(57)【要約】  本発明は、（ｉ）標的核酸配列に相補的であり、発現すると標的核酸の発現を妨げるか又は減少させる核酸、及び（ｉｉ）神経伝達物質輸送体に高い親和性で結合することができる選択的作用剤を含むコンジュゲートを提供する。本発明のコンジュゲートは、関心のある細胞に核酸を送達するために有用であり、したがって、標的核酸によりコードされるタンパク質の下方制御を必要とする疾患の治療のために、並びに診断の目的で細胞に撮像剤を送達するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）１種又は複数種の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１種の選択的作用剤、及び
ｉｉ）神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現している標的分子に特異的に結合することができる少なくとも１種の核酸
を含んでなる、コンジュゲート。
【請求項２】
神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現している標的分子に特異的に結合することができる核酸配列が、２本鎖ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ギャップマー、ＰＮＡ、ＬＮＡ、リボザイム及びアプタマーからなる群から選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
標的分子に対する核酸の結合が標的分子の活性の阻害を生ずる、請求項１又は２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
選択的作用剤がオリゴヌクレオチドの５’末端にコンジュゲーションしている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
選択的作用剤とオリゴヌクレオチドとが連結基により接続している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
第１のオリゴヌクレオチド配列に相補的な第２のオリゴヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に付いた保護基をさらに含んでなる、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に付いた保護基が、下記の構造物：
【化１】
2013525330.tif 000123
（式中、
ＭがＨ又は脂質部分であり、
Ａ及びＢは、単糖及び（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレングリコールからなる群から独立に選択されるモノマーユニットを表し；
ａ及びｂは０から５０の範囲の整数であり；
ｃは０から３０の範囲の整数であり；
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、ホスホジエステル、ホスホロチオネート、カルバメート、メチルホスホネート、グアニジニウム、スルファメート、スルファミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、スルホン、アミド及びそれらの混合物からなる群から独立に選択される連結化合物であり；
ｄは０又は１である）
を有する、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
単糖が、フラノース、フルクトース、フラノース、グルコース、ガラクトース、マンノース、改変された単糖、シアル酸及びエリトロースからなる群から選択される、請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレングリコールがエチレングリコール、プロピレングリコール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項９又は１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
ＭがＨであり、Ａがフラノースであり；ＢがＣ１８エチレングリコールであり；ａ、ｂ及びｃが１であり、ｄが０であり、Ｌ２及びＬ３がホスホジエステル結合である、請求項１１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
１種又は複数種の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する選択的作用剤が、セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＲＩ）、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）、ノルアドレナリン作動性で且つ特異的セロトニン作動性の抗鬱剤（ＮＡＳＳＡ）、ノルアドレナリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）、内在性カンナビノイド再取り込み阻害剤（ｅＣＢＲＩ）、アデノシン再取り込み阻害剤（ＡｄｏＲＩ）、興奮性アミノ酸再取り込み阻害剤（ＥＡＡＲＩ）、グルタメート再取り込み阻害剤（ＧｌｕＲＩ）、ＧＡＢＡ再取り込み阻害剤（ＧＲＩ）、グリシン再取り込み阻害剤（ＧｌｙＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
選択的作用剤が、セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＲＩ）、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）からなる群から選択される、請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）が、セルトラリン、セルトラリンの構造的アナログ、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、インダプリン、ジメリジン、シタロプラム、ダポキセチン、エスシタロプラム、及びそれらの混合物からなる群から選択され、且つオリゴヌクレオチドの配列がニューロンのアミノ酸輸送体と同じ細胞で発現している標的核酸に相補的である、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
（Ｉ）又は（ＩＩ）からなる群から選択される構造を有する請求項１５に記載のコンジュゲート：
【化２】
2013525330.tif 000124
【化３】
2013525330.tif 000125
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、水素及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｘ及びＹは、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＯＲａ及びＳＲｂから独立に選択され、ここでＲａ及びＲｂはＣ１〜Ｃ３アルキル及びＣ６〜Ｃ１０アリールから独立に選択され；
Ｗは、水素、ハロゲン、ＣＮ，ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＮＲｃＲｄ、ＳＯ２ＮＲｅＲｆ、ＮＲｇＳＯ２Ｒｈ、ＣＯ２Ｒｉから選択され、ここでＲｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ及びＲｉは水素及びＣ１〜Ｃ３アルキルから独立に選択され；
ｍ、ｎ及びｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択され、ここでｍ＋ｎ＋ｐの和は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７及び１８から選択される整数である）。
【請求項１７】
【化４】
2013525330.tif 000126
及び
【化５】
2013525330.tif 000127
及び
【化６】
2013525330.tif 000128
からなる群から選択される構造を有する、請求項１６に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
前記標的分子が、１Ａ型セロトニン受容体（５−ＨＴ１Ａ）、１Ａ型セロトニン受容体（５−ＨＴ１Ａ）をコードするｍＲＮＡ、セロトニン輸送体タンパク質及びセロトニン輸送体をコードするｍＲＮＡからなる群から選択される、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
核酸が、セロトニン受容体１Ａ型（５−ＨＴ１Ａ）をコードするｍＲＮＡに特異的に結合することができ、且つ配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４の群から選択される配列を含んでなる、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
選択的作用剤が、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）及びセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤からなる群から選択され、且つ標的分子がα−シヌクレイン又はα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
選択的作用剤がノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）であり、且つ標的分子がドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ又はドーパミン−β−ヒドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
選択的作用剤が、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）及びセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤からなる群から選択され、且つ標的分子はＢＡＸ又はＢＡＸをコードするｍＲＮＡである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
選択的作用剤が、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）及びセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤からなる群から選択され、且つ標的分子はタウ（Ｔａｕ）又はタウをコードするｍＲＮＡである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
選択的作用剤が、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）及びセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤からなる群から選択され、且つ標的分子がハンチンチン又はハンチンチンをコードするｍＲＮＡである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
構造：
【化７】
2013525330.tif 000129
を有する、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
構造：
【化８】
2013525330.tif 000130
を有する、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
医薬に使用するための、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
（ｉ）選択的作用剤が、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）及びセロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）の群から選択され、及び
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、セロトニン受容体１Ａ型（５−ＨＴ１Ａ）をコードするｍＲＮＡ、セロトニン輸送体をコードするｍＲＮＡ、セロトニン受容体１Ａ型（５−ＨＴ１Ａ）及びセロトニン輸送体の群から選択される標的分子に特異的に結合することができる、
鬱病関連障害の治療又は予防に使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
鬱病関連障害が、大鬱病、強迫性障害（ＯＣＤ）、広汎性発達障害（ＰＤＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安障害、双極性障害、摂食障害及び慢性疼痛からなる群から選択される、請求項２８に記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
（ｉ）選択的作用剤がドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）の群から選択され、及び
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドがα−シヌクレインをコードするｍＲＮＡ又はα−シヌクレインポリペプチドである標的分子に特異的に結合することができる、
レヴィー小体の堆積と関連する疾患の治療又は予防に使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
レヴィー小体の堆積と関連する疾患が、パーキンソン病、レヴィー小体型認知症及び多系統萎縮症の群から選択される、請求項３０に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
（ｉ）選択的作用剤がノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）であり、及び
（ｉｉ）標的分子はドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ又はドーパミン−β−ヒドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡである、
ノルアドレナリン作動性突起中におけるドーパミン欠乏と関連する疾患の治療又は予防に使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
（ｉ）選択的作用剤がノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）の群から選択され、及び
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）をコードするｍＲＮＡ又はノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）ポリペプチドである標的分子に特異的に結合することができる、
ノルアドレナリン作動性突起中におけるドーパミン欠乏と関連する疾患の治療又は予防に使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
ノルアドレナリン作動性突起中におけるドーパミン欠乏と関連する疾患が、認知症、鬱病及び神経変性性疾患と関連する記憶又は認識過程である、請求項３３に記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
（ｉ）選択的作用剤が、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）及びセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤からなる群から選択され、及び
（ｉｉ）標的分子がＢＡＸ又はＢＡＸをコードするｍＲＮＡである、
ニューロンのアポトーシス及び細胞死と関連する疾患の治療に使用する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
ニューロンのアポトーシス及び細胞死と関連する疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病及びハンチントン病、脳卒中／外傷、多発性及び筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、請求項３５に記載の使用のためのコンジュゲート。
【請求項３７】
（ｉ）選択的作用剤が、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）及びセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤からなる群から選択され、及び
（ｉｉ）標的分子がタウ又はタウをコードするｍＲＮＡである、
タウ関連疾患の治療又は予防に使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３８】
タウ関連疾患が、タウにおける異常と関連する疾患及びタウ障害の群から選択される、請求項３７に記載の使用のためのコンジュゲート。
【請求項３９】
タウ関連疾患が、第１７染色体遺伝子に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）を含む前頭側頭型認知症、進行性核上麻痺（ｐａｌｓｙ）、大脳皮質基底核変性症、ピック病、嗜銀性顆粒性疾患、並びにパーキンソン病、ダウン症候群、脳炎後パーキンソン症候群、筋緊張性ジストロフィー、ニーマンピックＣ病、ボクサー認知症、Ｂｌｉｎｔ疾患、プリオン疾患、筋萎縮性側索硬化症、グアムのパーキンソン症候群認知症複合、多発性硬化症、緑内障、糖尿病性網膜症、及び外傷性脳損傷；並びにハンチントン病、レヴィー小体型認知症、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性痙性対麻痺、及び多系統萎縮症からなる群から選択される、請求項３８に記載のコンジュゲート。
【請求項４０】
（ｉ）選択的作用剤が、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）及びセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤からなる群から選択され、及び
（ｉｉ）標的分子がハンチンチン又はハンチンチンをコードするｍＲＮＡである、
ハンチントン疾患の治療に使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項４１】
脳室内に又は鼻内に投与される、請求項４０に記載の使用のためのコンジュゲート。
【請求項４２】
（ｉ）１種又は複数種の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１種の選択的作用剤、及び
（ｉｉ）撮像剤
を含んでなるコンジュゲート。
【請求項４３】
撮像剤が磁気共鳴撮像造影剤である、請求項４２に記載のコンジュゲート。
【請求項４４】
磁気共鳴撮像造影剤がガドリニウム系化合物である、請求項４２又は４３に記載のコンジュゲート。
【請求項４５】
選択的作用剤が、請求項１３〜２６のいずれか１項に記載のものである、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項４６】
神経伝達物質輸送体を発現している細胞を撮像する方法であって、前記細胞を請求項４２〜４５のいずれか１項に記載のコンジュゲートと接触させることを含んでなり、コンジュゲートの一部を形成する選択的作用剤が前記細胞により発現される神経伝達物質輸送体に特異的に結合する、方法。
【請求項４７】
診断剤として使用するための、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項４８】
式（ＩＩ）の化合物：
【化９】
2013525330.tif 000131
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、水素及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｘ及びＹは、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＯＲａ及びＳＲｂから独立に選択され、ここでＲａ及びＲｂはＣ１〜Ｃ３アルキル及びＣ６〜Ｃ１０アリールから独立に選択され；
Ｒ６がカルボニル活性化基であり；
Ｗは、水素、ハロゲン、ＣＮ，ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＮＲｃＲｄ、ＳＯ２ＮＲｅＲｆ、ＮＲｇＳＯ２Ｒｈ、ＣＯ２Ｒｉから選択され、ここでＲｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ及びＲｉは水素及びＣ１〜Ｃ３アルキルから独立に選択され；
ｎ及びｐが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択される）を調製する方法であって、
ａ）式（ＩＩＩ）の化合物：
【化１０】
2013525330.tif 000132
と式（ＶＩＩ）のアシル化剤：
【化１１】
2013525330.tif 000133
（式中、ｐは上で定義した通りであり、Ｚはハロゲン又はＯＨであり、及びＰＧはアミン保護基である）
とを反応させて式（ＩＶ）の化合物：
【化１２】
2013525330.tif 000134
を得るステップと；
ｂ）式（ＩＶ）の化合物中のアミノ保護基を脱保護して式（Ｖ）の化合物：
【化１３】
2013525330.tif 000135
を得るステップと；
ｃ）式（Ｖ）の化合物と式（ＶＩＩＩ）又は（ＩＸ）のアシル化剤とを反応させて
【化１４】
2013525330.tif 000136
（式中、ｎは上で定義した通りであり、及びＺはハロゲン又はＯＨである）、式（ＶＩ）の化合物：
【化１５】
2013525330.tif 000137
を導くステップと；
ｄ）式（ＶＩ）の化合物をカルボニル活性化基で処理するステップと
を含んでなる、方法。
【請求項４９】
式（ＩＩ）の化合物と式（Ｘ）：
【化１６】
2013525330.tif 000138
（式中、Ｒ１〜Ｒ５、Ｘ、Ｙ、Ｗ、ｍ、ｎ及びｐは請求項４８で定義された通りである）
のアミノ改変オリゴヌクレオチドとを反応させて、請求項２５に記載の式（Ｉ）のコンジュゲートを得ることをさらに含んでなる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
オリゴヌクレオチドが配列番号：５および１２の群から選択される配列を含んでなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
（ｉ）式（ＩＩ）を有する化合物：
【化１７】
2013525330.tif 000139
（式中、Ｒ１〜Ｒ６、Ｘ、Ｙ、Ｗ、ｎ及びｐは、請求項４８で定義された通りである）；
（ｉｉ）式（ＩＶ）を有する化合物：
【化１８】
2013525330.tif 000140
（式中、Ｒ１〜Ｒ５、Ｘ、Ｙ、Ｗ、ｐ及びＰＧは請求項４８で定義された通りである）；
（ｉｉｉ）式（Ｖ）の化合物：
【化１９】
2013525330.tif 000141
（式中、Ｒ１〜Ｒ５、Ｘ、Ｙ、Ｗ及びｐは請求項４８で定義された通りである）；
（ｉｖ）式（ＶＩ）の化合物：
【化２０】
2013525330.tif 000142
（Ｒ１〜Ｒ５、Ｘ、Ｙ、Ｗ、ｐ及びｎは請求項４８で定義された通りである）
からなる群から選択される化合物。
【請求項５２】
（ｉ）構造：
【化２１】
2013525330.tif 000143
を有する化合物、
（ｉｉ）構造：
【化２２】
2013525330.tif 000144
を有する化合物、
（ｉｉｉ）構造：
【化２３】
2013525330.tif 000145
を有する化合物及び
（ｉｖ）構造：
【化２４】
2013525330.tif 000146
を有する化合物
の群から選択される、請求項５１に記載の化合物。
【請求項５３】
構造：
【化２５】
2013525330.tif 000147
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が水素及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｘ及びＹは、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＯＲａ及びＳＲｂから独立に選択され、ここでＲａ及びＲｂは、Ｃ１〜Ｃ３アルキル及びＣ６〜Ｃ１０アリールから独立に選択され；
Ｗは、水素、ハロゲン、ＣＮ，ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＮＲｃＲｄ、ＳＯ２ＮＲｅＲｆ、ＮＲｇＳＯ２Ｒｈ、ＣＯ２Ｒｉから選択され、ここでＲｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ及びＲｉは、水素及びＣ１〜Ｃ３アルキルから独立に選択され；
ｎ及びｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択される）を有するコンジュゲートの合成方法であって、
ａ）下式：
【化２６】
2013525330.tif 000148
の化合物と
式（Ｖ）のアシル化剤：
【化２７】
2013525330.tif 000149
（式中、ｐは上で定義した通りであり、Ｚはハロゲン又はＯＨであり、及びＰＧはアミン保護基である）
とを反応させて式（ＶＩ）の化合物：
【化２８】
2013525330.tif 000150
を得るステップと；
ｂ）式（ＶＩ）の化合物中のアミノ保護基を脱保護して式（ＶＩＩ）の化合物：
【化２９】
2013525330.tif 000151
を得るステップと；及び
ｃ）式（ＶＩＩ）の化合物と式（ＸＩＶ）のカルボキシ改変オリゴヌクレオチド：
【化３０】
2013525330.tif 000152
とを反応させるステップと
を含んでなる、方法。
【請求項５４】
式（ＸＩＶ）の化合物：
【化３１】
2013525330.tif 000153
（式中、
Ｒ１は、水素、低級アルキル基又はベンジル基であり；
Ｒ２は、水素、メチル、塩素又はフッ素基であり；
Ｒ２’は、水素、メチル、メトキシ、ヒドロキシル又はハロゲン原子であり；
Ｒ３及びＲ４は、水素、低級アルキル基を表し；
Ｒ５は、５−又は６−位における水素、塩素又はメトキシ基を表し；及び
ｐは２〜６である）
を調製する方法であって、
ａ）式（ＸＶＩ）の化合物：
【化３２】
2013525330.tif 000154
と式（Ｖ）のアシル化剤：
【化３３】
2013525330.tif 000155
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ４，Ｒ５及びｐは上で定義した通りであり、Ｚはハロゲン又はＯＨであり、ＰＧはアミン保護基である）
とを反応させて、式（ＸＶＩＩ）の化合物：
【化３４】
2013525330.tif 000156
を得るステップと；
ｂ）式（ＸＶＩＩ）の化合物中のアミノ保護基を脱保護して式（ＸＶＩＩＩ）の化合物：
【化３５】
2013525330.tif 000157
を得るステップと；
ｃ）上記の式（ＸＶＩＩＩ）の化合物と式（Ｘ）のアミノ改変オリゴヌクレオチド：
【化３６】
2013525330.tif 000158
とを反応させるステップと
を含んでなる、方法。
【請求項５５】
（ｉ）式（ＸＶＩＩ）を有する化合物：
【化３７】
2013525330.tif 000159
及び
（ｉｉ）式（ＸＶＩＩＩ）を有する化合物：
【化３８】
2013525330.tif 000160
からなる群から選択される化合物。
【請求項５６】
（ｉ）構造：
【化３９】
2013525330.tif 000161
を有する化合物
及び
（ｉｉ）構造：
【化４０】
2013525330.tif 000162
を有する化合物
の群から選択される、請求項５５に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関心のある標的に特異的な核酸と、該核酸を中枢神経系内の特異的細胞に送達することを、前記細胞の表面上の神経伝達物質輸送体分子に対する親和性により可能にする基とを含むコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の使用は、細胞の状態を変更するために効果的であることが証明されている。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）の細胞への導入は、細胞中の特定の遺伝子の発現を上方制御又は下方制御して、それにより、１つ又は複数の生化学的経路に強く影響するために使用することができる。細胞生理を変化させるために使用される核酸に基づく技法のなかで、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、種々の生物体において転写後のレベルで遺伝子の発現を調節することに与えられた総称である。ＲＮＡｉ遺伝子サイレンシングは、短い干渉性又は「ｓｉＲＮＡ」として知られている相同性の短い（２１〜２３ｂｐ）ｄｓＲＮＡ断片を使用して達成することができる。長いｄｓＲＮＡが細胞ラインに導入されると、それを細胞酵素のダイサーが短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子に切断するであろう。この短い干渉性ＲＮＡ分子は、現在ガイドＲＮＡと呼ばれている。ガイドＲＮＡはＲＮＡ誘発サイレンシング−コンプレックス（ＲＩＳＣ）を相同性の標的ｍＲＮＡに誘導するであろう。ひとたびそれが相同性ｍＲＮＡ配列とハイブリッド構造物を形成すれば、ＲＩＳＣはｍＲＮＡを切断するであろう。結果として、該ｍＲＮＡにコードされたタンパク質は、最早産生されず、それにより遺伝子のサイレンシングが起こる。ＲＮＡ干渉とは、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される動物における配列特異的転写後の遺伝子サイレンシングの過程を指す。
【０００３】
しかしながら、脳病理のためのＲＮＡｉに基づく治療手法の開発に対する主要な障害物は血液脳関門（ＢＢＢ）である。脳は、２つのバリアシステム：血液脳関門（ＢＢＢ）及び血液脳脊髄液関門（ＢＣＳＦＢ）の存在により毒性の可能性のある物質に対して遮蔽されている。ＢＢＢは、その表面積がＢＣＳＦＢより約５０００倍大きいので、血清リガンドの取り込みのための主要な経路であると考えられる。ＢＢＢを構成する脳内皮細胞は、ＣＮＳの多くの障害に対する可能性のある薬剤の使用に対する主要な障害物の代表である。一般原則として、小さい親油性分子のみがＢＢＢを越えて、即ち、全身を循環する血液から脳へ通過することができる。より大きいサイズ又はより高い疎水性を有する多くの薬剤が、ＣＮＳ障害を治療するための動物での研究で有望な結果を示す。
【０００４】
全身投与されるＲＮＡ干渉分子によりＣＮＳにおいて遺伝子サイレンシングを達成するために、直接脳内投与の他に色々な戦略が記載されている。例えば、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ、２００７、４４８：３９−４４）には、ｓｉＲＮＡとアルギニン九量体を含む狂犬病ウイルスの糖タンパク質から誘導されたペプチドとのコンジュゲート及び静脈注射後の脳中において遺伝子発現を抑制するそれらの能力が記載されている。Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，２４：２３０９−２３１６）には、ビオチン化ｓｉＲＮＡを含むコンジュゲート及び全身送達後に中枢神経系における遺伝子発現を抑制することができるアビジン−抗トランスフェリン受容体抗体を含むコンジュゲートが記載されている。国際公開第２００９７９７９０号には、ｓｉＲＮＡを含むコンジュゲート及び低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−１）を使用して受容体に媒介されるトランスサイトーシスにより血液脳関門を越えることができて、前記ペプチドを含む全身投与されたコンジュゲートのＣＮＳへの送達を可能にするＡｎｇｉｏｐｅｐｓとして一まとめにして知られる一連のペプチドが記載されている。国際公開第２００７１０７７８９号には、鼻内投与の使用により、ＣＮＳ中に存在する標的に特異的なＲＮＡ干渉及びＣＮＳへの送達を起こすことができる化合物の使用が記載されている。
【０００５】
しかしながら、これら全てのシステムは全身投与されたｓｉＲＮＡのＣＮＳへの送達を可能にするが、一方それらは脳内の特定のタイプの細胞への送達は可能でない。事実として、ＣＮＳ内の特異的タイプの細胞に対する治療剤の送達を可能にする送達システムは記載されたことがない。中枢神経系に特異性の知られたｓｉＲＮＡを送達する可能性は、所与の遺伝子の望ましくない活性／発現により引き起こされる、鬱病、認識障害、パーキンソン病、アルツハイマー病等を含む疾患の治療のために有用であろう。
【０００６】
鬱病は、中枢神経系の疾患と認識されている。鬱病は、心理学的、行動的及び生理学的レベルで顕在化した症状を伴う生物学的にも遺伝的にも多様な障害である。さらに、鬱病は、不安障害及び不安自体（典型的には予期不安）の高度の併発を示し、抑鬱性の患者に最も頻繁な症状の１つである。実際、大部分の不安障害も、抗鬱剤で治療される。
【０００７】
大鬱病の治療において最初に使用される薬剤は、イミプラミン型の三環式抗鬱剤（ＴＣＡ）及びモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）であった。これらの薬剤は、１９５０年代後期に発見されて有効なことが証明されたが、しかしそれらは多くの重篤な副作用を示し、それが、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）又は選択的セロトニン再取り込み阻害剤及びノルアドレナリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）などの新薬の開発をもたらした。
【０００８】
ＴＣＡ（及びその後、ＳＳＲＩ及びＳＮＲＩ）が、モノアミンセロトニン（５−ＨＴ）及びノルアドレナリン（ＮＡ）のシナプス前部の細胞への再取り込みを阻害し、シナプス間隙内における５−ＨＴのレベルを増大させて、それによりシナプス後部の受容体におけるそれらの活性を増強するという発見は、鬱病の病因の最初の仮説、即ち、鬱病は脳中におけるこれらのモノアミン作動性神経伝達物質システムの活性の不足により引き起こされるという仮説をもたらした。それ以来今まで、全ての市販された抗鬱薬剤は、セロトニン作動性及び／又はノルアドレナリン作動性輸送体又は受容体を標的としてきた。
【０００９】
５−ＨＴ受容体は、動物における神経細胞及び他のタイプの細胞の細胞膜上に位置する。５−ＨＴ３受容体を例外として、全ての他の５−ＨＴ受容体は、細胞内の第２のメッセンジャーカスケードを活性化する、Ｇタンパク質が結合した７つの膜貫通型（又はヘプタヘリカル）受容体である。同定された５−ＨＴ受容体の幾つかには、セロトニンニューロンのシナプス前部で発現した５−ＨＴ１Ａ（自己受容体）及びシナプス後部の５−ＨＴ神経末端にかけて位置するニューロン上で発現した５−ＨＴ１Ｂ／１Ｄ受容体（自己受容体）が含まれる。ＳＳＲＩの抗鬱効果と直接の関連がより大きい５−ＨＴ受容体は５−ＨＴ１Ａ受容体であった。
【００１０】
現在、新しい抗鬱薬剤が、比較的選択的なノルエピネフリン再取り込み阻害（ＮＡＲＩ）に基づく作用機構により登録されつつあり、例えばレボキセチン、又は二重遮断（ＳＮＲＩ）では、ベンラファキシン又はデュロキセチンなどである。ネファゾドン、トラゾドン又はミルタザピンなどの他の薬剤は、それらよりもモノアミン輸送体及びブロックモノアミン作動性受容体で弱い作用を有する。
【００１１】
しかしながら、ＳＳＲＩの商業的成功にも拘わらず、これらの化合物には２つの主要な限界がある：１）患者の６０％が治療に応答するのみである（ベースライン重症度の半分に軽減）、及び２）応答は、数週間の継続した治療の後にようやく現れる。これはシナプス前部のニューロンで起こる負のフィードバック機構に基づく。簡単に述べると、セロトニン再取り込みの遮断により誘発される高いセロトニンレベルは後部シナプスセロトニン受容体を活性化するだけでなく、シナプス前部の自己受容体も活性化して、それが細胞のためのフィードバックセンサとして役立つのであろう。５−ＨＴ又は選択的アゴニストによる５−ＨＴ１Ａ自己受容体（シナプス前部の５−ＨＴ１Ａ受容体又はシナプス前部の５−ＨＴ１ＡＲとも呼ばれる）の活性化は、細胞発火及びインパルス依存性５−ＨＴ放出を抑制するのに対して、５−ＨＴ１Ｂ受容体は末端レベルで５−ＨＴ合成及び放出を制御する。５−ＨＴ１Ａ及び５−ＨＴ１Ｂ受容体は両方とも、ニューロンシナプス後部から５−ＨＴ神経末端にも、主として皮質辺縁系領域に局在化している。セルトラリン（ＳＥＲＴ、ＳＳＲＩの１つ）の再取り込み遮断により産生された細胞外５−ＨＴの増加は、中脳縫線核中のシナプス前部の５−ＨＴ１Ａ受容体を活性化して、細胞発火及び末端放出を抑制し、再取り込み遮断により生じた細胞外５−ＨＴ増大を和らげる効果がある。５−ＨＴ１Ｂ自己受容体は局所レベルで同様な負のフィードバックを発揮する。ＳＳＲＩの反復投与に続いて、５−ＨＴ１Ａ自己受容体は脱感作して、それがセロトニン作動性ニューロンが細胞発火を回復し、細胞外５−ＨＴの増加を、単独治療後に見られるレベルより高いレベルにもたらす。脳組織のこれらの（ゆっくり進行する）神経生理学的適応は、通常数週間の連続したＳＳＲＩの使用が抗鬱効果が十分顕在化するのに必要である理由であるだけでなく、増大する不安が最初の２〜３日又は２〜３週間の使用における普通の副作用である理由である。５−ＨＴ１Ａ及び／又は５−ＨＴ１Ｂ受容体のアンタゴニストによるこれらの負のフィードバック機構の遮断は、ＳＳＲＩにより生ずる５−ＨＴ増加を強化して、それ故、ＳＳＲＩの臨床的効果を助長するために役立つ可能性があることが知られている。
【００１２】
ＳＳＲＩ投与中にシナプス前部の５−ＨＴ１Ａ受容体の作用を遮断することにより抗鬱応答を助長する薬理学的戦略が（±）ピンドロールを使用して試験された。この化合物は、５−ＨＴ１Ａ受容体に対する拮抗作用を推定されるβ１−２アドレナリン作用性の受容体アンタゴニストである。（±）ピンドロールは、中枢の５−ＨＴ１Ａ受容体の活性化により媒介される数種類の作用、例えば低体温又はホルモンの分泌などを弱めた。一般的に、ピンドロールのＳＳＲＩへの添加は抗鬱応答を助長する。しかしながら、ピンドロールは幾つかの研究で、臨床的用量でヒト脳中において５−ＨＴ１Ａ受容体の一部を占めることが示されているが、他の研究では低い占拠率が見出されている。それに加えて、５−ＨＴ１Ａ受容体はセロトニン作動性のニューロン上だけでなくシナプス後部ニューロンからセロトニン作動性のニューロンにかけても局在化していることを忘れるべきでない。実際、重要な懸念は、シナプス前部とシナプス後部の５−ＨＴ１Ａ受容体に対するこれらの作用剤の選択性の欠如である。即ち、シナプス後部の受容体の完全遮断は抗鬱剤により生じた前脳部５−ＨＴ１Ａ受容体を通る伝達の増大を打ち消す可能性がある。
【００１３】
したがって、抗鬱剤の開発においてなされた進歩にも拘わらず、シナプス前部の５−ＨＴ１Ａ受容体に特異的に作用する代替的化合物の必要性が未だに存在する。
【００１４】
パーキンソン病（ＰＤ）は、患者の運動機能、言語、及び他の機能を傷害するすることが多い中枢神経系の変性性障害である（Ｏｌａｎｏｗ）。パーキンソン病の症状は、黒質の緻密部領域（ＳＮｐｃ）中のドーパミン作動性細胞の活性が大きく低下した結果による（Ｏｌａｎｏｗ、Ｄａｗｓｏｎ）。これらのニューロンは、線条体に突き出しており、それらが減少すると、運動を調節する基底神経節内の神経回路の活性における変化、本質的には直接経路の阻害及び間接経路の励起が生ずる。直接経路は、運動を容易にし、間接経路は運動を阻害し、したがって、これらの細胞が減少すると運動低下症の運動障害が生ずる。ドーパミンの不足は視床の前方前核の阻害が増大する結果となり、それは運動野に興奮性突起を送り、その結果運動低下症が生ずる。
【００１５】
ＰＤは、ＳＮｐｃにおけるドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失及びレヴィー小体（ＬＢ）と称する細胞内封入体の存在により特徴づけられる。神経化学的に、ＰＤはミトコンドリアのコンプレックスＩの機能不全及び酸化ストレス指数の増大により特色づけられる。ＰＤについて、酸化ストレス及びニトロソ化ストレス、ミトコンドリアの機能不全、タンパク質の折り畳み異常及び凝集、及びアポトーシスを含む数通りの病理機構が提案されている。ＰＤは、大部分が散発性であるが、ＰＤの幾つかの症例は家族性であることが示されている。同定された最初の家族性ＰＤ遺伝子はα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）であり、それは実際に全てのＰＤ患者におけるＬＢの主要な成分である。α−シヌクレインの正常機能は十分にわかっていない。α−シヌクレインは、脂質に結合することができて、ニューロン中で、シナプス前部の小胞及びプラズマ膜と、おそらく脂質ラフトを通して結合している。α−シヌクレインの堆積した病理学的形態は凝集しており、正常タンパク質より低い溶解性を示す。３点変異が家族性ＰＤを引き起こすと記載されているが、ＳＮＣＡ遺伝子の重複及び三重複もＰＤ及びレヴィー小体病の原因であると報告されている。それ故、配列の変形がなくてさえ、α−シヌクレイン投与はレヴィー小体病の原因となり得る。
【００１６】
α−シヌクレインはミトコンドリアに影響して、おそらくアポトーシスを誘発する。事実として、α−シヌクレインと酸化的損傷との間の密接な関係に対する蓄積する証拠があり、即ち、変異体α−シヌクレインの過剰発現がニューロンを酸化ストレス及びドーパミン及びコンプレックスＩ阻害剤による損傷に敏感にして、その結果インビトロ及びインビボでタンパク質のカルボニル化及び脂質過酸化が増大する。逆に、ミトコンドリアのコンプレックスＩの機能不全がＰＤの散発性形態と関連していた。コンプレックスＩに依存する酸化的損傷及び欠陥のあるミトコンドリアの機能がＰＤにおけるニューロンの変性及び細胞死の主原因である。したがって損なわれたミトコンドリアの機能及びＲＯＳ産生によりミトコンドリアの膜間間隙中のチトクロームｃの貯留レベルが増加して、その急速な放出が、細胞死アゴニストのＢＡＸタンパク質が活性化されたときに可能になる。
【００１７】
まとめると、ＰＤにおけるシナリオは、一方でα−シヌクレイン蓄積を増加させて他方ではＢＡＸに媒介される細胞死を活性化するＲＯＳ産生増加を伴うニューロンのミトコンドリアの機能不全の状況であろう。さらに、α−シヌクレイン蓄積は、順送りで、細胞のＲＯＳ産生及びニューロンの変性の誘発を増強するであろう。
【００１８】
ＰＤのために最も広く使用される治療は、種々の形態のＬ−ドーパである。しかしながら、１〜５％のＬ−ドーパがドーパミン作動性ニューロンに入るにすぎない。残余のＬ−ドーパはしばしば他の箇所で代謝されてドーパミンになり、広範囲の副作用を惹起する。ドーパデカルボキシラーゼ阻害剤様のカルビドパ及びベンセラジドも、Ｌ−ドーパの代謝を、それがドーパミン作動性ニューロンに到達する前に防止するのでＰＤの治療のために使用されて、一般にカルビドパ／レボドパ及びベンセラジド／レボドパの配合製剤として与えられる。さらに、ドーパミンアゴニストは中程度に有効であり、ドーパミン受容体の一部を刺激することにより作用する。しかしながら、それらはドーパミン受容体が次第に感じにくくなり、それにより最終的に症状が進む原因になる。
【００１９】
アンチセンスの手法も役に立つ可能性があり、ラット及びマウスの脳で作用すると報告されている。この手法は、α−シヌクレインは本当はヒトにおけるＣＮＳ機能にとってなくても済むという発想に基づいており、それはマウスにおいてそのように思われるからであるが、多分タンパク質レベルにおける控えめな減少でさえＰＤ進行を遅らせるのに十分である。
【００２０】
しかしながら、ＰＤ療法の開発においてなされた進歩にも拘わらず、黒質の緻密部領域中のドーパミン作動性細胞の活性低下を特異的に防止することができる代替的化合物の必要性が未だ存在する。
【００２１】
中脳皮質及び中脳辺縁系のドーパミン（ＤＡ）系は統合失調症を含む多くの精神医学的障害において決定的な役割を演じる。統合失調症における脳のドーパミン作動性神経伝達の一般的な増強は薬理学的証拠により示唆された（Ｓｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，１９７５；Ｃｒｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ，１９７６）。しかしながら、最新の見解は、低活動中脳皮質と一緒に皮質下のＤＡ伝達が機能亢進することを示す。陽性（精神病性）症状を治療する古典的（ＤＡＤ２受容体アンタゴニスト）及び非定型抗精神病薬（ＡＰＤ、ＤＡＤ２受容体アンタゴニストに対する優先的５−ＨＴ２Ａ／２Ｃ）の全体的有効性は同様である。対照的に、後者の群の幾つかの作用剤、特にクロザピンは、陰性症状及び認識障害を治療するために古典的抗精神病薬に勝る。この臨床的特徴は、少なくとも一部は、中脳皮質経路におけるＤＡ放出を増加させる能力、非定型の古典的でない抗精神病薬により誘発される効果と関連していた。実際、最適の前頭前野のＤＡ機能は作業記憶及び実行機能にとって決定的である。
【００２２】
中脳皮質におけるＤＡ放出及び中脳辺縁系のＤＡ経路は、数種の要因により制御される。第一に、それはＶＴＡ  ＤＡニューロンの発火様式（持続性／一過性）に依存する。第２に、それは細胞発火及びＤＡ放出を制御する細胞体樹状突起の及び末端Ｄ２／３自己受容体の活性化によりしっかり調節される。最後に、ＤＡ輸送体（ＤＡＴ）に媒介される再取り込みは、細胞外ＤＡ濃度の減衰動力学を決定する決めての機構の１つである。以前の研究でＰＦＣ及び線条体中におけるＤＡＴの異なった密度が示されている。
【００２３】
さらに、ノルアドレナリン（ＮＡ）軸索は、ＮＡ輸送体（ＮＡＴ）がＮＡ及びＤＡに対する同様な親和性を示すので、細胞外脳空間からＤＡを除去することに役立ち得る。したがって、ＮＡＴ阻害剤は、尾状核及び核側坐核（ＮＡｃ）よりも内側のＰＦＣ（ｍＰＦＣ）における細胞外ＤＡ濃度を優先的に上昇させる。したがって、青斑核（ＬＣ）ニューロンからのＮＡ軸索はＰＦＣ中の細胞外ＤＡ濃度を、ＤＡを取り込むか又は共放出することにより調節することに役立ち得る。幾人かの研究者は、ＮＡを標的として中脳皮質ＤＡ伝達を選択的に増強する薬剤（ＮＡＴ阻害剤に加えてα２−アドレナリン作用性のアンタゴニスト）に基づく新しい組合せ治療の効果を示している。
【００２４】
しかしながら、中脳皮質のＤＡ伝達を増強することができる化合物に対する必要性が未だ存在する。
【発明の概要】
【００２５】
本発明者らは、所与の標的遺伝子に特異的な核酸及び神経伝達物質輸送体の選択的阻害剤を含有する核酸構築物を開発した。これらの構築物は、関心のある核酸を神経伝達物質輸送体を発現する細胞の内部に送達するために特に有用であることが示されている。如何なる理論にも拘束されることは望まず、神経伝達物質輸送体の阻害剤が、輸送体が発現している細胞の表面における対応する神経伝達物質輸送体に結合して、それが順送りで核酸阻害剤のコンプレックスを細胞内部に移動させるであろうと考えられる。したがって、本発明の実施例３に例示したように、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体に特異的なｓｉＲＮＡ及び特異的セロトニン輸送体阻害剤（セルトラリン）を含む構造物の投与は、８−ＯＨ−ＤＰＡＴ（セロトニン作動性のシグナル伝達の尺度）に対する応答において５−ＨＴ１Ａ受容体のｍＲＮＡの減少及び非コンジュゲートのｓｉＲＮＡで得られるよりもはるかに高度の低体温応答欠如を生ずる。
【００２６】
当業者は、本発明はセロトニン作動性のニューロンに送達するためのコンジュゲートに限定されないことを理解するであろう。反対に、本発明において提供される結果は、ニューロンにより神経伝達物質を輸送するのに使用される機構が、前記神経伝達物質輸送体に対する親和性を示す分子に結合した低分子の細胞への送達を促進する適切な手段であることを例示する。
【００２７】
したがって、第１の態様において、本発明は
（ｉ）１種又は複数種の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１種の選択的作用剤、及び
（ｉｉ）神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現する標的分子に特異的に結合することができる少なくとも１種の核酸
を含むコンジュゲートに関する。
【００２８】
第２の態様において、本発明は、医薬で使用するための本発明のコンジュゲートに関する。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）選択的作用剤が選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）の群から選択され、且つ
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、セロトニン受容体の１Ａ型（５−ＨＴ１Ａ）をコードするｍＲＮＡ又はセロトニン輸送体（５−ＨＨＴ輸送体又はＳＥＲＴ）をコードするｍＲＮＡ又はセロトニン受容体の１Ｂ型（５−ＨＴ１Ｂ）をコードするｍＲＮＡ又はＴＲＥＫ−１カリウムチャンネル若しくはＧｉｒ−ＫカリウムチャンネルをコードするｍＲＮＡの群から選択される標的分子に特異的に結合することができる、
鬱病関連障害の治療又は予防に使用するため本発明のコンジュゲートに関する。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）選択的作用剤が、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）又はノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）又はセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＳＮＤＲＩ又はトリプルブロッカー）の群から選択され、且つ
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、α−シヌクレインをコードするｍＲＮＡである標的分子に特異的に結合することができる、
神経伝達物質小胞の機能障害及びレヴィー小体の堆積と関連する疾患の治療又は予防に使用するための本発明のコンジュゲートに関する。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）選択的作用剤がドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）又はノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）又はセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＳＮＤＲＩ又はトリプルブロッカー）の群から選択され、且つ
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、ＢＡＸをコードするｍＲＮＡである標的分子に特異的に結合することができる、
ニューロンのアポトーシス及び細胞死に関連する疾患（即ちパーキンソン及びアルツハイマー）の治療又は予防において使用するための本発明のコンジュゲートに関する。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）選択的作用剤がノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）の群から選択され、且つ
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、ドーパミンβヒドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡ又はノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）又はドーパミンβヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするｍＲＮＡである標的分子に特異的に結合することができる、
