(57)【要約】  サンプルにおける少なくとも１つの核酸の存在を決定するための方法及び材料であって、上記方法が（１）配列特異的なハイブリッド捕捉を用いた精製工程と、（２）増幅工程と、（３）標的核酸を複数の検出可能に標識した核酸検出プローブと接触させることを含む検出工程であって、各プローブが（ａ）他の検出プローブと異なる検出可能な標識を有し、かつ／又は（ｂ）同じ検出可能な標識を有するプローブと異なる融解温度を有する、検出工程とを含む、サンプルにおける少なくとも１つの核酸の存在を決定するための方法及び材料が提供される。かかる方法に使用するための組成物及びキットも開示する。【選択図】図１
2013528049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおける少なくとも１つの標的核酸を検出する方法であって、
Ａ．該少なくとも１つの標的核酸を精製することであって、
Ａ１．該少なくとも１つの標的核酸を該少なくとも１つの標的核酸に特異的な少なくとも第１の核酸プローブを含むハイブリッドプローブセットとハイブリダイズすることにより、該少なくとも１つの標的核酸の二本鎖核酸ハイブリッドを生成すること、及び、
Ａ２．該サンプルから該二本鎖核酸ハイブリッドを分離し、少なくとも１つの精製された核酸を生成する、分離すること、
により、該少なくとも１つの標的核酸を精製することと、
Ｂ．該少なくとも１つの精製された核酸の少なくとも一部分を増幅し、増幅された核酸を生成する、増幅することと、
Ｃ．該標的核酸を検出することであって、
Ｃ１．該増幅された核酸を少なくとも１つの検出プローブセットと接触させることであって、
Ｃ１（ａ）．該検出プローブセットの各検出プローブが検出可能な標識を有し、
Ｃ１（ｂ）．該検出プローブセットの少なくとも２つの検出プローブが同じ検出可能な標識を保有し、
Ｃ１（ｃ）．同じ検出可能な標識を保有する各プローブが同じ標識を有する他のプローブとは異なる融解温度（Ｔｍ）を有する、
該増幅された核酸を少なくとも１つの検出プローブセットと接触させること、
Ｃ２．該増幅された核酸とハイブリダイズした検出プローブの該検出可能な標識を検出及び特定すること、並びに、
Ｃ３．該検出プローブが該増幅された核酸から解離する温度を検出すること、
により、該標的核酸を検出することと、
を含み、
該標的核酸の同一性を、該検出可能な標識及び該検出プローブが該増幅された核酸から解離する温度の特定により決定することができる、サンプルにおける少なくとも１つの標的核酸を検出する方法。
【請求項２】
二本鎖核酸ハイブリッドが、該二本鎖核酸ハイブリッドをハイブリッド特異的な分子と接触させることにより該サンプルから分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ハイブリッド特異的な分子の結合により、該標的核酸が固相に固定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ハイブリッド特異的な分子が固体支持体と結合するか、又は固体支持体と結合するように適合される、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
標的核酸を該固相に固定させたままで増幅する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
二本鎖核酸ハイブリッドがＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであり、該ハイブリッド特異的な分子が抗ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド抗体又はその断片である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
標的核酸を等温増幅により増幅する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
等温増幅が、（ａ）鎖置換活性を有するポリメラーゼと、（ｂ）ランダムプライマーとを利用する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
等温増幅が全ゲノム増幅を含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
同じ検出可能な標識を含む各プローブがその融解温度に関して、少なくとも０．１℃、又は０．５℃〜１０℃、又は約１℃〜約５℃、又は約５℃異なる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
検出プローブセットの各プローブが、
ｃ１（ｄ）：３６５±２０ｎｍの励起源により励起し、４６０±１５ｎｍの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、
ｃ１（ｅ）：４７０±１０ｎｍの励起源により励起し、５１０±５ｎｍの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、
ｃ１（ｆ）：５３０±５ｎｍの励起源により励起し、５５５±５ｎｍの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、
ｃ１（ｇ）：５８５±５ｎｍの励起源により励起し、６１０±５ｎｍの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、
ｃ１（ｈ）：６２５±１０ｎｍの励起源により励起し、６６０±１０ｎｍの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、及び、
ｃ１（ｉ）：６８０±５ｎｍの励起源により励起し、７１２ｎｍのロングパス検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、
からなる群から選択される少なくとも１つのフルオロフォアを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
検出プローブセットが、プローブの少なくとも３つの群を含み、前記少なくとも３つの群のそれぞれの各プローブが、
α）ｃ１（ｄ）〜ｃ１（ｉ）に記載の単一群内のフルオロフォアを含み、
β）同じ群の他のいかなるプローブとも少なくとも０．１℃異なる融解温度を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
検出プローブセットが、
ｃ１（ｄ）：ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ−１、ｇｙｒＢ−２、ｐａｒＣ及びｐａｒＥからなる群から選択されるシプロフロキサシン耐性標的に特異的な少なくとも１つの検出プローブ、並びに、
ｃ１（ｅ）:ｃａｐＢ２、ｃａｐＢ４、ｐＸＯ１、ｐＸＯ２、ＰＬＡ、ＰＩＭ、ＣＡＦ１、ｔｕｌ４及びｆｏｐＡからなる群から選択されるゲノム標的又はプラスミド標的に特異的な少なくとも１つの検出プローブ、
を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
検出プローブセットが、マイコバクテリウム・ツベルクロシス、ストレプトコッカス属細菌、シュードモナス属細菌、赤痢菌属細菌、カンピロバクター属細菌、サルモネラ属細菌、Ａ型呼吸器合胞体ウイルス、Ｂ型呼吸器合胞体ウイルス；アデノウイルス、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、Ａ型／Ｂ型インフルエンザウイルス、ｈＭＰＶ、１型〜４型パラインフルエンザウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、ボカウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＩＶ、Ｈ１Ｎ１ウイルス、クラジミア、ナイセリア・ゴノレア、トリコモナス・バギナリス、スタフィロコッカス・アウレウス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス、大腸菌、バシラス・アンスラシス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、エルシニア・ペスティス、ビブリオ・コレレ、フランシセラ・ツラレンシス、ブルセラ属細菌、コクシエラ・バーネッティ、マクポウイルス、コクシジオイデス・イミチス、コクシジオイデス・ポサダシ、バークホルデリア・マレイ、バークホルデリア・シュードマレイ、赤痢菌亜種細菌、リケッチア・リケッチイ、リケッチア・プロワツェキイ、クラミドフィラ・シタッシ、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、大痘瘡及び小痘瘡からなる群から選択される病原菌から誘導される核酸に特異的な少なくとも１つの検出プローブを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
増幅された核酸を検出前に及び／又は検出中に断片化する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
増幅された核酸を、
Ａ．該増幅された核酸を制限酵素若しくはヌクレアーゼ、又はその断片に接触させること、
Ｂ．ランダムリボヌクレオチド一リン酸を該増幅された核酸に組み込むとともに、得られる増幅された核酸をアルカリ処理に供すること、並びに、
Ｃ．超音波処理、噴霧及び流体力学的剪断からなる群から選択される手法により、該増幅された核酸を物理的に断片化すること、
からなる群から選択される少なくとも１つの手法により断片化する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
増幅と検出とを同時に行う、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
検出プローブが該増幅された核酸から解離する該温度を、該増幅された核酸を二本鎖核酸特異的な色素と接触させることにより決定する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
二本鎖核酸特異的な色素が、ＳＹＢＲ（商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ（商標）  Ｇｏｌｄ、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、ＹＯ−ＰＲＯ−Ｉ及びＹＯ−ＹＯ−Ｉ、ＳＹＴＯ（商標）９、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ（商標）  Ｐｌｕｓ＋、並びにＥｖａＧｒｅｅｎ（商標）からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
それぞれが検出可能な標識を含む少なくとも３つの核酸プローブを含む検出プローブセットであって、
Ａ．該核酸プローブの少なくとも２つが同じ検出可能な標識を含み、
Ｂ．各プローブが同じ検出可能な標識を含む他のいかなるプローブとも異なる融点を有する、
それぞれが検出可能な標識を含む少なくとも３つの核酸プローブを含む検出プローブセット。
【請求項２１】
融点が少なくとも０．１℃、又は０．５℃〜１０℃、又は約１℃〜約５℃、又は約５℃異なる．請求項２０に記載の検出プローブセット。
【請求項２２】
（ａ１）：各プローブが、３６５±２０ｎｍの励起源により励起し、４６０±１５ｎｍの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、
（ａ２）：各プローブが、４７０±１０ｎｍの励起源により励起し、５１０±５ｎｍの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、
（ａ３）：各プローブが、５３０±５ｎｍの励起源により励起し、５５５±５ｎｍの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、
（ａ４）：各プローブが、５８５±５ｎｍの励起源により励起し、６１０±５ｎｍの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、
（ａ５）：各プローブが、６２５±１０ｎｍの励起源により励起し、６６０±１０ｎｍの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、及び、
（ａ６）：各プローブが、６８０±５ｎｍの励起源により励起し、７１２ｎｍのロングパス検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、
からなる群から選択される少なくとも２つのプローブセットを含む、請求項２０又は２１に記載の検出プローブセット。
【請求項２３】
標的核酸を検出するためのキットであって、
Ａ．少なくとも１つのハイブリッド捕捉プローブ、及び、
Ｂ．請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の検出プローブセットを含み、
任意で、
Ｃ．ポリメラーゼ、又は鎖置換活性を有するポリメラーゼ、
Ｄ．二本鎖核酸特異的な色素、又は少なくとも５０％、少なくとも８０％若しくは少なくとも９９％の飽和度を有する、若しくはＳＹＢＲ（商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ（商標）  Ｇｏｌｄ、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、ＹＯ−ＰＲＯ−Ｉ、ＹＯ−ＹＯ−Ｉ、ＳＹＴＯ（商標）９、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ（商標）  Ｐｌｕｓ＋、及びＥｖａＧｒｅｅｎ（商標）からなる群から選択される、二本鎖核酸特異的な色素、
Ｅ．抗ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド抗体、並びに、
