(57)【要約】  本開示は、リジン特異的脱メチル化酵素−１（ＬＳＤ１）ポリペプチドの酵素活性および／もしくはレベル、ならびに／またはメチル化ＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を調節することを伴う、免疫不全ウイルス転写を調節する方法を提供する。本開示はまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を調節する薬剤を特定する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した細胞中における前記ＨＩＶの転写を阻害する方法であって、前記細胞を、リジン特異的脱メチル化酵素−１（ＬＳＤ１）ポリペプチドの酵素活性を阻害する、前記細胞の前記ＬＳＤ１ポリペプチドのレベルを低減する、前記細胞のＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を低減する、またはＣｏＲＥＳＴポリペプチドのレベルもしくは活性を低減する薬剤と接触させることを含み、前記接触させることは、ＨＩＶ転写の阻害をもたらす、方法。
【請求項２】
前記薬剤は、セレギリン、セレギリン塩酸塩、ジメチルセレギリン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｅｌｅｇｉｌｅｎｅ）、ブロファロミン、フェネルジン、トラニルシプロミン、モクロベミド、ベフロキサトン、サフィナミド、イソカルボキサジド、ニアラミド、ラサギリン、イプロニアジド、イプロクロジド、トロキサトン、ビフェメラン、デスオキシペガニン（ｄｅｓｏｘｙｐｅｇａｎｉｎｅ）、ハルミン、ハルマリン、リネゾリド、およびパルギリンから選択されるモノアミンオキシダーゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤は、ポリアミン化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリアミン化合物は、式：
【化１】
2013540767.tif 000018
の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは水和物であって、式中、ｎは、１〜１２の整数であり、ｍおよびｐは独立して、１〜５の整数であり、ｑは、０または１であり、各Ｒ１は独立して、Ｃ１−Ｃ８置換または非置換アルキル、Ｃ４−Ｃ１５置換または非置換シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１５置換または非置換分岐アルキル、Ｃ６−Ｃ２０置換または非置換アリール、Ｃ６−Ｃ２０置換または非置換ヘテロアリール、Ｃ７−Ｃ２４置換または非置換アラルキル、およびＣ７−Ｃ２４置換または非置換ヘテロアラルキルからなる群から選択され、各Ｒ２は独立して、水素またはＣ１−Ｃ８置換もしくは非置換アルキルから選択される、化合物、
あるいはその薬学的に許容される塩である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤は、式：
【化２】
2013540767.tif 000019
のフェニルシクロプロピルアミン誘導体であって、式中、
Ｒ１〜Ｒ５の各々は独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−Ｌ−アリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｌ−カルボシクリル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルキニル、アミノ、アルキルアミノ、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、シアノ、シアナト、ハロアリール、ヒドロキシル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルコキシ、イソシアナト、イソチオシアネート、ニトロ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、チオカルボニル、チオシアナト、トリハロメタンスルホンアミド、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、およびＣ−アミドから選択され、
Ｒ６は、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ、アルキル、またはシクロアルキルであり、
Ｒ８は、−Ｌ−ヘテロシクリルであり、前記−Ｌ−ヘテロシクリルの環または環系は、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−Ｌ−アリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｌ−カルボシクリル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルキニル、アミノ、アルキルアミノ、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、シアノ、シアナト、ハロアリール、ヒドロキシル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルコキシ、イソシアナト、イソチオシアネート、ニトロ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、チオカルボニル、チオシアナト、トリハロメタンスルホンアミド、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、およびＣ−アミドから選択される０〜３個の置換基を有するか、あるいは、
Ｒ８は、−Ｌ−アリールであり、前記−Ｌ−アリールの環または環系は、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−Ｌ−アリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｌ−カルボシクリル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルキニル、アミノ、アルキルアミノ、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、シアノ、シアナト、ハロアリール、ヒドロキシル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルコキシ、イソシアナト、イソチオシアネート、ニトロ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、チオカルボニル、チオシアナト、トリハロメタンスルホンアミド、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、およびＣ−アミドから選択される１〜３個の置換基を有し、
各Ｌは独立して、−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｎ−、および−（ＣＨ２）ｎＳ（ＣＨ２）ｎ−から選択され、各ｎは独立して、０、１、２、および３から選定される、フェニルシクロプロピルアミン誘導体、
あるいはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤は、前記細胞のＬＳＤ１のレベルを特異的に低減する干渉核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤は、ＬＳＤ１ポリペプチドの、ＣｏＲＥＳＴポリペプチドとの相互作用を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤は、ＬＳＤ１に結合するが、ＬＳＤ１の酵素活性を増加させない、ＣｏＲＥＳＴポリペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣｏＲＥＳＴポリペプチドは、約５個のアミノ酸〜約２７５個のアミノ酸の長さを有し、前記ＣｏＲＥＳＴポリペプチドは、配列番号８に記載される前記ＣｏＲＥＳＴアミノ酸配列のアミノ酸１０５〜３８１の約５個のアミノ酸〜約２７５個のアミノ酸の連続した広がりに対して、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤は、前記細胞のＣｏＲＥＳＴポリペプチドのレベルを低減する干渉核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤は、ＢＨＣ８０ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤は、ヒストンデアセチラーゼ−１または−２阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は、Ｔリンパ球である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症を有する個体におけるＨＩＶ感染症を治療する方法であって、前記個体に、リジン特異的脱メチル化酵素−１（ＬＳＤ１）ポリペプチドの酵素活性を阻害する、細胞中の前記ＬＳＤ１ポリペプチドのレベルを低減する、または細胞中のＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を低減する、有効量の薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項１５】
前記薬剤は、ＬＳＤ１ポリペプチドの酵素活性を阻害し、前記薬剤は、ポリアミン化合物、フェニルシクロプロピルアミン誘導体、またはモノアミンオキシダーゼ阻害剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤は、セレギリン、セレギリン塩酸塩、ジメチルセレギリン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｅｌｅｇｉｌｅｎｅ）、ブロファロミン、フェネルジン、トラニルシプロミン、モクロベミド、ベフロキサトン、サフィナミド、イソカルボキサジド、ニアラミド、ラサギリン、イプロニアジド、イプロクロジド、トロキサトン、ビフェメラン、デスオキシペガニン、ハルミン、ハルマリン、リネゾリド、およびパルギリンから選択されるモノアミンオキシダーゼ阻害剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤は、ポリアミン化合物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリアミン化合物は、式：
【化３】
2013540767.tif 000020
の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは水和物であって、式中、ｎは、１〜１２の整数であり、ｍおよびｐは独立して、１〜５の整数であり、ｑは、０または１であり、各Ｒ１は独立して、Ｃ１−Ｃ８置換または非置換アルキル、Ｃ４−Ｃ１５置換または非置換シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１５置換または非置換分岐アルキル、Ｃ６−Ｃ２０置換または非置換アリール、Ｃ６−Ｃ２０置換または非置換ヘテロアリール、Ｃ７−Ｃ２４置換または非置換アラルキル、およびＣ７−Ｃ２４置換または非置換ヘテロアラルキルからなる群から選択され、各Ｒ２は独立して、水素またはＣ１−Ｃ８置換もしくは非置換アルキルから選択される、化合物、
あるいはその薬学的に許容される塩である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記薬剤は、式：
【化４】
2013540767.tif 000021
のフェニルシクロプロピルアミン誘導体であり、式中、
Ｒ１〜Ｒ５の各々は独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−Ｌ−アリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｌ−カルボシクリル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルキニル、アミノ、アルキルアミノ、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、シアノ、シアナト、ハロアリール、ヒドロキシル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルコキシ、イソシアナト、イソチオシアネート、ニトロ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、チオカルボニル、チオシアナト、トリハロメタンスルホンアミド、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、およびＣ−アミドから選択され、
Ｒ６は、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ、アルキル、またはシクロアルキルであり、
Ｒ８は、−Ｌ−ヘテロシクリルであり、前記−Ｌ−ヘテロシクリルの環または環系は、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−Ｌ−アリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｌ−カルボシクリル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルキニル、アミノ、アルキルアミノ、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、シアノ、シアナト、ハロアリール、ヒドロキシル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルコキシ、イソシアナト、イソチオシアネート、ニトロ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、チオカルボニル、チオシアナト、トリハロメタンスルホンアミド、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、およびＣ−アミドから選択される０〜３個の置換基を有するか、あるいは、
Ｒ８は、−Ｌ−アリールであり、前記−Ｌ−アリールの環または環系は、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−Ｌ−アリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｌ−カルボシクリル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルキニル、アミノ、アルキルアミノ、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、シアノ、シアナト、ハロアリール、ヒドロキシル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルコキシ、イソシアナト、イソチオシアネート、ニトロ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、チオカルボニル、チオシアナト、トリハロメタンスルホンアミド、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、およびＣ−アミドから選択される１〜３個の置換基を有し、
各Ｌは独立して、−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｎ−、および−（ＣＨ２）ｎＳ（ＣＨ２）ｎ−から選択され、各ｎは独立して、０、１、２、および３から選定される、フェニルシクロプロピルアミン誘導体、
あるいはその薬学的に許容される塩である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤は、細胞中のＬＳＤ１のレベルを特異的に低減する干渉核酸である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記薬剤は、ＬＳＤ１ポリペプチドの、ＣｏＲＥＳＴポリペプチドとの相互作用を阻害する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤は、ＬＳＤ１に結合するが、ＬＳＤ１の酵素活性を増加させない、ＣｏＲＥＳＴポリペプチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣｏＲＥＳＴポリペプチドは、約５個のアミノ酸〜約２７５個のアミノ酸の長さを有し、前記ＣｏＲＥＳＴポリペプチドは、配列番号８に記載される前記ＣｏＲＥＳＴアミノ酸配列のアミノ酸１０５〜３８１の約５個のアミノ酸〜約２７５個のアミノ酸の連続した広がりに対して、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬剤は、細胞中のＣｏＲＥＳＴポリペプチドのレベルを低減する干渉核酸である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬剤は、ＢＨＣ８０ポリペプチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤は、ヒストンデアセチラーゼ−１または−２阻害剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
ウイルス複製、ウイルスプロテアーゼ活性、ウイルス逆転写酵素活性、細胞中へのウイルス侵入、ウイルスインテグラーゼ活性、ウイルスＲｅｖ活性、ウイルスＴａｔ活性、ウイルスＮｅｆ活性、ウイルスＶｐｒ活性、ウイルスＶｐｕ活性、およびウイルスＶｉｆ活性から選択される免疫不全ウイルス機能を阻害する、有効量の薬剤を投与することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
前記投与することは、膣の投与経路による、直腸の投与経路による、口内の投与経路による、または静脈内の投与経路による、請求項１４に記載の方法。
【請求項２９】
ＨＩＶ感染細胞のゲノム中に組み込まれた潜伏ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を再活性化する方法であって、前記細胞を、前記細胞中のリジン特異的脱メチル化酵素−１（ＬＳＤ１）ポリペプチドの活性および／またはレベルを増加させる薬剤と接触させることを含む、方法。
【請求項３０】
個体におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症を治療する方法であって、前記方法は、
個体に有効量の第１の活性剤を投与することであって、前記第１の活性剤は、リジン特異的脱メチル化酵素−１（ＬＳＤ１）酵素活性および／またはレベルを増加させ、前記第１の活性剤は、前記個体における細胞のゲノム中に組み込まれた潜伏ＨＩＶを再活性化させる、投与することと、
前記個体に有効量の第２の活性剤を投与することであって、前記第２の活性剤は、ウイルス複製、ウイルスプロテアーゼ活性、ウイルス逆転写酵素活性、細胞中へのウイルス侵入、ウイルスインテグラーゼ活性、ウイルスＲｅｖ活性、ウイルスＴａｔ活性、ウイルスＮｅｆ活性、ウイルスＶｐｒ活性、ウイルスＶｐｕ活性、およびウイルスＶｉｆ活性から選択される免疫不全ウイルス機能を阻害する、投与することと、を含む、方法。
【請求項３１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）Ｔａｔポリペプチドのリジン特異的脱メチル化酵素−１（ＬＳＤ１）媒介型脱メチル化を阻害する薬剤を特定するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
ａ）ＬＳＤ１ポリペプチドおよびメチル化Ｔａｔポリペプチドを、試験薬剤と接触させることと、
ｂ）該当する場合、前記試験薬剤の、前記Ｔａｔポリペプチドの前記メチル化に対する効果を決定することと、を含み、
試験薬剤であって、前記ＬＳＤ１ポリペプチドによる前記メチル化Ｔａｔポリペプチドの脱メチル化を、前記試験薬剤の不在下での前記Ｔａｔポリペプチドのメチル化のレベルと比較して阻害する、試験薬剤は、ＨＩＶ  ＴａｔのＬＳＤ１媒介型メチル化の阻害剤と見なされる、方法。
【請求項３２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の転写を阻害する薬剤を特定するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
ａ）ＬＳＤ１ポリペプチドおよびメチル化ＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチドを、試験薬剤と接触させることと、
ｂ）該当する場合、前記試験薬剤の、前記Ｔａｔポリペプチドの前記メチル化に対する効果を決定することと、を含み、
試験薬剤であって、前記ＬＳＤ１ポリペプチドによる前記メチル化Ｔａｔポリペプチドの脱メチル化を、前記試験薬剤の不在下での前記Ｔａｔポリペプチドのメチル化のレベルと比較して阻害する、試験薬剤は、ＨＩＶ転写の阻害のための候補薬剤と見なされる、方法。
【請求項３３】
前記メチル化Ｔａｔポリペプチドは、図１２に示されるアミノ酸配列（配列番号５）にＬｙｓ−５１に対応する位置でメチル化Ｌｙｓ−５１またはメチル化リジンを含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記メチル化Ｌｙｓ−５１は、モノメチル化またはジメチル化である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記メチル化Ｔａｔポリペプチドは、アミノ酸配列ＳＹＧＲＫＫｍｅＲＲＱＲを含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法は、無細胞方法または細胞ベースの方法である、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記メチル化Ｔａｔポリペプチドは、放射標識メチル基を含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３８】
薬学的組成物であって、
ａ）リジン特異的脱メチル化酵素−１（ＬＳＤ１）酵素活性の阻害剤と、
ｂ）薬学的に許容される賦形剤と、を含み、
前記組成物は、直腸または膣送達のために製剤化される、組成物。
【請求項３９】
薬物送達デバイスであって、
ａ）リジン特異的脱メチル化酵素−１（ＬＳＤ１）酵素活性の阻害剤を含む、第１の容器と、
ｂ）ウイルス複製、ウイルスプロテアーゼ活性、ウイルス逆転写酵素活性、細胞中へのウイルス侵入、ウイルスインテグラーゼ活性、ウイルスＲｅｖ活性、ウイルスＴａｔ活性、ウイルスＮｅｆ活性、ウイルスＶｐｒ活性、ウイルスＶｐｕ活性、およびウイルスＶｉｆ活性から選択される免疫不全ウイルス機能を阻害する薬剤を含む、第２の容器と、を含む、薬物送達デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１０年１０月７日に出願された米国仮特許出願第６１／３９０，９６８号、および２０１１年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／４３１，２４１号の利益を主張し、それらの出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
リジン特異的脱メチル化酵素−１（ＬＳＤ１）は、ヒストン脱メチル化活性を表すことが示されてきており、発癌および炎症等のプロセスに関与してきた。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症は、世界中の公衆衛生に対する差し迫った脅威である。ＵＮＡＩＤＳの推定によれば、２００７年末時点で、世界中で３３２０万の人々がＨＩＶ−１に感染し、同年だけで、それらのうちの２５０万人が新たに感染し、更なる２１０万人がＨＩＶ関連死により死亡した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許公開第２００８／００７０２５７号
【特許文献２】米国特許公開第２００９／０１７０７９６号
【特許文献３】米国特許第７，７４１，０８６号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：８０２３
【非特許文献２】Ｋａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：１３４１
【非特許文献３】Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１０３：６１５
【非特許文献４】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  ８８２
【非特許文献５】Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９：８５７
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、リジン特異的脱メチル化酵素−１（ＬＳＤ１）ポリペプチドの酵素活性および／もしくはレベル、ならびに／またはメチル化ＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を調節することを伴う、免疫不全ウイルス転写を調節する方法を提供する。本開示はまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を調節する薬剤を特定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ−Ｄ】合成Ｔａｔペプチドを使用したインビトロアセチル化およびメチル化アッセイを示す。
【図２Ａ−Ｃ】細胞ＴａｔのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析を示す。図２Ａは、Ｔａｔ−ＦＬＡＧペプチド（配列番号７２）の配列を示し、図２Ｂは、ＧＲＫＫＲＲＱＲ（配列番号７０）を示し、図２Ｃは、ＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号７１）を示す。
【図３Ａ−Ｃ】抗Ｔａｔ抗体を使用したＫ５０Ａｃ／Ｋ５１Ｍｅ  Ｔａｔの分析を示す。
【図４Ａ−Ｄ】ＬＳＤ１によるモノメチル化Ｋ５１  Ｔａｔの脱メチル化を示す。
【図５Ａ−Ｃ】ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）へのＬＳＤ１およびＣｏＲＥＳＴのインビボ動員を示す。
【図６Ａ−Ｆ】ＬＳＤ１／ＣｏＲＥＳＴ複合体によるＴａｔ依存性ＨＩＶ転写の活性を示す。
【図７Ａ−Ｂ】培養細胞中（図７Ａ）および初代ＣＤ４＋Ｔ細胞中の、フェネルジンによるＨＩＶ転写の阻害を示す。
【図８】ヒトＬＳＤ１アイソフォームａのアミノ酸配列を提供する。
【図９Ａ−Ｂ】ヒトＬＳＤ１アイソフォームａをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【図１０】ヒトＬＳＤ１アイソフォームｂのアミノ酸配列を提供する。
【図１１Ａ−Ｂ】ヒトＬＳＤ１アイソフォームｂをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【図１２】コンセンサスＴａｔアミノ酸配列を提供する。
【図１３Ａ−Ｂ】Ｔａｔアミノ酸配列を提供する。
【図１４】Ｔａｔポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【図１５】ＣｏＲＥＳＴポリペプチド（配列番号８）のアミノ酸配列を提供する。
【図１６】ＣｏＲＥＳＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【図１７】ＢＨＣ８０ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。
【図１８Ａ−Ｂ】ＢＨＣ８０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
「免疫不全ウイルス」という用語は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス、およびサル免疫不全ウイルスを含む。本明細書で使用される「ヒト免疫不全ウイルス」という用語は、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス−２（ＨＩＶ−２）、ならびに多様なＨＩＶサブタイプおよび疑似種のうちのいずれをも指す。
【０００８】
本明細書で使用されるとき、「治療」、「治療すること」等という用語は、所望の薬理的および／または生理的効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防する点で予防的であってもよく、かつ／または疾患および／もしくは疾患に起因し得る有害作用に対する部分的もしくは完全な治癒の点で治療的であってもよい。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物における、特にヒトにおける、疾患のいずれの治療をも包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、それを有すると未だに診断されていない対象において疾患が生じるのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発達を止めること、および（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことを含む。
【０００９】
「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、ネズミ科動物（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ科動物、ネコ科動物、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）等を含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。
【００１０】
「治療上有効量」または「効果的量」は、疾患を治療するために哺乳動物または他の対象に投与されるとき、その疾患に対するかかる治療を達成するのに十分である、化合物の量を指す。「治療上有効量」は、化合物または細胞、疾患およびその重症度、ならびに治療されるべき対象の年齢、体重等に応じて変動するであろう。
【００１１】
「共投与」および「と組み合わせて」という用語は、同時に、並行に、または具体的な時限のない範囲での順次のいずれかでの、２つ以上の治療剤の投与を含む。一実施形態では、薬剤は、細胞中もしくは対象の体内に同時に存在するか、またはそれらの生物学的もしくは治療的効果を同時に発揮する。一実施形態では、治療剤は、同じ組成物または単位剤形中にある。他の実施形態では、治療剤は、別個の組成物または単位剤形中にある。ある種の実施形態では、第１の薬剤は、第２の治療剤の投与の前に（例えば、分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）、それと併用で、またはその後に（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）、投与することができる。
【００１２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」、という用語は、本明細書で交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸の重合型を指し、それは、コードアミノ酸および非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されたまたは誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含む可能性がある。この用語は、Ｎ末端メチオニン残基を有するまたは有さない、非相同アミノ酸配列との融合タンパク質、非相同および相同リーダー配列との融合；免疫学的にタグされた（免疫学的にタグ）タンパク質等を含むが、これらに限定されない融合タンパク質を含む。標準的ポリペプチド命名法に合わせて、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３（１９６９），３５５２−５９が使用される。
【００１３】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチドの重合型を指すように本明細書で交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体を含有してもよい。
【００１４】
「薬学的に許容される賦形剤」、「薬学的に許容される希釈剤」、「薬学的に許容される担体」、および「薬学的に許容されるアジュバント」は、一般に安全で、非毒性であり、生物学的にも他の方法でも望ましくないことがない薬学的組成物を調製する際に有用である、賦形剤、希釈剤、担体、およびアジュバントを意味し、獣医学的使用ならびにヒト薬学的使用に許容される賦形剤、希釈剤、担体、およびアジュバントを含む。本明細書および特許請求の範囲で使用される「薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、およびアジュバント」は、１つおよび複数のかかる賦形剤、希釈剤、担体、およびアジュバントを含む。
【００１５】
本明細書で使用されるとき、「薬学的組成物」は、哺乳動物、とりわけヒト等の対象への投与に好適な組成物を包含することが意図される。一般に、「薬学的組成物」は、滅菌されており、対象内で望ましくない反応を引き出す可能性のある汚染物質がない（例えば、薬学的組成物中の化合物（複数可）は、薬学的グレードである）。薬学的組成物は、それを必要とする対象または患者への、経口、頬側、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内等を含む幾つかの異なる投与経路を介した投与のために、設計することができる。幾つかの実施形態では、組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）以外の浸透増強剤を使用した、経皮経路による投与に好適である。他の実施形態では、薬学的組成物は、経皮投与以外の経路による投与に好適である。薬学的組成物は、幾つかの実施形態では、対象化合物および薬学的に許容される賦形剤を含むであろう。幾つかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、ＤＭＳＯ以外である。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、本発明の化合物の「薬学的に許容される誘導体」は、その塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、酸、塩基、溶媒和物、水和物、またはプロドラッグを含む。かかる誘導体は、当業者によって、かかる誘導体化のための既知の方法を使用して、容易に調製され得る。生成される化合物は、動物またはヒトに、実質的な毒性作用なしに投与され得る、薬学的に活性であるか、またはプロドラッグであるかのいずれかである。
【００１７】
化合物の「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され、かつ親化合物の所望の薬理的活性を有する、塩を意味する。かかる塩には、次のものが含まれる：（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸により形成される酸付加塩；または酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス−（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸等の有機酸により形成される酸付加塩；あるいは（２）親化合物中に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、もしくはアルミニウムイオンによって置き換えられるときに形成される塩；またはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミン等の有機塩基で配位するときに形成される塩。
【００１８】
本発明の化合物の「薬学的に許容されるエステル」は、薬学的に許容され、かつ親化合物の所望の薬理的活性を有する、エステルを意味し、カルボン酸、リン酸、ホスフィン酸、スルホン酸、スルフィン酸、およびボロン酸を含むが、これらに限定されない酸性基のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、およびヘテロシクリルエステルを含むが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明の化合物の「薬学的に許容されるエノールエーテル」は、薬学的に許容され、かつ親化合物の所望の薬理的活性を有する、エノールエーテルを意味し、式Ｃ＝Ｃ（ＯＲ）の誘導体を含むが、これらに限定されず、式中、Ｒは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクリルである。
【００２０】
本発明の化合物の「薬学的に許容される溶媒和物または水和物」は、薬学的に許容され、かつ親化合物の所望の薬理的活性を有する、溶媒和物または水和物複合体を意味し、１個以上の溶媒または水分子、あるいは１個〜約１００個、または１個〜約１０個、または１個〜約２個、３個もしくは４個の溶媒または水分子を有する、本発明の化合物の複合体を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
「プロドラッグ」は、かかるプロドラッグが哺乳類対象に投与されるときに、インビボで、下に示される一般式のうちの１つ以上に従った活性親薬物を放出する任意の化合物を意味する。下で示される一般式のうちの１つ以上の化合物のプロドラッグは、一般式の化合物中に存在する官能基を、修飾物がインビボで開裂されて親化合物を放出するような方法で修飾することによって調製される。プロドラッグは、下に示される一般式のうちの１つ以上の化合物を含み、ここで下に示される一般式のうちの１つ以上におけるヒドロキシ、アミノ、またはスルフヒドリル基は、インビボで開裂されて、それぞれ、遊離ヒドロキシル、アミノ、またはスルフヒドリル基を再生し得る、任意の基に結合される。プロドラッグの例としては、下に示される一般式のうちの１つ以上の化合物中のヒドロキシ官能基の、エステル（例えば、酢酸塩、ギ酸塩、および安息香酸塩誘導体）、カルバメート（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書で使用される「有機基」および「有機ラジカル」という用語は、脂肪族基、環式基、芳香族基、それらの官能化誘導体および／またはそれらの種々の組み合わせとして分類される炭化水素基を含む、任意の炭素含有基を意味する。「脂肪族基」という用語は、飽和または不飽和の、直鎖または分岐鎖炭化水素基を意味し、例えば、アルキル、アルケニル、およびアルキニル基を包含する。「アルキル基」という用語は、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘプチル、イソ−プロピル、ｎ−オクチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、２−エチルヘキシル等を含む、置換または非置換の、飽和直鎖または分岐鎖炭化水素基または鎖（例えば、Ｃ１〜Ｃ８）を意味する。好適な置換基には、カルボキシ、保護カルボキシ、アミノ、保護アミノ、ハロ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、一置換アミノ、保護一置換アミノ、二置換アミノ、Ｃ１〜Ｃ７アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ７アシル、Ｃ１〜Ｃ７アシルオキシ等が含まれる。「置換アルキル」という用語は、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、アミノ、保護アミノ、シアノ、ハロ、トリフロロメチル（ｔｒｉｆｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）、一置換アミノ、二置換アミノ、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、カルボキシ、保護カルボキシ、またはカルボキシ、アミノ、および／もしくはヒドロキシ塩によって１〜３回置換された、上に定義されるアルキル基を意味する。ヘテロアリール環に対する置換基と組み合わせて使用されるとき、「置換（シクロアルキル）アルキル」および「置換シクロアルキル」という用語は、下に定義されるように、「置換アルキル」基について列挙されるものと同じ基で置換される。「アルケニル基」という用語は、ビニル基等の、１つ以上の炭素−炭素二重結合を有する、不飽和の、直鎖または分岐鎖炭化水素基を意味する。「アルキニル基」という用語は、１つ以上の炭素−炭素三重結合を有する、不飽和の、直鎖または分岐鎖炭化水素基を意味する。「環式基」という用語は、脂環式基、芳香族基、または複素環式基として分類される閉環炭化水素基を意味する。「脂環式基」という用語は、脂肪族基の特性に類似した特性を有する環式炭化水素基を意味する。「芳香族基」または「アリール基」という用語は、単環式または多環式芳香族炭化水素基を意味し、１個以上のヘテロ原子を含んでもよく、それらは下で更に定義される。「複素環式基」という用語は、環中の原子のうちの１個以上が炭素以外の元素（例えば、窒素、酸素、硫黄等）である閉環炭化水素を意味し、それらは下で更に定義される。
【００２３】
「有機基」は、官能化されてもよく、あるいは、保護されても保護されなくてもよい、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル等の有機基に関連する更なる官能性を含んでもよい。例えば、「アルキル基」という語句は、メチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチル等の純粋な開鎖飽和炭化水素アルキル置換基だけでなく、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルスルホニル、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシル等の、当該技術分野で既知の更なる置換基を担持するアルキル置換基も含むことが意図される。故に、「アルキル基」は、エーテル、エステル、ハロアルキル、ニトロアルキル、カルボキシアルキル、ヒドロキシアルキル、スルホアルキル等を含む。
【００２４】
本明細書における開示に加えて、本明細書で使用される有機基のうちのいずれも、置換されても置換されなくてもよい。「置換」という用語は、特定される基またはラジカルを修飾するために使用されるとき、特定される基またはラジカルの１個以上の水素原子が各々、互いに独立して、本明細書に定義される同じまたは異なる置換基と置き換えられることを意味する可能性もある。
【００２５】
「ハロ」および「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード基を指す。同じまたは異なる１つ以上のハロゲンが存在する可能性がある。特に目的とするハロゲンには、クロロおよびブロモ基が含まれる。
【００２６】
「ハロアルキル」という用語は、１個以上のハロゲン原子によって置換される、上に定義されるアルキル基を指す。ハロゲン原子は、同じであっても、異なってもよい。「ジハロアルキル」という用語は、同じであっても、異なってもよい２個のハロ基によって置換される、上に定義されるアルキル基を指す。「トリハロアルキル」という用語は、同じであっても、異なってもよい３個のハロ基によって置換される、上述のアルキル基を指す。「ペルハロアルキル（ｐｅｒｈａｌｏａｌｋｙｌ）」という用語は、アルキル基における各水素原子がハロゲン原子によって置き換えられている、上に定義されるハロアルキル基を指す。「ペルフルオロアルキル（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏａｌｋｙｌ）」という用語は、アルキル基における各水素原子がフルオロ基によって置き換えられている、上に定義されるハロアルキル基を指す。
【００２７】
「シクロアルキル」という用語は、完全に飽和または部分的に不飽和である、単環式、二環式、または三環式飽和環を意味する。かかる基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、アダマンチル、シクロオクチル、シスデカリンまたはトランスデカリン、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、シクロヘキサ−１−エニル、シクロペンタ−１−エニル、１，４−シクロオクタジエニル等が挙げられた。
【００２８】
「（シクロアルキル）アルキル」という用語は、上記のシクロアルキル環のうちの１つに代わって置換された、上に定義されるアルキル基を意味する。かかる基の例としては、（シクロヘキシル）メチル、３−（シクロプロピル）−ｎ−プロピル、５−（シクロペンチル）ヘキシル、６−（アダマンチル）ヘキシル等が挙げられる。
【００２９】
「置換フェニル」という用語は、例えば、ビフェニルまたはナフチル基がもたらされるように、置換または非置換のハロゲン、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ７アシル、Ｃ１〜Ｃ７アシルオキシ、カルボキシ、オキシカルボキシ、保護カルボキシ、カルボキシメチル、保護カルボキシメチル、ヒドロキシメチル、保護ヒドロキシメチル、アミノ、保護アミノ、（一置換）アミノ、保護（一置換）アミノ、（二置換）アミノ、カルボキサミド、保護カルボキサミド、Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）カルボキサミド、保護Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）カルボキサミド、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）カルボキサミド、トリフルオロメチル、Ｎ−（（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルホニル）アミノ、Ｎ−（フェニルスルホニル）アミノ、またはフェニルからなる群から選定される１つ以上の部分、場合によっては、１、２、または３つの部分で置換される、フェニル基を特定する。
【００３０】
