(57)【要約】一態様において、本発明は、ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞の成長および／または増殖の阻害方法であって、該腫瘍細胞をＣＳＮＫ１εインヒビターと接触させる工程を含む方法を提供する。別の態様では、本発明は、ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞を含む腫瘍に苦しんでいる被験体の処置方法であって、該被験体にＣＳＮＫ１εインヒビターを含む組成物を、該腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するのに有効な量で投与することを含む方法を提供する。
2013525283.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法であって、該腫瘍細胞をＣＳＮＫ１εインヒビターと接触させる工程を含む方法。
【請求項２】
前記ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞が神経起源のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経起源のｍｙｃ駆動型腫瘍細胞が、原発性神経芽細胞腫腫瘍、転移性神経芽細胞腫腫瘍または脳腫瘍に由来するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞が卵巣癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞が、横紋筋肉腫、肝臓癌、黒色腫、乳癌、結腸癌、前立腺癌、バーキットリンパ腫および肺癌からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍細胞をインビトロで接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍細胞を哺乳動物被験体においてインビボで接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＳＮＫ１εインヒビターが小分子インヒビターである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＳＮＫ１εインヒビターが、ＩＣ２６１、ＰＦ−４８００５６７、およびＰＦ−６７０４６２からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞を含む腫瘍に苦しんでいる被験体の処置方法であって、該被験体にＣＳＮＫ１εインヒビターを含む組成物を、該腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するのに有効な量で投与することを含む方法。
【請求項１１】
前記被験体が神経起源のｍｙｃ駆動型腫瘍細胞を含む腫瘍に苦しんでいる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経起源のｍｙｃ駆動型腫瘍細胞が、原発性神経芽細胞腫腫瘍、転移性神経芽細胞腫腫瘍または脳腫瘍に由来するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞が卵巣癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞が、横紋筋肉腫、肝臓癌、黒色腫、乳癌、結腸癌、前立腺癌、バーキットリンパ腫および肺癌からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験体に、１種類以上のさらなる抗癌療法がさらに施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
該さらなる抗癌療法が化学療法を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞がシスプラチンに抵抗性であり、前記ＣＳＮＫ１εインヒビターによって該細胞がシスプラチンに対して感受性となる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＳＮＫ１εインヒビターが小分子インヒビターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＳＮＫ１εインヒビターが、ＩＣ２６１、ＰＦ−４８００５６７、およびＰＦ−６７０４６２からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＳＮＫ１εインヒビターを含む前記組成物での処置の前に、前記被験体の前記腫瘍がｍｙｃ駆動型腫瘍細胞を含むかどうかを調べる工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、その全体が本明細書中に参考として援用される、２０１０年４月６日に出願された米国仮出願６１／３２１，４１４号の米国特許法１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。
【０００２】
政府実施許諾の記載
本発明は、米国立衛生研究所から付与された助成金番号ＡＧ０２６６６１による米国政府の補助を伴って行なわれた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般的に、抗癌療法剤を特定し、使用するための方法に関し、より詳しくは、ＭＹＣ駆動型腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するためのカゼインキナーゼ１ε−アイソフォーム（ＣＳＮＫ１ε）のインヒビターの特定方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
癌、すなわち、制御不能な細胞増殖は、依然として世界的に大きな健康問題である。種々の癌の検出および治療法は大きく進歩してきているが、予防または処置のための普遍的に好成績な方法は現在のところ得られていない。現在使用されている治療法は、一般的に、化学療法、手術または放射線を併用して、増殖している細胞を選択的に破壊または除去することに基づいたものである。しかしながら、このような処置は、多くの患者において不充分であることがしばしば判明する。そのため、最近では、具体的な癌の細胞レベルおよび遺伝子レベルでの原因の個別化処置が重要視されてきている。
【０００５】
癌は、癌遺伝子の活性化および／または腫瘍関連抑制遺伝子の不活化をもたらす多重遺伝子変異の蓄積である。細胞が細胞周期に対する制御を無効にして非抑制性の増殖を起始することを可能にするのは、このような重要な遺伝子およびその下流エフェクターの識別的発現である。発癌の下地となる多くの遺伝的機構が解明されているが、多くの既知の癌遺伝子の産物は、健常細胞において必須機能を促進させる（細胞周期および細胞成長の促進など）。したがって、多くの癌遺伝子および／または癌タンパク質は、正常細胞に毒性をもたらすため、指向的癌処置には問題となる標的である。したがって、癌遺伝子の機能と関連している薬物標的であって、処置が健常細胞に対するマイナス効果が最小限である標的を特定する必要性が依然として存在している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本概要は、詳細説明において以下にさらに説明する概念のうち選定したものを簡略化した形態で紹介するために示す。本概要は、特許請求の範囲に記載の主題の枢要な特徴を特定することを意図するものでなく、特許請求の範囲に記載の主題の範囲の決定の補助として使用されることを意図するものでもない。
【０００７】
一態様において、本発明は、ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞の成長および／または増殖の阻害方法であって、該腫瘍細胞をＣＳＮＫ１εインヒビターと接触させる工程を含む方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞を含む腫瘍に苦しんでいる被験体の処置方法であって、該被験体にＣＳＮＫ１εインヒビターを含む組成物を、該腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するのに有効な量で投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、ｍｙｃ駆動型癌細胞の増殖を阻害し得る化合物の特定方法を提供する。本発明のこの態様による方法は：（ａ）ＣＳＮＫ１εを発現しているｍｙｃ駆動型癌細胞株を候補化合物と細胞培養状態で接触させること；ならびに（ｂ）（ｉ）候補化合物の存在下および非存在下でのＷＮＴの発現もしくは活性のレベル、または（ｉｉ）候補化合物の存在下および非存在下でのＳＨＨの発現もしくは活性のレベル、または（ｉｉｉ）候補化合物の存在下および非存在下でのＣＳＮＫ１εの発現もしくは活性のレベルのうちの少なくとも１つを測定することを含み、候補化合物の存在下でのＷＮＴの発現レベルもしくは活性の減少；および／またはＳＨＨの発現レベルもしくは活性の減少、および／またはＣＳＮＫ１εの発現レベルもしくは活性の減少は、化合物が癌細胞の増殖を阻害するものであることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図面の説明
本発明の前述の態様および付随する利点の多くは、より容易に認識されることとなり、これは、以下の詳細説明を参照することにより、添付の図面と併せて解釈すると、より良好に理解されることとなろう。
【図１Ａ】図１Ａは、ＭＹＣＮ発現が増幅している、または増幅していない神経芽細胞腫細胞におけるＣＳＮＫ１εのタンパク質レベルを示すウエスタンブロットである。；実施例１に記載のとおり。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＭＹＣＮ発現が増幅している、または増幅していない神経芽細胞腫細胞におけるＣＳＮＫ１εの遺伝子発現レベルを示す棒グラフである；実施例１に記載のとおり。
【図２】図２は、ＭＹＣＮ発現が増幅している、または増幅していない神経芽細胞腫細胞におけるＣＳＮＫアイソフォームの相対発現を示す棒グラフである（ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定）；実施例１に記載のとおり。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｄｏｘ誘導ｓｉＲＮＡサイレンシングを行なった、または行なっていない神経芽細胞腫細胞におけるＣＳＮＫ１ε  ｍＲＮＡの相対レベルを示す棒グラフである（ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定）；実施例１に記載のとおり。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｓｉＲＮＡサイレンシングの誘導を行なった、または行なっていない神経芽細胞腫細胞におけるＣＳＮＫ１εタンパク質の相対レベルを示すウエスタンブロットである；実施例１に記載のとおり。
【図３Ｃ】図３Ｃは、２つのＣＳＮＫ１ε配列および対照配列に標的化される誘導性ｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルス構築物で形質導入したときの、ＭＹＣＮが増幅している神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２およびＩＭＲ−３２）またはＭＹＣＮ増幅がない神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ）のバイアビリティを示す棒グラフである；実施例１に記載のとおり。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＭＹＣＮが増幅している神経芽細胞腫細胞（ＩＭＲ−３２）およびＭＹＣＮ増幅がない神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ）における細胞バイアビリティに対するｓｉＲＮＡでのＣＳＮＫ１εまたはＭＹＣＮ一過性ノックダウンの効果を示す棒グラフであり、ここで、該細胞は、各遺伝子（３種類の異なる二本鎖）に特異的なｓｉＲＮＡプールでトランスフェクトし、バイアビリティはトランスフェクションの９６時間後にアッセイした；実施例１に記載のとおり。
【図４Ａ】図４Ａは、ＩＣ２６１濃度の関数としての、ＭＹＣＮが増幅している神経芽細胞腫細胞（ＩＭＲ−３２）およびＭＹＣＮ増幅がない神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ）のバイアビリティを示すグラフであり、ここで、バイアビリティは処理の４８時間後にアッセイした；実施例１に記載のとおり。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＩＣ２６１濃度の関数としての、ＭＹＣＮが増幅している神経芽細胞腫細胞（ＩＭＲ−３２）およびＭＹＣＮ増幅がない神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ）のバイアビリティを示すグラフであり、ここで、バイアビリティは処理の７２時間後にアッセイした；実施例１に記載のとおり。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＩＣ２６１濃度の関数としての、ＭＹＣＮが増幅している神経芽細胞腫細胞（ＩＭＲ−３２）およびＭＹＣＮ増幅がない神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ）のバイアビリティを示すグラフであり、ここで、バイアビリティは処理の９６時間後にアッセイした；実施例１に記載のとおり。