Ｆ．該抗ハイブリッド抗体に結合するように適合した固体支持体、
Ｇ．変性試薬、
Ｈ．ヘリカーゼ、並びに、
Ｉ．増幅された核酸を断片化するための試薬、
の内の１つ又は複数を含む、標的核酸を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は核酸を精製、検出及び特性化するための方法、組成物及びキットに関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は２０１０年５月１９日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３４６，２１８号（その内容全体が参照により本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
サンプルにおける特異的な核酸配列の有無の特定は、現代の研究所及び臨床背景で用いられる多くのアッセイ及び試験の中心となっている。一般的なスキームでは、初めにサンプル由来の核酸は、様々な物理的特性を操作することによりサンプルに存在する他の巨大分子から分離される。例えば、核酸は一般的に、そのホスホジエステル骨格のために中性ｐＨで正味の負電荷を有する。この特性を操作して、アニオン交換樹脂を用いて他の巨大分子から核酸を分離する。別の例として、或る特定の溶媒中での他の巨大分子と比較した核酸の溶解性の差を利用して、核酸をサンプルから抽出する。他にもこのようなスキームが数多く存在する。しかしながら、一般的に精製される核酸の総量に比べて標的核酸の量は極めて少ない。そのため、標的核酸を検出することができるようになるまでに、何らかの増幅が必要となる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の標的増幅方法により特異的なヌクレオチド配列（複数も可）の量を増大するか、又は特異的なヌクレオチド配列（複数も可）を検出可能な標識と反応させ、標識からのシグナルを検出可能なレベルまで増幅する。
【０００４】
現在の核酸検出アッセイは通常、ゲノムのほんの一部を検出するＰＣＲに基づくものである。最先端の増幅フォーマットは、アンプリコンの混入のリスクを排除する「閉管フォーマット」で行うリアルタイムＰＣＲである。
【０００５】
残念なことに、これらの方法の有用性は制限されている。制限の一つは、ＰＣＲ等の標的特異的な増幅方法は本質的にエラーを起こしやすいことである。例えば、プライマーハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを制御することができるが、それでも非特異的なプライマー結合及びプライマー非依存的な増幅の可能性があり、このことが偽陽性の結果につながる場合がある。その上、異なる配列が異なる速度で増幅する場合があり、これにより増幅の偏りが生じる。結果として、単一反応における複数の核酸配列の定量的分析には多くの場合、感度の喪失のおそれがあり、これにより多重化能の制限が起こる。このアプローチの制限は、ＰＣＲの多重化能の制限、及びアンプリコン領域が突然変異した場合の潜在的な偽陰性の結果である。別の要件は、リアルタイムＰＣＲには自動化システムへの適用性を制限する場合がある複雑な熱サイクリング設備が必要とされることである。加えて、他の核酸に比べて低い濃度で存在する標的核酸が、ポリメラーゼから実質的に「マスキングされる（masked）」可能性があり、このことが偽陰性の結果につながる場合がある。かかるアッセイの特異性及び感度の両方を低減する他の因子が存在し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このため、少なくとも１つの特異的配列を含有する少なくとも１つの標的核酸の特異的かつ感度の高い単離及び分析のための方法及び組成物が必要となる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
態様及び実施の形態における本開示は、（１）サンプルからの標的核酸の配列特異的な単離と、（２）単離された標的核酸の増幅と、（３）複数の検出可能に標識された核酸検出プローブを用いる標的核酸の検出であって、各プローブが（ａ）他の検出プローブと異なる検出可能な標識を有し、かつ／又は（ｂ）同じ検出可能な標識を有するプローブと異なる融解温度を有する、複数の検出可能に標識された核酸検出プローブを用いる標的核酸の検出とを含む、少なくとも１つの標的核酸を検出する方法を提供することにより、これらの様々な要求及び課題に対処している。本開示は、かかる方法に使用されるキットにも関する。
【０００８】
一態様では、本方法は、Ａ．少なくとも１つの標的核酸を精製することであって、Ａ１．少なくとも１つの標的核酸を少なくとも１つの標的核酸に特異的な少なくとも第１の核酸プローブを含むハイブリッドプローブセットとハイブリダイズすることにより、少なくとも１つの標的核酸の二本鎖核酸ハイブリッドを生成すること、及びＡ２．サンプルから二本鎖核酸ハイブリッドを分離し、少なくとも１つの精製された核酸を生成する、分離することを含む方法により、少なくとも１つの標的核酸を精製することと、Ｂ．少なくとも１つの精製された核酸の少なくとも一部分を増幅することと、Ｃ．標的核酸を検出することであって、Ｃ１．増幅された核酸を少なくとも１つの検出プローブセットと接触させることであって、Ｃ１（ａ）．検出プローブセットの検出プローブのそれぞれが検出可能な標識を有し、Ｃ１（ｂ）．検出プローブセットの検出プローブの少なくとも２つが同じ検出可能な標識を保有し、Ｃ１（ｃ）．同じ検出可能な標識を保有するプローブのそれぞれが同じ標識を有する他のプローブとは異なる融解温度（Ｔｍ）を有する、増幅された核酸を少なくとも１つの検出プローブセットと接触させること、Ｃ２．標識されたプローブがその核酸配列とハイブリダイズしているか否かを決定することにより、増幅された核酸を検出すること、並びにＣ３．各検出プローブが、該検出プローブが結合した核酸配列から解離する温度を検出することを含む方法により、標的核酸を検出することとを含む。
【０００９】
１つの実施の形態では、二本鎖核酸ハイブリッドは、二本鎖核酸ハイブリッドを二本鎖核酸ハイブリッドと特異的に結合する分子、好ましくは抗ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド抗体に接触させることを含む方法によりサンプルから分離される。
【００１０】
別の実施の形態では、標的を等温増幅、好ましくは全ゲノム増幅を含む方法により増幅する。
【００１１】
別の実施の形態では、増幅された核酸を断片化した後で、それらを検出プローブセットと接触させる。
【００１２】
別の実施の形態では、標的核酸は、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）、ストレプトコッカス属細菌、シュードモナス属細菌、赤痢菌属細菌、カンピロバクター属細菌、サルモネラ属細菌、Ａ型呼吸器合胞体ウイルス、Ｂ型呼吸器合胞体ウイルス；アデノウイルス、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、Ａ型／Ｂ型インフルエンザウイルス、ｈＭＰＶ、１型〜４型パラインフルエンザウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、ボカウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＩＶ、Ｈ１Ｎ１ウイルス、クラジミア、ナイセリア・ゴノレア（Neisseria gonorrhoeae）、トリコモナス・バギナリス（Trichomonasvaginalis）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス、大腸菌（Escherichia coli）、バシラス・アンスラシス（Bacillusanthracis）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、エルシニア・ペスティス（Yersiniapestis）、ビブリオ・コレレ（Vibrio cholerae）、フランシセラ・ツラレンシス（F. tularensis）、ブルセラ属細菌、コクシエラ・バーネッティ（Coxiella burnetii）、マクポウイルス、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、コクシジオイデス・ポサダシ（Coccidioidesposadasii.）、バークホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）、バークホルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）、赤痢菌亜種細菌、リケッチア・リケッチイ（Rickettsia rickettsii）、リケッチア・プロワツェキイ（Rickettsiaprowazekii）、クラミドフィラ・シタッシ（Chlamydophila psittaci）、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、大痘瘡（Variola major）及び小痘瘡（Variola minor）からなる群から選択される病原菌に特異的である。
【００１３】
更なる態様では、少なくともハイブリッドプローブセットと、検出プローブセットとを含む、本明細書に開示される方法を行うためのキットが開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本方法の検出工程に使用することができるＴａｑＭｅｌｔ（商標）プローブの原理を示す図である。１つの行においてプローブを用いて行われる反応は全て共通の標識を共有する。しかしながら、プローブの融解温度が異なる。このため異なる融解温度によって各プローブを特定することが可能である。例えば２列目のプローブは全て同じ融解温度を有するが、異なる標識を有する。このため異なる標識により各プローブを特定することが可能である。このフォーマットは、野生型配列とは異なる温度で融解することにより単一ヌクレオチド多型（「ＳＮＰ」）を検出するプローブを作製することによるこれらのＳＮＰの検出に有用である。
【図２】ライノウイルス、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ１〜ＰＩＶ３）、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルス、Ｂ型アデノウイルス、並びにＡ型呼吸器合胞体ウイルス及びＢ型呼吸器合胞体ウイルス等のウイルス病原菌を検出する１２ｐｌｅｘ多重ＰＣＲにおける例示的な検出プローブセットの有用性を示す図である。加えて、表２に示されるようにＩＤ（ヒトゲノムＤＮＡ）及びＩＣ（プラスミド）の２つの対照を検出する。臨床サンプルをサンプル精製のためにＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ（商標）システム（QiagenGmbH, Hilden, Germany）で処理した。増幅及び検出を、ＴａｑＭｅｌｔ（商標）の原理を使用してＲｏｔｏｒＧｅｎｅＱ（商標）で行った。
【図３】本開示の方法を、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ（商標）システム（QiagenGmbH, Hilden, Germany）を用いて閉管フォーマットにおいてどのようにして実践することができたかを示す図である。
【図４】本開示の検出工程の多重能力を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、サンプルにおける少なくとも１つの標的核酸の存在を決定するための方法、組成物、試薬及びキットを含む。この方法、組成物、試薬、システム及びキットを、病原生物の検出及び特定、並びに特定の疾患に対する遺伝的素因の検出を含むが、これらに限定されない臨床診断目的で使用することができる。他の態様では、この方法及び組成物は、法医学的用途又は生体防御用途における使用に適しているとされる。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「プローブ」という用語は、別の核酸に結合することができる核酸である。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「組織」という用語は、乳房、前立腺、血液、血清、脳脊髄液、肝臓、腎臓、乳房、頭頸部、咽頭、甲状腺、すい臓、胃、結腸、結腸直腸（colorectum）、子宮、子宮頸部、骨、骨髄、精巣、脳、神経組織、卵巣、皮膚及び肺を含むが、これらに限定されないヒト、動物又は植物における任意の組織又は流体を表す。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「プローブセット」という用語は、特定の位置で核酸分子と相互作用することができる３つ以上の作用因子、すなわち配列のセットである。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「標識」はプローブと共有結合又は非共有結合する部分であり、そこで光学的手段又は他の物理的手段により検出することができるシグナルを発生させることができる。
【００２０】
一態様では、サンプルにおいて少なくとも１つの標的核酸を検出する方法であって、（１）サンプルからの標的核酸の配列特異的な単離と、（２）単離された標的核酸の少なくとも一部分の増幅と、（３）複数の検出可能に標識された核酸検出プローブを用いる標的核酸の検出であって、各検出プローブが（ａ）他の検出プローブと異なる検出可能な標識を有し、かつ／又は（ｂ）同じ検出可能な標識を有するプローブと異なる融解温度を有する、複数の検出可能に標識された核酸検出プローブを用いる標的核酸の検出とを含む、サンプルにおいて少なくとも１つの標的核酸を検出する方法が開示される。
