(57)【要約】  本発明は、配列番号２、４、６、および８からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部である、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン鎖のエピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインと、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合することが可能な第２の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体分子に関する。また、本発明は、前記二重特異性単鎖抗体分子をコードする核酸、それを作製するためのベクターおよび宿主細胞、ならびにプロセスを提供する。さらに、本発明は、前記二重特異性単鎖抗体分子を含む医薬組成物、および前記二重特異性単鎖抗体分子の医療的使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原相互作用部位であり、ヒト、および、コモンマーモセット、ワタボウシタマリン、またはコモンリスザルのＣＤ３ε（イプシロン）鎖エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインと、
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合することが可能な第２の結合ドメインとを含み、
前記エピトープは、配列番号２、４、６、または８からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部であり、少なくともアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ（ＱＤＧＮＥ）を含む、二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドにおいて、
前記エピトープは、配列番号２、４、６、および８からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部であり、少なくとも前記アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕを含む、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の二重特異性単鎖抗体分子であって、
前記第１または第２の結合ドメインのうちの少なくとも１つが、ＣＤＲ移植ドメイン、ヒト化ドメイン、またはヒトドメインである、二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性単鎖鎖抗体分子であって、
ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な前記第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号２７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２８に示されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号２９に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
（ｂ）配列番号１１７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１８に示されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１１９に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
（ｃ）配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ３
から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性単鎖抗体分子であって、
ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な前記第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号１２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１４に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｂ）配列番号３０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｃ）配列番号４８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号５０に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号６６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６７に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６８に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｅ）配列番号８４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８５に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号８６に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）配列番号１０２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１０３に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１０４に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）配列番号１２０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２１に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１２２に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｈ）配列番号１３８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１４０に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉ）配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５７に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１５８に示されるＣＤＲ−Ｈ３；ならびに
（ｊ）配列番号１７４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７５に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１７６に示されるＣＤＲ−Ｈ３
から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む、二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載の二重特異性単鎖抗体分子であって、
ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な前記第１の結合ドメインが、配列番号３５、３９、１２５、１２９、１６１、または１６５に示されるＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含む、二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項７】
請求項１または３および５のいずれか１項に記載の二重特異性単鎖抗体分子であって、
ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な前記第１の結合ドメインが、配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７、または１８１に示されるＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含む、二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の二重特異性単鎖抗体分子であって、
ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な前記第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号１７または２１に示されるＶＬ領域、および配列番号１５または１９に示されるＶＨ領域；
（ｂ）配列番号３５または３９に示されるＶＬ領域、および配列番号３３または３７に示されるＶＨ領域；
（ｃ）配列番号５３または５７に示されるＶＬ領域、および配列番号５１または５５に示されるＶＨ領域；
（ｄ）配列番号７１または７５に示されるＶＬ領域、および配列番号６９または７３に示されるＶＨ領域；
（ｅ）配列番号８９または９３に示されるＶＬ領域、および配列番号８７または９１に示されるＶＨ領域；
（ｆ）配列番号１０７または１１１に示されるＶＬ領域、および配列番号１０５または１０９に示されるＶＨ領域；
（ｇ）配列番号１２５または１２９に示されるＶＬ領域、および配列番号１２３または１２７に示されるＶＨ領域；
（ｈ）配列番号１４３または１４７に示されるＶＬ領域、および配列番号１４１または１４５に示されるＶＨ領域；
（ｉ）配列番号１６１または１６５に示されるＶＬ領域、および配列番号１５９または１６３に示されるＶＨ領域；ならびに
（ｊ）配列番号１７９または１８３に示されるＶＬ領域、および配列番号１７７または１８１に示されるＶＨ領域
からなる群から選択されるＶＬ領域およびＶＨ領域を含む、二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項９】
請求項８に記載の二重特異性単鎖抗体分子であって、
ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインが、配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５、または１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の二重特異性単鎖抗体分子であって、
前記第２の結合ドメインが、ヒトＰＳＭＡおよび／または非チンパンジー霊長動物のＰＳＭＡに結合することが可能である、二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の二重特異性単鎖抗体分子であって、
ａ）配列番号２２６〜２２８のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号２３１〜２３３のＣＤＲＬ１−３；
ｂ）配列番号２４０〜２４２のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号２４５〜２４７のＣＤＲＬ１−３；
ｃ）配列番号２５４〜２５６のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号２５９〜２６１のＣＤＲＬ１−３；
ｄ）配列番号２６８〜２７０のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号２７３〜２７５のＣＤＲＬ１−３；
ｅ）配列番号６１８〜６２０のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号６２３〜６２５のＣＤＲＬ１−３；
ｆ）配列番号２８２〜２８４のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号２８７〜２８９のＣＤＲＬ１−３；
ｇ）配列番号２９６〜２９８のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号３０１〜３０３のＣＤＲＬ１−３；
ｈ）配列番号３１０〜３１２のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号３１５〜３１７のＣＤＲＬ１−３；
ｉ）配列番号３２４〜３２６のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号３２９〜３３１のＣＤＲＬ１−３；
ｊ）配列番号３３８〜３４０のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号３４３〜３４５のＣＤＲＬ１−３；
ｋ）配列番号３５２〜３５４のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号３５７〜３５９のＣＤＲＬ１−３；
ｌ）配列番号３６６〜３６８のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号３７１〜３７３のＣＤＲＬ１−３；
ｍ）配列番号３８０〜３８２のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号３８５〜３８７のＣＤＲＬ１−３；
ｎ）配列番号３９４〜３９６のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号３９９〜４０１のＣＤＲＬ１−３；
ｏ）配列番号４０８〜４１０のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号４１３〜４１５のＣＤＲＬ１−３；
ｐ）配列番号４２２〜４２４のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号４２７〜４２９のＣＤＲＬ１−３；
ｑ）配列番号４３６〜４３８のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号４４１〜４４３のＣＤＲＬ１−３；
ｒ）配列番号４５０〜４５２のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号４５５〜４５７のＣＤＲＬ１−３；
ｓ）配列番号４６４〜４６６のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号４６９〜４７１のＣＤＲＬ１−３；
ｔ）配列番号４７８〜４８０のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号４８３〜４８５のＣＤＲＬ１−３；
ｕ）配列番号４９２〜４９４のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号４９７〜４９９のＣＤＲＬ１−３；
ｖ）配列番号５０６〜５０８のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号５１１〜５１３のＣＤＲＬ１−３；
ｗ）配列番号５２０〜５２２のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号５２５〜５２７のＣＤＲＬ１−３；
ｘ）配列番号５３４〜５３６のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号５３９〜５４１のＣＤＲＬ１−３；
ｙ）配列番号５４８〜５５０のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号５５３〜５５５のＣＤＲＬ１−３；
ｚ）配列番号５６２〜５６４のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号５６７〜５６９のＣＤＲＬ１−３；
ａａ）配列番号５７６〜５７８のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号５８１〜５８３のＣＤＲＬ１−３；
ａｂ）配列番号５９０〜５９２のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号５９５〜５９７のＣＤＲＬ１−３；ならびに
ａｃ）配列番号６０４〜６０６のＣＤＲ Ｈ１−３および配列番号６０９〜６１１のＣＤＲＬ１−３
から選択される配列群を、前記第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、およびＣＤＲ Ｌ３として含む、二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の二重特異性単鎖抗体分子であって、
前記結合ドメインは、ＶＨ ＰＳＭＡ−ＶＬＰＳＭＡ−ＶＨ ＣＤ３−ＶＬ ＣＤ３またはＶＬ ＰＳＭＡ−ＶＨ ＰＳＭＡ−ＶＨ ＣＤ３−ＶＬ ＣＤ３の順に並んでいる、二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の二重特異性単鎖抗体分子であって、
（ａ）配列番号２３７、２５１、２６５、２７９、６２９、２９３、３０７、３２１、３３５、３４９、３６３、３７７、３９１、４０５、４１９、４３３、４４７、４６１、４７５、４８９、５０３、５１７、５３１、５４５、５５９、５７３、５８７、６０１、または６１５のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列；および
（ｂ）配列番号２３８、２５２、２６６、２８０、６３０、２９４、３０８、３２２、３３６、３５０、３６４、３７８、３９２、４０６、４２０、４３４、４４８、４６２、４７６、４９０、５０４、５１８、５３２、５４６、５６０、５７４、５８８、６０２、または６１６のうちのいずれかに示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列
から選択される配列を含む、二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の二重特異性単鎖抗体分子をコードする核酸配列。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターであって、
請求項１４に記載の前記核酸配列に作動的に連結された調節配列をさらに含むベクター。
【請求項１７】
発現ベクターである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１５から１７のいずれか１項に記載のベクターにより形質転換されるか、またはこれをトランスフェクトした宿主。
【請求項１９】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の二重特異性単鎖抗体分子を作製するためのプロセスであって、
請求項１８に記載の宿主を、請求項１から１３のいずれか１項に記載の二重特異性単鎖抗体分子を発現させる条件下で培養するステップと、
生成されたポリペプチドを前記培養物から回収するステップと
を含むプロセス。
【請求項２０】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の二重特異性単鎖抗体分子、または請求項１９に記載のプロセスにより作製される二重特異性単鎖抗体分子を含む医薬組成物。
【請求項２１】
癌を予防、治療、または改善するのに用いられる、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の二重特異性単鎖抗体分子、または請求項１９に記載のプロセスにより作製される二重特異性単鎖抗体分子であって、
癌を予防、治療、または改善するのに用いられる二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項２３】
前記癌が、固形腫瘍、好ましくは癌腫または前立腺癌である、請求項２１に記載の医薬組成物、または請求項２２に記載の二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項２４】
担体、安定化剤、および／または賦形剤による適切な製剤を場合によってさらに含む、請求項２０、２１、もしくは２３に記載の医薬組成物、または、請求項２２もしくは２３に記載の二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項２５】
追加薬物との組み合わせ投与に適する、請求項２０、２１、２３、もしくは２４に記載の医薬組成物、または、請求項２２、２３、もしくは２４に記載の二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項２６】
前記薬物が、非タンパク質性化合物またはタンパク質性化合物である、請求項２５に記載の医薬組成物または二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項２７】
前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物が、請求項２２、２３、もしくは２４に記載の二重特異性単鎖抗体分子、または請求項２０もしくは２１に記載の医薬組成物と同時に投与されるか、または同時には投与されない、請求項２６に記載の医薬組成物または二重特異性単鎖抗体分子。
【請求項２８】
疾患を予防、治療、または改善する医薬組成物を調製するための、請求項１から１３のいずれか１項に記載の二重特異性単鎖抗体分子、または請求項１９にしたがって作製される二重特異性単鎖抗体分子の使用。
【請求項２９】
疾患の予防、治療、または改善を必要とする対象においてその疾患を予防、治療、または改善する方法であって、請求項２０または２１に記載の医薬組成物を有効量投与するステップを含む方法。
【請求項３０】
前記疾患が癌である、請求項２９に記載の方法、または請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
前記癌が、固形腫瘍、好ましくは癌腫または前立腺癌である、請求項３０に記載の方法または使用。
【請求項３２】
前記医薬組成物が、追加薬物と組み合わせて投与される、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法、または請求項２８、３０、もしくは３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記薬物が、非タンパク質性化合物またはタンパク質性化合物である、請求項３２に記載の方法または使用。
【請求項３４】
前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物が、請求項２０または２１に記載の医薬組成物と同時に投与されるか、または同時には投与されない、請求項３３に記載の方法または使用。
【請求項３５】
前記対象がヒトである、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の方法、または請求項２８もしくは３０〜３４に記載の使用。
【請求項３６】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の二重特異性単鎖抗体分子、請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１８に記載の宿主を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトおよび非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン鎖のエピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインと、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合することが可能な第２の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体分子であって、前記エピトープが、配列番号２、４、６、および８からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部である、二重特異性単鎖抗体分子に関する。また、本発明は、前記二重特異性単鎖抗体分子をコードする核酸、それを作製するためのベクターおよび宿主細胞、ならびにプロセスも提供する。さらに、本発明は、前記二重特異性単鎖抗体分子を含む医薬組成物、および前記二重特異性単鎖抗体分子の医療的使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞による認識は、ペプチドを取り込んだペプチドＭＨＣ（ｐＭＨＣ）分子と相互作用する、クローン型によりアルファ：ベータおよびガンマ：デルタに区分されたＴ細胞受容体（ＴｃＲ）を介する（Davis & Bjorkman, Nature 334 (1988), 395-402）。ＴｃＲの抗原特異的鎖は、シグナル伝達ドメインを保有しないが、その代わりに、保存的なマルチサブユニットからなるシグナル伝達装置であるＣＤ３と結合している（Call, Cell 111 (2002), 967-979、Alarcon, Immunol.Rev. 191 (2003), 38-46、Malissen Immunol. Rev. 191(2003), 7-27）。ＴｃＲライゲーションがこのシグナル伝達装置へ直接的に伝達されるメカニズムは、依然として、Ｔ細胞生物学における根本的な疑問である（Alarcon, 前記引用箇所; Davis, Cell 110 (2002),285-287）。持続的なＴ細胞反応が、共受容体の係合、ＴｃＲのオリゴマー化、および、免疫学的シナプスにおけるＴｃＲ−ｐＭＨＣ複合体のより高次元的な形での配置を伴うことは明らかであると考えられる（Davis & van der Merwe, Curr. Biol. 11 (2001), R289-R291、Davis, Nat. Immunol. 4 (2003), 217-224）。しかし、非常に早期のＴｃＲシグナル伝達は、これらの事象の不在下で生じる。また、非常に早期のＴｃＲシグナル伝達は、ＣＤ３イプシロンにおいてリガンド誘導による立体構造変化を伴う可能性がある（Alarcon, 前記引用箇所、Davis (2002), 前記引用箇所、Gil, J. Biol. Chem. 276 (2001), 11174-11179、Gil,Cell 109 (2002), 901-912）。このシグナル伝達複合体のイプシロンサブユニット、ガンマサブユニット、デルタサブユニット、およびゼータサブユニットは、互いに会合し合って、ＣＤ３イプシロン：ガンマヘテロ二量体、ＣＤ３イプシロン：デルタヘテロ二量体、およびＣＤ３ゼータ：ゼータホモ二量体を形成する（Call, 前記引用箇所）。様々な研究は、ＣＤ３分子がアルファ：ベータＴｃＲの細胞表面における適正な発現と、Ｔ細胞の正常な発生とに重要である、ということを示している（Berkhout, J. Biol. Chem. 263 (1988), 8528-8536、Wang, J. Exp. Med. 188 (1998), 1375-1380、Kappes,Curr. Opin. Immunol. 7 (1995), 441-447）。マウスＣＤ３イプシロン：ガンマヘテロ二量体の外部ドメイン断片の溶液構造は、このイプシロン：ガンマサブユニットがいずれも、互いに作用して隣り合わせのまれな二量体の立体構造を形成するＣ２セットＩｇドメインであることを示した（Sun, Cell 105 (2001), 913-923）。システインに富むストークも、ＣＤ３の二量体化を促すのに重要な役割を果たすと考えられる（Su, 前記引用箇所、Borroto, J. Biol. Chem. 273(1998), 12807-12816）が、これらのタンパク質がＴｃＲベータと会合するには、ＣＤ３イプシロンおよびＣＤ３ガンマの細胞外ドメインによる相互作用で十分である（Manolios, Eur. J. Immunol. 24 (1994), 84-92、Manolios& Li, Immunol. Cell Biol. 73 (1995), 532-536）。異論の余地はあるが、ＴｃＲの主要な化学量論的組成は、１つのアルファ：ベータＴｃＲ、１つのＣＤ３イプシロン：ガンマヘテロ二量体、１つのＣＤ３イプシロン：デルタヘテロ二量体、および１つのＣＤ３ゼータ：ゼータホモ二量体を含む可能性が極めて高い（Call, 前記引用箇所）。免疫反応におけるヒトＣＤ３イプシロン：ガンマヘテロ二量体の中心的な役割を踏まえ、治療用抗体であるＯＫＴ３に結合させたこの複合体の結晶構造が近年になって明らかにされた（Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680）。
【０００３】
ＴｃＲシグナル伝達を標的とすることによりＴ細胞の免疫作用を調節する治療戦略は数多く、特に、抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、免疫抑制療法において臨床的に広く用いられている。ヒトにおける使用について初めて承認されたｍＡｂは、ＣＤ３特異性マウスｍＡｂであるＯＫＴ３であり（Sgro, Toxicology 105 (1995), 23-29）、これは、移植（Chatenoud,Clin. Transplant 7 (1993), 422-430、Chatenoud, Nat. Rev.Immunol. 3 (2003), 123-132、Kumar, Transplant. Proc. 30(1998), 1351-1352）、１型糖尿病（Chatenoud (2003), 前記引用箇所）、および乾癬（Utset, J. Rheumatol. 29 (2002), 1907-1913）における免疫抑制剤として臨床的に広く使用されている。さらに、抗ＣＤ３ｍＡｂは、部分的なＴ細胞シグナル伝達およびクローンアネルギーを誘導することができる（Smith, J. Exp. Med. 185 (1997), 1413-1422）。ＯＫＴ３は、文献において、強力なＴ細胞マイトジェンとして（Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18）のほか、強力なＴ細胞殺滅剤として（Wong, Transplantation 50 (1990), 683-9）も説明されている。ＯＫＴ３は、これらの活性の両方を時間依存的な形で示す。ＯＫＴ３は、初期にＴ細胞を活性化させ、サイトカインを放出させた後で、さらに投与されると、その後、既知のすべてのＴ細胞機能を遮断する。同種移植組織の拒絶を軽減し、または消失さえさせるための治療計画において、ＯＫＴ３が免疫抑制剤としてこのように広く適用されているのは、このように、後期においてＴ細胞機能を消滅させるからである。
【０００４】
ＯＫＴ３が同種移植組織の拒絶を可逆化するのは、急性拒絶において主要な役割を果たす全てのＴ細胞機能を遮断することによる可能性がきわめて高い。ＯＫＴ３は、ヒトＴ細胞膜内のＣＤ３複合体と反応してその機能を遮断する。なお、このＣＤ３複合体は、Ｔ細胞（ＴＣＲ）の抗原認識構造と関連し、且つ、シグナル伝達に不可欠なものである。ＴＣＲ／ＣＤ３のどのサブユニットにＯＫＴ３が結合するかは、複数の研究の主題となっている。一部の証拠は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のイプシロンサブユニットに対するＯＫＴ３の特異性を指摘している（Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101,(2004), 7675-7680）が、さらなる証拠は、ＯＫＴ３がＴＣＲ／ＣＤ３複合体に結合するには、この複合体の他のサブユニットの存在が必要であることを示している（Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52）。
【０００５】
ＣＤ３分子に対して特異的なその他の周知の抗体は、Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ、Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １（１９８９）、５４６〜５０に列挙されている。上記で示した通り、このようなＣＤ３特異性抗体は、リンホカイン産生（Von Wussow,J. Immunol. 127 (1981), 1197; Palacious, J. Immunol. 128 (1982), 337）、リンホカイン増殖（Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18）、および、サプレッサーＴ細胞の誘導（Kunicka, in 「Lymphocyte Typing II」 1 (1986), 223）などの各種Ｔ細胞反応を誘導することが可能である。すなわち、実験条件に応じて、ＣＤ３特異性モノクローナル抗体は、細胞障害性を阻害する場合もあり、これを誘導する場合もある（Leewenberg, J. Immunol. 134 (1985), 3770; Phillips, J. Immunol. 136 (1986) 1579; Platsoucas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 4500; Itoh, Cell. Immunol. 108 (1987), 283-96; Mentzer, J. Immunol. 135 (1985), 34; Landegren,J. Exp. Med. 155 (1982), 1579; Choi (2001), Eur. J. Immunol. 31, 94-106; Xu(2000), Cell Immunol. 200, 16-26; Kimball (1995), Transpl. Immunol. 3, 212-221）。
