(57)【要約】  本発明は、タンパク質および／またはその断片および誘導体、ならびにワクチンとしての、およびバイオテクノロジー法におけるその使用に関する。ワクチンには、特に、ウシにおける趾皮膚炎から単離されるトレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種における免疫原性タンパク質が含まれる。本発明はさらに、前記タンパク質またはその断片に対して作製される抗体、ならびに抗体がウシにおける趾皮膚炎の徴候として検出される診断法における前記タンパク質の使用にも関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号４または配列番号６記載のアミノ酸配列を有する単離タンパク質、あるいは前記タンパク質に対する免疫反応を誘導可能なその断片または誘導体、あるいは前記タンパク質に対する免疫反応において被験体によって産生される抗体に結合可能な断片または誘導体。
【請求項２】
獣医学的医薬品において使用するための、請求項１記載のタンパク質、断片または誘導体。
【請求項３】
トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種によって引き起こされる疾患、例えば趾皮膚炎の防止において使用するための、請求項１記載のタンパク質、断片または誘導体。
【請求項４】
トレポネーマ属種によって引き起こされる疾患の治療または防止のための方法であって、配列番号２、配列番号４または配列番号６記載のアミノ酸配列を有する単離タンパク質、あるいは前記タンパク質に対する免疫反応を誘導可能なその断片または誘導体を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項５】
トレポネーマ属種によって引き起こされる疾患が趾皮膚炎である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
配列番号２、配列番号４または配列番号６記載のアミノ酸配列を有する単離タンパク質、あるいは前記タンパク質に対する免疫反応を誘導可能なその断片または誘導体、および場合による薬学的に許容されうるアジュバント、キャリアーおよび／または希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項７】
試料において、トレポネーマ属種由来のタンパク質に対する抗体の存在を検出するための方法であって：
−前記試料を、配列番号２、配列番号４または配列番号６記載のアミノ酸配列を有する単離タンパク質、あるいは前記タンパク質に対する免疫反応において被験体によって産生される抗体に結合可能なその断片または誘導体と接触させ；そして
−前記タンパク質、断片または誘導体に結合する抗体を検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項８】
トレポネーマ属種によって引き起こされる疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断のための方法であって：
−被験体由来の体液または組織の試料を得て；
−前記試料を、配列番号２、配列番号４または配列番号６記載のアミノ酸配列を有する単離タンパク質、あるいは前記タンパク質に対する免疫反応において被験体によって産生される抗体に結合可能なその断片または誘導体と接触させ；そして
−前記タンパク質、断片または誘導体に結合する抗体を検出する；
ここで、前記タンパク質、断片または誘導体に結合する抗体の存在が、トレポネーマ属種によって引き起こされる疾患の指標となる
工程を含む、前記方法。
【請求項９】
前記疾患が趾皮膚炎である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
配列番号２、配列番号４または配列番号６記載のアミノ酸配列を有する単離タンパク質に特異的に結合する抗体、またはその結合性断片。
【請求項１１】
トレポネーマ属種によって引き起こされる疾患の治療または防止のための方法であって、請求項１０記載の抗体を被験体に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１２】
トレポネーマ属種によって引き起こされる疾患が趾皮膚炎である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
試料からトレポネーマ属細菌を分離するための方法であって：
−固相に結合した請求項１０記載の抗体と、前記試料を接触させ；
−前記抗体が、前記トレポネーマ属細菌中のトレポネーマ属タンパク質に結合するのを可能にし；そして
−前記試料から前記固相を分離し
それによって、前記試料から前記トレポネーマ属細菌を分離する
工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
前記分離が免疫磁気分離である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１記載のタンパク質、断片または誘導体をコードする核酸分子。
【請求項１６】
配列番号１、配列番号３または配列番号５記載のヌクレオチド配列を有する、請求項１５記載の核酸分子。
【請求項１７】
請求項１５または１６記載の核酸分子、および場合によって宿主細胞における発現のための制御配列を含む、ベクター。
【請求項１８】
請求項１７記載のベクターを含むトランスジェニック宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１記載のタンパク質、断片または誘導体を産生するための方法であって：
−適切な培地中で請求項１８記載の宿主細胞を培養し；そして
−前記培地から前記タンパク質、断片または誘導体を単離する
工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質および／またはその断片および誘導体、ならびにワクチンとしての、およびバイオテクノロジー法におけるその使用に関する。ワクチンには、特に、ウシにおける趾皮膚炎から単離されるトレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種における免疫原性タンパク質が含まれる。本発明はさらに、前記タンパク質またはその断片に対して作製される抗体、ならびに抗体がウシにおける趾皮膚炎の徴候として検出される診断法における前記タンパク質の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
趾皮膚炎（ＤＤ）は、ウシにおける、最も一般的には集約的酪農生産において見られる、跛行を引き起こす感染性鉤爪疾患である。該疾患は、１９７４年、イタリアで最初に記載された。スウェーデンでは、最近、ＤＤの最初の群れが記載された（ＨｉｌｌｓｔｒｏｅｍおよびＢｅｒｇｓｔｅｎ、２００５）が、以前には、散発的な非定型の症例しか報告されてきていない（Ｍａｎｓｋｅら、２００２）。湿った／汚い鉤爪環境およびＤＤの発生の間に強い関連があり（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌａｉｎｚら、１９９６）、例えば通路（ａｌｌｅｙｓ）上の糞便および尿の集積が典型的な衛生上の問題である小部屋（ｃｕｂｉｃｌｅ）系において強い関連がある。動物福祉の問題であることに加えて、ミルク産生減少および体重喪失による経済的な損失が、ＤＤに関連付けられている（Ｌｏｓｉｎｇｅｒ、２００６）。