【００２１】
Ｉ．サンプル及びサンプル調製
核酸が存在し得る任意のサンプルを出発点として使用することができ、これには臨床生物学的サンプル及び研究用生物学的サンプルを含む検体又は培養物（例えば細胞培養物、微生物培養物及びウイルス培養物）；環境サンプル、例えば水、粉塵、土及び空気のサンプル；食品サンプル及び農業サンプル；並びに精液、毛髪、血液、皮膚及び唾液のサンプルを含む法医学的サンプルが含まれるが、これらに限定されない。生物学的サンプルはヒトを含む動物由来のもの、流体、固体（例えば糞便）、又は組織、並びに乳製品、野菜、食肉及び食肉副産物等の液体又は固体の食品及び飼料の製品及び原料、並びに廃棄物であり得る。環境サンプルとしては、表層物質、土壌、水及び産業サンプル等の環境物質、並びに食品及び乳製品の加工用の機器、装置、設備、器具、使い捨て及び使い捨てではない（non-disposable）製品から得られるサンプルが挙げられる。
【００２２】
別の態様では、サンプルは生物学的サンプルから抽出された核酸を含み得るか、これからなり得るか、又はこれから本質的になり得る。生物学的サンプル又は環境サンプルから核酸を抽出する方法が数多く知られており、これにはフェノール／クロロホルム抽出、アニオン交換クロマトグラフィ、塩化セシウム勾配超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィ、及びシリカ／カオトロピック塩抽出が含まれるが、これらに限定されない。特定の核酸サイズを含むサンプルが望ましい場合、抽出した核酸を更に、ゲル電気泳動によりサイズに従って分離し、ゲルから抽出することができる。
【００２３】
上で述べられるように、本明細書で開示される方法は、サンプルにおける少なくとも１つの標的核酸の検出及び／又はジェノタイピングに関する。少なくとも１つの標的核酸はＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はＤＮＡ及びＲＮＡの両方であってもよく、一本鎖、二本鎖、又は部分的に一本鎖であってもよい。少なくとも１つの標的核酸はより大きな核酸内に含有されていてもよい。少なくとも１つの標的核酸又は少なくとも１つの標的核酸を含むより大きな核酸のいずれの検出も本開示で企図される。
【００２４】
一態様では、核酸は自然発生的な又は合成による核酸であってもよく、これにはＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｔＲＮＡ（ミトコンドリアＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｎＲＮＡ（核ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ｓｃａＲＮＡ（カハール小体特異的ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、リボザイム、リボスイッチ、ウイルスＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）、ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡ）、ｎＤＮＡ（核ＤＮＡ）、ｓｎＤＮＡ（核内低分子ＤＮＡ）等、又はサンプルにおいてバルク核酸と区別することができる任意の他のクラス若しくはサブクラスの核酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
少なくとも１つの標的核酸は、生物学的サンプル及び環境サンプルを含む検体又は培養物（例えば細胞培養物、微生物培養物及びウイルス培養物）で見出される核酸を含み得るが、これらに限定されない。少なくとも１つの標的核酸は、ヒトを含む動物に由来する生物学的サンプル、流体、固体（例えば糞便）、又は組織、並びに乳製品、野菜、食肉及び食肉副産物等の液体又は固体の食品及び飼料の製品及び原料、並びに廃棄物中に見られるものであり得る。少なくとも１つの標的核酸は環境サンプル中に見られるものであってもよく、環境サンプルには表層物質、土壌、水及び産業サンプル等の環境物質、並びに食品及び乳製品の加工用の機器、装置、設備、器具、使い捨て及び使い捨てではない製品から得られるサンプルが含まれる。
【００２６】
少なくとも１つの標的核酸は、他のウイルス（virus）、細菌、抗酸菌又は変形体、例えばマイコバクテリウム・ツベルクロシス、ストレプトコッカス属細菌、シュードモナス属細菌、赤痢菌属細菌、カンピロバクター属細菌、サルモネラ属細菌、Ａ型呼吸器合胞体ウイルス、Ｂ型呼吸器合胞体ウイルス；アデノウイルス、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、Ａ型／Ｂ型インフルエンザウイルス、ｈＭＰＶ、１型〜４型パラインフルエンザウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、ボカウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＩＶ、Ｈ１Ｎ１ウイルス、クラジミア、ナイセリア・ゴノレア、トリコモナス・バギナリス、スタフィロコッカス・アウレウス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス、大腸菌、バシラス・アンスラシス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、エルシニア・ペスティス、ビブリオ・コレレ、フランシセラ・ツラレンシス、ブルセラ属細菌、コクシエラ・バーネッティ、マクポウイルス、コクシジオイデス・イミチス、コクシジオイデス・ポサダシ、バークホルデリア・マレイ、バークホルデリア・シュードマレイ、赤痢菌亜種細菌、リケッチア・リケッチイ、リケッチア・プロワツェキイ、クラミドフィラ・シタッシ、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、大痘瘡及び小痘瘡由来であり得る。
【００２７】
一態様では、少なくとも１つの標的核酸は、子宮頸部サンプル（例えば子宮頸部スワブから得られるサンプル）又は子宮頸部細胞サンプル、アデノイド細胞、肛門上皮細胞、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳汁、リンパ液、喀痰、尿及び精液、他のウイルス、細菌、抗酸菌又は変形体、例えばマイコバクテリウム・ツベルクロシス、ストレプトコッカス属細菌、シュードモナス属細菌、赤痢菌属細菌、カンピロバクター属細菌、サルモネラ属細菌、Ａ型呼吸器合胞体ウイルス、Ｂ型呼吸器合胞体ウイルス；アデノウイルス、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、Ａ型／Ｂ型インフルエンザウイルス、ｈＭＰＶ、１型〜４型パラインフルエンザウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、ボカウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＩＶ、Ｈ１Ｎ１ウイルス、クラジミア、ナイセリア・ゴノレア、トリコモナス・バギナリス、スタフィロコッカス・アウレウス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス、大腸菌、バシラス・アンスラシス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、エルシニア・ペスティス、ビブリオ・コレレ、フランシセラ・ツラレンシス、ブルセラ属細菌、コクシエラ・バーネッティ、マクポウイルス、コクシジオイデス・イミチス、コクシジオイデス・ポサダシ、バークホルデリア・マレイ、バークホルデリア・シュードマレイ、赤痢菌亜種細菌、リケッチア・リケッチイ、リケッチア・プロワツェキイ、クラミドフィラ・シタッシ、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、大痘瘡及び小痘瘡のいずれか一つに関連する核酸に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一である。
【００２８】
一態様では、少なくとも１つの標的核酸はＨＰＶ核酸である。別の態様では、ＨＰＶ核酸はＨＲ−ＨＰＶ型のＨＰＶ  ＤＮＡである。別の態様では、ＨＰＶ核酸はＬＲ−ＨＰＶ型のＨＰＶ  ＲＮＡである。別の態様では、少なくとも１つの標的核酸は、１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型及び８２型のＨＲ−ＨＰＶのいずれか一つ、又は２型、３型、６型、７型、１０型、１１型、１３型、２７型、２８型、３０型、３２型、４０型、４２型、４３型、５３型、５４型、５５型、６１型、６２型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型、８５型、８６型、８７型、８９型、９０型及び９１型のＬＲ−ＨＰＶのいずれか一つである。
【００２９】
別の態様では、複数の標的核酸が標的となる。一態様では、複数の標的核酸は、異なるヌクレオチド配列を有する２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個又は１００個の核酸のセットからなる。標的となる任意の核酸のセットを使用することができる。一態様では、複数の標的核酸はそれぞれが他のものに関連するように選択される。例えば、これに限定されないが、核酸のセットは、構造的に互いに関連するもの（例えば遺伝子ファミリーの成員）、機能的に互いに関連するもの（例えば炎症誘発性サイトカインをコードする核酸）、系統発生的に互いに関連するもの（例えばウイルスのファミリーの異なる成員、例えばＨＰＶファミリーウイルスに特異的な核酸）、異なる細胞型若しくは組織型における差次的発現に関連するもの（例えばマクロファージ関連核酸及び前立腺関連核酸）、又は疾患状態に関連するもの（子宮頸がん関連核酸）であり得る。別の態様では、核酸のセットには関連がない。
【００３０】
一態様では、標的核酸のセットは、１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型及び８２型のＨＲ−ＨＰＶ、又はその任意のサブセットを含むか、これからなるか、又はこれから本質的になる。別の態様では、標的核酸のセットは、２型、３型、６型、７型、１０型、１１型、１３型、２７型、２８型、３０型、３２型、４０型、４２型、４３型、５３型、５４型、５５型、６１型、６２型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型、８５型、８６型、８７型、８９型、９０型及び９１型のＬＲ−ＨＰＶ、又はその任意のサブセットを含むか、これからなるか、又はこれから本質的になる。別の態様では、標的核酸のセットは、１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型及び８２型のＨＲ−ＨＰＶ、又はその任意のサブセット、並びに２型、３型、６型、７型、１０型、１１型、１３型、２７型、２８型、３０型、３２型、４０型、４２型、４３型、５３型、５４型、５５型、６１型、６２型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型、８５型、８６型、８７型、８９型、９０型及び９１型のＬＲ−ＨＰＶ、又はその任意のサブセットを含むか、これからなるか、又はこれから本質的になる。別の態様では、少なくとも１つの標的核酸は、ＨＰＶ、ＨＰＶの遺伝的変異体、ＨＲ−ＨＰＶ型のＨＰＶ  ＤＮＡ、又はＨＲ−ＨＰＶ型のＨＰＶ  ＲＮＡのいずれか一つに関連する核酸に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一である。別の態様では、少なくとも１つの標的核酸は、１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型及び８２型のＨＲ−ＨＰＶのいずれか一つ、又は２型、３型、６型、７型、１０型、１１型、１３型、２７型、２８型、３０型、３２型、４０型、４２型、４３型、５３型、５４型、５５型、６１型、６２型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型、８５型、８６型、８７型、８９型、９０型及び９１型のＬＲ−ＨＰＶのいずれか一つに関連する核酸に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一である。
【００３１】
別の態様では、最大でも（not more than）３５％〜６５％のＧＣ  ＡＴリッチ、４０％〜６０％のＧＣリッチ、４５％〜５５％のＧＣリッチ、又は５０％〜６５％のＧＣリッチである標的核酸が選ばれる。別の態様では、最近接ではない交差反応性の変異体又は種である標的核酸が選択される。
【００３２】
サンプルを回収した後で、サンプルを変性試薬で処理し、少なくとも１つの標的核酸をハイブリダイゼーションさせやすくすることができる。一態様では、サンプルはアルカリ溶液を用いて変性させる。限定するものではないが、好適なアルカリとしては、ＮａＯＨ及びＫＯＨが挙げられる。
【００３３】
タンパク質のアルカリ処理により、検体が効率的にホモジナイズされ、所与のサンプルの分析結果の再現性が確保される。このアルカリ処理は、サンプルの粘度を低減し、動態を増大させ、サンプルをホモジナイズし、サンプルにおける任意の内因性の一本鎖ＲＮＡ核酸、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを破壊することによりバックグラウンドを低減させることもできる。またこのアルカリ処理は、サンプルに存在し得るＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ等の酵素を不活性化するのを助ける。当業者は、ＲＮＡが少なくとも１つの標的核酸である場合（ＤＮＡではない（as opposed to））、フェノール抽出及びＴＣＡ／アセトン沈殿、並びにチオシアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルム抽出用の試薬を含むが、これらに限定されない異なる試薬が好まれ得ることを理解するであろう。
