(57)【要約】  本発明は、ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体の間の相互作用を調節することによりニューロンの生存を高める方法に関する。ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体の間の相互作用を調節するために用いられる薬剤は、タンパク質、ペプチド、抗体または小型有機化合物から選択される。また本発明は、これらの薬剤を含む医薬組成物、ならびに、ニューロンの喪失に伴った疾患、および／またはニューロンの生存が望まれる疾患の治療における前記薬剤または医薬組成物の使用に関する。
2013532144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１の間の相互作用を調節または阻害することにより、必要とされる患者の脳におけるＧＤＮＦの細胞外レベルを高める方法。
【請求項２】
ＧＤＮＦの内在化および／または分解が阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１の間の相互作用を調節することによるドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンの生存を高める方法。
【請求項４】
傷害誘発神経細胞死、脊髄傷害、末梢神経損傷、脳虚血、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、慢性疼痛、神経因性疼痛、てんかん、がん、パーキンソン病、大うつ病、統合失調症、注意欠陥および多動性障害（ＡＤＨＤ）、薬物乱用、不安障害、および／または双極性障害（躁うつ病）からなる群から選択される疾患を治療するための請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１の間の相互作用を調節および／または阻害するために使用される薬剤がＳｏｒＬＡまたはＧＦＲα１に対する抗体である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
抗体がＳｏｒＬＡまたはＧＦＲα１の細胞外ドメイン上の１つまたは複数の結合部位に結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
結合部位が配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および／または配列番号７を含むか、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および／または配列番号７に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗体がポリクローナルまたはモノクローナルである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
抗体が単離されているか、組換えである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
抗体がヒト化抗体、キメラ抗体または単鎖抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
請求項５〜１０のいずれか１項に記載の抗体および担体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項５〜１０のいずれか１項に記載の抗体または請求項１１に記載の医薬組成物の有効量を投与することによる、ドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンの喪失に伴った疾患の治療のため、および／またはドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンの生存もしくは保護のための方法。
【請求項１３】
傷害誘発神経細胞死、脊髄傷害、末梢神経損傷、脳虚血、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、慢性疼痛、神経因性疼痛、てんかん、がん、パーキンソン病、大うつ病、統合失調症、注意欠陥および多動性障害（ＡＤＨＤ）、薬物乱用、不安障害、および／または双極性障害（躁うつ病）からなる群から選択される疾患を治療するための請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１の間の相互作用を調節することにより患者の脳におけるＧＤＮＦの細胞外レベルを高めるための、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の抗体または請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＧＤＮＦの内在化および／または分解が阻害される、請求項１４に記載の抗体または医薬組成物。
【請求項１６】
ドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンの喪失に伴った疾患を治療するため、および／またはドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンの生存もしくは保護のための、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の抗体または請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
傷害誘発神経細胞死、脊髄傷害、末梢神経損傷、脳虚血、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、慢性疼痛、神経因性疼痛、てんかん、がん、パーキンソン病、大うつ病、統合失調症、注意欠陥および多動性障害（ＡＤＨＤ）、薬物乱用、不安障害、および／または双極性障害（躁うつ病）からなる群から選択される疾患を治療するための請求項１４〜１６に記載の抗体または医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の疾患を治療するための薬を調製するための、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の抗体または請求項１１に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｖｐｓ１０ｐドメイン受容体ＳｏｒＬＡおよびそのＧＤＮＦファミリーリガンド受容体との相互作用の調節に関する。この相互作用を調節または阻害し得る薬剤は、神経系障害、精神障害および行動障害の治療における可能性を有する。本発明は、ＳｏｒＬＡを介するシグナル伝達、さらに、限定されるものではないが、ＧＤＮＦの逆行性輸送およびソーティングのモジュレーターとして作用し得るそのようなリガンドを提供する。したがって、薬剤は、特定タイプの神経系障害、精神障害および行動障害に応じてアンタゴニスト／阻害剤およびアゴニストから選択される。
【０００２】
また本発明は、ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体の間の相互作用を調節することが可能な新規薬剤を同定するためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
神経系疾患（特に精神障害および行動障害）は、世界中の１５歳以上の成人における、障害を持って生きる人生年数の３７パーセント超を占め、また、数年のうちにますますより大きな健康問題、社会問題および経済問題となる可能性の高い疾患として、能力低下の主要原因の１つとなっている（LopezおよびMurray 1998）。
【０００４】
神経系疾患は、例えば、World Health OrganizationのICD10、第VI章、G00-G99ブロック（神経系疾患）に定義されており、例えば、パーキンソン病などの神経変性疾患などが挙げられる。
【０００５】
精神障害および行動障害は、World Health OrganizationのICD10、第V章、F00-F99ブロック（精神障害および行動障害）に定義されており、例えば、大うつ病、統合失調症、注意欠陥および多動性障害（ＡＤＨＤ）、薬物乱用、不安障害および双極性障害（躁うつ病）などが挙げられる。
【０００６】
これらの障害は、一般的に重篤かつ慢性であって、多くの場合、生命に危険のある病気である。自殺は、大うつ病および双極性障害などの障害罹患患者において１５％以下の死因であることが推定されるとともに、別の多くの健康に関連する悪影響が認められている（Michelson, Stratakisら、1996; Musselman, Evansら、1998; Ciechanowski, Katonら、2000; Schulz, Beachら、2000; Kupfer 2005）。これらの障害の一部は、複数の臓器系への悪影響を伴う全身性疾患であることが徐々に認識されてきている。
【０００７】
変化したニューロンの活性、生存、特にシナプス可塑性およびシナプス伝達における損傷は、神経系疾患の病態生理下にあると考えられる。神経伝達物質ドーパミンは、特に、様々な脳機能の一般的障害、とりわけパーキンソン病、統合失調症、注意欠陥、多動性障害の他に、薬物依存症および特定の内分泌障害にも関与する。これらの症状の治療に臨床的に使用される薬物の大半は、ドーパミン透過に影響を及ぼすことにより作用する。主要なドーパミン作動性経路が３つある。運動調節において重要な黒質線条体路およびこの経路のドーパミン作動性ニューロンの選択的変性は、パーキンソン病の特徴である。中脳辺縁系経路／中脳皮質系経路は、中脳内の細胞群から大脳辺縁系の部位（特に側座核）および皮質にまで及んでおり、これらの経路は、感情誘発性および薬物誘発性の報酬系に関与する。最後は、視床下部から脳下垂体まで延びる隆起核下垂体経路（tuberohypophyseal pathway）であり、その分泌をこれらは制御する。
【０００８】
神経栄養因子はニューロンの「生命維持」シグナルの有効なメディエーターであって、シナプス伝達およびシナプス可塑性に重大な影響を及ぼす。グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は関連ホモ二量体神経栄養因子の群の１つであり、これはニュールツリン（ＮＲＴＮ）、パーセフィン（ＰＳＰＮ）およびアルテミン（ＡＲＴＮ）も包含する。これらは、まとめて、ＧＤＮＦ−ファミリーリガンド（ＧＦＬ）と表される。ＧＤＮＦは、発生中には神経系全体にわたって発現されるが、成体の脳においては、ＧＤＮＦは、特に、線条体、視神経床、皮質および海馬のニューロンで高度に発現される。逆行性輸送により、線条体由来のかなりの量のＧＤＮＦがさらに黒質で確認される。また、星状細胞およびシュワン細胞、ならびに腎臓、精巣および骨格筋などの非ニューロン系組織でも発現される。
【０００９】
ＧＤＮＦは、パーキンソン病に機能的に関係している（Linら、1993）。パーキンソン病は、黒質のドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失とその後の線条体のドーパミン作動性ニューロン神経支配の喪失を特徴とする。この経路は、随意運動行動にとって不可欠である。黒質線条体のドーパミン作動性経路が選択的に変性するにつれて、基底核のドーパミンが再発する。ニューロン欠損が５０〜６０％を超過すると、重要な運動系徴候、すなわち、振戦、無動、硬直、姿勢の不安定および動作緩慢が出現する。これらの運動症状の大半は、ドーパミン代替品によってほぼ完全に食い止めることができる（Sianら、1999）。死後のヒトパーキンソン病の脳黒質内の神経栄養因子分布に関する試験において、ＮＧＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４にはほとんど変化がないか、全く変化がなかったが、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＣＮＴＦは、年齢一致の対照群と比較した場合、パーキンソン病の脳内での減少が有意であった。ＧＤＮＦは、より大幅に減少していた（Chauhanら、2001）。試験では、ニューロパイル、すなわち、織り合わされた軸索、樹状突起および膠細胞からなる灰白質中のニューロンの間の深い間隙におけるニューロンのレベルおよび濃度に注目した。特に、ＧＤＮＦは、両領域で広範囲に減少されたが、比較的ニューロパイルでより多く減少された。パーキンソン病の分子的な病因は完全に解明されていないが、ＧＤＮＦが関係しているように思われる。
【００１０】
ＧＤＮＦシグナル伝達は、２つの受容体とのその相互作用を介してもたらされる。最初に、活性二量体は、細胞膜上にリガンドを集中させるように機能する、その主要受容体ＧＦＲα１に結合し、続いて、生じた四量体（２：２）複合体がホモ二量体受容体チロシンキナーゼＲＥＴと相互作用し、ＲＥＴリン酸化を誘導するとともに、シグナル伝達複合体を形成する。ニュールツリン、パーセフィンおよびアルテミンはシグナル伝達に関する類似機序を用いるが、これら３つはそれぞれ別のＧＦＲαのタイプ（２〜４）に結合した後に、Ｒｅｔ受容体をターゲティングする。ＧＦＲα受容体はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって原形質膜に結合されるが、未知のホスホリパーゼまたはプロテイナーゼによって細胞表面から遊離され得る。また可溶性ＧＦＲα１はＲＥＴリン酸化を刺激することもできるが、膜結合または可溶性ＧＦＲα１と一緒にＧＤＮＦにより開始される下流シグナル伝達系は異なる。
【００１１】
その関連因子とともに、ＧＤＮＦは、運動ニューロンの生存において、交感神経性および感覚ニューロンの発生において、ならびに海馬のシナプス形成において、重要な役割を果たす。ＧＤＮＦは、成体の脳外傷後にドーパミン作動性ニューロンの生存と再成長を促進し、成体のドーパミンニューロンの維持と生存にとって不可欠である。したがって、ＧＤＮＦは、パーキンソン病の治療における好ましい標的である。しかし、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１およびＲｅｔは、胚形成中のドーパミン作動性系の発生には必要ではない。その代わり、ＧＤＮＦまたは受容体の遺伝子破壊により、老齢マウスにおいて黒質線条体系の加速度的変性が生じる。また、様々な報告書は、ＧＤＮＦシグナル伝達と注意欠陥および多動性障害（ＡＤＨＤ）（Syedら、2007 Am J Med Genet）、ならびに統合失調症（Souzaら、2010 J Psychiatr Res）（Williamsら、2007 Schizophr Res）の発症との間の遺伝的連鎖を示唆しているが、パーキンソン病とＧＤＮＦ系の間に遺伝的関連は指摘されていない。興味深いことに、腹側被蓋領域および側座核におけるＧＤＮＦシグナル伝達が増強されると、げっ歯類で精神刺激薬（例えば、コカイン）に対する反応および感作が低下するが、このことは、ＧＤＮＦが薬物乱用に対する行動反応に重大な役割を果たすことを示唆している。Ｒｅｔは既知のＧＤＮＦシグナル伝達受容体であるが、ＧＦＲα１を発現する多くの細胞はＲｅｔを発現しない。これは代替ＧＤＮＦ／ＧＦＲα１受容体の存在を示唆している。
【００１２】
ＲＥＴ、ＧＦＲα１およびＧＤＮＦノックアウトマウスは、極めて類似する表現型を共有することが報告されており、これは、３つのタンパク質が同じシグナル伝達カスケードに参加している結果と考えられる。実際、ＧＤＮＦ（Mooreら、1996）、ＧＦＲα１（Cacalanoら、1998; Enomotoら、1998; Tomacら、2000）またはＲｅｔ（Durbecら、1996; Schuchardtら、1994）に欠損のあるマウスはすべて、腎臓非形成および様々な副交感神経ニューロンと腸神経系全体の欠如が原因で出生後に死亡する。驚いたことに、ＧＦＲα１ノックアウトマウスのＰＮＳおよびＣＮＳの別の多数のニューロン群に加えて中脳のドーパミン作動性ニューロンは、誕生時に異常を示さないか、わずかしか示さない（Tomacら、2000）。これらのノックアウトに関する報告書から、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１およびＲＥＴは、一般にニューロンの発生に関与しないようであるが、神経堤由来の神経細胞系（例えば、腸神経系および上頚神経節の大部分）は、報告によれば、これらのニューロンがノックアウト胚および新生児において存在しないので（Durbecら、1996）、通常の発生に関して機能性Ｒｅｔに依存する。ノックアウトマウスは誕生直後に死亡するので、喪失に関するＣＮＳの長期的影響は評価されていない。乳児期および成体期の影響を検討するために別の手法が適用される。ヘテロ接合ＧＦＲα１＋／−マウスは成体期まで生存可能であり、野生型の同腹子と比較して、脳虚血の誘発によって証明されたＧＤＮＦ介在性神経保護の低下を示す。したがって、利用可能なＧＦＲα１のレベルは、ＧＤＮＦ効率における限定因子であることが示唆される（Tomacら、2000）。ＧＦＲα１＋／−ヘテロ接合マウスにおける同化は、線条体中ドーパミンの減少を示し、付随する黒質のドーパミン作動性ニューロンの年齢依存的減少は、運動活性を低下させた（Zamanら、2008）。領域選択的なＲＥＴ消失は、老齢マウスの黒質において特異的にドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失を誘発する（Kramerら、2007）。黒質線条体の神経支配の喪失はドーパミン作用性線条体ニューロンに間接的に作用し、線条体中の神経終末の実質的な年齢依存的分解と誘発ドーパミン放出のレベル低下をもたらす。したがって、ＲＥＴは、黒質線条体のドーパミン系の維持に重要である（Kramerら、2007）。同様に、中脳の胎児神経ＧＤＮＦ−／−組織を移植した成体野生型マウスは、ＧＤＮＦヌル変異を利用する中脳ドーパミン作動性ニューロンの継続的な生後発達に関する試験で利用される（Granholmら、2000）。ＧＤＮＦ−／−組織移植によりドーパミン作動性ニューロンと神経突起伸長の数が減少し、この試験は、ＧＤＮＦが中脳ドーパミン作動性ニューロンの長期生存にとって重要であることを実証した（Granholmら、2000）。黒質線条体ドーパミン作動性機能の年齢依存的低下はＧＤＮＦシグナル経路障害マウスに一般的であり、この表現型は、パーキンソン病の初期と関連する改変に似ている。
【００１３】
ＧＦＬ−ＧＦＲα−ＲＥＴ結合性の表示は、成体マウスのＣＮＳにおける相補的発現パターンである。ここで、ＲＥＴを発現するＧＤＮＦおよびＮＲＴＮ応答脳領域は、ＧＦＲα１またはＧＦＲα２を同時発現する。逆に、ＧＦＲα１またはＧＦＲα２発現ニューロンからのプロジェクションを受ける様々な領域は内在性のＧＤＮＦおよびＮＲＴＮを有する（Goldenら、1998）。ＧＦＬおよび対応するＧＦＲαノックアウトマウスが極めて類似する表現型を示すので、対合は特異的である（Airaksinenら、1999）。しかし、上頸交感神経節のニューロンに関して、ＧＤＮＦ−／−、ＧＦＲα１−／−およびＲＥＴ−／−マウスの表現型は相反している。これらのニューロンは、ＲＥＴヌルマウスにおいては完全になくなっている（Durbecら、1996）。これらはＧＤＮＦ−／−新生児では軽微な程度（ニューロン数の３５％減）にしか影響されていないのに対し（Mooreら、1996）、ＧＦＲα１ノックアウトマウスにおいては正常であり、影響を受けないように思われる（Enomotoら、1998）。これは、上頸交感神経節ニューロンが形成、遊走および生後の生存に関してＡＲＴＮ−ＧＦＲα３シグナル伝達に依存するので、これらのニューロンのＧＦＬおよびＧＦＲαの間での余剰により説明することができるかもしれない（Nishinoら、1999）。結果的に、ＧＦＲα３−／−マウスは生存可能で繁殖力はあるが、眼瞼下垂の明確な表現型を示す。様々な神経節における広範囲のＧＦＲα３発現にもかかわらず、ＧＦＲα３介在性シグナル伝達は別のＰＮＳ神経節においては決定的でない（Nishinoら、1999）。ＧＦＲα２は、様々な節後副交感神経ニューロンの発生における重要因子であり、ＧＦＲα２減少は、機能不全のコリン作動性繊維神経支配による小腸腸筋神経叢（すなわち、胃腸管運動性を制御する腸神経系の一部）の不全の他に、涙腺および唾液腺の機能不全をもたらす（Rossiら、1999）。ＧＦＲα２−／−マウスは、ＧＦＲα３ノックアウトマウスと同様に生存可能であり（Rossiら、1999）、たとえ、ＮＲＴＮおよびＧＦＲα２が成体のＣＮＳ全体にわたって発現されたとしても、ＣＮＳにおける不全は示さない（Goldenら、1998）。マイナー表現型のみがＧＦＬまたはＧＦＲαのノックアウトマウス（kockout mice）のＣＮＳにおいて確認されるという事実は、中枢ニューロンに対する栄養余剰によるものであろう。
