(57)【要約】  本発明は、接種対象へのワクチン接種のための改善された方法に関する。特に、本発明は、接種対象における選択された病原体に対する既存の免疫性を増強及び改善するために皮膚に抗原製剤を使用することを開示する。本発明は、従来のワクチン接種と組み合わせた皮膚への製剤の使用、又は選択された病原体に対する接種対象への、又は改善された免疫化のための初回抗原刺激若しくはワクチン接種を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の接種対象の病原体に対する既存の免疫反応を増強するのに用いるための感染性病原体に特異的な抗原製剤であって、
アジュバントを用いず、接種対象の無処置の皮膚に適用され、
前記増強される免疫反応は、Ｔｈ１指向性である抗原製剤。
【請求項２】
乾燥状態である請求項１に記載の既存の免疫反応を増強するのに用いるための抗原製剤。
【請求項３】
実質的に異常が無い角質層を有する皮膚の領域に適用される、請求項１又は２に記載の既存の免疫反応を増強するのに用いるための抗原製剤。
【請求項４】
前記既存の免疫性は、前記接種対象への先の非経口、経口又は経鼻での前記病原体に対するワクチン接種により生じる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の既存の免疫反応を増強するのに用いるための抗原製剤。
【請求項５】
前記既存の免疫性は、前記接種対象への先の非経口、経口又は経鼻での前記病原体に対する初回抗原刺激により生じる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の既存の免疫反応を増強するのに用いるための抗原製剤。
【請求項６】
前記既存の免疫性は、前記接種対象への先の前記病原体の自然曝露により生じる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の既存の免疫反応を増強するのに用いるための抗原製剤。
【請求項７】
密封性のパッチデバイスを用いて前記接種対象の皮膚に適用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の既存の免疫反応を増強するのに用いるための抗原製剤。
【請求項８】
前記密封性のパッチデバイスは、前記抗原が、好ましくは接着剤が加えられずに静電気又はファンデルワールス力により結合された担体を含む、請求項７に記載の抗原製剤。
【請求項９】
前記接種対象の皮膚に１回、２回又は３回の追加免疫として投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の既存の免疫反応を増強するのに用いるための抗原製剤。
【請求項１０】
初回抗原刺激又は抗原曝露の好ましくは２〜８週間後の皮膚への第１の追加免疫、任意である第１の追加免疫の好ましくは１〜１２カ月後の皮膚への第２の追加免疫、及び任意である第２の追加免疫の好ましくは１〜１２カ月後の皮膚への第３の追加免疫を含む、請求項９に記載の既存の免疫反応を増強するのに用いるための抗原製剤。
【請求項１１】
皮膚への追加免疫と先の初回抗原刺激又はワクチン接種とは、同一の抗原が用いられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗原製剤。
【請求項１２】
感染性病原体は、ウィルス、細菌、寄生生物又は真菌である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗原製剤。
【請求項１３】
前記抗原は、ウィルス又は細菌の表面抗原である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗原製剤。
【請求項１４】
病原体に対して前免疫された哺乳動物の接種対象における免疫反応を増強するのに用いるための感染性病原体に特異的な抗原製剤であって、
前記免疫反応の増強及びＴｈ１指向化を可能とする条件下で、前記接種対象の無処置の皮膚に乾燥形態で適用される抗原製剤。
【請求項１５】
哺乳動物の接種対象における病原体特異的なＴｈ１指向性免疫反応を誘導する又は刺激するための方法に用いる感染性病原体に特異的な抗原製剤であって、
その方法は、前記病原体に対する免疫反応を引き起こす又は刺激するために、前記病原体に特異的な抗原を哺乳動物に非経口、経口又は経鼻投与すること、及び、
その後に、Ｔｈ１指向性免疫反応を増強させるように、前記病原体に特異的な抗原を哺乳動物の無処置の皮膚に適用することを含む抗原製剤。
【請求項１６】
哺乳動物の接種対象にそれぞれ別々に順次投与される、選択された感染性病原体に特異的な抗原の注射可能な製剤と、
皮膚への投与に適する、前記選択された病原体に特異的な抗原の乾燥状態である非アジュバント製剤とを含む組成物。
【請求項１７】
選択された感染性病原体に特異的な抗原の注射可能な製剤と、
皮膚への投与に適する、前記選択された病原体に特異的な抗原の乾燥状態である非アジュバント製剤とを含むキット。
【請求項１８】
哺乳動物の接種対象における感染性病原体に対する既存の免疫反応を増大する方法であって、
前記接種対象の皮膚に前記病原体に特異的な抗原の非アジュバント製剤を適用することを含む方法。
【請求項１９】
感染性病原体に対して前免疫された哺乳動物の接種対象における免疫反応を増強する方法であって、
前記免疫反応の増強及びＴｈ１指向化を可能とする条件下で、前記接種対象の皮膚に前記病原体に特異的な抗原製剤を適用することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、接種対象へのワクチン接種のための改善された方法に関する。特に、本発明は、接種対象における選択された病原体に対する既存の免疫性を増強及び改善するために皮膚に抗原製剤を使用することを開示する。本発明は、改善された免疫化又は選択された病原体に対する接種対象へのワクチン接種のための、従来のワクチン接種又は初回抗原刺激と組み合わせた皮膚への製剤の使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
接種対象へのワクチン接種は、選択された病原体に対する防御的免疫反応を起こす方法である。ワクチン接種は、病原体に対する接種対象の免疫性防御を増大、拡大又は刺激するために、予防的、すなわち、接種対象が病原体に曝露される前に行われ得る、及び／又は治療的、すなわち、曝露後に行われ得る。
【０００３】
従来のワクチン接種は、接種対象への抗原の非経口、経鼻又は経口投与を含む。多くのワクチン接種プログラムは、病原体の選択された特定の抗原の接種対象への（繰り返しの）非経口投与（例えば注射）を含み、これにより、病原体に対する接種対象の免疫システムを誘導又は増強する。従来のワクチン接種は、経口又は経鼻であってもよい。
【０００４】
一般に、ワクチン接種は、初回抗原刺激の後に１回又は数回の追加免疫を含む、繰り返しの投与プロトコールを含む。多くの場合、そのような１回よりも多い免疫化を必要とする初回−追加ワクチン接種は、同種の追加免疫として同一のワクチンを複数回用いて行われる。また、従来のワクチン接種プログラムにおいて、一般に、抗原は適切な免疫反応を起こすために、１つ又はそれ以上のアジュバントと組み合わせて用いられる。
