(57)【要約】分離された真菌が記載される。分離された真菌は、1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物を産生する。1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物を製造するための方法もまた、記載される。この方法は、少なくとも一つの化合物を産生するのに十分な条件の下で、容器において培養培地上またはその中で真菌を培養する段階を含む。2013528050.tif 000009
2013528050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物を産生する、分離された真菌。
【請求項２】
ヒポキシロン属（Hypoxylon）由来である、請求項1記載の分離された真菌。
【請求項３】
Co27-5（NRRL 50500として寄託されている）、C14A（NRRL 50501として寄託されている）、Ti-13（NRRL 50502として寄託されている）、およびEc-38（NRRL 50503として寄託されている）からなる群より選択される分離株である、請求項2記載の分離された真菌。
【請求項４】
ノデュロスポリウム属（Nodulosporium）由来である、請求項1記載の分離された真菌。
【請求項５】
ダルジニア属（Daldinia）由来である、請求項1記載の分離された真菌。
【請求項６】
ムスコドル属（Muscodor）由来である、請求項1記載の分離された真菌。
【請求項７】
1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物を製造するための方法であって、該少なくとも一つの化合物を製造するのに十分な条件の下で、容器において培養培地上またはその中で真菌を培養する段階を含む、方法。
【請求項８】
培養培地からまたは容器中の蒸気から、少なくとも一つの化合物を分離する段階をさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
真菌が、ヒポキシロン属由来である、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
真菌が、Co27-5（NRRL 50500として寄託されている）、C14A（NRRL 50501として寄託されている）、Ti-13（NRRL 50502として寄託されている）、およびEc-38（NRRL 50503として寄託されている）からなる群より選択される分離株である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
真菌が、ノデュロスポリウム属由来である、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
真菌が、ダルジニア属由来である、請求項7記載の方法。
【請求項１３】
真菌が、ムスコドル属由来である、請求項7記載の方法。
【請求項１４】
1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物を作製するためのキットであって、該少なくとも一つの化合物の作製用に真菌を増殖させるための、少なくとも一種の真菌および指示書を含む、キット。
【請求項１５】
1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物の合成または産生に関与するポリペプチドをコードする、真菌由来の単離された核酸分子。
【請求項１６】
1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物の、増加した産生速度または産生量を有する真菌の変異株を作製するための方法であって、以下を含む方法：
真菌の胞子を変異させる段階；
変異した胞子を培養する段階；ならびに
1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物の増強された産生速度または産生量について、変異した胞子の培養物をスクリーニングする段階。
【請求項１７】
真菌が、ノデュロスポリウム属由来である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
真菌が、ダルジニア属由来である、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
真菌が、ヒポキシロン属由来である、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
真菌が、Co27-5（NRRL 50500として寄託されている）、C14A（NRRL 50501として寄託されている）、Ti-13（NRRL 50502として寄託されている）、およびEc-38（NRRL 50503として寄託されている）からなる群より選択される分離株である、請求項19記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2010年5月18日に出願された米国特許仮出願第61/345,918号の優先権を主張し、その開示全体は、本明細書において示されるように全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
揮発性有機化合物（VOC）の特定および製造は、多くの商工業の発展および拡大において駆動力であり続ける。例えば、一般的にユーカリプトールと呼ばれる1,8-シネオールは、精油の70〜85％を構成する、ユーカリ油の薬学的に活性を有する成分である。ユーカリ油の伝統的な使用は、主に、処方箋の無い調合薬、芳香剤、および脱脂界面活性剤を含む（Opdyke, 1975, Food and Cosmetics Toxicology 13: 91-112（非特許文献1）；Hong and Shellock, 1991, American Journal of Physical Medicine and Rehabilitation 70:29-33（非特許文献2）；Leung, Y. (1980). Eucalyptus. New York: Wiley.（非特許文献3）；Furia, T., & Bellanca, N. (1971). Fenaroli's Handbook of Flavor Ingredients. Cleveland, Ohio: Chemical Research Co.（非特許文献4）；Barton, et al., 1997, Chemistry in Australia 64:4-6）（非特許文献5）。1,8-シネオールはまた、エタノール-ガソリン燃料ブレンドにおいて添加物として使用されると相分離を予防することが示されているため、代替燃料製造において潜在的用途を有し（Barton and Tjandra, 1989, Fuel 68:11-17（非特許文献6））、かつ、ガソリン／ユーカリ油混合物から構成される代替燃料（主要な燃料成分として1,8-シネオールを有する）は、改善されたオクタン価および減少した一酸化炭素排気を結果としてもたらした（米国特許第4,297,109号（特許文献1））。
【０００３】
また、フェンチョカンホロンは、フェンチェン中間体を介したフェンコールの誘導体であり、それらは両方ともモノテルペンである（Croteau, et al., 1988, Journal of Biological Chemistry 263:15449-15453（非特許文献7））。同様の派生物のモノテルペンでもあるフェンチョンは、ウイキョウ種子油の主要な構成要素として見出されている揮発性化合物である（Azeez, S. (2008). Fennel. In Chemistry of Spices, pp. 227-241. Edited by Parthasarathy, V.A., Chempakam, B., & Zachariah, T. Cambridge, MA: CAB International.（非特許文献8））。ウイキョウ油はまた、植物精油と考えられており、かつその強い香りが評価されているが、抗酸化物質、肝保護剤、抗癌剤としても認知されており、かつ他の生物活性がそれについて記載されている（Azeez 2008；Cosimi et al., 2009, Journal of Stored Products Research 45:125-132（非特許文献9））。
【０００４】
別の例は、1,4-シクロヘキサジエンであり、それは、多くの精油に関連する成分である天然のモノテルペン誘導体、γ-テルピネンを生じる、引火性の高いシクロアルケンである。1,4-シクロヘキサジエンはまた、多数の様々な方法により容易に酸化されてベンゼンになり（Breton, et al., 2005, Electrochemistry Communications 7:1445-1448（非特許文献10）；Smith and Gray, 1990, Catalysis Letters 6:195-200（非特許文献11）；Hepworth et al., 2002, Aromatic Chemistry, pp.129-134（非特許文献12）；Brooks, B.T. (1922). The Cyclic Non-benzoid Hydrocarbons: The Cyclohexane Series. In The Chemistry of Non-benzoid Hydrocarbons and Their Simple Derivatives, pp. 278-383. Edited by B.T. Brooks. New York, NY: Chemical Catalog Company, Inc.（非特許文献13））、工業化学において複数の用途をもたらす。ベンゼンは、原油およびガソリンの天然成分であり、かつ、プラスチック、ナイロン、および樹脂、ならびにいくつかのタイプのゴム、界面活性剤、潤滑剤、色素、および農薬の製造において広く使用される化学物質である（Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR)(2007). Toxicological Profile for Benzene (Update). Atlanta, GA: U.S. Department of Public Health and Human Services, Public Health Service（非特許文献14））。
【０００５】
しかしながら、これらの揮発性化合物、特に1,8-シネオールの広範な工業的用途における主要な制限因子は、その生物学的供給源に関係する。現在、このモノテルペノイドは、単に、ユーカリ属（Eucalyptus）のある特定の種に限定されているが、ロスマリナス・オフィシナリス（Rosmarinus officinalis）（ローズマリー）、およびタイマス・バルガリス（Thymus valgaris）（タイム）（Thomas, et al., 2000, Chemical Industry Digest (Special Millennium Issue)pp. 104-108（非特許文献15））、メラレウカ・テレチホリア（Melaleuca teretifolia）（Southwell, et al., 2003, Journal of Essential Oil Research 15:339-341（非特許文献16））、およびメンタ・スピカタ（Mentha spicata）（Cook, et al., 2007, The Journal of Essential Oil Research 19:225-230（非特許文献17））もまた含む植物により産生されている。これらの化合物についての新規かつより豊富な供給源は、それらの工業的応用プロファイルを有意に進歩させることができるであろう。
【０００６】
生きている植物の組織に常在している微生物である内生菌（Stone et al., Microbial Endophytes, Ed. C. W. Bacon and J.F. White Marcel Decker, Inc, NY, 2000（非特許文献18））は、相対的に研究されておらず、かつ、医療、農業、および工業における活用のための新規の天然産物の潜在的な供給源である。地球上に存在するほぼ300,000の植物種について、各個々の植物が一つまたは複数の内生菌の宿主であることは、注目する価値がある。これらの植物の一握りが、その内生生態に関連してこれまで完全に研究されているのみである。従って、様々な状況および生態系における無数の植物の間で、新たなかつ興味深い内生微生物を見出す見込みは大きい。非常に多くの珍しい環境において増殖する、事実上何百万もの独特の生物学的ニッチ（高等植物）を占める非常に多くのものが存在するため、現在、内生菌は、生理活性天然産物の優れた供給源としてみなされている。
【０００７】
微生物が、工業的有用性を有する化学化合物、酵素、および他の複合体の生成源となり得ることは、よく受け入れられる。内生菌が新規の生理活性産物を産生するという期待は、いくつかの内生菌がそのそれぞれの高等植物と共進化している可能性があり、かつ結果としてそれらの宿主のある特定の植物化学的特性を生じる可能性があるという見解に由来する（Strobel and Daisy, 2003, Microbiology and Molecular Biology Reviews 67:491-502（非特許文献19）；Tan and Zou, 2001, Nat. Prod. Rep. 18:448-459（非特許文献20））。微生物の生活型の存在により作られる莫大な多様性は、深海の堆積物から地上の温泉に渡る新規のニッチに生息する能力により増幅される。内生真菌は、一つのそのような生物学的ニッチに生息し、かつ生きている植物組織に無症候性にコロニー形成する能力を特徴とする。無数の潜在的な新規の真菌の属が存在し、そのうち内生菌は有意な割合を構成する（Smith, et al., 2008, PloS 1 3(8):e3052（非特許文献21））。最も大きな植物多様性を呈する生態系はまた、外観上、微生物内生菌の最も大きな存在度および多様性を呈する。結局、そのような高度に競合的な生態系においては恒常的な化学的革新が必要とされるため、生物学的多様性が化学的多様性を暗示する。従って、抗生物質、抗ウイルス化合物、抗癌剤、抗酸化物質、殺虫薬、抗糖尿病剤、および免疫抑制化合物としての使用を包含する、天然産物の活性を有する新規の内生微生物の探索は、進行中である（Strobel and Daisy, 2003, Microbiology and Molecular Biology Reviews 67:491-502（非特許文献19））。
【０００８】
一つのそのような内生菌は、ヒポキシロン属（Hypoxylon）の種であり、それは、カナリア諸島自生の常緑樹であり、豊富には生えていないが、テネリフェを含むいくつかの島でラウリシルバ（Laurisilva）において見られるパーシア・インディカ（Persea indica）の真菌内生菌である。ワニナシ属（Persea）の種はまた、中央アメリカおよび南アメリカにも自生しており、後に南カリフォルニアに導入された（Zentmyer, et al., 1990, California Avocado Society 1990 Yearbook 74:239-242（非特許文献22））。
【０００９】
疑いなく、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエンおよび(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンなどの他の揮発性有機化合物の中での、1,8-シネオールの真菌供給源による産生は、広範な工業的用途におけるそのような化合物の使用にとって重要な意味合いを有するであろう。従って、真菌により産生される揮発性有機化合物の特定および産生について必要性が存在する。本発明は、この必要性を満足させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第4,297,109号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Opdyke, 1975, Food and Cosmetics Toxicology 13: 91-112
【非特許文献２】Hong and Shellock, 1991, American Journal of Physical Medicine and Rehabilitation 70:29-33
【非特許文献３】Leung, Y. (1980). Eucalyptus. New York: Wiley.
