(57)【要約】  本発明は、転写因子ＰｒｆＡのゲノム遺伝子座が欠失しているリステリア・モノサイトゲネス種遺伝子組み換え細菌であって、内部増幅コントロールとして作用する人工配列をゲノムレベルで含むことを特徴とするリステリア・モノサイトゲネス細菌、この細菌の使用、並びに、野生型リステリア・モノサイトゲネスで汚染されている疑いのあるサンプル中における前記微生物の存在を定性的および／または定量的に検出および決定するための方法、およびキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写因子ＰｒｆＡのゲノム遺伝子座が欠失しているリステリア・モノサイトゲネス種遺伝子組み換え細菌であって、内部増幅コントロール(ＩＡＣ)として作用する人工配列をゲノムレベルで含むことを特徴とするリステリア・モノサイトゲネス細菌。
【請求項２】
ＩＡＣとして作用する前記人工配列が、５'および３'末端にプライマー結合配列を含む、請求項１に記載のリステリア・モノサイトゲネス細菌。
【請求項３】
前記プライマー結合配列が、野生型リステリア・モノサイトゲネスのゲノムｐｒｆＡ遺伝子座のプライマー結合配列と同一である、請求項２に記載のリステリア・モノサイトゲネス細菌。
【請求項４】
ＩＡＣとして作用する前記人工配列が、配列番号:１による１００ｂｐ配列である、請求項１〜３のいずれかに記載のリステリア・モノサイトゲネス細菌。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ菌株。
【請求項６】
２０１０年５月２０日にＤＳＭ  ２３６３９の番号でリステリア・モノサイトゲネスΔｐｒｆＡ／＋ＩＡＣとしてＤＳＭＺに寄託された配列番号：１の内部増幅コントロール配列（ＩＡＣ）を含んでなる、転写因子ＰｒｆＡのゲノム遺伝子座が欠失している遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ菌株。
【請求項７】
野生型リステリア・モノサイトゲネスで汚染されている疑いのあるサンプル中における前記微生物の存在を定性的および／または定量的に検出および決定するための、請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスの使用。
【請求項８】
サンプルが食物である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
リアルタイムＰＣＲアッセイのための内部サンプルプロセスコントロール（ＩＳＰＣ）としての、請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスの使用。
【請求項１０】
野生型リステリア・モノサイトゲネスで汚染されている疑いのあるサンプル中における前記病原性微生物の存在を検出および決定するための方法であって、
（ａ）請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネス細菌の所定量の細胞を前記サンプルに添加する工程、
（ｂ）該サンプルを抽出溶液と共にインキュベーションする工程、
（ｃ）標準的方法によりＤＮＡを単離する工程、
（ｄ）（ｉ）野生型リステリア・モノサイトゲネスのゲノムｐｒｆＡ遺伝子座および請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスのＩＡＣ配列に特異的なプライマー、並びに（ｉｉ）前記ｐｒｆＡ遺伝子座と特異的にハイブリッド形成することができる蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブおよび前記ＩＡＣ配列と特異的にハイブリッド形成することができる蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、リアルタイムＰＣＲを適用する工程、
（ｅ）工程（ｄ）により生じた蛍光信号を定性的および／または定量的に決定する工程、および
（ｆ）野生型リステリア・モノサイトゲネスで汚染されている疑いのあるオリジナルサンプル中における前記微生物の細胞の存在および／または量を、工程（ｅ）から決定するおよび／または計算する工程
を含んでなる方法。
【請求項１１】
工程（ｄ）（ｉ）で用いられるプライマーがＬｉｐ１（配列番号：２）およびＬｉｐ２（配列番号：３）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｄ）（ｉｉ）で用いられる蛍光標識プローブが、ＩＡＣ配列を検出するためのｐＬｕｃＬｍ４（配列番号：４）およびｐｒｆＡ遺伝子座を検出するためのＬｉｐＰｒｏｂｅ（配列番号：５）である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）の抽出溶液が少なくともＭｇＣｌ2および／またはイオン液体を含む、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
野生型リステリア・モノサイトゲネスで汚染されている疑いのあるサンプル中における前記微生物を検出および決定するためのアッセイにおいて用いるためのキットであって、少なくとも、一または二以上のパッケージ中に、
（ｉ）請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネス、
（ｉｉ）野生型リステリア・モノサイトゲネスのゲノムｐｒｆＡ遺伝子座および請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスのＩＡＣ配列に特異的なプライマー、および
（ｉｉｉ）前記ｐｒｆＡ遺伝子座と特異的にハイブリッド形成することができる蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブおよび前記ＩＡＣ配列と特異的にハイブリッド形成することができる蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ
を含んでなるキット。
【請求項１５】
前記プライマーがＬｉｐ１（配列番号：２）およびＬｉｐ２（配列番号：３）である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記蛍光標識プローブが、ＩＡＣ配列を検出するためのｐＬｕｃＬｍ４（配列番号：４）およびｐｒｆＡ遺伝子座を検出するためのＬｉｐＰｒｏｂｅ（配列番号：５）である、請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネス細菌を生成する方法であって、
（ａ）リステリア・モノサイトゲネス細菌種の転写因子ＰｒｆＡのゲノム遺伝子座を欠失させる工程、
（ｂ）ＩＡＣを含むベクターをクローニングする工程、および
（ｃ）工程（ｂ）のベクターを、工程（ａ）の細菌種中に形質転換する工程
を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写因子ＰｒｆＡのゲノム遺伝子座が欠失しているリステリア・モノサイトゲネス種遺伝子組み換え細菌であって、内部増幅コントロールとして作用する人工配列をゲノムレベルで含むことを特徴とするリステリア・モノサイトゲネス細菌、この細菌の使用、並びに、野生型リステリア・モノサイトゲネスで汚染されている疑いのあるサンプル中における前記微生物の存在を定性的および／または定量的に検出および決定するための方法、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
リステリア・モノサイトゲネスは、病原性グラム陽性細菌である。これは、リステリア症を引き起こすので、最も伝染力の強い食物媒介病原菌の一つである。食物サンプル、血液、組織、または排泄物のような臨床サンプルなどのサンプル中の病原菌の検出が、ますます重要になってきている。しかしながら、サンプル中に含まれる細胞を明確に同定し任意に定量するためには、その検出および定量のための信頼性のある方法が提供されなくてはならない。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)が初めて実現されて以来、この分子生物学的ツールは、微生物の検出の向上のための多くの機会を提供する方法にまで発展した。ＰＣＲに基づく方法が国際的に認められた標準になるための重要な要件は、内部増幅コントロール(ＩＡＣ)である。ＩＡＣは同じサンプル管内に存在する非標的ＤＮＡ配列であり、標的配列と同時に共増幅される。ＩＡＣを用いないＰＣＲにおいては、負の結果は、標的配列が存在しなかったことを意味し得るが、増幅反応が種々の因子により阻害されたことも意味し得るので、明確ではない。従って、欧州標準化委員会(European Standardization Committee)は国際標準化機構(International Standard Organisation：ISO)と連携して、ＩＡＣの存在を必要とする診断的ＰＣＲのための一般的ガイドラインを提案した(ＩＳＯ/ＤＩＳ ２２１７４)。
【０００４】
ＩＡＣは、標的ＰＣＲと同じプライマー結合部位を用いて競合的であると共に、リアルタイムＰＣＲにおいて用いられるプローブ染料の長さおよび蛍光波長により、標的ＤＮＡアンプリコンから明確に区別され得るべきである。要するに、コントロールの特性は標的の特性にできるだけ近いが、標的検出への妨害は無視できる程度であることが確保されるべきである。
【０００５】
ＩＡＣをＰＣＲアッセイに適用すると、陰性結果の信頼性が確保されるが、このことは、ＰＣＲにおける標的増幅を促進する酵素反応およびリアルタイムＰＣＲにおける蛍光プローブの使用に基づく定量的かつ確証的検出反応だけに当てはまる。しかしながら、サンプル調製およびサンプルマトリクスからのＤＮＡ−単離／精製のような予備的系統的工程は、この種のコントロールの対象とならず、たとえそうであっても、外部コントロールにより確認される。これは、単一サンプルのコントロールを可能とせず、よって、陰性結果は、研究サンプル、例えば食物の病原菌状況の誤った検証の可能性を暗示することになる。
【０００６】
従って、従来のまたはリアルタイムＰＣＲを用いた病原菌の信頼性ある定量的検出に必要な全ての系統的工程を対象とすべき内部サンプルプロセスコントロール(ＩＳＰＣ)が必要である。
【０００７】
食物および水媒介のＲＮＡウイルスの検出のために、内部コントロールとしてのネコカリシウイルス(Feline Calcivirus)およびバクテリオファージＭＳ２の使用が報告されている(Mattison et al. (2009) Int. J. Food Microbiol. 132, 73-77; Di et al. (2010) J. Virol. Methods 165, 57-63; Dreier et al. (2005) J. Clin. Microbiol. 43, 4551-4557)。
【０００８】
Murphy et al. (2007,Int.J.Food Microbiol.120,110-119)(非特許文献１)は、リステリア・モノサイトゲネスおよびサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)の検出のための細菌性内部サンプルプロセスコントロールを開示している。このコントロールは、サルモネラ・エンテリカの緑色蛍光遺伝子(ｇｆｐ)およびｉｒｏＢ遺伝子のフラグメントを含む組み換え大腸菌株に基づく。このコントロールは定量的目的で用いたのではなく、基本となるグラム陰性大腸菌株は、リステリア・モノサイトゲネスと比べてサンプル調製中に異なる特性を示すものである。
【０００９】
結果として、汚染サンプル中においてリアルタイムＰＣＲにより病原菌であるリステリア・モノサイトゲネスの検出および定量を可能にする新しい信頼性ある方法が必要とされている。
【００１０】
予想外に、この問題は、検出プロセス全体を対象とする内部プロセルコントロールとしてＩＡＣ＋,Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ菌株を用いることにより解決し得ることが発見された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Murphy et al., Int.J.Food Microbiol.120,2007,110-119