【０００５】
Wu等(2005)は、異種の初回−追加免疫方法を開示し、それにおいて、初回抗原刺激は、第１抗原（抗原をコードするプラスミドＤＮＡ）の注射により行われ、追加免疫は、第２の製剤（同一の抗原をコードする複製不全アデノウィルスベクター）の注射により行われる。このアプローチは、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウィルス、エボラウィルス及びベネズエラウマ脳炎ウィルスを含む多くのウィルス性病原体に対するワクチンの開発において試験されている。ＤＮＡの初回抗原刺激の後のアデノウィルスの追加免疫は、細菌性疾病に対する免疫化のためのアプローチとして評価されている（McConnell等, 2007）。
【０００６】
従来のワクチン接種は、例えばタンパク質、ペプチド、細胞、不活化病原体、トキソイド及びウィルス様粒子等の種々の型の抗原を用いて研究されている。
【０００７】
皮膚におけるワクチン製剤の局所的な適用も提案されている。
【０００８】
特に、Partidos等（2003）は、接種対象へ特定の投与条件、特定のアジュバントの使用及び皮膚への前処理を前提として、免疫反応が皮膚経路により引き起こされ得ることが示されている。
【０００９】
US 7,378,097は、アジュバント抗原成分の前処理された皮膚への適用によるワクチン接種に関する。
Mishra等, 2006は、局所的投与を介して抗原を輸送する新規の小胞状コンストラクト、融合性ベソソームを用いて経皮免疫化のシステムを提示している。しかしながら、この小胞性のシステムは、液体、非密封性システムであり、水を含ませた皮膚にアジュバントと共に抗原を適用する必要がある。
【００１０】
Hammond等, 2001は、アジュバント抗原の溶液が水を含ませた皮膚に局所的に適用される経皮免疫化の方法を提示している。
【００１１】
上記の全ては、免疫反応を起こすためにアジュバントの使用を必要とする。また、それらは、液体製剤を用い、誘発された免疫反応の性質が調節も分析もされていない。
【００１２】
WO2007/122226及びWO2009/080933は、無処置の皮膚に適用されるアジュバントを欠く抗原製剤を用いる皮膚の免疫化を開示している。この適用は、防御的反応がアジュバントを加えること、及び皮膚への前処理を行うことなく、抗原の皮膚への適用により得られ得ることを示す。
【００１３】
上記の方法、及び哺乳動物の接種対象のワクチン接種による免疫化又は保護のためのポジティブな反応にもかかわらず、本技術分野において改善された免疫化方法が未だ必要であり、そのような方法は、患者にとってより有利であり、感染性疾病等の病気の予防又は治療のために適切で十分な免疫反応を誘導するものである。
【発明の概要】
【００１４】
本願は、哺乳動物の接種対象における病原体に対する免疫性を向上する新規の方法を提供する。特に、本発明は、皮膚に用いる抗原製剤で接種対象における既存の免疫性を増強する及び／又は方向づける方法を提供する。本出願において、開示されるように、この方法は、強いＴｈ１指向性免疫反応を引き起こし、現行のワクチン接種プロトコールよりも便利である。特に、本発明は、皮膚への追加免疫が既存の免疫反応の増強と、免疫反応のＴＨ１分極との両方を起こし、それは、効率的なワクチン接種のために特に適している。
【００１５】
従って、本発明の目的は、哺乳動物の接種対象における病原体に対する既存の免疫反応を刺激する及び／又はＴＨ１指向化するための方法を得ることにあり、その方法は、病原体に対する既存の免疫反応を有する接種対象の皮膚にその病原体に特異的な抗原を適用することを含み、前記皮膚に適用する製剤は、前記反応の刺激及びＴＨ１指向化を引き起こす。
【００１６】
また、本発明は、哺乳動物の接種対象の皮膚に投与されることにより、その哺乳動物の接種対象における病原体に対する既存の免疫反応を増強する及び／又はＴｈ１指向化するのに用いるための病原体特異的な抗原製剤に関する。好ましくは、その抗原製剤は、乾燥状態である及び／又はアジュバントが利用されない。
【００１７】
好ましくは、その抗原製剤は、接種対象の無処置の皮膚に適用される。また、好ましい実施形態において、抗原製剤は、密封性のパッチデバイスを用いて接種対象の皮膚に適用される。
【００１８】
また、本発明は、哺乳動物の接種対象の皮膚に適用されることにより、その接種対象における病原体に対する既存の免疫反応を増強する及び好ましくはＴｈ１指向性にするための薬剤の製造のためのその病原体特異的な抗原の製剤の使用に関する。好ましくは、その抗原は、乾燥状態である及び／又はアジュバントが利用されない。
【００１９】
本願で開示されるように、既存の免疫性は、前記病原体に対する接種対象の先の従来のワクチン接種、先の従来の初回抗原刺激、及び／又は先の自然曝露から生じ得る。
【００２０】
従って、本発明の更なる対象は、選択された病原体に対する哺乳動物のワクチン接種方法であり、その方法は、(i)前記病原体に対する免疫反応を起こす又は刺激するために、その病原体に特異的な抗原を哺乳動物に従来型で投与することと、(ii)続いて、その病原体に特異的な抗原をその哺乳動物の皮膚に適用することとを含む。記述しているように、そのような皮膚への適用は、免疫反応の増強及びＴｈ１指向化を可能とする。ステップ(ii)は、ステップ(i)のすぐ後、又は病原体に対する免疫性が接種対象にまだ存在する限り、それ以降に行われ得る。ステップ(ii)は、通常、１回、２回又は３回の追加免疫処理からなり、それは、例えば病原体に依存して通常１〜１８カ月の種々の間隔を空けて行われ得る。
【００２１】
従って、本発明の更なる対象は、選択された病原体に対する哺乳動物へのワクチン接種に使用するための抗原製剤であり、その抗原は、前記病原体への免疫反応を引き起こす又は刺激するために、まず従来型の投与がなされ、その後に哺乳動物の皮膚に適用される。
本発明の他の対象は、病原体に対して免疫化された哺乳動物における免疫反応を増強する方法であり、その方法は、病原体に特異的な抗原、好ましくは乾燥状態であり、アジュバントを利用しない製剤を接種対象の皮膚に適用することを含む。より好ましくは、その抗原製剤は、アジュバントを利用せず、接種対象の無処置領域に適用される。
【００２２】
本発明の他の対象は、前免疫された哺乳動物の接種対象における病原体に対する免疫反応を増強する及びＴｈ１指向化する方法であり、その方法は、好ましくは乾燥状態である及び／又は非アジュバント製剤である、その病原体に特異的な抗原を前免疫された接種対象の無処置の皮膚に適用することを含む。
【００２３】
また、本発明は、接種対象の皮膚にその抗原を適用することにより前免疫された哺乳動物の接種対象において、前記病原体に対する免疫反応を増強する及びＴｈ１指向化するのに用いるための病原体に特異的な抗原（好ましくは、乾燥状態である及び／又はアジュバント製剤である）に関する。
【００２４】