【図５】図５は、ＩＣ２６１への曝露前および曝露の４８時間後の、ＭＹＣＮが増幅している神経芽細胞腫細胞（ＩＭＲ−３２）およびＭＹＣＮ増幅がない神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ）を示す一連の顕微鏡写真を示す；実施例１に記載のとおり。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｄは、腫瘍を生着させた４匹のマウスの腫瘍体積をグラフで示したものであり、ここで、腫瘍細胞は、ＭＹＣ発現が増幅しているものであり（ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２）、ＣＳＮＫ１εまたは対照に特異的なＤｏｘ誘導性ｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターが含まれており、腫瘍体積は、ＤｏｘによるｓｈＲＮＡ誘導後、経時的に表示している；実施例２に記載のとおり。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｄは、腫瘍を生着させた４匹のマウスの腫瘍体積をグラフで示したものであり、ここで、腫瘍細胞は、ＭＹＣ発現が増幅しているものであり（ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２）、ＣＳＮＫ１εまたは対照に特異的なＤｏｘ誘導性ｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターが含まれており、腫瘍体積は、ＤｏｘによるｓｈＲＮＡ誘導後、経時的に表示している；実施例２に記載のとおり。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｄは、腫瘍を生着させた４匹のマウスの腫瘍体積をグラフで示したものであり、ここで、腫瘍細胞は、ＭＹＣ発現が増幅しているものであり（ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２）、ＣＳＮＫ１εまたは対照に特異的なＤｏｘ誘導性ｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターが含まれており、腫瘍体積は、ＤｏｘによるｓｈＲＮＡ誘導後、経時的に表示している；実施例２に記載のとおり。
【図６Ｄ】図６Ａ〜Ｄは、腫瘍を生着させた４匹のマウスの腫瘍体積をグラフで示したものであり、ここで、腫瘍細胞は、ＭＹＣ発現が増幅しているものであり（ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２）、ＣＳＮＫ１εまたは対照に特異的なＤｏｘ誘導性ｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターが含まれており、腫瘍体積は、ＤｏｘによるｓｈＲＮＡ誘導後、経時的に表示している；実施例２に記載のとおり。
【図７Ａ】図７Ａは、ＩＣ２６１処置により、ＤＭＳＯ対照処置と比較して、ＩＭＲ−３２（ＭＹＣＮ発現が増幅している）異種移植片腫瘍の成長がインビボで阻害されることをグラフで示したものである；実施例２に記載のとおり。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＩＣ２６１での処置前および処置後の異種移植片マウスを示す；実施例２に記載のとおり。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＤＭＳＯ（対照）での処置前および処置後の異種移植片マウスを示す；実施例２に記載のとおり。
【図７Ｄ】図７Ｄは、Ｈ−Ｅ、ＴＵＮＥＬまたはＢｒＤｕで染色した、ＩＣ２６１処置群およびＤＭＳＯ処置群の腫瘍切片の免疫組織化学的解析を示す；実施例２に記載のとおり。
【図８Ａ】図８Ａは、ＷＮＴ媒介性転写応答が、ＭＹＣＮ発現が増幅している神経芽細胞腫細胞において、通常のＭＹＣＮ発現を有する神経芽細胞腫細胞と比べて、顕著に上昇していたことを示す棒グラフであり、ここで、ＷＮＴシグナル伝達は、検出可能なβ−カテニンレポーターのシグナル伝達の関数として表示している；実施例３に記載のとおり。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＩＣ２６１処置の関数としての、誘導性Ｔｅｔ−ＭＹＣＮを発現する神経芽細胞腫細胞におけるＷＮＴシグナル伝達の棒グラフであり、ここで、ＷＮＴシグナル伝達は、検出可能なβ−カテニンレポーターのシグナル伝達の関数として表示している；実施例３に記載のとおり。
【図８Ｃ】図８Ｃは、β−カテニンの一過性ノックダウンによって、ＭＹＣＮ発現が増幅している、または増幅していない神経芽細胞腫細胞のバイアビリティが同様に影響されたことを示す棒グラフである；実施例３に記載のとおり。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＭＹＣＮ発現が増幅している神経芽細胞腫細胞（ＩＭＲ−３２およびＳＫ−Ｎ−ＢＥ２）ならびにＭＹＣＮ発現が増幅していない神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＡＳおよびＳＨ−Ｓｙ５Ｙ）におけるソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達を示す棒グラフであり、ここで、ＳＨＨシグナル伝達は、Ｇｌｉ／ｍＧＬｉシグナル伝達比の関数として示している；実施例３に記載のとおり。
【図８Ｅ】図８Ｅは、ＭＹＣＮ発現が増幅している神経芽細胞腫細胞（ｃａｌｌ）（ＩＭＲ−３２）およびＭＹＣＮ発現が増幅していない神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ）の成長に対するＳＨＨインヒビターシクロパミンの阻害効果を示す棒グラフであり、この場合、細胞は１μＭのシクロパミンとともにインキュベートした；実施例３に記載のとおり。
【図８Ｆ】図８Ｆは、ＭＹＣＮ発現が増幅している神経芽細胞腫細胞（ＩＭＲ−３２）およびＭＹＣＮ発現が増幅していない神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ）の成長に対するＳＨＨインヒビターシクロパミンの阻害効果を示す棒グラフであり、この場合、細胞は１０μＭのシクロパミンとともにインキュベートした；実施例３に記載のとおり。
【図９Ａ】図９Ａは、いくつかの卵巣癌細胞株でのｃ−ＭＹＣタンパク質の相対レベルを示すウエスタンブロットである；実施例４に記載のとおり。
【図９Ｂ】図９Ｂは、いくつかの卵巣癌細胞株でのｃ−ＭＹＣ  ｍＲＮＡの相対発現レベルを示す棒グラフである（ｑＲＴ−ＰＣＲ解析によって測定）；実施例４に記載のとおり。
【図９Ｃ】図９Ｃは、いくつかの卵巣癌細胞株でのｃ−ＭＹＣの遺伝子コピー数を示す棒グラフである（ＰＣＲ解析によって測定）；実施例４に記載のとおり。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｄｏｘ誘導ｓｈＲＮＡコードレンチウイルス構築物を用いてトランスフェクトしたｃ−ＭＹＣ発現が増幅している卵巣癌細胞（ＣＯＬＯ７２０Ｅ）における、ＣＳＮＫ１εのノックダウンを示すウエスタンブロットである；実施例４に記載のとおり。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している卵巣癌細胞（ＣＯＬＯ７２０Ｅ）におけるＣＳＮＫ１εの誘導性ｓｈＲＮＡｉノックダウンによってＷＮＴシグナル伝達の減少が引き起こされることを示す棒グラフであり、ここで、ＷＮＴシグナル伝達は、β−カテニンレポーターのシグナル伝達の関数として測定したものである；実施例４に記載のとおり。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、漸増用量のＩＣ２６１とともに培養したｃ−ＭＹＣ発現が増幅している卵巣癌細胞（ＣＯＬＯ７２０Ｅ）におけるＣＳＮＫ１εキナーゼ機能の阻害によって、ＷＮＴシグナル伝達の減少が引き起こされることを示す棒グラフであり、ここで、ＷＮＴシグナル伝達は、β−カテニンレポーターのシグナル伝達の関数として測定したものである；実施例４に記載のとおり。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＩＣ２６１またはＤＭＳＯ対照での処置後の、ヒト卵巣癌細胞（ＴＯＶ１１２Ｄ／Ｌｕｃ）の腹腔内異種移植片を含むマウスにおける癌細胞の増殖およびバイアビリティの低下をグラフで示したものであり、ここで、癌細胞の増殖およびバイアビリティはＬｕｃイメージングによって測定したものである；実施例４に記載のとおり。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＩＣ２６１での処置後、ヒト卵巣癌細胞の腹腔内異種移植片を含むマウスにおける生存率の改善を示す生存のカプラン・マイヤープロットである；実施例４に記載のとおり。
【図１２Ａ】図１２Ａは、１μＭのＩＣ２６１の投与前および投与後の、細胞周期のＧ１チェックポイントのｃ−ＭＹＣ発現が増幅している卵巣癌細胞（ＴＯＶ１１２Ｄ）およびｃ−ＭＹＣ発現が増幅していない卵巣癌細胞（ＣａＯＶ３）の割合をグラフで示したものである；実施例４に記載のとおり。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、１μＭのＩＣ２６１の投与前および投与後の、細胞周期のＧ２チェックポイントのｃ−ＭＹＣ発現が増幅している卵巣癌細胞（ＴＯＶ１１２Ｄ）およびｃ−ＭＹＣ発現が増幅していない卵巣癌細胞（ＣａＯＶ３）の割合をグラフで示したものである；実施例４に記載のとおり。
【図１３Ａ】図１３Ａは、漸増用量のシスプラチン（ＣＤＤＰ）の存在下でＩＣ２６１の存在下で培養したときの、Ａ２７８０およびＡ２７８０−ＣＰ７０（シスプラチン抵抗性）卵巣癌細胞の相対細胞バイアビリティをグラフで示したものである；実施例４に記載のとおり。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、漸増用量のシスプラチン（ＣＤＤＰ）の存在下でＩＣ２６１の存在下で培養したときの、ＰＥ０１およびＰＥＯ４（シスプラチン抵抗性派生体）卵巣癌細胞の相対細胞バイアビリティをグラフで示したものである；実施例４に記載のとおり。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細説明
特に定義していない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されている意味を有する。当該技術分野の定義および用語に関して、実施者は、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）を参考にされたい。
【００１２】
本明細書において論考する任意の実施形態は、本発明の任意の方法、試薬または組成物に関して実施され得ることが想定され、その逆も同様である。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用され得る。
【００１３】
本明細書で用いる場合、ＣＳＮＫ１εインヒビターまたはＣＳＮＫ１εインヒビターを含む組成物の「有効量」または「治療有効量」は、所望の効果、例えば、該薬剤の非存在下で検出される通常発現レベルとの比較におけるＣＳＮＫ１εの発現もしくは酵素（キナーゼ）活性の阻害、あるいは腫瘍細胞の成長および／または増殖の阻害がもたらされるのに充分な量である。ＣＳＮＫ１εもしくはタンパク質の発現レベルが、対照試料の標的遺伝子ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現レベルと比べて約８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％もしくは０％である場合、またはＣＳＮＫ１εの活性レベルが阻害剤なしの対照試料中のＣＳＮＫ１εの活性レベルと比べて約８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％もしくは０％である場合、阻害剤によるＣＳＮＫ１εの発現または活性の阻害が達成されている。
【００１４】
本明細書で用いる場合、「腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害する」という用語は、該細胞を死滅させること、または該細胞の成長を永久的もしくは一時的に停止させることを意味する。哺乳動物腫瘍細胞の阻害は、かかる細胞の数が、インビトロ培養槽内または被験体のいずれかにおいて、本発明の組成物の投与後、一定のままであるか、または減少している場合を暗に示していることがあり得る。また、腫瘍細胞の増殖の阻害は、かかる細胞の絶対数は増加しているが、腫瘍成長速度は低下している場合を暗に示していることがあり得る。
【００１５】
本明細書で用いる場合、「被験体」は、生物体または生物体に由来する細胞試料、組織試料もしくは器官試料（例えば、培養細胞株、生検材料、血液試料、あるいは細胞を含有している体液試料など）をいう。例えば、生物体は、動物、例えば限定されないが、例えば、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物であり得、通常、ヒトなどの哺乳動物である。
【００１６】
本明細書で用いる場合、用語「Ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞（１つまたは複数）」は、Ｍｙｃの過剰発現（ｃ−Ｍｙｃ、ＭＹＣＮ、またはＬＭＹＣ）を引き起こす遺伝子改変、例えば、遺伝子重複、遺伝子増幅、転座、過剰発現をもたらす転写の脱調節、または異常タンパク質の調節の結果としてＭｙｃの過剰発現を引き起こす遺伝子改変を有する腫瘍細胞（１つまたは複数）をいう。かかる調節異常に影響を及ぼす既知の遺伝子改変の例としては、ｔ８；１４転座、ｃ−Ｍｙｃまたは他のＭＹＣ−ファミリー構成員の遺伝子増幅、およびＡＰＣにおける変異が挙げられる。Ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞の例としては、バーキットリンパ腫細胞、神経芽細胞腫細胞、卵巣癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、肝臓癌細胞、および表１に示した他のものが挙げられる。
【００１７】
