(57)【要約】  ＰＤ−１抗体。重鎖及び軽鎖を含む、ヒトＰＤ−１に結合するヒト化アゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を含み、並びに軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号７に示される配列を含む、上記ヒト化アゴニスト抗体。本開示はまた、該抗体分子、該抗体組成物の治療的使用、及び前記抗体分子を産生する方法にも及ぶ。
2013521769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖及び軽鎖を含む、ヒトＰＤ−１に結合するヒト化アゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を含み、軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号７に示される配列を含む、上記ヒト化アゴニスト抗体。
【請求項２】
重鎖を含む、ヒトＰＤ−１に結合するヒト化アゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を含み、重鎖フレームワーク領域が、ヒト下位集団配列ＶＨ  １−３  １−４６＋ＪＨ４（配列番号５２）由来である、上記ヒト化アゴニスト抗体。
【請求項３】
重鎖の可変ドメインの２５、３７、４１、４８、７１、７３、及び７６位の少なくとも１つの残基がドナー残基である、請求項２に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
配列番号３０、配列番号３８、又は配列番号４０に示される重鎖可変ドメイン配列を有する、請求項３に記載のヒト化抗体。
【請求項５】
重鎖を含む、ヒトＰＤ−１に結合するヒト化アゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を含み、重鎖フレームワーク領域が、ヒト下位集団配列ＶＨ  １−２  １−ｅ＋ＪＨ４（配列番号５４）由来である、上記ヒト化アゴニスト抗体。
【請求項６】
配列番号４６に示される重鎖可変ドメイン配列を有する、請求項５に記載のヒト化抗体。
【請求項７】
重鎖の可変ドメインの２５、３７、４１、４８、７１、７６、及び７８位の少なくとも１つの残基がドナー残基である、請求項５に記載のヒト化抗体。
【請求項８】
配列番号４２、又は配列番号４４に示される重鎖可変ドメイン配列を有する、請求項７に記載のヒト化抗体。
【請求項９】
軽鎖を含む、ヒトＰＤ−１に結合するヒト化アゴニスト抗体であって、軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６又は配列番号７に示される配列を含み、軽鎖フレームワーク領域が、ヒト下位集団配列ＶＫ１  ２−１（１）  Ｌ２３＋ＪＫ４（配列番号４８）由来である、上記ヒト化アゴニスト抗体。
【請求項１０】
軽鎖の可変ドメインの１、２、３、４、４７、６０、及び７０位の少なくとも１つの残基がドナー残基である、請求項９に記載のヒト化抗体。
【請求項１１】
配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２又は配列番号２４に示される軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項１０に記載のヒト化抗体。
【請求項１２】
軽鎖を含む、ヒトＰＤ−１に結合するヒト化アゴニスト抗体であって、軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６又は配列番号７に示される配列を含み、軽鎖フレームワーク領域が、ヒト下位集団配列ＶＫ３  ６−１−（１）  Ａ２７＋ＪＫ４（配列番号５０）由来である、上記ヒト化アゴニスト抗体。
【請求項１３】
軽鎖の可変ドメインの２、４７、５８、７０、７１、及び８５位の少なくとも１つの残基がドナー残基である、請求項１２に記載のヒト化抗体。
【請求項１４】
配列番号２６、又は配列番号２８に示される軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項１３に記載のヒト化抗体。
【請求項１５】
配列番号３０、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、及び配列番号４６からなる群から選択される配列を含む重鎖、並びに配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、及び配列番号２８からなる群から選択される配列を含む軽鎖を有する、ヒトＰＤ−１に結合するヒト化アゴニスト抗体。
【請求項１６】
全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子、又はＦａｂ、修飾されたＦａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＶＨ、ＶＬ、若しくはｓｃＦｖ断片などのこの断片からなる群から選択される、請求項１から１５までのいずれか一項に記載のアゴニスト抗体分子。
【請求項１７】
軽鎖の可変ドメインが、請求項１５に記載の抗体の軽鎖可変ドメインと少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、重鎖の可変ドメインが、請求項１５に記載の抗体の重鎖可変ドメインと少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む、ヒトＰＤ−１に結合するヒト化アゴニスト抗体。
【請求項１８】
５ｎＭ未満の単離されたヒトＰＤ−１（例えばヒト細胞外ドメイン）に対する結合親和性を有するヒト化アゴニスト抗体。
【請求項１９】
請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体の重鎖（単数又は複数）及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列。
【請求項２０】
請求項１９に記載の１又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載の１又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の宿主細胞を培養すること、及び抗体を単離することを含む、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体を産生するための方法。
【請求項２３】
請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体を、１又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項２４】
他の有効成分をさらに含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
免疫障害の治療又は予防において使用するための、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体又は請求項２３又は請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
免疫障害の治療又は予防するための薬剤の製造における、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＰＤ−１の抗原決定基に特異性を有する抗体分子、及びこれを含む組成物に関する。本発明はまた、該抗体分子、組成物の治療的使用、及び前記抗体分子を産生する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ２７９としても知られるプログラム死１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  １（ＰＤ−１））、遺伝子名ＰＤＣＤ１、受託番号ＮＰ＿００５００９は、免疫系における刺激シグナルと阻害シグナルのバランスの調節、及び末梢性寛容の維持に重要な役割を有する細胞表面受容体である（Ｉｓｈｉｄａ，Ｙら  １９９２  ＥＭＢＯ  Ｊ  １１  ３８８７；Ｋｉｅｒ，Ｍａｒｙ  Ｅら  ２００８  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６  ６７７−７０４；Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔａｋｕら  ２００７  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９  ８１３−８２４）。ＰＤ−１は、ＣＤ２８と相同性を有する免疫グロブリンスーパーファミリーの阻害メンバーである。ＰＤ−１の構造は、１つの免疫グロブリン可変様細胞外ドメイン、並びに免疫受容阻害チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｗｉｔｃｈ  ｍｏｔｉｆ（ＩＴＳＭ））を含有する細胞質ドメインからなる、単量体１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ−１の発現は、例えばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達を介したリンパ球活性化時に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び単球で誘導性である（Ｋｉｅｒ，Ｍａｒｙ  Ｅら  ２００８  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６  ６７７−７０４；Ａｇａｔａ，Ｙら  １９９６  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８  ７６５−７２）。ＰＤ−１は、Ｂ７ファミリーの細胞表面発現メンバーである２つの既知のリガンド、ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）を有する（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇｏｒｄｏｎら  ２０００  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２  １０２７；Ｌａｔｃｈｍａｎ，Ｙら  ２００１  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２  ２６１）。リガンドが結合すると、ＰＤ−１は、ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２などのホスファターゼをＰＤ−１の細胞内チロシンモチーフに動員し、この後、ＴＣＲ又はＢＣＲシグナル伝達により活性化されたエフェクター分子を脱リン酸化する（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ，Ｊら  ２００４  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３  ９４５−９５４；Ｒｉｌｅｙ，Ｊａｍｅｓ  Ｌ  ２００９  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２２９  １１４−１２５）。このように、ＰＤ−１は、ＴＣＲ又はＢＣＲと同時に関与するときにのみ阻害シグナルをＴ及びＢ細胞に伝達する。
【０００３】
ＰＤ−１は、細胞内因性及び細胞外因性機能機序の両方を介してエフェクターＴ細胞応答をダウンレギュレートすることが示されている。ＰＤ−１を通じた阻害シグナル伝達は、Ｔ細胞におけるアネルギー又は不応答の状態を誘導し、クローン拡大することができない、又は最適レベルのエフェクターサイトカインを産生することができない細胞をもたらす。ＰＤ−１は、共刺激からの生存シグナルを抑制する能力を介してＴ細胞におけるアポトーシスを誘導することもでき、Ｂｃｌ−ＸＬなどの重要な抗アポトーシス分子の発現の減少をもたらす（Ｋｉｅｒ，Ｍａｒｙ  Ｅら  ２００８  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６  ６７７−７０４）。これらの直接的な影響に加えて、最近の刊行物は、ＰＤ−１が制御性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）の誘導及び維持を促してエフェクター細胞の抑制に関与しているとしている。例えば、樹枝状細胞で発現されるＰＤ−Ｌ１は、ＴＧＦ−βと相乗作用して、増強された抑制機能によりＣＤ４＋  ＦｏｘＰ３＋  ＴＲＥＧの誘導を促すことが示された（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｌｏｉｓｅ  Ｍら  ２００９  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０６  ３０１５−３０２９）。
【０００４】
末梢性寛容及び炎症性疾患におけるＰＤ−１の重要性についての最初の指摘は、ＰＤ−１ノックアウト（Ｐｄｃｄ１−／−）マウスは自発性自己免疫を発症するという観察からもたらされた。Ｃ５７ＢＬ／６背景でＰｄｃｄ１−／−マウスの５０パーセントが、１４か月齢までにループス様糸球体腎炎及び関節炎を発症し、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｐｄｃｄ１−／−マウスは、致死的な拡張型心筋症を発症し、心臓トロポニンＩに対する自己抗体の産生を生じる（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈら  １９９９  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１  １４１−１５１；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈら  ２００１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１  ３１９−３２２）。さらに、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス株へのＰＤ−１欠損の導入は、糖尿病の発症及び発生を劇的に加速させ、全てのＮＯＤ−Ｐｄｃｄ１−／−マウスが１０週齢までに糖尿病を発症する結果となる（Ｗａｎｇ，Ｊら  ２００５  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２  １１８２３）。さらに、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）などの自己免疫の誘導マウスモデル、又は移植／移植片対宿主（ＧＶＨＤ）モデルを用いて、いくつかのグループは、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ相互作用のブロックが疾患を悪化させることを示し、炎症性疾患におけるＰＤ−１の重要な役割をさらに確認した。重要には、ヒトＰＤＣＤ１における多型は、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、Ｉ型糖尿病（ＴＩＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、及びグレーブス病を含む様々な自己免疫疾患と関連していることから（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔａｋｕら  ２００７  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９  ８１３−８２４；Ｐｒｏｋｕｎｉｎａ，Ｌら  ２００２  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３２  ６６６−６６９；Ｋｒｏｎｅｒ，Ａら  ２００５  Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ５８  ５０−５７；Ｐｒｏｋｕｎｉｎａ，Ｌら  ２００４  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５０  １７７０）、証拠は、ＰＤ−１がヒトにおいてマウスと同等の免疫調節機能を有することを示唆している。
【０００５】
自己免疫のマウスモデルを用いた、ＰＤ−１シグナル伝達を増強し炎症性疾患を調節するためのいくつかの治療アプローチが報告されている。試された１つのこのようなアプローチは、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現する人工樹枝状細胞を生成することであった。ＭＯＧペプチド免疫付与によるＥＡＥの誘導前後の抗原負荷ＰＤ−Ｌ１−樹枝状細胞によるマウスの注射は、脊髄の炎症、及び該疾患の臨床的重症度を減少させた（Ｈｉｒａｔａ，Ｓら  ２００５  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４  １８８８−１８９７）。別のアプローチは、マウスＰＤ−Ｌ１を発現する組換えアデノウイルスを用いてＰＤ−１シグナルを送達することにより、ＢＸＳＢマウスにおける狼瘡様症候群を治癒させようとすることであった。このウイルスの注射は、タンパク尿のより低い頻度、血清抗ｄｓＤＮＡ  Ｉｇの減少、及びより良好な腎臓病態により示されるように腎炎の発生を部分的に防いだ（Ｄｉｎｇ，Ｈら  ２００６  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１８  ２５８）。これらの結果は、ＰＤ−１シグナルの増強が、ヒト自己免疫疾患において治療効果を有し得ることを示唆している。ヒト薬物治療としてより適切な代替治療アプローチは、ヒトＰＤ−１に対するアゴニストモノクローナル抗体を使用することであろう。このアゴニスト抗体の結合は、ＰＤ−１を通じて理想的には独立に阻害シグナルを伝達するが、天然のＰＤ−１−ＰＤ１−Ｌ相互作用から発する進行中の内因性シグナルとの相乗作用も与える。アゴニスト抗ＰＤ−１  ｍＡｂは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及び単球を含む、炎症性疾患に関与する様々な免疫細胞型を調節することが予測され、したがって広範なヒト自己免疫障害又は炎症性障害の治療に有用性を有するであろう。