認知症、鬱病及び神経変性性疾患と関連する記憶及び認識過程のようなノルアドレナリン作動性突起様中におけるドーパミン欠乏と関連する疾患の治療又は予防に使用するための本発明のコンジュゲートに関する。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）選択的作用剤がノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）の群から選択され、且つ
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）又はノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡである標的分子に特異的に結合することができる、
認知症、鬱病及び神経変性性疾患と関連する記憶及び認識過程のようなノルアドレナリン作動性突起中におけるドーパミン欠乏と関連する疾患の治療又は予防に使用するための本発明のコンジュゲートに関する。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）選択的作用剤が、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）又はノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）又はセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＳＮＤＲＩ又はトリプルブロッカー）の群から選択され、且つ
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、タウ（Ｔａｕ）をコードするｍＲＮＡである標的分子に特異的に結合することができる、
アルツハイマーのようにタウタンパク質における変異による神経変性と関連する疾患の治療又は予防に使用するための本発明のコンジュゲートに関する。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）選択的作用剤が、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）又はノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）又はセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＳＮＤＲＩ又はトリプルブロッカー）の群から選択され、且つ
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、ハンチンチンをコードするｍＲＮＡである標的分子に特異的に結合することができる、
ハンチンチンの変化した（遺伝子内重複）発現の蓄積により生じた神経変性性疾患の治療又は予防に使用するための本発明のコンジュゲートに関する。
【００３６】
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）選択的作用剤が、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）の群から選択され、且つ
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、ドーパミンβヒドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡ又はノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）をコードするｍＲＮＡである標的分子に特異的に結合することができる、
認知症、鬱病及び神経変性性疾患と関連する記憶及び認識過程のようにノルアドレナリン作動性突起中のドーパミン欠乏と関連する疾患の治療又は予防に使用するための本発明のコンジュゲートに関する。
【００３７】
他の態様において、本発明は、
（ｉ）１種又は複数種の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１種の選択的作用剤、及び
（ｉｉ）造影剤又は標識剤
を含むコンジュゲートに関する。
【００３８】
さらに他の態様において、本発明は、診断剤として使用するための標識剤の造影剤を含むコンジュゲートに関する。
【００３９】
本発明のこれらの及び他の目的を、以下の詳細な説明の節においてさらに詳述するが、それらにより本発明を限定することは意図しない。特に断らない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により共通的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと同様な又は等価な方法及び材料は、本発明の実施に使用することができる。説明及び請求項を通じて、用語「含む」及びその変形は、他の技術的特徴、添加剤、成分、又はステップを排除することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】シナプス前部の５−ＨＴ１ＡＲ活性の機能測定の例として、５−ＨＴ１ＡＲを標的とするｓｉＲＮＡ（裸出又はコンジュゲート）を背側の縫線核（ＤＲＮ）に局所的に入れられたマウスにおける、（Ｒ）−（＋）−８−ヒドロキシ−２−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）テトラリン臭化水素酸塩（８−ＯＨ−ＤＰＡＴ、選択的５−ＨＴ１ＡＲアゴニスト）により誘発される低体温応答の不在を示す。マウスに：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）ナンセンス裸出 （naked）ｓｉＲＮＡ（ｎｓ裸出ｓｉＲＮＡ）、ｉｉｉ）ナンセンスＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）、ｉｖ）裸出５−ＨＴ１ＡＲ−ｓｉＲＮＡ、又はｖ）５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（ＤＲＮ中に０．３μｇ／１μｌ／２日）を与えた。５−ＨＴ１ＡＲノックアウト（５−ＨＴ１ＡＲ−ＫＯ）マウスの追加群も評価した。体温を８−ＯＨ−ＤＰＡＴ投与（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）の５分前並びに１５、３０、６０及び１２０分後に測定した。値は群当たり５〜７匹のマウスから体温における変化の平均±ＳＥＭとして示す。要因と時間との間で対象者内変量として処理して、反復測定分散分析を使用し、続いて多重比較Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行い、＊＊ｐ＜０．０１でビヒクル、ｎｓ裸出ｓｉＲＮＡ、ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡとそれぞれ有意の差があった。
【図２】５−ＨＴ１ＡＲを標的とする−ｓｉＲＮＡ（裸出又はコンジュゲート）の背側の縫線核（ＤＲＮ）への局所注射が５−ＨＴ１ＡＲタンパク質レベルの特異的ノックダウンを誘発したことを示す。マウスには：（ｉ）ビヒクル、ｉｉ）ナンセンス裸出ｓｉＲＮＡ（ｎｓ裸出ｓｉＲＮＡ）、ｉｉｉ）ナンセンスＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）、ｉｖ）裸出５−ＨＴ１ＡＲ−ｓｉＲＮＡ、又はｖ）５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（ＤＲＮ中に０．３μｇ／１μｌ／２日）の注射した。棒はマウスのＤＲＮ中の５−ＨＴ１ＡＲに結合している［３Ｈ］−８−ＯＨ−ＤＰＡＴのデンシトメトリーによる定量を示し、５−ＨＴ１ＡＲ（ｆｍｏｌ／ｍｇ組織タンパク質）の平均±ＳＥＭとして表した（１群当たり４ないし５匹の動物で１匹の動物当たりの背側縫線核の３ＡＰレベルで２回観察）。一元配置分散分析を使用し次にＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定を行い、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で、ビヒクル、ｎｓ裸出ｓｉＲＮＡ及びｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡと有意の差があった。
【図３】５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）投与による選択的５−ＨＴ１Ａ自己受容体サイレンシングを示す。Ａ）縫線核における５−ＨＴ１ＡＲ発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成により観察評価した。マウスは背側第三脳室（Ｄ３Ｖ）中に以下の単回投与を受けた：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）ナンセンス裸出ｓｉＲＮＡ（ｎｓ裸出ｓｉＲＮＡ）、ｉｉｉ）ナンセンスＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）、ｉｖ）裸出５−ＨＴ１ＡＲ−ｓｉＲＮＡ又はｖ）５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（３０μｇ／２．５μｌ／１日）。ａ１〜ａ５５５は３３Ｐ標識オリゴヌクレオチドの結合したマウスの縫線核の冠状切片を３つの異なる前後方向（ＡＰ）座標で示す（ｍｍ）：十字縫合から−４．８４／−４．９６、−４．３６／−４．６０及び−４．２４／−４．３６（左から右へ尾から頭へ）。尺度のバー：２ｍｍ。Ｂ）ａ１１１〜ａ５５５に示した切片の高倍率拡大。尺度のバー：５００μｍ。Ｃ）５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡが背側の縫線核において５−ＨＴ１ＡＲｍＲＮＡレベルの低下を誘発したことを示す棒グラフ。フィルムで測定した５−ＨＴ１ＡＲｍＲＮＡ陽性のグレインのデンシトメトリーによる定量を平均光学密度（ＯＤ）（％）±ＳＥＭとして示す（群当たりｎ＝４〜５匹のマウス及び背側の縫線核の３ＡＰレベルで２ないし４回観察）。一元配置分散分析を使用し次にＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定を行い、＊＊ｐ＜０．０１でビヒクル、ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ及び裸出５−ＨＴ１ＡＲ−ｓｉＲＮＡと有意の差があった。
【図４】５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡは、シナプス前部の部位で５−ＨＴ１ＡＲの特異的ノックダウンを誘発したが、シナプス後部の部位では誘発しなかったことを示す。背側の縫線核（Ａ）、前頭前野の皮質（Ｂ）及び海馬（Ｃ）における５−ＨＴ１ＡＲタンパク質レベルを３［Ｈ］−８−ＯＨ−ＤＰＡＴを使用してオートラジオグラフィー結合により観察評価した。マウスは背側の３脳室（Ｄ３Ｖ）中に以下の単回投与を受けた：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）ナンセンス裸出ｓｉＲＮＡ（ｎｓ裸出ｓｉＲＮＡ）、ｉｉｉ）ナンセンスＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）、ｉｖ）裸出５−ＨＴ１ＡＲ−ｓｉＲＮＡ又はｖ）５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（３０μｇ／２．５μｌ／１日）。棒は５−ＨＴ１ＡＲの平均（ｆｍｏｌ／ｍｇ組織タンパク質）±ＳＥＭを示す（群当たりｎ＝４〜５匹のマウス及び背側の縫線核の３ＡＰレベルで２回観察及び前頭前野の皮質及び海馬の左及び右の部位で２回観察）。一元配置分散分析を使用し次にＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定を行い、＊ｐ＜０．０５で全ての他の処置と有意の差があった。
【図５】背側の縫線核におけるセロトニン−５−ＨＴ輸送体（５−ＨＴＴ）及び５−ＨＴ１Ｂ受容体（５−ＨＴ１ＢＲ）結合レベルは５−ＨＴ１ＡＲ−ｓｉＲＮＡ治療により変化しなかったことを示す。Ａ）背側の縫線核における５−ＨＴＴタンパク質レベルを、３［Ｈ］−シタロプラムを使用してオートラジオグラフィー結合により観察評価した。Ｂ）背側の縫線核における５−ＨＴ１ＢＲタンパク質レベルを、β−アドレナリン作用部位を遮断するイソプレナリンの存在下で１２５［Ｉ］シアノピンドロールを使用してオートグラフィー結合により評価した。マウスは背側の３脳室（Ｄ３Ｖ）中に以下の単回投与を受けた：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）ナンセンス裸出ｓｉＲＮＡ（ｎｓ裸出ｓｉＲＮＡ）、ｉｉｉ）ナンセンスＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）、ｉｖ）裸出５−ＨＴ１ＡＲ−ｓｉＲＮＡ又はｖ）５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（３０μｇ／２．５μｌ／１日）。棒グラフは：Ａ）平均５−ＨＴＴｆｍｏｌ／ｍｇ組織タンパク質±ＳＥＭ及び、Ｂ）平均光学密度（ＯＤ）（％）±ＳＥＭ（群当たりｎ＝４匹のマウス及び背側の縫線核の３ＡＰレベルで２回観察）を示す。
【図６】シナプス前部の５−ＨＴ１ＡＲ活性の機能測定として、（Ｒ）−（＋）−８−ヒドロキシ−２−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）テトラリン臭化水素酸塩（８−ＯＨ−ＤＰＡＴ、選択的５−ＨＴ１ＡＲアゴニスト）により誘発された低体温応答を示す。マウスは、背側の３脳室（Ｄ３Ｖ）中に以下の単回投与を受けた：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）ナンセンス裸出ｓｉＲＮＡ（ｎｓ裸出ｓｉＲＮＡ）、ｉｉｉ）ナンセンスＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）、ｉｖ）裸出５−ＨＴ１ＡＲ−ｓｉＲＮＡ又はｖ）５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（３０μｇ／２．５μｌ／１日）。５−ＨＴ１ＡＲノックアウト（５−ＨＴ１ＡＲ−ＫＯ）マウスの追加群も評価した。体温を８−ＯＨ−ＤＰＡＴ投与（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）の５分前及び１５、３０、６０及び１２０分後に測定評価した。５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート及び５−ＨＴ１ＡＲ−ＫＯマウスにおける体温に対して８−ＯＨ−ＤＰＡＴは効果がないことに注目されたい。表示値は群当たり７〜１０匹のマウスから体温の変化の平均±ＳＥＭとして示す。要因と時間との間で対象者内変量として処理して、反復測定分散分析を使用し、続いて多重比較Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行い、＊＊ｐ＜０．０１で、それぞれビヒクル、ｎｓ裸出ｓｉＲＮＡ、ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ及び裸出５−ＨＴ１ＡＲ−ｓｉＲＮＡと有意の差があった。
【図７】マウスの内側前頭前野の皮質（ｍＰＦＣ）における透析液の５−ＨＴレベルに対する（Ｒ）−（＋）−８−ヒドロキシ−２−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）テトラリン臭化水素酸塩の全身投与（８−ＯＨ−ＤＰＡＴ、０．５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）の効果を示す。マウスの群は以下の通りであった：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）ナンセンスＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）、ｉｉｉ）５−ＨＴ１ＡＲを標的とするＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）及びｉｖ）５−ＨＴ１ＡＲノックアウトマウス（５−ＨＴ１ＡＲ−ＫＯ）。マウスにビヒクル又はｓｉＲＮＡを３０μｇ／２．５μｌ／１日、ｉ．ｃ．ｖで注入し、微小透析実験を注入の２４〜４８時間後に実施した。５−ＨＴ１Ａ自己受容体ノックダウン及び５−ＨＴ１ＡＲノックアウトマウスのｍＰＦＣにおける５−ＨＴレベル低下に対して８−ＯＨ−ＤＰＡＴ効果のないことに注目されたい。データはベースラインのパーセンテージで表し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５〜９匹のマウス／群）で示す。要因と時間との間で対象者内変量として処理して、反復測定分散分析を使用し、続いて多重比較Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行い、＊＊ｐ＜０．０１でビヒクル及びｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ群で有意の差があった。
【図８】５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの５−ＨＴニューロンへの送達に対するセルトラリン（セロトニン輸送体−５−ＨＴＴの選択的阻害剤）の効果を示す。Ａ）セルトラリンの急性注射（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）は５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートによる５−ＨＴ１Ａ自己受容体のサイレンシングを防止し、８−ＯＨＤＰＡＴの急性投与（選択的５−ＨＴ１ＡＲアゴニスト、０．５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）は内側前頭前野の皮質における５−ＨＴレベルを低下させた。マウスの群は以下の通りであった：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）ナンセンスＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）、ｉｉｉ）５−ＨＴ１ＡＲを標的とするＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）及びｉｖ）５−ＨＴ１ＡＲノックアウト（５−ＨＴ１ＡＲ−ＫＯ）。マウスは、５−ＨＴＴ阻害剤、セルトラリン（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）の急性注射をｓｉＲＮＡのＤ３Ｖへの注入（３０μｇ／２．５μｌ／１日、ｉ．ｃ．ｖ．）の３時間前に受けた。それに加えて、マウスの１群にはビヒクルｉ．ｐ及びＤ３Ｖ中へのビヒクルを与えた。微小透析実験はｉ．ｃ．ｖ．でビヒクル又はｓｉＲＮＡ投与の２４時間後に実施した。データはベースラインのパーセンテージで表し、平均±ＳＥＭを示す（ｎ＝５〜８マウス／群）。一元配置分散分析を使用し、次に多重比較Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行って、＊＊＊ｐ＜０．００１で対照と５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ群とで有意の差があった。Ｂ）選択的５−ＨＴＴ阻害剤セルトラリン（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で予め処置したＮＬＦ−ｓｉＲＮＡマウスにおける体温に対する８−ＯＨ−ＤＰＡＴ投与（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）の効果を示す。マウス群はパネルＡと同様であった。５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ群とは異なり、８−ＯＨ−ＤＰＡＴ投与は、セルトラリンで前処置した５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡマウスにおいて低体温応答を生じた。表示値は群当たり６〜１０匹のマウスから体温変化の平均±ＳＥＭで示す。２元配置分散分析を使用して次に多重比較Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行い、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図９】フルオキセチンの急性投与（セロトニン輸送体−５−ＨＴＴの選択的阻害剤、２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）のマウスの内側前頭前野の皮質（ｍＰＦＣ）における透析液５−ＨＴレベルに対する効果を示す。マウスの群は以下の通りであった：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）ナンセンスＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）、ｉｉｉ）５−ＨＴ１ＡＲを標的とするＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）及びｉｖ）５−ＨＴ１ＡＲノックアウト（５−ＨＴ１ＡＲ−ＫＯ）。マウスにビヒクル又はｓｉＲＮＡを３０μｇ／２．５μｌ／１日、ｉ．ｃ．ｖを注入して、微小透析実験を注入の２４〜４８時間後に実施した。５−ＨＴ１ＡＲ−ＫＯマウスにおける場合と同様な、フルオキセチンの、５−ＨＴ１Ａ自己受容体ノックダウンマウスのｍＰＦＣにおける５−ＨＴレベルに対する増大した効果に注目されたい。データは、ベースラインのパーセンテージで表し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４−６マウス／群）で示す。要因と時間との間で対象者内変量として処理して、反復測定分散分析を使用し、続いて多重比較Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行い、＊＊ｐ＜０．０１で、ビヒクル及びｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ群と有意の差があった。
【図１０】５−ＨＴ１Ａ自己受容体ノックダウンマウスにおいて、不安様の挙動に変化はないが、ストレス／鬱病関連検査で変化した応答があったことを示す。マウス群は以下の通りであった：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）５−ＨＴ１ＡＲを標的とするＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）及びｉｉｉ）５−ＨＴ１ＡＲノックアウト（５−ＨＴ１ＡＲ−ＫＯ）。マウスは、Ｄ３Ｖ中にビヒクル又はｓｉＲＮＡを３０μｇ／２．５μｌ／１日、ｉ．ｃ．ｖで注入した。Ａ）不安様挙動を高架式十字迷路法を使用してビヒクル又はｓｉＲＮＡ投与の２４時間後に評価した。５−ＨＴ１ＡＲノックアウトマウス（５−ＨＴ１ＡＲ−ＫＯ）と異なって、５−ＨＴ１Ａ自己受容体ノックダウンマウス（５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）は、高架式十字迷路の開放枝道に入る回数及びそこで過ごす時間に差を示さなかった。Ｂ）尾懸垂試験法は急性ストレス／鬱病状態における応答を評価するために選んだ典型であった。この試験をビヒクル又はｓｉＲＮＡ投与の４８時間後に観察評価した。５−ＨＴ１Ａ自己受容体ノックダウン及び５−ＨＴ１ＡＲ−ＫＯマウスは、ストレスに満ちた状態にあるビヒクル群と比較して増加した運動を示した。表示値は平均±ＳＥＭである（ｎ＝１２〜１８匹のマウス／群）。一元配置分散分析を使用し次にＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定を行って、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１で、ビヒクルと有意の差があった。
【図１１】５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの鼻内投与による選択的５−ＨＴ１Ａ自己受容体サイレンシングを示す。マウスは以下の単回鼻内投与を受けた：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）ナンセンスＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）及びｉｉｉ）５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（各鼻孔中に１５μｇ／５μｌ）。Ａ）背側の縫線核（ＤＲＮ）における５−ＨＴ１ＡＲ発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成により観察評価した。棒グラフは５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡがＤＲＮにおける５−ＨＴ１ＡＲｍＲＮＡレベルの低下を誘発したことを示す。フィルムで測定した５−ＨＴ１ＡＲｍＲＮＡ陽性グレインのデンシトメトリーによる定量を平均光学密度（ＯＤ）（％）±ＳＥＭで示す（群当たりｎ＝４匹のマウス及びＤＲＮの３ＡＰレベルで２回観察）。Ｂ〜Ｄ）５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡはシナプス前部における５−ＨＴ１ＡＲの特異的ノックダウンを誘発したが、シナプス後部の部位では誘発しなかった。背側の縫線核（Ｂ）、前頭前野の皮質（Ｃ）及び海馬（Ｄ）における５−ＨＴ１ＡＲタンパク質レベルは３［Ｈ］−８−ＯＨ−ＤＰＡＴを使用してオートラジオグラフィー結合により観察評価した。棒は５−ＨＴ１ＡＲ（ｆｍｏｌ／ｍｇ組織タンパク質）の平均±ＳＥＭを表す（群当たりｎ＝４匹のマウス、及びＤＲＮの３ＡＰレベルで２回観察及び前頭前野皮質及び海馬の左及び右の部位で２回観察）。一元配置分散分析を使用し次にＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定を行い、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で、ビヒクル及びｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡと有意の差があった。
【図１２】５−ＨＴ１Ａ自己受容体ノックダウンマウスにおける生理学的及び神経化学的パラメーターに対する８−ＯＨ−ＤＰＡＴ（選択的５−ＨＴ１ＡＲアゴニスト）の効果はないことを示す。マウスの群は以下の単回鼻内投与を受けた：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）ナンセンスＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）及びｉｉｉ）５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（各鼻孔中に１５μｇ／５μｌ）。Ａ）ビヒクル及びｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ処置マウスと異なって、１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．用量の８−ＯＨ−ＤＰＡＴは、５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡマウスにおいて体温にいかなる変化も生じなかった。表示値は体温変化の平均±ＳＥＭで示す（群当たりｎ＝４〜７匹のマウス）。Ｂ）８−ＯＨ−ＤＰＡＴの全身投与（０．５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）後に、ビヒクル、ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ及び５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡマウスのｍＰＦＣにおけるインビボ微小透析により測定した細胞外５−ＨＴレベルを示す。５−ＨＴレベルはｍＰＦＣにおいてビヒクル及びｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの両方で低下した。しかしながら、５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡマウスは、ｍＰＦＣにおける５−ＨＴレベルに対して８−ＯＨ−ＤＰＡＴの効果がないことを示した。データはベースラインのパーセンテージで表し、平均±ＳＥＭで示す（ｎ＝４〜９匹のマウス／群）。それぞれ１元又は２元配置の分散分析を使用し次に多重比較Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行って、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１で、ビヒクル及びｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡと有意の差があった。
【図１３】鼻内５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡは、５−ＨＴ１Ａ−自己受容体遺伝子の発現を抑制し、抗鬱様応答を誘起する。マウスは以下の単回鼻内投与を受けた：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（各鼻孔中に１５μｇ／５μｌ）及びｉｉｉ）５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（各鼻孔中に５０μｇ／５μｌ）。Ａ）いかなる用量の５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡも高架式十字迷路法における不安様応答に影響しなかった（ｎ＝６）。表示値は平均±ＳＥＭである。Ｂ）５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの単回鼻内投与（３０又は１００μｇ）は尾懸垂試験法における用量依存性の無動状態減少を誘起した（ｎ＝１０〜１５）。表示値は平均±ＳＥＭである。一元配置分散分析は群の有意の効果を示した、Ｆ２，３４＝８．７０、ｐ＜０．００１。ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｃ）５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの単回鼻内投与（１００μｇ）は、強制水泳試験において無動状態の減少を誘起した（ｎ＝１３〜１６）。表示値は平均±ＳＥＭである。一元配置分散分析は、ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で群の有意の効果を示した。
【図１４】５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの鼻内投与による特異的５−ＨＴ輸送体（５−ＨＴＴ）のサイレンシングを示す。Ａ）背側の縫線核（ＤＲ）における５−ＨＴＴ発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成により観察評価した。マウスは以下の単回投与を受けた：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）各鼻孔中に５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡを５μｇ／５μｌ（５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ  １０）及び、ｉｉｉ）各鼻孔中に５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡを１５μｇ／５μｌ（５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ  ３０）。ａ１−ａ３３３は、マウスの縫線核の３３Ｐ標識５−ＨＴＴ特異的オリゴヌクレオチドが結合した冠状切片を異なる前後３方向（ＡＰ）の座標で示す（ｍｍ）：十字縫合から４．２４／−４．３６、−４．３６／−４．６０及び−４．７２／−４．８４（左から右へ頭部から尾側）。尺度のバー：５００μｍ。Ｂ）棒グラフは５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡが背側の縫線核において５−ＨＴＴｍＲＮＡレベルの低下を誘発したことを示す。フィルムで測定した５−ＨＴＴｍＲＮＡ陽性グレインのデンシトメトリーによる定量を光学密度（ＯＤ）の平均値（％）±ＳＥＭで示す（群当たりｎ＝４匹のマウス及び背側の縫線核の３ＡＰレベルで２ないし４回観察）。一元配置分散分析を使用し次にＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定を行って、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１でビヒクルと有意の差がある。
【図１５】ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成及びオートグラフィー結合により評価した、５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡに誘発されたセロトニン輸送体の特異的ノックダウンを示す。マウスは、以下の単回投与を受けた：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）各鼻孔中にナンセンス−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡを１５μｇ／５μｌ、ｉｉｉ）各鼻孔中に５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡを５μｇ／５μｌ（各鼻孔中に５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ  １０）及び、ｉｖ）各鼻孔中に５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡを１５μｇ／５μｌ（５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ  ３０）。Ａ）棒グラフは、５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡが、背側（ＤＲ）及び中位の（ＭｎＲ）縫線核において５−ＨＴＴｍＲＮＡレベルの低下を誘発したことを示す。フィルムで測定した５−ＨＴＴｍＲＮＡ陽性グレインのデンシトメトリーによる定量を平均光学密度（ＯＤ）の値（％）±ＳＥＭで示す（群当たりｎ＝７〜１０匹のマウス）。一元配置分散分析を使用し次にＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定を行って、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１で、同じ領域においてビヒクル及びナンセンス−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡと有意の差がある。Ｂ〜Ｃ）各領域においてＮＬＦ−ｓｉＲＮＡにより誘発された５−ＨＴＴ下方制御の程度を例示するために、特異的５−ＨＴＴ結合のデンシトメトリーによる分析を、ビヒクル注入マウスの対応する領域における結合率（％）で示す。棒は６〜９匹のマウス／群の平均±ＳＥＭを表す）。一元配置分散分析を使用し次にＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定を行って、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で、同じ領域においてビヒクル及びナンセンス−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡと有意の差がある。
【図１６】Ａ）フルオキセチン（５−ＨＴ輸送体の選択的阻害剤、２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）の急性投与のマウスの背側の線条体における透析液５−ＨＴレベルに対する効果を示す。マウスは、以下の単回投与を受けた：ｉ）ビヒクル、ｉｉ）各鼻孔中に５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡを５μｇ／５μｌ（５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ  １０）及び、ｉｉｉ）各鼻孔中に５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡを１５μｇ／５μｌ（５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ  ３０）。微小透析実験は、適用の２４〜４８時間後に実施した。フルオキセチンはビヒクル群の背側の線条体における上昇した５−ＨＴレベルを生じたが、５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ群では生じなかった。Ｂ）選択的５−ＨＴ輸送体阻害剤、シタロプラム（Ｃｉｔ）の、ビヒクル及び５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉｒＲＮＡマウスの背側の線条体における５−ＨＴレベルに対する局所的効果を示す。シタロプラムの局所投与は、ビヒクル群の背側の線条体において５−ＨＴレベルを濃度依存性様式で上昇させた。しかしながら、僅か５０μＭのシタロプラムは、５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ群の線条体における５−ＨＴレベルの僅かな上昇を生じただけであった。データはベースラインのパーセンテージで表し、平均±ＳＥＭで示す（ｎ＝７〜８匹のマウス／群）。要因と時間との間で対象者内変量として処理して、反復測定分散分析を使用し、続いて多重比較Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行い、＊＊ｐ＜０．０１でビヒクルと有意の差があった。
【図１７】黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンのＮＬＦ−ＮＳ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３による選択的ターゲティングを示す。Ａ及びＣは、マウスの腹側中脳におけるｓｉＲＮＡのＩＣＶ投与後それぞれ１時間及び３時間のＮＬＦ−ＮＳ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３の赤色標識を示す。Ｂ及びＤは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）染色と併せた同じ標識を示す。ＮＬＦ−ＮＳ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３ＩＣＶ投与の１時間後（Ａ及びＢ）、赤色標識（Ｃｙ３）は、ＴＨ陽性黒質ニューロン（青色）内で検出することができるが、黒質細網のＧＡＢＡ作動性ニューロン（＊）では検出できない。赤色標識は斑点状の紋様をたどる（挿入写真）。注射の３時間後には、いかなる赤色細胞内標識も検出することができない（Ｃ及びＤ）。
【図１８】遺伝子座位青斑核のノルアドレナリン作動性ニューロンのＮＬＦ−ＮＳ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３による選択的ターゲティング。Ａ及びＣは、ｓｉＲＮＡのＩＣＶ投与後それぞれ１時間及び３時間のＮＬＦ−ＮＳ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３の赤色標識を示す。Ｂ及びＤは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）染色と併せた同じ標識を示す。ＮＬＦ−ＮＳ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３のＩＣＶ投与の１時間後（Ａ及びＢ）には、赤色標識（Ｃｙ３）を主としてＴＨ陽性ノルアドレナリン作動性ニューロン（青色）内で検出することができる。赤色標識は斑点状の紋様（挿入写真）をたどる。注射の３時間後にはいかなる赤色細胞内標識も検出することができない（Ｃ及びＤ）。
【図１９】セルトラリン−コンジュゲート２−Ｏ’−メチル（ＴＯＭ）で改変したナンセンスオリゴヌクレオチド（Ｃ−ｎｓ−ＴＯＭ）の縫線核セロトニンニューロンにおける選択的蓄積を示す。マウスは、Ｃｙ３標識Ｃ−ｎｓ−ＴＯＭ（３０μｇ）の単回脳室内注入を背側の第３脳室中に受けて注入後２４時間で殺害した（ｎ＝２匹のマウス）。ＹＯＹＯ１免疫反応性細胞核（緑色）のレーザ共焦点像が免疫局在化Ｃｙ３標識Ｃ−ｎｓ−ＴＯＭ（赤色）を示す。尺度のバーは４０μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明者らは、予想外に、神経伝達物質輸送体を発現している関心のある細胞を特定して核酸の標的とすることが、前記神経伝達物質輸送体に、さらに特定すれば、前記輸送体の阻害剤に特異的に結合することができる分子に前記核酸を共有結合でカップリングすることにより、可能であることに気づいた。
【００４２】
Ａ．  本発明のコンジュゲート
第１の態様において、本発明は、
ｉ）１種又は複数種の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１種の選択的作用剤、
ｉｉ）神経伝達物質輸送体と同じ細胞中に発現している標的分子に特異的に結合することができる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド
を含むコンジュゲートに関する。
【００４３】
本明細書中で使用する「コンジュゲート」という用語は、２種以上の個々の化合物の共有結合から生ずる任意の化合物を指す。本発明において、コンジュゲートは共有結合でカップリングした核酸と選択的作用剤とを含む分子を指し、前記カップリングは直接又は結合剤化合物を通して行われる。
【００４４】
「共有結合カップリング」又は「共有結合」という用語は、核酸と選択的作用剤とが、直接共有結合で互いに連結するか、又はそうではなくて間接的に共有結合で、リンカー、又は架橋、又はスペーサーの部分（単数又は複数）などの介在する構造部分（単数又は複数）を通して互いに連結するかのいずれかであることを意味する。
【００４５】
Ａ．１．  選択的作用剤
本明細書中で使用する「１種又は複数種の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する選択的作用剤」という表現は、神経伝達物質輸送体に結合する任意の物質を指す。この結合特異性は、前記選択的作用剤に結合した分子を前記神経伝達物質輸送体を含有する細胞、組織又は器官に送達することを可能にする。このようにして、前記選択的作用剤を担持するコンジュゲートは、動物に投与されたときに又はインビトロで異なったタイプの細胞の集団と接触したときに、前記細胞に特異的に向かうであろう。
【００４６】
本明細書中で使用する、第１の分子の第２の分子への特異的結合は、第１の分子が前記第２の分子に非特異的相互作用とはっきり異なる方式で結合する能力を指す。本発明による選択的作用剤は、標的（神経伝達物質輸送体）に対して少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ以上のＫｄを示すことができる。
【００４７】
本明細書中で使用する用語「神経伝達物質輸送体」は、ニューロンの細胞膜の両側にまたがり、その主な機能はこれらの膜を越えて神経伝達物質を運び、それらの特定の細胞内の位置へのさらなる輸送を指示する膜輸送タンパク質のクラスに属するタンパク質を指す。本発明の選択的作用剤により標的とされ得る神経伝達物質輸送体として、ニューロンのプラズマ膜中に存在する取り込み担体及び神経伝達物質を細胞外空間から細胞中に送り込むグリア細胞が挙げられるが、これらに限定されない。この過程は、プラズマ膜を通してのＮａ＋勾配、特にＮａ＋の共輸送に依存する。タンパク質の２つのファミリーが同定されている。１つのファミリーは、ＧＡＢＡ、ノルアドレナリン、ドーパミン、セロトニンなどのモノアミン、及びグリシン及びプロリンなどのアミノ酸のための輸送体を含む。共通の構造物成分としては、１２個の推定されている膜貫通型α−ヘリカルドメイン、細胞質のＮ−及びＣ−末端、及び膜貫通ドメインを３と４に分離する大きいグリコシル化された細胞外ループが含まれる。相同性タンパク質のこのファミリーは、Ｎａ＋及びＣｌ−イオンと神経伝達物質の細胞中への共輸送からそれらのエネルギーを引き出す（Ｎａ＋／Ｃｌ−神経伝達物質輸送体）。第２のファミリーとしては、グルタメートなどの興奮性アミノ酸のための輸送体が含まれる。共通構造成分としては、推定されている６〜１０個の膜貫通型ドメイン、細胞質のＮ−及びＣ−末端、及び細胞外ループ中のグリコシル化物が含まれる。興奮性アミノ酸輸送体は、Ｃｌ−に依存せず、及び且つ細胞内Ｋ＋イオンを必要とし得る（Ｎａ＋／Ｋ＋−神経伝達物質輸送体）（Ｌｉｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：３５６−３６３）。
【００４８】
本発明の選択的作用剤の標的とされ得る神経伝達物質輸送体として、細胞内小胞膜中に存在する神経伝達物質輸送体、典型的には、主要な機能が、シナプス伝達中に小胞内容物のエキソサイトーシス前に神経伝達物質を細胞質から小胞中に濃縮することであるシナプス小胞も挙げられる。小胞の輸送には、Ｈ＋−ＡＴＰアーゼにより生ずる小胞の膜の両側間の電気化学的勾配が使用される。神経伝達物質の小胞への輸送にはタンパク質の２つのファミリーが関与する。１つのファミリーは、主としてプロトン交換を使用して分泌性小胞中への輸送を推進するもので、モノアミン及びアセチルコリンの輸送体が含まれる。例えば、モノアミン輸送体は細胞質伝達物質の各分子のために２つの管腔プロトンを交換する。第２のファミリーには、シナプス小胞内の正電荷に依存するＧＡＢＡ輸送体が含まれる。小胞の輸送体の２つのクラスは、互いに配列類似性を示さず、プラズマ膜担体の小胞とは異なった構造を有する（Ｓｃｈｌｏｓｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：５９５−５９９；Ｌｉｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：３５６−３６３）。
【００４９】
本発明の選択的作用剤の標的にすることができる神経伝達物質輸送体の特定のタイプには、興奮性アミノ酸輸送体１（ＥＡＡＴ１）、興奮性アミノ酸輸送体２（ＥＡＡＴ２）、興奮性アミノ酸輸送体３（ＥＡＡＴ３）、興奮性アミノ酸輸送体４（ＥＡＡＴ４）、興奮性アミノ酸輸送体５（ＥＡＡＴ５）、小胞のグルタメート輸送体１（ＶＧＬＵＴ１）、小胞のグルタメート輸送体２（ＶＧＬＵＴ２）及び小胞のグルタメート輸送体３（ＶＧＬＵＴ３）を含むグルタメート／アスパラテート輸送体；１型ＧＡＢＡ輸送体（ＧＡＴ１）、２型ＧＡＢＡ輸送体（ＧＡＴ２）、３型ＧＡＢＡ輸送体（ＧＡＴ３）、ベタイン輸送体（ＢＧＴ１）及び小胞のＧＡＢＡ輸送体（ＶＧＡＴ）を含むＧＡＢＡ輸送体；１型グリシン輸送体（ＧｌｙＴ１）、２型グリシン輸送体（ＧｌｙＴ２）を含むグリシン輸送体；ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）、セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）、小胞のモノアミン輸送体１（ＶＭＡＴ１）、小胞のモノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）を含むモノアミン輸送体；受動拡散型ヌクレオシド輸送体１（ＥＮＴ１）、受動拡散型ヌクレオシド輸送体２（ＥＮＴ２）、受動拡散型ヌクレオシド輸送体３（ＥＮＴ３）及び受動拡散型ヌクレオシド輸送体４（ＥＮＴ４）及び小胞のアセチルコリン輸送体（ＶＡＣｈＴ）を含むアデノシン輸送体が含まれる。
【００５０】
好ましい実施形態において、選択的作用剤はペプチドではない。
【００５１】
好ましい実施形態において、選択的作用剤は、セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＲＩ）、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）、ノルアドレナリン作動性及び特異的セロトニン作動性の抗鬱剤（ＮＡＳＳＡ）、ノルアドレナリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）、内在性カンナビノイド再取り込み阻害剤（ｅＣＢＲＩ）、アデノシン再取り込み阻害剤（ＡｄｏＲＩ）、興奮性アミノ酸再取り込み阻害剤（ＥＡＡＲＩ）、グルタメート再取り込み阻害剤（ＧｌｕＲＩ）、ＧＡＢＡ再取り込み阻害剤（ＧＲＩ）、グリシン再取り込み阻害剤（ＧｌｙＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）の群から選択される。
【００５２】
用語「セロトニン再取り込み阻害剤」又は「ＳＲＩ」は、セロトニン取り込みを阻止することができて、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）（他の神経伝達物質に実質的に影響せずに特異的にセロトニン取り込みを阻止する）に加えて非選択的セロトニン再取り込み阻害剤、例えば、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）及びセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＳＮＤＲＩ）も含む分子を指す。
【００５３】
用語「セロトニン選択的再取り込み阻害剤」又は「ＳＳＲＩ」は、他の神経伝達物質再取り込み又は輸送体系に実質的に影響しないセロトニン再取り込みの選択的阻害剤を指す。これらの化合物は、主としてシナプス前部のセロトニン作動性の細胞に作用して神経伝達物質セロトニンの細胞外レベルの上昇をもたらし、それによりシナプス後部の受容体に結合し得るセロトニンのレベルを上昇させて脳中のこのモノアミン作動性神経伝達物質系の活性の欠乏を回復させる。ＳＳＲＩの例示となる例として、セルトラリン（ＣＡＳ７９６１７−９６−２）、セルトラリンの構造的アナログ、フルオキセチン（ＣＡＳ５４９１０−８９−３）、フルボキサミン（ＣＡＳ５４７３９−１８−３）、パロキセチン（ＣＡＳ６１８６９−０８−７）、インダプリン（ＣＡＳ６３７５８−７９−２）、ジメルジン（ＣＡＳ５６７７５−８８−３）、シタロプラム（ＣＡＳ５９７２９−３３−８）及びエスシタロプラム（ＣＡＳ２１９８６１−０８−２）が挙げられるが、これらに限定されない。所与の化合物がＳＳＲＩとして作用しているかどうかを決定するためのアッセイは、例えば、体外でセロトニンの取り込みを減少させて、Ｋｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９８３，２２６：６８６−７００）に本質的に記載されたように静脈内［３Ｈ］ノルエピネフリンのラット心臓取り込みに影響せずにセロトニンを消耗させるｐ−クロロアンフェタミンの作用に拮抗する能力である。
【００５４】
好ましい実施形態において、ＳＳＲＩはセルトラリン又は構造（Ｉ）
【化１】
2013525330.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、独立に、水素又は場合により置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルであり；Ｘ及びＹは水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、及びシアノからなる群から各々選択され；及びＷは水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチル、ニトロ及びＣ１〜Ｃ３アルコキシからなる群から選択される）
