(57)【要約】  本発明は、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容される塩を合成する方法に関するものであり：（Ｉ）式中、Ｘ、ＡｌｋおよびＷは上で定義され、本明細書に記載されている通りである。【選択図】図７
2013537529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
2013537529.tif 000073
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
Ｗは薬物である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ａの化合物：
【化２】
2013537529.tif 000074
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）前記式Ａの化合物をアミン含有薬物と反応させて、式Ｉの化合物を形成するステップ；
を含む方法。
【請求項２】
式ＩＩの化合物：
【化３】
2013537529.tif 000075
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ａの化合物：
【化４】
2013537529.tif 000076
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）前記式Ａの化合物をインスリン分子と反応させて、式ＩＩの化合物を形成するステップ；
を含む方法。
【請求項３】
Ｘの各出現が同じリガンドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＬＧ１が−ＯＳｕである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
式ＩＩの化合物が図１に示すものから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
式Ａの化合物：
【化５】
2013537529.tif 000077
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよく；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｂの化合物：
【化６】
2013537529.tif 000078
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）式Ｂの前記化合物のカルボン酸を活性化して、式Ａの化合物を形成するステップ；
を含む方法。
【請求項７】
式Ｂの化合物：
【化７】
2013537529.tif 000079
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｃの化合物：
【化８】
2013537529.tif 000080
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ２−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）式Ｃの化合物を脱保護して、式Ｂの化合物を形成するステップ；
を含む方法。
【請求項８】
式Ｃの化合物：
【化９】
2013537529.tif 000081
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｄの化合物：
【化１０】
2013537529.tif 000082
（式中：
ＰＧ１はカルボン酸保護基であり；および
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）式Ｄの化合物をアミン含有リガンドＨ２Ｎ−Ｘ（Ｅ）と反応させて、式Ｃの化合物を形成するステップ；
を含む方法。
【請求項９】
式Ｄの化合物：
【化１１】
2013537529.tif 000083
（式中：
ＰＧ１はカルボン酸保護基であり；および
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｆの化合物：
【化１２】
2013537529.tif 000084
（式中：
Ａｌｋ１はＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）化合物Ｆのカルボン酸部分を保護して、式Ｄの化合物を与えるステップ；
を含む方法。
【請求項１０】
式Ａの化合物：
【化１３】
2013537529.tif 000085
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｆの化合物：
【化１４】
2013537529.tif 000086
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ；
（ｂ）化合物Ｆのカルボン酸部分を保護して、式Ｄの化合物：
【化１５】
2013537529.tif 000087
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を与えるステップ；
（ｃ）式Ｄの化合物をアミン含有リガンドＨ２Ｎ−Ｘ（Ｅ）と反応させて、式Ｃの化合物：
【化１６】
2013537529.tif 000088
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を形成するステップ；
（ｄ）式Ｃの化合物を脱保護して、式Ｂの化合物：
【化１７】
2013537529.tif 000089
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を形成するステップ；
および
（ｅ）前記式Ｂの化合物のカルボン酸を活性化して、式Ａの化合物を形成するステップ；
を含む方法。
【請求項１１】
式Ｉの化合物：
【化１８】
2013537529.tif 000090
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
Ｗは薬物である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｆの化合物：
【化１９】
2013537529.tif 000091
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ；
（ｂ）化合物Ｆのカルボン酸部分を保護して、式Ｄの化合物：
【化２０】
2013537529.tif 000092
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を与えるステップ；
（ｂ）式Ｄの化合物をアミン含有リガンドＨ２Ｎ−Ｘ（Ｅ）と反応させて、式Ｃの化合物：
【化２１】
2013537529.tif 000093
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を形成するステップ；
（ｄ）式Ｃの化合物を脱保護して、式Ｂの化合物：
【化２２】
2013537529.tif 000094
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を形成するステップ；
（ｅ）式Ｂの前記化合物のカルボン酸を活性化して、式Ａの化合物：
【化２３】
2013537529.tif 000095
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を形成するステップ；
および
（ｆ）式Ａの化合物をアミン含有薬物と反応させて、式Ｉの化合物を形成するステップ；
を含む方法。
【請求項１２】
式ＩＩの化合物：
【化２４】
2013537529.tif 000096
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｆの化合物：
【化２５】
2013537529.tif 000097
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ；
（ｂ）化合物Ｆのカルボン酸部分を保護して、式Ｄの化合物：
【化２６】
2013537529.tif 000098
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を与えるステップ；
（ｃ）式Ｄの化合物をアミン含有リガンドＨ２Ｎ−Ｘ（Ｅ）と反応させて、式Ｃの化合物：
【化２７】
2013537529.tif 000099
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよく；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を形成するステップ；
（ｄ）式Ｃの化合物を脱保護して、式Ｂの化合物：
【化２８】
2013537529.tif 000100
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を形成するステップ；
（ｅ）式Ｂの前記化合物のカルボン酸を活性化して、式Ａの化合物：
【化２９】
2013537529.tif 000101
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を形成するステップ；
および
（ｆ）式Ａの化合物をインスリン分子と反応させて、式ＩＩの化合物；
を形成するステップ。
【請求項１３】
式Ｆの化合物：
【化３０】
2013537529.tif 000102
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン基は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換され得る。）。
【請求項１４】
式Ｆの化合物が
【化３１】
2013537529.tif 000103
である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
式Ｄの化合物：
【化３２】
2013537529.tif 000104
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン基は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換され得て；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）。
【請求項１６】
式Ｄの化合物が
【化３３】
2013537529.tif 000105
である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
式Ｃの化合物：
【化３４】
2013537529.tif 000106
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換され得て；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）。
【請求項１８】
式Ｃの化合物が
【化３５】
2013537529.tif 000107
である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
式Ｂの化合物：
【化３６】
2013537529.tif 000108
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）。
【請求項２０】
式Ｂの化合物が
【化３７】
2013537529.tif 000109
である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
式Ａの化合物：
【化３８】
2013537529.tif 000110
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換され得て；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）。
【請求項２２】
式Ａの化合物が
【化３９】
2013537529.tif 000111
である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
式のコンジュゲート：
【化４０】
2013537529.tif 000112
（式中、
【化４１】
2013537529.tif 000113
はインスリン分子であり、ＧｌｙＡ１に結合して示されているＮＨ−基は、インスリン分子のＡ１位置におけるグリシン残基のアルファアミノ酸からであり、およびＬｙｓＢ２９に結合して示されているＮＨ−基は、インスリン分子のＢ２９位置におけるリジン残基のイプシロンアミノ酸からである。）。
【請求項２４】
【化４２】
2013537529.tif 000114
が野生型ヒトインスリンである、請求項２３に記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／２２２６８号は、コンジュゲート・ベース・システム、その調製方法およびこれらのコンジュゲートのたとえば治療薬としての使用について記載している。薬物−リガンドコンジュゲートの代わりの合成方法が所望される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００２】
【特許文献１】国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／２２２６８号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本明細書に記載する場合、本発明は、インスリンなどの薬物の薬物動態（ＰＫ）および／または薬力学（ＰＤ）プロフィールを、グルコースなどの糖類の全身濃度に応答する方法で制御することができる薬物−リガンドコンジュゲートを調製する方法を提供する。このようなコンジュゲートは、式Ｉのコンジュゲート：
【０００４】
【化１】
2013537529.tif 000003
またはその医薬的に許容される塩を包含し、式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；
Ｗは薬物である。
【０００５】
本発明は、このようなコンジュゲートを調製するのに有用な合成中間体も提供する。ある実施形態において、薬物−リガンドコンジュゲートの調製に有用な例示的中間体は、式Ａのコンジュゲートであり：
【０００６】
【化２】
2013537529.tif 000004
式中、Ｘ、ＡｌｋおよびＬＧ１は、定義されている通りであり、本明細書の実施形態に記載されている。
【０００７】
本発明は、Ｗのような薬物の代わりに、検出可能な標識を包含するコンジュゲートを調製する方法も提供する。
定義
本明細書全体を通じて使用する具体的な官能基、化学用語および一般用語の定義を、以下でより詳細に記載する。本発明の目的のために、化学元素は、Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＣＡＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５ｔｈ  Ｅｄ．，内表紙に従って明示されるものであり、具体的な官能基は一般にその中に記載されているように定義されている。加えて、有機化学の一般原理ならびに具体的な官能部分および反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，１９９９；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ  Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１；Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８７に記載されている。
【０００８】
アシル−本明細書で使用する場合、「アシル」という用語は、一般式−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸＩ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＸＩ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸＩ、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲＸＩ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＸＩ）２、−Ｃ（＝Ｓ）ＲＸＩ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（ＲＸＩ）２および−Ｃ（＝Ｓ）Ｓ（ＲＸＩ）、−Ｃ（＝ＮＲＸＩ）ＲＸＩ、−Ｃ（＝ＮＲＸＩ）ＯＲＸＩ、−Ｃ（＝ＮＲＸＩ）ＳＲＸＩならびに−Ｃ（＝ＮＲＸＩ）Ｎ（ＲＸＩ）２（式中、ＲＸＩは、水素；ハロゲン；置換もしくは非置換ヒドロキシル；置換もしくは非置換チオール；置換もしくは非置換アミノ；置換もしくは非置換アシル；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分枝もしくは非分枝脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換，分枝もしくは非分枝ヘテロ脂肪族；環式もしくは非環式、置換もしくは非置換，分枝もしくは非分枝アルキル；環式もしくは非環式，置換もしくは非置換，分枝もしくは非分枝アルケニル；置換もしくは非置換アルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、モノ−もしくはジ脂肪族アミノ、モノ−もしくはジヘテロ脂肪族アミノ、モノ−もしくはジアルキルアミノ、モノ−もしくはジヘテロアルキルアミノ、モノ−もしくはジアリールアミノ、またはモノ−もしくはジヘテロアリールアミノであるか；または２個のＲＸＩ基がひとまとめにされて、５から６員複素環式環を形成する。）を指す。例示的なアシル基としては、アルデヒド（−ＣＨＯ）、カルボン酸（−ＣＯ２Ｈ）、ケトン、アシルハライド、エステル、アミド、イミン、カーボネート、カルバメートおよび尿素が挙げられる。アシル置換基としては、これに限定されるわけではないが、安定性部分の形成を生じる、本明細書に記載する置換基のいずれか（たとえば脂肪族、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロ脂肪族，複素環式、アリール、ヘテロアリール、アシル、オキソ、イミノ、チオキソ、シアノ、イソシアノ、アミノ、アジド、ニトロ、ヒドロキシル、チオール、ハロ、脂肪族アミノ、ヘテロ脂肪族アミノ、アルキルアミノ、ヘテロアルキルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アルキルアリール、アリールアルキル、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、アシルオキシなど、そのそれぞれはさらに置換されていても、または置換されていなくてもよい。）が挙げられる。
【０００９】
脂肪族−本明細書で使用する場合、「脂肪族」または「脂肪族基」という用語は、直鎖（すなわち非分枝）、分枝または環式（「炭素環式」）であり得る、および完全に飽和され得るまたは１単位以上の不飽和を含有し得るが、芳香族ではない、置換されていてもよい炭化水素部分を示す。別途規定しない限り、脂肪族基は１−１２個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態において、脂肪族基は１−６個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態において、脂肪族基は１−４個の炭素原子を含有して、また他の実施形態において、脂肪族基は１−３個の炭素原子を含有する。好適な脂肪族基としては、これに限定されるわけではないが，直鎖または分枝アルキル、アルケニルおよびアルキニル基、ならびにたとえば（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキルまたは（シクロアルキル）アルケニルなどのそのハイブリッドが挙げられる。
【００１０】
アルケニル−本明細書で使用する場合、「アルケニル」という用語は、単一の水素原子の除去により少なくとも１個の炭素間二重結合を有する直鎖または分枝鎖脂肪族部分から誘導された置換されていてもよい１価基を示す。ある実施形態において、本発明で用いられるアルケニル基は２−６個の炭素原子を含有する。ある実施形態において、本発明で用いられるアルケニル基は２−５個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態において、本発明で用いられるアルケニル基は２−４個の炭素原子を含有する。別の実施形態において、用いられるアルケニル基は２−３個の炭素原子を含有する。アルケニル基としては、たとえばエテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イルなどが挙げられる。
【００１１】
アルキル−本明細書で使用する場合、「アルキル」という用語は、単一の水素原子の除去により１から６個の間の炭素原子を含有する脂肪族部分から誘導された置換されていてもよい飽和、直鎖または分枝鎖炭化水素ラジカルを指す。いくつかの実施形態において、本発明で用いられるアルキル基は１−５個の炭素原子を含有する。別の実施形態において、用いられるアルキル基は１−４個の炭素原子を含有する。なお他の実施形態において、アルキル基は１−３個の炭素原子を含有する。また別の実施形態において、アルキル基は１−２個の炭素を含有する。アルキルラジカルの例としては、これに限定されるわけではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｓｅｃ−ペンチル、イソ−ペンチル，ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ドデシルなどが挙げられる。
【００１２】
アルキニル−本明細書で使用する場合、「アルキニル」という用語は、単一の水素原子の除去により少なくとも１個の炭素間三重結合を有する直鎖または分枝鎖脂肪族部分から誘導された置換されていてもよい１価基を指す。ある実施形態において、本発明で用いられるアルキニル基は２−６個の炭素原子を含有する。ある実施形態において、本発明で用いられるアルキニル基は２−５個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態において、本発明で用いられるアルキニル基は２−４個の炭素原子を含有する。別の実施形態において、用いられるアルキニル基は２−３個の炭素原子を含有する。代表的なアルキニル基としては、これに限定されるわけではないが、エチニル、２−プロピニル（プロパルギル）、１−プロピニルなどが挙げられる。
【００１３】
アリール−本明細書で使用する場合、「アリール」という用語は、単独でまたは「アラルキル」、「アラルコキシ」または「アリールオキシアルキル」におけるようにより大型の部分の一部として使用され、５から１０環員を有する置換されていてもよい単環式または二環式環系であって、系の少なくとも１個の環が芳香族であり、系の各環が３から７個の環員を含有する単環式または二環式環系を指す。「アリール」という用語は、「アリール環」という用語と互換的に使用され得る。本発明のある実施形態において、「アリール」は、これに限定されるわけではないが、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラシルなどを包含し、１個以上の置換基を担持し得る芳香環系を指す。
【００１４】
アリールアルキル−本明細書で使用する場合、「アリールアルキル」という用語は、アリール基（たとえば芳香族またはヘテロ芳香族基）によって置換されたアルキル基を指す。
【００１５】
アルキレン鎖−本明細書で使用する場合、「アルキレン鎖」（単に「アルキレン」とも呼ばれる）という用語は、ポリメチレン基、すなわち−（ＣＨ２）Ｚ−であり、式中、ｚは、１から３０の、１から２０の、１から１２の、１から８の、１から６の、１から４の、１から３の、１から２の、２から３０の、２から２０の、２から１０の、２から８の、２から６の、２から４の、または２から３の正の整数である。置換二価炭化水素鎖は、１つ以上のメチレン水素原子が置換基によって置き換えられているポリメチレン基である。置換脂肪族基のための好適な置換基は下記の置換基を包含する。メチレン単位−ＣＨ２−も−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−などの他の二価基によって置き換えられていてもよい。
【００１６】
カルボニル−本明細書で使用する場合、「カルボニル」という用語は、炭素−酸素二重結合を含有する一価または二価部分を指す。カルボニル基の非制限的な例としては、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、アシルハライド、無水物、尿素、カルバメート、カーボネート、チオエステル、ラクトン、ラクタム、ヒドロキサメート、イソシアネートおよびクロロホルメートが挙げられる。
【００１７】
脂環式−本明細書で使用する場合、「脂環式」、「炭素環」、または「炭素環式」は、単独でまたより大型の部分の一部として使用され、３から１０個の環員を有する、本明細書に記載されているような、置換されていてもよい飽和または部分不飽和の、環式脂肪族単環式または二環式環系を指す。脂環式基としては、制限なく、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、シクロオクチル、シクロオクテニルおよびシクロオクタジエニルが挙げられる。いくつかの実施形態において、シクロアルキルは３−６個の炭素を有する。
【００１８】
ハロゲン−本明細書で使用する場合、「ハロ」および「ハロゲン」という用語は、フッ素（フルオロ、−Ｆ）、塩素（クロロ、−Ｃｌ）、臭素（ブロモ、−Ｂｒ）およびヨウ素（ヨード、−Ｉ）から選択される原子を指す。
【００１９】
ヘテロ脂肪族−本明細書で使用する場合、「ヘテロ脂肪族」または「ヘテロ脂肪族基」という用語は、直鎖（すなわち非分枝）、分枝または環式（「複素環式」）であり得る、および完全に飽和され得るまたは１単位以上の不飽和を含有し得るが、芳香族ではない、炭素原子に加えて１から５個のヘテロ原子を有する、置換されていてもよい炭化水素部分を示す。別途規定しない限り、ヘテロ脂肪族基は１−６個の炭素原子を含有し、１−３個の炭素原子は、酸素、窒素および硫黄から選択されるヘテロ原子によって独立して置き換えられていてもよい。いくつかの実施形態において、ヘテロ脂肪族基は１−４個の炭素原子を含有して、１−２個の炭素原子は、酸素、窒素および硫黄から選択されるヘテロ原子によって独立して置き換えられていてもよい。また他の実施形態において、ヘテロ脂肪族基は１−３個の炭素原子を含有して、１個の炭素原子は、酸素、窒素および硫黄から選択されるヘテロ原子によって独立して置き換えられていてもよい。好適なヘテロ脂肪族基としては、これに限定されるわけではないが、直鎖または分枝ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよびヘテロアルキニル基が挙げられる。
【００２０】
ヘテロアラルキル−本明細書で使用する場合「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールによって置換され、アルキルおよびヘテロアリール部分が独立して置換されていてもよいアルキル基を指す。
【００２１】
ヘテロアリール−本明細書で使用する場合、単独でまたはより大型の部分の一部、たとえば「ヘテロアラルキル」もしくは「ヘテロアラルコキシ」として使用される「ヘテロアリール」という用語は、５から１０個の環原子、好ましくは５、６または９個の環原子を有する；環式アレイ内で共有される６、１０または１４個のπ電子を有し；および炭素原子に加えて、１から５個のヘテロ原子を有する、置換されていてもよい基を指す。ヘテロアリール基としては、制限なく、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニルおよびプテリジニルが挙げられる。「ヘテロアリール」および「ヘテロアル−」という用語は、本明細書で使用する場合、ヘテロ芳香族環が１つ以上のアリール環、炭素環式環または複素環式環に縮合され、ラジカルまたは結合点がヘテロ芳香族環上にある基も包含する。非制限的な例としては、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ−キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニルおよびテトラヒドロイソキノリニルが挙げられる。ヘテロアリール基は単環式または二環式であり得る。「ヘテロアリール」という用語は、「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」または「ヘテロ芳香族」という用語と互換的に使用され得て、その用語のいずれも置換されていてもよい環を包含する。
【００２２】
ヘテロ原子−本明細書で使用する場合、「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素または硫黄を指し、窒素または硫黄のいずれの酸化形および塩基性窒素のいずれの四級化形も包含する。「窒素」という用語は置換された窒素も包含する。
【００２３】
複素環式−本明細書で使用する場合、「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式ラジカル」および「複素環式環」という用語は、互換的に使用され、飽和または部分不飽和のどちらかであり、炭素原子に加えて１個以上の上で定義したようなヘテロ原子を有する、安定な、置換されていてもよい５から７員単環式または７から１０員二環式複素環式部分を指す。複素環式環は、安定な構造を生じるいずれのヘテロ原子または炭素原子にてそのペンダント基に結合することができ、環原子のいずれも置換されていてもよい。このような飽和または部分不飽和複素環式ラジカルの例としては、制限なく、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニルおよびキヌクリジニルが挙げられる。「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」および「複素環式ラジカル」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ヘテロシクリル環がインドリニル、３Ｈ−インドリル、クロマニル、フェナントリジニルまたはテトラヒドロキノリニルなどの１個以上のアリール環、ヘテロアリール環または炭素環式環に縮合され、ラジカルまたは結合点がヘテロシクリル環上にある基も包含する。ヘテロシクリル基は単環式または二環式であり得る。「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、アルキル基がヘテロシクリルによって置換されたアルキル基を指し、アルキル部分およびヘテロシクリル部分は独立して、置換されていてもよい。
【００２４】
不飽和−本明細書で使用する場合、「不飽和」という用語は、部分が１個以上の二重または三重結合を有することを意味する。
【００２５】
部分不飽和−本明細書で使用する場合、「部分不飽和」という用語は、少なくとも１つの二重または三重結合を含む環部分を指す。「部分不飽和」という用語は、複数の不飽和部位を有する環を含むことを意図するが、本明細書で定義するようなアリールまたはヘテロアリール部分を包含することは意図しない。
【００２６】
置換されていてもよい−本明細書に記載する場合、本発明の化合物は「置換されていてもよい」部分を含有し得る。概して、「置換された」という用語は、「されていてもよい」という用語に先行されていてもいなくても、指示された部分の１個以上の水素が好適な置換基によって置き換えられていることを意味する。別途指摘しない限り、「置換されていてもよい」基は、基の各置換可能な位置に好適な置換基を有し得て、所与の構造中の１を超える位置が規定された群より選択された１を超える置換基によって置換され得る場合、置換基は、各位置にて同じであり得るか、または異なり得るかのいずれかである。本発明により想定される置換基の組合せは、好ましくは安定な、または化学的に実現可能な化合物の形成を生じる組合せである。「安定な」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に開示した目的の１つ以上のための、その生成、検出、ならびにある実施形態において、その回収、精製および使用を可能にする条件に供されたときに、実質的に改変されない化合物を指す。
【００２７】
「置換されていてもよい」基の置換可能な炭素原子上の好適な一価置換基は独立して、ハロゲン；−（ＣＨ２）０−４Ｒ○；−（ＣＨ２）０−４ＯＲ○；−Ｏ−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−（ＣＨ２）０−４ＣＨ（ＯＲ○）２；−（ＣＨ２）０−４ＳＲ○；−（ＣＨ２）０−４Ｐｈ（Ｒ○によって置換され得る）；−（ＣＨ２）０−４Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ（Ｒ○によって置換され得る）；−ＣＨ＝ＣＨＰｈ（Ｒ○によって置換され得る）；−ＮＯ２；−ＣＮ；−Ｎ３；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ○）２；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｓ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｓ）ＮＲ○２；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（Ｓ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＳＲ○；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＳｉＲ○３；−（ＣＨ２）０−４ＯＣ（Ｏ）Ｒ○；−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）０−４ＳＲ−；ＳＣ（Ｓ）ＳＲ○；−（ＣＨ２）０−４ＳＣ（Ｏ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｓ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｓ）ＳＲ○；−ＳＣ（Ｓ）ＳＲ○、−（ＣＨ２）０−４ＯＣ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ○）Ｒ○；−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（ＮＯＲ○）Ｒ○；−（ＣＨ２）０−４ＳＳＲ○；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）２Ｒ○；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）２ＯＲ○；−（ＣＨ２）０−４ＯＳ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ○２；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｓ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｎ（ＯＲ○）Ｒ○；−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ○２；−Ｐ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｐ（Ｏ）Ｒ○２；−ＯＰ（Ｏ）Ｒ○２；−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ○）２；ＳｉＲ○３；−（Ｃ１−４直鎖もしくは分枝アルキレン）Ｏ−Ｎ（Ｒ○）２；または−（Ｃ１−４直鎖もしくは分枝アルキレン）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｎ（Ｒ○）２であり、式中、各Ｒ○は、下で定義するように置換され得て、独立して水素、Ｃ１−６脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または窒素、酸素もしくは硫黄より独立して選択される０−４個のヘテロ原子を有する５−６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環であるか、または上の定義にかかわらず、Ｒ○の２つの独立した出現は、その介在原子とひとまとめにされて、下で定義されるように置換され得る、窒素、酸素、または硫黄より独立して選択される０−４個のヘテロ原子を有する３−１２員飽和、部分不飽和またはアリール単環式または二環式環を形成する。
【００２８】
Ｒ○（またはＲ○の２つの独立した出現をその介在原子とひとまとめにすることによって形成された環）上の好適な一価置換基は、独立してハロゲン、−（ＣＨ２）０−２Ｒ●、−（ハロＲ●）、−（ＣＨ２）０−２ＯＨ、−（ＣＨ２）０−２ＯＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＣＨ（ＯＲ●）２；−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｎ３、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）Ｒ●、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＳＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＳＨ、−（ＣＨ２）０−２ＮＨ２、−（ＣＨ２）０−２ＮＨＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＮＲ●２，−ＮＯ２、−ＳｉＲ●３、−ＯＳｉＲ●３、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ●、−（Ｃ１−４直鎖または分枝アルキレン）Ｃ（Ｏ）ＯＲ●または−ＳＳＲ●であり、式中、各Ｒ●は非置換であるか、または「ハロ」に先行されている場合は１つ以上のハロゲンでのみ置換されており、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される０−４個のヘテロ原子を有する５−６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環から独立して選択される。Ｒ○の飽和炭素原子上の好適な二価置換基としては、＝Ｏおよび＝Ｓが挙げられる。