また、本発明は、哺乳動物の接種対象における病原体特異的、Ｔｈ１指向性免疫反応を誘導する又は刺激するための方法に関し、その方法は、前記病原体に対する免疫反応を引き起こす又は刺激するために病原体特異的な抗原をその哺乳動物に従来型の投与をすることと、その後に、Ｔｈ１指向性免疫反応を増強させるように、その病原体に特異的な抗原をその哺乳動物の無処置の皮膚に適用することとを含む。
【００２５】
また、本発明は、哺乳動物の接種対象における病原体に対する既存の免疫反応を増強する方法に関し、その方法は、接種対象の無処置の皮膚に、前記病原体に特異的な抗原の乾燥状態でありアジュバントを利用しない製剤を適用することを含む。
【００２６】
また、本発明は、哺乳動物の接種対象における病原体に対する既存の免疫反応を増強する方法に関し、その方法は、免疫反応の増強及びＴｈ１指向化を可能とする条件下で、前記接種対象の皮膚に前記病原体に特異的な抗原の製剤を適用することを含む。
【００２７】
本発明の更なる目的は、それぞれ別々に順次哺乳動物の接種対象に適用される、選択された病原体に特異的な抗原の注射可能な製剤と、皮膚に投与するのに適する、前記選択された病原体に特異的な抗原の乾燥状態でありアジュバントを利用しない製剤とを含む組成物を得ることにある。
【００２８】
また、本発明は、選択された病原体に特異的な抗原の注射可能な製剤と、皮膚に投与するのに適する、前記選択された病原体に特異的な抗原の乾燥状態でありアジュバントを利用しない製剤とを含むキットに関する。
【００２９】
本発明は、病原体に対する予防的な及び／又は治療的な免疫反応を誘導する又は増強するために、哺乳動物、特にヒトの接種対象に用いられ得る。また、本発明は、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ及びネコ等を含む家畜又はペット等の動物を治療するための獣医学分野に用いられ得る。それは、特に感染性病原体に対するワクチン接種に適する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】抗HBsAg IgG1反応における皮膚への追加免疫の影響を示すグラフである。
【図２】抗HBsAg IgG2a反応における皮膚への追加免疫の影響を示すグラフである。
【図３】皮膚への適用又は注射により２回の追加免疫がなされたマウスにおけるサイトカイン生成細胞量を示す図である。
【図４】皮膚への適用又は注射により２回の追加免疫がなされたマウスにおけるサイトカイン分泌量を示すグラフである。
【図５】皮膚への適用又は注射により２回の追加免疫がなされたマウスにおけるＩＬ−５反応量（ELISA）を示すグラフである。
【図６】皮膚への適用又は注射により２回の追加免疫がなされたマウスにおけるＩＦＮ−γ反応量（ELISA）を示すグラフである。
【図７】無処置の皮膚及びテープストリップした皮膚で誘導された免疫反応を比較するグラフであり、図７ＡはＩｇＥ特異的な量を示し、図７ＢはＩｇＧ２ａ特異的な量を示す。
【図８】無処置の皮膚及びテープストリップした皮膚で誘導された免疫反応を比較するグラフであり、食道における好酸球量を示す。
【図９】無処置の皮膚及びテープストリップした皮膚で誘導された免疫反応を比較するグラフであり、食道におけるサイトカインのｍＲＮＡ発現量を示し、図９Ａはエオタキシンを示し、図９ＢはＩＬ−５を示し、図９ＣはＩＬ−１３を示している。
【図１０】無処置の皮膚及びテープストリップした皮膚で誘導された免疫反応を比較するグラフであり、食道におけるサイトカインのｍＲＮＡ発現量を示し、図１０ＡはＧＡＴＡ−３を示し、図１０ＢはＦｏｘｐ３を示している。
【図１１】無処置の皮膚及びテープストリップした皮膚で誘導された免疫反応を比較するグラフであり、組織学的データ、空腸における絨毛／陰窩比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、ワクチン接種を改善するための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、皮膚の抗原輸送を用いて接種対象における既存の免疫性を刺激することに関する。本発明は、免疫システムが初回抗原刺激をする組成物の従来型の投与により誘導され、追加免疫のための抗原組成物の皮膚への適用により追加免疫される、改善された「初回抗原刺激−追加免疫」ワクチン接種方法を開示する。また、本発明は、皮膚への抗原投与を用いて前免疫された接種対象において、病原体に対する防御的なＴＨ１指向性免疫反応を起こすための方法に関する。この方法は、患者に安全で、実用的であり、哺乳動物の接種対象において強いＴｈ１指向性免疫反応を起こす。
【００３２】
本発明は、先のワクチン接種及び／又は病原体への自然曝露である従来の初回抗原刺激により引き起こされるＴＨ２指向性の特定の免疫反応が、接種対象の皮膚への追加免疫で効率的に増強され、ＴＨ１指向化され得ることを示す。ここでの結果は、アジュバントを用いず、皮膚への前処理を行わない皮膚への追加免疫が、既存の免疫反応の効率的な増強及びＴＨ１指向化を引き起こすことを示す。さらに、その結果は、追加免疫が乾燥状態の抗原製剤及び密封性の皮膚デバイスを用いて行われた場合に、そのような反応が特に起こることを示す。
【００３３】
本発明は、免疫反応を誘導する又は増強するために、及び病原体に対する免疫性を生じさせるために用いられ得る。本発明は、病原体により引き起こされる疾病の予防又は治療のためにも用いられ得る。
【００３４】
本開示は、以下の定義を参照することによって十分に理解されるであろう。
【００３５】
-定義-
本明細書で用いられるように、「従来型」投与又はワクチン接種は、非経口、経口又は経鼻の投与又はワクチン接種をいう。非経口投与は、注射（例えば、筋肉内、皮内、静脈内又は皮下）、穿刺、及び／又は経皮投与により行われ得る。好ましい非経口投与経路は注射である。
【００３６】
皮膚性又は皮膚への適用は、皮膚の表面に接触した条件下で接種対象の皮膚に抗原を適用することをいう。本発明に係る皮膚への適用は、好ましくは無処置（又は前処理をしていない）皮膚に行われる。皮膚への適用は、皮膚の表層に抗原が浸透できる、及び／又は免疫細胞と抗原が接触できるのに十分な期間、維持されるべきである。
【００３７】
本発明において、「無処置の皮膚」は、完全な角質層が実質的に維持されていることを示す。以前の研究では、効率的な皮膚の免疫療法、増強された抗原の浸透、及び免疫反応の活性化のためには、（例えば、研磨又はテープストリップによる）皮膚の角質層の除去、又は（例えば顕微針を用いた）角質層の貫通を必要とすることが提案されていた(Frerichs等.,Vaccine 2008, p2782 ; Strid等,Eur J. Immunol 2004 p2100)。これらの以前の研究は、完全な角質層を変質することにより、生物のより良い反応を引き起こすように、ケラチノサイト及びランゲルハンス細胞が活性化又は刺激されることを示す。これらの先の結果に対して、本発明は、例えば完全な角質層が本質的に維持されている皮膚の表面又は領域である無処置（すなわち前処理がされていない）皮膚に抗原を適用することが好ましいことを示す。実際に、本発明は、指向化されたＴｈ２免疫反応を回避するために、完全な角質層を維持すること、並びに角質層の下に位置するケラチノサイト及びランゲルハンス細胞の自然活性状態を維持することが重要であることを示す。この完全性を維持することにより、得られる反応が耐性という意味で高い指向化がなされる。従って、例えば角質細胞の除去のための、例えば水分補給、水での洗浄、又は非常に穏やかな単一のストリップといった皮膚の表面の穏やかな洗浄が、適用される部位において行われ得るが、皮膚は実質的に完全な角質層を維持するために前処理は行うべきでない。そのような前処理は、全て又は一部の角質層を破壊する又は除去し、ケラチノサイトの刺激を引き起こすため、特に、皮膚へのテープストリップ又は強い研磨は行うべきでない。同様に、角質層の穿孔処理は避けられるべきである。