【０００６】
いくつかの拮抗性抗ＰＤ−１抗体が記載されているが、これまで文献に記載された唯一のＰＤ−１アゴニスト抗体は、本発明者らが知る限りでは、ＰＤ−１−ＰＤ１Ｌ及びＰＤ１−ＰＤ２Ｌ相互作用も依然としてブロックする。例えば、ＷＯ２００４／０５６８７５を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって患者の治療に適した改善されたアゴニスト抗ＰＤ−１抗体、特にＰＤ１−ＰＤＬ１又はＰＤ１−ＰＤＬ２相互作用をブロックしないものが当該技術分野では依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、現在、例えばＴ細胞応答を低下させることにより、免疫障害の治療又は予防での使用に適した高親和性アゴニスト抗ＰＤ−１抗体を同定した。被験者へのＰＤ−１特異的抗体の投与により治療することができる免疫障害の非限定例には、限定されないが、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、全身性紅斑性狼瘡、Ｉ型糖尿病、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、過剰増殖性免疫障害（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、癌、及び感染症が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本開示による抗体９４９に関するアミノ酸配列を示す図である。
【図２】本開示による抗体に関する特定のアミノ酸又はＤＮＡ配列を示す図である。
【図３】本開示による抗体に関する特定のアミノ酸又はＤＮＡ配列を示す図である。
【図４】本開示による抗体に関する特定のアミノ酸又はＤＮＡ配列を示す図である。
【図５】本開示による抗体に関する特定のアミノ酸又はＤＮＡ配列を示す図である。
【図６】本開示による抗体に関する特定のアミノ酸又はＤＮＡ配列を示す図である。
【図７】本開示による抗体に関する特定のアミノ酸又はＤＮＡ配列を示す図である。
【図８】本開示による抗体に関する特定のアミノ酸又はＤＮＡ配列を示す図である。
【図９】本開示による抗体に関する特定のアミノ酸又はＤＮＡ配列を示す図である。
【図１０】本開示による抗体に関する特定のアミノ酸又はＤＮＡ配列を示す図である。
【図１１】本開示による抗体に関する特定のアミノ酸又はＤＮＡ配列を示す図である。
【図１２】本開示による抗体に関する特定のアミノ酸又はＤＮＡ配列を示す図である。
【図１３】抗体９４９によるヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の阻害を示す図である。
【図１４】抗体９４９及びヒト化バージョンによるリガンドブロッキングアッセイを示す図である。
【図１５】抗体９４９によるヒトＰＤ−１／ＣＤ２８／ゼータレポーター細胞系からのＳＥＡＰの刺激を示す図である。
【図１６】ＰＤ−１との９４９キメラ移植片及びヒト化移植片の種交差反応性を示す図である。
【図１７】マウスに関する軽鎖、アクセプターフレームワーク、及びヒト化軽鎖のアラインメントを示す図である。
【図１８】マウスに関する重鎖、アクセプターフレームワーク、及びヒト化重鎖のアラインメントを示す図である。
【図１９】ｈｕＩｇＧ４フォーマットにおける抗体９４９の重鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図２０】ｈｕＩｇＧ４フォーマットにおける抗体９４９の重鎖の核酸配列を示す図である。
【図２１】ｈｕＩｇＧ４フォーマットにおける抗体９４９の、シグナル配列を含む重鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図２２】ｈｕＩｇＧ４フォーマットにおける抗体９４９の、シグナル配列を含む重鎖の核酸配列を示す図である。
【図２３】ｈｕＩｇＧ１フォーマットにおける抗体９４９の重鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図２４】ｈｕＩｇＧ１フォーマットにおける抗体９４９の重鎖の核酸配列を示す図である。
【図２５】ｈｕＩｇＧ１フォーマットにおける抗体９４９の、シグナル配列を含む重鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図２６】ｈｕＩｇＧ１フォーマットにおける抗体９４９の、シグナル配列を含む重鎖の核酸配列を示す図である。
【図２７】ＣＤＲ３がアミド化部位を除去するのに修正されている可変領域に関する様々なアミノ酸又はヌクレオチド配列を示す図である。
【図２８】ＣＤＲ３がアミド化部位を除去するのに修正されている可変領域に関する様々なアミノ酸又はヌクレオチド配列を示す図である。
【図２９】ＣＤＲ３がアミド化部位を除去するのに修正されている可変領域に関する様々なアミノ酸又はヌクレオチド配列を示す図である。
【図３０】ＣＤＲ３がアミド化部位を除去するのに修正されている可変領域に関する様々なアミノ酸又はヌクレオチド配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ヒト化抗体が由来する親マウス抗体ハイブリドーマは、本明細書ではクローン１９と呼ばれる。クローン１９に由来するクローン化組換え抗体は、抗体ＣＡ０５１＿００９４９と本明細書で呼ばれ、本明細書で９４９とも呼ばれる。
【００１１】
抗体可変ドメインにおける残基は、通常、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って番号付けされる。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、米国保健社会福祉省（ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ、ＵＳＡ（以後、「Ｋａｂａｔら（前述）」）に記載されている。特に明記しない場合は、この番号付けシステムが本明細書において使用される。
【００１２】
Ｋａｂａｔ残基表記法は、アミノ酸残基の線形番号付けと必ずしも直接対応しない。実際の線形アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであっても相補性決定領域（ＣＤＲ）であっても、構造成分の短縮又はそこへの挿入に対応して、厳密なＫａｂａｔ番号付けの場合よりも少ない又は多いアミノ酸を含んでもよい。残基の正しいＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列の相同性の残基を「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列とアラインメントすることにより、所定の抗体について決定してもよい。
【００１３】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置している。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７））によると、ＣＤＲ−Ｈ１に同等なループは残基２６から残基３２に伸びる。故に特に指示のない限り本明細書で使用するとき「ＣＤＲ−Ｈ１」とは、Ｋａｂａｔ番号付けシステム及びＣｈｏｔｈｉａの位相的ループ定義の組合せにより記載された残基２６〜３５を指すことが意図される。
【００１４】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従うと、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）、及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置される。
【００１５】
本明細書で使用するとき、用語「アゴニスト抗体」は、ＰＤ−１の生物学的シグナル伝達活性を刺激し、細胞内ドメインへのホスファターゼ動員、並びに従ってＴ又はＢ細胞受容体シグナル伝達及び活性化に関連した表現型特性の不活化をもたらすことができる抗体を表す。
【００１６】
本発明に使用するための抗体は、当該技術分野において既知の任意の適切な方法を用いて得ることができる。融合タンパク質、例えばＰＤ−１−Ｆｃ融合タンパク質、又はポリペプチド（活性化Ｔ細胞などの）を（組換え的に又は自然に）発現する細胞を含むＰＤ−１ポリペプチド／タンパク質は、ＰＤ−１を特異的に認識する抗体を産生するのに用いることができる。ＰＤ−１ポリペプチドは、「成熟な」ポリペプチド又は生物学的に活性なこの断片若しくは誘導体であってもよい。適切にはＰＤ−１ポリペプチドは、成熟なヒトポリペプチド又はこの細胞外ドメイン若しくは断片である。細胞外ドメインは、典型的には、ＰＤ−１タンパク質のアミノ酸２１〜１７０（ＳＷＩＳＳ  ＰＲＯＴエントリーＱ１５１１６）を含む。ＰＤ−１ポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から当該技術分野において周知な方法によって調製されてもよく、又は天然の生物学的供給源から回収されてもよい。本出願では、用語「ポリペプチド」には、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質が含まれる。これらは、他に明記されていなければ、相互交換して用いられる。ＰＤ−１ポリペプチドは、ある場合には、例えばアフィニティータグに融合された融合タンパク質などの巨大タンパク質の一部であってもよい。ＰＤ−１ポリペプチドに対して生じた抗体は、動物の免疫付与が必要な場合は、周知であり日常的なプロトコルを用いて動物に、好ましくは非ヒト動物に該ポリペプチドを投与することによって得ることができ、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編），Ｖｏｌ  ４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８６）を参照されたい。多数の温血動物、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタを免疫してもよい。しかしながら、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが、一般的には最も適切である。
【００１７】
モノクローナル抗体は、当該技術分野において知られているいずれかの方法によって調製されてもよく、例えば、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７７−９６頁，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）が挙げられる。
【００１８】
また、本発明に使用するための抗体は、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１５）：７８４３−７８４８１；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及び国際特許出願番号ＷＯ２００４／１０６３７７によって報告されている方法によって、特異的抗体を産生するために選択される単一のリンパ球から生じさせた免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングし、発現させることによる単一のリンパ球抗体法を用いて生じさせてもよい。
【００１９】
抗体のスクリーニングは、ヒトＰＤ−１への結合を測定するアッセイ、及び／又はＰＤ１活性にアゴニスト作用を及ぼす能力を測定するアッセイを用いて行うことができる。特に、結合アッセイの例としては、プレートに固相化されたヒトＰＤ−１及びヒトＦｃの融合タンパク質を用い、この融合タンパク質に結合した抗ＰＤ−１抗体を検出するためのコンジュゲートされた二次抗体を使用するＥＬＩＳＡが挙げられる。適切なアゴニスト作用及びリガンドブロッキングアッセイの例は、本明細書の実施例に記載されている。
【００２０】
ヒト化抗体（ＣＤＲグラフト抗体を含む）は、非ヒト種由来の１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。ＣＤＲ全体ではなくＣＤＲの特異性決定残基を移すことが単に必要なだけであり得ることは理解されよう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５−３４を参照されたい）。ヒト化抗体は、場合により、ＣＤＲに由来する非ヒト種由来の１又は複数のフレームワーク残基をさらに含んでもよい。
【００２１】
本発明は、ヒトＰＤ−１に特異性を有するアゴニストヒト化抗体を提供する。
【００２２】
アゴニストマウス抗ＰＤ−１抗体（クローン１９）は、ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０６９４０（未公開）に記載されており、この抗体の可変領域及びＣＤＲの配列が図１に提供されている。特にこの抗体のＣＤＲは、図１（ｃ）、配列番号１〜６に提供されている。
【００２３】
クローン１９由来のＣＤＲＬ３（配列番号６）の改善されたバージョンは、図２（ａ）（配列番号７）に提供され、潜在的な脱アミド化部位が修飾されている。したがって、一実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖を含む、ヒトＰＤ−１に結合するヒト化アゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を含み、並びに軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号７に示される配列を含む、上記ヒト化アゴニスト抗体を提供する。
【００２４】
本明細書中で使用するとき、用語「ヒト化抗体分子」とは、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークにグラフトされたドナー抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）由来の１又は複数のＣＤＲ（所望により、１又は複数の修飾されたＣＤＲを含む）を含む抗体分子を指す。概説については、Ｖａｕｇｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９，１９９８を参照されたい。一実施形態では、移されている全ＣＤＲというよりはむしろ、本明細書において上記されたいずれか１つのＣＤＲ由来の特異性決定残基のほんの１又は複数が、ヒト抗体フレームワークに移されている（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５−３４を参照されたい）。一実施形態では、本明細書において上記された１つ又は複数のＣＤＲ由来の特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移されている。別の一実施形態では、本明細書において上記された各々のＣＤＲ由来の特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移されている。
【００２５】
ＣＤＲ又は特異性決定残基をグラフトした場合、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列は、ＣＤＲが誘導されるドナー抗体のクラス／タイプを考慮して使用されてもよく、マウス、霊長類及びヒトのフレームワーク領域が含まれる。適切には、本発明に係るヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域、並びに、図１（ｃ）又は図２（ｃ）に示される１若しくは複数のＣＤＲを含む可変ドメインを有する。このようにして、一実施形態では、ヒトＰＤ−１に結合するアゴニストヒト化抗体が提供され、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む。
【００２６】
本発明において用いることができるヒトフレームワークの例としては、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭが挙げられる（Ｋａｂａｔら、上述）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖に使用することができ、ＲＥＩは軽鎖に使用することができ、並びにＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは重鎖と軽鎖の両方に使用することができる。或いは、ヒト生殖系列配列を用いてもよい；ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／で利用可能である。
【００２７】
本発明に係るヒト化抗体では、アクセプターの重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ抗体由来である必要はなく、所望により、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでもよい。
【００２８】
