(57)【要約】  ヒトＯｒａｉ１の細胞外ループ２（ＥＣＬ２）にアミノ酸配列である配列番号４に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントのような、ただしこれに限定されない、単離された抗原結合蛋白を開示する。又、抗原結合蛋白を含む医薬組成物及び医薬、それをコードする単離された核酸、それを作成する方法において有用なベクター及び宿主細胞、及び患者における障害又は疾患を治療する場合にそれを使用する方法も開示する。
2013511279.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗原結合蛋白であって、配列番号４に特異的に結合する、単離された抗原結合蛋白。
【請求項２】
単離された抗原結合蛋白がヒトカルシウム応答活性化カルシウム（ＣＲＡＣ）チャンネル活性を阻害する、請求項１の単離された抗原結合蛋白。
【請求項３】
単離された抗原結合蛋白がタプシガルギン処理されたヒト全血中のＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、又は両方の放出を阻害する、請求項１の単離された抗原結合蛋白。
【請求項４】
蛋白がＮＦＡＴ媒介発現を阻害する、請求項１の単離された抗原結合蛋白。
【請求項５】
単離された抗原結合蛋白が抗体又は抗体フラグメントを含む、請求項１の単離された抗原結合蛋白。
【請求項６】
請求項５の単離された抗原結合蛋白であって、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、ここで：
（ａ）重鎖可変領域は配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号２５０、配列番号２５１；配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、又は配列番号２５５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むか；又は、
（ｂ）軽鎖可変領域は配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、又は配列番号２６５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むか；又は、
（ｃ）（ａ）の重鎖可変領域及び（ｂ）の軽鎖可変領域；
である、単離された抗原結合蛋白。
【請求項７】
免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と標記される３つの相補性決定領域を含み、ここで：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号２６６又は配列番号２６７のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、又は配列番号２７２のアミノ酸配列を含み；そして、
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、又は配列番号２７７のアミノ酸配列を含む；
請求項５の単離された抗原結合蛋白。
【請求項８】
免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と標記される３つのＣＤＲを含み、ここで：
（ａ）ＣＤＲＬ１は配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、又は配列番号２８３のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＣＤＲＬ２は配列番号５６、配列番号５７、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、又は配列番号２８９のアミノ酸配列を含み；そして、
（ｃ）ＣＤＲＬ３は配列番号５８又は配列番号５９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、又は配列番号２９７のアミノ酸配列を含む；
請求項５の単離された抗原結合蛋白。
【請求項９】
免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と標記される３つの相補性決定領域を含み、そして軽鎖可変領域がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と標記される３つのＣＤＲを含み、ここで：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号２６６又は配列番号２６７のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、又は配列番号２７２のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、又は配列番号２７７のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＣＤＲＬ１は配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、又は配列番号２８３のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＣＤＲＬ２は配列番号５６、配列番号５７、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、又は配列番号２８９のアミノ酸配列を含み；そして、
（ｆ）ＣＤＲＬ３は配列番号５８又は配列番号５９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、又は配列番号２９７のアミノ酸配列を含む；
請求項５の単離された抗原結合蛋白。
【請求項１０】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４を含む、請求項１の単離された抗原結合蛋白。
【請求項１１】
モノクローナル抗体を含む、請求項５の単離された抗原結合蛋白。
【請求項１２】
キメラ又はヒト化抗体を含む、請求項１１の単離された抗原結合蛋白。
【請求項１３】
ヒト抗体を含む、請求項１１の単離された抗原結合蛋白。
【請求項１４】
請求項５の単離された抗原結合蛋白であって、
（ａ）配列番号２９、配列番号３３、配列番号３４、又は配列番号３５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
又は、
（ｂ）配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；又は、
（ｃ）（ａ）の免疫グロブリン重鎖及び（ｂ）の免疫グロブリン軽鎖；
を含む、単離された抗原結合蛋白。
【請求項１５】
ヒトＯｒａｉ１ポリペプチドに特異的に結合する単離された抗原結合蛋白であって、ここで：
（ａ）抗原結合蛋白は：
（ｉ）配列番号２１０；
（ｉｉ）配列番号２０４；
（ｉｉｉ）配列番号１９２；
（ｉｖ）配列番号１２９；又は、
（ｖ）配列番号１０３；
よりなるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合し、そして、
（ｂ）抗原結合蛋白は：
（ｖｉ）配列番号９１；
（ｖｉｉ）配列番号１９８；
（ｖｉｉｉ）配列番号１１３；
（ｉｘ）配列番号１２３；
（ｘ）配列番号１０７；又は、
（ｘｉ）配列番号１１７；
よりなるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合しない；
単離された抗原結合蛋白。
【請求項１６】
単離された抗原結合蛋白がヒトカルシウム応答活性化カルシウム（ＣＲＡＣ）チャンネル活性を阻害する、請求項１５の単離された抗原結合蛋白。
【請求項１７】
単離された抗原結合蛋白がタプシガルギン処理されたヒト全血中のＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、又は両方の放出を阻害する、請求項１５の単離された抗原結合蛋白。
【請求項１８】
蛋白がＮＦＡＴ媒介発現を阻害する、請求項１５の単離された抗原結合蛋白。
【請求項１９】
単離された抗原結合蛋白が抗体又は抗体フラグメントを含む、請求項１５の単離された抗原結合蛋白。
【請求項２０】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４を含む、請求項１５の単離された抗原結合蛋白。
【請求項２１】
モノクローナル抗体を含む、請求項１５の単離された抗原結合蛋白。
【請求項２２】
キメラ又はヒト化抗体を含む、請求項２１の単離された抗原結合蛋白。
【請求項２３】
ヒト抗体を含む、請求項２１の単離された抗原結合蛋白。
【請求項２４】
請求項１９の単離された抗原結合蛋白であって、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、ここで単離された抗原結合蛋白が：
ａ．重鎖可変領域が配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号２５０、配列番号２５１；配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、又は配列番号２５５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むか；又は、
ｂ．軽鎖可変領域配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、又は配列番号２６５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むか；又は、
ｃ．（ａ）の重鎖可変領域および（ｂ）の軽鎖可変領域；
を含む、単離された抗原結合蛋白。
【請求項２５】
免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と標記される３つの相補性決定領域を含み、ここで：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号２６６又は配列番号２６７のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、又は配列番号２７２のアミノ酸配列を含み；そして、
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、又は配列番号２７７のアミノ酸配列を含む；
請求項１９の単離された抗原結合蛋白。
【請求項２６】
免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と標記される３つのＣＤＲを含み、ここで：
（ａ）ＣＤＲＬ１は配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、又は配列番号２８３のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＣＤＲＬ２は配列番号５６、配列番号５７、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、又は配列番号２８９のアミノ酸配列を含み；そして、
（ｃ）ＣＤＲＬ３は配列番号５８又は配列番号５９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、又は配列番号２９７のアミノ酸配列を含む；
請求項１９の単離された抗原結合蛋白。
【請求項２７】
免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と標記される３つの相補性決定領域を含み、そして軽鎖可変領域がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と標記される３つのＣＤＲを含み、ここで：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号２６６又は配列番号２６７のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、又は配列番号２７２のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、又は配列番号２７７のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＣＤＲＬ１は配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、又は配列番号２８３のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＣＤＲＬ２は配列番号５６、配列番号５７、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、又は配列番号２８９のアミノ酸配列を含み；そして、
（ｆ）ＣＤＲＬ３は配列番号５８又は配列番号５９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、又は配列番号２９７のアミノ酸配列を含む；
請求項１９の単離された抗原結合蛋白。
【請求項２８】
請求項５又は請求項１９の単離された抗原結合蛋白であって、免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と標記される３つの相補性決定領域を含み、ここで：
（ａ）ＣＤＲＨｌは：
ａ１Ｙａ３ａ４ａ５／／配列番号２９８
のアミノ酸配列を有し、
ここで、
ａ１はグリシン、セリン又はアスパルテート残基であり；そして、
ａ３はチロシン又はトリプトファン残基であり；そして、
ａ４はトリプトファン、メチオニン、又はイソロイシン残基であり；そして、
ａ５はセリン、ヒスチジン、又はアスパラギン残基であり；そして、
（ｂ）ＣＤＲＨ２は：
ｂ１Ｉｂ３ｂ４ｂ５ｂ６ｂ７ｂ８ｂ９ｂ１０ｂ１１ｂ１２ｂ１３ｂ１４ｂ１５ｂ１６ｂ１７／／配列番号２９９
のアミノ酸配列を有し、
ここで、
ｂ１はトリプトファン、グルタメート、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｂ３はアスパラギン、アスパルテート、又はリジン残基であり；そして、
ｂ４はプロリン又はヒスチジン残基であり；そして、
ｂ５はアスパラギン、アスパルテート、又はセリン残基であり；そして、
ｂ６はアスパラギン、セリン、又はグリシン残基であり；そして、
ｂ７はグリシン、セリン、又はアルギニン残基であり；そして、
ｂ８はグリシン、スレオニン、イソロイシン、又はグルタメート残基であり；そして、
ｂ９はスレオニン、セリン、アスパラギン、又はリジン残基であり；そして、
ｂ１０はチロシン、セリン、アスパラギン、アスパルテート、ヒスチジン、又はリジン残基であり；そして、
ｂ１１はチロシン又はアスパラギン残基であり；そして、
ｂ１２はアラニン、バリン、又はプロリン残基であり；そして、
ｂ１３はグルタミン、アラニン、又はアスパルテート残基であり；そして、
ｂ１４はリジン、ロイシン、又はセリン残基であり；そして、
ｂ１５はフェニルアラニン、リジン、又はバリン残基であり；そして、
ｂ１６はグルタミン、セリン、又はリジン残基であり；そして、
ｂ１７はグリシン又はアスパルテート残基であるか非存在であり；そして、
（ｃ）ＣＤＲＨ３は：
ｃ１ｃ２ｃ３Ｇｃ５ｃ６ｃ７ｃ８ｃ９ｃ１０ｃ１１ｃ１２ｃ１３／／配列番号３００
のアミノ酸配列を有し、
ここで、
ｃ１はアラニン又はアルギニン残基であるか非存在であり；そして、
ｃ２はグルタメート、グリシン、又はチロシン残基であり；そして、
ｃ３はグルタメート、セリン、アルギニン、又はチロシン残基であり；そして、
ｃ５はグリシン又はアスパルテート残基であり；そして、
ｃ６はチロシン、トリプトファン、イソロイシン、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｃ７はグルタメート、セリン、又はグリシン残基であるか非存在であり；そして、
ｃ８はメチオニン残基であるか非存在であり；そして、
ｃ９はスレオニン又はアスパルテート残基であり；そして、
ｃ１０はフェニルアラニン、トリプトファン、又はバリン残基であり；そして、
ｃ１１はフェニルアラニン残基であるか非存在であり；そして、
ｃ１２はアスパルテート残基であるか非存在であり；そして、
ｃ１３はプロリン又はチロシン残基であるか非存在である；
単離された抗原結合蛋白。
【請求項２９】
免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と標記される３つのＣＤＲを含み、ここで：
（ａ）ＣＤＲＬ１は
ｄ１Ｇｄ３ｄ４ｄ５ｄ６ｄ７ｄ８ｄ９ｄ１０ｄ１１ｄ１２ｄ１３ｄ１４／／配列番号３０１、
のアミノ酸配列を含み、
ここで、
ｄ１はスレオニン又はセリン残基であり；そして、
ｄ３はセリン、スレオニン、又はアスパルテート残基であり；そして、
ｄ４はアスパラギン、アルギニン、アラニン、又はセリン残基であり；そして、
ｄ５はロイシン又はセリン残基であり；そして、
ｄ６はアスパラギン、アスパルテート、又はプロリン残基であり；そして、
ｄ７はイソロイシン、バリン、又はリジン残基であり；そして、
ｄ８はグリシン又はリジン残基であり；そして、
ｄ９はアラニン、スレオニン、グリシン、又はチロシン残基であり；そして、
ｄ１０はアラニン、グリシン、又はチロシン残基であり；そして、
ｄ１１はチロシン、フェニルアラニン、システイン、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｄ１２はアスパラギン、アスパルテート、又はチロシン残基であるか非存在であり；そして、
ｄ１３はバリン残基であるか非存在であり；そして、
ｄ１４はヒスチジン又はセリン残基であるか非存在であり；そして、
（ｂ）ＣＤＲＬ２は
ｅ１ｅ２ｅ３ｅ４ＲＰＳ／／配列番号３０２、
のアミノ酸配列を有し含み、
ここで、
ｅ１はバリン、セリン、アスパルテート、グルタメート、又はグリシン残基であり；そして、
ｅ２はヒスチジン、アスパルテート、アスパラギン、バリン、又はチロシン残基であり；そして、
ｅ３はヒスチジン、フェニルアラニン、アルギニン、セリン、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｅ４はイソロイシン、アスパラギン、又はリジン残基であり；そして、
（ｃ）ＣＤＲＬ３は
ｆ１Ｓｆ３ｆ４ｆ５ｆ６ｆ７ｆ８ｆ９ｆ１０ｆ１１ｆ１２／／配列番号３０３、
のアミノ酸配列を含み、
ここで、
ｆ１はグルタミン、セリン、チロシン、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｆ３はチロシン又はスレオニン残基であり；そして、
ｆ４はセリン、アスパルテート、グリシン、又はアラニン残基であり；そして、
ｆ５はセリン、グリシン、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｆ６はセリン、グリシン、又はアルギニン残基であり；そして、
ｆ７はロイシン、グリシン、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｆ８はセリン又はアスパラギン残基であるか非存在であり；そして、
ｆ９はヒスチジン又はアスパルテート残基であるか非存在であり；そして、
ｆ１０はセリン、グリシン、又はフェニルアラニン残基であるか非存在であり；そして、
ｆ１１はバリン、セリン、トリプトファン、アスパルテート、又はスレオニン残基であり；そして、
ｆ１２はロイシン又はバリン残基である；
請求項５又は請求項１９の単離された抗原結合蛋白。
【請求項３０】
請求項２９の単離された抗原結合蛋白であって、ここで
ｄ１はスレオニン残基であり；そして、
ｄ３はセリン又はスレオニン残基であり；そして、
ｄ４はアスパラギン、アルギニン、又はセリン残基であり；そして、
ｄ５はセリン残基であり；そして、
ｄ６はアスパラギン又はアスパルテート残基であり；そして、
ｄ７はイソロイシン又はバリン残基であり；そして、
ｄ８はグリシン残基であり；そして、
ｄ９はアラニン、スレオニン、又はグリシン残基であり；そして、
ｄ１０はグリシン又はチロシン残基であり；そして、
ｄ１１はチロシン、フェニルアラニン、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｄ１２はアスパラギン、アスパルテート、又はチロシン残基であり；そして、
ｄ１３はバリン残基であり；そして、
ｄ１４はヒスチジン又はセリン残基である；
単離された抗原結合蛋白。
【請求項３１】
請求項１９の単離された抗原結合蛋白であって：
（ａ）配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、又は配列番号３４８のアミノ酸配列を含むか、又は、Ｎ末端又はＣ末端又は両方から１、２、３、４又は５個のアミノ酸残基が欠失している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖；又は、
（ｂ）配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、又は配列番号３４２のアミノ酸配列を含むか、又は、Ｎ末端又はＣ末端又は両方から１、２、３、４又は５個のアミノ酸残基が欠失している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖；又は、
（ｃ）（ａ）の免疫グロブリン重鎖及び（ｂ）の免疫グロブリン軽鎖；
を含む、単離された抗原結合蛋白。
【請求項３２】
請求項１又は請求項１５の抗原結合蛋白；及び製薬上許容しうる希釈剤、賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１の抗原結合蛋白をコードする単離された核酸。
【請求項３４】
請求項５の抗原結合蛋白をコードする単離された核酸。
【請求項３５】
請求項１５の抗原結合蛋白をコードする単離された核酸。
【請求項３６】
請求項１９の抗原結合蛋白をコードする単離された核酸。
【請求項３７】
請求項３３、３４、３５又は３６の何れかの単離された核酸であって、単離された核酸が、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号２５０、配列番号２５１；配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、又は配列番号２５５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む抗原結合蛋白をコードする、単離された核酸。
【請求項３８】
単離された核酸が、免疫グロブリン重鎖可変領域及びＮ末端シグナル配列をコードし、核酸が配列番号２３、配列番号２５、又は配列番号２７を有する、請求項３３、３４、３５又は３６の何れかの単離された核酸。
【請求項３９】
単離された核酸が、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、又は配列番号２６５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗原結合蛋白をコードする、請求項３３、３４、３５又は３６の何れかの単離された核酸。
【請求項４０】
単離された核酸が、免疫グロブリン軽鎖可変領域及びＮ末端シグナル配列をコードし、核酸が配列番号１５、配列番号１７、又は配列番号１９を有する、請求項３３、３４、３５又は３６の何れかの単離された核酸。
【請求項４１】
単離された核酸がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と標記される３つの相補性決定領域に対するコーディング配列を含み、そしてここで：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号２６６又は配列番号２６７のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、又は配列番号２７２のアミノ酸配列を含み；そして、
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、又は配列番号２７７のアミノ酸配列を含み；
免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする、請求項３３、３４、３５又は３６の何れかの単離された核酸。
【請求項４２】
単離された核酸がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と標記される３つの相補性決定領域に対するコーディング配列を含み、そしてここで：
（ａ）ＣＤＲＬ１は配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、又は配列番号２８３のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＣＤＲＬ２は配列番号５６、配列番号５７、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、又は配列番号２８９のアミノ酸配列を含み；そして、
（ｃ）ＣＤＲＬ３は配列番号５８又は配列番号５９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、又は配列番号２９７のアミノ酸配列を含み；
免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする、請求項３３、３４、３５又は３６の何れかの単離された核酸。
【請求項４３】
単離された核酸が配列番号２９、配列番号３３、配列番号３４、又は配列番号３５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖を含む抗原結合蛋白をコードする、請求項３３、３４、３５又は３６の何れかの単離された核酸。
【請求項４４】
単離された核酸が配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む抗原結合蛋白をコードする、請求項３３、３４、３５又は３６の何れかの単離された核酸。
【請求項４５】
請求項３３、３４、３５又は３６の何れかの単離された核酸を含むベクター。
【請求項４６】
発現ベクターを含む請求項４５のベクター。
【請求項４７】
請求項４６の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項４８】
方法であって、
（ａ）発現ベクターによりコードされた抗原結合蛋白の発現を可能にする条件下に培地中で請求項４７の宿主細胞を培養すること；及び、
（ｂ）培地から抗原結合蛋白を回収すること；
を含む方法。
【請求項４９】
ハイブリドーマであって、ハイブリドーマが請求項１１又は請求項２１の抗原結合蛋白を生産する、ハイブリドーマ。
【請求項５０】
方法であって、
（ａ）ハイブリドーマによる抗原結合蛋白の発現を可能にする条件下に培地中で請求項４９のハイブリドーマを培養すること；及び、
（ｂ）培地から抗原結合蛋白を回収すること；
を含む方法。
【請求項５１】
患者における免疫疾患を治療する方法であって、有効量の請求項１、５、１５又は１９の抗原結合蛋白を投与することを含み、免疫疾患がＴ細胞媒介自己免疫、移植物拒絶、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）、関節リューマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、アレルギー性鼻炎、好酸球性疾患、自己免疫中枢神経系（ＣＮＳ）炎症、及び炎症誘発性肝傷害から選択される、方法。
【請求項５２】
患者における静脈又は動脈の血栓形成に関連する疾患を治療する方法であって、有効量の請求項１、５、１５又は１９の抗原結合蛋白を投与することを含み、疾患が動脈血栓、心筋梗塞、卒中、虚血再灌流傷害、虚血性脳梗塞、炎症、補体活性化、フィブリン溶解、ＦＸＩＩ誘発キニン形成に関連する血管形成、遺伝性血管浮腫、肺の細菌感染、トリパノソーマ感染、低血圧性ショック、膵炎、シャーガス病、血小板減少症及び関節性痛風から選択される、方法。
【請求項５３】
請求項１、５、１５又は１９の抗原結合蛋白の有効量を投与することを含む、患者における乳癌を治療する方法。
【請求項５４】
請求項１又は請求項１５の単離された抗原結合蛋白であって、抗原結合蛋白が、動的排除分析（kinetic  exclusion  assay）により測定した場合に２００ｐＭ以下のＫｄで哺乳類細胞により発現された配列番号２に特異的に結合する、単離された抗原結合蛋白。
【請求項５５】
抗原結合蛋白が、動的排除分析により測定した場合に１０５ｐＭ以下のＫｄで哺乳類細胞により発現された配列番号２に特異的に結合する、請求項１又は請求項１５の単離された抗原結合蛋白。
【請求項５６】
抗原結合蛋白が、動的排除分析により測定した場合に５０ｐＭ以下のＫｄで哺乳類細胞により発現された配列番号２に特異的に結合する、請求項１又は請求項１５の単離された抗原結合蛋白。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願はコンピューター読み取り可能な形式（ＣＲＦ）及び紙コピーの両方として使用でき、そして参照により全体が本明細書に組み込まれるＡＳＣＩＩ”ｔｘｔ”コンプライアントの配列表を含んでいる。２０１０年１１月１８日に作成した”ｔｘｔ”ファイルの名称はＡ−１４６６−国際特許出願ＷＯ−ＰＣＴ−１１１８１０ｒｅｖ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは５１４ｋｂである。
【０００２】
本出願全体を通して、種々の公開文書を括弧内で参照している。これらの公開文書の開示内容は、本発明が関連する技術水準をより十分説明するために本出願において参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
１．発明の分野
【０００４】
本発明は障害及び疾患を治療するための抗Ｏｒａｉ１抗原結合蛋白、より特記すれば抗Ｏｒａｉ１抗体及び抗体フラグメントに関する。
【０００５】
２．関連技術の考察
【０００６】
原形質膜は細胞内と細胞外のコンパートメントを分離させる障壁を与え、これにより一方のコンパートメントから他方へのイオンの移動を防止する。イオンチャンネルは小型の無機イオンが膜を通過できるようにするトンネルを形成する膜包埋蛋白の多様な群である。それらは電位依存性及びリガンド依存性のイオンチャンネルという２つの主要な群に典型的に分類されるナトリウム、カリウム及びカルシウムカチオンチャンネル及びクロリドアニオンチャンネルを包含する。チャンネルの後者の群は細胞外及び細胞内のリガンド依存性チャンネルよりなる。
【０００７】
細胞内カルシウムの濃度を調節しているカルシウムチャンネルは収縮及び分泌のような短期応答から細胞の成育及び増殖のより長期の調節までに渡る多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしている。細胞内カルシウムの調節は、細胞内への、そして細胞内部における、シグナルの伝達の重要な特徴である。細胞内カルシウムは遺伝子発現、細胞分化、サイトカイン分泌及びカルシウムホメオスタシスの調節において重要な二次メッセンジャーとなっている（Parekh  and  Putney,  Store-operated  calciumchannels,  Physiology  Review,  85:757-810(2005)）。事実上は全ての細胞型が、細胞機能の調節のため、又は成長因子、神経伝達物質、ホルモン及び種々の他のシグナル分子への特定の応答をトリガーするために何らかの態様において細胞質  Ca2+の発生に依存している。
【０００８】
通常は、これらのＣａ２＋−媒介シグナルには小胞体（ＥＲ）のような細胞内ストアからのＣａ２＋の放出及び原形質膜を通るＣａ２＋の流入の何らかの組み合わせが関与している。細胞内カルシウムの大部分は核周囲から細胞終端までの細胞質全体に渡って分布している小胞体（ＥＲ）ストア内にある。
【０００９】
１つの例において、細胞の活性化はＧ蛋白機序を介したホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の活性化と対になった表面膜受容体へのアゴニスト結合と共に開始される。活性化ＰＬＣが次に化学メッセンジャーホスファチジルイノシトール−４、５−ビホスフェートをイノシトール−１、４、５−トリホスフェート（ＩＰ３）及びジアグリセロールに加水分解する。次に第２のメッセンジャーＩＰ３がＥＲ膜上に存在するＩＰ３受容体に結合し、これによりカルシウムのジカチオンをＥＲストアから放出させる（Hogan等、Transcriptional  regulation  by  calcium,  calcineurin  and  NFAT.  Gene  Dev.17:2205-2232(2003)）。次にＥＲCa2+の低下が原形質膜ストア−作動カルシウム（ＳＯＣ）チャンネルにシグナルされる。
【００１０】
ストア−作動カルシウム流入、又は進入は細胞内Ｃａ２+ストアの最充填（Putney,  A  model  for  receptor-regulated  calcium  entry,  Cell  Calcium,  7:1-12(1986);Putney等、Cell,  75,  199-201(1993)）、酵素活性の活性化(Fagan等、J.  Biol.  Chern.  275:26530-26537(2000)）、遺伝子転写(Lewis,  Annu.  Rev.  Immunol.  19:497-521(2001)）、細胞増殖（Nunez等、J.  Physiol.  571.1,  57-73(2006)）、及びサイトカイン放出(Winslow等、Curr.  Opin.  Immunol.  15:299-307(2003))のような、ただしこれに限定されない、このような多様な機能を制御する細胞内生理のプロセスである。一部の「非興奮性細胞」、例えば血球、造血細胞において、そして単球及びマクロファージ、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＴリンパ球を包含する免疫系の大部分の細胞上においては、SOC  流入は、一種のＳＯＣチャンネルであるカルシウム放出−活性化カルシウム（ＣＲＡＣ）チャンネルを介して起こる。ＣＲＡＣ電流（「ＩＣＲＡＣ」又は「ＩＣＲＡＣ」）は数十秒遅延する活性化動態及び数分に渡って崩壊する内向き整流特性を呈する。更に又、チャンネルはカルシウムに対する高い特異性を有する(Hoth  and  Penner,  Calcium  release-activated  calcium  current  in  rat  mast  cells,  J.  Physiol.,  465:359-386(1993);Hoth  and  Penner,  Depletion  of  intracellular  calcium  stores  activates  a  calcium  current  in  mast  cells,  Nature  355:353-355(1992)）。
【００１１】
Ｔリンパ球におけるCRAC-媒介カルシウム調節は（ｉ）短期、及び（ｉｉ）長期の作用によってカテゴリー化できる。短期の作用は細胞の運動性及び免疫学的シナプス、即ちＣＤ４陽性Ｔリンパ球に対する抗原を抗原提示細胞が提示する界面の形成である。カルシウムレベルの細胞内上昇の阻害は免疫学的シナプスの安定な形成を効果的に中和することがわかっている。長期の作用はリンパ球エフェクター機能、無応答性の状態、ナイーブのＴ細胞からＴヘルパー１又は２のＴ細胞への分化、及び未成熟のＴ細胞の発生に影響するサイトカイン発現の転写調節に関連している（Feske,  Calcium  signaling  in  lymphocyte  activation  and  disease,  Nature  Rev.  Immunol.  7:690-702(2007)）。Ｔ（及びＢ細胞）における損なわれたカルシウムシグナリングは多くの遺伝性免疫不全疾患に関連付けられており、そして免疫応答におけるカルシウム調節の役割の我々の理解に多大に寄与している。自己反応性Ｔ細胞は関節リューマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発性硬化症、及び１型糖尿病を包含する幾つかの自己免疫疾患の発症において重要な役割を果たし；そして自己反応性Ｂ細胞は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に関与している。
【００１２】
ＣＲＡＣを介したＳＯＣ進入（ＳＯＣＥ）経路の活性化には小胞体（ＥＲ）に局在する間質相互作用分子１（ＳＴＩＭ１）及び原形質膜に局在するカルシウムチャンネルサブユニット（Ｏｒａｉ１、カルシウム放出−活性化カルシウムモジュレーター１（ＣＲＡＣＭ１）又は膜貫通蛋白１４２Ａ（ＴＭＥＭ１４２Ａ）としても知られている）が関与している。高スループットのＲＮＡ干渉スクリーニング技術の進歩により蛋白の発現をそれをコードするメッセンジャーＲＮＡを排除することによりノックダウンすることができるようになったため、ＳＴＩＭ１はショウジョウバエＳ２昆虫細胞中のＣＲＡＣチャンネル活性化において役割を果たすことがわかった（Roos等、STIM1  an  essential  and  conserved  component  of  store-operated  Ca  channel  function,  J.  Cell  Biol.169:435-445(2005)）。類似の研究を通じて、ＨｅＬａ細胞におけるＳＴＩＭ１又はＳＴＩＭ２の発現を阻害するとＣＲＡＣ活性が抑制されることがわかった（Liou等、STIM1  is  a  Ca2+  sensor  essential  for  Ca2+store  depletion  triggered  Ca2+  influx,Current  Biol.  15:1235-1241(2005)）。STIM1はＣ末端を細胞質中に、そしてＮ末端をＥＲ管腔内に置きながらＥＲ内に主に存在する１回膜貫通蛋白をコードする。Ｎ末端領域はグルタメート及びアスパルテートアミノ酸を含有するヘリックス−ループ−ヘリックス（ＥＦ−ハンド）に特異的であり、そしてステライルアルファモチーフ（ＳＡＭ）ドメインはカルシウム結合を担っている(Stathopulos等、stored  Ca  depletion-induced  oligomerization  ofSTIM  via  EF-SAM  region:  An  initiation  mechanism  for  capacitative  Ca  entry,  J.  Biol.  Chern.  281:35855-35862(2006)）。カルシウムＥＲストアが豊富であれば、カルシウム結合ＳＴＩＭ１がＥＲ全体に分布するが、カルシウムストアが枯渇すると未結合のＳＴＩＭ１はオリゴマーを形成し、これは原形質膜に近接して所在するＥＲのサブ領域に分布し、個別のパンクタ構造を形成する(Zhang等、STIM1  is  a  Ca  sensor  that  activates  CRAC  channels  and  migrates  from  the  Ca  store  to  the  plasma  membrane,  Nature  437:902-905(2005)）。ＳＴＩＭ１のカルボキシ末端領域は、この領域のドメインに相当するペプチドフラグメントの発現がカルシウムストア枯渇の非存在下にもＣＲＡＣチャンネルに結合してオープンさせることがわかっているため、ＣＲＡＣチャンネルの活性化を担っている。(Yuan等、SOAR  and  the  polybasic  STIM1  domain  gate  and  regulate  Orai  channels,  Nature  Cell  Biology  11:337-343(2009);Park等、STIM1  clusters  and  activates  CRAC  channels  via  direct  binding  of  a  cytosolic  domain  to  Orai1,  Cell  136:876-890(2009)）。カルシウム誘導ファクター（ＣＩＦ）のような他の拡散性ファクターがＳＴＩＭ１に関与してＣＲＡＣチャンネルを活性化させることも可能である(Csutora等、Novel  role  for  STIM1  as  a  trigger  for  calcium  influx  factor  production,  J.  Biol.  Chern.  283:14524-31(2008)）。
【００１３】
Calloway等は、Ｃａ２＋ストアの枯渇及び静電気的相互作用に動的に依存している原形質膜におけるＯｒａｉ１／ＣＲＡＣＭ１とのＥＲ中のＳＴＩＭ１の分子クラスタリングを記載している((Calloway等、Molecular  clustering  of  STIM1  with  Ｏｒａｉ１/CRACM1  at  the  plasma  membrane  depends  dynamically  on  depletion  of  Ca2+  store  and  on  electrostatic  interactions,  Mol  Biol  Cell.  20(1  ):389-99.(2009  Jan;Epub  2008  Nov  5)）。
【００１４】
ヒト患者における遺伝性の重度の複合免疫不全（ＳＣＩＤ）はＯｒａｉ１におけるミスセンス突然変異に起因するＣＲＡＣチャンネル機能の停止に関連付けられている(Feske等、A  severe  defect  in  CRAC  Ca2+  channel  activation  and  altered  of  K+  channel  gating  in  T  cells  from  immunodeficient  patients,  J.  Exptl.  Med.  202(5):651-62(2005);Feske等、A  mutation  in  Ｏｒａｉ１  causes  immune  deficiency  by  abrogating  CRAC  channel  function,  Nature  441:  179-85(2006)）。２つの他のグループがＣＲＡＣ活性において役割を果たす遺伝子に関してショウジョウバエＳ２細胞との高スループットＲＮＡ干渉を用いて同じ遺伝子を識別している(Vig等、CRACM1  is  a  plasma  membrane  protein  essential  for  store-operated  Ca  entry,  Science  312:1220-1223(2006);Zhang等、Genome-wide  RNAi  screen  of  Ca  influx  identifies  genes  that  regulate  Ca  release-activated  Ca  channel  activity,  PNAS  103:9357-9362(2006)）。ショウジョウバエには僅か１つのＯｒａｉ１遺伝子のみ存在するが、Ｏｒａｉ２及びＯｒａｉ３と称される哺乳類における２つの別の相同体が存在する。Ｏｒａｉ１遺伝子は細胞質中に所在するアミノ末端及びカルボキシ末端及び２つの短小な細胞外ループを有する４回膜貫通蛋白をコードする。電気生理学を用いた突然変異誘発試験によれば、カルシウムに対するチャンネルの選択性に対して特定の突然変異体がネガティブな影響を与えたことを明らかにすることにより、Ｏｒａｉ１が真のＣＲＡＣチャンネルであると結論付けられた(Yeromin等、Molecular  identification  of  the  CRAC  channel  b  altered  ion  selectivity  in  a  mutant  of  Ｏｒａｉ１,  Nature  433:226-229(2006);Prakirya等、Ｏｒａｉ１  is  an  essential  pore  subunit  of  the  CRAC  channel,  Nature  443:230-233(2006);Vig等、CRACM1  multimers  form  the  ion-selective  pore  of  the  CRAC  channel,  Curr.  Biol.  16:2073-2079(2006)）。ＣＲＡＣチャンネルは一般的にＯｒａｉ１蛋白のホモ４量体を含むと考えられているが、一部の場合においてはＯｒａｉ２及び／又はＯｒａｉ３蛋白と共にＯｒａｉ１を含有するヘテロ４量体が形成される可能性もなお存在する。
【００１５】
Rao等はヒトＯｒａｉ１配列をクローニングしている(Rao等、Regulators  of
NFAT、国際特許出願国際特許出願ＷＯ２００７／０８１８０４Ａ２）。ＣＲＡＣチャンネルの高いＣａ２＋選択性のために必須であると報告されているＯｒａｉ１の膜貫通ドメインＩ及びＩＩＩ中及びＩ−ＩＩループにおける保存された酸性アミノ酸のセット（Ｅ１０６、Ｅ１９０、Ｄ１１０、Ｄ１１２、Ｄ１１４）が識別されており；Yamashita等はこれらの酸性残基の改変がＣａ２＋選択性を低下さセルことが可能であり、そして上昇したＣｓ＋透過性をもたらしたことを観察している(Yamashita等、Ｏｒａｉ１mutations  alter  ion  permeation  and  Ca2+-dependent  fast  inactivation  of  CRAC  channels:  evidence  for  coupling  of  permeation  and  gating,  J  Gen  Physiol  130(5):  525.(2007)）。Ｏｒａｉ１蛋白の別の構造機能分析によれば、ＣＲＡＣチャンネルの内因性ゲーティングの存在が明らかにされており；選択性フィルターに近いＯｒａｉ１（Ｖ１０２Ｉ）の突然変異は膜脱分極に対するＣＲＡＣチャンネル感受性を修正し、そして負電位におけるＣＲＡＣチャンネルの緩徐菜ゲーティングをもたらした(Spassova等、Voltage  gating  at  the  selectivity  filter  of  the  Ca2+  release-activated  Ca2+  channel  induced  by  mutation  of  the  Orai1  protein,  J.  Biol.  Chern.  283(22):  14938-45(2008)）。
【００１６】
ＣＲＡＣチャンネルを介した持続性カルシウム流入をもたらすカスケード性のシグナリング事象は幾つかの転写因子の活性化をもたらし、そして最も特徴的なものは活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）である。カルモジュリンは細胞質におけるカルシウムのレベルを感受し、そして、カルシウムシグナルを伝達し、細胞応答を調整することができる多くのカルシウム尿結合蛋白の１つである。カルモジュリンはカルシウムに結合するとカルシニューリン、即ちセリン及びスレオニンホスファターゼを活性化し、そしてこれが次にＮＦＡＴを脱ホスホリル化する。ホスホリル化されたＮＦＡＴは核エキスポート配列を露出させ、そしてエキスポーチン蛋白に結合し、そして細胞質局在化をもたらす。脱ホスホリル化されたＮＦＡＴは核局在化配列を露出させ、インポーチンへの
結合及び核のトランスロケーションをもたらす(Okamura等、Concerted
dephosphorylation  of  the  transcription  factor  NFAT  induces  a  conformational  switch  that  regulates  transcriptional  activity,  Mol.  Cell  6:539-550(2000)）。核においては、ＮＦＡＴはＴ細胞活性化にとって重要なインターロイキン−２（ＩＬ２）及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）のようなサイトカインをコードする種々の遺伝子の転写を活性化する(Feske等、Ca/calcineurin  signaling  in  cells  of  the  immune  system,  Biochem.  Biophys.  Res.Comm.  311:11I7-I132(2003)）。シクロスポリンＡ（Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）Ｓ及びｌｍｍｕｎｅ）及びＦＫ５０６（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ；ＰＲＯＧＲＡＦ（登録商標））はカルシニューリンを阻害するように設計された小型分子であり、そして固形臓器移植片に生じる拒絶を包含する重度の免疫障害の治療のために使用されている。Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）は重度の関節リューマチ及び乾癬を治療するために認可されている。前臨床データからカルシニューリン阻害剤に対して示唆されている他の炎症性疾患は炎症性腸疾患及び多発性硬化症を包含する。狼瘡はカルシニューリン経路に介入することから利益を被る別の適応症である場合がある。カルシニューリンはＴ細胞におけるＮＦＡＴ活性化の調節において重要な役割を果たしているが、これは腎臓を含む身体の全組織において発現される。この発現プロファイルは、高血圧及び腎毒性のようなオンターゲット系毒性のために、シクロスポリン及びＦＫ５０６に狭小な安全性マージンを与えている。シクロスポリン及びＦＫ５０６はカルシニューリン経路をブロックする場合には有効であるにも関わらず、これらの薬品はそれらの毒性のために、主に重度の免疫疾患を治療するために確保されている。
【００１７】
結果として、ＣＲＡＣ、そして特にＯｒａｉ１をターゲティングするヒトの障害及び疾患、例えば免疫障害又は静脈又は動脈の血栓形成に関連する障害を治療するためには、他の治療薬が探求されている(例えばNormant等、Methods  and  Compositions  for  Screening  ICRAC  Modulators、ＵＳ６、６９６、２６７；Cahalan等、CRAC  channel  and  modulator  screening  methods、ＵＳ２００８／０３９３９２Ａ1;Stauderman等、Calcium  Channel  Proteins  and  Uses  thereof,国際特許出願ＷＯ２００８／１４８１０８Ａ１及びＵＳ２００８／０２９３０９２Ａ１；Velcelebi等、Compounds  that  Modulate  Intracellular  Calcium、国際特許出願ＷＯ２００９／０３５８1８Ａ１；Roos等、Methods  of  Modulating  and  Identifying  Agents  that  Modulate  Intracellular  Calcium、国際特許出願ＷＯ２００４／０７８９９５Ａ２；Fleig等、CRAC  Modulators  and  Use  of  Same  for  Drug  Discovery、国際特許出願ＷＯ２００７／１２１１８６Ａ２；Xie等、Compounds  for  Inflammation  and  Immune-related  Uses、ＵＳ２００５／０１０７４３６Ａ１；Xie等、Method  for  Modulating  Calcium-Ion-Release-Activated  Calcium  Ion  Channels、ＵＳ２００５／０１４８６３３Ａ１；Vo等、Fused  Ring  Compounds  for  Inflammation  and  Immune-related  Uses、国際特許出願ＷＯ２００８／０３９５２０Ａ２及びＵＳ２００８／０１３２５１３Ａ１；Bohnert等、Cyclohexenyl-Aryl  Compounds  for  Inflammation  and  Immune-related  Uses、国際特許出願ＷＯ２００８／０６３５０４Ａ２及びＵＳ２００８／０２０７６４１Ａ１；Chen、Pyridine  Compounds  for  Inflammation  and  Immune-related  Uses、国際特許出願ＷＯ２００９／０１７８１９Ａ１；  Chen、Heterocycle-Aryl  Compounds  for  Inflammation  and  Immune-related  Uses、国際特許出願ＷＯ２００９／０１７８１８Ａ１；  Braun等、The  calcium  sensor  STIM1  and  the  platelet  SOC  channel  Ｏｒａｉ１(CRACM1)  are  essential  for  pathological  thrombus  formation、国際特許出願ＷＯ２００９／１１５６０９Ａ１；  Braun等、The  calcium  sensor  STIM1  is  essential  for  pathological  thrombus  formation、EP２１０３３１１Ａ１)。
【００１８】
本発明はＯｒａｉ１に指向された強力で選択的なブロッキング抗体を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】Rao等、Regulators  of  NFAT,  国際特許出願国際特許出願ＷＯ２００７／０８１８０４Ａ２
【特許文献２】Normant等、Methods  and  Compositions  for  Screening  ICRAC  Modulators、ＵＳ６、６９６、２６７
【特許文献３】Cahalan等、CRAC  channel  and  modulator  screening  methods、ＵＳ２００８／０３９３９２Ａ1
【特許文献４】Stauderman等、Calcium  Channel  Proteins  and  Uses  thereof,国際特許出願ＷＯ２００８／１４８１０８Ａ１及びＵＳ２００８／０２９３０９２Ａ１
【特許文献５】Velcelebi等、Compounds  that  Modulate  Intracellular  Calcium、国際特許出願ＷＯ２００９／０３５８１８Ａ１
【特許文献６】Roos等、Methods  of  Modulating  and  Identifying  Agents  that  Modulate  Intracellular  Calcium、国際特許出願ＷＯ２００４／０７８９９５Ａ２
【特許文献７】Fleig等、CRAC  Modulators  and  Use  of  Same  for  Drug  Discovery、国際特許出願ＷＯ２００７／１２１１８６Ａ２
【特許文献８】Xie等、Compounds  for  Inflammation  and  Immune-related  Uses、ＵＳ２００５／０１０７４３６Ａ１
【特許文献９】Xie等、Method  for  Modulating  Calcium-Ion-Release-Activated  Calcium  Ion  Channels、ＵＳ２００５／０１４８６３３Ａ１
【特許文献１０】Vo等、Fused  Ring  Compounds  for  Inflammation  and  Immune-related  Uses、国際特許出願ＷＯ２００８／０３９５２０Ａ２及びＵＳ２００８／０１３２５１３Ａ１
【特許文献１１】Bohnert等、Cyclohexenyl-Aryl  Compounds  for  Inflammation  and  Immune-related  Uses、国際特許出願ＷＯ２００８／０６３５０４Ａ２及びＵＳ２００８／０２０７６４１Ａ１
【特許文献１２】Chen、Pyridine  Compounds  for  Inflammation  and  Immune-related  Uses、国際特許出願ＷＯ２００９／０１７８１９Ａ１
【特許文献１３】Chen、Heterocycle-Aryl  Compounds  for  Inflammation  and  Immune-related  Uses、国際特許出願ＷＯ２００９／０１７８１８Ａ１
【特許文献１４】Braun等、The  calcium  sensor  STIM1  and  the  platelet  SOC  channel  Orai1  (CRACM1)  are  essential  for  pathological  thrombus  formation、国際特許出願ＷＯ２００９／１１５６０９Ａ１
【特許文献１５】Braun等、The  calcium  sensor  STIM1  is  essential  for  pathological  thrombus  formation、ＥＰ２１０３３１１Ａ１
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Hogan等、Transcriptional  regulation  by  calcium,  calcineurin  and  NFAT.  Gene  Dev.17:2205-2232(2003)
【非特許文献２】Putney,  A  model  for  receptor-regulated  calcium  entry,  Cell  Calcium,  7:1-12(1986);Putney等、Cell,  75,  199-201(1993)
【非特許文献３】Fagan等、J.  Biol.  Chern.  275:26530-26537(2000)Lewis,  Annu.  Rev.  Immunol.  19:497-521(2001)
【非特許文献４】Nunez等、J.  Physiol.  571.1,  57-73(2006)
【非特許文献５】Winslow等、Curr.  Opin.  Immunol.  15:299-307(2003)Hoth  and  Penner,  Calcium  release-activated  calcium  current  in  rat  mast  cells,  J.  Physiol.,  465:359-386(1993)
【非特許文献６】Hoth  and  Penner,  Depletion  of  intracellular  calcium  stores  activates  a  calcium  current  in  mast  cells,  Nature  355:353-355(1992)
【非特許文献７】Feske,  Calcium  signaling  in  lymphocyte  activation  and  disease,  Nature  Rev.  Immunol.  7:690-702(2007)
【非特許文献８】Roos等、STIM1  an  essential  and  conserved  component  of  store-operated  Ca  channel  function,  J.  Cell  Biol.169:435-445(2005)
【非特許文献９】Liou等、STIM1  is  a  Ca2+  sensor  essential  for  Ca2+store  depletion  triggered  Ca2+  influx,Current  Biol.  15:1235-1241(2005)
【非特許文献１０】Stathopulos等、stored  Ca  depletion-induced  oligomerization  ofSTIM  via  EF-SAM  region:  An  initiation  mechanism  for  capacitative  Ca  entry,  J.  Biol.  Chern.  281:35855-35862(2006)
【非特許文献１１】Zhang等、STIM1  is  a  Ca  sensor  that  activates  CRAC  channels  and  migrates  from  the  Ca  store  to  the  plasma  membrane,  Nature  437:902-905(2005)
【非特許文献１２】Yuan等、SOAR  and  the  polybasic  STIM1  domain  gate  and  regulate  Orai  channels,  Nature  Cell  Biology  11:337-343(2009)
【非特許文献１３】Park等、STIM1  clusters  and  activates  CRAC  channels  via  direct  binding  of  a  cytosolic  domain  to  Orai1,  Cell136:876-890(2009)
【非特許文献１４】Csutora等、Novel  role  for  STIM1  as  a  trigger  for  calcium  influx  factor  production,  J.  Biol.  Chern.  283:14524-31(2008)
【非特許文献１５】Calloway等、Molecular  clustering  of  STIM1  with  Orai1/CRACM1  at  the  plasma  membrane  depends  dynamically  on  depletion  of  Ca2+stores  and  on  electrostatic  interactions,  Mol  Biol  Cell.  20(1  ):389-99.(2009  Jan;Epub  2008  Nov  5)
【非特許文献１６】Feske等、A  severe  defect  in  CRAC  Ca2+  channel  activation  and  altered  of  K+  channel  gating  in  T  cells  from  immunodeficient  patients,  J.  Exptl.  Med.  202(5):651-62(2005)
【非特許文献１７】Feske等、A  mutation  in  Orai1    causes  immune  deficiency  by  abrogating  CRAC  channel  function,  Nature  441:  179-85(2006)
【非特許文献１８】Vig等、CRACM1  is  a  plasma  membrane  protein  essential  forstore-operated  Ca  entry,  Science  312:1220-1223(2006)
【非特許文献１９】Zhang等、Genome-wide  RNAi  screen  of  Ca  influx  identifies  genes  that  regulate  Ca  release-activated  Ca  channel  activity,  PNAS  103:9357-9362(2006)
【非特許文献２０】Yeromin等、Molecular  identification  of  the  CRAC  channel  b  altered  ion  selectivity  in  a  mutant  of  Orai1,  Nature  433:226-229(2006)
【非特許文献２１】Prakirya等、Orai1  is  an  essential  pore  subunit  of  the  CRAC  channel,  Nature  443:230-233(2006)
【非特許文献２２】Vig等、CRACM1  multimers  form  the  ion-selective  pore  of  the  CRAC  channel,  Curr.  Biol.  16:2073-2079(2006)
【非特許文献２３】Yamashita等、Orai1  mutations  alter  ion  permeation  and  Ca2+-dependent  fast  inactivation  of  CRAC  channels:  evidence  for  coupling  of  permeation  and  gating,  J  Gen  Physiol130(5):  525.(2007)
【非特許文献２４】Spassova等、Voltage  gating  at  the  selectivity  filter  of  the  Ca2+  release-activated  Ca2+  channel  induced  by  mutation  of  the  Orai1  protein,  J.  Biol.  Chern.  283(22):  14938-45(2008)
【非特許文献２５】Okamura等、Concerted  dephosphorylation  of  the  transcription  factor  NFAT  induces  a  conformational  switch  that  regulates  transcriptional  activity,  Mol.  Cell  6:539-550(2000)
【非特許文献２６】Feske等、Ca/calcineurin  signaling  in  cells  of  the  immune  system,  Biochem.  Biophys.  Res.Comm.  311:11I7-I132(2003)
【発明の概要】
【００２１】
本発明はネイティブのヒトＯｒａｉ１の推定細胞外ループ（ＥＣＬ）のアミノ酸配列である、配列番号4（即ち配列番号２のアミノ酸残基１９８〜２３３）に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを包含する単離された抗原結合蛋白に関する。特定の実施形態においては、抗原結合蛋白は配列番号２のアミノ酸残基２０４〜２２３のサブセット；又は、配列番号２のアミノ酸残基２０４〜２１７のサブセット；又は、配列番号２のアミノ酸残基２０７〜２１３のサブセット；又は配列番号２のアミノ酸残基２１３〜２１７のサブセットに特異的に結合する。
【００２２】
一部の実施形態においては、抗体又は抗体フラグメントを包含する本発明の抗原結合蛋白はヒトＯｒａｉ１ポリペプチドに特異的に結合し、ここで：
【００２３】
（ａ）抗原結合蛋白は下記：
【００２４】
（ｉ）配列番号２１０［ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）、実施例８に記載］；又は、
【００２５】
（ｉｉ）配列番号２０４［ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ）、実施例８に記載］；又は、
【００２６】
（ｉｉｉ）配列番号１９２［ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）、実施例８に記載］；又は、
【００２７】
（ｉｖ）配列番号１２９［ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）、実施例８に記載］；又は、
【００２８】
（ｖ）配列番号１０３［ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＫＰＰＡ）、実施例８に記載］；
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合し；
そして、
【００２９】
（ｂ）抗原結合蛋白は下記：
【００３０】
（ｖｉ）配列番号９１［ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２、実施例８に記載］；又は、
【００３１】
（ｖｉｉ）配列番号１９８［ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡＡＮＶＳＴ）、実施例８に記載］；又は、
【００３２】
（ｖｉｉｉ）（配列番号１１３）［ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡ）、実施例８に記載］；又は、
【００３３】
（ｉｘ）配列番号１２３［ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＡＮＶＳＴ）、実施例８に記載］；又は、
【００３４】
（ｘ）配列番号１０７［ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＧＡＡ）、実施例８に記載］；又は、
【００３５】
（ｘｉ）配列番号１１７［ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＳＴ）、実施例８に記載］．
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドには特異的に結合しない。
【００３６】
一部の実施形態においては、本発明の抗原結合蛋白はヒトカルシウム応答活性化カルシウム（ＣＲＡＣ）チャンネル活性を阻害する。他の実施形態において、本発明の抗原結合蛋白はタプシガルギン処理されたヒト全血中のＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、又は両方の発現及び／又は放出を阻害する。
【００３７】
本発明はまた、そのような本発明の抗原結合蛋白を製造するための物質及び方法、例えばそれらをコードする単離された核酸、ベクター及び単離された宿主細胞及びハイブリドーマを提供する。同様に提供されるものは本明細書に開示した免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖配列及び／又はＶＨ及び／又はＶＬ配列及び／又はＣＤＲ配列の何れかをコードする単離された核酸である。関連する実施形態において、上記した核酸の何れかを含む発現ベクターが提供される。又別の実施形態において、上記した核酸又は発現ベクターの何れかを含む宿主細胞が提供される。
【００３８】
本発明の単離された抗原結合蛋白、例えば抗体及び抗体フラグメントの実施形態は、医薬組成物又は医薬の製造において使用できる。本発明の医薬組成物又は医薬は抗原結合蛋白及び製薬上許容しうる希釈剤、担体又は賦形剤を含む。本発明の例示される実施形態はヒトにおける免疫の障害又は疾患を治療するために有用である医薬組成物又は医薬を包含する。本発明の別の例示される実施形態は静脈又は動脈の血栓形成に関係する障害を治療するために有用である医薬組成物又は医薬を包含する。
【００３９】
本発明は更に、患者に本発明の抗原結合蛋白の有効量を投与することを含む、患者における免疫の障害又は疾患を治療又は防止するために抗原結合蛋白の何れか、又はそれらを含有する医薬を使用する方法を提供し、ここで免疫障害は
Ｔ細胞媒介自己免疫、移植物拒絶(例えば自家移植片拒絶）、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）、関節リューマチ、多発性硬化症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、アレルギー性鼻炎、好酸球性疾患、自己免疫中枢神経系（ＣＮＳ）炎症、炎症誘発性肝傷害よりなる群から選択される（例えばMa等、T-cell-specific  deletion  of  STIM1  and  STIM2  protects  mice  from  EAE  by  impairing  the  effector  functions  of  Th1  and  Th17  cells,  Eur  J  Immunol.  2010  Nov;40(11):3028-42.  doi:  10.1002/eji.201040614.  Epub  2010  Oct  27;Zitt等、Potent  inhibition  of  Ca2+  release-activated  Ca2+  channels  and  T  -lymphocyte  activation  by  the  pyrazole  derivative  BTP2,  J  Biol  Chern.  279(13):  12427-37(2004);Yoshino等、YM-58483,  a  selective  CRAC  channel  inhibitor,  prevents  antigeninduced  airway  eosinophilia  and  late  phase  asthmatic  responses  via  Th2  cytokine  inhibition  in  animal  models,  Eur  J.  Pharmacal.  560(2-3):225-33.(2007);Ohga等、Characterization  of  YM-58483/BTP2,  a  novel  store-operated  Ca2+  entry  blocker,  on  T  cell-mediated  immune  responses  in  vivo,  Int.  Immunopharmacol.  8(13-14):1787-92(2008);Schuhmann等、Stromal  interaction  molecules  1  and  2  are  key  regulators  of  autoreactive  T  cell  activation  in  murine  autoimmune  central  nervous  system  inflammation,  J  Immunol.  2010  Feb  1;184(3):1536-42.  Epub  2009  Dec  18;Vig等、Defective  mast  cell  effector  functions  in  mice  lacking  the  CRACM1  pore  subunit  of  store-operated  calcium  release-activated  calcium  channels,  Nat  Immunol.  9(1):89-96(2008);DiSabatino等、Targeting  gut  T  cell  Ca2+  release-activated  Ca2+  channels  inhibits  T  cell  cytokine  production  and  T  -box  transcription  factor  T-bet  in  inflammatory  bowel  disease,  J.  Immunol.  2009  Sep  1;183(5):3454-62.  Epub  2009  Jul31;Djuric等、3,5-Bis(trifluoromethyl)pyrazoles:  a  novel  class  of  NFAT  transcription  factor  regulator,  J.  Med.  Chern.  43(16):2975-81(2000);Lin等、Up-regulation  of  Orai1  in  murine  allergic  rhinitis,  Histochem  Cell  Biol,  2010  Jul,134(1):93-102.  Epub  2010  Jun  16;Lin等、2-Aminoethoxydiphenyl  borate  administration  into  the  nostril  alleviates  murine  allergic  rhinitis,  Am  J  Otolaryngol.  2010  Sep  9.  [Epub  ahead  of  print];McCarl等、Store-operated  Ca2+  entry  through  ORAI1  is  critical  for  T  cell-mediated  autoimmunity  and  allograft  rejection,  J.  Immunol.  2010  Nov  15;185(10):5845-58,  Epub  2010  Oct  18;Yonetoku等、Novel  potent  and  selective  calcium-release-activated  calcium(CRAC)  channel  inhibitors.  Part  2:  Synthesis  and  inhibitory  activity  of  aryl-3-trifluoromethylpyrazoles,  Bioorg  Med  Chern.  14(15):5370-83(2006);Yonetoku等、Novel  potent  and  selective  Ca2+  release-activated  Ca2+(CRAC)  channel  inhibitors.  Part  3:  synthesis  and  CRAC  channel  inhibitory  activity  of  4'-[(trifluoromethyl)pyrazol-1-yl]carboxanilides,  Bioorg  Med  Chern.  16(21):9457-66(2008)参照）。
【００４０】
本発明は更に、患者に本発明の抗原結合蛋白の有効量を投与することを含む、患者における静脈及び動脈の血栓形成に関連する障害を治療又は防止するために抗原結合蛋白の何れか、又はそれらを含有する医薬を使用する方法を提供し、ここで障害は動脈血栓、心筋梗塞、卒中、虚血再灌流傷害、虚血性脳梗塞、炎症、補体活性化、フィブリン溶解、ＦＸＩＩ誘発キニン形成に関連する血管形成、遺伝性血管浮腫、肺の細菌感染、トリパノソーマ感染、低血圧性ショック、膵炎、シャーガス病、血小板減少症及び関節性痛風よりなる群から選択される（例えばVarga-Szabo等、The  calcium  sensor  STIM1  is  an  essential  mediator  of  arterial  thrombosis  and  ischemic  brain  infarction,  J  Exp  Med.  205(7):1583-91(2008);Braun等、Orai1(CRACM1)  is  the  platelet  SOC  channel  and  essential  for  pathological  thrombus  formation,  Blood  113(9):2056-63(2009);Varga-Szabo等、Calcium  signaling  in  platelets,  J  Thromb  Haemost.  7(7):1057-66(2009);Bergmeier等、R93W  mutation  in  Orai1  causes  impaired  calcium  influx  in  platelets,  Blood  113(3):675-78(2009)参照）。
【００４１】
本発明は又、乳癌を治療、又は特にエストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）乳癌細胞の腫瘍形成、腫瘍細胞遊走及び／又は転移を防止するために本発明の抗原結合蛋白又はそれを含有する医薬の何れかを使用する方法を提供する（例えばYang等、Orai1  and  STIM1  are  critical  for  breast  tumor  cell  migration  and  metastasis,  Cancer  Cell  15(2):124-34(2009);Motiani等、A  novel  native  store-operated  calcium  channel  encoded  by  Orai3:  selective  requirement  of  Orai3  versus  Orai1  in  estrogen  receptor-positive  versus  estrogen  receptor-negative  breast  cancer  cells,  J  Biol  Chern.  2010  Jun  18;285(25):19173-83.  Epub  2010  Apr  15;Feng等、Store-independent  activation  of  Orai1  by  SPCA2  in  mammary  tumors,  Cell.  2010  Oct  1;143(1):84-98参照）。
【００４２】
本発明では多くの方法を意図している。例えばコードされた抗原結合蛋白が発現されるように本発明の発現ベクターを含む上記宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。ハイブリドーマによる抗原結合蛋白の発現を可能にする条件下に培地中で上記ハイブリドーマを培養する方法も提供する。そのような方法は又、宿主細胞培養物から抗原結合蛋白を回収する工程を含むことができる。関連する実施形態においては、上記方法により生産された単離された抗原結合蛋白を提供する。
【００４３】
上記した概要は本発明の１つ１つの側面を定義することを意図しておらず、そして追加的な側面は発明を実施するための形態のような他のセクションにおいて記載される。全文書は統一された開示として関連付けられることを意図しており、そして、本明細書に記載した特徴の全ての組み合わせは、その特徴の組み合わせが本文書の同じ文章、又はパラグラフ、又はセクションにおいて共に存在していない場合でも、意図されるものと理解しなければならない。
【００４４】
上記に加えて、本発明は追加的な側面として、上記した特定のパラグラフにより定義される変更よりも何らかの態様において範囲の狭い本発明の全ての実施形態も包含する。例えば、本発明は属として記載されている本発明の特定の側面は、属の１つ１つのメンバーが独立して本発明の側面であると理解しなければならない。更に又、属として記載されているか、属のメンバーを選択している側面は属のメンバー２つ以上の組み合わせを包含すると理解しなければ成らない。出願にンは本明細書に記載する本発明の全範囲を発明しているが、出願人は他の従来技術の研究に記載されている要件を請求することを意図していない。従って、請求項の範囲内の法的従来技術が特許庁又は他の実体又は個人により出願人の察知に付された場合は、出願人はそのような請求項の範囲からそのような法的従来技術又は法的従来技術の明らかな変更を特定的に排除するために、そのような請求項の要件を再定義する該当特許法下の補正の権利を行使する権利を確保している。そのような補正請求項により定義される本発明の意変更もまた本発明の側面として意図される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１はタプシガルギン処理されたヒト全血からのサイトカイン放出（ＩＬ−２、丸；ＩＦＮ−ガンマ、四角）の阻害により評価したヒトＯｒａｉ１へのハイブリドーマ上澄みの機能的結合を示す。陰性対照ハイブリドーマ上澄みと共に陽性Ｏｒａｉ１結合上澄みを２５％（ｖ／ｖ）で使用することにより対照のパーセントとしてあらわしたサイトカイン分泌の阻害を評価した。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｄは２人の別個のヒトドナー（ドナーＡ：図２Ａ及び図２Ｃ；ドナーＢ：図２Ｂ及び図２Ｄ）から採取したタプシガルギン処理されたヒト全血に由来するサイトカイン放出（ＩＬ−２、図２Ａ〜Ｂ；及びＩＦＮ−ガンマ、図２Ｃ−Ｄ）の精製されたモノクローナル抗体による用量依存性阻害を示す。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図２Ｄ】同上。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｂは非還元（図３Ａ）及び還元条件（図３Ｂ）下に１．０ｍｍの４〜２０％ＴｒｉｓグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動に付された精製された組み換え抗ヒトＯｒａｉ１モノクローナル抗体を示す。左から（２μｇ蛋白／ウェル）：レーン１、Ｍａｒｋ１２ＭＷマーカー；レーン２、ｍＡｂ２Ｄ２．１；レーン３、ｍＡｂ２Ｃ１．１；レーン４、ブランク；レーン５、ｍＡｂ２Ｂ７．１；レーン６、ｍＡｂ２Ａ２．２−１；レーン７、ｍＡｂ２Ａ２．２−２；レーン８、ｍＡｂ２Ｂ４．１。
【図３Ｂ】同上。
【図４】図４はＡＭ１−ＣＨＯ細胞の表面上に発現されたヒトＯｒａｉ１への組み換えモノクローナル抗体の結合を示すＦＡＣＳ分析を示す。ＡＭ１−ＣＨＯ親及びＡＭ１−ＣＨＯ／Ｏｒａｉ１／ＳＴＩＭ１−ＹＦＰを先ず組み換えモノクローナル抗体で染色し、次に、二次フィコエリスリン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントで逆染色し、そしてＦＡＣＳを用いながら可視化した。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｄは組み換えモノクローナル抗体ｍＡｂ２Ｄ２．１、ｍＡｂ２Ｃ１．１及びｍＡｂ２Ｂ７．１が（ｍＡｂ２Ｂ４．１、ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４とは異なり）２人の別個のヒトドナー（ドナーＡ：図５Ａ及び図５Ｃ；ドナーＢ：図５Ｂ及び図５Ｄ）のタプシガルギン処理されたヒト全血からの用量依存的態様におけるインターロイキン−２及びインターフェロン−ガンマの分泌（ＩＬ−２、図５Ａ〜Ｂ；及びＩＦＮ−ガンマ、図５Ｃ−Ｄ）を阻害したことを示している。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図５Ｄ】同上。
【図５Ｅ】図５Ｅ−Ｈは精製されたモノクローナル抗体ｍＡｂ５Ａ１．１、ｍＡｂ５Ａ４．２、ｍＡｂ５Ｂ１．１、ｍＡｂ５Ｂ５．２、ｍＡｂ５Ｃ１．１、ｍＡｂ５Ｆ２．１、及びｍＡｂ５Ｆ７．１が２人の別個のヒトドナー（ドナーＡ：図５Ｅ及び図５Ｇ；ドナーＢ：図５Ｆ及び図５Ｈ）のタプシガルギン処理されたヒト全血からの用量依存的態様におけるインターロイキン−２及びインターフェロン−ガンマの分泌（ＩＬ−２、図５Ｅ−Ｆ；及びＩＦＮ−ガンマ、図５Ｇ−Ｈ）を阻害したことを示している。
【図５Ｆ】同上。
【図５Ｇ】同上。
【図５Ｈ】同上。
【図６Ａ】図６Ａはｘ軸上の時間に対するｙ軸上の３９５ｎｍ／４８５ｎｍ発光比により示したＨＥＫ−２９３細胞内へのカルシウム進入のプロットである。記録の最初の分は何れかの投与の前のベースラインを示し、細胞内部の低いカルシウムレベルを示す低い比を有する。タプシガルギンを１分後に添加することにより内部ストアされたカルシウムの放出を誘導した。約６分後、内部カルシウムレベルはベースラインに戻った時点で、外部カルシウムジカチオンを２ｍＭ終濃度となるように添加したところ、３９５ｎｍ／４８５ｎｍ比の即座かつ急激な上昇がもたらされ、Ｏｒａｉ１（ＣＲＡＣ）チャンネルを介したカルシウム流入により生じた細胞内部のなお高値のレベルのカルシウムを示している。
【図６Ｂ】図６Ｂ−Ｃは、ＮＦＡＴ駆動ルシフェラーゼレポーター遺伝子と共にヒトＯｒａｉ１及びヒトＳＴＩＭ１を発現するＨＥＫ−２９３細胞におけるルシフェラーゼ活性を本発明の抗Ｏｒａｉ１ｍＡｂが用量依存的に阻害したことを示す代表的データを示している。ｍＡｂ２Ｃ１．１（丸）、ｍＡｂ２Ｄ２．１（四角）及びｍＡｂ２Ｂ７．１（ダイアモンド）はルシフェラーゼ活性の用量依存的ブロッキングを示しているのに対し、陰性対照ｍＡｂ（三角）は活性の僅かな用量依存的上昇を示している。図６ＣにおいてｍＡｂ２Ｂ４．１（三角）は、僅かな用量依存的阻害、及び、ｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１又はｍＡｂ２Ｂ７．１と相対比較して遥かに低値のＩＣ５０を示している。
