(57)【要約】  本開示は、腫瘍および癌の予防および治療に有用な腫瘍ワクチンを提供する。腫瘍ワクチンは、抗原提示ペプチドと、サイトカインと、腫瘍および癌の予防および治療に有用な他の因子とをコードする核酸、またはこのような核酸を含有する発現ベクターもしくはウイルス、またはこのような核酸もしくは発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、
サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチド、
および少なくとも１つのプロモーター
を含み、
少なくとも１つのプロモーターが第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つに機能可能に連結している組成物。
【請求項２】
抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドセグメント、
サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドセグメント、
および少なくとも１つのプロモーター
を含み、
少なくとも１つのプロモーターが第１のポリヌクレオチドセグメントおよび第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに機能可能に連結している発現ベクター。
【請求項３】
抗原提示ポリペプチドが熱ショックタンパク質である、請求項１に記載の組成物または請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
熱ショックタンパク質が、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ２０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７１、Ｈｓｐ７２、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４、Ｈｓｐ１１０、アルファ−Ｂ−クリスタリン、およびグルコース調節型のタンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物または請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項５】
熱ショックタンパク質がＨｓｐ７０である、請求項４に記載の組成物または発現ベクター。
【請求項６】
抗原提示ポリペプチドがＨｓｐ７０に少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組成物または請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項７】
サイトカインが、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージ／顆粒球コロニー刺激因子、幹細胞因子、およびエリスロポエチンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物または請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項８】
プロモーターに機能可能に連結している、サイトカインをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物または請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項９】
第１のポリヌクレオチドが構成的プロモーターに機能可能に連結しており、第２のポリヌクレオチドが腫瘍特異的なプロモーターに機能可能に連結している、請求項１に記載の組成物または請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
少なくとも１つのプロモーターが真核生物プロモーターである、請求項１に記載の組成物または請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
少なくとも１つのプロモーターが腫瘍特異的なプロモーターである、請求項１に記載の組成物または請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
プラスミド、ウイルス、ファージ、およびコスミドからなる群から選択される、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
ウイルスベクターである、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
ウイルスベクターが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、水胞性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器および腸管オーファンウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ならびにセンダイウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のウイルスに由来するベクターである、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
ウイルスベクターが複製可能ベクターである、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
ウイルスベクターが、Ｅ１ａ遺伝子を含有するアデノウイルスベクターである、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
Ｅ１ａ遺伝子が、腫瘍特異的なプロモーターに機能可能に連結している、請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１に記載の組成物または請求項２に記載の発現ベクターを含有する、単離された宿主細胞。
【請求項１９】
薬学的に許容可能な担体と、請求項１に記載の組成物、請求項２に記載の発現ベクター、および請求項１８に記載の単離された宿主細胞のいずれか１つとを含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、癌を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
抗原提示は適応免疫応答におけるプロセスであり、この間に、抗原提示細胞は抗原を捕捉し、Ｔ細胞による認識のためにその表面に抗原を提示する。抗原は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と共に抗原提示細胞の表面上に提示され、これは、Ｔ細胞受容体によって認識および結合され得、このようにして抗原提示を促進する。Ｔ細胞が、細胞表面上に提示された抗原を認識すると、Ｔ細胞は活性化され、抗原に対する免疫応答を生じさせる。抗原提示を通して、Ｔ細胞は、外因性抗原に対しても内因性抗原に対しても免疫応答を生じさせ得る。
【０００２】
サイトカインは、免疫応答の調節における重要なプレイヤーである。サイトカインは、免疫系を調節するためのシグナルを伝達するように機能し得る、免疫系における細胞によって分泌される低分子タンパク質である。異なるサイトカインは、異なるシグナルを有し得る。例えば、一部のサイトカインは免疫細胞の増殖または成熟を刺激し得、一部のサイトカインは免疫細胞の移動を指示し得、一部のサイトカインは細胞に基づく免疫応答を増強し得る。
【０００３】
癌または腫瘍は、人々における癌化に対する免疫応答の弱体化または欠損に少なくとも部分的に関係すると考えられている。遺伝子療法を含めた様々な治療法が、癌を治療するために用いられている。癌治療のための遺伝子療法は、癌細胞を死滅させ得るかもしくは阻害し得る遺伝子、癌細胞に対する免疫応答を増強させ得る遺伝子、突然変異もしくは改変した遺伝子を修復し得るかもしくは置き換え得る遺伝子、または癌細胞を化学療法もしくは放射線照射療法に対してさらに感受性にし得る遺伝子の送達を伴い得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、腫瘍および癌の予防および治療に有用な組換え腫瘍ワクチンに関するものである。腫瘍ワクチンは、抗原提示ペプチドと、サイトカインと、腫瘍および癌の予防および治療に有用な他の因子とをコードする核酸、ならびに／またはこのような核酸を含有する発現ベクター、ならびに／またはこのような核酸および／もしくは発現ベクターを含有する宿主細胞を含有し得る。本開示はまた、腫瘍ワクチンを含有する医薬組成物、ならびに腫瘍ワクチンを用いて腫瘍および癌を予防および治療する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの態様において、本開示は、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチド、ならびに少なくとも１つのプロモーターは第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つに機能可能に連結している少なくとも１つのプロモーターの組成物を含む組換え腫瘍ワクチンを提供する。
【０００６】
別の態様において、本開示は、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドセグメント、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドセグメント、ならびに第１のポリヌクレオチドセグメントおよび第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに機能可能に連結している少なくとも１つのプロモーターを有する発現ベクターを含む組換え腫瘍ワクチンを提供する。
【０００７】
別の態様において、本開示は、薬学的に許容可能な担体と、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチド、ならびに第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つに機能可能に連結している少なくとも１つのプロモーターを含有する腫瘍ワクチンとを含有する医薬組成物を提供する。
【０００８】
別の態様において、本開示は、薬学的に許容可能な担体と、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチド、ならびに第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つに機能可能に連結している少なくとも１つのプロモーターを含有する腫瘍ワクチンとを含有する医薬組成物を対象に投与することを含む、腫瘍を治療する方法を提供する。
【０００９】
別の態様において、本開示は、薬学的に許容可能な担体と、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドセグメント、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドセグメント、ならびに第１のポリヌクレオチドセグメントおよび第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに機能可能に連結している少なくとも１つのプロモーターを含有する腫瘍ワクチンとを含有する医薬組成物を提供する。
【００１０】
別の態様において、本開示は、薬学的に許容可能な担体と、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドセグメント、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドセグメント、ならびに第１のポリヌクレオチドセグメントおよび第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに機能可能に連結している少なくとも１つのプロモーターを含有する腫瘍ワクチンとを含有する医薬組成物を対象に投与することを含む、腫瘍を治療する方法を提供する。
【００１１】
前述の概要は例示的なものにすぎず、多少なりとも限定することを意図したものではない。上記の例示的な態様、実施形態、および特徴に加えて、さらなる態様、実施形態、および特徴が、図面および以下の発明を実施するための形態を参照することによって明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】発現ベクターｐＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦの概略的マップを示す図である。
【図２】アデノウイルスＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦのゲノムの概略的マップを示す図である。
【図３】アデノウイルスＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦのゲノムの概略的マップを示す図である。
【図４】それぞれ１０、１００、および１０００の感染多重度（ＭＯＩ）でＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦに感染させたＢ１６細胞（ａ）、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ｂ）、およびＨｅｌａ細胞（ｃ）における、ＥＬＩＳＡによって決定されたｍＧＭ−ＣＳＦの発現レベルを示す図である。
【図５】それぞれ１０、１００、および１０００のＭＯＩでＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦに感染させたＢ１６細胞（ａ）、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ｂ）、およびＨｅｌａ細胞（ｃ）における、ＥＬＩＳＡによって決定されたｈＨＳＰ７０の発現レベルを示す図である。
【図６】３００の感染多重度における、異なる腫瘍細胞に対するＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦの細胞傷害効果を示す図である。
【図７】１００の感染多重度における、異なる腫瘍細胞に対するＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦの細胞傷害効果を示す図である。
【図８】３０の感染多重度における、異なる腫瘍細胞に対するＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦの細胞傷害効果を示す図である。
【図９】異なる７タイプの細胞に対するＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦの細胞傷害性を示す図である。
【図１０】Ａｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦで処理されたマウスにおける腫瘍サイズの変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下の発明を実施するための形態において、本明細書の一部を形成する添付の図面が参照される。図面において、類似の記号は、典型的には、文脈から別段の指示がない限り、類似の構成要素を特定する。発明を実施するための形態、図面、および特許請求の範囲において記載されている例示的な実施形態は、限定するためのものではない。本明細書において提示される対象の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態が利用され得、また他の変化がなされ得る。
【００１４】
核酸組成物
本開示は、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチド、ならびに第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つに機能可能に連結している少なくとも１つのプロモーターを含有する組成物を有する組換え腫瘍ワクチンに関する。
【００１５】
本明細書において用いられる用語「組換え」は、１つまたは複数の分子生物学的技術を用いて１つまたは複数の生体分子、例えばポリヌクレオチド分子またはポリペプチド分子を人工的に操作して、このような（１つまたは複数の）生体分子をその天然状態以外の何かにすることを言う。
【００１６】
本明細書において用いられる用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、または混合リボ核酸−デオキシリボ核酸、例えばＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを言う。ポリヌクレオチドまたは核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。ポリヌクレオチドまたは核酸は、線状または環状であり得る。
【００１７】
