(57)【要約】圧縮エンジンにおいて用いることを対象とする方法、生物油、バイオ燃料、ユニット、及び／又は有機体。生物油を製造する方法は、有機体を生成させ、有機体によって供給材料を消費させることを含む。有機体は、脂肪酸を含む脂質を含む。有機体は少なくとも２つの基準値を満足するか又はこれを超える。基準値は、（Ａ）少なくとも約１１５ｇ／Ｌの細胞密度；（Ｂ）乾燥質量基準で少なくとも約４９％の脂肪酸含量；（Ｃ）少なくとも約１５ｇ／Ｌ・日の脂肪酸生産性；（Ｄ）消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．１７５ｇの産生される脂肪酸の脂肪酸収率；（Ｅ）少なくとも約３０ｇ／Ｌ・日の２４時間ピーク脂肪酸生産性；（Ｆ）全脂肪酸含量基準のパーセントで少なくとも約５０％の抽出効率；及び／又は（Ｇ）消費される酸素基準で１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数として約０．４より多い酸素あたりの脂肪酸の収率；を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約５．１の脂肪酸効率に関する総合指数１（ＯＩＬＥ１）：
（ここで、ＯＩＬＥ１＝Ｃ・Ｄ・Ｆであり；
Ｃ＝脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；
Ｄ＝脂肪酸収率（消費される供給材料１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数）であり；
Ｆ＝全脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率である）
を有する、生物油を産生するための単離有機体。
【請求項２】
単離有機体が少なくとも約１１５ｇ／Lの細胞密度を有する、請求項１に記載の単離有機体。
【請求項３】
単離有機体が乾燥質量基準で少なくとも約４９％の脂肪酸含量を有する、請求項１〜２のいずれかに記載の単離有機体。
【請求項４】
単離有機体が少なくとも約３０ｇ／Ｌ・日の２４時間ピーク脂肪酸生産性を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の単離有機体。
【請求項５】
単離有機体における酸素あたりの脂肪酸の収率が、消費される酸素１ｇあたり約０．４ｇより多い請求項１〜４のいずれかに記載の単離有機体。
【請求項６】
単離有機体が、Pseudozyma aphidis、Pseudozyma rugulosa、Pseudozyma sp.、Rhodosporidium fluviale、Rhodosporidium paludigenum、Rhodotorula glutinis、Rhodotorula hordea、Rhodotorula ingenosa、Sporobolomyces ruberrimus、Tremella sp.、Ustilago sp.、Rhodosporidium toruloides、Sporidiobolus pararoseus、Leucosporidium scottii、Pseudozyma antarctica、Rhodosporidium sphaerocarpum、Rhodotorula muscorum、Cryptococcus laurentii、Candida tropicalis、Rhodosporidium diobovatum、Chlorella protothecoides、又はこれらの組合せを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の単離有機体。
【請求項７】
有機体がＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−１１６１５及びそれから誘導される変異株の識別特徴を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の単離有機体。
【請求項８】
有機体がＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−１１６１６及びそれから誘導される変異株の識別特徴を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の単離有機体。
【請求項９】
有機体がＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−１１６１７及びそれから誘導される変異株の識別特徴を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の単離有機体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の単離有機体から産生される脂肪酸を含むか又はそれから製造される生物油又はバイオ燃料。
【請求項１１】
脂肪酸を含む有機体を生成させ；そして
有機体から脂肪酸を取り出して生物油を形成する；
ことを含み、
有機体は、それぞれの基準値が
少なくとも約１１５ｇ／Ｌの細胞密度；
乾燥質量基準で少なくとも約４９％の脂肪酸含量；
少なくとも約１５ｇ／Ｌ・日の脂肪酸生産性；
消費される供給材料１ｇあたり、少なくとも約０．１７５ｇの産生される脂肪酸の脂肪酸収率；
少なくとも約３０ｇ／Ｌ・日の２４時間ピーク脂肪酸生産性；
消費される酸素１ｇあたり、約０．４ｇより多い酸素あたりの脂肪酸の収率；
を含む少なくとも２つの基準値を満足するか又はこれを超える、生物油の製造方法。
【請求項１２】
有機体が少なくとも更に３つの基準値を満足するか又はこれを超える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
有機体が、Rhodosporidium、Pseudozyma、Tremella、Rhodotorula、Sporidiobolus、Sporobolomyces、Ustilago、Cryptococcus、Leucosporidium、Candida属の有機体、又はこれらの組合せを含む、請求項１１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
有機体が、Schizochytrium、Thraustochytrium、Ulkenia、Chlorella、Prototheca属の有機体、又はこれらの組合せを含む、請求項１１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１種類の有機酸を含む供給材料を更に含む、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法によって産生される脂肪酸を含むか又はこれから製造される生物油又はバイオ燃料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
３５ＵＳＣ§１０３（ｃ）（２）の目的のために、BP Biofuels UK LimitedとMartek Biosciences Corporationの間で２００８年１２月１８日にバイオ燃料の分野における共同研究契約が締結された。また、３５ＵＳＣ§１０３（ｃ）（２）の目的のために、BP Biofuels UK LimitedとMartek Biosciences Corporationの間で２００９年８月７日にバイオ燃料の分野における共同開発契約が締結された。
【０００２】
本出願は、２０１０年３月１１日出願の米国仮特許出願６１／３１３，０５５の利益を主張する。米国仮出願６１／３１３，０５５の全ての開示事項はその全部を参照として本明細書中に包含する。
【０００３】
本発明は、圧縮エンジンにおいて用いるのに好適な方法、生物油、バイオ燃料、ユニット、及び／又は有機体に関する。
【背景技術】
【０００４】
温室効果ガスのレベル及び気候変動の問題のために、固定炭素と遊離二酸化炭素との間の自然のサイクルを利用しようとする技術の開発が行われている。これらの技術の進歩として、供給材料をバイオ燃料に転化する種々の技術が開発されている。しかしながら、上記の技術の進歩があっても、再生可能な炭素源を燃料に転化する経済的実行可能性を向上する必要性及び要望が未だ存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、圧縮エンジンにおいて用いるのに好適な方法、生物油、バイオ燃料、ユニット、及び／又は有機体に関する。本発明方法は、再生可能な炭素源の燃料への経済的な転化を与える。特に、本発明は、サトウキビの粗抽出物のような炭素源を含む糖を、有機体による生物油の産生によってバイオディーゼルに転化させることを含む。
【０００６】
幾つかの態様によれば、本発明は脂肪酸を含む生物油の製造方法に関する。この方法は、脂肪酸を含む有機体を生成及び／又は成長させることを含む。生成及び／又は成長は、同時及び／又は逐次的に行うことができる。有機体は少なくとも２つの基準値を満足するか又はこれを超える。この基準値は、（Ａ）少なくとも約１１５ｇ／Ｌの細胞密度；（Ｂ）乾燥質量基準で少なくとも約４９％の脂肪酸含量；（Ｃ）少なくとも約１５ｇ／Ｌ・日の脂肪酸生産性；（Ｄ）消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．１７５ｇの産生される脂肪酸の脂肪酸収率；（Ｅ）少なくとも約３０ｇ／Ｌ・日の２４時間ピーク脂肪酸生産性；（Ｆ）全脂肪酸含量基準のパーセントで少なくとも約５０％の抽出効率；及び／又は（Ｇ）消費される酸素１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数として表して少なくとも約０．４の酸素あたりの脂肪酸の収率；を含む。
【０００７】
幾つかの態様によれば、本発明は脂肪酸を含む生物油の製造方法に関する。この方法は、脂肪酸を含む有機体を生成及び／又は成長させることを含む。生成及び／又は成長は、同時及び／又は逐次的に行うことができる。有機体は少なくとも２つの基準値を満足するか又はこれを超える。この基準値は、少なくとも約１１５ｇ／Ｌの細胞密度；乾燥質量基準で少なくとも約４９％の脂肪酸含量；少なくとも約１５ｇ／Ｌ・日の脂肪酸生産性；消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．１７５ｇの産生される脂肪酸の脂肪酸収率；少なくとも約３０ｇ／Ｌ・日の２４時間ピーク脂肪酸生産性；及び／又は消費される酸素１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数として表して少なくとも約０．４の酸素あたりの脂肪酸の収率；を含む。
【０００８】
幾つかの態様によれば、有機体は少なくとも３つの基準値を満足するか又はこれを超える。
幾つかの態様によれば、有機体は少なくとも４つの基準値を満足するか又はこれを超える。
【０００９】
幾つかの態様によれば、有機体は少なくとも５つの基準値を満足するか又はこれを超える。
幾つかの態様によれば、有機体は、スクロース、グルコース、フルクトース、キシロース、グリセロール、マンノース、アラビノース、ラクトース、ガラクトース、マルトース、又はこれらの組合せを含む供給材料を消費する。
【００１０】
幾つかの態様によれば、供給材料はリグノセルロース誘導材料を含む。
幾つかの態様によれば、有機体は、Rhodosporidium、Pseudozyma、Tremella、Rhodotorula、Sporidiobolus、Sporobolomyces、Ustilago、Cryptococcus、Leucosporidium、Candida属の有機体、又はこれらの組合せを含む。
【００１１】
幾つかの態様によれば、有機体は、Schizochytrium、Thraustochytrium、Ulkenia、Chlorella、Prototheca属の有機体、又はこれらの組合せを含む。
幾つかの態様によれば、有機体は、Pseudozyma aphidis、Pseudozyma rugulosa、Pseudozyma sp.、Rhodosporidium fluviale、Rhodosporidium paludigenum、Rhodotorula glutinis、Rhodotorula hordea、Sporobolomyces ruberrimus、Tremella sp.、Ustilago sp.、Rhodosporidium toruloides、Rhodotorula ingenosa、Sporidiobolus pararoseus、Leucosporidium scottii、Pseudozyma antarctica、Rhodosporidium sphaerocarpum、Rhodotorula muscorum、Cryptococcus laurentii、Candida tropicalis、Rhodosporidium diobovatum、Chlorella protothecoides、又はこれらの組合せを含む。
【００１２】
幾つかの態様によれば、脂肪酸は、質量基準で約１％未満の４以上の二重結合を有する脂肪酸を含む。
幾つかの態様によれば、脂肪酸は、質量基準で約３５％未満の飽和脂肪酸を含む。
【００１３】
幾つかの態様によれば、脂肪酸はナタネに少なくとも実質的に類似するプロファイルを含む。
幾つかの態様によれば、消費及び産生は少なくとも約２０℃の温度で行う。
【００１４】
幾つかの態様によれば、この方法は、有機体から脂肪酸を抽出することを更に含み、抽出は全脂肪酸含量基準の重量％で少なくとも約８５％の効率を有する。
幾つかの態様によれば、抽出は、エタノール、ヘキサン、アルコール、又はこれらの組合せによる溶媒抽出を含む。
【００１５】
幾つかの態様によれば、脂肪酸生産性は少なくとも約３０ｇ／Ｌ・日を満足するか又はこれを超え、脂肪酸収率は消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．１７５ｇの産生される脂肪酸を満足するか又はこれを超える。
【００１６】
幾つかの態様によれば、２４時間ピーク脂肪酸生産性は、少なくとも約５０ｇ／Ｌ・日を満足するか又はこれを超える。
幾つかの態様によれば、６時間ピーク脂肪酸生産性は、少なくとも約７０ｇ／Ｌ・日を満足するか又はこれを超える。
【００１７】
幾つかの態様によれば、消費及び産生は窒素制限下で行う。
幾つかの態様によれば、供給材料は少なくとも１種類の有機酸を含む。
幾つかの態様によれば、消費及び産生は約８以下のｐＨにおいて行う。
【００１８】
幾つかの態様によれば、この方法は、エステル化、水素化、又はこれらの組合せによって脂肪酸をバイオ燃料に転化させることを更に含む。
幾つかの態様によれば、本発明は、本明細書内に開示されている任意の方法、ユニット、及び／又は有機体によって産生される脂肪酸を含む生物油に関する。
【００１９】
幾つかの態様によれば、本発明は、本明細書内に開示されている任意の生物油から製造されるバイオ燃料に関する。
幾つかの態様によれば、本発明は圧縮エンジンにおいて用いるのに好適なバイオ燃料に関する。このバイオ燃料は、全脂肪酸基準の重量％で約５０％〜約７０％のオレイン酸、及び／又は全脂肪酸基準の重量％で約１５％〜約３５％のリノレン酸を有する脂肪酸メチルエステルプロファイルを含み、バイオ燃料は微生物から産生される。
【００２０】
幾つかの態様によれば、脂肪酸メチルエステルプロファイルは、ストラメノパイル界、菌界、又はこれらの組合せからの有機体によって産生される脂質から誘導される。
幾つかの態様によれば、本発明は生物油を製造するためのユニットに関する。このユニットは、供給流、供給流に接続されている容器、容器内に配置されている有機体、及び容器に接続されている脂肪酸含有流を含む。有機体は少なくとも２つの基準値を満足するか及び／又はこれを超える。基準値は、（Ａ）少なくとも約１１５ｇ／Ｌの細胞密度；（Ｂ）乾燥質量基準で少なくとも約４９％の脂肪酸含量（細胞内及び／又は細胞外）；（Ｃ）少なくとも約１５ｇ／Ｌ・日の脂肪酸生産性；（Ｄ）消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．１７５ｇの産生される脂肪酸の脂肪酸収率；（Ｅ）少なくとも約３０ｇ／Ｌ・日の２４時間ピーク脂肪酸生産性；（Ｆ）全脂肪酸含量基準のパーセントで少なくとも約５０％の抽出効率；及び／又は（Ｇ）消費される酸素１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数として表して少なくとも約０．４の酸素あたりの脂肪酸の収率；を含む。
【００２１】
幾つかの態様によれば、本発明は生物油を製造するためのユニットに関する。このユニットは、供給流、供給流に接続されている容器、容器内に配置されている有機体、及び容器に接続されている脂肪酸含有流を含む。有機体は少なくとも２つの基準値を満足するか及び／又はこれを超える。基準値は、少なくとも約１１５ｇ／Ｌの細胞密度；乾燥質量基準で少なくとも約４９％の脂肪酸含量（細胞内及び／又は細胞外）；少なくとも約１５ｇ／Ｌ・日の脂肪酸生産性；消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．１７５ｇの産生される脂肪酸の脂肪酸収率；少なくとも約３０ｇ／Ｌ・日の２４時間ピーク脂肪酸生産性；及び／又は消費される酸素１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数として表して少なくとも約０．４の酸素あたりの脂肪酸の収率；を含む。
【００２２】
幾つかの態様によれば、ユニット内の有機体は少なくとも３つの基準値を満足するか又はこれを超える。
幾つかの態様によれば、ユニット内の有機体は少なくとも４つの基準値を満足するか又はこれを超える。
【００２３】
幾つかの態様によれば、ユニット内の有機体は少なくとも５つの基準値を満足するか又はこれを超える。
幾つかの態様によれば、有機体は、ストラメノパイル界、菌界、又はこれらの組合せからの有機体を含む。
【００２４】
幾つかの態様によれば、容器は、バッチ式、連続式、又はこれらの組合せで運転する。
幾つかの態様によれば、本発明は生物油を製造するための単離有機体に関する。有機体は、少なくとも約２．９の脂肪酸効率に関する総合指数１（ＯＩＬＥ１）を有する。ＯＩＬＥ１は、ＯＩＬＥ１＝Ｃ・Ｄ・Ｆ（ここで、Ｃ＝脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；Ｄ＝脂肪酸収率（消費される供給材料１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数）であり；及び、Ｆ＝全脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率である）として定義されている。
【００２５】
幾つかの態様によれば、本発明は生物油を製造するための単離有機体に関する。有機体は、少なくとも約４，９５８の脂肪酸効率に関する総合指数（ＯＩＬＥ）を有する。ＯＩＬＥは、ＯＩＬＥ＝Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄ・Ｅ・Ｆ・Ｇ（ここで、Ａ＝細胞密度（ｇ／Ｌ）であり；Ｂ＝乾燥質量％基準の脂肪酸含量であり；Ｃ＝脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；Ｄ＝脂肪酸収率（消費される供給材料１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数）であり；Ｅ＝２４時間ピーク脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；Ｆ＝全脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率であり；及び、Ｇ＝消費される酸素基準で１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数として表される酸素あたりの脂肪酸の収率である）として定義されている。
【００２６】
幾つかの態様によれば、本発明は生物油を製造するための単離有機体に関する。有機体は、少なくとも約２３５の脂肪酸効率に関する総合指数２（ＯＩＬＥ２）を有する。ＯＩＬＥ２は、ＯＩＬＥ２＝Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄ・Ｆ（ここで、Ａ＝細胞密度（ｇ／Ｌ）であり；Ｂ＝乾燥質量％基準の脂肪酸含量であり；Ｃ＝脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；Ｄ＝脂肪酸収率（消費される供給材料１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数）であり；及び、Ｆ＝全脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率である）として定義されている。
【００２７】
幾つかの態様によれば、本発明は生物油を製造するための単離有機体に関する。有機体は、少なくとも約１４２の脂肪酸効率に関する総合指数４（ＯＩＬＥ４）を有する。ＯＩＬＥ４は、ＯＩＬＥ４＝Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄ・Ｆ・Ｇ（ここで、Ａ＝細胞密度（ｇ／Ｌ）であり；Ｂ＝乾燥質量％基準の脂肪酸含量であり；Ｃ＝脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；Ｄ＝脂肪酸収率（消費される供給材料１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数）であり；Ｆ＝全脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率であり；及び、Ｇ＝消費される酸素基準で１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数として表される酸素あたりの脂肪酸の収率である）として定義されている。
【００２８】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、天然有機体、遺伝子組換え有機体、又はこれらの組合せを含む。
幾つかの態様によれば、単離有機体は炭素供給材料を消費し、炭素供給材料は少なくとも約１０％の消費される全窒素を含む。
【００２９】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、主として糖単独と比べて糖及びグリセロール上で成長させた場合に約５０％超多い脂肪酸を産生する。
幾つかの態様によれば、本発明は生物油を製造するための単離有機体に関する。有機体は、少なくとも約４．４の脂肪酸効率に関する総合指数３（ＯＩＬＥ３）を有する。ＯＩＬＥ３は、ＯＩＬＥ３＝Ｄ・Ｅ・Ｆ（ここで、Ｄ＝脂肪酸収率（消費される供給材料１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数）であり；Ｅ＝２４時間ピーク脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；及び、Ｆ＝全脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率である）として定義されている。
【００３０】
幾つかの態様によれば、本発明は、少なくとも約２．９の脂肪酸効率に関する総合指数１（ＯＩＬＥ１）を有する有機体を同定し、その有機体を単離することを含む、生物油を製造するための有機体を単離する方法に関する。ＯＩＬＥ１は、ＯＩＬＥ１＝Ｃ・Ｄ・Ｆ（ここで、Ｃ＝脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；Ｄ＝脂肪酸収率（消費される供給材料１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数）であり；及び、Ｆ＝全脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率である）として定義されている。
【００３１】
幾つかの態様によれば、本発明は、少なくとも約４，９５８の脂肪酸効率に関する総合指数（ＯＩＬＥ）を有する有機体を同定し、その有機体を単離することを含む、生物油を製造するための有機体を単離する方法に関する。ＯＩＬＥは、ＯＩＬＥ＝Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄ・Ｅ・Ｆ・Ｇ（ここで、Ａ＝細胞密度（ｇ／Ｌ）であり；Ｂ＝乾燥質量％基準の脂肪酸含量であり；Ｃ＝脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；Ｄ＝脂肪酸収率（消費される供給材料１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数）であり；Ｅ＝２４時間ピーク脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；Ｆ＝全脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率であり；及び、Ｇ＝消費される酸素基準で１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数として表される酸素あたりの脂肪酸の収率である）として定義されている。
【００３２】
幾つかの態様によれば、本発明は、少なくとも約２３５の脂肪酸効率に関する総合指数２（ＯＩＬＥ２）を有する有機体を同定し、その有機体を単離することを含む、生物油を製造するための有機体を単離する方法に関する。ＯＩＬＥ２は、ＯＩＬＥ２＝Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄ・Ｆ（ここで、Ａ＝細胞密度（ｇ／Ｌ）であり；Ｂ＝乾燥質量％基準の脂肪酸含量であり；Ｃ＝脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；Ｄ＝脂肪酸収率（消費される供給材料１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数）であり；及び、Ｆ＝全脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率である）として定義されている。
【００３３】