を有するそれらの構造的アナログである。幾つかの実施形態において、セルトラリンアナログはシス異性体配置である。用語「シス異性体の」は、シクロヘキセン環上のＮＲ１Ｒ２とフェニル部分との相対的配向を指す（即ちそれらは両方とも環の同じに側にある）。１−及び４−炭素は両方とも非対称的に置換されているので、各シス化合物は、（１−炭素に関して）シス（１Ｒ）及びシス（１Ｓ）エナンチオマーと表示される２つの光学活性鏡像異性形を有する。
【００５５】
ある有用なセルトラリンアナログは、（１Ｓ）−鏡像異性又は（１Ｓ）（１Ｒ）ラセミ体、及びそれらの薬学的に許容される塩のいずれかである以下の化合物である：
ｃｉｓ−Ｎ−メチル−４−（３，４−ジクロロフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−ｌナフタレンアミン；
ｃｉｓ−Ｎ−メチル−４−（４−ブロモフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−ｌナフタレンアミン；
ｃｉｓ−Ｎ−メチル−４−（４−クロロフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−ｌナフタレンアミン；
ｃｉｓ−Ｎ−メチル−４−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−ｌ−ナフタレンアミン；
ｃｉｓ−Ｎ−メチル−４−（３−トリフルオロメチル−４−クロロフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−１−ナフタレンアミン；
ｃｉｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−（４−クロロフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−ｌ−ナフタレンアミン；
ｃｉｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−ｌ−ナフタレンアミン及び
ｃｉｓ−Ｎ−メチル−４−（４−クロロフェニル）−７−クロロ−ｌ，２，３，４−テトラヒドロ−ｌ−ナフタレンアミン。
ｃｉｓ−Ｎ−メチル−４−（３，４−ジクロロフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−ｌ−ナフタレンアミンの（１Ｒ）−エナンチオマーも興味がある。
【００５６】
セルトラリンアナログは、米国特許第４，５３６，５１８号にも記載されている。他の関係ある化合物として、（Ｓ，Ｓ）−Ｎ−デスメチルセルトラリン、ｒａｃ−ｃｉｓ−Ｎ−デスメチルセルトラリン、（１Ｓ，４Ｓ）−デスメチルセルトラリン、１−デス（メチルアミン）−１−オキソ−２−（Ｒ，Ｓ）−ヒドロキシセルトラリン、（１Ｒ，４Ｒ）−デスメチルセルトラリン、セルトラリン、スルホンアミド、セルトラリン（反転）メタンスルホンアミド、１Ｒ，４Ｒセルトラリン、エナンチオマー、Ｎ，Ｎ−ジメチルセルトラリン、ニトロセルトラリン、セルトラリンアニリン、セルトラリンヨウ化物、セルトラリンスルホンアミドＮＨ２、セルトラリンスルホンアミドエタノール、セルトラリンニトリル、セルトラリン−ＣＭＥ、ジメチルセルトラリン反転スルホンアミド、セルトラリン反転スルホンアミド（ＣＨ２リンカー）、セルトラリンＢ−環オルトメトキシ、セルトラリンＡ−環メチルエステル、セルトラリンＡ−環エタノール、セルトラリンＮ，Ｎ−ジメチルスルホンアミド、セルトラリンＡ環カルボン酸、セルトラリンＢ−環パラフェノキシ、セルトラリンＢ−環パラ−トリフルオロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルセルトラリンＢ−環及びパラ−トリフルオロメタン、及びＵＫ−４１６２４４が含まれる。これらのアナログの構造を下に示す。
【００５７】
【表１】
2013525330.tif 000003
2013525330.tif 000004
2013525330.tif 000005
2013525330.tif 000006
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2013525330.tif 000010
用語「セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤」又は「ＳＮＲＩ」は、セロトニン輸送体を遮断することによりセロトニンの再取り込み、及びノルエピネフリン輸送体を遮断することによりノルエピネフリンの再取り込みを阻害することができる化合物のファミリーを指す。このファミリーには、ベンラファキシン（ＣＡＳ９３４１３−６９−５）、デスベンラファキシン（ＣＡＳ９３４１３−６２−８）、デュロキセチン（ＣＡＳ１１６５３９−５９−４）、ミルナシプラン（ＣＡＳ９２６２３−８５−３）、シブトラミン（１０６６５０−５６−０）、トラマドール（ＣＡＳ２７２０３−９２−５）及びビシファジン（ＣＡＳ７１１９５−５７−８）などの化合物が含まれる。所与の化合物が、ＳＮＲＩとして作用するかどうかを決定するためのアッセイは、例えば、Ｂｏｌｄｅｎ−ＷａｔｓｏｎＣ，Ｒｉｃｈｅｌｓｏｎ  Ｅ．（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．１９９３；５２（１２）：１０２３−９）に本質的に記載された脳シナプトソームによるセロトニン及びノルエピネフリンの取り込みを減少させる能力である。ＳＮＲＩの特定のタイプは３環を含む一般的分子構造を有するＳＮＲＩである三環式抗鬱剤である。抗鬱剤の中でも突出しているのは、線状三環式、例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトプチリン、ドキセピン、ケチプラミン、ミアンセリン、ドチエピン、アモキサピン、ジベンゼピン、メリトラセン、マプロチリン、フルペンチキソール、アザフェン、チアネピン及び同様な活性を示す関連化合物である。角形三環式には、インドリリン、クロダゾン、ノミフェンシン、及び関連化合物が含まれる。種々の他の構造的に多様な抗鬱剤、例えば、イプリンドール、ウェルバトリン、ニアラミド、ミルナシプラン、フェネルジン及びトラニルシプロミンが同様な活性を生ずることが示されている。それらは機能的に三環式抗鬱剤と同等であり、それ故本発明の範囲内に含まれる。したがって、三環式抗鬱剤という用語は、上記の広範なクラスの抗鬱剤を、アミトリプチリン、アミトリプチリンオキシド、カルバマゼピン、ブトリプチリン、クロミプラミン、デメキシプチリン、デシプラミン、ジベンゼピン、ジメタクリン、ドスレピン／ドチエピン、ドキセピン、イミプラミン、イミプラミンオキシド、イプリンドール、ロフェプラミン、メリトラセン、メタプラミン、ニトロキサゼピン、ノルトリプチリン、ノキシプチリン、プレガバリン、プロピゼピン、プロトリプチリン、キヌプラミン及びトリミプラミンなどの化合物を含むがこれらに限定されない全て抗鬱剤活性を有し共通の性質を有する関連化合物と一緒に包含することが本発明者により意図される。
【００５８】
用語「ノルアドレナリン再取り込み阻害剤」、「ＮＲＩ」、「ＮＥＲＩ」、アドレナリン作用性の再取り込み阻害剤」又は「ＡＲＩ」は、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）の作用を阻害することによりノルアドレナリン及びアドレナリンの再取り込みを阻止することができる化合物のファミリーを指す。このファミリーの化合物には、他のモノアミン輸送体に影響せずにもっぱらＮＥＴを遮断する選択的ＮＲＩ並びにノルエピネフリン輸送体及びセロトニン輸送体（上を参照されたい）を遮断するＳＮＲＩ、ノルエピネフリン及びドーパミン輸送体（下を参照されたい）を遮断するノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）、三環式抗鬱剤及び四環式抗鬱剤（上を参照されたい）などの非選択的ＮＲＩが含まれる。本発明に適した選択的ＮＲＩとして、アトモキセチン／トモキセチン（ストラッテラ又はＣＡＳ８３０１５−２６−３）、マジンドール（マザノール、サノレックス又はＣＡＳ２２２３２−７１−９）、レボキセチン（エドロナックス、ベストラ又はＣＡＳ９８８１９−７６−２）及びビロキサジン（ビバラン又はＣＡＳ４６８１７−９１−８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
用語「ドーパミン再取り込み阻害剤」又は「ＤＲＩ」は、ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）の作用を遮断することにより神経伝達物質ドーパミンの再取り込み阻害剤として作用する。これは、順送りで、ドーパミンの上昇した細胞外濃度を、それ故ドーパミン作動性神経伝達の増強をもたらす。適当なＤＲＩには、アミネプチン、ベンザトロピン／ベンズトロピン、ブプロピオン、デクスメチルフェニデート、エスケタミン、エチベンザトロピン／エチベ（Ｅｔｈｙｂｅ）、ポナリド、フェンカムファミン、フェンカミン、ケタミン、レフェタミン、メジホキサミン、メソカルブ、メチルフェニデート、ネホパム、ノミフェンシン、ピプラドロール、プロリンタン、ピロバレロン、チレタミン及びトリペレンアミンなどの医薬；アルトロパン、アンホネリン酸、ベノシクリジン、ブラソフェンシン、ブロマンタン、ＤＢＬ−５８３、ジクロロパン、ジクロフェンシン、ジエチシクリジン、ジフルオロピン、ガシクリジン、ＧＢＲ−１２，９３５、インダトラリン、イオフルパン、イオメトパン、マニファクシン、ラダファクシン、タメトラリン、テソフェンシン、トロパリル及びバノキセリンなどの研究用化学物質が含まれるが、これらに限定されない。適当なＤＲＩは、Ｋｕｌａら（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３４：２５６７−２５７５，１９８４）により発表された方法を使用して記載されたように実施して、ラット死体の線条体から調製されたシナプトソーム製剤によるドーパミンの高親和性取り込みを阻害する、推定されているＤＲＩの能力の定量などの当業者に知られたアッセイを使用して同定することができる。
【００６０】
本明細書中で使用する用語「内在性カンナビノイド再取り込み阻害剤」又は「ｅＣＢＲＩ」は、内在性カンナビノイド輸送体の作用を遮断することにより内在性カンナビノイドの再取り込み阻害剤として作用する任意の化合物を指す。この活性を有する化合物は、Ｂｅｌｔｒａｍｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７７：１０９４−１０９７）に記載された方法を使用して、ラットのニューロン及び星状細胞によるアナンダミドの取り込みを阻止する推定されている内在性カンナビノイド再取り込み阻害剤の能力に基づいて同定することができ、ＡＭ４０４、アルバニル及びオルバニルを含むが、これらに限定されない。
【００６１】
用語「アデノシン再取り込み阻害剤」又は「ＡｄｏＲＩ」は、１種又は複数種の受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ＥＮＴ）の作用を遮断することにより、プリンヌクレオシド及び神経伝達物質アデノシンの再取り込み阻害剤として作用する化合物を指す。これは、順送りで、アデノシンの増大した細胞外濃度、それ故アデノシン作動性神経伝達の増強をもたらす。ＡｄｏＲＩ活性を有する化合物は、赤血球によるアデノシン取り込みの阻害における推定されているＡｄｏＲＩの能力に基づくインビトロアッセイ並びにアデノシンの血管拡張剤効果を阻害する推定されているＡｄｏＲＩの能力並びにアデノシンに媒介される側副血管の成長の促進を妨げる能力に基づくインビボアッセイを使用して同定することができ、それらの全ては米国特許第６９８４６４２号に本質的に記載されたようにして実施することができる。適当なＡｄｏＲＩとして、アカデシン、アセテート、バルビツール酸、ベンゾジアゼピン、カルシウムチャンネル遮断剤、カルバマゼピン、カリソプロドール、シロスタゾール、シクロベンザプリン、ジラゼプ、ジピリダモル、エストラジオール、エタノール（アルコール）、フルマゼニル、ヘキソベンジン、ヒドロキシジン、インドメタシン、イノシン、ＫＦ２４３４５、メプロバメート、ニトロベンジルチオグアノシン、ニトロベンジルチオイノシン、パパベリン、ペントキシフィリン、フェノチアジン、フェニトイン、プロゲステロン、プロペントフィリン、プロポフォール、ピューロマイシン、Ｒ７５２３１、ＲＥ１０２ＢＳ、ソフルフラジン、トヨカマイシン、トラカゾレート、三環式抗鬱剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
用語「興奮性アミノ酸再取り込み阻害剤」又は「ＥＡＡＲＩ」は、興奮性アミノ酸輸送体又はＥＥＡＴを遮断することにより興奮性アミノ酸の再取り込みを阻害する化合物を指す。多くの化合物が、ＥＡＡＴに結合すること及び輸送体機能を阻害することが知られている。ＥＡＡＴの阻害剤は、それらの作用様式が異なる２つの主要なクラス：即ち非輸送性遮断剤及び競合性基質に入る。適当なＥＡＡＲＩとして、ＤＬ−トレオ−β−ベンジルオキシアスパラテート、カイナイト、ジヒドロカイネート、２Ｓ４Ｒ４ＭＧ、トレオ−β−ヒドロキシアスパラテート、Ｌ−トランス−ピロリジン−２，４−ジカルボン酸（ｔ−２，４−ＰＤＣ）が挙げられるがこれらに限定されない。適当なＥＥＡＲＩは、例えば、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９８，５３：１９５−２０１）により記載されたアッセイを使用して、ヒト興奮性アミノ酸輸送体−１（ＥＡＡＴ１）又はヒト興奮性アミノ酸輸送体−２（ＥＥＡＴ２）が発現しているＣｏｓ−１細胞による放射性標識グルタメートの取り込みを阻害する推定されているＥＥＡＲＩの能力に基づいて同定することができる。
【００６３】
用語「グルタメート再取り込み阻害剤」又は「ＧｌｕＲＩ」は、１種又は複数種のグルタメート輸送体の作用を遮断することによりグルタメートの再取り込み阻害剤として作用する化合物を指す。グルタメート再取り込みの適当な阻害剤は、実例として、トレオ−３ヒドロキシ−ＤＬ−アスパラギン酸（ＴＨＡ）、（２Ｓ）−トランス−ピロリジン−２，４−ジカルボン酸（ＰＤＣ）、アミノカプロン酸、及び（２Ｓ，３Ｓ）−３−｛３−［４−（トリフルオロメチル）ベンゾイルアミノ］ベンジルオキシ｝アスパラテートを含む当技術分野において既知の阻害剤の任意のものを包含する。ＧｌｕＲＩ活性を有する化合物は、例えばＳｈｉｍａｍｏｔｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９８，５３：１９５−２０１）により記載されたアッセイを使用して、放射性標識グルタメートのヒト興奮性アミノ酸輸送体−１（ＥＡＡＴ１）又はヒト興奮性アミノ酸輸送体−２（ＥＥＡＴ２）を発現しているＣｏｓ−１細胞中への取り込みを阻害する推定されているＧｌｕＲＩの能力に基づいて同定することができる。
【００６４】
用語「ＧＡＢＡ再取り込み阻害剤」又は「ＧＲＩ」は、γ−アミノ酪酸輸送体（ＧＡＴ）の作用を遮断することにより神経伝達物質γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の再取り込み阻害剤として作用する化合物を指す。これは、順送りでＧＡＢＡの上昇した細胞外濃度及びそれ故ＧＡＢＡ作動性神経伝達の増強をもたらす。ＧＡＢＡ再取り込みの適当な阻害剤として、アドハイパフォリン（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ（セイヨウオトギリソウ））に見出される）、ＣＩ−９６６、デラムシクラン（ＥＧＩＳ−３８８６）、Ｇｕｖａｃｉｎｅ（Ｃ１０１４９）、ハイパフォリン（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ（セイヨウオトギリソウ））に見出される））、ニペコチン酸、ＮＮＣ０５−２０９０、ＮＮＣ−７１１、ＳＫＦ−８９９７６Ａ、ＳＮＡＰ−５１１４、スチリペントール及びＢｏＲｄｅｎ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９４，２６９：２１９−２２４）に記載されたチアガビン（ガビトリル）が含まれるがこれらに限定されない。所与の化合物がＧＡＢＡ再取り込み阻害剤であるかどうかを検知する方法は、当技術分野において知られており、例えば、米国特許第６９０６１７７号；米国特許第６２２５１１５号；米国特許第４３８３９９９号及びＡＩｉ，Ｆ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８５，２８，６５３−６６０）に記載されている。これらの方法は、通常細胞を放射性標識ＧＡＢＡと接触させること及び候補化合物の存在及び不在下においてＧＡＢＡの取り込みを検出することを含む。
【００６５】
用語「グリシン再取り込み阻害剤」又は「ＧｌｙＲＩ」は、シナプス間隙からグリシンを除去することに関与するグリシン輸送体（１型）ＧｌｙＴ１並びにグリシンのシナプス小胞への再取り込み及び再装入に必要とされるＧｌｙＴ２を遮断する化合物を含むグリシン輸送体（ＧｌｙＴ）の作用を遮断することにより、神経伝達物質グリシンの再取り込み阻害剤として作用する化合物を指す（Ｇｏｍｅｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ  ６（５）：６７５−８２）。本発明において使用する適当なグリシン再取り込み阻害剤として、Ｎ−メチル−Ｎ−［［（１Ｒ，２Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−メトキシ−１−フェニル−２−ナフタレニル］メチルグリシン（ＭＴＨＭＰＮＭグリシンの遊離塩基）、国際公開第０００７９７８号及び国際公開第０１３６４２３号に記載されている４−［３−フルオロ−４−プロポキシフェニル］−スピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−１’−酢酸（ＦＰＰＳＢＰＡＡの遊離塩基）、ＡＬＸ５４０７、ザルコシン、５，５−ジアリール−２−アミノ−４−ペンタノエート又は国際公開第０２０８２１６号に記載された化合物などのＧｌｙＴ１特異的阻害剤並びにその内容をそれら全体で引用により組み込む国際公開第０５０４４８１０号Ａに記載されたものなどのＧｌｙＴ２特異的阻害剤が含まれる。ＧｌｙＴ１特異的又はＧｌｙＴ２特異的再取り込み阻害剤を検出する方法は当技術分野において知られており、例えば、関連のある受容体（ＧｌｙＴ１又はＧｌｙＴ２）を発現している細胞と放射性標識グリシンとを再取り込み阻害活性を試験すべき化合物及び細胞内に見出されるグリシンの量の存在下に接触させ、所与の時間後に測定する、国際公開第０５０１８６７６号Ａ又は国際公開第０５０４４８１０号に記載された方法が挙げられる。
【００６６】
本明細書中で使用する用語「ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤」又は「ＮＤＲＩ」は、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）及びドーパミン輸送体（ＤＡＴ）の作用を遮断することにより、それぞれ神経伝達物質ノルエピネフリン及びドーパミンの再取り込み阻害剤として作用する化合物を指す。これは順送りで、ノルエピネフリン及びドーパミン両方の増大した細胞外濃度及びそれ故アドレナリン作用性の及びドーパミン作動性神経伝達の増強をもたらす。本発明のコンジュゲートに使用するために適当なＮＤＲＩとして、アミネプチン（サーベクター、マレオン、ジレクチン）、ブプロピオン（ウェルブトリン、ザイバン）、デクスメチルフェニデート（フォカリン）、フェンカムファミン（グルコエネルガン、レアクチバン）、フェンカミン（アルチミナ、シコクロール）、レフェタミン（サンテノール）、メチルフェニデート（リタリン、コンサータ）、ノミフェンシン（メリタール）、ピプラドロール（メレトラン）、プロリンタン（プロモチル、コトビット）、ピロバレロン（セントロトン、チメルギックス）、ネホパム（アキュパン）、アドハイパフォリン（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ（セイヨウオトギリソウ）に見出される）、ハイパフォリン（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ（セイヨウオトギリソウ）に見出される）、コカイン、デソキシピプラドロール（２−ＤＰＭＰ）、ジフェニルプロリノール（Ｄ２ＰＭ）、メチレンジオキシピロベレロン（ＭＤＰＶ）、シロバミン、マニファクシン（ＧＷ−３２０，６５９）、ラダファクシン（ＧＷ−３５３，１６２）、タメトラリン（ＣＰ−２４，４４１）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートは、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）である選択的作用剤を含有する。さらにより好ましい実施形態において、ＳＳＲＩはセルトラリン又は上で定義したそれらの構造的アナログである。
【００６８】
Ａ．２．  本発明のコンジュゲートの核酸
本発明によるコンジュゲートの第２の成分は、神経伝達物質輸送体と同じ細胞で発現している標的分子に特異的に結合することができる核酸である。典型的には、本発明の核酸は、標的分子の機能を阻害することができる。したがって、標的分子がｍＲＮＡであれば、その場合該核酸（典型的にはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はアンチセンス核酸）はｍＲＮＡの翻訳を阻害することにより作用し、ｍＲＮＡによりコードされたタンパク質のレベルの低下をもたらす。標的分子がタンパク質であれば、その場合核酸（典型的にはアプタマー）はタンパク質の活性を阻害することにより作用する。
【００６９】
本明細書中で使用する用語「核酸」は、２つ以上デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ分子並びに天然核酸と構造的に類似であるが、核酸骨格（例えば、天然核酸中のリン酸エステル）、核酸の糖（例えば、天然ＤＮＡのデオキシリボース及び天然ＲＮＡ中のリボース）、及び核酸塩基（例えば、天然核酸中のアデノシン、シトシン、グアニン又はチミジン）の１箇所又は複数の箇所で天然核酸とは異なる分子（例えば、化学的改変により）を有するポリマーを指す。
【００７０】
オリゴヌクレオチドは、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムを含む２本鎖又は一本鎖オリゴヌクレオチドであってよいが、これらに限定されない。２本鎖核酸が使用される場合、これらは標的核酸に対して相補的な第１のセンス鎖と該センス鎖に対して相補的な第２のアンチセンス鎖とを含み、それが第１鎖と第２鎖との間における塩基対形成による２本鎖ＤＮＡの形成を可能にする。
【００７１】
用語「アンチセンス鎖」は、２本鎖核酸のうち標的配列に実質的に相補的な領域を含む鎖のことである。相補的な領域が標的配列に完全に相補的でない場合、ミスマッチはアンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチド２〜７の外側なら大抵許容される。
【００７２】
本明細書中で使用する用語「センス鎖」は、ｄｓＲＮＡのうちアンチセンス鎖の領域に実質的に相補的な領域を含む鎖を指す。
【００７３】
低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）という用語は、ＲＮＡ干渉経路を誘発する小さい阻害ＲＮＡ二重鎖のことである。これらの分子は、長さが変化してもよく（一般的に１８〜３０塩基対）、アンチセンス鎖中のそれらの標的ｍＲＮＡに対する相補性の程度はさまざまである。全てではないが幾つかのｓｉＲＮＡは、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の５’又は３’末端に不対の塩基が突出している。用語「ｓｉＲＮＡ」は、２本の別の鎖の二重鎖を含む。本明細書中で使用するｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ分子に限定されず、さらにモルホリノなど１つ又は複数の化学的に改変されたヌクレオチドを含む核酸を含む。
【００７４】
本明細書中で使用する用語「ｓｈＲＮＡ」又は「ショートヘアピンＲＮＡ」は、２つの鎖が一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端との連続したヌクレオチドの鎖により接続されて二重構造物を形成しているｄｓＲＮＡのことである。
【００７５】
用語「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」は、典型的には、遺伝子発現を調節することができる長さ約２１〜２３ヌクレオチドの短い一本鎖のＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡは合成（即ち、組み替え）でも天然でもよい。天然ｍｉＲＮＡはＤＮＡから転写された遺伝子によりコードされ、最初の転写物（「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」）から短い幹ループ構造物（「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」）に加工されて、最後に成熟ｍｉＲＮＡになる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は１つ又は複数のｍＲＮＡ分子に部分的に相補的であり、ＲＮＡ干渉と同様な過程により、又はｍＲＮＡの翻訳を阻害することにより遺伝子発現を下方制御する。
【００７６】
本明細書中で使用する「アンチセンス配列」は、標的ｍＲＮＡ（センス）又はＤＮＡ（アンチセンス）の配列に結合することができる一本鎖の核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む。所与のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導できることが、例えば、Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９，（１９８８）及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，（１９８８）に記載されている。
【００７７】
本明細書中で使用する、用語「リボザイム」又は「ＲＮＡ酵素」又は「触媒的ＲＮＡ」は、化学的反応の触媒になるＲＮＡ分子を指す。多くの天然リボザイムは、それら自体のホスホジエステル結合の１つの加水分解、又は他のＲＮＡの結合の加水分解のいずれかを触媒するが、それらは、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡリガーゼのリガーゼ活性、及び従来のタンパク質酵素により実施される多数の他の化学的反応を触媒することも見出されている。
【００７８】
本明細書中で使用する「アプタマー」は、結合が「相補的」でなくて即ち、核酸リガンドと標的核酸配列との間の塩基対形成に基づかずに、標的分子の２つ以上の部位に結合する核酸リガンドを指す。ポリペプチドを含む任意の構想し得る標的に結合するアプタマーを設計することができる。アプタマーはそれらが一般的に使用される生体分子、抗体に匹敵する分子認識の性質を提供するので、バイオテクノロジー及び治療用途のための効用を提供する。それらの選択的認識に加えて、アプタマーは、それらは完全に試験管中で操作することができて、化学的合成により容易に製造され、望ましい貯蔵性を有し、治療に応用して免疫原性をほとんど又は全く誘発しないので、抗体に勝る利点を提供する。アプタマーはインビトロで分配、選択及び増幅の繰り返しという、「ＳＥＬＥＸ」（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（Ｓｈａｍａｈ  ｅｔ  ａｌ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２００８，４１  ｐｐ．１３０−８）として当技術の段階で知られている方法により合成することができる。あるいは、それらは、例えば、逐次固相法により合成することができる。
【００７９】
本発明の核酸は、核酸塩基、糖類及び／又はヌクレオチド間の連結中に１つ又は複数の改変を含むことができる。
【００８０】
核酸の１つ又は複数の骨格残基に対する改変は、以下の１つ又は複数を含むことができる：２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−メトキシエトキシ、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）などの２’糖改変；４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋を含む４’糖改変；ロックド核酸（ＬＮＡ）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）；捻りインターカレーティング核酸（ＴＩＮＡ）；ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；シクロヘキサン核酸（ＣＮＡ）；シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）；トレオシル核酸（ＴＮＡ）；モルホリノオリゴヌクレオチド；ギャップマー；ミックスマー；組み込みアルギニンリッチペプチド；合成ＲＮＡに５’−ホスフェートの付加；ＲＮＡアプタマー（Ｑｕｅ−Ｇｅｗｉｒｔｈ  ＮＳ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００７  Ｆｅｂ；１４（４）：２８３−９１．）；特異的ＲＮＡアプタマーを対象に対する解毒剤で調節したＲＮＡアプタマー（Ｏｎｅｙ  Ｓ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００７  Ｆａｌｌ；１７（３）：２６５−７４．を参照されたい）又は任意のそれらの組合せである。
【００８１】
核酸の１つ又は複数ヌクレオシド間連結に対する改変は、以下の１つ又は複数を含むことができる：ホスホロチオネート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロジチオネート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオネート及びホスホロアニリデート、又は任意のそれらの組合せである。
【００８２】
しばしば隔離ＲＮＡと称されるロックド核酸（ＬＮＡ）は、改変されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は２’炭素と４’炭素とを接続するエキストラ架橋（Ｏ２’，Ｃ４’−メチレン架橋）で改変されている。架橋はＤＮＡ又はＲＮＡでしばしば見出される３’エンド構造配座でリボースを「ロック」する。ＬＮＡヌクレオチドは、望めばいつでも核酸中のＤＮＡ又はＲＮＡ塩基と混合することができる。そのようなオリゴマーは市販されている。ロックドリボースの配座は塩基のスタッキング及び骨格の前組織化を強化する。これは、ＬＮＡ−改変核酸の熱的安定性（溶融温度）及びハイブリッド形成親和性だけでなく改善されたミスマッチ識別能力を大きく向上させる。これらの性質によりそれらはアンチセンスに基づく技法にとって非常に有用になる。さらに、ＬＮＡ抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドは、霊長類で試験して有望な結果及び低毒性が得られている。
【００８３】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）はＤＮＡ又はＲＮＡと同様な人工的に合成されたポリマーであり、生物学の研究及び医学的治療において使用される。ＰＮＡが天然に生ずることは知られていない。ＤＮＡ及びＲＮＡはそれぞれデオキシリボース及びリボース糖骨格を有するのに対して、ＰＮＡの骨格はペプチド結合によって連結した反復するＮ−（２−アミノエチル）−グリシンユニットで構成されている。種々のプリン及びピリミジン塩基は、メチレンカルボニル結合により骨格に連結している。ＰＮＡは、Ｎ末端が第１の（左）位置にあり、Ｃ末端が右にあるペプチドのように描かれる。ＰＮＡの骨格は無荷電のホスフェート基を含有するので、ＰＮＡ／ＤＮＡ鎖間の結合は静電的反発の欠如によりＤＮＡ／ＤＮＡ鎖より強い。混合塩基ＰＮＡ分子は塩基対認識に関してＤＮＡ分子の真の模倣体である。ＰＮＡ／ＰＮＡ結合はＰＮＡ／ＤＮＡ結合より強い。
【００８４】
インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）は、疎水性挿入部に共有結合で連結した正常デオキシリボヌクレオチドを含む改変された核酸類似体である。ＩＮＡは、各改変について相補的ＤＮＡに対する１１度まで安定化した高い親和性を有する。ＩＮＡは、ミスマッチした標的を超えて完全に合致した標的に対して正常ＤＮＡより高い特異性を有する。ＩＮＡがＤＮＡに対して高い親和性を有することを利用してより短いプローブを使用することが可能となり、それによりさらになお特異性が増強される。さらに、ＩＮＡはＤＮＡとＲＮＡとの間を識別する独特の能力を有するＤＮＡ選択的オリゴヌクレオチド類似体である。ＩＮＡは相補的ＤＮＡに対して高い親和性を有するのに、相補的ＩＮＡの相補的配列に対する親和性はより低い。捻りインターカレーティング核酸はＴＩＮＡと表示される。
【００８５】
ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）は、天然核酸塩基及びリン酸化された１，５−アンヒドロヘキシトール骨格から構築されたオリゴヌクレオチドである。ＨＮＡとＲＮＡの間の分子の会合はＨＮＡとＤＮＡとの間及び天然核酸間（ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ）より安定である。他の合成的に改変されたオリゴヌクレオチドは、ＡＮＡ（アラビノ核酸）、ＣＮＡ（シクロヘキサン核酸）、ＣｅＮＡ（シクロヘキセニル核酸）及びＴＮＡ（トレオシル核酸）を含む。
【００８６】
モルホリノは、天然核酸構造物の再設計の産物である合成分子である。構造的に、モルホリノとＤＮＡ又はＲＮＡとの相違は、モルホリノは標準的核酸塩基を有するが、これらの塩基がデオキシリボース／リボース環ではなくて６員モルホリン環に結合しており且つ非イオン性ホスホロジアミデートのサブユニット間連結がアニオン性ホスホジエステル連結を置き換えていることである。モルホリノはＰＭＯ（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド）と称される場合もある。６員モルホリン環の化学式はＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２）２−ＮＨである。
【００８７】
ギャップマー又は「ギャップ付きオリゴマー化合物」は、ＤＮＡの窓又は「ギャップ」がさもなければ正常な又は「ウィング（Ｗｉｎｇ）」として知られる改変されたＲＮＡオリゴヌクレオチド中に挿入されたＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドプローブである。この改変は、インビボにおけるオリゴヌクレオチド安定性及びプローブと標的との相互作用の結合力を向上させ、その結果、より短いプローブを効果的に使用することができる。好ましくは、ウィングは、ヌクレアーゼ分解から内部の単位を保護する、２’−Ｏ−メチル（ＯＭｅ）又は２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）で改変されたリボヌクレオチドである。さらに、ギャップ又はウィングを形成するヌクレオチドは、ホスホジエステル結合により又はホスホロチオネート結合により接続することができ、したがってＲＮアーゼ分解に抵抗性になる。それに加えて、ウィングを形成するヌクレオチドは３’メチルホスホネート連結により接続された塩基を組み込むことにより改変することもできる。
【００８８】
本発明のコンジュゲートの核酸は、神経伝達物質輸送体と同じ細胞中で発現している標的分子に特異的に結合することができる。核酸の標的分子への結合は、標的分子が核酸の配列に相補的である配列を含有する核酸である場合に、ワトソン−クリック相互作用により起こり得る。あるいは、標的分子がポリペプチドである場合に、本発明のコンジュゲートの核酸は、前記分子と相互作用することもでき、その場合核酸はアプタマーとして作用する。
【００８９】
本発明のコンジュゲートの一部を形成する核酸が、標的ｍＲＮＡの核酸配列に相補的である場合、最も適切な核酸を選択するために異なった基準が当業者に利用可能である。例として、コンジュゲートの一部を形成する核酸がｓｉＲＮＡである場合、これは、ＡＡジヌクレオチドに対する標的のｍＲＮＡ配列を走査して、ＡＡの直ぐ下流の１９個のヌクレオチドを記録することにより選択することができる。他の方法も核酸標的を選択するために使用することができる。１例において、ｓｉＲＮＡ標的配列の選択は、標的配列がＧＧで開始して、ＢＬＡＳＴサーチにより解析された他の遺伝子と有意の配列相同性を共有しない限り、純粋に経験的に決定される（例えば、Ｓｕｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：５５１５−２０（２００２）を参照されたい）。他の例において、より精巧な方法がｓｉＲＮＡ標的配列を選択するために使用される。この手順は、内在ｍＲＮＡ中の接近可能な任意の部位が合成オリゴデオキシリボヌクレオチド／ＲＮアーゼＨ法により分解するために標的となり得る（例えば、Ｌｅｅ  ＮＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−０５（２００２）を参照されたい）という観察を活用する。
【００９０】
あるいは、ヘアピンｓｉＲＮＡ発現カセットは、標的のセンス鎖に続いて短いスペーサー、標的のアンチセンス鎖、及び転写ターミネーターとして５〜６個のＴを含むように構築される。ｓｉＲＮＡ発現構築物中におけるセンス鎖及びアンチセンス鎖の順は、ヘアピンｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性に悪影響を及ぼさずに変更することができる。ある場合には、順序の逆転は遺伝子サイレンシング活性の部分的低下の原因となり得る。
【００９１】
ｓｉＲＮＡ発現カセットの幹として使用されるヌクレオチド配列の長さは、例えば、１９から２９の範囲にすることができる。ループサイズは３から２３ヌクレオチドの範囲にすることができる。他の長さ及び／又はループサイズも使用することができる。
【００９２】
さらに他の実施形態において、ヘアピンｓｉＲＮＡが遺伝子サイレンシングにおいて機能する限り、ヘアピンｓｉＲＮＡ構築物中の５’突出を使用することができる。特定の１例において、５’突出は約６ヌクレオチド残基を含む。
【００９３】
さらなる他の実施形態において、ＲＮＡｉに対する標的配列は２１塩基長の配列フラグメントである。標的配列の５’末端はジヌクレオチド「ＮＡ」を有し、「Ｎ」は任意の塩基であってよく「Ａ」はアデニンを表す。残余の１９塩基長の配列は３５％と５５％の間のＧＣ含有率を有する。それに加えて、残余の１９塩基長配列には、いかなる４つ連続したＡ又はＴ（即ち、ＡＡＡＡ又はＴＴＴＴ）も、３つ連続したＧ又はＣ（即ち、ＧＧＧ又はＣＣＣ）も、又は連続して７つの「ＧＣ」もない。
【００９４】
追加の基準もＲＮＡｉの標的配列を選択するために使用することができる。例えば、残余の１９塩基長配列のＧＣ含有率は４５％と５５％の間に制限することができる。さらに、３つ連続した同一の塩基（即ち、ＧＧＧ、ＣＣＣ、ＴＴＴ、又はＡＡＡ）又は５個以上の塩基の回文配列を有するいかなる１９塩基長配列も排除される。さらに、残余の１９塩基長配列は、他の遺伝子に対する相同性の低い配列でも選択することができる。１つの特定の例において、可能性がある標的配列をＮＣＢＩのヒトＵｎｉＧｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ配列データベースに対するＢＬＡＳＴＮにより検索することができる。ヒトＵｎｉＧｅｎｅデータベースには遺伝子指向の集団の余剰のないセットが含まれる。各ＵｎｉＧｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒには一意的な遺伝子を表す配列が含まれる。ＢＬＡＳＴＮ検索で他のヒト遺伝子にヒットしない１９塩基長配列を選択することができる。検索中に、ｅ−値を厳密な値（「１」など）に設定することができる。
【００９５】
ｓｉＲＮＡ配列、並びに本発明にしたがって誘導された任意の他のＲＮＡｉ配列の、標的遺伝子のサイレンシング発現における有効性は、当技術分野において知られている種々の方法を使用して評価することができる。
【００９６】
用語「サイレンス」及び「の発現を阻害する」「の発現の下方制御」「の発現を抑制する」等は、それらが標的遺伝子を指す限りにおいて、本明細書においては、標的遺伝子が転写されて標的遺伝子の発現が阻害されるように処理された第１の細胞又は細胞群から単離することができる標的ｍＲＮＡの量が、第１の細胞又は細胞群と実質的に同一であるがそのように処理されていない第２の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較して減少することにより証明されるような、標的遺伝子の発現の少なくとも部分的抑制を指す。阻害の程度は通常以下のことに関して表す：
（対照細胞中のｍＲＮＡ）−（処理された細胞中のｍＲＮＡ）＊１００パーセント
（対照細胞中のｍＲＮＡ）
【００９７】
あるいは、阻害の程度は、標的遺伝子発現に機能的に関連するパラメーター、例えば、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の量又はある表現型を示す細胞の数の減少によって示すこともできる。原則として、標的ゲノムサイレンシングは、標的を発現する任意の細胞において、構成要素により又はゲノムの操作により、及び任意の適当なアッセイによりのいずれかで測定することができる。しかしながら、所与の核酸がある程度標的遺伝子の発現を阻害するか、それ故本発明に含まれるかを決定するために参照が必要な場合に、下の例で提供するアッセイ及び当技術分野において知られているアッセイがそのような参照として役立つであろう。例えば、ある例では、二重螺旋オリゴヌクレオチドの投与により、標的遺伝子の発現は、少なくとも約５パーセント、１０パーセント、１５パーセント、２０パーセント、２５パーセント、３０パーセント、３５パーセント、４０パーセント、４５パーセント、又は５０パーセント抑制される。幾つかの実施形態において、二重鎖オリゴヌクレオチドの投与により、標的遺伝子は、少なくとも約６０パーセント、７０パーセント、又は８０パーセント抑制される。幾つかの実施形態において、二重螺旋オリゴヌクレオチドの投与により、標的遺伝子は、少なくとも約８５パーセント、９０パーセント、又は９５パーセント抑制される。
【００９８】
例えば、本発明による核酸配列は、標的遺伝子を発現している細胞中に導入することができる。細胞中における標的遺伝子のｍＲＮＡレベルは、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット又は任意の他の標準的方法を使用することにより検出することができる。あるいは、標的ｍＲＮＡによりコードされたポリペプチドのレベルを、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ又は任意の他の免疫学的又は非免疫学的方法を使用して測定することができる。ｓｉＲＮＡ配列の導入後の、遺伝子によりコードされたｍＲＮＡ又は標的タンパク質の発現レベルにおける実質的変化は、標的遺伝子の発現の抑制におけるｓｉＲＮＡ配列の有効性を示す。１つの特定の例においては、他の遺伝子の発現レベルもｓｉＲＮＡ配列導入の前及び後にモニターする。標的遺伝子発現の対する阻害効果を有するが他の遺伝子の発現には有意に影響しないｓｉＲＮＡ配列を選択することができる。他の特異的例において、複数のｓｉＲＮＡ又は他のＲＮＡｉ配列を同じ標的細胞中に導入することができる。これらのｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ配列は、標的遺伝子発現を特異的に阻害するが、他の遺伝子の発現は阻害しない。さらに他の特定の例においては、標的遺伝子及び他の遺伝子（単数又は複数）の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡ又は他のＲＮＡｉ配列を使用することができる。
【００９９】
当業者は、本発明のコンジュゲート中に組み込まれる核酸分子の特異的選択がコンジュゲートに存在する選択的作用剤のタイプに依存するであろうということを理解するであろう。したがって、核酸は、選択的作用剤が特異的に結合する神経伝達物質輸送体を発現する細胞中で発現している標的分子に対して特異的であろう。
【０１００】
好ましい実施形態において、核酸は、セロトニン受容体１Ａ型（５−ＨＴ１Ａ）に対して特異的である。核酸がアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はリボザイムである場合で、標的分子がセロトニン受容体１Ａ型（５−ＨＴ１Ａ）をコードするｍＲＮＡである場合には、核酸は標的分子と塩基対を形成することにより作用する。核酸がアプタマーであれば、標的分子はセロトニン受容体１Ａ型（５−ＨＴ１Ａ）ポリペプチドである。
【０１０１】
本明細書中で使用する用語「１Ａ型セロトニン受容体」又は「５−ＨＴ１ＡＲ」は、セロトニン作動性のニューロンのシナプス前部で主に見出されるセロトニン受容体のタイプを指す。これらの受容体は、細胞外セロトニンにより活性化して細胞発火活性を減少させ、順送りで、主要な前脳領域におけるセロトニン放出を減少させる。この負のフィードバックによって、抗鬱剤により急性の誘発を起こすことができるシナプスセロトニンの増加は制限される。時が経つにつれて、細胞体樹状突起の自己受容体は感度が下がり、ＳＳＲＩの最大限の効果が前脳部で発揮されることが可能になる。この期間が抗鬱活性の発症までの潜伏期に相当することが見出されている［Ｐｅｒｅｚ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，１９９７，３４９：１５９４−１５９７］。したがって、セロトニン１Ａ型受容体が不活性化された細胞においては、セロトニン輸送体における遮断の結果として細胞外セロトニンの増加は細胞発火活性の減少に結びつかず、したがって、セロトニン再取り込みの阻害剤による処理と関連する負のフィードバックを防止する。
【０１０２】
本発明のコンジュゲートの核酸により標的とされ得る１Ａ型セロトニン受容体は、配列がＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて受入番号Ｐ０８９０８を与えられているヒト５−ＨＴ１ＡＲ、配列がＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて受入番号Ｑ６４２６４を与えられているマウス５−ＨＴ１ＡＲ、配列がＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて受入番号Ｐ１９３２７を与えられているラット５−ＨＴ１ＡＲ、配列がＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて受入番号Ｑ６ＸＸＸ９を与えられているイヌ５−ＨＴ１ＡＲを含むが、これらに限定されない任意の１Ａ型セロトニン受容体であってよい。
【０１０３】
当業者は、５−ＨＴ１ＡＲをコードするｍＲＮＡに対して特異的な本発明の核酸は、上記の方法のいずれかを使用して選択することができ、且つ対応するｍＲＮＡのレベルの実質的低下を誘発する能力を試験することができることを理解するであろう。本発明者らは、本発明の核酸により優先的に標的とされ得る５−ＨＴ１ＡＲ  ｍＲＮＡの配列内の領域を同定した。これらの領域は、コード領域内の翻訳コンプレックスとの可能な干渉を避けるための、異なった種の間で高度に保存されている領域又は最初の転写物の非コード領域に対応する領域に相当する。
【０１０４】
したがって、好ましい実施形態において、核酸配列は、マウス５−ＨＴ１ＡＲ  ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩデータベースにおける受入番号ＮＭ＿００８３０８の配列）内のヌクレオチドの６２１から１６４０に又はヌクレオチドの１８８０から２４００に又は他の種の５−ＨＴ１ＡＲのｃＤＮＡにおける対応する領域に対応する領域に相補的である。前記の対応する領域は、前記ｃＤＮＡのマウス５−ＨＴ１ＡＲのｃＤＮＡとの対における配列比較により又は異なった５−ＨＴ１ＡＲのｃＤＮＡの複数の配列比較及びマウス５−ＨＴ１ＡＲのｃＤＮＡ中の選択された領域と重なる前記の他のｃＤＮＡ中の領域の同定により決定することができる。
【０１０５】
２つの所与の核酸配列を対で配列比較する方法は、当業者に広く知られており、ＢＬＡＳＴＮタイプの標準的アルゴリズム［ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）］により初期パラメーターを使用して実施することができる。複数の核酸配列を配列比較する方法は、ＣＬＵＳＴＡＬＷタイプの標準的アルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９４，２２：４６７３−４６８０）を使用し、初期パラメーターを使用して実施することができる。異なった種における５−ＨＴ１ＡＲのｃＤＮＡの領域が同定されたら、本発明のコンジュゲートコンジュゲートの核酸中に組み込むことができる適当な核酸配列を同定することが可能である。好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートは、５−ＨＴ１ＡＲ  ｍＲＮＡ中の配列番号：１（マウス５−ＨＴ１ＡＲ  ｍＲＮＡのヌクレオチド１８４１から１９１０）、配列番号：２（マウス５−ＨＴ１ＡＲ  ｍＲＮＡのヌクレオチド５９１から７００）、配列番号：３（マウス５−ＨＴ１ＡＲ  ｍＲＮＡのヌクレオチド８３１から９４０）及び配列番号：４（マウス５−ＨＴ１ＡＲ  ｍＲＮＡのヌクレオチド２１２０から４４４１）の群から選択された領域を標的とする配列を含む核酸配列を含む。
【０１０６】
さらにより好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートの核酸は、配列番号５、配列番号７、配列番号：９、及び配列番号：１１（表２参照）の群から選択される配列を含む。
【０１０７】
核酸が二重螺旋核酸として（例えばｓｉＲＮＡとして）提供される場合には、オリゴヌクレオチドを、配列番号６、配列番号８、配列番号：１０、及び配列番号：１２（表２参照）で提供される対応するアンチセンス鎖と一致させる。
【０１０８】
他の実施形態において、本発明の核酸は、セロトニン輸送体をコードするｍＲＮＡ（この場合、核酸は標的と塩基対形成により作用する）を、又はセロトニン輸送体自体（この場合、直接結合してポリペプチド活性を阻害することによりアプタマーとして作用する）を指向する。
【０１０９】
本明細書中で使用する用語「セロトニン輸送体」又は「ＳＥＲＴ」は、神経伝達物質セロトニンをシナプス空間からシナプス前部のニューロン中に輸送する内在性膜タンパク質であるポリペプチドを指す。ヒト、ラット、マウス及びウシの配列ＳＥＲＴは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいてそれぞれ受入番号Ｐ３１６４５、Ｐ３１６５２、Ｑ６０８５７及びＱ９ＸＴ４９で提供される。５−ＨＴ１ＡＲのｃＤＮＡを標的とする核酸によるのと同様に、ＳＥＲＴのｃＤＮＡ中の任意の領域は、それが対応するｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質のレベルで実質的阻害を生ずる限り、標的とすることができる。したがって、適当なＳＥＲＴ特異的核酸は、上記のように試験すべき核酸と接触した後ＳＥＲＴを発現している細胞中のＳＥＲＴ  ｍＲＮＡ又はＳＥＲＴタンパク質のレベルを測定することにより同定することができる。
【０１１０】