【００１４】
総合すれば、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、アルテミンまたはパーセフィンによって誘導されるシグナル伝達の機能障害は、多数の障害、特に運動ニューロン疾患、感覚再生および神経因性疼痛、虚血、てんかん、パーキンソン病、薬物乱用、ならびに統合失調症に機能的にまたは遺伝学的に関係している。
【００１５】
ＳｏｒＬＡ
ソーティングタンパク質関連受容体を略記したＳｏｒＬＡ（Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ  ＩＤ  ｎｏ  Ｑ９２６７３）は、ＬＲ１１としても知られており、２５０ｋＤａの１型膜タンパク質であって、Ｖｐｓ１０ｐドメイン受容体ファミリーで同定された第２のメンバーである。このファミリーの受容体はすべて、受容体Ｖｐｓ１０ｐをソーティングする酵母の内腔部分を構成する、２つのドメインのそれぞれに対し強い類似性を有する約６００アミノ酸Ｎ−末端ドメインの構造的な特徴を共有する（Marcusson, Horazdovskyら、1994）。リガンドのなかでもとりわけ、神経栄養因子およびニューロペプチドに結合するＶｐｓ１０ｐドメイン（Ｖｐｓ１０ｐ−Ｄ）（Mazella, Zsurgerら、1998; Munck Petersen, Nielsenら、1999; Nykjaer, Leeら、2004; Westergaard, Sorensenら、2004; Teng, Tengら、2005）は、第１の同定メンバーであるソルチリンの内腔部分全体を構成し、酵素プロペプチド切断によりリガンド結合に対して活性化される（Mazella, Zsurgerら、1998; Munck Petersen, Nielsen ら、1999）。ＳｏｒＬＡは、ソルチリンと同様に、その内腔ドメインがＶｐｓ１０ｐドメインのみからなるが、後ゴルジコンパートメントでフューリンによって切断される受容体前駆体として合成される。プロペプチド切断は、ニューロペプチドと受容体関連タンパク質のプロペプチド阻害可能結合のためにＶｐｓ１０ｐドメインを調整することが示されている。ＳｏｒＬＡ  Ｖｐｓ１０ｐドメインの配列は、配列番号３と記載する。プロペプチドによって阻害されない受容体関連タンパク質、アポリポタンパク質Ｅおよびリポタンパク質リパーゼの強結合が、別の内腔ドメインに位置している部位に生じることも示されている（Jacobsen, Madsenら、2001）。トランスフェクト細胞において、完全長ＳｏｒＬＡの約１０％が細胞内取込を介在し得る細胞表面上で発現される。受容体の主要プールが後ゴルジコンパートメントで確認され、新しく合成されたリガンドとの相互作用が示唆されている。ＳｏｒＬＡは、発生中および成体において、神経系全体で異なる細胞型で高度に発現される（Kanaki, Bujoら、1998; Motoi, Aizawaら、1999; Offe, Dodsonら、2006）。興味深いことに、ＳｏｒＬＡレベルは散発型のアルツハイマー病で低下し（Scherzer, Offeら、2004; Dodson, Gearingら、2006; Sager, Wuuら、2007）、ＳｏｒＬＡ遺伝子中の遺伝性突然変異は、遅発症性アルツハイマー病に遺伝学的に関係している（Rogaeva, Mengら、2007）。重要なことには、ＳｏｒＬＡは、アミロイド前駆タンパク質の高親和性結合およびソーティングを介在すること、Ａβ生成に対して保護を付与することが明らかとなっている（Andersen, Reicheら、2005; Offe, Dodsonら、2006; Spoelgen, von Arnimら、2006; Rogaeva, Mengら、2007）。
【００１６】
多数の薬物が神経系障害、精神障害および行動障害の治療において既に利用可能となっているが、それらのすべてが複雑な間接的作用機構を有しており、その疾患の根本原因の治療ではなく症状を軽減することを目指すものである。その代わりに、神経系障害、精神障害および行動障害に対する長期治療法として、シナプス可塑性またはニューロンの生存を制御するシグナル経路をターゲットとする薬物を開発するべきであると一般に考えられている（Manji, Drevetsら、2001）。広範囲の実験および臨床データは、精神障害および行動障害における、ならびに一般に神経系の疾患におけるＧＤＮＦシグナル伝達に関する中心的機能を示唆している。例えば、ＧＤＮＦ遺伝子またはＧＦＲα１〜３遺伝子の多型は統合失調症と関連があり、また、ＧＤＮＦ多型は注意欠陥および多動障害に関係している。さらに、ＧＤＮＦの血中濃度の変化は双極性障害と関連する。
【００１７】
パーキンソン病は、緻密部および黒質内における選択されたニューロン（主に中脳ドーパミン作動性ニューロン）の進行性の死滅が原因である、運動機能および認知機能の損傷を特徴とする神経変性障害である。これは、ドーパミンレベルの低下をもたらす（Davie 2008に概説されている）。パーキンソン病に対する最新の治療は、根本的なニューロン変性が継続するので、対症療法でしかない。この緩和治療としては、ドーパミン代謝の各種阻害剤と組み合わせたドーパミンアゴニストおよびＬＤＯＰＡの投与が挙げられる。ＧＤＮＦは、ドーパミン作動性ニューロンに対する神経保護効果および神経再生効果を有することが明らかにされており（Beckら、1995; Kearnsら、1995; Linら、1993; Sauerら、1995）、パーキンソン病の治療法と考えられた。ＧＤＮＦのプラス効果はパーキンソン病のＭＰＴＰ障害および６−ＯＨＤＡ障害動物モデルで明らかにされており、この場合、ＧＤＮＦは中脳のドーパミン作動性ニューロンの生存を促進することが示された（Gashら、1998; Tomacら、1995）。パーキンソン病のアカゲザルへのＧＤＮＦ脳内投与実験からは、パーキンソン病の３つの主症状、すなわち、運動緩徐、硬直および姿勢の不安定の有意な軽減が明らかとなった（Gashら、1996）。ＧＤＮＦ投与動物には、ドーパミンレベル、線維密度および中脳のドーパミン作動性ニューロンの細胞の大きさに有意な増強があり、特に、黒質中のドーパミン作動性ニューロンの数に増加があった。ＧＤＮＦは血液脳関門を透過するのが困難であるので、ＧＤＮＦ治療に関する問題は送達である。パーキンソン病のげっ歯類およびサルで遺伝子治療が試みられ、良好な結果が得られている（Zurnら、2001）。カプセル化遺伝子組換え細胞系によって送達されたＧＤＮＦは、低レベルのＧＤＮＦを継続的に放出し、続いて、黒質のドーパミン作動性ニューロンを保護し、挙動を回復した。さらに、レンチウイルスベクター系によりＧＤＮＦ送達すると、パーキンソン病の機能性障害の反転をもたらす黒質ニューロンの再生が示された。しかし、パーキンソン病の治療法としてＧＤＮＦを試験する臨床試験から得た結果では、違った結果があった。ＧＤＮＦを脳室内投与してもパーキンソン病患者に対症効果をもたらすことはできず、悪心、幻覚およびうつ病をはじめとする多くの副作用が伴っていた（Nuttら、2003）。代わりに線条体へＧＤＮＦを投与すると有意な臨床効果が得られた（Gillら、2003）。しかし、これらの結果は、二重盲検のプラセボ比較試験において確認することはできなかった（Langら、2006）。異なる結果が得られたことから臨床試験は決定的ではないが、引き続き、ＧＤＮＦはパーキンソン病に対する有用な治療法と考えるべきである。しかし、解消しなければならない様々な問題がある。これらの問題としては、ＧＤＮＦの送達が挙げられ、ＧＤＮＦが血液脳関門を透過する必要があり、ＧＤＮＦが適切な標的に拡散される必要があり、非標的送達の効果を最小限にして副作用を低下させる必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体（例えば、ＧＦＲα１、２、３および／または４受容体）の間の相互作用を調節することにより、ドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンの生存を高める方法に関する。一実施形態によれば、それの必要な患者の脳のＧＤＮＦの細胞外レベルを、ＳｏｒＬＡとＧＦＲα１の間の相互作用を調節するか阻害することにより増加させることができるか、あるいは、ＧＤＮＦの内在化および／または分解が阻害される。
【００１９】
特に、本発明は、ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体の間の相互作用を調節するために用いられる薬剤がタンパク質、ペプチド、抗体または小型有機化合物から選択される方法に関する。
【００２０】
また本発明は、そのような薬剤を１つまたは複数の医薬的に許容される担体もしくは希釈剤と組み合わせて、またはアジュバントと組み合わせて含む医薬組成物に関する。
【００２１】
さらに、本発明は、特に傷害誘発性神経細胞死、脊髄傷害、末梢神経損傷、脳虚血、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、慢性疼痛、神経因性疼痛、てんかん、がん、パーキンソン病、大うつ病、統合失調症、注意欠陥および多動性障害（ＡＤＨＤ）、薬物乱用、不安障害（axiety disorder）、および／または双極性障害（躁うつ病）を含む疾患の中で、ニューロン（例えばドーパミン作動性ニューロン）の生存を高めるためのそのような薬剤または医薬組成物の使用に関する。
【００２２】
最後に、本発明は、ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体の間の相互作用を阻害することが可能な薬剤を同定するための各種アッセイに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＧＤＮＦファミリーリガンドのシグナル伝達を示す図である。
【図２】Ｖｐｓ１０ｐドメイン受容体のドメイン構造を示す図である。
【図３】ＳｏｒＬＡは選択的にＧＤＮＦを結合するが、別のＧＤＮＦファミリーリガンドに結合しないことを示す図である。（Ａ）ＳｏｒＬＡのドメイン構造を表す。（Ｂ）ＧＤＮＦはＳＰＲによって示したような濃度依存性方法で固定化ＳｏｒＬＡに結合する。算出ＫＤは３〜８ｎＭの範囲である。（Ｃ）ＳｏｒＬＡ結合はＧＤＮＦに選択的であるが、別のＧＤＮＦファミリーリガンドのアルテミン、ニュールツリンおよびパーセフィンに選択的でない。使用した神経栄養因子濃度は２０ｎＭである。（Ｄ）相互作用はＧＤＮＦの成熟部分により介在されるが、ＧＤＮＦプロペプチド（ＧＤＮＦｐｒｏ）により介在されない。１００ｎＭリガンド濃度のセンサーグラムを示す。（Ｅ）過剰ＳｏｒＬＡプロペプチド（ＳｏｒＬＡｐｒｏ、１０μＭ）が部分的にＧＤＮＦ結合を阻害する（１００ｎＭ）。（Ｆ）ＧＤＮＦ（５０ｎＭ）の結合が過剰ニューロテンシン（ＮＴ、２０μＭ）により完全に阻害される。（Ｇ〜Ｈ）２９３細胞または安定的にＳｏｒＬＡを発現する２９３細胞による５０ｎＭ  ＧＤＮＦの内在化を示す。内在化ＧＤＮＦ（緑）は、免疫蛍光法によって視覚化した。（Ｉ）ＧＤＮＦ内在化は過剰ニューロテンシンによって阻害された（ＮＴ、２０μＭ）。
【図４】ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１による共同的ＧＤＮＦ取り込みを示す図である。（Ａ）４５分間の間にＳｏｒＬＡにより内在化されたＧＤＮＦ（５０ｎＭ）を免疫蛍光法によって視覚化した。しかし、内在化は１０ｎＭ  ＧＤＮＦを使用して検出することができなかった。ＧＤＮＦ（５０ｎＭ）はＧＦＲα１を発現する細胞によって内在化されなかったが、表面に結合されているままであった。（Ｂ）ＧＤＮＦがＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１の両方を発現する細胞によってかなりの程度まで内在化されることを示す。（Ｃ）ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１による表面からのＧＤＮＦ（１０ｎＭ）内在化のプロセスの時間経過を示す。
【図５】ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１が細胞表面ＧＤＮＦ受容体複合体を形成することを示す図である。（Ａ）ＳｏｒＬＡは、両方の受容体を発現する細胞からのＧＦＲα１とＳｏｒＬＡの免疫共沈降により示したように、細胞においてＧＦＲα１と直接的に相互作用する。（Ｂ）細胞外ドメインに対する抗体および蛍光性標識した第２の抗体を使用する、非透過性固定化細胞におけるＳｏｒＬＡ（アクセプター）およびＧＦＲα１（ドナー）の間の細胞表面相互作用の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析。代表的な細胞を示す。（Ｃ）細胞表面ＳｏｒＬＡ／ＧＦＲα１複合体形成は高度に特異的である。平均Ｅａｐｐ％値は、全ＦＲＥＴチャンネル画像においてサイズ５×５ピクセルの関心領域（ＲＯＩ）内で算出し、ＲＯＩの対応する平均アクセプターシグナルの機能としてプロットする。アクセプターシグナルに対するＥａｐｐ％のほぼ一定の依存は、特異的相互作用を示す。（Ｄ）ＳｏｒＬＡ／ＧＦＲα１相互作用に対して平均１６％のＥａｐｐ％値の正規分布を示すヒストグラム（黒いヒストグラム）。比較については、Ｅａｐｐ％値は安定的にトランスフェクトされた細胞のＳｏｒＬＡおよびＲｅｔについて測定した（灰色のヒストグラム）。平均Ｅａｐｐ％値は６％であり、有望なＳｏｒＬＡ／Ｒｅｔ相互作用が特異的ではないことを示唆している。（Ｅ）ＧＦＲα１は約６ｎＭのＫＤで濃度依存的に固定化ＳｏｒＬＡ細胞外ドメインに結合する。（Ｆ）ＳｏｒＬＡとのＧＦＲα１に特異的であるがＲｅｔ細胞外ドメイン（いずれも２００ｎＭ）に特異的でない相互作用。（Ｇ）ＳｏｒＬＡ／ＧＤＮＦ相互作用と異なり、ＳｏｒＬＡにより結合されているＧＦＲα１（２００ｎＭ）は、過剰ニューロテンシン（ＮＴ、２０μＭ）により阻害されない。（Ｈ）ＳｏｒＬＡに結合しているＧＦＲα１（２００ｎＭ）は、過剰ＳｏｒＬＡプロペプチド（５μＭ）により阻害される。
【図６】ＳｏｒＬＡによるＧＦＲα１／ＧＤＮＦの逆行性ソーティングを示す図である。（Ａ）ＧＦＲα１（緑）はＳｏｒＬＡの存在下で時間とともに細胞表面から内在化される。（Ｂ）内在化は、ＧＤＮＦの存在により増強されるように見える。（Ｃ）ＧＦＲα１は、実験の間に、単独で内在化されない。（Ｄ）ＳｏｒＬＡ／ＧＦＲα１相互作用は低ｐＨで安定しており、複合体がエンドソームのｐＨで存続することを示唆している。（Ｅ）固定化ＳｏｒＬＡへの５０ｎＭのＧＤＮＦおよび５０ｎＭのＧＦＲα１の結合に関するＳＰＲ分析により明らかなように、ＳｏｒＬＡ／ＧＤＮＦおよびＳｏｒＬＡ／ＧＦＲα１は競合的相互作用（competive interactions）ではない。
【図７】ＳｏｒＬＡはＧＦＲα１細胞内局在性を制御することを示す図である。（Ａ）ＳｏｒＬＡの存在により、安定的にトランスフェクトされた細胞内で、ＧＦＲα１は、よりベシクル状に局在化する。（Ｂ）表面ビオチン化は、ＳｏｒＬＡを発現する細胞の表面局所化ＧＦＲα１の減少を示すことについて試験する。（Ｃ）ＳｏｒＬＡは、ショ糖濃度勾配遠心法によって評価した場合、フロチリン（脂質ラフトマーカー）含有画分のＧＦＲα１の相対量を低下させる。
【図８】ＳｏｒＬＡがＲｅｔ表面クラスター形成を阻害することを示す図である。（Ａ）ＳｏｒＬＡの過剰発現は、平衡勾配遠心分離によって明らかなように、ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞の内在性Ｒｅｔの細胞内局在性を変える。（Ｂ）非透過性分化型ＳＹ５Ｙ細胞のＲｅｔ染色は、野生型ＳｏｒＬＡが過剰発現される時に表面局所化Ｒｅｔクラスターの存在が消失するが、ＳｏｒＬＡデルタテイル（deltatail）の過剰発現により消失しないことを示す。（Ｃ）内在性Ｒｅｔおよび一部のＳｏｒＬＡを発現する分化型神経芽細胞腫（ＳＹ５Ｙ）細胞、野生型ＳｏｒＬＡまたは細胞質側末端（ＳｏｒＬＡ  ｄｅｌｔａｔａｉｌ）を欠損するＣ末端切断型ＳｏｒＬＡ変異体を過剰表現するＳＹ５Ｙ細胞の蛍光免疫染色。非トランスフェクト細胞では、内在性Ｒｅｔは濃く染色された分散型クラスターで認められる。しかし、Ｒｅｔクラスター形成は、ＳｏｒＬＡ過剰発現により完全に阻害される。ＳｏｒＬＡ細胞質側末端のトランケーションは、Ｒｅｔクラスター形成を援助する。
【図９】ＳｏｒＬＡがＲｅｔシグナル伝達および下流の機能を調節することを示す図である。（Ａ）０分、１５分および４５分間、６ｎＭ  ＧＤＮＦ＋／−６ｎＭ  可溶性ＧＦＲα１によるＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞の刺激。Ｒｅｔは抗Ｒｅｔ抗体を使用して免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体を使用し、ウェスタンブロッティングにより分析した。（Ｂ）ＳｏｒＬＡを過剰発現する神経芽細胞腫細胞を用いる類似の実験。（Ｃ）Ｒｅｔリン酸化のＳｏｒＬＡ阻害は、試験中、１０μｇ／ｍｌの抗ＳｏｒＬＡ抗体の存在により助けられる。（Ｄ）過剰プロペプチド（ＳｏｒＬＡｐｒｏ）の存在による内在性ＳｏｒＬＡの阻害は、神経芽細胞腫細胞の生存を高めるが、過剰発現（ＳｏｒＬＡ）は生存を低下させる。（Ｅ）過剰プロペプチドによるＳｏｒＬＡの阻害は、神経芽細胞腫細胞の増殖を高める。（Ｆ）ＳｏｒＬＡの過剰発現はＧＤＮＦ誘発神経突起伸長を阻害するが、レチノイン酸（ＲＡ）誘発神経突起伸長は阻害しない。
【図１０】ＳｏｒＬＡが脳の至る所でＧＦＲα１およびＲｅｔの細胞内局在化を制御することを示す図である。（Ａ）ＳｏｒＬＡは、ウェスタンブロッティングによって示した、若齢マウスおよび老齢マウスの中枢神経系全体にわたって発現される。（Ｂ）免疫組織化学は、皮質全体にわたってニューロン細胞体の周囲のベシクルにＳｏｒＬＡが存在することを示す。（Ｃ）野生型マウスまたはＳｏｒＬＡ−／−マウスから得た脳ホモジェネートのショ糖濃度勾配遠心法により評価した、ＳｏｒＬＡ−／−脳のＧＦＲα１の細胞内局在化の変化。（Ｄ）ＳｏｒＬＡ−／−脳のＲｅｔの細胞内局在化変化を示す類似の実験。
【図１１】ＳｏｒＬＡがＧＦＲαに対する一般的なソーティング受容体であることを示す図である。（Ａ）ＳｏｒＬＡを安定的に発現する細胞を、示したようにＧＦＲα１〜４で一時的にトランスフェクトし、続いて抗ＧＦＲα１、−２、−３および−４をそれぞれ使用して免疫沈降させ、その後、抗ＳｏｒＬＡを使用してウェスタンブロッティングを行った。（Ｂ）ＳｏｒＬＡの存在下におけるＧＦＲα２（緑）の逆行性ソーティング。（Ｃ）ショ糖濃度勾配遠心法を使用して評価した場合のＳｏｒＬＡ−／−脳のＧＦＲα２の細胞内局在化の変化。
【図１２】ＳｏｒＬＡ阻害がドーパミン作動性ニューロンのＧＤＮＦ誘発生存を高めることを示す図である。（Ａ）黒質に関する免疫組織化学は、ドーパミン作動性ニューロン（赤）のＳｏｒＬＡ（緑）の存在を示す。（Ｂ）グリア細胞層上で成長したドーパミン作動性ニューロン（赤）の初代培養。ＳｏｒＬＡはグリアおよびニューロンの両方で発現される。（Ｃ）主要ドーパミン作動性ニューロンのニューロンおよびグリアにおけるＳｏｒＬＡおよびＧＤＮＦの共局在化。（Ｄ）主要ドーパミン作動性ニューロンのニューロンおよびグリアにおけるＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１の共局在化。（Ｅ）主要ドーパミン作動性ニューロンの生存にはＧＤＮＦが必要とされ、抗ＳｏｒＬＡ抗体により促進される。