【図６Ｃ】同上。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｃは、ＣＲＡＣ電流は本発明の抗ｈＯｒａｉ１抗体であるｍＡｂ２Ｂ７．１によっては阻害されたが抗ジニトロフェノール（ＤＮＰ）ｍＡｂ（陰性対照ｍＡｂ）には阻害されなかったことを示している。細胞は保持電位０ｍＶに維持された。膜電位は２５ｍｓの間−１００ｍＶとし、そして−１００から１００ｍＶへの１００ｍｓ電圧ランプを与えることによりＩ−Ｖ関係を得た（図７Ａ）。完全に活性化されたＩＣＲＡＣに関する代表的なＩ−Ｖ関係は陰性対照モノクローナル抗体（１μＭ）の前投与は対照曲線と比較してＩＣＲＡＣに対する作用は殆ど又は全く無かったことを示している（図７Ｂ）。完全に活性化されたＩＣＲＡＣに関する代表的なＩ−Ｖ関係は対照曲線と比較してｍＡｂ２Ｂ７．１（１μＭ）がＩＣＲＡＣを阻害したことを示している（図７Ｃ）。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｆは本発明の抗ｈＯｒａｉ１抗体（１μＭ）がＩＣＲＡＣを阻害したことを示している。初期リーク電流は最大電流から差し引いてある。−１００ｍＶで計測した平均電流振幅はＩＣＲＡＣを有意に変化させなかった緩衝液対照（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０＋９％スクロース緩衝液、「Ａ５ＳＵ」）（図８Ｅ）と比較して、又は対照細胞又はＩＣＲＡＣに対する作用が殆ど又は全く無かった陰性対照ｍＡｂを投与した陰性対照ｍＡｂを投与した細胞（図８Ａ）と比較して、抗ｈＯｒａｉ１抗体ｍＡｂ２Ｂ７．１（図８Ｂ）、ｍＡｂ２Ｄ２．１（図８Ｃ）、ｍＡｂ２Ｃ１．１（図８Ｄ）、ｍＡｂ２Ｂ４．１（図８Ｆ）、マウス抗−ｈＯｒａｉ１抗体ｍＡｂ１３３．４及びｍＡｂ８４．５（図８Ｅ）を投与した細胞では有意に異なっていた。データは平均±ＳＥＭで示す。
【図８Ｂ】同上。
【図８Ｃ】同上。
【図８Ｄ】同上。
【図８Ｅ】同上。
【図８Ｆ】同上。
【図９】図９はヒトＯｒａｉ１（配列番号２）、ヒトＯｒａｉ２（配列番号６１）及びヒトＯｒａｉ３（配列番号６３）蛋白のアミノ酸配列のアライメントを示す。ｃｈ．ＥＭＢｎｅｔ（ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）より入手したＴＭｐｒｅｄプログラムを用いて予測した場合の推定細胞外ループＥＣＬ１（二重下線）及びＥＣＬ２（一重下線）におけるアミノ酸残基を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｂはチンパンジー（配列番号８０）、ヒト（配列番号２）、カニクイザル（Ｎ−末端トランケーションされた部分配列；配列番号８２）、イヌ（配列番号８４）、マウス（配列番号７２）及びラット（配列番号７６）から得たＯｒａｉ１蛋白のアミノ酸配列のアライメントを示す。ｃｈ．ＥＭＢｎｅｔ（ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）より入手したＴＭｐｒｅｄプログラムを用いて予測した場合の推定細胞外ループＥＣＬ１（二重下線）及びＥＣＬ２（一重下線）におけるアミノ酸残基を示す。ヒトと比較してイヌ及び非ヒト霊長類から得られた種々異なるＯｒａｉ１蛋白の間にはＥＣＬ１におけるアミノ酸配列の１００％保存が観察されたが、げっ歯類とヒトとの間では僅か８７．５％の保存であった。ＴＭｐｒｅｄプログラムは又、ＥＣＬ２領域（一重下線アミノ酸残基）も予測した。ＥＣＬ１とは異なり、ＥＣＬ２は長さが変化しており、保存は主に末端であった。
【図１０Ｂ】同上。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｂは本発明のｍＡｂによるヒトＯｒａｉ１への特異的結合を示すＦＡＣＳ結合データを示す。初期ヒットから誘導したサブクローンのハイブリドーマ上澄みから得た精製されたモノクローナル抗体を、ベクタートランスフェクトした対照親細胞と共にＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ細胞上に発現させたヒトＯｒａｉ１、Ｏｒａｉ２及びＯｒａｉ３への結合に関して評価した。一次ｍＡｂを用いるか用いることなく染色した細胞を二次フィコエリスリン標識ヤギ（「Ｇｔ」）抗ヒト（「Ｈｕ」）ＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントを用いて逆染色し、そしてＦＡＣＳを用いて可視化した。ネズミｍＡｂ８４．５及び１３３．４に関しては、二次フィコエリスリン標識Ｇｔ抗マウス（「Ｍｕ」）ＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントを代わりに使用した。
【図１１Ｂ】同上。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜ＢはＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ細胞の表面上に発現されるヒトＯｒａｉ１野生型ｖｓ１ポリヌクレオチド変異体への同様の結合を示すＦＡＣＳ分析の結果を示す。ヒトＯｒａｉ１又は配列番号２の２１８位のアミノ酸残基セリンがグリシンと置き換えられている（Ｓ２１８Ｇ）ヒトＯｒａｉ１変異体を発現するコンストラクトでＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ細胞を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を組み換えモノクローナル抗体で先ず染色し、次に、二次フィコエリスリン標識Ｇｔ抗ＨｕＩｇＧＦ（ａｂ’）２又はＧｔ抗ＭｕＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントで適宜逆染色し、そしてＦＡＣＳを用いて可視化した。
【図１２Ｂ】同上。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜Ｂは２μＭタプシガルキンを投与したＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ細胞の表面上に発現されるヒトＯｒａｉ１への結合を示すＦＡＣＳ分析の結果を示す。ヒトＯｒａｉ１及びヒトＳＴＩＭ１、マウスＯｒａｉ１及びマウスＳＴＩＭ１、ラットＯｒａｉ１及びラットＳＴＩＭ１  及び対照空ベクターでＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ細胞を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を組み換えモノクローナル抗体で先ず染色し、次に、二次フィコエリスリン標識Ｇｔ抗ＨｕＩｇＧＦ（ａｂ’）２又はＧｔ抗ＭｕＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントで適宜逆染色し、そしてＦＡＣＳを用いて可視化した。
【図１３Ｂ】同上。
【図１４】図１４はヒト（配列番号２）及びマウス（配列番号７２）から得たＯｒａｉ１蛋白のアミノ酸配列のアライメントを示す。予測される推定細胞外ループＥＣＬ１（二重下線）及びＥＣＬ２（一重下線）におけるアミノ酸残基を示す。二重下線のアミノ酸残基はｃｈ．ＥＭＢｎｅｔ（ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）より入手したＴＭｐｒｅｄプログラムを用いて予測した場合のＥＣＬ１ドメインを示す。プログラムは採点のための幾つかのウエイトマトリックスの組み合わせを用いながら天然に存在する膜貫通蛋白のデータベース、即ちＴＭｂａｓｅの統計学的分析に基づいて膜スパニング領域の予測を行う。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜ＢはＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ細胞の表面上に発現されるヒトＯｒａｉ１細胞外ループ−２−マウスＯｒａｉ１突然変異体への結合を示すＦＡＣＳ分析の結果を示す。ヒトＯｒａｉ１細胞外ループ２がマウスＯｒａｉ１細胞外ループ２を置き換えているマウスＯｒａｉ１突然変異体及びマウスＯｒａｉ１細胞外ループ２がヒトＯｒａｉ１細胞外ループ２を置き換えているヒトＯｒａｉ１突然変異体でＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ細胞を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、組み換えモノクローナル抗体で先ず染色し、次に二次フィコエリスリン標識ヤギ（「Ｇｔ」）抗ヒト（「Ｈｕ」）ＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントで逆染色し、そしてＦＡＣＳを用いて可視化した。
【図１５Ｂ】同上。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜ＤはＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ細胞の表面に発現される記載したｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ突然変異体への結合を示すＦＡＣＳ分析の結果を示す。トランスフェクトした細胞を、組み換えモノクローナル抗体で先ず染色し、次に二次フィコエリスリン標識ヤギ（「Ｇｔ」）抗ヒト（「Ｈｕ」）ＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントで逆染色し、そしてＦＡＣＳを用いて可視化した。図１６Ｂ及び図１６Ｄにおいて、対照のパーセントとしての相対蛍光強度（ＲＦＩ−ＰＯＣ）の値を相対蛍光強度幾何平均（Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ）から計算した。幾何平均は一連の数値を掛け合わせ、そして一連の数字の数をｎとした場合のｎ乗根をとることにより計算される平均である。これは極端な値の影響を最低限にする高度に変動するデータセットにおける中心的傾向を表示するためにしばしば使用される返還された数値のセットの統計学的平均である。ＲＦＩ−ＰＯＣは表１１Ａ〜Ｂに関して実施例８において記載したアルゴリズムＩＩを用いながら計算した。試験したキメラは（ｉ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＱＡＧＱＰＳＰＴＫＰＰＡＥ）（配列番号２２６）；（ｉｉ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥ）（配列番号２１４）；（ｉｉｉ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＰＰＡＥ）（配列番号１３３）；（ｉｖ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶ）（配列番号２１８）；（ｖ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ）（配列番号２３２）；（ｖｉ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ）（配列番号２２２）；（ｖｉｉ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶ）（配列番号１４１）；（ｖｉｉｉ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＩＶ）（配列番号１３７）；（ｉｘ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＨＳＤ）（配列番号１４５）；（ｘ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（配列番号９１）；及び（ｘｉ）ｍＯｒａｉ−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（配列番号９７）であった。
【図１６Ｂ】同上。
【図１６Ｃ】同上。
【図１６Ｄ】同上。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜ＤはＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ細胞の表面上に発現される記載されたｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ2キメラ突然変異体への結合を示すＦＡＣＳの結果を示す。トランスフェクトした細胞を、組み換えモノクローナル抗体で先ず染色し、次に二次フィコエリスリン標識ヤギ（「Ｇｔ」）抗ヒト（「Ｈｕ」）ＩｇＧＦ（ａｂ’）２  抗体フラグメントで逆染色し、そしてＦＡＣＳを用いて可視化した。図１７Ｂ及び図１７Ｄにおいて、表１０Ａ〜Ｂに関して実施例８で記載したアルゴリズムＩを用いながら対照のパーセントとしての相対蛍光強度（ＲＦＩ−ＰＯＣ）を相対蛍光強度幾何平均（Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ）から計算した。試験したキメラは（ｉ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）（配列番号２１０）；（ｉｉ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ）（配列番号２０４）；（ｉｉｉ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）（配列番号１９２）；（ｉｖ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）（配列番号１２９）；（ｖ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＫＰＰＡ）（配列番号１０３）；（ｖｉ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（配列番号９１）；（ｖｉｉ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡＡＮＶＳＴ）（配列番号１９８）；（ｖｉｉｉ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡ）（配列番号１１３）；（ｉｘ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＡＮＶＳＴ）（配列番号１２３）；（ｘ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＧＡＡ）（配列番号１０７）；（ｘｉ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＳＴ）（配列番号１１７）；及び（ｘｉｉ）ｍＯｒａｉ−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（配列番号９７）であった。
【図１７Ｂ】同上。
【図１７Ｃ】同上。
【図１７Ｄ】同上。
【図１８】図１８はＡＭ１−ＣＨＯ細胞の表面に発現されたヒトＯｒａｉ１への結合を示すＦＡＣＳ分析の結果を示す。ＡＭ１−ＣＨＯ親及びＡＭ１−ＣＨＯ／Ｏｒａｉ１／ＳＴＩＭ１−ＹＦＰ  を先ず組み換えまで染色し、次に二次ＦＩＴＣ標識抗体フラグメントで逆染色し、そしてＦＡＣＳで可視化した。図１８はヒトＯｒａｉ１ＥＣＬ１又はＥＣＬ２を示すペプチドのような細胞外エピトープ抗原に対して育成された市販抗体の全てのＦＡＣＳによる結合評価を示している。
【図１９】図１９は１μＭのタプシガルギンで刺激したＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１  ＢＢ６．３細胞を用いたＦＬＩＰＲ系カルシウム流入アッセイの代表的結果を示す
【図２０】図２０は本発明のｍＡｂによるカニクイザルＯｒａｉ１への結合を示すＦＡＣＳ結合データを示す。ＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ細胞をベクタートランスフェクト対照親細胞と共にｃｙｎｏＯｒａｉ１を発現するコンストラクトで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を先ず組み換えまで染色し、次に二次フィコエリスリン標識Ｇｔ抗ＨｕＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントで逆染色し、そしてＦＡＣＳを用いて可視化した。
【図２１】図２１はベクタートランスフェクト対照親細胞と共にＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ細胞の表面上に発現されるヒトＯｒａｉ１１ポリヌクレオチド変異体への結合を示すＦＡＣＳ分析の結果を示す。ＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ細胞を、配列番号２の２２３位のアミノ酸残基アスパラギンがセリンで置き換えられている（Ｎ２２３Ｓ；配列番号３１７）ヒトＯｒａｉ１変異体を発現するコンストラクトで一過性にトランスフェクトした。
【図２２Ａ】図２２Ａ〜ＢはＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ細胞の表面に発現される記載されたｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ突然変異体及びｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ突然変異体への市販のポリクローナル抗体の結合の非存在を示すＦＡＣＳ分析の結果を示す。トランスフェクトされた細胞を先ずヒトＯｒａｉ１に対する市販の抗体で染色し、次に二次ＦＩＴＣ標識抗体フラグメントで逆染色し、そしてＦＡＣＳを用いて可視化した。試験したキメラは（ｉ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＱＡＧＱＰＳＰＴＫＰＰＡＥ）（配列番号２２６）；（ｉｉ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥ）（配列番号２１４）；（ｉｉｉ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＰＰＡＥ）（配列番号１３３）；（ｉｖ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶ）（配列番号２１８）；（ｖ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ）（配列番号２３２）；（ｖｉ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ）（配列番号２２２）；（ｖｉｉ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶ）（配列番号１４１）；（ｖｉｉｉ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＩＶ）（配列番号１３７）；（ｉｘ）ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＨＳＤ）（配列番号１４５）；（ｘ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）（配列番号２１０）；（ｘｉ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ）（配列番号２０４）；（ｘｉｉ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）（配列番号１９２）；（ｘｉｉｉ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）（配列番号１２９）；（ｘｉｖ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＫＰＰＡ）（配列番号１０３）；（ｘｖ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡＡＮＶＳＴ）（配列番号１９８）；（ｘｖｉ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡ）（配列番号１１３）；（ｘｖｉｉ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＡＮＶＳＴ）（配列番号１２３）；（ｘｖｉｉｉ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＧＡＡ）（配列番号１０７）；（ｘｖｉｉｉｉ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＳＴ）（配列番号１１７）；（ｘｘ）ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（配列番号９１）；及び（ｘｘｉ）ｍＯｒａｉ−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（配列番号９７）であった。図２２Ａ−ＢはヒトＯｒａｉ１ＥＣＬ１又はＥＣＬ２を示すペプチドのような細胞外エピトープ抗原に対して育成された表１２（本明細書の実施例９）における全ての市販の抗体のＦＡＣＳによる結合評価を示す。
【図２２Ｂ】同上。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜ＥはＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３、Ｊｕｒｋａｔ、ＡＭ１／ＣＨＯ及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１細胞溶解物を用いたネイティブ条件下におけるヒトＯｒａｉ１蛋白に対する市販の抗体の検出を示すウエスタン分析の結果を示す。細胞溶解物を先ずヒトＯｒａｉ１に対する市販抗体でプローブし、次に二次セイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートＩｇＧ抗体で検出した。増強ルミネセンス系を用いて蛋白を可視化した。図２３Ａ〜Ｅは表１２（本明細書の実施例９）において更に記載する通りヒトＯｒａｉ１ＥＣＬ１又はＥＣＬ２を示すペプチドに対して育成された５つの記載した市販ポリクローナル抗体のウエスタン評価を示す。
【図２３Ｂ】同上。
【図２３Ｃ】同上。
【図２３Ｄ】同上。
【図２３Ｅ】同上。
【図２４Ａ】図２４Ａ〜ＥはＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３、Ｊｕｒｋａｔ、ＡＭ１／ＣＨＯ及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１細胞溶解物を用いた還元及び非還元条件下におけるヒトＯｒａｉ１蛋白に対する市販の抗体の検出を示すウエスタン分析の結果を示す。細胞溶解物を先ずヒトＯｒａｉ１に対する市販抗体でプローブし、次に二次セイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートＩｇＧ抗体で検出した。増強ルミネセンス系を用いて蛋白を可視化した。図２４Ａ〜Ｅは表１２（本明細書の実施例９）において更に記載する通りヒトＯｒａｉ１ＥＣＬ１又はＥＣＬ２を示すペプチドに対して育成された５つの記載した市販ポリクローナル抗体のウエスタン評価を示す。
【図２４Ｂ】同上。
【図２４Ｃ】同上。
【図２４Ｄ】同上。
【図２４Ｅ】同上。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜ＤはＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３、Ｊｕｒｋａｔ、ＡＭ１／ＣＨＯ及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１細胞溶解物を用いたネイティブ条件下においてヒトＯｒａｉ１蛋白を本発明の抗Ｏｒａｉ１ｍＡｂが検出したことを示す代表的データを示す。細胞溶解物を先ず組み換え抗ｈＯｒａｉ１モノクローナル抗体ｍＡｂ２Ｂ７．１（図２５Ａ）、ｍＡｂ２Ｃ１．１（図２５Ｂ）、ｍＡｂ２Ｄ２．１（図２５Ｃ）及びｍＡｂ５Ｆ７．１（図２５Ｄ）でプローブし、そして次に二次セイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートＩｇＧ抗体で検出した。増強ルミネセンス系を用いて蛋白を可視化した。
【図２５Ｂ】同上。
【図２５Ｃ】同上。
【図２５Ｄ】同上。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜ＤはＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３、Ｊｕｒｋａｔ、ＡＭ１／ＣＨＯ及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１細胞溶解物を用いた還元及び非還元条件下においてヒトＯｒａｉ１蛋白を本発明の抗Ｏｒａｉ１ｍＡｂが検出したことを示す代表的データを示す。細胞溶解物を先ず組み換え抗ｈＯｒａｉ１モノクローナル抗体ｍＡｂ２Ｂ７．１（図２６Ａ）、ｍＡｂ２Ｃ１．１（図２６Ｂ）、ｍＡｂ２Ｄ２．１（図２６Ｃ）及びｍＡｂ５Ｆ７．１（図２６Ｄ）でプローブし、そして次に二次セイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートＩｇＧ抗体で検出した。増強ルミネセンス系を用いて蛋白を可視化した。
【図２６Ｂ】同上。
【図２６Ｃ】同上。
【図２６Ｄ】同上。
【図２７】図２７はＡＭ１−ＣＨＯ細胞の表面に発現されるヒトＯｒａｉ１に対する組み換えモノクローナル抗体の結合を示すＦＡＣＳ分析を示す。ＡＭ１−ＣＨＯ親及びＡＭ１−ＣＨＯ／Ｏｒａｉ１を先ず組み換えモノクローナル抗体で染色し、次に次に、二次フィコエリスリン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントで逆染色し、そしてＦＡＣＳを用いながら可視化した。ヒト抗ＤＮＰｍＡｂ（ＤＮＰ−３Ａ４−Ｆ）はＷａｌｋｅｒ等、国際特許出願ＷＯ２０１０／１０８１５３Ａ２に記載されている。
【図２８】図２８は静脈内又は皮下注射を介したヒト異種ＧＶＨＤマウスにおける抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１の薬物動態プロファイルを示す。血清試料中の抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１のレベルはＥＬＩＳＡで計測し、そして、時間濃縮データは、WinNonLin（登録商標）を用いたノンコンパートメント法を用いて分析した。
【図２９】図２９はヒト異種ＧＶＨＤマウスにおける体重減少を防止する抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１を示す。ＮＳＧマウスに２００ＲａｄのＣｓ−１３７を照射し、そして尾静脈注射によりＰＢＳ２００μＬ中ヒトＰＢＭＣ２０百万個を転移した。いかなる投与及びヒトＰＢＭＣ転移を受けなかった照射マウスの群をＧＶＨＤ非存在の対照とした。レシピエントに、照射後第０日であってヒトＰＢＭＣ転移前、そして第５日に腹腔内注射により抗ＫＬＨｈｕＩｇＧ２（Ｗａｌｋｅｒ等、国際特許出願ＷＯ２０１０／１０８１５３Ａ２に記載）、Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標）又は抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１を投与した。
【図３０Ａ】図３０Ａ〜Ｄはヒト異種ＧＶＨＤマウスにおける炎症性サイトカイン、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５及びＩＬ−１０の生産を減衰させる抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１を示す。ＮＳＧマウスに２００ＲａｄのＣｓ−１３７を照射し、そして尾静脈注射によりＰＢＳ２００μＬ中ヒトＰＢＭＣ２０百万個を転移した。いかなる投与及びヒトＰＢＭＣ転移を受けなかった照射マウスの群をＧＶＨＤ非存在の対照とした。レシピエントに、照射後第０日であってヒトＰＢＭＣ転移前、そして第５日に腹腔内注射により抗ＫＬＨｈｕＩｇＧ２（Ｗａｌｋｅｒ等、国際特許出願ＷＯ２０１０／１０８１５３Ａ２に記載）、Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標）（アバタセプト（ａｂａｔａｃｅｐｔ）；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）又は抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１を投与した。
【図３０Ｂ】同上。
【図３０Ｃ】同上。
【図３０Ｄ】同上。
【図３１Ａ】図３１Ａ〜Ｄはヒト異種ＧＶＨＤマウスの脾臓におけるヒトＴ細胞の生着を防止する抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１を示す。ＮＳＧマウスに２００ＲａｄのＣｓ−１３７を照射し、そして尾静脈注射によりＰＢＳ２００μＬ中ヒトＰＢＭＣ２０百万個を転移した。いかなる投与及びヒトＰＢＭＣ転移を受けなかった照射マウスの群をＧＶＨＤ非存在の対照とした。レシピエントに、照射後第０日であっ  てヒトＰＢＭＣ転移前、そして第５日に腹腔内注射により抗ＫＬＨｈｕＩｇＧ２（Ｗａｌｋｅｒ等、国際特許出願ＷＯ２０１０／１０８１５３Ａ２に記載）、Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標）（登録商標）（アバタセプト（ａｂａｔａｃｅｐｔ）；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）又は抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１を投与した。
【図３１Ｂ】同上。
【図３１Ｃ】同上。
【図３１Ｄ】同上。
【図３２】図３２はヒト異種ＧＶＨＤマウスの体重減少を抗ヒトＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１は防止したが抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｂ４．１は防止しなかったことを示している。ＮＳＧマウスに２００ＲａｄのＣｓ−１３７を照射し、そして尾静脈注射によりＰＢＳ２００μＬ中ヒトＰＢＭＣ２０百万個を転移した。いかなる投与及びヒトＰＢＭＣ転移を受けなかった照射マウスの群をＧＶＨＤ非存在の対照とした。レシピエントに、照射後第０日であってヒトＰＢＭＣ転移前、そして第５日に腹腔内注射により抗ＤＮＰｈｕＩｇＧ２（ＤＮＰ−３Ａ４−Ｆ−Ｇ２；Ｗａｌｋｅｒ等、国際特許出願ＷＯ２０１０／１０８１５３Ａ２に記載）、抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１又は抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｂ４．１を投与した。
【図３３Ａ】図３３Ａ〜ＢはｍＡｂ２Ｂ４．１及びヒトアイソタイプ対照抗ＤＮＰｍＡｂ（ＤＮＰ−３Ａ４−Ｆ−Ｇ２；Ｗａｌｋｅｒ等、国際特許出願ＷＯ２０１０／１０８１５３Ａ２に記載）、未染色対照、及び直接標識二次抗体フラグメント陰性染色対照と比較した場合の、本発明の記載されたｍＡｂ実施形態、組み換え抗ｈＯｒａｉ１モノクローナル抗体ｍＡｂ２Ｃ１．１（上パネル）、ｍＡｂ２Ｄ２．１（中央パネル）及びｍＡｂ５Ｆ７．１（下パネル）によりＪｕｒｋａｔ細胞中で発現された内因性ヒトＯｒａｉ１への結合を示すＦＡＣＳ結合データ（図３３Ａ）及びＦＡＣＳプロファイル（図３３Ｂ）を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞は先ず組み換えモノクローナル抗体又はアイソタイプ対照ｍＡｂで染色し、次にフィコエリスリン標識Ｇｔ抗ＨｕＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントで逆染色し、そしてＦＡＣＳを用いて可視化した。
【図３３Ｂ】同上。
【図３４】図３４はＡＭ１−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ細胞上に発現されたｈＯｒａｉ１に対する本発明の抗Ｏｒａｉ１ｍＡｂの結合を示す。３０ｐＭの各抗Ｏｒａｉ１ｍＡｂを３．０×１０５、１．０×１０５又は３．０×１０４個／ｍＬの細胞と共にインキュベートし、そして平衡化させた。遊離ｍＡｂの上澄みを先ずヤギ抗ｈｕＦｃコーティングビーズを通過させることにより計測し、次にＫｉｎＥｘＡ機を用いながら蛍光（Ｃｙ５）標識ヤギ抗ｈｕＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体により検出した。結合シグナルのパーセントは、特定の細胞密度に結合する特定のｍＡｂ（ｍＡｂ５Ｆ７．１、５Ｈ３．１、２Ｃ１．１、５Ｄ７．２、５Ｆ２．１、５Ａ４．２、２Ｂ７．１、５Ｂ１．１、５Ｂ５．１、２Ｄ２．１又は２Ｂ４．１）の遊離ｍＡｂ値を細胞に結合していないそのｍＡｂの遊離ｍＡｂ値で割ることにより計算した。
【図３５】図３５はホールセルパッチクランプによるｍＡｂ２Ｃ１．１（ｎ＝３−６）の６濃度において計測したＣＲＡＣ電流に対するｍＡｂ２Ｃ１．１の阻害作用を示す。
【図３６】図３６は１μＭのヒトアイソタイプ対照抗ＤＮＰｍＡｂ（ＤＮＰ−３Ａ４−Ｆ−Ｇ２；Ｗａｌｋｅｒ等、国際特許出願ＷＯ２０１０／１０８１５３Ａ２に記載）と比較した場合の１μＭｍＡｂ２Ｃ１．１によるＩＣＲＡＣのパーセント阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本明細書において使用するセクション見出しは構造上の目的のためのみにあり、記載した要件を限定すると捕らえてはならない。
【００４７】
定義
【００４８】
本明細書において特段に定義しない限り、本出願に関連して使用する科学的及び技術的な用語は当業者が共通して理解している意味を有するものとする。
更に又、文脈により別様に要求されない限り、単数の用語は複数も含み、複数の用語は単数を含む物とする。即ち本明細書及び添付の請求項で使用する場合、文脈により別様に明示されない限り（英語原文において）単数形の「a（ある１つの）」、「an（ある１つの）」及び「the（その）」を使用している場合でも複数標記を包含するものとする。例えば「ある蛋白」とは複数の蛋白を包含し；「ある細胞」とは複数の細胞の集団を包含する。
【００４９】
「Ｏｒａｉ１」とは、カルシウム放出活性化カルシウムモジュレーター1；ＣＲＡＣＭ１；カルシウム放出活性化カルシウムチャンネル蛋白１；膜貫通蛋白１４２Ａ；及びＴＭＥＭ１４２Ａとしても知られているＯｒａｉカルシウム放出活性化カルシウムモジュレーター１を意味する。ヒトＯｒａｉ１(「ｈＯｒａｉ１」）は以下のレファレンスアミノ酸配列（配列番号２；ＮＣＢＩレファレンス配列ＮＰ１１６１６９．２）を有することが決定されている。
【００５０】
【化１】
2013511279.tif 000003
【００５１】
ヒトＯｒａｉ１に包含されるものは天然の多形、例えば限定しないが、多形変異体Ｓ２１８Ｇ（ＮＣＢＩのＳＮＰデータベース参照、ｒｓ３７４１５９６）である。
【００５２】
【化２】
2013511279.tif 000004
ヒトＯｒａｉ１の推定される細胞外ループ１（「ＥＣＬ１」）ドメインは配列番号２のアミノ酸残基１１０〜１１７及び配列番号６５の１１０〜１１７（両方上記）において上記に示されており、これは太字で一重下線を付されており、そして下記配列：
DADHDYPP//配列番号３；
を有する。
ヒトＯｒａｉ１の細胞外ループ２（「ＥＣＬ２」）ドメインは配列番号２のアミノ酸残基１９８〜２３３又は配列番号６５の１９８〜２３３（両方上記）において示されており、これは一重下線を付されており、そして下記配列：
KFLPLKKQPGQPRPTSKPPASGAAANVSTSGITPGQ//  配列番号４、
又は変異体Ｓ２１８Ｇにおいては下記：
KFLPLKKQPGQPRPTSKPPAGGAAANVSTSGITPGQ//  配列番号７０；
を有する。
【００５３】
同様にヒトＯｒａｉ１に包含されるものは天然の多形変異体Ｎ２２３Ｓ（ＮＣＢＩのＳＮＰデータベース参照、ｒｓ７５６０３７３７）である。
【００５４】
【化３】
2013511279.tif 000005
ヒトＯｒａｉ１の推定される細胞外ループ１（「ＥＣＬ１」）ドメインは配列番号２のアミノ酸残基１１０〜１１７及び配列番号３１７の１１０〜１１７（両方上記）において上記に示されており、これは太字で一重下線を付されており、そして下記配列：
DADHDYPP//配列番号３；
を有する。
ヒトＯｒａｉ１の細胞外ループ２（「ＥＣＬ２」）ドメインは配列番号２のアミノ酸残基１９８〜２３３又は配列番号３１７の１９８〜２３３（両方上記）において示されており、これは一重下線を付されており、そして下記配列：
KFLPLKKQPGQPRPTSKPPASGAAANVSTSGITPGQ//配列番号４、
又は変異体Ｎ２２３Ｓにおいては下記:
KFLPLKKQPGQPRPTSKPPASGAAASVSTSGITPGQ//配列番号３１３；
を有する。
【００５５】
それぞれ上記下配列番号２の１１０〜１１７位及び１９８〜２３３位における予測されるＥＣＬ１及びＥＣＬ２ドメインを、膜スパニング領域及びその方向の予測を行うＴＭｐｒｅｄプログラム（ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌにおいて入手可能）を用いながら決定した。ＴＭｐｒｅｄソフトウエアのアルゴリズムは天然に存在する膜貫通蛋白のデータベースであるＴＭｂａｓｅの統計学的分析に基づいている。採点のための幾つかのウエイトマトリックスの組み合わせを用いながら予測を行う(K.  Hofmann  &  W.  Stoffel,  TMbase  -  A  database  of  membrane  spanning  proteins  segments,  Biol.  Chem.  Hoppe-Seyler  374:166(1993)）。
ＴＭｐｒｅｄプログラムを用いてヒトＯｒａｉ１アミノ酸配列を分析した所、２つの構造モデル、即ち：（１）細胞内Ｎ末端、配列番号の８８〜１０９位、配列番号２の１１８〜１３６位、配列番号２の１７２〜１９７位、及び配列番号２の２３４〜２５５位の４つの強力な膜貫通ヘリックスを有する特に好適なモデル；及び、（２）配列番号２の１１８〜１３６位、配列番号２の１７２〜１９７位、及び配列番号２の２３４〜２５５位の３つの強力な膜貫通ヘリックスを有する代替の低好適度のモデル；が得られた。ヒトＯｒａｉ１のその他の構造モデルは種々異なるアルゴリズムに基づいて発見できる。例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔＱ９６Ｄ３１予測はやはり４つの膜貫通ドメイン（それぞれ配列番号２の８８〜１０５位、１２０〜１４０位、１７４〜１９４位及び２３５〜２５５位)と、これに加えて配列番号２の１〜８７位に細胞質ドメイン、配列番号２の１０６〜１１９位に細胞外ドメイン(ECL1)  、配列番号２の１４１〜１７３位に細胞質ドメイン、配列番号１の１９５〜２３４位に細胞外ドメイン(ECL2)  、そして配列番号２の２５６〜３０１位に細胞質ドメインを有する。配列番号２の１１０〜１２５位にＥＣＬ１を、そして配列番号２の１９７〜２３６位にＥＣＬ２を置く別の構造予測も又、科学的に支持してよい（Vig等、CRACM1  multimers  form  the  ion-selective  pore  of  the  CRAC  channel,  Curr.  Biol.16:2073-2079(2006)参照）。Ｏｒａｉ１のアミノ酸配列はＥＣＬ２のＮ末端及びＣ末端の両方において、そして隣接する膜貫通領域内部に向けて、哺乳類種間で高度に保存される蛍光があるため（図１０Ａ〜Ｂ及び図１４参照）、本発明者等は現実的な目的のためには推定ヒトＯｒａｉ１ＥＣＬ２配列として採用するためには配列番号２の合理的サブセット１９８〜２３３位（即ち配列番号４）を選択している。しかしながら、本発明は如何なる特定の構造モデルにも依存しない。
【００５６】
「ポリペプチド」及び「蛋白」は本明細書においては互換的に使用し、そしてペプチド結合を介して共有結合しているアミノ酸２つ以上の分子鎖を包含する。用語は生成物の特定の長さを指すものではない。即ち「ペプチド」及び「オリゴマー」はポリペプチドの定義内に包含される。用語はポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化等を包含する。更に、蛋白フラグメント、類縁体、突然変異又は変異した蛋白、融合蛋白等もポリペプチドの意味内に包含される。
【００５７】
「単離された蛋白」という用語は、対象となる蛋白が、（１）自然界で通常共に観察される他の蛋白の少なくとも一部を伴っておらず、（２）同じ原料、例えば同じ種に由来する他の蛋白を本質的に伴っておらず、（３）非相同の種又は種類の細胞により組み換え発現され、（４）自然界で会合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、又は他の物質の少なくとも約５０％から分離されており、（５）自然界で会合していないポリペプチド作動可能に会合（共有結合又はノン共有結合の相互作用による）しており、及び／又は（６）自然界に存在しないことを意味する。典型的には、「単離された蛋白」は所定の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、又は少なくとも約５０％を構成する。合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ、又はこれらの何れかの組み合わせはそのような単離された蛋白をコードしてよい。好ましくは、単離された蛋白は、その治療上、診断上、予防上、研究上又は他の用途を妨害するその天然環境において観察される蛋白又はポリペプチド又は他の夾雑物を実質的に伴っていない。
【００５８】
ポリペプチド（例えば抗原結合蛋白又は抗体）の「変異体」は、他のポリペプチド配列と相対比較した場合に、アミノ酸残基１つ以上がアミノ酸配列内に挿入、そこから欠失及び／又はそこへ置換しているアミノ酸配列を含む。変異体は融合蛋白を包含する。  
【００５９】
「融合蛋白」という用語は蛋白が１つより多い親蛋白又はポリペプチドから誘導されたポリペプチド成分を包含することを意味する。典型的には、融合蛋白は、１つの蛋白に由来するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なる蛋白に由来するポリペプチド配列をコードする核酸と、インフレームに付随しており、そして場合により、それからのリンカーにより分離されている融合遺伝子から発現される。融合蛋白は次に、単一の蛋白として組み換え宿主細胞により発現されることができる。
【００６０】
「分泌された」蛋白とは、分泌シグナルペプチド配列の結果としてＥＲ、分泌小胞、又は細胞外空間に指向されることができる蛋白、並びにシグナル配列を必ずしも含有しない細胞外空間中に放出される蛋白を指す。分泌された蛋白が細胞外空間に放出されると、分泌蛋白は細胞外プロセシングを起こして「成熟」蛋白を生産することができる。細胞外空間への放出はエキソサイトーシスおよび蛋白分解的切断を包含する多くの機序により起こりえる。本発明の組成物の一部の他の実施形態においては、トキシンペプチド類縁体を分泌蛋白として宿主細胞により合成することができ、次にこれを細胞外空間及び／又は培地から更に精製できる。
【００６１】
本明細書においては、「可溶性の」とは、宿主細胞における組み換えＤＮＡ技術により生産される蛋白に言及している場合は、水溶液中に存在する蛋白であり；蛋白が２アルギニンシグナルアミノ酸配列を含有する場合は、可溶性蛋白はグラム陰性細菌宿主においてはペリプラズム空間にエキスポートされるか、又は分泌が可能な真核生物宿主により、又は適切な遺伝子（例えばｋｉｌ遺伝子）を保有する細菌宿主により、培地中に分泌される。即ち、可溶性蛋白は宿主細胞内部の封入体中には観察されない蛋白である。あるいは、文脈に応じて、可溶性蛋白は細胞膜中に組み込まれて観察される蛋白であり；これとは対照的に、不溶性蛋白は宿主細胞中の細胞質顆粒（封入体と称される）の内部の変性された形態として存在するものであり、或いは又、文脈に応じて、不溶性蛋白は細胞膜、例えば限定しないが、細胞質膜、ミトコンドリア膜、クロロプラスト膜、小胞体膜等の中に存在するものである。
【００６２】
「組み換え」という用語は、その物質（例えば核酸又はポリペプチド）が人間の介入により人工的に、又は合成により（即ち非天然に）改変されていることを示す。壊変はその物質に対して、その天然の環境又は状態の内部において、又はそれから脱離している状態で、実施できる。例えば、「組み換え核酸」は例えばクローニング、ＤＮＡ車夫リング又は他の良く知られた分子生物学的操作法の間に、核酸を組み換えることにより作成されるものである。そのような分子生物学的操作法の例はManiatis等、Molecular  Cloning.  A  Laboratory  Manual.  Cold  Spring  Harbour  Laboratory,  Cold  Spring  Harbour,  N.Y(1982)に記載されている。「組み換えＤＮＡ分子」は、このような分子生物学的技術により連結されたＤＮＡのセグメントから成る。「組み換え蛋白」又は「組み換えポリペプチド」という用語はは本明細書においては、組み換えＤＮＡ分子を使用しながら発現される蛋白分子を指す。「組み換え宿主細胞」は組み換え核酸を含有及び／又は発現する細胞である。
【００６３】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語はヌクレオチド残基２つ以上を含有する１本鎖および２本鎖のヌクレオチド重合体の両方を包含する。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド残基はリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチドの何れかの形の修飾された形態であることができる。該修飾は、塩基修飾、例えばブロモウリジンおよびイノシン誘導体、リボース修飾、例えば２’３’−ジデオキシリボース、およびヌクレオチド間連結修飾、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデートおよびホスホロアミデートを包含する。
【００６４】
「オリゴヌクレオチド」という用語は２００以下のヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドを意味する。一部の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基長である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０〜４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは例えば突然変異体遺伝子の構築における使用のためには１本鎖又は２本鎖であってよい。オリゴヌクレオチドはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。オリゴヌクレオチドは検出アッセイのために標識、例えば放射標識、蛍光標識、ハプテン又は抗原標識を包含できる。オリゴヌクレオチドは例えばＰＣＲプライマー、クローニングプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとして使用してよい。
【００６５】
「ポリヌクレオチド配列」又は「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」は、本明細書において互換的に使用される場合、文脈に応じて、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド残基、例えばオリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡ、核酸の一次配列、又はオリゴヌクレオチドの一次配列を示すキャラクターストリングである。何れかの特定のポリヌクレオチド配列に関して、所定の核酸又は相補ポリヌクレオチドの配列の何れかを決定できる。包含されるものは１本鎖又は２本鎖であり、センス又はアンチセンスの鎖を示してよいゲノム又は合成起源のＤＮＡ又はＲＮＡである。特段の記載が無い限り、本明細書で考察する何れかの１本鎖ポリヌクレオチド配列の左末端は５’末端であり；２本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の方向を５’方向と称する。ナセントＲＮＡ転写物の５’から３’の付加の方向を転写方向と称し；ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域を「上流配列」と称し；ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域を「下流配列」と称する。
【００６６】
本明細書においては、「単離された核酸分子」又は「単離された核酸配列」とは、（１）核酸の天然の原料において通常会合している少なくとも１つの夾雑核酸分子から識別および分離されているか、又は（２）目的の核酸配列が決定できるように、クローニング、増幅、タグ付け、又は別様にバックグラウンドの核酸から区別されているかの何れかである核酸分子である。単離された核酸分子は天然に観察される形態又は状況におけるものとは異なる。しかしながら単離された核酸分子は、例えば核酸分子が天然の細胞の染色体箇所とは異なる箇所にある、抗原結合蛋白（例えば抗体）を通常発現する細胞内に含有される核酸分子を包含する。
【００６７】
本明細書においては、「〜をコードする核酸分子」、「〜をコードするＤＮＡ配列」および「〜をコードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序又は配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序はｍＲＮＡ鎖に沿ったリボヌクレオチドの順序を決定し、そして更に、ポリペプチド（蛋白）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。すなわちＤＮＡ配列はＲＮＡ配列に関して、そしてアミノ酸配列に関してコードしている。
【００６８】
「遺伝子」という用語は生物学的機能に関連する何れかの核酸を指すために広範に使用される。遺伝子は典型的にはコーディング配列及び／又はそのようなコーディング配列の発現のために必要な調節配列を包含する。「遺伝子」という用語は特定のゲノム又は組み換え配列、並びにその配列によりコードされたｃＤＮＡ又はｍＲＮＡに適用される。「融合遺伝子」はトキシンペプチド類縁体をコードするコーディング領域を含有する。遺伝子は又、例えば他の蛋白に関する認識配列を形成する非発現の核酸セグメントを包含する。隣接又は近傍の転写因子のような調節蛋白が結合して配列の転写をもたらす転写制御エレメントを包含する非発現調節配列である。
【００６９】
「遺伝子の発現」又は「核酸の発現」とは文脈により示されるとおり、ＤＮＡからＲＮＡへの転写（場合によりＲＮＡの修飾、例えばスプライシングを包含する）、ＲＮＡからポリペプチドへの翻訳（その後のポリペプチドの翻訳後修飾を包含する場合がある）、又は転写と翻訳の両方を意味する。
【００７０】
本明細書においては、「コーディング領域」又は「コーディング配列」という用語は、構造遺伝子に言及して使用する場合、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果としてナセントのポリペプチド中に存在するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。コーディング領域は、真核生物においては、イニシエーターのメチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」により５’側で、そして、終止コドンを特定する３つのトリプレット（即ちＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）の１つにより３’側で、結合している。
【００７１】
「制御配列」又は「制御シグナル」という用語は特定の宿主細胞において、それがライゲーションしているコーディング配列の発現およびプロセシングに影響することができるポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は宿主生物に依存する場合がある。特定の実施形態において、原核生物の制御配列はプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列を包含してよい。真核生物の制御配列は、転写因子のための認識部位１つ又は複数を含むプロモーター、転写エンハンサー配列又はエレメント、ポリアデニル化部位、および転写終止配列を包含してよい。制御配列はリーダー配列及び／又は融合相手の配列を包含できる。プロモーターおよびエンハンサーは転写に関与する細胞性蛋白と特異的に相互作用するＤＮＡの短いアレイよりなる(Maniatis,等、Science  236:1237(1987)）。プロモーターおよびエンハンサーのエレメントはコウボ、昆虫および哺乳類細胞およびウィルスにおける遺伝子を包含する種々の真核生物原料から単離されている（類似の制御エレメント、即ち、プロモーターは原核生物にも観察されている）。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は目的の蛋白を発現させるためにどの細胞型を使用するかによる。一部の真核生物プロモーターおよびエンハンサーは広範な宿主範囲を有するのに対し、他のものは細胞型の限定されたサブセットにおいて機能する(検討するには例えばVoss,等、Trends  Biochem.  Sci.,  11:287(1986)  and  Maniatis,等、Science  236:1237(1987)参照）。
【００７２】
「ベクター」という用語は宿主細胞内に蛋白コーディング情報を転移するために使用される何れかの分子又は実体（例えば核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウィルス）を意味する。
【００７３】
「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」という用語は本明細書においては、所望のコーディング配列および特定の宿主細胞において作動可能に連結されたコーディング配列の発現のために必要な適切な核酸制御配列を含有する組み換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは転写、翻訳に影響し、そして、イントロンが存在する場合は、それに作動可能に連結したコーディング領域のＲＮＡスプライシングに影響する、配列を包含するが、これに限定されない。真核生物における発現のために必要な核酸配列はプロモーター、場合によりオペレーター配列、リボソーム結合部位および恐らくは他の配列を包含する。真核生物の細胞はプロモーター、エンハンサー、および終止およびポリアデニル化シグナルを利用することがわかっている。分泌シグナルペプチド配列は又、場合により、所望により細胞から目的のポリペプチドのより効率的な単離のために、発現されたポリペプチドが組み換え宿主により分泌されるように、目的のコーディング配列に作動可能に連結した発現ベクターによりコードされることができる。そのような手法は当該分野で良く知られている（例えば
Goodey,  Andrew  R.;等、Peptide  and  DNA  sequences,  米国特許5,302,697;Weiner
et  al.,  Compositions  and  methods  for  protein  secretion,  米国特許6,022,952  and  米国特許 6,335,178;Uemura等、Protein  expression  vector  and  utilization  thereof,  米国特許 7,029,909;Ruben等、27  human  secreted  proteins,  US  2003/0104400  A1参照）。
【００７４】
「作動可能な組み合わせにおいて」、「作動可能な順序において」及び「作動可能に連結下」という用語は、本明細書においては、所定の遺伝子の転写及び／又は所望の蛋白分子の合成を指向することができる核酸分子が生産されるような態様における核酸配列の連結を指す。用語は又、機能的蛋白が生産されるような態様におけるアミノ酸配列の連結も指す。例えば、蛋白コーディング配列に「作動可能に連結」したベクター中の制御配列は、蛋白コーディング配列の発現が制御配列の転写活性に適合した条件下に達成されるようにそれにライゲーションされる。
【００７５】
「宿主細胞」という用語は核酸により形質転換されているか、形質転換されることが可能であり、そしてそれにより目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。用語は、親細胞の子孫が形態又は遺伝子的な成り立ちにおいて元の親細胞と同一であるか否かに関わらず、目的の遺伝子が存在する限り、この子孫も包含する。多くの入手可能でよく知られている宿主細胞を本発明の実施において使用してよい。特定の宿主の選択は当該分野により認識されている多くの要因に応じたものとなる。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によりコードされているペプチドの毒性、形質転換率、ペプチドの回収し易さ、発現特性、生物安全性及び費用が包含される。これらの要因のバランスは、特定のＤＮＡ配列の発現のために全ての宿主が等しく効果的ではないという理解と合致している。これらの一般的指針の内部において、培養における有用な微生物宿主細胞は細菌（例えばエシェリシア・コリ・エスピー）、コウボ（例えばサッカロマイセス・エスピー）及び他のカビ細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類（ヒトを包含する）の細胞、例えばＣＨＯ細胞、及びＨＥＫ−２９３細胞を包含する。修飾はＤＮＡレベルにおいても行ってよい。ペプチドコードＤＮＡ配列は選択された宿主細胞とより適合するコドンに変更してよい。Ｅ．ｃｏｌｉに関しては、最適化されたコドンが当該分野で知られている。コドンは制限部位を排除するため、サイレントな制限部位を包含するために置き換えることができ、これにより選択された宿主細胞中のＤＮＡのプロセシングに役立つ場合がある。次に、形質転換された宿主を培養して精製する。宿主細胞は所望の化合物が発現されるように従来の発酵条件下に培養してよい。そのような発酵条件は当該分野で良く知られている。
【００７６】
「トランスフェクション」という用語は細胞による外来性又は外因性のＤＮＡの取り込みを意味し、そして外因性のＤＮＡが細胞膜の内部に導入されているときに、細胞は「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術が当該分野で良く知られており、本明細書において開示されている。例えばGraham等、1973,  Virology  52:456;Sambrook等、2001,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,上出;Davis等、1986,  Basic  Methods  in  Molecular  Biology,  Elsevier;Chu等、1981,  Gene  13:  197を参照できる。そのような手法は１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適当な宿主細胞に導入するために使用できる。
【００７７】
「形質転換」という用語は細胞の遺伝子的特徴に置ける変化を指し、そして細胞はそれが新しいＤＮＡ又はＲＮＡを含有するように修飾されているときに形質転換されている。例えばトランスフェクション、トランスダクション又は他の手法を介して新しい遺伝子的物質を導入することにより自身のネイティブの状態から遺伝子的に修飾される場合に細胞は形質転換される。形質転換又はトランスダクションの後、形質転換ＤＮＡは細胞の染色体内への物理的組み込みにより細胞のものとの組み換えを行ってよく、又は、複製されることなくエピソームのエレメントとして一過性に維持されても良く、又はプラスミドとして独立して複製されても良い。細胞の分裂に伴って形質転換ＤＮＡが複製されるときに、細胞は「安定に形質転換」されていると見なされる。
【００７８】
要件の組成物の「生理学的に許容される塩」、例えば抗体のような抗原結合蛋白の塩とは、製薬上許容しうることが知られているか、後に判明する何れかの塩を意味する。製薬上許容しうる蛋白の非限定的な例は酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；ハロゲン化水素の塩、例えば塩酸塩及び臭化水素酸塩；硫酸塩；クエン酸塩;マレイン酸塩;酒石酸塩；グリコール酸塩；グルコン酸塩；コハク酸塩；メタンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩；没食子酸エステルの塩（没食子酸は３、４、５−トリヒドロキシ安息香酸としても知られている）、例えばペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）及びエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、コレステリルスルフェートの塩、パモ酸塩、タンニン酸塩及びシュウ酸塩である。
【００７９】
蛋白の「ドメイン」又は「領域」（本明細書においては互換的に使用する）とは、完全な蛋白に至るまで、ただし典型的には完全な蛋白未満を含む、全蛋白の何れかの部分である。ドメインは、蛋白鎖の残余とは無関係に非必然的に折り重なることができ、及び／又は、特定の生物学的、生化学的、又は構造的な機能又は箇所（例えば、リガンド結合ドメイン、又はシトゾル、膜貫通又は細胞外ドメイン）に相関することができる。
【００８０】
「治療」又は「治療する」とは障害の発生防止又は病理改変の意図により実施される介入である。従って、「治療」とは施療的治療及び予防的又は防止的な手段の両方を指す。治療を要する者は既に障害を有する者、並びに、障害を防止すべき者を包含する。「治療」は傷害、病理又は状態の緩解における奏功の何れかの徴候、例えば何れかの他覚的又は自覚的なパラメーター、例えば減退；軽快；症状の減衰又は傷害、病理又は状態を患者にとってより耐容可能なものとすること；変質又は低下の速度を緩徐化すること;変質の終点をより低衰弱性のものとすること；患者の身体的又は精神的な安寧を向上させることを包含する。症状の治療又は緩解は、他覚的又は自覚的なパラメーター；例えば身体検査の結果、患者の自己報告、神経精神科的検査、及び／又は精神科的評価に基づくことができる。
【００８１】
「有効量」とは一般的に、症状の重症度及び／又は頻度を低減し、症状及び／又は伏在する原因を排除し、症状及び／又はその伏在する原因の発生を防止し、及び／又は、偏頭痛に起因するか、又は関連する損傷を改善又は救済するために十分な量である。一部の実施形態においては、有効量は治療有効量又は予防有効量である。「治療有効量」は疾患の状態（例えば移植物拒絶、即ちＧＶＨＤ）又は症状、特に疾患状態に関連する状態又は症状を矯正するか、別様に、何れかの方法において疾患状態又は疾患に関連する何れかの他の望ましくない症状の進行を防止、遮蔽、遅滞又は逆行させる（即ち「治療効果」をもたらす）ために十分な量である。「予防有効量」とは、対象に投与した場合に、意図する予防的作用、例えば偏頭痛の発症（又は再発）を防止又は遅延すること、又は、偏頭痛の発症（又は再発）の尤度又は偏頭痛の症状を低減することができる、医薬組成物の量である。完全な治療的又は予防的作用は１用量の投与により生じる必要はなく、そして一連の用量の投与後にのみ生じてよい。即ち、治療又は予防有効量は１回以上の投与において投与してよい。
【００８２】
治療目的のための「哺乳類」とは、哺乳類と分類される何れかの動物、例えばヒト、家畜及び牧場動物、及び動物園、競技用、又は愛玩用の動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、マウス、サル等を包含する。好ましくは、哺乳類はヒトである。好ましくは哺乳類はヒトである。
【００８３】
「天然に存在する」とは、ポリペプチド、核酸、宿主細胞等のような生物学的物質との関連において明細書を通じて使用する場合、天然に観察される物質を指す。
【００８４】
「抗体」という用語は最も広範な意味において使用され、そして完全に組み立てられた抗体、モノクローナル抗体（ヒト、ヒト化又はキメラの抗体を包含する）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の生物学的活性を呈する限りにおいて、上記した相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗原に結合できる抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディー）を包含する。未損傷の分子又はフラグメントの多量体又は凝集物、例えば化学的に誘導体化された抗体を意図している。何れかのアイソタイプクラス又はサブクラスの抗体、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２、又は何れかのアロタイプが意図される。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有し；例えばＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプは典型的には抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を有する。グリコシル化及び未グリコシル化抗体は「抗体」という用語に包含される。
【００８５】
「抗原結合蛋白」（ＡＢＰ）という用語は上記定義した抗体及び抗体フラグメント、及び、所望の抗原結合特性を有するＣＤＲから誘導された配列を含有することにより自身が目的の標的抗原に特異的に結合できるようになった組み換えペプチド又は他の化合物を包含する。
【００８６】
一般的に、抗原結合蛋白、例えば抗体又は抗体フラグメントは、それが、同じ結合アッセイ条件下に他の未関連の蛋白に対するその親和性と比較して、ある抗原に対して有意に高値の結合親和性を有し、そしてその結果、それを区別することができる場合に、その抗原に「特異的に結合する」。典型的には、抗原結合蛋白は平衡解離定数（Ｋｄ）が≦１０−８Ｍである場合にその標的抗原に「特異的に結合すると言われる。抗体はＫｄが≦５ｘ１０−９Ｍである場合に「高い親和性」で、そして、Ｋｄが≦５ｘ１０−１０Ｍである場合に「極めて高い親和性」で抗原に特異的に結合する。１つの実施形態において、抗体は約１０−８Ｍと１０−１０Ｍの間のＫｄでヒトＯｒａｉ１に結合することになり、そして更に別の実施形態においては抗体は、Ｋｄ≦５ｘ１０−９で結合することになる。本発明の抗原結合蛋白の特定の実施形態においては、単離された抗原結合蛋白は、Rathanaswami等(2008)の方法により実施する速度論的排除アッセイにおいて測定した場合に５００ｐＭ（５．０ｘ１０−１０Ｍ）以下、２００ｐＭ（２．０ｘ１０−１０Ｍ）以下、１５０ｐＭ（１．５０ｘ１０−１０Ｍ）以下、１２５ｐＭ（１．２５ｘ１０−１０Ｍ）以下、１０５ｐＭ（１．０５ｘ１０−１０Ｍ）以下、５０ｐＭ（５．０ｘ１０−１１Ｍ）以下、又は２０ｐＭ（２．０ｘ１０−１１Ｍ）以下のＫｄで哺乳類細胞（例えばＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、Ｊｕｒｋａｔ）により発現された配列番号２に特異的に結合する（Rathanaswami等、High  affinity  binding  measurements  of  antibodies  to  cell-surface-expressed  antigens,  Analytical  Biochemistry  373:52-60(2008;例えば本明細書の実施例１５参照）。
【００８７】
本発明の抗原結合蛋白、例えば抗体又は抗体フラグメントは、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）アッセイシステムにおいて、ヒトＯｒａｉ１ポリペプチド（配列番号２）に「特異的に結合している」か「特異的に結合し」、及び／又は、配列番号４（配列番号２のアミノ酸残基１９８〜２３３）に「特異的に結合し」、及び／又は（ｉ）配列番号２１０；又は（ｉｉ）配列番号２０４；又は（ｉｉｉ）配列番号１９２；又は（ｉｖ）配列番号１２９；又は（ｖ）配列番号１０３よりなるアミノ酸配列を有するポリペプチドに「特異的に結合」する。まず、哺乳類宿主細胞、例えばＣＨＯ（例えばＡＭ−１−ＣＨＯ）、ＨＥＫ−２９３（例えばＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ又はＨＥＫ−２９３Ｔ）、Ｕ２ＯＳ又は他のトランスフェクト可能な哺乳類細胞型を、標的配列が宿主細胞表面で発現されるように、本パラグラフに記載した標的アミノ酸配列の１つをコードする作動可能に連結したコーディング配列及び特定の宿主細胞におけるその作動可能に連結したコーディング配列の発現のために必要な適切な核酸制御配列を含有する組み換えＤＮＡ分子を包含する発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ５／ＴＯ又はｐｃＤＮＡ３．１）で（安定に又は一過性に）トランスフェクトする。トランスフェクションの４８時間以内に宿主細胞を採取し、氷冷した１ＸＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸塩緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ；０．９０１ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（無水）、０．４９３ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ）、２．６７ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４７ｍＭ１塩基性リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１３７．９３塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及び８．０６ｍＭ２塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰ０４−７Ｈ２Ｏ））、ｐＨ７．２で１回洗浄し、そして氷冷したＦＡＣＳ緩衝液（１ＸＤ−ＰＢＳ＋２％ヤギ血清）中、２ｘ１０５個／１００μｌの濃度となるように再懸濁する。以下の抗体インキュベーション工程の全ては１時間氷上で実施する。即ち、（ａ）細胞を先ず未標識の被験抗原結合蛋白（ＡＢＰ；例えば抗体又は抗体フラグメント）１μｇと共にインキュベートし、その後ＦＡＣＳ緩衝液２００μＬで洗浄する；（ｂ）（ａ）における未標識の被験ＡＢＰ（例えば抗体又は抗体フラグメント）を次にＡＢＰの検出に適する標識された二次抗体、例えばヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ−フィコエリスリン（ＰＥ）（又はフルオレセインイソチオシアネート［ＦＩＴＣ］−標識）又は抗ヒトＩｇＧ−フィコエリスリン（又はＦＩＴＣ標識）を用いて検出し、その後氷冷ＦＡＣＳ緩衝液２００μＬで洗浄し、その後何れかの適当なＦＡＣＳ機を用いて２時間以内にフローサイトメトリー分析を行う。自身に対する二次標識抗体が容易に入手できる免疫グロブリン形（例えばマウスＩｇＧ又はヒトＩｇＧ）のＡＢＰではない場合、サンドイッチアッセイを使用することができ、その場合、ＡＢＰに特異的に結合する二次抗体（又は抗体フラグメント；例えばヤギ抗ＡＢＰ抗体）と共に１時間インキュベートした後、更に氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、その後、最終的な１時間のインキュベーションを二次（ここでは三次）標識抗体と共に行い、その後、更に氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄することによ���未結合の標識抗体を除去し、新しい氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に細胞を再懸濁し、そして適当なＦＡＣＳ可能な機器（例えばＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭＩＩ、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭ［ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ］；又はＣｙｔｏｍｉｃｓＦＣ５００［Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ］）を用いて蛍光検出する。以下の陰性対象、即ち：（１）未染色細胞（二次標識抗体非含有ＦＡＣＳ緩衝液と共にインキュベート）；（２）検出抗体で染色した細胞（即ち、被験ＡＢＰ非含有ＦＡＣＳ緩衝液と共に１時間インキュベートした後に二次標識抗体と共にインキュベート）；及び（３）使用した発現ベクター系でトランスフェクトした宿主細胞は、標的コーディング配列の非存在下に処理し、それ以外は被験ＡＢＰ及び二次／三次標識抗体と共にインキュベートする。追加的な陰性対照も適宜使用できる。自身の表面に発現ベクターにより含有される作動可能に連結したＤＮＡによりコードされる配列番号９７よりなるアミノ酸配列を有する組み換え蛋白及び配列番号３３よりなるアミノ酸配列を有する２つの免疫グロブリン重鎖及び配列番号３１よりなるアミノ酸配列を有する２つの免疫グロブリン軽鎖を有する組み換えｍＡｂ２Ｄ２．１を発現するようにトランスフェクトされた上記使用のものと同じ哺乳類宿主細胞を、本明細書に記載した良く知られた組み換え手法により作成して精製した（例えば実施例４及びCabilly等、Methods  of  producing  immunoglobulins,  vectors  and  transformed  host  cells  for  use  therein,  米国特許６、３３１、４１５を参照）。相対蛍光強度（ＲＦＩ）の値をＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）又はＦＡＣＳ分析に適する別のソフトウエアパッケージを用いて計算し、そして平均値は対数変換データを用いて計算した（幾何平均）。対象のパーセントとしてのＲＦＩ（ＲＦＩ−ＰＯＣ）値は特定の試料キメラに結合する特定のｍＡｂの幾何平均（Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ）のアルゴリズム（本明細書実施例８のアルゴリズム１）を用いた相対蛍光強度ＧｅｏＭｅａｎからｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラに結合するｍＡｂのＧｅｏＭｅａｎで割った未染色細胞及び直接標識二次抗体のみ（陰性対照）の平均ＧｅｏＭｅａｎを引いたものに１００をかけてパーセントとしたものとして計算した。陽性対照の１％以上のＲＦＩ−ＰＯＣとの結合を「特異的結合」と見なす。
【００８８】
一部の実施形態においては、本発明の抗原結合蛋白（例えば抗体又は抗体フラグメント）は１％〜５％未満のＲＦＩ−ＰＯＣ値を有する。他の実施形態において、本明細書の抗原結合蛋白は５％〜４０％未満のＲＦＩ−ＰＯＣ値を有する。さらに他の実施形態において、本発明の抗原結合蛋白は４０％以上のＲＦＩ−ＰＯＣを有する。
【００８９】
例えば本発明の抗原結合蛋白は配列番号２のアミノ酸配列よりなるポリペプチド中の配列番号４（配列番号２の１９８〜２３３のアミノ酸配列を有するヒトＯｒａｉ１ＥＣＬ２）に特異的に結合するが、マウス又はラットのＯｒａｉ１とは、或いはヒトＯｒａｉ２又はヒトＯｒａｉ３とは有意には交差反応しない。一部の実施形態においては、抗原結合蛋白は他の哺乳類種、例えば霊長類のＯｒａｉ１、例えばカニクイザルのＯｒａｉ１；又はイヌのＯｒａｉ１とは交差反応するが、別の実施形態においては抗原結合蛋白はヒト又は霊長類Ｏｒａｉ１にのみ結合し、他の哺乳類Ｏｒａｉ１には有意に結合しない。
【００９０】
「抗原結合領域」又は「抗原結合部位」とは特定の抗原に特異的に結合する蛋白の部分を意味する。例えば、抗原と相互作用し、そして抗原結合蛋白にその抗原に対する特異性及び親和性を付与するアミノ酸残基を含有する抗原結合蛋白のその部分は、「抗原結合領域」と称される。抗原結合領域は典型的には１つ以上の「相補性結合領域」（「ＣＤＲ」）を包含する。特定の抗原結合領域は又１つ以上の「フレームワーク」領域（「ＦＲ」）を包含する。「ＣＤＲ」は抗原結合の特異性及び親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は抗原結合領域と抗原の間の結合を促進するＣＤＲの適正なコンホーメーションを維持することに役立っている。
【００９１】
「単離された」抗原結合蛋白又は抗体は、その天然の環境又はそれが産生細胞により分泌されている培地の１つ以上の成分から識別及び分離されているものである。その天然の環境又は培地の「夾雑物」成分は抗体の診断上又は治療上の使用を妨害すると思われる物質であり、そして酵素、ホルモン及び他の蛋白性又は非蛋白性の溶質を包含してよい。一部の実施形態においては、抗体は（１）抗体９５重量％超、そして最も好ましくは９９重量％超まで、又は（２）還元条件下、場合により染色、例えばクーマシーブルー又は銀染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性にまで、精製されることになる。単離された天然に存在する抗体は、抗体の天然の環境の成分少なくとも１つが存在しないことになることから、組み換え細胞内部のインサイチュの抗体を包含する。しかしながら、典型的には、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製されることになる。
【００９２】
「モノクローナル抗体」という用語は本明細書においては、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、即ち、集団に含まれる個々の抗体は些少な量において存在する場合がある可能性として天然に生じる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は種々異なるエピトープに対して指向された種々異なる抗体を典型的には包含するポリクローナル抗体調製品とは対照的に、高度に特異的であり、個々の抗原部位又はエピトープに対して指向されている。モノクローナル抗体の非限定的な例はネズミ、ウサギ、ラット、ニワトリ、キメラ、ヒト化、又はヒトの抗体、完全に組み立てられた抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、抗原に結合できる抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディー）、マキシボディー、ナノボディー、所望の生物学的活性を呈する限りにおいて上記したＣＤＲを含む組み換えペプチド、又はその変異体又は誘導体を包含する。
【００９３】
形容詞「モノクローナル」は抗体の実質的に均質な集団から得られているものとしての抗体の特徴を示すものであって、何れかの特定の方法による抗体の生産を要求するものと捕らえてはならない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohler等、Nature,  256:495  [1975]によって最初に報告されたハイブリドーマ法により作成してよく、又は、組み換えＤＮＡ法（例えば米国特許４、８１６、５６７参照）により作成しても良い。「モノクローナル抗体」は例えばClackson等、Nature,352:624-628[1991]及びMarks等、J.  Mol.Biol.,  222:581-597(1991)に記載の手法を用いてファージ抗体ライブラリから単離しても良い。  
【００９４】
「多重特異性」結合剤又は抗原結合蛋白又は抗体は１つより多い抗原又はエピトープをターゲティングするものである。
【００９５】
「二重特異性」、「デュアル特異性」又は「２官能性」の結合剤又は抗原結合蛋白又は抗体は２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッドである。２抗原結合蛋白、抗原結合蛋白及び抗体は多重抗原結合蛋白、抗原結合蛋白又は多重特異性抗体の１種であり、そして、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’フラグメントの連結を包含するがこれらに限定されない種々の方法により生産してよい。例えばSongsivilai  and  Lachmann,  1990,  Clin.  Exp.  Immunol.  79:315-321;Kostelny等、1992,  J.  Immunol.  148:1547-1553を参照できる。二重特異性抗原結合蛋白又は抗体の２つの結合部位は同じか又は異なる蛋白標的上に存在する場合がある２つの異なるエピトープに結合することになる。
【００９６】
「免疫グロブリン」又は「ネイティブ抗体」とは４量体糖蛋白である。天然に存在する免疫グロブリンにおいては、各４量体はポリペプチド鎖の同一な対２つよりなり、各対は、約２２０アミノ酸（約２５ｋＤａ）の「軽」鎖１つ、及び、約４４０アミノ酸（約５０〜７０ｋＤａ）の「重」鎖１つを有する。各鎖のアミノ末端部分は抗原認識を主に担っている約１００〜１１０以上のアミノ酸の「可変」（「Ｖ」）領域を包含する。各鎖のカルボキシ末端はエフェクター機能を主に担っている定常領域を定義する。可変領域は異なる抗体の間では異なっており、定常領域は異なる抗体の間でも同じである。各重鎖又は軽鎖の可変領域内部において、抗原に対する抗体の特異性を決定する場合に役立つ超可変サブ領域３つが存在する。超可変領域の間の可変ドメイン残基はフレームワーク残基と呼ばれ、一般的には異なる抗体間である程度相同である。免疫グロブリン葉それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに帰属させることができる。ヒト軽鎖はカッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖に分類される。軽鎖及び重鎖の内部において、可変領域及び定常領域は約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により接合されており、重鎖は更に約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を包含する。一般的にFundamental  Immunology,  Ch.  7(Paul,  W.,  ed.,  2nd  ed.  Raven  Press,  N.Y.(1989))を参照できる。
【００９７】
「軽鎖」又は「免疫グロブリン軽鎖」という用語は結合特異性を付与するための十分な可変領域配列を有する完全長の軽鎖及びそのフラグメントを包含する。完全長の軽鎖は可変領域ドメインＶＬ、及び定常領域ドメインＣＬを包含する。軽鎖の可変領域ドメインはポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖はカッパ鎖及びラムダ鎖を包含する。  
【００９８】
「重鎖｝又は「免疫グロブリン重鎖」という用語は結合特異性を付与するための十分な可変領域配列を有する完全長の重鎖及びそのフラグメントを包含する。完全長の重鎖は可変領域ドメインＶＨ、及び３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を包含する。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端に有り、そしてＣＨドメインはカルボキシル末端に有り、そしてＣＨ３はポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖はミュウ（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、及びイプシロン（ε）に分類され、そして抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義する。本発明の別個の実施形態においては、重鎖はＩｇＧ（例えばＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ（例えばＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブタイプ）、ＩｇＭ及びＩｇＥを包含する何れかのアイソタイプのものであってよい。これらのうち幾つかは更にサブクラス又はアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分割される場合がある。異なるＩｇＧアイソタイプは異なるエフェクター機能（Ｆｅ領域により媒介される）、例えば抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を有する場合がある。ＡＤＣＣにおいて、抗体のＦｃ領域はナチュラルキラー及びマクロファージのような免疫エフェクター細胞の表面上のＦｃ  受容体（ＦｃγＲｓ）に結合し、ターゲティングされた細胞の貪食作用又は溶解をもたらす。ＣＤＣにおいては、抗体は細胞表面の補体カスケードをトリガーすることによりターゲティングされた細胞を殺傷する。
【００９９】
「Ｆｃ領域」は抗体のＣＨ１及びＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含有する。２つの重鎖フラグメントは２つ以上のジスルフィド結合により、そしてＣＨ３ドメインの疎水的相互作用により相互に保持される。
【０１００】
「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボの血清中半減期の増大を担うＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【０１０１】
「アロタイプ」とは免疫原性であることができ、そしてヒトにおける特定の対立遺伝子によりコードされる頻繁には定常領域における抗体配列の変動である。アロタイプはヒト５つのヒトＩＧＨＣ遺伝子、即ちＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＡ２及びＩＧＨＥ遺伝子に関して識別されており、そしてそれぞれＧ１ｍ、Ｇ２ｍ、Ｇ３ｍ、Ａ２ｍ、及びＥｍアロタイプと標記される。少なくとも１８個のＧｍアロタイプ、即ち：ｎＧ１ｍ（１）、ｎＧ１ｍ（２）、Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）又はＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）又はＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ５、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）が知られている。２つのＡ２ｍアロタイプＡ２ｍ（１）及びＡ２ｍ（２）が存在する。
【０１０２】
