(57)【要約】本発明は調節遺伝子技術を利用し抗生素単一成分高含有量、高生産量菌株を構築獲得したことに関し、研究の結果、本発明から提供された含ist-acyB2双遺伝子生成のイソバレリルスピラマイシンIの菌種が、一定発酵条件下に、元々ist単遺伝子のみ含有した菌種より生成イソバレリルスピラマイシンI成分含有量が1.7倍を向上でき、発酵能力が4.14倍を向上できたと証明し、この抗生素工業化生産に良好的な条件を創造した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソバレリル基転移酵素遺伝子istとacyB2調節遺伝子連鎖遺伝子が、イソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ-2中において共同表現のクローン菌株であることを特徴とする一株イソバレリルスピラマイシンI成分高含有量、高生産量遺伝子工程菌。
【請求項２】
A)耐熱ストレプトマイセス（Streptomyces thermotolarences CGMCC4.1501）総DNAを鋳型とし、NCBIに公開されたist-acyB2配列に基づき、プライマーを設計し、PCRでist-acyB2連鎖遺伝子断片を獲得し、其の中に適当な制限酵素部位を加入し、また適当的な制限酵素部位を通じて夫夫istとacyB2遺伝子断片を、イソバレリルスピラマイシンI生成菌が転入できる整合型ベクターと結合し、含ist-acyB2遺伝子の組換えプラスミドを獲得し；
B)含ist-acyB2組換えプラスミドをイソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ-2に転入し、抗性選択により獲得した形質転換体が加薬のない情況下に連続に後世に伝えた後、更に加薬検出して安定表現の組換えプラスミド含有イソバレリルスピラマイシンI生成菌を獲得し、命名：WSJ-IA、菌種受託番号  CGMCC No3942、を特徴とする請求項1に記載の遺伝子工程菌構築方法。
【請求項３】
獲得したWSJ-IA菌種がPCR検証により遺伝子水準にist-acyB2配列を含有することを特徴とする請求項２に記載の遺伝子工程菌構築方法。
【請求項４】
WSJ-IA菌種が培養、発酵をした後、発酵能力を計算し、獲得したWSJ-IA菌種発酵能力が1160μｇ/ｍｌ以上で、生成したイソバレリルスピラマイシンI総含有量が12.061%以上であることを特徴とする請求２に記載の遺伝子工程菌構築方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子技術を利用し抗生素単一成分含有量高、生産量高の菌株を構築獲得することにに関する。
【背景技術】
【０００２】
BITEスピラマイシン(shengjiマイシン)[特許番号：ZL97104440.6 ]は遺伝子工程技術を利用し、耐熱ストレプトマイセス（streptomyces）のイソバレリル基転移酵素遺伝子istをスピラマイシン生成菌遺伝子グループと組合せ、スピラマイシン炭酵素糖4”位水酸基をイソバレリル基によりエステル化させた誘導体である。BITEスピラマイシンはグラム陽性菌に対し比較的な活性を有し、特に肺炎連鎖球菌、肺炎マイコプラズマ（mycoplasma pneumoniae）、クラミジア（chlamydia）活性に対し強く、エリスロマイシン（erythromycin）とβ-ラクタム類抗生素耐薬菌、インフフエンザ桿菌、レジオネラ（legionella）、クロストジウム  パーフリジェス（clostridium pertringens）に対し抗菌活性を有する；同類薬と比べて完全なクロス耐薬性がない。かつやや高い親脂性があり、経口吸收が速く、組織浸透性が強く、分布が広く、体内の維持時間が長く、良い抗生素の後エフェクトがある。いま既に遺伝子工程BITEスピラマイシンの三期臨床試験研究を完成し、結果はそれが良好的な治療効果と安全性を示し、目下国家一類新薬許可書を申請している。
【０００３】
臨床研究において既に、BITEスピラマイシンは服用安全有効的な抗生素で、其の治療効果が現在に認められた最も良い大環ラクトン類抗生素アーチ酵素（azithromycin）より劣らないと証明された。しかし、其の自身は多成分薬物で、目下建てられた錠剤生産プロセスによって、製品比例制御可能、品質安定なBITEスピラマイシンを得たにも関わらず、抽出、純化プロセスの制御に対する要求がやや高、品質検定コースも煩雑である。同時に、其の臨床治療効果を向上するために、其の注射製剤の研究は必要である。周知のとおり、注射剤の薬効が迅速で、重病の患者又は経口不可の患者に適用する。勿論、注射剤には品質のコントロール方面要求が更に高い。
【０００４】
