工程(i)からの単離したＤＮＡとは遺伝子座のメチル化状態が異なっていることが特徴である、工程と；
(vii)  前記工程(vi)で選択された遺伝子座のサブセットを特定する工程と；
(viii)  前記選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態を、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）および／または注目する細胞サンプルと関連させる工程と；
を含む。
【００４４】
必要に応じて、前記方法は、
(ix)  前記選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態を、前記遺伝子座を選択するためには使用されなかった、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせと関連させる工程、
を含む。
【００４５】
本発明の第二の態様において、特定の非定型成長条件（ストレス）を特定するための複数のＤＮＡ遺伝子座（ストレスセンチネル）群を特定する方法が提供され、前記方法は、
(i)  対照成長条件下で、注目する細胞の複数のサンプルを成長させる工程であって、前記複数の注目する細胞は異なる遺伝子型を有する、工程と；
(ii)  工程(i)のように注目する細胞の複数のサンプルを成長させる工程であって、前記細胞は少なくとも一つの非定型成長条件のある環境にある、工程と；
(iii)  工程(i)および(ii)の各細胞サンプルからＤＮＡを単離する工程と；
(iv)  前記工程(iii)の単離したＤＮＡ中の、メチル化できる遺伝子座の、メチル化状態を特定する工程と；
(v)  前記工程(i)および(ii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する、または、前記工程(i)および(iii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する、もしくは前記工程(ii)および(iii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する工程と；
(vi)  遺伝子座のサブセットを選択する工程であって、前記サブセットは、前記工程(ii)からの単離したＤＮＡにおいて前記工程(i)および／または(iii)からの単離したＤＮＡとは遺伝子座のメチル化状態が異なっていること、および／または前記工程(iii)からの単離したＤＮＡにおいて前記工程(i)からの単離したＤＮＡとは遺伝子座のメチル化状態が異なっていること、が特徴である、工程と；
(vii)  前記工程(vi)で選択された遺伝子座のサブセットを特定する工程と；
(viii)  前記選択された遺伝子座のサブセットとそのメチル化状態を、前記非定型成長条件および／または注目する細胞サンプルと関連させる工程と；
を含む。
【００４６】
必要に応じて、前記方法はさらに、
(ix)  前記選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態を、前記遺伝子座を選択するためには使用されなかった、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせと関連させる工程、
を含む。
【００４７】
本発明の第三の態様において、複数の非定型成長条件を特定するためのＤＮＡ遺伝子座群を特定する方法が提供され、前記方法は、
(i)  対照成長条件下で、注目する細胞のサンプルを成長させる工程と；
(ii)  工程(i)の注目する細胞と同じ細胞の複数のサンプルを、少なくとも一つの非定型成長条件のある環境で成長させる工程であって、各サンプルは異なる非定型成長条件中で成長させられる、工程と；
(iii)  工程(i)および(ii)の各細胞／サンプルからＤＮＡを単離する工程と；
(iv)  前記工程(iii)の単離したＤＮＡ中の、メチル化できる遺伝子座の、メチル化状態を特定する工程と；
(v)  前記工程(i)および(ii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する工程と；
(vi)  遺伝子座のサブセットを選択する工程であって、前記サブセットは、各サンプル(ii)からの単離したＤＮＡにおいて前記工程(i)からの単離したＤＮＡとは遺伝子座のメチル化状態が異なっていることが特徴である、工程と；
(vii)  前記工程(vi)で選択された遺伝子座のサブセットを特定する工程と；
(viii)  前記遺伝子座のサブセットとそのメチル化状態とを、前記工程(ii)の異なる非定型成長条件に関連させる工程と；
を含む。
【００４８】
必要に応じて、さらに、
(ix)  前記選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態を、前記遺伝子座を選択するためには使用されなかった、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせと関連させる工程、
がある。
【００４９】
好適には、前記遺伝子座のサブセットの各遺伝子座が、単一の条件のみを診断付けるわけではない。
【００５０】
好適には、選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態が、前記遺伝子座を選択するためには使用されなかった、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせを診断付ける。
【００５１】
好適には、選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態が、前記遺伝子座を選択するために使用された、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせを診断付ける。
【００５２】
好適には、選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態が、(i)前記遺伝子座を選択するためには使用されなかった、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせと；  (ii)前記遺伝子座を選択するために使用された、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせとを、診断付ける。
【００５３】
本発明の全態様の方法の中核をなすのは、ストレス、原料物質、および／または生理学的状態を診断付けるために使用できる、何より、選択過程のために使用できる、メチル化部位（センチネル）を特定し選択するために使用される基準である。これを得るために、条件間および／または原料サンプル間でおおむね多様なマーカーであって、理想的には単一の条件のみを診断付けるわけではないマーカーを選択することが、好ましい。このように、診断に結びつくのは、２〜３個の条件特異的遺伝子座の状態ではなく、むしろ、複数のセンチネルにわたる差次的メチル化パターンである。この原理を示す表を以下に示す。
【００５４】
したがって、本発明の方法において、遺伝子座の選択されたサブセットが、条件間で、および／または原料サンプル間で多様な遺伝子座であって、単一の条件および／または原料サンプルのみを診断付けるわけではない遺伝子座から構成されることが好ましいことは当然であろう。
【００５５】
仮定の状況において６個のストレス（Ａ〜Ｆ）と８個の遺伝子座（１〜８）があり、様々なストレスに対するメチル化状態を、メチル化（＋）または非メチル化（−）と採点している。下記の表１（ａ）は、想定できる一つの結果を示す。
【００５６】
【表１ａ】
2013526271.tif 000002
【００５７】
全８個の遺伝子座のうち、遺伝子座６および７は、ストレスの訓練群の間で異なっていない（すなわち、遺伝子座６はすべてメチル化され、遺伝子座７はすべてメチル化されていない）ので、潜在的センチネルとしては削除される。
【００５８】
遺伝子座３および４は異なっており、それぞれ一個のストレス（それぞれＡとＦ）を診断付ける。これらはセンチネルの候補と考えられるが、遺伝子座に対し１個のストレスを示しているようなので理想的ではなく、もしほかのストレスがあれば、多数のストレスのプロファイルでは目立ちそうにない。
【００５９】
残る遺伝子座は、なんらかの一つの特定のストレスを診断付けるわけではないが、集団的に訓練用群中のストレスすべての分離を可能にする（下記の表１（ｂ）を参照）。
【００６０】
【表１ｂ】
2013526271.tif 000003
【００６１】
別のストレスがさらに導入されると（Ｇ、矢印で示す）、このストレスは前記選択過程で使用されなかったのに、前記選択されたセンチネルマーカーで識別できるが、前記削除されたものでは識別できない。
【００６２】
【表１ｃ】
2013526271.tif 000004
【００６３】
このように、理想的なセンチネルマーカーは、ストレス／サンプル源のほぼ半数に現れ、ストレスを相互補完的に「分離」する。
【００６４】
メチル化検出工程は、既存のいずれの方法を使用して行ってもよく、その例としては、メチル化感受性増幅断片解析（ＭＳＡＰ）、つまりアイソシゾマー制限酵素を使用して生成されたマルチプロダクトプロファイルが比較される増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）（Xiong et al, 1999参照）；重亜硫酸ナトリウムでＤＮＡを処理した後サイクルシークエンシングを行う方法（Frommer et al. 1992参照）、ピロシークエンシング（Uhlmann et al. 2002参照）、超高速単分子ＤＮＡシークエンシング（たとえばZeschnigk et al 2009参照）、またはqPCR（Munson et al 2007参照）、ＨＰＬＣ（たとえば、Sandhu et al 2009）、質量分光測定法（たとえば、Igarashi et al 2009）などがあり（これらに限定されるわけではない）、または高分解能溶融分析（WO2009/010776）を直接行うことによって行ってもよい。一つの実施形態において、メチル化状態は、厳密に定性的に（つまり、その有無で）使用される。別の実施形態では、メチル化状態は、たとえば判定の閾値を設定する、量的なデータに基づく判別分析システムを配備する、などによって、遺伝子座のメチル化についての量的なデータによって測定される（主成分分析（ＰＣＯ）など）。
【００６５】
ＰＣＯ分析は、多次元にわたる変動が測定されて、第一軸（第一主成分として知られる）が一つの次元の変動の最大量をとらえるように新たな軸をひく、標準的な技術である。第二軸は、別の軸にいくつかの次元にわたる変動の二番目に大きい量をとらえ、それは第二主成分として知られる。このように、第一および第二成分が何らかの特定の変数を示さず、これが標準的な分析戦略である。
【００６６】
「注目する細胞のサンプル」という表現は、生体外の細胞株から得られた細胞や、組織、器官、または生物全体などの生体材料から得られた細胞、またはそれらを形成する細胞をも含む。
【００６７】
「注目する細胞のサンプルを成長させる」という表現は、生体外または生体内の条件における細胞の成長を含む。たとえば、細胞のサンプルは、細胞成長用の適切な実験室機器中で、生体外で成長させられてもよい。または、細胞のサンプルは、「生体内で」、すなわち、注目する個体生物（植物、動物、またはヒトなど）中で、成長させられてもよい。
【００６８】
「対照成長条件」という表現は、成長条件が能動的に制御される（すなわち指定され調整される）こと、または成長条件の特徴が明瞭化されているという意味を含む。前記対照成長条件は、細胞のサンプルがどのように成長させられるかによって決まり、能動的制御は生体外成長条件にとってさらに適切であり、特徴が明瞭な制御条件は生体内成長条件にとってさらに適切である。ただし、常にそうでなくともよい。
【００６９】
「非定型成長条件」という表現は、前記対照成長条件中の等価の条件とは異なる成長条件、たとえば前記対照成長条件と比べて高い温度など、を意味する。
【００７０】
前記「非定型成長条件」という表現は、変化した個々の条件、たとえば温度、ｐＨ、光照射などを含み（しかしこれらに限定されるわけではない）、また、全組織または生物レベルでは、生理学的状態、疾患状態、化学物質、薬物、生物学的作用物質などに対する曝露なども含む。
【００７１】
「表現型および／または生理学的変化」という表現は、細胞、組織、または全生物レベルのいずれかで測定可能な変化を含む。たとえば、高温度への曝露は、細胞レベルと全生物レベルとでは異なる観察可能な効果を有するであろう。
【００７２】
変化は、質的（たとえば、物理的反応）であっても、量的（既存の表現型または生理学的特徴の増減）であってもよい。
【００７３】
本発明の第二または第三の態様のひとつの実施形態において、前記工程(ii)における複数のサンプルは、１〜１０，０００個のストレス条件であり、好適には１０〜５００個のストレス条件であり、さらに好適には３０〜１００個のストレス条件である。
【００７４】
好適には、たとえば前記工程(iii)で特定された遺伝子座は、非定型成長条件に曝露されたサンプルと対照サンプルとの間で、または選択に使用された細胞サンプル間で、区別が明瞭である。
【００７５】
本発明の第一、第二、第三の態様のいずれにおいても、工程(vii)、(viii)、および必要に応じた工程(ix)の後に以下の工程が行われる。
(x)   前記遺伝子座のサブセットとそのメチル化状態とを、前記細胞サンプル、または前記細胞サンプルが得られた組織、器官、または生物中の表現型および／または生理学的応答と関連させる工程。
【００７６】
一つの実施形態において、本発明の第一、第二、第三の態様のいずれかの方法は、必要に応じて、
(xi)  細胞のサンプルからＤＮＡを単離する工程であって、前記細胞の成長条件は不明である、工程と；
(xii)  前記工程(xi）の単離したＤＮＡ中の、前記工程(vii)で特定された前記遺伝子座のサブセットのメチル化状態を特定する工程と；
(xiii)  前記工程(xi)の細胞のサンプルが非定型成長条件に曝露されていたかどうかを特定するために、前記工程(xii）で特定された遺伝子座のメチル化状態を、前記工程(viii)の結果と比較する工程と、
を含んでもよい。
【００７７】
別の実施形態において、本発明の第一、第二、第三の態様のいずれかの方法は、（上記必要に応じた工程(x)に続いて）必要に応じて、
(xi)  細胞のサンプルからＤＮＡを単離する工程であって、一つ以上の非定型成長条件に曝露された時の前記細胞（またはその細胞が得られた組織／生物）の表現型および／または生理学的応答が不明である、工程と；
(xii)  前記工程(xi）の単離したＤＮＡ中の、前記工程(vii)で特定された前記遺伝子座のサブセットのメチル化状態を特定する工程と；
(xiii)  前記細胞（またはその細胞が得られた組織／生物）が、特徴が明瞭または不明瞭な非定型成長条件に対する表現型および／または生理学的応答をしたかどうかを特定するために、前記工程(vi)で特定された遺伝子座のメチル化状態を、前記工程(x)の結果と比較する工程と、
を含んでもよい。
【００７８】
好適には、前記工程(xii)は、前記細胞が曝露されていた非定型成長条件のタイプも特定する。
【００７９】
有利には、前記工程(xii)は、前記工程(ii)でテストされなかった非定型成長条件に前記細胞が曝露されたことを特定する。
【００８０】
好適には、前記方法、たとえば前記工程(viii)はまた、前記細胞／組織／器官／個体が曝露されていた非定型成長条件に対する生理学的応答のタイプも特定する。
【００８１】
有利には、前記工程(xiii)は、前記細胞（またはその細胞が得られた組織または生物）が、前記工程(i)および(ii)の細胞と関連する前記応答とは異なる一つ以上の非定型成長条件に曝露された後に、表現型および／または生理学的応答をしたことを特定する。
【００８２】
好適には、前記対照成長条件が、前記注目する細胞の生物学的に正常な生体内成長条件の範囲と同じ範囲である。当業者であれば、前記正常な成長条件は、調査されている細胞型または生物に応じて決まるということを理解するであろう。正常な成長条件の例は、指定された細胞株または組織の培養のための、またはさらには、指定された種または属またはより高次の分類群の生物の生存のための、公開されたプロトコルを構成する。
【００８３】
本発明に使用されてもよい前記多数の特定の細胞株のいくつかのための正常な成長条件の例は、下記を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００８４】
前立腺癌 DU145  Alimirah F, et al (2006).  "DU-145 and PC-3 human prostate cancer cell lines express andogren receptor: implications for the androgen receptor functions and regulations".  FEBS Lett. 580 (9): 2294-300. 