【０００３】
ＤＤ病変を抗生物質で処置すると迅速な反応があることから、細菌が原因であることが強く裏付けられる。異なる属の多くの細菌、例えばトレポネーマ属、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ディケロバクター属（Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、およびポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）がＤＤ病変から単離され、そして原因が多微生物性であるとしばしば論じられる。しかし、ＤＤの病因において、トレポネーマ属種が主因である強い状況証拠がある。早くは１９６４年に、ウシの「腐蹄」徴候の異なる変種由来のスメアにおいて、スピロヘータ（ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅ）が観察された（Ｇｕｐｔａら、１９６４）。スピロヘータの別の初期観察は、１９８８年に行われ、これは、英国においてＤＤが記載された最初の例であった（ＢｌｏｗｅｙおよびＳｈａｒｐ、１９８８）。ＤＤからの最初のスピロヘータ培養が１９９５年に報告された（Ｗａｌｋｅｒら、１９９５）。ＤＤ病変由来の組織プレパラートにおいて、トレポネーマが表皮のより深部の層に浸潤していることが見出されている（Ｍｏｔｅｒら、１９９８）。さらに、感染したウシにおいて、トレポネーマ属種に対する体液性免疫反応が立証されてきている（Ｗａｌｋｅｒら、１９９７；  Ｔｒｏｔｔら、２００３）。ＤＤ病変からの新鮮な剥離物の接種を通じた疾患の実験的伝染の成功が１９９６年に記載された（ＲｅａｄおよびＷａｌｋｅｒ、１９９６）。接種１〜２週間後に、スピロヘータが組織に浸潤することもまた、組織病理によって確認された（Ｒｅａｄら、１９９８）。
【０００４】
トレポネーマ属のいくつかの系統型が同じ病変中に存在する可能性もある。異なる系統型が同じ動物から単離されてきており（Ｗａｌｋｅｒら、１９９５；  Ｅｖａｎｓら、２００８）、そして１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のクローニングおよび配列決定によって、５つの異なる系統型が４頭のウシ由来のプール試料中で同定された（Ｃｈｏｉら、１９９７）。ＤＤ病変由来の生検に対する蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、皮層における分布が系統型間で異なることもまた立証されてきている（Ｍｏｔｅｒら、１９９８）。トレポネーマ・ファゲデニス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ）様系統型は主に、角質層および有棘層に位置した。いくつかの系統型は、いまだに培養されたとは報告されていない。最近、いくつかの研究において、トレポネーマ・ファゲデニス様系統型は、ＤＤの発病における重要な病原体であることが示されてきている（Ｋｌｉｔｇａａｒｄら、２００８、Ｎｏｒｄｈｏｆｆら、２００８、Ｙａｎｏら、２００９）。
【０００５】
ＤＤが蔓延している国々では、抗生物質を含有するフットバスがしばしば用いられる。これらのフットバスは、迅速に糞便および汚れで汚染され、そしてしたがって、抗生物質耐性細菌の巨大選択培養物として機能する。スウェーデンにおいてはテトラサイクリンが用いられるが、個々の動物の局所治療に関してのみであり、これは、群れのレベルでは、硫酸銅を含むフットバスが推奨されているためである。
【０００６】
現在まで、ＤＤに関する商業的なワクチンまたは血清学的試験は利用可能でない。トレポネーマ属種に対する体液性反応は、ＤＤに罹患したウシにおいて示されてきており、そして研究において、全細胞溶解物ＥＬＩＳＡ研究に用いられている（Ｄｅｍｉｒｋａｎら、１９９９、Ｔｒｏｔｔら、２００３、Ｖｉｎｋら、２００９、Ｗａｌｋｅｒら、１９９７）。Ｎｏｖａｒｔｉｓは、２０００年代初期に数年間、ＵＳＡ市場用に全細胞溶解物ＤＤワクチン（ＴｒｅｐＳｈｉｅｌｄ）を製造した（Ｂｅｒｒｙら、２００４、Ｋｅｉｌら、２００２）。
【０００７】
ワクチン開発のための技術および戦略は、とりわけ、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０１１）およびＶａｃｃｉｎｅｓ：  Ｆｒｏｍ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ（Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  １９９８）に記載される。ワクチンとしての組換えタンパク質の使用は、Ｅｒｄｉｌｅら、１９９７に記載される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＨｉｌｌｓｔｒｏｅｍおよびＢｅｒｇｓｔｅｎ、２００５
【非特許文献２】Ｍａｎｓｋｅら、２００２
【非特許文献３】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌａｉｎｚら、１９９６
【非特許文献４】Ｌｏｓｉｎｇｅｒ、２００６
【非特許文献５】Ｇｕｐｔａら、１９６４
【非特許文献６】ＢｌｏｗｅｙおよびＳｈａｒｐ、１９８８
【非特許文献７】Ｗａｌｋｅｒら、１９９５
【非特許文献８】Ｍｏｔｅｒら、１９９８
【非特許文献９】Ｗａｌｋｅｒら、１９９７
【非特許文献１０】Ｔｒｏｔｔら、２００３
【非特許文献１１】ＲｅａｄおよびＷａｌｋｅｒ、１９９６
【非特許文献１２】Ｒｅａｄら、１９９８
【非特許文献１３】Ｅｖａｎｓら、２００８
【非特許文献１４】Ｃｈｏｉら、１９９７
【非特許文献１５】Ｋｌｉｔｇａａｒｄら、２００８
【非特許文献１６】Ｎｏｒｄｈｏｆｆら、２００８
【非特許文献１７】Ｙａｎｏら、２００９
【非特許文献１８】Ｄｅｍｉｒｋａｎら、１９９９
【非特許文献１９】Ｖｉｎｋら、２００９
【非特許文献２０】Ｂｅｒｒｙら、２００４
【非特許文献２１】Ｋｅｉｌら、２００２
【非特許文献２２】Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０１１）
【非特許文献２３】Ｖａｃｃｉｎｅｓ：  Ｆｒｏｍ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ（Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  １９９８）