構造の詳細な説明及び抗体の形成に関しては、参照により全体が本明細書に組み込まれるRoth,  D.B.,  and  Craig,  N.L.,  Cell,  94:411-414(1998)を参照できる。要すれば、重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡを形成するためのプロセスは主にＢ細胞の発生において起こる。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの再配置及び接合の前には、Ｖ、Ｄ、Ｊ及び定常（Ｃ）遺伝子セグメントは一般的に単一の染色体上の相対的近接部において観察される。Ｂ細胞分化の間、Ｖ、Ｄ、Ｊ（又は軽鎖遺伝子の場合はＶ及びＪのみ）遺伝子セグメントの適切なファミリーメンバーの各々の１つを組み換えて重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子の機能的に再アレンジされた可変領域を形成する。この遺伝子セグメントの再アレンジのプロセスは逐次的であると考えられる。まず、重鎖のＤ−ｔｏ−Ｊの接合部を作成し、その後、重鎖のＶ−ｔｏ−ＤＪの接合部及び軽鎖のＶ−ｔｏ−Ｊの接合部を作成する。Ｖ、Ｄ及びＪセグメントの再アレンジに加えて、軽鎖のＶ及びＪセグメントが接合している、そして重鎖のＤ及びＪセグメントが接合している箇所における可変な組み換えにより、更なる多様性を免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の一次レパートリーにおいて発生させる。軽鎖におけるこのような変更は典型的にはＶ遺伝子セグメントの最後のコドン及びＪセグメントの最初のコドンの内部において起こる。同様の接合における不正確さは、Ｄ及びＪＨセグメントの間の重鎖染色体上で起こり、そして１０ヌクレオチドまでの多数に渡り伸長する。更に又、ゲノムＤＮＡによりコードされていない数個のヌクレオチドをＤとＪＨの間、及びＶＨとＤ遺伝子セグメントの間に挿入してよい。これらのヌクレオチドの付加はＮ領域多様性として知られている。可変領域遺伝子セグメントのこのような再アレンジ及びそのような接合の間に起こる場合のある可変の組み換えの実質的な影響は、一次抗体レパートリーの生成である。
【０１０３】
「超可変」領域とは、抗原結合を担っている抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は相補性決定領域即ちＣＤＲに由来するアミノ酸残基を含む［即ち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）、Kabat等、Sequences  of  Proteins  oflmmunological  Interest,  5th  Ed.  Public  Health  Service,  National  Institutes  of  Health,  Bethesda,  Md.(1991)参照]。単一のＣＤＲは、全てのＣＤＲを含有する全抗原結合部位よりも低値の親和性を有するが、しかしなお抗原を認識して結合する。
【０１０４】
超可変「ループ」由来の残基の代替の定義は軽鎖可変ドメインにおける２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインにおける２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）の残基としてChothia等、J  Mol.Biol.  196:  901-917(1987)  に記載されている。
【０１０５】
「フレームワーク」即ち「ＦＲ」の残基は超可変領域残基以外の可変領域残基である。
【０１０６】
「抗体フラグメント」は未損傷の完全長の抗体の部分、好ましくは未損傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディー；線状抗体(Zapata等、Protein  Eng.,8(10):1057-1062(1995));単鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性を包含する。
【０１０７】
抗体のパパイン消化は各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」と称される２つの同一の抗原結合フラグメント、及び定常領域を含有する残余の「Ｆｃ」フラグメントを生じさせる。Ｆａｂフラグメントは全ての可変ドメイン、並びに軽鎖の定常ドメイン、および重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆｃフラグメントは炭水化物をディスプレイし、そして抗体の１つのクラスを別のものから区別する多くの抗体エフェクター機能（例えば相補体及び細胞受容体への結合）を担っている。
【０１０８】
ペプシン処理は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む「単鎖Ｆｖ」即ち「ｓｃＦｖ」抗体フラグメント２つを有するＦ（ａｂ’）２フラグメントをもたらし、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。Ｆａｂフラグメントは抗体のヒンジ領域に由来するシステイン１つ以上を包含する重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数個の追加的残基の包含により、Ｆａｂ’フラグメントとは異なっている。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは更に、抗原結合のための所望の構造をＦｖが形成できるようにするためのＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含んでいる。ｓｃＦｖの考察に関しては
Pluckthun  in  The  Pharmacology  of  Monoclonal  Antibodies,  vol.  113,  Rosenburg  and  Moore  eds.,  Springer-Verlag,  New  York,  pp.  269-315(1994)を参照できる。
【０１０９】
「Ｆａｂフラグメント」は軽鎖１つ及びＣＨ１及び重鎖１つの可変領域よりなる。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
【０１１０】
「Ｆａｂ’フラグメント」は、鎖間ジスルフィド結合が２つのＦａｂ’フラグメントの２つの重鎖の間に形成されてＦ（ａｂ’）２分子が形成できるように、軽鎖１つ及び及びＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン及びＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の領域を含有する重鎖１つの部分を含有する。
【０１１１】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は重鎖２つの間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように軽鎖２つ及びＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の定常領域の部分を含有する重鎖２つを含有する。即ち、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは重鎖２つの間のジスルフィド結合により相互に保持された２つのＦａｂ’フラグメントより成る。
【０１１２】
「Ｆｖ」は完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。この領域は堅固な非共有結合の会合状態にある１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインの２量体よりなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲがＶＨＶＬ２量体の表面上の抗原結合部位を定義するように相互作用するのはこの配置においてである。  単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的なＣＤＲ３つのみを含むＦｖの半分）は、全結合部位よりも低い親和性においてであるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【０１１３】
「単鎖抗体」は重鎖と軽鎖の可変領域がフレキシブルリンカーにより連結されることにより単一のポリペプチド鎖が形成され、これが抗原結合領域を形成するＦｖ分子である。単鎖抗体は国際特許出願公開ＷＯ８８／０１６４９及び米国特許４、９４６、７７８及び５、２６０、２０３において詳細に考察されており、その開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
「単鎖Ｆｖ」即ち「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含んでおり、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在し、そして場合により抗原結合のための所望の構造をＦｖが形成できるようにするためのＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含んでいる(Bird等、
Science  242:423-426,  1988,  及びHuston等、Proc.Natl.Acad.Sci.  USA85:  5879-5883,1988）。「Ｆｄ」フラグメントはＶＨ及びＣＨ１ドメインよりなる。
【０１１５】
「ダイアボディー」という用語は２つの抗原結合部位を有する小型の抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは同じポリペプチド鎖（ＶＨＶＬ）中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の上の２つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは別の相補ドメインと強制的に対形成させられて２つの抗原結合部位を生じる。ダイアボディーはより詳細には例えばＥＰ４０４、０９７；国際特許出願ＷＯ９３／１１１６１;及びHollinger等、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  90:6444-6448(1993)に記載されている。
【０１１６】
「ドメイン抗体」は重鎖の可変領域又は軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントである。一部の例においては２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーと共有結合により接合することにより２価ドメイン抗体を形成する。２価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は同じか又は異なる抗原をターゲティングして良い。
【０１１７】
「競合する」という用語は、同じエピトープに対して競合する抗原結合蛋白（例えば中和抗原結合蛋白又は中和抗体）の文脈において使用する場合は、抗原結合蛋白の間の競合を意味し、試験に付されている抗原結合蛋白（例えば抗体又は免疫学的に機能性のそのフラグメント）が共通の抗原（例えばｈＯｒａｉ１又はそのフラグメント）へのレファレンス抗原結合蛋白（例えばリガンド、又はレファレンス抗体）の特異的結合を防止又は阻害するアッセイにおいて測定される。多くの種類の競合結合アッセイ、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えばStahli等、1983,  Methods  in  Enzymology  9:242-253参照）;固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えばKirkland等、1986,  J.  Immunol.  137:3614-3619)  、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えばHarlow  and  Lane,  1988,  Antibodies,  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Press参照）;Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識RIA（例えばMorel等、1988,  Molec.  Immunol.  25:7-15参照）;固相直接ビオチン−アビジンEIA（例えばCheung,等、1990,  Virology  176:546-552参照);及び直接標識RIA（Moldenhauer等、1990,  Scand.  J.  Immunol.  32:77-82)を使用できる。典型的には、そのようなアッセイでは、固体表面に結合した精製された抗原又はこれらの何れかを担持した細胞、未標識の被験抗原結合蛋白及び標識されたレファレンス抗原結合蛋白を使用する。競合的阻害は被験抗原結合蛋白の存在下に、固体表面又は細胞に結合した標識の量を測定することにより計測する。通常は被験抗原結合蛋白は過剰に存在する。競合アッセイにより識別される抗原結合蛋白（競合抗原結合蛋白）はレファレンス抗原結合蛋白と同じエピトープに結合する抗原結合蛋白、及びレファレンス抗原結合蛋白により結合されたエピトープに、立体障害を生じさせるために十分近接した隣接エピトープに結合した抗原結合蛋白を包含する。競合結合を測定するための方法に関するこのほかの詳細は本明細書の実施例において提示する。通常、競合抗原結合蛋白が過剰に存在する場合は、それは共通の抗原へのレファレンス抗原結合蛋白の特異的結合を、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％まで阻害することになる。一部の場合においては、結合は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９７％以上まで阻害される。
【０１１８】
「抗原」という用語は選択的結合剤、例えば抗原結合蛋白（例えば抗体又はその免疫学的に機能性のフラグメント）により結合されることができ、そして更にその抗原に結合することができる抗体を生産するために動物において使用されることができる、分子又は分子の部分を指す。抗原は異なる抗原結合蛋白、例えば抗体と相互作用できるエピトープ１つ以上を保有してよい。
【０１１９】
「エピトープ」という用語は抗原結合蛋白（例えば抗体）により結合される分子の部分である。用語は抗原結合蛋白、例えば抗体に、又は、Ｔ細胞受容体に、特異的に結合することができる何れかの決定基を包含する。エピトープは近接又は非近接であることができる（例えば単鎖ポリペプチドにおいては、ポリペプチド配列中では相互に近接ではないが、分子の範囲においては抗原結合蛋白により結合されているアミノ酸残基）。特定の実施形態においては、エピトープは、それらが抗原結合蛋白を形成するために使用されるエピトープと同様の三次元構造を含み、なお、抗原結合蛋白を形成するために使用されるそのエピトープ中に存在するアミノ酸残基を全く含まないか一部のみ含んでいるという点において、ミメティックであってよい。最も頻繁には、エピトープは蛋白上に残存するが、一部の例においては他の種の分子、例えば核酸上に残存する。エピトープ決定基は分子の化学的に活性な表面基  、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル基を包含してよく、そして特定の三次元構造特性及び／又は特定の荷電特性を有してよい。一般的に、特定の標的抗原に対して特異的な抗体は、蛋白及び／又は巨大分子の複合混合物中の標的抗原上のエピトープを優先的に認識することになる。
【０１２０】
「同一性」という用語は配列をアラインして比較することにより測定される２つ以上のポリペプチド分子又は２つ以上の核酸分子の配列の間の関連性を指す。「パーセント同一性」とは比較される分子中のアミノ酸又はヌクレオチドの間の同一残基のパーセントを意味し、そして比較される分子の最小のもののサイズに基づいて計算される。これらの計算のためには、アライメントにおける間隙（存在する場合）は特定の数学的モデル又はコンピュータープログラム（即ち「アルゴリズム」）により検討されなければならない。アラインされた核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用できる方法は  Computational  Molecular  Biology,(Lesk,  A.M.,  ed.),  1988,  New  York:  Oxford  University  Press;Biocomputing  Informatics  and  Genome  Projects,(Smith,  D.  W.,  ed.),  1993,  New  York:  Academic  Press;Computer  Analysis  of  Sequence  Data,  Part  I,(Griffin,  A.M.,  and  Griffin,  H.  G.,  eds.),  1994,  New  Jersey:  Humana  Press;von  Heinje,  G.,  1987,  Sequence  Analysis  in  Molecular  Biology,  New  York:  Academic  Press;Sequence  Analysis  Primer,(Gribskov,  M.  and  Devereux,  J.,  eds.),  1991,  New  York:  M.  Stockton  Press；及びCarillo等、1988,  SIAM  J.  Applied  Math.48:1073に記載されたものを包含する。例えば、配列同一性は２つのポリペプチドのアミノ酸の位置における同様性を比較するために一般的に使用されている標準的方法により決定できる。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡのようなコンピュータープログラムを使用しながら、２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチドの配列を、（１つ又は両方の配列の完全長に沿って、又は１つ又は両方の配列の予め定められた部分に沿って）それらのそれぞれの残基の最適なマッチングを目標にアラインする。プログラムはデフォルトのオープニングペナルティー及びデフォルトのギャップペナルティーを与えており、そしてＰＡＭ２５０のような評点マトリックス[標準評点マトリックス;Dayhoff等、in  Atlas  of  Protein  Sequence  andStructure,  vol.  5,  supp.  3(1978)参照]をコンピュータープログラムと組み合わせて使用できる。例えば、パーセント同一性を次に以下の通り、即ち、同一マッチの総数に１００をかけ、そして次にマッチしたスパン内部のより長い配列の長さと２つの配列をアラインするためにより長い配列内に導入されたギャップの数の総和で割ったものとして計算できる。パーセント同一性を計算する場合、比較される配列は配列間で最大のマッチが得られるような方法でアラインする。
【０１２１】
ＧＣＧプログラムパッケージはパーセント同一性を決定するために使用できるコンピュータープログラムであり、そのパッケージはＧＡＰを包含する（Devereux等、1984,  Nucl.  Acid  Res.  12:387;Genetics  Computer  Group,  University  of  Wisconsin,  Madison,  WI）。コンピューターアルゴリズムＧＡＰはパーセント配列同一性を決定すべき２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチドをアラインするために使用される。配列はそれらのそれぞれのアミノ酸又はヌクレオチドの最適マッチが得られるようにアラインされる（「マッチドスパン」、アルゴリズムにより決定）。  ギャップオープニングペナルティー（これは３ｘ平均ダイアゴナルとして計算され、個々で「平均ダイアゴナル」とは使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均であり；「ダイアゴナル」とは特定の比較マトリックスにより各々の完全アミノ酸マッチに割り付けられる評点又は数である）及びギャップエクステンションペナルティー（これは通常はギャップオープニングペナルティーの１／１０倍である）、並びにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリックスをアルゴリズムと組み合わせて使用する。特定の実施形態においては、標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスに関してはDayhoff等、1978,  Atlas  of  Protein  Sequence  and  Structure  5:345-352参照;ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスに関してはHenikoff等、1992,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  89:10915-10919参照）も又アルゴリズムにより使用される。
【０１２２】
ＧＡＰプログラムを用いたポリペプチド又はヌクレオチド配列のパーセント同一性を決定するための推奨されるパラメーターは以下のものを包含する。
【０１２３】
アルゴリズム：  Needleman等、1970,  J.  Mol.  Biol.  48:443-453;
【０１２４】
比較マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２。Henikoff等（1992）上出による；
【０１２５】
ギャップペナルティー：１２（ただし末端ギャップに関してはペナルティーなし）
【０１２６】
ギャップレングスペナルティー：４
【０１２７】
同様性の閾値：０
【０１２８】
２つのアミノ酸配列をアラインするための特定のアライメントスキームは２つの配列の短い領域のみのマッチングをもたらす場合があり、そしてこの小型のアラインされた領域は、２つの完全長配列の間に有意な関係が無いのにも関わらず、極めて高い配列同一性を有する場合がある。従って、選択されたアライメント法（ＧＡＰプログラム）は、要望に応じて、標的ポリペプチドの少なくとも５０近接アミノ酸に渡るアライメントをもたらすように調整することができる。
【０１２９】
「修飾」という用語は、本発明の抗体及び抗体フラグメントを包含する抗原結合蛋白との関連において使用する場合、１つ以上のアミノ酸変化（例えば置換、挿入又は欠失）；化学修飾；治療薬又は診断薬とのコンジュゲーションによる共有結合修飾；標識（例えば、放射性核種又は種々の酵素による）；共有結合重合体連結、例えばＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）及び非天然アミノ酸の化学合成による挿入又は置換を包含するがこれらに限定されない。本発明の修飾された抗原結合蛋白は本発明の未修飾の分子の結合特性を保持することになる。
【０１３０】
「誘導体」という用語は、本発明の抗原結合蛋（抗体及び抗体フラグメントを包含する）との関連において使用する場合、治療薬又は診断薬とのコンジュゲーション、標識（例えば、放射性核種又は種々の酵素による）、共有結合重合体連結、例えばＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）及び非天然アミノ酸の化学合成による挿入又は置換により共有結合的に修飾された抗原結合蛋白を指す。本発明の誘導体は本発明の未誘導体化分子の結合特性を保持することになる。
【０１３１】
「ヒトカルシウム応答活性化カルシウム（ＣＲＡＣ）チャンネル活性を阻害する」単離された抗原結合蛋白の実施形態は、被験試料において、
（ｉ）よく知られた電気生理学的手法及び適当な機材、例えば本明細書の実施例６において使用されたものを用いて計測した場合にＣＲＡＣ電流（ＩＣＲＡＣ又はＩＣＲＡＣ）を低減、減少又は排除する；及び／又は、
（ｉｉ）よく知られたＦＬＩＰＲ手法及び蛍光検出／画像化機材（例えば本明細書の実施例６）又はよく知られたレシオメトリックなカルシウム流入アッセイ手法（例えば本明細書の実施例５）を用いて計測した場合にＣＲＡＣチャンネルを介したカルシウム流入を低減、現象又は排除するものである。ＣＲＡＣチャンネル活性の阻害は、抗原結合蛋白への曝露の前の同じ被験試料中、又は、抗原結合蛋白に曝露されていない異なる比較可能な被験試料中のＣＲＡＣチャンネル活性に対して相対的に検出及び記録される。
【０１３２】
「タプシガルギン処理されたヒト全血中のＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、又は両方の放出を阻害する」単離された抗原結合蛋白の実施形態は、本明細書の実施例４に開示するヒト全血エクスビボアッセイにおける被験試料中でＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、又は両方の放出を低減、減少又は排除するものである。ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、又は両方の放出の阻害は抗原結合蛋白に曝露されていない比較可能な被験試料中のＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、又は両方の放出に対して相対的に検出される。
【０１３３】
「ＮＦＡＴ媒介発現を阻害する」単離された抗原結合蛋白の実施形態は、  本発明の実施例５に開示するＮＦＡＴルシフェラーゼレポーターアッセイの被験試料において、抗原結合蛋白に曝露されていない比較可能な被験試料に対して相対比較した場合に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の検出可能な発現を低減、減少又は排除するものである。
【０１３４】
抗原結合蛋白の免疫グロブリン実施形態
【０１３５】
完全長免疫グロブリン軽鎖及び重鎖において、可変及び定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により接合されており、重鎖は更に約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を包含する。例えばFundamental  Immunology,  2nd  ed.,  Ch.7(Paul,  W.,  ed.)  1989,  New  York:Raven  Press(全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる)を参照できる。各軽／重鎖対の可変領域は典型的には抗原結合部位を形成する。
【０１３６】
ヒトＩｇＧ２重鎖（ＨＣ）定常ドメインの一例は以下のアミノ酸配列を有する。
【０１３７】
【化４】
2013511279.tif 000006
【０１３８】
【化５】
2013511279.tif 000007
【０１３９】
他のＩｇＧアイソタイプの定常領域配列は所望によりＩｇＧ１、ＩｇＧ２、」ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４免疫グロブリンアイソタイプを有する本発明の抗原結合蛋白の組み換えバージョンを作成するために当該分野で知られている。一般的にヒトＩｇＧ２はエフェクター機能が所望されない場合の標的のために使用でき、そしてヒトＩｇＧ１はそのようなエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ））が所望される状況において使用できる。ヒトＩｇＧ３は相対的に短い半減期を有し、そしてヒトＩｇＧ４は抗体「半分子」を形成する。ＩｇＧ１には４つの知られたアロタイプが存在する。好ましいアロタイプは「ｈＩｇＧ１ｚ」と称されｍ「ＫＥＥＭ」アロタイプとしても知られている。ヒトＩｇＧ１アロタイプ、「ｈＩｇＧ１ｚａ（ＫＤＥＬ）」、「ｈＩｇＧ１ｆ（ＲＥＥＭ）」及び「ｈＩｇＧ１ｆａ」もまた有用で有り；全てＡＤＣＣエフェクター機能を有すると考えられる。
【０１４０】
ヒトｈＩｇＧ１ｚ重鎖（ＨＣ）定常ドメインは以下のアミノ酸配列を有する。
【０１４１】
【化６】
2013511279.tif 000008
【０１４２】
ヒトｈＩｇＧ１ｚａ重鎖（ＨＣ）定常ドメインは以下のアミノ酸配列を有する。
【０１４３】
【化７】
2013511279.tif 000009
【０１４４】
【化８】
2013511279.tif 000010
【０１４５】
ヒトｈＩｇＧ１ｆ重鎖（ＨＣ）定常ドメインは以下のアミノ酸配列を有する。
【０１４６】
【化９】
2013511279.tif 000011
【０１４７】
ヒトｈＩｇＧ１ｆａ重鎖（ＨＣ）定常ドメインは以下のアミノ酸配列を有する。
【０１４８】
【化１０】
2013511279.tif 000012
【０１４９】
ヒト免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）定常領域配列の一例は以下の通りである（「ＣＬ−１」と標記）。
【０１５０】
【化１１】
2013511279.tif 000013
【０１５１】
ＣＬ−１は抗体のｐＩを上昇させるために有用であり、そして好都合である。その他３つのヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域が存在し、「ＣＬ−２」、
「ＣＬ−３」及び「ＣＬ−７」と標記され、これらもまた本発明の範囲に包含できる。ＣＬ−２及びＣＬ−３はヒト集団においてより共通している。
【０１５２】
ＣＬ−２ヒト軽鎖（ＬＣ）定常ドメインは以下のアミノ酸配列を有する。
【０１５３】
【化１２】
2013511279.tif 000014
【０１５４】
ＣＬ−３ヒトＬＣ定常ドメインは以下のアミノ酸配列を有する。
【０１５５】
【化１３】
2013511279.tif 000015
【０１５６】
ＣＬ−７ヒトＬＣ定常ドメインは以下のアミノ酸配列を有する。
【０１５７】
【化１４】
2013511279.tif 000016
【０１５８】
免疫グロブリン鎖の可変領域は一般的に同じ全体的構造を呈し、より頻繁には「相補性決定領域」即ちＣＤＲと称される３つの超可変領域により接合された相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。上記した各々の重鎖／軽鎖対の２つの鎖に由来するＣＤＲは、フレームワーク領域によりアラインあされて、標的蛋白（例えばｈＯｒａｉ１）上の特定のエピトープ又はドメインと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端に向けて、天然に存在する軽鎖及び重鎖の可変領域は両方とも典型的には以下の順序のこれらのエレメント：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４と合致している。これらのドメインの各々における位置を占有するアミノ酸に数を割り付けるためのナンバリングシステムが考案されている。このナンバリングシステムはKabat  Sequences  of  Proteins  of  lmmunological  Interest(1987  and  1991,  NIH,  Bethesda,  MD)又はChothia&  Lesk,  1987,  J  Mol.  Biol.196:901-917;Chothia等、1989,  Nature  342:878-883に定義されている。
【０１５９】
提供される抗体の完全長の軽鎖及び重鎖の一部の特定の例及びそれらの相当するアミノ酸配列を以下に示す表１Ａ及び表１Ｂに総括する。表１Ａは例示される軽鎖配列を示し、これらは全て、全てのラムダ軽鎖に関して共通の定常領域ラムダ定常領域１（ＣＬ−１；配列番号１４）を有する。表１Ｂは例示される重鎖配列を示し、これらは全て定常領域ヒトＩｇＧ２（配列番号２２）を包含する。しかしながら、本発明に包含されるものは表１Ａ及び／又は表１Ｂにおいて列挙したものの定常又はフレームワーク領域における配列の変化を有する免疫グロブリンである（例えばＩｇＧ４対ＩｇＧ２、ＣＬ２対ＣＬ１）。更に又、表１ＡにおけるＬ１−Ｌ３配列及び表１ＢにおけるＨ１−Ｈ４配列に関するシグナルペプチド（ＳＰ）配列は同じ、即ち、高スループットクローニングプロセスにおいて使用されるＶＫ−１ＳＰ（MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC//配列番号２３４）であるが、何れかの他の適当なシグナル配列も本発明の範囲内において使用してよい。有用なシグナルペプチド配列の一部の例は以下のもの、即ち：
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG（配列番号３２９）、
MEWTWRVLFLVAAATGAHS（配列番号３３０）、
METPAQLLFLLLLWLPDTTG（配列番号３３１）、及び
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS（配列番号３３２）、
を包含する。有用なシグナルペプチド配列の別の例はVH21  SP  MEWSWVFLFFLSVTTGVHS（配列番号３３２）である。
【表１−１】
2013511279.tif 000017
【表１−２】
2013511279.tif 000018
【表１−３】
2013511279.tif 000019
【表１−４】
2013511279.tif 000020
【表１−５】
2013511279.tif 000021
【表１−６】
2013511279.tif 000022
【表１−７】
2013511279.tif 000023
【表１−８】
2013511279.tif 000024
【０１６０】
抗体又は抗体フラグメントを含む単離された抗原結合蛋白の一部の実施形態は下記：
【０１６１】
（ａ）配列番号２９、配列番号３３、配列番号３４、又は配列番号３５のアミノ酸配列を有するか、又は上記配列から１、２、３、４又は５個のアミノ酸残基がＮ末端又はＣ末端又は両方から欠失しているものを含む、免疫グロブリン重鎖；又は、
【０１６２】
（ｂ）配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２のアミノ酸配列を有するか、又は上記配列から１、２、３、４又は５個のアミノ酸残基がＮ末端又はＣ末端又は両方から欠失しているものを含む、免疫グロブリン軽鎖；又は、
【０１６３】
（ｃ）（ａ）の免疫グロブリン重鎖及び（ｂ）の免疫グロブリン軽鎖；
を含む。
【０１６４】
シグナルペプチド配列が重鎖及び軽鎖に存在しない抗体又は抗体フラグメントを含む単離された抗原結合蛋白の一部の他の実施形態は、下記：
【０１６５】
（ａ）配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、又は配列番号３４８のアミノ酸配列を含むか、又は上記配列から１、２、３、４又は５個のアミノ酸残基がＮ末端又はＣ末端又は両方から欠失しているものを含む、免疫グロブリン重鎖；又は、
【０１６６】
（ｂ）配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、又は配列番号３４２のアミノ酸配列を含むか、又は上記配列から１、２、３、４又は５個のアミノ酸残基がＮ末端又はＣ末端又は両方から欠失しているものを含む、免疫グロブリン軽鎖；又は、
又は、
【０１６７】
（ｃ）（ａ）の免疫グロブリン重鎖及び（ｂ）の免疫グロブリン軽鎖；
を包含する。
【０１６８】
ここでも又、表１Ｂに列挙した例示される重鎖（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、又はＨ１４）の各々は、表１Ａに示す例示される軽鎖の何れかと組み合わせることにより抗体を形成することができる。このような組み合わせの例はＨ１とＬ１〜Ｌ１６の何れかを組み合わせたもの；Ｈ２とＬ１〜Ｌ１６の何れかを組み合わせたもの；Ｈ３とＬ１〜Ｌ１６の何れかを組み合わせたもの；Ｈ４とＬ１〜Ｌ１６の何れかを組み合わせたもの等を等を包含する。一部の例においては抗体は表１Ａ及び１Ｂに列挙するものから選択される少なくとも１つの重鎖及び１つの軽鎖を包含する。一部の場合においては、抗体は表１Ａ及び表１Ｂに列挙される２つの異なる重鎖及び２つの異なる軽鎖を含む。別の例においては、抗体は２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含有する。一例として、抗体又は免疫学的に機能性のフラグメントは、２つのＨ１重鎖及び２つのＬ１軽鎖、又は２つのＨ２重鎖及び２つのＬ２軽鎖、又は２つのＨ３重鎖及び２つのＬ３軽鎖、及び、表１Ａ及び表１Ｂに列挙するとおり軽鎖の対及び重鎖の対の他の類似した組み合わせを包含してよい。  
【０１６９】
提供される他の抗原結合蛋白は、表１Ａ及び表１Ｂに示す重鎖及び軽鎖の組み合わせにより形成される抗体の変異体であり、そして、各々がこれらの鎖のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の同一性を各々が有する軽鎖及び／又は重鎖を含む。一部の例においては、このような抗体は少なくとも１つの重鎖及び１つの軽鎖を包含し、そして他の例においては変異体型は２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含有する。
【０１７０】
重鎖及び／又は軽鎖が、例えば翻訳後修飾により、表１Ａ及び表１Ｂに示す重鎖及び軽鎖の何れか１つに関連してＮ末端又はＣ末端又は両方から欠失した
１、２、３、４又は５個のアミノ酸残基を有してよいことは、本発明の範囲に包含される。例えばＣＨＯ細胞は典型的にはＣ末端リジンを切断排除している。
【０１７１】
抗体の可変ドメイン
【０１７２】
本明細書に記載する種々の重鎖及び軽鎖の可変領域を表２に示す。これらの可変領域の各々を上記した重鎖及び軽鎖の定常領域に連結することによりそれぞれ完全な抗体重鎖及び軽鎖を形成してよい。更に又、このようにして形成された重鎖及び軽鎖の配列の各々を組み合わせて完全な抗体構造を形成してよい。本明細書に記載した重鎖及び軽鎖の可変領域を、上記列挙した例示配列以外の異なる配列を有する定常ドメインに連結させることもできると理解しなければならない。
【０１７３】
同様に提供されるものは、後に示す表２に示す通り、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、及びＶＨ１０から選択される少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変領域及び／又はＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、ＶＬ１２、及びＶＬ１３から選択される少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域、及び、これらの軽鎖及び重鎖可変領域の免疫学的に機能性のフラグメント、誘導体、ムテイン及び変異体を含有するか包含する抗体又は抗体フラグメントを包含する抗原結合蛋白である。
【０１７４】
この型の抗原結合蛋白は一般的に式「ＶＨｘ／ＶＬｙ」により標記することができ、式中、「ｘ」は抗原結合蛋白内に包含される重鎖可変領域の数に相当し、そして「ｙ」は抗原結合蛋白内に包含される軽鎖可変領域の数に相当する（一般的にｘ及びｙはそれぞれ１又は２である）。
【表２−１】
2013511279.tif 000025
【表２−２】
2013511279.tif 000026
【表２−３】
2013511279.tif 000027
【０１７５】
免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体又は抗体フラグメントを含む単離された抗原結合蛋白の一部の実施形態は、下記：
【０１７６】
（ａ）重鎖可変領域は配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、又は配列番号２５５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むか；又は、
【０１７７】
（ｂ）軽鎖可変領域は配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、又は配列番号２６５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むか；又は、
【０１７８】
（ｃ）（ａ）の重鎖可変領域及び（ｂ）の軽鎖可変領域；
である。
【０１７９】
表２に列挙した重鎖可変領域の各々は、それがより大きい重鎖に包含されているか否かに関わらず、表２に示す軽鎖可変領域の何れかと組み合わせることにより抗原結合蛋白を形成してよい。そのような組み合わせの例はＶＬ１、ＶＬ２、又はＶＬ３の何れかと組み合わせたＶＨ１；ＶＬ１、ＶＬ２、又はＶＬ３の何れかと組み合わせたＶＨ２；ＶＬ１、ＶＬ２、又はＶＬ３の何れかと組み合わせたＶＨ３；ＶＬ１、ＶＬ２、又はＶＬ３の何れかと組み合わせたＶＨ４等を包含する。
【０１８０】
一部の例においては、抗原結合蛋白は表２に列挙したものから選択される少なくとも１つの重鎖可変領域及び／又は１つの軽鎖可変領域を包含する。一部の例においては、抗原結合蛋白は表２に列挙したものから選択される少なくとも２つの異なる重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を包含する。そのような抗原結合蛋白の例は（ａ）１つのＶＨ１、及び（ｂ）ＶＨ２、ＶＨ３、又はＶＨ４の１つを含む。別の例は（ａ）１つのＶＨ２、及び（ｂ）ＶＨ１、ＶＨ３、又はＶＨ４の１つを含む。更に別の例は（ａ）１つのＶＨ３、及び（ｂ）ＶＨ１、ＶＨ２、又はＶＨ４の１つを含む。更に別の例は（ａ）１つのＶＨ４、及び（ｂ）ＶＨ１、ＶＨ２、又はＶＨ３の１つを含む等してよい。
【０１８１】
同様に、そのような抗原結合蛋白の別の例は（ａ）つのＶＬ１、及び（ｂ）ＶＬ２又はＶＬ３の１つを含む。同様にそのような抗原結合蛋白の別の例は（ａ）１つのＶＬ２、及び（ｂ）ＶＬ１又はＶＬ３の１つを含む。同様にそのような抗原結合蛋白の別の例は（ａ）１つのＶＬ３、及び（ｂ）ＶＬ１又はＶＬ２の１つを含む等してよい。
【０１８２】
重鎖可変領域の種々の組み合わせを軽鎖可変領域の種々の組み合わせの何れかと組み合わせてよい。
【０１８３】
別の例においては、抗原結合蛋白は２つの同一の軽鎖可変領域及び／又は２つの同一の重鎖可変領域を含有する。一例として、抗原結合蛋白は、表２に列挙した軽鎖可変領域の対及び重鎖可変領域の対と組み合わせて２つの軽鎖可変領域及び２つの重鎖可変領域を包含する抗体又は免疫学的に機能性のフラグメントであることができる。
【０１８４】
提供される一部の抗原結合蛋白は、僅か１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５アミノ酸残基においてＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、及びＶＨ１０から選択される重鎖可変ドメインの配列とは異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、ここで各々のそのような配列の相違は、独立して、アミノ酸１つの欠失、挿入又は置換の何れかであり、その欠失、挿入及び／又は置換は前記した可変ドメイン配列と相対比較して１５以下のアミノ酸の変化をもたらす。一部の抗原結合蛋白における重鎖可変領域は、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、又はＶＨ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【０１８５】
特定の抗原結合蛋白は、僅か１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５アミノ酸残基においてＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、ＶＬ１２、及びＶＬ１３から選択される軽鎖可変ドメインの配列とは異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、ここで各々のそのような配列の相違は、独立して、アミノ酸１つの欠失、挿入又は置換の何れかであり、その欠失、挿入及び／又は置換は前記した可変ドメイン配列と相対比較して１５以下のアミノ酸の変化をもたらす。一部の抗原結合蛋白における軽鎖可変領域は、ＶＬ１、ＶＬ２、又はＶＬ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【０１８６】
更に別の抗原結合蛋白、例えば抗体又は免疫学的に機能性のフラグメントは本明細書に記載する変異体重鎖及び変異体軽鎖の変異体型を包含する。
【０１８７】
ＣＤＲ
【０１８８】
本明細書に開示する抗原結合蛋白は１つ以上のＣＤＲがグラフト化、挿入及び／又は接合されているポリペプチドである。抗原結合蛋白は、１、２、３、４、５又は６個のＣＤＲを有することができる。すなわち抗原結合蛋白は、例えば１つの重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）、及び／又は１つの重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）、及び／又は１つの重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）、及び／又はひとつの軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）、及び／又はひとつの軽鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）、及び／又はひとつの軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）を有することができる。一部の抗原結合蛋白はＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ３の両方を包含する。特定の重鎖及び軽鎖のＣＤＲをそれぞれ表３Ａ及び表３Ｂに示す。
【０１８９】
所定の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）はKabat等がSequences  of  Proteins  oflmmunological  Interest,  5th  Ed.,  US  Dept.  of  Health  and  Human  Services,  PHS,  NIH,  NIH  Publication  no.  91-3242,  1991に記載されているシステムを用いて識別してよい。本明細書に開示する特定の抗体は表３Ａ（ＣＤＲＨ）及び表３Ｂ（ＣＤＲＬ）に示したＣＤＲの１つ以上のアミノ酸配列と同一であるか、かなりの配列同一性を有するアミノ酸配列１つ以上を含む。
【表３−１】
2013511279.tif 000028
【表３−２】
2013511279.tif 000029
【表３−３】
2013511279.tif 000030
【表３−４】
2013511279.tif 000031
【表３−５】
2013511279.tif 000032
【０１９０】
天然に存在する抗体内部のＣＤＲの構造及び特性は上記した通りである。要すれば、伝統的な抗体においては、ＣＤＲは重鎖及び軽鎖の可変領域中のフレームワーク内部に包埋されており、そこでそれらは抗原結合及び認識を担う領域を構成している。可変領域は、少なくとも３つの重鎖又は軽鎖のＣＤＲ（上記Kabat等、1991,  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  Public  Health  Service  N.I.H.,  Bethesda,  MD参照;同様にChothia  and  Lesk,  1987,  J  Mol.  Biol.  196:901-917;Chothia等、1989,  Nature  342:  877-883参照）を、フレームワーク領域内部(標記フレームワーク領域１−４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、Kabat等1991上出による;同様に上出Chothia  and  Lesk、1987も参照)に含む。しかしながら本明細書に記載したＣＤＲは伝統的な抗体の構造の抗原結合ドメインを定義するためのみにしようされずともよく、寧ろ本明細書に記載した種々の他のペプチド構造中に包埋して良い。
【０１９１】
単離された抗原結合蛋白の一部の実施形態は、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、抗体又は抗体フラグメントを含む。重鎖可変領域はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と標記される３つの相補性決定領域を含み、及び／又は、軽鎖可変領域はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と標記される３つのＣＤＲを含み、ここで：
【０１９２】
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号２６６又は配列番号２６７のアミノ酸配列を有し；及び／又は、
【０１９３】
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９；配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、又は配列番号２７２のアミノ酸配列を有し；及び／又は、
【０１９４】
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、又は配列番号２７７のアミノ酸配列を有し；及び／又は、
【０１９５】
（ｄ）ＣＤＲＬ１は配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、又は配列番号２８３のアミノ酸配列を有し；及び／又は、
【０１９６】
（ｅ）ＣＤＲＬ２は配列番号５６、配列番号５７、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、又は配列番号２８９のアミノ酸配列を有し；及び／又は、
【０１９７】
（ｆ）ＣＤＲＬ３は配列番号５８、配列番号５９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、又は配列番号２９７のアミノ酸配列を有する；
である。
【０１９８】
別の側面において、提供されるＣＤＲは
(A)  下記：
（ｉ）配列番号４３、４４、４５、２６６、及び２６７から選択されるＣＤＲＨ１；
（ｉｉ）配列番号４６、４７、４８、４９、２６８、２６９、２７０、２７１、及び２７２から選択されるＣＤＲＨ２；
（ｉｉｉ）配列番号５０、５１、５２、２７３、２７４、２７５、２７６、及び２７７から選択されるＣＤＲＨ３；及び
（ｉｖ）５、４、３、２、又は１つより多いアミノ酸の、１つ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＨ；
から選択されるＣＤＲＨ；
（Ｂ）下記：
（ｉ）配列番号５３、５４、５５、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、及び２８３から選択されるＣＤＲＬ１；
（ｉｉ）配列番号５６、５７、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、及び２８９から選択されるＣＤＲＬ２；
（ｉｉｉ）配列番号５８、５９：２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、及び２９７から選択されるＣＤＲＬ３；及び
（ｉｖ）５、４、３、２、又は１つより多いアミノ酸の、１つ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＬ；
から選択されるＣＤＲＬ；
である。
【０１９９】
別の側面において、抗原結合蛋白は、各々が表３Ａ及び表３Ｂに列挙するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列同一性を有する、表３Ａ及び表３Ｂに列挙するＣＤＲの１、２、３、４、５、又は６変異体型を包含する。一部の抗原結合蛋白は表３Ａ及び表３Ｂに列挙するＣＤＲの１、２、３、４、５、又は６個を包含し、各々がこれらの表に列挙するＣＤＲとは１、２、３、４又は５アミノ酸以下までの相違を有する。
【０２００】
更に別の側面において、本明細書に開示したＣＤＲは関連するモノクローナル抗体の群から誘導されたコンセンサス配列を包含する。本明細書においては、「コンセンサス配列」とは多くの配列の間で共通の保存されたアミノ酸及び所定のアミノ酸配列の内部において変動する可変アミノ酸を有するアミノ酸配列を指す。提供されるＣＤＲコンセンサス配列はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の各々に相当するＣＤＲを包含する。
【０２０１】
又別の実施形態において、抗原結合蛋白はＣＤＲＨｌ、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と標記される３つの相補性決定領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、ここで：
（ａ）ＣＤＲＨｌは下記：
ａ１Ｙａ３ａ４ａ５／／配列番号２９８、
のアミノ酸配列を有し、ここで、
ａ１はグリシン、セリン又はアスパルテート残基であり；そして、
ａ３はチロシン又はトリプトファン残基であり；そして、
ａ４はトリプトファン、メチオニン、又はイソロイシン残基であり；そして、
ａ５はセリン、ヒスチジン、又はアスパラギン残基であり；そして、
（ｂ）ＣＤＲＨ２は下記：
ｂ１Ｉｂ３ｂ４ｂ５ｂ６ｂ７ｂ８ｂ９ｂ１０ｂ１１ｂ１２ｂ１３ｂ１４ｂ１５ｂ１６ｂ１７／／配列番号２９９、
のアミノ酸配列を有し、ここで、
ｂ１はトリプトファン、グルタメート、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｂ３はアスパラギン、アスパルテート、又はリジン残基であり；そして、
ｂ４はプロリン又はヒスチジン残基であり；そして、
ｂ５はアスパラギン、アスパルテート、又はセリン残基であり；そして、
ｂ６はアスパラギン、セリン、又はグリシン残基であり；そして、
ｂ７はグリシン、セリン、又はアルギニン残基であり；そして、
ｂ８はグリシン、スレオニン、イソロイシン、又はグルタメート残基であり；そして、
ｂ９はスレオニン、セリン、アスパラギン、又はリジン残基であり；そして、
ｂ１０はチロシン、セリン、アスパラギン、アスパルテート、ヒスチジン、又はリジン
残基であり；そして、
ｂ１１はチロシン又はアスパラギン残基であり；そして、
ｂ１２はアラニン、バリン、又はプロリン残基であり；そして、
ｂ１３はグルタミン、アラニン、又はアスパルテート残基であり；そして、
ｂ１４はリジン、ロイシン、又はセリン残基であり；そして、
ｂ１５はフェニルアラニン、リジン、又はバリン残基であり；そして、
ｂ１６はグルタミン、セリン、又はリジン残基であり；そして、
ｂ１７はグリシン又はアスパルテート残基であるか非存在であり；そして、
のアミノ酸配列を有し；そして、
（ｃ）ＣＤＲＨ３は下記：
ｃ１ｃ２ｃ３Ｇｃ５ｃ６ｃ７ｃ８ｃ９ｃ１０ｃ１１ｃ１２ｃ１３／／配列番号３００、
のアミノ酸配列を有し、ここで、
ｃ１はアラニン又はアルギニン残基であるか非存在であり；そして、
ｃ２はグルタメート、グリシン、又はチロシン残基であり；そして、
ｃ３はグルタメート、セリン、アルギニン、又はチロシン残基であり；そして、
ｃ５はグリシン又はアスパルテート残基であり；そして、
ｃ６はチロシン、トリプトファン、イソロイシン、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｃ７はグルタメート、セリン、又はグリシン残基であるか非存在であり；そして、
ｃ８はメチオニン残基であるか非存在であり；そして、
ｃ９はスレオニン又はアスパルテート残基であり；そして、
ｃ１０はフェニルアラニン、トリプトファン、又はバリン残基であり；そして、
ｃ１１はフェニルアラニン残基であるか非存在であり；そして、
ｃ１２はアスパルテート残基であるか非存在であり；そして、
ｃ１３はプロリン又はチロシン残基であるか非存在である。
【０２０２】
上記パラグラフに記載した免疫グロブリン重鎖可変領域を場合により包含してよい抗原結合蛋白の又別の実施形態において、抗原結合蛋白は免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と標記される３つのみＣＤＲを含み、
ここで：
（ａ）ＣＤＲＬ１は下記：
ｄ１Ｇｄ３ｄ４ｄ５ｄ６ｄ７ｄ８ｄ９ｄ１０ｄ１１ｄ１２ｄ１３ｄ１４／／配列番号３０１、
のアミノ酸配列を含み、ここで、
ｄ１はスレオニン又はセリン残基であり；そして、
ｄ３はセリン、スレオニン、又はアスパルテート残基であり；そして、
ｄ４はアスパラギン、アルギニン、アラニン、又はセリン残基であり；そして、
ｄ５はロイシン又はセリン残基であり；そして、
ｄ６はアスパラギン、アスパルテート、又はプロリン残基であり；そして、
ｄ７はイソロイシン、バリン、又はリジン残基であり；そして、
ｄ８はグリシン又はリジン残基であり；そして、
ｄ９はアラニン、スレオニン、グリシン、又はチロシン残基であり；そして、
ｄ１０はアラニン、グリシン、又はチロシン残基であり；そして、
ｄ１１はチロシン、フェニルアラニン、システイン、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｄ１２はアスパラギン、アスパルテート、又はチロシン残基であるか非存在であり；そして、
ｄ１３はバリン残基であるか非存在であり；そして、
ｄ１４はヒスチジン又はセリン残基であるか非存在であり；そして、
（ｂ）ＣＤＲＬ２は下記：
ｅ１ｅ２ｅ３ｅ４ＲＰＳ／／配列番号３０２、
のアミノ酸配列を有し含み、ここで、
ｅ１はバリン、セリン、アスパルテート、グルタメート、又はグリシン残基であり；そして、
ｅ２はヒスチジン、アスパルテート、アスパラギン、バリン、又はチロシン残基であり；そして、
ｅ３はヒスチジン、フェニルアラニン、アルギニン、セリン、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｅ４はイソロイシン、アスパラギン、又はリジン残基であり；そして、
（ｃ）ＣＤＲＬ３は下記：
ｆ１Ｓｆ３ｆ４ｆ５ｆ６ｆ７ｆ８ｆ９ｆ１０ｆ１１ｆ１２／／配列番号３０３、
のアミノ酸配列を含み、ここで、
ｆ１はグルタミン、セリン、チロシン、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｆ３はチロシン又はスレオニン残基であり；そして、
ｆ４はセリン、アスパルテート、グリシン、又はアラニン残基であり；そして、
ｆ５はセリン、グリシン、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｆ６はセリン、グリシン、又はアルギニン残基であり；そして、
ｆ７はロイシン、グリシン、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｆ８はセリン又はアスパラギン残基であるか非存在であり；そして、
ｆ９はヒスチジン又はアスパルテート残基であるか非存在であり；そして、
ｆ１０はセリン、グリシン、又はフェニルアラニン残基であるか非存在であり；そして、
ｆ１１はバリン、セリン、トリプトファン、アスパルテート、又はスレオニン残基であり；そして、
ｆ１２はロイシン又はバリン残基である。
【０２０３】
これらの実施形態のサブセットにおいて：
ｄ１はスレオニン残基であり；そして、
ｄ３はセリン又はスレオニン残基であり；そして、
ｄ４はアスパラギン、アルギニン、又はセリン残基であり；そして、
ｄ５はセリン残基であり；そして、
ｄ６はアスパラギン又はアスパルテート残基であり；そして、
ｄ７はイソロイシン又はバリン残基であり；そして、
ｄ８はグリシン残基であり；そして、
ｄ９はアラニン、スレオニン、又はグリシン残基であり；そして、
ｄ１０はグリシン又はチロシン残基であり；そして、
ｄ１１はチロシン、フェニルアラニン、又はアスパラギン残基であり；そして、
ｄ１２はアスパラギン、アスパルテート、又はチロシン残基であり；そして、
ｄ１３はバリン残基であり；そして、
ｄ１４はヒスチジン又はセリン残基である。
【０２０４】
一般的に、抗体−抗原相互作用は会合速度定数、単位：Ｍ−１ｓ−１（ｋａ又はＫｏｎ）、又は解離速度定数、単位：ｓ−１（ｋｄ又はＫｏｆｆ）、又は、代替として平衡解離定数、単位：Ｍ（Ｋｄ）、即ち製造元が示す一般的操作法又は当該分野で知られている他の方法を用いて速度論的排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）により測定できる結合親和性の尺度を用いて特性化できる（Rathanaswami等、High  affinity  binding  measurements  of  antibodies  to  cell-surface-expressed  antigens,  Analytical  Biochemistry  373:52-60(2008)参照）。ＫｉｎＥｘＡ技術を使用する場合、以下のもの、即ちＫｄ（Ｍ）、即ち平衡解離定数、及びＫｏｎ（Ｍ−１s−１）、即ち会合速度定数を計測できる。これらの値から、解離速度定数Ｋｏｆｆ（s−１）をＫｄｘＫｏｎより計算できる。
【０２０５】
結合親和性は又、表面プラズモン共鳴（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）；例えばFischer等、A  peptide-immunoglobulin-conjugate,  国際特許出願ＷＯ２００７／０４５４６３Ａ１）を用いて測定できる平衡定数（ＫＤ）によっても特性化できる。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器を使用する場合、以下のもの、即ち：ｋａ（Ｍ−１ｓ−１）、即ち会合速度定数、及びｋｄ（ｓ−１）、即ち解離速度定数を計測できる。これらの値より、平衡定数ＫＤ（Ｍ）を動的速度定数の比ｋｄ／ｋａとして計算できる。
【０２０６】
本発明は種々の抗原結合蛋白、例えば限定しないが、１０−９Ｍ以下の範囲、又は１０−１２Ｍ以下までの範囲のｈＯｒａｉ１に対するＫｄ又はＫＤにより計測される結合親和性、又は、１０−４ｓ−１以下の範囲、又は１０−１０ｓ−１以下までの範囲のｈＯｒａｉ１に対するｋｄ（解離速度定数）により計測されるアビディティのような所望な特性を呈するヒトＯｒａｉ１に特異的に結合する抗体を提供する。
【０２０７】
一部の実施形態においては、抗原結合蛋白（例えば、抗体又は抗体フラグメント）は約１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０ｓ−１以下のｈＯｒａｉ１に対するｋｄ（解離速度定数）により計測される結合アビディティ（より低い値がより高い結合アビディティを示す）及び／又は約１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３、１０−１４、１０−１５、１０−１６Ｍ以下のｈＯｒａｉ１に対するＫｄ（平衡解離定数）又はＫＤ（平衡定数）により計測される結合親和性（より低い値がより高い結合親和性を示す）のような所望の特性を呈する。会合速度定数、解離速度定数、又は平衡定数は、表面プラズモン共鳴のような動的分析手法を用いながら容易に測定され（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）；例えばFischer等、A  peptide-immunoglobulin-conjugate,  国際特許出願ＷＯ２００７／０４５４６３Ａ１、実施例１０、これは参照により全体が本明細書に組み込まれる）、或いは平衡解離定数は製造元が示す一般的操作法又は当該分野で知られている他の方法を用いて速度論的排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）を用いて測定してよい(Rathanaswami等、High  affinity  binding  measurements  of  antibodies  to  cell-surface-expressed  antigens,  Analytical  Biochemistry  373:52-60(2008)参照、これは参照により全体が本明細書に組み込まれる）。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）又はＫｉｎＥｘＡにより得られた速度論的データは製造元の記載した方法により分析してよい。
【０２０８】
一部の実施形態においては、抗体は軽鎖ＣＤＲ３つ全て、重鎖ＣＤＲ３つ全て、又はＣＤＲ６つ全てを含む。一部の例示される実施形態においてはある抗体に由来する軽鎖ＣＤＲ２つが異なる抗体由来の第３のの軽鎖ＣＤＲと組み合わせられる。或いは、特にＣＤＲが高度に相同である場合は、１つの抗体に由来するＣＤＲＬ１を異なる抗体に由来するＣＤＲＬ２及び更に別の抗体に由来するＣＤＲＬ３に組み合わせることができる。同様に、ある抗体に由来する２つの重鎖ＣＤＲを異なる抗体に由来する第３の重鎖ＣＤＲと組み合わせても良く；或いは、特にＣＤＲが高度に相同である場合は、１つの抗体に由来するＣＤＲＨ１を異なる抗体に由来するＣＤＲＨ２及び更に別の抗体に由来するＣＤＲＨ３に組み合わせることができる。
【０２０９】
即ち、本発明は修飾型又は誘導体型をも包含する、抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域の１、２、及び／又は３つのＣＤＲを含む種々の組成物を提供する。そのような組成物は本明細書に記載した、又は当該分野で知られた手法により形成してよい。
【０２１０】
本発明に記載する通り、本発明の抗原結合蛋白（抗体及び抗体フラグメントを包含する）及び免疫障害又は静脈又は動脈の血栓形成に関連する障害を治療する方法は、単独で使用されるか、他の治療薬と組み合わせられる１つ以上の抗ｈＯｒａｉ１抗原結合蛋白を利用することにより所望の効果を達成する。治療薬の適応症における薬品のバリデーションにおいて有用な前臨床動物モデルが当該分野で知られている（例えばValverde等、J.  Bone  Mineral  Res.  19:155(2004)による歯周病の養子移入モデル；  Gruner等、Blood  105:1492-99(2005)における動脈血栓の超音波小胞周囲ドプラーフローメーター系動物モデル；Braun等の国際特許出願ＷＯ２００９／１１５６０９Ａ１における肺血栓塞栓モデル、大動脈閉塞モデル、及びネズミ卒中モデル）。例えば、多発性硬化症の養子移入実験的自己免疫脳脊髄炎（ＡＴ−ＥＡＥ）モデルは多発性硬化症のような免疫疾患に関する研究について記載されている(Beeton等、J.  Immunol.  166:936(2001);Beeton等、PNAS  98:13942(2001);Sullivan等、国際特許出願ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２の実施例４５、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。ＡＴ−ＥＡＥモデルにおいて、有意に低下した疾患の重症度及び増大した生存が本発明の医薬組成物の有効量を投与した動物で期待されるのに対し、未投与の動物は重度の疾患及び／又は死亡率を示すと予測される。ＡＴ−ＥＡＥモデルを指向するために、ミエリン塩基性蛋白（ＭＢＰ）に対して特異的な脳脊髄形成性ＣＤ４＋ラットＴ細胞系統ＰＡＳがDr.  Evelyne  Beraudより発案された。インビトロのこれらの細胞の維持及びＡＴ−ＥＡＥモデルにおけるそれらの使用は以前に報告されている（Beeton等、(2001)  PNAS  98,  13942）。ＰＡＳＴ細胞を、ＭＢＰ及び放射線照射胸腺細胞存在下の抗原刺激又は活性化（２日間）、及びＴ細胞成長因子存在下の増殖（５日間）の交互ラウンドにより、インビトロで維持する。ＰＡＳＴ細胞（３ｘ１０５／ｍｌ）の活性化では１０μｇ／ｍｌのＭＢＰ及び１５ｘ１０６／ｍｌの同系放射線照射（３５００ｒａｄ）胸腺細胞と共に２日間細胞をインキュベートする。第２日に、インビトロ活性化の後、１０〜１５ｘ１０６の生存ＰＡＳＴ細胞を６〜１２週齢の雌性Ｌｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、尾静脈注射する。ベヒクル（ＰＢＳ中２％Ｌｅｗｉｓラット血清）又は被験医薬組成物の毎日の皮下注射を第−１〜３日に行い、ここで第−１日とはＰＡＳＴ細胞（第０日）の注射の一日前を指す。ベヒクル投与ラットにおいて、急性のＥＡＥはＰＡＳＴ細胞注射後４〜５日に発生すると予測される。典型的には、血清を、第４日には尾静脈出血により、そして第８日（試験終了時）には心穿刺により採取し、阻害剤レベルの分析に付する。ラットは典型的には第−１、４、６及び８日に計量する。細胞転移の日（第０日）から第３日には１日１回、そして第４日〜第８日には一日２回、動物を盲検的に採点してよい。臨床徴候を各四肢及び尾部の不全麻痺の程度の総合評点として評価する。臨床評点：０＝無徴候、０．５＝遠位が倒伏した尾部、１．０＝倒伏した尾部、２．０＝軽度の不全対麻痺、運動失調、３．０＝中等度の不全対麻痺、３．５＝片方の後足の完全麻痺、４．０＝全後足の完全麻痺��５．０＝全後足の完全麻痺及び失禁、５．５＝四肢麻痺、６．０＝瀕死状態又は死亡。５．０の評点に到達したラットは典型的には安楽死させた。
【０２１１】
有用なペプチド誘導実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルは又、自己免疫性ＣＮＳ炎症のモデルとしても記載されている（Schuhmann等、Stromal  interaction  molecules  1  and  2  are  key  regulators  of  autoreactive  T  cell  activation  in  murine  autoimmune  central  nervous  system  inflammation,  J  Immunol.  2010  Feb  1;184(3):1536-42.  Epub  2009  Dec  18、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２１２】
抗原結合蛋白の抗体実施形態の生成
【０２１３】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は該当する抗原及びアジュバントの多数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）腫瘍者により動物中に好ましく育成される。あるいは抗原を動物のリンパ節に直接注射してよい（例えばKilpatrick等、Hybridoma,  16:381-389,  1997参照）。２官能性又は誘導体形成性の剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を解したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸又は他の当該分野で知られている剤を用いながら、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシタイログロブリン、又は大豆トリプシン阻害剤のような、免疫化する種において免疫原性である蛋白に該当抗原をコンジュゲートすることにより、向上した抗体応答を得てよい。  
【０２１４】
例えば蛋白又はコンジュゲート（マウスに対する）１００μｇを３容量のフロイント完全アジュバントと混合し、溶液を多数部位において皮内注射することにより抗原、免疫原性コンジュゲート又は誘導体に対して動物を免疫化する。
１ヵ月後、多数の部位における皮下注射により、フロイント完全アジュバント中のペプチド又はコンジュゲートの初回量の１／５〜１／１０で動物をブーストする。ブースター注射の７〜１４日後、動物を出血させて血清の抗体力価をアッセイする。力価が定常状態となるまで動物をブーストする。好ましくは、同じ抗原のものであるが、異なる蛋白に、及び／又は異なる交差結合剤を介してコンジュゲートされているコンジュゲートで動物をブーストする。融合蛋白のような組み換え細胞培養物中にコンジュゲートを作成してもよい。更に又、ミョウバンのような凝集剤を適宜使用することにより免疫応答を増強する。
【０２１５】
モノクローナル抗体。本発明の抗原結合蛋白又は提供される抗原結合蛋白はｈＯｒａｉ１に結合するモノクローナル抗体を包含する。当該分野で知られている何れかの手法を用いながら、例えば免疫化スケジュールの終了後にトランスジェニック動物から採取された脾細胞を不朽化することにより、モノクローナル抗体を生産することができる。脾細胞は、当該分野で知られている手法の何れかを用いて、例えばそれらをミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作成することにより、不朽化され得る。例えばモノクローナル抗体は、Kohler等、Nature,  256:495(1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作成されて良く、或いは,  組み換えＤＮＡ法(e.g.,  Cabilly等、Methods  of  producing  immunoglobulins,  vectors  and  transformed  host  cells  for  use  therein,米国特許６、３３１、４１５）、例えば、抗体をグリコシル化できる哺乳類細胞系統（例えばＣＨＯ細胞）を場合により使用しながら軽鎖及び重鎖の一般的に等モルの生産を促進する「スプリットＤＨＦＲ」法のような方法により作成されてもよい（例えばPage,  Antibody  production,  ＥＰ０４８１７９０Ａ２及び米国特許５、５４５、４０３参照）。
【０２１６】
ハイブリドーマ法においては、マウス又は他の適切な宿主哺乳類、例えばラット、ハムスター又はマカクモンキーを本明細書に記載する通り免疫化することにより、免疫化のために使用する蛋白に特異的に結合することになる抗体を生産するか生産できるリンパ球を誘発する。或いは、リンパ球はインビトロで免疫化されても良い。次にリンパ球を安定な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いてミエローマ細胞と融合することにより、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding,  Monoclonal  Antibodies:  Principles  and  Practice,  pp.59-103(Academic  Press,  1986)）。
【０２１７】
一部の例においては、ハイブリドーマ間細胞系統は、ｈＯｒａｉ１免疫原でヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物を免疫化すること；免疫化された動物から脾細胞を採取すること；採取された脾細胞をミエローマ細胞系統と融合し、これによりハイブリドーマ細胞を形成すること；ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞系統を樹立すること、及び、ｈＯｒａｉ１に結合する抗体を生産するハイブリドーマ細胞系統を識別することにより、生産される。そのようなハイブリドーマ細胞系統及び、それらにより生産された抗Ｏｒａｉ１モノクローナル抗体は、本発明の側面である。
【０２１８】
本発明は又モノクローナル抗体である本発明の抗原結合蛋白を生産するハイブリドーマも包含する。従って、本発明は又、下記工程：
【０２１９】
（ａ）ハイブリドーマによる抗原結合蛋白の発現を可能にする条件下に培地中でハイブリドーマを培養すること；及び、
【０２２０】
（ｂ）本明細書の実施例４に開示されるモノクローナル抗体精製手法のような、ただしこれに限定されない知られた抗体精製手法により達成できる、培地から抗原結合蛋白を回収すること；
を含む方法にも関する。
【０２２１】
ハイブリドーマ細胞は、調整された後は、未融合の親ミエローマ細胞の成育又は生存を阻害しない物質１つ以上を好ましくは含有する適当な培地中に播種して生育させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠失している場合は、ハイブリドーマのための培地は典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成育を防止する物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を包含することになる。
【０２２２】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、そして培地に感受性であるものである。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系統もまた、ヒトモノクローナル抗体の生産に関して報告されている（Kozbor,  J.  Immunol.,  133:  3001(1984);Brodeur等、Monoclonal  Antibody  Production  Techniques  and  Applications,  pp.  51-63(Marcel  Dekker,  Inc.,  New  York,  1987)）。ハイブリドーマ生産融合操作法において使用するためのミエローマ細胞は好ましくは、非抗体産生であり、高い融合効率を有し、そして、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの生育を支援する特定の選択培地中でそれらを生育不能とする酵素欠損性のものである。  マウス融合における使用のための適当な細胞系統の例はＳｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７及びＳ１９４／５ＸＸＯＢｕｌを包含し；ラット融合において使用される細胞系統の例はＲ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０を包含する。細胞融合に有用な他の細胞系統はＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２及びＵＣ７２９−６である。
【０２２３】
ハイブリドーマ細胞を成育させている培地は、抗原に対して指向されたモノクローナル抗体の生産に関してアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により生産されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によるか、インビトロの結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、測定する。モノクローナル抗体の結合親和性は例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）又はＳｃａｔｃｈａｒｄ分析（Munson等、Anal.  Biochem.,  107:220(1980);Fischer等、A  peptide-immunoglobulin-conjugate,  国際特許出願ＷＯ２００７／０４５４６３Ａ１、実施例１０、これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる)により測定できる。
【０２２４】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞が識別された後、限界希釈法によりクローンをサブクローニングし、そして標準的方法により生育させて良い（Goding,  Monoclonal  Antibodies:
Principles  and  Practice,  pp.59-103(Academic  Press,  1986)）。この目的のための適当な培地は、例えばＤ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。更に又、ハイブリドーマ細胞は動物中の腹水腫瘍としてインビボで生育させても良い。
【０２２５】
ハイブリドーマ又はｍＡｂを更にスクリーニングすることにより特定の特性、例えばＣＲＡＣチャンネルを介したＣａ２＋流出を阻害する能力を有するｍＡｂを識別してよい。そのようなスクリーニングの例を後に記載する例において示す。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製操作、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー、又は当該分野で知られている何れかの他の適当な精製手法により、培地、腹水、又は血清から、適宜、分離される。
【０２２６】
抗体の組み換え生産。本発明は場合により宿主細胞により認識される制御配列に作動可能に連結した本明細書に記載する抗体フラグメントを包含する抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）の何れかをコードする単離された核酸、その核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び、核酸が発現されるように宿主細胞を培養すること、及び、場合により、宿主細胞の培養物又は培地から抗体を回収することを含んでよい、抗体の生産のための組み換え手法を提供する。同様の物質及び方法をポリペプチド系の抗原結合蛋白の生産に適用する。
【０２２７】
目的の免疫グロブリン又はポリペプチドに由来する該当するアミノ酸配列は、直接蛋白配列決定により決定されて良く、そして適当なコードヌクレオチド配列をユニバーサルコドン表に従って標記することができる。あるいは、モノクローナル抗体をコードするゲノム又はｃＤＮＡは、従来の手法を用いて（例えばモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）そのような抗体を生産する細胞から単離して配列決定されてよい。
【０２２８】
ＤＮＡのクローニングは標準的手法を用いて実施する（例えば参照により本明細書に組み込まれるSambrook等、(1989)  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Guide,  Vols  1-3,  Cold  Spring  Harbor  Pressを参照）。例えば、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは膜会合ｍＲＮＡの逆転写によりｃＤＮＡライブラリをコンストラクトして良く、そしてそのライブラリを、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを用いてスクリーニングする。１つの実施形態においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて目的の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば軽鎖又は重鎖の可変領域セグメント）をコードするｃＤＮＡ（又は完全長ｃＤＮＡの部分）を増幅する。増幅された配列は容易に、何れかの適当なベクター、例えば発現ベクター、ミニジーンベクター、又はファージディスプレイベクター内にクローニングされることができる。当然ながら、目的の免疫グロブリンポリペプチドの一部の配列を決定することが可能である限り、使用する特定のクローニング方法は需要ではない。
【０２２９】
抗体核酸の１つの入手元は、目的の抗原で免疫化した動物からＢ細胞を得ること、及び、それを不朽細胞と融合することにより作成されるハイブリドーマである。或いは、核酸を免疫化動物のＢ細胞（又は全脾臓）から単離することができる。抗体のコードする核酸の別の入手元は、例えばファージディスプレイ技術を介して作成されたそのような核酸のライブラリである。目的のペプチド、例えば所望の結合特性を有する可変領域ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、パニングのような標準的手法により識別することができる。
【０２３０】
免疫グロブリンポリペプチドの全可変領域をコードする配列を決定してよいが；可変領域の部分、例えばＣＤＲコード蛋白のみを配列決定することで十分である場合がある。配列決定は標準的な手法を用いて実施される（例えば参照により本明細書に組み込まれるSambrook等、(1989)  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Guide,  Vols  1-3,  Cold  Spring  Harbor  Press及びSanger,  F.等(1977)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  74:  5463-5467参照）。クローニングされた核酸の配列をヒト免疫グロブリン遺伝子及びｃＤＮＡの公開された配列と比較することにより、同業者であれば容易に、配列決定した領域に応じて、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプを包含する）の生殖細胞系統のセグメントの使用及び（ｉｉ）Ｎ領域付加及び体性突然変異のプロセスに起因する配列を包含する重鎖及び軽鎖可変領域の配列を決定することができるはずである。免疫グロブリン遺伝子配列の１つの情報源はNational  Center  for  Biotechnology  Information,  National  Library  of  Medicine,  National  Institutes  ofHealth,  Bethesda,  Mdである。
【０２３１】
単離されたＤＮＡを制御配列に作動可能に連結するか、又は発現ベクターに入れることができ、これを次に免疫グロブリン蛋白を別様には生産しない宿主細胞にトランスフェクトすることにより、組み換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を指向することができる。抗体の組み換え生産は当該分野で良く知られている。
【０２３２】
核酸は他の核酸配列と機能的関係におかれている場合に作動可能に連結している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーに関するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与しているプレ蛋白として発現されればポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結しており；プロモーター又はエンハンサーはそれが配列の転写に影響すればコーディング配列に作動可能に連結しており；又は、リボソーム結合部位はそれが翻訳を促進するように位置していればコーディング配列に作動可能に連結している。一般的に作動可能に連結とは、連結しているＤＮＡ配列が近接しており、そして分泌リーダーの場合は、近接であり、読み取り相にある事を意味する。しかしながら、エンハンサーは近接している必要はない。連結は好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の慣行に従って、」合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用する。
【０２３３】