【０００６】
当技術分野で説明されるＣＤ３抗体の多くは、ＣＤ３複合体のうちのＣＤ３イプシロンサブユニットを認識することが報告されているが、実際のところ、これらのうちの大半は立体構造エピトープに結合し、したがって、ＴＣＲの天然環境にあるＣＤ３イプシロンだけを認識する。立体構造エピトープは、２つ以上の離散アミノ酸残基の存在を特徴とし、これらのアミノ酸残基は、一次配列では分離されているが、ポリペプチドが天然のタンパク質／抗原へと折り畳まれると、この分子の表面上において一体化するものである（Sela, (1969) Science 166, 1365およびLaver, (1990) Cell61, 553-6）。当技術分野において説明される、ＣＤ３イプシロン抗体が結合する立体構造エピトープは、２つの群に分類することができる。主要な群において、前記エピトープは、例えば、ＣＤ３イプシロン鎖およびＣＤ３ガンマ鎖、またはＣＤ３イプシロン鎖およびＣＤ３デルタ鎖の２つのＣＤ３サブユニットにより形成されている。例えば、最も広く用いられているＣＤ３イプシロンモノクローナル抗体であるＯＫＴ３、ＷＴ３１、ＵＣＨＴ１、７Ｄ６、およびＬｅｕ−４は、ＣＤ３イプシロン鎖だけをトランスフェクトした細胞には結合しないことが複数の研究で分かっている。しかし、これらの抗体は、ＣＤ３イプシロンにＣＤ３ガンマまたはＣＤ３デルタを加えた組み合わせを２重にトランスフェクトした細胞を染色した（Tunnacliffe, 前記引用箇所; Law, Int. Immunol. 14 (2002), 389-400; Salmeron, J.Immunol. 147 (1991), 3047-52; Coulie, Eur. J. Immunol. 21 (1991), 1703-9）。第２のより小さな群において、立体構造エピトープは、ＣＤ３イプシロンサブユニット自体の内部において形成されている。例えば、この群のメンバーは、変性ＣＤ３イプシロンに対して作製されているｍＡｂであるＡＰＡ１／１である（Risueno, Blood 106 (2005), 601-8）。まとめると、当技術分野で説明されるＣＤ３イプシロン抗体のうちの大半は、ＣＤ３の２つ以上のサブユニット上に位置する立体構造エピトープを認識する。これにより、これらのエピトープの３次元構造を形成する離散アミノ酸残基は、ＣＤ３イプシロンサブユニット自体の上に位置する場合もあり、ＣＤ３イプシロンサブユニットと、ＣＤ３ガンマまたはＣＤ３デルタなど、他のＣＤ３サブユニットとの上に位置する場合もある。
【０００７】
ＣＤ３抗体に関する別の問題は、多くのＣＤ３抗体が、種特異的であると分かっていることである。抗ＣＤ３モノクローナル抗体は、他の任意のモノクローナル抗体について一般に成り立つように、それらの標的分子に対する高度に特異的な認識により機能する。抗ＣＤ３抗体は、それらの標的であるＣＤ３分子上における単一の部位またはエピトープだけを認識する。例えば、ＣＤ３複合体に特異的なモノクローナル抗体で最も広く用いられ、且つ、最もよく特徴づけられているのは、ＯＫＴ−３である。この抗体は、チンパンジーのＣＤ３とは反応するが、マカクザルなどその他の霊長類のＣＤ３相同体、またはイヌのＣＤ３とは反応しない（Sandusky et al., J. Med. Primatol. 15 (1986), 441-451）。同様に、国際公開第２００５／１１８６３５号または国際公開第２００７／０３３２３０号は、ヒトＣＤ３イプシロンとは反応するが、マウス、ラット、ウサギ、または、アカゲザル、カニクイザル、もしくはヒヒなど、非チンパンジー霊長類のＣＤ３イプシロンとは反応しない、ヒトＣＤ３イプシロンモノクローナル抗体について説明している。抗ＣＤ３モノクローナル抗体であるＵＣＨＴ−１もチンパンジーに由来するＣＤ３とは反応するが、マカクザルに由来するＣＤ３とは反応しない（独自のデータ）。他方、マカクザル抗原は認識するが、それらのヒト対応物は認識しないモノクローナル抗体の例も見られる。この群の一例は、マカクザルに由来するＣＤ３を指向するモノクローナル抗体であるＦＮ−１８である（Uda et al., J. Med. Primatol. 30 (2001), 141-147）。興味深いことに、ＣＤ３抗原はマカクザル内でも多型であるため、カニクイザルのうち約１２％に由来する末梢リンパ球は、抗アカゲザルＣＤ３モノクローナル抗体（ＦＮ−１８）との反応性を欠くことが分かっている。Ｕｄａらは、ＦＮ−１８抗体と反応しないカニクイザルのＣＤ３配列中では、２つのアミノ酸が、ＦＮ−１８抗体と反応する動物に由来するＣＤ３と比較して置換されていることについて説明した（Uda et al., J Med Primatol. 32 (2003), 105-10; Uda et al., J Med Primatol.33 (2004), 34-7）。
【０００８】
ＣＤ３モノクローナル抗体（およびこれらの断片）だけでなく、モノクローナル抗体一般においても固有の識別能、すなわち、種特異性は、それらを、ヒト疾患を治療するための治療剤として開発する上でも重大な障害である。市販承認を得るために、任意の新規の候補薬は、厳格な試験を通過しなければならない。この試験は、前臨床相および臨床相に区分される。後者は、周知の臨床第Ｉ相、第ＩＩ相、および第ＩＩＩ相へとさらに区分され、ヒト患者において実施されるのに対し、前者は動物において実施される。前臨床試験の目的は、候補薬物が所望の活性を有すること、および、最も重要なこととしては候補薬物が安全であることを証明することである。前臨床試験により、候補薬物の動物における安全性と考えられる有効性とが確立された場合に限り、この候補薬物は、各規制機関により、ヒトにおける臨床試験についての承認を受ける。動物における候補薬物の安全性を、以下の３つの方法において、つまり、（ｉ）関連種、すなわち、候補薬物がオーソログ抗原を認識することのできる種において、（ｉｉ）ヒト抗原を含有するトランスジェニック動物において、および、（ｉｉｉ）動物に存在するオーソログ抗原に結合することのできる候補薬物のサロゲートを用いてテストすることができる。トランスジェニック動物の限界は、この技法が、典型的には齧歯動物に限定されるということである。齧歯動物とヒトとでは、生理学的特性の差違が著明であり、安全性についての結果をヒトへと容易に当てはめることはできない。候補薬物のサロゲートの限界は、実際の候補薬物と比較して材料組成が異なり、また、用いられる動物も、多くの場合、上記で論じた限界を有する齧歯動物であるということである。したがって、齧歯動物において作製された前臨床データは、候補薬物に関する予測力が限定されている。安全性試験に最適の手法は、関連種、好ましくは下等霊長動物の使用である。当技術分野で説明される、ヒトにおける治療的介入に適するモノクローナル抗体は、現時点において、関連種が高等霊長類、特に、チンパンジーであるという限界を有する。チンパンジーは、絶滅危惧種であると考えられており、このような動物を、それらがヒト様の性質を有する理由で薬物の安全性試験に用いることは、欧州において禁止されており、他の地域でも厳しく制限されている。ＣＤ３は、細胞傷害性Ｔ細胞を病理学的細胞へと再指向させ、その結果として、各内臓から疾患細胞を枯渇させる目的で、二重特異性単鎖抗体の標的としても用いられて成功を収めている（国際公開第９９／５４４４０号；国際公開第０４／１０６３８０号）。例えば、近年、Ｂａｒｇｏｕら（Science 321 (2008):974-7）は、ヒト患者におけるすべての細胞傷害性Ｔ細胞に係合して、癌細胞を溶解させる可能性を有する、ブリナツモマブと称するＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の臨床活性について報告している。非ホジキンリンパ腫患者において、１日につき１平方メートル当たり０．００５ミリグラムの低用量で、血中の標的細胞が消失した。腫瘍の部分退縮および完全退縮が初めて観察されたのは０．０１５ミリグラムの用量レベルであり、０．０６ミリグラムの用量レベルで治療された７例の患者すべてが、腫瘍の退縮を経験���た。ブリナツモマブは、骨髄および肝臓からの腫瘍細胞を消失させることにもなった。この研究は、血液細胞に由来する癌を治療する場合に、二重特異性単鎖抗体フォーマットが有する治療的効力についての臨床的概念実証を確立したが、他の種類の癌の治療についても、成功概念が依然として必要である。
【０００９】
２００８年において、米国では、推定１８６，３２０人の男性が新たに前立腺癌と診断され、約２８，６６０人の男性が同疾患により死亡する。癌の死亡率について入手可能な最新の報告は、２００４年において、米国人男性における前立腺癌による総死亡率が、１００，０００人当たり２５人であったことを示す。１９８０年代後半において、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）検査の広範な採用により、前立腺癌の管理は大きく改善された。この検査では、前立腺癌を有する患者において上昇することが多い、血中のＰＳＡタンパク質量が測定される。１９８６年に米国食品医薬品局は、ＰＳＡ検査を、前立腺癌を有する患者のモニタリングに用いることを承認し、さらに１９９４年には、この疾患についてのスクリーニング検査として用いることも承認した。米国においてＰＳＡ検査が広範にわたって実施されたことにより、今日では、全前立腺癌のうちの約９０％が初期段階で診断され、その結果、診断後の生存が延長されている。しかし、ＰＳＡスクリーニングによって実際に命が助かるのかどうかを判定するには、ＮＣＩを依頼者として進行中の２つの臨床試験である、「前立腺、肺、結腸直腸、および卵巣（ＰＬＣＯ）についてのスクリーニング試験」、ならびに「欧州前立腺癌スクリーニング試験（ＥＲＳＰＣ）」の結果が必要とされる。過去２５年間にわたって進行中の臨床試験では、前立腺癌の予防における天然化合物および合成化合物の有効性が調査されてきた。例えば、約１９，０００人の健常男性が登録された「前立腺癌予防試験（ＰＣＰＴ）」では、前立腺の非癌性肥大である良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の治療について承認された薬物であるフィナステリドにより、前立腺癌の発生危険性が２５パーセント低下することが判明した。別の試験である「セレニウムおよびビタミンＥによる癌予防試験（ＳＥＬＥＣＴ）」では、セレニウムおよびビタミンＥを毎日補給することにより、健常男性における前立腺癌の発生率を低下させることができるかどうかを判定する目的で、３５，０００人超の男性について調べつつある。現在のところ、他の前立腺癌予防試験では、マルチビタミン、ビタミンＣおよびＤ、大豆、緑茶、およびトマト中に見いだされる天然化合物であるリコペンの潜在的保護能について評価しつつある。２００５年に報告された一研究は、解析された前立腺癌のうちの６０〜８０パーセントにおいて、特定の遺伝子が融合していることを示した。この研究は、前立腺癌における、ランダムでない遺伝子再配列についての最初の観察である。この遺伝子変化は、この疾患の診断、および、場合によっては治療を支援するために、バイオマーカーとして最終的に用いられてもよい。他の研究は、第８染色体の特定の領域における遺伝子変異により、男性の前立腺癌を発生させる危険性が増大する可能性があることを示した。これらの遺伝子変異は、白人男性において発生する前立腺癌のうちの約２５パーセントの原因となる。これらは、前立腺癌を発生させる危険性を増大させることが検証された最初の遺伝子変異体であり、研究者らがこの疾患の遺伝子的原因をよりよく理解する一助となるかもしれない。患者の血中を循環するタンパク質をどのように用いれば、前立腺癌および他の癌の診断を改善できるかについて検討する研究も進行中である。２００５年に研究者らは、前立腺癌に反応して、患者の免疫系により生成される特異的なタンパク質群を同定した。ある種の自己抗体であるこれらのタンパク質により、９０パーセントを超える正確さで、血液標本中における前立腺癌細胞の存在を検出することができた。ＰＳＡとの組み合わせで使用される場合、これらおよび他の血液タンパク質は、単独のＰＳＡ検査で得られる偽陽性結果の数を減らすため、したがって、偽陽性のＰＳＡ検査結果により毎年実施される多数の不要な前立腺生検を低減するために最終的に用いられてもよい。
【００１０】
ＰＳＡ以外にも、例えば、前立腺上皮６回膜貫通型抗原（ＳＴＥＡＰ）（Hubert et al., PNAS 96 (1999), 14523-14528）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Reiter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 1735-1740, 1998）、および前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ；ＰＳＭ）（Israeli et al., Cancer Res. 53 (1993)）を含め、前立腺癌の他の複数のマーカーが同定されている。ＰＳＭＡは、元来、リンパ節における前立腺腺癌（ＬＮＣａＰ）細胞株から部分的に精製された膜調製物による免疫化に由来するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）である７Ｅ１１により規定された（Horoszewicz et al., Anticancer Res. 7 (1987), 927-35）。ＰＳＭＡタンパク質をコードする２．６５ｋｂのｃＤＮＡ断片がクローニングされ、その後、染色体１１ｐ１１．２へとマップされた（Israeli et al., 前記引用箇所; O’Keefe et al., Biochem. Biophys. Acta 1443 (1998), 113-12７）。ＰＳＭＡについての初期の解析は、前立腺分泌上皮細胞内における広範な発現を裏付けた。免疫組織化学染色は、過形成組織内および良性組織内ではＰＳＭＡの発現が不在〜中程度であるのに対し、悪性組織は最大強度で染色されることを示した（Horoszewicz et al., 前記引用箇所）。その後の調査は、これらの結果を再確認し、ＰＳＭＡの発現を、現在までに検討された事実上すべての前立腺組織における普遍的な特徴として明示している。これらの報告は、ＰＳＭＡの発現が、腫瘍の侵襲性に比例して急上昇することをさらに裏付けている（Burger et al., Int. J. Cancer 100 (2002), 228-237; Chang et al., CancerRes. 59 (1999), 3192-98; Chang et al., Urology 57 (2001), 1179-83; KawakamiおよびNakayama, Cancer Res. 57 (1997), 2321-24; Liu et al., Cancer Res. 57(1997), 3629-34; Lopes et al., Cancer Res. 50 (1990), 6423-29; Silver et al., Clin.Cancer Res. 9 (2003), 6357-62; Sweat et al., Urology 52 (1998), 637-40; Troyer etal., Int. J. Cancer 62 (1995), 552-558; Wright et al., Urology 48 (1996),326-334）。ＰＳＭＡ発現と腫瘍病期との相関に符合して、ＰＳＭＡレベルの上昇は、アンドロゲンに依存しない前立腺癌（ＰＣａ）と関連する。前立腺癌患者に由来する組織試料の解析は、物理的去勢またはアンドロゲン遮断療法後において、ＰＳＭＡレベルが上昇することを示している。アンドロゲン除去後において下方調節される前立腺特異抗原の発現と異なり、ＰＳＭＡの発現は、原発性腫瘍および転移性腫瘍のいずれの標本においても著明に上昇する（Kawakami et al., Wright et al., 前記引用箇所）。アンドロゲンに依存しない腫瘍における発現の上昇と符合して、ＰＳＭＡの転写は、ステロイドによって下方調節されることも知られ、テストステロンの投与は、ＰＳＭＡのタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルの劇的な低下を媒介する（Israeli et al., Cancer Res. 54 (1994), 1807-11; Wright et al., 前記引用箇所）。ＰＳＭＡは、続発性前立腺腫瘍および潜在性の転移性疾患においても高度に発現する。免疫組織学的解析は、良性の前立腺組織と比較して、リンパ節、骨、軟組織、および肺に局在化する転移性病変内では、ＰＳＭＡが比較的強くかつ均一に発現することを明らかにした（Chang et al. (2001), 前記引用箇所; Murphy et al., Cancer 78 (1996), 809-818; Sweat et al., 前記引用箇所）。一部の報告は、腎近位尿細管のサブセット、腸刷子縁膜のうちの一部の細胞、および結腸陰窩内のまれな細胞を含めた前立腺外組織内では、限定的ながらＰＳＭＡが発現することも示している（Chang et al. (1999), Horoszewicz et al.、Israeli et al. (1994)、Lopes et al.、Troyer et al., 前記引用箇所）。しかし、これらの組織内におけるＰＳＭＡのレベルは一般に、前立腺において観察されるレベルより２〜３桁低い（Sokoloffet al., Prostate 43 (2000), 150-157）。ＰＳＭＡは、検討された大半の固形癌の、腫瘍に関連する新生血管内においても発現するが、正常な血管内皮においては不在である（Chang et al. (1999)、Liu et al.、Silver et al., 前記引用箇所）。血管系内においてＰＳＭＡが発現することの意義は不明であるが、腫瘍関連内皮に対する特異性により、ＰＳＭＡは、悪性腫瘍の多くの形態を治療するための潜在的な標的となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
癌の治療法のための新規の標的を同定することに多大の努力が払われているが、癌は、依然として、診断されることが最も多い疾患の１つである。このことに照らすと、癌に対する有効な治療が依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ヒトおよび非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε（イプシロン）鎖エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインと、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合することが可能な第２の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体分子であって、前記エピトープが、配列番号２、４、６、および８からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部である、二重特異性単鎖抗体分子を提供する。
【００１３】
当技術分野で説明される、Ｔ細胞に係合する二重特異性単鎖抗体は、悪性疾患の治療に対して大きな治療的可能性を有するが、これらの二重特異性分子の大半は、それらが種特異的であり、ヒト抗原および（遺伝子の類似性により）おそらくはチンパンジーの対応物だけを認識するという点で限定されている。本発明の利点は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物に対して異種間特異的な、ＣＤ３イプシロン鎖結合ドメインを含む二重特異性単鎖抗体を提供することである。
【００１４】
驚くべきことに、本発明では、ＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインのＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド断片であって、当技術分野で説明される他のすべての既知のＣＤ３イプシロンエピトープとは対照的に、ＣＤ３複合体（であり、場合によっては、ＥｐＣＡＭまたは免疫グロブリンのＦｃ部分などの異種アミノ酸配列に融合させた）内におけるその天然環境から取り出されたときにその３次元構造における完全性を維持するポリペプチド断片が同定された。したがって、本発明は、ヒト、および少なくとも１つの非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン鎖によるＣＤ３イプシロン（このＣＤ３イプシロンは、例えば、その天然環境から取り出され、および／またはＴ細胞（の表面に存在すること）により包含される）の細胞外ドメインのＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド断片エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインと；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合することが可能な第２の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体分子であって、前記エピトープは、配列番号２、４、６、および８からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部である二重特異性単鎖抗体分子を提供する。好ましい非チンパンジー霊長類は、本明細書の別の箇所で言及される。コモンマーモセット、ワタボウシタマリン、コモンリスザル、およびカニクイザル（配列番号６３１もしくは６３２、またはこれらの両方）から選択される少なくとも１つの（１または複数の）霊長動物（またはそのうちのいずれかもしくはすべて）が、特に好ましい。リーサスモンキーとしても知られるアカゲザルも、別の好ましい霊長動物であると想定される。したがって、本発明の抗体は、ヒトならびにコモンマーモセット、ワタボウシタマリン、コモンリスザル、およびカニクイザル（配列番号６３１もしくは６３２、またはこれらの両方）、そして、場合によっては、アカゲザルのＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド断片による、環境に依存しない（context-independent）エピトープに結合する（結合可能である）と想定される。本明細書で定義される第１の結合ドメインを含む二重特異性単鎖抗体分子は、国際公開第２００８／１１９５６７号（特に、国際公開第２００８／１１９５６７号の実施例２）においてデザインされるプロトコールに従って入手することができ（入手可能であり）、または、作製することができる。この目的のために、（ａ）ヒトおよび／またはコモンリスザルのＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド断片でマウスを免疫化すること；（ｂ）マウス免疫抗体であるｓｃＦｖのライブラリーを作製すること；（ｃ）少なくとも配列番号２、４、６、および８に結合する能力について調べることにより、ＣＤ３イプシロン特異的結合剤を同定することが想定される。
【００１５】
本発明で提供される、環境に依存しないＣＤ３エピトープは、ＣＤ３イプシロンのＮ末端における最初の２７アミノ酸、またはこの２７アミノ酸の連なりによる機能的断片に対応する。ＣＤ３エピトープとの関連において本明細書で用いられる「環境に依存しない」という語句は、本明細書に記載の本発明による結合分子／抗体分子の結合が、抗原決定基またはエピトープの周囲における立体構造、配列、または構造の変化または改変をもたらさないことを意味する。これに対し、従来の（例えば、国際公開第９９／５４４４０号または国際公開第０４／１０６３８０号に開示されるような）ＣＤ３結合分子により認識されるＣＤ３エピトープは、環境に依存しないエピトープのＮ末端におけるアミノ酸１〜２７に対してＣ末端側のＣＤ３イプシロン鎖上に局在するが、従来のＣＤ３結合分子により認識されるＣＤ３エピトープは、該イプシロン鎖の残りの部分の中に埋め込まれ、該イプシロン鎖がＣＤ３ガンマ鎖またはＣＤ３デルタ鎖とヘテロ二量体化することによって適正な立体構造位置に保持される場合に限り、適正な立体構造を帯びる。
【００１６】
本明細書において提供されるようなＰＳＭＡｘＣＤ３二重特異性単鎖分子の一部としての抗ＣＤ３結合ドメインは、国際公開第２００８／１１９５６７号に記載されている。これらの結合ドメインは、環境に依存しないＣＤ３エピトープに対して作製され（また、これを指向し）、Ｔ細胞の再分布に関して驚くべき臨床的改善をもたらし、それゆえ、より好ましい安全性プロファイルをもたらす。理論に拘束されることなしに述べると、該ＣＤ３エピトープは環境に依存せず、ＣＤ３複合体の残りの部分に対してさほどの影響を及ぼすことなく、自律的な自己充足的サブドメインを形成するので、本明細書に記載のＰＳＭＡｘＣＤ３二重特異性単鎖分子のＣＤ３結合ドメインが誘導するＣＤ３立体構造のアロステリック変化は、環境に依存するＣＤ３エピトープを認識する従来のＣＤ３結合分子（例えば、国際公開第９９／５４４４０号または国際公開第０４／１０６３８０号に記載の分子など）が誘導する同変化よりも小さい。
【００１７】
本発明のＰＳＭＡｘＣＤ３二重特異性単鎖抗体のＣＤ３結合ドメインにより認識されるＣＤ３エピトープの環境非依存性は、本発明の前記ＰＳＭＡｘＣＤ３二重特異性単鎖抗体による治療の開始期において、Ｔ細胞の再分布（Ｔ細胞の再分布とは、絶対Ｔ細胞カウントが初期に低下するエピソード、およびその後の回復と同じである）がより低度であるか、またはそれが見られないことと関連している。この結果、本発明のＰＳＭＡｘＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、環境に依存するＣＤ３エピトープを認識する当技術分野で知られる従来のＣＤ３結合分子よりも、安全性プロファイルがより良好となる。特に、ＣＤ３結合分子による治療の開始期におけるＴ細胞の再分布は、ＣＮＳ有害事象などの有害事象の主要な危険因子であるため、本発明のＰＳＭＡｘＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、環境に依存するＣＤ３エピトープではなく、環境に依存しないＣＤ３エピトープを認識することにより、当技術分野で知られるＣＤ３結合分子を凌駕する、実質的な安全性の利点を有する。従来のＣＤ３結合分子による治療の開始期におけるＴ細胞の再分布と関連するこのようなＣＮＳ有害事象を有する患者は通常、錯乱および見当識障害を患い、場合によっては、尿失禁も患う。錯乱とは、患者が、その通常レベルの明晰さで思考することができない精神状態の変化である。患者は通常、集中することが困難であり、思考は、ぼやけて不明瞭なだけでなく、著しく緩慢となることが多い。従来のＣＤ３結合分子による治療の開始期におけるＴ細胞の再分布と関連するＣＮＳ有害事象を有する患者は、記憶喪失も患う場合がある。錯乱は、人、場所、時間、または日付を認識する能力を喪失させることが多い。錯乱においては、見当識障害の感覚が一般的であり、意思決定能力が損なわれる。従来のＣＤ３結合分子による治療の開始期におけるＴ細胞の再分布と関連するＣＮＳ有害事象は、言語不明瞭および／または適語発見の困難をさらに含むことがある。この障害は、読み書きだけではなく、言語の表現および理解の両方を損なう場合がある。患者によって、従来のＣＤ３結合分子による治療の開始期におけるＴ細胞の再分布と関連するＣＮＳ有害事象には、尿失禁に加えて、回転性眩暈および眩暈が伴う場合もある。
【００１８】
言及されたＣＤ３イプシロンのＮ末端における２７アミノ酸のポリペプチド断片内における３次元構造の維持を用いて、インビトロにおけるＮ末端ＣＤ３イプシロンポリペプチド断片、および同じ結合能でインビボのＴ細胞上における天然のＣＤ３複合体（のＣＤ３イプシロンサブユニット）に結合することが可能な、好ましくはヒト結合ドメインを作製することができる。これらのデータは、本明細書に記載のＮ末端断片が、インビボにおいて通常存在するその構造に類似する３次構造を形成することを強く示す。ＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１〜２７の構造的完全性の重要性についての極めて高感度の試験を実施した。ＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１〜２７のうちの個々のアミノ酸を、アラニンに変化させ（アラニン走査）、わずかな撹乱に対するＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１〜２７の感受性を調べた。本発明のＰＳＭＡｘＣＤ３二重特異性単鎖抗体の一部としてのＣＤ３特異性結合ドメインを用いて、ＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１〜２７のアラニン突然変異体に対する結合について調べた（国際公開第２００８／１１９５６７号参照）。該断片の最Ｎ末端にある最初の５つのアミノ酸残基、並びに、ＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１〜２７のうちの２３位および２５位にある２つのアミノ酸の個々の変化が、該抗体分子の結合にとって極めて重要であった。残基Ｑ（１位におけるグルタミン）、Ｄ（２位におけるアスパラギン酸）、Ｇ（３位におけるグリシン）、Ｎ（４位におけるアスパラギン）、およびＥ（５位におけるグルタミン酸）を含む第１〜５位の領域内にあるアミノ酸残基をアラニンへと置換したところ、前記断片に対する、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡｘＣＤ３二重特異性単鎖抗体の結合が消失した。一方、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体のうちの少なくとも一部について、言及された断片のＣ末端における２つのアミノ酸残基であるＴ（２３位におけるトレオニン）およびＩ（２５位におけるイソロイシン）をアラニンへと置換したところ、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体に対する結合エネルギーが低下した。
【００１９】
予測外のことに、このようにして単離された、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、ヒトＣＤ３イプシロンＮ末端断片を認識するだけでなく、新世界ザル（マーモセット、コモンマーモセット；ワタボウシタマリン；コモンリスザル）、および旧世界ザル（サイノモルガスモンキーとしても知られるカニクイザル；またはリーサスモンキーとしても知られるアカゲザル）を含めた各種の霊長類によるＣＤ３イプシロンの対応する相同性の断片も認識することが判明した。したがって、本発明のＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の複数の霊長動物に対する特異性が検出された。以下の配列解析により、ヒトおよび霊長類は、ＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのＮ末端において高度に相同性の配列の連なりを共有することが確認された。
【００２０】
前述のＣＤ３イプシロンのＮ末端断片のアミノ酸配列は、配列番号２（ヒト）、配列番号４（コモンマーモセット）；配列番号６（ワタボウシタマリン）；配列番号８（コモンリスザル）；配列番号６３１：ＱＤＧＮＥＥＭＧＳＩＴＱＴＰＹＱＶＳＩＳＧＴＴＩＬＴＣ、または配列番号６３２：ＱＤＧＮＥＥＭＧＳＩＴＱＴＰＹＱＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴ（サイノモルガスモンキーとしても知られるカニクイザル）、および配列番号６３３：ＱＤＧＮＥＥＭＧＳＩＴＱＴＰＹＨＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴ（リーサスモンキーとしても知られるアカゲザル）において示される。
【００２１】
本発明のＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の第２の結合ドメインは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する。ＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の第２の結合ドメインは、ヒトＰＳＭＡ、または非チンパンジー霊長動物のＰＳＭＡに結合することが好ましく；ヒトＰＳＭＡ、および非チンパンジー霊長動物のＰＳＭＡに結合し、したがって、異種間特異的であることがより好ましく；ヒトＰＳＭＡ、およびマカクザルのＰＳＭＡに結合することがさらにより好ましい（したがって、異種間特異的でもある）。マカクザルのＰＳＭＡは、サイノモルガスモンキーのＰＳＭＡ、および／またはリーサスモンキーのＰＳＭＡであることが特に好ましい。しかし、該第２の結合ドメインは齧歯動物におけるＰＳＭＡ相同体など他の種のＰＳＭＡ相同体にも結合してもよい、ということが本発明の範囲から除外されることはない。