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ｐＰＬ２−ＩＡＣ，Ｅ.ｃｏｌｉおよびＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅの確認を示す。
【図２】リステリアゲノム中へのｐＰＬ２−ＩＡＣの陽性インテグレーションの確認、および得られたＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ菌株の従来法ＰＣＲによる確認を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
従って、本発明の第一の局面は、転写因子ＰｒｆＡのゲノム遺伝子座が欠失しているリステリア・モノサイトゲネス種遺伝子組み換え細菌であって、内部増幅コントロール(ＩＡＣ)として作用する人工配列をゲノムレベルで含むことを特徴とするリステリア・モノサイトゲネス細菌である。
【００１４】
リステリア・モノサイトゲネス種遺伝子組み換え細菌は、遺伝子組み換え技術を用いて遺伝物質を変化させることにより生じるリステリア・モノサイトゲネス種を意味する。遺伝子組み換えには、遺伝子の挿入および／または欠失が挙げられる。ｐｒｆＡ遺伝子の欠失は、例えば、Boeckmann et al. (1996) Mol. Microbiol. 22, 643-653に開示のように達成される。
【００１５】
転写因子ＰｒｆＡのゲノム遺伝子座は、タンパク質ＰｒｆＡをコードしている核酸配列を意味する。これは、７０５個の塩基対からなる配列である(Leimeister-Wachter et al., 1990; Proc Natl Acad Sci USA, 87, 8336-40; Glaser et al., 2001 ; Science, 294, 849-52)。その遺伝子は、リステリア・モノサイトゲネスのリステリオリシン遺伝子（ｌｉｓＡ)の周りの染色体領域内に位置する(ＧｅｎｅＩＤ:９８７０３１; http://www.ncbi.nlm.nih. gov/gene/987031#pageTop)。転写因子ＰｒｆＡに関する情報は、Scortti et al.(2007) Microbes and Infection 9, 1 196-1207にも与えられており、それをここで参照として援用する。ＰｒｆＡは、リステリア・モノサイトゲネスの主要病原性決定因子の発現を調節する。ＰｒｆＡは、２３７個の残基からなる２７ｋＤａのタンパク質である。転写因子ＰｒｆＡのゲノム遺伝子座の欠失は、突然変異による非病原菌を提供する。
【００１６】
本発明によれば、内部増幅コントロール(ＩＡＣ)は、Hoorfar et al. (2003) Lett. Appl. Microbiol. 38, 79-80により定義されているように、ＰＣＲ反応中にサンプル管内に存在して特定の標的配列と共増幅される人工核酸配列を意味する。ＩＡＣの存在により、偽陰性の結果を決めることができる。ＩＡＣ配列は、どんなポリヌクレオチド配列であってもよい。この配列の大きさは、特異的ＰＣＲアッセイおよびその反応条件により変わり得る。
【００１７】
ＩＡＣ配列は、単一コピーヌクレオチド配列、すなわちリステリア・モノサイトゲネス細菌のハプロイドゲノム中に１回だけ存在するヌクレオチド配列であることが好ましい。
【００１８】
好ましくは、ＩＡＣ配列は、検査される一つのサンプルまたはサンプルマトリクスそのものの中に自然に存在することが予想されるリステリア・モノサイトゲネス、または何らかの他の種の中に存在しない配列である。
【００１９】
ＩＡＣ配列は、５’および３’末端にプライマー結合配列を含むことが好ましい。
【００２０】
本発明によれば、ＩＡＣは競合的ＩＡＣである、すなわち遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスのＩＡＣと野生型リステリア・モノサイトゲネスの標的配列ｐｒｆＡとが、リアルタイムＰＣＲ中、同じ条件下に同じＰＣＲ管内で共通の１セットのプライマーを用いて増幅されることが好ましい。従って、ＩＡＣのプライマー結合配列は、野生型リステリア・モノサイトゲネスのゲノムｐｒｆＡ遺伝子座のプライマー結合配列と同一であることが特に好ましい。
【００２１】
本発明の特に好ましい態様において、人工ＩＡＣ配列は、配列番号:１：5'-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC GTA TTC GAA ATG TCC GTT CGG TTG GCG CTA TGA AGA GAT ACG CGG TGG AAC CTG GAA CCT GAT GGC ATC AAG ATT ACA C-3'による１００ｂｐ配列である。
【００２２】
このＩＡＣ配列は、Rossmanith et al. (2006) Res. Microbiol. 157, 763-771に開示されている。本発明によれば、配列番号:１への相同性が８０％を超えるＩＡＣ配列を用いることができる。好ましくは、配列相同性は９０％を超え、より好ましくは９５％を超える。
【００２３】
本発明によれば、先に特定したような遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ菌株が好ましい。
【００２４】
リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ菌株は、リステリア・モノサイトゲネス血清型１/２ａ臨床製剤である。この菌株は、科学的用途において最も広まっているモデル生物である(GenBank: AL591978; Glaser et al. (2001) Science 294 (5543), 849-52)。
【００２５】
本発明のさらなる局面は、２０１０年５月２０日にＤＳＭ ２３６３９の番号でリステリア・モノサイトゲネスΔｐｒｆＡ/+ＩＡＣとしてＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig)に寄託されている配列番号:１の内部増幅コントロール(ＩＡＣ)配列を含んでなる、転写因子ＰｒｆＡのゲノム遺伝子座が欠失している遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ菌株である。
【００２６】
本発明のリステリア・モノサイトゲネス種遺伝子組み換え細菌は、信頼性ある内部サンプルプロセスコントロールに課せられる要求を満たす。これは、野生型リステリア・モノサイトゲネスにできるだけ近いものである。これは、リアルタイムＰＣＲによる主検出反応を妨げず、コントロールの検出のための基本となる化学反応の性能は、主反応に等しい。さらに、ＩＳＰＣとしてリステリア・モノサイトゲネス細胞を適用することにより、サンプル調製からリアルタイムＰＣＲを用いる検出までの食物病原菌検出に含まれる必要な方法の全工程を対象することができる。
【００２７】
本発明のもう一つの局面は、野生型リステリア・モノサイトゲネスで汚染されている疑いのあるサンプル中における前記微生物の存在を定性的および／または定量的に検出および決定のための、先に特定された遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスの使用である。
【００２８】
好ましくは、そのサンプルは、食物サンプル、体液、特に血液、血漿もしくは血清；水または組織サンプルである。
【００２９】
例示的サンプルとしては、食物（例えば、雌牛、雌羊、雌山羊、雌馬、ロバ、ラクダ、ヤク、水牛およびトナカイの乳；乳製品；牛、山羊、子羊、羊、豚、蛙足、子牛、齧歯動物、馬、カンガルー、家禽（例えば、鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、土鳩またはハト）、ダチョウおよびエミューの肉；海産物（例えば、サケおよびテラピアのようなフィンフィッシュ(finfish)、並びに軟体動物、甲殻類および巻貝のようなシェルフィッシュ(shellfish)）；肉製品；植物生成物；種子；イネ科の穀類（例えば、トウモロコシ、小麦、米、大麦、ソルガムおよび雑穀）；非イネ科の穀類（例えば、ソバ、アマランスおよびキノア）；マメ科植物（例えば、豆、落花生、エンドウおよびレンティル）；堅果（例えば、アーモンド、クルミおよび松の実）；油糧種子（例えば、ヒマワリ、菜種およびゴマ）；根菜のような野菜（例えば、ジャガイモ、キャッサバおよびカブ）；葉菜（例えば、アマランス、ホウレンソウおよびケール）；海藻（例えば、デュルセ、コンブおよびバダーロックス）；茎菜（例えば、タケノコ、ノパレスおよびアスパラガス）；花序野菜（例えば、アーティチョーク、ブロッコリーおよび萱草）；および果菜（例えば、カボチャ、オクラおよび茄子）；果物；ハーブおよびスパイス）；全血；尿；痰；唾液；羊水；血漿；血清；肺洗浄液および組織（例えば、限定はされないが、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉および膵臓）；等が挙げられるがこられに限定されない。当業者は、前記例示的サンプルのいずれかから得られる溶解物、抽出物または(均質化)材料、前記例示的サンプルの混合物、または前記例示的サンプルの一種または二種以上を含む組成物も、本発明の範囲内のサンプルであることを理解する。
【００３０】
食物サンプルが特に好ましい。
【００３１】
食物サンプルは、好ましくは乳製品、好ましくは乳、特に生乳、粉乳、ヨーグルト、チーズまたはアイスクリーム、魚製品、好ましくは生魚、肉製品、好ましくは生肉、濯ぎ肉(meat rinse)またはソーセージ、濯ぎサラダ(salad rinse)、チョコレート、卵または卵製品、マヨネーズ等である。
【００３２】
本発明の方法において用いられる特に好ましい食物サンプルは、発病させる可能性のあるリステリア・モノサイトゲネスを含むことが通常知られているサンプル、例えばチーズである。
【００３３】
好ましくは、先に特定した遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスは、リアルタイムＰＣＲアッセイのための内部サンプルプロセスコントロール(ＩＳＰＣ)として用いられる。
【００３４】
本発明によれば、ＩＳＰＣは、サンプル調製前にオリジナルサンプルに加えられるモデル生物である。ＩＳＰＣは、サンプル調製から標的分子検出までの全分析連鎖の効率に対する尺度を提供し、従来のまたはリアルタイムＰＣＲを用いた信頼性ある定量的病原菌検出に必要な全ての系統的工程を対象とする。
【００３５】
本発明のさらなる局面は、野生型リステリア・モノサイトゲネスで汚染されている疑いのあるサンプル中における前記病原性微生物の存在を検出および決定するための方法であって、
(ａ)先に特定した遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネス細菌の所定量の細胞を前記サンプルに添加する工程、
(ｂ)そのサンプルを抽出溶液と共にインキュベーションする工程、
(ｃ)標準的方法によりＤＮＡを単離する工程、
(ｄ)(ｉ)野生型リステリア・モノサイトゲネスのゲノムｐｒｆＡ遺伝子座および先に特定した遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスのＩＡＣ配列に特異的なプライマー、並びに(ｉｉ)前記ｐｒｆＡ遺伝子座と特異的にハイブリッド形成することができる蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブおよび前記ＩＡＣ配列と特異的にハイブリッド形成することができる蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、リアルタイムＰＣＲを適用する工程、
(ｅ)工程(ｄ)により生じた蛍光信号を定性的および／または定量的に決定する工程、および
(ｆ)野生型リステリア・モノサイトゲネスで汚染されている疑いのあるオリジナルサンプル中における前記微生物の細胞の存在および／または量を、工程(ｅ)から決定するおよび／または計算する工程
を含んでなる方法である。