【００８５】
乳癌 MCF-7  Dickson RB et al (1986) "Characterisation of estrogen responsive transforming activity in human breast cancer cell lines".  Cancer Res. 46: 1707-13.
【００８６】
白血病 THP-1  Dickson RB et al (1986).  "Characterisation of estrogen responsive transforming activity in human breast cancer cell lines".  Cancer Res.  46: 1707-13.
【００８７】
神経芽細胞腫 SHSY5Y  Biedler JL et al (1973) Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture.  Cancer Res. 33(11): 2643-52.
【００８８】
骨肉腫 Saos-2  Biedler JL et al (1973) Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture.  Cancer Res. 33(11): 2643-52.
【００８９】
ラット SP12  Greene LA and Tischler AS (1976).  "Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells with respond to nerve growth factor".  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73 (7): 2428-8.
【００９０】
マウス MC3T3  Bilezikian et al (2002).  Principles of Bone Biology. San Diego: Academic Press. 1506.
【００９１】
タバコ植物 BY-2  Nagata t et al (1992).  Tobacco BY-2 cell line as the "Hela" cell in the cell biology of higher plants.  International Review of Cytology. 132: 1-30.
【００９２】
前記センチネルマーカーを含む前記サブセットを構成するＤＮＡ遺伝子座の数は、好適には、研究下のゲノム中のＤＮＡメチル化の１〜５０００個の部位、または好適には、ＤＮＡメチル化を含む１０〜１０００個の標的領域、および最も好適には、ＤＮＡメチル化を含む２０〜１００個の標的領域である。
【００９３】
便宜的には、前記第二の態様の工程(ii)における様々な非定型成長条件は、相違する。「相違する」という表現は、前記非定型成長条件が同じまたは類似の型または種類ではないことを意味する。たとえば、温度と養分利用性とは、相違する条件とみなされるであろうし、同じ病原性種の違う型に曝露されることは相違する条件とはみなされない。
【００９４】
前記非定型成長条件は、特に、次にあげるものから選択してもよい：温度、物理的ストレス（大気圧の増減、対象物に対する指向性圧力、撹拌、重力、物理的緊張）、物理的損傷、養分利用性、化学毒素やホルモン、シグナル伝達分子への曝露、その他の化学薬剤への曝露、可視光線ストレス（スペクトルの質および強度）、地上レベルを超えた非可視光線（たとえば、Ｘ線、ガンマ線、赤外線、紫外線、マイクロ波など）の照射への曝露、病原体または寄生生物への曝露、その他の生物や同じ種のその他の構成体への曝露、他の生物や個体からの浸出液, 前記標的生物に対する他の生物による植食／摂食、水分ストレス（過多、または過少）、前記対象物が休止状態に入るように刺激するシグナルまたは条件への曝露、酸素ストレス、または、過剰または準最適な量の遊離基への曝露。
【００９５】
好適には、前記工程(vi)で選択された前記遺伝子座のサブセットは、細胞ストレス応答経路の成分用の遺伝子と関連する。前記遺伝子座は、遺伝子そのものであってもよく、または一つ以上の遺伝子と関連する制御領域であってもよい。
【００９６】
かかる遺伝子座は、保存されている細胞ストレス応答経路の機能の発現と関連したＤＮＡのエキソン領域または制御領域からのものであってもよい。植物についての例には、ジャスモン酸経路（たとえばDempsey et al 1999; Wasternack, 2007; Fan et al 2007; Zhao et al 2007; Reinbothe et al 2009参照）、一酸化窒素経路（たとえばWilson et al 2008)、サリチル酸経路（Fan et al 2007; Zabala et al 2009）、エチレン経路（たとえばZhao et al 2007参照）、アブシジン酸経路（Zabala et al 2009; Fan et al 2009)に直接または間接的に関与する遺伝子、およびフェノール化合物の制御に含まれる遺伝子（たとえばSaltveit and Choi, 2007参照）などがある（が、これらに限定されるわけではない）。
【００９７】
ヒトおよび哺乳類生物についての例は、ｐ５３マスター転写経路（たとえば、Millau et al 2009参照）；Ｐ１３Ｋ経路（たとえばAssinder et al 2009; Maria et al 2009参照）、ＰＴＥＮ−ＡＫＴ３シグナル伝達カスケード（たとえばMadhunapantula and Robertson 2009参照）、小胞体ストレス応答遺伝子hire1pおよびその関連物（Tirasophon et al 1998）およびＲＥＴ膜貫通受容体と関連するカスケード遺伝子（Myers and Mulligan 2004）などがある（が、これらに限定されるわけではない）。
【００９８】
便宜的には、前記遺伝子座は、前記注目する細胞の各ストレス応答経路の少なくとも一つの成分についての遺伝子または制御領域に位置する。
【００９９】
前記ＤＮＡ遺伝子座（センチネル）のサブセットは、メチル化変化の明瞭性および一貫性と、生物／組織／細胞型が様々な非定型成長条件（一般的にはストレス）に曝露される時に違うメチル化をするかもしれないセンチネルにまたがるメチル化パターンとに基づいて選択される。前記ＤＮＡ遺伝子座は集団で、メチル化プロファイルに変化をおこしたストレスを診断付ける「帰納的な診断」を可能にする。多数の誘発ストレスの特定が可能になるが、これは、センチネルマーカーが違うタイプのストレスへの相補的な（非同一の）応答（または無応答）を呈するからである。前記方法は、多数の部位に、多数のストレス誘導因子に対する生物または器官または組織または細胞型の生理学的応答全体に対してセンチネルとして作用させる。
【０１００】
便宜的には、前記ＤＮＡ遺伝子座は「万能」であるよう選択されるので、関連性の無い広範囲なストレスを特定するために使用することができる。ストレス診断は、選択されたセンチネルマーカーすべてにまたがるメチル化パターン全体に基づき、個々のストレスは、たとえば多変量解析や決定木解析など（これらに限定されるわけではない）によって特定される。重要なことに、このアプローチはまた、通常の制御プロファイルを呈するサンプルの診断と、不明なストレスへの曝露を示唆する、非定型だがこれまでに特徴が明瞭化されていない相違するプロファイルを呈するサンプルの診断とを可能にする。
【０１０１】
これらセンチネルにはいくつかの必須の特徴があるが、それは、特徴が明瞭化されたストレスや特徴が明瞭化されていないストレスを診断する能力を、ゲノムのランダムな選択、または特定のストレスと特異的に関連した標的領域、または全ゲノム（全ゲノムではノイズ‐シグナル比がストレスの区別の分解能を低下させうる）から推定されるその能力よりも高めるような特徴である。
【０１０２】
ストレスセンチネルの好適な特徴を下記に示す。
１．同一器官からの同一組織型については、同一のストレスに対して同様に応答してメチル化状態を再現可能に変化させる。
２．同一時に同一個体からの同一組織から採取された複製サンプル間でのメチル化状態に、理想的にはばらつきを示さないか、好適には２０％未満のばらつきをしめす。
３．容易に検出される異なるストレス状態と関連した定性的メチル化変化を生む。
４．あるストレスに対して応答してメチル化状態を変化させるが、ほかのストレスについてはそうしない（好適には、ストレスの１５〜８５％について、より好適には、ストレスの２５〜７５％について、最も好適には、ストレスの４０〜６０％について変化させる）。
５．生物のストレス応答経路の、好適には大部分を、理想的にはすべてを表す、メチル化に基づく遺伝子座を含む。
６．生物の各組織／器官型について別々に組み立てられる。
７．特定の組織、器官、または発生段階に対しての使用のみを意図していない限り、組織／発生段階の間で理想的にはばらつきが無く、好適にはばらつきが１０％未満である。
【０１０３】
好適には、本発明に使用される前記ＤＮＡ遺伝子座はこれらの特徴の一つ以上を有する。
【０１０４】
有利には、前記工程(vi)での前記遺伝子座のサブセットの選択は、コンピュータープログラムによって自動的に行われる。
【０１０５】
コンピュータープログラムが遺伝子座を選択できる方法の汎用例を挙げるには、測定されたメチル化状態の多数の遺伝子座の解析が必要である。一つの可能な実施形態には、遺伝子のサブセットと、その遺伝子の発現レベルを様々なストレスと照らし合わせたものとを収集し、メチル化状態が示されることが必要である。コンピュータープログラム用のコードを組み立てるために下記アプローチを行った。
【０１０６】
データ
遺伝子発現に４倍以上の変化があったものを「１」、４分の１以下に変化したものを「−１」、遺伝子発現に変化のなかったものを「０」として表す（コード化する）ことによって、遺伝子発現データを３段階に変換した。
【０１０７】
遺伝子のどれにおいても発現レベルに変化を起こさせないストレスは、特定できず、除去される。同じような発現応答を有するストレスは、個別的に特定できず、したがってすべて（または一つを除いてすべて）除去される。
【０１０８】
アルゴリズム（Ａ）
所与の数のストレスを特定するために必要な遺伝子の最小数を判定する。アルゴリズムは確率論的かつ不完全であるので、最適な答えを生成する保証はないが、最適値に非常に近似した答えを常に生成するであろう。前記アルゴリズムはまた十分一貫しているので、実験間の統計的比較を可能にする。
用語：
Ｎ、使用する遺伝子の所定の数。
Ｅｖａｌ、Ｎ個の遺伝子の順序集合を取り、一意的に特定されたストレスの数を返す。
【０１０９】
ヒルクライマー（Hill Climber）（たとえば、Goldfeld, SM, Quandt RE and Trotter HF (1966) Econometrica 34 541;Prigel-Bennett A (2004) Theoretical Computer Science 320, 135-153参照）
１．Ｎ個の遺伝子のランダムな群を生成する。Ｎは使用される遺伝子の所定の数である。
２．前記群のＮ個の遺伝子の一つを、現在群の中に無い遺伝子と置き換える。