【００３４】
加熱工程を利用する、例えばサンプルを約９５℃に加熱して、核酸の鎖を分離するといったような他の変性方法を用いることができる。ヘリカーゼ等の酵素を使用することもできる。
【００３５】
ＩＩ．精製工程
一態様では、配列特異的な精製工程は、（１）少なくとも１つの標的核酸に特異的な少なくとも１つの核酸プローブを標的核酸とハイブリダイズすることにより標的核酸の二本鎖核酸ハイブリッドを生成することと、（２）サンプルから二本鎖核酸ハイブリッドを分離し、精製された標的核酸を生成する、分離することとを含む。
【００３６】
核酸を含むサンプルをハイブリダイゼーションのために調製した後に、この核酸を少なくとも１つのポリヌクレオチドハイブリッド捕捉プローブと、そのハイブリッド捕捉プローブがその相補体とハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させる。少なくとも１つのポリヌクレオチドハイブリッドプローブは完全長ＤＮＡ、切断ＤＮＡ若しくは合成ＤＮＡ、又は完全長ＲＮＡ、切断ＲＮＡ若しくは合成ＲＮＡであり得る。少なくとも１つの標的核酸がＤＮＡである場合、少なくとも１つのポリヌクレオチドハイブリッドプローブはＲＮＡであってもよい。少なくとも１つの標的核酸がＲＮＡである場合、プローブはＤＮＡであってもよい。
【００３７】
一態様では、単一ポリヌクレオチドプローブが精製工程に使用される。単一ポリヌクレオチドハイブリッド捕捉プローブは、単一標的核酸だけに特異的であっても、又はストリンジェントな条件下で複数の標的核酸とハイブリダイズするように設計してもよい。例えば、これに限定されないが、ポリヌクレオチドプローブは関連核酸の属の高度に保存された領域に対して設計することができ、これによりポリヌクレオチドプローブが、ストリンジェントな条件下でこの属の実質的に全ての核酸とハイブリダイズすることが予測される。
【００３８】
別の態様では、複数のポリヌクレオチドプローブが精製工程に使用される。複数のポリヌクレオチドプローブは、単一標的核酸だけに特異的であっても、又は複数の標的核酸に特異的であってもよい。例えば、これに限定されないが、単一標的核酸に特異的な複数のポリヌクレオチドプローブを、標的核酸を断片化することにより生成することができる。一態様では、各標的核酸に少なくとも１つのポリヌクレオチドハイブリッドプローブが与えられる。別の態様では、各標的核酸に少なくとも２つのポリヌクレオチドハイブリッドプローブが与えられる。
【００３９】
一態様では、ポリヌクレオチドハイブリッドプローブは、ＨＰＶ、ＨＰＶの遺伝的変異体、ＨＲ−ＨＰＶ型のＨＰＶ  ＤＮＡ、若しくはＨＲ−ＨＰＶ型のＨＰＶ  ＲＮＡ、又は１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型及び８２型のＨＲ−ＨＰＶのいずれか一つ、又は２型、３型、６型、７型、１０型、１１型、１３型、２７型、２８型、３０型、３２型、４０型、４２型、４３型、５３型、５４型、５５型、６１型、６２型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型、８５型、８６型、８７型、８９型、９０型及び９１型のＬＲ−ＨＰＶのいずれか一つに関連する核酸に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一である核酸とハイブリダイズ又は結合することが可能である。別の態様では、プローブは、ＨＰＶ、ＨＰＶの遺伝的変異体、ＨＲ−ＨＰＶ型のＨＰＶ  ＤＮＡ、若しくはＨＲ−ＨＰＶ型のＨＰＶ  ＲＮＡ、又は１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型及び８２型のＨＲ−ＨＰＶのいずれか一つ、又は２型、３型、６型、７型、１０型、１１型、１３型、２７型、２８型、３０型、３２型、４０型、４２型、４３型、５３型、５４型、５５型、６１型、６２型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型、８５型、８６型、８７型、８９型、９０型及び９１型のＬＲ−ＨＰＶのいずれか一つと相補的である。
【００４０】
別の態様では、複数のポリヌクレオチドハイブリッドプローブが与えられ、この複数のポリヌクレオチドハイブリッドプローブは標的核酸のセットのそれぞれとハイブリダイズし、標的核酸のセットのそれぞれを精製するように選択される。一態様では、複数のポリヌクレオチドハイブリッドプローブは、１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型及び８２型のＨＲ−ＨＰＶの核酸、又はその任意のサブセットからなる標的核酸のセットの各核酸とハイブリダイズすることが可能である。一態様では、複数のポリヌクレオチドハイブリッドプローブは、２型、３型、６型、７型、１０型、１１型、１３型、２７型、２８型、３０型、３２型、４０型、４２型、４３型、５３型、５４型、５５型、６１型、６２型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型、８５型、８６型、８７型、８９型、９０型及び９１型のＬＲ−ＨＰＶ、又はその任意のサブセットからなる標的核酸のセットの各核酸とハイブリダイズすることが可能である。一態様では、複数のポリヌクレオチドハイブリッドプローブは、１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型及び８２型のＨＲ−ＨＰＶの核酸、又はその任意のサブセット、並びに２型、３型、６型、７型、１０型、１１型、１３型、２７型、２８型、３０型、３２型、４０型、４２型、４３型、５３型、５４型、５５型、６１型、６２型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型、８５型、８６型、８７型、８９型、９０型及び９１型のＬＲ−ＨＰＶ、又はその任意のサブセットからなる標的核酸のセットの各核酸とハイブリダイズすることが可能である。
【００４１】
少なくとも１つの標的核酸を、アルカリ処理を用いて変性させる場合、１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブを中和ハイブリダイゼーションバッファとしても働くことができる（塩基性変性試薬を中和する）プローブ希釈剤で希釈することができる。
【００４２】
ＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブに使用されるプローブ希釈剤は、ＲＮＡの安定性に対してＤＮＡで必要される要件が異なることから、異なり得る。例えば、プローブがＲＮＡである場合、過度のアルカリ性がＲＮＡを破壊する可能性があるため、初めにサンプルを中和し、次いでプローブを添加するか、又は代替的にＲＮＡプローブと中和剤（プローブ希釈剤）とを同時にサンプルに添加することが好ましい。プローブ希釈剤を用いて、プローブを溶解させ、希釈し、またサンプルを略中性のｐＨ、例えば約ｐＨ６〜約ｐＨ９に戻すのを助け、ハイブリダイゼーションにより有利な環境を与えることができる。十分な容量のプローブ希釈剤、好ましくは２分の１容量のサンプルを用いて、塩基処理サンプルを中和することができる。
【００４３】
完全長プローブでは、加熱したアルカリ溶液をサンプルに添加し、次いでプローブ希釈剤を室温でサンプルに添加した後、サンプルを再加熱するものとする。かかるプロセスは二次構造が形成されるのを抑えることができる。抗体は二次構造を有する構造体と不可逆的に結合する傾向がある。切断プローブ又は合成プローブ等の不完全長プローブを使用する場合、二次構造の問題が存在しないため、溶液又はサンプルの加熱の必要はないとされる。一態様では、切断プローブ又は合成プローブとともに使用する場合、サンプルは加熱しない。
【００４４】
変性試薬による処理の後、一定量の中和バッファ、一態様では１つ又は複数のプローブが溶解した記載のプローブ希釈剤を、プローブと少なくとも１つの標的核酸とのハイブリダイゼーション又は結合が起こるのに適切な条件下でサンプルに添加することができる。中和バッファは単一緩衝塩を含有し得る。一態様では、中和バッファは単一緩衝塩以外含有しない。ハイブリダイゼーション条件は、サンプルにおいて１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブを、存在する場合に対応する相補的な核酸配列とアニーリングして、二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分なものである。
【００４５】
本明細書に記載される特定のプローブ及び希釈剤に好適なハイブリダイゼーション条件が利用される。例えば、プローブ及びサンプル核酸を、ハイブリダイゼーション時間、好ましくは少なくとも約５分間〜約３０分間、約５分間〜約２０分間、又は約７分間〜約１５分間、又は約１０分間、及び１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブが対応する相補的な核酸配列とアニーリングするのに十分な上述の範囲内のいずれかの時間（number）、インキュベートすることができる。ハイブリダイゼーション条件には、少なくとも約６５℃、約６８．５℃及び約６７℃〜約７０℃、並びに上述の範囲内のいずれかの温度（number）のハイブリダイゼーション温度が含まれ得る。所与の少なくとも１つの標的核酸及び所与のプローブでは、当業者は、日常的な実験により所望のハイブリダイゼーション条件を容易に決定することができる。当業者は更に、ハイブリダイゼーションの時間と温度とを互いに最適化させなければならないことを理解するであろう。このため、より高いハイブリダイゼーション温度であれば、より短期間でハイブリダイゼーションを行うことができ、その逆もまた同様である。限定するものではないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、温度の増大、０．５Ｍ超へのイオン条件の増大（例えばＮａＣｌ）、又はＰＡＡの濃度の低減により制御することができる。非限定的な例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、高温、例えば少なくとも約６５℃、少なくとも約６８．５℃、約６７℃〜約７０℃、及び約６９℃〜約７０℃の高温でハイブリダイゼーション反応を行うことが含まれ得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、高温、例えば少なくとも約６５℃、少なくとも約６８．５℃、約６７℃〜約７０℃の高温も含まれ得る。
【００４６】
一態様では、サンプルを回収媒体に懸濁し、少なくとも１つの標的核酸を、変性試薬を用いて変性させ、中和バッファに懸濁した核酸プローブとハイブリダイズする。別の態様では、中和バッファはプローブ希釈剤である。別の態様では、プローブ希釈剤は、２．２Ｍ  ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、２．６％ポリアクリル酸、０．７Ｎ  ＮａＯＨ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む。
【００４７】
一態様では、標的核酸の配列特異的な精製がハイブリッド捕捉を用いて行われる。ハイブリッド捕捉は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの生成、及びＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと特異的に結合する分子を使用することによるＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの単離を含む核酸を単離及び分析する方法を表す。ハイブリッド捕捉の様々な態様は、Nazarenko et al., A novel method of HPV genotyping using HybridCaptureR samplepreparation method combined with GP5+/6+ PCR and multiplex detection on LuminexR XMAPR（Journal of Virological Methods 154 (2008) 76-81）及びNazarenko et al.の米国特許第７，６０１，４９７号（それぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【００４８】
二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な分子としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、タンパク質（ＲＮアーゼ（RNase）Ｈ等であるが、これに限定されない）、核酸（アプタマーを含むが、これに限定されない）、又は配列特異的な核酸が挙げられるが、これらに限定されない。アプタマーは、標的とハイブリダイズし、ハイブリダイズしたアプタマーを増幅して、この選抜プロセスを繰り返すことにより、配列のライブラリーから連続的に選択したランダム配列の短いストレッチである。
【００４９】