本明細書において用いられる用語「コードする」または「をコードする」は、ｍＲＮＡに転写され得ることおよび／またはペプチドもしくはタンパク質に翻訳され得ることを言う。「コード配列」または「遺伝子」は、ｍＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を言う。これらの２つの用語は、本開示において区別せずに用いられる。
【００１８】
本明細書において用いられる用語「ｍＲＮＡ」は、鋳型ＤＮＡ配列に相補的であり、タンパク質合成のための鋳型として働き得るＲＮＡ分子を言う。
【００１９】
本明細書において用いられる用語「抗原提示ポリペプチド」は、抗原に結合し得、抗原を抗原提示細胞に提示し得、かつ抗原提示細胞による抗原の認識を容易にし得るポリペプチドまたはタンパク質を言う。
【００２０】
本明細書において用いられる用語「抗原提示細胞」は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）をその表面上に有する抗原を提示して、提示された抗原をＴ細胞が認識できるようにし得る細胞を言う。提示された抗原は、Ｔ細胞などの免疫細胞によって認識され得、Ｔ細胞はその結果、抗原に対する免疫応答を生じさせる。ある実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、または上皮細胞である。例示的な実施形態において、抗原提示細胞は樹状細胞である。
【００２１】
本明細書において用いられる用語「機能可能に連結している」は、コード配列の発現を可能にするように、コード配列が直接的にまたは間接的に１つまたは複数の調節配列に連結しているかまたはこれを伴っていることを言う。
【００２２】
本明細書において用いられる用語「発現」は、ｍＲＮＡへのコード配列の転写、および／またはペプチドもしくはタンパク質へのコード配列の翻訳を言う。
【００２３】
本明細書において用いられる用語「転写」は、ＤＮＡ配列がＲＮＡポリメラーゼによって読み取られて、ＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ鎖が生産される、ＲＮＡ合成のプロセスを言う。
【００２４】
本明細書において用いられる用語「翻訳」は、ｍＲＮＡ配列がリボソームによって読み取られて、ｍＲＮＡ配列に含有されるアミノ酸コドンに従ったアミノ酸鎖が生産される、ペプチド合成またはタンパク質合成のプロセスを言う。
【００２５】
本明細書において用いられる用語「調節配列」は、コード配列の発現に必要なまたは有利な任意のヌクレオチド配列を言う。調節配列には、限定はしないが、１つまたは複数のプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化配列、および内部リボソーム侵入部位が含まれ得る。
【００２６】
本明細書において用いられる用語「プロモーター」は、コード配列の転写を制御し得るポリヌクレオチド配列を言う。プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合、および転写開始に十分な特定の配列を含む。さらに、プロモーター配列は、このＲＮＡポリメラーゼの認識、結合、および転写開始活性を調整する配列を含み得る。プロモーターは、それ自体と同一の核酸分子上に位置する遺伝子、またはそれ自体と異なる核酸分子上に位置する遺伝子の転写に影響し得る。プロモーター配列の機能は、調節の性質に応じて、構成的なものであり得るか、または刺激によって誘導されるものであり得る。「構成的」プロモーターは、宿主細胞における遺伝子発現を連続的に活性化させるように機能するプロモーターを言う。「誘導性」プロモーターは、特定の（１つまたは複数の）刺激の存在下で宿主細胞における遺伝子発現を活性化させるプロモーターを言う。
【００２７】
本明細書において用いられる用語「エンハンサー」は、コード配列の転写および／または翻訳を増大させるヌクレオチド配列を言う。エンハンサーは、コード配列の５’末端または３’末端に機能可能に連結していてよい。真核細胞において機能的な任意のエンハンサーを、本開示において用いることができる。エンハンサーの具体例には、限定はしないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するエンハンサーが含まれる。
【００２８】
本明細書において用いられる用語「転写ターミネーター」は、真核細胞のＲＮＡポリメラーゼによって認識されて転写を終結させるヌクレオチド配列を言う。ターミネーター配列は、コード配列の３’末端に機能可能に連結していてよい。ある実施形態において、ターミネーターは、ＲＮＡ上のポリアデニル化部位が曝露され得るようにＲＮＡを切断するためのシグナルを含み得る。真核細胞において機能的な任意のターミネーター配列を、本開示において用いることができる。ターミネーター配列の具体例には、限定はしないが、ウイルスに由来する終結配列、例えばＳＶ４０ターミネーター、および既知の遺伝子に由来する終結配列、例えばウシ成長ホルモンターミネーター配列が含まれる。
【００２９】
本明細書において用いられる用語「ポリアデニル化配列」は、転写されると真核細胞によって、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして認識される、ヌクレオチド配列を言う。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端に機能可能に連結していてよい。真核細胞において機能的な任意のポリアデニル化配列を、本開示において用いることができる。ポリアデニル化配列の具体例には、限定はしないが、ＡＡＵＡＡＡおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが含まれる。
【００３０】
本明細書において用いられる用語「内部リボソーム侵入部位」（ＩＲＥＳ）は、ｍＲＮＡ配列の中央からの翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列を言う。ＩＲＥＳは、１つのポリヌクレオチド分子上にある２つ以上のコード配列を分離して、２つ以上のコード産物の個別の翻訳を可能にするために用いることができる。ＩＲＥＳは、第１のコード配列の３’末端の後および第２のコード配列の５’末端の前の位置で、機能可能に連結され得る。真核細胞において機能的な任意のＩＲＥＳ配列を、本開示において用いることができる。ＩＲＥＳの具体例には、限定はしないが、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ＩＲＥＳ、およびＣ型肝炎ＩＲＥＳが含まれ得る。
【００３１】
本開示は、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよびサイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドを含有する組成物を提供する。ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、異なる核酸分子上にある。ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、同一の核酸分子上にある。ある実施形態において、単一のプロモーターが、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの発現を制御する。ある実施形態において、異なるプロモーターが、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの発現を制御する。
【００３２】
ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、第１および第２のポリヌクレオチドの発現を制御する１つのプロモーターに機能可能に連結しており、ここで、第１のポリヌクレオチドセグメントおよび第２のポリヌクレオチドセグメントは、ＩＲＥＳ配列によって分離している。
【００３３】
ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの発現を制御する第１のプロモーターに機能可能に連結しており、第２のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの発現を制御する第２のプロモーターに機能可能に連結している。第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、同一であっても異なっていてもよい。
【００３４】
ある実施形態において、本開示のプロモーターは、真核生物プロモーター、例えば、ＣＭＶ由来のプロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター（ＣＭＶプロモーター））、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター（例えば、ＨＩＶの長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター）、モロニーウイルスプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ヒト遺伝子由来のプロモーター、例えばヒトミオシンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター、ヒト筋肉クレアチンプロモーター、ヒトメタロチオネインベータアクチンプロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、ヒトチミジンキナーゼプロモーター（ＴＫ）、ヒト伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１Ａ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、Ｅ２Ｆ−１プロモーター（Ｅ２Ｆ１転写因子１のプロモーター）、アルファフェトプロテインのプロモーター、コレシストキニンのプロモーター、癌胎児性抗原のプロモーター、Ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ癌遺伝子のプロモーター、シクロオキシゲナーゼのプロモーター、ＣＸＣ−ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）のプロモーター、ヒト精巣上体タンパク質４（ＨＥ４）のプロモーター、ヘキソキナーゼＩＩ型のプロモーター、Ｌ−プラスチンのプロモーター、ムチン様糖タンパク質（ＭＵＣ１）のプロモーター、前立腺特異的な抗原（ＰＳＡ）のプロモーター、スルビビンのプロモーター、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ１）のプロモーター、およびチロシナーゼのプロモーターである。
【００３５】
ある実施形態において、本開示のプロモーターは、腫瘍特異的なプロモーターであり得る。本明細書において用いられる用語「腫瘍特異的なプロモーター」は、腫瘍細胞において遺伝子発現を優先的にまたは排他的に活性化するように機能し、非腫瘍細胞または非癌細胞において活性を有さないかまたは活性が低減しているプロモーターを言う。腫瘍特異的なプロモーターの具体例には、限定はしないが、Ｅ２Ｆ−１プロモーター、アルファフェトプロテインのプロモーター、コレシストキニンのプロモーター、癌胎児性抗原のプロモーター、Ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ癌遺伝子のプロモーター、シクロオキシゲナーゼのプロモーター、ＣＸＣＲ４のプロモーター、ＨＥ４のプロモーター、ヘキソキナーゼＩＩ型のプロモーター、Ｌ−プラスチンのプロモーター、ＭＵＣ１のプロモーター、ＰＳＡのプロモーター、スルビビンのプロモーター、ＴＲＰ１のプロモーター、およびチロシナーゼのプロモーターが含まれる。ある実施形態において、本開示のプロモーターはＥ２Ｆ−１である。ある実施形態において、Ｅ２Ｆ−１プロモーターは、配列番号２９のヌクレオチド配列を有する。
【００３６】
上記の第１のプロモーターおよび／または第２のプロモーターは、構成的プロモーターであり得る。ある実施形態において、構成的プロモーターは、基本的な細胞機能に必要であるハウスキーピング遺伝子のプロモーターであり得る。具体例には、限定はしないが、ベータアクチンプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＴＫプロモーター、およびＥＦ１Ａプロモーターが含まれる。ある実施形態において、構成的プロモーターはウイルスプロモーターであり得る。具体例には、限定はしないが、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、およびＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが含まれる。
【００３７】
ある実施形態において、本開示の組換え核酸組成物は、ＣＭＶプロモーターなどの構成的プロモーターによって制御される、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、Ｅ２Ｆ−１プロモーターなどの腫瘍特異的なプロモーターによって制御される、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドとを含有する。
【００３８】
ある実施形態において、抗原提示ポリペプチドは熱ショックタンパク質である。熱ショックタンパク質は、細胞が高温または他のストレスに曝露されるとその発現が増大するタンパク質ファミリーである。熱ショックタンパク質は、適切な立体構造を作るためのタンパク質のフォールディングにおいて重要な役割を果たすことが知られている。さらに、熱ショックタンパク質は、タンパク質断片を免疫系に提示することが明らかにされている。
【００３９】
任意の熱ショックタンパク質を、本開示の抗原提示ポリペプチドとして用いることができる。熱ショックタンパク質の具体例には、限定はしないが、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ２０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７１、Ｈｓｐ７２、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４、Ｈｓｐ１１０、アルファ−Ｂ−クリスタリン、およびグルコース調節型のタンパク質が含まれる。
【００４０】
ある実施形態において、抗原提示ポリペプチドはＨｓｐ７０である。Ｈｓｐ７０タンパク質には、限定はしないが、Ｈｓｐ７０−１、Ｈｓｐ７０−２、Ｈｓｐ７０−４、Ｈｓｐ７０−５、Ｈｓｐ７０−６、Ｈｓｐ７０−７、Ｈｓｐ７０−８、Ｈｓｐ７０−９、Ｈｓｐ７０−１２、およびＨｓｐ７０−１４が含まれる。ある実施形態において、抗原提示ポリペプチドはＨｓｐ７０−１である。Ｈｓｐ７０−１タンパク質には、限定はしないが、Ｈｓｐ７０−１ＡおよびＨｓｐ７０−１Ｂが含まれる。
【００４１】
ある実施形態において、抗原提示ポリペプチドはＨｓｐ９０である。Ｈｓｐ９０タンパク質には、限定はしないが、Ｈｓｐ９０−α1、Ｈｓｐ９０−α2、Ｈｓｐ９０−β、エンドプラスミン、およびＴＮＦ受容体関連タンパク質１が含まれる。
【００４２】
ある実施形態において、抗原提示ポリペプチドはグルコース調節型タンパク質である。グルコース調節型タンパク質には、限定はしないが、グルコース調節型タンパク質７５（Ｇｒｐ７５、Ｈｓｐ７０−９としても知られている）、Ｇｒｐ７８（Ｈｓｐ７０−５としても知られている）、Ｇｒｐ９４（エンドプラスミンとしても知られている）、およびＧｒｐ１７０が含まれる。
【００４３】
熱ショックタンパク質の具体例およびそれらのＧｅｎＢａｎｋ受託番号を表１に列挙する。
【００４４】
【表１】
2013532977.tif 000003
【００４５】
ある実施形態において、本開示の抗原提示ポリペプチドは、抗原を抗原提示細胞に提示する機能を保持している、完全長熱ショックタンパク質の断片である。ある実施形態において、本開示の抗原提示ポリペプチドは、天然抗原提示ポリペプチドの機能的同等物である。機能的同等物は、天然抗原提示ポリペプチドに対して構造的に相同であり、抗原を抗原提示細胞に提示するように機能し得る。天然抗原提示ポリペプチドの機能的同等物は、天然抗原提示ポリペプチド配列に対する１つまたは複数の保存的なもしくは非保存的なアミノ酸の置換、付加、欠失、修飾、または他の変更を有し得る。
【００４６】
ある実施形態において、本開示の抗原提示ポリペプチドは、１つまたは複数の熱ショックタンパク質とペプチド配列同一性を共有する。本明細書において用いられる用語「ペプチド配列同一性」は、候補配列と鋳型配列との間の同一アミノ酸残基を最大にするために配列をアラインし、必要であればギャップを導入した後に、かついかなる保存的な置換も配列同一性の一部として考慮せずに、鋳型配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基を言う。
【００４７】