BITEスピラマイシン生成菌から多成分が生成できるのはスピラマイシンの多成分があるためである。スピラマイシンは一つ大環ラクトン類抗生素で、其の主核は一つ16元環からなるラクトン環で、プラト（pratt）ラクトンと同質であり、フォロールのグリコサミノグリカン、炭素酵素糖アミンと炭素酵素糖などの三つ糖分子を含み、しかもBITEスピラマイシン主成分はスピラマイシン炭素酵素4”位水酸基がイソバレリル基によりエステル化された誘導体である。スピラマイシン生成菌には3-O-アシル基トランスフェラーゼ遺伝子が存在するため、したがってスピラマイシンラクトン環3位水酸基がアセチル化でき、スピラマイシンII成分に形成する；プロピオニル化すると、スピラマイシンIII成分に形成する；ラクトン環3位は水酸基であった場合、スピラマイシンI成分に形成した。従ってBITEスピラマイシンが少なくともイソバレリルスピラマイシンI、II、III三つ成分を含有する。BITEスピラマイシン主成分の化学構造が以下とおり:
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式中：
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【０００５】
研究を通じて、イソバレリルスピラマイシン単成分I、II、IIIが共に抗菌活性を備えると表明した、同時にその間に活性の比較は顕著な差異がない [特許出願番号：201010119745.1]、目下BITEスピラマイシンの品質基準に基づき、其の中にイソバレリルスピラマイシン（I+II+III ）が60%以下を低下しないはずである。従って、単一成分（含有量60%以上）によって多成分混合物の代わることができる。菌種生成多種成分を減少するために、本実験室は遺伝子組換え技術を利用し、BITEスピラマイシン生成菌WSJ-1中に、3-O-アリル基転移酵素遺伝子のブロックを通じて、イソバレリルスピラマイシンI成分の菌種WSJ-2[ Chunyan Ma et al. Current Microbiology, 2011,62:16-20]しか生成しないことを構築した。しかし、当該菌種発酵単位がとても低、規模化生産を行うことが難しい。本発明は調節遺伝子acyB2を利用し、菌種WSJ-2を改造し、イソバレリルスピラマイシンI成分の含有量及び生産量を向上することにあり、臨床で単成分BITEスピラマイシン同族物イソバレリルスピラマイシンI新薬を研究するために基礎をたてる。
【０００６】
耐熱ストレプトマイセスからのイソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子istが調節遺伝子acyB2と連鎖し、遺伝子の存在を調節してist遺伝子をアクティブする表現ができることは公知である。完整istとacyB2調節遺伝子のストレプトマイセスタイプ菌株を含有したストレプトマイセス  リビダンス（streptomy-ces  lividans）は、外来から加入したタイロシン（tylosin）の67-79%ものを4”イソバレリルタイロシンに転化でき、しかし単個ist又はistと不完整のacyB2遺伝子のみを含有したstrepto mycete  lividans は、タイロシンの転化率は0-2.4% である[ Arisawa A et al:Biosci Biotechnol Biochem 1993,57（12）:2020-2025 ]。IstとacyB2遺伝子を含有した自主複製型（pIJ702或pIJ943ベクター）の組換えプラスミドをタイロシン生成菌（Streptomyces fradiae）に転入し、その形質転換体が加薬（外から硫ペプチド菌素）の場合、発酵して、主要にタイロシンを生成した以外、微量4”イソバレリルタイロシン（約56μｇ/ｍｌ）[ Arisawa A. et al ：J Antibiotics 1996,49(4):349-354 ]が検出できる。しかし、今までにタイロシン生成菌にistとacyB2遺伝子を転入して4”イソバレリルタイロシン生産量又は単成分含有量を向上できる報道がない。
【０００７】