【００３６】
工程(ａ)において、先に特定した遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネス細菌の所定量の細胞をサンプルに添加する。サンプルへの添加量はサンプルの大きさに依存する。好ましくは、２５〜１０００００ＣＦＵ(コロニー形成単位)の量の遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスを、例えば２５ｇのサンプルに添加する。２５ｇ当たり１００〜５０００ＣＦＵの量が特に好ましい。
【００３７】
コロニー形成単位(ＣＦＵ)は、サンプル中の生存細胞の評価基準である。これは、培養方法により、例えば細菌培養ゲル上にサンプルを均一に塗り広げることにより決めることができる。適切な培養条件下でのインキュベーションの結果としてコロニーが形成される。コロニーの数はサンプル中のコロニー形成単位の数を表す。別の方法として、細胞計数は、例えばＬｉｖｅ/Ｄｅａｄ(登録商標) ＢａｃＬｉｇｈｔ(商標) Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ (Molecular Probes, Willow Creek, OR, USA)を用いる蛍光染色細胞の顕微鏡的計数または匹敵する商業的方法により決めることができる。
【００３８】
工程(ｂ)で用いられる抽出溶液は、水溶液または緩衝溶液である。典型的には、そのｐＨ値は５を超え９を下回る、好ましくは６を超え８を下回る、好ましくは６．５〜７．５の間である。抽出溶液は、さらに、２０％までの一種または二種以上の水混和性有機溶媒を含んでよい。
【００３９】
本発明の方法で用いることができる緩衝液は、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液(ＰＢＳ)、２−アミノ-２-ヒドロキシメチル−１,３−プロパンジオール(ＴＲＩＳ)緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水緩衝液(ＴＢＳ)およびＴＲＩＳ/ＥＤＴＡ(ＴＥ)からなる群より選択されることが好ましい。
【００４０】
本発明の一つの態様において、抽出溶液は、さらに、ＭｇＣｌ２および／またはイオン液体を含む。ＭｇＣｌ２は、存在する場合、典型的には０．０５〜３Ｍ、好ましくは０．１〜２Ｍ、より好ましくは０．３〜１Ｍの間の濃度で存在する。
【００４１】
本発明のもう一つの態様において、抽出溶液は、さらに、少なくとも一種のカオトロープおよび少なくとも一種の洗剤を含む。
【００４２】
イオン液体は、存在する場合、典型的には、混合物の重量を基準に０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％の間の濃度で存在する。このイオン液体は、一種のイオン液体または二種以上のイオン液体の混合物であり得る。好ましい態様において、抽出溶液はＭｇＣｌ２またはイオン液体を含む。
【００４３】
本発明で用いられるイオン液体は、有機カチオンおよび通常は無機のアニオンからなるイオン種である。これらは、いかなる中性分子も含まず、通常、融点が３７３Ｋを下回る。イオン液体についての総説は、例えばR. Sheldon "Catalytic reactions in ionic liquids", Chem. Commun., 2001, 2399-2407; M.J. Earle, K.R. Seddon "Ionic liquids. Green solvent for the future", Pure Appl. Chem., 72 (2000), 1391-1398; P. Wasserscheid, W. Keim "lonische Fluessigkeiten - neue Loesungen fuer die Uebergangsmetallkatalyse" [Ionic liquids - Novel Solutions for Transition-Metal Catalysis], Angew. Chem., 1 12 (2000), 3926-3945; T. Welton "Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis", Chem. Rev., 92 (1999), 2071-2083またはR. Hagiwara, Ya. Ito "Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions", J. Fluorine Chem., 105 (2000), 221-227である。
【００４４】
通常、当業者に知られている一般式Ｋ＋Ａ−で示される全てのイオン液体、特に水と混和性であるものが、本発明の方法において適している。
【００４５】
さらに好ましい態様において、イオン液体またはＭｇＣｌ２が存在する場合、抽出溶液は洗剤を含まない、これは、ドデシル硫酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳ、ルテンゾールＡＯ−７のようなアニオン性、両性イオン性または非イオン性洗剤が抽出溶液に添加されないことを意味している。
【００４６】
ここで用いられる「カオトロープ」という用語は、例えば、限定はされないが、一次構造はそのまま残しつつ二次、三次または四次構造を変化させることによりタンパクまたは核酸において無秩序を引き起こす物質を意味する。例示的カオトロープとしては、グアニジン塩酸塩(ＧｕＨＣｌ)、チオシアン酸グアニジン(ＧｕＳＣＮ)、チオシアン酸ナトリウム(ＫＳＣＮ)、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、尿素等が挙げられるが、こられに限定されない。カオトロープおよびカオトロピック塩の記述を、例えば、K. Hamaguchi et al. (Proc.Natl.Acad.Sci.(1962)62:1129-1136)に見つけることができる。
【００４７】
ここで用いられる「洗剤」という用語は、親油性および親水性も有する(すなわち両親媒性の)分子を意味する。本発明による洗剤は、例えば脂肪酸残基および親水性(例えばアニオン性またはカチオン性)部分を含んでよい。
【００４８】
さらに、特定のサンプル中に存在する物質の分解を促す生体高分子分解酵素または不安定化剤のような一種または二種以上のさらなる物質を抽出溶液に加えることが可能である。一例は、多量のコラーゲンおよび／またはデンプンを含む食物サンプル用のデンプン分解酵素の添加である。
【００４９】
インキュベーションは、典型的には１８℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４５℃、より好ましくは３０℃〜４２℃の間の温度で行われる。
【００５０】
サンプルは、典型的には、抽出溶液と共に１０分〜６時間、好ましくは２０分〜１時間インキュベーションされる。
【００５１】
サンプルの溶解を容易するために、前記サンプルを、例えば、抽出溶液と共にインキュベーションする前にストマッカーを用いて均質化することができる。インキュベーション中に混合物を攪拌すると溶解がさらに支持および／または促進される。
【００５２】
さらなる抽出方法を、例えばBrehm-Stecher et al. (2009) Journal of Food Protection 72: 1774-1789に見ることができる。
【００５３】
本発明によれば細菌材料のＤＮＡを工程(ｃ)で単離する。当該分野で知られている種々の方法、例えばSambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に開示された方法を用いてＤＮＡを抽出することができる。通常、ＤＮＡ抽出は、細胞溶解と、沈殿または、種々の基質、例えばシリカへの特異的結合によるＤＮＡ精製とを含む。
【００５４】
細胞溶解は、標準的方法により、例えば、酵素法、ビード法、超音波処理、洗剤法またはそれらの組み合わせにより達成することができる。好ましくは洗剤法が用いられる。酵素的細胞溶解のための適切な酵素は、例えば、リゾチーム、リゾスタフィン、ザイモラーゼ、セルラーゼ、ムタノライシン、グリカナーゼ、プロテアーゼおよびマンナーゼである。
【００５５】
細胞破壊に適したビードは、ガラス、セラミック、ジルコニウムまたはスチールである。ビードを細胞に添加した後、混合物のかき回しまたは揺り動かしによる攪拌が適用される。攪拌は、例えば一般的実験室用ボルテックスミキサーによりまたは特別に設計されたクランプ中で適用することができる。
【００５６】
本発明によれば、細胞溶解のためのさらなる方法は超音波処理である。この方法はサンプルへの超音波(典型的には２０−５０ｋＨｚ)の適用を含む。
【００５７】
洗剤系細胞溶解の結果として、細胞を取り囲む脂質バリアが破壊される。適切な洗剤は、非イオン性、両性イオン性およびイオン性洗剤、例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ(登録商標)ＸまたはＴＷＥＥＮ(登録商標)から選択することができる。好ましくはイオン性洗剤が用いられる。適切なイオン性洗剤に対する一例はＳＤＳである。
【００５８】
洗剤の選択に加えて、最適な細胞溶解のための他の重量な考慮事項には、緩衝液、ｐＨ、イオン強度および温度が挙げられる。溶解溶液は、典型的には、ｐＨ値が５を超え９を下回る、好ましくは６を超え８を下回る、より好ましくは６．５〜７．５の間である。
【００５９】
用いることができる緩衝液は、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液(ＰＢＳ)、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１,３−プロパンジオール(ＴＲＩＳ)緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水緩衝液(ＴＢＳ)およびＴＲＩＳ/ＥＤＴＡ(ＴＥ)からなる群より選択されることが好ましい。
【００６０】
任意に、一種または二種以上のキレート剤を溶解溶液に加えて二価カチオンを封鎖することができる。適切なキレート剤は、例えば、ＥＤＴＡ(エチレンジアミン四酢酸)、ＥＧＴＡ(エチレングリコール四酢酸)またはエチレンジアミンである。好ましくはＥＤＴＡが用いられる。
【００６１】
前記細胞溶解法には、典型的には、細胞材料からＤＮＡを分離するための遠心分離が続く。当業者は遠心分離のためのパラメーターを容易に決めることができる。典型的には、遠心分離はSambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に開示されたように行われる。
【００６２】
細胞溶解後、ＤＮＡは、通常、アルコール、好ましくはエタノールまたはイソプロパノールを添加することにより沈殿させられる。
【００６３】
さらに、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ(登録商標)組織キットのような市販のＤＮＡ単離キットおよびグラム陽性細菌用のサポートプロトコール(Machery-Nagel, Duren, Germany)または細菌からのゲノムＤＮＡ用のＮｅｘｔｔｅｃ(登録商標)キット(Nexttec GmbH Biotechnologie, Leverkusen, Germany)を用いて、増幅に適した状態でＤＮＡを提供することができる。
【００６４】
本発明のさらなる態様において、細菌材料は、工程(ｃ)におけるＤＮＡ単離の前に分離される。このさらなる工程は、得られるＰＣＲサンプル中のＤＮＡの高濃度を達成可能にするので特に好ましい。細菌材料の分離は、遠心分離、濾過、誘電泳動および超音波または親和結合のような任意の既知の方法により、例えば、好ましくはビード上に固定された抗体、レクチン、ウイルス結合性タンパク、アプタマーまたは抗微生物ペプチド(ＡＭＰ)を用いて達成することができる。好ましくは、細胞は濾過または遠心分離により、最も好ましくは遠心分離により単離される。本発明の方法でほとんど抽出できないまたは抽出できない材料を複合サンプルが含む場合、抽出サンプルの濾過が特に必要である。典型的には、これらの材料はデンプンおよび／または繊維を含む。しかしながら、抽出混合物から細胞を単離するための好ましい方法は遠心分離である。