【００２２】
前立腺癌は、男性において２番目に多い癌である。２００８年の米国では、１８６，３２０人が新たに前立腺癌と診断され、約２８，６６０人が同疾患により死亡すると推定されている。前立腺癌の危険性は、年齢と強く関連している：５０歳未満の男性で登録された症例は極めて少数であり、症例の４分の３は６５歳を超える男性において発生している。症例の最多数は、７０〜７４歳の患者で診断されている。現在のところ、老齢人口の増加率は、総人口の増加率よりも著明に高い。予測では、２０２５〜２０３０年までに、６０歳を超える人口は、総人口の３．５倍の速さで増加する。老齢者の比率は、次の半世紀には世界全体で２倍を超えると予測され、これは、診断による前立腺癌の発生率のさらなる増大を将来に向けて予測しなければならないことを意味する。ＰＳＭＡの発現およびその上方調節は、前立腺癌の進行病期および転移性疾患に高度に限定されるほか、ＰＳＭＡは、他の多くの異なる種類の固形腫瘍の腫瘍血管系においても新抗原としての役割を果たすため、抗体ベースの癌治療の魅力的な標的抗原としての資質を有する。以下の実施例で示す通り、本発明のＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、ＰＳＭＡを発現するヒト癌細胞、例えば、ヒト前立腺癌細胞株であるＬＮＣａＰを死滅させるための有利なツールを提供する。加えて、本発明のＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の細胞傷害活性は、当技術分野で説明される抗体の細胞傷害活性を上回る。本発明のＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体のＣＤ３結合ドメインおよびＰＳＭＡ結合ドメインは、好ましくはいずれも異種間特異的である、すなわち、ヒト抗原および非チンパンジー霊長類の抗原と反応するので、霊長類におけるこれらの結合ドメインの安全性プロファイル、活性プロファイル、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、且つ、（同一の形態で）ヒトにおける薬物として用いることができる。
【００２３】
本発明は、ヒトPSMAと、マカクザルPSMA相同体、すなわち、非チンパンジー霊長動物による相同体との両方に結合する第２の結合ドメインを含むＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体も提供することが有利である。したがって、好ましい実施形態において、二重特異性単鎖抗体は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のPSMAに対して異種間特異的な第２の結合ドメインを含む。この場合、同一の二重特異性単鎖抗体分子を、霊長類におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、且つ、ヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。言い換えれば、同じ分子を、前臨床動物研究およびヒトにおける臨床研究に用いることができる。これにより、種特異的なサロゲート分子と比較して、動物研究の結果が高度に比較可能となり、且つ、動物研究による予測力が大幅に増大する。本発明のＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体のCD３結合ドメインおよびPSMA結合ドメインは共に、異種間特異的である、すなわち、ヒト、および非チンパンジー霊長類の抗原と反応するので、これを、霊長類におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、および／または薬物動態プロファイルの前臨床評価用に、且つ、同一の形態でヒトにおける薬物としての両方に用いることができる。好ましい実施形態において、本発明の抗体の第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインの異種間特異性は同一であることが理解される。
【００２４】
本発明では、同一の分子を、前臨床動物試験およびヒトにおける臨床研究において用いることができ、さらに、ヒトにおける治療においても用いることができる、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体を作製することが可能であることが判明した。これは、ヒトCD３イプシロンおよびPSMA（ならびに、遺伝子の類似性により、おそらくは、チンパンジーの対応物）のそれぞれに対する結合に加えて、新世界ザルおよび旧世界ザルを含めた、非チンパンジー霊長類の前記抗原の相同体にも結合する、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体が予測外に同定されたためである。以下の実施例で示される通り、前記本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、癌が含まれるがこれらに限定されない各種の疾患に対する治療剤として用いることができる。ＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、癌、好ましくは固形腫瘍、より好ましくは癌腫および前立腺癌の治療に特に有利である。上記を考慮すると、系統発生的に（ヒトから）遠い種における試験のためのサロゲートＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体を構築する必要は消滅する。結果として、臨床試験のほか、市販承認後、および治療薬投与においてヒトに投与することを意図するのと同様に、前臨床動物試験においても同一の分子を用いることができる。ヒトに対するその後の投与における分子と同じ分子を前臨床動物試験にも用いることができれば、前臨床動物試験において得られたデータをヒトの場合に適用する可能性が限定される危険が、事実上取り除かれるか、または少なくとも大幅に低減される。つまり、ヒトに対して実際に投与される分子と同じ分子を用いて、動物における前臨床安全性データを得ることは、該データをヒトに対して関連性の高いシナリオに適用する可能性を裏付けることに寄与する。これに対し、サロゲート分子を用いる従来の手法では、前記サロゲート分子を、前臨床安全性評価に用いられる動物試験系に分子適応させなければならない。したがって、ヒト治療において実際に用いられる分子は、薬物動態パラメータおよび／または生物学的活性の前臨床試験で用いられるサロゲート分子とは、配列、および、おそらくは構造も異なり、結果として、前臨床動物試験で得られたデータをヒトの場合に適用する可能性／移し替える可能性が限定されてしまう。サロゲート分子の使用は、完全に新たな構築物の構築、作製、精製、および特徴づけを必要とする。これにより、その分子を得るのに必要な開発費用および時間がかさむことになる。つまり、ヒト治療において用いられる実際の薬物に加えて、サロゲートを別個に開発しなければならず、そのため、２つの分子のための２系統の開発を実施しなければならない。したがって、本明細書で説明される異種間特異性を示す、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の主要な利点は、ヒトにおける治療剤用にも前臨床動物試験においても同一の分子を用いることができることである。
【００２５】
本発明の二重特異性単鎖抗体の前記第１または第２の結合ドメインのうちの少なくとも１つは、以下でより詳細に記載される通り、ＣＤＲ移植ドメイン、ヒト化ドメイン、またはヒトドメインであることが好ましい。本発明の二重特異性単鎖抗体の第１および第２の結合ドメインは両方とも、ＣＤＲ移植ドメイン、ヒト化ドメイン、またはヒトドメインであることが好ましい。本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の場合、前記結合分子に対する免疫反応の発生は、ヒト患者に対する該分子の投与時に可能な範囲で最大限に排除される。
【００２６】
本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の別の主要な利点は、各種の霊長類における前臨床試験に対するその適用可能性である。動物における候補薬物の挙動は、理想的には、ヒトに対する投与におけるこの候補薬物の予測される挙動を示すべきである。したがって、結果として、このような前臨床試験から得られるデータは一般に、ヒトの場合に対する高度な予測力を有するべきである。しかし、ＴＧＮ１４１２（ＣＤ２８モノクローナル抗体）についての最近の第Ｉ相臨床試験による痛ましい結果から分かるように、候補薬物は、霊長類種において、ヒトにおける作用とは異なる形で作用する場合がある。サイノモルガスモンキーにより実施された前記抗体の前臨床動物試験では有害作用がまったく観察されないか、または極めて限定された形でしか観察されなかったのに対し、６名のヒト患者が前記抗体の投与時に多臓器不全を発症した（Lancet 368 (2006), 2206-7）。これらの劇的で望ましくない、否定的事象を示す結果により、前臨床試験を唯一の（非チンパンジー霊長動物）種に限定するのでは不十分かもしれないことが示唆される。本発明のＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体が一連の新世界ザルおよび旧世界ザルに結合するという事実は、上記に述べた場合において直面する問題を克服する一助となるかもしれない。したがって、本発明は、ヒト治療用の薬物を開発し、これらを試験にかける場合における作用の種間差違を最小化する手段および方法を提供する。
【００２７】
本発明の、好ましくはヒト異種間特異的ＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体により、例えば、トランスジェニック動物の作製など、ヒトに対する投与が意図される候補薬物に対して試験動物を適合させることも必要なくなる。本発明の使用および方法に従い、異種間特異性を示す、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体を、非チンパンジー霊長類に対する遺伝子操作なしに、該動物における前臨床試験に直接用いることができる。当業者には周知の通り、試験動物を候補薬物に適合させる手法は、動物が改変されているので前臨床安全性試験において得られた結果がヒトについてはあまり典型的ではなく予測性のあるものではない、という危険性を常にはらむ。例えば、トランスジェニック動物において、トランス遺伝子によりコードされるタンパク質は、高度に過剰発現されることが多い。したがって、該タンパク質抗原に対する抗体の生物学的活性について得られたデータの予測的価値は、このタンパク質がはるかにより低く、より生理学的なレベルで発現されるヒトの場合、限定されていることもある。
【００２８】
異種間特異性を示す、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の使用によるさらなる利点は、絶滅の危機にある種としてのチンパンジーを、動物試験にかけずに済むということである。チンパンジーは、ヒトに対する最も近い類縁種であり、近年、ゲノム配列決定データに基づき、ヒト科へと群分けされた（Wildman et al., PNAS 100 (2003), 7181）。したがって、チンパンジーについて得られたデータは一般に、ヒトについての予測性が高いと考えられる。しかし、チンパンジーは絶滅危惧種なので、医学実験に用いることのできるチンパンジーの数は極めて制約されている。したがって、上述の通り、チンパンジーを動物試験用に維持することには、費用および倫理の両面において問題がある。本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の使用により、得られる動物試験データの質、すなわち、適用可能性を偏向させることなく、前臨床試験の際の倫理的障害および財政的負担の両方が回避される。このことに照らし、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の使用は、チンパンジーにおける研究に対する理にかなった代替法を提供する。
【００２９】
本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体のまたさらなる利点は、例えば、薬物動態動物試験を実施する過程で前臨床動物試験の一部としてそれを用いる場合に、複数の血液試料を抽出できることである。非チンパンジー霊長動物によれば、マウスなどの下等動物よりもはるかに容易に複数の血液抽出物を得ることができる。複数の血液試料を抽出することにより、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体により誘導される生物学的効果を決定するための血液パラメータの持続的な検査が可能となる。さらに、複数の血液試料を抽出することで、研究者は、本明細書で定義される、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の薬物動態プロファイルを評価することが可能である。加えて、血液パラメータに反映される、前記本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体により誘導される可能性のある潜在的な副作用を、前記抗体を投与する中で抽出される異なる血液試料において測定することもできる。これにより、本明細書で定義される、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の潜在的な毒性プロファイルを決定することができる。
【００３０】
異種間特異性を示す、本明細書で定義される、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の利点は、以下の通りに簡略にまとめることができる。
【００３１】
第１に、前臨床試験で用いられる、本明細書で定義される、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、ヒト治療において用いられる抗体と同じである。したがって、薬物動態特性および生物学的活性において異なることもある２つの個別の分子を開発する必要がなくなる。これは、例えば、薬物動態結果を、従来のサロゲート法などの場合よりも直接的に、ヒト状況へと移し替えることが可能であり、且つ、適用することが可能である点において、極めて有利である。
【００３２】
第２に、ヒトにおける治療剤を調製するための、本明細書で定義される、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の使用は、サロゲート法よりも費用集約性および労働集約性が低い。
【００３３】
第３に、本明細書で定義される、本発明の、好ましくはヒトＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、１つの霊長類種における前臨床試験に用いることができるだけでなく、一連の異なる霊長類種における前臨床試験にも用いることができ、このため、霊長類とヒトとの潜在的な種間差違の危険性を制限することができる。
【００３４】
第４に、動物試験用として絶滅の危機にある種としてのチンパンジーを、所望の場合、用いずに済ますことができる。
【００３５】
第５に、広範な薬物動態研究用に、複数の血液試料を抽出することができる。
【００３６】
第６に、本発明の好ましい実施形態による、好ましくは、ヒト結合分子は、ヒト由来であるため、ヒト患者に投与した場合、前記結合分子に対する免疫反応の発生が最小化される。マウス由来の治療分子に対してヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を発生させる、例えば、マウスなど、非ヒト種に由来する候補薬物に特異的な抗体による免疫反応の誘導が排除される。
【００３７】
最後になるが重要なことは、本発明のＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の治療的使用は、癌、好ましくは固形腫瘍、より好ましくは癌腫および前立腺癌に対する新規の発明による治療法を提供する。以下の実施例で示す通り、本発明のＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体は、ＰＳＭＡを発現するヒト前立腺癌細胞を死滅させるための有利なツールを提供する。さらに、本発明のＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性単鎖抗体の細胞傷害活性は、当技術分野で説明される抗体の細胞傷害活性よりも高い。
【００３８】
本明細書の上記で言及した通り、本発明は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のCD３ε鎖のエピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインと、PSMAに結合することが可能な第２の結合ドメインとを含むポリペプチド、すなわち、二重特異性単鎖抗体分子を提供する。該第２の結合ドメインが、ヒトPSMAおよび非チンパンジー霊長動物のPSMAに結合することが好ましい。本発明の好ましい二重特異性単鎖抗体の要件を満たす候補薬物としての二重特異性単鎖抗体の利点は、このような分子を、前臨床動物試験および臨床試験において用い、さらにヒトにおける治療用にも用いることである。本発明の異種間特異的な二重特異性単鎖抗体の好ましい実施形態において、PSMAに結合する第２の結合ドメインは、ヒトである。本発明による異種間特異的な二重特異性単鎖抗体において、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のCD３イプシロン鎖のエピトープに結合する結合ドメインは、該二重特異性分子のN末端またはC末端において、VH−VLまたはVL−VHの順序で配置される。第１および第２の結合ドメインにおいてVH鎖およびVL鎖の配列が異なる、本発明による異種間特異的な二重特異性分子の例は、別記の実施例において説明する。
【００３９】
本明細書で用いられる「二重特異性単鎖抗体」とは、２つの結合ドメインを含む単一のポリペプチド鎖を指す。各結合ドメインは、抗体の重鎖に由来する１つの可変領域（「ＶＨ領域」）を含み、第１の結合ドメインのＶＨ領域はＣＤ３ε分子に特異的に結合し、第２の結合ドメインのＶＨ領域は、ＰＳＭＡに特異的に結合する。２つの結合ドメインは、場合によって、短いポリペプチドスペーサーにより互いに連結される。ポリペプチドスペーサーの非限定的な例は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ）およびその反復配列である。各結合ドメインはさらに、抗体軽鎖に由来する１つの可変領域（「ＶＬ領域」）を含む場合もあり、第１および第２の結合ドメインの各々の内にあるＶＨ領域およびＶＬ領域は、例えば、ＥＰ６２３６７９Ｂ１において開示および特許請求される種類のポリペプチドリンカーであるが、いずれにせよ、第１の結合ドメインのＶＨ領域およびＶＬ領域、ならびに第２の結合ドメインのＶＨ領域およびＶＬ領域が、それらが一体で、第１および第２の結合ドメインそれぞれに特異的に結合できるように、互いと対合することを可能とするのに十分な長さのポリペプチドリンカーにより互いに連結される。
【００４０】
「タンパク質」という用語は、当技術分野においては周知であり、生物学的化合物について述べる用語である。タンパク質は、１または複数のアミノ酸鎖（ポリペプチド）を含み、該アミノ酸は、ペプチド結合により互いに結合されている。本明細書で用いられる「ポリペプチド」という用語は、３０を超えるアミノ酸からなる分子群について述べる用語である。本発明によれば、ポリペプチド群は、タンパク質が単一のポリペプチド鎖からなる限り、「タンパク質」を含む。また、この定義に沿って述べると、「ポリペプチド」という用語は、タンパク質の断片が３０を超えるアミノ酸からなる限り、タンパク質の断片についても述べる用語である。ポリペプチドは、二量体、三量体、およびより高次のオリゴマーなどの、すなわち、複数のポリペプチド分子からなる多量体をさらに形成する場合がある。このような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一の場合もあり、同一でない場合もある。結果として、このような多量体の対応する高次構造は、ホモ二量体またはヘテロ二量体、ホモ三量体またはヘテロ三量体などと呼ばれる。ヘテロ多量体の例は、その天然形態において、２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および２つの同一の重鎖ポリペプチドからなる抗体分子である。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、天然修飾ポリペプチド／タンパク質も指し、この場合、修飾は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの翻訳後修飾により実施される。このような修飾は、当技術分野で周知である。
【００４１】
「結合ドメイン」という用語は、本発明との関連においては、任意の標的構造／抗原／エピトープに特異的に結合する／これらと特異的に相互作用するポリペプチドドメインを特徴づける。したがって、結合ドメインは、「抗原との相互作用部位」である。「抗原との相互作用部位」という用語は、本発明によれば、特異的抗原または特異的抗原群、例えば、異なる種における同一の抗原と特異的に相互作用することのできるポリペプチドモチーフを定義する。前記結合／相互作用は、「特異的認識」を定義するとも理解される。「特異的に認識する」という用語は、本発明では、抗体分子が、抗原、例えば、本明細書で定義されるヒトCD３抗原の少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つのアミノ酸と特異的に相互作用し、および／またはこれらに特異的に結合することが可能なことを意味する。このような結合は、「鍵と鍵穴の原理」の特異性により例示することができる。したがって、結合ドメインのアミノ酸配列中における特異的モチーフ、および抗原は、一次構造、二次構造、または三次構造の結果として、ならびに、前記構造の副次的修飾の結果として互いに結合する。抗原との相互作用部位が、その特異的抗原と特異的に相互作用する結果、前記部位が、該抗原に単純に結合する場合もある。さらに代替的に、結合ドメイン／抗原との相互作用部位が、その特異的抗原と特異的に相互作用する結果、例えば、抗原の立体構造変化、抗原のオリゴマー化などが誘導されるために、シグナルが誘発される場合もある。本発明に沿った結合ドメインの好ましい例は、抗体である。結合ドメインは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の場合もあり、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に由来する場合もある。
【００４２】
「抗体」という用語は、結合特異性をなおも保持するその派生体または機能的断片を含む。抗体を作製するための技法は当技術分野では周知であり、例えば、HarlowおよびLane、「Antibodies,A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988、HarlowおよびLane 「Using Antibodies: A Laboratory Manual」 Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1999、および Little 「Recombinant Antibodies for Immunotherapy」 CambridgeUniversity Press 2009において説明されている。「抗体」という用語は、異なるクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）およびサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）の免疫グロブリン（Ｉｇ）も含む。
【００４３】
「抗体」という用語の定義は、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体などの形態のほか、とりわけＦａｂ断片のような抗体断片も包含する。抗体の断片または派生体は、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、または、単一ドメイン抗体、単一可変ドメイン抗体、または、可変ドメインを１つしか含まない免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含み、この単一可変ドメインは、他のＶ領域またはＶドメインに依存せずに抗原またはエピトープに特異的に結合するものであり、ＶＨまたはＶＬである可能性がある（例えば、HarlowおよびLanc（1988）および（1999）およびLittle (2009), 前記引用箇所を参照）。このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、単離された抗体の単一可変ドメインポリペプチドだけでなく、抗体の単一可変ドメインのポリペプチド配列による１または複数の単量体を含むより高分子のポリペプチドも包含する。
【００４４】
当技術分野では各種の手順が知られており、これらを用いてこのような抗体および／または断片を作製してもよい。したがって、（抗体）派生体を、ペプチド模倣体により作製することもできる。さらに、単鎖抗体の作製について説明される方法（とりわけ、米国特許第４，９４６，７７８号を参照）を適合させて、選択された（１または複数の）ポリペプチドに特異的な単鎖抗体を作製することができる。また、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質に特異的なヒト化またはヒト抗体を発現させるためにトランスジェニック動物を用いてもよい。モノクローナル抗体を調製するには、持続的な細胞株培養物により生成された抗体を提供する任意の技法を用いることができる。このような技法の例としては、ハイブリドーマ法（KohlerおよびMilsteinNature 256 (1975), 495-497）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor,Immunology Today 4 (1983), 72）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶハイブリドーマ法（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,Inc. (1985), 77-96）が挙げられる。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで用いられる表面プラズモン共鳴を用いて、ＣＤ３イプシロン、またはＰＳＭＡなどの標的ポリペプチドエピトープに結合するファージ抗体の有効性を増大させることができる（Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol.Methods 183 (1995), 7-13）。本発明の文脈では、「抗体」という用語が、本明細書の以下で説明される宿主内で発現される可能性のある抗体構築物、例えば、とりわけ、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターによりトランスフェクトおよび／またはこれにより形質導入される可能性のある抗体構築物も含むものとする。
【００４５】
本発明により用いられる「特異的相互作用」という用語は、結合ドメインが、その結合対象のポリペプチドと同様の構造を有するポリペプチドであって、対象のポリペプチドと同じ細胞により発現される可能性のあるポリペプチドと交差反応しないか、または著明には交差反応しないことを意味する。被験結合ドメインパネルの交差反応性は、例えば、通常の条件下において、前記結合ドメインパネルの結合を評価することにより調べることができる（例えば、HarlowおよびLane（1988）および（1999）、ならびにLittle（2009）、前記引用箇所を参照）。結合ドメインが特異的抗原と特異的に相互作用する例は、リガンドがその受容体に対して特異的な場合を含む。前記定義は特に、リガンドがその特異的受容体に結合するとシグナルを誘発するというリガンドの相互作用を含む。前記定義にも特に含まれる前記相互作用の例は、抗原決定基（エピトープ）と抗体の結合ドメイン（抗原結合部位）との相互作用である。
【００４６】
本明細書で用いられる「異種間特異的」または「種間特異性」という用語は、本明細書に記載の結合ドメインが、ヒト、および非チンパンジー霊長類における同じ標的分子に結合することを意味する。したがって、「異種間特異的」または「種間特異性」とは、異なる種において発現する同じ分子である「Ｘ」に対する種間反応性ではあるが、「Ｘ」以外の分子に対する種間反応性ではないものとする。例えば、ヒトＣＤ３イプシロンを認識するモノクローナル抗体が、非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン、例えば、マカクザルＣＤ３イプシロンに対して異種間特異的であるかどうかは、例えば、ＦＡＣＳ解析により決定することができる。ＦＡＣＳ解析は、前記ヒト、および非チンパンジー霊長動物それぞれのＣＤ３イプシロン抗原を発現する、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の細胞、例えば、マカクザルの細胞に対する結合について、それぞれのモノクローナル抗体を調べる形で実施する。適切なアッセイを、以下の実施例で示す。上述の対象物質は、適宜変更して、ＰＳＭＡ抗原にあてはまる：例えば、ヒトのＰＳＭＡを認識するモノクローナル抗体が、非チンパンジー霊長動物のＰＳＭＡ、例えば、マカクザルのＰＳＭＡに対して異種間特異的であるかどうかは、例えば、ＦＡＣＳ解析により決定することができる。ＦＡＣＳ解析は、前記ヒト、および非チンパンジー霊長動物それぞれのＰＳＭＡ抗原を発現する、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の細胞、例えば、マカクザルの細胞に対する結合について、各モノクローナル抗体を調べる形で実施する。
【００４７】
本明細書で用いられるＣＤ３イプシロンとは、Ｔ細胞受容体の一部として発現する分子を指し、先行技術においてそれが有すると典型的にみなされる意味を有する。ヒトにおいて、それは、個別の形態または個別に組み合わせた形態において、既知のすべてのＣＤ３サブユニット、例えば、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３アルファ、およびＣＤ３ベータを包含する。本明細書で言及される非チンパンジー霊長動物の非ヒトＣＤ３抗原は、例えば、カニクイザルＣＤ３およびアカゲザルＣＤ３である。カニクイザルにおいて、それは、ＣＤ３イプシロンＦＮ−１８陰性、およびＣＤ３イプシロンＦＮ−１８陽性、ＣＤ３ガンマ、およびＣＤ３デルタを包含する。アカゲザルにおいて、それは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、およびＣＤ３デルタを包含する。本明細書で用いられる前記ＣＤ３は、ＣＤ３イプシロンであることが好ましい。
【００４８】
ヒトＣＤ３イプシロンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００７３３において示されており、配列番号１を含む。ヒトＣＤ３ガンマは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００７３において示されている。ヒトＣＤ３デルタは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００７３２において示されている。
【００４９】
カニクイザルのＣＤ３イプシロン「ＦＮ−１８陰性」（すなわち、上記の多形のため、モノクローナル抗体であるＦＮ−１８により認識されないＣＤ３イプシロン）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０７３９９４において示されている。
【００５０】
カニクイザルのＣＤ３イプシロン「ＦＮ−１８陽性」（すなわち、モノクローナル抗体であるＦＮ−１８により認識されるＣＤ３イプシロン）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０７３９９３において示されている。カニクイザルのＣＤ３ガンマは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０７３９９２において示されている。カニクイザルのＣＤ３デルタは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０７３９９１において示されている。