acyB2調節遺伝子はスピラマイシン生成菌(Streptomyces ambofaciens)中における転写調節蛋白Srm28cと同源であり [Fatma Karray et al Microbiology 2007,153,4111-4122]、その一致性（identity）が69%で、タイロシン生成菌(Streptomyces fradiae)中の調節蛋白tylRとの一致性が41%で、tylRはタイロシン生成菌生物合成プラス調節蛋白で、かれがタイロシン中一つポリメラーぜケトン（poliketone merase）モデル（tylGI）の表現を制御し、同時にタイロシン糖基の合成とポリケトン環に対する酸化に対し制御作用を果たす。tylR遺伝子が生成菌においての高表現は、タイロシンの生産量を向上できる[George S. etal Mol.Microbiology 2004,54(5):1326-1334]。しかし、acyB2調節遺伝子同源遺伝子を含有したスピラマイシン生成菌中に、染色体-組換えプラスミド同源DNA組換え技術を採用しist遺伝子をスピラマイシン生成菌に整合した方法は、イソバレリルスピラマイシン混合物しか生成しない、其の生産量は800μｇ/ｍｌに達成し[尚広東等 生物工程学報1999,15(2):171]、これはist遺伝子が単独に含有acyB2ような調節遺伝子に転入された菌株は、其の目的産物の生産量と成分含有量を顕著に向上できないと表明した。
【０００８】
本実験室はかつて遺伝子工程技術を利用しist遺伝子を直列させ、ist遺伝子をスピラマイシン生成菌中に其のコピー数を増加させ、其の遺伝子剤量の増加を通じて生成菌イソバレリル基化能力を向上した；同時に強いスタート活性のプロモート、例えばエリスロシン（eｔythocin）抗性遺伝子ermEプロモート配列をも利用し、原ist遺伝子プロモート配列を着替え、ist遺伝子の表現を強めたので、遺伝子工程菌生成イソバレリルスピラマイシン主成分含有量を62％を向上させた。[特許出願番号200910148767.8 ]
【０００９】
本発明の目的は、高効及び安定表現システムを採用し、istと調節遺伝子acyB2連鎖遺伝子を既に獲得されたイソバレリルスピラマイシンI成分のみを生成した菌株に表現させ、BITEスピラマイシン単成分-イソバレリルスピラマイシンIの高含有量及び高生産量菌株を獲得するためである。このために、実用価値のある抗生素生成菌において外来遺伝子に対する制限修飾障害を克服し、外来DNAの転化率を向上した。同時に、安定表現のベクターシステムを選択し、構築した遺伝子工程菌を大規模工業化生産に適用させることにある。本発明がストレプトマイセス中に非自主複製整合型ベクターを採用し、このベクター中にストレプトマイセスファージ整合酵素と附着部位を含有しかつ大腸桿菌の複製子しか含有しないで、大腸桿菌中において製造し易いためのですが、ストレプトマイセス複製子が乏しい。ストレプトマイセス菌体に進入すると、其のベクター上に含有の附着部位（attachment site attP）が宿主菌特有の附着部位と整合を行う。従って、大規模に生産するには外来遺伝子に対し安定表現ができる。本発明に述べられたイソバレリル基転移酵素遺伝子istと調節遺伝子acyB2がイソバレリルスピラマイシンI生成菌中に共同に表現し、イソバレリルスピラマイシンI成分含有量と生産量を向上する研究及び中規模実験研究は、いままで尚国内外には関連的な報道がない。
【発明の概要】
【００１０】
1、本発明は一株イソバレリルスピラマイシンI成分高含有量、高生産量遺伝子工程菌を提供し、前記工程菌はイソバレリル基転移酵素遺伝子istとacyB2調節遺伝子連鎖遺伝子がイソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ-2中に共同表現したクローン菌株である。
【００１１】
2、本発明はイソバレリルスピラマイシンI成分高含有量、高生産量菌株の構築を提供し、前記構築が耐熱ストレプトマイセス（Streptomyces thermotolarences CGMCC4.1501）総DNAを鋳型とし、NCBIに公開されたist-acyB2配列によって、プライマーを設計し、PCRでist-acyB2連鎖遺伝子断片を獲得し、其の中に適当な制限酵素部位を加入し；また適合な制限酵素部位により夫々istとacyB2遺伝子断片を、イソバレリルスピラマイシンI生成菌を導入できる整合型ベクターに接合し、含ist-acyB2遺伝子組換えプラスミドを構築した。 ist-acyB2遺伝子組換えプラスミドをイソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ-2に導入し、PCRによってist-acyB2が形質転換体遺伝子グループに整合し、イソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ-IAを獲得したことを確認した。
【００１２】
3、本発明はストレプトマイセス分類及鑑定基準に基づき、WSJ-IA菌株に対し菌株特徴の鑑定を行った。
【００１３】
4、本発明は含ist単遺伝子イソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ-2をもって対照とし、WSJ-IA菌株発酵性能を検定し、微生物法で検測WSJ-IA菌株の発酵能力を測定、かつHPLCを以って発酵液中イソバレリルスピラマイシンIの含有量を定量分析したことを含む。結果、acyB2調節遺伝子の導入によって、明らかに菌種がイソバレリルスピラマイシンI成分の含有量及び生産量を上げたことを証明した。