ｃ−Ｍｙｃは、成長、増殖、分化および発生の枢要な調節因子である。ｃ−Ｍｙｃ癌タンパク質の脱調節は、アポトーシス、形質転換、ならびにリンパ系および非リンパ系起源の悪性腫瘍において報告されている。ｃ−Ｍｙｃ遺伝子は、ヘリックス−ループ−ヘリックスロイシンジッパークラスの転写因子をコードしており、転写のモジュレーションおよび開始において役割を果たしている。ｃ−Ｍｙｃが標的遺伝子付近のＥ−ボックス（ＣＡＣＧＴＧ）に結合すると、該遺伝子は活性化される。ＤＮＡ結合活性には、Ｍａｘと称される別のヘリックス−ループ−ヘリックスロイシンジッパータンパク質との二量体化が必要とされる。また、Ｍａｘは、おそらくｃ−Ｍｙｃ標的遺伝子の発現を下方調節しているＭａｄおよびＭｘｉｌなどの転写抑制因子とも相互作用することができる。ｃ−Ｍｙｃは、短寿命の核内の癌タンパク質であり、正常な二倍体細胞の細胞周期の間に厳密に調節される。該タンパク質の半減期の増大は、不死化および形質転換と関連している。ｃ−Ｍｙｃの脱調節は多くの腫瘍の共通の特徴であり、腫瘍内では、高頻度に転座が生じている、および／または増幅されて過剰発現している。また、ｃ−ｍｙｃ遺伝子は、多くの場合、プロウイルスの挿入の部位である。Ｍａｒｃｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：３６−３９（１９９２）；Ｓｔａｎｔｏｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５７４８−５７５５（１９８３）；およびＣｏｌｅら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：８０９（１９８６）を参照のこと。
【００１８】
ｎ−Ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質、またはＭＹＣＮあるいはＮＭＹＣは、ＭＹＣＮ遺伝子にコードされたタンパク質である。本明細書で用いる場合、用語「ｎ−ＭＹＣ」、「ＭＹＣＮ」および「ＮＭＹＣ」は同義的であり、互換的である。該遺伝子は、転写因子のＭＹＣファミリーの構成員である。発現されたタンパク質は、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスドメインを含み、ＤＮＡに結合するためには、別の塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスドメインを二量体化しなければならない。ｃ−Ｍｙｃと同様、ＭＹＣＮタンパク質はＭＡＸと相互作用する。ＭＹＣＮ遺伝子の増幅は、ほとんどがさまざまな腫瘍と、最も顕著には神経芽細胞腫と関連している。
【００１９】
ＣＳＮＫ１プロテインキナーゼファミリーは、７種類の哺乳動物アイソフォーム：α、β、γ１、γ２、γ３、δおよびεが進化において保存されている。ヒトＣＳＮＫ１εタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＣＡＧ３０３１５．１）は、配列番号：２として示したものであり、配列番号：１として示したｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＣＲ４５６４２９．１）にコードされている。カゼインキナーゼ１イプシロン、ＣＳＮＫ１イプシロン、ＣＳＮＫ１ε、およびＣＳＮＫ１εという用語は、本明細書において互換的に用いている。ＣＳＮＫ１εの遺伝子産物は、他の時計タンパク質（ＰＥＲＩＯＤなど）をリン酸化することによって概日リズムを調節していることが知られている。ＣＳＮＫ１εの過剰発現は、Ｔｃｆ３のリン酸化およびβ−カテニンの安定化によるＷＮＴ−シグナル伝達を模倣しており、幹細胞の性質における機能的役割を示唆している。さらに、ＣＳＮＫ１εタンパク質は、ｐ５３をリン酸化してＭｄｍ２との相互作用を妨げる。ＣＳＮＫ１εは、主に神経系において発現される。
【００２０】
本発明は、一部において、カゼインキナーゼ１のε−アイソフォーム（ＣＳＮＫ１ε）は、種々のＭｙｃ駆動型癌において上方調節されているという知見、ならびにＣＳＮＫ１εのインヒビターは、ｍｙｃ駆動型癌細胞の成長および／または増殖の阻害に有効であり、確立された腫瘍のサイズは低減させるが、正常に増殖している細胞（すなわちＭｙｃ駆動型でないもの）には有害な影響を及ぼさないという知見に基づいている。実施例１において後述するように、ＣＳＮＫ１ε発現は、ＭＹＣＮ発現が増幅している神経芽細胞腫細胞において上昇していることがわかった。ＣＳＮＫ１ε発現のノックダウンまたはＣＳＮＫ１εキナーゼ活性の化学的阻害を行なうと、ＭＹＣＮ発現が増幅している神経芽細胞腫細胞では、バイアビリティの低下および増殖の低減が示された。このような結果は、実施例２に記載のように、マウス異種移植片モデルにおいてインビボで反復された。第１に、ＣＳＮＫ１εを標的化する誘導性ｓｈＲＮＡを含む異種移植片の神経芽細胞腫腫瘍では、ＣＳＮＫ１ε発現のノックダウンを誘導すると、サイズの縮小が示された。第２に、ＣＳＮＫ１εの小分子インヒビターＩＣ２６１を、異種移植片の神経芽細胞腫腫瘍（ＭＹＣＮ発現が増幅している）を有するマウスに投与すると、腫瘍サイズの縮小がもたらされた。本明細書においてさらに記載しているように、ＭＹＣＮ発現が増幅している神経芽細胞腫細胞内での腫瘍の増殖に対するＣＳＮＫ１εの効果の媒介におけるＷＮＴおよびＳＨＨシグナル伝達の役割が見い出された。ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している卵巣癌細胞でも、ＣＳＮＫ１ε発現の同様の役割が見られた。実施例４に記載のように、ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している卵巣癌株でも、ＣＳＮＫ１ε発現のノックダウンを誘導すると、バイアビリティの低下およびＷＮＴシグナル伝達の低減が示された。また、ＩＣ２６１の投与によっても、異種移植片腫瘍細胞のインビボバイアビリティおよびマウスの生存期間が低下した。細胞周期のチェックポイントを調べると、ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している卵巣癌細胞の大部分は、細胞周期のＧ２チェックポイントで停止するが、Ｇ２  ＤＮＡ含有量より多く（＞）蓄積されると進行して複製されることが示された。
【００２１】
ＣＳＮＫ１εのインヒビター
前述のことに従い、本発明の一態様は、ＣＳＮＫ１εのインヒビターのスクリーニング方法、ならびにＭｙｃ駆動型腫瘍細胞を含む腫瘍の成長および／または増殖を阻害するためのＣＳＮＫ１εインヒビターの使用方法であって、該腫瘍細胞をＣＳＮＫ１εインヒビターと接触させることを含む方法を提供する。ＣＳＮＫ１εインヒビターは、直接的または間接的のいずれかであるさまざまな機構によってＣＳＮＫ１εキナーゼ活性を低下させ得る。したがって、ＣＳＫＮＫ１εインヒビターは、ＣＳＮＫ１εをＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびポリペプチドレベルで阻害し得るものであり、転写、翻訳および機能性酵素（キナーゼ）活性を標的化する。
【００２２】
一実施形態では、該インヒビターは、ＣＳＮＫ１εの発現を低減させ、したがってポリペプチド産物、すなわちＣＳＮＫ１εキナーゼのレベルを低下させるものである。例えば、発現の阻害は、ＣＳＮＫ１εをコードするＤＮＡに物理的に結合し、したがって完全長ｍＲＮＡの転写のための遺伝子への到達を妨げる薬剤によって行なわれ得る。また、転写の阻害を行なってもよい（例えば、ＣＳＮＫ１ε遺伝子座に対応するクロマチン構造の修飾により）。
【００２３】
別の実施形態では、該阻害剤は、ＣＳＮＫ１ε  ｍＲＮＡ分子に結合または該分子を修飾してＣＳＮＫ１εキナーゼポリペプチドへの翻訳を妨げる。これは、例えば、ＲＮＡ干渉を用いて行なわれ得る。以下の実施例１〜４に記載のように、誘導性ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、ＣＳＮＫ１ε発現の阻害に好成績で使用された。
【００２４】
別の実施形態では、ＣＳＮＫ１ε阻害剤は、ＣＳＮＫ１εキナーゼドメインに結合すること、またはその基質に結合する能力もしくは基質をリン酸化する能力に干渉することにより、ＣＳＮＫ１εの酵素活性を阻害するものである。かかるＣＳＮＫ１ε阻害剤の実例としての非限定的な例としては、ＩＣ２６１、ＰＦ−４８００５６７、およびＰＦ−６７０４６２などの小分子が挙げられる。これらのインヒビターの構造を以下に示す。
【００２５】
【化１】
2013525283.tif 000003
【００２６】
本発明の方法によって特定されるＣＳＮＫ１εインヒビター、ならびに当該技術分野で知られているＣＳＮＫ１εインヒビター（例えば、ＩＣ２６１、ＰＦ−４８００５６７、およびＰＦ−６７０４６２）が、Ｍｙｃ駆動型癌の処置における治療用薬剤として、インビボおよびインビトロで本明細書に記載の方法に従って使用され得る。
【００２７】
別の態様では、本発明は、ＣＳＮＫ１εのインヒビターのスクリーニング方法を提供する。該方法は、Ｍｙｃ駆動型腫瘍、癌細胞または形質転換細胞を候補ＣＳＮＫ１εインヒビター因子と接触させることを含む。Ｍｙｃ駆動型細胞は、ＣＳＮＫ１εキナーゼの活性または発現の低減についてモニタリングされ、キナーゼの活性または発現の低減が生じることは、候補薬剤がＣＳＮＫ１εのインヒビターであることを示す。
【００２８】
好ましい実施形態では、ＣＳＮＫ１εキナーゼ活性の低下は、活性を参照標準と比較することにより判定される。さらなる実施形態では、参照標準は、インヒビター因子と接触させていない同様のＭｙｃ駆動型腫瘍、癌または形質転換細胞である。別の実施形態では、参照標準は、インヒビター因子と接触させる前の同じＭｙｃ駆動型腫瘍、癌または形質転換細胞である。
【００２９】
上記のように、当業者には、ＣＳＮＫ１εキナーゼの活性または発現の低減がＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで確認され得ることが理解されよう。したがって、一実施形態では、ＣＳＮＫ１ε発現の低減は、ＣＳＮＫ１εの転写活性の低下、すなわち、ＲＮＡ遺伝子産物の相対アバンダンスのモニタリングに基づいて判定され得る。例えば、ｍＲＮＡ遺伝子産物のアバンダンスの測定には、ＰＣＲ、定量的ＲＴ  ＰＣＲなどの一般的に知られた方法が適用され得る。別の方法は、アンチセンスプローブ（例えば、放射性標識または非同位体で標識する）を溶液中でＲＮＡ試料にハイブリダイズさせるヌクレアーゼ保護アッセイである。ハイブリダイゼーション後、一本鎖の非ハイブリダイズプローブおよびＲＮＡをヌクレアーゼによって分解させ、二本鎖分子のアンチセンスプローブの強度を測定する。また別の実施形態では、ノザンブロットアッセイを使用し、試料中のＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）の相対量を、当該技術分野で知られた慣用的なノザンハイブリダイゼーション手法に従って検出し、確認する。
【００３０】
さらなる実施形態では、ＲＮＡを形質転換細胞または対照細胞から抽出する必要はない。例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを用いて、細胞中の標的ｍＲＮＡの存在、相対量および空間的分布が測定され得る。実例としての一例では、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＲＮＡ  ＦＩＳＨ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）において、標的配列の相違する部分に相補的な多数の短鎖の個々に標識したオリゴヌクレオチドプローブを使用する。各プローブが一本鎖のｍＲＮＡ鋳型に結合すると、該ｍＲＮＡの協働的巻き戻しが引き起こされ、さらなるプローブの結合が促進される。その正味の結果として、非常に多数の蛍光標識がｍＲＮＡ鋳型の単一の分子に結合することとなり、広視野蛍光顕微鏡検査画像において各標的ｍＲＮＡが高い信頼性で位置確認されるのに充分な蛍光がもたらされる。
【００３１】
本明細書に記載の任意の方法に有用な検出可能なプローブ、ＲＮＡ干渉分子などは、よく知られた手法に従って、配列番号：１として示したＣＳＮＫ１ε遺伝子のヒトｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＣＲ４５６４２９．１）またはその天然に存在しているバリアントに基づいて構築され得る。
【００３２】
別の実施形態では、ＣＳＮＫ１εキナーゼ活性の低下は、試料中のポリペプチドＣＳＮＫ１εキナーゼの量のモニタリングに基づいて判定され得る。例えば、ウエスタンブロットなどのイムノアッセイは、当該技術分野でよく知られた方法による試料由来タンパク質の免疫沈降を伴う。この後、タンパク質試料のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行なう。タンパク質の分離後、免疫細胞化学などを用いて、試料中に存在するＣＳＮＫ１εキナーゼの量が測定され得る。目的タンパク質の検出に好ましい薬剤は、ＣＳＮＫ１εキナーゼに結合し得る検出可能な抗体またはその断片である。
【００３３】
抗体は、当業者によく知られた標準的な手法を用いて作製され得る。かかる抗体はポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体を使用しても、抗体断片（例えば、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２）を使用してもよい。本明細書に記載の任意の方法に有用な検出可能なプローブ（例えば、抗体など）は、よく知られた手法に従って、ＣＳＮＫ１εキナーゼのポリペプチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＣＡＧ３０３１５．１）（配列番号：２）の諸態様またはその天然に存在しているバリアントもしくはその誘導体を含むポリペプチド部分を用いて構築され得る。
【００３４】