【非特許文献４】Furia, T., & Bellanca, N. (1971). Fenaroli's Handbook of Flavor Ingredients. Cleveland, Ohio: Chemical Research Co.
【非特許文献５】Barton, et al., 1997, Chemistry in Australia 64:4-6）
【非特許文献６】Barton and Tjandra, 1989, Fuel 68:11-17
【非特許文献７】Croteau, et al., 1988, Journal of Biological Chemistry 263:15449-15453
【非特許文献８】Azeez, S. (2008). Fennel. In Chemistry of Spices, pp. 227-241. Edited by Parthasarathy, V.A., Chempakam, B., & Zachariah, T. Cambridge, MA: CAB International.
【非特許文献９】Azeez 2008；Cosimi et al., 2009, Journal of Stored Products Research 45:125-132
【非特許文献１０】Breton, et al., 2005, Electrochemistry Communications 7:1445-1448
【非特許文献１１】Smith and Gray, 1990, Catalysis Letters 6:195-200
【非特許文献１２】Hepworth et al., 2002, Aromatic Chemistry, pp.129-134
【非特許文献１３】Brooks, B.T. (1922). The Cyclic Non-benzoid Hydrocarbons: The Cyclohexane Series. In The Chemistry of Non-benzoid Hydrocarbons and Their Simple Derivatives, pp. 278-383. Edited by B.T. Brooks. New York, NY: Chemical Catalog Company, Inc.
【非特許文献１４】Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR)(2007). Toxicological Profile for Benzene (Update). Atlanta, GA: U.S. Department of Public Health and Human Services, Public Health Service
【非特許文献１５】Thomas, et al., 2000, Chemical Industry Digest (Special Millennium Issue)pp. 104-108
【非特許文献１６】Southwell, et al., 2003, Journal of Essential Oil Research 15:339-341
【非特許文献１７】Cook, et al., 2007, The Journal of Essential Oil Research 19:225-230
【非特許文献１８】Stone et al., Microbial Endophytes, Ed. C. W. Bacon and J.F. White Marcel Decker, Inc, NY, 2000
【非特許文献１９】Strobel and Daisy, 2003, Microbiology and Molecular Biology Reviews 67:491-502
【非特許文献２０】Tan and Zou, 2001, Nat. Prod. Rep. 18:448-459
【非特許文献２１】Smith, et al., 2008, PloS 1 3(8):e3052
【非特許文献２２】Zentmyer, et al., 1990, California Avocado Society 1990 Yearbook 74:239-242
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物を産生する分離された真菌に関連する。一つの態様において、真菌は、ヒポキシロン属由来である。さらなる態様において、真菌は、分離株Co27-5（NRRL 50500として寄託されている）である。別の態様において、真菌は、分離株C14A（NRRL 50501として寄託されている）である。別の態様において、真菌は、分離株Ti-13（NRRL 50502として寄託されている）である。別の態様において、真菌は、分離株Ec-38（NRRL 50503として寄託されている）である。別の態様において、真菌は、ノデュロスポリウム属（Nodulosporium）由来である。別の態様において、真菌は、ダルジニア属（Daldinia）由来である。別の態様において、真菌は、ムスコドル属（Muscodor）由来である。
【００１３】
本発明はまた、1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物を製造するための方法に関連する。この方法は、少なくとも一つの化合物を産生するのに十分な条件の下で、容器において培養培地上またはその中で真菌を培養する段階を含む。一つの態様において、前記方法は、培養培地からまたは容器中の蒸気から、少なくとも一つの化合物を分離する段階をさらに含む。さらなる態様において、真菌は、ヒポキシロン属由来であり、例えば、分離株Co27-5、C14A、Ti-13、またはEc-38のうちの一つである。別の態様において、真菌は、ノデュロスポリウム属由来である。別の態様において、真菌は、ダルジニア属由来である。別の態様において、真菌は、ムスコドル属由来である。
【００１４】
本発明はまた、1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物を作製するためのキットに関連する。キットは、少なくとも一つの化合物の製造用に真菌を増殖させるための、少なくとも一種の真菌および指示書を含む。
【００１５】
本発明はまた、1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物の合成または産生に関与するポリペプチドをコードする、真菌から単離された核酸分子に関連する。
【００１６】
本発明はまた、1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物の、増加した産生速度または産生量を有する真菌の変異株を作製するための方法に関連する。この方法は、真菌の胞子を変異させる段階、変異した胞子を培養する段階、ならびに、1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物の増強された産生速度または産生量について、変異した胞子の培養物をスクリーニングする段階、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明を例証する目的で、本発明のある特定の態様が図面に示される。しかしながら、本発明は、図面に示される態様の正確な配置および手段に限定されない。
【００１８】
【図１】ヒポキシロン属の種によるVOC産生をモニタリングするために使用されるPTR-質量分析計を示す。ヒポキシロン属の種の培養は、7日で121.6 cm2の寒天斜面を覆う100.5 mg乾燥重量の表面菌糸体を生じた。モニタリングは、真菌を寒天表面上に接種してから2.5日後に開始した。挿入画は、培養フラスコ中へのガスフローを調節するために使用される機器の詳細を示す。制御装置スイッチは、対照瓶（PDAのみ）から真菌培養物へのガスの投入を連続的に変化させる。コンピュータースクリーンは、ガス相において見出される個々のイオンの連続的産出量を示す。
【図２】図2Aおよび2Bから構成され、上側（2A）および下側（2B）の両方からの、PDA上で増殖させたヒポキシロン属の種の10日間培養物を示す。写真のより暗い外観は、緑色を帯びた黄褐色の呈色の様々な程度を表す。
【図３】ノデュロスポリウム属の種（CI-4）の分枝型分生子柄のSEM画像であり、分生子柄の出芽小胞由来の分生子および瘢痕を示す。
【図４】ヒポキシロン属の種（CI-4）の、20種の他の近い分類群との進化的関係を示す図である（BLASTに基づく）。進化的歴史を、近隣結合法を用いて推測した（Saitou and Nei, 1987, Molecular Biology and Evolution 4:406-425）。分枝長の合計＝0.83699359を有する最適な系統樹を示す。ギャップを含有する位置およびデータが無い位置すべてを、データセットから排除した（complete deletion option）。最終的なデータセットに、合計で307の位置が存在した。系統発生解析は、MEGA4において実施した（Tamura, et al., 2007, Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599）。
【図５】真菌の揮発性有機化合物である、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン（左上）、1,8-シネオール（右上）、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロン（下）の構造描写である。
【図６】ヒポキシロン属の種の5日間培養物の上部空間のPTR質量スペクトルである。
【図７】測定しかつPTR質量スペクトルデータから計算した時間の関数としての、ヒポキシロン属の種のVOCにおける個々の化合物の産生のグラフである。121のm/zは、質量が120である一連のプロトン化環状アルカン／アルケンである可能性が高い（本明細書における表3を参照されたい）。1,8シネオールを含むテルペンは、質量81、137、および155を生じる化合物の寄与から計算された。すべての計算値は、PDAバックグラウンド対照フラスコを引いたものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本発明は、印象的な範囲の揮発性有機化合物（VOC）、とりわけ、最も注目すべきことに、1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンを産生することができる、分離された真菌株に関連する（下記の表3を参照されたい）。本発明はまた、真菌からそのようなVOCを製造する方法、ならびに、商業的および／または工業的使用のために製造されたVOCを収集または回収する方法に関連する。
【００２０】