３．関数Ｅｖａｌで、工程２からの遺伝子の群を使用して、一意的に特定されたストレスの数を見出す。
４．工程２および３からの解が、現在保持されているものよりもさらによい解を生む場合、現在保持されている解を、工程２／３からの解と置き換える。
５．もしストレスすべてが一意的に特定されれば、解を報告し、終了し、さもなければ工程２へ行く。
【０１１０】
ヒルクライマーは、１万回のイタレーションで実行され、独立して１０００回実行される。全ストレスを一意的に特定して、最適な解が見いだせないと、ほとんどのストレスを一意的に特定する解が返される。
【０１１１】
本発明の第四の態様において、一つ以上の非定型成長条件を特定するための一つ以上のＤＮＡ遺伝子座群を特定する方法が提供され、前記方法は、
(a) 同時に、本発明の第一、第二、または第三の態様のうちの一つ以上の方法を行って、一つ以上のＤＮＡ遺伝子座群を一つ以上の非定型成長条件と関連させる工程か、または
(b)一つ以上の非定型成長条件で一つ以上のＤＮＡ遺伝子座群を特定するために、本発明の第一、第二、または第三の態様のうちの一つ以上における工程(viii)および(ix)の結果を組み合わせる工程
のいずれかの工程を含む。
【０１１２】
本発明の第五の態様において、一つ以上の非定型成長条件を特定するためのＤＮＡ遺伝子座群が提供され、前記ＤＮＡ遺伝子座群は本明細書に記載するような方法に従って定義される。
【０１１３】
本発明の第六の態様において、注目する細胞が曝露された一つ以上の非定型成長条件を特定する方法が提供され、前記方法は、
(i)  注目する細胞からＤＮＡを単離する工程であって、前記細胞の成長条件が不明である、工程と；
(ii)  前記工程(i)の単離したＤＮＡ中の、メチル化できる遺伝子座群のメチル化状態を特定する工程と；
(iii)  前記工程(ii)で特定されたような遺伝子座のメチル化状態を、同一の遺伝子座群についての既知のメチル化状態群と比較する工程であって、前記既知のメチル化状態群は一つ以上のストレスの特徴を示している、工程と；
(iv)  注目する細胞が非定型成長条件（複数の非定型成長条件）に曝露されていたかどうかを特定する工程と
を含む。
【０１１４】
好適には、前記工程(iv)はまた、前記細胞が曝露されていた非定型成長条件のタイプを特定する。
【０１１５】
本発明の第七の態様において、細胞が曝露された非定型成長条件の特定に、上記で定義されたようなＤＮＡ遺伝子座群を使用することが提供される。
【０１１６】
前記非定型成長条件への曝露が続行している、前記第六および第七の態様の使用または方法。
【０１１７】
前記非定型成長条件への曝露は過去に（すなわち、テスト以前のある時に）起こったことである、前記第六および第七の態様の使用または方法。
【０１１８】
広範囲の適用について非定型成長条件または細胞（または細胞が得られた組織／器官）を特定するために、前記ＤＮＡ遺伝子座および関連する診断用メチル化パターンが使用されてもよい。前記特定は、現在および過去の曝露の両方を含んでもよく、前記非定型成長条件がサンプル中に存在しない場合も含み、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：
−症候性または無症候性疾患の診断（詳細については下記を参照されたい）
−後天的な感染症感受性
−アレルギー
−加齢
−医薬品や毒物への曝露（事前の曝露は、活性成分が存在することを必要としない）
−運動能力向上薬への曝露。たとえば、ステロイド、ナンドロロン、エリスロポエチン、ニケタミド、カチン、クレンブテロール、ノルアンドロステロン、スタノゾロール、およびヒドロクロロチアジドなど（これらに限定されるわけではない）
−生物の農薬への曝露
−市販細胞株の状態のチェック
−生体医療目的で細胞株の生理学的状態を試験すること。この例としては、合成または分離幹細胞の生存能力、潜在能力、および／または分化全能性を調査する；移植について皮膚細胞株の潜在能力および能力を評価する；参照基準に対する標準的細胞株培養の均一な生理学的状態を確保する、などがあるが、これらに限定されるわけではない。
−前臨床試験‐予防、医療、または毒性の生化学用試薬に対する細胞株または器官または生物の好ましくない、または好ましい、非定型反応についてテストすること。
【０１１９】
疾患の診断には、無症状、発症前、またはその他あいまいな症状という診断も含まれる。前記多数の例は、癌、代謝異常、潜伏感染（たとえば結核）を含むウイルスまたは細菌感染への曝露、ストレス関連疾患／障害、寄生生物による感染または侵入などの様々な形態の診断を含んでもよい。センチネルを使用して診断できる疾患の例としては、とりわけ以下のようなものがある：
−結核（症候性および無症候性感染）、髄膜炎、敗血症、クラミジアなど、症状を呈さないか症状が曖昧である、または症状が遅れて出る細菌性疾患。
−無症候段階または寛解期のものを含むすべてのタイプの癌。
−症状を呈さないか症状が曖昧である、または症状が遅れて出るウイルス性疾患。その例としては、ＨＩＶ、ヘルペス、インフルエンザ、およびエボラなどがある。
−メチル化変化がすでに指摘されているため、当該システムが診断に役立つ疾患、たとえば白血病、頭部癌および頸部癌、ホジキン病、胃癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、乳癌、バーキットリンパ腫、ウィルムス腫瘍、プラダー・ウィリー／アンジェルマン症候群、ＩＣＦ症候群、皮膚線維腫、高血圧、小児神経生物学など。
【０１２０】
本発明の第八の態様において、非定型成長条件を特定し識別するための異なるメチル化状態の遺伝子座のサブセットを選択するためのコンピュータープログラムが提供される。
【０１２１】
本発明の第八の態様において、シロイヌナズナの細胞サンプルが曝露されていた一つ以上の非定型成長条件を特定するためのＤＮＡ遺伝子座群が提供され、異なるメチル化状態および／または発現の前記遺伝子座は、下記シロイヌナズナ遺伝子うちの一つ以上、たとえばすべての、内部またはその５ｋｂ上流／下流までに、位置する（Lister et al （2008）参照）。
AT2G15800
AT2G38240
AT5G54720
AT1G76650
AT3G31540
AT3G28820
AT5G02580
AT1G07120
AT1G61800
AT1G48110
AT5G28235
AT5G28430
AT5G28760
AT3G53300
AT5G46200
AT3G57260
AT4G02330
AT3G05400
AT5G25110
AT3G28770
AT5G62750
【０１２２】
本発明のさらなる態様において、前記態様のいずれかの方法であって、前記遺伝子座群が第九の態様で定義され、前記遺伝子座は、シロイヌナズナの注目する細胞における前記非定型成長条件または生理学的／表現型応答を特定するために使用される。または、前記遺伝子座は、シロイヌナズナ以外の植物種からの注目する細胞における前記非定型成長条件または生理学的／表現型応答を特定するために使用される。
【０１２３】
本発明のさらなる態様において、ヒトの細胞サンプルが曝露されていた一つ以上の非定型成長条件を特定するためのＤＮＡ遺伝子座群が提供され、異なるメチル化状態および／または発生の前記遺伝子座は、下記ヒト遺伝子または染色体座位のうちの一つ以上、たとえばすべての、内部またはその５ｋｂ上流／下流までに位置する（Eckhardt et al. (2006))
ZNRF3
SLC7A4
Myosin-18B(MYO18B)
Glycoprotein Ib (platelet), beta polypeptide
RP1-47A17.8
OncostatinM(OSM)
CTA-299D3.6
CTA-941F9.6
Cytohesin-4
PIB5PA
SUSD2
chr 22:35,256,796-35,277,053,NCBI 36
RP3-438O4.2
RP4-756G23.1
Somatostatin receptor type 3 (SSTR3)
Bcl-2 interacting killer (BIK)
GAS2L1
RP3-355C18.2
Gamma-parvin
CARMA 3
TMPRSS6
Platelet-derived growth factor B chain precursor (PDGFB)
CELSR1 Cadherin 
T-box transcription factor (TBX1)
Q6ZRW2_HUMAN
NKG2DL4 (RAET1E)
DAAM2
RP1-47M23.1
RP11-397G17.1
Nesprin-1 (Syne-1)
Myogenic repressor I-mf (MDFI)
RP11-174C7.4
CMAH
PKHD1
Glutathione peroxidase 5
GRIK2
SLC22A1
RP11-235G24.1
TBX18
TGM3
RIN2
SLC24A3
Q9ULE8_HUMAN
C20orf117
Breast carcinoma amplified sequence 4 (BCAS4)
Nuclear factor of activated Tcells (NFATC2)
SCUBE1
JAG1
【０１２４】
本発明の別の態様によると、生体サンプルが受けてきた曝露の診断および特性明瞭化のために生物のゲノムＤＮＡ内に位置する標的ＤＮＡ配列群をコンパイルし使用するための方法と、および／または組織（または複数の組織）または細胞（または複数の細胞）の属性または由来とが提供され、前記方法は、メチル化状態を有するＤＮＡ配列を選択することを含み、前記メチル化状態はサンプル間でばらつきがあるが単独の条件（生体サンプルが受けた曝露）やソース（組織（または複数の組織）または細胞（または複数の細胞）の属性と由来）を個別的に診断付けるわけではないような方法である。
【０１２５】
本発明の別の態様によると、組織（または複数の組織）または細胞（または複数の細胞）の属性または由来の診断および特性明瞭化のために生物のゲノムＤＮＡ内に位置する標的ＤＮＡ配列群をコンパイルし使用するための方法が提供され、前記方法は、メチル化状態を有するＤＮＡ配列を選択することを含み、前記メチル化状態はサンプル間でばらつきがあるが単独のソース（組織（または複数の組織）または細胞（または複数の細胞）の属性と由来）を個別的に診断付けるわけではないような方法である。
【０１２６】
本発明の別の態様によると、生体サンプルが受けてきた曝露の診断および特性明瞭化のために生物のゲノムＤＮＡ内に位置する標的ＤＮＡ配列群をコンパイルし使用するための方法が提供され、前記方法は、メチル化状態を有するＤＮＡ配列を選択することを含み、前記メチル化状態はサンプル間でばらつきがあるが単独の条件（生体サンプルが受けた曝露）や単一の条件（生体サンプルが受けてきた曝露）を個別的に診断付けるわけではないような方法である。
【０１２７】
本発明の別の態様によると、組織（または複数の組織）および／または細胞（または複数の細胞）の属性または由来の診断および特性明瞭化のために生物のゲノムＤＮＡ内に位置する標的ＤＮＡ配列群をコンパイルし使用するための方法が提供され、前記方法は、
(i)  既知であるが異なる属性または由来の細胞の二つ以上のサンプルからＤＮＡを単離する工程と；
(ii)  各サンプルの前記単離したＤＮＡ中のメチル化可能な遺伝子座のメチル化状態を特定する工程と；