多く述べたが当該分野で知られている。ベクター成分は以下のもの、即ち：シグナル配列（例えば抗体の分泌を指向してよいもの；例えば、ＶＫ−１シグナルペプチド配列ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ／／配列番号２３４をコードするＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴ／／配列番号２３３）、複製起点、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子（例えば抗生物質又は他の薬剤体性を付与するもの、栄養要求性不全を補償するもの、又は培地中では得られない重要な栄養を供給するもの）、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終止配列の１つ以上を包含してよく、これらは全て当該分野で良く知られている。
【０２３４】
細胞、細胞系統、及び細胞培養物は、互換的に使用され、そしてこれらの標記は全て本明細書においては、子孫を包含する。形質転換体及び形質転換された細胞は一次対象細胞及びそれから誘導された培養物を包含し、転移の回数には関係しない。又、全ての子孫は故意又は偶然の突然変異のため、ＤＮＡ含有量において厳密に同一でなくとも良いと理解する。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同様の機能又は生物学的活性を有する突然変異体子孫を包含する。
【０２３５】
例示される宿主細胞は原核生物、コウボ、又はより高等な真核生物の細胞を包含する。原核生物宿主細胞は真正細菌目、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物、例えば腸内細菌科、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えばＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及び  Ｓｈｉｇｅｌｌａ、並びにＢａｃｉｌｌｕｓ
例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  及び  Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、及び  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを包含する。真核生物の微生物、例えば糸状菌のカビ又はコウボは、組み換えポリペプチド又は抗体のための適当なクローニング又は発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、即ちパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら、多くの他の属、種、及び系統が一般的に入手可能であり、そして本発明において有用であり、例えばＰｉｃｈｉａ、例えばＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｖｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ；Ｃ及びｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ例えばＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；及び  糸状菌のカビ、例えばＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、及び  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  の宿主、例えばＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  及び  Ａ．ｎｉｇｅｒが挙げられる。
【０２３６】
抗体を含むグリコシル化された抗原結合蛋白の発現のための宿主細胞は、多細胞生物から誘導できる。無脊椎動物細胞の例は植物及び昆虫の細胞を包含する。多くのバキュロウイルス系統及び変異体及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）、  Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（カ）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（カ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉのような宿主に由来する相当する許容性昆虫宿主細胞が識別されている。そのような細胞のトランスフェクションのための種々のウィルス系統は市販されており、そしてＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏrnｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変異体、及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５系統が挙げられる。
【０２３７】
脊椎動物宿主細胞も又、適当な宿主であり、そしてそのような細胞からの抗原結合蛋白（抗体を包含する）の組み換え生産が定型的な操作法となっている。
有用な哺乳類宿主細胞系統の例はチャイニーズハムスター卵巣細胞、例えばＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub等、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  77:  4216(1980));ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎細胞系統（懸濁培養において生育のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、［Graham等、J.  Gen  Viral.  36:  59(1977)］；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４、Mather,  Biol.  Reprod.  23:  243-251(1980)）；サル腎細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲ０−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒトヘパトーム細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ等、Annals  N.Y  Acad.  Sci.  383:  44-68(1982)）；ＭＲＣ５細胞又はＦＳ４細胞；又は哺乳類ミエローマ細胞である。
【０２３８】
宿主細胞は抗原結合蛋白の生産のための上記した核酸又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされ、そしてプロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜変更された従来の栄養培地中で培養される。更に又、選択可能なマーカーにより分離された転写ユニットの多数コピーを有する新規なベクター及びトランスフェクトされた細胞系統は抗原結合蛋白の発現のために特に有用である。
【０２３９】
本発明の抗原結合蛋白を生産するために使用する宿主細胞は、種々の培地中において培養してよい。市販の培地、例えば、ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ変性イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）が宿主細胞を培養するために適している。更に又、Ham等、Meth.  Enz.  58:  44(1979),  Barnes等、Anal.  Biochem.  102:  255(1980）、米国特許４、７６７、７０４；４、６５７、８６６；４、９２７、７６２；４、５６０、６５５；又は５、１２２、４６９；国際特許出願ＷＯ９０１０３４３０；国際特許出願ＷＯ８７／００１９５；又は米国特許３０、９８５に記載されている培地の何れも宿主細胞のための培地として使用してよい。これらの培地の何れにも、必要に応じてホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン又は表皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝物質（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシンＴＭ薬）、微量元素（マイクロモル範囲の終濃度で通常は存在する向き化合物として定義される）、及びグルコース又は同等のエネルギー源を補給してよい。何れかの他の必要な補給物もまた、当該分野で知られている通り、適切な濃度で包含させて良い。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は、発現のために選択された宿主細胞で以前から使用されていたものとし、そして当該分野で知られているものとなる。  
【０２４０】
宿主細胞を培養する際には、抗原結合蛋白は細胞内に、ペリプラズム空間に生産させるか、又は、直接培地中に分泌させることができる。抗原結合蛋白を細胞内に生産させる場合は、第１工程として、粒状の破砕物、宿主細胞又は溶解物としてのフラグメントの何れも、例えば遠心分離又は限外濾過により除去する。
【０２４１】
抗原結合蛋白（例えば抗体又は抗体フラグメント）は例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、カチオン又はアニオン交換クロマトグラフィー、又は好ましくはアフィニティーリガンドとして目的の抗原又はプロテインＡ又はプロテインＧを使用したアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製できる。プロテインＡはヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づいたポリペプチドを包含する蛋白を精製するために使用できる（Lindmark等、J.  Immunol.  Meth.  62:  1-13(1983)）。プロテインＧは全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される（Gusset  al.,  EMBOJ.  5:15671575(1986)）。アフィニティーリガンドを結合させるマトリックスは最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも使用される。機械的に安定なマトリックス、例えばコントロール細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースで達成できるものよりも、より速い流量及びより短い処理時間を可能とする。蛋白がＣＨ３ドメインを含む場合、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢＸ（商標）樹脂(J.  T.  Baker,  Phillipsburg,N.J.)が精製に有用である。蛋白精製のための他の手法、例えばエタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈降法もまた回収すべき抗体に応じて可能である。
【０２４２】
キメラ、ヒト化及びヒトＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄTMモノクローナル抗体
げっ歯類モノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインがヒト定常Ｉｇドメインに融合されているキメラモノクローナル抗体を、当該分野で知られている標準的操作法を用いて形成することができる（Morrison,  S.  L.等、(1984)  Chimeric  Human  Antibody  Molecules;Mouse  Antigen  Binding  Domains  with  Human  Constant  Region  Domains,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  81,  6841-6855;及びBoulianne,  G.  L.等、Nature  312,  643-646(1984)参照）。例えば（１）ヒトフレームワーク及び定常領域上に非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフトすること（「ＣＤＲグラフティング」を介したヒト化と当該分野で称されているプロセス）、又は（２）全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基を置き換えることによりヒト様表面をそれらに「クローキング」すること（「ベニアリング」と当該分野で称されているプロセス）又は（３）選択された非ヒトアミノ酸残基を抗原結合又は抗体構造に関与する各残基の尤度及び免疫原性のその尤度に基づいてよりヒト型となるように修飾することにより、抗体配列をよりヒト様にヒト化又は修飾するための多くの手法が報告されている。例えばJones等、Nature  321:522  525(1986);Morrison等、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.,  U.S.A.,  81:6851  6855(1984);Morrison  and  Oi,  Adv.  Immunol.,  44:65  92(1988);Verhoeyer等、Science  239:1534  1536(1988);Padlan,  Molec.  Immun.  28:489  498(1991);Padlan,  Molec.  Immunol.  31(3):169  217(1994)；及びKettleborough,  C.A.等、Protein  Eng.  4(7):773  83(1991);Co,  M.S.等（1994),  J.  Immunol.  152,  2968-2976);Studnicka等、Protein  Engineering  7:  805-814(1994)を参照することができ;これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４３】
例えば（１）ヒトフレームワーク及び定常領域上に非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフトすること（「ＣＤＲグラフティング」を介したヒト化と当該分野で称されているプロセス）、又は（２）全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基を置き換えることによりヒト様表面をそれらに「クローキング」すること（「ベニアリング」と当該分野で称されているプロセス）又は（３）選択された非ヒトアミノ酸残基を抗原結合又は抗体構造に関与する各残基の尤度及び免疫原性のその尤度に基づいてよりヒト型となるように修飾することにより、抗体配列をよりヒト様にヒト化又は修飾するための多くの手法が報告されている。例えばJones等、Nature  321:522  525(1986);Morrison等、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.,  U.S.A.,  81:6851  6855(1984);Morrison  and  Oi,  Adv.  Immunol.,  44:65  92(1988);Verhoeyer等、Science  239:1534  1536(1988);Padlan,  Molec.  Immun.  28:489  498(1991);Padlan,  Molec.  Immunol.  31(3):169  217(1994)；及びKettleborough,  C.A.等、Protein  Eng.  4(7):773  83(1991);Co,  M.S.等（1994),  J.  Immunol.  152,  2968-2976);Studnicka等、Protein  Engineering  7:  805-814(1994)を参照することができ;これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４４】
１つの側面において、本明細書に記載した抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域のＣＤＲ（表２参照）は、同じか又は異なる系統発生的種に由来する抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトされる。例えば、重鎖可変領域（例えばＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、又はＶＨ１０）及び／又は軽鎖可変領域（例えば  ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、ＶＬ１２、又はＶ Ｌ１３）のＣＤＲをコンセンサスヒトＦＲにグラフとすることができる。コンセンサスヒトＦＲを作成するためには、幾つかのヒト重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列をアラインすることによりコンセンサスアミノ酸配列を発見してよい。他の実施形態において、本明細書に開示した重鎖又は軽鎖のＦＲを異なる重鎖又は軽鎖に由来するＦＲと置き換える。１つの側面において、抗ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２抗体の重鎖及び軽鎖のＦＲにおける希少アミノ酸は置き換えず、ＦＲアミノ酸の残余を置き換える。「希少アミノ酸」とは、特定のアミノ酸が通常はＦＲ中に観察されない位置にあるこの特定のアミノ酸である。或いは、１つの重鎖又は軽鎖に由来するグラフトされた可変領域を、本明細書に開示する通り、その特定の重量％さ又は軽鎖の定常領域とは異なる定常領域と共に使用してよい。他の実施形態において、グラフとされた可変領域は単鎖Ｆｖ抗体の部分である。
【０２４５】
ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２に対する抗体は又、内因性免疫グロブリン生産を有さず、そしてヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように操作されたトランスジェニック動物を用いて生産することもできる。例えば、国際特許出願ＷＯ９８／２４８９３は内因性の重鎖及び軽鎖の遺伝子座の不活性化のために動物が機能的内因性免疫グロブリンを生産しないヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示している。国際特許出願ＷＯ９１／１０７４１も又、抗体が霊長類の定常及び／又は可変領域を有し、そして内因性免疫グロブリンコード遺伝子座が置換されているか、不活性化されている、免疫原に対する免疫応答を起こすことができるトランスジェニックの非霊長類哺乳類宿主を開示している。国際特許出願ＷＯ９６／３０４９８は修飾された抗体分子を形成するために定常又は可変領域の全て又は部分を置き換えるため等、哺乳類における免疫グロブリン遺伝子座を修飾するためのＣｒｅ／Ｌｏｘシステムの使用を開示している。国際特許出願ＷＯ９４／０２６０２は不活性かされた内因性Ｉｇ遺伝子座及び機能性ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳類宿主を開示している。米国特許５、９３９、５９８はマウスが内因性重鎖を欠失しており、そして異種性の定常領域１つ以上を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスの作成方法を開示している。
【０２４６】
上記したトランスジェニック動物を用いながら、免疫応答を起こすことにより、抗原分子を選択することができ、そして抗体産生細胞を動物から取り出してヒト誘導モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作成するためにしようすることができる。免疫化のプロトコル、アジュバント等は当該分野で知られており、そして例えば国際特許出願ＷＯ９６／３３７３５に記載されているトランスジェニックマウスの免疫化において使用される。モノクローナル抗体は、相当する蛋白の生物学的活性又は生理学的作用を阻害又は中和する能力に関して試験することができる。Jakobovits等、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  90:2551(1993);Jakobovits等、Nature,  362:255-258(1993);Bruggermann等、Year  in  Immuno.,  7:33(1993);Mendez等、Nat.  Genet.  15:146-156(1997);及び米国特許５、５９１、６６９、米国特許５、５８９、３６９、米国特許５、５４５、８０７；及び米国特許出願２００２０１９９２１３も参照できる。米国特許出願２００３００９２１２５は所望のエピトープに対する動物の免疫応答をバイアスするための方法を記載している。ヒト抗体は又、インビトロの活性化Ｂ細胞によっても形成してよい（米国特許５、５６７、６１０及び５、２２９、２７５参照）。
【０２４７】
ファージディスプレイ手法による抗体生産
【０２４８】
組み換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを作成するための技術、及び、フィラメント性のバクテリオファージの表面上へのコードされた抗体フラグメントのディスプレイは、ヒト誘導抗体を作成するための別の手段を提供している。ファージディスプレイは例えばDower等、国際特許出願ＷＯ９１／１７２７１、McCafferty等、国際特許出願ＷＯ 92/01047、及びCaton  and  Koprowski,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  87:6450-6454(1990)に記載されており、これらの各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。ファージ技術により生産された抗体は通常は細菌中で抗原結合フラグメント、例えばＦｖ又はＦａｂフラグメントとして生産され、従って、エフェクター機能は欠失している。エフェクター機能は、２つの方策の一方で導入することができ；即ち、哺乳類細胞における発現のための完全な抗体内部に、又はエフェクター機能をトリガーできる第２の結合部位を有する二重特異性抗体フラグメント内部にあるように、フラグメントを操作することができる。
【０２４９】
典型的には、抗体のＦｄフラグメント（ＶＨ−ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）はＰＣＲにより別個にクローニングされ、そしてコンビナトリアルファージディスプレイライブラリにおいてランダムに組み換えられ、そして次にこれを特定の抗原への結合に関して選択することができる。抗体フラグメントをファージ表面に発現させ、そして抗原結合によるＦｖ又はＦａｂ（そして従って抗体フラグメントをコードするＤＮＡを含有するファージ）の選択をパニングと称される数ラウンドの抗原結合と再増幅を介して達成する。抗原に対して特異的な抗体フラグメントをリッチ化し、そして最終的に単離する。
【０２５０】
ファージディスプレイ手法は又、「ガイデッド選択」と称されるげっ歯類モノクローナル抗体のヒト化のための手順において使用することもできる（Jespers,  L.  S.,等、Bio/Technology  12,  899-903(1994)参照）。このためには、マウスモノクローナル抗体のＦｄフラグメントをヒト軽鎖ライブラリと組み合わせてディスプレイすることができ、そして得られたハイブリッドＦａｂライブラリを次に抗原を用いて選択してよい。マウスＦｄフラグメントはこれにより選択の指針となる鋳型を与える。その後、選択されたヒト軽鎖をヒトＦｄフラグメントライブラリと組み合わせる。得られたライブラリの選択により完全にヒトＦａｂが得られる。
【０２５１】
ファージディスプレイライブラリからヒト抗体を誘導する種々の操作法が記載されている（例えばHoogenboom等、J.  Mol.  Biol.,  227:381(1991);Marks等、J.  Mol.  Biol,  222:581-597(1991);米国特許５、５６５、３３２及び５、５７３、９０５；Clackson,  T.,  and  Wells,  J.  A.,  TIBTECH  12,  173-184(1994)を参照できる）。特に、ファージディスプレイライブラリから誘導した抗体のインビトロの選択及び進化は強力なツールとなっている（Burton,  D.  R.,  and  Barbas  III,  C.  F.,  Adv.  Immunol.  57,  191-280(1994)；及び、Winter,  G.,等、Annu.  Rev.  Immunol.  12,  433-455(1994);米国特許出願２００２０００４２１５及びＷ０９２／０１０４７；２００３年１０月９日公開の米国特許出願２００３０１９０３１７、及び米国特許６、０５４、２８７；米国特許５、８７７、２９３を参照できる）。
【０２５２】
Watkinsの「Screening  of  Phage-Expressed  Antibody  Libraries  by  Capture  Lift（Methods  in  Molecular  Biology,  Antibody  Phage  Display:  Methods  and
Protocols  178:  187-193）」、及び２００３年３月６日公開の米国特許出願２００３００４４７７２は、固体支持体上への候補結合分子の固定化を行う方法である、キャプチャーリフトによるファージ発現抗体ライブラリ又は他の結合分子をスクリーニングするための方法を記載している。
【０２５３】
抗原結合蛋白の他の実施形態:抗体フラグメント
【０２５４】
上記した通り、抗体フラグメントは未損傷の完全長抗体の部分、好ましくは未損傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含み、そして抗体フラグメントから形成された線状抗体及び多重特異性抗体を包含する。抗体フラグメントの非限定的な例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体フラグメント、マキシボディー、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ミニボディー、線状抗体、キレート形成組み換え抗体、トリボディー又はビボディー、イントラボディー、ナノボディー、小型モジュラーイムノファーマシューティカル（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合蛋白、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、又はムテイン又はその誘導体、及びＣＤＲ配列のようなポリペプチドへの特異的抗原結合を付与するために十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドを、所望の生物学的活性を抗体が保持している限りにおいて包含する。そのような抗原フラグメントは全抗体の修飾により生成するか、又は組み換えＤＮＡ技術又はペプチド合成を用いて新規に合成してよい。
【０２５５】
その他の抗体フラグメントはＶＨドメインよりなるドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント(Ward等、Nature  341:544-546,  1989)を包含する。
【０２５６】
「線状抗体」は一対の抗原結合領域を形成する一対の縦列Ｆｄセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む。戦場抗体は二重特異性又は単一特異性であることができる（Zapata等、Protein  Eng.  8:1057-62(1995)）。
【０２５７】
ペプチドリンカー（ヒンジレス）を介するかＩｇＧヒンジを介してＣＨ３に融合しているｓｃＦｖよりなる「ミニボディー」はOlafsen,等、Protein  Eng  Des
Sel.  2004  Apr;17(4):315-23に記載されている。
【０２５８】
「マキシボディー」という用語は免疫グロブリンのＦｃ領域に共有結合した２価のｓｃＦｖを指し、例えばFredericks等、Protein  Engineering,  Design  &  Selection,  17:95-106(2004)及びPowers等、Journal  of  Immunological  Methods,  251:123-135(2001)を参照できる。
【０２５９】
軽鎖を有さない機能的重鎖抗体は特定の種の動物、例えばテンジクザメ、オオセ及びラクダ科、例えばラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びラマにおいて天然に存在している。抗原結合部位はこれらの動物においては単一のドメイン、即ちＶＨＨドメインにまで低減している。これらの抗体は重鎖可変領域のみを用いて抗体結合領域を形成し、即ち、これらの機能的抗体は構造Ｈ２Ｌ２を有するのみの重鎖のホモ２量体である（「重鎖抗体」即ち「ＨＣＡｂ」と称する）。ラクダ化されたＶＨＨはヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含有し、そしてＣＨ１ドメインを欠失しているＩｇＧ２及びＩｇＧ３定常領域と組み換えらレルと報告されている。古典的なＶＨのみのフラグメントは可溶性形態において生産することが困難であるが、フレームワーク残基がよりＶＨＨ様に改変されれば溶解度及び特異的結合における改善が得られる。（例えばReichman等、J  Immunol  Methods  1999,  231:25-38参照。）ラクダ化ＶＨＨドメインは高親和性で抗原に結合し（Desmyter等、J  Biol.  Chem.  276:26285-90,  2001）、そして溶液中で高い安定性を有する（Ewert等、Biochemistry  41  :3628-36,  2002）ことがわかっている。ラクダ化された重鎖を有する抗体を形成するための方法は例えば米国特許公開００５／０１３６０４９及び２００５／００３７４２１に記載されている。サメＶ-ＮＡＲスカホールドにより緊密にマッチしているヒト可変様ドメインから代替のスカホールドを作成することができ、そして長貫通ループ構造のためのフレームワークを与えてよい。
【０２６０】
重鎖抗体の可変ドメインは僅か１５ｋＤａの分子質量を有する最小の完全に機能する抗原結合フラグメントであるため、この実体はナノボディーと称されている（Cortez-Retamozo等、Cancer  Research  64:2853-57,  2004）。ナノボディーライブラリはConrath等が記載する通り、免疫化ヒトコブラクダから作成してよい（Antimicrob  Agents  Chemother  45:  2807-12,  2001）。
【０２６１】
イントラボディーは細胞内発現を示し、そして細胞内蛋白機能を操作することができる単鎖抗体である（Biocca,等、EMBO  J  9:101-108,  1990;Colby等、Proc  Natl  Acad  Sci  US  A.  101:17616-21,  2004））。細胞内領域に抗体コンストラクトを保持する細胞シグナル配列を含むイントラボディーはMhashilkar等（EMBO  J
14:1542-51,  1995）及びWheeler等（FASEB  J.  17:1733-5.  2003）の記載する通り作成してよい。トランスボディーは蛋白トランスダクションドメイン（ＰＴＤ）が単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体と融合している細胞透過性の抗体である（Heng等、Med  Hypotheses.  64:1105-8,  2005）。
【０２６２】
本発明に更に包含されるものはＳＭＩＰ又は標的蛋白に対して特異的な可変ドメイン免疫グロブリン融合蛋白である抗体である。これらのコンストラクトは抗体エフェクター機能を実施するために必要な免疫グロブリンドメインに融合した抗原結合ドメインを含む単鎖ポリペプチドである。例えばＷ００３／０４１６００、米国特許公開２００３０１３３９３９及び米国特許公開２００３０１１８５９２を参照できる。
【０２６３】
種々の手法が抗体フラグメントの生産のために開発されている。伝統的にはこれらのフラグメントは未損傷抗体の蛋白分解的消化を介して誘導されていたが、組み換え宿主細胞により直接生産させることもできる。例えばBetter等、Science  240:  1041-1043(1988);Skerra等、Science  240:1038-1041(1988);Carter等、Bio/Technology  10:163-167(1992)を参照できる。
【０２６４】
抗原結合蛋白の別の実施形態：多価抗体
【０２６５】
一部の実施形態においては、多価又は更には多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性等）のモノクローナル抗体を作成することが望ましい場合がある。そのような抗体は標的抗原の少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有してよく、或いは、それは２つの異なる分子に、例えば標的抗原に、そして細胞表面の蛋白又は受容体に、結合してよい。例えば、二重特異性抗体は標的に結合するアーム及び白血球上のトリガー分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えばＣＤ２又はＣＤ３）、又はＩｇＧに関するＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合する別のアームを包含し、これにより細胞の防御機序を標的発現細胞に集中させて良い。別の例として、二重特異性抗体は標的抗原を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させるために使用してよい。これらの抗体は標的結合アーム及び細胞毒性剤（例えばサポリン、抗インターフェロン−６０、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン）に結合するアームを保有している。多重特異性抗体は完全長抗体又は抗体フラグメントとして調製できる。
【０２６６】
更に又、本発明の抗Ａβ抗体は多価の形態に折り畳まれるように構築することができ、これは結合親和性、特異性を向上させ、及び／又はより長い血中半減期をもたらす場合がある。抗Ａβ抗体の多価の形態は当該分野で知られている手法により調製できる。
【０２６７】
二重特異性又は多重特異性の抗体は交差結合又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を包含する。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方をアビジンに、他方をビオチンにカップリングすることができる。ヘテロコンジュゲート抗体は何れかの好都合な交差結合方法を用いて作成してよい。適当な交差結合剤は当該分野で良く知られており、そして、多くの交差結合の手法と共に米国特許４、６７６、９８０に開示されている。別の方法はｓｃＦｖのＣ末端にストレプトアビジンコーディング配列を付加することにより４量体を作成するように設計されている。ストレプトアビジンが４つのサブユニットを有し、このため、ｓｃＦｖ−ストレプトアビジンが折り畳まれると、４つのサブユニットが会合して４量体を形成する（Kipriyanov等、Hum  Antibodies  Hybridomas  6(3):  93-101(1995）、この開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２６８】
二重特異性抗体を作成するための他の手順によれば、一対の抗体分子の間の界面を操作することにより組み換え細胞培養物から回収されるヘテロ２量体のパーセントを最大にすることができる。一方の界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。本方法においては第１の抗体分子の界面に由来する１つ以上の小型のアミノ酸側鎖がより大きい側鎖（チロシン又はトリプトファン）で置き換えられる。大型のアミノ酸側鎖をより小型のもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより大型の側鎖と同一又は同様の補償「キャビティー」が第２の抗体分子の界面に形成される。これによりホモ２量体のような他の望ましくない最終生成物を越えてヘテロ２量体の収量を増大するための機序が与えられる。１９９６年９月６日公開の国際特許出願ＷＯ９６／２７０１１を参照できる。
【０２６９】
抗体フラグメントから二重特異性又は多重特異性抗体を形成するための手法もまた文献に記載されている。例えば、二重特異性又は三重特異性の抗体は化学連結を用いて調製できる。Brennan等、Science  229:81(1985)  は未損傷の抗体が蛋白分解的に切断されてF(  ab')2フラグメントを形成する操作法を記載している。これらのフラグメントをジチオール複合体化剤である亜砒酸ナトリウムの存在下で還元することにより付近のジチオールを安定化させ、そして分子間ジスルフィド形成を防止する。形成されたFab'フラグメントを次にチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つを次に、メルカプトエチルアミンを用いた還元によりＦａｂ’−値オールに変換し、そして等モル量の別のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。生成した二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための剤として使用できる。Better等はScience240:  1041-1043(1988)において細菌からの機能性抗体フラグメントの分泌を開示している（例えばBetter等、Skerra等、Science  240:  1038-1041(1988)参照）。例えばＦａｂ’−ＳＨフラグメントを直接Ｅ・コリから回収し、そして化学的にカップリングして二重特異性抗体を形成することができる（Carter等、Bio/Technology  10:163-167(1992);Shalaby等、J.  Exp.  Med.  175:217-225(1992)）。
【０２７０】
Shalaby等はJ.  Exp.  Med.  175:217-225(1992)  において完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生産を記載している。各Ｆａｂ’フラグメントをＥ.コリから別個に分泌させ、そしてインビトロの指向された化学カップリングに付すことにより二重特異性抗体を形成している。
【０２７１】
組み換え細胞培養物から直接二重特異性又は多重特異性抗体フラグメントを作成及び単離するための種々の手法も記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパー、例えばＧＣＮ４を用いながら生産されている。（一般的にKostelny等、J.  Immunol.  148(5):1547-1553(1992)を参照できる）。Ｆｏｓ及びＪｕｎ蛋白由来のロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。抗体ホモ２量体をヒンジ領域で還元することにより単量体とし、そして次に再参加して抗体ヘテロ２量体を形成した。この方法は又、抗体ホモ２量体を生産するためにも利用できる。
【０２７２】
上記したダイアボディーは、二重特異性抗体の一例である。例えば
Hollinger等、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  90:6444-6448(1993)を参照できる。２価のダイアボディーはジスルフィド結合により安定化できる。
【０２７３】
安定な単一特異性又は二重特異性のＦｖ四量体は又、(scFv2)2配置における非共有結合会合により、又は、ビステトラボディーとして作成できる。或いは２つの異なるｓｃＦｖを縦列に接合してビスｓｃＦｖを形成することができる。
【０２７４】
単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）２量体の使用によりビス抗体フラグメントを作成するための別の方策もまた報告されている。Gruber等、J.  Immunol.  152:  5368(1994)を参照できる。１つの手順は２つのｓｃＦｖ抗体をリンカー又はジスルフィド結合により連結することであった（Mallender  and  Voss,  J.  Biol.  Chem.  269:199-2061994,  国際特許出願ＷＯ９４／１３８０６及び米国特許５、９８９、８３０、これらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２７５】
或いは、ビス抗体はZapata等、Protein  Eng.  8(10):1057-1062(1995)に記載されるとおり生産された「線状抗体」であってよい。要すれば、これらの抗体は一対の抗体結合領域を形成する一対の縦列Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は二重特異性又は単一特異性であることができる。
【０２７６】
２より多い価数を有する抗体も又意図される。例えば三重特異性抗体を調製できる（Tutt等、J.  Immunol.  147:60(1991)）。
【０２７７】
「キレート形成組み換え抗体」は標的抗原の隣接する非オーバーラップのエピトープを認識し、そして両方のエピトープに同時に結合するために十分フレキシブルな二重特異性抗体である（Neri等、J  Mol  Biol.  246:367-73,  1995）。
【０２７８】
二重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（「ビボディー」）及び三重特異性Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２）（「トリボディー」）の生産はSchoonjans等（J  Immunol.  165:7050-57,  2000）及びWillems等（J  Chromatogr  B  Analyt  Technol  Biomed  Life  Sci.  786:161-76,  2003)に記載されている。ビボディー又はトリボディーに関しては、ｓｃＦｖ分子をＶＬ−ＣＬ（Ｌ）及びＶＨ−ＣＨ１（Ｆｄ）鎖の一方又は両方に融合し、例えばトリボディーを生産するためには、２つのｓｃＦｖをＦａｂのＣ末端に融合し、そしてビボディーにおいては１つのｓｃＦｖをＦａｂのＣ末端に融合する。
【０２７９】
更に別の方法においては、遊離のシステインを親蛋白に導入した後に２量体、３量体、及び４量体を生産する。種々の数（２〜４）のマレイミド基を有するペプチド系交差結合を使用することにより目的の蛋白を遊離のシステインに交差結合した（Cochran等、Immunity  12(3):  241-50(2000）、この開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２８０】
抗原結合蛋白の他の実施形態
【０２８１】
その他の抗原結合蛋白は、例えば抗体のＣＤＲに基づくか、又は多様なペプチド又はペプチドに対する有機化学化合物又はｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２に対する所望の結合特性を示す化合物のライブラリをスクリーニングすることにより調製できる。ヒトＯｒａｉ１ＥＣＬ２抗原結合蛋白は本明細書の表３Ａ及び３Ｂに示すＣＤＲ配列１つ以上と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上同一であるアミノ酸配列を含有するペプチドを包含する。
【０２８２】
本発明の抗原結合蛋白はまた、ペプチボディーを包含する。「ペプチボディー」という用語は少なくとも１つのペプチドに連結した抗体Ｆｃドメインを含む分子を指す。ペプチボディーの生産は一般的に２０００年５月４日に公開された国際特許出願ＷＯ００／２４７８２に記載されている。何れかのこれらのペプチドをリンカーを使用するか使用することなく、縦列に（即ち逐次的に）連結してよい。システイニル残基を含有するペプチドを他のＣｙｓ含有ペプチドと交差結合して良く、その一方又は両方をベヒクルに連結してよい。１つより多いＣｙｓ残基を有する何れかのペプチドは同様にペプチド内ジスルフィド結合を形成してよい。これらのペプチドの何れも誘導体化してよく、例えば、カルボキシル末端をアミノ基でキャップして良く、システインをキャップして良く、又はアミノ酸残基をアミノ酸残基以外の部分で置換しても良い（例えばBhatnagar等、J.  Med.  Chern.  39:  3814-9(1996),  and  Cuthbertson等、J.  Med.  Chern.  40:  2876-82(1997)を参照でき、これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる）。ペプチド配列は抗体の親和性成熟と同様に最適化してよく、又は、別様に、アラニンスキャニング又はランダム又は指向性突然変異誘発により改変し、その後、スクリーニングすることにより最適な結合物を識別してよい。Lowman,  Ann.  Rev.  Biophys.  Biomol.  Struct.  26:  401-24(1997）。種々の分子を、例えばペプチド部分そのものの内部、又はペプチドと抗原結合蛋白のベヒクル部分の間において抗原結合蛋白構造内に挿入することができ、その際、抗原結合蛋白の所望の活性は保持する。例えばＦｃドメイン又はそのフラグメント、ポリエチレングリコール又は他の関連する分子、例えばデキストラン、脂肪酸、脂質、コレステロール基、小型炭水化物、ペプチド、本明細書に記載する検出可能な部分（蛍光剤、放射標識、例えば放射性同位体を包含する）、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、干渉（又は他の）ＲＮＡ、酵素、ホルモン等のような分子を容易に挿入できる。この態様における挿入に適する他の分子は当該分野で知られている通りであり、そして本発明の範囲内に包含される。これは例えば場合により適当なリンカーで接合された２つの連続するアミノ酸の間の所望の分子の挿入を包含する。
【０２８３】
リンカー。「リンカー」又は「リンカー部分」とは本明細書においては、互換的に使用され、本発明の組成物に含有されるポリペプチド鎖（例えば免疫グロブリンＨＣ又は免疫グロブリンＬＣ又は免疫グロブリンＦｃドメイン）のアミノ酸残基に共有結合した生物学的に許容されるペプチジル又は非ペプチジルの有機の基を指し、そのリンカー部分はポリペプチド鎖を分子内の別のペプチド又はポリペプチド鎖に、又は治療薬部分、例えば生物学的に活性な小分子又はオリゴペプチドに、又は半減期塩法部分に、共有結合的に接合させるかコンジュゲートし、例えばSullivan等、Toxin  Peptide  Therapeutic  Agents,  US2007  /0071764;Sullivan等、Toxin  Peptide  Therapeutic  Agents,  PCT/US2007/022831、即ち国際特許出願ＷＯ２００８／０８８４２２として公開されたもの；及び２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願６１／２１０、５９４を参照でき、これらは全て、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８４】
本発明の抗原結合蛋白の何れかのリンカー部分の存在は任意である。存在する場合、リンカーは、本発明の抗原結合蛋白の分子のある１つの機能的部分を、１つ以上の他の機能的部分との相対関係において、位置決め、接合、連結、又はその提示又は位置の最適化のためのスペーサーとして主に機能するため、その化学構造は重要ではない。リンカー部分の存在は本発明の抗原結合蛋白（抗体及び抗体フラグメントを包含する）の一部の実施形態の薬理学的活性を最適化する場合に有用となることができる。リンカーは好ましくはペプチド結合により相互に連結されたアミノ酸により構成される。リンカー部分が存在する場合は、それは、本発明の抗原結合蛋白中に存在する場合がある何れかの他のリンカーとは、独立して同じか又は異なることができる。
【０２８５】
上記した通り、リンカー部分は、（抗原結合蛋白の一次アミノ酸配列内部に、又は本発明の抗原結合蛋白に治療薬部分又は半減期延長部分を連結するためのリンカーとして）存在する場合には、性質において「ペプチジル」であり（即ちペプチド結合により共に連結されたアミノ酸よりなり）、そして好ましくは、１から４０アミノ酸残基、より好ましくは１から２０アミノ酸残基、そして最も好ましくは１〜約１０アミノ酸残基の長さで構成されることができる。必須ではないが好ましくは、リンカー中のアミノ酸残基は２０個のカノニカルなアミノ酸から、より好ましくはシステイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及び／又はセリンから形成される。更により好ましくは、ペプチジルリンカーはペプチド結合で連結されたグリシン、セリン、及びアラニンのような立体障害を受けないアミノ酸の多数により構成される。ペプチジルリンカーは、存在する場合は、インビボの循環系において急速な蛋白分解的ターンオーバーを回避するように選択されることが望ましい。これらのアミノ酸の一部は、当該分野で良く知られているとおり、グリコシル化してよい。例えばシアリル化部位を構成する有用なリンカー配列はＸ１Ｘ２ＮＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号１４８）であり、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５は各々独立して何れかのアミノ酸残基である。
【０２８６】
他の実施形態において、ペプチジルリンカー部分の１〜４０アミノ酸はグリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択される。好ましくは、リンカーはグリシン及びアラニンのような立体障害を受けないアミノ酸の多数から構成される。即ち、好ましいリンカーは、ポリグリシン、ポリセリン、及びポリアラニン、又はこれらの何れかの組み合わせを包含する。一部の例示されるペプチジルリンカーはポリ（Ｇｌｙ）１−８、特に（Ｇｌｙ）３、（Ｇｌｙ）４（配列番号１４９）、（Ｇｌｙ）５（配列番号１５０）及び（Ｇｌｙ）７（配列番号１５１）、並びに、ポリ（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ（配列番号１５２）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）２−４及びポリ（Ａｌａ）１−８である。ペプチジルリンカーの他の特定の例は（Ｇｌｙ）５Ｌｙｓ（配列番号１５４）、及び（Ｇｌｙ）５ＬｙｓＡｒｇ（配列番号１５５）を包含する。リンカーの他の特定の例は：他の有用なペプチジルリンカーの他の例は：
【０２８７】
（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号１５９）；
【０２８８】
（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号１５６）；
【０２８９】
（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号１５７）；及び、
【０２９０】
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号１５８）である。    
【０２９１】
上記の命名法を説明すれば、例えば（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４  はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１５９）を意味する。Ｇｌｙ  及び  Ａｌａの他の組み合わせも有用である。
【０２９２】
一般的に使用されているリンカーは本明細書において「Ｌ５」（ＧＧＧＧＳ；又は「Ｇ４Ｓ」；配列番号１５２）、「Ｌ１０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号１５３）、「Ｌ２５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号１４６）として識別されてよいもの及び後述するワーキング実施例において使用されているいずれかのリンカーを包含する。
【０２９３】
ペプチドリンカー部分を含む本発明の組成物の一部の実施形態においては、産生の残基、例えばグルタメート又はアスパルテート残基をリンカー部分のアミノ酸配列内に位置させる。例は以下のペプチドリンカー配列を包含する。
【０２９４】
ＧＧＥＧＧＧ（配列番号１６０）；
【０２９５】
ＧＧＥＥＥＧＧＧ（配列番号１６１）；
【０２９６】
ＧＥＥＥＧ（配列番号１６２）；
【０２９７】
ＧＥＥＥ（配列番号１６３）；
【０２９８】
ＧＧＤＧＧＧ（配列番号１６４）；
【０２９９】
ＧＧＤＤＤＧＧ（配列番号１６５）；
【０３００】
ＧＤＤＤＧ（配列番号１６６）；
【０３０１】
ＧＤＤＤ（配列番号１６７）；
【０３０２】
ＧＧＧＧＳＤＤＳＤＥＧＳＤＧＥＤＧＧＧＧＳ（配列番号１６８）；
【０３０３】
ＷＥＷＥＷ（配列番号１６９）；
【０３０４】
ＦＥＦＥＦ（配列番号１７０）；
【０３０５】
ＥＥＥＷＷＷ（配列番号１７１）；
【０３０６】
ＥＥＥＦＦＦ（配列番号１７２）；
【０３０７】
ＷＷＥＥＥＷＷ（配列番号１７３）；又は、
【０３０８】
ＦＦＥＥＥＦＦ（配列番号１７４）。
【０３０９】
他の実施形態において、リンカーはホスホリル化部位、例えば：Ｘ１Ｘ２ＹＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号１７５）、式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、及びＸ５は各々独立して何れかのアミノ酸残基であり；Ｘ１Ｘ２ＳＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号１７６）、式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５は各々独立して何れかのアミノ酸残基であり；又はＸ１Ｘ２ＴＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号１７７）、式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５は各々独立して何れかのアミノ酸残基である；を構成する。
【０３１０】
本明細書に記載するリンカーは例示であり；本発明の範囲に包含されるペプチジルリンカーはより長くともよく、そして他の残基を包含してよい。ペプチジルリンカーは例えばシステイン、他のチオール又は親核物質を半減期延長部分とのコンジュゲーションのために含有できる。別の実施形態においては、リンカーはシステイン又はホモシステイン残基、又は他の２−アミノエタンチオール又は３−アミノプロパンチオール部分を、マレイミド、ヨードアセトアミド又はチオエステル、官能性付与半減期延長部分とのコンジュゲーションのために含有する。
【０３１１】
別の有用なペプチジルリンカーは、ランダムなＧｌｙ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列、例えば：ＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴＨ（配列番号１７８）又はＨＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴ（配列番号１７９）を含むフレキシブルリンカーであり、これは概ね１ｋＤａＰＥＧ分子のサイズであると推定されている。あるいは有用なペプチジルリンカーはリジッドでヘリカルな構造を形成することが当該分野で知られているアミノ酸配列を有してよい（例えばリジッドリンカー−ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧ−）（配列番号１８０）。更に又、ペプチジルリンカーは式−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−の６炭素脂肪族分子のような非ペプチジルセグメントを含むこともできる。ペプチジルリンカーは本明細書に記載する通り改変して誘導体を形成することができる。
【０３１２】
場合により、非ペプチジルリンカー部分は又、半減期延長部分コンジュゲートトキシンペプチド類縁体のペプチド部分に半減期延長部分をコンジュゲートするためにも有用である。例えばアルキルリンカー、例えば−ＮＨ−（ＣＨ２）５−Ｃ（Ｏ）−、式中ｓ＝２〜２０を使用できる。これらのアルキルリンカーは更に、何れかの非立体障害基、例えば低級アルキル（例えばＣ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えばＣｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等で置換されても良い。例示される非ペプチジルリンカーはポリエチレングリコール（ＰＥＧリンカー（例えば下記）：
【０３１３】
（Ｉ）
【０３１４】
【化１５】
2013511279.tif 000033
［式中、ｎはリンカーが約１００〜約５０００ダルトン（Ｄａ）、好ましくは約１００〜約５００Ｄａの分子量を有するようなものである］である。
【０３１５】
１つの実施形態において、非ペプチジルリンカーはアリールである。リンカーは例えばSullivan等、Toxin  Peptide  Therapeutic  Agents,  US2007  /0071764;Sullivan  et  al.,  Toxin  Peptide  Therapeutic  Agents,  国際特許出願ＷＯ２００８／０８８４２２として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１；及び２００９年３月２０日出願の米国仮特許出願６１／２１０、５９４において当該分野で報告されている態様と同様にして改変し、誘導体を形成してよく、これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０３１６】
更に又、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧアルデヒドを用いた還元的アルキル化又はスクシンイミド又はＰＥＧのカーボネートエステルを用いたアシル化の何れかによるか、又は、チオールコンジュゲーションにより、Ｎ末端アミン又は選択された側鎖アミンに連結してよい。
【０３１７】
「アリール」はフェニル又は飽和、部分飽和、又は不飽和の３−、４−、又は５員の炭素架橋と近接して融合したフェニルであり、フェニル又は架橋はＣ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル又はハロから選択される置換基０、１、２又は３個で置換されている。
【０３１８】
「ヘテロアリール」は不飽和の５、６又は７員の単環又は部分飽和又は不飽和の６、７、８、９、１０又は１１員の２環であり、ここで少なくとも１つの環は不飽和であり、単環及び２環の環はＮ、Ｏ及びＳから選択される１、２、３又は４個の原子を含有し、ここで環はＣ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル又はハロから選択される置換基０、１、２又は３個で置換されている。
【０３１９】
非ペプチジルリンカー又は非ペプチド半減期延長部分のような、本発明用件組成物の非ペプチド部分は従来の有機化学反応により合成できる。  
【０３２０】
上記は例示に過ぎず、そして本発明に従って場合により使用できるリンカーの種類を網羅的に処理したものではない。
【０３２１】
抗原結合蛋白の生産。上記した通り、組み換えＤＮＡ及び／又はＲＮＡ媒介蛋白発現及び蛋白操作の手法、又は何れかの他のペプチド調製方法を、本発明の組成物の作成に適用される。例えば、ポリペプチドは形質転換された宿主細胞中で作成できる。要すれば、ペプチドをコードしている組み換えＤＮＡ分子、又はコンストラクトを調製する。そのようなＤＮＡ分子を調製する方法は、当該分野で良く知られている。例えば、ペプチドをコードする配列を適当な制限酵素を用いてＤＮＡから切り出すことができる。多数の入手可能で当該分野で良く知られている宿主細胞の何れかを本発明の実施において使用してよい。特定の宿主の選択は当該分野で認識されている多くの要因に依存している。それらは例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によりコードされるペプチドの毒性、形質転換の比率、ペプチドの回収の容易さ、発現特性、生物安全性及び費用を包含する。これらの要因のバランスは、宿主の全てが特定のＤＮＡ配列の発現のために等しく有効ではないという考え方と合致する。これらの一般的指針の範囲内で、培養において有用な微生物宿主細胞は、細菌（例えばエシェリシア・コリ・エスピー）、コウボ（例えばサッカロマイセス・エスピー）及び他のカビ細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類（ヒトを包含）細胞、例えばＣＨＯ細胞及びＨＥＫ−２９３細胞、及び本明細書に記載するか別様に当該分野で知られている他のものを包含する。修飾はＤＮＡレベルでも行うことができる。ペプチドコードＤＮＡ配列は選択された宿主細胞とより適合性であるコドンに変更してよい。Ｅ・コリの場合、最適化されたコドンが当該分野で知られている。制限部位を排除するため、又はサイレントな制限部位を包含するためにコドンを置換することができ、これにより選択された宿主細胞中でのＤＮＡのプロセシングに役立つ場合がある。次に形質転換された宿主を培養して精製する。宿主細胞は所望の化合物が発現されるように従来の発酵条件下に培養してよい。そのような発行条件は当該分野で良く知られている。更に又、ＤＮＡは、融合蛋白のコーディング領域対して５’において、発現された特異的結合剤又は抗原結合蛋白、例えば免疫グロブリン蛋白に作動可能に連結したシグナルペプチド配列（例えば分泌シグナルペプチド）を更にコードする。適切な組み換え方法の別の例、及び、本発明の特異的結合剤にコンジュゲートした２量体Ｆｃ融合蛋白（「ペプチボディー」）又はキメラ免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）−Ｆｃヘテロ３量体（「ヘミボディー」）を包含する、哺乳類による本発明の組成物の組み換え発現のために有用な例示されるＤＮＡコンストラクトに関しては、例えばSullivan等、Toxin  Peptide  Therapeutic  Agents,  US2007  /0071764;Sullivan等、Toxin  Peptide  Therapeutic  Agents,  国際特許出願ＷＯ 2008/088422として公開されたPCT/US2007/022831；及び２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願61/210,594を参照でき、そしてこれらは全て参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０３２２】
所望の抗原結合蛋白のアミノ酸配列変異体は、コードするＤＮＡないに適切なヌクレオチドの変化を導入することによるか、又はペプチド合成により調製してよい。そのような変異体は、例えば、抗原結合蛋白又は抗体のアミノ酸配列内部に残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を包含する。欠失、挿入及び置換の何れかの組み合わせを最終コンストラクトで間に合うように行うが、このとき最終コンストラクトは所望の特性を保有していなければならない。ああ変化は又グリコシル化部位の数又は位置を変えることのような、抗原結合蛋白の翻訳後プロセスを改変しても良い。特定の例においては、抗原結合蛋白変異体はエピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基を修飾する意図を持って調製される。他の実施形態においては、エピトープ結合に直接関与しない残基、又は如何なる態様においてもエピトープ結合に関与しない残基の修飾が、本明細書において考察する目的のために望ましい。ＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域の何れかの内部における突然変異誘発が意図される。抗体又は抗体フラグメントを含む抗原結合蛋白のアミノ酸配列における有用な修飾を設計するために、共分散分析法を当業者は使用できる。（例えばChoulier,等、Covariance  Analysis  of  Protein  Families:  The  Case  ofthe  Variable  Domains  of  Antibodies,  Proteins:  Structure,  Function,  and  Genetics  41:475-484(2000);Demarest等、Optimization  of  the  Antibody  CH3  Domain  by  Residue  Frequency  Analysis  oflgG  Sequences,  J.  Mol.  Biol.  335:41-48(2004);Hugo等、VL  position  34  is  a  key  determinant  for  the  engineering  of  stable  antibodies  with  fast  dissociation  rates,  Protein  Engineering  16(5):381-86(2003);Aurora等、Sequence  covariance  networks,  methods  and  uses  thereof,  米国特許出願２００８／０３１８２０７Ａ１;Glaser等、Stabilized  polypeptide  compositions,  米国特許出願２００９／００４８１２２Ａ１;Urech等、Sequence  based  engineering  and  optimization  of  single  chain  antibodies,  国際特許出願ＷＯ２００８／１１０３４８Ａ１;Borras等、Methods  of  modifying  antibodies,  and  modified  antibodies  with  improved  functional  properties,  国際特許出願ＷＯ２００９／００００９９Ａ２）。このような修飾は抗原結合蛋白の力価、薬物動態、薬力学、及び／又は製造性の特性を向上させることができる。
【０３２３】
抗原結合蛋白又は抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当該分野で知られている種々の方法により調製される。そのような方法は抗原結合蛋白のより早期に調製された変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位指向性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発を包含する。
【０３２４】
超可変又はＣＤＲ領域又はフレームワーク領域の何れかの内部における置換突然変異誘発が意図される。突然変異誘発のための好ましい箇所である抗原結合蛋白の特定の残基又は領域の識別のための有用な方法はCunningham  and  Wells  Science,  244:1081-1085(1989)に記載される通り、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と称される。ここで、  残基又は標的残基の群を識別（例えば荷電残基、例えばarg、asp、his、  lys及びglu）し、そして、中性又は負荷電のアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）で置き換えることにより抗原内のアミノ酸の相互作用に影響することができる。次に置換に対して機能的感受性を呈しているアミノ酸箇所を、置換の部位における、又はそれに対する追加的又は別の変異体を導入することにより精製する。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位を予め決定するが、突然変異の性質そのものは予め決定する必要はない。例えば、所定の位置における突然変異の性能を分析するためには、ａｌａスキャニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域において実施し、そして発現された変異体をスクリーニングして所望の活性を有するものを得る。
【０３２５】
本発明の抗原結合蛋白の一部の実施形態は合成方法により作成できる。固相合成は小型ペプチドの最も経費効率的な方法であるため、個々のペプチドを作成する好ましい方法である。例えば、よく知られた固相合成の手法は、保護基、リンカー及び固相支持体、並びに特定の保護及び脱保護の反応条件、リンカー切断条件の使用、スカベンジャーの使用、及び固相ペプチド合成のその他の側面を包含する。適する手法は当該分野で良く知られている。（例えばMerrifield(1973),  Chem.  Polypeptides,  pp.  335-61(Katsoyannis  and  Panayotis  eds.);Merrifield(1963),  J.  Am.  Chem.  Soc.  85:  2149;Davis等、(1985),  Biochem.  Intl.  10:  394-414;Stewart  and  Young(1969),  Solid  Phase  Peptide  Synthesis;U.S.  Pat.  No.  3,941,763;Finn等、(1976),  The  Proteins(3rd  ed.)  2:  105-253；及びErickson等、(1976),  The  Proteins(3rd  ed.)  2:  257-527;"Protecting  Groups  in  Organic  Synthesis,"  3rd  Edition,  T.  W.  Greene  and  P.  G.  M.  Wuts,  Eds.,  John  Wiley  &  Sons,  Inc.,  1999;NovaBiochem  Catalog,  2000;"Synthetic  Peptides,  A  User's  Guide,"  G.  A.  Grant,  Ed.,  W.H.  Freeman  &  Company,  New  York,  N.Y.,  1992;"Advanced  Chemtech  Handbook  of  Combinatorial  &  Solid  Phase  Organic  Chemistry,"  W.  D.  Bennet,  J.  W.  Christensen,  L.  K.  Hamaker,  M.  L.  Peterson,  M.  R.  Rhodes,  and  H.  H.  Saneii,  Eds.,  Advanced  Chemtech,  1998;"Principles  of  Peptide  Synthesis,  2nd  ed.,"  M.  Bodanszky,  Ed.,  Springer-Verlag,  1993;"The  Practice  of  Peptide  Synthesis,  2nd  ed.,"  M.  Bodanszky  and  A.  Bodanszky,  Eds.,  Springer-Verlag,  1994;"Protecting  Groups,"  P.  J.  Kocienski,  Ed.,  Georg  Thieme  Verlag,  Stuttgart,  Germany,  1994;"Fmoc  Solid  Phase  Peptide  Synthesis,  A  Practical  Approach,"  W.  C.  Chan  and  P.  D.  White,  Eds.,  Oxford  Press,  2000,  G.  B.  Fields等、Synthetic  Peptides:  A  User's  Guide,  1990,  77-183参照）。本発明の要件組成物の作成に適用される当該分野で知られている合成及び精製の方法のその他の例はに関しては、例えばSullivan等、Toxin  Peptide  Therapeutic  Agents,  US2007  /0071764  and  Sullivan等、Toxin  Peptide  Therapeutic  Agents,  国際特許出願ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１を参照でき、これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０３２６】
本明細書において抗原結合蛋白並びに変異体の何れかを更に説明する場合に、天然に存在するペプチド及び蛋白に一般的に取り込まれている２０種の「カノニカル」なアミノ酸残基のアイデンティティーを標記するために、一文字略記システムを頻繁に適用する（表４）。そのような一文字略記法は３文字略記法又は非略記アミノ酸名と、意味においては全く互換である。本明細書において使用する一文字略記システムにおいては、大文字はＬ−アミノ酸、小文字はＤ−アミノ酸を示す。例えば略記法「Ｒ」はＬ−アルギニンを示し、そして略記法「ｒ」はＤ−アルギニンを示す。
【表４−１】
2013511279.tif 000034
【０３２７】
アミノ酸配列におけるアミノ酸置換は典型的には特定の位置におけるアミノ酸残基の一文字略記、それに続いて目的の元の配列に対して相対的な数字によるアミノ酸の位置、そしてそれに続いて置換されたアミノ酸残基に関する一文字符号により、本明細書においては標記する。例えば「Ｔ３０Ｄ」は、目的の元の配列に対して相対的なアミノ酸位置３０におけるアスパルテート残基によるスレオニン残基の置換を表している。別の例「Ｓ２１８Ｇ」は、目的の元の配列、例えば配列番号２に対して相対的なアミノ酸位置２１８におけるグリシン残基によるセリン残基の置換を表している。
【０３２８】
組み換え発現する細胞を使用する蛋白操作の知られた手法を用いながら本発明の範囲内で非カノニカルなアミノ酸残基をポリペプチドに取り込むことができる（例えばLink等、Non-canonical  amino  acids  in  protein  engineering,  Current  Opinion  in  Biotechnology,  14(6):603-609(2003)を参照できる）。「非カノニカルなアミノ酸残基」という用語は、天然に存在する蛋白に一般的に取り込まれる２０種のカノニカルなアミノ酸に属さないＤ又はＬ型のアミノ酸残基、例えばβ−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸及び誘導体化された側鎖を有するアミノ酸を指す。例は、（Ｌ型又はＤ型としてβ−アラニン、β−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノマレイン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎα−エチルグリシン、Ｎα−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロイソロイシン、ω−メチルアルギニン、Ｎα−メチルグリシン、Ｎα−メチルイソロイシン、Ｎα−メチルバリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ  −アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎα−アセチルセリン、Ｎα−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、及び他の同様のアミノ酸、及び以下に示す表５に列挙するもの、及び本明細書に記載する通りのこれらの何れかの誘導体化された形態を包含する。表５は本発明において有用な一部の例示される非カノニカルなアミノ酸残基及び本明細書において典型的に使用する関連の略記法を含んでいるが、異なる略記法及び命名法を同じ物質に適用してよく、そして本明細書においては互換であることは、当業者の知る通りである。
［表５］
本発明によるペプチド配列内へのアミノ酸の付加、挿入、又は置換のために有用な非カノニカルアミノ酸。表５に列挙する略記法が本明細書に別途開示する同じ物質に関する別の略記法と異なる場合は、両方の略記法を適用すると理解する。表５に列挙するアミノ酸はＬ型又はＤ型であることができる。
【表５−１】
2013511279.tif 000035
【表５−２】
2013511279.tif 000036
【表５−３】
2013511279.tif 000037
【表５−４】
2013511279.tif 000038
【０３２９】
「Nomenclature  and  Symbolism  for  Amino  Acids  and  Peptides  by  the
UPAC-IUB  Joint  Commission  on  Biochemical  Nomenclature(JCBN)  」が以下の文書：Biochem.  J.,  1984,  219,  345-373;Eur.  J.  Biochem.,  1984,  138,  9-37;1985,  152,  1;1993,  213,  2;Internat.  J.  Pept.  Prot.  Res.,  1984,  24,  following  p  84;J.  Biol.  Chem.,  1985,  260,  14-42;Pure  Appl.  Chern.,  1984,  56,  595-624;Amino  Acids  and  Peptides,  1985,  16,  387-410;Biochemical  Nomenclature  and  Related  Documents,  2nd  edition,  Portland  Press,  1992,  pages  39-69において公開されている。
【０３３０】
本発明の抗原結合蛋白のペプチドドメインに対する有用な修飾１つ以上は、知られた化学的手法により達成できるアミノ酸の付加又は挿入、アミノ酸の欠失、ペプチドのトランケーション、アミノ酸の置換、及び／又はアミノ酸の化学的誘導体化を包含できる。例えばこのように修飾されたアミノ酸配列は、目的のネイティブの配列のアミノ酸配列と相対比較して自身の内部に挿入又は置換された少なくとも１つのアミノ酸残基を包含し、その場合、挿入又は置換されたアミノ酸残基は、リンカー及び／又は半減期延長部分にペプチドをコンジュゲートする親核又は親電子の反応性官能基を含む側鎖を有する。本発明によれば、そのような親核又は親電子の反応性官能基の有用な例は、チオール、第１アミン、セレノ、ヒドラジド、アルデヒド、カルボン酸、ケトン、アミノオキシ、マスクされた（保護された）アルデヒド、又はマスクされた（保護された）ケトの官能基を包含するがこれらに限定されない。親核反応性官能基を含む側鎖を有するアミノ酸の例は、リジン残基、ホモリジン、α、β−ジアミノプロピオン酸残基、α、γ−ジアミノ酪酸残基、オルニチン残基、システイン、ホモセリン、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、又はセレノシステイン残基を包含するが、これらに限定されない。
【０３３１】
アミノ酸残基は種々異なる化学的及び／又は物理的特性に従ってカテゴリー化される。「酸性アミノ酸残基」という用語は酸性の基を含む側鎖を有するＤ又はＬ型のアミノ酸残基を指す。例示される酸性の残基はアスパラギン酸及びグルタミン酸の残基を包含する。「アルキルアミノ酸残基」という用語はプロリンの場合のようにアミノ酸アミンを包含する直鎖、分枝鎖、又は環化されていてよいＣ１−６アルキル側鎖を有するＤ又はＬ型のアミノ酸残基、ここでＣ１−６アルキルはＣ１−４ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、−ＮＲａＣ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、−ＯＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−ＯＣ２−６アルキルＮＲａＲａ、−ＯＣ２−６アルキルＯＲａ、−ＳＲａ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（＝０）２Ｒｂ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ、−ＮＲａＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｂ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ、−ＮＲａＣ２−６アルキルＮＲａＲａ及び−ＮＲａＣ２−６アルキルＯＲａから選択される置換基０、１、２又は３個で置換されており；ここでＲａは独立して、各場合において、Ｈ又はＲｂであり；そしてＲｂは独立して、各場合において、ハロ、Ｃ１−４ａｌｋ、Ｃ１−３ハロａｌｋ、−ＯＣ１−４ａｌｋ、−ＮＨ２、−ＮＨＣ１−４ａｌｋ、及び−Ｎ（Ｃ１−４ａｌｋ）Ｃ１−４ａｌｋから選択される置換基０、１、２又は３個で置換されたＣ１−６アルキルであるもの；又は、その何れかの保護された形態を指し、例えばアラニン、バリン、ロイシン,イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメート,アスパラギン、グルタミン、システイン、メチオニン、ヒドロキシプロリンを包含するが、この残基はアリール又は芳香族基を含有しない。「芳香族アミノ酸残基」という用語は芳香族基を含む側鎖を有するＤ又はＬ型のアミノ酸残基を指す。例示される芳香族残基はトリプトファン、チロシン、３−（１−ナフチル）アラニン、又はフェニルアラニン  残基を包含する。「塩基性アミノ酸残基」という用語は塩基性の基を含む側鎖を有するＤ又はＬ型のアミノ酸残基を指す。例示される塩基性アミノ酸残基は、ヒスチジン、リジン、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、及びホモアルギニン（ｈＲ）残基を包含する。「親水性アミノ酸残基」という用語は極性基を含む側鎖を有するＤ又はＬ型のアミノ酸残基を指す。例示される親水性残基はシステイン、セリン、スレオニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、アスパルテート、グルタメート、グルタミン、及びシトルリン（Ｃｉｔ）残基を包含する。「親油性アミノ酸残基」という用語は未荷電の脂肪族又は芳香族の基を含む側鎖を有するＤ又はＬ型のアミノ酸残基を指す。例示される親油性側鎖はフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン���バリン、トリプトファン、及びチロシンを包含する。アラニン（Ａ）は両親媒性であり、これは親水性又は親油性の残基として作用することができる。したがってアラニンは「親油性残基」及び「親水性残基」の両方の定義内に包含される。「非官能性アミノ酸残基」という用語は酸性、塩基性及び芳香族の基を欠いた側鎖を有するＤ又はＬ型のアミノ酸残基を指す。例示される中性のアミノ酸残基はメチオニン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、及びノルロイシン（Ｎｌｅ）残基を包含する。
【０３３２】
別の有用な実施形態は本明細書に開示したポリペプチドのアミノ酸配列の保存的修飾から得ることができる。保存的修飾はそのような修飾を行うもととなるコンジュゲートされた（例えばＰＥＧコンジュゲートされた）ペプチドのものと同様の機能的、物理的、及び化学的な特性を有する半減期延長部分コンジュゲートペプチドを生成することになる。本明細書に開示するコンジュゲートされたポリペプチドのそのような保存的修飾を受けた形態もまた本発明の実施形態として意図される。
【０３３３】
一方、ペプチドの機能的及び／又は化学的特性における実質的修飾は、（ａ）例えばヘリカルコンホーメーションとしての、置換の領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は、（ｃ）分子の大きさを維持することに対するそれらの作用が有意に異なるアミノ酸配列における置換を選択することにより達成してよい。
【０３３４】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性又は電荷に対して影響が僅かであるか全く無いような、ネイティブのアミノ酸残基の非ネイティブの残基による置換を包含してよい。更に又、ポリペプチドにおける何れかのネイティブの残基は又、「アラニンスキャニング突然変異誘発」に関して以前に報告されている通り、アラニンによって置換されても良い（例えばアラニンスキャニング突然変異誘発に関して考察しているMacLennan等、Acta  Physiol.  Scand.  Suppl.,  643:55-67(1998);Sasaki等、1998,  Adv.  Biophys.  35:1-24(1998)を参照できる）。
【０３３５】
所望のアミノ酸置換（保存的又は非保存的な）は、そのような置換が望まれるときに、当業者により決定されることができる。例えば、アミノ酸置換はペプチド配列の重要な残基を発見するため、又は本明細書に記載したペプチド又はベヒクルコンジュゲートペプチドの分子の親和性を増大又は減少させるために使用できる。
【０３３６】
天然に存在する残基は共通尿の側鎖の特性に基づいて以下の通り分類される。
１）疎水性：ノルロイシン（Ｎｏｒ又はＮｌｅ）、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び、
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【０３３７】
保存的アミノ酸置換はこれらのクラスの１つのメンバーの同じクラスの別のメンバーとの交換を包含してよい。保存的アミノ酸置換は非天然に存在するアミノ酸残基を包含してよく、これは典型的には生物学的な系における合成よりは寧ろ科学的なペプチド合成により取り込まれる。これらはペプチドミメティック及びアミノ酸部分の他の逆転又は反転した形態を包含する。
【０３３８】
非保存的置換はこれらのクラスの１つのメンバーの別のクラスのメンバーに対する交換を包含してよい。そのような置換された残基は毒素ペプチド類縁体の領域内に導入してよい。
【０３３９】
特定の実施形態に従ってこのような変更を行う場合、アミノ酸のハイドロパシック指数を考慮してよい。各アミノ酸はその疎水性及び荷電特性に基づいてハイドロパシック指数を割り付けられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【０３４０】