さらに、抗体またはその断片を、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡検査の場合のように、ＣＳＮＫ１εタンパク質のインサイチュ検出のために組織学的に使用することもできる。インサイチュ検出は、組織学的被検物質（例えば、生検の被検物質または固定化細胞培養物）を得、これを、ＣＳＮＫ１εポリペプチドに対する標識抗体に適用することにより行なわれ得る。抗体（または断片）は、好ましくは生物学的試料上に適用される。かかる手順の使用により、目的タンパク質の存在だけでなく、その試料中での分布も調べることが可能になる。かかるインサイチュ検出を行なうために、よく知られた多種多様な組織学的方法（染色処理など）が使用され得る。
【００３５】
抗体は、例えば、検出可能な物質を抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結させる）ことによる抗体の直接標識によって検出してもよく、直接標識された別の試薬との反応性による抗体の間接標識によって検出してもよい。間接標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出が挙げられる。一部の実施形態では、生物学的試料は、固相支持体もしくは担体（ニトロセルロースなど）、または細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化させ得る他の固形支持体と接触させると、これに固定化され得る。次いで、支持体は、適当なバッファーで洗浄された後、検出可能に標識されたフィンガープリント遺伝子特異的抗体で処理され得る。次いで、固相支持体は、未結合抗体を除去するために該バッファーで２回目の洗浄が行われ得る。次いで、固形支持体上の結合標識の量が慣用的な手段によって検出され得る。また、既知の多種多様なシグナル伝達機構、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドフルオレサミンなども、記載のイムノアッセイに利用可能である。
【００３６】
別の実施形態では、ＣＳＮＫ１εキナーゼ活性の低下は、標準的なキナーゼアッセイでのＣＳＮＫ１εキナーゼの酵素活性レベルのモニタリングに基づいて判定され得る。例えば、ＩＣ２６１などの小分子は、キナーゼアッセイにおいて、Ｍａｓｈｈｏｏｎ  Ｍ．ら，“Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｃａｓｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ−１  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７５（２６）：２００５２−２００６０（２０００）（引用によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載の方法に従ってスクリーニングされ得る。簡単には、ＣＳＮＫ１εキナーゼ活性の標準的な活性アッセイが３７℃で実施され得る。標準的な反応液（４０μｌ）は、２５ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ｐＨ６．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍｇ／ｍｌのカゼイン、２ｍＭのＥＧＴＡ、１００μＭの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（１００〜４００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を含むものであった。速度定数およびその標準誤差を計算する。インヒビターの効力（ＩＣ５０）のアッセイでは、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを一定（１０μＭ）に保持し、一方、候補インヒビターの濃度（ｏｆ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃａｎ  ｂｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を変化させた（０．１、０．３、１、３、および１０μＭなど）。アッセイには、１０μＭの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰと可変濃度の候補インヒビターを含める。ＩＣ５０値を既知の方法、例えば、ＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）の非線形回帰アルゴリズムによって計算する。また、ＣＳＮＫ１εキナーゼ活性の測定のための標的アミノ酸配列を含む適当な合成または天然基質を、キナーゼアッセイに使用してもよい。
【００３７】
スクリーニング方法に有用な候補化合物としては、化学物質ライブラリーの化合物が挙げられる。代表的な有用な化学物質ライブラリーとしては、構造が多様な化合物のライブラリー、治療用薬物様化合物のライブラリー、および米食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認された治療用薬物のライブラリーが挙げられる。
【００３８】
Ｍｙｃ駆動型癌
正常なＭｙｃ遺伝子は、全ヒト遺伝子のおよそ１５％の調節において役割を有するＭＹＣ転写因子をコードしている。古典的転写因子としての役割に加え、ＭＹＣは、ヒストンのアセチル化を調節することによりクロマチン構造を全体的に修飾する能力を有する。上記のように、Ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞（１つまたは複数）は、Ｍｙｃ癌遺伝子の過剰発現を引き起こす遺伝子改変を有する腫瘍細胞（１つまたは複数）をいう。かかる過剰発現は、ＭｙｃのｍＲＮＡ発現の脱調節発現を引き起こし、転写速度の増大をもたらす遺伝子改変の結果であり得る。さらに、該過剰発現は、該遺伝子がＩｇ遺伝子エンハンサーに隣接し、したがって、Ｂ細胞系統の細胞内で構成的に発現される転座事象、または遺伝子重複もしくは遺伝子コピー数の増幅が存在する転座事象（数百コピーのＭＹＣＮ遺伝子が存在している神経芽細胞腫の場合など）の結果であり得る。かかる場合では、該さらなる遺伝子コピーが発現シグナル増大の一因となるが、いずれかの１つの遺伝子座が正常とみなされ得る速度で調節されることがあり得る。脱調節され、したがって過剰なＭｙｃの発現を示す癌の非限定的な例を表１に示す。
【００３９】
【表１】
2013525283.tif 000004
【００４０】
該方法の一実施形態において、Ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞は神経起源のものである。神経起源を有する癌としては、原発性神経芽細胞腫腫瘍、転移性神経芽細胞腫腫瘍または脳腫瘍（脳細胞の癌、転移性の脳の癌（体内の別の部分から脳に拡延した癌）によって引き起こされる）に由来する腫瘍細胞が挙げられる。神経起源の癌のさらなる例としては、限定されないが：神経芽細胞腫；グリオーマ（星状細胞腫、膠芽細胞腫、希乏突起膠腫、神経鞘腫）；髄芽細胞腫（未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）としても知られている）；聴神経腫；松果体腫および松果体芽細胞腫；網膜芽細胞腫；髄膜腫；脳室上衣細胞腫；脳幹グリオーマ；頭蓋咽頭腫；松果体部の腫瘍の神経細胞腫；ならびに神経節細胞腫が挙げられる。
【００４１】
ＣＳＮＫ１ε発現の全身アトラスの検討により、発現が最高である組織は脳／胎児および松果体であることが示された。さらに、最高ＣＳＮＫ１ε発現の２８種類の組織のうち、１５種類は神経起源である（例えば、脳／小脳、脳梁、視床、視床下核、橋、扁桃体、視床下部、前頭葉、前前頭皮質、後根神経節、および尾状核）。さらに、Ｏｎｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｄａｔａｂａｓｅを参照すると、ＣＳＮＫ１εは、異常レベルまたは高レベルのｎ−ＭＹＣ発現を示す神経芽細胞腫細胞の臨床試料で高度に発現されていることが示された。
【００４２】
別の実施形態では、Ｍｙｃ駆動型癌は卵巣癌である。別の実施形態では、Ｍｙｃ駆動型癌は、横紋筋肉腫、肝臓癌、黒色腫、乳癌、結腸癌、前立腺癌、バーキットリンパ腫および肺癌からなる群より選択される。
【００４３】
一態様において、本発明は、Ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法であって、該細胞をＣＳＮＫ１εインヒビターと接触させることを含む方法を提供する。一実施形態では、該腫瘍細胞をインビトロで接触させる。別の実施形態では、該腫瘍細胞を哺乳動物被験体においてインビボで接触させる。一部の実施形態では、哺乳動物被験体は霊長類、齧歯類、イヌ、ネコ、ウマまたはウシである。好ましい実施形態では、哺乳動物被験体はヒトである。一実施形態において、ＣＳＮＫ１εインヒビターは小分子である。一部の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｅｎｔ）では、ＣＳＮＫ１εの小分子インヒビターは、ＩＣ２６１、ＰＦ−４８００５６７またはＰＦ−６７０４６２のうちの少なくとも１種類である。
【００４４】
別の態様では、本発明は、ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞を含む腫瘍に苦しんでいる被験体の処置方法であって、該被験体に、ＣＳＮＫ１εインヒビターを含む組成物を、該腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するのに有効な量で投与することを含む方法を提供する。Ｍｙｃ駆動型癌の例は本明細書に記載している。一部の実施形態では、被験体は、ｍｙｃ駆動型神経起源の癌（その例は本明細書に示している）に苦しんでいる被験体である。一部の実施形態では、神経起源のｍｙｃ駆動型腫瘍細胞は、原発性神経芽細胞腫腫瘍、転移性神経芽細胞腫腫瘍または脳腫瘍に由来するものである。一部の実施形態では、被験体は、ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞を含む卵巣癌に苦しんでいる被験体である。一部の実施形態では、被験体は、横紋筋肉腫、肝臓癌、黒色腫、乳癌、結腸癌、前立腺癌、バーキットリンパ腫および肺癌からなる群より選択されるｍｙｃ駆動型腫瘍細胞を含む癌に苦しんでいる被験体である。
【００４５】
一部の実施形態では、該方法は、さらに、ＣＳＮＫ１εインヒビターを含む前記組成物での処置の前に、前記被験体の腫瘍がｍｙｃ駆動型腫瘍細胞を含むかどうかを調べる工程を含む。前記被験体の腫瘍がｍｙｃ駆動型腫瘍細胞を含むかどうかを調べる工程は、データベースを評価すること、または被験体から得られる細胞（前記被験体由来の生検材料試料など）を正常細胞と比べて（もしくは参照標準と比べて）異常に高いレベルのＭｙｃタンパク質もしくはｍＲＮＡ発現についてアッセイ（ａｓｓｓａｙ）すること、または被験体から採取した細胞を、ＭｙｃをコードするｃＤＮＡの増幅された遺伝子コピーの存在について、当該技術分野で知られており、本明細書においてさらに記載する標準的な方法を用いてアッセイすることにより行なわれ得る。
【００４６】
一部の実施形態では、ＣＳＮＫ１εインヒビターを含む組成物は、ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞の成長および／または増殖を選択的に阻害するのに有効であるが、非ｍｙｃ駆動型細胞（すなわち、通常の低レベルのｍｙｃを有する細胞）の成長および増殖は阻害しない。
【００４７】
ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するのに有効なＣＳＮＫ１εインヒビターを含む組成物の投与は、よく知られたさまざまな方法（これは、腫瘍細胞を阻害する（例えば、医薬用担体にて該インヒビターを提供する）工程を含むものであり得る）、細胞にインビトロで（細胞培養状態で）投与する方法、または薬剤活性が保持され、癌細胞への到達がもたらされる当該技術分野で知られた任意の様式によるインビボでの哺乳動物被験体への投与に従って行なわれ得る。このようなものとしては、限定されないが、経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内および髄腔内投与経路が挙げられる。
【００４８】
また、ＣＳＮＫ１εインヒビターを含む医薬組成物も提供する。かかる組成物には、約０．０１〜９０％（重量基準）（１〜２０％または１〜１０％など）のＣＳＮＫ１εインヒビターが薬学的に許容され得る担体中に含まれている。経口投与のための該組成物の固形製剤には、適当な担体または賦形剤、例えば、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、アカシア、スクロース、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、またはアルギン酸が含有され得る。水または他の水性ビヒクルで調製される経口投与のための該組成物の液状製剤には、種々の懸濁化剤、例えば、メチルセルロース、アルギネート、トラガカント、ペクチン、ケルジン（ｋｅｌｇｉｎ）、カラギーナン、アカシア、ポリビニルピロリドン、およびポリビニルアルコールが含有され得る。
【００４９】
ＣＳＮＫ１εインヒビターを含む組成物の注射用製剤には、種々の担体、例えば、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、またはポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）が含有され得る。静脈内注射のためには、該化合物の水溶性の型が、抗真剤と生理学的に許容され得る賦形剤を含む医薬製剤を注入する点滴法によって投与され得る。生理学的に許容され得る賦形剤としては、例えば、５％デキストロース、０．９％生理食塩水、リンゲル液、ならびに他の適当な賦形剤が挙げられ得る。筋肉内用調製物（例えば、本発明の化合物の滅菌製剤）は、注射用水、０．９％生理食塩水または５％グルコース溶液などの医薬用賦形剤に溶解させて投与され得る。
【００５０】
医薬製剤は哺乳動物被験体に、医学分野の当業者に知られた慣用的な方法を用いて投与され得る。医薬製剤は、経口、皮下、肺内、経粘膜、腹腔内、子宮内、舌下、髄腔内、筋肉内、経鼻、経直腸、経膣、および意図される単一または多数の治療作用部位への送達薬剤の分布が有効にもたらされる他の送達経路によって投与され得る。