例として、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００５  Ａｕｇ；１０（８）：７８２−９，７１４及びＪ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．２００６；２６：５２７−４７に記載されたＳＥＲＴ特異的ｓｉＲＮＡを使用することができる。さらにより好ましい実施形態において、ＳＥＲＴ特異的ｓｉＲＮＡは、配列
【化２】
2013525330.tif 000011
を含有する。
【０１１１】
さらに他の実施形態において、ＳＥＲＴ特異的ｓｉＲＮＡは、表Ｘ中に記載した配列を含む。
【表２】
2013525330.tif 000012
【０１１２】
シナプス前部の５−ＨＴ１Ａの他に、ＴＲＥＫ−１又はＧＩＲＫなど５−ＨＴ１Ａ作用の下流の幾つかのイオンチャンネルを調節することにより、５−ＨＴ１Ａ作用を調節することも可能である。これらのチャンネルはカリウムの大きい内向き流速を生じさせることによって膜を過分極させることによりニューロン活性を調節する。膜電位におけるこの変化は、ニューロン発火を阻害する。ＴＲＥＫ−１又はＧＩＲＫの受容体活性化作用はニューロン活性を増強することが提案されている。これは末端において高レベルのセロトニンの存在でシナプス前部の５−ＨＴ１Ａ阻害効果を乱すであろう。
【０１１３】
他の実施形態において、本発明の核酸は、５−ＨＴ１Ａ作用の下流で作用するイオンチャンネルをコードするｍＲＮＡ（この場合核酸は標的と塩基対を形成することにより作用する）又は５−ＨＴ１Ａ自体の下流で作用するイオンチャンネル（この場合核酸は、直接結合してポリペプチドの活性を阻害することによりアプタマーとして作用する）を指向する。これらのチャンネルは、カリウムの大きい内向き流速を生じさせることによって膜を過分極させることによりニューロン活性を調節する。膜電位における変化はニューロン発火を阻害する。これは末端において高レベルのセロトニンの存在でシナプス前部の５−ＨＴ１Ａの阻害効果を乱すであろう。好ましい実施形態において、５−ＨＴ１Ａの下流で作用するイオンチャンネルはＴＲＥＫ−１又はＧＩＲＫである。
【０１１４】
本明細書中で使用する用語「ＴＲＥＫ−１」は、ＫＣＮＫ２、ＴＲＥＫ、ＴＰＫＣ１、Ｋ２ｐ２．１、ＴＲＥＫ１、ｈＴＲＥＫ−１ｃ、ｈＴＲＥＫ−１ｅ、ＭＧＣ１２６７４２、ＭＧＣ１２６７４４及びＫＣＮＫ２としても知られるポリペプチドを指し、２孔ドメインであるＫＣＮＫ２は、細胞からカリウムを漏らして静止膜電位を制御するチャンネルを創り出す２つのホモダイマーにより形成されるカリウムチャンネルの背景となる。しかしながら該チャンネルは、ある種の麻酔剤、膜の伸張、細胞内アシドーシス、及び熱により開くことができる。ヒトにおいては、ＴＲＥＫ遺伝子の代替的スプライシングから生ずるもので、ＮＣＢＩデータベースにおいて受入番号ＮＰ＿００１０１７４２４．１、ＮＰ＿００１０１７４２５．２及びＮＰ＿０５５０３２．１で提供される３種のイソ型がある。ＴＲＥＫ−１のイヌ（Canis familiaris）、チンパンジー（Pan troglodytes）、ウシ（Bos taurus）、ラット（Rattus norvegicus）及びマウス（Mus musculus）オルソログが、ＮＣＢＩタンパク質データベースにおいて、それぞれ受入番号ＸＰ＿８４９２７８、ＸＰ＿００１１７１６７７、ＮＰ＿７７７１１１、ＮＰ＿７４２０３８及びＮＰ＿０３４７３７で提供される。５−ＨＴ１ＡＲのｃＤＮＡを標的とする核酸についてと同様に、ＴＲＥＫ−１のｃＤＮＡ中の任意の領域は、対応するｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質のレベルにおいて実質的阻害を生ずる限り、標的とすることができる。したがって、適当なＴＲＥＫ−１特異的核酸は、上記のように前記細胞を試験すべき核酸と接触させた後にＴＲＥＫ−１を発現している細胞中のＴＲＥＫ−１  ｍＲＮＡ又はＴＲＥＫ−１タンパク質のレベルを測定することにより同定することができる。
【０１１５】
本発明のコンジュゲートにおいて使用することができるＴＲＥＫ−１特異的ｓｉＲＮＡとして、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより提供されるｓｃ−３７１８０  ｓｉＲＮＡ、及び米国特許出願第２００９３１７８１１号に記載されたアンチセンス分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
本明細書中で使用するＧタンパク質のカップリングした内向き整流カリウムチャンネル、ＧＩＲＫ又はＫｉｒ３．ｘという用語は、リガンドで刺激されたＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）で開始するシグナル伝達カスケードにより活性化される（開口する）内向き整流カリウムイオンチャンネルのファミリーの任意のメンバーを指す。ＧＰＣＲは、順送りで不活性なヘテロトリマーのＧタンパク質コンプレックス（Ｇαβγ）から活性化したＧ−タンパク質βγサブユニット（Ｇβγ）を放出する。最後にＧβγダイマーのタンパク質はＧＩＲＫチャンネルと相互作用してそれらを開口させ、その結果それらはカリウムイオンに透過性となり、細胞の過分極を生ずる。Ｇタンパク質のサブユニットによりＧＩＲＫチャンネルがこのように直接活性化されるので、Ｇタンパク質がカップリングした内向き整流カリウムチャンネルは、１種のＧタンパク質ゲート制御イオンチャンネルである。
【０１１７】
適当なＧＩＲＫとして、例えば、ＮＣＢＩ遺伝子データベースにおいて受入番号Ｕ３９１９６で同定されている核酸に対応するヒトＧＩＲＫ１又はＧＩＲＫｄとして知られるそれらの脳変種などのメンバー３（ＧＩＲＫ１又はＫｉｒ３．１としても知られる）、例えば、ＮＣＢＩ遺伝子データベースにおいて受入番号Ｕ２４６６０で同定されている核酸に対応するヒトＧＩＲＫ２などのメンバー６（ＧＩＲＫ２又はＫｉｒ３．２としても知られる）、例えば、ＮＣＢＩ遺伝子データベースにおいて受入番号Ｕ５２１５２で同定される核酸に対応するヒトＧＩＲＫ３などのメンバー９（ＧＩＲＫ３又はＫｉｒ３．３としても知られる）、例えばＮＣＢＩ遺伝子データベースにおいて受入番号Ｕ３９１９５で同定される核酸に対応するヒトＧＩＲＫ４などのメンバー５（ＧＩＲＫ４又はＫｉｒ３．４としても知られる）、例えばＮＣＢＩ遺伝子データベースにおいて受入番号Ｕ２４０５５で同定される核酸に対応するヒトＩＲＫ１などのメンバー２（ＩＲＫ１又はＫｉｒ２．１としても知られる）及び例えばＮＣＢＩ遺伝子データベースにおいて受入番号Ｕ０７３６４で同定される核酸に対応するヒトＩＲＫ３などのメンバー４（ＩＲＫ３又はＫｉｒ２．３としても知られる）を含むＪサブファミリーの全てのメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
ＧＩＲＫを標的とすることができる適当な核酸として、例えば、国際公開第２００５０５４８４８号に記載されたリボザイム、アンチセンス分子が挙げられる。
【０１１９】
５−ＨＴ１ＡＲ  ｍＲＮＡ若しくは５−ＨＴ１ＡＲタンパク質、ＳＥＲＴ  ｍＲＮＡ若しくはタンパク質、ＴＲＥＫ−１  ｍＲＮＡ若しくはタンパク質又はＧＩＲＫ  ｍＲＮＡ若しくはタンパク質を標的とするこれらの核酸は、５−ＨＴ１ＡＲ、ＳＥＲＴ、ＴＲＥＫ−１又はＧＩＲＫが発現している細胞、即ち、ドーパミン作動性ニューロン中に存在する神経伝達物質輸送体と結合することができる選択的作用剤とカップリングすることが好ましい。したがって、本発明のコンジュゲートとして、非選択的セロトニン輸送体（ＳＲＩ又はＳＮＲＩなど）又は、より好ましくは選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）であってよいセロトニン輸送体と結合することができる選択的作用剤とカップリングした５−ＨＴ１ＡＲ特異的核酸、ＳＥＲＴ特異的核酸、ＴＲＥＫ−１特異的核酸又はＧＩＲＫ特異的核酸が挙げられる。
【０１２０】
他の実施形態において、本発明のコンジュゲートの一部を形成する核酸はシヌクレインを指向する。
【０１２１】
本明細書中で使用する用語「シヌクレイン」は、ある種の神経疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病及びレヴィー小体病などで現れるレヴィー小体として知られる細胞内凝集物を形成し得る交換可能なアポリポタンパク質のクラスＡ２脂質に結合したドメインと類似性のある高度に保存されたα−ヘリカル脂質結合モチーフを含むシヌクレインメンバーファミリーのポリペプチドを指す。用語「シヌクレイン」は、α−シヌクレイン、β−シヌクレイン又はγ−シヌクレインを指す。好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートの一部を形成する核酸はα−シヌクレインに特異的である。
【０１２２】
ヒト、ラット、マウス及びウシのα−シヌクレインの配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいてそれぞれ受入番号Ｐ３７８４０、Ｐ３７３７７、Ｏ５５０４２及びＱ３Ｔ０Ｇ８で提供される。５−ＨＴ１ＡＲのｃＤＮＡを標的とする核酸でと同様に、α−シヌクレイン特異的核酸は、上記の任意の方法を使用して、同定し又は選択することができ、対応するｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質のレベルで実質的阻害を誘発するそれらの能力について試験することができる。したがって、適当なα−シヌクレイン特異的核酸は、上記のように、前記細胞を試験すべき核酸と接触させた後でα−シヌクレインを発現している細胞中のα−シヌクレイン  ｍＲＮＡ又はα−シヌクレインタンパク質のレベルを測定することにより同定することができる。
【０１２３】
好ましい実施形態において、α−シヌクレイン特異的核酸はヒトα−シヌクレインのｃＤＮＡの領域に対して指向する。他の実施形態において、本発明の核酸は、５−ＨＴ１Ａ作用の下流で作用するイオンチャンネルをコードするｍＲＮＡを指向するか（この場合核酸は標的と塩基対形成することにより作用する）又は５−ＨＴ１Ａ自体の下流で作用するイオンチャンネルを指向する（この場合、核酸は、直接結合してポリペプチドの活性を阻害することによりアプタマーとして作用する）。これらのチャンネルは、カリウムの大きい内向き流速を生ずることにより膜を過分極することによってニューロン活性を調節する。膜電位におけるこの変化はニューロン発火を阻害する。これは、高レベルのセロトニンの存在において末端でシナプス前部の５−ＨＴ１Ａ阻害効果を乱すであろう。好ましい実施形態において、５−ＨＴ１Ａの下流で作用するイオンチャンネルはＴＲＥＫ−１である。
【０１２４】
α−シヌクレインｍＲＮＡ内の適当な標的領域として、国際公開第０７１３５４２６号に記載されたもの（例えば核酸、及び特に、国際公開第２００６０３９２５３号に記載されたｓｉＲＮＡの群から選択された配列、例えば、
【化３】
2013525330.tif 000013
などを含むｓｉＲＮＡ又は配列番号：２１及び２２にそれぞれ対応する配列
【化４】
2013525330.tif 000014
を有するヘアピンオリゴヌクレオチド）
が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
他のシヌクレイン特異的ｓｉＲＮＡ配列は、米国特許出願第２００８１３９７９９号に記載されたもの（内容を引用により本明細書に組み込む実施例ＸＶＩＩに描かれた配列）及び国際公開第２００９０７９３９９号に記載され、
【化５】
2013525330.tif 000015
（表中＊はホスホロチオエート連結基を示し、下線を引いたヌクレオチドは２’−Ｏ−Ｍｅ改変を示す）
の群から選択されたｓｉＲＮＡ配列である。
【０１２６】
これらは、シヌクレインが発現している細胞中に存在する神経伝達物質輸送体に結合する選択的作用剤とカップリングしていることが好ましい。したがって、本発明のコンジュゲートは、モノアミン作動性ニューロン中への内部移行を媒介することができる選択的作用剤とカップリングしているシヌクレイン特異的核酸を含む。したがって、シヌクレインｍＲＮＡ又はタンパク質を標的とする核酸は、前記核酸のセロトニン作動性でノルアドレナリン作動性で且つ／又はドーパミン作動性のニューロン中への内部移行を促進することができる作用剤とカップリングされる。したがって、好ましい実施形態において、シヌクレイン特異的核酸は、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）、ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）（ＳＮＤＲＩ又はトリプルブロッカー）の群から選択される、セロトニン作動性でノルアドレナリン作動性で且つドーパミン作動性のニューロンに対する選択的作用剤とカップリングされる。
【０１２７】
他の実施形態において、本発明のコンジュゲートの一部を形成する核酸は一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）を指向する。
【０１２８】
本明細書中で使用する「一酸化窒素合成酵素」又は「ＮＯＳ」は、インビボで一酸化窒素の合成を触媒する天然に生ずる酵素を意味する。一酸化窒素（ＮＯ）は、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）と称する酵素のファミリーによりＬ−アルギニンのグアニジノ基から合成される。該用語は生体系に見出される一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）の全てのイソ型に適用され、ＮＯＳの常在型、内皮の一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、ニューロンの一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）、及び誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）を含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
ヒト、ラット、マウス、イヌ及びウシのｉＮＯＳの配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいてそれぞれ受入番号Ｐ３５２２８、Ｑ０６５１８、Ｐ２９４７７、Ｏ６２６９９及びＱ２７９９５で提供される。ヒト、ラット、マウス及びウシのｅＮＯＳの配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいてそれぞれ受入番号Ｐ２９４７４、Ｑ６２６００、Ｐ７０３１３及びＰ２９４７３で提供される。ヒト、ラット、マウス及びウシのｎＮＯＳの配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいてそれぞれ受入番号Ｐ２９４７５、Ｐ２９４７６、Ｑ９Ｚ０Ｊ４及びＰ２９４７３で提供される。
【０１３０】
ＮＯＳのｃＤＮＡ中の任意の領域は、それが対応するｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質のレベルで実質的阻害を生ずる限り標的とすることができる。したがって、適当なＮＯＳ特異的核酸は、上記のように、ＮＯＳを発現している細胞中のＮＯＳｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを、前記細胞を試験すべき核酸と接触させた後で測定することにより、又は処理された細胞中のＮＯＳの活性を定量することにより同定することができる。ＮＯＳ活性は、場合によっては、ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳ及びｎＮＯＳ活性を定量するために当技術分野において知られた任意の方法により測定することができる。例えば、ＮＯＳ活性は、［３Ｈ］−アルギニンの［３Ｈ］Ｌ−シトルリンへの変換を放射測定法により又はＧｒｉｅｓｓアッセイを使用して一酸化窒素の形成で測定することにより定量することができる。
【０１３１】
適当なＮＯＳ特異的サイレンシング作用剤として、国際公開第０８１００５９１号に記載され、以下のポリヌクレオチド対により得られるｎＮＯＳ特異的ｓｉＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない：
【化６】
2013525330.tif 000016
【化７】
2013525330.tif 000017
の配列を有するｉＮＯＳ特異的ｓｉＲＮＡ；
・オリゴ同定番号ＨＳＳ１０７３２６、ＨＳＳ１０７３２７及びＨＳＳ１０７３２８を有するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手可能なｅＮＯＳ特異的ｓｉＲＮＡ；
・Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ、２０１０、１６：１４２９−１４３５）の表２に記載されたｉＮＯＳ特異的ｓｉＲＮＡ；
【化８】
2013525330.tif 000018
の配列を有するｉＮＯＳ特異的ｓｉＲＮＡ。
【０１３２】
本発明における使用に適した実例になるＮＯＳ特異的アンチセンスとして：
・Ｇｒａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２００３，２２８：４９１−８）に記載された
【化９】
2013525330.tif 000019
の配列を有するｉＮＯＳ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド。
・ＨｅｍｍＲｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００３，２８５：Ｃ４８９−Ｃ４９８）により記載された
【化１０】
2013525330.tif 000020
の配列を有するｉＮＯＳ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド。
・国際公開第０１５２９０２号中の表１及び２に記載されたｉＮＯＳ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド。
・Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ，２０１０，１６：１４２９−１４３５）の表１中に記載されたｉＮＯＳ特異的アンチセンス分子
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
ＮＯＳ特異的サイレンシング作用剤は、ＮＯＳが発現している細胞中に存在する神経伝達物質輸送体と結合することができる選択的作用剤とカップリングしていることが好ましい。したがって、本発明のコンジュゲートは、モノアミン作動性ニューロン中への内部移行を媒介することができる選択的作用剤とカップリングしているＮＯＳ特異的核酸を含む。したがって、シヌクレインｍＲＮＡ又はタンパク質を標的とする核酸は、セロトニン作動性でノルアドレナリン作動性及び／又はドーパミン作動性のニューロン中への前記核酸の内部移行を促進することができる作用剤とカップリングされる。したがって、好ましい実施形態において、シヌクレイン特異的核酸は、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）、ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）（ＳＮＤＲＩ又はトリプルブロッカー）の群から選択されるセロトニン作動性でノルアドレナリン作動性で且つドーパミン作動性のニューロンに対する選択的作用剤とカップリングされる。
【０１３４】
他の実施形態において、本発明のコンジュゲートの一部を形成する核酸はノルアドレナリン輸送体を指向する。
【０１３５】
用語「ノルアドレナリン輸送体」、「ＮＡＴ」、「ノルエピネフリン輸送体」又は「ＮＥＴ」は、本明細書においては、神経伝達物質ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）及びドーパミンをシナプスからその小胞に後で使用するまで貯蔵するために輸送して戻すモノアミン輸送体を区別せずに指して使用される。ＮＥＴは長さが６１７アミノ酸であり、ＳＬＣ６Ａ２遺伝子によりコードされる１２の膜貫通型ドメインを含む。
【０１３６】
ヒト、イヌ（Canis familiaris）、チンパンジー（Pan troglodytes、ウシ（Bos taurus）、ラット（Rattus norvegicus）及びマウス（Mus musculus）のノルエピネフリン輸送体の配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいてそれぞれ受入番号Ｐ２３９７５、ＸＭ＿５４４３９８．２、ＸＭ＿００１１６７６８０．１、ＮＭ＿１７４６０８．２、ＮＭ＿０３１３４３．１及びＮＭ＿００９２０９．２で提供される。ＮＥＴｃＤＮＡ中の任意の領域は、それが前記ｍＲＮＡによりコードされる対応するｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルで実質的阻害を生ずる限り標的とすることができる。したがって、適当なＮＥＴ特異的核酸は、上記のように、ＮＥＴを発現している細胞中のＮＥＴ  ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを、前記細胞を試験すべき核酸と接触させた後で測定することにより同定することができる。
【０１３７】
適当なＮＥＴ特異的核酸として、インビトロジェンから受入番号ＨＳＳ１０９８５２、ＨＳＳ１０９８５３及びＨＳＳ１８５８５８で入手できるＲＮＡなど任意のＳＬＣ６Ａ２特異的ＲＮＡｉが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
他の実施形態において、本発明のコンジュゲートの一部を形成する核酸はドーパミン−β−ヒドロキシラーゼを指向する。
【０１３９】
本明細書中で使用する用語「ドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ」は、ドーパミンをノルエピネフリンに変換することができるポリペプチドを指す。
【０１４０】
ヒト、ラット、マウス及びウシのドーパミン−β−ヒドロキシラーゼの配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースにおいてそれぞれ受入番号ＮＰ＿０００７７８、ＮＰ＿０３７２９０、ＮＰ＿６２０３９２及びＮＰ＿８５１３３８で提供される。本発明による他の核酸を標的とする核酸についてと同様に、ドーパミン−β−ヒドロキシラーゼのｃＤＮＡ中の任意の領域は、それが対応するｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質のレベルで実質的阻害を生ずる限り標的とすることができる。したがって、適当なドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ特異的核酸は、上記のようにドーパミン−β−ヒドロキシラーゼを発現している細胞中のドーパミン−β−ヒドロキシラーゼｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを、前記細胞を試験すべき核酸と接触させた後で測定することにより同定することができる。
【０１４１】
適当なドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ特異的核酸として、
【化１１】
2013525330.tif 000021
の配列を有する国際公開第２００８０１９１５９号に記載された核酸並びにサンタクルーズバイオテクノロジーから（カタログ番号ｓｃ−３５１８０）、インビトロジェンから（カタログ番号ＨＳＳ１７５９５３、ＨＳＳ１７５９５４及びＨＳＳ１７５９５５）、アブノバから（カタログ番号Ｈ００００１６２１−Ｒ０１）、アプライドバイオシステムズから（ｓｉＲＮＡ  ｉｄｓ  ｓ３９４６、ｓ３９４７及びｓ３９４５）入手できる市販のドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ特異的ｓｉＲＮＡなどのドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ特異的核酸が挙げられるが、これに限定されない。
【０１４２】
ドーパミン−β−ヒドロキシラーゼｍＲＮＡ又はタンパク質を標的とするこれらの核酸は、ドーパミン−β−ヒドロキシラーゼが発現しており、所与の病態を引き起こしている神経伝達物質不足を補うためにドーパミン−β−ヒドロキシラーゼの減少が必要な細胞中に存在する神経伝達物質輸送体と結合することができる選択的作用剤とカップリングされることが好ましい。したがって、本発明のコンジュゲートは、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）と結合することができる選択的作用剤とカップリングしているドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ特異的核酸を含む。
【０１４３】
他の実施形態において、本発明のコンジュゲートの一部を形成する核酸はＢＡＸに特異的である。本明細書中で使用する用語「ＢＡＸ」又は「ＢＣＬ２会合Ｘタンパク質」は、その活性化が細胞レベル下の転座及び２量化に関与するプロアポトーシスのＢＣＬ−２ファミリーメンバーを指す。生存可能な細胞において、ＢＣＬ２会合Ｘタンパク質の実質的部分はモノマー状であり、細胞基質中か又は膜と緩く会合しているかのいずれかで見出される。死の刺激に続いて、細胞質のモノマー状ＢＣＬ２会合Ｘタンパク質はミトコンドリアに転座して、そこで架橋可能な内在性膜タンパク質になる。ＢＣＬ２会合Ｘタンパク質に特徴的なイオン伝導性膜の孔を形成する能力は、細胞死に至るミトコンドリアの機能不全の原因の一部であり得る（Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，１９９９，６４，３４３−３５０；Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０００，７，１１６６−１１７３）。用語「ＢＡＸ」は、ＢＡＸ−α（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ２２４７３）、ＢＡＸ−β（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ００４３２４））、ＢＡＸ−γ（Ｏｌｔｖａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９３，７４，６０９−６１９）、ＢＡＸ−δ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＩ３８２３０５）（Ａｐｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９５，２６，５９２−５９４）、ＢＡＸ−ω（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ００８１９６）（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，１１９３０−１１９３６）及びＢＡＸ−ε（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ００７８２６）（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９９，２５４，７７９−７８５）を含むそれらのスプライス変種のいずれかを指す。ＢＡＸ−α、ＢＡＸ−β及びＢＡＸ−γをコードするヌクレオチド配列は、米国特許第５，６９１，１７９及び第５，９５５，５９５号で開示及び特許請求されている。ＢＡＸ−ωをコードするヌクレオチド配列は米国特許第６，１４０，４８４号及び対応するＰＣＴ国際公開第９７／０１６３５号で開示及び特許請求されている。ヒトＢＡＸ−ωのエクソン５／イントロン５接合部に対して指向する２２塩基長アンチセンスオリゴヌクレオチドも米国特許第６，１４０，４８４号で開示されている。
【０１４４】
本発明によるコンジュゲートにおいて使用する適当なＢＡＸ特異的核酸として、
【化１２】
2013525330.tif 000022
の配列（中国特許第１０１２５５４２２号に記載）、
・（Ｍａｎｆｒｅｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１９９８，８，３４１−３５０）に記載されたヒトＢＡＸの塩基８３〜１０２及び１０３〜１２２並びに好中球（Ｄｉｂｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９９，９６，１３３３０−１３３３５）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、
・内容を引用により本明細書に組み込む米国特許出願第２００４００７７５８３号（表１及び３）に開示された任意の配列
が挙げられる。
【０１４５】
ＢＡＸのｍＲＮＡ又はタンパク質を標的とするこれらの核酸は、ＢＡＸが発現している細胞中に存在する神経伝達物質輸送体と結合することができる選択的作用剤とカップリングしていることが好ましい。したがって、本発明のコンジュゲートは、セロトニン作動性でノルアドレナリン作動性且つドーパミン作動性のニューロン中への内部移行を媒介することができる選択的作用剤とカップリングされているＢＡＸ特異的核酸を含む。したがって、好ましい実施形態において、選択的作用剤は、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）又はノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）又はセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＳＮＤＲＩ又はトリプルブロッカー）の群から選択される。
【０１４６】
他の実施形態において、本発明のコンジュゲートの核酸は、微小管会合タンパク質タウのｍＲＮＡ又はタンパク質を標的とする。用語「タウ」は、天然タウタンパク質モノマー、前駆体タウタンパク質、タウペプチド、タウ中間体、代謝物及びヒト（Ｐ１０６３６）、イヌ（ＸＭ＿８４４９３９）、チンパンジー（ＮＭ＿００１００９０６８．１）、マウス（Ｚ１２１３３）、ゼブラフィッシュ（ＢＩ９８１２８２．１）及び線虫（C. elegans）（ＮＭ＿００１０２７４０７．２）を含む任意の起源のタウ誘導体を含むタウタンパク質ファミリーの任意のタンパク質を指すが、これらに限定されず、それらは過リン酸化を受けてアルツハイマー病及び他のタウ病理の病原性に関与する対を形成するヘリカルフィラメント及び直線状フィラメントの縺れの自己集合体を生じ得る。
【０１４７】
適当なタウ特異的核酸として、
国際公開第２００５１１８８５８号に記載された下記配列を有するｓｉＲＮＡ
【化１３】
2013525330.tif 000023
米国特許第２００４２４１８５４号に記載された下記配列を有するｓｉＲＮＡ
【表３】
2013525330.tif 000024
【０１４８】
Ｃａｃｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，１１：１５１５−ｌ５２３）により記載された下記配列を有するタウ特異的アンチセンス核酸：
【化１４】
2013525330.tif 000025
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
これらのタウのｍＲＮＡ又はタンパク質を標的とする核酸は、好ましくは、タウが発現している細胞中に存在する神経伝達物質輸送体と結合することができる選択的作用剤とカップリングされている。したがって、本発明のコンジュゲートは、モノアミン作動性ニューロン、特に、セロトニン作動性でノルアドレナリン作動性且つドーパミン作動性のニューロン中への内部移行を媒介することができる選択的作用剤とカップリングされたタウ特異的核酸を含む。したがって、好ましい実施形態において、選択的作用剤は、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）又はノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）又はセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＳＮＤＲＩ又はトリプルブロッカー）の群から選択される。
【０１５０】
他の実施形態において、本発明のコンジュゲートの核酸は、ハンチンチンｍＲＮＡ又はタンパク質を標的とする。用語「ハンチンチン」は、ＵｎｉＰｏｒｔＫＢデータバンク受入番号Ｐ４２８５８の機能未知の３５０ｋＤａタンパク質並びに受入番号Ｌ１２３９２で預託された核酸配列によりコードされるタンパク質及びイヌ（ＮＣＢＩ受入番号ＸＰ＿５３６２２１．２）、チンパンジー（ＮＣＢＩ受入番号ＸＰ＿５１７０８０．２）、ウシ（ＮＣＢＩ受入番号ＸＰ＿８７１８５１．２）、ラット（ＮＣＢＩ受入番号ＸＰ＿５７３６３４．１）又はマウス（ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０３４５４４．１１）に見出されるそれらのオルソログ並びにＣＡＧ反復の拡大から生ずるそれらの変種（野生型タンパク質中のＣＡＧ６−３７から変異体タンパク質中のＣＡＧ３５−１２１反復へ）を指す。ＣＡＧ拡大はハンチンチンタンパク質中のポリグルタミン束の拡大を含む変異体タンパク質の産生を生ずる。
【０１５１】
適当なハンチンチン特異的核酸として、米国特許出願第２００８０３９４１８号Ａ中の表４及び５並びに米国特許第７３２０９６５号中の表１、２、７、８、９及び１０に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、米国特許出願第２００５０４２６４６号Ａに記載された。
【化１５】
2013525330.tif 000026
の配列を有するｓｉＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。ハンチンチンｍＲＮＡ又はタンパク質を標的とするこれらの核酸は、ハンチンチンが発現している細胞中に存在する神経伝達物質輸送体と結合することができる選択的作用剤とカップリングしていることが好ましい。したがって、本発明のコンジュゲートは、モノアミン作動性ニューロン、特にセロトニン作動性でノルアドレナリン作動性且つドーパミン作動性のニューロン中への内部移行を媒介することができる選択的作用剤とカップリングしているハンチンチン特異的核酸を含む。したがって、好ましい実施形態において、選択的作用剤は、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）又はノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）又はセロトニン−ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＳＮＤＲＩ又はトリプルブロッカー）の群から選択される。
【０１５２】
本発明による選択的作用剤及び核酸の適当な組合せを表Ｉにまとめる。
【０１５３】
【表４】
2013525330.tif 000027
【０１５４】
Ａ３．  本発明のコンジュゲートのリンカー領域
核酸と選択的作用剤とは直接カップリングすることができる。しかしながら、両部分を接続基により連結することが好ましい。
【０１５５】
本明細書において使用する用語「接続基」及び「リンカー」及びそれらと等価の用語は化合物の２つの部分を接続する有機部分を指して使用される。選択的作用剤は、核酸内の任意のセンス又はアンチセンスヌクレオチドに付くことができるが、３’末端ヌクレオチド及び／又は５’末端ヌクレオチドを通してカップリングできることが好ましい。内部コンジュゲートでは、リンカーを通してヌクレオチドにリボース基の２’位で、又は他の適当な位置に直接又は間接的に付けることができる。
【０１５６】
核酸が二重螺旋核酸である場合には、コンジュゲートはセンスの３’末端ヌクレオチド、センスの５’末端ヌクレオチド、アンチセンスの３’末端ヌクレオチド、及び／又はアンチセンスの５’末端ヌクレオチドに付いていてよい。
【０１５７】
定義又は慣例に制限されることは望まないが、本出願においてリンカーの長さは、コンジュゲート部分をリンカーに結びつける原子とオリゴヌクレオチドに結合してそれを通してリンカーがオリゴヌクレオチドに付く末端ホスフェート部分の酸素原子との間の最短距離を表す原子数を数えることにより記述する。リンカーが１つ又は複数の環構造物を含む場合には、最短経路で環を通る原子を数えることが好ましい。
【０１５８】
本発明において使用する適当なリンカー基として、改変された又は改変されていないヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリマー、糖類、炭水化物、ポリアルキレン、例えばポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールなど、ポリアルコール、ポリプロピレン、エチレングリコールとプロピレングリコールの混合物、ポリアルキルアミン、ポリアミン、例えばポリリシン及びスペルミジンなど、ポリエステル、例えばポリ（エチルアクリレート）、ポリホスホジエステルなど、脂肪族化合物、及びアルキレンが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、ω−アミノ−１，３−ジオール、ω−アミノ−ｌ，２−ジオール、ヒドロキシプロリノール、ω−アミノ−アルカノール、ジエタノールアミン、ω−ヒドロキシ−ｌ，３−ジオール、ω−ヒドロキシ−ｌ，２−ジオール、ω−チオ−ｌ，３−ジオール、ω−チオ−１，２−ジオール、ω−カルボキシ−ｌ，３−ジオール、ω−カルボキシ−１，２−ジオール、コヒドロキシ−アルカノール、ω−チオ−アルカノール、ω−カルボキシ−アルカノール、官能化オリゴエチレングリコール、アリルアミン、アクリル酸、アリルアルコール、プロパルギルアミン、プロパルギルアルコール等に基づくリンカー／リンカー化合物は、適当な長さのリンカーを生成するこの関係で適用することができる。
【０１５９】
リンカーは、改善された水溶性、コンジュゲート部分とオリゴヌクレオチドとの間の最適の分離距離、柔軟性（又はその欠如）、特定の配向、分岐など他の望ましい性質をオリゴヌクレオチドコンジュゲートに付与することもできる。
【０１６０】
好ましくは、前記接続基は以下の構造を有する：
【化１６】
2013525330.tif 000028
（式中、
ｍ、ｎ及びｐは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択され、
その際ｍ＋ｎ＋ｐの和は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７及び１８から選択される整数であり、及び
ｋは０又は１である）。
【０１６１】
好ましい実施形態において、ｐが５であり、ｎが２であり、ｋが１であり、及びｍが６であり、構造：
【化１７】
2013525330.tif 000029
を有するリンカーを与える。
他の好ましい実施形態において、ｐが５であり、ｎ及びｋが０であり、及びｍが６であり、構造：
【化１８】
2013525330.tif 000030
を有するリンカーを与える。
【０１６２】
特定の実施形態において、リンカーは、選択的作用剤のために２つ以上のカップリングを含む。好ましい実施形態において、リンカーは２価又は３価のリンカーであり、即ち選択的作用剤の２又は３個の分子がそれぞれカップリングすることができる。
【０１６３】
選択的作用剤の２つ以上の分子がリンカーを通して核酸にカップリングしている場合、前記分子は同じ選択的作用剤でも異なった選択的作用剤でもよい。
【０１６４】
特定の実施形態において、２価又は３価のリンカーは以下の式を有する：
【化１９】
2013525330.tif 000031
又は
【化２０】
2013525330.tif 000032
（式中、
ｍ、ｍ’、ｍ’’、ｎ、ｎ’、ｎ’’、ｐ、ｐ’、ｐ’’、ｒ、ｒ’、ｒ’’、ｓ、ｓ’、ｓ’’、ｔ及びｕは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から独立に選択され；
ｋ、ｋ’、ｋ’’及びｖは、０及び１から独立に選択され；及び
Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＯ、Ｃ（Ｏ）Ｏ及びＣ（Ｏ）ＮＨから独立に選択される）。
【０１６５】
上記の基の価数に依存して、分岐リンカーは対称的であることも非対称的であることもある。
【０１６６】
特定の実施形態において、ｐ及びｐ’が５であり、ｎ及びｎ’が２であり、ｋ及びｋ’が１であり、並びにｍ及びｍ’が６であるリンカーは、上に示した２価のリンカーである。特定の実施形態において、ｐ及びｐ’が５であり、ｎ，ｎ’、ｋ及びｋ’が０であり、並びにｍ及びｍ’が６であるリンカーは２価のリンカーである。
【０１６７】
特定の実施形態において、ｒ及びｒ’が４であり、ｓ及びｓ’が１であり、ｔ及びｖが０であり、並びにＸ１及びＸ２がＣ（Ｏ）ＮＨを表すリンカーは上に示した２価リンカーである。他の実施形態において、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔ及びｖが０であり、並びにＸ１及びＸ２がＣＨ２を表すリンカーは２価リンカーである。
【０１６８】
特定の実施形態において、ｐ及びｐ’が５であり、ｎ及びｎ’が２であり、ｋ及びｋ’が１であり、ｍ及びｍ’が６であり、ｒ及びｒ’が４であり、ｓ及びｓ’が１であり、ｔ及びｖが０であり、並びにＸ１及びＸ２がＣ（Ｏ）ＮＨを表すリンカーは２価のリンカーである。
【０１６９】
他の実施形態において、ｐ及びｐ’が５であり、ｎ及びｎ’が２であり、ｋ及びｋ’が１であり、ｍ及びｍ’が６であり、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔ及びｖが０であり、並びにＸ１及びＸ２がＣＨ２を表すリンカーは２価のリンカーである。
【０１７０】
他の実施形態において、ｐ及びｐ’が５であり、ｎ、ｎ’、ｋ及びｋ’が０であり、ｍ及びｍ’が６であり、ｒ及びｒ’が４であり、ｓ及びｓ’が１であり、ｔ及びｖが０であり、並びにＸ１及びＸ２がＣ（Ｏ）ＮＨを表すリンカーは２価のリンカーである。
【０１７１】
他の実施形態において、ｐ及びｐ’が５であり、ｎ、ｎ’、ｋ及びｋ’が０であり及びｍ及びｍ’が６であり、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔ及びｖが０であり、並びにＸ１及びＸ２がＣＨ２を表すリンカーは２価のリンカーである。
【０１７２】
特定の実施形態において、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’及びｎ’’が２であり、ｋ、ｋ’及びｋ’’が１であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が６であるリンカーは、上で示したように３価リンカーである。特定の実施形態において、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’、ｎ’’、ｋ、ｋ’及びｋ’’が０であり及びｍ、ｍ’及びｍ’’が６であるリンカーは３価リンカーである。
【０１７３】
特定の実施形態において、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり、並びにＸ１、Ｘ２及びＸ３がＯを表すリンカーは上で示したように３価リンカーである。他の実施形態において、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり、並びにＸ１、Ｘ２及びＸ３がＯを表すリンカーは３価リンカーである。
【０１７４】
特定の実施形態において、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’及びｎ’’が２であり、ｋ、ｋ’及びｋ’’が１であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり並びにＸ１、Ｘ２及びＸ３がＯを表すリンカーは３価リンカーである。
【０１７５】
他の実施形態において、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’及びｎ’’が２であり、ｋ、ｋ’及びｋ’’が１であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり並びにＸ１、Ｘ２及びＸ３がＯを表すリンカーは３価リンカーである。
【０１７６】
他の実施形態において、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’、ｎ’’、ｋ、ｋ’及びｋ’’が０であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり、並びにＸ１、Ｘ２及びＸ３がＯを表すリンカーは３価リンカーである。
【０１７７】
他の実施形態において、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’、ｎ’’、ｋ、ｋ’及びｋ’’が０であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり、並びにＸ１、Ｘ２及びＸ３がＯを表すリンカーは３価リンカーである。
【０１７８】
Ａ４．  本発明のコンジュゲートのターゲティング部分
本発明のコンジュゲートの他の改変は、核酸の活性、細胞分配又は細胞取り込みを増強する１つ又は複数の部分又はコンジュゲートを、核酸又は保護基に化学的に連結することを含む。そのような部分は、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４  ４  １０５３−１０６０）などの脂質部分、チオエーテル、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセリン又はトリエチル−アンモニウム  ｌ，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９９５，  ３６，  ３６５１−３６５４；  Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９０，  １８，  ３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）を含むが、これらに限定されない。
【０１７９】
あるいは、細胞分配を増大させ得る部分は、前記生物学的障壁中に存在する特異的輸送体を使用して受容体に媒介されるエンドサイトーシスの使用により生物学的障壁を越えて特異的に移動することができる低分子量化合物又はポリペプチドであり得る。取り込み受容体及び担体の広いアレイとそれに伴うさらに多数の受容体特異的リガンドは、当技術分野において知られている。本発明により使用する、エンドサイトーシス及び／又はトランスサイトーシスを媒介する受容体に対する好ましいリガンドとして、例えば、チアミン輸送体、フォレート受容体、ビタミンＢ１２受容体、アシアロ糖タンパク質受容体、α（２，３）−シアロ糖タンパク質受容体（例えば、受容体特異的リガンドとしてのラマ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなるＦＣ５及びＦＣ４４ナノボディを伴う）、トランスフェリン−１及び−２受容体、捕捉剤受容体（クラスＡ又はＢ、タイプＩ、ＩＩ又はＩＩＩ、又はＣＤ３６又はＣＤ１６３）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体（ＬＲＰｌ、タイプＢ）、ＬＲＰ２受容体（メガリン又は糖タンパク質３３０としても知られる）、ジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ、これはヘパリン−結合上皮性成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の膜結合前駆体である）、インスリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、サブスタンスＰ受容体、グルタチオン受容体、グルタメート受容体及びマンノース６−ホスフェート受容体に対する、又はそれらに特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【０１８０】
本発明にしたがって使用するこれらの受容体と結合する好ましいリガンドとして、例えば、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、α−２−マクログロブリン（α２Ｍ）、受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）、ラクトフェリン、デスモテプラーゼ、組織−及びウロキナーゼ−型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ／ｕＰＡ）、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤（ＰＡＩ−Ｉ）、ｔＰＡ／ｕＰＡ：ＰＡＩ−ｌ複合体、メラノトランスフェリン（又はＰ９７）、トロンボスポンジン１及び２、肝リパーゼ、第Ｖｌｌａ因子／組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、第ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、アベタール−４０、アミロイド−β前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、Ｃｌ阻害剤、補体Ｃ３、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）、シュードモナス外毒素Ａ、ＣＲＭ６６、ＨＩＶ−Ｉ  Ｔａｔタンパク質、ライノウイルス、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ−３）、スピンゴリピド活性化タンパク質（ＳＡＰ）、妊娠帯タンパク質、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補助因子ＩＩ、αｌ−アンチトリプシン、熱ショックタンパク質９６（ＨＳＰ−９６）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アポリポタンパク質Ｊ（ａｐｏＪ、又はクラステリン）、ａｐｏＪ及びａｐｏＥに結合したＡＢＥＴＡ、アプロチニン、ａｎｇｉｏ−ｐｅｐｌ、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、トランスフェリン、インスリン、レプチン、インスリン様成長因子、上皮性成長因子、レクチン、ペプチド模倣体及び／又はヒト化モノクローナル抗体又は前記受容体に特異的なペプチド（例えば、ヒトトランスフェリン受容体と結合する配列ＨＡＩＹＰＲＨ及びＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ、又は抗ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）モノクローナル抗体Ａ２４）、ヘモグロビン、ジフテリア毒素ポリペプチド鎖の無毒性部分、ジフテリア毒素Ｂ鎖の全体又は一部（ＤＴＢ−Ｈｉｓを含む（Ｓｐｉｌｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｔｏｘｉｃｏｎ．，４６（８）：９００−６により記載されたもの））、ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７の無毒性変異体の全体又は一部、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタンパク質Ｅ（例えば、ナノ粒子上のポリソーブ−８０コーティングに結合後）、ビタミンＤ−結合タンパク質、ビタミンＡ／レチノール結合タンパク質、ビタミンＢ１２／コバラミンプラズマ担体タンパク質、グルタチオン及びトランスコバラミン−Ｂ１２からなる群から選択されたリガンドが挙げられる。
【０１８１】
Ａ．５  保護基
本発明のコンジュゲートの核酸形成部分は、生体の異なった体液及び区画を通じたそれらの輸送中に、ヌクレアーゼ（エンド／エキソヌクレアーゼ）などの分解因子から保護されなければならない。この目的で、オリゴヌクレオチドは、酵素的消化に抵抗して、オリゴヌクレオチドのインビボ安定性及びバイオアベイラビリティを改善するように設計される。核酸は、ヌクレアーゼに媒介される分解を防止する基の存在により化学的に改変されることが好ましい。