一態様では、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な分子は、抗ハイブリッド抗体として知られる抗体により捕捉される。別の態様では、抗ハイブリッド抗体を支持体上に固定した後、二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉する。抗体を固体支持体に固定する方法が当該技術分野で既知である。例えば、これに限定されないが、抗体は固体支持体に共有結合的に連結することができる。別の例として、抗体は、例えばタンパク質間相互作用、プロテインＧビーズ、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、カルボキシル基若しくはトシル基等へのＥＤＡＣの結合、又は例えばアフィニティカラムで配列特異的な核酸を用いた固体支持体上への直接的なハイブリダイゼーションにより支持体上に吸着することができる。
【００５０】
別の態様では、抗ハイブリッド抗体を二本鎖核酸ハイブリッドと複合体形成した後、固体支持体上に固定することができる。例えば、これに限定されないが、抗ハイブリッド抗体をビオチン標識にコンジュゲートすることができ、支持体をストレプトアビジン部分にコンジュゲートすることができる。それから抗ハイブリッド抗体／二本鎖核酸ハイブリッド複合体を固体支持体の非存在下で与えることができる。固体支持体を反応混合物に添加する場合、抗ハイブリッド抗体／二本鎖核酸ハイブリッド複合体を、ビオチンコンジュゲートとストレプトアビジン部分との間の相互作用により固体支持体に固定する。
【００５１】
支持体としては、ビーズ；磁性ビーズ（常磁性ビーズ、反磁性ビーズ、強磁性ビーズを含む）、カラム、プレート、ろ紙、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）；ディップスティック；コーティングした管、プレート及びディッシュ；並びに樹脂カラムが挙げられるが、これらに限定されない。液相の抽出が可能であり、結合抗体と結合していない抗体とを分離する能力があれば、あらゆる支持体を使用することができる。ビーズを固定するのに、磁場を印加する場合、常磁性ビーズが、溶液中に残り、液相を抽出又はデカンテーションすることができるという点で特に有用である。電荷の切り替え又はシリカ捕捉を利用する（磁場を印加しない）他のビーズを使用することもできる。
【００５２】
固定された抗ハイブリッド抗体が二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉するのに十分な時間、ハイブリッドを支持体に付着した抗ハイブリッド抗体とインキュベートした。一態様では、支持体はビーズである。
【００５３】
抗ハイブリッド抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。一態様では、抗体はモノクローナル抗体である。一態様では、抗体は、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＡＣ）リンカーにより支持体に結び付く。一態様では、支持体はポリスチレンビーズである。一態様では、抗体と結び付いた支持体又はビーズをビーズ希釈バッファで希釈する。ビーズ希釈バッファは、ビーズ上のタンパク質変性を最小限に抑えるのに有用である。ビーズ希釈バッファの一例は、６％カゼイン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む。
【００５４】
一態様では、抗ハイブリッド抗体をコーティングしたビーズを、約６７℃〜約７０℃で約３０分間、サンプルとインキュベートする。別の態様では、ビーズ及びサンプルを約６８℃〜約６９℃で約３０分間、インキュベートする。更に別の態様では、ビーズ及びサンプルを約６８．５℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション時間は、約５分間〜約６０分間、約１５分間〜約４５分間、約２０分間〜約４０分間、又は上述の範囲内のいずれかの時間の範囲とすることができ、一般的に温度とは反比例関係である。インキュベーション時間、温度及び／又は振盪条件を、所望のように代替的な捕捉動態を達成するように変更することができることが、当業者により理解されるであろう。
【００５５】
上記のような少なくとも１つの標的核酸／プローブハイブリッドの捕捉の後に、捕捉されていない核酸を洗い流すことにより、残りのサンプルから捕捉されたハイブリッドを分離することができる。
【００５６】
ＩＩＩ．増幅工程
少なくとも１つの標的核酸を精製したら、これを増幅する。この時点で増幅を行い、少なくとも１つの標的核酸の量を増大させることにより、本方法の感度を増大させる。
【００５７】
様々な増幅方法を適用することができ、これらは例えば、ローリングサイクル増幅（例えば、Liu, et al.,"Rolling circle DNA synthesis: Small circular oligonucleotidesas efficient templates for DNA polymerases,"（J. Am,Chem. Soc. 118: 1587-1594 (1996)））、等温増幅（例えばWalker, etal.,"Strand displacement amplification-an isothermal, in vitro DNA amplificationtechnique"（Nucleic Acids Res. 20(7): 1691-6(1992)））、リガーゼ連鎖反応（例えば、Landegren, et al.,"ALigase-Mediated Gene Detection Technique,"（Science241 : 1077-1080, 1988）、又はWiedmann, et al.,"Ligase ChainReaction (LCR)-- Overview and Applications,"、ＰＣＲ方法及び適用（Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, NY1 1994) pp. S51-S64.）である。
【００５８】
核酸増幅は、大きく温度サイクリング（temperature cycled）増幅及び等温増幅の２つのカテゴリーに分けることができる。
【００５９】
温度サイクリング増幅では、通常、温度を標的核酸の融点を超えて上昇させ、あらゆる二本鎖部分を「融解させて（melt）」、次いでオリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸の一本鎖部分とアニーリングする温度点まで低下させ、それからプライマーのアニーリングが維持され、かつポリメラーゼが活性である温度まで再び上昇させる。
【００６０】
等温増幅では、温度サイクリングなしでの増幅を可能にする作用物質を反応混合物に添加する。例えば、ヘリカーゼ依存的な増幅（「ＨＤＡ」）では、ヘリカーゼ活性を有する酵素を増幅混合物に添加する。本明細書で使用される場合、「ヘリカーゼ」又は「ヘリカーゼ活性を伴う又はヘリカーゼ活性を有する酵素」は、二本鎖核酸を解くことが可能な任意の酵素を表す。ヘリカーゼには二本鎖核酸を解く機能があり、このため反復融解サイクルの必要がなくなる。例示的なヘリカーゼとしては、大腸菌ヘリカーゼＩ、大腸菌ヘリカーゼＩＩ、大腸菌ヘリカーゼＩＩＩ及び大腸菌ヘリカーゼＩＶ、Ｒｅｐ、ＤｎａＢ、ＰｒｉＡ、ＰｃｒＡ、Ｔ４  Ｇｐ４１ヘリカーゼ、Ｔ４  Ｄｄａヘリカーゼ、Ｔ７  Ｇｐ４ヘリカーゼ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、酵母ＲＡＤが挙げられる。有用であり得る更なるヘリカーゼには、ＲｅｃＱヘリカーゼ、サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス（T. tengcongensis）及びサーマス・サーモフィラス（T.thermophilus）由来の熱安定性ＵｖｒＤヘリカーゼ、サーマス・アクアティカス（T. aquaticus）由来の熱安定性ＤｎａＢヘリカーゼ、並びに古細菌生物及び真核生物由来のＭＣＭヘリカーゼが含まれる。別の例としては、ニック開始性（nick-initiated：切れ目開始性）増幅（「ＮＩＡ」）では、ニック誘導剤を用いて、核酸骨格のホスホジエステル結合の破壊を誘導する。それから鎖置換活性を有するポリメラーゼにより、プライマーとして核酸の一方の鎖と、鋳型としてもう一方の鎖とを用いて、ニックの部位で増幅を開始することができる。本明細書で使用される場合、「ニック誘導剤」は、二本鎖核酸の一方の鎖での２つの隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合の破壊を導入する任意の酵素試薬若しくは化学試薬、又は物理的処理剤を表す。ニック誘導酵素の例としては、Ｂｐｕ１０  Ｉ、ＢｓｔＮＢ  Ｉ、Ａｌｗ  Ｉ、ＢｂｖＣ  Ｉ、ＢｂｖＣ  Ｉ、Ｂｓｍ  Ｉ、ＢｓｒＤ及び大腸菌エンドヌクレアーゼＩが挙げられる。
【００６１】
開示される方法における増幅は温度サイクリング増幅又は等温増幅のいずれかであり得る。増幅の例示的な方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、逆転写酵素（「ＲＴ」）反応、ＲＴ−ＰＣＲ、ＨＤＡ、ＲＴ−ＨＤＡ、高温（thermophilic）ヘリカーゼ依存的な増幅（「ｔＨＤＡ」）、ＲＴ−ｔＨＤＡ、全ゲノム増幅（「ＷＧＡ」）、ＲＴ−ＷＧＡ、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）、ＲＴ−ＬＣＲ、ＮＩＡ及びＲＴ−ＮＩＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
増幅反応を配列依存的な増幅又は配列非依存的な増幅に更に分けることができる。
【００６３】
「配列依存的な増幅」は、標的特異的なプライマーを用いた、サンプルに存在する非標的配列に対する標的配列の特異的な増幅を表す。本明細書で使用される場合、「標的特異的なプライマー」は、標的核酸上の所定の一本鎖領域と結合し、標的核酸のポリメラーゼ依存的な複製を促進させ、選択的に増大させることが可能な一本鎖核酸を表す。
【００６４】
一態様では、増幅は配列特異的な増幅である。別の態様では、一方が各標的核酸内の標的配列の５’側とハイブリダイズし、もう一方が標的配列の３’側とハイブリダイズする標的特異的なプライマー対を用いて、標的配列の指数関数的な増幅を達成する。このため全ての標的核酸が遺伝子型を決定しようとしている可変領域を含み、また可変領域の両側に保存領域が隣接するような配置が有用である。別の態様では、標的特異的な複数のプライマー対を、同時に複数の標的核酸を増幅するために単一反応で利用する。
【００６５】
概して、好適な標的特異的なプライマー対は、短い合成オリゴヌクレオチド、例えば１０ヌクレオチド長を超え、かつ５０ヌクレオチド長未満の合成オリゴヌクレオチドである。標的特異的なオリゴヌクレオチドプライマー設計は、ストリングベースのアラインメントスコア、融解温度、プライマー長及びＧＣ含量等の様々なパラメータを含む。標的特異的なプライマーを設計する場合、重要な要素の一つは、増幅される核酸分子に特異的な標的断片内の配列を選ぶことである。別の重要な要素は、反応のために標的特異的なプライマーの融解温度を算出することである。標的特異的なプライマーの融解温度は、そのオリゴヌクレオチドの長さ及びＧＣ含量により決定される。一態様では、プライマーの融解温度はプライマーのハイブリダイゼーション及び標的の増幅が起こる温度よりも約１０℃〜３０℃高い。
【００６６】
「プライマーハイブリダイゼーション」は、プライマーが鋳型鎖の或る領域でその相補配列とだけ特異的に結合し、鋳型の他の領域とは結合しない条件下での一本鎖核酸鋳型の領域とのオリゴヌクレオチドプライマーの結合を表す。ハイブリダイゼーションの特異性は、オリゴヌクレオチドプライマーの長さ、ハイブリダイゼーション反応を行う温度、イオン強度及び反応混合物のｐＨにより影響を受け得る。
【００６７】
標的特異的なプライマーはそれぞれ、標的核酸の各末端とハイブリダイズし、鋳型として標的ヌクレオチド配列を用いてポリメラーゼにより３’から５’の方向へと伸長することができる。特異的な増幅を達成するために、相同的な又は完全に一致した標的特異的なプライマーが好ましい。しかしながら、標的特異的なプライマーは、５’末端に標的ヌクレオチド配列（複数も可）と非相補的な配列を含んでいてもよい。代替的に、標的特異的なプライマーは、全体にわたって標的核酸と正確に相補的ではないヌクレオチド又は配列を含有していてもよい。
【００６８】
標的特異的なプライマーは、デオキシリボヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、Ｇ若しくはＣのいずれか、及び／又は１つ若しくは複数のリボヌクレオチド塩基Ａ、Ｃ、Ｕ、Ｇ、及び／又は１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）（ここで修飾は、核酸とのプライマーのハイブリダイゼーション、又は標的特異的なプライマーの伸長、又は二本鎖分子の変性を防がないものとする）を含み得る。標的特異的なプライマーをホスホロチオエート若しくはメチルホスホネート等の化学基で、又は非ヌクレオチドリンカーで修飾し、その性能を高めるか、又は増幅産物の特性化を促進することができる。
【００６９】
概して、標的特異的なプライマー−鋳型の認識の特異性を可能にするのに好適な変性、及び続くアニーリングの温度は或る温度範囲、例えば２０℃〜７５℃にわたるものであり得る。好ましい変性温度は、どのヘリカーゼが融解プロセスで選択されるかに応じて選択することができる。選択されたヘリカーゼの存在下での核酸の増幅に最適な温度を決定する試験を、反応混合物の温度を変更し、ゲル電気泳動を用いて増幅産物を比較することで日常的な実験により決定することができる。
【００７０】