【非特許文献２４】Ｅｒｄｉｌｅら、１９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、動物における皮膚炎、特に反芻動物における趾皮膚炎の効率的な診断法および該皮膚炎に対する免疫保護、ならびに前記目的のための製品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ウシにおいて趾皮膚炎から単離されるトレポネーマ属種における免疫原性タンパク質、そしてより具体的には組換えタンパク質に関する。
第一の側面において、本発明は、以下にさらに定義するように、それぞれ配列番号２、配列番号４または配列番号６記載のアミノ酸配列を持つ単離トレポネーマ・ファゲデニス様タンパク質、ＴｍｐＡ、Ｔｔｍ、およびＰｒｒＡに関し、トレポネーマ属種に対する免疫反応を誘導可能なその断片および誘導体に関し、そして前記タンパク質に対する免疫反応において被験体によって産生される抗体に結合可能な断片および誘導体に関する。
【００１１】
本発明の１つの態様において、トレポネーマ属タンパク質、ならびにその断片および誘導体は、組換え的に産生される。
１つの側面において、本発明は、本発明記載のタンパク質、断片および誘導体をコードする核酸分子に関する。
【００１２】
本発明はまた、獣医学的医薬品における、特に、趾皮膚炎の防止のためのワクチンとしての、前記タンパク質、その断片および誘導体の使用にも関する。
さらなる側面において、本発明は、趾皮膚炎に対する保護のための獣医学的ワクチンであって、１またはそれより多い前記組換えタンパク質および／またはその活性断片、ならびに慣用的でそして適切なアジュバントを含む、前記ワクチンを提供する。こうしたワクチンには、さらに、より広い免疫反応のためのワクチンにおいて、他のトレポネーマ属免疫原、または異なるトレポネーマ属種の全細胞溶解物がさらに含まれてもよいし、または含まれなくてもよい。
【００１３】
別の側面にしたがって、本発明はまた、動物における趾皮膚炎の防止のための方法であって、前記ワクチンを投与する必要がある動物に前記ワクチンを投与する工程を含む、前記方法にも関する。
【００１４】
さらにさらなる側面にしたがって、前記組換えタンパク質および／または活性断片が、前記試料中のトレポネーマ属種に対する抗体の存在を検出するのに用いられる、試料中のトレポネーマ属種に対する抗体の存在を検出する方法を提供する。
【００１５】
さらにさらなる側面にしたがって、前記組換えタンパク質および／または活性断片が、動物中のトレポネーマ属種に対する抗体の存在を検出するのに用いられる、動物における趾皮膚炎の診断のための方法を提供する。
【００１６】
前記検出法または診断法の１つの態様において、前記組換えタンパク質および／または活性断片が、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）法において用いられる。
１つの側面において、本発明は、前記免疫原性タンパク質、あるいはその免疫原性誘導体または断片に対して作製される抗体に関する。こうした抗体は、受動免疫による、トレポネーマ属種によって引き起こされる疾患の治療に有用であり、そしてまたトレポネーマ属種細菌の免疫磁気分離などの多様な実験法においてもまた有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】トレポネーマ・ファゲデニス様株Ｖ１免疫原性タンパク質ＴｍｐＡ、Ｔｔｍ、およびＰｒｒＡを抗原として用いた酵素連結免疫吸着アッセイ。該アッセイは、急性趾皮膚炎に罹患した８頭の乳牛（黒いバー）、趾皮膚炎の既知の病歴がない２頭の乳牛および６〜７ヶ月齢の５頭の子ウシ（灰色のバー）由来の血清を用いて行われた。西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化ウサギ抗ウシＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）（Ａ）またはモノクローナル２２：２６抗ウシＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｓｖａｎｏｖａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）（Ｂ）を二次抗体として用いた。補正光学密度（ＣＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。
【図１Ｂ】トレポネーマ・ファゲデニス様株Ｖ１免疫原性タンパク質ＴｍｐＡ、Ｔｔｍ、およびＰｒｒＡを抗原として用いた酵素連結免疫吸着アッセイ。該アッセイは、急性趾皮膚炎に罹患した８頭の乳牛（黒いバー）、趾皮膚炎の既知の病歴がない２頭の乳牛および６〜７ヶ月齢の５頭の子ウシ（灰色のバー）由来の血清を用いて行われた。西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化ウサギ抗ウシＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）（Ａ）またはモノクローナル２２：２６抗ウシＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｓｖａｎｏｖａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）（Ｂ）を二次抗体として用いた。補正光学密度（ＣＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
「免疫原性物質」または「免疫原」は、場合によってアジュバントと組み合わされて、患者に投与された際に、それ自体に対する免疫学的反応を誘導可能である。
【００１９】
「活性断片」または「活性誘導体」は、本明細書において、場合によってアジュバントと組み合わされて、患者に投与された際に、前記天然免疫原性物質に対する免疫学的反応を誘導可能な、天然免疫原性物質の断片または誘導体である。活性断片または誘導体は、少なくとも１つの「エピトープ」または「抗原決定基」を含むかまたは模倣する。
【００２０】
「結合性断片」または「結合性誘導体」は、本明細書において、前記天然免疫原性物質に対する免疫反応において、被験体によって産生される抗体に免疫特異的に結合可能な、天然免疫原性物質の断片または誘導体である。結合性断片または誘導体は、少なくとも１つの「エピトープ」または「抗原決定基」を含むかまたは模倣する。
【００２１】
タンパク質の「誘導体」は、元来のタンパク質に対する実質的な配列相同性を示すタンパク質であってもよい。配列相同性は、アミノ酸配列の５０％同一性またはそれより大きく、例えば６５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一性であってもよい。置換されるアミノ酸は好ましくは保存性置換である。置換されるアミノ酸は、天然または非天然アミノ酸であってもよい。