幾つかの態様によれば、本発明は、少なくとも約１４２の脂肪酸効率に関する総合指数４（ＯＩＬＥ４）を有する有機体を同定し、その有機体を単離することを含む、生物油を製造するための有機体を単離する方法に関する。ＯＩＬＥ４は、ＯＩＬＥ４＝Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄ・Ｆ・Ｇ（ここで、Ａ＝細胞密度（ｇ／Ｌ）であり；Ｂ＝乾燥質量％基準の脂肪酸含量であり；Ｃ＝脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；Ｄ＝脂肪酸収率（消費される供給材料１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数）であり；Ｆ＝全脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率であり；及び、Ｇ＝消費される酸素基準で１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数として表される酸素あたりの脂肪酸の収率である）として定義されている。
【００３４】
幾つかの態様によれば、同定される有機体は、天然有機体、遺伝子組換え有機体、又はこれらの組合せを含む。
幾つかの態様によれば、同定される有機体は炭素供給材料を消費し、炭素供給材料は少なくとも約１０％の消費される全窒素を含む。
【００３５】
幾つかの態様によれば、同定される有機体は、主として糖単独と比べて糖及びグリセロール上で成長させた場合に約５０％超多い脂肪酸を産生する。
幾つかの態様によれば、本発明は、少なくとも約４．４の脂肪酸効率に関する総合指数３（ＯＩＬＥ３）を有する有機体を同定し、その有機体を単離することを含む、生物油を製造するための有機体を単離する方法に関する。ＯＩＬＥ３は、ＯＩＬＥ３＝Ｄ・Ｅ・Ｆ（ここで、Ｄ＝脂肪酸収率（消費される供給材料１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数）であり；Ｅ＝２４時間ピーク脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；及び、Ｆ＝全脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率である）として定義されている。
【００３６】
幾つかの態様によれば、本発明は、少なくとも約５．１の脂肪酸効率に関する総合指数１（ＯＩＬＥ１）を有する、生物油を製造するための単離有機体に関する。ＯＩＬＥ１は、ＯＩＬＥ１＝Ｃ・Ｄ・Ｆ（ここで、Ｃ＝脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；Ｄ＝脂肪酸収率（消費される供給材料１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数）であり；及び、Ｆ＝全脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率である）として定義されている。
【００３７】
幾つかの態様によれば、単離有機体は少なくとも約１１５ｇ／Ｌの細胞密度を有する。
幾つかの態様によれば、単離有機体は乾燥質量基準で少なくとも約４９％の脂肪酸含量を有する。
【００３８】
幾つかの態様によれば、単離有機体は少なくとも約３０ｇ／Ｌ・日の２４時間ピーク脂肪酸生産性を有する。
幾つかの態様によれば、単離有機体は消費される酸素１ｇあたり約０．４ｇより多い産生される脂肪酸の、酸素あたりの脂肪酸の収率を有する。
【００３９】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、菌類、藻類、及び／又はこれらの組合せである。
幾つかの態様によれば、単離有機体は、Rhodosporidium、Pseudozyma、Tremella、Rhodotorula、Sporidiobolus、Sporobolomyces、Ustilago、Cryptococcus、Leucosporidium、Candida属の有機体、又はこれらの組合せを含む。
【００４０】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、Schizochytrium、Thraustochytrium、Ulkenia、Chlorella、Prototheca属の有機体、又はこれらの組合せを含む。
幾つかの態様によれば、単離有機体は、Pseudozyma aphidis、Pseudozyma rugulosa、Pseudozyma sp.、Rhodosporidium fluviale、Rhodosporidium paludigenum、Rhodotorula glutinis、Rhodotorula hordea、Rhodotorula ingenosa、Sporobolomyces ruberrimus、Tremella sp.、Ustilago sp.、Rhodosporidium toruloides、Sporidiobolus pararoseus、Leucosporidium scottii、Pseudozyma antarctica、Rhodosporidium sphaerocarpum、Rhodotorula muscorum、Cryptococcus laurentii、Candida tropicalis、Rhodosporidium diobovatum、Chlorella protothecoides、又はこれらの組合せを含む。
【００４１】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、Pseudozyma aphidis、Pseudozyma rugulosa、Rhodotorula ingenosa、Sporidiobolus pararoseus、又はこれらの組合せを含む。
幾つかの態様によれば、単離有機体はPseudozyma aphidisを含む。
【００４２】
幾つかの態様によれば、単離有機体はPseudozyma rugulosaを含む。
幾つかの態様によれば、単離有機体はRhodotorula ingenosaを含む。
幾つかの態様によれば、単離有機体はSporidiobolus pararoseusを含む。
【００４３】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−１１６１５及びそれから誘導される変異株の識別特徴を有する。
幾つかの態様によれば、単離有機体は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−１１６１５の識別特徴を有する。
【００４４】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−１１６１５及びそれから誘導される誘導体、変異体、及び／又は変異株の識別特徴を有する。
幾つかの態様によれば、単離有機体は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−１１６１６及びそれから誘導される変異株の識別特徴を有する。
【００４５】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−１１６１６の識別特徴を有する。
幾つかの態様によれば、単離有機体は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−１１６１６及びそれから誘導される誘導体、変異体、及び／又は変異株の識別特徴を有する。
【００４６】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−１１６１７及びそれから誘導される変異株の識別特徴を有する。
幾つかの態様によれば、単離有機体は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−１１６１７の識別特徴を有する。
【００４７】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−１１６１５及びそれから誘導される誘導体、変異体、及び／又は変異株の識別特徴を有する。
幾つかの態様によれば、単離有機体は、少なくとも約４，９５８の脂肪酸効率に関する総合指数（ＯＩＬＥ）を有する。ここでＯＩＬＥは、ＯＩＬＥ＝Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄ・Ｅ・Ｆ・Ｇ（ここで、Ａ＝細胞密度（ｇ／Ｌ）であり；Ｂ＝乾燥質量％基準の脂肪酸含量であり；Ｃ＝脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；Ｄ＝脂肪酸収率（消費される供給材料１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数）であり；Ｅ＝２４時間ピーク脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；Ｆ＝全脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率であり；及び、Ｇ＝消費される酸素基準で１ｇあたりの全脂肪酸のグラム数の酸素あたりの脂肪酸の収率である）として定義されている。
【００４８】
幾つかの態様によれば、本発明は、本明細書において開示する単離有機体から産生される脂肪酸を含む生物油を包含する。
幾つかの態様によれば、本発明は、本明細書内に開示されている生物油から製造されるバイオ燃料を包含する。
【００４９】
幾つかの態様によれば、本発明は、脂肪酸を含む有機体を産生し、有機体から脂肪酸を取り出して生物油を形成することによって生物油を製造する方法を包含する。ここで、有機体は少なくとも２つの基準値を満足するか又はこれを超える。この基準値は、少なくとも約１１５ｇ／Ｌの細胞密度；乾燥質量基準で少なくとも約４９％の脂肪酸含量；少なくとも約１５ｇ／Ｌ・日の脂肪酸生産性；消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．１７５ｇの産生される脂肪酸の脂肪酸収率；少なくとも約３０ｇ／Ｌ・日の２４時間ピーク脂肪酸生産性；及び／又は消費される酸素１ｇあたり約０．４ｇより多い産生される脂肪酸の、酸素あたりの脂肪酸の収率；を含む。
【００５０】
幾つかの態様によれば、この方法の有機体は少なくとも更に１つの基準値を満足するか又はこれを超える。
幾つかの態様によれば、この方法の有機体は少なくとも更に２つの基準値を満足するか又はこれを超える。
【００５１】
幾つかの態様によれば、この方法の有機体は少なくとも更に３つの基準値を満足するか又はこれを超える。
幾つかの態様によれば、この方法の有機体は、Rhodosporidium、Pseudozyma、Tremella、Rhodotorula、Sporidiobolus、Sporobolomyces、Ustilago、Cryptococcus、Leucosporidium、Candida属の有機体、又はこれらの組合せを含む。
【００５２】
幾つかの態様によれば、この方法の有機体は、Schizochytrium、Thraustochytrium、Ulkenia、Chlorella、Prototheca属の有機体、又はこれらの組合せを含む。
幾つかの態様によれば、有機体は、Pseudozyma aphidis、Pseudozyma rugulosa、Pseudozyma sp.、Rhodosporidium fluviale、Rhodosporidium paludigenum、Rhodotorula glutinis、Rhodotorula hordea、Rhodotorula ingenosa、Sporobolomyces ruberrimus、Tremella sp.、Ustilago sp.、Rhodosporidium toruloides、Sporidiobolus pararoseus、Leucosporidium scottii、Pseudozyma antarctica、Rhodosporidium sphaerocarpum、Rhodotorula muscorum、Cryptococcus laurentii、Candida tropicalis、Rhodosporidium diobovatum、Chlorella protothecoides、又はこれらの組合せを含む。
【００５３】
幾つかの態様によれば、この方法の脂肪酸は、質量基準で約１％未満の４以上の二重結合を有する脂肪酸を含む。
幾つかの態様によれば、この方法の脂肪酸は、質量基準で約３５％未満の飽和脂肪酸を含む。
【００５４】
幾つかの態様によれば、６時間ピーク脂肪酸生産性は、少なくとも約７０ｇ／Ｌ・日を満足するか又はこれを超える。
幾つかの態様によれば、この方法は少なくとも１種類の有機酸を含む供給材料を消費することを含む。
【００５５】
一態様によれば、本明細書において開示されている任意の方法によって産生される脂肪酸を含む生物油。
一態様によれば、本発明は、本明細書において開示されている任意の生物油から製造されるバイオ燃料を包含する。
【００５６】
一態様によれば、本発明は圧縮エンジンにおいて用いるのに好適なバイオ燃料を包含する。バイオ燃料は、全脂肪酸基準の重量％で約５０％〜約７０％のオレイン酸、全脂肪酸基準の重量％で約１５％〜約３５％のリノール酸、及び全脂肪酸基準の重量％で約１０％未満のパルミチン酸の脂肪酸メチルエステルプロファイルを有する。ここで、バイオ燃料は油性微生物から産生される。
【００５７】
一態様によれば、脂肪酸メチルエステルプロファイルは、ストラメノパイル界、菌界、又はこれらの組合せからの有機体によって産生される脂質から誘導される。
幾つかの態様によれば、本発明は本明細書内に開示されている任意の生物油から製造されるバイオ燃料で運転されるエンジンに関する。
【００５８】
本明細書内に包含されその一部を構成する添付の図面は、本発明の幾つかの態様を示し、明細書と一緒に、本発明の幾つかの特徴、有利性、及び原理を説明するように働く。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、幾つかの態様によるユニットを図示する。
【図２】図２は、幾つかの態様による２段階ユニットを図示する。
【図３】図３は、幾つかの態様による抽出を伴うユニットを図示する。
【図４】図４は、幾つかの態様による発酵槽を図示する。
【図５】図５は、幾つかの態様による時間ｖｓバイオマスのグラフを示す。
【図６】図６は、幾つかの態様による時間ｖｓ脂肪のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明は、圧縮エンジンにおいて用いるのに好適な方法、生物油、バイオ燃料、ユニット、及び／又は単離有機体に関する。幾つかの態様によれば、本発明には、１種類又は複数の生物油の改良された製造を含ませることができる。本発明にはまた、微生物脂質の製造、及びこれらの脂質内に含まれる微生物脂肪酸を用いるバイオディーゼルの製造も含ませることができる。
【００６１】
幾つかの態様によれば、本発明は、バイオディーゼルの製造及び／又は栄養用途のために好適な微生物油を非常に低コストで製造するための技術を開発することを包含する。微生物油に関するより低い製造コストは、微生物油の製造の問題点への全体的アプローチを用いて得ることができる。主としてこの問題の１つ又は２つの様相のみに焦点を当てた努力では、微生物油の技術開発の非常に早い段階で取り扱うべき主要な障害を見出すことはできないかもしれない。
【００６２】
本発明には、微生物油における専門知識、燃料における理解などを用いる目標の製造プロセス及び／又はモデルを含ませることができる。目標の製造プロセスによって、非常に低いコストの微生物油を製造する過程で克服すべき主要な障害を特定することができる。この情報を多変量のアプローチ及び／又は分析において用いて、菌株の単離、菌株の成長、発酵装置のデザイン、発酵運転モード、発酵方法などをはじめとする技術の主要構成要素の開発を導くことができる。
【００６３】
幾つかの態様によれば、統合アプローチによって、微生物油を製造するための複合低コスト炭素基質を用いる方法及び／又はプロセスが得られる。有機体の菌株を単離及び／又は成長させて、目標の製造条件下において目標の基質上で成長させながら、所望の脂肪酸プロファイルを有する大量の油を製造した。目標の製造条件は、高い温度、低い塩化物レベルなどを含んでいた。有機体の菌株は、目標の低コスト発酵装置を用いて成長させることができ、低コスト抽出技術を用いて有機体の菌株から油を取り出す。
【００６４】
統合アプローチによって、複数のパラメーター：（１）より高いレベルの細胞濃度；（２）より高い脂肪酸含量；（３）消費される単位糖あたりのより良好な脂肪酸収率；（４）より高い脂肪酸生産性；及び／又は（５）従来達成されるよりも低い、産生される脂肪酸の量あたりの酸素必要量；を同時に達成することができる。この５つの主要パラメーター及び／又は変量によって、バイオディーゼルの製造において用いるのに好適な微生物油のような非常に低コストの微生物油を製造することができる。経済的に存立できるバイオディーゼルは、望ましくは、政府の委託及び／又は補助金を用いるか及び／又は用いないで、コストについて石油ベースのディーゼルと競争することができる。バイオディーゼルはまた、セタン価、冷間流動特性、曇り点、煤の形成、微粒子、イオウ含量、窒素酸化物の発生などのような性能基準について、石油ベースのディーゼルと競争することができるか、及び／又はこれを超えることができる。
【００６５】
統合アプローチによって、ナタネ様のプロファイルのような独特の脂肪酸プロファイルを有する微生物脂質を産生することができる。５つのパラメーターを満足することは、目標の性質を有して単離される新規な菌株を利用し、主要な発酵パラメーターを確認し、脂肪酸の産生を向上させる条件又はプロセスを求め、低コストの基質又は源から炭素及び他の栄養素を効率的に利用することなどによって行うことができる。統合アプローチにおいては、バイオディーゼルの経済的製造に含まれるような微生物油を非常に低コストで製造するために従来改善されていなかった主要な問題点に取り組む。
【００６６】
統合アプローチの例は、以下の事項：（１）良好な油産生タイプの微生物であることが従来知られておらず、スクロース及びキシロースのような目標の基質上で油を産生することができる酵母の属及び菌株を同定すること；（２）油産生酵母、並びにスクロース又はキシロースを炭素源として利用することに伴う問題点を確認及び解決すること；（３）発酵温度を上昇させ、ｐＨを低下させ、及び窒素レベルを減少させることによってスクロースあたりの脂肪酸収率を大きく向上させる可能性；を包含することができるが、これらに限定されない。
【００６７】
例えば、窒素制限条件下（油の産生に好都合）においては、酵母はスクロース（グルコース＋フルクトース）のフルクトース部分の利用を減少及び／又は停止することができる。驚くべきことに且つ予期しなかったことに、発酵培地にグリセロールを加えると、酵母はスクロースのような炭素源からのフルクトースを利用し始めることができる。同様に、発酵温度を上昇させ、ｐＨを低下させ、及び窒素レベルを減少させると、油の産生を増加させながら製造コストを好ましく低下させることができる。他の態様においては、少なくとも１０％の全窒素、少なくとも約２０％の全窒素、少なくとも約４０％の全窒素、及び／又は少なくとも約５０％の全窒素を、油の産生中に炭素源供給材料の一部として発酵に供給することができる。
【００６８】
図１は、幾つかの態様によるユニット１１０を図示する。図において、同一か又は機能的に同様の構成要素を示すために同様の参照番号を用いる。それぞれの参照番号の最も左の桁は、参照番号が最初に現れる図に対応する。ユニット１１０は、容器１１２、並びに、容器１１２に接続されている供給材料流１１４、及び容器１１２に接続されている脂質（脂肪酸）流１１６を含む。供給材料流１１４は容器１１２に供給材料を供給し、ここで供給材料は下記の供給材料の定義に含まれる任意の材料及び／又は物質であってよい。容器１１２内に存在する脂質を、脂質流１１６を通して容器１１２から排出し、ここで脂質は下記の脂質の定義に含まれる任意の物質であってよい。容器１１２は容器１１２内に配置されている有機体１８を含むか又は含有し、ここで有機体１１８は下記の有機体の定義に含まれる任意の物質であってよい。容器１１２は、発酵ブロスのような培地１２０を含むか又は含有する。有機体１１８は培地１２０中に存在させることができる。
【００６９】
図２は、幾つかの態様による２段階ユニット２１０を図示する。２段階ユニット２１０は、容器２１２、並びに、容器２１２に接続されている供給材料流２１４、及び容器２１２に接続されている脂質（脂肪酸）流２１６を含む。供給材料流２１４は容器２１２に供給材料を供給し、ここで供給材料は下記の供給材料の定義に含まれる任意の材料及び／又は物質であってよい。容器２１２内に存在する脂質を、脂質流２１６を通して容器２１２から排出し、ここで脂質は下記の脂質の定義に含まれる任意の物質であってよい。容器２１２は容器２１２内に配置されている有機体２１８を含むか又は含有し、ここで有機体２１８は下記の有機体の定義に含まれる任意の物質であってよい。容器２１２は発酵ブロスのような培地２２０を含むか又は含有する。有機体２１８は培地２２０中に存在させることができる。２段階ユニット２１０は、成長容器２２２、並びに、成長供給材料流２２５、及び成長容器２２２を容器２１２に接続する有機体流２２４を含む。成長供給材料流２２５は成長容器２２２に成長供給材料を供給し、ここで成長供給材料は供給材料流２１４内に存在するものと同じ供給材料であってよい。有機体流２２４は、成長容器２２２から容器２１２へ有機体２１８を供給する。
【００７０】
図３は、幾つかの態様による抽出を伴うユニット３１０を図示する。ユニット３１０は、容器３１２、並びに、容器３１２に接続されている供給材料流３１４、及び容器３１２に接続されている脂質（脂肪酸）流３１６を含む。供給材料流３１４は容器３１２に供給材料を供給し、ここで供給材料は下記の供給材料の定義に含まれる任意の材料及び／又は物質であってよい。容器３１２内に存在する脂質を、脂質流３１６を通して容器３１２から排出し、ここで脂質は下記の脂質の定義に含まれる任意の物質であってよい。容器３１２は容器３１２内に配置されている有機体３１８を含むか又は含有し、ここで有機体２１８は下記の有機体の定義に含まれる任意の物質であってよい。容器３１２は発酵ブロスのような培地３２０を含むか又は含有する。有機体３１８は培地３２０中に存在させることができる。ユニット３１０は抽出装置３２６を含む。脂質流３１６を、容器３１２から抽出装置３２６に供給する。抽出装置３２６は、脂質流３１６中に存在する脂質を脂質流３１６の内容物の残りから取り出して、脂質生成物流３２８を抽出装置３２６から排出する。また、脱脂バイオマス流３３０も抽出装置３２６から排出される。
【００７１】
図４は、幾つかの態様による発酵槽４３２を図示する。発酵槽４３２は、例えば空気及び／又は他の気体をプロセス中に導入するための噴霧器４３４を含む。発酵槽４３２は、例えば発酵槽４３２の内容物を撹拌するための撹拌器４３６を含む。幾つかの態様においては、容器１１２、容器２１２、又は容器３１２は、発酵槽４３２と同様の発酵槽であってよい。
【００７２】
幾つかの態様によれば、本発明には生物油の製造方法を含ませることができる。この方法には、有機体を生成又は成長させることを含ませることができる。この方法には、少なくとも２つの基準値を満足するか又はこれを超えることを含ませることができる。有機体は、脂肪酸を含む脂質及び／又は脂肪酸を含む一定量の複数種の脂質内に含ませるか又はこの中に有することができる。別の形態においては、有機体は生物油を分泌及び／又は放出することができる。基準値は、
（Ａ）少なくとも約１１５ｇ／Ｌの細胞密度；
（Ｂ）乾燥質量基準で少なくとも約４９％の脂肪酸含量；
（Ｃ）少なくとも約１５ｇ／Ｌ・日の脂肪酸生産性；
（Ｄ）消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．１７５ｇの産生される脂肪酸の脂肪酸収率；
（Ｅ）少なくとも約３０ｇ／Ｌ・日の２４時間ピーク脂肪酸生産性；
（Ｆ）脂肪酸含量基準のパーセントで少なくとも約５０％の抽出効率；及び／又は
（Ｇ）消費される酸素１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数として表して少なくとも約０．４の酸素あたりの脂肪酸の収率；
を含むことができる。基準値の任意の好適な組合せ、例えばＡ及びＢ；Ａ及びＣ；Ａ及びＤ；Ａ及びＥ；Ａ及びＦ；Ａ及びＧ；Ｂ及びＣ；Ｂ及びＤ；Ｂ及びＥ；Ｂ及びＦ；Ｂ及びＧ；Ｃ及びＤ；Ｃ及びＥ；Ｃ及びＦ；Ｃ及びＧ；Ｄ及びＥ；Ｄ及びＦ；Ｄ及びＧ；Ｅ及びＦ；Ｅ及びＧ；Ｆ及びＧ；Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、及びＤ；Ａ、Ｂ、及びＥ；Ａ、Ｂ、及びＦ；Ａ、Ｂ、及びＧ；Ｂ、Ｃ、及びＤ；Ｂ、Ｃ、及びＥ；Ｂ、Ｃ、及びＦ；Ｂ、Ｃ、及びＧ；Ｃ、Ｄ、及びＥ；Ｃ、Ｄ、及びＦ；Ｃ、Ｄ、及びＧ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；Ｄ、Ｅ、及びＧ；Ｅ、Ｆ、及びＧ；Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ；Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＥ；Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＦ；Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＧ；Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ；Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＦ；Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＧ；Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦ；Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＧ；Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＦ；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＧ；Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦ；Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＧ；Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦ；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＧ；Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ；などが、所望の基準を満足することができる。