【００５１】
本発明によるＣＳＮＫ１εインヒビターを含む組成物は、所望のレベルの治療効果が維持されるように決定された周期的な間隔をあけて全身投与または局所投与され得る。例えば、ＣＳＮＫ１εインヒビターを含む組成物は、毎日、毎週、２〜４週間毎またはより高頻度もしくは低頻度の間隔で、皮下注射などによって投与され得る。投薬量レジメンは、医師が、該薬剤の併用の作用に影響を及ぼし得る種々の要素を考慮して決定する。このような要素としては、処置対象の病状の進行の程度、患者の年齢、性別および体重、ならびに他の臨床的要素が挙げられる。個々の各薬剤の投薬量は、組成物中に内包される阻害剤ならびに薬物送達ビヒクル（あれば）（例えば、徐放送達ビヒクル）の存在および性質の関数として種々である。
【００５２】
該方法の一部の実施形態では、ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞を含む腫瘍に苦しんでいる被験体に、さらに、１種類以上のさらなる抗癌療法が提供される。該さらなる治療法としては、手術、ＣＳＮＫ１εインヒビターとは相違する化学療法剤が使用される化学療法、および放射線療法が挙げられ得る。一部の実施形態では、該さらなる治療法としては、ＳＨＨの発現もしくは活性インヒビターおよび／またはＷＮＴの発現もしくは活性のインヒビターの投与が挙げられる。
【００５３】
一実施形態において、ｍｙｃ駆動型腫瘍細胞は、該さらなる化学療法剤に対して抵抗性、またはある程度低下した感受性レベルを示すものであり、該さらなる化学療法剤をＣＳＮＫ１εインヒビターとともに投与すると、該腫瘍細胞は、該さらなる化学療法剤に対して感受性となる。一実施形態では、ｍｙｃ駆動型腫瘍は、シスプラチンに対して抵抗性である細胞を含むものであり、ＣＳＮＫ１εインヒビターによって該細胞がシスプラチンに対して感受性となる。したがって、一部の実施形態では、ＣＳＮＫ１εインヒビターを含む組成物は、シスプラチンでの処置を受けている被験体に投与される。一実施形態において、本発明は、シスプラチンなどの化学療法剤と併用されるＣＳＮＫ１εインヒビターを含む組成物を提供する。
【００５４】
別の態様では、本発明は、ｍｙｃ駆動型癌細胞の増殖を阻害し得る化合物を特定するための方法を提供する。該方法は、ＣＳＮＫ１εを発現しているｍｙｃ駆動型癌細胞株を候補化合物と細胞培養状態で接触させることを含む。次いで、（ｉ）候補化合物の存在下および非存在下でのＷＮＴの発現もしくは活性のレベル、（ｉｉ）候補化合物の存在下および非存在下でのＳＨＨの発現もしくは活性のレベル、または（ｉｉｉ）候補化合物の存在下および非存在下でのＣＳＮＫ１εの発現もしくは活性のレベルのうちの少なくとも１つの測定を行なう。候補化合物の存在下でのＷＮＴの発現レベルの減少もしくは活性；および／またはＳＨＨの発現レベルもしくは活性の減少、および／またはＣＳＮＫ１εの発現レベルもしくは活性の減少は、化合物が癌細胞の増殖を阻害するものであることを示す。
【００５５】
ＷＮＴ、ＳＨＨまたはＣＳＮＫ１εの発現または活性の検出は、当該技術分野でよく知られた方法によって行なわれ得る。例えば、ｍＲＮＡおよびポリペプチド遺伝子産物を検出して発現レベルを示すための方法を、上記に記載している。さらに、シグナル伝達活性の検出は、よく知られたレポーターアッセイを用いて行なわれ得る。例えば、実施例３および４に記載のような、β−カテニン活性をアッセイするためのコンセンサス（ＴＯＰ）および変異型（ＦＯＰ）ＴＣＦ結合部位が使用されたＷＮＴデュアルレポーター系。β−カテニン活性は、ＷＮＴシグナル伝達の機能性レポーターであり、したがって、この方法によるその検出によって、実験系に応答したＷＮＴシグナル伝達の測定が可能になる。さらに、ＳＨＨシグナル伝達のアッセイを可能にするＧｌｉ検出可能レポーターが使用された同様のデュアルレポーターＳＨＨ系を実施例３に記載している。したがって、さらなる実施形態では、該方法は、ＷＮＴに作動的に連結された遺伝子を含む腫瘍細胞株を含む。別の実施形態では、該方法は、ＳＨＨに作動的に連結された遺伝子を含む腫瘍細胞株を含む。
【００５６】
一部の実施形態では、ＣＳＮＫ１εを発現しているｍｙｃ駆動型癌細胞株は、神経芽細胞腫細胞または卵巣癌細胞である。一部の実施形態では、該癌細胞株は、ＷＮＴに作動的に連結されたレポーター遺伝子を含むものである。一部の実施形態では、候補化合物は、構造が多様な化合物のライブラリー、治療用薬物様化合物のライブラリー、または米食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認された治療用薬物のライブラリー由来のものである。
【００５７】
以下の実施例は、単に、本発明の実施について現時点で想定される最良の形態の実例を示したものであって、本発明を限定するものと解釈されるべきでない。引用文献はすべて、引用により明示的に組み込まれる。
【実施例】
【００５８】
実施例１
この実施例では、神経芽細胞腫細胞の増殖をインビトロで阻害するためのＣＳＫＮ１εのインヒビターの使用を記載する。
【００５９】
理論的根拠
ヒト線維芽細胞由来の細胞でのｓｉＲＮＡスクリーニングにおいて、ＣＳＮＫ１εを標的化する低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）により、このような操作細胞内で成長阻害が誘導されることを調べた（Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｓ．，およびＢ．Ｒ．Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｓｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  １−ｅｐｓｉｌｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ−Ｃｅｌｌ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，ＰＥＲＩＯＤ２−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａｒｒｅｓｔ，”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：Ｒ９２，２００８）。ＣＳＮＫ１εの遺伝子配列を調べると、エキソン１の近くのプロモーター領域内に、いくつかの推定ＭＹＣ−ＭＡＸ結合部位が明らかになった。神経芽細胞腫は、ｃ−ＭＹＣのニューロン発現ホモログであるＭＹＣＮの増幅が多くの場合で示される小児癌であり、概説については、Ｐａｒｋ，Ｊ．ら，“Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，”Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ５５：９７−１２０，２００８を参照のこと。ＭＹＣＮは、マウスモデルにおける神経芽細胞腫の起始と維持の充分に文献に記載された駆動因子であり（Ｗｅｉｓｓ，Ｗ．Ａ．ら，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＭＹＣＮ  Ｃａｕｓｅｓ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ，”Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６：２９８５−２９９５，１９９７）、予後不良の最も有力な分子マーカーである（Ｒｉｌｅｙ，Ｒ．Ｄ．ら，“Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，”Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：４−１２，２００４）。この仮説は、ｃ−ＭＹＣとＭＹＣＮが共有している転写プログラムと細胞表現型（Ｂｏｏｎ，Ｋ．ら，“Ｎ−ｍｙｃ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｅｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０：１３８３−１３９３，２００１；Ｍｅｓｔｄａｇｈ，Ｐ．ら，“ＭＹＣＮ／ｃ−ＭＹＣ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  Ｒｅｐｒｅｓｓ  Ｃｏｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｐｏｏｒ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ＭＹＣＮ／ｃ−ＭＹＣ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔｕｍｏｒｓ，”Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２９：１３９４−１４０４）、およびｃ−ＭＹＣは、マウスの発生時に、ＭＹＣＮと機能的に置き換えられることがあり得るという観察結果（Ｍａｌｙｎｎ，Ｂ．Ａ．ら，“Ｎ−ｍｙｃ  Ｃａｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｒｅｐｌａｃｅ  ｃ−ｍｙｃ  ｉｎ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｇｒｏｗｔｈ，ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，”Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４：１３９０−１３９９，２０００）に端を発している。さらに、Ｏｎｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓの神経芽細胞腫の予後データベースにおいて入手可能なマイクロアレイデータを参照すると、神経芽細胞腫の生存期間はＣＳＮＫ１ε発現に基づいて分かれることが示された。具体的には、高いＣＳＮＫ１εを有する神経芽細胞腫患者は、低ＣＳＮＫ１εを有する患者よりも生存期間が有意に短かった。
【００６０】
したがって、本発明者らは、神経起源の癌の、具体的には神経芽細胞腫細胞における新規な治療標的としてＣＳＮＫ１εを調べた（後述）。
【００６１】
方法および結果
ＣＳＮＫ１ε発現は、高いＭＹＣＮ発現を有する神経芽細胞腫細胞において上昇している。
【００６２】
ＣＳＮＫ１εの遺伝子配列を調べると、エキソン１の近くのプロモーター領域内に、いくつかの推定ＭＹＣ−ＭＡＸ結合部位が明らかになった。この観察結果により、ＣＳＮＫ１εがＭＹＣの潜在的な転写標的であることが示された。この仮説は、ＣＳＮＫ１εが、ＭＹＣＮをコードしているテトラサイクリン誘導性ベクターを含むトランスジェニック神経芽細胞腫細胞株において誘導されるという観察結果によってさらに裏付けられた（データ表示せず）。
【００６３】
高いＭＹＣＮレベルとＣＳＮＫ１ε発現の間に相関性があるかどうかを調べるため、ＣＳＮＫ１εおよびＭＹＣＮのタンパク質レベルを、３種類の異なる神経芽細胞腫細胞株：ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２およびＩＭＲ−３２でウエスタンブロットによってアッセイした。タンパク質を、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２およびＩＭＲ−３２神経芽細胞腫細胞株の細胞ライセートから、当該技術分野で知られた標準的なタンパク質単離手法を用いて抽出した。この抽出試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離し、標準的なプロトコルに従い、以下の抗体：抗ＣＳＮＫ１ｅ（６１０４４５，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ｎ−Ｍｙｃ（ＮＣＭ−ＩＩ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および抗アクチン（ＡＣ−１５，ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いてブロットした。ウエスタンブロットの定量は、ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ）を用いて行なった。
【００６４】
図１Ａに示されるように、高レベルのＣＳＮＫ１εタンパク質産物を示す濃いバンドが、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２およびＩＭＲ−３２において検出され、また、ＭＹＣＮの過剰発現も示された。対照的に、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ神経芽細胞腫細胞では、ＣＳＮＫ１εタンパク質産物は最小限であり、検出可能なＭＹＣＮタンパク質産物はなかった。また、５種類のさらなる神経芽細胞腫細胞株（ＳＨ−ＳＹ−５Ｙ、ＮＢＬ−Ｗ−Ｎ、ＫＣＮ、ＫＣＮＲ、およびＬＡ−Ｎ−５）を組み込んだ拡張ウエスタンブロット解析も実施した。ポリペプチドレベルを、ＭＹＣＮ、ＭＹＣ（ポリクローナル）、ＣＳＮＫ１ε、およびアクチンに特異的な抗体を用いて検出した。ＣＳＮＫ１ε／アクチン発現をＭＹＣＮ／アクチン発現と比較すると、神経芽細胞腫細胞におけるＣＳＮＫ１εとＭＹＣＮとの発現間に正の相関（Ｒ２＝０．６３９；ｐ−０．０３８）が示された。
【００６５】
また、ＣＳＮＫ１εとＭＹＣＮ発現の間の正の相関は転写レベルでも確認された。ＲＮＡを、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２およびＩＭＲ−３２神経芽細胞腫細胞株の培養物から、標準的なプロトコルに従って抽出した。ＣＳＮＫ１εに対応するｍＲＮＡを逆転写させ、定量的ＲＴ  ＰＣＲ（標準的なサイクルパラメータを使用）を用いて増幅させた。図１Ｂに示されるように、ｎ−ＭＹＣを過剰発現することがわかっている神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２およびＩＭＲ−３２では、ｎ−ＭＹＣを過剰発現しない対照神経芽細胞腫株ＳＫ−Ｎ−ＡＳと比べて４〜５倍多くのＣＳＮＫ１ε  ｍＲＮＡが、ｑＲＴＰＣＲによって検出された。