【００２２】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、Ｂおよび／またはＴ細胞が反応する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、隣接するアミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングによって並置される非隣接アミノ酸の両方から形成可能である。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露に際して保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理に際して失われる。エピトープには、典型的には、ユニークな空間コンホメーションにある、少なくとも３、そしてより一般的には、少なくとも５または８〜１０アミノ酸が含まれる。エピトープの空間コンホメーションを決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ６６，  Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ監修（１９９６）を参照されたい。
【００２３】
同じエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が、ターゲット免疫原、あるいはその断片または誘導体に対する別の抗体の結合を遮断する能力を示す、単純なイムノアッセイにおいて、同定可能である。
【００２４】
用語「抗体」は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体またはその結合性断片を指す。抗体は、完全抗体分子（ポリクローナル、モノクローナルまたはキメラを含む）を含んでもよいし、またはその抗原結合性断片を含んでもよい。抗体断片には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｃ、およびＦｄ断片が含まれ、そして単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖ内に取り込まれていてもよい（例えばＨｏｌｌｉｎｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ，  ２００５，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２３，  ９，  １１２６−１１３６を参照されたい）。
【００２５】
配列表
【００２６】
【表１】
2013518563.tif 000002
【００２７】
詳細な説明
本発明の側面および態様のさらなる概要
１つの側面において、本発明は、配列番号２、配列番号４または配列番号６記載のアミノ酸配列を有する単離タンパク質、あるいは前記タンパク質に対する免疫反応を誘導可能なその断片または誘導体、あるいは前記タンパク質に対する免疫反応において被験体によって産生される抗体に結合可能な断片または誘導体に関する。前記タンパク質、断片または誘導体は、獣医学的医薬品において使用されてもよく、例えば、トレポネーマ属種によって引き起こされる疾患、例えば趾皮膚炎の防止において使用されてもよい。
【００２８】
別の側面において、本発明は、トレポネーマ属種によって引き起こされる疾患の治療または防止のための方法であって、配列番号２、配列番号４または配列番号６記載のアミノ酸配列を有する単離タンパク質、あるいは前記タンパク質に対する免疫反応を誘導可能なその断片または誘導体を、被験体に投与する工程を含む、前記方法に関する。前記方法は、趾皮膚炎などの疾患のために使用されてもよい。
【００２９】
さらなる側面において、本発明は、配列番号２、配列番号４または配列番号６記載のアミノ酸配列を有する単離タンパク質、あるいは前記タンパク質に対する免疫反応を誘導可能なその断片または誘導体、および場合による薬学的に許容されうるアジュバント、キャリアーおよび／または希釈剤を含む、薬学的組成物に関する。
【００３０】
さらに別の側面において、本発明は、試料において、トレポネーマ属種由来のタンパク質に対する抗体の存在を検出するための方法であって：
−前記試料を、配列番号２、配列番号４または配列番号６記載のアミノ酸配列を有する単離タンパク質、あるいは前記タンパク質に対する免疫反応において被験体によって産生される抗体に結合可能なその断片または誘導体と接触させ；そして
−前記タンパク質、断片または誘導体に結合する抗体を検出する
工程を含む、前記方法に関する。
【００３１】
本発明のさらなる側面は、トレポネーマ属種によって引き起こされる疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断のための方法であって：
−被験体由来の体液または組織の試料を得て；
−前記試料を、配列番号２、配列番号４または配列番号６記載のアミノ酸配列を有する単離タンパク質、あるいは前記タンパク質に対する免疫反応において被験体によって産生される抗体に結合可能なその断片または誘導体と接触させ；そして
−前記タンパク質、断片または誘導体に結合する抗体を検出する；
ここで、前記タンパク質、断片または誘導体に結合する抗体の存在が、トレポネーマ属種によって引き起こされる疾患の指標となる
工程を含む、前記方法に関する。
【００３２】
前記方法は、趾皮膚炎などの疾患のために使用されてもよい。
本発明のさらなる側面は、配列番号２、配列番号４または配列番号６記載のアミノ酸配列を有する単離タンパク質に特異的に結合する抗体、またはその結合性断片に関する。
【００３３】
本発明の別の側面は、トレポネーマ属種によって引き起こされる疾患の治療または防止のための方法であって、前記抗体を被験体に投与する工程を含む、前記方法に関する。趾皮膚炎はこうした疾患の一例である。
【００３４】
本発明のさらなる側面は、試料からトレポネーマ属細菌を分離するための方法であって：
−固相に結合した前記抗体と、前記試料を接触させ；
−前記抗体が、前記トレポネーマ属細菌中のトレポネーマ属タンパク質に結合するのを可能にし；そして
−前記試料から前記固相を分離し
それによって、前記試料から前記トレポネーマ属細菌を分離する
工程を含む、前記方法に関する。
【００３５】
前記方法において、分離は、例えば免疫磁気分離によって達成可能である。
本発明の別の側面は、本発明記載のタンパク質、断片または誘導体をコードする核酸分子に関する。１つの態様において、タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５およびその一部からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００３６】
本発明のさらなる側面は、前記核酸分子、および場合によって宿主細胞における発現のための制御配列を含む、ベクターに関する。
本発明の別の側面は、前記ベクターを含むトランスジェニック宿主細胞に関する。
【００３７】
本発明はまた、本発明記載のタンパク質、断片または誘導体を産生するための方法であって：
−適切な培地中で本発明記載の宿主細胞を培養し；そして
−前記培地から前記タンパク質、断片または誘導体を単離する