【００７３】
別の形態においては、この方法には供給材料を消費して有機体を生成することを含ませることができる。
生成すること及び生成とは、生成、形成、発生、成形、引き起こすこと、存在させること、製造、成長、合成などを指す。幾つかの態様によれば、生成には、発酵、細胞培養などが含まれる。生成には、新規か又は更なる有機体、及び既存の有機体の熟成を含ませることができる。
【００７４】
成長とは、例えば材料を生命有機体などの中に吸収させることなどによって寸法を増加させることを指す。
生物とは、生命系、生命過程、生命有機体などを指す。生物とは、古細菌、バクテリア、及び／又は真核細胞からの有機体を指すことができる。生物とはまた、生物有機体から誘導及び／又は変性した化合物及び／又は材料を指すこともできる。幾つかの態様によれば、少なくとも約１，０００年前に寿命が終わったもののような化石化及び／又は古代材料は生物から排除される。
【００７５】
油とは、少なくとも多少は疎水性及び／又は撥水性である炭化水素物質及び／又は材料を指す。油としては、鉱油、有機油、合成油、エッセンシャルオイルなどを挙げることができる。鉱油とは、化石燃料のような少なくとも部分的に地球及び／又は地下から得られる石油及び／又は関連する物質を指す。有機油とは、少なくとも部分的に植物、動物、他の有機体などから得られる材料及び／又は物質を指す。合成油とは、例えば潤滑油中で用いることができる少なくとも部分的に化学反応及び／又はプロセスから得られる材料及び／又は物質を指す。油は、非極性溶媒及び他の炭化水素中に少なくとも概して可溶であってよいが、水及び／又は水溶液中に少なくとも概して不溶であってよい。油は、全て質量基準で、非極性溶媒中に少なくとも約５０％可溶、非極性溶媒中に少なくとも約７５％可溶、非極性溶媒中に少なくとも約９０％可溶、非極性溶媒中に完全に可溶、非極性溶媒中に約５０％可溶〜非極性溶媒中に約１００％可溶などであってよい。
【００７６】
脂質とは、油、脂肪、ワックス、グリース、コレステロール、グリセリド、ステロイド、ホスファチド、セレブロシド、脂肪酸、脂肪酸に関連する化合物、誘導化合物、他の油状物質などを指す。脂質は、生体細胞中で産生することができ、比較的高い炭素含量、及び比較的高い水素含量、並びに比較的低い酸素含量を有することができる。脂質は、通常は、例えば質量基準で比較的高いエネルギー含量を有する。
【００７７】
生物油とは、少なくとも部分的に動物、植物、菌類、酵母、藻類、微細藻類、バクテリアなどのような生命有機体から得られる炭化水素材料及び／又は物質を指す。幾つかの態様によれば、生物油は、再生可能な材料及び／又はバイオ燃料として用いるか及び／又はこれらに転化させるのに好適である可能性がある。
【００７８】
再生な材料とは、少なくとも部分的に、自然の生態サイクル及び／又は供給源によって置き換えることができる源及び／又はプロセスから得られる物質及び／又は物を指す。再生可能な材料としては、化学物質、化学中間体、溶媒、モノマー、オリゴマー、ポリマー、バイオ燃料、バイオ燃料中間体、バイオガソリン、バイオガソリンブレンドストック、バイオディーゼル、グリーンディーゼル、再生可能ディーゼル、バイオディーゼルブレンドストック、バイオ蒸留物などを挙げることができる。幾つかの態様においては、再生可能な材料は、植物、藻類、バクテリア、菌類などのような生命有機体から得ることができる。
【００７９】
バイオ燃料とは、少なくとも部分的に再生可能な源から得られる燃料及び／又は燃焼源として用いるのに好適な成分及び／又は流れを指す。バイオ燃料は、例えば化石燃料と比べて、好適に製造することができ、及び／又は大気への正味の炭素放出を減少するか又は無くすことができる。幾つかの態様によれば、例えば地下から採鉱又は採掘された材料は、再生可能な源から除外される可能性がある。幾つかの態様においては、再生可能な源としては、単細胞有機体、多細胞有機体、植物、菌類、バクテリア、藻類、栽培作物、非栽培作物、木材などを挙げることができる。バイオ燃料は、例えば陸上車、船舶、航空機などにおいて用いるための輸送燃料として用いるのに好適である可能性がある。バイオ燃料は、発電において用いて、例えば蒸気を発生させ、好適な熱伝達媒体によってエネルギーを交換し、シンガスを生成させ、水素を生成させ、電気を発生させることなどを行うのに好適である可能性がある。
【００８０】
バイオディーゼルとは、直接用いるか、及び／又はディーゼルプール及び／又はセタン供給流中にブレンドするのに好適な再生可能な源から得られる成分又は流れを指す。好適なバイオディーゼル分子としては、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、脂質、脂肪アルコール、アルカン、ナフサ、蒸留範囲の材料、パラフィン系材料、芳香族材料、脂肪族化合物（直鎖、分岐、及び／又は環式）などを挙げることができる。バイオディーゼルは、自動車用ディーゼル内燃エンジン、トラック用ヘビーデューティーディーゼルエンジンなどのような圧縮点火エンジンにおいて用いることができる。別の形態においては、バイオディーゼルはまた、ガスタービン、ヒーター、ボイラーなどにおいて用いることもできる。幾つかの態様によれば、バイオディーゼル及び／又はバイオディーゼルブレンドは、Ｂ２０、Ｂ４０、Ｂ６０、Ｂ８０、Ｂ９９．９、Ｂ１００などのような工業的に認められている燃料の標準規格を満足するか又はこれに合致する。
【００８１】
バイオ蒸留物とは、直接用いるか、及び／又は航空機燃料（ジェット）、潤滑剤ベースストック、灯油燃料、燃料油などにブレンドするのに好適な成分又は流れを指す。バイオ蒸留物は再生可能な源から得ることができ、約１００℃〜約７００℃、約１５０℃〜約３５０℃などの範囲の沸点範囲のような任意の好適な沸点範囲を有する。
【００８２】
消費とは、消尽、利用、摂取、食尽、変換などを指す。幾つかの態様によれば、消費としては、細胞代謝（異化作用及び／又は同化作用）、細胞呼吸（好気性及び／又は嫌気性）、細胞再生、細胞成長、発酵、細胞培養などの間及び／又はその一部の間のプロセスを挙げることができる。
【００８３】
供給材料とは、例えば有機物、機械、プロセス、製造プラントなどに供給、供与、提供などするために用いる材料及び／又は物質を指す。供給材料としては、転化、合成などのために用いる原材料を挙げることができる。幾つかの態様によれば、供給材料としては、糖、ヘキソース、ペントース、単糖、二糖、三糖、ポリオール（糖アルコール）、有機酸、デンプン、炭水化物などのような、有機体によって消費するのに好適な任意の材料、化合物、物質などを挙げることができる。幾つかの態様によれば、供給材料としては、スクロース、グルコース、フルクトース、キシロース、グリセロール、マンノース、アラビノース、ラクトース、ガラクトース、マルトース、他の５炭素糖、他の６炭素糖、他の１２炭素糖、糖を含む植物エキス、他の粗糖などを挙げることができる。供給材料とは、供給材料中に存在する場合に上記に列記した１種類以上の有機化合物を指すことができる。
【００８４】
幾つかの態様によれば、本方法及び／又はプロセスには、栄養素、ビタミン、ミネラル、金属、水などのような有機体を支援及び／又は補助するための他の材料及び／又は物質を加えることを含ませることができる。消泡剤、凝集剤、乳化剤、解乳化剤、粘度向上剤、粘度低下剤、界面活性剤、塩、他の流体変性材料などのような他の添加剤の使用も、本発明の範囲内である。
【００８５】
有機とは、炭水化物、糖、ケトン、アルデヒド、アルコール、リグニン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、他の炭素含有物質などのような炭素含有化合物を指す。
幾つかの態様によれば、供給材料は、１以上の供給流を用いて発酵中に供給することができる。幾つかの態様においては、供給材料は、接種の前に容器に充填する培地中に存在させることができる。幾つかの態様においては、供給材料は、容器に充填する培地に加えて、１以上の供給流を通して加えることができる。
【００８６】
幾つかの態様によれば、供給材料としては、少なくとも部分的にバイオマス及び／又はリグノセルロース源から得られる材料のようなリグノセルロース誘導材料を挙げることができる。バイオマスとは、少なくとも部分的に植物及び／又はリグノセルロース源のような生命有機体及び／又は最近まで生きていた有機体から得られる植物性及び／又は動物性の材料及び／又は物質を指す。バイオマスとしては、栄養素、ビタミン、ミネラル、金属、水などのような有機体を支援及び／又は補助する他の材料及び／又は物質を挙げることができる。
【００８７】
リグノセルロースとは、少なくとも多少のセルロース、ヘミセルロース、リグニンなどを含むことを指す。リグノセルロースとは、植物材料及び／又は植物由来の材料を指すことができる。リグノセルロース材料としては、サトウキビ、サトウキビ滓、エネルギー用サトウキビ、エネルギー用サトウキビ滓、コメ、稲わら、トウモロコシ、トウモロコシわら、小麦、麦わら、メイズ、メイズわら、モロコシ、モロコシわら、サトウモロコシ、サトウモロコシわら、綿、綿くず、キャッサバ、サトウダイコン、サトウダイコンパルプ、大豆、ナタネ、ジャトロファ、スイッチグラス、ミスカンサス、他の芝類、木材、軟材、硬材、樹皮、木くず、おがくず、紙、紙くず、農業廃棄物、肥料、肥やし、下水、都市固形廃棄物、任意の他の好適なバイオマス材料などのような任意の好適な材料を挙げることができる。リグノセルロース材料は、酸加水分解、中性加水分解、塩基性加水分解、熱加水分解、接触加水分解、酵素加水分解、アンモニア繊維膨張、蒸気爆発などのような任意の好適なプロセス及び／又は方法によって予備処理及び／又は処理することができる。
【００８８】
細胞培養とは、好気的のように最終電子ドナーが酸素である炭水化物の代謝を指す。細胞培養プロセスは、バクテリア、菌類（酵母を含む）、藻類などのような任意の好適な有機体を用いることができる。好適な細胞培養プロセスには、天然有機体及び／又は遺伝子組換え有機体を含ませることができる。
【００８９】
発酵とは、細胞培養、並びに嫌気的のように最終電子ドナーが酸素でない炭水化物の代謝の両方を指す。発酵としては、炭水化物のような高エネルギー化合物の二酸化炭素及びアルコール、有機酸、脂質などへの酵素で制御された嫌気性分解を挙げることができる。別の形態においては、発酵とは、無機又は有機化合物の生物学的に制御された変換を指す。発酵プロセスは、バクテリア、菌類（酵母を含む）、藻類などのような任意の好適な有機体を用いることができる。好適な発酵プロセスには、天然有機体及び／又は遺伝子組換え有機体を含ませることができる。
【００９０】
生物学的プロセスとしては、任意の好適な生活系、及び／又は生活系及び／又はプロセスから得られる物を挙げることができる。生物学的プロセスとしては、発酵、細胞培養、好気呼吸、嫌気呼吸、異化反応、同化反応、生体内変化、糖化、液化、加水分解、解重合、重合などを挙げることができる。
【００９１】
有機体とは、それらの全体的な機能によってその関係及び／又は特性を概して決定することができる相互依存及び従属の元素の少なくとも比較的複雑な構造体を指す。有機体としては、機能が別であるが互いに依存する器官を有する生命活動を持続するように作られている個体を挙げることができる。有機体としては、例えば成長、再生などを行うことができる生命体を挙げることができる。
【００９２】
有機体としては、任意の好適な単一型（単）細胞体、複雑型（多）細胞体などを挙げることができる。有機体としては、藻類、菌類（酵母を含む）、バクテリアなどを挙げることができる。有機体としては、バクテリア又は原生動物のような微生物を挙げることができる。有機体としては、１種類以上の天然有機体、１種類以上の遺伝子組換え有機体、天然有機体と遺伝子組換え有機体との組み合わせなどを挙げることができる。複数の異なる有機体の組み合わせを用いる態様は本発明の範囲内である。任意の好適な組合せ又は有機体、例えば１種類以上の有機体、少なくとも約２種類の有機体、少なくとも約５種類の有機体、約２種類の有機体〜約２０種類の有機体などを用いることができる。
【００９３】
油性物とは、油を有するか、油を含有するか、及び／又は油、脂質、脂肪を産生するか、及び／又は他の油様の物質を指す。油性物としては、少なくとも約２０重量％の油、少なくとも約３０重量％の油、少なくとも約４０重量％の油、少なくとも約５０重量％の油、少なくとも約６０重量％の油、少なくとも約７０重量％の油、少なくとも約８０重量％の油などを産生する有機体を挙げることができる。
【００９４】
幾つかの態様によれば、有機体としては、例えばthraustochytrid及び／又は黄金色藻のようなストラメノパイル界の一員を挙げることができる。有機体は、Schizochytrium属、Thraustochytrium属、Ulkenia属などのものであってよい。
【００９５】
幾つかの態様によれば、有機体としては植物界の一員を挙げることができる。有機体は、Chlorella属、Prototheca属などのものであってよい。
別の形態においては、有機体は、例えば酵母のような菌界の単細胞の一員であってよい。有機体は、Rhodosporidium属、Leucosporidium属、Pseudozyma属、Tremella属、Rhodotorula属、Sporidiobolus属、Sporobolomyces属、Ustilago属、Cryptococcus属、Leucosporidium属、Candida属などのものであってよい。
【００９６】
幾つかの態様によれば、有機体としては、Pseudozyma aphidis、Pseudozyma rugulosa、Pseudozyma sp.、Rhodosporidium fluviale、Rhodosporidium paludigenum、Rhodotorula glutinis、Rhodotorula hordea、Rhodotorula ingenosa、Sporobolomyces ruberrimus、Tremella sp.、Ustilago sp.、ＣＢＳ６０１６などのRhodosporidium toruloides、ＣＢＳ８５８７などのRhodosporidium toruloides、Sporidiobolus pararoseus、Leucosporidium scottii、Pseudozyma antarctica、Rhodosporidium sphaerocarpum、Rhodotorula muscorum、Cryptococcus laurentii、Candida tropicalis、Rhodosporidium diobovatum、ＵＴＥＸ２５０などのChlorella protothecoidesなどを挙げることができる。
【００９７】
スクロースを用いる幾つかの態様によれば、有機体としては、Leucosporidium scottii、Pseudozyma Antarctica、Rhodosporidium sphaerocarpum、Rhodotorula muscorumなどを挙げることができる。キシロースを用いる幾つかの態様によれば、有機体としては、Leucosporidium scottii、Cryptococcus laurentii、Candida tropicalis、Rhodosporidium diobovatum、Rhodosporidium toruloides、Pseudozyma Antarctica、Sporidiobolus pararoseus、Rhodotorula muscorumなどを挙げることができる。
【００９８】
有機体は、嫌気的、好気的、光合成的、複栄養的などのような任意の好適な条件下で活動させ、機能させ、及び／又は生存させることができる。
遺伝子工学とは、遺伝コードの少なくとも一部の意図的な操作及び／又は組み替え、及び／又は有機体の遺伝コードの発現を指す。
【００９９】
遺伝子組換えとは、遺伝子組換えした有機体、培養物、単細胞、生物相などを指す。遺伝子組換え有機体としては、１以上の遺伝子、タンパク質の一部、プロモーター領域、非コード領域、染色体などのゲノム突然変異、付加、及び／又は除去によって操作されたものを挙げることができる。
【０１００】
天然とは、少なくとも概して人間、機械などのような外力による介在作用のない有機体、培養物、単細胞、生物相などを指す。天然有機体としては、局所環境（植物相及び／又は動物相）などにおいて見られるものを挙げることができる。天然有機体は、回収、単離、培養、精製などを行うことができる。
【０１０１】
幾つかの態様によれば、有機体は、キシロース、スクロース、及び／又はグリセロールの上で成長させると、主としてグルコース単独の上での収量と比べて、有機体の乾燥重量の約２５％より多く、約５０％より多く、約７５％より多く、約１００％、約４５％〜約９０％などを脂肪酸として産生し、同量及び／又はより多い量のバイオマスを生成する能力を有することができる。
【０１０２】
幾つかの態様によれば、有機体は、主として糖（例えばスクロース、グルコース、フルクトース、キシロースなど）とグリセロールの組み合わせの上で成長させると、主として糖単独と比べて約２５％より多く、約５０％より多く、約７５％より多く、約１００％、約２５％〜約１００％などの量多い脂肪酸を産生することができる。糖とグリセロールとの比は、質量基準、モル基準、体積基準などで約１００：１、約５０：１、約１０：１、約１：１、約１：１０、約１：５０、約１：１００、約１〜２０：５０〜１００などのような任意の好適な量であってよい。
【０１０３】
幾つかの態様においては、有機体を生成するとは、有機体が脂肪酸を含み、及び／又は１以上の小胞体及び／又は嚢の中又はその上などに脂肪酸を含む有機体を与える場合を含む。別の形態においては、脂肪酸は、例えば拘束膜を比較的含まずに細胞内及び／又は細胞の外側に比較的含まれなくてもよい。有機体の生成には、細胞再生（より多い細胞）、及び細胞成長（例えば脂肪酸含量を増加させることによる寸法及び／又は細胞の内部物の増加）を含ませることができる。再生及び成長は、互いと少なくとも実質的に同時に、互いを少なくとも実質的に除いて、少なくとも部分的に同時に、及び少なくとも部分的に排他的になどで行うことができる。
【０１０４】
幾つかの態様によれば、本方法には、上記に列記した基準値（Ａ〜Ｇ）の少なくとも２以上を少なくとも実質的に同時に満足するか又はこれを超えることを含ませることができる。バイオ燃料のための経済的に存立できる生物油法は、原油のような他のエネルギー源と競争することができる。したがって、幾つかのファクターを用いて経済的なプロセスを与えることができる。驚くべきことに且つ予期しなかったことに、少なくとも２つの基準値を満足するか及び／又はこれを超える生物油の製造方法は、バイオ燃料のための経済的に存立できる生物油を与えることができる。より多い（更なる）基準値を満足するか及び／又はこれを超えることによって、経済的成功のより大きな可能性を有するより強固なプロセスを得ることができる。異なる基準値は互いに多少競合して、１つを最適化すると他のもののより低い結果をもたらす可能性がある。しかしながら、本発明のプロセスは、２、３、４、５、６、及び／又は７つの基準値を、任意の組合せで少なくとも実質的に同時に（同じ全プロセス内で用いることを包含する）満足するか及び／又はこれを超えることができる。
【０１０５】
基準値とは、有効性、利用度、転化率、生成率、成功率などの測定のような測定標準値及び／又は主要な成績指標を指す。
満足とは、到達すること、獲得すること、満足すること、匹敵することなどを指す。
【０１０６】
超えるとは、超えて伸びること、上回ることなどを指す。幾つかの態様によれば、超えることとしては、閾値の量及び／又は数量より少なくとも２％高いことが挙げられる。
基準値Ａ：（発酵培地又はブロスの）１Ｌあたりのグラム数で測定される（有機体の）細胞密度は、有機体の生産性、発酵培地（ブロス）の利用度、及び／又は発酵容器容積の利用度を評価及び／又は示す。増加した細胞密度は、増加した生成物収率及び装置の増加した利用度（より低い設備コスト）を与えることができる。一般に、増加した細胞密度は有益であるが、過度に高い細胞密度は、より高いポンプ移送コスト（増加した粘度）、及び／又は熱の除去の困難性（より低い熱伝達係数）などをもたらす可能性がある。
【０１０７】
密度とは、材料及び／又は物質の単位体積あたりの質量を指す。細胞密度とは、単位体積あたりの生体細胞の重量のような単位体積あたりの細胞の質量を指す。これは、通常は１Ｌあたりの乾燥細胞の重量として表す。細胞密度は、発酵の開始時、発酵中、発酵の終了時、全バッチを通してなどのような方法における任意の好適な時点で測定することができる。
【０１０８】
細胞密度の基準値としては、１Ｌあたり少なくとも約５０ｇの乾燥重量、１Ｌあたり少なくとも約１００ｇの乾燥重量、１Ｌあたり少なくとも約１１５ｇの乾燥重量、１Ｌあたり少なくとも約１２５ｇの乾燥重量、１Ｌあたり少なくとも約１５０ｇの乾燥重量、１Ｌあたり少なくとも約１７５ｇの乾燥重量、１Ｌあたり少なくとも約２００ｇの乾燥重量、１Ｌあたり少なくとも約２５０ｇの乾燥重量、１Ｌあたり少なくとも約３５０ｇの乾燥重量、１Ｌあたり約４００ｇの乾燥重量未満、１Ｌあたり５０ｇの乾燥重量〜１Ｌあたり３５０ｇの乾燥重量、１Ｌあたり１１５ｇの乾燥重量〜１Ｌあたり２００ｇの乾燥重量などのような任意の好適な値を挙げることができる。
【０１０９】
基準値Ｂ：乾燥質量基準のパーセントで測定される脂肪酸含量は、重量基準でどのくらい多い脂肪酸が有機体内に含まれているかを評価及び／又は示す。一般に、より高い脂肪酸含量が望ましく、細胞物質の残り及び／又は残渣からの脂肪酸のより容易な抽出及び／又は取り出し、並びに供給材料及び／又は装置に関して増加した利用度及び／又は生産性を与えることができる。
【０１１０】
含量とは、含まれる特定の材料の量を指す。乾燥質量基準とは、水を少なくとも実質的に含まないことを指す。脂肪酸含量は、発酵の開始時、発酵中、発酵の終了時、全バッチを通してなどのような方法における任意の好適な時点において測定することができる。
【０１１１】
脂肪酸含量の基準値としては、乾燥質量基準で少なくとも約２５％の脂肪酸、乾燥質量基準で少なくとも約４９％の脂肪酸、乾燥質量基準で少なくとも約５５％の脂肪酸、乾燥質量基準で少なくとも約６０％の脂肪酸、乾燥質量基準で少なくとも約７０％の脂肪酸、乾燥質量基準で少なくとも約８０％の脂肪酸、乾燥質量基準で少なくとも約９０％の脂肪酸、乾燥質量基準で約１００％未満の脂肪酸、乾燥質量基準で約２５％の脂肪酸〜乾燥質量基準で約９０％の脂肪酸、乾燥質量基準で約４９％の脂肪酸〜乾燥質量基準で約７０％の脂肪酸などのような任意の好適な値を挙げることができる。
【０１１２】
基準値Ｃ：ブロス及び／又は発酵槽体積１Ｌあたり、経過した発酵時間１日（２４時間）あたりの脂肪酸のグラム数で測定される脂肪酸生産性は、転化速度及び／又は脂肪酸が産生される速度を評価及び／又は示す。一般に、より迅速に（即ち減少したサイクル時間で）生成物を製造することが望ましいので、より高い脂肪酸生産性はより経済的なプロセスを与える。
【０１１３】
生産性とは、単位体積あたりの速度のような製造及び／又は生成の質及び／又は状態を指す。脂肪酸生産性は、発酵の開始時、発酵中、発酵の終了時、全バッチを通してなどのような方法における任意の好適な時点において測定することができる。生産性は、各日の正午から正午のような定刻時間で測定することができる。別の形態においては、生産性は、任意の２４時間のような好適な周期的基準で測定することができる。生産性を測定するための他の基準は本発明の範囲内である。
【０１１４】
脂肪酸生産性の基準値としては、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約５ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約１０ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約１５ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約２０ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約２５ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約３０ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約４０ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約５０ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約６０ｇ、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約７０ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約８０ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約９０ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり約１００ｇ未満の脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり約５ｇの脂肪酸〜１Ｌあたり１日あたり約９０ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり約１０ｇの脂肪酸〜１Ｌあたり１日あたり約７０ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり約１５ｇの脂肪酸〜１Ｌあたり１日あたり約９０ｇの脂肪酸などのような任意の好適な値を挙げることができる。
【０１１５】
基準値Ｄ：消費される供給材料１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数で測定される脂肪酸収率は、供給材料の生成物への転化の選択率を評価及び／又は示す。より高い脂肪酸収率は、糖から、副生成物及び／又は細胞集団ではなく脂肪酸への炭素転化を示すので一般に好ましい。
【０１１６】
収率とは、産生及び／又は戻される量及び／又は数量を指す。脂肪酸収率は、発酵の開始時、発酵中、発酵の終了時、全バッチを通してなどのような方法における任意の好適な時点において測定することができる。
【０１１７】