【図１３】ＳｏｒＬＡ−／−マウスがアンフェタミンへの機能促進および非感受性を示す図である。（Ａ）ＳｏｒＬＡ−／−マウスはオープンフィールドで試験した場合、高活性である。機能促進は年齢によって逆転する。（Ｂ）オープンフィールドにおける２０分間の若齢および老齢ＳｏｒＬＡ−／−マウスの軌跡プロット。（Ｃ）ＳｏｒＬＡ−／−マウスは１０ｍｇ／ｋｇのアンフェタミンに非感受性である。（Ｄ）生理食塩水またはアンフェタミン注射後のオープンフィールドにおける４０分間の幼若（８週齢未満）野生型およびＳｏｒＬＡ−／−マウスの軌跡プロット。（Ｅ）生理食塩水またはアンフェタミン注射後のオープンフィールドにおける４０分間の成体（１２週齢以上）野生型およびＳｏｒＬＡ−／−マウスの軌跡プロット。
【図１４】ＳｏｒＬＡ−／−マウスがリスクテイキング行動および注意欠陥の増加を示す図である。（Ａ）ＳｏｒＬＡ−／−マウスは、高架型十字迷路で試験した場合、高活性である。（Ｂ）ＳｏｒＬＡ−／−マウスに、高架型十字迷路の走行路間の退出が増える。（Ｃ）ＳｏｒＬＡ−／−マウスに、走行路間の出口合計に対して壁のない走行路への入場が増える。（Ｄ）ＳｏｒＬＡ−／−マウスは、壁のない走行路において、消費時間の割合が増加する。（Ｅ）野生型（ｎ＝２３）およびＳｏｒＬＡ−／−（ｎ＝１２）マウスにおける高架型十字迷路の落下。（Ｆ）高架型十字迷路において１０分間試験した野生型およびＳｏｒＬＡ−／−マウスの軌跡プロット。
【図１５】ＳｏｒＬＡによるＧＤＮＦ受容体の逆行性ソーティングについて説明する仮説モデル。
【図１６】ＧＦＲα１ドメイン１のトランケーションがＳｏｒＬＡに対する親和性を低下させることを示す図である。（Ａ）可溶性完全長ＧＦＲα１（ｓＧＦＲα１  ＦＬ）は、推定Ｋｄ＝１２ｎＭの濃度依存的にＳｏｒＬＡに結合する。（Ｂ）ＧＦＲα１は３つの相同ドメインからなる。ドメイン１に対応する配列長を欠損するＮ末端切断型可溶性ＧＦＲα１変異体（ｓＧＦＲα１  Δドメイン１）は、Ｋｄ＝１２０ｎＭで固定化ＳｏｒＬＡに結合する。
【図１７】成熟ＧＤＮＦのＮ末端３８アミノ酸がＳｏｒＬＡに結合することを示す図である。（Ａ）ＧＳＴとＧＤＮＦプロペプチド（ＧＤＮＦｐｒｏｐｅｐ）の間の融合タンパク質、成熟ＧＤＮＦのＮ末端３８アミノ酸（ＧＤＮＦＮ−ｔｅｒｍ）、または固定化ＳｏｒＬＡに結合している、ＧＤＮＦプロペプチドとそれに続く成熟ＧＤＮＦの最初の３８アミノ酸（ＧＤＮＦＮ−ｔｅｒｍ  ｐｒｏｐｅｐ）。ＧＳＴのみを陰性対照として含む。（Ｂ）成熟ＧＤＮＦの最初の３８アミノ酸を含むペプチドは、濃度依存的にＳｏｒＬＡに結合する。
【図１８】ＳｏｒＬＡがＣＮＳのＧＤＮＦ内在化受容体であることを示す図である。（Ａ）皮質グリア細胞の初代培養はハイレベルのＳｏｒＬＡを発現する。（Ｂ）ＧＤＮＦ（１０ｎＭ、１５分）は野生型マウス由来のグリア細胞により内在化されるが、Ｓｏｒｌ１−／−マウス由来のグリア細胞により内在化されない。
【図１９】ＧＦＲα１ではなくＧＤＮＦが分解においてリソソームにソーティングされることを示す図である。（Ａ）リソソーム分解の阻害は、ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１を発現する細胞の内在化ＧＤＮＦレベルを増加する。（Ｂ〜Ｃ）代謝標識法、続いてパルスチェイス分析により評価した場合のＳｏｒＬＡの不在下または存在下におけるＧＦＲα１の代謝回転。
【図２０】ＳｏｒＬＡノックアウトマウスにおけるＧＤＮＦレベルの増加を示す図である。野生型マウスおよびＳｏｒｌ１ノックアウトマウス由来の組織においてＥＬＩＳＡによりＧＤＮＦが検出された。ＧＤＮＦはノックアウト動物のＶＴＡおよび線条体で増加する（Ｐ＝０．０１、ｎ＝３；それぞれ３匹の動物のプールを含む）。
【図２１】ＳｏｒＬＡ機能阻止抗体によるＧＤＮＦ内在化および分解の阻害を示す図である。（Ａ）ＧＦＲａ１およびＳｏｒＬＡを発現する２９３個の細胞を、２時間、非特異的ウサギＩｇＧ（１０ｕｇ／ｍｌ）と前培養し、続いて、１５分間、ＧＤＮＦ（１０ｎＭ）およびウサギＩｇＧの両方と前培養した。次いで、細胞を固定化し、ＧＤＮＦ抗体および蛍光標識した第２抗体を使用して染色した。（Ｂ）ウサギポリクローナル抗体を使用する類似の実験をＳｏｒＬＡの細胞外ドメインに対して行った。抗ＳｏｒＬＡ  ＩｇＧの存在により、表面ＧＤＮＦ免疫蛍光が増強される。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
定義
アジュバント：投与される免疫原性決定因子／抗原との混合が前記決定因子に対する免疫応答を増加させる、または別の形で改変する任意の物質。
【００２５】
親和性：リガンドのそれらの結合部位との相互作用は、結合親和性に関して特徴づけることができる。一般的に、高親和性リガンド結合は、リガンドとその受容体とのより強い分子間力から生じるが、低親和性リガンド結合は、リガンドとその受容体とのより弱い分子間力を伴う。一般的に、高親和性結合は、低親和性結合の場合より、リガンドのその受容体結合部位でのより長い滞留時間を伴う。リガンドの受容体への高親和性結合は、結合エネルギーの一部を用いて受容体に立体構造的変化を引き起こすことができ、結果として、関連イオンチャネルまたは酵素の挙動の変化を生じる場合、生理学的に重要であることが多い。受容体に結合し、受容体の機能を変化させ、生理的応答をトリガーすることができるリガンドは、その受容体のアゴニストと呼ばれる。アゴニストの受容体への結合は、どれくらい生理的応答をトリガーすることができるかということ、および生理的応答を生じるのに必要とされるアゴニストの濃度の両方に関して特徴づけることができる。高親和性リガンド結合は、比較的低濃度のリガンドが、最大限にリガンド結合部位を占有して、生理的応答をトリガーするのに十分であることを意味する。低親和性結合は、結合部位が最大限に占有され、リガンドに対する最大生理的応答が達成されるには比較的高い濃度のリガンドが必要とされることを意味する。リガンド結合は、解離定数（ｋｄ）として知られている、受容体結合部位の半分が占有される時点のリガンドの濃度に関して特徴づけられることが多い。また親和性は、受容体とそれらのリガンドの間の、例えば、抗体とその抗原の間の結合強度である。
【００２６】
アゴニスト：アゴニストは、受容体の活性を増加させるまたはもたらす能力がある化合物である。
【００２７】
アンタゴニスト：アンタゴニストは、この場合、阻害剤と同義である。アンタゴニストは、受容体などのエフェクターの活性を減少させる能力がある化合物である。
【００２８】
詳細には、ＳｏｒＬＡまたはＧＤＮＦファミリーリガンド受容体（ＧＦＲα１〜４）に対するアゴニストまたはアンタゴニストは、それらの細胞外ドメイン、例えば、ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体の間の特異的結合を仲介するドメイン（例えば、配列番号５または配列番号７に記載されているもの）に結合することが可能である。ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体の間の相互作用を調節することが可能であるように方向づけられた薬剤としては、ＳｏｒＬＡまたはＧＤＮＦファミリーリガンド受容体の可溶性断片、それぞれの受容体を対象とした抗体、天然の結合パートナー（例えば、ＧＤＮＦもしくはニューロテンシン）、または合成の小型有機化合物が挙げられる。
【００２９】
抗体：本明細書に記載した用語「抗体」とは、全抗体、およびそれらの任意の抗原結合フラグメント（すなわち「抗原結合部分」）または単鎖を包含する。
【００３０】
「全抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された、少なくとも２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質、またはそれらの抗原結合部分を意味する。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記）および重鎖定常領域（本明細書ではＣＨと略記）で構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記）および軽鎖定常領域（本明細書ではＣＬと略記）で構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、さらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存性のある領域の間にちりばめられている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分することができる。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４にアミノ末端からカルボキシ末端へ配置されている、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互に作用する結合ドメインを含有している。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または因子（免疫系の各種細胞（例えば作動細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む）への結合を介在することができる。
【００３１】
本明細書で用いられる、抗体の「抗原結合部分」という用語とは、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を意味する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって成し遂げることができることがわかっている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例としては、次のものが挙げられる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１のドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨのドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂフラグメント（Wardら、(1989) Nature 341:544-546）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｖｉｉ）合成リンカーによって場合により連結されてもよい、２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせ。さらにＦｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は個別の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え法を使用して、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対になって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらが調製されることを可能にする合成リンカーによって連結することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である；例えば、Birdら (1988) Science 242:423-426；およびHustonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含されるものとする。
【００３２】
抗原結合ドメインのさらなる例は免疫グロブリン融合タンパク質であって、次のものを含む：（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに縮合された結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域へ縮合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域へ縮合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域であり得る。このような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、ＵＳ２００３／０１１８５９２およびＵＳ２００３／０１３３９３９にさらに開示されている（両方とも参照によりその全体を本明細書に援用する）。
【００３３】
これらの抗体フラグメントは当業者に公知の慣用の技術を用いて得られ、フラグメントは、無傷抗体である場合と同じように、有用性についてスクリーニングされる。
【００３４】
用語「エピトープ」とは、抗体に特異的に結合することが可能であるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学上活性のある表面集団からなり、通常、特異的な三次元構造特性ならびに比電荷特性を有する。立体エピトープおよび非立体エピトープは、変性溶媒の存在下で、前者への結合は失われるが後者では失われないことで区別される。
【００３５】
本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を包含するものとする。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでのランダム突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発によって導入される、あるいはインビボでの体細胞突然変異によって導入される変異）。しかし、本明細書で用いる「ヒト抗体」という用語は、マウスのような別の哺乳動物種の生殖細胞系列由来のＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上にグラフトされている抗体を包含するものではない。
【００３６】
本明細書の「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製または単離されるすべてのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子におけるトランスジェニック動物またはトランスクロモゾーマル（transchromosomal）動物（例えばマウス）あるいはそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体、（ｂ）形質転換されることで抗体を発現する宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（transfectoma）から単離される抗体、（ｃ）組換えられたコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離される抗体、およびｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、作製または単離される抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する。しかし、特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体に対し、親和性成熟とも呼ばれる、インビトロでの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が用いられる場合、インビボでの体細胞突然変異誘発）を実施可能であり、それ故、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来しかつそれらに関連する一方、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリーの範囲内に天然に存在することがない配列である。
【００３７】
本明細書では、「特異的結合」とは所定の抗原／エピトープに結合する抗体を意味する。一般的に、抗体は、ＦＡＣＳにおいてＩＣ５０値に基づいた見掛けの親和性として測定した場合に、約１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ以下、例えば約１０−９Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、または約１０−１１Ｍ以下のＫＤに相当する親和性で結合し、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのその親和性より少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低いＫＤに相当する親和性で所定の抗原に結合する。
【００３８】
抗体のクラス：それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。少なくとも５つの主要クラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ（ａ）、デルタ（ｄ）、イプシロン（ｅ）、ガンマ（ｇ）およびミュー（μ）と呼ばれる。抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ配列に基づいて、カッパ（ｋ）およびラムダ（ｌ）と呼ばれる、２つの明らかに異なるタイプの１つに割り当てることができる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構造は周知である。
【００３９】
キメラ抗体：可変領域が動物のある種に由来し、かつ定常領域が動物の別種由来である抗体。例えば、キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒトである定常領域を有する抗体であり得る。
【００４０】
相補性決定領域またはＣＤＲ：抗体認識および結合ドメインを一緒に形成する抗体のＶドメインにおける領域。
【００４１】
定常領域または定常ドメインまたはＣドメイン：定常領域は、保存的置換をその中に含有し得る所定のアイソタイプ内のアミノ酸残基配列を含む抗体分子のそれらの構造的部分である。具体的な重鎖免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４およびＣＨ５として当技術分野で公知の免疫グロブリン分子のそれらの部分である。具体的な軽鎖免疫グロブリン定常領域は、ＣＬとして当技術分野で公知の免疫グロブリン分子のその部分である。
【００４２】
ヒト抗体フレームワーク：抗原結合部位を有し、本質的に、ヒト免疫グロブリン由来の分子の免疫グロブリン誘導部位をすべて維持している分子。
【００４３】
ヒト化抗体フレームワーク：ヒト以外の種からの免疫グロブリン由来の抗原結合部位を有する分子であるが、分子の残りの免疫グロブリン誘導部位の一部または全部がヒト免疫グロブリン由来である分子。抗原結合部位は次のものを含んでいてもよい：１つまたは複数のヒト定常ドメイン上に縮合されているヒト以外の免疫グロブリンからの完全な可変ドメイン；あるいは可変ドメイン中の適切なヒトフレームワーク領域上にグラフト化された相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つまたは複数。ヒト化抗体において、ＣＤＲはマウスモノクローナル抗体からのものであってもよく、抗体の別の領域はヒトである。
【００４４】
免疫グロブリン：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤを含む、血清抗体。
【００４５】
免疫グロブリンアイソタイプ：異なるＨ鎖を有するＩｇを表す名称で、名称は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、２、３、４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、２）、ｓＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤである。
【００４６】
免疫学的に異なる：免疫学的に異なるという句は、ポリペプチドの１つに特異的に結合するが、別のポリペプチドには特異的に結合しない抗体の能力について、２つのポリペプチドを区別する能力を意味する。
【００４７】