「置換フェニル」という用語の例としては、２，３，もしくは４−クロロフェニル、２，６−ジクロロフェニル、２，５−ジクロロフェニル、３，４−ジクロロフェニル、２，３，もしくは４−ブロモフェニル、３，４−ジブロモフェニル、３−クロロ−４−フルオロフェニル、２，３，もしくは４−フルオロフェニル等のモノもしくはジ（ハロ）フェニル基；２，３，もしくは４−ヒドロキシフェニル、２，４−ジヒドロキシフェニル、それらの保護ヒドロキシ誘導体等のモノもしくはジ（ヒドロキシ）フェニル基；２，３，もしくは４−ニトロフェニル等のニトロフェニル基；シアノフェニル基、例えば、２，３，もしくは４−シアノフェニル；２，３，もしくは４−メチルフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２，３，もしくは４−（イソ−プロピル）フェニル、２，３，もしくは４−エチルフェニル、２，３，もしくは４−（ｎ−プロピル）フェニル等のモノもしくはジ（アルキル）フェニル基；モノもしくはジ（アルコキシ）フェニル基、例えば、２，６−ジメトキシフェニル、２，３，もしくは４−（イソプロポキシ）フェニル、２，３，もしくは４−（ｔ−ブトキシ）フェニル、３−エトキシ−４−メトキシフェニル等；２，３，もしくは４−トリフルオロメチルフェニル；２，３，もしくは４−カルボキシフェニルまたは２，４−ジ（保護カルボキシ）フェニル等のモノもしくはジカルボキシフェニルまたは（保護カルボキシ）フェニル基；２，３，もしくは４−（保護ヒドロキシメチル）フェニルまたは３，４−ジ（ヒドロキシメチル）フェニル等のモノもしくはジ（ヒドロキシメチル）フェニルまたは（保護ヒドロキシメチル）フェニル；２，３，もしくは４−（アミノメチル）フェニルまたは２，４−（保護アミノメチル）フェニル等のモノもしくはジ（アミノメチル）フェニルまたは（保護アミノメチル）フェニル；あるいは２，３，もしくは４−（Ｎ−（メチルスルホニルアミノ））フェニル等のモノもしくはジ（Ｎ−（メチルスルホニルアミノ））フェニルが挙げられる。また、「置換フェニル」という用語は、置換基が異なる二置換フェニル基、例えば、３−メチル−４−ヒドロキシフェニル、３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル、２−メトキシ−４−ブロモフェニル、４−エチル−２−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシ−４−ニトロフェニル、２−ヒドロキシ−４−クロロフェニル等も表す。
【００３１】
「（置換フェニル）アルキル」という用語は、上述のアルキル基のうちの１個に結合された上記の置換フェニル基のうちの１個を意味する。かかる基の例としては、２−フェニル−１−クロロエチル、２−（４’−メトキシフェニル）エチル、４−（２’，６’−ジヒドロキシフェニル）ｎ−ヘキシル、２−（５’−シアノ−３’−メトキシフェニル）ｎ−ペンチル、３−（２’，６’−ジメチルフェニル）ｎ−プロピル、４−クロロ−３−アミノベンジル、６−（４’−メトキシフェニル）−３−カルボキシ（ｎ−ヘキシル）、５−（４’−アミノメチルフェニル）−３−（アミノメチル）ｎ−ペンチル、５−フェニル−３−オキソ−ｎ−ペンタ−１−イル、（４−ヒドロキシナフタ−２−イル）メチル等が挙げられる。
【００３２】
上述のように、「芳香族」または「アリール」という用語は、６員の炭素環式環を指す。また、上述のように、「ヘテロアリール」という用語は、単独で、または硫黄もしくは酸素環原子と併せてのいずれかで、酸素、硫黄、および／または窒素原子等の１個〜４個のヘテロ原子、特に窒素を有する、任意に置換された５員または６員環を表す。
【００３３】
更に、上記の任意に置換された５員または６員環は、任意に、芳香族５員または６員環系に縮合することができる。例えば、環は、ピリジンまたはトリアゾール系等の芳香族５員または６員環系に、好ましくはベンゼン環に、縮合することができる。
【００３４】
次の環系は、「ヘテロアリール」という用語によって表される複素環式（置換または非置換であれ）ラジカルの例である：チエニル、フリル、ピロリル、ピロリジニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、テトラゾリル、チアトリアゾリル、オキサトリアゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、オキサジニル、トリアジニル、チアジアジニルテトラゾロ、１，５−［ｂ］ピリダジニル、およびプリニル、ならびにベンゾ縮合誘導体、例えば、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル（ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｙｌ）、ベンゾイミダゾリル（ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ）、およびインドリル。
【００３５】
上記の任意に置換されたヘテロアリール環に対する置換基は、１〜３個のハロ、トリハロメチル、アミノ、保護アミノ、アミノ塩、一置換アミノ、二置換アミノ、カルボキシ、保護カルボキシ、カルボン酸塩、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ヒドロキシ基の塩、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換（シクロアルキル）アルキル、フェニル、置換フェニル、フェニルアルキル、および（置換フェニル）アルキルである。ヘテロアリール基に対する置換基は、これより前に定義される通りであるか、またはトリハロメチルの場合には、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、トリブロモメチル、もしくはトリヨードメチルである可能性がある。ヘテロアリール環に対する上記の置換基と組み合わせて使用されるとき、「低級アルコキシ」は、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ基を意味し、同様に、「低級アルキルチオ」は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルチオ基を意味する。
【００３６】
「（一置換）アミノ」という用語は、フェニル、置換フェニル、アルキル、置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アシル、Ｃ２〜Ｃ７アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７アルキニル、Ｃ７〜Ｃ１６アルキルアリール、Ｃ７〜Ｃ１６置換アルキルアリール、およびヘテロアリール基からなる群から選定される１個の置換基を有するアミノ基を指す。（一置換）アミノは、追加的に、「保護（一置換）アミノ」という用語によって包含されるアミノ保護基を有する可能性がある。「（二置換）アミノ」という用語は、フェニル、置換フェニル、アルキル、置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アシル、Ｃ２〜Ｃ７アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７アルキニル、Ｃ７〜Ｃ１６アルキルアリール、Ｃ７〜Ｃ１６置換アルキルアリール、およびヘテロアリールからなる群から選定される２個の置換基を有するアミノ基を指す。２個の置換基は、同じであるか、または異なる可能性がある。
【００３７】
「ヘテロアリール（アルキル）」という用語は、任意の位置で、上に定義されるヘテロアリール基によって置換される、上に定義されるアルキル基を表す。
【００３８】
「任意の」または「任意に」は、その後に説明される事象、状況、特色、または要素が生じてもよいが、その必要はなく、かつその説明が、その事象または状況が生じる事例およびそれが生じない事例を含むことを意味する。例えば、「アルキル基で任意に一置換または二置換されるヘテロシクロ基」は、アルキルが存在してもよいが、その必要はなく、その説明が、ヘテロシクロ基がアルキル基で一置換または二置換される状況、およびヘテロシクロ基がアルキル基で置換されない状況を含むことを意味する。
【００３９】
同じ分子式を有するが、それらの原子の結合の性質もしくは配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または空間内でのそれらの原子の配列（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において異なる化合物は、「異性体」と称される。空間内でのそれらの原子の配列において異なる異性体は、「立体異性体」と称される。互いの鏡像でない立体異性体は、「ジアステレオマー」と称され、重ね合わせ不可能な鏡像である立体異性体は、「鏡像異性体」と称される。化合物が不斉中心を有する、例えば、それが４個の異なる基に結合されるとき、鏡像異性体の対が可能である。鏡像異性体は、その不斉中心の絶対配置によって特徴付けることができ、カーンおよびプレローグのＲ−およびＳ−配列決定規則によって、または分子が偏光の平面を回転する様態によって説明され、右旋性または左旋性として（すなわち、それぞれ（＋）または（−）異性体として）表記される。キラル化合物は、個々の鏡像異性体として、またはその混合物としてのいずれかで、存在する可能性がある。均等な割合の鏡像異性体を含有する混合物は、「ラセミ混合物」と呼ばれる。
【００４０】
化合物は、１つ以上の不斉中心を有してもよく、かかる化合物はしたがって、個々の（Ｒ）もしくは（Ｓ）立体異性体として、またはそれらの混合物として、生成することができる。別途指示しない限り、本明細書および特許請求の範囲における特定の化合物の説明または命名は、個々の鏡像異性体およびその混合物、ラセミ、またはその他の両方を含むことが意図される。立体化学の決定および立体異性体の分離のための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、”Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２の第４章における考察を参照されたい）。
【００４１】
本明細書で使用される「と組み合わせて」または「共投与される」または「共投与」は、例えば、第１の化合物が、第２の化合物の投与の全過程中に投与される場合；第１の化合物が、第２の化合物の投与と重複している一定期間にわたって投与される場合、例えば、第１の化合物の投与が、第２の化合物の投与前に始まり、第１の化合物の投与が、第２の化合物の投与が終わる前に終わる場合；第２の化合物の投与が、第１の化合物の投与前に始まり、第２の化合物の投与が、第１の化合物の投与が終わる前に終わる場合；第１の化合物の投与が、第２の化合物の投与が始まる前に始まり、第２の化合物の投与が、第１の化合物の投与が終わる前に終わる場合；第２の化合物の投与が、第１の化合物の投与が始まる前に始まり、第１の化合物の投与が、第２の化合物の投与が終わる前に終わる場合の使用を指す。したがって、「組み合わせて」はまた、２つ以上の化合物の投与を伴うレジメンも指す可能性がある。本明細書で使用される「と組み合わせて」はまた、同じまたは異なる製剤中で、同じまたは異なる経路によって、かつ同じまたは異なる剤形型において投与され得る、２つ以上の化合物の投与も指す。
【００４２】
本発明が更に説明される前に、本発明が、説明される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら、異なり得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される専門用語が、特定の実施形態を説明する目的のためにすぎず、限定するものとしては意図されないこともまた理解されたい。
【００４３】
値の範囲が提供される場合、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り下限の単位の小数第１位までの、その範囲の上限と下限の間の、かつその指定範囲における任意の他の指定されたまたは介在する値である各介在値（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｖａｌｕｅ）が、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、指定範囲における任意の具体的な除外限度を条件として、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、それもまた本発明内に包含される。指定範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限度の一方または両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
【００４４】
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての学術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および物質と同様または同等のいずれの方法および物質もまた、本発明の実践または試験で使用することができるが、好ましい方法および物質が今は記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用される関連となる方法および／または物質を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。故に、例えば、「免疫不全ウイルス（ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）」への言及は、複数のかかる免疫不全ウイルスを含み、「活性剤（ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）」への言及は、１つ以上の活性剤および当業者に既知のその均等物への言及を含み、その他も同様である。特許請求の範囲は、いずれの任意要素を除外するように起草され得ることに更に留意する。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連する「のみ（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」等の排他的専門用語の使用、または「否定的」限定の使用のための、先立つ記載としての機能を果たすことが意図される。
【００４６】
明確さのために別個の実施形態の文脈において記載される、本発明のある種の特色はまた、単一の実施形態と組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔さのために単一の実施形態の文脈において記載される、本発明の種々の特色もまた、別個にまたは任意の好適な部分的組み合わせで提供され得る。本発明に関する実施形態の全ての組み合わせは、あたかもありとあらゆる組み合わせが個々にかつ明示的に開示されたかのごとく、かかる組み合わせが、例えば、安定な化合物である化合物（すなわち、作製、単離、特徴付けし、生物学的活性について試験することができる化合物）である対象物を包含する程度まで、本発明によって具体的に包含され、本明細書に開示される。更に、種々の実施形態およびその要素（例えば、かかる変数を説明する実施形態に列挙される化学基の要素）の全ての部分的組み合わせもまた、あたかもありとあらゆるかかる部分的組み合わせが本明細書に個々にかつ明示的に開示されたかのごとく、本発明によって具体的に包含され、本明細書に開示される。
【００４７】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前にそれらを開示するためのみに提供される。本明細書のいかなる部分も、本発明が、先願発明に基づいて、かかる刊行物に先行する権利を有さないという承認として解釈されるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、実際の刊行物の日付と異なる場合があり、それらは独立して確認される必要があり得る。
【００４８】
詳細な説明
本開示は、リジン特異的脱メチル化酵素−１（ＬＳＤ１）ポリペプチドの酵素活性および／もしくはレベルを調節すること、ならびに／またはＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を調節することを伴う、免疫不全ウイルス転写を調節する方法を提供する。本開示はまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を調節する薬剤を特定する方法を提供する。
【００４９】
ＬＳＤ１がＨＩＶ転写および潜伏の活性化因子であり、ＬＳＤ１阻害剤がＨＩＶ転写を抑制することが観察されている。本開示は、免疫不全ウイルスに感染した細胞中の転写を阻害する方法を提供し、その方法は一般に、細胞を、細胞中のＬＳＤ１の酵素活性を阻害するおよび／もしくはＬＳＤ１のレベルを低減する、ならびに／または細胞中のＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤と接触させることを伴う。本方法は、個体における免疫不全ウイルス感染症を治療するのに有用である。故に、本開示は、個体における免疫不全ウイルス感染症を治療する方法を更に提供し、その方法は一般に、個体に、個体における免疫不全ウイルスに感染した細胞中のＬＳＤ１の酵素活性を阻害するおよび／もしくはＬＳＤ１のレベルを低減する、ならびに／または個体における免疫不全ウイルスに感染した細胞中のＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する、有効量の薬剤を投与することを伴う。
【００５０】
本開示は、ＨＩＶ感染細胞のゲノム中に組み込まれた潜伏ＨＩＶを再活性化する方法を提供する。本方法は一般に、ＨＩＶが潜伏しているＨＩＶ感染細胞を、細胞中のＬＳＤ１酵素活性を増加させる薬剤と接触させることを伴う。潜在的に感染した細胞は、転写レベルで遮断され、ウイルスタンパク質発現の不在をもたらす、自己増殖能を有する（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）組込み型ＨＩＶ−１ゲノムを含有する。本開示は、個体における潜伏免疫不全ウイルスの貯蔵を低減するための方法を提供する。
【００５１】
免疫不全ウイルス転写を調節する方法
本開示は、免疫不全ウイルスに感染した細胞中の転写を調節する方法を提供し、その方法は一般に、細胞を、細胞中のＬＳＤ１の酵素活性を調節するおよび／もしくはＬＳＤ１のレベルを低減する、ならびに／または細胞中のＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤と接触させることを伴う。
【００５２】
ＬＳＤ１酵素活性を低減する薬剤には、次のものが含まれる：１）ＬＳＤ１酵素活性を阻害する小分子薬剤、および２）ＢＨＣ８０ポリペプチド。細胞中のＬＳＤ１のレベルを低減する薬剤には、次のものが含まれる：１）ＬＳＤ１発現を特異的に低減する阻害性核酸薬剤、２）ドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴポリペプチド、および３）ＣｏＲＥＳＴ発現を低減する阻害性核酸薬剤。メチル化ＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤には、ＨＤＡＣ阻害剤が含まれる。場合によっては、好適な薬剤は、ＬＳＤ１に対するいずれの直接効果からも独立して、ＣｏＲＥＳＴを標的とする薬剤である。
【００５３】
免疫不全ウイルス転写を阻害する方法が提供され、ここで免疫不全ウイルス転写を阻害する対象方法は、免疫不全ウイルスに感染した細胞を、細胞中のＬＳＤ１の酵素活性を阻害する、および／または細胞中のＬＳＤ１のレベルを低減する、および／または細胞中のＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤と接触させることを伴う。かかる方法は、個体における免疫不全ウイルス感染症を治療するのに有用である。
【００５４】
免疫不全ウイルスに感染した細胞のゲノム中に存在する潜伏免疫不全ウイルスを活性化する方法もまた提供され、ここで潜伏免疫不全ウイルスを活性化する対象方法は、細胞のゲノム中に潜伏した免疫不全ウイルスを有する細胞を、薬剤細胞中のＬＳＤ１の活性を増加させる、および／または細胞中のＬＳＤ１のレベルを増加させる薬剤と接触させることを伴う。
【００５５】
免疫不全ウイルス転写を阻害する方法
本開示は、免疫不全ウイルスに感染した細胞中の転写を阻害する方法を提供し、その方法は一般に、細胞を、細胞中のＬＳＤ１の酵素活性を阻害するおよび／もしくはＬＳＤ１のレベルを低減する、ならびに／または細胞中のＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する、ならびに／またはＬＳＤ１に対するいずれの直接効果からも独立してＣｏＲＥＳＴ構成成分の活性を阻害する薬剤と接触させることを伴う。
【００５６】
ＬＳＤ１ポリペプチドの酵素活性を減少させる好適な薬剤は、ＬＳＤ１ポリペプチドの酵素活性を、薬剤の不在下でのＬＳＤ１ポリペプチドの酵素活性のレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％を超えて減少させる。
【００５７】
ＬＳＤ１ポリペプチドの酵素活性には、ＴａｔポリペプチドのＬｙｓ−５１の脱メチル化、例えば、図１２に示され、配列番号５に記載されるコンセンサスＴａｔアミノ酸配列のＬｙｓ−５１に対応するＴａｔポリペプチドリジン残基の脱メチル化が含まれる。コンセンサスＴａｔ配列のＬｙｓ−５１に対応する位置におけるＴａｔリジン残基は、モノメチル化またはジメチル化することができる。脱メチル化には、モノメチル化Ｔａｔのメチル基の除去、およびジメチル化Ｔａｔの一方または双方のメチル基の除去が含まれる。
【００５８】
細胞中のＬＳＤ１のレベルを低減する好適な薬剤は、細胞中のＬＳＤ１のレベルを、薬剤の不在下での細胞中のＬＳＤ１のレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％を超えて低減する。
【００５９】
細胞中のメチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を低減する好適な薬剤は、メチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を、薬剤の不在下での細胞中のメチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％を超えて低減する。例えば、細胞中のメチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を低減する好適な薬剤は、図１２に示され、配列番号５に記載されるコンセンサスＴａｔアミノ酸配列のＬｙｓ−５１に対応する、Ｔａｔポリペプチドリジン残基の脱メチル化を低減する。細胞中のメチル化Ｔａｔポリペプチドのレベルを決定するための方法は、当該技術分野で既知であり、実施例節内を含めて、下に詳述される。例えば、細胞中のメチル化Ｔａｔポリペプチドの量は、メチル化Ｔａｔに特異的な抗体を使用して決定することができる。メチル化Ｔａｔポリペプチドを生成する細胞は、薬剤と接触させることができ、ＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化のレベルに対する薬剤の効果は、メチル化Ｔａｔに特異的な抗体を使用して決定することができる。メチル化高アルギニンモチーフ（ＡＲＭ）Ｔａｔペプチドを使用することができ、ここで好適なメチル化ＡＲＭペプチドは、配列ＲＫＫＭｅＲＲＱＲＲＲ（配列番号３５）を有し、ここでＫＭｅは、モノメチル化リジンである。
【００６０】
細胞中のＬＳＤ１ポリペプチドの酵素活性を減少させるおよび／または細胞中のＬＳＤ１のレベルを低減する薬剤は、細胞中の免疫不全ウイルスの転写を、薬剤の不在下での細胞中の免疫不全ウイルスの転写のレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％を超えて減少させる。細胞中の免疫不全ウイルス転写が低減されるかどうかは、例えば、免疫不全ウイルスＲＮＡおよび／または免疫不全ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡコピーの検出のために確立された方法を含む、幾つかの周知の方法によって決定することができる。かかる方法には、例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法、逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法等が含まれる。
【００６１】
ＬＳＤ１ポリペプチド
「ＬＳＤ１ポリペプチド」は、既知のＬＳＤ１ポリペプチドに対して実質的なアミノ酸配列同一性を有する、および例えば、メチル基を、ヒストン（例えば、Ｌｙｓ−４をヒストンＨ３から脱メチル化する）、ＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチド（例えば、ＨＩＶ  ＴａｔのＬｙｓ−５１を脱メチル化する）等の基質ポリペプチドから除去する能力等を含む酵素活性を有する、ポリペプチドである。幾つかの種からの、ＬＳＤ１ポリペプチドのアミノ酸配列、およびかかるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、一般に入手可能である。例えば、１）カニス・ファミリアリスＬＳＤ１アミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿８６６６１０．１、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿８６６６１０．１にて提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿８６１５１７．１、２）パン・トログロデュテスＬＳＤ１アミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿５１３１９０．２、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿５１３１９０．２にて提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５１３１９０．２、３）ラッツス・ノーウィジアスＬＳＤ１アミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿５７５９３６．２、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿５７５９３６．２にて提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５７５９３６．２、４）ムース・ムースクルスアミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿５９８６３３．１、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿５９８６３３．１にて提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿１３３８７２．１、５）ホモ・サピエンスＬＳＤ１アミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０５５８２８およびＮＰ＿００１００９９９、ならびにＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０５５８２８およびＮＰ＿００１００９９９にて提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１５０１３およびＮＭ＿００１００９９９９を参照されたい。ヒトＬＳＤ１の結晶構造は、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：１３９５６に報告される。Ｆｏｒｎｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５７９：２２０３もまた参照されたい。
【００６２】
幾つかの実施形態では、ＬＳＤ１ポリペプチドは、図８に示され、配列番号１に記載されるアミノ酸配列の約７５０アミノ酸〜約８００アミノ酸、または約８００アミノ酸〜８５２アミノ酸の連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、ＬＳＤ１ポリペプチドは、図１０に示され、配列番号３に記載されるアミノ酸配列の約７５０アミノ酸〜約８００アミノ酸、約８００アミノ酸〜約８５０アミノ酸、または約８５０アミノ酸〜８７６アミノ酸の連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６３】
幾つかの実施形態では、ＬＳＤ１ポリペプチドは、図９Ａおよび９Ｂに示され、配列番号２に記載されるヌクレオチド配列の約２４００ヌクレオチド〜約２５００ヌクレオチド、または２５００ヌクレオチド〜２５５９ヌクレオチドの連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。幾つかの実施形態では、ＬＳＤ１ポリペプチドは、図１１Ａおよび１１Ｂに示され、配列番号４に記載されるヌクレオチド配列の約２５００ヌクレオチド〜約２６００ヌクレオチド、または２６００ヌクレオチド〜２６３１ヌクレオチドの連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【００６４】
Ｔａｔポリペプチド
ＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチドのアミノ酸配列は既知であり、これらの配列のうちのいずれも、対象アセチル化Ｔａｔポリペプチドに含めることができる。多数のＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質アミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋの下に見出される。例示的で非限定的なＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＯ２６２５０、ＡＡＯ２６２５２、ＡＡＯ２６２５４、ＡＡＯ２６２５８、ＡＡＯ２６２６０、ＡＡＯ２６２６２、ＡＡＯ２６２６４、ＡＡＯ２６２６６、ＡＡＯ２６２６８、ＡＡＯ２６２７０、ＡＡＯ２６２７２、ＡＡＯ２６２７４、ＡＡＯ２６２７６、ＡＡＯ２６２７８、ＡＡＯ２６２８０、ＡＡＯ２６２８２、ＡＡＯ２６２８４、ＡＡＯ２６２８６、ＡＡＯ２６２８８、ＡＡＯ２６２９０、ＡＡＯ２６２９２、ＡＡＯ２６２９４、ＡＡＯ２６２９６、ＡＡＯ２６２９８、ＡＡＯ２６３００、ＡＡＯ２６３０２、ＡＡＯ２６３０４、ＡＡＯ２６３０６、ＡＡＯ２６３０８、ＡＡＢ５０２５６、ＡＡＬ１２２０４、ＡＡＬ１２１９５、ＡＡＬ１２１８６、ＡＡＬ１２１７７、ＡＡＮ４７１３１、ＡＡＮ４７１２２、ＡＡＮ４７１１３、ＡＡＮ４７１０４、ＡＡＮ０３３３２、ＡＡＮ０３３２３、ＡＡＮ０３３１４、ＡＡＮ０３３０５、ＡＡＮ０３２９６、ＡＡＮ０３２８７、ＡＡＮ０３２７８、ＡＡＮ３１５９２、ＡＡＮ６４１２６、ＡＡＮ６４１１７、ＡＡＮ６４１０８、ＡＡＮ６４０９９、ＡＡＮ６４０９０、ＡＡＮ６４０８０、Ｋ０２０１３、ＡＡＬ２９４６０の下に見出され、図１３Ａおよび１３Ｂに示される通りである（配列番号１２〜３４、およびコンセンサスＴａｔ配列番号５）。更なるＨＩＶ  Ｔａｔアミノ酸配列は、Ｐｅｌｏｐｏｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１４７３−１１４７８、およびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：９６０−９６４に見出される。
【００６５】
ＬＳＤ１ポリペプチドのためのメチル化基質は、モノメチル化および／またはジメチル化リジンを含む可能性がある。幾つかの実施形態では、メチル化ＬＳＤ１基質は、メチル化ＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチドである。幾つかの実施形態では、メチル化Ｔａｔポリペプチドは、図１２に示され、配列番号５に記載されるアミノ酸配列のＬｙｓ−５１に対応する位置におけるメチル化リジンを含み、ここでメチル化リジンは、モノメチル化またはジメチル化される。ＬＳＤ１は、モノメチル化リジンおよびジメチル化リジンを脱メチル化するが、トリメチル化リジンを脱メチル化しない。幾つかの実施形態では、メチル化Ｔａｔポリペプチドは、アミノ酸配列ＳＹＧＲＫＫＭｅＲＲＱＲ（配列番号６）（ここで表記「ＫＭｅ」はメチル化リジンである）、またはその変形を含み、ここでメチル化リジンは、モノメチル化またはジメチル化される。
【００６６】
ＣｏＲＥＳＴポリペプチドおよび核酸
ＣｏＲＥＳＴがＬＳＤ１を活性化すること、およびＣｏＲＥＳＴがＬＳＤ１と直接相互作用することが示されている。したがって、ＣｏＲＥＳＴレベルの低減および／またはＣｏＲＥＳＴ−ＬＳＤ１結合の阻害は、ＬＳＤ１レベルおよび／またはＬＳＤ１酵素活性の低減をもたらす。場合によっては、ＣｏＲＥＳＴポリペプチドに結合する薬剤は、ＬＳＤ１に対するいずれの直接効果からも独立して、ＣｏＲＥＳＴポリペプチドの活性を低減する可能性がある。
【００６７】
完全長ＣｏＲＥＳＴポリペプチドは、ＬＳＤ１ポリペプチドに結合し、結合されたＬＳＤ１ポリペプチドの酵素活性を増加させる一方で、ＣｏＲＥＳＴのある種の断片は、ＬＳＤ１ポリペプチドに結合するが、ＬＳＤ１ポリペプチドの酵素活性を強化しない。例えば、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９：８５７を参照されたい。
【００６８】
幾つかの種からの、ＣｏＲＥＳＴポリペプチドのアミノ酸配列、およびかかるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、一般に入手可能である。例えば、１）ホモ・サピエンスＣｏＲＥＳＴアミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＦ０１４９８、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＦ０１４９８にて提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１５５５９５、２）ポンゴ・アベリイＣｏＲＥＳＴアミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿００２８２５１７９．１、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿００２８２５１７９．１にて提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿００２８２５１３３、３）ムース・ムースクルスＣｏＲＥＳＴアミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＢ９３９４３、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＢ９３９４３にて提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ８３５８７、４）ガルス・ガルスＣｏＲＥＳＴアミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿４２６４６７．２、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿４２６４６７．２にて提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿４２４６７、ならびに５）ラッツス・ノーウィジアスＣｏＲＥＳＴアミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＤＬ９７４８４．１を参照されたい。Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ２３：３７７は、ＬＳＤ１ポリペプチドとの複合体中のＣｏＲＥＳＴポリペプチドの結晶構造を提示する。
【００６９】
幾つかの実施形態では、ＣｏＲＥＳＴポリペプチドは、図１５に示されるアミノ酸配列（配列番号８）の約５０〜約７５、約７５〜約１００、約１００〜約１２５、約１２５〜約１５０、約１５０〜約２００、約２００〜約２５０、約２５０〜約２７５、約２７５〜約３００、約３００〜約３５０、約３５０〜約４００、約４００〜約４５０、または約４５０〜４８２の、隣接アミノ酸の連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７０】
幾つかの実施形態では、ＣｏＲＥＳＴポリペプチドは、図１６に示されるヌクレオチド配列（配列番号９）の約１５０〜約４５０、約４５０〜約１０００、または約１０００〜１４４９の、隣接ヌクレオチドの連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【００７１】
上述のように、ＣｏＲＥＳＴ核酸（ＣｏＲＥＳＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）は、当該技術分野で既知である。例えば、ＣｏＲＥＳＴ核酸は、図１６に示されるヌクレオチド配列（配列番号９）の約１５０〜約４５０、約４５０〜約１０００、または約１０００〜１４４９の、隣接ヌクレオチドの連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００７２】
ＢＨＣ８０ポリペプチドおよび核酸
ＢＨＣ８０ポリペプチドは、ＣｏＲＥＳＴおよびＬＳＤ１との複合体の一部を形成する。ＢＨＣ８０はまた、ＰＨＤフィンガータンパク質２１Ａとしても知られる。ＢＨＣ８０ポリペプチドは、ＬＳＤ１脱メチル化酵素活性を阻害することができる。
【００７３】
ＢＨＣ８０ポリペプチドのアミノ酸配列、およびＢＨＣ８０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、一般に入手可能である。例えば、１）ホモ・サピエンスＢＨＣ８０アミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０５７７０５、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０５７７０５に記載されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対するＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０１６６２１、２）ムース・ムースクルスＢＨＣ８０アミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿６２００９４、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿６２００９４に記載されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対するＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿１３８７５５、３）ガルス・ガルスＢＨＣ８０アミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ００１１８５７６．１、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ００１１８５７６．１に記載されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対するＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００１１９９６４７、ならびに４）ボース・タウルスＢＨＣ８０アミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＡＡ２１７９３を参照されたい。
【００７４】
ＢＨＣ８０ポリペプチドは、図１７に示されるアミノ酸配列（配列番号１０）の約１００アミノ酸（ａａ）〜約２００ａａ、約２００ａａ〜約３００ａａ、約３００ａａ〜約４００ａａ、約４００ａａ〜約５００ａａ、約５００ａａ〜約６００ａａ、または約６００ａａ〜６３４ａａの連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可能性がある。
【００７５】
ＢＨＣ８０ポリペプチドは、図１８Ａおよび１８Ｂに記載されるヌクレオチド配列（配列番号１１）の約３００ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５００ｎｔ、約５００ｎｔ〜約１０００ｎｔ、約１０００ｎｔ〜約１５００ｎｔ、または約１５００ｎｔ〜１９０５ｎｔの連続した広がりとの、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる可能性がある。
【００７６】
ＢＨＣ８０核酸（ＢＨＣ８０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）は、図１８Ａおよび１８Ｂに記載されるヌクレオチド配列（配列番号１１）の約３００ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５００ｎｔ、約５００ｎｔ〜約１０００ｎｔ、約１０００ｎｔ〜約１５００ｎｔ、または約１５００ｎｔ〜１９０５ｎｔの連続した広がりとの、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む可能性がある。
【００７７】
ＬＳＤ１の酵素活性を低減する小分子薬剤
対象方法において使用するのに好適である、ＬＳＤ１の酵素活性を低減する小分子薬剤（本明細書で「ＬＳＤ１阻害剤」とも称される）には、ＬＳＤ１酵素活性もまた阻害するモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）阻害剤、ＬＳＤ１酵素活性を阻害するポリアミン化合物、ＬＳＤ１酵素活性を阻害するフェニルシクロプロピルアミン誘導体等が含まれる。
【００７８】
幾つかの実施形態では、ＬＳＤ１ポリペプチドの酵素活性を阻害する好適な薬剤は、５０μＭ未満のＩＣ５０を有し、例えば、対象方法において使用するのに好適なＬＳＤ１阻害剤は、約５０μＭ〜約５ｎｍ、または５ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。例えば、幾つかの実施形態では、対象方法において使用するのに好適なＬＳＤ１阻害剤は、約５０μＭ〜約２５μＭ、約２５μＭ〜約１０μＭ、約１０μＭ〜約５μＭ、約５μＭ〜約１μＭ、約１μＭ〜約５００ｎＭ、約５００ｎＭ〜約４００ｎＭ、約４００ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３００ｎＭ〜約２５０ｎＭ、約２５０ｎＭ〜約２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約１５０ｎＭ、約１５０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約３０ｎＭ、約３０ｎＭ〜約２５ｎＭ、約２５ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１５ｎＭ、約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約５ｎＭ、または約５ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
【００７９】
免疫不全ウイルスを阻害する対象方法においておよび／または免疫不全ウイルス感染症を治療する対象方法において使用するのに好適であるＭＡＯ阻害剤には、ＭＡＯ−Ａ選択的阻害剤、ＭＡＯ−Ｂ選択的阻害剤、およびＭＡＯ非選択的阻害剤が含まれる。ＭＡＯ阻害剤の非限定的例としては、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）（５−ＨＴ）およびノルエピネフリン（ＮＥ）を優先的に脱アミノ化する、ＭＡＯ−Ａアイソフォームの報告される阻害剤、ならびに／またはフェニルエチルアミン（ＰＥＡ）およびベンジルアミンを優先的に脱アミノ化する、ＭＡＯ−Ｂアイソフォームが挙げられる（ＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂの両方がドーパミン（ＤＡ）を代謝する）。種々の実施形態では、ＭＡＯ阻害剤は、不可逆的であっても、可逆的（例えば、ＭＡＯ−Ａの可逆的阻害剤（ＲＩＭＡ））であってもよく、ＭＡＯ−Ａおよび／またはＭＡＯ−Ｂに対する様々な効力を有してもよい（例えば、非選択的二重阻害剤またはアイソフォーム選択的阻害剤）。
【００８０】
免疫不全ウイルスを阻害する対象方法においておよび／または免疫不全ウイルス感染症を治療する対象方法において有用なＭＡＯ阻害剤の非限定的例としては、クロルジリン、Ｌ−デプレニル、イソカルボキサジド（マルプラン（商標））、アヤワスカ、ニアラミド、イプロニアジド、イプロクロジド、モクロベミド（オーロリクス（商標）、４−クロロ−Ｎ−（２−モルホリン−４−イルエチル）ベンズアミド）、フェネルジン（ナルジル（商標）、（±）−２−フェニルエチルヒドラジン）、トラニルシプロミン（パルネート（商標）、（±）−トランス−２−フェニルシクロプロパン−１−アミン）（フェネルジンの同属）、トロキサトン、レボ−デプレニル（セレギリン（商標））、ハルマラ、ＲＩＭＡ（例えば、Ｄａ  Ｐｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２４８：４００−４１４（１９８９）に記載されるモクロベミド、ブロファロミン、ならびにＣｕｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｆｆｅｃｔ  Ｄｉｓｏｒｄ  ５１：２８７−３０３（１９９８）に記載されるベフロキサトン、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４０（１）：９９−１０７（１９９６）、およびＳＬ２５．１１３１に記載され、Ａｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，３１０：１１７１−１１８２（２００４）に記載されるラザベミド（Ｒｏ  １９  ６３２７））、セレギリン塩酸塩（Ｉ−デプレニル、ＥＬＤＥＰＲＹＬ、ＺＥＬＡＰＡＲ）、ジメチルセレギリン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｅｌｅｇｉｌｅｎｅ）、サフィナミド、ラサギリン（ＡＺＩＬＥＣＴ）、ビフェメラン、デスオキシペガニン（ｄｅｓｏｘｙｐｅｇａｎｉｎｅ）、ハルミン（テレパシンまたはバナステリン（ｂａｎａｓｔｅｒｉｎｅ）としても知られる）、リネゾリド（ＺＹＶＯＸ、ＺＹＶＯＸＩＤ）、パルギリン（ＥＵＤＡＴＩＮ、ＳＵＰＩＲＤＹＬ）、ジエノリドカバピロンデスメトキシヤンゴニン（ｄｉｅｎｏｌｉｄｅ  ｋａｖａｐｙｒｏｎｅ  ｄｅｓｍｅｔｈｏｘｙｙａｎｇｏｎｉｎ）、５−（４−アリールメトキシフェニル）−２−（２−シアノエチル）テトラゾール等が挙げられる。
【００８１】
免疫不全ウイルスを阻害する対象方法においておよび／または免疫不全ウイルス感染症を治療する対象方法において使用するのに好適であるＬＳＤ１酵素活性の阻害剤には、Ｗｏｓｔｅｒらによって米国公開第２００７／０２０８０８２号に記載されるポリアミン化合物が含まれ、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【００８２】
免疫不全ウイルスを阻害する対象方法においておよび／または免疫不全ウイルス感染症を治療する対象方法において使用するのに好適であるＬＳＤ１酵素活性のポリアミン阻害剤は、式（Ｉ）：
【化１】
2013540767.tif 000002
【００８３】
の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは水和物を含み、式中、
【００８４】
ｎは、１〜１２の整数であり、
【００８５】
ｍおよびｐは独立して、１〜５の整数であり、
【００８６】
ｑは、０または１であり、
【００８７】