脂肪酸収率の基準値としては、消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．１ｇの産生される脂肪酸、消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．１５ｇの産生される脂肪酸、消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．１７５ｇの産生される脂肪酸、消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．２ｇの産生される脂肪酸、消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．２２５ｇの産生される脂肪酸、消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．２５ｇの産生される脂肪酸、消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．３ｇの産生される脂肪酸、消費される供給材料１ｇあたり約０．１ｇの産生される脂肪酸〜消費される供給材料１ｇあたり約０．２ｇの産生される脂肪酸、消費される供給材料１ｇあたり約０．２ｇの産生される脂肪酸及び消費される供給材料１ｇあたり約０．３５ｇの産生される脂肪酸、消費される供給材料１ｇあたり約１．７５ｇの産生される脂肪酸〜消費される供給材料１ｇあたり約０．２２５ｇの産生される脂肪酸などのような任意の好適な値を挙げることができる。
【０１１８】
基準値Ｅ：１Ｌあたり１日あたりの脂肪酸のグラム数で測定される２４時間ピーク脂肪酸生産性は、２４時間の間に産生される脂肪酸の量及び／又は速度を評価及び／又は示す。
【０１１９】
ピーク脂肪酸生産性としては、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約１５ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約２０ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約３０ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約４０ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約５０ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約７５ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約１００ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約１２５ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり約１５０ｇ未満の脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり約１５ｇの脂肪酸〜１Ｌあたり１日あたり約１２５ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり約３０ｇの脂肪酸〜１Ｌあたり１日あたり約１２５ｇの脂肪酸、１Ｌあたり１日あたり約４０ｇの脂肪酸〜１Ｌあたり１日あたり約１００ｇの脂肪酸などのような任意の好適な値を挙げることができる。
【０１２０】
基準値Ｆ：全脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率は、生成物として利用することができる脂肪酸の回収量ｖｓ有機体によって産生される全脂肪酸を評価及び／又は示す。
抽出効率としては、全脂肪酸含量の少なくとも約２５％、全脂肪酸含量の少なくとも約３５％、全脂肪酸含量の少なくとも約４５％、全脂肪酸含量の少なくとも約５５％、全脂肪酸含量の少なくとも約６５％、全脂肪酸含量の少なくとも約７５％、全脂肪酸含量の少なくとも約８５％、全脂肪酸含量の少なくとも約９５％、全脂肪酸含量の約１００％未満、全脂肪酸含量の約２５％〜全脂肪酸含量の約９５％、全脂肪酸含量の約２５％〜全脂肪酸含量の約９５％、全脂肪酸含量の約３５％〜全脂肪酸含量の約７５％などのような任意の好適な値を挙げることができる。
【０１２１】
抽出効率は、少なくとも約１Ｌ、少なくとも約１０Ｌ、少なくとも約１００Ｌ、少なくとも約１，０００Ｌ、約１０，０００Ｌ未満、約１Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１Ｌ〜約１，０００Ｌ、約１Ｌ〜約１００Ｌ、約１Ｌ〜約１０Ｌなどのような任意の好適な値の抽出体積を基準とすることができる。幾つかの態様によれば、抽出効率に関する体積は発酵ブロスの体積を基準とすることができる。
【０１２２】
基準値Ｇ：消費される酸素基準で１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数として表される酸素あたりの脂肪酸の収率は、脂肪酸を産生するのに用いる酸素の量及び／又は速度を評価及び／又は示す。より高い酸素要求は、設備費及び／又は運転費を増加させる可能性がある。
【０１２３】
酸素あたりの脂肪酸の収率としては、消費される酸素１ｇあたり約０．４ｇより多い産生される脂肪酸、消費される酸素１ｇあたり約０．５ｇより多い産生される脂肪酸、消費される酸素１ｇあたり約０．６ｇより多い産生される脂肪酸、消費される酸素１ｇあたり約０．７ｇより多い産生される脂肪酸、消費される酸素１ｇあたり約０．８ｇより多い産生される脂肪酸、消費される酸素１ｇあたり約０．９より多く約１．０ｇ未満の産生される脂肪酸、消費される酸素１ｇあたり約０．４ｇの産生される脂肪酸〜消費される酸素１ｇあたり約０．９ｇの産生される脂肪酸、消費される酸素１ｇあたり約０．６ｇの産生される脂肪酸〜消費される酸素１ｇあたり約０．８ｇの産生される脂肪酸などのような任意の好適な値を挙げることができる。
【０１２４】
幾つかの態様によれば、本方法には、少なくとも２つ又はそれ以上の基準値を少なくとも概して同時か又は製造中に満足するか又はこれを超えることを含ませることができる。
幾つかの態様によれば、本方法には、少なくとも３つ又はそれ以上の基準値を少なくとも概して同時か又は製造中に満足するか又はこれを超えることを含ませることができる。
【０１２５】
幾つかの態様によれば、本方法には、少なくとも４つ又はそれ以上の基準値を少なくとも概して同時か又は製造中に満足するか又はこれを超えることを含ませることができる。
幾つかの態様によれば、本方法には、少なくとも５つ又はそれ以上の基準値を少なくとも概して同時か又は製造中に満足するか又はこれを超えることを含ませることができる。
【０１２６】
幾つかの態様によれば、本方法には、少なくとも６つ又はそれ以上の基準値を少なくとも概して同時か又は製造中に満足するか又はこれを超えることを含ませることができる。
幾つかの態様によれば、本方法には、少なくとも７つの基準値を少なくとも概して同時か又は製造中に満足するか又はこれを超えることを含ませることができる。
【０１２７】
本方法には、細胞溶解、圧力の印加、溶媒抽出、蒸留、遠心分離、他の機械的処理、他の熱処理、他の化学的処理などによって脂肪酸を含む脂質を抽出及び／又は取り出すことのような任意の好適な更なる動作を更に含ませることができる。別の形態においては、産生性有機体によって、更なる処理を行うことなく有機体から脂肪酸を含む脂質を分泌及び／又は放出することができる。
【０１２８】
脂肪酸は、例えばバイオ燃料の製造のために一般的に好適な任意の好適なプロファイル及び／又は特性を有していてよい。幾つかの態様によれば、脂肪酸は、質量基準で４つ以上の二重結合を有する好適な量及び／又はパーセントの脂肪酸を含んでいてよい。別の形態においては、脂肪酸は、３つ以上の二重結合、２つ以上の二重結合、１つ以上の二重結合などを有する好適な量及び／又はパーセントの脂肪酸を含んでいてよい。
【０１２９】
二重結合の好適な量は、全脂肪酸の約２５重量％未満、全脂肪酸の約１５重量％未満、全脂肪酸の約１０重量％未満、全脂肪酸の約５重量％未満、全脂肪酸の約３重量％未満、全脂肪酸の約２重量％未満、全脂肪酸の約１重量％未満、全脂肪酸の約０．５重量％未満、全脂肪酸の約０．１重量％未満、全脂肪酸の少なくとも約５重量％、全脂肪酸の約２５重量％〜全脂肪酸の約０．１重量％、全脂肪酸の約１０重量％〜全脂肪酸の約５重量％などであってよい。
【０１３０】
脂肪酸とは、例えば脂肪及び脂肪油中のグリセリドの形態の飽和及び／又は不飽和モノカルボン酸を指す。グリセリドとしては、アシルグリセリド、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドなどを挙げることができる。
【０１３１】
二重結合とは、分子内の２つの原子によって共有されている２対の電子を指す。
更に及び／又は別の形態においては、得られる脂肪酸は、全脂肪酸の重量％として少なくとも約３０％のモノ不飽和脂肪酸、全脂肪酸の重量％として少なくとも約４０％のモノ不飽和脂肪酸、全脂肪酸の重量％として少なくとも約５０％のモノ不飽和脂肪酸、全脂肪酸の重量％として少なくとも６０％のモノ不飽和脂肪酸、全脂肪酸の重量％として少なくとも約７０％のモノ不飽和脂肪酸、全脂肪酸の重量％として少なくとも約８０％のモノ不飽和脂肪酸、全脂肪酸の重量％として少なくとも約９０％のモノ不飽和脂肪酸、全脂肪酸の重量％として約３０％のモノ不飽和脂肪酸〜全脂肪酸の重量％として約９０％のモノ不飽和脂肪酸、全脂肪酸の重量％として約１００％未満のモノ不飽和脂肪酸、全脂肪酸の重量％として約５０％のモノ不飽和脂肪酸〜全脂肪酸の重量％として約７０％のモノ不飽和脂肪酸などを含んでいてよい。モノ不飽和とは１つの二重結合を有する分子を指す。
【０１３２】
幾つかの態様によれば、脂質は、全脂肪酸質量基準で任意の好適な量及び／又はパーセントの飽和脂肪酸を含んでいてよい。飽和脂肪酸の好適な量及び／又はパーセントとしては、全脂肪酸の重量％として約５％未満の全脂肪酸、全脂肪酸の重量％として約１０％未満の全脂肪酸、全脂肪酸の重量％として約２０％未満の全脂肪酸、全脂肪酸の重量％として約２５％未満の全脂肪酸、全脂肪酸の重量％として約３０％未満の全脂肪酸、全脂肪酸の重量％として約３５％未満の全脂肪酸、全脂肪酸の重量％として約４０％未満の全脂肪酸、全脂肪酸の重量％として約５０％未満の全脂肪酸、全脂肪酸の重量％として約６０％未満の全脂肪酸、全脂肪酸の重量％として少なくとも約１％の全脂肪酸、全脂肪酸の重量％として約１０％の全脂肪酸〜全脂肪酸の重量％として約６０％の全脂肪酸、全脂肪酸の重量％として約２５％の全脂肪酸〜全脂肪酸の重量％として約４０％の全脂肪酸、全脂肪酸の重量％として約１％の全脂肪酸〜全脂肪酸の重量％として約１０％の全脂肪酸などを挙げることができる。飽和とは、原子（炭素原子）間に二重結合及び／又は三重結合を有しない化合物を指す。
【０１３３】
生物油は、エステル化、エステル交換、水素化、クラッキングなどのような任意の好適な方法でバイオ燃料に更に処理することができる。別の形態においては、生物油はバイオ燃料として直接用いるのに好適である可能性がある。エステル化とは、酸をアルコールと反応させてエステルを形成することなどによってエステルを生成及び／又は形成することを指す。エステル交換とは、例えばアルコールをトリグリセリドと反応させて脂肪酸エステル及びグリセロールを形成することなどによって、１種類のエステルを１種類以上の異なるエステルに変化させることを指す。水素化及び／又は水素処理とは、材料を飽和及び／又は還元することのような、水素を分子に加える反応を指す。
【０１３４】
更に及び／又は別の形態においては、エステル交換によって得られる脂肪酸は、任意の好適な脂肪酸メチルエステルプロファイルを有することができる。プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）としては、全て質量基準で、約３０％のオレイン酸〜約９０％のオレイン酸、約５０％のオレイン酸〜約７０％のオレイン酸、約６０％のオレイン酸などを挙げることができる。プロファイルとしては、約１０％のリノール酸〜約７０％のリノール酸、約３０％のリノール酸〜約５０％のリノール酸、約１５％のリノール酸〜約３５％のリノール酸、約４０％のリノール酸などを挙げることができる。
【０１３５】
エステル交換には、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのような任意の好適なアルコールを用いることを含ませることができる。
幾つかの態様によれば、脂肪酸メチルエステルプロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）としては、約１％のパルミチン酸〜約１０％のパルミチン酸；約０．５％のステアリン酸〜約２．５％のステアリン酸；約５０％のオレイン酸〜約７０％のオレイン酸；約１５％のリノール酸〜約３５％のリノール酸；及び／又は約６％のリノレン酸〜約１２％のリノレン酸；を挙げることができる。
【０１３６】
幾つかの態様によれば、脂肪酸メチルエステルプロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）としては、約０％のミリスチン酸〜約１．５％のミリスチン酸；約１％のパルミチン酸〜約１０％のパルミチン酸；約０．５％のステアリン酸〜約２．５％のステアリン酸；約０％のアラキン酸〜約１．５％のアラキン酸；約０％のベヘン酸〜約１．５％のベヘン酸；約０％のリグノセリン酸〜約２％のリグノセリン酸；約０％のパルミトレイン酸〜約１％のパルミトレイン酸；約５０％のオレイン酸〜約７０％のオレイン酸；約０％のエイコセン酸〜約３％のエイコセン酸；約０％のエルカ酸〜約５％のエルカ酸；約１５％のリノール酸〜約３５％のリノール酸；及び／又は約６％のリノレン酸〜約１２％のリノレン酸；を挙げることができる。
【０１３７】
異なる脂肪酸エステルプロファイルの他の態様は本発明の範囲内である。
得られるバイオ燃料は、国際標準規格ＥＮ−１４２１４：２００８（ディーゼルエンジン用の自動車燃料、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ））及び／又はＡＳＴＭ−Ｄ６７５１−０９（中間留分燃料用のバイオディーゼル燃料ブレンドストック（Ｂ１００）に関する標準仕様）を満足するか及び／又は超えることができる。ここでＥＮ−１４２１４：２００８及びＡＳＴＭ−Ｄ６７５１−０９の全内容は、参照としてその全部を本明細書の一部として包含する。
【０１３８】
幾つかの態様によれば、脂肪酸は、ナタネにおいて見られる脂肪酸と少なくとも実質的に類似しているプロファイルを有することができる。実質的とは、大体において明記及び／又は特定されているものであることを指す。類似とは、劇的に異なってはいないような、共通の特性を有することを指す。実質的に類似としては、全て例えば相関分析によって測定して全脂肪酸基準の重量％で、ナタネに少なくとも約５０％類似、ナタネに少なくとも約６０％類似、ナタネに少なくとも約７０％類似、ナタネに少なくとも約８０％類似、ナタネに少なくとも約９０％類似、ナタネに少なくとも約９５％類似、ナタネに少なくとも約９９％類似、ナタネに約９０％未満類似、ナタネに約５０％類似〜ナタネに約９９％類似などのプロファイルを有することを挙げることができる。
【０１３９】
細胞集団の生成及び／又は脂肪酸を含む脂質の産生は、少なくとも約１８℃、少なくとも約２０℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約３０℃、少なくとも約３５℃、少なくとも約４０℃、少なくとも約４５℃、少なくとも約５０℃、約１００℃未満、約１８℃〜約５０℃、約２０℃〜約３０℃などの温度のような任意の好適な条件において行うことができる。高い温度において運転すると、収率を増加させ、生産性を増加させ、異質な有機体の成長を減少させるなどを行うことができる。消費及び／又は産生は、同じ温度及び／又は異なる温度において行うことができる。消費及び／又は産生中に温度過渡（時間に対する温度変化）を有する態様は本発明の範囲内である。
【０１４０】
幾つかの態様によれば、本方法及び／又はプロセスには、例えば熱、冷却などを加えることによる温度制御を含ませることができる。熱は、蒸気、飽和流、過熱流、熱水、グリコール、熱伝達油、熱伝達流体、他のプロセス流などによって供給することができる。冷却は、冷却水、冷媒、塩水、グリコール、熱伝達流体、冷却剤、他のプロセス流などによって供給することができる。温度制御は、間接熱交換、直接熱交換、対流、伝導、放射などのような任意の好適な技術及び／又は構成を用いることができる。
【０１４１】
幾つかの態様によれば、本方法には有機体から脂肪酸を抽出することを含ませることができ、ここで抽出は、全て全脂肪酸含量基準のパーセントで、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約１００％未満、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％などの効率を有する。
【０１４２】
抽出としては、エタノール、ヘキサン、他のアルコール、他の好適な溶媒（化学的溶媒、物理的溶媒、非極性溶媒、極性溶媒、及び／又は超臨界溶媒）などによる溶媒抽出を挙げることができる。
【０１４３】
幾つかの態様によれば、有機体の脂肪酸生産性は１Ｌあたり１日あたり少なくとも約３０ｇを満足するか又はこれを超え、及び／又は脂肪酸収率は供給材料中の炭素１ｇあたり少なくとも約０．１７５ｇの産生される脂肪酸を満足するか及び／又はこれを超える。
【０１４４】
幾つかの態様によれば、２４時間ピーク脂肪酸生産性は、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約５０ｇを満足するか及び／又はこれを超える。
幾つかの態様によれば、６時間ピーク脂肪酸生産性は、１Ｌあたり１日あたり少なくとも約７０ｇを満足するか及び／又はこれを超える。
【０１４５】
幾つかの態様によれば、消費及び／又は産生は窒素制限下で行う。窒素制限とは、例えば細胞再生において用いられる窒素の欠如を指す。別の形態においては、消費及び／又は産生の少なくとも一部は、例えばアンモニアからの窒素付加を用いて行う。
【０１４６】
幾つかの態様によれば、有機体の生成及び／又は脂肪酸を含む脂質の産生は、別の容器内のように糖発酵とは独立して行う。別の形態においては、有機体の産生及び／又は脂肪酸を含む脂質の産生は、同じ容器内のように糖発酵と多少は同時期及び／又は同時に行う。
【０１４７】
消費及び／又は産生は、約３より低いｐＨ、約５より低いｐＨ、約６より低いｐＨ、約７．０以下のｐＨ、約７のｐＨ、少なくとも約８のｐＨ、少なくとも約９のｐＨ、少なくとも約１０のｐＨ、約５〜約９のｐＨ、約６〜約８のｐＨ、約７〜約８のｐＨなどのような任意の好適なｐＨにおいて行うことができる。異なるｐＨレベルにおいて運転すると異質の有機体の成長を抑制することができる。異質の有機体の成長を抑制することによって、例えばそれぞれのバッチの開始時において別の滅菌プロセスの必要なしに方法の運転を行うことができる。運転中のｐＨの変化を伴う態様は本発明の範囲内である。
【０１４８】
滅菌は、エネルギー、時間、及び／又は他の資源を消費する可能性がある。したがって、幾つかの態様においては、例えば上記で議論したようにｐＨレベルが異質の有機体の成長を抑制する場合には滅菌プロセスは用いない。別の形態においては、本方法に、少なくとも閾値温度への好適な時間の蒸気処理のような滅菌プロセスを更に含ませることができる。
【０１４９】
幾つかの態様によれば、本発明には、有機体の成長を成長のために最適な温度において行い、一方、脂肪酸を含む脂質の産生段階を、最適な成長温度よりも少なくとも約２℃、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃、少なくとも約５℃、少なくとも約７℃、約２０℃未満、約２℃〜約７℃、約４℃〜約５℃などの温度高い温度において行う、油を産生する発酵プロセスのエネルギーコスト及び／又は設備コストを減少させる方法を含ませることができる。
【０１５０】
幾つかの態様によれば、本発明には、本明細書内に開示されている任意の方法、ユニット、及び／又は有機体によって製造される生物油を含ませることができる。
幾つかの態様によれば、本発明には、本明細書内に開示されている任意の生物油から製造されるバイオ燃料を含ませることができる。
【０１５１】
幾つかの態様によれば、本発明には、圧縮エンジンにおいて用いるのに好適なバイオ燃料を含ませることができる。バイオ燃料は脂肪酸メチルエステルプロファイルを有していてよい。脂肪酸メチルエステルプロファイルとしては、全脂肪酸基準の重量％で約５０％〜約７０％のオレイン酸、及び／又は全脂肪酸基準の重量％で約１５％〜約３５％のリノレン酸を挙げることができる。
【０１５２】
幾つかの態様によれば、脂肪酸メチルエステルプロファイルは、ストラメノパイル界、菌界などからの有機体によって産生される脂肪酸から得られる。
幾つかの態様によれば、本発明には生物油を製造するためのユニットを含ませることができる。ユニットには、供給材料流、供給材料流に接続されている容器、容器内に配置されている有機体、及び／又は容器に接続されている脂質流を含ませることができる。有機体は少なくとも２つの基準値を満足するか及び／又はこれを超えることができ、ここで基準値は、（Ａ）少なくとも約１１５ｇ／Ｌの細胞密度；（Ｂ）乾燥質量基準で少なくとも約４９％の脂肪酸含量；（Ｃ）少なくとも約１５ｇ／Ｌ・日の脂肪酸生産性；（Ｄ）消費される供給材料１ｇあたり少なくとも約０．１７５ｇの脂肪酸の脂肪酸収率；（Ｅ）少なくとも約３０ｇ／Ｌ・日の２４時間ピーク脂肪酸生産性；（Ｆ）全脂肪酸含量基準のパーセントで少なくとも約６５％の抽出効率；及び／又は（Ｇ）消費される酸素１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数として表して少なくとも約０．４の、酸素あたりの脂肪酸の収率；を含む。
【０１５３】
単位とは、１以上の特定の機能及び／又は成果などを果たすように働く装置の全体、１つ、及び／又は複合体としてみなされる単一の量を指す。
流れとは、定常的な連続状態のような物質及び／又は材料の流れ及び／又は供給流を指す。流れの流動は、連続的、不連続的、断続的、バッチ式、半バッチ式、半連続的などであってよい。
【０１５４】
容器とは、液体、気体、発酵ブロスなどのような物質の容器及び／又は収容器を指す。容器は、少なくとも約１Ｌ、少なくとも約１，０００Ｌ、少なくとも約１００，０００Ｌ、少なくとも約１，０００，０００Ｌ、少なくとも約１，０００，０００，０００Ｌ、約１，０００，０００Ｌ未満、約１Ｌ〜約１，０００，０００，０００Ｌなどのような任意の好適な寸法及び／又は形状を有していてよい。容器としては、タンク、反応器、カラム、バット、樽、貯留槽などを挙げることができる。容器には、ポンプ、撹拌装置、給気装置、熱交換器、コイル、ジャケット、加圧システム（正圧及び／又は真空）、制御システムなどのような任意の好適な補助装置を含ませることができる。
【０１５５】
配置とは、設置すること、配置すること、準備することなどを指す。有機体は、自由に、発酵ブロス中に導入（懸濁）、及び／又は容器の少なくとも一部内の好適な培地及び／又は表面上に固定することができる。有機体は、ブロスよりも概して高密度（沈漬）、ブロスよりも概して低密度（浮遊）、ブロスに対して概して中立浮遊性などであってよい。
【０１５６】
適合とは、特定の用途、目的などに適するようにすることを指す。
幾つかの態様によれば、容器内に配置する有機体としては、ストラメノパイル界、菌界などからの有機体を挙げることができる。
【０１５７】
幾つかの態様によれば、容器は、バッチ式、不連続式、半バッチ式、半連続式、連続式などで運転する。直列及び／又は並列の容器の組合せは本発明の範囲内である。
幾つかの態様によれば、本発明には、脂肪酸効率に関する次の総合指数の１以上を達成する生物油を製造するための単離有機体を含ませることができる。ここで、ＯＩＬＥ、ＯＩＬＥ１、ＯＩＬＥ２、ＯＩＬＥ３、及びＯＩＬＥ４は、
ＯＩＬＥ＝Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄ・Ｅ・Ｆ・Ｇ
ＯＩＬＥ１＝Ｃ・Ｄ・Ｆ
ＯＩＬＥ２＝Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄ・Ｆ
ＯＩＬＥ３＝Ｄ・Ｅ・Ｆ
ＯＩＬＥ４＝Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄ・Ｆ・Ｇ
（式中、
Ａ＝細胞密度（ｇ／Ｌ）であり；
Ｂ＝乾燥質量％基準の脂肪酸含量であり；
Ｃ＝脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；
Ｄ＝脂肪酸収率（消費される供給材料１ｇあたりの脂肪酸のグラム数）であり；
Ｅ＝２４時間ピーク脂肪酸生産性（ｇ／Ｌ・日）であり；
Ｆ＝脂肪酸含量基準のパーセントの抽出効率であり；及び／又は
Ｇ＝消費される酸素基準で１ｇあたりに産生される脂肪酸のグラム数として表される酸素あたりの脂肪酸の収率である）
として定義することができる。
【０１５８】
基準値Ｂ及びＦはパーセントとして測定される。ＯＩＬＥ、ＯＩＬＥ１、ＯＩＬＥ２、ＯＩＬＥ３、及び／又はＯＩＬＥ４に関する値を計算する場合には、Ｂ及びＦに関するパーセントを小数（１．０未満）として代入する。
【０１５９】
幾つかの態様によれば、本発明には、上記で議論した脂肪酸効率に関する総合指数（ＯＩＬＥ、ＯＩＬＥ１、ＯＩＬＥ２、ＯＩＬＥ３、及びＯＩＬＥ４）の１以上を達成する有機体を同定し、次に有機体を単離することを含む、生物油を製造するための有機体を単離する方法を含ませることができる。
【０１６０】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、少なくとも約８１１、少なくとも約４，９５８、少なくとも約２０，２９２、少なくとも約３３，３４２、少なくとも約５３，０００、約８１１〜約５３，０００、約４，９５８〜約５３，０００、約４，９５８〜約２０，２９２、約４，９５８〜約３３，３４２、約２０，２９２〜約５３，０００、約２０，２９２〜約３３，３４２、約３３，３４２〜約５３，０００などのような任意の好適な値の脂肪酸効率に関する総合指数（ＯＩＬＥ）を有することができる。
【０１６１】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、少なくとも約１．５、少なくとも約２．９、少なくとも約５．１、少なくとも約６．３、少なくとも約７．６、約１．５〜約７．６、約２．９〜約７．６、約２．９〜約６．３、約２．９〜約５．１、約５．１〜約７．６、約５．１〜約６．３、約６．３〜約７．６などのような任意の好適な値の脂肪酸効率に関する総合指数１（ＯＩＬＥ１）を有することができる。