【００６５】
サンプルマトリクスに応じて、インキュベーション工程を１回または複数回、例えば２回、３回、４回、５回または１０回繰り返してよい。これらのインキュベーション工程の間に、細菌材料および残存サンプルマトリクスを、例えば遠心分離により上澄みから分離することができる。
【００６６】
細菌材料の分離後、細胞を水、緩衝溶液および／または洗剤含有溶液で洗うことが好ましい。洗浄工程は数回繰り返してよい。
【００６７】
工程(ｄ)において、ＰＣＲ、好ましくはリアルタイムＰＣＲが適用される。リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲの開始前のテンプレート核酸の量に比例する、ＰＣＲの各サイクル中に生じる産物を検出および測定するための方法である。増幅曲線のような得られた情報を用いてテンプレート核酸配列の最初の量を定量することができる。
【００６８】
検出は、好ましくは設定温度においてサイクル毎に蛍光をモニターすることに基づく。蛍光は、通常、サンプル中に存在する特定の蛍光染料についての特異的励起および発光波長におけるデータを収集するために光学デバイスを用いてモニターされる。サンプルからの蛍光が、バックグラウンドを超える蛍光の検出についての閾値を交差するサイクルはサイクル閾値Ｃｔと呼ばれ、開始テンプレートの定量を可能にする。
【００６９】
ＰＣＲ条件は特に限定されないが、各ＰＣＲ装置について最適条件を選択することができる。例えば以下の条件を用いることができる：
・二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの熱変性：
加熱は、通常約９０〜９８℃、好ましくは約９２〜９６℃で、通常約３秒〜１分間、好ましくは約３０秒〜１分間行う
・アニーリング：
加熱は、通常約４０〜７０℃、好ましくは約５５〜６５℃で、通常約５秒〜２分間、好ましくは約３０秒〜９０秒間行う
・ＤＮＡ伸長反応：
加熱は、通常約６０〜７５℃、好ましくは約７０〜７４℃で、通常約１０秒〜３分間、好ましくは約３０秒〜２分間行う
・反応液中のＭｇイオン濃度：
通常約１〜５ｍＭ、好ましくは約１．５〜３．５ｍＭ。
【００７０】
この反応は、典型的には約２０〜５０サイクル、好ましくは約４５サイクルで行われ、それにより標的ＤＮＡを検出可能水準まで増幅することができる。
【００７１】
任意の市販のリアルタイムＰＣＲ装置を用いることができる。
【００７２】
本発明の方法の工程（ｄ）（ｉ）によれば、野生型リステリア・モノサイトゲネスのゲノムｐｒｆＡ遺伝子座および先に定義したような遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスのＩＡＣ配列に特異的なプライマーが用いられる。
【００７３】
通常、「プライマー」という用語は、標的核酸、すなわちゲノムｐｒｆＡ遺伝子座およびＩＡＣ配列のストランドに沿った部分に相補的な、ヌクレオチド９個以上の長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドのような短い核酸分子を意味し、プライマーの目的は、そのストランドに沿ってより長い核酸の核酸複製を開始することである。本発明によれば、ヌクレオチド１５〜４０個のプライマーが好ましい。本発明において、「プライマー」という用語は、増幅すべき標的配列の側面に位置するプライマー対のために用いられる。
【００７４】
好ましくは、工程（ｄ）（ｉ）で用いられるプライマーはＬｉｐ１およびＬｉｐ２である。Ｌｉｐ１の配列は5'-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC-3'(配列番号:２)であり、Ｌｉｐ２の配列は5'-GTG TAA TCT TGA TGC CAT CAG G-3'(配列番号:３)である。
【００７５】
本発明の方法の工程(ｄ)(ｉｉ)によれば、前記ｐｒｆＡ遺伝子座と特異的にハイブリッド形成することができる蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブおよび前記ＩＡＣ配列と特異的にハイブリッド形成することができる蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが用いられる。
【００７６】
本発明によれば、「特異的にハイブリッド形成」という用語は、検出可能にかつ特異的に結合することを意味する。非特異的核酸への検出可能結合の感知できる量を最少化するハイブリッド形成条件下に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそのフラグメントが選択的に核酸ストランドにハイブリッド形成する。
【００７７】
蛍光標識オリゴヌクレオチドは、典型的には共有結合した蛍光色素分子を提示するオリゴヌクレオチドである。蛍光色素分子は、特定の光波長に晒されて励起したときに、例えば異なる光波長で、光(蛍光)を発する化学的化合物である。
【００７８】
好ましくは、前記ｐｒｆＡ遺伝子座および前記ＩＡＣ配列と特異的にハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチドプローブは、異なる波長の光を発する異なる蛍光色素分子を提示する。これにより、一つのプローブを他から独立して検出できるようになる。
【００７９】
リアルタイムＰＣＲに典型的に用いられる蛍光標識プローブは、例えば、ライトサイクラー(LightCycler)(ハイブリッド形成)プローブ、分子指標または加水分解プローブ(いわゆるＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブ)である。好ましくは、加水分解プローブが用いられる。
【００８０】
ライトサイクラー・プローブは、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)の技術を利用する。この方法のために、ＦＲＥＴ供与体およびＦＲＥＴ受容体にそれぞれ結合している２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブが、各標的配列のために用いられる。これらのプローブは、並んで標的配列に結合し、蛍光色素分子を近接させる。
【００８１】
分子指標(Tyagi et al., Nat. Biotechnol.14:303-8,1996)は、レポーター蛍光色素分子およびクエンチャーに結合したオリゴヌクレオチドプローブである。５’末端のヌクレオチドは３’末端のヌクレオチドに相補的であり、ステム・ループ構造を形成している。蛍光色素分子とクエンチャーとが近接しているので、蛍光が観察されない。リアルタイムＰＣＲ中にプローブが標的配列とハイブリッド形成することにより、レポーターとクエンチャーとの距離が増し、その結果、レポーターの蛍光をもたらす。
【００８２】
好ましくは、加水分解プローブ(ＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブ)が用いられる(Lee et al., Nucleic Acids Res. 21 :3761-6, 1993)。これらのプローブは、また、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)の技術を利用する。これらのプローブは一端において蛍光レポーター、反対端において蛍光のクエンチャーを提示する。レポーターがクエンチャーに極めて近接しているので、レポーター蛍光の検出は抑制される。ＰＣＲのアニーリング段階中に、プライマーとプローブの両方がＤＮＡ標的にアニーリングされる。新しいＤＮＡストランドを重合することにより、ポリメラーゼの５'−３'エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解されると共に、蛍光レポーターがクエンチャーから物理的に分離し、その結果、蛍光が増す。リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラーにおいて蛍光を検出および測定することができ、産物の指数関数的増加に対応するその幾何学的増加を用いて、各反応における閾値サイクル(Ｃｔ)を決める（下記参照）。
【００８３】
例示的レポーターとして、６−カルボキシフルオレセイン；カルボキシフルオレセイン(ＦＡＭ)；ホウ素ジピロメテンジフルオリド(ＢＯＤＩＰＹ)；アクリジン、スチルベン、６−カルボキシ-フルオレセイン(ＨＥＸ)、ＴＥＴ(テトラメチルフルオレセイン)、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン(ＲＯＸ)、ローダミン−６Ｇ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、２',７'−ジメトキシ−４',５'−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン(ＪＯＥ)、Ｃｙ(登録商標)３、Ｃｙ(登録商標)５、ＶＩＣ(登録商標)(Applied Biosystems)、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ(登録商標)、また、それらの誘導体が挙げられるが、こられに限定されない。本発明において、ＦＡＭおよびＨＥＸから選択されるレポーターが好ましく用いられる。
【００８４】
例示的クエンチャーとして、ＢＨＱ１(商標)およびＢＨＱ２(商標)のようなＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ(ＷＯ０１／８６００１Ａ１)、ＭＧＢ(マイナー−グルーブ−バインダー、ＥＰ０８１９１３３Ｂ１)、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミン(ＴＡＭＲＡ)、Ｅｃｌｉｐｓｅ(登録商標) Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、ＤＤＱ ＩおよびＤＤＱ ＩＩが挙げられるが、こられに限定されない。本発明によれば、好ましく用いられるクエンチャーはＭＧＢまたはＢＨＱ１(商標)である。
【００８５】
当業者はレポーターとクエンチャーとの適切な組み合わせを容易に選択することができる。典型的には、クエンチャーの吸収スペクトルは、最適クエンチングを可能とするためにレポーターの発光スペクトルと充分に重複している必要がある。
【００８６】
好ましくは、工程(ｄ)(ｉｉ)のＩＡＣ配列とハイブリッド形成する蛍光標識プローブは、Rossmanith et al. (2006) Res. Microbiol. 157, 763-771に開示されているｐＬｕｃＬｍ４(配列番号:４)である。ｐｒｆＡ遺伝子座とハイブリッド形成する蛍光標識プローブは、好ましくはＬｉｐＰｒｏｂｅ(配列番号:５)である。
【００８７】
蛍光標識プローブｐＬｕｃＬｍ４は、好ましくはレポーター蛍光色素分子としてＨＥＸをクエンチャーとしてＢＨＱ１(商標)を提示する。
【００８８】
蛍光標識プローブＬｉｐＰｒｏｂｅは、好ましくはレポーターとしてＦＡＭをクエンチャーとしてＭＧＢを提示する。
【００８９】
本発明によれば、工程(ｄ)で生じる蛍光信号は、工程(ｅ)において定性的および／または定量的に決められる。
【００９０】
検出は、好ましくは設定温度においてサイクル毎に蛍光をモニターすることに基づく。蛍光は、通常、サンプル中に存在する特定の蛍光色素分子についての特異的励起および発光波長におけるデータを収集するために光学デバイスを用いてモニターされる。
【００９１】
工程(ｆ)において、野生型リステリアモノサイトゲネスで汚染されている疑いのあるオリジナルサンプル中における前記微生物の細胞の存在および／または量を、工程(ｅ)から決定するおよび／または計算する。
【００９２】
オリジナルサンプル中における野生型リステリアモノサイトゲネス細胞の存在は、典型的には、工程(ｅ)において蛍光信号を定性的に決定することにより決められる。
【００９３】