【００３８】
本明細書に記載されているように、「ワクチン接種」という用語は、通常、抗原に対する免疫反応を起こす及び／又は増強するための、哺乳動物に対する１回又はそれ以上の連続的な投与をいう。連続的な投与は、初回抗原刺激による免疫化の後の１回又は複数回の追加免疫を含む。
【００３９】
本発明において、「病原体」の用語は、病的な状態を引き起こし得る因子をいう。「病原体」の例は、細胞（例えば、細菌細胞、病気の哺乳動物細胞又は哺乳動物の癌細胞）、真菌、寄生生物、ウィルス、プリオン又は毒素等を含む。好ましい病原体は、感染性の病原体である。特定の実施形態において、感染性の病原体は、肝炎ウィルス、ロタウィルス、水痘ウィルス、インフルエンザ、サイトメガロウィルス、流感、ＨＩＶ、エボラウィルス又は狂犬病等のウィルスである。
【００４０】
感染性の病原体の特定の例は、ジフテリア菌、破傷風菌、百日咳菌、ポリオウィルス、マンプス、風疹、水痘、肺炎連鎖球菌、ロタウィルス、ＨＰＶ（ヒトパピローマウィルス）、アフリカトリパノソーマ症（睡眠病）、炭疽病、トリインフルエンザ、ブルーリ腫瘍、コレラ、クリミア−コンゴ出血性熱ウィルス、デング熱及び出血性デング熱、エボラ出血熱、非ポリオエンテロウィルス、ヘモフィルスインフルエンザＢ型菌（ＨｉＢ）、ヘンドラウィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、インフルエンザ（季節性）、ラッサ熱、レジオネラ症、ハンセン病、マラリア、マールブルグ病ウィルス、はしか、髄膜炎菌性髄膜炎、二パウィルス、疫病、灰白髄炎、リフトバレー熱、天然痘、結核又は黄熱の病原体等を含む。
【００４１】
本明細書で用いられる抗原とは、接種対象におけるＴ細胞又はＢ細胞免疫反応を起こし得る分子をいう。病原体に特異的な抗原は、通常、その病原体から得られた要素、又はその病原体に由来する要素であり、それはエピトープを含み、また、それはその病原体日する免疫反応を起こし得る。病原体の因子に依存して、抗原は（ポリ）ペプチド、タンパク質、核酸、脂質又は細胞等の種々のものであってもよい。病原体（例えば、細菌又はウィルス）の弱体型、死んでいる状態、又は不活性型も用いられ、また、それらから精製された材料であるタンパク質、ペプチド又は脂質等も用いられ得る。抗原は、自然に生じ得る、又は人為的に作られ得る。それは、治療される哺乳動物に対して外因性であってもよく、又は内因性（例えば腫瘍抗原）であってもよい。抗原は、例えば、合成若しくは組換え技術、又は酵素的アプローチ等の本技術分野において周知の技術により生成され得る。
【００４２】
本発明において用いるのに適する抗原の特定の例は、例えばウィルス抗原、好ましくは、例えばＢ型又はＡ型肝炎ウィルス抗原（HBsAg、HAsAg）等のウィルス表面抗原を含む。他の抗原は、腫瘍関連の抗原、すなわち正常細胞、細菌タンパク質等でなく、腫瘍細胞により発現された抗原を含む。
【００４３】
特定の実施形態において、抗原はタンパク質、ポリペプチド及び／又はペプチドである。「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」の用語は、アミノ酸残基のポリマーを意味するために、本明細書において互換的に用いられる。それらの用語は、自然に生じるアミノ酸に対応する人為的な化学的擬似体等の、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が修飾されている、又は非天然の残基を含むようなアミノ酸ポリマーにも適用される。「タンパク質」の用語が、エピトープを含む断片、又は病原体から得られたタンパク質及びその酵素的、化学的、機械的若しくは熱的に修飾されたもの等の、断片又は変異体といった種々の抗原をも含むことが理解されるべきである。
【００４４】
さらに以下で論じるように、抗原は液体又は乾燥状態等の種々の状態であってもよい。一般に、皮膚への適用のためには、抗原は乾燥状態であり、一方、従来のワクチン接種又は初回抗原刺激のためには、抗原は液体状態である。
【００４５】
本発明は、皮膚に抗原を適用することを用いて、哺乳動物の接種対象における既存の免疫性を改善する新規の方法に関する。本発明は、既存の免疫反応を改善、刺激、増強、拡張及び／又は再分極するために用いられ得る。そして、それは、
選択された病原体に対する接種対象への先の従来のワクチン接種、
選択された病原体に対する接種対象への先の従来の初回抗原刺激、及び／又は、
選択された病原体に対する接種対象への自然曝露、
により生じ得る。
【００４６】
第１の実施形態において、本発明は、従来のワクチン接種を受けた哺乳動物の接種対象において、病原体に対する既存の免疫反応を刺激するために、好ましくはＴＨ１分極化するために、抗原を使用することに関し、その抗原は、皮膚に適用することで接種対象に投与される。既存の免疫性は、かなり昔に、例えば子供の時に接種対象に行われた従来のワクチン接種により生じ得る。従来のワクチン接種と皮膚への適用との間の期間は、既存の免疫性が接種対象に表れている限り、実際には実質的に異なり得る。そのような既存の免疫性の存在は、必要なときに、従来の方法により確認され得る。この方法は、例えば子供の時に肝炎又は破傷風に対するワクチン接種を受けた接種対象の場合に適する。皮膚に追加免疫するために用いられる抗原は、不活性型、サブユニット（例えば、インフルエンザ、Ｂ型若しくはＡ型肝炎又は百日咳）、又は弱毒化型（水痘、ＢＣＧ、ポリオ、インフルエンザ、狂犬病又は黄熱病等）であってもよい。
【００４７】
他の実施形態において、本発明は、従来の初回抗原刺激を受けた哺乳動物の接種対象において、病原体に対する既存の免疫反応を刺激するために、好ましくはＴＨ１分極化するために、抗原を使用することに関し、その抗原は、皮膚に適用することで接種対象に投与される。実施例に示すように、本発明者らは、非経口での初回抗原刺激と皮膚への追加免疫とを組み合わせることで、強くてＴｈ１指向性である免疫反応を起こすことを示している。
【００４８】
特定の実施形態において、本発明は、病原体に対する接種対象へのワクチン接種の方法に関し、それは、病原体に対する免疫反応を起こす又は刺激するために抗原を用いて接種対象に従来の初回抗原刺激を行う第１ステップと、その後に、その病原体に特異的な抗原を皮膚に適用することにより免疫反応を増強するステップとを含む。
【００４９】
初回抗原刺激は、１回又は複数回の連続的な抗原投与を含み得る。最も一般的な方法において、従来の初回抗原刺激は、１回又は２回の抗原投与を含む。好ましくは、初回抗原刺激は注射により行われる。