工程を含む、前記方法にも関する。
【００３８】
詳細
ショットガン・ファージディスプレイを用いて、Ｔ．ファゲデニスに緊密に関連するＤＤトレポネーマ属系統型の単離体（Ｖ１）における３つの免疫原性タンパク質を同定した。この系統型は、ＤＤの発病における重要な病原体であることがいくつかの研究において示されてきている（Ｋｌｉｔｇａａｒｄら、２００８、Ｎｏｒｄｈｏｆｆら、２００８、Ｙａｎｏら、２００９）。ファージ・ライブラリーは、生きた細菌で免疫したウサギ由来の抗体に対して選択された。
【００３９】
梅毒トレポネーマ亜種パリダム（Ｔ．  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｌｌｉｄｕｍ）のよく性質決定された免疫原性タンパク質ＴｍｐＡに対する相同体、ならびにいかなる既知のスピロヘータ・タンパク質にも相同性を持たない２つのタンパク質が同定された。４５４  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭによって生成されたＶ１のゲノム配列から、これらのタンパク質の完全アミノ酸配列を予測した。３つの特異的免疫原性タンパク質、およびそのアミノ酸配列は、配列番号２、４および６に記載される。
【００４０】
本発明の第一の側面記載のタンパク質、断片および誘導体は、Ｔ．ファゲデニス株Ｖ１に緊密に関連するトレポネーマ属系統型の培養物から単離されるか、または好ましくは以下に記載するように組換え的に産生されてもよい。
【００４１】
ウェスタンブロットを行って、免疫したウサギ由来の抗体ならびに天然感染したウシ由来の抗体の両方が、組換え的に産生されたＴｍｐＡ相同体およびＴｔｍ断片に結合することを示した。
【００４２】
パイロットＥＬＩＳＡ実験を行い、そしてＤＤに罹患したおよびしていないウシ由来の血清間で、吸光度における相違が記録されてきている（表１）。単一抗原（ＴｍｐＡ相同体またはＴｔｍ断片）を用いると、健康群および感染群の結果間にはわずかな重複しかなく、そして２つの抗原の組み合わせを用いると、重複はなかった。
【００４３】
本発明記載の免疫原性タンパク質、およびその活性断片を、Ｔ．ファゲデニスに緊密に関連するトレポネーマ属系統型または他のトレポネーマ属種によって少なくとも部分的に引き起こされる疾患に対するワクチンにおいて使用してもよい。
【００４４】
特定の態様において、完全タンパク質がワクチンにおいて用いられる。特定の態様において、適切なエピトープを含む断片のみが用いられる。特定の態様において、１またはそれより多いタンパク質の１またはそれより多いエピトープが単一の分子に組み合わされ、そしてワクチンにおいて用いられる。組換えタンパク質、その誘導体または断片は、したがって、単独で、または異なる組み合わせで、または結合性エピトープの融合タンパク質として用いられうる。
【実施例】
【００４５】
方法
ヘルパーファージ、細菌株、増殖条件、およびＤＮＡ技術
ファージＲ４０８（Ｐｒｏｍｅｇａ）をヘルパー・ファージとして用いた。ファージまたはファージミドが関与するすべての実験において、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＴＧ１（Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Δ（ｍｃｒＢ−ｈｓｄＳＭ）５（ｒＫ−ｍＫ−）ｔｈｉ−１  ｓｕｐＥ［Ｆ’ｔｒａＤ３６  ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑＺΔＭ１５］；  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を宿主として用い、そしてＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ）中、またはＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天（ＬＡ）上で増殖させた。適切な場合、５０μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｃ１６Ｈ１８Ｎ３Ｏ４ＳＮａ、Ｒｏｃｈｅ）を添加した。インキュベーションは３７℃であった。ファージライブラリーの構築のため、トレポネーマ属種株Ｖ１由来の染色体ＤＮＡを用いた。嫌気性ジャー中、振盪装置（９０ｒｐｍ）上で、ＦＡＢＧＳ（１リットルあたり２．０ｇ  Ｄ−グルコースおよび２５％ウシ胎児血清、Ｓ  ０１１５、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、ドイツを含む、偏好性嫌気性細菌ブロス、ＬＡＢ  ７１、ＬａｂＭ、英国ランカシャー州）を含むフラスコ中、３７℃でインキュベーションし、トレポネーマ属株を増殖させた。ブロス培養物を等張生理食塩水（ｐＨ６．３）で３回洗浄し、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）で１回洗浄した。慣用的なフェノール−クロロホルム抽出によってトレポネーマ属ＤＮＡを調製した。制限酵素および修飾酵素は、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＡＢ由来であり、そしてこれらを製造者の指示にしたがって用いた。ＱＩＡｐｒｅｐＴＭ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、プラスミドを調製した。
【００４６】
免疫およびポリクローナル抗体の精製
研究のこの部分は、ウプサラにおける動物実験に関する倫理委員会によって認可された（Ｃ  ３００／８）。ニュージーランドホワイト・ウサギを、トレポネーマ属種株Ｖ１の生菌培養物で皮下免疫した。２回洗浄し、そして０．５ｍｌ体積の等張生理食塩水中に分配したおよそ１０９細菌の用量を２０日おいて２回注射した。最初の免疫の３８日後の最終出血由来の血清を、この研究のための抗体（ＩｇＧ）の精製に用いた。０．４５μｍシリンジフィルターを通じて１０ｍｌの血清を滅菌ろ過し、そして５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐＴＭプロテインＧ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に適用した。Ａｂ緩衝液キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、製造者の指示にしたがって、ウサギＩｇＧを精製した。Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、精製抗体の溶出物を脱塩し、そしてマイナス２０℃、ＰＢＳ中で保存した。
【００４７】
トレポネーマ属種ファージディスプレイライブラリーの構築および結合性ファージの選択（パニング）