【００１４】
発明効果：本発明の積極的な効果は、acyB2調節遺伝子がイソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ-2に導入した後、生成菌発酵単位414%を向上でき、イソバレリルスピラマイシン成分I含有量170.2%.を向上できた。本発明による構築したイソバレリルスピラマイシンI高生産菌株が既に2トン発酵缶に中等試験を行って、イソバレリルスピラマイシンIのために累積したサンプルがもう薬効学研究階段に入った。当該菌株の応用は単成分抗生素工業化生産の品質性制御と検定基準を簡素化するだけでなく、同時にイソバレリルスピラマイシン注射剤型の製造に条件を創造した。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
図1 はist-acyB2遺伝子組換えプラスミドpSET52-iaの構築である；
図２は、ist-acyB2遺伝子がイソバレリルスピラマイシンIを整合し、細菌染色体を生成したことに用いるPCR証明試験である、其の中に：M-MarkerIII;１−WSJ-2対照菌；2-5− WSJ-IA1-4転換体；
図3 は含ist-acyB2遺伝子組換えプラスミドpSET52-ia菌種WSJ-IAが発酵を通じて生成したイソバレリルスピラマイシン成分IのHPLC分析である、其の中に：A−WSJ-2対照菌； B−WSJ-IA  istと調節遺伝子acyB2を含有の遺伝子工程菌；SP−スピラマイシン； ISO-SP−イソバレリルスピラマイシンI。
【具体的な実施態様】
【００１６】
以下に実施例は本分野技術者に更に本発明を理解するためであるが、いかなる方式で本発明を制限してはならない。
【００１７】
《実施例1》 含ist-acyB2双遺伝子組換えプラスミドpSET52-iaの構築
本実験室がまず構築した組換えプラスミドpSW4[尚広東等、生物工程学報1999,15(2):171 ] 中から、SmaI-BamHIに制限酵素で、含ist完整遺伝子と含acyB2遺伝子上流部分の1820bp断片を獲得し、中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターから提供された耐熱ストレプトマイセス（Streptomyces thermotolarences CGMCC4.1501）総DNAを鋳型とし、NCBI公布のacyB2配列によって、プライマー 
p1：CGCTCAGGGACGCAAGACC とP2：CCGGAATTCGCCCCGTGACCTCACCGTCを設計し 、PCR反応により、反応条件は94℃、 予変性2min；94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 1min、28循環；72℃ 延伸5minである。acyB2遺伝子下流部分1013bp断片を獲得し、PCRの生産物をBamHI-EcoRI制限酵素で、934bp断片を獲得し、前記SmaI-BamHI(1820bp)、BamHI-EcoRI（934bp）断片をpBluesript II KS(+)ベクター（Merck会社）のSmaI-EcoRI制限酵素部位に接合し、含istと完整acyB2遺伝子組換えプラスミドpBKS-iaを獲得した。XbaI-EcoRI制限酵素部位により大腸桿菌/ストレプトマイセスストレプトマイセス接合転移プラスミド整合型pSET152プラスミド[Bierman M. et al Gene 1992,116,43-49来自遺伝子バンク共享資源www.genecool.com] に結合し、ist-acyB2遺伝子組換えプラスミドpSET52-iaを獲得した（実験方法は宝生物工程（大連）有限公司操作規程に寄った）。構築フロシートは（図1）に示す。
【００１８】
《実施例2》 組換えプラスミドpSET52-iaがイソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ-2に転化
イソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ-2は本実験室にて構築されたのである [Chunyan Ma et al. Current Microbiology, 2011,62:16-20]。前記菌種が斜面培地に[大豆ケーキ粉 2.0%,グルコース1.0%,澱粉3.0%、CaCO3 0.5%,NaCl 0.4%,寒天 2.0%]28℃で7-10日間培養し、文献[D.A.Hopwood等 Genetic manipulation of Streptomyces、A Laboratory Manual、Norwich;John Innes Foundation UK、1985]において説明の方法によって原生質体を製造し,具体的に、菌種を塊堀りし、含ショ糖R2YE培地に接種し28℃で2-4日間培養し、10%接種量にて前記培地に転種し、かつ0.5%グリシン、20時間培養し、遠心で菌糸を収集し、10.3%ショ糖溶液で2-3回洗浄し、含溶菌酵素2mg/mlのP溶液中において37℃で15-60分間溶菌し、綿を通しロ過して原生質体を獲得した。イソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ-2が外来遺伝子に対する限制修飾作用を克服するために、本発明にはまず組換えプラスミドpSET52-iaをメチル化欠陥型大腸桿菌E.coli12567 [Mac Neil et al Gene 1992,111,61-68] に転入、遺伝子バンク共同に享受資源からのであるwww.genecool.com。形質転換体からプラスミドDNAを採取し、その後PEGを介し原生質体に転入し,かつR2YE固体培地に塗布し、28℃で24時間培養した後、含アラビア酵素溶液で培養物を被って、アラビア酵素を培地中における最終濃度50μｇ/ｍｌにせしめ、続いて7-10日間培養し抗性形質転換体を選択した。加薬しない条件下で連続に世代した後、更に加薬検定を通じて、安定表現抗性の組換えプラスミドpSET52-iaを含有したイソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ-IAを獲得した。
【００１９】
ist上流及びacyB2遺伝子下流区プライマーP3：GAGGTAGAAGGCGAAGGTとP4：CGTCAGATGCCAGTTCACを設計し、夫夫対照菌WSJ-2と本発明WSJ-IA形質転換体（4個）総DNAを鋳型としPCRを行い、PCR反応過程：94℃ 予変性2min；94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 2min、28個循環；72℃ 延伸5minである（図2）。結果は、WSJ-IA遺伝子グループから1733bp PCR産物を獲得できたが、対照菌中ではPCR産物が得られない、これはist-acyB2遺伝子が既に成功に目的菌種の遺伝子グループへ整合したことを説明した。前記菌株が2010年6月25日に北京市朝陽区北辰西路1号院3号の中国微生物菌保藏種管理委員会普通微生物中心へ寄託し、受託番号No.CGMCC 3942、分類命名はStreptomyces spiramyceticusである。
【００２０】
《実施例3》 WSJ-IA菌株特徴の鑑定と確認
本発明は《放線菌分類及び鑑定》[閏孫初監修、1992年]を参照し、WSJ-IA菌株に対し菌株特徴の鑑定と確認を行った。
1、 WSJ-IA培養形態及び生理生化特徴
（1）培養特徴
菌株の異なった培地における気生菌糸、基内菌糸と可溶性色素の色を観察し、結果を表1に示す。
（2）顕著な特徴：
胞子糸柔軟、フック状と螺旋形；胞子柱形と楕円形。 
表1    WSJ-IA菌株の培養特徴
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注：Czapek-Dox培地: ショ糖30ｇ、NaNO3 3.0ｇ、MgSO4 7H2O 0.5ｇ、KCl 0.5ｇ 、FeSO4 4H2O、K2HPO4 1.0ｇ、寒天 15.0ｇ、 蒸留水1.0リットル,pH6.0-6.5。
グルコースアスパラグス培地：グルコース10ｇ、アスパラグス0.5ｇ、K2HPO4 0.5ｇ、寒天 15.0ｇ、蒸留水1.0リットル,pH7.2-7.4。
グリセリンアスパラグス培地： グリセリン10ｇ、アスパラグス0.5ｇ、K2HPO4 0.5ｇ、寒天 15.0ｇ、蒸留水1.0リットル,pH7.2-7.4。
無機塩澱粉培地： 可溶性澱粉 10.0ｇ、MgSO4 7H2O 1.0ｇ、NaCl 1.0、
（NH4）2SO4 2.0ｇ、CaCO3 2.0ｇK2HPO4 1.0ｇ、MnCl2 4H2O 10ｍｇ、FeSO4 10ｍｇ、ZnSO4 7H2O 10ｍｇ、寒天15.0ｇ、蒸留水1.0リットル、pH7.2。
ISP-2培地：酵母クリーム 4.0 ｇ、マルトエキスクリーム 10.0ｇ、グルコース 4.0ｇ、寒天20.0ｇ、蒸留水1.0リットル、pH7.2-7.4。
オートミール培地：オートミール20.0ｇ、微量塩溶液1ｍl、寒天15ｇ、蒸留水 1.0    リットル、pH7.2。注：微量塩液溶液: FeSO4 7H2O 0.1ｇ、MnCl2 4H2O 0.1ｇ、ZnSO4 7H2O 0.1ｇ、100ｍｌ蒸留水。