本発明は、多数のヒポキシロン属の種を含む選択された真菌が、印象的な範囲のVOC、最も注目すべきことに1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンを産生するという発見に基づく。デンプンおよび／または糖関連基質を含有する培地が、真菌によるVOC産生を最も良好に支持する。VOCの直接のオンライン定量は、連続範囲を扱うプロトン移動質量分析計（PTR-MS）により測定し、最適なVOC産生は6日に起こり145 ppmvであり、産生速度は7.65 ppmv/時間であった。これは、1,8-シネオール（モノテルペン）が、この化合物の新規のかつ重要な供給源となる微生物により産生されることを実証した。1,8-シネオールは、オクタン誘導体であり、かつ下記の表3に列挙されるこの生物の他のVOCと同様に、燃料添加物として潜在的用途を有する。従って、本明細書において記載されるヒポキシロン属の種および他の真菌により産生されるような、本化合物および他のVOCの真菌による調達は、医療、工業、およびエネルギー生産におけるそれらの潜在的用途を大幅に拡大する。
【００２１】
定義
他の方法で定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が記載される。
【００２２】
本明細書において使用される際、以下の用語の各々は、本節におけるものに関連する意味を有する。
【００２３】
「a」および「an」という冠詞は、本明細書において、冠詞の文法上の目的語の一つまたは一つより多く（すなわち、少なくとも一つ）を指すように使用される。例として、「元素」とは、一つの元素または一つより多い元素を意味する。
【００２４】
量、時間的継続期間などのような測定可能な値を指す時に本明細書において使用される「約」とは、開示される方法を実施するのに適切であるような、特定化された値から±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、およびまたより好ましくは±0.1％の変動を包含することを意味する。
【００２５】
本明細書において使用される際、「炭化水素」という用語は、一般に、炭素（C）および水素（H）元素からなる化学化合物を指す。すべての炭化水素は、炭素主鎖およびその主鎖に付加された水素の原子からなる。炭化水素は、主要な化石燃料（石炭、石油、天然ガスなど）および生物燃料、ならびにプラスチック、ろう、溶剤、および油の構成要素を包含するため、経済的に最も重要である。
【００２６】
「真菌（「fungus」または「fungi」）」という用語は、多種多様の、葉緑素が無い有核の胞子を生む生物を含む。真菌の例は、酵母、糸状菌、白カビ、サビ菌、およびキノコを含む。
【００２７】
「細菌」という用語は、明確な核を有さない任意の原核生物を含む。
【００２８】
「分離された」という用語は、ヒトの行為を通して、天然状態または生物学的ニッチから変更されたかまたは取り出されたことを意味する。
【００２９】
「抗生物質」という用語は、微生物を殺傷または阻害することができる任意の物質を含む。抗生物質は、微生物により、または合成過程もしくは半合成過程により産生され得る。従って、該用語は、真菌を阻害または殺傷する物質、例えば、シクロヘキシミドまたはナイスタチンを含む。
【００３０】
「培養」という用語は、種々の種類の固体または液体培地の上または中における生物の増殖を指す。
【００３１】
「有効量」という用語は、有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、1回または複数の投与において投与することができる。処置および保護の点において、「有効量」とは、標的感染症または疾患状態の寛解、安定化、逆転、その進行の減速または遅延に十分な量である。
【００３２】
「代謝産物」または「揮発性物質」という用語は、生物活性を有する微生物の発酵の任意の化合物、物質、または副産物を指す。
【００３３】
「変異体」という用語は、親株の変種を指し、および、望ましい生物活性が親株により発現されるものと同様である変異体または変種を取得するための方法を指す。「親株」とは、変異誘発前の本来の真菌（例えば、ヒポキシロン属）株として、本明細書において定義される。変異体は、ヒトの介入が無く天然で生じる。それらはまた、当業者により理解される様々な方法および組成物での、またはそれらによる処置により取得可能である。例えば、親株は、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホンなどの化学物質で、またはγ線、x線を用いた照射もしくはUV照射により、または他の手段により処置されてもよい。
【００３４】
「変種」という用語は、真菌株の識別特性すべてを有する株を指し、かつ、高いストリンジェンシーの条件の下で生物のゲノムにハイブリダイゼーションするゲノムを有するとして特定することができる。変種はまた、生物のゲノムに対して85％より高い、より好ましくは90％より高い、またはより好ましくは95％より高い配列同一性であるゲノム配列を有する株として定義され得る。ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、80％、85％、90％、または95％）の「配列同一性」を有し、これは、アラインメントした時、二つの配列の比較においてそのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が同一であることを意味する。このアラインメントおよび相同性または配列同一性のパーセントは、当技術分野において公知である公的に利用可能なソフトウェアプログラムを用いて決定することができる。
【００３５】
「指示用材料」という用語は、本明細書において使用される際、最適なVOC産生に最適な条件の下で真菌を増殖させるためのキットにおいて、本発明の有用性または手順段階を伝えるために使用することができる、刊行物、記録、図表、または任意の他の表現手段を含む。
【００３６】
本開示を通して、本発明の種々の局面を、範囲形式において提示することができる。範囲形式における記載は、単に便宜および簡潔のためだけであり、かつ、本発明の範囲への確固たる限定として解釈されるべきではないことが、理解されるべきである。従って、範囲の記載は、可能な部分的範囲のすべて、ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているようにみなされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などのような部分的範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、6、およびそれらの間の任意の全体的および部分的増分を具体的に開示しているようにみなされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず当てはまる。
【００３７】
さらに、すべての数字表示、例えば、pH、温度、時間、濃度、および分子量は、範囲を含めて、0.1の増分により（＋）または（−）へ変動し得る近似値である。常に明確に述べられるわけではないが、すべての数字表示の前に「約」という用語がつくことが、理解されるべきである。また、常に明確に述べられるわけではないが、本明細書において記載される試薬は単に例示的であること、およびその等価物が当技術分野において周知であることも、理解されるべきである。
【００３８】
VOCの製造に適する真菌
常緑樹であるパーシア・インディカを宿主とする内生菌の探索により、本明細書において記載されるようなヒポキシロン属の種の存在が明らかになった。本生物の調査により、1,8-シネオール；1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンを非限定的に含む重要なVOCを産生することが明らかになった（下記の表3を参照されたい）。これらの化合物は、Mycodiesel（商標）（Strobel, et al., 2008, Microbiology 154:3319-3328）として現在公知であるいくつかの他の内生真菌のVOCのように、燃料または添加物などの潜在的な工業的有用性を有する。
【００３９】
一つの局面において、本発明は、少なくとも一種のVOCを産生することができる、分離された真菌を含む。例えば、各々少なくとも一種のVOCを産生することができる、以下のヒポキシロン属の真菌分離株が、2011年5月11日に、ブタペスト条約の条項の下にARS Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604-3999 USAに寄託され、対応するアクセッション番号を割り当てられた。
2013528050.tif 000003
【００４０】
これらの株は、これらの培養が37 C.F.R.§1.14および35 U.S.C.§122の下で権利を与えられているとCommissioner of Patents and Trademarksにより判定された人に容易に利用可能であり、かつ対象出願の対応物またはその後代が出願されている国において外国特許法により必要とされる際利用可能であるように、入手権利を保証する条件の下で寄託されている。しかしながら、寄託物の利用可能性は、政府の措置により付与される特許権の減損において対象発明を実施する許諾を構成するわけではないことが、理解されるべきである。これらの寄託物に基づき、ヒポキシロン属分離株Co27-5、C14A、Ti-13、Ec-38、またはNi-25 2Aの全ゲノムが、これにより本出願に組み入れられ、かつ含まれる。
【００４１】
本発明の一つの態様において、本明細書において記載される真菌の任意の一つは、構造が図5に示されている、1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンを非限定的に含む、印象的な範囲の揮発性有機化合物を産生することができる（下記の表3を参照されたい）。本発明は、ヒポキシロン属による前述のVOCの産生に限定されないことが、認識されるべきである。むしろ、本発明は、任意の真菌による、またはさらに言えば任意の微生物による、VOC、特に1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンの産生を含む。例えば、1,8-シネオールは、Ni5などの分離されたムスコドル属の種によってもまた産生することができ、従ってこれもまた、本発明の形成部分として企図される。別の例において、本発明は、ノデュロスポリウム属の種、ヒポキシロン属の種、ダルジニア属の種、およびムスコドル属の種の分離株由来の、炭化水素などの揮発性有機化合物を産生する内生真菌に関連する。真菌により産生されるこれらの化合物は、その後、医療、エネルギー生産、および燃料の添加物または構成要素を含む、様々な商工業において使用することができる。この新規の再生可能な炭化水素の供給源は、再生不能な炭化水素の現存する限定された資源に補充を提供するため、望ましい。