【０１８２】
本発明の目的のために、「キャップ構造」又は「保護基」は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれた化学的改変を意味すると理解すべきである。５’−キャップの例として、反転した塩基脱落残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環状ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；改変塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオネート連結基；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−ｓｅｃｏヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分；３’−３’−反転塩基脱落部分；３’−２’−反転ヌクレオチド部分；３’−２’−反転塩基脱落部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホロアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３’−ホスホロチオネート；ホスホロジチオネート；又は架橋又は非架橋メチルホスホネート部分が挙げられるが、これらに限定されない。詳細は引用により本明細書に組み込まれる国際公開第９７／２６２７０号に記載されている。３’−キャップとしては、例えば、４’，５’−メチレンヌクレオチド；ｌ−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド：４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；ｌ，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；改変塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオネート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−ｓｅｃｏヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド部分；５’−５’−反転塩基脱落部分；５’−ホスホロアミデート；５’−ホスホロチオネート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５‘−アミノ；架橋及び／又は非架橋５’−ホスホロアミデート、ホスホロチオネート及び／又はホスホロジチオネート、架橋又は非架橋メチルホスホネート及び５’−メルカプト部分が挙げられる。引用により内容を本明細書組み込まれるＢｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９，１９２５を参照されたい。
【０１８３】
好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートの核酸配列に付けられたキャップ構造は、以下の一般的構造を有する：
【化２１】
2013525330.tif 000033
（式中、
Ｍは、Ｈ、脂質部分又は上で定義したターゲティング基であり；
Ａ及びＢは、単糖及び（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレングリコールからなる群から独立に選択されるモノマーユニットを表し；
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、ホスホジエステル、ホスホロチオネート、カルバメート、メチルホスホネート、グアニジニウム、スルファメート、スルファミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、スルホン、アミド及びそれらの混合物からなる群から独立に選択される連結化合物であり；
ａ及びｂは０から５０の範囲の整数であり；
ｃは０及び３０の範囲の整数であり；
ｄは少なくとも１の整数である）。
【０１８４】
本明細書中で使用する脂質部分は、脂肪、油脂、精油、ワックス、ステロイド、ステロール、リン脂質、糖脂質、スルホリピド、アミノリピド、クロモリピド（リポクローム）、及び脂肪酸を含むが、これらに限定されない親油性又は両親媒性の性質を有する有機化合物を指す。用語「脂質」は、天然の脂質及び合成で生成した脂質の両方を包含する。脂質部分は、通常、オリゴヌクレオチドの親油性を増大させてインビボにおけるオリゴヌクレオチド構造の細胞内取り込みを助長する。使用され得る適当な脂質として、脂肪酸；脂肪；油；ワックス；コレステロール；ステロール；ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＫなどの脂溶性ビタミン；モノグリセリド；ジグリセリド、及びリン脂質が挙げられる。好ましい脂肪酸は、ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）、ドコサン酸（Ｃ２２）、及びリトコール酸とオレイルアミンとのハイブリッド（リトコール−オレイルアミン、Ｃ４３）からなる群から選択されるものである。脂質は、標的組織、標的細胞、投与経路、オリゴヌクレオチドがたどると予想される経路等を考慮に入れることによって状況により当業者が選択できる。
【０１８５】
本明細書中で使用する用語「単糖」は、当技術分野において周知であり、ブロック又は部分を構成するより小さい糖にさらに分解することのできない単糖ユニットからなる糖の単純形態を指す。この接合基として好ましい糖部分は、フラノース、フルクトース、グルコース、ガラクトース、マンノース、改変された単糖、シアル酸及びエリトロース及びそれらの混合物からなる群から選択される。単糖は、その線状又は環状形態（ヘミアセタール環状異性体）にあることができる。フラノースは、Ｄ−リボース又はフルクトース残基（Ｄ−（−）−フルクトフラノース）などの５員フラン系環を含む任意の単糖である。単糖の組合せで、複数の糖構造物を得ることができる。フルクトオリゴサッカライド（ＦＯＳ）及びガラクトオリゴサッカライド（ＧＯＳ）は、二糖類のサッカロース又はラクトース、又は多糖類のイヌリン、デキストリン、デンプン若しくはグリコーゲンと同様に特に興味ある組合せである。
【０１８６】
本明細書中で使用する用語「アルキレングリコール」、「ポリ（アルキレングリコール）」「アルキレンオキシド」は、一般式−Ｏ−［（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−］ｎ−（式中、ｍは各アルキレングリコールユニット中に存在するメチレン基の数を表し、及びｎは反復ユニットの数を表し、それ故ポリマーのサイズ又は長さを表す）を共有するポリエーテルポリマーのファミリーを包含する。該用語は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジアルキレングリコール（例えば、ジエチレングリコール）、トリアルキレングリコール（例えば、トリエチレングリコール）、及び上記のグリコールの対応するモノ及びジ−アルキルエーテルなどのグリコール、（アルキルエーテルは１から６個の炭素原子（例えば、メチル、エチル、プロピルエーテル等）を有する低級アルキルエーテルである）を含むが、これらに限定されない。
【０１８７】
他の実施形態において、式（Ｉ）の基は、炭素原子が２から２０個の任意の線状又は分岐分子であってよい（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレングリコールモノマーユニット、又はａ及びｂの価に依存して、数個の（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレングリコールモノマーユニットを有するポリアルキレングリコールポリマーを有する。好ましくは、アルキレングリコール基は、Ｃ１６−Ｃ２０アルキレングリコールから選択される。さらにより好ましくは、アルキレングリコール基はＣ１８アルキレングリコールである。
【０１８８】
本発明のコンジュゲートに適切な保護基として、
【化２２】
2013525330.tif 000034
において、
・上の式（式中、ＭはＨであり、ｄが０であり、ＡはＰＥＧであり、Ｂは糖であり、ａ及びｂは各々１でありＬ１及びＬ２はホスホジエステル結合である）に対応するＰＥＧ＋糖；
・上の式（式中、ＡはＰＥＧであり、Ｂは糖であり、ａが１であり、ｂが２であり、ＭはＨであり及びｄが０であり及びＬ１及びＬ２はホスホジエステル結合である）に対応するＰＥＧ＋（糖）２；
・上の式（式中、ＡはＰＥＧであり、Ｂは糖であり、ａが２であり、ｂが１であり、ＭはＨであり及びｄが０であり及びＬ１及びＬ２はホスホジエステル結合である）に対応する（ＰＥＧ）２＋糖；
・上の式（式中、ＡはＰＥＧであり、Ｂは糖であり、ａが３であり、ｂが１であり、ＭはＨであり及びｄが０であり及びＬ１及びＬ２はホスホジエステル結合である）に対応する（ＰＥＧ）３＋糖；
・上の式（式中、ＡはＰＥＧであり、Ｂは糖であり、ａが５であり、ｂが１であり、ＭはＨであり及びｄが０であり及びＬ１及びＬ２はホスホジエステル結合である）に対応する（ＰＥＧ）５＋糖
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
用語「ＰＥＧ」及び「糖」は、本質的に上記のように使用され、糖としてフラノース及びＣ３、Ｃ９及びＣ１８のスペーサーの群から選択されたＰＥＧを含む。
【０１９０】
Ｂ．  本発明のコンジュゲートの構造物
本発明によるコンジュゲートの異なった要素は異なった様式で配列することができる。したがって、選択的作用剤は核酸の５’末端及び／又は３’末端にカップリングすることができる。さらに、核酸と選択的作用剤とは、直接連結することができ又はリンカーにより接続することができる。同様に、リンカーを核酸の５’末端及び／又は３’末端にカップリングすることができる。したがって、本発明の核酸が単一の核酸鎖を含有する場合、可能な配列は：
・５’末端に付けた選択的作用剤を含む核酸、
・３’末端に付けた選択的作用剤を含む核酸、
・５’ 末端に付けた選択的作用剤を含む核酸及び３’末端に付けた保護基、及び
・５’末端に付けた保護基及び３’末端に付けた選択的作用剤を含む核酸、
・第１の及び第２の選択的作用剤を含む改変された核酸であって、前記第１の及び第２の選択的作用剤は同じであるか又は異なり、両方の選択的作用剤が、核酸の５’末端に接続されている二官能性リンカーの２つの末端に接続されている核酸、
・第１の及び第２の選択的作用剤を含む改変された核酸であって、前記第１の及び第２の選択的作用剤は同じである又は異なり、両方の選択的作用剤が、核酸の３’末端に接続されている二官能性リンカーの２つの末端に接続されている核酸、
・４つの選択的作用剤を含む改変された核酸であって、前記選択的作用剤は同じである又は異なり、選択的作用剤の２つは核酸の５’末端に接続されている第１の二官能性リンカーの両末端に接続され、選択的作用剤の２つは核酸の３’末端に接続されている第２の二官能性リンカーの両末端に接続されている核酸
である。
【０１９１】
それに加えて、本発明のコンジュゲートは、標的分子の発現を調節する２つ以上の核酸鎖を含むことができる。例えば、本発明の構造物は、所与の標的分子の異なった領域を標的としたホスホジエステルを通して直列に結びつけた５個までの異なった核酸を含むことができる。
【０１９２】
さらに、核酸が２本鎖核酸であるこれらの場合には、選択的作用剤はセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖とカップリングすることができ、直接カップリングするか又はリンカー基により接続することができる。
【０１９３】
本発明のコンジュゲートの一部を形成する核酸は、それらが生体の種々の体液及び区画を通る輸送中にヌクレアーゼ（エンド／エキソヌクレアーゼ）などの分解因子から保護されなければならない。この目的で、オリゴヌクレオチドは、酵素による消化に抵抗し、且つオリゴヌクレオチドのインビボ安定性及びバイオアベイラビリティを改善するように設計しなければならない。細胞のエキソヌクレアーゼは遊離の５’末端を標的として使用する。したがって、一本鎖核酸の場合には、選択的作用剤は、核酸の５’にカップリングしたときに安定化部分として作用することができる。しかしながら、２本鎖核酸を含むコンジュゲート又は選択的作用剤が３’末端に連結している一本鎖核酸の場合に、コンジュゲートは、通常エキソヌクレアーゼの活性による核酸の分解を防止する基である安定化部分又はキャップ構造をさらに含むことができる。２本鎖核酸の場合、以下の可能な配列が存在する：
［１］選択的作用剤が鎖の一方の５’末端に付き、その場合キャップ構造を反対の鎖の５’末端に付けることが有用である。それに加えて、キャップ構造は１つ又は２つの３’末端に存在することもできる。
［２］選択的作用剤が鎖の一方の３’末端に付き、その場合キャップ構造をセンス鎖及びアンチセンス鎖の５’末端に付けることが有用である。それに加えて、キャップ構造は遊離３’末端に存在することもできる。
［３］同じであっても異なっていてもよい２つ以上の選択的作用剤を含むコンジュゲートであって、その場合、選択的作用剤はセンス鎖及びアンチセンス鎖の５’末端にカップリングしている。場合により、キャップ構造が１つ又は２つの遊離３’末端にカップリングしていてもよい。
【０１９４】
好ましい実施形態において、核酸は、選択的作用剤がアンチセンス鎖の５’末端に連結し、且つ保護基がセンス鎖の５’末端に連結している２本鎖ＲＮＡである。さらにより好ましい実施形態において、保護基は、構造
【化２３】
2013525330.tif 000035
（式中、ＭはＨであり、ｄが０であり、ＡはポリエチレングリコールのＣ１８スペーサーであり、Ｂはフラノースであり、ａが２であり、ｂ及びｃが１であり並びにＬ２及びＬ３はホスホジエステル結合である）
を有する。
【０１９５】
好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートは、
（ｉ）１種又は複数種の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１種の選択的作用剤であって、セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＲＩ）、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）からなる群から選択される選択的作用剤、及び
（ｉｉ）標的分子に特異的に結合することができる核酸であって、標的分子が、セロトニン受容体１Ａ型（５−ＨＴ１Ａ）、セロトニン受容体１Ａ型（５−ＨＴ１Ａ）をコードするｍＲＮＡ、セロトニン輸送体タンパク質及びセロトニン輸送体をコードするｍＲＮＡからなる群から選択される核酸
を含む。
【０１９６】
より好ましい実施形態において、セロトニン受容体１Ａ型（５−ＨＴ１Ａ）をコードするｍＲＮＡと特異的に結合することができる核酸は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４の群からなる配列を含む。
【０１９７】
さらにより好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートは、構造（Ｉ）
【化２４】
2013525330.tif 000036
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は水素及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｘ及びＹは、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＯＲａ及びＳＲｂから独立に選択され、ここでＲａ及びＲｂはＣ１〜Ｃ３アルキル及びＣ６〜Ｃ１０アリールから独立に選択され；
Ｗは、水素、ハロゲン、ＣＮ，ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＮＲｃＲｄ、ＳＯ２ＮＲｅＲｆ、ＮＲｇＳＯ２Ｒｈ、ＣＯ２Ｒｉから選択され、ここでＲｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ及びＲｉは、水素及びＣ１〜Ｃ３アルキルから独立に選択され；
ｍ、ｎ及びｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択され、ここでｍ＋ｎ＋ｐの和は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７及び１８から選択される整数であり、並びに
オリゴヌクレオチドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４の群から選択された配列を含む）
を有する。
【０１９８】
他の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、構造：
【化２５】
2013525330.tif 000037
（式中、オリゴヌクレオチドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４の群から選択された配列を含む）
を有する。
【０１９９】
さらにより好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートは、構造（ＸＩＶ）
【化２６】
2013525330.tif 000038
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、水素及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｘ及びＹは、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＯＲａ及びＳＲｂから独立に選択され、ここでＲａ及びＲｂはＣ１〜Ｃ３アルキル及びＣ６〜Ｃ１０アリールから独立に選択され；
Ｗは、水素、ハロゲン、ＣＮ，ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＮＲｃＲｄ、ＳＯ２ＮＲｅＲｆ、ＮＲｇＳＯ２Ｒｈ、ＣＯ２Ｒｉから選択され、ここでＲｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ及びＲｉは、水素及びＣ１〜Ｃ３アルキルから独立に選択され；
ｍ及びｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択され、ここでｍ＋ｐの和は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７及び１８から選択される整数であり、並びに
オリゴヌクレオチドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４の群から選択された配列を含む）
を有する。
【０２００】
特定の実施形態において、コンジュゲートは、構造
【化２７】
2013525330.tif 000039
（式中、オリゴヌクレオチドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４の群から選択された配列を含む）
を有する。
【０２０１】
さらに他の好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートは、センス鎖の５’末端が保護基とカップリングし、アンチセンス鎖の５’末端が選択的作用剤とカップリングしている２本鎖核酸を含む。保護基が、構造：
【化２８】
2013525330.tif 000040
（式中、ＭはＨであり、ｄが０であり、ＡはポリエチレングリコールのＣ１８スペーサーであり、Ｂはフラノースであり、ａが２であり、ｂ及びｃが１であり並びにＬ２及びＬ３はホスホジエステル結合である）を有する場合及び保護基がセルトラリンである場合、本発明の化合物は、構造：
【化２９】
2013525330.tif 000041
を有する。
【０２０２】
さらにより好ましい実施形態において、本発明の化合物は、構造：
【化３０】
2013525330.tif 000042
を有する。
【０２０３】
さらにより好ましい実施形態において、本発明の化合物は、構造：
【化３１】
2013525330.tif 000043
を有する。
【０２０４】
他の実施形態において、コンジュゲートは、以下の構造：
【化３２】
2013525330.tif 000044
（式中、
Ｒ１は水素、低級アルキル基又はベンジル基を表し、
Ｒ２は水素、メチル、塩素又はフッ素基を表し、
Ｒ２’は水素、メチル、メトキシ、ヒドロキシル又はハロゲン原子を表し、
Ｒ３及びＲ４は水素、低級アルキル基を表し、
Ｒ５は５−又は６−位における水素、塩素又はメトキシ基を表し、且つ
ｐは２〜６である）
を有する。
【０２０５】
さらにより好ましい実施形態において、コンジュゲートは、以下の構造
【化３３】
2013525330.tif 000045
を有する。
【０２０６】
さらにより好ましい実施形態において、上で定義したコンジュゲートの一部を形成するオリゴヌクレオチドは：
・ドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ、
・ドーパミン−β−ヒドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡ、
・ＢＡＸ、
・ＢＡＸをコードするｍＲＮＡ、
・タウ、
・タウをコードするｍＲＮＡ、
・ハンチンチン及び
・ハンチンチンをコードするｍＲＮＡ
からなる群から選択された標的分子に特異的に結合することができる。
【０２０７】
本発明の趣旨において、式の保護基は、連結化合物（式（Ｉ）の基中でＬ”として参照される）によりオリゴヌクレオチドの５’−ＯＨ又は３’−ＯＨ基に連結することができ、したがってコンジュゲート−オリゴヌクレオチドを得ることができる。オリゴヌクレオチド及び式（Ｉ）の基の化学的性質により、数通りの実施形態が可能になる。
【０２０８】
例えば、単一のオリゴヌクレオチド分子中に、該オリゴヌクレオチドが二重螺旋か又は一本鎖かに依存して可変の、典型的には２から４個の式（Ｉ）の基を連結することが可能であるが、ただし、連結は５’−ＯＨ及び／又は３’−ＯＨを通して行われる。数個の式（Ｉ）の基の鎖をオリゴヌクレオチドに連結することも可能であり、前記式（Ｉ）の基は、分子及び／又はオリゴヌクレオチドの間にホスホジエステル結合を生成させるホスホルアミダイト誘導体などの連結化合物により互いに連結される。オリゴヌクレオチド構造は、オリゴヌクレオチドの１つの末端に連結した数個の式（Ｉ）の基の鎖及びオリゴヌクレオチドの他の末端に連結した式（Ｉ）の他の基も含むことができる。
【０２０９】
本発明のヌクレオチド構造は、オリゴヌクレオチドの２つの鎖の５’−ＯＨ及び３’−ＯＨ末端の中で可能な全ての組合せで分布した又は式（Ｉ）の基に結びついた２つ以上のターゲティング作用剤を含むことができる。さらに、２種以上ターゲティング作用剤があれば、これらを、式（Ｉ）の基及び／又はオリゴヌクレオチドに直列に連結することができる。
【０２１０】
オリゴヌクレオチド構造が２種以上ターゲティング作用剤を含めば、異なった組合せが可能である。例えば、保護基を、オリゴヌクレオチド鎖の１つの５’−ＯＨ又は３’−ＯＨ末端基に連結することができる。他の可能な組合せは、１方のオリゴヌクレオチド鎖の５’−ＯＨ基に連結した薬剤化合物及び他方のオリゴヌクレオチド鎖に結合した式（Ｉ）の基の末端ユニットに結びついたひと続きのアプタマーを含む。
【０２１１】
Ｃ．  本発明の医薬組成物
本発明者らは、本発明のコンジュゲートがコンジュゲートの核酸配列により標的とされた核酸の発現を調節する能力を有することを見出した。例えば、シナプス前部の５−ＨＴ１ＡＲに特異的な核酸を含むコンジュゲートの場合、該構造物が対象者に投与されると、それは対象者の中脳縫線核（即ちセロトニン作動性ニューロンの集まりが位置する脳中の領域）中の５−ＨＴ１ＡＲの特異的ノックダウンを効果的に誘発することができる。
【０２１２】
したがって、当業者は、本発明のコンジュゲートが、本発明のコンジュゲート中に存在する核酸により標的とされる遺伝子の発現レベルの低下から利益を得る疾患の治療のために適していることを理解するであろう。したがって、他の態様において本発明は医薬で使用する本発明によるコンジュゲートに関する。それに加えて、本発明は、本発明によるコンジュゲート及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物にも関する。
【０２１３】
適当な量の本発明のオリゴヌクレオチド構造物は、薬学的に許容される賦形剤及び／又は担体とともに剤形化して医薬組成物にすることができる。本発明によるコンジュゲートを含む組成物は、種々の経路により対象者に送達することができる。典型的経路は、線条体内、脳室内、髄腔内、実質内（例えば、線条体内）、鼻内、及び眼内送達を含む。組成物は、全身的に、例えば、静脈内、皮下又は筋肉注射により送達することもでき、それはコンジュゲートを末梢ニューロンに送達するために特に有用である。それに加えて、本発明のコンジュゲートを鼻内に投与することも可能で、それにより非侵襲的投与様式による全身性投与が可能になる。心室内投与も適切なことがある。好ましい送達経路は脳へ直接、例えば、脳室又は脳の視床下部中へ、又は脳の側方又は背側の領域中へである。
【０２１４】
本発明の医薬組成物は、複数の異なったコンジュゲートを含むことができて、その場合、異なったコンジュゲートは、同じ標的分子の異なった領域を標的とする核酸を含む。したがって、医薬組成物は、各々異なった核酸を含む少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６種以上の異なったコンジュゲートを含むことができる。
【０２１５】
当業者は、いずれも参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１７ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５）並びにＧｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，１９９０）などの広く知られ利用可能な資料で論じられている原理及び手順を熟知している。
【０２１６】
好ましい実施形態において、コンジュゲートは、標準的手順にしたがってヒト及び他の哺乳動物に送達される投与に適合した医薬組成物として剤形化される。通常、静脈内又は心室内投与用の組成物は滅菌等張緩衝水溶液である。
【０２１７】
必要な場合、組成物は、注射部位における何らかの疼痛を緩和するために可溶化作用剤及び局所麻酔薬も含むことができる。一般的に、含有成分は、アンプル又は活性作用剤の量を示す薬袋などの気密の密封容器中で、例えば、凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別々に又は単位剤形中に一緒に混合してのいずれかで供給される。組成物を点滴により投与すべき場合、薬学的規格の滅菌水又は食塩水を含む点滴瓶で投薬することができる。組成物が注射により投与される場合、含有成分を投与前に混合することができるように、注射用滅菌水又は食塩水のアンプルを提供することができる。
【０２１８】
静脈内投与以外の場合、組成物は少量の加湿剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することができる。組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、ゲル、ポリマー、又は徐放化剤形にすることができる。組成物は、当技術分野において知られている伝統的結合剤及び担体を用いて剤形化することができる。剤形は、薬学グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、糖ナトリウム、セルロース、酸化マグネシウムなどの標準的担体、医薬の製造における機能性が十分確立されている不活性担体を含むことができる。リポソーム、微粒子、マイクロカプセル等中へのカプセル化を含む種々の送達システムが知られており、本発明の治療剤を投与するために使用することができる。
【０２１９】
さらに他の好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートを含む治療剤は、中性又は塩形として剤形化することができる。薬学的に許容される塩として、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されたものなど遊離アミノ基で形成されたもの、及び水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導されたものなど遊離カルボキシル基で形成されたものが挙げられる。
【０２２０】
組成物が血液脳関門を越えて送達される実施形態について、組成物は、例えば、例えば、米国特許第６，３７２，２５０（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ）に記載されたリポソーム、及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書中に記載するリポソームは、生物学的に活性な作用剤を血液脳関門を越えて送達することができ、続いて脳中で発現する。リポソーム及びナノ粒子は、薬剤カプセル化のために一般的に使用されるナノ容器の典型的形態である。リポソームの直径は、好ましくは２００ナノメートル未満である。リポソームの直径は５０ナノメートルと１５０ナノメートルの間が好ましい。特に好ましいのは、外径が約８０ナノメートルのリポソーム又は他のナノ容器である。適当なタイプのリポソームは、リポソーム内のＤＮＡを安定化するために、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、ジホシファチジルホスホコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）などの中性リン脂質を、又は少量（１パーセント）の臭化ジドデシルジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）などのカチオン性脂質と一緒にコレステロールを用いて作製される。
【０２２１】
リポソームは、ＤＮＡをカプセル化して、剤形が未だ血液中にある間又は血液から標的細胞の細胞内区画に移るときに核酸をヌクレアーゼからから保護することができるナノ粒子又は直径が２００ｎｍ未満の任意の他の分子のナノ容器で置き換えることができる。ＰＥＧ鎖などの接合剤を使用する代わりに、スフィンゴミエリンなどの１種又は複数種の他のポリマー状物質も、リポソーム又はナノ容器の表面に付けて、「輸送可能なペプチド」をコンジュゲーションするための足場を提供すること及び剤形の血液からの除去を遅らせて血漿薬物動態を最適化することの二重の目的に役立てることができる。さらに、本発明は、特異的標的受容体を有する細胞又は器官の任意の群にＤＮＡを送達することを意図する。リポソームはＤＮＡを肝臓、肺及び脾臓などの器官に送達するために使用することができる。
【０２２２】
本発明のコンジュゲートを送達するための他の適当な容器として、デンドリマーが挙げられる。用語「デンドリマー」は、コア及びコアから放射状に出る分岐構造の複数の骨組みを有する巨大分子を指す。デンドリマー担体の形状及びサイズは様々であり得る。幾つかの例において、デンドリマー担体は、形状がおよそ球形又は球状であり得る。さらに、デンドリマー担体は、対応する分子量範囲、例えば、約５００ダルトンから約２百万ダルトンで、約１５オングストローム（Ａ）から約２５０Ａの範囲内の直径を有することができる。デンドリマーは、種々の供給源（例えば、Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ、Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）から市販品として得るか又は当業者に知られた方法により合成することができる。デンドリマー分子は、低分子量種と高分子量種とに大まかに分けることができる。第１のカテゴリーは、デンドリマー及びデンドロンを含むが、それに対して第２のカテゴリーはデンドロン化したポリマー、超分岐ポリマー、及びブラッシポリマー（ボトルブラッシとも呼ばれる）を包含する。デンドリマー及びデンドロンは、繰り返し分岐し、単分散で、及び通常高度に対称性の化合物である。デンドリマーとデンドロンの定義で明確な相違はない。デンドロンは、通常焦点があると言われる単一の化学的に指定可能な基を含む。モル質量分布がないので、高いモル質量のデンドリマー及びデンドロンは巨大分子であるがポリマーではない。デンドリマーの性質は、分子の表面の官能基により支配される。機能的分子のデンドリマーカプセル化は、デンドリマーの足場が内部的機能と外部的機能とを分離するので、活性な部位、生体材料中の活性な部位の構造を模倣する構造物の単離を可能にする。例えば、デンドリマーは、その末端基がカルボキシル基のような親水性基である場合、水溶性であることができる。
【０２２３】
デンドリマーは、以下の特徴により一般的に特徴づけることができる：（ｉ）１つ又は複数の反応部位を有し、点様であるか又は有意のサイズがあり、デンドリマーの最終的立体配置に影響する開始剤コア（Ｉ）；（ｉｉ）開始剤コアに付いた分岐した反復ユニットの１つ又は複数の層；（ｉｉｉ）場合により連結基を通してデンドリマー表面に付いたアニオン性又はカチオン性基などの機能的末端基。
【０２２４】
本明細書において考慮するデンドリマーは、ユニットを構築するリシン、又はリシン類似体を含むことができる。用語「リシン類似体」は、構築ユニットの前の層に付くための単一の尖端カルボキシル基、及び構築ユニット、遮断基、リンカー又はアリール酸基がさらに付くことができる２つ又は３つの第一級アミン基を有する分子を指す。本明細書において考慮する「リシン類似体」の例は、ＰＣＴ／ＡＵ２００７／０００３５２に記載され、例えばグリシル−リシンである。幾つかの特定の例において、デンドリマーは、構築ユニットとしてリシンのみ又はリシン類似体の１つのタイプを含む。
【０２２５】
本明細書において考慮する他のデンドリマーとして、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エーテルヒドロキシルアミン）（ＰＥＨＡＭ）又はポリプロピレンイミン構築ユニットを含むものが挙げられる。特定のそれらの例においては、デンドリマーは、構築ユニットとして、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エーテルヒドロキシルアミン）（ＰＥＨＡＭ）又はポリプロピレンイミンのみを有する。
【０２２６】
コア部分は、構築ユニットへの付加点を１つのみを含むことができるか又は構築ユニットが付くためにさらに利用できるか又はできない２若しくは３個以上の点を含むことができる。典型的には、付加点は遊離アミノ基である。コア部分は、構築ユニットからなるか、それを含むか又はそれから誘導することができ、構築ユニットと異なった分子であってよい。典型的コア部分は、本明細書中で例示し、及びＰＣＴ／ＡＵ２００７／０００３５２に記載されている。
【０２２７】
リポソーム及びデンドリマーは、静脈内投与のために、任意の適当な薬学的担体と組み合わせることができる。組成物の静脈内投与は、その侵襲性が最小なので好ましい経路である。他の投与経路は、所望であれば可能である。適当な薬学的に許容される担体として、食塩水、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、又は任意の他の水溶液が挙げられる。適当な用量は、当業者に周知の手順により確立することができる。
【０２２８】
Ｄ．  本発明のコンジュゲートの治療的使用
本発明のコンジュゲートで治療することができる臨床状態はコンジュゲートの一部を形成する核酸の特異性に依存するであろうということは理解されるであろう。したがって、本発明のコンジュゲートは、神経伝達物質輸送体を発現する細胞中の関心のある遺伝子をノックダウンすることにより改善することができる任意の疾患の治療のために使用することができる。当業者は、コンジュゲートが、細胞中におけるタンパク質の異常な発現（例えば、レヴィー小体中におけるα−シヌクレインの蓄積）により特徴づけられる疾患又は標的タンパク質が正常レベルで発現しているが前記標的タンパク質の発現を減少させることにより改善することができる疾患の治療のために有用であることを理解するであろう。
【０２２９】
Ｄ．１．  セロトニン作動性ニューロン中に位置する５−ＨＴ１Ａ受容体、セロトニン輸送体又はイオンチャンネルを標的とする核酸を含むコンジュゲート
上記のように、ＳＳＲＩがそれを必要とする対象者に投与される場合、セロトニン作動性ニューロン中に位置する５−ＨＴ１Ａ受容体（シナプス前部の５−ＨＴ１ＡＲ）の活性化の結果として生ずる負のフィードバック機構がある。ＳＳＲＩの作用は、セロトニン作動性ニューロン中に位置するセロトニン再取り込み輸送体（ＳＥＲＴ）により媒介されるセロトニン再取り込みの遮断により誘発される高いセロトニンレベルをもたらす。このことはシナプス後部のセロトニン受容体だけでなく、細胞のためのフィードバックセンサとして役立つシナプス前部の５−ＨＴ１ＡＲも活性化するであろう。これらの５−ＨＴ１ＡＲの活性化は、細胞発火の抑制及びインパルス依存性セロトニン放出の故にセロトニンレベルの低下を引き起こし、それ故投与されたＳＳＲＩの効果を制限する。
【０２３０】
この効果は、例えば本発明の実施例２及び３に示し、そこで、セルトラリン及び５−ＨＴ１ＡＲ特異的ｓｉＲＮＡを含むコンジュゲートの注入が、選択的５−ＨＴ１ＡＲアゴニスト）により誘発される体温低下応答を防止することができることが示される。この効果により、コンジュゲートの一部を形成する核酸に相補的な遺伝子の発現をノックダウンするとこが望ましい場合に、これら全ての臨床状態における本発明のコンジュゲートの使用を可能になる。
【０２３１】
これは、本発明のオリゴヌクレオチドが市販のＳＳＲＩの上記の好ましくない作用、即ち、作用の遅い発現及び有効性の限定を打ち消すために役立ち得るので、抗鬱療法分野における重要な発見である。それに加えて、本発明の高度に選択的なオリゴヌクレオチド構造を使用することにより、低用量の治療用オリゴヌクレオチドが、所望の効果を得るために投与される必要があるにすぎない。結果として、本発明の構造物は、シナプス領域に存在する異常な濃度のセロトニンと関連する疾患、特にセロトニンの不十分な伝達（即ちシナプスにおけるセロトニン濃度の低下したレベル）と関連する疾患、例えば鬱病関連障害などの治療に有用である。
【０２３２】
したがって、核酸がシナプス前部のセロトニン作動性のニューロンの成分を標的としていれば、コンジュゲートは、シナプス前部のセロトニン作動性のニューロンの活性低下が必要な疾患の治療に適するであろう。したがって、他の態様において、本発明は、
（ｉ）選択的作用剤が、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）又はノルアドレナリン作動性及び特異的セロトニン作動性の抗鬱剤（ＮＡＳＳＡ）の群から選択され、及び
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、セロトニン受容体１Ａ型（５−ＨＴ１Ａ）ｍＲＮＡ、セロトニン輸送体ｍＲＮＡ、ＴＲＥＫ−１ｍＲＮＡ、セロトニン受容体１Ａ型（５−ＨＴ１Ａ）ポリペプチド、セロトニン輸送体ポリペプチド及びＴＲＥＫ−１ポリペプチドの群から選択される標的分子に特異的に結合することができる、
鬱病関連障害の治療又は予防において使用するための本発明のコンジュゲートに関する。
【０２３３】
あるいは、本発明は、本発明のコンジュゲートをそれを必要とする対象者に投与することを含む鬱病関連障害の治療又は予防のための方法であって、
（ｉ）選択的作用剤が、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）又はノルアドレナリン作動性及び特異的セロトニン作動性の抗鬱剤（ＮＡＳＳＡ）の群から選択され、及び
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、セロトニン受容体１Ａ型（５−ＨＴ１Ａ）をコードするｍＲＮＡ、セロトニン輸送体ｍＲＮＡ、ＴＲＥＫ−１  ｍＲＮＡ、セロトニン受容体１Ａ型（５−ＨＴ１Ａ）ポリペプチド、セロトニン輸送体ポリペプチド及びＴＲＥＫ−１ポリペプチドの群から選択される標的分子に特異的に結合することができる
方法に関する。
【０２３４】
本明細書中で使用する発現「鬱病関連障害」とは、シナプス中の異常に低レベルのセロトニンを特徴として、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣにより出版されたＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ−−第４版（ＤＳＭ−ＩＶ）において定義された状態のことであり、限定されないが、大鬱病、長期の鬱病、難治性鬱病、気分変調症；絶望、落胆、「ブルー」、憂鬱症、自尊心喪失、罪悪間及び自責の念、対人接触からの逃避、及び食事及び睡眠の乱れなどの肉体症状により特徴づけられる抑鬱した気分の精神状態を含むが、これらに限定されない。好ましくは、鬱病関連障害は、：大鬱病、妄想−強迫性障害（ＯＣＤ）、広汎性発達障害（ＰＤＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安障害、双極性障害、食餌障害及び慢性疼痛を含む群から選択される。
【０２３５】
それに加えて、作動性ニューロンに特異的な選択性試薬及び５−ＨＴ１Ａ受容体を下方制御するオリゴヌクレオチドを含む本発明のコンジュゲートにより、前頭前野の皮質におけるセロトニン放出が、抗鬱剤単独により生じた５０％増加と比較してベースライン値の約１５０〜２００％増加した（図８参照）。前に言及したように、伝統的抗鬱剤はセロトニンの伝達を改善するように設計されているが、シナプス前部の５−ＨＴ１Ａ受容体の活性化に基づく効果は限られている。したがって、本発明の構造のオリゴヌクレオチドを用いれば、前記抗鬱剤の主な限界（作用の遅い発現及び限られた有効性）が克服される。その結果、抗鬱治療に対する正の応答を短期間内に得ることができ、市販の抗鬱剤（即ちＳＳＲＩ）のみ用いる治療と比較して治療に応答する患者の数を改善することができる。したがって、他の態様において、本発明は、本発明によるコンジュゲートと抗鬱剤との投与を含む鬱病関連障害の治療方法に関する。
【０２３６】
本発明のオリゴヌクレオチド構造物は、現行の抗鬱剤（ＳＳＲＩ、ＮＡＲＩｓ、ＭＡＯＩ、ＴＣＡ等．）とともに同時に投与することができる。５−ＨＴ１Ａ自己受容体の発現を遮断するオリゴヌクレオチド配列の投与は、再取り込み遮断により生じた細胞外５−ＨＴの増加の減弱を阻止することにより、これらの抗鬱剤の効果を改善することを可能にする。
【０２３７】
Ｄ．２．シヌクレインを標的とする核酸を含むコンジュゲート
他の態様において本発明は、
（ｉ）選択的作用剤が、ドーパミン再取り込み阻害剤（ＤＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）の群から選択され、及び
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、α−シヌクレインをコードするｍＲＮＡ又はα−シヌクレインポリペプチドである標的分子に特異的に結合することができる、
レヴィー小体の堆積と関連する疾患の治療又は予防のための本発明のコンジュゲートに関する。
【０２３８】
用語「レヴィー小体の堆積と関連する疾患」は、異常なニューロンのα−シヌクレイン封入体の形成を生じさせるα−シヌクレイン代謝の障害により特徴づけられる状態を指す。より特定のレヴィー小体障害には、パーキンソン病（ＰＤ）、レヴィー小体（ＤＬＢ）型認知症、認知症を伴うＰＤ（ＰＤＤ）及び多系統萎縮症が含まれる。
【０２３９】
好ましくは、本発明のコンジュゲートは、鬱病及び／又は鬱病関連障害の治療のためにＳＳＲＩなどの市販の抗鬱剤と一緒に投与することができる。
【０２４０】
Ｄ．３．  ノルエピネフリン輸送体を標的とする核酸を含むコンジュゲート
背景技術の節で説明したように、中脳皮質ＤＡ伝達の増大は統合失調症の治療に有用である。ＮＡ輸送体（ＮＡＴ）は、ＮＡ及びＤＡに対して同様な親和性を示すので、ＮＡＴ阻害剤は内側ＰＦＣ（ｍＰＦＣ）の細胞外ＤＡ濃度を、尾状核及び核側坐核（ＮＡｃ）と比較して優先的に増大させる。それ故、遺伝子座位青斑核（ＬＣ）ニューロンからのＮＡ軸索は、ＰＦＣ中の細胞外ＤＡ濃度を、ＤＡを取り込むか又は共放出するかのいずれかにより調節することに寄与し得る。
【０２４１】
他の態様において本発明は、
（ｉ）選択的作用剤が、ドーパミン再取り込み阻害剤、ノルアドレナリン再取り込み阻害剤、セロトニン−ノルアドレナリン再取り込み阻害剤及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）の群から選択され、及び
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドがノルエピネフリン輸送体又はノルエピネフリンポリペプチドをコードするｍＲＮＡである標的分子に特異的に結合することができる、
ノルエピネフリン再取り込み阻害により媒介されるか又はそれに応答する疾患の治療又は予防のための本発明のコンジュゲートに関する。
【０２４２】
そのような病態の例として、神経障害性疼痛及び慢性疼痛などの疼痛障害、大鬱病などの抑鬱性障害、不安障害などの情緒障害、注意欠陥機能亢進障害、認知症などの認識障害、及びストレス尿失禁が挙げられる。
【０２４３】
Ｄ．４．  ドーパミン−β−ヒドロキシラーゼを標的とする核酸を含むコンジュゲート
背景技術の節で説明したように、中脳皮質ＤＡ伝達の増強は、統合失調症の治療に有用であり得る。この増強はノルアドレナリン輸送体の阻害剤の使用により又は、別法として、ドーパミン−β−ヒドロキシラーゼを阻害することにより達成することができる。この酵素は、ドーパミンからノルアドレナリンへの変換の原因となり、したがって、ノックダウンされると、その結果として、ＮＡニューロン中のドーパミンレベルが増大するであろう。これは順送りでＮＡを含むノルアドレナリン作動性小胞を生じさせ、且つＤＡレベルが高くなるであろう。これは、脳中の認識及び記憶に関する機能を改善するＮＡ保護帯におけるＤＡレベルを増大させる。
【０２４４】
したがって、他の態様において本発明は、ノルアドレナリン作動性突起中におけるドーパミン欠乏と関連する疾患の治療又は予防のための、
（ｉ）選択的作用剤が、ノルエピネフリン輸送体阻害剤（ＳＤＮＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）の群から選択され、及び
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、ドーパミン−β−ヒドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡ又はドーパミン−β−ヒドロキシラーゼポリペプチドである標的分子に特異的に結合することができる、
本発明のコンジュゲートに関する。
【０２４５】
本明細書中で使用する「ノルアドレナリン作動性突起中におけるドーパミン欠乏と関連する疾患」という表現は、認知症、鬱病及び神経変性性疾患と関連する記憶及び認識過程と関連する。
【０２４６】
Ｄ．５．  ＢＡＸを標的とする核酸を含むコンジュゲート
他の態様において本発明は、ニューロンのアポトーシス及び細胞死と関連する疾患の治療又は予防のための、
（ｉ）選択的作用剤が、セロトニン−ドーパミン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＤＮＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）の群から選択され、及び
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、ＢＡＸをコードするｍＲＮＡ又はＢＡＸポリペプチドである標的分子に特異的に結合することができる、
本発明のコンジュゲートに関する。
【０２４７】
本明細書中で使用する用語「ニューロンのアポトーシス及び細胞死と関連する疾患」は、多くのヒトの神経障害の「エンドポイント」を指し、アルツハイマー病、パーキンソン病及びハンチントン病、脳卒中／外傷、多発性及び筋萎縮性側索硬化症を含むが、こられに限定されない。海馬及び皮質のニューロンのアポトーシス性の死はアルツハイマー病の症状の原因であり；神経伝達物質ドーパミンを使用する中脳ニューロンの死はパーキンソン病の根元であり；ハンチントン病は身体の運動を制御する線条体中のニューロンの死を伴い；及び下位運動ニューロンの死は筋萎縮性側索硬化症として顕在化する。それに加えて、脳虚血及び外傷は脳の小領域の壊死を誘発し、それは次に、壊死細胞によって放出された神経毒物質によるアポトーシスにより、ニューロンの細胞の損耗を脳のより広い領域に伝播する。アポトーシス性のニューロン細胞の損耗は、生理学的過程として加齢する脳においても観察される。
【０２４８】
Ｄ．６．  タウを標的とする核酸を含むコンジュゲート
他の態様において、本発明は、タウ関連疾患の治療又は予防における使用のための、
（ｉ）選択的作用剤が、セロトニン−ドーパミン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＤＮＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）の群から選択され、及び
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、タウをコードするｍＲＮＡ又はタウポリペプチドである標的分子に特異的に結合することができる、
本発明のコンジュゲートに関する。
【０２４９】
本明細書中で使用する用語「タウ関連疾患」は、タウにおける異常と関連する疾患並びに「タウ障害」である疾患を指す。タウ関連疾患として、第１７染色体遺伝子に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、嗜銀性顆粒性疾患、並びにパーキンソン病、ダウン症候群、脳炎後パーキンソン症候群、筋緊張性ジストロフィー、ニーマンピックＣ病、ボクサー認知症、ブリント（Ｂｌｉｎｔ）病、プリオン疾患、筋萎縮性側索硬化症、グアムのパーキンソン症候群認知症複合、多発性硬化症、緑内障、糖尿病性網膜症、及び外傷性脳損傷；並びにハンチントン病、レヴィー小体型認知症、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性痙性対麻痺、及び多系統萎縮症が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において定義する「タウ障害」は、脳におけるタウタンパク質の繊維形態（縺れ）と関連する神経変性性疾患を意味する。これらの疾患はＡＤを含むが、しかしながら、他のタウ障害として、第１７染色体遺伝子に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、及び嗜銀性顆粒性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５０】
Ｄ．７．ハンチンチンを標的とする核酸を含むコンジュゲート
他の態様において本発明は、ハンチンチン関連疾患の治療又は予防のための、
（ｉ）選択的作用剤が、セロトニン−ドーパミン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＤＮＲＩ）及びノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）の群から選択され、及び
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドが、ハンチンチンをコードするｍＲＮＡ又はハンチンチンポリペプチドである標的分子に特異的に結合することができる、
本発明のコンジュゲートに関する。
【０２５１】
本明細書中で使用する用語「ハンチンチン関連疾患」は、変異ハンチンチンタンパク質により惹起された異常な配座又は凝集又は発現を指し、ハンチントン疾患及びそれらの変種を含む疾患を含むが、これらに限定されない。
【０２５２】