Gause’s一号培地：可溶性澱粉20.0ｇ、KNO3 1.0ｇ、K2HPO40.5ｇ、MgSO4 7H2O 0.5ｇ、NaCl 0.5ｇ、FeSO4 7H2O 0.01ｇ 寒天15.0ｇ、蒸留水1.0リットル、pH7.2-7.4。
Santa’s培地：KH2PO4 0.5 ｇ、MgSO4 7H2O 0.5 ｇ、クエン酸2.0ｇ、クエン酸鉄アンモニウム0.05 ｇ、グリセリン 60 ｍｌ、アスパラミド 4.0ｇ、寒天15.0ｇ、蒸留水1.0リットル、pH7.4。
（3）生理生化特徴:
A、選択基礎培地上にWSJ-IA菌株の炭源に対する利用を検出
基礎培地：(NH4)2SO4 2.0ｇ、MgSO4 7H2O 0.2ｇ、NaH2PO4 H2O 0.5ｇ、CaCl2 2H2O 0.1ｇ、K2HPO40.5ｇ、蒸留水1.0リットル、測定炭源が0.1%-0.5%で夫夫基礎培地に入った。滅菌後、菌懸濁液を持って接種し、28℃で培養、連続に3代移種、菌体成長情況にてWSJ-IA菌株の炭源に対する利用を確認。
B、マロン酸利用の基礎培地測定： 酵母クリーム1.0ｇ、(NH4)2SO4 2.0ｇ、 K2HPO4 0.6ｇ、KH2PO4 0.4ｇ NaCl 2.0ｇ、マロン酸ナトリウム 3.0ｇ、ブロムチモールブルー0.025ｇ、蒸留水1.0リットル、pH7.0-7.4。滅菌後、菌懸濁液で接種し、28℃1-2日培養、培地がグリーン色からブルー色に変化したものはマロン酸利用とした。
C、酒石酸塩利用の基礎培地測定: 蛋白ゼリー10.0ｇ、NaCl 5.0ｇ、酒石酸ナトリウム10.0ｇ、ブロモチモールブルー（0.2%）12.5ｍｌ、蒸留水1.0リットル、滅菌。同時に酢酸鉛飽和溶液を製造した。菌懸濁液接種後14日間、28℃で培養14日間、等体積酢酸鉛試薬を仕込み、溶液が緑黄色に変化し、少量酢酸鉛沈殿のものは酒石酸利用を表した。 
D、ゼラチン液化：基礎培地蛋白ゼリー5.0ｇ、ゼラチン100-150ｇ、蒸留水1.0リットル、pH7.2-7.4、滅菌。成長18-24時間の菌培養物を取って、それにゼラチン培地に挿し接種、かつ未接種対照を設け、20℃保温箱中にて培養し、2,7,10,14と30日間、20℃以下室温で菌体成長及びゼラチン液化を観察し、結果、菌が既に成長、ゼラチン表面に凹部なし且つ安定的な凝塊を示せば、ゼラチン液が陰性と認められる。
E、ミルク反応：新鮮ミルク煮沸、冷蔵庫に一晩に放置し、底層脱脂ミルクを取った；リトマス2.5ｇを100ｍｌ蒸留水に一晩に浸漬し、ろ過、2.5%リトマス水溶液4ｍｌ、脱脂ミルク100ｍｌを取って、装入試験管の高さが約4cm、滅菌、菌株接種28℃で培養1,3,5,7,14和30日間、観察結果は、ミルク塊ゼリー化を表した。
F、硝酸塩還元：培地肉エキスゼリー培地1.0リットル、KNO3 1.0ｇ、pH7.0-7.6、各管に4-5ｍｌを装入、滅菌。グリース氏（Griess）試薬：a） ｐ−アミノベンゼンスルファニル酸0.5ｇ、希酢酸（10%）150ｍｌ；b） -ナフチルアミン 0.1ｇ、蒸留水 20ｍｌ、希酢酸（10%）150ｍｌ。ジアニリン試薬：ジアニリン0.5ｇを100ｍｌ濃硫酸に溶解し、20ｍｌ蒸留水で希釈した。菌種を硝酸塩培地に接種し、28℃で培養1,3,5日間、洗浄管に1,3,5日間の培養液を少量に加入、夫夫一滴a）、b）液を滴下し、溶液は赤色に変化すれば、硝酸塩が亜硝酸塩に還元されたと表示、一滴ジアニリン試薬を加入し、青色反応を呈していない。
G、チロシン酵素：菌種がGause’s一号液体培地に接種され、28℃で7,9,12日間培養、別々に2ｍｌ培養液をサンプルし、遠心後に上清液を取り、2ｍｌリン酸緩衝液（pH5.9）と1ｍｌ0.04%チロシン溶液を仕込、37℃で5分間保温し、赤色反応を呈しない。
H、澱粉酵素：菌種が肉エキスゼリー中に接種して0.2%可溶性澱粉寒天培地中に加入し、28℃で2-5日間培養し、寒天平板上で明らかにコロニーに形成した後、平板上にヨード液（ヨード1.0ｇ、ヨード化カリウム2.0ｇ、300ｍｌ蒸留水）、コロニー周囲に不辺色の透明環を呈すると、澱粉水解を表明した。 
WSJ-IA菌株の生理生化特徴は表2に示す。
2、WSJ-IAの分子系統学特徴分析   
（1）16S rDNA遺伝子配列：
16SrDNAが細菌リボソームの組成部分で、16SrDNA遺伝子は細菌染色体上にコードrRNA相応的なDNA配列で、それは遺伝学に高度保守性を備えるため、従って、其の配列が既に細菌分子分類学の特徴の一に公認された。
以下の16SrDNAプライマー：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’を採用