モノクローナル抗体：その各種文法形態におけるモノクローナル抗体という句は、特定の抗原と免疫反応し得る抗体結合部の種を１つしか含有していない抗体分子の群を意味する。したがって、モノクローナル抗体は、典型的には、それが免疫反応するあらゆる抗原に対して単一の結合親和性を示す。モノクローナル抗体は、それぞれ異なる抗原に免疫特異的な、多数の抗体結合部位を有する抗体分子を含有していてもよく、例えば二重特異性モノクローナル抗体がある。
【００４８】
ポリクローナル抗体：ポリクローナル抗体は特異的な規定の抗原を認識する抗体分子の混合物であり、したがって、ポリクローナル抗体は、前記抗原内の異なるエピトープを認識することができる。
【００４９】
結合：「結合」または「〜と会合した」という用語は、化学的実体もしくは化合物またはそれらの部分の間での近接な状態を意味する。その結びつきは、近位が水素結合またはファンデルワールス相互作用もしくは静電相互作用によってエネルギー的に有利である非共有結合であってもよいし、共有結合であってもよい。
【００５０】
結合部位：本明細書では、「結合部位」または「結合ポケット」という用語は、その形状の結果として、別の分子、分子複合体、化学的実体または化合物と有利に会合する分子または分子複合体の領域を意味する。本明細書では、ポケットは、少なくとも深い空洞、場合によっては浅い空洞を含む。
【００５１】
断片：本発明によるポリペプチド断片（それらの任意の機能性等価物も含む）は、一実施形態において、３０未満のアミノ酸残基、例えば２５未満のアミノ酸、１５未満のアミノ酸または１０未満のアミノ酸を含み得る。したがって、断片は、例えば、約２から約３０のアミノ酸、または約２から、それぞれ約２５、約１５または約１０のアミノ酸を含み得るものと考えられる。
【００５２】
ＧＤＮＦファミリーリガンド受容体は、ＧＦＲα１、２、３および／または４という名称の受容体を包含するものとする。またその定義にはそれらのアイソフォームも包含し、明示されれば、例えば、配列番号４〜１２で定められているようなそれらの断片またはドメインも包含する。
【００５３】
ＳｏｒＬＡは、ＳｏｒＬＡ受容体、または、例えば、配列番号１〜３で定められているような、それらの断片もしくはドメインを包含するものとする。
【００５４】
相同性：アミノ酸配列間の相同性は、周知のスコアリングマトリックスを用いて計算することができる。例えば、ＢＬＯＳＵＭ  ３０、ＢＬＯＳＵＭ  ４０、ＢＬＯＳＵＭ  ４５、ＢＬＯＳＵＭ  ５０、ＢＬＯＳＵＭ  ５５、ＢＬＯＳＵＭ  ６０、ＢＬＯＳＵＭ  ６２、ＢＬＯＳＵＭ  ６５、ＢＬＯＳＵＭ  ７０、ＢＬＯＳＵＭ  ７５、ＢＬＯＳＵＭ  ８０、ＢＬＯＳＵＭ  ８５、およびＢＬＯＳＵＭ  ９０のいずれか１つなどが挙げられる。
【００５５】
リガンド：（第２の）生体分子に結合し、それとの複合体を形成して生物学的目的に適うことができる物質、化合物または生体分子（例えば、受容体を含むタンパク質など）。狭い意味では、それは、イオン結合、水素結合、およびファンデルワールス力などの分子間力によって、標的タンパク質上の部位への分子結合をトリガーするシグナルである。結合（会合）は、通常、可逆性（解離）である。リガンドとその標的分子との間の実際の不可逆性共有結合は、生物学的系においてはまれである。有機金属化学および無機化学における意味に反して、ヘモグロビンにおける場合のように、リガンドが実際に金属部位で結合するかどうかは無関係である。受容体へのリガンド結合は、化学的立体構造、すなわち、受容体タンパク質の三次元形を変化させることができる。受容体タンパク質の立体構造状態は受容体の機能状態を決定する。結合の傾向または強度は親和性と呼ばれる。リガンドとしては、基質、阻害剤、活性化剤、非自己受容体、共受容体および神経伝達物質が挙げられる。放射性リガンドは、放射性同位元素標識化合物であり、インビボでＰＥＴ研究におけるトレーサーとして、およびインビトロの結合研究において用いられる。
【００５６】
医薬品：「医薬品」または「薬物」または「薬」または「薬剤」という用語は、患者における病弊、苦痛、症状、疾患または傷害の（予防、診断、軽減または治癒をはじめとする）治療に用いることができる、すべての治療剤または予防剤を意味する。治療的に有用な遺伝的決定基、ペプチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、医薬または薬物という用語の意味の中に含まれ得る。本明細書で定義したように、「治療剤」、「医薬品」または「薬物」または「薬」または「薬剤」は生物活性剤の一種である。
【００５７】
医薬組成物：または組成物は、患者に適切に投与した場合、所望の治療効果を誘導することができる、すべての化学的または生物学的な物質、化合物または組成物を意味する。
【００５８】
ポリペプチド：本明細書で用いる「ポリペプチド」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸を含む分子を意味する。アミノ酸は天然であっても合成であってもよい。また「ポリペプチド」という用語は、タンパク質、すなわち、少なくとも１つのポリペプチドを含む機能性生体分子も含むものとする。少なくとも２つのポリペプチドを含む場合、これらは、共有結合した複合体を形成していてもよいし、非共有結合的に結合していてもよい。
【００５９】
配列同一性：配列同一性は、一実施形態において、少なくとも２５個の連続したアミノ酸を含み、かつ当該タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９９％同一であるアミノ酸配列を有する断片を利用することによって決定され、その場合、パーセント同一性は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０におけるアルゴリズムＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴまたはＦＡＳＴＡでデフォルトギャップ重みを用いて決定される。
【００６０】
本発明は、ＳｏｒＬＡが（ＧＤＮＦと無関係に）極めて高親和性でＧＦＲα１と結合し、その２つがトランスフェクト細胞から効率的に共沈殿されるという所見を提供する（図６）。細胞において共発現された場合、ＳｏｒＬＡは、ＧＦＲα１の内在化およびダウンレギュレーションを媒介し、核周囲のコンパートメント（ゴルジコンパートメント）へのその逆行性輸送を介在し、それによりリソソームの分解を回避する（図６）。特に、ＧＦＲα２、３および４を用いた同様の結果からは、ＳｏｒＬＡがすべてのＧＦＲαタイプと相互作用する可能性があること、下記に述べた機能的意味は、実際、ＧＤＮＦだけでなく、ニュールツリン、パーセフィンおよびアルテミンにも関係し得ることが示唆される。さらに、ＳｏｒＬＡの発現は、Ｒｅｔシグナル伝達のＧＤＮＦ誘導に多大な影響がある。すなわち、ＧＤＮＦの増加性濃度に応答するＲｅｔおよびＧＦＲα１陽性細胞において、ＳｏｒＬＡの過剰発現は著しくＲｅｔリン酸化を阻害する（図９）。神経芽細胞腫細胞および培養ニューロンに対して行った機能に関する試験は、これらの結果と一致している。したがって、ＳｏｒＬＡの存在は、ＧＤＮＦ誘導性の生存、増殖および神経芽細胞腫細胞の分化を阻害するとともに（図９）、ＳｏｒＬＡが抗ＳｏｒＬＡ抗体によって機能的に遮断される場合、主要ドーパミン作動性ニューロンのＧＤＮＦ誘導性生存が有意に増強される（図１２）。
【００６１】
したがって、発明者らは、ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体（例えばＧＦＲα１）の間の相互作用がＧＤＮＦシグナル伝達における重要な制御エレメントであること、ＧＤＮＦファミリーリガンド受容体および／またはＳｏｒＬＡに応答し得る結合部位をターゲティングする薬物（ペプチド、タンパク質、合成物、小型有機化合物）を用いて、ＳｏｒＬＡに結合するＧＤＮＦファミリーリガンド受容体を阻害することにより、ＧＤＮＦ機能を促進または抑制することができることを提案する。したがって、本発明は、神経芽細胞腫細胞の生存、増殖および分化を阻害または低減する方法に関し、別の実施形態においては、ニューロン（例えばドーパミン作動性ニューロン）の生存を高める方法に関する。
【００６２】
各種疾患は、ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体の間の相互作用を調節することが可能なこれらの薬剤または薬物を使用して治療することができ、その場合、ニューロン（例えばドーパミン作動性ニューロン）の喪失が変化または低減され、かつ／または、神経芽細胞腫細胞の分化、増殖および／もしくは生存が低減されることが想定される。これらの疾患および損傷としては、神経細胞死、脊髄傷害、末梢神経損傷、脳虚血、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、慢性疼痛、神経因性疼痛、てんかん、がん、パーキンソン病、大うつ病、統合失調症、注意欠陥および多動性障害（ＡＤＨＤ）、薬物乱用、不安障害、および／または双極性障害（躁うつ病）が挙げられる。
【００６３】
本発明者らは、ＧＦＲα：ＳｏｒＬＡ複合体のターゲティングがインビボにおけるＧＦＬ表現型（ＡＤＨＤおよびパーキンソン病などの行動的表現型を含む）の治療に対する全く新しい方法を示すことを明らかにする。そのような方法は、上述した進行中の臨床試験および前臨床試験よりも優れた多数の長所を有する。例えば、約３６ｋＤａのＧＤＮＦファミリーリガンド二量体を直接送達する代わりに、本発明者らは、血液脳関門を通過し、ＳｏｒＬＡとＧＦＲα受容体の間の相互作用を特異的に調節し、それにより内在性ＧＤＮＦファミリーリガンドの生物学的活性を高める、小分子アゴニストまたはアンタゴニストの作製を提案する。
【００６４】
様々な薬剤に、ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体の相互作用に対するこれらのモジュレーター効果があることを想定することができる。特に、ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体の間の相互作用を調節するのに使用される薬剤は、タンパク質、ペプチド、抗体または小型有機化合物から選択される。
【００６５】
薬剤は、ＳｏｒＬＡ（配列番号１）の細胞外ドメイン、それらのアイソフォームまたは断片を含んでいてもよい。対象へこのポリペプチドを投与することによって、神経芽細胞腫細胞またはニューロン（例えばドーパミン作動性ニューロン）で確認されたＧＤＮＦファミリーリガンド受容体間の競合が起こり、それにより相互作用が阻害される。ＧＤＮＦファミリーリガンド受容体に対する親和性を有するいくつかの断片、特にＳｏｒＬＡのＮ末端Ｖｐｓ１０ｐドメイン（配列番号３）を含む約６００アミノ酸のＳｏｒＬａのＮ末端が考えられる。それに加えて、本発明の発明者らは、ＳｏｒＬＡプロペプチド（配列番号２）がこの相互作用の阻害に有効であることを明らかにした。
【００６６】
ＳｏｒＬＡの細胞外ドメインの各種改変は、ＧＤＮＦファミリーリガンド受容体への結合を妨げることなく調製することができる。したがって、配列番号１、２または３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド、例えば、配列番号１、２または３に対して少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチドは、この相互作用に関する類似の効果または関連する効果を有する可能性があることが想定される。
【００６７】
また、薬剤または薬物は、言うまでもなく、ＧＦＲα１〜４受容体を含むＧＤＮＦファミリーリガンド受容体、それらのアイソフォームまたは断片の細胞外ドメインから選択することもできる。特に、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２として定義される配列またはそれらの断片である。配列番号７はＳｏｒＬＡへの結合部位であり、この配列を含むペプチドが特に好ましい。
【００６８】
配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、例えば、配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１２に対して少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する配列は、この相互作用に関する類似の効果または関連する効果を有することが想定される。
【００６９】
また、ニューロテンシンがこの相互作用を阻害し得ることも明らかにされた。したがって、一実施形態によれば、ニューロテンシン（配列番号１３）またはそれらの断片（例えば、配列番号１４または１５で定義したもの）を使用することができる。
【００７０】
本発明の別の実施形態によれば、タンパク質は、ＧＤＮＦファミリーリガンド受容体、ＧＦＲα１への天然結合パートナーであるＧＤＮＦである。したがって、本発明はまた、ＧＤＮＦ、それらの断片またはそれらのアイソフォームに関する。ＧＤＮＦタンパク質は、配列番号１６または１８を含んでいてもよい。別の実施形態によれば、このタンパク質は、配列番号１６または１８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、例えば、配列番号１６または１８に対して少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する。
【００７１】
また、プロペプチドは、ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体（特にＧＦＲα１）の間の相互作用を調節することができる場合があることが明らかになった。したがって、一実施形態によれば、本タンパク質は、配列番号１７で定義したＧＤＮＦのプロペプチドを含み、または、配列番号１７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、例えば、配列番号１７に対して少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するタンパク質を含む。
【００７２】
さらに、本発明者らは、ＳｏｒＬＡ−／−トランスジェニックマウスが、ドーパミン作用活性の変化を示唆する、注意欠陥および機能促進を特徴とする行動的表現型−およびＡＤＨＤ様の表現型を示すことを見出した（図１４）。ＳｏｒＬＡ−／−マウスはアンフェタミンに反応しないように思われるので、ｗｔおよびトランスジェニックマウスのアンフェタミン治療を使用する予備実験はこの仮説を立証する。
【００７３】
特定の実施形態によれば、本発明は、ＳｏｒＬＡとＧＦＲα１の間の相互作用を調節または阻害することにより、例えば、ＧＤＮＦの内在化および／または分解の阻害が阻害されることにより、必要とする患者の脳におけるＧＤＮＦの細胞外レベルを高める方法に関する。
【００７４】
この方法は、ＳｏｒＬＡとＧＦＲα１の間の相互作用を調節することによりニューロン（例えばドーパミン作動性ニューロン）の生存を高めることが可能であり、したがって、例えば、傷害誘発神経細胞死、脊髄傷害、末梢神経損傷、脳虚血、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、慢性疼痛、神経因性疼痛、てんかん、がん、パーキンソン病、大うつ病、統合失調症、注意欠陥および多動性障害（ＡＤＨＤ）、薬物乱用、不安障害および／または双極性障害（躁うつ病）などの疾患の治療に好適であると想定される。
【００７５】
ＳｏｒＬＡとＧＦＲα１の間の相互作用を調節または阻害するのに好適な薬剤は、ＳｏｒＬＡまたはＧＦＲα１に対する抗体である。この抗体は、好ましくは、例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７などの結合部位を含むＧＦＲα１および／またはＳｏｒＬＡの細胞外ドメインに結合する。
【００７６】
抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体、例えば、ヒト化抗体、キメラ抗体または単鎖抗体であってもよい。
【００７７】
抗体
ＳｏｒＬＡまたはＧＤＮＦファミリーリガンド受容体と同じ受容体標的に結合する抗体、例えば本発明のＧＦＲα１〜４は、免疫抗原としての対象とする小型ペプチドを含有する完全ポリペプチドまたは断片を使用して調製することができる。動物に免疫性を与えるために用いられるポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術または化学合成により得ることができ、担体タンパク質に場合により結合していてもよい。
【００７８】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製は当技術分野で公知である。
【００７９】
ポリクローナル抗体は、特に、例えば、Greenら、: 「Production of Polyclonal Antisera」、Immunochemical 5 Protocols (Manson, 編)；Humana Press, 1992, pages 1-5; Coliganら、: 「Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters」、Current Protocols in Immunology, 1992, Section 2.4.1、およびEd Harlow and David Lane (編)、「Antibodies; A laboratory manual」 Cold Spring Harbor Lab. Press 1988により記載されているようにして得ることができる。モノクローナル抗体は、特に、例えば、Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256:495； Coliganら、Current Protocols in Immunology, 1992, Sections 2.5.1 -2.6.7；およびHarlowら、Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, Pub., 1988, page 726（これらはすべてその全体を参照により組み入れるものとする）によって記載されているようにして得ることができる。
【００８０】
簡潔に説明すると、モノクローナル抗体は、例えば、抗原を含む組成物をマウスに注射し、血清試料を採取して抗体産生の存在を確認し、Ｂリンパ球を得るために脾臓を摘出し、Ｂリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを生成させ、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対して抗体を生成する陽性クローンを選択し、ハイブリドーマ培養物から抗体を単離することにより得ることができる。
【００８１】
モノクローナル抗体は、プロテインＡセファロースによる親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーをはじめとする、確立されている様々な技術によってハイブリドーマ培養物から単離し精製することができる。例えば、Coliganら、Current Protocols in Immunology, 1992, Sections 2.7.1 -2.7.12, およびSections 2.9.1 - 2.9.3；ならびに、Barnesら:「Purification of Immunoglobulin 25 G (IgG)」 Methods in Molecular Biology； Humana Press, 1992, Vol. 10, Pages 79-104（これらはすべてその全体を参照により組み入れるものとする）を参照。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、例えば、抗体が生成されたポリペプチドが結合されているマトリックスに結合させ溶出させることにより、場合によりさらに精製することができる。
【００８２】