各Ｒ１は独立して、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ４−Ｃ１５シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１５分岐アルキル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ６−Ｃ２０ヘテロアリール、Ｃ７−Ｃ２４アラルキル、Ｃ７−Ｃ２４ヘテロアラルキルからなる群から選択され、
【化２】
2013540767.tif 000003
、
【００８８】
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ４−Ｃ１５シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１５分岐アルキル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ６−Ｃ２０ヘテロアリール、Ｃ７−Ｃ２４アラルキル、およびＣ７−Ｃ２４ヘテロアラルキルからなる群から選択され、
【００８９】
各Ｒ２は独立して、水素またはＣ１−Ｃ８アルキルから選択される。
【００９０】
好適なポリアミン化合物は、式（Ｉ）の化合物であり、式中、一方または双方のＲ１は、限定なしにフェニルを含む、単環アリール等のＣ６−Ｃ２０アリールである。一実施形態では、化合物は、式（Ｉ）のものであり、各Ｒ１は、フェニルである。一実施形態では、ｑは、１であり、ｍおよびｐは、３であり、ｎは、４である。別の実施形態では、ｑは、１であり、ｍおよびｐは、３であり、ｎは、７である。
【００９１】
好適なポリアミン化合物は、式（Ｉ）の化合物であり、式中、少なくとも一方または双方のＲ１は、直鎖アルキル等のＣ８−Ｃ１２またはＣ１−Ｃ８アルキルである。一方または双方のＲ１は、メチルまたはエチル等のＣ１−Ｃ８直鎖アルキルであってもよい。一実施形態では、各Ｒ１は、メチルである。一方または双方のＲ１は、直鎖アルキル基を含有するシクロアルキル基等のＣ４−Ｃ１５シクロアルキル基を含むか、またはＣ４−Ｃ１５シクロアルキル基であってもよく、ここでシクロアルキル基は、そのアルキルまたはシクロアルキル部分のいずれかを介して分子に結合される。例えば、一方または双方のＲ１は、シクロプロピルメチルまたはシクロヘキシルメチルであってもよい。一実施形態では、一方のＲ１は、シクロプロピルメチルまたはシクロヘキシルメチルであり、他方のＲ１は、限定なしにエチル基を含む直鎖Ｃ１−Ｃ８非置換アルキル基等の直鎖アルキル基である。一実施形態では、Ｒ１は、イソプロピル等のＣ３−Ｃ１５分岐アルキル基である。Ｒ１がＣ１−Ｃ８置換アルキルであるとき、置換アルキルは、一級、二級、三級、または四級アミンを含む、任意の置換基で置換されてもよい。したがって、一実施形態では、Ｒ１は、Ｒ１が例えば、アルキル−ＮＨ２または−−（ＣＨ２）ｙＮＨ（ＣＨ２）ｚＣＨ３（式中、ｙおよびｚは独立して１〜８の整数である）等のアルキル−アミン−アルキル部分であり得るように、アミンで置換されたＣ１−Ｃ８アルキル基である。一実施形態では、Ｒ１は、−−（ＣＨ２）３ＮＨ２である。
【００９２】
一実施形態では、化合物は、一方または双方のＲ１がＣ７−Ｃ２４置換または非置換アラルキルである式（Ｉ）のものであり、それは、一実施形態において、そのアルキル部分を介して分子に結合されるアラルキル（例えば、ベンジル）である。一実施形態では、双方のＲ１は、アラルキル部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）であり、ここでその部分（ｍｏｉｅｔｙ）のアルキル部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）は、２個のアリール基で置換され、その部分（ｍｏｉｅｔｙ）は、そのアルキル基を介して分子に結合される。例えば、一実施形態では、一方または双方のＲ１は、Ｒ１が２，２−ジフェニルエチルまたは２，２−ジベンジルエチルであるとき等の、アルキル部分が２個のフェニル基で置換される、Ｃ７−Ｃ２４アラルキルである。一実施形態では、式（Ｉ）の双方のＲ１は、２，２−ジフェニルエチルであり、ｎは、１、２、または５である。一実施形態では、式（Ｉ）の各Ｒ１は、２，２−ジフェニルエチルであり、ｎは、１、２、または５であり、ｍおよびｐは、各々１である。
【００９３】
一実施形態では、少なくとも１つのＲ１は、水素である。一方のＲ１が水素であるとき、他方のＲ１は、ベンジル等のアリール基を含む、Ｒ１について上に列挙されるいずれの部分であってもよい。上に列挙される式（Ｉ）の化合物のいずれも、Ｒ２の少なくとも１つまたは両方が水素またはＣ１−Ｃ８置換もしくは非置換アルキルである化合物を含む。一実施形態では、各Ｒ２は、メチル等の非置換アルキルである。別の実施形態では、各Ｒ２は、水素である。上に列挙される式（Ｉ）の化合物のいずれも、ｑが１であり、ｍおよびｐが同じである化合物であってもよい。したがって、式（Ｉ）のポリアミノグアニジンは、ポリアミノグアニジンコアを参照して（例えば、Ｒ１を除外する）対称であってもよい。代替的に、式（Ｉ）の化合物は、例えば、ｑが０であるとき、非対称であってもよい。一実施形態では、ｍおよびｐは、１である。一実施形態では、ｑは、０である。一実施形態では、ｎは、１〜５の整数である。
【００９４】
一実施形態では、化合物は、ポリアミノビグアニドまたはＮ−アルキル化ポリアミノビグアニドである。Ｎ−アルキル化ポリアミノビグアニドは、少なくとも１つのビグアニドの少なくとも１つのイミン窒素がアルキル化されるポリアミノビグアニドを意図する。一実施形態では、化合物は、式（Ｉ）のポリアミノビグアニド、またはその塩、溶媒和物、もしくは水和物であり、式中、ｑは、１であり、少なくとも１つのまたは各Ｒ１は、構造：
【化３】
2013540767.tif 000004
、
【００９５】
のものであり、式中、各Ｒ３は独立して、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ６−Ｃ２０ヘテロアリール、Ｃ７−Ｃ２４アラルキル、およびＣ７−Ｃ２４ヘテロアラルキルからなる群から選択され、各Ｒ２は独立して、水素またはＣ１−Ｃ８アルキルである。
【００９６】
一実施形態では、ポリアミノビグアニド化合物において、少なくとも１つのまたは各Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ８アルキルである。例えば、Ｒ３がＣ１−Ｃ８アルキルであるとき、アルキルは、一級、二級、三級、または四級アミンを含む、任意の置換基で置換されてもよい。したがって、一実施形態では、Ｒ３は、Ｒ３が例えば、アルキル−ＮＨ２または−−（ＣＨ２）ｙＮＨ（ＣＨ２）ｚＣＨ３（式中、ｙおよびｚは独立して１〜８の整数である）等のアルキル−アミン−アルキル部分であり得るように、アミンで置換されたＣ１−Ｃ８アルキル基である。一実施形態では、Ｒ３は、−−（ＣＨ２）３ＮＨ２である。Ｒ３はまた、Ｃ４−Ｃ１５シクロアルキルまたはＣ３−Ｃ１５分岐アルキルであってもよい。一実施形態では、少なくとも１つのまたは各Ｒ３は、Ｃ６−Ｃ２０アリールである。一実施形態では、ｑは、１であり、ｍおよびｐは、３であり、ｎは、４である。別の実施形態では、ｑは、１であり、ｍおよびｐは、３であり、ｎは、７である。
【００９７】
一実施形態では、化合物は、少なくとも１つのＲ３がＣ７−Ｃ２４アラルキルである式（Ｉ）のポリアミノビグアニドであり、それは、一実施形態において、そのアルキル部分を介して分子に結合されるアラルキルである。一実施形態では、各Ｒ３は、アラルキル部分（ｍｏｉｅｔｙ）であり、ここでその部分（ｍｏｉｅｔｙ）のアルキル部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）は、１個または２個のアリール基で置換され、その部分（ｍｏｉｅｔｙ）は、そのアルキル部分（ｍｏｉｅｔｙ）を介して分子に結合される。例えば、一実施形態では少なくとも１つのまたは各Ｒ３は、Ｒ３が２，２−ジフェニルエチルまたは２，２−ジベンジルエチルであるとき等の、アルキル部分が２個のフェニルまたはベンジル基で置換される、アラルキルである。一実施形態では、各Ｒ３は、２，２−ジフェニルエチルであり、ｎは、１、２、または５である。一実施形態では、各Ｒ３は、２，２−ジフェニルエチルであり、ｎは、１、２、または５であり、ｍおよびｐは、各々１である。
【００９８】
上に列挙される式（Ｉ）のポリアミノビグアニド化合物のいずれも、Ｒ２の少なくとも１つまたは両方が水素またはＣ１−Ｃ８アルキルである化合物を含む。一実施形態では、各Ｒ２は、メチル等の非置換アルキルである。別の実施形態では、各Ｒ２は、水素である。
【００９９】
上に列挙される式（Ｉ）のポリアミノビグアニド化合物のいずれも、ｑが１であり、ｍおよびｐが同じである化合物を含む。したがって、式（Ｉ）のポリアミノビグアニドは、ポリアミノビグアニドコアを参照して対称であってもよい。代替的に、式（Ｉ）の化合物は、非対称であってもよい。一実施形態では、ｍおよびｐは、１である。一実施形態では、ｑは、０である。一実施形態では、ｎは、１〜５の整数である。一実施形態では、ｑ、ｍおよびｐは、各々１であり、ｎは、１、２、または５である。
【０１００】
式（Ｉ）を参照して開示される各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｍ、ｎ、ｐ、およびｑは、あたかもＲ１、Ｒ２、Ｒ３、ｍ、ｎ、ｐ、およびｑのありとあらゆる組み合わせが具体的かつ個々に列挙されたのと同じように、それらの全ての組み合わせを意図し、それらを含むことが本開示によって理解され、明確に伝達される。
【０１０１】
式（Ｉ）の代表的化合物には、例えば：
【化４】
2013540767.tif 000005
が含まれる。
【０１０２】
ある種の実施形態では、ポリアミン化合物は、式（ＩＩ）：
【化５】
2013540767.tif 000006
【０１０３】
の構造のもの、またはその塩、溶媒和物、もしくは水和物であり、
【０１０４】
式中、ｎは、１、２、または３であり、
【０１０５】
各Ｌは独立して、約２〜１４炭素長の、例えば、約２、３、４、５、６、８、１０、１２、または１４炭素原子長のリンカーであり、ここでリンカー骨格原子は、飽和であっても不飽和であってもよく、通常１、２、３、または４個以下の不飽和原子が、テザー骨格中に存在し、骨格原子の各々は、（例えば、Ｃ１−Ｃ８アルキルで）置換されても置換されなくてもよく、リンカー骨格は、環式基（例えば、輪の３個の原子が骨格中に含まれる、シクロヘキサ−１，３−ジイル基）を含んでもよく、
【０１０６】
各Ｒ１２は独立して、水素およびＣ１−Ｃ８アルキルから選択され、
【０１０７】
各Ｒ１１は独立して、水素、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ１−Ｃ８アルキルまたはＣ３−Ｃ８分岐アルキル（例えば、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソプロピル、ペンチル、シクロブチル、シクロプロピルメチル、３−メチルブチル、２−エチルブチル、５−ＮＨ２−ペンタ−１−イル、プロピル−１−イルメチル（フェニル）ホスフィネート、２−（６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプチル）エチル、２−（デカヒドロナフチル）エチル等）、Ｃ６−Ｃ２０アリールまたはヘテロアリール、Ｃ７−Ｃ２４アラルキルまたはヘテロアラルキル（２−フェニルベンジル、４−フェニルベンジル、２−ベンジルベンジル、３−ベンジルベンジル、３，３−ジフェニルプロピル、３−（ベンゾイミダゾリル）−プロピル、４−イソプロピルベンジル、４−フルオロベンジル、４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル、３−イミダゾリル−プロピル、２−フェニルエチル等）、─Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８アルキル、─Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８アルケニル、─Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８アルキニル、アミノ−置換シクロアルキル（例えば、５−ＮＨ２−シクロヘプチル、３−ＮＨ２−シクロペンチル等の、一級、二級、三級、または四級アミンで置換されるシクロアルキル基）、およびＣ２−Ｃ８アルカノイル（例えば、メチルおよびアルキルアジド基で置換されるアルカノイル）から選択される。
【０１０８】
ある種の実施形態では、各Ｌは独立して：─ＣＨＲ１３−（ＣＨ２）ｍ─、─ＣＨＲ１３−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨＲ１３─、─（ＣＨ２）ｍ−ＣＨＲ１３─、─ＣＨ２−Ａ−ＣＨ２─、および─（ＣＨ２）ｐ─から選択され、
【０１０９】
式中、
【０１１０】
ｍは、１〜５の整数であり、
【０１１１】
Ａは、（ＣＨ２）ｍ、エタン−１，１−ジイル、またはシクロヘキサ−１，３−ジイルであり、
【０１１２】
ｐは、１、２、３、４、または５等の、２〜１４の整数であり、
【０１１３】
ｎは、１〜１２の整数であり、
【０１１４】
Ｒ１３は、Ｃ１−Ｃ８アルキルである。
【０１１５】
式（ＩＩ）を参照した置換アラルキルまたはヘテロアラルキルは、アリールまたはヘテロアリール基で置換されるアルカノイル部分、すなわち、−−Ｃ（＝Ｏ）−アリール、−−Ｃ（＝Ｏ）−アラルキル、−−Ｃ（＝Ｏ）−ヘテロアリール、および−−Ｃ（＝Ｏ）−ヘテロアラルキルを意図し、それらを含む。一実施形態では、アラルキルまたはヘテロアラルキル部分のアルキル部分は、そのアルキル部分を介して分子に結合される。例えば、Ｒ１１の少なくとも１つまたは両方は、２−フェニルベンジル、４−フェニルベンジル、３，３，−ジフェニルプロピル、２−（２−フェニルエチル）ベンジル、２−メチル−３−フェニルベンジル、２−ナフチルエチル、４−（ピレニル）ブチル、２−（３−メチルナプチル（ｍｅｔｈｙｌｎａｐｔｈｙｌ））エチル、２−（１，２−ジヒドロアセナフト−４−イル）エチル等のアラルキル部分であってもよい。別の実施形態では、Ｒ１１の少なくとも１つまたは両方は、３−（ベンゾイミダゾリル）プロパノイル、１−（ベンゾイミダゾリル）メタノイル、２−（ベンゾイミダゾリル）エタノイル、２−（ベンゾイミダゾリル）エチル等のヘテロアラルキル部分であってもよい。
【０１１６】
ある種の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、ｔ−ブチル、イソプロピル、２−エチルブチル、１−メチルプロピル、１−メチルブチル、３−ブテニル、イソペンタ−２−エニル、２−メチルプロパン−３−オリル、エチルチイル、フェニルチイル、プロピノイル、１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−イル、トリフルオロメチル、シクロプロパンカルバルデヒド、ハロ−置換フェニル、ニトロ−置換フェニル、アルキル−置換フェニル、２，４，６−トリメチルベンジル、ハロ−Ｓ−置換フェニル（等のパラ−（Ｆ３Ｓ）−フェニル、アジド、および２−メチルブチルからなる群から選択される少なくとも１つの部分を含む。
【０１１７】
ある種の実施形態では、式（ＩＩ）において、各Ｒ１１は独立して、水素、ｎ−ブチル、エチル、シクロヘキシルメチル、シクロペンチルメチル、シクロプロピルメチル、シクロヘプチルメチル、シクロヘキシルエタ−２−イル、およびベンジルから選択される。
【０１１８】
ある種の実施形態では、ポリアミン化合物は、式（ＩＩ）の構造のものであり、式中、ｎは、３であり、その結果、化合物は、式（ＩＩＩ）：
【化６】
2013540767.tif 000007
【０１１９】
の構造のものであり、式中、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は独立して、─ＣＨＲ１３−（ＣＨ２）ｍ─、─ＣＨＲ１３−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨＲ１３─、─（ＣＨ２）ｍ−ＣＨＲ１３─、─ＣＨ２−Ａ−ＣＨ２─、および─（ＣＨ２）ｐ─から選択され、
ｍ、Ａ、ｐ、ｎ、およびＲ１３は、上に定義される通りである。
【０１２０】
ある種の実施形態では、ポリアミン化合物は、式（ＩＩＩ）の構造のものであり、式中、
【０１２１】
Ｌ１は、─ＣＨＲ１３−（ＣＨ２）ｍ─であり、
【０１２２】
Ｌ２は、─ＣＨＲ１３−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨＲ１３─であり、
【０１２３】
Ｌ３は、─（ＣＨ２）ｍ−ＣＨＲ１３─であり、
【０１２４】
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、ｍ、およびｎは、上に定義される通りである。
【０１２５】
ある種の実施形態では、ポリアミン化合物は、式（ＩＩＩ）の構造のものであり、式中、
【０１２６】
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は独立して、─ＣＨ２−Ａ−ＣＨ２─であり、
【０１２７】
Ｒ１２は、水素であり、
【０１２８】
Ｒ１１およびＡは、上に定義される通りである。特定の実施形態では、ＡおよびＲ１１のうちの少なくとも１つは、アルケニル部分を含む。
【０１２９】
ある種の実施形態では、ポリアミン化合物は、式（ＩＩＩ）の構造のものであり、式中、
【０１３０】
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は独立して、─（ＣＨ２）ｐ─であり、ｐは、上に定義される通りであり、
【０１３１】
Ｒ１２は、水素である。特定の実施形態では、Ｌ１およびＬ３について、ｐは、３〜７の整数であり、Ｌ３について、ｐは、３〜１４の整数である。
【０１３２】
ある種の実施形態では、ポリアミン化合物は、式（ＩＩＩ）の構造のものであり、式中、
【０１３３】
Ｌ１およびＬ３は独立して、─（ＣＨ２）ｐ─であり、
【０１３４】
Ｌ２は、─ＣＨ２−Ａ−ＣＨ２─であり、
【０１３５】
Ｒ１２は、水素であり、
【０１３６】
Ｒ１２、ｐ、およびＡは、上に定義される通りである。特定の実施形態では、Ｌ１およびＬ３について、ｐは、２〜６の整数であり、Ｌ３について、Ａは、（ＣＨ２）ｘであり、ｘは、１〜５の整数であるか、またはシクロヘキサ−１，３−ジイルである。
【０１３７】
ある種の実施形態では、ポリアミン化合物は、式（ＩＩ）の構造のものであり、式中、ｎは、２であり、その結果、化合物は、式（ＩＶ）：
【化７】
2013540767.tif 000008
【０１３８】
の構造のものであり、式中、Ｌ１およびＬ２は独立して、─ＣＨＲ１３−（ＣＨ２）ｍ─、─ＣＨＲ１３−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨＲ１３─、─（ＣＨ２）ｍ−ＣＨＲ１３─、─ＣＨ２−Ａ−ＣＨ２─、および─（ＣＨ２）ｐ─から選択され、
ｍ、Ａ、ｐ、ｎ、およびＲ１３は、上に定義される通りである。
【０１３９】
ある種の実施形態では、ポリアミン化合物は、式（ＩＶ）の構造のものであり、式中、
【０１４０】
Ｌ１は、─（ＣＨ２）ｐ─であり、
【０１４１】
Ｌ２は、─（ＣＨ２）ｍ−ＣＨＲ１３─であり、
【０１４２】
Ｒ１３、ｍ、およびｐは、上に定義される通りである。特定の実施形態では、Ｌ１について、ｐは、３〜１０の整数であり、Ｌ２について、ｎは、２〜９の整数である。
【０１４３】
ある種の実施形態では、ポリアミン化合物は、式（ＩＶ）の構造のものであり、式中、
【０１４４】
Ｌ１およびＬ２は、─（ＣＨ２）ｐ─であり、
【０１４５】
ｐは、上に定義される通りである。特定の実施形態では、ｐは、３〜７の整数である。
【０１４６】
ある種の実施形態では、ポリアミン化合物は、式（ＩＩ）の構造のものであり、式中、ｎは、１であり、その結果、化合物は、式（Ｖ）：
【化８】
2013540767.tif 000009
【０１４７】
の構造のものであり、式中、Ｌ１は、─（ＣＨ２）ｐ─であり、ｐは、上に定義される通りである。特定の実施形態では、ｐは、２〜６の整数である。
【０１４８】
特定の実施形態では、式（Ｖ）において、一方のＲ１１は、アミノ−置換シクロアルキル（例えば、一級、二級、三級、または四級アミンで置換されるシクロアルキル基）またはＣ２−Ｃ８アルカノイル（このアルカノイルは、メチルまたはアルキルアジド基等の１個以上の置換基で置換されてもよい）であり、他方のＲ１１は、Ｃ１−Ｃ８アルキルまたはＣ７−Ｃ２４アラルキルである。
【０１４９】
式（ＩＩ）の代表的化合物には、例えば：
【化９】
2013540767.tif 000010
2013540767.tif 000011
2013540767.tif 000012
2013540767.tif 000013
2013540767.tif 000014
が含まれる。
【０１５０】
ＬＳＤ１酵素活性の阻害剤であり、免疫不全ウイルスを阻害する対象方法においておよび／または免疫不全ウイルス感染症を治療する対象方法において使用するのに好適である、フェニルシクロプロピルアミン誘導体は、式：
【化１０】
2013540767.tif 000015
【０１５１】
の化合物であって、式中、
【０１５２】
Ｒ１〜Ｒ５の各々は独立して、Ｈ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−Ｌ−アリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｌ−カルボシクリル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルキニル、アミノ、アルキルアミノ、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、シアノ、シアナト、ハロアリール、ヒドロキシル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルコキシ、イソシアナト、イソチオシアネート、ニトロ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、チオカルボニル、チオシアナト、トリハロメタンスルホンアミド、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、およびＣ−アミドから選択され、
【０１５３】
Ｒ６は、Ｈまたはアルキルであり、
【０１５４】
Ｒ７は、Ｈ、アルキル、またはシクロアルキルであり、
【０１５５】
Ｒ８は、−Ｌ−ヘテロシクリルであり、ここで−Ｌ−ヘテロシクリルの環または環系は、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−Ｌ−アリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｌ−カルボシクリル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルキニル、アミノ、アルキルアミノ、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、シアノ、シアナト、ハロアリール、ヒドロキシル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルコキシ、イソシアナト、イソチオシアネート、ニトロ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、チオカルボニル、チオシアナト、トリハロメタンスルホンアミド、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、およびＣ−アミドから選択される０〜３個の置換基を有するか、あるいは
【０１５６】
Ｒ８は、−Ｌ−アリールであり、ここで−Ｌ−アリールの環または環系は、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−Ｌ−アリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｌ−カルボシクリル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルキニル、アミノ、アルキルアミノ、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、シアノ、シアナト、ハロアリール、ヒドロキシル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルコキシ、イソシアナト、イソチオシアネート、ニトロ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、チオカルボニル、チオシアナト、トリハロメタンスルホンアミド、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、およびＣ−アミドから選択される１〜３個の置換基を有し、
【０１５７】
各Ｌは独立して、−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｎ−、および−（ＣＨ２）ｎＳ（ＣＨ２）ｎ−から選択され、各ｎは独立して、０、１、２、および３から選定される、化合物、
【０１５８】
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【０１５９】
場合によっては、Ｌは、共有結合である。場合によっては、Ｒ６およびＲ７は、ヒドロである。場合によっては、Ｒ１〜Ｒ５のうちの１つは、−Ｌ−アリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、および−Ｌ−カルボシクリルから選択される。
【０１６０】
式ＶＩの化合物の幾つかの実施形態では、Ｒ８環または環系上の置換基（単数または複数）は、ヒドロキシル、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）２、−ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１−３アルキル）２、−Ｓ（＝Ｏ）２（Ｃ１−３アルキル）、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｃ１−３アルキル）２、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、−ＣＮ、−ＮＨ２、および−ＮＯ２から選択される。
【０１６１】
ある種の実施形態では、本発明の化合物式（ＶＩ）のものであり、式中、
【０１６２】
各Ｒ１〜Ｒ５は、任意に置換され、独立して、−Ｈ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−Ｌ−アリール、−Ｌ−ヘテロアリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｌ−カルボシクリル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルキニル、アミノ、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、シアノ、シアナト、ハロアリール、ヒドロキシル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルコキシ、イソシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、チオカルボニル、チオシアナト、トリハロメタンスルホンアミド、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、およびＣ−アミドから選定され、
【０１６３】
Ｒ６は、−Ｈおよびアルキルから選定され、
【０１６４】
Ｒ７は、−Ｈ、アルキル、およびシクロアルキルから選定され、
【０１６５】
Ｒ８は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙおよび−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｚから選定され、
【０１６６】
存在するとき、Ｒｘは、−Ｈ、アルキル、アルキニル、アルケニル、−Ｌ−カルボシクリル、−Ｌ−アリール、および−Ｌ−ヘテロシクリルから選定され、それらの全ては、任意に置換され（−Ｈを除いて）、
【０１６７】
存在するとき、Ｒｙは、−Ｈ、アルキル、アルキニル、アルケニル、−Ｌ−カルボシクリル、−Ｌ−アリール、および−Ｌ−ヘテロシクリルから選定され、それらの全ては、任意に置換され（−Ｈを除いて）、ＲｘおよびＲｙは、環式で連結されてもよい。
【０１６８】
存在するとき、Ｒｚは、−Ｈ、アルコキシ、−Ｌ−カルボシクリル、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｌ−アリールから選定され、ここでアリール、ヘテロシクリル、またはカルボシクリルは、任意に置換され、各Ｌは、式Ｉの主要な足場をカルボシクリル、ヘテロシクリル、またはアリール基に連結するリンカーであり、リンカー−Ｌ−の炭化水素部分は、飽和、部分的に飽和、または不飽和であり、かつ独立して、−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｓ）Ｓ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＯＣ（＝Ｏ）Ｓ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＳ（ＣＨ２）ｎ−、および−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−の式を有する飽和の親基から選定され、式中、各ｎは独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、および８から選定される。この実施形態によれば、任意に置換されるとは、独立してアシルアミノ、アシルオキシ、アルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルキル、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルキニル、アミノ、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、カルボシクリル、シアノ、シアナト、ハロ、ハロアルキル、ハロアリール、ヒドロキシル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロアリールアルコキシ、イソシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、チオカルボニル、チオシアナト、トリハロメタンスルホンアミド、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、およびＣ−アミドから選定されるゼロまたは１個〜４個の任意の置換基を指す。この実施形態のより具体的な態様では、任意の置換基は、ハロ、アルキル、アリール、およびアリールアルキルから選定される１または２個の任意の置換基である。
【０１６９】
ある種の実施形態では、式Ｖ（Ｉ）において、Ｒ８は、−ＣＯＲｚであり、その結果、化合物は、次の構造：
【化１１】
2013540767.tif 000016
【０１７０】
のものであり、式中、
【０１７１】
Ｒ１〜Ｒ７は、上述され、
【０１７２】
Ｒｚは、独立してアシルアミノ、アシルオキシ、アルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルキル、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルキニル、アミノ、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、カルボシクリル、シアノ、シアナト、ハロ、ハロアルキル、ハロアリール、ヒドロキシル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロアリールアルコキシ、イソシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、チオカルボニル、チオシアナト、トリハロメタンスルホンアミド、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、およびＣ−アミドから選定される１個〜４個の任意の置換基で任意に置換される、−Ｌ−ヘテロシクリルであり、該−Ｌ−は独立して、−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｎ−、および−（ＣＨ２）ｎＳ（ＣＨ２）ｎ−から選定され、ここで各ｎは独立して、０、１、２、および３から選定される。
【０１７３】
この実施形態の具体的な態様では、各Ｌは独立して、−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＨ２）ｎ−および−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｎから選定され、ここで各ｎは独立して、０、１、２、および３から選定される。この実施形態のより具体的な態様では、各Ｌは、結合、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＯＣＨ２−、−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−から選定される。より具体的な態様では、各Ｌは、結合、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、ＯＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−から選定される。なおも更により具体的な態様では、Ｌは、結合および−ＣＨ２−から選定される。
【０１７４】
式ＶＩの例示的な化合物には、次のものが含まれる：
【化１２】
2013540767.tif 000017
【０１７５】
式ＶＩの例示的な化合物には、次のものが含まれる：
【０１７６】
Ｎ−シクロプロピル−２−｛［（トランス）−２−フェニルシクロプロピル］アミノ｝アセトアミド、
【０１７７】
２−｛［（トランス）−２−フェニルシクロプロピル］アミノ｝アセトアミド、
【０１７８】
Ｎ−シクロプロピル−２−｛［（トランス）−２−フェニルシクロプロピル］アミノ｝プロパンアミド、
【０１７９】
２−｛［（トランス）−２−フェニルシクロプロピル］アミノ｝−Ｎ−プロパ−２−イニルアセトアミド、
【０１８０】
Ｎ−イソプロピル−２−｛［（トランス）−２−フェニルシクロプロピル］アミノ｝アセトアミド、
【０１８１】
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチル）−２−｛［（トランス）−２−フェニルシクロプロピル］アミノ｝アセトアミド、
【０１８２】
Ｎ−（２−モルホリン−４−イル−２−オキソエチル）−Ｎ−［（トランス）−２−フェニルシクロプロピル］アミン、
【０１８３】
２−｛［（トランス）−２−フェニルシクロプロピル］アミノ｝プロパンアミド、
【０１８４】
メチル２−｛［（トランス）−２−フェニルシクロプロピル］アミノ｝プロパノエート、
【０１８５】
Ｎ−シクロプロピル−２−｛メチル［（トランス）−２−フェニルシクロプロピル］アミノ｝アセトアミド、
【０１８６】
２−｛メチル［（トランス）−２−フェニルシクロプロピル］アミノ｝アセトアミド、
【０１８７】
Ｎ−メチル−トランス−２−（フェニルシクロプロピルアミノ）プロパンアミド、
【０１８８】
１−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−（（トランス）−２−フェニルシクロプロピルアミノ）エタノン、
【０１８９】
１−（４−エチルピペラジン−１−イル）−２−（（トランス）−２−フェニルシクロプロピルアミノ）エタノン、
【０１９０】
１−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）−２−（（トランス）−２−フェニルシクロプロピルアミノ）−エタノン、
【０１９１】
２−（（トランス）−２−フェニルシクロプロピルアミノ）−１−（４−フェニルピペラジン−１−イル）エタノン、
【０１９２】
２−（（トランス）−２−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）シクロプロピルアミノ）−１−（４−メチルピペラジン−１−イル）エタノン、
【０１９３】
２−（（トランス）−２−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）シクロプロピルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルアセトアミド、
【０１９４】
２−（（トランス）−２−（４−（３−フルオロベンジルオキシ）フェニル）シクロプロピルアミノ）−１−（４−メチルピペラジン−１−イル）エタノン、
【０１９５】
２−（（トランス）−２−（４−（３−クロロベンジルオキシ）フェニル）シクロプロピルアミノ）−１−（４−メチルピペラジン−１−イル）エタノン、
【０１９６】
２−（（トランス）−２−（ビフェニル−４−イル）シクロプロピルアミノ）−１−（４−メチルピペラジン−１−イル）エタノン、
【０１９７】
１−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−（（トランス）−２−（４−フェネトキシフェニル）シクロプロピルアミノ）エタノン、
【０１９８】
２−（（トランス）−２−（４−（４−フルオロベンジルオキシ）フェニル）シクロプロピルアミノ）−１−（４−メチルピペラジン−１−イル）エタノン、
【０１９９】
２−（（トランス）−２−（４−（ビフェニル−４−イルメトキシ）フェニル）シクロプロピルアミノ）−１−（４−メチルピペラジン−１−イル）エタノン、
【０２００】
（トランス）−Ｎ−（４−フルオロベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２０１】
（トランス）−Ｎ−（４−フルオロベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミニウム（ａｍｉｎｉｕｒｎ）、
【０２０２】
４−（（（トランス）−２−フェニルシクロプロピルアミノ）メチル）ベンゾニトリル、
【０２０３】
（トランス）−Ｎ−（４−シアノベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミニウム、
【０２０４】
（トランス）−２−フェニル−Ｎ−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）シクロプロパンアミン、
【０２０５】
（トランス）−２−フェニル−Ｎ−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）シクロプロパンアミニウム、
【０２０６】
（トランス）−２−フェニル−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）シクロプロパンアミン、
【０２０７】
（トランス）−２−フェニル−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）シクロプロパンアミン、
【０２０８】
（トランス）−２−フェニル−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）シクロプロパンアミン、
【０２０９】
（トランス）−Ｎ−（（６−メチルピリジン−２−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２１０】
（トランス）−２−フェニル−Ｎ−（チアゾール−２−イルメチル）シクロプロパンアミン、
【０２１１】
（トランス）−２−フェニル−Ｎ−（チオフェン−２−イルメチル）シクロプロパンアミン、
【０２１２】
（トランス）−Ｎ−（（３−ブロモチオフェン−２−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２１３】
（トランス）−Ｎ−（（４−ブロモチオフェン−２−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２１４】
（トランス）−Ｎ−（３，４−ジクロロベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２１５】
（トランス）−Ｎ−（３−フルオロベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミニウム、
【０２１６】
（トランス）−Ｎ−（２−フルオロベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２１７】
（トランス）−２−フェニル−Ｎ−（キノリン−４−イルメチル）シクロプロパンアライン（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎａｒａｉｎｅ）、
【０２１８】
（トランス）−Ｎ−（３−メトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２１９】
（トランス）−２−フェニル−Ｎ−（（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）メチル）シクロプロパンアミン、
【０２２０】
（トランス）−Ｎ−（（６−クロロピリジン−３−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２２１】
（トランス）−Ｎ−（（４−メチルピリジン−２−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２２２】
（トランス）−Ｎ−（（６−メトキシピリジン−２−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２２３】
２−（（（トランス）−２−フェニルシクロプロピルアミノ）メチル）ピリジン−３−オール、
【０２２４】
（トランス）−Ｎ−（（６−ブロモピリジン−２−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２２５】
４−（（（トランス）−２−（４（ベンジルオキシ）フェニル）シクロプロピルアミノ）メチル）ベンゾニトリル、
【０２２６】
（トランス）−Ｎ−（４−（ベンジルオキシ）ベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２２７】
（トランス）−Ｎ−ベンジル−２−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）シクロプロパンアミン、
【０２２８】
（トランス）−２−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−Ｎ−（４−メトキシベンジル）シクロプロパンアミン、
【０２２９】
（トランス）−２−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−Ｎ−（４−フルオロベンジル）シクロプロパンアミン、
【０２３０】
（トランス）−２−フェニル−Ｎ−（キノリン−２−イルメチル）シクロプロパンアミン、
【０２３１】
（トランス）−２−フェニル−Ｎ−（（５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル）メチル）シクロプロパンアミン、
【０２３２】
（トランス）−Ｎ−（（３−フルオロピリジン−２−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２３３】
（トランス）−２−フェニル−Ｎ−（キノリン−３−イルメチル）シクロプロパンアミン、
【０２３４】
（トランス）−Ｎ−（（６−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２３５】
（トランス）−Ｎ−（（５−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２３６】
（トランス）−Ｎ−（（２−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２３７】
（トランス）−Ｎ−（（３Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２３８】
３−（（（トランス）−２−フェニルシクロプロピルアミノ）メチル）ベンゾニトリル、
【０２３９】
（トランス）−Ｎ−（２−メトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２４０】
３−（（（トランス）−２−フェニルシクロプロピルアミノ）メチル）ピリジン−２−アミン、
【０２４１】
（トランス）−Ｎ−（（２−クロロピリジン−３−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２４２】
（トランス）−Ｎ−（３，４−ジメトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２４３】
（トランス）−Ｎ−（（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２４４】
（トランス）−Ｎ−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルメチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２４５】
（トランス）−Ｎ−（（２，，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２４６】
（トランス）−Ｎ−（２，６−ジフルオロ−４−メトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２４７】
（トランス）−２−フェニル−Ｎ−（４−（トリフルオロメトキシ）ベンジル）シクロプロパンアミン、
【０２４８】
（トランス）−Ｎ−（５−フルオロ−２−メトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２４９】
（トランス）−Ｎ−（２−フルオロ−４−メトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２５０】
（トランス）−Ｎ−（（４−メトキシナフタレン−１−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２５１】
（トランス）−Ｎ−（２−フルオロ−６−メトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２５２】
（トランス）−Ｎ−（（２−メトキシナフタレン−１−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２５３】
（トランス）−Ｎ−（（４，７−ジメトキシナフタレン−１−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２５４】
（トランス）−Ｎ−（４−メトキシ−３−メチルベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２５５】
（トランス）−Ｎ−（３−クロロ−４−メトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２５６】