WSJ-IA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程：96℃予変性1 min；各循環中に、96 ℃で変性30 s、50℃でアニール30 s、72℃で延伸1.5 min、25個循環; 72℃で延伸10 min。1393bp配列表（1）を獲得。
表2   WSJ-IA菌株の生理生化特徴
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表3   WSJ-IA 16S rDNA遺伝子配列と既知菌との比較
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【００２１】
本発明はまたWSJ-IA菌株において、ストレプトマイセス分子分類学に通用の以下五つ肝心な遺伝子atpD,gyrB,rpoB,recAとtrpBに対し配列を測定した。これら遺伝子は単コピーとコード蛋白の遺伝子で、これら遺伝子配列構造が安定で、其の中に隙間又は重ね現象が存在していない。従って、其の配列測定結果は直接にヌクレオチド水準及びアミノ酸水準で菌株の種間における比較に用いられ、更にWSJ-IAが分類中における位置を確定できる。
【００２２】
（2）肝心遺伝子 
A．atpD遺伝子配列
atpD遺伝子はATP合成酵素サブユニットで、微生物種属中において高い安定性と普遍性を備え, 種系分類の分子標識とするのは適合である。本発明は以下プライマーを採用：
5’-GTCGGCGACTTCACCAAGGGCAAGGTGTTCAACACC-3’ 
5’-GTGAACTGCTTGGCGACGTGGGTGTTCTGGGACAGGAA -3’
WSJ-IA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程：96 ℃予変性1 min；各循環中96 ℃で変性30 s、63 ℃でアニール30 s、72 ℃延伸1.0 min、28個循環; 72℃延伸10 min。680bp配列表（2）を獲得。
【００２３】
B．gyrB遺伝子配列
GyrBはDNAジャイレース四量体のサブユニットで、原核生物II型DNAトポロジ異性酵素に属され、かれがDNA切断と重複接合作用によってDNAのトポロジ構造を調節し、ある抗生素生成菌の抗性と関わり、微生物種属中において高い安定性と普遍性を備え,種系分類の分子標識とするのは適合である。従って、其の配列が既に細菌分子分類学の特徴の一に公認された。
本発明は以下プライマーを採用：
5’-GAGGTCGTGCTGACCGTGCTGCACGCGGGCGGCAAGTTCGGC-3’ 
5’-GTTGATGTGCTGGCCGTCGACGTGAGCGTCCGCCAT -3’
WSJ-IA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程：96 ℃予変性1 min；各循環中96 ℃で変性30 s、65 ℃でアニール30 s、72 ℃延伸1.0 min、28個循環; 72℃延伸10 min1177bp配列表（3）を獲得。
【００２４】
C．rpoB遺伝子配列
rpoBはRNAポリメラーゼb-サブユニットで、ストレプトマイセスにおいて広汎に存在している。
本発明は以下プライマーを採用：：
5’- GAGCGCATGACCACCCAGGACGTCGAGGC-3’ 
5’-CCTCGTAGTTGTGACCCTCCCACGGCATGA -3’
WSJ-IA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程：96 ℃予変性1 min；各循環中96 ℃で変性30 s、65 ℃でアニール30 s、72 ℃延伸1.0 min、28個循環; 72℃延伸10 min870bp配列表（4）を獲得。
【００２５】
D．recA遺伝子配列
RecAは組換え酵素で、DNA同源組換えと損害修復DNAの過程において重要な役割を果たす。RecAの存在は菌株遺伝子グループDNA構造安定性の重要ファクターで、従って、其の配列が既に細菌分子分類学の特徴の一に公認された。
本発明は以下プライマーを採用：：
5’- CCGCRCTCGCACAGATTGAACGSCAATTC -3’ 
5’- GCSAGGTCGGGGTTGTCCTTSAGGAAGTTGCG -3’
WSJ-IA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程：96 ℃予変性1 min；各循環中96 ℃で変性30 s、65 ℃でアニール30 s、72 ℃延伸1.0 min、28個循環; 72℃延伸10 min701bp配列表（5）を獲得。
【００２６】
E．trpB遺伝子配列
trpB遺伝子はコードトリプトファン合成酵素で、ストレプトマイセス初級代謝に参与し、菌株種属特異性を有すると認められ、其の配列が既に細菌分子分類学の特徴の一に公認された。。