本発明のヒト化抗体の重鎖についてこのように適切なフレームワーク領域は、ヒト下位集団のＶＨ１配列１−３  １−４６、並びにＪＨ４（配列番号５２）由来である。したがって、一例では、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を含むアゴニストヒト化抗体であって、重鎖フレームワーク領域は、ヒト下位集団のＶＨ１配列１−３  １−４６、並びにＪＨ４由来である、上記抗体が提供される。ヒトＪＨ４の配列は、以下の通りである：（ＹＦＤＹ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ（配列番号５６）。ＹＦＤＹモチーフはＣＤＲ−Ｈ３の一部であり、フレームワーク４の一部ではない（Ｒａｖｅｔｃｈ，ＪＶ．ら，１９８１，Ｃｅｌｌ，２７，５８３−５９１）。
【００２９】
本発明のヒト化抗体の重鎖に関する別の適切なフレームワーク領域は、ヒト下位集団ＶＨ１配列１−２  １−ｅ、及びＪＨ４由来である（配列番号５４）。したがって、一例では、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を含むアゴニストヒト化抗体であって、重鎖フレームワーク領域が、ヒト下位集団ＶＨ１配列１−２  １−ｅ、及びＪＨ４、例えば配列番号４６を参照されたい）由来である、上記アゴニストヒト化抗体が提供される。ヒトＪＨ４の配列は、以下の通りである：（ＹＦＤＹ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ（配列番号５６）。ＹＦＤＹモチーフはＣＤＲ−Ｈ３の一部であり、フレームワーク４の一部ではない（Ｒａｖｅｔｃｈ，ＪＶ．ら，１９８１，Ｃｅｌｌ，２７，５８３−５９１）。一例では、抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号４６に示される配列を含む。
【００３０】
本発明のヒト化抗体の軽鎖について適切なフレームワーク領域は、ヒト生殖系列下位集団のＶＫ１配列２−１−（１）  Ｌ２３、並びにＪＫ４（配列番号４８）由来である。したがって、一例では、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６又は配列番号７に示される配列を含むアゴニストヒト化抗体であって、軽鎖フレームワーク領域は、ヒト下位集団の配列２−１−（１）  Ｌ２３、並びにＪＫ４由来である、上記抗体が提供される。ＪＫ４配列は、以下の通りである：（ＬＴ）ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５７）。ＬＴモチーフはＣＤＲ−Ｌ３の一部であり、フレームワーク４の一部ではない（Ｈｉｅｔｅｒ，ＰＡ．ら，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，１５１６−１５２２）。
【００３１】
本発明のヒト化抗体の軽鎖に関する別の適切なフレームワーク領域は、ヒト下位集団ＶＫ３配列６−１−（１）  Ａ２７、及びＪＫ４由来である（配列番号５０）。したがって、一例では、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６又は配列番号７に示される配列を含むアゴニストヒト化抗体であって、軽鎖フレームワーク領域が、ヒト下位集団ＶＫ３配列６−１−（１）  Ａ２７、及びＪＫ４由来である、上記アゴニストヒト化抗体が提供される。ヒトＪＫ４の配列は、以下の通りである：（ＬＴ）ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５７）。ＬＴモチーフはＣＤＲ−Ｌ３の一部であり、フレームワーク４の一部ではない（Ｈｉｅｔｅｒ，ＰＡ．ら，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，１５１６−１５２２）。
【００３２】
また、本発明のヒト化抗体では、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のフレームワーク領域と同じ配列を正確に有している必要はない。例えば、稀な残基は、そのアクセプター鎖のクラス又はタイプについてより出現することが多い残基に変化されてもよい。或いは、アクセプターフレームワーク領域において選択された残基は、ドナー抗体と同じ位置で見られる残基に対応するように変化されてもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２４を参照されたい）。このような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するために必要最小限に止めておくべきである。変化が必要とされ得るアクセプターフレームワーク領域において残基を選択するためのプロトコルは、ＷＯ９１／０９９６７に記載されている。
【００３３】
適切には、本発明のヒト化抗体分子において、アクセプター重鎖がヒトＶＨ１配列１−３  １−４６、並びにＪＨ４を有する場合、重鎖のアクセプターフレームワーク領域は、３つのドナーＣＤＲ（配列番号１、２及び３）に加えて、２５位、３７位、４１位、４８位、７１位、７３位及び７６位のうちの少なくとも１つにドナー残基を含む（Ｋａｂａｔら（上述）による）。したがって、一例では、少なくとも、重鎖の可変ドメインの２５位、３７位、４１位、４８位、７１位、７３位及び７６位のそれぞれの残基がドナー残基であるＣＤＲグラフト抗体が提供され、例えば配列番号３０に示される配列を参照されたい。一例では、少なくとも、重鎖の可変ドメインの２５、３７、４１、及び４８位の各々の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される（例えば配列番号３８に示される配列を参照されたい）。一例では、少なくとも、重鎖の可変ドメインの２５位の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される（例えば配列番号４０に示される配列を参照されたい）。
【００３４】
適切には、本発明のヒト化抗体分子では、アクセプター重鎖がヒトＶＨ１配列１−２  １−ｅ、及びＪＨ４を有する場合、重鎖のアクセプターフレームワーク領域は、３つのドナーＣＤＲ（配列番号１、２、及び３）に加えて、２５、３７、４１、４８、７１、７６、及び７８位の少なくとも１つにドナー残基を含む（Ｋａｂａｔら（上述）による）。したがって、一例では、少なくとも、重鎖の可変ドメインの２５、３７、４１、４８、７１、７６、及び７８位の各々の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される（例えば配列番号４２に示される配列を参照されたい）。一例では、少なくとも、重鎖の可変ドメインの２５、３７、４１、及び４８位の各々の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される（例えば配列番号４４に示される配列を参照されたい）。
【００３５】
適切には、本発明によるヒト化抗体分子では、アクセプター軽鎖がヒト下位集団ＶＫ１配列２−１−（１）Ｌ２３、及びＪＫ４を有する場合、軽鎖のアクセプターフレームワーク領域は、３つのドナーＣＤＲ（配列番号４、５、及び６又は７）に加えて、１、２、３、４、４７、６０、及び７０位の少なくとも１つにドナー残基を含む。したがって、一例では、少なくとも、軽鎖の可変ドメインの１、２、３、４、４７、６０、及び７０位の各々の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される（例えば配列番号１０を参照されたい）。一例では、少なくとも、軽鎖の可変ドメインの１、２、３、及び４位の各々の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される（例えば配列番号１８又は配列番号２０を参照されたい）。一例では、少なくとも、軽鎖の可変ドメインの１、２、及び３位の各々の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される（例えば配列番号２２又は配列番号２４を参照されたい）。
【００３６】
適切には、本発明によるヒト化抗体分子では、アクセプター軽鎖がヒト下位集団ＶＫ３配列６−１−（１）Ａ２７、及びＪＫ４を有する場合、軽鎖のアクセプターフレームワーク領域は、３つのドナーＣＤＲ（配列番号４、５、及び６又は７）に加えて、２、４７、５８、７０、７１、及び８５位の少なくとも１つにドナー残基を含む。したがって、一例では、少なくとも、軽鎖の可変ドメインの２、４７、５８、７０、７１、及び８５位の各々の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される（例えば、配列番号２６又は配列番号２８を参照されたい）。
【００３７】
ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち、ＣＤＲが本来誘導されている抗体由来の残基である。ドナー残基は、ヒトアクセプターフレームワーク由来の適切な残基に置換されてもよい（アクセプター残基）。
【００３８】
ドナー残基を各フレームワークに置換するための適切なヒトアクセプター残基は、以下に挙げられる。
【表１】
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【００３９】
本発明の抗体分子は、適切には、それぞれ相補的軽鎖又は相補的重鎖を含む。したがって、一実施形態では、本発明は、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、及び配列番号４６からなる群から選択される配列を含む重鎖、並びに配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、及び配列番号２８からなる群から選択される配列を含む軽鎖を有する、ヒトＰＤ−１に結合するヒト化アゴニスト抗体を提供する。
【００４０】
ＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１活性にアゴニスト作用を及ぼす抗体の能力が著しく変更されなければ、本発明によって提供されるＣＤＲ又は他の配列（例えば、可変ドメイン）に対して、１又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失がなされてもよいことは理解されよう。アミノ酸の置換、付加及び／又は欠失のいずれによる影響も、例えば、本明細書、特に実施例に記載されている方法を用いて、当業者によって容易に試験され、ＰＤ−１結合及びＰＤ−１アゴニスト作用を決定することができる。
【００４１】
別の実施形態では、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、又は配列番号４６のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、又は配列番号４６のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００４２】
「同一性」とは、本明細書中で使用するとき、整列された配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを指す。「類似性」とは、本明細書中で使用するとき、整列された配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似したタイプであることを指す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンで置換されてもよい。多くの場合、互いに置換され得る他のアミノ酸には、限定されないが、
フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が含まれる。同一性及び類似性の程度は容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１，ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆  Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆  Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）。
【００４３】
別の実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、又は配列番号２８のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００４４】
一実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、又は配列番号２８のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００４５】
本発明の別の実施形態では、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、又は配列番号４６のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、又は配列番号２８のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００４６】
適切には、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、又は配列番号４６のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、又は配列番号２８のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００４７】
本発明の抗体分子は、全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子又はその断片を含んでもよく、限定されないが、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ、Ｆａｂ’、修飾されたＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価若しくは四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、二機能性抗体、三機能性抗体、四機能性抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片であってもよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３），２０９−２１７を参照されたい）。これらの抗体断片を作製し、産生する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１を参照されたい）。本発明に使用するための他の抗体断片には、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されたＦａｂ及びＦａｂ’断片が含まれる。多価抗体は、複数の特異性、例えば二重特異性を含んでもよく、又は単一特異的であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。
【００４８】
一実施形態では、本開示による抗体は、免疫グロブリン部分、例えばＦａｂ又はＦａｂ’断片、及びこれに直接的又は間接的に連結された１つ又は２つの単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（例えばＷＯ２００９／０４０５６２に記載されたような）を含むＰＤ−１結合抗体融合タンパク質として提供される。
【００４９】
一実施形態では、融合タンパク質は、場合によりジスルフィド結合により連結された２つのドメイン抗体（例えば可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ペアリングのような）を含む。
【００５０】
一実施形態では、融合タンパク質のＦａｂ又はＦａｂ’エレメントは、単一ドメイン抗体又は抗体（複数）と同一又は類似の特異性を有する。一実施形態では、Ｆａｂ又はＦａｂ’は、単一ドメイン抗体又は抗体（複数）とは異なる特異性を有し、すなわち融合タンパク質は多価である。一実施形態では、本発明による多価融合タンパク質はアルブミン結合部位を有し、例えばこのＶＨ／ＶＬペアはアルブミン結合部位を提供する。
【００５１】
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提案された機能、特に、必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択されてもよい。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってもよい。特に、ヒトＩｇＧ定常領域ドメインが用いられてもよく、特に、抗体分子が治療用であり、抗体エフェクター機能が要求される場合、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプであってもよい。或いは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプは、抗体分子が治療目的であり、抗体エフェクター機能が要求されない場合、例えば、単にＰＤ−１活性にアゴニスト作用を及ぼすために用いられてもよい。これらの定常領域ドメインの配列改変体も使用され得ることは承認されよう。例えば、２４１位のセリンが、Ａｎｇａｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，３０（１），１０５−１０８に報告されるようにプロリンに変更されているＩｇＧ４分子を用いてもよい。また、抗体が様々な翻訳後修飾を受けてもよいことは当業者に理解されよう。これらの修飾のタイプ及び範囲は、多くの場合、抗体を発現させるために使用される宿主細胞系並びに培養条件に依存する。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸塩異性化及びアスパラギン脱アミド化のバリエーションを含んでもよい。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用に起因した、カルボキシ末端の塩基性残基（例えば、リシン又はアルギニン）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９−１３４，１９９５に記載される通りである）。したがって、図８（ａ）、配列番号３６に示される抗体重鎖のＣ末端リシンは欠乏していてもよい。