(iii)  各サンプルからの単離したＤＮＡの前記メチル化状態を比較する工程と；
(iv)  遺伝子座のサブセットを選択する工程であって、サンプル間でばらつきがあるが単一の属性または由来を個別的に診断付けるわけではないメチル化状態によって特徴付けられている、工程と、
を含む。
【０１２８】
本発明の別の態様において、非定型成長条件（ストレス）を特定するためのＤＮＡ遺伝子座（ストレスセンチネル）群を特定する方法が提供され、前記方法は、
(i)  対照成長条件下で、注目する細胞のサンプルを成長させる工程と；
(ii)  工程(i)の注目する細胞と同じ細胞のサンプルを、少なくとも一つの非定型成長条件のある環境で成長させる工程と；
(iii)  工程(i)および(ii)の各細胞サンプルからＤＮＡを単離する工程と；
(iv)  前記工程(iii)の単離したＤＮＡ中の、メチル化できる遺伝子座の、メチル化状態を特定する工程と；
(v)  前記工程(i)および(ii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する工程と；
(vi)  遺伝子座のサブセットを選択する工程であって、前記遺伝子座のサブセットは、前記工程(ii)からの単離したＤＮＡにおいて前記工程(i)からの単離したＤＮＡとは遺伝子座のメチル化状態が異なっていることが特徴であり、かつ、前記サブセットの中の各遺伝子座は、ある非定型成長条件に応答してメチル化状態を変化させるが、他の非定型成長条件に対してはそうしない、工程と
を含む。
【０１２９】
必要に応じて、前記方法は、
(vii)  前記選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態を、前記遺伝子座を選択するためには使用されなかった、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせと関連させる工程、
を含む。
【０１３０】
本発明の別の態様において、特定の非定型成長条件（ストレス）を特定するためのＤＮＡ遺伝子座（ストレスセンチネル）群を特定する方法が提供され、前記方法は、
(i)  対照成長条件下で、注目する細胞の複数のサンプルを成長させる工程であって、前記複数の注目する細胞は異なる遺伝子型を有する、工程と；
(ii)  工程(i)のように注目する細胞の複数のサンプルを成長させる工程であって、前記細胞は少なくとも一つの非定型成長条件のある環境にある、工程と；
(iii)  工程(i)および(ii)の各細胞サンプルからＤＮＡを単離する工程と；
(iv)  前記工程(iii)の単離したＤＮＡ中の、メチル化できる遺伝子座の、メチル化状態を特定する工程と；
(v)  前記工程(i)および(ii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する、または、前記工程(i)および(iii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する、もしくは前記工程(ii)および(iii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する工程と；
(vi)  遺伝子座のサブセットを選択する工程であって、前記サブセットは、前記工程(ii)からの単離したＤＮＡにおいて前記工程(i)または(iii)からの単離したＤＮＡとは遺伝子座のメチル化状態が異なっていること；および／または前記工程(iii)からのＤＮＡにおいて前記工程(i)からの単離したＤＮＡとは遺伝子座のメチル化状態が異なっていること、が特徴であり、かつ、前記サブセットの中の各遺伝子座は、ある非定型成長条件に応答してメチル化状態を変化させるが、他の非定型成長条件に対してはそうしない、工程と；
を含む。
【０１３１】
必要に応じて、
(viii)  前記選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態を、前記遺伝子座を選択するためには使用されなかった、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせと関連させる工程、
がさらにある。
【０１３２】
本発明の別の態様において、複数の非定型成長条件を特定するためのＤＮＡ遺伝子座群を特定する方法が提供され、前記方法は、
(i)  対照成長条件下で、注目する細胞のサンプルを成長させる工程と；
(ii)  工程(i)の注目する細胞と同じ細胞の複数のサンプルを、少なくとも一つの非定型成長条件のある環境で成長させる工程であって、各サンプルは異なる非定型成長条件中で成長させられる、工程と；
(iii)  工程(i)および(ii)の各細胞サンプルからＤＮＡを単離する工程と；
(iv)  前記工程(iii)の単離したＤＮＡ中の、メチル化できる遺伝子座の、メチル化状態を特定する工程と；
(v)  前記工程(i)および(ii)からの単離したＤＮＡのメチル化状態を比較する工程と；
(vi)  遺伝子座のサブセットを選択する工程であって、前記遺伝子座のサブセットは、前記工程(ii)の各サンプルからの単離したＤＮＡにおいて前記工程(i)からの単離したＤＮＡとは遺伝子座のメチル化状態が異なっていることが特徴であり、かつ、前記サブセットの中の各遺伝子座は、ある非定型成長条件に応答してメチル化状態を変化させるが、他の非定型成長条件に対してはそうしない、工程と
を含む。
【０１３３】
必要に応じて、
(vii)  前記選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態を、前記遺伝子座を選択するためには使用されなかった、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせと関連させる工程、
がさらにある。
【０１３４】
好適には、選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態が集団的に、前記遺伝子座を選択するためには使用されなかった、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせを診断付ける。
【０１３５】
好適には、選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態が集団的に、前記遺伝子座を選択するために使用された、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせを診断付ける。
【０１３６】
好適には、選択された遺伝子座のサブセットのメチル化状態が、(i)前記遺伝子座を選択するためには使用されなかった、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせと；  (ii)前記遺伝子座を選択するために使用された、前記非定型成長条件（複数の非定型成長条件）、および／または組織／細胞型、および／またはそれらの組み合わせとを、診断付ける。
【０１３７】
好適には、本発明の方法は、前記遺伝子座のサブセットを選択するために、異なるストレス、組織型または細胞型を、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個、少なくとも約７個、少なくとも約８個、少なくとも約９個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、またはそれ以上使用することを含む。
【０１３８】
たとえば、いくつかの実施形態においては、本発明の方法は、前記遺伝子座のサブセットを選択するために、異なるストレス、組織型または細胞型を、１〜約10,000個、好適には約１０〜約５００個、より好適には約３０〜約１００個使用することを含む。
【０１３９】
本明細書に記載したように、好適な実施形態において、前記遺伝子座のサブセットの中の各遺伝子座は、単一の条件のみを診断付けるわけではない。
【０１４０】
好適には、前記遺伝子座のサブセットの中の各遺伝子座は、下記特徴のうち一つ以上、たとえば二つ以上、三つ以上、四つ以上、五つ以上、六つ以上、七つまたは八つを有する。
(i)  同一器官からの同一組織型については、同一のストレスに対して同様に応答してメチル化状態を再現可能に変化させる。
(ii)  同一時に同一個体からの同一組織から採取された複製サンプル間でのメチル化状態に、ばらつきを示さないか、好適には２０％未満のばらつきをしめす。
(iii)  容易に検出される異なるストレス状態、または、細胞（複数の細胞）および／または組織（複数の組織）の属性または由来と関連した定性的メチル化変化を生む。
(iv)  容易に検出される異なるストレス状態、または、細胞（複数の細胞）および／または組織（複数の組織）の属性または由来と関連した顕著な定量的メチル化変化を生む。
(v)  あるストレスに対して応答してメチル化状態を変化させるが、ほかのストレスについてはそうしない（好適には、ストレスの１５〜８５％について、より好適には、ストレスの２５〜７５％について、最も好適には、ストレスの４０〜６０％について変化させる）。
(vi)  (a)生物のストレス応答経路、(b)細胞（複数の細胞）および／または組織（複数の組織）のタイプの、好適には大部分を、理想的にはすべてを、表すメチル化のある遺伝子座を含む。
(vii)  生物の各組織／器官型について別々に組み立てられる。
(viii)  特定の組織、器官、または発生段階に対しての使用のみを意図していない限り、組織／発生段階の間でばらつきが無く、好適にはばらつきが１０％未満である。
【０１４１】
好適には、前記遺伝子座のサブセットの中の遺伝子座のいずれも、なんらかの一つのストレス、原料物質、または生理学的状態を個別に診断付けることはない。
【０１４２】
好適には、前記遺伝子座のサブセットは、一つのストレス、原料物質、または生理学的状態を使用して特定できるけれども、異なるストレス、原料物質、または生理学的状態に曝露されたサンプルに適用される時にもなお診断特性を保持している。
【０１４３】
好適には、前記遺伝子座のサブセットの各遺伝子座は、前記遺伝子座の選択に使用されたストレスまたはサンプル源のほぼ半数に現れ、ストレスを相補的に分離する。
【０１４４】
本発明によってさらに提供されるのは、本明細書に記載される方法によって特定されるＤＮＡ配列の一つ以上の群、または遺伝子座の一つ以上のサブセットである。また、前記一つ以上の標的ＤＮＡ配列または遺伝子座の一つ以上のサブセットを、本明細書中に記載される応用に使用することも提供され、たとえば本明細書中の他の箇所にも記載されているように、下記の一つ以上の応用に使用される
−症候性または無症候性疾患の診断（詳細については下記を参照されたい）
−後天的な感染症感受性
−アレルギー
−加齢
−医薬品や毒物への曝露（事前の曝露は、活性成分が存在することを必要としない）
−運動能力向上薬への曝露。たとえば、ステロイド、ナンドロロン、エリスロポエチン、ニケタミド、カチン、クレンブテロール、ノルアンドロステロン、スタノゾロール、およびヒドロクロロチアジド
−生物の農薬への曝露
−市販細胞株の状態のチェック
−生体医療目的で細胞株の生理学的状態を試験すること。この例としては、合成または分離幹細胞の生存能力、潜在能力、および／または分化全能性を調査する；移植について皮膚細胞株の潜在能力および能力を評価する；参照基準に対する標準的細胞株培養の均一な生理学的状態を確保する、などがあるが、これらに限定されるわけではない。