更なる態様では、増幅は配列非依存的な増幅である。本明細書で使用される場合、「配列非依存的な増幅」は、特定の配列を増幅しない任意の増幅を表す。例えば、これに限定されないが、ランダムプライマー混合物又はニック誘導剤を用いて、配列非依存的な増幅を開始することができる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「ランダムプライマー混合物」は、ランダムに生成された短いオリゴヌクレオチド配列の混合物を表す。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「ニック開始性ポリメラーゼ活性」は、外因性プライマーの非存在下でのポリメラーゼ活性を表し、これは鋳型における一本鎖破壊により開始する。合成は、外因性の合成プライマーの末端ではなくＤＮＡにおいて一本鎖破壊が起こった場所で開始する。ニック開始性合成では、プライマーの除去が不必要であり、コスト、操作時間、及び産物の喪失又は分解の可能性が低減する。加えて、ニック開始性合成はプライマーの自己伸長により引き起こされる誤った増幅シグナルを低減する。ニックは、認識配列に切れ目を入れる酵素を用いることにより、規定の場所に導入することができるか、又は標的ポリヌクレオチドにランダムに導入することができる。本明細書で使用される場合、「ニック誘導剤」は、二本鎖核酸の一方の鎖での２つの隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合の破壊を導入する任意の酵素試薬若しくは化学試薬、又は物理的処理剤を表す。ニック誘導酵素の例としては、Ｂｐｕ１０  Ｉ、ＢｓｔＮＢ  Ｉ、Ａｌｗ  Ｉ、ＢｂｖＣ  Ｉ、ＢｂｖＣ  Ｉ、Ｂｓｍ  Ｉ、ＢｓｒＤ及び大腸菌エンドヌクレアーゼＩが挙げられる。一態様では、少なくとも１つのニック誘導酵素が、反応混合物におけるヘリカーゼの代替物として含まれる。別の態様では、少なくとも１つのヘリカーゼに加えて少なくとも１つのニック誘導酵素を反応混合物に添加する。
【００７３】
一態様では、増幅は等温増幅である。別の態様では、等温増幅は全ゲノム増幅（「ＷＧＡ」）である。ＷＧＡは、鋳型として標的核酸配列を用いてアンプリコンを生成するのに非特異的なプライマーを用いる等温プロセスである。複数のランダムプライマーを用いるため、ＷＧＡを用いると、実質的に標的核酸を含む分子全体を増幅することができる。例えば、Ｐｈｉ  ２９  ＤＮＡポリメラーゼを非特異的なプライマーと併用して、標的核酸配列を増幅することができる。ポリメラーゼは標的核酸配列に沿って移動しながら、相補的な鎖を置換することができる。置換された鎖は複製のための鋳型となり、これにより生成される高分子量のＤＮＡの収率が高くなる。一態様では、ＷＧＡ反応を、少なくとも１つのヘリカーゼ、少なくとも１つのニック誘導剤、又はその両方を含むように変更する（modified）。ＷＧＡの様々な態様は、Nazarenko et al.の米国特許第７，６０１，４９７号（これはその全体が参照により本明細書に援用される）に記載される。
【００７４】
ＩＶ．検出工程
標的核酸は、（１）その標的核酸を複数のポリヌクレオチド検出プローブを含む少なくとも１つの検出プローブセットと、検出プローブのそれぞれをその相補体とハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させること、（２）ポリヌクレオチド検出プローブの少なくとも１つのハイブリダイゼーションを検出すること、及び（３）標的核酸とハイブリダイズしたポリヌクレオチド検出プローブの融解温度（Ｔｍ）を決定することにより、増幅された核酸のプールから検出される。検出プローブセットのポリヌクレオチド検出プローブは完全長ＤＮＡ、切断ＤＮＡ若しくは合成ＤＮＡ、又は完全長ＲＮＡ、切断ＲＮＡ若しくは合成ＲＮＡであり得る。少なくとも１つの捕捉プローブは少なくとも１つの標的核酸の同一性とは関係なしにＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｙｎＲＮＡ又はＰＮＡであり得る。ポリヌクレオチド検出プローブは、検出可能な標識を受容し得るように検出可能に標識又は適合するものとする。さらに、検出プローブセットは、（１）複数の検出プローブの内の少なくとも２つが同じ検出可能な標識を有し、（２）複数の検出プローブの内の少なくとも２つが異なる検出可能な標識を有し、（３）同じ検出可能な標識を有する複数の検出プローブのいずれもが異なる融解温度（Ｔｍ）を有するように構築されるものとする。
【００７５】
本明細書に記載される特定のプローブ及び希釈剤に好適なハイブリダイゼーション条件が利用される。例えば、プローブ及びサンプル核酸を、ハイブリダイゼーション時間、好ましくは少なくとも約５分間〜約３０分間、約５分間〜約２０分間、又は約７分間〜約１５分間、又は約１０分間、及び１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブが対応する相補的な核酸配列とアニーリングするのに十分な上述の範囲内のいずれかの時間、インキュベートすることができる。ハイブリダイゼーション条件には、少なくとも約６５℃、約６８．５℃及び約６７℃〜約７０℃、並びに上述の範囲内のいずれかの温度のハイブリダイゼーション温度が含まれ得る。所与の少なくとも１つの標的核酸及び所与のプローブでは、当業者は、日常的な実験により所望のハイブリダイゼーション条件を容易に決定することができる。当業者は更に、ハイブリダイゼーションの時間と温度とを互いに最適化させなければならないことを理解するであろう。このため、より高いハイブリダイゼーション温度であれば、より短期間でハイブリダイゼーションを行うことができ、その逆もまた同様である。限定するものではないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、温度の増大、０．５Ｍ超へのイオン条件の増大（例えばＮａＣｌ）、又はＰＡＡの濃度の低減により制御することができる。非限定的な例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、高温、例えば少なくとも約６５℃、少なくとも約６８．５℃、約６７℃〜約７０℃、及び約６９℃〜約７０℃の高温でハイブリダイゼーション反応を行うことが含まれ得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、高温、例えば少なくとも約６５℃、少なくとも約６８．５℃、約６７℃〜約７０℃の高温も含まれ得る。
【００７６】
本明細書で用いられる全てのプローブ（ハイブリッド捕捉プローブ及び検出プローブを含む）は少なくとも１つの標的核酸とだけ特異的に結合する短い合成ＲＮＡプローブであり得る。例としては、２００９年４月１７日付けで出願された米国特許出願第１２／４２６，０７６号（その内容全体が参照により本明細書に援用される）に記載される。
【００７７】
一態様では、検出工程は、（１）増幅された核酸を少なくとも４つの検出プローブを含む検出プローブセットと接触させることであって、（ａ）検出プローブのそれぞれが核酸配列に特異的であり、（ｂ）検出プローブの内の少なくとも２つが同じ標識を保有し、（ｃ）同じ標識を保有するプローブのそれぞれが加熱によりそれらの標的核酸配列から解離する場合、それらのプローブは同じ標識を有する他のプローブと少なくとも２℃異なる融解温度（Ｔｍ）を有する、増幅された核酸を少なくとも４つの検出プローブを含む検出プローブセットと接触させることと、（２）標識されたプローブがその核酸配列に結合しているか否かを決定することにより標識核酸を検出することと、（３）それぞれの所与の標識されたプローブが、それが結合している核酸配列から解離する温度を検出することとを含む。同様の方法が先だって国際公開第２００９１３５８３２号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【００７８】
一実施形態では、検出プローブセットは少なくとも４つの検出プローブを含み、少なくとも２つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【００７９】
別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも４つの検出プローブを含み、少なくとも３つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【００８０】
別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも５つの検出プローブを含み、少なくとも２つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【００８１】
別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも５つの検出プローブを含み、少なくとも３つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【００８２】
別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも５つの検出プローブを含み、少なくとも４つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【００８３】
別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも６つの検出プローブを含み、少なくとも２つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【００８４】
別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも６つの検出プローブを含み、少なくとも３つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【００８５】
別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも６つの検出プローブを含み、少なくとも４つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【００８６】
別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも７つの検出プローブを含み、少なくとも２つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【００８７】
別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも７つの検出プローブを含み、少なくとも３つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【００８８】
別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも７つの検出プローブを含み、少なくとも４つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【００８９】
別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも８つの検出プローブを含み、少なくとも２つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【００９０】
別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも８つの検出プローブを含み、少なくとも３つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【００９１】
別の実施形態では、検出プローブセットは少なくとも８つの検出プローブを含み、少なくとも４つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【００９２】
検出プローブの標識は蛍光標識であり得る。蛍光標識が用いられる場合、２つ以上の標識が０℃〜約１０℃異なる最大発光波長を有すれば、それらは「同じ標識」であるとみなす。
【００９３】
一実施形態では、同じ標識を有する検出プローブが、少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、約５℃〜約１０℃、約５℃〜約８℃、約５℃〜約７℃、約５℃〜約６℃異なる融解温度を有する。本明細書において温度値との関連で、「約」という用語は温度値の最大±１０％の偏差を含むように理解される。
【００９４】
一実施形態では、検出工程は、（１）増幅された核酸を少なくとも２つの検出プローブセットと接触させることであって、（ａ）各検出プローブセットが少なくとも３つの検出プローブからなり、（ｂ）検出プローブのそれぞれが核酸配列に特異的であり、（ｃ）所与の検出プローブセットにおける検出プローブのそれぞれが異なる標識を保有し、（ｄ）所与の検出プローブセットにおける検出プローブの全てが加熱によりそれらの標的核酸配列から解離する場合、それらのプローブは同様の又は同一の融解温度（Ｔｍ）を有する、増幅された核酸を少なくとも２つの検出プローブセットと接触させることと、（２）標識された検出プローブがその核酸配列に結合しているか否かを決定することにより増幅された核酸を検出することと、（３）それぞれの所与の標識された検出プローブが、それが結合している核酸配列から解離する温度を検出することとを含む。
【００９５】
更なる実施形態では、本方法は少なくとも３つの検出プローブセットを含み、各検出プローブセットは少なくとも３つの検出プローブからなる。
【００９６】
検出プローブセットは少なくとも３つの検出プローブを含む。検出プローブセットは、共通の標識を共有するそれらの全ての検出プローブだけでなく、共通の融解温度（Ｔｍ）を共有するそれらの全ての検出プローブとして見ることができる。理想的には、同じ標識又は互いに区別することができない標識を有する検出プローブセットにおける検出プローブは異なる融解温度を有する。同一の又は非常に類似した融解温度を有する検出プローブセットにおける検出プローブは異なる標識を有するものとする。
【００９７】