【００５２】
一実施形態では、抗体の重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体の軽鎖はＣＬドメインのカッパ又はラムダのいずれかを含む。
【００５３】
生体分子、例えば抗体又は断片は、酸性及び／又は塩基性官能基を含み、それにより、分子に正味の正電荷又は負電荷を与える。全体の「観察された」電荷量は、実在物の絶対アミノ酸配列、３Ｄ構造における荷電基の局所環境、及び分子の環境条件に依存する。等電点（ｐＩ）は、特定の分子又はその溶媒接触表面が正味の電荷を担持しないｐＨである。一例では、本発明のＰＤ−１抗体及び断片は、適切な等電点を有するように操作されてもよい。これは、より強固な特性、特に、適切な溶解性及び／又は安定性プロフィール及び／又は改善された精製特性を有する抗体及び／又は断片をもたらすことができる。
【００５４】
このようにして、一態様では、本発明は、初めに特定された抗体９４９の等電点とは異なる等電点を有するように操作されたヒト化ＰＤ−１抗体を提供する。例えば、抗体は、アミノ酸残基の置換、例えば、１又は複数の塩基性アミノ酸残基で酸性アミノ酸残基を置換することによって操作されてもよい。或いは、塩基性アミノ酸残基が導入されてもよく、又は酸性アミノ酸残基が除去され得る。或いは、分子が容認されない高いｐＩ値を有する場合、酸性アミノ酸残基は、必要に応じてｐＩを下げるように導入されてもよい。ｐＩを操作する場合、抗体又は断片の所望の活性を保持するように注意すべきであることは重要である。このようにして、一実施形態では、操作された抗体又は断片は、「修飾されていない」抗体又は断片と同じ又は実質的に同じ活性を有する。
【００５５】
＊＊ＥｘＰＡＳＹ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｔ−ａｒｌｅｓ．ｕｐ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｗ３ｂｂ／ｄ＿ａｂｉｍ／ｃｏｍｐｏ−ｐ．ｈｔｍｌなどのプログラムを用いて、抗体又は断片の等電点を予測してもよい。
【００５６】
本発明の抗体分子は、適切には、高い結合親和性、特にナノモル濃度を有する。親和性は、単離された天然の若しくは組換えＰＤ−１又は適切な融合タンパク質／ポリペプチドを用いて、本明細書の実施例に記載されているＢＩＡｃｏｒｅを含む当該技術分野において既知の任意の適切な方法を用いて測定されてもよい。一例では、親和性は、本明細書の実施例に記載されている組換えヒトＰＤ−１細胞外ドメインを用いて測定される。一例では、用いられる組換えヒトＰＤ−１細胞外ドメインは、単量体である。適切には、本発明の抗体分子は、単離されたヒトＰＤ−１に対する結合親和性が約６ｎＭ又はそれより良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約５ｎＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約４ｎＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約３ｎＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明は、結合親和性が約５ｎＭ又はそれよりも良好であるヒト化抗体を提供する。
【００５７】
本発明によって提供される抗体の親和性は、当該技術分野において知られている任意の適切な方法を用いて変更されてもよいことは理解されよう。したがって、本発明はまた、ＰＤ−１に対する改善された親和性を有する、本発明の抗体分子の改変体に関する。このような改変体は、多数の親和性成熟プロトコルによって得ることができ、ＣＤＲの突然変異（Ｙａｎｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２−４０３，１９９５）、チェーンシャッフリング（Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９−７８３，１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９−３６８，１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４−７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７−８８，１９９６）、及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８−２９１，１９９８）が挙げられる。Ｖａｕｇｈａｎら（上述）は、親和性成熟のこれらの方法を検討している。
【００５８】
一実施形態では、本発明の抗体分子は、ヒトＰＤ−１活性にアゴニスト作用を及ぼす。ＰＤ−１にアゴニスト作用を及ぼす抗体の能力を決定するのに適したアッセイは、本明細書の実施例に記載されている。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−１Ｌの相互作用をブロックしない。抗体がそのリガンドＰＤ−１ＬとのＰＤ−１相互作用をブロックするかどうかを決定するのに適したアッセイは、本明細書の例に記載されている（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇｏｒｄｏｎら  ２０００  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２  １０２７；Ｂｕｔｔｅ，Ｍａｎｎｉｓｈら，２００７  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７（１）２００７）。
【００５９】
所望により、本発明に使用するための抗体は、１又は複数のエフェクター分子にコンジュゲートされてもよい。エフェクター分子が、単一のエフェクター分子、又は本発明の抗体に結合できる単一部分を形成するように連結された２以上のこのような分子を含んでもよいことは承認されよう。エフェクター分子に連結された抗体断片を得ることが望まれる場合、これは、抗体断片を直接又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結する、標準的な化学的又は組換えＤＮＡの手法によって調製されてもよい。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートさせるための技術は当該技術分野において周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，第２版Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編，１９８７，６２３−５３頁；Ｔｈｏｒｐｅら，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８、及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７−１２３を参照されたい）。具体的な化学的手法には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３０３１５８１に記載の手法が含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えば、ＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載されるような組換えＤＮＡ手法を用いて達成することができる。
【００６０】
エフェクター分子なる用語は、本明細書中で使用するとき、例えば、抗腫瘍薬、薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体断片、合成の又は天然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート金属、ナノ粒子、及び蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出できる化合物などのレポーター基を含む。
【００６１】
エフェクター分子の例には、細胞毒素、又は細胞にとって有害（例えば致死的）である任意の薬物を含む細胞毒性剤が含まれてもよい。例としては、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、マイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにそれらの類似体又は相同体が挙げられる。
【００６２】
また、エフェクター分子には、限定されないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、並びにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、及び有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が含まれる。
【００６３】
他のエフェクター分子は、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレートされた放射性核種；又は、限定されないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物を含み得る。他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素が挙げられる。対象となる酵素には、限定されないが、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれる。対象となるタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、限定されないが、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素又はジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、血栓剤又は抗血管新生剤、例えばアンギオスタチン又はエンドスタチン、或いはリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、又は他の増殖因子などの生物反応修飾因子、及び免疫グロブリンが挙げられる。
【００６４】
他のエフェクター分子は、例えば診断において有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放出トモグラフィーにおける使用のため）及び非放射性常磁性金属イオンを含む。診断としての使用のための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号全体を参照されたい。適切な酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子族はストレプトアビジン、アビジン及びビオチンを含み、適切な蛍光物質はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル及びフィコエリトリンを含み、適切な発光物質はルミノールを含み、適切な生物発光物質は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを含み、適切な放射性核種は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃを含む。
【００６５】
別の例において、エフェクター分子は、インビボにおける抗体の半減期の増加及び／又は抗体の免疫原性の減少及び／又は上皮バリアを越える免疫系への抗体の送達を強化できる。この型のエフェクター分子の適切な例は、ＷＯ０５／１１７９８４に記載されたような、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又はアルブミン結合化合物を含む。
【００６６】
エフェクター分子がポリマーである場合、一般に、合成の又は天然に存在するポリマー、例えば、場合により置換された直鎖又は分岐鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンポリマー、或いは分岐又は非分岐の多糖類、例えば、ホモ又はヘテロの多糖類であってよい。
【００６７】
上記の合成ポリマーに存在してもよい特定の任意の置換基は、１又は複数のヒドロキシ基、メチル基又はメトキシ基を含む。
【００６８】
合成ポリマーの具体例には、場合により置換された直鎖又は分岐鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に、場合により置換されたポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）及びその誘導体が挙げられる。
【００６９】
具体的な天然に存在するポリマーは、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体を含む。
【００７０】
「誘導体」は、本明細書中で使用するとき、反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのチオール選択的反応基を含むものとする。反応基は、ポリマーに直接又はリンカーセグメントを介して連結されてもよい。このような基の残基が、抗体断片とポリマーとの間の連結基として、時には生成物の一部を形成することは理解されよう。
【００７１】
ポリマーのサイズは、所望に応じて変更可能であるが、一般には、平均分子量が５００Ｄａから５００００Ｄａ、例えば５０００から４００００Ｄａ、例えば２００００から４００００Ｄａの範囲となる。ポリマーサイズは、特に、生成物の使用目的、例えば腫瘍などのある種の組織に局在する能力又は循環半減期を延長させる能力に基づいて選択できる（総説としては、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５を参照されたい）。したがって、例えば、生成物を腫瘍の治療に使用するために循環から離れて組織に浸透させようとする場合、分子量の小さいポリマー、例えば約５０００Ｄａの分子量のポリマーの使用が有利である場合がある。生成物が循環に残存する場合の適用に関しては、分子量のより大きいポリマー、例えば２００００Ｄａから４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリマーの使用が有利である場合がある。
【００７２】
適したポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、或いは特にメトキシポリ（エチレングリコール）などの、特に約１５０００Ｄａから約４００００Ｄａの範囲の分子量のポリアルキレンポリマー又はその誘導体を含む。
【００７３】
一例では、本発明において使用するための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部位に結合される。特定の一例では、抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は抗体断片に位置する末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を介して結合されてもよい。このようなアミノ酸は、抗体断片中に自然に発生してもよく、又は組換えＤＮＡ法を用いて断片中に操作してもよい（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６、ＵＳ５，６６７，４２５、ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい）。一例において、本発明の抗体分子は修飾されたＦａｂ断片であり、修飾は抗体分子の重鎖のＣ末端への、エフェクター分子の結合を可能にする、１又は複数のアミノ酸の付加である。適切には、付加アミノ酸は、エフェクター分子が結合できる１又は複数のシステイン残基を含む、修飾されたヒンジ領域を形成する。２以上のＰＥＧ分子を結合するために複数の部位が使用できる。
【００７４】
適切には、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置した少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合される。修飾された抗体断片に結合した各ポリマーは、断片に位置したシステイン残基のイオウ原子に共有結合されてもよい。共有結合は、一般に、ジスルフィド結合、又は、特にイオウ−炭素の結合である。チオール基が結合点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばマレイミドなどのチオール選択性誘導体及びシステイン誘導体が使用されてもよい。上記のように、活性化ポリマーが、ポリマーによって修飾された抗体断片の調製において、出発物質として用いることができる。活性化ポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどの、チオール反応基を含む任意のポリマーであってもよい。このような出発物質は、市販で（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡから）得ることができる、又は市販の出発物質から、従来の化学的手法を用いて調製することができる。特定のＰＥＧ分子は、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ，Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）を含む。