−前臨床試験‐予防、医療、または毒性の生化学用試薬に対する細胞株または器官または生物の好ましくない、または好ましい、非定型反応について試験すること。
【０１４５】
本発明は、付随する図および実施例に示される。実施例の教示が決して本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１：主成分分析（ＰＣＯ）  異なるストレスを与えられたシロイヌナズナからのメチル化感受性増幅断片解析（ＭＳＡＰ）データの解析に基づく図。上位二つの成分が、全ばらつきの２３．２％にあたる（未訓練データについて）。（Ｓ＝塩分ストレス、Ｎ＝温度ストレス、Ｈ＝植食、Ｃ＝対照）。
【図２】図２：塩分、温度、対照サンプルのみの間の多型ＭＳＡＰマーカーのＰＣＯ。上位二つの成分は、ばらつきの２４．８％にあたる（Ｃ，Ｎ、Ｓについて訓練済み）。（Ｓ＝塩分ストレス、Ｎ＝温度ストレス、Ｈ＝植食、Ｃ＝対照）。
【図３】図３：全ストレス（センチネル群）間の多型ＭＳＡＰマーカーのＰＣＯ  上位二つの成分が、ばらつきの３２．７％にあたる。（Ｓ＝塩分ストレス、Ｎ＝温度ストレス、Ｈ＝植食、Ｃ＝対照）。
【図４】図４：４つの処理間の統計的一対比較により解析されたデータ。全３８１個の単位複製配列の６つの比較のそれぞれからの、有意な単位複製配列の上位１００個。全ばらつきで上位二つの成分がカバーするのは１５．２％である。（Ｓ＝塩分ストレス、Ｎ＝温度ストレス、Ｈ＝植食、Ｃ＝対照）。
【図５】図５：前記４つの処理間の統計的一対比較により解析されたデータ。全２１７個の単位複製配列の６つの比較のそれぞれからの、有意な単位複製配列の上位５０個。全ばらつきで上位二つの成分がカバーするのは１７．９％である。（Ｓ＝塩分ストレス、Ｎ＝温度ストレス、Ｈ＝植食、Ｃ＝対照）。
【図６】図６：前記４つの処理間の統計的一対比較により解析されたデータ。全１１６個の単位複製配列の６つの比較のそれぞれからの、有意な単位複製配列の上位２５個。全ばらつきで上位二つの成分がカバーするのは２０．５％である。（Ｓ＝塩分ストレス、Ｎ＝温度ストレス、Ｈ＝植食、Ｃ＝対照）。
【図７】図７：前記４つの処理間の統計的一対比較により解析されたデータ。全５２個の単位複製配列の６つの比較のそれぞれからの、有意な単位複製配列の上位１０個。全ばらつきで上位二つの成分がカバーするのは２５．４％である。（Ｓ＝塩分ストレス、Ｎ＝温度ストレス、Ｈ＝植食、Ｃ＝対照）。
【図８】図８：前記４つの処理間の差異により解析されたデータ。全３８０個の単位複製配列の６つの比較のそれぞれからの、大きな差異を示した単位複製配列の上位１００個。全ばらつきで上位二つの成分がカバーするのは２３．５％である。（Ｓ＝塩分ストレス、Ｎ＝温度ストレス、Ｈ＝植食、Ｃ＝対照）。
【図９】図９：前記４つの処理間の差異により解析されたデータ。全２０６個の単位複製配列の６つの比較のそれぞれからの、大きな差異を示した単位複製配列の上位５０個。全ばらつきで上位二つの成分がカバーするのは２８．３％である。（Ｓ＝塩分ストレス、Ｎ＝温度ストレス、Ｈ＝植食、Ｃ＝対照）。
【図１０】図１０：前記４つの処理間の差異により解析されたデータ。全１１２個の単位複製配列の６つの比較のそれぞれからの、大きな差異を示した単位複製配列の上位２５個。全ばらつきで上位二つの成分がカバーするのは３３．３％である。（Ｓ＝塩分ストレス、Ｎ＝温度ストレス、Ｈ＝植食、Ｃ＝対照）。
【図１１】図１１：前記４つの処理間の差異により解析されたデータ。全５３個の単位複製配列の６つの比較のそれぞれからの、大きな差異を示した単位複製配列の上位１０個。上位二つの成分がカバーする全ばらつきは、３９．２％である。（Ｓ＝塩分ストレス、Ｎ＝温度ストレス、Ｈ＝植食、Ｃ＝対照）。
【図１２】図１２：異なるストレスを与えられたマウスＲＡＷ細胞からの増幅断片長多型データの全訓練済み解析に基づく主成分解析。全ばらつきで上位二つの成分は１５．８％を表す。（■）ＩＬ４、（◆）ＬＰＳ、（▲）栄養的ストレス、（●）対照。
【図１３】図１３：異なるストレスを与えられたマウスＲＡＷ細胞からの増幅断片長多型データの対照、ＩＬ４、および栄養的ストレスの訓練済み解析に基づく主成分解析。上位二つの成分が全ばらつきの２０．７％を表す。（■）ＩＬ４、（◆）ＬＰＳ、（▲）栄養的ストレス、（●）対照。
【図１４】図１４：異なるストレスを与えられたマウスＲＡＷ細胞からの増幅断片長多型データの対照、ＩＬ４、およびＬＰＳの訓練済み解析に基づく主成分解析。上位二つの成分が全ばらつきの１９．８％を表す。（■）ＩＬ４、（◆）ＬＰＳ、（▲）栄養的ストレス、（●）対照。
【図１５】図１５：異なるストレスを与えられたマウスＲＡＷ細胞からの増幅断片長多型データの対照、ＬＰＳ、および栄養的ストレスの訓練済み解析に基づく主成分解析。上位二つの成分が全ばらつきの１９．９％を表す。（■）ＩＬ４、（◆）ＬＰＳ、（▲）栄養的ストレス、（●）対照。
【図１６】図１６：メチル化によって制御されたことがわかる、ランダムに選択されたシロイヌナズナマーカーの発現への８２個のストレスの影響を示した、Genevestigatorの結果（Lister et al (2008)。列は８２個のストレスを示す。行は遺伝子マーカーの選択を示す。各ボックスの灰色は、シロイヌナズナが対応するストレス（列）に曝露された時の対応する遺伝子（行）の発現レベルを表す。シロイヌナズナは対応するストレス（列）に曝露される。黒は、発現に変化がないことを示し、薄い灰色は下方制御、濃い灰色は上方制御である。
【図１７】図１７：メチル化によって制御されたことがわかる、ランダムに選択されたシロイヌナズナマーカーの発現への、９個の発生段階の影響を示した、Genevestigatorの結果（Lister et al (2008)。列は９個の発生段階を示す。行は遺伝子マーカーの選択を示す。各ボックスの灰色は、各発生段階（列に示される）でのシロイヌナズナからの対応する遺伝子（行）の発現レベルを表す。
【図１８】図１８：メチル化によって制御されたことがわかる、ランダムに選択されたシロイヌナズナマーカーの発現への、４０個の器官の影響を示した、Genevestigatorの結果（Lister et al (2008)。列は４０個の器官を示す。行は遺伝子マーカーの選択を示す。各ボックスの灰色は、各シロイヌナズナの器官からの対応する遺伝子（行）の発現レベルを表す。
【図１９】図１９：それぞれ３つの状態を表す３個のセンチネルを使用した２７個のストレスの分類（灰色連続連結：上方制御または低メチル化センチネル；灰色断続連結：下方制御または高メチル化センチネル；黒色連結：発生またはセンチネルのメチル化レベルに変化なし）。
【図２０】図２０：制御における変化をストレスに関連付ける三又のツリー、２個の遺伝子が８個のストレスＳ１〜Ｓ８に連結されることが示される。「＋」は上方制御を示し、「−」は下方制御を示す。遺伝子１が下方制御され（−）、遺伝子２が上方制御されると、これはＳ６のストレスプロファイルに対応する。
【図２１】図２１：７８個の異なるストレスに曝露された１５個の遺伝子座のセンチネルプロファイル（二成分フォーマットに標準化された発現プロファイル）の分類を示すPCoAプロット（第一主座標対第二主座標）。前記ストレスは以下の非公式なグループに人為的に分類された：生物（黒四角）、化学（白四角）、ホルモン（白三角）、光（黒三角）、栄養（白丸）、ＰＣＯ（黒丸）、低温（白菱形）、乾燥（黒菱形）、熱（灰色菱形）、低酸素（星形）、浸透圧（灰色四角）、塩（十字）、および損傷（灰色丸）。
【図２２】図２２：７８個の異なるストレスに曝露された３６個の遺伝子座のセンチネルプロファイル（二成分フォーマットに標準化された発現プロファイル）の分類を示すPCoAプロット（第一主座標対第二主座標）。前記ストレスは以下の非公式なグループに人為的に分類された：生物（黒四角）、化学（白四角）、ホルモン（白三角）、光（黒三角）、栄養（白丸）、ＰＣＯ（黒丸）、低温（白菱形）、乾燥（黒菱形）、熱（灰色菱形）、低酸素（星形）、浸透圧（灰色四角）、塩（十字）、および損傷（灰色丸）。
【図２３】図２３：７８個の異なるストレスに曝露された３６個の遺伝子座のセンチネルプロファイル（二成分フォーマットに標準化された発現プロファイル）の分類を示すPCoAプロット（第一主座標対第三主座標）。前記ストレスは以下の非公式なグループに人為的に分類された：生物（黒四角）、化学（白四角）、ホルモン（白三角）、光（黒三角）、栄養（白丸）、ＰＣＯ（黒丸）、低温（白菱形）、乾燥（黒菱形）、熱（灰色菱形）、低酸素（星形）、浸透圧（灰色四角）、塩（十字）、および損傷（灰色丸）。
【図２４】図２４：７８個の異なるストレスに曝露された５９個の遺伝子座のセンチネルプロファイル（二成分フォーマットに標準化された発現プロファイル）の分類を示すPCoAプロット（第一主座標対第二主座標）。前記ストレスは以下の非公式なグループに人為的に分類された：生物（黒四角）、化学（白四角）、ホルモン（白三角）、光（黒三角）、栄養（白丸）、ＰＣＯ（黒丸）、低温（白菱形）、乾燥（黒菱形）、熱（灰色菱形）、低酸素（星形）、浸透圧（灰色四角）、塩（十字）、および損傷（灰色丸）。
【図２５−１】図２５：ヒトにおいて差次的にメチル化されたことがわかる４９個のマーカーの発現への、５０６個のストレスの影響を示した、Genevestigatorの結果（Eckhardt et al (2006)）。色コードは、黒は、発現に変化がないことを示し、薄い灰色は下方制御、濃い灰色は上方制御である。
【図２５−２】図２５（続き）
【図２５−３】図２５（続き）
【図２５−４】図２５（続き）
【図２６】図２６：ヒトにおいて差次的にメチル化されたことがわかる４９個のマーカーの発現への、８個の年齢グループの影響を示した、Genevestigatorの結果（Eckhardt et al (2006)）。
【図２７−１】図２７：ヒトにおいて差次的にメチル化されたことがわかる４９個のマーカーの発現への、４０個の器官の影響を示した、Genevestigatorの結果（Eckhardt et al (2006)）。
【図２７−２】図２７（続き）
【発明を実施するための形態】
【０１４７】
実施例
下記の実施例に適用可能な分子生物学に使用される方法は、当業者に公知である。当業者に公知の従来の分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技術を記載している包括的論文には、たとえば以下のようなものがある：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); Glover ed., DNA Cloning: Practical Approach, Volumes I and II, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1985); and Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.GT., Smith J.A.,  Struhl, K.  Current protocols in molecular biology.  Green Publishing Associates/Wiley Intersciences, New York.