本明細書に開示される方法を用いて、２０個の異なる標的核酸の多重検出を単一反応で行うことができる。一実施形態では、５つの異なる標識が用いられ、共通の標識を共有する全ての検出プローブはわずかに異なる融解温度を有する。一方で共通の融解温度を共有する全ての検出プローブは異なる標識を有する。増幅中又は増幅後のいずれかで標識及び融解温度を検出することにより、本発明者らは初めて、例えば１つの管における上記の２０個の鋳型の分析を可能にする手段を提供した。
【００９８】
原則として、この「標識されたプローブがその核酸配列に結合しているか否かを決定することにより増幅された核酸を検出すること」及び「それぞれの所与の標識されたプローブが、それが結合している核酸配列から解離する温度を検出すること」を、所与の反応の終了時に又は反応中に行うことができる。
【００９９】
第１の及び第２の又は更なる検出プローブセットにおける検出プローブの標識は、蛍光標識であり、非常に類似した発光波長を有する。このため理想的には、標識は、検出装置により検出することができる波長調整を変えることなく検出することができる。第１の、第２の及び第３の又は更なる検出プローブセットにおけるプローブの標識が同一であることが好ましい。
【０１００】
一実施形態では、標識は、ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン又は６−カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ１  １ＲＤ−７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ１  ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ＰＥＴ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｂｏｔｈｅｌｌ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）  ３５０  ＦＡＭ（商標）、ＳＹＢＲ（商標）  Ｇｒｅｅｎ  １、フルオレセイン、ＥｖａＧｒｅｅｎ（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）  ４８８  ＪＯＥ（商標）、ＶＩＣ（商標）、ＨＥＸ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ（商標）  Ｇｏｌｄ  ５４０、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ（商標）、ＲＯＸ（商標）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ（商標）  Ｒｅｄ  ６１０、Ｃｙ３．５（商標）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）  ５６８  Ｃｙ５（商標）、Ｑｕａｓａｒ（商標）  ６７０、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｒｅｄ６４０（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３  Ｑｕａｓａｒ（商標）  ７０５、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｒｅｄ７０５（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）  ６８０、ＳＹＴＯ（商標）９、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ（商標）  Ｐｌｕｓ＋、ＥｖａＧｒｅｅｎ（商標）の群から選択される蛍光標識である。
【０１０１】
一実施形態では、同じ標識を保有するプローブは、それらが所与の機器で融点により区別可能であるように融解温度（Ｔｍ）が異なる、典型的に０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃、１℃、１．５℃、２℃、２．５℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃又は１０℃を超える融解温度の差異を有する。融解温度の差異が１℃、１．５℃、２℃、２．５℃、３℃、４℃、５℃を超えるのが好ましい。
【０１０２】
一実施形態では、二本鎖セグメントの融解転移は、二本鎖核酸特異的な（ｄｓＮＡＳ）色素の蛍光強度をモニタリングすることにより決定することができる。一実施形態では、二本鎖核酸特異的な色素は、ＳＹＢＲ（商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ（商標）  Ｇｏｌｄ、臭化エチジウム、臭化プロピジウム、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、ＹＯ−ＰＲＯ−Ｉ及びＹＯ−ＹＯ−Ｉ、ＳＹＴＯ（商標）９、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ（商標）  Ｐｌｕｓ＋、ＥｖａＧｒｅｅｎ（商標）からなる群から選択される。これらの飽和色素は、ＰＣＲの阻害を最小限に抑えながら、増幅中に又は増幅後にＤＮＡに関して十分に飽和する条件で存在することが可能である。例えば、最大のＰＣＲ相溶性濃度で、ｄｓＤＮＡ結合色素は少なくとも５０％の飽和度を有する。他の実施形態では、飽和度は少なくとも８０％である。更に別の実施形態では、飽和度は少なくとも９９％である。飽和度は飽和濃度での同じ色素の蛍光と比較した蛍光度であると理解される。飽和濃度は所定の量のｄｓＤＮＡの存在下で可能な限り最大の蛍光強度を与える濃度である。これらの色素は、或る特定の核酸反応に顕著に干渉することなく顕著に高い濃度で存在し得るため、これらの色素は一本鎖核酸及びｄｓＤＮＡの立体構造をモニタリングするのに特に有用であり得る。
【０１０３】
本開示の検出方法の利点の一つ（One）は、検出を増幅工程と同時に行うことができることである。この特徴により、全方法が「閉管」フォーマットで実施される。本方法の閉管フォーマットの例示的なワークフローを図１に示す。
【０１０４】
検出プローブは、様々な標的、例えば疾患マーカー、病原菌、法医学的マーカー又は増幅により対処することができる任意の他の標的に特異的であり得る。本明細書に開示される方法は特に、病原菌の分析に適している。このため、一実施形態では、プライマー及びプローブは１つ又は複数の病原性細菌又はウイルスに特異的である。
【０１０５】
最も一般的な細菌性疾患は、マイコバクテリウム・ツベルクロシス細菌により引き起こされ、年間約２００万人の死者を出している（ほとんどがサハラ以南のアフリカにおけるものである）結核症である。病原性細菌は、他の世界的に重大な疾患、例えばストレプトコッカス属細菌及びシュードモナス属細菌等の細菌により引き起こされ得る肺炎、並びに赤痢菌細菌、カンピロバクター属細菌及びサルモネラ属細菌等の細菌により引き起こされ得る食品媒介の病気に寄与する。
【０１０６】
病原性細菌により、破傷風、腸チフス、ジフテリア、梅毒及びハンセン病等の感染症も引き起こされる。食品又は水を汚染させる主要経路の一つは、未処理の汚水が飲料水供給源へと又は耕作地に放出されることによるものであり、その結果汚染源を口にした（eat or drink）人々が感染状態になる。発展途上国では、ほとんどの汚水を環境へと又は耕作地に流している。これがコレラ、Ａ型肝炎、ポリオウイルス及びロタウイルスの感染体の一般的な伝播様式である。
【０１０７】
多くの呼吸器疾患は、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ１〜ＰＩＶ３）、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルス、Ｂ型アデノウイルス、並びにＡ型呼吸器合胞体ウイルス及びＢ型呼吸器合胞体ウイルスを含む病原性ウイルスにより引き起こされる。
【０１０８】
更には、例えばバシラス・アンスラシス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、エルシニア・ペスティス、ビブリオ・コレレ、フランシセラ・ツラレンシス、ブルセラ属細菌、コクシエラ・バーネッティ、マクポウイルス、コクシジオイデス・イミチス、コクシジオイデス・ポサダシ、バークホルデリア・マレイ、バークホルデリア・シュードマレイ、赤痢菌亜種細菌、リケッチア・リケッチイ、リケッチア・プロワツェキイ、クラミドフィラ・シタッシ、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、大痘瘡及び小痘瘡を含む、一部の病原性細菌及びウイルスは、生物兵器としての使用が考慮される。
【０１０９】
生物兵器用の病原菌バシラス・アンスラシス（B. anthracis）（ＢＡ）、エルシニア・ペスティス（Y. pestis）（ＹＰ）及びフランシセラ・ツラレンシス（ＦＴ）が、軍人及び一般市民の両方を攻撃するのに使用することができる大量破壊兵器となる可能性を有するとして特定されている。これらの３つの生物は、全て感染性の高い病原菌であり、ヒトにとって致命的であるため、生物兵器としての使用に特に好適な病原菌である。これらは全て、エアロゾル形態で送達されることがあり、これによりより致死的な肺疾患状況が引き起こされる。病原性を増大させる、又はワクチン保護を回避するためにバシラス・アンスラシスの抗菌剤耐性株又は遺伝的修飾を秘密裏に用いることが可能である。肺ペストを伴うバイオテロ攻撃では、一部その疾患の伝染性により広範な疾患及びパニックが引き起こされる。１９６９年、世界保健機構は、先進国では５００万人の住民がいる大都市圏での５０ｋｇの病原性フランシセラ・ツラレンシスのエアロゾル散布により、１９０００人の死亡を含め、２５００００人が病気になると予測した。これらの大量破壊兵器の使用の更なる脅威は、診断アッセイを失敗させ、かつ／又は効果的な治療剤の備蓄及び効果的な治療を回避するという目的での意図的な抗生物質耐性株の遺伝子操作である。更には、これらの病原菌の抗生物質耐性株は世界中の地域で自然発生し、秘密裏に行われるローテク方法により単離し、拡散させることができる。
【０１１０】
そのため一実施形態では、標的核酸は、生物兵器として有用であり得る病原菌に特異的な少なくとも１つのゲノムマーカー又はプラスミドマーカーである。更なる態様では、標的核酸は、バシラス・アンスラシス（ＢＡ）、エルシニア・ペスティス（ＹＰ）又はフランシセラ・ツラレンシス（ＦＴ）に特異的な少なくとも１つのマーカーである。別の実施形態では、標的核酸は少なくとも１つのシプロフロキサシン耐性標的である。例示的な標的を表１に示す。
【０１１１】
更なる実施形態では、（１）ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ−１、ｇｙｒＢ−２、ｐａｒＣ及びｐａｒＥからなる群から選択されるシプロフロキサシン耐性標的に特異的な少なくとも１つの検出プローブ、並びに（２）ｃａｐＢ２、ｃａｐＢ４、ｐＸＯ１、ｐＸＯ２、ＰＬＡ、ＰＩＭ、ＣＡＦ１、ｔｕｌ４及びｆｏｐＡからなる群から選択されるゲノム標的又はプラスミド標的に特異的な少なくとも１つの検出プローブを含むか、これからなるか、又はこれから本質的になる検出プローブセットが提供される。
【０１１２】
【表１】
2013528049.tif 000003
【０１１３】
更なる実施形態では、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ−１、ｇｙｒＢ−２、ｐａｒＣ、ｐａｒＥ、ｃａｐＢ２、ｃａｐＢ４、ｐＸＯ１、ｐＸＯ２、ＰＬＡ、ＰＩＭ、ＣＡＦ１、ｔｕｌ４及びｆｏｐＡのそれぞれに特異的な少なくとも１つの検出プローブを含むか、これから本質的になるか、又はこれからなる検出プローブセットが提供される。
【０１１４】
上述のように、増幅工程は全ゲノム増幅を含むことができ、これにより典型的には１０キロベース長を超えるアンプリコンが生じる。通常、プローブベースの検出には、かなり短いアンプリコン、典型的には１００塩基長〜２５０塩基長のアンプリコンが要求される。このため、増幅工程で大きいアンプリコンが生成される場合、検出前にアンプリコンを断片化することが有用となり得る。このようなことを行う方法は当該技術分野で数多く知られており、これには、ＤＮアーゼＩをＭｎ２＋補因子と共に使用する等といった酵素を用いてＤＮＡを断片化する方法の使用（Anderson, S., Nucleic Acids Research, 1981, Vol. 9, No. 13 3015-3027（参照により本明細書に援用される））、及び様々な制限酵素を用いた部分消化（Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., 1989, MolecularCloning: A laboratory manual, 2nd Ed., p. 5.2-5.95, 9.32, ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York（参照により本明細書に援用される））；アンプリコンにおけるランダムリボヌクレオシド一リン酸の組込み、それに続くアルカリ消化；並びに超音波処理、噴霧及び流体力学的剪断等による物理的な断片化が含まれるが、これらに限定されない。このため、一実施形態では、増幅された核酸が検出前に断片化される。
【０１１５】
一実施形態では、ウラシル残基が増幅反応中に組み込まれる。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ）は、大腸菌のｕｎｇ−遺伝子の産物であり、大腸菌（E. coli）でクローニングされ、シークエンシングされ、発現している。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）はＤＮＡ糖−ホスホジエステル骨格を破壊することなく（破壊によりハイブリダイゼーション標的として又はＤＮＡポリメラーゼの鋳型としてのＤＮＡの使用が妨げられる）、ＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡ）からこれらのウラシル残基を除去する。得られる脱塩基部位は高温で加水分解的な切断を起こしやすい。このため、ウラシル塩基の除去は通常、ＤＮＡの断片化と同時に起こる。当業者は汚染を避けるためにウラシルＤＮＡグリコシラーゼを使用する方法を認識している。