蛋白に相互作用的な生物学的機能を付与する場合のハイドロパシックアミノ酸指数の重要性は当該分野で理解されている（例えばKyte等、1982,  J  Mol.  Biol.  157:105-131を参照できる）。特定のアミノ酸は同様のハイドロパシック指数又はスコアを有する他のアミノ酸を置換してよく、そしてなお同様の生物学的活性を保持している。ハイドロパシック指数に基づいて変化を起こす場合、特定の実施形態においてはハイドロパシック指数が±２以内であるアミノ酸の置換を包含する。特定の実施形態においては、±１以内であるものを包含し、特定の実施形態においては±０．５以内であるものを包含する。
【０３４１】
類似のアミノ酸の置換は、特にそれにより作成される生物学的に機能性の蛋白又はペプチドが本明細書に定義するとおり免疫学的実施形態における使用を意図している場合に、親水性に基づいて効果的に行えることも当該分野で理解されている。特定の実施形態においては、蛋白の最大の局所的平均親水性は、その隣接アミノ酸の親水性により決定される通り、その免疫原性及び抗原性と、即ち、蛋白の生物学的特性と相関している。
【０３４２】
以下の親水性価がこれらのアミノ酸残基に割り付けられており、即ち：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）である。同様の親水性価に基づいて変化を起こす場合、特定の実施形態においては親水性価が±２以内であるアミノ酸の置換を包含し、特定の実施形態においては、±１以内であるものを包含し、特定の実施形態においては±０．５以内であるものを包含する。更に又、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを発見しても良い。これらの領域は「エピトープコア領域」とも称される。
【０３４３】
保存的置換の例は、１つの非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンノルロイシン、アラニン、又はメチオニンの別のものとの置換、１つの極性（親水性）アミノ酸残基の別のものとの置換、例えばアルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間の置換、１つの塩基性アミノ酸残基、例えばリジン、アルギニン又はヒスチジンの別のものとの置換、又は１つの酸性残基、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸の別のものとの置換を包含する。「保存的アミノ酸置換」という句は又、非誘導体化残基の代わりとなる化学的誘導体化残基の使用を包含するが、ただし、そのようなポリペプチドが必要な生物学的活性をディスプレイしなければならない。本発明において有用であることができるその他の例示されるアミノ酸置換は以下の表６に示される通りである。
【表６】
2013511279.tif 000039
【０３４４】
通常は、抗原結合蛋白のアミノ酸配列変異体は、重鎖又は軽鎖の可変領域の何れかの、元の抗原結合蛋白又は抗体のアミノ酸配列と少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％又は少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、更により好ましくは少なくとも９０％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有することになる。この配列に関する同一性又は相同性は、本明細書においては、最大パーセント配列同一性を達成するために配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後に、そして如何なる保存的置換も配列同一性の部分と見なさない場合に、元の配列と同一である候補配列におけるアミノ酸のパーセンテージとして定義される。抗原結合蛋白又は抗体の配列内へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸長、欠失、又は挿入も配列の同一性又は相同性に影響するものとしない。
【０３４５】
アミノ酸配列の挿入は、１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに、単一又は多数のアミノ酸残基の配列内挿入を包含する。末端挿入の例はＮ末端メチオニル残基を有する抗原結合蛋白又はエピトープタグ又はサルベージ受容体結合エピトープに融合された抗原結合蛋白（抗体又は抗体フラグメントを包含）を包含する。抗原結合蛋白又は抗体分子の他の挿入変異体は、例えばＮ末端又はＣ末端における抗原結合蛋白の血清中半減期を延長するポリペプチドの融合を包含する。
【０３４６】
エピトープタグの例は、流行性感冒ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等、Mol.  Cell.  Biol.  8:  2159-2165(1988)];ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等、Mol.  Cell.  Biol.  5(12):  3610-3616(1985)]；及び単純疱疹ウィルス糖蛋白Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Paborsky等、Protein  Engineering  3(6):  547-553(1990)]を包含する。その他の例示されるタグは、ニッケルキレート形成を用いて標識された化合物の単離を可能にする一般的には約６ヒスチジン残基のポリヒスチジン配列である。他の標識及びタグ、例えばＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Eastman  Kodak,  Rochester,  NY）が当該分野で良く知られており、定型的に使用されている。
【０３４７】
抗体及び抗体フラグメントを包含する本発明の抗原結合蛋白のアミノ酸置換変異体の一部の特定の非限定的な実施形態を以下に例示する。
【０３４８】
抗原結合蛋白の適切なコンホーメーションの維持に関与しない何れかのシステイン残基も又、一般的にはセリンで置換することにより、分子の酸化安定性を向上させ、異常な交差結合を防止してよい。逆に、システイン結合を抗原結合蛋白に付加することによりその安定性を向上させても良い（特に抗原結合蛋白が抗体フラグメント、例えばＦｖフラグメントの場合）。
【０３４９】
特定の例においては、抗原結合蛋白変異体はエピトープ結合に直接関与しているアミノ酸残基を修飾する意図で調製される。他の実施形態においては、エピトープ結合に直接関与していない残基又は如何なる態様においてもエピトープ結合に関与していない残基の修飾が、本明細書において考察する目的のために望ましい。ＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域の何れかの内部の突然変異誘発が意図される。
【０３５０】
どの抗原結合蛋白のアミノ酸残基がエピトープ認識と結合のために重要であるかを調べるために、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施して置換変異体を生成するコーティングとができる。例えばCunningham等、Science,  244:1081-1085(1989)を参照することができ、その開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。この方法においては、個々のアミノ酸残基を１回に１つアラニン残基で置き換え、そして得られる抗Ａβ抗原結合蛋白を、未修飾ポリペプチドと相対比較した場合にその特異的エピトープに結合するその能力に関してスクリーニングする。低減した結合能力を有する修飾された抗原結合蛋白を配列決定することにより、どの残基が変化したかを調べることができ、結合又は生物学的特性におけるその重要性がわかる。
【０３５１】
抗原結合蛋白の置換変異体は、ランダムアミノ酸変化を親ポリペプチド配列内に導入する親和性成熟により調製できる。例えばOuwehand等、Vox  Sang  74(Suppl2):223-232,  1998;Rader等、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA    95:8910-8915,  1998;Dall'  Acqua等、Curr.  Opin.  Struct.  Biol.  8:443-450,  1998を参照でき、その開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。親和性成熟では、抗ｈＯｒａｉ１抗原結合蛋白又はその変異体を調製及びスクリーニングし、そして、得られた変異体から、修飾された生物学的特性、例えば親抗Ａβ抗原結合蛋白と相対比較して増大した結合親和性を有するものを選択する。置換変異体を作成するための好都合な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟である。要すれば、幾つかの超可変領域の部位を突然変異させて各部位において全ての可能なアミノ置換が生じるようにする。このようにして発生した変異体は、フィラメントファージ粒子の表面上に１価の態様において、各粒子内部にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として発現される。ファージディスプレイされた変異体を次に、それらの生物学的活性（例えば結合親和性）に関してスクリーニングする。例えば国際特許出願ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９３／１１２３６６、ＷＯ９５／１５３８８及びＷＯ９３／１９１７２を参照できる。
【０３５２】
現在の抗体の親和性成熟方法は２つの突然変異誘発のカテゴリー、即ち統計法及び非統計法に属する。エラープローンＰＣＲ、突然変異誘発遺伝子細菌系統（Low等、J  Mol.  Biol.  260,  359-68,  1996）、及び飽和突然変異誘発（Nishimiya等、J  Biol.  Chem.  275:12813-20,  2000;Chowdhury,  P.  S.  Methods  Mol.  Biol.  178,  269-85,  2002）が統計的突然変異誘発法の典型例である（Rajpal等、Proc  Natl  Acad  Sci  US  A.  102:8466-71,  2005）。非統計的手法は頻繁にはアラニンスキャニング又は部位指向性の突然変異誘発を使用することにより特定のムテインの限定的コレクションを作成する。一部の方法は後述において更に説明する。
【０３５３】
パニング法を介した親和性成熟−組み換え抗体の親和性成熟は一般的には全原料の抗原の存在下の候補抗体の数ラウンドのパニングを介して実施される。ラウンド当たりの抗原の量を低減すると、抗原への最も高い親和性を有する抗体が選択され、これにより大プールの原料から高親和性の抗体が得られる。パニングを介した親和性成熟は当該分野で良く知られており、例えばHuls等、（Cancer  Immunol  Immunother.  50:163-71,  2001）に記載されている。ファージディスプレイ技術を使用した親和性成熟の方法は本明細書に別途記載して折り、そして当該分野で知られている（例えばDaugherty等、Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  97:2029-34,  2000参照）。
【０３５４】
ルックスルー突然変異誘発−ルックスルー突然変異誘発（ＬＴＭ）（Rajpal等、Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  102:8466-71,  2005）は抗体結合部位を迅速にマッピングするための方法を提供する。ＬＴＭのためには、２０の天然のアミノ酸により与えられる主要な側鎖化学特徴の代表である９つのアミノ酸を選択して、抗体の全６箇所のＣＤＲの位置毎の結合への機能的側鎖の寄与を精査する。ＬＴＭは各「野生型」残基が９種の選択されたアミノ酸の１つにより系統的に置換されるＣＤＲ内部の単独突然変異の位置的シリーズをもたらす。突然変異したＣＤＲを組み合わせ、全てのムテインの定量的ディスプレイに対して禁制的となることなく、複雑性及び大きさが漸増するコンビナトリアルな単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ライブラリを作成する。正の選択の後、向上した結合を有するクローンを配列決定し、そして有益な突然変異をマッピングする。
【０３５５】
エラープローンＰＣＲ−エラープローンＰＣＲでは種々の選択ラウンド間の核酸のランダム化を行う。ランダム化は使用するポリメラーゼの内因性エラー率により低比率で生じるが、転写の間で高い内因性エラー率を有するポリメラーゼを用いる（Hawkins等、J  Mol  Biol.226:889-96,  1992）を用いるエラープローンＰＣＲ（Zaccolo等、J.  Mol.  Biol.  285:775-783,  1999）により増強できる。突然変異サイクルの後、抗原に対する向上した親和性を有するクローンを当該分野で定型的な方法を用いて選択する。
【０３５６】
遺伝子シャフリング及び指向性進化を利用した手法もまた抗Ｏｒａｉ１ＥＣＬ２抗原結合蛋白又はその変異体を調製し、望ましい活性に関してスクリーニングするために利用してよい。例えば、Jermutus等のProc  Natl  Acad  Sci  USA.,  z8(1):75-80(2001)  はｓｃＦｖのオフレート又は熱力学的な安定性を進化させるためにリボソームディスプレイに基づいたテイラードインビトロ選択の方策をＤＮＡシャフリングによるインビトロ多様化と組み合わせたことを示している。  Fermer等のTumour  Biol.  2004  Jan-Apr;25(1-2):7-13はＤＮＡシャフリングと組み合わせてファージディスプレイを使用したところ親和性がほぼ３桁上昇したことを報告している。Dougherty等のProc  Natl  Acad  Sci  USA.  2000  Feb.  29;97(5):2029-2034は（ｉ）機能的クローンは超突然変異ライブラリ中意外な高頻度で起こり、（ｉｉ）機能獲得（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）突然変異体はそのようなライブラリ中で良好に示され、そして（ｉｉｉ）より高値の親和性をもたらすｓｃＦｖ突然変異の大部分は結合部位からは遠い残基に相当すると報告している。
【０３５７】
代替又は追加として、抗体と抗原の間の接点を識別するために抗原抗体複合体の結晶構造を分析するか、又はそのような接点をモデル化するためにコンピューターソフトウエアを使用することが有益である場合がある。そのような残基及び近隣の残基は本明細書において検討している手法に従った置換のための候補である。そのような変異体が作成された後、それらを本明細書に記載するとおりスクリーニングに節、そして１つ以上の該当アッセイにおいて優れた特性を有する抗体をその後の開発のために選択してよい。
【０３５８】
修飾された炭水化物を有する抗原結合蛋白
【０３５９】
親ポリペプチドと相対比較して修飾されたグリコシル化パターンを有する抗原結合蛋白変異体を、例えば、抗原結合蛋白に結合した炭水化物部分１つ以上を付加又は欠失させながら、及び／又は、抗原結合蛋白中のグリコシル化部位１つ以上を付加又は欠失させながら、生成することができる。
【０３６０】
抗体を包含するポリペプチドのグリコシル化は典型的にはＮ連結又はＯ連結の何れかである。Ｎ連結とはアスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の連結を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン、ただしここでＸはプロリン以外の何れかのアミノ酸であるものが、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的連結のための認識配列である。ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列の何れかの存在が潜在的グリコシル化部位を創生する。即ち、Ｎ連結グリコシル化部位は、これらのトリペプチド配列１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することにより、抗原結合蛋白に付加される。Ｏ連結グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの１つの連結を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンもまた使用してよい。Ｏ連結グリコシル化部位は、元の抗原結合蛋白又は抗体の配列にセリン又はスレオニン残基１つ以上を挿入又は置換することにより抗原結合蛋白に付加してよい。  
【０３６１】
改変されたエフェクター機能
【０３６２】
システイン残基を抗体のＦｃ領域又はＦｃ含有ポリペプチドから除去するかこれに導入することにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を排除又は増大してよい。このようにして形成されたホモ２量体の抗原結合蛋白は、向上した内在化能力及び／又は増大した補体媒介細胞殺傷及び抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有してよい。Caron等、J.  Exp  Med.  176:  1191-1195(1992)  and  Shopes,  B.  J.  Immunol.  148:  2918-2922(1992)を参照できる。ホモ２量体抗原結合蛋白又は抗体は又、Wolff等のCancer  Research  53:  2560-2565(1993)に記載されるとおり、ヘテロ２官能性交差結合剤を用いて調製しても良い。或いは、抗原結合蛋白は２つのＦｃ領域を有するように操作することもでき、これにより増大した補体溶解及びＡＤＣＣの能力を有してよい。Stevenson等のAnti-CancerDrug  Design  3:  219-230(1989)を参照できる。
【０３６３】
ＣＤＲ内部の配列がＭＨＣクラスＩＩへの抗体の結合を誘発して望ましくないヘルパーＴ細胞応答をトリガーすることがわかっている。保存的置換は、抗原結合蛋白に結合活性を保持させつつ、望ましくないＴ細胞応答をトリガーするその能力を低減することができる。重鎖又は軽鎖のＮ末端の２０個のアミノ酸の１つ以上が除去されることも意図している。
【０３６４】
例えばサルベージ受容体結合エピトープの取り込み又は付加による（例えば適切な領域の突然変異によるか、又はペプチドタグ内へのエピトープの取り込みにより行い、次にこれを例えばＤＮＡ又はペプチド合成により何れかの末端又は中央の抗原結合蛋白に融合する）（例えば国際特許公開ＷＯ９６／３２４７８参照）か、又はＰＥＧ又は多糖類重合体を包含する他の水溶性重合体のような分子を付加することによる、血清中半減期を増大させるための修飾もまた望ましい場合がある。
【０３６５】
サルベージ受容体結合エピトープは好ましくはＦｃドメインのループ１つ又は２つに由来するアミノ酸残基何れか１つ以上が抗原結合蛋白又はフラグメントの類似の位置に転移される領域を構成する。より好ましくは、Ｆｃドメインのループ１つ又は２つに由来するアミノ酸残基３つ以上が転移される。さらに好ましくは、エピトープはＦｃ領域（例えばＩｇＧの）のＣＨ２ドメインから取り出され、そして抗原結合蛋白又は抗体のＣＨ１、ＣＨ３又はＶＨ領域、又はそのような領域の１つより多くに転移される。或いは、エピトープはＦｃ領域のＣＨ２ドメインから取り出され、そして抗原結合蛋白又はフラグメントのＣＬ領域又はＶＬ領域又は両方に転移される。Ｆｃ変異体及びサルベージ受容体とのそれらの相互作用を記載している国際特許出願ＷＯ９７／３４６３１及び国際特許出願ＷＯ９６／３２４７８も参照できる。
【０３６６】
定常領域の他の部位及びアミノ酸残基も、Ｃ１ｑ結合部位のように補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に対して、及び／又は抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に対して役割を果たしている定常領域の他の部位及びアミノ酸残基も識別されている［例えば特定の位置における突然変異の作用を説明しているMolec.  Immunol.  29(5):  633-9(1992);Shields等、J.  Biol.  Chem.,  276(9):6591-6604(2001);Lazar等、Proc.  Nat'l.  Acad.  Sci.  103(11):  4005(2006)を参照することができ、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる］。Ｆｃ受容体結合部位内部の残基の突然変異は改変された（即ち増大又は低減された）エフェクター機能、例えばＦｃ受容体に対する改変された親和性、改変されたＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性、又は改変された半減期をもたらすことができる。上記した通り、潜在的な突然変異は、１つ以上の残基の挿入、欠失又は置換、例えばアラニンとの置換、保存的置換、非保存的置換、又は、異なるサブクラスの同じ位置における相当するアミノ酸残基による置き換え（例えばＩｇＧ１残基をその位置における相当するＩｇＧ２残基で置き換えること）を包含する。
【０３６７】
本発明は又、進歩したＡＤＣＣ活性を呈する、フコシル化が無いか、低減されている抗体分子を包含する改変されたエフェクター化成をもたらす改変された炭水化物構造を有する抗体及び抗体フラグメントを包含する抗原結合蛋白分子の生産も包含する。これを達成するためには種々の方法が当該分野で知られている。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７におけるＮ連結グリコシル化の炭水化物構造に依存することがわかっている、ＦｃγＲＩＩＩ受容体への抗体分子の結合により媒介される。非フコシル化抗体は上昇した親和性でこの受容体に結合し、そしてネイティブのフコシル化抗体よりも効率的にＦｃγＲＩＩＩ媒介エフェクター機能をトリガーする。例えば、アルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞中の非フコシル化抗体の組み換え生産は、１００倍上昇したＡＤＣＣ活性を有する抗体をもたらす（Yamane-Ohnuki等、Biotechnol  Bioeng.  2004  Sep  5;87(5):614-22）。同様の効果は、例えばｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ処理を介してフコシル化経路における上記又は別の酵素の活性を低下させること、酵素をノックアウトするために細胞系統を操作すること、又は、選択的グリコシル化阻害剤と共に培養することによって達成することができる（Rothman等、Mol  Immunol.  1989  Dec;26(12):  1113-23）。一部の宿主細胞系統、例えばＬｅｃ１３又はラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞系統はより低いフコシル化レベルにおいて抗体を天然に生産する。Shields等、J  Biol  Chem.  2002  Jul  26;277(30):26733-40;Shinkawa等、J  Biol  Chem.  2003  Jan  31;278(5):3466-73。例えばＧｎＴＩＩＩを過剰発現する細胞中で抗体を組み換え生産することを介した２分された炭水化物のレベルの上昇もまたＡＤＣＣ活性を上昇させることがわかっている。Umana等、Nat  Biotechnol.  1999  Feb;17(2):  176-80。２つのフコース残基のうち１つのみ不在であることがＡＤＣＣ活性を上昇させるために十分であると予測されている（Ferrara等、J  Biol  Chem.  2005  Dec  5）。
【０３６８】
抗原結合蛋白の別の共有結合修飾
【０３６９】
抗Ｏｒａｉ１ＥＣＬ２抗原結合蛋白の他の特定の共有結合修飾もまた本発明の範囲に包含される。それらは適宜、抗原結合蛋白又は抗体の化学合成によるか、酵素的又は化学的切断により、作成してよい。共有結合修飾のその他の型は、ターゲティングされたアミノ酸残基を、選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応することができる有機の誘導体化剤と反応させることにより導入できる。
【０３７０】
システイニル残基は、最も一般的にはα−ハロアセテート（及び相当するアミン）、例えばクロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応させることにより、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体とする。システイニル残基は又、ブロモフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−β−（５−イミドリル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。
【０３７１】
ヒスチジル残基はｐＨ５．５〜７．０におけるジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化されるが、それはこの剤がヒスチジル側鎖に対して相対的に特異的であるからである。パラブロモフェニルブロミドも使用でき；反応は好ましくはｐＨ６．０において０．１Mのナトリウムカコジレート中で実施される。
【０３７２】
リジニル及びアミノ末端残基は無水コハク酸又は他の無水カルボン酸と反応させる。これらの剤を用いた誘導体かは、リジニル残基の電荷を反転させる作用を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適当な剤は、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート、ピリドキサルホスフェート、ピリドキサルクロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２、４−ペンタンジオン及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応を包含する。
【０３７３】
アルギニル残基は１種又は数種の従来の試薬、例えばフェニルグリオキサール、２、３−ブタンジオン、１、２−クロロヘキサンジオン及びニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニ残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのため、アルカリ条件において反応を行うことを必要とする。更に又、これらの剤はリジンの基並びにアルギニンのイプシロンアミノ基とも反応する場合がある。
【０３７４】
チロシル残基の特定の修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によりチロシル残基内にスペクトル標識を導入する場合に特に有利に行える。最も一般的には、N−アセチルイミヂゾール及びテトラニトロメタンを使用してＯ−アセチルチロシル物質種及び３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。チロシル残基を１２５Ｉ又は１３１Ｉを用いてヨウ素化することによりラジオイムノアッセイにおける使用のための標識された蛋白を調製する。
【０３７５】
カルボキシル側鎖（アスパルチル又はグルタミル）はカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）、ただし式中Ｒ及びＲ’は異なるアルキル基であるもの、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４、４−ジメチルフェニル）カルボジイミドとの反応により選択的に修飾さる。更に又、アスパルチル及びグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。
【０３７６】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は頻繁には脱アミド化されてそれぞれ相当するグルタミル及びアスパルチル残基になる。これらの残基は中性又は塩基性の条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は本発明の範囲内に包含される。
【０３７７】
他の修飾はプロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のホスホリル化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化（T.  E.  Creighton,  Proteins:  Structure  and  Molecular  Properties,  W.H.  Freeman  &  Co.,  San  Francisco,  pp.  79-86(1983)）、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び何れかのＣ末端カルボキシル基のアミド化を包含する。
【０３７８】
共有結合修飾の別の型は抗原結合蛋白（例えば抗体又は抗体フラグメント）にグリコシドを化学的又は酵素的にカップリングすることを包含する。これらの操作法は、それらがＮ−又はＯ−連結グリコシル化に関するグリコシル化能力を有する宿主細胞における抗原結合蛋白の生産を必要としない点で有利である。使用するカップリング様式に応じて、糖は（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）遊離のスルフィドリル基、例えばシステインのもの、（ｄ）遊離のヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニン、又はヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンのもの、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に連結してよい。これらの方法は１９８７年９月１１日に公開された国際特許出願ＷＯ８７／０５３３０及びAplin  and  Wriston,  CRC  Crit.  Rev.  Biochem.,  pp.  259-306(1981).
に記載されている。
【０３７９】
抗原結合蛋白上に存在する何れかの炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に達成してよい。化学的脱グリコシル化は、抗原結合蛋白を化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は等価な化合物に曝露することを必要とする。この処理により、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大部分又は全ての糖の切断がもたらされ、そして抗原結合蛋白は未損傷のままとなる。化学的脱グリコシル化はHakimuddin等、Arch.  Biochem.  Biophys.  259:  52(1987)  及びEdge等、Anal.  Biochem.,  118:  131(1981)により記載されている。抗原結合蛋白上の炭水化物部分の酵素的切断はThotakura等、Meth.
Enzymol.  138:  350(1987)の記載する通り種々のエンド及びエキソグリコシダーゼの使用により達成できる。
【０３８０】
本発明の抗原結合蛋白（抗体及び抗体フラグメントを包含する）の共有結合修飾の別の型は、抗原結合蛋白を種々の非蛋白性重合体、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン類、又は多糖類重合体、例えばデキストランの１つに連結することを含む。このような方法は当該分野で知られており、例えば米国特許４、６４０、８３５；４、４９６、６８９；４、３０１、１４４；４、６７０、４１７；４、７９１、１９２、４、１７９、３３７、４、７６６、１０６、４、１７９、３３７、４、４９５、２８５、４、６０９、５４６又は欧州特許ＥＰ３１５４５６を参照できる.
【０３８１】
単離された核酸
【０３８２】
本発明の別の側面は本発明の抗原結合蛋白をコードする単離された核酸、例えば限定しないが、本発明の抗体又は抗体フラグメントをコードする単離された核酸である。そのような核酸は当該分野で知られている、及び／又は本明細書に開示している組み換え手法により作成する。
【０３８３】
例えば単離された核酸は配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、又は配列番号４２と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む抗原結合蛋白をコードできる。
【０３８４】
他の例示される実施形態において、単離された核酸は、免疫グロブリン重鎖可変領域及びＮ末端シグナル配列をコードし、その核酸は配列番号２３、配列番号２５、又は配列番号２７を有する。
【０３８５】
他の実施形態において、単離された核酸は配列番号３６、配列番号３７、又は配列番号３８に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗原結合蛋白をコードする。
【０３８６】
一部の別の実施形態は免疫グロブリン軽鎖可変領域及びＮ末端シグナル配列をコードする単離された核酸を包含し、核酸は配列番号１５、配列番号１７、又は配列番号１９を有する。
【０３８７】
単離された核酸の別の例は、免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするものを包含し、ここで単離された核酸はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と標記される３つの相補性決定領域のコーディング配列を含み、そしてここで：
【０３８８】
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号４３、配列番号：４４、又は配列番号４５のアミノ酸配列を有し；
【０３８９】
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号４６、配列番号：４７、配列番号４８、又は配列番号４９のアミノ酸配列を有し；そして、
【０３９０】
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号５０、配列番号：５１、又は配列番号52のアミノ酸配列を有する。
【０３９１】
単離された核酸の更に別の例は、免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするものを包含し、ここで単離された核酸はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と標記される３つの相補性決定領域のコーディング配列を含み、そしてここで：
【０３９２】
（ａ）ＣＤＲＬ１は配列番号５３、配列番号５４、又は配列番号５５のアミノ酸配列を有し；
【０３９３】
（ｂ）ＣＤＲＬ２は配列番号５６又は配列番号５７のアミノ酸配列を有し；そして、
【０３９４】
（ｃ）ＣＤＲＬ３は配列番号５８又は配列番号５９のアミノ酸配列を有する。
【０３９５】
他の実施形態において、単離された核酸は配列番号２９、配列番号３３、配列番号３４、又は配列番号３５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖を含む抗原結合蛋白をコードする。
【０３９６】
そして一部の実施形態においては、単離された核酸は配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む抗原結合蛋白をコードする。
【０３９７】
本発明は更に本発明の単離された核酸の何れかを含む発現ベクターを包含するベクターに関する。発現ベクターを含む単離された宿主細胞もまた本発明に包含され、それは当該分野で知られている及び／又は本明細書に開示した分子生物学の手法により作成される。本発明は又、下記工程：  
【０３９８】
（ａ）発現ベクターによりコードされる抗原結合蛋白の発現を可能にする条件下に培地中で宿主細胞を培養すること；及び、
【０３９９】
（ｂ）培地から抗原結合蛋白を回収すること；
を含む方法に関する。抗原結合蛋白の回収は、抗体精製の知られた方法、例えば限定しないが、本明細書において実施例４及び別途開示する抗体精製手法により行える。
【０４００】
遺伝子療法
【０４０１】
適切な細胞への治療用抗原結合蛋白の送達は当該分野で知られている何れかの適当な手順の使用により、エクスビボ、インサイチュ、又はインビボの遺伝子療法を介して行うことができる。例えばインビボの治療の場合は、所望の抗原結合蛋白又は抗体をコードする核酸を、単独、又は、ベクター、リポソーム、又はプレシピテートと組み合わせて対象に直接注射し、そして一部の実施形態においては、抗原結合蛋白化合物の発現が望まれる部位に注射してよい。エクスビボの治療の場合は、対象の細胞を取り出し、核酸をこれらの細胞に導入し、そして修飾された細胞を直接、又は、例えば患者に移植する多孔性膜内部にカプセル化して、対象に戻す。例えば米国特許４、８９２、５３８及び５、２８３、１８７を参照できる。
【０４０２】
生細胞内に核酸を導入するためには種々の手法が使用できる。手法は核酸を培養細胞にインビトロで、又は意図する宿主の細胞にインビボで転移させるかに応じて変動する。インビトロの哺乳類細胞への核酸の転移のために適する手法は、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、化学処理、ＤＥＡＥデキストラン、及びリン酸カルシウム沈降を包含する。他のインビボの核酸転移の手法はウィルスベクター（例えばアデノウィルス、単純疱疹Ｉウィルス、アデノ関連ウィルス又はレトロウィルス）及び脂質系を用いたトランスフェクションを包含する。核酸及びトランスフェクション剤は場合により微粒子と会合している。例示されるトランスフェクション剤は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈殿物、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、第４アンモニウム両親媒性物質ＤＯＴＭＡ（（ジオレオイルオキシプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬよりＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎとして販売）（Felgner等、(1987)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  84,  7413-7417;Malone等、(1989)  Proc.  Natl  Acad.  Sci.  USA  86    6077-6081）；懸垂トリメチルアンモニウムヘッド部を有する親油性グルタメートジエステル（Ito等、(1990)  Biochem.  Biophys.  Acta  1023,  124-132）；代謝可能な親脂質、例えばカチオン性脂質ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）（J.  P.  Behr(1986)  Tetrahedron  Lett.  27,  5861-5864;J.P.  Behr等、(1989)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  86,  6982-6986）；代謝性の第４アンモニウム塩（ＤＯＴＢ、Ｎ−（１−［２、３−ジオレオイルオキシ］プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ポリエチレンイミン（ＰＥｌ）、ジオレオイルエステル、ＣｈｏＴＢ、ＣｈｏＳＣ、ＤＯＳＣ）（Leventis等、(1990)  Biochim.  Inter.  22,  235-241）；３ベータ［Ｎ−（Ｎ’、Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／３ベータ［Ｎ−（Ｎ’、Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールＤＣ−Ｃｈｏｌの１対１混合物（Gao等、(1991)  Biochim.  Biophys.  Acta  1065,  8-14）、スペルミン、スペルミジン、リポポリアミン（Behr等、Bioconjugate  Chern,  1994,  5:  382-389）、親油性ポリリジン（ＬＰＬＬ）（Zhou等、(1991)  Biochim.  Biophys.  Acta  939,  8-18）、過剰なホスファチジルコリン／コレステロールを有する［［（１、１、３、３−テトラメチルブチル）クレゾキシ］エトキシ］エチル］ジメチルベンジルアンモニウムヒドロキシド（ＤＥＢＤＡヒドロキシド）（Ballas等、(1988)  Biochim.  Biophys.  Acta  939,  8-18）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）／ＤＯＰＥ混合物（Pinnaduwage等、(1989)  Biochim.  Biophys.  Acta  985,  33-37）、グルタミン酸（ＴＭＡＧ）のＤＯＰＥ、ＣＴＡＢ、ＤＥＢＤＡ、ジドデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）及びステアリルアミンとの親油性ジエステルとホスファチジルエタノールアミンとの混合物（Rose  et  al.,(1991)  Biotechnique  10,  520-525）、��ＤＡＢ／ＤＯＰＥ（トランスフェクトＡＣＥ、ＧＩＢＣＯＢＲＬ）、及びオリゴガラクトース担持脂質を包含する。転移の高率を高める例示されるトランスフェクション増強剤は、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、リソソーム途絶ペプチド（Ohmori  NI  等、  Biochem  Biophys  Res  Commun  Jun.  27,  1997;235(3):726-9）、コンドロイタン系プロテオグリカン、硫酸化プロテオグリカン、ポリエチレンイミン、ポリリジン（Pollard  H等、J  Biol  Chern,  1998  273(13):7507-11）、インテグリン結合ペプチドＣＹＧＧＲＧＤＴＰ（配列番号２３５）、線状デキストラン無糖化物、グリセロール、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシド間連結部において係留された（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）コレステリル基（Letsinger,  R.  L.1989  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  86:(17):6553-6）、リソホスファチド、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、及び１−オレオイルリソフォスファチジルコリンを包含する。
【０４０３】
一部の状況においては、標的細胞に核酸含有ベクターを指向させる剤を用いて核酸を送達することが望ましい場合がある。そのような「ターゲティング」分子は、標的細胞上の細胞表面膜蛋白に対して特異的な抗原結合蛋白、又は標的細胞上の受容体に対するリガンドを包含する。リポソームを使用する場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜蛋白に結合する蛋白を、ターゲティングのため、及び／又は、取り込みを促進するために使用してよい。そのような蛋白の例は、特定の細胞型に対して向性のキャプシド蛋白及びそのフラグメント、サイクリング中に内在化を起こす蛋白に対する抗原結合蛋白、及び細胞内局在化を標的とし、そして細胞内半減期を延長する蛋白を包含する。他の実施形態において、受容体媒介エンドサイトーシスを使用できる。そのような方法は、例えばWu等、1987又はWagner等、1990に記載されている。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子療法のプロトコルの考察に関してはAnderson  1992を参照できる。更に又、国際特許出願ＷＯ９３／２５６７３及びその引用文献も参照できる。遺伝子療法技術の更なる考察のためには、Friedmann,  Science,  244:  1275-1281(1989);Anderson,  Nature,  supplement  to  vol.  392,  no  6679,  pp.  25-30(1998);Verma,  Scientific  American:  68-84(1990)；及びMiller,  Nature,  357:  455460(1992)を参照できる。
【０４０４】
医薬品製剤の投与及び調製
【０４０５】
本発明の方法の実施において使用する抗ｈＯｒａｉ１抗原結合蛋白又は抗体は所望の送達方法に適する担体を含む医薬組成物及び医薬に製剤してよい。適する担体は、抗ｈＯｒａｉ１抗原結合蛋白又は抗体と組み合わせられた場合に、ｈＯｒａｉ１の高親和性結合を保持し、そして対象の免疫系とは非反応性である何れかの物質を包含する。例は、多くの標準的な医薬品用担体、例えば滅菌リン酸塩緩衝食塩水、静菌水等を包含するがこれらに限定されない。種々の水性担体、例えば水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン等を使用してよく、そして、僅かな化学修飾等を施されたアルブミン、リポ蛋白、グロブリンのような、安定性増強のための他の蛋白を包含してよい。
【０４０６】
製剤中の例示される抗原結合蛋白の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１８０ｍｇ／ｍｌ又は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、又は更には約２ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲であってよい。抗原結合蛋白の水性製剤は例えば約４．５〜約６．５、又は約４．８〜約５．５、又は約５．０の範囲のｐＨにおけるｐＨ緩衝溶液として調製してよい。この範囲のｐＨに適する緩衝剤の例は酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えばコハク酸ナトリウム）、グルコネート、ヒスチジン、クエン酸塩及び他の有機酸の緩衝物質を包含する。緩衝物質の濃度は、例えば緩衝物質及び製剤の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、又は約１０ｍＭ〜約６０ｍＭであることができる。
【０４０７】
同様に抗原結合蛋白を安定化させる場合がある張度調整剤を製剤中に包含させてよい。例示される張度調節剤はポリオール、例えばマンニトール、スクロース又はトレハロースを包含する。好ましくは、水性製剤は等張性であるが、高張性又は低張性の溶液も適する場合がある。製剤中のポリオールの例示される濃度は約１％〜約１５％ｗ／ｖの範囲であってよい。
【０４０８】
界面活性剤は、製剤された抗原結合蛋白の凝集を低減し、及び／又は製剤中の粒状物の形成を最小限とし、及び／又は吸収を低減するために、抗原結合蛋白製剤に添加してよい。例示される界面活性剤はノニオン系界面活性剤、例えばポリソルベート（例えばポリソルベート２０、又はポリソルベート８０）又はポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）を包含する。界面活性剤の例示される濃度は約０．００１％〜約０．５％、又は約０．００５％〜約０．２％、又は約０．００４％〜約０．０１％ｗ／ｖの範囲であってよい。
【０４０９】
１つの実施形態において、製剤は上記した剤（即ち抗原結合蛋白、緩衝物質、ポリオール及び界面活性剤）を含有し、そして、１つ以上の保存料、例えばベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール及び塩化ベンザルコニウムを本質的に含有しない。別の実施形態においては、保存料は例えば約０．１％〜約２％、又は約０．５％〜約１％の範囲の濃度において製剤中に含有させてよい。１つ以上の他の製薬上許容しうる担体、賦形剤又は安定化剤、例えばRemington's  Pharmaceutical  Sciences  16th  edition,  Osol,  A.  Ed.(1980)に記載されているものも、それらが製剤の所望の特性に悪影響を与えない限り、製剤中に含有させて良い。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、使用する用量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そして追加的な緩衝剤；共溶媒；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；キレート形成剤、例えばＥＤＴＡ；金属複合物（例えばＺｎ−蛋白複合物）；生体分解性重合体、例えばポリエステル類；及び／又は塩形成対イオン、例えばナトリウムを包含する。
【０４１０】
抗原結合蛋白の治療薬製剤は所望の純度を有する抗原結合蛋白を任意の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤（Remington's  Pharmaceutical  Sciences  16th  edition,  Osol,A.  Ed.(1980)）と、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態において、混合することにより保存用として調製される。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は使用する用量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そして、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸のような緩衝物質；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存料（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；蛋白、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；単糖類、２糖類、及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、マルトース、又はデキストリン類；キレート形成剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−蛋白複合体）；及びノニオン系界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。
【０４１１】
１つの実施形態において、請求項記載の本発明の適する製剤は、リン酸塩、酢酸塩、又はトリス緩衝剤を、張度を調節して安定化させるポリオール、ソルビトール、スクロース又は塩化ナトリウムのような張度調節剤と組み合わせて含有する。そのような張度調節剤の一例は５％ソルビトール又はスクロースである。更に又、製剤は０．０１〜０．０２％ｗ／ｖで凝集防止及び安定化等のために界面活性剤を含む。製剤のｐＨは４．５〜６．５又は４．５〜５．５の範囲であってよい。抗体のための医薬品製剤の他の例示される説明は各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願２００３／０１１３３１６及び米国特許６、１７１、５８６に記載されている。
【０４１２】
ここで製剤は治療すべき特定の適応症のために必要な１つより多い活性化合物、好ましくは相互に悪影響を与えない補足的な活性を有するものも含有してよい。例えば、免疫抑制剤を更に与えることが望ましい場合がある。そのような分子は意図する目的のために有効である量において組み合わせて適宜存在させる。
【０４１３】
活性成分は又、コアセルベーション法によるか、又は界面重合により調整されるマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、
コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマクロエマルジョン中に捕獲させてよい。そのような手法はRemington's  Pharmaceutical  Sciences  16th  edition,  Osol,  A.Ed.(1980)に開示されている。
【０４１４】
懸濁液及び結晶形態の抗原結合蛋白も意図される。懸濁液及び結晶形態を作成する方法は当該分野で知られている。
【０４１５】
インビボ投与のために使用する製剤は滅菌されていなければならない。本発明の組成物は従来の当該分野で良く知られている滅菌手法により滅菌してよい。例えば滅菌は滅菌濾過膜を通過させる濾過により容易に行える。得られた溶液は、無菌条件下に包装して使用に供するか、濾過して凍結乾燥し、そして凍結乾燥された調製品を投与前に滅菌溶液と混合する。  
【０４１６】
凍結乾燥のプロセスは特にポリペプチドが液体組成物中で比較的不安定である場合に、長期保存のためにポリペプチドを安定化するためにしばしば使用される。凍結乾燥サイクルは通常は以下の３工程、即ち：凍結、一次乾燥、及び二次乾燥を含み；  Williams  and  Polli,  Journal  of  Parenteral  Science  and  Technology,  Volume  38,  Number  2,  pages  48-59(1984)を参照できる。凍結工程においては、溶液が十分凍結するまでそれを冷却する。溶液中の大部分の水はこの段階で氷を形成する。氷は一次乾燥段階で昇華するが、これは真空を使用しながら氷の蒸気圧よりも下にチャンバー圧を低下させることにより行う。最後に吸着又は結合した水を二次乾燥段階において低下させたチャンバー圧と上昇したシェルフ温度の下に除去する。プロセスは凍結乾燥ケーキとして知られる物質をもたらす。その後、ケーキを再建して使用することができる。  
【０４１７】
凍結乾燥した物質の標準的な再建方法はある量の純水（典型的には凍結乾燥の間に除去された量）を加え戻すことであるが、非経腸投与用の医薬品の生成においては抗細菌剤の希薄溶液を使用する場合もあり；Chen,  Drug  Development  and  Industrial  Pharmacy,  Volume  18,  Numbers  11  and  12,  pages  1311-1354(1992)を参照できる。
【０４１８】
凍結乾燥製品の場合は安定化剤として作用する賦形剤が指示される場合があり；  Carpenter等、Developments  in  Biological  Standardization,  Volume  74,  pages  225-239(1991)を参照できる。例えば、  知られた賦形剤はポリオール（マンニトール、ソルビトール及びグリセロールを包含する）；糖（グルコース及びスクロースを包含する）；及びアミノ酸（アラニン、グリシン及びグルタミン酸を包含する）を包含する。
【０４１９】
更に又、ポリオール及び糖は凍結及び乾燥により誘導される損傷からポリペプチドを保護するため、及び乾燥状態における保存の間の安定性を増強するためにもしばしば使用される。一般的には、糖、特に２糖類が凍結乾燥プロセスと保存の両方において効果的である。他のクラスの分子、例えば単糖類及び２糖類及び重合体、例えばＰＶＰも凍結乾燥製品の安定化剤として報告されている。
【０４２０】
注射用には、医薬品製剤及び／又は医薬は上記した適切な溶液を用いた再建に適する粉末であってよい。これらには凍結乾燥、ロータリー乾燥又は噴霧乾燥された粉末、不定形の粉末、顆粒、沈殿物又は粒状物が包含されるがこれらに限定されない。注射用には、製剤は場合により、安定化剤、ｐＨ調節剤、界面活性剤、生物学的利用性調節剤及びこれらの組み合わせを含有してよい。
【０４２１】
除放性調製品を調製してよい。除放性調製品の適当な例は、抗原結合蛋白を含有する固体疎水性重合体の半透性マトリックスを包含し、このマトリックスは形状付与された物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。除放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシメチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許３、７７３、９１９）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドよりなる注射可能な微小球）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸のような重合体は１００日を越えて分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い期間蛋白を放出する。カプセル化ポリペプチドは長時間身体内に残存するが、それらは３７℃における水分への曝露の結果として変性又は凝集し、生物学的活性の損失及び免疫原性の変化の可能性をもたらす場合がある。関与する機序に応じて安定化のために合理的な方策を考案することができる。例えば凝集の機序がチオジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−−Ｓ結合の形成であることが判明した場合、安定化はスルフィドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含有量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、及び特定の重合体マトリックス組成物を開発することにより達成してよい。
【０４２２】
本発明の製剤は、本明細書に記載する通り、短時間作用性、急速放出性、長時間持続性、又は除放性となるように設計してよい。即ち、医薬品製剤は又、制御放出のため、又は緩徐放出のために製剤してよい。
【０４２３】
特定の用量は、疾患の状態、対象の年齢、体重、全身健康状態、性別、及び食餌、薬品の投薬間隔、投与経路、排出速度、及び組み合わせに応じて調節してよい。有効量を含有する上記剤型の何れも定型的な実験の範囲内に確実にあり、従って、本発明の範囲内に確実にある。
【０４２４】
抗原結合蛋白は適当な手段、例えば非経腸、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻内投与、そして局所投与が望まれる場合は、患部内投与により投与される。非経腸注入は静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内又は皮下投与を包含する。更に又、抗原結合蛋白は、パルス注入により、特に漸減用量の抗原結合蛋白又は抗体と共に適宜投与される。好ましくは、投薬は注射により、最も好ましくは部分的には投与が短期か長期かに応じて、静脈内又は皮下注射により行われる。  他の投与方法、例えば局所、特に経皮、経粘膜、直腸、経口又は所望部位に接近して留置されたカテーテルを介した局部投与も意図される。最も好ましくは、本発明の抗原結合蛋白は、日当たり、週当たり、乃至は月当たり（例えば毎日、一日おき、３日毎、又は週当たり２、３、４、５又は６回）の範囲の頻度において０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量において、好ましくは週当たり２又は３回の頻度で０．１〜４５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ又は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量において、又は月１回４５ｍｇ／ｋｇまでにおいて、生理学的溶液中で静脈内投与される。
【０４２５】
本発明は以下の実施例により説明されるが、これは如何なる態様においても限定的であることを意図していない。
【実施例】
【０４２６】
実施例１    抗原としてのＯｒａｉ１チャンネルの形成
【０４２７】
ヒトＯｒａｉ１及びヒトＳＴＩＭ１の分子クローニング。以下のＤＮＡ配列（ＮＣＢＩレファレンス配列ＮＭ＿０３２７９０）：
【０４２８】
【化１６】
2013511279.tif 000040
【０４２９】
【化１７】
2013511279.tif 000041
によりコードされるヒトＯｒａｉ１（ｈＯｒａｉ１；配列番号２）、及び以下のヒトＳＴＩＭ１（ＮＣＢＩレファレンス配列ＮＭ＿００３１５６）：
【０４３０】
【化１８】
2013511279.tif 000042
【０４３１】
【化１９】
2013511279.tif 000043
【０４３２】
【化２０】
2013511279.tif 000044
のｃＤＮＡを、哺乳類細胞における発現のために、それぞれｐｃＤＮＡ３．１／Ｎｅｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及びｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。更に又、ヒトＯｒａｉ１をＣＭＶ系哺乳類発現ベクターｐＴＴ１４（Ａｍｇｅｎベクター（ＣＭＶプロモーター、ポリＡテール及びピューロマイシン耐性遺伝子を含有するＡｍｇｅｎベクター））内にクローニングした。.
【０４３３】
要すれば、ヒトＯｒａｉ１を形成するために、鋳型としてＢｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｃ．より入手したヒト脳ｃＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において以下に示す配列（配列番号１１及び配列番号１２）を有する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。
フォワードプライマー：5  '  -
CGGATCCTGAACCACCATGCATCCGGAGCCCGCCCCGCC-3'（配列番号１１）
及び、
リバースプライマー：5'-GCGGCCGCCTAGGCATAGTGGCTGCCGGGCG-3'（配列番号１２）。
【０４３４】
得られた９３０ｂｐのＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。ｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシンベクターも又ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。消化したＰＣＲ産物及びベクターをライゲーションしてｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシン−ｈＯｒａｉ１ベクターを作成した。インサートを配列決定したところ、ｈＯｒａｉ１ｃＤＮＡコーディング配列と１００％同一であることが解った（配列番号１ヒトＯｒａｉ１ｃＤＮＡ、ＮＣＢＩレファレンス配列ＮＭ＿０３２７９０、配列番号２をコード）。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏｃｉｎ中のヒトＳＴＩＭ１をＰＣＲ法を用いて同様に形成し、そしては、ｐｃＤＮＡ３．１/ゼオシン-hSTIM1ベクターと称することとした。インサートを配列決定したところ、ヒトＳＴＩＭ１と１００％同一であることがわかった（配列番号５；ヒトＳＴＩＭ１ｃＤＮＡ、ＮＣＢＩレファレンス配列ＮＭ＿００３１５６、ヒトＳＴＩＭ１蛋白配列、配列番号６：
【０４３５】
【化２１】
2013511279.tif 000045
【０４３６】
【化２２】
2013511279.tif 000046
をコード）。
黄色経口蛋白（ＹＦＰ）ｃＤＮＡ（配列番号７、ＹＦＰ配列番号８をコード）に融合され、そしてｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ（配列番号９、ヒトＳｔｉｍ１−ＹＦＰ蛋白配、列番号１０をコード）と称することとしたヒトＳＴＩＭ１ｃＤＮＡをＰＣＲ技術を用いて構築した。このコンストラクトは２つの部分で形成され、第１の部分はＹＦＰにｈＳＴＩＭ１の最初の３９アミノ酸残基を連結させる。第２の部分に関しては、末端に適切な制限酵素部位を有するＰＣＲにより最初の３９アミノ酸を有さないｈＳＴＩＭ１を形成した。自身の終止コドンを有さないＹＦＰ遺伝子へのｈＳＴＩＭ１の最初の３９アミノ酸をコードするＤＮＡフラグメントの連結は、鋳型としてＹＦＰ遺伝子を用いたＰＣＲ反応において以下に示す配列を有する３つのフォワードプライマー（Ａ１、Ａ２及びＡ３）及び１つのリバースプライマー（Ａ４）を用いながら実施した。
フォワードプライマーA  1  :  5  '-
GCTAGCTGAACCACCATGGATGTATGCGTCCGTCTTG-3'(配列番号181);
フォワードプライマーA2:
5'-
GGGACTCCTCCTGCACCAGGGCCAGAGCCTCAGCCATAGTCACAGTGAG
AAG-3'(配列番号182);
フォワードプライマーＡ３：
5'-
CAGCCATAGTCACAGTGAGAAGGCGACAGGAACCAGCTCGGGAGCCAAC
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3'（配列番号１８３）；
リバースプライマーＡ４：
5  '-CGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCTGAGGAGTCGACTGCAGCAG-3'
（配列番号１８４）
得られた８７０ｂｐのＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル上で目視確認し、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた精製の後にＮｈｅＩ及びＳａｌＩ制限酵素（Ｒｏｃｈｅ）で制限酵素消化した。第２の部分について、最初の１１７ｂｐを欠いたｈＳＴＩＭ１フラグメントは、下記に示す配列を有するフォワード（Ｂ１）及びリバース（Ｂ２）プライマー及び鋳型としてのｈＳＴＩＭ１を用いたＰＣＲにより形成した。
フォワードプライマーＢ１：  5'-GGAGTCGACTGCAGCAGAGTTTTGCCG-3'（配列番号１８５）及び；
リバースプライマーＢ２：  5  '-CTTTAAGAAGCCTCTT  AAGAAGTAGGCGGCCGC-3'
（配列番号１８６）。
得られたＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル上で可視化し、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた精製の後にＳａｌＩ及びＮｏｔＩ制限酵素（Ｒｏｃｈｅ）で制限酵素消化した。
【０４３７】
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏｃｉｎ発現ベクターをＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、大型のフラグメントを０．８％アガロースゲル上で分割して切り出し、そしてＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏｃｉｎベクターのゲル精製された大型フラグメント及び制限酵素消化されたＰＣＲ産物をライゲーションし、ＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に形質転換することによりｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏｃｉｎ−ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰを作成した。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏｃｉｎベクター中のｈＳＴＩＭ−ＹＦＰに由来するＤＮＡを配列決定することによりｈＳＴＩＭ−ＹＦＰ領域を確認したところ、配列は（配列番号９、ＨｕｍａｎＳｔｉｍ１−ＹＦＰｃＤＮＡ及び配列番号１０、ヒトＳｔｉｍ１−ＹＦＰ蛋白配列）に１００％同一であった。
【０４３８】
細胞系統の開発。製造元のプロトコル（Ｒｏｃｈｅ）に従って生育培地中のＦｕＧＥＮＥを用いながらｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシン−ｈＯｒａｉ１ベクターをＵ２ＯＳ、即ちヒト骨肉種細胞系統（ＡＴＣＣＨＴＢ−９６）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、０．５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いながらプレート表面から細胞を剥離し、そしてゲネシチン５００μｇ／ｍｌを含有する生育培地（Ｇｉｂｃｏ）に再プレーティングした。ヒトＯｒａｉ１発現Ｕ２ＯＳ細胞をモノクローナル抗体８４．５、即ちマウス抗ヒトＯｒａｉ１抗体（ｍＡｂ８４．５）への結合に関して選択した。要すれば、細胞を３０分間４℃でｍＡｂ８４．５と共にインキュベートし、その３０分間４℃でフィコエリスリンで直接標識されたヤギ抗マウス免疫グロブリンガンマ抗体フラグメントで染色し、そして次に蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）に付した。ｍＡｂ８４．５を用いたＦＡＣＳ２回の後、細胞系統をＵ２ＯＳ／ｈＯｒａｉ１と称することとした。
【０４３９】
製造元のプロトコル（Ｒｏｃｈｅ）に従って生育培地中のＦｕＧＥＮＥ６を用いながら上記したｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシン−ｈＯｒａｉ１ベクターを更にＡＭ−１ＣＨＯ細胞（Urlaub  and  Chasin,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  77,  4216(1980)に記載のＣＨＯＤＨＦＲ欠損細胞系統由来の無血清生育培地適応変異体)内にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、０．５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いながらプレート表面から細胞を剥離し、そしてゲネチシン７００μｇ／ｍｌを含有する生育培地（Ｇｉｂｃｏ）に再プレーティングした。ヒトＯｒａｉ１発現細胞を、抗ヒトＯｒａｉ１  mAb84.5を用いたＦＡＣＳにより２回ソートした。その後、ソートされたプールを、製造元のプロトコル（Ｒｏｃｈｅ）に従って生育培地中のＦｕＧＥＮＥ６を用いながら、pｃＤＮＡ３．１／ゼオシン−ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、０．５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いながらプレート表面から細胞を剥離し、そしてゲネチシン５００μｇ／ｍｌ及びゼオシン２００μｇ／ｍｌを含有する生育培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にプレーティングした。ヒトＯｒａｉ１及びｈＳＴＩＭ１−ＴＦＰ蛋白を安定に同時発現する細胞を、抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ８５．５を用いたＦＡＣＳにより、そして黄色蛍光蛋白の検出により選択し、そしてＡＭ１−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰと称することとした。
【０４４０】
実施例２    ヒトＯｒａｉ１に対する抗体の形成
【０４４１】
免疫化。２つの別個のキャンペーン、即ち「キャンペーン１」及び「キャンペーン２」において、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）ＸＭＧ２ＫＬ、ＸＭＧ４ＫＬ、ＸＭＧ１ＫＬ及びＸＭＧ２ｋ系統のマウスを一般的にMendez等、Nat.  Genet.  15:146-156(1997)において以前記載されたとおりに形成し、そしてキャンペーン１においてはマウス当たり４．０ｘ１０６細胞の用量を用いながらＡＭ１−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ又はＵ２ＯＳ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１細胞で、そして２．０ｘ１０６個／マウスの細胞密度における同型抗原の後ブーストにより免疫化した。キャンペーン２においては、タプシガルギン処理されたＵ２ＯＳ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１細胞をマウス当たり４．０ｘ１０６細胞で使用し、そして２．０ｘ１０６タプシガルギン処理されたＵ２ＯＳ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１細胞／マウスの後ブーストによりマウスを免疫化した。タプシガルギン処理されたＵ２ＯＳ／Ｏｒａｉ１細胞は２ｍＭタプシガルギン（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ＃  Ｔ９０３３）を含有する完全生育培地中、ｍＬ当たり３００万個の細胞となるように細胞を希釈することにより調製し、細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、１ｘリン酸塩緩衝食塩水で２回洗浄し、そして即座に免疫化のために使用した。使用した注射部位は尾基部皮下及び腹腔内の組み合わせとした。免疫化は米国特許７、０６４、２４４に開示されている方法に従って実施し、その開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。アジュバントＡｌｕｍ（E.M.  Sergent  Pulp  and  Chemical  Co.,  Clifton,  NJ,  cat.  #1452-250）は製造元の説明書に従って調製し、そしてアジュバントエマルジョンと抗原溶液１：１で混合した。ヒトＯｒａｉ１に対して育成された力価をモニタリングするために、初回注射後４〜６週に血清を採取し、そして特異的力価を、タプシガルギン非処理のＵ２ＯＳ／ｈＯｒａｉ１又はＡＭ１−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ細胞の何れかを用いながらＦＡＣＳ染色により測定した。免疫化されたマウスは、約１〜３．５ヶ月の期間にわたって１１〜１７免疫化の範囲においてブーストした。最高血清力価を有するマウスを識別しハイブリドーマ形成のために調製した。免疫化は多数のマウス、典型的には１０匹の群において実施した。腸間膜、鼠径部及び大動脈周囲のリンパ節及び脾臓の組織を典型的には各群からプールし、ハイブリドーマ融合物の形成に付す。  
【０４４２】
モノクローナル抗体の調製。適当な力価を呈しているマウスを識別し、そして排出しているリンパ節からリンパ球を採取し、そして必要に応じて各コホートにつきプールした。適当な培地（例えばダルベッコの変性イーグル培地；ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡより入手可能）中でリンパ様組織からリンパ球を解離させることにより組織から細胞を放出させ、そしてＤＭＥＭ中に懸濁させた。Ｂ細胞は、適当な方法を用いて選択及び／又は増殖させ、そして適当な融合相手、例えば非分泌性ミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＣＲＬ１５８０；Kearney等、J.  Immunol.  123,  1979,  1548-1550）と融合させた。
【０４４３】
リンパ球は１：４の比で融合相手細胞と混合した。細胞混合物は４分間４００Ｇで遠心分離することにより穏やかにペレット化し、上澄みを傾瀉し、そして１ｍｌピペットを用いながら細胞混合物を穏やかに混合した。ＰＥＧ／ＤＭＳＯ（ポリエチレングリコール／ジメチルスルホキシド；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．ＬｏｕｉｓＭＯより入手；リンパ球１００万個当たり１ｍｌ）を用いて融合を誘発した。１分間かけて穏やかに振とうしながらＰＥＧ／ＤＭＳＯをゆっくり添加し、その後１分間混合した。次にＩＤＭＥＭ（グルタミン非含有ＤＭＥＭ；Ｂ細胞１００万個当たり２ｍｌ）を穏やかに振とうしながら２分間かけて添加し、その後更にＩＤＭＥＭ（Ｂ細胞１００万個当たり８ｍｌ）を３分間かけて添加した。
【０４４４】
融合した細胞は穏やかにペレット化（４００Ｇ、６分間）シ、そしてＢ細胞当たり２０ｍｌの選択培地（例えばアザセリン及びヒポキサンチン（ＨＡ）及び必要に応じて他の補助的物質を含有するＤＭＥＭ）中に再懸濁した。細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベートし、次に２００ｍｌの選択培地に再懸濁し、そしてＴ１７５フラスコ中３〜４日間培養した後に９６穴プレーティングした。
【０４４５】
細胞は、得られるコロニーのクローン形成性が最大となるように、標準的手法を用いて９６穴プレートに分配した。数日間培養した後、ハイブリドーマ上澄みを採取し、そしてヒトＯｒａｉ１チャンネルへの結合の確認を含む後述する実施例において詳述する通りスクリーニングアッセイに付した。陽性細胞を更に選択して標準的なクローニング及びサブクローニングの手法に付した。クローン系統をインビトロで増殖させ、そして分泌されたヒト抗体を得て分析に供した。
【０４４６】
実施例３    Ｏｒａｉ１特異的モノクローナル抗体の識別
【０４４７】
ＦＭＡＴによるＯｒａｉ１-特異的結合抗体の選定。培養１４日の後、蛍光マイクロボリュームアッセイテクノロジー（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＭｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅＡｓｓａｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＦＭＡＴ）（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）により、ハイブリドーマ上澄みをヒトＯｒａｉ１特異的モノクローナル抗体に関してスクリーニングした。上澄みをＡＭ１−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ細胞に対してスクリーニングし、そして、Ｕ２ＯＳ／ｈＯｒａｉ１細胞（実施例１に記載の通り調製）による免疫化から誘導されたハイブリドーマ上澄みに関して親ＡＭ１−ＣＨＯ細胞に対して逆スクリーニングした。逆に、ＡＭｌ−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ細胞による免疫化から誘導されたハイブリドーマに関しては、Ｕ２ＯＳ／Ｏｒａｉ１を用いながら結合スクリーニングを実施し、そして親Ｕ２ＯＳ細胞で逆スクリーニングした。
【０４４８】
要すれば、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中の細胞を３８４穴ＦＭＡＴプレート、即ち５０μＬ／ウェルの総容量中約４０００個のＡＭ１−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ又はＵ２ＯＳ／ｈＯｒａｉ１細胞／ウェルと約１６、０００個の相当する親細胞／ウェルの混合物に播種し、そして細胞を３７℃で一夜インキュベートした。次に１０μＬ／ウェルの上澄みを添加し、そしてプレートを４℃で約１時間インキュベートし、その後、１０μＬ／ウェルの抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ５二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ、ＰＡ）を２．８μｇ／ｍｌの濃度で添加した（４００ｎｇ／ｍｌ終濃度）。次にプレートを４℃で１時間インキュベートし、そしてＦＭＡＴマイクロコンフォーカルスキャナー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を用いながら蛍光を読み取った。逆スクリーニングのために、親ＡＭ−１ＣＨＯ細胞又はＵ２ＯＳ細胞を総容量５０μＬ／ウェル中約１６０００細胞／ウェルで播種し、そして細胞を３７℃で一夜インキュベートした。ＦＭＡＴ逆スクリーニングは、同様に、そして細胞蛋白には結合するがＯｒａｉ１チャンネルには結合しないハイブリドーマを区別して排除するための結合スクリーニングと平行して実施した。
【０４４９】
ＦＡＣＳによるＯｒａｉ１特異的結合抗体の選択。数種の陰性結合体と共にＦＡＭＴ結合アッセイで陽性と採点されたハイブリドーマ上澄みを遺伝子ＦＡＣＳ分析によりＯｒａｉ１結合に関して評価した。ＡＭ１−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ細胞による免疫化から誘導したハイブリドーマ上澄みをＵ２ＯＳ／Ｏｒａｉ１細胞に対してスクリーニングし、そして親Ｕ２ＯＳ細胞に対して逆スクリーニングした。Ｕ２ＯＳ／ｈＯｒａｉ１細胞による免疫化から誘導したハイブリドーマ上澄みをＡＭ１−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ細胞に対してスクリーニングし、そして親ＡＭ１−ＣＨＯ細胞に対して逆スクリーニングした。ＦＡＣＳによるハイブリドーマ上澄み結合スクリーニングで得られた例示されるデータを以下の表７に示す。
【表７】
2013511279.tif 000047
【０４５０】
実施例４    タプシガルギン処理されたヒト全血からのサイトカイン放出を阻害する場合の抗ヒトＯｒａｉ１モノクローナル抗体の機能の評価
【０４５１】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）及びインターフェロン（ＩＦＮ）ガンマの分泌に対するｈＯｒａｉ１阻害剤の影響を調べるためのエクスビボアッセイ。キャンペーン１及びキャンペーン２から得られたヒトＯｒａｉ１結合抗体がヒト全血中のＴ細胞活性化を阻害する能力を、以前に報告されているエクスビボアッセイを用いて試験した（国際特許出願ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２の実施例４６参照、これは参照により全体が本明細書に組み込まれる）。要すれば、５０％ヒト全血をタプシガルギン（筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ［ＳＥＲＣＡ］ポンプ阻害剤）で刺激してストア枯渇、カルシウム固定化及びサイトカイン分泌を誘導する。Ｔ細胞サイトカイン分泌をブロックする分子の効力を評価するために、タプシガルギン刺激剤の添加前３０〜６０分間、ヒト全血と共に種々の濃度の抗Ｏｒａｉ１モノクローナル抗体を予備インキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２において４８時間の後、コンディショニング培地を収集し、そしてサイトカイン分泌のレベルをＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙの４スポット電子化学ルミネセントイムノアッセイを用いて測定した。タプシガルギン刺激剤を用いた場合、サイトカインＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマは多数のドナーから単離した血液から頑健に分泌された。陽性ハイブリドーマ上澄みは、それらがＩＬ−２とＩＦＮ−ガンマの放出の両方を少なくとも８０％ブロックする能力により選択した。各ヒットから少なくとも１つの代表的サブクローンを選択して網羅的な上澄みを形成させ、それから相当するモノクローナル抗体を精製した。  
【０４５２】
より詳細には、ヘパリンバキュテナー中に健康非投薬ドナーからヒト全血を採取した。ＤＭＥＭ完全培地は０．１％ヒトアルブミン（Ｇｅｍｉｎｉ、＃８００−１２０）、５５μＭ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）及び１ＸＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｇｌｎ（ＰＳＧ、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１０３７８−０１６）を含有するＩｓｃｏｖｅｓＤＭＥＭ（＋Ｌ−グルタミン及び２５ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液）とした。タプシガルギンはＡｌｏｍｏｎｅＬａｂｓ（Ｉｓｒａｅｌ）より得た。１００％ＤＭＳＯ中のタプシガルギンの１０ｍＭ保存溶液をＤＭＥＭ完全培地で希釈して４０μＭ（４ｘ溶液）とし、カルシウム固定化のための４ｘタプシガルギン刺激剤とした。対照：Ｋｖ１．３阻害剤ペプチドＳｈＫ（Ｓｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ毒素、Ｃａｔ＃Ｈ−２３５８、Ｂａｃｈｅｍ）を、Ｎ末端ＰＥＧ化型において陽性対照として使用し（例えば国際特許出願ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２の実施例３４による）；シャリブド毒素（Ｃａｔ＃Ｈ−９５９５ｍ、Ｂａｃｈｅｍ）も陽性対照として使用し；Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］が使用したもう１つの陽性対照であり、これは国際特許出願ＷＯ２００８／０８８４２２Ａ２の実施例２に記載のとおり作成し精製しており；マウロトキシン（ＡｌｏｍｏｎｅＲＴＭ−３４０、ＡｌｏｍｏｎｅＬａｂｓ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）を陰性対照として使用した。これらのポリペプチド対照はアッセイにおいては１００ｎＭの終濃度で使用した。他の、又は追加的な、陽性及び／又は陰性対照は、少なくとも１つの陽性及び少なくとも１つの陰性対照をアッセイのために使用する限り、使用することができ；例えばカルシニューリン阻害剤シクロスポリンＡもまた陽性対照として使用でき、そして種々の供給元から市販されている。
【０４５３】