【００２９】
「置換されていてもよい」基の飽和炭素原子上の好適な二価置換基としては、以下の：＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＮＲ＊２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ＊、＝ＮＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ＊、＝ＮＲ＊、＝ＮＯＲ＊、−Ｏ（Ｃ（Ｒ＊２））２−３Ｏ−または−Ｓ（Ｃ（Ｒ＊２））２−３Ｓ−が挙げられ、Ｒ＊の各独立した出現は、水素、下で定義するように置換され得るＣ１−６脂肪族、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される０−４個のヘテロ原子を有する非置換５−６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環から独立して選択される。「置換されていてもよい」基の近接した置換可能な炭素に結合されている好適な二価置換基としては：−Ｏ（ＣＲ＊２）２−３Ｏ−が挙げられ、Ｒ＊の各独立した出現は、水素、下で定義するように置換され得るＣ１−６脂肪族、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される０−４個のヘテロ原子を有する非置換５−６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環から独立して選択される。
【００３０】
Ｒ＊の脂肪族基上の好適な置換基としては、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２、または−ＮＯ２が挙げられ、各Ｒ●は非置換であるか、または「ハロ」に先行されている場合は１つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される０−４個のヘテロ原子を有する５−６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環である。
「置換されていてもよい」基の置換可能な窒素上の好適な置換基としては、−Ｒ†、−ＮＲ†２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ†、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ†２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ†２、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ†２、または−Ｎ（Ｒ†）Ｓ（Ｏ）２Ｒ†が挙げられ；各Ｒ†は独立して、水素、下で定義するように置換され得るＣ１−６脂肪族、非置換−ＯＰｈ、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される０−４個のヘテロ原子を有する非置換５−６員飽和、部分不飽和、もしくはアリール環であり、または上の定義にかかわらず、Ｒ†の２つの独立した出現は、その介在原子とひとまとめにされて、窒素、酸素、または硫黄より独立して選択される０−４個のヘテロ原子を有する非置換３−１２員飽和、部分不飽和またはアリール単環式または二環式環を形成する。
【００３１】
Ｒ†の脂肪族基上の好適な置換基は、独立して、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２、または−ＮＯ２であり、各Ｒ●は非置換であるか、または「ハロ」に先行されている場合は１つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される０−４個のヘテロ原子を有する５−６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環である。
【００３２】
好適な保護基−本明細書で使用する場合、「好適な保護基」という用語は、化合物内の位置に応じてアミノ保護基またはカルボン酸保護基を指し、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に記載されている保護基を含む。
【００３３】
好適なカルボン酸保護基としては、シリル−、アルキル−、アルケニル−、アリール−およびアリールアルキル−保護カルボン酸が挙げられる。好適なシリル基の例としては、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリイソプロピルシリルなどが挙げられる。好適なアルキル基の例としては、メチル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、トリチル、ｔ−ブチル、テトラヒドロフラン−２−イルが挙げられる。好適なアルケニル基の例としては、アリールが挙げられる。好適なアリール基の例としては、置換されていてもよいフェニル、ビフェニル、またはナフチルが挙げられる。好適なアリールアルキル基の例としては、置換されていてもよいベンジル（たとえばｐ−メトキシベンジル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジル、Ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル）、ならびに２−および４−ピコリルが挙げられる。
【００３４】
化学可変部（たとえばＲ基）が環の結合と交差している結合に結合して示されているいずれの場合においても、このことは１つ以上のこのような可変部が交差している結合を有する環に結合されていてもよいことを意味する。このような環上の各Ｒ基は、いずれの好適な位置にも結合することができ、このことは該基が、親環上の水素原子の代わりに結合されていることを意味すると一般に理解される。このことは２つのＲ基が同じ環原子に結合できる可能性を包含する。さらに、１つを超えるＲ基が環上に存在する場合、各Ｒ基は環に結合されている他のＲ基と同じであり得るか、または異なり得て、各基は、それらが同じ識別子名で表され得る場合でも、同じ分子上の別の箇所に結合され得る他の基とは独立して定義される。
【００３５】
生体分子−本明細書で使用する場合、「生体分子」という用語は、天然発生型であるか、または人工的に生成されたかにかかわらず（たとえば合成もしくは組換え方法）、細胞内および組織内に普通に見出される分子（たとえばポリペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、多糖類、糖類、脂質、核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ステロイド、代謝産物など）を指す。生体分子の具体的なクラスとしては、これに限定されるわけではないが、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、成長因子および化学走化性因子などの細胞応答修飾因子、抗体、ワクチン、ハプテン、毒素、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス剤、プラスミド、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。
【００３６】
薬物−本明細書で使用する場合、「薬物」という用語は、生物学的事象を改変する、阻害する、活性化する、またはそうでなければ影響を及ぼす小分子または生体分子を指す。たとえば薬物としては、これに限定されるわけではないが、抗ＡＩＤＳ物質、抗癌物質、抗生物質、抗糖尿物質、免疫抑制薬、抗ウイルス物質、酵素阻害薬、神経毒、オピオイド、催眠薬、抗ヒスタミン薬、潤滑薬、精神安定薬、抗痙攣薬、筋弛緩薬および抗パーキンソン病物質、チャネルブロッカー、縮瞳薬および抗コリン作用薬を含む鎮痙薬および筋収縮薬、抗緑内障化合物、抗寄生虫および／または抗原虫化合物、細胞増殖阻害薬および抗接着分子を含む細胞−細胞外マトリックス相互作用の調節薬、血管拡張剤、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の合成阻害薬、抗高血圧薬、鎮痛薬、解熱薬、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤、抗血管形成因子、抗分泌因子、抗凝固薬および／または抗血栓剤、局所麻酔薬、眼科用薬、プロスタグランジン、抗鬱薬、抗精神病物質、制吐薬、ならびに造影剤が挙げられ得る。本発明における使用に適した例示的な薬物のより完全な列挙は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｐａｔｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ａｘｅｌ  Ｋｌｅｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｊｕｒｇｅｎ  Ｅｎｇｅｌ著、Ｔｈｉｅｍｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９９；ｔｈｅ「Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ：Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ」，Ｓｕｓａｎ  Ｂｕｄａｖａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６、およびｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ−２５／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ−２０，ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．刊，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ，２００１に見出され得る。
【００３７】
外因性の−本明細書で使用する場合、「外因性の」分子は、患者に投与されない限り、有意なレベルで患者に存在しない分子である。ある実施形態において、患者は哺乳動物、たとえばヒト、イヌ、ネコ、ラット、ミニブタなどである。本明細書で使用する場合、分子は、その種類の患者の正常血清が０．１ｍＭ未満の分子を包含する場合、分子は有意なレベルで患者に存在しない。ある実施形態において、患者の正常血清は、０．０８ｍＭ未満、０．０６ｍＭ未満、または０．０４ｍＭ未満の分子を包含し得る。
【００３８】
正常血清−本明細書で使用する場合、「正常血清」は、５名以上の非糖尿病患者による凝固全血の液体部分をほぼ等しい量を貯留することにより得られる血清である。非糖尿病ヒト患者は、血液が採取されるときに糖尿病症状を呈していない、無作為に選択される１８歳から３０歳の患者である。
【００３９】
ポリマー−本明細書で使用する場合、「ポリマー」または「ポリマー構造」は、共有結合された一連のモノマーを包含する構造である。ポリマーは１種類のモノマーまたは１を超える種類のモノマーから作製することができる。「ポリマー」という用語はしたがって、異なる種類のモノマーがポリマー全体内で個別にグループ化されているブロックコポリマーを包含するコポリマーを含む。ポリマーは直鎖または分枝であることができる。
【００４０】
ポリヌクレオチド−本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーである。「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され得る。ポリマーとしては、天然ヌクレオシド（すなわちアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（たとえば２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、ジヒドロウリジン、メチルプソイドウリジン、１−メチルアデノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシンおよび２−チオシチジン）、化学修飾塩基、生物学的修飾塩基（たとえばメチル化塩基）、インターカレート塩基、修飾糖類（たとえば２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−メチルシチジン、アラビノースおよびヘキソース）、または修飾リン酸基（たとえばホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）が挙げられ得る。
【００４１】
ポリペプチド−本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」はアミノ酸のポリマーである。「ポリペプチド」、「タンパク質」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」という用語は、互換的に使用され得る。ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸（すなわち天然には存在しないが、ポリペプチド鎖内に組み込むことができる化合物）および／または当分野で公知であるようなアミノ酸類似体を含有し得る。またポリペプチド中のアミノ酸残基の１つ以上が、たとえば炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化または他の修飾のためのリンカーなどの化学的実体の付加によって修飾され得る。このような修飾としては、ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸の組み込みなどが挙げられ得る。
【００４２】
多糖−本明細書で使用する場合、「多糖」は糖類のポリマーである。「多糖」、「炭水化物」および「オリゴ糖」という用語は、互換的に使用され得る。ポリマーとしては、天然糖類（たとえばアラビノース、リキソース、リボース、キシロース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノース、タロース、フルクトース、プシコース、ソルボース、タガトース、マンノヘプツロース、セドヘプツロース、オクツロース（ｏｃｔｏｌｏｓｅ）およびシアロース（ｓｉａｌｏｓｅ）および／または修飾糖質（たとえば２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボースおよびヘキソース）が挙げられ得る。例示的な二糖としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ゲンチオビオース、イソマルトース、コージビオース、ラミナリビオース、マンノビオース、メリビオース、ニゲロース、ルチノースおよびキシロビオースが挙げられる。
【００４３】
小分子−本明細書で使用する場合、「小分子」という用語は、天然発生型であるか、または人工的に生成されたかにかかわらず（たとえば化学合成により）、比較的低い分子量を有する分子を指す。通例、小分子は単量体であり、約１５００Ｄａ未満の分子量を有する。好ましい小分子は、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトにおいて局所または全身効果を産生するという点で生物学的に活性である。ある好ましい実施形態において、小分子は薬物である。好ましくは、必ずしもというわけではないが、薬物は、適切な政府機関または団体によって、使用が安全および有効であるとすでにみなされている薬物である。たとえばＦＤＡにより２１  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§３３０．５，３３１から３６１および４４０から４６０に挙げられたヒトに使用するための薬物；ＦＤＡにより２１  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§５００から５８９に挙げられた動物に使用するための薬物はすべて、本発明による使用に許容され得るとみなされる。
【００４４】
処置する−本明細書で使用する場合、「処置する」（または「処置すること」、「処置された」、「処置」など）という用語は、病気（たとえば糖尿病）、病気の１つもしくは複数の症状（たとえば高血糖）または病気への素因を軽減する、緩和する、改変する、回復させる、改善する、または影響を及ぼす目的で、処置を必要とする対象への本開示のコンジュゲートの投与を指す。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】例示的なインスリン−コンジュゲートの構造。実施例に記載したように、これらのコンジュゲートはそれぞれ組換え野生型ヒトインスリンを用いて調製された（野生型ヒトインスリンの構造については下を参照）。したがって図１に示すような楕円形内の記号「インスリン」は、野生型ヒトインスリンを表すことを主に意図する。本明細書で議論するように、本開示は、野生型ヒトインスリン以外のインスリン分子を包含するこれらおよび他のコンジュゲートのタイプも特に含むことが理解されるべきである。
【図１−１】例示的なインスリン−コンジュゲートの構造。実施例に記載したように、これらのコンジュゲートはそれぞれ組換え野生型ヒトインスリンを用いて調製された（野生型ヒトインスリンの構造については下を参照）。したがって図１に示すような楕円形内の記号「インスリン」は、野生型ヒトインスリンを表すことを主に意図する。本明細書で議論するように、本開示は、野生型ヒトインスリン以外のインスリン分子を包含するこれらおよび他のコンジュゲートのタイプも特に含むことが理解されるべきである。
【図１−２】例示的なインスリン−コンジュゲートの構造。実施例に記載したように、これらのコンジュゲートはそれぞれ組換え野生型ヒトインスリンを用いて調製された（野生型ヒトインスリンの構造については下を参照）。したがって図１に示すような楕円形内の記号「インスリン」は、野生型ヒトインスリンを表すことを主に意図する。本明細書で議論するように、本開示は、野生型ヒトインスリン以外のインスリン分子を包含するこれらおよび他のコンジュゲートのタイプも特に含むことが理解されるべきである。
【図１−３】例示的なインスリン−コンジュゲートの構造。実施例に記載したように、これらのコンジュゲートはそれぞれ組換え野生型ヒトインスリンを用いて調製された（野生型ヒトインスリンの構造については下を参照）。したがって図１に示すような楕円形内の記号「インスリン」は、野生型ヒトインスリンを表すことを主に意図する。本明細書で議論するように、本開示は、野生型ヒトインスリン以外のインスリン分子を包含するこれらおよび他のコンジュゲートのタイプも特に含むことが理解されるべきである。
【図１−４】例示的なインスリン−コンジュゲートの構造。実施例に記載したように、これらのコンジュゲートはそれぞれ組換え野生型ヒトインスリンを用いて調製された（野生型ヒトインスリンの構造については下を参照）。したがって図１に示すような楕円形内の記号「インスリン」は、野生型ヒトインスリンを表すことを主に意図する。本明細書で議論するように、本開示は、野生型ヒトインスリン以外のインスリン分子を包含するこれらおよび他のコンジュゲートのタイプも特に含むことが理解されるべきである。
【図２】非糖尿病オスＳＤラット（ｎ＝３）へのＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３コンジュゲートＩＩ−１の皮下注射（時間０における）と、続いて１５分後のアルファ−メチルマンノース（左）または食塩水（右）の腹腔内注射の後の血清インスリンおよび血中グルコースレベルのプロット。アルファ−メチルマンノースは、非常に高い親和性の糖類であり、Ｃｏｎ  Ａなどのレクチンへの結合についてＡＥＭと競合することができる。図示されているように、アルファ−メチルマンノースの注射から生じるＰＫ／ＰＤプロフィールの変化は有意である（ｐ＜０．０５）。
【図３】非糖尿病オスＳＤラット（ｎ＝３）へのＴＳＰＥ−ＡＥＴＭ−３コンジュゲートＩＩ−２の皮下注射（時間０における）と、続いて１５分後のアルファ−メチルマンノース（左）または食塩水（右）の腹腔内注射の後の血清インスリンおよび血中グルコースレベルのプロット。アルファ−メチルマンノースは、非常に高い親和性の糖類であり、Ｃｏｎ  Ａなどのレクチンへの結合についてＡＥＭと競合することができる。図示されているように、アルファ−メチルマンノースの注射から生じるＰＫ／ＰＤプロフィールの変化は有意である（ｐ＜０．０５）。
【図４】非糖尿病オスＳＤラット（用量当りｎ＝３）への長期作用型コンジュゲート製剤の皮下注射（時間０における）、続いてのグルコース（４ｇ／ｋｇ）の腹腔内注射（２４０分における）の後の、血清インスリン（◆）および血中グルコース（Ｏ）レベルのプロット。コンジュゲートは、ＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３（ＩＩ−１）およびＴＳＰＥ−ＡＥＴＭ−３（ＩＩ−２）である。
【図５】Ｂ２９位置にコンジュゲートされた例示的なインスリンコンジュゲートの組成物。図５の概略図は、野生型ヒトインスリンを表すことを主に意図する。本明細書で議論するように、本開示は野生型ヒトインスリン以外のインスリン分子を包含するこれらおよび他のコンジュゲートのタイプも特に含むことが理解されるべきである。
【図６】Ａ１位置にコンジュゲートされた例示的なインスリンコンジュゲートの組成物。図６の概略図は、野生型ヒトインスリンを表すことを主に意図する。本明細書で議論するように、本開示は、野生型ヒトインスリン以外のインスリン分子を包含するこれらおよび他のコンジュゲートのタイプも特に含むことが理解されるべきである。
【図７】Ｎ末端保護アミノ酸がインスリン分子中に操作されなかった例示的なコンジュゲーションスキーム。Ｌはプロインスリンリーダーペプチドである。Ｃは、ＢペプチドのＣ末端およびＡペプチドのＮ末端を結合するＣペプチドである。これらは第１のステップにおいてプロインスリンから、Ｃ末端リジンプロテアーゼまたはｌｙｓ−Ｃ酵素（たとえばアクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）プロテアーゼすなわちＡＬＰ）を使用して切断される。生じた生物活性インスリン分子（ジスルフィド結合を介して結合されたＡおよびＢペプチドを持つ）は次にＮＨＳ−Ｒ＊とコンジュゲートされ、Ｒ＊は前官能化リガンドフレームワークに相当して、ＮＨＳはＮＨＳエステル基に相当する。コンジュゲーションは、Ａ１、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９位置にて非選択的に発生することが示されている。所望のＬｙｓＢ２９コンジュゲートは次に、コンジュゲートの混合物から精製される。
【図８Ａ】Ｎ末端保護アミノ酸がインスリン分子のＡペプチドおよびＢペプチドの両方の中に操作された例示的なコンジュゲーションスキーム。Ｎ末端保護アミノ酸は、Ａ０およびＢ０として示されている。リーダーペプチドおよびＣ−ペプチドを切断するためのＣ末端リジンプロテアーゼによる処置の後、インスリン分子はＮＨＳ−Ｒ＊とコンジュゲートされる。コンジュゲーションは、ＬｙｓＢ２９位置にて優先的に発生することが示されているが、Ａ０およびＢ０位置でも発生する。
【図８Ｂ】Ｎ末端保護アミノ酸がインスリン分子のＡペプチドおよびＢペプチドの両方の中に操作された例示的なコンジュゲーションスキーム。Ｎ末端保護アミノ酸は、Ａ０およびＢ０として示されている。リーダーペプチドおよびＣ−ペプチドを切断するためのＣ末端リジンプロテアーゼによる処置の後、インスリン分子はＮＨＳ−Ｒ＊とコンジュゲートされる。コンジュゲーションは、ＬｙｓＢ２９位置にて優先的に発生することが示されているが、Ａ０およびＢ０位置でも発生する。Ｎ末端保護アミノ酸は次に最終ステップにおいて、多様なンスリンコンジュゲート中間体を所望のＬｙｓＢ２９コンジュゲート生成物まで崩壊させるためのＡｒｇ残基のＣ末端での切断が可能である、トリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼによって切断される。
【図９Ａ】Ｎ末端保護アミノ酸がインスリン分子のＡペプチド中にのみ操作される例示的なコンジュゲーションスキーム。Ｎ末端保護アミノ酸は、Ａ０として示されている。
【図９Ｂ】Ｎ末端保護アミノ酸がインスリン分子のＡペプチド中にのみ操作される例示的なコンジュゲーションスキーム。Ｎ末端保護アミノ酸は、Ａ０として示されている。
【図１０Ａ】Ｎ末端保護アミノ酸がインスリン分子のＢペプチド中にのみ操作される例示的なコンジュゲーションスキーム。Ｎ末端保護アミノ酸は、Ｂ０として示されている。
【図１０Ｂ】Ｎ末端保護アミノ酸がインスリン分子のＢペプチド中にのみ操作される例示的なコンジュゲーションスキーム。Ｎ末端保護アミノ酸は、Ｂ０として示されている。
【図１１Ａ】緩衝（ＢＭＭＹ）および非緩衝（ＭＭＹ）条件下で増殖させたＧＳ１１５株クローンからの未精製培養上清収量。ＥＬＩＳＡ分析（イソ−インスリンＥＬＩＳＡ、メルコディア、ウプサラ、スウェーデン）を使用した、多様なクローンからのインスリン分子収量（ｍｇ／Ｌ）（「Ｃｌｏｎｅ＃」は各種のジェネティシンプレート耐性レベルから得たクローンを指す）。
【図１１Ｂ】緩衝（ＢＭＭＹ）および非緩衝（ＭＭＹ）条件下で増殖させたＧＳ１１５株クローンからの未精製培養上清収量。産生されたインスリン分子の分子量を示すクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。組換えヒトインスリン標準（ＲＨＩ標準）を収量比較する目的で、右上ゲルのレーン１４および右下ゲルのレーン２に２５０ｍｇ／Ｌに示す。
【図１２Ａ】緩衝条件下で増殖させたＫＭ７１株クローンからの未精製培養上清収量。ＥＬＩＳＡ分析（イソ−インスリンＥＬＩＳＡ、メルコディア、ウプサラ、スウェーデン）を使用した、多様なクローンからのインスリン分子収量（ｍｇ／Ｌ）（「Ｃｌｏｎｅ＃」は各種のジェネティシンプレート耐性レベルから得たクローンを指す）。
【図１２Ｂ】緩衝条件下で増殖させたＫＭ７１株クローンからの未精製培養上清収量。産生されたインスリン分子の分子量を示すクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。組換えヒトインスリン標準（ＲＨＩ標準）は、右上ゲルのレーン１５−１８（６０−５００ｍｇ／Ｌ）および右下ゲルのレーン５−９（３０−５００ｍｇ／Ｌ）に、収率を比較する目的で示されている。
【図１３Ａ】非緩衝条件下で増殖させたＫＭ７１株クローンからの未精製培養上清収量。ＥＬＩＳＡ分析（イソ−インスリンＥＬＩＳＡ、メルコディア、ウプサラ、スウェーデン）を使用した、多様なクローンからのインスリン分子収量（ｍｇ／Ｌ）（「Ｃｌｏｎｅ＃」は各種のジェネティシンプレート耐性レベルから得たクローンを指す）。
【図１３Ｂ】非緩衝条件下で増殖させたＫＭ７１株クローンからの未精製培養上清収量。産生されたインスリン分子の分子量を示すクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。組換えヒトインスリン標準（ＲＨＩ標準）は、右上ゲルのレーン８および９（２５０および１００ｍｇ／Ｌ）および右下ゲルのレーン１８（２５０ｍｇ／Ｌ）に、収率を比較する目的で示されている。
【図１４Ａ】ＡＬＰ消化前後のＫＭ７１  ＲＨＩ−１  Ａ−Ｅブロスのウェスタンブロット。「−」は酵素なしを示し、「＋」は酵素消化があることを示す。レーン：１  タンパク質ラダー、２  ペプチドラダー、３  ＲＨＩ−、４  ＲＨＩ＋、５  ＲＨＩ−１Ａ−、６  ＲＨＩ−１Ａ＋、７  ＲＨＩ−１Ｂ−、８  ＲＨＩ−１＋、９  ＲＨＩ−１Ｃ−、１０  ＲＨＩ−１Ｃ＋、１１  ＲＨＩ−１Ｄ−、１２  ＲＨＩ−１Ｄ＋、１３  ＲＨＩ−１Ｅ−、１４  ＲＨＩ−１Ｅ＋。
【図１４Ｂ】ＡＬＰ消化前後のＧＳ１１５  ＲＨＩ−１  Ａ−Ｅブロスのウェスタンブロット。「−」は酵素なしを示し、「＋」は酵素消化があることを示す。レーン：１  タンパク質ラダー、２  ペプチドラダー、３  ＲＨＩ−、４  ＲＨＩ＋、５  ＲＨＩ−１Ａ−、６  ＲＨＩ−１Ａ＋、７  ＲＨＩ−１Ｂ−、８  ＲＨＩ−１＋、９  ＲＨＩ−１Ｃ−、１０  ＲＨＩ−１Ｃ＋、１１  ＲＨＩ−１Ｄ−、１２  ＲＨＩ−１Ｄ＋、１３  ＲＨＩ−１Ｅ−、１４  ＲＨＩ−１Ｅ＋。  本発明の方法および中間体は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている、２０１０年１月２７日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１０／２２２６８号に記載されたコンジュゲートを調製するのに有用である。ある実施形態において、本コンジュゲートは一般に、下に示すスキームに従って調製される：
【００４６】
【化３】
2013537529.tif 000005
上のスキームＩにおいて、ＰＧ１、ＬＧ１、Ａｌｋ、ＸおよびＷのそれぞれは、下で定義する通りであり、本明細書に記載するようなクラスおよびサブクラス内にある。
カルボン酸保護基（ＰＧ１）
式ＤおよびＣのＰＧ１基は、好適なカルボン酸保護基である。保護された酸は当分野で周知であり、Ｇｒｅｅｎｅ（１９９９）に詳細に記載されているものを包含する。好適なカルボン酸保護基の例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、アリル（Ａｌｌ）、ベンジル（Ｂｎ）、トリチル（Ｔｒｔ）、２−クロロトリチル（２−Ｃｌ−Ｔｒｔ）、２，４−ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ），２−フェニルイソプロピル（２−ＰｈｉＰｒ）、９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）、４−（Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリジン）−３−メチルブチル］アミノ）ベンジル（Ｄｍａｂ）、カルバモイルメチル（Ｃａｍ）、ｐ−ニトロベンジル（ｐＮＢ）、２−トリメチルシリルエチル（ＴＭＳＥ）、２−フェニル−（２−トリメチルシリル）エチル（ＰＴＭＳＥ）、２−（トリメチルシリル）イソプロピル（ＴＭＳＩ）、２，２，２−トリクロロエチル（Ｔｃｅ）、ｐ−ヒドロキシフェンアシル（ｐＨＰ）、４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル（Ｄｍｎｂ）および１，１−ジメチルアリル（Ｄｍａ）が挙げられる。ある実施形態において、ＰＧ１はベンジルである。
脱離基（ＬＧ１）
式ＡのＬＧ１基は好適な脱離基であり、式Ａの−Ｃ（Ｏ）ＬＧ１を、求核攻撃を受ける活性化エステルにする。「求核攻撃を受ける」好適な「脱離基」は、所望の入来求核化学成分によってただちに置き換えられる化学基である。好適な脱離基は当分野で周知であり、たとえばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１を参照。このような脱離基としては、これに限定されるわけではないが，ハロゲン、アルコキシ、−Ｏ−スクシンイミド（−ＯＳｕ）、−Ｏ−ペンタフルオロフェニル、−Ｏ−ベンゾトリアゾール（−ＯＢｔ）または−Ｏ−アザベンゾトリアゾール（−ＯＡｔ）が挙げられる。活性化エステルは、対応するカルボン酸のカルボジイミド試薬（たとえばＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ））による処置によって生成されたＯ−アシルイソ尿素中間体でもあり得る。ある実施形態において、ＬＧ１は−ＯＳｕである。
Ｃ１−Ｃ１２アルキレン（Ａｌｋ）
式Ｆ、Ｄ、Ｃ、Ｂ、ＡおよびＩのＡｌｋ基は、１個以上のメチレン基が−Ｏ−または−Ｓ−によって置換され得るＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖である。ある実施形態において、Ａｌｋは１個の酸素を含有する。ある実施形態において、ＡｌｋはＣ１−Ｃ４アルキレン鎖である。いくつかの実施形態において、ＡｌｋはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１またはＣ１２アルキレン鎖である。ある実施形態において、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖である。
リガンド（Ｘ）
式Ｅ、Ｃ、Ｂ、ＡおよびＩのＸ基はリガンドである。式Ｄの化合物はアミノ末端リガンドである。ある実施形態において、式Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｂ、ＡおよびＩのＸ基は糖類を包含するリガンドである。
【００４７】
ある実施形態において、リガンドは、内因性糖類結合分子（たとえば制限なく、界面活性タンパク質ＡおよびＤまたはセレクチンファミリのメンバー）への結合について、糖類（たとえばグルコースまたはマンノース）と競合することができる。ある実施形態において、リガンドは、細胞表面糖受容体（たとえば制限なく、マクロファージマンノース受容体、グルコース輸送体リガンド、内皮細胞糖受容体または肝細胞糖受容体）への結合について、糖類（たとえばグルコースまたはマンノース）と競合することができる。ある実施形態において、リガンドは、内因性グルコース結合分子（たとえば制限なく、界面活性タンパク質ＡおよびＤまたはセレクチンファミリのメンバー）への結合について、グルコースと競合することができる。ある実施形態において、リガンドは、非ヒトレクチン（たとえばＣｏｎ  Ａ）への結合について、糖類と競合することができる。ある実施形態において、リガンドは、非ヒトレクチン（たとえばＣｏｎ  Ａ）への結合について、グルコースまたはマンノースと競合することができる。例示的なグルコース結合レクチンとしては、カルネキシン、カルレチクリン、Ｎ−アセチルグルコサミン受容体、セレクチン、アシアロ糖タンパク質受容体、コレクチン（マンノース結合レクチン）、マンノース受容体、アグリカン、バーシカン、ピスム・サティヴム（ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）凝集素（ＰＳＡ）、ビシア・ファバ（ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）ソラマメレクチン、レンズ・クリナリス（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）レクチン、ダイズレクチン、ラッカセイレクチン、ラティルス・オキルス（ヒゲレンリソウ（ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｏｃｈｒｕｓ））レクチン、イガマメレクチン、ソホラ・ヤポニカ（ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）レクチン、ボーリンギア・ミルブラエディ（ｂｏｗｒｉｎｇｉａ  ｍｉｌｂｒａｅｄｉｉ）レクチン、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）およびヤマゴボウマイトジェンが挙げられる。
【００４８】
ある実施形態において、リガンドは、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）のリガンドであり：
【００４９】
【化４】
2013537529.tif 000006
式中：
各Ｒ１は独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、−Ｏ−Ｙ、−ＣＨ２Ｒｘまたは−Ｇ−であり、Ｒ１の１つが−Ｇ−であり；
各Ｒｘは独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙまたは−Ｏ−Ｙであり；
各Ｒｙは独立して、−Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２またはＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２であり；
各Ｙは独立して、単糖、二糖または三糖であり；
各Ｇは独立して、共有結合または置換されていてもよいＣ１−９アルキレンであり、Ｇの１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２−またはＮ（Ｒ２）ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−によって置き換えられていてもよく；
各Ｚは独立して、ハロゲン、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−Ｎ３、−Ｃ≡ＣＲ２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２または−ＯＳＯ２Ｒ２であり；および
各Ｒ２は独立して、水素、またはＣ１−６脂肪族、フェニル、窒素、酸素もしくは硫黄から選択される１−２個のヘテロ原子を有する４−７員複素環式環または窒素、酸素もしくは硫黄から選択される１−４個のヘテロ原子を有する５−６員単環式ヘテロアリール環から選択される置換されていてもよい基である。
【００５０】
ある実施形態において、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）のリガンドは単糖である。ある実施形態において、リガンドは二糖である。ある実施形態において、リガンドは三糖である。ある実施形態において、リガンドは四糖である。ある実施形態において、合計４を超えない単糖部分を含む。
【００５１】
一般に上で定義されているように、各Ｒ１は独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、−Ｏ−Ｙ、−ＣＨ２Ｒｘまたは−Ｇ−であり、Ｒ１の１つは−Ｇ−である。ある実施形態において、Ｒ１は水素である。ある実施形態において、Ｒ１は−ＯＨである。他の実施形態において、Ｒ１は−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある実施形態において、Ｒ１は−Ｏ−Ｙである。ある他の実施形態において、Ｒ１は−Ｇ−である。いくつかの実施形態において、Ｒ１は−ＣＨ２ＯＨである。他の実施形態において、Ｒ１は−ＣＨ２−Ｏ−Ｙである。また他の実施形態において、Ｒ１は−ＮＨ２である。当業者は、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）の各Ｒ１置換基は（Ｒ）または（Ｓ）空間配置であり得ることが認識するであろう。