【００６６】
ＣＳＮＫ１には６種類の異なるアイソフォームが存在し、別々の遺伝子にコードされている（Ｈａｎｋｓ，Ｓ．Ｋ．，およびＴ．Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅｓ  ６：Ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：Ｋｉｎａｓｅ（Ｃａｔａｌｙｔｉｃ）Ｄｏｍａｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ９：５７６−５９６，１９９５）。ＣＳＮＫ１ε遺伝子の調節におけるＭｙｃの役割を解析するため、すべてのＣＳＮＫ１アイソタイプでＭＹＣＮ発現とＣＳＮＫ１ε発現を調べ、相関があるかどうかを調べた。異なるＭＹＣＮ発現レベルを有する神経芽細胞腫細胞をｑＲＴ−ＰＣＲによって解析し、異なるＣＳＮＫ１アイソフォームの発現パターンおよびＭＹＣＮ発現の増幅との相関（あれば）を調べた。７種類の神経芽細胞腫細胞株を使用した。神経芽細胞腫株ＳＫ−Ｎ−ＡＳおよびＳＨ−ＳＹ−５ＹではＭＹＣＮ発現の増幅は低い、または増幅はないが、神経芽細胞腫株ＬＡＮ−５、ＩＭＲ−３２、ＫＣＮ、ＫＣＮＲおよびＳＫ−Ｎ−ＢＥ２は、ＭＹＣＮ発現が増幅している。図２に示されるように、イプシロンアイソフォームが、神経芽細胞腫細胞株において発現されるＣＳＮＫ１の主要アイソフォームであり、また該細胞では、ＭＹＣＮ発現も増幅していた。したがって、ＭＹＣＮとＣＳＮＫ１ε発現間の相関および機能的関係は、ＣＳＮＫ１のイプシロンアイソフォームに特異的であるようであった。
【００６７】
総合すると、これらのデータは、ＣＳＮＫ１ε発現が、多数の高ＭＹＣＮ発現神経芽細胞腫細胞株において高いＭＹＣＮ癌遺伝子発現と相関していることを示す。さらに、ＭＹＣＮは、ＣＳＮＫ１ε遺伝子の転写を直接調節しているようである。これは、ＣＳＮＫ１εが、ＭＹＣＮ発現が増幅している細胞のバイアビリティに重要であり、それにより、ＣＳＮＫ１εが神経起源のＭｙｃ駆動型癌細胞における潜在的な治療標的となることを示す。
【００６８】
ＣＳＮＫ１ε発現のノックダウンにより、ＭＹＣＮ発現が増幅している細胞のバイアビリティが低下した
神経芽細胞腫細胞株の成長に対するＣＳＮＫ１ε阻害の効果を試験するため、半合成テトラサイクリン化合物であるドキシサイクリン（「Ｄｏｘ」）によって誘導するとＣＳＮＫ１εのコンディショナルノックダウンを可能にするレンチウイルスベクターを構築した。ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２神経芽細胞腫細胞（ＭＹＣＮ遺伝子が増幅している）を、対照ｓｈＲＮＡ構築物、およびＣＳＮＫ１ε  ｍＲＮＡ配列の２つの異なる標的配列に対応する以下の２種類のｓｈＲＮＡ構築物でトランスフェクトした。ｄｏｘ誘導性ｓｈＲＮＡに使用したＣＳＮＫ１ｅの２つのコア標的配列を以下に示す。
【００６９】
【化２】
2013525283.tif 000005
【００７０】
これらのｓｈＲＮＡコードプラスミドで該細胞をトランスフェクトし、Ｄｏｘの存在下または非存在下で４日間培養した後、遺伝子発現レベルをｑＰＣＲで定量した。図３Ａは、それぞれＣＳＮＫ１εに対応する第１および第２のｓｈＲＮＡ構築物をＤｏｘ誘導発現させると、ＣＳＮＫ１εの相対発現が通常レベルの約０．４〜約０．６に低下したことを示す。これは、タンパク質レベルでもウエスタンブロット解析によって確認され、この場合、ＣＳＮＫ１ε遺伝子産物の測定可能なタンパク質レベルは、Ｄｏｘで処理したトランスフェクト細胞において低減していた。図３Ｂ参照。これは、ＣＳＮＫ１ε遺伝子および対応するポリペプチド遺伝子産物の発現のノックダウンに対するＣＳＮＫ１ε  ｓｉＲＮＡコード誘導性レンチウイルスベクターの有効性を示す。注目すべきことに、ＣＳＮＫ１εのノックダウンは、その他のアイソフォームの発現に影響せず（ｑＰＣＲによって測定時）、標的化用ｓｈＲＮＡヘアピン型の特異性を示す（データ表示せず）。
【００７１】
ＣＳＮＫ１ε標的化Ｄｏｘ誘導性ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターで、通常のＭＹＣＮ発現を有する神経芽細胞腫株ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ならびにＭＹＣＮ発現が増幅している神経芽細胞腫株ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２およびＩＭＲ−３２に形質導入した。ｓｈＲＮＡの発現はＤｏｘにより誘導され、細胞バイアビリティを、４日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてアッセイした。図３Ｃに示されるように、どちらのＣＳＮＫ１ε  ｓｈＲＮＡ構築物で誘導しても、ＭＹＣＮが増幅している神経芽細胞腫細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＢＥおよびＩＭＲ３２）では、細胞バイアビリティの相当な低下が引き起こされたが、通常のＭＹＣＮ発現を有する神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ）では引き起こされなかった。これは、ＣＳＮＫ１εの発現が、神経芽細胞腫細胞においてＭＹＣ癌遺伝子の発現が異常で増強されている状況においてのみ必要とされることを示す。
【００７２】
さらに、細胞バイアビリティに対するＣＳＮＫ１εまたはＭＹＣＮの一過性ノックダウンの効果をＳＫ−Ｎ−ＡＳおよびＩＭＲ−３２細胞においてアッセイした。細胞を各遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡプール（３種類の異なる二本鎖）でトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後、細胞のバイアビリティをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって測定した。図３Ｄに示されるように、ＣＳＮＫ１εおよびＭＹＣＮの一過性ノックダウンはどちらも、ＭＹＣＮが増幅している神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＢＥ）では、通常のＭＹＣＮ発現を有する神経芽細胞腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ）と比べて有意に大きな細胞バイアビリティの低下がもたらされた。図３Ｄに示したデータは、対照構築物で形質導入した細胞と比べたときの平均バイアビリティ±ＳＤを表す。
【００７３】
ＣＳＮＫ１εキナーゼ活性の化学的阻害により神経芽細胞腫の成長が阻止される
腫瘍細胞の成長阻害のためのＣＳＮＫ１εキナーゼインヒビターの治療潜在性を評価するため、ＣＳＮＫ１εポリペプチドのキナーゼ機能をＣＳＮＫ１εの小分子インヒビターＩＣ２６１およびｄキナーゼ活性（ｄ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）でブロックした（Ｍａｓｈｈｏｏｎ，Ｎ．ら，“Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｃａｓｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ−１  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：２００５２−２００６０，２０００）。具体的には、対照と比べたＩＣ２６１に対するＭＹＣ過剰発現細胞の感受性をインビトロで、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳ（通常のＭＹＣＮ発現）およびＩＭＲ−３２（ＭＹＣＮ発現が増幅している）を用いて調べた。培養細胞を一連の濃度のＩＣ２６１で処理し、細胞バイアビリティの割合を４日間にわたって上記のようにして記録した。０．３３μｇ／ｍｌ以上のＩＣ２６１濃度ではわずか４８時間後に、ＩＭＲ−３２神経芽細胞腫細胞（ＭＹＣＮ発現が増幅している）では、ＳＮ−Ｎ−ＡＳ神経芽細胞腫細胞（通常のＭＹＣＮ発現）と比べて細胞バイアビリティの割合の低下が示された。細胞バイアビリティの差は、１、５および１０μＭの濃度で有意であった。図４Ａ参照。神経芽細胞腫細胞株間の細胞バイアビリティにおける有意な差は７２時間まで持続した。図４Ｂ参照。神経芽細胞腫細胞株のバイアビリティ間の差は、高用量ではさらに９６時間まで持続した（が、差は統計学的に有意でなかった）。図４Ｃ参照。
【００７４】
ＳＮ−Ｎ−ＡＳ（通常のＭＹＣＮ発現）およびＩＭＲ−３２（ＭＹＣＮ発現が増幅している）神経芽細胞腫細胞株の顕微鏡解析により、ＭＹＣＮを過剰発現している神経芽細胞腫細胞の健常性および増殖に対するＣＳＮＫ１εインヒビターＩＣ２６１の効果の差がさらに裏づけられる。図５の上列を参照されたい。ＤＭＳＯ、０．３３μＭまたは３．３μＭのＩＣ２６１との培養前および培養４８時間後のＳＫ−Ｎ−ＡＳ（通常のＭＹＣＮ発現）細胞（培養状態）を示す顕微鏡写真を示している。図５の下列を参照されたい。ＤＭＳＯ、０．１μＭまたは１．０μＭのＩＣ２６１との培養前および培養４８時間後のＩＭＲ−３２細胞（ＭＹＣＮ発現が増幅している）（培養状態）を示す顕微鏡写真を示している。両株の処理前の細胞およびＤＭＳＯ処理細胞では健常的な拡延が示された。しかしながら、ＩＣ２６１処理の４８時間後、ＩＭＲ−３２芽細胞腫細胞では、大部分がプレート表面から剥離し、混乱状態（ｂａｌｌｅｄ  ｕｐ）が見られたが、ＳＮ−Ｎ−ＡＳでは、大部分で健常的な拡延および付着が維持された。このような結果は、ＣＳＮＫ１ε機能は、通常のＭＹＣＮレベルを有する細胞の成長および増殖には必要とされないが、ＭＹＣＮ発現が異常に高い（すなわち、ＭＹＣＮが増幅している）細胞の成長および増殖にはＣＳＮＫ１εが必要とされることを示す。
【００７５】
結論
これらのデータは、ＣＳＮＫ１εの発現が、ＭＹＣＮ発現が増幅している神経芽細胞腫細胞において上昇していることを示す。さらに、このような結果は、ＭＹＣＮがＣＳＮＫ１εの転写を直接調節していることを示す。さらに、このような結果は、ＣＳＮＫ１ε発現のノックダウンまたはＣＳＮＫ１εキナーゼ機能の化学的阻害により、ＭＹＣＮレベルが増幅している神経芽細胞腫細胞のバイアビリティが特異的に低下されるが、通常のＭＹＣＮレベルを有する細胞のバイアビリティは阻害されないことを示す。したがって、ＣＳＮＫ１εは、神経芽細胞腫細胞においてＭＹＣ癌遺伝子の発現が異常で増強されている状況においてのみ必要とされる。このような結果により、ＣＳＮＫ１εが、ＭＹＣ駆動型腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための実施可能な治療標的として確立される。
【００７６】
実施例２
この実施例は、マウス異種移植片モデルにおいて神経芽細胞腫細胞の増殖をインビボで阻害するためのＣＳＫＮ１ｅのインヒビターの使用を示す。
【００７７】
理論的根拠
実施例１に記載のように、ＣＳＮＫ１ε発現は、神経芽細胞腫細胞におけるＭＹＣＮ発現の上昇と関連していることがわかった。さらに、ＣＳＮＫ１ε発現およびキナーゼ機能は、ＭＹＣＮ発現が異常に高い神経芽細胞腫細胞のバイアビリティの継続に必要とされることがわかった。したがって、ＭＹＣＮ発現が高い確立された腫瘍におけるＣＳＮＫ１εの阻害をインビボで調べた。
【００７８】
方法および結果
ＣＳＮＫ１εキナーゼ活性のノックダウンおよび化学的阻害により神経芽細胞腫異種移植片の成長が阻止される
腫瘍成長のインビボ阻害におけるＣＳＮＫ１εノックダウン（発現および機能のノックダウン）の有効性を、神経芽細胞腫異種移植片マウスの治療モデルにおいて、それぞれＳＫ−Ｎ−ＢＥ２およびＩＭＲ−３２細胞株を用いて試験した。
【００７９】
ＣＳＮＫ１εのバイアビリティを癌治療の標的として確立させるため、ＣＳＮＫ１εの発現を、確立されたＳＫ−Ｎ−ＢＥ２（ＭＹＣＮ発現が増幅している）異種移植片芽細胞腫腫瘍において誘導性ｓｈＲＮＡ干渉を用いてノックダウンした。具体的には、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２細胞をインビトロで、ＣＳＮＫ１ε  ｍＲＮＡまたは対照を標的化するｓｈＲＮＡコードＤｏｘ誘導性レンチウイルスベクター（実施例１において上記）により形質導入し、マウスに以下のとおりに注射した。およそ２×１０６個の細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの側腹部に皮下注射した。得られた生着腫瘍は、２〜３週間で確立が認められた。次いで、マウスに毎日７日間、１ｍｇ／ｍｌのＤｏｘ（５％スクロース水中）を注射した。図６Ａ〜Ｄに示されるように、ｓｈＣＳＮＫ１εベクターを含む腫瘍を有する４匹のマウスのうち３匹で、Ｄｏｘ誘導されると腫瘍成長の阻害が示され、ＣＳＮＫ１εのサイレンシングが、ＭＹＣＮ発現が異常に高い神経芽細胞腫細胞の成長の阻止に有効であることが示された。
【００８０】