【００４２】
さらに、開示されるヒポキシロン属分離株はまた、使用される真菌特定方法論に応じて、内生ノデュロスポリウム属の種またはダルジニア属の種としても分類できることが、認識されるべきである。一般的に言えば、ほぼすべての真菌が、完全期（有性期）および不完全期（無性期）を有し、かつ各々が名称を与えられている。例えば、ノデュロスポリウム属様の生物は、ヒポキシロン属またはダルジニア属の完全期を有することができる。従って、本明細書において企図される際、ノデュロスポリウム属の種、ヒポキシロン属の種、およびダルジニア属の種の任意の一つとして特定された真菌が、本明細書において記載されるようなVOCの生成について本発明の部分を形成する。さらに、本発明の真菌は、そのような形が存在しかつ利用可能である範囲で、すべてのアナモルフおよびテレオモルフを含む。例えば、ヒポキシロン属株Co27-5、C14A、Ti-13、およびEc-38は、そのアナモルフ期としてノデュロスポリウム属の種を有する。アナモルフとテレオモルフとの間の差異は、一方が無性期でありかつ他方が有性期であることであり、二つの期はある特定の条件の下で異なる形態を呈する。真菌が有性および無性の両方で生殖する場合、これらの真菌は二つの名称を有し得る。例えば、テレオモルフ名称は、有性生殖する時の真菌を説明するのに対して、アナモルフ名称は、無性生殖する時の真菌を指す。また、ホロモルフ名称は、両方の生殖方法を包含する「真菌全体」を指す。真菌を説明するようにこれらの名称の任意の一つに言及する時、異なる名称または代替的な名称が存在し得るか否かにかかわらず、本発明において、すべてのそのような真菌の期および形が企図され、かつ含まれる。従って、前述のノデュロスポリウム属の種、ヒポキシロン属の種、およびダルジニア属の種、およびさらにムスコドル属の種、ならびにそれらの異名に関して、本発明は、それらが呼ばれる種名にかかわらず、完全および不完全（「アナモルフ」）期の両方、ならびに他の分類学上の同等物、例えばテレオモルフを包含することが、認識されるべきである。当業者は、適切な同等物の同一性を容易に認知するであろう。
【００４３】
当業者により認識されるであろうように、ノデュロスポリウム属の種、ヒポキシロン属の種、ダルジニア属の種、およびムスコドル属の種などの微生物は、生物燃料の大規模製造のために、他の微生物（例えば、酵母または他の細菌）との組み合わせで使用することができる。
【００４４】
本明細書において企図される際、本発明はまた、ノデュロスポリウム属、ヒポキシロン属、ダルジニア属、またはムスコドル属の分離された株を含み、該分離された真菌株は、連続的に増殖した。株が連続的に増殖する時、株の特性のいくつかが変化する可能性がある。そのような変化は、代謝経路の欠失または抑制、ある特定の代謝経路の増加、染色体、遺伝子、および／またはオペロンの変化（例えば、該遺伝子またはオペロンの発現レベルを制御する調節因子における変異または変化を介する）を含む。例えば、ヒポキシロン属の株は、ヒポキシロン属分離株Co27-5、C14A、Ti-13、Ec-38、またはNi-25 2Aと比較した際に、その代謝特性および／または遺伝子構造中に変化を有する可能性がある。代謝特性および／または遺伝子構造に対するそのような変化は、表3に列挙される特定の化合物の産生を増加および／または減少させる可能性がある。望ましい特性を有する変異体細胞を分離するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,348,872号を参照されたい。
【００４５】
本発明はまた、炭化水素などの揮発性有機化合物を製造するための方法を提供する。一つの態様において、この方法は、ノデュロスポリウム属の種、ヒポキシロン属の種、ダルジニア属の種、およびムスコドル属の種の分離株を、VOCを産生するのに十分な条件の下で培養する段階、ならびに、産生されたVOCを収集または回収する段階を含む。本発明の方法はまた、本明細書を通して記載されるような、真菌の培養および少なくとも一種のVOCの回収において使用される、手順および段階の任意の組み合わせを含む。
【００４６】
真菌により産生される揮発性有機化合物
以前に述べたように、本発明は、下記の表3に列挙される炭化水素などの揮発性有機化合物を産生する内生真菌に関連する。構造が図5に示される、1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンの産生が、特に関心対象である。これらの化合物の各々は、モノテルペン自体か、またはモノテルペン化合物の直接誘導体のいずれかである。モノテルペンが植物精油の最重要構成要素であることを考慮すると、内生真菌によるそのような化合物の産生は、これらの真菌がそのそれぞれの高等植物宿主と共進化するにつれて、遺伝子導入が起き、特徴的な宿主植物化学物質の産生をもたらしたという見解を支持し得る（Strobel and Daisy, 2003, Microbiology and Molecular Biology Reviews 67:491-502）。これがこの特定の内生菌に合致するかどうかにかかわりなく、1,8-シネオールが、カリフォルニアにおけるパーシア・インディカ植物の葉から収集される精油の構成要素であるとは知られていない（Weyerstahl, et al., 1993, Flavour and Fragrance Journal 8:201-207）。しかしながら、この分離株の高度に多様な環境を考慮すると、この可能性は無視されるべきではない。典型的に抗微生物活性と関連するモノテルペン化合物を合成するヒポキシロン属の種の能力は、精油を産生する植物に生息する微生物の能力を例証し、かつこれらの化合物の生合成経路を獲得する潜在的な役割は見落とされるべきではない（表2）。
【００４７】
1,8シネオールは、処方箋不要の医療用軟膏から、溶剤／脱脂剤、香料／芳香剤、代替燃料まで、広範囲の用途を有する。従って、真菌分離株による1,8-シネオールの産生は、有意であり、かつ、広範囲の工業的応用についてその可能性を大幅に拡大する。例えば、以前の研究は、1,8-シネオールがエタノール-ガソリン燃料ブレンドにおいて添加物として使用される時の相分離の予防を示しており（Barton and Tjandra, 1989, Fuel 68:11-17）、かつ、主要な燃料成分として1,8-シネオールを有する、ガソリン／ユーカリ油混合物から構成される代替燃料は、改善されたオクタン価および減少した一酸化炭素排気を結果としてもたらした（Sugito, K., & Takeda, S. (1981). 米国特許第4,297,109号）。
【００４８】
ある特定の態様において、VOCは、炭化水素であってもよく、かつ、生物燃料、プラスチック、可塑剤、抗生物質、ゴム、燃料添加物、および／または接着剤の製造のために有用であり得る。当業者により認識されるであろうように、炭化水素はまた、発電および加熱のために使用することもできる。化学、石油化学、プラスチックおよびゴム工業もまた、その製造物用の原料として炭化水素に依存している。本明細書において使用される際、「生物燃料」という用語は、一般に、バイオマス、すなわち、ウシ由来の肥料、または真菌により産生される炭化水素などの、最近生きている生物またはその代謝副産物に由来する任意の燃料を指す。生物燃料はさらに、生きている生物の代謝産物に由来する燃料として定義され得る。
【００４９】
セラトシスチス属（Ceratocystis）の種、トラメテス・オドラータ（Trametes odorata）、フェリヌス属（Phellinus）の種、およびクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）などの微生物による、シトロネロール、ゲラニオール、リナロオール、ネロール、およびα-テルピノールなどの他のモノテルペンの産生（Kempler, G.M. (1983). Production of Flavor Compounds by Microorganisms. III. Terpenenes. B. Production of Monoterpenes by Microorganisms. In Advances in Applied Microbiology, Vol 29, pp. 35-37. Edited by A.I.Laskin. New York, NY: Academic Press, Inc.）が実証されているが、本発明は、表3に列挙される1,8-シネオールおよび他の揮発性産物が内生真菌により産生され得ることを初めて示すものである。これより前には、1,8-シネオールの唯一の公知の生物学的供給源は、植物組織由来であった。真菌からのVOCの産生は、植物由来よりもはるかに優れた商業生産モデルとなる。
【００５０】
1,8-シネオールの生合成は、1,8-シネオールシクラーゼ（シネオールシンターゼ）によるゲラニルピロホスファートからの変換を含み、その活性は、システインおよびヒスチジンを対象とする試薬により阻害されるが、基質-金属イオン複合体により保護され、この酸素を含有するテルペンのエーテル酸素原子は専ら水に由来する（Croteau, et al., 1994, Arch-Biochem-Biophys 309:184-192）。比較すると、フェンチョカンホロンもまた、ゲラニルピロホスファートから変換され、かつ、 (-)-エンド-フェンコールシクラーゼ（シンターゼ）を介して中間体(-)-(3R)-リナリルピロホスファートとしての経路を通って進行し、その後、(4R)-α-テルピニルおよび(1R,5R)-ピニル陽イオンの存在下で環化して(-)-エンド-フェンコールを形成し、これはさらに酸化してα/β-フェンチョカンホロンになり得る（Croteau, et al., 1988, Journal of Biological Chemistry 263:15449-15453）。これらの個々の経路、およびメバロナートからのゲラニルピロホスファートの産生を含む共通の経路（MVA経路）由来のその派生物を理解することは、ヒポキシロン属の種がモノテルペンの生合成のために調節され得、かつこれらの経路のその後の操作が大量の商業規模での最適な製造をもたらし得るという見解と一致する。
【００５１】
VOCの製造のための真菌の増殖基質および培養
当業者により理解されるであろうように、表4に列挙される成分の任意のものを、任意の比および組み合わせで非限定的に含む、真菌の増殖を促進するのに適する任意の基質が、VOCの製造において使用されてもよいことが、認識されるべきである。本明細書において企図される際、炭水化物供給源として大量のデンプンを含有する基質利用アッセイにより実証されるように、高デンプン基質は、最適なVOC産生を促進する（表4）。ある特定の態様において、セルロースもまた、適当な基質であり得る。莫大な量の累積セルロース性バイオマスおよびアルコール（燃料）の製造における食料穀物の利用を考慮すると、VOCの産生のためにセルロースを利用する微生物は、実に魅力的である。