【０１６２】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、少なくとも約７３、少なくとも約２３５、少なくとも約５９３、少なくとも約８０３、少なくとも約１，０００、約７３〜約１，０００、約２３５〜約１，０００、約２３５〜約８０３、約２３５〜約５９３、約５９３〜約１，０００、約５９３〜約８０３、約８０３〜約１，０００などのような任意の好適な値の脂肪酸効率に関する総合指数２（ＯＩＬＥ２）を有することができる。
【０１６３】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、少なくとも約２．２、少なくとも約４．４、少なくとも約７．６、少なくとも約９．４、少なくとも約１１．４、約２．２〜約１１．４、約４．４〜約１１．４、約４．４〜約９．４、約４．４〜約７．６、約７．６〜約１１．４、約７．６〜約９．４、約９．４〜約１１．４などのような任意の好適な値の脂肪酸効率に関する総合指数３（ＯＩＬＥ３）を有することができる。
【０１６４】
幾つかの態様によれば、単離有機体は、少なくとも約３２、少なくとも約１４２、少なくとも約４５７、少なくとも約６８２、少なくとも約９９０、約３２〜約９９０、約１４２〜約９９０、約１４２〜約６８２、約１４２〜約４５７、約４５７〜約９９０、約４５７〜約６８２、約６８２〜約９９０などのような任意の好適な値の脂肪酸効率に関する総合指数４（ＯＩＬＥ４）を有することができる。
【０１６５】
幾つかの態様によれば、ＯＩＬＥ、ＯＩＬＥ１、ＯＩＬＥ２、ＯＩＬＥ３、又はＯＩＬＥ４のための単離有機体としては、天然有機体、遺伝子組換え有機体などを挙げることができる。
【０１６６】
幾つかの態様によれば、本明細書内に開示されている任意の方法、ユニット、及び／又は有機体は、炭素供給材料を消費する有機体を用いることができ、ここで、炭素供給材料は、全て質量基準で、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、約１％〜約２５％などの消費される全窒素を含む。
【実施例】
【０１６７】
実施例１：
約１，５００の微生物の菌株を、非光合成脂肪酸産生能力に関して試験した。菌株とは、例えば明確な生理的な差意を有するが、必ずしも形態的な差意を有しない推定共通祖先の群及び／又は集合を指す。試験した有機体の菌株には、微細藻類、酵母、及び酵母様有機体が含まれていた。試験した有機体には、天然の単離有機体、及び多少遺伝子組換えした有機体が含まれていた。試験によって、脂肪酸プロファイルに基づく脂肪酸産生能力及び潜在的なバイオ燃料特性を調べた。有機体は、上記で議論した主要な性能基準値を満足するかどうかに基づいてスクリーニングした。第１の基準は、良好な成長及び高い脂肪蓄積の可能性であった。第２の基準は、脂肪酸プロファイルがナタネ油と類似しているかどうかであった。
【０１６８】
ナタネ油を基準とする脂肪酸プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）に関する通常の範囲には、全て質量基準で、約１％〜約１０％の１６：０、約０．５％〜約２．５％の１８：０、約５０％〜約７０％の１８：１、約１５〜約３５％の１８：２、約６％〜約１２％の１８：３、及び約１％未満の多不飽和脂肪酸が含まれる。脂肪酸の命名における第１の数は分子内の炭素原子の数を表し、第２の数は分子内の二重結合の数を示す。
【０１６９】
第１及び第２の基準を満足する菌株は、振盪フラスコ内でのスクリーニング条件下で成長させると、少なくとも約８ｇ／Ｌの乾燥バイオマス重量を生成し、乾燥重量で少なくとも約３５％の脂肪酸含量を有していた。これらの基準を適用することによって、約１，５００の菌株が更なる試験のための１５４の菌株（同定された菌株）に削減された。同定された菌株は、５．６ｇ／Ｌ〜２７．３ｇ／Ｌの乾燥バイオマス重量を有していた。同定された菌株は、乾燥重量で１５％〜７４％の脂肪酸含量を有していた。同定された菌株は、０％〜３７％の１４：０、１１％〜５４％の１６：０、０％〜２３％の１６：１、１％〜２４％の１８：０、０％〜６６％の１８：１、０％〜４５％の１８：２、０％〜９％の１８：３、及び０％〜４４％の多不飽和脂肪酸含量を有する脂肪酸プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）を産生した。
【０１７０】
実施例２：
上記の実施例１において同定した１５４の菌株をフラスコ試験用に準備した。菌株を、幾つかの可能性のある培地上で成長する能力に関して試験した。試験培地には、グルコース、スクロース、グリセロール、フルクトース、及び／又はキシロースが含まれていた。培地源は純粋な糖源を用いた。この実験のために、標準培養培地を変性して酵母エキス及びグルタミン酸モノナトリウムのような有機炭素を排除した。有機炭素を排除することによって、それぞれの菌株を特定の培養基上での成長に関して試験することが可能になる。
【０１７１】
酵母エキスを有しない標準振盪フラスコ培地のための培地を用いて振盪フラスコを調製した。それぞれの菌株の接種物を、グルコースを含む標準振盪フラスコ培地内で成長させた。０．５ｍＬの接種物を用いて４９．５ｍＬの実験培地に接種した。それぞれの菌株に関して６つの異なるタイプの培地を用いた。培地の１つのタイプは、試験したそれぞれのタイプの糖（グルコース、スクロース、グリセロール、フルクトース、キシロース）、及び接種からの栄養素の繰り越しの結果として起こった成長に関する対照試料として添加有機炭素を含まない更なる培地に対応していた。それぞれの菌株を、振盪フラスコ内のそれぞれのタイプの培地内において、２２．５℃及び２００ｒｐｍで７日間成長させた。それぞれのフラスコの内容物を遠心分離によって採取し、洗浄し、凍結乾燥し、バイオマス重量を測定した。１ｇ／Ｌより多いバイオマス乾燥重量を与えた試料に関して、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）分析によって全脂肪含量を求めた。１ｇ／Ｌ未満のバイオマス重量を有する試料は、分析のために十分な物質を生成しなかった。
【０１７２】
実施例３：
スクロース上で成長させた実施例２からの７つの酵母菌株を、予備抽出試験のために用いた。３つのステンレススチール球を有するスエディッシュチューブ内において、１０ｍＬのヘキサンを１ｇの凍結乾燥したバイオマスに加えた。チューブを高速で３時間振盪した。２５ミクロンの濾紙を用いて混合物を濾過した。バイオミールを、各回更に１０ｍＬのヘキサンで３回洗浄し、各回濾過して混合濾液を形成した。濾液を合わせて蒸発させ、回収された油を秤量した。エステル化したバイオマス及びバイオミール試料を用いて抽出収率を計算した。
【０１７３】
また、水性抽出手順を用いて同じ７つの菌株を評価した。１ｇの凍結乾燥したバイオマスを６ｇの水で戻して、約１４％のバイオマスを有する溶液を調製した。この溶液を、標準抽出法を用いて処理した。溶媒としてヘキサンを用いた抽出収率は、異なる菌株に関して４８％〜９４％の範囲であった。Schizochytriumは８６％の抽出収率を有していた。幾つかの菌株は予測されるよりも強い細胞壁を有することができ、細胞を有効に破壊するために更なる工程を行うことができる。標準抽出手順からは相当量の油層は存在しなかった。1幾つかの菌株に関しては小数の小さい油滴が存在する可能性があったが、収率はなお比較的低かった。酵母菌株に関して抽出手順を修正すると収率を向上させることができる。
【０１７４】
スクロース：
スクロース培地上で産生する２６の菌株を分析したところ、１．３ｇ／Ｌ〜３．１ｇ／Ｌの乾燥バイオマス重量を有していた。同定された菌株は、乾燥重量で３６％〜７３％の脂肪酸含量を有していた。同定された菌株は、０％〜１７％の１４：０、１３％〜３３％の１６：０、０％〜１３％の１６：１、１％〜２４％の１８：０、３％〜５９％の１８：１、０％〜２９％の１８：２、０％〜９％の１８：３、及び０〜３１％の多不飽和脂肪酸含量を有する脂肪酸プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）を産生した。
【０１７５】
Rhodotorula及びRhodosporidium属の一員は、一貫して、自然分離株及び公的に入手可能な菌株からのより良好に機能するものの中に含まれていた。更に、Sporobolomyces及びSporidiobolus属の一員も、他の属よりも良好に機能した。これらの４つの属は油性であり、バイオ燃料の製造のために好適であることが分かった。更なる２つの属、Pseudozyma及びCryptococcusも、良好に機能するものであることが分かった。具体的には、Pseudozymaは２ｇ／Ｌの乾燥バイオマス重量、及び乾燥重量で５７％の脂肪酸含量を有していた。Pseudozymaは、０％の１４：０、１３％の１６：０、３％の１６：１、４％の１８：０、５９％の１８：１、１４％の１８：２、０％の１８：３、及び０％の多不飽和脂肪酸含量を有する脂肪酸プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）を産生した。
【０１７６】
キシロース：
キシロース培地上で産生する１２の菌株を分析したところ、０．４ｇ／Ｌ〜２．９ｇ／Ｌの乾燥バイオマス重量を有していた。同定された菌株は３８％〜６９％の脂肪酸含量を有していた。同定された菌株は、０％〜１％の１４：０、１２％〜３２％の１６：０、０％〜１２％の１６：１、２％〜５２％の１８：０、１４％〜５０％の１８：１、１０％〜３２％の１８：２、０％〜７％の１８：３、及び０％〜２％の多不飽和脂肪酸含量を有する脂肪酸プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）を産生した。
【０１７７】
キシロース培地内で分析した菌株の幾つかは、高い脂肪酸蓄積を有する限られた数の菌株を与えた。概して、これらの菌株は他の糖に匹敵する脂肪酸蓄積は有していなかった。３つの菌株のみが５０％より多い脂肪酸含量を有していた。酵母はキシロース分離株として他の菌株よりも良好に機能する傾向を有しており、殆どはスクロース上でより良好に機能する菌株の中にも含まれていた。具体的には、Pseudozymaは、２ｇ／Ｌの乾燥バイオマス重量、及び乾燥重量で５５％の脂肪酸含量を有していた。Pseudozymaは、１％の１４：０、１６％の１６：０、４％の１６：１、５％の１８：０、５０％の１８：１、１６％の１８：２、０％の１８：３、及び０％の多不飽和脂肪酸含量を有する脂肪酸プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）を産生した。
【０１７８】
グルコース：
グルコース培地上で産生する２６の菌株を分析したところ、２．０ｇ／Ｌ〜３．３ｇ／Ｌの乾燥バイオマス重量を有していた。同定された菌株は、乾燥重量で５０％〜８０％の脂肪酸含量を有していた。同定された菌株は、０％〜２６％の１４：０、１８％〜４２％の１６：０、０％〜２５％の１６：１、０％〜２６％の１８：０、５％〜５４％の１８：１、０％〜２６％の１８：２、０％〜６％の１８：３、及び０％〜２３％の多不飽和脂肪酸含量を有する脂肪酸プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）を産生した。
【０１７９】
Schizochytriumのような微細藻類の分離株は、グルコース培地において他の菌株よりも良好に機能した。これらの菌株の殆どは少なくとも６０％の脂肪酸含量レベルを有しており、幾つかは７０％より高い脂肪酸含量を有していた。多数の菌株はグルタミン酸モノナトリウム及び酵母エキスを含む元々のスクリーニング培地においては良好に成長したが、変性培地においてグルコース上では良好に成長しなかった。具体的には、Schizochytriumは、２．８ｇ／Ｌの乾燥バイオマス重量、及び乾燥重量で６７％の脂肪酸含量を有していた。Schizochytriumは、１９％の１４：０、３１％の１６：０、２１％の１６：１、１％の１８：０、６％の１８：１、０％の１８：２、０％の１８：３、及び２１％の多不飽和脂肪酸含量を有する脂肪酸プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）を産生した。
【０１８０】
フルクトース：
フルクトース培地上で産生する２０の菌株を分析したところ、２．０ｇ／Ｌ〜３．４ｇ／Ｌの乾燥バイオマス重量を有していた。同定された菌株は、乾燥重量で３７％〜８１％の脂肪含量を有していた。同定された菌株は、０％〜２７％の１４：０、１７％〜４５％の１６：０、０％〜１７％の１６：１、０％〜２４％の１８：０、５％〜４６％の１８：１、０％〜３０％の１８：２、０％〜７％の１８：３、及び０％〜２３％の多不飽和脂肪酸含量を有する脂肪酸プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）を産生した。
【０１８１】
Schizochytriumのような微細藻類の分離株は、フルクトース培地において他の菌株よりも良好に機能した。これらの菌株の殆どは乾燥重量％として少なくとも６０％の脂肪酸を有しており、幾つかは７０％より高かった。グルコース及びフルクトース上で最高の性能を発揮するものの間に相当なオーバーラップがあった。具体的には、Schizochytriumは、２．７ｇ／Ｌの乾燥バイオマス重量、及び乾燥重量で６５％の脂肪酸含量を有していた。Schizochytriumは、２０％の１４：０、３２％の１６：０、１７％の１６：１、１％の１８：０、６％の１８：１、０％の１８：２、０％の１８：３、及び２３％の多不飽和脂肪酸含量を有する脂肪酸プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）を産生した。
【０１８２】
グリセロール：
グリセロール培地上で産生する２０の菌株を分析したところ、２ｇ／Ｌ〜３．５ｇ／Ｌの乾燥バイオマス重量を有していた。同定された菌株は、乾燥重量で３８％〜７４％の脂肪酸含量を有していた。同定された菌株は、１％〜２２％の１４：０、１７％〜４３％の１６：０、０％〜２３％の１６：１、０％〜２６％の１８：０、６％〜４４％の１８：１、０％〜１６％の１８：２、０％〜５％の１８：３、及び０％〜２８％の多不飽和脂肪酸含量を有する脂肪酸プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）を産生した。
【０１８３】
Schizochytriumのような微細藻類の分離株は、フルクトース培地において他の菌株よりも良好に機能した。これらの菌株の多くは少なくとも６０％の脂肪酸含量を有しており、グルコース及びフルクトースの両方に関する藻類菌株の間に相当なオーバーラップがあった。具体的には、Schizochytriumは、３．４ｇ／Ｌの乾燥バイオマス重量、及び乾燥重量で６８％の脂肪酸含量を有していた。Schizochytriumは、１９％の１４：０、２８％の１６：０、２２％の１６：１、１％の１８：０、７％の１８：１、０％の１８：２、０％の１８：３、及び２１％の多不飽和脂肪酸含量を有する脂肪酸プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）を産生した。更に、Pseudozymaは、２ｇ／Ｌの乾燥バイオマス重量、及び６２％又は１．２ｇ／Ｌの脂肪含量を有していた。Pseudozymaは、１％の１４：０、２１％の１６：０、５％の１６：１、７％の１８：０、４４％の１８：１、１５％の１８：２、０％の１８：３、及び０％の多不飽和脂肪酸含量を有する脂肪酸プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）を産生した。
【０１８４】
異なる培地にわたる評価のために選択された菌株において、広範囲の脂肪酸プロファイルが観察された。脂肪酸プロファイル（全脂肪酸の重量％として表す）は、５０％より多い量〜１％未満の多不飽和脂肪酸、及び６０％より多い量〜５％未満のモノ不飽和脂肪酸の範囲であった。一般に、微細藻類は最も広い範囲の脂肪酸を有しており、一方、酵母は全て、比較的高いモノ不飽和物を有する相対的に非常に低い多不飽和脂肪酸であった。一般に、酵母菌株は、目標のナタネのプロファイルに少なくとも多少類似している脂肪酸プロファイルを有していた。
【０１８５】
公共カルチャーコレクションの菌株に関して、幾つかの代表的な菌株を評価のために公共カルチャーコレクションから注文した。これらの菌株の７つは、グルコース及びフルクトースを含む培地上でまあまあ良く成長した。Lipomyces starkeyiは２つの別の場合に成長しなかった。これらの菌株の２つ（Rhodotortula glutinis及びPseudozyma aphidis）は、スクロース上で良好な成長及び脂肪酸蓄積を有していた。公共の菌株はいずれも、キシロース上で良好な成長又は脂肪酸蓄積を有しなかった。
【０１８６】
実施例４：
より低い塩分濃度（塩化物）条件（海洋環境から始めに単離してから継続して）における脂肪酸蓄積速度及び脂肪酸を産生するそれらの能力をより良く理解するための追跡フラスコ実験のために、実施例３からのスクロース上で良好な脂肪酸産生を有する主要な菌株を用いた。それぞれの菌株を、振盪フラスコ培地内の振盪フラスコ内で、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の４つの異なるレベル（２５ｇ／Ｌ、１２．５ｇ／Ｌ、０．６２５ｇ／Ｌ、及び０ｇ／Ｌ）において成長させた。全てのフラスコを、振盪しながら２２．５℃において２００ｒｐｍでインキュベートした。それぞれの菌株に関してそれぞれの塩分濃度条件からの１つのフラスコを毎日採取し、乾燥バイオマス重量及び脂肪酸含量を測定した。
【０１８７】
図５及び６に、時間に対する異なる塩化ナトリウムレベルに関するPseudozymaに関するバイオマス及び脂肪のパーセントを示す。
これら６つの菌株は全て、概して、より低い塩化物レベル（０ｇ／Ｌ又は０．６２５ｇ／ＬのＮａＣｌ）において、２５ｇ／Ｌの通常のＮａＣｌレベルと同等か又はこれよりも良好に成長した。同時に、全ての菌株は、低塩化物条件下において相当量の脂肪酸を蓄積した。このデータは、酵母菌株に関して塩分濃度レベルを減少させても、脂肪酸蓄積に対して負の影響はなく、実際に生産性が向上させることができることを示唆している。
【０１８８】
実施例５：
本実施例においては、thraustochytrid Schizochytrium sp.（ＡＴＣＣ２０８８８）を、１００ＬのNew Brunswick Scientific（Edison, New Jersey,米国）BioFlo 6000発酵槽内において、炭素（グルコース）及び窒素（水酸化アンモニウム）供給バッチプロセスを用いて培養した。発酵槽に６Ｌの培養物を接種した。接種物の増殖のために、１４ＬのVirTis（SP Scientific Gardiner, New York,米国）発酵槽を用いた。接種培地は、４つの別々のグループで調製した１０Ｌの培地を含んでいた。グループＡは、９８ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、２０２ｇのＮａ２ＳＯ４、５ｇのＫＣｌ、２２．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２３．１ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１４．７ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．９ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１７．７ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１８．１ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１１．８ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１１．８ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、及び２ｍＬのDow（Midland, Michgan,米国）1520US（消泡剤）を含んでいた。約９．５Ｌの体積のグループＡを、接種発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、２．９４ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び１ｇのクエン酸を含む１Ｌの貯蔵液の２０ｍＬを含んでいた。グループＢの貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、１０ｍＬ中に溶解して濾過滅菌した、３７．６ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．９ｍｇのビタミンＢ１２、及び１．９ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＤは、４００ｇのグルコース粉末を含む１，０００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２９．５℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を５．５にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。
【０１８９】
接種発酵槽に１８ｍＬの標準ＡＴＣＣ２０８８８振盪フラスコ培養物を接種し、２９．５℃、ｐＨ５．５、３５０ｒｐｍの撹拌、及び８Ｌ／分の空気において２７時間培養し、その時点で６Ｌの接種ブロスを１００Ｌの発酵槽に移した。１００Ｌの発酵槽は８０Ｌの発酵培地を含んでいた。発酵培地は、接種発酵槽と同様の方法で調製した。発酵培地は７つのバッチ培地グループを含んでいた。グループＡは、１，０８９．６ｇのＮａ２ＳＯ４、５７．６ｇのＫ２ＳＯ４、４４．８ｇのＫＣｌ、１８１．６ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び９０．４ｇのＫＨ２ＰＯ４を含んでいた。約３５Ｌの体積のグループＡを、１００Ｌの発酵槽内で１２２℃において６０分間蒸気滅菌した。グループＢは、約５００ｍＬの体積の、９０．４ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、及び１０．４ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＣは、約２００ｍＬの体積の１５．２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＤは、約２Ｌの蒸留水中の１，２００ｇの粉末グルコースを含んでいた。グループＥは、約１Ｌの体積の、２４８ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２４８ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．２ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．２ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１６５．６ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び１６５．６ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＦは、約２８０ｍＬの体積の、８２４ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び２８０．３ｍｇのクエン酸を含んでいた。グループＧは、約６７．４ｍＬの体積の蒸留水中の、濾過滅菌した、７８０ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１２．８ｍｇのビタミンＢ１２、及び２６６．４ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧを混合し、発酵槽が２９．５℃の運転温度に達した後に発酵槽に加えた。接種前の発酵槽の容積は約３８Ｌであった。
【０１９０】
発酵槽に、上記に記載の発酵からの６Ｌのブロスを接種した。４Ｎ−水酸化アンモニウムの５．４Ｌの溶液を用いて、発酵を５．５のｐＨにｐＨ制御した。１８０ｒｐｍ〜４８０ｒｐｍの撹拌及び６０Ｌ／分〜１００Ｌ／分の空気流を用いて、溶解酸素を発酵の間中５％〜２０％の間に制御した。発酵の間を通して、９５％デキストロースの８５０ｇ／Ｌ溶液３８．４Ｌを供給して、５０ｇ／Ｌ未満の濃度を維持した。６５時間後、発酵槽は、６，０５６ｇの脂肪酸を含む９，７９７ｇのバイオマスを含んでいた。得られた培養物の全脂肪酸生産性は３０．３ｇ／Ｌ・日であり、得られた脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．２１４であった。
【０１９１】
実施例６：