【００５１】
アカゲザルのCD３イプシロン相同体、CD３ガンマ相同体、およびCD３デルタ相同体それぞれの核酸配列およびアミノ酸配列は、当技術分野で説明される組換え法（Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold SpringHarbor Laboratory Press, 3rd edition 2001）により同定および単離することができる。これは、適宜変更して、本明細書で定義されるその他の非チンパンジー霊長類のＣＤ３イプシロン相同体、ＣＤ３ガンマ相同体、およびＣＤ３デルタ相同体にも適用される。コモンマーモセット、コモンリスザル、およびワタボウシタマリンのアミノ酸配列の同定は、別記の実施例において説明する。コモンマーモセットのＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸配列を配列番号３に示し、ワタボウシタマリンのアミノ酸配列を配列番号５に示し、コモンリスザルのアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【００５２】
ヒトＰＳＭＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号「ＡＹ１０１５９５」に示されている。マカクザルのＰＳＭＡ相同体のクローニングを以下の実施例に示し、対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２２３および２２４に示す。
【００５３】
上記に沿って、「エピトープ」という用語は、本明細書で定義される結合ドメインが特異的に結合／同定する抗原決定基を定義する。結合ドメインは、標的構造、例えば、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン鎖またはヒト、および非チンパンジー霊長動物のＰＳＭＡに固有の、立体構造的エピトープまたは連続エピトープに特異的に結合してもよい／これと特異的に相互作用してもよい。立体構造的エピトープまたは不連続エピトープは、ポリペプチド抗原について、２つ以上の離散アミノ酸残基の存在を特徴とし、これらのアミノ酸残基は、一次配列では分離されているが、該ポリペプチドが天然のタンパク質／抗原へと折り畳まれると、分子の表面上において一体化するものである（Sela, (1969) Science 166, 1365、およびLaver,(1990) Cell 61, 553-6）。エピトープに寄与する２つ以上の離散アミノ酸残基は、１または複数のポリペプチド鎖の個別の区画上に存在する。これらの残基は、（１または複数の）該ポリペプチド鎖が３次元構造へと折り畳まれてエピトープを構成すると、分子表面上では一体となる。これに対し、連続エピトープまたは直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖の単一の直鎖状セグメント内に存在する２つ以上の離散アミノ酸残基からなる。本発明においては、「環境に依存する」ＣＤ３エピトープとは、前記エピトープの立体構造を指す。ＣＤ３のイプシロン鎖上に局在する、このような環境に依存するエピトープは、それが残りのイプシロン鎖内に埋め込まれており、該イプシロン鎖がＣＤ３ガンマ鎖またはＣＤ３デルタ鎖とヘテロ二量体化することで適正な位置に保持されている場合に限り、その適正な立体構造を発生させることができる。これに対し、本明細書に記載の、環境に依存しないＣＤ３エピトープとは、ＣＤ３イプシロンのＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド、またはその機能的断片を指す。このＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド、またはその機能的断片は、ＣＤ３複合体内におけるその天然環境から取り出しても、その３次元構造的完全性、および適正な立体構造を維持する。したがって、Ｎ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド、またはＣＤ３イプシロン細胞外ドメインの一部であるその機能的断片が環境に依存しないということは、国際公開第２００４／１０６３８０号においてヒト結合分子を調製する方法との関連で説明されるＣＤ３イプシロンのエピトープとは完全に異なるエピトープであることを意味する。前記方法では、単独で発現させた組換えＣＤ３イプシロンを用いた。この単独で発現させた組換えＣＤ３イプシロンの立体構造は、その天然形態、すなわち、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３イプシロンサブユニットが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３デルタサブユニットまたはＣＤ３ガンマサブユニットと非共有結合する複合体の一部として存在する形態において採用される形態とは異なっていた。このような単独で発現させた組換えＣＤ３イプシロンタンパク質を、抗体ライブラリーから抗体を選択するための抗原として用いると、この抗原に特異的な抗体がライブラリーから同定されるが、このようなライブラリーは、自己抗原に対して特異的な抗体を含有しない。これは、単独で発現させた組換えＣＤ３イプシロンタンパク質がインビボでは存在せず、それが自己抗原ではないという事実に起因する。結果として、このタンパク質に特異的な抗体を発現させるＢ細胞の部分集団はインビボにおいて枯渇しなかったが、このようなＢ細胞から構築された抗体ライブラリーは、単独で発現させた組換えＣＤ３イプシロンタンパク質に特異的な抗体の遺伝物質を含有するであろう。
【００５４】
しかし、環境に依存しない、Ｎ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド、またはその機能的断片は、その天然形態において折り畳まれるエピトープであるため、本発明に沿った結合ドメインを、国際公開第２００４／１０６３８０号に記載の手法に基づく方法によって同定することはできない。したがって、国際公開第２００４／１０６３８０号で開示される結合分子がＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７に結合不可能である、ということを試験で検証できるであろう。こうして、従来の抗ＣＤ３結合分子、または抗ＣＤ３抗体分子（例えば、国際公開第９９／５４４４０号で開示される）は、本明細書に記載の、環境に依存しない、Ｎ末端におけるアミノ酸残基１〜２７のポリペプチド、またはその機能的断片よりもＣ末端側に定められる位置において、ＣＤ３イプシロン鎖に結合する。先行技術による抗体分子であるＯＫＴ３およびＵＣＨＴ−１も、アミノ酸残基３５〜８５において、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のイプシロンサブユニットに特異的であり、したがって、これらの抗体のエピトープも、よりＣ末端側に位置する。加えて、ＵＣＨＴ−１は、アミノ酸残基４３〜７７の領域においてＣＤ３イプシロン鎖に結合する（Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101,(2004), 7675-7680; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52）。したがって、先行技術による抗ＣＤ３分子は、本明細書で定義される、環境に依存しない、Ｎ末端におけるアミノ酸残基１〜２７エピトープ（またはその機能的断片）に結合せず、これを指向しない。特に、最新技術でも、環境に依存しないＮ末端におけるアミノ酸残基１〜２７エピトープに特異的に結合し、異種間特異的である、すなわち、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロンに結合する抗ＣＤ３分子は提供されていない。
【００５５】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子内に含まれる、好ましくはヒト結合ドメインを作製するには、例えば、ヒトおよび非チンパンジー霊長動物（例えば、マカクザル）の両方のＣＤ３イプシロンに結合するモノクローナル抗体、または、ヒトおよび非チンパンジー霊長動物の両方のＰＳＭＡに結合するモノクローナル抗体を用いることができる。
【００５６】
本明細書で用いられる「ヒト（human）」および「ヒト（man）」とは、ヒトホモサピエンス種を指す。本明細書に記載の構築物の医療的な使用に関する限り、ヒト患者は、同じ分子により治療されるものとする。
【００５７】
本発明の二重特異性単鎖抗体の前記第１または第２の結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＣＤＲ移植ドメイン、ヒト化ドメイン、またはヒトドメインであることが好ましい。本発明の二重特異性単鎖抗体の第１および第２の結合ドメインは両方とも、ＣＤＲ移植ドメイン、ヒト化ドメイン、またはヒトドメインであることが好ましい。
【００５８】
本明細書で用いられる「ヒト」抗体という用語は、本明細書で定義される二重特異性単鎖抗体が、ヒト生殖細胞系列の抗体レパートリー内に含有される（１または複数の）アミノ酸配列を含むことを意味するものとする。したがって、本明細書における定義を目的とするなら、前記二重特異性単鎖抗体は、それが、このようなヒト生殖細胞系列の（１または複数の）アミノ酸配列からなる場合に、すなわち、問題となる二重特異性単鎖抗体の（１または複数の）アミノ酸配列が、発現させたヒト生殖細胞系列の（１または複数の）アミノ酸配列と同一である場合に、ヒト抗体であると考えてもよい。本明細書で定義される二重特異性単鎖抗体は、（１または複数の）配列からなり、該（１または複数の）配列が、体細胞超変異の刷り込みにより、その（それらの）最も近い（１または複数の）ヒト生殖細胞系列配列から予測の範囲を超えて逸脱しないものである場合は、ヒト抗体とみなしてもよい。加えて、多くの非ヒト哺乳動物、例えば、マウスおよびラットなどの齧歯動物の抗体は、発現させたヒト抗体レパートリー内にも存在すると予測される可能性のあるＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。本発明の目的では、発現させたヒトレパートリー内に存在すると予測される可能性のある、ヒト由来または非ヒト由来の、（１または複数の）任意のこのような配列も、「ヒト」配列と考えられるであろう。
【００５９】
本明細書で用いられる「ヒト化した」、「ヒト化」、「ヒト様」という用語、またはこれらの文法的に類縁の変化形は、互換的に用いられて、非ヒト抗体またはその断片に由来する少なくとも１つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を、結合ドメインのうちの少なくとも１つに含む二重特異性単鎖抗体を指す。ヒト化法は、例えば、国際公開第９１／０９９６８号および米国特許第６，４０７，２１３号明細書において説明されている。非限定的な例として述べると、該用語は、少なくとも１つの結合ドメインの可変領域が、別の非ヒト動物、例えば、齧歯動物に由来する単一のＣＤＲ領域、例えば、ＶＨの第３のＣＤＲ領域（ＣＤＲＨ３）を含む場合と、一方または両方の可変領域が、そのそれぞれの第１、第２、および第３のＣＤＲの各々において、前記非ヒト動物に由来するＣＤＲを含む場合とを包含する。二重特異性単鎖抗体の結合ドメインのすべてのＣＤＲが、それらの対応する、例えば、齧歯動物に由来する同等物により置換されている場合は、「ＣＤＲ移植」のことを述べていることが典型的であり、この用語は、本明細書で用いられる「ヒト化」またはこれに類縁の文法的変化形に含まれるものとする。また、「ヒト化」またはこれに類縁の文法的変化形は、第１および／または第２の結合ドメインのＶＨおよび／またはＶＬ内において１または複数のＣＤＲ領域を置換させることに加えて、さらに、ＣＤＲ間において、フレームワーク（「ＦＲ」）領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を突然変異（例えば、置換）させる場合を包含し、この突然変異は、その／それらの位置におけるアミノ酸が、置換に用いられる該１または複数のＣＤＲ領域の由来元の動物の、その／それらの位置における該１または複数のアミノ酸に対応するように行われる。当技術分野で知られる通り、このような個々の突然変異は、その標的分子のＣＤＲドナーとして用いられる非ヒト抗体の元の結合能を回復させるために、ＣＤＲ移植後のフレームワーク領域内において作製されることが多い。「ヒト化」という用語は、上記で説明した、フレームワーク領域におけるアミノ酸置換に加え、非ヒト動物に由来するＣＤＲ領域内における（１または複数の）アミノ酸が、ヒト抗体に由来する、対応するＣＤＲ領域の（１または複数の）アミノ酸へと置換されることをさらに含む場合もある。
【００６０】
本明細書で用いられる「相同体」または「相同」という用語は、以下のように理解されるものとする。すなわち、タンパク質間およびＤＮＡ間における相同性とは、とりわけ、バイオインフォマティックスにおける配列類似性に基づいて結論付けられることが多い。例えば、一般に、２つ以上の遺伝子が高度に類似するＤＮＡ配列を有する場合、それらは相同性である可能性が高い。しかし、配列類似性は、異なる始祖から生じる場合もある。つまり、短い配列は、偶然類似する場合があり、複数の配列は、双方が転写因子などの特定のタンパク質に結合するように選択されたために類似する場合もある。このような配列は、類似してはいるが、相同性ではない。相同性の配列領域は、保存的であるとも呼ばれる。これは、特定の位置におけるアミノ酸が変化しているが該アミノ酸の生理化学的な特性は変化せずに維持されるアミノ酸配列における保存と混同されるべきではない。相同性の配列には、２つの種類、すなわち、オーソロガスおよびパラロガスがある。相同性の配列は、それらが、種分化イベントにより分離される場合、オーソロガスである。つまり、種が２つの個別の種に分岐する場合、結果として生じる種における単一遺伝子の分岐コピーをオーソロガスという。オーソログまたはオーソロガス遺伝子は、それらが共通の始祖に由来するために互いに類似する、異なる種における遺伝子である。類似する２つの遺伝子がオーソロガスであることの最も強力な証拠は、遺伝子系統についての系統発生解析の結果である。１つの分岐群内において見いだされる遺伝子は、共通の始祖に由来するオーソログである。オーソログは、常にではないが多くの場合は、同じ機能を有する。オーソロガス配列は、生物の分類学的分類研究において有用な情報を提供する。遺伝学的分岐のパターンを用いて、生物の類縁性を追跡することができる。極めて密接な類縁性を示す２つの生物は、２つのオーソログ間において、極めて類似するＤＮＡ配列を示す可能性が高い。逆に、別の生物から進化的に遠く隔たっている生物は、研究対象のオーソログの配列においてより大きな相違を示す可能性が高い。相同性の配列は、それらが遺伝子複製イベントにより分離される場合、パラロガスである。つまり、ある生物内における遺伝子が複製されて、同じゲノム内における異なる２つの位置を占める場合、この２つのコピーはパラロガスである。パラロガスである配列セットを、互いに対するパラログと呼ぶ。パラログは、同じまたは類似の機能を有することが典型的であるが、そうでない場合、つまり、複製される遺伝子の１つのコピーに対して元の選択圧がかからないために、このコピーが自由に突然変異し、新たな機能を獲得する場合もある。一例は、ラットおよびマウスなどの齧歯動物において見いだすことができる。機能の相違が生じているかどうかは不明であるが、齧歯動物は、パラロガスなインスリン遺伝子対を有する。パラロガスな遺伝子は、同じ種に属することが多いが、必ずしもそうではない。例えば、ヒトのヘモグロビン遺伝子と、チンパンジーのミオグロビン遺伝子とはパラログである。これは、バイオインフォマティックスにおける共通の問題である。つまり、異なる種のゲノムが配列決定され、相同遺伝子が見つかった場合、これらの遺伝子が同じまたは類似の機能を有すると即座に結論付けることはできない。なぜなら、これらの遺伝子は、それらの機能が相違しているパラログであるかもしれないからである。
【００６１】
本明細書で用いられる「非チンパンジー霊長動物」もしくは「非チンプ霊長動物」、またはこれらの文法的変化形は、チンパンジー以外の動物、すなわち、チンパンジー属に属し、アンスロポピテクス・トログロディテスまたはシミア・サティルスとしても知られるチンバンジー種およびボノボ種を含む動物以外の任意の霊長動物（すなわち、ヒト以外の動物）を指す。しかし、本発明の抗体は、それらの第１および／または第２の結合ドメインにより、前記チンパンジーのそれぞれのエピトープ／断片などにも結合できる可能性があると理解される。意図は、所望の場合、チンパンジーにより実施される動物試験を回避することだけである。したがって、別の実施形態において、本発明の抗体は、それらの第１および／または第２の結合ドメインにより、チンパンジーのそれぞれのエピトープにも結合することも意図される。「霊長動物」、「霊長類種」、「霊長類」、またはこれらの文法的変化形は、真獣類哺乳動物の１つの目を示し、これは、原猿および類人の２つの亜目に分類され、類人猿、サル、およびキツネザルを含む。具体的には、本明細書で用いられる「霊長類」は、曲鼻猿亜目（非メガネザル原猿）を含み、これには、キツネザル下目（コビトキツネザル上科およびキツネザル上科を含む）、アイアイ下目（アイアイ科を含む）、およびロリス下目（ロリス科およびガラゴ科を含む）が含まれる。本明細書で用いられる「霊長類」は、直鼻猿亜目も含み、これには、メガネサル下目（メガネザル科を含む）、真猿下目（広鼻下目または新世界ザル、および、オナガザル科を含む狭鼻下目または旧世界ザルを含む）が含まれる。
【００６２】
非チンパンジー霊長類種は、本発明の意味の範囲内で、キツネザル、メガネザル、テナガザル、マーモセット（オマキザル科の新世界ザルに属する）、または旧世界ザル（オナガザル上科に属する）であると理解されてもよい。
【００６３】
本明細書で用いられる「旧世界ザル」は、オナガザル上科に分類される任意のサルを含み、オナガザル上科は、オナガザル亜科（オナガザル亜科は主にアフリカ産であるが、これにはアジア産および北アフリカ産であるマカクザルの多様な属も含まれる）；およびコロブス亜科（コロブス亜科にはアジア産の属が多く含まれるが、これにはアフリカ産のコロブスモンキーも含まれる）に細分される。
【００６４】
具体的には、オナガザル亜科内において、有利な非チンパンジー霊長動物は、オナガザル族に由来するものであればよく、これは、アレノピテクス属（アレン沼地ザル（Allen's Swamp Monkey, Allenopithecus nigroviridis））内；ミオピテクス属（南部タラポアン（Angolan Talapoin, Miopithecus talapoin）; 北部タラポアン（Gabon Talapoin, Miopithecus ogouensis））内；エリスロセブス属（パタスモンキー（Patas Monkey, Erythrocebus pata））内；クロロセブス属（ミドリザル（Green Monkey, Chlorocebus sabaceus）; サバンナモンキー（Grivet, Chlorocebus aethiops）; ベールマウンテンズメルベットモンキー（Bale Mountains Vervet, Chlorocebus djamdjamensis）; タンタルスモンキー（Tantalus Monkey, Chlorocebustantalus）; ベルベットモンキー（VervetMonkey, Chlorocebus pygerythrus）; マルブラウクモンキー（Malbrouck, Chlorocebus cynosuros））内；または、セルコピテクス属（ドリアスモンキー（Dryas MonkeyまたはSalongo Monkey、Cercopithecus dryas）；ダイアナモンキー（Diana Monkey、Cercopithecus diana）；ロロウェイモンキー（Roloway Monkey、Cercopithecus roloway）；オオハナジログエノン（Greater Spot-nosedMonkey、Cercopithecus nictitans）；ブルーモンキー（Blue Monkey、Cercopithecus mitis）；シルバーモンキー（Silver Monkey、Cercopithecus doggetti）；ゴールデンモンキー（Golden Monkey、Cercopithecus kandti）；サイクスモンキー（Sykes’s Monkey、Cercopithecusalbogularis）；モナモンキー（Mona Monkey、Cercopithecus mona）；キャンベルモンキー（Campbell’s Mona Monkey、Cercopithecus campbelli）；ロウモンキー（Lowe’s Mona Monkey、Cercopithecuslowei）；クラウングエノン（Crested Mona Monkey、Cercopithecus pogonias）；ウォルフグエノン（Wolf’s Mona Monkey、Cercopithecus wolfi）；デントグエノン（Dent’s Mona Monkey、Cercopithecusdenti）；ショウハナジログエノン（Lesser Spot-nosed Monkey、Cercopithecus petaurista）；アカハラグエノン（White-throatedGuenon、Cercopithecus erythrogaster）；スクレーターグエノン（Sclater’s Guenon、Cercopithecussclateri）；アカミミグエノン（Red-eared Guenon、Cercopithecus erythrotis）；クチヒゲグエノン（MoustachedGuenon、Cercopithecus cephus）；アカオザル（Red-tailed Monkey、Cercopithecus ascanius）；ロエストグエノン（L’Hoest’s Monkey、Cercopithecus lhoesti）；プロイスグエノン（Preuss’s Monkey、Cercopithecuspreussi）；サンテールモンキー（Sun-tailed Monkey、Cercopithecus solatus）；フクロウグエノン（Hamlyn’s MonkeyまたはOwl-faced Monkey、Cercopithecus hamlyni）；ブラッザグエノン（De Brazza’s Monkey、Cercopithecus neglectus）内であればよい。
【００６５】
あるいは、有利な非チンパンジー霊長動物は、これらもまたオナガザル亜科内であるがそのうちのヒヒ族内であり、マカク属（バーバリーザル（Barbary Macaque、Macaca sylvanus）；シシオザル（Lion-tailed Macaque、Macaca silenus）；ブタオザル（Southern Pig-tailed MacaqueもしくはBeruk、Macaca nemestrina）；キタブタオザル（Northern Pig-tailedMacaque、Macaca leonina）；メンタワイブタオザル（Pagai Island MacaqueまたはBokkoi、Macaca pagensis）；シブルー島マカク（Siberut Macaque、Macaca siberu）；ムーアザル（Moor Macaque、Macaca maura）；ブーツザル（Booted Macaque、Macaca ochreata）；トンケアンザル（Tonkean Macaque、Macaca tonkeana）；ヘックザル（Heck’s Macaque、Macaca hecki）；ゴロンタロザル（Gorontalo Macaque、Macaca nigriscens）；クロザル（Celebes Crested MacaqueまたはBlack “Ape”、Macacanigra）；カニクイザル（Cynomolgus monkeyまたはCrab-eating MacaqueまたはLong-tailed MacaqueまたはKera、Macaca fascicularis）；ベニガオザル（Stump-tailed MacaqueまたはBear Macaque、Macaca arctoides）；アカゲザル（Rhesus Macaque、Macaca mulatta）；タイワンザル（Formosan Rock Macaque、Macaca cyclopsis）；ニホンザル（Japanese Macaque、Macaca fuscata）；トクモンキー（Toque Macaque、Macaca sinica）；ボンネットザル（Bonnet Macaque、Macaca radiata）；バーバリーザル（Barbary Macaque、Macaca sylvanmus）；アツサムザル（Assam Macaque、Macaca assamensis）；チベットモンキー（Tibetan MacaqueまたはMilne-Edwards’ Macaque、Macacathibetana）；アルナーチャルモンキー（Arunachal MacaqueまたはMunzala、Macaca munzala））内；ロフォセブス属（ホホジロマンガベイ（Gray-cheeked Mangabey、Lophocebus albigena）；ロフォセブス・アルビゲナ・アルビゲナ；ロフォセブス・アルビゲナ・オスマーニ；ロフォセブス・アルビゲナ・ジョンストーニ；ブラックマンガベイ（Black Crested Mangabey、Lophocebus aterrimus）；オプデンボッシュマンガベイ（Opdenbosch’s Mangabey、Lophocebusopdenboschi）；ハイランドマンガベイ（Highland Mangabey、Lophocebus kipunji））内；パピオ属（マントヒヒ（Hamadryas Baboon、Papio hamadryas）；ギニアヒヒ（Guinea Baboon、Papio papio）；アヌビスヒヒ（Olive Baboon、Papio anubis）；キイロヒヒ（Yellow Baboon、Papio cynocephalus）；チャクマヒヒ（Chacma Baboon、Papio ursinus））内；テロピテクス属（ゲラダ（Gelada、Theropithecus gelada））内；セルコセブス属（スーティーマンガベイ（SootyMangabey、Cercocebus atys）；セルコセブス・アティス・アティス；セルコブス・アティス・ルヌラートゥス；シロエリマンガベイ（Collared Mangabey、Cercocebus torquatus）；アジルマンガベイ（Agile Mangabey、Cercocebus agilis）；ゴールデンマンガベイ（Golden-bellied Mangabey、Cercocebus chrysogaster）；タナリバーマンガベイ（Tana River Mangabey、Cercocebus galeritus）；サンジェマンガベイ（Sanje Mangabey、Cercocebus sanjei））内；または、マンドリル属（マンドリル（Mandrill、Mandrillus sphinx）；ドリル（Drill、Mandrillus leucophaeus））内であればよい。
【００６６】
最も好ましいのは、カニクイザル（サイノモルガスモンキーとしても知られ、したがって、実施例では「サイノモルガス」と称する）、およびアカゲザル（リーサスモンキー、「リーサス」と称する）である。
【００６７】
コロブス亜科内において、有利な非チンパンジー霊長動物は、アフリカ群に由来するものであればよく、これは、コロブス属（クロコロブス（Black Colobus、Colobus satanas）；アンゴラコロブス（Angola Colobus、Colobus angolensis）；キングコロブス（King Colobus、Colobus polykomos）；クマコロブス（Ursine Colobus、Colobus vellerosus）；アビシニアコロブス（Mantled Guereza、Colobus guereza））内；ピリオコロブス属（アカコロブス（Western Red Colobus、Piliocolobus badius）；ピリオコロブス・バディス・バディス；ピリオコロブス・バディス・テミンキー；ピリオコロブス・バディス・ワルドローナエ；ペナントアカコロブス（Pennant’s Colobus、Piliocolobuspennantii）；ピリコロブス・ペナンティー・ペナンティー；ピリコロブス・ペナンティー・エピエニー；ピリコロブス・ペナンティー・ブビエリー；プロイスアカコロブス（Preuss’s Red Colobus、Piliocolobuspreussi）；トロンアカコロブス（Thollon’s Red Colobus、Piliocolobus tholloni）；中央アフリカアカコロブス（Central African Red Colobus、Piliocolobus foai）；ピリオコロブス・フォアイー・フォアイー；ピリオコロブス・フォアイー・エリオティー；ピリオコロブス・フォアイー・ウスタレティー；ピリオコロブス・フォアイー・セムリキエンシス；ピリオコロブス・フォアイー・パルメンティエロールム；ウガンダアカコロブス（Ugandan Red Colobus、Piliocolobus tephrosceles）；ウジングワアカコロブス（Uzyngwa Red Colobus、Piliocolobus gordonorum）；ザンジバルアカコロブス（Zanzibar Red Colobus、Piliocolobus kirkii）；タナリバーアカコロブス（Tana River Red Colobus、Piliocolobus rufomitratus））内；または、プロコロブス属（オリーブコロブス（Olive Colobus、Procolobus verus））内であればよい。
【００６８】
代替的に、コロブス亜科内において、有利な非チンパンジー霊長動物は、ラングール（リーフモンキー）群に由来するものであればよく、これは、セムノピテクス属（ネパールグレイラングール（Nepal Gray Langur、Semnopithecus schistaceus）；カシミールグレイラングール（Kashmir Gray Langur、Semnopithecus ajax）；タライグレイラングール（Tarai Gray Langur、Semnopithecus hector）；ハヌマンラングール（Northern Plains Gray Langur、Semnopithecus entellus）；クロアシラングール（Black-footed Gray Langur、Semnopithecus hypoleucod）；南部平野グレイラングール（Southern Plains Gray Langur、Semnopithecus dussumieri）；タフテッドグレイラングール（Tufted Gray Langur、Semnopithecus priam））内；トラキピテクス属のＴ．ベツルス群（カオムラサキラングール（Purple-faced Langur、Trachypithecus vetulus）；ニルギリラングール（Nilgiri Langur、Trachypithecus johnii））内；トラキピテクス属のＴ．クリスタトゥス群（ジャワルトン（Javan Lutung、Trachypithecus auratus）；シルバールトン（Silvery Leaf MonkeyまたはSilvery Lutung、Trachypithecus cristatus）；インドシナルトン（IndochineseLutung、Trachypithecus germaini）；テナセリムルトン（Tenasserim Lutung、Trachypithecus barbei））内；トラキピテクス属のＴ．オブスキュラス群（ダスキールトン（Dusky Leaf MonkeyまたはSpectacled Leaf Monkey、Trachypithecus obscurus）；ファイールルトン（Phayre’s Leaf Monkey、Trachypithecus phayrei））内；トラキピテクス属のＴ．ピレアトゥス群（ボウシラングール（Capped Langur、Trachypithecus pileatus）；ショートリッジラングール（Shortridge’s Langur、Trachypithecusshortridgei）；ゴールデンラングール（Gee’s Golden Langur、Trachypithecus geei））内；トラキピテクス属のＴ．フランコイシ群（フランソワルトン（Francois’ Langur、Trachypithecusfrancoisi）；ハティンラングール（Hatinh Langur、Trachypithecus hatinhensis）；ワタボウシルトン（White-headedLangur、Trachypithecus poliocephalus）；ラオスラングール（Laotian Langur、Trachypithecus laotum）；コシジロラングール（Delacour’s Langur、Trachypithecusdelacouri）；インドシナクロラングール（Indochinese Black Langur、Trachypithecus ebenus））内；または、プレスビティス属（クロカンムリリーフモンキー（Sumatran Surili、Presbytis melalophos）；シマコノハザル（Banded Surili、Presbytis femoralis）；サラワクスリリ（Sarawak Surili、Presbytis chrysomelas）；シロモモスリリ（White-thighed Surili、Presbytis siamensis）；シロビタイスリリ（White-fronted Surili、Presbytis frontata）；ジャワスリリ（Javan Surili、Presbytis comata）；トーマスラングール（Thomas’s Langur、Presbytisthomasi）；ホーズラングール（Hose’s Langur、Presbytis hosei）；クリイロリーフモンキー（Maroon Leaf Monkey、Presbytis rubicunda）；オナガラングール（Mentawai LangurまたはJoja、Presbytis potenziani）；ナトウナ島スリリ（Natuna IslandSurili、Presbytis natunae））内であればよい。