２つのアミノ酸配列の同一性は、２つのアミノ酸配列をアラインすることによって決定することができる。ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを、アラインメントにおいて用いることができる。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたる最大アラインメントの達成に必要な任意のアルゴリズムを含めた、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００４８】
ある実施形態において、抗原提示ポリペプチドは、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ２０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７１、Ｈｓｐ７２、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４、Ｈｓｐ１１０、アルファ−Ｂ−クリスタリン、およびグルコース調節型タンパク質の１つと、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９９％のペプチド配列同一性を有する。
【００４９】
ある実施形態において、抗原提示ポリペプチドは、Ｈｓｐ７０と、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９９％のペプチド配列同一性を有する。
【００５０】
ある実施形態において、抗原提示ポリペプチドは、１つまたは複数の熱ショックタンパク質に由来する１つまたは複数の機能的ドメインを含有する。本明細書において用いられる用語「機能的ドメイン」は、抗原を抗原提示細胞に提示する機能を有する、熱ショックタンパク質の一部を言い、この機能は、残りのタンパク質配列および構造と無関係である。ある実施形態において、抗原提示ポリペプチドは、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７１、Ｈｓｐ７２、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４、アルファ−Ｂ−クリスタリン、およびグルコース調節型タンパク質からなる群から選択される１つまたは複数の熱ショックタンパク質に由来する１つまたは複数の機能的ドメインを含有する。
【００５１】
ある実施形態において、核酸組成物は、１つまたは複数の熱ショックタンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含有する。ある実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、１つ、２つ、３つ、または４つの熱ショックタンパク質をコードし得る。ある実施形態において、本開示の組成物は、１つ、２つ、３つ、または４つのポリヌクレオチドを含有し、そのそれぞれは１つの熱ショックタンパク質をコードする。ある実施形態において、組成物は、２つ以上の熱ショックタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する。
【００５２】
本明細書において用いられる用語「サイトカイン」は、細胞によって分泌され、かつ免疫細胞の機能の刺激、免疫細胞の成長の促進、または必要な局部への免疫細胞の方向付けなどの免疫調節効果を有する、タンパク質またはポリペプチドを言う。
【００５３】
任意の適切なサイトカインを本開示に用いることができる。サイトカインの具体例には、限定はしないが、コロニー刺激因子、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、幹細胞因子、およびエリスロポエチン；インターフェロン（ＩＦＮ）、例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、およびＩＦＮω；インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３５；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦαおよびＴＮＦβ；ケモカイン、例えば、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、およびＣＸ３Ｌ１が含まれる。
【００５４】
ある実施形態において、本開示のサイトカインは、抗原提示細胞の機能および／または蓄積を刺激し得る。ある実施形態において、サイトカインには、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、幹細胞因子、およびエリスロポエチンが含まれる。ある実施形態において、本開示のサイトカインはＧＭ−ＣＳＦである。ＧＭ−ＣＳＦの具体例およびそれらのＧｅｎＢａｎｋ受託番号を表２に列挙する。
【００５５】
【表２】
2013532977.tif 000004
【００５６】
ある実施形態において、本開示のサイトカインは、サイトカインの免疫調節効果の機能を保持している、サイトカインの断片である。
【００５７】
ある実施形態において、本開示のサイトカインは、１つまたは複数のサイトカインとペプチド配列同一性を共有する。ある実施形態において、第２のポリヌクレオチドによってコードされるサイトカインは、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、幹細胞因子、およびエリスロポエチンの１つまたは複数と、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９９％のペプチド配列同一性を有する。
【００５８】
ある実施形態において、第２のポリヌクレオチドによってコードされるサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦと、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９９％のペプチド配列同一性を有する。
【００５９】
ある実施形態において、サイトカインは、１つまたは複数のサイトカインに由来する１つまたは複数の機能的ドメインを含有する。ある実施形態において、抗原提示ポリペプチドは、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、幹細胞因子、およびエリスロポエチンからなる群から選択される１つまたは複数のサイトカインに由来する１つまたは複数の機能的ドメインを含有する。
【００６０】
ある実施形態において、核酸組成物は、１つまたは複数のサイトカインをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含有する。ある実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、１つ、２つ、３つ、または４つのサイトカインをコードし得る。ある実施形態において、本開示の組成物は、１つ、２つ、３つ、または４つのポリヌクレオチドを含有し、そのそれぞれは１つのサイトカインをコードする。ある実施形態において、組成物は、２つ以上のサイトカインをコードするポリヌクレオチドを含有する。
【００６１】
ある実施形態において、組成物は、細胞毒性遺伝子をコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含有する。本明細書において用いられる用語「細胞毒性遺伝子」は、細胞死を含めた細胞傷害性を誘発または増強するように機能し得る遺伝子を言う。ある実施形態において、細胞毒性遺伝子は、マクロファージなどの他の細胞による溶解に対する細胞の感受性を向上させ得る。細胞毒性遺伝子の具体例には、限定はしないが、チミジンキナーゼ遺伝子およびシトシンデアミナーゼ遺伝子が含まれる。
【００６２】
第３のポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結していてよい。ある実施形態において、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、および第３のポリヌクレオチドの発現は、同一のプロモーターによって制御される。ある実施形態において、第１、第２、および第３のポリヌクレオチドの２つの発現は、同一のプロモーターによって制御される。ある実施形態において、１つまたは複数のＩＲＥＳ配列を用いて、同一のポリヌクレオチド分子上のコード配列を分離して、コード産物が個別に翻訳され、ポリヌクレオチド分子から個別に発現するようにすることができる。
【００６３】
ある実施形態において、異なるプロモーターが、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、および第３のポリヌクレオチドの発現を制御する。ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドは第１のプロモーターに機能可能に連結しており、第２のポリヌクレオチドは第２のプロモーターに機能可能に連結しており、第３のポリヌクレオチドは第３のプロモーターに機能可能に連結している。ある実施形態において、第１、第２、および／または第３のプロモーターは、真核生物プロモーターである。ある実施形態において、第１、第２、および／または第３のプロモーターは、構成的プロモーターである。ある実施形態において、第１、第２、および／または第３のプロモーターは、腫瘍特異的なプロモーターである。ある実施形態において、第１、第２、および第３のプロモーターの少なくとも１つは、腫瘍特異的なプロモーターである。ある実施形態において、第１、第２、および第３のプロモーターの少なくとも２つは、腫瘍特異的なプロモーターである。ある実施形態において、第１、第２、および第３のプロモーターの全ては、腫瘍特異的なプロモーターである。
【００６４】
本開示の核酸配列は、公開されているか、または当業者が容易に入手することができる。本開示のポリヌクレオチドまたは核酸は、当技術分野における周知の組換え技術を通して作製することができる（例えば、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい）。
【００６５】
発現ベクター
上記のポリヌクレオチドは、１つまたは複数の発現ベクター内に挿入することができる。本開示は、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドセグメント、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドセグメント、および少なくとも１つのプロモーターを含有する発現ベクターであって、少なくとも１つのプロモーターが第１のポリヌクレオチドセグメントおよび第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに機能可能に連結している発現ベクターを提供する。
【００６６】
本明細書において用いられる用語「発現ベクター」は、細胞を形質転換またはトランスフェクトし得、かつ細胞における遺伝子発現を可能にし得る、ポリヌクレオチド媒体を言う。本明細書において用いられる用語「セグメント」は、核酸配列の一部または断片を言う。
【００６７】
本開示の発現ベクターは、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、またはコスミドであり得る。ある実施形態において、本開示の発現ベクターは、ウイルス、プラスミド、ファージ、もしくはコスミドに由来する１つまたは複数の遺伝子配列、またはその断片をさらに含み得る。
【００６８】
ある実施形態において、本開示の発現ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、ウイルスゲノムの全体または一部を含有し得る。ある実施形態において、ウイルスベクターは、２つ以上のウイルスのウイルスゲノムの全体または一部を含有する。
【００６９】
ある実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスに由来する。アデノウイルスは、宿主ゲノム内に組み込まれ得ない二本鎖の線状ＤＮＡゲノムを有する。アデノウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、第１世代アデノベクター（例えば、Ｅ１ａ遺伝子およびＥ１ｂ遺伝子が欠失しているアデノベクター、ならびにＥ１遺伝子およびＥ３遺伝子が欠失しているアデノベクター）、第二世代アデノウイルスベクター（例えば、Ｅ１遺伝子およびＥ２遺伝子が欠失しているアデノベクター、Ｅ１遺伝子およびＥ４遺伝子が欠失しているアデノベクター）、および全てのウイルスコード配列が欠失しているガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスベクター（ヘルパー依存性アデノウイルスベクターとも呼ばれる）が含まれる。
【００７０】
ある実施形態において、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する。アデノ随伴ウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染し得、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。アデノ随伴ウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型３、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型６、ＡＡＶ血清型７、ＡＡＶ血清型８、ＡＡＶ血清型９、ＡＡＶ血清型１０、ＡＡＶ血清型１１、およびＡＡＶ血清型１２に由来するベクターが含まれる。
【００７１】
ある実施形態において、ウイルスベクターはレトロウイルスに由来する。レトロウイルスは、ＲＮＡゲノムを有し、逆転写酵素を介して宿主細胞内で複製して、ＲＮＡゲノムからＤＮＡを生産することができる。レトロウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、鳥白血病ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、マウス白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス、ＨＩＶ−１（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）、ＥＩＡＶ（ウマ感染性貧血ウイルス）、ＦＩＶ（ネコ免疫不全ウイルス）、ＣＡＥＶ（ヤギ関節炎脳炎ウイルス）、ＶＭＶ（ビスナ／マエディウイルス）、ヒトスプマウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、およびサル泡沫状ウイルスに由来するベクターが含まれる。
【００７２】
ある実施形態において、ウイルスベクターはレンチウイルスに由来する。レンチウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、ＨＩＶ−１、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＶ、およびＥＩＡＶに由来するベクターが含まれる。
【００７３】
ある実施形態において、ウイルスベクターはアルファウイルスに由来する。アルファウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、オニョンニョンウイルス、チクングニヤウイルス、マヤロウイルス、ロスリバーウイルス、およびバーマフォレストウイルスに由来するベクターが含まれる。
【００７４】
ある実施形態において、ベクターはポックスウイルスに由来する。ポックスウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、ワクシニアウイルス、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、鳥ポックスウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、天然痘、オルフウイルス、偽牛痘、ウシ血疹性口内炎ウイルス、タナ痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、および伝染性軟属腫ウイルスに由来するベクターが含まれる。
【００７５】
ある実施形態において、ベクターはヘルペスウイルスに由来する。ヘルペスウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス−２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、リンホクリプトウイルス、ＣＭＶ、ヘルペスリンパ向性ウイルス、ロゼオロウイルス、およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）に由来するベクターが含まれる。
【００７６】
ある実施形態において、ベクターはポリオウイルスに由来する。ポリオウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、ポリオウイルス血清型１（ＰＶ１）、ＰＶ２、およびＰＶ３に由来するベクターが含まれる。
【００７７】