本実施例においては、thraustochytrid Schizochytrium sp.（ＡＴＣＣ２０８８８）を、１００ＬのNew Brunswick Scientific BioFlo 6000発酵槽内において、炭素（グルコース／フルクトース）及び窒素（水酸化アンモニウム）供給バッチプロセスを用いて培養した。発酵槽に６Ｌの半連続接種培養物を接種した。接種物の増殖のために、１４ＬのVirTis発酵槽を用いた。接種培地は、４つの別々のグループで調製した１０Ｌの培地を含んでいた。グループＡは、９８ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、２０２ｇのＮａ２ＳＯ４、５ｇのＫＣｌ、２２．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２３．１ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１４．７ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．９ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１７．７ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１８．１ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１１．８ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１１．８ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、及び２ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約９．５Ｌの体積のグループＡを、接種発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、２．９４ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び１ｇのクエン酸を含む１Ｌの貯蔵液の２０ｍＬを含んでいた。グループＢの貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、１０ｍＬの蒸留水中に溶解して濾過滅菌した、３７．６ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．９ｍｇのビタミンＢ１２、及び１．９ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＤは、４００ｇのグルコース粉末を含む１，０００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２９．５℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を５．５にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。
【０１９２】
接種発酵槽に１８ｍＬの標準ＡＴＣＣ２０８８８振盪フラスコ培養物を接種し、２９．５℃、ｐＨ５．５、３５０ｒｐｍの撹拌、及び８Ｌ／分の空気において２３時間培養し、その時点で５Ｌを発酵槽から採取した。残りの５Ｌの発酵ブロスに、５Ｌの新しく調製した培地を接種発酵槽に加えて戻した。更に５．３時間培養した後、６Ｌの接種ブロスを１００Ｌの発酵槽に移した。１００Ｌの発酵槽は８０Ｌの発酵培地を含んでいた。発酵培地は、接種発酵槽と同様の方法で調製した。発酵培地は７つのバッチ培地グループを含んでいた。グループＡは、１，０８９．６ｇのＮａ２ＳＯ４、５７．６ｇのＫ２ＳＯ４、４４．８ｇのＫＣｌ、１８１．６ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び９０．４ｇのＫＨ２ＰＯ４を含んでいた。約３５Ｌの体積のグループＡを、１００Ｌの発酵槽内で１２２℃において６０分間蒸気滅菌した。グループＢは、約５００ｍＬの体積の、９０．４ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、及び１０．４ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＣは、約２００ｍＬの体積の１５．２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＤは、約２Ｌの蒸留水中の６００ｇの粉末グルコース及び６００ｇの粉末フルクトースを含んでいた。グループＥは、約１Ｌの体積の、２４８ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２４８ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．２ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．２ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１６５．６ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び１６５．６ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＦは、約２８０ｍＬの体積の蒸留水中の、８２４ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び２８０．３ｍｇのクエン酸を含んでいた。グループＧは、約６７．４ｍＬの体積の蒸留水中の、濾過滅菌した、７８０ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１２．８ｍｇのビタミンＢ１２、及び２６６．４ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧを混合し、発酵槽が２９．５℃の運転温度に達した後に発酵槽に加えた。接種前の発酵槽の容積は約３８Ｌであった。
【０１９３】
発酵槽に、上記に記載の発酵からの６Ｌのブロスを接種した。４Ｎ−水酸化アンモニウムの５．４Ｌの溶液を用いて、発酵を５．５のｐＨにｐＨ制御した。１８０ｒｐｍ〜４８０ｒｐｍの撹拌及び６０Ｌ／分〜１２５Ｌ／分の空気流を用いて、溶解酸素を発酵の間中２％〜３５％の間に制御した。発酵の間を通して、５０／５０フルクトース／デキストロースの８５０ｇ／Ｌ溶液３７．９Ｌを供給して、１００ｇ／Ｌ未満の濃度を維持した。９５時間後、発酵槽は、５，４６３ｇの脂肪酸を含む８，５７５ｇのバイオマスを含んでいた。このグルコース／フルクトースを用いた供給バッチプロセスは、０．１４の培養物の脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）、及び１７．３ｇ／Ｌ・日の全脂肪酸生産性を与えた。
【０１９４】
実施例７：
本実施例においては、thraustochytrid Schizochytrium sp.（ＡＴＣＣ２０８８８）を、１０ＬのNew Brunswick Scientific BioFlo 3000発酵槽内において、炭素（グルコース／フルクトース）非滅菌供給バッチプロセスを用いて培養した。発酵槽に１．８Ｌの培養物を接種した。接種物の増殖のために、３ＬのBroadley James（Irvine, California,米国）BioNet発酵槽を用いた。接種培地は、６つの別々のグループで調製した２Ｌの培地を含んでいた。グループＡは、４０．８６ｇのＮａ２ＳＯ４、２．１６ｇのＫ２ＳＯ４、１．６８ｇのＫＣｌ、６．８１ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び３．３９ｇのＫＨ２ＰＯ４を含んでいた。グループＢは、０．５７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＣは、１１．３ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、及び１．３ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＤは、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３１ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、３１ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＤは、蒸留水中に溶解して濾過滅菌した、９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．６ｍｇのビタミンＢ１２、及び３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＥは、６０ｇの５０／５０グルコース／フルクトース粉末を含む約１００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２９．５℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、Ｄ、及びＥを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を５．５にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。
【０１９５】
４Ｎ−水酸化アンモニウムの０．６７８Ｌの溶液を用いて、接種発酵を５．５のｐＨにｐＨ制御した。接種発酵槽に１５０ｍＬの標準ＡＴＣＣ２０８８８振盪フラスコ培養物を接種し、２９．５℃、ｐＨ５．５（ＮＨ４ＯＨを用いた）、６３６ｒｐｍ〜１，２００ｒｐｍの撹拌、及び０．８Ｌ／分の空気において５５．２５時間培養し、その時点で１．８Ｌの接種ブロスを１４Ｌの発酵槽に移した。１４Ｌの発酵槽は１０Ｌの発酵非滅菌塩溶液を含んでいた。外気条件下において、成分の滅菌を行わないで、発酵培地を発酵槽に加えた。発酵培地は、約６Ｌの蒸留水中の以下の培地成分：９５．３４ｇのＮａ２ＳＯ４、５．０４ｇのＫ２ＳＯ４、３．９２ｇのＫＣｌ、１５．８９ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３３ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及び９０ｇの粉末５０／５０フルクトース／グルコースを含んでいた。
【０１９６】
発酵槽が２９．５℃の安定な運転温度に達した後、発酵槽に、上記に記載の発酵からの１．８Ｌのブロスを接種した。発酵はｐＨ制御しなかった。３００ｒｐｍ〜５８０ｒｐｍの撹拌及び６Ｌ／分〜８Ｌ／分の空気流を用いて、溶解酸素を発酵の間中２０％の目標値に維持するように制御した。発酵の間を通して、５０／５０グルコース／フルクトースの加熱した非滅菌の８５０ｇ／Ｌ溶液１．８４５Ｌを供給して、１２０ｇ／Ｌ未満の全糖濃度を維持した。６２時間後、発酵槽は、５１９．７ｇの脂肪酸を含む８４７．８ｇのバイオマスを含んでいた。この発酵の脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１９であり、全脂肪酸生産性は２０．３ｇ／Ｌ・日であった。グルコース／フルクトースを用いた滅菌成長段階及び非滅菌産生段階を有するこの２段階発酵は、グルコース／フルクトースの混合供給流を用いた標準的な供給バッチ条件（実施例６）と比べて、脂肪酸産生及び脂肪酸収率が実質的に向上した。
【０１９７】
実施例８：
本実施例においては、独立分類機関によってPseudozyma aphidis及びPseudozyma rugulosaの両方（この場合には形態に基づく更なる区別を行うことはできない可能性がある）のＤＮＡ一致（リボソーム遺伝子のＤ１／Ｄ２及びＩＴＳ領域についてのＤＮＡシーケンシング）に９９％超類似していると確認された酵母Pseudozyma sp.（ＡＴＣＣ１１６１５）を、１４ＬのNew Brunswick Scientific BioFlo 3000発酵槽内において、炭素（グルコース）及び窒素（水酸化アンモニウム）供給バッチプロセスを用いて培養した。発酵に０．４Ｌの接種培養物を接種した。接種物の増殖のために、３ＬのBroadley James BioNet発酵槽を用いた。接種培地は、４つの別々のグループで調製した２Ｌの培地を含んでいた。グループＡは、１８ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、１．２５ｇのＮａＣｌ、０．５８ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｇのＫＣｌ、１０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．７４ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、１．０４ｇのＫＨ２ＰＯ４、及び０．２ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約１．８Ｌの体積のグループＡを、接種発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、９ｍＬの体積の蒸留水中の、２０．６ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３６．８８ｍｇのクエン酸、６．２ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、６．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０８ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０８ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．１４ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び４．１４ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＢ貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、２ｍＬの蒸留水中に溶解して濾過滅菌した、１９．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、０．３２ｍｇのビタミンＢ１２、及び６．６６ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＤは、１００ｇのグルコース粉末を含む２００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２２．５℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を６．９にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。
【０１９８】
接種発酵槽に５ｍＬの標準振盪フラスコ培養物を接種し、２２．５℃、ｐＨ７、４３０ｒｐｍ〜８５０ｒｐｍの撹拌、及び０．５Ｌ／分〜１．０Ｌ／分の空気において２６時間培養し、その時点で０．４Ｌを発酵槽から採取して１４Ｌの発酵槽に移した。１４Ｌの発酵槽は１０Ｌの発酵培地を含んでいた。発酵培地は接種発酵槽と同様の方法で調製した。発酵培地は４つのバッチ培地グループを含んでいた。グループＡは、５０ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、６．２５ｇのＮａＣｌ、２０ｇのＮａ２ＳＯ４、２．９ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｇのＫＣｌ、５０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．４ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、１７．７ｇのＫＨ２ＰＯ４、及び１．００ｍＬのDOW 1520US（消泡剤）を含んでいた。約５．５Ｌの体積のグループＡを、発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、４５ｍＬの体積の蒸留水中の、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１８４．４ｍｇのクエン酸、３１ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、３１ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＢ貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、１０ｍＬの蒸留水中に溶解して濾過滅菌した、９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．６ｍｇのビタミンＢ１２、３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩、及び３６．５μｇのビオチンを含んでいた。グループＤは、３００ｇのグルコース粉末を含む５００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２２．５℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を６．５にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。
【０１９９】
接種前の発酵槽の容積は約５．５Ｌであった。発酵槽に、上記に記載の発酵からの０．４Ｌのブロスを接種した。４Ｎ−水酸化アンモニウムの０．８８３Ｌの溶液を用いて発酵を６．５のｐＨにｐＨ制御した。２９０ｒｐｍ〜１，０００ｒｐｍの撹拌及び９．５Ｌ／分の空気流を用いて、溶解酸素を発酵の間中２０％の目標設定値に維持するように制御した。発酵の間を通して、デキストロースの８５０ｇ／Ｌ溶液３．７５Ｌを供給して、６０ｇ／Ｌ未満の濃度を維持した。９５時間後、発酵槽は、５８１．５ｇの脂肪酸を含む１，１７２．７ｇのバイオマスを含んでいた。２２．５℃、ｐＨ６．５、及び１Ｘ窒素における脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１３８であり、全脂肪酸生産性は１４．７ｇ／Ｌ・日であった。
【０２００】
実施例９：
本実施例においては、酵母Pseudozyma sp.（ＡＴＣＣ１１６１５）を、１４ＬのNew Brunswick Scientific BioFlo 3000発酵槽内において、炭素（グルコース）及び窒素（水酸化アンモニウム）供給バッチプロセスを用いて培養した。発酵に０．５Ｌの接種培養物を接種した。接種物の増殖のために、３ＬのBroadley James BioNet発酵槽を用いた。接種培地は、４つの別々のグループで調製した２Ｌの培地を含んでいた。グループＡは、１８ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、１．２５ｇのＮａＣｌ、０．５８ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｇのＫＣｌ、１０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．７４ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、１．０４ｇのＫＨ２ＰＯ４、及び０．２ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約１．８Ｌの体積のグループＡを、発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、９ｍＬの体積の、２０．６ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３６．８８ｍｇのクエン酸、６．２ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、６．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０８ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０８ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．１４ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び４．１４ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＢ貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、２ｍＬの蒸留水中に溶解して濾過滅菌した、１９．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、０．３２ｍｇのビタミンＢ１２、及び６．６６ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＤは、１００ｇのスクロース粉末を含む２００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２９℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を６．５にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。
【０２０１】
接種発酵槽に５ｍＬの標準振盪フラスコ培養物を接種し、２９℃、ｐＨ６．５、６３４ｒｐｍの撹拌、及び１．０Ｌ／分の空気において２２．５時間培養し、その時点で０．５Ｌを発酵槽から採取して１４Ｌの発酵槽に移した。１４Ｌの発酵槽は１０Ｌの発酵培地を含んでいた。発酵培地は接種発酵槽と同様の方法で調製した。発酵培地は４つのバッチ培地グループを含んでいた。グループＡは、５０ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、６．２５ｇのＮａＣｌ、２０ｇのＮａ２ＳＯ４、２．９ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｇのＫＣｌ、５０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．４ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、１７．７ｇのＫＨ２ＰＯ４、及び１．０ｍＬのDOW 1520US（消泡剤）を含んでいた。約５．５Ｌの体積のグループＡを、発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、４５ｍＬの体積の、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１８４．４ｍｇのクエン酸、３１ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、３１ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＢ貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、１０ｍＬ中に溶解して濾過滅菌した、９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．６ｍｇのビタミンＢ１２、３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩、及び３６．５μｇのビオチンを含んでいた。グループＤは、３００ｇのスクロース粉末を含む５００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２９℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を５．５にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。接種前の発酵槽の容積は約４．８Ｌであった。
【０２０２】
発酵槽に、上記に記載の発酵からの０．５Ｌのブロスを接種した。６Ｎ−水酸化アンモニウムの０．４８Ｌの溶液を用いて発酵を６．５のｐＨにｐＨ制御した。３５７ｒｐｍ〜８３３ｒｐｍの撹拌及び８Ｌ／分〜１３Ｌ／分の空気流を用いて、溶解酸素を発酵の間中２０％の目標設定値に維持するように制御した。発酵の間を通して、スクロースの８５０ｇ／Ｌ溶液３．３Ｌを供給して、全糖（グルコース＋フルクトース＋スクロース）の濃度を９０ｇ／Ｌ未満に維持した。７０時間後、発酵槽は、４０２．８ｇの脂肪酸を含む９８４．９ｇのバイオマスを含んでいた。２９．５℃、ｐＨ５．５、及び１Ｘ窒素における脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１４５であり、全脂肪酸生産性は１３．８ｇ／Ｌ・日であった。
【０２０３】
実施例１０：
本実施例においては、酵母Pseudozyma sp.（ＡＴＣＣ１１６１５）を、１４ＬのNew Brunswick Scientific BioFlo 3000発酵槽内において、炭素（グルコース）及び窒素（水酸化アンモニウム）供給バッチプロセスを用いて培養した。発酵に０．５Ｌの接種培養物を接種した。接種物の増殖のために、３ＬのBroadley James BioNet発酵槽を用いた。接種培地は、４つの別々のグループで調製した２Ｌの培地を含んでいた。グループＡは、１８ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、１．２５ｇのＮａＣｌ、０．５８ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｇのＫＣｌ、１０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．７４ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、１．０４ｇのＫＨ２ＰＯ４、及び０．２ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約１．８Ｌの体積のグループＡを、接種発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、９ｍＬの体積の蒸留水中の、２０．６ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３６．８８ｍｇのクエン酸、６．２ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、６．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０８ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０８ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．１４ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び４．１４ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＢ貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、２ｍＬの蒸留水中に溶解して濾過滅菌した、１９．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、０．３２ｍｇのビタミンＢ１２、及び６．６６ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＤは、１００ｇのスクロース粉末を含む２００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２９℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を６．５にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。