特定の障害又は状態の治療に有効と思われる本発明の治療剤の量は、障害又は状態の性質に依存するであろうが、治療剤の投与が十分確立された標準的臨床技法により決定することができる。剤形に使用すべき厳密な用量は、投与経路、及び疾患又は障害の重症度にも依存依存すると思われ、医師の判断及び患者の必要性により決定すべきである。脳内投与のための適当な用量範囲は、一般的に１から３０００マイクロリットルの１回の注射容量で送達されるマイクロリットル当たり約１０３から１０１５感染性ユニットのウイルスベクターである。マイクロリットル当たりのベクター感染ユニットの添加量は、一般的に約１０、５０、１００、２００、５００、１０００、又は２０００マイクロリットルで送達されるウイルスベクターの約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４感染性ユニットを含む。効果的な用量は、インビトロ又はインビボ試験システムから導かれる用量−応答曲線から外挿することができる。
【０２５３】
根治療法のために本発明のコンジュゲートを脳室内に投与する目的で、接続口を有する複数のカテーテルを所与の患者に埋め込むことができる。好ましい実施形態においては、脳又は脳半球当たり１つの入り口と多分数本のカテーテルのシステムがある。神経外科医により埋め込みが実施されたら、患者の神経内科医は、数週間又は数ヶ月にわたって繰り返されるコンジュゲートのボーラス注射からなる療法コースを、経時的治療効果をモニターしながら実施することができる。フルコースの療法のためには、デバイスを数ヶ月又は数年間埋め込んだままにしておくことができる。治療の有効性の確認後、接続口を場合により取り出してもよく、またカテーテルを封じて廃棄することができ、又は同様に取り出すこともできる。デバイス材料は、磁気共鳴撮像に干渉するべきでなく、また、いうまでもなく、低分子干渉ＲＮＡ製剤は、接続口及びカテーテル材料及び任意の表面コーティングと適合性でなければならない。
【０２５４】
Ｅ．  本発明のコンジュゲートの合成
本発明のコンジュゲートは、典型的には有機合成における標準的手順を使用して合成される。当業者は、合成の厳密なステップは、合成しなければならないコンジュゲートの厳密な構造物に依存することを理解するであろう。例えば、コンジュゲートが選択的作用剤にその５’末端を通してコンジュゲート化された単一の核酸鎖を含むならば、その場合、合成は、通常下で説明するようにアミノ活性化オリゴヌクレオチドと反応性の活性化された選択性試薬とを接触させることにより実施される。
【０２５５】
コンジュゲートが２本鎖核酸を含むと、その場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は標準的分子の生物学の手順を使用してインビトロで別々に合成され、アニールされる。典型的なコンジュゲートにおいては、第１の核酸鎖が選択的作用剤を担持して第２の核酸鎖は保護基を担持する。さらにより好ましい実施形態においては、選択的作用剤は第１の核酸鎖の５’末端とカップリングし及び／又は保護基は第２の核酸鎖の５’末端に付くが、選択的作用剤又は保護基の付加は核酸鎖の３’末端で実施することもできる。
【０２５６】
コンジュゲートの合成は、以下のように実施することができる：
［１］
選択的作用剤−［オリゴヌクレオチド］−３’
という構造を有するコンジュゲートが、
典型的には以下のステップを使用して合成される：
（ｉ）選択的作用剤を活性化するステップ。好ましくは、選択的作用剤中の活性基はスクシンイミド基又はアミノ基である；
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドをその５’末端で活性化するステップ。好ましくは、オリゴヌクレオチド中の活性基はアミノ基（この場合、選択的作用剤はスクシンイミド基により活性化されている）又はカルボキシル基（この場合、選択的作用剤はアミン基により活性化されている）である、及び
（ｉｉｉ）活性化された選択的作用剤と活性化されたオリゴヌクレオチドとを２つの活性基間の反応に適した条件下で接触させるステップ。
【０２５７】
［２］
保護基−［センス鎖］−３’
３’−［アンチセンス鎖］−選択的作用剤
という構造を有するコンジュゲートは、典型的には、以下のステップを使用して合成される：
（ｉ）選択的作用剤を活性化するステップ。好ましくは、選択的作用剤中の活性基はスクシンイミド又はアミノ基である；
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドをその５’末端で活性化するステップ。好ましくは、オリゴヌクレオチド中の活性基はアミノ基（この場合、選択的作用剤はスクシンイミド基により活性化されている）又はカルボキシル基（この場合、選択的作用剤はアミン基により活性化されている）；
（ｉｉｉ）活性化された選択的作用剤と活性化されたオリゴヌクレオチドとを２つの活性基間の反応に適した条件下で接触させるステップ；
（ｉｖ）固定化したアンチセンス鎖に保護基を付加するステップ。このステップは好ましくは反応性基がアセチル化又はベンジル化（フラノース基）、２−シアノエチル化（ホスホジエステル連結）及びＦＭＯＣ（環外アミノ基）により封鎖されているオリゴヌクレオチドを使用して実施される。
（ｖ）センス鎖及びアンチセンス鎖をアニーリングするステップ。
【０２５８】
Ｅ．１．  核酸と５’末端に付けたＳＳＲＩとを含むコンジュゲートの合成
本発明のコンジュゲートは、当業者により知られた技法を使用して調製することができる。コンジュゲートの合成は、官能基の選択的保護及び脱保護を含むことがある。適当な保護基は当業者にとって周知のことである。例えば、有機化学における保護基の総説は、Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．及びＧｒｅｅｎｅ  Ｔ．Ｗ．によりＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（４ｔｈＥｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）で、及びＫｏｃｉｅｎｓｋｉ  Ｐ．Ｊ．によりＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ（３ｒｄ  Ｅｄ．Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ）で提供されている。
【０２５９】
本発明の関係においては、以下の用語は下で詳細に説明する意味を有する：
・用語「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」は、不飽和を含まず、単結合により該分子の他の部分に結びついた１から６個の、好ましくは１から３個の（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）炭素原子を有する炭素原子と水素原子とからなる線状又は分岐炭化水素基を指す。アルキル基の例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル及びヘキシルなどのアルキル基が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくはアルキルはメチルを指す。
・用語「ハロゲン」は、ブロモ、クロロ、ヨード又はフルオロを指す。
・用語「ハロアルキル」は、少なくとも１個の水素原子がハロゲンにより置き換えられた上で定義したアルキル基を指す。ハロアルキル基の例として、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＨＦ２、ＣＦ２ＣＦ３が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくはハロアルキルはＣＦ３を指す。
・用語「Ｃ６〜Ｃ１０アリール」は、例えばフェニル、ナフチル及びジフェニルを含む炭素−炭素結合により結合したか又は融合した１個又は２個の芳香族核を含む６から１０個の間の炭素原子を有する芳香族基を指す。好ましくは「アリール」はフェニルを指す。
・用語「ヘテロシクリル」は、炭素原子と窒素、酸素、及びイオウからなる群から選択される１から５個のヘテロ原子とからなり、部分的に又は完全に飽和していても芳香族（「ヘテロアリール」）であってもよい安定な３員〜１０員の環基、好ましくは５又は６員環を指す。本発明の目的に対して、複素環は、縮合環系を含んでもよい単環式、二環式又は三環式環系であることができる。特定の実施形態において、ヘテロシクリル基はスクシンイミドである。
【０２６０】
上記の式（Ｉ）により表される本発明の化合物は、キラル中心の存在に依存する立体異性体を含むことができる。単一異性体、エナンチオマー又はジアステレオ異性体及びそれらの混合物は本発明の範囲内に入る。
【０２６１】
特に断らない限り、本発明において使用する化合物は、１つ又は複数の同位体に富む原子存在のみが異なる化合物を含むことを意図される。例えば、水素の重水素又はトリチウムによる置換、又は炭素の１３Ｃ又は１４Ｃに富む炭素による置換又は１５Ｎに富む窒素による置換を除く本発明の構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。
【０２６２】
ｉ．アミノ誘導体化された核酸及び活性化されたセルトラリン誘導体を使用する合成
第１の実施形態において、本発明によるコンジュゲートは、アミノ誘導体化された核酸を活性化されたセルトラリンの誘導体形又はそれらのアナログにカップリングすることにより得ることができ、その場合、選択的作用剤の活性化された該誘導体は、式（ＩＩ）の化合物である：
【化３４】
2013525330.tif 000046
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、水素及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｘ及びＹは、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＯＲａ及びＳＲｂから独立に選択され、ここでＲａ及びＲｂは、Ｃ１〜Ｃ３アルキル及びＣ６〜Ｃ１０アリールから独立に選択され；
Ｒ６はカルボニル活性化基であり；
Ｗは、水素、ハロゲン、ＣＮ，ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＮＲｃＲｄ、ＳＯ２ＮＲｅＲｆ、ＮＲｇＳＯ２Ｒｈ、ＣＯ２Ｒｉから選択され、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ及びＲｉは、水素及びＣ１〜Ｃ３アルキルから独立に選択され；
ｎ及びｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択される）。
【０２６３】
用語「カルボニル活性化基」は、カルボニルを求核付加し易くするカルボニルの置換基を指す。特定の実施形態において、それは、カルボニル基と一緒になって、酸無水物、酸ハロゲン化物又はエステル基を形成する。好ましい実施形態において、カルボニル活性化基は、ハロゲン、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＲ’、−ＳＲ’’から選択され；Ｒ、Ｒ’及びＲ’’はＣ１〜Ｃ６アルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールから独立に選択される。
【０２６４】
特定の実施形態において、Ｒ６はスクシンイミドオキシ基である。それ故、他の実施形態において、本発明によるコンジュゲートは、アミノ誘導体化された核酸をセルトラリンの活性化された誘導体形又はそれらのアナログにカップリングすることにより得ることができ、該選択的作用剤の活性化された誘導体は、式（ＩＩＩ）の化合物である：
【化３５】
2013525330.tif 000047
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、水素及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｘ及びＹは、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＯＲａ及びＳＲｂから独立に選択され、ここでＲａ及びＲｂは、Ｃ１〜Ｃ３アルキル及びＣ６〜Ｃ１０アリールから独立に選択され；
Ｗは、水素、ハロゲン、ＣＮ，ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＮＲｃＲｄ、ＳＯ２ＮＲｅＲｆ、ＮＲｇＳＯ２Ｒｈ、ＣＯ２Ｒｉから選択され、ここでＲｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ及びＲｉは、水素及びＣ１〜Ｃ３アルキルから独立に選択され；
ｎ及びｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択される）。
【０２６５】
特定の実施形態によれば、式（ＩＩＩ）の活性化された化合物は化合物（１）である：
【化３６】
2013525330.tif 000048
【０２６６】
一実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、ａ）ないしｄ）を含む一連のステップにより調製することができる：
ａ）
式（ＩＶ）の化合物
【化３７】
2013525330.tif 000049
と式（Ｖ）のアシル化剤
【化３８】
2013525330.tif 000050
（式中、ｐは上で定義した通りであり、Ｚはハロゲン又はＯＨであり、及びＰＧはアミン保護基である）
とを反応させて、式（ＶＩ）の化合物
【化３９】
2013525330.tif 000051
を得るステップ；
【０２６７】
（アミンのために一般的に使用される保護基として、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、９Ｈ−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ）、アリル又はニトロフェニルカルバメートなどのカルバメート；ホルムアミド、アセトアミド、トリフルオロアセトアミド、スルホンアミド、トリフルオロメタンスルホニルアミド又はｔｅｒｔ−ブチルスルホニルアミドなどのアミド；及びｐ−メトキシフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ジメトキシトリチル又はモノメトキシトリチルアミンなどのアリール又はアリールアルキルアミンが挙げられる。特定の実施形態において、式（Ｖ）のアシル化剤は９Ｈ−フルオレニルメトキシカルボニル−６−アミノヘキサン酸である。
【０２６８】
順送りで式（ＩＶ）の化合物は、例えば米国特許第６４５５７３６号に記載されたようにして調製することができる。特に、式（ＩＶ）の化合物がセルトラリンであれば、それは、対応するクロロハイドレート（市販で入手可能）から、アルカリ又はアルカリ土類炭酸塩又は水酸化物、アンモニア又はアミン、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、ピペリジン、モルホリンなどの有機又は無機塩基を含む適当な塩基で処理することにより得ることができる）
【０２６９】
ｂ）式（ＩＶ）の化合物中のアミノ保護基を脱保護して式（ＶＩＩ）の化合物を得るステップ：
【化４０】
2013525330.tif 000052
（適当な脱保護条件は、例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｔ．Ｗ．，４ｔｈ  Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）及びＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ（Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ  Ｐ．Ｊ．，３ｒｄ  Ｅｄ．Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ）で当業者に知られている。特定の実施形態において、保護基は、ピペリジン、モルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジイソプロピルエチルアミン又はジメチルアミノピリジンなどのアミンの存在下で、好ましくはピペリジンの存在下で除去される）
【０２７０】
ｃ）式（ＶＩＩ）の化合物を式（ＶＩＩＩ）又は（ＩＸ）のアシル化剤と反応させて、
【化４１】
2013525330.tif 000053
（式中、ｎは上で定義した通りであり、Ｚはハロゲン又はＯＨである）、式（Ｘ）の化合物を得るステップ：
【化４２】
2013525330.tif 000054
（特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）のアシル化剤はコハク酸酸無水物である）
【０２７１】
ｄ）式（Ｘ）の化合物をカルボニル活性化基で処理するステップ。
用語「カルボニル活性化基」は、カルボン酸基のカルボニルを例えば酸無水物、カルボン酸ハロゲン化物、カルボジイミド、ハロゲン化剤、ジスルフィドなど求核付加をより受け易いものに変換する化合物を指す。特定の実施形態において、カルボニル活性化基は、ハロゲン化剤、Ｒ（Ｏ）ＣＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＲＣ（Ｏ）ハロゲン、Ｒ’ＯＨ、Ｒ’’ＳＨ、Ｒ’’ＳＳＲ’’から選択され；Ｒ、Ｒ’及びＲ’’はＣ１〜Ｃ６アルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールから独立に選択される。
【０２７２】
特定の実施形態において、カルボニル活性化基はＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドである。この場合、反応は、好ましくはさらなるカルボニル活性化基の存在下で実施される。
【０２７３】
それ故、特定の実施形態において、ステップｄ）は、さらなるカルボニル活性化基の存在下で式（Ｘ）の化合物をＮ−ヒドロキシスクシンイミドで処理することを含む。
【０２７４】
この過程に適したカルボニル活性化基として、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などのカルボジイミド、並びに１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及び１−ヒドロキシ−７−アザ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）などのトリアゾールが挙げられる。好ましい実施形態において、式（ＶＩ）の化合物は、ジイソプロピルカルボジイミドの存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応して式（ＩＩ）の活性化された誘導体を生ずる。
【０２７５】
他の態様によれば、本発明は、式（ＶＩ）の中間体を指向する：
【化４３】
2013525330.tif 000055
（式中、Ｒ１〜Ｒ５、Ｘ、Ｙ、Ｗ、ｐ及びＰＧは上で定義した通りである。好ましい実施形態において、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２〜Ｒ５は水素であり、Ｘ及びＹは塩化物であり、Ｗは水素であり、ｐが５であり、及びＰＧは９Ｈ−フルオレニルメトキシカルボニルである）。より好ましくは、式（ＶＩ）の化合物は化合物（２）である。
【化４４】
2013525330.tif 000056
他の態様によれば、本発明は、式（ＶＩＩ）の中間体を指向する。
【化４５】
2013525330.tif 000057
（式中、Ｒ１〜Ｒ５、Ｘ、Ｙ、Ｗ及びｐは上で定義した通りである。好ましい実施形態において、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２〜Ｒ５は水素であり、Ｘ及びＹは塩化物であり、Ｗは水素であり及びｐは５である。より好ましくは、式（Ｖ）の化合物は化合物（３）である。
【化４６】
2013525330.tif 000058
【０２７６】
他の態様によれば、本発明は式（Ｘ）の中間体を指向する。
【化４７】
2013525330.tif 000059
（式中、Ｒ１〜Ｒ５、Ｘ、Ｙ、Ｗ、ｐ及びｎは、上で定義した通りである）。好ましい実施形態において、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２〜Ｒ５水素であり、Ｘ及びＹは塩化物であり、Ｗは水素であり、ｐが５であり及びｎは２である）。より好ましくは、式（ＶＩＩＩ）の化合物は化合物（４）である。
【化４８】
2013525330.tif 000060
他の態様によれば、本発明は式（ＩＩ）の中間体を指向する。
【化４９】
2013525330.tif 000061
（式中、Ｒ１〜Ｒ６、Ｘ、Ｙ、Ｗ、ｐ及びｎは上で定義した通りである）。
【０２７７】
他の態様によれば、本発明は式（ＩＩＩ）の中間体を指向する。
【化５０】
2013525330.tif 000062
（式中、Ｒ１〜Ｒ５、Ｘ、Ｙ、Ｗ、ｐ及びｎは上で定義した通りである）。好ましい実施形態において、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２〜Ｒ５は水素であり、Ｘ及びＹは塩化物であり、Ｗは水素であり、ｐが５であり及びｎは２である。より好ましくは、式（ＩＩ）の化合物は化合物（１）である。
【化５１】
2013525330.tif 000063
【０２７８】
選択的作用剤に付けようとするｓｉＲＮＡ鎖は、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集の「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）に開示された方法にしたがって、固体支持体上で段階的固相合成により形成することができる。
【０２７９】
選択性リガンドをコンジュゲート化するためには、オリゴヌクレオチドをアミノ誘導体にする必要がある。これは、５’又は３’末端で行うことができる。好ましい実施形態において、選択性リガンドは５’末端に付けられる。
【０２８０】
一実施形態によれば、式（Ｉ）のコンジュゲートは、上記の式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物と式（ＸＩＩ）のアミノ改変オリゴヌクレオチドとを反応させることにより調製することができる。
【化５２】
2013525330.tif 000064
【０２８１】
アミノリンカー改変剤を使用してオリゴヌクレオチドを活性化する一般的手順は下記のスキームによるであろう。
【化５３】
2013525330.tif 000065
【０２８２】
式（ＸＩＩ）の化合物は、オリゴヌクレオチドの５’−ＯＨ基を式（ＸＩＩＩ）のアミノ改変剤と反応させることにより調製することができる：
【化５４】
2013525330.tif 000066
（式中、ｍは上で定義した通りであり、ＰＧはアミン保護基である）。アミンのために普通使用される保護基として、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、９Ｈ−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ）；アリル又はニトロフェニルカルバメートなどのカルバメート；ホルムアミド、アセトアミド、トリフルオロアセトアミド、スルホンアミド、トリフルオロメタンスルホニルアミド又はｔｅｒｔ−ブチルスルホニルアミドなどのアミド；及びｐ−メトキシフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ジメトキシトリチル又はモノメトキシトリチルアミンなどのアリール又はアリールアルキルアミンが挙げられる。特定の実施形態において、式（ＸＩＩＩ）のアミノリンカーは、６−（トリフルオロアセチルアミノ）ヘキシル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト（５’−ＴＦＡ−Ｃ６−アミノ改変剤−ＣＥＰ）又は６−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ヘキシル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト（５’−ＭＭＴ−Ｃ６−アミノ改変剤−ＣＥＰ）である。
【０２８３】
オリゴヌクレオチドの５’−ＯＨ基をアミノリンカーにカップリング後、アミン保護基が知られた条件下で除去される。例えば、ＴＦＡ保護アミノ誘導体は、アンモニア処理により脱保護することができるが、それに対してＭＭＴ保護アミノ誘導体は、酢酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸又はトリフルオロ酢酸で処理することにより脱保護することができる。
【０２８４】
アミノ改変オリゴヌクレオチド合成の一般的方法：
（ｉ）無水アセトニトリル中のリンカー／改変剤分子（真空乾燥）の溶液（市販のアミダイトの大部分で０．１Ｍ溶液が使用される）を調製して合成装置中の追加の貯蔵器に入れる（Ｙ）；
（ｉｉ）必要とされるオリゴヌクレオチド配列の合成開始時に、Ｙの塩基を５’末端に付加する。これがＹの貯蔵器からのリンカー／改変剤分子がオリゴヌクレオチド配列の末端にカップリングすることを可能にするであろう。
（ｉｉｉ）適当なカップリングサイクルを使用する合成を開始する。同じカップリングサイクルが、リンカー／改変剤分子カップリングを実施するために使用されるであろう。
（ｉｖ）オリゴヌクレオチド合成終了時に、支持体を洗浄して最後に支持体をガスで乾燥する。
（ｖ）固体支持体をカラムから取り出してスクリューキャップ付きバイアル中に移し、２ステップの脱保護を完了する。
【０２８５】
アミノ改変オリゴヌクレオチドは、さらに選択的作用剤と接合するために脱保護しなければならない。この目的のために、オリゴヌクレオチド中の全ての残余の保護基を以下のようにして除去する。２０％ｖ／ｖのメチルアミン（水溶液４０％ｗ／ｖ）及び８０％ｖ／ｖの飽和アンモニア溶液（３０〜３２％ｗ／ｖのＮＨ３を含有する）を含有する５００μｌの混合物をオリゴヌクレオチド（２００ｎｍｏｌ規模）の入ったエッペンドルフチューブに加える。該チューブを密閉して４５分間６５℃の温度に加熱した。この手順によりヌクレオチドのリン原子における保護基（フラノースのアセチル化又はベンゾイル化及びホスホジエステル連結の２−シアノエチル化）及び環外アミノ基の保護基（Ｂｚ、Ａｃ、ＩＢｕ）が除去される。次に混合物を冷却して濾過し、上清を乾燥した。残留ペレットを１Ｍトリエチルアミン−ＨＦと３時間６５℃で反応させて保護基をヌクレオチド（２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ＴＢＤＭＳ）の２’で切断した。最後に、生じた溶液をセファデックスカラムで脱塩すると、アミノ改変−５’−オリゴヌクレオチドが残った。
【０２８６】
アミノ改変剤リンカーを３’ＯＨ末端に組み込む場合；対応するポリマー支持体（ＣＰＧボール）を使用すべきで、合成スキームは以下の流れ図に対応するであろう。
【化５５】
2013525330.tif 000067
（加水分解は水酸化アンモニウム又はベックマン試薬を使用することにより行うことができる）（メチルアミン：水酸化アンモニウム）。
【０２８７】
両方の場合とも、脱保護ステップは同一で、そのような場合における接合手法も同じであるが有効性の程度は異なるであろう。大抵の場合、５’−アミノ誘導体化を用いる方がよい結果が得られる。
【０２８８】
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号：５〜１２の群から選択される配列を含むことができる。
【０２８９】
アミノ基が活性化されたオリゴヌクレオチドは、次に式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の選択的作用剤の上で定義した活性化された誘導体と反応させられる。構造
【化５６】
2013525330.tif 000068
（式中、Ｒ１〜Ｒ５、Ｘ、Ｙ、Ｗ、ｐ及びｎは上で定義した通りであり、ｍは２から１０である）
を有するコンジュゲートが得られる。
【０２９０】
好ましい実施形態において、コンジュゲートは、構造
【化５７】
2013525330.tif 000069
を有する。
【０２９１】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２価又は３価のホスホルアミドと予め反応させてある。このように、２つ又は３つのカップリング位置を有する化合物を得ることができて、その結果、選択的作用剤の２つの又は３つの分子がオリゴヌクレオチドとカップリングすることができる。選択的作用剤の前記２つの又は３つの分子は、同じであっても異なっていてもよい。
【０２９２】
特定の実施形態において、同じ選択的作用剤の２つ又は３つの分子がオリゴヌクレオチドにカップリングされる。他の実施形態においては、２つ又は３つの異なった選択的作用剤がオリゴヌクレオチドにカップリングされる。
【０２９３】
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは２価又は３価のホスホルアミダイトと反応して式（ＸＸ）又は（ＸＸＩ）の化合物を生ずる：
【化５８】
2013525330.tif 000070
（式中、
ＰＧ、ＰＧ’’及びＰＧ’’’は、Ｈ及びヒドロキシ保護基から独立に選択され；
ｒ、ｒ’、ｒ’’、ｓ、ｓ’、ｓ’’、ｔ及びｕは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から独立に選択され；
ｖは０及び１から独立に選択され；及び
Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＯ、Ｃ（Ｏ）Ｏ及びＣ（Ｏ）ＮＨから独立に選択される）。
【０２９４】
ヒドロキシ保護基、並びに適当な保護及び脱保護条件は、当業者には、例えばＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｔ．Ｗ．，４ｔｈ  Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）及びＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ（Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ  Ｐ．Ｊ．，３ｒｄ  Ｅｄ．Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ）で知られている。
【０２９５】
特定の実施形態において、ヒドロキシ保護基は、エーテル、シリルエーテル、エステル、スルホネート、スルフェネート、スルフィネート、カーボネート及びカルバメートから選択される。好ましい実施形態においては、ヒドロキシル保護基は、アセチル，ベンゾイル、ベンジル、メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル（ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、トリチル（Ｔｒ）、９Ｈ−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、及びトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテルから選択される。好ましくは、ＰＧ、ＰＧ’及びＰＧ’’は、Ｈ、ＤＭＴ及びＦｍｏｃから独立に選択される。
【０２９６】
特定の実施形態において、式（ＸＸ）又は（ＸＸＩ）の化合物中のヒドロキシル保護基は異なり、その結果それらは、選択的に脱保護されて、所望であれば、異なった分子とカップリングされ得る。
【０２９７】
特定の実施形態は、ｒ及びｒ’が４であり、ｓ及びｓ’が１であり、ｔ及びｖが０であり、Ｘ１及びＸ２がＣ（Ｏ）ＮＨを表し、及びＰＧ１及びＰＧ２が、Ｈ、ＤＭＴ及びＦｍｏｃから独立に選択される式（ＸＸ）の化合物を指向している。他の実施形態においては、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔ及びｖが０であり、Ｘ１及びＸ２はＣＨ２を表し、ＰＧ１及びＰＧ２はＨ及びＤＭＴから独立に選択される式（ＸＸ）の化合物に関係する。
【０２９８】
ある実施形態は、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がＯを表し、及びＰＧ１、ＰＧ２及びＰＧ３がＨ及びＤＭＴから独立に選択される式（ＸＸＩ）の化合物を指向する。他の実施形態は、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がＯを表し、ＰＧ１、ＰＧ２及びＰＧ３がＨ及びＤＭＴから独立に選択される式（ＸＸＩ）の化合物に関係する。
【０２９９】
式（ＸＸ）及び（ＸＸＩ）の化合物は次に脱保護され、必要ならば、式（ＸＩＩＩ）のアミノ改変剤と反応して：
【化５９】
2013525330.tif 000071
（式中、ｍ及びＰＧは上で定義した通りである）それぞれ式（ＸＸＩＩ）又は（ＸＸＩＩＩ）の化合物を生ずる：
【化６０】
2013525330.tif 000072
（式中、
ｍ、ｍ’、ｍ’’、ｒ、ｒ’、ｒ’’、ｓ、ｓ’、ｓ’’、ｔ、ｕ、ｖ、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は前に定義した通りである）。
【０３００】
式（ＸＸＩＩ）及び（ＸＸＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＩ）の化合物と、好ましくは式（ＩＩＩ）の化合物とさらに反応することができて、それぞれコンジュゲート（ＸＸＩＶ）及び（ＸＸＶ）を生ずる：
【化６１】
2013525330.tif 000073
【化６２】
2013525330.tif 000074
（式中、
ｍ、ｍ’、ｍ’’、ｎ、ｎ’、ｎ’’、ｐ、ｐ’、ｐ’’、ｒ、ｒ’、ｒ’’、ｓ、ｓ’、ｓ’’、ｔ、ｕ、ｖ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ１〜Ｒ５、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＺは、前に記載した通りである）。
【０３０１】
ある特定の実施形態は上で定義した式（ＸＸＩＶ）の化合物を指向する。
【０３０２】
他の実施形態は、式（ＸＸＩＶ）の化合物（式中、選択的作用剤がセルトラリンであり、ｐ及びｐ’が５であり、ｎ及びｎ’が２であり、ｍ及びｍ’が６であり、ｒ及びｒ’が４であり、ｓ及びｓ’が１であり、ｔ及びｖが０であり並びにＸ及びＸ’がＣ（Ｏ）ＮＨを表す）を指向する。他の実施形態は、式（ＸＸＩＶ）の化合物（式中、選択的作用剤がセルトラリンであり、ｐ及びｐ’が５であり、ｎ及びｎ’が２であり、ｍ及びｍ’が６であり、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔ及びｖが０であり、並びにＸ及びＸ’がＣＨ２を表す）を指向する。
【０３０３】
ある特定の実施形態は上で定義した式（ＸＸＶ）の化合物を指向する。
【０３０４】
ある特定の実施形態は、式（ＸＸＶ）の化合物（式中、選択的作用剤がセルトラリンであり、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’及びｎ’’が２であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり並びにＸ、Ｘ’及びＸ’’がＯを表す）を指向する。他の実施形態は、式（ＸＸＶ）の化合物（式中、選択的作用剤がセルトラリンであり、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｎ、ｎ’及びｎ’’が２であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり並びにＸ、Ｘ’及びＸ’’がＯを表す）を指向する。
【０３０５】
ｉｉ．カルボキシル誘導体化された核酸及びアミノ誘導体化されたセルトラリンを使用しする合成
他の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、アミノ誘導体化された選択的作用剤とカルボキシル誘導体化されたオリゴヌクレオチドとの接合により得られる。
【０３０６】
特定の実施形態において、選択的作用剤の活性化された誘導体は式（ＶＩＩ）の化合物である：
【化６３】
2013525330.tif 000075
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、水素及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｘ及びＹは、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＯＲａ及びＳＲｂから独立に選択され、ここでＲａ及びＲｂは、Ｃ１〜Ｃ３アルキル及びＣ６〜Ｃ１０アリールから独立に選択され；
Ｗは、水素、ハロゲン、ＣＮ，ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ＮＲｃＲｄ、ＳＯ２ＮＲｅＲｆ、ＮＲｇＳＯ２Ｒｈ、ＣＯ２Ｒｉから選択され、ここでＲｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ及びＲｉは、水素及びＣ１〜Ｃ３アルキルから独立に選択され；
ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３から選択される）。
【０３０７】
ある特定の実施形態によれば、活性化された式（ＩＩ）の化合物は上記の化合物（３）である。
【化６４】
2013525330.tif 000076
【０３０８】
式（ＶＩＩ）の化合物は、
（ｉ）式（ＩＶ）の化合物
【化６５】
2013525330.tif 000077
と式（Ｖ）のアシル化剤：
【化６６】
2013525330.tif 000078
（式中、ｐは上で定義した通りであり、Ｚはハロゲン又はＯＨであり、及びＰＧはアミン保護基である）
とを反応させて式（ＶＩ）の化合物
【化６７】
2013525330.tif 000079
を得るステップ（アミンのために通常使用される保護基として、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、９Ｈ−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ）、アリル又はニトロフェニルカルバメートなどのカルバメート；ホルムアミド、アセトアミド、トリフルオロアセトアミド、スルホンアミド、トリフルオロメタンスルホニルアミド又はｔｅｒｔ−ブチルスルホニルアミドなどのアミド；及び、ｐ−メトキシフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ジメトキシトリチル又はモノメトキシトリチルアミンなどのアリール又はアリールアルキルアミンが挙げられる。特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）のアシル化剤は９Ｈ−フルオレニルメトキシカルボニル−６−アミノヘキサン酸である。
順送りで式（ＩＩＩ）の化合物は例えば上記のようにして調製することができる）と；
【０３０９】
（ｉｉ）式（ＶＩ）の化合物中のアミノ保護基を脱保護して式（ＶＩＩ）の化合物
【化６８】
2013525330.tif 000080
を得るステップ（適当な脱保護条件は、例えばＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  ＧｒｅｅｎｅＴ．Ｗ．，４ｔｈ  Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）及びＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ（Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ  Ｐ．Ｊ．，３ｒｄ  Ｅｄ．Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ）で当業者に知られている。特定の実施形態において、保護基は、ピペリジン、モルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジイソプロピルエチルアミン又はジメチルアミノピリジンなどのアミンの存在下で、好ましくはピペリジンの存在下で除去される）と：
を含む一連のステップにより上記のようにして調製することができる。
【０３１０】
好ましい実施形態において、アミノ改変選択的作用剤は化合物（３）に対応する。
【化６９】
2013525330.tif 000081
【０３１１】
選択的作用剤に付けようとするｓｉＲＮＡ鎖は、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ．編集の「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ−１９８５）に開示された方法にしたがって固体支持体上の段階的固相合成により形成される。
【０３１２】
選択性リガンドをコンジュゲート化するために、オリゴヌクレオチドをカルボキシ誘導体にする必要がある。これは５’又は３’末端で行うことができる。好ましい実施形態において、選択性リガンドは５’末端に付けられる。
【０３１３】
一実施形態によれば、式（ＸＩＶ）のコンジュゲートは、上記の式（ＶＩＩ）の化合物と式（ＸＶ）：
【化７０】
2013525330.tif 000082
のカルボキシ改変オリゴヌクレオチドとを反応させることにより調製することができる。  
【０３１４】
カルボキシルリンカー改変剤を使用してオリゴヌクレオチドを活性化する一般的手順は、典型的には下記のスキームにしたがうであろう。
【化７１】
2013525330.tif 000083
【０３１５】
カルボキシ改変オリゴヌクレオチドを合成する一般的方法：
（ｉ）無水アセトニトリル中で改変剤分子溶液を調製して、それを追加の貯蔵器に入れる（Ｙ）。
（ｉｉ）必要とされるオリゴヌクレオチド配列の合成開始時に、Ｙ塩基を５’末端に付加する。これがＹ貯蔵器からのリンカー／改変剤分子がオリゴヌクレオチド配列の末端にカップリングすることを可能にするであろう。
（ｉｉｉ）適当なカップリングサイクルを使用する合成を開始する。同じカップリングサイクルが、リンカー／改変剤分子カップリングを実施するために使用されるであろう。
（ｉｖ）オリゴヌクレオチド合成終了時に、支持体を洗浄して最後に支持体をガスで乾燥する。
（ｖ）固体支持体をカラムから取り出してスクリューキャップ付きバイアル中に移し、２ステップの脱保護を完了する。
【０３１６】
カルボキシ改変オリゴヌクレオチドは、選択的作用剤とさらにコンジュゲーションさせるために脱保護すべきである。この目的のために、オリゴヌクレオチド中の全ての残余の保護基を以下のようにして除去する。２０％ｖ／ｖのメチルアミン（水溶液４０％ｗ／ｖ）及び８０％ｖ／ｖの飽和アンモニア溶液、（３０〜３２％ｗ／ｖのＮＨ３を含有する）を含有する５００μｌの混合物をオリゴヌクレオチド（２００ｎｍｏｌ規模）の入ったエッペンドルフチューブに加える。該チューブを密閉して４５分間６５℃の温度に加熱した。この手順によりヌクレオチドのリン原子における保護基（フラノースのアセチル化又はベンゾイル化及びホスホジエステル連結の２−シアノエチル化）及び環外アミノ基の保護基（Ｂｚ、Ａｃ、ＩＢｕ）が排除される。次に混合物を冷却して濾過し、上清を乾燥した。残留ペレットを１Ｍトリエチルアミン−ＨＦと３時間６５℃で反応させて保護基をヌクレオチド（２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ＴＢＤＭＳ）の２’で切断した。最後に、生じた溶液をセファデックスカラムで脱塩すると、カルボキシ改変−５’−オリゴヌクレオチドが残った。
【０３１７】
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号：５〜１２の群からから選択される配列を含むことができる。
【０３１８】
次にカルボキシル活性化オリゴヌクレオチドを、上で定義した式（ＶＩＩ）の選択的作用剤の活性化された誘導体と反応させる。一般式：
【化７２】
2013525330.tif 000084
を有する化合物が得られる。
【０３１９】
特定の実施形態において、該コンジュゲートは、構造
【化７３】
2013525330.tif 000085
を有する。
【０３２０】
他の特定の実施形態において、コンジュゲートは構造
【化７４】
2013525330.tif 000086
を有する。
【０３２１】
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは最初に２価又は３価のホスホルアミダイトと反応して前に定義した式（ＸＸ）又は（ＸＸＩ）の化合物を生ずる。式（ＸＸ）及び（ＸＸＩ）の化合物は、次に必要があれば脱保護し、カルボキシ改変剤と反応させて、それぞれ式（ＸＸＶＩ）又は（ＸＸＶＩＩ）の化合物を得る：
【化７５】
2013525330.tif 000087
【化７６】
2013525330.tif 000088
（式中、ｍ、ｍ’、ｍ’’、ｒ、ｒ’、ｒ’’、ｓ、ｓ’、ｓ’’、ｔ、ｕ、ｖ、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は前に定義した通りである）。
【０３２２】
式（ＸＸＶＩ）及び（ＸＸＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ）の化合物とさらに反応させて、それぞれコンジュゲート（ＸＸＶＩＩＩ）及び（ＸＸＩＸ）を得ることができる：
【化７７】
2013525330.tif 000089
【化７８】
2013525330.tif 000090
（ＸＸＩＸ）
（式中、
ｍ、ｍ’、ｍ’’、ｐ、ｐ’、ｐ’’、ｒ、ｒ’、ｒ’’、ｓ、ｓ’、ｓ’’、ｔ、ｕ、ｖ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ１〜Ｒ５、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＺは前に記載した通りである）。
【０３２３】
ある特定の実施形態は上で定義した式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物を指向する。
【０３２４】
ある特定の実施形態は、式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物（式中、選択的作用剤がセルトラリンであり、ｐ及びｐ’が５であり、ｍ及びｍ’が６であり、ｒ及びｒ’が４であり、ｓ及びｓ’が１であり、ｔ及びｖが０であり、並びにＸ及びＸ’がＣ（Ｏ）ＮＨを表す）を指向する。他の実施形態は、式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物（式中、選択的作用剤がセルトラリンであり、ｐ及びｐ’が５であり、ｍ及びｍ’が６であり、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔ及びｖが０であり並びにＸ及びＸ’がＣＨ２を表す）を指向する。
【０３２５】
ある特定の実施形態は、式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物（式中、選択的作用剤がセルトラリンであり、ｐ及びｐ’が５であり、ｍ及びｍ’が９であり、ｒ及びｒ’が４であり、ｓ及びｓ’が１であり、ｔ及びｖが０であり並びにＸ及びＸ’がＣ（Ｏ）ＮＨを表す）を指向する。他の実施形態は、式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物（式中、選択的作用剤がセルトラリンであり、ｐ及びｐ’が５であり、ｍ及びｍ’が９であり、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔ及びｖが０であり並びにＸ及びＸ’がＣＨ２を表す）を指向する。
【０３２６】
ある特定の実施形態は、上で定義した式（ＸＸＩＸ）の化合物を指向する。
【０３２７】
ある特定の実施形態は、式（ＸＸＩＸ）の化合物（式中、選択的作用剤がセルトラリンであり、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり並びにＸ、Ｘ’及びＸ’’がＯを表す）を指向する。他の実施形態は、式（ＸＸＩＸ）の化合物（式中、選択的作用剤がセルトラリンであり、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり、Ｘ、Ｘ’及びＸ’’がＯを表す）を指向する。
【０３２８】
ある特定の実施形態は、式（ＸＸＩＸ）の化合物（式中、選択的作用剤がセルトラリンであり、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が９であり、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり並びにＸ、Ｘ’及びＸ’’がＯを表す）を指向する。他の実施形態は、式（ＸＸＩＸ）の化合物（式中、選択的作用剤がセルトラリンであり、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が９であり、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり、Ｘ、Ｘ’及びＸ’’がＯを表す）を指向する。
【０３２９】
ｉｉｉ．  カルボキシル誘導体化された核酸及びアミノ誘導体化されたノミフェンシンを使用する合成
ノミフェンシン及びそれらのアナログは、カルボキシ改変オリゴヌクレオチドに対するカップリングに原理的に使用され得るアミノ基を含有する。しかしながら、アミノ基が芳香環に直接にカップリングされている結果、反応性が減少して立体障害が生ずる。そのようなわけで、式（ＸＶＩ）
【化７９】
2013525330.tif 000091
（式中、
Ｒ１は、水素、アルキルＣ１〜Ｃ６基又はベンジル基を表し、
Ｒ２は、水素、メチル、塩素又はフッ素基を表し、
Ｒ２’は、水素、メチル、メトキシ、ヒドロキシル又はハロゲン原子を表し、
Ｒ３及びＲ４は、水素、アルキルＣ１〜Ｃ６基を表し、
Ｒ５は、５−又は６−位における水素、塩素又はメトキシ基を表し、及び
Ｐは２〜６である）
を有するアミノ改変ノミフェンシン又はそれらの変種が調製される。
【０３３０】
特定の実施形態において、選択的作用剤の活性化された誘導体は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、及びＲ５がＨであり、Ｒ４がメチルである化合物（５）である。
【化８０】
2013525330.tif 000092
【０３３１】
一実施形態によれば、式（ＸＶＩ）の化合物は：
ａ）式（ＸＶＩＩ）の化合物
【化８１】
2013525330.tif 000093
と式（Ｖ）
【化８２】
2013525330.tif 000094
（式中、ｐは上で定義した通りであり、Ｚはハロゲン又はＯＨであり、及びＰＧはアミン保護基である）
のアシル化剤とを反応させて、：
式（ＸＶＩＩＩ）の化合物
【化８３】
2013525330.tif 000095
を得るステップ
（アミンのために通常使用される保護基として、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、９Ｈ−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ）、アリル又はニトロフェニルカルバメートなどのカルバメート；ホルムアミド、アセトアミド、トリフルオロアセトアミド、スルホンアミド、トリフルオロメタンスルホニルアミド又はｔｅｒｔ−ブチルスルホニルアミドなどのアミド；及びｐ−メトキシフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ジメトキシトリチル又はモノメトキシトリチルアミンなどのアリール又はアリールアルキルアミンが挙げられる。特定の実施形態において、式（Ｖ）のアシル化剤は９Ｈ−フルオレニルメトキシカルボニル−６−アミノヘキサン酸である。