ある実施形態において、発現ベクターはバキュロウイルスに由来する。バキュロウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａのマルチカプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）、ｏｒｇｙｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａのマルチカプシド多角体病ウイルス（ＯｐＭＮＰＶ）、ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒのマルチカプシド核多角体病ウイルス（ＬｄＭＮＰＶ）、ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉの核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）、ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａの核多角体病ウイルス（ＣｆＭＮＰＶ）、ｃｒｙｐｔｏｐｈｌｅｂｉａ  ｌｅｕｃｏｔｒｅｔａの顆粒病ウイルス（ＣｌＧＶ）、ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｚｅａの核多角体病ウイルス（ＨｚＳＮＰＶ）、およびｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａの顆粒病ウイルス（ＣｐＧＶ）に由来する発現ベクターが含まれる。
【００７８】
ある実施形態において、発現ベクターはパピローマウイルスに由来する。パピローマウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、ウシパピローマウイルス４型、ウシパピローマウイルス２型、ヒトパピローマウイルス１１型、ヒトパピローマウイルス５ｂ型、ヒトパピローマウイルス６ｂ型、ウシパピローマウイルス１型、ワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）、シカパピローマウイルス（ＤＰＶ）、ヒトパピローマウイルス１３型、およびヒトパピローマウイルス１６型に由来するベクターが含まれる。
【００７９】
ある実施形態において、発現ベクターはポリオーマウイルスに由来する。ポリオーマウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、セキセイインコ雛病ウイルス（ＢＦＰｙＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ＢＫポリオーマウイルス（ＢＫＰｙＶ）、ウシポリオーマウイルス（ＢＰｙＶ）、ハムスターポリオーマウイルス（ＨａＰｙＶ）、ＪＣポリオーマウイルス（ＪＣＰｙＶ）（ＪＣＶ）、マウスポリオーマウイルス（ＭＰｙＶ）、およびＢリンパ球向性ポリオーマウイルス（ＬＰＶ）に基づくベクターが含まれる。
【００８０】
ある実施形態において、発現ベクターはパルボウイルスに由来する。パルボウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）、ハムスターパルボウイルスＨ１、ミンク腸炎ウイルス（ＭＥＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、パルボウイルスＬｕＩＩＩ、およびブタパルボウイルス（ＰＰＶ）に由来する発現ベクターが含まれる。
【００８１】
ある実施形態において、ウイルスベクターは麻疹ウイルスに由来する。ある実施形態において、ウイルスベクターは水胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に由来する。ある実施形態において、ウイルスベクターは呼吸器および腸管オーファンウイルス（ＲＥＯウイルス）に由来する。ある実施形態において、ウイルスベクターはニューカッスル病ウイルスに由来する。ある実施形態において、ウイルスベクターはセンダイウイルス（ＳｅＶ）に由来する。
【００８２】
ある実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶ、ＶＳＶ、麻疹ウイルス、ＲＥＯウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびＳｅＶからなる群から選択される１つまたは複数のウイルスに由来するベクターである。
【００８３】
ある実施形態において、ウイルスベクターは細胞溶解し得る。細胞溶解性のウイルスベクターは、宿主細胞において複製し、宿主細胞の溶解によって細胞から放出されるウイルス粒子に集合することが可能である。細胞溶解性のウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶ、ＶＳＶ、麻疹ウイルス、ＲＥＯウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびＳｅＶに由来するベクターが含まれる。
【００８４】
ある実施形態において、ウイルスベクターは、腫瘍細胞が感染した際のウイルス遺伝子の発現のための腫瘍特異的なプロモーターを含有する。
【００８５】
ある実施形態において、発現ベクターはプラスミドである。プラスミドベクターの具体例には、限定はしないが、ｐＢＲ３２２、ｐＴＺ１９Ｒ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ５７、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ系、およびｐｃＤＮＡ３が含まれる。
【００８６】
ある実施形態において、発現ベクターはファージベクターである。ファージの具体例には、限定はしないが、Ｔ４ファージ、ラムダファージ、Ｔ７ファージ、ｐ１ファージ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩファージミド、およびｐＢＣファージミドが含まれる。
【００８７】
ある実施形態において、発現ベクターはコスミドベクターである。コスミドベクターの具体例には、限定はしないが、ＳｕｐｅｒＣｏｓ１ベクター、ｐＪＣ８１、およびｐＨＳ２６２が含まれる。
【００８８】
本開示の発現ベクターは、宿主細胞のゲノム内に組み込まれない一過性発現ベクター、または宿主細胞内への導入の後に宿主細胞のゲノム内にその遺伝子を組み込み得る安定な発現ベクターであり得る。
【００８９】
ある実施形態において、発現ベクターは一過性発現ベクターである。宿主細胞が分裂するにつれ、一過性発現ベクターは宿主細胞において希薄となり、したがって、外因性遺伝子を限られた時間のみ発現させる。一過性発現ベクターの具体例には、限定はしないが、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、非組み込みプラスミド、またはファージが含まれる。
【００９０】
ある実施形態において、発現ベクターは安定な発現ベクターである。安定な発現ベクターは、任意のランダムな部位または特定の指定された部位で宿主ゲノム内に組み込まれ得る。組み込まれた遺伝子は、宿主ゲノムに沿って複製し得、したがって、宿主細胞における遺伝子の安定な発現を可能にする。安定な発現ベクターの具体例には、限定はしないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、および組み込みプラスミドに由来するベクターが含まれる。
【００９１】
本開示の発現ベクターは、複製可能ベクターまたは複製欠損ベクターであり得る。ある実施形態において、発現ベクターは複製可能ベクターである。本明細書において用いられる用語「複製可能ベクター」は、自己複製に必要な（１つまたは複数の）配列を含有し、宿主細胞において自ら（宿主ゲノム内に組み込まれることなく）複製し得るベクターを言う。ある実施形態において、複製可能ベクターは、腫瘍細胞などの特定の特異的宿主細胞において選択的にまたは条件付きで複製し得る。
【００９２】
ある実施形態において、複製可能ベクターはウイルスベクターであり得る。複製可能ウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶ、ＶＳＶ、麻疹ウイルス、ＲＥＯウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびＳｅＶに由来するベクターが含まれる。ある実施形態において、複製可能ウイルスベクターは、ウイルスの複製に必須のウイルス遺伝子を含有する。例えば、複製可能アデノウイルスベクターは、アデノウイルスのＥ１ａ遺伝子を含有する。ある実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子は、腫瘍特異的なプロモーターに機能可能に連結している。ある実施形態において、アデノウイルスのＥ１ａ遺伝子は、配列番号３０のヌクレオチド配列を有する。
【００９３】
ある実施形態において、発現ベクターは複製欠損ベクターであり得る。本明細書において用いられる用語「複製欠損ベクター」は、宿主細胞において自ら複製し得ないベクターを言う。ある実施形態において、複製欠損ベクターはウイルスベクターであり得る。複製欠損ウイルスベクターの具体例には、限定はしないが、Ｅ１ａ遺伝子機能を欠いているかまたはそれが欠損しているアデノウイルスベクターが含まれる。
【００９４】
ある実施形態において、本開示の発現ベクターは、抗原提示ペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドセグメントを含有し、抗原提示ペプチドは熱ショックタンパク質である。ある実施形態において、発現ベクターは、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドセグメントをさらに含有し、サイトカインはＧＭ−ＣＳＦである。ある実施形態において、発現ベクターは、第１および／または第２のポリヌクレオチドセグメントに機能可能に連結している１つまたは複数のプロモーターを含有する。
【００９５】
ある実施形態において、発現ベクターの第１および／または第２のポリヌクレオチドセグメントに機能可能に連結しているプロモーターは、真核生物プロモーターである。ある実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーター、例えば、ベータアクチンプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＴＫプロモーター、ＥＦ１Ａプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、およびＣａＭＶ３５Ｓプロモーターである。ある実施形態において、プロモーターは、腫瘍特異的なプロモーター、例えば、Ｅ２Ｆ−１プロモーター、アルファフェトプロテインのプロモーター、コレシストキニンのプロモーター、癌胎児性抗原のプロモーター、Ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ癌遺伝子のプロモーター、シクロオキシゲナーゼのプロモーター、ＣＸＣＲ４のプロモーター、ＨＥ４のプロモーター、ヘキソキナーゼＩＩ型のプロモーター、Ｌ−プラスチンのプロモーター、ＭＵＣ１のプロモーター、ＰＳＡのプロモーター、スルビビンのプロモーター、ＴＲＰ１のプロモーター、およびチロシナーゼのプロモーターである。
【００９６】
ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドセグメントおよび第２のポリヌクレオチドセグメントの発現は、同一のプロモーターによって制御される。ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドセグメントおよび第２のポリヌクレオチドセグメントは、１つのプロモーターに機能可能に連結しており、ここで、第１のポリヌクレオチドセグメントおよび第２のポリヌクレオチドセグメントは、ＩＲＥＳ配列によって分離している。
【００９７】
ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドセグメントおよび第２のポリヌクレオチドセグメントの発現は、異なるプロモーターによって制御される。ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドセグメントは第１のプロモーターに機能可能に連結しており、第２のポリヌクレオチドセグメントは第２のプロモーターに機能可能に連結している。ある実施形態において、第１のプロモーターは構成的プロモーターであり、第２のプロモーターは腫瘍特異的なプロモーターである。ある実施形態において、第１のプロモーターは腫瘍特異的なプロモーターであり、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。ある実施形態において、第１および第２のプロモーターは、両方とも腫瘍特異的なプロモーターである。
【００９８】
ある実施形態において、発現ベクターは、細胞毒性遺伝子をコードする第３のポリヌクレオチドセグメントをさらに含有する。第３のポリヌクレオチドセグメントは、プロモーターに機能可能に連結していてよい。ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドセグメント、第２のポリヌクレオチドセグメント、および第３のポリヌクレオチドセグメントの発現は、同一のプロモーターによって制御される。ある実施形態において、第１、第２、および第３のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも２つの発現は、同一のプロモーターによって制御される。ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドセグメントおよび第３のポリヌクレオチドセグメントの発現は、同一のプロモーターによって制御される。ある実施形態において、第２のポリヌクレオチドセグメントおよび第３のポリヌクレオチドセグメントの発現は、同一のプロモーターによって制御される。ある実施形態において、１つまたは複数のＩＲＥＳ配列を用いて、同一のポリヌクレオチド分子上のコード配列を分離して、コード産物が個別に翻訳され、ポリヌクレオチド分子から個別に発現するようにすることができる。
【００９９】
ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドセグメント、第２のポリヌクレオチドセグメント、および第３のポリヌクレオチドセグメントの発現は、異なるプロモーターによって制御される。ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドセグメントは第１のプロモーターに機能可能に連結しており、第２のポリヌクレオチドセグメントは第２のプロモーターに機能可能に連結しており、第３のポリヌクレオチドセグメントは第３のプロモーターに機能可能に連結している。ある実施形態において、第１、第２、および／または第３のプロモーターは、真核生物プロモーターである。ある実施形態において、第１、第２、および／または第３のプロモーターは、構成的プロモーターである。ある実施形態において、第１、第２、および／または第３のプロモーターは、腫瘍特異的なプロモーターである。
【０１００】
発現ベクターは、任意の適切な組換え技術、例えば、限定はしないが、制限酵素および核酸ライゲーションの使用を伴う分子クローニング技術、ならびに２つの類似した核酸鎖の間でのヌクレオチド配列の交換を伴う相同組換え技術を用いて生産することができる（概説は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１；Ｃ．Ｋ．Ｒａｙｍｏｎｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２６（１）：１３４〜１４１（１９９９）を参照されたい）。例えば、市販されているベクターを、制限酵素を用いて線状化し、次に標的配列（例えば、第１のポリヌクレオチドおよび／または第２のポリヌクレオチドおよび／または腫瘍特異的なプロモーター）とライゲーションすることができる。標的配列は、標的配列に相補的なプライマーと、このような標的配列を含有する細胞から単離および精製された標的配列を含有する鋳型とを用いる、ＰＣＲ反応を介して得ることができる。標的配列はまた、対応する制限部位を生じさせる制限酵素を用いる、容易に入手可能なベクターからの消化によって得ることができる。ライゲーションの後、得られたベクターを適切な宿主細胞内に形質転換することができ、ライゲーションされたベクターを含有する宿主細胞が、選択マーカー（例えば抗生物質）を含有する選択培地において選択される。選択された宿主細胞を増殖させ、ベクターを、エタノール沈殿またはゲル抽出などの周知の方法を用いて宿主細胞から単離および精製することができる。得られたベクターは、その後、類似の方法を用いて別の目的の配列と共に挿入することができるか、または将来的に用いるための別の標的配列を生じさせるために制限酵素で消化することができるか、または類似の配列を有する別のベクターとの相同組換えにおいて用いることができる。
【０１０１】