オリジナルサンプル中における野生型リステリアモノサイトゲネス細胞の量は、典型的には、以下の工程を含む方法で計算される。
【００９４】
・リアルタイムＰＣＲ増幅後のそれぞれの蛍光信号に基づいてＣｔ法(閾値法)を用いて遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスおよび野生型リステリア・モノサイトゲネスのＤＮＡコピーによりＤＮＡの最初の量を計算する。閾値法は、調査サンプルのそれぞれの信号を校正基準と比較することに基づく(Kaltenbock et al. (2005), Advances in Clinical Chemistry 40: 219-259)。
【００９５】
・サンプル中の遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスの最初の細胞の既知の値とリアルタイムＰＣＲ後にＣｔ法により得られる細胞の値とに基づいて、分析手順(本発明の方法の工程(ｂ)、(ｃ)および(ｄ)によるサンプル調製、ＤＮＡ精製および単離、およびリアルタイムＰＣＲを含む)中の損失を計算する。
【００９６】
・分析手順中の遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネス細胞の計算された損失に基づいて、野生型リステリア・モノサイトゲネスで汚染されている疑いのあるサンプル中に存在する前記微生物の細胞の数を計算する。
【００９７】
本発明の方法は、分子生物学的病原菌検出のための内部サンプルプロセスコントロール(ＩＳＰＣ)としてリステリア・モノサイトゲネスを用いることにより、標的生物への類似性が最も高くなり、従って、細菌性病原菌検出への適用性が最も高くなるので、有利である。リステリア・イノキュア(Listeria innocua)のような関係の近い種であっても、リアルタイムＰＣＲ中に第二のプライマー対を必要とする非競合的内部コントロールとなる。存在するＩＡＣから誘導されるＤＮＡ系ＩＳＰＣを検出プロセスの極初期から単体使用することは、同様に、コントロールと標的との最も高い類似性の要件を満たさない。さらに、大部分のＤＮＡは、ＰＣＲ検出前の種々の系統的工程中に失われる。
【００９８】
本発明のさらなる局面は、野生型リステリア・モノサイトゲネスで汚染されている疑いのあるサンプル中における前記微生物を検出および決定するためのアッセイにおいて用いるためのキットであって、少なくとも一または二以上のパッケージ中に、
(ｉ)先に特定した遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネス、
(ｉｉ)野生型リステリア・モノサイトゲネスのゲノムｐｒｆＡ遺伝子座および先に特定した遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネスのＩＡＣ配列に特異的なプライマー、および
（ｉｉｉ)前記ｐｒｆＡ遺伝子座と特異的にハイブリッド形成することができる蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブおよび前記ＩＡＣ配列と特異的にハイブリッド形成することができる蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ
を含んでなるキットである。
【００９９】
好ましくは、キットのプライマーはＬｉｐ１(配列番号:２)およびＬｉｐ２(配列番号:３)である。
【０１００】
蛍光標識プローブは、好ましくは、ＩＡＣ配列を検出するためのｐＬｕｃＬｍ４(配列番号:４)およびｐｒｆＡ遺伝子座を検出するためのＬｉｐＰｒｏｂｅ(配列番号:５)である。
【０１０１】
本発明によれば、キットは、さらに抽出溶液を含んでよい。
【０１０２】
本発明のもう一つの局面は、先に特定された遺伝子組み換えリステリア・モノサイトゲネス細菌を生成する方法であって、
(ａ)リステリア・モノサイトゲネス細菌種の転写因子ＰｒｆＡのゲノム遺伝子座を欠失させる工程、
(ｂ)ＩＡＣを含むベクターをクローニングする工程、および
(ｃ)工程(ｂ)のベクターを、工程(ａ)の細菌種中に形質転換する工程
を含んでなる方法である。
【０１０３】
工程(ａ)によるＰｒｆＡのゲノム遺伝子座の欠失は、当該分野で知られている技術により達成され、例えばBockmann et al. (1996) Mol. Microbiol. 22, 643-653に開示のように達成することができる。原理上はノックアウトプラスミドが構築される。このプラスミドはリステリア・モノサイトゲネス細胞中に形質転換される。遺伝交差の結果ｐｒｆＡ遺伝子が切除される。得られる生物はΔ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスとも呼ばれる。
【０１０４】
リステリア・モノサイトゲネス細菌のための最適培養条件は、当業者により容易に決めることができる。典型的には、細菌は、通気しながら、ＴＳＢ−Ｙ(トリプトンソーヤブロス-酵母エキス)中、３７℃で培養される。
【０１０５】
工程(ｂ)において、ＩＡＣを含むベクターが生成される。
【０１０６】
クローニング用の適量のＩＡＣ配列が、典型的には、従来法ＰＣＲによる配列の増幅により生成される(Rossmanith et al. (2006) Res. Microbiol. 157, 763-771)。ＰＣＲに用いられるプライマーは、典型的には、ベクター中への後のインテグレーションを可能にする特別の制限酵素のための制限部位を含む。配列番号:１によるＩＡＣ配列のために、制限部位ＢａｍＨＩおよびＳａｌｌをそれぞれ含む修飾プライマーＬｉｐＢａｍ(配列番号:６)およびＬｉｐＳａｌ(配列番号:７)が好ましく用いられる。
【０１０７】
ＬｉｐＢａｍの配列は、5'GCG CGG ATC CGA TAC AGA AAC ATC GGT TGG C'3 (配列番号:6)である。
【０１０８】
ＬｉｐＳａｌの配列は、5'GCG CGT CGA CGT GTA ATC TTG ATG CCA TCA GG'3 (配列番号:7)である。
【０１０９】
増幅産物の精製後、制限消化、脱リン酸化、および適当なインテグレーションベクターとのライゲーションが行われる。
【０１１０】
制限消化は、典型的には、ＰＣＲに用いられるプライマーの制限部位に対応する市販の制限酵素を用いて増幅産物をインキュベーションすることにより行われる。好ましくはＢａｍＨＩおよびＳａｌｌが用いられる。
【０１１１】
ＩＡＣフラグメントの脱リン酸化は、適切なホスファターゼ、例えばＦａｓｔ ＡＰ(商標)感熱性アルカリホスファターゼ(Fermentas)を用いてインキュベーションすることにより達成することができる。適切なインテグレーションベクターは、当業者が容易に選択することができる。ベクターは、陽性クローンの後の選択を可能にするために、細菌の意図する受容菌株が感受性のある抗生物質(例えばクロラムフェニコール)への抵抗力を与える遺伝子配列を含む。好ましくは、ファージ挿入ベクター、例えばLauer et al. (2002) J. Bacteriol. 184, 4177-4186に開示されているｐＰＬ１またはｐＰＬ２が用いられる。ファージ挿入ベクターｐＰＬ２(６１２３ｂｐ)は、リステリア・モノサイトゲネスのゲノム中に単一コピーを安定に挿入するので、特に好ましい。
【０１１２】
適量の挿入ベクターは、細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ １０Ｆ'中でベクターを増幅させ、その後、前述したような単離、制限消化および脱リン酸化を行うことにより生成することができる。典型的には、ベクターのマルチクローニイングサイト(ＭＣＳ)において制限部位を見つけることができる。
【０１１３】
ライゲーションは、典型的には、ＤＮＡリガーゼ、例えばＦｅｒｍｅｎｔａｓから入手されるＴ４ ＤＮＡリガーゼの添加により成される。
【０１１４】
得れらるベクターは、陽性クローンの増幅および選択のために、適切な細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ'中に形質転換される。この選択は、典型的には、前記抗生物質を含む培地上で細菌を平板培養することにより成される。
【０１１５】
工程(ｃ)において、工程(ｂ)のベクターが工程(ａ)のリステリア・モノサイトゲネス細胞中に移される。形質転換は、最新技術において良く知られている種々の方法を用いて行うことができる。例は、ヒートショックまたはエレクトロポレーションによる形質転換である。好ましくは、形質転換はエレクトロポレーションにより成される。
【０１１６】
ヒートショックによる形質転換は、細胞膜をプラスミドＤＮＡに対して透過性にするＣａ２＋(ＣａＣｌ２)またはＲｂ２＋(ＲｂＣｌ２)のような二価カチオンの存在下に細胞を冷却することにより達成される。細胞を、ＤＮＡと共に氷上で培養し、次に、短時間、ヒートショックを与える（典型的には、４１〜４３℃で３０〜１２０秒間）。
【０１１７】
エレクトロポレーションのためには、１０−２５ｋＶ/ｃｍの電場で細胞に短時間ショックを与える。好ましくは、エレクトロポレーションはPark et al. (1990) Gene 94, 129-132に従って達成される。
【０１１８】
クローニングが成功すると、得られる生物を検査することができる。Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスゲノム中へのベクターの挿入の成功は、ＰＣＲ(Lauer et al. (2002) J. Bacteriol. 184, 4177-4186に従って)により４９９ｂｐフラグメントを増幅し、配列決定することにより検査することができる。
【０１１９】
Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスのゲノム中へのＩＡＣの単一コピー挿入は、リステリアゲノムの既知の寸法(Nelson et al.(2004) Nucleic Acids Res. 32, 2386-2395)に基づき、ＵＶ/ＶＩＳ分光法で測定した形質転換リステリア・モノサイトゲネスのゲノムＤＮＡ量を、野生型データと比べてリアルタイムＰＣＲ後のデータと比較することにより確認することができる。
【０１２０】
本発明を以下の図面および実施例によりさらに説明するが、それらに限定されるわけではない。
【０１２１】
図１：ｐＰＬ２−ＩＡＣ，Ｅ.ｃｏｌｉおよびＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅの確認(実施例１．４および１．６による)
(Ａ)プラスミド中の人工ＩＡＣを目的とした、形質転換およびプラスミド単離後のｐＰＬ２−ＩＡＣ，Ｅ.ｃｏｌｉクローンのリアルタイムＰＣＲ増幅。左側の増幅プロットは、標的としてのプラスミド製剤を含む。右側の増幅プロット(ｓｓ ＩＡＣ)は、校正機能を表す(効率:９６．８％；Ｒｓｑ：０．９９９)。(Ｂ)リステリアゲノム中へのベクターｐＰＬ２−ＩＡＣのインテグレーションを確認するための、ゲノム中の人工ＩＡＣを目的とした、ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅクローンのリアルタイムＰＣＲ増幅(効率:９６．０％；Ｒｓｑ：０．９９９)。左側の増幅プロットは、標的としての４種のＩＡＣ＋,Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅクローンのゲノムＤＮＡを含む。
【０１２２】
図２：リステリアゲノム中へのｐＰＬ２−ＩＡＣの陽性インテグレーションの確認、および得られたＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ菌株の従来法ＰＣＲによる確認（実施例１．６による）