【００５２】
一般に上で定義されているように、各Ｒｘは独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙまたは−Ｏ−Ｙである。いくつかの実施形態において、Ｒｘは水素である。ある実施形態において、Ｒｘは−ＯＨである。他の実施形態において、Ｒｘは−Ｏ−Ｙである。
【００５３】
一般に上で定義されているように、各Ｒｙは独立して、−Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２である。いくつかの実施形態において、Ｒｙは水素である。他の実施形態において、Ｒｙは−Ｒ２である。いくつかの実施形態において、Ｒｙは−Ｃ（Ｏ）Ｒ２である。ある実施形態において、Ｒｙはアセチルである。他の実施形態において、Ｒｙは、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−ＣＯ２Ｒ２または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２である。
【００５４】
一般に上で定義されているように、Ｙは単糖、二糖または三糖である。ある実施形態において、Ｙは単糖である。いくつかの実施形態において、Ｙは二糖である。他の実施形態において、Ｙは三糖である。いくつかの実施形態において、Ｙは、マンノース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラムノースまたはキシロピラノースである。いくつかの実施形態において、Ｙは、スクロース、マルトース、ツラノース、トレハロース、セロビオースまたはラクトースである。ある実施形態において、Ｙはマンノースである。ある実施形態において、ＹはＤ−マンノースである。当業者は、糖類Ｙがアノマー炭素を介して−Ｏ−Ｙの酸素基に結合されて、グリコシド結合が形成されることを認識するであろう。グリコシド結合はアルファまたはベータ構造であり得る。
【００５５】
一般に上で定義されているように、各Ｇは独立して、共有結合または置換されていてもよいＣ１−９アルキレン、Ｇの１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２−または−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−によって置き換えられていてもよい。いくつかの実施形態において、Ｇは共有結合である。ある実施形態において、Ｇは−Ｏ−Ｃ１−８アルキレンである。ある実施形態において、Ｇは−ＯＣＨ２ＣＨ２−である。
【００５６】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩａ）のＣ１炭素上のＲ１置換基は−Ｇ−であり、式（ＩＩＩａ−ｉ）の化合物を与える：
【００５７】
【化５】
2013537529.tif 000007
式中、Ｒ１およびＧは、本明細書で定義および記載されている通りである。
【００５８】
いくつかの実施形態において、リガンドは式（ＩＩＩａ−ｉｉ）であり：
【００５９】
【化６】
2013537529.tif 000008
式中、Ｒ１、ＲｘおよびＧは、本明細書で定義および記載されている通りである。
【００６０】
ある実施形態において、リガンドはグルコースと同じ化学構造を有し得るか、またはグルコースの化学的に関連する種であり得る。多様な実施形態において、たとえばコンジュゲートのグルコース応答を微調整するために、リガンドがグルコースから各種の化学構造を有することが好都合であり得る。たとえばある実施形態において、グルコース、マンノース、Ｌ−フコースまたこれらの誘導体（たとえばアルファ−Ｌ−フコピラノシド、マンノサミン、ベータ結合Ｎ−アセチルマンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、エチルマンノース、プロピルグルコース、プロピルマンノースなど）および／またはこれらの高次組合せ（たとえばビマンノース、直鎖および／または分枝トリマンノースなど）を包含するリガンドが使用され得る。
【００６１】
ある実施形態において、リガンドは単糖を包含する。ある実施形態において、リガンドは二糖を包含する。ある実施形態において、リガンドは三糖を包含する。いくつかの実施形態において、リガンド前駆体Ｈ２Ｎ−Ｘ（Ｊ）は糖類および１つ以上のアミノ基を含む。ある実施形態において、糖類およびアミン基は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、たとえばＣ１−Ｃ３アルキル基によって分離されている。いくつかの実施形態において、Ｊはアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）である。いくつかの実施形態において、Ｊはアミノエチルマンノース（ＡＥＭ）である。いくつかの実施形態において、Ｊはアミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）である。いくつかの実施形態において、Ｊはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）である。いくつかの実施形態において、Ｊはβ−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）である。いくつかの実施形態において、Ｊはアミノエチルフコース（ＡＥＦ）である。ある実施形態において、糖類リガンドは「Ｄ」配置である。他の実施形態において、糖類リガンドは「Ｌ」配置である。例示的なＪ化合物の構造を以下に示す。他の例示的なリガンドは当業者によって認識されるであろう。
【００６２】
【化７】
2013537529.tif 000009
上に示したＪ化合物がステップＳ−１において反応して、アミド結合を形成することが当業者によって理解されるであろう。このため上に示した化合物のリガンド（Ｘ）部分は以下の通りである：
【００６３】
【化８】
2013537529.tif 000010
2013537529.tif 000011
薬物（Ｗ）
Ｗ−ＮＨ２はアミン含有薬物である。コンジュゲートはいずれの薬物Ｗも含み得ることが理解されるべきである。コンジュゲートは、いずれの特定の薬物にも限定されず、小分子薬または生体分子薬を包含し得る。概して、使用される薬物は処置される疾患または障害によって変わる。本明細書で使用する場合、「薬物」という用語は、薬物の塩形および非塩形を含む。たとえば「インスリン分子」という用語は、インスリン分子のすべての塩形および非塩形を含む。塩形が薬物に応じてアニオン性またはカチオン性であり得ることが認識されるであろう。
【００６４】
たとえば制限なく、多様な実施形態において、Ｗは以下の薬物のいずれか１つから選択される：ジクロフェナク、ニフェジピン、リバスチグミン、メチルフェニデート、フルオキセチン（ｆｌｕｏｒｏｘｅｔｉｎｅ）、ロシグリタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、コデイン、エチルモルヒネ、
デキストロメトルファン、ノスカピン、ペントキシベリン（ｐｅｎｔｏｘｉｖｅｒｉｎｅ）、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、エピネフリン、イソプレナリン、オルシプレナリン、エフェドリン、フェノテロール、リミテロール、イプラトロピウム、コリンテオフィリネート、プロキシフィリン、ベクロメタゾン、ブデソニド、デスラノシド、ジゴキシン、ジギトキシン、ジソピラミド、プロスシラリジン、キニジン、プロカインアミド、メキシレチン、フレカイニド、アルプレノロール、プロプラノロール（ｐｒｏｐｒｏａｎｏｌｏｌ）、ナドロール、ピンドロール、オクスプレノロール、ラベタロール、チモロール、アテノロール、ペンタエリスリトールテトラニトラート、イソソルビドジニトラート、イソソルビドモノニトラート、ニフェジピン、フェニルアミン、ベラパミル、ジルチアゼム、シクランデラール（ｃｙｃｌａｎｄｅｌａｒ）、ニコチニルアルコール、イノシトールニコチネート、アルプロスタジル（ａｌｐｒｏｓｔａｔｄｉｌ）、エチレフリン、プレナルテロール、ドブタミン、ドパミン、ジヒドロエルゴタミン、グアネチジン、ベタニジン、メチルドパ、レセルピン、グアンファシン、トリメタファン、ヒドララジン、ジヒドララジン、プラゾシン、ジアゾキサイド、カプトプリル、ニフェジピン、エナラプリル、ニトロプルシド、ベンドロフルメチアジド、ヒドロクロロチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、クロルタリドン、シネタゾン、クロパミド、メフルシド、メトラゾン、ブメタニド、エタクリナシド、スピロノラクトン、アミロリド、クロフィブラート、ニコチン酸、ニセリトロール（ｎｉｃｈｅｒｉｔｒｏｌ）、ブロモフェニルアミン、シンナリジン、デキシクロルフェニラミン、クレマスチン、アンタゾリン、シプロヘプタジン、プロメタジン（ｐｒｏｅｔｈａｚｉｎｅ）、シメチジン、ラニチジン、スクラルファート、パパベリン、モキサベリン、アトロピン、ブチルスコポラミン、エメプロン、グルコピロン、ヒヨスチアミン、メペンソラール、メチルスコポラミン、オキシフェンサイクリミン、プロバンテリン、テロジリン、センナグリコシド、サグラダエキストラクト、ダントロン、ビサコジル、ピコスルファートナトリウム、エツロース（ｅｔｕｌｏｓ）、ジフェノキシレート、ロペラミド、サラゾスルファピリジン、ピルヴィン（ｐｙｒｖｉｎ）、メベンダゾール、ジメチコン、フェロフマレート、フェロサクシネート、フェリテトラセミナトリウム、シアノコバラミン、葉酸ヘパリン、ヘパリン補因子、ジクルマロール、ワルファリン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ビタミンＫ、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、カルムスチン、メルカプトプリン、チオグアニン、アザチオプリン、シタラビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、プロカルバジン、ダカルバジン、ロムスチン、エストラムスチン、テニポシド、エトポシド、シスプラチン、アムサクリン、アミノグルテチミド、ホスフェストロール、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｉｐｒｏｇｒｅｓｔｅｒｏｎｅ）、ヒドロキシプロゲステロン、メゲステロール、ノレチステロン、タモキシフェン、シクロスポリン、スルフィソミジン（ｓｕｌｆｏｓｏｍｉｄｉｎｅ）、ベンシルペニシリン、フェノキシメチルペニシリン、ジクロキサシリン、クロキサシリン、フルクロキサシリン、アンピシリン、アモキシリン、ピバンピシリン、バカンピシリン、ピペラシリン、メズロシリン、メシリナム、ピブメシリナム、セファロチン、セファレキシン、セフラジン、セファドロキシル、セファクロル、セフロキシム、セフォタキシム、セフタジジム、セフォキシチン、アズトレオナム、イミペネム、シラスタチン、テトラサイクリン、リメサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、オキシテトラサイクリン（ｏｘｉｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ドキシサイクリン、クロラムフェニコール、スピラマイシン、フシジン酸、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、アンフォテリシンＢ、グリセオフルビン、ニスタチン、バンコマイシン、メトロニダゾール、チニダゾール、トリメトプリム、ノルフロキサシン、サラゾスルファピリジン、アミノサリル、イソニアジド、エタンブトール（ｅｔａｍｂｕｔｏｌ）、ニトロフラントイン、ナリジクス酸、メテナミン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、チニダゾール、ケトコナゾール、アシクロビル、インターフェロン  イドクスウリジン、レチナール、チアミン（ｔｉａｍｉｎ）、デクスパンテノール（ｄｅｘｐａｎｔｅｎｏｌ）、ピリドキシン、葉酸、アスコルビン酸、トコフェロール（ｔｏｋｏｆｅｒｏｌ）、フィトミナジオン、フェンフルナミン、コルチコトロピン、テトラコサクチド、チロトロピン、ソマトトロピン、ソマトレム、バソプレシン、リプレシン、デスモプレシン、オキシトシン、クロリオンゴナドトロピン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、フルオキシメステロン、メステロロン、ナンドロロン、スタノゾロール、オキシメトロン、シプロテロン、レボチロキシン、リオチロニン、プロピルチオウラシル、カルビマゾール、チアマゾール、ジヒドロタキステロール、アルファカルシドール、カルシチロール、インスリン、トルブタミド、クロルプロパミド、トラズアミド、グリピジド、グリベンクラミド、フェノバルビタール、メチプリロン、ピリチルジオン、メプロバメート、クロルジアゼポキシド、ジアゼパム、ニトラゼパム、バクロフェン、オキサゼパム、ジカリウムクロラゼペート、ロラゼパム、フルニトラゼパム、アルプラゾラム、ミダゾラム、ヒドロキシジン、ダントロレン、クロメチアゾール、プロピオンマジン、アリメマジン、クロルプロマジン、レボメプロマジン、アセトフェナジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、プロクロルペナジン、トリフルオペラジン、ジキシラジン、チオリダジン（ｔｈｉｏｄｉｒａｚｉｎｅ）、ペリシアジン、クロルプロチキセン（ｃｈｌｏｐｒｏｔｈｉｘｅｎｅ）、チザニジン、ザレプロン、ズクロペンチゾール、フルペンチゾール、チオチキセン（ｔｈｉｔｈｉｘｅｎ）、ハロペリドール、トリミプラミン、オピプラモール、クロミプラミン（ｃｈｌｏｍｉｐｒａｍｉｎ）、デシプラミン、ロフェプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、マプトロチリン、カフェイン、シンナ���ジン、サイクリジン、ジメンヒドリナート（ｄｉｍｅｎｈｙｄｉｎａｔｅ）、メクロジン、プロメタジン、チエチルペラジン、メトクロプラミド、スコポラミン、フェノバルビタール、フェニトイン、エトスクシミド、プリミドン、カルバマゼピン、クロナゼパム、オルフェナドリン、アトロピン、ベンサトロピン、ビペリデン、メチキセン、プロシリジン、レボドパ、ブロモクリプチン、アマンタジン、アンベノン、ピリドスチグミン、シンスチグミン、ジスルフィラム、モルヒネ、コデイン、ペンタゾシン、ブプレノルフィン、ペチジン、フェノペリジン、フェンタニル、メタドン、ピリトラミド、デキストロプロポキシフェン、ケトベミドン、アセチルサリチル酸、セレコキシブ、フェナゾン、フェニルブタゾン、アザプロパゾン、ピロキシカム、エルゴタミン、ジヒドロエルゴタミン、シプロヘプタジン、ピジチフェン、フルメドロキソン、アロプリノール、プロベネシド、ナトリウムアウロチオマレート（ｓｏｄｉｕｍｍａｕｒｏｔｈｉｏｍａｌａｔｅ）、オーラノフィン（ａｕｒｏｎｏｆｉｎ）、ペニシラミン、エストラジオール、エストラジオールバレリアネート、エストリオール、エチニルエストラジオール、ジヒドロゲステロン、リネストレノール、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｉｐｒｏｇｒｅｓｔｅｒｏｎｅ）、ノルエチステロン、シクロフェニル（ｃｙｃｌｏｐｈｅｎｉｌｅ）、クロミフェン、レボノルゲストレル、メストラノール、オルニダゾール、チニダゾール、エコナゾール（ｅｋｏｎａｚｏｌ）、クロトリマゾール、ナタマイシン、ミコナゾール、スルベンチン、メチルエルゴタミン、ジノプロスト、ジノプロストン、ゲメプロスト、ブロモクリプチン、フェニルプロパノールアミン、ナトリウムクロモグリカート、アセタゾラミド、ジクロフェナミド、ベータカロテン、ナロキソン、カルシウムフォリナート、特にクロニジン、テオフィリン（ｔｈｅｐｈｙｌｌｉｎｅ）、ジピラダモール、ヒドロクロルチアジド、スコポラミン、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎｅ）、フロセミド、塩化カリウム、モルヒネ、イブプロフェン、サルブタモール、テルブタリン、カルシトニン。この列挙は例示的であること意図され、いずれかの薬物が、公知であるか、後に発見されるかにかかわらず、本開示のコンジュゲートに使用され得ることが理解されるべきである。
【００６５】
多様な実施形態において、Ｗは、ペプチド系または非ペプチド系であり得るホルモン薬、たとえばアドレナリン、ノルアドレナリン、アンギオテンシン、アトリオペプチン、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、カルシトニン、カルシトリオール、カルシジオール、コルチコトロピン、コルチゾール、ドパミン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、エリスロポエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒスタミン、ヒト胎盤性ラクトゲン、インスリン、インスリン様増殖因子、インヒビン、レプチン、ロイコトリエン、リポトロピン、メラトニン、オレキシン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔｇｌａｎｄｉｎ）、レニン、セロトニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（または甲状腺刺激ホルモン）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、チロキシン、トリヨードチロニン、バソプレシンなどである。
【００６６】
ある実施形態において、ホルモンはグルカゴン、インスリン、インスリン様増殖因子、レプチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（または甲状腺刺激ホルモン）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、チロキシンおよびトリヨードチロニンから選択され得る。
【００６７】
ある実施形態において、Ｗはインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）である。この列挙は例示的であること意図され、いずれかのホルモン薬が、公知であるか、後に発見されるかにかかわらず、本開示のコンジュゲートに使用され得ることが理解されるべきである。
【００６８】
多様な実施形態において、Ｗは甲状腺ホルモンである。
【００６９】
多様な実施形態において、Ｗは抗糖尿病薬（すなわち糖尿病に罹患している患者に有益な効果を有する薬物）である。
【００７０】
ステップＳ−５を行うために、薬物がアミノ基を含有しなければならないことが認識されるであろう。このため、ある実施形態において、本開示の薬物は１つ以上のアミノ基（たとえばインスリン分子）を含有する。他の実施形態において、薬物は、アミノ基を含有する誘導体を形成するように修飾される。
【００７１】
多様な実施形態において、Ｗはインスリン分子である。本明細書で使用する場合、「インスリン」または「インスリン分子」という用語は、インスリン分子のすべての塩形および非塩形を含む。塩形がインスリン分子に応じてアニオン性またはカチオン性であり得ることが認識されるであろう。「インスリン」または「インスリン分子」によって、我々は、インスリンが生理活性である（すなわちインビボで投与した場合に、検出可能なグルコースの低減を引き起こすことができる）限り、野生型インスリンおよび修飾インスリンの両方を含むことを意図する。野生型インスリンとしては、精製形、合成形または組換え形にかかわらず、いずれの種にも由来するインスリン（たとえばヒトインスリン、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど）が挙げられる。これらのいくつかはたとえばシグマ−アルドリッチ（セントルイス、ミズーリ州）より市販されている。
【００７２】
ヒトインスリンの野生型配列は、下に示すように、配列番号２７のアミノ酸配列（Ａペプチド）および配列番号２８のアミノ酸配列（Ｂペプチド）および３個のジスルフィドブリッジを含む：
【００７３】
【化９】
2013537529.tif 000012
当分野で周知であるように、ヒト膵島のβ細胞は、プロインスリンとして公知であるインスリンの単鎖前駆体を分泌する。ヒトにおいて、プロインスリンは配列：［Ｂペプチド］−［Ｃペプチド］−［Ａペプチド］を有し、ここでＣペプチドは、配列番号２９の配列を持つ結合ペプチドである：Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ。
【００７４】
ヒトにおいて、膵島のβ細胞による生物活性インスリン分子の分泌前に、Ｃペプチドは２つの二塩基部位、Ａｒｇ−ＡｒｇおよびＬｙｓ−Ａｒｇにおける切断により、プロインスリンから除去される。上で示したように、切断は生物活性インスリン分子を別個のＡペプチドおよびＢペプチドとして放出して、ＡペプチドおよびＢペプチドは２つのジスルフィド結合によって結合され、一方のジスルフィド結合はＡペプチド内にある。
【００７５】
すべての生物がヒトプロインスリン配列を認識して、正しく処理を行うわけではない。たとえば、ある実施形態において、酵母は代わりのプロインスリン配列を利用し得る：［リーダーペプチド］−［Ｂペプチド］−［Ｃペプチド］−［Ａペプチド］。
【００７６】
酵母プロインスリン配列において、リーダーペプチドは酵母中のインスリン分子の適切な切断を促進すると考えられ、たとえば配列：Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号３０）またはＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２２）を含み得る。いくつかの実施形態において、リーダーペプチドは、配列Ｘａａ’−Ｐｒｏ−［Ｌｙｓ／Ａｒｇ］の配列を有し、Ｘａａ’は：
ａ．長さが少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０もしくは少なくとも２５アミノ酸である、または
ｂ．長さが５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、５０以下のアミノ酸である；および
ｃ．少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％のアミノ酸（たとえばＡｓｐおよび／またはＧｌｕ）
を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、リーダーペプチドは、そのＣ末端にアミノ酸Ｐｒｏ−Ｌｙｓを含有する。いくつかの実施形態において、リーダーペプチドは、そのＣ末端にアミノ酸Ｐｒｏ−Ａｒｇを含有する。
【００７８】
加えて、ヒトプロインスリンに見出される長いＣペプチド結合セグメントの代わりに、操作された酵母プロインスリン配列は、はるかに短いＣペプチド配列、たとえばＡｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（配列番号１６）、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（配列番号１７）またはＴｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（配列番号３１）を有し得る。いくつかの実施形態において、ＣペプチドはＸａａ”−［Ｌｙｓ／Ａｒｇ］の配列を有し、Ｘａａ”は：
ａ．欠損しているか、または長さが少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５もしくは少なくとも２０アミノ酸である；
ｂ．長さが２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１５以下、２０以下もしくは２５以下のアミノ酸である；または
ｃ．長さが正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５アミノ酸である。
【００７９】
いくつかの実施形態において、Ｃペプチドは、ヒトプロインスリンに見出されるのとは異なるアミノ酸配列を有する。概して、Ｃペプチドは、インスリンＡ鎖とＢ鎖との間に見出されるプロインスリン中のいずれのアミノ酸配列も指す。いくつかの実施形態において、Ｃペプチドは、インスリンＡ鎖とＢ鎖との間に見出され、酵素により切断されて生物活性インスリン分子を産生する、プロインスリン中のいずれのアミノ酸配列も指す。
【００８０】
いずれの特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、これらのリーダー配列とＣペプチド配列との組合せによって酵母からの機能性インスリンの産生が可能になることが考えられる。
【００８１】
本開示は、ヒトインスリン分子（すなわちヒトプロインスリンまたは生物活性ヒトインスリン分子）に限定されない。概して、本開示は、インスリン様生物活性を保持する（すなわち好適な種にインビボで適切な用量で投与された場合に、グルコースの検出可能な減少を引き起こすことができる）いずれのヒトまたは非ヒトインスリンも含む。たとえば下で議論するように、本開示は、修飾ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなども含む。
【００８２】
本開示のインスリン分子は野生型インスリンには存在しない化学修飾および／または突然変異を包含し得ることが理解されるべきである。多種多様の修飾インスリンが当分野で公知である（たとえばＣｒｏｔｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｅｍｅｒｇ．Ｃａｒｅ．２３：９０３−９０５，２００７およびＧｅｒｉｃｈ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１１３：３０８−１６，２００２ならびにそこで引用された参考文献を参照）。インスリンの修飾形は、化学的に修飾され得る（たとえば下に記載するようなＰＥＧ基または脂肪アシル鎖などの化学部分の付加により）および／または突然変異され得る（すなわちアミノ酸の付加、欠失もしくは置換により）。
【００８３】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、野生型インスリンとは１−１０（たとえば１−９、１−８、１−７、１−６、１−５、１−４、１−３、１−２、２−９、２−８、２−７、２−６、２−５、２−４、２−３、３−９、３−８、３−７、３−６、３−５、３−４、４−９、４−８、４−７、４−６、４−５、５−９、５−８、５−７、５−６、６−９、６−８、６−７、７−９、７−８、８−９、９、８、７、６、５、４、３、２または１）のアミノ酸置換、付加および／または欠失で異なる。ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、野生型インスリンとはアミノ酸置換のみが異なる。ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、野生型インスリンとはアミノ酸付加のみが異なる。ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、野生型インスリンとはアミノ酸置換および付加の両方が異なる。ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、野生型インスリンとはアミノ酸置換および欠失の両方が異なる。
【００８４】
ある実施形態において、アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性性質の類似性に基づいて行われ得る。ある実施形態において、置換は保存的であり得る、すなわち１つのアミノ酸は類似の形状および電荷の１つと置き換えられる。保存的置換は当分野で周知であり、通例、以下の基：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびチロシン、フェニルアラニンの範囲内での置換を包含する。ある実施形態において、アミノ酸の疎水性インデックスは、好適な突然変異を選ぶ際に考慮され得る。ポリペプチドに相互作用的な生物機能を付与する際の疎水性アミノ酸インデックスの重要性は、当分野で一般に理解されている。または同様のアミノ酸の置換を、疎水性に基づいて効果的に行うことができる。ポリペプチドの相互作用的な生物機能を付与する際の親水性の重要性は、当分野で一般に理解されている。ポリペプチドを設計する際の疎水性インデックスまたは親水性の使用は、米国特許第５，６９１，１９８号明細書でさらに議論されている。
【００８５】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、配列番号１（Ａ−ペプチド）のアミノ酸配列および配列番号２のアミノ酸配列（Ｂペプチド）および３つのジスルフィドブリッジを、式ＸＩに示すように含む：
【００８６】
【化１０】
2013537529.tif 000013
式中、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは独立して、コード可能なアミノ酸、コード可能なアミノ酸の配列であるか、または欠損している；位置Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１８およびＡ２１それぞれにおけるＸａａは独立して、コード可能なアミノ酸であり；位置Ｂ３、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０それぞれにおけるＸａａは独立して、コード可能なアミノ酸または欠損している。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「コード可能なアミノ酸」は、標準遺伝暗号によるポリペプチド合成のために直接コードされている２０のアミノ酸のいずれか１つである。
【００８８】
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは独立して、コード可能なアミノ酸、２−５０のコード可能なアミノ酸の配列であるか、または欠損している。
【００８９】
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは独立して、コード可能なアミノ酸、２−２５のコード可能なアミノ酸の配列であるか、または欠損している。
【００９０】
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは独立して、コード可能なアミノ酸、２−１０のコード可能なアミノ酸の配列であるか、または欠損している。
【００９１】
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは独立して、コード可能なアミノ酸、２−９のコード可能なアミノ酸の配列であるか、または欠損している。
【００９２】
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは独立して、コード可能なアミノ酸、２−８のコード可能なアミノ酸の配列であるか、または欠損している。
【００９３】
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは独立して、コード可能なアミノ酸、２−７のコード可能なアミノ酸の配列であるか、または欠損している。
【００９４】
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは独立して、コード可能なアミノ酸、２−６のコード可能なアミノ酸の配列であるか、または欠損している。
【００９５】
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは独立して、コード可能なアミノ酸、２−５のコード可能なアミノ酸の配列であるか、または欠損している。
【００９６】
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは独立して、コード可能なアミノ酸、２−４のコード可能なアミノ酸の配列であるか、または欠損している。
【００９７】
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは独立して、コード可能なアミノ酸、２−３のコード可能なアミノ酸の配列であるか、または欠損している。
【００９８】
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは独立して、コード可能なアミノ酸、２のコード可能なアミノ酸の配列であるか、または欠損している。
【００９９】
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２，Ｂ０およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは欠損している。
【０１００】
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは欠損している。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、位置Ａ２２，Ｂ０およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは欠損している。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、位置Ａ２２およびＢ３１それぞれにおけるＸａａは欠損している。
【０１０３】
ある実施形態において、式ＸＩのＡペプチドおよびＢペプチドの１つ以上の位置におけるＸａａは下の表１および２に示されている選択肢から選択される。
【０１０４】
【表１】
2013537529.tif 000014
【０１０５】
【表２】
2013537529.tif 000015
いくつかの実施形態において、式ＸＩのインスリン分子は、下の表３に示す位置から選択される位置Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＢ３０にアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、式ＸＩのインスリン分子は、（たとえばヒト配列またはＡ８のＴｈｒ、Ａ９のＳｅｒ、Ａ１０のＩｌｅおよびＢ３０のＴｈｒから）単一の種について下の表３に示す位置から選択される位置Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＢ３０にアミノ酸を含む。
【０１０６】
【表３】
2013537529.tif 000016
多様な実施形態において、本開示のインスリン分子は、Ｂペプチド配列のＢ２８位置および／またはＢ２９位置にて突然変異する。たとえばインスリンリスプロ（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））は、ＢペプチドのＣ末端上の最後から２番目のリジン残基とプロリン残基が逆転している速効型インスリンミュータント（ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン）である。この修飾により、インスリン多量体の形成がブロックされる。インスリンアスパルト（ＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標））は、位置Ｂ２８のプロリンがアスパラギン酸で置換された別の速効性インスリンミュータント（ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン）である。本ミュータントも多量体の形成を防止する。いくつかの実施形態において、位置Ｂ２８および／またはＢ２９における突然変異は、インスリン分子内の別の箇所に１つ以上の変異を伴う。たとえば、インスリングルリジン（ＡＰＩＤＲＡ（登録商標））は、位置Ｂ３のアスパラギン酸がリジン残基で置き換えられ、位置Ｂ２９のリジンがグルタミン酸残基で置き換えられた、また別の速効性インスリンミュータント（ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン）である。
【０１０７】
多様な実施形態において、本開示のインスリン分子は、ヒトインスリンと比べて移動されている等電点を有する。いくつかの実施形態において、等電点の移動は、インスリンＡペプチドのＮ末端および／またはインスリンＢペプチドのＣ末端に１つ以上のアルギニン残基を付加することに達成される。このようなインスリン分子の例としては、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンおよびＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンが挙げられる。さらなる例として、インスリングラルギン（ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））は、ＡｓｐＡ２１がグリシンで置き換えられ、２個のアルギニン残基がＢペプチドのＣ末端に付加された例示的な長期作用型インスリンミュータントである。これらの変化の効果は、等電点を移動させて、ｐＨ４で完全に可溶性である溶液が産生されることである。このため、いくつかの実施形態において、本開示のインスリン分子は、Ａ２１がＧｌｙであるＡペプチド配列およびＢ３１がＡｒｇ−ＡｒｇであるＢペプチド配列を含む。本開示が本明細書に記載されているこれらの突然変異およびその他の突然変異（たとえばＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン）の単一および複数の組合せすべてを含むことが理解されるべきである。
【０１０８】
多様な実施形態において、本開示のインスリン分子は１つ以上の欠失を包含し得る。たとえば，ある実施形態において、本開示のインスリン分子のＢペプチド配列は、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８および／またはＢ２９が欠損している。
【０１０９】