ＧＦＲα１〜４に対する抗体は市販されており、例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓの、例えば、ヒトＧＤＮＦ  ＭＡｂ（Ｃｌｏｎｅ  ２７１０６）、マウスＩｇＧ１ヒトＧＦＲアルファ−４  ＭＡｂ（Ｃｌｏｎｅ  ２１５７２５）、マウスＩｇＧ１ヒトＧＦＲアルファ−２  ＭＡｂ（Ｃｌｏｎｅ  １２９０３０）、マウスＩｇＧ２ＢヒトＧＦＲアルファ−３  ＭＡｂ（Ｃｌｏｎｅ  １１１００４）、マウスＩｇＧ１ヒトＧＦＲアルファ−１  ＭＡｂ（Ｃｌｏｎｅ  ２６０７１４）、マウスＩｇＧ１ヒト／ラットＧＤＮＦアフィニティー精製ポリクローナルＡｂ、ヤギＩｇＧヒトＧＦＲアルファ−４アフィニティー精製ポリクローナルＡｂ、ヤギＩｇＧヒトＧＦＲアルファ−１アフィニティー精製ポリクローナルＡｂ、ヤギＩｇＧヒトＧＦＲアルファ−２アフィニティー精製ポリクローナルＡｂ、ヤギＩｇＧヒトＧＦＲアルファ−３アフィニティー精製ポリクローナルＡｂ、ヤギＩｇＧである。
【００８３】
さらに、本発明者らは、ヒトＳｏｒＬＡの全細胞外ドメインに対するウサギポリクローナル抗体を作製した。ＳｏｒＬＡ細胞外ドメインはＣＨＯ細胞で発現され、親和性クロマトグラフィーを使用して培養上清から精製された。
【００８４】
これらの抗体は、図９および図１２で示したように、ＳｏｒＬＡアンタゴニストとして機能すること可能である。
【００８５】
本発明者らは、類似の方法でヒトＳｏｒＬＡの全細胞外ドメインに対するマウスモノクローナル抗体のパネルを作製した。これらは、ＳｏｒＬＡのアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するそれらの能力に基づいて選択することができる。次いで、選択した抗体のパラトープがクローン化され、ヒト化抗体を産生することができる。
【００８６】
一態様において、本発明は、ＧＦＲα１、２、３または４の細胞外ドメイン上のエピトープに特異的に結合することができる抗体の使用に関し、特に配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２または配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２に対して少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する配列は、その相互作用に対して類似の効果または関連する効果を有すると想定される。配列番号７はＳｏｒＬＡへの結合部位であり、この配列を含むペプチドが特に好ましい。
【００８７】
別の実施形態によれば、本発明は、ＳｏｒＬＡの細胞外ドメインの上にエピトープを有する抗体に関し、特にＮ末端Ｖｐｓｐ１０ｐドメイン（配列番号３）、配列番号１もしくは２、または配列番号１、２もしくは３に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号１、２または３に対する少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を含む配列は、その相互作用に対する類似の効果または関連の効果を有する可能性がある。
【００８８】
一実施形態において、本明細書の上記で定義した抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、組換え抗体、キメラ抗体、またはそれらのちょうど抗原となる部分からなる群から選択される。
【００８９】
医薬組成物および投与形態
本治療方法における薬物送達の主要経路は、静脈内、経口および局所である。標的部位への薬物の送達または血流への薬物を導入に有効である別の薬物の投与方法（例えば、皮下注射または吸入による投与）も考えられる。
【００９０】
本発明の大多数の化合物がタンパク質であるので、投与の最も一般的な方法は静脈内投与、筋肉内投与または皮下投与であるが、鼻腔内適用による投与もまた文献に十分に記載されている。
【００９１】
そのような投与に適切な剤形は、慣用の技術により調製することができる。
【００９２】
本発明による化合物は、単一の活性剤として投与されてもよく、少なくとも１つの他の活性剤と一緒に投与されてもよい。
【００９３】
製剤
本発明の化合物は粗製化学物質として投与することも可能であるが、医薬製剤の形態中にそれら化合物が存在するのが好ましい。
【００９４】
したがって、さらに本発明は、医用適用において、本発明の化合物および医薬的に許容される担体または希釈剤を含む医薬製剤を提供する。
【００９５】
本発明の一部の実施形態において、抗体の形態で提供される。医薬製剤は、この抗体およびアジュバントを含む。
【００９６】
適切なアジュバントの例（限定されるものではない）は、免疫ターゲティングアジュバント；免疫モジュレーティングアジュバント、例えば、毒素、サイトカインおよびマイコバクテリア誘導体；油製剤；ポリマー；ミセル形成アジュバント；サポニン；免疫刺激複合体マトリックス（ＩＳＣＯＭマトリックス）；粒子；ＤＤＡ；アルミニウムアジュバント；ＤＮＡアジュバント；ｙ−イヌリン；およびカプセル化アジュバントからなる群から選択される。
【００９７】
アジュバントの適用には、水酸化アルミニウムまたはリン酸塩（ミョウバン）などの薬剤の使用を包含する。
【００９８】
本発明によれば、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）もまた、ＤＮＡおよびｙ−イヌリンであるようなアジュバントの候補であるが、またフロインド完全アジュバントおよび不完全アジュバントならびにキラヤサポニン（例えば、ＱｕｉｌＡおよびＱＳ２１）もＲＩＢＩとして注目される。さらに可能性のあるものとしては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、前述のＣ３およびＣ３ｄ、ならびにムラミルジペプチド（ＭＤＰ）である。
【００９９】
リポソーム製剤もアジュバント効果を付与することが知られており、したがって、リポソームアジュバントが本発明には好ましい。
【０１００】
また免疫刺激複合体マトリックスタイプ（ＩＳＣＯＭＯマトリックス）アジュバントも本発明に従い使用することができる。
【０１０１】
組成物および免疫刺激複合体の使用に関する詳細は、例えば、Morein Bら、1995, Clin. Immunother. 3: 461-475、ならびにBarr IGおよびMitchell GF, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25（両方とも参照により本明細書に組み入れるものとする）で確認することができる。
【０１０２】
本発明の化合物は、（例えば、ボーラス注入または持続点滴などの注射による）非経口投与用に製剤化することができ、保存剤が添加された、アンプル、プレフィルドシリンジ、少量注入容器における単位用量型で、または複数回用量容器で提供することができる。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液、または乳濁液、例えば、水性ポリエチレングリコール中の溶液のような形をとることができる。油性または非水性担体、希釈剤、溶媒、または媒体の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、および注射可能有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられ、それらは、保存剤、湿潤剤、乳化剤もしくは懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤化剤を含んでもよい。
【０１０３】
あるいは、活性成分は、滅菌固体の無菌的単離により、または適切な媒体、例えば、発熱物質を含まない滅菌水を用いる使用前の構成として溶液からの凍結乾燥により、得られる粉末形であってもよい。
【０１０４】
非経口製剤に有用な油として、石油、動物油、植物油、または合成油が挙げられる。そのような製剤に有用な油の具体例として、ピーナッツ油、３５ダイズ油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、石油、および鉱油が挙げられる。非経口製剤に用いる適切な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例である。
【０１０５】
非経口製剤に用いる好適なセッケンとしては、脂肪アルカリ金属塩、アンモニウム塩、およびトリエタノールアミン塩が挙げられ、適切な界面活性剤として、（ａ）例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハロゲン化物およびアルキルピリジニウムハロゲン化物などの陽イオン界面活性剤；（ｂ）例えば、アルキル、アリール、およびオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、およびモノグリセリド硫酸塩、ならびにスルホサクシネートなどの陰イオン界面活性剤；（ｃ）例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリオキシエチレンポリプロピレン共重合体などの非イオン性界面活性剤；（ｄ）例えば、アルキル−β−アミノプロピオン酸および２−アルキルイミダゾリン第四アンモニウム塩などの両性界面活性剤、ならびに（ｅ）それらの混合物が挙げられる。
【０１０６】
非経口製剤は、典型的には、溶液中に約０．５重量％から約２５％重量％までの活性成分を含む。保存剤および緩衝剤を用いてもよい。注射部位での刺激を最小限にし、または排除するために、そのような組成物は、約１２から約１７までの親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つまたは複数の非イオン性界面活性剤を含んでもよい。そのような製剤における界面活性剤の量は、典型的には、約５重量％から約１５重量％までの範囲である。適切な界面活性剤として、モノオレイン酸ソルビタンなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、およびプロピレンオキシドのプロピレングリコールとの縮合によって形成される疎水性塩基を有するエチレンオキシドの高分子量付加物が挙げられる。非経口製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数回用量の密封された容器で提供することができ、使用直前に、注射用に、滅菌済み液体賦形剤、例えば、水の添加だけを必要とする凍結乾燥（freeze-dried）（凍結乾燥（lyophilized））状態で保存することが可能である。即時注射溶液および懸濁液は、前に記載した種類の滅菌済み粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【０１０７】
経皮送達
本明細書に記載された医薬品−化学修飾剤複合体は経皮的に投与することができる。経皮投与は典型的には、患者の体循環への薬物の経皮的通過のための医薬品の送達に関わる。皮膚部位として、薬物を経皮的に投与するための解剖学的領域が挙げられ、前腕、腹部、胸部、背中、臀部、乳様突起部などがある。
【０１０８】
経皮送達は、長期間、その複合体の供給源を患者の皮膚へ暴露することによって達成される。経皮パッチは、医薬品−化学修飾剤複合体の身体への制御性送達を提供するというさらなる長所を有する。Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives、HadgraftおよびGuy（編）、Marcel Dekker, Inc.、(1989)；Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications、RobinsonおよびLee（編）、Marcel Dekker Inc.、(1987)；ならびにTransdermal Delivery of Drugs、1〜3巻、KydonieusおよびBerner（編）、CRC Press、(1987)を参照（これらはすべてその全体を参照により組み入れるものとする）。そのような剤形は、エラストマーマトリックス材料などの適切な媒質中に医薬品−化学修飾剤複合体を溶解、分散、または別の形で組み入れることによって作製することが可能である。また吸収促進剤も、皮膚を通しての化合物の流入を増加させるために用いることができる。かかる流入速度は、速度制御性膜を供給するか、またはポリマーマトリックスもしくはゲル内に化合物を分散させるかによって制御することができる。
【０１０９】
受動的経皮薬物送達
本明細書に記載された方法に様々な型の経皮パッチを用いることができる。例えば、単純な接着パッチは、裏当て素材およびアクリル酸系接着剤から調製することが可能である。医薬品−化学修飾剤複合体および任意の促進剤を粘着性成形溶液中へ製剤化し、十分混合する。溶液を裏当て素材上へ直接流し込み、成形溶媒をオーブン内で蒸発させ、粘着フィルムを残す。剥離ライナーを接着させて、系を完成させることができる。
【０１１０】
あるいは、ポリウレタンマトリックスパッチを、医薬品−化学修飾剤複合体の送達に用いることができる。このパッチの層は、裏当て、ポリウレタン薬物／促進剤マトリックス、膜、接着剤、および剥離ライナーを含む。ポリウレタンマトリックスは、ポリウレタンプレポリマーを硬化させる室温を用いて調製される。プレポリマーへ水、アルコール、および複合体を添加することにより、裏当て素材上に直接成形され得る粘着性フィルムエラストマーの形成を生じる。
【０１１１】
本発明のさらなる実施形態は、ハイドロゲルマトリックスパッチを利用する。典型的には、ハイドロゲルマトリックスは、アルコール、水、薬物、およびいくつかの親水性ポリマーを含む。このハイドロゲルマトリックスは、経皮パッチへ裏当てと接着剤層の間に組み込むことができる。
【０１１２】
液体貯留パッチもまた本明細書に記載された方法に用いることができる。このパッチは、不透性または半透性のヒートシール可能裏当て素材、ヒートシール可能膜、アクリル酸系感圧皮膚接着剤、およびシリコン処理した剥離ライナーを含む。裏当ては、膜へヒートシールされ、貯留層を形成し、それを、その後、複合体、促進剤、ゲル化剤、および他の賦形剤の溶液で充填することができる。
【０１１３】
泡マトリックスパッチは、ゲル状医薬品−化学修飾剤溶液が薄い泡層、典型的にはポリウレタン内に拘束されていること以外は、液体貯留層システムと設計および構成要素の点で類似している。この泡層は、裏当てと、パッチ周辺部でヒートシールされている膜との間に位置する。
【０１１４】
受動的送達系に関して、放出速度は、典型的には、貯留層と皮膚の間に置かれた膜によって、モノシリック装置からの拡散によって、または送達系において速度制御バリアとして働く皮膚そのものによって制御される。米国特許第４，８１６，２５８号；同第４，９２７，４０８号；同第４，９０４，４７５号；同第４，５８８，５８０号；同第４，７８８，０６２号などを参照（これらはすべてその全体を参照により組み入れるものとする）。薬物送達の速度は、膜の性質に一部依存している。例えば、身体内での膜を通しての薬物送達の速度は、一般的には、皮膚バリアを通してよりも高い。複合体が装置から膜へ送達される速度は、貯留層と皮膚の間に置かれている速度制限膜の使用によって最も都合よく制御される。皮膚が複合体に対して十分な透過性がある（すなわち、皮膚を通しての吸収は膜を通しての通過速度より大きい）と仮定すると、膜は、患者が経験する投薬速度を制御するように機能する。
【０１１５】
適切な透過性膜材料は、所望の程度の透過性、複合体の性質、および装置を構成することに関連した力学的考察に基づいて選択することができる。例示的な透過性膜材料として、ポリジメチルシロキサン（シリコーンゴム）、酢酸エチレンビニル共重合体（ＥＶＡ）、ポリウレタン、ポリウレタン−ポリエーテル共重合体、ポリエチレン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、セルロース系材料、例えば、三酢酸セルロースおよび硝酸／酢酸セルロース、ならびにハイドロゲル、例えば、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）などの様々な種類の天然および合成重合体が挙げられる。
【０１１６】
所望の装置の特徴に応じて、治療用製品の他の慣用の成分などの他のアイテムを装置に含んでもよい。例えば、本発明による組成物はまた、１つまたは複数の保存剤または静菌剤、例えば、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、クロロクレゾール、塩化ベンザルコニウムなどを含んでもよい。これらの薬学的組成物はまた、抗菌剤、特に、抗生物質、麻酔剤、鎮痛剤、および鎮痒剤などの他の活性成分を含むことができる。
【０１１７】
本発明の化合物は、坐剤としての投与のために製剤化することができる。脂肪酸グリセリドまたはカカオバターの混合物などの低融点ワックスをまず融解し、活性成分を、例えば、撹拌により均一に分散させる。その後、溶融した均一な混合物を、便利なサイズの型へ注ぎ、冷却し固化させる。
【０１１８】
活性化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）担体（例えば、ＰＥＧ  １０００［９６％］およびＰＥＧ  ４０００［４％］）中に配置された、例えば、約０．５％〜約５０％の本発明の化合物を含む坐剤へ製剤化することができる。本発明の化合物は、膣投与用に製剤化することができる。活性成分に加えて、適切であることが当技術分野において知られている担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡、またはスプレー。
【０１１９】
本発明の化合物は、経鼻投与用に製剤化することが可能である。溶液または懸濁液は、慣用の手段、例えば、スポイト、ピペットまたはスプレーを用いて鼻腔へ直接適用される。製剤は、単一用量または複数回用量の形で提供することができる。スポイトまたはピペットの後者の場合、これは、適切な所定の容量の溶液または懸濁液を患者が投与することによって行うことができる。スプレーの場合、これは、例えば、定量噴霧スプレーポンプを用いて行うことができる。
【０１２０】
本発明の化合物は、エアロゾル投与用に、特に鼻腔内投与を含む呼吸器への投与用に製剤化することが可能である。化合物は、一般的に、例えば、５ミクロン以下くらいの小さな粒子サイズである。そのような粒子サイズは、当技術分野において公知の手段、例えば、微粒子化によって得ることができる。活性成分は、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、もしくはジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスなどの適切な噴射剤とともに加圧されたパックで提供される。エアロゾルは、都合よくは、レシチンなどの界面活性剤も含んでもよい。薬物の用量は、定量バルブによって調整することができる。あるいは、活性成分は、乾燥粉末、例えば、ラクトース、デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのデンプン誘導体、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの適切な粉末基剤中の化合物の粉末混合物の形をとって提供することができる。粉末担体は、鼻腔内でゲルを形成する。粉末組成物は、粉末が吸入器を用いて投与することが可能であり、例えば、ゼラチンなどのカプセルもしくはカートリッジ、またはブリスターパックにおいて、単位用量の剤形で提供することができる。所望の場合、製剤は、活性成分の徐放性または放出制御性投与に適応した腸溶コーティングで調製することができる。薬学的調製物は、好ましくは、単位剤形である。かかる剤形において、調製物は、適切な量の活性成分を含む単位用量へ細分される。単位剤形は、パッケージングされた調製物であってもよく、そのパッケージは、パッケージングされた錠剤、カプセル、およびバイアルまたはアンプル中の粉末などの個別量の調製物を含む。また、単位投与５剤形は、カプセル、錠剤、カシェ剤、またはトローチ剤自体であってもよく、またはそれは、これらのいずれかの適当な数をパッケージングされた形であってもよい。
【０１２１】