【００６９】
代替的に、有利な非チンパンジー霊長動物は、オナガザル亜科内の異鼻貌群に由来し、ピガスリクス属（ドゥクラングール（Red-shankedDouc、Pygathrix nemaeus）；クロアシドゥクラングール（Black-shanked Douc、Pygathrix nigripes）；ハイイロアシドゥクラングール（Gray-shanked Douc、Pygathrix cinerea））内；リノピテクス属（ゴールデンモンキー（Golden Snub-nosed Monkey、Rhinopithecus roxellana）；クロキンシコウ（Black Snub-nosed Monkey、Rhinopithecus bieti）；ハイイロキンシコウ（Gray Snub-nosed Monkey、Rhinopithecus brelichi）；トンキンシシバナザル（Tonkin Snub-nosedLangur、Rhinopithecus avunculus））内；ナサリス属（テングザル（Proboscis Monkey、Nasalis larvatus））内；または、シミアス属（シマコブ（Pig-tailed Langur、Simias concolor）内であればよい。
【００７０】
本明細書で用いられる「マーモセット」という用語は、マーモセット属の任意の新世界ザル、例えば、カリトリクス亜属の大西洋マーモセット：（コモンマーモセット（Common Marmoset、Callithrix（Callithrix）jacchus）；クロミミマーモセット（Black-tufted Marmoset、Callithrix（Callithrix）penicillata）；ウィードマーモセット（Wied’s Marmoset、Callithrix（Callithrix）kuhlii）；シロガオマーモセット（White-headed Marmoset、Callithrix（Callithrix）geoffroyi）；キクガシラコモンマーモセット（Buffy-headed Marmoset、Callithrix（Callithrix）flaviceps）；ミミナガコモンマーモセット（Buffy-tufted Marmoset、Callithrix（Callithrix）aurita））に属する新世界ザル、ミコ亜属のアマゾンマーモセット（リオアカリマーモセット（Rio Acari Marmoset、Callithrix（Mico）acariensis）；マニコレマーモセット（Manicore Marmoset、Callithrix（Mico）manicorensis）；シルバーマーモセット（Silvery Marmoset、Callithrix（Mico）argentata）；ホワイトマーモセット（White Marmoset、Callithrix（Mico）leucippe）；エミリアマーモセット（Emilia’s Marmoset、Callithrix（Mico）emiliae）；クロテマーモセット（Black-headed Marmoset、Callithrix（Mico）nigriceps）；マルカマーモセット（Marca’s Marmoset、Callithrix（Mico）marcai）；オグロマーモセット（Black-tailed Marmoset、Callithrix（Mico）melanura）；サンタレムマーモセット（Santarem Marmoset、Callithrix（Mico）humeralifera）；マウエスマーモセット（Maues Marmoset、Callithrix（Mico）mauesi）；キンシロフサミミマーモセット（Gold-and-white Marmoset、Callithrix（Mico）chrysoleuca）；フサミミマーモセット（Hershkovitz’s Marmoset、Callithrix（Mico）intermedia）；サテレマーモセット（Satere Marmoset、Callithrix（Mico）saterei））に属する新世界ザル、カリベラ亜属に属するルースマレンコビトマーモセット（Roosmalens’ Dwarf Marmoset、Callithrix（Callibella）humilis）、または、セブエラ亜属に属するピグミーマーモセット（Pygmy Marmoset、Callithrix（Cebuella）pygmaea）を指す。
【００７１】
新世界ザルの他の属は、タマリン属のタマリン（ワタボウシタマリン群、アカテタマリン群、クロクビタマリン群、クチヒゲタマリン群、フタイロタマリン群、およびマダラガオタマリン群を含む）、およびリスザル属のリスザル（例えば、コモンリスザル、セアカリスザル、クロリスザル、ボリビアリスザル、サイミリ・バンゾリニ）を含む。
【００７２】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子の好ましい実施形態において、非チンパンジー霊長動物は、旧世界ザルである。該ポリペプチドのより好ましい実施形態において、該旧世界ザルは、パピオ属、マカク属のサルである。マカク属のサルは、アッサムザル（Assamese macaque（Macaca assamensis））、バーバリーザル（Barbary macaque（Macaca sylvanus））、ボンネットザル（Bonnet macaque（Macaca radiata））、ブーツザル（Booted macaqueもしくはSulawesi-Booted macaque（Macaca ochreata））、クロザル（Sulawesi-crested macaque（Macaca nigra））、タイワンザル（Formosanrock macaque（Macaca cyclopsis））、ニホンザル（Japanese snow macaqueもしくはJapanese macaque（Macaca fuscata））、カニクイザル（Cynomologus monkeyもしくはcrab-eating macaqueもしくはlong-tailedmacaqueもしくはJava macaque（Macaca fascicularis））、シシオザル（Lion-tailed macaque（Macaca silenus））、ブタオザル（Pigtailed macaque（Macaca nemestrina））、アカゲザル（Rhesus macaque（Macaca mulatta））、チベットモンキー（Tibetan macaque（Macaca thibetana））、トンケアンザル（Tonkean macaque（Macaca tonkeana））、トクモンキー（Toque macaque（Macaca sinica））、ベニガオザル（Stump-tailed macaqueもしくはRed-faced macaqueもしくはBear monkey（Macaca arctoides））、またはムーアザル（Moor macaque（Macaca maurus））であることが最も好ましい。パピオ属のサルは、マントヒヒ（HamadryasBaboon、Papio hamadryas）；ギニアヒヒ（GuineaBaboon、Papio papio）；アヌビスヒヒ（OliveBaboon、Papio anubis）；キイロヒヒ（YellowBaboon、Papio cynocephalus）；チャクマヒヒ（Chacma Baboon、Papio ursinus）であることが最も好ましい。
【００７３】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子の代替的に好ましい実施形態において、非チンパンジー霊長動物は、新世界ザルである。該ポリペプチドのより好ましい実施形態において、該新世界ザルは、マーモセット属（マーモセット）、タマリン属、またはリスザル属のサルである。マーモセット属のサルはコモンマーモセットであり、タマリン属のサルはワタボウシタマリンであり、リスザル属のサルはコモンリスザルであることが最も好ましい。
【００７４】
本明細書で用いられる「細胞表面抗原」という用語は、細胞表面上において提示される分子を指す。大半の場合において、この分子は、この分子の少なくとも一部が３次形態おいて細胞の外側からの結合可能性を維持するように、該細胞の細胞質膜内または細胞質膜上に位置する。細胞質膜内に位置する細胞表面分子の非限定的な例は、その３次立体構造において、親水性領域および疎水性領域を含む膜貫通タンパク質である。この場合、少なくとも１つの疎水性領域により、細胞表面分子が、細胞の疎水性細胞質膜内に埋め込まれるか、または挿入されることが可能となるのに対し、親水性領域は、細胞質膜の両側において、それぞれ、細胞質内および細胞外間隙へと延びる。細胞質膜上に位置する細胞表面分子の非限定的な例は、システイン残基においてパルミトイル基を保有するように修飾されたタンパク質、Ｃ末端のシステイン残基においてファルネシル基を保有するように修飾されたタンパク質、またはＣ末端においてグリコシルホスファチジルイノシトール（「ＧＰＩ」）アンカーを保有するように修飾されたタンパク質である。これらの基により、細胞質膜の外面に対するタンパク質の共有結合が可能となり、細胞質膜の外面において、タンパク質は、抗体などの細胞外分子による認識可能性を維持する。細胞表面抗原の例は、ＣＤ３イプシロンおよびＰＳＭＡである。本明細書の上記で説明した通り、ＰＳＭＡは、癌を治療するための標的である細胞表面抗原である。なお、この癌とは、固形腫瘍、好ましくは腫癌および前立腺癌を含むがこれに限定されない。
【００７５】
これに照らし、ＰＳＭＡを、腫瘍抗原としても特徴づけることができる。本明細書で用いられる「腫瘍抗原」という用語を、腫瘍細胞上において提示される抗原として理解してもよい。これらの抗原は、分子の膜貫通性且つ細胞質性の部分と組み合わされることが多い細胞外部分により、細胞表面上に提示され得る。これらの抗原は、場合により、腫瘍細胞だけによって提示される可能性があるが、正常細胞によって提示されることはない。腫瘍抗原は、腫瘍細胞上だけに発現する可能性があり、または、正常細胞と比較して、腫瘍特異的な突然変異を示す可能性がある。この場合、それらは、腫瘍特異的抗原と呼ばれる。腫瘍細胞および正常細胞により提示される抗原がより一般的であり、それらは、腫瘍関連抗原と呼ばれる。これらの腫瘍関連抗原は、正常細胞の場合と比較して過剰発現する可能性があり、または、腫瘍組織の構造が正常組織と比較してそれほど稠密でないために、腫瘍細胞内において抗体結合が可能である。本発明に沿った腫瘍抗原の一例は、ＰＳＭＡである。
【００７６】
本明細書の上記で説明した通り、本発明の二重特異性単鎖抗体分子は、第１の結合ドメインにより、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε（イプシロン）鎖エピトープに結合し、該エピトープは、配列番号２、４、６、もしくは８に示される２７のアミノ酸残基からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部、またはその機能的断片である。
【００７７】
本発明に沿って述べると、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の場合、前記エピトープは、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸を含むアミノ酸配列の一部であることが好ましい。
【００７８】
前記エピトープは、少なくとも、アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ（Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｅ）を含むことがより好ましい。
【００７９】
本発明の範囲内で、Ｎ末端におけるアミノ酸残基１〜２７の機能的断片とは、前記機能的断片が、ＣＤ３複合体（ＥｐＣＡＭ、または、例えば国際公開第２００８／１１９５６７号の実施例３．１で示すような免疫グロブリンＦｃ部分などの異種アミノ酸配列に融合させた）内におけるその天然環境から取り出しても依然としてその３次元構造的完全性を維持する、環境に依存しないエピトープであることを意味する。ＣＤ３イプシロンのＮ末端における２７アミノ酸のポリペプチドまたはその機能的断片内における３次元構造が維持されることを用いて、インビトロでのＮ末端ＣＤ３イプシロンポリペプチド断片、および、インビボでのＴ細胞上における天然のＣＤ３複合体（のＣＤ３イプシロンサブユニット）に対して、同じ結合能で結合する結合ドメインを作製することができる。本発明の範囲内で、Ｎ末端におけるアミノ酸残基１〜２７の機能的断片とは、本明細書に記載のＣＤ３結合ドメインがこのような機能的断片に環境に依存せずに依然として結合できる、ということを意味する。当業者は、エピトープのどのアミノ酸残基がこのような抗ＣＤ３結合ドメインにより認識されるかを決定するエピトープマッピングの方法（例えば、アラニン走査；国際公開第２００８／１１９５６７号の実施例を参照）について承知している。
【００８０】
本発明の一実施形態において、本発明の二重特異性単鎖抗体分子は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な（第１の）結合ドメインと、細胞表面抗原であるＰＳＭＡに結合することが可能な第２の結合ドメインとを含む。
【００８１】
本発明の範囲内において、第２の結合ドメインは、ヒト細胞表面抗原であるＰＳＭＡおよび／または非チンパンジー霊長動物のＰＳＭＡに結合することがさらに好ましい。第２の結合ドメインは、ヒトＰＳＭＡ、および非チンパンジー霊長動物のＰＳＭＡ、好ましくは、マカクザルのＰＳＭＡに結合することが特に好ましい。第２の結合ドメインは、非チンパンジー霊長動物の少なくとも１つのＰＳＭＡに結合するが、非チンパンジー霊長動物の２つ、３つ以上のＰＳＭＡ相同体にも結合してもよいものとする。例えば、第２の結合ドメインは、サイノモルガスモンキーのＰＳＭＡ、およびリーサスモンキーのＰＳＭＡに結合してもよい。
【００８２】
本明細書で説明されるすべての方法、使用、キットなどを含めた本発明は、第２の結合ドメインそれ自体（すなわち、二重特異性単鎖抗体と関連しない）にも関する。「それ自体」には、本明細書で説明される二重特異性単鎖抗体以外の抗体フォーマット、例えば、抗体断片（該第２のドメインを含む）、ヒト化抗体、該第２のドメインを含む融合タンパク質などがさらに含まれる。本発明の二重特異性単鎖抗体以外の抗体フォーマットについては、本明細書の上記でも説明している。
【００８３】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子、例えば、本明細書で定義される二重特異性単鎖抗体の第２の結合ドメインを作製するには、ＰＳＭＡなど、ヒト、および／または非チンパンジー霊長動物それぞれの細胞表面抗原の両方に結合するモノクローナル抗体を用いることができる。本明細書で定義される二重特異性ポリペプチドに適切な結合ドメインを、例えば、当技術分野で説明される組換え法により、異種間特異的モノクローナル抗体から生成することができる。上記の通り、ヒト細胞表面抗原と非チンパンジー霊長動物における前記細胞表面抗原の相同体とに結合するモノクローナル抗体は、ＦＡＣＳアッセイにより調べることができる。異種間特異的抗体を、文献（MilsteinおよびKohler, Nature 256 (1975), 495-7）で説明されるハイブリドーマ法によって作製することもできる。例えば、ＰＳＭＡなど、ヒトおよび非チンパンジー霊長動物の細胞表面抗原により交互にマウスを免疫化してもよい。上記の通り、これらのマウスから、ハイブリドーマ法により異種間特異的抗体を生成するハイブリドーマ細胞を単離し、ＦＡＣＳにより解析する。本明細書で説明される異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体などの二重特異性ポリペプチドの作製および解析については、以下の実施例に示す。異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体の利点には、本明細書で列挙される点が含まれる。
【００８４】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子において、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインは、以下から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが特に好ましい：
（ａ）配列番号２７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２８に示されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号２９に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
（ｂ）配列番号１１７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１８に示されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１１９に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに
（ｃ）配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ３。
【００８５】
当技術分野において、可変領域、すなわち、可変軽鎖（「Ｌ」鎖または「ＶＬ」鎖）および可変重鎖（「Ｈ」鎖または「ＶＨ」鎖）は、抗体の結合ドメインをもたらすと理解されている。これらの可変領域は、相補性決定領域を保有する。
【００８６】
当技術分野において、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、抗体の抗原特異性を決定することが周知である。「ＣＤＲ−Ｌ」または「ＬＣＤＲ」または「ＬＣＤＲ」という用語が、ＶＬにおけるＣＤＲを指すのに対し、「ＣＤＲ−Ｈ」または「Ｈ ＣＤＲ」または「ＨＣＤＲ」という用語は、ＶＨにおけるＣＤＲを指す。
【００８７】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子の代替的に好ましい実施形態において、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインは、以下から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む：
（ａ）配列番号１２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１４に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｂ）配列番号３０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｃ）配列番号４８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号５０に示されるＣＤＲ−Ｈ３２；
（ｄ）配列番号６６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６７に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６８に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｅ）配列番号８４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８５に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号８６に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）配列番号１０２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１０３に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１０４に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）配列番号１２０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２１に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１２２に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｈ）配列番号１３８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１４０に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉ）配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５７に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１５８に示されるＣＤＲ−Ｈ３；ならびに
（ｊ）配列番号１７４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７５に示されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１７６に示されるＣＤＲ−Ｈ３。
【００８８】
ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な結合ドメインは、配列番号３５、３９、１２５、１２９、１６１、または１６５に示されるＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含むことがさらに好ましい。
【００８９】
ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインは、配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７、または１８１に示されるＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含むことが代替的に好ましい。
【００９０】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子は、以下からなる群から選択されるＶＬ領域およびＶＨ領域を含む、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインを特徴とすることがより好ましい：
（ａ）配列番号１７または２１に示されるＶＬ領域、および配列番号１５または１９に示されるＶＨ領域；
（ｂ）配列番号３５または３９に示されるＶＬ領域、および配列番号３３または３７に示されるＶＨ領域；
（ｃ）配列番号５３または５７に示されるＶＬ領域、および配列番号５１または５５に示されるＶＨ領域；
（ｄ）配列番号７１または７５に示されるＶＬ領域、および配列番号６９または７３に示されるＶＨ領域；
（ｅ）配列番号８９または９３に示されるＶＬ領域、および配列番号８７または９１に示されるＶＨ領域；
（ｆ）配列番号１０７または１１１に示されるＶＬ領域、および配列番号１０５または１０９に示されるＶＨ領域；
（ｇ）配列番号１２５または１２９に示されるＶＬ領域、および配列番号１２３または１２７に示されるＶＨ領域；
（ｈ）配列番号１４３または１４７に示されるＶＬ領域、および配列番号１４１または１４５に示されるＶＨ領域；
（ｉ）配列番号１６１または１６５に示されるＶＬ領域、および配列番号１５９または１６３に示されるＶＨ領域；ならびに
（ｊ）配列番号１７９または１８３に示されるＶＬ領域、および配列番号１７７または１８１に示されるＶＨ領域。
【００９１】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子の好ましい実施形態によれば、ＣＤ３イプシロンに結合する第１の結合ドメイン内におけるＶＨ領域およびＶＬ領域の対は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）のフォーマットである。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順序に並べられる。ＶＨ領域は、リンカー配列に対してＮ末端側に位置することが好ましい。ＶＬ領域は、リンカー配列に対してＣ末端側に位置することが好ましい。言い換えれば、本発明の二重特異性単鎖抗体分子のＣＤ３結合ドメインにおけるドメイン配列はＶＨ−ＶＬであることが好ましく、前記ＣＤ３結合ドメインは、第２の（ＰＳＭＡなど、細胞表面抗原の）結合ドメインに対してＣ末端側に位置する。該ＶＨ−ＶＬは、配列番号１８５を含むか、または配列番号１８５であることが好ましい。
【００９２】
上記で説明した、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の好ましい実施形態は、配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５、または１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３ε鎖エピトープに結合することが可能な第１の結合ドメインを特徴とする。
【００９３】
本発明は、上記で説明した二重特異性単鎖抗体であって、第２の結合ドメインが、細胞表面抗原であるＰＳＭＡに結合する抗体にさらに関する。
【００９４】
本発明の好ましい実施形態によると、上記で特徴付けられた二重特異性単鎖抗体分子は、以下からなる群から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２およびＣＤＲ Ｌ３として含む： 
ａ）配列番号２２６〜２２８のＣＤＲＨ１−３および配列番号２３１〜２３３のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｂ）配列番号２４０〜２４２のＣＤＲＨ１−３および配列番号２４５〜２４７のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｃ）配列番号２５４〜２５６のＣＤＲＨ１−３および配列番号２５９〜２６１のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｄ）配列番号２６８〜２７０のＣＤＲＨ１−３および配列番号２７３〜２７５のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｅ）配列番号６１８〜６２０のＣＤＲＨ１−３および配列番号６２３〜６２５のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｆ）配列番号２８２〜２８４のＣＤＲＨ１−３および配列番号２８７〜２８９のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｇ）配列番号２９６〜２９８のＣＤＲＨ１−３および配列番号３０１〜３０３のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｈ）配列番号３１０〜３１２のＣＤＲＨ１−３および配列番号３１５〜３１７のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｉ）配列番号３２４〜３２６のＣＤＲＨ１−３および配列番号３２９〜３３１のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｊ）配列番号３３８〜３４０のＣＤＲＨ１−３および配列番号３４３〜３４５のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｋ）配列番号３５２〜３５４のＣＤＲＨ１−３および配列番号３５７〜３５９のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｌ）配列番号３６６〜３６８のＣＤＲＨ１−３および配列番号３７１〜３７３のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｍ）配列番号３８０〜３８２のＣＤＲＨ１−３および配列番号３８５〜３８７のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｎ）配列番号３９４〜３９６のＣＤＲＨ１−３および配列番号３９９〜４０１のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｏ）配列番号４０８〜４１０のＣＤＲＨ１−３および配列番号４１３〜４１５のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｐ）配列番号４２２〜４２４のＣＤＲＨ１−３および配列番号４２７〜４２９のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｑ）配列番号４３６〜４３８のＣＤＲＨ１−３および配列番号４４１〜４４３のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｒ）配列番号４５０〜４５２のＣＤＲＨ１−３および配列番号４５５〜４５７のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｓ）配列番号４６４〜４６６のＣＤＲＨ１−３および配列番号４６９〜４７１のＣＤＲ Ｌ１−３と；
ｔ）配列番号４７８〜４８０のＣＤＲＨ１−３および配列番号４８３〜４８５のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｕ）配列番号４９２〜４９４のＣＤＲＨ１−３および配列番号４９７〜４９９のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｖ）配列番号５０６〜５０８のＣＤＲＨ１−３および配列番号５１１〜５１３のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｗ）配列番号５２０〜５２のＣＤＲＨ１−３２および配列番号５２５〜５２７のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｘ）配列番号５３４〜５３６のＣＤＲＨ１−３および配列番号５３９〜５４１のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｙ）配列番号５４８〜５５０のＣＤＲＨ１−３および配列番号５５３〜５５５のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｚ）配列番号５６２〜５６４のＣＤＲＨ１−３および配列番号５６７〜５６９のＣＤＲ Ｌ１−３；
ａａ）配列番号５７６〜５７８のＣＤＲＨ１−３および配列番号５８１〜５８３のＣＤＲ Ｌ１−３；
ａｂ）配列番号５９０〜５９２のＣＤＲＨ１−３および配列番号５９５〜５９７のＣＤＲ Ｌ１−３；ならびに
ａｃ）配列番号６０４〜６０６のＣＤＲＨ１−３および配列番号６０９〜６１１のＣＤＲ Ｌ１−３。
【００９５】
二重特異性単鎖 抗体 分子の好ましい群は、以下からなる群から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲ Ｌ３として含む：
ａ）配列番号２２６〜２２８のＣＤＲＨ１−３および配列番号２３１〜２３３のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｂ）配列番号２４０〜２４２のＣＤＲＨ１−３および配列番号２４５〜２４７のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｃ）配列番号２５４〜２５６のＣＤＲＨ１−３および配列番号２５９〜２６１のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｄ）配列番号２６８〜２７０のＣＤＲＨ１−３および配列番号２７３〜２７５のＣＤＲ Ｌ１−３；ならびに