【０２０４】
接種発酵槽に５ｍＬの標準振盪フラスコ培養物を接種し、２９℃、ｐＨ６．５、６３４ｒｐｍの撹拌、及び１．０Ｌ／分の空気において２２．５時間培養し、その時点で０．５Ｌを発酵槽から採取して１４Ｌの発酵槽に移した。１４Ｌの発酵槽は１０Ｌの発酵培地を含んでいた。発酵培地は接種発酵槽と同様の方法で調製した。発酵培地は４つのバッチ培地グループを含んでいた。グループＡは、５０ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、６．２５ｇのＮａＣｌ、２０ｇのＮａ２ＳＯ４、２．９ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｇのＫＣｌ、５０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．４ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、１７．７ｇのＫＨ２ＰＯ４、及び１．０ｍＬのDOW 1520US（消泡剤）を含んでいた。約５．５Ｌの体積のグループＡを、接種発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、４５ｍＬの体積の蒸留水中の、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１８４．４ｍｇのクエン酸、３１ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、３１ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＢ貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、１０ｍＬ中に溶解して濾過滅菌した、９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．６ｍｇのビタミンＢ１２、３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩、及び３６．５μｇのビオチンを含んでいた。グループＤは、３００ｇのスクロース粉末を含む５００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２９℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を５．５にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。接種前の発酵槽の容積は約４．８Ｌであった。
【０２０５】
発酵槽に、上記に記載の発酵からの０．５Ｌのブロスを接種した。６Ｎ−水酸化アンモニウムの０．２８Ｌの溶液を用いて発酵を６．５のｐＨにｐＨ制御した。３５７ｒｐｍ〜８３３ｒｐｍの撹拌及び８Ｌ／分〜１３Ｌ／分の空気流を用いて、溶解酸素を発酵の間中２０％の目標設定値に維持するように制御した。発酵の間を通して、スクロースの８５０ｇ／Ｌ溶液３．７Ｌを供給して、全糖（グルコース＋フルクトース＋スクロース）の濃度を９０ｇ／Ｌ未満に維持した。７０時間後、発酵槽は、５３５．８ｇの脂肪酸を含む１，１２６．９ｇのバイオマスを含んでいた。最終細胞密度は、乾燥重量で１１３ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は細胞乾燥重量の４７．５％であり、平均脂肪酸生産性は１８．３ｇ／Ｌ・日であり、得られた培養物の脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１７５であった。６時間にわたって測定した培養物の最高ピーク脂肪酸生産性は６９．６ｇ／Ｌ・日であった。２４時間にわたって測定した培養物の最高ピーク脂肪酸生産性は５０．４ｇ／Ｌ・日であった。２９．５℃、ｐＨ５．５、及び０．５Ｘ窒素における脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１７５ｇ／ｇであった。酸素あたりの脂肪酸の収率（消費した酸素１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．４２ｇ／ｇであった。実施例８、９、及び１０は、グルコースの代わりに炭素源としてスクロースを用い、発酵温度を上昇させ、発酵ｐＨを低下させ、及び窒素投入量を減少させることによって脂肪酸収率を増加させることができることを示す。下表１に、発酵中の時間ｖｓ測定された変数を示す。
【０２０６】
【表１】
2013521778.tif 000002
【０２０７】
実施例１１：
本実施例においては、thraustochytrid Schizochytrium sp.（ＡＴＣＣ２０８８８）を、１４ＬのNew Brunswick Scientific BioFlo 3000発酵槽内において、第１（５０／５０グルコース／フルクトース）及び第２（グリセロール）炭素供給、並びに窒素（水酸化アンモニウム）供給バッチプロセスを用いて培養した。発酵に０．５Ｌの半連続接種培養物を接種した。接種物の増殖のために、１４ＬのVirTis発酵槽を用いた。接種培地は、４つの別々のグループで調製した１０Ｌの培地を含んでいた。グループＡは、９８ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、２０２ｇのＮａ２ＳＯ４、５ｇのＫＣｌ、２２．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２３．１ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１４．７ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．９ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１７．７ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１８．１ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１１．８ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１１．８ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、及び２ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約９．５Ｌの体積のグループＡを、接種発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、２．９４ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び１ｇのクエン酸を含む１Ｌの貯蔵液の２０ｍＬを含んでいた。グループＢの貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、１０ｍＬの蒸留水中に溶解して濾過滅菌した、３７．６ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．９ｍｇのビタミンＢ１２、及び１．９ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＢは、４００ｇのグルコース粉末を含む１，０００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２９．５℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を５．５にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。
【０２０８】
接種発酵槽に１８ｍＬの標準ＡＴＣＣ２０８８８振盪フラスコ培養物を接種し、２９．５℃、ｐＨ５．６、３９０ｒｐｍの撹拌、及び８Ｌ／分の空気において２４時間培養し、その時点で４Ｌを発酵槽から採取した。残りの６Ｌの発酵ブロスに、４Ｌの新しく調製した培地を接種発酵槽に加えて戻した。
【０２０９】
更に１．２５時間培養した後、０．５Ｌの接種ブロスを１４Ｌの発酵槽に移した。１４Ｌの発酵槽は１０Ｌの発酵培地を含んでいた。発酵培地は、接種発酵槽と同様の方法で調製した。発酵培地は７つのバッチ培地グループを含んでいた。グループＡは、１３６．２ｇのＮａ２ＳＯ４、７．２ｇのＫ２ＳＯ４、５．６ｇのＫＣｌ、２２．７ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び１１．３ｇのＫＨ２ＰＯ４を含んでいた。約５Ｌの体積のグループＡを、１４Ｌの発酵槽内で１２１℃において約８０分間オートクレーブ処理した。グループＢは、約２００ｍＬの体積の、１１．３ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、及び１．３ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＣは、約５０ｍＬの体積の１．９ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＤは、約２．５Ｌの蒸留水中の１５０ｇの粉末グルコース／フルクトースを含んでいた。グループＥは、約０．２Ｌの体積の、３１ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、３１ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＦは、約３５ｍＬの体積の、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び３５ｍｇのクエン酸を含んでいた。グループＧは、約８．４ｍＬの体積の蒸留水中の、濾過滅菌した、９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．６ｍｇのビタミンＢ１２、及び３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧを混合し、発酵槽が２９．５℃の運転温度に達した後に発酵槽に加えた。接種前の発酵槽の容積は約５Ｌであった。
【０２１０】
発酵槽に、上記に記載の半連続発酵からの０．５Ｌのブロスを接種した。４Ｎ−水酸化アンモニウムの０．６７８Ｌの溶液を用いて、発酵を５．５のｐＨにｐＨ制御した。２５０ｒｐｍ〜１，２００ｒｐｍの撹拌及び７．５Ｌ／分〜１２Ｌ／分の空気流を用いて、溶解酸素を発酵の間中０．１％より高く制御した。発酵の間を通して、５０／５０グルコース／フルクトースの８５０ｇ／Ｌ溶液２．８Ｌを供給して、１００ｇ／Ｌ未満の濃度を維持した。同時に、６２５ｇ／Ｌのグリセロール溶液１．３５Ｌを供給して、２〜２０ｇ／Ｌの濃度を維持した。９１時間後、発酵槽は、６４２．４ｇの脂肪酸を含む１，４３３．６ｇのバイオマスを含んでいた。この発酵においては、脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１８６であり、全脂肪酸生産性は２４．３ｇ／Ｌ・日であった。実施例６の結果（１７．３ｇ／Ｌ・日の全脂肪酸生産性）と比べると、本実施例は、炭素及び窒素供給バッチ条件下において、グルコース／フルクトース供給マトリクスにグリセロールを加えることによって脂肪酸生産性を回復及び向上させることができることを示す。
【０２１１】
本明細書内で他に示さない限りにおいて、上記の発酵実施例は、本明細書内で示さない限りにおいて米国特許６，６０７，９００からの手順を概して追従するか又はそれにしたがって実施することができる。
【０２１２】
実施例１２：
表２のように、実施例５〜１１からの脂肪酸を脂肪酸プロファイルに関して分析した。データは全脂肪酸の重量％として表す。表中のブランクの欄は、検出及び／又は特性評価を下回るレベルを示す。
【０２１３】
【表２】
2013521778.tif 000003
【０２１４】
実施例１３：
本実施例においては、酵母Rhodosporidium toruloides（ＣＢＳ６０１６）を、１４ＬのNew Brunswick Scientific BioFlo 3000発酵槽内において、炭素（スクロース）及び窒素（水酸化アンモニウム）供給バッチプロセスを用いて培養した。発酵に０．５Ｌの接種培養物を接種した。接種物の増殖のために、３ＬのBroadley James BioNet発酵槽を用いた。接種培地は、４つの別々のグループで調製した２．３Ｌの培地を含んでいた。グループＡは、２０．７ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、１．４４ｇのＮａＣｌ、０．６６７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２．３ｇのＫＣｌ、１１．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１３．８ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、１．１９６ｇのＫＨ２ＰＯ４、及び０．２３ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約２．１Ｌの体積のグループＡを、接種発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、４．５ｍＬの体積の蒸留水中の、２３．７ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４２．４１２ｍｇのクエン酸、７．１３ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、７．１３ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０９２ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０９２ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．７６１ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び４．７６１ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＢの貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、約２ｍＬの蒸留水中に溶解して濾過滅菌した、２２．４２５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、０．３６８ｍｇのビタミンＢ１２、及び７．６７ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＤは、１１５ｇのスクロース粉末を含む２００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を３０℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を６．９にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。
【０２１５】
接種発酵槽に１０ｍＬの標準振盪フラスコ培養物を接種し、３０℃、ｐＨ６．９、６３６ｒｐｍの撹拌、及び１．２Ｌ／分の空気において１６．７５時間培養し、その時点で０．５Ｌを発酵槽から採取して１４Ｌの発酵槽に移した。１４Ｌの発酵槽は１０Ｌの発酵培地を含んでいた。発酵培地は、接種発酵槽と同様の方法で調製した。発酵培地は４つのバッチ培地グループを含んでいた。グループＡは、６．２５ｇのＮａＣｌ、２０ｇのＮａ２ＳＯ４、２．９ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｇのＫＣｌ、５０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、１７．６５ｇのＫＨ２ＰＯ４、及び１．０ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約６．２５Ｌの体積のグループＡを、発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、約４５ｍＬの体積の蒸留水中の、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３７０ｍｇのクエン酸、３１ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、３１ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＢ貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、約１０ｍＬ中に溶解して濾過滅菌した、９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．６ｍｇのビタミンＢ１２、３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩、及び３５．８μｇのビオチンを含んでいた。グループＤは、３００ｇのスクロース粉末を含む約５００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２７℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を５．５にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。接種前の発酵槽の容積は約５．６Ｌであった。
【０２１６】
発酵槽に、上記に記載の接種発酵からの０．５Ｌのブロスを接種した。６Ｎ−水酸化アンモニウムの０．２６Ｌの溶液を用いて、発酵を５．５のｐＨにｐＨ制御した。３５７ｒｐｍ〜１２００ｒｐｍの撹拌、４Ｌ／分〜８Ｌ／分の空気流、及び０．０Ｌ／分〜４．０Ｌ／分の酸素を用いて、溶解酸素を発酵の間中２０％の目標設定値を維持するように制御した。発酵の間を通して、スクロースの８５０ｇ／Ｌ溶液３．８５Ｌを供給して、全糖（グルコース＋フルクトース＋スクロース）の濃度を６５ｇ／Ｌ未満に維持した。８９時間後、発酵槽は、６１０．８ｇの脂肪酸を含む１１２７ｇのバイオマスを含んでいた。最終細胞密度は乾燥重量で１１２．７ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は細胞乾燥重量の５４．１８％であり、平均脂肪酸生産性は１６．５６ｇ／Ｌ・日であり、得られる培養物の脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１９５６であった。８時間にわたって測定した培養物の最高ピーク脂肪酸生産性は３１．６８ｇ／Ｌ・日であった。２４時間にわたって測定した培養物の最高ピーク脂肪酸生産性は３０．１ｇ／Ｌ・日であった。２７℃、ｐＨ５．５、及び０．５Ｘ窒素における脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１９５６であった。
【０２１７】
５００ｇ〜６００ｇの凍結乾燥バイオマスを６倍の質量体積比のヘキサンと混合することによって、脂質の抽出を行った。高剪断ミキサーを用いて固体を湿潤させた。Ｚタイプの相互作用室（G10Z）を１０，０００ｐｓｉの圧力において用いることによって、混合物を、細胞破壊用にセットアップしたMicrofluidics（Newton, Massachusetts,米国）ホモジナイザー（110Y）に２回通した。ホモジナイズした材料を４，０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離して、ヘキサン／粗油層から固体を分離した。ヘキサン抽出したバイオマスを示す固体をバイオミールと呼ぶ。より軽質のヘキサン粗油層を取り出し、ロータリーエバポレーター（Buchi Labortechnik AG, Flawil,スイス）内において、約５０℃〜約６０℃の水浴温度を用いてヘキサンを蒸発させた。油を窒素でパージし、冷凍保存した。最初の凍結乾燥バイオマス、及びヘキサン抽出後のバイオミールの試料をＦＡＭＥ分析にかけた。抽出収率は、最初のバイオマス中の全脂肪酸からバイオミール中の全脂肪酸を減じ、最初のバイオマス中の全脂肪酸で割った値に基づく。抽出収率は９１％であった。
【０２１８】
脂肪酸効率に関する総合指数は次の通りである。０．４のＧ（酸素１ｇあたりに産生する脂肪酸のグラム数として表す酸素あたりの脂肪酸の収率）に関する前提値に基づいて、ＯＩＬＥ＝２１７０；ＯＩＬＥ１＝３．０；ＯＩＬＥ２＝１８０；ＯＩＬＥ３＝５．４；及びＯＩＬＥ４＝７２．１。
【０２１９】
実施例１４：
本実施例においては、酵母Rhodosporidium toruloides（ＣＢＳ８５８７）を、１４ＬのNew Brunswick Scientific BioFlo 3000発酵槽内において、炭素（スクロース）及び窒素（水酸化アンモニウム）供給バッチプロセスを用いて培養した。発酵槽に０．５Ｌの接種培養物を接種した。接種物の増殖のために、３ＬのBroadley James BioNet発酵槽を用いた。接種培地は、４つの別々のグループで調製した２．３Ｌの培地を含んでいた。グループＡは、２０．７ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、１．４４ｇのＮａＣｌ、０．６６７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２．３ｇのＫＣｌ、１１．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１３．８ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、１．１９６ｇのＫＨ２ＰＯ４、及び０．２３ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約２．１５Ｌの体積のグループＡを、接種発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、５２ｍＬの体積の蒸留水中の、２３．７ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４２．４１２ｍｇのクエン酸、７．１３ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、７．１３ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０９２ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０９２ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．７６１ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び４．７６１ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＢの貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、約２ｍＬの蒸留水中に溶解して濾過滅菌した、２２．４２５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、０．３６８ｍｇのビタミンＢ１２、及び７．６７ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＤは、１１５ｇのスクロース粉末を含む２００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２７℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を６．９１にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。
【０２２０】
接種発酵槽に２６ｍＬの標準振盪フラスコ培養物を接種し、２７℃、ｐＨ６．９、６４３ｒｐｍの撹拌、及び１．２Ｌ／分の空気において１６．７５時間培養し、その時点で０．５Ｌを発酵槽から採取して１４Ｌの発酵槽に移した。１４Ｌの発酵槽は１０Ｌの発酵培地を含んでいた。発酵培地は、接種発酵槽と同様の方法で調製した。発酵培地は４つのバッチ培地グループを含んでいた。グループＡは、６．２５ｇのＮａＣｌ、２０ｇのＮａ２ＳＯ４、２．９ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｇのＫＣｌ、５０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、１７．６５ｇのＫＨ２ＰＯ４、及び１．０ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約６．５Ｌの体積のグループＡを、発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、約４５ｍＬの体積の蒸留水中の、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３７０ｍｇのクエン酸、３１ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、３１ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＢ貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、約１０ｍＬ中に溶解して濾過滅菌した、９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．６ｍｇのビタミンＢ１２、３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩、及び３５．８μｇのビオチンを含んでいた。グループＤは、３００ｇのスクロース粉末を含む約５００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２７℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を７にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。接種前の発酵槽の容積は約６．３Ｌであった。