【００５０】
従来の投与のために、抗原は、通常、アジュバントと組み合わされる。適当な抗原は、例えば増強された抗原特異的な免疫反応を起こすための免疫システムを活性化する又は促進する物質を含む。本発明に用いられ得るアジュバントの例は、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム及び水酸化アルミニウム等の無機塩、ＣｐＧオリゴヌクレオチド等の免疫賦活性ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、抗体若しくはＴｏｌｌ様受容体に結合するタンパク質等のタンパク質、ＱＳ２１等のサポニン、ムラミルジペプチド誘導体等のサイトカイン、ＬＰＳ、ＭＰＬ及び３Ｄ−ＭＰＬを含む誘導体、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）、イミキモド、コロイド粒子、完全若しくは不完全フロイントアジュバント、リビアジュバント、又はコレラ毒素若しくはエンテロトキシン（ＬＴ）等の細菌性毒素を含む。
【００５１】
従来の初回抗原刺激のために、通常、アジュバントと組み合わされ、抗原を含む初回抗原刺激のための抗原組成物が用いられる。そのような組成物は、一般に、注射に適する液体型である。その組成物は、希釈剤、キャリア、等張液又は水等の適当な賦形剤をさらに含み得る。
【００５２】
上述のように、本発明では、従来の初回抗原刺激又はワクチン接種と、皮膚への追加免疫とを組み合わせる。皮膚への追加免疫のステップは、通常、皮膚に接触可能な条件下で、接種対象の皮膚に抗原製剤を適用することを含む。その適用は、通常、抗原が表皮の角質層の中に侵入できる、及び／又は免疫細胞にまで達し得るのに十分な条件及び／又は期間で行われる。
【００５３】
皮膚への適用は、好ましくは、抗原製剤と接種対象の皮膚との接触を維持するのに適当なデバイスを用いて行われる。そのようなデバイスは、パッチ、テープ、ドレッシング、シート又は当業者に周知の他の形態等を含む。好ましくは、その皮膚デバイスはパッチであり、より好ましくは密封性のパッチである。好ましいパッチデバイスは、皮膚の完全性を変更しない。
【００５４】
その適用で生じる結果は、皮膚への追加免疫が密封性の皮膚パッチデバイスを用いて行われた場合、明白なＴｈ１指向性免疫反応が起こることを示す。
【００５５】
最も好ましい実施形態において、本発明の方法では、国際特許出願WO2002/071950及びWO2007/122226に記載されているような皮膚パッチデバイスを用いる。
【００５６】
そのようなデバイスは、密封性であり、乾燥状態の抗原を用いるために構成され、その抗原は、接着剤を用いることなく静電気及び／又はファンデルワールス力でパッチに保持されている。そのようなデバイス（Viaskin（登録商標）と呼ばれる）の調製及び特性は、上記の引用された出願に詳細に開示されており、それらは全体で参照として本明細書に組み込まれる。
【００５７】
本発明の実施のために、それは、皮膚と密閉されたチャンバを作るために適合された基材を含むデバイスを使用するのに特に適し、この基材は、チャンバ内の皮膚と対抗する面に静電気力及び／又はファンデルワールス力で接着された乾燥抗原を有する。皮膚への適用において、そのチャンバにおける湿気の増大は、抗原の溶解を引き起こし、皮膚に接触する。
【００５８】
本発明の他の好ましい実施形態において、抗原は、抗原を結合させるための担体を含む密封性パッチデバイスを用いて哺乳動物の皮膚に適用される。好ましくは、抗原は、接着剤を用いずに静電気又はファンデルワールス力でパッチの担体に結合される。特定の実施形態において、パッチの担体は、セルロースプラスチック（ＣＡ、ＣＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアクリル、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリエチレン、及びエチレンビニルアクリレート（ＥＶＡ）からなる群から選択されるガラス又はポリマーを含み得る。
【００５９】
最も好ましい実施形態において、皮膚への追加免疫は、乾燥状態の抗原製剤を用いて行われ、それは、好ましくは静電気皮膚デバイスを用いて皮膚に適用される。これに関して、「乾燥状態」の用語は、追加免疫をする抗原製剤が、例えばそれぞれが分かれている又は凝集している粒子の形態であるような実質的に粉末状であることをいう。
【００６０】
あまり好ましくないが、追加免疫をする抗原製剤は、液体であってもよく、貯水部又は穴が開いた膜を有する密封性デバイス等の周知のデバイスを用いて適用されてもよい。
【００６１】
本発明の好ましい方法は、アジュバントが用いられた液体の初回抗原刺激のための抗原製剤と、乾燥状態の追加免疫のための抗原製剤とを組み合わせる。
【００６２】
さらに、好ましい実施形態において、追加免疫のための抗原製剤は、アジュバントを用いずに製剤化又は使用される。実際に、本発明は、追加免疫の製剤にアジュバントを加えなくとも、その方法は、強くて、ＴＨ１分極化した免疫反応を起こすことを示す。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態は、アジュバントが用いられた液体の初回抗原刺激のための抗原製剤と、アジュバントが用いられていない乾燥状態の追加免疫のための抗原製剤とを組み合わせる。
【００６４】
追加免疫のための抗原製剤は、浸透増強剤又は水和剤等の不活性な賦形剤又は他の成分を含み得る。しかしながら、単一の活性物質として１つ又は複数の抗原を含む、すなわちアジュバント又は浸透増強剤等の更なる活性物質を含まない追加免疫のための抗原製剤を用いることが好ましい。
【００６５】
追加免疫ステップは、１つ又はそれ以上のパッチデバイスが、１回又はそれ以上の回数、前処理がされておらず、好ましくは体のうち無毛の部位の無処置の皮膚に直接に適用され得る。実際に、本願に含まれるが、そのデバイスの適用の前に、皮膚において処置をする必要はない。さらに、本願は、皮膚の前処理が、皮膚への追加免疫により誘導される免疫反応の型に実質的に影響することを示す。特に、抗原製剤がアジュバントを用いず、無処置の皮膚に適用される場合、既存の免疫反応は、強く増強され、Ｔｈ１分極化が起こる。これは、全く期待されておらず、特に有利である。
【００６６】
従って、本発明の対象は、接種対象におけるＴｈ１分極化された抗原特異的免疫反応を誘導する又は増強する方法であり、その方法は、接種対象の無処置の皮膚に、乾燥状態でアジュバントを用いない抗原製剤を適用することを含む。
【００６７】
本発明の更なる対象は、選択された病原体に特異的な抗原の注射可能な製剤、及び乾燥状態でアジュバントを用いないその選択された病原体に特異的な抗原の製剤をそれぞれ別々に含み、連続的に哺乳動物の接種対象へ適用される組成物である。
【００６８】
本発明の更なる対象は、哺乳動物の接種対象における病原体特異的でＴｈ１指向性の免疫反応を誘導する、刺激する又は増強するのに用いるための上記のように定義された組成物である。本発明の更なる対象は、哺乳動物の接種対象における選択された疾病に対する免疫反応を増強するための上記のように定義された組成物である。