多様な実施形態において、本開示のインスリン分子は切断され得る。たとえばＢペプチド配列は、欠損残基Ｂ（１−２）、Ｂ（１−３）、Ｂ３０、Ｂ（２９−３０）もしくＢ（２８−３０）であり得る。いくつかの実施形態において、これらの欠失および／または切断は、（たとえば制限なく、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリンリスプロ、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリンアスパルト、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリングルリジン、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリングラルギンなどを産生するために）上述のいずれのインスリン分子にも適用される。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、インスリン分子は、ＡまたはＢペプチド配列のＮまたはＣ末端に追加のアミノ酸残基を含有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸残基は、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０および／またはＢ３１に位置する。いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸残基は、位置Ａ０に位置する。いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸残基は、位置Ａ２２に位置する。いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸残基は、位置Ｂ０に位置する。いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸残基は、位置Ｂ３１に位置する。ある実施形態において、インスリン分子は、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０またはＢ３１にいずれの追加のアミノ酸残基も包含していない。
【０１１１】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、１つ以上のアミド化アミノ酸が酸性形態で置き換えられている変異を有し得る。たとえばアスパラギンは、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。同様に、グルタミンは、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。特に、ＡｓｎＡ１８、ＡｓｎＡ２１もしくはＡｓｎＢ３、またはこれらの残基のいずれの組合せも、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。ＧｌｎＡ１５もしくはＧｌｎＢ４または両方が、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。ある実施形態において、インスリン分子は、位置Ａ２１にアスパラギン酸を、もしくは位置Ｂ３にアスパラギン酸を、または両方を有する。
【０１１２】
当業者は、生物活性を保持したまま、インスリン分子中のまた他のアミノ酸を変異させることが可能であることを認識するであろう。たとえば制限なく、以下の修飾：位置Ｂ１０のヒスチジン残基のアスパラギン酸による置き換え（ＨｉｓＢ１０→ＡｓｐＢ１０）；位置Ｂ１のフェニルアラニン残基のアスパラギン酸による置き換え（ＰｈｅＢ１→ＡｓｐＢ１）；位置Ｂ３０のトレオニン残基のアラニンによる置き換え（ＴｈｒＢ３０→ＡｌａＢ３０）；位置Ｂ２６のチロシン残基のアラニンによる置き換え（ＴｙｒＢ２６→ＡｌａＢ２６）；および位置Ｂ９のセリン残基のアスパラギン酸によるの置き換え（ＳｅｒＢ９→ＡｓｐＢ９）も当分野で広く受け入れられている。
【０１１３】
多様な実施形態において、本開示のインスリン分子は、持続性作用プロフィールを有する。このためある実施形態において、本開示のインスリン分子は、脂肪酸によってアシル化され得る。すなわち、インスリン分子上のアミノ基と脂肪酸のカルボン酸基との間にアミド結合が形成される。アミノ基は、インスリン分子のＮ末端アミノ酸のα−アミノ基であり得るか、またはインスリン分子のリジン残基のε−アミノ基であり得る。本開示のインスリン分子は、野生型インスリンに存在する３つのアミノ基の１つ以上にてアシル化され得るか、または野生型配列中に導入されたリジン残基上でアシル化され得る。ある実施形態において、インスリン分子は位置Ｂ１にてアシル化され得る。ある実施形態において、インスリン分子は位置Ｂ２９にてアシル化され得る。ある実施形態において、脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデシル酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデシル酸（Ｃ１７）およびステアリン酸（Ｃ１８）から選択される。たとえばインスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））は、ＴｈｒＢ３０が欠失しており、Ｃ１４脂肪酸鎖（ミリスチン酸）がＬｙｓＢ２９に結合された長期作用型インスリンミュータントである。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、ＡペプチドのＮ末端、ＢペプチドのＮ末端、位置Ｂ２９のＬｙｓのイプシロン−アミノ基または本開示のインスリン分子中のその他の利用可能なアミノ基が、一般式の脂肪酸部分に共有結合され：
【０１１５】
【化１１】
2013537529.tif 000017
式中、ＲＦは、水素またはＣ１−３０アルキル基である。いくつかの実施形態において、ＲＦは、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−１９アルキル基、Ｃ５−１８アルキル基、Ｃ６−１７アルキル基、Ｃ８−１６アルキル基、Ｃ１０−１５アルキル基またはＣ１２−１４アルキル基である。ある実施形態において、インスリン分子は、部分にＡ１位置にてコンジュゲートされる。ある実施形態において、インスリン分子は、部分にＢ１位置にてコンジュゲートされる。ある実施形態において、インスリン分子は、部分に位置Ｂ２９のＬｙｓのイプシロン−アミノ基にてコンジュゲートされる。ある実施形態において、インスリン分子の位置Ｂ２８はＬｙｓであり、ＬｙｓＢ２８のイプシロン−アミノ基は脂肪酸部分にコンジュゲートされる。ある実施形態において、インスリン分子の位置Ｂ３はＬｙｓであり、ＬｙｓＢ３のイプシロン−アミノ基は脂肪酸部分にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、脂肪酸鎖は、８−２０炭素長である。いくつかの実施形態において、脂肪酸は、オクタン酸（Ｃ８）、ノナン酸（Ｃ９）、デカン酸（Ｃ１０）、ウンデカン酸（Ｃ１１）、ドデカン酸（Ｃ１２）またはトリデカン酸（Ｃ１３）である。ある実施形態において、脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデカン酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデカン酸（Ｃ１７）、ステアリン酸（Ｃ１８）、ノナデカン酸（Ｃ１９）またはアラキジン酸（Ｃ２０）である。
【０１１６】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン（インスリンリスプロ）、ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン（インスリンアスパルト）、ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン（インスリングルリジン）、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン（インスリングラルギン）、ＮεＢ２９−ミリストイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン（インスリンデテミル）、ＡｌａＢ２６−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１ＧｌｕＢ１３−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ２７）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ２８−Ｂ３０）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ１）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ１−Ｂ３）−ヒトインスリン。
【０１１７】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−パルミトイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル（ｍｙｒｉｓｏｔｙｌ）−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−パルミトイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１１８】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−パルミトイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−ミリストイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−パルミトイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−パルミトイル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−リトコリル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ヒトインスリン。
【０１１９】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−
ＡｒｇＢ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。
【０１２０】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ３０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ａｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。
【０１２１】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。
【０１２２】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−トリデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン。
【０１２３】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン。
【０１２４】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン。
【０１２５】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン。
【０１２６】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
【０１２７】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
【０１２８】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
【０１２９】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
【０１３０】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン。
【０１３１】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン。
【０１３２】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン。
【０１３３】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン。
【０１３４】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン。
【０１３５】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン。
【０１３６】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン。
【０１３７】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン。
【０１３８】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン。
【０１３９】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン。
【０１４０】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２８−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１４１】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１４２】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２８−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１４３】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２８−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１４４】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１４５】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１４６】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１４７】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１４８】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２８−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１４９】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２８−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１５０】
ある実施形態において、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの変異および／または化学修飾を含む：
ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ｄｅｓ（Ｂ２６）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＡｓｐＢ１ＡｓｐＢ３ＡｓｐＢ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン。
【０１５１】
本開示は、上述の突然変異および／または化学修飾のいずれか１つを含む非ヒトインスリン（たとえばブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど）の修飾形も含む。
【０１５２】
これらおよび他の修飾インスリン分子は、米国特許第６，９０６，０２８号明細書；同第６，５５１，９９２号明細書；同第６，４６５，４２６号明細書；同第６，４４４，６４１号明細書；同第６，３３５，３１６号明細書；同第６，２６８，３３５号明細書；同第６，０５１，５５１号；同第６，０３４，０５４号明細書；同第５，９５２，２９７号明細書；同第５，９２２，６７５号明細書；同第５，７４７，６４２号明細書；同第５，６９３，６０９号明細書；同第５，６５０，４８６号明細書；同第５，５４７，９２９号明細書；同第５，５０４，１８８号明細書；同第５，４７４，９７８号明細書；同第５，４６１，０３１明細書；および同第４，４２１，６８５号明細書；ならび米国特許同第７，３８７，９９６号明細書；同第６，８６９，９３０号明細書；同第６，１７４，８５６号明細書；同第６，０１１，００７号明細書；同第５，８６６，５３８号明細書；および同第５，７５０，４９７号明細書に詳細に記載されている。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、インスリン分子は、インスリン受容体に対するその親和性を低下させるために修飾および／または突然変異される。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、インスリン分子の受容体親和性を修飾（たとえばアシル化）または突然変異によって低下させることにより、インスリン分子が血清から排出される速度が低下し得ることが考えられる。いくつかの実施形態において、低下したインスリン受容体親和性はインビトロで、インスリンコンジュゲートに対する優れたインビボ活性に転換される。ある実施形態において、インスリン分子は、突然変異部位がコンジュゲーション点として使用されるように突然変異され、突然変異された部位におけるコンジュゲーションがインスリン受容体（たとえばＬｙｓＡ３）への結合を低下させる。ある他の実施形態において、既存の野生型アミノ酸または末端におけるコンジュゲーションは、インスリン受容体（たとえばＧｌｙＡ１）への結合を低下させる。いくつかの実施形態において、インスリン分子は、位置Ａ４、Ａ５、Ａ８、Ａ９またはＢ３０にてコンジュゲートされる。ある実施形態において、位置Ａ４、Ａ５、Ａ８、Ａ９またはＢ３０におけるコンジュゲーションは、野生型アミノ酸側鎖（たとえばＧｌｕＡ４）にて起きる。ある他の実施形態において、インスリン分子は位置Ａ４、Ａ５、Ａ８、Ａ９またはＢ３０にて突然変異されて、コンジュゲーションのための部位（たとえばＬｙｓＡ４、ＬｙｓＡ５、ＬｙｓＡ８、ＬｙｓＡ９またはＬｙｓＢ３０）を与える。
【０１５４】
インスリン分子を包含する薬物をコンジュゲートする方法は、本明細書に記載されている。ある実施形態において、インスリン分子は、Ａ１アミノ酸残基を介してコンジュゲートされる。ある実施形態において、Ａ１アミノ酸残基はグリシンである。しかし、本開示はＮ末端コンジュゲーションに限定されないこと、およびある実施形態において、インスリン分子は、非末端Ａ鎖アミノ酸残基を介してコンジュゲートされ得ることが理解されるべきである。特に本開示は、Ａ鎖内のいずれかの位置に存在する（野生型または部位特異的変異誘発によって導入された）リジン残基のイプシロン−アミン基を介したコンジュゲーションを含む。Ａ鎖上のコンジュゲーション位置が異なると、異なるインスリン活性の低下がもたらされ得ることが認識されるであろう。ある実施形態において、インスリン分子は、Ｂ１アミノ酸残基を介してコンジュゲートされる。ある実施形態において、Ｂ１アミノ酸残基はフェニルアラニンである。しかし、本開示はＮ末端コンジュゲーションに限定されないこと、およびある実施形態において、インスリン分子は、非末端Ｂ鎖アミノ酸残基を介してコンジュゲートされ得ることが理解されるべきである。特に本開示は、Ｂ鎖内のいずれかの位置に存在する（野生型または部位特異的変異誘発によって導入された）リジン残基のイプシロン−アミン基を介したコンジュゲーションを含む。たとえばある実施形態において、インスリン分子はＢ２９リジン残基を介してコンジュゲートされ得る。インスリングルリジンの場合、少なくとも１つのリガンドへのＢ３リジン残基を介したコンジュゲーションが用いられ得る。Ｂ鎖上のコンジュゲーション位置が異なると、異なるインスリン活性の低下がもたらされ得ることが認識されるであろう。
【０１５５】
ある実施形態において、リガンドは、インスリン分子などの薬物の１を超えるコンジュゲーション点にコンジュゲーションされている。たとえばインスリン分子は、Ａ１  Ｎ末端およびＢ２９リジンの両方にコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態において、炭酸塩緩衝液中でアミドコンジュゲーションが起こり、Ｂ２９位置とＡ１位置にコンジュゲートされるが、Ｂ１位にはコンジュゲートされない。他の実施形態において、他の実施形態では、インスリン分子は、Ａ１のＮ末端、Ｂ１のＮ末端およびＢ２９リジンにコンジュゲートされ得る。また他の実施形態において、保護基は、コンジュゲーションがＢ１およびＢ２９位置またはＢ１およびＡ１位置で起こるように使用される。インスリン分子上のコンジュゲーション点のいずれの組合せも用いられ得ることが認識されるであろう。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション点の少なくとも１つは突然変異リジン残基、たとえばＬｙｓＡ３である。
【０１５６】
多様な実施形態において、Ｗはインスリン増感剤（すなわちインスリンの作用を増強する薬物）である。インスリンの効果を増強する薬物としては、ビグアニド（たとえばメトホルミン）およびグリタゾンが挙げられる。最初のグリタゾン薬はトログリタゾンであったが、これは重篤な副作用を有することが判明した。第２世代のグリタゾンとしては、耐容性がより良好であるピオグリタゾンおよびロシグリタゾンが挙げられるが、ロシグリタゾンは、ある治験において有害な心血管事象と関連していた。
【０１５７】
多様な実施形態において、Ｗは、インスリン分泌促進薬（すなわち膵臓のベータ細胞によるインスリンの分泌を刺激する薬物）である。たとえば多様な実施形態において、コンジュゲートはスルホニル尿素を包含し得る。スルホニル尿素は、膵臓のベータ細胞をグルコースの作用に感作させることによって、ベータ細胞によるインスリン分泌を刺激する。スルホニル尿素はさらに、グルカゴン分泌を阻害して、標的組織をインスリンの作用に感作させることができる。第１世代のスルホニル尿素としては、トルブタミド、クロルプロパミドおよびカルブタミドが挙げられる。より低い用量で活性である第２世代のスルホニル尿素としては、グリピジド、グリベンクラミド、グリクラジド、グリボルヌリドおよびグリメピリドが挙げられる。多様な実施形態において、コンジュゲートとしてはメグリチニドが挙げられ得る。好適なメグリチニドとしてはナテグリニド、ミチグリニドおよびレパグリニドが挙げられる。これらの血糖降下作用は、スルホニル尿素の作用より高速で短期である。他のインスリン分泌促進薬としては、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）およびＧＬＰ−１類似体（すなわちＧＬＰ−１様生物活性を有し、ＧＬＰ−１とは１−１０のアミノ酸置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾で異なるペプチド）が挙げられる。ＧＬＰ−１は、中枢作用を通じて胃排出を抑制して満腹感を上昇させること、およびグルカゴンの放出を抑制することによって、食物摂取を減少させる。ＧＬＰ−１は、膵島細胞の増殖を増大させることによって血漿グルコースレベルを低下させて、食物摂食後のインスリン産生を増加させる。ＧＬＰ−１は、たとえばリラグルチドのように脂質コンジュゲーションによって化学修飾され得て、そのインビボ半減期が延長される。また他のインスリン分泌促進薬としては、エキセンジン−４およびエキセンジン−４類似体（すなわちエキセンジン−４とは１−１０個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾で異なる、エキセンジン−４様生物活性を持つペプチド）が挙げられる。エキセンジン−４は、アメリカドクトカゲの毒中に見られ、ＧＬＰ−１様生物活性を呈する。エキセンジン−４は、ＧＬＰ−１よりもはるかに長い半減期を有し、ＧＬＰ−１とは異なり、生物活性を失わずにＮ末端にて８アミノ酸残基を切断することができる。ＧＬＰ−１およびエキセンジン−４のＮ末端領域はほぼ同一であり、重大な相違は２番目のアミノ酸残基、ＧＬＰ−１におけるアラニン、エキセンジン−４におけるグリシンであり、グリシンによってエキセンジン−４にはインビボ消化に対する抵抗性が付与される。エキセンジン−４は、ＧＬＰ−１と比べて、Ｃ末端に余分の９アミノ酸残基も有する。Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，Ｔｒａｎｓ．３５：７１３−７１６，２００７およびＲｕｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：５８３０−５８４０，２００７は、本開示のコンジュゲートに使用され得る多種多様のＧＬＰ−１およびエキセンジン−４類似体を記載している。ＧＬＰ−１の短い半減期は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による酵素的消化から生じる。ある実施形態において、内因性ＧＬＰ−１の効��は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害薬（たとえばビルダグリプチン、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチンまたはアログリプチン）の投与によって増強され得る。
【０１５８】
多様な実施形態において、Ｗは、アミリンまたはアミリン類似体（すなわちアミリンとは１−１０のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾で異なる、アミリン様生物活性を持つペプチド）を含むものであり得る。アミリンは、グルコースの調節で重要な役割を果たす（たとえばＥｄｅｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｙｅｒ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１７５−１８９，２００２を参照）。アミリンは、食物摂取に応答して膵臓のベータ細胞によってインスリンとともに共分泌される神経内分泌ホルモンである。インスリンは血流からのグルコースの消失を調節するよう作用するのに対して、アミリンは、胃および肝臓からの血流中のグルコースの出現の調節を助けるように作用する。プラムリンチドアセテート（ＳＹＭＬＩＮ（登録商標））は例示的なアミリン類似体である。未変性ヒトアミリンはアミロイド形成性であるため、プラムリンチドを設計する戦略は、ある残基をアミロイド形成性でないラットアミリンからの残基で置換することを伴っていた。特に、プロリン残基は構造破壊性残基であることが公知であり、プロリン残基はラット配列からヒト配列中に直接グラフトされた。Ｇｌｕ−１０もアスパラギンによって置換された。
スキームＩのステップ
１つの態様において、本発明は、上のスキームＩに示したステップに従って、前官能化リガンドフレームワーク（ＰＬＦ）Ａから式Ｉのコンジュゲートを調製する方法を提供する。
【０１５９】
ステップＳ−１において、式Ｆの化合物は、カルボン酸保護基によって保護される。ある実施形態において、式Ｆの４つのカルボン酸のうち１つのカルボン酸は、ステップＳ−１でカルボン酸保護基によって保護される。ある実施形態において、ＰＧ１がベンジルである場合、ステップＳ−１は２−ベンジルオキシ−１−メチルピリジニウム（ｐｙｒｉｄｉｎｕｍ）トリフレートを使用して行われる。ある実施形態において、ステップＳ−１は極性非プロトン性溶媒中で行われる。極性非プロトン性溶媒としては、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトン、エチルアセテート、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）が挙げられる。ある実施形態において、溶媒はＤＭＦである。いくつかの実施形態において、ステップＳ−１は、室温より上の温度にて行われる。ある実施形態において、ステップＳ−１は、約５０℃と約１００℃との間の温度にて行われる。ある実施形態において、ステップＳ−１は約８０℃にて行われる。
【０１６０】
ステップＳ−２において、式Ｅの化合物は、式Ｄの化合物にアミド結合形成を介して結合される。いくつかの実施形態において、ステップＳ−２は、当分野で公知である標準ペプチドカップリング条件下で行われる；たとえばＢａｉｌｅｙ，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ（１９９０）；Ｊｏｎｅｓ，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＯＵＰ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９４）；Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ，Ｏｒｇ．Ｒｅａｃｔ．，１２，１５７（１９６２）；Ｃａｒｐｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２９，２６８（１９９６）を参照。いくつかの実施形態において、ペプチドカップリング試薬は形質転換で使用される。例示的なペプチドカップリング試薬としては、これに限定されるわけではないが、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢＯＰ−Ｃｌ）、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ）およびクロロトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＣｌＯＰ）が挙げられる。ある実施形態において、カルボジイミドカップリング試薬（たとえばＥＤＣ、ＤＣＣ、ＤＩＣ）は、ステップＳ−２で用いられる。ある実施形態において、ＥＤＣが使用される。いくつかの実施形態において、添加剤が形質転換で使用される。例示的な添加剤としては、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）が挙げられ��。ある実施形態において、ＨＯＢｔはステップＳ−２で用いられる。いくつかの実施形態において、塩基はステップＳ−２で用いられる。いくつかの実施形態において、塩基は有機塩基である。ある実施形態において、塩基は第三級アミン（たとえばジイソプロピルエチルアミンまたはトリエチルアミン）である。ある実施形態において、塩基はジイソプロピルエチルアミンである。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、ステップＳ−２は極性非プロトン性溶媒中で行われる。極性非プロトン性溶媒としては、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトン、エチルアセテート、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）が挙げられる。ある実施形態において、溶媒はＤＭＦである。いくつかの実施形態において、ステップＳ−２は溶媒混合物中で行われる。ある実施形態において、溶媒混合物としては、極性非プロトン性溶媒および極性プロトン性溶媒が挙げられる。ある実施形態において、ステップＳ−２はＤＭＦ／Ｈ２Ｏ中で行われる。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、ステップＳ−２は室温より低い温度にて行われる。いくつかの実施形態において、ステップＳ−２は室温にて行われる。ある実施形態において、ステップＳ−２は、室温より低い温度（たとえば約０から５℃）にて開始されて、室温まで加温される。
【０１６３】
ステップＳ−３において、式Ｃの化合物のＰＧ１保護基の除去は、式Ｂの遊離酸含有化合物を与える。好適なアミノ保護基の除去の手順は当分野で周知である；Ｇｒｅｅｎ（１９９９）を参照。ある実施形態において、式ＣのＰＧ１部分がベンジルである場合、ＰＧ１は水素添加または当分野で公知の他の方法によって除去される。ある実施形態において、ベンジル基は触媒水素添加または移動水素添加を使用して除去される。ある実施形態において、ベンジル基は触媒水素添加を使用して除去される。ある実施形態において、水素添加はアルコール性溶媒中で行われる。ある実施形態において、水素添加はメタノール中で行われる。ある実施形態において、水素添加はパラジウム炭素の存在下で行われる。
【０１６４】
ステップＳ−４において、式Ｂの化合物の遊離酸基は、これが求核置換を受ける好適な脱離基（ＬＧ１）を含むように活性化される。好適なＬＧ１基は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、ＬＧ１は−ＯＳｕである。ある実施形態において、ステップＳ−４は、ＬＧ１を組み込むためにウロニウム試薬を用いる。ある実施形態において、ステップＳ−４は、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＳＴＵ）を用いる。ある実施形態において、ステップＳ−４は極性非プロトン性溶媒中で行われる。ある実施形態において、ステップＳ−４はＤＭＦ中で行われる。いくつかの実施形態において、活性化は塩基の存在下で行われる。ある実施形態において、塩基は有機塩基である。ある実施形態において、塩基は第三級アミン（たとえばトリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミン）である。ある実施形態において、塩基はジイソプロピルエチルアミンである。ある実施形態において、ステップＳ−４は塩基の非存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ステップＳ−４は室温より低い温度にて行われる。ある実施形態において、反応は約０℃と室温との間の温度にて行われる。ある実施形態において、反応は約０℃にて行われる。
コンジュゲーションの方法
ステップＳ−５において、アミン含有薬物Ｗは、式Ａの化合物と反応してアミド結合を形成する。多様な実施形態において、アミン担持薬物は、末端活性化エステル部分を含有する式Ａの化合物にカップリングすることができる（たとえばＨｅｒｍａｎｓｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００８およびそこで引用されている参考文献を参照）。簡潔には、末端活性化エステル（たとえば−ＯＳｕなど）を有する式Ａの化合物がＤＭＳＯまたはＤＭＦなどの無水有機溶媒に溶解される。次に所望の当量数の薬物が添加され、数時間にわたって室温にて混合される。Ｂａｕｄｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．９：１７６−１８３，１９９８に記載されているように、薬物を式Ｂの遊離酸化合物にコンジュゲートして、安定なアミド結合を産生することもできる。本反応は、トリブチルアミン（ＴＢＡ）およびイソブチルクロロホルメートを無水条件下で式Ｂの化合物および薬物のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液に添加することによって達成することができる。
【０１６５】
ある薬物は、１を超えるアミノ基を自然に所有し得る。いくつかの例において、構成成分をこれらの部位の１つのみにて選択的に反応させるために、化学反応の種類および条件を選ぶことが可能である。たとえばインスリン分子が反応性アミンを通じてコンジュゲートされる場合、ある実施形態において、インスリン分子のＡ１およびＢ２９アミノ基は、実施例に記載されているようにＢＯＣ保護されているので、各インスリン分子は、Ｐｈｅ−Ｂ１α−アミノ基においてのみ反応することができる。いくつかの実施形態において、インスリン分子のＢ１およびＢ２９アミノ基は、実施例に記載されているようにＢＯＣ保護されているので、各インスリン分子は、Ｇｌｙ−Ａｌ  α−アミノ基においてのみ反応することができる。ある実施形態において、およそ１当量のＢＯＣ２−インスリンをＤＭＳＯ溶液として、過剰なトリエチルアミンを含有する、式Ａの化合物のＤＭＳＯ溶液に室温にて添加して、適切な長さの時間にわたって反応させる。ある実施形態において、反応はおよそ１時間行われる。いくつかの実施形態において、未反応ＢＯＣ２−インスリンから所望の生成物を精製するために、生じたコンジュゲートを逆相ＨＰＬＣ（Ｃ８、０．１％ＴＦＡを含有する、アセトニトリル／水移動相）によって精製する。ある実施形態において、所望の溶離ピークを収集、プールおよび回転蒸発させてアセトニトリルを除去して、続けて凍結乾燥させて、乾燥粉末を得る。最後に、凍結乾燥粉末を９０％ＴＦＡ／１０％アニソールに１時間にわたって４℃にて溶解させて、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有するＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．２緩衝液による１０倍過希釈を続けて、ＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを７．０と８．０との間に調整して、この後に物質をバイオゲルＰ２カラムに通過させて、アニソール、ＢＯＣおよびその他の汚染塩を除去する。次に脱保護、精製されたコンジュゲート水溶液を所望のレベルまで濃縮して、必要となるまで４℃にて貯蔵する。
【０１６６】
別の態様において、反応がＢ２９イプシロン−アミノ基にて、未保護インスリン分子を使用して炭酸塩緩衝液中で行われ得るのは、このような条件下では、Ｂ２９アミノ基が野生型インスリンに存在する３個のアミノ基のうちで最も反応性であるためである。例示的な合成において、式Ａの化合物を無水ＤＭＳＯに溶解させて、トリエチルアミン（ＴＥＡ）の添加を続ける。溶液を室温にて所望の長さの時間にわたって迅速に撹拌する。次に未保護インスリン分子（１７．２ｍＭ）を炭酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ１１）中に個別に溶解させて、続いて１．０Ｎ水酸化ナトリウムによってｐＨを１０．８まで調整する。溶解したら、Ａ／ＤＭＳＯ／ＴＥＡ溶液を薬物／炭酸塩緩衝溶液に滴加する。添加中に、必要ならば希ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用して、生じた混合物のｐＨを定期的に１０．８まで調整する。滴加の後に溶液を所望の長さの時間にわたって撹拌して、完全に反応させる。