本発明の発現ベクターは、コードされた配列を発現させるための宿主細胞のトランスフェクションに用いることができる。別の態様において、本開示は、本明細書において提供される発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。発現ベクターがそれにトランスフェクトされ得、その中で複製し得る、任意の適切な細胞を、宿主細胞として用いることができる。宿主細胞の具体例には、限定はしないが、酵母細胞および哺乳動物細胞が含まれる。宿主細胞はまた、以下に記載されるような本開示の治療方法を用いる治療が必要な対象から採取された細胞であり得る。発現ベクターは、当技術分野において知られている任意の適切な方法を用いて宿主細胞内に導入することができ、この方法には、限定はしないが、エレクトロポレーション、塩化カルシウム介在性の、塩化リチウム介在性の、酢酸リチウム／ポリエチレングリコール介在性の、リン酸カルシウム介在性の、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性の、リポソーム介在性のポリヌクレオチド取り込み、スフェロプラスト化、注射、マイクロインジェクション、微粒子銃、ファージ感染、ウイルス感染、または他の確立された方法が含まれる。あるいは、目的の遺伝子配列を含有する発現ベクターは、インビトロで転写され得、得られたｍＲＮＡは、周知の方法によって、例えば注射（Ｋｕｂｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．２４１：１１９、（１９８８）を参照されたい）によって、一過性発現のために宿主細胞内に導入することができる。例えば、発現ベクターは、塩化カルシウム溶液と混合し、その後、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水と組み合わせることができ、細胞培養物に導入すると発現ベクターに結合するリン酸カルシウムの細かい沈殿物が形成され、発現ベクターは、沈殿物と共に細胞によって取り込まれる。別の実施例では、発現ベクターをリポソーム体にカプセル化し、細胞に導入することができ、リポソームが細胞膜と融合すると、それらはカプセル化された発現ベクターを細胞内に放出する。さらに別の実施例では、発現ベクターは、細胞膜に微小な穴を生じさせる放電下で細胞内に送達され得る。さらに別の実施例では、発現ベクターは、不活性固体のナノ粒子（例えば金粒子）に結合し得、次に、遺伝子銃などの特殊な装置を用いて、標的細胞の核内に直接発射される。さらに別の実施例では、発現ベクター自体が、細胞に感染しポリヌクレオチド材料を細胞内に放出し得るウイルスであり得る。
【０１０２】
本明細書において提供される発現ベクターを含有する宿主細胞は、任意の適切な形態で提供され得る。例示的な実施形態において、宿主細胞は細胞培養物から単離され、この細胞培養物は、培養培地、細胞残屑、および／または他の望ましくない物質を除去するために、濾過または遠心分離またはそれ以外の処理をされ得る。宿主細胞は、その中の発現ベクターの濃度を増大させるために、当業者によって適切であるとみなされるさらなる精製プロセスを受け得る。組成物は、液体形態または乾燥固体形態で調製することができる。
【０１０３】
医薬組成物
本開示において記載されている核酸組成物、発現ベクター、および宿主細胞は、腫瘍および／または癌を予防および／または治療するための腫瘍ワクチンとして用いることができる。別の態様において、本開示は、薬学的に許容可能な担体と、本明細書において提供される核酸組成物、発現ベクター、および／または宿主細胞とを含む医薬組成物を提供する。核酸、発現ベクター、および宿主細胞は、当技術分野において周知の方法を用いて、構築、単離、および精製することができる。本明細書において用いられる用語「薬学的に許容可能な担体」は、本開示の核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞の保管および対象への投与を容易にし得る、任意のおよび全ての溶媒、分散媒質、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを言う。薬学的に許容可能な担体には、任意の適切な構成要素、例えば、限定はしないが、生理食塩水、リポソーム、ポリマー性賦形剤、コロイド、または担体粒子が含まれ得る。
【０１０４】
ある実施形態において、薬学的に許容可能な担体は、本開示の核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞を溶解または分散させ得る生理食塩水である。生理食塩水の具体例には、限定はしないが、緩衝生理食塩水、正常生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、重炭酸塩緩衝液、ショ糖溶液、塩溶液、およびポリソルベート溶液が含まれる。
【０１０５】
ある実施形態において、薬学的に許容可能な担体はリポソームである。リポソームは、脂溶性材料および内側の水性部分から形成される膜を有する、単一ラメラ小胞または複数ラメラ小胞である。本開示の核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、リポソームの水性部分内でカプセル化され得る。リポソームの具体例には、限定はしないが、３［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｌｏ）に基づくリポソーム、Ｎ−（２，３−ジオレオイロキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）に基づくリポソーム、および１，２−ジオレオイロキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）に基づくリポソームが含まれる。リポソームの調製方法およびリポソーム内への発現ベクターのカプセル化の方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ発行、１９９７を参照されたい）。
【０１０６】
ある実施形態において、薬学的に許容可能な担体は、ポリマー性の賦形剤、例えば、限定はしないが、ミクロスフェア、マイクロカプセル、ポリマー性ミセル、およびデンドリマーである。本開示の核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、当技術分野において知られている方法によって、ポリマーベースの構成要素上にカプセル化、接着、または被覆させることができる（例えば、Ｗ．Ｈｅｉｓｅｒ、Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ発行、２００４；米国特許第６０２５３３７号；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５７（１５）：２１７７〜２２０２（２００５）を参照されたい）。
【０１０７】
ある実施形態において、薬学的に許容可能な担体は、コロイド粒子または担体粒子、例えば、金コロイド、金ナノ粒子、シリカナノ粒子、およびマルチセグメントナノロッドである。核酸、発現ベクター、または細胞は、当技術分野において知られている任意の適切な様式で、担体上に被覆することができるか、担体に接着させることができるか、または担体を伴わせることができる（例えば、Ｍ．Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１０：１８８２〜１８９０（２００３）、Ｃ．Ｍｃｌｎｔｏｓｈら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２３（３１）：７６２６〜７６２９（２００１）、Ｄ．Ｌｕｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８：８９３〜８９５（２０００）、およびＡ．Ｓａｌｅｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２：６６８〜６７１（２００３）を参照されたい）。
【０１０８】
ある実施形態において、医薬組成物は、添加剤、例えば、限定はしないが、安定剤、防腐剤、および細胞による薬剤の取り込みを助けるトランスフェクション促進剤をさらに含み得る。適切な安定剤には、限定はしないが、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、ＥＤＴＡ、およびアルブミンが含まれ得る。適切な防腐剤には、限定はしないが、２−フェノキシエタノール、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、ヒドロキシ安息香酸メチル、フェノール、チメロサール、および抗生物質が含まれ得る。適切なトランスフェクション促進剤には、限定はしないが、カルシウムイオンが含まれ得る。
【０１０９】
ある実施形態において、医薬組成物は、１つまたは複数の抗腫瘍剤をさらに含む。腫瘍または癌に対して活性であることが知られている任意の作用物質を、組成物において用いることができる。ある実施形態において、抗腫瘍剤は、化学的作用物質、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０１１０】
ある実施形態において、抗腫瘍剤は化学的作用物質である。抗腫瘍化学的作用物質の具体例には、限定はしないが、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エトポシド、タモキシフェン、パクリタキセル、ビンクリスチン、およびラパマイシンが含まれる。
【０１１１】
ある実施形態において、抗腫瘍剤はポリヌクレオチドである。抗腫瘍ポリヌクレオチドの具体例には、限定はしないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド、クラステリンアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチド；ならびにＲＮＡ干渉し得るＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびマイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含める）、例えば、抗ＶＥＧＦのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ、抗ｂｃｌ−２のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ、および抗クローディン−３のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡが含まれる。
【０１１２】
ある実施形態において、抗腫瘍剤はペプチドまたはタンパク質である。抗腫瘍ペプチドまたはタンパク質の具体例には、限定はしないが、抗体、例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、エドレコロマブ、アレムツズマブ、ダクリズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、およびエドレコロマブ、タンパク質治療薬、例えば、エンドスタチン、アンジオスタチンＫ１−３、ロイプロリド、性ホルモン結合グロブリン、およびビクニンが含まれる。
【０１１３】
別の態様において、本開示は、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチド、および少なくとも１つのプロモーターを含有する腫瘍ワクチンであって、少なくとも１つのプロモーターが第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つに機能可能に連結している腫瘍ワクチンを提供する。
【０１１４】
別の態様において、本開示は、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドを含有する腫瘍ワクチンであって、第１のポリヌクレオチドがＣＭＶプロモーターなどの構成的プロモーターに機能可能に連結しており、第２のポリヌクレオチドがアデノウイルスのＥ２Ｆ−１プロモーターなどの腫瘍特異的なプロモーターに機能可能に連結している腫瘍ワクチンを提供する。
【０１１５】
別の態様において、本開示は、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドセグメント、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドセグメント、ならびに第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つに機能可能に連結している少なくとも１つのプロモーターを含有する発現ベクターを含有する腫瘍ワクチンを提供する。
【０１１６】
別の態様において、本開示は、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドセグメント、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドセグメントを含有し、第１のポリヌクレオチドセグメントがＣＭＶプロモーターなどの構成的プロモーターに機能可能に連結しており、第２のポリヌクレオチドセグメントがアデノウイルスのＥ２Ｆ−１プロモーターなどの腫瘍特異的なプロモーターに機能可能に連結している発現ベクターを含有する、腫瘍ワクチンを提供する。
【０１１７】
別の態様において、本開示は、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドセグメント、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドセグメント、ならびに第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つに機能可能に連結している少なくとも１つのプロモーターを含有する発現ベクターを含有する宿主細胞を有する腫瘍ワクチンを提供する。
【０１１８】
別の態様において、本開示は、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドセグメント、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドセグメントを含有し、第１のポリヌクレオチドセグメントがＣＭＶプロモーターなどの構成的プロモーターに機能可能に連結しており、第２のポリヌクレオチドセグメントがアデノウイルスのＥ２Ｆ−１プロモーターなどの腫瘍特異的なプロモーターに機能可能に連結している発現ベクターを含有する宿主細胞を有する腫瘍ワクチンを提供する。
【０１１９】
別の態様において、本開示は、ウイルス粒子を有する腫瘍ワクチンであって、前記ウイルス粒子中のウイルスゲノムが、抗原提示ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドセグメント、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドセグメントを含有する腫瘍ワクチンを提供する。ある実施形態において、ウイルスゲノムの第１のポリヌクレオチドセグメントは、ＣＭＶプロモーターなどの構成的プロモーターに機能可能に連結しており、ウイルスゲノムの第２のポリヌクレオチドセグメントは、アデノウイルスのＥ２Ｆ−１プロモーターなどの腫瘍特異的なプロモーターに機能可能に連結している。ある実施形態において、ウイルス粒子は組換えアデノウイルスである。
【０１２０】
ある実施形態において、腫瘍ワクチンはアジュバントをさらに含む。本明細書において用いられる用語「アジュバント」は、本明細書において提供されるワクチン組成物と共に投与されるとワクチンに対する免疫応答を非特異的に増強し得る作用物質を言う。
【０１２１】
治療方法
別の態様において、本開示は、薬学的に許容可能な担体と本開示の腫瘍ワクチンとを含有する医薬組成物を対象に投与することを含む、腫瘍を治療する方法を提供する。
【０１２２】
本明細書において用いられる用語「対象」には、動物およびヒトが含まれる。
【０１２３】
医薬組成物は、当技術分野において知られている任意の適切な経路を介して投与することができ、この経路には、限定はしないが、非経口、経口、腸内、口腔内、経鼻、局所的、直腸、膣、経粘膜、表皮、経皮、真皮、眼、肺、および皮下の投与経路が含まれる。
【０１２４】
医薬組成物は、各投与経路に適した製剤または調製物の形態で対象に投与することができる。医薬組成物の投与に適した製剤には、限定はしないが、溶液、分散液、エマルジョン、粉末、懸濁液、エアロゾル、スプレー、点鼻薬、リポソームベースの製剤、パッチ、インプラント、および坐剤が含まれ得る。
【０１２５】
製剤は、都合良く単位投与形態とすることができ、調剤学の分野において周知の任意の方法によって調製することができる。これらの製剤または組成物の調製方法は、本開示の腫瘍ワクチンを、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体と、場合によっては１つまたは複数のアジュバントとに提供するステップを含む。このような製剤を作製するための方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．、１９９５；Ｒ．Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１１２７７〜１１２８１（１９９２）；Ｔ．Ｗ．Ｋｉｍら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７（６）：７４９〜７５８（２００５）；Ｓ．Ｆ．Ｊｉａら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９：３４６２（２００３）；Ａ．Ｓｈａｈｉｗａｌａら、Ｒｅｃｅｎｔ  ｐａｔｅｎｔｓ  ｏｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ、１：１〜９（２００７）；Ａ．Ｂａｒｎｅｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２０００  ２：８７〜９３（２０００））において見ることができる。