(Ａ)リステリア・モノサイトゲネスと確認されるクローニング菌株のアガロースゲル。Ｍ：マーカー、１：リステリア・イバノビー(L. ivanovii)、リステリア・シーリゲリ(L. seeligeri)およびリステリア・ウェルシメリ(L. welshimeri)、２：リステリア・イノキュア(L. innocua)、３：リステリア・モノサイトゲネス、４：リステリア・グレイ(L. grayi)、および５〜８：４種のＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅクローン。(Ｂ)全てのリステリア種に特異的な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子およびリステリア・モノサイトゲネスに特異的なｈｌｙ遺伝子を増幅させる、ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅの確認。９：リステリア種、１０：リステリア・モノサイトゲネス、および１１〜１４：４種のＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅクローン。(Ｃ)Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ菌株のインテグレーションの確認。１〜４：４種のＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅクローンのゲノム中へのｐＰＬ２−ＩＡＣ得られるＰＣＲ後の４９９ｂｐフラグメントは、インテグレーションを示す。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲル中に分散され、臭化エチジウムで染色される。
【０１２３】
上記および以下において引用された全ての出願、特許および公報の開示全体が、ここで参照として援用される。
【実施例】
【０１２４】
以下の実施例は、本発明の実用を記載している。
【０１２５】
１．１  細菌菌株および培養条件
リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ(１/２ａ、内部番号２９６４)は、Institute of Milk Hygiene, Milk Technology and Food Science, Department of Veterinary Public Health and Food Science, University of Veterinary Medicine, Vienna, Austria (IMML)における細菌菌株のコレクションの一部である。Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ(１/２ａ)は、Department of Microbiology, Theodor Boveri Institute, University of Wuerzburg, Wuerzburg, Germanyにおける細菌菌株のコレクションの一部である。エレクトロコンピテントＥ.ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ’はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ(Carlsbad, CA, USA)から入手される。全ての細菌菌株は、ＭｉｃｒｏＢａｎｋ(商標)技術(Pro-Lab Diagnostics, Richmont Hill, Canada)を用いて−８０℃に維持される。
【０１２６】
細菌培養物の光学濃度の測定は、ＨＰ ８４５２分光光度計(Hewlett Packard, Paolo Alto, CA, USA)を用いて、６００ｎｍ(ＯＤ６００)で二回行われる。リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ ｗｔおよびＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅの選択的平板培養は、ＲＡＰＩＤ’Ｌ．ｍｏｎｏ(Bio-Rad laboratories GmbH, Muenchen, Germany)、ＯＣＬＡ(Oxoid Chromogenic Listeria agar; Oxoid, Hampshire, UK)、ＰＡＬＣＡＭ(Solabia Biokar Diagnostics, Pantin Cedex, France)および血液寒天培地(Biomerieux, Marcy I'Etoile, France)の上において、細菌培養物１００μｌを筋状にプレートに付けるまたはループ技術により行われる。細菌懸濁液の計数は、プレートカウント法またはＬｉｖｅ/Ｄｅａｄ(登録商標) ＢａｃＬｉｇｈｔ(商標) Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ(Molecular Probes, Willow Creek, OR, USA)を用いて、製造者の指示に従って行われる。
【０１２７】
１．２  オリゴヌクレオチド、プラスミドおよび酵素反応
オリゴヌクレオチドおよびプラスミドの配列を表１に提示する。従来のおよびリアルタイムＰＣＲ用のプライマーおよびＨＥＸ−標識プローブｐＬｕｃｌｍ４はＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ (Ebersberg, Germany)から入手され、ＭＧＢ−修飾ＬｉｐＰｒｏｂeはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ(Foster City, CA, USA)から入手される。ＩＡＣのための人工１００ｂｐ標的は、ＶＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ(Vienna, Austria)により合成される。ｐＰＬ２ファージ挿入ベクターは、Lauer et al. (2002) J. Bacteriol. 184, 4177-4186による。
【０１２８】
【表１】
2013532962.tif 000002
【０１２９】
【表２】
2013532962.tif 000003
【０１３０】
【表３】
2013532962.tif 000004
【０１３１】
制限消化は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ(Fermentas International Inc., Burlington, Canada)から入手されるＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ(登録商標)制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌｌを用いて、製造者の指示に従って行われる。合計反応体積２０μlを３７℃で１時間インキュベーションする。ライゲーションの前のベクターおよびＩＣＡフラグメントの脱リン酸化は、ＦａｓｔＡＰ(商標) Thermosensitive Alkaline PHosphatase(Fermentas)を用いて、製造者の指示に従って、３７℃で３０分間行う。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(Fermentas)を用いて、ベクターｐＰＬ２と人工ＩＡＣフラグメントとのライゲーションを４℃で一晩行う。
【０１３２】
ｐｒｆＡ遺伝子の２７４ｂｐフラグメントを標的することによるリステリア・モノサイトゲネスのリアルタイムＰＣＲ検出は、以前に公開されたフォーマットに従って、プライマーＬｉｐ１およびＬｉｐ２並びにＦＡＭ−標識ＬｉｐＰｒｏｂｅ(D'Agostino et al. (2004) J. Food Prot. 67, 1646-1655; Rossmanith et al. (2006) Res. Microbiol. 157, 763-771)を用いて行う。人工ＩＡＣフラグメントのリアルタイムＰＣＲ検出は、Rossmanith et al. (2006)に従って、Ｌｉｐ１およびＬｉｐ２並びにＨＥＸ−標識ｐＬｕｃＬｍ４を用いて行う。 
【０１３３】
フォワードプライマー(Ｌｉｐ１: 5'-GATACAGAAACATCGGTTGGC-3')およびリバースプライマー(Ｌｉｐ２: 5'-GTGTAATCTTGATGCCATCAGG-3')がｐｒｆＡ遺伝子の２７４ｂｐフラグメントを増幅させる。融点の上がった２種の異なるＴａｑＭａｎ(商標)プローブフォーマットを用いる。Ｌｉｐ−Ｐｒｏｂｅ(5'-FAM-CAGGATTAAAAGTTGACCGCA-MGB-3')はＭＧＢ修飾を用いる。
【０１３４】
アッセイのＩＡＣ用のプローブ(ｐＬｕｃＬｍ ４： 5'-HEX-TTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGC -BHQ1-3')をＨＥＸで標識する。プライマーおよびプローブｐＬｕｃＬｍ ４は、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ (Ebersberg, Germany)で購入することができる。ＭＧＢ−修飾プローブは、Applied Biosystemsで購入する。Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅゲノム中へのｐＰＬ２−ＩＡＣの挿入を確認するための従来法ＰＣＲは、プライマーＮＣ１６およびＰＬ９５（Lauer et al. (2002) J. Bacteriol. 184, 4177-4186)を用いて行われる。ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅは、Bubert et al. (1999, Appl. Environ. Microbiol. 65, 4688-4692)に従ってリステリア・モノサイトゲネスのｉａｐ−遺伝子座を増幅し、Border et al. (1990, Lett. Appl. Microbiol. 11, 158-162)に従って全てのリステリア種に特異的な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子およびリステリア・モノサイトゲネスに特異的なｈｌｙ遺伝子を標的することにより、リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅであると同定される。
【０１３５】
従来のおよびリアルタイムＰＣＲ反応は、Ｍｘ３０００ｐリアルタイムＰＣＲサーモサイクラー(Stratagene, La Jolla, CA, USA)において行われる。体積２５μl中に、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、３．５ｍＭのＭｇＣＩ２、５００ｎＭの各プライマー、２５０ｎＭの各プローブ、(各)２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、１．５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標) Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ(Invitrogen, Lofer, Austria)および５μｌの単離ＤＮＡを含む。９４℃で２分間の最初の変性後の増幅は、９４℃で１５秒間および６４℃で１分間で４５サイクル行う。
【０１３６】
リアルタイムＰＣＲ定量用のＤＮＡ標準のために、リステリア・モノサイトゲネス菌株ＥＧＤｅの純培養物１ｍｌを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ(登録商標)組織キットおよびグラム陽性細菌用のサポートプロトコールを用いて、ＤＮＡ単離に付する。ＤＮＡ濃度は、Ｈｏｅｆｅｒ ＤｙＮＡ Ｑｕａｎｔ２００デバイス(Pharmacia Biotech)を用いて蛍光分析により測定する。リステリア・モノサイトゲネスのゲノムの分子量に基づいて、ＤＮＡの１ｎｇが全ゲノムの３．１×１０５コピーに相当すると仮定すると共に、ｐｒｆＡ遺伝子が単一コピー遺伝子であると仮定して、ｐｒｆＡ遺伝子のコピー数を決定する。標準曲線のスロープを用いて、以下の等式を用いて、ＰＣＲ効率(Ｅ)を計算する：Ｅ＝１０−１/ｓ−１ ［２１］。
【０１３７】