【０１６７】
ある実施形態において、生じたコンジュゲートを、分取逆相ＨＰＬＣを使用して精製する。溶液を収集したら、回転蒸発させてアセトニトリルを除去して、凍結乾燥させて純粋なコンジュゲートを得る。
【０１６８】
さらに炭酸塩緩衝液条件下で、Ａ１アミノ基は野生型インスリンの２番目に反応性のアミノ基である。このため、ある実施形態において、Ａ１，Ｂ２９−２置換インスリン−コンジュゲートは、上記の条件を使用して、Ｂ２９−１置換インスリン−コンジュゲート合成と比べて、インスリン分子当りおよそ１０倍の量の前官能化リガンドフレームワークを用いて合成される。
【０１６９】
これらの例示的な手順を使用して、異なるリガンドおよび薬物との他のコンジュゲートが産生され得ることが認識されるであろう。
Ｎ末端保護アミノ酸配列を使用するコンジュゲーション
いくつかの実施形態において、上記のコンジュゲーション工程は、Ｎ末端保護アミノ酸配列を包含する組換えインスリン分子を使用して行われる。図８は、ＡおよびＢペプチドの両方にＮ末端保護アミノ酸配列を包含する組換えインスリン分子に関連する、本工程の１つの実施形態を示す（Ｎ末端保護アミノ酸配列はそれぞれＡ０およびＢ０として示されている）。下でさらに詳細に記載するように、Ｎ末端保護アミノ酸配列Ａ０およびＢ０は、これらのアミノ酸配列がＡｒｇ残基をそのＣ末端に包含する限り、１つ以上のアミノ酸残基を包含し得る。図８Ａに示し、実施例２３に記載するように、これらのＮ末端保護アミノ酸配列を含むプロインスリン分子は、酵母中で最初に組換え産生される。精製後、Ｎ末端リーダーペプチド（図８のＬ）およびプロインスリン分子の内部Ｃペプチド（図８のＣ）は、Ｃ末端リジンプロテアーゼ（たとえばアクロモバクター・ライチカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）プロテアーゼ、すなわちＡＬＰ）を使用して切断される。Ｎ末端リーダーペプチドが切断されるのは、これがＣ末端Ｌｙｓ残基を包含するためである。内部Ｃペプチドが切断されるのは、これに２つのＬｙｓ残基（Ｂ２９におけるＬｙｓ残基およびＣペプチド配列のＣ末端におけるＬｙｓ残基）が隣接しているためである。次にコンジュゲーションが行われ、この間にＮ末端保護アミノ酸配列はインスリン分子上に存在して、コンジュゲートインスリン中間体の混合物を産生する（コンジュゲーションは一般に、より反応性であるＬｙｓＢ２９にて優先的に発生するが、ＡＯおよび／またはＢＯのＮ末端でも発生し得る）。図８Ａにおいて、インスリン分子はＮＨＳ−Ｒ＊とコンジュゲートされ、Ｒ＊は前官能化リガンドフレームワークに相当して、ＮＨＳはＮＨＳエステル基に相当する。これらの図のＮＨＳエステル基は例示的であること、および本開示のこの箇所および他のいずれの箇所でも、ＮＨＳエステル基は別の好適な活性化エステル基で置き換えられることが理解されるべきである。上記のように、ある実施形態において、本コンジュゲーションステップは、ＮＨＳ−Ｒ＊をＤＭＳＯまたはＤＭＦなどの無水有機溶媒に溶解させること、および次に所望の当量数のインスリン分子を添加すること、続いて室温にて数時間撹拌することによって行われ得る。コンジュゲートインスリン中間体は次に、Ａｒｇ残基のＣ末端上で切断することができるトリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼによって処置される。図８Ｂに示すように、本酵素処理ステップは、コンジュゲートインスリン中間体すべてを、ＬｙｓＢ２９のみがコンジュゲートされる所望のインスリン−コンジュゲートに崩壊させる。
【０１７０】
図７は、ＡおよびＢペプチドのＮ末端保護アミノ酸配列の非存在下で、同じ工程が進行する方法を示す。図示されているように、工程はコンジュゲートされた生成物の混合物を生じ、所望の生成物（たとえばＬｙｓＢ２９のみがコンジュゲートされる場合はインスリン−コンジュゲート）は、混合物から（たとえば分取逆相ＨＰＬＣを使用して）精製する必要がある。
【０１７１】
図９は、ＡペプチドのみにＮ末端保護アミノ酸配列を包含する組換えインスリン分子に関連する、本工程の別の実施形態を示す（Ｎ末端保護アミノ酸配列はＡ０として示されている）。図９に示すように、反応は、コンジュゲーションを利用可能なすべての位置（すなわちＡ０、Ｂ１およびＢ２９）にて促進する条件下で行われる。たとえばこれは、過剰なＮＨＳ−Ｒ＊を反応物に添加することによって達成できる。または、Ｂ１およびＢ２９位置にてコンジュゲーションを促進する条件を使用することができる。コンジュゲートインスリン中間体は次に、トリプシンによって処置されて、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９がコンジュゲートされる所望のインスリン−コンジュゲートが産生される。いくつかの実施形態において、Ｂ２９位置またはＡ０およびＢ２９位置の両方においてコンジュゲーションを促進する条件を使用することができる（たとえば所望の生成物が、ＬｙｓＢ２９のみがコンジュゲートされるインスリン−コンジュゲートである場合）。本開示は、コンジュゲーション反応がコンジュゲートインスリン中間体のより複雑な混合物（たとえばＢ２９、Ａ０／Ｂ２９、Ｂ１／Ｂ２９およびＡ０／Ｂ１／Ｂ２９コンジュゲートインスリン中間体）を産生する実施形態も含む。このような実施形態において、トリプシンを用いた処置により、生成物の混合物（たとえばＢ２９コンジュゲートインスリン分子およびＢ１／Ｂ２９コンジュゲートインスリン分子）が産生されるであろう。次に所望の生成物は、本明細書で開示されている技法によって（たとえば分取逆相ＨＰＬＣを使用して）本混合物から精製される。
【０１７２】
図１０は、ＢペプチドのみにＮ末端保護アミノ酸配列を包含する組換えインスリン分子に関連する、本工程のまた別の実施形態を示す（Ｎ末端保護アミノ酸配列はＡ０として示されている）。図１０に示すように、反応は、コンジュゲーションを利用可能なすべての位置（すなわちＡ１、Ｂ０およびＢ２９）にて促進する条件下で行われる。たとえばこれは、過剰なＮＨＳ−Ｒ＊を反応物に添加することによって達成できる。または、Ａ１およびＢ２９位置においてコンジュゲーションを促進する条件を使用することができる（たとえば炭酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ１１）中で、Ａ１位置は、Ｂ２９の次に反応性である位置である。）。コンジュゲートされたインスリン中間体は次に、トリプシンによって処置されて、Ａ１およびＬｙｓＢ２９がコンジュゲートされる所望のインスリン−コンジュゲートが産生される。本開示は、コンジュゲーション反応がコンジュゲートされたインスリン中間体のより複雑な混合物（たとえばＢ２９、Ａ１／Ｂ２９、Ｂ０／Ｂ２９およびＡ１／Ｂ０／Ｂ２９のコンジュゲートされたインスリン中間体）を産生する実施形態も含む。このような実施形態において、トリプシンを用いた処置によって、生成物の混合物（たとえばＢ２９コンジュゲートインスリン分子およびＡ１／Ｂ２９コンジュゲートインスリン分子）が産生されるであろう。次に所望の生成物は、本明細書で開示されている技法によって（たとえば分取逆相ＨＰＬＣを使用して）本混合物から精製される。
【０１７３】
ある実施形態において、１つ以上のＮ末端保護アミノ酸配列を包含する組換えインスリン分子は、配列番号１のアミノ酸配列（Ａペプチド）および配列番号２のアミノ酸配列（Ｂペプチド）および３つのジスルフィドブリッジを、式ＸＩに示すように含む。
【０１７４】
【化１２】
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式中、位置Ａ０におけるＸａａは、Ｎ末端保護アミノ酸配列を包含するか、または欠損している：および位置Ｂ０におけるＸａａは、Ｎ末端保護アミノ酸配列を包含するか、または欠損している、ただしＡ０またはＢ０の少なくとも１つがＮ末端保護アミノ酸配列を含むという条件である。
【０１７５】
式Ｘ１の位置Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２１、Ａ２２、Ｂ３、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０およびＢ３１におけるＸａａは、本明細書に記載されている式ＸＩのインスリン分子のいずれかに従って定義され得ることが理解されるべきである（表１−３に示すものを含む）。ある実施形態において、Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＢ３０は、表３に示すものから選択される。ある実施形態において、Ａ１８は、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕである。ある実施形態において、Ａ２１は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＡｌａである。ある実施形態において、Ａ２２、Ｂ３０およびＢ３１は欠損している。ある実施形態において、Ｂ３は、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕである。ある実施形態において、Ｂ２８は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＡｓｐである。ある実施形態において、Ｂ２９は、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＧｌｕである。ある実施形態において、Ｂ２９はＬｙｓである。
【０１７６】
ある実施形態において、Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＢ３０は、表３に示すものから選択される；Ａ１８は、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕである；Ａ２１は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＡｌａである；Ａ２２、Ｂ３０およびＢ３１は欠損している；Ｂ３は、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕである；Ｂ２８は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＡｓｐである；ならびにＢ２９はＬｙｓである。
【０１７７】
ある実施形態において、Ａ２２、Ｂ３０およびＢ３１は欠損していて、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ３、Ｂ２８およびＢ２９は、野生型ヒトインスリンの場合と同じである。
【０１７８】
ある実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａはＮ末端保護アミノ酸配列を包含して、位置Ｂ０におけるＸａａはＮ末端保護アミノ酸配列を包含する。ある実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａはＮ末端保護アミノ酸配列を包含して、位置Ｂ０におけるＸａａは欠損している。ある実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａは欠損していて、位置Ｂ０におけるＸａａはＮ末端保護アミノ酸配列を包含する。
【０１７９】
ある実施形態において、Ｎ末端保護アミノ酸配列はモチーフ［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］−Ｘａａ’’’−ＡｒｇをＣ末端に含み、Ｘａａ’’’は欠損しているか、または１−１０のコード可能なアミノ酸配列であり、ただしＸａａ’’’はＡｒｇを包含しないという条件である。
【０１８０】
ある実施形態において、Ｘａａ’’’はＣｙｓまたはＬｙｓを包含しない。
【０１８１】
ある実施形態において、Ｘａａ’’’は、Ａｓｐの１−１０回の出現を包含する。ある実施形態において、Ｘａａ’’’は、Ｇｌｕの１−１０回の出現を包含する。ある実施形態において、Ｘａａ’’’は、Ａｓｐの１−５回の出現およびＧｌｕの１−５の出現を包含する。
【０１８２】
ある実施形態において、Ｘａａ’’’はＰｒｏである。ある実施形態において、Ｘａａ’’’は、Ｃ末端にＰｒｏを包含する。ある実施形態において、Ｘａａ’’’は、Ｃ末端のＰｒｏおよびＡｓｐの１−１０回の出現を包含する。ある実施形態において、Ｘａａ’’’は、Ｃ末端のＰｒｏおよびＧｌｕの１−１０回の出現を包含する。ある実施形態において、Ｘａａ’’’は、Ｃ末端のＰｒｏ、Ａｓｐの１−１０回の出現およびＧｌｕの１−５回の出現を包含する。
【０１８３】
ある実施形態において、Ｘａａ’’’はＧｌｙである。ある実施形態において、Ｘａａ’’’はＣ末端にＧｌｙを包含する。ある実施形態において、Ｘａａ’’’はＣ末端のＧｌｙおよびＡｓｐの１−１０回の出現を包含する。ある実施形態において、Ｘａａ’’’はＣ末端のＧｌｙおよびＧｌｕの１−１０回の出現を包含する。ある実施形態において、Ｘａａ’’’は、Ｃ末端のＧｌｙ、Ａｓｐの１−５回の出現およびＧｌｕの１−５回の出現を包含する。
【０１８４】
ある実施形態において、Ｎ末端保護アミノ酸配列は、Ｃ末端にモチーフ［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］−［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］−Ａｒｇを含む。
【０１８５】
ある実施形態において、Ｎ末端保護アミノ酸配列は、Ｃ末端にモチーフ［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］−Ａｓｐ−Ａｒｇを含む。
【０１８６】
ある実施形態において、Ｎ末端保護アミノ酸配列は、Ｃ末端にモチーフ［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］−Ｇｌｕ−Ａｒｇを含む。
【０１８７】
ある実施形態において、Ｎ末端保護アミノ酸配列は、Ｃ末端にモチーフＡｓｐ−［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］−Ａｒｇを含む。
【０１８８】
ある実施形態において、Ｎ末端保護アミノ酸配列は、Ｃ末端にモチーフＧｌｕ−［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］−Ａｒｇを含む。
【０１８９】
ある実施形態において、Ｎ末端保護アミノ酸配列は、Ｃ末端にモチーフ［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］−［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］−［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］−［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２０）を含む。
【０１９０】
ある実施形態において、Ｎ末端保護アミノ酸配列は、Ｃ末端にモチーフ［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］−［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］−Ｇｌｙ−［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］−Ｘａａ’’’−Ａｒｇを含み、Ｘａａ’’’はいずれかのコード可能なアミノ酸である（配列番号２１）。ある実施形態において、Ｘａａ’’’はＧｌｙである。ある実施形態において、Ｘａａ’’’はＰｒｏである。
【０１９１】
ある実施形態において、Ｎ末端保護アミノ酸配列は、Ｃ末端にモチーフＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２２）を含む。
【０１９２】
ある実施形態において、Ｎ末端保護アミノ酸配列は、Ｃ末端にモチーフＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２３）を含む。
【０１９３】
ある実施形態において、Ｎ末端保護アミノ酸配列は、Ｃ末端にモチーフＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号２４）を含む。
【０１９４】
ある実施形態において、Ｎ末端保護アミノ酸配列は、Ｃ末端にモチーフＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号２５）を含む。
【０１９５】
ある実施形態において、Ｎ末端保護アミノ酸配列は、Ｃ末端にモチーフＡｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（配列番号２６）を含む。
【０１９６】
ある実施形態において、Ｎ末端保護アミノ酸配列は、上述のモチーフの１つより成る。ある実施形態において、位置Ａ０および／またはＢ０におけるＸａａは、上述のモチーフの１つより成る。
【０１９７】
ある実施形態において、本開示は：（ａ）末端活性化エステルを包含する前官能化リガンドフレームワークと１つ以上のＮ末端保護アミノ酸配列を包含するＮ末端インスリン分子との間でアミドコンジュゲーションを行って、１つ以上のコンジュゲートインスリン中間体を産生するステップおよび（ｂ）１つ以上のＮ末端保護アミノ酸配列を１つ以上のコンジュゲートインスリン中間体からＡｒｇのＣ末端側で切断するプロテアーゼを用いて切断するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼはトリプシンである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼはトリプシン様プロテアーゼである。いくつかの実施形態において、所望の生成物は、ステップ（ｂ）で産生されたコンジュゲートインスリン分子の混合物から（たとえば分取逆相ＨＰＬＣを使用して）精製される。
【０１９８】
ある実施形態において、インスリン分子は式ＸＩで示す通りであり、式中、位置Ａ０におけるＸａａはＮ末端保護アミノ酸配列を包含して、位置Ｂ０におけるＸａａはＮ末端保護アミノ酸配列を包含する。これらのいくつかの実施形態において、位置Ｂ２９におけるＸａａはＬｙｓであり、方法は式Ｘ１のインスリン分子を産生し、式中、Ａ０およびＢ０は欠損していて、前官能化リガンドフレームワークはＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされる。
【０１９９】
ある実施形態において、インスリン分子は式ＸＩで示す通りであり、式中、位置Ａ０におけるＸａａはＮ末端保護アミノ酸配列を包含して、位置Ｂ０におけるＸａａは欠損している。これらのいくつかの実施形態において、位置Ｂ２９におけるＸａａはＬｙｓであり、方法は式ＸＩのインスリン分子を産生し、式中、Ａ０およびＢ０は欠損していて、前官能化リガンドフレームワークは位置Ｂ１およびＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされる。これらのいくつかの実施形態において、位置Ｂ２９におけるＸａａはＬｙｓであり、方法は式ＸＩのインスリン分子を産生し、式中、Ａ０およびＢ０は欠損していて、前官能化リガンドフレームワークはＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされる。ある実施形態において、位置Ｂ１およびＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされるインスリン分子は、位置Ｂ１およびＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされるインスリン分子ならびにＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされるインスリン分子を包含する混合物から（たとえば分取逆相ＨＰＬＣを使用して）精製される。ある実施形態において、ＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされるインスリン分子は、位置Ｂ１およびＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされるインスリン分子ならびにおよびＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされるインスリン分子を包含する混合物から（たとえば分取逆相ＨＰＬＣを使用して）精製される。
【０２００】
ある実施形態において、インスリン分子は式ＸＩで示す通りであり、式中、位置Ａ０におけるＸａａは欠損していて、位置Ｂ０におけるＸａａはＮ末端保護アミノ酸配列を包含する。これらのいくつかの実施形態において、位置Ｂ２９におけるＸａａはＬｙｓであり、方法は式ＸＩのインスリン分子を産生し、式中、Ａ０およびＢ０は欠損していて、前官能化リガンドフレームワークは位置Ａ１およびＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされる。これらのいくつかの実施形態において、位置Ｂ２９におけるＸａａはＬｙｓであり、方法は式ＸＩのインスリン分子を産生し、式中、Ａ０およびＢ０は欠損していて、前官能化リガンドフレームワークはＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされる。ある実施形態において、位置Ａ１およびＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされるインスリン分子は、位置Ａ１およびＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされるインスリン分子ならびにＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされるインスリン分子を包含する混合物から（たとえば分取逆相ＨＰＬＣを使用して）精製される。ある実施形態において、ＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされるインスリン分子は、位置Ａ１およびＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされるインスリン分子ならびにおよびＬｙｓＢ２９にてコンジュゲートされるインスリン分子を包含する混合物から（たとえば分取逆相ＨＰＬＣを使用して）精製される。
コンジュゲーションの複数部位（スキームＩＩ）
式Ａの化合物が１を超えるアミノ基を有する薬物と複数回反応し得ることが理解されるであろう。このため、ある実施形態において、本発明は、下のスキームＩＩに示すように、適切な当量数の式Ａの化合物から式Ｉ−ａのコンジュゲートを調製する方法を提供し：
【０２０１】
【化１３】
2013537529.tif 000019
式中、Ｘ、Ａｌｋ、ＬＧ１およびＷは上で定義した通りであり、本明細書に記載するクラスおよびサブクラス内にあり、ならびにｊは２または３である。概して、単一のコンジュゲーション点を示す、本明細書で開示するいずれのスキームも、２つ以上の式Ａの化合物が薬物Ｗにコンジュゲートされる実施形態を含むことが理解されるべきである。
スキームＩＩＩ
いくつかの実施形態において、Ｗはインスリン分子であり、本発明は、下のスキームＩＩＩに示すように、式Ａの化合物から式ＩＩのコンジュゲートを調製する方法を提供し：
【０２０２】
【化１４】
2013537529.tif 000020
式中、Ｘ、Ａｌｋ、およびＬＧ１は上で定義した通りであり、本明細書に記載するクラスおよびサブクラス内にある。
【０２０３】
本明細書に記載する場合、インスリン分子は多様なアミン位置にてコンジュゲートされ得る。ある実施形態において、インスリンコンジュゲートは図１に示されている。ある実施形態において、インスリン分子はＢ１、Ａ１またはＬｙｓＢ２９位置にてコンジュゲートされる。スキームＩＩＩの式ＩＩは、簡略化するために１つのコンジュゲーション点のみを示しているが、式Ａの化合物は、スキームＩＩおよび式Ｉ−ａに示すように、インスリン分子の２つ以上の位置にてコンジュゲートされ得ることが理解されるべきである。ある実施形態において、インスリン分子は、Ａ１およびＬｙｓＢ２９位置にてコンジュゲートされる。ある実施形態において、インスリン分子はＡ１およびＢ１位置にてコンジュゲートされる。ある実施形態において、インスリン分子はＢ１およびＬｙｓＢ２９位置にてコンジュゲートされる。ある実施形態において、インスリン分子はＡ１、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９位置にてコンジュゲートされる。ある実施形態において、インスリン分子は、ヒトインスリンの野生型配列中に存在し得るまたは存在し得ない非末端リジン残基の側鎖を介して（たとえば位置Ｂ３、Ｂ２８またはＢ２９にて）コンジュゲートされる。
スキームＩＶ
いくつかの実施形態において、ＬＧ１は−ＯＳｕであり、本発明は、下のスキームＩＶに示すように、式Ａ−ｉの化合物から式ＩＩのコンジュゲートを調製する方法を提供し：
【０２０４】
【化１５】
2013537529.tif 000021
式中、ＸおよびＡｌｋは上で定義した通りであり、本明細書に記載するクラスおよびサブクラス内にある。スキームＩＶの式ＩＩは、簡略化するために１つのコンジュゲーション点のみを示しているが、式Ａ−ｉの化合物は、スキームＩＩおよび式Ｉ−ａに示すように、インスリン分子の２つ以上の位置にてコンジュゲートされ得ることが理解されるべきである。
【０２０５】
ステップＳ−８において、式Ａ−ｉの化合物の−ＯＳｕ基は、上記のインスリンアミノ基で置き換えられる。
化合物ＡからのコンジュゲートＩの合成
別の態様により、本発明は、式Ｉのコンジュゲート：
【０２０６】
【化１６】
2013537529.tif 000022
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
Ｗは薬物である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ａの化合物：
【０２０７】
【化１７】
2013537529.tif 000023
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）前記式Ａの化合物をアミン含有薬物と反応させて、式Ｉのコンジュゲートを形成するステップ；
を含む方法を提供する。
【０２０８】
上の式Ｉは、簡略化するために１つのコンジュゲーション点のみを示しているが、スキームＩＩおよび式Ｉ−ａに示すように、式Ａの化合物は、薬物Ｗの２つ以上の位置にてコンジュゲートされ得ることが理解されるべきである。
化合物ＡからのコンジュゲートＩＩの合成
ある実施形態において、本発明は、式ＩＩのコンジュゲート：
【０２０９】
【化１８】
2013537529.tif 000024
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ａの化合物：
【０２１０】
【化１９】
2013537529.tif 000025
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）前記式Ａの化合物をインスリン分子と反応させて、式ＩＩのコンジュゲートを形成するステップ；
を含む方法を提供する。
【０２１１】
上で定義したように、式ＩＩおよびＡの化合物において、Ｘの各出現は独立してリガンドである。ある実施形態において、Ｘの各出現は同じリガンドである。上で定義したように、式Ａの化合物において、ＬＧ１は好適な脱離基である。ある実施形態において、ＬＧ１は−ＯＳｕである。
【０２１２】
上で定義したように、式ＩＩおよびＡの化合物において、Ａｌｋの各出現は独立してＣ２−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。ある実施形態において、Ａｌｋの各出現は同じである。ある実施形態において、式ＩＩおよびＡのＡｌｋはエチレンである。
【０２１３】
上の式ＩＩは、簡略化するために１つのコンジュゲーション点のみを示しているが、スキームＩＩおよび式Ｉ−ａに示すように、式Ａの化合物は、インスリン分子の２つ以上の位置にてコンジュゲートされ得ることが理解されるべきである。
【０２１４】
ある実施形態において、式ＩＩのコンジュゲートは、図１に示すものから選択される。
化合物Ｂからの化合物Ａの合成
別の実施形態により、本発明は、式Ａの化合物：
【０２１５】
【化２０】
2013537529.tif 000026
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｂの化合物：
【０２１６】
【化２１】
2013537529.tif 000027
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）式Ｂの前記化合物のカルボン酸を活性化して、式Ａの化合物を形成するステップ；
を含む方法を提供する。
化合物Ｃからの化合物Ｂの合成
別の実施形態により、本発明は、式Ｂの化合物
【０２１７】
【化２２】
2013537529.tif 000028
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｃの化合物：
【０２１８】
【化２３】
2013537529.tif 000029
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ２−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）式Ｃの化合物を脱保護して、式Ｂの化合物を形成するステップ；
を含む方法を提供する。
化合物Ｄからの化合物Ｃの合成
本発明のまた別の態様は、式Ｃの化合物：
【０２１９】
【化２４】
2013537529.tif 000030
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｄの化合物：
【０２２０】
【化２５】
2013537529.tif 000031
（式中：
ＰＧ１はカルボン酸保護基であり；および
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ
および
（ｂ）式Ｄの化合物をアミン含有リガンドＨ２Ｎ−Ｘ（Ｅ）と反応させて、式Ｃの化合物を形成するステップ；
を含む方法を提供する。
化合物Ｆからの化合物Ｄの合成
別の実施形態により、本発明は、式Ｄの化合物
【０２２１】
【化２６】
2013537529.tif 000032
（式中：
ＰＧ１はカルボン酸保護基であり；および
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｆの化合物：
【０２２２】
【化２７】
2013537529.tif 000033
（式中：
Ａｌｋ１はＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）化合物Ｆのカルボン酸部分を保護して、式Ｄの化合物を与えるステップ；
を含む方法を提供する。
化合物Ａの合成（ステップＳ−１からＳ−４）
別の実施形態により、本発明は、式Ａの化合物：
【０２２３】
【化２８】
2013537529.tif 000034
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｆの化合物：
【０２２４】
【化２９】
2013537529.tif 000035
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ；
（ｂ）化合物Ｆのカルボン酸部分を保護して、式Ｄの化合物：
【０２２５】
【化３０】
2013537529.tif 000036
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＰＧ２はカルボン酸保護基である。）
を与えるステップ；
（ｃ）式Ｄの化合物をアミン含有リガンドＨ２Ｎ−Ｘ（Ｅ）と反応させて、式Ｃの化合物：
【０２２６】
【化３１】
2013537529.tif 000037
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよく；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を形成するステップ；
（ｄ）式Ｃの化合物を脱保護して、式Ｂの化合物：
【０２２７】
【化３２】
2013537529.tif 000038
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を形成するステップ；
および
（ｅ）式Ｂの前記化合物のカルボン酸を活性化して、式Ａの化合物を形成するステップ；
を含む方法を提供する。
コンジュゲートＩの合成（ステップＳ−１からＳ−５）
別の実施形態により、本発明は、式Ｉのコンジュゲート：
【０２２８】
【化３３】
2013537529.tif 000039
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
Ｗは薬物である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｆの化合物：
【０２２９】
【化３４】
2013537529.tif 000040
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ
（ｂ）化合物Ｆのカルボン酸部分を保護して、式Ｄの化合物：
【０２３０】
【化３５】
2013537529.tif 000041
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を与えるステップ；
（ｃ）式Ｄの化合物をアミン含有リガンドＨ２Ｎ−Ｘ（Ｅ）と反応させて、式Ｃの化合物：
【０２３１】
【化３６】
2013537529.tif 000042
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を与えるステップ；
（ｄ）式Ｃの化合物を脱保護して、式Ｂの化合物：
【０２３２】
【化３７】
2013537529.tif 000043
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を形成するステップ；
（ｅ）式Ｂの前記化合物のカルボン酸を活性化して、式Ａの化合物：
【０２３３】
【化３８】
2013537529.tif 000044
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を形成するステップ；
および
（ｆ）式Ａの化合物をアミン含有薬物と反応させて、式Ｉのコンジュゲートを形成するステップ；
を含む方法を提供する。
【０２３４】
上の式Ｉは、簡略化するために１つのコンジュゲーション点のみを示しているが、スキームＩＩおよび式Ｉ−ａに示すように、式Ａの化合物は、薬物Ｗの２つ以上の位置にてコンジュゲートされ得ることが理解されるべきである。
コンジュゲートＩＩの合成（ステップＳ−１、Ｓ−２、Ｓ−３、Ｓ−４およびＳ−７）
別の実施形態により、本発明は、式ＩＩのコンジュゲート：
【０２３５】
【化３９】
2013537529.tif 000045
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
Ｗは薬物である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｆの化合物：
【０２３６】
【化４０】
2013537529.tif 000046
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ；
（ｂ）化合物Ｆのカルボン酸部分を保護して、式Ｄの化合物：
【０２３７】
【化４１】
2013537529.tif 000047
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を与えるステップ；
（ｃ）式Ｄの化合物をアミン含有リガンドＨ２Ｎ−Ｘ（Ｅ）と反応させて、式Ｃの化合物：
【０２３８】
【化４２】
2013537529.tif 000048
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を形成するステップ；
（ｄ）式Ｃの化合物を脱保護して、式Ｂの化合物：
【０２３９】
【化４３】
2013537529.tif 000049
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を形成するステップ；
（ｅ）式Ｂの前記化合物のカルボン酸を活性化して、式Ａの化合物：
【０２４０】
【化４４】
2013537529.tif 000050
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を形成するステップ；
および
（ｆ）式Ａの化合物をインスリン分子と反応させて、式ＩＩの化合物を形成するステップ；
を含む方法を提供する。
【０２４１】
上の式ＩＩは、簡略化するために１つのコンジュゲーション点のみを示しているが、スキームＩＩおよび式Ｉ−ａに示すように、式Ａの化合物は、インスリン分子の２つ以上の位置にてコンジュゲートされ得ることが理解されるべきである。
中間体化合物Ｆ
本発明のまた別の態様は、式Ｆの化合物：
【０２４２】
【化４５】
2013537529.tif 000051
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン基は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換され得る。）
を提供する。
【０２４３】
式Ｆの化合物では、Ａｌｋは本明細書で実施形態に記載されている通りである。いくつかの実施形態において、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖である。本発明の１つの態様により、
式Ｆの化合物は
【０２４４】
【化４６】
2013537529.tif 000052
である。
中間体化合物Ｄ
本発明のまた別の態様は、式Ｄの化合物：
【０２４５】
【化４７】
2013537529.tif 000053
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン基は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換され得て；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を提供する。
【０２４６】