４ｘ終濃度においてＤＭＥＭ完全培地中に阻害剤の３倍連続希釈物を調製し、その５０μＬを９６穴Ｆａｌｃｏｎ３０７５平底マイクロプレートに添加した。マイクロプレートのカラム１〜５及び７〜１１には阻害剤（各列に別個の阻害剤希釈シリーズを入れる）をいれ、５０μｌのＤＭＥＭ完全培地のみをカラム６の８ウェルに入れ、１００μｌのＤＭＥＭ完全培地のみをカラム１２の８ウェルに入れた。実験を開始するために全血１００μＬをマイクロプレートの各ウェルに添加した。次にプレートを１時間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。１時間後、プレートを取り出し、そして５０μｌの４Ｘタプシガルギン刺激剤（１０μＭタプシガルギン終濃度）を、カラム１２の８ウェル以外のプレートの全ウェルに添加した。プレートを４８時間３７℃５％ＣＯ２下に戻した。全血中に分泌されたＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマの量を測定するために、９６穴プレートの各ウェルから上澄み（コンディショニング培地）１００μＬをストレージプレートに移した。サイトカイン生産のＭＳＤ電気化学ルミネセンス分析のために、上澄み（コンディショニング培地）２５μＬをＭＳＤＭｕｌｔｉ−Ｓｐｏｔ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｃｏａｔｅｄプレート（ｗｗｗ．ｍｅｓｏ−ｓｃａｌｅ．ｃｏｍ）に添加した。これらのプレート上のワーキング電極を予め４種のキャプチャー抗体（ｈＩＬ−５、ｈＩＬ−２、ｈＩＦＮｇ及びｈＩＬ−４）でコーティングした。ＭＳＤプレートにコンディショニング培地２５μＬを添加した後、検出抗体とＰ４緩衝液のカクテル１３０μＬを各ウェルに添加した。１３０μＬのカクテルは２０μＬの４種の検出抗体（ｈＩＬ−５、ｈＩＬ−２、ｈＩＦＮｇ及びｈＩＬ−４）を各々１μｇ／ｍｌにおいて、そして１１０μｌの２ＸＰ４緩衝液を含有した。プレートを被覆し、振とうプラットホーム上に一夜（暗所）置いた。翌日、プレートをＭＳＤセクターイメージャー上で読み取った。各プレートのカラム６中の８ウェルはタプシガルギン刺激剤のみ添加し、阻害剤は存在しなかったため、この場合の平均ＭＳＤ応答を用いて各プレートに関する「高」値を計算した。計算されたプレートの「低」値はタプシガルギン刺激剤非含有、阻害剤非含有のカラム１２の８ウェルの平均ＭＳＤ応答から求めた。対照のパーセント（ＰＯＣ）は、未刺激ｖｓ刺激対照に対する相対的な応答の尺度であり、ここで１００ＰＯＣはタプシガルギン刺激剤単独の平均応答、即ち「高」値にと同等である。従って、１００ＰＯＣは応答の０％阻害を示す。一方、０ＰＯＣは応答の１００％阻害を示し、そして刺激剤が存在しない場合の応答、即ち「低」値と同等である。対照のパーセント（ＰＯＣ）を計算する場合、以下の式を使用する。
［（ウェルのＭＳＤ応答）−（「低」）］／［（「高」）−（「低」）］ｘ１００
全血中の分子の効力は、阻害曲線（ＩＣ）からの曲線フィッティングの後に計算し、そしてＩＣ５０は標準曲線フィッティングソフトウエアを用いて誘導した。本発明者等は高スループットのＭＳＤ電気化学ルミネセンスアッセイを用いたサイトカイン生産の計測をここに記載したが、低スループットＥＬＩＳＡアッセイもサイトカイン生産の計測のために等しく適用できることは当業者の知る通りである。
【０４５４】
キャンペーン１（表７）及びキャンペーン２においてＦＡＣＳ分析により測定した場合にヒトＯｒａｉ１への特異的結合体として識別されたヒットを、
タプシガルギンで刺激されているヒト全血から放出されたインターロイキン−２（ＩＬ−２）及びインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ｇ）を上記した通りモニタリングするサイトカイン放出ヒト全血アッセイにおいて評価した。アッセイは２つの異なるヒトドナー血液試料に対して実施し、そしてＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇ放出の結果を阻害剤無添加の対照のパーセントとして表示している。代表的な結果を図１に示す。結合ヒットのハイブリドーマ上澄みの２５％（ｖ／ｖ）は９５％超〜約４０％の阻害範囲を呈したが、陰性対照モノクローナル抗体単独は１５％未満から阻害するのみであった。更に又、ＩＬ−２のブロッキングとＩＦＮ−ｇ放出の間には堅固な相関があると考えられた。８０％超の阻害を呈したヒットを選択し、更に進んでヒットのサブクローンの網羅的上澄みから精製されたモノクローナル抗体を獲得し、そして、重鎖及び軽鎖の抗体配列の配列を決定するためのサブクローニング及び配列決定に付した。
【０４５５】
精製されたモノクローナル抗体のヒトＯｒａｉ１への結合についてＦＡＣＳにより、そしてタプシガルギン処理されたヒト全血からのＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマサイトカイン放出の阻害におけるそれらの機能的活性について、評価した（図２Ａ−Ｄ）。選択されたヒットのサブクローン由来の網羅的ハイブリドーマ上澄みを作成し、それらのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）がｍＡｂのヒトＯｒａｉ１への特異的結合を確認した後に精製できるようにした。精製ｍＡｂは、種々の濃度におけるヒト全血アッセイからのサイトカイン放出をブロックするそれらの能力に関して評価し、そして上記した通り種々の濃度のｍＡｂに対する阻害剤非含有対照のパーセントとしてグラフ化した。図２Ａ及び２Ｂはタプシガルギン処理されたドナーＡ及びＢから採取したヒト全血からのＩＬ−２放出を阻害する選択されたｍＡｂ（２Ｃ１．１、２Ｄ１．２、２Ｂ３．２、２Ａ７．１及び２Ｆ４．１）の例示される結果を示す。しかしながら、ヒト全血アッセイからのサイトカイン放出のブロッキングに関する内部陰性対照として選択されたがヒトＯｒａｉ１の結合体であるｍＡｂ２Ｂ４．１は漸増濃度においてＩＬ−２放出の阻害を示さなかった。図２Ｃ及び２ＥはｍＡｂｓ２Ｃ１．１、２Ｄ１．２、２Ｂ３．２、２Ａ７．１及び２Ｆ４．１に関しては同様の用量応答阻害を示しているが、結合体単独対照ｍＡｂ２Ｂ４．１に関しては示していない。ＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇに関する阻害曲線は両方のサイトカインの放出の完全な阻害を示している。効力評価においては、タプシガルギン処理された２人の異なるドナーの全血からのＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマの両方の放出の用量依存的阻害、及び低ナノモル範囲におけるＩＣ５０が示され、これは以下の表８Ａ（キャンペーン１）及び表８Ｂ（キャンペーン２）に示す通りである。
【０４５６】
表８Ａはタプシガルギン処理されたヒト全血からのＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマ分泌のブロッキングにおけるキャンペーン１の１６個の選択されたサブクローン由来の精製されたモノクローナル抗体の半最大阻害の濃度（ＩＣ５０）を示す。１６個の選択されたブロッキングｍＡｂに加えて、２つの結合単独ｍＡｂ２Ｂ４．１及び２Ｈ４．１を内部陰性対照ｍＡｂとして選択した。１６個の選択されたｍＡｂは全て、２人の異なるドナーに由来するヒト血液中のＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇの放出を阻害する低ナノモル濃度における強力なＩＣ５０を示した。一方、予測されたとおり、ｍＡｂ２Ｂ４．１及び２Ｈ４．１では阻害は観察されなかった。表は又、回帰直線が実際のデータ点にどの程度良好に近似するかに関して、極めて良好な両者間のフィットを示すものに極めて近い測定のＲ２係数を示している。
【表８−１】
2013511279.tif 000048
【表８−２】
2013511279.tif 000049
【０４５７】
選択されたモノクローナル抗体の配列分析。初回機能スクリーニング（図１）から得られた１８個の陽性ヒットをサブクローニングした。各ヒットのサブクローンから発現されたモノクローナル抗体を含有するハイブリドーマ上澄みのヒトＯｒａｉ１への結合をＦＭＡＴ結合スクリーニングにより確認した。各ヒットから３つの選択されたサブクローンを選択し、ヒトＯｒａｉ１への陽性結合に基づいて抗体の重鎖及び軽鎖の配列決定に進めた。各ヒットの３つの選択されたサブクローンに由来するモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の抗体配列を得るために、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）抗体遺伝子のメッセンジャーＲＮＡを単離し、標準的な逆転写ＰＣＲ法により配列決定した。ＨＣ及びＬＣ配列は上記表１Ａ及び１Ｂに示す通りである。キャンペーン１からのクローン数個は同じＬＣ又はＨＣ配列を共有しており、これは抗Ｏｒａｉ１キャンペーン１の間に検出されたヒト抗体が極めて緊密に関連していることを示している。  
【０４５８】
組み換えモノクローナル抗体を形成するための一過性の発現。ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞を３７℃５％ＣＯ２下にＬ−グルタミン（６ｍＭ）及びゲネチシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したＦ１７培地中、２ｘ１０５〜１．２ｘ１０６個／ｍｌの細胞密度で３−ＬのＦｅｍｂａｃｈ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中に維持し、６５ＲＰＭで振とうした。トランスフェクション時、最終培養容量の９０％において上記したＦ１７培地中１．１ｘ１０６個／ｍｌの細胞密度まで細胞を希釈した。重鎖及び軽鎖の複合体の１対１の比のＤＮＡを最終培養容量の１０％においてＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に調製した。ＤＮＡ複合体は培養物リットル当たり５００μｇの全ＤＮＡ及び培養物リットル当たり１．５ｍｌのＰＥＩｍａｘを含有するものとした。ＤＮＡ複合物は成分添加後に短時間振とうし、そして１０〜２０分間室温でインキュベートした後、細胞培養物に添加し、次にこれをインキュベーターに戻した。トランスフェクションの翌日、トリプトンＮ１（５ｇ／Ｌ）を液体２０％保存物から培養物に添加した。トランスフェクションの６日後、培養物を４０分間４０００ＲＰＭで遠心分離し、そして０．４５μｍフィルターを通して培地を採集した。
【０４５９】
組み換えモノクローナル抗体の精製。コンディショニング培地は、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ培地（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いながらＦｃ領域のアフィニティーキャプチャー結合により精製した。アフィニティーキャプチャーシステムはＡＫＴＡ高速蛋白液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）ＥｘｐｌｏｒｅｒＴＭ自動システム上で精製した。使用した緩衝液系は緩衝液Ａ平衡緩衝液：ダルベッコＰＢＳカチオン非含有（Ｇｉｂｃｏ）；緩衝液Ｂ溶離：１００ｍＭ酢酸、ｐＨ３．５及び任意の緩衝液Ｃ：１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．７とした。各試料をアフィニティー媒体にロードし、緩衝液Ａで洗浄し、次に２．５ｃｍ／時間未満でアイソクラティック１００％ステップ溶離緩衝液Ｂとした。蛋白プールはλ＝２８０ｎｍにおけるＦＰＬＣシステムのピーク吸光度により求めた。緩衝液Ｂのピークからλ＝２８０ｎｍにおいてピークが観察されない場合、緩衝液Ｃを用いて残存する抗体を全て溶離させた。溶離した画分はピーククロマトグラフィー画分によりプールした。次に２Ｍトリス塩基を用いてプールをｐＨ５．０にあわせた。プール試料は０．８μｍ／０．２μｍフィルター（Ｐａｌｌ）を用いて濾過した。
１０ｋＤａの分子量カットオフの膜（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いながら、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％スクロース、ｐＨ５．０に対して直接、試料を透析した。必要に応じて、３０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ；Ｖｉｖａｓｐｉｎ）遠心濃縮機を用いながら試料を濃縮した。蛋白濃度は分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）上でＵＶ吸光度スペクトル（λ＝２６０；２８０；３４０ｎｍ）を分析することにより測定した。
【０４６０】
組み換え抗体の特性化。トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でヨードアセトアミドを用いながら還元（＋ベータメルカプトエタノール）及び非還元の条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析により組み換え抗体を分析し、そしてＢｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ染料で染色した。試料の滅菌性はリムルスアメーバ様細胞溶解物試験カートリッジ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて確認した。ＨＥＫ−２９３細胞中の重鎖及び軽鎖の抗体遺伝子の一過性の発現の後、プロテインＡを用いたアフィニティーキャプチャー結合により組み換えｍＡｂを精製した。精製の後、組み換えｍＡｂを非還元（図３Ａ）及び還元条件（図３Ｂ）下にトリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で可視化した。ゲルの写真によればｍＡｂは高い純度まで精製されていた。
【０４６１】
組み換え抗体によるｈＯｒａｉ１への結合を本明細書に記載したＦＡＣＳ法により評価した。図４は組み換えモノクローナル抗体２Ｄ２．１、２Ｃ１．１、２Ｂ７．１、及び２Ｂ４．１によるｈＯｒａｉ１への結合を示す。ヒト全血アッセイからのサイトカイン放出の強力な阻害に関して識別された１６個のｍＡｂのうち、それらの相当する重鎖及び軽鎖の抗体配列の分析によれば、ｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１及びｍＡｂ２Ｂ７．１と称されるユニークなモノクローナル抗体が存在することが示された。組み換えｍＡｂはまず、ＡＭ１／ＣＨＯ細胞表面上に発現されたｈＯｒａｉ１へのそれらの特異的結合を確認するために評価した。図４は親ＣＨＯに結合しているｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１及びｍＡｂ２Ｂ７．１は無視できる程度であり、未染色の対照及び直接標識された二次試薬単独染色対照に匹敵する低い相対蛍光強度幾何平均（ｇｅｏ平均）値を有していた。ＡＭ１／ｈＯｒａｉ１に関するｇｅｏ平均値もまた見染色対照及び二次試薬単独に関しては低値であった。しかしながらＡＭ１／ｈＯｒａｉ１上のｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１、ｍＡｂ２Ｂ７．１及びｍＡｂ２Ｂ４．１に関するｇｅｏ平均の値の大幅な増大により閉めされる通り、有意な特異的結合があった。注目すべき点は、ｍＡｂ２Ｂ４．１に関するｇｅｏ平均は他のｍＡｂの値の約半分であり、そして恐らくは、試験した他のｍＡｂと比較してｍＡｂ２Ｂ４のより低い結合親和性を示していると考えられる。ｍＡｂ２Ｂ４．１はＡＭ１／ｈＯｒａｉ１に結合し、そしてある程度まではＣＲＡＣチャンネルを阻害する能力を示しているが（図６Ｃ参照）、上記したタプシガルギン全血アッセイにおけるＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマ放出の阻害においては非有効であった。ｍＡｂ２．Ｂ４．１のより低い相対的結合強度が全血アッセイにおいてサイトカイン放出を阻害する能力が無かったことと直接関係しているか否かは不明である。
【０４６２】
上記した通り、組み換え抗体ｍＡｂ２Ｂ４．１はｈＯｒａｉ１には特異的に結合したが、全血アッセイ系においてはサイトカイン分泌の阻害において検出可能な機能的活性を呈さなかった（図４及び図５Ａ−Ｄ）。図５Ａ−Ｄは全血アッセイにおいてキャンペーン１モノクローナル抗体ｍＡｂ２Ｄ２．１、ｍＡｂ２Ｃ１．１、及びｍＡｂ２Ｂ７．１によるＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマ分泌の用量依存的阻害を示している。図５Ｅ−Ｈは全血アッセイにおいてキャンペーン２抗体ｍＡｂ５Ａ１．１、ｍＡｂ５Ａ４．２、ｍＡｂ５Ｂ１．１、ｍＡｂ５Ｂ５．２、ｍＡｂ５Ｃ１．１、ｍＡｂ５Ｆ２．１、及びｍＡｂ５Ｆ７．１によるＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマ分泌の用量依存的阻害を示している。キャンペーン１組み換え抗体の各々のＩＣ５０値を以下の表９Ａに示す。組み換えｍＡｂが種々の濃度においてヒト全血アッセイからのサイトカイン放出をブロックする能力を評価し、そしてｍＡｂの種々の濃度に対する阻害剤非含有の対照のパーセントとしてグラフ化した。図５Ａ−ＨはｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１、ｍＡｂ２Ｂ７．１、ｍＡｂ５Ａ１．１、ｍＡｂ５Ａ４．２、ｍＡｂ５Ｂ１．１、ｍＡｂ５Ｂ５．２、ｍＡｂ５Ｃ１．１、ｍＡｂ５Ｆ２．１、及びｍＡｂ５Ｆ７．１はヒト全血からのＩＬ−２放出を用量依存的にブロックしたが、ｍＡｂ２Ｂ４．１及びｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４は２人の異なるドナーに由来するヒト全血においてＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマの放出を阻害しなかったことを示している。結果は、１３個全てのｍＡｂはｈＯｒａｉ１に強力に結合したが、ｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１、ｍＡｂ２Ｂ７．１、ｍＡｂ５Ａ１．１、ｍＡｂ５Ａ４．２、ｍＡｂ５Ｂ１．１、ｍＡｂ５Ｂ５．２、ｍＡｂ５Ｃ１．１、ｍＡｂ５Ｆ２．１及びｍＡｂ５Ｆ７．１のみがヒト全血アッセイ系においてＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇの両方の放出を阻害したことを示している。
【０４６３】
表９Ａ（下記）はタプシガルギン処理されたヒト全血からのＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマの分泌のブロッキングにおける組み換えｍＡｂ２Ｃ１．１、２Ｄ２．１及び２Ｂ７．１の半最大抑制濃度（ＩＣ５０）を示している。表８Ａ（上記）の精製ｍＡｂのＩＣ５０を表９Ａ（下記）の組み換えｍＡｂのＩＣ５０とを比較すると、ヒト全血アッセイからのサイトカイン放出の阻害において低いＩＣ５０値ほど効力が増大していることがわかる。更に又、３つの組み換えｍＡｂの全てが、より低値のＩＣ５０で示されるとおりヒト全血からのＩＦＮ−ｇ放出よりもより強力にＩＬ−２分泌をブロックしたことも興味深い。
【表９】
2013511279.tif 000050
【０４６４】
実施例５    機能性ルシフェラーゼアッセイにおける抗ｈＯｒａｉ１モノクローナル抗体の評価
【０４６５】
細胞の開発。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を製造元のプロトコル（Ｒｏｃｈｅ）に従って生育培地中のＦｕＧＥＮＥ６を用いながらｐＴＴ１４／ｐｕｒｏ−ｈＯｒａｉ１及びｐｃＤＮＡ  ３．１／ｚｅｏ−ＹＦＰ−ｈＳＴＩＭ１でトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、０．５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いながらプレート表面から細胞を剥離し、そして０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び０．５μｇ／ｍＬのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する生育培地（Ｇｉｂｃｏ）に再プレーティングした。プールを２回ＹＦＰに関してＦＡＣＳによりソートし、低、中及び高プールとした。中プールをサブクローニングし、そしてクローンをＩｎｄｏ−１ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）レシオメトリックＣａ２＋流出アッセイを用いて評価した。次に形成した細胞系統を1  x  106個／ウェルで6穴プレートにプレーティングし、ＦｕｇｅｎｅＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）を用いながらＰｒｏｍｅｇａより入手したｐＧＬ４．３０（ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦＡＴ−ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ）２μｇでトランスフェクトし、そしてピューロマイシン及びゼオマイシン選択を維持しながらハイグロマイシン（Ｒｏｃｈｅ）で２００μｇ／ｍＬにおいて選択した。このプールを単細胞限界希釈クローニングによりサブクローニングし、そしてサブクローンをＮＦＡＴ−ｌｕｃ活性に基づいて評価し、これによりＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーターアッセイのために使用した細胞系統を得た。
【０４６６】
レシオメトリックカルシウム流入アッセイ。ヒトＯｒａｉ１及びhStim1-YFP融合蛋白を発現しているＨＥＫ−２９３細胞を形成し、Ｉｎｄｏ−１レシオメトリックカルシウム流入アッセイを用いて特性化した。このアッセイはカルシウムの存在下及び非存在下にＩｎｄｏ−１の発光波長の変化により細胞内へのカルシウムの流入を計測するためにＦＡＣ機においてＩｎｄｏ−１レシオメトリックカルシウム染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用している。Ｏｒａｉ１チャンネルを介してカルシウム流入を開始するために、Ｓｔｉｍ１の転座及びＯｒａｉ１チャンネルの活性化をトリガーするタプシガルギンで処理することにより、ストアからの内部カルシウム放出を誘発した。Ｏｒａｉ１チャンネルの開始はＩｎｄｏ−１染料により可視化できる細胞内への濃度勾配を降下するカルシウムの流入に起因する。図６Ａは３９５ｎｍ／４８５ｎｍの発射光の比をｙ軸に、そして時間（秒）をｘ軸上に取ることにより示した細胞内へのカルシウム進入のプロットである。最初１分の記録は細胞内部の低いカルシウムレベルを示す低い比を有する如何なる投与も行う前のベースラインを示す。図６Aによれば、内部ストアカルシウムの放出を誘発するための１分後のタプシガルギン刺激の後、３９５ｎｍ／４８５ｎｍ比は即座に上昇したが、急速にベースラインまで経時低下し、細胞内部のカルシウムの一過性の上昇を表している。内部カルシウムレベルがベースラインに戻ると、次に外部カルシウムジカチオンを２ｍＭまで添加することにより、３９５ｎｍ／４８５ｎｍ比の即時急速な上昇がもたらされ、Ｏｒａｉ１チャンネルの開始による細胞内へのカルシウム流入により生じた細胞内部の寧ろ高値のカルシウムレベルを示している。図６Ａにおいて内部ストアからのカルシウム放出を示す最初のピークは、ＨＥＫ−２９３Ｔ親細胞を含めて、全ての細胞系統で同様であった（ただしＨＥＫ−２９３Ｔ／ｈＯｒａｉ１／Ｓｔｉｍ１−ＹＦＰ−Ｍ３８においては幾分より急速であった）。しかしながら、クローンＨＥＫ−２９３Ｔ／ｈＯｒａｉ１／Ｓｔｉｍ１−ＹＦＰ−Ｍ３８に関するＯｒａｉ１チャンネルを介したカルシウム流入を示す第２のピークは他の細胞系統全てよりも劇的に高値であり、そして、それがこのＩｎｄｏ−１レシオメトリックカルシウム流入アッセイにより計測した場合により高値のＯｒａｉ１活性を呈したことから、その後の実験のためのリードとして選択した。
【０４６７】
ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーターアッセイ。Ｏｒａｉ１活性のタプシガルギン刺激上昇がＮＦＡＴ活性化ルシフェラーゼ活性と共に報告できるようにＮＦＡＴ転写因子の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポータープラスミドを保有するようにＨＥＫ−２９３Ｔ／ｈＯｒａｉ１／Ｓｔｉｍ１−ＹＦＰ−Ｍ３８細胞系統を操作した。ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼアッセイはＯｒａｉ１チャンネルを介したカルシウムの持続的流入をタプシガルギン処理が誘発するという事実に基づいている（図６Ａ参照）。細胞内カルシウムレベルの持続的上昇はカルモジュリンのような多くのカルシウム結合蛋白を介した多くの細胞応答を調整することができる。カルモジュリンはカルシウムジカチオンと結合すると、カルシニューリン、即ちセリン及びスレオニンのホスファターゼを活性化し、次にこれがＮＦＡＴを脱ホスホリル化し、核内へのＮＦＡＴの転座をもたらす。核内において、ＮＦＡＴは、活性を容易に計測できるルシフェラーゼ酵素に関してコードしているルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を活性化する。リード細胞系統ＨＥＫ−２９３Ｔ／ｈＯｒａｉ１／Ｓｔｉｍ１−ＹＦＰ−Ｍ３８−ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ−３Ｃ１２は、外部カルシウム存在下のタプシガルギン処理は相対的光単位（ＲＬＵ）の大幅な上昇を誘発するが、外部カルシウムの非存在下にタプシガルギン処理した場合はＲＬＵの上昇は無視できる程度であるという基準に基づいて選択した。
【０４６８】
ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーターアッセイにおいては、トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をカルシウム非含有培地（１０％ＦＢＳ＋１ＸＮＥＡＡ＋１Ｘピルビン酸ナトリウム＋Ｌ−グルタミン添加ＤＭＥＭ［Ｇｉｂｃｏ］）中１ｘ１０５／ウェル（２５μＬ／ウェル）でプレーティングした。抗Ｏｒａｉ１ｍＡｂを対数用量において５００ｎＭ（２５μＬ／ウェル）を始点としてウェルに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。タプシガルギンを１０μＭ終濃度で各ウェル（２５μＬ／ウェル）に添加し、そして１時間３７℃でインキュベートした。２ｍＭ終濃度のカルシウムを次に各ウェルに添加し、プレートを３７℃で５時間インキュベートした。Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１００μＬ／ウェルで添加し、プレートを５分間室温でインキュベートし、そして次にＷａｌｌａｃＥｎＶｉｓｉｏｎTMプレートリーダー上で読み取った。
【０４６９】
図6B-CはＯｒａｉ１チャンネルを介したタプシガルギン刺激カルシウム流入に応答したルシフェラーゼレポーター遺伝子のＮＦＡＴ活性化転写をブロックする場合の抗Ｏｒａｉ１ｍＡｂを評価するための２つの代表的なアッセイから得られた結果を示す。これらの結果はＣＲＡＣを介したカルシウム流出がＮＦＡＴ媒介ルシフェラーゼアッセイにおいて用量依存的な態様においてｍＡｂ２Ｃ１．１（ＩＣ５０＝４．４ｎＭ）、ｍＡｂ２Ｄ２．１（ＩＣ５０＝２．８ｎＭ）、及びｍＡｂ２Ｂ７．１（ＩＣ５０＝４．２ｎＭ）により阻害されたが；陰性対照ｍＡｂはそれが不可能であったことを示している（図６Ｂ）。図６Ｃに示す実験においては同様のＩＣ５０値がｍＡｂ２Ｃ１．１（ＩＣ５０＝１．８ｎＭ）、ｍＡｂ２Ｄ２．１（ＩＣ５０＝２．７ｎＭ）、ｍＡｂ２Ｂ７．１（ＩＣ５０＝３．５ｎＭ）、及びｍＡｂ２Ｂ４．１（ＩＣ５０＝１．８μＭ）に関して測定された。
【０４７０】
上記した通りヒトＯｒａｉ１には結合するがサイトカイン放出ヒト全血アッセイにおいては不活性であるｍＡｂ２Ｂ４．１を用いて実験を繰り返した。図６Ｃに示す結果によれば、ここでも又、ｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１及びｍＡｂ２Ｂ７．１はルシフェラーゼ活性の用量依存的阻害を呈した。ｍＡｂ２Ｂ４．１のみが僅かにより高い濃度の抗体を阻害し、用量依存性の傾向も伴っていた。しかしながらｍＡｂ２Ｂ４．１に関して計算したＩＣ５０はこの抗体が約１０００倍低効力であり、ＩＣ５０はマイクロモル範囲であるのに対し、ｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１及びｍＡｂ２Ｂ７．１に関してはＩＣ５０は低いナノモルにあったことを示している（上記パラグラフ参照）。全てのｍＡｂによる用量依存性の阻害は５０パーセント最大阻害では部分的であり、このアッセイ系におけるカルシウム流入がＯｒａｉ１のみだけではなくｍＡｂによりブロックされない他のＳＯＣにより媒介されている可能性があることは興味深いものである。
【０４７１】
実施例６    電気生理学的アッセイによる抗ヒトＯｒａｉ１モノクローナル抗体の評価
【０４７２】
細胞系統の開発。ヒトＯｒａｉ１ｃＤＮＡ（配列番号１）をテトラサイクリン誘導ベクターｐｃＤＮＡ５／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、そしてｐｃＤＮＡ５／ＴＯ−ｈＯｒａｉ１と称することとした。この誘導ベクターとテトラサイクリンリプレッサーを発現する発現ベクターｐｃＤＮＡ６−ＴＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐｃＤＮＡ３．１／ゼオシン−ｈＳＴＩＭ１をＨＥＫ−２９３Ｔ内に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、０．５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いながらプレート表面から細胞を剥離し、そして５μｇ／ｍＬのブラスチシジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン（Ｒｏｃｈｅ）及び１００μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する生育培地（Ｇｉｂｃｏ）に再プレーティングした。トランスフェクトされた細胞の選択は目視可能なコロニーが生じるまで継続した。単コロニーを２４穴組織培養プレート中に釣菌し、そして増殖させて機能的カルシウム流入評価に付した。選択されたコロニーは更にクローニングすることによりクローン性を確実なものとし、そしてサブクローンも同様に傾向画像化プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）系カルシウム流入アッセイ系により評価した。ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３クローンと称することとした細胞系統をカルシウム流入及び電気生理学的アッセイのためのリードとして選択した。
【０４７３】
ＦＬＩＰＲ系カルシウム流入アッセイによる細胞系統の機能的評価。ＢＢ６．３細胞をアッセイ前日コラーゲンＩＣｅｌｌｗａｒｅ３８４穴黒色／透明プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に、ウェル当たり生育培地５０μＬ中２５０００個の細胞密度でプレーティングした。カルシウムリゲル溶液ベース（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、４ｍＭＭｇＣｌ２、１２０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．２及び０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ））、１０ＸＰＢＸシグナルエンハンサー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びカルシウムインジケーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有するダイロード緩衝液を使用直前に添加した。生育培地を細胞プレートから慎重に傾瀉し；  ダイロード緩衝液を添加し、その後、２９℃で少なくとも１．５時間インキュベートした。カルシウムインジケーターをロードした後、カルシウムリンゲル溶液ベース中の１μＭタプシガルギン（終濃度）を細胞に添加した。プレートを１．５分間画像化し、そしてデータをRasnow等、Apparatus  and  Method  for  Interleaving  Detection  of  Fluorescence  and  Luminescence,  国際特許出願ＷＯ２００８／０９１４２５及び米国特許出願ＵＳ２００８／０１７９５３９に記載のとおり、蛍光検出／プレート画像化能力のある画像化機器を用いて記録したが、何れかの適当なＦＬＩＰＲ機を代わりに使用しても良い。次にプレートを２９℃で３０分間インキュベートし、その後、カルシウムリンゲル溶液ベース中のカルシウムを加え戻した。プレートをカルシウム画像化機中で１．５分間画像化し、そしてデータを分析した。前述したとおり、細胞のタプシガルギン処理はストアからのカルシウムの放出、及びＳｔｉｍ１の活性化及び転座を誘発し、そして外部カルシウムの非存在下においては如何なる検出可能なカルシウム流入も無かった。次にＳｔｉｍ１は、外部カルシウムが加え戻されると、Ｏｒａｉ１チャンネルの開始を活性化して細胞内へのカルシウムの流入を可能にする。カルシウムは染料に結合し、そしてイメージャー上で読み取られる。
【０４７４】
代表的な結果は、外部カルシウムジカチオン濃度に応答したＯｒａｉ１活性を示すＲＦＵを示す図１９に示す。細胞は、カルシウムを培地に加え戻し、そしてＯｒａｉ１チャンネルを経由して細胞内にカルシウムが流入すると、相対的蛍光単位の用量依存的上昇を示し、機能的ＣＲＡＣチャンネル活性を示していた。ヒトＯｒａｉ１蛋白の発現はテトラサイクリン誘導ベクターの制御下にあったが、ヒトＯｒａｉ１の発現の漏れが観察された。この発現レベルとヒトＳｔｉｍ１の構成的発現レベルとを組み合わせると、テトラサイクリン投与細胞と比較してＦＬＩＰＲ系カルシウム流入アッセイ系において最大の相対的蛍光単位（ＲＦＵ）が与えられる。選択されたクローンＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３はＦＬＩＰＲ系カルシウム流入アッセイ系のための最適な条件としてのテトラサイクリンによる導入が伴わないリード細胞系統として選択した。
【０４７５】
電気生理学。ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３細胞を室温で１時間、１μＭの抗体を予備投与するか、又は抗体非存在下（対照）とした。全ての実験はＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）より入手したＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ６００ＴＭ電気生理学システムを用いて実施した。細胞は１１２ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＣｓＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ２、１０ｍＭＧｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭＨＥＰＥＳを含有する細胞外溶液、ｐＨ＝７．２、２９８ｍＯｓｍ中にバッチ化した。１．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管中の再懸濁細胞を適切なスロットのＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓＴＭ中に挿入した。ＳｅａｌｃｈｉｐｓＴＭをＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ上の自動化操作により１０ｍＭＢＡＰＴＡ、１２０ｍＭグルタミン酸セシウム、８ｍＭＮａＣｌ、８ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＨＥＰＥＳを含有する内部溶液、ｐＨ＝７．２、２９２ｍＯｓｍで満たした。ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ上において、細胞をパッチし、そしてギガオームシールが達成されたら、全細胞コンホーメーションが得られている。電流はＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｃｏｍｍandｅｒソフトウエアを用いて可視化した。細胞は０ｍＶの保持電位において維持した。膜電位は−１００ｍＶまで２５ｍｓステップし、そして１００ｍｓの電圧ランプを−１００から１００ｍＶまで、１５ｓ間隔で適用した。データはＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウエアを用いて分析した。平均は平均±ＳＥＭとして表示する。統計学的分析のためには、対応のない両側ｔ検定を用いた。代表的な結果を図７Ａ−Ｃ及び図８Ａ−Ｆに示すが、これらはｍＡｂ２Ｂ７．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１、ｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｂ４．１、ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４を包含する、ＣＲＡＣ電流（ＩＣＲＡＣ）を阻害する本発明の幾つかの抗ｈＯｒａｉ１抗体の能力を示している。ＩＣＲＡＣに関するｍＡｂ２Ｃ１．１のＩＣ５０を求めた（本明細書の実施例２０参照）
【０４７６】
実施例７    抗ヒトＯｒａｉ１モノクローナル抗体の結合特異性の評価
【０４７７】
ヒトＯｒａｉ２及びヒトＯｒａｉ３の分子クローニング。ヒトＯｒａｉ２ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩレファレンス配列  ＮＭ＿０３２８３１；配列番号６０）及びヒトＯｒａｉ３ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩレファレンス配列  ＮＭ＿１５２２８８；配列番号６２）を哺乳類細胞中での発現のためｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシン内にクローニングした。ｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシンベクター中のヒトＯｒａｉ２のＤＮＡを配列決定することによりヒトＯｒａｉ２ｃＤＮＡを確認したところ、配列は配列番号６０及びｈＯｒａｉ２蛋白のコードされたアミノ酸配列（配列番号６１）と１００％同一であった。ｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシンベクター中のヒトＯｒａｉ３のＤＮＡを配列決定することによりヒトＯｒａｉ３ｃＤＮＡを確認したところ、配列は配列番号６２及びｈＯｒａｉ３蛋白のコードされたアミノ酸配列（配列番号６３）と１００％同一であった。図９は細胞質アミノ末端及びカルボキシ末端を有する４膜貫通蛋白であると予測されるヒトＯｒａｉ１、Ｏｒａｉ２及びＯｒａｉ３の蛋白のアライメントを示す。構造予測に基づけば、二重下線アミノ酸は細胞外ループ１（ＥＣＬ１）を示し、そして一重下線アミノ酸は細胞外ループ２（ＥＣＬ２）を示す。３つのヒトＯｒａｉのアライメントによれば、ＥＣＬ１の長さは３つの蛋白に関して同じであるのに対し、ＥＣＬ２の長さは異なり、Ｏｒａｉ３が最も長かった。配列同様性はＥＣＬ１で約５０％であり、３つの異なるヒトＯｒａｉ蛋白のＥＣＬ２では遥かにより多様である。
【０４７８】
ヒトＯｒａｉ１の１塩基多形変異体Ｓ２１８Ｇの形成。ヒトＯｒａｉ１（Ｓ２１８Ｇ）変異体蛋白（配列番号６５）を形成するために、以下に示す２つのオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号６６及び配列番号６７）を、製造元の推奨する全てのＰＣＲ増幅条件と共に、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩＸＬ部位指向性突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いながら、部位指向性突然変異誘発ＰＣＲ反応において使用した。
フォワードプライマー：
5  '-  CCACCAGCAAGCCCCCCGCCGGTGGCGCAGCAGCCAACGTCAG  -3'
（配列番号６６）及び、
リバースプライマー：
5  '-  CTGACGTTGGCTGCTGCGCCACCGGCGGGGGGCTTGCTGGTG  G  -3'
（配列番号６７）。
【０４７９】
部位指向性突然変異誘発のために使用した鋳型は完全長ヒトＯｒａｉ１野生型コンストラクト（配列番号１）であり、これは以前にｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン内にクローニングしており、そして得られたコンストラクトはｈＯｒａｉ１（Ｓ２１８Ｇ）ｃＤＮＡ（配列番号６４；ｈＯｒａｉ１（Ｓ２１８Ｇ）蛋白（配列番号６５）をコードしている）と称している。
【０４８０】
マウス及びラットＯｒａｉ１及びマウス及びラットＳＴＩＭ１の分子クローニング。マウスＯｒａｉ１（ｍＯｒａｉ１）を標準的なＰＣＲ技術を用いて構築した。要すれば、２つの以下のプライマー：
フォワードプライマー：5'-
GGATCCTGAACCACCATGCATCCGGAGCCTGCCCCGCC-3'（配列番号６８）
及び、
リバースプライマー：5  '-GCGGCCGCTTAGGCATAGTGGGTGCCCGGTG-3'（配列番号６９）
を、ＰＣＲ反応において、鋳型としてＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）より入手したマウス脳ｃＤＮＡを用いながら使用した。
【０４８１】
得られた９３８ｂｐのＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。ｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシンベクターをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し；次にｍＯｒａｉ１フラグメント（配列番号７１）をｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシンベクターのＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ部位にライゲーションすることによりｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシン−ｍＯｒａｉ１ベクターを作成した。ｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシンベクター中のｍＯｒａｉ１のＤＮＡを配列決定することによりマウスＯｒａｉ１領域を確認したところ、配列は配列番号７１（マウスＯｒａｉ１ｃＤＮＡＮＣＢＩレファレンス配列ＮＭ＿１７５４２３；配列番号７２のｍＯｒａｉ１蛋白をコード）と１００％同一であった。マウスＳＴＩＭ１（マウスＳＴＩＭ１ｃＤＮＡＮＣＢＩレファレンス配列ＮＭ＿００９２８７；配列番号７３；配列番号７４のマウスＳＴＩＭ１蛋白をコード）をＰＣＲ技術を用いながらｐｃＤＮＡ３．１／ゼオシン発現ベクター内にクローニングした。更に又、ラットＯｒａｉ１（ｒＯｒａｉ１；ラットＯｒａｉ１ｃＤＮＡＮＣＢＩレファレンス配列ＮＭ＿００１０１３９８２；配列番号７５；配列番号７６のラットＯｒａｉ１蛋白をコード）及びラットＳＴＩＭ１（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓＳＴＩＭ１ｃＤＮＡＮＣＢＩレファレンス配列ＸＭ＿３４１８９６（配列番号７７；配列番号７８のＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓＳＴＩＭ１をコード）を、哺乳類細胞中の発現のためにそれぞれｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシン及びｐｃＤＮＡ３．１／ゼオシン内にクローニングした。ヒト、非ヒト霊長類（チンパンジー及びカニクイザル）、イヌ及びげっ歯類（マウス及びラット）を包含する種々異なる種に由来するＯｒａｉ１蛋白配列のアライメントを図１０Ａ〜Ｂに示す。カニクイザルノＯｒａｉ１蛋白配列は不完全であり、最初の６３アミノ酸を欠いているが、アライメントは、Ｏｒａｉ１蛋白は高い程度にまで種の間で保存されていることを示している。二重下線アミノ酸はch.ＥＭＢｎｅｔ（ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）より入手したＴＭｐｒｅｄプログラムを用いて予測されたＥＣＬ１ドメインを示している。プログラムは採点のための幾つかのウエイトマトリックスの組み合わせを用いながら天然に存在する膜貫通蛋白のデータベース、即ちＴＭｂａｓｅの統計学的分析に基づいて膜スパニング領域の予測を行う。ヒトと比較した場合にイヌ及び非ヒト霊長類に由来する種々異なるＯｒａｉ１蛋白の間にはＥＣＬ１におけるアミノ酸配列の１００％保存があるが、げっ歯類とヒトとの間では僅か８７．５％の保存である。同じＴＭｐｒｅｄプログラムは一重下線アミノ酸であるＥＣＬ２領域を予測している。ＥＣＬ１とは異なり、ＥＣＬ２は長さが異なり、そして保存は主に末端にある。
【０４８２】
ＦＡＣＳ結合分析のための一過性の発現。トランスフェクションの１日前に、２９３ＥＢＮＡ細胞を１００ｍｍの組織培養ディッシュ上の１０ｍＬの生育培地中に３．５ｘ１０６個／ディッシュの細胞密度でプレーティングした。１枚の１００ｍｍディッシュにつき１０μｇのＤＮＡを４６０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈し、穏やかに混合し、そして５分間室温でインキュベートした。次に４０μＬのＦｕＧｅｎｅＨＤトランスフェクション試薬を混合物に添加し、穏やかに混合し、そして２０分間室温でインキュベートした。トランスフェクション混合物を細胞に滴下し、そしてディッシュを穏やかに攪拌して複合体の均一な分布を確保した。
【０４８３】
ＦＡＣＳ結合分析。トランスフェクトされた２９３ＥＢＮＡ細胞は一過性にｈＯｒａｉ１、ヒトＯｒａｉ２、又はヒトＯｒａｉ３（結合比較の結果は図１１Ａ−Ｂ）、ｏｒｈＯｒａｉ１（Ｓ２1８Ｇ）（結合比較の結果は図１２Ａ−Ｂ）；又はｈＯｒａｉ１及びｈＳＴＩＭ１；ｍＯｒａｉ１及びマウスＳＴＩＭ１；又はラットＯｒａｉ１及びラットＳＴＩＭ１（結合比較の結果は図１３）を発現した。トランスフェクトされた細胞はトランスフェクション後４８時間に採取した。ｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクトした細胞を陰性対照として使用した。細胞は１回氷冷１ｘＰＢＳで洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（１ｘＤ−ＰＢＳ＋２％ヤギ血清）中に再懸濁し、そして１００μＬ中２ｘ１０５個の細胞を抗体組み合わせ当たり染色した。全抗体のインキュベーション工程を１時間氷上で実施した。細胞は先ず１μｇの未標識のマウス抗体（ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４）又はヒト抗ｈＯｒａｉ１モノクローナル抗体と共にインキュベートし、その後２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。次に未標識抗体をヤギＦ（ａｂ’）２抗マウス又は抗ヒトＩｇＧ−フィコエリスリン（ＩｇＧ−ＰＥ）を用いて検出し、その後、２００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後にフローサイトメトリー分析に付した。未染色の細胞及び検出抗体で染色した細胞を陰性対照として使用した。蛍光の相対レベルの値はＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓ（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて計算し、そして平均値は対数変換データを用いて計算した（幾何平均）。精製ｍＡｂは、ＨＥＫ−２９３上に発現されたヒトＯｒａｉ１、Ｏｒａｉ２及びＯｒａｉ３蛋白に特異的に結合するそれらの能力に関してＦＡＣＳ試験により評価した。図１１Ａ〜Ｂは試験した２８ｍＡｂ中２７によるヒトＯｒａｉ１への強力な染色があったことを示している。３種のＯｒａｉ１蛋白の何れにも有意に結合できなかったｍＡｂ２Ｈ４．１を除き全てのｍＡｂのＧｅｏ平均値はｈＯｒａｉ１結合において相互に同等程度であったが、ｍＡｂ２Ｂ４．１、ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４の値は他の２４種の結合ｍＡｂに関する値より低値であった。しかしながら、これらの精製された抗体は、染色が未染色対照及び直接標識二次抗体フラグメント陰性染色対照よりも僅かに高値であったにも関わらず、ＨＥＫ−２９３細胞の表面上に発現されたヒトＯｒａｉ２及びｈＯｒａｉ３を認識しなかった。この対照と相対比較したときの僅かに高値の染色はｍＡｂ２Ｂ４．１及びｍＡｂ２Ｈ４．１を除く大部分のｍＡｂに関してベクター単独トランスフェクトＨＥＫ−２９３対照（２９３ＥＢＮＡ／ｐｃＤＮＡ３．１）の場合にも観察されており、恐らくはｍＡｂの大部分はＨＥＫ−２９３細胞中に存在することが知られている内因性に発現されたヒトＯｒａｉ１を認識していたことを示していると考えられる（例えばSternfeld等、Activation  of  muscarinic  receptors  reduces  store-operated  Ca2+  entry  in  HEK-293  cells,  Cellular  Signalling  19:1457-64(2007);  Fasolato等、Store  depletion  triggers  the  calcium  release-activated  calcium  current  (ICRAC)  in  macrovascular  endothelial  cells:  a  comparison  with  Jurkat  and  embryonic  kidney  cell  lines,  Pfluegers  Arch.-  Eur.  J.  Physiol.  436(1):69-74(1998)参照）。
【０４８４】
ヒトＯｒａｉ１はＥＣＬ２ドメインに所在するｈＯｒａｉ１（配列番号６４〜６５）の２１８位におけるセリンからグリシンへの置換をコードする一塩基多形（ＳＮＰ）を有する（ＮＣＢＩのＳＮＰデータベース参照、ｒｓ３７４１５９６）。組み換えｍＡｂがヒトＯｒａｉ１蛋白の２つの異なるＳＮＰ変異体を識別する能力に関してこれらを評価した。図１２Ａ〜Ｂは、ヒトＯｒａｉ１ＳＮＰ変異体に対するキャンペーン１又はキャンペーン２の完全ヒトｍＡｂによる結合には差は認められなかったことを示している。しかしながら、マウス
ｍＡｂ84.5  及びマウスｍＡｂ133.4は２１８位にグリシン残基を有するＳＮＰ変異体に対するよりも２１８位にセリン残基を有する野生型ｈＯｒａｉ１に対してより強力に結合した。
【０４８５】
組み換えｍＡｂがヒト、マウス及びラット由来のＯｒａｉ１蛋白に結合する能力についてそれらを評価した。図１３Ａ〜Ｂはキャンペーン１及びキャンペーン２のヒトｍＡｂ及びネズミｍＡｂｓ８４．５及び１３３．４はヒトＯｒａｉ１に特異的に結合したが、マウス又はラットのＯｒａｉ１は認識しなかったことを示している。ここでも又、ｍＡｂ２Ｂ４．１以外の全てのｍＡｂで観察された未染色対照及び直接標識二次抗体フラグメント陰性染色対照を超えた低レベル結合はＨＥＫ−２９３細胞におけるヒトＯｒａｉ１の内因性発現に起因すると考えられる（例えばSternfeld等、Activation  of  muscarinic  receptors  reduces  store-operated  Ca2+  entry  in  HEK-293  cells,  Cellular  Signalling  19:1457-64(2007);Fasolato等、Store  depletion  triggers  the  calcium  release-activated  calcium  current(ICRAC)  in  macrovascular  endothelial  cells:  a  comparison  with  Jurkat  and  embryonic  kidney  cell  lines,  Pfluegers  Arch.-  Eur.  J.  Physiol.  436(1):69-74(1998)参照）。
【０４８６】
実施例８    ヒトＯｒａｉ１へのｍＡｂの結合特異性の更に進んだ特性化
【０４８７】
キメラヒト及びマウスＯｒａｉ１の形成。ヒトに対して形成されたモノクローナル抗体はげっ歯類Ｏｒａｉ１に結合しなかった（図１３Ａ〜Ｂ）ため、ヒト及びマウスのＯｒａｉ１蛋白のアライメントを作成した（図１４）。アライメントはＥＣＬ１領域（二重下線）においてヒトＯｒａｉ１及びマウスＯｒａｉ１の間でアミノ酸配列における８７．５％同一性を示している。しかしながら、ＥＣＬ２領域（一重下線）におけるヒト及びマウスのＯｒａｉ１蛋白配列の間には僅か６２．２％の同一性があるのみである。これは８アミノ酸の推定ＥＣＬ１領域には僅か１つのみのアミノ酸相違が存在するためにｍＡｂはＥＣＬ２領域におけるヒトＯｒａｉ１に結合することを示すものであった。従って、本発明者等は、本発明のモノクローナル抗体が結合するＯｒａｉ１上の部位を決定する場合に、最も関心のあるヒトＯｒａｉ１のサブ領域として細胞外ループ２に先ず着目した。
【０４８８】
相当するヒトＯｒａｉ１ＥＣＬ２配列（配列番号４）の代わりに配列番号２のアミノ酸残基１９８〜２３３においてマウスＯｒａｉ１ＥＣＬドメイン配列ＫＦＬＰＬＫＲＱＡＧＱＰＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤＳＳＧＩＴＰＧＥ（配列番号８５；即ち配列番号７２のアミノ酸残基２００〜２３６）を担持しているヒトＯｒａｉ１のキメラ蛋白を形成したが、ただしここでは、配列番号２（ヒトＯｒａｉ１）の２３３位のグルタメートは、マウスＥＣＬ２配列の場合のようにグルタミンにより置換するのではなくその場に残すこととし、その理由は、これは保存的置換であり、そして膜貫通ドメインに直接隣接しており、従ってｍＡｂによる結合においては役割を果たしていないと考えたためである。このキメラ蛋白は本明細書においてはｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラと称する。これらのキメラを形成するために、鋳型として予めクローニングされた完全長のヒトＯｒａｉ１（配列番号１）及びマウスＯｒａｉ１（配列番号７１）を用いる２パート（パートＡ及びＢ）ＰＣＲ法において、以下に記載する配列（配列番号８６〜８９）を有するプライマーを使用した。パートＡ用のフォワードプライマーはＳａｌ１制限酵素部位を含有するのに対し、パートＡ用のリバースプライマーはＳｐｈ１を含有する。パートＢについては、最も外側のプライマーがやはりＳｐｈ１制限酵素部位を含有する４つのオーバーラップするフォワードプライマー及びＮｏｔＩ制限部位を含有する１つのリバースプライマーを４回の連続ラウンドのＰＣＲ増幅法において使用することにより、標準的なＰＣＲ反応においてＤＮＡフラグメントを形成した。
【０４８９】
パートＡ用のフォワードプライマーは下記：  
5'-GGTCGACATGCATCCGGAGCCCGCCCC-3'（配列番号８６）;であり、そして、
パートＡ用のリバースプライマーは下記：
5  '-GGCGGTGCATGCGCTCATGTGGTGACTCCTTGACCGAGTTGAG-3'（配列番号８７）
とした。パートＢ用の４つのフォワードプライマーは下記：
5'-
CGCATGCACCGCCACATCGAGCTGGCCTGGGCCTTCTCCACCGTCATCGG
CACGCTGCTCTTCCTAGCTGAGG-3'（配列番号８８）;
【０４９０】
CTGCTCTTCCTAGCTGAGGTGGTGCTGCTCTGCTGGGTCAAGTTCTTGCCC
CTCAAGAGGCAAGCGGGACAG-3'（配列番号２３６）;
【０４９１】
CTCAAGAGGCAAGCGGGACAGCCAAGCCCCACCAAGCCTCCCGCTGAAT
CAGTCATCGTCGCCAACC-3'（配列番号２３７）
【０４９２】
GAATCAGTCATCGTCGCCAACCACAGCGACAGCAGCGGCATCACCCCGG
GCCAGGCAGCTGCCATCGC-3'（配列番号２３８）;
であり、そしてパートＢ用のリバースプライマーは下記：
5'-
CGCGGCCGCCTAGGCATAGTGGCTGCCGGGCGTCAGGGGGTGGTCCCCT
CTGTGGTCCAGCTGGTC-3'（配列番号８９）；
とした。
【０４９３】
Ｓａｌ１及びＳｐｈ１制限酵素で消化したパートＡの５２０ｂｐのＰＣＲ産物はｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２コンストラクトの５’フラグメントを構成する。ＰＣＲ増幅法の連続ラウンドは最も内側のフォワードプライマー、リバースプライマー及びＤＮＡフラグメントを形成するための鋳型としてのｈＯｒａｉ１を使用した。次にＤＮＡフラグメントを次に外側のプライマー及びリバースプライマーと共に使用して更に長いＤＮＡフラグメントを増幅した。この操作を更に２回、漸進的により外側となるプライマー及びリバースプライマーを用いて反復することにより、更に長いＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。４連続ラウンドのＰＣＲ増幅により、Ｓｐｈ１及びＮｏｔ１で消化され、そしてｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２コンストラクトの３’フラグメントを構成するパートＢからの４１０ｂｐの最終生成物がもたらされた。ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシンベクターをＸｈｏ１及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。消化したベクター及び２つの制限酵素消化ＰＣＲ産物をライゲーションすることによりｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２ベクターを作成した。ｐｃＤＮＡ３．１/ハイグロマイシンベクター中のｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２に由来するＤＮＡを配列決定したところ、以下の配列（配列番号９０；ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラｃＤＮＡと標記；配列番号９１のｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ蛋白をコード；ＥＣＬ２ドメイン配列は下線）に１００％同一であることが確認された。
【０４９４】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラｃＤＮＡ配列：
【０４９５】
【化２３】
2013511279.tif 000051
【０４９６】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ蛋白配列：
【０４９７】
【化２４】
2013511279.tif 000052
【０４９８】
【化２５】
2013511279.tif 000053
【０４９９】
逆に、相当するマウスＯｒａｉ１ＥＣＬ２配列（配列番号８５）の代わりに配列番号７２のアミノ酸残基２００〜２３６においてヒトＯｒａｉ１ＥＣＬ2ドメイン配列（配列番号４）を担持しているマウスＯｒａｉ１のキメラ蛋白を形成したが、ただしここでは、配列番号７２（マウスＯｒａｉ１）の２３６位のグルタメートは、ヒトＥＣＬ２配列の場合のようにグルタミンにより置換するのではなくその場に残すこととし、その理由は、これは保存的置換であり、そして膜貫通ドメインに直接隣接しており、従ってｍＡｂによる結合においては役割を果たしていないと考えたためである。キメラ蛋白は本明細書においては、
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラと称することとした。このキメラを形成するために、標準的ＰＣＲ反応において鋳型として以前にクローニングされた完全長のｍＯｒａｉ１を用いながら７連続ラウンドのＰＣＲ増幅法においてＢａｍＨＩ制限酵素部位を含有する１つのフォワードプライマー（配列番号９２）及びＮｏｔＩ制限酵素部位を含有する最も外側のプライマーを含む７つのリバースプライマー（以下に示す配列番号９３〜９５、及び２３９〜２４２）を使用した。
【０５００】
フォワードプライマーは下記：
5'-
CGGATCCTGAACCACCATGCATCCGGAGCCTGCCCCGCCCCCGAGTCACA
GCAATC-3'（配列番号９２）；であり、そして。
リバースプライマーは下記：
【０５０１】
７つのリバースプライマーは下記：
【０５０２】
GGGCTTGCTGGTGGGCCTTGGCTGGCCTGGCTGCTTCTTGAGAGGTAAGA
ACTTGACCCAGCAG-3'（配列番号９３）；
【０５０３】
GGTGATGCCGCTGGTGCTGACGTTGGCTGCTGCGCCACTGGCGGGGGGCT
TGCTGGTGGGCCTTG-3'（配列番号９４）；
【０５０４】
GGAACCATGATGGCGGTGGAGGCAATGGCTGCCGCCTCACCCGGGGTGA
TGCCGCTGGTGCTGAC-3'（配列番号９５）；
【０５０５】
GAGCGGTAGAAGTGAACAGCAAAGACGATAAAAACCAGGCCACAGGGA
ACCATGATGGCGGTGGAG-3'（配列番号２３９）；
【０５０６】
CTCATTGAGCTCCTGGAACTGCCGGTCCGTCTTATGGCTGACCAGGGAGC
GGTAGAAGTGAACAGC-3'（配列番号２４０）；
【０５０７】
CTCTGTGGTCCAGCTGGTCCTGCAAGCGGGCAAACTCGGCCAGCTCATTG
AGCTCCTGGAACTGC-3'（配列番号２４１）；及び、
【０５０８】
CGCGGCCGCTTAGGCATAGTGGGTGCCCGGTGTTAGAGAATGGTCCCCTC
TGTGGTCCAGCTGGTCCTGC-3'（配列番号２４２）；
であった。
【０５０９】
方法ではフォワードプライマーを先ず最も内側のプライマーと共に使用することによりＤＮＡフラグメントを形成した。このフラグメントを次に鋳型としてＰＣＲ反応において使用し、その際はフォワードプライマーと次に外側のプライマーを使用し、これにより、より大きいＤＮＡフラグメントを得た。操作は更に５回反復し、各工程ではフォワードプライマーと漸進的により外側となるプライマーを用いて更に大きいＤＮＡフラグメントをＰＣＲ形成した。７ラウンドのＰＣＲ増幅の後、得られたＰＣＲ産物を１パーセントアガロースゲル上の９３０ｂｐバンドとして分割した。９３０ｂｐのＰＣＲ産物をＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、次にＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）制限酵素で消化し、そしてアガロースゲルのＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシンベクターをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、そして大型のフラグメントをＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより精製した。ゲル精製されたｈＯｒａｉ１フラグメントを精製された大型フラグメントにライゲーションし、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換することによりｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシン−ｈＯｒａｉ１ベクターを作成した。消化したベクター及び２つの制限酵素消化ＰＣＲ産物をライゲーションしてｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２ベクターを作成した。ｐｃＤＮＡ３．１ハイグロマイシンベクター中のｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２のＤＮＡを配列決定したところ、以下の配列（配列番号９６；Ｏｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラｃＤＮＡと標記；ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ蛋白配列番号９７をコード；ＥＣＬ２ドメイン配列は下線）に１００％同一であることが確認された。
【０５１０】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラｃＤＮＡ配列：
【０５１１】
【化２６】
2013511279.tif 000054
【０５１２】
【化２７】
2013511279.tif 000055
【０５１３】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ蛋白配列：
【０５１４】
【化２８】
2013511279.tif 000056
【０５１５】
ＦＡＣＳ結合分析のための一過性の発現。トランスフェクションの１日前に、２９３ＥＢＮＡ細胞を１００ｍｍの組織培養ディッシュ上の１０ｍＬの生育培地中に３．５ｘ１０６個／ディッシュの細胞密度でプレーティングした。１枚の１００ｍｍディッシュにつき１０μｇのＤＮＡを４６０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈し、穏やかに混合し、そして５分間室温でインキュベートした。次に４０μＬのＦｕＧｅｎｅＨＤトランスフェクション試薬を混合物に添加し、穏やかに混合し、そして２０分間室温でインキュベートした。トランスフェクション混合物を細胞に滴下し、そしてディッシュを穏やかに攪拌して複合体の均一な分布を確保した。
【０５１６】
ＦＡＣＳ結合分析。トランスフェクトされた２９３ＥＢＮＡ細胞は一過性にｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２又はｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラを発現した。トランスフェクトされた細胞はトランスフェクション後４８時間に採取した。ｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクトした細胞を陰性対照として使用した。細胞は１回氷冷１ｘＰＢＳで洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（１ｘＤ−ＰＢＳ＋２％ヤギ血清）中に再懸濁し、そして１００μＬ中２ｘ１０５個の細胞を抗体組み合わせ当たり染色した。全抗体のインキュベーション工程を１時間氷上で実施した。細胞は先ず１μｇの未標識のマウス抗体（ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４）又はヒト抗ｈＯｒａｉ１モノクローナル抗体と共にインキュベートし、その後２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。次に未標識抗体をヤギＦ（ａｂ’）２抗マウス又は抗ヒトＩｇＧ−フィコエリスリン（ＩｇＧ−ＰＥ）を用いて検出し、その後、２００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後にフローサイトメトリー分析に付した。未染色の細胞及び検出抗体で染色した細胞を陰性対照として使用した。蛍光の相対レベルの値はＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓ（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて計算し、そして平均値は対数変換データを用いて計算した（幾何平均）。ＦＡＣＳ分析の結果は表１５Ａ〜Ｂに示す通りであり、これは非地ＥＣＬ２ドメインは本発明の抗体が結合したｈＯｒａｉ１の領域であるという結論を裏付けている。
【０５１７】
要すれば、組み換えｍＡｂがｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ及びｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラに特異的に結合する能力に関してこれらを評価した。ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラはヒトＯｒａｉ１バックグラウンドにおいてマウスＯｒａｉ１ＥＣＬ２領域がヒトＯｒａｉ１ＥＣＬ２領域を置き換えている突然変異体であるが、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラはマウスＯｒａｉ１バックグラウンドにおいてマウスＯｒａｉ１ＥＣＬ２がヒトＥＣＬ２領域で置き換えられているという点で逆である。図１５ＡはｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１、ｍＡｂ２Ｂ７．１、ｍＡｂ２Ｂ４．１、ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４はｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラに強力に結合したが、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラにはそうではなかったことを示している。未染色対照及び直接標識二次抗体フラグメント陰性染色対照より高値であったｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１、ｍＡｂ  ２Ｂ７．１及びｍＡｂ８４．５によるｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラへの僅かな結合があったものの、それらはＨＥＫ−２９３細胞におけるヒトＯｒａｉ１の内因性発現に起因すると考えられる（例えばSternfeld等、Activation  of  muscarinic  receptors  reduces
store-operated  Ca2+  entry  in  HEK-293  cells,  Cellular  Signalling  19:1457-64(2007);  Fasolato等、Store  depletion  triggers  the  calcium  release-activated  calcium  current  (ICRAC)  in  macrovascular  endothelial  cells:  a  comparison  with  Jurkat  and  embryonic  kidney  cell  lines,  Pfluegers  Arch.-  Eur.  J.  Physiol.  436(1):69-74(1998)）。図１５Ｂにおいて、ＥＬＣ２領域がマウス型である以外は全蛋白がヒト型である突然変異体であるｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラへのキャンペーン２ｍＡｂの全てによる有意な結合が無かったことは、ｍＡｂがＥＣＬ２領域においてのみヒトＯｒａｉ１に結合することの追加的な強力な証拠である。
【０５１８】
逆に図１５Ａ〜ＢはＥＣＬ２領域がヒト型であり、そして蛋白のアミノ酸配列の残余がマウスＯｒａｉ１である突然変異体であるｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラには全てのｍＡｂが強力に結合した。図１３はｍＡｂがマウスＯｒａｉ１蛋白に特異的に結合しないことを示している。図１５Ａ〜Ｂに示すｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＬＣ２への全てのｍＡｂによる結合の獲得
は、マウスＯｒａｉ１蛋白の範囲内のヒトＥＣＬ２はｍＡｂにより認識されるべき野生型のヒトＯｒａｉ１蛋白と折り畳みの同様性を有することから、ｍＡｂはＥＣＬ２領域においてのみヒトＯｒａｉ１に結合することの決定的証拠を与えている。したがって,  ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２において観察された結合の獲得及びｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２における結合の損失を組み合わせると、これらの結果はヒトＥＬＣ２が試験した抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂによる結合のために十分であることを示している。
【０５１９】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラの突然変異。抗Ｏｒａｉ１モノクローナル抗体が結合するヒト細胞外ループ２ドメイン内の領域を決定するために、本発明者等は鋳型としてｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２及びｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラコンストラクトを用いながら一連の突然変異体を形成するために製造元の説明書に従ってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）による部位指向性突然変異誘発を用いた。突然変異体の最初のシリーズはモノクローナル抗体抗ｈＯｒａｉ１抗体により結合されないｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ  を用いて開始し、そしてＦＡＣＳ結合分析により抗Ｏｒａｉ１抗体により結合される突然変異を有するｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラに進んだ。ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラを用いて開始することで、本発明者等は、マウスアミノ酸が、ヒト及びマウスのＯｒａｉ１蛋白の間の非保存領域に基づいてその相当するヒトの対応物と交換されている一連の突然変異体を設計した（図１４）。
【０５２０】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２ベクター及び以下に示す配列番号１００〜１０１の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＫＰＰＡＥ（配列番号９８）を有する配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２１５〜２１９が、配列ＳＫＰＰＡ（配列番号９９）を有し、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＫＰＰＡ）蛋白（配列番号１０３）と称され、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＫＰＰＡ）ｃＤＮＡ（配列番号１０２）にコードされている、配列番号２（ｈＯｒａｉ１）の残基２１３〜２１７の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０５２１】
フォワードプライマー配列は：5'-
GGGACAGCCAAGCCCCACCAGCAAGCCCCCTGCATCAGTCATCGTCGCC
AACC-3'//（配列番号１００）；であり、そして、
リバースプライマー配列は：  5  '-
GGTTGGCGACGATGACTGATGCAGGGGGCTTGCTGGTGGGGCTTGGCTG
TCCC-3'（配列番号１０１）；
であった。
【０５２２】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＫＰＰＡ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＳＫＡＰＰＡ（配列番号９９）コーディング配列は二重下線）。
【０５２３】
【化２９】
2013511279.tif 000057
【０５２４】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＫＰＰＡ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＳＫＡＰＰＡ（配列番号９９）配列は二重下線）。
【０５２５】
【化３０】
2013511279.tif 000058
【０５２６】
【化３１】
2013511279.tif 000059
【０５２７】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２ベクター及び以下に示す配列番号１０４〜１０５の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＶＩＶを有する配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２２１〜２２３が、配列ＧＡＡを有し、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＧＡＡ）蛋白（配列番号１０７）と称され、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＧＡＡ）ｃＤＮＡ（配列番号１０６）にコードされている配列番号２（ｈＯｒａｉ１）の残基２１９〜２２１の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０５２８】
フォワードプライマー配列は下記：
5  '-CCTCCCGCTGAATCAGGCGCCGCCGCCAACCACAGCGAC-3'（配列番号１０４）；であり、そして、
リバースプライマー配列は下記：
5  '-GTCGCTGTGGTTGGCGGCGGCGCCTGATTCAGCGGGAGG-3'（配列番号１０５）；
であった。
【０５２９】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＧＡＡ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＧＡＡコーディング配列は二重下線）。
【０５３０】
【化３２】
2013511279.tif 000060
【０５３１】
【化３３】
2013511279.tif 000061
【０５３２】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＧＡＡ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＧＡＡ配列は二重下線）。
【０５３３】
【化３４】
2013511279.tif 000062
【０５３４】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２ベクター及び以下に示す配列番号１１０〜１１１の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＡＥＳＶＩＶ（配列番号１０８）を有する配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２１８〜２２３が、
配列ＰＡＳＧＡＡ（配列番号１０９）を有し、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡ）蛋白（配列番号１１３）と称され、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡ）ｃＤＮＡ（配列番号１１２）にコードされている、配列番号２（ｈＯｒａｉ１）の残基２１６〜２２１の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０５３５】
フォワードプライマー配列は：5'-
CCCACCAAGCCTCCCCCTGCATCAGGCGCCGCCGCCAACCACAGCGA-
3'//（配列番号１１０）；であり、そして、
リバースプライマー配列は：  5  '-
TCGCTGTGGTTGGCGGCGGCGCCTGATGCAGGGGGAGGCTTGGTGGG-3'
（配列番号１１１）；
である。
【０５３６】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＰＡＳＧＡＡ（配列番号１０９）コーディング配列は二重下線）。
【０５３７】
【化３５】
2013511279.tif 000063
【０５３８】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＰＡＳＧＡＡ（配列番号１０９）配列は二重下線）。
【０５３９】
【化３６】
2013511279.tif 000064
【０５４０】
【化３７】
2013511279.tif 000065
【０５４１】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２ベクター及び以下に示す配列番号１１４〜１１５の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＨＳＤを有する配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２２６〜２２８が、配列ＶＳＴを有し、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＳＴ）蛋白（配列番号１１７）と称され、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＳＴ）ｃＤＮＡ（配列番号１１６）にコードされている、配列番号２（ｈＯｒａｉ１）の残基２２４〜２２６の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０５４２】
フォワードプライマー配列は下記：
5'-GCGCCGCCGCCAACGTCAGCACCAGCAGCGGCATCA-3'（配列番号１１４）；であり、そして、
リバースプライマーは下記：  
5  '-TGATGCCGCTGCTGGTGCTGACGTTGGCGGCGGCGC-3'（配列番号１１５）；であった。
【０５４３】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＳＴ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＶＳＴコーディング配列は二重下線）。
【０５４４】
【化３８】
2013511279.tif 000066
【０５４５】
【化３９】
2013511279.tif 000067
【０５４６】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＳＴ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＶＳＴ配列は二重下線）。
【０５４７】
【化４０】
2013511279.tif 000068
【０５４８】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２ベクター及び以下に示す配列番号１２０〜１２１の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＶＡＮＨＳＤ（配列番号１１８）を有する配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２２３〜２２８が、
配列ＡＡＮＶＳＴ（配列番号１１９）を有し、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＡＮＶＳＴ）蛋白（配列番号１２３）と称され、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＡＮＶＳＴ）ｃＤＮＡ（配列番号１２２）にコードされている、配列番号２（ｈＯｒａｉ１）の残基２２１〜２２６の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０５４９】
フォワードプライマー配列は下記：5'-  GCGCCGCCGCCAACGTCAGCACCAGCAGCGGCATCA-3'//（配列番号１２０）；であり、そして、
リバースプライマー配列は：  5  '-
TGATGCCGCTGCTGGTGCTGACGTTGGCGGCGGCGC-3'（配列番号１２１）；
であった。
【０５５０】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＡＮＶＳＴ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＡＡＮＶＳＴ（配列番号１１９）コーディング配列は二重下線）。
【０５５１】
【化４１】
2013511279.tif 000069
【０５５２】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＡＮＶＳＴ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＡＡＮＶＳＴ（配列番号１１９）配列は二重下線）。
【０５５３】
【化４２】
2013511279.tif 000070
【０５５４】
【化４３】
2013511279.tif 000071
【０５５５】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＫＰＰＡ）ベクター及び以下に示す配列番号１２６〜１２７の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＳＰＴＫＰＰＡＥ（配列番号１２４）を有する配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２１２〜２１９が、配列ＲＰＴＳＫＰＰＡ（配列番号１２５）を有し、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）蛋白（配列番号１２９）と称され、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）ｃＤＮＡ（配列番号１２８）にコードされている、配列番号２（ｈＯｒａｉ１）の残基２１０〜２１７の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０５５６】
フォワードプライマー配列は下記：5'-
GGGACAGCCAAGGCCCACCAGCAAG-3'//（配列番号１２６）；であり、そして、
リバースプライマーは：  5  '-CTTGCTGGTGGGCCTTGGCTGTCCC-3'（配列番号  １２７）；
であった。
【０５５７】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＲＰＴＳＫＰＰＡ（配列番号１２５）コーディング配列は二重下線）。
【０５５８】
【化４４】
2013511279.tif 000072
【０５５９】
【化４５】
2013511279.tif 000073
【０５６０】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＲＰＴＳＫＰＰＡ（配列番号１２５）配列は二重下線）。
【０５６１】
【化４６】
2013511279.tif 000074