【００７５】
一実施形態では、抗体は、例えば、ＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７に開示されている方法に従って、ＰＥＧ化された、すなわちＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））が共有結合した、修飾されたＦａｂ断片又はｄｉＦａｂである［（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ及び「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，１９９８，Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ、Ａ．２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００２、５４：５３１−５４５も参照されたい］。一例では、ＰＥＧは、ヒンジ領域においてシステインに結合する。一例では、ＰＥＧ修飾されたＦａｂ断片は、修飾ヒンジ領域において単一のチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リシン残基は、マレイミド基に共有結合でき、リシン残基上の各アミン基は、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーに結合できる。したがって、Ｆａｂ断片に結合したＰＥＧの全分子量は約４０，０００Ｄａであってもよい。
【００７６】
特定のＰＥＧ分子は、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ社、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ社から入手可能）としても知られている、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ  ２０，０００）修飾リシンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドを含む。
【００７７】
ＰＥＧリンカーの代替供給源には、ＧＬ２−４００ＭＡ２（以下の構造中、ｍは５）及びＧＬ２−４００ＭＡ（ｍは２）を供給するＮＯＦ社が含まれ、ｎは約４５０である：
【化１】
2013521769.tif 000004
【００７８】
すなわち各ＰＥＧは約２０，０００Ｄａである。
【００７９】
以下のタイプのさらなる代替ＰＥＧエフェクター分子：
【化２】
2013521769.tif 000005
は、Ｄｒ  Ｒｅｄｄｙ、ＮＯＦ社及びＪｅｎｋｅｍ社から入手可能である。
【００８０】
一実施形態では、鎖中のアミノ酸２２６又はアミノ酸２２６の前後、例えば重鎖のアミノ酸２２６（連続した番号付けによる）で、システインアミノ酸残基を通じて付加される、ペグ化される（例えば本明細書に記載されたＰＥＧにより）抗体が提供される。
【００８１】
また、本発明は、本発明の抗体分子の重鎖（単数又は複数）及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。適切には、ＤＮＡ配列は、本発明の抗体分子の重鎖又は軽鎖をコードする。本発明のＤＮＡ配列は、例えば、化学的方法によって作製された合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はそれらの任意の組合せを含んでもよい。本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の一部又は全てをコードするＤＮＡ配列は、所望に応じて決定されたＤＮＡ配列から、又は対応するアミノ酸配列に基づいて合成されてもよい。
【００８２】
アクセプターのフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者に広く利用可能であり、それらの知られたアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。
【００８３】
分子生物学の標準的技術を用いて、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製しもよい。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、完全に又は部分的に合成され得る。部位特異的突然変異誘発法及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を必要に応じて使用することができる。
【００８４】
適切なＤＮＡ配列の例は図２〜１２、特に配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、及び４７に提供される。
【００８５】
本発明はまた、本発明の１又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターにも関する。したがって、提供されるのは、本発明の抗体をコードする１又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターである。適切には、クローニングベクター又は発現ベクターは、本発明の抗体分子の軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする２つのＤＮＡ配列、並びに適切なシグナル配列を含む。一例では、ベクターは、重鎖と軽鎖の遺伝子間配列を含む（ＷＯ０３／０４８２０８を参照されたい）。
【００８６】
ベクターを構築できる一般的な方法、トランスフェクション法及び培養方法は、当業者に周知である。この点において、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編），Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにより作成されたマニアティスのマニュアル（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌ）を参照する。
【００８７】
また、本発明の抗体をコードする１又は複数のＤＮＡ配列を含む１又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。任意の適切な宿主細胞／ベクター系は、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を発現させるために用いられてもよい。細菌、例えば大腸菌及び他の微生物系を使用することができ、又は真核生物、例えば哺乳動物、宿主細胞発現系もまた使用することができる。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマの細胞が含まれる。
【００８８】
また、本発明は、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質を発現させるのに適した条件下で、本発明のベクターを含む宿主細胞を培養するステップ、及びこの抗体分子を単離するステップを含む、本発明に係る抗体分子を産生するための方法を提供する。
【００８９】
抗体分子は、重鎖又は軽鎖のポリペプチドをコードする配列だけが宿主細胞にトランスフェクトの使用に必要とされる場合には、重鎖又は軽鎖のポリペプチドだけを含んでもよい。重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物の作製について、細胞系に、２つのベクターである軽鎖ポリペプチドをコードする第１ベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第２ベクターをトランスフェクトしてもよい。或いは、軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含むベクターである単一のベクターを用いることができる。
【００９０】
本開示に係る抗体及び断片は、宿主細胞から良好なレベルで発現される。このようにして、抗体及び／又は断片の特性は、市販用加工に最適であり、貢献するものである。
【００９１】
本発明の抗体は病態の治療及び／又は予防に有用であるため、本発明はまた、本発明の抗体分子を、１又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む医薬組成物又は診断用組成物を提供する。したがって、薬剤を製造するための本発明の抗体の使用が提供される。組成物は、薬学的に許容される担体を通常は含む、無菌の医薬組成物の一部として通常は供給されることになる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントをさらに含んでもよい。
【００９２】
また、本発明は、本発明の抗体分子を、１又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と共に添加又は混合すること含む、医薬組成物又は診断用組成物を調製する方法を提供する。
【００９３】
この抗体分子は、医薬組成物又は診断用組成物における唯一の有効成分であってもよく、又は他の抗体成分、例えば、抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ−１β抗体、抗Ｔ細胞抗体、抗ＩＦＮγ抗体又は抗ＬＰＳ抗体、或いはキサンチンなどの非抗体成分を含む他の有効成分を伴ってもよい。
【００９４】
さらなる実施形態では、本開示に係る抗体、断片又は組成物は、さらなる医薬として活性のある作用物質、例えば、コルチコステロイド（例えばプロピオン酸フルチカゾン）及び／又はベータ−２−作動薬（例えばサルブタモール、サルメテロール若しくはフォルモテロール）又は細胞成長及び増殖の阻害剤（例えばラパマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート）、或いは選択的にＣＤ２８及び／又はＣＤ４０阻害剤と組み合わせて使用される。一実施形態では、阻害剤は小分子である。別の実施形態では、阻害剤は標的に特異的な抗体である。
【００９５】
医薬組成物は、適切には、治療有効量の本発明の抗体を含む。用語「治療有効量」とは、本明細書中で使用するとき、標的となる疾患若しくは状態を治療、改善又は予防するために、或いは検出可能な治療効果又は予防効果を示すために必要とされる治療薬の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデルにおいて、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類のいずれかにおいて、初期に推定することができる。また、動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために用いることができる。続いて、このような情報は、ヒトにおける有用な投薬量及び投与経路を決定するために用いることができる。
【００９６】
ヒト対象に対する正確な治療有効量は、疾患状態の重篤度、対象の全体的な健康状態、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ（単数又は複数）、治療に対する反応感受性及び耐性／応答に依存する。この量は、日常の実験によって決定でき、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。好都合には、医薬組成物は、１用量あたり所定量の本発明の活性剤を含む単位剤形で存在してもよい。
【００９７】
組成物は、患者に個別に投与してもよく、又は他の薬物、薬剤若しくはホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、連続して又は別々に）投与されてもよい。
【００９８】
本発明の抗体分子を投与する場合の投薬量は、治療される状態の性質、存在する炎症の程度、及び抗体分子が予防的に使用されるか又は現状を治療するために使用されているかどうかに依存する。
【００９９】
投薬の頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の持続期間に依存する。抗体分子の半減期が短い（例えば、２〜１０時間）場合、１日に１回又は複数回の投薬が必要とされ得る。或いは、抗体分子の半減期が長い（例えば２〜１５日）場合、１日に１回、１週間に１回、若しくはさらに１又は２か月に１回の投薬だけが必要とされ得る。
【０１００】
薬学的に許容される担体は、それ自体は組成物を摂取する個体に対して有害な抗体の産生を誘導してはならず、毒性があってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、及び不活性ウイルス粒子などの大型の緩慢に代謝される巨大分子であってよい。
【０１０１】
薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸の塩が使用できる。
【０１０２】
治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、さらに水、食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含んでもよい。さらに、湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質がこのような組成物中に存在してもよい。このような担体は、患者による摂取のために、医薬組成物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液などに処方可能にする。
【０１０３】
投与の好ましい形態は、例えば注射又は注入による、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与に適した形態を含む。生成物が注射用又は注入用である場合、油性又は水性のビヒクルにおいて懸濁液、溶液又は乳剤の形態を取ってよく、懸濁剤、防腐剤、安定剤及び／又は分散剤などの製剤助剤を含んでもよい。或いは、抗体分子は、使用前に適切な滅菌の液体により再構成するために、乾燥形態であってもよい。
【０１０４】
一度処方されると、本発明の組成物は対象に直接投与することができる。治療されるべき対象は動物であり得る。しかしながら、１又は複数の実施形態では、組成物はヒト対象に投与するために適合される。
【０１０５】
適切には、本開示に係る製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体又は断片の等電点の値に類似せず、例えば、製剤のｐＨが７である場合、８〜９又はそれを超えるｐＩが適切であり得るためである。望ましくは理論に束縛されずに、これは、最終的には、改善された安定性を有する最終製剤を提供することができ、例えば、抗体又は断片が溶液中に留まると考えられる。
【０１０６】
一実施形態では、４．０〜７．０の範囲のｐＨの医薬製剤は、１〜２００ｍｇ／ｍＬの本開示による抗体、１〜１００ｍＭの緩衝液、０．００１〜１％の界面活性剤、ａ）１０〜５００ｍＭの安定剤、ｂ）１０〜５００ｍＭの安定剤及び５〜５００ｍＭの等張化剤、又はｃ）５〜５００ｍＭの等張化剤を含む。
【０１０７】
例えば約ｐＨ６の製剤は、１〜５０ｍｇ／ｍＬの抗体、２０ｍＭ  Ｌ−ヒスタジン（ｈｉｓｔａｄｉｎｅ）ＨＣｌ、２４０ｍＭトレハロース、及び０．０２％ポリソルベート２０を含んでもよい。或いは約ｐＨ５．５の製剤は、１〜５０ｍｇ／ｍＬの抗体、２０ｍＭクエン酸塩緩衝液、２４０ｍＭスクロース、２０ｍＭアルギニン及び０．０２％ポリソルベート２０を含んでもよい。
【０１０８】
本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮的、経皮的（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所的、舌下、膣内又は直腸の経路を含む、任意の数の経路によって投与できる。皮下噴射器もまた本発明の医薬組成物の投与のために使用できる。典型的には、治療用組成物は、溶液又は懸濁液のどちらかとして、注射可能に調製できる。注射前の、液体媒体中における溶液用又は懸濁液用に適した固体形態にもまた調製できる。
【０１０９】
組成物の直接送達は、一般に、注射、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内によって達成され、又は組織の間質腔に送達される。組成物はまた、病変内に投与され得る。投薬処置は、単回投薬スケジュール又は複数回投薬スケジュールであってもよい。
【０１１０】
組成物中の有効成分が抗体分子であることは承認されよう。そのため、消化管における分解を受けやすい。このようにして、組成物が消化管を使用する経路によって投与されるべきである場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、消化管から一度吸収されたら抗体を放出する薬物を含む必要がある。
【０１１１】
薬学的に許容される担体の詳細な考察は、レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．１９９１）において利用可能である。
【０１１２】
一実施形態では、製剤は、吸入を含む局所投与用の製剤として提供される。
【０１１３】
適切な吸入可能な調製物には、吸入可能な粉末、高圧ガスを含む計量エアロゾル、又は高圧ガスを伴わない吸入可能な溶液が挙げられる。活性物質を含む、本開示に係る吸入可能な粉末は、上記の活性物質だけからなっているか、又は上記の活性物質と生理学的に許容される賦形剤との混合物からなっていてもよい。