ｐＧ８ＳＡＥＴファージミドベクター中で、ファージライブラリーを構築した。大部分の断片が長さ０．４〜１．５ｋｂになるまで、トレポネーマ属種株Ｖ１染色体ＤＮＡを超音波処理によって断片化した。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４  ＤＮＡキナーゼ処理によって、断片を平滑端化し、そして次いで、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴＭ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ試験管（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＳｎａＢ１消化しそして脱リン酸化したファージミドベクターｐＧ８ＳＡＥＴ内に連結した。連結した物質を大腸菌ＴＧ１細胞に電気形質転換し（２．５ｋＶ、２５μＦ、３６０Ω）、ヘルパーファージを用いて感染させ、そしてファージ粒子を増殖させることによって、最終ライブラリーを生成した。この方法は、ユニークなクローンと見なされる、４ｘ１０７形質転換体を生じ、１４のランダムに選択されたクローンに対するコロニーＰＣＲによって決定すると、このうち８６％が挿入物を所持した。最終ライブラリーは、１ｍｌあたり、１ｘ１０１１コロニー形成単位の力価を有した。
【００４８】
ウサギ抗トレポネーマ属種株Ｖ１  ＩｇＧに対するパニングによって、免疫原性ポリペプチドをディスプレイするファージを単離した。３回のパニング実験を行った。マイクロウェル（ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、２００μｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５中、１０μｇの濃度のＺｙｍｅｄ組換えプロテインＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングした。その後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ−Ｔ）でウェルをブロッキングした。ウサギ抗トレポネーマ属種株Ｖ１  ＩｇＧを２００μｌ  ＰＢＳまたは１００μｌ  ＰＢＳ＋１００μｌ未精製大腸菌溶解物（ブロッキング用）中、８５または２１５μｇの濃度で添加した。洗浄後、２００μｌのファージライブラリーを添加した。ウェルを室温で３時間または２℃で一晩インキュベーションし、その後、これらを２５回洗浄した後、５０ｍＭクエン酸Ｎａ／１４０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ２．０を添加することによって、ファージを溶出させた。２Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で溶出物を直ちに中和し、そしてアンピシリンを含むＬＡプレート（ＬＡａｍｐ）上にプレーティングした大腸菌ＴＧ１を感染させるのに用いた。１つのパニング実験において、ウェルに添加したＴＧ１細胞を、結合したファージによって直接感染させることによってもまた、溶出を行った。一晩インキュベーションした後、コロニーを計数し、そして１００のコロニーをＬＡａｍｐプレートに移した。次いで、マウス抗Ｅ−タグ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ標識した二次ヒツジ抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＥ−タグ発現のスクリーニングのために、これらのコロニーをニトロセルロース・フィルターにトランスファーした。残ったコロニーをプレートから洗い流し、そしてヘルパーファージで重感染させて、濃縮ライブラリー／ファージストックを作製し、同じプロトコルにしたがって、これを二次濃縮サイクル（再パニング）において用いた。全部で２回の再パニングを行った。プラスミド調製およびプライマーＳＡｓｅｋｖ（５’−ＴＡＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＴＡＡ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＣＴ−３’、配列番号１７）を用いた挿入物の配列決定のため、２００を超えるＥ−タグ陽性コロニーを選択した。ウプサラ・ゲノム・センターで、３７３０ｘｌ  ＤＮＡ分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上、プラスミドＤＮＡを配列決定し、そしてＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（ＣＬＣ  ｂｉｏ）で分析した。挿入物の分析によって、３つの異なる遺伝子から、それぞれ、９、９、および８の重複する部分配列が明らかになった。
【００４９】
ゲノム配列決定および配列分析
トレポネーマ属種株Ｖ１の染色体ＤＮＡを配列決定し、そしてロングリードＧＳ  ＦＬＸチタン化学反応および４５４新規アセンブリー装置、Ｎｅｗｂｌｅｒ（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国コネチカット州ブランフォード）とともに、ゲノム配列決定装置ＦＬＸ系を用いて、ＫＴＨ王立工科大学のＫＴＨゲノムセンター、スウェーデン・ストックホルムでアセンブリーした。ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ３（ＣＬＣ  ｂｉｏ）を用いて読み取り配列のさらなる新規アセンブリーを行い、そしてさらなる配列編集のため、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ５（ＣＬＣ  ｂｉｏ）を用いた。
【００５０】
ゲノム配列を用いて、３つの免疫原性タンパク質の全長オープンリーディングフレームおよび対応するアミノ酸配列を予測した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、相同性検索を行った。シグナルペプチドの予測には、グラム陽性データを含むＳｉｇｎａｌＰ  ３．０サーバーを用いた。１つのタンパク質は、Ｓｅｔｕｂａｌら、２００６にしたがって、リポタンパク質と予測された。
【００５１】
タンパク質発現および精製のためのクローンの構築