式Ｄの化合物では、ＡｌｋおよびＰＧ１はそれぞれ本明細書で実施形態に記載されている通りである。いくつかの実施形態において、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖である。本発明の１つの態様により、式Ｄの化合物は
【０２４７】
【化４８】
2013537529.tif 000054
である。
中間体化合物Ｃ
本発明のまた別の態様は、式Ｃの化合物：
【０２４８】
【化４９】
2013537529.tif 000055
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン基は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換され得て；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を提供する。
【０２４９】
式Ｃの化合物では、Ｘ、ＡｌｋおよびＰＧ１はそれぞれ本明細書で実施形態に記載されている通りである。いくつかの実施形態において、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖である。ある実施形態において、Ｘは、本明細書に記載されているように、ＥＧ、ＥＭ、ＥＢＭ、ＥＴＭ、ＥＧＡまたはＥＦである。本発明の１つの態様により、式Ｃの化合物は
【０２５０】
【化５０】
2013537529.tif 000056
である。
中間体化合物Ｂ
本発明のまた別の態様は、式Ｂの化合物：
【０２５１】
【化５１】
2013537529.tif 000057
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン基は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を提供する。
【０２５２】
式Ｂの化合物では、ＸおよびＡｌｋはそれぞれ本明細書で実施形態に記載されている通りである。いくつかの実施形態において、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖である。ある実施形態において、Ｘは、本明細書に記載されているように、ＥＧ、ＥＭ、ＥＢＭ、ＥＴＭ、ＥＧＡまたはＥＦである。本発明の１つの態様により、式Ｂの化合物は
【０２５３】
【化５２】
2013537529.tif 000058
である。
中間体化合物Ａ
本発明の別の態様は、式Ａの化合物：
【０２５４】
【化５３】
2013537529.tif 000059
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン基は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換され得て；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を提供する。
【０２５５】
式Ａの化合物では、Ｘ、ＡｌｋおよびＬＧ１はそれぞれ本明細書で実施形態に記載されている通りである。いくつかの実施形態において、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖である。ある実施形態において、Ｘは、本明細書に記載されているように、ＥＧ、ＥＭ、ＥＢＭ、ＥＴＭ、ＥＧＡまたはＥＦである。１つの態様により、式Ａの化合物は
【０２５６】
【化５４】
2013537529.tif 000060
である。
【０２５７】
上述の実施形態のいずれかにおいて、Ｗがインスリン分子であるとき、以下が適用され得る：
ある実施形態において、Ｘは、ＥＴＭ、ＥＭ、ＥＢＭ、ＥＧ、ＥＧＡおよびＥＦのいずれか１つであり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＢ１アミノ基と反応する。
【０２５８】
ある実施形態において、Ｘは、ＥＴＭ、ＥＭ、ＥＢＭ、ＥＧ、ＥＧＡおよびＥＦのいずれか１つであり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１アミノ基と反応する。
【０２５９】
ある実施形態において、Ｘは、ＥＴＭ、ＥＭ、ＥＢＭ、ＥＧ、ＥＧＡおよびＥＦのいずれか１つであり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２６０】
ある実施形態において、Ｘは、ＥＴＭ、ＥＭ、ＥＢＭ、ＥＧ、ＥＧＡおよびＥＦのいずれか１つであり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１およびＢ１アミノ基と反応する。
【０２６１】
ある実施形態において、Ｘは、ＥＴＭ、ＥＭ、ＥＢＭ、ＥＧ、ＥＧＡおよびＥＦのいずれか１つであり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＢ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２６２】
ある実施形態において、Ｘは、ＥＴＭ、ＥＭ、ＥＢＭ、ＥＧ、ＥＧＡおよびＥＦのいずれか１つであり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２６３】
ある実施形態において、Ｘは、ＥＴＭ、ＥＭ、ＥＢＭ、ＥＧ、ＥＧＡおよびＥＦのいずれか１つであり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２６４】
上述の実施形態のいずれかにおいて、Ｗがインスリン分子であるとき、以下が適用され得る：
ある実施形態において、ＸはＥＴＭであり、ならびに中間体化合物Ａは、インスリン分子のＢ１アミノ基、インスリン分子のＡ１アミノ基、インスリン分子のＬｙｓＢ２９アミノ基、インスリン分子のＡ１およびＢ１アミノ基、インスリン分子のＢ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基、インスリン分子のＡ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基、またはインスリン分子のＡ１、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２６５】
ある実施形態において、ＸはＥＭであり、ならびに中間体化合物Ａは、インスリン分子のＢ１アミノ基、インスリン分子のＡ１アミノ基、インスリン分子のＬｙｓＢ２９アミノ基、インスリン分子のＡ１およびＢ１アミノ基、インスリン分子のＢ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基、インスリン分子のＡ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基、またはインスリン分子のＡ１、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２６６】
ある実施形態において、ＸはＥＢＭであり、ならびに中間体化合物Ａは、インスリン分子のＢ１アミノ基、インスリン分子のＡ１アミノ基、インスリン分子のＬｙｓＢ２９アミノ基、インスリン分子のＡ１およびＢ１アミノ基、インスリン分子のＢ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基、インスリン分子のＡ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基、またはインスリン分子のＡ１、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２６７】
ある実施形態において、ＸはＥＧであり、ならびに中間体化合物Ａは、インスリン分子のＢ１アミノ基、インスリン分子のＡ１アミノ基、インスリン分子のＬｙｓＢ２９アミノ基、インスリン分子のＡ１およびＢ１アミノ基、インスリン分子のＢ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基、インスリン分子のＡ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基、またはインスリン分子のＡ１、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２６８】
ある実施形態において、ＸはＥＧＡであり、ならびに中間体化合物Ａは、インスリン分子のＢ１アミノ基、インスリン分子のＡ１アミノ基、インスリン分子のＬｙｓＢ２９アミノ基、インスリン分子のＡ１およびＢ１アミノ基、インスリン分子のＢ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基、インスリン分子のＡ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基、またはインスリン分子のＡ１、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２６９】
ある実施形態において、ＸはＥＦであり、ならびに中間体化合物Ａは、インスリン分子のＢ１アミノ基、インスリン分子のＡ１アミノ基、インスリン分子のＬｙｓＢ２９アミノ基、インスリン分子のＡ１およびＢ１アミノ基、インスリン分子のＢ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基、インスリン分子のＡ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２７０】
ある実施形態において、ＸはＥＴＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、および中間体化合物Ａはインスリン分子のＢ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＴＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、および中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＴＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１およびＢ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＴＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＢ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＴＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＴＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２７１】
ある実施形態において、ＸはＥＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、および中間体化合物Ａはインスリン分子のＢ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、および中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１およびＢ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＢ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２７２】
ある実施形態において、ＸはＥＢＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、および中間体化合物Ａはインスリン分子のＢ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＢＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、および中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＢＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１およびＢ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＢＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＢ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＢＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＢＭであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２７３】
ある実施形態において、ＸはＥＧであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、および中間体化合物Ａはインスリン分子のＢ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＧであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、および中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＧであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１およびＢ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＧであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＢ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＧであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＧであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２７４】
ある実施形態において、ＸはＥＧＡであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、および中間体化合物Ａはインスリン分子のＢ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＧＡであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、および中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＧＡであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１およびＢ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＧＡであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＢ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＧＡであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＧＡであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２７５】
ある実施形態において、ＸはＥＦであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、および中間体化合物Ａはインスリン分子のＢ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＦであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、および中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＦであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１およびＢ１アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＦであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＢ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＦであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。ある実施形態において、ＸはＥＦであり、ＡｌｋはＣ２アルキレン鎖であり、ならびに中間体化合物Ａはインスリン分子のＡ１、Ｂ１およびＬｙｓＢ２９アミノ基と反応する。
【０２７６】
ある実施形態において、コンジュゲートは、図１に示すようなコンジュゲートＩＩ−１、ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＩＩ−４、ＩＩ−５またはＩＩ−６であり、インスリン分子のＡ１、Ｂ１またはＢ２９残基に結合して示されているＮＨ−基は、その位置のアミノ酸残基からである（Ａ１およびＢ１の場合にはアルファアミノ基、Ｂ２９の場合にはイプシロンアミノ基）。ある実施形態において、これらのコンジュゲートの
【０２７７】
【化５５】
2013537529.tif 000061
は、野生型ヒトインスリンである。
他の実施形態
上記のように、多様な実施形態において、コンジュゲートは、検出可能な標識を薬物の代わりにＷとして含み得る。たとえば検出可能な標識は、コンジュゲートがセンサ中で使用される場合などに、生物、組織または細胞内でのコンジュゲートの位置を検出するために包含され得る。コンジュゲートが当分野で公知のいずれの検出可能な標識も含むことができることが理解されるべきである。コンジュゲートは、同じ標識の１を超えるコピーを含むことができる、および／または１を超える種類の標識を含むことができる。概して、使用される標識は、最終用途および検出に使用される方法によって代わる。
【０２７８】
検出可能な標識は、直接検出可能であり得るか、またはシグナル生成系の１つ以上の追加のメンバーとの複合作用を通じて、間接的に検出可能であり得る。直接検出可能な標識の例としては、放射性、常磁性、蛍光、光散乱、吸収性および比色標識が挙げられる。フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン  フィコシアニン、アロフィコシアニン、−フタルアルデヒド、フルオレサミンなどはすべて例示的な蛍光標識である。化学発光標識、すなわち二次基質を発色生成物に変換することができる標識は、間接的に検出可能な標識の例である。たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅ）、−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、イクオリンなどは、すべて例示的なタンパク質ベース化学発光標識である。ルミノール、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、オキサレートエステルなどは、例示的な非タンパク質ベース化学発光標識である。間接的に検出可能な標識の別の非制限的なおよび一般に使用される例は、親和性リガンド、すなわちそれ自体が直接または間接的に検出されることができる二次結合パートナー（たとえば抗体またはアパタマー）に対して強い親和性を持つ標識である。
【０２７９】
概して、検出可能な標識は多種多様の方法で、特定の検出可能な標識に基づいて選ばれる特定の検出方式により描出または検出され得て、代表的な検出手段としては、たとえばシンチレーションカウンティング、オートラジオグラフィー、常磁性の測定、蛍光測定、光吸収測定、光散乱の測定などが挙げられる。
【０２８０】
概して、検出可能な標識はアミン基を含有する。具体的な例としては、アルファ−末端アミンおよび／またはイプシロン−アミンリジン基を担持するペプチド標識が挙げられ、これらの反応性部分のいずれも、すでに存在しなければ公知の標識に人工的に付加され得ることが認識されるであろう。たとえばペプチド標識の場合、好適なアミノ酸（たとえばリジン）は、アミノ酸配列中に付加または置換され得る。加えて、本明細書でより詳細に議論するように、コンジュゲーション工程は、コンジュゲーションの前に反応性部分を選択的にブロックすることにより制御され得ることが認識されるであろう。
【実施例】
【０２８１】
（実施例１）
アジドエチルグルコース（ＡｚＥＧ）の合成
ａ．ブロモエチル（ｂｒｏｍｏｅｔｈｙｌｅ）グルコースの合成
ダウエックス５０Ｗｘ４樹脂（アルファエイサー、ワードヒル、マサチューセッツ州）を脱イオン水で洗浄して色を除去した。Ｄ−グルコース２２５グラム（１．２５ｍｏｌ；１当量、アルファエイサー）およびダウエックス５０Ｗｘ４  １４０グラムの混合物を２−ブロモエタノール２．２Ｌ（３０．５ｍｏｌ、２５当量；１２４．９７グラム／ｍｏｌ；１．７６２グラム／ｍＬ；ＢＰ＝１５０℃；アルファエイサー）で処置して、撹拌混合物を８０℃まで４時間加熱した。反応をＴＬＣ（２０％メタノール／ジクロロメタン（ＤＣＭ））によって監視した。約４時間後に反応が完了して、これを放冷して室温とした。溶液を濾過して樹脂を除去し、樹脂をエチルアセテートおよびＤＣＭで洗浄した。生じた濾液を回転蒸発器でストリッピング（蒸発除去）して琥珀色油とした。ストリッピング後には合計４００グラムであった。
【０２８２】
琥珀色油を以下の方式でシリカゲル（ＤＣＭ中で充填されたシリカ４ｋｇ）によって精製した。粗製物をＤＣＭに溶解させて、カラムに注入し、次に１０％メタノール／ＤＣＭ  ２×４Ｌ；１５％メタノール／ＤＣＭ  ２×４Ｌ；および２０％メタノール／ＤＣＭ  ３×４Ｌによって溶離させた。（ＴＬＣに基づいて）画分を含有する生成物をプールして、ストリッピングにより乾固させて、１−α−ブロモエチル−グルコース１５２グラム（４２％）を得た。
ｂ．ブロモエチルグルコースのアジドエチルグルコース（ＡｚＥＭ）への変換
加熱マントル、オーバーヘッドスターラーおよび温度計を装備した５Ｌ丸底３口フラスコにブロモエチルグルコース１５０グラム（５２５ｍｍｏｌ）を注入した。該油を水２Ｌに溶解させて、アジ化ナトリウム６８．３グラム（１．０５ｍｏｌ、２当量；６５グラム／ｍｏｌ；アルファエイサー）、続いてヨウ化ナトリウム７．９グラム（５２．５ｍｍｏｌ、０．０８当量；１４９．８９グラム／ｍｏｌ；アルファエイサー）で処理して、溶液５０℃まで加温して、一晩撹拌した。溶液を室温まで冷却して、回転蒸発器で濃縮乾固させた。固体残渣を５：１体積のＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ  ３×５００ｍＬによって４０℃にて消化した。合せた有機部を濾過して、蒸発乾固させて、アジドエチルグルコース（８６グラム）をオフホワイト色固体として得た。ＴＬＣ（２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ；Ｈ２ＳＯ４による炭化）：シングルスポット、開始物質と区別不能。
ｃ．アジドエチルグルコースの再精製
アジドエチルグルコース３２グラムを水１００ｍＬ中に取った。混濁溶液をガラス・マイクロファイバ・フィルタ（ワットマンＧＦ／Ｂ）で濾過した。金色の濾液を回転蒸発器で蒸発固化させた。固体をメタノール（１００ｍＬ）中に取り、混濁溶液をガラス・マイクロファイバ・フィルタで再度濾過した。生じた薄黄色濾液を真空下でストリッピングし固体化した。
【０２８３】
固体を最小量のメタノール（５０ｍＬ）に取り、エチルアセテート（１５０ｍＬ）を撹拌しながらゆっくり添加した。重スラリを冷却および濾過した。固体を空気乾燥させて（吸湿性）、６０℃の乾燥器に一晩入れた。ＴＬＣはごくわずかな最初の物質を有する。収量１５．４グラム。母液を真空下で蒸発させて黄色粘性物質とした。この時点でこの物質をさらに精製する試みは行われなかった。
（実施例２）
アジドエチルマンノース（ＡｚＥＭ）の合成
ａ．ブロモエチルマンノースの合成
ダウエックス５０Ｗｘ４樹脂（アルファエイサー、ワードヒル、マサチューセッツ州）を脱イオン水で洗浄して色を除去する。Ｄ−マンノース２２５グラム（１．２５ｍｏｌ；１当量、アルファエイサー）およびダウエックス５０Ｗｘ４  １４０グラムの混合物を２−ブロモエタノール２．２Ｌ（３０．５ｍｏｌ、２５当量；１２４．９７グラム／ｍｏｌ；１．７６２グラム／ｍＬ；ＢＰ＝１５０℃；アルファエイサー）で処理して、撹拌混合物を８０℃まで４時間加熱する。反応をＴＬＣ（２０％メタノール／ジクロロメタン（ＤＣＭ））によって監視する。約４時間後に反応が完了して、次に放冷して室温とする。溶液を濾過して樹脂を除去し、樹脂をエチルアセテートおよびＤＣＭで洗浄する。生じた濾液を回転蒸発器でストリッピング（蒸発除去）して琥珀色油とした。
【０２８４】
琥珀色油を以下の方式でシリカゲル（ＤＣＭ中で充填されたシリカ４ｋｇ）によって精製する。粗製物をＤＣＭに溶解させて、カラムに注入し、次に１０％メタノール／ＤＣＭ  ２×４Ｌ；１５％メタノール／ＤＣＭ  ２×４Ｌ；および２０％メタノール／ＤＣＭ  ３×４Ｌによって溶離させる。（ＴＬＣに基づいて）画分を含有する生成物をプールして、ストリッピングにより乾固させて、１−α−ブロモエチル−マンノース１５２グラム（４２％）を得る。
ｂ．ブロモエチルマンノースのアジドエチルマンノース（ＡｚＥＭ）への変換
加熱マントル、オーバーヘッドスターラーおよび温度計を装備した５Ｌ丸底３口フラスコにブロモエチルマンノース１５０ｇｍ（５２５ｍｍｏｌ）を注入する。油を水２Ｌに溶解させて、アジ化ナトリウム６８．３グラム（１．０５ｍｏｌ、２当量；６５グラム／ｍｏｌ；アルファエイサー）、続いてヨウ化ナトリウム７．９グラム（５２．５ｍｍｏｌ、０．０８当量；１４９．８９グラム／ｍｏｌ；アルファエイサー）で処理して、溶液５０℃まで加温して、一晩撹拌する。溶液を室温まで冷却して、回転蒸発器で濃縮乾固させる。固体残渣を５：１体積のＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ  ３×５００ｍＬによって４０℃にて消化する。合せた有機部を濾過して、蒸発乾固させて、アジドエチルマンノースをオフホワイト色固体として得る。
ｃ．アジドエチルマンノースの再精製
アジドエチルマンノース３２グラムを水１００ｍＬ中に取る。混濁溶液をガラス・マイクロファイバ・フィルタ（ワットマンＧＦ／Ｂ）で濾過する。金色の濾液を回転蒸発器で蒸発固化させる。固体をメタノール（１００ｍＬ）中に取り、混濁溶液をガラス・マイクロファイバ・フィルタで再度濾過する。生じた薄黄色濾液を真空下でストリッピングし固体化する。
【０２８５】
固体を最小量のメタノール（５０ｍＬ）に取り、エチルアセテート（１５０ｍＬ）を撹拌しながらゆっくり添加する。重スラリを冷却および濾過する。固体を空気乾燥させて（吸湿性）、６０℃の乾燥器に一晩入れる。母液を真空下で蒸発させて黄色粘性物質とする。
（実施例３）
アジドエチルマンノビオース（ＡｚＥＢＭ）の合成
実施例２からのＡｚＥＭ化合物を、ベンゼンジメチルエーテルを使用して選択的に保護して、カラムクロマトグラフィーによって精製し、続いてベンジルブロミドと反応させて、１−α−（２−アジドエチル）−４，６−ベンズアルデヒドジアセタール−３−ベンジル−マンノピラノシドを得る。続いて生成物を厳密な無水条件下で１−α−ブロモ−２，３，４，６−テトラベンゾイルマンノピラノシドによって銀トリフラート化学作用を使用してグリコシル化して、保護アジドエチルマンノビオース生成物を得る。次に中間体生成物を脱保護してベンゾイル基を除去して、ＡｚＥＢＭを得る。
（実施例４）
アジドエチルマンノトリオース（ＡｚＥＴＭ）の合成
ａ．１−α−ブロモ−２，３，４，６−テトラベンゾイル−マンノース
撹拌棒および窒素入口を含有する５００ｍＬ  ３口フラスコにペンタベンゾイルマンノース４０グラム（６０．９ｍｍｏｌ）および塩化メチレン８０ｍＬを添加した。生じた溶液を冷浴で５℃未満に冷却して、添加漏斗を介して３３％ＨＢｒ−酢酸溶液８０ｍＬを１０℃未満の反応温度を維持するような速度で添加した。添加完了時に（約３０分）、冷浴を外して、撹拌を３時間継続した。
【０２８６】
反応溶液を等体積（１６０ｍＬ）のＤＣＭで希釈して、水（２×５００ｍＬ）、飽和重炭酸塩（２×５０ｍＬ）および塩水（１×５０ｍＬ）で続けて抽出し、硫酸マグネシウムで脱水して、溶媒を蒸発させて、固体発泡体４１グラム（理論収量４０．１グラム）を得て、冷凍庫にてＮ２下で貯蔵する。この物質をそれ以上精製せずに使用した。反応をＴＬＣによって監視した：シリカゲル（ヘキサン／エチルアセテート、７／３）、開始物質Ｒｆ  ０．６５、生成物Ｒｆ  ０．８、ＵＶ描出。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．１１（ｄ，２Ｈ），８．０１（ｍ，４Ｈ），７．８４（ｄ，２Ｈ），７．５８（ｍ，４Ｈ），７．４１（ｍ，６Ｈ），７．２８（ｔ，２Ｈ），６．５８（ｓ，１Ｈ），６．２８（ｍ，２Ｈ），５．８（ｍ，１Ｈ），４．７５（ｄｄ，１Ｈ）４．６８（ｄｄ，１Ｈ）４．５（ｄｄ，１Ｈ）。
ｂ．１−アジドエチル−２，４−ジベンゾイルマンノース
撹拌棒、窒素入口および無水アセトニトリル３００ｍＬを含有する１．０Ｌ  ３口フラスコに、１−アジドエチルマンノース２５グラム（１００．４ｍｍｏｌ）およびトリエチルオルトベンゾアート５０ｍＬ（２２０ｍｍｏｌ、２．２当量）を添加した。生じたスラリを室温にて撹拌して、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．８ｍＬ（１０ｍｍｏｌ）を希釈せずに添加した。溶液は１０分以内に清澄となり、撹拌をさらに２時間継続して、次に１０％ＴＦＡ水溶液２５ｍＬを添加し、撹拌をさらに２時間継続して、中間体を加水分解してエステル異性体とする。溶媒を真空下で蒸発させて粘性油とし、これをＤＣＭ  ５０ｍＬによって粉砕して、再度蒸発させて粘性油とした。
【０２８７】
トルエン（７０ｍＬ）を残渣に添加して、粘性溶液に２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノースを種結晶とした。微細沈殿物が１５分以内に形成され、撹拌を室温にて一晩継続した。生じた重懸濁物を冷凍庫で２−４時間を固化させて、次に濾過して、固体を氷冷トルエン（２×１０ｍＬ）で洗浄した。固体を恒量まで空気乾燥させて、約９５％異性体純度の２１グラム（５０％異性体純度にてＴＹ  ２２．８５グラム）を得た。生成物をトルエン４０ｍＬ中に取り、１時間撹拌して、次に冷凍庫でさらに２時間固化させた。固体を濾過して、氷冷トルエンで洗浄し（２×１０ｍＬ）、恒量まで空気乾燥させて、単一の異性体生成物２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノース１８．５グラムを収率８３％で得た。母液は望ましくない異性体および少量の所望の異性体を含有していた。反応をＴＬＣによって監視した：ＳＧ（ヘキサン／エチルアセテート  ７／３）、開始物質Ｒｆ  ０．０、オルトエステル中間体Ｒｆ  ０．９。（ヘキサン／エチルアセテート：８／２）ＳＭ  Ｒｆ  ０．８、所望の異性体Ｒｆ  ０．４、望ましくない異性体Ｒｆ  ０．２
１Ｈ  ＮＭＲ  ３００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ３）δ８．１２（ｔ，４Ｈ），７．６６（ｔ，２Ｈ），７．５（ｍ，４Ｈ），５．５６（ｔ，ＩＨ），５．４８（ｍ，１Ｈ），５．１４（ｍ，１Ｈ），４．５（ｄｄ，１Ｈ），４．０（ｍ，２Ｈ），３．８（ｍ，３Ｈ），３．５６（ｍ，１Ｈ），３．４４（ｍ，１Ｈ）。
ｃ．過ベンゾイル化−マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシド
撹拌棒、窒素入口を備えた１．０Ｌ  ３口フラスコに、ＤＣＭ  １８５ｍＬ中の粗１−ブロモ−テトラベンゾイルマンノース４１グラム（６０．９ｍｍｏｌ、約２．５当量）を添加した。これに２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノース１１．２グラム（２４．５ｍｍｏｌ）、続いて４Ａシーブ１１．２グラムを添加した。スラリを室温にて１０分撹拌して、メタノール／氷浴で−１５℃まで冷却した。
別の暗色容器にトルエン１９０ｍＬ、続いて銀トリフルオロメタンスルホナート（ＡｇＯＴｆ）１５．１グラム（５８．８ｍｍｏｌ、２．４当量）を添加して、暗所で撹拌して溶解させた。この溶液を大型添加漏斗に移し、反応物を光から保護しながら撹拌懸濁物に滴加した。ＡｇＯＴｆ添加速度を調整することによって、反応温度を−１０℃未満に維持した。反応完了時に（約３０分）、冷浴を取外し、単一生成物がＴＬＣ（ＳＧ、ヘキサン／エチルアセテート：７／３、ブロモＲｆ  ０．９、アジドＲｆ  ０．４、トリオス生成物Ｒｆ  ０．５、ｕｖ描出）によって残存するまで反応物をさらに２時間撹拌した。
【０２８８】
トリエチルアミン（７ｍＬ、５．０当量）、続いてＤＣＭ  ２００ｍＬを添加した。生じたスラリをシリカゲルおよびセライトのパッドで濾過して、ＤＣＭ  ２×７５ｍＬで洗浄した。溶媒を真空下で蒸発させて、残渣をエチルアセテート中に取り、水（２×１００ｍＬ）、重曹（２×５０ｍＬ）、塩水（１×７５ｍＬ）で順に洗浄して、硫酸マグネシウムで脱水した。溶媒を真空下で蒸発させて、固体発泡体３９グラム（ＴＹ  ３９．５グラム）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  ３００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ３）δ８．３（ｄ，２Ｈ），８．２（ｍ，８Ｈ），７．８５（ｄ，４Ｈ），７．７５（ｄｄ，４Ｈ），７．３−７．６５（ｍ，３０Ｈ），７．２（ｔ，２Ｈ），６．０５（ｍ，４Ｈ），５．９（ｔ，２Ｈ），５．６３（ｍ，２Ｈ），５．３８（ｓ，２Ｈ），５．１８（ｄ，１Ｈ），４．６５（ｍ，４Ｈ），４．５（ｍ，２Ｈ），４．３５（ｍ，４Ｈ），３，８（ｍ，２Ｈ），３．５４（ｍ，２Ｈ）。
ｄ．マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシド
過ベンゾイル化マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノースピラノシド３．０グラム１．８６ｍｍｏｌ）のメタノール４０ｍＬによる撹拌懸濁物に、メタノール中の４．２８Ｍナトリウムメトキシド０．２ｍＬを添加した。生じた懸濁物を室温にて２０時間撹拌して、透明溶液を得た。反応完了をＴＬＣによって監視した（ＳＧ、ヘキサン／エチルアセテート：８／２  ＳＭ  Ｒｆ  ０．４、生成物Ｒｆ  ０．０）。
【０２８９】
メタノールを真空下で蒸発させて、油性半固体を得た。残渣をエチルアセテート（５０ｍＬ）中に取り、３時間撹拌した。固体を濾過して、新たなエチルアセテート（２×２０ｍＬ）で洗浄して、恒量まで空気乾燥させて、生成物１．０９グラム（ＴＹ  １．０７グラム）を得た。母液は残留メチルベンゾアート、脱保護副生成物を含有していた。
（実施例５）
アジドエチル糖類（ＡｚＥＧ、ＡｚＥＭ、ＡｚＥＢＭ、ＡｚＥＴＭ）からのアミノエチル糖類（ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭ）の合成
実施例１から４によるアジド終端化合物を、パラジウム／炭素触媒、少量の酢酸および溶媒としてのエタノールを使用して室温にてただちに水素添加して、対応するアミン終端化合物を得た。ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭおよびＡＥＴＭの化学構造は本明細書に記載されている。工程は、当業者が試薬、溶媒などの量を水素添加される糖類−リガンドのモル数に合せて変倍するべきことを理解することを除き、以下のＡＥＴＭについて記載されている工程と同一である。
ａ．マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アミノエチルマンノピラノシド（「アミノエチルマンノース」、ＡＥＴＭ）
マン（α−１，３）−マン（α−１．６）−α−１−アジドエチルマンノースピラノシド５．３グラム（９．２５ｍｍｏｌ）の水１００ｍＬおよびエタノール５０ｍＬによる溶液に、５％Ｐｄ／Ｃ  ０．８ｇグラムを添加した。激しく撹拌されている懸濁物を３０−４０ｐｓｉにて４８時間にわたって、または開始物質がＴＬＣ（ＳＧ、メタノール、ＳＭ  Ｒｆ  ０．７５、Ｐｄｔ  Ｒｆ  ０．０、ＰＭＡ描出）によって見えなくなるまで水素添加した。懸濁物をセライトで濾過して、これをエタノール（２×５０ｍＬ）ですすぎ、濾液を真空下で濃縮した。この物質のＨＰＬＣ（Ｃ１８、３％アセトニトリル／９７％  ０．１％Ｈ３ＰＯ４、２２０ｎｍ、２ｍｌ／分）により、ベンゾアートエステルを示す、注入カラム空隙物質のＵＶ吸着、Ｒｔ  ２．５分を得た。
【０２９０】
濾液を水７０ｍＬおよび１Ｎ  ＮａＯＨ  １２ｍＬで希釈して、溶液を室温にて一晩撹拌した（ＨＰＬＣ：カラム空隙Ｒｔ  ２．５分にてＵＶ物質なし、Ｒｔ  １０．５分、安息香酸による同時溶離にてＵＶ物質、）。脱色炭２グラムを添加して、撹拌混合物を８０℃まで加熱し、室温まで冷却して、セライトで濾過した。濾液ｐＨを２Ｎ  ＨＣｌによって８．０まで調整して、無色溶液を真空下で約５０％の体積まで濃縮した。
【０２９１】
溶液を樹脂カラム（ダウエックス５０Ｗ、５０グラム）上に添加して、溶離画分が中性からｐＨになるまで水で洗浄して（６×７５ｍＬ）、いずれの残留酸副生成物も除去した。アミン生成物をカラムから０．２５Ｎ水酸化アンモニウム（６×７５ｍＬ）によって洗い流し、アミン生成物−ニンヒドリン検出を含有する画分を合せて、真空下で２５−３０ｍＬまで濃縮した。この濃縮溶液を撹拌エタノール３００ｍＬに滴加して、撹拌をさらに２時間継続した。生成物を濾過して、新たなエタノール（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、恒量まで空気乾燥させた。生じた白色非晶質固体をさらに真空乾燥器で８０℃にて５時間乾燥させて、白色粒状固体４．１グラム（ＴＹ  ５．１グラム）を得た。ＮＭＲには芳香族プロトンがなかった。１Ｈ  ＮＭＲ  ３００ＭＨｚ（Ｄ２Ｏ）δ５．０８（ｓ，１Ｈ），４．８７（ｓ，１Ｈ），４．８１（ｓ，１Ｈ），４．８−３．６（ｍ，１８Ｈ），２．９（ｍ，２Ｈ）。
【０２９２】
【化５６】
2013537529.tif 000062
（実施例６）
３−｛３−［３−（ベンジルオキシ）−３−オキソプロポキシ］−２，２−ビス［（２−カルボキシエトキシ）メチル］プロポキシ｝プロピオン酸（２）の合成