【０１１４】
これらの吸入可能な粉末は、単糖（例えば、グルコース又はアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（例えば、デキストラン）、多価アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、又はこれら同士の混合物を含んでもよい。単糖又は二糖が適切には使用され、それは、ラクトース又はグルコースの使用、特に、限定されないが、それらの水和物の形態である。
【０１１５】
肺における沈着用の粒子は、１０ミクロン未満の粒径を必要とし、例えば、１〜９ミクロン、例えば０．１〜５μｍ、特に１〜５μｍである。有効成分（例えば、抗体又は断片）の粒径は、最も重要である。
【０１１６】
吸入可能なエアロゾルを調製するために用いることができる噴射ガスは当該技術分野において知られている。適切な噴射ガスは、炭化水素、例えばｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタン、ハロ炭化水素、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体の中から選択される。上記の噴射ガスは、単独で又はそれらの混合物で使用されてもよい。
【０１１７】
特に適切な噴射ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）、及びそれらの混合物が特に適している。
【０１１８】
また、噴射ガス含有の吸入可能なエアロゾルは、他の成分、例えば共溶媒、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤、及びｐＨを調整するための手段を含んでもよい。これらの全ての成分は当該技術分野において知られている。
【０１１９】
本発明に係る噴射ガス含有の吸入可能なエアロゾルは、最大５重量％の活性物質を含んでもよい。本発明に係るエアロゾルは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％、又は０．５〜１重量％の有効成分を含む。
【０１２０】
或いは、肺への局所投与はまた、溶液製剤又は懸濁製剤の投与によって、例えば、噴霧器などのデバイス、例えば、圧縮器に接続された噴霧器（例えば、Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｖａ．により製造されたＰａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）圧縮器に接続されたＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（登録商標）噴霧器）を用いるものであってもよい。
【０１２１】
本発明の抗体は、溶媒に分散されて、例えば、溶液又は懸濁液の形態で送達させることができる。適切な生理溶液、例えば、生理食塩水又は他の薬理学的に許容される溶媒、又は緩衝液に懸濁することができる。当該技術分野において知られている緩衝液には、水１ｍｌあたり、０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸２ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムが含まれていてもよく、それにより、約４．０〜５．０のｐＨを達成する。懸濁液は、例えば、凍結乾燥させた抗体を使用することができる。
【０１２２】
また、治療用の懸濁液又は溶液製剤は、１又は複数の賦形剤を含んでもよい。賦形剤は当該技術分野において周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液及び重炭酸塩緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールが挙げられる。溶液又は懸濁液をリポソーム又は生分解性マイクロスフェアにカプセル化することができる。製剤は、一般に、無菌的な製造プロセスを用いて、実質的に無菌形態で提供される。
【０１２３】
これは、処方に使用される緩衝溶媒／溶液のろ過、該無菌の緩衝溶媒溶液への抗体の無菌懸濁、及び当業者によく知られている方法による無菌容器への製剤の分注による製造及び滅菌を含んでもよい。
【０１２４】
本開示にかかる噴霧可能な製剤は、例えば、アルミホイルに包まれた単一投薬量単位（例えば、密封されたプラスチック容器又はバイアル）として提供されてもよい。各バイアルは、ある体積、例えば２ｍｌの溶媒／溶液緩衝液中の単位用量を含む。
【０１２５】
本明細書に開示される抗体は、噴霧を介した送達に適していてもよい。
【０１２６】
また、本発明の抗体は、遺伝子治療の使用により投与されてもよいことが予測される。これを達成するために、適切なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列が患者に導入され、その結果、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現され、インサイチュで集積される。
【０１２７】
また、本発明は、炎症性疾患、例えば急性又は慢性炎症性疾患の調節に使用するための抗体分子（又はそれを含む組成物）を提供する。適切には、抗体分子（又はそれを含む組成物）は、炎症過程を減少させる、又は炎症過程を妨げるために使用され得る。一実施形態では、活性化Ｔ細胞、特に、不適切な炎症性免疫応答に関与した活性化Ｔ細胞、例えば、このような応答の近辺／位置に動員される活性化Ｔ細胞のインビボでの減少がもたらされる。
【０１２８】
活性化Ｔ細胞の減少は、本明細書で用いられる場合、処置前又は処置なしと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％、又はそれを超える減少であってもよい。好都合には、本発明に係る抗体、断片又は組成物による処置により、患者のＴ細胞（不活性化Ｔ細胞）の一般レベルを減少させずに、活性化Ｔ細胞のレベルを減少させることができる。これは、より少ない副作用をもたらし、おそらくは患者におけるＴ細胞減少を妨げることができる。
【０１２９】
また、本発明は、免疫障害の治療又は予防において使用するための本発明の抗体分子を提供する。免疫障害は、例えば、感染（ウイルス、細菌、真菌、及び寄生）、感染と関連した内毒素性ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、ＣＯＰＤ、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、脈管炎、外科的癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症などの中枢神経系及び末梢神経系の免疫介在性炎症性障害、狼瘡（例えば全身性紅斑性狼瘡）、及びギラン・バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、サルコイドーシス、強皮症、ヴェグナー肉芽腫症、他の自己免疫障害、膵臓炎、外傷（外科）、移植片対宿主病、移植片拒絶反応、心筋梗塞などの虚血性疾患及びアテローム性動脈硬化症を含む心臓疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周炎、並びに低塩酸症、又は母子間免疫寛容の欠如に関連した不妊症からなる群から選択されてもよい。
【０１３０】
一実施形態では、本発明による抗体は、アレルギー、ＣＯＰＤ、自己免疫疾患、又は関節リウマチの治療に使用される。
【０１３１】
また、本発明は、疼痛、特に炎症と関連している疼痛の治療又は予防に使用するための、本発明に係る抗体分子を提供する。
【０１３２】
さらに、本発明は、免疫障害の治療又は予防のための薬剤の製造における、本発明に係る抗体分子、断片又は組成物の使用を提供し、特に、免疫障害は関節リウマチ、喘息又はＣＯＰＤである。
【０１３３】
さらに、本発明は、本明細書に記載されている１又は複数の医学的兆候の治療又は予防のための薬剤の製造における、本発明に係る抗体分子、断片又は組成物の使用を提供する。
【０１３４】
本発明の抗体分子、断片又は組成物は、任意の治療に利用されてもよく、この場合、ヒト又は動物の生体におけるＰＤ−１の効果を増加させることが望まれる。
【０１３５】
一実施形態では、本発明の抗体分子又はそれを含む組成物は、例えば、本明細書に記載される炎症性疾患を制御するために使用される。
【０１３６】
また、本発明は、免疫障害に罹患しているか又はその危険性があるヒト又は動物対象を治療するための方法であって、有効量の本発明の抗体分子、又はそれを含む組成物を該対象に投与することを含む上記方法を提供する。
【０１３７】
一実施形態では、抗体（特に、本発明に係る抗体又は断片）を精製するための方法であって、
不純物がカラムに保持され、抗体が溶出するように、非結合モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを行うステップ
を含む上記方法が提供される。
【０１３８】
該方法に使用するための適切なイオン交換樹脂には、Ｑ．ＦＦ樹脂（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社により供給）が含まれる。このステップは、例えば、ｐＨが約８で行われてもよい。
【０１３９】
該方法は、例えば、４．５など約４〜５のｐＨで実行される陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた初期捕捉ステップをさらに含んでもよい。陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、ＣａｐｔｏＳ樹脂又はＳＰセファロースＦＦ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社により供給）などの樹脂を用いてもよい。抗体又は断片は、次いで塩化ナトリウムなどのイオン食塩水を、例えば２００ｍＭの濃度で用いて、樹脂から溶出することができる。
【０１４０】
故にクロマトグラフィーステップ（単数又は複数）は、必要に応じて１又は複数の洗浄ステップを含み得る。
【０１４１】
また、精製方法は、透析ろ過ステップなどの１又は複数のろ過ステップをさらに含んでもよい。
【０１４２】
このようにして、一実施形態では、精製された抗ＰＤ−１抗体又は断片、例えば、実質的に精製された形態であり、特に、内毒素及び／又は宿主細胞のタンパク質若しくはＤＮＡを含まないか、又は実質的に含まない、ヒト化抗体又は断片、特に本発明に係る抗体又は断片が提供される。
【０１４３】
上記で使用される精製された形態は、少なくとも９０％の純度を指すものとし、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ又はそれを超えて純粋である。
【０１４４】
内毒素が実質的に含まないとは、一般に、抗体生成物１ｍｇあたりの内毒素含量が１ＥＵ未満であることを指すものとし、例えば、生成物１ｍｇあたり０．５又は０．１ＥＵである。
【０１４５】
宿主細胞のタンパク質又はＤＮＡが実質的に含まないとは、一般に、抗体生成物１ｍｇあたり宿主細胞タンパク質及び／又はＤＮＡ含量が４００μｇ未満であるであることを指すものとし、例えば、必要に応じて、１ｍｇあたり１００μｇ未満、特に１ｍｇあたり２０μｇである。
【０１４６】
また、本発明の抗体分子は診断、例えば、ＰＤ−１に関与する疾患状態のインビボでの診断及び画像化に使用されてもよい。
【０１４７】
本明細書との関連で含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味するものとする。
【０１４８】
この場合、本発明の技術的に適切な実施形態を組み合わせてもよい。
【０１４９】
実施形態は、本明細書において、ある種の特徴／要素を含むものとして記載されている。また、本開示は、上記特徴／要素からなるか又は本質的に上記特徴／要素からなる実施形態を区別するように広げる。
【０１５０】
本発明は、添付の図面について言及する以下の実施例においてのみ、例示としてさらに説明される：
【０１５１】
実施例
図１は、詳細には
ａ）抗体９４９の軽鎖Ｖ領域（配列番号８）
ｂ）抗体９４９の重鎖Ｖ領域（配列番号９）
ｃ）抗体９４９のＣＤＲＨ１（配列番号１）、ＣＤＲＨ２（配列番号２）、ＣＤＲＨ３（配列番号３）、ＣＤＲＬ１（配列番号４）、ＣＤＲＬ２（配列番号５）、ＣＤＲＬ３（配列番号６）
を示す。
【０１５２】
図２
ａ）修飾されたＣＤＲＬ３（修飾された脱アミド化部位）
ｂ）９４９  ＶＫ１  ｇＬ１  Ｖ領域（配列番号１０）
ｃ）９４９  ＶＫ１  ｇＬ１  Ｖ領域ＤＮＡ（配列番号１１）
ｄ）シグナル配列を有する９４９  ＶＫ１  ｇＬ１  Ｖ領域（配列番号１２）
ｅ）シグナル配列を有する９４９  ＶＫ１  ｇＬ１  Ｖ領域ＤＮＡ（配列番号１３）
ｆ）９４９  ＶＫ１  ｇＬ１軽鎖  Ｖ＋定常（配列番号１４）
【０１５３】
図３
ａ）９４９  ＶＫ１  ｇＬ１  軽鎖Ｖ＋定常ＤＮＡ（配列番号１５）
ｂ）シグナル配列を有する９４９  ＶＫ１  ｇＬ１  軽鎖Ｖ＋定常（配列番号１６）
ｃ）シグナル配列を有する９４９  ＶＫ１  ｇＬ１  軽鎖Ｖ＋定常ＤＮＡ（配列番号１７）
ｄ）９４９  ＶＫ１  ｇＬ９  Ｖ領域（配列番号１８）
【０１５４】
図４
ａ）９４９  ＶＫ１  ｇＬ９  Ｖ領域ＤＮＡ（配列番号１９）
ｂ）９４９  ＶＫ１  ｇＬ１１  Ｖ領域（配列番号２０）
ｃ）９４９  ＶＫ１  ｇＬ１１  Ｖ領域ＤＮＡ（配列番号２１）
ｄ）９４９  ＶＫ１  ｇＬ１２  Ｖ領域（配列番号２２）
ｅ）９４９  ＶＫ１  ｇＬ１２  Ｖ領域ＤＮＡ（配列番号２３）
ｆ）９４９  ＶＫ１  ｇＬ１４  Ｖ領域（配列番号２４）
【０１５５】
図５
ａ）９４９  ＶＫ１  ｇＬ１４  Ｖ領域ＤＮＡ（配列番号２５）
ｂ）９４９  ＶＫ３  ｇＬ１  Ｖ領域（配列番号２６）
ｃ）９４９  ＶＫ３  ｇＬ１  Ｖ領域ＤＮＡ（配列番号２７）
ｄ）９４９  ＶＫ３  ｇＬ１１  Ｖ領域（配列番号２８）
ｅ）９４９  ＶＫ３  ｇＬ１１  Ｖ領域ＤＮＡ（配列番号２９）
ｆ）９４９  ｇＨ１ａ  Ｖ領域（配列番号３０）
【０１５６】
図６
ａ）９４９  ｇＨ１ａ  Ｖ領域ＤＮＡ（配列番号３１）
ｂ）シグナル配列を有する９４９  ｇＨ１ａ  Ｖ領域（配列番号３２）
ｃ）シグナル配列ＤＮＡを有する９４９  ｇＨ１ａ  Ｖ領域（配列番号３３）
ｄ）９４９  ｇＨ１ａ  Ｖ領域及び定常領域（配列番号３４）
【０１５７】
図７
ａ）９４９  ｇＨ１ａ  Ｖ領域及び定常領域ＤＮＡ（配列番号３５）
【０１５８】
図８
ａ）シグナル配列を有する９４９  ｇＨ１ａ  Ｖ領域及び定常領域（配列番号３６）
【０１５９】
図９
ａ）シグナル配列ＤＮＡを有する９４９  ｇＨ１ａ  Ｖ領域及び定常領域（配列番号３７）
【０１６０】
図１０
ａ）９４９  ｇＨ８ａ  Ｖ領域(配列番号３８)
ｂ）９４９  ｇＨ８ａ  Ｖ領域ＤＮＡ(配列番号３９)
ｃ）９４９  ｇＨ２０ａ  Ｖ領域(配列番号４０)
ｄ）９４９  ｇＨ２０ａ  Ｖ領域ＤＮＡ(配列番号４１)
ｅ）９４９  ｇＨ１ｂ  Ｖ領域(配列番号４２)
ｆ）９４９  ｇＨ１ｂ  Ｖ領域(配列番号４３)
【０１６１】
図１１
ａ）９４９  ｇＨ８ｂ  Ｖ領域(配列番号４４)
ｂ）９４９  ｇＨ８ｂ  Ｖ領域ＤＮＡ(配列番号４５)
ｃ）９４９  ｇＨ２０ｂ  Ｖ領域(配列番号４６)
ｄ）９４９  ｇＨ２０ｂ  Ｖ領域ＤＮＡ(配列番号４７)
ｅ）ヒトＶＫ１  ２−１−（１）  Ｌ２３  ＪＫ４  アクセプターフレームワーク(配列番号４８)
ｆ）ヒトＶＫ１  ２−１−（１）  Ｌ２３  ＪＫ４  アクセプターフレームワークＤＮＡ(配列番号４９)
【０１６２】
図１２
ａ）ヒトＶＫ３  ６−１−（１）  Ａ２７  ＪＫ４  アクセプターフレームワーク(配列番号５０)
ｂ）ヒトＶＫ３  ６−１−（１）  Ａ２７  ＪＫ４  アクセプターフレームワークＤＮＡ(配列番号５１)
ｃ）ヒトＶＨ１  １−３  １−４６  ＪＨ４  アクセプターフレームワーク(配列番号５２)
ｄ）ヒトＶＨ１  １−３  １−４６  ＪＨ４  アクセプターフレームワークＤＮＡ(配列番号５３)
ｅ）ヒトＶＨ１  １−２  １−ｅ  ＪＨ４  アクセプターフレームワーク(配列番号５４)
ｆ）ヒトＶＨ１  １−２  １−ｅ  ＪＨ４  アクセプターフレームワークＤＮＡ(配列番号５５)
【０１６３】
図１３は、抗体９４９によるヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の阻害を示す。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、負の選択によりヒトＰＢＭＣから精製され、及び抗ＣＤ３プラス対照（ＢＳＡ）又は抗ＰＤ−１抗体／組換えＰＤ−Ｌ２で被覆されたＤｙｎａｌｂｅａｄｓと共に培養された。増殖（ｙ軸）は、６日目に３Ｈ−チミジン取り込みにより測定された。バーは、最大応答（抗ＣＤ３／ＢＳＡ）の％を表し、４つの異なるドナー培養物の平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。
【０１６４】
図１４は、抗体９４９を用いたリガンドブロッキングアッセイ。ＰＤ−１発現ＨＥＫ２９３細胞は、精製されたキメラ９４９若しくはヒト化９４９、又はアイソタイプマッチされた陽性及び陰性対照と共にプレインキュベートされ、この後組換えＰＤ−Ｌ２と共にインキュベートされた。抗体９４９によるＰＤ−１に対するＰＤ−Ｌ２のブロッキングは、抗マウスＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ  ＰＥコンジュゲート抗体と結合しているＰＤ−Ｌ２を明らかにして評価された。括弧内の数字は、プレインキュベーション段階中に添加されたヒト化９４９の計算された濃度（μｇ／ｍＬ）を表す。