【００５２】
例えば、いくつかの態様において、真菌を培養するための培養培地は、オートミール、オオムギ、またはポテト寒天ベースを含む基質を含んでもよい。培養培地はまた、PDA培地、セルロース培地であってもよく、かつ、デンプン、グルコース、または表4に列挙される成分の任意の組み合わせを含んでもよい。さらに、選択された真菌株を、無機塩、ペプトン、脱脂綿実粉、コーンスティープリカー、または酵母エキスなどの有機窒素源、および炭素源の任意の組み合わせを含有する培地において増殖させてもよい。炭素源の例は、グルコース、ラクトース、スクロース、セルロース、または他の炭水化物を含んでもよいが、それらに限定されない。さらにまた、本発明は、使用される増殖培地のタイプまたは量により限定されるべきではなく、かつ、当業者に理解されるであろうような真菌を培養するのに適する任意の培地の使用を含むべきであることが、認識されるべきである。他の態様において、これらの条件はまた、酸素の非存在下（嫌気性条件）において、または低減した酸素条件（例えば、微好気性条件）において真菌を培養する段階を含むことができる。
【００５３】
一般的に言えば、本発明の分離された真菌は、当業者により理解されるであろうような標準的な方法を用いて培養することができる。あるいは、真菌培養物は、従来の発酵技術を用いて、商業的使用のために大規模で培養することができる。本文脈において、発酵とは、任意の制御された真菌培養条件を指すように広く使用される。大規模増殖の前に、該増殖培養の接種物を、一般に培養する。ある特定の態様において、真菌は、VOCの拡大された産生のためにバイオリアクター容器において培養することができる。任意の従来のバイオリアクター容器を、本発明の目的のための容器として使用することができる。例えば、容器は、ステンレス鋼、ガラス、プラスチック、および／またはセラミックスなどの材料で作製されてもよく、かつ、約100 ml〜10,000 Lまたはそれより大きい容積を有してもよい。バイオリアクター容器は、栄養溶液、ならびに培養およびVOC回収過程の種々のパラメータを維持および制御するための溶液を含有する、一連の貯蔵フラスコに連結されてもよい。発酵の特定の必要性に応じて、容器への基質の個々の供給用に別々の貯蔵フラスコが存在してもよく、該基質は、容器中の生細胞のために炭素、窒素、または鉱物源として働く。
【００５４】
さらに、いくつかの方法を、本発明における使用のための種々の真菌分離株を増殖させるのに使用することができる。フェドバッチ培養は、通常のバッチ培養の変形物であり、バッチへの栄養分供給の追加を含む。細胞は、固定量の培地中で培養する。最高細胞濃度に達する前に、特定の補充用栄養分を培養物に追加する。供給物の量は、培養物の量と比較して最小である。フェドバッチ培養は、典型的に、実質的に固定した量で、固定した持続期間進行し、細胞が死んだ時またはそれより早いあらかじめ設定された時点のいずれかの単回の採取を伴う。
【００５５】
連続培養において、細胞は最初、固定量の培地中で増殖させる。減退相の開始を回避するために、最高細胞濃度に達する前に、新鮮な培地をバイオリアクター中に注入する。一定量を維持するために、細胞の一部を含有する使用済み培地を、バイオリアクターから連続的に除去する。この過程はまた、連続的に採取することができる所望の産物も取り出し、かつ、栄養分の連続的な供給を提供して、細胞が指数関数的増殖状態に維持されることを可能にする。理論的には、この過程は、無期限に稼働することができる。連続培養は、培養量の連続的増加、所望の産物の増加および希釈、ならびに指数関数的増殖培養の連続的維持を特徴とする。
【００５６】
灌流培養は、培地をリアクターの外に汲み出す時に、細胞を除去しないこと以外は、連続培養と同様である。連続培養のように、灌流培養は、理論的に無期限に継続することができる、連続的な採取を伴う量増加システムである。
【００５７】
VOCの回収
選択された真菌分離株によりいったん産生されると、培養培地からまたは増殖チャンバー中の蒸気から、表3に列挙されるVOCを分離するために、いくつかの方法を使用することができる。例えば、一般的な分離技術を、培養液または寒天から細胞を除去するために使用することができ、かつ、（非限定的に）抽出、蒸留、およびカルボカラム（carbocolumn）捕捉手順などの一般的な分離手順を、細胞を含まない培養液または寒天からVOCを取得するために使用することができる。例えば、各々が全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,275,234号、第5,510,526号；第5,641,406号、および第5,831,122号、ならびに国際特許出願番号第WO 93/00440号を参照されたい。
【００５８】
分別蒸留および／または吸収クロマトグラフィーもまた、本発明の真菌分離株により産生された所望の産物を抽出する方法の非限定的な例である。分別蒸留とは、化合物のいくつかの分画が蒸発すると考えられる温度への加熱による、沸点による化学化合物の分離におけるような、混合物のその成分部分または分画への分離である。吸収クロマトグラフィーとは、一方が固定されており（固定相）、他方（移動相）が一定の方向でそれを通って移動する二相間の分布における差異により、混合物の成分が分離される、物理的分離法である。物質は、固定相により保持および分離されるように、固定相と相互作用しなければならない。
【００５９】
ガスクロマトグラフィーとは、異なる揮発性の化合物の混合物を含有する試料において、種々の成分を分画しかつその相対量を測定するための周知の技術である。例えば、試料を気化させ、かつ結果として生じたガスの全体量を分析用クロマトグラフィーカラムに通過させる。ガスクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー過程は、本発明の真菌分離株により産生されると考えられるような、多成分試料の揮発性物質含量を迅速に測定することができる。
【００６０】
いくつかの例において、圧力スイング吸着法（PSA）を、ガスの混合物からいくつかのガス種を分離するために、種の分子特性および吸着材料についての親和性に従う圧力の下で使用してもよい。PSAは、ほぼ周囲温度で稼働し、かつ従ってガス分離の低温蒸留技術とは異なる。特別の吸着材料（例えば、ゼオライト）を、分子ふるいとして使用し、好ましくは高圧で標的ガス種を吸着する。過程はその後、吸着材料を脱着するように低圧にスイングする。
【００６１】
VOCの増強された産生のための変異体および／または改変された真菌
本発明はまた、少なくとも一種のVOCの産生収量か、または、変異体もしくは改変された真菌が少なくとも一種のVOCを産生できる速度を最終的に増加させる、変異体または改変された真菌を含む。変異体または改変された真菌は、当業者により理解される様々な方法および組成物での、またはそれらによる真菌の処置により取得可能である。例えば、親株は、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホンなどの化学物質で、またはγ線、x線を用いた照射もしくはUV照射により、または他の手段により処置されてもよい。
【００６２】
例えば、本明細書において企図される際、本発明はまた、本明細書において記載される各真菌のゲノムから、少なくとも一種のVOCの産生をコードする遺伝子を同定およびクローニングする段階を含む。一つの態様において、ヒポキシロン属のゲノムを、1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンなどの、表3由来のVOCを産生する合成経路をコードする遺伝子または複数の遺伝子（例えば、オペロン）について探索する。従って、本発明は、少なくとも一種のVOCの合成または産生に関与するポリペプチドをコードする、真菌から単離された核酸分子を包含する。別の態様において、単離された核酸分子は、本明細書において記載される真菌分離株の任意の一つ由来の該単離された核酸分子と、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％同一である。別の態様において、ポリペプチド配列は、本明細書において記載される真菌分離株の任意の一つ由来のポリペプチドと、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％同一である。
【００６３】
合成経路についてゲノムをクローニングおよび／または探索する方法は、cDNAおよび／またはゲノムライブラリーを作製する段階、ならびにVOC合成経路を生じる遺伝子についてライブラリーをスクリーニングする段階を含んでもよい。従って、本発明は、本明細書において記載される真菌分離株の任意の一つのDNAおよび／または染色体ライブラリーを含む。一つの態様において、ライブラリーを、原核細胞および／または真核細胞において複製することができるベクター中にクローニングする。別の態様において、真核細胞は真菌細胞である。別の態様において、ライブラリーは、ラムダファージ、酵母人工染色体、細菌人工染色体、および／またはcDNAである。別の態様において、ライブラリーを、1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンなどの、表3由来のVOCの産生についてスクリーニングする。
【００６４】
VOCの産生をコードする遺伝子、複数の遺伝子、および／またはオペロンを決定するための別の方法は、本明細書において記載される真菌の任意の一つのゲノムに変異誘発する段階、および特定のVOCの増加、付加、減少、または除去を探す段階を含む。これは、化学的および／またはトランスポゾン変異誘発を介して達成することができる。遺伝子、複数の遺伝子、および／またはオペロンがいったん同定されると、該遺伝子、複数の遺伝子、および／またはオペロンを、クローニングおよび／または単離することができる。従って、本発明の一つの態様は、本明細書において記載される真菌の任意の一つの単離された核酸を含み、該核酸分子は、ベクター中にクローニングされる。別の態様において、該核酸分子は、表3のVOCの産生に関与するタンパク質をコードする遺伝子、複数の遺伝子、またはオペロンをコードする。別の態様において、ベクターは、自己複製するか、または宿主の染色体中に組み込まれる。別の態様において、該ベクターは、異種細胞中に、形質転換されるか、またはトランスフェクションされる。別の態様において、該異種細胞は、原核細胞または真核細胞からなる群より選択される。
【００６５】