【０１１６】
リアルタイムＰＣＲには、サーマルサイクラー、コンピュータ、蛍光励起及び蛍光発光の回収並びにデータ収集用の光学部品（optics）、並びに分析用ソフトウェアからなる機器プラットフォームが要求される。幾つかの製造業者から入手可能なこれらの機械は、サンプル容量（９６ウェル又は３８４ウェルの標準的なプレートフォーマットのものもあれば、より少ないサンプルを処理するか、又は専用のガラス製毛細管が要求されるものもあり、ブロックフォーマットのものもあれば、回転式のものもある）、励起方法（レーザーを使用するものもあれば、波長可変フィルター、又は１つ若しくは複数のダイオードを備える広域スペクトルの光源を使用するものもある）、検出方法（カメラを使用するものもあれば、光電子増倍管又は光検出系タイプのものを使用するものもある）及び全体感度が異なる。ソフトウェアがデータを処理する方法にはプラットフォーム特異的な差異もある。原則として、２つ以上の検出チャネルを有する利用可能な機械が本明細書に開示される方法に適している。
【０１１７】
Ｖ．キット
（１）少なくとも１つのハイブリッド捕捉プローブ、抗ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド抗体及び固体支持体からなる群から選択される少なくとも１つのハイブリッド捕捉成分と、（２）少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの検出プローブを含む検出プローブセットとを含むキットも開示される。
【０１１８】
一実施形態では、キットは少なくとも４つの検出プローブを含み、少なくとも２つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【０１１９】
別の実施形態では、キットは少なくとも４つの検出プローブを含み、少なくとも３つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【０１２０】
別の実施形態では、キットは少なくとも５つの検出プローブを含み、少なくとも２つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【０１２１】
別の実施形態では、キットは少なくとも５つの検出プローブを含み、少なくとも３つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【０１２２】
別の実施形態では、キットは少なくとも５つの検出プローブを含み、少なくとも４つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【０１２３】
別の実施形態では、キットは少なくとも６つの検出プローブを含み、少なくとも２つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【０１２４】
別の実施形態では、キットは少なくとも６つの検出プローブを含み、少なくとも３つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【０１２５】
別の実施形態では、キットは少なくとも６つの検出プローブを含み、少なくとも４つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【０１２６】
別の実施形態では、キットは少なくとも７つの検出プローブを含み、少なくとも２つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【０１２７】
別の実施形態では、キットは少なくとも７つの検出プローブを含み、少なくとも３つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【０１２８】
別の実施形態では、キットは少なくとも７つの検出プローブを含み、少なくとも（at least）４つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【０１２９】
別の実施形態では、キットは少なくとも８つの検出プローブを含み、少なくとも２つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【０１３０】
別の実施形態では、キットは少なくとも８つの検出プローブを含み、少なくとも３つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【０１３１】
別の実施形態では、キットは少なくとも８つの検出プローブを含み、少なくとも４つの検出プローブが同じ標識を保有する。
【０１３２】
一実施形態では、ストリンジェントな条件下で、１つ又は複数の核酸分子とハイブリダイズすることが可能な少なくとも６つのプローブを含むキットであって、ａ）少なくとも３つのプローブの第１の群は第１の標識を保有し、この群のプローブは全て、その融解温度が異なり、ｂ）少なくとも３つのプローブの第２の群は第２の標識を保有し、この群のプローブは全て、その融解温度が異なる、ストリンジェントな条件下で、１つ又は複数の核酸分子とハイブリダイズすることが可能な少なくとも６つのプローブを含むキットが開示される。
【０１３３】
別の実施形態では、ストリンジェントな条件下で、１つ又は複数の核酸分子とハイブリダイズすることが可能な少なくとも９つのプローブを含むキットであって、（ａ）少なくとも２つのプローブの第１の群は第１の標識を保有し、この群のプローブは全て、その融解温度が異なり、（ｂ）少なくとも２つのプローブの第２の群は第２の標識を保有し、（ｃ）少なくとも２つのプローブの第３の群は第３の標識を保有し、この群のプローブは全て、その融解温度が異なり、少なくとも２つのプローブの少なくとも第３の群は第３の標識を保有し、この群のプローブは全て、その融解温度が異なる、ストリンジェントな条件下で、１つ又は複数の核酸分子とハイブリダイズすることが可能な少なくとも９つのプローブを含むキットが開示される。
【０１３４】
融解温度（Ｔｍ）が異なるプローブの融解温度は、少なくとも０．５℃、１℃、１．５℃、２℃、２．５℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃又は１０℃異なる。融解温度の差異が１℃、１．５℃、２℃、２．５℃、３℃、４℃、５℃を超えるのが好ましい。理想的にはプローブの融解温度が約５℃異なる。融解温度に関連して用いられる場合、「約」という語句は、指定の温度に四捨五入してなる（roundable）温度を全て含む。
【０１３５】
理想的には、同じ標識を有するプローブは、融解分析により確実に区別することができるように選択された、融解温度（Ｔｍ）の固定の差異間隔、例えば５℃を有する。かかる実施形態では、例えばフルオレセインで標識されるプローブは、例えば４０℃、４５℃、５０℃及び５５℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。
【０１３６】
別の実施形態では、キットは更に、バッファ、ヌクレオチド及び１つ又は複数の酵素、例えばポリメラーゼを含む。キットはプレミックスとして適合させることができ、ここでは使用者はプローブを添加するだけで十分である。
【０１３７】
キットは、ヒト診断若しくは獣医学的診断に、食品若しくは水を検査するのに、法医学的用途に、生体防御用途に、又は科学的目的に使用することができる。
【０１３８】
サンプルにおける少なくとも１つの標的核酸の検出のためのキットであって、
ｉ．少なくとも１つのポリヌクレオチドハイブリッド捕捉プローブ、
ｉｉ．抗ハイブリッド抗体、
ｉｉｉ．ポリメラーゼ、
ｉｖ．検出プローブセット、
ｖ．任意で抗ハイブリッド抗体に結合するように適合させた常磁性ビーズ、
ｖｉ．任意で変性試薬、
ｖｉｉ．任意でヘリカーゼ、及び
ｖｉｉｉ．任意で増幅された核酸を断片化するための試薬
を含むか、これからなるか、又はこれから本質的になる、サンプルにおける少なくとも１つの標的核酸の検出のためのキットも提供される。
【０１３９】
一態様では、複数のハイブリッド捕捉プローブ及び複数の検出プローブセットがキットに与えられる。
【０１４０】
キットには、開示される方法及びアッセイに関連する手法を説明する取扱説明書も含まれ得る。キットには、患者の情報を文字情報にする（transcribing）手段も含まれ得る。一態様では、この手段としては、患者の情報を伝達することが可能な紙、コンピュータ又はデバイスが挙げられる。キットには、患者のサンプルを採取したのと同じ場所で方法を完了させるのに必要な成分が全て含まれ得る。
【０１４１】
一態様では、キットには、検出アッセイに関連する色分けされた試薬が含まれ得る。試薬バイアルは使い易くするために色分けされ、キットに含まれ得る。試薬瓶は、記号、文字又は他の既知の識別子によっても識別され得る。
【０１４２】
キットの個々の成分が、使用しやすいプラットフォームで一緒になる場合、本明細書に記載のキットの利点の一つは、サンプルの即時検査が与えられることである。これにより、患者の検査結果を迅速に決定することが可能になる。
【０１４３】
一態様では、本開示の方法は、現場で患者のサンプルを回収し、処理し、精製工程を行うことを含み得る。一態様では、サンプルを回収した後、患者のサンプルを回収したのと同じ場所で本方法の工程の一部を実施する。その場所は、村落、診療所、研究所、又は個人が健康診断及び医学的評価を受ける共用エリアであり得る。その場所は常設又は仮設であってもよい。一態様では、核酸はサンプルを採取する場所とは異なる研究所又は診療所等の場所で検出する。一態様では、キットは発展途上国、又は医療を受ける機会を容易に利用することができない地理的地域で使用するために設計される。
【０１４４】
この方法は更に、ＳＴＭサンプル及びＰＣサンプルに対応可能である。
【０１４５】
以下の実施例は例示的なものにすぎず、本開示を限定する意図は全くない。
【実施例】
【０１４６】
この実験では、図２に示されるワークフローの実行可能性を実証する。表２で示されるように反応物を構成し、四重で設定して、表３に示すプロトコルを用いて実施した。
【０１４７】
【表２】
2013528049.tif 000004
【０１４８】
【表３】
2013528049.tif 000005
【０１４９】
この目的で、表４の試薬を使用した。
【０１５０】
【表４】
2013528049.tif 000006
【０１５１】
２０×プライマーミックス及び５０×プローブミックスの組成をそれぞれ、表５及び表６に示す。
【０１５２】
【表５】
2013528049.tif 000007
【０１５３】
【表６】
2013528049.tif 000008
【０１５４】
プライマー及びプローブの配列を表７に示す。
【０１５５】
【表７】
2013528049.tif 000009
【０１５６】
ＰＣＲにおける鋳型核酸として、ヒト白血球由来のｃＤＮＡと、表７に示す各標的のそれぞれのｆｏｒプライマー及びｒｅｖプライマーとを用いて、ＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物をＱｉａＱｕｉｃｋ（Qiagen）ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、１０００倍希釈で使用した。鋳型を表８に示す個々の反応物に添加した。
【０１５７】
【表８】
2013528049.tif 000010
【０１５８】
第１の場合「ＩＣ単独」では、内部陽性対照として機能するＵｂｉ鋳型だけを添加した。第２の場合では、Ｕｂｉ  ＩＣ及び標的１であるＡｌｂを添加した。第３の場合では、Ｕｂｉ  ＩＣ及び標的２であるＣｍｙｃを使用した。第４の場合では、Ｕｂｉ  ＩＣ及び標的３であるＴＢＰを導入した。第５の場合では、Ｕｂｉ  ＩＣ及び標的４であるＧＡＰを添加した。第６の場合では、Ｕｂｉ  ＩＣ及び標的５であるＳＲＹを鋳型として添加した。
【０１５９】
リアルタイムＰＣＲを、７２箇所のロータを備えるＲｏｔｏｒＧｅｎｅ  ６０００  ＰＣＲシステム（６チャネル）で行った。６つの検出チャネルの詳細を、それぞれのチャネルで検出するのに好適な蛍光色素の例を挙げている表９に示す。
【０１６０】
【表９】
2013528049.tif 000011
【０１６１】
ＰＣＲサイクリングのパラメータ及びその後の融解曲線を表３に示す。続いて実行データを、適切な機器ソフトウェアを用いて分析した。内部対照（ＩＣ）及びそれぞれの標的のリアルタイムＰＣＲで観察されるＣＴ値を表１０に示す。
【０１６２】
【表１０】
2013528049.tif 000012
【０１６３】
プローブの融点（図８に示される融解ピークの最大値）を決定し、結果を表１１に示す。
【０１６４】
【表１１】
2013528049.tif 000013
【０１６５】
四重の反応物に対する６つの異なる実験条件（表８）で観察された融解ピークを図４に示す。全ての反応物は予測された結果を示し、これにより正しい検出チャネルでのＣＴ値及び添加された標的を検出するそれぞれのプローブに関して予測される融点を有する融解ピークが示された。
【図１】
2013528049.tif 000014
【図２】
2013528049.tif 000015
【図３】
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【図４】
2013528049.tif 000017
【配列表】
2013528049000001.app
【国際調査報告】
2013528049.tif 000018
2013528049.tif 000019
2013528049.tif 000020
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