【０１６５】
図１５は、抗体９４９によるヒトＰＤ−１／ＣＤ２８／ＴＣＲζ  ＳＥＡＰレポーター細胞系からのＳＥＡＰの刺激。抗体の希釈物は、レポーター細胞と共にインキュベートされ、放出されたＳＥＡＰが決定された。データは、発光量比（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）（シグナル／バックグラウンドシグナル）としてプロットされた。
【０１６６】
図１６は、カニクイザル及びアカゲザル由来のＰＤ−１との９４９キメラ移植片及びヒト化移植片の交差反応性。空ベクター（ｄ）、又はヒト（ａ）、カニクイザル（ｂ）若しくはアカゲザル（ｃ）由来のＰＤ−１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への９４９移植片の結合は、フローサイトメトリーにより測定された。データは、ＰＤ−１抗体結合蛍光の幾何平均として表される。
【０１６７】
図１７は、マウスに関する軽鎖、アクセプターフレームワーク、及びヒト化軽鎖のアラインメントを示す。ＣＤＲは、ボールド体であり、下線が付されている。ドナー残基は、ボールド体であり、イタリック体であり、反転表示されている。
【０１６８】
図１８は、マウスに関する重鎖、アクセプターフレームワーク、及びヒト化重鎖のアラインメントを示す。ＣＤＲは、ボールド体であり、下線を付されている。ドナー残基はボールド体、イタリック体であり、強調表示されている。
【０１６９】
図１９は、９４９ｇＨ１ａ重鎖（Ｖ＋定常−ｈｕ  ＩｇＧ４ＰデルタＬｙｓ）（配列番号５８）を示す。
【０１７０】
図２０は、９４９ｇＨ１ａ重鎖（Ｖ＋定常−ｈｕ  ＩｇＧ４ＰデルタＬｙｓ、下線を付されたエクソン）（配列番号５９）。
【０１７１】
図２１は、下線を付され、イタリック体にされたシグナル配列を有する９４９ｇＨ１ａ重鎖（Ｖ＋定常−ｈｕ  ＩｇＧ４ＰデルタＬｙｓ）（配列番号６０）。
【０１７２】
図２２は、下線を付され、イタリック体にされたシグナル配列を有する９４９ｇＨ１ａ重鎖（Ｖ＋定常−ｈｕ  ＩｇＧ４ＰデルタＬｙｓ、下線を付されたエクソン）（配列番号６１）。
【０１７３】
図２３は、９４９ｇＨ１ａ重鎖（Ｖ＋定常−ｈｕ  ＩｇＧ１デルタＬｙｓ）（配列番号６２）。
【０１７４】
図２４は、９４９ｇＨ１ａ重鎖（Ｖ＋定常−ｈｕ  ＩｇＧ１デルタＬｙｓ、下線を付されたエクソン）（配列番号６３）。
【０１７５】
図２５は、下線を付され、イタリック体にされたシグナル配列を有する９４９ｇＨ１ａ重鎖（Ｖ＋定常−ｈｕ  ＩｇＧ１デルタＬｙｓ）（配列番号６４）。
【０１７６】
図２６は、下線を付され、イタリック体にされたシグナル配列を有する９４９ｇＨ１ａ重鎖（Ｖ＋定常−ｈｕ  ＩｇＧ１デルタＬｙｓ  下線を付されたエクソン）（配列番号６５）。
【実施例】
【０１７７】
（例１）抗ＰＤ−１抗体クローン１９の作製方法
抗体クローン１９の作製は、国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００６９４０（未公開）に既に記載されている。
【０１７８】
１．１  骨髄腫細胞系
融合には、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ  ＧｍｂＨ、ブラウンシュバイク）からの骨髄腫細胞系ＳＰ２／０−Ａｇ１４を用いた。この細胞系は、ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞と骨髄腫細胞系Ｐ３ｘ６３Ａｇ８のハイブリッドである。該細胞は、免疫グロブリン鎖を合成又は分泌せず、２０μｇ／ｍｌで８−アザグアニンに耐性であり、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地で増殖しないとされている。ＳＰ２／０細胞は、標準増殖培地（１０％ＦＣＳを含む）において組織培養フラスコ中で常に維持する。ＨＧＰＲＴ陽性復帰突然変異体の実施を回避するために、凍結ＳＰ２／０細胞の新たなアリコートを２週間後に用いた。骨髄腫細胞は、全てのマイコプラズマ試験において陰性であることが示された。
【０１７９】
１．２  免疫付与及びスクリーニング用の抗原
組換えタンパク質ＰＤ−１Ｆｃを、ＣＤ２８Ｆｃの産生について記載された方法（Ｅｖａｎｓら  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６，２７１−９（２００５））を用いて調製し、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で５．１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。還元及び非還元条件下で行った抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、タンパク質の純度が＞９５％であることを証明した。
【０１８０】
１．３  免疫付与
５匹のマウス（約８週齢）を、６０日間にわたる免疫付与プロトコルを用いて腹腔内腔を介して免疫した。免疫付与のために、免疫原のミョウバン沈降物を調製した。ミョウバン沈降物は、追加免疫ごとに新たに調製した。マウスは、５０μｇタンパク質で免疫し、２５μｇタンパク質で追加免疫した。３匹のマウスを融合に使用した。
【０１８１】
１．４  細胞の一般的処理
細胞は、層流システム、滅菌材料、及び滅菌溶液を用いて滅菌条件下で処理した。細胞は、５％二酸化炭素を含有する湿潤雰囲気中で３７℃でインキュベートした。ハイブリドーマ細胞の培養のために、補助剤２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、グルタマックス、ＨＴ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質／抗真菌剤溶液（供給者により推奨された濃度での）、及びＦＣＳを含むＤＭＥＭを異なる濃度（１０％、１５％又は２０％）で含有する完全増殖培地（ＣＧＭ）を使用した。
【０１８２】
１．５  脾臓細胞の調製及び細胞融合
３匹の免疫したマウスをＣＯ２中で窒息させた後、脾臓を無菌的に除去した。プールした脾臓の単一細胞懸濁液を調製した。脾臓細胞及び骨髄腫細胞をＤＭＥＭで数回洗浄し、１ｍｌ  ５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３５５０の存在下で２回融合した（脾臓細胞対ＳＰ２／０比  ２．５：１及び２．４：１）。産生されたハイブリドーマを、２０％ＦＣＳ及びアミノプテリンを含有するＣＧＭ（ＨＡＴ培地）で再懸濁した。各融合の細胞懸濁液（１４０Ｃｌ／ウェル）を、２０％ＦＣＳを含むＣＧＭ中に支持細胞として１４０Ｃｌ／ウェルの腹腔滲出細胞を含有する、８つの９６ウェル組織培養平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ社）にプレートアウトした。プレートは１０日間インキュベートした。この期間中、細胞にＨＡＴ培地を２回供給した。脾臓細胞調製物のアリコート（約８×１０６脾臓細胞）を、２４ウェルプレートのウェルで１０日間培養し、細胞培養上清はＥＬＩＳＡでの陽性対照として用いた。
【０１８３】
１．６  スクリーニングアッセイ
ＥＬＩＳＡを、細胞培養上清中のＩｇＧのスクリーニングに用いた。９６ウェル平底ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社、カタログ番号６５５０６１）を、０．５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６中、５０μｌ／ウェルのＰＤ−１Ｆｃ抗原（５μｇ／ｍｌ）で被覆した。湿室で４℃、一晩インキュベーション後、プレートを、０．０１％トリトンＸ−１００（洗浄緩衝液）を含有するトリス緩衝液食塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．８、５００ｍＭ塩化ナトリウム）で洗浄し、振とう機で室温（ＲＴ）、１時間、ＴＢＳ（ブロッキング緩衝液）中２００μｌ／ウェルの２％ＦＣＳでブロックした。ウェルを洗浄緩衝液で洗浄し、１００μｌ細胞培養上清を適切なウェルに添加した。ＳＰ２／０骨髄腫細胞からの細胞培養上清は、陰性対照として使用した。陽性対照としては、脾臓細胞培養からの細胞培養上清を使用した。プレートはＲＴで１時間、振とう機でインキュベートし、この後数回洗浄した。結合抗体の検出のために、プレートを、ブロッキング緩衝液中、アルカリホスファターゼにコンジュゲートした５０μｌ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）（１：５０００）と共に、振とう機で、ＲＴ、１時間インキュベートし、この後、数回洗浄し、１５０μｌ／ウェルの基質緩衝液（５％ジエタノールアミン中２ｍＭ  ４−ニトロフェニルリン酸＋０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８）を添加した。光学密度（ＯＤ）は、１２チャンネルＤｙｎｅｘ  Ｏｐｓｙｓ  ＭＲマイクロプレートリーダーで４０５ｎｍで推定した。ＯＤ４０５ｎｍの平均プレート値より２倍高いＯＤ４０５ｎｍを有するウェルを、陽性として選択した。
【０１８４】
１．７  安定な抗体産生株の選択
陽性ＩｇＧ産生培養物からの細胞を４８ウェルプレートのウェルに移し、数日間培養した（細胞の増殖特性に応じて）。特異的バインダーを選択するために、予め被覆した抗原なしでＰＤ−１ＦｃについてＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡ陽性ウェルからの細胞を、凍結培地（９０％ＦＣＳ、１０％ＤＭＳＯ）で凍結した。該細胞のアリコートを、さらなる特徴付け用に細胞培養上清を作製するため、さらに培養した。
【０１８５】
１．８  限界希釈クローニング
陽性ウェルを同定するとすぐに、非産生細胞による異常増殖のリスクを減少させるために、ハイブリドーマ細胞をクローニングした（１次クローニング）。抗体が本当に単クローンであることを確実にするために、ハイブリドーマを再びクローニングした（２次クローニング）。限界希釈の方法を、両方のクローニング手順に用いた。ＩｇＧ産生細胞は、１ウェルあたり１〜３細胞の密度でフィーダー細胞を含有する１つの９６ウェルプレートに分配した。８〜１０日後（増殖特性に応じて）、単クローン性増殖の検出のため、全てのプレートを顕微鏡下で視覚的に検査した。このようなウェルからの培養上清を、上記スクリーニングアッセイを用いて特異的免疫グロブリン含量についてスクリーニングした。増殖特性及びＥＬＩＳＡシグナルに関して適切なクローンを選択し、２４ウェルプレートのウェルに移し、数日間培養した。スクリーニングアッセイを行った。この手順を２〜３回繰り返した。２次クローニング手順又は凍結保存のための培養に適切なサブクローンを、それぞれ選択した。この手順は、クローン１９として知られる抗ＰＤ−１抗体の産生をもたらした。
【０１８６】
１．９  抗体の調製及びアイソタイピング
ハイブリドーマ上清を調製し、滅菌したアジドフリーＰＢＳに希釈した。モノクローナル抗体の精製したストックを、ＩｓｏＳｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社；ｓｃ−２４９５８）を用いてＰＢＳ中１μｇ／ｍｌでアイソタイピングした。クローン１９は、アイソタイプＩｇＧ１κであることを見出した。
【０１８７】
１．１０  クローン１９の配列決定
クローン１９をコードする遺伝子をクローニングし、配列決定し、図１に提供する。この抗体を抗体ＣＡ０５１＿００９４９と命名した（しばしば９４９と省略される）。
【０１８８】
（例２）抗体９４９の特徴付け及び選択
２．１  抗体選択の理論的根拠
ＰＤ−１を通じて阻害シグナルをＴ細胞に伝達することができる治療試薬を作製するために、アゴニスト抗ＰＤ−１モノクローナル抗体を選択した。この抗体で膜近位エピトープを標的化することは、この抗体がＰＤ−１に対する内因性リガンド（ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２）の結合をブロックしないことを確実にするであろう。したがって、該アゴニスト抗体はＰＤ−１を通じて伝達されるリガンドからのいずれの天然の阻害シグナルにも付加して作用することになり、及び該シグナルを増強することができる。この抗体のヒト化バージョンは、不適切なレベルのＴ又はＢリンパ球活性化を伴う広範なヒト疾患において潜在的な治療有用性を有するであろう。
【０１８９】
２．２  ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞で抗体９４９により誘導されたＰＤ−１アゴニスト作用の分析
抗体９４９（親可変領域、マウスＩｇＧ１）がＰＤ−１を通じたシグナル伝達を誘導することができることを実証するために、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）誘導活性化シグナルを阻害する該抗体の能力について試験した。これは、９４９をＴＣＲ活性化抗ＣＤ３抗体と共にＤｙｎａｌｂｅａｄｓに共有結合させて達成した。ビーズは、次いで初代ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞の培養物に添加し、結果として得られた増殖を、６日後に３Ｈ−チミジン取り込みにより測定した。
【０１９０】
トシル活性化４．５μｍ  Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓ（Ｍ４５０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を０．１Ｍ滅菌リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で洗浄し、１×１０７ビーズあたり２μｇの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３）を、連続反転混合により８時間、３７℃でロードした。ビーズを次いで洗浄して非コンジュゲート抗ＣＤ３を除去し、アリコートを、連続反転混合により１９時間、３７℃、１×１０７ビーズあたり３μｇのＢＳＡ、非アゴニスト対照抗ＰＤ−１抗体、９４９又は組換えヒトＰＤ−Ｌ２．ｍＦｃで二次被覆した。ビーズをこの後洗浄し、０．２Ｍトリス／０．１％ＢＳＡ（ｐＨ８．５）中で３時間インキュベートして遊離トシル基を不活化し、この後洗浄し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）にビーズを再懸濁した。ビーズセットの均等な抗ＣＤ３及び抗体／リガンド被覆は、ビーズの蛍光色素標識アイソタイプ特異的抗体による染色、及びフローサイトメトリーによる分析により確認した。
【０１９１】
ヒトＴ細胞増殖試験のため、新鮮なヘパリン添加血液を、ＲＰＭＩにより１：１希釈し、リンパ球を密度勾配分離（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ）により分離した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＭＡＣＳ（ＣＤ４＋  Ｔ細胞分離キットＩＩ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いた陰性選択により全ＰＢＭＣから精製した。１×１０５  ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞／ウェルを、９６ウェル丸底プレート中で被覆ビーズと共に１：１比で培養し、３７℃／５％ＣＯ２／１００％湿度で６日間インキュベートした。増殖は、６日後に、培養の最後の６時間に０．５μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンを添加して測定した。細胞をガラス繊維フィルター上に回収し、取り込まれた３Ｈ−チミジンをβシンチレーション計数により測定した。
【０１９２】
２．３  結果
図１３の結果は、抗ＣＤ３プラス抗ＰＤ−１抗体又はＢＳＡ対照被覆ビーズの存在下で測定したヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞による６日目の増殖応答を示す。データは、最大応答（抗ＣＤ３プラスＢＳＡ対照）のパーセンテージとして表され、４つの異なるドナー応答の平均である。ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖は抗体９４９により阻害され、その結果、観察された平均増殖は最大値のわずか５１．６％であった。ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の類似の阻害は、ＰＤ−１シグナル伝達の陽性対照として利用した組換えヒトＰＤ−Ｌ２で見られた。比較では、非アゴニスト抗ＰＤ−１  ｍＡｂを使用し、該ｍＡｂは、本アッセイにおいてＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖に対する期待されたような効果を示さなかった。これは、抗体９４９がＰＤ−１を通じたアゴニストシグナル伝達を誘導することができ、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞応答の阻害をもたらすことを証明するものである。
【０１９３】
（例３）抗体ＣＡ０５１＿００９４９のヒト化
抗体ＣＡ０５１＿００９４９は、マウス抗体Ｖ領域由来の相補性決定領域（ＣＤＲ、図１ｃ）をヒト生殖系列抗体Ｖ領域フレームワークにグラフトしてヒト化した。抗体の活性を回復するために、マウスＶ領域由来のいくつかのフレームワーク残基もヒト化配列に保持された。これらの残基は、Ａｄａｉｒら（１９９１）（「ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」  ＷＯ９１／０９９６７）により概説されたプロトコルを用いて選択した。マウス抗体（ドナー）Ｖ領域配列とヒト生殖系列抗体（アクセプター）Ｖ領域配列とのアラインメントは、設計されたヒト化配列と共に図１７及び１８に示される。