【０２９３】
【化５７】
2013537529.tif 000063
テトラカルボン酸１（２．０２５ｇ、４．７７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（９．５ｍＬ）に溶解させて、トリエチルアミン（６６５μＬ、４．７７ｍｍｏｌ）および２−ベンジルオキシ−１−メチルピリジニウムトリフレート（１．６６７ｇ、４．７７ｍｍｏｌ）で順に２３℃にてアルゴン雰囲気下で処置した。生じた透明溶液を油浴に入れ８３℃にて２４時間加熱した。この時間の間に、溶液は透明から明黄色を経由して暗橙茶色への、色の変化を受けた。２４時間後、反応混合物を真空中で濃縮して、揮発性物質を除去し、濃い油性残渣を直接シリカゲルカラム［ＳｉＯ２  １５０ｍＬ、４．０×１２．５ｃｍ］に加えて、０．５％ＡｃＯＨを含有するエチルアセテート／ヘキサンの段階勾配［５０％→６０％→７０％→８０％］を用いて溶離させ、１．１３６ｇ（４６％）のモノベンジルエステル２を透明油として得た。Ｒｆ  ０．２０（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ、８：２：０．１：０．１；ＰＭＡによるダークスポット）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１２．１８（ｂｒ  ｓ，３Ｈ，ＣＯ２Ｈ），７．３５（ｓ，５Ｈ，ＰｈＨ），５．０９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｐｈ），３．６０（オーバーラッピングｔ，２Ｈ，ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｂｎ），３．４９（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ，ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ），３．２３（ｓ，２Ｈ，ＣｑｕａｔＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｂｎ），３．２０（ｓ，６Ｈ，ＣｑｕａｔＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ），２．５８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＯ２Ｂｎ），２．３８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１７６．８７，１７１．９２，１３６．１５，１２８．７９，１２８．４５，１２８．３９，６９．９５，６９．７７，６６．９９，６６．６３，４５．３８，３５．３２，３５．０４ｐｐｍ；Ｃ２４Ｈ３４Ｏ１２［Ｍ＋Ｈ］＋のＭＳ計算値５１５．５、実測値５１５．５。
（実施例７）
ベンジル３−｛３−（３−｛［２−（α−Ｄ−マンノピラノシルオキシ）エチル］アミノ｝−３−オキソプロポキシ）−２，２−ビス［（３−｛［２−（α−Ｄ−マンノピラノシルオキシ）エチル］アミノ｝−３−オキソプロポキシ）メチル］プロポキシ｝プロピオネート（３）の合成
【０２９４】
【化５８】
2013537529.tif 000064
三酸２（２００ｍｇ、０．３８９ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（２．４ｍＬ）溶液にアミノエチルマンノース（ＡＥＭ，３９１ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）のＤＩ水（１．２ｍＬ）による溶液を添加すると、透明な無色溶液が生成された。この溶液に２３℃のＨＯＢｔ（２３９ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）を添加して、続いて０℃まで冷却し、ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン、３１１μＬ、１．７９ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（３３９ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）を添加した。生じた透明明黄色溶液を０−５℃にて１．５時間、次に２３℃にて撹拌した。ＡＥＭおよびＥＤＣの追加の分量を２０．５時間および２５時間（どちらの時点も１．０当量）に加えた。４０．５時間後、溶媒を減圧下、４０℃にて除去して、残留粗物質をＦＣＣ［１００ｍＬ、４．０×８．５ｃｍ］によってメタノール／クロロホルム／水の段階勾配［３：７：０→４：６：０→５：５：０→４：５．５：０．５］で溶離させて精製し、４８９ｍｇ（不純物のために＞１００％）のトリマンノース３を白色固体として得た；Ｒｆ  ０．３０（ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３／Ｈ２Ｏ、５：４．５：０．５；ＰＭＡによるダークスポット）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７．９３（Ｃ（Ｏ）ＮＨ），７．３１（ｂｒ  ｓ，５Ｈ，Ｐｈ−Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｐｈ），３．９２（３Ｈ，Ｈ−２），３．８９（３Ｈ，Ｈ−６），３．７９（３Ｈ，Ｈ−３），３．７７（３Ｈ，Ｈ−６），３．６７（３Ｈ，Ｈ−４），３．６２−３．５８（６Ｈ，ＣＨ２Ｎ），３．５２−３．３７（ｍ，６Ｈ，ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），３．３９−３．５６（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２ＯＣＨ２ＣｑｕａｔＣＨ２ＯＣＨ２），３．１６−３．２７（ｍ，８Ｈ，ＯＣＨ２ＣｑｕａｔＣＨ２Ｏ），２．５８（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＯ２Ｂｎ），２．３８（ｔ，６Ｈ，ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１７１．８０（ＣＯ２Ｂｎ），１７０．９９（Ｃ（Ｏ）ＮＨ），４４．２９（Ｃｑｕａｔ），１３６．８８，１２９．１１，１２８．６７，１２８．５６（フェニルＣ），１００．６３（Ｍａｎ  Ｃ−１），７４．６３（Ｍａｎ  Ｃ−５），７１．６１（Ｍａｎ  Ｃ−３），７０．９２（Ｍａｎ  Ｃ−２），６８．０１（Ｍａｎ  Ｃ−４），６９．５５（ＣｑｕａｔＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ），６７．６９（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），６６．０９（ＣＨ２ＣＯ２Ｂｎ），６１．９１（Ｍａｎ  Ｃ−６），３９．３９（ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），３５．４２（ＣＨ２ＣＯ２Ｂｎ）；Ｃ４８Ｈ７９Ｎ３Ｏ２７［Ｍ＋Ｈ］＋のＭＳ計算値１１３０．１、実測値１１３０．５。
（実施例８）
３−｛３−（３−｛［２−（α−Ｄ−マンノピラノシルオキシ）エチル］アミノ｝−３−オキソプロポキシ）−２，２−ビス［（３−｛［２−（α−Ｄ−マンノピラノシルオキシ）エチル］アミノ｝−３−オキソプロポキシ）メチル］プロポキシ｝プロピオン酸（４）の合成
【０２９５】
【化５９】
2013537529.tif 000065
モノベンジルエステル３（４００ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）を無水メタノール（１．５ｍＬ）に溶解させて透明溶液を生成し、これにパラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ、５重量％、２０ｍｇ）を添加した。生じた黒色スラリを水素ガス雰囲気下に置いて、２３℃にて撹拌した。７時間後、Ｐｄ／Ｃの追加の分量（２０ｍｇ）を反応物に添加して、撹拌を継続した。２４．５時間後、反応混合物をセライトパッドで濾過して、固体をメタノール（２５ｍＬ）ですすいだ。真空中での濾液の濃縮により粗生成物を得て、これをＦＣＣ（フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー）［ＳｉＯ２  ２５ｍＬ、２．０×９．０ｃｍ；試料の乾燥装填：ＭｅＯＨ  ２５ｍＬ、ＳｉＯ２  ５ｍＬ］によってメタノール／クロロホルム／水の段階勾配［４：６：０→５：５：０→６：４：０→４：５．５：０．５］で溶離させて精製し、２４７ｍｇ（６７％）のモノカルボン酸４を白色固体として得た：Ｒｆ  ０．１０（ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３／Ｈ２Ｏ、５：４．５：０．５；ＰＭＡによるダークスポット）；Ｃ４１Ｈ７３Ｎ３Ｏ２７［Ｍ＋Ｈ］＋のＭＳ計算値１０４０．０、実測値１０４０．０。
（実施例９）
３−（３−｛３−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−３−オキソプロポキシ｝−２，２−ビス［（３−｛［２−（α−Ｄ−マンノピラノシルオキシ）エチル）アミノ｝−３−オキソプロポキシ）メチル］プロポキシ）−Ｎ−［２−（α−Ｄ−マンノピラノシルオキシ）エチル］プロパンアミド（５）の合成
【０２９６】
【化６０】
2013537529.tif 000066
カルボン酸４（５４ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１．７０ｍＬ）による溶液にアルゴン雰囲気下、２３℃にてＴＳＴＵ（１５．７ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ、１．０当量）を固体として添加した。生じた透明無色溶液を２３℃にて３０分撹拌して、この後に反応が完了したと見なした（ＬＣ／ＭＳ分析）。生成物３を以下のように沈殿により単離した：反応溶液を自動ピペットによって、無水アセトン（１０体積、１７．０ｍＬ）を含有する管に移した。３００μＬずつ滴加して、続いて静かに撹拌した。生じた白色懸濁物を遠心分離すると（３０００ｒｐｍ、５分、１５℃）、透明上清および白色ペレットが生成した。上清を除去して、粘着性の白色ペレットをアセトン（１．０ｍＬ）で洗浄して、続いて遠心分離して（上のように）、高真空下で乾燥させて、乾燥白色固体４９ｍｇ（Ｐ１）を得た。固体をＤＭＦ（６００μＬ）に再溶解させて、上記のようにアセトン（１０体積、６．０ｍＬ）によって沈殿させ、遠心分離後に白色固体３０ｍｇ（Ｐ２）を得て、高真空下で乾燥させた。白色固体をＤＭＦ（５００μＬ）に再び再溶解させて、アセトン（１０体積、５．０ｍＬ）によって沈殿させ、遠心分離して、アセトン（１．０ｍＬ）で洗浄し、高真空下で乾燥させて、１８ｍｇ（３１％）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５を白色粉末（Ｐ３）として得た：Ｃ４５Ｈ７６Ｎ４Ｏ２９［Ｍ＋Ｈ］＋のＭＳ計算値１１３７．０９、実測値１１３７．１。
【０２９７】
実施例１０および１１は、本開示のＰＬＦをアミン担持薬物と有機溶媒または水性溶媒中でそれぞれコンジュゲートする一般的な方法について記載し、実施例１２は、コンジュゲーション後の精製の一般的な方法について記載する。
（実施例１０）
有機溶媒中での前官能化リガンドフレームワークとのアミン官能化薬物コンジュゲーション
前官能化リガンドフレームワーク（ＰＬＦ）を無水ＤＭＳＯ  １１．１ｍＬ中に６０ｍＭで溶解して、室温にて１０分撹拌する。次にアミン担持薬物を、７０ｍＭ無水トリエチルアミンを含有する無水ＤＭＳＯ  ２７．６ｍＬ中に９．２ｍＭの濃度で別に溶解させる。溶解させたら、ＰＬＦ溶液をアミン担持薬物／ＤＭＳＯ／ＴＥＡ溶液に数回に分けて添加して、続いて室温で約１時間混合する。この時点で、反応を分析ＨＰＬＣによって分析して反応の程度を評価し、この後に必要な場合はさらにＰＬＦ溶液を添加して、所望の程度のコンジュゲーションを達成する。ＰＬＦのアミン担持薬物に対する所望の程度のコンジュゲーションが達成された場合、エタノールアミンをＰＬＦ／アミン担持薬物／ＤＭＳＯ／ＴＥＡ溶液に添加して、エタノールアミンの最終濃度を１９５ｍＭとする。反応溶液をＲＴにてさらに０．５時間撹拌する。
【０２９８】
生じた溶液を次に水で２０×に過希釈して、続いて１Ｎ  ＨＣｌ（および必要な場合には０．１Ｎ  ＮａＯＨ）によりｐＨ調整して、最終ｐＨを２．０とする。生じた水溶液を限外濾過（ミリポアペリコンミニＴＦＦシステム、１ＫＤａ  ＭＷＣＯ膜）によりおよそ２００ｍＬまで濃縮して、続いて水１０−１５ダイア容量（ＤＶ）を使用してダイアフィルトレーション（ミリポアペリコンミニＴＦＦシステム、１ＫＤａ  ＭＷＣＯ膜）を続ける。所望の場合、溶液をアミコン−１５（３ｋＤａ  ＭＷＣＯ）の使用によりさらに濃縮して、およそ１０ｍｇ／ｍＬとする。水溶液を４℃にて一晩貯蔵する。
（実施例１１）
水性溶媒中での前官能化リガンドフレームワークとのアミン官能化薬物コンジュゲーション
前官能化リガンドフレームワーク（ＰＬＦ）を無水ＤＭＳＯ  １１．１ｍＬ中に６０ｍＭで溶解して、室温にて１０分撹拌する。アミン担持薬物を次に０．１Ｍ、ｐＨ１１．０炭酸ナトリウム緩衝液１４．３ｍＬ中に１７．２ｍＭにて別に溶解させて、続いてｐＨを１．０Ｎ水酸化ナトリウムによって１０．８に調整する。
【０２９９】
溶解させたら、ＰＬＦ／ＤＭＳＯ溶液をアミン担持薬物／炭酸塩溶液に数回に分けて添加して、続いて室温にて混合する。添加中に、必要ならば希ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用して、生じた混合物のｐＨを５分ごとに調整して、ｐＨを＞１０．８に維持する。反応を完了させるために、滴加後に溶液をさらに１５分撹拌する。この時点で、反応を分析ＨＰＬＣによって分析して反応の程度を評価し、この後に必要な場合は追加のＰＬＦ溶液を添加して、所望の程度のコンジュゲーションを達成する。
【０３００】
生じた溶液を次に水で２０×に過希釈して、続いて１Ｎ  ＨＣｌ（および必要な場合には０．１Ｎ  ＮａＯＨ）によりｐＨ調整して、最終ｐＨを２．０とする。生じた水溶液を限外濾過（ミリポアペリコンミニＴＦＦシステム、１ＫＤａ  ＭＷＣＯ膜）によりおよそ２００ｍＬまで濃縮して、続いて水１０−１５ダイア容量（ＤＶ）を使用してダイアフィルトレーション（ミリポアペリコンミニＴＦＦシステム、１ＫＤａ  ＭＷＣＯ膜）を続ける。所望の場合、溶液をアミコン−１５（３ｋＤａ  ＭＷＣＯ）の使用によりさらに濃縮して、およそ１０ｍｇ／ｍＬとした。水溶液を４℃にて一晩貯蔵する。
（実施例１２）
アミン官能化薬物−ＰＬＦコンジュゲートのＨＰＬＣによる精製
ウォーターズＣ４、７ｕｍ、５０×２５０ｍｍカラムによる分取逆相ＨＰＬＣを使用してアミン担持薬物−ＰＬＦコンジュゲート溶液をさらに精製して、所望の生成物を得る。緩衝液Ａは０．１％ＴＦＡを含有する脱イオン水であり、緩衝液Ｂは０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリルであった。精製前に、ウォーターズデルトラプレップ６００  ＨＰＬＣシステムを使用して、カラムを１５ｍｌ／分で８０％Ａ／２０％Ｂ移動相により平衡にした。粗溶液およそ１６ｍｌを流速５０ｍｌ／分で２分の間にわたってカラム上に注入して、この後に８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂ（薬物コンジュゲートの特性に応じて、またはそれ以上）までの直線勾配を次の５分にわたって、続いて７５％Ａ／２５％Ｂから７０％Ａ／３０％Ｂ（薬物コンジュゲートの特性に応じて、またはそれ以上）までのより低速の多段階勾配を次の７０分にわたって用いる。所望のピークの保持時間は、使用した薬物、フレームワークおよびリガンドに応じて変化する。興味のあるピークの溶離の間、画分収集装置およびＬＣ−ＭＳ（アクイティＨＰＬＣ、ウォーターズＣｏｒｐ．、ミルフォード、マサチューセッツ州）を用いてピーク画分の純度をさらに評価して、所望のレベルの薬物コンジュゲート純度を得るために組合せるべき所望のピークの画分を決定する。
溶媒除去
溶液を収集したら、回転蒸発させて（ブッチモデルＲ−２１５、ニューキャッスル、デラウェア州）、アセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて、純粋なコンジュゲートを得て、この特性をＨＰＬＣ−ＭＳ（ＨＴラボラトリーズ、サンディエゴ、カリフォルニア州）によって検証する。
他の溶媒除去
所望の画分を収集したら、画分を大型ガラス容器内に１つの溶液として合せ、限外濾過（ミリポアペリコンミニＴＦＦシステム、１ＫＤａ  ＭＷＣＯ膜）によっておよそ２００ｍＬまで濃縮する。生じた溶液を高度純水およそ１５−２０ダイア容量でダイアフィルトレーションする（ミリポアペリコンミニＴＦＦシステム、１ＫＤａ  ＭＷＣＯ膜）。所望の場合、溶液をアミコン−１５（３ｋＤａ  ＭＷＣＯ）の使用によりさらに濃縮して、およそ１０ｍｇ／ｍＬとする。水溶液を４℃にて一晩貯蔵する。
（実施例１３）
Ｂ１置換インスリンコンジュゲートを得るためのインスリンコンジュゲーション
ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンの合成
代表的な合成では、粉末インスリン４ｇ（シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）を無水ＤＭＳＯ  １００ｍｌに室温にて溶解させて、続いてトリエチルアミン（ＴＥＡ）４ｍｌを添加する。溶液を室温にて３０分撹拌する。次に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネート／ＴＨＦ溶液（シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州））１．７９ｍｌ（２．６当量）をインスリン−ＴＥＡ溶液にゆっくり添加して、およそ１時間混合する。ＤＭＳＯ  ５ｍｌ中にエタノールアミン２５０ｕｌを含有するストック溶液４ｍｌの添加により反応を停止させて、続いて５分混合する。反応停止後、溶液全体をアセトン１６００ｍｌに注入して、スパチュラで短時間混合する。次に、１８．９％ＨＣｌ：水溶液の一定分量８×４００μｌを混合物表面上に滴加して、反応したインスリンを沈殿させる。沈殿した物質を次に遠心分離にかけて、上清を第２のビーカーにデカンテーションして、一方で沈殿ケーキは確保しておく。上清溶液に、１８．９％ＨＣｌ：水溶液のさらなる一定分量８×４００μｌを混合物表面上に滴加して、反応したインスリンの第２の沈殿を得る。この第２の沈殿を遠心分離にかけて、上清を廃棄する。２回の沈殿ステップによる混合させた遠心分離ケーキをアセトンで１回洗浄して、続いて真空下室温にて乾燥させて、６０％の所望のＢＯＣ２生成物および４０％のＢＯＣ３物質を通例含有する粗粉末を得る。
【０３０１】
分取逆相ＨＰＬＣ法を使用して、純ＢＯＣ２−インスリンを粗粉末から単離する。緩衝液Ａは０．１％ＴＦＡを含有する脱イオン水であり、緩衝液Ｂは０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。カラムへの注入前に、粗粉末を７０％Ａ／３０％Ｂ混合物に２５ｍｇ／ｍｌで溶解させて、シリンジ濾過した。精製前にウォーターズデルトラプレップ６００システムを使用して、カラム（ウォーターズシンメトリープレップＣ１８、７ｕｍ、１９×１５０ｍｍ）を１５ｍｌ／分で７０％Ａ／３０％Ｂ移動相により平衡させる。粗粉末溶液およそ５ｍｌをカラム上に流速１５ｍｌ／分で５分の間にわたって注入して、この後に７０％／Ａ３０％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂの直線勾配を次の３．５分の間にわたって用いて、そこでさらに２．５分維持した。この方法を使用して、所望のＢＯＣ２ピークはおよそ１０．６分にて溶離して、すぐにＢＯＣ３ピークが続く。溶液を収集したら、回転蒸発させてアセトニトリルを除去して、凍結乾燥させて純粋なＢＯＣ２インスリン粉末を得る。特性をＬＣ−ＭＳ（ＨＴラボラトリーズ、サンディエゴ、カリフォルニア州）によって検証して、コンジュゲーション部位をＮ末端シーケンシング（ウェスタンアナリティカル、セントルイス、ミズーリ州）によって決定する。
コンジュゲーション
ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを実施例１０に従ってＰＬＦにコンジュゲートする。生じたコンジュゲートは次に、実施例１２に従って精製され得る。
（実施例１４）
Ａ１置換インスリンコンジュゲートを与えるためのインスリンコンジュゲーション
ＮＨ２−Ａ１，Ｂ１−ＢＯＣ（Ｂ２９）−インスリンの合成
インスリンを１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１）およびアセトニトリルの６６：３７体積：体積混合物に１４．７ｍＭの濃度で溶解させる。単官能性保護基活性化エステル（たとえばＢＯＣ−ＮＨＳ）を別に、アセトニトリル中に４６７ｍＭにて溶解させる。インスリンが溶解したら、単官能性保護基活性化エステル（たとえばＢＯＣ−ＮＨＳ）の少量の一定分量をインスリン溶液に添加する。ｐＨを工程の間監視して、０．１Ｍ水酸化ナトリウムの添加により１０．２−１１．０に維持する。反応を逆相ＨＰＬＣによって監視する。未修飾インスリンすべてが反応されることおよび反応混合物の実質的な部分がＢ２９保護インスリンに変換されたことがＨＰＬＣクロマトグラムによって示されるまで、単官能性保護基活性化エステルの一定分量を添加する。通例、保護基は本質的により疎水性となり、インスリン上で反応すると、未修飾インスリンよりも長いＨＰＬＣ保持時間にて溶離する。
コンジュゲーション
ＮＨ２−Ａ１，Ｂ１−ＢＯＣ（Ｂ２９）−インスリンは、実施例１０に従ってＰＬＦにコンジュゲートする。生じたコンジュゲートは次に、実施例１２に従って精製され得る。
（実施例１５）
Ａ１，Ｂ２９置換インスリンコンジュゲートを与えるためのインスリンコンジュゲーション
Ａ１，Ｂ２９インスリンコンジュゲートは、実施例１０に従ってＰＬＦを未保護インスリンにコンジュゲートすることによって得られる。生じたコンジュゲートは次に、実施例１２に従って精製され得る。ある実施形態において、コンジュゲートは、図１および６に示すような２置換（Ａ１，Ｂ２９）ＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３（ＩＩ−６）コンジュゲートである。
（実施例１６）
Ａ１，Ｂ１置換インスリンコンジュゲートを与えるためのインスリンコンジュゲーション
ＮＨ２−Ａ１，Ｂ１−ＢＯＣ（Ｂ２９）−インスリンは、実施例１４に記載されているように合成される。Ａ１，Ｂ１置換インスリンコンジュゲートは、実施例１０に従って、ならびに適切な当量のＰＬＦおよび薬物を使用して合成される。生じたコンジュゲートは次に、実施例１２に従って精製され得る。
（実施例１７）
Ｂ１，Ｂ２９置換インスリンコンジュゲートを与えるためのインスリンコンジュゲーション
ＮＨ２−Ｂ１，Ｂ２９−ＢＯＣ（Ａ１）−インスリンの合成
ＮＨ２−Ｂ１，Ｂ２９−ＢＯＣ（Ａ１）−インスリンは、実施例１３の手順を使用して、しかしＡ１，Ｂ２９−ジＢＯＣ−インスリン、Ａ１−ＢＯＣ−インスリンおよびＢ２９−ＢＯＣ−インスリン生成物の分布を生じるために、より少ない当量のＢＯＣ試薬と反応して調製することができる。ＮＨ２−Ｂ１，Ｂ２９−ＢＯＣ（Ａ１）−インスリンは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって単離されて、Ｎ末端シーケンシングにより確認することができる。
コンジュゲーション
ＮＨ２−Ｂ１，Ｂ２９−ＢＯＣ（Ａ１）−インスリンを実施例１０に従ってＰＬＦにコンジュゲートする。生じたコンジュゲートは次に、実施例１２に従って精製され得る。
（実施例１８）
Ｂ２９置換インスリンコンジュゲートを与えるためのインスリンコンジュゲーション
Ｂ２９インスリンコンジュゲートは、実施例１１に従ってＰＬＦを未保護インスリンにコンジュゲートすることによって得られる。生じたコンジュゲートは次に、実施例１２に従って精製され得る。
（実施例１９）
インビボ試験に備えたインスリンコンジュゲートの製剤
組換えヒトインスリン１．５ｇを実施例１１および１３に記載された工程によってコンジュゲートおよび精製した後、生じたインスリン−コンジュゲートは精製水中でおよそ７６０マイクロモルの濃度であり、溶液の総体積はおよそ１４０ｍＬである。この溶液に、グリセリン１．７８ｍＬ、ｍ−クレゾール０．２２ｇ、フェノール０．０９ｇおよびリン酸ナトリウム０．５３ｇを含むｐＨ７．４製剤緩衝液濃縮物１４ｍＬを添加する。生じた溶液の最終体積は１５４ｍＬである。
（実施例２０）
コンジュゲートＩＩ−１およびＩＩ−２のＰＫおよび生物活性に対するα−ＭＭの効果
本実施例において、我々はコンジュゲートＩＩ−１およびＩＩ−２の薬物動態および薬力学挙動の決定を試みた（コンジュゲートの構造については図１を参照）。各場合において、同じ用量のコンジュゲート（５Ｕ／ｋｇ）を絶食正常非糖尿病ラット（オスのスプラーグ−ドーリー、４００−５００グラム、ｎ＝３）の頸部の後ろに注射した。１５分の遅延の後、α−ＭＭ４ｇ／ｋｇ用量を腹腔内注射した。血液試料を０分ならびに初期コンジュゲート注射後３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分に尾静脈採血により収集した。血中グルコース値は、市販の試験ストリップ（プレシジョンエキストラ、アボットラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州）を使用して測定した。加えて、各時点の血液を４℃にて遠心分離にかけて血清を収集した。続いて血清インスリン濃度をを市販のＥＬＩＳＡキット（イソインスリンＥＬＩＳＡ、メルコディア、ウプサラ、スウェーデン）で測定した。対照は、１５分後にα−ＭＭの代わりに食塩水を注射することによって行った。
【０３０２】
図２は、ＩＩ−１の皮下注射の１５分後にα−ＭＭが腹腔内注射によって投与されたときに得られた結果を示す。図示されているように、α−ＭＭの注射から生じたＰＫ／ＰＤプロフィールの上昇は、食塩水を注射した対照群と比べたときに、ＩＩ−１について非常に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０３０３】
図３は、ＩＩ−２の皮下注射の１５分後にα−ＭＭが腹腔内注射によって投与されたときに得られた結果を示す。図示されているように、α−ＭＭの注射から生じたＰＫ／ＰＤプロフィールの上昇は、食塩水を注射した対照群と比べたときに、ＩＩ−２について非常に有意であった（ｐ＜０．０５）。
（実施例２１）
インビボ半減期／排出速度の比較
実施例２０で得られた結果は、競合する糖類の存在下で混乱することがあるレクチン依存性機構によって例示的なコンジュゲートが体から排出されていることに一致している。この機構をより詳細に調べるために、例示的なコンジュゲートに以下の実験を行って、未コンジュゲートインスリンと比べて、インビボで血清から排除される速度を決定した。
【０３０４】
各場合において、可溶性コンジュゲートを０．４ｍｇコンジュゲート／ｋｇ体重にて両頸静脈にカニューレ挿入されたオスのスプラーグ−ドーリーラット（タコニック、ＪＶ／ＪＶ、３５０−４００ｇ、ｎ＝３）に投薬した。一方のＪＶカニューレを介して滅菌コンジュゲート溶液または対照インスリンを静脈内注射して、続いてすぐにヘパリン−食塩水の追加液を注射して、すべてのコンジュゲート用量が動物に投与されるようにした。第２のカニューレを使用して、ｔ＝０（投薬前）、ならびに投薬後１、２、４、８、１５、３０、６０、９０、１２０および１８０分に血液試料を採取した。
【０３０５】
血中グルコース値は、市販の試験ストリップ（プレシジョンエキストラ、アボットラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州）を使用して測定した。加えて、各時点の血液を４℃にて遠心分離にかけて血清を収集した。続いて血清インスリンまたは血清コンジュゲート濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（イソインスリンＥＬＩＳＡ、メルコディア、ウプサラ、スウェーデン）で測定した。
【０３０６】
ＲＨＩまたはコンジュゲートのどちらの血清濃度も静脈内注射後の時間の関数としてプロットした。データは、２コンパートメント双指数関数モデルを使用して、以下の一般式に適合させた：Ｃ（ｔ）＝Ａ０ＥＸＰ（−ａｔ）＋Ｂ０ＥＸＰ（−ｂｔ）（式中、ｔは時間であり、Ｃ（ｔ）は時間の関数としての、血清中の濃度であり、Ａ０は第１コンパートメント濃度定数であり、ａは第１コンパートメント指数時間定数であり、Ｂ０は第２コンパートメント濃度定数であり、およびｂは第２コンパートメント指数時間定数である。
【０３０７】
以下の表に、試験したＲＨＩおよびコンジュゲートのｔ１／２パラメータをまとめる：
【０３０８】
【表４】
2013537529.tif 000067
このデータは、例示的なコンジュゲートが未コンジュゲートインスリンよりも高速に血清から排出され、その程度は内因性レクチンへの特定のコンジュゲートの親和性およびコンジュゲート当りの置換されたリガンドの数によって決まるという仮説に一致している。さらに、実施例１９で示されたＰＫ／ＰＤプロフィールのα−ＭＭに誘起された上昇は、試験した各コンジュゲートのｂ相半減期の短縮と十分に相関している。
（実施例２２）
様々なリガンド親和性および多価性を持つコンジュゲートから調製した長期作用型コンジュゲートの性能
本実施例において、我々はコンジュゲートＩＩ−１およびＩＩ−２の長期作用型製剤の時間作用およびグルコース応答性ＰＫプロフィールの決定を試みた（コンジュゲートの構造については図１を参照）。以下の長期作用型製剤を各コンジュゲートに使用した。
【０３０９】
【表５】
2013537529.tif 000068
４時間ＩＰグルコース注射（４ｇ／ｋｇ）実験は、上記の各コンジュゲート１５Ｕ／ｋｇ（体重（グラム）／１．８７＝注射体積のマイクロリットル）を投薬することによって行った。図４に示すように、４時間グルコース注射後に、すべてのコンジュゲートは遅延吸収プロフィールを呈し、測定された血清インスリン濃度は多少上昇気味であった。長期作用型ＴＳＰＥ−ＡＥＴＭ−３コンジュゲートＩＩ−２の注射後の最初の４時間に、多少の有意なコンジュゲート吸収があったと思われる。ＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３コンジュゲートＩＩ−１は、平坦な吸収プロフィールを呈した。これらの結果は、これらのコンジュゲートの半減期はすべて実施例２１に記載したような未修飾インスリンよりも低く、そのそれぞれが実施例２０に記載したようなＰＫ／ＰＤプロフィールのα−ＭＭに誘起された上昇を示すという事実と十分に相関している。
（実施例２３）
組換えインスリン分子：酵素における産生、タンパク質精製およびインビトロ酵素処理
本実施例は、小規模および大規模の両方での２つの異なる酵母株（ＫＭ７１およびＧＳ１１５）における複数の例示的なインスリン分子の組換え産生を示す。これらのインスリン分子のいくつかは、Ｎ末端保護アミノ酸配列を包含するように操作された。組換え産生されたインスリン分子は、予想された分子量を有し、抗インスリン抗体によって認識された。本実施例に記載する実験は、酵母において製造されたインスリン分子が商業規模の収量を生成したことを示す。本実施例は、組換え産生されたインスリン分子のインビトロ酵素処理および前官能化リガンドフレームワークとのコンジュゲーションに使用された手順も記載する。
【０３１０】
ＫＭ７１（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を３０℃にてＹＰＤブロス（１リットルに付き：酵母抽出物１０ｇ、ペプトン２０ｇおよびグルコース２０ｇ、ｐＨ６．５）中で培養した。株の復元が成功した後、エレクトロコンピテントＫＭ７１をＷｕおよびＬｅｔｃｈｗｏｒｔｈ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３６：１５２−４）によって記載されたように調製した。エレクトロコンピテントＫＭ７１を−８０℃の冷凍庫に貯蔵した。エレクトロコンピテントＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を同じ手順によって調製した。
遺伝子構築物を発現するインスリン分子の調製
インスリン分子構築物の遺伝子合成をジーンアート（レーゲンスブルク、ドイツ）にて行った。簡潔には、インスリン分子の発現をコードする対象の遺伝子を表４に挙げる。遺伝子はジーンアートにて合成され、次にＢａｍＩ（５’部位）およびＥｃｏＲＩ（３’部位）酵素によって切断して、次にｐＰＩＣ３．５Ｋベクター（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）の同じ部位に挿入した。生じたプラスミドを次に培養フラスコ内の大腸菌中で増幅して、次に抽出、精製し、プラスミドＤＮＡのＴＥ緩衝液による約１ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０３１１】
【表６】
2013537529.tif 000069
2013537529.tif 000070
Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）形質転換のためのＤＮＡ調製
ＧＳ１１５およびＫＭ７１を形質転換するために、４つの遺伝子構築物を最初に使用した。電子穿孔による形質転換の前に、各構築物をＳａｌＩによって直線化した。各構築物の直線化の完了は、アガロースゲル電気泳動によって確認した。次にキアクイックＰＣＲ精製スピンカラム（キアジェン）を使用して、ＳａｌＩおよび塩を直線化プラスミドから除去した。直線化プラスミドをスピンカラムから、オートクレーブ処理した脱イオン水を使用して溶離させた。
【０３１２】
ＤＮＡが酵母株に形質転換されたら、生じた遺伝子構築物は、表５に示すアミノ酸配列をコードした。プロ−リーダーペプチド配列は、培地中へのタンパク質分泌の前に、酵母内でＫｅｘ−２エンドプロテアーゼによって切断されるように設計されている（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２９：７９−８６）。このため、培地中に分泌された生じたインスリン分子は、［Ｂペプチド］−［Ｃペプチド］−［Ａペプチド］配列に結合されたリーダーペプチド配列のみを包含する。
【０３１３】
【表７】
2013537529.tif 000071
Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）形質転換
直線化プラスミドは、ＷｕおよびＬｅｔｃｈｗｏｒｔｈによって報告された手順（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３６：１５２−４）に従って、エレクトロコンピテントＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５およびＫＭ７１に個別に形質転換された（どちらもＨｉｓ−株）。電子穿孔した細胞を氷冷１Ｍソルビトール１ｍＬに再懸濁させて、最少デキストロース−ソルビトール寒天（アンモニウムおよびアミノ酸を含まない、１．３４％酵母窒素ベース、４×１０−５％ビオチン、２％デキストロース、１Ｍソルビトールおよび２％寒天）プレートに播種した。寒天プレートを３０℃にて４−７日インキュベートした。ＧＳ１１５およびＫＭ７１ゲノムに組み込まれた発現プラスミドは、Ｈｉｓ＋表現型を形質転換体にして、形質転換体をヒスチジン添加なしの最少デキストロース−ソルビトール寒天上で増殖させる。
Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）形質転換体の、高コピー数の発現カセットを持つクローンについてのスクリーニング
上のステップにおける４つの発現プラスミドを持つＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の２つの株に由来するクローンを、高コピー数の遺伝子構築物の組み込みについて個別にスクリーニングした。すべての形質転換体をヒスチジン添加なしの最少デキストロース−ソルビトール寒天上で選択した。各形質転換は、５００超のＨｉｓ＋形質転換体を生成した。Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）では複数の組み込みイベントが自然に起こるため、これらの形質転換体のいくつかは複数のコピーの発現プラスミドを含有することが予想された。これらの高コピー数形質転換体は、より高いレベルのインスリン分子を産生することができるであろう。したがって、発現プラスミドのすべてがｐＰＩＣ３．５Ｋ誘導体であり、ジェネティシン耐性マーカーを含有する（すなわちより高いコピーのクローンはジェネティシン耐性のより高い組み込みをもたらすはずである。）ため、最高のコピー数を持つ形質転換体を選択するために、すべての形質転換体をジェネティシンに対するその耐性に基づいてスクリーニングした。
【０３１４】
以下の手順により、Ｈｉｓ＋形質転換体を最少デキストロース−ソルビトール寒天上で培養して、ともにプールしてジェネティシンを含有するＹＰＤ寒天（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロースおよび２％寒天）に播種した：
・滅菌水１から２ｍｌを、各最少デキストロース−ソルビトールプレート上のＨｉｓ＋形質転換体（各発現プラスミド−株の組合せからの）の上にピペットで移した。
・滅菌スプレッダを使用して、スプレッダを寒天上面で移動することによって、Ｈｉｓ＋形質転換体を水中に再懸濁させる。
・細胞懸濁物を滅菌された５０ｍｌコニカル遠心管に移動・プールして、短時間ボルテックス処理する。
・細胞懸濁物の細胞密度を分光光度計によって決定した（１ＯＤ６００単位≒５×１０７細胞／ｍｌ）。
・１０５細胞を０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、３．０および４．０ｍｇ／ｍｌの最終濃度でジェネティシンを含有するＹＰＤプレート上に播種した。
・プレートを３０℃にてインキュベートして、毎日チェックした。ジェネティシン耐性コロニーが出現するまで３から５日かかった。
【０３１５】
ＹＰＤ−ジェネティシンプレート上で増殖したコロニーを同じ濃度のジェネティシンを含有するＹＰＤ寒天上で純度について画線培養して、単離されたコロニーが高濃度のジェネティシンに耐性であることを確認した。次に多様なジェネティシン濃度レベルの複数のクローンを、振とうフラスコでのインスリン分子発現試験のために選択した。