リアルタイムＰＣＲの結果を、細菌細胞等価物(ＢＣＥ)として表す。リステリア・モノサイトゲネスのゲノムの分子量に基づいて、ＤＮＡの１ｎｇが全ゲノムの３．１×１０５コピーに相当すると仮定すると共に、ｐｒｆＡ遺伝子およびＩＡＣインサートがそれぞれ単一コピー遺伝子およびゲノム中の単一コピーインサートである(Nelson et al.(2004) Nucleic Acids Res. 32, 2386-2395)と仮定して、ｐｒｆＡ遺伝子およびＩＡＣインサートのコピー数を決定する。全てのリアルタイムＰＣＲ反応は、特記しない限り２回行う。
【０１３８】
従来法ＰＣＲのＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル中に９０Ｖで２５分間分散させ、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム(Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Germany)で染色する。ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ １００ｂｐ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)を標準として用いた。
【０１３９】
１．３  ＤＮＡ抽出および測定
一晩細胞培養物１ｍｌのゲノムＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ(登録商標)組織キット(Macherey-Nagel)およびグラム陽性細菌用サポートプロトコールを用いて抽出する。クローニング実験用のプラスミドＤＮＡを、Ｑｕｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ(Hilden, Germany)を用いて、製造者の指示に従って抽出する。ＤＮＡ濃度を、Ｈｏｅｆｅｒ ＤｙＮＡ Ｑｕａｎｔ２００装置(Pharmacia Biotech, San Francisco, CA, USA)および８４５２Ａ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ(Hewlett Packard, Palo Alto, CA, USA)を用いて蛍光分析測定により分析的に決定する。
【０１４０】
１．４  ｐＰＬ２−ＩＡＣのクローニング
制限部位ＢａｍＨＩおよびＳａｌｌを含む修飾プライマーＬｉｐＢａｍおよびＬｉｐＳａｌを用いてRossmanith et al. (2006, Res. Microbiol. 157, 763-771)に従って従来法ＰＣＲにより１００ｂｐフラグメントを増幅することにより、クローニング用の適量のＩＡＣ(ＩＡＣ: 5'-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC GTA TTC GAA ATG TCC GTT CGG TTG GCG CTA TGA AGA GAT ACG CGG TGG AAC CTG GAA CCT GAT GGC ATC AAG ATT ACA C-3')を生成する。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ(登録商標) Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩ(Macherey-Nagel)を用いて増幅産物を精製した後、前述のように制限消化および脱リン酸化を行い、続いてベクターｐＰＬ２を用いてライゲーションを行う。ライゲーションの前に、ファージインテグレーションベクターｐＰＬ２を、増幅のために標準的ヒートショック技術(Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)によりＥ.ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ’中に形質転換する。ベクターを前述のように抽出し、精製、制限消化および脱リン酸化の後のライゲーションのために用いる。得られたプラスミドｐＰＬ２−ＩＡＣを、次に、ヒートショックによりＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ’中に形質転換する。クロラムフェニコール２５ｐｇ／ｍｌを含むルリア・ベルターニブロス(Luria-Bertani broth)(ＬＢ；Ｏｘｏｉｄ）上で平板培養することにより、ｐＰＬ２−ＩＡＣ陽性クローンを選択する。
【０１４１】
単一細菌コロニーを取り出し、ｐＰＬ２−ＩＡＣを含む大腸菌の陽性形質転換についてスクリーニングする。制限消化分析により、ベクターおよびインサートの長さに対応する約６０００ｂｐおよび１００ｂｐの長さの２つのフラグメントが得られ、ｐＰＬ２−ＩＡＣの大腸菌中への形質転換が示される。ｐＬｕｃＬｍ４を用いるＩＡＣを標的とするリアルタイムＰＣＲの結果として標的が増幅され、制限消化分析が確認される（図１Ａ）。
【０１４２】
１．５  Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ中へのｐＰＬ２−ＩＡＣの形質転換
修正エレクトロポレーションプロトコール(Park et al. (1990) Gene 94, 129-132)を用いて、Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅをｐＰＬ２−ＩＡＣを用いて形質転換する。エレクトロコンピテントΔ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ細胞は、以下のように調製する。細胞を、ペニシリンＧを５ｐｇ／ｍｌ含むブレインハートインフージョンブロス（Brain heart infusion broth）（ＢＨＩ；Ｏｘｏｉｄ）中において３７℃でＯＤ６００が０．３になるまで培養する。細胞を、４℃で８０００×ｇ下に１０分間採取し、ペレットを、１／１０(体積基準)の３．５×ＳＭＨＥＭ緩衝液(７２ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ)中で２回洗う。１／１００(体積基準)の３．５×ＳＭＨＥＭ緩衝液中にペレットを再懸濁させた後、１００μｌの分量を−８０℃で貯蔵する。
【０１４３】
エレクトロポレーションのために、１００μｌの分量のエレクトロコンピテントΔ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅを氷上で溶解し、ｐＰＬ２−ＩＡＣを含む５μｌのＤＮＡ懸濁液(約１ｐｇ／反応液)と混合する。氷上で１分間インキュベーションした後、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ(商標)エレクトロポレーションシステム(Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, USA)においてエレクトロポレーションを行う(１００Ω，５０μＦ，１０００Ｖ)。予め温めたＢＨＩの１ｍｌを加え、サンプルを３７℃で６時間インキュベーションし、その後、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含むＢＨＩ寒天培地上で平板培養する。３７℃で２４〜４８時間インキュベーションした後、個々のコロニーを採取し、ｐＰＬ２−ＩＡＣ陽性Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅクローンについてスクリーニングする。
【０１４４】
１．６  ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅの確認
ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅの４種類のクロラムフェニコールスクリーニング陽性クローンを、Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ中におけるＩＡＣ配列の存在を検査することにより確認する。これは、プローブｐＬｕｃＬｍ４を用いてＩＡＣの１００ｂｐフラグメントを増幅することにより成される。ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅからのゲノムＤＮＡは、リアルタイムＰＣＲに付され、結果として陽性増幅が生じる(図１Ｂ)。検査したクローンは、平均５．３６×１０７コピーに対応する平均Ｃｔ−値１１．５(ＳＤ(標準偏差)：０．１６)を達成する。クローニングした菌株のΔ−ｐｒｆＡ状態を、野生型リステリア・モノサイトゲネスのｐｒｆＡ遺伝子座の２７４ｂｐフラグメントをハイブリッド形成するプローブＬｉｐＰｒｏｂｅを用いるリアルタイムＰＣＲにより検査すると、増幅は見られない。
【０１４５】
ゲノム中へのベクターのインテグレーションを、パラグラフ１．２に記載の従来法ＰＣＲを用いて検査する。電気泳動後の得られたフラグメントは、増幅産物の計画長さ４９９ｂｐに相当する(図２Ｃ)。このことは、プライマーＮＣ１６およびＰＬ９５が、リステリア・モノサイトゲネス血清型１／２ａにおける付着部位ｔＲＮＡＡｒｇ−ａｔｔＢＰ'を横切る増幅を可能にし、その結果、ベクター(３')の配列およびリステリアゲノム(５')の一部を含むハイブリッド増幅物が得られるので、リステリアゲノム中へのベクターの挿入を示唆している。
【０１４６】
ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅの配列決定分析は、プライマーＮＣ１６およびＰＬ９５を用いるこのハイブリッドＰＣＲ増幅物を用いて行われる。得られる配列は、シャトルインテグレーションベクターｐＰＬ２の２１０ｂｐフラグメントと１００％一致し、計画付着部位ｔＲＮＡＡｒｇ−ａｔｔＢＰ'(菌株ＥＧＤｅ、完全ゲノム、セグメント６／１２；ｅｍｂ／ＡＬ５９１９７８．１)を含むリステリア・モノサイトゲネスの２６１ｂｐフラグメントに１００％一致する。さらに、得られるＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡ菌株がリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅであることを確認する検査を、パラグラフ１．２に記載の従来法ＰＣＲにより行う。結果を図２ＡおよびＢに提示する。両ＰＣＲアッセイについてＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅおよびコントロールリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅのフラグメント寸法の調和が示される。
【０１４７】
１．６  ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ配列決定
増幅後の陽性クローンからのＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ(登録商標) Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩ Ｋｉｔ(Macherey-Nagel)を用いて、製造者の指示に従って精製する。精製されたＰＣＲ産物を、ＤＮＡ配列決定のためにMacrogen Inc. (Seoul, Korea)に送る。サンプルを、サイクル配列決定反応においてＮＣ１６およびＰＬ９５プライマーを用いて両ストランド上で配列決定する。
【０１４８】
得られる配列を、National Center for Biotechnology Information website (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)において入手されるＢＬＡＳＴサーバーを用いて、分析および整列させる。
【０１４９】
１．７  Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅのゲノム中へのｐＰＬ２−ＩＡＣの単一コピー挿入の確認のための定量的リアルタイムＰＣＲおよびリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ野生型データに対する校正
ゲノムＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅのＤＮＡおよびリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ野生型の校正標準を、プローブｐＬｕｃＬｍ４およびＬｉｐＰｒｏｂｅを用いるマルチプレックスシステムにおいてｐｒｆＡリアルタイムＰＣＲアッセイを用いて比較する。ｐｒｆＡが単一コピー遺伝子であるという仮定に基づき、両ＤＮＡ標的の１０倍希釈を比較する。１０倍希釈は、蛍光分析およびＵＶ−ＶＩＳ測定により決められるゲノムＤＮＡの５ｎｇに相当する１．５８×１０６コピーで始める。結果は、表３に示され、両標準系列のＣｔ−値の確実な一致を示している。これは、反応中の両プローブの同等な性能も示している。基本的データは、４回のリアルタイムＰＣＲランにおいて繰り返された複製に由来するものである。これらの結果の確認のために、ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅの培養物の濃度を、生存率染色により決め、リアルタイムＰＣＲの結果と比較する。リアルタイムＰＣＲにより得られるサンプル当たり３．２×１０３(ＲＳＤ．：６．７％)ＢＣＥの数は、生存率染色により決められるサンプル当たり２．８×１０３(ＲＳＤ．：２５．０％)ＣＦＵに匹敵する。
【０１５０】
【表４】
2013532962.tif 000005
【０１５１】
野生型菌株のｐｒｆＡ遺伝子座および主細菌標的を増幅する主反応の性能に対する、ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅから誘導されるゲノムＤＮＡの増加量の影響を、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲにより調べる。Ｌｉｐ−ＰｒｏｂｅおよびｐＬｕｃＬｍ４を用いて、１．５８×１０６〜１．５８×１０１コピーで始まるゲノムリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ野生型ＤＮＡの１０倍希釈を、ゲノムＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅのＤＮＡの１．５８×１０６〜１．５８×１０１コピーの１０倍希釈のバックグランドに対して上行性および下行性マトリクスにおいて検査する。全ての検査した組み合わせについて得られるＣｔ値は、標準濃度の全ての組み合わせに対して平均標準偏差が０．３である両菌株のゲノム標準のモノプレックス実験により得られるそれぞれの値から外れる。例として、リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅのゲノムＤＮＡの１０倍希釈について得られるＣｔ−値を、ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅの１．５８×１０５コピーのバックグラウンドに対して表３に示す。
【０１５２】
１．８  人工および天然汚染食物サンプル
人工汚染させるためのＵＨＴミルクを地元のスーパーマーケットで購入し、リステリア・モノサイトゲネスのｐｒｆＡ遺伝子座を標的としてリアルタイムＰＣＲを行って植菌前にリステリア・モノサイトゲネス陰性であることを検査する。８．５×１０８ＣＦＵ／ｍｌを含むリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅの純培養物のリンゲル液（Ｏｘｏｉｄ）中での１０倍希釈系列を用いて、人工汚染を行う。適切な希釈物１００μｌをサンプルに添加する。１０１−１０２、１０２−１０３、１０３−１０４および１０４−１０５のＣＦＵ／ｍｌを含むように希釈系列を調製する。０．６％酵母を含むトリプトン大豆寒天(ＴＳＡ−Ｙ；Ｏｘｏｉｄ)を用いてプレートカウント法により、希釈系列の各工程についてＣＦＵの数を得る。実験を３回行う。天然汚染ソフトチーズサンプルは、規制当局から提供され、オーストリアのスチリアにおける近年のリステリア・モノサイトゲネスの勃発に由来するものであり、４℃で貯蔵されている。２種の異なる製造貯蔵物からの２つのサンプルを４回加工し、その結果８つの個々のサンプルを得る。さらに、各サンプルについてＩＳＯ１１２９０−２を行って、実験の定量的結果をこの標準的方法と比較する（ＩＳＯ１１２９０−２；ＩＳＯ１１２９０−２／Ａｍｄ１）。
【０１５３】
１．９  サンプル処理
Mester et al. (2010) J. Food Protect. 73, 680-687およびRossmanith et al. (2007) J. Microbiol. Methods 69, 504-511により公開されているマトリクス溶解プロトコールを用いて、サンプル処理を行う。
【０１５４】
１．１０  統計的分析
２群比較をカイ２乗検定により分析する。Ｐ値を計算し、０．０５以下の値を有意とみなす。
【０１５５】
２．適用例
２．１  ＯＣＬＡ、ＰＡＬＣＡＭ、血液寒天培地およびＲＡＰＩＤ'Ｌ.ｍｏｎｏ寒天培地の上でのＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅの表現型
血液寒天培地上では、ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅは溶血を示さない。ＰＡＬＣＡＭ寒天培地上では、ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅは、表２に示すように、リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ野生型と同じ表現型を示す。ＯＣＬＡ上でのＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅの形態および色も、２４時間および４８時間のインキュベーション後、ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅについて観察されないハロー形成を除いて、野生型に類似している。７２時間のインキュベーション後、ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅは、同様に弱いハロー形成を示す。ＲＡＰＩＤ'Ｌ.ｍｏｎｏ上で平板培養した場合、クローニングした菌株は白色を呈し、ＲＡＰＩＤ'Ｌ.ｍｏｎｏ寒天培地上でのリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ野生型菌株の特徴的緑色を欠く。
【０１５６】
【表５】
2013532962.tif 000006
【０１５７】
２．２  内部プロセスコントロールとしてのＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅの、人工汚染ＵＨＴミルクおよび天然汚染Ｑｕａｒｇｅｌチーズへの適用
人工および天然汚染食物サンプルを、Rossmanith et al. (2007) J. Microbiol. Methods 69, 504-511に開示の方法に従って加工する。この方法は、食物マトリクスの溶解によるサンプル調製、その後の遠心分離を用いる標的細菌の分離、それに続くＤＮＡ単離およびリアルタイムＰＣＲ検出に基づく。サンプル調製中、イオン液体であるチオシアン酸１−エチル−３−メチルイミダゾリウム([ｅｍｉｍ]ＳＣＮ)を溶媒として用いる。
【０１５８】
人工汚染については、セクション１．８に記載のようなリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ野生型の４段階１０倍希釈系列をＵＨＴミルクのサンプル１２．５ｇに垂らす。さらに、内部サンプルプロセスコントロールであるＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅのサンプル当たり１．４×１０３(ＲＳＤ．：２９．０％)ＣＦＵを加える。
【０１５９】
主標的病原菌であるリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ野生型を、顕微鏡的計数で比べて５５％(ＲＳＤ(相対標準偏差)：１０．９％)だけＵＨＴミルクから回収する。対数尺度での相対的標準偏差は１０．９％であり、これは対数尺度回収率の観点で高水準の正確さおよび再現性を表し、ＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅ細胞による内部サンプルプロセスコントロールの偏りの無い影響を示唆する。
【０１６０】
内部サンプルプロセスコントロールは、顕微鏡的計数で比べて４９％(ＲＳＤ．：２７．１％)の回収率を示唆する。最初にサンプル当たり１．４×１０３(ＲＳＤ．：２９．０％)のＣＦＵ(ｃｏｌｏｎｙ形成単位)が、回収およびリアルタイムＰＣＲ検出の後に６．９×１０２(ＲＳＤ．：２７．０％)のＢＣＥとなる。
【０１６１】
次に、システムを、Ｑｕａｒｇｅｌチーズの天然汚染サンプルに適用する。さらに、サンプル当たり１．４×１０３(ＲＳＤ．：２９．０％)ＣＦＵのＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅを加える。
【０１６２】
サンプルを２つの方法で加工する。リステリア・モノサイトゲネスの値の直接定量が、マトリクス溶解およびその後のリアルタイムＰＣＲにより成される。ＩＳＯ１１２９０−２も、比較のために行う。さらに、サンプルを、マトリクス溶解により、およびその後の、タンパク質分解酵素Ｋ工程を除くＤＮＡ単離プロトコールを用いるリアルタイムＰＣＲにより加工する。これは、消化性能および結果としての全プロトコールの効率を人工的に偏らせる。
【０１６３】
リアルタイムＰＣＲの後に直接得られるサンプルのリステリア・モノサイトゲネス汚染の値は、２つのそれぞれのＱｕａｒｇｅｌチーズ貯蔵物に対して平均で１．４×１０６(ＲＳＤ．：５．９％)ＢＣＥおよび１．１×１０８(ＲＳＤ．：８．９％)ＢＣＥとなる。これらの値は、リアルタイムＰＣＲ後の６．９×１０２(ＲＳＤ．：５．９％)ＢＣＥのＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅプロセスコントロールの平均値に各複製の値を比較することにより得られる各サンプルについての有効率に従って補正される。この補正後、リステリア・モノサイトゲネス汚染は、２つの貯蔵物について平均で１．１×１０６(ＲＳＤ．：３５．８％)ＢＣＥおよび２．３×１０８(ＲＳＤ．：１０．２％）となる。最初の１．４×１０３(ＲＳＤ．：２９．０％)ＣＦＵからリアルタイムＰＣＲ後に６．９×１０２(ＲＳＤ．：５．９％)となるＩＡＣ＋，Δ−ｐｒｆＡリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤｅプロセスコントロール細胞の全体損失を含むさらなる補正を行う。このことにより、ＩＳＯ  １１２９０−２により得られる２．０７×１０６(ＲＳＤ．：９１．１％)ＣＦＵ／ｇおよび４．９×１０８(ＲＳＤ．：７３．２％)ＣＦＵ／ｇに対して、２つのチーズ貯蔵物について２．３２×１０６(ＲＳＤ．：３６．０％)ＢＣＥ／ｇおよび５．０×１０８(ＲＳＤ．：９．９％)ＢＣＥ／ｇの結果となる。人工的に偏らせたＤＮＡ単離により加工されたサンプルは、それぞれのチーズ貯蔵物に対して平均して４．９×１０５(ＲＳＤ．：６．３％)ＢＣＥおよび３．７×１０７(ＲＳＤ．：２．９％)の基本的値となる。先に規定したように補正した後、それぞれのリステリア・モノサイトゲネス汚染は１．８×１０６(ＲＳＤ．：４７％)ＢＣＥおよび４．６×１０８(ＲＳＤ．：１０．１％)ＢＣＥである。
【０１６４】
【表６−１】
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【０１６５】
【表６−２】
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【０１６６】
【表６−３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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