（トランス）−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２５７】
（トランス）−Ｎ−（４−メトキシ−２−メチルベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２５８】
（トランス）−Ｎ−（（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピン−６−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２５９】
（トランス）−Ｎ−（（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピン−７−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２６０】
（トランス）−Ｎ−（（２，２−ジメチルクロマン−６−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２６１】
（トランス）−Ｎ−（４−メトキシ−２，３−ジメチルベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２６２】
（トランス）−Ｎ−（４−メトキシ−２，５−ジメチルベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２６３】
（トランス）−Ｎ−（２−フルオロ−４，５−ジメトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２６４】
（トランス）−Ｎ−（３−クロロ−４，５−ジメトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２６５】
（トランス）−Ｎ−（２−クロロ−３，４−ジメトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２６６】
（トランス）−Ｎ−（２，４−ジメトキシ−６−メチルベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２６７】
（トランス）−Ｎ−（２，５−ジメトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２６８】
（トランス）−Ｎ−（２，３−ジメトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２６９】
（トランス）−Ｎ−（２−クロロ−３−メトキシベンジル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２７０】
（トランス）−Ｎ−（（１Ｈ−インドール−５−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２７１】
（トランス）−２−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）シクロプロパンアミン、
【０２７２】
（トランス）−２−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−Ｎ−（２−メトキシベンジル）シクロプロパンアミン、
【０２７３】
（トランス）−Ｎ−（１−（４−メトキシフェニル）エチル）−２−フェニルシクロプロパンアライン（ｐｈｅｎｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎａｒａｉｎｅ）
【０２７４】
（トランス）−Ｎ−（１−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２７５】
（トランス）−Ｎ−（１−（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）エチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２７６】
（トランス）−Ｎ−（１−（５−フルオロ−２−メトキシフェニル）エチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２７７】
（トランス）−Ｎ−（１−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパン−２−イル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２７８】
（トランス）−Ｎ−（（３−メチル−ｌ，２，４−オキサジアゾール−５−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパンアミン、
【０２７９】
およびそれらの薬学的に許容される塩。
【０２８０】
ＬＳＤ１活性を低減するＢＨＣ８０ポリペプチド
場合によっては、ＬＳＤ１酵素活性を阻害する薬剤は、ＢＨＣ８０ポリペプチドである。ＢＨＣ８０ポリペプチドは、完全長ＢＨＣ８０ポリペプチド、またはＬＳＤ１酵素活性を阻害するＢＨＣ８０ポリペプチドの断片であり得る。
【０２８１】
好適なＢＨＣ８０ポリペプチドは、約２５個のアミノ酸（ａａ）〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約２００ａａ、約２００ａａ〜約３００ａａ、約３００ａａ〜約４００ａａ、約４００ａａ〜約５００ａａ、約５００ａａ〜約６００ａａ、または約６００ａａ〜６３４ａａの長さを有する可能性があり、図１７に示されるアミノ酸配列の約２５個のアミノ酸（ａａ）〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約２００ａａ、約２００ａａ〜約３００ａａ、約３００ａａ〜約４００ａａ、約４００ａａ〜約５００ａａ、約５００ａａ〜約６００ａａ、または約６００ａａ〜６３４ａａの連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可能性がある。
【０２８２】
ＢＨＣ８０ポリペプチドは、ポリペプチドをそれ自体で送達することによって、または細胞中に、ＢＨＣ８０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＢＨＣ８０核酸を導入することによって、細胞中に導入することができる。ＢＨＣ核酸は、図１８Ａおよび１８Ｂに記載されるヌクレオチド配列の約３００ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５００ｎｔ、約５００ｎｔ〜約１０００ｎｔ、約１０００ｎｔ〜約１５００ｎｔ、または約１５００ｎｔ〜１９０５ｎｔの連続した広がりとの、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む可能性がある。
【０２８３】
ＢＨＣ８０核酸は、組換え発現ベクターであり得る。ＢＨＣ８０コードヌクレオチド配列は、発現ベクター中の転写制御要素（複数可）、例えば、プロモーターに作動可能に連結することができる。好適なベクターは、例えば、組換えレトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノウイルス；レトロウイルス発現ベクター、レンチウイルス発現ベクター、核酸発現ベクター、およびプラスミド発現ベクターを含む。場合によっては、発現ベクターは、細胞のゲノム中に組み込まれる。他の場合には、発現ベクターは、細胞中にエピソーム状態で存続する。
【０２８４】
好適な発現ベクターには、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスに基づくウイルスベクター（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３５：２５４３  ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６：５１５  ５２４，１９９９、Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ  ９２：７７００  ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：１０８８  １０９７，１９９９、国際公開第９４／１２６４９号、国際公開第９３／０３７６９号、国際公開第９３／１９１９１号、国際公開第９４／２８９３８号、国際公開第９５／１１９８４号、および国際公開第９５／００６５５号を参照されたい）、アデノ関連ウイルス（例えば、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：８１  ８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：６９１６  ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３８：２８５７  ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：６８３  ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：６４１  ６４８，１９９９、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ５：５９１  ５９４，１９９６、国際公開第９３／０９２３９号におけるＳｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５、およびＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７を参照されたい）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：１０３１９  ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：７８１２  ７８１６，１９９９を参照されたい）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルス等のようなレトロウイルスに由来するベクター）等が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８５】
細胞中のＬＳＤ１のレベルを低減する干渉核酸薬剤
細胞中のＬＳＤ１のレベルを低減する薬剤には、細胞中の活性ＬＳＤ１のレベルを低減する核酸薬剤（「阻害性核酸」）が含まれる。細胞中ＬＳＤ１活性のレベルを低減する（例えば、細胞中のＬＳＤ１総量を低減する）好適な薬剤には、干渉核酸、例えば、干渉ＲＮＡ分子が含まれる。一実施形態では、ＬＳＤ１レベルの低減は、細胞を、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子等の小核酸分子と接触させることによるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を通じて、あるいはＬＳＤ１の減少したレベルを提供するための小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の発現の調節を通じて、遂行される。
【０２８６】
ＬＳＤ１特異的干渉核酸は、ＬＳＤ１コードヌクレオチド配列のヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、幾つかの実施形態では、配列番号２または配列番号４に記載されるＬＳＤ１コードヌクレオチド配列を使用して、干渉核酸が設計される。
【０２８７】
細胞中のＬＳＤ１のレベルを低減する薬剤には、細胞中のＣｏＲＥＳＴの発現を低減し、それが次に細胞中の活性ＬＳＤ１ポリペプチドのレベルを低減する、核酸薬剤（「阻害性核酸」）が含まれる。細胞中のＣｏＲＥＳＴの発現を低減する好適な薬剤には、干渉核酸、例えば、干渉ＲＮＡ分子が含まれる。一実施形態では、ＣｏＲＥＳＴ発現の低減は、細胞を、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子等の小核酸分子と接触させることによるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を通じて、あるいはＣｏＲＥＳＴの減少した発現を提供し、それによってＬＳＤ１ポリペプチドのレベルを減少させるための小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の発現の調節を通じて、遂行される。
【０２８８】
ＣｏＲＥＳＴ特異的干渉核酸は、ＣｏＲＥＳＴコードヌクレオチド配列のヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、幾つかの実施形態では、図１６に記載されるＣｏＲＥＳＴコードヌクレオチド配列を使用して、干渉核酸が設計される。
【０２８９】
本明細書で使用される「短干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「短干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「短干渉核酸分子」、「短干渉オリゴヌクレオチド分子」、または「化学修飾された短干渉核酸分子」という用語は、例えば、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」を媒介することによって、または配列特異的様態での遺伝子サイレンシングによって、遺伝子発現を阻害または下方調節することが可能な、任意の核酸分子を指す。標的遺伝子を与えられたときのＲＮＡｉ分子の設計は、当該技術分野で日常的である。米国特許第２００５／０２８２１８８号（それは参照により本明細書に組み込まれる）ならびにそこで引用される参考文献もまた参照されたい。例えば、Ｐｕｓｈｐａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００６  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；３３（５−６）：５０４−１０、Ｌｕｔｚｅｌｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｈａｎｄｂ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６；（１７３）：２４３−５９、Ａｒｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６  Ｍａｒ；１３（６）：５０９−１６、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．２００６  Ｊａｎ；１１（１−２）：６７−７３、Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５；１２（２６）：３１４３−６１、およびＰｅｋａｒａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ．２００５  Ｄｅｃ  １５；６８（１−２）：１１５−２０．Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｓｅｐ  ９を参照されたい。
【０２９０】
所望の標的に対するｓｉＲＮＡの設計および生成のための方法は、当該技術分野で既知であり、本明細書に開示される目的のための、それらのＬＳＤ１遺伝子またはＣｏＲＥＳＴ遺伝子への適用は、当業者に容易に明らかとなり、例えば、強化された安定性、生物学的利用能、および治療薬としての使用を強化するための他の特性を提供するための修飾（例えば、化学修飾）を有するｓｉＲＮＡを生成する方法も同様である。更に、ｓｉＲＮＡの製剤化および対象への送達ための方法もまた、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第２００５／０２８２１８８号、米国特許第２００５／０２３９７３１号、米国特許第２００５／０２３４２３２号、米国特許第２００５／０１７６０１８号、米国特許第２００５／００５９８１７号、米国特許第２００５／００２０５２５号、米国特許第２００４／０１９２６２６号、米国特許第２００３／００７３６４０号、米国特許第２００２／０１５０９３６号、米国特許第２００２／０１４２９８０号、および米国特許第２００２／０１２０１２９号を参照されたく、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９１】
ｓｉＲＮＡの設計を促進するための一般に入手可能なツールは、当該技術分野で入手可能である。例えば、ＤＥＱＯＲ：Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＲＮＡｉ（インターネット上で、ｃｌｕｓｔｅｒ−１．ｍｐｉ−ｃｂｇ．ｄｅ／Ｄｅｑｏｒ／ｄｅｑｏｒ．ｈｔｍｌにて入手可能）を参照されたい。Ｈｅｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４  Ｊｕｌ  １；３２（ウェブサーバー発行）：Ｗ１１３−２０もまた参照されたい。ＤＥＱＯＲは、ｓｉＲＮＡ設計についての最先端のパラメータに基づくスコアリング体系を使用して、ｓｉＲＮＡの阻害効力を評価する、ウェブベースのプログラムである。ＤＥＱＯＲは、したがって、（ｉ）塩基対組成に基づく高いサイレンシング能力を示す遺伝子中の領域、および（ｉｉ）化学合成のための高いサイレンシング可能性を有するｓｉＲＮＡを予測する一助となり得る。更に、インプットクエリから発生する各ｓｉＲＮＡは、クロスサイレンシング活性の可能性について、ＢＬＡＳＴ検索を、選択された生物のトランスクリプトームまたはゲノムに対比して行うことによって評価される。ＤＥＱＯＲは、したがって、ｍＲＮＡ断片が細胞中の他の遺伝子と交差反応する確率を予測することができ、研究者らが、ｓｉＲＮＡまたは化学設計されたｓｉＲＮＡの特異性を試験するための実験を設計する一助となる。
【０２９２】
ＬＳＤ１発現を低減するのに好適なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ配列には、例えば、５’−ＧＡＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＡＧＣＡＡＴＡ−３’（配列番号３６）が含まれる。
【０２９３】
ｓｉＮＡ分子は、多様な形態のいずれの分子でもあり得る。例えば、ｓｉＮＡは、自己相補的センスおよびアンチセンス領域を含む２本鎖ポリヌクレオチド分子であり得、ここでアンチセンス領域は、標的核酸分子またはその部分におけるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその部分に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡはまた、２つの別個のオリゴヌクレオチドから組み立てることもでき、ここで一方の鎖はセンス鎖であり、他方はアンチセンス鎖であり、アンチセンスおよびセンス鎖は、自己相補的である。この実施形態では、各鎖は一般に、他方の鎖におけるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、すなわち、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、例えば、２本鎖領域が約１５塩基対〜約３０塩基対、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基対である、二重鎖または２本鎖構造を形成する場合等があり、そのアンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその部分におけるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そのセンス鎖は、標的核酸配列またはその部分に対応するヌクレオチド配列を含む（例えば、ｓｉＮＡ分子の約１５ヌクレオチド〜約２５以上のヌクレオチドが標的核酸またはその部分に相補的である）。
【０２９４】
代替的に、ｓｉＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、ここでｓｉＮＡの自己相補的センスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースのまたは非核酸ベースのリンカー（複数可）によって連結される。ｓｉＮＡは、二重鎖、非対称二重鎖、自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有する、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を備えるポリヌクレオチドであり得、ここでアンチセンス領域は、別個の標的核酸分子またはその部分におけるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその部分に対応するヌクレオチド配列を有する。
【０２９５】
ｓｉＮＡは、自己相補的センスおよびアンチセンス領域を含む、２つ以上のループ構造およびステムを有する環状１本鎖ポリヌクレオチドであり得、ここでアンチセンス領域は、標的核酸分子またはその部分におけるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその部分に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロのいずれかでプロセスされて、ＲＮＡｉを媒介することが可能な活性ｓｉＮＡ分子を産生することができる。ｓｉＮＡはまた、標的核酸分子またはその部分におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する１本鎖ポリヌクレオチドを含む可能性もあり（例えば、かかるｓｉＮＡ分子が、標的核酸配列またはその部分に対応するヌクレオチド配列のｓｉＮＡ分子内の存在を要求しない場合）、ここで１本鎖ポリヌクレオチドは、５’−リン酸塩（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３−５７４およびＳｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，１０，５３７−５６８を参照されたい）、または５’，３’−二リン酸塩等の末端リン酸基を更に含む可能性がある。
【０２９６】
ある種の実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、別個のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含有し、ここでセンスおよびアンチセンス領域は、当該技術分野で既知であるように、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合されるか、代替的に、イオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および／またはスタッキング相互作用によって非共有で結合される。ある種の実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列と、標的遺伝子の発現の阻害を引き起こす様態で相互作用する。
【０２９７】
本明細書で使用されるとき、ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はないが、化学修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを更に包含する。ある種の実施形態では、短干渉核酸分子は、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠いている。ｓｉＮＡは、ＲＮＡｉを媒介するために、必ずしも２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を要求するわけではなく、したがって、ｓｉＮＡ分子は、任意にいずれのリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）も含まない。ＲＮＡｉを支持するためにｓｉＮＡ分子内にリボヌクレオチドの存在を要求しないかかるｓｉＮＡ分子は、しかしながら、２’−ＯＨ基を有する１つ以上のヌクレオチドを含有する、結合されたリンカー（単数または複数）または他の結合されたもしくは関連する基、部分、もしくは鎖を有する可能性がある。任意に、ｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド位置の約５、１０、２０、３０、４０、または５０％において、リボヌクレオチドを含む可能性がある。修飾された短干渉核酸分子はまた、短干渉修飾オリゴヌクレオチド「ｓｉＭＯＮ」と称される可能性がある。
【０２９８】
本明細書で使用されるとき、ｓｉＮＡという用語は、配列特異的ＲＮＡｉを媒介することが可能である核酸分子、例えば、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、短干渉核酸、短干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、およびその他を説明するために使用される他の用語と同等であることが意図される。更に、本明細書で使用されるとき、ＲＮＡｉという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、または後成的発現等の、配列特異的ＲＮＡ干渉を説明するために使用される他の用語と同等であることが意図される。例えば、ｓｉＮＡ分子を使用して、標的遺伝子を、転写後レベル、転写前レベル、または転写後および転写前両方のレベルで、後成的にサイレンシングすることができる。非限定的例において、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の後成的調節は、遺伝子発現を変化させるためのクロマチン構造またはメチル化パターンのｓｉＮＡ媒介型修飾からもたらされる可能性がある（例えば、Ｖｅｒｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６７２−６７６、Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６６９−６７２、Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９、Ｖｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７、Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８、およびＨａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照されたい）。
【０２９９】
本明細書で企図されるｓｉＮＡ分子は、二重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）を含む可能性があり、例えば、国際公開第０５／０１９４５３号、および米国特許第２００５／０２３３３２９号を参照されたく、それらは参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書で企図されるｓｉＮＡ分子はまた、多機能性ｓｉＮＡも含む（例えば、国際公開第０５／０１９４５３号および米国特許第２００４／０２４９１７８号を参照されたい）。多機能性ｓｉＮＡは、配列標的化、例えば、ＬＳＤ１の２つの領域、またはＣｏＲＥＳＴの２つの領域を含む可能性がある。
【０３００】
本明細書で企図されるｓｉＮＡ分子は、非対称ヘアピンまたは非対称二重鎖を含む可能性がある。本明細書で使用される「非対称ヘアピン」とは、アンチセンス領域、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含み得るループ部分、およびセンス領域が、アンチセンス領域と塩基対形成し、ループを備える二重鎖を形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する程度に、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含むセンス領域を含む、直鎖ｓｉＮＡ分子を意味する。例えば、非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、細胞中またはインビトロ系におけるＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例えば、約１５〜約３０、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域、および約４〜約１２（例えば、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）ヌクレオチドを含むループ領域、およびアンチセンス領域に相補的である約３〜約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチドを有するセンス領域を含む可能性がある。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子はまた、化学修飾することができる５’末端リン酸基を含む可能性もある。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は、本明細書に記載されるヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、または共役分子を含む可能性がある。
【０３０１】
本明細書で使用される「非対称二重鎖」とは、センス領域およびアンチセンス領域を含む２つの別個の鎖を有するｓｉＮＡ分子を意味し、ここでセンス領域は、センス領域が、アンチセンス領域と塩基対形成し、二重鎖を形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する程度に、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含むセンス領域を含む。例えば、非対称二重鎖ｓｉＮＡ分子は、細胞中またはインビトロ系におけるＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例えば、約１５〜約３０、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域、およびアンチセンス領域に相補的である約３〜約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチドを有するセンス領域を含む可能性がある。
【０３０２】
ｓｉＲＮＡの安定性および／または半減期は、核酸分子を、血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を予防することができる修飾（塩基、糖、および／またはリン酸塩）を用いて化学的に合成することを通じて改善することができ、それは、それらの効力を増加させることができる（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎらの国際公開第ＷＯ９２／０７０６５号、Ｐｅｒｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４，５６５、Ｐｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３，３１４、Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  １７，３３４、Ｕｓｍａｎらの国際公開第ＷＯ９３／１５１８７号、およびＲｏｓｓｉらの国際公開第ＷＯ９１／０３１６２号、Ｓｐｒｏａｔの米国特許第５，３３４，７１１号、Ｇｏｌｄらの米国特許第６，３００，０７４号、ならびに上記のＢｕｒｇｉｎらを参照されたく、それらの全ては、参照により本明細書に組み込まれ、本明細書に記載される核酸分子の塩基、リン酸塩、および／または糖部分に対して行うことができる種々の化学修飾を記載する。細胞中のそれらの有効性を強化する修飾、およびオリゴヌクレオチド合成時間を短縮し、化学的要件を低減するための、核酸分子からの塩基の除去が所望される。
【０３０３】
例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈでの修飾、ヌクレオチド塩基修飾によって、安定性を強化するおよび／または生物学的活性を強化するために修飾される（概説については、Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ．１７，３４、Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３、Ｂｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０を参照されたい）。核酸分子の糖修飾は、当該技術分野で後半に記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎらの国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９２／０７０６５号、Ｐｅｒｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４，５６５−５６８、Ｐｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５３，３１４−３１７、Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９２，１７，３３４−３３９、Ｕｓｍａｎらの国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９３／１５１８７号、Ｓｐｒｏａｔの米国特許第５，３３４，７１１号およびＢｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２５７０２、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらの国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９７／２６２７０号、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらの米国特許第５，７１６，８２４号、Ｕｓｍａｎらの米国特許第５，６２７，０５３号、Ｗｏｏｌｆらの国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９８／１３５２６号、１９９８年４月２０日に出願されたＴｈｏｍｐｓｏｎらの米国特許第６０／０８２，４０４号、Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１、Ｅａｍｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｇａｉｔ，１９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９−５５、Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９−１３４、ならびにＢｕｒｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１９９９−２０１０を参照されたく、それらの各々は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。かかる教示を考慮して、細胞中のＲＮＡｉを助長するｓｉＮＡの能力が有意に阻害されない限り、同様の修飾を、本明細書に記載されるように使用して、本明細書に開示されるｓｉＮＡ核酸分子を修飾することができる。
【０３０４】
活性を維持または強化する化学修飾を有する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子が、本明細書で企図される。かかる核酸はまた、一般に、修飾されていない核酸よりも、ヌクレアーゼに対してより抵抗性がある。したがって、インビトロおよび／またはインビボ活性は、有意に低下されるべきでない。外来性で送達される核酸分子は、一般に、少なくとも、標的ＲＮＡの転写および／または翻訳が生じるのに、ならびに標的遺伝子産物のレベルの低減を促進するように、コードされたｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドの生成の調節を提供するのに十分な期間にわたって、細胞内で安定であるように選択される。
【０３０５】
ＲＮＡおよびＤＮＡ分子の生成は、合成的に遂行することができ、強化されたヌクレアーゼ安定性を提供するためのヌクレオチド修飾の導入を提供することができる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３、２６７７、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９を参照されたい。一実施形態では、核酸分子は、１つ以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える）Ｇ−クランプヌクレオチドを含み、それは、相補的グアニン二重鎖内のワトソンクリック面およびフーグスティーン面の両方に水素結合する能力を付与する、修飾されたシトシン類似体であり、核酸標的に対する強化された親和性および特異性を提供することができる（例えば、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，８５３１−８５３２を参照されたい）。別の例では、核酸分子は、２’，４’−Ｃメチレンビシクロヌクレオチド等の１つ以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える）ＬＮＡ「ロックト核酸」ヌクレオチドを含む可能性がある（例えば、Ｗｅｎｇｅｌらの国際公開第００／６６６０４号および国際公開第９９／１４２２６号を参照されたい）。
【０３０６】
ｓｉＮＡ分子は、例えば、ｓｉＮＡ分子の細胞中への送達を促進するために、共役体および／または複合体として提供することができる。例示的な共役体および／または複合体には、ｓｉＮＡおよび小分子、脂質、コレステロール、リン脂質、ヌクレオシド、抗体、毒素、負電荷性重合体からなるものが含まれる（例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール、またはポリアミン）。一般に、記載される輸送体は、個々にまたは多成分系の一部としてのいずれかで、分解性リンカーを用いてまたは用いずに使用されるように設計される。これらの化合物は、血清の存在または不在下で、核酸分子の細胞中への送達および／または局在化を改善することができる（例えば、米国特許第５，８５４，０３８号を参照されたい）。本明細書に記載される分子の共役体は、生物学的に活性な分子に、生分解性核酸リンカー分子等の生分解性であるリンカーを介して結合することができる。
【０３０７】
ドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴポリペプチド薬剤
上述のように、場合によっては、細胞中の酵素的に活性なＬＳＤ１のレベルを低減する薬剤は、細胞中のＣｏＲＥＳＴのＬＳＤ１への結合を阻害する薬剤である。場合によっては、薬剤は、ＬＳＤ１ポリペプチドに結合するが、ＬＳＤ１ポリペプチドの酵素活性を強化しない、ＣｏＲＥＳＴポリペプチドである。かかるＣｏＲＥＳＴポリペプチドは、ドミナントネガティブポリペプチドと見なされる可能性がある。好適なドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴポリペプチドには、約５個のアミノ酸〜約２７５個のアミノ酸の長さを有するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されず、ここでドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴポリペプチドは、図１５に記載されるＣｏＲＥＳＴアミノ酸配列（配列番号８）のアミノ酸１０５〜３８１の約５個のアミノ酸〜約２７５個のアミノ酸の連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３０８】
例えば、好適なドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴポリペプチドは、約５個のアミノ酸〜８８個のアミノ酸（例えば、約５個のアミノ酸（ａａ）〜約１０ａａ、約１０ａａ〜約１５ａａ、約１５ａａ〜約２０ａａ、約２０ａａ〜約２５ａａ、約２５ａａ〜約３０ａａ、約３０ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約８０ａａ、または約８０ａａ〜８８ａａ）の長さを有し、次の配列の約５個のアミノ酸〜８８個のアミノ酸（例えば、ドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴポリペプチドと同じ長さのアミノ酸の連続した広がりに対して、例えば、約１０ａａ、約１０ａａ〜約１５ａａ、約１５ａａ〜約２０ａａ、約２０ａａ〜約２５ａａ、約２５ａａ〜約３０ａａ、約３０ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約８０ａａ、または約８０ａａ〜８８ａａ）の連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：ｖｋｋｅｋｈｓｔ  ｑａｋｎｒａｋｒｋｐ  ｐｋｇｍｆｌｓｑｅｄ  ｖｅａｖｓａｎａｔａ  ｔｔｖｌｒｑｌｄｍ  ｅｌｖｓｖｋｒｑｉｑ  ｎｉｋｑｔｎｓａｌｋ  ｅｋｌｄｇｇｉｅｐｙ  ｒｌｐｅｖｉｑｋｃｎ  ａ（配列番号３７）。
【０３０９】
非限定的な例として、ドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴポリペプチドは、次のアミノ酸配列のものであり得る：
【０３１０】
１）ｑａｋｎｒａｋｒｋｐ  ｐｋｇｍｆｌｓｑｅｄ  ｖｅａｖｓａｎａｔａ（配列番号３８）、
【０３１１】
２）ｔｔｖｌｒｑｌｄｍ  ｅｌｖｓｖｋｒｑｉｑ  ｎｉｋｑｔｎｓａｌｋ（配列番号３９）、
【０３１２】
３）ｅｌｖｓｖｋｒｑｉｑ  ｎｉｋｑｔｎｓａｌｋ  ｅｋｌｄｇｇｉｅｐｙ（配列番号４０）、
【０３１３】
４）ｎｉｋｑｔｎｓａｌｋ  ｅｋｌｄｇｇｉｅｐｙ  ｒｌｐｅｖｉｑｋｃｎ（配列番号４１）、
【０３１４】
５）ｖｋｋｅｋｈｓｔ  ｑａｋｎｒａｋｒｋｐ  ｐｋｇｍｆｌｓｑｅｄ（配列番号４２）、
【０３１５】
６）ｑａｋｎｒａｋｒｋｐ  ｐｋｇｍｆｌｓｑｅｄ  ｖｅａｖｓａｎａｔａ  ｔｔｖｌｒｑｌｄｍ  ｅｌｖｓｖｋｒｑｉｑ  ｎｉｋｑｔｎｓａｌｋ  ｅｋｌｄｇｇｉｅｐｙ（配列番号４３）、
【０３１６】
７）ｐｋｇｍｆｌｓｑｅｄ  ｖｅａｖｓａｎａｔａ  ｔｔｖｌｒｑｌｄｍ  ｅｌｖｓｖｋｒｑｉｑ  ｎｉｋｑｔｎｓａｌｋ  ｅｋｌｄｇｇｉｅｐｙ  ｒｌｐｅｖｉｑｋｃｎ（配列番号４４）、
【０３１７】
８）ｐｋｇｍｆｌｓｑｅｄ  ｖｅａｖｓａｎａｔａ  ｔｔｖｌｒｑｌｄｍ  ｅｌｖｓｖｋｒｑｉｑ  ｎｉｋｑｔｎｓａｌｋ  ｅｋｌｄｇｇｉｅｐｙ（配列番号４５）、
【０３１８】
９）ｖｅａｖｓａｎａｔａ  ｔｔｖｌｒｑｌｄｍ  ｅｌｖｓｖｋｒｑｉｑ  ｎｉｋｑｔｎｓａｌｋ  ｅｋｌｄｇｇｉｅｐｙ（配列番号４６）、および
【０３１９】
１０）ｖｋｋｅｋｈｓｔ  ｑａｋｎｒａｋｒｋｐ  ｐｋｇｍｆｌｓｑｅｄ  ｖｅａｖｓａｎａｔａ  ｔｔｖｌｒｑｌｄｍ  ｅｌｖｓｖｋｒｑｉｑ  ｎｉｋｑｔｎｓａｌｋ  ｅｋｌｄｇｇｉｅｐｙ  ｒｌｐｅｖｉｑｋｃｎ  ａ（配列番号３７）。
【０３２０】
ドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴポリペプチドは、１つ以上の非相同アミノ酸配列を含む可能性がある。例えば、ドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴポリペプチドは、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む可能性がある。「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、または小胞膜を横切るのを促進する、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機もしくは無機化合物を指す。別の分子に結合されるＰＴＤは、膜を横切る、例えば、細胞外空間から細胞内空間へと、またはサイトゾルからオルガネラ内へと進む分子を促進する。幾つかの実施形態では、ＰＴＤは、ポリペプチドのアミノ末端に共有結合される。幾つかの実施形態では、ＰＴＤは、ポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合される。
【０３２１】
例示的なポリペプチドＰＴＤには、最小のウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（配列番号４７、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを含むＨＩＶ−１  Ｔａｔの残基４７〜５７に対応する）、細胞中への侵入を導くのに十分な幾つかのアルギニンを含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０個のアルギニン）、ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９−９６）、ショウジョウバエ・アンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２（７）：１７３２−１７３７）、切頭ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１２４８−１２５６）、ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３００３−１３００８）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号４８）、トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号４９）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号５０）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５１）が含まれるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤには、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４７）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号５２）、３個のアルギニン残基〜５０個のアルギニン残基のアルギニン同種重合体が含まれるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列には、次のうちのいずれかが含まれるが、これらに限定されない：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４７）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号５３）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号５４）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号５５）、およびＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号５６）。