ｅ）配列番号６１８〜６２０のＣＤＲＨ１−３および配列番号６２３〜６２５のＣＤＲ Ｌ１−３。
【００９６】
これらの分子は、細胞表面抗原ＰＳＭＡに結合する第２の結合ドメインを含み、この細胞表面抗原ＰＳＭＡは、親ＰＳＭＡ特異的結合分子に由来するＶＨ鎖と、異なる抗原に対する、すなわち、ＣＤ３２６としても知られる上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対して特異性を有する結合分子に由来するＶＬ鎖とからなる。驚くべきことに、親ＰＳＭＡ特異的結合分子に由来のＶＨ鎖と親ＥｐＣＡＭ特異的結合分子に由来のＶＬ鎖との特定の組み合わせを有する結合分子はＰＳＭＡだけに結合してＥｐＣＡＭには結合しない、ということが見いだされた。本発明の二重特異性単鎖抗体分子に含まれるこの群のＰＳＭＡ特異的結合ドメインの結合特異性は、添付の実施例３に記載されている。
【００９７】
二重特異性単鎖抗体分子の他の好ましい群は、以下からなる群から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、およびＣＤＲ Ｌ３として含む：
ａ）配列番号２８２〜２８４のＣＤＲＨ１−３および配列番号２８７〜２８９のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｂ）配列番号２９６〜２９８のＣＤＲＨ１−３および配列番号３０１〜３０３のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｃ）配列番号３１０〜３１２のＣＤＲＨ１−３および配列番号３１５〜３１７のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｄ）配列番号３２４〜３２６のＣＤＲＨ１−３および配列番号３２９〜３３１のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｅ）配列番号３３８〜３４１のＣＤＲＨ１−３および配列番号３４３〜３４５のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｆ）配列番号３５２〜３５４のＣＤＲＨ１−３および配列番号３５７〜３５９のＣＤＲ Ｌ１−３；ならびに
ｇ）配列番号３６６〜３６８のＣＤＲＨ１−３および配列番号３７１〜３７３のＣＤＲ Ｌ１−３。
【００９８】
二重特異性単鎖抗体分子のさらに他の好ましい群は、以下からなる群より選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、およびＣＤＲ Ｌ３として含む：
ａ）配列番号３８０〜３８２のＣＤＲＨ１−３および配列番号３８５〜３８７のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｂ）配列番号３９４〜３９６のＣＤＲＨ１−３および配列番号３９９〜４０１のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｃ）配列番号４０８〜４１０のＣＤＲＨ１−３および配列番号４１３〜４１５のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｄ）配列番号４２２〜４２４のＣＤＲＨ１−３および配列番号４２７〜４２９のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｅ）配列番号４３６〜４３８のＣＤＲＨ１−３および配列番号４４１〜４４３のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｆ）配列番号４５０〜４５２のＣＤＲＨ１−３および配列番号４５５〜４５７のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｇ）配列番号４６４〜４６６のＣＤＲＨ１−３および配列番号４６９〜４７１のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｈ）配列番号４７８〜４８０のＣＤＲＨ１−３および配列番号４８３〜４８５のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｉ）配列番号４９２〜４９４のＣＤＲＨ１−３および配列番号４９７〜４９９のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｊ）配列番号５０６〜５０８のＣＤＲＨ１−３および配列番号５１１〜５１３のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｋ）配列番号５２０〜５２２のＣＤＲＨ１−３および配列番号５２５〜５２７のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｌ）配列番号５３４〜５３６のＣＤＲＨ１−３および配列番号５３９〜５４１のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｍ）配列番号５４８〜５５０のＣＤＲＨ１−３および配列番号５５３〜５５５のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｎ）配列番号５６２〜５６４のＣＤＲＨ１−３および配列番号５６７〜５６９のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｏ）配列番号５７６〜５７８のＣＤＲＨ１−３および配列番号５８１〜５８３のＣＤＲ Ｌ１−３；
ｐ）配列番号５９０〜５９２のＣＤＲＨ１−３および配列番号５９５〜５９７のＣＤＲ Ｌ１−３；ならびに
ｑ）配列番号６０４〜６０６のＣＤＲＨ１−３および配列番号６０９〜６１１のＣＤＲ Ｌ１−３。
【００９９】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子において、細胞表面抗原ＰＳＭＡに結合する第２の結合ドメインは、以下からなる群から選択される配列群を、第２の結合ドメイン内におけるＶＨ鎖およびＶＬ鎖として含むことが好ましい：
ａ）配列番号２２５のＶＨ鎖および配列番号２３０のＶＬ鎖；
ｂ）配列番号２３９のＶＨ鎖および配列番号２４４のＶＬ鎖；
ｃ）配列番号２５３のＶＨ鎖および配列番号２５８のＶＬ鎖；
ｄ）配列番号２６７のＶＨ鎖および配列番号２７２のＶＬ鎖；
ｅ）配列番号６１７のＶＨ鎖および配列番号６２２のＶＬ鎖；
ｆ）配列番号２８１のＶＨ鎖および配列番号２８６のＶＬ鎖；
ｇ）配列番号２９５のＶＨ鎖および配列番号３００のＶＬ鎖；
ｈ）配列番号３０９のＶＨ鎖および配列番号３１４のＶＬ鎖；
ｉ）配列番号３２３のＶＨ鎖および配列番号３２８のＶＬ鎖；
ｊ）配列番号３３７のＶＨ鎖および配列番号３４２のＶＬ鎖；
ｋ）配列番号３５１のＶＨ鎖および配列番号３５６のＶＬ鎖；
ｌ）配列番号３６５のＶＨ鎖および配列番号３７０のＶＬ鎖；
ｍ）配列番号３７９のＶＨ鎖および配列番号３８４のＶＬ鎖；
ｎ）配列番号３９３のＶＨ鎖および配列番号３９８のＶＬ鎖；
ｏ）配列番号４０７のＶＨ鎖および配列番号４１２のＶＬ鎖；
ｐ）配列番号４２１のＶＨ鎖および配列番号４２６のＶＬ鎖；
ｑ）配列番号４３５のＶＨ鎖および配列番号４４０のＶＬ鎖；
ｒ）配列番号４４９のＶＨ鎖および配列番号４５４のＶＬ鎖；
ｓ）配列番号４６３のＶＨ鎖および配列番号４６８のＶＬ鎖；
ｔ）配列番号４７７のＶＨ鎖および配列番号４８２のＶＬ鎖；
ｕ）配列番号４９１のＶＨ鎖および配列番号４９６のＶＬ鎖；
Ｖ）配列番号５０５のＶＨ鎖および配列番号５１０のＶＬ鎖；
ｗ）配列番号５１９のＶＨ鎖および配列番号５２４のＶＬ鎖；
ｘ）配列番号５３３のＶＨ鎖および配列番号５３８のＶＬ鎖；
ｙ）配列番号５４７のＶＨ鎖および配列番号５５２のＶＬ鎖；
ｚ）配列番号５６１のＶＨ鎖および配列番号５６６のＶＬ鎖；
ａａ）配列番号５７５のＶＨ鎖および配列番号５８０のＶＬ鎖；
ａｂ）配列番号５８９のＶＨ鎖および配列番号５９４のＶＬ鎖；ならびに
ａｃ）配列番号６０３のＶＨ鎖および配列番号６０８のＶＬ鎖。
【０１００】
上記ＶＨ鎖およびＶＬ鎖は、配列番号２３５、２４９、２６３、２７７、６２７、２９１、３０５、３１９、３３３、３４７、３６１、３７５、３８９、４０３、４１７、４３１、４４５、４５９、４７３、４８７、５０１、５１５、５２９、５４３、５５７、５７１、５８５、５９９、および６１３にもそれぞれ示されている。
【０１０１】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子の第２の結合ドメインの対応するＶＬ領域およびＶＨ領域の配列（アミノ酸配列およびヌクレオチド配列）のほか、それぞれのｓｃＦｖ配列も配列表に示す。
【０１０２】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子において、結合ドメインは、別記の実施例で例示する通り、ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ、またはＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨの順序に並べられる。結合ドメインは、ＶＨＰＳＭＡ−ＶＬ ＰＳＭＡ−ＶＨ ＣＤ３−ＶＬ ＣＤ３、またはＶＬ ＰＳＭＡ−ＶＨ ＰＳＭＡ−ＶＨ ＣＤ３−ＶＬ ＣＤ３の順序に並べられることが好ましい。
【０１０３】
本発明の特に好ましい実施形態は、上記で特徴づけられたポリペプチドに関し、該二重特異性単鎖抗体分子は、以下から選択される配列を含む：
（ａ）配列番号２３７、２５１、２６５、２７９、６２９、２９３、３０７、３２１、３３５、３４９、３６３、３７７、３９１、４０５、４１９、４３３、４４７、４６１、４７５、４８９、５０３、５１７、５３１、５４５、５５９、５７３、５８７、６０１、または６１５のいずれかに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２３８、２５２、２６６、２８０、６３０、２９４、３０８、３２２、３３６、３５０、３６４、３７８、３９２、４０６、４２０、４３４、４４８、４６２、４７６、４９０、５０４、５１８、５３２、５４６、５６０、５７４、５８８、６０２、または６１６のいずれかに示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列。
【０１０４】
本発明は、配列番号２３７、２５１、２６５、２７９、６２９、２９３、３０７、３２１、３３５、３４９、３６３、３７７、３９１、４０５、４１９、４３３、４４７、４６１、４７５、４８９、５０３、５１７、５３１、５４５、５５９、５７３、５８７、６０１、または６１５のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列を含む二重特異性単鎖抗体分子のほか、配列番号２３７、２５１、２６５、２７９、６２９、２９３、３０７、３２１、３３５、３４９、３６３、３７７、３９１、４０５、４１９、４３３、４４７、４６１、４７５、４８９、５０３、５１７、５３１、５４５、５５９、５７３、５８７、６０１、または６１５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％同一であり、好ましくは９７％、より好ましくは少なくとも９８％同一であり、最も好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列にも関する。また、本発明は、配列番号２３８、２５２、２６６、２８０、６３０、２９４、３０８、３２２、３３６、３５０、３６４、３７８、３９２、４０６、４２０、４３４、４４８、４６２、４７６、４９０、５０４、５１８、５３２、５４６、５６０、５７４、５８８、６０２、または６１６のうちのいずれかに記載の対応する核酸配列のほか、配列番号２３８、２５２、２６６、２８０、６３０、２９４、３０８、３２２、３３６、３５０、３６４、３７８、３９２、４０６、４２０、４３４、４４８、４６２、４７６、４９０、５０４、５１８、５３２、５４６、５６０、５７４、５８８、６０２、または６１６に示される核酸配列に対して少なくとも９６％同一であり、好ましくは９７％、より好ましくは少なくとも９８％同一であり、最も好ましくは少なくとも９９％同一である核酸配列にも関する。配列同一性は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の全体に亘って決定されるものとする。配列アライメントを行うには、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711 (1991)）に含まれるＧａｐプログラムまたはＢｅｓｔＦｉｔプログラムを用いることができる（NeedlemanおよびWunsch J. Mol. Biol. 48 (1970), 443-453; SmithおよびWaterman, Adv. Appl. Math 2 (1981), 482-489）。例えば上記プログラムのうちの１つを使用して、本発明の二重特異性単鎖抗体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して、例えば、９６％（９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定および同定することは、当業者にとって日常的な方法である。例えば、クリックのゆらぎ仮説によると、アンチコドン上の５’塩基は、他の２つの塩基ほど空間的に制約されておらず、したがって、非標準的な塩基対を形成することが可能であろう。言い換えれば、コドントリプレット内の３位は、この３位を異にする２つのトリプレットが同じアミノ酸残基をコードする可能性があるように変化するであろう。前記仮説は、当業者には周知である（例えば、http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis; Crick, J Mol Biol 19(1966): 548-55)を参照）。
【０１０５】
本発明のＰＳＭＡｘＣＤ３二重特異性単鎖抗体構築物において好ましいドメイン配列を、以下の実施例において示す。
【０１０６】
本発明の好ましい実施形態において、二重特異性単鎖抗体は、ＣＤ３イプシロンと、二重特異性単鎖抗体の第２の結合ドメインにより認識される、ヒト、および非チンパンジー霊長動物の細胞表面抗原であるＰＳＭＡとに対して異種間特異的である。
【０１０７】
代替的な実施形態において、本発明は、上記で説明した、本発明の二重特異性単鎖抗体分子をコードする核酸配列を提供する。
【０１０８】
また、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
【０１０９】
所望の機能に依存して選択される多くの適切なベクターが分子生物学の当業者に知られており、ベクターには、遺伝子操作において従来用いられているプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、およびその他のベクターが含まれる。当業者に周知の方法を用いて、各種のプラスミドおよびベクターを構築することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前記引用箇所）、およびＡｕｓｕｂｅｌ、「Current Protocols in Molecular Biology」、GreenPublishing Associates and Wiley Interscience、N.Y.(1989)、(1994)において説明される技法を参照）。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターを、リポソーム内へと再構成して標的細胞へと送達することもできる。以下でさらに詳しく論じる通り、クローニングベクターを用いて、個々のＤＮＡ配列を単離した。関与する配列を、特定のポリペプチドの発現が必要とされる発現ベクター内へと形質導入することができる。典型的なクローニングベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、およびｐＧＢＴ９が含まれる。典型的な発現ベクターには、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが含まれる。
【０１１０】
前記ベクターは、本明細書で定義される前記核酸配列に作動的に連結された調節配列である核酸配列を含むことが好ましい。
【０１１１】
「調節配列」という用語は、ＤＮＡ配列を指し、このＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列がライゲーションされるコード配列を発現させるのに必要なものである。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物の場合、制御配列には一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターが含まれる。真核生物の場合、制御配列には一般に、プロモーター、ターミネーター、また場合によって、エンハンサー、トランス活性化因子、または転写因子が含まれる。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現に必要なすべてのコンポーネントを包含することを意図し、さらなる有利なコンポーネントも包含してもよい。
【０１１２】
「作動的に連結された」という用語は、上述のようなコンポーネントがそれらに意図された形で機能できるような関係にあるように並べることを指す。コード配列に対して「作動的に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合的な状態で達成されるようにライゲーションされている。制御配列がプロモーターの場合、二本鎖核酸を用いることが好ましいことは、当業者に明らかである。
【０１１３】
したがって、列挙されるベクターは、発現ベクターであることが好ましい。「発現ベクター」とは、選択された宿主を形質転換するために使用できる構築物であり、該選択された宿主内におけるコード配列の発現をもたらす。発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクター、または組込みベクターであり得る。発現は、好ましくは、翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。原核生物および／または真核細胞内における発現を確保する調節エレメントは、当業者には周知である。真核細胞の場合、それらは、転写の開始を確保するプロモーターを標準的に含み、転写の終結および転写の安定化を確保するポリＡシグナルを任意に含む。原核生物宿主細胞内における発現を可能とする可能な調節エレメントは、例えば、大腸菌におけるＰＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、またはｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能とする調節エレメントの例は、酵母におけるＡＯＸ１プロモーターもしくはＧＡＬ１プロモーター、または哺乳動物細胞および他の動物細胞におけるＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、もしくはグロビンイントロンである。
【０１１４】
転写開始の一因となるエレメント以外に、このような調節エレメントは、ポリヌクレオチドの下流において、ＳＶ４０ポリＡ部位またはｔｋポリＡ部位などの転写終結シグナルも含んでいてもよい。さらに、用いられる発現系に応じて、ポリペプチドを細胞内コンパートメントへと誘導することが可能な、またはポリペプチドを媒体内へと分泌することが可能なリーダー配列を、列挙した核酸配列のコード配列へと付加してもよく、これらリーダー配列は当技術分野では周知である（国際公開第２００８／１１９５６７号を参照）。（１または複数の）リーダー配列は、翻訳配列、開始配列、および終結配列と適切に同調する形で構築され、ある１つのリーダー配列は、翻訳されたタンパク質またはその一部の分泌を、ペリプラズム腔内または細胞外媒体内へ誘導できることが好ましい。場合によって、異種配列は、Ｎ末端同定ペプチドを包含する融合タンパク質をコードすることができ、このＮ末端同定ペプチドは、所望の特徴、例えば、発現される組換え産物の安定性、またはその精製の簡略さを付与するものである（上記参照）。この文脈において、当技術分野では、岡山−ＢｅｒｇによるｃＤＮＡ発現ベクターであるｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社製）、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ、ｐＥＦ−ＡＤＡ、もしくはｐＥＦ−ｎｅｏ（Mack et al. PNAS (1995) 92, 7021-7025、およびRaumet al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150）、またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）など適切な発現ベクターが知られている。
【０１１５】
発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることが可能なベクター内における真核細胞プロモーター系であることが好ましいが、原核生物宿主用の制御配列を用いてもよい。ベクターを適切な宿主内へと組み込んだら、該宿主を、高レベルの核酸配列発現に適する条件下に維持し、その後、所望の場合は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の回収および精製を行ってもよい（例えば、別記の実施例を参照）。
【０１１６】
細胞周期と相互作用するタンパク質を発現させるために用いることのできる代替的な発現系は、昆虫系である。このような系の１つでは、キンウワバ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて外来遺伝子をヨウトガ細胞またはイラクサギンウワバ細胞において発現させる。列挙した核酸分子のコード配列は、ポリヘドリン遺伝子などの該ウイルスの非エッセンシャル領域内へとクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれてもよい。前記コード配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子が不活化され、被覆タンパク質コートを欠く組換えウイルスが作製される。次いで、組換えウイルスを用いて、ヨウトガ細胞またはイラクサギンウワバ細胞に感染させ、そこで本発明のタンパク質を発現させる（Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994),3224-3227）。
【０１１７】
さらなる調節エレメントには、転写エンハンサーのほか、翻訳エンハンサーも含まれていてもよい。本発明の上記で説明したベクターは、選択マーカーおよび／またはスコアリングマーカーを含むと有利である。
【０１１８】
形質転換細胞、ならびに、例えば、植物組織および植物の選択に有用な選択マーカー遺伝子は当業者には周知であり、例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒの選択ベースとしての抗代謝物質耐性（Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149）；アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシン、およびパロマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔ（Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995）；および、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロ（Marsh, Gene 32 (1984), 481-485）を含む。さらなる選択遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを用いることを可能とするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを用いることを可能とするｈｉｓＤ（Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047）；細胞がマンノースを用いることを可能とするマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（国際公開第９４／２０６２７号）、および、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）に対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology,Cold Spring Harbor Laboratory ed.）、または、ブラスチシジンＳに対する耐性を付与する、アスペルギルス・テレウスに由来するデアミナーゼ（Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338）についても説明されている。
【０１１９】
有用なスコアリングマーカーも、当業者に知られており、市販されている。前記マーカーは、ルシフェラーゼ（Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178(1996), 121）、緑色蛍光タンパク質（Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996),44-47）、またはβ−グルクロニダーゼ（Jefferson, EMBO J. 6 (1987),3901-3907）をコードする遺伝子であることが有利である。この実施形態は、列挙したベクターを含有する細胞、組織、および生物の簡略で迅速なスクリーニングに特に有用である。
【０１２０】
上記で説明した通り、列挙した核酸分子は、例えば、精製を目的とするが、遺伝子治療を目的としても、単独で、または、細胞内において本発明の二重特異性単鎖抗体分子を発現するベクターの一部として用いることができる。上記で説明した、本発明の二重特異性単鎖抗体分子のいずれか１つをコードする（１または複数の）ＤＮＡ配列を含有する核酸分子またはベクターを細胞内へと導入し、これにより対象のポリペプチドを作製する。エクスビボ法またはインビボ法により治療遺伝子を細胞内へと導入することに基づく遺伝子治療は、遺伝子導入の最も重要な適用の１つである。インビトロまたはインビボにおける遺伝子治療に適するベクター、方法、または遺伝子送達系は文献において説明されており、当業者に知られている（例えば、Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79(1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389(1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77(1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998),692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. GeneTher. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716;国際公開第９４／２９４６９号；国際公開第９７／００９５７号，米国特許第５，５８０，８５９号明細書；米国特許第５，５８９，４６６号明細書；またはSchaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640; dosSantos CouraおよびNardi Virol J. (2007), 4:99を参照）。列挙した核酸分子およびベクターは、細胞内への直接的な導入用、または、リポソームもしくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター）を介する導入用に設計されていてもよい。前記細胞は、生殖細胞系列細胞、胚細胞、もしくは卵細胞、またはこれらに由来する細胞であることが好ましく、前記細胞は、幹細胞であることが最も好ましい。胚性幹細胞の例は、とりわけ、Ｎａｇｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０（１９９３）、８４２４〜８４２８において説明される幹細胞であり得る。
【０１２１】
また、本発明は、本発明のベクターにより形質転換されるか、またはこれをトランスフェクトした宿主も提供する。前記宿主は、上記で説明した本発明のベクター、または上記で説明した本発明の核酸分子を宿主内へと導入することにより作製されてもよい。少なくとも１つのベクターまたは少なくとも１つの核酸分子が宿主内に存在することにより、上記で説明した単鎖抗体構築物をコードする遺伝子の発現が媒介されることがある。
【０１２２】
宿主内に導入される、本発明の上述の核酸分子またはベクターは、該宿主のゲノム内へと一体化してもよく、または、染色体外に保持されてもよい。
【０１２３】
宿主は、任意の原核生物または真核細胞であり得る。
【０１２４】
「原核生物」という用語は、本発明のタンパク質を発現させるためのＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子により形質転換することのできる、または、これをトランスフェクトすることのできる全ての細菌を包含することを意図する。原核生物宿主には、例えば、大腸菌、ネズミチフス菌、霊菌、および枯草菌など、グラム陰性菌ならびにグラム陽性菌が含まれていてもよい。「真核細胞の」という用語は、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および、好ましくは、哺乳動物細胞を包含することを意味する。組換え体作製手順において用いられる宿主に応じて、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、グリコシル化されてもよいし、または、グリコシル化されなくてもよい。本発明の二重特異性単鎖抗体分子、ならびにこれに遺伝子融合させたＮ末端ＦＬＡＧタグおよび／またはＣ末端Ｈｉｓタグのコード配列を含有するプラスミドまたはウイルスの使用がとりわけ好ましい。前記ＦＬＡＧタグの長さは、約４〜８アミノ酸であることが好ましく、８アミノ酸であることが最も好ましい。上記で説明したポリヌクレオチドは、当業者に一般的に知られる技法のうちのいずれかを用いて宿主を形質転換するか、またはこれにトランスフェクトするのに用いることができる。さらに、融合され、作動的に連結された遺伝子を調製し、例えば、哺乳動物細胞内および細菌内でそれらを発現させる方法も、当技術分野ではよく知られている（Sambrook, 前記引用箇所）。
【０１２５】
前記宿主は、細菌細胞、または昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞、もしくは動物細胞であることが好ましい。
【０１２６】
列挙した宿主が哺乳動物細胞であってもよい、ということが特に意図される。特に好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２／０またはＮＳ／０などの骨髄腫細胞株を含む。同類の他の分子についての国際公開第２００８／１１９５６７号の実施例に示すように、宿主としては、ＣＨＯ細胞が特に好ましい。
【０１２７】
前記宿主細胞は、ヒト細胞またはヒト細胞株、例えば、ｐｅｒ．ｃ６であることがより好ましい (Kroos, Biotechnol. Prog., 2003, 19:163-168)。
【０１２８】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を作製するためのプロセスであって、本発明の宿主を、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の発現を可能とする条件下で培養するステップと、生成されたポリペプチドを該培養物から回収するステップとを含むプロセスに関する。
【０１２９】
形質転換した宿主を、発酵器内で増殖させ、当技術分野で知られる技法により培養して、最適の細胞増殖を達成することができる。そして、増殖培地、細胞溶解物、または細胞膜画分から、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を単離することができる。例えば、微生物に発現させた二重特異性単鎖抗体分子の単離および精製は、例えば、予備的なクロマトグラフィーによる分離、および、例えば、本発明の、または別記の実施例に記載の二重特異性単鎖抗体分子のタグを指向するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用を伴う分離などの免疫学的分離など、従来の任意の手段を介してもよい。
【０１３０】
当技術分野において、発現を可能とする宿主の培養条件は、このようなプロセスで用いられる宿主系および発現系／発現ベクターに依存することが知られている。組換えポリペプチドの発現を可能とする条件を達成するために変更すべきパラメータは、当技術分野で知られている。したがって、適切な条件は、発明のためのさらなる努力なしに、当業者により決定され得る。