【０１２６】
ある実施形態において、本開示の核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞を含有する医薬組成物は、腫瘍部位での標的組織または標的器官内への局所的送達を介する治療が必要な対象に投与される。ある実施形態において、医薬組成物は、シリンジを用いて、皮膚を介して触診可能な腫瘍部位に直接注射される。ある実施形態において、医薬組成物は、カテーテルラインまたは他の医療アクセス装置に接続され、かつ腫瘍部位に導く画像システムと組み合わせて用いることができる、移植可能な投与装置を用いて注射される。ある実施形態において、効果的用量が、曝露された手術野において視認可能な腫瘍部位に直接注射される。ある実施形態において、医薬組成物（例えば、ベクターで被覆された金粒子）が、粒子を腫瘍内に直接発射する遺伝子銃を用いて、腫瘍部位に撃ち込まれる（例えば、Ｒ．Ｍｕａｎｇｍｏｏｎｃｈａｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０（２）：１４５〜１５１（２００２）を参照されたい）。ある実施形態において、医薬組成物は、静脈内注射を介して対象に投与される。ある実施形態において、医薬組成物は、経口的にまたは経粘膜的に対象に投与される。治療的核酸を細胞または動物内に導入する方法の参照については、例えば、Ｙａｎｇ、Ｎ−Ｓ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：３３５〜３５６（１９９２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｗ．Ｆ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８〜８１３（１９９２）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ.Ｓ.、Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５〜４６０（１９９２）；Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｒ．Ｇ．、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．９２（ｓｕｐｐｌ  ６Ａ）：４４Ｓ〜５２Ｓ（１９９２）；Ｚｗｉｅｂｅｌ、Ｊ．Ａ.ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６１８：３９４〜４０４（１９９１）；ＭｃＬａｃｈｌｉｎ、Ｊ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３８：９１〜１３５（１９９０）；Ｋｏｈｎ、Ｄ．Ｂ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．７：１７９〜１９２（１９８９）を参照されたい。これらの参考文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
ある実施形態において、医薬組成物は、治療上効果的な投与量で投与される。本明細書において用いられる用語「治療上効果的な投与量」は、投与後に、所望の治療的結果を達成するために効果的である、腫瘍ワクチンの量を言う。腫瘍ワクチンの治療上効果的な量は、個体の病状、年齢、性別、および体重などの因子、ならびに腫瘍ワクチンが個体において所望の応答を引き起こす能力に従って、患者ごとに変化し得る。治療上効果的な投与量は、任意の有害な副作用の存在と共に治療効果（例えば、癌細胞の成長の低減）をモニタリングしながら、少ないが安全な用量で開始し、より高い容量に増やしていくことによって決定することができる。
【実施例】
【０１２８】
以下の実施例は、本開示の理解を助けるために記載されており、その後の特許請求の範囲において規定される本発明の範囲を多少なりとも限定すると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１２９】
アデノウイルスベクターＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦベクターの構築
アデノウイルスベクターＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦを、以下に記載されるように構築する。
【０１３０】
まず、プラスミドｐＩＲＥＳ−Ｅ１ａ−ｂｌｕｎｔを、プラスミドｐＥＧＦＰ内のＥＧＦＰ断片をＩＲＥＳ断片およびＥ１ａ断片で置き換えることによって構築する。ＩＲＥＳ断片は、プライマー対：ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＡＡＣＧＴＴＡＣ（フォワードプライマー）およびＧＴＧＧＣＣＡＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧ（リバースプライマー）を用いて、ｐＩＲＥＳプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｖｉｅｗ、ＣＡ、カタログ番号：６３１６０５）からＰＣＲによって得る。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩを用いて消化する。Ｅ１ａ断片は、プライマー対：ＣＣＧＡＣＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＣＡＴＡＴＴＡＴＣ（フォワードプライマー）およびＣＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡＣＡＣＧＣＡＡＴＣＡＣＡＧＧ（リバースプライマー）を用いて、ｐＸＣ１プラスミド（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ、製品番号：ＰＤ−０１−０３；ＭｃＫｉｎｎｏｎ（１９８２）Ｇｅｎｅ  １９：３３〜４２もまた参照されたい）からＰＣＲによって得る。ＰＣＲ産物を、ＡｇｅＩおよびＢｓｒＧＩを用いて消化する。プラスミドｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｖｉｅｗ、ＣＡ、カタログ番号：６０７７−１）を、ＢａｍＨＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、得られた２．７ｋｂの断片を精製し、得られたＩＲＥＳ断片およびＥ１ａ断片とライゲーションする。Ｅ１ａ配列は、ベクター内のＳＶ４０配列の上流に位置する。得られたライゲーション産物を制限消化によって確認し、プラスミドｐＩＲＥＳ−Ｅ１ａ−ｂｌｕｎｔと名付ける。
【０１３１】
次に、プラスミドｐＥ２Ｆ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａを、Ｅ２ＦプロモーターおよびヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｈＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子の両方を含有する断片をプラスミドｐＩＲＥＳ−Ｅ１ａ−ｂｌｕｎｔに挿入することによって構築する。ｐＩＲＥＳ−Ｅ１ａ−ｂｌｕｎｔを、制限酵素Ｘｈｏ  ＩおよびＥｃｏＲＩで線状化する。５．６ｋｂの線状化産物（以下、断片Ａと呼ぶ）を、０．５％アガロースゲル電気泳動を用いて分析し、ゲル抽出によって精製する。プラスミドｐＯＲＦ９−ｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号：ｐｏｒｆ−ｈｇｍｃｓｆ）を、Ｘｈｏ  ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、この消化によって、１．３ｋｂの断片および２．４ｋｂの断片が生じる。Ｅ２ＦプロモーターおよびｈＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含有する１．３ｋｂの断片（以下、断片Ｂと呼ぶ）を精製し、次に、断片Ａとライゲーションする。ライゲーション産物を制限消化によって確認し、プラスミドｐＥ２Ｆ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａと名付ける。ｐＥ２Ｆ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａ内のｈＧＭ−ＣＳＦは、配列番号２８のヌクレオチド配列を有する。プラスミドｐＯＲＦ９−ｈＧＭ−ＣＳＦに由来するもう一方の２．４ｋｂの消化断片（以下、断片Ｃと呼ぶ）もまた、その後の使用のためにゲル抽出によって精製する。
【０１３２】
プラスミドｐＹ１−ＨＳＰ−ａｍｐを、ＣＭＶプロモーターおよびヒト熱ショックタンパク質７０（ｈＨＳＰ７０）遺伝子をプラスミドｐＳＬ１１９０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号２７−４３８６；Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ、ＤＮＡ、８（１０）：７５９〜７７（１９８９）もまた参照されたい）内に挿入することによって構築する。ｈＨＳＰ７０遺伝子は、プライマー対：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＣ（フォワードプライマー）およびＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＣＴＡＡＴＣＴＡＣＣＴＣ（リバースプライマー）を用いて、ヒトＨＳＰ７０  ｃＤＮＡクローン（Ｏｒｉｇｅｎｅ、カタログ番号ＳＣ１１６７６６）からＰＣＲによって得る。ｈＨＳＰ７０遺伝子は、配列番号２７のヌクレオチド配列を有する。ＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化する。ＣＭＶプロモーターは、プライマー対：ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧ（フォワードプライマー）およびＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣ（リバースプライマー）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｓｂａｄ、ＣＡ、カタログ番号：Ｖ８６０−２０）からＰＣＲによって得る。ＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化する。プラスミドｐＳＬ１１９０をＮｄｅ  ＩおよびＢａｍＨＩで線状化し、３．２ｋｂの線状化産物をゲル抽出によって精製し、次に、ｈＨＳＰ７０断片およびＣＭＶプロモーター断片とライゲーションする。最終ライゲーション産物を制限消化によって確認し、プラスミドｐＹ１−ＨＳＰ−ａｍｐと名付ける。
【０１３３】
次に、プラスミドｐＯＲＦ９−ｈＨＳＰ７０を、断片ＣとＣＭＶプロモーターおよびｈＨＳＰ７０遺伝子を含有するｐＹ１−ＨＳＰ−ａｍｐに由来する断片とをライゲーションすることによって構築する。プラスミドＹ１−ＨＳＰ−ａｍｐを、Ｘｈｏ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで消化する。ＣＭＶプロモーターおよびｈＨＳＰ７０遺伝子を含有する、得られた２．５ｋｂの断片を、ゲル抽出によって精製し、次に、断片Ｃとライゲーションする。得られたライゲーション産物を制限消化によって確認し、ｐＯＲＦ９−ｈＨＳＰと名付ける。
【０１３４】
次に、プラスミドｐ−ＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａを、ＣＭＶプロモーター、ｈＨＳＰ７０遺伝子、およびＳＶ４０ｐＡを含有する断片をプラスミドｐ−Ｅ２Ｆ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａ内に挿入することによって構築する。プラスミドｐ−Ｅ２Ｆ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａを、Ｘｈｏ  ＩおよびＰｖｕ  Ｉで線状化し、線状化された６．７ｋｂの産物（以下、断片Ｄと呼ぶ）を、ゲル抽出によって精製する。プラスミドｐＯＲＦ９−ｈＨＳＰを、Ｘｈｏ  ＩおよびＰａｃ  Ｉを用いて消化し、ＣＭＶプロモーター、ｈＨＳＰ７０、およびＳＶ４０ｐＡを含有する、得られた３．０ｋｂの断片（以下、断片Ｅと呼ぶ）を、ゲル抽出によって精製する。断片Ｄおよび断片Ｅを、ＤＮＡリガーゼによってライゲーションする。ライゲーション産物を制限消化によって確認し、ｐＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａと名付ける。
【０１３５】
次に、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａを、ｐＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａに由来するＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａの断片をｐＳｈｕｔｔｌｅベクター内に挿入することによって構築する。ｐ−ＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａを、Ｘｈｏ  ＩおよびＳｓｐ  Ｉで消化し、ＣＭＶプロモーター、ｈＨＳＰ７０、ＳＶ４０ｐＡ、Ｅ２Ｆプロモーター、ｈＧＭ−ＣＳＦ、ＩＲＥＳおよびＥ１ａ、ならびにＳＶ４０ｐＡを含有する、得られた６．０ｋｂの断片（断片Ｆと呼ぶ）を、ゲル抽出によって精製する。ＳｈｕｔｔｌｅプラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、カタログ番号：Ｋ１６５０−１）を、ＥｃｏＲ  ＶおよびＳａｌ  Ｉを用いて線状化し、得られた６．５ｋｂの線状化産物（以下、断片Ｇと呼ぶ）を、ゲル抽出によって精製する。断片Ｆおよび断片Ｇを、ＤＮＡリガーゼによってライゲーションする。ライゲーション産物を制限消化によって確認し、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａと名付ける。
【０１３６】
最後に、アデノウイルスベクターＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦを、プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａ（ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦと呼ぶ）およびｐＡｄＥａｓｙ−１ウイルスＤＮＡプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、カタログ番号２４０００９）の相同組換えによって作製する。左アームの相同配列および右アームの相同配列を含有するｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦを、Ｐｍｅ  Ｉで線状化して、２つのそれぞれの末端に分離して位置する２つの相同配列を有する線状化産物を得る。線状化産物を、ｐＡｄＥａｓｙ−１ウイルスＤＮＡプラスミドと共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＪ５１８３内に共形質転換し、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦとｐＡｄＥＡＳＹとの間の相同組換えが、左の相同配列と右の相同配列との間で生じる。形質転換体をカナマイシン耐性について選択し、ｐＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦと呼ばれる、得られた組換えベクターを、その後、単離し、制限消化によって同定する。同定されたｐＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦベクターを配列決定して、挿入された標的遺伝子において突然変異が生じていないことを確認する。ｐＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦの概略的な構造を図１に示す。ｐＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦベクターをＰａｃ  Ｉで消化して、アデノウイルスＤＮＡおよび挿入された遺伝子を含有し、両端で逆方向末端反復（ＩＴＲ）が曝露されている消化産物を得る。消化産物をＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトして、アデノウイルス生産２９３細胞を作製し、これからアデノウイルスＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦを回収する。アデノウイルスＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦのゲノムの概略的な構造を図２に示す。