注射は、静脈内、筋肉内、脊髄内、腹腔内、皮下、ボーラス投与または連続投与である。
【０１２２】
一実施形態において、本発明による医薬組成物は、３０分間〜２４時間の間隔で投与される。
【０１２３】
さらなる実施形態において、本発明による医薬組成物は、１時間〜６時間の間隔で投与される。
【０１２４】
さらなる実施形態において、本発明による医薬組成物は、６時間〜７２時間の間隔で投与される。
【０１２５】
別の実施形態において、本医薬組成物は、１ｋｇの体重あたり１０μｇ〜５００ｍｇの用量で投与される。
【０１２６】
本発明のポリペプチドおよび抗体は、医学的に許容される任意の方法で投与することができる。これには、１０の非経口経路、例えば、静脈内、血管内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、脳室内（intraventricular）、硬膜内、気管内、髄腔内、脳室内（intracerebroventricular）、脳間部内、肺内の経路、または他の経路、ならびに鼻腔内、眼内、直腸内または局所経路による注射が含まれ得る。徐放性投与も、デポー注射または浸食性（erodible）移植片などの手段により、本発明に特に含まれる。
【０１２７】
また、タンパク質が胃の中の分解から保護されるという条件で、経口投与も考えられる。
【０１２８】
投与は、調製物の定期的なボーラス注射であってもよいし、または、容器からの静脈内投与または腹腔内投与によってより連続的であってもよく、前記容器は外部的（例えばIVバッグ）または内部的（例えば生体侵食性移植片、生体人工器官、生体適合性カプセルである。例えば、米国特許第４，４０７，９５７号、同第５，７９８，１１３号および同第５，８００，８２８号を参照（これらの各文献は参照により本明細書に組み入れるものとする）。肺内送達方法および器具は、例えば、米国特許第５，６５４，００７号、同第５，７８０，０１４号および同第５，８１４，６０７号に記述されており、これらの各文献は参照により本明細書に組み入れられる。全身送達の他に、血液脳関門または血液網膜関門の後ろにあるＣＮＳへの直接的な送達も考慮される。局所的な送達は、カテーテルを介した１つまたは複数の動脈（例えばＣＮＳにつながる大脳動脈）への送達などの手段によるものであり得る。タンパク質製剤のＣＮＳへの局所的ポンプ送達の方法は、米国特許第６，０４２，５７９号（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）に記述されている（参照によりその全体を組み入れるものとする）。
【０１２９】
「医薬的に許容される担体」という用語は、ポリペプチドまたは抗体と組み合わされてその適用を促進する、１つまたは複数の有機成分または無機成分を意味し、天然のものでも合成のものでもよい。適切な担体としては、無菌食塩水が含まれるが、医薬的に許容されることが知られる他の水性および非水性等張無菌液ならびに無菌懸濁液も当業者には知られている。
【０１３０】
「有効量」とは、疾患、変性、または損傷状態を改善することができる、またはその進行を遅延することができる量を指す。有効量は個々の場合に応じて決定することができ、部分的には、治療するべき症状および求められる結果についての考えに基づく。有効量は、そのような因子を活用する技術分野の当業者が、ルーチン的な実験法を使用するだけで決定することができる。
【０１３１】
リポソーム系は、いかなる種類の単層ベシクル、多層ベシクル、または安定複層ベシクルでもよく、当業者には周知の方法により調製および投与することができる（例えば、米国特許第５，１６９，６３７号、同第４，７６２，９１５号、同第５，０００，９５８号または同第５，１８５，１５４号の開示による（これらはすべてその全体を参照により組み入れるものとする））。それに加えて、この発明の新規ポリペプチド、およびその他の選択されるポリペプチドを、リポソームへの結合を増強するために、リポタンパク質として発現することが望ましい場合がある。
【０１３２】
全身性投与のための様々な投与レジメンが考慮される。一実施形態においては、抗体またはポリペプチドを含む製剤を対象に投与する方法は、投与量あたり、対象の体重ｋｇあたり１μｇから３０，０００μｇの用量を投与することを含む。
【０１３３】
別の実施形態においては、当該用量は、投与量あたり、対象の体重ｋｇあたり１０μｇから３０，０００μｇである。さらなる実施形態においては、当該用量は、投与量あたり、対象の体重ｋｇあたり１０  ３０μｇから１０，０００μｇである。異なる一実施形態においては、当該用量は、投与量あたり、対象の体重ｋｇあたり５μｇから１０，０００μｇである。さらに別の実施形態においては、当該用量は、投与量あたり、対象の体重ｋｇあたり２５μｇから３，０００μｇである。最も好ましい実施形態においては、投与量あたり、当該用量は、対象の体重ｋｇあたり５０μｇから３，０００μｇである。特定の投与用量および方法についての手引きは文献に記述されている。例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、同第５，２０６，３４４号または同第５，２２５，２１２号を参照のこと（これらはすべて参照によりその全体を組み入れるものとする）。異なる治療化合物および異なる障害に対しては異なる製剤化が有効であること、例えばある器官や組織を標的にする投与においては、別の器官や組織を標的にする場合とは異なる送達の方法が必要となり得ることが想定される。
【０１３４】
アッセイ
本発明はまた、ＳｏｒＬＡおよびＧＤＮＦファミリーリガンド受容体の両方を含む、ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体（例えば、ＧＦＲα１、２、３または４）の間の相互作用を調節することが可能である、新しい結合パートナーを同定するためのインビトロおよび／またはインビボにおけるアッセイを包含する。これらのアッセイは、例えば、受容体ＳｏｒＬＡまたはＧＦＲα１、２、３もしくは４または両方を発現する細胞を含み、応答を測定することを含む細胞系であってもよい。あるいは、インビトロアッセイは、相互作用を阻害する新しい結合パートナーの能力を測定することにより実施することもできる。下記に、本発明による各種の実施形態を記載する。
【０１３５】
細胞系アッセイ
本発明はまた、ＳｏｒＬａとＧＤＮＦファミリーリガンドレセプター複合体（特にＧＦＲα１）の間の相互作用を調節することが可能な薬剤を同定することができる各種アッセイに関する。
【０１３６】
Ｖｐｓ１０ｐドメイン受容体ファミリーのメンバーによる結合、内在化またはシグナル伝達の測定は、細胞系で行うことができる（実施例６）。例えば、ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１およびＧＤＮＦのそれぞれ３つの受容体をすべてコードしているプラスミドとのトランスフェクション後のＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１およびＧＤＮＦ発現細胞は、候補薬剤（阻害剤／アンタゴニスト）化合物とインキュベートする。前記薬剤は、例えば、リガンド（例えば、ＳｏｒＬＡプロペプチド）またはそれぞれの受容体の断片を結合する、受容体のＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１のいずれかに対する抗体を意味する。インキュベーション後、細胞を洗浄し、タンパク質複合体を、例えば、ジチオ−ビス［スクシンイミジルプロピオナート］（ＤＳＰ、Ｐｉｅｒｃｅ）と架橋結合させ、続いて、溶解させることができる。こうして得られた細胞溶解物は、続いて、例えばセファロースのビーズに結合されている、ＳｏｒＬＡもしくはＧＦＲα１または両方のいずれかに対する抗体とインキュベートすることができる。次いで、沈殿した複合体を洗浄ビーズから溶出させ、ウエスタンブロットにより分析することができる。
【０１３７】
したがって、一実施形態において、本発明は、ａ）対象の薬剤を、ＳｏｒＬＡ受容体、ＧＤＮＦおよび／またはＧＤＮＦファミリーリガンド受容体を発現する細胞とインキュベートするステップと、ｂ）細胞を溶解させ、ＳｏｒＬＡまたはＧＤＮＦファミリーリガンド受容体に対して特異的な抗体と細胞とをインキュベートするステップと、ｃ）ウエスタンブロットにより複合体形成を分析するステップとを含む、ＳｏｒＬａおよびＧＤＮＦファミリーリガンドレセプター複合体に結合することが可能な薬剤を同定するための細胞系スクリーニングアッセイに関する。
【０１３８】
別の実施形態において、本発明は、ＳｏｒＬＡを阻害することが可能な薬剤を同定するための細胞系のスクリーニング方法に関する。
【０１３９】
ＳｏｒＬＡ：ＧＦＲα１：ＧＤＮＦレセプター複合体の実体に対するアンタゴニストは、複合体全体の阻害剤として作用することができる。したがって、例えばＶｐｓ１０ｐドメイン受容体実体に結合することが可能な薬剤についてスクリーニングすることに関連する。そのような方法は、実施例８に記載されている。Ｖｐｓ１０ｐドメイン受容体ファミリーのメンバーによる結合、内在化またはシグナル伝達の測定は、細胞系で行うことができる。内生的に、または、例えば受容体のｃＤＮＡを含有するプラスミドとのトランスフェクション後に、受容体の１つを発現する細胞は、候補阻害剤／アンタゴニスト化合物の不在下および存在下のそれぞれにおいて、放射標識したリガンドとインキュベートすることができる。インキュベーション後、細胞を洗浄して非特異的結合を除去し、続いて回収することができる。候補アンタゴニスト／阻害剤の受容体への結合の程度は、当業者に公知の慣用の放射リガンドアッセイを使用することにより測定する。例えば、Bylund and Toews (1993) Am J Physiol. 265(5 Pt 1):L421-9 entitled 「Radioligand binding methods: practical guide and tips」を参照。同様に、細胞内取込／内在化は、Nykjaerら (1992) FEBS 300:13-、およびNielsenら (2001) EMBO Jに記載されているようにして測定することができる（前記文献は両方とも参照によりそれら全体を組み入れるものとする）。
【０１４０】
したがって、別の実施形態によれば、本発明は、ａ）ＳｏｒＬＡ受容体、ＧＤＮＦおよび／またはＧＤＮＦファミリーリガンド受容体を発現する細胞を放射性標識薬剤とインキュベートするステップと、ｂ）細胞を洗浄し非特異的結合を除去するステップと、ｃ）細胞を回収するステップと、ｄ）結合の量を測定するステップとを含む、ＳｏｒＬＡを阻害することが可能な薬剤を同定するための細胞系のスクリーニング方法に関する。
【０１４１】
さらなる実施形態において、ＳｏｒＬＡによってＧＦＲα受容体の逆行性ソーティングを調節することが可能な薬剤を同定するための細胞系スクリーニング方法が考えられる。この場合、ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα受容体の両方を発現する細胞において、表面に局所するＧＦＲα受容体を蛍光タグまたは蛍光抗体のいずれかにより標識化し、続いて、例えば約２０分から約３０分の間、ＳｏｒＬＡアゴニスト／アンタゴニストとインキュベートする。次いで引き続き、内在化したＧＦＲα受容体の量は、図６および図１１に示すような共焦点顕微鏡法を使用することにより評価することができる。
【０１４２】
したがって、さらなる実施形態によれば、本発明は、ａ）ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα受容体の両方を発現する細胞において、蛍光タグまたは蛍光抗体により薬剤を標識化するステップと、ｂ）続いて、所定時間の間ＳｏｒＬＡアゴニスト／アンタゴニストと前記細胞をインキュベートするステップと、ｃ）内在化したＧＦＲα受容体の量を分析するステップとを含む、ＳｏｒＬＡによってＧＦＲα受容体の逆行性ソーティングを調節することが可能な薬剤を同定するための細胞系スクリーニング方法に関連する。
【０１４３】
よりさらなる実施形態において、Ｒｅｔリン酸化を増加させることが可能な薬剤を同定するための細胞系スクリーニング方法が考えられる。
【０１４４】
神経芽細胞腫細胞（例えばＳＹ５Ｙ細胞）は、ＳｏｒＬＡアンタゴニストまたはアゴニストの不在下または存在下において、所定の時間ＧＤＮＦの濃度を高めることにより刺激することができる。次いで、細胞を溶解させ、細胞溶解物は、Ｇａｍｍａｂｉｎｄビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合されたＲｅｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する抗体とインキュベートすることができる。次いで、沈殿タンパク質を洗浄ビーズから溶出させ（酸性緩衝液、続いて中和）、すべてのリン酸化Ｒｅｔを、抗ホスホチロシン（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ウェスタンブロッティングにより視覚化することができる（図９に示すとおり）。
【０１４５】
したがって、本発明はまた、ａ）神経芽細胞腫細胞を、ＳｏｒＬＡ結合剤の存在下または不在下において、所定の時間に濃度増加のＧＤＮＦとインキュベートするステップと、ｂ）細胞を溶解させるステップと、ｃ）抗ホスホチロシン抗体を使用して、リン酸化Ｒｅｔを免疫沈降させるステップと、ｄ）リン酸化を視覚化させるステップとを含む、Ｒｅｔリン酸化を高めることが可能な薬剤を同定するための細胞系スクリーニング方法に関する。
【０１４６】
よりさらなる実施形態において、本発明は、細胞生存を高めることが可能な薬剤を同定するための細胞系スクリーニング方法に関する。
【０１４７】
神経芽細胞腫細胞（例えばＳＹ５Ｙ）を細胞培養物から回収し、増殖培地、例えば、１％グルタマックスならびに１％Ｐ／Ｓ（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含有するフェノールレッド（ＬＯＮＺＡ）を含まないＤＭＥＭに再懸濁することができる。続いて、細胞を９６ウェル中に入れる。翌日、次いで、細胞を、ＳｏｒＬＡアンタゴニストまたはアゴニストの不在下または存在下において、ＧＤＮＦ濃度を高めることにより刺激し、それらの通常のインキュベーター中で一定時間（例えば７２時間）インキュベートすることができる。インキュベーション後、ＭｕｌｔｉＴｏｘ−Ｆｌｕｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ細胞毒性アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を調製し、製造業者の添付技術文献による指示のとおり、細胞に加え、インキュベートすることができる。その後、蛍光は、例えば、Ｗａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ３ＴＭ  １４２０多重標識カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒＴＭ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定することが可能である。この場合、シグナルは生存に正比例する。
【０１４８】
したがって、本発明はまた、ａ）ＳｏｒＬＡアンタゴニストまたはアゴニストの不在下または存在下において、ＧＤＮＦの濃度を高める神経芽細胞腫細胞をインキュベートし、一定の時間インキュベートするステップと、ｂ）細胞毒性試験を使用して細胞生存を測定するステップとを含む、細胞生存を高めることが可能な薬剤を同定するための細胞系スクリーニング方法に関する。
【０１４９】
別の実施形態においては、生存を試験するとは９６ウェルプレートの代わりにカバーガラス上で細胞を成長させることである。インキュベーション後、次いで、細胞を、所定時間（例えば室温で３０分）、例えば、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に固定させ、スライド上にマウントさせる。その後、細胞は、図９Ｄに示すように、蛍光顕微鏡で直接数えることができる。
【０１５０】
したがって、本発明はまた、ａ）ＳｏｒＬＡアンタゴニストまたはアゴニストの不在下または存在下において、ＧＤＮＦの濃度を高める神経芽細胞腫細胞をインキュベートし、一定時間インキュベートするステップと、ｂ）細胞を固定化させるステップと、ｃ）細胞を数えるステップとを含む、細胞生存を高めることができる薬剤を同定するための細胞系スクリーニング方法に関する。
【０１５１】
インビトロアッセイ
ＧＦＲα１および／またはＧＤＮＦとＳｏｒＬＡの相互作用を阻害する薬剤を同定するためのインビトロアッセイ
【０１５２】
固定化タンパク質に対する薬剤（例えば、限定されるものではないがＳｏｒＬＡ、ＧＦＲα１およびＧＤＮＦを含む、小型有機分子、ペプチドまたは可溶性受容体）の直接結合に関する測定は、例えば、標準の泳動バッファーとしてＣａＨＢＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、および０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、例えば、表面プラズモン共鳴分析（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）により行うことができる。そのような薬剤は、成熟ＧＤＮＦ（図１７）またはＧＦＲα１ドメイン１（図１６）のＮ末端から得ることができる。
【０１５３】
Ｂｉａｃｏｒｅ（ＣＭ５、カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）のバイオセンサーチップは、供給元により説明されているＮＨＳ／ＥＤＣ法を用いて活性化した後、ＳｏｒＬＡでコーティングされる。いくつかの様々な手法を用いることができる。候補薬剤は、結合シグナル（応答単位）を受容体の１つで固定化したチップと比較し、このシグナルを空のフローセルと比較することにより同定することができる。別の手法においては、既知薬剤の阻害を、推定阻害剤の不在下または存在下でモニターすることができる。シグナルの差は、アンタゴニストの阻害ポテンシャルを表す。回収されたデータは、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．１プログラムを使用して、親和性評価および阻害ポテンシャルに関するセンサーグラムを適合することにより分析することができる。表面プラズモン共鳴アッセイは、Ｖｐｓ１０ｐドメイン受容体、薬剤または推定阻害剤が固相上に固定化される、別のアッセイへと容易に変換することができる。例えば、受容体は、一定の時間インキュベーションすることにより（例えば、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６中、４℃で１６時間）、例えばＮｕｎｃ製のＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイターウェル（カタログ番号４３９４５４）に固定化することができる。室温で２時間、５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９６４７）を使用してブロッキングした後、ウェルをＭＢ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で３回洗浄し、各種濃度の候補阻害剤の不在下または存在下において、標識リガンド（例えば、ヨウ素化）とインキュベーションすることができる。インキュベーション（例えば４℃で一晩）の後、ＭＢ緩衝液で洗浄し、結合放射活性は１０％ＳＤＳを添加することにより遊離される。ウシ血清アルブミンのみでコーティングしたウェルへのトレーサーの非特異的結合を測定し、結合実験で測定された値から減じることができる。結合データポイントは、ＧｒａｐｈＰａｄ製のプリズムソフトウェア（バージョン４）を使用して、結合方程式に合わせることができる。同様に、アンタゴニストも標識化することが可能であり、固定化受容体への結合を直接測定することができる。さらに別の構成において、受容体、リガンドまたはアンタゴニストはシンチレーションビーズ上に固定化することが可能であり、受容体結合分子が放射活性を用いて標識化されている結合をシンチレーション近接アッセイにおいて測定することができる。