【０５６２】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）ベクター及び以下に示す配列番号１８７〜１８８の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶ（配列番号１８９）を有する配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２１２〜２２３が、配列ＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ（配列番号１９０）を有し、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）蛋白（配列番号１９２）と称され、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）ｃＤＮＡ（配列番号１９１）にコードされている、配列番号２（ｈＯｒａｉ１）の残基２１０〜２２１の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０５６３】
フォワードプライマー配列は下記：5'-
AAGCCCCCTGCATCAGGCGCCGCCGCCAACCACAGCGAC-3'//(配列番号１８７）；であり、そして、
リバースプライマー配列は下記：5'-
GTCGCTGTGGTTGGCGGCGGCGCCTGATGCAGGGGGCTT-3'（配列番号１８８）；
であった。
【０５６４】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ（配列番号１９０）コーディング配列は二重下線）。
【０５６５】
【化４７】
2013511279.tif 000075
【０５６６】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ（配列番号１９０）配列は二重下線）。
【０５６７】
【化４８】
2013511279.tif 000076
【０５６８】
【化４９】
2013511279.tif 000077
【０５６９】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡ）ベクター及び以下に示す配列番号１９３〜１９４の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ（配列番号１９５）を有する配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２１８〜２２８が、配列ＰＡＳＧＡＡＡＮＶＳＴ（配列番号１９６）を有し、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡＡＮＶＳＴ）蛋白（配列番号１９８）と称され、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡＡＮＶＳＴ）ｃＤＮＡ（配列番号１９７）にコードされている、配列番号２（ｈＯｒａｉ１）の残基２１６〜２２６の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０５７０】
フォワードプライマー配列は：5'-  GCGCCGCCGCCAACGTCAGCACCAGCAGCGGCATCA-3'//（配列番号１９３）；であり、そして、
リバースプライマー配列は：5  '-
TGATGCCGCTGCTGGTGCTGACGTTGGCGGCGGCGC-3'（配列番号１９４）；であった。
【０５７１】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡＡＮＶＳＴ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＰＡＳＧＡＡＡＮＶＳＴ（配列番号１９６）コーディング配列は二重下線）。
【０５７２】
【化５０】
2013511279.tif 000078
【０５７３】
【化５１】
2013511279.tif 000079
【０５７４】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＰＡＳＧＡＡＡＮＶＳＴ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＰＡＳＧＡＡＡＮＶＳＴ（配列番号１９６）配列は二重下線）。
【０５７５】
【化５２】
2013511279.tif 000080
【０５７６】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）ベクター及び以下に示す配列番号１９９〜２００の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＲＱＡＧＱＰＳＰＴＫＰＰＡＥ（配列番号２０１）を有する配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２０６〜２１９が、配列ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ（配列番号２０２）を有し、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ）蛋白（配列番号２０４）と称され、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ）ｃＤＮＡ（配列番号２０３）にコードされている、配列番号２（ｈＯｒａｉ１）の残基２０４〜２１７の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０５７７】
フォワードプライマー配列は：5'-
AGTTCTTGCCCCTCAAGAAGCAACCGGGACAGCC-3'//（配列番号１９９）；であり、そして、
リバースプライマー配列は：5  '-
GGCTGTCCCGGTTGCTTCTTGAGGGGCAAGAACT-3'（配列番号２００）；
である。
【０５７８】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ（配列番号２０２）コーディング配列は二重下線）。
【０５７９】
【化５３】
2013511279.tif 000081
【０５８０】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ（配列番号２０２）配列は二重下線）。
【０５８１】
【化５４】
2013511279.tif 000082
【０５８２】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ）ベクター及び以下に示す配列番号２０５〜２０６の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＲＱＡＧＱＰＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶ（配列番号２０７）を有する配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２０６〜２２３が、配列ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ（配列番号２０８）を有し、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）蛋白（配列番号２１０）と称され、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）ｃＤＮＡ（配列番号２０９）にコードされている、配列番号２（ｈＯｒａｉ１）の残基２０４〜２２１の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０５８３】
フォワードプライマー配列は：  5'-
AAGCCCCCTGCATCAGGCGCCGCCGCCAACCACAGCGAC-3'//（配列番号２０５）；であり、そして、
リバースプライマー配列は：  5'-
GTCGCTGTGGTTGGCGGCGGCGCCTGATGCAGGGGGCTT-3'（配列番号２０６）；
であった。
【０５８４】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ（配列番号２０８）コーディング配列は二重下線）。
【０５８５】
【化５５】
2013511279.tif 000083
【０５８６】
ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ（配列番号２０８）配列は二重下線）。
【０５８７】
【化５６】
2013511279.tif 000084
【０５８８】
【化５７】
2013511279.tif 000085
【０５８９】
本発明の例示される抗ｈＯｒａｉ１抗体による上記した突然変異体のｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラへの結合のＦＡＣＳ分析の代表的結果を以下の図１７Ａ〜Ｄ、表１０Ａ及び表１０Ｂに示す。表１０Ａ（キャンペーン１）及び表１０Ｂ（キャンペーン２）はＦＡＣＳにより測定した場合のｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ突然変異体への例示されるモノクローナル抗体の結合能力における獲得分を示している。図１７Ａは本発明者等がｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラを使用しながら出発し、そしてＥＣＬ２におけるマウスアミノ酸を相当するヒトアミノ酸へ変えながら、一連の突然変異体を作成した実験で得られたＧｅｏ平均の生データを示しており、ここではキャンペーン１並びに精製ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４からの組み換えｍＡｂによる「結合獲得（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｂｉｎｄｉｎｇ）」突然変異体を探すための２つの種の間の相違が存在している。図１７Ｃは比較のためにキャンペーン１の組み換えｍＡｂ２Ｄ２．２と共にキャンペーン２の７種の精製ｍＡｂから得られた同様の「結合獲得」データを示している。「結合獲得」実験は本発明のｍＡｂによる結合のために重要であるヒトＥＣＬ２におけるサブ領域をより決定的に本発明者等に教示することを意図していたが、その理由は、結合獲得はキメラバックグラウンドにおける適切なコンホーメーションの維持によってのみ達成可能であるからである。キメラコンストラクト及びｐｃＤＮＡ３．１ベクターでトランスフェクトした細胞への未染色対照及び直接標識二次抗体対照結合のＧｅｏ平均は全て低値であり、一緒になって「陰性対照」となっている。一部の場合におけるｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（配列番号９１）へのｍＡｂの結合のＧｅｏ平均における相違のために、本発明者等は対照のパーセント（ＰＯＣ）としてＧｅｏ平均を再プロットすることにより何れかの内因性に発現されたｈＯｒａｉ１へのバックグラウンド結合に関してコントロールし、その際、ゼロとしてバックグラウンド染色、そして、各試料に対する対照のパーセント（ＰＯＣ）を計算するためのそのｍＡｂに関して到達可能な最高値として完全ヒト型のＯｒａｉ１ＥＣＬ２配列を有するｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（配列番号９７；Ｃｈ．１２）への結合を用いた。図１７Ｂ及び図１７ＤはそのようなＰＯＣプロットであり、そしてそのため、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２への結合に関しては全ての値が１００％となるが、一部の場合においては、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（配列番号９１）への結合に関する値は、恐らくはＨＥＫ−２９３細胞における内因性ヒトＯｒａｉ１発現のためにゼロとはならない（例えばSternfeld等、Activation  of  muscarinic  receptors  reduces  store-operated  Ca2+  entry  in  HEK-293  cells,  Cellular  Signalling  19:1457-64(2007);Fasolato等、Store  depletion  triggers  the  calcium  release-activated  calcium  current(ICRAC)  in  macrovascular  endothelial  cells:  a  comparison  with  Jurkat  and  embryonic  kidney  cell  lines,  Pfluegers  Arch.-  Eur.  J.  Physiol.  436(1):69-74(1998)参照）。表１０Ａは図１７Ｂの模式的表示であり、そして表１０Ｂは図１７Ｄの模式的表示であり、ここでは結合結果は４０％〜１００％の結合ＰＯＣを示す（＋＋＋）、���％〜４０％未満の結合ＰＯＣを示す（＋＋）、１％〜５％未満の結合ＰＯＣを示す（＋）、及びＰＯＣ１％未満の無結合としての（−）として記録する。表１０Ａ〜Ｂの最上部はＥＣＬ２領域のみにおけるヒト及びマウスのＯｒａｉ１蛋白の間のアライメントを示し、ヒトアミノ酸は大文字で示し、マウスＥＣＬ２アミノ酸は小文字で示し、そして下線を付したアミノ酸はヒト及びマウスの蛋白配列の間の相違を示す。キメラ（Ｃｈ．）は左側にナンバリングし、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（配列番号９１）をＣｈ．１として始まり、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（配列番号９７）をＣｈ．１２とする。Ｃｈ．２からＣｈ．１１はｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２突然変異体であり、ここで特定のマウスアミノ酸がそれらのヒト対応物で置き換えられている。表におけるヒトからマウスへのアミノ酸の変化は大文字で表し、そしてダッシュは不変を示す。表１０Ａで「結合」の下には、キャンペーン１の組み換えヒトｍＡｂ２Ｄ２．１、ｍＡｂ２Ｃ１．１及びｍＡｂ２Ｂ７．１は左行にまとめ、キャンペーン１のヒトｍＡｂ２Ｂ４．１は単独で中央の行に、そしてマウスｍＡｂ８４．５及び１３３．４は最も右の行にまとめる。表１０Ｂで「結合」の下には、キャンペーン１の組み換えヒトｍＡｂ２Ｄ２．１は比較のために左行に示し、キャンペーン２の精製ｍＡｂ５Ｂ１．１及びｍＡｂ５Ｂ５．２は中央の行に示し、そしてキャンペーン２の精製ｍＡｂの残余は右行に示す。ＲＦＩ−ＰＯＣは相対的蛍光強度幾何平均（Ｇｅｏ平均）から計算し、使用するアルゴリズム（アルゴリズムＩ、下記）は、キメラを発現している細胞に結合しているｍＡｂのＧｅｏ平均マイナス陰性対照の平均Ｇｅｏ平均をＣｈ．１２（ｍＯｒａｉ−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２；配列番号９７）に結合している特定のｍＡｂのＧｅｏ平均で割り、全体の量に１００を掛ける。
【０５９０】
アルゴリズムＩ（特定のｍＡｂ及び目的の試料キメラの例として「ｍＡｂ２Ｄ２０１」及び「Ｃｈ．２」を代入するが、後者は別の目的のもので置きかえることができる）：
Ｃｈ．２に結合するｍＡｂ２Ｄ２．１のＲＦＩ−ＰＯＣ＝｛［Ｃｈ．２に結合するｍＡｂ２Ｄ２．１のＧｅｏ平均−陰性対照の平均Ｇｅｏ平均］／Ｃｈ．1２に結合するｍＡｂ２Ｄ２．１のＧｅｏ平均｝ｘ１００
【表１０−１】
2013511279.tif 000086
【表１０−２】
2013511279.tif 000087
【表１０−３】
2013511279.tif 000088
【０５９１】
表１０ＡはＣｈ．７〜１１にはｍＡｂの何れも結合しなかったことを示しており、この領域がキャンペーン１並びに精製ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４からの組み換えｍＡｂによる結合において役割を果たしていない可能性があることを示している。表１０Ｂもまた、キャンペーン２の精製ｍＡｂによるＣｈ．７〜１１への結合が同様に無かったことを示している。しかしながら、配列番号２のアミノ酸残基２１６〜２２６からの領域が結合において些少な役割を果たしている可能性を排除できないものの、ＦＡＣＳ結合実験において可視化するために十分な親和性は獲得できていない。ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＫＰＰＡ）（Ｃｈ．６；配列番号１０３）に関してはキャンペーン１のｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１、２Ｂ７．１、ｍＡｂ及び２Ｂ４．１及びキャンペーン２の精製ｍＡｂ５Ｂ１．１及びｍＡｂ５Ｂ５．２と結合の獲得が観察されており、これはｍＯｒａ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（Ｃｈ．１２；配列番号９７）に関して観察された結合のある割合に過ぎず、配列番号２（ヒトＯｒａｉ１配列）のアミノ酸残基２１３〜２１７のこの領域がそれらの結合のために重要であることを示している。興味深いことに、精製ｍＡｂ５Ａ１．１、ｍＡｂ５Ａ４．２、ｍＡｂ５Ｃ１．１、ｍＡｂ５Ｆ２．１及びｍＡｂ５Ｆ７．１によるｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＫＰＰＡ）（配列番号１０３；Ｃｈ．６）への図１７Ｄ及び表１０Ｂで観察された結合獲得はｍＯｒａ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（配列番号９７；Ｃｈ．１２）へのそれらの結合とほぼ同じく強力であった。このことはキャンペーン１の組み換えｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１、ｍＡｂ２Ｂ７．１及びｍＡｂ２Ｂ４．１とキャンペーン２の精製ｍＡｂ５Ｂ１．１及びｍＡｂ５Ｂ５．２との間にはキャンペーン２の精製ｍＡｂ５Ａ１．１、ｍＡｂ５Ａ４．２、ｍＡｂ５Ｃ１．１、ｍＡｂ５Ｆ２．１及びｍＡｂ５Ｆ７．１と比較して大きな相違があることを示している（図１７Ｂ及び１７Ｄ及び表１０Ａ〜Ｂ）。
【０５９２】
本発明者等が配列番号２のアミノ酸残基２１０〜２１７を有するマウスＥＣＬ2  領域のヒト化を延長するとすれば（Ｃｈ．５；ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）、配列番号１２９）、キャンペーン１のｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１、２Ｂ７．１及びｍＡｂ２Ｂ４．１による結合はＣｈ１２．（ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２、配列番号９７）へのこれらのｍＡｂによる結合とほぼ同じく強力となる（図１７Ｂ及び表１０Ａ）。更に又、キャンペーン２の精製ｍＡｂによるｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）（Ｃｈ．５；配列番号１２９）への同様の結合も観察されている（図１７Ｄ及び表１０Ｂ）。
【０５９３】
しかしながら、配列番号２のアミノ酸２０４〜２２１を包含する領域にまでｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）（Ｃｈ．２；配列番号２１０）及びｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ）（Ｃｈ．３；配列番号２０４）を用いながらアミノ末端方向に更にヒト化を進める場合、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）（Ｃｈ．５；配列番号１２９）と比較して．ｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１、２Ｂ７．１及びｍＡｂ２Ｂ４．１に関するＰＯＣに僅かな低下が生じる。キャンペーン２の精製ｍＡｂのｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）（Ｃｈ．２；配列番号２１０）及びｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ）（Ｃｈ．３；配列番号２０４）への結合はｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）（Ｃｈ．５；配列番号１２９）へのそれらの結合に匹敵するものであったが、ただしｍＡｂ５Ｂ１．１及びｍＡｂ５Ｂ５．２は例外であり、これらはｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）（Ｃｈ．２；配列番号２１０）及びｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ）（Ｃｈ．３；配列番号２０４）にはｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）（Ｃｈ．５；配列番号１２９）よりも僅かに低強度において結合した（図１７Ｄ及び表１０Ｂ）。しかしながら、キャンペーン２のｍＡｂ５Ａ１．１、ｍＡｂ５Ａ４．２、ｍＡｂ５Ｃ１．１、ｍＡｂ５Ｆ２．１及びｍＡｂ５Ｆ７．１の結合はキャンペーン１ｍＡｂとは僅かに異なっており、即ち、キャンペーン２のｍＡｂはｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＫＰＰＡ）（Ｃｈ．６；配列番号１０３）に対して、それらがｍＯｒａ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（Ｃｈ．１２；配列番号９７）に結合する場合とほぼ同様に頑健に結合した（表１０Ｂ）。データは配列番号２のアミノ酸２０４〜２０６からのサブ領域はキャンペーン１の組み換えｍＡｂ及びキャンペーン２の精製ｍＡｂの結合のためには重要ではないことを示している。
【０５９４】
更に又、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＡＡＳＧＡＡ）（Ｃｈ．４；配列番号ｌ９２）及びｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）（Ｃｈ．２；配列番号２１０）を用いながらカルボキシ末端方向にヒト化を更に伸長する場合、キャンペーン１の組み換えｍＡｂ及びキャンペーン２の精製ｍＡｂによる結合において差が無くなり、配列番号２のアミノ酸２１８〜２２１のサブ領域が結合に重要ではないことを示している（図１７Ｂ及び図１７Ｄ及び表１０Ａ〜Ｂ）。従って本発明者等は「結合獲得」実験から、配列番号２のアミノ酸残基２０７〜２１７のサブセットはキャンペーン１のｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１、ｍＡｂ２Ｂ７．１及びｍＡｂ２Ｂ４．１及びキャンペーン２の精製ｍＡｂ５Ａ１．１、ｍＡｂ５Ａ４．２、ｍＡｂ５Ｂ１．１、ｍＡｂ５Ｂ５．２、ｍＡｂ５Ｃ１．１、ｍＡｂ５Ｆ２．１及びｍＡｂ５Ｆ７．１による結合のためには重要であると結論した。
【０５９５】
ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４に関しては、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）（Ｃｈ．２；配列番号２１０）及びｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）（Ｃｈ．４；配列番号ｌ９２）を用いた場合には結合獲得が観察されたが、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ）（Ｃｈ．３；配列番号２０４）及びｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）（Ｃｈ．５；配列番号１２９）を用いた場合には観察されなかったことは、配列番号２（ヒトＯｒａｉ１）のアミノ酸２１９〜２２１の領域が結合のために重要で有り、そしてアミノ酸２０４から２１８までのそれに先行する領域と比較してより重要な役割を果たしている可能性があることを示している（表１０Ａ）。更に又、図１７Ｂが更に詳細に示していることは、ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ．１３３．４のｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）（Ｃｈ．２；配列番号２１０）及びｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＡＡＳＧＡＡ）（Ｃｈ．４；配列番号１９２）への結合には無視できる程度の差しかなく、配列番号２のアミノ酸２０４〜２０６の領域が結合に有意に寄与していないことを示している。従って、本発明者等は「結合獲得」実験から、配列番号２（ヒトＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２０７〜２２３のサブセットがｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４による結合のために重要であり、そして配列番号２のアミノ酸残基２１８〜２２３のサブセットが結合においてより重要な役割を果たしていると結論できる。
【０５９６】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラの突然変異  。次のシリーズの未突然変異体は、ヒト細胞外ループ２のサブ領域のどこで本発明のモノクローナル抗体が結合するのかを、突然変異体における結合の損失を探すことにより探索するために設計した。これを達成するために、本発明者等はモノクローナル抗体が結合するｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラを最初に使用し、そして、ヒト及びマウスのＯｒａｉ１蛋白の間の非保存領域（図１４）に基づいて、細胞外ループ２におけるヒトアミノ酸がそれらの相当するマウス対応物と交換されている突然変異体のシリーズを設計し、そして結合の損失を探した。
【０５９７】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２ベクター及び以下に示す配列番号１３０〜１３１の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＳＫＰＰＡ（配列番号９９）を有する配列番号２（ｈＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２１３〜２１７が、配列ＫＰＰＡＥ（配列番号９８）を有し、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＰＰＡＥ）蛋白（配列番号１３３）と称され、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＰＰＡＥ）ｃＤＮＡ（配列番号１３２）にコードされている、配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）の残基２１５〜２１９の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０５９８】
CAGCCAAGGCCCACCAAGCCGCCCGCCGAGAGTGGCGCAGCAGC-3'//
（配列番号１３０）；であり、そして、
リバースプライマー配列は：5'-
GCTGCTGCGCCACTCTCGGCGGGCGGCTTGGTGGGCCTTGGCTG-3'（配列番号１３１）
であった。
【０５９９】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＰＰＡＥ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＫＰＰＡＥ（配列番号９８）コーディング配列は二重下線）。
【０６００】
【化５８】
2013511279.tif 000089
【０６０１】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＰＰＡＥ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＫＰＰＡＥ（配列番号９８）配列は二重下線）。
【０６０２】
【化５９】
2013511279.tif 000090
【０６０３】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２ベクター及び以下に示す配列番号１３４〜１３５の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＧＡＡを有する配列番号２（ｈＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２１９〜２２１が、配列ＶＩＶを有し、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＩＶ）蛋白（配列番号１３７）と称され、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＩＶ）ｃＤＮＡ（配列番号１３６）にコードされている、配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）の残基２２１〜２２３の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０６０４】
フォワードプライマー配列は：5'-
AAGCCCCCCGCCAGTGTCATAGTAGCCAACGTCAGCACC-3'//（配列番号１３４）；であり、そして、
リバースプライマー配列は：5  '-
GGTGCTGACGTTGGCTACTATGACACTGGCGGGGGGCTT-3'（配列番号１３５）；
であった。
【０６０５】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＩＶ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＶＩＶコーディング配列は二重下線）。
【０６０６】
【化６０】
2013511279.tif 000091
【０６０７】
【化６１】
2013511279.tif 000092
【０６０８】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＩＶ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＶＩＶ配列は二重下線）。
【０６０９】
【化６２】
2013511279.tif 000093
【０６１０】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２ベクター及び以下に示す配列番号１３８〜１３９の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＰＡＳＧＡＡ（配列番号１０９）を有する配列番号２（ｈＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２１６〜２２１が、配列ＡＥＳＶＩＶ（配列番号１０８）を有し、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶ）蛋白（配列番号１４１）と称され、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶ）ｃＤＮＡ（配列番号１４０）にコードされている、配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）の残基２１８〜２２３の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０６１１】
フォワードプライマー配列は：5'-
GCCCACCAGCAAGCCCGCCGAGAGTGTCATAGTAGCCAACGTCAGCACC-
3'//（配列番号１３８）；であり、そして、
リバースプライマー配列は：5  '-
GGTGCTGACGTTGGCTACTATGACACTCTCGGCGGGCTTGCTGGTGGGC-
3'（配列番号１３９）；
であった。
【０６１２】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＡＥＳＶＩＶ（配列番号１０８）コーディング配列は二重下線）。
【０６１３】
【化６３】
2013511279.tif 000094
【０６１４】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＡＥＳＶＩＶ（配列番号１０８）配列は二重下線）。
【０６１５】
【化６４】
2013511279.tif 000095
【０６１６】
【化６５】
2013511279.tif 000096
【０６１７】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２ベクター及び以下に示す配列番号１４２〜１４３の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＶＳＴを有する配列番号２（ｈＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２２４〜２２６が、配列ＨＳＤを有し、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＨＳＤ）蛋白（配列番号１４５）と称され、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＨＳＤ）ｃＤＮＡ（配列番号１４４）にコードされている、配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）の残基２２６〜２２８の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０６１８】
フォワードプライマー配列は：5'-
GGCGCAGCAGCCAACCACAGCGACAGCGGCATCACCCC-3'//（配列番号１４２）；であり、そして、
リバースプライマー配列は：5  '-
GGGGTGATGCCGCTGTCGCTGTGGTTGGCTGCTGCGCC-3'（配列番号１４３）；
であった。
【０６１９】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＨＳＤ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＨＳＤコーディング配列は二重下線）。
【０６２０】
【化６６】
2013511279.tif 000097
【０６２１】
【化６７】
2013511279.tif 000098
【０６２２】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＨＳＤ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＨＳＤ配列は二重下線）。
【０６２３】
【化６８】
2013511279.tif 000099
【０６２４】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＰＰＡＥ）ベクター及び以下に示す配列番号２１１〜２１２の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＲＰＴＳＫＰＰＡ（配列番号１２５）を有する配列番号２（ｈＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２１０〜２１７が、配列ＳＰＴＫＰＰＡＥ（配列番号１２４）を有し、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥ）蛋白（配列番号２１４）と称され、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥ）ｃＤＮＡ（配列番号２１３）にコードされている、配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）の残基２１２〜２１９の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０６２５】
フォワードプライマー配列は：5'-
GGCCAGCCAAGCCCCACCAAGCC-3'//（配列番号２１１）；であり、そして、
リバースプライマー配列は：5'-GGCTTGGTGGGGCTTGGCTGGCC-3'（配列番号２１２）であった。
【０６２６】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＳＰＴＫＰＰＡＥ（配列番号１２４）コーディング配列は二重下線）。
【０６２７】
【化６９】
2013511279.tif 000100
【０６２８】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥ）蛋白の配列は以下の通りであるＥＣＬ２ドメインは下線、ＳＰＴＫＰＰＡＥ（配列番号１２４）配列は二重下線）。
【０６２９】
【化７０】
2013511279.tif 000101
【０６３０】
【化７１】
2013511279.tif 000102
【０６３１】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥ）ベクター及び以下に示す配列番号２１５〜２１６の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ（配列番号１９０）を有する配列番号２（ｈＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２１０〜２２１が、配列ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶ（配列番号１８９）を有し、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶ）蛋白（配列番号２１８）と称され、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶ）ｃＤＮＡ（配列番号２１７）にコードされている、配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）の残基２１２〜２２３の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０６３２】
フォワードプライマー配列は：5'-
CCGCCCGCCGAGAGTGTCATAGTAGCCAACGTCAGCACC-3'//（配列番号２１５）；であり、そして、
リバースプライマー配列は：5  '-
GGTGCTGACGTTGGCTACTATGACACTCTCGGCGGGCGG-3'（配列番号２１６）であった。
【０６３３】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶ（配列番号１８９）コーディング配列は二重下線）。
【０６３４】
【化７２】
2013511279.tif 000103
【０６３５】
【化７３】
2013511279.tif 000104
【０６３６】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶ（配列番号１８９）配列は二重下線）。
【０６３７】
【化７４】
2013511279.tif 000105
【０６３８】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶ）ベクター及び以下に示す配列番号２１９〜２２０の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＰＡＳＧＡＡＡＮＶＳＴ（配列番号１９６）を有する配列番号２（ｈＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２１６〜２２６が、配列ＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ（配列番号１９５）を有し、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ）蛋白（配列番号２２２）と称され、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ）ｃＤＮＡ（配列番号２２１）にコードされている、配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）の残基２１８〜２２８の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０６３９】
フォワードプライマー配列は：5  '-
GTGTCATAGTAGCCAACCACAGCGACAGCGGCATCACCCCGG-3'//（配列番号２１９）；であり、そして、
【０６４０】
リバースプライマー配列は：5  '-
CCGGGGTGATGCCGCTGTCGCTGTGGTTGGCTACTATGACAC-3'（配列番号２２０）であった。
【０６４１】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ（配列番号１９５）コーディング配列は二重下線）。
【０６４２】
【化７５】
2013511279.tif 000106
【０６４３】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ（配列番号１９５）配列は二重下線）。
【０６４４】
【化７６】
2013511279.tif 000107
【０６４５】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥ）ベクター及び以下に示す配列番号２２３〜２２４の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ（配列番号２０２）を有する配列番号２（ｈＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２０４〜２１７が、配列ＲＱＡＧＱＰＳＰＴＫＰＰＡＥ（配列番号２０１）を有し、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＱＡＧＱＰＳＰＴＫＰＰＡＥ）蛋白（配列番号２２６）と称され、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＱＡＧＱＰＳＰＴＫＰＰＡＥ）ｃＤＮＡ（配列番号２２５）にコードされている、配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）の残基２０６〜２１９の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０６４６】
フォワードプライマー配列は：5'CTTACCTCTCAAGAGGCAGGCAGGCCAGCCAAGC-3'//（配列番号２２３）；であり、そして、
リバースプライマー配列は：5  '-
GCTTGGCTGGCCTGCCTGCCTCTTGAGAGGTAAG-3'（配列番号２２４）であった。
【０６４７】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＱＡＧＱＰＳＰＴＫＰＰＡＥ）ｃＤＮＡの配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＲＱＡＧＱＰＳＰＴＫＰＰＡＥ（配列番号２０１）コーディング配列は二重下線）。
【０６４８】
【化７７】
2013511279.tif 000108
【０６４９】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＱＡＧＱＰＳＰＴＫＰＰＡＥ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＲＱＡＧＱＰＳＰＴＫＰＰＡＥ（配列番号２０１）
配列は二重下線）。
【０６５０】
【化７８】
2013511279.tif 000109
【０６５１】
ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン−ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶ）ベクター及び以下に示す配列番号２２７〜２２８の配列を有するプライマーを用いながら、本発明者等は、アミノ酸配列ＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡＡＮＶＳＴ（配列番号２２９）を有する配列番号２（ｈＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２１０〜２２６が、配列ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ（配列番号２３０）を有し、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ）蛋白（配列番号２３２）と称され、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ）ｃＤＮＡ（配列番号２３１）にコードされている、配列番号７２（ｍＯｒａｉ１）の残基２１２〜２２８の相当するアミノ酸配列に突然変異しているｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２を形成した。
【０６５２】
フォワードプライマー配列は：5  '-
GTGTCATAGTAGCCAACCACAGCGACAGCGGCATCACCCCGG-3'//（配列番号２２７）；であり、そして、
リバースプライマー配列は：5  '-
CCGGGGTGATGCCGCTGTCGCTGTGGTTGGCTACTATGACAC-3'（配列番号２２８）であった。
【０６５３】
【化７９】
2013511279.tif 000110
【０６５４】
【化８０】
2013511279.tif 000111
【０６５５】
ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ）蛋白の配列は以下の通りである（ＥＣＬ２ドメインは下線、ＳＰＴＫＰＰＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ（配列番号２３０）配列は二重下線）。
【０６５６】
【化８１】
2013511279.tif 000112
【０６５７】
図１５Ａ〜Ｂによれば、全てのｍＡｂによる結合のためには、それらが全てｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラには結合したがマウスＯｒａｉ１には結合しなかったことから、ヒトＥＣＬ２は十分であることが示された。本発明者等は本発明のｍＡｂがヒト何処でＯｒａｉ１ＥＣＬ２領域に結合するかを確認することを必要とした。これを達成するために、本発明者等はｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラから出発して、ヒトアミノ酸をマウスアミノ酸と、２つの種の間に相違がある場合に置き換えながら、種々の突然変異体を作成した（図１４参照）。この「結合損失」分析において何処で変化が起こっているかを可視化するための好都合な方法を表１１Ａ〜Ｂに示す。ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラは全てのｍＡｂにより結合されるため、ｍＡｂによりもはや結合されない突然変異体は、突然変異体において変化が起こったサブ領域がｍＡｂによる結合において重要な役割を果たしていることを示している。
【０６５８】
表１１Ａ〜ＢはＦＡＣＳにより測定した場合のｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラへのキャンペーン１（表１１Ａ）及びキャンペーン２（表１１Ｂ）のモノクローナル抗体の結合能力の損失を示している。表１１Ａ及び表１１Ｂはそれぞれ図１６Ｂ及び図１６ＤのＰＯＣデータの模式的表示であり、ここでは結合結果は４０％〜１００％の結合ＰＯＣを示す（＋＋＋）、５％〜４０％未満の結合ＰＯＣを示す（＋＋）、１％〜５％未満の結合ＰＯＣを示す（＋）、及びＰＯＣ１％未満の無結合としての（−）として記録する。表１１Ａ〜Ｂの最上部はＥＣＬ２領域のみにおけるヒト及びマウスのＯｒａｉ１蛋白の間のアライメントを示し、ヒトアミノ酸は大文字で示し、マウスＥＣＬ２アミノ酸は小文字で示し、そして下線を付したアミノ酸はヒト及びマウスの蛋白配列の間の相違を示す。キメラコンストラクト（Ｃｈ．）は左側にナンバリングし、mＯｒａｉ１−hＯｒａｉ１ＥＣＬ２を１として始まり、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２をＣｈ．１１とする。Ｃｈ．２から１０は、特定のヒトアミノ酸がそのマウス対応物で置き換えられているｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２突然変異体であり、ここではＥＣＬ２領域における２動物種間の配列の相違がある。表におけるヒトからマウスへのアミノ酸の変化は小文字で表し、そしてダッシュは不変を示す。表１１Ａで「結合」の下には、ヒトｍＡｂ２Ｄ２．１、ｍＡｂ２Ｃ１．１及びｍＡｂ２Ｂ７．１は左行にまとめ、ヒトｍＡｂ２Ｂ４．１は単独で中央の行に、そしてマウスｍＡｂ８４．５及び１３３．４は右の行にまとめる。表１１Ｂで「結合」の下には、キャンペーン１のヒトｍＡｂ２Ｄ２．１は比較のために左行に示し、精製ｍＡｂ５Ｂ１．１及は中央の行に示し、そしてキャンペーン２の精製ｍＡｂの残余はまとめて最も右の行に示す。未染色の対照及びキメラコンストラクトでトランスフェクトした細胞に結合した直接標識二次抗体対照及びｐｃＤＮＡ３．１ベクター対照のＧｅｏ平均は全て低値であり、一緒になって「陰性対照」となっている。ＲＦＩ−ＰＯＣは相対的蛍光強度幾何平均（Ｇｅｏ平均）から計算し、使用するアルゴリズム（アルゴリズムＩＩ、下記）は、キメラを発現している細胞に結合しているｍＡｂのＧｅｏ平均マイナス陰性対照の平均Ｇｅｏ平均をＣｈ．１（ｍＯｒａｉ−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２；配列番号９７）に結合している特定のｍＡｂのＧｅｏ平均で割り、全体の量に１００を掛ける。
【０６５９】
アルゴリズムＩＩ（特定のｍＡｂ及び目的の試料キメラの例として「ｍＡｂ２Ｄ２.１」及び「Ｃｈ．２」を代入するが、後者は別の目的のもので置きかえることができる）：
Ｃｈ．２に結合するｍＡｂ２Ｄ２．１のＲＦＩ−ＰＯＣ＝｛［Ｃｈ．２に結合するｍＡｂ２Ｄ２．１のＧｅｏ平均−陰性対照の平均Ｇｅｏ平均］／Ｃｈ．1に結合するｍＡｂ２Ｄ２．１のＧｅｏ平均｝ｘ１００
【表１１−１】
2013511279.tif 000113
【表１１−２】
2013511279.tif 000114
【０６６０】
図１６Ａはキャンペーン１並びに精製ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４からの組み換えｍＡbによる結合において重要であるＥＣＬ２内部のサブ領域を確認するための「結合損失」実験の生のＧｅｏ平均データを示す。図１６Ｃは比較のためのキャンペーン１の組み換えｍＡｂ２Ｄ２．１と共にキャンペーン２の７種の精製ｍＡｂから得られた同様の結合損失データを示す。  未染色の対照及びキメラコンストラクトでトランスフェクトした細胞に結合した直接標識二次抗体対照及びｐｃＤＮＡ３．１ベクター対照のＧｅｏ平均は全て低値であり、一緒になって「陰性対照」となっている。ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１キメラへのｍＡｂのＧｅｏ平均はｍＡｂに応じて低１００桁〜低１０００桁の範囲の最大結合を示す。他の図からわかるとおり、キャンペーン１の組み換えｍＡｂ２Ｂ４．１の染色は他のｍＡｂと比較して有意に低値であり、そして約３０％となっている。ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２へのｍＡｂ結合のＧｅｏ平均における相違のため、本発明者等は、各試料に関する対象のパーセント（ＰＯＣ）を計算するために、ゼロ値としてのバックグラウンド及び特定のｍＡｂに関して達成可能な最大値としてのｍＡｂに応じたｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２を用いながら対照のパーセント（ＰＯＣ）としてＧｅｏ平均を再プロットする必要があると考えた。図１６Ｂ及び図１６Ｄはそれぞれキャンペーン１ヒト組み換えｍＡｂ、キャンペーン２の精製されたマウスｍＡｂ８４．５及び１３３．４、及び精製されたヒトｍＡｂに関するＰＯＣのプロットを示す。図１６Ｄにおいて、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２の値は１００％に設定するがｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２の値は恐らくはＨＥＫ−２９３細胞中の内因性のヒトＯｒａｉ１発現のためにゼロとはならなかった（例えばSternfeld等、Activation  of  muscarinic  receptors  reduces  store-operated  Ca2+  entry  in  HEK-293  cells,  Cellular  Signalling  19:1457-64(2007);Fasolato等、Store  depletion  triggers  the  calcium  release-activated  calcium  current(ICRAC)  in  macrovascular  endothelial  cells:  a  comparison  with  Jurkat  and  embryonic  kidney  cell  lines,  Pfluegers  Arch.-  Eur.  J.  Physiol.  436(1  ):69-74(1998)）。
【０６６１】
表１１Ａ〜Ｂから明らかにわかるとおり、キャンペーン１の全てのヒト組み換えｍＡｂ、そして同様にキャンペーン２の精製ｍＡｂ８４．５及び１３３．４及び精製されたヒトｍＡｂはキメラＣｈ．２〜Ｃｈ．６への結合を損失しており、配列２のアミノ酸残基２０４〜２１７のサブセットがそれらの結合のために重要であることを示唆している。逆にｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＨＳＤ）（Ｃｈ．１０）に対して観察された結合は全てのｍＡｂによるｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（Ｃｈ．１）への結合に匹敵するものであり、これは配列番号２のアミノ酸２２４〜２２６のサブ領域が結合に関与していないことを示している（図１６Ｂ及び図１６Ｄ及び表１１Ａ〜Ｂ）。ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４に関しては、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＩＶ）（Ｃｈ．９）突然変異体への結合の完全な損失があり、これはキャンペーン１の全ての組み換えｍＡｂ及びキャンペーン２の精製ｍＡｂでは観察されておらず、配列番号２のアミノ酸残基２１９〜２２１のサブ領域がｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４による結合において重要な役割を果たしていることを示している（図１６Ａ及び図１６Ｃ）。キャンペーン１の組み換えｍＡｂ２Ｃ１．１、２Ｄ２．１及び２Ｂ７．１及びキャンペーン２の精製ｍＡｂ５Ｂ１．１のｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ）（Ｃｈ．７）及びｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶ）（Ｃｈ．８）突然変異体への結合はなお一部存在していたが、結合はｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２への結合においてこれらのｍＡｂで観察されたものの僅かの比率であった（Ｃｈ．１；図１６Ｂ及び図１６Ｄ及び表１１Ａ〜Ｂ）。これは配列番号２のアミノ酸残基２１６〜２２１のサブ領域がｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１及びｍＡｂ２Ｂ７．１及びｍＡｂ５Ｂ１．１による結合において何らかの役割を果たしていることを示している。Ｃｈ．７及びＣｈ．８へのｍＡｂ２Ｂ４．１の結合の損失はｍＡｂ２Ｂ４．１の比較的低い結合親和性によるものと考えられる。一方、キャンペーン２の精製ｍＡｂｓ５Ａ１．１、５Ａ４．２、５Ｂ５．２、５Ｃ１．１、５Ｆ２．１及び５Ｆ７．１によるＣｈ．７及びＣｈ．８への結合の損失は、真実であり、そして配列番号２の２１６〜２２１のサブ領域がそれらの結合において重要な役割を果たしていることを反映している（図１６Ｄ及び表１１Ｂ）。ｍＡｂ５Ｂ１．１は弱いがなおｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ）（Ｃｈ．７）及びｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶ）（Ｃｈ．８）に結合しており、これはキャンペーン１のｍＡｂ２Ｂ７．１を連想させるものであった。配列番号２のアミノ酸残基２１８はキャンペーン１の組み換えｍＡｂ及びキャンペーン２の精製ｍＡｂの結合には重要であった（図１２Ａ及び１２Ｂ）。更に又、配列番号２の２１９位〜２２１位のサブセットはｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４の結合のためには重要であるがキャンペーン１の組み換えｍＡｂ及びキャンペーン２の精製ｍＡｂのためにはそうではなかった（表１１Ａ−Ｂ及び図１６Ａ−Ｄ）。従って「結合損失」実験から、本発明者等は配列番号２（ヒトＯｒａｉ１配列）のアミノ酸残基２０４〜２１７のサブセットがキャンペーン１の組み換えｍＡｂ２Ｄ２．１、２Ｃ１．１、２Ｂ７．１及び２Ｂ４．１及び精製されたｍＡｂｓ５Ａ１．１、５Ａ４．２、５Ｂ１．１、５Ｂ５．２、５Ｃ１．１、５Ｆ２．１及び５Ｆ７．１による結合のために重要であり、そして配列番号２のアミノ酸２０４〜２２３のサブセットがｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４の結合のために必須であると結論した。
【０６６２】
「結合損失」実験（図１６Ａ〜Ｄ及び表１１Ａ〜Ｂ）と「結合獲得」実験（図１７Ａ〜Ｄ及び表１０Ａ〜Ｂ）を組み合わせて解釈すると、ＨＥＫ−２９３細胞表面上の突然変異体の不適切な提示が、本発明者等の観察した結果に包含されている可能性を最小限にできる。総括すれば、キャンペーン１のヒト組み換えｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１、ｍＡｂ２Ｂ７．１及びｍＡｂ２Ｂ４．１及びキャンペーン２のヒト精製ｍＡｂ５Ａ１．１、ｍＡｂ５Ａ４．２、ｍＡｂ５Ｂ１．１、ｍＡｂ５Ｂ５．２、ｍＡｂ５Ｃ１．１、ｍＡｂ５Ｆ２．１及びｍＡｂ５Ｆ７．１に関する「結合損失」実験は配列番号２（ヒトＯｒａｉ１）のアミノ酸残基２０４〜２１７が結合のために重要であることを示している。
「結合獲得」実験はそれと整合しており、そしてこれを配列番号２のアミノ酸残基２０７〜２１７のサブセットに絞っている。キャンペーン１及び２のｍＡｂによる結合のフットプリントは同じであるが、精製されたｍＡｂ５Ａ１．１、ｍＡｂ５Ａ４．２、ｍＡｂ５Ｃ１．１、ｍＡｂ５Ｆ２．１及びｍＡｂ５Ｆ７．１はより強力に配列番号２の２１３〜２１７のサブ領域に結合する点において結合の強調度は僅かに異なっていた。キャンペーン１の組み換えｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１、ｍＡｂ２Ｂ７．１及びｍＡｂ２Ｂ４．１及びキャンペーン２の精製ｍＡｂ５Ｂ１．１及び５Ｂ５．２によるヒトＯｒａｉ１への結合は残基２０７〜２１３のサブセットをより強力に強調していた（図１７Ｂ及び１７Ｄ及び表１０Ａ〜Ｂ）。ｍＡｂ２Ｂ４．１による結合は他のキャンペーン１ｍＡｂの僅か約３０％であった（図１６Ａ及び図１７Ａ）。ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４に関する「結合損失」実験は配列番号２のアミノ酸残基２０４〜２２３のサブセットが結合のために重要であることを示していた。ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４に関する「結合獲得」実験の結果は上記結果を裏付けており、そして配列番号２のアミノ酸残基２０７〜２２３のサブセットに更に絞っている。更に又、配列番号２のアミノ酸残基２１８〜２２１のサブセットはｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４による結合のために厳密に重要である（図１２Ａ及び図１７Ａ）。興味深いことに、ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４に対するこの領域の重要性はキャンペーン１の組み換えｍＡｂ及びキャンペーン２の精製ｍＡｂに対しては共有されておらず、そして本発明者等が特性化したヒトＯｒａｉ１チャンネルに対するネズミ及びヒトのｍＡｂの間の差異となっている。
【０６６３】
実施例９    ヒトＯｒａｉ１結合における市販の抗Ｏｒａｉ１抗体の評価
【０６６４】
ＡＭ１−ＣＨＯ親及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ細胞（実施例１参照）を用いながらヒトＯｒａｉ１への数種の市販のポリクローナル抗Ｏｒａｉ１抗体の結合を評価した。表１２は試験したヒトＯｒａｉ１に対する市販の抗体を列挙しており、これらは製造元の製品添付文書によれば、ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ１およびＥＣＬ２ドメインに由来する種々のペプチドに対して育成されている。抗体はウサギ又はヤギにおいて育成されたポリクローナル抗体であり、何れもモノクローナル抗体ではない。図１８に示した結果によれば、市販抗体の結合は本明細書に記載したＦＡＣＳ結合アッセイにおいてはヒトＯｒａｉ１を発現しているＡＭ１／ＣＨＯを用いた場合には「検出不能」と思われた。
【０６６５】
細胞は１回氷冷１ｘＰＢＳで洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（１ｘＤ−ＰＢＳ＋２％ヤギ血清）中に再懸濁し、そして１００μＬ中２ｘ１０５個の細胞を抗体組み合わせ当たり染色した。全抗体のインキュベーション工程を１時間氷上で実施した。細胞は先ず１μｇの未標識のマウス抗ｈＯｒａｉ１（ｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４）又はヒト抗ｈＯｒａｉ１（ｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｂ７．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１、又はｍＡｂ２Ｂ４．１）モノクローナル抗体、又は表１２に示すそれぞれの市販のヤギ又はウサギのポリクローナル抗体と共にインキュベートし、その後２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。次に試験する抗体の哺乳類原料に応じて適宜、［”Ｇｔ”］Ｆ（ａｂ’）２抗マウス［”Ｍｕ”］ＩｇＧ−ＦＩＴＣ、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒト［”Ｈｕ”］ＩｇＧ−ＦＩＴＣ、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ウサギ［”Ｒｂ”］ＩｇＧ−ＦＩＴＣ、又はウサギＦ（ａｂ’）２抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣを用いて未標識抗体を検出し、その後、２００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後にフローサイトメトリー分析に付した。未染色の細胞及び検出抗体で染色した細胞を陰性対照として使用した。蛍光の相対レベルの値はＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓ（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて計算し、そして平均値は対数変換データを用いて計算した（幾何平均）。結果による結合の比較は図１８に示す通りであり、これによれば、陰性対照と比較した場合、市販抗体の何れによってもＡＭ１／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ細胞表面上に発現されたヒトＯｒａｉ１への検出可能な結合は無かったのに対し、本発明のｍＡｂはＡＭ１／ＣＨＯ細胞の表面上に発現されたヒトＯｒａｉ１に強力に結合した。
【表１２】
2013511279.tif 000115
【０６６６】
実施例１０    ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２及びｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ突然変異体に結合する場合の市販の抗Ｏｒａｉ１ポリクローナル抗体の更なる特性化
【０６６７】
本明細書に記載した「結合損失」及び「結合獲得」実験は配列番号２のアミノ酸残基２０４〜２１７のサブセットがそれぞれキャンペーン１及びキャンペーン２により形成されたヒト組み換え及び精製ｍＡｂによる結合のために必須であり（図１６Ａ〜Ｄ、表１１Ａ〜Ｂ、図１７Ａ〜Ｄ、表１０Ａ〜Ｂ）、そして、配列番号２のアミノ酸２０４〜２２３のサブセットがｍＡｂ８４．５及びｍＡｂ１３３．４の結合のために重要である（図１６Ａ〜Ｄおよび表１０Ａ及び１１Ａ）ことを示していた。従って本発明者等は、市販の抗ｈＯｒａｉ１抗体（実施例９の表１２参照）を、本発明のｍＡｂの実施形態により「結合損失」及び「結合獲得」実験において上記した通り、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ突然変異体（Ｃｈ．２〜Ｃｈ．１１）（表１０Ａ〜Ｂ）、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２及びｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ突然変異体（Ｃｈ．２〜Ｃｈ．１１）（表１１Ａ〜Ｂ）（実施例８参照）に結合するそれらの能力に関して検査した。表1２（本明細書の実施例９）は試験したヒトＯｒａｉ１に対する市販の抗体を列挙しており、これは製造元の製品添付文書によればｈＯｒａｉ１ＥＣＬ１及びＥＣＬ２ドメイン由来の種々のペプチドから育成されている。抗体はウサギ又はヤギにおいて育成されたポリクローナル抗体であり、何れもモノクローナル抗体ではない。図２２Ａ〜Ｂに示した結果によれば、市販抗体の結合は本明細書に記載したＦＡＣＳ結合アッセイにおいてはｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ突然変異体（Ｃｈ．２〜Ｃｈ．１１）及びｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２又はｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ突然変異体（Ｃｈ．２〜Ｃｈ．１１）発現している２９３ＥＢＮＡを用いた場合には「検出不能」と思われたのに対し、本発明のｍＡｂ２Ｄ２．１はｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（配列番号９７）、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡＳＧＡＡ）（Ｃｈ．２；配列番号２１０）、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＫＱＰＧＱＰＲＰＴＳＫＰＰＡ）（Ｃｈ．３；配列番号２０４）、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＡＡＳＧＡＡ）（Ｃｈ．４；配列番号１９２）、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＲＰＴＳＫＰＰＡ）（Ｃｈ．５；配列番号１２９）、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＶＩＶ）（Ｃｈ．９；配列番号１３７）又はｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＨＳＤ）（Ｃｈ．１０；配列番号１４５）に強力に結合し、そして低比率のｍＡｂ２Ｄ２．１によるｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＳＫＰＰＡ）（Ｃｈ．６；配列番号１０３）、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶＡＮＨＳＤ）（Ｃｈ．７；配列番号２２２）又はｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２（ＡＥＳＶＩＶ）（Ｃｈ．８；配列番号１４１）への結合があり、これは図１６Ａ〜Ｄ及び図１７Ａ〜Ｄで観察されたものと整合していた。方法は以下において更に記載する。
【０６６８】
ＦＡＣＳ結合分析のための一過性の発現。トランスフェクションの１日前に、２９３ＥＢＮＡ細胞を１００ｍｍの組織培養ディッシュ上の１０ｍＬの生育培地中に３．５ｘ１０６個／ディッシュの細胞密度でプレーティングした。１枚の１００ｍｍディッシュにつき１０μｇのＤＮＡを４６０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈し、穏やかに混合し、そして５分間室温でインキュベートした。次に４０μＬのＦｕＧｅｎｅＨＤトランスフェクション試薬を混合物に添加し、穏やかに混合し、そして２０分間室温でインキュベートした。トランスフェクション混合物を細胞に滴下し、そしてディッシュを穏やかに攪拌して複合体の均一な分布を確保した。
【０６６９】
ＦＡＣＳ結合分析。トランスフェクトされた２９３ＥＢＮＡ細胞は一過性にｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ突然変異体、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２又はｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ突然変異体を発現した。トランスフェクトされた細胞はトランスフェクション後４８時間に採取した。ｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクトした細胞を陰性対照として使用した。細胞は１回氷冷１ｘＰＢＳで洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（１ｘＤ−ＰＢＳ＋２％ヤギ血清）中に再懸濁し、そして１００μＬ中２ｘ１０５個の細胞を抗体組み合わせ当たり染色した。全抗体のインキュベーション工程を１時間氷上で実施した。細胞は先ず１μｇのヒトＯｒａｉ１に対する市販の抗体と共にインキュベートし、その後２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。次に未標識抗体を試験する抗体の哺乳類原料に応じて適宜、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ウサギ［”Ｒｂ”］ＩｇＧ−ＦＩＴＣ又はウサギＦ（ａｂ’）２抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣを用いて検出し、その後、２００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後にフローサイトメトリー分析に付した。未標識のヒト抗ヒチモノクローナル抗体（ｍＡｂ２Ｄ２．１）で染色され、そしてヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒト［”Ｈｕ”］ＩｇＧ−ＦＩＴＣで検出された細胞を陽性対照として使用した。未染色の細胞及び検出抗体で染色した細胞を陰性対照として使用した。蛍光の相対レベルの値はＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓ（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて計算し、そして平均値は対数変換データを用いて計算した（幾何平均）。結果から結合を比較したものを図２２Ａ〜Ｂに示すが、これによれば、陰性対照と比較した場合に、市販抗体の何れによってもｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２、ｈＯｒａｉ１−ｍＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ突然変異体（Ｃｈ．２〜Ｃｈ．１１）、ｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２及びｍＯｒａｉ１−ｈＯｒａｉ１ＥＣＬ２キメラ突然変異体（Ｃｈ．２〜Ｃｈ．１１）を発現する２９３ＥＢＮＡ細胞の表面上に発現されるヒトＯｒａｉ１への検出可能な結合は無かった。
【０６７０】
実施例１１    ウエスタン分析によるｈＯｒａｉ１蛋白を検出する場合の市販抗Ｏｒａｉ１ポリクローナル抗体の評価
【０６７１】
本発明者等は更に市販の抗ｈＯｒａｉ１抗体（実施例９の表１２参照）が
ｈＯｒａｉ１蛋白を検出する能力を、ウエスタン分析により、ネイティブ、還元及び非還元条件下に、２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３、  Ｊｕｒｋａｔ、ＡＭ１／ＣＨＯ及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１細胞溶解物を用いて評価した。
【０６７２】
全細胞溶解物の調製。ＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３、Ｊｕｒｋａｔ、ＡＭ１／ＣＨＯ及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１細胞を採取し氷冷１ｘＰＢＳで２回濯ぎ、次にＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を含有する細胞溶解緩衝液(1%  ＴｒｉｔｏｎＸ・１００、０．１ＭＮａＣｌ、０．０５ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＮａ３ＶＯ４）中に可溶化した。沈殿物を４℃で１５分間１４、０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを−８０℃で保存した。
【０６７３】
ｈＯｒａｉ１蛋白の検出における市販ポリクローナル抗体のウエスタン分析。ｈＯｒａｉ１のネイティブのコンホーメーションを検出するために、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮａｔｉｖｅＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓａｍｐｌｅ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３、Ｊｕｒｋａｔ、ＡＭ１／ＣＨＯ及びＡＭ１／ｈＯｒａｉの各々の細胞溶解物約５μｇをＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の４〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を通した電気泳動で分離し、そしてニトロセルロースフィルター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。変性したｈＯｒａｉ１蛋白を検出するために、非還元又は還元（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）条件下、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３、Ｊｕｒｋａｔ、ＡＭ１／ＣＨＯ及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１の各々の細胞溶解物約５μｇをＮｏｖｅｘ（登録商標）  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の４〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を通した電気泳動で分離し、ニトロセルロースフィルター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。イムノブロットをＡｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ又はＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓより入手したウサギ抗ｈＯｒａｉ１ポリクローナル抗体の１：５００希釈物中、又はＥｖｅｒｅｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄより入手したヤギ抗ｈＯｒａｉ１抗体の１：５００希釈物中、又はＮｅｗＥａｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより入手したウサギ抗ｈＯｒａｉ１ポリクローナル抗体の１：２０００希釈物中でインキュベートし、その後、セイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ又はウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：２０、０００希釈物中、又はセイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗ヤギＩｇＧ又はウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：２０、０００希釈物中でインキュベートした。増強ルミネセンス系（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、入手元Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて蛋白を可視化した。
【０６７４】
図２３Ａ〜Ｅは市販抗体の全てがネイティブコンホーメーションにおいてｈＯｒａｉ１蛋白を検出できなかったことを示している。イムノブロットを還元及び非還元条件下に実施したところ、ｈＯｒａｉ１のグリコシル化型に関する予測される大きさに相当する約４８ｋＤａの１つの免疫反応性の物質種は、ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３中のＮｅｗ  Ｅａｓｔ  Ｏｒａｉ１−Ｌ１及びＮｅｗ  Ｅａｓｔ  Ｏｒａｉ１−Ｌ２抗体（図２４Ｄ−Ｅ）及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１細胞溶解物では検出されたがＡｌｏｍｏｎｅ−Ｏｒａｉ１−Ｌ２、Ｅｎｚｏ−Ｏｒａｉ１−Ｌ２及びＥｖｅｒｅｓｔ−Ｏｒａｉ１−Ｌ２抗体によっては検出されなかった（図２４Ａ〜Ｃ）。ＡＭ１／ＣＨＯ細胞は内因性ｈＯｒａｉ１を発現せず、約３３ｋＤａのバンドは全ての市販の抗体により検出され（図２４Ａ〜Ｅ）、ＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３、Ｊｕｒｋａｔ、ＡＭ１／ＣＨＯ及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１細胞溶解物に渡って３３ｋＤａで観察された免疫反応性の物質種は非特異的バンドであることを示していた（図２４Ａ〜Ｅ）。
【０６７５】
実施例１２    ウエスタン分析によるｈＯｒａｉ１蛋白の検出における組み換えヒト抗ｈＯｒａｉ１モノクローナル抗体の評価
【０６７６】
本発明者等はキャンペーン１及びキャンペーン２で形成された組み換えヒト抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂがｈＯｒａｉ１蛋白を検出する能力を、ＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３、Ｊｕｒｋａｔ、ＡＭ１／ＣＨＯ及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１細胞溶解物を用いながらネイティブ、還元及び非還元の条件下、ウエスタン分析により評価することにより、実施例９の表１２に列挙した市販抗体と比較した（比較、本発明の実施例１１）。
【０６７７】
全細胞溶解物の調製。ＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３、Ｊｕｒｋａｔ、ＡＭ１／ＣＨＯ及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１細胞を採取し氷冷１ｘＰＢＳで２回濯ぎ、次にＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を含有する細胞溶解緩衝液(1%  ＴｒｉｔｏｎＸ・１００、０．１ＭＮａＣｌ、０．０５ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＮａ３ＶＯ４）中に可溶化した。沈殿物を４℃で１５分間１４、０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを−８０℃で保存した。
【０６７８】
ｈＯｒａｉ１蛋白の検出における組み換え抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂのウエスタン分析。ｈＯｒａｉ１のネイティブのコンホーメーションを検出するために、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮａｔｉｖｅＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｓａｍｐｌｅ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３、Ｊｕｒｋａｔ、ＡＭ１／ＣＨＯ及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ1の各々の細胞溶解物約５μｇをＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の４〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を通した電気泳動で分離し、そしてニトロセルロースフィルター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。変性したｈＯｒａｉ１蛋白を検出するために、非還元又は還元（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）条件下、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３、Ｊｕｒｋａｔ、ＡＭ１／ＣＨＯ及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１の各々の細胞溶解物約５μｇをＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の４〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を通した電気泳動で分離し、ニトロセルロースフィルター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。イムノブロットをｍＡｂ２Ｂ７．１、ｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１又はｍＡｂ５Ｆ７．１の１：２０００希釈物中でインキュベートし、その後、セイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：２０、０００希釈物中でインキュベートした。増強ルミネセンス系（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、入手元Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて蛋白を可視化した。
【０６７９】
代表的な結果はｈＯｒａｉ１のオリゴマーに相当する約１９２ｋＤａの免疫反応性の物質種をＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３中のｍＡｂ２Ｂ７．１、ｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１及びｍＡｂ５Ｆ７．１及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１細胞溶解物により検出したことを示す図２５Ａ〜Ｄに示す通りであり、これはネイティブのコンホーメーションにおけるｈＯｒａｉ１を検出する本発明のヒト抗ｈＯｒａｉ１抗体の能力を示しており、これは本明細書に記載したＦＡＣＳ結合結果に観察されるものと合致する。その後、組み換え抗ｈＯｒａｉ１抗体のｈＯｒａｉ１を識別する能力を還元及び非還元条件下に評価した。代表的結果は図２６Ａ〜Ｄに示す通りであり、これによればｈＯｒａｉ１のグリコシル化型の予測される大きさに相当する約４８ｋＤａの免疫反応性の物質種がＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３中のｍＡｂ２Ｂ７．１、ｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ２．１及びｍＡｂ５Ｆ７．１及びＡＭ１／ｈＯｒａｉ１細胞溶解物により検出された。組み換え抗ｈＯｒａｉ１抗体は又、それぞれ未グリコシル化ｈＯｒａｉ１及びオリゴマーｈＯｒａｉ１の蛋白に相当する約３３ｋＤａ及び９６ｋＤａにおいて２つのバンドを示していた（図２６Ａ〜Ｄ）。
【０６８０】
実施例１３    本発明の抗体によるサイトカイン放出の阻害
【０６８１】
ヒト全血アッセイよりサイトカイン放出の強力な阻害についてキャンペーン２で識別された１４種のｍＡｂのうち、それらの相当する重鎖及び軽鎖の抗体配列の分析によれば、ｍＡｂ５Ｆ７．１、ｍＡｂ５Ｈ３．１、ｍＡｂ５Ｆ２．１、ｍＡｂ５Ｂ１．１、ｍＡｂ５Ｂ５．１、ｍＡｂ５Ａ４．２及びｍＡｂ５Ｄ７．２と称される７種のユニークなモノクローナル抗体が存在することが示された。組み換え抗体によるヒトＯｒａｉ１への結合は本明細書に記載したＦＡＣＳ法により評価した。組み換えモノクローナル抗体を一過性にＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞中で発現し、精製し、そして上記した実施例４に記載した方法により特性化した。組み換えｍＡｂは先ずＡＭ１／ＣＨＯ細胞の表面上に発現されたヒトＯｒａｉ１へのその特異的結合を確認するために評価した。図２７によれば、親ＣＨＯへのｍＡｂ５Ｆ７．１、ｍＡｂ５Ｈ３．１、ｍＡｂ５Ｆ２．１、ｍＡｂ５Ｂ１．１、ｍＡｂ５Ｂ５．１、ｍＡｂ５Ａ４．２及びｍＡｂ５Ｄ７．２の結合は無視できる程度であり、未染色の対照、直接標識された二次試薬単独染色対照及びアイソタイプ対照ｍＡｂＤＮＰ−３Ａ４−Ｆ−Ｇ２（Ｗａｌｋｅｒ等が国際特許出願ＷＯ２０１０／１０８１５３Ａ２の実施例１２に記載したヒト抗ＤＮＰ抗体）に匹敵する低い相対蛍光強度幾何平均（ｇｅｏ平均）値を有していた。ＡＭ１／ｈＯｒａｉ１に関するｇｅｏ平均値は又、未染色対照、二次試薬単独及びアイソタイプ対照に関しても低値であった。しかしながらｍＡｂ５Ｆ７．１、ｍＡｂ５Ｈ３．１、ｍＡｂ５Ｆ２．１、ｍＡｂ５Ｂ１．１、ｍＡｂ５Ｂ５．１、ｍＡｂ５Ａ４．２及びｍＡｂ５Ｄ７．２に関するｇｅｏ平均の値の大きな上昇により示されるとおり、有意な特異的結合が存在し、これはキャンペーン１の組み換えｍＡｂ２Ｃ１．１の結合に匹敵するものであった。