【０１４８】
実施例１  −  シロイヌナズナにおけるストレス特定用のメチル化感受性増幅断片長多型
候補のセンチネルＤＮＡメチル化マーカーを組み立て、シロイヌナズナ（生態型：Columbia）のコホートを二つの相違する外的ストレスに曝露し、得られたＭＳＡＰ（メチル化感受性増幅多型）プロファイル中の差次的マーカーを検査する。ストレスを与えられたテスト対象物のメチル化プロファイルは、互いに比較され、かつ標準的な実験条件下で成長した参照（対照）集団と比較された。特徴が明瞭化されていないストレス下で成長した植物を診断するためのセンチネルマーカーの能力（本方法の例証）が、ストレスを与えられた第三の集団を参照することにより、確認された。このように、候補センチネルの４つの群を組み立ててテストすることができた（ストレスを与えられた３つの集団のうちの二つから選択され、第三の集団に照らしてテストされたセンチネル）。
【０１４９】
植物の成長
４ｃｍ×４ｃｍのセルが２４個あるトレイの各セルに２つずつ植物体を成長させる。底面給水用に、セルを一つ取り除く。このように、各処理ごとに４６個の植物体があった。種子を４℃で発芽させ、温室で１週間成長させ、その後４つの管理された生育箱中の実験条件下へ移された。前記植物体は開花を抑制するために日長８時間（約70 μmol/m2/s）で成長させた。
【０１５０】
前記４つの生育箱のうち３つの温度を２２℃に設定した；４番目の生育箱（温度をストレスとしてテストする）を下記のように設定した。前記植物体を少しずつ異なる条件下で二つの分離したロットで成長させた。
【０１５１】
【表２】
2013526271.tif 000005
【０１５２】
ＤＮＡ抽出
ＤＮＡの抽出はすべてQiagen社のキットを使用し、製造者の指示にしたがって行った。各処理につき全４６個の植物体から、シロイヌナズナサンプルからのＤＮＡ抽出を行うために、DNeasy（登録商標）社のプラントミニキットを使用した。下記に示す試薬はすべてこのキットからのものである。
【０１５３】
約１００ｍｇの植物体組織を、はさみを使用して１．５ｍｌ遠心分離管の液体窒素中で破壊した。すぐに、前記組織を融かさずに、６５℃に予備加熱した４００μｌの溶解バッファーＡＰ１と４μｌのリボヌクレアーゼＡとを各管に加えた。前記内容物を反転により混合し、２〜３分ごとに時折混合しながら、６５℃で１０分間培養した。
【０１５４】
これに続いて、ＡＰ２バッファーを１３０μｌ、各サンプルに加え、各管を５分間氷の上で培養し、タンパク質と多糖類とを沈殿させた。それから管は13,000rpmで５分間遠心分離にかけ、粘性の溶解物を沈殿させた。
【０１５５】
QIAshredder（商標）カラム（シリカゲルマトリクス付）へ前記上清を移し、13,000rpmで２分間遠心分離にかけて沈殿物と細胞残屑とを除去した。カラム中の流動物は回収されて新しい管へ移され、体積の０．５の洗浄バッファーおよび体積の１のエタノールと混合した。この混合物を、第二のDNeasyミニ回転カラムへ写し、8,000rpmで１分間遠心分離にかけた。ＤＮＡ分子がカラム上に保持されているため、前記流動物を廃棄した。５００μｌの洗浄バッファーＡＷを前記カラムに通し8,000rpmで１分間遠心分離を行って、付着しているＤＮＡを２度洗った。
【０１５６】
続いて、６５℃に予備加熱した１００μｌのバッファーＡＥを加えて室温で５分間培養したのちに、前記膜を13,000rpmで１分間遠心分離にかけて乾燥させた。
【０１５７】
アガロースゲルによる定量化
ＤＮＡのアリコート（１〜５μｌ）を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にかけ、存在するＤＮＡの質および量を判定した。前記ゲルは、アガロースの適量を1(TAEバッファー（４０ｍＭトリスアセテート、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の適当な体積中に溶解し、その後前記アガロースが融解するまで電子レンジ中で加熱することにより、調製した。前記ゲル溶液は、５０℃まで冷却してから１０ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液を加えて、最終的に０．３５μｇ／ｍｌの濃度にし、その後、適当なコームを設置してローディングウェルを作成したキャスティングトレイに注入した。
【０１５８】
セットすると、前記ゲルは、陰極端部にゲルコームを備えた水平電気泳動装置へ移動した。前記ゲルコームを取り除き、十分な量の1(TAEバッファーを電極チャンバに加えて、前記ゲルを約１ｍｍで覆うようにした。調製したＤＮＡサンプル（５μｌＤＮＡ：１μｌ青色ローディングダイ[０．２３％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、６０ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０％（ｗ／ｖ）スクロース]）をゲルウェルにロードした。HyperLadderII（Bioline, BIO-33040）サイズマーカーを隣のレーンにロードした。前記ゲルを３〜５Ｖ／ｃｍの範囲の一定の電圧で１５〜６０分電気泳動させた。前記ＤＮＡを、紫外線トランスイルミネータ（波長３２０ｎｍ）を使用して可視化した。
【０１５９】
メチル化感受性増幅断片長多型
Vos et al (1995)によって記載されたＡＦＬＰプロトコルに基づき、ただし同じ認識モチーフを標的にしたアイソシゾマーを使用して、処理ごとにランダムに選択した８個のＤＮＡサンプルについてメチル化感受性増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）を行った。
【０１６０】
この技術の基礎となっているのは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によってゲノムＤＮＡの制限断片を検出することである。これは、限定的な汎用プライマー群を使用して何らかの由来または複雑系のＤＮＡから指紋を作成することを可能にし、事前に配列を知ることは不要とする。メチル化に感度を有する制限酵素の使用により、この方法をメチル化検出に適用できる。
【０１６１】
前記ＤＮＡを、シトシンメチル化に感受性のある、レアカッター一つと一般的なカッター一つの、二つの制限酵素によって制限した。一般的なカッターの、シトシンメチル化の異なるタイプに感度を有するアイソシゾマーを使用して、二つの異なる制限を行った。酵素はすべてカナダのFermentas社から取得した。
【０１６２】
Ｍｓｐｌ酵素：配列5'CCGG3'の二つのシトシンの間で切断する。その作用は、一つ目のＣ上のメチル化によって阻害されるが、二つ目のＣ上のメチル化では阻害されない。
【０１６３】
Ｈｐａｌｌ酵素：配列5'CCGG3'の二つのシトシンの間で切断する。その作用は、二つ目のＣ上のメチル化によって阻害されるが、一つ目のＣ上のメチル化では阻害されない。
【０１６４】
【表３】
2013526271.tif 000006
【０１６５】
制限部位に特異的なアダプターはＤＮＡに連結して、最初に配列情報を取得する必要なく、汎用プライマーで断片を増幅することを可能にする。前記酵素はすべてFermentas社から取得し、前記アダプターはSigma-Genosys社から取得した。
【０１６６】
【表４】
2013526271.tif 000007
【０１６７】
アダプター混合物は、EcoRIアダプターを１ｎＭと、MspI/HpaIIアダプターを１０ｎＭとを組み合わせて作成した。
【０１６８】
【表５】
2013526271.tif 000008
【０１６９】
前記増幅ラウンドは、前記EcoRI末端に対応する一つのオリゴヌクレオチドプライマーと、前記MspI/Hpall末端に対応する一つのオリゴヌクレオチドプライマーとを使用して行われる。増幅の第一ラウンドは、前記プライマーの３’末端に余分に１個、塩基を追加することによって断片の数を減らし、増幅の第二ラウンドは、前記プライマーの３’末端に余分に１個または２個の塩基を追加することによって断片の量をさらに減らす。前記第二ラウンドEcoRIプライマーは、6-Fam（カルボキシフルオレセイン）と標識化され、生成物の可視化を可能にする。
【０１７０】
【表６】
2013526271.tif 000009
【０１７１】
【表７】
2013526271.tif 000010
【０１７２】
【表８】
2013526271.tif 000011
【０１７３】
【表９】
2013526271.tif 000012
【０１７４】
【表１０】
2013526271.tif 000013
【０１７５】
【表１１】
2013526271.tif 000014
【０１７６】
選択的増幅工程の生成物は、韓国のMacrogen社へ送付され、そこでApplied Biosystems社の遺伝子アナライザー上でキャピラリー電気泳動法により分画された。その結果をGeneMapper社の解析ソフトウェアを使用して可視化し解釈して、さらに解析するためにMicrosoft Excelへエクスポートした。Kovach, W. (1998); MVSP - A Multivariate Statistical Package for Windows, Version 3.0.  Pentraeth, Wales, UK: Kovach Computing Servicesが記載しているようにＭＶＳＰ（http://www.kovcomp.co.u/mvsp/）を使用するか、または、Minitab 15 (http://www.minitab.com/en-GB/default.apsx?WT.srch=1&WT.mc_id=SE004815)を使用して、多変量解析（主座標分析）を行った。
【０１７７】
ＡＦＬＰプロトコル内の各バンド（単位複製配列）は、単一の遺伝子座の単一の対立遺伝子であると考えられた。各処理について、各遺伝子座の対立遺伝子属性をまず単純な定量的方法で１（有）または０（無）として各複製個体について割り当てた。もし遺伝子座について個体の前記対立遺伝子プロファイルが３個体分以上異なっていれば、前記遺伝子座は、一対のストレス処理間で、または対照とストレス処理との間で異なっているとみなされた（たとえば、１１１１１１１１と１１１１１０００は異なるとみなされるが、１１１１１１１１と００１１１１１１は異なるとはみなされなかった）。遺伝子座すべてがこの基準を満たせば、その後に行われる多変量解析用のセンチネルマーカーの候補とみなされた（以下を参照）。
【０１７８】
センチネルＤＮＡメチル化マーカーを組み立てるための訓練は４ラウンドあった。このため、対照を含む３つの処理の４つのグループで、処理間の比較を行った（表１１）。その後、これら４つのグループからのデータを組み合わせ、センチネルを統合した群とし、全サンプルに適用した。
【０１７９】
【表１２】
2013526271.tif 000015
訓練済みセンチネルからの結果を解析するために、主座標分析を使用した。
【０１８０】
結果
全マーカー（選択的訓練無し）
全条件にわたって多型座を特定することに訓練を限定すると（組み合わせ訓練）、９５９個の遺伝子座が記録され、それらすべては個体間で何らかの多型レベルを示した。多変量解析をコンパイルするために前記データを使用したとき、ストレスを与えられた集団に妥当な分離が見られ、同じストレスに曝露された植物体がクラスターを形成する傾向があった（ＰＣＯ、図１）。ただし、異なるストレス処理を受けた個体間、特に温度ストレスと、植食または対照との間に、重複もあった。上位二つの成分は、全ばらつきの２３．２％であった。
【０１８１】
２個のストレスと対照とでセンチネル選択用基準を満たすマーカーのみを使用すると、使用されたマーカーの数は減るのに訓練済みストレス間の分離は向上した。たとえば、対照サンプルと塩分および温度ストレスとについてセンチネルを選択すると、使用されるマーカーの数は９５９から５２５へ減った。それにもかかわらず、これらグループ間の分離は向上し（訓練群間の重複は無かった）、上位２つの主成分が表すばらつきの率は若干増えて２４．８％となった。
【０１８２】
重要なことに、未訓練のストレス（植食）に曝露された個体もまた、非常に明瞭な分離を示し、曖昧なのは一つのサンプル（Ｈ８）のみであった（図２）。
【０１８３】
これら３個のストレスすべてを訓練が含むと、遺伝子座の数は減って１３７となるが、ストレス間の分離は顕著に向上し、曖昧な個体が無くなった（図３）。さらに、全ばらつきにおいて上位２つの主成分が表すばらつきの率は顕著に増えた（３２．７％へ）。
【０１８４】
センチネル選択のための統計的アプローチ