【０１９４】
ドナーからアクセプター配列にグラフトされたＣＤＲは、合体されたＣｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔ定義が使用されるＣＤＲ−Ｈ１を例外として（Ａｄａｉｒら（１９９１）「ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」  ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら，「免疫学的対象のタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」（１９８７）．Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳ）によって定義されている。
【０１９５】
抗体９４９の重鎖ＣＤＲは、ヒトＶ領域ＶＨ１  １−３  １−４６プラスＪＨ４  Ｊ領域（Ｖ  ＢＡＳＥ、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）にグラフトした。重鎖フレームワーク残基は、ドナー残基フェニルアラニン（Ｆ２５）、メチオニン（Ｍ３７）、ヒスチジン（Ｈ４１）、イソロイシン（Ｉ４８）、バリン（Ｖ７１）、リシン（Ｋ７３）、及びスレオニン（Ｔ７６）がそれぞれ保持された、残基２５、３７、４１、４８、７１、７３、及び７６（Ｋａｂａｔ番号付け）を例外として、全てヒト生殖系列遺伝子由来である。ヒトフレームワークの１位のグルタミン残基を、グルタミン酸（Ｅ１）と置換して均一な産物の発現及び精製を得た。抗体及び抗体断片のＮ末端におけるグルタミンのピログルタミン酸への転換は広く報告されている。得られたヒト化配列は、９４９  ｇＨ１ａと命名した。もう１つのヒト化重鎖配列、９４９  ｇＨ１ｂは、ＣＤＲをヒトＶ領域ＶＨ１  １−２  １−ｅプラスＪＨ４  Ｊ領域（Ｖ  ＢＡＳＥ、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）にグラフトして作製した。重鎖フレームワーク残基は、ドナー残基フェニルアラニン（Ｆ２５）、メチオニン（Ｍ３７）、ヒスチジン（Ｈ４１）、イソロイシン（Ｉ４８）、バリン（Ｖ７１）、スレオニン（Ｔ７６）及びバリン（Ｖ７８）がそれぞれ保持された、残基２５、３７、４１、４８、７１、７６、及び７８（Ｋａｂａｔ番号付け）を例外として、全てヒト生殖系列遺伝子由来である。ヒトフレームワークの１位のグルタミン残基を、グルタミン酸（Ｅ１）と置換して均一な産物の発現及び精製を得た。
【０１９６】
ヒトＶ領域ＶＫ１  ２−１−（１）Ｌ２３＋ＪＫ４  Ｊ領域（Ｖ  ＢＡＳＥ、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）は、軽鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択された。軽鎖フレームワーク残基は、ドナー残基グルタミン酸（Ｅ１）、アスパラギン（Ｎ２）、バリン（Ｖ３）、ロイシン（Ｌ４）、トリプトファン（Ｗ４７）、アスパラギン酸（Ｄ６０）、及びセリン（Ｓ７０）がそれぞれ保持された、残基１、２、３、４、４７、６０、及び７０（Ｋａｂａｔ番号付け）を例外として、全てヒト生殖系列遺伝子由来である。得られたヒト化配列は、９４９  ＶＫ１  ｇＬ１と命名した。もう１つのヒト化軽鎖配列、９４９  ＶＫ３  ｇＬ１は、ＣＤＲをヒトＶ領域ＶＫ３  ６−１−（１）Ａ２７プラスＪＫ４  Ｊ領域（Ｖ  ＢＡＳＥ、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）にグラフトして作製した。軽鎖フレームワーク残基は、ドナー残基アスパラギン（Ｎ２）、トリプトファン（Ｗ４７）、バリン（Ｖ５８）、セリン（Ｓ７０）、チロシン（Ｙ７１）、及びスレオニン（Ｔ８５）がそれぞれ保持された、残基２、４７、５８、７０、７１、及び８５（Ｋａｂａｔ番号付け）を例外として、全てヒト生殖系列遺伝子由来である。
【０１９７】
ヒト化９４９  ＶＫ１  ｇＬ１、９４９  ＶＫ３  ｇＬ１、９４９  ｇＨ１ａ、及び９４９  ｇＨ１ｂ軽鎖並びに重鎖Ｖ領域配列をコードする遺伝子は、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨによる自動化合成アプローチにより設計し、構築した。ヒト化重鎖及び軽鎖のいくつかの異なる改変体は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により該遺伝子を修飾して作製し、ＣＤＲＬ３については、場合により脱アミド化部位を修飾した（図２ａ）。ヒト化９４９軽鎖Ｖ領域遺伝子配列は、ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈヒト軽鎖発現ベクターｐＫＨ１０．１にクローニングされ、このベクターはヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含有する。ヒト化９４９重鎖Ｖ領域遺伝子配列は、ヒンジ安定化突然変異Ｓ２４１Ｐを有するヒトガンマ−４重鎖定常領域（Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９３、３０（１）：１０５−８）をコードするＤＮＡを含有する、ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈヒトガンマ−４重鎖発現ベクターｐＶｈγ４Ｐ  ＦＬにクローニングし、及びＣ末端リシン残基のコドンが除去されている、ヒトガンマ−４Ｐ重鎖ベクターの一バージョン、ｐＶｈγ４ＰデルタＬｙｓにもクローニングした。ヒト化９４９重鎖 Ｖ領域遺伝子配列はまた、Ｃ末端リシン残基が除去されたヒトガンマ−１重鎖定常領域をコードするＤＮＡを含有する、ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈヒトガンマ−１重鎖発現ベクターｐＶｈγ１デルタＬｙｓにもクローニングした。ＨＥＫ２９３懸濁細胞への軽鎖及び重鎖ベクターの一過性コトランスフェクションは、２９３フェクチン（１２３４７−０１９  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて達成し、ヒト化された組換え９４９抗体の発現をもたらした。
【０１９８】
ヒト化重鎖及び軽鎖のいくつかの異なる改変体は、抗体９４９由来の図１（ｃ）のＣＤＲ、及び２（ａ）修飾された脱アミド化部位を有するクローン１９由来のＣＤＲＬ３、及び使用されるフレームワークに応じて以下に列挙された１又は複数のドナー残基を含めることにより作製した。配列は、図２〜１１並びに図１７及び１８に提供されている。
【０１９９】
３．１  ヒト化のためのＡｂ９４９残基
【表２】
2013521769.tif 000006
【０２００】
（例４）例３で作製されたヒト化抗体の特徴付け
４．１  親和性
結合親和性測定
アッセイフォーマットは、固定化された抗ヒトＦｃによる９４９又はこのヒト化バージョンの捕捉、及びこの後の、捕捉表面でのヒトＰＤ−１の滴定を含んだ。
ＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）はＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ）を用いて行われた。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）は、約６０００反応単位（ＲＵ）の捕捉レベルまでアミンカップリング化学を介してＣＭ５センサーチップ上に固相化された。ブランク表面は、この手法からＦｃ断片を除いて、同様の方法により調製された。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ２０、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ）は、泳動緩衝液として使用され、流速は１０μｌ／分であった。約１μｇ／ｍＬで９４９  ＩｇＧの１０μｌ注入は、固相化された抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃによる約２００ＲＵの捕捉のために用いられた。ヒトＰＤ−１は、流速を３０μＬ／分にして、種々の濃度（５０ｎＭ以下）の捕捉された９４９又はヒト化改変体全体で滴定された。表面は、流速を１０μＬ／分にして、４０μＭ  ＨＣｌの１０μＬ注入、続く５ｍＭ  ＮａＯＨの５μＬ注入によって再生された。
【０２０１】
バックグラウンド除去結合曲線は、標準的な手法に従って、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン３．２）を用いて分析された。動態パラメータは適合アルゴリズムから測定された。
【０２０２】
９４９及びこの様々なヒト化バージョンについてのデータが、表１に示される。１つ、（ＶＫ１  ｇＬ１１ｇＨ１ａ）を除く、試験した全てのグラフトについて、ＰＤ−１に対する親和性は９４９親抗体に比べて改善された。キメラは、ヒトＩｇＧ４定常ドメインを有する９４９可変領域を含有した。
【表３】
2013521769.tif 000007
【０２０３】
４．２  抗体９４９及び９４９のヒト化バージョンのリガンドブロッキング活性の分析
ＰＤ−１リガンド結合アッセイを行って、抗体９４９（キメラヒトＩｇＧ４（親Ｖ領域）、及び９４９のヒト化一過性クローン）がリガンド結合をブロックする能力を有するかどうかを決定した。このアッセイでは、ＰＤ−１発現ＨＥＫ細胞を、精製された又は一過性に発現された抗体上清と共に３０分間インキュベートし、この後、組換えヒトＰＤ−Ｌ２．ｍＦｃ融合タンパク質と共にインキュベートした。細胞発現ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ２．ｍＦｃの結合は、次いで、ＰＥコンジュゲート抗マウスＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ抗体を用いて明らかにした。
【０２０４】
方法
ＨＥＫ２９３細胞には、５μｇヒトＰＤ−１  ＤＮＡ及び２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、６ウェルプレートで一晩、５×１０６／ウェルで培養して一過性にトランスフェクトした。翌日、ＰＤ−１発現ＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルＵ−プレートに５０μＬ中１×１０６／ウェルで添加し、５０μＬのヒトＩｇＧ４対照（１０μｇ／ｍＬ）、若しくは精製されたキメラ９４９（１０、３．３又は１．１μｇ／ｍＬ）、若しくは対照抗ＰＤ−１抗体（１０、３．３又は１．１μｇ／ｍＬ）、又は１５０μＬの無希釈のヒト化９４９一過性上清のどちらかと共に、氷上で３０分間プレインキュベートした。組換えヒトＰＤ−Ｌ２．ｍＦｃ融合タンパク質を、氷上でさらに３０分間、０．３μｇ／ｍＬ最終濃度で細胞に添加した。ＨＥＫ細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄した。フィコエリトリンコンジュゲート抗マウスＨ＋Ｌ  ＩｇＧを１／２００希釈し、ウェルあたり５０μＬで細胞ペレットに添加した。細胞は、３０分間、氷上でインキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、直ちにフローサイトメーターに取り込んだ。
【０２０５】
結果
図１４のデータは、対照ＩｇＧ４又は抗ＰＤ−１抗体のどちらかで予めブロックした場合の、ＰＤ−１トランスフェクトＨＥＫ細胞へのＰＤ−Ｌ２．ｍＦｃ結合を示す。対照ＩｇＧ４は、幾何平均蛍光強度の増加により示されるように、細胞へのＰＤ−Ｌ２の結合を阻害しなかった。精製されたキメラ９４９抗体は、１から１０μｇ／ｍＬの間の濃度ではＰＤ−１発現細胞へのＰＤ−Ｌ２結合を阻害しなかった。既知のリガンドブロッキング特性を有する対照抗ＰＤ−１抗体は、試験濃度でＰＤ−１発現細胞へのＰＤ−Ｌ２結合をブロックし、リガンドブロッキングがこのアッセイフォーマットで検出され得ることを確認した。抗体９４９の全てのヒト化バージョンも、細胞で発現されたＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ２結合を阻害しなかった。
【０２０６】
４．３  抗体９４９及びこのヒト化バージョンの機能的活性の分析
レポーター遺伝子アッセイは、ヒトＰＤ−１の細胞外リガンド結合ドメイン及び膜貫通ドメイン、並びにヒトＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及びヒトＴＣＲζ細胞内ドメインを含むキメラ受容体を安定に発現するＪｕｒｋａｔ細胞系を用いて開発した。これらの細胞は、ＮＦκＢ依存性プロモーターの制御下のレポーター遺伝子を有し、組換えヒトＰＤ−リガンド１又は２で刺激されると、該細胞は分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を産生する。これは、このレポーターアッセイがＰＤ−１アゴニスト作用を検出できることを証明している。アッセイは、親マウス抗体９４９の機能アゴニスト活性を様々なヒト化構築物と比較するのに使用した。
【０２０７】
ヒトＰＤ−１／ＣＤ２８／ＴＣＲζキメラ構築物は、国際出願ＷＯ２００７／０６０４０６に記載された方法により作製した。Ｊｕｒｋａｔ細胞には、ＳＥＡＰレポーターベクターでヒトＰＤ−１／ＣＤ２８／ＴＣＲζキメラを安定にトランスフェクトした。細胞を大量に調製し、使用されるまで液体窒素中で貯蔵した。細胞を解凍し、３８４ウェルあたり３０，０００細胞を含有する培地の１５μＬアリコートで分注した。抗体／構築物は、ＮＭ６培地において４×最終濃度で調製し、５μＬ容量を添加してウェルを複製した。１８時間のインキュベーション後、４μＬの上清を、添付文書に記載されているようにＳＥＡＰ活性についてアッセイした（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｇｒｅａｔ  Ｅｓｃａｐｅ（商標）ＳＥＡＰ）。活性は、発光量比（バックグラウンドシグナルで除したシグナル）として計算した。
【０２０８】
図１５のデータは、ＪｕｒｋａｔヒトＰＤ−１／ＣＤ２８／ＴＣＲζＳＥＡＰレポーター細胞系からの、ＳＥＡＰの抗体９４９刺激放出を示す。対照ヒト抗体、ＣＡＮ−１は、ＳＥＡＰの放出を刺激しなかった。最初のＣＡ９４９構築物、ｃＬｃＨ、及び構築物ＶＫ１  ｇＬ１２  ｇＨ８ｂは、アッセイにおいて類似の滴定を生じた。表２は、試験した全てのヒト化構築物が、このアッセイにおいてＳＥＡＰ応答を引き起こしたことを示しており、該構築物が、ヒト化後にアゴニスト機能を維持していることを証明している。
【表４】
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【０２０９】
４．４  ＨＥＫ２９３ヒト、カニクイザル、及びアカゲザルＰＤ−１に結合している９４９キメラ移植片及び９４９ヒト化移植片のフローサイトメトリー分析
抗体９４９のヒト化移植片が、ヒト以外の霊長類ＰＤ−１との交差反応性を維持したことを確認するために、フローサイトメトリーアッセイを、完全長ヒト、カニクイザル、又はアカゲザルＰＤ−１をコードするＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３懸濁細胞で実施した。ＨＥＫ２９３細胞には、５μｇ  ＤＮＡ及び２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、６ウェルプレートで一晩、５×１０６／ウェルで培養して一過性にトランスフェクトした。翌日、ヒト、カニクイザル、又はアカゲザルＰＤ−１発現ＨＥＫ２９３細胞を、０．２％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）ＰＢＳ＋０．０９％アジ化ナトリウムに再懸濁し、所定濃度の９４９キメラ移植片、９４９ヒト化移植片、９４９キメラ（精製）抗体、又は対照抗体と共に、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、二次抗体−１：１０００  ＦＩＴＣ（Ｆａｂ）２ヤギ抗ヒトＦｃ特異的（１０９−００６−０９８  Ｊａｃｋｓｏｎ社）と共に、４℃で１時間インキュベートした。分析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で行った。
【０２１０】
結果は図１６に示される。結果は、ｉ）全ての移植片は、ＰＤ−１発現細胞に特異的に結合する（図１６ａ、ｄ）、ｉｉ）移植片は全て、オリジナル配列（図１６ａ）に等しいヒトＰＤ−１結合を保持する、並びにｉｉｉ）移植片は全て、カニクイザル（図１６ｂ）及びアカゲザル（図１６ｃ）由来のＰＤ−１と交差反応する、ことを示している。
【０２１１】
本発明は単なる例示として記載され、決して限定的にする意図はなく、詳細の変更が以下の特許請求の範囲内でなし得ることは当然理解されよう。本発明の各実施形態の好ましい特徴は、変更すべきところは変更した他の実施形態それぞれについても同様である。限定するものではないが、本明細書に引用した特許及び特許出願を含む全ての刊行物は、それぞれ個々の刊行物が、具体的に且つ個別に、完全に説明されたように本明細書中に参照により援用されることを示唆したかのように、本明細書中に参照により援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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