【実施例２】
【０１３７】
アデノウイルスベクターＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦの構築
アデノウイルスベクターＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦを、以下に記載されるように構築する。
【０１３８】
まず、プラスミドｐＩＲＥＳ−Ｅ１ａ−ｂｌｕｎｔを、プラスミドｐＥＧＦＰ内のＥＧＦＰ断片をＩＲＥＳ断片およびＥ１ａ断片で置き換えることによって構築する。ＩＲＥＳ断片は、プライマー対：ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＡＡＣＧＴＴＡＣ（フォワードプライマー）およびＧＴＧＧＣＣＡＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧ（リバースプライマー）を用いて、ｐＩＲＥＳプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｖｉｅｗ、ＣＡ、カタログ番号：６３１６０５）からＰＣＲによって得る。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩを用いて消化する。Ｅ１ａ断片は、プライマー対：ＣＣＧＡＣＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＣＡＴＡＴＴＡＴＣ（フォワードプライマー）およびＣＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡＣＡＣＧＣＡＡＴＣＡＣＡＧＧ（リバースプライマー）を用いて、ｐＸＣ１プラスミド（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ、製品番号：ＰＤ−０１−０３；ＭｃＫｉｎｎｏｎ（１９８２）Ｇｅｎｅ  １９：３３〜４２もまた参照されたい）からＰＣＲによって得る。ＰＣＲ産物を、ＡｇｅＩおよびＢｓｒＧＩを用いて消化する。プラスミドｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｖｉｅｗ、ＣＡ、カタログ番号：６０７７−１）を、ＢａｍＨＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、得られた２．７ｋｂの断片を精製し、先に得られたＩＲＥＳ断片およびＥ１ａ断片とライゲーションする。Ｅ１ａ配列は、ベクターのＳＶ４０配列の上流に位置する。得られたライゲーション産物を制限消化によって確認し、プラスミドｐＩＲＥＳ−Ｅ１ａ−ｂｌｕｎｔと名付ける。
【０１３９】
次に、プラスミドｐＯＲＦ９−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ｃｏｍを、プラスミドｐＯＲＦ９−ｈＧＭ−ＣＳＦ内のｈＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をプラスミドｐＯＲＦ９−ｍＧＭ−ＣＳＦに由来するマウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子（ｍＧＭ−ＣＳＦ）で置き換えることによって構築する。プラスミドｐＯＲＦ−ｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号：ｐｏｒｆ−ｈｇｍｃｓｆから入手可能である）を、ＳｇｒＡ  ＩおよびＮｈｅ  Ｉで消化し、得られた３．２ｋｂの断片（断片Ｈと呼ぶ）を、ゲル抽出によって精製する。プラスミドｐＯＲＦ−ｍＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号：ｐｏｒｆ−ｍｇｍｃｓｆから入手可能である）を、Ａｇｅ  ＩおよびＮｈｅ  Ｉで消化し、ｍＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含有する、得られた４５２ｂｐの断片（断片Ｉと呼ぶ）をゲル抽出によって精製する。断片Ｈおよび断片ＩをＤＮＡリガーゼによってライゲーションする。ライゲーション産物を制限消化によって確認し、プラスミドｐＯＲＦ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ｃｏｍと名付ける。
【０１４０】
次に、プラスミドｐＥ２Ｆ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａを、Ｅ２ＦプロモーターおよびｍＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両方を含有する断片をプラスミドｐＩＲＥＳ−Ｅ１ａ−ｂｌｕｎｔに挿入することによって構築する。ｐＩＲＥＳ−Ｅ１ａ−ｂｌｕｎｔを、制限酵素Ｘｈｏ  ＩおよびＥｃｏＲＩで線状化する。５．６ｋｂの線状化産物（以下、断片Ａ’と呼ぶ）を、０．５％アガロースゲル電気泳動を用いて分析し、ゲル抽出によって精製する。プラスミドｐＯＲＦ９−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ｃｏｍを、Ｘｈｏ  ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、この消化によって、１．３ｋｂの断片および２．４ｋｂの断片が生じる。Ｅ２ＦプロモーターおよびｍＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含有する１．３ｋｂの断片（以下、断片Ｂ’と呼ぶ）を精製し、次に、断片Ａ’とライゲーションする。ライゲーション産物を制限消化によって確認し、プラスミドｐＥ２Ｆ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａと名付ける。ｐＥ２Ｆ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａ内のｍＧＭ−ＣＳＦは、配列番号３１のヌクレオチド配列を有する。プラスミドｐＯＲＦ９−ｈＧＭ−ＣＳＦに由来するもう一方の２．４ｋｂの消化断片（以下、断片Ｃ’と呼ぶ）もまた、その後の使用のためにゲル抽出によって精製する。
【０１４１】
プラスミドｐＹ１−ＨＳＰ−ａｍｐを、ＣＭＶプロモーターおよびヒト熱ショックタンパク質７０（ｈＨＳＰ７０）遺伝子をプラスミドｐＳＬ１１９０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号２７−４３８６；Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ、ＤＮＡ、８（１０）：７５９〜７７（１９８９）もまた参照されたい）内に挿入することによって構築する。ｈＨＳＰ７０遺伝子は、プライマー対：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＣ（フォワードプライマー）およびＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＣＴＡＡＴＣＴＡＣＣＴＣ（リバースプライマー）を用いて、ヒトＨＳＰ７０  ｃＤＮＡクローン（Ｏｒｉｇｅｎｅ、カタログ番号ＳＣ１１６７６６）からＰＣＲによって得る。ｈＨＳＰ７０遺伝子は、配列番号２７のヌクレオチド配列を有する。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化する。ＣＭＶプロモーターは、プライマー対：ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧ（フォワードプライマー）およびＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣ（リバースプライマー）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｓｂａｄ、ＣＡ、カタログ番号：Ｖ８６０−２０）からＰＣＲによって得る。ＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化する。プラスミドｐＳＬ１１９０をＮｄｅ  ＩおよびＢａｍＨＩで線状化し、３．２ｋｂの線状化産物をゲル抽出によって精製し、次に、ｈＨＳＰ７０断片およびＣＭＶプロモーター断片とライゲーションする。最終ライゲーション産物を制限消化によって確認し、プラスミドｐＹ１−ＨＳＰ−ａｍｐと名付ける。
【０１４２】
次に、プラスミドｐＯＲＦ９−ｈＨＳＰ７０を、断片Ｃ’と、ＣＭＶプロモーターおよびｈＨＳＰ７０遺伝子を含有するｐＹ１−ＨＳＰ−ａｍｐに由来する断片とをライゲーションすることによって構築する。プラスミドＹ１−ＨＳＰ−ａｍｐを、Ｘｈｏ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで消化する。ＣＭＶプロモーターおよびｈＨＳＰ７０遺伝子を含有する、得られた２．５ｋｂの断片を、ゲル抽出によって精製し、次に、断片Ｃ’とライゲーションする。得られたライゲーション産物を制限消化によって確認し、ｐＯＲＦ９−ｈＨＳＰと名付ける。
【０１４３】
次に、プラスミドｐ−ＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａを、ＣＭＶプロモーター、ｈＨＳＰ７０遺伝子、およびＳＶ４０ｐＡを含有する断片をプラスミドｐ−Ｅ２Ｆ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａ内に挿入することによって構築する。プラスミドｐＥ２Ｆ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａを、Ｘｈｏ  ＩおよびＰｖｕ  Ｉで線状化し、線状化された６．７ｋｂの産物（以下、断片Ｄ’と呼ぶ）を、ゲル抽出によって精製する。プラスミドｐＯＲＦ９−ＨＳＰを、Ｘｈｏ  ＩおよびＰａｃ  Ｉを用いて消化し、ＣＭＶプロモーター、ｈＨＳＰ７０、およびＳＶ４０ｐＡを含有する、得られた３．０ｋｂの断片（以下、断片Ｅ’と呼ぶ）を、ゲル抽出によって精製する。断片Ｄ’および断片Ｅ’を、ＤＮＡリガーゼによってライゲーションする。ライゲーション産物を制限消化によって確認し、ｐ−ＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａと名付ける。
【０１４４】
次に、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａを、ｐＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａに由来するＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａの断片をｐＳｈｕｔｔｌｅベクター内に挿入することによって構築する。ｐ−ＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａを、Ｘｈｏ  ＩおよびＳｓｐ  Ｉで消化し、ＣＭＶプロモーター、ｈＨＳＰ７０、ＳＶ４０ｐＡ、Ｅ２Ｆプロモーター、ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＩＲＥＳおよびＥ１ａ、ならびにＳＶ４０ｐＡを含有する、得られた６．０ｋｂの断片（断片Ｆ’と呼ぶ）を、ゲル抽出によって精製する。ＳｈｕｔｔｌｅプラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、カタログ番号：Ｋ１６５０−１）を、ＥｃｏＲ  ＶおよびＳａｌ  Ｉを用いて線状化し、得られた６．５ｋｂの線状化産物（以下、断片Ｇ’と呼ぶ）を、ゲル抽出によって精製する。断片Ｆ’および断片Ｇ’をＤＮＡリガーゼによってライゲーションする。ライゲーション産物を制限消化によって確認し、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａと名付ける。
【０１４５】
最後に、アデノウイルスベクターＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦを、プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ｈＨＳＰ７０−Ｅ２Ｆ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ａ（ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦと呼ぶ）およびｐＡｄＥａｓｙ−１ウイルスＤＮＡプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、カタログ番号２４０００９）の相同組換えによって作製する。左アームの相同配列および右アームの相同配列を含有するｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦを、Ｐｍｅ  Ｉで線状化して、２つのそれぞれの末端で分離している２つの相同配列を有する線状化産物を得る。線状化産物を、ｐＡｄＥａｓｙ−１ウイルスＤＮＡプラスミドと共に大腸菌株ＢＪ５１８３内に共形質転換し、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦとｐＡｄＥＡＳＹとの間の相同組換えが、左の相同配列と右の相同配列との間で生じる。形質転換体をカナマイシン耐性について選択し、ｐＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦと呼ばれる、得られた組換えベクターを、その後、単離し、制限消化によって同定する。同定されたｐＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦベクターを配列決定して、挿入された標的遺伝子において突然変異が生じていないことを確認する。ｐＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦベクターをＰａｃ  Ｉで消化して、アデノウイルスＤＮＡおよび挿入された遺伝子を含有し、両端で逆方向末端反復（ＩＴＲ）が曝露されている消化産物を得る。消化産物をＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトして、アデノウイルス生産２９３細胞を作製し、これからアデノウイルスＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦを回収する。アデノウイルスＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦのゲノムの概略的な構造を図３に示す。
【実施例３】
【０１４６】
アデノウイルス感染細胞におけるＧＭ−ＣＳＦタンパク質およびＨＳＰ７０タンパク質の発現
アデノウイルスベクターＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦを用いて、Ｈｅｌａ細胞およびＨｅｐＢ細胞をそれぞれ含めたヒト細胞系、ならびにマウスＢ１６細胞を感染させる。
【０１４７】
アデノウイルスベクターＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦを、１０（ウイルス力価１０7）、１００（ウイルス力価１０8）、または１０００（ウイルス力価１０9）のＭＯＩで、各タイプの細胞について試験する。各ＭＯＩで、細胞を、アデノウイルスベクターと共にそれぞれ１２時間、２４時間、３６時間、および４８時間にわたりインキュベートする。各時点で、３つのウェルの細胞を各タイプの細胞について収集する。したがって、各タイプの細胞について３６のウェルの試験試料がある。各タイプの細胞で、３つのさらなるウェルの細胞を未感染対照として含め、未感染対照は、インキュベーションの１２時間後に収集する。ＭＯＩは、ウェル内に入れられたウイルスのｐｆｕをウェル内の細胞数で割った比率である。細胞数は、血球計測定法を用いて計算または測定する。ウイルス複製を、ウイルス滴定アッセイによって確認する。
【０１４８】
実験を、以下に記載するように行う。細胞を培養プレート内で培養する。細胞が９０％のコンフルエンスに達すると、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次に、３ｍｌの消化溶液で２〜３分間にわたりトリプシン処理する。接着細胞が分離すると、１０ｍｌのダルベッコ変法イーグル完全培地（ＤＭＥＭ）の培養培地をプレートに添加して、細胞を懸濁させる。細胞懸濁液内の細胞数を計数し、細胞懸濁液を完全ＤＭＥＭによって希釈して、１０6個細胞／ｍｌの最終濃度とする。各タイプの細胞の細胞懸濁液を、次に、１ｍｌ／ウェルの量で１２ウェルプレートに添加する。
【０１４９】