【００６９】
本発明の他の対象は、病原体に対して従来の免疫化がなされた哺乳動物の接種対象における免疫反応を増強する方法であり、その方法は、アジュバントを用いず、その病原体に特異的な抗原を、その接種対象の前処理されていない皮膚に適用することを含み、そのような適用は免疫反応の増強を引き起こす。
【００７０】
「従来の免疫化」の用語は、先に哺乳動物が従来の抗原投与により抗原に曝露されている（初回抗原刺激されている）ことを意味する。本発明により生じた結果は、アジュバントを用いず、皮膚へ前処理を行わない皮膚への追加免疫が、従来の投与により先に起こされた又は刺激された免疫反応の効率的な増強及びＴｈ１指向化を引き起こす。
【００７１】
本発明の実施において、初回抗原刺激及び追加免疫のために用いられる抗原は、その抗原が選択された病原体に特異的である限り、同一であっても異なっていてもよい。一般に、初回抗原刺激及び追加免疫に用いられる抗原は、共に少なくとも１つのＴ細胞及び／又はＢ細胞エピトープを含む。また、用いられる抗原の量は、当業者により調整され得る。初回抗原刺激ステップは、以下に示される用量で実施され得る。本発明に係る追加免疫のために、欠く皮膚デバイスにおける抗原の量は、通常０．１μｇから１００００μｇの範囲、好ましくは２０μｇから５０００μｇの範囲である。
【００７２】
本発明の方法の追加免疫は、１回又は複数回の追加免疫の適用を含むことができ、それらは、接種対象、抗原、皮膚デバイスおよび疾病等に依存して、同一又は別々の抗原、好ましくは同一の抗原を用いて、種々の時間間隔で実施され得る。
【００７３】
特定の実施形態において、各抗原での追加免疫は、１日から数カ月に延長し得る期間において、１回から１０回、通常は１回から５回、好ましくは１回、２回又は３回の連続的な皮膚デバイスの適用を含む。各適用は、１日から数週間、通常は１週間から１０週間の期間が空けられ得る。
【００７４】
さらに、本発明の好ましい処理は、通常、１回、２回又は３回の抗原による追加免疫を含む。
【００７５】
最初の追加免疫は、抗原特異的な免疫細胞が存在する限り、初回抗原刺激又は病原体の曝露の後の何時に行われてもよい。好ましくは、最初の追加免疫は、初回抗原刺激の後、２週間から１０週間までに行われる。
【００７６】
特定の実施形態において、本方法は、従来の初回抗原刺激による免疫化の通常３〜６週間後における１回の追加免疫を含む。
【００７７】
必要であれば第２の追加免疫が、また任意に第３の追加免疫が行われ得る。第２及び第３の追加免疫は、例えば先の追加免疫の後の２〜１８カ月といった月単位の間隔で行われ得る。
【００７８】
この点に関して、特定の実施形態において、本方法は、従来の初回抗原刺激による免疫化の通常３〜６週間後の最初の追加免疫と、通常は１〜１８カ月後、好ましくは１〜１２カ月後、例えば３〜６週間後の第２の追加免疫とを含む。
【００７９】
他の特定の実施形態において、本方法は、(i)従来の初回抗原刺激による免疫化、(ii)通常は３〜６週間後の最初の追加免疫、(iii)通常は１〜１８カ月後、好ましくは１〜１２カ月後、例えば３〜６週間後の第２の追加免疫、並びに(iv) 通常は１〜１８カ月後、好ましくは１〜１２カ月後、例えば３〜６週間後の第３及び最後の追加免疫からなる。
【００８０】
抗原の特定の容量、追加免疫の適用の回数及び接触期間は、接種対象、抗原製剤の性質及び用いられるパッチデバイスの型等に依存して熟練者により適合され得る。Viaskin（登録商標）デバイス等の密封性デバイスにおいて、接触期間は５時間から７２時間が好ましい。好ましくは、それぞれの適用において、２４時間から６０時間程度、より好ましくは２４時間から４８時間程度、一般に２４時間、３６時間又は４８時間の期間中、デバイスが皮膚上に保持される。
【００８１】
その処理は、いつでも、例えば免疫反応の十分な増幅及び／又はＴｈ１指向化が１度確立されれば止められ得る。この点に関して、本発明は、非経口による初回抗原刺激により誘導されたＴｈ２指向性である特定の免疫反応が、皮膚への追加免疫で十分に増幅され、Ｔｈ１分極化され得る。Ｔｈ１及びＴｈ２細胞は、サイトカインの生成パターンがそれぞれ異なるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の２つの型である。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＴＦＮ−βを生成し、細胞内の病原体及び悪性細胞に対する生体防御において有益な細胞性免疫反応に携わる。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を分泌し、ＩｇＥの生成を含む抗体反応を増強する。Ｔｈ１及びＴｈ２反応は、それらが互いに平衡し、相互制御して正常に存在するように、相互に拮抗的である。
【００８２】
本発明に関して、免疫反応のＴｈ１指向化は、本発明の追加免疫の結果として、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫細胞又はサイトカインの比率が増大する、好ましくは少なくとも１０％増大することを意味する。
【００８３】
実施例において開示されるように、本発明に従って追加免疫された接種対象から抽出されたＴ細胞の上清は、従来の投与経路により追加免疫された接種対象の場合と比較して、顕著に高い濃度のＩＦＮ−γ（主要なＴｈ１サイトカイン）及び顕著に低い濃度のＩＬ−５を含み、従って免疫反応のＴｈ１指向化が証明された。Ｔｈ１指向化は、特定の実施形態において、ＩＦＮ−γの濃度若しくはＩＦＮ−γ生成細胞の数が従来の投与経路を用いて処理された接種対象の場合と比較して、少なくとも１０％増大すること、及び／又はＩＬ−５の濃度若しくはＩＬ−５生成細胞の数が従来の投与経路を用いて処理された接種対象の場合と比較して、少なくとも１０％低減することを示す。
【００８４】
本発明の更なる対象は、従来法で免疫化された哺乳動物の接種対象における病原体に対する免疫反応を増強及びＴｈ１指向化する方法に関し、その方法は、アジュバントを加えることなく、病原体に特異的な抗原を免疫化された接種対象に対して、非経口で皮膚上に適用することを含む。
【００８５】
本発明の他の対象は、従来法で免疫化された哺乳動物の接種対象における病原体に対する免疫反応を増強及びＴｈ１指向化する方法に関し、その方法は、アジュバントを加えることなく、病原体に特異的な抗原を免疫化された接種対象に対して、非経口で、前処理されていない皮膚上に適用することを含む。
【００８６】
以下の実施例は、本発明を詳細に説明することを目的とし、この例に限定されるものではない。
［実施例］
実施例１：皮膚における追加免疫による免疫反応の増幅及びＴＨ１指向化
Ａ．材料及び方法
動物
大人のＢＡＬＢ／ｃマウスを、CharlesRiver Laboratories (フランス)から購入した。全ての試験は、動物飼育に関する欧州共同体の規則に従って行った。
【００８７】
抗原
Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原、すなわちＨＢｓＡｇを用いた。