【０１３１】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子を、発現してから、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準的な手順によって精製することができる（Scopes, 「Protein Purification」, Springer-Verlag, N.Y. (1982)を参照）。医薬用には、少なくとも約９０〜９５％の均一性を有する、実質的に純粋なポリペプチドが好ましく、９８〜９９％以上の均一性が最も好ましい。次いで、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を、部分的に、または所望の均一性まで精製してから、治療（体外治療を含めた）、またはアッセイ手順の開発および実施に用いることができる。さらに、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を培養物から回収する方法の例も、同類の他の分子についての国際公開第２００８／１１９５６７号の別記の実施例において詳細に説明する。回収は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）エピトープに結合することが可能な、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を単離する方法であって、
（ａ）（１または複数の）ポリペプチドを、アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号２１１）またはＧｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号２１２）を含み、そのＣ末端を介して固相へと固定した、最大２７アミノ酸によるＣＤ３εの細胞外ドメインのＮ末端断片と接触させるステップと；
（ｂ）前記断片から、結合した（１または複数の）ポリペプチドを溶出させるステップと；
（ｃ）（ｂ）の溶出物から、（１または複数の）ポリペプチドを単離するステップとを含む方法によっても達成することができる。
【０１３２】
本発明の上記の方法により単離される（１または複数の）ポリペプチドは、ヒト由来であることが好ましい。
【０１３３】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子を単離するこの方法は、複数の候補ポリペプチドから、そのＮ末端においてアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号２１１）またはＧｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号２１２）を含むＣＤ３εの細胞外ドメイン断片に対して同じ特異性を有する、１または複数の異なるポリペプチドを単離する方法のほか、溶液からポリペプチドを精製する方法としても理解される。二重特異性単鎖抗体分子を溶液から精製する後者の方法の非限定的な例は、例えば、組換えにより発現させた二重特異性単鎖抗体分子を培養物上清から精製する方法、またはこのような培養物からの調製である。
【０１３４】
前述の通り、この方法で用いる断片は、霊長動物ＣＤ３ε分子の細胞外ドメインのＮ末端断片である。異なる種によるＣＤ３ε分子の細胞外ドメインのアミノ酸配列を、配列番号１、３、５、および７に示す。Ｎ末端八量体の２つの形態を、配列番号２１１および２１２に示す。このＮ末端は、本発明の方法により同定されるポリペプチドに、フリーで結合可能であることが好ましい。本発明の文脈において、「フリーで結合可能」という用語は、Ｈｉｓタグなど、さらなるモチーフを含まないこととして理解される。本明細書に記載の結合分子に対するこのようなＨｉｓタグの干渉は、国際公開第２００８／１１９５６７号に記載されている。
【０１３５】
この方法によれば、前記断片は、そのＣ末端を介して固相へと固定される。当業者は、本発明の方法で用いる実施形態に応じて、適切な固相支持体を、発明的努力なしに容易に選択するであろう。固体支持体の例は、ビーズ（例えば、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ポリスチロールビーズ、デキストランビーズ）、プレート（培養プレートまたはマルチウェルプレート）のほか、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）社製が知られるチップなどのマトリックスを含むが、これらに限定されない。前記固体支持体に断片を固定／固定化するための手段および方法の選択は、該固体支持体の選択に依存する。固定／固定化に一般的に用いられる方法は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを介した結合である。この結合のほか、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）によるものなど、固定／固定化のための代替的な方法の根本をなす化学反応は、当業者に知られている。クロマトグラフィー支持体上において固定／固定化するためには、一般に、以下の手段：ＮＨＳ活性化セファロース（例えば、ＧＥＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ社製のＨｉＴｒａｐ−ＮＨＳ）、ＣｎＢｒ活性化セファロース（例えば、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、ＮＨＳ活性化デキストランビーズ（Ｓｉｇｍａ社製）、または活性化ポリメタクリレートを用いる。これらの試薬は、バッチ法で用いられてもよい。また、酸化鉄を含むデキストランビーズ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を、バッチ法で用いてもよい。これらのビーズは、溶液からビーズを分離するための磁石と組み合わせて用いてもよい。ＮＨＳ活性化カルボキシメチルデキストランを用いることにより、ポリペプチドをＢｉａｃｏｒｅ社のチップ（例えば、ＣＭ５チップ）上に固定化することができる。適切な固体支持体のさらなる例は、アミン反応性マルチウェルプレート（例えば、Ｎｕｎｃ社製のＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ（商標）プレート）である。
【０１３６】
この方法により、ＣＤ３イプシロン細胞外ドメインによる前記断片を、直接的に、または、アミノ酸の連なりを介して固体支持体に連結することができる。なお、これらのアミノ酸は、リンカーの場合もあり、別のタンパク質／ポリペプチド部分の場合もある。あるいは、ＣＤ３イプシロン細胞外ドメインを、１または複数のアダプター分子を介して間接的に連結することもできる。
【０１３７】
固定化させたエピトープに結合したペプチドまたはポリペプチドを溶出させる手段および方法は、当技術分野において周知である。同じことは、同定した（１または複数の）ポリペプチドを、溶出物から単離する方法についてもあてはまる。
【０１３８】
Ｎ末端においてアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘは、ＭｅｔまたはＩｌｅである）を含み、ＣＤ３εの細胞外ドメイン断片に対して同じ特異性を有する、１または複数の異なる二重特異性単鎖抗体分子を、複数の候補ポリペプチドから単離する方法は、抗原特異的実体を選択するための以下の方法の１または複数のステップを含んでいてもよい。
【０１３９】
ＣＤ３ε特異性結合ドメインは、抗体由来のレパートリーから選択することができる。ファージ提示法ライブラリーは、例えば、「Phage Display: A Laboratory Manual」; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001で開示される標準的な手順に基づき構築することができる。抗体ライブラリー内における抗体断片のフォーマットは、ｓｃＦｖであり得るが、また一般的に、Ｆａｂ断片でもよいし、または、単一ドメイン抗体断片でもよい。抗体断片を単離するには、ナイーブ抗体断片のライブラリーを用いてもよい。その後治療的に用いる際、潜在的に免疫原性の低い結合実体を選択するのに、ヒト抗体断片を直接的に選択するには、ヒト抗体断片のライブラリーが好都合であろう。場合によって、それらは、合成的な抗体ライブラリーのための基盤を形成することもある（Knappik et al. J Mol. Biol. 2000, 296:57以下）。対応するフォーマットは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ（以下で説明する）、またはドメイン抗体（Holt et al., Trends Biotechnol. 2003, 21:484以下で総説されるdAb）でもよい。
【０１４０】
当技術分野では、標的抗原に対して利用できるヒト免疫抗体供給源が多くの場合は無い、ということも知られている。したがって、標的抗原により動物を免疫化し、例えば、脾臓またはＰＢＭＣなどの動物組織から、それぞれの抗体ライブラリーを単離する。Ｎ末端断片は、ビオチニル化されてもよく、または、ＫＬＨまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質に共有結合させてもよい。一般的な手法によれば、免疫化には齧歯動物が用いられる。他の理由、例えば、（Muyldermans, J Biotechnol. 74:277; De Genst et al. Dev Como Immunol. 2006, 30:187以下に記載にように）ラクダ科動物種に由来して単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）が存在するという理由で、非ヒト由来の一部の免疫抗体レパートリーがとりわけ好ましいかもしれない。したがって、抗体ライブラリーの対応するフォーマットは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ（以下で説明する）、または単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）でもよい。
【０１４１】
可能な一手法では、ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ５７ｂｌａｃｋ交配による１０週齢のＦ１マウスを、例えば、成熟ＣＤ３ε鎖のＮ末端におけるアミノ酸１〜２７をＮ末端において翻訳融合体として提示する膜貫通ＥｐＣＡＭを発現する全細胞により免疫化することができる。あるいは、ＣＤ３イプシロン１〜２７−Ｆｃ融合タンパク質によりマウスを免疫化することもできる（対応する手法は、国際公開第２００８／１１９５６７号に記載されている）。（１または複数回にわたる）追加投与による免疫化の後、血液試料を採取し、例えば、ＦＡＣＳ解析において、ＣＤ３陽性Ｔ細胞に対する抗体の血清力価を調べることができる。通常、血清力価は、免疫化しない動物よりも免疫化した動物において著しく高い。
【０１４２】
免疫化した動物は、免疫抗体ライブラリーを構築するための基盤を形成することもある。このようなライブラリーの例は、ファージ提示法ライブラリーを含む。このようなライブラリーは、例えば、「Phage Display: A Laboratory Manual」; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001において開示される標準的な手順に基づいて一般的に構築されてもよい。
【０１４３】
非ヒト抗体を、選択時に結合剤のために後に濃縮され得る可変的な抗体ライブラリーの発生により、ファージ提示法によってヒト化することもできる。
【０１４４】
ファージ提示法アプローチでは、抗体ライブラリーを提示するファージプールのうちのいずれか１つは、それぞれの抗原を標的分子として用いて、結合実体を選択するための基盤を形成する。抗原特異性の抗原結合ファージが単離される中心的な段階を、パニングと称する。抗体断片がファージ表面上に提示されるため、この一般的な方法は、ファージ提示法と呼ばれる。選択の好ましい一方法は、ファージにより提示されるｓｃＦｖのＮ末端へと翻訳融合させた線維状ファージのＮ２ドメインなどの小タンパク質の使用である。結合実体を単離するのに用いてもよい、当技術分野で知られる別の提示法は、リボソーム提示法である（GrovesおよびOsbourn、ExpertOpin Biol Ther．、２００５、５、１２５以下；LipovsekおよびPluckthun、J Immunol Methods ２００４、２９０、５２以下において総説されている）。ＣＤ３ε１〜２７−Ｆｃ融合体タンパク質に対するｓｃＦｖファージ粒子の結合を実証するために、クローニングされたｓｃＦｖレパートリーを保有するファージライブラリーを、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）によってそれぞれの培養物上清から採取することができる。ＳｃＦｖファージ粒子を、固定化させたＣＤ３ε−Ｆｃ融合体タンパク質と共にインキュベートしてもよい。固定化させたＣＤ３ε−Ｆｃ融合体タンパク質を、固相にコーティングしてもよい。結合実体を溶出させることができ、該溶出物を用いて、新鮮な未感染の細菌宿主に感染させることができる。ヒトｓｃＦｖ断片をコードするファージミドコピーの形質導入に成功した細菌宿主を、さらに、カルベニシリン耐性について選択し、その後、これに、例えば、ＶＣＭＳ１３ヘルパーファージを感染させて、抗体提示およびインビトロにおける選択の第２ラウンドを開始させる。通常、計４〜５ラウンドの選択を実施する。単離された結合実体の結合については、フローサイトメトリーアッセイを用いて、ＣＤ３イプシロン陽性のジャーカット細胞、ＨＰＢａｌｌ細胞、ＰＢＭＣ、または、表面提示されたＥｐＣＡＭに融合させた、Ｎ末端におけるＣＤ３ε配列を保有する、トランスフェクトされた真核細胞上において調べることができる（国際公開第２００８／１１９５６７号参照）。
【０１４５】
好ましくは、上記の方法は、ＣＤ３εの細胞外ドメイン断片が、配列番号２、４、６、または８に示されるいずれか１つによるアミノ酸配列を有するポリペプチドの１または複数の断片からなる方法でもよい。前記断片は、長さ８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７のアミノ酸残基であることがより好ましい。
【０１４６】
二重特異性単鎖抗体分子を同定するこの方法は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３εのエピトープに結合する異種間特異的結合ドメインを含む、複数の二重特異性単鎖抗体分子をスクリーニングする方法でもよい。あるいは、該同定法は、ヒト、および非チンパンジー霊長動物のＣＤ３εに結合する異種間特異的結合ドメインを含む、二重特異性単鎖抗体分子の精製／単離法である。
【０１４７】
さらに、本発明は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子、または上記で開示したプロセスにより作製される二重特異性単鎖抗体を含む組成物を提供する。前記組成物は、医薬組成物であることが好ましい。
【０１４８】
また、本発明は、本明細書で定義されるか、または本明細書で定義されるプロセスにより作製される二重特異性単鎖抗体分子であって、癌を予防、治療、または改善するのに用いられる二重特異性単鎖抗体分子を提供する。前記癌は、固形腫瘍であることが好ましく、癌腫または前立腺癌であることがより好ましい。二重特異性単鎖抗体は、担体、安定化剤、および／または賦形剤による適切な製剤をさらに含むことが好ましい。さらに、前記二重特異性単鎖抗体分子は、追加薬物との組み合わせ投与に適することも好ましい。前記薬物は、非タンパク質性化合物でもタンパク質性化合物でもよく、本明細書で定義される二重特異性単鎖抗体分子と同時に投与しても同時に投与しなくてもよい。
【０１４９】
本発明によれば、「医薬組成物」という用語は、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、環境に依存しないCD３エピトープを指向し、且つ、これに対して作製される二重特異性単鎖抗体を含む。医薬組成物は、担体、安定化剤、および／または賦形剤による適切な製剤を含むことが好ましい。好ましい実施形態において、医薬組成物は、非経口投与用、経皮投与用、管腔内投与用、動脈内投与用、髄腔内投与用、および／もしくは鼻腔内投与用、または組織内への直接的な注射用の組成物を含む。特に、前記組成物は、注入または注射により患者に投与されることが意図される。適切な組成物の投与は、異なる方式、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、または皮内投与により実施されてもよい。特に、本発明は、適切な組成物の中断されない投与を提供する。非限定的な例として述べると、中断されない投与、すなわち、持続投与を、患者により装着されて患者の体内への治療剤の流入量を測定する小型ポンプシステムにより実施してもよい。本発明の、環境に依存しないCD３エピトープを指向し、且つ、これに対して作製される二重特異性単鎖抗体を含む医薬組成物を、前記ポンプシステムを用いて投与することができる。このようなポンプシステムは、当技術分野で一般に知られており、一般的に、注入される治療剤を含有するカートリッジの定期的な交換に依拠する。このようなポンプシステム内においてカートリッジを交換する場合、その他の場合には中断されない患者の体内への治療剤の流れが、結果的に一時中断されることがある。このような場合、カートリッジ交換前における投与相、およびカートリッジ交換後における投与相もなお、本発明の薬学的な手段および方法の意図の範囲内にあると考えられ、併せて、このような治療剤の１つの「中断されない投与」を構成する。
【０１５０】
本発明の、環境に依存しないＣＤ３エピトープを指向し、且つ、これに対して作製されるこれらの二重特異性単鎖抗体の持続投与または中断されない投与は、容器から流体を駆出する駆出機構と、該駆出機構を作動させる作動機構とを含めた、流体送達デバイスまたは小型ポンプシステムによる静脈内投与または皮下投与でもよい。皮下投与用のポンプシステムは、患者の皮膚に穿刺して、適切な組成物を患者の体内へと送達する注射針またはカニューレを包含していてもよい。前記ポンプシステムは、静脈、動脈、または血管とは別に、患者の皮膚に直接固定するかまたは取り付けられてもよく、これにより、ポンプシステムと、患者の皮膚との間の直接的な接触が可能となる。ポンプシステムは、２４時間〜数日間にわたり患者の皮膚に取り付けることができる。ポンプシステムは、小容量の容器を伴う小型サイズでもよい。非限定的な例として述べると、投与される適切な医薬組成物用の容器の用量は、０．１ｍｌを上回り５０ｍｌ未満であり得る。
【０１５１】
持続投与は、皮膚上に貼付され、一定間隔で貼りかえられるパッチによる経皮投与でもよい。当業者は、この目的に適する薬物送達用のパッチシステムについて承知している。例えば、第１の使用済みパッチのすぐ近傍の皮膚表面において、第１の使用済みパッチをはがす直前に、第１の使用済みパッチの交換を、新たな第２のパッチの貼付と同時に達成することができて有利であるため、経皮投与は、中断されない投与にとりわけ適することが注目に値する。流れの中断または動力電池の故障による問題は生じない。
【０１５２】
特に、環境に依存しないＣＤ３エピトープを指向し、且つ、これに対して作製される二重特異性単鎖抗体を含む本発明の組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。適切な医薬担体の例は、当技術分野では周知であり、リン酸緩衝生理食塩液などの溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、各種の保湿剤、滅菌溶液、リポソームなどを含む。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法により調製することができる。製剤は、炭水化物、緩衝液、アミノ酸、および／または界面活性剤を含み得る。炭水化物は、非還元性の糖、好ましくは、トレハロース、スクロース、オクタスルフェート、ソルビトール、またはキシリトールでもよい。このような製剤は、静脈内投与の場合もあり、皮下投与の場合もあり、ポンプシステムを伴う場合もあり、かつ／またはこれを伴わない場合もある持続投与に用いることができる。アミノ酸は、荷電アミノ酸、好ましくは、リシン、酢酸リシン、アルギニン、グルタミン酸、および／またはヒスチジンでもよい。界面活性剤は、好ましくは分子量が＞１．２ＫＤである洗浄剤、および／または、好ましくは分子量が＞３ＫＤであるポリエーテルでもよい。好ましい洗浄剤の非限定的な例は、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０、またはトゥイーン８５である。好ましいポリエーテルの非限定的な例は、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ ３３５０、ＰＥＧ ４０００、またはＰＥＧ ５０００である。本発明で用いられる緩衝液系は、その好ましいｐＨが５〜９であり、クエン酸、コハク酸、リン酸、ヒスチジン、および酢酸を含んでいてもよい。本発明の組成物は、適切な用量で対象に投与することができ、この適切な用量は、非チンパンジー霊長類、例えば、マカクザルに対して、本明細書で説明される異種間特異性を示す、本発明の二重特異性単鎖抗体分子の用量を増加させて投与することによる、例えば、用量漸増研究により決定することができる。上記の通り、本明細書で説明される異種間特異性を示す、本発明の二重特異性単鎖抗体分子は、非チンパンジー霊長類を対象とする前臨床試験においても、ヒトにおける薬物としても、同一の形態で用いることができて有利である。これらの組成物は、他のタンパク質性薬物および非タンパク質性薬物と組み合わせて投与することもできる。これらの薬物は、本明細書で定義される、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を含む組成物と同時に投与してもよいし、適時に規定された間隔および用量により、前記ポリペプチドの投与前または投与後において別個に投与してもよい。投与計画は、主治医および臨床的因子により決定される。医療技術分野で周知の通り、任意の一患者に対する用量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数および投与経路、一般的な健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物を含めた多くの因子に依存する。非経口投与用の調製物には、滅菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョン、または生理食塩液および緩衝媒体を含めた懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム液、リンゲルデキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウムによるリンゲル液、乳酸加リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、体液および栄養素の補給物質、電解質補給物質（リンゲルデキストロース液ベースの補給物質など）などが含まれる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなどの防腐剤および他の添加剤も存在していてもよい。さらに、本発明の組成物は、例えば、好ましくはヒト由来の血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性担体を含む場合もあり得る。本発明の組成物は、本明細書で定義される、本発明の二重特異性単鎖抗体分子に加え、該組成物の使用意図に応じて、さらなる生物学的活性剤も含む場合があり得る。このような薬剤は、当技術分野で知られる、消化器系に作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、炎症反応を調節する薬物、循環系に作用する薬物、および／またはサイトカインなどの薬剤の可能性があり得る。
【０１５３】
本明細書で定義される医薬組成物の生物学的活性は、例えば、以下の実施例、国際公開第９９／５４４４０号、またはＳｃｈｌｅｒｅｔｈら（Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12）において説明される細胞障害性アッセイにより決定することができる。本明細書で用いられる「有効性」または「インビボにおける有効性」とは、例えば、ＮＣＩにより標準化された応答基準を用いる、本発明の医薬組成物による治療に対する応答を指す。本発明の医薬組成物を用いる治療の奏効またはインビボにおける有効性とは、その意図する目的に対する該組成物の有効性、すなわち、該組成物がその所望の効果を奏する、すなわち、腫瘍細胞などの病原性細胞を枯渇させる能力を指す。インビボにおける有効性は、白血球カウント、白血球分類、蛍光活性化細胞分類、骨髄吸引が含まれるがこれらに限定されない、それぞれの疾患実体に対応する確立された標準的方法によってモニタリングされてもよい。加えて、各種の疾患特異的な臨床化学パラメータ、および、他の確立された標準的な方法を用いてもよい。さらに、コンピュータ断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、米国国立癌研究所基準に基づく応答評価[Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM,Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D,Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, CanellosGP. Report of an international workshop to standardize response criteria fornon-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr;17(4):1244])、陽電子放射断層撮影走査、白血球カウント、白血球分類、蛍光活性化細胞分類、骨髄吸引、リンパ節生検／組織学、および各種の癌特異的な臨床化学パラメータ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）、ならびにその他の確立された標準的方法を用いてもよい。
【０１５４】
本発明の医薬組成物などの薬物を開発する場合の別の主要な難題は、薬物動態特性の予測可能な調節である。この目的で、候補薬物の薬物動態プロファイル、すなわち特定の薬物が任意の状態を治療する能力に影響する薬物動態パラメータのプロファイルを確立する。特定の疾患実体を治療する薬物の能力に影響する薬物の薬物動態パラメータには、半減期、分布容積、肝臓における初回通過代謝、および血清結合度が含まれるがこれらに限定されない。任意の薬剤の有効性は、上述のパラメータの各々により影響される可能性がある。
【０１５５】
「半減期」とは、投与された薬物の５０％が、生物学的過程、例えば、代謝、分泌などにより消失することを意味する。
【０１５６】
「肝臓における初回通過代謝」とは、薬物が、肝臓との最初の接触時、すなわち、肝臓におけるその最初の通過時において代謝される傾向を意味する。
【０１５７】
「分布容積」とは、例えば、細胞内腔および細胞外間隙、組織、ならびに内臓など、体内の各種コンパートメント全体における薬物の貯留度、ならびにこれらのコンパートメント内における薬物の分布を意味する。
【０１５８】
「血清結合度」とは、薬物が、アルブミンなどの血清タンパク質と相互作用してこれらに結合し、該薬物の生物学的活性の低下または喪失をもたらす傾向を意味する。
【０１５９】
薬物動態パラメータには、任意の量の投与された薬物のバイオアベイラビリティー、遅延時間（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、作用開始の迅速度、および／またはＣｍａｘも含まれる。
【０１６０】
「バイオアベイラビリティー」とは、血液コンパートメント内における薬物量を意味する。
【０１６１】
「遅延時間」とは、薬物を投与する時点と、血中または血漿中においてそれが検出されて測定可能となる時点との間の時間の遅延を意味する。
【０１６２】
「Ｔｍａｘ」とは、薬物の血中濃度が最大になるまでの時間であり、「Ｃｍａｘ」とは、任意の薬物により得られる最大血中濃度である。その生物学的効果に必要な薬物の血中濃度または組織内濃度に達するまでの時間は、すべてのパラメータにより影響される。上記で概説した非チンパンジー霊長類を対象とする前臨床動物試験において決定されてもよい、異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体の薬物動態パラメータについては、例えば、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈらによる刊行物（Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12）にも記載されている。
【０１６３】
本明細書で用いられる「毒性」という用語は、有害事象または重篤な有害事象において発現する薬物の毒性作用を指す。これらの副作用事象は、投与後における薬物の全身における忍容性の欠如、および／または、局所的な忍容性の欠如を指す場合もある。毒性は、薬物によって引き起こされる催奇形性または発癌性の効果を含むこともあり得る。
【０１６４】
本明細書で用いられる「安全性」、「インビボにおける安全性」、または「忍容性」という用語は、薬物の投与直後（局所的な忍容）、および、比較的長い期間にわたる薬物の適用中に、重篤な有害事象を伴わない薬物投与を定義する。「安全性」、「インビボにおける安全性」、または「忍容性」は、例えば、治療期間および追跡期間において、定期的な間隔で評価することができる。測定には、臨床評価、例えば、内臓症状、および検査値異常のスクリーニングが含まれる。臨床評価を実施し、正常所見からの逸脱をＮＣＩ−ＣＴＣ基準および／またはＭｅｄＤＲＡ基準に従って記録／コード化してもよい。内臓症状には、例えば、有害事象についての「共通用語法基準」ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）に記載される、アレルギー症状／免疫学的症状、血液症状／骨髄症状、心不整脈、凝血などの基準が含まれる場合がある。検査してもよい検査パラメータには、例えば、血液分析、生化学分析、凝血プロファイル分析、および尿検査、ならびに、血清、血漿、リンパ、または髄液など、他の体液の検査が含まれる。したがって、安全性を、例えば、身体所見、造影法（すなわち、超音波、ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴造影（ＭＲＩ））、技術デバイスによる他の測定（すなわち、心電図）、バイタルサインによって、検査パラメータを測定し、有害事象を記録することにより評価することができる。例えば、本発明による使用および方法では、非チンパンジー霊長類における有害事象を、組織病理学的方法および／または組織化学的方法により検査してもよい。
【０１６５】
本明細書で用いられる「有効で毒性の無い用量」という用語は、主要な毒性作用なしに、または本質的にこれらなしに、病理学的細胞の枯渇、腫瘍の消失、腫瘍の退縮、または疾患の安定化をもたらすのに十分な高量の、本明細書で定義される二重特異性単鎖抗体の忍容可能な用量を指す。このような有効で毒性の無い用量は、例えば、当技術分野で説明される用量漸増研究により決定されてもよく、重篤な有害副作用（用量制限毒性、ＤＬＴ）を誘発する用量未満であるべきである。
【０１６６】
上記の用語は、例えば、Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｄｅｒｉｖｅｄｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓ６；ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；１９９７年７月１６日のＩＣＨ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅミーティングにおいても言及されている。
【０１６７】
さらに、本発明は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を含むか、または癌を予防、治療、もしくは改善するために、本発明によるプロセスに従い作製された医薬組成物に関する。前記癌は、固形腫瘍であることが好ましく、癌腫または前立腺癌であることが好ましい。前記医薬組成物は、担体、安定化剤、および／または賦形剤による適切な製剤をさらに含むことが好ましい。
【０１６８】
本発明のさらなる態様は、疾患を予防、治療、または改善する医薬組成物を調製するための、本明細書の上記で定義したか、または本発明の上記で定義したプロセスに従い作製される、二重特異性単鎖抗体分子／ポリペプチドの使用にも関する。前記疾患は、癌であることが好ましい。前記癌は、固形腫瘍であることがより好ましく、癌腫または前立腺癌であることが好ましい。