本発明はまた、VOCを産生する経路を生じるか、またはその一部である、本明細書において記載される真菌の任意の一つのポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質の変種および断片を包含する。変種は、構成タンパク質のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列における変更を含有してもよい。ポリペプチドについての「変種」という用語は、参照配列について一つまたは複数のアミノ酸により変更されているアミノ酸配列を指す。変種は、「保存的」変化、または「非保存的」変化を有することができ、例えば、相似性の軽微な変形物はまた、アミノ酸欠失もしくは挿入、または両方も含むことができる。さらに、正確なコード領域がクローニングされ、かついかなる不要な変異も含有しないことを保証するために、ヌクレオチドの配列決定をすることができる。
【００６６】
一つまたは複数の生合成酵素またはタンパク質をコードする核酸分子、ならびにこれらの配列のオーソログおよびホモログを、本明細書において記載される真菌の任意の一つの形質転換または発現ベクター中に組み入れてもよい。本明細書において使用される際、「ベクター」という用語は、一般に、宿主細胞中に導入され、それにより形質転換された宿主細胞を生じるような核酸分子を指す。ベクターは、複製開始点などの、宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含んでもよい。ベクターはまた、当技術分野において公知である一つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝子要素を含んでもよい。形質転換された細胞は、分子生物学技術によりその中に核酸分子が導入された細胞である。この用語は、ウイルスベクターでのトランスフェクション、プラスミドベクターでの形質転換、ならびに、エレクトロポレーション、リポフェクション、および粒子銃加速による裸のDNAの導入を含む、そのような細胞中に核酸分子が導入され得るすべての技術を包含する。
【００６７】
本明細書において記載される真菌の任意の一つの遺伝子および／またはオペロンがいったん同定、クローニング、異種生物（または合成ゲノム由来の新たな生物）中に形質転換、トランスフェクション、または感染されると、表3に列挙されるものを含む所望のVOCを生成および精製するために、異種生物を増殖させることができる。
【００６８】
従って、本発明はまた、1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロン、または下記の表3に列挙される任意の他の化合物などの少なくとも一つの化合物の、増加した産生速度または産生量を有する、真菌の変異株を作製するための方法を含む。この方法は、真菌の胞子を変異させる段階、変異した胞子を培養する段階、ならびに、1,8-シネオール、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン、および(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物の増強された産生速度または産生量について、変異した胞子の培養物をスクリーニングする段階を含む。
【００６９】
キット
本発明はまた、本発明の組成物の原材料の一つまたは複数で満たされた一つまたは複数の容器を含むキットを提供する。本発明は、本明細書において記載される方法の任意のものにおいて使用することができるキットを提供する。一つの態様において、キットは、一つまたは複数の容器中に、少なくとも一つのノデュロスポリウム属の種、ヒポキシロン属の種、ダルジニア属の種、またはムスコドル属の種を含む。生物は、培地中で凍結して、凍結乾燥して、および／または胞子として供給することができる。キットはまた、最適なVOC産生に最適な条件の下で真菌を増殖させるための指示用材料を含む。指示書における方法は、特定のバイオリアクター容積、精製計画、最適温度、pH、および／または他の条件を含んでもよい。キットはまた、増殖培地を含んでもよい。これらのキットの容器中に含有される培地は、すぐ使用できる配合物として、またはより濃縮された配合物として存在してもよい。さらに、培地は、乾燥粉末で供給することができる。従って、キットは、本発明の培地の乾燥粉末、および培地を懸濁するための液体を含むことができる。液体は、水または当技術分野において公知である緩衝液であってもよい。培地の滅菌用のフィルターもまた、提供されてもよい。
【実施例】
【００７０】
本発明を次に、以下の実施例に関連して説明する。これらの実施例は、例証の目的のみのために提供され、かつ本発明は、決してこれらの実施例に限定されるように解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書において提供される教示の結果として明白になる任意かつすべての変形物を包含すると解釈されるべきである。
【００７１】
さらなる説明無しで、当業者は、前記の説明および以下の例証となる実施例を用いて、本発明を作製および利用することができ、かつ、特許請求される方法を実施することができる。従って、以下の実施例は、本発明の好ましい態様を具体的に指摘し、かつ、決して開示のいかなる部分も限定するようには解釈されるべきではない。
【００７２】
真菌の分離および保管
内生真菌培養株CI-4を、カナリア諸島に自生する常緑樹（パーシア・インディカ）由来の内生菌として取得した。一つの小さな葉身を、N-28°32'23"；W-16°16'16"のスペインのテネリフェ島に生えていることが見出されたパーシア・インディカから切除した。この同一の島から試料採取した他の植物種は、アカシア属（Acacia）の種、ピヌス・カナリエンシス（Pinus canariensis）、プルヌス・ルシタニカ（Prunus lusitanica）、およびラムヌス・グランディフォリア（Rhamnus glandifolia）を含み、それらのいずれもCI-4の回収を助長しなかった。分離手順は、以前に記載されたプロトコルに従った（Worapong, et al., 2001, Cinnamomun zeylanicum. Mycotaxon 79:67-79；Ezra, et al., 2004, Microbiology 150:4023-4031）。簡潔には、内部組織の切除の前に外部組織を徹底的に70％エタノールに曝し、内部組織を素寒天およびグリセロールアルギニン培地（GAM）の標準的なペトリ皿上で培養した。その後、植物組織から増殖した内生真菌を選び取り、ポテトデキストロース寒天（PDA）上で再培養した。CI-4は、他の植物源からの迅速な分離を促進すると考えられるM.アルブス（M. albus）のVOCの存在下で容易に増殖することもまた、注目に値する（Strobel, et al., 2001, Microbiology 147:2943-2950）。15％グリセロール中に菌糸体の成長を支持するPDAの小さなプラグを置くことにより、真菌を-70℃で保管した。真菌を滅菌オオムギ種子にコロニー形成させ、続いてそれを風乾し、その後-70℃で保管する代替的な保管法もまた、利用した。
【００７３】
走査電子顕微鏡法
Ezraにより概要が述べられた以下のプロトコルに従って（Ezra, et al., 2004, Microbiology 150:4023-4031）、CI-4がコロニー形成した滅菌カーネーション葉に対して走査電子顕微鏡法（SEM）を実施した。真菌を、PDA、またはγ照射したカーネーション葉の上で数週間増殖させ、その後、SEMのために加工処理した。試料を、エタノール中でゆっくり脱水し、その後臨界点乾燥し、金でコーティングし、Everhart-Thornley検出器を用いて高真空モードで、FEI XL30走査電子顕微鏡（SEM）FEGで検査した。
【００７４】
真菌DNAの分離およびITS- 5.8S rDNA系統学の獲得
真菌をPD培養液上で7日間増殖させ、その後菌糸体を採取し、DNeasy Plant and Fungi Mini Kit (Qiagen)を用いて、製造業者の指示に従いゲノムDNAを抽出した。真菌の内部転写スペーサー（ITS）領域を、以下のユニバーサルITSプライマーでのPCRを用いて増幅した：
2013528050.tif 000004
すべての他の手順は、Ezraにより以前に記載されたように行った。DNAを配列決定し、GenBankに投稿した。本研究において取得した配列を、BLASTソフトウェアを用いてGenBankデータベースと比較した。ギャップを含有する位置およびデータが無い位置をデータセットから排除し（complete deletion option）、MEGA4（Tamura, et al., 2007, Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599）および近隣結合法（Saitou and Nei, 1987, Molecular Biology and Evolution 4:406-425）を用いて、系統樹を構築した。
【００７５】
病原体に対するヒポキシロン属の種のVOCのバイオアッセイ試験
CI-4により産生されたVOCを、ムスコドル・アルブス（Muscodor albus）により産生されたVOCの分析のために以前に記載されたバイオアッセイ試験システムに従って（Strobel, et al., 2001, Microbiology 147:2943-2950）、選択された病原性真菌および細菌に対する阻害的抗微生物活性について試験した。揮発性生理活性化合物の最適な産生を、試験生物を様々な齢の培養物に曝露することにより判定した。3〜7日後にCI-4により産生されたVOCの阻害活性を比較し、その結果、観察された最大阻害が、最高濃度の生理活性VOCを示唆すると考えられた。その後のバイオアッセイ試験を、より広い範囲の試験生物について、CI-4が最大量の生理活性VOCを産生した適切な点で実施した。
【００７６】
PDAの標準的なペトリプレートの中央部分から2.5 cm幅の寒天の細片を除去し、寒天の二つの分離した半分を作製することにより、アッセイを実施した。真菌（CI-4）を、一つの半月寒天断片上に接種し、揮発性化合物の最適な産生を可能にするように、23℃で6日間インキュベーションした。試験病原体を、CI-4を接種した半月切片の反対側の寒天の半月切片上に接種した。その後、プレートに単一断片のパラフィルムを巻き、23℃で24時間インキュベーションした。その後、酵母および細菌の増殖は、画線接種の微生物密度に基づいて定性的に評価したが、糸状菌の増殖は、Strobelにより記載されたように（Strobel, et al., 2001, Microbiology 147:2943-2950）、対応する対照と比較可能な接種プラグの縁から伸びる成長の複数の測定に基づいて定量的に評価した。最終的に、増殖が観察されなかった各試験病原体の生存度を、CI-4 VOCへの3日間の曝露の後に、元々曝露した接種プラグまたは画線のPDAの新鮮なプレート上への移動により評定した。その後、生存度を、3日以内の増殖の観察により判定した（Strobel, et al., 2001, Microbiology 147:2943-2950）。すべての試験を、三連で実施した。