【０３２２】
ドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴポリペプチド−融合タンパク質は、例えば、Ｎ末端〜Ｃ末端：１）ＰＴＤ−ドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴ、または２）ドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴ−ＰＴＤを含む可能性がある。ＰＴＤはまた、ドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴポリペプチド内に挿入することもできる。
【０３２３】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤
場合によっては、細胞中のＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を低減する薬剤は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、例えば、ヒストンデアセチラーゼ−１（ＨＤＡＣ１）またはヒストンデアセチラーゼ−２（ＨＤＡＣ２）阻害剤である。
【０３２４】
クラスＩ  ＨＤＡＣには、ＨＤＡＣ  １、２、３、および８が含まれる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００４９５５（ＨＤＡＣ１）、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００１５１８（ＨＤＡＣ２）、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００３８７４（ＨＤＡＣ３）、およびＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０６０９５６（ＨＤＡＣ８）を参照されたい。
【０３２５】
クラスＩＩ  ＨＤＡＣには、ＨＤＡＣ  ４、５、６、７、９、および１０が含まれる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００６０２８（ＨＤＡＣ  ４）、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿６３１９４４（ＨＤＡＣ５）、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００６０３５（ＨＤＡＣ６）、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０５７６８０（ＨＤＡＣ７）、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿４７８０５６（ＨＤＡＣ９）、およびＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿１１４４０８（ＨＤＡＣ１０）を参照されたい。例えば、Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｇｒeｇｏｉｒｅ（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：２８７３もまた参照されたい。
【０３２６】
クラスＩＩＩ  ＨＤＡＣには、Ｓｉｒｔ１、Ｓｉｒｔ２、Ｓｉｒｔ３、Ｓｉｒｔ４、Ｓｉｒｔ５、Ｓｉｒｔ６、およびＳｉｒｔ７が含まれる。例えば、Ｂｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ（２００４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：４１７、およびＢｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．７５：９３９を参照されたい。
【０３２７】
ＨＤＡＣ阻害剤は、当該技術分野で既知であり、多様なＨＤＡＣ阻害剤のうちのいずれを使用することもできる。場合によっては、ＨＤＡＣ阻害剤は、全てのクラスＩ  ＨＤＡＣを阻害するが、いかなるクラスＩＩ  ＨＤＡＣまたはいかなるクラスＩＩＩ  ＨＤＡＣも実質的に阻害しない。場合によっては、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣ１を特異的に阻害する（かつ他のＨＤＡＣポリペプチドを実質的に阻害せず、例えば、ＨＤＡＣ  ２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはいかなるクラスＩＩＩ  ＨＤＡＣも実質的に阻害しない）。場合によっては、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣ２を特異的に阻害する（かつ他のＨＤＡＣポリペプチドを実質的に阻害せず、例えば、ＨＤＡＣ  １、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはいなかるクラスＩＩＩ  ＨＤＡＣも実質的に阻害しない）。場合によっては、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２の両方を阻害するが、他のＨＤＡＣポリペプチドを実質的に阻害せず、例えば、ＨＤＡＣ  ３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはいかなるクラスＩＩＩ  ＨＤＡＣも実質的に阻害しない。
【０３２８】
ＨＤＡＣ阻害剤の例としては、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（（Ｒ，２Ｅ，４Ｅ）−７−（４−（ジメチルアミノ）フェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソヘプタ−２，４−ジエンアミド）、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド（ＳＡＨＡ）、スルホンアミド等のオキサムフラチン（（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−５−（３−（フェニルスルホンアミド）フェニル）ペンタ−２−エン−４−イナミド）、およびベリノスタット（ＰＸＤ１０１）（（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−（４−（Ｎ−フェニルスルファモイル）フェニル）アクリルアミド）が挙げられる。他のヒドロキサム酸−スルホンアミドの阻害剤ヒストンデアセチラーゼは、以下に記載される：Ｌａｖｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１：２８４７−５０、Ｂｏｕｃｈａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８４６：８２０−８３０、Ｂｏｕｃｈａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０：２３５９−２３７２、Ｍａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：２４７７−２４８１、Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８８：１６３０−１６５７、国際公開第２００２０３０８７９号、国際公開第２００３０８２２８８号、国際公開第２００５００１１６６１号、国際公開第２００５１０８３６７号、国際公開第２００６１２３１２１号、国際公開第２００６０１７２１４号、国際公開第２００６０１７２１５号、および米国特許第２００５／０２３４０３３号。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の他の構造的クラスは、短鎖脂肪酸、環式ペプチド、およびベンズアミドを含む。Ａｃｈａｒｙａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６８：９１７−９３２。
【０３２９】
ＨＤＡＣ阻害剤の更なる例としては、例えば、Ｄｏｋｍａｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：９８１、米国特許第７，６４２，２７５号、米国特許第７，６８３，１８５号、米国特許第７，７３２，４７５号、米国特許第７，７３７，１８４号、米国特許第７，７４１，４９４号、米国特許第７，７７２，２４５号、米国特許第７，７９５，３０４号、米国特許第７，７９９，８２５号、米国特許第７，８０３，８００号、米国特許第７，８４２，７２７号、米国特許第７，８４２，８３５号、米国特許公開第２０１０／０３１７７３９号、米国特許公開第２０１０／０３１１７９４号、米国特許公開第２０１０／０３１０５００号、米国特許公開第２０１０／０２９２３２０号、および米国特許公開第２０１０／０２９１００３号に開示されるものが挙げられる。場合によっては、所与のＨＤＡＣ阻害剤またはＨＤＡＣ阻害剤のクラスは、具体的に除外される。例えば、場合によっては、ＴＳＡは、具体的に除外される。
【０３３０】
治療法；ＬＳＤ１酵素活性を低減するおよび／またはＬＳＤ１レベルを低減するおよび／またはＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を低減する薬剤を投与する
本開示は、個体における免疫不全ウイルス感染症を治療するための方法を提供し、その方法は一般に、個体に、個体における細胞（例えば、免疫不全ウイルス感染細胞）中のＬＳＤ１ポリペプチドの酵素活性を阻害するおよび／もしくはＬＳＤ１ポリペプチドのレベルを低減する、ならびに／または細胞中のメチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する、有効量の薬剤を投与することを伴う。ＬＳＤ１酵素活性の阻害剤は、免疫不全ウイルスに感染した細胞中の免疫不全ウイルスのレベルを低減し、それを使用して、個体における免疫不全ウイルス感染症を治療することができる。同様に、細胞中のＬＳＤ１ポリペプチドのレベルを低減する薬剤は、免疫不全ウイルスに感染した細胞中の免疫不全ウイルスのレベルを低減し、それを使用して、個体における免疫不全ウイルス感染症を治療することができる。同様に、細胞中のメチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤は、免疫不全ウイルスに感染した細胞中の免疫不全ウイルスのレベルを低減し、それを使用して、個体における免疫不全ウイルス感染症を治療することができる。
【０３３１】
ＬＳＤ１酵素活性を低減する薬剤には、次のものが含まれる：１）ＬＳＤ１阻害剤である小分子薬剤、および２）ＢＨＣ８０ポリペプチド。
【０３３２】
ＬＳＤ１の酵素活性を低減し、対象治療法において使用するのに好適である小分子薬剤（本明細書で「ＬＳＤ１阻害剤」とも称される）には、ＬＳＤ１酵素活性もまた阻害するモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）阻害剤、ＬＳＤ１酵素活性を阻害するポリアミン化合物、ＬＳＤ１酵素活性を阻害するフェニルシクロプロピルアミン誘導体等が含まれる。かかる薬剤は、以上に、ならびに例えば、米国特許公開第２００７／０２０８０８２号、国際公開第２０１０／０４３７２１号、および国際公開第２０１０／０８４１６０号に記載される。
【０３３３】
ＬＳＤ１の酵素活性を低減し、対象治療法において使用するのに好適である他の薬剤には、上述されるＢＨＣ８０ポリペプチドが含まれる。
【０３３４】
細胞中のＬＳＤ１のレベル、例えば、酵素的に活性なＬＳＤ１のレベルを低減し、対象治療法において使用するのに好適である薬剤には、次のものが含まれる：１）上述されるＬＳＤ１発現を特異的に低減する阻害性核酸薬剤、２）上述されるＣｏＲＥＳＴ発現を低減する阻害性核酸薬剤、および３）ドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴポリペプチド。
【０３３５】
メチル化ＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤には、ＨＤＡＣ阻害剤が含まれる。
【０３３６】
幾つかの実施形態では、ＬＳＤ１ポリペプチドの酵素活性を阻害するおよび／またはＬＳＤ１ポリペプチドのレベルを低減するおよび／またはメチル化ＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤の「有効量」は、個体に、１回以上の用量で、単剤療法または併用療法において投与されるとき、個体における免疫不全ウイルス負荷を、薬剤での治療の不在下での個体における免疫不全ウイルス負荷と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％を超えて低減するのに有効である量である。
【０３３７】
幾つかの実施形態では、ＬＳＤ１ポリペプチドの酵素活性を阻害するおよび／またはＬＳＤ１ポリペプチドのレベルを低減するおよび／またはメチル化ＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤の「有効量」は、個体に、１回以上の用量で、単剤療法または併用療法において投与されるとき、個体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の数を、薬剤での治療の不在下での個体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の数と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍を超えて増加させるのに有効である量である。
【０３３８】
多様な方法のいずれを使用しても、治療法が有効であるかどうかを決定することができる。例えば、対象方法および／または所与のＬＳＤ１阻害剤が、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）ウイルス負荷を低減すること、および／または免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）感染症を治療することにおいて有効であるかどうかを決定する方法は、ウイルス負荷を、例えば、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）ポリヌクレオチド配列に特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、例えば、生物学的試料中の免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）の量を測定することによって測定すること；免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）によってコードされるポリペプチド、例えば、ｐ２４、ｇｐ１２０、逆転写酵素を、例えば、そのポリペプチドに特異的な抗体を用いる酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等の免疫学的アッセイを使用して検出および／または測定すること；ならびに個体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数を測定することを含むが、これらに限定されない、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）感染症の兆候についての任意の既知の試験である。
【０３３９】
（ＨＩＶ）感染症（または（ＨＩＶ）感染症に関連する任意の兆候）をアッセイする方法は、当該技術分野で既知であり、ＨＩＶプロトコル（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１７）Ｎ．Ｌ．Ｍｉｃｈａｅｌ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈ．Ｋｉｍ，ｅｄｓ．（１９９９）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ等の多数の刊行物に記載されている。
【０３４０】
潜伏ＨＩＶを再活性化する方法
本開示は、細胞のゲノム中に組み込まれたＨＩＶゲノムを含む細胞（例えば、ＨＩＶ感染細胞）のゲノム中に組み込まれた潜伏ＨＩＶを再活性化する方法を提供する。本方法は一般に、ＨＩＶが潜伏しているＨＩＶ感染細胞を、細胞内でＬＳＤ１酵素活性を増加させる薬剤と接触させることを伴う。潜在的に感染した細胞は、転写レベルで遮断され、ウイルスタンパク質発現の不在をもたらす、自己増殖能を有する組込み型ＨＩＶ−１ゲノムを含有する。
【０３４１】
細胞中のＬＳＤ１のレベルを増加させる薬剤には、次のものが含まれる：ＬＳＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、およびＬＳＤ１ポリペプチド。故に、ＨＩＶ感染細胞のゲノム中に組み込まれた潜伏ＨＩＶを再活性化するための対象方法は、ＨＩＶ感染細胞を、ＬＳＤ１ポリペプチドと、またはＬＳＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、接触させることを含む可能性がある。
【０３４２】
好適なＬＳＤ１ポリペプチドは、上述される。幾つかの実施形態では、ＬＳＤ１ポリペプチドは、タンパク質形質導入ドメインを含む。
【０３４３】
「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、または小胞膜を横切るのを促進する、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機もしくは無機化合物を指す。別の分子に結合されるＰＴＤは、膜を横切る、例えば、細胞外空間から細胞内空間へと、またはサイトゾルからオルガネラ内へと進む分子を促進する。幾つかの実施形態では、ＰＴＤは、ＬＳＤ１ポリペプチドのアミノ末端に共有結合される。幾つかの実施形態では、ＰＴＤは、ＬＳＤ１ポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合される。
【０３４４】
例示的なタンパク質形質導入ドメインには、最小のウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（配列番号４７、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを含むＨＩＶ−１  Ｔａｔの残基４７〜５７に対応する）、細胞中への侵入を導くのに十分な幾つかのアルギニンを含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０個のアルギニン）、ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９−９６）、ショウジョウバエ・アンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２（７）：１７３２−１７３７）、切頭ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１２４８−１２５６）、ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３００３−１３００８）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号４８）、トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号４９）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号５０）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５１）が含まれるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤには、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４７）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号５２）、３個のアルギニン残基〜５０個のアルギニン残基のアルギニン同種重合体が含まれるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列には、次のうちのいずれかが含まれるが、これらに限定されない：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４７）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号５３）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号５４）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号５５）、およびＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号５６）。
【０３４５】
好適な核酸は、図９Ａおよび９Ｂに示され、配列番号２に記載されるヌクレオチド配列の約２４００ヌクレオチド〜約２５００ヌクレオチド、または２５００ヌクレオチド〜２５５９ヌクレオチドの連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含む。好適な核酸は、図１１Ａおよび１１Ｂに示され、配列番号４に記載されるヌクレオチド配列の約２５００ヌクレオチド〜約２６００ヌクレオチド、または２６００ヌクレオチド〜２６３１ヌクレオチドの連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含む。好適な核酸は、酵素的に活性なＬＳＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。核酸は、それが導入される宿主細胞に対して外来性である。
【０３４６】
ＬＳＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外来性核酸は、組換え発現ベクターであり得、ここで好適なベクターは、例えば、組換えレトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノウイルス；レトロウイルス発現ベクター、レンチウイルス発現ベクター、核酸発現ベクター、およびプラスミド発現ベクターを含む。場合によっては、１つ以上の外来性核酸が、細胞のゲノム中に組み込まれる。他の場合には、１つ以上の外来性核酸は、細胞中にエピソーム状態で存続する。
【０３４７】
好適な発現ベクターには、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスに基づくウイルスベクター（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３５：２５４３  ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６：５１５  ５２４，１９９９、Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ  ９２：７７００  ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：１０８８  １０９７，１９９９、国際公開第９４／１２６４９号、国際公開第９３／０３７６９号、国際公開第９３／１９１９１号、国際公開第９４／２８９３８号、国際公開第９５／１１９８４号、および国際公開第９５／００６５５号を参照されたい）、アデノ関連ウイルス（例えば、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：８１  ８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：６９１６  ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３８：２８５７  ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：６８３  ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：６４１  ６４８，１９９９、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ５：５９１  ５９４，１９９６、国際公開第９３／０９２３９号におけるＳｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５、およびＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７を参照されたい）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：１０３１９  ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：７８１２  ７８１６，１９９９を参照されたい）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルス等のようなレトロウイルスに由来するベクター）等が含まれるが、これらに限定されない。
【０３４８】
多数の好適な発現ベクターは、当業者に既知であり、多くが市販されている。次のベクターは、真核性宿主細胞についての、例として提供される：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、宿主細胞と適合性である限り、任意の他のベクターが使用されてもよい。
【０３４９】
好適なウイルスベクターの例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスに基づくウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。好適なレトロウイルス系のベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に基づくベクターであるが、他の組換えレトロウイルス、例えば、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、テナガザル（Ｇｉｂｂｏｎ  Ａｂｅ）白血病ウイルス、マソンファイザーサルウイルス、またはラウス肉腫ウイルスがまた使用されてもよく、例えば、米国特許第６，３３３，１９５号を参照されたい。
【０３５０】
他の場合には、レトロウイルス系のベクターは、レンチウイルス系のベクター（例えは、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））であり、例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７３（６）：４９９１−５０００  （ＦＩＶ）、Ｎｅｇｒｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙおよびＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２６１：５３−７４  （ＳＩＶ）、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：２６３−２６７（ＨＩＶ）を参照されたい。
【０３５１】
利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写終結因子等を含む、幾つかの好適な転写および翻訳制御要素のうちのいずれが、発現ベクター中で使用されてもよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４を参照されたい）。
【０３５２】
治療法；ＬＳＤ１酵素活性および／またはレベルを増加させる薬剤を投与する
本開示は、個体における免疫不全ウイルス感染症を治療する方法を提供し、その方法は一般に、個体に、潜伏ＨＩＶを再活性化させる薬剤および抗ＨＩＶ薬剤を共投与することを伴う。本開示は、個体に、ＬＳＤ１酵素活性および／またはＬＳＤ１レベルを増加させる有効量の薬剤を投与することによって、個体における潜伏免疫不全ウイルスの貯蔵を低減するための方法を提供する。好適な薬剤は、上述される。
【０３５３】
ＬＳＤ１酵素活性および／またはＬＳＤ１レベルを増加させる有効量の薬剤は、個体における潜伏ＨＩＶを再活性化させ、潜伏ＨＩＶの貯蔵を、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％低減する量である。「潜伏ＨＩＶの貯蔵の低減」（「潜伏感染した細胞の貯蔵」とも称される）は、潜伏ＨＩＶ感染症を有する個体における細胞の数の低減である。潜伏感染した細胞の貯蔵が低減されるかどうかは、Ｂｌａｎｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ  １８２（６）：１６３６−１６４２に記載される方法を含む、任意の既知の方法を使用して決定することができる。
【０３５４】
幾つかの実施形態では、治療を必要とする個体における免疫不全ウイルス感染症を治療する対象方法は、次のことを伴う：ａ）個体に、ＬＳＤ１酵素活性および／またはＬＳＤ１レベルを増加させる薬剤を投与すること、ならびにｂ）個体に、免疫不全ウイルス機能を阻害する有効量の薬剤を投与すること。免疫不全ウイルス機能は、ウイルス複製、ウイルスプロテアーゼ活性、ウイルス逆転写酵素活性、細胞中へのウイルス侵入、ウイルスインテグラーゼ活性、ウイルスＲｅｖ活性、ウイルスＴａｔ活性、ウイルスＮｅｆ活性、ウイルスＶｐｒ活性、ウイルスＶｐｕ活性、およびウイルスＶｉｆ活性から選択することができる。個体に、ＬＳＤ１酵素活性および／またはＬＳＤ１レベルを増加させる薬剤を投与することは、潜伏免疫不全ウイルスの再活性化をもたらす。免疫不全ウイルス機能を阻害する薬剤を投与することは、次のうちの１つまたは両方をもたらす可能性がある：個体における免疫不全ウイルス負荷の低減、および個体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加。
【０３５５】
幾つかの実施形態では、ＬＳＤ１酵素活性および／またはレベルを増加させる薬剤は、次のものとの併用療法において投与される：１）１つ以上のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、コンビビル、エピビル、ハイビッド、レトロビル、ヴァイデックス、ゼリット、ザイアジェン等）、２）１つ以上の非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、レスクリプター、サスティバ、ビラミューン等）、３）１つ以上のプロテアーゼ阻害剤（例えば、アゲネラーゼ（Ａｇｅｎｅｒａｓｅ）、クリキシバン、フォートベイス、インビラーゼ、カレトラ、ノービア、ビラセプト等）、４）プロテアーゼ阻害剤およびヌクレオシド逆転写酵素阻害剤等の抗ＨＩＶ薬剤、５）プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、および非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤等の抗ＨＩＶ薬剤、６）プロテアーゼ阻害剤および非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤等の抗ＨＩＶ薬剤。ＬＳＤ１酵素活性および／またはレベルを増加させる有効量の薬剤と、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、および非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤のうちの１つ以上等の１つ以上の抗ＨＩＶ薬剤との、他の組み合わせが企図される。
【０３５６】
多様な方法のいずれを使用しても、治療法が有効であるかどうかを決定することができる。例えば、本発明の方法が、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）ウイルス負荷を低減すること、および／または免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）感染症を治療することにおいて有効であるかどうかを決定する方法は、ウイルス負荷を、例えば、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）ポリヌクレオチド配列に特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、例えば、生物学的試料中の免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）の量を測定することによって測定すること；免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）によってコードされるポリペプチド、例えば、ｐ２４、ｇｐ１２０、逆転写酵素を、例えば、そのポリペプチドに特異的な抗体を用いる酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等の免疫学的アッセイを使用して検出および／または測定すること、および個体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数を測定することを含むが、これらに限定されない、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）感染症の兆候についての任意の既知の試験である。
【０３５７】
製剤、投薬量、および投与経路
一般に、活性剤（例えば、ＬＳＤ１活性を阻害する薬剤、ＬＳＤ１のレベルを低減する薬剤、メチル化ＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤、ＬＳＤ１に対するいずれの直接効果からも独立してＣｏＲＥＳＴポリペプチドの活性を阻害する薬剤、ＬＳＤ１のレベルおよび／または活性を増加させる薬剤）は、宿主への送達のために薬学的に許容される組成物（複数可）中で調製される。免疫不全ウイルス転写を低減する文脈において、「活性剤」、「薬物」、「薬剤」、「治療剤」等の用語は、ＬＳＤ１の酵素活性を阻害するおよび／またはＬＳＤ１のレベルを低減するおよび／またはメチル化ＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤を指すように本明細書で交換可能に使用される。潜伏ＨＩＶを再活性化する文脈において、「活性剤」、「薬物」、「薬剤」、「治療剤」等の用語は、ＬＳＤ１のレベルおよび／または酵素活性を増加させる薬剤を指すように本明細書で交換可能に使用される。
【０３５８】
活性剤（および任意に１つ以上の更なる治療剤）との使用に好ましい薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれてもよい。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射用有機エステルが挙げられる。水性担体には、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液、および微粒子が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補給液（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒｓ）、電解質補給液（ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒｓ）（リンゲルデキストロースに基づくもの等）等が含まれる。活性剤（および任意に１つ以上の更なる治療剤）を含む組成物はまた、本発明による後の再構成および使用のために、当該技術分野で周知の手段を使用して凍結乾燥されてもよい。
【０３５９】
製剤
活性剤は、それを必要とする個体に、薬学的に許容される賦形剤（複数可）を有する製剤中で投与される。多種多様な薬学的に許容される賦形剤は、当該技術分野で既知であり、本明細書で詳述される必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄＤｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ  ７ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄ  ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．を含む、多様な刊行物に十分に記載されている。製剤の次の説明に関して、「活性剤」は、上述される活性剤、および任意に１つ以上の更なる治療剤を含む。
【０３６０】
対象方法において、活性剤は、宿主に、所望の度合いの、１）免疫不全ウイルス転写の低減、または２）潜伏免疫不全ウイルスの再活性化をもたらすことが可能な、任意の好都合な手段を使用して投与され得る。故に、活性剤は、治療的投与のために多様な製剤中に組み込むことができる。例えば、活性剤は、適切な、薬学的に許容される担体または希釈剤との組み合わせによって、薬学的組成物へと製剤化することができ、また錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座剤、注射、吸入剤、およびエアロゾル等の固体、半固体、液体、または気体形態で、調製物へと製剤化されてもよい。例示的な実施形態では、活性剤は、ゲルとして、溶液として、または膣内投与に好適な何らかの他の形態で製剤化される。更に例示的な実施形態では、活性剤は、ゲルとして、溶液として、または直腸（例えば、直腸内）投与に好適な何らかの他の形態で製剤化される。
【０３６１】
薬学的剤形において、活性剤は、その薬学的に許容される塩の形態で投与され得るか、またはそれはまた、単独で、もしくは適切な会合で、ならびに他の薬学的に活性化合物と組み合わせて使用されてもよい。次の方法および賦形剤は、例示的なものにすぎず、決して限定的ではない。
【０３６２】
幾つかの実施形態では、活性剤は、水性緩衝液中で製剤化される。好適な水性緩衝液には、約５ｍＭ〜約１００ｍＭまでの様々な強度の、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、水性緩衝液は、等張性溶液を提供する試薬を含む。かかる試薬は、塩化ナトリウム、および糖、例えば、マンニトール、デキストロース、スクロース等を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、水性緩衝液は、ポリソルベート２０または８０等の非イオン性界面活性剤を更に含む。任意に製剤は、防腐剤を更に含んでもよい。好適な防腐剤には、ベンジルアルコール、フェノール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム等が含まれるが、これらに限定されない。多くの場合、製剤は、約４℃で保管される。製剤はまた、凍結乾燥させられてもよく、その場合それらは、一般に、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、マンニトール等の凍結保護物質を含む。凍結乾燥製剤は、長期間にわたって、周囲温度であってさえ、保管することができる。
【０３６３】
経口調製物について、活性剤は、単独で、または錠剤、粉末、顆粒、もしくはカプセルを作製するための適切な添加剤と、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、もしくはジャガイモデンプン等の従来の添加剤と；結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシデンプン、もしくはゼラチン等の結合剤と；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、もしくはナトリウムカルボキシメチルセルロース等の崩壊剤と；タルクもしくはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤と；ならびに所望される場合、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤および香味剤と組み合わせて、使用することができる。
【０３６４】
活性剤は、注射のために、それらを、植物油もしくは他の同様の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸もしくはプロピレングリコールのエステル等の水性または非水性溶媒中に溶解、懸濁、または乳化させることによって、ならびに所望される場合、可溶化剤、等張性薬剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、および防腐剤等の従来の添加剤と共に、調製物へと製剤化することができる。
【０３６５】
活性剤は、吸入を介して投与されるべきエアロゾル製剤で利用することができる。活性剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容される噴霧剤へと製剤化することができる。
【０３６６】
更に、活性剤は、乳化基剤または水溶性基剤等の多様な基剤と混合することによって、座剤へと作製することができる。活性剤は、座剤を介して直腸投与することができる。座剤は、体温で融解するが、室温では固体化される、ココアバター、カルボワックス、およびポリエチレングリコール等のビヒクルを含む可能性がある。
【０３６７】
シロップ、エリキシル、および懸濁液等の、経口または直腸投与のための単位剤形が提供されてもよく、各投薬量単位、例えば、茶さじ量、食さじ量、錠剤、または座剤は、１つ以上の活性剤を含有する既定量の組成物を含有する。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、生理食塩水、または別の薬学的に許容される担体中の溶液としての組成物中に、活性剤（複数可）を含んでもよい。
【０３６８】
シロップ、エリキシル、ゲル、および懸濁液等の、膣内または直腸内投与のための単位剤形が提供されてもよく、ここで各投薬量単位、例えば、茶さじ量、食さじ量、錠剤、単位ゲル体積、または座剤は、１つ以上の活性剤を含有する既定量の組成物を含有する。
【０３６９】
本明細書で使用される「単位剤形」という用語は、ヒトおよび動物対象のための単位投薬として好適な、物理的に個別の単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体、またはビヒクルとの関連で、所望の効果をもたらすのに十分な量に算出された既定量の活性剤を含有する。所与の活性剤のための明細は、一部には、用いられる特定の化合物および達成されるべき効果、および宿主における各化合物に関連する薬力学に依存するであろう。
【０３７０】
他の投与様式もまた、本発明と共に使用されるであろう。例えば、活性剤は、座剤、ならびに場合によっては、エアロゾルおよび鼻腔内組成物に製剤化することができる。座剤について、ビヒクル組成物は、ポリアルキレングリコール、またはトリグリセリド等の、伝統的な結合剤および担体を含むであろう。かかる座剤は、約０．５％〜約１０％（ｗ／ｗ）、例えば、約１％〜約２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成されてもよい。
【０３７１】
活性剤は、注射物質として投与することができる。典型的には、注射用組成物は、液体溶液または懸濁液として調製されるが、注射前の液体ビヒクル中の溶液、またはその中の懸濁液に好適な固体形態がまた調製されてもよい。調製物はまた、乳化されてもよく、またはリポソームビヒクル中にカプセル封入された活性成分であってもよい。
【０３７２】
活性剤は、幾つかの実施形態では、膣送達のために製剤化されるであろう。膣内投与のための対象製剤は、膣内生体付着性錠剤、膣内生体付着性微粒子、膣内クリーム、膣内ローション、膣内泡状物質、膣内軟膏、膣内ペースト、膣内溶液、または膣内ゲルとして製剤化される活性剤を含む。
【０３７３】
活性剤は、幾つかの実施形態では、直腸送達のために製剤化されるであろう。直腸内投与のための対象製剤は、直腸内生体付着性錠剤、直腸内生体付着性微粒子、直腸内クリーム、直腸内ローション、直腸内泡状物質、直腸内軟膏、直腸内ペースト、直腸内溶液、または直腸内ゲルとして製剤化される活性剤を含む。
【０３７４】
対象製剤は、賦形剤（例えば、スクロース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、または炭酸カルシウム）、結合剤（例えば、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アラビアガム、ポリ（エチレングリコール）、スクロース、またはデンプン）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルデンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、またはクエン酸カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、またはラウリル硫酸ナトリウム）、香味剤（例えば、クエン酸、メントール、グリシン、またはオレンジ粉末）、防腐剤（例えば、安息香酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メチルパラベン、またはプロピルパラベン）、安定剤（例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、または酢酸）、懸濁剤（例えば、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはステアリン酸アルミニウム）、分散剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、希釈剤（例えば、水）、およびベースワックス（例えば、ココアバター、白色ワセリン、またはポリエチレングリコール）のうちの１つ以上を含む活性剤を含む。
【０３７５】
活性剤を含む錠剤は、好適な薄膜形成薬剤、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、またはエチルセルロースでコーティングされてもよく、それに対する好適な賦形剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ジエチルフタレート、またはグリセロール三酢酸塩等の軟化剤；スクロース、ソルビトール、キシリトール、グルコース、またはラクトース等の充填剤；水酸化チタン等の着色剤等が、任意に添加されてもよい。
【０３７６】
好適な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組み合わせである。更に、所望される場合、ビヒクルは、湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤等の少量の補助材料を含有してもよい。かかる剤形を調製する実際の方法は、既知であるか、または当業者に明らかとなろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５を参照されたい、投与されるべき組成物または製剤は、いずれにせよ、治療されている対象における所望の状態を達成するのに十分な薬剤の量を含有するであろう。
【０３７７】