グラム陰性細菌用のプロトコルにしたがって、ＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＰＣＲ用のゲノム・トレポネーマ属種株Ｖ１  ＤＮＡを調製した。ＭｇＳＯ４を含む１０Ｘ  Ｐｆｕ緩衝剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）５μｌ、各０．２ｍＭのデオキシヌクレオチド、表２に示すような０．２μＭの順方向および逆方向プライマー、１．２５Ｕ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および５０ｎｇゲノムＤＮＡの５０μｌ反応混合物を調製した。熱サイクリング条件は、９５℃１分間、３０周期の９５℃３０秒間、５０℃３０秒間および７２℃３分間、ならびに７２℃５分間の最終伸長であった。アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ産物を分析し、そしてｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。製造者の指示（Ｆａｓｔ  ｄｉｇｅｓｔ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）にしたがって、精製アンプリコンを、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩまたはＮｄｅＩおよびＳａｐＩのいずれかで消化し、そして先に記載するように精製した。消化アンプリコンを、ＲｅａｄｙＴｏＧｏ  Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、それぞれのベクター、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＧＥＸ−６Ｐ−１（バルクＧＳＴ精製モジュール、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＮｄｅＩおよびＳａｐＩで消化したｐＴＸＢ１（ＩＭＰＡＣＴＴＭキット、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）内に連結した。連結した材料を、コンピテント大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＧＳＴ）またはＥＲ２５６６（ＩＭＰＡＣＴ）内に電気形質転換し、そしてアンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＡ上にスプレッドした。ベクター配列決定プライマーを用いたＰＣＲによって、多くのコロニー中の挿入物の存在を分析した。ＤＮＡ配列決定によって、正しいサイズの挿入物を持つクローンをさらに分析した。
【００５２】
組換え免疫原性トレポネーマ属タンパク質の産生
組換え免疫原性トレポネーマ属タンパク質の産生のため、製造者の指示にしたがって、商業的に入手可能なタンパク質発現および精製系、例えばバルクＧＳＴ精製モジュール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＩＭＰＡＣＴＴＭキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用いた。アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地中、３７℃で、組換えクローンを増殖させた。光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）〜０．６の際、増殖培地にＩＰＴＧ（最終濃度０．３ｍＭ）を補充し、そして増殖温度を２０℃にシフトした。一晩インキュベーションした後、細胞を採取し、そして緩衝液［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０］中に再懸濁し、そして凍結融解によって溶解した。遠心分離後、上清を滅菌ろ過し、そしてキチンカラム上に適用した。同じ緩衝液を用いてカラムを徹底的に洗浄し、そして続いて切断緩衝液［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および３０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）］で処理した。抗原を含有する溶出試料を、リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ；  １３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）］に対して透析した。
【００５３】
ＧＳＴ−グルタチオン・アフィニティ系において、上記方法にしたがって、増殖、誘導および採取後、最終濃度０．１％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０を補充したＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に大腸菌細胞を懸濁したら、凍結融解によって細胞を溶解した。遠心分離後、上清を滅菌ろ過し、そしてグルタチオン−セファロース・ビーズでバッチ精製した。ＰＢＳＴを用いて徹底的に洗浄した後、グルタチオン溶出緩衝液で融合タンパク質を溶出させるか、またはｓｃｉｓｓｏｒプロテアーゼで処理して、生じたタンパク質を放出させた。最後に、分光光度測定を用いて、得られた抗原の量を決定し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色によって品質を分析した。最後にタンパク質を−２０℃で保存した。
【００５４】
酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡにおいて、全細胞溶解物に比較して、大腸菌で組換え的に産生された精製タンパク質を用いる利点は、大規模産生の可能性があり、そして試験が最適化されることである（タンパク質の異なる組み合わせを用いると、しばしば、特異性がより高くなるため、バックグラウンドがより低くなる）。趾皮膚炎（ＤＤ）に罹患したおよびしていないウシ由来の血清、ならびに免疫したウサギ（上記）由来の血清を用いて、最初のＥＬＩＳＡ試験を行った。マイクロプレート（ＰｏｌｙＳｏｒｐＴＭ、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、１００μｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５中、それぞれ２．５μｇおよび／または０．３１μｇの濃度で、組換えＴｍｐＡ相同体および／または組換えテール・テープ測定タンパク質断片で、２℃で一晩、コーティングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む４００μｌのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ−Ｔ）で、ウェルを２回洗浄した。その後、ＰＢＳ−Ｔで、室温で１時間、ウェルをブロッキングした。１００μｌの血清またはＰＢＳ−Ｔを各ウェルに添加した。各血清の４つの希釈、１：２５、１：５０、１：１００、および１：２００を用いた。マイクロプレートを３７℃で１時間インキュベーションし、そして次いで、４００μｌ  ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。それぞれ１：４０００および１：５００希釈した西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ・コンジュゲート化ブタ抗ウサギ（Ｄａｋｏ）およびウサギ抗ウシ（Ｄａｋｏ）抗体を適切なウェルに添加し、そしてプレートを３７℃で１時間インキュベーションした。４００μｌ  ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、１：２０で混合した２０ｍＭテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と０．１Ｍクエン酸カリウム／Ｈ２Ｏ２（２３０μｌ／ｌ）ｐＨ４．２５からなる１００μｌ溶液を添加した。プレートを室温で１０分間インキュベーションした。反応を停止するため、５０μｌの１０％硫酸を添加した。光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定し、そして読み取り値を試料緩衝液ブランクに対して補正した。