式（ＸＶＩＩ）の化合物は、順送りで例えば米国特許第４１８５１０５号に記載されたようにして調製することができる。特に、式（ＩＩＩ）の化合物がノミフェンシンである場合、それは、対応するクロロハイドレート（市販で入手可能）から、アルカリ又はアルカリ土類の炭酸塩又は水酸化物、アンモニア又は、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、ピペリジン、モルホリンなどのアミンなどの有機又は無機塩基を含む適当な塩基で処理することにより得ることができる）と；
【０３３２】
ｂ）式（ＸＶＩＩＩ）の化合物中のアミノ保護基を脱保護して式（ＸＩＸ）：
【化８４】
2013525330.tif 000096
（適当な脱保護条件は、例えばＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｔ．Ｗ．，４ｔｈ  Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）及びＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ（Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ  Ｐ．Ｊ．，第３  Ｅｄ．Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ）で当業者に知られている。特定の実施形態において、保護基は、ピペリジン、モルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジイソプロピルエチルアミン又はジメチルアミノピリジンなどのアミンの存在下で、好ましくはピペリジンの存在下で除去される）の化合物を得るステップと；
を含む一連のステップにより調製することができる。
【０３３３】
他の態様によれば、本発明は式（ＸＶＩＩＩ）の中間体
【化８５】
2013525330.tif 000097
（式中、Ｒ１〜Ｒ５、Ｘ、Ｙ、Ｗ、ｐ及びＰＧは上で定義した通りである。好ましい実施形態において、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２〜Ｒ５は水素であり、Ｘ及びＹは塩化物であり、Ｗは水素であり、ｐが５であり、ＰＧは９Ｈ−フルオレニルメトキシカルボニルである）
を指向する。より好ましくは、式（ＸＶＩＩＩ）の化合物は化合物（８）
【化８６】
2013525330.tif 000098
である。
【０３３４】
選択的作用剤に結合すべき核酸は、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集の「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ−１９８５）に開示された方法にしたがって固体支持体上で段階的固相合成により形成することができる。
【０３３５】
選択性リガンドをコンジュゲート化するためには、オリゴヌクレオチドをカルボキシ誘導体にする必要がある。このことは、５’又は３’末端で行うことができる。好ましい実施形態において、選択性リガンドは５’末端に付けられる。
【０３３６】
一実施形態により、式（ＸＶＩ）のコンジュゲートは、上記の式（ＸＩＸ）の化合物と式（ＸＶ）のアミノ改変オリゴヌクレオチド：
【化８７】
2013525330.tif 000099
（式中、ｍは２から６である）
とを反応させることにより調製することができる。カルボキシ基を使用するオリゴヌクレオチドの活性化は、上で説明したようにして行うことができる。
【０３３７】
好ましい実施形態において、ノミフェンシン又はその誘導体にカップリングされたオリゴヌクレオチドは：
（ｉ）α−シヌクレインに相補的な核酸、好ましくは、配列番号：１６〜３６のいずれかから選択された配列を含む核酸、
（ｉｉ）ＢＡＸに相補的な核酸、好ましくは配列番号：３８の配列を含む核酸、
（ｉｉｉ）タウに相補的な核酸、
（ｉｖ）ＮＥＴに相補的な核酸、及び
（ｖ）ハンチンチンに相補的な核酸、好ましくは配列番号：３９〜５５のいずれかから選択される配列を含む核酸
からなる群から選択される。
【０３３８】
次にカルボキシル活性化オリゴヌクレオチドを上で定義した式（ＸＶＩ）の選択的作用剤の活性化された誘導体と反応させて、一般的構造：
【化８８】
2013525330.tif 000100
の化合物を得る。
好ましい実施形態において、コンジュゲートは、構造
【化８９】
2013525330.tif 000101
を有する。
他の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、構造
【化９０】
2013525330.tif 000102
を有する。
【０３３９】
特定の実施形態において、式（ＸＶＩ）の化合物を、式（ＸＸＶＩ）又は（ＸＸＶＩＩ）の化合物と反応させて、それぞれコンジュゲート（ＸＸＸ）及び（ＸＸＸＩ）を得る：
【化９１】
2013525330.tif 000103
【化９２】
2013525330.tif 000104
（式中、
ｍ、ｍ’、ｍ’’、ｐ、ｐ’、ｐ’’、ｒ、ｒ’、ｒ’’、ｓ、ｓ’、ｓ’’、ｔ、ｕ、ｖ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＲ１〜Ｒ５は前に記載した通りである）。
【０３４０】
ある特定の実施形態は、上で定義した式（ＸＸＸ）の化合物を指向する。
【０３４１】
ある特定の実施形態は、式（ＸＸＸ）の化合物（式中、選択的作用剤がノミフェンシンであり、ｐ及びｐ’が５であり、ｍ及びｍ’が６であり、ｒ及びｒ’が４であり、ｓ及びｓ’が１であり、ｔ及びｖが０であり並びにＸ及びＸ’がＣ（Ｏ）ＮＨを表す）を指向する。他の実施形態は、式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物（式中、選択的作用剤がノミフェンシンであり、ｐ及びｐ’が５であり、ｍ及びｍ’が６であり、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔ及びｖが０であり並びにＸ及びＸ’がＣＨ２を表す）を指向する。
【０３４２】
ある特定の実施形態は、式（ＸＸＸ）の化合物（式中、選択的作用剤がノミフェンシンであり、ｐ及びｐ’が５であり、ｍ及びｍ’が９であり、ｒ及びｒ’が４であり、ｓ及びｓ’が１であり、ｔ及びｖが０であり、並びにＸ及びＸ’がＣ（Ｏ）ＮＨを表す）を指向する。他の実施形態は、式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物（式中、選択的作用剤がノミフェンシンであり、ｐ及びｐ’が５であり、ｍ及びｍ’が９であり、ｒが２であり、ｒ’が０であり、ｓが１であり、ｓ’が０であり、ｔ及びｖが０であり、並びにＸ及びＸ’がＣＨ２を表す）を指向する。
【０３４３】
ある特定の実施形態は、上で定義した式（ＸＸＸＩ）の化合物を指向する。
【０３４４】
ある特定の実施形態は、式（ＸＸＸＩ）の化合物（式中、選択的作用剤がノミフェンシンであり、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり、並びにＸ、Ｘ’及びＸ’’がＯを表す）を指向する。他の実施形態は、式（ＸＸＸＩ）の化合物（式中、選択的作用剤がノミフェンシンであり、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が６であり、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり、並びにＸ、Ｘ’及びＸ’’がＯを表す）を指向する。ある特定の実施形態は、式（ＸＸＸＩ）の化合物（式中、選択的作用剤がノミフェンシンであり、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が９であり、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｖが０であり、並びにＸ、Ｘ’及びＸ’’がＯを表す）を指向する。他の実施形態は、式（ＸＸＸＩ）の化合物（式中、選択的作用剤がノミフェンシンであり、ｐ、ｐ’及びｐ’’が５であり、ｍ、ｍ’及びｍ’’が９であり、ｒ、ｒ’及びｒ’’が３であり、ｓ、ｓ’及びｓ’’が１であり、ｔが１であり、ｕが３であり、ｖが１であり、並びにＸ、Ｘ’及びＸ’’がＯを表す）を指向する。
【０３４５】
ｉｖ．カルボキシル誘導体化された核酸、二官能性リンカー、アミノ誘導体化されたノミフェンシン及びアミノ誘導体化されたセルトラリンを使用して二重に誘導体化されたオリゴヌクレオチドの合成
式（ＸＸ）及び（ＸＸＩ）の化合物中のヒドロキシ保護基ＰＧ、ＰＧ’及びＰＧ’’は、同じであっても異なっていてもよい。
【０３４６】
特定の実施形態において、式（ＸＸ）の化合物中のＰＧ及びＰＧ’は異なり、その結果それらは独立に脱保護することができて、式（ＸＸ）の化合物は所望であれば２つの異なった活性化選択的作用剤とカップリングすることができる。
【０３４７】
特定の実施形態において、ＰＧ及びＰＧ’が異なる式（ＸＸ）の化合物は、カルボキシ改変剤と、次に式（ＶＩＩ）の化合物と順に反応させ、一方他のカップリング位置はカルボキシ改変剤と、次に式（ＸＶＩ）の化合物と反応させて、式（ＸＸＸＩＩ）のコンジュゲート：
【化９３】
2013525330.tif 000105
（式中、ｍ、ｍ’、ｐ、ｐ’、ｒ、ｒ’、ｓ、ｓ’、ｔ、ｕ、ｖ、Ｘ１、Ｘ２並びにＲ１〜Ｒ５、Ｘ、Ｙ及びＺは、前に記載した通りである）
を得る。
【０３４８】
好ましい実施形態においては、ＰＧとＰＧ’とが異なる式（ＸＸ）の化合物を、カルボキシ改変剤及び次に式（１０）の化合物と順次反応させ、一方他のカップリング位置はカルボキシ改変剤及び次に式（１１）の化合物と反応させて、式（ＸＸＸＩＩａ）のコンジュゲート：
【化９４】
2013525330.tif 000106
（式中、ｒ、ｒ’、ｓ、ｓ’、ｔ、ｕ、ｖ、Ｘ１及びＸ２は前に記載した通りである）
を得る。
【０３４９】
特定の実施形態においては、式（ＸＸＸＩＩ）又は（ＸＸＸＩＩａ）の化合物中で、ｒ及びｒ’が４であり、ｓ及びｓ’が１であり、ｔ及びｖが０であり、並びにＸ及びＸ’がＣ（Ｏ）ＮＨを表す。
【０３５０】
本発明の特定の実施形態において、ＰＧとＰＧ’とが異なる式（ＸＸ）の化合物は式（ＸＸａ）の化合物：
【化９５】
2013525330.tif 000107
である。
【０３５１】
好ましい実施形態において、式（ＸＸＸＩＩａ）の化合物は下記の式：
【化９６】
2013525330.tif 000108
を有する。
【０３５２】
特定の実施形態において、本発明は、式（ＸＸＸＩＩ）及び（ＸＸＸＩＩａ）の化合物（式中、ｍ、ｍ’、ｐ、ｐ’、ｒ、ｒ’、ｓ、ｓ’、ｔ、ｕ、ｖ、Ｘ１、Ｘ２並びにＲ１〜Ｒ５、Ｘ、Ｙ及びＺは前に記載した通りである）を指向する。
【０３５３】
好ましい実施形態において、本発明は、上で定義した化合物（１２）を指向する。
【０３５４】
Ｅ．２．  核酸及び５’末端に付いた保護基を含むコンジュゲートの合成
合成は第１鎖に保護基を付加することにより開始する。保護基が複数の部分により形成される場合、保護基の一部を形成する異なった部分は、ヌクレオチドを既に存在している核酸に付加するときに使用されるものと同様な手法を使用して核酸に付加される。即ち、遊離ヒドロキシ基の反応性を強化するために付加すべき基が最初に活性化される。適当な活性化試薬として、ホスホロチオネート化合物、カルバメート化合物、メチルホスホネート化合物、グアニジニウム化合物、スルファメート化合物、スルファミド化合物、ホルムアセタール化合物、チオホルムアセタール化合物、スルホン化合物、ホスホロアミデート化合物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、保護基の群はホスホルアミダイト化合物及びそれらの混合物で活性化される。
【０３５５】
遊離ＯＨ基を活性化するのに適した典型的なホスホロアミデートは、例えば式：
【化９７】
2013525330.tif 000109
の（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラジイソプロピルホスホロジアミダイト
及び式：
【化９８】
2013525330.tif 000110
（式中、ｎは６から１２である）
の（２−シアノエチル）Ｎ−ジイソプロピル，Ｎ’−アルキルアミンホスホルアミダイトである。
【０３５６】
典型的な反応は以下のステップを含む：
Ａ）フラノースユニット（適当な化学量論は当業者には明らかであろう）と４，４’−ジメトキシトリチル塩化物（ＤＭＴｒ−Ｃｌ）とを第一級ヒドロキシル基の位置においてのみ反応が起き易い条件で反応させる。次に、残余のヒドロキシル基をアセチル化又はベンゾイル化保護基と反応させる。活性化されたフラノースは、典型的には、構造：
【化９９】
2013525330.tif 000111
を有する。
Ｂ）目的のｓｉＲＮＡ（センス（ｓ）鎖又はアンチセンス（ａ）鎖であってよい）の一方の鎖を固体支持体上で段階的固相合成により形成し、そこで、通常はジメトキシトリチル（ＤＭＴ）により保護されている成長鎖中の末端サブユニットの５’−ＯＨ基を、５’−ＯＨ  ＤＭＴ保護基を除去するために酸性条件下に置き、一方プリン及びピリミジン塩基は（フルオレン−９−イル）メトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）で保護されたままで残す。他の適当な保護基は、ホスホロアミデート化合物、ホスホロチオネート化合物及びＯ−メチル（オキソメチル）及びＯ−エチル（オキソエチル）基に結合した６員モルホリン環を有する化合物である。
【０３５７】
Ｃ）ｓｉＲＮＡ鎖の脱保護された５’−ＯＨ基をステップＡ）の反応性フラノースと反応させ、このようにして１次コンジュゲート化オリゴヌクレオチドを得る。最後に、酸性条件下でフラノースの第一級ヒドロキシルのＤＭＴ保護基を除去して５’−ＯＨ基は残す。
Ｄ）Ｃ１８員の反応性リンカー（以後Ｃ１８）である、エチレングリコールの６モノマーを有するアルキレングリコールモノマー（１２炭素原子及び６酸素原子）は、ホスフィチル化条件下で、末端ＯＨ基に上記の（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホルアミダイトなどのホスホルアミダイト化合物を付加することにより形成する。
【０３５８】
ホスホルアミダイト化合物は、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド骨格中に存在するようなホスホジエステル連結の生成に特に有用である。ポリエチレングリコールを反応性にする他の適当な化合物は、ホスホロアミデート化合物、ホスホロチオネート化合物及びＯ−メチル（オキソメチル）及びＯ−エチル（オキソエチル）基に結合した６員モルホリン環を有する化合物である。
【０３５９】
典型的には、６モノマーのエチレングリコールを有する反応性（Ｃ１８）アルキレングリコールモノマーは、構造
【化１００】
2013525330.tif 000112
を有する。
Ｅ）フラノース−ｓｉＲＮＡ鎖の脱保護され５’−ＯＨ基をステップＤ）の反応性（Ｃ１８）アルキレングリコールモノマーと反応させ、このようにして式：
ＤＭＴ−（Ｃ１８）アルキレングリコール−ホスホジエステル−フラノース−ホスホジエステル−ＲＮＡ鎖
を有する２次コンジュゲート化オリゴヌクレオチドを得る。
【０３６０】
Ｆ）（Ｃ１８）アルキレングリコールの第一級ヒドロキシルのＤＭＴ保護基を酸性条件下で除去して５’−ＯＨ基を残す。
【０３６１】
Ｇ）（Ｃ１８）アルキレングリコール−ホスホジエステル−フラノース−ホスホジエステル−ＲＮＡ鎖の脱保護された５’−ＯＨ基をステップＤ）のものような第２の反応性（Ｃ１８）アルキレングリコールモノマーと反応させて、式：
ＤＭＴ−（Ｃ１８）アルキレングリコール−ホスホジエステル−（Ｃ１８）アルキレングリコール−ホスホジエステル−フラノース−ホスホジエステル−ＲＮＡ鎖
を有する３次コンジュゲート化オリゴヌクレオチドを得る。
【０３６２】
Ｈ）（Ｃ１８）アルキレングリコール末端の第一級ヒドロキシルのＤＭＴ保護基を酸性条件下で除去してさらなる操作のために５’−ＯＨ基を残す。
【０３６３】
保護基が脂質部分を含む場合、本発明によるオリゴヌクレオチド構造物を得るための方法は、ステップＨ）と（Ｉ）との間に追加されるステップ、好ましくは脂肪酸の活性なエステル、アミン、チオール又は酸の形態にある脂質部分を末端基（場合によりフラノース又はＣ１８アルキレングリコール）に結合するステップを含む。当業者は、前記ステップを実施するのに適当な条件や試薬等を、脂質及び前記基の性質に応じて選択することができる。好ましい条件は、ホスホルアミダイト化学により脂肪酸を誘導体化して、ホスホジエステル連結基を通してオリゴヌクレオチド構造に遊離末端５’−ＯＨ又は３’ＯＨで縮合することができる活性化された分子を作ることにある。
【０３６４】
Ｅ．３．  第１の核酸及び５’末端に付いた保護基を含むコンジュゲートと核酸に相補的な鎖及び５’に付いたＳＳＲＩを含むコンジュゲートとをアニーリングすることによるｓｉＲＮＡの合成
上記のようにＥ．１．で得たＳＳＲＩにコンジュゲート化したｓｉＲＮＡの相補鎖を、Ｅ．２．で定義し、得られた改変ｓｉＲＮＡ鎖とアニールする。この目的のために、ＲＮＡ鎖中の全ての残余の保護基は予め以下のようにして除去する。２０％ｖ／ｖのメチルアミン（水溶液４０％ｗ／ｖ）及び８０％ｖ／ｖの飽和したアンモニア溶液３０（３０〜３２％ｖ／ｖのＮＨ３を含有）を含有する５００μｌの混合物をｓｉＲＮＡ（２００ｎｍｏｌスケール）を入れたエッペンドルフチューブに加えた。チューブを密閉して４５分間６５℃の温度に加熱した。この手順によりヌクレオチドのリン原子における保護基（フラノースのアセチル化又はベンジル化及びホスホジエステル連結の２−シアノエチル化）、及び環外アミノ基の保護基（ＦＭＯＣ）が除去される。混合物を次に冷却して濾過し、上清を乾燥した。残留したペレットを１Ｍトリエチルアミン−ＨＦと３時間６５℃で反応させて、保護基をヌクレオチド（２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ＴＢＤＭＳ）の２’で切断した。最後に、生じた溶液をセファデックスカラムで脱塩した。
【０３６５】
そのような２本鎖構造物を形成するのに適した核酸アニーリングの条件は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）及びＨａｙｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８５）により開示されている。
【０３６６】
本発明の構造物のオリゴヌクレオチドの有効性の実例を下に示す。実施例２はｓｉＲＮＡの一方の鎖に連結したフラノース及び２つのＣ１８アルキレングリコール、及び他方の鎖にリンカーを通して連結したセルトラリン分子の付いた本発明のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド配列は、裸出形態（naked form）の対応するｓｉＲＮＡよりも標的シナプス前部の５−ＨＴ１ＡＲの発現をより大きく遮断したことを示す。
【０３６７】
Ｆ．  診断用のコンジュゲート及びそれらの使用
神経伝達物質輸送体に高い親和性で結合することができる選択的作用剤を使用することにより治療用の化合物を標的細胞に特異的に送達する可能性は、診断目的に使用することができる化合物の送達に応用することもできる。したがって、他の実施形態において、本発明は、
（ｉ）１種又は複数種の神経伝達物質輸送体に特異的に結合する少なくとも１種の選択的作用剤、及び
（ｉｉ）撮像剤
を含むコンジュゲートを提供する。
【０３６８】
用語「選択的作用剤」及び「神経伝達物質輸送体」は、上で詳細に説明してあり、診断用の本発明のコンジュゲートについても同様に理解してよい。
【０３６９】
用語「撮像剤」及び「造影剤」は、本明細書において互換的に使用され、使用するとこれらの像の異なった領域間の「コントラスト」を強化することにより像の異なった部分の区別が容易になる生体適合性化合物を指す。したがって用語「造影剤」は、そのような作用剤がなくても発生させることができる像（例えば、ＭＲＩの場合のように）の品質を向上するために使用される作用剤、並びに像の発生に欠くことのできない作用剤（例えば、核撮像の場合のように）を包含する。適当な造影剤として、放射性核種撮像、コンピューター断層撮影、ラマン分光法、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）及び光学的撮像のための造影剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７０】
放射性核種撮像用の造影剤として、通常１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、８２Ｒｂ、６２Ｃｕ及び６８Ｇａなどの陽電子エミッターで標識された放射性薬剤が挙げられる。ＳＰＥＣＴ放射性薬剤は、通常９４ｍＴｃ、２０１Ｔｌ及び６７Ｇａなどの陽電子エミッターで標識される。放射性核種撮像様式（陽電子断層撮影（ＰＥＴ）；シングルフォトンエミッションＣＴ（ＳＰＥＣＴ））は、放射性核種標識の放射性トレーサーの位置及び濃度をマッピングする診断用断面撮像技法である。ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴは、代謝活性を測定することにより放射性核種を局在化させて特徴づけることに使用することができる。ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴは細胞の生存率などの細胞のレベルにおける情報に属する情報を提供する。ＰＥＴにおいて、患者は、陽電子を放出する微弱な放射性物質を摂取するか又は注射され、該物質は身体中を移動するのでモニターすることができる。１つの一般的な適用では、例えば、患者は陽電子エミッター付きのグルコースを与えられ、種々の課題を遂行させながら彼らの脳がモニターされる。脳はそれがはたらくときにグルコースを使用するので、ＰＥＴ像はどこで脳活性が高いかを示す。本発明のある実施形態においては、細胞をインビボのＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ撮像のために体外で標識する。ＰＥＴと密接に関係するのはシングルフォトンエミッションＣＴ、又はＳＰＥＣＴである。２つの間の主要な相違は、ＳＰＥＣＴは、陽電子放出物質の代わりに低エネルギー光子を放出する放射性トレーサーを使用することである。
【０３７１】
ＣＴ撮像用の造影剤は、例えば、ヨウ素化又は臭素化造影媒体を含む。これらの作用剤の例として、イオタラメート、イオヘキシル、ジアトリゾエート、イオパミドール、エチオド−ル及びイオパノエートが挙げられる。ガドリニウム剤もＣＴ造影剤として使用されることが報告されている（例えば、Ｈｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４参照）。例えば、ガドペンテート剤がＣＴ造影剤として使用されている（Ｓｔｒｕｎｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｌｄ，２００４で論じられた）。コンピューター断層撮影（ＣＴ）は本発明の関係では撮像様式として考慮されている。一連のＸ線を種々の角度から時には千回を超えて取り、次にそれらをコンピューターと組み合わせることにより、ＣＴは身体の任意の部分の３次元像を構築することを可能にする。コンピューターは２次元断面を任意の角度から及び任意の深さで表示するようにプログラムされている。ＣＴにおいて、最初のＣＴスキャンで診断がつかないときには、本明細書に記載したものなどの放射線不透過性造影剤の静脈注射が、軟組織体の同定及び描写の助けになり得る。
【０３７２】
光学的撮像用の造影剤としては、例えば、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、インドシアニングリーン、オレゴングリーン、オレゴングリーン誘導体誘導体、ローダミングリーン、ローダミングリーン誘導体、エオシン、エリスロシン、テキサスレッド、テキサスレッド誘導体、マラカイトグリーン，ナノゴールドスルホスクシンイミジルエステル、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン、ピリジルオキサゾール誘導体、カスケードイエロー色素、ダポキシル（ｄａｐｏｘｙｌ）色素及び本明細書において開示した種々の他の蛍光性化合物が挙げられる。
【０３７３】
好ましい実施形態において、造影剤は、磁気共鳴撮像装置により撮像され得る化合物である。磁気共鳴撮像装置により撮像できる造影剤は他の撮像技法で使用されるものと異なる。それらの目的は、同一のシグナル特性が同じ組織成分間を識別するのに役立つこと及び緩和時間を短かくすること（Ｔｌ強調スピンエコーＭＲ像により強いシグナル及びＴ２強調像に強度のより小さいシグナルを生ずるであろう）である。ＭＲＩ造影剤の例として、ガドリニウムキレート、マンガンキレート、クロムキレート、及び鉄粒子が挙げられる。特定の１実施形態において、ＭＲＩ造影剤は、１９Ｆである。ＣＴ及びＭＲＩは両方とも組織の境界を識別するのに役立つ解剖学的情報を提供する。ＣＴに比較したＭＲＩの不利点として、より低い患者耐性、ペースメーカー及びある種の他の金属のインプラントデバイスにおける禁忌、及び複数の原因（それらの少なからずが運動である）が関係するアーチファクトが挙げられる。他方、ＣＴは迅速で、十分耐えられ、また容易に利用できるが、ＭＲＩよりコントラスト解像度が低く、ヨウ素化した造影剤及びイオン化性放射線が必要になる。ＣＴ及びＭＲＩの両方の不利点は、いずれの撮像様式も細胞レベルにおける機能的情報を提供しないことである。例えば、いずれの様式も細胞の生存率に関する情報を提供しない。磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）は、ＣＴより新しく、高強度磁石及びラジオ波周波数シグナルを使用して像を生ずる撮像様式である。生物組織中に最も豊富な分子の種は水である。撮像検査で究極的にシグナルを生じさせるのは水のプロトン核の量子力学的「スピン」である。ＭＲＩにおいては、撮像されるべき試料が強い静的磁場（１〜１２テスラ）に置かれ、スピンがラジオ波周波数（Ｒｆ）の放射線のパルスで励起されて試料における正味の磁化を生じさせる。次に種々の磁場勾配及び他のＲｆパルスがスピンに作用して空間的情報を記録されるシグナル中に信号化する。これらのシグナルを集めて解析することにより、ＣＴ画像のように、通常２次元断面で表示される３次元画像を計算することが可能である。
【０３７４】
ＭＲＩ造影剤として、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）及びエルビウム（ＩＩＩ）からなる群から選択される金属の錯体が挙げられる。好ましい実施形態において、磁気共鳴撮像装置により撮像することができる化合物は、ガドリニウム系化合物である。
【０３７５】
本明細書中で使用する用語「ガドリニウム系化合物」は、撮像に関して使用される場合、対象者に投与可能で静脈内増強が生ずる任意のガドリニウム含有物質を意味することとする。他の実施形態において、ガドリニウム含有造影剤は、ガドリニウム、ガドリニウムペンテート、及びガドジアミドからなる群から選択される。
【０３７６】
投与すべきガドリニウム含有造影剤の量は、体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇの量で変化する。他の実施形態においては、第２の磁気共鳴像がガドリニウム含有造影剤を投与した約４５分後に取得される。本発明は、ステップ（ｃ）又はステップ（ｄ）のいずれかに続いて対象者の腹腔内に食塩水溶液（例えばリンゲル溶液）を投与するステップをさらに含む上記の方法も提供する。
【０３７７】
本発明は、診断剤として上で定義したコンジュゲートの使用及び神経伝達物質輸送体をそれらの表面上に発現する細胞の検出方法も提供する。
【０３７８】
撮像されるべき細胞のタイプに応じて、コンジュゲートは１種又は複数種の選択的作用剤を組み込む。以下の表に、撮像しなければならない細胞のタイプに応じて使用することができる選択的作用剤を記載する。
【表５】
2013525330.tif 000113
【０３７９】
本発明は多モードの撮像方法も提供する。本発明のある実施形態は、複数のシグナルを測定することを含む複数の撮像様式を使用して対象者又は対象者内の部位を撮像する方法に関係する。ある実施形態においては、細胞上又は細胞中の単一の標識から複数のシグナルが生ずる。上で説明したように、当業者に知られた任意の撮像様式を、本発明の撮像方法のこれらの実施形態で適用することができる。
【０３８０】
撮像様式は、標識された組成物、例えば、標識された細胞の投与中又は投与の後任意の時間に実施される。例えば、撮像試験は、本発明の標識された細胞の投与中に、又はその後の任意の時間に、即ち、特定の位置への送達を導くのに役立つように実施することができる。
【０３８１】
第１の撮像様式と同時に、又は第１の撮像様式後の任意の時間に追加の撮像様式を実施することができる。例えば、追加の撮像様式は、第１の撮像様式の完了の約１秒、約１時間、約１日、又はそれより長い任意の時間後に、又は任意のこれらの述べた時の間の任意の時に実施することができる。本発明のある実施形態においては、複数の撮像様式が並行して実施され、それらは標識された細胞又は作用剤の投与に続いて同時に開始される。当業者は、本発明により考慮される種々の撮像様式の実行に精通しているであろう。
【０３８２】
本発明の撮像方法の幾つかの実施形態においては、同じ撮像デバイスが第１の撮像様式及び第２の撮像様式を実施するために使用される。他の実施形態においては、異なった撮像デバイスが異なった撮像様式を実施するために使用される。当業者は、本明細書に記載した撮像様式を実行するために利用し得る撮像デバイスに精通しているであろう。
【０３８３】
本発明は、１つ又は複数撮像様式を使用して細胞を撮像する方法を提供する。幾つかの実施形態において、細胞が複数種の撮像剤で、及び細胞が単一の標識剤で標識される他の態様で標識される。ある実施形態においては、単一の標識剤が多モード検出可能な作用剤である。
【０３８４】
以下の実施例及び図面は例示として提供され、本発明を限定することは意図しない。
【実施例】
【０３８５】
実施例１
セルトラリン及びオリゴヌクレオチドを含む本発明のコンジュゲートの合成。
【０３８６】
活性化されたセルトラリン（４）の合成
活性化されたセルトラリンを以下のスキームに示したようにして調製した。
【０３８７】
【化１０１】
2013525330.tif 000114
Ａ．１．  化合物（１）の合成
セルトラリン塩酸塩（市販で入手可能、３４ｍｇ）、９Ｈ−フルオレニルメトキシカルボニル−６−アミノヘキサン酸（Ｆｍｏｃ−ＡＣＡ、４９ｍｇ）、ＤＭＦ（２ｍｌ）、Ｎ−メチル−モルホリン（２２μｌ）及びＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ、６８ｍｇ）の混合物を室温で終夜攪拌した。反応に続いてＴＬＣ（１０％ＣＨ３ＯＨ／ＣＨＣｌ３）を行った。混合物を蒸発させると濃い油状物が生じ、それをさらに３×５ｍｌの石油エーテルで洗浄した。２ｍｌの水を油性化合物に加えて、生じた沈殿を２×１０ｍｌの水で再び洗浄した。沈殿を２０ｍｌの塩化メチレン（ＤＣＭ）で溶解して２０ｍｌのＮａＣｌ溶液で後処理し、次にＮａ２ＳＯ４で乾燥した。溶液を蒸発させて乾燥し、次に機械的ポンプで乾燥すると固体（１２９ｍｇ粗生成物）が生じた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、１％、２％、次に５％メタノール／ＤＣＭで溶出した。分画を合わせて蒸発乾固した。生成物を真空で６時間乾燥して９０ｍｇの純粋化合物（１）を得た。
【０３８８】
Ａ．２．  化合物（２）の合成
化合物（１）（９０ｍｇ）をＤＣＭ中２０％ピペリジン３ｍｌに１時間かけて溶解した。反応に続いてＴＬＣ（１０％メタノール／ＣＨＣｌ３）を行った。混合物を蒸発させると油状物が生じ、それを３×１０ｍｌの石油エーテルで洗浄した。生じた粗製化合物（５４ｍｇ）はさらに精製しなくても次の反応に十分な純度であった。
【０３８９】
Ａ．３．  化合物（３）の合成
化合物（２）（５４ｍｇ）、ピリジン（３ｍｌ）、コハク酸酸無水物（１６ｍｇ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１８ｍｇ）の混合物を室温で終夜攪拌した。反応に続いてＴＬＣ（８５：１０：５＝ＤＣＭ：メタノール：酢酸）を行った。１０ｍｌの水を反応混合物に加えた。反応混合物を濃縮するとガム状になり、次に１０ｍｌのＤＣＭ中に懸濁した。有機相を２×１０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３溶液、１０ｍｌの５％クエン酸溶液及び１０ｍｌの塩水溶液で洗浄した。該溶液を硫酸ナトリウムで乾燥して蒸発させ、化合物（３）を白色発泡体（４６ｍｇ）として得た。
【０３９０】
Ａ．４．  化合物（４）の合成
化合物（３）（４６ｍｇ）、ヒドロキシスクシンイミド（１３ｍｇ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、６０μｌ）及びＤＣＭ（４ｍｌ）の混合物を室温で終夜攪拌し、続いてＴＬＣ（１０％メタノール／ＣＨＣｌ３）を行った。溶液を蒸発乾固すると１５０ｍｇの粗固体が生じた。粗製化合物を分取ＴＬＣ（２ｍｍ厚さ、２０×２０ｃｍ）で精製し、ＴＬＣを１％酢酸を含有する７％メタノール／ＣＨＣｌ３により展開した。適当なバンドを切り出してフィルタ−漏斗中に入れた。１５％メタノール／ＣＨＣｌ３で溶出した後、溶液を蒸発乾固して３５ｍｇの化合物（４）（ＨＰＬＣ純度９８％）を得た。
【０３９１】
Ｂ．  アミノ改変オリゴヌクレオチド（５）及び（６）の合成
合成は、自動合成装置で、市販のアミノリンカーである６−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ヘキシル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト（５’−ＭＭＴ−Ｃ６−アミノ改変剤−ＣＥＰ）及び６−（トリフルオロアセチルアミノ）ヘキシル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト（５’−ＴＦＡ−Ｃ６−アミノ改変剤−ＣＥＰ）をそれぞれ使用して実施した。
【化１０２】
2013525330.tif 000115
次のステップを続けた。
【０３９２】
１．アミノ−リンカー−ＣＥＰを不活性雰囲気（アルゴン又は窒素）下で無水アセトニトリルに溶解した（１ｍｌ中に１００μＭ）。該溶液を清浄な追加の貯蔵器（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９００合成装置の位置５〜９又は任意の他の合成装置の予備のポート）に入れた。ラインに手作業で２〜３秒予備送液するか又はプライミングプログラムを使用して送達チューブをこの試薬で満たした。
２．所望の配列を書いた；予備の塩基位置（５〜９）を有する５’末端、そして改変試薬を機器による合成の最終ステップに組み込んだ。
３．オリゴヌクレオチドがＨＰＬＣ精製を必要とするので、ＤＭＴオプションを有する配列を、合成プログラムについて確認した。
４．適当なスケール（０．２〜１．０μＭ）のカップリングプログラムを使用して機器で合成を開始した。
５．合成が終了したら、カラムを機器から取り外し、注射器を使用して支持体をエタノールで洗浄し（３×１ｍｌ）、残留する酸（脱トリチル化ステップからの）及びヨウ素（酸化ステップからの）を除去した。
【０３９３】
Ｃ．オリゴヌクレオチドの支持体からの脱保護及び除去
以下のステップを実施した。
１．前のステップで乾燥した支持体をスクリューキャップ付きバイアル（１．５〜２ｍｌ）中に移した。
２．５００μＬ（０．２μＭスケール）の濃ＮＨ４ＯＨ（３０％）溶液を加えた。
３．キャップをきつく締めて懸濁液を５５℃で少なくとも８時間から終夜インキュベートした（Ｇに富む配列のためにはより長い時間が与えられるべきであった）。
４．上清を０℃に冷却して他の微量遠心管に移した。
５．支持体を同量の蒸留水ですすぎ、この洗液をアンモニア上清に加えた。その結果アンモニア溶液は、オリゴヌクレオチドに連結した、５’末端に遊離アミノヘキシル基（Ｎ−ＴＦＡ−アミノヘキシルホスホルアミダイトが組み込まれた場合）又は保護されたアミノヘキシルのいずれかを有する全長オリゴヌクレオチドをヌクレオシドでない物質及び短い配列と一緒に含有した。
【０３９４】
遊離アミノヘキシルリンカーの付いたオリゴヌクレオチドの精製は、アニオン交換ＨＰＬＣ、エタノール沈殿又はポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により達成することができた。
【０３９５】
Ｄ．活性化されたセルトラリンの遊離第一級アミンへの結合。
ステップＢ及びＣで得られた５’末端アミノ連結オリゴヌクレオチドのステップＡで得られたＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体による標識を、以下の手順により溶液相で実施した：
Ａ．マーカーの結合
１．前のステップで得た部分的に又は完全に精製されたアミノ連結オリゴヌクレオチド（２０〜２５ＯＤＵ（Ａ２６０）約７００μｇ）を２５０μＬの１．０Ｍ  ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．０）混合物中に溶解した。生じた溶液のｐＨをチェックして塩基性であることを確認した。
２．ステージＡで得た活性化された誘導体（５〜６ｍｇ）の溶液５００μＬを１．０Ｍ  ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ＝９．０）：ＤＭＦ：水（５：２：３ｖ／ｖ）の混合物に加えた。
３．混合物をボルテックスにかけ、露光を防止するためにエッペンドルフチューブをアルミニウム箔で覆った。
４．室温で２０時間インキュベーションした後、混合物に１Ｍ  ＴＥＡＡ溶液を添加して反応を停止させた。
【０３９６】
Ｂ．セファデックスＧ−２５カラムを使用する過剰なマーカーの除去
１．活性化された誘導体試料をカラム上に載せた。
２．カラムを水で溶出して、１．０ｍｌの分画でエッペンドルフチューブ中に集めた。所望の生成物は溶媒容積の後で溶出を開始し、所望の生成物の大部分は分画３〜９に溶出した。
３．大部分の材料を含有する分画をプールして濃縮した。
４．通常１２〜１５ＯＤＵ Ａ２６０ （７０％）が得られ、それは過剰な染料／マーカー分子を含まない。必要であれば、生成物を逆相ＨＰＬＣの電気泳動（２０％ＰＡＧＥ）によりさらに精製することができる。
【０３９７】
実施例２
セルトラリンとコンジュゲート化したセンスオリゴヌクレオチド及び式Ｃ１８−Ｌ３−Ｃ１８−Ｌ２−フラノース−Ｌ１−［オリゴヌクレオチド］−３’（Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はホスホジエステル連結である）の保護基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡの合成
合成は以下のステップ実施した：
（ａ）ＲＮＡオリゴヌクレオチドは固体支持体上で段階的固相合成により形成し、そこで成長鎖中の末端サブユニットの通常はジメトキシトリチル（ＤＭＴ）により保護されている５’−ＯＨ基を酸性条件下に置いて５’−ＯＨのＤＭＴ保護基を除去するが、一方プリン及びピリミジン塩基は（フルオレン−９−イル）メトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）で保護されたままで残す。
（ｂ）Ｄ−リボース又はＤ−（−）−フルクトフラノースなどのフラノースユニットを、第一級ヒドロキシル基の位置における反応にだけ有利な条件下に４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴｒ−ＣＩ）と反応させる。次に、残余のヒドロキシル基をアセチル化又はベンジル化保護基と反応させる。最後に、酸性条件下で第一級ヒドロキシルのＤＭＴ保護基を除去する。フラノースの前記脱保護されたヒドロキシル基はステップ（ａ）で得られたｓｉＲＮＡ鎖の脱保護された５’−ＯＨ基と反応させ、このようにして第１のコンジュゲート化オリゴヌクレオチドを得る。
（ｃ）共有結合結合ユニット（Ｃ１８スペーサー）１８個のスペーサーを与えるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のモノマー６個を有する反応性ポリエチレングリコールは、末端ＯＨ基にホスフィチル化条件下で、式（ＩＩ）
【化１０３】
2013525330.tif 000116
の（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホルアミダイトなどのホスホロアミデート化合物を付加することにより形成した。
（ｄ）フラノースの脱保護された５’−ＯＨ基をステップ（ｃ）の反応性ポリエチレングリコールと反応させ、そのようにして構造：
ＯＨ−Ｃ１８−Ｌ２−フラノース−Ｌ１−［オリゴヌクレオチド］−３’
（Ｌ１及びＬ２はホスホジエステル結合である）
を有するｓｉＲＮＡ鎖を得た。
（ｅ）１８共有結合ユニットのスペーサー（Ｃ１８スペーサー）を与えるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のモノマー６個を有する第２の反応性ポリエチレングリコールは、末端ＯＨ基にホスフィチル化条件下で、式（ＩＩ）
【化１０４】
2013525330.tif 000117
（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホルアミダイトなどのホスホロアミデート化合物を付加することにより形成した。
（ｆ）Ｃ１８の脱保護された５’−ＯＨ基をステップ（ｅ）からの第２の反応性Ｃ１８ポリエチレングリコールと反応させ、そのようにして構造：
Ｃ１８−Ｌ３−Ｃ１８−Ｌ２−フラノース−Ｌ１−［オリゴヌクレオチド］−３’
（Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はホスホジエステル結合である）
を有するｓｉＲＮＡ鎖を得た。
【０３９８】
（ｇ）実施例１に記載したセルトラリンとコンジュゲート化したｓｉＲＮＡの相補鎖を、ステップｆ）の改変されたｓｉＲＮＡ鎖とアニールした。この目的でＲＮＡ鎖中の全ての残余の保護基は予め以下のようにして除去しておく。２０％ｖ／ｖのメチルアミン（水溶液４０％ｗ／ｖ）及び８０％ｖ／ｖの飽和アンモニア溶液３０（３０〜３２％ｖ／ｖのＮＨ３を含有）を含む５００μＬの混合物を、ｓｉＲＮＡ（２００ｎｍｏｌ規模）を入れたエッペンドルフチューブに加えた。チューブを密閉して４５分間６５℃の温度に加熱した。この手順で、ヌクレオチドのリン原子における保護基（フラノースのアセチル化又はベンジル化及びホスホジエステル連結の２−シアノエチル化）、及びヌクレオチドの保護基（ＦＭＯＣ）が除去される。該混合物を次に冷却して濾過し、上清を乾燥した。残留ペレットを１Ｍトリエチルアミン−ＨＦと３時間６５℃で反応させてヌクレオチド（２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ＴＢＤＭＳ）の２’の保護基を切断した。最後に、生じた溶液をセファデックスカラムで脱塩した。
【０３９９】
実施例３
マウスの背側の縫線核（ＤＲＮ）中にインビボ局所注射することによる、５−ＨＴ１ＡＲを標的とするｓｉＲＮＡと式（Ｉ）の基とのコンジュゲート及び１種のターゲティング作用剤（以後ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）及び５−ＨＴ１ＡＲを標的とする裸出ｓｉＲＮＡ（以後裸出ｓｉＲＮＡ）の有効性アッセイ
【０４００】
本実施例はＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ及び裸出ｓｉＲＮＡがシナプス前部の５−ＨＴ１ＡＲのノックダウンに対して同様な有効性を呈することを示し、それは、セロトニン作動性ニューロンの本体が位置する背側の縫線核中に局所的に適用されたときに、そのタンパク質レベルの低下及びその機能により測定される。このことは式（Ｉ）の基及び本発明の構造物で使用されるターゲティング作用剤が干渉性オリゴヌクレオチドの有効性に干渉しないことを示す。
【０４０１】
実施例１及び２の構造を有する一組の化合物が上で開示したようにして合成され、以下の構造を有した。
【化１０５】
2013525330.tif 000118
【０４０２】
ｓｉＲＮＡは以下のＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００８３０８）のセロトニン受容体５−ＨＴ  １Ａ型（５−ＨＴ１ＡＲ）配列：６３３−６５１、８５２−８７０，１８８９−１９０７及び２１６７−２１８５の領域を標的とするように設計した。各ｓｉＲＮＡのアンチセンス及びセンス鎖は化学的に合成し（配列番号５〜１０、表１）、等張ＲＮＡアニーリング緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ：７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で、各鎖の５０μＭ溶液を組み合わせることによりアニールした。該溶液を次に１分間９０℃でインキュベートし、１５秒遠心して次に３７℃で１時間インキュベートした。アニールした溶液はＨＰＬＣで精製してｓｉＲＮＡの選択された分画を凍結乾燥した。凍結乾燥した生成物をＲＮＡアーゼを含まない水中に再懸濁することによりｓｉＲＮＡの貯蔵溶液を調製して、使用するまで−２０℃で貯蔵した。使用に先立って全てのｓｉＲＮＡ貯蔵溶液は、脳に適用するために適当なビヒクル（ｉ．ｃ．ｖ．局所適用）であるＣＳＦ（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ，１．２６ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．１８ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び５％グルコース）中で最終濃度に希釈した。
【表６】
2013525330.tif 000119
【０４０３】
全てのこれらのｓｉＲＮＡ配列はＨＴ１Ａ受容体のｍＲＮＡに相補的なアンチセンス配列を含み、したがって前記ｍＲＮＡを阻止してその発現を妨げることができる。これらの配列の等モルカクテルを全ての実験に使用した。
【０４０４】
対照として、ナンセンスｓｉＲＮＡ配列（ｎｓ  ｓｉＲＮＡ）を注入した。このｎｓ  ｓｉＲＮＡは、Ｂｌａｓｔ配列比較アルゴリズムでマウスの全トランスクリプトームと比較したときに如何なるマウス遺伝子とも相補的でない。該ｎｓ  ｓｉＲＮＡは以下の配列を有した：
【化１０６】
2013525330.tif 000120
【０４０５】
全ての配列は、細胞中の正常過程のｍＲＮＡを調節するタンパク質との干渉を避けるために、少なくとも１つのチミン（Ｔ）を含むヌクレオチド末端ＤＮＡダイマーを有する（示していない）。この技法は当業者によく知られている。これらの末端ダイマーとともに、該オリゴヌクレオチドは、効率的なＲＮＡｉ機構を可能にする２１〜２３塩基対を有する。
【０４０６】
表１の式（Ｉ）の基とコンジュゲート化したｓｉＲＮＡ配列、及び上記の１種のターゲティング作用剤（ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）、式（Ｉ）の基とコンジュゲート化したナンセンスｓｉＲＮＡ及び１種のターゲティング作用剤（ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）及び改変のない裸出オリゴヌクレオチド（表１の裸出ｓｉＲＮＡ又はｎｓ裸出ｓｉＲＮＡ）を実験に使用した。
【０４０７】
ｓｉＲＮＡを注入するために、マイクロカニューレシステムを当技術分野において前に記載された標準的定位法を使用して埋め込んだ。２５ゲージ配管により通した流入マイクロカニューレは、１１０μｍＯＤ及び４０μｍＩＤの溶融シリカ毛細管の配管からなる。マイクロカニューレの所定の長さは標的とすべき脳領域の深さ（即ち、背側の縫線核に対して１ｍｍ）に基づいて決定される。
【０４０８】
雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２１〜２９ｇ、９〜１２週齢雄）の背側の縫線核（ＤＲＮ）に１本のマイクロカニューレを埋め込んだ。定位座標（ｍｍ）は、Ｆｒａｎｋｌｉｎ及びＰａｘｉｎｏｓ（１９９７）にしたがって十字縫合及び頭蓋の頂点から、ＡＰ：−４．５、Ｌ：−１．０、ＤＶ：−４．４であり、横からの角度は２０度であった。マイクロカニューレは歯科用セメント及び２本の長さ２ｍｍ、直径０．９５ｍｍのスクリューで頭蓋に固定した。マイクロ注入実験は、覚醒マウスで手術後２０〜２４時間に実施した。精密ポンプにより０．５μＬ／分の速度で作動する注射器に注射マイクロカニューレをポリエチレン配管を通して接続した。
【０４０９】
シナプス前部の５−ＨＴ１ＡＲ活性の機能測定試験のために、本発明者らは、（Ｒ）−（＋）−８−ヒドロキシ−２−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）テトラリン臭化水素酸塩（８−ＯＨ−ＤＰＡＴ、選択的５−ＨＴ１ＡＲアゴニスト）により誘発される低体温応答を、裸出ｓｉＲＮＡ又はＮＬＦ−ｓｉＲＮＡのプールを背側の縫線核中に注入（ＤＲＮ、０．３μｇ（０．０２ｎｍｏｌ）／１μｌ／２日）して２４時間後に評価した。対照群には、同じ量のビヒクル（ＣＳＦ：１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ，１．２６ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．１８ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び５％グルコース）、ｎｓ裸出ｓｉＲＮＡ及びｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡを注入した。マウスは、実験前の１時間、実験室内の個別のケージに２２℃の安定した温度で保管した。全ての実験は１０：００ａ．ｍ．と１４：００ｐ．ｍ．の間に実施した。体温は、マウスを自由に運動させながら温度の読み取りの５分前に、潤滑したプローブを直腸中に挿入することにより測定した。表示値はディジタル温度計を使用して得た。基礎値は８−ＯＨ−ＤＰＡＴ投与の５分前及び１５、３０、６０及び１２０分後に測定した。８−ＯＨ−ＤＰＡＴは食塩水溶液に溶解して、腹腔内に（ｉ．ｐ．）１ｍｇ／ｋｇ、体積では５ｍｌ／ｋｇで注射した。低体温を誘発するために選択した８−ＯＨ−ＤＰＡＴの用量は以前の研究に基づく。マウスの異なった群及びそれらのそれぞれの対照において、５−ＨＴ１Ａを標的とするｓｉＲＮＡをＤＲＮ中に最後に適用した２４時間後に体温を測定した。体温を直腸で測定する追加の実験を５−ＨＴ１ＡＲ  ＫＯマウス（５−ＨＴ１ＡＲのないマウス）で実施して８−ＯＨ−ＤＰＡＴ誘発低体温のないことを評価した。
【０４１０】
図１で見ることができるように、ｓｉＲＮＡの局所注射による５−ＨＴ１ＡＲのノックダウンは、５−ＨＴ１ＡＲ  ＫＯマウスと同様な８−ＯＨ−ＤＰＡＴにより誘発される低体温応答の欠如を示す。
【０４１１】
このアッセイの後、マウスを斬首により殺害して脳を迅速に取り出し、ドライアイスで凍結して−２０℃で貯蔵した。ミクロトームクリオスタットを使用して厚さ１４μｍの組織切片を切り、ＡＰＴＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン）コートスライド上に解凍固定して、使用するまで−２０℃に保った。
【０４１２】
５−ＨＴ１ＡＲタンパク質の密度を測定する目的で、本発明者らは、５−ＨＴ１Ａ受容体部位のオートラジオグラフィーによる可視化のために［３Ｈ］８−ＯＨ−ＤＰＡＴを使用した。［３Ｈ］８−ＯＨ−ＤＰＡＴのための実験におけるインキュベーション条件は、当技術の状況において以前に記載されている。簡単に述べれば、凍結した組織切片を解凍して乾燥し、ｐＨ７．６の１７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．０１％アスコルビン酸中で３０分間室温で予備インキュベートして、次に１ｎＭ［３Ｈ］−ＯＨ−ＤＰＡＴ（２３４．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び１０−５Ｍパルギリンを含む同じ緩衝液中で６０分間室温でインキュベートした。非特異的結合は、１０−５Ｍの５−ＨＴの存在下で残るものと定義した。インキュベーション及び洗浄後、組織切片を蒸留氷冷水中に浸漬して、冷空気流下で急速に乾燥した。組織をトリチウム感応性フィルムにプラスチックの３Ｈ−標準と一緒に６０日間４℃で暴露した。
【０４１３】