薬学的に許容される賦形剤等のビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤は、公衆にとって容易に入手可能である。更に、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張性調整剤、安定剤、湿潤剤薬剤等の薬学的に許容される補助材料は、公衆にとって容易に入手可能である。
【０３７８】
投薬量
使用される投薬量は、達成されるべき臨床目標に応じて変動するであろうが、活性剤の好適な投薬量範囲は、最大約１ｍｇ〜約１０００ｍｇを提供するものであり、例えば、約１ｍｇ〜約２５ｍｇ、約２５ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約２５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、または約５００ｍｇ〜約１０００ｍｇの活性剤を、単回用量で投与することができる。
【０３７９】
当業者であれば、用量レベルが、特異的化合物、症状の重症度、および副作用に対する対象の感受性の関数として変動し得ることを容易に理解するであろう。所与の化合物のために好ましい投薬量は、当業者によって、多様な手段により容易に決定可能である。
【０３８０】
幾つかの実施形態では、活性剤の単回用量が投与される。他の実施形態では、活性剤の多回用量が投与される。多回用量が一定期間にわたって投与される場合、活性剤は、１日２回（ｑｉｄ）、毎日（ｑｄ）、２日毎（ｑｏｄ）、３日毎、週３回（ｔｉｗ）、または週２回（ｂｉｗ）、一定期間にわたって投与される。例えば、活性剤は、１日２回（ｑｉｄ）、毎日（ｑｄ）、２日毎（ｑｏｄ）、３日毎、週３回（ｔｉｗ）、または週２回（ｂｉｗ）、１日〜約２年間以上の期間にわたって投与される。例えば、活性剤は、種々の要因に応じて、前述の頻度のいずれかで１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年間、もしくは２年間、またはそれを超えて投与される。
【０３８１】
２つの異なる活性剤が投与される場合、第１の活性剤および第２の活性剤は、別個の製剤中で投与することができる。第１の活性剤および第２の活性剤は、実質的に同時に、または互いに約３０分、約１時間、約２時間、約４時間、約８時間、約１６時間、約２４時間、約３６時間、約７２時間、約４日間、約７日間、または約２週間以内に投与することができる。
【０３８２】
投与経路
活性剤は、個体に、インビボ法およびエクスビボ法、ならびに全身投与および局所投与経路を含む、薬物送達に好適な任意の利用可能な方法および経路を使用して投与される。
【０３８３】
従来のかつ薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、経皮、皮下、皮内、局所適用、静脈内、膣、鼻、および他の非経口投与経路が含まれる。幾つかの実施形態では、活性剤は、膣内の投与経路を介して投与される。他の実施形態では、活性剤は、直腸内の投与経路を介して投与される。投与経路は、所望される場合組み合わされても、薬剤および／または所望の効果に応じて調整されてもよい。組成物は、単回用量で、または多回用量で、投与することができる。
【０３８４】
活性剤は、宿主に、全身経路または局所経路を含む、従来の薬物の送達に好適な任意の利用可能な従来の方法および経路を使用して投与することができる。一般に、本発明によって企図される投与経路には、経腸、非経口、または吸入経路が含まれるが、これらに限定されない。
【０３８５】
吸入投与以外の非経口投与経路には、局所、膣、経皮、皮下、筋肉内、および静脈内経路、すなわち、消化管を通じる以外の任意の投与経路が含まれるが、これらに限定されない。非経口投与を行って、薬剤の全身または局所送達を達成することができる。全身送達が所望される場合、投与は、典型的には、薬学的調製物の侵襲的なまたは全身的に吸収された局所または粘膜投与を伴う。
【０３８６】
活性剤はまた、対象に、経腸投与によって送達することができる。経腸投与経路には、経口および直腸（例えば、座剤を使用した）送達が含まれるが、これらに限定されない。
【０３８７】
治療とは、宿主が罹患した病的状態に関連する症状を少なくとも寛解させることを意味し、ここで寛解は、単位血液当たりのウイルス粒子の数等の、治療されている病的状態に関連するパラメータ、例えば、症状の大きさを少なくとも低減することを指すように幅広い意味で使用される。したがって、治療はまた、宿主が病的状態または少なくとも病的状態を特徴とする症状をもはや患わないように、病的状態、または少なくともそれに関連する症状が完全に阻害される、例えば、起こることを予防される、または停止される、例えば、終結される状況を含む。
【０３８８】
多様な宿主（ここで「宿主」という用語は、本明細書で「対象」および「患者」という用語と交換可能に使用される）が、対象方法により治療可能である。一般に、かかる宿主は、「哺乳動物」または「哺乳類」であり、ここでこれらの用語は、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）感染症の影響を受けやすい、哺乳綱および霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）内にある生物を説明するように幅広く使用される。多くの実施形態では、宿主は、ヒトであろう。
【０３８９】
キット、容器、デバイス、送達系
例えば、経口、膣、直腸、経皮、または注射用用量（例えば、筋肉内、静脈内、または皮下注射のため）中の活性剤の単位用量を有するキットが提供される。かかるキット中には、単位用量を含有する容器に加えて、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）感染症を治療する際の、薬物の使用および付随する便益を説明する、情報提供のためのパッケージ挿入物が存在するであろう。好適な活性剤および単位用量は、本明細書に上述されるものである。
【０３９０】
多くの実施形態では、対象キットは、対象方法を実践するための指示書またはそれを得るための手段を更に含み（例えば、ユーザを、指示書を提供するウェブページに導くウェブサイトＵＲＬ）、これらの指示書は、典型的に基材上に印刷され、その基材は、次のうちの１つ以上であってもよい：パッケージ挿入物、パッケージ材料、製剤容器等。
【０３９１】
幾つかの実施形態では、対象キットは、患者の服薬遵守を増加させる１つ以上の構成要素または特色、例えば、活性剤を適切な時間または間隔で摂取することを念頭に置く際に患者を補助するための、構成要素または体系を含む。かかる構成要素には、活性剤を適切な時間または間隔で摂取することを念頭に置く際に患者を補助するための、カレンダー管理体系が含まれるが、これらに限定されない。
【０３９２】
本発明は、ＬＳＤ１酵素活性を阻害する活性剤を含む送達系を提供する。幾つかの実施形態では、送達系は、活性剤を含む製剤の皮下、静脈内、または筋肉内注射を提供する送達系である。他の実施形態では、送達系は、膣または直腸送達系である。
【０３９３】
幾つかの実施形態では、活性剤は、経口投与のためにパッケージ化される。本発明は、活性剤の毎日の投薬量単位を含むパッケージ単位を提供する。例えば、パッケージ単位は、幾つかの実施形態では、従来のブリスターパックまたは錠剤、丸薬等を含む任意の他の形態である。ブリスターパックは、ボール紙、板紙、ホイル、またはプラスチック裏板により密封されたブリスターパック中に適切な数の単位剤形を含有し、好適な被覆内に密閉されるであろう。各ブリスター容器は、例えば、１日目から開始して、付番されるか、あるいはラベル付けされてもよい。
【０３９４】
幾つかの実施形態では、対象の送達系は、注射デバイスを含む。例示的な、非限定的薬物送達デバイスは、ペン型注射器等の注射デバイスおよび針／シリンジデバイスを含む。幾つかの実施形態では、本発明は、ＬＳＤ１酵素活性を阻害する有効量の活性剤を含む製剤で事前充填された、注射送達デバイスを提供する。例えば、対象送達デバイスは、ＬＳＤ１酵素活性を阻害する活性剤の単回用量で事前充填された注射デバイスを含む。対象注射デバイスは、再使用可能でも、使い捨てでもあり得る。
【０３９５】
ペン型注射器は、当該技術分野で周知である。本方法における使用に適合させられ得る、例示的なデバイスは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎからの多様なペン型注射器、例えば、ＢＤ（商標）Ｐｅｎ、ＢＤ（商標）Ｐｅｎ  ＩＩ、ＢＤ（商標）Ａｕｔｏ−Ｉｎｊｅｃｔｏｒのうちのいずれ；Ｉｎｎｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．からのペン型注射器；米国特許第５，７２８，０７４号、第６，０９６，０１０号、第６，１４６，３６１号、第６，２４８，０９５号、第６，２７７，０９９号、および第６，２２１，０５３号等に考察される薬品送達ペン型デバイスのいずれでもある。薬品送達ペンは、使い捨てでも、または再使用可能および再充填可能でもあり得る。
【０３９６】
本発明は、個体の膣または直腸への、活性剤の膣または直腸送達のための送達系を提供する。送達系は、膣または直腸中への挿入のためのデバイスを含む。幾つかの実施形態では、送達系は、製剤の膣または直腸中への送達のためのアプリケーターと、活性剤を含む製剤を含有する容器とを含む。これらの実施形態では、容器（例えば、管）は、製剤をアプリケーター中に送達するために適合させられる。他の実施形態では、送達系は、膣または直腸中に挿入されるデバイスを含み、そのデバイスは、活性剤を含む。例えば、デバイスは、活性剤を含む製剤でコーティングされるか、それにより浸漬されるか、あるいはそれを含有する。
【０３９７】
幾つかの実施形態では、膣または直腸送達系は、対象製剤を含むタンポンまたはタンポン様デバイスである。薬物送達タンポンは、当該技術分野で既知であり、いずれのかかるタンポンも対象薬物送達系と併せて使用することができる。薬物送達タンポンは、例えば、米国特許第６，０８６，９０９号に記載される。タンポンまたはタンポン様デバイスが使用される場合、活性剤がデバイス中に組み込まれ得る、多数の方法が存在する。例えば、薬物は、デバイスの先端におけるゲル様生体付着性貯蔵器中に組み込むことができる。代替的に、薬物は、タンポンの先端に位置付けられた粉末物質の形態であり得る。薬物はまた、例えば、薬物を薬学的に許容される担体中に溶解させ、薬物溶液をタンポン繊維中に吸収させることによって、タンポンの先端の繊維中に吸収させることもできる。薬物はまた、タンポンの先端に適用されるコーティング物質中に溶解させることもできる。代替的に、薬物は、タンポンの先端に関連して配置された挿入可能な座剤中に組み込むことができる。
【０３９８】
他の実施形態では、薬物送達デバイスは、膣または直腸リングである。膣または直腸リングは、通常、送達されるべき活性剤を含有するエラストマーの別の層によってコーティングされた、不活性エラストマーリングからなる。リングは、ユーザによって、簡便に挿入し、所望の一定期間（例えば、最大７日間）にわたって定置に残し、次いで除去することができる。リングは、任意に、薬物を何ら含有しない第３の外部速度制御エラストマー層を含む可能性がある。任意に、第３のリングは、二重放出リングのための第２の薬物を含有する可能性がある。薬物は、送達されるべき薬物のための貯蔵器として作用するように、シリコンエラストマーリング全体にわたってポリエチレングリコール中に組み込むことができる。
【０３９９】
他の実施形態では、対象の膣または直腸送達系は、膣または直腸スポンジである。活性剤は、文献に記載される円筒状の薬物不含ポリウレタンスポンジ上にコーティングされるシリコンマトリックス中に組み込まれる。
【０４００】
ペッサリー、錠剤、および座剤は、本発明において使用され得る薬物送達系の他の例である。これらの系は、文献に広範に記載されている。
【０４０１】
生体付着性微粒子は、本発明において使用するのに好適な、依然として別の薬物送達系を構成する。この体系は、多くの座剤製剤のように膣または直腸から滲出しない、多相液体または半固体調製物である。材料は、膣または直腸の壁に付着し、薬物を一定期間にわたって放出する。これらの体系のうちの多くは、鼻用の使用のために設計されたが、膣または直腸でも同様に使用することができる（例えば、米国特許第４，７５６，９０７号）。体系は、活性剤を有するミクロスフェア、および薬物の取り込みを強化するための界面活性剤含んでもよい。微粒子は、１０〜１００μｍの直径を有し、デンプン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲン、またはデキストランから調製することができる。
【０４０２】
別の体系は、アプリケーターとの使用のために適合させられる、対象製剤を含む容器（例えば、管）である。活性剤は、アプリケーターを使用して膣または直腸に適用され得るクリーム、ローション、泡状物質、ペースト、軟膏、およびゲル中に組み込まれる。クリーム、ローション、泡状物質、ペースト、軟膏、およびゲル中の医薬品を調製するためのプロセスは、文献全体を通じて見出すことができる。好適な体系の例は、ＪＥＲＧＥＮＳ（商標）（Ａｎｄｒｅｗ  Ｊｅｒｇｅｎｓ  Ｃｏ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）の商標の下に販売される製品等の、グリセロール、セラミド、鉱物油、ワセリン、パラベン、香料、および水を含有する標準的な無香料ローション製剤である。本発明の組成物における使用に好適な非毒性の薬学的に許容される体系は、薬学的製剤の技術分野の専門家に明らかとなり、例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，１９９５に記載される。好適な担体の選定は、所望される特定の膣または直腸剤形の厳密な性質、例えば、活性成分（複数可）が、クリーム、ローション、泡状物質、軟膏、ペースト、溶液、またはゲルへと製剤化されるべきであるかどうか、ならびに活性成分（複数可）の素性に依存するであろう。他の好適な送達デバイスは、米国特許第６，４７６，０７９号に記載されるものである。
【０４０３】
併用療法
幾つかの実施形態では、ＬＳＤ１酵素活性を阻害する、細胞中のＬＳＤ１のレベルを低減する、またはＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を低減する２つ以上の薬剤が、併用療法で投与される。例えば、次の薬剤を共投与することができる：１）ＬＳＤ１酵素活性の小分子阻害剤およびドミナントネガティブＣｏＲＥＳＴポリペプチド、２）ＬＳＤ１酵素活性の小分子阻害剤およびＢＨＣ８０ポリペプチド、３）ＬＳＤ１酵素活性の小分子阻害剤およびＨＤＡＣ阻害剤、４）ＬＳＤ１酵素活性の小分子阻害剤およびＣｏＲＥＳＴ発現を低減する干渉核酸。他の組み合わせもまた、本開示によって包含される。
【０４０４】
幾つかの実施形態では、活性剤は、１つ以上の更なる治療剤との併用療法で投与される。好適な更なる治療剤には、免疫不全ウイルスの１つ以上の機能を阻害する薬剤、免疫不全ウイルス感染症の症状を治療するまたは寛解させる薬剤、免疫不全ウイルス感染症に続発して生じる感染症を治療する薬剤等が含まれる。
【０４０５】
治療剤には、例えば、ベータ−ラクタム抗生物質、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、グラミシジン、バシトラシン、スルホンアミド、ニトロフラゾン、ナリジクス酸、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、フルオコルトロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン（ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ）、インドメタシン、スリンダク、アシクロビル、アマンタジン、リマンタジン、組換え可溶性ＣＤ４（ｒｓＣＤ４）、抗受容体抗体（例えば、ライノウイルスに対する）、ネビラピン、シドホビル（ビスタイド（商標））、ホスホノギ酸三ナトリウム（ホスカルネット（商標））、ファムシクロビル、ペンシクロビル、バラシクロビル、核酸／複製阻害剤、インターフェロン、ジドブジン（ＡＺＴ、レトロビル（商標））、ジダノシン（ジデオキシイノシン、ｄｄＩ、ヴァイデックス（商標））、スタブジン（ｄ４Ｔ、ゼリット（商標））、ザルシタビン（ジデオキシシトシン、ｄｄＣ、ハイビッド（商標））、ネビラピン（ビラミューン（商標））、ラミブジン（エピビル（商標）、３ＴＣ）、プロテアーゼ阻害剤、サクイナビル（インビラーゼ（商標）、フォートベイス（商標））、リトナビル（ノービア（商標））、ネルフィナビル（ビラセプト（商標））、エファビレンツ（サスティバ（商標））、アバカビル（ザイアジェン（商標））、アンプレナビル（アゲネラーゼ（商標））インジナビル（クリキシバン（商標））、ガンシクロビル、ＡｚＤＵ、デラビルジン（レスクリプター（商標））、カレトラ、トリジビル、リファンピン、クラシロマイシン（ｃｌａｔｈｉｒｏｍｙｃｉｎ）、エリスロポエチン、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド阻害剤、アドリアマイシン、フルオロウラシル、メトトレキセート、アスパラギナーゼ、およびそれらの組み合わせが含まれる。抗ＨＩＶ薬剤は、１つ以上のＨＩＶタンパク質の機能を特異的に標的とする、前述の一覧のものである。
【０４０６】
幾つかの実施形態では、対象抗体は、２つ以上の抗ＨＩＶ薬剤との併用療法で投与される。例えば、対象抗体は、１、２、または３つのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、コンビビル、エピビル、ハイビッド、レトロビル、ヴァイデックス、ゼリット、ザイアジェン等）との併用療法で投与することができる。対象抗体は、１つまたは２つの非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、レスクリプター、サスティバ、ビラミューン等）との併用療法で投与することができる。対象抗体は、１つまたは２つのプロテアーゼ阻害剤（例えば、アゲネラーゼ、クリキシバン、フォートベイス、インビラーゼ、カレトラ、ノービア、ビラセプト等）との併用療法で投与することができる。対象抗体は、プロテアーゼ阻害剤およびヌクレオシド逆転写酵素阻害剤との併用療法で投与することができる。対象抗体は、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、および非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤との併用療法で投与することができる。対象抗体は、プロテアーゼ阻害剤および非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤との併用療法で投与することができる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、および非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤のうちの１つ以上との対象抗体の他の組み合わせが企図される。
【０４０７】
幾つかの実施形態では、対象治療法は、次のものを投与することを伴う：ａ）活性剤（例えば：１）ＬＳＤ１酵素活性を阻害する薬剤、２）ＬＳＤ１のレベルを低減する薬剤、３）メチル化ＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤、４）ＬＳＤ１活性および／またはレベルを増加させる薬剤）、ならびにｂ）ウイルス複製、ウイルスプロテアーゼ活性、ウイルス逆転写酵素活性、細胞中へのウイルス侵入、ウイルスインテグラーゼ活性、ウイルスＲｅｖ活性、ウイルスＴａｔ活性、ウイルスＮｅｆ活性、ウイルスＶｐｒ活性、ウイルスＶｐｕ活性、およびウイルスＶｉｆ活性から選択される免疫不全ウイルス機能を阻害する薬剤。
【０４０８】
幾つかの実施形態では、対象治療法は、次のものを投与することを伴う：ａ）活性剤（例えば：１）ＬＳＤ１酵素活性を阻害する薬剤、２）ＬＳＤ１のレベルを低減する薬剤、３）メチル化ＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤、４）ＬＳＤ１活性および／またはレベルを増加させる薬剤）、ならびにｂ）ＨＩＶ阻害剤（ここで好適なＨＩＶ阻害剤には、１つ以上のヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、融合阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、ケモカイン受容体（例えば、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５）阻害剤、およびヒドロキシ尿素が含まれるが、これらに限定されない）。
【０４０９】
ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤には、アバカビル（ＡＢＣ、ザイアジェン（商標））、ジダノシン（ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、ヴァイデックス（商標））、ラミブジン（３ＴＣ、エピビル（商標））、スタブジン（ｄ４Ｔ、ゼリット（商標）、ゼリット  ＸＲ（商標））、ザルシタビン（ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、ハイビッド（商標））、ジドブジン（ＺＤＶ、かつてはアジドチミジン（ＡＺＴ）として知られた、レトロビル（商標））、アバカビル、ジドブジン、およびラミブジン（ＴＲＩＺＩＶＩＲ（商標））、ジドブジンおよびラミブジン（コンビビル（商標））、およびエムトリシタビン（ＥＭＴＲＩＶＡ（商標））が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤には、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩（ＶＩＲＥＡＤ（商標））が含まれる。ＨＩＶのための非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤には、ネビラピン（ビラミューン（商標））、メシル酸デラビルジン（レスクリプター（商標））、およびエファビレンツ（サスティバ（商標））が含まれるが、これらに限定されない。
【０４１０】
ＨＩＶ感染症を治療するためのプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）には、アンプレナビル（アゲネラーゼ（商標））、メシル酸サキナビル（フォートベイス（商標）、インビラーゼ（商標）．）、リトナビル（ノービア（商標））、硫酸インジナビル（クリキシバン（商標））、メシル酸ネルフィナビル（ｎｅｌｆｍａｖｉｒ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）（ビラセプト（商標））、ロピナビルおよびリトナビル（カレトラ（商標））、アタザナビル（ＲＥＹＡＴＡＺ（商標））、ならびにホスアンプレナビル（ＬＥＸＩＶＡ（商標））が含まれる。
【０４１１】
融合阻害剤は、ウイルスと細胞との間の融合が生じるのを予防し、したがって、ＨＩＶ感染症および分裂増殖を予防する。融合阻害剤には、エンフビルチド（ＦＵＺＥＯＮ（商標））、Ｌａｌｅｚａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．，３４８：２１７５−２１８５（２００３）、およびマラビロク（ＳＥＬＺＥＮＴＲＹ（商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０４１２】
インテグラーゼ阻害剤は、インテグラーゼの作用を遮断して、ＨＩＶ−１遺伝物質が宿主ＤＮＡ中に組み込まれるのを予防し、それによってウイルス複製を停止する。インテグラーゼ阻害剤には、ラルテグラビル（ＩＳＥＮＴＲＥＳＳ（商標）、Ｍｅｒｃｋ）、およびエルビテグラビア（ｅｌｖｉｔｅｇｒａｖｉｒ）（ＧＳ  ９１３７、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０４１３】
成熟阻害剤には、例えば、ベビリマット（３β−（３−カルボキシ−３−メチル−ブタノイルオキシ）ｌｕｐ−２０（２９）−エン−２８−オイック酸）、およびビベコン（Ｖｉｖｅｃｏｎ）（ＭＰＣ９０５５）が含まれる。
【０４１４】
幾つかの実施形態では、対象治療法は、次のものを投与することを伴う：ａ）活性剤（例えば：１）ＬＳＤ１酵素活性を阻害する薬剤、２）ＬＳＤ１のレベルを低減する薬剤、３）メチル化ＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤、４）ＬＳＤ１活性および／またはレベルを増加させる薬剤）、ならびにｂ）次のうちの１つ以上：（１）アンプレナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、リトナビル、ネルフィナビル、サクイナビル、チプラナビル、ブレカナビル、ダルナビル、ＴＭＣ−１２６、ＴＭＣ−１１４、モゼナビル（ＤＭＰ−４５０）、ＪＥ−２１４７（ＡＧ１７７６）、Ｌ−７５６４２３、ＲＯ０３３４６４９、ＫＮＩ−２７２、ＤＰＣ−６８１、ＤＰＣ−６８４、ＧＷ６４０３８５Ｘ、ＤＧ１７、ＰＰＬ−１００、ＤＧ３５、およびＡＧ  １８５９から選択されるＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、（２）カプラビリン、エミビリン（ｅｍｉｖｉｒｉｎｅ）、デラビリジン（ｄｅｌａｖｉｒｉｄｉｎｅ）、エファビレンツ、ネビラピン、（＋）カラノリドＡ、エトラビリン、ＧＷ５６３４、ＤＰＣ−０８３、ＤＰＣ−９６１、ＤＰＣ−９６３、ＭＩＶ−１５０、およびＴＭＣ−１２０、ＴＭＣ−２７８（リルピビリン（ｒｉｌｐｉｖｉｒｅｎｅ））、エファビレンツ、ＢＩＬＲ  ３５５  ＢＳ、ＶＲＸ  ８４０７７３、ＵＫ−４５３０６１、およびＲＤＥＡ８０６から選択される逆転写酵素のＨＩＶ非ヌクレオシド阻害剤、（３）ジドブジン、エムトリシタビン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、ラミブジン、アバカビル、アムドキソビル、エルブシタビン（ｅｌｖｕｃｉｔａｂｉｎｅ）、アロブジン、ＭＩＶ−２１０、ラシビル、Ｄ−ｄ４ＦＣ、エムトリシタビン、ホスファジド（ｐｈｏｓｐｈａｚｉｄｅ）、フォジブジンチドキシル（ｆｏｚｉｖｕｄｉｎｅ  ｔｉｄｏｘｉｌ）、アプリシチビン（ａｐｒｉｃｉｔｉｂｉｎｅ）（ＡＶＸ７５４）、アムドキソビル、ＫＰ−１４６１、およびフォサルブジンチドキシル（ｆｏｓａｌｖｕｄｉｎｅ  ｔｉｄｏｘｉｌ）（かつてはＨＤＰ  ９９．０００３）から選択される逆転写酵素のＨＩＶヌクレオシド阻害剤、（４）テノホビルおよびアデホビルから選択される逆転写酵素のＨＩＶヌクレオチド阻害剤、（５）クルクミン、クルクミンの誘導体、チコリ酸、チコリ酸の誘導体、３，５−ジカフェオイルキナ酸、３，５−ジカフェオイルキナ酸の誘導体、アウリントリカルボン酸、アウリントリカルボン酸の誘導体、コーヒー酸フェネチルエステル、コーヒー酸フェネチルエステルの誘導体、チルホスチン、チルホスチンの誘導体、ケルセチン、ケルセチンの誘導体、Ｓ−１３６０、ジンテビル（ｚｉｎｔｅｖｉｒ）（ＡＲ−１７７）、Ｌ−８７０８１２、およびＬ−８７０８１０、ＭＫ−０５１８（ラルテグラビル）、ＢＭＳ−５３８１５８、ＧＳＫ３６４７３５Ｃ、ＢＭＳ−７０７０３５、ＭＫ−２０４８、およびＢＡ  ０１１から選択されるＨＩＶインテグラーゼ阻害剤、（６）エンフビルチド、スフビルチド（ｓｉｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、ＦＢ００６Ｍ、およびＴＲＩ−１１４４から選択されるｇｐ４１阻害剤、（７）ＡＭＤ−０７０等のＣＸＣＲ４阻害剤、（８）ＳＰ０１Ａ等の侵入阻害剤、（９）ＢＭＳ−４８８０��３および／またはＢｌｏｃｋＡｉｄｅ／ＣＲ等のｇｐ１２０阻害剤、（１０）イムニチン（ｉｍｍｕｎｉｔｉｎ）等のＧ６ＰＤおよびＮＡＤＨ−オキシダーゼ阻害剤、（１１）アプラビロク、ビクリビロク、マラビロク、ＰＲＯ−１４０、ＩＮＣＢ１５０５０、ＰＦ−２３２７９８（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＣＣＲ５  ｍＡｂ００４からなる群から選択されるＣＣＲ５阻害剤、（１２）ＢＡＳ−１００、ＳＰＩ−４５２、ＲＥＰ  ９、ＳＰ−０１Ａ、ＴＮＸ−３５５、ＤＥＳ６、ＯＤＮ−９３、ＯＤＮ−１１２、ＶＧＶ−１、ＰＡ−４５７（ベビリマット）、アンプリゲン（Ａｍｐｌｉｇｅｎ）、ＨＲＧ２１４、シトリン（Ｃｙｔｏｌｉｎ）、ＶＧＸ−４１０、ＫＤ−２４７、ＡＭＺ  ００２６、ＣＹＴ  ９９００７Ａ−２２１  ＨＩＶ、ＤＥＢＩＯ−０２５、ＢＡＹ  ５０−４７９８、ＭＤＸＯ１０（イピリムマブ）、ＰＢＳ１１９、ＡＬＧ  ８８９、およびＰＡ−１０５００４０（ＰＡ−０４０）から選択される、ＨＩＶを治療するための別の薬物、（１３）上記のいずれの組み合わせまたは混合物。
【０４１５】
更なる例として、幾つかの実施形態では、対象治療法は、次のものを投与することを伴う：ａ）活性剤（例えば：１）ＬＳＤ１酵素活性を阻害する薬剤、２）ＬＳＤ１のレベルを低減する薬剤、３）メチル化ＴａｔのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤、４）ＬＳＤ１活性および／またはレベルを増加させる薬剤）、ならびにｂ）次のうちの１つ以上：ｉ）アンプレナビル（アゲネラーゼ、（３Ｓ）−オキソラン−３−イル  Ｎ−［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−［Ｎ−（２−メチルプロピル）（４−アミノベンゼン）スルホンアミド］−１−フェニルブタン−２−イル］カルバメート）を、６００ｍｇもしくは１２００ｍｇの量で１日２回、ｉｉ）チプラナビル（アプティバス、Ｎ−｛３−［（１Ｒ）−１−［（２Ｒ）−６−ヒドロキシ−４−オキソ−２−（２−フェニルエチル）−２−プロピル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−５−イル］プロピル］フェニル｝−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−スルホンアミド）を、５００ｍｇの量で１日２回、ｉｉｉ）インジナビル（ｉｄｉｎａｖｉｒ）（クリキシバン、（２Ｓ）−１−［（２Ｓ，４Ｒ）−４−ベンジル−２−ヒドロキシ−４−｛［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］カルバモイル｝ブチル］−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−（ピリジン−３−イルメチル）ピペラジン−２−カルボキサミド）を、８００ｍｇの量で１日３回、ｉｖ）サクイナビル（インビラーゼ、２Ｓ）−Ｎ−［（２Ｓ，３Ｒ）−４−［（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル）−デカヒドロイソキノリン−２−イル］−３−ヒドロキシ−１−フェニルブタン−２−イル］−２−（キノリン−２−イルホルムアミド）ブタンジアミド）を、１，０００ｍｇの量で１日２回、ｖ）ロピナビルおよびリトナビル（カレタ（Ｋａｌｅｔａ）（ここでロピナビルは、２Ｓ）−Ｎ−［（２Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−５−［２−（２，６−ジメチルフェノキシ）アセトアミド］−４−ヒドロキシ−１，６−ジフェニルヘキサン−２−イル］−３−メチル−２−（２−オキソ−１，３−ジアジナン−１−イル）ブタンアミドであり、リトナビルは、１，３−チアゾール−５−イルメチル  Ｎ−［（２Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−［（２Ｓ）−３−メチル−２−｛［メチル（｛［２−（プロパン−２−イル）−１，３−チアゾール−４−イル］メチル｝）カルバモイル］アミノ｝ブタミド］−１，６−ジフェニルヘキサン−２−イル］カルバメートである）を、１３３ｍｇの量で１日２回、ｖｉ）ホスアンプレナビル（レキシバ、｛［（２Ｒ，３Ｓ）−１−［Ｎ−（２−メチルプロピル）（４−アミノベンゼン）スルホンアミド］−３−（｛［（３Ｓ）−オキソラン−３−イルオキシ］カルボニル｝アミノ）−４−フェニルブタン−２−イル］オキシ｝ホスホン酸）を、７００ｍｇもしくは１４００ｍｇの量で１日２回）、ｖｉｉ）リトナビル（ノービア）を、６００ｍｇの量で１日２回、ｖｉｉｉ）ネルフィナビル（ビラセプト、（３Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−［（２Ｒ，３Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−［（３−ヒドロキシ−２−メチルフェニル）ホルムアミド］−４−（フェニルスルファニル）ブチル��−デカヒドロイソキノリン−３−カルボキサミド）を、７５０ｍｇの量で１日３回、もしくは１２５０ｍｇの量で１日２回、ｉｘ）フュージオン（Ｆｕｚｅｏｎ）（アセチル−ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱ  ＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ−アミド、配列番号５７）を、９０ｍｇの量で１日２回、ｘ）コンビビルを、１５０ｍｇラミブジン（３ＴＣ、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン）および３００ｍｇジドブジン（ＡＺＴ、アジドチミジン）の量で１日２回、ｘｉ）エムトリシタビン（エムトリバ、４−アミノ−５−フルオロ−１−［（２Ｒ，５Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−オキサチオラン−５−イル］−１，２−ジヒドロピリミジン−２−オン）を、２００ｍｇの量で１日１回、ｘｉｉ）エプジコムを、６００ｍｇアバカビル（ＡＢＶ、｛（１Ｓ，４Ｒ）−４−［２−アミノ−６−（シクロプロピルアミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル］シクロペンタ−２−エン−１−イル｝メタノール）および３００ｍｇ  ３ＴＣの量で１日１回、ｘｉｉｉ）ジドブジン（レトロビル、ＡＺＴもしくはアジドチミジン）を、２００ｍｇの量で１日３回、ｘｉｖ）トリジビルを、１５０ｍｇ  ３ＴＣおよび３００ｍｇ  ＡＢＶおよび３００ｍｇ  ＡＺＴの量で１日２回、ｘｖ）ツルバダ（Ｔｒｕｖａｄａ）を、２００ｍｇエムトリシタビンおよび３００ｍｇテノホビル（（｛［（２Ｒ）−１−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−２−イル］オキシ｝メチル）ホスホン酸）の量で１日１回、ｘｖｉ）ジダノシン（ヴァイデックス、２’，３’−ジデオキシイノシン）を、４００ｍｇの量で１日１回、ｘｖｉｉ）テノホビル（ビリアード（Ｖｉｒｅａｄ））を、３００ｍｇの量で１日１回、ｘｖｉｉｉ）アバカビル（ザイアジェン）を、３００ｍｇの量で１日２回、ｘｉｘ）アタザナビル（レイアタッツ、メチル  Ｎ−［（１Ｓ）−１−｛［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−［（２Ｓ）−２−［（メトキシカルボニル）アミノ］−３，３−ジメチル−Ｎ’−｛［４−（ピリジン−２−イル）フェニル］メチル｝ブタンヒドラジド］−１−フェニルブタン−２−イル］カルバモイル｝−２，２−ジメチルプロピル］カルバメート）を、３００ｍｇの量で１日１回、もしくは４００ｍｇの量で１日１回、ｘｘ）ラミブジン（エピビル）を、１５０ｍｇの量で１日２回、ｘｘｉ）スタブジン（ゼリット、２’−３’−ジデヒドロ−２’−３’−ジデオキシチミジン）を、４０ｍｇの量で１日２回、ｘｘｉｉ）デラビルジン（レスクリプター、Ｎ−［２−（｛４−［３−（プロパン−２−イルアミノ）ピリジン−２−イル］ピペラジン−１−イル｝カルボニル）−１Ｈ−インドール−５−イル］メタンスルホンアミド）を、４００ｍｇの量で１日３回、ｘｘｉｉｉ）エファビレンツ（サスティバ、（４Ｓ）−６−クロロ−４−（２−シクロプロピルエチニル）−４−（トリフルオロメチル）−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−２−オン）を、６００ｍｇの量で１日１回）、ｘｘｉｖ）ネビラピン（ビラミューン、１１−シクロプロピル−４−メチル−５，１１−ジヒドロ−６Ｈ−ジピリド［３，２−ｂ：２′，３′−ｅ］［１，４］ジアゼピン−６−オン）を、２００��ｇの量で１日２回）、ｘｘｖ）ベビリマット、ならびにｘｘｖｉ）ビベコン（Ｖｉｖｅｃｏｎ）。
【０４１６】
治療に好適な対象
本開示の方法は、免疫不全ウイルス感染症を有する、例えば、免疫不全ウイルス感染症を有すると診断された、個体を治療するのに好適である。
【０４１７】
本開示の方法は、（ＨＩＶ）感染症を有する（例えば、（ＨＩＶ）感染症を有すると診断された）個体、およびＨＩＶ感染症に接触する危険性がある個体を治療するのに好適である。かかる個体には、健康で無傷の免疫系を有するが、ＨＩＶに感染するようになる危険性がある個体（「危険性がある」個体）が含まれるが、これらに限定されない。危険性がある個体には、一般集団よりも、ＨＩＶに感染するようになる可能性がより高い個体が含まれるが、これらに限定されない。ＨＩＶに感染するようになる危険性がある個体には、ＨＩＶに感染した個体との性行為に起因して、ＨＩＶ感染症に対する危険性がある個体が含まれるが、これらに限定されない。治療に好適な個体には、ＨＩＶ−１および／もしくはＨＩＶ−２および／もしくはＨＩＶ−３、またはそれらの任意の変異型に感染した、またはそれらに感染するようになる危険性がある個体が含まれる。
【０４１８】
幾つかの実施形態では、癌を有すると診断された対象は、具体的に除外される。幾つかの実施形態では、神経障害を有すると診断された対象は、具体的に除外される。
【０４１９】
スクリーニング法
本開示は、スクリーニング法、例えば、ＬＳＤ１酵素活性および／またはＬＳＤ１レベルを調節する薬剤を特定する方法を提供する。
【０４２０】
本開示は、メチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤を特定する方法を提供する。本方法は一般に、次のことを含む：ａ）ＬＳＤ１ポリペプチドおよびメチル化Ｔａｔポリペプチドを試験薬剤と接触させること、ならびにｂ）該当する場合、試験薬剤の、Ｔａｔポリペプチドのメチル化に対する効果を決定すること。ＬＳＤ１ポリペプチドによるメチル化Ｔａｔポリペプチドの脱メチル化を、試験薬剤の不在下でのＴａｔポリペプチドのメチル化のレベルと比較して阻害する試験薬剤は、ＨＩＶ  ＴａｔのＬＳＤ１媒介型メチル化の阻害剤と見なされる。
【０４２１】
ＬＳＤ１ポリペプチドによるメチル化Ｔａｔポリペプチドの脱メチル化を阻害する薬剤は、ＨＩＶ転写を阻害するための候補薬剤と見なされ、故に、個体における（ＨＩＶ）感染症を治療するための候補薬剤と見なされる。
【０４２２】
本開示は、メチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を増加させる薬剤を特定する方法を提供する。本方法は一般に、次のことを含む：ａ）ＬＳＤ１ポリペプチドおよびメチル化Ｔａｔポリペプチドを試験薬剤と接触させること、ならびにｂ）該当する場合、試験薬剤の、Ｔａｔポリペプチドのメチル化に対する効果を決定すること。メチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を、試験薬剤の不在下でのＴａｔポリペプチドのメチル化のレベルと比較して増加させる試験薬剤は、ＨＩＶ  ＴａｔのＬＳＤ１媒介型メチル化の活性化因子と見なされる。
【０４２３】
ＬＳＤ１ポリペプチドによるメチル化Ｔａｔポリペプチドの脱メチル化を増加させる薬剤は、ＨＩＶ感染細胞のゲノム中に組み込まれた潜伏ＨＩＶを再活性化するための候補薬剤と見なされる。かかる薬剤は、１つ以上の抗ＨＩＶ薬剤との併用療法で使用される可能性がある。
【０４２４】
本明細書で交換可能に使用される「試験薬剤」、「候補薬剤」、およびそれらの文法的同等物は、ＬＳＤ１ポリペプチドによるＴａｔポリペプチドのメチル化を阻害する際の活性について試験されるべきである、任意の分子（例えば、タンパク質（それは本明細書でタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを含む）、小さい（すなわち、５Ｄａ〜１０００Ｄａ、１００Ｄａ〜７５０Ｄａ、２００Ｄａ〜５００Ｄａ、または５００Ｄａ未満のサイズ）有機または無機分子、多糖類、ポリヌクレオチド等）を意味する。
【０４２５】
多様な異なる試験薬剤が、対象方法を使用してスクリーニングされてもよい。候補薬剤は、多数の化学クラス、例えば、５０ダルトン超える、および約１０，０００ダルトン未満、約５，０００ダルトン未満、または約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物を包含する。試験薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、例えば、水素結合に必要な官能基を含む可能性があり、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、もしくはカルボキシル基、または官能性化学基のうちの少なくとも２個を含む可能性がある。試験薬剤は、上記の官能基のうちの１個以上で置換される、環状炭素もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくはポリ芳香族構造を含む可能性がある。試験薬剤もまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体、またはそれらの組み合わせを含む生体分子の中から見出される。
【０４２６】
試験薬剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む、多種多様な源から得られる。例えば、無作為化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生体分子の無作為合成および指向性合成のために、多数の手段が利用可能である。代替的に、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態での天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、または容易に生成される。追加的に、天然または合成的に生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段を通じて容易に修飾され、それらを使用して、コンビナトリアルライブラリーを生成してもよい。既知の薬理的薬剤を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化等の指向性または無作為化学修飾に供して、構造的類似体を生成してもよい。更に、スクリーニングは、既知の薬理的に活性な化合物およびそれらの化学類似体、または合理的薬物設計を通じて作り出されるもの等の未知の特性を有する新たな薬剤を対象としてもよい。
【０４２７】
一実施形態では、試験薬剤は、合成化合物である。無作為化オリゴヌクレオチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生体分子の無作為合成および指向性合成のために、幾つかの技法が利用可能である。例えば、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、国際公開第９４／２４３１４号を参照されたく、それは無作為化学法ならびに酵素法を含む、新たな化合物を産生するための方法を考察する。
【０４２８】
別の実施形態では、試験薬剤は、入手可能であるか、または容易に生成される、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態での天然化合物のライブラリーとして提供される。追加的に、天然または合成的に生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段を通じて容易に修飾される。既知の薬理的薬剤を、酵素修飾を含む、指向性または無作為化学修飾に供して、構造的類似体を生成してもよい。
【０４２９】
一実施形態では、試験薬剤は、有機部分である。この実施形態では、国際公開第９４／２４３１４号に一般に記載されるように、試験薬剤は、化学修飾され得る一連の基質から合成される。本明細書で「化学修飾される」は、伝統的な化学反応ならびに酵素反応を含む。これらの基質には一般に、アルキル基（アルカン、アルケン、アルキン、およびヘテロアルキルを含む）、アリール基（アレーンおよびヘテロアリールを含む）、アルコール、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン、酸、エステル、アミド、環式化合物、複素環式化合物（プリン、ピリミジン、ベンゾジアゼピン、ベータ−ラクタム、テトラサイクリン、セファロスポリン、および炭水化物を含む）、ステロイド（エストロゲン、アンドロゲン、コルチゾン、エクジソン（ｅｃｏｄｙｓｏｎｅ）等を含む）、アルカロイド（麦角、ビンカ、クラレ、ピロリジジン（ｐｙｒｏｌｌｉｚｄｉｎｅ）、およびマイトマイシンを含む）、有機金属化合物、ヘテロ原子担持化合物、アミノ酸、およびヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。化学（酵素を含む）反応をその部分に対して行って、新たな基質または候補薬剤を形成してもよく、それは次いで、本発明を使用して試験され得る。
【０４３０】
本明細書で使用されるとき、「決定すること」という用語は、定量的決定および定性的決定の両方を指し、したがって、「決定すること」という用語は、本明細書で「アッセイすること」、「測定すること」等と交換可能に使用される。
【０４３１】
好適なＬＳＤ１ポリペプチドは、上述される。例えば、ＬＳＤ１ポリペプチドは、図８に示され、配列番号１に記載されるアミノ酸配列の約７５０アミノ酸〜約８００アミノ酸、または約８００アミノ酸〜８５２アミノ酸の連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可能性がある。別の例として、ＬＳＤ１ポリペプチドは、図１０に示され、配列番号３に記載されるアミノ酸配列の約７５０アミノ酸〜約８００アミノ酸、約８００アミノ酸〜約８５０アミノ酸、または約８５０アミノ酸〜８７６アミノ酸の連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可能性がある。
【０４３２】
別の例として、ＬＳＤ１ポリペプチドは、図９Ａおよび９Ｂに示され、配列番号２に記載されるヌクレオチド配列の約２４００ヌクレオチド〜約２５００ヌクレオチド、または２５００ヌクレオチド〜２５５９ヌクレオチドの連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。別の例として、ＬＳＤ１ポリペプチドは、図１１Ａおよび１１Ｂに示され、配列番号４に記載されるヌクレオチド配列の約２５００ヌクレオチド〜約２６００ヌクレオチド、または２６００ヌクレオチド〜２６３１ヌクレオチドの連続した広がりに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【０４３３】