細胞を、それらが十分なコンフルエンスに達するまで培養する。培養培地を廃棄し、完全ＤＭＥＭで希釈したウイルス溶液を、１ｍｌ／ウェルで、１０、１００、または１０００のＭＯＩで細胞プレートに添加する。１２時間目、２４時間目、３６時間目、および４８時間目に、各ＭＯＩおよび各細胞タイプについて３つのウェルの細胞を収集する。上清におけるタンパク質の発現を後に決定するために、細胞培養物を１．５ｍｌの遠心分離管内に収集する。次に、ウェル内に残っている細胞をＰＢＳで３回、穏やかに洗浄し、次に、トリプシン処理し、個別の遠心分離管に収集する。収集された細胞を２５００ｒｐｍで５分にわたり遠心分離し、次に、上清を廃棄した後、−８０℃の冷蔵庫内で保管する。
【０１５０】
４８時間の実験期間の後、全ての試料を収集および調製したら、その後、タンパク質抽出を行う。５倍抽出試薬を、冷たい（４℃）脱イオン水を用いて１倍に希釈し、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｔａｂｌｅｔｓを添加する（１０ｍｌの抽出溶液当たり１個のタブレット）。抽出溶液を、１０6〜１０7個細胞：１ｍｌタンパク質抽出溶液の比率で、収集された細胞に添加し、細胞を、細胞ペレットをほとんど有さない均質な溶液に再懸濁する。再懸濁された細胞を、断続的に振とうしながら、または短超音波処理を行いながら、氷上に３０分置く。細胞を、次に２１０００ｇで、４℃で１０分間にわたり遠心分離し、上清を新たな遠心分離管に移し、この遠心分離管は、全タンパク質を含有する。
【０１５１】
ｍＧＭ−ＣＳＦおよびｈＨＳＰ７０の発現レベルを、ＥＬＩＳＡキットを用いて決定する。ｍＧＭ−ＣＳＦの発現は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入したＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ  ＧＭ−ＣＳＦ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（カタログ番号：ＭＧＭ００）を用いて決定する。ｈＨＳＰ７０の発現は、Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓから購入したＳｔｒｅｓｓＸｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｈｓｐ７０  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（カタログ番号：ＥＫＳ−７００Ｂ）を用いて決定する。ｍＧＭ−ＣＳＦおよびｈＨＳＰ７０の濃度を、ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔの指示に従って測定する。結果を図４（ａ）、４（ｂ）、および４（ｃ）、ならびに図５（ａ）、５（ｂ）、および５（ｃ）に示す。
【０１５２】
ｍＧＭ−ＣＳＦの発現レベルを図４に示す。ｍＧＭ−ＣＳＦは、３つの細胞タイプの全てにおいて発現し、このうち、Ｈｅｐ３Ｂ細胞が最大量のｍＧＭ−ＣＳＦを発現し、Ｂ１６細胞が最低量を発現する。３つの細胞タイプの全てにおいて、発現レベルは、インキュベーション時間に応じて増大し、そのうち、Ｈｅｐ３Ｂ細胞の発現レベルは、約４８時間で最大量に達する。同時点では、ｍＧＭ−ＣＳＦの発現量は、全体として、ＭＯＩが１０から１０００に増大するにつれ高まる。各時点で、上清におけるタンパク質発現レベルは、細胞ペレットにおける発現レベルよりも高く、このことは、タンパク質が分泌されていることを示唆する。
【０１５３】
ｈＨＳＰ７０の発現レベルを図５に示す。ｈＨＳＰ７０は、３つの細胞タイプの全てにおいて発現し、このうち、Ｈｅｐ３Ｂ細胞が最大量のｈＨＳＰ７０を発現し、Ｂ１６細胞が最低量を発現する。Ｂ１６細胞においては、ＭＯＩ１００で３６時間目に収集された試料を除いて、発現は検出されない。これは、マウス細胞に対するヒトアデノウイルスの感染性が低いことに起因する可能性がある。３つの細胞タイプの全てにおいて、発現レベルは、インキュベーション時間に応じて増大し、そのうち、Ｈｅｐ３Ｂ細胞の発現レベルは、約２４時間で最大量に達する。同時点では、ｈＨＳＰ７０の発現量は、全体として、ＭＯＩが１０から１０００に増大するにつれ高まる。Ｈｅｐ３Ｂ細胞において、細胞ペレットにおける発現レベルは、上清における発現レベルよりも高い。Ｈｅｌａ細胞において、上清における発現レベルは、細胞ペレットにおける発現レベルよりも高い。
【実施例４】
【０１５４】
細胞におけるアデノウイルスベクターの増幅
ウイルスベクターを、Ｔ型フラスコ内のＨＥＫ２９３細胞において増幅し、ＣｓＣｌ勾配遠心分離によって精製する。ウイルス収量を、ウイルス滴定アッセイおよび分光光度計法によって決定する。ウイルスを、その後の使用のために−７０℃で保管する。
【実施例５】
【０１５５】
Ａｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦと他のウイルスベクターとの細胞傷害性の比較
アデノウイルスベクターＡｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦの細胞傷害性を、Ａ５４９（Ｆｕｄａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａから購入した、腺癌ヒト歯槽基底上皮細胞）、Ｈｅｐａｌ−６（Ｃｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）、Ｗｕｈａｎ、Ｃｈｉｎａから購入した、マウス肝臓癌細胞）、ＭＣＦ−７（Ｆｕｄａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａから購入した、ヒト乳癌細胞）、ＴＣａ８１１３（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｈａｎｇｈａｉから購入した、ヒト舌癌細胞）、ＡＣＣ−Ｍ（ＣＣＴＣＣ、Ｗｕｈａｎ、Ｃｈｉｎａから購入した、肺に高度に転移性である腺様嚢胞癌細胞クローン）、ＨｅＬａ（Ｆｕｄａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａから購入した、ヒト子宮頸癌細胞）、Ｈｅｐ３Ｂ（Ｆｕｄａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａから購入した、ヒト肝臓癌細胞）、およびＬｎｃａｐ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｈａｎｇｈａｉから購入した、アンドロゲン感受性のヒト前立腺腺癌細胞）を含めた異なる腫瘍細胞系において、他のウイルスベクターと比較する。Ａｄ−ＧＭ−ＣＳＦ（プラスミドｐＯＲＦ９−ｈＧＭ−ＣＳＦとｐＡｄＥａｓｙ−１ウイルスＤＮＡプラスミドとの間の相同組換えによって構築された）、ＯＮＹＸ０１５（ｐ５３欠損癌細胞において選択的に複製するＥ１Ｂ−５５ｋ欠失アデノウイルス）（千葉大学から譲り受けた）、およびＡｄ−ＣＭＶ−ＨＳＰ（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｕｎｗａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈから譲り受けた）を、細胞傷害効果の比較のために並行して試験する。
【０１５６】
細胞を、９０％のコンフルエンスになるまで、７５ｃｍ2の細胞培養ボトル内で成長させる。培養培地を廃棄し、２ｍｌのトリプシン溶液を添加して、細胞をトリプシン処理する。細胞が分離したら、２％ウシ胎児血清を含有する培養培地１０ｍｌを添加して、細胞を懸濁させる。細胞懸濁液における細胞数を計数し、細胞懸濁液を、２％ウシ胎児血清を含有する培養培地によって、２×１０5個細胞／ｍｌの最終濃度まで希釈する。細胞の量を、血球計測定法を用いて計算または測定する。細胞懸濁液を、次に、５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに添加する。９６ウェルプレートを、ＣＯ2インキュベーター内で１日間インキュベートする。
【０１５７】
ウイルス溶液を、２％ウシ胎児血清を含有する培養培地で希釈し、５０μｌ／ウェルで、３００、１００、および３０のＭＯＩで、細胞プレートに添加する。各ＭＯＩで、感染は３組行う。ブランク対照は、ウェル当たり１００μｌの培養培地を含有する。９６ウェルプレートを、ＣＯ2インキュベーター内で６日間インキュベートする。
【０１５８】
各細胞タイプにおける各ベクターの細胞傷害性を、Ｐｒｏｍｅｇａから購入したＭＴＳ検出キット：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ）（カタログ番号Ｇ３５８０）を用いて決定する。簡潔に述べると、各タイプの細胞を９６ウェルプレートに接種し、３７℃で９５％のコンフルエンスになるまで培養する。ウイルスを、対応するＭＯＩで細胞に添加し、培養物を３７℃で成長させ続ける。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを、１：５のｖ／ｖ比率で各培養物に添加する。３７℃で１〜４時間のさらなるインキュベーションの後、プレートを、分光光度計を用いて４９０ｎｍで吸光度について測定する。各細胞タイプの細胞の生存能力を、ウイルス感染後に細胞で測定された光学密度をウイルス感染していない対照細胞で測定された光学密度で割ることによって計算する。
【０１５９】
結果を図６〜８に示す。Ａｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦは、試験した細胞タイプの全ておよび試験したＭＯＩの全てで、腫瘍細胞の成長の阻害において有意な活性を示す。ＴＣａ８１１３細胞、ＡＣＣ−Ｍ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、およびＬｎｃａｐ細胞は、Ａｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦでの処理の後に５０％超が死滅し、一方、他の細胞は、処理の後に５０％未満が死滅する。Ａｄ−ＨＳＰ−ｈＧＭ−ＣＳＦの抗腫瘍活性は、ベクターＡｄ−ＧＭ−ＣＳＦ、ＯＮＹＸ０１５、およびＡｄ−ＣＭＶ−ＨＳＰで見られる抗腫瘍活性に匹敵し、また多くのケースにおいて、これよりも良好である。
【実施例６】
【０１６０】
異なる腫瘍細胞に対するＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦの細胞毒性の比較
組換え腫瘍溶解性アデノウイルスＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦの細胞傷害性を、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｐ３Ｂ、Ａ５４９、７４０２（Ｆｕｄａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａの肝癌研究所から購入した、肝細胞癌細胞系）、７７２１（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｆｕｄａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａから購入した、肝細胞癌細胞系）、およびＨｅｌａを含めた異なるヒト腫瘍細胞系において試験し、これらの細胞系の全てを、ＲＰＭＩ１６４０完全培地において維持する。正常細胞系（２ＢＳ）を対照として用いる。ＨＥＫ２９３細胞系は、アデノウイルスのＥ１遺伝子で形質転換されており、したがって任意のタイプのアデノウイルスの成長を支え得るため、この細胞系を陽性対照として用いる。特異的殺腫瘍効果を比較する。
【０１６１】
各細胞系を、それぞれ０．１、１、１０、１００、および１０００ＭＯＩのＡｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦで感染させた、５つのグループに分ける。
【０１６２】
実験は、実施例５に記載されているものと同様に行う。細胞傷害性を、実施例５に記載されているＭＴＳ検出キットを用いて決定する。細胞の生存能力を、ウイルス感染で処理した細胞で測定された光学密度をウイルス感染していない対照細胞で測定された光学密度で割ることによって計算する。図９において示されるように、アデノウイルスベクターの細胞傷害性は、正常細胞と腫瘍細胞との間で異なる。２ＢＳ細胞では、細胞の生存能力は、１０００のＭＯＩのウイルスに感染した場合、８０％を超える。しかし、腫瘍細胞系の生存能力は、ウイルス感染のＭＯＩが増大するにつれ、減少する。Ａ５４９細胞および７４０２細胞では、ウイルスは１００のＭＯＩで有意な細胞傷害性を示し始め、細胞の生存能力は、ＭＯＩがさらに増大すると急激に低下する。Ｈｅｐ３Ｂ細胞、７７２１細胞、およびＨｅｌａ細胞、ならびに陽性対照のＨＥＫ２９３細胞では、ウイルスは、１０のＭＯＩで有意な細胞傷害性を示し始め、細胞の生存能力は、ＭＯＩがさらに増大すると急激に低下する。
【実施例７】
【０１６３】
マウスにおける腫瘍の低減
Ａｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦの治療効果を、Ｃ５７マウスＢ１６腫瘍モデルにおいて研究する。高用量群、中用量群、および低用量群を含めた３つの実験群を設定する。ブランク対照群（１０％グリセリンＰＢＳ）および陽性対照群（２ｍｇ／ｋｇのシスプラチン）もまた含める。投与群を表３に示す。
【０１６４】
【表３】
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【０１６５】
Ｂ１６細胞を、Ｃ５７マウスの腹部下に、各マウス当たり７×１０5個細胞の接種投与量で皮下接種する（総数で、３．８５×１０7個のＢ１６細胞）。接種後８日目に、腫瘍容積は閾値サイズ（５０〜７０ｍｍ3）に達し、動物はすぐに研究で用いることができる状態である。
【０１６６】
適切な腫瘍のサイズおよび形状を有し、同時発生している腫瘍を有さず、かつ行動の良い、Ｂ１６腫瘍を有するＣ５７マウスを選択する。マウスを、その腫瘍サイズに従って等級分けし、次に、ランダムにグループに分ける。薬剤投与を開始する前の日に、各マウスの腫瘍サイズを、皮下腫瘍の長さおよび幅を外部からキャリパー測定することによって、インビボで決定する。１日目の薬剤投与の容積を腫瘍サイズの２５％と計算し、この容積は、以降の日も同一に維持する。シスプラチンを０．０１ｍｌ／ｇの容積で投与し、濃度は０．２ｍｇ／ｍｌである。
【０１６７】
マウスに、Ａｄ−ＨＳＰ−ｍＧＭ−ＣＳＦウイルスを、連続する５日間にわたり毎日１回腫瘍内注射することによって、それぞれ所定の投与量の薬剤を投与する。陽性対照には、連続する５日間にわたり毎日１回、腹腔内経路を介して投与する。１０％グリセリンＰＢＳを、連続する５日間にわたり毎日１回、ブランク対照群の動物に、腫瘍内注射を介して投与する。３日ごとに、各マウスの腫瘍サイズを、皮下腫瘍の長さおよび幅を外部からキャリパー測定することによって、インビボで決定し、体重も同様に同一の間隔で決定する。マウスは、その腫瘍サイズが２０００ｍｍ3を超えたら屠殺する。
【０１６８】
腫瘍サイズを、以下の計算方程式を用いて、異なる時点で各実験群について計算する。
【数１】
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【０１６９】
研究の結果を図１０に示す。低用量群における平均腫瘍サイズは、ブランク対照とほとんど同一であり、このことは、低用量が腫瘍阻害効果をほとんど有さないことを示す。中用量群における平均腫瘍サイズは、ブランク対照よりも低いが陽性対照よりも高く、このことは、中用量が中程度の腫瘍阻害効果を有することを示す。高用量群における平均腫瘍サイズは、陽性群よりも良好であり、このことは、高用量が腫瘍の成長に対して有意な阻害を有することを示す。マウスの生存期間もまた記録し、高用量群は研究の最後で最も高い生存率を有し、低用量群は最も低い生存率を有する。結果は、ウイルスの腫瘍阻害効果が用量依存性であることを示す。結果はまた、生存曲線が全体的に腫瘍サイズ曲線と一致することを示す。
【０１７０】
本明細書における実質的にいずれの複数形および／または単数形の用語の使用に関しても、当業者であれば、文脈および／または適用に適切となるように、複数形から単数形に、および／または単数形から複数形に変換し得る。
【０１７１】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループの観点で記載されている場合、当業者であれば、その開示が、それによって、マーカッシュグループのいずれの個別のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されていることが認識されよう。
【０１７２】
様々な態様および実施形態が本明細書において開示されてきたが、他の態様および実施形態は当業者に明らかとなろう。本明細書において開示されている様々な態様および実施形態は、説明を目的としたものであり、限定することを意図したものではなく、正確な範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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