整理されたデータの計算を、Ｒウェブサイト（www.r-project.org）から得たパッケージを使用してＲ環境（Ｒ環境）で行った。対にした処理の間で比較し、４つの処理を区別するためにはどの特徴（バンド）が統計的に最も関連があるかを判定した。３つの異なる方法、Random forest, Welch t-statistic, 曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、特徴を選択し、これら３つすべてから得られた結果を組み合わせて、前記異なる処理を区別するために最も適切な特徴群とした（表１３）。
【０１８５】
前記選択された特徴のサブセットを、主座標分析を使用して可視化し、前記４つの処理間の最大の分離のための、最適な数を判定した（図４〜７）。
【０１８６】
差異アプローチ
前記整理されたデータを使用して、前記４つの処理の各々について８の潜在的な数から存在するバンドの全数を算出した。処理の対の差異を算出し、これら処理の対の間の最も大きな差異を有する特徴をセンチネルとして選択した（表１４）。
【０１８７】
【表１３】
2013526271.tif 000016
【０１８８】
【表１４】
2013526271.tif 000017
【０１８９】
前記選択された特徴のサブセットを、主座標分析を使用して可視化し、前記４つの処理間の最大の分離のための、最適な数を判定した（図８〜１１）。ここで、センチネルマーカーの数が減ってグループ間の明瞭な区別が保持されたが、全体に対する比率は上位１００個のマーカーを使用したときの１６．１％（図８）から、上位１０個のマーカーがセンチネルとして使用された時の２７％（図１１）へと増加した。
【０１９０】
実施例２  −  マウス細胞株におけるストレス特定用のメチル化感受性増幅断片長多型
細胞培養条件
マウス単球マクロファージ細胞RAW 264.7（ECACC No. 91062702）のエピゲノムに対する外部ストレスの影響を検証する。細胞を３２ウェルのマイクロプレートに2.5(105細胞／ｍｌで植え付けて培養し、採取するまで２０時間、３７℃、二酸化炭素５％で培養した。特段の記載がなければ、使用された培地は、２ｍＭのＬ−グルタミンと１０％のウシ胎仔血清を補給したＤＭＥＭである。
【０１９１】
これら細胞の集団に３つのストレスを与えた。
１．（Ｉ）２０ｍｇ／ｍｌのインターロイキン４（ＩＬ４）
２．（Ｌ）１ｍｇ／ｍｌのリポ多糖類（ＬＰＳ）
３．（Ｓ）培地からのＬ−グルタミンが無いこと
【０１９２】
ＤＮＡの抽出はすべてQiagen社のキットを使用し、製造者の指示にしたがって行った。マクロファージサンプルからＤＮＡ抽出を行うために、DNeasy社の血液組織キットを使用した。下記に言及する試薬はすべて前記DNeasyキットからのものである。
【０１９３】
培養ウェルから反転によって媒質を除去し、２００μｌのＰＢＳ、２０μｌのプロテイナーゼ、および２００μｌのバッファーＡＬ（エタノールを使用せず）と置き換えた。ボルテックスすることによって前記内容物を混合し、５６℃で１０分培養した。これに続き、２００μｌのエタノール（９５〜１００％）を各サンプルに加え、ボルテックスによって前記プレートを混合した。各ウェルからのこの混合物をDNeasyミニ回転カラムへ移し、8,000rpmで１分遠心分離にかけた。
【０１９４】
ＤＮＡ分子がカラム上に保持されているため、前記流動物を廃棄した。５００μｌの洗浄バッファーＡＷ１を前記カラムに通し8,000rpmで１分間遠心分離を行って、付着しているＤＮＡを１度洗い、５００μｌの洗浄バッファーＡＷ２を前記カラムに通し8,000rpmで１分間遠心分離を行って、付着しているＤＮＡを１度洗った。続いて、前記膜を13,000rpmで１分間遠心分離にかけて乾燥させ、１００μｌのバッファーＡＥを加えてＤＮＡを溶出させ、室温で１分間培養したのちに、8,000rpmで１分間遠心分離を行った。
【０１９５】
ＤＮＡの質および量は、上記実施例１で詳述したようにテストされる。
【０１９６】
増幅断片長多型
増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）は、Vos et al(1995)によって記載されたプロトコルに基づいており、上記実施例１で詳述したように実行した。
【０１９７】
センチネルの選択
実施例１におけるシロイヌナズナについて上述したものと同じように、マウスセンチネルを選択した。
【０１９８】
結果
全マーカー（選択的訓練無し）
全条件にまたがって多型座を特定することに訓練を限定すると（組み合わせ訓練）、７３４個の遺伝子座が記録され、それらすべては個体間で何らかの多型レベルを示した。多変量解析をコンパイルするために前記データを使用したとき、ストレスを与えられた集団に妥当な分離が見られ、同じストレスに曝露された細胞株がクラスターを形成する傾向があった（ＰＣＯ、下記図１２）。全ばらつきついて上位二つの成分が明らかにしているのは、１５．８％のみであった。
【０１９９】
ふたつのストレスと対照サンプルとの間で最も一貫した相違を示したマーカーを選択すると、ストレスグループ間の区別を維持し（またはわずかに改善し）たが、第一と第二の主成分にカバーされるばらつきの率を増加させ、３つのストレスのうち２つについて訓練されたプロットについては全ばらつきの１９．８〜２０．７％という狭い範囲に入った（図１３〜１５）。
【０２００】
このように、２つのストレス処理間の差異を強調する多型マーカーのサブセットを選択することで、全多型マーカーを使用して行われるＰＣＯで第三のストレスを同様に分離できた。
【０２０１】
さらに、全マーカーを使用するプロットにおいてよりも、訓練済みセンチネル群の中でのほうが、グループの区別に関与する上位２つの主成分が、全ばらつきのより多くに対応し、したがって「ノイズ」のばらつきが少なかった。ただし、前記訓練済みセンチネル群は、処理内、および処理間の、どちらにおいても変動する遺伝子座をいくつか含み、したがってストレス診断に単独で使用されると役に立たないであろう。
【０２０２】
実施例３−センチネルを作成するサンプル方法と、シロイヌナズナにおけるその使用
センチネルとして使用するための標的遺伝子の選択を、２つの相補的データベースを相互参照することによって行った。
【０２０３】
第一のデータベース（the Highly Integrated Single-Base Resolution Maps of the Epigenome in Arabidopsis, http://neomorph.salk.edu/epigenome/epigenome.html）は、シロイヌナズナ野生型とＤＮＡメチル化維持（met1-3）および確立（drm1-2, drm2-2, cmt3-11）とに欠陥のある突然変異種とでトランスクリプトームおよびメチロームを比較した最近の研究によって作成された、メチル化によって制御される遺伝子のリストを含んでいる（Lister et al 2008）。これら遺伝子の発現レベルが上がり、それに続いて、野生型と比べて突然変異種でのＤＮＡメチル化のグローバルロスが起こると、これら遺伝子がＤＮＡメチル化によって制御され、大半がメチル化によって下方制御されると推測できる。したがって、対照と比較してテストされたストレスのいずれかの下で、または発生段階または組織のいずれかの間で、発現に変化があると、それは変化した条件によってメチル化プロファイルにおける変化が引き起こされたことを意味し、それらは候補センチネルとしてふさわしいことになる。
【０２０４】
Genevestigator (https://www.genevestigator.com)は、ある範囲の特定のストレス、器官、および発生段階の下でのシロイヌナズナの４８４個の遺伝子の発現について、マイクロアレイ解析から得られた情報を提供した（図１６〜１８）。
【０２０５】
遺伝子が所与のストレスにさらされた時に対照と比較して４倍の発現を示すと、その遺伝子はストレス下で上方制御されたと分類された。下方制御は、対照と比較して発現が４分の１に減少するものと定義された。遺伝子発現に４倍以上の変化があったものを「１」、４分の１以下に変化したものを「−１」、遺伝子発現に変化のなかったものを「０」として表す（コード化する）ことによって、出力データを３段階に変換した。このように、下記の解析において、ＤＮＡメチル化状態の未処理の相関関係としてｃＤＮＡの存在量を使用し、したがってこれら遺伝子座でのメチル化センチネルの潜在力の最悪状況指標を提供する。ＤＮＡメチル化を直接測定すれば、無益なばらつきが明らかになることを減らせるであろう。なぜなら、ｍＲＮＡはその存在量に突然な不安定な変化が起こりやすい（Stavreva et al 2009; Kageyama et al 2007）から、また、個々の遺伝子座の各々はそれ自体がセンチネルとして使用できるいくつかの潜在的なメチル化部位を含むからである。
【０２０６】
ストレス４および７５は、遺伝子のいずれにおいても発現レベルの変化を生じさせないので特定できず、したがって解析から除去した。ストレスＳ５１、Ｓ５２，およびＳ５７は同様の発現応答を有するので個別に特定できず、Ｓ５１およびＳ５２を除去した（Ｓ５７は解析に残した）。当初の８２個のストレスのうち、したがって７８個のプロファイルが解析に使用された。
【０２０７】
４８４個の遺伝子と、その各々について８２個のストレスで、合計３９，６８８個の遺伝子‐ストレス対の組み合わせを検証した。これらの対のうち、１８０６個（４．５６％）が発現において４倍以上の変化を示し、９３１個（２．３５％）がストレス下で上方制御され、８７５個（２．２１％）が下方制御された。
【０２０８】
コンピュータプログラム
ソフトウエア開発とプログラミング
すべてのベイズ解釈と同様、当該解析用のアルゴリズムも確率論的かつ不完全である；したがって、プログラムが確実な答えを生成するという保証はないが、確実な答えを生成することもよくあり、そうでなかったとしても、確実な答えに比較目的には十分に近い値を常に提供する。
【０２０９】
タスク定義とアルゴリズムの設計
プログラムの目的を、所与の数のストレスを特定するために必要な最小限の数の遺伝子を判定することと定義した。この場合、候補センチネルとして選択した遺伝子すべての発現がメチル化変異で変わるので（上記参照）、発現における４倍の変化を、これら遺伝子座でのメチル化状態における変化を示しているとみなした。
【０２１０】
アルゴリズム（Ａ）
Ｎ、使用する遺伝子の所定の数。
Ｅｖａｌ、Ｎ個の遺伝子の順序集合を取り、一意的に特定されたストレスの数を返す。
【０２１１】
３つの異なる段階（−１：下方制御、０：変化無し、１：上方制御）を表す遺伝子を使用して分類されうるストレスの数は３である。したがって、遺伝子発現プロファイルの群から特定されるストレスの論理的な数は、前記群の中の遺伝子の三乗である。さらに、組み合わせの公式に従うと、なんらかのＮ個の要素を重複なく３つずつ取れば、N3個の組み合わせができる（一例としては、図１９を参照）。
【０２１２】
４８８個の遺伝子から、８１個のストレスを分類できる最小数の遺伝子の群を特定するためにコンピュータープログラムを作成した。三又のツリーを使用して解を表すが、ツリーのノードは遺伝子に対応し、枝はストレスへの応答を示し、上方制御か下方制御か、制御に変化無しかを示している（図２０）。二つの遺伝子が、８つのストレスＳ１〜Ｓ８に結びつくことが示されている。「＋」は上方制御を示し、「−」は下方制御を示している。もし遺伝子１が下方制御（−）され遺伝子２が上方制御（＋）されると、これはＳ６のストレスプロファイルに対応する。
【０２１３】
所与の数の遺伝子から特定できるストレスの最適数を特定するために、確率論的なヒルクライマーを使用した。少数の遺伝子および／またはストレスについては完全な解が可能かもしれないが、遺伝子またはストレスの数が増加するにつれて幾何学級数的に計算条件が増加するので、このアプローチはこの問題に対する最も有用な解決策を提供する。
【０２１４】
ヒルクライマー
１．Ｎ個の遺伝子のランダムな群を生成する。Ｎは使用される遺伝子の所定の数である。
２．前記群のＮ個の遺伝子の一つを、現在群の中に無い遺伝子と置き換える。
３．機能Ｅｖａｌで、工程２からの遺伝子の群を使用して、一意的に特定されたストレスの数を見出す。
４．工程２および３からの解が、現在保持されているものよりもさらによい解を生む場合、現在保持されている解を、工程２／３からの解と置き換える。
５．もしストレスすべてが一意的に特定されれば、解を報告し、終了し、さもなければ工程２へ行く。
【０２１５】
ヒルクライマーは、１万回のイタレーションで実行され、独立して１０００回実行される。全ストレスを一意的に特定して、最適な解が見いだせないと、ほとんどのストレスを一意的に特定する解が返される。