【００７７】
VOC産生に好ましい基質利用アッセイのための培地選択
様々な選択された培地を、CI-4によるVOC産生を最も促進する基質の組み合わせを判定するために使用した。PDA上で活発に増殖するCI-4の培養物から取得した単一のプラグを、各々の寒天ベースの培地に接種するために使用した。1.8シネオールは臭いにより容易に検知されるため、この化合物の予備的定量を、ヒト嗅覚法により概算した。パラフィルムで密封し、22℃で増殖させた7日間培養物に対して、2回の別々の機会で7人の異なる観察者により、独立した評点を与えた。評点システムは、1（低〜無）から5（最大の産生）までであった。評定を平均化し、標準偏差を計算した。
【００７８】
真菌の菌糸体成長の量を、寒天面の表面から直接かき取り、乾燥し、かつ秤量することにより評価した。以下の培地を試験した：（A）酵母エキス0.1 g l-1＋塩；（B）ペプトン0.1 g l-1＋塩；（C）セルロース25 g l-1＋塩および酵母エキス0.1 g l-1；（D）セルロース25 g l-1＋塩およびペプトン0.1 g l-1；（E）デンプン25 g l-1＋塩および酵母エキス0.1 g l-1；（F）デンプン25 g l-1＋塩およびペプトン0.1 g l-1；（G）グルコース25 g l-1＋塩および酵母エキス0.1 g l-1；（H）グルコース25 g l-1＋塩およびペプトン0.1 g l-1；（I）セロビオース25 g l-1＋塩および酵母エキス0.1 g l-1；（J）セロビオース25 g l-1＋塩およびペプトン0.1 g l-1；（K）グリセロール25 ml l-1＋塩および酵母エキス0.1 g l-1；（L）グリセロール25 ml l-1＋塩およびペプトン0.1 g l-1；（M）インスタントマッシュポテト25 g l-1＋塩および酵母エキス0.1 g l-1（MP）；（N）ポテトデキストロース（Difco）（PDA）；ならびに（O）オートミール寒天（Difco）。各培地において使用する塩および寒天濃度は、PinkertonおよびStrobelにより以前に概要が述べられたM1-D培地の配合表に従った（Pinkerton and Strobel, 1976, Proc Natl Acad Sci USA 73:4007-4011）。各アッセイは二連で実施し、データを分析して、平均質量／速度値および標準偏差を取得した。
【００７９】
CI-4揮発性物質の定性分析
8日間23℃で、PDA上で増殖させたCI-4の培養物の上部の空間におけるガスの分析を、Strobelにより記載された以下のプロトコルに従って実施した（Strobel, et al., 2001, Microbiology 147:2943-2950）。最初に、安定で柔軟なファイバー上にポリジメチルシロキサン上の50/30ジビニルベンゼン／carboxenからなる焼いた「固相マイクロ抽出」シリンジ（Supelco）を、ペトリプレートの側面に開けた小さな穴を通して置き、高濃度の真菌VOCのために5分間のみ蒸気相に曝露した。その後、シリンジを、0.50μmの薄膜厚を有する30 m x 0.25 mm I.D. ZB Waxキャピラリーカラムを含有するHewlett Packard 6890ガスクロマトグラフのスプリットレス注入口中へ挿入した。カラムは、以下のように温度をプログラムした：30℃2分間、5℃／分で220℃へ上昇。キャリアガスは超高純度ヘリウムであり、最初のカラムヘッド圧力は50 kPaであった。揮発性物質を捕捉する前に、ファイバーを、ヘリウムガスの流れの下で、240℃で20分間調整した。30秒の注入時間を使用して、GC中に試料ファイバーを導入した。ガスクロマトグラフを、単位解像度で稼働するHewlett Packard 5973質量選択検出器（質量分析計）に接続した。MSは、35〜360 amuの質量範囲に渡って1秒あたり2.5スキャンの速度でスキャンした。データの獲得およびデータの加工処理は、Hewlett Packard ChemStationソフトウェアシステム上で実施した。CI-4により産生された化合物の仮特定を、NISTデータベースを用いてライブラリー比較により行い、本報告において記載されるすべての化学化合物は、NISTデータベース化学用語法を使用する。最終の確証的特定は、Sigma/Aldrichから取得される利用可能な真正標準品を有する任意の化合物について、1-8-シネオールおよび1-メチル-1,4-シクロヘキサジエンを含む、標準品のGC/MSデータを、真菌産物のGC/MSデータと比較することにより行った。GC/MS試験は、真菌ガスに対するファイバーの様々な曝露時間の下で数回実施し、真菌により産生されるVOCの大きな体積を考慮すると、5分の曝露が最適であった。
【００８０】
真菌揮発性物質の定量
20±2℃で1L瓶におけるPDAの300 ml斜面上で増殖する2.5日間培養物から開始して、連続的モニタリング方式で真菌揮発性物質の産生を定量するために、PTR-MSを使用した。瓶は、10 std cc/分の精製された圧縮空気を伴う吸入口および排出口管の両方を有するように改変されているOリング密封キャップを有した（Ezra, et al., 2004, Plant Science 166:1471-1477）（図1）。スペクトル中に生じるすべてのイオンのモニタリングを7.5日間行い、VOCの濃度を概算した（Ezra, et al., 2004, Plant Science 166:1471-1477；Bunge, et al., 2008, Appl Environ Microbiol 74:2179-2186；Strobel, et al., 2008, Microbiology 154:3319-3328）。培養した試料および接種していない試料の空間分析を、培養瓶に空気（医療グレードの圧縮空気）の小さな流れを通すことにより行い、その後、同一品質の空気で希釈した（図1）。試料ラインは、全体的にPFA Teflon管類および付属品で構築した。1/20〜1/10希釈により、機器の直線的ダイナミックレンジ内に測定値を保ち、かつ試料ライン中に水が凝縮するのを予防した。20〜220 Daの質量スペクトルスキャンを獲得した。
【００８１】
PTR-MS機器は、H3O+との反応を通してガス相において有機分子をイオン化し、標準的な四極子質量分析計によりその後検出することができる大部分プロトン化された分子（MH+、式中、Mは中性有機分子である）を形成することが、認知されるべきである。空気の主たる構成要素（窒素、酸素、アルゴン、および二酸化炭素）は水より低いプロトン親和性を有し、かつ従ってイオン化されないため、この過程は、希釈を伴うかまたは伴わない実際の空気試料について行うことができる。大部分の有機分子（アルカンを除く）は、水より高いプロトン親和性を有し、かつ従ってイオン化されて検出される。PTR-MSのさらなる利点は、公知または計算された量、反応時間、存在するH3O+の量、およびプロトン移動反応についての理論的反応速度定数から、試料中の構成要素の絶対濃度を定量できることである（Lindinger, et al., 1998, Int J Mass Spectrom Ion Process 173:191-241）。最後に、PTR-MSの絶大なる利点は、リアルタイムで行うことができ、かつ関心対象の特定のイオンの濃度についてのデータを連続的に生成できることである。
【００８２】
PTR-MS測定値に由来する濃度を、反応速度論に由来する方程式を用いて計算し、2×10-9 ml s-1の反応速度係数がすべての化合物について適切であると仮定する（Lindinger, et al., 1998, Int J Mass Spectrom Ion Process 173:191-241；Ezra, et al., 2004, Plant Science 166:1471-1477）。この方法は、任意の質量の測定されたイオン強度を等量濃度として表現することができる単純な手段を提供する。特定のイオンを単一化合物のものとみなすことができる事象において、その時その特定化合物の濃度は、上述と同一の手順、その後の希釈および任意の生成イオン断片化についての補正を用いて、測定することができる。生成イオン分布は、純粋な標準品より調製した混合物から測定する。
【００８３】
実施例1：ヒポキシロン属の種のVOCの生物活性
アッセイ試験生物の感受性の程度は、24時間曝露されたヒポキシロン属の種の培養物の齢に依存した（表1）。
【００８４】
（表1）ヒポキシロン属の種のVOCに対する選択された真菌病原体の感受性を示す、真菌VOCへの24時間曝露でのヒポキシロン属の種の培養齢の関数としての、進行性（時間経過）バイオアッセイ
報告するパーセンテージは、ヒポキシロン属の種を除いたPDAプレート上の試験生物の増殖と比較したものである。
2013528050.tif 000005
【００８５】
10種類の異なる真菌病原体を用いた進行性（時間経過）アッセイを、真菌によるVOC産生の最高点にも関連し得る、試験生物の最大感受性が起きる時点を測定するために計画した。3、4、5、6、および7日後に産生されたVOCの阻害活性を比較すると、揮発性生理活性物質の最高濃度を示唆する最大阻害が10種類の試験生物のうち8種類で6日目に起き、この時点での最大阻害を呈した。ヒポキシロン属の種のVOCに対して最も感受性が高い試験生物は、フィトフトラ属（Phytophthora）の種、スクレロチニア・スクレロチオルム、アスペルギルス・フミガーツス、およびセルコスポラ・ベチコラであった（表1）。
【００８６】
16種類の植物関連真菌を含む拡大したバイオアッセイ試験により、バイオアッセイのペトリプレート試験システムを介して評定した際の、変動する応答の程度が明らかになった（Strobel, et al., 2001, Microbiology 147:2943-2950）。生物は、ヒポキシロン属の種の6日間培養物由来の真菌VOCに対する3日間の曝露で、最小から完全な阻害まで示したが、種々の酵母および細菌の阻害は無かった（表2）。
【００８７】
（表2）種々の真菌に対するヒポキシロン属の種の6日間培養物のVOCの効果
阻害値を、3日の曝露で処置していない対照試験生物と比較した増殖阻害のパーセンテージとして計算した。試験を三連で実施し、標準偏差により示されるように結果は変動した。すべての生物は、真菌VOCへの曝露後に生存していた。