【０６８２】
組み換えｍＡｂがヒト全血アッセイよりサイトカイン放出をブロックする能力を種々の濃度において評価した。これらのｍＡｂはヒト全血アッセイ系においてＩＬ−２及びＩＦＮ−γの両方の放出を用量依存的に阻害した。
【０６８３】
表１３（下記）はタプシガルギン処理されたヒト全血からのＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマの分泌をブロックする場合の組み換えｍＡｂ５Ｆ７．１、５Ｈ３．１、５Ｆ２．１、５Ｂ１．１、５Ｂ５．１、５Ａ４．２及び５Ｄ７．２の半最大抑制濃度（ＩＣ５０）を示す。表８Ｂ（本明細書の上記実施例４）の精製ｍＡｂのＩＣ５０を表１３の組み換えｍＡｂのＩＣ５０と比較すると、ヒト全血アッセイからのサイトカイン放出の阻害においては効力が同等程度であることがわかった。一方、予測された通り、アイソタイプ対照ｍＡｂＤＮＰ−３Ａ４−Ｆ−Ｇ２（Ｗａｌｋｅｒ等が国際特許出願ＷＯ２０１０／１０８１５３Ａ２の実施例１２に記載したヒト抗ＤＮＰ抗体）では阻害は観察されなかった。
【表１３】
2013511279.tif 000116
【０６８４】
実施例１４    ヒト抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂの結合特異性の評価
【０６８５】
ｃｙｎｏＯｒａｉの分子クローニング。  以下のｃＤＮＡ配列：
【０６８６】
【化８２】
2013511279.tif 000117
によりコードされるカニクイザルＯｒａｉ１（ｃｙｎｏＯｒａｉ１；配列番号３０６）を哺乳類細胞における発現のためにｐｃＤＮＡ３．１／ネオマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）内にクローニングした。
【０６８７】
カニクイザルＯＲＡＩ１（ｃｙｎｏＯｒａｉ１)を標準的ＰＣＲ技術を用いて構築した。要すれば、下記に示す配列（配列番号３０７〜３１０）を有するプライマーを２パート（パートＡ及びＢ）ＰＣＲ法において鋳型としてＢｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｃ．のカニクイザル骨格菌ｃＤＮＡを用いながら使用した。
【０６８８】
パートＡのフォワードプライマーは:  5  '-GATGCATCCGGAGCCCGC-3'（配列番号３０７）;であり、そして、
パートＢのリバースプライマーは：5  '-GCTCGTTGAGCTCCTGGAAC-3'（配列番号３０８）であった。
【０６８９】
パートＢのフォワードプライマーは5'  -CCTCAACGAGCACTCCATGCAGG-3'（配列番号３０９）であり、そして、
パートＡのリバースプライマーは：5  '-CTCTTAGAGGACAGTTTCAAAGTG-3'（配列番号３１０）であった。
【０６９０】
得られたパートＡの８４１ｂｐＰＣＲ産物及びパートＢの８９０ｂｐＰＣＲ産物を次に精製し、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングした。
【０６９１】
次に、以下の配列（配列番号３０８、３０９、３１１、３１２）を有するプライマーを２パート（パートＣ及びＤ）ＰＣＲ法において、鋳型としてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクター中のパートＡ及びパートＢの産物を用いながら使用しながら使用した。
【０６９２】
パートＣのフォワードプライマーは：
5'-
GAAGCTTTGAACCACCATGCATCCGGAGCCCGCCCCGCCCCCGAGCCGC
AG-3'（配列番号３１１）であり；そして、
パートＣのリバースプライマーは：5  '-GCTCGTTGAGCTCCTGGAAC-3'（配列番号３０８）であった。
【０６９３】
パートＤのフォワードプライマーは：
5'-CCTCAACGAGCACTCCATGCAGG  -3'（配列番号３０９）であり；そして、
パートＣのリバースプライマーは：
5'GCGGCCGCCTAGGCATAGTGGCTGCC  3'（配列番号３１２）であった。
【０６９４】
得られたパートＣの８５７ｂｐのＰＣＲ産物及びパートＤの７７１ｂｐ産物を次に精製し、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングした。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ中のパートＣの８５７ｂｐのＰＣＲ産物ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩ制限酵素で消化してｃｙｎｏＯｒａｉ１コンストラクトの５’フラグメントを構成し、そしてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ中のパートＤの７７１ｂｐのＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化してｃｙｎｏＯｒａｉ１コンストラクトの３’フラグメントを構成する。ｐｃＤＮＡ３．１/ネオマイシン発現ベクターをHindlII  and  NotI制限酵素で消化した。消化したＰＣＲ産物及びベクターをライゲーションしてｐｃＤＮＡ３．１/ネオマイシン-cynoＯｒａｉ１を作成した。インサートを配列決定したところ、ｃｙｎｏＯｒａｉ１ｃＤＮＡコーディング配列（配列番号３０５、コードしている配列はｃｙｎｏＯｒａｉ１蛋白配列である配列番号３０６）：
【０６９５】
【化８３】
2013511279.tif 000118
と１００％同一であると決定された。
【０６９６】
ヒトＯｒａｉ１の１塩基置換多形変異体Ｎ２２３Ｓの作成。ヒトＯｒａｉ１（Ｎ２２３Ｓ）変異体蛋白（配列番号３１７）を形成するために、以下に示す２つのオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３１４及び配列番号３１５）を部位指向性突然変異誘発ＰＣＲ反応において、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いながら、製造元の推奨する全てのＰＣＲ増幅条件と共に使用した。
フォワードプライマー：
5'-  GGCGCAGCAGCCAGCGTCAGCACCＡ-3'（配列番号３１４）及び、
リバースプライマー：
5'-  TGGTGCTGACGCTGGCTGCTGCGCC-3'（配列番号３１５）。
【０６９７】
部位指向性突然変異誘発のために使用した鋳型は完全長ヒトＯｒａｉ１野生型コンストラクト（配列番号１）であり、これは以前にｏｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン内にクローニングされており、そして得られたコンストラクトをｈＯｒａｉ１（Ｎ２２３Ｓ）ｃＤＮＡと称した（配列番号３１６；ｈＯｒａｉ１（Ｎ２２３Ｓ）蛋白（配列番号３１７）をコード）。インサートを配列決定したところ、ｈＯｒａｉ１（Ｎ２２３Ｓ）ｃＤＮＡコーディング配列（配列番号３１６）：
【０６９８】
【化８４】
2013511279.tif 000119
【０６９９】
【化８５】
2013511279.tif 000120
に１００％同一であることが決定された。
【０７００】
ＦＡＣＳ結合分析のための一過性の発現。トランスフェクションの１日前に、２９３ＥＢＮＡ細胞を１００ｍｍの組織培養ディッシュ上の１０ｍＬの生育培地中に３．５ｘ１０６個／ディッシュの細胞密度でプレーティングした。１枚の１００ｍｍディッシュにつき１０μｇのＤＮＡを４６０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈し、穏やかに混合し、そして５分間室温でインキュベートした。次に４０μＬのＦｕＧｅｎｅＨＤトランスフェクション試薬を混合物に添加し、穏やかに混合し、そして２０分間室温でインキュベートした。トランスフェクション混合物を細胞に滴下し、そしてディッシュを穏やかに攪拌して複合体の均一な分布を確保した。
【０７０１】
ＦＡＣＳ結合分析。トランスフェクトされた２９３ＥＢＮＡ細胞は一過性に
Cyno  Ｏｒａｉ１（図２０に示す結合の結果図20)又はｈＯｒａｉ１(N223S)（図２１に示す結合の結果）を発現した。トランスフェクトされた細胞はトランスフェクション後４８時間に採取した。ｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクトした細胞を陰性対照として使用した。細胞は１回氷冷１ｘＰＢＳで洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（１ｘＤ−ＰＢＳ＋２％ヤギ血清）中に再懸濁し、そして１００μＬ中２ｘ１０５個の細胞を抗体組み合わせ当たり染色した。全抗体のインキュベーション工程を１時間氷上で実施した。細胞は先ず２μｇの未標識ヒト抗ｈＯｒａｉ１モノクローナル抗体と共にインキュベートし、その後２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。次に未標識抗体をヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧフィコエリスリン（ＩｇＧ−ＰＥ）を用いて検出し、その後、２００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後にフローサイトメトリー分析に付した。未染色の細胞、検出抗体で染色した細胞及びアイソタイプ対照抗体で染色した細胞を陰性対照として使用した。蛍光の相対レベルの値はＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓ（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて計算し、そして平均値は対数変換データを用いて計算した（幾何平均）。
【０７０２】
組み換えｍＡｂがｃｙｎｏＯｒａｉ１蛋白に結合する能力を評価した。図２０は本発明の抗Ｏｒａｉ１ｍＡｂの実施形態によるヒトＯｒａｉ１の強力な染色があったことを示しており、これは対照ベクタートランスフェクト親細胞では観察されていない。アイソタイプ対照抗体（抗−ＤＮＰ−３Ａ４−Ｆ）、未染色対照及び直接標識二次抗体フラグメント陰性染色対照と比較して、大部分のｍＡｂ（ｍＡｂ２Ｂ４．１を除く）に関してベクター単独トランスフェクトＨＥＫ−２９３対照（２９３ＥＢＮＡ／ｐｃＤＮＡ３．１）を用いた場合に僅かに高値の染色が観察された。これは恐らくはＨＥＫ−２９３細胞に存在することが知られている内因性に発現されたヒトＯｒａｉ１を大部分のｍＡｂが認識していたことを示している（例えばSternfeld等、Activation  of  muscarinic  receptors  reduces  store-operated  Ca2+  entry  in  HEK-293  cells,  Cellular  Signalling  19:1457-64(2007);Fasolato等、Store  depletion  triggers  the  calcium  release-activated  calcium  current(ICRAC)  in  macrovascular  endothelial  cells:  a  comparison  with  Jurkat  and  embryonic  kidney  cell  lines,  Pfluegers  Arch.-  Eur.  J.  Physiol.  436(1):69-74(1998)）。
【０７０３】
ヒトＯｒａｉ１はＥＣＬ２ドメインに所在するｈＯｒａｉ１（配列番号３１６〜３１７）の２２３位におけるアスパラギンからセリンへの置換をコードする一塩基多形（ＳＮＰ）を有する（ＮＣＢＩのＳＮＰデータベース参照、ｒｓ７５６０３７３７）。組み換えｍＡｂがヒトＯｒａｉ１蛋白の（Ｎ２２３Ｓ）変異体に結合する能力を評価した。図２１は本発明の抗Ｏｒａｉ１ｍＡｂの実施形態がヒトＯｒａｉ１ＳＮＰ変異体に結合したが、対照ベクタートランスフェクト親細胞を認識しなかったことを示している。ここでも又、アイソタイプ対照抗体、未染色抗体及び直接標識二次抗体フラグメント陰性染色対照よりも、ｍＡｂ２Ｂ４．１を除く大部分のｍＡｂに関してベクター単独トランスフェクトＨＥＫ−２９３対照（２９３ＥＢＮＡ／ｐｃＤＮＡ３．１）を用いた場合に低値の染色が観察され、これは恐らくはＨＥＫ−２９３細胞に存在することが知られている内因性に発現されたヒトＯｒａｉ１を大部分のｍＡｂが認識していたことを示している（例えばSternfeld等、Activation  of  muscarinic  receptors  reduces  store-operated  Ca2+  entry  in  HEK-293  cells,  Cellular  Signalling  19:1457-64(2007);Fasolato等、Store  depletion  triggers  the  calcium  release-activated  calcium  current(ICRAC)  in  macrovascular  endothelial  cells:  a  comparison  with  Jurkat  and  embryonic  kidney  cell  lines,  Pfluegers  Arch.-  Eur.  J.  Physiol.  436(1):69-74(1998)）。
【０７０４】
実施例１５    ｈＯｒａｉ１へのヒト抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂの結合親和性の評価
【０７０５】
組み換え抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂを、安定な細胞系統ＡＭ１−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ上に発現されるネイティブのヒトＯｒａｉ１へのそれらの親和性に関して評価した。
【０７０６】
ＦＡＣＳのＫｄ計測のための平衡セットアップ。抗体を力価測定し、そして、２つの異なる一定細胞濃度、即ち１つはウェル当たり１０Ｋ個、もう１つはウェル当たり４００Ｋ個の細胞でインキュベートする２つの平衡セットをセットアップした。ウェルあたり６０μＬの最終容量において４つの２連の列に１０ウェルに対して１：４で２００ｎＭから９６ウェルＶ底プレート全体に渡って０．０５％アジ化ナトリウムと共に細胞培地中、抗体を力価検定した。細胞解離溶液を用いて細胞を解離させ、氷冷１ｘＰＢＳで２回洗浄し、ヘモサイトメーターを用いて計数した。検定された抗体溶液の入ったＶ底プレートの上２列に、ウェル当たり１０Ｋ個の細胞を０．０５％アジ化ナトリウムを含有する培地６０μＬ中で添加した。検定された抗体溶液の入ったＶ底プレートの次の２列には、ウェル当たり４００Ｋ個の細胞を０．０５％アジ化ナトリウムを含有する培地６０μＬ中で添加した。プレートをパラフィルムで密封して一夜３７℃で振とう培養した。
【０７０７】
ＦＡＣＳ分析。平衡プレートを３分間５００ｇで遠心分離し、そして細胞ペレットを氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（１ｘＤ−ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）２００μＬで２回洗浄した。次に細胞を暗所氷上１時間、５μｇ／ｍｌでウェル当たり１００μＬの二次抗体、ヤギ抗ヒトＦｃＣｙ５と共にインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を２００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後フローサイトメトリー分析に付した。生細胞集団上にゲーティングされたＧｅｏ平均値は結合［Ａｂ］を計測する。平衡溶液中の理論的遊離［Ａｇ］を繁栄するＧｅｏ平均の逆数を次に計算する。Ｇｅｏ平均読み取り値の逆数をＫｉｎＥｘＡ（登録商標）Ｐｒｏソフトウエア中で使用することにより各抗体の分析及びＫｄ計算を行った。遊離の［Ａｇ］の計測値を検定成分の開始濃度に対してプロットし、そして２つの異なる細胞濃度におけるこれらのプロットからＫｉｎＥｘＡ  Ｐｒｏソフトウエアにおけるｎ−曲線分析を用いた曲線フィッティングからＫｄを求める。９５％信頼区間はＫｄ低値及びＫｄ高値として得られる。表１４（下記）に示されるものは、ＦＡＣＳのＫｄ計測により求められる本発明のｍＡｂの平衡解離定数（Ｋｄ）の値である。これらの抗体はｈＯｒａｉ１への低ナノモル〜ピコモル濃度範囲の結合におけるＫｄを示していた。予測されたとおり最低の結合親和性はブロッキングｍＡｂではないｍＡｂ２Ｂ４．１に関して観察された。
【表１４】
2013511279.tif 000121
【０７０８】
ＫｉｎＥｘＡ親和性計測のための平衡セットアップ。ＦＡＣＳＫｄ計測（上記参照）の結果に基づいて、４つの代表的な組み換え抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂを選択して、更にＫｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＫｉｎＥｘＡ）による速度論的親和性評価に付し、そこで、抗体と細胞表面発現抗原との間に平衡が達成された後に溶液中に残存する遊離の抗体の濃度からＫｄを求めた。より高度なＫｉｎＥｘＡアッセイによれば、上記したＦＡＣＳ系アッセイシステムよりも結合親和性のより高感度な測定が可能となる。Rathanaswami等（２００８）のＫｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ法を用いた（Rathanaswami等、High  affinity  binding  measurements  of  antibodies  to  cell-surface-expressed  antigens,  Analytical  Biochemistry  373:52-60(2008）、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。要すれば、細胞を力価測定し、そして、２つの異なる一定抗体濃度、即ち１つは２０ｐＭ、もう１つは５００ｐＭでインキュベートする２つの異なる平衡セットをセットアップした。細胞解離溶液を用いて細胞を解離させ、氷冷１ｘＰＢＳで２回洗浄し、ヘモサイトメーターを用いて計数した。細胞検定液及び抗体溶液は０．０５％アジ化ナトリウムを含有する培地中にセットアップした。細胞はミリリットル当たり２又は４百万の濃度から、１：３で、１０点につき、１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ試験管中で検定した。低［Ａｂ］平衡セットについては７ｍｌの４０ｐＭＡｂを最終細胞及びＡｂ濃度を二分の一希釈した各細胞検定溶液７ｍＬと混合した。高［Ａｂ］平衡セットについては７５０μＬの１ｎＭＡｂを最終細胞及びＡｂ濃度を二分の一希釈した各細胞検定溶液７５０μＬと混合した。各平衡セットにつき、ブランクの細胞倍地単独試料及び細胞無添加試料をレファレンス点として包含させた。平衡セットは振とうしながら３７℃で４８時間インキュベートした。
【０７０９】
ＫｉｎＥｘＡ分析のための平衡試料調製。浸透しながら３７℃で平衡セットを４８時間インキュベートした後、５分間５００Ｇで遠心分離することにより細胞ペレットから上澄みを分離した。遠心分離の前に、各試験管に、約１００万個の未トランスフェクトＣＨＯ−ＡＭ１Ｄフィラー脚棒を添加することにより細胞のより効率的なペレット化を確保した。試料の低［Ａｂ］平衡セットを次に室温で１時間真空チャンバーを用いて脱気した。高  ［Ａｂ］及び低［Ａｂ］平衡セットの両方の上澄みを次にＫｉｎＥｘＡ３２００機を用いて試行した。
【０７１０】
ＫｉｎＥｘＡ分析。各平衡試料セットをＫｉｎＥｘＡ機上で３連で読み取った。低［Ａｂ］平衡試料については４ｍＬを３連で各試料のランを行った。高［Ａｂ］平衡試料については３００μＬを３連で各試料のランを行った。ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート粒子ビーズをＧｔ抗ヒトＦｃＡｂでコーティング市、そしてその後、ブロッキング溶液（１ｘＰＢＳｐＨ７．４＋１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ＋０．０５％アジ化ナトリウム）でブロックした。各平衡試料につき、遊離の［Ａｂ］は先ずコーティングビーズをフローセル通過させることにより検出し、次にランニング緩衝液（１ｘＰＢＳｐＨ７．４＋１％ＢＳＡ＋０．０５％アジ化ナトリウム）で短時間洗浄後、平衡試料をビーズ通過させ、その後ランニング緩衝液で短時間洗浄した。次に二次検出Ａｂ、Ｇｔ抗Ｈｕ（Ｈ＋Ｌ）Ｃｙ５を１μｇ／ｍＬ及びラン当たり１０００μＬでフローセル通過させてランした。次にＫｉｎＥｘＡ電圧アウトプットシグナルをＫｉｎＥｘＡソフトウエアにおいて使用し、各抗体に関するＫｄ値を計算した。２つの異なる所期全［Ａｂ］濃度におけるプロットから、ＫｉｎＥｘＡＰｒｏソフトウエア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｉｓｅ  ＩＤ）におけるｎ曲線分析を用いた曲線フィッティングからＫｄを得た。９５％信頼区間はＫｄ低値及びＫｄ高値として得られる。
【０７１１】
表１５（下記）はＫｉｎＥｘＡＫｄ計測により測定された４つの代表的な組み換え抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂの平衡解離定数（Ｋｄ）値を示す。これらの抗体はｈＯｒａｉ１に対する低ピコモル濃度範囲の結合のＫｄを示した。
【０７１２】
ヒト抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂの数種の実施形態の結合親和性のランクの評価
【０７１３】
結合計測のための平衡セットアップ。ＵｌｔｒａＬｉｎｋ  Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ＃  ５３１１０）をヤギ抗ｈｕＦｃＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔ＃１０９−００５−０９８）で予備コーティングし、そしてＢＳＡでブロッキングした。３０ｐＭの抗Ｏｒａｉ１抗体を１％  ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム、及びＤＭＥＭ中の３．０ｘ１０５、１．０ｘ１０５、及び３．０ｘ１０４個／ｍｌのＡＭ１−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ細胞と共にインキュベートした。Ａｂ及び全細胞を含有する試料を室温で４時間振とうした。全細胞及び抗体−細胞複合体を、５分間約２２０ＧでＢｅｃｋｍａｎＧＳ−６Ｒ遠心分離機を使用しながら未結合の遊離Ａｂから分離した。上澄みを０．２２μｍのフィルターで濾過した後、ヤギ抗ｈｕＦｃコーティングビーズに通した。ビーズ結合Ａｂの量は、蛍光（Ｃｙ５）標識ヤギ抗ｈｕＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔ＃  １０９−１７５−０８８）により定量した。結合シグナルは各細胞密度において溶液中の遊離のＡｂの濃度に比例する。相対結合シグナル１００％は３０ｐＭ抗体単独を示す。低下したシグナルはＡＭ１−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ細胞との抗体結合を示す。
【０７１４】
要すれば、組み換え抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂが安定な哺乳類細胞系統ＡＭ１−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ上に発現されているネイティブのヒトＯｒａｉ１（配列番号２）に結合する能力についてＫｉｎＥｘＡを用いて評価することにより抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂの親和性をランク付けした。図３４は遊離ｍＡｂのパーセントは細胞無添加試料では１００％であり、そして遊離ｍＡｂのパーセントは添加したＡＭ１−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ細胞の密度が上昇するに連れて低下すし、抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂがＡＭ１−ＣＨＯ／ｈＯｒａｉ１／ｈＳＴＩＭ１−ＹＦＰ細胞上のｈＯｒａｉ１に結合したことを示している。各セットにつき遊離ｍＡｂのパーセントは高親和性結合体についてはより低値であり、そして低親和性結合体についてはより高値であった。これらの分析に基づけば、試験した抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂに関する結合親和性のランクは５Ｆ７．１＞５Ｈ３．１＝２Ｃ１．１＝５Ｄ７．２＝５Ｆ２．１＝５Ａ４．２＝２Ｂ７．１＝５Ｂ１．１＝５Ｂ５．１＞２Ｄ２．１＞＞２Ｂ４．１であった。
【表１５】
2013511279.tif 000122
【０７１５】
実施例１６    ヒト異種ＧＶＨＤマウスにおける抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１の薬物動態プロファイルの評価
【０７１６】
ヒト異種GVHDマウス。一般的にＮＳＧマウスとして知られている非肥満糖尿病（ＮＯＤ）重度複合免疫不全（ｓｃｉｄ）インターロイキン（ＩＬ）−２受容体ガンマノックアウト（ＩＬ２Ｒガンマ−／−）マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒガンマ−／−）は十度に免疫無防備状態であり、成熟Ｔ細胞及びＢ細胞の非存在、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の欠失を特徴としている。ＮＳＧマウスは又、ＮＫ細胞の発生をブロックし、そして更に生得免疫を損なうサイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、及びＩＬ２１）に対する幾つかの高親和性受容体に関して欠損性である。ＮＳＧマウスにおける化合物免疫不全は広範な一次ヒト細胞の移植を可能にし、そして、ヒトの生物学及び疾患の多くの分野の高度なモデリングを可能にする。ＮＳＧマウスにヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を転移させることによりヒト異種対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）マウスモデルを樹立する。これらのマウスは多くの態様においてヒトＧＶＨＤを模倣する疾患を発症する。これらのマウスの１００％が使用したＰＢＭＣドナーに関わらず５ｘ１０６ヒトＰＢＭＣもの少量の注射の後に異種性のＧＶＨＤを発症する(King等、Human  peripheral  blood  leucocyte  non-obese  diabetic-severe  combined  immunodeficiency  interleukin-2  receptor  gamma  chain  gene  mouse  model  of  xengeneic  graft-versus-host-like  disease  and  the  role  of  the  host  major  histocompatibility  complex,  Clinical  and  Experimental  Immunology,  157:104-118(2009)）。
【０７１７】
雌性ＮＳＧマウス（＃００５５５７、６〜８週齢）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｅｒ、ＭＥ）から購入した。全ての動物の処置は地域の動物ケア委員会により認可されたプロトコルに従って実施した。移植片拒絶を回避するために、全ての実験におけるレシピエントマウスに２００ＲａｄのＣｓ−１３７による全身致死量未満照射を実施した。凍結したヒトＰＢＭＣをＨｅｍａｃａｒｅ  Ｉｎｃ．（Ｌｅｕｋｏｐａｃ  ｄｏｎｏｒ（＃０７５００１１）、Ｖａｎ  Ｎｕｙｓ、ＣＡ）より購入した。細胞を２回冷ＰＢＳで洗浄し、そして２００μＬのＰＢＳ中２０ｘ１０６個のヒトＰＢＭＣを尾静脈（ｉｖ）注射を介して各レシピエントマウスに転移させた。
【０７１８】
ヒト異種ＧＶＨＤマウスからの血清試料の収集。抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１を投与されたヒトＰＢＭＣを転移された各ＮＳＧマウスの血液約２５０μｌを投与後０、０．０８３、０．５、２、４、８、２４、４８、９６、１６８、及び３３６時間にＭｉｃｒｏｔａｉｎｅr（登録商標）血清セパレーター試験管中に収集した。各試料を収集後室温に維持し、そして３０〜４０分の凝固時間の後、試料をカリブレーションされたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１７Ｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）を用いながら約１０分間１１、５００ｒｐｍで２〜８℃で遠心分離した。収集した血清を次に予め標識した凍結保存試験管に移し、後の分析のために−６０℃〜−８０℃で保存した。
【０７１９】
ｐＴＴ５哺乳類発現ベクター中の６ｘＨｉｓ−ヒトＯｒａｉ１の形成。以下のＤＮＡ配列：
【０７２０】
【化８６】
2013511279.tif 000123
によりコードされる６ｘ−Ｈｉｓ−ヒト  Ｏｒａｉ１（６ｘＨ−ｈＯｒａｉ１；配列番号３１８）をＣＭＶ系哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ、Ｃａｎａｄａ）内にクローニングした。
【０７２１】
要すれば、下記に示す配列（配列番号３０４及び配列番号３２０）を有する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、鋳型としてｈＯｒａｉ１を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法において使用した。
フォワードプライマー：5'-
GGTCGACTGAACCACCATGCATCATCATCACCACCACCATCCGGAGCCCG
CCCCGCCCCCGAG-3'（配列番号３０４）及び、
リバースプライマー：5  '-CTGACGCCCGGCAGCCACTATGCCTAGGCGGCCGC-3'（配列番号３２０）。
得られた９４８ｂｐのＰＣＲ産物を精製し、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。ＴＴ５ベクターも又ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。消化したＰＣＲ産物及びベクターをライゲーションしてｐＴＴ５−６ｘＨ−ｈＯｒａｉ１ベクターを作成した。インサートを配列決定したところ、６ｘＨｉｓ−ヒトＯｒａｉ１ｃＤＮＡコーディング配列（配列番号３１８；コードしている配列は６ｘＨｉｓ−ヒトＯｒａｉ１蛋白配列である配列番号３１９）：
【０７２２】
【化８７】
2013511279.tif 000124
と１００％同一であると決定された。
６ｘＨＩＳは配列番号３１９のアミノ酸残基３〜８において上記に示しており、これは一重下線を付され、そしてＨＨＨＨＨＨ（配列番号３２１）の配列を有する。
【０７２３】
６ｘＨ−ｈＯｒａｉ１を発現する２９３−６Ｅを形成するための一過性の発現。トランスフェクションの１日前、２９３−６Ｅ細胞を生育培地１０００ｍＬ中に１ｘ１０６個／ｍｌの細胞密度で接種した。培地ｍＬあたり０．５μｇのＤＮＡをＦ１７培地に添加し、次に培地ｍＬ当たり１．５μｇのＰＥIｍａｘ試薬を混合物に添加し、穏やかに混合し、１５分間室温でインキュベートした。トランスフェクション混合物を細胞に添加し、そして培地を３７℃５％ＣＯ２に設定したインキュベーター中１１０ｒｐｍでオービタルシェーカー上に維持した。トリプトンＮ１をトランスフェクション後２４時間に添加し、細胞をトランスフェクション後４８時間に採取した。
【０７２４】
ヒトＯｒａｉ１細胞膜の調製。ｐＴＴ５−６ｘＨ−ｈＯｒａｉ１で一過性にトランスフェクトされた２９３−６Ｅ細胞をトランスフェクション後４８時間に採取し、氷冷１ｘＰＢＳで２回濯ぎ、その後Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を添加した低張性溶解緩衝液（２５ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、３ｍＭＭｇＣｌ２）中に再懸濁し、そしてＧｌａｓ−Ｃｏｌホモゲナイザー中でホモゲナイズした。懸濁液を４℃で１２分間ＪＡ２０ローター中２０、０００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットをＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを添加した低張性溶解緩衝液（２５ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、３ｍＭＭｇＣｌ２）中に再懸濁し、再度ホモゲナイズし、２５Ｇ針で剪断し、そして再度遠心分離した。ペレットをＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを添加した最終ペレット緩衝液（２５ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、３ｍＭＭｇＣｌ２、１０％（ｗ／ｖ）スクロース）中に再懸濁し、２〜３回２５Ｇ針を通過させ、次に使用時まで−８０℃で保存した。
【０７２５】
血清試料中の抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂを検出するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。ＰＫ試験試料から血清試料濃度を計測するために以下の方法を使用した。即ち１／２面積白色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３６９３）をＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌの６ｘＨ−ｈＯｒａｉ１細胞膜でコーティングし、次に４℃で一夜インキュベートした。次にプレートを洗浄し、４℃で一夜Ｉ−ＢｌｏｃｋTM（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でブロックした。試料を希釈する必要がある場合は、それらはマウス血清で希釈した。次に標準物質及び試料をＩ−ＢｌｏｃｋＴＭ＋５％ＢＳＡ中１：５０に希釈した（即ち１０μｌの標準物質及び試料を４９０μｌの希釈緩衝液に入れる）。プレートを洗浄し、そして前処理標準物質及び試料の５０μｌ試料をｈＯｒａｉ１細胞膜コーティングプレート中に移し、そして室温で１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次にＩ−ＢｌｏｃｋＴＭ＋５％ＢＳＡ中２００ｎｇ／ｍｌの抗ｈｕＬａｍｂｄａ軽鎖抗体、クローンＬ−２Ｈ１．１−ＨＲＰコンジュゲート５０μＬを添加し、１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次に５０μｌのＰｉｃｏ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加し、その後プレートを即座にルミノメーターで分析した。
【０７２６】
要すれば抗ｈＯｒａｉ１  ｍＡｂ２Ｃ１．１の薬物動態（ＰＫ）プロファイルは、５ｍｇ／ｋｇ静脈内、５ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇ皮下注射することによりヒト異種ＧＶＨＤマウス中で測定した。開発したＥＬＩＳＡ法を用いながら、抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１レベルに関してＰＫ試料をアッセイした。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（登録商標）（Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．１．１、２００６、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ（登録商標）Ｃｏｒｐ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるノンコンパートメント法を用いながら時間濃度データを分析した。得られた薬物動態プロファイルは２週間にわたる曝露を示し、半減期は約７〜２５日であった（図２８）。しかしながら、第２週から得られたデータの変動性は、動物の死亡率が高かったために極めて大きかった。ヒトＰＢＭＣを転移されたＮＳＧマウス中の抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１のＰＫパラメーターを表１６（下記）に総括する。
【表１６】
2013511279.tif 000125
【０７２７】
実施例１７    ヒト異種ＧＶＨＤモデルにおける抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂの作用
【０７２８】
ＧＶＨＤの誘導及びインビボ投与。
一般的にＮＳＧマウスとして知られている非肥満糖尿病（ＮＯＤ）重度複合免疫不全（ｓｃｉｄ）インターロイキン（ＩＬ）−２受容体ガンマノックアウト（ＩＬ２Ｒガンマ−／−）マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒガンマ−／−）は十度に免疫無防備状態であり、成熟Ｔ細胞及びＢ細胞の非存在、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の欠失を特徴としている。ＮＳＧマウスは又、ＮＫ細胞の発生をブロックし、そして更に生得免疫を損なうサイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、及びＩＬ２１）に対する幾つかの高親和性受容体に関して欠損性である。ＮＳＧマウスにおける化合物免疫不全は広範な一次ヒト細胞の移植を可能にし、そして、ヒトの生物学及び疾患の多くの分野の高度なモデリングを可能にする。ＮＳＧマウスにヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を転移させることによりヒト異種対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）マウスモデルを樹立する。これらのマウスは多くの態様においてヒトＧＶＨＤを模倣する疾患を発症する。これらのマウスの１００％が使用したＰＢＭＣドナーに関わらず５ｘ１０６ヒトＰＢＭＣもの少量の注射の後に異種性のＧＶＨＤを発症する(King等、Human  peripheral  blood  leucocyte  non-obese  diabetic-severe  combined  immunodeficiency  interleukin-2  receptor  gamma  chain  gene  mouse  model  of  xengeneic  graft-versus-host-like  disease  and  the  role  of  the  host  major  histocompatibility  complex,  Clinical  and  Experimental  Immunology,  157:104-118(2009)）。
【０７２９】
３４匹の雌性ＮＳＧマウス（＃００５５５７、６〜８週齢）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｅｒ、ＭＥ）から購入した。全ての動物の処置は地域の動物ケア委員会により認可されたプロトコルに従って実施した。移植片拒絶を回避するために、全ての実験におけるレシピエントマウスに２００ＲａｄのＣｓ−１３７による全身致死量未満照射を実施した。照射後、マウスを４〜８匹の５群に無作為に分割した。第１群（ｎ＝４）は如何なる投与も受けず、ヒトＰＢＭＣ転移も受けなかった。凍結したヒトＰＢＭＣをＨｅｍａｃａｒｅ  Ｉｎｃ．（Ｌｅｕｋｏｐａｃ  ｄｏｎｏｒ（＃０７５００１１）、Ｖａｎ  Ｎｕｙｓ、ＣＡ）より購入した。細胞を２回冷ＰＢＳで洗浄し、そして２００μＬのＰＢＳ中２０ｘ１０６個のヒトＰＢＭＣを尾静脈注射を介して各レシピエントマウスに転移させた。照射後４時間にヒトＰＢＭＣを投与されたレシピエントを８匹の４群に分割し、アイソタイプ対照ｈｕＩｇＧ２、陰性対照として使用する抗−ＫＬＨｈｕＩｇＧ２（Ｗａｌｋｅｒ等が国際特許出願ＷＯ２０１０／１０８１５３Ａ２に記載）９０  ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）、又は陽性対照として使用するＯｒｅｎｃｉａ（登録商標）（アバタセプト；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）５ｍｐｋ、又は抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１を３０及び９０  ｍｐｋにおいて投与した。第２〜５群のマウス全てにヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を照射４時間後に転移させた。投与群においては、照射後第０日に腹腔内注射（ｉｐ）によりｍＡｂをマウスに投与し、その後第５日にヒトＰＢＭＣを転移させた。各マウスの体重は第０、３、５日及び第７日から第１０日までは毎日計測した。第０日における体重をベースラインとして使用し、これを１００％と表示し、そして平均の体重変化を第０日体重のパーセントとして表示した。実験は第１０日に終了した。マウスはＣＯ２吸入により安楽死させた。２５Ｇ７／８インチの針のついた１ｍｌのシリンジを用いながら心穿刺により採決した。次に血液をセパレーターのついた血清収集試験管に入れた。３０〜６０分間室温で凝固させた後、試料を４℃で５分間１０００0ｒｐｍで遠沈した。血清を異なる試験管に移し、−８０℃に凍結し、その後のサイトカイン及び薬品レベルの計測に付した。脾臓を採取してＦＡＣＳ分析（臨床免疫）に付した。
【０７３０】
血清中のサイトカインのレベルはＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙより入手した７スポット（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＦＮガンマ及びＴＮＦａ）電気化学ルミネセントイムノアッセイを用いながら製造元の説明書に従って測定した。
【０７３１】
図２９は、アイソタイプ対照ｍＡｂ、抗ＫＬＨｍＡｂを投与されたマウスでは第７日に体重減少が始まったことを示している。体重減少は急速に起こり、第１０日に最大となった。この時点において、マウスは典型的には約２０％体重減少していた。ヒトＰＢＭＣを転移されていない照射対照は試験期間中体重減少を呈さなかった。Ｏｒｅｎｃｉａは臨床使用されているバイオ薬品である。Ｏｒｅｎｃｉａを５ｍｐｋで投与された動物では体重減少は防止され、平均体重は非転移マウスと同等であった。３０及び９０ｍｐｋで抗Ｏｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１を投与されたマウスはアイソタイプ対照ｍＡｂと比較して体重減少を呈さず、そして平均体重は非転移マウスと同様であった。
【０７３２】
ｍＡｂ２Ｂ４．１はＦＡＣＳＫｄ親和性計測によれば約１．８ｎＭの結合親和性を有する弱い結合体である（本明細書実施例１５の表１４参照）。インビボの機能評価において、ｍＡｂ２Ｂ４．１はタプシガルギン処理されたヒト全血中のインターロイキン−２及びインターフェロン−ガンマの分泌を阻害しなかった（図５Ａ〜Ｄ）が、ＮＦＡＴ媒介ルシフェラーゼアッセイでは弱い阻害剤であり（図６Ｃ）、そしてｍＡｂ２Ｃ１．１と比較してＣＲＡＣ電流の有意に低値のブロックをもたらした（データ示さず）。本発明者等はヒト異種ＧＶＨＤモデルにおけるｍＡｂ２Ｂ４．１の作用を検討した。結果は図３２に示す通りであり、これによれば、アイソタイプ対照ｍＡｂ、抗ＤＮＰｍＡｂを投与されたマウスでは第６日に体重減少が始まり、そして第１１日には約１５％体重減少していた。ヒトＰＢＭＣを転移されていない照射対照は試験期間中体重減少を呈さなかった。３０ｍｐｋで抗Ｏｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１を投与されたマウスは非転移群と同様体重減少を呈さなかった。これとは対照的に、１０及び３０ｍｐｋで抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｂ４．１を投与されたマウスはアイソタイプ対照と同様の体重減少を経験していた。これらのマウスでは第６日に体重減少が始まり、第１１日には約１５％体重減少しており、アイソタイプ対照マウスと同等であった。
【０７３３】
実施例１８    抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ投与ヒト異種ＧＶＨＤマウスにおけるヒトＴ細胞移植及び炎症サイトカイン生産の評価
【０７３４】
ヒト及びマウスＰＢＭＣの表現型に関するＦＡＣＳ分析。実験は第１０日に終了した。マウスはＣＯ２吸入により安楽死させた。脾臓を採取し、赤血球（ＲＢＣ）溶解緩衝液を用いて赤血球を溶解した。試験管を周囲温度（１８〜２５℃で水平ローター（スイングアウトヘッド）遠心分離機中３００相対遠心分離力（ＲＣＦ）で遠心分離した。脾細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中に希釈し、１００μＬ中３ｘ１０５個の細胞を抗体組み合わせ当たり染色した。細胞を先ず３０分間、ヒト及びマウス及びＴ細胞特異的表面マーカーに対して特異的な抗体、ＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ４、ＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ８、ＰｅｒＣＰマウス抗ヒトＣＨ４５又はＰＥラット抗マウスＣＤ４５と共にインキュベートし、その後２００μＬのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで洗浄した。細胞を最終容量１５０μＬのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中に再懸濁し、そして５０μＬの５％パラホルムアルデヒド／０．５％ＢＳＡ中に固定し、そしてフローサイトメトリー分析まで暗所に保存した。データはＢＤソフトウエアを用いて分析した。
【０７３５】
マウスＣＤ４５＋Ｔ細胞はヒトＰＢＭＣを転移されていない照射対照の脾臓において検出された（図３１Ｂ）が、ヒトＣＤ４５＋Ｔ細胞及びＣＤ４及びＣＤ８を発現している細胞は検出できなかった（それぞれ図３１Ａ及び図３１Ｃ〜Ｄ）。図３１Ａ〜Ｄによれば、Ｔ細胞の移植はアイソタイプ対照（抗ＫＬＨｍＡｂ、Walker等の国際特許出願ＷＯ２０１０／１０８１５３Ａ２に記載）を投与したレシピエントにおいて観察されたことを示しており、ここではヒトＣＤ４５＋Ｔ細胞の移植は約４５％において脾臓で検出された（図３１Ａ）のに対しマウスＣＤ４５＋Ｔ細胞は約４％であった（図３１Ｂ）。脾臓中約５０％のヒトＣＤ４５＋Ｔ細胞がＣＤ４を発現しており（図３１Ｃ）、そして２０％がＣＤ８を発現していた（図３１Ｄ）。５ｍｐｋでＯｒｅｎｃｉａ（登録商標）（アバタセプト；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）を投与された動物ではアイソタイプ対照レシピエントと比較して、ヒトＣＤ４５＋のパーセンテージが約２２％まで低減され、そしてＣＤ４及びＣＤ８を発現したヒトＣＤ４５＋Ｔ細胞のパーセンテージはそれぞれ約２５％及び１２％まで減衰していた（図３１Ａ）。秘蔵における宿主マウスのＣＤ４５＋Ｔ細胞のパーセンテージはアイソタイプ対照ｍＡｂを投与されたレシピエントよりもＯｒｅｎｃｉａ（登録商標）（アバタセプト）を投与されたレシピエントにおいて約１０倍高値であった（図３１Ｂ）。３０及び９０ｍｐｋで抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１を投与されたマウスではアイソタイプ対照レシピエントと比較して、ヒトＣＤ４５＋Ｔ細胞及び脾臓でＣＤ４及びＣＤ８を発現する細胞のパーセントが用量依存的に低下していた（それぞれ図３１Ａ、図３１Ｃ、及び図３１Ｄ）。それぞれ３０及び９０ｍｐｋの抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１を投与されたレシピエントにおいては、脾臓中のヒトＣＤ４５＋Ｔ細胞のパーセンテージは約２５％及び１３％まで低下し（図３１Ａ）、この場合ＣＤ４＋Ｔ細胞は約１６％及び１０％まで低下（図３１Ｃ）し、そしてＣＤ８＋Ｔ細胞は約５％及び３％まで低下した（図３１Ｄ）。これらの所見は抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１がヒトＰＢＭＣを転移されたＮＳＧマウスに於いてＴ細胞移植を効果的に防止したことを示している。３０及び９０ｍｐｋの抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１を投与されたレシピエントにおける宿主マウスのＣＤ４５＋Ｔ細胞のパーセントは、アイソタイプ対照ｍＡｂを投与されたレシピエントの場合よりも有意に高値であり、それぞれ３７％及び３５％であった（図３１Ｂ）。
【０７３６】
炎症サイトカイン生産の評価。実験は第１０日に終了した。マウスはＣＯ２吸入により安楽死させた。脾臓を採取し、赤血球（ＲＢＣ）溶解緩衝液を用いて赤血球を溶解した。２５Ｇ７／８インチの針のついた１ｍｌのシリンジを用いながら心穿刺により採決した。次に血液をセパレーターのついた血清収集試験管に入れた。３０〜６０分間室温で凝固させた後、試料を４℃で５分間１0０００ｒｐｍで遠沈した。血清を異なる試験管に移し、−８０℃に凍結し、その後のサイトカインの計測に付した。
【０７３７】
血清中のサイトカインのレベルはＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）より入手した７スポット（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＦＮガンマ及びＴＮＦａ）電気化学ルミネセントイムノアッセイを用いながら製造元の説明書に従って測定した。
【０７３８】
図３０Ａ〜Ｄによれば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５及びＩＬ−１０のレベルはそれぞれ、無疾患マウス、即ち非転移マウスと比較してアイソタイプ対照抗体（抗ＫＬＨｍＡｂ）を投与されたマウスの血清中で上昇していた。５ｍｐｋのＯｒｅｎｃｉａ（登録商標）（ａｂａｔａｃｅｐｔ）を投与された動物は炎症サイトカイン、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５及びＩＬ−１０の生産を有意にブロックした。３０及び９０ｍｐｋで抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１を投与したマウスは炎症性サイトカイン生産、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５及びＩＬ−１０を有意に減衰させた。ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−１７のレベルは全群において検出不能であった（データ示さず）。
【０７３９】
実施例１９    Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する内因性ヒトＯｒａｉ１の結合における抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂの評価
【０７４０】
ＦＡＣＳ結合分析。Ｊｕｒｋａｔ細胞を１回で洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（１ｘＤ−ＰＢＳ＋２％ヤギ血清）中に再懸濁し、そして１００μＬ中３ｘ１０５個の細胞を抗体組み合わせ当たり染色した。全抗体のインキュベーション工程を１時間氷上で実施した。細胞は先ず１μｇの未標識のヒト抗ｈＯｒａｉ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ１．１、ｍＡｂ５Ｆ７．１及びｍＡｂ２Ｂ４．１）又はアイソタイプ対照ｍＡｂ（ＤＮＰ−３Ａ４−Ｆ−Ｇ２）と共にインキュベートし、その後２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。次に未標識抗体をヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ−フィコエリスリン（ＩｇＧ−ＰＥ）を用いて検出し、その後、２００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後にフローサイトメトリー分析に付した。未染色の細胞及び検出抗体で染色した細胞を陰性対照として使用した。蛍光の相対レベルの値はＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓ（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて計算し、そして平均値は対数変換データを用いて計算した（幾何平均）。  
【０７４１】
ヒトＯｒａｉ１はＪｕｒｋａｔ細胞中に存在することがわかっている(Fasolato等、Store  depletion  triggers  the  calcium  release-activated  calcium  current(ICRAC)  in  macrovascular  endothelial  cells:  a  comparison  with  Jurkat  and  embryonic  kidney  cell  lines,  Pfluegers  Arch.-  Eur.  J.  Physiol.  436(1):69-74(1998)）。本発明者等は抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂがＪｕｒｋａｔ細胞上の内因性ヒトＯｒａｉ１を検出する能力を評価する。図３３Ａは試験した４種の抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂｓ（ｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ．１、ｍＡｂ５Ｆ７．１及びｍＡｂ２Ｂ４．１）がＪｕｒｋａｔ細胞の表面上で内因性に発現されたヒトＯｒａｉ１を認識したことを示している。３種の高親和性結合体ｍＡｂ２Ｃ１．１、ｍＡｂ２Ｄ．１及びｍＡｂ５Ｆ７．１のＧｅｏ平均はｈＯｒａｉ１への結合において相互に同等であったが、弱い結合体であるｍＡｂ２Ｂ４．１に関する値は３種の高親和性結合体に関する値より有意に低値であった。未染色対照、直接標識二次抗体フラグメント陰性染色対照及びアイソタイプ対照ｍＡｂの結合は「検出不可能」と考えられた。図３３Ｂは各ｍＡｂ２Ｂ４．１、未染色対照、直接標識二次抗体フラグメント陰性染色対照およびアイソタイプ対照ｍＡｂと比較した場合の高親和性結合体のＦＡＣＳプロファイルを示しており、ｍＡｂ２Ｂ４．１と比較して各高親和性結合体は約１対数分右側にシフトしていることが示されている。  
【０７４２】
実施例２０    本発明の抗原結合蛋白によるＩＣＲＡＣブロックの電気生理学的試験
【０７４３】
ヒトＳＴＩＭ１及びヒトＯｒａｉ１を安定して発現するＨＥＫ−２９３／ｈＯｒａ１／ｈＳＴＩＭ１ＢＢ６．３細胞系統を用いて抗ｈＯｒａｉ１ｍＡｂ２Ｃ１．１によるＣＲＡＣ電流ブロックのＩＣ５０測定を行った。細胞はＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｘＭＥＭ  ＮＥＡＡ、５μｇ／ｍｌブラスチシジン、１００μｇ／ｍｌゼオシン、２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンよりなる培地中で生育させた。
【０７４４】
電流はＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）７０００Ａ自動パラレルパッチクランプシステム（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＩｎｃ．）を用いながら全細胞配置において記録した。細胞外溶液は１１０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ２、３ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＣｓＣｌ、１０ｍＭＤ−グルコース、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）よりなるものであった。細胞内溶液は９５ｍＭグルタミン酸セシウム、８ｍＭＮａＣｌ、８ｍＭＭｇＣｌ２、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭＢＡＰＴＡ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）よりなるものであった。全ての記録は室温（２１〜２３℃）で実施した。保持電位は＋３０ｍＶであった。電圧プロトコルは以下の通り、即ち：１０−ｍｓｅｃステップで−１００ｍＶまで、その後１００−ｍｓｅｃランプを−１００から＋１００ｍＶまでとし；プロトコルは５秒毎に適用した。記録した電流は１０μＭＧｇＣｌ３を含有する細胞外溶液で収集したデータを用いてリーク差し引きした。ＩＣＲＡＣ電流に対するｍＡｂ２Ｃ１．１抗体の阻害作用はｍＡｂ２Ｃ１．１の６段階濃度において計測した（ｎ＝３〜６）（図３５）。ｍＡｂ２Ｃ１．１抗体を含有する細胞外溶液は１分間隔で３回交換することにより如何なる潜在的な非特異的結合も考慮した。ＩＣＲＡＣ電流ブロックのパーセンテージを抗体濃度に対してプロットし；ＩＣ５０は５５．８６±５．９０ｎＭに等しいと計算された。これとは対照的に、１μＭ濃度で適用されたヒト抗ＤＮＰ抗体（抗ＤＮＰ−３Ａ４−Ｆ−Ｇ２、Ｗａｌｋｅｒ等の
国際特許出願ＷＯ２０１０／１０８１５３Ａ２に記載）はＩＣＲＡＣ電流に対する有意な作用を示さなかった（図３６）。
【０７４５】
実施例２１    タプシガルギン処理されたカニクイザル全血からのサイトカイン放出の阻害における抗ヒトＯｒａｉ１モノクローナル抗体の機能評価
【０７４６】
ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１７の分泌に対するＣＲＡＣ阻害剤抗体の影響を調べるためのエクスビボアッセイ。カニクイザル全血をヘパリンバキュテナー中に３匹の健康な雄性カニクイザルから得た。ＤＭＥＭ完全培地は
０．１％ヒトアルブミン（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、＃８００−１２０）、５５μＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）、及び１ｘＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｇｌｎ（ＰＳＧ、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１０３７８−０１６）を含有するＩｓｃｏｖｅｓＤＭＥＭ（＋Ｌ−グルタミン及び２５  ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液）とした。タプシガルギンはＡｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ（Ｉｓｒａｅｌ）より入手した。１００％ＤＭＳＯ中のタプシガルギンの１０ｍＭ保存溶液をＤＭＥＭ完全培地で希釈して４０μＭ、４ｘ溶液とすることにより、カルシウム固定のための４ｘタプシガルギン刺激剤を得た。２Ｃ１．１モノクローナル抗体をＤＭＥＭ完全培地で希釈して２０００ｎＭの出発４ｘ濃度とし、そして１：４希釈により連続希釈して全１０濃度とした（４ｘ濃度は２０００ｎＭ、３７５ｎＭ、９３．７５ｎＭ、２３．４４ｎＭ、５．８６ｎＭ、１．４６ｎＭ、０．３７ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０２ｎＭ、及び０．０１ｎＭ）。アッセイは９６穴Ｆａｌｃｏｎ３０７５平底マイクロプレート中にセットアップした。対照として行１１及び１２に５０μＬのＤＭＥＭ完全培地を添加し、カラム１〜１０には５０μＬの４ｘ２Ｃ１．１検定物を入れた。実験を開始するために、各サル由来の全血ウェル当たり１００μＬをマイクロプレートの３つの列に添加した。次にプレートを１時間３７℃５％ＣＯ２でインキュベートした。１時間後、プレートを取り出し、５０μＬの４ｘタプシガルギン刺激剤（４０μＭ）を行１〜１１のウェルに添加した。行１２には５０μＬのＤＭＥＭ完全培地を添加した。プレートを４８時間３７℃５％ＣＯ２下に戻した。全血中に分泌されたＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１７の量を測定するために９６穴プレートの各ウェルから上澄み（コンディショニング培地）１００μＬをストレージプレートに移した。サイトカイン生産のＭＳＤ電気化学ルミネセンス分析のために、上澄み（コンディショニング培地）２５μＬをＭＳＤＭｕｌｔｉ−Ｓｐｏｔ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｃｏａｔｅｄプレート（ｗｗｗ．ｍｅｓｏ−ｓｃａｌｅ．ｃｏｍ）に添加した。これらのプレート上のワーキング電極を予め７種のキャプチャー抗体（ｈＩＬ−２、ｈＩＬ−４、ｈＩＬ−５、ｈＩＬ−１０、ｈＴＮＦａ、ｈＩＦＮｇ及びｈＩＬ−１７）でコーティングした。プレートをＭＳＤヒト血清サイトカインアッセイ希釈液でブロッキングし、ついで０．０５％Ｔｗｅｅｎ-20含有ＰＢＳで３回洗浄した後、２５μＬのコンディショニング培地をＭＳＤプレートに添加した。プレートを被覆し、１０分間振とうプラットホーム上に置いた。次にＭＳＤ抗体希釈液中の検出抗体のカクテル２５μＬを各ウェルに添加した。カクテルは各々１μｇ／ｍｌにおいて７種の検出抗体（ｈＩＬ−２、ｈＩＬ−４、ｈＩＬ−５、ｈＩＬ−１０、ｈＴＮＦａ、ｈＩＦＮｇ及びｈＩＬ−１７）を含有していた。プレートを被覆し（暗所）一夜振とうプラットホーム上においた。翌日プレートをＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。植えるあたり１５０μＬの２ｘＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔをプレートに添加した後に、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ上で読み取った。隠れとの各行１１のウェルはタプシガルギン刺激剤のみを添加し、阻害��を添加していないため、ここでの平均ＭＳＤ応答を用いて各動物の列における「被験」値を計算した。各動物に関する計算された「陰性対照」値は、タプシガルギンも阻害剤の添加していない各列の行１２における平均ＭＳＤ応答から計算した。動物の「陽性対照」値はタプシガルギン刺激剤は含有するが阻害剤は含有しない行１１のウェルからの平均ＭＳＤ応答から誘導した。対照のパーセント（ＰＯＣ）は２Ｃ１．１による試料の相対阻害の尺度である。従って、１００ＰＯＣはタプシガルギン単独に対する最大応答を表す。逆に、０ＰＯＣは刺激剤非存在下で生産されるサイトカインの量を表す。対照のパーセント（ＰＯＣ）を計算するためには以下の式、即ち：［（「被験」）−（「陰性対照」）］／［（「陽性対照」）−（「陰性対照」）］ｘ１００を使用する。本発明者等は高スループットのＭＳＤ電気化学ルミネセンスアッセイを用いたサイトカイン生産の計測を本明細書に記載したが、より低いスループットのＥＬＩＳＡアッセイをサイトカイン生産の計測のために等しく適用できることは当業者の知る通りである。
【０７４７】
３匹のカニクイザルドナーの各々に関する全血機能試験におけるＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１７放出の阻害に関するＩＣ５０値を以下の表１７に示す。
【表１７】
2013511279.tif 000126
略記法
本明細書を通じて使用した略記法は、特定の状況下に特段の記載が無い限り以下に定義するとおりである。
Ａｃ：アセチル（アセチル化残基を指すために使用）
ＡｃＢｐａ：アセチル化ｐ−ベンゾフェニル−Ｌ−フェニルアラニン
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＡｃＯＨ：酢酸
ＡＤＣＣ：抗体依存性細胞性細胞毒性
Ａｉｂ：アミノ酪酸
ｂＡ：ベータ−アラニン
Ｂｐａ：ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン
ＢｒＡc：ブロモアセチル（ＢｒＣＨ２Ｃ（Ｏ）
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
Ｂｚｌ：ベンジル
Ｃａｐ：カプロン酸
ＣＢＣ：完全血球数
ＣＯＰＤ：慢性閉塞性肺疾患
ＣＴＬ：細胞毒性Ｔリンパ球
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
Ｄｄｅ：１−（４、４−ジメチル−２、６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）エチル
ＤＮＰ：２、４−ジニドロフェノール
ＤＯＰＣ：１、２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＤＯＰＥ：１、２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＰＰＣ：１、２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＤＳＰＣ：１、２−ジステアリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＥＡＥ：実験的自己免疫脳脊髄炎
ＥＣＬ：増強された化学ルミネセンス
ＥＳＩ−ＭＳ：電子スプレーイオン化質量スペクトル分析
ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞ソーティング
Ｆｍｏｃ：フルオレニルメトキシカルボニル
ＧＨＴ：グリシン、ヒポキサンチン、チミジン
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＬ：ホモセリンセリンラクトン
ＩＢ：封入対
ＫＣａ：カルシウム活性化カリウムチャンネル（ＩＫＣａ、ＢＫＣａ、ＳＫＣａを包含）
ＫＬＨ：キーホールリンペットヘモシアニン
Ｋｖ：電位依存性カリウムチャンネル
Ｌａｕ：ラウリン酸
ＬＰＳ：リポ多糖類
ＬＹＭＰＨ：リンパ球
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ：マトリックス支援レーザー脱着イオン化質量スペクトル分析
Ｍｅ：メチル
ＭｅＯ：メトキシ
ＭｅＯＨ：メタノール
ＭＨＣ：主要組織適合複合体
ＭＭＰ：マトリックスメタロプロテイナーゼ
ＭＷ：分子量
ＭＷＣＯ：分子量カットオフ
１−Ｎａｐ：１−ナフチルアラニン
ＮＥＵＴ：好中球
Ｎｌｅ：ノルロイシン
ＮＭＰ：Ｎ−メチル−２−ピロリジノン
ＯＡｃ：アセテート
ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞
ＰＢＳ：リン酸塩緩衝食塩水
Ｐｂｆ：２、２、４、６、７−ペンタデカメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＤ：薬力学
Ｐｅｃ：ピペコリン酸
ＰＥＧ：ポリ（エチレングリコール）
ｐＧｌｕ：ピログルタミン酸
Ｐｉｃ：ピコリン酸
ＰＫ：薬物動態
ｐＹ：ホスホチロシン
ＲＢＳ：リボソーム結合部位
ＲＴ：室温（約２５℃）
Ｓａｒ：サルコシン
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＴＫ：セリン−スレオニンキナーゼ
ｔ−Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル
ｔＢｕ：ｔ−ブチル
ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：胸腺体液因子
Ｔｒｔ：トリチル
【図１】
2013511279.tif 000127
【図２Ａ】
2013511279.tif 000128
【図２Ｂ】
2013511279.tif 000129
【図２Ｃ】
2013511279.tif 000130
【図２Ｄ】
2013511279.tif 000131
【図３Ａ】
2013511279.tif 000132
【図３Ｂ】
2013511279.tif 000133
【図４】
2013511279.tif 000134
【図５Ａ】
2013511279.tif 000135
【図５Ｂ】
2013511279.tif 000136
【図５Ｃ】
2013511279.tif 000137
【図５Ｄ】
2013511279.tif 000138
【図５Ｅ】
2013511279.tif 000139
【図５Ｆ】
2013511279.tif 000140
【図５Ｇ】
2013511279.tif 000141
【図５Ｈ】
2013511279.tif 000142
【図６Ａ】
2013511279.tif 000143
【図６Ｂ】
2013511279.tif 000144
【図６Ｃ】
2013511279.tif 000145
【図７Ａ】
2013511279.tif 000146
【図７Ｂ】
2013511279.tif 000147
【図７Ｃ】
2013511279.tif 000148
【図８Ａ】
2013511279.tif 000149
【図８Ｂ】
2013511279.tif 000150
【図８Ｃ】
2013511279.tif 000151
【図８Ｄ】
2013511279.tif 000152
【図８Ｅ】
2013511279.tif 000153
【図８Ｆ】
2013511279.tif 000154
【図９】
2013511279.tif 000155
【図１０Ａ】
2013511279.tif 000156
【図１０Ｂ】
2013511279.tif 000157
【図１１Ａ】
2013511279.tif 000158
【図１１Ｂ】
2013511279.tif 000159
【図１２Ａ】
2013511279.tif 000160
【図１２Ｂ】
2013511279.tif 000161
【図１３Ａ】
2013511279.tif 000162
【図１３Ｂ】
2013511279.tif 000163
【図１４】
2013511279.tif 000164
【図１５Ａ】
2013511279.tif 000165
【図１５Ｂ】
2013511279.tif 000166
【図１６Ａ】
2013511279.tif 000167
【図１６Ｂ】
2013511279.tif 000168
【図１６Ｃ】
2013511279.tif 000169
【図１６Ｄ】
2013511279.tif 000170
【図１７Ａ】
2013511279.tif 000171
【図１７Ｂ】
2013511279.tif 000172
【図１７Ｃ】
2013511279.tif 000173
【図１７Ｄ】
2013511279.tif 000174
【図１８】
2013511279.tif 000175
【図１９】
2013511279.tif 000176
【図２０】
2013511279.tif 000177
【図２１】
2013511279.tif 000178
【図２２Ａ】
2013511279.tif 000179
【図２２Ｂ】
2013511279.tif 000180
【図２３】
2013511279.tif 000181
【図２４】
2013511279.tif 000182
【図２５】
2013511279.tif 000183
【図２６】
2013511279.tif 000184
【図２７】
2013511279.tif 000185
【図２８】
2013511279.tif 000186
【図２９】
2013511279.tif 000187
【図３０Ａ】
2013511279.tif 000188
【図３０Ｂ】
2013511279.tif 000189
【図３０Ｃ】
2013511279.tif 000190
【図３０Ｄ】
2013511279.tif 000191
【図３１Ａ】
2013511279.tif 000192
【図３１Ｂ】
2013511279.tif 000193
【図３１Ｃ】
2013511279.tif 000194
【図３１Ｄ】
2013511279.tif 000195
【図３２】
2013511279.tif 000196
【図３３Ａ】
2013511279.tif 000197
【図３３Ｂ】
2013511279.tif 000198
【図３４】
2013511279.tif 000199
【図３５】
2013511279.tif 000200
【図３６】
2013511279.tif 000201
【配列表】
2013511279000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年7月26日(2012.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗原結合蛋白であって、ネイティブのヒトＯｒａｉ１の細胞外ループ（ＥＣＬ）２中の配列番号４に特異的に結合する、単離された抗原結合蛋白。
【請求項２】
請求項１の単離された抗原結合蛋白であって：
（ａ）ネイティブのヒトＯｒａｉ１のポリペプチドに特異的に結合し、
（ｂ）
（ｉ）配列番号２１０；
（ｉｉ）配列番号２０４；
（ｉｉｉ）配列番号１９２；
（ｉｖ）配列番号１２９；又は、
（ｖ）配列番号１０３；
よりなるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合し、
そして、
（ｃ）
（ｖｉ）配列番号９１；
（ｖｉｉ）配列番号１９８；
（ｖｉｉｉ）配列番号１１３；
（ｉｘ）配列番号１２３；
（ｘ）配列番号１０７；又は、
（ｘｉ）配列番号１１７；
よりなるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合しない；
単離された抗原結合蛋白。
【請求項３】
単離された抗原結合蛋白が抗体又は抗体フラグメントを含む、請求項１又は２の単離された抗原結合蛋白。
【請求項４】
請求項３の単離された抗原結合蛋白であって、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、ここで：
（ａ）重鎖可変領域は配列番号４０、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、配列番号２５０、配列番号２５１；配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、又は配列番号２５５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むか；又は、
（ｂ）軽鎖可変領域は配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、又は配列番号２６５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むか；又は、
（ｃ）（ａ）の重鎖可変領域及び（ｂ）の軽鎖可変領域；
である、単離された抗原結合蛋白。
【請求項５】
免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と標記される３つの相補性決定領域を含み、並びに軽鎖可変領域がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と標記される３つのＣＤＲを含み、ここで：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号２６６又は配列番号２６７のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号４７、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、又は配列番号２７２のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、又は配列番号２７７のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＣＤＲＬ１は配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、又は配列番号２８３のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＣＤＲＬ２は配列番号５６、配列番号５７、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、又は配列番号２８９のアミノ酸配列を含み；及び
（ｆ）ＣＤＲＬ３は配列番号５８又は配列番号５９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、又は配列番号２９７のアミノ酸配列を含む；
請求項３の単離された抗原結合蛋白。
【請求項６】
（ａ）配列番号３４、配列番号２９、配列番号３３、又は配列番号３５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
又は、
（ｂ）配列番号３１、配列番号３０、又は配列番号３２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；又は、
（ｃ）（ａ）の免疫グロブリン重鎖及び（ｂ）の免疫グロブリン軽鎖；
を含む、請求項３の単離された抗原結合蛋白。
【請求項７】
単離された抗原結合蛋白がヒトカルシウム応答活性化カルシウム（ＣＲＡＣ）チャンネル活性を阻害する、請求項１又は２の単離された抗原結合蛋白。
【請求項８】
単離された抗原結合蛋白がタプシガルギン処理されたヒト全血中のＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、又は両方の放出を阻害する、請求項１又は２の単離された抗原結合蛋白。
【請求項９】
蛋白がＮＦＡＴ媒介発現を阻害する、請求項１又は２の単離された抗原結合蛋白。
【請求項１０】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４を含む、請求項１又は２の単離された抗原結合蛋白。
【請求項１１】
モノクローナル抗体を含む、請求項３の単離された抗原結合蛋白。
【請求項１２】
キメラ又はヒト化抗体を含む、請求項１１の単離された抗原結合蛋白。
【請求項１３】
ヒト抗体を含む、請求項１１の単離された抗原結合蛋白。
【請求項１４】
請求項３の単離された抗原結合蛋白であって、
（ａ）配列番号３２６、配列番号３２５、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、又は配列番号３４８のアミノ酸配列を含むか、又は、Ｎ末端又はＣ末端又は両方から１、２、３、４又は５個のアミノ酸残基が欠失している上記配列を含む免疫グロブリン重鎖；又は、
（ｂ）配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、又は配列番号３４２のアミノ酸配列を含むか、又は、Ｎ末端又はＣ末端又は両方から１、２、３、４又は５個のアミノ酸残基が欠失している上記配列を含む免疫グロブリン軽鎖；又は、
（ｃ）（ａ）の免疫グロブリン重鎖及び（ｂ）の免疫グロブリン軽鎖；
を含む、単離された抗原結合蛋白。
【請求項１５】
請求項１又は請求項２の抗原結合蛋白；及び製薬上許容しうる希釈剤、賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１、２又は３の抗原結合蛋白をコードする単離された核酸。
【請求項１７】
単離された核酸が、配列番号４０、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、配列番号２５０、配列番号２５１；配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、又は配列番号２５５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む抗原結合蛋白をコードする、請求項１６の単離された核酸。
【請求項１８】
単離された核酸が、免疫グロブリン重鎖可変領域及びＮ末端シグナル配列をコードし、核酸が配列番号２３、配列番号２５、又は配列番号２７を有する、請求項１６の単離された核酸。
【請求項１９】
単離された核酸が、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、又は配列番号２６５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗原結合蛋白をコードする、請求項１６の単離された核酸。
【請求項２０】
単離された核酸が、免疫グロブリン軽鎖可変領域及びＮ末端シグナル配列をコードし、核酸が配列番号１５、配列番号１７、又は配列番号１９を有する、請求項１６の単離された核酸。
【請求項２１】
単離された核酸がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と標記される３つの相補性決定領域に対するコーディング配列を含み、ここで：
（ａ）ＣＤＲＨ１は配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号２６６又は配列番号２６７のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＣＤＲＨ２は配列番号４７、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、又は配列番号２７２のアミノ酸配列を含み；及び
（ｃ）ＣＤＲＨ３は配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、又は配列番号２７７のアミノ酸配列を含み；
免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする、請求項１６の単離された核酸。
【請求項２２】
単離された核酸がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と標記される３つの相補性決定領域に対するコーディング配列を含み、ここで：
（ａ）ＣＤＲＬ１は配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、又は配列番号２８３のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＣＤＲＬ２は配列番号５６、配列番号５７、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、又は配列番号２８９のアミノ酸配列を含み；及び 
（ｃ）ＣＤＲＬ３は配列番号５８又は配列番号５９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、又は配列番号２９７のアミノ酸配列を含み；
免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする、請求項１６の単離された核酸。
【請求項２３】
単離された核酸が配列番号２９、配列番号３３、配列番号３４、又は配列番号３５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖を含む抗原結合蛋白をコードする、請求項１６の単離された核酸。
【請求項２４】
単離された核酸が配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む抗原結合蛋白をコードする、請求項１６の単離された核酸。
【請求項２５】
請求項１６の単離された核酸を含むベクター。
【請求項２６】
発現ベクターを含む請求項２５のベクター。
【請求項２７】
請求項２６の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項２８】
（ａ）発現ベクターによりコードされた抗原結合蛋白の発現を可能にする条件下に培地中で請求項２７の宿主細胞を培養すること；及び、
（ｂ）培地から抗原結合蛋白を回収すること；
を含む方法。
【請求項２９】
請求項１１の抗原結合蛋白を生産する、ハイブリドーマ。
【請求項３０】
（ａ）ハイブリドーマによる抗原結合蛋白の発現を可能にする条件下に培地中で請求項２９のハイブリドーマを培養すること；及び、
（ｂ）培地から抗原結合蛋白を回収すること；
を含む方法。
【請求項３１】
患者における免疫疾患を治療するための、請求項１、２又は３の単離された抗原結合蛋白を含む医薬の使用であって、免疫疾患がＴ細胞媒介自己免疫、移植物拒絶、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）、関節リューマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、アレルギー性鼻炎、好酸球性疾患、自己免疫中枢神経系（ＣＮＳ）炎症、及び炎症誘発性肝傷害から選択される、使用。
【請求項３２】
患者における静脈又は動脈の血栓形成に関連する疾患を治療するための、請求項１、２又は３の単離された抗原結合蛋白を含む医薬の使用であって、疾患が動脈血栓、心筋梗塞、卒中、虚血再灌流傷害、虚血性脳梗塞、炎症、補体活性化、フィブリン溶解、ＦＸＩＩ誘発キニン形成に関連する血管形成、遺伝性血管浮腫、肺の細菌感染、トリパノソーマ感染、低血圧性ショック、膵炎、シャーガス病、血小板減少症及び関節性痛風から選択される、使用。
【請求項３３】
患者における乳癌を治療するための、請求項１、２又は３の単離された抗原結合蛋白を含む医薬の使用。
【請求項３４】
請求項１又は請求項２の単離された抗原結合蛋白であって、抗原結合蛋白が、動的排除分析（kinetic exclusion assay）により測定した場合に２００ｐＭ以下のＫｄで哺乳類細胞により発現された配列番号２に特異的に結合する、請求項１又は請求項２の単離された抗原結合蛋白。
【請求項３５】
抗原結合蛋白が、動的排除分析により測定した場合に１０５ｐＭ以下のＫｄで哺乳類細胞により発現された配列番号２に特異的に結合する、請求項１又は請求項２の単離された抗原結合蛋白。
【請求項３６】
抗原結合蛋白が、動的排除分析により測定した場合に５０ｐＭ以下のＫｄで哺乳類細胞により発現された配列番号２に特異的に結合する、請求項１又は請求項２の単離された抗原結合蛋白。
【国際調査報告】
2013511279.tif 000202
2013511279.tif 000203
2013511279.tif 000204
2013511279.tif 000205