【００８８】
皮膚デバイス
WO 2007/122226に記載されているようなViaskin（登録商標）デバイスを用いた。そのデバイスは、密封性であり、静電気的である。抗原は、乾燥状態で且つアジュバントを含まない状態で、静電気力により基材の表面に保持されている。
【００８９】
特定のＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２の定量化
血液サンプルを免疫療法前及び免疫療法中に後眼窩の静脈叢から採取し、その血漿を更なる分析まで−３０℃で保存した。
【００９０】
ＩＣＨガイドラインを用いて検証された定量的ＥＬＩＳＡを特定のＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのために用いた。手短に言えば、マイクロタイタープレートを２μｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇでコーティングした。１００μｌの各血清の段階希釈を各ウェル毎に行い、４℃で２４時間インキュベートした。ペルオキシダーゼでラベルされた抗マウスＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａ抗体をトレーサーとして用いた。試薬（ＴＭＢ）を酵素基質として用いた。希釈曲線をプロットし、血清のタイトレーションを同一の縦座標（ｙ軸）で決定した。
【００９１】
サイトカインの生成
最後の血液のサンプリングの後、マウスを脊椎脱臼により殺し、無菌状態で脾臓を採取した。
【００９２】
ＥＬＩＳＡによる定量化
細胞培養を２４ウェルマイクロタイタープレート（２．１０６cells/well）でＨＢｓＡｇ（０〜５０μｇ.ｍｌ−１）の存在下で行った。インビトロの刺激の７２時間後、上清を回収し、ＩＬ−５及びＩＦＮγの定量化を製造者の説明書に従って、CytoSetTMキット（BioSource International Europe,Belgium）を用いて行った。
【００９３】
ＥＬＩＳｐｏｔ
細胞培養を製造者（BD, USA）の推奨に従って、ＥＬＩＳｐｏｔマイクロタイタープレート（R&D system, USA）でＨＢｓＡｇ（０〜５０μｇ.ｍｌ−１）の存在下で行った。ＩＬ−５及びＩＦＮγの定量化を、刺激の４８時間後に行った。
【００９４】
プロトコール
初回抗原刺激：大人のＢＡＬＢ／Ｃマウス（７匹で２群）に対して２ｍｇＨＢｓＡｇ／１０μｇＡｌＯＨで従来の免疫化（筋肉内注射）を行った。
【００９５】
初回抗原刺激の後２８日目
血清の回収
グループ１「ＨＢｓＡｇ／Ａｌｕｍ」：２ｍｇＨＢｓＡｇ／１０μｇＡｌＯＨでの追加免疫
グループ２「Viaskin（登録商標）／ＨＢｓＡｇパッチ」：１００ｍｇＨＢｓＡｇを含むViaskinでの追加免疫。Viaskinを適用後４８時間で外した。
【００９６】
初回抗原刺激の後４９日目（追加免疫Ｉ後２１日目）
血清の回収
グループ１：追加免疫なし
グループ２：１００ｍｇＨＢｓＡｇを含むViaskinでの追加免疫
追加免疫１及び追加免疫２のためのパッチを２つの異なる方法で調製した：追加免疫１のためのパッチを凍結乾燥で調製し、追加免疫２のためのパッチを乾燥により調製した。しかしながら、２つの製剤において、パッチ上に抗原を粉末で付けた。
【００９７】
初回抗原刺激の後６３日目（追加免疫II後１４日目）
血清の回収
脾臓をＴ細胞反応の分析のために採取した。
【００９８】
抗体の定量化：血清抗ＨＢｓＡｇ抗体（ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）を０日、２８日、４９日及び６３日に抗原がコーティングされたプレートを用いたＥＬＩＳＡにより定量化した。
【００９９】
Ｔ細胞反応：
エクスビボ：
脾臓細胞を、サイトカインの分泌を抑制するためのブレフェルディンＡ／モネンシンの添加前に、ＨＢｓＡｇ（５ｍｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で１時間培養した。
【０１００】
６時間の更なる培養の後に、細胞を表面分子に対する抗体で染色し、固定及び透過処理し、ＩＬ−５、ＩＬ−２、ＩＦＮγに対する抗体で染色した。
【０１０１】
結果（示さず）：サイトカイン生成細胞は、いずれの試験群（マイトジェン刺激したコントロール脾臓細胞を除く）においても、バックグラウンド以上が検出されなかった。
【０１０２】
インビトロの再刺激後
脾臓細胞を、７２時間の分析の前に、抗原（５ｍｇ／ｍｌ及び２０ｍｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で培養した。
【０１０３】
ＩＬ−５及びＩＦＮγ生成脾臓細胞に対して、ＨＢｓＡｇの存在下又は非存在下での４８時間培養後にＥＬＩＳｐｏｔによる定量化を行った。
【０１０４】
サイトカイン分泌量を、ＨＢｓＡｇの存在下又は非存在下での７２時間培養後に、ＥＬＩＳＡにより培養上清で決定した。
【０１０５】
統計分析
Graph Pad Software (SanDiego, USA)を統計分析のために用いた。データを、コントロールと処理したマウスとを比較する場合では分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びダネット検定を用いて分析し、全ての群を互いに比較する場合ではＡＮＯＶＡ及びチューキー検定を用いて分析した。
【０１０６】
Ｂ．結果
抗ＨＢｓＡｇ ＩｇＧ１反応における本発明の皮膚への追加免疫の影響（図１）
提示した結果は、最初の皮膚パッチの適用によるＩｇＧ１の顕著な増幅を示す（図１のＤ４９とＤ２８との比較）。
【０１０７】
抗ＨＢｓＡｇ ＩｇＧ２ａ反応における本発明の皮膚への追加免疫の影響（図２）
提示した結果は、最初の皮膚パッチの適用によるＩｇＧ１の顕著な増幅を示す（図２のＤ４９とＤ２８との比較）。
【０１０８】
本発明の皮膚への追加免疫又はＨＢｓＡｇ／ＡｌＯＨを用いて２度の追加免疫が行われたマウスにおけるサイトカイン生成細胞（ＥＬＩＳｐｏｔ）（図３）
図３に提示された結果は、ＩＦＮγ生成細胞の数がViaskinで追加免疫した場合とアジュバントを用いた筋肉内注射で追加免疫した場合とで類似しており、一方、ＩＬ−５生成細胞がViaskinで追加免疫した場合の方がより少ないことを示している。従って、ＨＢｓＡｇ／ＡｌＯＨでＴｈ２誘導初回抗原刺激したにもかかわらず、Viaskinでの追加免疫は、（筋肉内注射による）ＨＢｓＡｇ／ＡｌＯＨの優先的なＴｈ２反応に対して、釣り合っているＴｈ１／Ｔｈ２反応を誘導した。
【０１０９】
本発明の皮膚への追加免疫又はＨＢｓＡｇ／ＡｌＯＨを用いて２度の追加免疫が行われたマウスにおけるサイトカイン生成細胞（ＥＬＩＳＡ）（図４）
７２時間の時点で、Viaskinで追加免疫されたマウスのＴ細胞の上清には、（筋肉内注射による）ＨＢｓＡｇ／ＡｌＯＨでの追加免疫の場合と比較して、ＩＦＮγが顕著に高い濃度で存在し、ＩＬ−５が顕著に低い濃度で存在している。
【０１１０】
本発明の皮膚への追加免疫又はＨＢｓＡｇ／ＡｌＯＨを用いて２度の追加免疫が行われたマウスにおけるＩＬ−５反応（ＥＬＩＳＡ−ＥＬＩＳｐｏｔの詳細）