2013528050.tif 000006
＊は、進行性バイオアッセイ試験システムにおいても使用した生物を意味する。D＝死およびA＝生
【００８８】
真菌VOCの存在下で完全な阻害を呈するものを含むすべての生物は、PDA上での再培養時に生存していた。最も感受性の高い真菌は、フィトフトラ属の種、セルコスポラ・ベチコラ、スクレロチニア・スクレロチオルム、およびボトリチス・シネレアであった（表2）。
【００８９】
実施例2：ヒポキシロン属の種により産生された揮発性物質の組成
いくつかのGC/MS分析を、ヒポキシロン属の種の8日間培養物により産生されたVOCについて実施した。接種していないPDAペトリプレートからなる対照を、培地が寄与する化合物を差し引くために使用した。真菌VOCの予備的特定を、未知の揮発性物質の、NISTデータベースに列挙される参照化合物のMSデータとの比較により判定した。VOCの大部分は決定的には特定できないことが注目されるべきである。しかしながら、特定することができたVOCについては、可能性のある化合物の特定を確認するために真正標準品を使用したところ、1,8-シネオールおよび1-メチル-1,4-シクロヘキサジエンを含んだ。さらに、他の化合物は、品質一致を60％とした任意のカットオフで、NISTデータベースに対する品質の一致（％）に基づいて、暫定的に特定した。最も豊富な化合物は、GC溶出プロファイルの統合されたピーク面積全体に基づき、モノテルペンの(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンであると暫定的に特定した（表3）（図5）。
【００９０】
（表3）SPMEファイバーを用いた、PDA上で23℃での8日のインキュベーション後にヒポキシロン属の種により産生された揮発性化合物のGC/MS空間分析
対照PDAペトリプレート中に存在する化合物を、データから差し引いている。未知の化合物とは、60未満の品質％値を有するものを表す。
2013528050.tif 000007
＊は、滞留時間およびMSスペクトルが、真正標準化合物と厳密に一致したかまたは同一であったことを意味する。明示された注釈の無い化合物は、NISTデータベースにおける適切な化合物と最も厳密に一致した質量スペクトルを有する。未知は、60％未満の品質格付けを有した。
？は、列挙された化合物の実際の同一性について疑問が残り、実際の産生物の正確な溶出時間が不特定のままであることを意味し、ピークは、(+)-α-メチレン-α-フェンチョカンホロンの異性体を表す可能性がある。
【００９１】
しかしながら、この化合物についての真正標準品が利用不可能であったため、出現した少なくとも二つのピークをこのモノテルペノイドと指定し、これらをフェンチョカンホロンの異性体または関係物として暫定的に割り当てている。より少ない量で検出された第2のモノテルペンは、すべてが1,8-シネオールと矛盾しない、NISTデータベースの一致、真正化合物に対する類似性、PTR質量スペクトルにおける81、137、155のピークの出現（真正標準品と同一）、および特徴的なユーカリ臭により、1,8-シネオールと特定した（表3；図5、図6）。真菌はまた、しばしばモノテルペン基の誘導体と考えられる第3の化合物である、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエンも産生した（図5、図6）。シクロヘキサン、1,2,4-トリス(メチレン)-（または異性体）、および8-アンチ-メチルビシクロ(3.2.1)オクタ-2,6-ジエン（または異性体）を含む多くの他の化合物がGC/MS分析において出現し、それらは、恐らく、121ピークのPTR質量スペクトル（MプラスH+）における主な寄与物質である（表3）（図6）。多くがより少ない量である他の特定されていない化合物もまた、各GC/MS分析でこの真菌のVOC中に見られた（表3）。GC/MSの結果は時々PTR-MSと矛盾し、これは、SPMEファイバーが普遍的な吸着効率を欠いており、かつ同様に、PTR-MSがプロトン化された分子種を他のイオン断片から識別する能力を欠いているという事実のためであることが、注目されるべきである。注目に値する矛盾の一つは、反復分析において、PTR-MSにより検出されるようなVOC混合物に存在する大量のエタノールおよびアセトアルデヒドの捕捉が、SPMEファイバーにおいて完全に欠如していることである（表3、図6、図7）。他方で、二つのMS技術のデータセットに互換性がある多くの例、すなわち、120のMWを有する化合物および1,8シネオールスペクトルについてのデータが存在する（表3および図6）。
【００９２】
二つ、場合によっては三つまたはそれより多いモノテルペン／モノテルペン誘導体の産生は、内生菌が、通常高等植物と関連するモノテルペン化合物の生合成のために特殊化された酵素機構を所有することを示唆する可能性がある。モノテルペンは、精油の一般的な構成要素として一般に関連する天然に形成される産物であり、かつ多くの場合抗微生物活性に寄与する（Madyastha, 1984, Journal of Chemical Sciences 93:677-686）。ヒポキシロン属の種によるそのようなモノテルペンの産生をもたらす生合成経路は、高度に生物活性を有する真菌であるM.アルブスの存在下で増殖する能力について、可能性のある洞察を示唆し得る。M.アルブスにより呈される抗微生物活性の広範な範囲は、VOCを産生する真菌といまだ一致していない（Strobel, et al., 2001, Microbiology 147:2943-2950）。それ自体のモノテルペン抗微生物薬に耐性を有する能力は、M.アルブスにより産生される強力な揮発性抗微生物薬に耐性を有する能力と関連している場合もあれば、または関連していない場合もある。
【００９３】
実施例3：選択された培地上でのVOC産生の基質による促進
ヒポキシロン属の種を、アミノ酸の供給源としてペプトンよりも酵母エキスで強化した培地上で増殖させた場合、一般に、揮発性化合物のより高い濃度が、嗅覚法により検出された（デンプンとの組み合わせにおいてのみ見られた以外）。PDA、オートミール寒天、およびMPを含む、炭水化物の供給源としてデンプン、グルコース、およびセロビオースを含有する培地もまた、より高い濃度の、嗅覚法により検出可能な揮発性化合物を促進した。
【００９４】
嗅覚定性分析は、各培地タイプ上の表面菌蓋の乾燥重量の定量的測定により裏付けられた。表面菌糸体の質量計算を、定性分析後に実施し、同様の基質嗜好性を得た。質量計算は、第1にアミノ酸供給源に、および第2に炭水化物供給源に依存するように見られたが、嗅覚評点は、炭水化物供給源に最も依存するように見られた。分析は両方とも二連で行い、標準偏差を計算した（表4）。
【００９５】
（表4）1〜5の独立した評点（5が最適である）に基づく定性的嗅覚観察、および表面菌蓋の乾燥重量を示す、様々な培地上での揮発性物質産生の基質による促進
2013528050.tif 000008
【００９６】
実施例4：ヒポキシロン属の種のVOCの定量
ヒポキシロン属の種により産生される揮発性産物の濃度を、PDAの300 ml斜面を有する1 L瓶中の上部の空間において連続的に定量するために、PTR-MSを含む直接法を用いた（図1）。PTRスペクトルにおけるすべてのイオンを連続方式でモニタリングしたところ、これらは質量41〜205の範囲であった（図6）。最大イオン産出量を、約6日のインキュベーションで検出した。これはヒポキシロン属の種のVOCに対するアッセイ生物の感受性と一致する（図7）（表1）。真菌VOCの最大産生全体は、6日で145 ppmvであり、7.65 ppmv/時間の計算速度であった（図7）。この真菌の、全体のVOC産生量は、他のガスを産生する真菌の産出量と比較した場合、相当なものであるように見られる（Ezra, et al., 2004a, Microbiology 150:4023-4031；Strobel, et al., 2008, Microbiology 154:3319-3328）。ガス混合物の主な成分は、PTR質量スペクトルがエタノール、アセトアルデヒド、および、質量が120である不飽和化合物のプロトン化された形を表す可能性が最も高い質量121と一致する化合物であった（表3）。1,8シネオール、ならびに、81、137、および155の質量を生成する他のテルペノイドと一致するイオンはまた、実験の時間経過に渡ってその濃度の概算を可能にし、それらは5.5〜6日で最高点に達する（図7）。しかしながら、フラスコ中の、質量155に基づく1,8シネオール産生の直接概算値は、6日で約800 ppbvであり、真菌VOC全体の約0.5％である。
【００９７】
要約すると、ヒポキシロン属の種の6日間培養物は、ボトリチス・シネレア、フィトフトラ・シナモミ、セルコスポラ・ベチコラ、およびスクレロチニア・スクレロチオルムに対して最大のVOC-抗微生物活性を提示し、VOCが真菌の生態およびその宿主植物中での生存においていくらかの役割を果たし得ることを示唆した。デンプンまたは糖関連基質を含有する培地は、真菌によるVOC産生を最も良好に支持した。VOCの直接のオンライン定量は、連続範囲を扱うプロトン移動質量分析計（PTR-MS）により測定し、最適なVOC産生は6日で145 ppmv生じ、産生速度は7.65 ppmv/時間であった。これは、1,8-シネオール（モノテルペン）が、この化合物の新規かつ重要な供給源となる微生物により産生されることを実証する。このモノテルペンは、オクタン誘導体であり、かつこの生物の他のVOCと同様に、燃料添加物として潜在的用途を有する。従って、ヒポキシロン属の種により産生されるような本化合物および他のVOCの真菌による調達は、医療、工業、およびエネルギー生産におけるそれらの潜在的用途を大幅に拡大する。
【００９８】
本明細書において引用される各々およびすべての特許、特許出願、および刊行物の開示はこれにより、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００９９】
本発明が特定の態様に関連して開示されてきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱すること無く、本発明の他の態様および変形物が、当業者により考案されてもよいことが明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような態様および等価の変形物を含むと解釈されるように意図される。
【図１】
2013528050.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2013528050000001.app
【国際調査報告】
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