ＣＳＮＫ１εキナーゼインヒビターＩＣ２６１の治療潜在性を評価するため、ＣＳＮＫ１εの小分子インヒビターおよびｄキナーゼ活性（Ｍａｓｈｈｏｏｎ、Ｎ．ら，“Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｃａｓｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ−１  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：２００５２−２００６０，２０００）を、確立されたＩＭＲ−３２（ＭＹＣＮ発現が増幅している）異種移植片芽細胞腫腫瘍を有するマウスに投与した。具体的には、１０匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに１×１０７個のＩＭＲ−３２芽細胞腫細胞を注射した。腫瘍を６週間で確立させた。マウスを対照群とＩＣ２６１処置群に無作為化した。処置の開始時、対照マウスの平均腫瘍サイズは９８．８±４２．５ｍｍ３であり、一方、ＩＣ２６１処置群の平均腫瘍サイズは１２１．９±４６．９ｍｍ３であった。これらの群に１日１回で７日間、２０．５ｍｇ／ｋｇのＩＣ２６１またはＤＭＳＯ（２００μｌ）を皮下注射した。処置期間中、腫瘍サイズをモニタリングした。図７Ａに示されるように、処置の最初の２日間では、ＤＭＳＯ処置マウスとＩＣ２６１処置マウス間で腫瘍体積に有意差はみられなかった。しかしながら、３日目、ＩＣ２６１処置マウスの平均腫瘍体積は縮小し、この傾向は残りの処置スケジュールを通して継続され、最終的に約１００ｍｍ３の体積まで縮小した。対照的に、ＤＭＳＯ処置マウスの腫瘍体積は継続して増大し、約３５０ｍｍ３の体積となった。処置前および処置後のＩＣ２６１群と対照群の代表的なマウスの写真を、それぞれ図７ＢおよびＣに示す。各群の腫瘍の組織学的切片を、ＩＣ２６１処置の８日目の後に調製した。腫瘍切片をヘマトキシリンとエオシンでの（Ｈ−Ｅ）染色、ＴＵＮＥＬ染色、およびＢｒｄＵ染色に供し、細胞構造、および細胞アポトーシスの頻度、および腫瘍内の細胞増殖を確認した。図７Ｄに示されるように、ＩＣ２６１処理腫瘍では、対照（ＤＭＳＯ処理）腫瘍と比較して、ＢｒｄＵ染色において、細胞増殖の徴候が劇的に低減されていた。図７Ｄに示す画像は、動物１匹あたり２つの染色切片で観察した少なくとも１０個の視野のうちの代表である。
【００８１】
結論
この実施例は、ＣＳＮＫ１ε発現および／または酵素活性の低減は、該キナーゼドメインの発現ノックダウンまたは化学的インヒビターのいずれによるものであれ、癌細胞の成長および増殖の阻害に有効であり、ＭＹＣ駆動型神経芽細胞腫癌の腫瘍サイズが低減されたことを示す。このような結果により、ＣＳＮＫ１εがＭＹＣ駆動型癌の治療標的であると確認される。
【００８２】
実施例３
この実施例では、神経芽細胞腫細胞のＷＮＴ活性の機能状態を調べる方法、およびＣＳＮＫ１εのインヒビターのスクリーニング方法を記載する。
【００８３】
理論的根拠
実施例１に記載のように、ＣＳＮＫ１εの高発現は腫瘍細胞内のＭＹＣ癌遺伝子の発現増幅に対応していることがわかり、ＣＳＮＫ１ε発現またはキナーゼ活性の選択的阻害により、ＭＹＣＮ発現が増幅している神経芽細胞腫細胞のバイアビリティの低下がもたらされることがわかった。さらに、実施例２に記載のように、ＭＣＹＮ発現が増幅している神経芽細胞腫異種移植片におけるＣＳＮＫ１ε発現またはキナーゼ活性の選択的阻害により、インビボで腫瘍サイズの縮小がもたらされることがわかった。ＣＳＮＫ１εとＭＹＣ癌遺伝子間の関係をもたらす機能機構をより良好に理解するため、２つの発生経路におけるＣＳＮＫ１εの役割を、ＭＹＣ発現に関して調べた。
【００８４】
方法および結果
ＣＳＮＫ１εノックダウンは２つの発生経路ＷＮＴとＳＨＨに影響を及ぼす
ＣＳＮＫ１εは、ＷＮＴシグナル伝達の正の調節因子であることが示唆されている（Ｓａｋａｎａｋａ，Ｃ．，“Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａ−Ｃａｔｅｎｉｎ  ｂｙ  Ｃａｓｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉ  Ｅｐｓｉｌｏｎ，”Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３２：６９７−７０３，２００２）。ＭＹＣＮ発現が増幅している、または増幅していない神経芽細胞腫細胞のＷＮＴ活性の機能状態を調べるため、コンセンサス（ＴＯＰ）および変異型（ＦＯＰ）の両方のＴＣＦ結合部位が使用されたＷＮＴデュアルレポーター系を、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳ（ＭＹＣＮは増幅されていない）、ＳＨ−Ｓｙ５Ｙ（ＭＹＣＮは増幅されていない）、ＩＭＲ−３２（ＭＹＣＮが増幅および過剰発現されている）、およびＳＫ−Ｎ−ＢＥ２（ＭＹＣＮが増幅および過剰発現されている）において、（Ｂｉｅｃｈｅｌｅ，Ｔ．Ｌ．ら，“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−Ｃａｔｅｎｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２００９，ｐｄｂ  ｐｒｏｔ５２２３）に記載のようにしてアッセイした。図８Ａに示されるように、ＷＮＴ媒介性転写応答は、ＭＹＣＮが増幅している細胞（すなわち、ＩＭＲ−３２およびＳＫ−Ｎ−ＢＥ４）では顕著に上昇していた（β−カテニンシグナル伝達によって表示）。
【００８５】
ＷＮＴとＭＹＣＮ発現との潜在的な直接的関係を、誘導性Ｔｅｔ−ＭＹＣＮ遺伝子を発現する神経芽細胞腫細胞を用いて探究した。Ｔｅｔ−ｏｆｆ−ＭＹＣＮ遺伝子を有するＴｅｔ−２１Ｎ神経芽細胞腫細胞（通常のＭＹＣＮ発現）を、上記に記載のようにして、Ｄｏｘ（テトラサイクリン化合物）で処理するか、または処理なしとした。ウエスタンブロット解析により、Ｄｏｘを受けたＴｅｔ−ＭＹＣＮ細胞では、ＭＹＣＮレベルの抑制と平行してＤｏｘなし細胞と比べてＣＳＮＫ１ε発現が低下することが示された（データ表示せず）。さらに、ＷＮＴ活性を、組み込まれたＷＮＴレポーターの検出可能な活性によってアッセイした。図８Ｂに示されるように、ＭＹＣＮ発現がオンである神経芽細胞腫細胞では、ＷＮＴシグナル伝達が高度に上昇し（検出可能なβ−カテニンシグナルによって表示）、ＩＣ−２６１の添加によりＷＮＴレポーターの抑制がもたらされた。このような結果は、ＭＹＣＮが神経芽細胞腫においてＷＮＴに対して正のフィードバックを奏功し得ることを示唆し、これは、ｃ−ＭＹＣ過剰発現が乳癌細胞においてＷＮＴに正の影響を及ぼすという以前の報告と整合している（Ｃｏｗｌｉｎｇ，Ｖ．Ｈ．，およびＭ．Ｄ．Ｃｏｌｅ，“Ｔｕｒｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔａｂｌｅｓ：Ｍｙｃ  Ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｗｎｔ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，”Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ６：２６２５−２６２７，２００７）。
【００８６】
また、Ｄｏｘ誘導性レンチウイルス構築物（上記）を用いたＣＳＮＫ１εのコンディショナルノックダウンによっても、神経芽細胞腫細胞内に組み込まれたＷＮＴレポーターの活性が低下した（データ表示せず）。これは、ＣＳＮＫ１ε活性が、ＷＮＴシグナル伝達活性に対するＭＹＣＮの効果を媒介していることを示す。
【００８７】
しかしながら、ＷＮＴシグナル伝達の枢要なメディエータであるβ−カテニンをｓｉＲＮＡ構築物（「ｓｉＣＴＮＮＢ１」）を用いてノックダウンすると、それぞれ、ＭＹＣＮが増幅されていない、およびＭＹＣＮが増幅された神経芽細胞腫株であるＳＫ−Ｎ−ＡＳおよびＳＫ−Ｎ−ＢＥ２のバイアビリティに対する影響は同等であったことに注目されたい。図８Ｃ参照。このような結果により、ＣＳＮＫ１εノックダウンによって引き起こされる選択的成長阻害は、ＷＮＴ依存性効果とＷＮＴ非依存性効果の両方によって引き起こされるのかもしれないことが示唆された。
【００８８】
全体レベルでのＣＳＮＫ１εノックダウンの効果を解明するため、ＣＳＮＫ１εのコンディショナルサイレンシング後に単離したｍＲＮＡのマイクロアレイ解析を、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２神経芽細胞腫細胞（ＭＹＣＮが増幅および過剰発現されている）において行ない、対照レンチウイルスベクターで形質導入した試料と比較した。その結果では、広範な遺伝子の組で遺伝子発現に有意な変化が示された。下方調節された遺伝子の経路解析では、いくつかがソニック・ヘッジホッグ（「ＳＨＨ」）シグナル伝達に関与していることが示された。これにより、ＳＨＨ発生経路がＣＳＮＫ１εノックダウンに対する細胞応答に役割を果たしていることが示された。ＭＹＣＮが増幅している神経芽細胞腫におけるＳＨＨの関与を確認するため、ＧＬＩデュアルレポーター系を神経芽細胞腫細胞株において、Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．ら，“Ａ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｌｉ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ＨＮＦ−３ｂｅｔａ  Ｆｌｏｏｒ  Ｐｌａｔｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃａｎ  Ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  Ｓｈｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：１３１３−１３２２，１９９７に既報の方法に従ってアッセイした。ＧＬＩ１は、ＳＨＨ応答を媒介する下流の転写因子であり、ＧＬＩ１結合部位を有するレポーターは、経路の状態を測定するために利用される。図８Ｄに示されるように、ＩＭＲ−３２およびＳＫ−Ｎ−ＢＥ２神経芽細胞腫株（どちらもＭＹＣＮ発現が増幅している）では、ＳＫ−Ｎ−ＡＳおよびＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫株（どちらも通常のＭＹＣＮ発現を有する）と対比して高いＧｌｉ／ｍＧｌｉ比が観察され、ＭＹＣＮ発現が増幅している神経芽細胞腫ではＳＳＨレポーターレベルが高いことが示された。
【００８９】
ＳＨＨの既知の天然インヒビターであるシクロパミンをＳＫ−Ｎ−ＡＳとＩＭＲ−３２に投与し、それぞれ、通常ＭＹＣＮ発現を有する、およびＭＹＣＮ発現が増幅している神経芽細胞腫細胞の細胞バイアビリティに対するＳＨＨ阻害の影響を評価した。シクロパミンは、ＳＫ−Ｎ−ＡＳおよびＩＭＲ−３２に対して１μＭまたは１０μＭの用量で投与し、成長阻害を４８、７２および９６時間目にアッセイした。成長阻害は、どちらの神経芽細胞腫細胞型でも検出された。しかしながら、効果は、ＭＹＣＮ発現が増幅している神経芽細胞腫細胞（ＩＭＲ−３２）の方が著明であった。図８ＥとＦ参照。これらのデータを合わせると、機能性ＳＨＨシグナル伝達経路およびそのＣＳＮＫ１ε機能との相互作用に対するＭＹＣ過剰発現細胞の依存性が示される。
【００９０】
結論
このような結果は、ＣＳＮＫ１εが、ＭＹＣＮ増幅によって設定される潜在的な正のフィードバックループによってＷＮＴとＳＨＨの両方のシグナル伝達に影響を及ぼすことを示す。両方の経路の活性が、ＭＹＣＮを過剰発現する増殖性神経芽細胞腫の可能性の一因となっているようである。
【００９１】
実施例４
この実施例は、卵巣癌細胞の増殖をインビトロおよびインビボで阻害するためのＣＳＫＮ１εのインヒビターの使用を示す。
【００９２】
理論的根拠
実施例１〜２に記載のように、ＣＳＮＫ１εの発現上昇は、神経の癌細胞においてＭＹＣＮの発現増幅と相関していることがわかった。実施例１と２で示されたように、ＭＹＣＮ発現が増幅している癌細胞におけるＣＳＮＫ１εの低減により、該細胞のバイアビリティが、インビトロおよびインビボの両方で低下した。さらに、実施例３に記載のように、ＭＹＣＮ発現が増幅している神経芽細胞腫細胞に対するＣＳＮＫ１εの増殖性効果は、ＣＳＮＫ１εの調節に対して正のフィードバックをもたらすＷＮＴとＳＨＨのシグナル伝達によって媒介されているようである。ＣＳＮＫ１εが、神経のものでない癌のＭＹＣの他のアイソタイプに対しても同様の役割を果たしているかどうかを評価するため、ＣＳＮＫ１εの発現を、ＭＹＣ発現の増幅を示す卵巣癌細胞において操作した。
【００９３】
方法および結果
ｃ−ＭＹＣ発現状態に関する卵巣癌株の特性評価
６例のヒト卵巣癌細胞株を、ｃ−ＭＹＣの相対発現レベルについて以下のとおりに特性評価した。第１に、卵巣癌細胞株ＣａＯＶ３、ＲＭＧ−１、ＤＯＶ−１３、ＰＥ０４、ＩＧＲＯＶ−１、およびＴＯＶ１１２Ｄから得たタンパク質抽出物を用いてウエスタンブロットを行なった。これらのタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ブロットし、ｃ−ＭＹＣモノクローナル抗体（ｓｃ−４２およびｓｃ−７６４，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でプローブ結合させた。
【００９４】
図９Ａに示されるように、ウエスタンブロットでは、ＰＥ０４において、特にＩＧＲＯＶ−１およびＴＯＶ１１２Ｄ細胞株において高レベルのｃＭＹＣが示された。対照的に、ＣａＯＶ３細胞のウエスタンブロットでは低いｃ−ＭＹＣレベルが示され、ＲＭＧ−１およびＤＯＶ−１３卵巣癌細胞株では検出可能なｃ−ＭＹＣはなかった。対照として、低レベルのｃ−ＭＹＣを発現するヒト包皮一次細胞（対照ベクターｐＢａｂｅを含むＨＦＦ）を陰性対照として使用し、ｃ−ＭＹＣ導入遺伝子を有するＨＦＦ細胞を陽性対照として使用した。
【００９５】
第２に、ｃ−ＭＹＣ  ｍＲＮＡを種々の卵巣癌細胞株において定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて定量した。ｃ−ＭＹＣの発現レベルを参照標準遺伝子ＧＡＰＤＨの検出レベルに対して標準化した。図９Ｂは、標準化ｃ−ＭＹＣ  ｍＲＮＡレベルを高くなる順に示す。斑点のあるバーは、近似値でＧＡＰＤＨの単一遺伝子コピーを有する細胞株を示し、一方、白色ボックスは、標準遺伝子の多数の遺伝子コピーを有する細胞株を表す。中でも、先にウエスタンブロットアッセイによって高値レベルのｃ−ＭＹＣポリペプチドを有すると特定された細胞株ＰＥ０４、ＩＧＴＯＶ−１およびＴＯＶ１１２Ｄは、ｃ−ＭＹＣのｍＲＮＡレベルが最高の卵巣細胞株であることに注目されたい。
【００９６】