【０１５４】
したがって、本発明はまた、
ａ）バイオセンサーチップにＧＦＲα１および／またはＳｏｒＬＡを固定化するステップと、
ｂ）薬剤を適用するステップと、
ｃ）このシグナルを標準と比較するステップ
とを含むか、あるいは、
ａ）固相上に薬剤、ＧＦＲα１、ＧＤＮＦまたはＳｏｒＬＡを固定化するステップと、
ｂ）各種濃度の前記薬剤の不在下または存在下において、これらを標識化された対応物（例えば、ヨウ素化した薬剤、ＧＦＲα１、ＧＤＮＦおよび／またはＳｏｒＬＡ）とインキュベートするステップと、
ｃ）結合をカウントまたは測定するステップ
とを含む、
ＧＦＲα１および／またはＳｏｒＬＡとＧＤＮＦとの相互作用を阻害する薬剤を同定するためのインビトロアッセイに関する。
【０１５５】
さらなる実施形態
１．ＳｏｒＬＡおよびＧＤＮＦファミリーリガンド受容体の間の相互作用を調節することにより、ドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンの生存を高める方法。
２．ＧＤＮＦファミリーリガンド受容体がＧＦＲα１、２、３および／または４を含む群から選択される、実施形態２に記載の方法。
３．ＳｏｒＬＡおよびＧＤＮＦファミリーリガンド受容体の間の相互作用を調節するために使用される薬剤がタンパク質、ペプチド、抗体または小型有機化合物から選択される、実施形態１または２に記載の方法。
４．薬剤がＳｏｒＬＡ（配列番号１）の細胞外ドメイン、それらのアイソフォームまたは断片である、実施形態３に記載の方法。
５．断片が、ＳｏｒＬＡのＮ末端Ｖｐｓ１０ｐドメインの断片（配列番号３）を含むか、前記断片である、実施形態４に記載の方法。
６．薬剤がＳｏｒＬＡプロペプチド（配列番号２）またはそれらの断片である、実施形態３に記載の方法。
７．配列番号１、２または３に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号１、２または３に対して少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する、実施形態２〜５のいずれか１つに記載の方法。
８．薬剤がＧＦＲα１〜４受容体の細胞外ドメイン、それらのアイソフォームまたは断片から選択される、実施形態３に記載の方法。
９．ＧＦＲα受容体が配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２で定義した配列またはそれらの断片を含む、実施形態８に記載の方法。
１０．配列番号４、５、６、７、７、８、９、１０、１１または１２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２に対して少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する、実施形態８に記載の方法。
１１．タンパク質が、ニューロテンシン（配列番号１３）またはそれらの断片、例えば配列番号１４または１５で定義した断片を含むか、それらからなる、実施形態３に記載の方法。
１２．タンパク質がＧＤＮＦ、それらの断片またはアイソフォームである、実施形態３に記載の方法。
１３．ＧＤＮＦが配列番号１６または１８を含むか、それらからなる、実施形態１２に記載の方法。
１４．配列番号１６または１８に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号１６または１８に対して少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する、実施形態１３に記載の方法。
１５．タンパク質が、配列番号１７で定義したような、ＧＤＮＦのプロペプチドを含むか、それからなる、実施形態３に記載の方法。
１６．配列番号１７に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号１７に対して少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する、実施形態１５に記載の方法。
１７．抗体がＧＦＲα１、２、３または４の細胞外ドメイン上にエピトープを有する、実施形態３に記載の方法。
１８．モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり、実施形態８、９または１０のいずれか１つに定義した配列のいずれかの中にエピトープを有する、実施形態１７に記載の方法。
１９．抗体がＳｏｒＬＡの細胞外ドメイン上にエピトープを有する、実施形態３に記載の方法。
２０．モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり、実施形態４、５、６または７のいずれか１つに定義した配列のいずれかの中にエピトープを有する、実施形態１９に記載の方法。
２１．実施形態１〜１６のいずれか１つに定義した薬剤を１つまたは複数の医薬的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物。
２２．実施形態１７〜２０のいずれか１つに定義した抗体およびアジュバントを含む医薬組成物。
２３．ニューロン、例えばドーパミン作動性ニューロンなどの生存を高めるための実施形態１〜２０のいずれか１つに定義した薬剤または実施形態２１および２２のいずれか１つに記載の医薬組成物の使用。
２４．ニューロン、例えばドーパミン作動性ニューロンなどの喪失に伴った疾患、および／またはニューロン、例えばドーパミン作動性ニューロンなどの生存が望まれる疾患の治療で使用するための実施形態１〜２０で定義した薬剤または実施形態２１および２２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
２５．疾患が、傷害誘発性神経細胞死、脊髄傷害、末梢神経損傷、脳虚血、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、慢性疼痛、神経因性疼痛、てんかん、がん、パーキンソン病、大うつ病、統合失調症、注意欠陥および多動性障害（ＡＤＨＤ）、薬物乱用、不安障害、および／または双極性障害（躁うつ病）を含む群から選択される、実施形態２４に記載の使用。
２６．実施形態１〜２０のいずれか１つに定義した薬剤または実施形態２１もしくは２２のいずれか１つに記載の医薬組成物の有効量を投与することによる、ニューロン、例えばドーパミン作動性ニューロンなどの喪失に伴った疾患、および／またはニューロン、例えばドーパミン作動性ニューロンなどの生存が望まれる疾患を治療する方法。
２７．実施形態２５に記載の疾患を治療するための実施形態２６に記載の方法。
２８．実施形態２４または２５のいずれか１つに記載の疾患応答治療用医薬を調製するための実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の化合物または実施形態２１および２２のいずれか１つに記載の医薬組成物の使用。
２９．ＳｏｒＬＡおよび／またはＧＤＮＦファミリーリガンド受容体を含む、ＳｏｒＬＡとＧＤＮＦファミリーリガンド受容体（例えば、ＧＦＲα１、２、３または４）の間の相互作用を調節することが可能な結合パートナーを同定するためのインビトロアッセイまたはインビボアッセイ。
【０１５６】
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【実施例１】
【０１５７】
ＳｏｒＬＡ：ＧＦＲα１複合体のデモンストレーション
ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１をコードしているプラスミドで安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞をＤＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）と架橋結合させ、続いて溶解させた。細胞溶解物は、Ｇａｍｍａｂｉｎｄビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合されているＳｏｒＬＡまたはＧＦＲα１に対する抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートした。沈殿した複合体を、ＳＤＳローディングバッファーを用いて洗浄ビーズから溶出させた。ウエスタンブロット解析は、ＳｏｒＬＡ：ＧＦＲα１複合体の存在下で明らかにされた（図５Ａ）。ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１の細胞外ドメインの直接的相互作用も、標準泳動バッファーとしてＣａＨＢＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を使用する、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して証明した。Ｂｉａｃｏｒｅ（ＣＭ５、カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）製のバイオセンサーチップは、供給元により説明されているようにＮＨＳ／ＥＤＣ法を使用して活性化し、その後、ＳｏｒＬＡでコーティングした（図５Ｃ）。
【実施例２】
【０１５８】
ＳｏｒＬＡ：ＧＦＲα２複合体のデモンストレーション
ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα２をコードしているプラスミドで安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞をＤＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）と架橋結合させ、続いて溶解させた。細胞溶解物を、Ｇａｍｍａｂｉｎｄビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合されているＧＦＲα２に対する抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートした。沈殿した複合体を、ＳＤＳローディングバッファーを用いて洗浄ビーズから溶出させた。ウエスタンブロット解析は、ＳｏｒＬＡ：ＧＦＲα２複合体の存在下で明らかにされた（図１１Ａ）。ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα２の細胞外ドメインの直接的相互作用も、標準泳動バッファーとしてＣａＨＢＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を使用する、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して証明した。Ｂｉａｃｏｒｅ（ＣＭ５、カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）製のバイオセンサーチップは、供給元により説明されているようにＮＨＳ／ＥＤＣ法を使用して活性化し、その後、ＳｏｒＬＡでコーティングした。
【実施例３】
【０１５９】
ＳｏｒＬＡ：ＧＦＲα３複合体のデモンストレーション
ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα３をコードしているプラスミドで安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞をＤＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）と架橋結合させ、続いて溶解させた。細胞溶解物を、Ｇａｍｍａｂｉｎｄビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合されているＧＦＲα３に対する抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートした。沈殿した複合体を、ＳＤＳローディングバッファーを用いて洗浄ビーズから溶出させた。ウエスタンブロット解析は、ＳｏｒＬＡ：ＧＦＲα３複合体の存在下で明らかにされた（図１１Ａ）。ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα３の細胞外ドメインの直接的相互作用も、標準泳動バッファーとしてＣａＨＢＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を使用する、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して証明した。Ｂｉａｃｏｒｅ（ＣＭ５、カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）製のバイオセンサーチップは、供給元により説明されているようにＮＨＳ／ＥＤＣ法を使用して活性化し、その後、ＳｏｒＬＡでコーティングした。
【実施例４】
【０１６０】
ＳｏｒＬＡ：ＧＦＲα４複合体のデモンストレーション
ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα４をコードしているプラスミドで安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞をＤＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）と架橋結合させ、続いて溶解させた。細胞溶解物を、Ｇａｍｍａｂｉｎｄビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合されているＧＦＲα４に対する抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートした。沈殿した複合体を、ＳＤＳローディングバッファーを用いて洗浄ビーズから溶出させた。ウエスタンブロット解析は、ＳｏｒＬＡ：ＧＦＲα４複合体の存在下で明らかにされた（図１１Ａ）。ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα４の細胞外ドメインの直接的相互作用も、標準泳動バッファーとしてＣａＨＢＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を使用する、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して証明した。Ｂｉａｃｏｒｅ（ＣＭ５、カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）製のバイオセンサーチップは、供給元により説明されているようにＮＨＳ／ＥＤＣ法を使用して活性化し、その後、ＳｏｒＬＡでコーティングした。
【実施例５】
【０１６１】
ＳｏｒＬＡ：ＧＤＮＦ複合体のデモンストレーション
ＳｏｒＬＡおよびＧＤＮＦの細胞外ドメインの直接的相互作用も、標準泳動バッファーとしてＣａＨＢＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を使用する、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して証明した。Ｂｉａｃｏｒｅ（ＣＭ５、カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）製のバイオセンサーチップは、供給元により説明されているようにＮＨＳ／ＥＤＣ法を使用して活性化し、その後、ＳｏｒＬＡでコーティングした（図３）。
【実施例６】
【０１６２】
ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１を含む複合体を調節する、受容体アンタゴニスト／アゴニストを同定するための細胞系スクリーニング方法。Ｖｐｓ１０ｐドメイン受容体ファミリーのメンバーによる、結合、内在化またはシグナル伝達の測定は、細胞系において行うことができる。例えば、それぞれ、ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１およびＧＤＮＦの３つの受容体をすべてコードしているプラスミドでトランスフェクションした後のＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１およびＧＤＮＦを発現する細胞を、候補薬剤（阻害剤／アンタゴニスト）化合物とインキュベートする。前記薬剤は、例えば、リガンド、例えば、ＳｏｒＬＡプロペプチド、またはそれぞれの受容体の断片を結合している、受容体ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１のいずれか１つに対する抗体を意味し得る。インキュベーション後、細胞を洗浄し、タンパク質複合体をジチオビス［スクシンイミジルプロピオナート］（ＤＳＰ、Ｐｉｅｒｃｅ）と架橋結合させ、続いて、プロテイナーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有するＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ノニデス（nonides）Ｐ−４０、ｐＨ８）中で溶解させた。細胞溶解物を、セファロースビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合されているＳｏｒＬＡまたはＧＦＲα１に対する抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートする。沈殿した複合体を洗浄ビーズから溶出させる（酸性緩衝液およびその後の中和）。溶離液中のＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα１をウエスタンブロット解析することにより、候補化合物がＳｏｒＬＡ：ＧＦＲα１複合体形成を阻害することが可能かどうかについて明らかにする。
【実施例７】
【０１６３】
ＧＦＲα１および／またはＳｏｒＬＡとＧＤＮＦの相互作用を阻害する薬剤を同定するためのインビトロアッセイ
固定化タンパク質へのリガンド、例えば、小型有機分子、ペプチドまたはＳｏｒＬＡ、ＧＦＲα１およびＧＤＮＦを含む（ただしこれらに限定されるものではない）可溶性受容体の直接結合の測定は、例えば、標準泳動バッファーとしてＣａＨＢＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を使用する、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）により行うことができる。そのような薬剤は、成熟ＧＤＮＦのＮ末端（図１７）またはＧＦＲα１ドメイン１（図１６）から得ることができる。Ｂｉａｃｏｒｅ（ＣＭ５、カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）製のバイオセンサーチップは、供給元により説明されているようにＮＨＳ／ＥＤＣ法を使用して活性化し、その後、ＳｏｒＬＡでコーティングした。いくつかの様々な手法を用いることができる：候補薬剤は、結合シグナル（応答単位）を受容体の１つで固定化したチップと比較し、このシグナルを空のフローセルと比較することにより同定することができる。別の手法においては、既知リガンドの阻害は、推定阻害剤の不在下または存在下でモニターすることができる。シグナルの差は、アンタゴニストの阻害ポテンシャルを表す。回収されたデータは、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．１プログラムを使用して、親和性評価および阻害ポテンシャルに関するセンサーグラムを適合することにより分析することができる。表面プラズモン共鳴アッセイは、Ｖｐｓ１０ｐドメイン受容体、リガンドまたは推定阻害剤が固相上に固定化される、別のアッセイへと容易に変換することができる。例えば、受容体は、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６中、４℃で１６時間インキュベーションすることにより、例えばＮｕｎｃ製のＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイターウェル（カタログ番号４３９４５４）に固定化することができる。室温で２時間、５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９６４７）を使用してブロッキングした後、ウェルをＭＢ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で３回洗浄し、各種濃度の候補阻害剤の不在下または存在下において、標識リガンド（例えば、ヨウ素化）とインキュベーションすることができる。インキュベーション（例えば４℃で一晩）の後、ＭＢ緩衝液で洗浄し、結合放射活性は１０％ＳＤＳを添加することにより遊離される。ウシ血清アルブミンのみでコーティングしたウェルへのトレーサーの非特異的結合を測定し、結合実験で測定された値から減じることができる。結合データポイントは、ＧｒａｐｈＰａｄ製のプリズムソフトウェア（バージョン４）を使用して、結合方程式に合わせることができる。同様に、アンタゴニストも標識化することが可能であり、固定化受容体への結合を直接測定することができる。さらに別の構成において、受容体、リガンドまたはアンタゴニストはシンチレーションビーズ上に固定化することが可能であり、受容体結合分子が放射活性を用いて標識化されている結合をシンチレーション近接アッセイにおいて測定することができる。