メチル化Ｔａｔポリペプチドは、約５０個のアミノ酸〜約１０５個のアミノ酸、例えば、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約７５ａａ、約７５ａａ〜約８０ａａ、約８０ａａ〜約８５ａａ、約８５ａａ〜約９０ａａ、約９０ａａ〜約９５ａａ、約９５ａａ〜約１００ａａ、または約１００ａａ〜約１０５ａａの長さを有する可能性があり、ここで単離されたメチル化Ｔａｔポリペプチドは、配列番号５のＬｙｓ−５１に対応する位置でメチル化Ｌｙｓを含み、また単離されたメチル化Ｔａｔポリペプチドは、配列番号５に記載されるアミノ酸配列（図１２）に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コンセンサスＴａｔ配列のＬｙｓ−５１に対応する位置におけるＴａｔリジン残基は、モノメチル化またはジメチル化することができる。脱メチル化には、モノメチル化Ｔａｔのメチル基の除去、およびジメチル化Ｔａｔの一方または双方のメチル基の除去が含まれる。
【０４３４】
ＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチドのアミノ酸配列は既知であり、これらの配列のうちのいずれも、対象アセチル化Ｔａｔポリペプチドに含めることができる。多数のＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質アミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋの下に見出される。例示的で非限定的なＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＯ２６２５０、ＡＡＯ２６２５２、ＡＡＯ２６２５４、ＡＡＯ２６２５８、ＡＡＯ２６２６０、ＡＡＯ２６２６２、ＡＡＯ２６２６４、ＡＡＯ２６２６６、ＡＡＯ２６２６８、ＡＡＯ２６２７０、ＡＡＯ２６２７２、ＡＡＯ２６２７４、ＡＡＯ２６２７６、ＡＡＯ２６２７８、ＡＡＯ２６２８０、ＡＡＯ２６２８２、ＡＡＯ２６２８４、ＡＡＯ２６２８６、ＡＡＯ２６２８８、ＡＡＯ２６２９０、ＡＡＯ２６２９２、ＡＡＯ２６２９４、ＡＡＯ２６２９６、ＡＡＯ２６２９８、ＡＡＯ２６３００、ＡＡＯ２６３０２、ＡＡＯ２６３０４、ＡＡＯ２６３０６、ＡＡＯ２６３０８、ＡＡＢ５０２５６、ＡＡＬ１２２０４、ＡＡＬ１２１９５、ＡＡＬ１２１８６、ＡＡＬ１２１７７、ＡＡＮ４７１３１、ＡＡＮ４７１２２、ＡＡＮ４７１１３、ＡＡＮ４７１０４、ＡＡＮ０３３３２、ＡＡＮ０３３２３、ＡＡＮ０３３１４、ＡＡＮ０３３０５、ＡＡＮ０３２９６、ＡＡＮ０３２８７、ＡＡＮ０３２７８、ＡＡＮ３１５９２、ＡＡＮ６４１２６、ＡＡＮ６４１１７、ＡＡＮ６４１０８、ＡＡＮ６４０９９、ＡＡＮ６４０９０、ＡＡＮ６４０８０、Ｋ０２０１３、ＡＡＬ２９４６０の下に見出され、図１３Ａおよび１３Ｂに示される通りである（配列番号１２〜３４、およびコンセンサスＴａｔ配列番号５）。更なるＨＩＶ  Ｔａｔアミノ酸配列は、Ｐｅｌｏｐｏｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１４７３−１１４７８、およびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：９６０−９６４に見出される。
【０４３５】
ＬＳＤ１ポリペプチドのためのメチル化基質は、モノメチル化および／またはジメチル化リジンを含む可能性がある。幾つかの実施形態では、メチル化ＬＳＤ１基質は、メチル化ＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチドである。幾つかの実施形態では、メチル化Ｔａｔポリペプチドは、図１２に示され、配列番号５に記載されるアミノ酸配列のＬｙｓ−５１に対応する位置におけるメチル化リジンを含み、ここでメチル化リジンは、モノメチル化またはジメチル化される。幾つかの実施形態では、メチル化Ｔａｔポリペプチドは、アミノ酸配列ＳＹＧＲＫＫＭｅＲＲＱＲ（配列番号６）、またはそれらの変形を含み、ここでメチル化リジンは、モノメチル化またはジメチル化される。好適なメチル化Ｔａｔポリペプチドは、例えば、米国特許公開第２００９／０２３３２６７号に記載される。
【０４３６】
幾つかの実施形態では、メチル化Ｔａｔポリペプチドは、非相同アミノ酸配列を含み、例えば、メチル化Ｔａｔポリペプチドは、メチル化Ｔａｔポリペプチドおよび融合パートナーを含む融合タンパク質であり得、ここで融合パートナーは、非相同ポリペプチド（例えば、Ｔａｔ以外のポリペプチド）である。非相同ポリペプチドは、Ｔａｔ以外のポリペプチドであり、ポリペプチド担体（下により詳細に考察される）；ヘマグルチニン（例えば、ＣＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号５８）、ＦＬＡＧ（例えば、ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号５９）、ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号６０）等を含むが、これらに限定されないエピトープタグ等の免疫学的タグ；蛍光タンパク質、酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等）等を含むが、これらに限定されない検出可能なシグナルを提供するタンパク質；融合タンパク質の精製または単離を促進するポリペプチド、例えば、６Ｈｉｓタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等の金属イオン結合ポリペプチド；真核性細胞膜を横切る輸送を促進するポリペプチド等が含まれるが、これらに限定されない。
【０４３７】
好適な蛍光タンパク質には、例えば、天然に生じるヌクレオチド配列のコドンが、ヒトコドンバイアスにより密接に合致するように変化させられる、ＧＦＰの「ヒト化」バージョン；オワンクラゲまたはその誘導体、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から市販されている高感度ＧＦＰ等の、例えば、「ヒト化」誘導体、に由来するＧＦＰ；例えば、国際公開第９９／４９０１９号およびＰｅｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０：５０７−５１９に記載される、ウミシイタケ、レニラ・ミューレリ、またはプチロサルクス・ゲルニ等の別の種からのＧＦＰ；「ヒト化」組換えＧＦＰ（ｈｒＧＦＰ）（Ｓｔｒａｔａ遺伝子）を含むが、これらに限定されない、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；例えば、Ｍａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９−９７３に記載される、花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａｎ）種からの多様な蛍光および有色タンパク質のいずれか；赤色蛍光タンパク質；黄色蛍光タンパク質等が含まれるが、これらに限定されない。融合パートナーが検出可能な生成物を産出する酵素である場合、生成物は、適切な手段を使用して検出することができ、例えば、β−ガラクトシダーゼは、基質に応じて、分光光度的に検出される有色生成物、または蛍光生成物を産出することができ、ルシフェラーゼは、ルミノメーターで検出可能な発光生成物を産出することができる等である。
【０４３８】
幾つかの実施形態では、メチル化Ｔａｔポリペプチドは、検出可能に標識される。種々の標識には、放射性同位体、蛍光体（例えば、蛍光染料）、化学発光体、酵素、特異的結合対のメンバー、粒子、例えば、磁気粒子等が含まれる。特異的結合対には、ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシン、レクチンおよび炭水化物部分、抗体およびハプテン、抗体および抗原等が含まれるが、これらに限定されない。
【０４３９】
メチル化Ｔａｔポリペプチドは、化学的または酵素的に合成されてもよく、組換えにより生成されてもよく、天然源から単離されても、または前述の組み合わせであってもよい。メチル化Ｔａｔポリペプチドは、高性能液体クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、または他の精製技法を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知のタンパク質精製の標準的方法を使用して、天然源から単離されてもよい。固相ペプチド合成技法を用いてもよく、かかる技法は、当業者に既知である。Ｊｏｎｅｓ，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）（１９９４）を参照されたい。一般に、かかる方法において、ペプチドは、活性化単量体単位の、固相に結合した成長ペプチド鎖への順次の付加を通じて生成される。ペプチドは、溶液中または固体支持体上で、従来の技法に従って合成することができる。種々の自動合成器が市販されており、既知のプロトコルに従って使用することができる。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（１９８４）、Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６４４２（１９８３）、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−３４７（１９８６）、およびＢａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−２８４（１９７９）を参照されたく、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。定着している組換えＤＮＡ技法を、メチル化Ｔａｔポリペプチドの生成のために用いることができる。
【０４４０】
幾つかの実施形態では、Ｔａｔポリペプチドは、合成後もしくは合成中、または例えば、Ｔａｔポリペプチドの天然に生じる源からの単離後のいずれかに、細胞不含反応においてインビトロでメチル化される。例えば、Ｔａｔポリペプチドは、ＳＥＴドメイン含有ポリペプチド（例えば、Ｓｅｔ９）と、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、およびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を含有する緩衝液中で接触させられる。幾つかの実施形態では、Ｌｙｓ５１メチル化Ｔａｔポリペプチドは、Ｔａｔポリペプチドの合成中に、例えば、放射性標識メチルドナーを使用して検出可能に標識される。
【０４４１】
好適なＳＥＴドメイン含有ポリペプチドには、例えば、Ｓｅｔ９ポリペプチド、ＳＥＴＤＢ１ポリペプチド、およびＳＥＴＤＢ２ポリペプチドが含まれる。Ｓｅｔ９アミノ酸配列については、米国特許公開第２００９／０２３３２６７号（例えば、米国特許公開第２００９／０２３３２６７号の図１２Ａおよび配列番号３１）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０８５１５１、ならびにびＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｑ８ＷＴＳ６、ＡＡＬ６９９０１、およびＡＡＩ２１０５を参照されたい。ＳＥＴＤＢ１ポリペプチドおよびＳＥＴＤＢ２ポリペプチドについては、例えば、ｖａｎＤｕｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．５：４０、ヒトＳＥＴＤＢ１のアミノ酸配列についてのＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ０９３６２、ならびにヒトＳＥＴＤＢ２のアミノ酸配列についてのＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ４７４３４およびＡＡＨ１７０７８を参照されたい。
【０４４２】
Ｓｅｔ９ポリペプチドのアミノ酸配列は、当該技術分野で既知である。例えば、ヒトＳｅｔ９アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０８５１５１に見出される。他のＳｅｔ９アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｑ８ＷＴＳ６、ＡＡＬ６９９０１、およびＡＡＩ２１０５６に提供される。好適なＳｅｔ９ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０８５１５１に提供されるアミノ酸配列の約２５０アミノ酸〜約３００アミノ酸、または約３００アミノ酸〜約３６５個のアミノ酸の連続した広がりに対して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、ここでＳｅｔ９ポリペプチドは、酵素的に活性であり、例えば、図１２に記載されるＴａｔポリペプチドのＬｙｓ−５１に対応する位置でリジンをメチル化することが可能である。
【０４４３】
Ｔａｔポリペプチドはまた、翻訳後に、生存細胞（例えば、哺乳類細胞株等の真核性細胞）中、インビトロでメチル化することができ、例えば、Ｌｙｓ−５１は、Ｔａｔポリペプチドの合成に続いて、翻訳後にメチル化される。例えば、細胞は、Ｓｅｔ９ポリペプチドを含む可能性があり、例えば、細胞は、内在性Ｓｅｔ９ポリペプチドを含む可能性があるか、またはＳｅｔ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子改変される可能性がある。代替的に、細胞は、ＳＥＴＤＢ１ポリペプチドまたはＳＥＴＤＢ２ポリペプチドを含む可能性があり、例えば、細胞は、内在性ＳＥＴＤＢ１ポリペプチドまたは内在性ＳＥＴＤＢ２ポリペプチドを含む可能性があるか、あるいはＳＥＴＤＢ１ポリペプチドまたはＳＥＴＤＢ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子改変される可能性がある。幾つかの実施形態では、Ｌｙｓ５１メチル化Ｔａｔポリペプチドは、Ｔａｔポリペプチドの合成中に、例えば、放射性標識メチルドナーを使用して検出可能に標識される。
【０４４４】
生存真核性細胞によって合成されるメチル化Ｔａｔポリペプチドは、タンパク質精製のための標準的方法を使用して回収することができる。幾つかの実施形態では、生存真核性細胞によってメチル化されるＴａｔポリペプチドは、精製を促進する部分（例えば、結合部分）、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６Ｈｉｓ等を含む融合タンパク質であり、メチル化Ｔａｔポリペプチドは、結合部分に適切な分離培地を使用して精製される。
【０４４５】
幾つかの実施形態では、メチル化Ｔａｔポリペプチドは、融合タンパク質、例えば、メチル化Ｔａｔポリペプチドおよび非相同（非Ｔａｔ）ポリペプチド（例えば、融合パートナー）を含むポリペプチドであり、ここで好適な非相同ポリペプチド（融合パートナー）には、例えば、エピトープタグ；基質に対して作用して、検出可能な生成物（例えば、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等）を産出する酵素；蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質等）等が含まれる。メチル化Ｔａｔポリペプチドはまた、例えば、放射標識で、検出可能に標識することもできる。幾つかの実施形態では、メチル化Ｔａｔポリペプチドは、ビオチン化される。
【０４４６】
メチル化Ｔａｔポリペプチド、ＬＳＤ１ポリペプチド、および試験薬剤に加えて、多様な他の試薬が、スクリーニングアッセイに含まれてもよい。好適な更なる試薬には、最適な酵素活性を促進するためおよび／または非特異的活性もしくはバックグラウンド活性を低減するために使用される薬剤を含む、試薬等の塩、中性タンパク質、例えば、アルブミン、洗剤等が含まれる。プロテアーゼ阻害剤、抗微生物薬剤等の、アッセイの効率を改善する試薬が使用されてもよい。アッセイ混合物の構成成分は、必須の活性を提供する任意の順序で添加される。インキュベーションは、任意の好適な温度、典型的に４℃〜４０℃で行われる。インキュベーション期間は、最適な活性のために選択されるが、また、迅速な高処理スクリーニングを促進するために最適化されてもよい。幾つかの実施形態では、０．１時間〜１時間、１時間〜２時間、または２時間〜４時間が十分であろう。
【０４４７】
本発明のアッセイは、対照を含み、好適な対照は、試料（例えば、試験薬剤の不在下でメチル化ＴａｔポリペプチドおよびＬＳＤ１ポリペプチドを含む試料）を含む。一般に複数のアッセイ混合物は、種々の濃度に対する示差的反応を得るために、異なる薬剤濃度と並行して実行される。典型的には、これらの濃度のうちの１つは、陰性対照としての機能を果たし、すなわち、ゼロ濃度であるか、または検出レベルを下回る。
【０４４８】
該当する場合、試験薬剤の、ＬＳＤ１ポリペプチドによるメチル化Ｔａｔポリペプチドの脱メチル化に対する効果は、基質メチル化Ｔａｔポリペプチドのメチル化の度合いを査定することによって容易に決定することができる。メチル化Ｔａｔポリペプチドの脱メチル化は、例えば、Ｌｙｓ−５１メチル化Ｔａｔポリペプチドに特異的な抗体を使用して決定することができる。メチル化Ｔａｔポリペプチドの脱メチル化はまた、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を使用して決定することもできる。
【０４４９】
幾つかの実施形態では、試験薬剤の、Ｔａｔポリペプチドのメチル化に対する効果は、Ｌｙｓ−５１メチル化Ｔａｔポリペプチドに特異的な抗体を使用して決定される。決定ステップは、免疫沈降方法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロットアッセイ、放射免疫測定法（ＲＩＡ）等を使用して行うことができ、ここでＬｙｓ−５１メチル化Ｔａｔポリペプチドに特異的な抗体が使用される。幾つかの実施形態では、配列番号５に記載されるアミノ酸配列のＬｙｓ−５１に対応するリジンがメチル化されない、アミノ酸配列ＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲ（配列番号６１）を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を使用して、Ｌｙｓ−５１メチル化されないＴａｔポリペプチドの量、例えば、配列番号１に記載されるアミノ酸配列のＬｙｓ−５１に対応するリジンにおいてメチル化されないＴａｔポリペプチドの量を査定することができる。
【０４５０】
他の実施形態では、メチルドナーが放射性標識され、決定ステップは、ＳＥＴドメイン含有ポリペプチドとの反応に続いて、メチル化Ｔａｔペプチドにおける放射標識を検出することを含む。
【０４５１】
幾つかの実施形態では、対象スクリーニング法は、無細胞インビトロスクリーニング法である。他の実施形態では、対象スクリーニング法は、細胞ベースのインビトロスクリーニング法である。
【０４５２】
無細胞インビトロスクリーニング法を行う際、メチル化ＴａｔポリペプチドおよびＬＳＤ１ポリペプチドは、試験試料中に、細胞抽出物中、実質的に純粋な形態で（例えば、汚染物質、ならびにＬＳＤ１ポリペプチドおよびメチル化Ｔａｔポリペプチド以外の高分子が、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％不在）、または他の非精製形態で、存在する可能性がある。
【０４５３】
幾つかの実施形態では、試験薬剤の、メチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化に対する効果を決定することに加えて、試験薬剤は、それが生存真核性細胞に対して示し得る任意の細胞傷害性活性について、トリパンブルー排除、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド）アッセイ等の周知のアッセイを使用して査定される。細胞傷害性活性を示さない薬剤が、候補薬剤と見なされる。
【０４５４】
幾つかの実施形態では、対象スクリーニング法は、細胞ベースのインビトロスクリーニング法である。ＬＳＤ１ポリペプチドおよびＴａｔポリペプチドを発現する細胞は、試験薬剤と接触させられ、該当する場合、試験薬剤の、ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化に対する効果が決定される。薬剤の、ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化に対する効果は、上述のように決定することができる。例えば、決定ステップについて、Ｔａｔポリペプチド（それは、メチル化および非メチル化Ｔａｔポリペプチドの混合物であり得る）を含む細胞抽出物または細胞ライセートが分析され得るか、またはＴａｔポリペプチド（それは、メチル化および非メチル化Ｔａｔポリペプチドの混合物であり得る）が、例えば、実質的に純粋な形態で、細胞ライセートから単離され、次いでメチル化について分析され得る。
【０４５５】
細胞ベースのインビトロスクリーニング法は、多様な細胞のいずれか、例えば、初代細胞、不死化細胞等を使用して行うことができる。幾つかの実施形態では、細胞は、真核性細胞である。好適な哺乳類細胞株には、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、齧歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株等が含まれる。好適な哺乳類細胞株には、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（例えば、ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞等が含まれるが、これらに限定されない。かかる細胞の誘導体もまた、使用に好適である。また、潜伏免疫不全ウイルスを有するヒトＴ細胞株、例えば、米国特許第７，２３２，６８５号に記載される細胞株も使用に好適である。
【０４５６】
幾つかの実施形態では、細胞は、内在性ＬＳＤ１ポリペプチドを生成する。他の実施形態では、細胞は、酵素的に活性なＬＳＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子改変される。対象細胞ベースのインビトロスクリーニング法における使用のために、細胞を遺伝子改変するための使用に好適なＬＳＤ１コードヌクレオチド配列は、上述される。
【０４５７】
細胞はまた、Ｔａｔ核酸、例えば、配列番号５に記載されるアミノ酸配列のＬｙｓ−５１に対応するリジンを少なくとも含む、Ｔａｔポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で、遺伝子改変することもできる。好適なＴａｔ核酸は、図１４に示されるヌクレオチド配列の約３０ヌクレオチド〜約４５ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド〜約７５ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド〜約１０５ヌクレオチド、約１０５ヌクレオチド〜約１２０ヌクレオチド、約１２０ヌクレオチド〜約１３５ヌクレオチド、約１３５ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド〜約１６５ヌクレオチド、約１６５ヌクレオチド〜約１８０ヌクレオチド、約１８０ヌクレオチド〜約１９５ヌクレオチド、約１９５ヌクレオチド〜約２１０ヌクレオチド、約２１０ヌクレオチド〜約２２５ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド〜約２４０ヌクレオチド、約２４０ヌクレオチド〜約２５５ヌクレオチド、約２５５ヌクレオチド〜約２７０ヌクレオチド、約２７０ヌクレオチド〜約２８５ヌクレオチド、または約２８５ヌクレオチド〜約３０６ヌクレオチドの連続した広がりとの、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は、配列番号５に記載されるアミノ酸配列のＬｙｓ−５１に対応するリジンをコードする配列を含み、例えば、ヌクレオチド配列は、少なくともＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲ（配列番号６１）、またはその変異型をコードする配列を含む。
【０４５８】
幾つかの実施形態では、Ｔａｔ核酸は、少なくともＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲ（配列番号６１）、またはその変異型を含む、Ｔａｔポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、好適なＴａｔ核酸は、ヌクレオチド配列５’−ＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡ−３’（配列番号６２）を含む。幾つかの実施形態では、Ｔａｔポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写制御要素に作動可能に連結され、またそれは、幾つかの実施形態では、後述の発現ベクター内に含有される。
【０４５９】
Ｔａｔ核酸を含む遺伝子改変宿主細胞が、コードされたＴａｔポリペプチドをメチル化しない場合、宿主細胞は、Ｓｅｔ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子改変される可能性がある。Ｓｅｔ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、当該技術分野で既知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＣ１２１０５５、および米国特許公開第２００９／０２３３２６７号の図１２Ｂ（配列番号３２）を参照されたい。例えば、好適なＳｅｔ９核酸は、米国特許公開第２００９／０２３３２６７号の図１２Ｂに記載されるヌクレオチド配列（配列番号３２）に対して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０４６０】
好適な発現ベクターには、バキュロウイルスベクター、バクテリオファージベクター、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター等に基づくウイルスベクター）、Ｐ１ベースの人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および目的の具体的宿主（大腸菌、哺乳類細胞、または酵母等）に特異的な任意の他のベクターが含まれるが、これらに限定されない。好適なベクターには、染色体ＤＮＡ、非染色体ＤＮＡ、および合成ＤＮＡ配列が含まれる。
【０４６１】
多数の好適な発現ベクターは、当業者に既知であり、多くが市販されている。例えば、真核性宿主細胞中での使用に好適な発現ベクターには、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａ遺伝子）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれるが、これらに限定されない。しかしながら、宿主細胞と適合性である限り、任意の他のベクターが使用されてもよい。
【０４６２】
好適な真核性プロモーターの非限定的例としては、ＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベルの範囲内に十分に入る。発現ベクターはまた、翻訳開始および転写終結因子のためのリボソーム結合部位を含有してもよい。発現ベクターはまた、発現を増幅するのに適切な配列を含んでもよい。
【０４６３】
一般に、発現ベクターは、複製の起点を含むであろう。更に、発現ベクターは、真核性細胞培養物に対するジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはネオマイシン抵抗性等の、形質転換された（遺伝子改変）宿主細胞の選択のために、表現型形質を提供するための１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。
【０４６４】
メチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤を特定する方法
本開示は、メチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を阻害する薬剤を特定する方法を提供する。本方法は一般に、次のことを含む：ａ）ＬＳＤ１ポリペプチドおよびメチル化Ｔａｔポリペプチドを試験薬剤と接触させること、ならびにｂ）該当する場合、試験薬剤の、Ｔａｔポリペプチドのメチル化に対する効果を決定すること。ＬＳＤ１ポリペプチドによるメチル化Ｔａｔポリペプチドの脱メチル化を、試験薬剤の不在下でのＴａｔポリペプチドのメチル化のレベルと比較して阻害する試験薬剤は、ＨＩＶ  ＴａｔのＬＳＤ１媒介型メチル化の阻害剤と見なされる。幾つかの実施形態では、対象スクリーニング法は、無細胞インビトロスクリーニング法である。他の実施形態では、対象スクリーニング法は、細胞ベースのインビトロスクリーニング法である。
【０４６５】
ＬＳＤ１ポリペプチドによるメチル化Ｔａｔポリペプチドの脱メチル化を阻害する薬剤は、ＨＩＶ転写を阻害するための候補薬剤と見なされ、故に、個体における（ＨＩＶ）感染症を治療するための候補薬剤と見なされる。
【０４６６】
ＬＳＤ１ポリペプチドによるメチル化Ｔａｔポリペプチドの脱メチル化を阻害する試験薬剤は、免疫不全ウイルス感染症を治療するための候補薬剤である。幾つかの実施形態では、目的の試験薬剤は、ＬＳＤ１ポリペプチドによるメチル化Ｔａｔポリペプチドの脱メチル化を、試験薬剤の不在下でのメチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化の度合いまたはレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、またはそれを超えて阻害する。
【０４６７】
例えば、幾つかの実施形態では、目的の試験薬剤は、ＬＳＤ１ポリペプチドによって脱メチル化される、試験試料中に存在する総計のメチル化Ｔａｔポリペプチドの割合を、試験薬剤の不在下でＬＳＤ１ポリペプチドによって脱メチル化される、試験試料中に存在する総計のメチル化Ｔａｔポリペプチドの割合と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれを超えて低減する。
【０４６８】
換言すると、幾つかの実施形態では、目的の試験薬剤は、試験試料中の、脱メチル化Ｔａｔポリペプチド（例えば、非メチル化Ｌｙｓ−５１メチル化を有するＴａｔポリペプチド、または配列番号５に記載されるアミノ酸配列のＬｙｓ−５１に対応する位置でメチル化されないＴａｔポリペプチド）の百分率を、試験薬剤の不在下での試験試料中の脱メチル化Ｔａｔポリペプチドの百分率と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれを超えて低減する。
【０４６９】
幾つかの実施形態では、目的の試験薬剤は、ＬＳＤ１ポリペプチドによるメチル化ＴａｔポリペプチドのＬｙｓ−５１脱メチル化（例えば、配列番号５のＬｙｓ−５１に対応する位置におけるＬｙｓ−５１の脱メチル化またはメチル化Ｌｙｓの脱メチル化）を、約１００μＭ〜約５０μＭ、約５０μＭ〜約２５μＭ、約２５μＭ〜約１０μＭ、約１０μＭ〜約５μＭ、約５μＭ〜約１μＭ、約１μＭ〜約５００ｎＭ、約５００ｎＭ〜約４００ｎＭ、約４００ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３００ｎＭ〜約２５０ｎＭ、約２５０ｎＭ〜約２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約１５０ｎＭ、約１５０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約３０ｎＭ、約３０ｎＭ〜約２５ｎＭ、約２５ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１５ｎＭ、約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約５ｎＭ、または約５ｎＭ未満の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を伴って、阻害するものである。
【０４７０】
ＬＳＤ１酵素活性および／またはレベルを増加させる薬剤を特定する方法
本開示は、メチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を増加させる薬剤を特定する方法を提供する。本方法は一般に、次のことを含む：ａ）ＬＳＤ１ポリペプチドおよびメチル化Ｔａｔポリペプチドを試験薬剤と接触させること、ならびにｂ）該当する場合、試験薬剤の、Ｔａｔポリペプチドのメチル化に対する効果を決定すること。メチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化を、試験薬剤の不在下でのＴａｔポリペプチドのメチル化のレベルと比較して増加させる試験薬剤は、ＨＩＶ  ＴａｔのＬＳＤ１媒介型メチル化の活性化因子と見なされる。幾つかの実施形態では、対象スクリーニング法は、無細胞インビトロスクリーニング法である。他の実施形態では、対象スクリーニング法は、細胞ベースのインビトロスクリーニング法である。
【０４７１】
ＬＳＤ１ポリペプチドによるメチル化Ｔａｔポリペプチドの脱メチル化を増加させる薬剤は、ＨＩＶ感染細胞のゲノム中に組み込まれた潜伏ＨＩＶを再活性化するための候補薬剤と見なされる。かかる薬剤は、１つ以上の抗ＨＩＶ薬剤との併用療法で使用される可能性がある。
【０４７２】
幾つかの実施形態では、目的の試験薬剤は、ＬＳＤ１ポリペプチドによるメチル化Ｔａｔポリペプチドの脱メチル化を、試験薬剤の不在下でのメチル化ＴａｔポリペプチドのＬＳＤ１媒介型脱メチル化の度合いまたはレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、または２５倍を超えて増加させる。
【０４７３】
例えば、幾つかの実施形態では、目的の試験薬剤は、ＬＳＤ１ポリペプチドによって脱メチル化される、試験試料中に存在する総計のメチル化Ｔａｔポリペプチドの割合を、試験薬剤の不在下でＬＳＤ１ポリペプチドによって脱メチル化される、試験試料中に存在する総計のメチル化Ｔａｔポリペプチドの割合と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、または２５倍を超えて増加させる。
【０４７４】
換言すると、幾つかの実施形態では、目的の試験薬剤は、試験試料中の、脱メチル化Ｔａｔポリペプチド（例えば、非メチル化Ｌｙｓ−５１メチル化を有するＴａｔポリペプチド、または配列番号５に記載されるアミノ酸配列のＬｙｓ−５１に対応する位置でメチル化されないＴａｔポリペプチド）の百分率を、試験薬剤の不在下での試験試料中の脱メチル化Ｔａｔポリペプチドの百分率と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、または２５倍を超えて増加させる。
【０４７５】
幾つかの実施形態では、目的の試験薬剤は、幾つかの実施形態では、目的の試験薬剤は、ＬＳＤ１ポリペプチドによるメチル化ＴａｔポリペプチドのＬｙｓ−５１脱メチル化（例えば、配列番号５のＬｙｓ−５１に対応する位置におけるＬｙｓ−５１の脱メチル化またはメチル化Ｌｙｓの脱メチル化）を、約１００μＭ〜約５０μＭ、約５０μＭ〜約２５μＭ、約２５μＭ〜約１０μＭ、約１０μＭ〜約５μＭ、約５μＭ〜約１μＭ、約１μＭ〜約５００ｎＭ、約５００ｎＭ〜約４００ｎＭ、約４００ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３００ｎＭ〜約２５０ｎＭ、約２５０ｎＭ〜約２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約１５０ｎＭ、約１５０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約３０ｎＭ、約３０ｎＭ〜約２５ｎＭ、約２５ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１５ｎＭ、約１５ｎＭ〜約１０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約５ｎＭ、または約５ｎＭ未満の最大半量の有効濃度（ＥＣ５０）を伴って、増加させるものである。
【実施例】
【０４７６】
次の例は、当業者に本発明の作製および使用方法の開示および説明を提供するために提示されるものであり、本発明者らが何を本発明として見なすかについての範囲を限定するようには意図されず、かつそれらが、下記の実験が全てのまたは唯一の行われた実験であることを表すことも意図されない。使用された数（例えば、量、温度等）に関する正確性を確実にするための努力がなされてきたが、幾つかの実験的誤差および偏差が考慮されるべきである。別途指示しない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。標準的な略号が使用され得、例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｐｌ、ピコリットル（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（ｓｅｃｏｎｄ）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時間（ｈｏｕｒ）（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｂｐ、塩基対（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）；ｉ．ｍ．、筋肉内（に）；ｉ．ｐ．、腹腔内（に）；ｓ．ｃ．、皮下（に）等である。抗体の文脈において、特定の抗原に対する抗体は、アルファ（α）によって表される可能性があり、例えば、抗ＣｏＲＥＳＴ抗体は、「α−ＣｏＲＥＳＴ」と称される可能性があり、抗ＦＬＡＧ抗体は、「α−ＦＬＡＧ」と称される可能性があり、抗ＬＳＤ１抗体は、「α−ＬＳＤ１」と称される可能性がある等である。
【０４７７】
実施例１
材料および方法
細胞、試薬、および抗体
ＨｅＬａおよび２９３Ｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た）、およびＪｕｒｋａｔクローンＡ２（Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２２：１８６８−１８７７）を、標準的な細胞培養条件下で維持した。次の抗体は、市販のものであった：α−ＬＳＤ１／ＫＤＭ１（番号ａｂ５１８７７、ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、α−ＣｏＲＥＳＴ（番号ａｂ２４１６６、ａｂｃａｍ）、α−ＦＬＡＧ  Ｍ２（番号Ｆ−３１６５  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）、α−ヒストン  Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（番号０７−０３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、α−ヒストン  Ｈ３（番号０７−６９０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、α−チューブリン（番号Ｔ６０７４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、α−Ｔａｔ（ＭＭＳ−１１６Ｐ、Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）およびα−ＣＤ２８（番号１６−０２８９−８５  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）。α−Ｋ５１モノメチル化Ｔａｔポリクローナル抗体は、前述された。Ｐａｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ７：２３４−２４４．α−ＣＤ３（ＯＫＴ−３）は、ＵＣＳＦモノクローナル抗体コア施設から得た。
【０４７８】
硫酸フェネルジンは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＭＨＧ  Ｃｏｒｐ．（番号３０３２  Ｇａｒｄｅｎａ，ＣＡ）およびＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（番号ＥＩ−２１７，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）から購入した。サクイナビルは、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨから得た。組換えヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）は、Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ（番号ＨＺ−１０１４、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）から購入した。
【０４７９】
合成Ｔａｔタンパク質（ａａ１〜７２）を前述のように合成し（Ｐａｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ３：ｅ４１）、ＡＲＭ領域短ペプチド（ａａ４５〜５８）と一緒に合成した（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０４８０】
ＨＩＶ  ＬＴＲルシフェラーゼ構築物、ＥＦ−１α−Ｔａｔ／ＦＬＡＧ発現ベクター、Ｋ５１Ａ突然変異ＥＦ−１α−Ｔａｔ／ＦＬＡＧ発現ベクター、およびｐＥＦ−１α−ＲＬ（ウミシイタケルシフェラーゼ）は、前述された。上記のＰａｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）。ＦＬＡＧアミノ酸配列は、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号５９）である。ＨｉｓタグＬＳＤ１原核性発現ベクターは、Ｄｒ．Ｙａｎｇ  Ｓｈｉ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｅｌｌ  １１９：９４１−９５）によって善意で提供された。ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３クローンを含有するルシフェラーゼ（それは、複数回の感染、および長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターから駆動されるルシフェラーゼの生成が可能である）は、Ｄｒ．Ｗａｒｎｅｒ  Ｃ  Ｇｒｅｅｎｅ（Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）によって善意で提供された。
【０４８１】
ＥＦ−１αプロモーター（ｐＳｉｃｏＲＭＳ）（Ｇｒｓｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ３：ｅ１４５、Ｖｅｎｔｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１０３８０−１０３８５）によって駆動される、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子をコードするｐＳｉｃｏＲレンチウイルスベクターの修飾バージョンは、Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｓｐｉｎｄｌｅｒ（Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ）によって善意で提供された。ＬＳＤ１（ＬＳＤ１番号１：ＧＡＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＡＧＣＡＡＴＡ、配列番号３６；ＬＳＤ１番号２：ＣＡＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧ、配列番号６３）を標的とする小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を、ｐＳｉｃｏＲＭＳ中にクローン化した。非標的型対照配列（ｓｈスクランブル：ＧＴＣＡＡＧＴＣＴＣＡＣＴＴＧＣＧＴＣ、配列番号６４）（Ｈｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３：４２７２−４２８２、および標的型ルシフェラーゼ（ｓｈルシフェラーゼ：ＣＴＴＡＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＡ、配列番号６５）を含有するｐＳｉｃｏＲＭＳは、Ｄｒ．Ｓｉｌｋｅ  Ｗｉｓｓｉｎｇ（Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）によって善意で提供された。ＣｏＲＥＳＴに対するＳｈＲＮＡおよび対照の空のｐＬＫＯ．１ベクターは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）から購入した。
【０４８２】
Ｔａｔタンパク質のゲル内消化およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析
Ｊｕｒｋａｔ  Ａ２細胞から精製したＣ末端ＦＬＡＧタグＴａｔタンパク質（Ｔａｔ／ＦＬＡＧ）（約１００ｎｇ）を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｆｌａｍｉｎｇｏ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって更に精製した。Ｔａｔバンドを切除し、５０％（ｖ／ｖ）エタノールを含有する２００μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、続いて２００μＬのエタノールで、２回洗浄した。次いで、ゲル中のＴａｔタンパク質を、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）により、５６℃で１時間還元し、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の５５ｍＭヨードアセトアミドにより、３０分間室温でアルキル化した。還元およびアルキル化後、ゲルを、アセトニトリルで３回脱水した。ゲルを、５ｎｇ／μＬのキモトリプシン（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｕｐｐｅｒ  Ｂａｖａｒｉａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む２００μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムを添加することによって再水和し、３０℃で２時間インキュベートした。Ｔａｔタンパク質から消化されたペプチドを、ゲルから、３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含有する１％（ｖ／ｖ）ギ酸、続いて６０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含有する１％（ｖ／ｖ）ギ酸で抽出した。抽出物したペプチド溶液を、スピードバック（ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ）によって乾燥させた。次いで、残基のペプチドを、２％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含有する３０μＬの０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で再構築し、ＺｉｐＴｉｐＣ１８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって、製造業者の説明に従って脱塩した。ＺｉｐＴｉｐＣ１８から溶出した２μＬの浄化されたペプチド溶液を、Ｂｒｕｋｅｒ金属ＭＡＬＤＩ標的（ＭＴＰ３８４研削鋼、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に積層し、２μＬの飽和マトリックス溶液（３３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ中の、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸溶液）と混合した。ペプチド混合物を、室温で乾燥させた。ペプチド混合物を、ウルトラフレックスＩＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計によって、陽イオン検出のためにリフレクタモードで作動させ、ｆｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌ３．０ソフトウェアによって制御して分析した。ＭＳ／ＭＳ取り込みのために、目的のイオンをレーザー誘起減衰によって断片化し、断片の質量を、ＬＩＦＴモードを使用して分析した。モノアイソトピック（Ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ）質量を、ｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ  ３．０ソフトウェアを使用し、ＳＮＡＰピークピッキングアルゴリズムを用いて決定した。ペプチドの修飾を、ＢｉｏｔｏｏｌｓソフトウェアにおけるＵｎｉＭｏｄデータベースを使用して分析した。