【０２２１】
発酵槽に、上記に記載の接種発酵からの０．５Ｌのブロスを接種した。６Ｎ−水酸化アンモニウムの０．２６Ｌの溶液を用いて、発酵を６．９のｐＨにｐＨ制御した。３５７ｒｐｍ〜１２００ｒｐｍの撹拌、４Ｌ／分〜９Ｌ／分の空気流、及び０．０Ｌ／分〜４．０Ｌ／分の酸素を用いて、溶解酸素を発酵の間中２０％の目標設定値を維持するように制御した。発酵の間を通して、スクロースの８５０ｇ／Ｌ溶液４．１３Ｌを供給して、全糖（グルコース＋フルクトース＋スクロース）の濃度を７５ｇ／Ｌ未満に維持した。９２時間後、発酵槽は、７０１ｇの脂肪酸を含む１３３４ｇのバイオマスを含んでいた。最終細胞密度は乾燥重量で１３３．４ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は細胞乾燥重量の５４％であり、平均脂肪酸生産性は１８．７５ｇ／Ｌ・日であり、得られる培養物の脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１９８８であった。８時間にわたって測定した培養物の最高ピーク脂肪酸生産性は３９ｇ／Ｌ・日であった。２４時間にわたって測定した培養物の最高ピーク脂肪酸生産性は２６ｇ／Ｌ・日であった。２７℃、ｐＨ６．９、及び０．５Ｘ窒素における脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１９８８であった。
【０２２２】
実施例１３と同じように脂質抽出を行った。抽出収率は７８％であった。
脂肪酸効率に関する総合指数は次の通りである。０．４のＧ（酸素１ｇあたりに産生する脂肪酸のグラム数として表す酸素あたりの脂肪酸の収率）に関する前提値に基づいて、ＯＩＬＥ＝２０４０；ＯＩＬＥ１＝２．７；ＯＩＬＥ２＝１９６；ＯＩＬＥ３＝３．８；及びＯＩＬＥ４＝７８．５。
【０２２３】
実施例１５：
本実施例においては、Sporidiobolus pararoseusの幾つかの菌株に１００％ＤＮＡ一致していると確認された酵母Sporidiobolus pararoseusの菌株（ＡＴＣＣ１１６１６）を、１４ＬのNew Brunswick Scientific BioFlo 3000発酵槽内において、炭素（スクロースシロップ）及び窒素（水酸化アンモニウム）供給バッチプロセスを用いて培養した。発酵槽に０．７５Ｌの接種培養物を接種した。接種物の増殖のために、３ＬのBroadley James BioNet発酵槽を用いた。接種培地は、４つの別々のグループで調製した２．３Ｌの培地を含んでいた。グループＡは、２０．７ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、１．４４ｇのＮａＣｌ、０．６６７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２．３ｇのＫＣｌ、１１．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１３．８ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、１．１９６ｇのＫＨ２ＰＯ４、及び０．２３ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約２．１Ｌの体積のグループＡを、接種発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、４．５ｍＬの体積の蒸留水中の、２３．７ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４２．４１２ｍｇのクエン酸、７．１３ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、７．１３ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０９２ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０９２ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．７６１ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び４．７６１ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＢの貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、約２ｍＬの蒸留水中に溶解して濾過滅菌した、２２．４２５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、０．３６８ｍｇのビタミンＢ１２、及び７．６７ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＤは、１１５ｇのスクロース粉末を含む２００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を３０℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を６．９にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。
【０２２４】
接種発酵槽に２９．５ｍＬの標準振盪フラスコ培養物を接種し、３０℃、ｐＨ６．９、８４７ｒｐｍの撹拌、及び１．２Ｌ／分の空気において１４．５時間培養し、その時点で０．７５Ｌを発酵槽から採取して１４Ｌの発酵槽に移した。１４Ｌの発酵槽は１０Ｌの発酵培地を含んでいた。発酵培地は、接種発酵槽と同様の方法で調製した。発酵培地は４つのバッチ培地グループを含んでいた。グループＡは、６．２５ｇのＮａＣｌ、４．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、１２．６６ｇのＮａ２ＨＰＯ４、及び１．０ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約６．２５Ｌの体積のグループＡを、発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、約４５ｍＬの体積の蒸留水中の、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３７０ｍｇのクエン酸、３１ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、３１ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＢ貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、約１０ｍＬ中に溶解して濾過滅菌した、９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．６ｍｇのビタミンＢ１２、３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩、及び３５．８μｇのビオチンを含んでいた。グループＤは、Lousiana,米国のRaceland Raw Sugar Corporationから得た約７００ｍＬの糖シロップを含んでいた。発酵槽を２７℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を７にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。接種前の発酵槽の容積は約６．１５Ｌであった。
【０２２５】
発酵槽に、上記に記載の接種発酵からの０．７５Ｌのブロスを接種した。６Ｎ−水酸化アンモニウムの０．２６Ｌの溶液を用いて、発酵を７のｐＨにｐＨ制御した。３５７ｒｐｍ〜１２００ｒｐｍの撹拌、３Ｌ／分〜８Ｌ／分の空気流、及び０Ｌ／分〜５Ｌ／分の酸素を用いて、溶解酸素を発酵の間中２０％の目標設定値を維持するように制御した。発酵の間を通して、５．６５Ｌの（Raceland）糖シロップを供給して、全糖（グルコース＋フルクトース＋スクロース）の濃度を８０ｇ／Ｌ未満に維持した。９２時間後、発酵槽は、６７０．７ｇの脂肪酸を含む１２５１ｇのバイオマスを含んでいた。最終細胞密度は乾燥重量で１２５．１ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は細胞乾燥重量の５３．６３％であり、平均脂肪酸生産性は１７．５６ｇ／Ｌ・日であり、得られる培養物の脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１６２５であった。８時間にわたって測定した培養物の最高ピーク脂肪酸生産性は５６．８ｇ／Ｌ・日であった。２４時間にわたって測定した培養物の最高ピーク脂肪酸生産性は３０．５ｇ／Ｌ・日であった。２７℃、ｐＨ７、及び０．５Ｘ窒素における脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１６２５であった。
【０２２６】
実施例１６：
本実施例においては、Rhodotorula ingenosaに９９％ＤＮＡ一致していると確認された酵母Rhodotorula ingenosa（ＡＴＣＣ１１６１７）を、１４ＬのNew Brunswick Scientific BioFlo 3000発酵槽内において、炭素（スクロースシロップ）及び窒素（水酸化アンモニウム）供給バッチプロセスを用いて培養した。発酵に０．７５Ｌの接種培養物を接種した。接種物の増殖のために、３ＬのBroadley James BioNet発酵槽を用いた。接種培地は、４つの別々のグループで調製した２．２Ｌの培地を含んでいた。グループＡは、２０．７ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、１．４４ｇのＮａＣｌ、０．６６７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２．３ｇのＫＣｌ、１１．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１３．８ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、１．１９６ｇのＫＨ２ＰＯ４、及び０．２３ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約２．１５Ｌの体積のグループＡを、接種発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、５２ｍＬの体積の蒸留水中の、２３．７ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４２．４１２ｍｇのクエン酸、７．１３ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、７．１３ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０９２ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０９２ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．７６１ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び４．７６１ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＢの貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、約２ｍＬの蒸留水中に溶解して濾過滅菌した、２２．４２５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、０．３６８ｍｇのビタミンＢ１２、及び７．６７ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＤは、１１５ｇのスクロース粉末を含む２００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２７℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を５．０９にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。
【０２２７】
接種発酵槽に２３ｍＬの標準振盪フラスコ培養物を接種し、２７℃、ｐＨ５．０９、６４４ｒｐｍの撹拌、及び１．２Ｌ／分の空気において１７．１７時間培養し、その時点で０．７５Ｌを発酵槽から採取して１４Ｌの発酵槽に移した。１４Ｌの発酵槽は１０Ｌの発酵培地を含んでいた。発酵培地は、接種発酵槽と同様の方法で調製した。発酵培地は４つのバッチ培地グループを含んでいた。グループＡは、６．２５ｇのＮａＣｌ、４．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、１２．６６ｇのＮａ２ＨＰＯ４、及び１．０ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約６．２５Ｌの体積のグループＡを、発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、約４５ｍＬの体積の蒸留水中の、１０３ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３７０ｍｇのクエン酸、３１ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、３１ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０．７ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び２０．７ｍｇのＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＢ貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、約１０ｍＬ中に溶解して濾過滅菌した、９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．６ｍｇのビタミンＢ１２、３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩、及び３５．８μｇのビオチンを含んでいた。グループＤは、LouisianaのRaceland Sugarから得た約７００ｍＬの糖シロップを含んでいた。発酵槽を２７℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、及びＤを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を５にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。接種前の発酵槽の容積は約４．８５Ｌであった。
【０２２８】
発酵槽に、上記に記載の接種発酵からの０．７５Ｌのブロスを接種した。６Ｎ−水酸化アンモニウムの０．２７Ｌの溶液を用いて、発酵を５のｐＨにｐＨ制御した。３５７ｒｐｍ〜１１００ｒｐｍの撹拌、０．９Ｌ／分〜７．９Ｌ／分の空気流、及び０Ｌ／分〜７Ｌ／分の酸素を用いて、溶解酸素を発酵の間中２０％の目標設定値を維持するように制御した。発酵の間を通して、４．９Ｌの（Raceland）糖シロップを供給して、全糖（グルコース＋フルクトース＋スクロース）の濃度を７５ｇ／Ｌ未満に維持した。８９時間後、発酵槽は、５５３ｇの脂肪酸を含む１１０４ｇのバイオマスを含んでいた。最終細胞密度は乾燥重量で１１０．４ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は細胞乾燥重量の５０．１％であり、平均脂肪酸生産性は１４．９６ｇ／Ｌ・日であり、得られる培養物の脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１６３４であった。８時間にわたって測定した培養物の最高ピーク脂肪酸生産性は３１．９ｇ／Ｌ・日であった。２４時間にわたって測定した培養物の最高ピーク脂肪酸生産性は２９．９ｇ／Ｌ・日であった。２７℃、ｐＨ５、及び０．５Ｘ窒素における脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１６３４であった。
【０２２９】
実施例１７：
本実施例においては、緑藻Chlorella protothecoides UTEX250（ＭＫ２８４１５）を、１４ＬのNew Brunswick Scientific BioFlo 3000発酵槽内において、炭素（酸加水分解したスクロースシロップ）及び窒素（水酸化アンモニウム）供給バッチプロセスを用いて培養した。発酵に１Ｌの接種培養物を接種した。接種物の増殖のために、１４ＬのBroadley James BioNet発酵槽を用いた。接種培地は、５つの別々のグループで調製した１０Ｌの培地を含んでいた。グループＡは、２０ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、２．９ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、及び１．０ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約９．５Ｌの体積のグループＡを、接種発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、約２００ｍＬの体積の２０ｇのＫＨ２ＰＯ４を含んでいた。グループＢ貯蔵液を２１２℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、全て蒸留水中に溶解した、１０．３ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１８４．４ｍｇのクエン酸、１８．１ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４９ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．９ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２８．６ｍｇのＨ３ＢＯ３、及び０．７９ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＣ貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＤは、約２０ｍＬの蒸留水中に溶解して濾過滅菌した、９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．６ｍｇのビタミンＢ１２、及び３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＥは、５００ｇのコーンシロップを含む１０００ｍＬの蒸留水を含んでいた。発酵槽を２７℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、Ｄ、及びＥを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を７にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。
【０２３０】
接種発酵槽に４００ｍＬの標準振盪フラスコ培養物を接種し、２７℃、ｐＨ７、３８４ｒｐｍの撹拌、及び５Ｌ／分の空気において４３．５時間培養し、その時点で１Ｌを発酵槽から採取して１４Ｌの発酵槽に移した。１４Ｌの発酵槽は１０Ｌの発酵培地を含んでいた。発酵培地は、接種発酵槽と同様の方法で調製した。発酵培地は５つのバッチ培地グループを含んでいた。グループＡは、２５ｇのＭＳＧ・１Ｈ２Ｏ、２．９ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｇの酵母エキス（Ｔ１５４）、及び１．０ｍＬのDow 1520US（消泡剤）を含んでいた。約５．５Ｌの体積のグループＡを、発酵槽内で１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＢは、約２５０ｍＬの体積の２５ｇのＫＨ２ＰＯ４を含んでいた。グループＢ貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＣは、全て蒸留水中に溶解した、２５７．５ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４６１ｍｇのクエン酸、４５．２５ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、５．５５ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．２２５ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、９．７５ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、７１．５ｍｇのＨ３ＢＯ３、及び１．９７５ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含んでいた。グループＣ貯蔵液を１２１℃においてオートクレーブ処理した。グループＤは、約２０ｍＬの蒸留水中に溶解して濾過滅菌した、３５．８μｇのビオチン、９７．５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、１．６ｍｇのビタミンＢ１２、及び３３．３ｍｇのパントテン酸ヘミカルシウム塩を含んでいた。グループＥは、LouisianaのRaceland Sugarから得た約１０００ｍＬの加水分解糖シロップを含んでいた。糖シロップは、約４のｐＨまで硫酸を加え、１２１℃において少なくとも１時間滅菌することによって加水分解した。発酵槽を２７℃に冷却した後、グループＢ、Ｃ、Ｄ、及びＥを発酵槽に加えた。接種の前に、水酸化ナトリウム及び硫酸を用いて発酵槽を７にｐＨ調節し、溶解酸素を１００％にした。接種前の発酵槽の容積は約５．９Ｌであった。
【０２３１】
発酵槽に、上記に記載の接種発酵からの１Ｌのブロスを接種した。６Ｎ−水酸化アンモニウムの０．２７Ｌの溶液を用いて、水酸化アンモニウム供給流を使い果たすまで（接種後約５５時間）発酵を７のｐＨにｐＨ制御し、その時点で４Ｎ−水酸化ナトリウムを発酵の残りのために用いた。３５７ｒｐｍ〜８５０ｒｐｍの撹拌、及び８Ｌ／分の空気流を用いて、溶解酸素を発酵の間中２０％の目標設定値を維持するように制御した。発酵の間を通して、５．２Ｌの（Raceland）糖シロップを供給して、全糖（グルコース＋フルクトース＋スクロース）の濃度を５５ｇ／Ｌ未満に維持した。９３時間後、発酵槽は、４６２．４ｇの脂肪酸を含む１０８２ｇのバイオマスを含んでいた。最終細胞密度は乾燥重量で１０８．２ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は細胞乾燥重量の４２．７３％であり、平均脂肪酸生産性は１１．９３ｇ／Ｌ・日であり、得られる培養物の脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１７６１７であった。８時間にわたって測定した培養物の最高ピーク脂肪酸生産性は３３．６ｇ／Ｌ・日であった。２４時間にわたって測定した培養物の最高ピーク脂肪酸生産性は２４．４ｇ／Ｌ・日であった。２７℃、ｐＨ７、及び０．５Ｘ窒素における脂肪酸収率（炭素供給材料１ｇあたりに産生された脂肪酸のグラム数）は０．１７６１７であった。
【０２３２】
ここで用いる「有する」、「有する」、「含む」、「有する」、「含む」、及び「包含する」という用語は、開かれた包含的な表現である。また、「から構成される」という用語は、閉じられた排他的な表現である。特許請求の範囲又は明細書における任意の用語の解釈においては不明確さが存在するが、明細書作成者の意図は開かれた包含的な表現である。
【０２３３】
ここで用いる「など」という用語は、リスト中の任意及び全ての個々の事項及び／又は構成要素並びにこれらの組合せに関するサポート、並びに個々の事項及び／又は構成要素並びにこれらの組合せの均等物に関するサポートを与える。
【０２３４】
方法又はプロセス中の段階に関する順番、数、順序、省略、及び／又は繰り返しの限界に関しては、他に明確に与えられていない限りにおいて、明細書作成者は、本発明の範囲に対して、段階に関する順番、数、順序、省略、及び／又は繰り返しの限界が含まれることは意図しない。
【０２３５】
範囲に関し、範囲は、例えば上界及び／又は下界を伴わない範囲を含む上限値及び下限値の間に含まれる全ての可能な範囲に関するサポートを与えるように、上限値と下限値の間の全ての点を包含するように解釈すべきである。
【０２３６】
運転、パーセント、及び手順に関する基準は、質量基準、体積基準、モル基準などのような任意の好適な基準に基づくものであってよい。基準が特定されていない場合には、質量基準又は他の適当な基準を用いるべきである。
【０２３７】
本発明の範囲又は精神から逸脱することなく開示されている構造及び方法において種々の修正及び変更を行うことができることは当業者に明らかであろう。特に、任意の態様の記載は、他の態様の記載と自由に組み合わせて、２以上の構成要素及び／又は限定の組合せ及び／又は変化を与えことができる。本発明の他の態様は、ここに開示する発明の詳細及び実施を考察することによって当業者に明らかとなるであろう。明細書及び実施例は例示のみのものと考えられ、発明の真の範囲及び精神は特許請求の範囲によって示されると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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