振とうフラスコ試験
４０のジェネティシン耐性クローン（４つの発現プラスミド×２株×５つの形質転換体）に対して２つの緩衝液条件（緩衝対非緩衝培地）にて、合計８０個の振とう培養フラスコについて振とうフラスコ試験を行った。
【０３１６】
形質転換体の半分はＫＭ７１誘導体であり、これはＭｕｔｓ表現型を有している。上で調製した画線されたプレートから単離したＫＭ７１形質転換体コロニーを使用して、１００ｍＬ非緩衝ＭＧＹブロス（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１．３４％酵母窒素ベース、４×１０−５％ビオチンおよび１％グリセロール）またはＢＭＧＹブロス１００ｍＬ（ＭＧＹと同じであるが、１００ｍＭリン酸カリウムを含む、ｐＨ６）に植菌した。これらの種培養物を３０℃にて、２５０ｒｐｍでオービタル振とうしながら、１６時間またはＯＤ６００値が２−６に達するまでインキュベートした。次に、わずかな一定分量の各ＭＧＹ培養物を使用してグリセロールストックを調製した。残りのＭＧＹ培養物を次に４０００×ｇにて５分の遠心分離によって集菌した。培養物上清を廃棄して、各細胞ペレットをＭＭＹブロス２０ｍＬ（グリセロールが０．５％メタノールで置き換えられていることを除いて、ＭＧＹと同じ）で再懸濁させた。同様に、ＢＭＧＹ種培養物を４０００×ｇにて５分の遠心分離によって集菌した。培養物上清を廃棄して、各細胞ペレットをＢＭＭＹブロス２０ｍＬ（グリセロールが０．５％メタノールで置き換えられていることを除いて、ＢＭＧＹと同じ）で再懸濁させた。
【０３１７】
ＭＭＹおよびＢＭＭＹブロス中のメタノールは、タンパク質発現を誘起する。ＭＭＹおよびＢＭＭＹ培養物を３０℃にて２５０ｒｐｍでオービタル振とうしながら９６時間インキュベートした。２４時間ごとに、メタノールを各培養物に０．５％の最終濃度まで添加した。０．５ｍＬの一定分量の培養物も各振とうフラスコから、誘起開始後に２４時間ごとに除去した。これらの試料では、細胞を培養物上清から微量遠心分離によって分離して、両方の画分を−８０℃にて貯蔵した。
【０３１８】
形質転換体のもう１つの半分はＧＳ１１５誘導体であり、これはＭｕｔ＋であることが予想された。先に記載したように調製した画線されたプレートから単離したＧＳ１１５形質転換体コロニーを使用して、ＭＧＹブロス２５ｍＬおよびＢＭＧＹブロス２５ｍＬを植菌した。これらの種培養物を３０℃にて、２５０ｒｐｍでオービタル振とうしながら、１６時間またはＯＤ６００値が２−６に達するまでインキュベートした。次に、わずかな一定分量の各ＭＧＹ培養物を使用してグリセロールストックを調製した。開始ＯＤ６００値が約１であるように、残りの細胞の別の一定分量を、ＭＭＹブロス２０ｍＬに植菌するために遠心分離によって集菌した。同様に、開始ＯＤ６００値が約１であるように、ＢＭＧＹ種培養物を使用してＢＭＭＹブロス２０ｍＬに植菌した。ＭＭＹおよびＢＭＭＹ培養物を３０℃にて２５０ｒｐｍでオービタル振とうしながら９６時間インキュベートした。２４時間ごとに、メタノールを各培養物に０．５％の最終濃度まで添加した。０．５ｍＬの一定分量の培養物を各振とうフラスコから、誘起開始後に２４時間ごとに除去した。細胞を培養物上清から微量遠心分離によって分離して、両方の画分を−８０℃にて貯蔵した。
【０３１９】
９６時間の誘起後、すべての培養物を遠心分離によって集菌した。細胞ペレットを廃棄した。最終培養物上清および誘起の間に多様な時点にて収集した培養物上清をインスリン分子発現収率について、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、バイオラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア州；標準ラダー：シーブルー＠プラス２前染色標準（１Ｘ）；染色：シンプリーブルー・セーフステイン；プレキャストゲル：基準プレキャストゲル１６．５％トリス−トリシン／ペプチド；ランニング緩衝液：１Ｘトリス／トリシン／ＳＤＳ緩衝液；ローディング緩衝液：トリシン試料緩衝液）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ、メルコディアイソ−インスリンＥＬＩＳＡ、ウプサラ、スウェーデン）によって分析した。
酵母における大規模インスリン分子発現のための培地
ＢＭ＿Ｙ＝ＢＭ＿Ｙベース培地（テクノバ、カタログ番号Ｂ８００１）
ＢＭＧＹ＝ＢＭ＿Ｙ＋０．１％グリセロール（体積／体積）
ＢＭＭＹ＝ＢＭ＿Ｙ＋メタノール
酵母における大規模インスリン分子発現のためのＭＤＳ寒天プレートの調製
ソルビトール３１９ｇおよび寒天３５ｇをジＨ２Ｏ  １．４Ｌに溶解させた。混合物をオートクレーブで３０分処理した。開始する前に温度を６０℃まで降下させた。次に、脱イオン水中に硫酸アンモニウムを含有する滅菌１３．４％（重量／体積）酵母窒素ベース（ＹＮＢ）１７５ｍＬを添加した。この混合物に、滅菌２０％グルコースの脱イオン水溶液１７５ｍＬおよび滅菌０．０２％ビオチンの脱イオン水溶液３．５ｍＬの一部を添加した。溶液を均一になるまで混合して、次にプレート中に注いだ。
酵母におけるインスリン分子の大規模発現および培養
滅菌ループを使用して、凍結細胞の一定分量をＭＤＳプレートに移し、単一コロニーを得るために画線培養した。プレートを３０℃にて２−４日インキュベートして、酵母コロニーを明らかにした。１個のコロニーを滅菌ループによって無作為に選び、ＢＭＧＹ培地２５ｍＬ（ＢＭ＿Ｙ  ２４．１７ｍＬ＋３０％グリセロール０．８３ｍＬ）に植菌するために使用した。この培地をインキュベータ／振とう器（約１５０ｒｐｍ）で３０℃にて２４時間インキュベートした。
【０３２０】
この時間の後、ＢＭＧＹ  ７５ｍＬ（ＢＭ＿Ｙ  ７２．５ｍＬおよび３０％グリセロール２．５ｍＬ）を培養物に添加して、約１００ｍＬの最終体積を得た。インキュベーションを同じ条件下でさらに２４時間続けた。翌日、光学密度（ＯＤ）を評価して、１０００ＯＤ一定分量を得るために前培養物がどれだけ必要かを決定した（たとえばＯＤ＝１５ならば、次に１０００ＯＤ／１５０Ｄ＊ｍＬ−１→１０００ＯＤを得るために、前培養物６６．７ｍＬが必要であった）。
【０３２１】
次に、計算した体積の前培養物を遠心分離して（４０００ｒｐｍ、４℃で１０分）、上清をデカンテーションした。ペレットをＢＭ＿Ｙ培地９９０ｍＬ中に再懸濁させた。ＯＤを再チェックして（ＯＤはおよそ１．０であるべきである。）、培養物の体積を必要ならばそれに従って調整した。生化学グレードメタノール１０ｍＬ（シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州＃４９４４３７）を次にフラスコ添加して、フラスコをインキュベータ／振とう器で約１５０ｒｐｍ、３０℃にて２４時間インキュベートした。メタノールを所望のタンパク質発現レベルに応じて、２−６日にわたって２４時間ごとに添加した。
【０３２２】
所望の酵母増殖レベルが達成された後、培養物を遠心分離した（１０，０００ｒｐｍ，４℃にて３０分）。上清をデカンテーションして、清浄な容器に保管して、必要となるまで、−８０℃に凍結させた。
インスリン分子の大規模精製
培養フラスコからの細胞を４０００×ｇ、４℃にて１０分の遠心分離により沈降させた。生じた上清を清浄なフラスコ中にデカンテーションした。１Ｎ  ＨＣ１または１Ｎ  ＮａＯＨを使用して上清のｐＨを約３．３に調整して、続いて上清を等量の脱イオン水（ミリＱ、ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州）によって希釈した。
【０３２３】
生じた培養物上清を０．２ミクロン低結合フィルタユニット（ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州）を通じた濾過により浄化した。別にイオン交換カラム（１．４２ｃｍ×１．４２ｃｍ×５．０ｃｍ）を、２５ｍＭクエン酸塩緩衝液ｐＨ３．３（ウォッシュバッファ）中で調製したＳＰセファロース・ファストフロー担体（ＧＥヘルスケア）を用いて調製した。カラムに適切に充填したら、カラムを蠕動ポンプに連結して、培養物上清をイオン交換カラム上に添加した（約１０ｍｌ／分）。すべての培養物上清をカラムに添加したら、蠕動ポンプを使用して、ウォッシュバッファおよそ１０カラム容量（ＣＶ）をカラムに通過させた。これを行った後に、溶離緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．６および２００ｍＭ  ＮａＣｌ）およそ２−５ＣＶを使用して、精製インスリン分子をカラムから溶離させた。
【０３２４】
生じた精製インスリン分子溶液をマスタフレックスモデル７５２３−８０ポンプ（コールパーマー、ヴァーノンヒルズ、イリノイ州）に連結されたダイアフィルトレーション装置（８８ｃｍ２および０．１１ｍ２カセットホルダ、５ｋＤａ  ＭＷＣＯペリコン３  ０．１１ｍ２カセットフィルタ、ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州）を使用して濃縮および脱塩した。溶液を最初に濃縮して、またはおよそ２５０ｍＬの体積に希釈して、次におよそ８−１０ダイア容量のミリ−Ｑ脱イオン水でダイアフィルトレーションした。
【０３２５】
脱塩した精製インスリン分子溶液を次に、凍結乾燥するか、または続いての酵素処理ステップで直接使用した。
インビトロ酵素処理
アクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）プロテアーゼ（ＡＬＰ）は、酵素２ＵをＭｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏ  １ｍＬに溶解させることによって調製した。酵素ストック溶液１：９をミリＱ  Ｈ２Ｏで０．２Ｕ／ｍＬの濃度にさらに希釈することによって作用溶液を調製した。
【０３２６】
すべての１０  ＲＨＩ−１ミュータントからのブロスを使用した（ＧＳ１１５  ＲＨＩ−１  Ａ−ＥおよびＫＭ７１  ＲＨＩ−１  Ａ−Ｅ）。各ブロス試料の２００μＬ一定分量を２つ調製して、２Ｍトリス４０μＬの添加によってｐＨ約１０に調整した。対照として用いるために、同じ方法で約５４０μｇ／ｍＬヒトＲＨＩの一定分量を２つ調製した。作用酵素溶液２．４μＬを一定分量各対の一方に添加した。ミリ−Ｑ  Ｈ２Ｏ  ２．４μＬを他方に添加して対照として用いた。試料をロッカー上で室温にて４．５時間インキュベートして、次に−８０℃にて分析まで凍結させた。
【０３２７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング用の試料は、トリシン試料緩衝液（バイオラッド）２０μＬを調製ブロス１０μＬに添加して、５分沸騰させることによって調製した。試料は、ペプチドおよびタンパク質ラダーと共に、１２５Ｖで運転されている１６．５％トリス−トリシンゲル上で室温にて１．７５時間分解させた。次にタンパク質を、ｉブロット・ドライ・トランスファーシステム（インビトロジェン）、プログラムＰ３を５．５分使用して、ニトロセルロース膜に移した。膜をＰＢＳ中０．２５％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）によって１５分固定させて、次にＴＢＳによって３×５分洗浄した。ブロッキングをＰＢＳ＋０．０５％ツイン−２０（ＰＢＳＴ）中の５％粉乳中でロッカー上にて室温で１時間行った。次にブロットをＰＢＳＴ中の１％粉乳で１：１０００に希釈されたマウス抗ヒトプロ−インスリン／インスリン抗体（アブカム）で振とう器上で４℃にて一晩インキュベートした。ブロットをＰＢＳＴによって２×１０分洗浄して、ＰＢＳＴ中１％乳中で１：３０００に希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ中で室温にて２時間インキュベートした。ブロットをＰＢＳＴ中で２×１０分洗浄して、続いてｄＨ２Ｏ中で２分洗浄した。ＴＭＢ基質（ピアス）中で室温にて２時間インキュベートすることによってバンドを展開させて、続いてｄＨ２Ｏによって徹底的に洗浄した。
前官能化リガンドフレームワークとのコンジュゲーション
（Ａ０／Ｂ０上に、Ａ０のみの上に、またはＢ０のみの上に）Ｎ末端保護アミノ酸を持つインスリン分子がＡＬＰによって処置されると、インスリン分子は末端活性化エステル（たとえば−ＯＳｕなど）を包含する前官能化リガンドフレームワークとコンジュゲートされる。反応は、前官能化リガンドフレームワークをＤＭＳＯまたはＤＭＦなどの無水有機溶媒に溶解させること、次に所望の当量数のＡＬＰ消化インスリン分子を添加すること、続いて室温にて数時間混合することによって行われる。
【０３２８】
前官能化リガンドフレームワークとＡＬＰ消化インスリン分子との間のコンジュゲーション反応は、炭酸塩緩衝液中でも起こり得て、Ｂ２９−コンジュゲートインスリン分子を与える。例示的な合成において、前官能化リガンドフレームワーク（ＰＬＦ）が無水ＤＭＳＯに溶解されて、続いてトリエチルアミン（ＴＥＡ）が添加される。溶液を室温にて所望の長さの時間にわたって迅速に撹拌する。次にＡＬＰ消化インスリン分子を１７．２ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ１１）中に個別に溶解させて、続いて１．０Ｎ水酸化ナトリウムによってｐＨを１０．８まで調整する。溶解したら、ＰＬＦ／ＤＭＳＯ／ＴＥＡ溶液を薬物／炭酸塩緩衝液溶液に滴加する。添加中に、必要ならば希ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用して、生じた混合物のｐＨを定期的に１０．８まで調整する。滴加の後に溶液を所望の長さの時間にわたって撹拌して、完全に反応させる。
【０３２９】
さらに、炭酸塩緩衝液条件下で、インスリン分子がＢ０のみにて保護されているある実施形態において、Ａ１，Ｂ２９−２置換インスリン−コンジュゲートは、上記の条件を使用して、Ｂ２９−１置換インスリン−コンジュゲート合成と比較して、インスリン分子当りの前官能化リガンドフレームワークの量のおよそ１０倍を用いて合成される。
Ｎ末端アミノ酸保護アミノ酸配列のインビトロ酵素切断
コンジュゲートインスリン中間体を次にトリプシンで処置して、表６に下線を付けて示されているＮ末端保護アミノ酸配列を切断する。簡潔には、０．５％（重量／重量）トリプシン（たとえばブタトリプシン）をコンジュゲートインスリン中間体に添加する。トリプシンは、反応混合物の体積の１０％体積／体積から３０％体積／体積（たとえば約２０％体積／体積）に達する体積で水溶物として提供され得る。室温にて約１時間後、反応を終了させる。反応はｐＨを調整することによって、たとえばｐＨを酸性ｐＨに（たとえば約１、約２、約３、約４、約５または約６のｐＨに）に調整することによって終了され得る。所望の生成物は、（たとえば分取逆相ＨＰＬＣを使用して）精製されていてもよい。
結果
酵母におけるインスリン分子の産生
本実施例は、酵母におけるインスリン分子の産生を示す。とりわけ本実施例は、２つの異なる酵母株におけるインスリン分子（特にＲＨＩ−１、ＲＨＩ−２、ＲＨＩ−３およびＲＡＴ−１の産生）産生を示す。本開示は、これらの手順が他のいずれの組換えインスリン分子を発現および精製するためにも有用であり得るという認識を含む。
【０３３０】
図１１は、緩衝（ＢＭＭＹ）および未緩衝（ＭＭＹ）条件下で培養されたＧＳ１１５株クローンからの未精製培養物上清の収量を示す。図１１の左パネルは、ＥＬＩＳＡ分析（イソ−インスリンＥＬＩＳＡ、メルコディア、ウプサラ、スウェーデン）を使用した、多様なクローン（「Ｃｌｏｎｅ＃」は、各種のジェネティシンプレート耐性レベルから得たクローンを指す）からのインスリン分子収量（ｍｇ／Ｌ）を示す。図１１の右パネルは、クローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、産生されたインスリン分子の分子量を示している。組換えヒトインスリン標準（ＲＨＩ標準）を収量比較する目的で、右上ゲルのレーン１４および右下ゲルのレーン２に２５０ｍｇ／Ｌに示す。予想した通り、インスリン分子は、リーダーペプチドおよび結合ペプチド（「Ｃペプチド」）のために、ＲＨＩ標準の分子量よりも高いＭＷを有する。
【０３３１】
図１２は、緩衝条件下で培養されたＫＭ７１株クローンからの未精製培養物上清収量を示す。図１２の左パネルは、ＥＬＩＳＡ分析（イソ−インスリンＥＬＩＳＡ、メルコディア、ウプサラ、スウェーデン）を使用した、多様なクローン（「Ｃｌｏｎｅ＃」は、各種のジェネティシンプレート耐性レベルから得たクローンを指す）からのインスリン分子収量（ｍｇ／Ｌ）を示す。図１２の右パネルは、クローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、産生されたインスリン分子の分子量を示している。組換えヒトインスリン標準（ＲＨＩ標準）は、右上ゲルのレーン１５−１８（６０−５００ｍｇ／Ｌ）および右下ゲルのレーン５−９（３０−５００ｍｇ／Ｌ）に、収率を比較する目的で示されている。予想した通り、インスリン分子は、リーダーペプチドおよび結合ペプチド（「Ｃペプチド」）のために、ＲＨＩ標準の分子量よりも高いＭＷを有する。
【０３３２】
図１３は、非緩衝条件下で培養されたＫＭ７１株クローンからの未精製培養物上清収量を示す。図１３の左パネルは、ＥＬＩＳＡ分析（イソ−インスリンＥＬＩＳＡ、メルコディア、ウプサラ、スウェーデン）を使用した、多様なクローン（「Ｃｌｏｎｅ＃」は、各種のジェネティシンプレート耐性レベルから得たクローンを指す）からのインスリン分子収量（ｍｇ／Ｌ）を示す。図１３の右パネルは、クローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、産生されたインスリン分子の分子量を示している。組換えヒトインスリン標準（ＲＨＩ標準）は、右上ゲルのレーン８および９（２５０および１００ｍｇ／Ｌ）および右下ゲルのレーン１８（２５０ｍｇ／Ｌ）に、収率を比較する目的で示されている。予想した通り、インスリン分子は、リーダーペプチドおよび結合ペプチド（「Ｃペプチド」）のために、ＲＨＩ標準の分子量よりも高いＭＷを有する。
【０３３３】
図１１−１３に示した結果は、多様なプラスミド構築物によって産生されたインスリン分子が正しいＭＷの分子であることを示す。加えて、これらのデータは、ヒトインスリンに特異的である抗体を使用する市販のインスリンＥＬＩＳＡキットによって測定可能および検出可能であったため、インスリン分子がインスリン様であることを示す。これらのデータは、インスリン分子が酵母において商業的に有用なレベル（たとえば＞２５ｍｇ／Ｌ）で発現され得ることをさらに示す。最後に、これらのデータは、ＥＬＩＳＡ測定収量と粗培養物上清からのＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定収量との間に良好な相関を示した。言い換えれば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバンド強度が上昇すると、ＥＬＩＳＡ測定値も上昇する傾向があった。この相関は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで適切な分子量の対象とするバンドが実際にインスリン分子であったことをさらに示す。
精製インスリン分子のインビトロ酵素処理
本実施例は、（Ｃペプチドおよびリーダーペプチドを除去するための）組換え産生インスリン分子のインビトロ酵素処理に使用された手順も記載する。本開示は、これらの手順がたとえば粗細胞培養物ブロスからの、浄化された上清からの、精製インスリン分子生成物などからの産生工程のいずれのステップにおいてもインスリン分子の精製に利用できるという認識を含んでいる。
【０３３４】
遺伝子ＲＨＩ−１を含有するメタノール誘起ミュータントからのブロスをアクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）プロテアーゼ（ＡＬＰ）によって消化した。ＡＬＰはＣ末端リジンプロテアーゼであり、したがってインスリン分子のＡペプチドとＢペプチドとの間のペプチドリンカ（Ｃ末端ＬｙｓがないＣペプチドを包含するＲＨＩ−２およびＲＨＩ−３構築物を除く）ならびにＢペプチドのＮ末端に結合されているリーダーペプチド配列を切断することが予想された。乾燥膜をスキャンして、図１４に示す。２つのバンドがブロスを含有する大半のレーンに存在し、両方のバンドが、酵素消化後には対照と比較してより低い分子量に移動した。各消化対のより低いＭＷのバンドは、ＲＨＩ対照とほぼ同じ位置にある。ＲＨＩ対照は、消化後にＭＷを変更しなかった。これらの結果は、適切なサイズのインスリン分子が酵素処理後に生成されたことを示す。インスリン分子ＲＨＩ−１、ＲＨＩ−４およびＲＡＴ−１のＡＬＰによる消化は、表６に示す生成物を産生することが予測されるであろう（生成物中のＡおよびＢペプチドは、式ＸＩに示すように、３つのジスルフィドブリッジを介して結合されている）。ＲＨＩ−２およびＲＨＩ−３のＣペプチドはＣ末端Ｌｙｓを包含しないため、ＣペプチドがＡｒｇのＣ末端側で切断する酵素（たとえばトリプシンまたは下で議論するようなトリプシン様プロテアーゼ）によってさらに処理されるまで、これらはＡペプチドのＮ末端に結合されたままであることが予想されるであろう。
【０３３５】
ＲＨＩ−２、ＲＨＩ−３およびＲＨＩ−４はそれぞれ、１つ以上のＮ末端保護アミノ酸配列（表６の配列で下線が付けられている）を包含するように設計された。図示されているように、ＲＨＩ−２はＮ末端保護アミノ酸配列を位置Ａ０およびＢ０に包含する（上述のように、ＲＨＩ−２のＣペプチドはＡＬＰによって切断されず、したがってＡペプチドのＮ末端になお結合されている）。ＲＨＩ−３は、Ｎ末端保護アミノ酸配列を位置Ａ０のみに包含する（上述のように、ＲＨＩ−３のＣペプチドはＡＬＰによって切断されず、したがってＡペプチドのＮ末端になお結合されている）。ＲＨＩ−４は、Ｎ末端保護アミノ酸配列を位置Ｂ０にのみ包含する。
【０３３６】
【表８】
2013537529.tif 000072
前官能化リガンドフレームワークとのコンジュゲーション
ＲＨＩ−２、ＲＨＩ−３およびＲＨＩ−４がＡＬＰによって処置されると、これらは末端活性化エステル（たとえば−ＯＳｕなど）を包含する前官能化リガンドフレームワークとコンジュゲートされる。反応は、前官能化リガンドフレームワークをＤＭＳＯまたはＤＭＦなどの無水有機溶媒に溶解させること、次に所望の当量数のＡＬＰ消化インスリン分子を添加すること、続いて室温にて数時間混合することによって行われる。
【０３３７】
または反応は、炭酸塩緩衝液中で所望の当量数の前官能化リガンドフレームワーク（ＰＬＦ）を無水ＤＭＳＯに溶解させること、続いてのトリエチルアミン（ＴＥＡ）の添加によって行われる。溶液を室温にて所望の長さの時間にわたって迅速に撹拌する。次にＡＬＰ消化インスリン分子を１７．２ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ１１）中に個別に溶解させて、続いて１．０Ｎ水酸化ナトリウムによってｐＨを１０．８まで調整する。溶解したら、ＰＬＦ／ＤＭＳＯ／ＴＥＡ溶液を薬物／炭酸塩緩衝液溶液に滴加する。添加中に、必要ならば希ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用して、生じた混合物のｐＨを定期的に１０．８まで調整する。滴加の後に溶液を所望の長さの時間にわたって撹拌して、完全に反応させる。
Ｎ末端アミノ酸保護アミノ酸配列のインビトロ酵素切断
コンジュゲートインスリン中間体を次にトリプシンで処置して、表６に下線を付けて示されているＮ末端保護アミノ酸配列を切断する。簡潔には、０．５％（重量／重量）トリプシン（たとえばブタトリプシン）をコンジュゲートインスリン中間体に添加する。トリプシンは、反応混合物の体積の１０％体積／体積から３０％体積／体積（たとえば約２０％体積／体積）に達する体積で水溶物として提供され得る。室温にて約１時間後、反応を終了させる。反応はｐＨを調整することによって、たとえばｐＨを酸性ｐＨに（たとえば約１、約２、約３、約４、約５または約６のｐＨに）に調整することによって終了され得る。所望の生成物は、（たとえば分取逆相ＨＰＬＣを使用して）精製されていてもよい。
【図１】
2013537529.tif 000115
【図１−１】
2013537529.tif 000116
【図１−２】
2013537529.tif 000117
【図１−３】
2013537529.tif 000118
【図１−４】
2013537529.tif 000119
【図２】
2013537529.tif 000120
【図３】
2013537529.tif 000121
【図４】
2013537529.tif 000122
【図５】
2013537529.tif 000123
【図６】
2013537529.tif 000124
【図７】
2013537529.tif 000125
【図８Ａ】
2013537529.tif 000126
【図８Ｂ】
2013537529.tif 000127
【図９Ａ】
2013537529.tif 000128
【図９Ｂ】
2013537529.tif 000129
【図１０Ａ】
2013537529.tif 000130
【図１０Ｂ】
2013537529.tif 000131
【図１１Ａ】
2013537529.tif 000132
【図１１Ｂ】
2013537529.tif 000133
【図１２Ａ】
2013537529.tif 000134
【図１２Ｂ】
2013537529.tif 000135
【図１３Ａ】
2013537529.tif 000136
【図１３Ｂ】
2013537529.tif 000137
【図１４Ａ】
2013537529.tif 000138
【図１４Ｂ】
2013537529.tif 000139
【配列表】
2013537529000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月25日(2013.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
2013537529.tif 000140
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
Ｗは薬物である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ａの化合物：
【化２】
2013537529.tif 000141
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）前記式Ａの化合物をアミン含有薬物と反応させて、式Ｉの化合物を形成するステップ；
を含む方法。
【請求項２】
式ＩＩの化合物：
【化３】
2013537529.tif 000142
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ａの化合物：
【化４】
2013537529.tif 000143
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）前記式Ａの化合物をインスリン分子と反応させて、式ＩＩの化合物を形成するステップ；
を含む方法。
【請求項３】
Ｘの各出現が同じリガンドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＬＧ１が−ＯＳｕである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
式ＩＩの化合物が図１に示すものから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
式Ａの化合物：
【化５】
2013537529.tif 000144
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよく；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｂの化合物：
【化６】
2013537529.tif 000145
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）式Ｂの前記化合物のカルボン酸を活性化して、式Ａの化合物を形成するステップ；
を含む方法。
【請求項７】
式Ｂの化合物：
【化７】
2013537529.tif 000146
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｃの化合物：
【化８】
2013537529.tif 000147
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ２−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）式Ｃの化合物を脱保護して、式Ｂの化合物を形成するステップ；
を含む方法。
【請求項８】
式Ｃの化合物：
【化９】
2013537529.tif 000148
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｄの化合物：
【化１０】
2013537529.tif 000149
（式中：
ＰＧ１はカルボン酸保護基であり；および
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）式Ｄの化合物をアミン含有リガンドＨ２Ｎ−Ｘ（Ｅ）と反応させて、式Ｃの化合物を形成するステップ；
を含む方法。
【請求項９】
式Ｄの化合物：
【化１１】
2013537529.tif 000150
（式中：
ＰＧ１はカルボン酸保護基であり；および
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｆの化合物：
【化１２】
2013537529.tif 000151
（式中：
Ａｌｋ１はＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ；
および
（ｂ）化合物Ｆのカルボン酸部分を保護して、式Ｄの化合物を与えるステップ；
を含む方法。
【請求項１０】
式Ａの化合物：
【化１３】
2013537529.tif 000152
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｆの化合物：
【化１４】
2013537529.tif 000153
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ；
（ｂ）化合物Ｆのカルボン酸部分を保護して、式Ｄの化合物：
【化１５】
2013537529.tif 000154
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を与えるステップ；
（ｃ）式Ｄの化合物をアミン含有リガンドＨ２Ｎ−Ｘ（Ｅ）と反応させて、式Ｃの化合物：
【化１６】
2013537529.tif 000155
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を形成するステップ；
（ｄ）式Ｃの化合物を脱保護して、式Ｂの化合物：
【化１７】
2013537529.tif 000156
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を形成するステップ；
および
（ｅ）前記式Ｂの化合物のカルボン酸を活性化して、式Ａの化合物を形成するステップ；
を含む方法。
【請求項１１】
式Ｉの化合物：
【化１８】
2013537529.tif 000157
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
Ｗは薬物である。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｆの化合物：
【化１９】
2013537529.tif 000158
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ；
（ｂ）化合物Ｆのカルボン酸部分を保護して、式Ｄの化合物：
【化２０】
2013537529.tif 000159
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を与えるステップ；
（ｂ）式Ｄの化合物をアミン含有リガンドＨ２Ｎ−Ｘ（Ｅ）と反応させて、式Ｃの化合物：
【化２１】
2013537529.tif 000160
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を形成するステップ；
（ｄ）式Ｃの化合物を脱保護して、式Ｂの化合物：
【化２２】
2013537529.tif 000161
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を形成するステップ；
（ｅ）式Ｂの前記化合物のカルボン酸を活性化して、式Ａの化合物：
【化２３】
2013537529.tif 000162
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を形成するステップ；
および
（ｆ）式Ａの化合物をアミン含有薬物と反応させて、式Ｉの化合物を形成するステップ；
を含む方法。
【請求項１２】
式ＩＩの化合物：
【化２４】
2013537529.tif 000163
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を調製する方法であって：
（ａ）式Ｆの化合物：
【化２５】
2013537529.tif 000164
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよい。）
を提供するステップ；
（ｂ）化合物Ｆのカルボン酸部分を保護して、式Ｄの化合物：
【化２６】
2013537529.tif 000165
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を与えるステップ；
（ｃ）式Ｄの化合物をアミン含有リガンドＨ２Ｎ−Ｘ（Ｅ）と反応させて、式Ｃの化合物：
【化２７】
2013537529.tif 000166
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよく；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
を形成するステップ；
（ｄ）式Ｃの化合物を脱保護して、式Ｂの化合物：
【化２８】
2013537529.tif 000167
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
を形成するステップ；
（ｅ）式Ｂの前記化合物のカルボン酸を活性化して、式Ａの化合物：
【化２９】
2013537529.tif 000168
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン単位は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置き換えられていてもよく；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）
を形成するステップ；
および
（ｆ）式Ａの化合物をインスリン分子と反応させて、式ＩＩの化合物；
を形成するステップ。
【請求項１３】
式Ｆの化合物：
【化３０】
2013537529.tif 000169
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン基は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換され得る。）
式Ｄの化合物：
【化３１】
2013537529.tif 000170
（式中：
ＡｌｋはＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン基は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換され得て；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
式Ｃの化合物：
【化３２】
2013537529.tif 000171
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン基は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換され得て；および
ＰＧ１はカルボン酸保護基である。）
式Ｂの化合物：
【化３３】
2013537529.tif 000172
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン基は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
式Ｂの化合物：
【化３４】
2013537529.tif 000173
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；および
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン基は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換されていてもよい。）
式Ａの化合物：
【化３５】
2013537529.tif 000174
（式中：
Ｘの各出現は独立してリガンドであり；
Ａｌｋの各出現は独立してＣ１−Ｃ１２アルキレン鎖であり、１つ以上のメチレン基は、−Ｏ−または−Ｓ−によって置換され得て；および
ＬＧ１は好適な脱離基である。）。
【請求項１４】
式の化合物。
【化３６】
2013537529.tif 000175
2013537529.tif 000176
【請求項１５】
式のコンジュゲート：
【化３７】
2013537529.tif 000177
（式中、
【化３８】
2013537529.tif 000178
はインスリン分子であり、ＧｌｙＡ１に結合して示されているＮＨ−基は、インスリン分子のＡ１位置におけるグリシン残基のアルファアミノ酸からであり、およびＬｙｓＢ２９に結合して示されているＮＨ−基は、インスリン分子のＢ２９位置におけるリジン残基のイプシロンアミノ酸からである。）。
【請求項１６】
【化３９】
2013537529.tif 000179
が野生型ヒトインスリンである、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【国際調査報告】
2013537529.tif 000180
2013537529.tif 000181
2013537529.tif 000182
2013537529.tif 000183