７２時間の時点で、Viaskinで追加免疫されたマウスの方が無処置のマウスよりも高いＩＬ−５濃度を示した。
【０１１１】
７２時間の時点で、Viaskinで追加免疫されたマウスの方がＨＢｓＡｇ／ＡｌＯＨで追加免疫されたマウスよりも低いＩＬ−５濃度を示した。
【０１１２】
同一のパターンは、再刺激条件にかかわらず観察された（ＥＬＩＳｐｏｔによるインビトロのＥＬＩＳＡ定量）。
【０１１３】
本発明の皮膚への追加免疫又はＨＢｓＡｇ／ＡｌＯＨを用いて２度の追加免疫が行われたマウスにおけるＩＦＮγ反応（ＥＬＩＳＡ−ＥＬＩＳｐｏｔの詳細）
免疫化マウスからの脾臓細胞は、ＩＦＮγを自然に放出し、この放出は、Viaskinで追加免疫されたマウスにおいてより多くなる。
【０１１４】
この自然放出が差し引かれる場合：
無処置のマウスと比較して、ＨＢｓＡｇ／ＡｌＯＨで追加免疫されたマウスでは、ＩＦＮγが顕著に高い濃度では検出されない。
【０１１５】
無処置のマウスと比較して、Viaskinで追加免疫されたマウスでは、ＩＦＮγが顕著に高い濃度で検出される。
【０１１６】
Ｃ．結論
本発明の皮膚への追加免疫は、ＨＢｓＡｇ／ＡｌＯＨで従来の初回抗原刺激されたマウスにおいて、抗ＨＢｓＡｇＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ反応を顕著に増大した。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａレベルは、従来の追加免疫（アジュバントを用いた筋肉内注射）により得られたものと同等であった。皮膚への追加免疫は、ＩＦＮγを増大し、ＩＬ−５抗ＨＢｓＡｇ反応を低減した。
【０１１７】
これらの結果は、インビボにおける好結果の増幅と、従来のＨＢｓＡｇ／ＡｌＯＨでの初回抗原刺激により誘導されたＴｈ２型反応のＴｈ１分極化を証明する。
【０１１８】
実施例２：皮膚への前処理の免疫反応の型に対する影響
Ａ．材料及び方法
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、アジュバントとしてコレラ毒素と混合された落花生タンパク質抽出物（ＰＰＥ）で胃内に６週間（１週間に１回）感作した。
【０１１９】
その後、免疫療法を８週連続行った。１０匹の感作されたマウスは、無処置の皮膚に処理された。１０匹の感作されたマウスは、１０回のテープストリップにより前処理された皮膚に処理された。テープストリップは、接着剤を用いた１０回のストリップを含み、それは、無処置の角質層の実質的な変更を引き起こす。１０匹の感作されたマウスは処理しなかった。１０匹の無処置のマウスをコントロールとした。
【０１２０】
免疫療法の最後において、全てのマウスに対して１０日間継続的に経口での落花生飼育を行った。殺した後、組織学的分析により食道及ぶ空腸における損傷を評価した。Ｔｈ１、Ｔｈ２及びＴｒｅｇサイトカインのｍＲＮＡの発現をＴＲ−ｑＰＣＲにより測定した。
【０１２１】
血清学的反応（特にＩｇＥ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）の測定を、免疫療法の前及びその最後にＥＬＩＳＡにより行った。
【０１２２】
Ｂ．結果
無処置の皮膚への処理の後で、ｓＩｇＥが低減し、ｓＩｇＧ２ａが増大し、それぞれ０．０３６±０．０１ｖｓ０．２３１±０．０２μｇ／ｍｌ（ＥＰＩＴｖｓＳｈａｍ，ｐ＜０．０５）及び２．８６±０．７８ｖｓ１．０６±０．２８μｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０５）であった。対照的に、テープストリップされた皮膚における免疫療法の後、ｓＩｇＥは増大し、ｓＩｇＧ２ａは変化せず、それぞれ０．３８３±０．０８μｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０１ｖｓＳｈａｍ）及び１．２５２±０．２２μｇ／ｍｌであった（図７Ａ及び７Ｂを参照）。
【０１２３】
その結果は、食道粘膜における好酸球濃度が、無処置の皮膚に処理されたマウス、２．７±０．９ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５）、及びネイティブマウス、１．１±０．７ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２（ｐ＜０．０１）と比較して、Ｓｈａｍ及び皮膚にストリップ処理されたマウスの方が実質的に高く、１９．９±１．５ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２及び２６．７±８．７ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２であった（図８を参照）。さらに、エオタキシン、ＩＬ−５及びＩＬ−１３のｍＲＮＡ発現は、Ｓｈａｍ（２．５７、２．６０、２．５０、ｐ＜０．０５）及び皮膚にストリップ処理されたマウス（２．０２、１．９５、２．０１、ｐ＜０．０５）と比較して、無処置の皮膚に処理することにより顕著に低減した（それぞれ１．１４、１．３５、１．０２）（図９Ａ、Ｂ及びＣを参照）。
【０１２４】
興味深いことに、Ｔｈ２転写因子であるＧＡＴＡ−３のｍＲＮＡは、図１０Ａに示すように、Ｓｈａｍ群と比較して、無処置の皮膚に処理されたマウスにおいて顕著に低減した（ｐ＜０．０５）。また、Ｔｒｅｇ転写因子であるＦｏｘｐ３は、Ｓｈａｍ（Ｐ＞０．０５）及び皮膚にストリップ処理されたマウス（Ｐ＜０．００１）と比較して、無処置の皮膚に処理されたマウスにおいて顕著に増大した（図１０Ｂを参照）。
【０１２５】
最後に、図１１に示すように、十二指腸の絨毛／陰窩の比率は、無処置の皮膚に処理されたマウス（２．９±０．２）（Ｐ＜０．０５）及びネイティブマウス（３．３±０．１）（Ｐ＜０．００１及びＰ＜０.０５）と比較して、Ｓｈａｍ（２．１±０．２）及び皮膚にストリップ処理されたマウス（２．４±０．３）では、顕著に低かった。
【０１２６】
Ｃ．考察
得られた結果は、皮膚への免疫療法における、無処置の角質層の損傷度のレベルに依存して引き起こされる免疫学的反応のプロファイルを示す。
【０１２７】
無処置の皮膚において、ＩｇＥの低減及びＩｇＧ２ａの増大が誘導される。
【０１２８】
変質された角質層を有する処理された皮膚において、ＩｇＥの増大が誘導され、ＩｇＧ２ａは誘導されない。
【０１２９】
また、落花生のみの食事を与えた後、好酸球の高い浸潤が、ストリップ処理された皮膚に処理されたマウスにのみ観察された。
【０１３０】
結論
その結果は、十分な免疫反応が、密封性のデバイスを用いて適用されたアジュバントを使わない追加免疫を用いた皮膚に対する処置によって得られ得る、及び増幅され得る。その追加免疫は、抗原が無処置の皮膚に適用されるとき、ＴＨ１指向化を引き起こし、特に強い免疫反応を引き起こす。
【０１３１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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