第３に、ＭＹＣ駆動型過剰発現を示し、したがってＭＹＣ駆動型増殖を示す多くの形質転換細胞は、ＭＹＣ遺伝子に重複が生じていることがわかっているため、ｃ−ＭＹＣのコピー数をＰＣＲによって該卵巣癌細胞株においてアッセイした。アッセイした種々の卵巣癌細胞株のコピー数を図９Ｃに、ＧＡＰＤＨコピー数の関数として示す。先でｃ−ＭＹＣ発現が増幅していると特定されたＩＧＲＯＶ−１およびＰＥ０４では、ｃ−ＭＹＣ遺伝子のコピー数が増大していることに注目されたい。しかしながら、ＴＯＶ１１２Ｄ細胞株はｃ−ＭＹＣコピーが増大していないようであり、これは、このような細胞における該遺伝子の発現レベルの増幅が単一の遺伝子座からの転写の脱調節に起因していることを示す。
【００９７】
ｃ−ＭＹＣが増幅している卵巣癌細胞におけるＣＳＮＫ１ε発現のノックダウン
ＣＳＮＫ１ε標的化ｓｉＲＮＡで、ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している２種類の卵巣癌細胞株（ＩＧＲＯＣ−１とＴＯＶ１１２Ｄ）およびｃ−ＭＹＣの発現レベルが通常（すなわち、低増幅、増幅なし）の２種類の卵巣癌細胞株（ＣａＯＶ３とＤＯＶ１３）をトランスフェクトし、ＣＳＮＫ１ε遺伝子の一過性ノックダウンを誘導した。ＵＮＩ標的化ｓｉＲＮＡを陰性対照として供し、すべての細胞に対して毒性であるＫＩＦ１１標的化ｓｉＲＮＡを陽性対照として供した。細胞バイアビリティを、トランスフェクション後、第５日目にＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏｗ  Ａｓｓａｙを用いてアッセイした。ＩＧＲＯＶ−１およびＴＯＶ１１２Ｄ細胞株の相対バイアビリティは、それぞれ、およそ５５％および４０％まで低下した。対照的に、ＣａＯＶ３およびＤＯＶ１３細胞株の相対バイアビリティは、それぞれ、およそ９５％および８５％まで低下した。このデータは、ＣＳＮＫ１εが、ｃ−ＭＹＣ発現の増幅を示す卵巣癌細胞のバイアビリティに必要であることを示す。
【００９８】
ＣＳＮＫ１εの安定なノックダウンの影響を、ＷＮＴシグナル機能の発現についてアッセイした。卵巣細胞における安定なノックダウン手法の有効性を確認するため、ＣＳＮＫ１ε標的化ｓｈＲＮＡをコードするＤｏｘ誘導性レンチウイルス構築物でＣＯＬＯ７２０Ｅ卵巣細胞に形質導入した。この細胞株では、すべての卵巣癌細胞株のうちで最高のｃ−ＭＹＣ  ｍＲＮＡレベルが示されたことに注目されたい。図９Ｂ参照。図１０Ａに示されるように、Ｄｏｘでの形質導入細胞の誘導により、非誘導細胞または対照レンチウイルス構築物を含む細胞と比べて、ＣＳＮＫ１εポリペプチドレベルの劇的な低減がもたらされた。次に、ＷＮＴシグナル伝達活性を評価するため、相対β−カテニン活性を記載のようにして（上掲）、ＣＳＮＫ１ε標的化レンチウイルスコードｓｈＲＮＡで形質導入したＣＯＬＯ７２０Ｅ卵巣細胞についてアッセイした。Ｄｏｘ誘導を行なうと、相対β−カテニン活性は、非誘導細胞と比べておよそ３分の１低下した。ＣＳＮＫ１εのインヒビターＩＣ２６１を投与すると、相対β−カテニン活性に対する同様の効果が観察された。簡単には、ＣＯＬＯ７２０Ｅ細胞を０、０．６７、３．３、および６．６７μＭのＩＣ２６１中で培養した。図１０Ｃに示されるように、相対β−カテニン活性、したがってＷＮＴシグナル伝達は、高用量のＩＣ２６１では３分の２より大きく低減された。これは、神経芽細胞腫での結果と同様、ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している卵巣癌細胞のバイアビリティに対するＣＳＮＫ１εの効果がＷＮＴシグナル伝達経路によって媒介されているようであることを示す。
【００９９】
ＩＣ２６１によるＣＳＮＫ１εの阻害は、ｃ−ＭＹＣが増幅している卵巣癌株の成長を選択的に障害する
卵巣癌株の細胞バイアビリティに対するＣＳＮＫ１εの効果をインビトロで調べた。まず、対照ベクターを含むＨＦＦ（非癌一次細胞）、ＲＭＧ−１（通常のｃ−ＭＹＣ発現）、ＣａＯＶ３（通常のｃ−ＭＹＣ発現）、ｃＭＹＣ誘導型ＨＦＦ（ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している）、ＴＯＶ１１２Ｄ（ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している）、およびＣＯＬＯ７２０Ｅ（ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している）を、漸増濃度のＩＣ２６１に曝露した。細胞バイアビリティを上記のようにしてアッセイした。０．５  ｌｏｇμＭ以上では、ｃ−ＭＹＣが増幅しているすべての細胞で、２５％以下までの相対バイアビリティの劇的な低下が示されたが、通常のｃ−ＭＹＣ発現細胞では、およそ７５％以上の細胞バイアビリティが示された。
【０１００】
同様のアッセイを、ＩＧＲＯＶ−１、ＰＥ０１、ＤＯＶ１３、ＯＡＷ４２、ＴＯＶ２１ＧおよびＳＫＯＶ３を含むさらなる卵巣癌細胞パネルで行なった。細胞バイアビリティの完全喪失をもたらすのに必要とされるＩＣ２６１濃度の半値を反映する最大有効濃度の半値（ｌｏｇＩＣ５０）の対数を計算した。結果を以下に表２に示す。注目すべきことに、先で最高のある程度までのｃ−ＭＹＮ発現レベルを有すると確立された２種類の卵巣癌細胞株ＩＧＲＯＶ−１とＰＥ０１は最高ｌｏｇＩＣ５０値を有し、細胞バイアビリティの低下を引き起こすためのＩＣ２６１の高い効力を示す。
【０１０１】
【表２】
2013525283.tif 000006
【０１０２】
次いで、卵巣癌細胞の細胞バイアビリティに対するＣＳＮＫ１εの効果をインビボで調べた。癌腫性腹膜炎モデルマウスを、ＴＯＶ１１２Ｄ／Ｌｕｃ細胞の腹腔内注射によって作出した。１週間後、マウスは対照群と実験群に無作為化し、次いで、ＩＣ２６１またはＤＭＳＯ担体の注射を３週間、毎日受けた。Ｌｕｃのイメージングを毎週、各マウスについて実験の各週の終わりに行ない、該マウスにおいて確立された癌細胞の相対バイアビリティをモニタリングした。図１１Ａに示されるように、ＩＣ２６１注射を毎日受けたマウスでは、２週間後、ＤＭＳＯを受けたマウスと比べて癌細胞増殖およびバイアビリティの有意な低下が示された。処置群間の差は第４週までに、さらにずっと著明になった。図１１Ｂの生存のグラフに示されるように、ＤＭＳＯ群とＩＣ２６１処置群は、３０日目から生存パーセントが分かれ始め、このときＤＭＳＯ群では劇的な死亡が発生し始めた。これは、ＣＳＮＫ１εの阻害により、発現が増幅している卵巣癌細胞のバイアビリティがインビトロで低下したことを示す。さらに、卵巣癌におけるインビボでのＣＳＮＫ１εの阻害により癌細胞のバイアビリティと増殖の低減がもたらされ、最終的に、被験体の寿命が長くなった。
【０１０３】
細胞周期の進行に関するＣＳＮＫ１εインヒビターの解析
ｃ−ＭＹＣ発現が通常である（すなわち、低い）卵巣癌細胞株および増幅している卵巣癌細胞株を、細胞周期の進行に対するＣＳＮＫ１εインヒビターＩＣ２６１の影響について評価した。ＣａＯＶ３細胞（通常のｃ−ＭＹＣ発現）およびＴＯＶ１１２Ｄ細胞（ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している）を１μＭのＩＣ２６１中で培養した。細胞を細胞周期の状態、すなわち、Ｇ１、Ｓ期およびＧ２について、ＩＣ２６１との接触前ならびに接触の１６時間後および２４時間後の時点で、ヨウ化プロピジウム染色、続いてＦＡＣＳ解析によって評価した。図１２Ａに示されるように、ＩＣ２６１の処置前では、両細胞株の大部分の細胞は細胞周期のＧ１期であった。ＩＣ２６１の投与後、Ｇ１期の細胞のパーセンテージは劇的に低下した。しかしながら、そのレベルは、ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している細胞の方が低かった。対照的に、ＩＣ２６１の投与前では、いずれの細胞株でも、観察されたＧ２期の細胞はごくわずかであった。図１２Ｂ参照。しかしながら、ＩＣ２６１を投与すると、ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している癌細胞の大部分がＧ２チェックポイントで停止した。この傾向は、通常ｃ−ＭＹＣ発現を有する癌細胞では観察されなかった。これは、ＣＳＮＫ１ε機能が、Ｇ２チェックポイントから中期に進行するＭＹＣ駆動型癌細胞の進行に必要とされることを示す。対照的に、通常ｃ−ＭＹＣの卵巣癌細胞に対しては、ＩＣ２６１が有するＧ２での細胞周期の停止を引き起こす能力は小さく、一過性にすぎない。
【０１０４】
シスプラチンでの処置に対する卵巣癌細胞の感受性におけるＣＳＮＫ１εインヒビターの役割
シスプラチン、またはシス−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ）は、卵巣癌を含む数多くの型の癌を処置するために一般的に使用される化学療法薬である。シスプラチンは白金錯体を含み、これがＤＮＡと架橋し、最終的に細胞のアポトーシスを誘発する。しかしながら、処置された多くの癌は再発し、シスプラチンに対して抵抗性を示す。ＣＳＮＫ１εインヒビターがｃ−ＭＹＣ発現が増幅している細胞のバイアビリティを低下させる能力を考慮し、シスプラチン抵抗性癌細胞に対するＣＳＮＫ１εインヒビターの同様の役割を調べた。Ａ２７８０およびＡ２７８０−ＣＰ７０（抵抗性派生体）、ＰＥ０１およびＰＥ０４（ＰＥ０１の抵抗性派生体）卵巣癌細胞株を、漸増用量のシスプラチンの存在下、ならびにＩＣ２６１の存在下および非存在下で培養した。細胞バイアビリティを上記のようにしてモニタリングした。図１３Ａに示されるように、Ａ２７８０とＡ２７８０−ＣＰ７０はどちらもシスプラチンに対する細胞応答が、１μＭのＩＣ−２６１の添加によって大きく感受性となった。Ａ２７８０細胞のｃ−ＭＹＣ発現レベルは、それでも測定されないことに注目されたい。図１３Ｂに示されるように、ともにｃ−ＭＹＣ発現が増幅しているＰＥ０１卵巣細胞および抵抗性派生体ＰＥ０４卵巣細胞でも、低用量のシスプラチンの存在下であって１μＭのＩＣ−２６１の存在下でもある場合、細胞バイアビリティの大きな低下が示された。このような結果は、ＩＣ−２６１または他のＣＳＮＫ１εインヒビターでのＣＳＮＫ１εの阻害を、化学療法抵抗性の卵巣癌の場合に利用できるかもしれないことを示す。
【０１０５】
結論
この実施例は、ＣＳＮＫ１εが、ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している卵巣癌細胞のバイアビリティに必要とされることを示す。神経芽細胞腫細胞で観察された役割と整合して、ＣＳＮＫ１ε遺伝子発現のノックダウンおよびＣＳＮＫ１εキナーゼ活性の機能阻害により、ＷＮＴシグナル伝達の低減がもたらされ、ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している細胞の卵巣細胞バイアビリティに対するＣＳＮＫ１εの効果の一部が、ＷＮＴシグナル伝達によって媒介されていることを示す。ＣＳＮＫ１εインヒビターＩＣ２６１を投与すると、インビトロおよびインビボで、ｃ−ＭＹＣ発現が増幅している卵巣癌細胞のバイアビリティおよび増殖の低下がもたらされる。したがって、このような結果は、ＣＳＮＫ１εが、ＭＹＣ駆動型卵巣癌のバイアビリティの継続に非常に重要な役割を果たしており、ＭＹＣ駆動型癌および別の様式のシスプラチンに対して抵抗性の癌の処置の標的であることを示す。
【０１０６】
本発明の好ましい実施形態の実例を示し、説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに種々の変更が行なわれ得ることは認識されよう。
【０１０７】
排他的所有権または特権を請求する本発明の実施形態を以下のとおりに規定する。
【図２】
2013525283.tif 000007
【図３Ａ】
2013525283.tif 000008
【図３Ｃ】
2013525283.tif 000009
【図３Ｄ】
2013525283.tif 000010
【図４Ａ】
2013525283.tif 000011
【図４Ｂ】
2013525283.tif 000012
【図４Ｃ】
2013525283.tif 000013
【図６Ａ】
2013525283.tif 000014
【図６Ｂ】
2013525283.tif 000015
【図６Ｃ】
2013525283.tif 000016
【図６Ｄ】
2013525283.tif 000017
【図７Ａ】
2013525283.tif 000018
【図７Ｂ】
2013525283.tif 000019
【図７Ｃ】
2013525283.tif 000020
【図７Ｄ】
2013525283.tif 000021
【図８Ａ】
2013525283.tif 000022
【図８Ｂ】
2013525283.tif 000023
【図８Ｃ】
2013525283.tif 000024
【図８Ｄ】
2013525283.tif 000025
【図８Ｅ】
2013525283.tif 000026
【図８Ｆ】
2013525283.tif 000027
【図９Ｂ】
2013525283.tif 000028
【図９Ｃ】
2013525283.tif 000029
【図１０Ｂ】
2013525283.tif 000030
【図１０Ｃ】
2013525283.tif 000031
【図１１Ａ】
2013525283.tif 000032
【図１１Ｂ】
2013525283.tif 000033
【図１２Ａ】
2013525283.tif 000034
【図１２Ｂ】
2013525283.tif 000035
【図１Ａ】
2013525283.tif 000036
【図１Ｂ】
2013525283.tif 000037
【図３Ｂ】
2013525283.tif 000038
【図５】
2013525283.tif 000039
【図９Ａ】
2013525283.tif 000040
【図１０Ａ】
2013525283.tif 000041
【図１３Ａ】
2013525283.tif 000042
【図１３Ｂ】
2013525283.tif 000043
【配列表】
2013525283000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年12月13日(2012.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013525283000001.app
【国際調査報告】
2013525283.tif 000044
2013525283.tif 000045
2013525283.tif 000046