【０４８３】
二重修飾（ｂｉ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）Ｔａｔ抗体の産生
二重修飾Ｔａｔ（ＡｃＫ５０／Ｍｅ１Ｋ５１）特異的抗体を産生するための戦略を、前述と同様に行った。上記のＰａｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）、Ｐａｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５３：９１。簡潔に述べると、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）で共役させた二重修飾高アルギニンモチーフ（ＡＲＭ）ペプチド（ＡｃＫ５０／Ｍｅ１Ｋ５１）を、ラビット中に免疫付与した。ペプチドのアミノ酸配列は、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号５２）、ＲＫＡｃＫＭｅＲＲＱＲＲＲ（配列番号６６）、ＲＫＡｃＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６７）、およびＲＫＫＭｅＲＲＱＲＲＲ（配列番号３５）であり、ここでＫＡｃは、アセチル化リジンであり、ＫＭｅは、モノメチル化リジンである。同じペプチドを、抗血清の親和性精製のために使用した。確立された抗体の特異性を、Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ分析によって、ＡＲＭペプチド（非修飾、Ｋ５０アセチル化、Ｋ５１モノメチル化、および二重修飾）および合成完全長Ｔａｔを使用したウェスタンブロット分析（非修飾、Ｋ５０アセチル化、Ｋ５１メチル化、および二重修飾）を使用して監視した。
【０４８４】
インビトロ酵素アッセイ
組換えＬＳＤ１のタンパク質発現および精製、ならびに合成Ｔａｔタンパク質（３μｇ）または精製された総計の細胞ヒストン（８μｇ）でのＬＳＤ１（０．５〜２．０μｇ）のインビトロ脱メチル化反応を、前述のように行った。上記のＳｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）。反応物を、ウェスタンブロットによって、α−Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔ抗体（１μｇ／ｍl）を使用して分析した。合成Ｔａｔタンパク質（アミノ酸（ａａ）１〜７２、１μｇ）およびＡＲＭペプチド（ａａ４５〜５８、１００μＭ）、Ｓｅｔ７／９−ＫＭＴ７酵素（２μｇ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ならびに３Ｈ−Ｓ−アデノシルメチオニン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でのインビトロメチル化反応を、前述のように行った。上記のＰａｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）。合成Ｔａｔタンパク質（１μｇ）、ＡＲＭペプチド（１００μＭ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ｐ３００ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）酵素（ａａ１１９５〜１８１０、５μｇ、Ｇｕ  ａｎｄ  Ｒｏｅｄｅｒ（１９９７）Ｃｅｌｌ  ９０：５９５−６０６）、および１４Ｃ−アセチルＣｏＡ（０．１μＣｉ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でのインビトロアセチル化反応を、記載されるように行った。Ｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ９：１４８９−１４９２。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅゲル電気泳動によって分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。
【０４８５】
ＲＮＡｉ実験
ＨｅＬａ細胞についての短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分析を記載されるように行った。上記のＰａｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）。簡潔に述べると、ＨｅＬａ細胞を、プールされたＬＳＤ１および対照ｓｉＲＮＡ（２００ｐｍｏｌ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ；Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）で、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（番号５８３０３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してトランスフェクトし、４８時間後に、ＨＩＶ  ＬＴＲルシフェラーゼ構築物（２００ｎｇ）、Ｔａｔ発現ベクター（２ｎｇ）、および対応量の空のベクターで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（番号５０４７０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって再度トランスフェクトした。細胞を２４時間後に採取し、ルシフェラーゼアッセイ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、番号Ｅ１５０１、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）またはウェスタンブロッティングのためにプロセスした。
【０４８６】
Ｊｕｒｋａｔ  Ａ２細胞を、ＬＳＤ１（ｓｈＬＳＤ１番号１および番号２）に対する、ルシフェラーゼ（ｓｈルシフェラーゼ）に対する、または非標的型ｓｈＲＮＡ対照（Ｓｈスクランブル）に対するｓｈＲＮＡを発現する、シュードタイピングされたｐＳｉｃｏＲＭＳ由来レンチウイルスベクターで形質導入した。これらのレンチウイルスベクターはまた、ＥＦ−１αプロモーターの制御下でｍＣｈｅｒｒｙタンパク質も発現する（細胞、試薬、抗体の項目を参照されたい）。感染の５〜１０日後、細胞を０．０８ｎｇ／ｍlのＴＮＦ−αで１２時間処理した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびｍＣｈｅｒｒｙの発現を、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＬＳＲＩＩ，Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）によって分析した。同じ実験を、ＣｏＲＥＳＴ（ｓｈＣｏＲＥＳＴ番号１および番号２）および空のベクター（ｓｈ対照）に対するｓｈＲＮＡを発現するｐＬＫＯ．１由来ベクターを使用して行った。ｐＬＫＯ．１ベクターの場合には、ピューロマイシンを、選択のために、ｓｈＲＮＡ感染の１日後に添加した（１ｎｇ／ｍl最終濃度）。
【０４８７】
クロマチン免疫沈降実験
Ｊｕｒｋａｔ  Ａ２細胞からのクロマチン免疫沈降を前述のように行った。Ｋａｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ５：ｅ１０００４９５、上記のＰａｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）。クロマチン溶液を、ＴＮＦ−α（２ｎｇ／ｍl）で処理したＡ２細胞から単離し、α−ＬＳＤ１抗体（ａｂｃａｍ）、α−ＣｏＲＥＳＴ抗体（ａｂｃａｍ）、または対照ラビット免疫前血清で免疫沈降させた。免疫沈降した物質を、リアルタイムポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＨＩＶ  ＬＴＲに特異的なプライマーを用いて、ＡＢＩ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）および２倍Ｈｏｔ  ＳｙｂｒリアルタイムＰＣＲキット（番号ＨＳＭ−４００、ＭｃＬａｂ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用して定量化した。プライマー配列は、次の通りであった：ＨＩＶ  ＬＴＲ上流：ＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＴＣＣＴＧＣＡＴＡ（配列番号６８）、ＨＩＶ  ＬＴＲ下流：ＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＣＴＴＴ（配列番号６９）。
【０４８８】
免疫共沈降実験
２９３Ｔ細胞を、Ｔａｔ発現ベクターで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を、免疫沈降（ＩＰ）緩衝液（２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＮＰ４０、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＮａＦ、およびプロテアーゼ阻害剤）中に溶解させ、α−ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により、一晩、４℃で免疫沈降させた。ビーズを十分に洗浄し、α−ＬＳＤ１、α−ＣｏＲＥＳＴ、またはモノクローナルα−ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。
【０４８９】
ＨＩＶ潜伏の初代Ｔ細胞モデル
初代Ｔ細胞ＨＩＶ潜伏モデルを、以前に報告されたモデルから修正した。Ｓｗｉｇｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：１４１７９−１４１８８。複数回の感染、およびＬＴＲプロモーターから駆動されるルシフェラーゼの生成が可能である、ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３クローンを含有するルシフェラーゼを使用した。ＮＬ４−３ルシフェラーゼベクターを、２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、トランスフェクトされた上清を収集し、超遠心機（２０，０００ｒｐｍ、２時間）によって濃縮し、ウイルス濃度を、ｐ２４  ｇａｇ（ＨＩＶ−１抗原ｐ２４酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）キット番号ＮＥＫ０５０Ａ００１ＫＴ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の濃度を分析することによって決定した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、匿名のドナーから得たヒト全血バフィーコートから、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（番号１０７７１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）クッション上での遠心分離、ヒツジ赤血球（番号ＣＳ１１５  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｅｒｕｍ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）とロゼット形成することによるＴ細胞の濃縮、ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（番号１３０−０９１−１５５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＡｕｔｏＭＡＣＳ細胞分離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた非ＣＤ４＋Ｔ細胞の除去によって単離した。単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞の純度を、フローサイトメトリーによって裏付けた。典型的には、１μｇのｐ２４ｇａｇを、５×１０６ＣＤ４Ｔ細胞のために使用した。ウイルスおよび細胞の混合物を２４００ｒｐｍで２時間遠心分離した。スピン接種（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）後、細胞を、５μＭサクイナビル（ＮＩＨ）の存在下で３日間培養し、次いで感染ＣＤ４Ｔ細胞を、α−ＣＤ３（２．５μｇ／ｍＬ、コーティングされる）およびα−ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ、可溶性）により、フェネルジン（１００μＭ〜１ｍＭ）の存在または不在下で刺激した。一晩のインキュベーション後、細胞を採取し、ルシフェラーゼアッセイ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ）のためにプロセスした。細胞生存率もまた、ヨウ化プロピジウム染色（番号Ｐ−３５６６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって決定した。
【０４９０】
結果
Ｋ５０のアセチル化は、ＴａｔにおけるＫ５１のモノメチル化をインビトロで阻害する
Ｋ５０のアセチル化が、隣接Ｋ５１残基のモノメチル化に影響を及ぼす様子を検査するために、５０位においてアセチル化リジンを担持する短合成Ｔａｔペプチド（ａａ４８〜５８）を、組換えＳｅｔ７／９／ＫＭＴ７酵素および放射標識Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）でインキュベートした。反応物を高率Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅゲル上で溶解させ、オートラジオグラフィーによって検査した。Ｋ５０におけるアセチル化は、Ｓｅｔ７／９／ＫＭＴ７によるペプチドのメチル化を抑制した（図１Ａ）。逆実験（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）もまた行った。５１位においてモノメチル基を担持するＴａｔペプチドを、Ｋ５０アセチルトランスフェラーゼｐ３００／ＫＡＴ３Ｂでインキュベートしたが、修飾されていないペプチドと比較して、Ｋ５０のアセチル化における何の変化も観察されなかった（図１Ｂ）。反応を、アセチル化Ｋ５０またはモノメチル化Ｋ５１残基を担持する完全長合成Ｔａｔタンパク質（ａａ１〜７２）を用いて行ったとき、同様の結果が観察された（図１ＣおよびＤ）。これらの結果は、Ｔａｔトランス活性化周期におけるＫ５１モノメチル化の役割を指摘する、以前のデータを支持し（上記のＰａｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０））、順次のモノメチル化／アセチル化がＴａｔ内で生じ得ることを示唆する。
【０４９１】
図１Ａ〜Ｄ。合成Ｔａｔペプチドを使用したインビトロアセチル化およびメチル化アッセイ（Ａ）短Ｔａｔペプチド（ａａ４５〜５８）のインビトロメチル化アッセイ。非修飾またはＫ５０アセチル化ペプチドを、組換えＳＥＴ７／９／ＫＭＴ７および３Ｈ−放射標識Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）でインキュベートした。ペプチドをＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅゲル電気泳動によって分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。（Ｂ）短Ｔａｔペプチドのインビトロアセチル化。非修飾またはＫ５１メチル化ペプチドを、組換えｐ３００−ＨＡＴおよび１４Ｃ−アセチル補酵素でインキュベートした。ペプチドをＡにあるようにプロセスした。（Ｃ）Ａにあるような、合成Ｔａｔ（ａａ１〜７２）およびＫ５０アセチル化合成Ｔａｔの放射活性インビトロメチル化アッセイ。反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。（Ｄ）Ｂにあるような、合成Ｔａｔ（ａａ１〜７２）およびＫ５１メチル化合成Ｔａｔの放射活性インビトロアセチル化アッセイ。反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。
【０４９２】
免疫沈降したＴａｔの質量分析
メチル化／アセチル化Ｔａｔ種が細胞中に存在するかどうかを検査するために、ＴＮＦ−α活性化Ｊ−Ｌａｔ  Ａ２細胞から免疫沈降させたＴａｔの質量分析を行った。このＪｕｒｋａｔ由来細胞株は、ＴＮＦ−αでの刺激時に組込み型ＨＩＶ  ＬＴＲ（ＬＴＲ−Ｔａｔ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）からＦＬＡＧタグＴａｔおよびＧＦＰを発現する、組込み型バイシストロニックレンチウイルスベクターを有する。上記のＪｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）。免疫沈降した物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＦＬＡＭＩＮＧＯ蛍光染料で染色した。Ｔａｔバンドをゲルから切断し、キモトリプシンでのゲル内消化に適用した。残基の消化されたペプチドを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析によって分析した。消化されたペプチドの、代表的なマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析（ＭＳ）スペクトルは図２Ａに示され、１００を超えるペプチドイオンシグナルが検出された。修飾を有さないＴａｔ  ＡＲＭ領域を包含するペプチドを、１０８４．６８１ｍ／ｚで検出し、それをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳ分析（タンデムＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析）によって、Ｔａｔ−ＦＬＡＧ分子中のグリシン４８〜アルギニン５５のペプチドとして特定した（図２Ｂ）。質量シグナルもまた、１１９７．７２４ｍ／ｚで検出し、それは、リジン５１においてモノメチル基を担持するリジン５０〜アルギニン５７のＴａｔペプチドに対応した（図２Ｃ）。二重修飾Ｔａｔ（ＡｃＫ５０／Ｍｅ１Ｋ５１）は、この実験で検出されなかった。更に、ジメチル化は、Ｋ５１において検出されなかったが、Ｋ５０およびＫ５１の両方が４２Ｄａの質量付加を担持したペプチドが検出され、これらの残基が細胞中でアセチル化されるか、またはトリメチル化されるかのいずれかであることを示している。
【０４９３】
図２Ａ〜Ｄ。細胞ＴａｔのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析は、Ｋ５１モノメチル化を裏付ける（Ａ）Ｔａｔ−ＦＬＡＧから消化されたペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（９００〜１，５００ｍ／ｚ）。ＭＳ／ＭＳによって更に分析したペプチドイオン（ＡおよびＢとして表記される）は、ｍ／ｚ値およびアミノ酸配列の数によって示される。Ｔａｔ−ＦＬＡＧ分子中のペプチドＡ（１０８４．６８１ｍ／ｚ）およびペプチドＢ（１１９７．７２４ｍ／ｚ）の位置は、図の下部ボックス中に提示される。特定されたＡＲＭペプチドは、Ｔａｔにおけるキモトリプシン消化ペプチドの予測サイズに基づいて予想されたよりも短く、それは、この実験で使用されたキモトリプシン調製物中のトリプシン様活性の汚染に起因する。（Ｂ）ペプチドＡイオンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳスペクトル（１０８４．６８１ｍ／ｚ）。（Ｃ）ペプチドＢイオンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳスペクトル（１１９７．７２４ｍ／ｚ）。これらのスペクトルにおいて、特定されたフラグメントイオンは、ＲｏｅｐｓｔｏｒｆｆおよびＦｏｈｌｍａｎによる命名法に従って、イオン型、ａ、ｂ、ｃ、ｙによって表される。Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ  Ｐ，Ｆｏｈｌｍａｎ  Ｊ（１９８４）Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １１：６０１。フラグメントイオンの、Ｔａｔ分子のＡＲＭ領域のアミノ酸配列への割り当ては、各スペクトル中に挿入されている。記号＊は、メチル化アミノ酸残基を示す。
【０４９４】
二重修飾Ｔａｔは、細胞中で検出されない
細胞中の二重修飾（ＡｃＫ５０／Ｍｅ１Ｋ５１）Ｔａｔの存在を独立して分析するために、二重に修飾されたＴａｔに特異的なポリクローナル抗血清を産生した。５０位におけるアセチル基および５１位におけるモノメチル基を担持するＡＲＭペプチドを、ラビット中に注射し、二重修飾抗原を担持するカラム上でアフィニティー精製した。結果として生じた抗体（α−ＡｃＫ５０／Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔ）は、二重修飾ＡＲＭペプチドに特異的であり、ドットブロット分析において、単一修飾された（ｓｉｎｇｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ペプチドと反応しなかった（図３Ａ）。対照的に、Ｔａｔにおけるモノメチル化Ｋ５１（α−Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔ）に対して以前に産生された抗血清（上記のＰａｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０））は、予想通り、Ｋ５１においてモノメチル化されたＡＲＭペプチドと反応したが、二重修飾ペプチドとの交差反応性もまた示した（図３Ａ）。抗体を、一方または双方の修飾のいずれかを担持した、完全長合成Ｔａｔタンパク質のウェスタンブロット分析によって試験したとき、同じ結果を得た。α−ＡｃＫ５０／Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔ抗体は、二重に修飾されたＴａｔを特異的に認識した一方で、α−Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔは、メチル化Ｔａｔおよび二重に修飾されたＴａｔの両方を認識した（図３Ｂ）。非修飾Ｔａｔまたはアセチル化Ｔａｔでは、何の交差反応性も観察されなかった。
【０４９５】
二重に修飾されたＴａｔが細胞中に存在するかどうかを試験するために、ＦＬＡＧタグＴａｔをコードする構築物を、２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトし、Ｔａｔを、α−ＦＬＡＧアガロースを含む細胞から精製した。Ｋ５１メチル化Ｔａｔは、α−Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔ抗体を使用したウェスタンブロット分析によって容易に検出された一方で、α−ＡｃＫ５０／Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔ抗体では、何のシグナルも検出されなかった（図３Ｃ）。双方の抗体は、完全長合成メチル化Ｔａｔタンパク質およびアセチル化／メチル化Ｔａｔタンパク質のウェスタンブロット分析によって示される、同様の感受性を有するそれらの同族抗原を認識したことに留意されたい（図３Ｃ）。同様の実験を、ＴａｔにおけるＡｃＫ５０Ｍｅ２Ｋ５１およびＡｃＫ５０Ｍｅ３Ｋ５１に対する抗体を用いて行ったが、細胞中のＴａｔとの何の反応性も示されなかった。この結果は、二重に修飾されたＴａｔが細胞中の主要なＴａｔ種でないことを示す、質量分析によって得られたデータを裏付ける。
【０４９６】
図３Ａおよび３Ｂ。新たに産生されたＴａｔ抗体によるＫ５０Ａｃ／Ｋ５１Ｍｅ  Ｔａｔの不検出。（Ａ）α−Ｍｅ１Ｋ５１またはα−ＡｃＫ５０／Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔ抗体を使用したＡＲＭペプチドのドットブロット分析。（Ｂ）α−Ｔａｔ、α−Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔ、またはα−ＡｃＫ５０／Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔ抗体を用いた、合成Ｔａｔ（ａａ１〜７２）のウェスタンブロット分析。（Ｃ）ＦＬＡＧタグＴａｔコード構築物でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からの全細胞ライセートを、α−ＦＬＡＧアガロースでの免疫沈降に供した。精製されタンパク質を、α−Ｔａｔ、α−Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔ、またはα−ＡｃＫ５０／Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔ抗体を使用したウェスタンブロット分析によって分析した。
【０４９７】
ＳＤ１／ＫＤＭ１は、Ｋ５１におけるＴａｔを脱メチル化する
Ｔａｔは、アセチル化が生じる前に、Ｋ５１において脱メチル化されることが憶測された。組換えＬＳＤ１／ＫＤＭ１は、合成モノメチル化Ｔａｔを、α−Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔ抗体を使用したウェスタンブロット分析によって示されるように、用量依存的様態で脱メチル化した（図４Ａ）。ＬＳＤ１／ＫＤＭ１はまた、予想通り、その同族基質である、ヒストンＨ３におけるジメチルリジン４も脱メチル化した（図４Ｂ）。興味深いことに、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１は、隣接Ｋ５０残基がアセチル化されたか否かに関わらず、モノメチル化Ｔａｔを脱メチル化し、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１が、アセチル化が生じた直後にも細胞中でＴａｔを脱メチル化し得たことを示している（図４Ｃ）。
【０４９８】
ＬＳＤ１／ＫＤＭ１が細胞中でのＴａｔの脱メチル化に関与するかどうかを試験するために、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１に対するｓｈＲＮＡを担持するレンチウイルスベクターを、Ｊ−Ｌａｔ  Ａ２細胞中に導入し、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１の内在性発現を低減した（図４Ｄ）。Ｔａｔ発現を、ＴＮＦ−αを用いて誘導し、Ｔａｔ  Ｋ５１のモノメチル化を、α−Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔ抗体を用いたウェスタンブロッティングを使用して監視した。Ｔａｔのモノメチル化は、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１に対するｓｈＲＮＡを発現する細胞中で、対照ｓｈＲＮＡを発現する細胞と比較して２．６倍強化されたが、Ｔａｔの全体的な発現は低減された（図４Ｄ）。総合的に、これらの結果は、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１が、Ｔａｔ  Ｋ５１をインビトロで、および細胞中で、脱メチル化することを実証する。
【０４９９】
図４Ａ〜Ｄ。ＬＳＤ１／ＫＤＭ１は、Ｔａｔにおけるモノメチル化Ｋ５１を脱メチル化する。（Ａ）合成Ｋ５１モノメチル化Ｔａｔタンパク質を、漸増量の組換えＬＳＤ１／ＫＤＭ１（０、０．５、１、２μｇ）により１時間、３７℃でインキュベートした。反応生成物を、α−Ｔａｔ、α−Ｍｅ１Ｋ５１  Ｔａｔ抗体を使用したウェスタンブロッティングによって分析した。（Ｂ）精製されたヒストンタンパク質を、ＬＳＤ１活性のための対照として、（Ａ）と同じ手順に供し、α−Ｍｅ２Ｈ３Ｋ４、またはα−ヒストンＨ３抗体によって分析した。（Ｃ）合成Ｋ５１−モノメチル化Ｔａｔ、またはＫ５０アセチル化／Ｋ５１−モノメチル化Ｔａｔタンパク質を、１μｇの組換えＬＳＤ１でインキュベートした。双方をＬＳＤ１によって脱メチル化した。（Ｄ）ＬＳＤ１  ｓｈＲＮＡ感染Ｊ−Ｌａｔ  Ａ２細胞中のＴａｔのＫ５１モノメチル化における増加。ＬＳＤ１に対して向けられるｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡに感染させ、ＴＮＦαで刺激したＪ−Ｌａｔ  Ａ２細胞から単離した全細胞ライセートを、示される抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。
【０５００】
ＬＳＤ１／ＫＤＭ１は、ＨＩＶプロモーターとインビボで会合する
ＬＳＤ１／ＫＤＭ１が細胞中でＴａｔと相互作用するかどうかを試験するために、ＦＬＡＧタグＴａｔタンパク質を、一過性トランスフェクション後に２９３Ｔ細胞中で発現させた。α−ＦＬＡＧ抗体での免疫沈降に続いて、内在性ＬＳＤ１／ＫＤＭ１を、免疫沈降した物質中のウェスタンブロッティングによって検出した（図５Ａ）。Ｋ５１（Ｋ５１Ａ）における点突然変異を担持するＴａｔタンパク質もまた、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１と効率的に免疫共沈降し、相互作用がＴａｔにおけるＫ５１の脱メチル化依存性でなかったことを示した。Ｔａｔの、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１補因子ＣｏＲＥＳＴとの相互作用を試験したとき、同様の結果を得（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １９：８５７−８６４；３１．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １３：５６３−５６７）、Ｔａｔが、官能性ＬＳＤ１／ＫＤＭ１／ＣｏＲＥＳＴ複合体を、ＨＩＶプロモーターに動員し得ることを示唆している。
【０５０１】
この仮説を試験するために、ＨＩＶ  ＬＴＲにおけるＬＳＤ１／ＫＤＭ１およびＣｏＲＥＳＴのクロマチン免疫沈降アッセイを行った。クロマチンをＪ−Ｌａｔ  Ａ２細胞から調製し、ここでＴａｔ発現を、ＴＮＦ−α処理によって刺激したか、または無刺激のまま残した。ＨＩＶ  ＬＴＲに特異的なプライマーを用いて免疫沈降した物質の定量的ＰＣＲ分析は、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１およびＣｏＲＥＳＴが、無刺激条件下ではプロモーターにおいて低濃度で存在するにすぎない一方で、ＴＮＦ−α刺激に反応して特異的に動員されたことを示した（図５Ｂ）。ＬＳＤ１／ＫＤＭ１およびＣｏＲＥＳＴの全体的な細胞発現は、Ｊ−Ｌａｔ  Ａ２細胞中のＴＮＦ−αでの処理に反応して上方調節されなかった（図５Ｃ）。これらの結果は、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１／ＣｏＲＥＳＴ複合体が、Ｔａｔに反応してＨＩＶ  ＬＴＲに動員されることを示唆する。しかしながら、動員はまた、ＴＮＦ−α処理に反応して他のＬＴＲ活性化因子を介して、間接的に生じる場合もある。
【０５０２】
図５Ａ〜Ｄ。ＬＳＤ１およびＣｏＲＥＳＴの、ＨＩＶ  ＬＴＲへのインビボ動員。（Ａ）一過性でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞中のＴａｔ／ＦＬＡＧおよびＴａｔ  Ｋ５１Ａ突然変異体を用いた、内在性ＬＳＤ１およびＣｏＲＥＳＴの免疫共沈降。（Ｂ）Ｊ−Ｌａｔ  Ａ２細胞のＬＳＤ１およびＣｏＲＥＳＴのクロマチン免疫沈降分析。Ａ２細胞をＴＮＦαで一晩刺激し、クロマチン免疫沈降を、α−ＬＳＤ１、α−ＣｏＲＥＳＴ、または抗体を使用して行い、続いてＨＩＶ  ＬＴＲ領域に特異的なプライマーを用いてリアルタイム逆転写−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。（Ｃ）Ａ２細胞から単離した全細胞ライセートをＴＮＦαで一晩刺激し、α−ＬＳＤ１、α−チューブリン、またはα−ＦＬＡＧ抗体を使用したウェスタンブロッティングによって分析した。
【０５０３】
ＬＳＤ１／ＫＤＭ１は、ＨＩＶ転写の活性化因子として作用する
ＨＩＶ転写におけるＬＳＤ１／ＫＤＭ１の機能を試験するために、Ａ２細胞を、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１に対して向けられる２つの異なるｓｈＲＮＡ、またはホタルルシフェラーゼ、もしくはスクランブルｓｈＲＮＡに対して向けられる対照ｓｈＲＮＡを発現する、レンチウイルスベクターで形質導入した。全てのベクターはまた、感染効率を追跡するためのｍＣｈｅｒｒｙマーカーも発現した。９０％を超える細胞が、レンチウイルスベクター感染後にｍＣｈｅｒｒｙを発現し、異なるレンチウイルスベクター間で、感染効率における何の差異も観察されなかった。ＳｈＲＮＡ発現細胞をＴＮＦαで刺激し、ＧＦＰの発現をフローサイトメトリーによって測定した。ＧＦＰ発現は、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１ノックダウン細胞中で、ルシフェラーゼまたはスクランブルｓｈＲＮＡを発現する細胞株と比較して４０〜６０％低減された（図６Ａ）。興味深いことに、ｓｈＲＮＡ番号１は、ｓｈＲＮＡ番号２よりも強力な抑制効果を有し、これらの細胞中のＬＳＤ１／ＫＤＭ１ノックダウンの度合いを反映した（図６Ｂ）。ＧＦＰ発現の同様の抑制がＡ２細胞株中で観察され、そこではＣｏＲＥＳＴの発現が抑制された（図６Ｃ、Ｄ）。総合的に、これらの結果は、通常は細胞遺伝子発現の抑制因子であるＬＳＤ１／ＫＤＭ１／ＣｏＲＥＳＴ複合体が、ＨＩＶ転写の共活性化因子として機能することを実証する。
【０５０４】
ＬＳＤ１／ＫＤＭ１が、Ｔａｔ脱メチル化を通じてＨＩＶ転写を活性化するかどうかを試験するために、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１に特異的なｓｉＲＮＡ、または対照ｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞中に導入した。細胞を次いで、ＨＩＶ  ＬＴＲルシフェラーゼレポーター遺伝子およびＴａｔのための発現構築物で共ランスフェクトした。ＨＩＶ  ＬＴＲのＴａｔトランス活性は、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１の発現が細胞中で低減されたとき、約５０％抑制され、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１がＴａｔトランス活性化の正の補因子であることを示している（図６Ｅ）。ＴａｔＫ５１Ａ突然変異体の共発現は、以前に報告されたように、Ｔａｔトランス活性化を約５０％低減したが（上記のＰａｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０））、更なる低減は、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１ノックダウン細胞中で観察されず、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１がＫ５１脱メチル化を通じてＴａｔトランス活性化を活性化するというモデルを支持している（図６Ｅ）。ＨＩＶ  ＬＴＲ単独の転写活性もまた、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１ノックダウン細胞中で低減されたが、値は、統計的有意性に到達せず、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１のための更なる標的が、Ｔａｔの不在下でのＨＩＶ  ＬＴＲにおいて存在し得ることを示唆する（図６Ｄ）。重要なことに、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１ノックダウンは、これらの共トランスフェクション実験においてＴａｔ発現を駆動していたＥＦ１αプロモーターに対して何の抑制効果も有さず、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１がＴａｔ機能ではなくＴａｔ発現を制御するという可能性を除外した。ＬＳＤ１／ＫＤＭ１発現のノックダウンの成功を、ウェスタンブロッティングによって裏付けた（図６Ｆ）。
【０５０５】
図６Ａ〜Ｆ。ＬＳＤ１／ＫＤＭ１／ＣｏＲＥＳＴ複合体は、ＨＩＶ転写を活性化する。（Ａ）ＬＳＤ１（番号１および番号２）に対するｓｈＲＮＡ、ルシフェラーゼまたはスクランブルｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを、Ｊ−Ｌａｔ  Ａ２細胞中に５〜１０日間感染させ、細胞を次いで低用量のＴＮＦα（０．０８ｎｇ／ｍl）で一晩刺激した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）＋細胞の数を、フローサイトメトリーによって分析し、ルシフェラーゼ−ｓｈＲＮＡ感染Ａ２細胞中のＧＦＰ＋細胞パーセントとして表した。３つの独立した実験の平均（平均±標準誤差）が示される。＊は、ｐ値＜０．０１に対応する。（Ｂ）ｓｈＲＮＡ発現細胞からの全細胞ライセートを、α−ＬＳＤ１およびα−チューブリン抗体を使用したウェスタンブロッティングによって分析した。（Ｃ）ＣｏＲＥＳＴ（番号１および番号２）に対するｓｈＲＮＡ、または対照ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを、Ｊ−Ｌａｔ  Ａ２細胞中に感染させた。（Ｃ）にあるものと同じ実験を行った。３つの独立した実験の平均（平均±標準誤差）が示される。＊は、ｐ値＜０．０１に対応する。（Ｄ）ｓｈＲＮＡ感染Ａ２細胞からの全細胞ライセートを、α−ＣｏＲＥＳＴおよびα−チューブリン抗体を使用したウェスタンブロッティングによって分析した。（Ｅ）ＳｉＲＮＡトランスフェクトＨｅＬａ細胞（ｓｉＲＮＡトランスフェクションの４８時間後）を、ＨＩＶ  ＬＴＲルシフェラーゼレポーター構築物、および野生型またはＫ５１Ａ突然変異体Ｔａｔのための発現ベクターで、再度トランスフェクトした。並行して、ＥＦ−１ａ  ＲＬレポーター構築物を、再度トランスフェクトした。ルシフェラーゼまたはウミシイタケ活性を、プラスミドトランスフェクションの２４時間後に測定した。野生型Ｔａｔトランス活性化と比較した、ルシフェラーゼ活性の相対的な差異を算出した。３つの独立した実験の平均（平均±標準誤差）が示される。＊は、ｐ値＜０．０１に対応する。（Ｆ）ｓｉＲＮＡトランスフェクトＨｅＬａ細胞からの全細胞ライセートを、α−ＬＳＤ１およびα−チューブリン抗体を使用したウェスタンブロッティングによって分析した。
【０５０６】
フェネルジンは、ＨＩＶ遺伝子発現の潜伏からの再活性化を抑制する。
モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）阻害剤フェネルジン（フェネチルヒドラジン）は、細胞中のＬＳＤ１／ＫＤＭ１活性を阻害することにおいて、以前に理解されていたよりもはるかにより強力であることが最近報告された。Ｃｕｌｈａｎｅ  ｅｔ  ａｌ。（２０１０）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３２：３１６４−３１７６。ＨＩＶ感染症におけるこの薬剤の活性を試験するために、Ｊ−Ｌａｔ  Ａ２細胞を、漸増量のフェネルジンまたは既知のＴａｔ阻害剤であるＣＤＫ阻害剤５、６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（ＤＲＢ）で処理した。フェネルジンは、ＤＲＢと同様に、遺伝子発現のＴＮＦα媒介型活性化を、ＤＲＢよりも約１５０倍高い濃度ではあるが、用量依存的様態で防止した（ＩＣ５０＝３００μＭ  図７Ａ、黒丸）。双方の薬剤について、試験された濃度で何の細胞毒性も観察されなかった（図７Ａ、白丸）。
【０５０７】
同じ実験を、ＨＩＶ潜伏の初代Ｔ細胞モデルにおいて行った。静止状態のＣＤ４＋Ｔ細胞を、２つの健康なドナーの血液から単離し、前述ようにＨＩＶ発現ルシフェラーゼの感染性クローンによりスピン接種した。上記のＳｗｉｇｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）。感染したＣＤ４＋細胞をサクイナビルで３日間培養して、組込み後の潜伏を確実にし、次いで漸増量のフェネルジンで処理し、続いてα−ＣＤ３およびα−ＣＤ２８抗体での刺激を行って、潜伏ＨＩＶ転写を活性化した。ルシフェラーゼ発現の活性化は、フェネルジン処理によって首尾よく抑制され、初代Ｔ細胞中のＨＩＶの完全長感染性クローンの文脈における薬物の有効性を裏付けた（図７Ｂ）。細胞生存率の若干の減少が、１つのドナーにおいて、フェネルジンの最高濃度で観察された（図７Ｂ）。興味深いことに、初代Ｔ細胞中で、フェネルジンは、ＨＩＶ遺伝子発現を抑制することにおいて、ＤＲＢよりも有効であり、それはまた非活性化細胞中のルシフェラーゼの基底発現も抑制した。総合的に、これらの結果は、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１を、ＨＩＶ転写の強力な活性化因子、およびＨＩＶ感染症の潜伏からの再活性化を防止するための可能性のある薬物標的として特定する。
【０５０８】
図７Ａおよび７Ｂ。ＬＳＤ１／ＫＤＭ１は、ＨＩＶ転写における可能性のある薬物標的である。（Ａ）Ｊ−Ｌａｔ  Ａ２細胞を、０．０８ｎｇ／ｍlのＴＮＦαを用いて、漸増量のフェネルジン（１００、３００、１０００、または３０００μＭ）、ＤＲＢ（０．３、１、３、または１０μＭ）、または担体対照としてのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下で、一晩刺激した。ＧＦＰ＋細胞の数、ならびに無傷細胞生存率の測定値としてのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。ＤＭＳＯ処理対照細胞と比較した百分率を算出した。２つの独立した実験の平均が示される。（Ｂ）精製された休止初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を、感染性ＨＩＶ−ＮＬ４−３ルシフェラーゼレポーターウイルスにより、高い感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）で感染させた。感染の３日後、細胞を、α−ＣＤ３およびα−ＣＤ２８抗体を用いて、フェネルジン（１００、３００、または１０００μＭ）、ＤＲＢ（１または１０μＭ）、またはＤＭＳＯの存在下で一晩刺激し、続いてルシフェラーゼ活性およびＰＩ取り込みについての分析を行った。
【０５０９】
本発明は、その具体的な実施形態を参照して記載されたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の変更が行われてもよく、均等物が置換されてもよいことが当業者によって理解されるべきである。更に、特定の状況、物質、物質の組成、プロセス、プロセスステップ（単数または複数）を本発明の目的、趣旨、および範囲に適合させるために、多くの修正が行われてもよい。全てのかかる修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１Ａ−Ｄ】
2013540767.tif 000022
【図２Ａ】
2013540767.tif 000023
【図２Ｂ】
2013540767.tif 000024
【図２Ｃ】
2013540767.tif 000025
【図３Ａ−Ｃ】
2013540767.tif 000026
【図４Ａ−Ｄ】
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【図５Ａ−Ｃ】
2013540767.tif 000028
【図６Ａ−Ｆ】
2013540767.tif 000029
【図７Ａ−Ｂ】
2013540767.tif 000030
【図８】
2013540767.tif 000031
【図９Ａ】
2013540767.tif 000032
【図９Ｂ】
2013540767.tif 000033
【図１０】
2013540767.tif 000034
【図１１Ａ】
2013540767.tif 000035
【図１１Ｂ】
2013540767.tif 000036
【図１２】
2013540767.tif 000037
【図１３Ａ】
2013540767.tif 000038
【図１３Ｂ】
2013540767.tif 000039
【図１４】
2013540767.tif 000040
【図１５】
2013540767.tif 000041
【図１６】
2013540767.tif 000042
【図１７】
2013540767.tif 000043
【図１８Ａ】
2013540767.tif 000044
【図１８Ｂ】
2013540767.tif 000045
【配列表】
2013540767000001.app
【国際調査報告】
2013540767.tif 000046
2013540767.tif 000047
2013540767.tif 000048
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