本発明は以下プライマーを採用：：
5’- GCGCGAGGACCTGAACCACACCGGCTCACACAAGATCAACA -3’ 
5’- TCGATGGCCGGGATGATGCCCTCGGTGCGCGACAGCAGGC -3’
WSJ-IA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程：96 ℃予変性1 min；各循環中96 ℃で変性30 s、66 ℃でアニール30 s、72 ℃延伸1.0 min、28個循環; 72℃延伸10 min611bp配列表（6）を獲得。
【００２７】
表3、表4から、WSJ-IA菌株16SrDNA及び五つ肝心遺伝子配列が既知菌株遺伝子配列と比べ完全な一致性がないので、WSJ-IAは一つストレプトマイセス新種であると判断できる。
表4  WSJ-IA肝心遺伝子配列と既知菌の比較
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【００２８】
《実施例3》 WSJ-IA菌種の中等試験規模発酵能力検出 
WSJ-IA菌種が《実施例2》前記斜面培地28℃で培養7-10日間、塊堀りで種子培地（大豆ケーキ粉 1.5%、澱粉 3.0%、NaCl  0.4%、 CaCO3  0.5%、魚蛋白ゼリー 0.3%、 KH2PO4  0.05%）に接種し、一級28℃で48時間培養して、二級種子培養に転入し28℃で24時間培養し、50L種子缶培養に転入し36時間培養し、更に2トン発酵缶に転入し、発酵培地（グルコース  0.5%、澱粉 6.0%、酵母粉0.5%、魚粉2.0%、NH4NO3 0.6%、NaCl 1.0%、CaCO3 0.5% 、KH2PO4 0.05%、MgSO4 0.1%）、28℃で96時間発酵培養した。発酵液から遠心上清液をサンプルし、含3%NaClのpH 7.8~8.0リン酸塩緩衝液で希釈した。胞子桿菌[CGMCC(B)63501]を検出菌とし、培地配合: 蛋白ゼリー 0.6%,牛肉浸漬粉 0.15%,酵母エキスクリーム 0.6%,グルコース 0.2% , 寒天1.5-2.0%, 中国薬典2010版二部附録XI Aによる基準曲線方法に基づき、アセチルスピラマイシンを基準品にして、発酵能力を計算した。本実験に三次重複した後、得られたWSJ-IA菌種発酵能力平均は1160ｍｇ/ｍｌ、含ist単遺伝子のWSJ-2菌種対照発酵能力の平均が280μｇ/ｍｌ（表5）である。
【００２９】
《実施例4》 WSJ-IA菌種発酵生産生イソバレリルスピラマイシンI成分の検出
《実施例3》で獲得発酵液からのサンプルをpH8.5までに調整し、等量酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル抽出液を濃縮し、乾しまでにした後、メタノールに溶解した。以下の条件を採用し：  Kromasil C18 カラム（4.5 mm×150 mm、5 μm）；流動相：メタノール：リン酸ジヒドロナトリウム溶液（体積比53:47）；検出波長：231 nm；流速：1.0 mL・min-1；カラム温度25℃；仕込み量：10-20 μL。HPLCにて産物中におけるイソバレリルスピラマイシンI成分の含有量を検出（図2）、三回実験結果から、WSJ-IA菌種発酵で生成したイソバレリルスピラマイシンI総含有量は平均に12.061%で、含ist単遺伝子のWSJ-2菌種対照生成イソバレリルスピラマイシンI総含有量は7.088%で、《実施例3》により発酵培養を行い、微生物法で二つ菌種発酵能力を測定し、酢酸エチル抽出産物に対しHPLC分析（図3）を行った。HPLC中ピーク面積により両者生成イソバレリルスピラマイシンI成分の情況を比較し、夫夫に両者生成イソバレリルスピラマイシンIがスピラマイシンとの比例を計算し、結果、ist-acyB2遺伝子の導入によって  WSJ-IA菌種発酵能力414%を向上し、生成イソバレリルスピラマイシンI含有量も170.2%を向上、相応的にスピラマイシンの生成を下げ、イソバレリルスピラマイシンI成分とスピラマイシン比例が218% を向上した（表5）。
【００３０】
本発明は含ist-acyB2遺伝子生成イソバレリルスピラマイシンIの菌種を提供し、当該菌種が一定発酵条件下で、元々にist遺伝子のみを含有した菌種生成イソバレリルスピラマイシンI成分含有量より1.7倍を向上し、発酵能力は4.14倍を向上した。
表5   WSJ-IAとWSJ-2菌種発酵能力及び成分含有量の比較
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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