【実施例８】
【０１６４】
ＳｏｒＬＡを阻害することが可能な薬剤を同定するための細胞系スクリーニング方法
ＳｏｒＬＡ：ＧＦＲα１：ＧＤＮＦレセプター複合体の実体に対するアンタゴニストは、複合体全体の阻害剤として作用することができる。したがって、例えばＶｐｓ１０ｐドメイン受容体実体に結合することが可能な薬剤についてスクリーニングすることに関連する。そのような方法は、本実施例に記載されている。Ｖｐｓ１０ｐドメイン受容体ファミリーのメンバーによる結合、内在化またはシグナル伝達の測定は、細胞系で行うことができる。内生的に、または、例えば受容体のｃＤＮＡを含有するプラスミドとのトランスフェクション後に、受容体の１つを発現する細胞は、候補阻害剤／アンタゴニスト化合物の不在下および存在下のそれぞれにおいて、放射標識したリガンドとインキュベートすることができる。インキュベーション後、細胞を洗浄して非特異的結合を除去し、続いて回収することができる。候補アンタゴニスト／阻害剤の受容体への結合の程度は、当業者に公知の慣用の放射リガンドアッセイを使用することにより測定する。例えば、Bylund and Toews (1993) Am J Physiol. 265(5 Pt 1):L421-9 entitled 「Radioligand binding methods: practical guide and tips」を参照。同様に、細胞内取込／内在化は、Nykjaer et al (1992) FEBS 300:13-、およびNielsen et al (2001) EMBO Jに記載されているようにして測定することができる。
【実施例９】
【０１６５】
ＳｏｒＬＡによってＧＦＲα受容体の逆行性ソーティングを調節することが可能な薬剤を同定するための細胞系スクリーニング方法。ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα受容体の両方を発現する細胞において、表面に局所するＧＦＲα受容体を蛍光タグまたは蛍光抗体のいずれかにより標識化し、３０分の間、ＳｏｒＬＡアゴニスト／アンタゴニストとインキュベートした。続いて、内在化されられたＧＦＲα受容体の量は、図６および図１１に示すような共焦点顕微鏡法を使用して評価することができる。
【実施例１０】
【０１６６】
Ｒｅｔリン酸化を高めることが可能な薬剤を同定するための細胞系スクリーニング方法
ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞は、ＳｏｒＬＡアンタゴニストまたはアゴニストの不在下または存在下において、所定の時間ＧＤＮＦの濃度を高めることにより刺激した。細胞を溶解させ、細胞溶解物は、Ｇａｍｍａｂｉｎｄビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合されたＲｅｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する抗体とインキュベートした。沈殿タンパク質を洗浄ビーズから溶出させ（酸性緩衝液、続いて中和）、リン酸化Ｒｅｔを、抗ホスホチロシン（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ウェスタンブロッティングにより視覚化した（図９に示すとおり）。
【実施例１１】
【０１６７】
細胞生存を高めることが可能な薬剤を同定するための細胞系スクリーニング方法
ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理により回収し、その後、１％グルタマックスならびに１％Ｐ／Ｓ（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含有するフェノールレッド（ＬＯＮＺＡ）を含まないＤＭＥＭに再懸濁させた。細胞を、５０μｌの最終容量で９６ウェルプレートのウェルあたり２００００個細胞でプレーティングした。翌日、細胞を、ＳｏｒＬＡアンタゴニストまたはアゴニストの不在下または存在下において、ＧＤＮＦ濃度を高めることにより刺激した。ＧＤＮＦなどを添加した後の最終容量は１００μｌであった。各種類の試料は四連として調製した。細胞は、それらの通常のインキュベーター中で７２時間インキュベートした。７２時間後、ＭｕｌｔｉＴｏｘ−Ｆｌｕｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ細胞毒性試験試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を調製し、製造者の添付技術書類による指示のとおり細胞に加えた。簡潔に説明すると、各試料について、アッセイバッファー１００μｌ、ＧＦ−ＡＦＣ基質０．１μｌおよびビス−ＡＡＦ−Ｒ１１０基質０．１μｌを混合し、ウェルに加えた。２４０ｒｐｍの揺動シェーカー（Ｉｋａ（登録商標）ＫＳ  ２６０  Ｂａｓｉｃ）上で１分間混合した後、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。その後、蛍光をＷａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ３ＴＭ  １４２０多重標識カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒＴＭ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。生存能力は４００ｎｍＥｘ／５０５ｎｍＥｍで測定した。シグナルは生存に正比例する。
【０１６８】
別法において、生存を試験するとは９６ウェルプレートの代わりにカバーガラス上で細胞を成長させることである。７２時間後、細胞を室温で３０分間、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に固定させ、ＤＡＰＩを含有するマウント培地を用いてスライド上にマウントすることができた。ＤＡＰＩ染色された細胞は、蛍光顕微鏡で直接カウントすることができた（図９Ｄに示すとおり）。
【実施例１２】
【０１６９】
ＳｏｒＬＡアンタゴニスト／アゴニストによる主要ニューロン細胞培養におけるＧＤＮＦファミリーリガンド活性の調節
主要ニューロンの培養物は野生型マウスの脳から調製する。生後０〜２日で脳を切開し、細胞を分離し、ＳｏｒＬＡアンタゴニストまたはアゴニストの存在下または不在下において、例えば１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦの存在下でプレーティングする。インビトロで１〜２週間培養物を成熟させた後、生存ニューロンの数を記録した。
【実施例１３】
【０１７０】
ＳｏｒＬＡアンタゴニスト／アゴニストによる主要ドーパミン作動性ニューロンにおけるＧＤＮＦ活性の調節
Ｐ０〜Ｐ２ラットの腹側被蓋領域から調製された主要ドーパミン作動性ニューロン。ラットの子の頭部を除去し、脳を単離し、冷却ＰＢＳに入れた。脳は腹側を下にして置いた。最初に脳全体の後ろから中脳屈曲部を切開し、二番目に吻側から屈曲部へ切開し、切片を平面に置いた。切片の腹面端部は視床下部の頂部に沿って切開され、次に、切片の腹面端部と脳室間孔のほぼ中間を切開した。組織をより小さな区分に切り、冷却Ｌ１５培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に置いた。組織を３７℃で３０分間、加温パパイン溶液（Ｌ１５培地、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０単位／ｍｌパパイン（ＴＭＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｍｅｄｉｎｏｖａ）、０．５ｍＭキヌレン酸およびＮａＯＨ（ｐＨを約７に調整））とインキュベートした。培地を除去し、組織をニューロン培地（Ｌ−グルタミンを含まないＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＢＳ、Ｂ−２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｒｉｍｏｃｉｎ（Ａｍａｘａ）、５−フルオロデオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ）およびウリジン（Ｓｉｇｍａ））中で穏やかに摩砕することにより粉砕した。ニューロンを沈降させ（８００ｒｐｍ、５分）、ペレットをニューロン培地で希釈し、１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦの存在下であって、ＳｏｒＬＡアンタゴニストまたはアゴニストの存在下または不在下において、皮質グリア細胞の層上に置いた。ニューロンをインビトロで１週間３７℃にてインキュベートし、その後、これらを室温で３０分間、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。その後、これらを、０．１％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ中で１５分間２回洗浄し、続いて、２０分間ＰＢＳ中の１０％ＦＢＳとインキュベーションした。その後、カバーガラスを４℃で一晩、１０％ＦＢＳのＰＢＳ中の抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体（Ｐｅｌ  ｆｒｅｅｚｅ、１：１０００）とインキュベートした。翌日、カバーガラスを０．１％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳで３回洗浄し、４℃で一晩、１０％ＦＢＳのＰＢＳ中のＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：１０００）とインキュベートした。その後、カバーガラスをＰＢＳ中の０．１％トリトンＸ−１００で２×１５分、ＰＢＳで１×１５分、水で１×１５分洗浄した。カバーガラスをＤａｋｏ  Ｆｌｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）とともにスライド上にマウントした。生存ニューロンの数を、チロシンヒドロキシラーゼのポジティブニューロンの数をカウントすることにより記録した（図１２に示すとおり）。
【実施例１４】
【０１７１】
アンフェタミン誘導機能促進に対するＳｏｒＬＡアンタゴニスト／アゴニストの効果
マウスをＳｏｒＬＡアンタゴニストまたはアゴニストで１〜３０日間前処理し、透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓ領域（４０×４０×３５ｃｍ）から構成されているオープンフィールド試験において、アンフェタミン誘導機能促進に関して試験した。領域は、Ａｎｙ−ｍａｚｅトラッキングシステムの制御下のコンピューター連結ビデオカメラ下に、薄暗い部屋でセットアップした。マウスを領域の隅に置き、図１３に示すように、それらマウスの活動を４０分間セッションの間記録した。アンフェタミン（０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内または静脈内に投与した。
【実施例１５】
【０１７２】
不安神経症関連挙動に対するＳｏｒＬＡアンタゴニスト／アゴニストの効果
野生型のＳｏｒＬＡトランスジェニックマウスの挙動を、高架型十字迷路において、不安神経症関連挙動に関して試験した。高架型十字迷路は、うつ病、躁病および不安神経症の関連挙動に関する実験モデルとして使用される。抗うつ薬または抗不安薬でマウスを治療すると、通常、移動距離、ライン交差の数、および入場回数および壁のない走行路での経過時間が増える。高架型十字迷路は床より４０ｃｍ上に設定されており、１５ｃｍの高い不透明な壁のある２つの向かい合う壁のある走行路と同じ大きさ（３５×５ｃｍ）の２つの向かい合う壁のない走行路から構成されている。高架型十字迷路は、Ａｎｙ−ｍａｚｅトラッキングシステム制御下でコンピューター連結ビデオカメラの下に、薄暗い明かりのついた部屋でセットアップした。１０分間の試験セッションを各マウスについて実施し、図１４に記載したように、入場回数と、壁のない走行路における滞在時間を測定した。マウスをＳｏｒＬＡアンタゴニストまたはアゴニストで１〜３０日間事前処置した、類似の実験を実施する。
【実施例１６】
【０１７３】
アンフェタミン誘導感作に対するＳｏｒＬＡアンタゴニスト／アゴニストの効果
５日間１日おきに１回、成体マウスを４ｍｇ／ｋｇのアンフェタミンまたは生理食塩水で前処理し、また一方でＳｏｒＬＡアンタゴニストまたはアゴニストを用いて処置し、オープンフィールドでの自発運動に関して試験した。最後のアンフェタミン前処置の後、ＳｏｒＬＡアンタゴニスト／アゴニストによる処置を１週間継続した。１６日目に、すべてのマウスがアンフェタミン（２ｍｇ／ｋｇ）の投与注射を受ける感作に関する試験を実施し、オープンフィールドにおける自発運動について試験した。
【実施例１７】
【０１７４】
マウスにおけるＭＰＴＰ誘導神経毒性に対するＳｏｒＬＡアンタゴニスト／アゴニストの保護作用
成体マウスに、２０ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン、ドーパミン作動性ニューロンに選択的に毒性のある薬剤）をＳｏｒＬＡアンタゴニスト／アゴニストと一緒に、またはＳｏｒＬＡアンタゴニスト／アゴニストを使用せずに注射した。注射の１日前、および注射終了の２日後に、透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓ領域（４０×４０×３５ｃｍ）からなるオープンフィールド試験において、運動活性を記録した。領域は、Ａｎｙ−ｍａｚｅトラッキングシステムの制御下でコンピューター連結ビデオカメラ下の薄暗い部屋でセットアップした。マウスを領域の隅に置き、マウスの活動を６０分のセッションの間記録した。最後に、免疫組織化学を使用して各種の形態学的マーカー（例えば、チロシンヒドロキシラーゼおよびドーパミン輸送体）を評価するために、マウスに４％パラホルムアルデヒドを潅流した。
【実施例１８】
【０１７５】
細胞分化を増進することが可能な薬剤を同定するための細胞系スクリーニング方法
神経芽細胞腫細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理で回収した。１０％ＦＢＳならびに１％Ｐ／Ｓ（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に細胞を再懸濁し、６ウェルプレートに播種した。翌日、培地を除去し、ＳｏｒＬＡアンタゴニストまたはアゴニストの不在下または存在下において、ＧＤＮＦの濃度を上昇させる新しい培地で細胞をインキュベートした。細胞は、それらの通常のインキュベーター中で７２時間インキュベートし、この後、カメラを連結した実体顕微鏡（ライカＤＣ３００）で細胞を視覚化した。神経突起伸長は、細胞直径より２倍長いプロセスとして神経突起を定義することにより記録した。
【実施例１９】
【０１７６】
治療方法
結果として、使用前に溶解される凍結乾燥されたもの、または、非経口投与経路（例えば、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）もしくは皮下（Ｓ．Ｃ．））で投与可能であるような直ぐに使用可能な溶液としてのペプチド／ポリペプチド性質（可能な抗体系）の活性剤が開発された。固体投与形態の粘膜施用もまた、この場合における可能性を示す。得られた開発活性剤が化学的性質である場合、経口投与用の製剤ならびに例えばＳ．Ｃ．またはＩ．Ｍ．で使用するための有望な経路用の製剤が調製される。開発された薬は、予防的目的で使用されるか、長期治療のために長期間投与される。この場合、活性剤は、精神障害および行動障害の症状に至る、起こる分子的事象のプロセスに干渉し、それにより阻害する。薬が使用されるべきである精神障害および行動障害を発症する傾向にある患者を分析するために遺伝子検査が開発される場合においては、そのような診断法と関連して可能である。精神障害および行動障害が発症した場合、薬を利用する長期の治療は別の可能性を示す。論理的根拠は、その病気の症状に至る分子的事象をコンスタントに抑制することができることである。最後に、本薬は、神経系障害または精神障害および行動障害の慣用の治療法、例えば、抗精神病薬、抗うつ薬またはリチウムと一緒に併用投与することが可能である。
【実施例２０】
【０１７７】
ＳｏｒＬＡによるＧＤＮＦファミリーリガンド（ＧＦＬ）の内在化および分解を調節することが可能な薬剤を同定するための細胞系スクリーニング方法
ＧＤＮＦまたは別のＧＦＬは、２〜１２０分間、ＳｏｒＬＡアゴニスト／アンタゴニスト（例えば抗体）の存在下または不在下において、ＳｏｒＬＡおよびＧＦＲα受容体の両方を発現する細胞とインキュベートした。ＧＤＮＦまたは別のＧＦＬは、蛍光タグまたは蛍光抗体のいずれかにより標識化した。続いて、図６および図１１および図２１に示したように、内在化ＧＤＮＦまたはＧＦＬの量を、共焦点顕微鏡法を使用して評価した。
【０１７８】
［配列表］
【表１】
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【表２】
2013532144.tif 000004
【表３】
2013532144.tif 000005
【表４】
2013532144.tif 000006
【表５】
2013532144.tif 000007
【表６】
2013532144.tif 000008
【表７】
2013532144.tif 000009
【表８】
2013532144.tif 000010
【表９】
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【表１０】
2013532144.tif 000012
【表１１】
2013532144.tif 000013
【表１２】
2013532144.tif 000014
【表１３】
2013532144.tif 000015
【表１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
2013532144.tif 000019
【図４】
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【図５】
2013532144.tif 000021
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2013532144.tif 000028
【図１３】
2013532144.tif 000029
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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