【０２１６】
結果
アルゴリズムＡを、上記データを使用して実行した。最小値、Ｎ、は、最初は２０とし、ストレスすべてを特定する解を見つけることができなくなるまで１ずつ減らした。このアプローチを用いて、７８個のストレスすべてを特定するために必要な遺伝子の最小数が１５であると特定した。前記選択された遺伝子とそれが適用される順序を、表１５に示す。表１６は、表１５の遺伝子発現リストを使用して各ストレスをどのように診断するかを示す。表１７は、各ストレスがこれらの遺伝子に、上方制御、下方制御、または変化無しということについて、どのように影響を与えるかをまとめている。
【０２１７】
前記７８個のストレスを特定することのできる遺伝子の重複群を作成するために、上記の手順を繰り返して、表１５の遺伝子を除去し、入手可能な遺伝子のプールとした。ストレス８０は、１回目の分析に使用された一つの遺伝子によってのみ特定され、その後特定できなかったために除去した。１５から開始して解が見つかるまで１ずつ増やすことにより、Ｎを見いだした。７７個のストレスすべてを特定できるＮの最低値は、２１であった。表１８は、７７個のストレスを特定するために必要な前記２１個の重複遺伝子とその順序を示す。
【０２１８】
【表１５】
2013526271.tif 000018
【０２１９】
【表１６−１】
2013526271.tif 000019
【表１６−２】
2013526271.tif 000020
【０２２０】
【表１７−１】
2013526271.tif 000021
【表１７−２】
2013526271.tif 000022
【０２２１】
異なるストレス間の類似点を、GeneAlexソフトウェアを使用した上記の発現プロファイルに基づき、主座標ユークリッド分析（PCoA）（Gower, 1966）によって判定した（Peakall and Slouse 2005）。この解析は、ストレスのグループ分けの一定水準を示した（図２１）。
【０２２２】
分離とグループ分けを改善するために、２１個の遺伝子という第二の群を、先の１５個の遺伝子に追加した（表１８）。
【０２２３】
【表１８】
2013526271.tif 000023
【０２２４】
これにより、表１９に示すマトリクスを作成するが、そこでは遺伝子センチネル１〜２１が遺伝子Ｓ１〜８２に応答して変化しなかった（−１）、下方制御された（０）、または上方制御された（１）。
【０２２５】
【表１９−１】
2013526271.tif 000024
【表１９−２】
2013526271.tif 000025
【０２２６】
ここでも、異なるストレス間の類似点を、上述したように主座標ユークリッド分析（PCoA）によって判定した。このセンチネル遺伝子の第二の群は、ストレスグループ分けによって高レベルのクラスタリングを示した。
【０２２７】
このように、これらデータは、３９個のストレスに基づいて特定されたセンチネルの群が、これらストレスへの曝露を識別することができ、また、センチネルを特定するために使用されなかったストレスの大部分への曝露も識別できる。さらに、ストレスのクラスタリングは、検出された不明のストレスの膨大な分類を、最適化が可能にするであろうということを示唆している。
【０２２８】
ストレスの分離の改善とクラスタリングの向上のために、２３個の遺伝子という第三の群を、先の３６個の遺伝子に追加した。表２０。
【０２２９】
【表２０】
2013526271.tif 000026
【０２３０】
ここでも、異なるストレス間の類似点を、上述したように主座標ユークリッド分析（PCoA）によって判定した。この遺伝子の第二の群は、ストレスグループ分けのなかで高レベルのクラスタリングを示した（図２４）。
【０２３１】
これにより、表２１に示すマトリクスを作成するが、そこでは遺伝子センチネル１〜２１が遺伝子Ｓ１〜８２に応答して変化しなかった（−１）、下方制御された（０）、または上方制御された（１）。
【０２３２】
【表２１−１】
2013526271.tif 000027
【表２１−２】
2013526271.tif 000028
【０２３３】
下記に示す図面は、PCoAによって得られた情報の一部である二次元スペース上の表現を示す。実際のところ、六次元までのボリュームを形成することによってストレスグループが分離できるスペースを生成した。これは図で示すことができないが、この情報はコンピューター内で使用できる。
【０２３４】
このデータは、センチネル原理を実証するために開発されたプログラムが、１５個、２１個、および２３個の遺伝子をそれぞれ含むシロイヌナズナのセンチネル遺伝子の、３つの連続的に訓練された群を生成したことを示している。各センチネル群は、７８個の調査されたストレスへの曝露を、対照サンプルから区別可能な発現／メチル化としてはっきりと診断できる。
【０２３５】
このように、前記適切な特性を有するマーカーの、一連の選択されたサブセットが組み立てられ、標準的対照成長条件に関連する「正常な」生理学的状態との相違を検出し、これらのマーカーにおける発現および／またはＤＮＡメチル化状態に対する変化として明示することができる。これらの群が独立しているということは、対照状態からの相違を示すことについてセンチネル群すべてにわたって一致しており、この一致が診断の正確さについての信頼性レベルを増している、ということを意味する。センチネル群が累進的に増加し蓄積するということや、多変量解析のためにそれらを集団的に使用するという、更なる特徴は、センチネルマーカーが増加するにつれてストレスタイプによるクラスタリングが増加し、散布図がますます体系化する（図２１および２４）、ということである。
【０２３６】
各ストレス用のサンプルを複製するために適用されると（実施例１，２のように）、このようにマーカーの数を増やすということは、同じストレスに曝露されたサンプル間のばらつきによって起こるノイズを最小限にする。このように、クラスター分析、またはその他の決定アルゴリズムは、それまでテストされなかったストレスやストレス応答を適切なグルーピングに正しく分類する。
【０２３７】
有効化
前記方法の予測力を有効にするには、置換することなくランダムにストレスの半分をサンプリングして、１０００個のデータ群を作成する。サンプリングされた半分のストレスを訓練用群として分類し、サンプリングされなかったストレスを、有効化群と呼んだ。
【０２３８】
訓練用群のそれぞれを、Ｎを１０、２０、３０、および４０と設定してアルゴリズムＡで４回解析した。
【０２３９】
その結果に対して、二つのテストを行った（表２２）。テストＡは、有効化群から各ストレスをかわるがわる取り、それが訓練用群から一意的に特定できるかを調べた。テストＢは、ストレスをすべて組み合わせた時の、グループの数と、存在するメンバーが一つだけであるグループの数と、を調べた。前記選択された遺伝子について発現に変化が無ければ、そのストレスは無効とされた。
【０２４０】
【表２２】
2013526271.tif 000029
【０２４１】
実施例４−生物学的サンプル用のストレスの特徴明瞭化
前記センチネル遺伝子座は、ストレスの区別と、ストレス特定に使用されなかった発生段階の区別と、のために発生させることができる。
【０２４２】
ヒト染色体６、２０、および２２をカバーする部分的メチロームが、Eckhardt et al (2006)によって公開された。この情報を使用して、２３４５個のヒトマーカーをセンチネル候補として選択し、そのうち４０個の遺伝子を器官によって異なるメチル化状態を有するものと特定した（表２２）。これら４０個の遺伝子は、Genevestigatorソフトウェア（Zimmerman et al 2004およびZimmerman et 2005）やウェブベースのアプリケーションで相互参照されるが、異なる組織での発現の変化を含み、これら組織やメチル化の研究に含まれなかった別の組織で差次的に発現することがわかった遺伝子であり（図２７）、その発現がメチル化に感度を持つことが確認されている。
【０２４３】
さらに、これら遺伝子の発現が、発生の様々な段階で研究されている時に、かつ、細胞／個体が幅広い刺激、薬物治療、疾患や、遺伝子改変にさらされている時に、所与の生物の遺伝子が活性化され、幅広い様々な発現プロファイルが観察される。これらプロファイルは、条件をすべてはテストできないとしても、大部分について一意的なプロファイルを組み立てることを可能にする。
【０２４４】
Genevestigatorを使用して、これらマーカーがヒトにおいて５０６個の刺激（化学物質への曝露、臓器移植、疾患、環境ストレス、などを含む）に応答していると判定することが可能である（図１６および２５）。この解析はまた、センチネルの発現レベルを使用して、ヒトにおける８つの異なる年齢グループで（図１７および２６）、最終的に２２７個のヒト細胞型で（図１８および２７）、行われた。
【０２４５】
変化した発現が通常（理想的にはいつも）これらセンチネル遺伝子座でのメチル化変化に関連するなら、これら遺伝子座にまたがるメチル化プロファイル中の変化は、疾患、ストレス、生理的年齢および／または状態の医療的診断や、さらには生物学的物質の由来の特定など、多数適用できるであろう。
【０２４６】
このセンチネル群をサンプルに適用するために、研究室、病院、医療診断所などではすでに使用されている既存の技術を使った様々なアプローチが利用できるだろう。センチネルのメチル化状態を採点するための技術としては、ゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩処理した後にセンチネル遺伝子座の各々について特定のプライマーを使用してセンチネルをＰＣＲ増幅し、その後、（１）高解像度溶融（ＨＲＭ）解析（Wojdacz andDbrovic 2007; White et al 2007）、（２）重亜硫酸塩特異的シーケンシング（Frommer et al 1992）、または（３）重亜硫酸塩特異的ピロシーケンシング（Yang et al 2004）を行う技術がある（これらに限定されるわけではない）。各センチネル遺伝子座についての特異的プライマーの設計は、当業者にとっては通常の業務であろう。
【０２４７】
これら３つのアプローチはすべて利点と欠点を有するが、高処理量のサンプル解析を可能にし、自動化でき、簡便に解析できるフォーマットのデジタルデータを生成することができる。
【０２４８】
最終的なプロトコル設計は、選択したアプローチに応じて決まる。センチネルすべてからの結果が得られれば、その結果は、上記の実施例に記載したソフトウェア（アルゴリズム）を含む能動的データベースに導入され、既知のストレスにそれら結果が関連づけられる。有効なプロファイルマッチが見つからなければ、サンプルのエピジェネティックプロファイルを上記のようにストレスのグループと関連されるために、PCoA（主座標分析）を行うことが可能であろう（実施例３のように）。
【０２４９】
表２２に示された例では、メチル化状態が定量的に提示されている。実施例３でのようにPCoAで使用するこれらの値に、単純閾値（たとえば、値>50% = 1; 値<50% = 0）を適用することができる。または、前記データを主成分解析などの定量的解析システムに直接使用して、ストレスクラスタリングパターンを判定することができる。
【０２５０】
表２３−差次的にメチル化されるとわかった遺伝子の例
４７０個の差次的にメチル化した（Ｐ＜０．００１）単位複製配列をゲノム注釈上にマッピングすると、解析された組織／細胞型で差次的にメチル化された遺伝子の特定が可能になる。前記表は、各組織についてのそれぞれの平均メチル化値を使用して、差次的メチル化を呈する４８個の遺伝子を示す。カラーコードは、黒＝無、薄い灰色＝不均一、白＝高メチル化を示す。Eckhardt et al., 2006を修正。
【表２３−１】
2013526271.tif 000030
【表２３−２】
2013526271.tif 000031
【０２５１】
本明細書中に記載された現在の好適な実施形態に対する様々な変更や改良は、当業者には明白であろうことが理解されるべきである。かかる変更や改良は、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、また、それに付随する利点を損なうことなく、行うことが可能である。したがって、かかる変更や改良は、付随するクレームの範囲内であるものとする
【０２５２】
本明細書中で引用されたすべての参照文献の内容は、この参照により、すべて本明細書に包含される。
【０２５３】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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