マウス中脳縫線核における十字縫合から３つの異なった前後方向（ＡＰ）座標（約ＡＰ−４．８４、−４．６０及び−４．２４ｍｍ）；（Ｆｒａｎｋｌｉｎ及びＰａｘｉｎｏｓ，１９９７）の組織ＤＲＮ切片を受容体部位の定量のために使用して、それらを同じ実験条件で同時に処理した。オートラジオグラムの定量分析はＡＩＳＲコンピューター画像解析システムで行った。
【０４１４】
図２で見ることができるように、裸出ｓｉＲＮＡ及びＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ群における５−ＨＴ１ＡＲタンパク質密度は、対照群（ビヒクル、ｎｓ裸出ｓｉＲＮＡ及びｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）の約４０〜５０％に低下した。この変化は図１に記載した低体温応答の抑制に対応する。
【０４１５】
これらの実験は、両方の鎖におけるＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの化学的改変が、裸出ｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡの標的遺伝子をノックダウンする能力を低下させないことを示す。さらに、５−ＨＴ１Ａ受容体特異的ｓｉＲＮＡのＤＲＮに対する注入による局所適用は、ｓｉＲＮＡが裸出であるか又はターゲティング部分とカップリングしているかに関わらず、標的ｍＲＮＡをノックダウンした。これは、該投与法が適用中にはたらく物理的圧力によるｓｉＲＮＡのニューロンの本体への直接移動を生じさせて、その結果、ニューロン膜を越える移動は必要とされないからと説明することができる。
【０４１６】
以下の実施例において、裸出５−ＨＴ１Ａ受容体に特異的なｓｉＲＮＡは脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）又は鼻内いずれの適用によっても標的ｍＲＮＡをノックダウンできないこと及びｓｉＲＮＡに付けたターゲティング分子の存在が標的ｍＲＮＡの有効なノックダウンを可能にすることが示されるであろう。
【０４１７】
実施例４
中脳縫線核中のセロトニン作動性ニューロンに対する差別的選択性及びマウスの背側の第３脳室（Ｄ３Ｖ）内へのインビボ脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注入による裸出ｓｉＲＮＡに対する本発明のＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ構造物の有効性アッセイ
本実施例は、ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ構造物及び裸出ｓｉＲＮＡは、それらが背側の第３脳室（Ｄ３Ｖ）中に適用されて脳脊髄液（ＣＳＦ）を通して脳全体及ぶときに、セロトニン作動性ニューロンに対する選択性及び５−ＨＴ１ＡＲをノックダウンする効力が異なることを示すことを示す。このことは、そのｍＲＮＡ発現レベルの低下、タンパク質レベルの低下、機能的変化及び抗鬱剤薬理学的増強作用の測定により評価した。
【０４１８】
実施例３に記載した一組の分子（ビヒクル、ｎｓ裸出ｓｉＲＮＡ、ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ、裸出ｓｉＲＮＡ及びＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ群）を、３０μｇ／２．５μｌ／１日（２．３ｎｍｏｌ）で背側の第３脳室（Ｄ３Ｖ）中に以下の定位座標で（ｍｍで：ＡＰ：−２．０、Ｌ：０、ＤＶ：−２．１）同様な系統のマウス及び実施例２の注入システムを使用して注入した。５−ＨＴ１ＡＲｍＲＮＡ発現レベルを決定するために本発明者らは、５−ＨＴ１ＡＲに対する、塩基８２〜１２２、１２３〜１７１、８８５〜９３３及び１３４１〜１３８９に相補的な４種のオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブを同時に使用して、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成アッセイを実施した。各５−ＨＴ１Ａ受容体オリゴヌクレオチドは、ＱＩＡｑｕｉｃｋヌクレオチド除去キットを使用して遠心により精製した［３３Ｐ］−ｄＡＴＰ（＞２５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を用いて末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用してその３’末端に個別に標識した（２ｐｍｏｌ）。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成における単一標識のためのプロトコルは以前に記載された手順に基づく。簡単に述べると、実施例２に記載した凍結組織切片を先ず室温に戻し、リン酸緩衝食塩水（１×ＰＢＳ：８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６ｍＭ  ＫＣｌ）中の４％パラホルムアルデヒド中で２０分間４℃で固定して、室温で３×ＰＢＳで５分間、１×ＰＢＳで２回各５分間洗浄し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＥＤＴＡ中２４Ｕ／ｍｌの最終濃度で予め消化したプロナーゼの溶液中において２１℃で２分間インキュベートする。酵素的活性は、１×ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌのグリシン中に３０秒間浸漬することにより停止した。組織は最後に１×ＰＢＳ中ですすいで等級づけされたエタノールにより脱水した。ハイブリッド形成のために、放射性標識されたプローブを、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、１×デンハルト溶液（０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン）、１０％デキストラン硫酸、１％サルコシル、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、２５０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ及び５００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中に希釈した。ハイブリッド形成緩衝液中の放射性プローブの最終濃度は、同じ範囲（１．５ｎＭ）であった。組織切片を標識されたプローブを含有するハイブリッド形成溶液で覆い、その上にＮｅｓｃｏｆｉｌｍカバーガラスを重ねて加湿箱中４２℃で終夜インキュベートした。次に切片を６０℃で１×ＳＳＣにより４回（各１５分）及び室温で１×ＳＳＣで１回３０分間洗浄し、脱水してフィルムに３〜４週間触れさせた。フィルムの光学密度をＡＩＳＲコンピューター画像解析システムで半定量した。
【０４１９】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成で使用したのと同じ群のマウスについて、本発明者らは、実施例２に記載した５−ＨＴ１Ａ受容体部位のオートラジオグラフィーによる可視化のための［３Ｈ］８−ＯＨ−ＤＰＡＴを使用して５−ＨＴ１ＡＲタンパク質の密度を測定した。
【０４２０】
５−ＨＴ１ＡＲタンパク質は、シナプス前部でセロトニンニューロン（中脳縫線核）上で及び５−ＨＴ神経末端に位置するシナプス後部でニューロン上に、主として皮質辺縁系領域（即ち海馬）において強く発現する。
【０４２１】
図３Ａ及びＢで見ることができるように、ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ分子だけが、セロトニン作動性ニューロンが位置するマウス中脳縫線核中の３つの異なった前後座標で、５−ＨＴ１ＡＲのｍＲＮＡレベルの特異的ノックダウンを誘発する。
【０４２２】
図３Ｃで見ることができるように、背側の縫線核における５−ＨＴ１ＡＲ  ｍＲＮＡ陽性グレインのフィルムにおける測定のデンシトメトリーによる定量は、ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの群における発現レベルで、他のアッセイされた群と比較して５０％の低下を示した。５−ＨＴ１ＡＲ  ｍＲＮＡの発現における相違は、主としてＤＲＮ領域において認められる。
【０４２３】
図４で見るとができるように、［３Ｈ］８−ＯＨ−ＤＰＡＴを使用する５−ＨＴ１Ａ受容体部位に対する結合アッセイにより定量して、ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ分子だけが５−ＨＴ１ＡＲタンパク質レベルの特異的低下（約５０％）をシナプス前部の（背側の縫線核）において誘発したが、シナプス後部の（海馬又は前頭前野の皮質）脳領域では誘発しなかった。５−ＨＴ１ＡＲのｍＲＮＡ及びタンパク質発現における相違は、主としてＤＲＮ領域において認められる。
【０４２４】
これらの結果は、ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡが、背側の縫線核に局在化している特異的セロトニン作動性ニューロンに対してｍＲＮＡの干渉を実行するオリゴヌクレオチドに選択的に向かい、その結果標的とされたニューロンの受容体の発現に対する前記ＲＮＡ干渉の効率を増強することを示した。
【０４２５】
５−ＨＴ１Ａ受容体の特異的ノックダウンがセロトニン輸送体（５−ＨＴＴ又はＳＥＲＴ）又は５−ＨＴ１Ｂ受容体のような関係する５−ＨＴタンパク質の発現に影響し得るか否かを調べるために、セロトニン輸送体タンパク質及び５−ＨＴ１Ｂ受容体の密度をＤＲＮで定量した。
【０４２６】
セロトニン輸送体タンパク質の密度をアッセイする目的で、本発明者らは、５−ＨＴＴ部位のオートラジオグラフィーによる可視化のために［３Ｈ］シタロプラムを使用した。簡単に述べると、凍結組織切片を解凍して乾燥し、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５ｍＭ  ＫＣｌを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２５℃でｐＨ７．４）中室温で１５分間プレインキュベートした。次に１．５ｎＭ［３Ｈ］シタロプラム（７０．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含有する同じ緩衝液中で６０分間室温でインキュベートした。非特異的結合は、１μＭフルオキセチンの存在下で残留するものと定義した。インキュベーション及び洗浄後、組織切片を蒸留氷冷水中に漬けて冷空気流下で急速乾燥した。組織をトリチウム感応性フィルムに、プラスチックの３Ｈ−標準と一緒に４℃で４０日間触れさせた。
【０４２７】
マウス中脳縫線核中において十字縫合からの３つの異なった前後方向（ＡＰ）座標（約ＡＰ−４．８４／−４．９６、−４．６０／−４．３６及び−４．２４ｍｍ）（十字縫合；Ｆｒａｎｋｌｉｎ及びＰａｘｉｎｏｓ、１９９７）のＤＲＮ組織切片を５−ＨＴＴ部位の定量に使用して、それらを同じ実験条件で同時に処理した。オートラジオグラムの定量的分析をＡＩＳＲコンピューター画像解析システムを用いて行った。図５Ａで見ることができるように、ビヒクル、裸出ｓｉＲＮＡ及びＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ群は背側の縫線核におけるタンパク質レベルで５−ＨＴＴ（セロトニン輸送体、ＳＥＲＴ）に如何なる低下も変化も示さない。
【０４２８】
５−ＨＴ１Ｂ受容体（５−ＨＴ１ＢＲ）タンパク質の密度をアッセイする目的で、本発明者らは５−ＨＴ１ＢＲ部位をオートラジオグラフィーで可視化するために［１２５Ｉ］ヨードシアノピンドロールを使用した。切片を１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中室温で１０分間プレインキュベートし、次に１００ｐＭ［１２５Ｉ］ヨードシアノピンドロール（［１２５Ｉ］ＣＹＰ、２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び１００ｎＭ  ８−ＯＨ−ＤＰＡＴで補完した同じ緩衝液中で２時間インキュベートして、５−ＨＴ１ＡＲ部位を遮断し、３０μＭイソプレナリンでβ−アドレナリン作用性部位を遮断した。非特異的結合は１０μＭ  ５−ＨＴの存在以外は同条件下でインキュベートした隣接切片で定量した。切片を同じ緩衝液で２回すすぎ、素早く４℃で蒸留水に漬け、冷い空気で乾燥し、感光性フィルム（ハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）−３Ｈ）に４℃で１日の間暴露した。フィルムの光学密度をＡＩＳＲコンピューター画像解析システムで半定量した。図５Ｂで見ることができるように、ビヒクル、裸出ｓｉＲＮＡ及びＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ群は、背側の縫線核における５−ＨＴ１Ｂ受容体においてタンパク質レベルのいかなる低下も変化も示さない。
【０４２９】
５−ＨＴ１ＡＲの機能的特徴に対するＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの効果を評価するために、本発明者らは８−ＯＨ−ＤＰＡＴにより誘発される低体温応答及び内側前頭前皮質（ｍＰＦＣ）における５−ＨＴ放出をアッセイした。本発明者らは、裸出ｓｉＲＮＡ又はＮＬＦ−ｓｉＲＮＡのプール（実施例２で記載した）を背側の第３脳室中に注入して（Ｄ３Ｖ、３０μｇ／２．５μｌ／１日）２４時間後に８−ＯＨ−ＤＰＡＴにより誘発される低体温応答を評価した。図６で見ることができるように、注入されたＮＬＦ−ｓｉＲＮＡによる５−ＨＴ１ＡＲのノックダウンのみが、５−ＨＴ１ＡＲ  ＫＯマウスと同様に、８−ＯＨ−ＤＰＡＴにより誘発される低体温応答のないことを示した。他の裸出ｓｉＲＮＡ及び対照（ビヒクル、ｎｓ裸出ｓｉＲＮＡ及びｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）群は、５−ＨＴ１ＡＲに対するノックダウン効果を示さず（図４及び５で見られたように）、８−ＯＨ−ＤＰＡＴにより誘発される低体温応答の典型的な曲線と類似であった。
【０４３０】
上記のように、内在性アゴニスト５−ＨＴ（神経伝達物質セロトニン）又は選択的アゴニスト（即ち８−ＯＨ−ＤＰＡＴ）によるセロトニン作動性ニューロン中に位置する５−ＨＴ１ＡＲの活性化は、内側前頭前野の皮質、海馬などの末端突起脳領域中の中脳縫線核における細胞発火及びインパルス依存性５−ＨＴ放出を抑制し、５−ＨＴレベルを低下させる（８−ＯＨ−ＤＰＡＴ効果）。５−ＨＴ放出を評価するために、当技術の現状で記載されている脳内微小透析手順を使用した。簡単に述べると、プローブのシャフトは長さ１５ｍｍ、２５ゲージ（５０１μｍ  ＯＤ、３００μｍ  ＩＤ）のステンレス−鋼配管で作製した。流入及び流出チューブは、１１０μｍ  ＯＤ及び４０μｍ  ＩＤの溶融シリカ毛細管配管からなる２５ゲージ配管を通った。シリカ配管の上部露出端を長さ７ｍｍ、２７ゲージ（４１０μｍ  ＯＤ、２２０ｍ  ＩＤ）のステンレス鋼配管中に挿入した。マウスをナトリウムペントバルビタール（４０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔して、定位枠で位置決めした。各マウスには、キュプロファン膜を備えた１つの透析プローブ（長さ２ｍｍ；カットオフ分子量５０００Ｄａ）を、内側前頭前野の皮質（ｍＰＦＣ）（ｍｍで：Ｆｒａｎｋｌｉｎ及びＰａｘｉｎｏｓ，１９９７の図解により十字縫合からＡＰ＋２．２、Ｌ−０．２、ＤＶ−３．４）に埋め込んた。
【０４３１】
微小透析実験は、手術の４８〜７２時間後に自由に運動するマウスで、上から吊した液体回転台に取り付けたＷＰＩモデルｓｐ２２０ｉ注射器ポンプを用いてａＣＳＦ（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ，１．２６ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．１８ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を２．０μｌ／分の速度で連続的に灌流するプローブにより実施した。６０μｌの透析液試料を３０分毎にマイクロ遠心バイアル中に集めた。
【０４３２】
初期６０分の安定化期の後、４つのベースライン試料を集めてから８−ＯＨ−ＤＰＡＴを全身投与して（０．５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）、次に後続の透析液試料を集めた。透析実験終了時に、マウスを犠牲死させて直ちに脳を取り出し−７０℃で凍結した。その後脳の冠状切片（５０μｍ）をクリオスタット上で切り、灌流部位を局在化するために標準的手順によりクレジルバイオレットで染色した。組織学的に正しいプローブ配置で動物から得られたデータのみ次の統計分析のために使用した。
【０４３３】
透析液試料中の５−ＨＴ濃度は、３μｍオクタデシルシリカ（ＯＤＳ）カラム（７．５ｃｍ×０．４６ｃｍ）を使用するＨＰＬＣにより、検出酸化電位を０．６Ｖに設定したヒューレットパッカード１０４９検出器で電流測定により検出して定量した。移動相は０．１５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、１．８ｍＭオクチル硫酸ナトリウム、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ（リン酸でｐＨ２．８に調節）及び３０％メタノールからなり、０．７ｍｌ／分でポンプ送液した。５−ＨＴに対する保持時間は３．５〜４分であり、検出限界は２ｆｍｏｌ／試料であった。
【０４３４】
図７で見ることができるように、ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ処理されたマウス群のマウスでは、ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ群マウスと比較して前頭前野のセロトニン放出に対する８−ＯＨ−ＤＰＡＴの効果がなかった。これは、セロトニン作動性ニューロン中の５−ＨＴ１ＡＲのノックダウンを、末端脳領域における５−ＨＴ量に対するアゴニストである８−ＯＨ−ＤＰＡＴの効果の減少により機能的に評価することができることを証拠づける。
【０４３５】
実施例５
リガンドで急激に前処理し、続いてＮＬＦ−ｓｉＲＮＡをインビボ脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注入されたマウスにおけるセロトニン作動性ニューロンの機能的パラメーターを測定することによる遊離の選択性リガンド（セルトラリン）と本発明によるＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ構造物との競争的アッセイ
【０４３６】
ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ中のｓｉＲＮＡとコンジュゲート化された選択性リガンドが、背側の縫線核細胞（主としてセロトニン作動性ニューロン）への送達の最重要成分であるかどうかを決定するために、幾つかの競争的アッセイを実施した。マウスには、Ｄ３Ｖ（３０μｇ／２．５μｌ／１日、ｉ．ｃ．ｖ．）にｓｉＲＮＡを注入する３時間前に選択的遊離リガンド５−ＨＴＴ阻害剤であるセルトラリン（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）の急性注射をした。それに加えて、マウスの１群ではビヒクルを腹腔内及びＤ３Ｖ内に投与した。
【０４３７】
微小透析実験は、ｉ．ｃ．ｖ．ビヒクル又はｓｉＲＮＡ投与の２４時間後に実施した。図８Ａで見ることができるように、急性セルトラリン注射（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）によりコンジュゲート化５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡによる５−ＨＴ１Ａ自己受容体のサイレンシングが回避され、急性８−ＯＨＤＰＡＴ投与（選択的５−ＨＴ１ＡＲアゴニスト、０．５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）により内側前頭前野の皮質中の５−ＨＴレベルは対照群のように低下した。
【０４３８】
選択的５−ＨＴＴ阻害剤であるセルトラリンで前に処理された（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡマウスの体温に対する８−ＯＨ−ＤＰＡＴ投与（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）の効果も、図８Ａで使用したものと同様なマウスで評価した。図８Ｂは、セルトラリンが５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡと有効に競合し、したがって対照群と同様な低体温応答が生じて、５−ＨＴ１ＡＲ  ｍＲＮＡのトランスフェクション及びノックダウンのないことを示す。
【０４３９】
これらの結果により、遊離の選択性リガンド（セルトラリン）の急性投与は、標的のニューロン（即ち５−ＨＴＴ、セロトニン輸送体）に同時に与えられて、セルトラリンコンジュゲート化ｓｉＲＮＡ（ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）を遮断するか又はそれと競合することが示される。第１の、セルトラリンは、５−ＨＴ輸送体による高い特異性及び親和性（ナノモルの範囲で）を有し、ｓｉＲＮＡとコンジュゲートすることによりＮＬＦ−ｓｉＲＮＡとなり、この新しいコンジュゲートはこの５−ＨＴ輸送体による親和性を維持する。それに対して、５−ＨＴ輸送体は５−ＨＴニューロン中でのみを発現し、輸送体による高い親和性のこの組合せ及び細胞タイプに特異的な発現が、コンジュゲート化したセルトラリン又はＳＳＲＩリガンドを有するＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの選択性を決定する。
【０４４０】
実施例６
対照群と比較した、マウスの背側第３脳室（Ｄ３Ｖ）中へのＮＬＦ−ｓｉＲＮＡのインビボ脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注入における、急性抗鬱剤（即ちフルオキセチン）適用後の前頭前野の皮質における５−ＨＴレベルの増大の相乗的増強
【０４４１】
生理的条件において、ＳＳＲＩ（即ちフルオキセチン）は、中脳縫線核及び前脳部におけるセロトニンの細胞外濃度の顕著な増大を惹起する。セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）の再取り込み遮断により生ずる細胞外５−ＨＴの増大は、中脳縫線核中の５−ＨＴ１Ａ自己受容体を活性化して、細胞発火及び末端放出を抑制し、再取り込み遮断により生ずる細胞外５−ＨＴの増大を弱める効果がある。その結果として、治療効果に寄与するシナプス後部のセロトニン受容体の活性化が期待より低い。５−ＨＴ１Ａ受容体アンタゴニスト（即ちピンドロール）によるこれらの負のフィードバック機構の遮断は、ＳＳＲＩにより生ずる５−ＨＴの増大を強化して、それ故、ＳＳＲＩの臨床的効果を助長することに役立つ可能性があることが知られている。
【０４４２】
図９で見ることができるように、内側前頭前野の皮質における透析物のセロトニン濃度は、５−ＨＴ１Ａ受容体が前に示したように十分機能的であると期待されたナンセンスＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ（ｎｓＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）マウス群におけるフルオキセチンの全身投与後にベースラインより約５０％高かった。ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡマウス群においては、シナプス前部の５−ＨＴ１Ａ受容体のノックダウンがフルオキセチンの全身投与の効果を、内側前頭前野の皮質における末端５−ＨＴレベルのベースラインの１５０％にまでを相乗的に増強する。
【０４４３】
これらの結果は、セルトラリン分子にカップリングしたの本発明のオリゴヌクレオチド配列（ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）が、５−ＨＴ１Ａ受容体の発現を、翻訳されるはずであった対応するｍＲＮＡ転写物をノックダウンすることにより遮断したことを明確に示す。本発明のオリゴヌクレオチド配列（ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）は、前記発現を、裸出形にある対応するｓｉＲＮＡ（裸出ｓｉＲＮＡ）よりも主要な指数でノックダウンした。それ故、本発明のオリゴヌクレオチドは、改変されていない同じ配列のｓｉＲＮＡ（裸出ｓｉＲＮＡ）の等量より有効である。
【０４４４】
これらの観察は、式（Ｉ）の基が受容体の発現のノックダウンに干渉しないと推定することを可能にする。さらに、追加のコンジュゲートの存在は、ＲＮＡｉ機構により実施される阻害の効力を増強する。
【０４４５】
実施例７
ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡのインビボ脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注入に対する応答及び５−ＨＴ１ＡＲノックアウト（ＫＯ）マウスとの比較における抗鬱剤及び抗不安薬の作用の検討
シナプス前部の５−ＨＴ１Ａ受容体のノックダウンの有望な抗抑鬱剤の効果をアッセイするために、９から１２週齢の成長したマウスで挙動分析を実施した。それらには試験の間に少なくとも１日の間隔をおいて、高架式十字迷路試験及び尾懸垂試験をこの順で実施した。高架式十字迷路試験は、薄暗い照明（５０ルクス）の室内で地面から３１ｃｍ上がった長さ３０ｃｍ及び幅５ｃｍの枝道を有する十字迷路を使用して実施した。動物は開放枝道に面した迷路の中央部分に導入して５分間自由に探索することを許した。開放及び閉鎖枝道内で費やした時間及び移動した距離をビデオ追跡システムにより測定した。装置を７０％エタノールで拭いて次のマウスとの間に乾燥した。全ての試験は１１：００ＡＭと４：００ＰＭの間に実施した。試験日に、動物を薄暗い照明の挙動実験室に運び入れて試験前に少なくとも１時間邪魔をせずに放置した。尾懸垂試験法においては、マウスを尾で懸垂し、本発明者らはテープを使用して彼らを水平な棒に固定した。動物を６分間懸垂して、この期間内の無動状態を自動ビデオ追跡ソフトウェアパッケージを使用して測定した。
【０４４６】
図１０で見ることができるように、不安様挙動に変化は観察されなかったが、５−ＨＴ１Ａ自己受容体ノックダウンマウスにおいてストレス／鬱病関連試験に変化した応答があった。ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの有望な抗鬱剤の可能性がＫＯマウスと野生型の対照マウスとの間にあった。それは、５−ＨＴ１Ａ受容体が鬱病治療のための新しい目標になり得ることを示唆する。抑鬱性患者の約４０％が従来のＳＳＲＩ治療に応答せず、彼らは該疾患に対する新しい治療の取組みにとって第１の候補者になり得る。
【０４４７】
実施例８
マウスにおけるインビボ鼻内（ｉ．ｎ）適用による機能的セロトニン作動性の測定によるナンセンスＮＬＦ−ｓｉＲＮＡに対する５−ＨＴ１ＡＲ  ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡによるノックダウンの相違した有効性
【０４４８】
有望な治療剤の投与として鼻内法の適用を検証するために、ビヒクル及びＮＬＦ−ｓｉＲＮＡを、低体温応答、背側の縫線核におけるｍＲＮＡレベル及び前頭前野の皮質における５−ＨＴ透析物をチェックするためにアッセイした。
【０４４９】
マウスをペントバルビタール４０ｍｇ／ｋｇｉ．ｐで麻酔して仰向けにした。ＰＢＳ又はＮＬＦ−ｓｉＲＮＡを５μｌに分けてマイクロピペットの尖端で交互に鼻孔内にゆっくりと穏やかに滴下した。
【０４５０】
図１１で見ることができるように、ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ又はビヒクルの鼻内適用の結果は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成により測定した５−ＨＴ１Ａ受容体のｍＲＮＡの減少及びリガンド結合アッセイにより測定した５−ＨＴ１Ａ受容体の減少であり、それらは、ｉ．ｃ．ｖ適用後に観察された結果と同様である。特に、シナプス前部のノックダウンは、３０％であった（ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡが脳室内に適用された場合の５０％ノックダウンと比較した場合）（図１１参照）。さらに、ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの鼻内適用の結果は、８−ＯＨ−ＤＰＡＴ投与後の低体温応答の減少（図１２Ａ参照）及び、８−ＯＨ−ＤＰＡＴの急性適用後の前頭前野皮質の透析物の５−ＨＴレベルの低下における減少であった（図１２Ｂ）。
【０４５１】
さらに、５−ＨＴ１ＡＲ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの有望な抗鬱効果を実施例７で記載した尾懸垂試験法を使用して評価した。不安様挙動もやはり高架式十字迷路法により評価した。図１３で見ることができるように、実験は、不安様挙動に変化は観察されなかったが（図１３Ａ）、無動状態時間の減少が５−ＨＴ１Ａ自己受容体ノックダウンマウスにおけるストレス／鬱病関連試験で誘起され（図１３Ｂ）及び強制水泳試験における無動状態時間の減少（図１３Ｃ）が観察されたことを示した。
【０４５２】
実施例９
式（Ｉ）の基及び１つのターゲティング作用剤とコンジュゲート化した５−ＨＴＴを標的とするｓｉＲＮＡ（セロトニン輸送ｓｉＲＮＡ）（以後５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）並びに対照群としてのビヒクルの１０又は３０μｇ／マウスの用量における、マウスにおけるインビボ鼻内適用による効力のアッセイ
【０４５３】
実施例１及び２の構造物を有する一組の化合物を上記のようにして合成した。ｓｉＲＮＡは、Mus musculus由来のセロトニン輸送体（５−ＨＴＴ）配列の以下の領域（マウス、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿０１０４８４）：１２３０−１２５０を標的とするように設計した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス及びセンス鎖は化学的に合成して（配列番号１〜２、表２）、等張のＲＮＡアニーリング緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ：７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で、各鎖の５０μＭ溶液を組み合わせることによりアニールした。次に該溶液を９０℃で１分インキュベートして、１５秒遠心し、次に３７℃で１時間インキュベートする。アニールした溶液をＨＰＬＣで精製して選択したｓｉＲＮＡ分画を凍結乾燥する。ｓｉＲＮＡの貯蔵溶液は、凍結乾燥した生成物をＲＮＡアーゼを含まない水に再懸濁することにより調製して使用するまで−２０℃で貯蔵した。使用に先立って、全てのｓｉＲＮＡ貯蔵溶液は、ＰＢＳ緩衝の適当なビヒクル中で鼻内適用の最終濃度に希釈した。
【０４５４】
【表７】
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【０４５５】
該ｓｉＲＮＡ配列は、５−ＨＴ輸送体（５−ＨＴＴ）のｍＲＮＡに相補的なアンチセンス配列を含み、したがって前記ｍＲＮＡを抑止し、且つその発現を遮断することができる。
【０４５６】
全ての配列は、細胞中で正常過程のｍＲＮＡを調節するタンパク質との干渉を避けるために、少なくとも１つチミン（Ｔ）を含むヌクレオチドの末端ＤＮＡダイマーを有する（示していない）。この技法は当業者に周知である。これらの末端ダイマーでオリゴヌクレオチドは有効なＲＮＡｉ機構を可能にする２１〜２３塩基対を有する。
【０４５７】
表２の式（Ｉ）の基とコンジュゲート化したｓｉＲＮＡ配列及び上記の１つのターゲティング作用剤（５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）を実験に使用した。
【０４５８】
実施例１０
２通りの用量（１０及び３０μｇ／マウス）でのマウスにおけるインビボ鼻内（ｉ．ｎ）適用による５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの機能測定アッセイによる相違したノックダウンの有効性
【０４５９】
雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２１〜２９ｇ、９〜１２週齢雄）をペントバルビタール４０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐを用いて麻酔し仰向けにした。ＰＢＳ又は５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡをマイクロピペット尖端から５μｌに小分けして交互に鼻孔内にゆっくりと穏やか滴下した。５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの評価した用量は：各鼻孔に５μｇ／５μｌ及び１５μｇ／５μｌ（ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの合計用量：１日当たり１０及び３０μｇ／マウス）であった。
【０４６０】
処置の２４時間後に、マウスを頭部切断により殺害して脳を迅速に取り出し、ドライアイスで凍結して−２０℃で貯蔵した。ミクロトーム−クリオスタットを使用して厚さ１４μｍの組織切片を切り、ＡＰＴＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン）コートスライド上に解凍して載せ、使用するまで−２０℃に保った。
【０４６１】
５−ＨＴＴ  ｍＲＮＡの発現レベルを決定するために、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成アッセイを、塩基８２０〜８６３（マウス、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿０１０４８４）に相補的で５−ＨＴＴに特異的なオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブを使用して実施した。該５−ＨＴＴオリゴヌクレオチドは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、その３’末端で［３３Ｐ］−ｄＡＴＰ（＞２５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）により個別に標識し（２ｐｍｏｌ）、ＱＩＡｑｕｉｃｋヌクレオチド除去キットを使用して遠心により精製した。単一標識ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成のためのプロトコルは、前に記載された手順に基づいた。簡単に述べると、実施例２で記載した凍結した組織切片を、最初室温に戻して、リン酸緩衝食塩水（１×ＰＢＳ：８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６ｍＭ  ＫＣｌ）中４％のパラホルムアルデヒド中において４℃で２０分間固定し、３×ＰＢＳ中室温で５分間、１×ＰＢＳ中で２回各５分間洗浄して、予備消化したプロナーゼの溶液中で２分間２１℃でインキュベートし、最終濃度は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＥＤＴＡ中で２４Ｕ／ｍｌであった。酵素活性は、１×ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌのグリシンに３０秒間浸漬することにより停止させた。最後に組織を１×ＰＢＳ中ですすいで、等級付きのエタノールにより脱水した。ハイブリッド形成のために、放射性標識されたプローブを５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、１×デンハルトの溶液（０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン）、１０％デキストラン硫酸、１％サルコシル、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、２５０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ及び５００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含有する溶液で希釈した。ハイブリッド形成緩衝液中の放射性プローブの最終濃度は、同じ範囲であった（１．５ｎＭ）。組織切片を標識されたプローブを含むハイブリッド形成溶液で覆い、ネスコフィルム（Ｎｅｓｃｏｆｉｌｍ）カバーガラスを上に重ねて加湿箱中で終夜４２℃でインキュベートした。次に切片を１×ＳＳＣ中６０℃で４回（各１５分）及び１×ＳＳＣ中室温で３０分間１回洗浄し、脱水してフィルムに１〜３日間触れさせた。フィルムの光学密度をＡＩＳＲコンピューター画像解析システムで半定量した。
【０４６２】
図１４Ａで見ることができるように、５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ分子の両方の用量が背側の縫線核中の３つの異なった前後方向座標で５−ＨＴＴｍＲＮＡの特異的ノックダウンを誘発した。
【０４６３】
図１４Ｂで見ることができるように、フィルムで測定された中脳縫線核における５−ＨＴＴｍ  ＲＮＡ陽性グレインのデンシトメトリーによる定量は、ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの群における発現レベルがビヒクル群と比較して３０％の低下したことを示した。
【０４６４】
これらの結果は、ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡが中脳縫線核中に局在化する特異的セロトニン作動性ニューロンに対するｍＲＮＡの干渉を実行するオリゴヌクレオチドを選択的に直接指向することを示した。
【０４６５】
セロトニン輸送体タンパク質の密度を実施例４で記載したように５−ＨＴＴ部位をオートラジオグラフィーで可視化するために［３Ｈ］シタロプラムを使用して測定した。ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの鼻内投与後２４〜４８時間で、マウスを殺害してそれらの脳を取り出し、厚さ１４μｍのひと続きの冠状切片を十字縫合に対して（Ｆｒａｎｋｌｉｎ及びＰａｘｉｎｏｓ、１９９７）以下のＡＰ座標（ｍｍで）で得た：２．２（前頭前野の皮質−ＰＦＣ）、１．１〜０．６（尾状核−ＣＰｕ、側方及び内側中隔核−Ｓｅｐ、腹側淡蒼球−ＶＰ）、−１．５〜−１．８（海馬−ＨＰＣ、視床下部−Ｈｉｐ）及び−４．２４〜−４．９６（背側の縫線核−ＤＲ及び中央値縫線核−ＭｎＲ）。簡単に述べると、凍結組織切片を解凍して乾燥し、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５ｍＭ  ＫＣｌを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２５℃でｐＨ７．４）中で１５分間室温でプレインキュベートした。次に１．５ｎＭ［３Ｈ］シタロプラム（７０．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含有する同じ緩衝液中で６０分間室温でインキュベートした。非特異的結合は、１μＭフルオキセチンの存在下で残留するものと定義した。インキュベーション及び洗浄後、組織切片を蒸留氷冷水中に漬けて、冷空気流下で急速乾燥した。組織をプラスチックの３Ｈ−標準と一緒にトリチウム感応性フィルムに４０日間４℃で触れさせた。
【０４６６】
オートラジオグラムの定量分析はＡＩＳコンピューター画像解析システムで行った。共暴露した放射性標準による組織−較正データを使用することにより、オートラジオグラムのＯＤ値を組織切片中の特定の脳領域に結合した放射活性（ｎＣｉ／ｍｇ組織タンパク質）のレベルに変換した。
【０４６７】
図１５で見ることができるように、ビヒクル又はＮＬＦ−ナンセンス−ｓｉＲＮＡの鼻内投与と比較して、５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの鼻内適用は、オートグラフィー結合アッセイにより定量して異なった脳領域におけるセロトニン輸送体レベルの低下を誘発した。
実施例１１
１０及び３０μｇ／マウスの用量の５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡのインビボ鼻内適用（ｉ．ｎ．）により処理されたマウスにおける前頭前野の皮質中の５−ＨＴレベルの対照群と比較した増大。
【０４６８】
５−ＨＴＴの機能的性質に対するＮＬＦ−ｓｉＲＮＡの効果を評価するために、選択的５−ＨＴ輸送体阻害剤の５−ＨＴＴ ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡに応答における背側の線条体中の５−ＨＴレベルに対する神経化学的効果を測定した。この目的で、雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２１〜２９ｇ、９から１２週齢雄）をペントバルビタール４０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐで麻酔して定位枠に固定した。各マウスにキュプロファン膜を備えた１本の透析プローブ（長さ１．５ｍｍ；分子量カットオフ５０００Ｄａ）を背側の線条体（ｍＰＦＣ）（Ｆｒａｎｋｌｉｎ及びＰａｘｉｎｏｓ，１９９７の図解によりｍｍで：十字縫合からＡＰ＋０．５、Ｌ−１．７、ＤＶ−４．５、）に埋め込んだ。
【０４６９】
微小透析実験は、手術の２４〜７２時間後に自由に運動するマウスで、上から吊した液体回転台に取り付けたＷＰＩモデルｓｐ２２０ｉ注射器ポンプを用いてａＣＳＦ（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ，１．２６ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．１８ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を２．０μｌ／分の速度で連続的に灌流するプローブにより実施した。６０μｌの透析液試料を３０分毎にマイクロ遠心バイアル中に集めた。  
【０４７０】
初期６０分の安定化期の後、４〜６個のベースライン試料を集めてから、シタロプラム（１〜１０〜５０μＭ）を局所投与又はフルオキセチン（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）を全身投与して次に逐次透析液試料を集めた。透析実験終了時に、マウスを犠牲死させて直ちに脳を取り出し−７０℃で凍結した。その後脳の冠状切片（５０μｍ）をクリオスタット上で切り、灌流部位を局在化するために標準的手順によりクレジルバイオレットで染色した。組織学的に正しいプローブ配置で動物から得られたデータのみ次の統計分析のために使用した。
【０４７１】
透析液試料中の５−ＨＴ濃度は、３μｍオクタデシルシリカ（ＯＤＳ）カラム（７．５ｃｍ×０．４６ｃｍ）を使用するＨＰＬＣにより、検出酸化電位を０．６Ｖに設定したヒューレットパッカード１０４９検出器により電流測定で検出して定量した。移動相は０．１５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、１．８ｍＭオクチル硫酸ナトリウム、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ（リン酸でｐＨ２．８に調節）及び３０％メタノールからなり、０．７ｍｌ／分でポンプ送液した。５−ＨＴに対する保持時間は３．５〜４分であり、検出限界は２ｆｍｏｌ／試料であった。
【０４７２】
図１６で見ることができるように、ビヒクル群と比較して、５−ＨＴＴ−ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ処理されたマウス群の背側の線条体において、セロトニンレベルのフルオキセチン及びシタロプラムを含む選択的５−ＨＴＴ阻害剤に対する５−ＨＴＴ応答の不在又は減少があった。これは、セロトニン作動性ニューロンにおける５−ＨＴＴのノックダウンを、末端脳領域における選択的輸送体阻害剤の５−ＨＴ量に対する効果の減少により機能的に評価することができることを証明する。
【０４７３】
これらの結果は、セルトラリンコンジュゲート化ｓｉＲＮＡ（ＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ）の投与が、核酸成分（ｓｉＲＮＡ）の配列に加えて５−ＨＴＴと選択的に相互作用することによりセロトニン作動性ニューロンを標的とすることを示す。
【０４７４】
実施例３から８は、５−ＨＴ１ＡＲを指向するＮＬＦ−ｓｉＲＮＡは、背側の縫線核に位置する５−ＨＴニューロン中で標的遺伝子を特異的にノックダウンすることができることを示す。この効果は、脳室内適用後並びに鼻内適用後の両方で観察される。
【０４７５】
実施例１０及び１１は、５−ＨＴＴに対して特異的なＮＬＦ−ｓｉＲＮＡも標的遺伝子、この場合５−ＨＴＴｍＲＮＡをノックダウンすることができることを示す。本発明のＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ構造物のターゲティング能力は、０．３から１ｍｇ／ｋｇ（マウスによるｓｉＲＮＡ分子の１０から３０μｇ）の用量で、第３脳室（３ＤＶ）内への脳室内適用並びに鼻内適用の両方の後で観察されている。これは、ｓｉＲＮＡ療法として普通許容される治療の範囲であり、ヒトの治療へグレードアップする可能性がある。非侵襲的な鼻内適用もＮＬＦ−ｓｉＲＮＡ分子が治療剤として発展する可能性を増大させる。
【０４７６】
実施例１２
右側脳室中へのインビボ脳室内注入によるノミフェンシンとコンジュゲート化したｓｉＲＮＡ（ＮＬＦ−ＮＳ−ｓｉＲＮＡ）の標的指向の検証
【０４７７】
本実施例は、脳室内に注入されたＮＬＦ−ＮＳ−ｓｉＲＮＡが黒質及び青斑核に位置する脳内特異的ニューロンに達することができることを示す。これらの細胞は、チロシンヒドロキシラーゼ染色に陽性であり、即ち、それらはドーパミン作動性又はノルアドレナリン作動性ニューロンである。
【０４７８】
使用される配列は、任意のヒト、マウス又はラット遺伝子のいずれとも相同性のないナンセンス（ｎｓ）ｓｉＲＮＡである：
【化１０７】
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配列は、細胞中の正常過程のｍＲＮＡを調節するタンパク質との干渉を避けるために、少なくとも１つのチミン（Ｔ）を含むヌクレオチドの末端ＤＮＡダイマーを有する（示していない）。この技法は当業者により周知である。これらの末端ダイマーとともに該オリゴヌクレオチドは、効率のよいＲＮＡｉ機構を可能にする２１塩基対を有する。アンチセンス（ａ）配列はＣｙ３分子も有し、共焦点の顕微鏡におけるその目視が可能になる。
【０４７９】
ｓｉＲＮＡを注入するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎｃｒｌ雄マウスをイソフルオランで深く麻酔して、ディジタル表示読み取りの付いた定位枠に取り付けたマウスアダプター（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  参照番号：５１６２５）（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、９４０型）中に置いた。２１Ｇ×１．５インチの滅菌針で頭蓋に穴を開けた後、注射器（１０μｌ  ハミルトン）により、２μｌのｓｉＲＮＡＮＬＦ−ＮＳ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３の蒸留水溶液（合計用量１００μｇ）又はビヒクルを、右側脳室中に（十字縫合からＡＰ＋０．２６；Ｌ−０．７５；ＤＶ−２．５）注射器ポンプ（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＫＤＳ３１０）により一定の流速０．５μｌ／分で（各時点についてｎ＝２）送達した。ｓｉＲＮＡ溶液が上方に流れるのを避けるために３分間その場に残しておいた。
【０４８０】
マウスは、ｓｉＲＮＡの投与後の２つの異なった時点、１及び３時間に４％ＰＦＡで灌流した。脳を切開して４％ＰＦＡの溶液中で２４時間４℃で後固定した。次に脳を３０％スクロース溶液中に４℃で４８時間置いた。脳を２−メチルブタン中で−３０から−４０℃で凍結して−８０℃で貯蔵した。脳をクリオスタットＬｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ（３０ｍｍ）で薄片に切った。遊離して浮く切片を洗浄して４℃で０．１Ｍ  ＰＢＳ及び０．００１％ナトリウムアジド中に貯蔵した。
【０４８１】
切片をＰＢＳで洗浄し、２％ヤギ血清及び０．１％トリトンで封鎖して、抗ＴＨ抗体（１：８００マウス）とともに４℃で終夜インキュベートした。洗浄後、切片をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７抗マウス二次抗体（インビトロジェン）とともに室温で１時間インキュベートした。最後に切片をＤａｋｏの蛍光性固定剤で固定して共焦点分光顕微鏡（ＦＶ１０００  オリンパス）を使用して分析した。像はＦＶ１０−ＡＳＷ  １．７  Ｖｉｅｗｅｒを使用して描いた。
【０４８２】
図１７及び１８で見ることができるように、ｉｃｖ注入の１時間後、黒質緻密部及び青斑核中の一部のＴＨ陽性細胞はＣｙ３に対しても陽性であった。全てのＴＨ陽性細胞がＣｙ３に対して陽性であったわけではないが、それらの多くの比率が内側にＣｙ３蛍光を有し、ＮＬＦ−ＮＳ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３分子が一部のＴＨ陽性ニューロン中に組み込まれたことを示した。
【０４８３】
実施例１３
心室内投与によるセルトラリンとコンジュゲート化したＣｙ３標識ナンセンス２−Ｏ’−メチル−改変ギャップマーのセロトニン作動性ニューロンへの標的指向性検証。
２−Ｏ’−メチルと１０ヌクレオチド長のナンセンスギャップ領域とを非特異的（ナンセンス）配列とともに各々含有する３個のヌクレオチドのＲＮＡウィングを含むギャップマーを含むコンジュゲートを合成した。該ギャップマーは、セルトラリンにその５’末端で及びＣｙ３にその３’末端でコンジュゲート化されている。マウスには、Ｃｙ３を脳室内に単回注入し（３０μｇ）、コンジュゲートを背側の第３脳室中に注入して、注入後２４時間で殺害した（ｎ＝２匹のマウス）。次に標識されたＣｙ３の局在化をレーザ共焦点顕微鏡により決定した。実験は、ギャップマーが特異的にセロトニン作動性のニューロンに局在化したことを示す（図１９）。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−２】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
2013525330.tif 000178
【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図３】
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【図８】
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【図１３−１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013525330.tif 000191
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