【０１６９】
本発明の二重特異性単鎖抗体分子の使用についての別の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、追加薬物と組み合わせて、すなわち、共治療の一部として投与するのに適している。前記共治療において、活性薬剤は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子と同じ医薬組成物中に随意に含まれていてもよいし、または、別個の医薬組成物中に含まれていてもよい。この後者の場合、前記別個の医薬組成物は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を含む前記医薬組成物の投与前において、この投与と同時に、またはこの投与後において投与するのに適する。追加薬物または医薬組成物は、非タンパク質性化合物でもよいし、または、タンパク質性化合物でもよい。追加薬物がタンパク質性化合物の場合、タンパク質性化合物は、免疫エフェクター細胞に対する活性化シグナルをもたらすことができると有利である。
【０１７０】
前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子、本明細書の上記で定義した核酸分子、本明細書の上記で定義したベクター、または本明細書の上記で定義した宿主と同時に投与しても同時に投与しなくてもよいことが好ましい。
【０１７１】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象において疾患を予防、治療、または改善する方法であって、有効量の、本発明の医薬組成物を投与するステップを含む方法に関する。前記疾患は、癌であることが好ましい。前記癌は固形腫瘍であることが好ましく、癌腫または前立腺癌であることが好ましい。
【０１７２】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、追加薬物と組み合わせて、すなわち、共治療の一部として投与するのに適している。前記共治療において、活性薬剤は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子と同じ医薬組成物中に随意に含まれていてもよいし、または、別個の医薬組成物中に含まれていてもよい。この後者の場合、前記別個の医薬組成物は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子を含む前記医薬組成物の投与前において、この投与と同時に、またはこの投与後において投与するのに適する。追加薬物または医薬組成物は、非タンパク質性化合物でもよいし、または、タンパク質性化合物でもよい。追加薬物がタンパク質性化合物の場合、タンパク質性化合物は、免疫エフェクター細胞に対する活性化シグナルをもたらすことができると有利である。
【０１７３】
前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子、本明細書の上記で定義した核酸分子、本明細書の上記で定義したベクター、または本明細書の上記で定義した宿主と同時に投与しても同時に投与しなくてもよいことが好ましい。
【０１７４】
上記で説明した本発明の方法の場合、前記対象はヒトであることが好ましい。
【０１７５】
さらなる態様において、本発明は、本発明の二重特異性単鎖抗体分子、本発明の核酸分子、本発明のベクター、または本発明の宿主を含むキットに関する。
【０１７６】
これらおよび他の実施形態は、本発明の説明および実施例により開示され包含されている。免疫学における組換えの技法および方法は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A LaboratoryManual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition 2001;Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook ofTechniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: AMolecular Cloning Manual; Cold Spring Laboratory Press, 2002において説明されている。本発明に従い用いられる抗体、方法、使用、および化合物のうちのいずれか１つに関するさらなる文献は、例えば、公共の図書館から、および、電子デバイスを用いて公開データベースから検索することができる。例えば、インターネット上で閲覧できる公開データベースである「Ｍｅｄｌｉｎｅ」は、例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlにおいて用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/などのさらなるデータベースおよびアドレス、またはhttp://www.embl.de/services/index.htmlのＥＭＢＬサービスによるホームページにおいて一覧されるさらなるデータベースおよびアドレスは当業者に知られており、これらは、例えば、http://www.google.comを用いて入手することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１（１）】図１（１）は、ヒトＰＳＭＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、マカクザルＰＳＭＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘに対する、指定の異種間特異的な二重特異性単鎖構築物の結合のＦＡＣＳによる解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例２．１に記載のように実施される。太線は、細胞培養上清と共にインキュベートし、その後、抗ヒス抗体とＰＥで標識化した検出抗体と共にインキュベートした細胞を表す。細線によるヒストグラムは、陰性対照：抗ヒス抗体および検出抗体だけと共にインキュベートした細胞を示す。
【図１（２）】図１（２）は、ヒトＰＳＭＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、マカクザルＰＳＭＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘに対する、指定の異種間特異的な二重特異性単鎖構築物の結合のＦＡＣＳによる解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例２．１に記載のように実施される。太線は、細胞培養上清と共にインキュベートし、その後、抗ヒス抗体とＰＥで標識化した検出抗体と共にインキュベートした細胞を表す。細線によるヒストグラムは、陰性対照：抗ヒス抗体および検出抗体だけと共にインキュベートした細胞を示す。
【図１（３）】図１（３）は、ヒトＰＳＭＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、マカクザルＰＳＭＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘに対する、指定の異種間特異的な二重特異性単鎖構築物の結合のＦＡＣＳによる解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例２．１に記載のように実施される。太線は、細胞培養上清と共にインキュベートし、その後、抗ヒス抗体とＰＥで標識化した検出抗体と共にインキュベートした細胞を表す。細線によるヒストグラムは、陰性対照：抗ヒス抗体および検出抗体だけと共にインキュベートした細胞を示す。
【図１（４）】図１（４）は、ヒトＰＳＭＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ、マカクザルＰＳＭＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘに対する、指定の異種間特異的な二重特異性単鎖構築物の結合のＦＡＣＳによる解析を示す図である。ＦＡＣＳによる染色は、実施例２．１に記載のように実施される。太線は、細胞培養上清と共にインキュベートし、その後、抗ヒス抗体とＰＥで標識化した検出抗体と共にインキュベートした細胞を表す。細線によるヒストグラムは、陰性対照：抗ヒス抗体および検出抗体だけと共にインキュベートした細胞を示す。
【図２（１）】図２（１）のＡ）及びＢ）は、表示の標的細胞株に対して再指向させた、指定の異種間特異的な二重特異性単鎖構築物により誘導される細胞傷害活性を示す図である。刺激ヒトＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＴ細胞をエフェクター細胞として用い、ヒトＰＳＭＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。アッセイは、実施例２．２に記載のように実施される。
【図２（２）】図２（２）のＣ）及びＤ）は、表示の標的細胞株に対して再指向させた、指定の異種間特異的な二重特異性単鎖構築物により誘導される細胞傷害活性を示す図である。刺激ヒトＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＴ細胞をエフェクター細胞として用い、ヒトＰＳＭＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。アッセイは、実施例２．２に記載のように実施される。
【図２（３）】図２（３）のＥ）は、表示の標的細胞株に対して再指向させた、指定の異種間特異的な二重特異性単鎖構築物により誘導される細胞傷害活性を示す図である。刺激ヒトＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＴ細胞をエフェクター細胞として用い、ヒトＰＳＭＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用いる。アッセイは、実施例２．２に記載のように実施される。
【発明を実施するための形態】
【０１７８】
本発明およびその多くの利点をよりよく理解させる以下の例示的で非限定的な実施例により、本発明をさらに説明する。
【０１７９】
（実施例１）
ＰＳＭＡおよびＣＤ３に対する異種間特異的な二重特異性単鎖抗体分子の作製および特徴づけ
１．１  ＣＨＯ細胞上におけるヒトＰＳＭＡ抗原のクローニングおよび発現
標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ヒトＰＳＭＡ抗原の配列（「ＡＹ１０１５９５」、ヒト前立腺特異的膜抗原のｍＲＮＡ、完全長、米国国立生物工学情報センター、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez）を用いて、合成分子を得た。また、この遺伝子合成断片を、真核細胞内において構築物を発現させるためのコザック部位と、ＤＮＡの始点および終点における制限部位とを含有するように設計した。導入された制限部位である、５’端のＸｂａＩと３’端のＳａｌＩとを、Ｍａｃｋら（Mack M et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1995;92:7021-5.およびRaum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3)）に記載されているｐＥＦＤＨＦＲと称する発現プラスミド内へのクローニングステップで用いた。配列を検証した後で、該プラスミドを用いて以下の通りにＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトした。つまり、配列を検証したプラスミドを用いて、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトした（このＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ９０９６；３７℃、湿度９５％、および７％ＣＯ２のインキュベーター内において、安定化グルタミン（ドイツ、ベルリン、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ社より購入）を用い、１０％のＦＣＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシン（これらはドイツ、ベルリン、ＢｉｏｃｈｒｏｍＡＧ社より購入）と、細胞培養グレードの試薬原液によるヌクレオシド（ドイツ、タウフキルヒェン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ社より購入）とを、１０μｇ／ｍｌアデノシン、１０μｇ／ｍｌデオキシアデノシン、および１０μｇ／ｍｌチミジンの最終濃度まで補充して、ＲＰＭＩ１６４０中で培養したものである）。トランスフェクションは、製造元のプロトコールに従い、ＰｏｌｙＦｅｃｔトランスフェクション試薬（ドイツ、ヒルデン、ＱｉａｇｅｎＧｍｂＨ社製）、および５μｇのプラスミドＤＮＡにより実施した。２４時間にわたる培養後に細胞をＰＢＳで１回洗浄し、前述の細胞培地中で再度培養したが、該培地にはヌクレオシドを補充せず、透析したＦＣＳ（ドイツ、ベルリン、ＢｉｏｃｈｒｏｍＡＧ社より購入）を用いた。したがって、細胞培地はヌクレオシドを含有せず、これにより、トランスフェクトされた細胞に対して選択を適用した。トランスフェクションの約１４日後において、耐性細胞の増殖が観察された。さらに７〜１４日後、ＦＡＣＳにより、構築物の発現が陽性であるかどうかについてトランスフェクタントを調べた。ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０) Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７−５６６により説明される通り、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内において、真核細胞内のタンパク質発現を実施する。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導する。
【０１８０】
１．２  ＣＨＯ細胞上におけるマカクザルＰＳＭＡ抗原のクローニングおよび発現
標準的なプロトコールに従い調製されたマカクザルの前立腺に由来するｃＤＮＡに対して５回のＰＣＲを１セット行うことにより、マカクザル（サイノモルガス）のＰＳＭＡのｃＤＮＡ配列を得た。以下の反応条件、すなわち、９４℃で２分間にわたる１サイクル、次いで、９４℃で１分間、５２℃で１分間、および、７２℃で１．５分間にわたる４０サイクル、次いで、７２℃で３分間にわたる最終サイクルと、以下のプライマーとを用いた：
・順方向プライマー：５’−ｃａｃｔｇｔｇｇｃｃｃａｇｇｔｔｃｇａｇｇ−３’（配列番号２１３）
逆方向プライマー：５’−ｇａｃａｔａｃｃａｃａｃａａａｔｔｃａａｔａｃｇｇ−３’（配列番号２１４）
・順方向プライマー：５’−ｇｃｔｃｔｇｃｔｃｇｃｇｃｃｇａｇａｔｇｔｇｇ−３’（配列番号２１５）
逆方向プライマー：５’−ａｃｇｃｔｇｇａｃａｃｃａｃｃｔｃｃａｇｇ−３’（配列番号２１６）
・順方向プライマー：５’−ｇｇｔｔｃｔａｃｔｇａｇｔｇｇｇｃａｇａｇｇ−３’（配列番号２１７）
逆方向プライマー：５’−ａｃｔｔｇｔｔｇｔｇｇｃｔｇｃｔｔｇｇａｇｃ−３’（配列番号２１８）
・順方向プライマー：５’−ｇｇｇｔｇａａｇｔｃｃｔａｔｃｃａｇａｔｇｇ−３’（配列番号２１９）
逆方向プライマー：５’−ｇｔｇｃｔｃｔｇｃｃｔｇａａｇｃａａｔｔｃｃ−３’（配列番号２２０）
・順方向プライマー：５’−ｃｔｃｇｇｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｇｇｇｔｇｇ−３’（配列番号２２１）
逆方向プライマー：５’−ｇｃａｔａｔｔｃａｔｔｔｇｃｔｇｇｇｔａａｃｃｔｇｇ−３’（配列番号２２２）。
【０１８１】
これらのＰＣＲにより、該ＰＣＲプライマーを用いる標準的なプロトコールに従い単離および配列決定される５つの重複する断片が生成され、これにより、その成熟タンパク質のコドン３から最終コドンまでにわたる、マカクザルＰＳＭＡをコードするｃＤＮＡ配列の部分がもたらされた。マカクザルＰＳＭＡを発現させる構築物を作製するため、標準的なプロトコールに従う遺伝子合成により、ｃＤＮＡ断片を得た（該構築物のｃＤＮＡおよびアミノ酸の配列を、配列番号２２３および２２４に列挙する）。この構築物では、その成熟ＰＳＭＡタンパク質のアミノ酸３から、終止コドンを後続させる最後のアミノ酸までにわたる、マカクザルＰＳＭＡのコード配列を、ヒトＰＳＭＡタンパク質の最初の２つのアミノ酸のコード配列へとインフレームで融合した。また、この遺伝子合成断片を、真核細胞内において該構築物を発現させるためのコザック部位と、該ｃＤＮＡを含有する断片の始点および終点における制限部位とを含有するように設計した。導入した制限部位である、５’端におけるＸｂａＩと、３’端におけるＳａｌＩとを、以下のクローニング手順で用いた。遺伝子合成断片を、ＸｂａＩおよびＳａｌＩを介して、ｐＥＦ−ＤＨＦＲと称するプラスミド内へと標準的なプロトコールに従ってクローニングした。前述の手順を、標準的なプロトコール（Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, ColdSpring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)）に従って実施した。真核細胞内において該構築物を発現させるため、ヌクレオチド配列を検証したクローンをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へとトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内における、真核細胞内のタンパク質発現を、ＫａｕｆｍａｎｎＲ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５，５３７−５６６に記載の通りに実施した。メトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を、最高２０ｎＭ ＭＴＸの最終濃度まで上昇させることにより、該構築物の遺伝子増幅を誘導した。
【０１８２】
（実施例２）
２．１  ＰＳＭＡおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性抗体の結合のフローサイトメトリーによる解析
ヒトおよびマカクザルのＰＳＭＡ、ならびに、ヒトおよびマカクザルのＣＤ３に対する結合能力に関して、異種間特異的二重特異性抗体構築物の機能性を調べるために、ＦＡＣＳ解析を実施した。この目的のために、ヒトＰＳＭＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ（ＤＳＭＺ社製、ブラウンシュヴァイク、ＡＣＣ４８３）を用いて、ヒト抗原に対する結合について調べた。マカクザル抗原に対する結合反応性は、作製したマカクザルＰＳＭＡトランスフェクタント、およびマカクザルＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘ（エアランゲン−ニュルンベルグ、衛生研究所、ウイルス学部門、Fickenscher教授による恵与；Knappe A, et al.,およびFickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61において公表されている）を用いることにより調べた。
【０１８３】
フローサイトメトリーによる解析を、以下のように実施した：
各細胞株２００，０００個ずつを、異種間特異的二重特異性抗体構築物による精製タンパク質（２μｇ／ｍｌ）、または、異種間特異的二重特異性抗体構築物を発現するトランスフェクト細胞の細胞培養物上清５０μｌと共に、氷上において３０分間にわたりインキュベートした。細胞を、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中で２回にわたり洗浄し、構築物の結合を、マウス抗Ｈｉｓ抗体（ペンタＨｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ社製；２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中で１：２０に希釈）によって検出した。洗浄後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを伴うＰＢＳ中において１：１００に希釈した、フィコエリトリンにコンジュゲートさせたＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製）によって検出した。トランスフェクトされなかったＣＨＯ細胞の上清を、Ｔ細胞株に対する結合についての陰性対照として用いた。非関与の標的特異性を有する単鎖構築物を、ＰＳＭＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対する結合についての陰性対照として用いた。
【０１８４】
フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置上で実施した；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取り込み、解析した（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ハイデルベルク）。ＦＡＣＳによる染色および蛍光強度の測定を、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Coligan, Kruisbeek, Margulies, ShevachおよびStrober,Wiley-Interscience, 2002）に記載されている通りに実施した。
【０１８５】
ＰＳＭＡに対して異種間特異的であり、且つ、ヒトＣＤ３およびマカクザルＣＤ３に対して異種間特異的である単鎖分子の二重特異性結合は、図１に示すように、明確に検出可能であった。ＦＡＣＳ解析において、すべての構築物は、それぞれの陰性対照と比較して、ＣＤ３およびＰＳＭＡに対する結合を示した。ヒトおよびマカクザルのＣＤ３抗原、ならびに、ヒトおよびマカクザルのＰＳＭＡ抗原に対する二重特異性抗体の異種間特異性が裏付けられた。
【０１８６】
２．２  ＰＳＭＡおよびＣＤ３に対する異種間特異的二重特異性単鎖抗体の生体活性
作製した二重特異性単鎖抗体の生体活性を、ヒトＰＳＭＡ陽性細胞株であるＣＨＯ細胞を用いて、インビトロでのクロム５１（５１Ｃｒ）放出細胞障害性アッセイによって解析した。エフェクター細胞としては、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣを用いた。
【０１８７】
刺激ＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣの作製は、以下の通りに実施した。
【０１８８】
ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ ＧｍｂＨ社、フリッケンハウゼン）のコーティングを、１μｇ／ｍｌの最終濃度にある市販の抗ＣＤ３特異性抗体（例えば、ＯＫＴ３、Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ社）により３７℃で１時間行った。結合しなかったタンパク質を、ＰＢＳによる１回の洗浄ステップによって除去した。新鮮なＰＢＭＣを、末梢血（３０〜５０ｍｌのヒト血液）から、標準的なプロトコールに従ったＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によって単離した。３〜５×１０７個のＰＢＭＣを、前記あらかじめコーティングしたペトリ皿へ、安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／２０Ｕ／ｍｌＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｃｈｉｒｏｎ社）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０中において添加し、２日間にわたり刺激した。３日目に細胞を回収し、ＲＰＭＩ １６４０により１回洗浄した。ＩＬ−２を、２０Ｕ／ｍｌの最終濃度まで添加し、細胞を、上記と同じ細胞培地中において再度１日間にわたり培養した。標準的なプロトコールに従いＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ５６＋ ＮＫ細胞を枯渇させることにより、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を濃縮した。
【０１８９】
標的細胞を、ＰＢＳにより２回にわたり洗浄し、３７℃で４５分間にわたり、５０％ＦＣＳを伴う、最終容量１００μｌのＲＰＭＩ中において１１．１ＭＢｑの５１Ｃｒにより標識化した。その後、標識化した標的細胞を、５ｍｌのＲＰＭＩにより３回にわたり洗浄し、次いで、細胞障害性アッセイにおいて用いた。アッセイを、９６ウェルプレート内の総容量２５０μｌの補充ＲＰＭＩ（上記の）中において、Ｅ：Ｔ比１０：１で実施した。１μｇ／ｍｌの異種間特異的な二重特異性単鎖抗体分子、および、それらの２０段階にわたる３倍希釈系列を適用した。アッセイ時間は１８時間であり、最大溶解量（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを添加した場合）と、自発溶解量（エフェクター細胞なしの場合）との差と比べた、上清中において放出されるクロムの相対値として、細胞障害性を測定した。すべての測定は４連で実施した。上清中におけるクロム活性の測定は、Ｗｉｚａｒｄ３’’ガンマカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ社、ケルン、ドイツ）により実施した。実験データの解析細胞を、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＰｒｉｓｍ５（ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０１、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）により実施した。ソフトウェアにより決定される通り、Ｓ字型の用量反応曲線は、典型的には、＞０．９０のＲ２値を有する。解析プログラムにより計算されるＥＣ５０値を、生体活性の比較に用いた。
【０１９０】
図２に示す通り、作製した異種間特異的二重特異性単鎖抗体構築物の全ては、刺激ヒトＣＤ４／ＣＤ５６枯渇ＰＢＭＣにより誘発されるヒトＰＳＭＡ陽性標的細胞に対して、細胞傷害活性を示した。
【０１９１】
（実施例３）
様々な細胞株に対するｓｃＦｖｓの結合の解析
３．１  大腸菌における単鎖抗体構築物の発現
ｓｃＦｖ分子であるＥｐＣＡＭ４−７（国際公開第９９／２５８１８号）、ＰＭ７４−Ｇ３、ＰＭ５２−Ｈ３、ＰＭ５２−Ｃ３、ＰＭ７５−Ａ１０、およびＰＭ９１−Ｂ６は、プラスミドであるｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓの使用により発現され、発現構築物（例えばｓｃＦｖ）は、Ｆｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）およびＨｉｓ６タグを含む。各ｓｃＦｖ分子のプラスミドＤＮＡを、１００μｌの熱ショックコンピテント大腸菌ＴＧ１株中へと形質転換し、カルベニシリンＬＢ寒天上へと播種した。ＶＬセグメントおよびＶＨセグメントを含むｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓによって形質転換された大腸菌は、１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導の後に十分な量の可溶性ｓｃＦｖを生成する。適切なシグナル配列により、ｓｃＦｖ鎖はペリプラズム内へと移出され、そこで、機能的な立体構造へと折り畳まれる。
【０１９２】
小スケールのペリプラズム調製物用に、形質転換プレートから単一の大腸菌ＴＧ１株による細菌コロニーを採取し、２０ｍＭのＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したＳＢ培地（例えば、１０ｍｌ）中で培養した（そして、回収後、ＰＢＳ（例えば、１ｍｌ）中に再溶解させた）。−７０℃における凍結および３７℃における融解の４ラウンドを介する温度ショックにより細菌の外膜を破壊し、ｓｃＦｖを包含する可溶性のペリプラズムタンパク質を上清中へと放出させた。遠心分離により、完全細胞および細胞破砕物を除去した後で、抗ＰＳＭＡｓｃＦｖを含有する上清を回収し、異なる細胞株との結合を判定するために用いた。
【０１９３】
３．２  様々な細胞株に対する単鎖抗体構築物の結合のフローサイトメトリーによる解析
ｓｃＦｖ分子であるＥｐＣＡＭ ４−７、ＰＭ７４−Ｇ３、ＰＭ５２−Ｈ３、ＰＭ５２−Ｃ３、ＰＭ７５−Ａ１０、およびＰＭ９１−Ｂ６を生成する大腸菌クローンのペリプラズム調整物を使用して、ヒトＰＳＭＡまたはヒトＥｐＣＡＭトランスフェクト細胞株に対する特異的結合を調べる。陰性対照として非トランスフェクトＣＨＯ細胞を使用する。
【０１９４】
フローサイトメトリーのため、２．５×１０５個の細胞を、５０μｌのｓｃＦＶペリプラズム調製物と共にインキュベートした。細胞に対するｓｃＦｖの結合を、２％ＦＣＳを伴う５０μｌのＰＢＳ中に２μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ−ＨｉｓＡｎｔｉｂｏｄｙ，ＢＳＡフリー，Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ社、ヒルデン、ドイツ連邦共和国）により検出した。第２ステップの試薬として、２％ＦＣＳ含む５０μｌのＰＢＳ中に１：１００で希釈した、Ｒ−フィコエリスリン結合アフィニティー精製Ｆ（ａｂ’）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃガンマ断片特異的）（Ｄｉａｎｏｖａ社、ハンブルク、ドイツ連邦共和国）を用いた。試料を、ＦＡＣＳｓｃａｎ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ハイデルベルク、ドイツ連邦共和国）により測定した。
【０１９５】
フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置において行う。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを取得し解析する（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ハイデルベルク）。ＦＡＣＳ染色および蛍光強度の測定を、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Coligan, Kruisbeek, Margulies, ShevachおよびStrober,Wiley-Interscience, 2002）に記載のように行う。
【０１９６】
ｓｃＦｖであるＥｐＣＡＭ４−７は、ヒトＥｐＣＡＭトランスフェクトＣＨＯ細胞株に対する強い結合を示したが、ヒトＰＳＭＡトランスフェクトまたは非トランスフェクト細胞に対する顕著な結合は示さなかった。これに対し、ｓｃＦｖであるＰＭ７４−Ｇ３、ＰＭ５２−Ｈ３、ＰＭ５２−Ｃ３、ＰＭ７５−Ａ１０、およびＰＭ９１−Ｂ６は、ヒトＰＳＭＡトランスフェクトＣＨＯ細胞に対しては強い結合を示したが、ヒトＥｐＣＡＭトランスフェクトまたは非トランスフェクトＣＨＯ細胞に対しては強い結合を示さなかった。（異なるトランスフェクト細胞株における各ｓｃＦｖのペリプラズム細胞抽出の結合結果を表１に示す）。
【０１９７】
表１：ＦＡＣＳ解析の結果：「＋」は結合シグナルを示し、「−」は結合シグナルが顕著でないことを示す。
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【図１（１）】
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【図１（２）】
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【図１（３）】
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【図１（４）】
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【図２（１）】
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【図２（２）】
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【図２（３）】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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