【００５５】
抗体を用いた免疫磁気分離
トレポネーマ属種は、増殖のために複雑な培地および嫌気性環境を必要とする偏好性生物である。さらに、ウシ鉤爪由来の試料は、培養を汚染させる大量の他の細菌を有する。培養およびＤＮＡ単離のためにトレポネーマ属種を濃縮しそして精製するオプションは、免疫磁気分離である（Ｄｅｍｉｒｋａｎら、１９９９、Ｄｅｍｉｒｋａｎら、２００１、Ｃｈｏｉら、１９９６）。例えば前記免疫原性タンパク質、その誘導体または活性断片に対して作製されたウサギ抗体とカップリングされた抗ウサギＩｇＧで共有的にコーティングされた免疫磁気ビーズを、Ｔ．ファゲデニスに緊密に関連するＤＤトレポネーマ属系統型の特異的分離に用いてもよい。
【００５６】
ワクチン
免疫系を刺激して抗体を産生させる細菌タンパク質はまた、ワクチン開発にも使用可能である。組換えタンパク質を免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）および／または全細胞溶解物と組み合わせて、動物における免疫反応を、そしてしたがって、疾患原因物質（単数または複数）に対する保護を増加させることも可能である。
【００５７】
行ったさらなる実験
酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
材料および方法：Ｔｐｌ株Ｖ１が単離された群れからの、急性ＤＤに罹患した８頭の乳牛、既知のＤＤの病歴がない別の群れからの２頭の乳牛、および６〜７ヶ月齢の５頭の子ウシ由来の血清を用いてアッセイを行った。趾皮膚炎診断は、視覚的検査によって行われた。マイクロプレート（ＰｏｌｙＳｏｒｐＴＭ、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、１００μｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ  ＴｍｐＡ、０．８μｇ／ｍｌ  Ｔｔｍまたは０．０２μｇ／ｍｌ  ＰｒｒＡの濃度の組換えタンパク質で、２℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ−Ｔでウェルを２回洗浄し、そしてＰＢＳ−Ｔで、室温で１時間、ブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔ中で１：１００希釈した１７１の１００μｌ血清を各ウェルに添加した。マイクロプレートを３７℃で１時間インキュベーションし、そして次いでＰＢＳ−Ｔで洗浄した。１：８０００希釈した西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化ウサギ抗ウシＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）または１：４０００希釈したモノクローナル２２：２６抗ウシＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｓｖａｎｏｖａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）をウェルに添加し、そして３７℃で１時間、プレートをインキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄し、その後、０．１Ｍクエン酸カリウムｐＨ４．２５中の１ｍＭテトラメチルベンジジンおよび０．００６％Ｈ２Ｏ２からなる１００μｌ溶液を添加した。プレートを室温で１０分間インキュベーションした。反応を停止するため、５０μｌの１０％硫酸を添加した。光学密度を４５０ｎｍで測定し、そして読み取り値から試料緩衝液ブランクの光学密度を減じて、補正光学密度（ＣＯＤ）を生じた。
【００５８】
結果：Ｔｐｌ株Ｖ１で同定された３つの免疫原性タンパク質を組換え的に産生した；予測されるリポタンパク質シグナルペプチドのシステイン残基に対してａａ＋１から停止コドン前の最後のａａまでの全長成熟タンパク質としてのＰｒｒＡ（ａａ：ｓ２２〜２５１）、予測されるリポタンパク質シグナルペプチドのシステイン残基に対してａａ＋７から停止コドン前の最後のａａまでのＴｍｐＡ（ａａ：ｓ２９〜３４４）、およびパニング実験由来の重複Ｔｔｍ配列のコンセンサス配列を構成するａａ：ｓであるａａ：ｓ６８９〜９７０を含む部分的ポリペプチドとしてのＴｔｍ。これらのタンパク質／ポリペプチドを、間接ＥＬＩＳＡにおける抗原として用い、ここでＤＤに罹患したおよびしていないウシ由来の血清試料を、抗原に対する抗体の存在に関して分析した。異なる濃度の抗原、血清、および二次抗体をパイロット実験において試験した（データ未提示）。ＤＤに罹患したおよびしていないウシの間の最適な区別を達成する条件を、最終実験で用いた。ＴｍｐＡ抗原に関して、ＤＤに罹患したウシ由来の３つの試料に関する光学密度は、臨床的に健康な２６９頭のウシ由来の試料に関する最高値よりも低く、一方、ＴｔｍおよびＰｒｒＡを用いた試験は、１つを除きすべての場合で識別力があった（図１ＡおよびＢ）。
【００５９】
【表２】
2013518563.tif 000003
【００６０】
表１．趾皮膚炎（ＤＤ）に罹患したおよびしていないウシ由来の血清の最初のＥＬＩＳＡ試験。４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定し、そして試料緩衝液ブランクに対して読み取り値を補正した。血清を１：１００に希釈し、ＴｍｐＡの濃度は２．５μｇ／ウェルであり、そして推定上のテール・テープ測定タンパク質断片の濃度は０．３１μｇ／ウェルであった。
【００６１】
【表３】
2013518563.tif 000004
【００６２】
表２：デオキシオリゴリボヌクレオチド
参考文献
【００６３】
【化１−１】
2013518563.tif 000005
【００６４】
【化１−２】
2013518563.tif 000006
【００６５】
【化１−３】
2013518563.tif 000007
【図１Ａ】
2013518563.tif 000008
【図１Ｂ】
2013518563.tif 000009
【配列表】
2013518563000001.xml
【国際調査報告】
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