(57)【要約】  本発明は、細胞が親和性を通常有さない又は低い親和性しか通常有さない支持体へのこれらの細胞の接着を促進するための方法であって、細胞に非筋ミオシンＩＩ阻害剤ブレビスタチンを供給して、さもなければ細胞が十分な親和性を有さない表面に細胞が付着できるようにすることによって、支持体への細胞の接着が促進される方法に関する。驚いたことに、細胞に阻害剤を供給すると、細胞が親和性を通常有さない又は低い親和性しか通常有さない表面、例えばＰＴＦＥ（テフロン（登録商標））にこれらの細胞が付着する能力が増大する。本発明は、非筋ミオシンＩＩ阻害剤ブレビスタチンの使用、及び表面に親和性を有さない又は低い親和性しか有さない細胞で被覆された少なくとも１つの前記表面を有する機器にさらに関係する。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体への細胞の接着を促進するための方法であって、細胞に非筋ミオシンＩＩ阻害剤ブレビスタチンを供給して、さもなければ細胞が十分な親和性を有さない表面に細胞が付着できるようにすることによって、支持体への細胞の接着が促進される方法。
【請求項２】
前記支持体が、非固着性材料である又は少なくとも部分的に非固着性材料で被覆されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非固着性材料が、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフルオロエチレン（ＰＦＥ）、ペルフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、二酸化チタン化合物若しくは二酸化チタンを含む組成物、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記支持体が、医療機器、好ましくはステント、パッチ又は人工血管若しくは器官の表面である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記支持体が、複数のマイクロキャリアである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、付着依存性細胞、特に成体幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、浮遊培養条件下で増殖される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、血清が低減された培地又は無血清培地に懸濁される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、ブレビスタチンの存在下で凍結及び／又は解凍され、次いで前記支持体に接触させられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞がさもなければ十分な親和性を有さない支持体への細胞の接着を促進するためのブレビスタチンの使用。
【請求項１１】
医療機器、好ましくはステント、パッチ又は人工血管若しくは器官の表面を、さもなければこの表面への親和性を有さない又は低い親和性しかを有さない細胞で被覆するためのブレビスタチンの使用。
【請求項１２】
この表面への親和性を通常有さない又は低い親和性しか通常有さない細胞で被覆された少なくとも１つの表面を有する機器。
【請求項１３】
前記表面が、非固着性材料、好ましくはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフルオロエチレン（ＰＦＥ）、ペルフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、二酸化チタン化合物若しくは二酸化チタンを含む組成物、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項１２に記載の機器。
【請求項１４】
前記細胞が、付着依存性細胞、特に成体幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞である、請求項１２又は１３に記載の機器。
【請求項１５】
医療機器、好ましくはステント、パッチ又は人工血管若しくは器官である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の機器。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の背景］
本発明は、細胞が親和性を通常有さない又は低い親和性しか通常有さない支持体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）へのこれらの細胞の接着を促進するための方法に関する。本発明は、非筋ミオシンＩＩ阻害剤ブレビスタチンの使用、及び表面に親和性を有さない又は低い親和性しか有さない細胞で被覆された少なくとも１つの前記表面を有する機器にさらに関係する。
【０００２】
［先行技術］
現在使用されている（成体幹細胞を含めた）治療上の細胞の多くは、固定（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）／付着に依存する様式で増殖させ、これは、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）などの潜在的な代替物にもあてはまる。しかしながら、かかる増殖は、規模及び経済性の厳しい制限を本質的に伴う。細胞培養増殖のために、細胞は、細胞が数時間のうちに付着する平面の表面上に典型的に播種され、増殖させ、タンパク質分解酵素及び／又はカルシウム除去を用いて採取される。付着は、均一なプロセスではなく、むしろ特定のゾーン、いわゆる限局的な接着ゾーンを通して起こる。いったん接着すると、細胞は、内部モータータンパク質を用いて張力を発揮する。したがって、細胞骨格は、組織化され、輸送、足場及び細胞生存を含めた種々のプロセスにおいて機能する。細胞の付着を外すと、これらは、モータータンパク質によって内部張力の増加に応じて急速に収縮し、すでに組織化された内部構造物（細胞骨格他）が妨害される。表面に再付着できない場合、かかる細胞は、付着依存性アポトーシス／アノイキスと呼ばれている細胞死プログラムを開始することになる。
【０００３】
米国特許出願公開第２０１０  ０００９  ４４２号は、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼのエフェクター分子であり、血管収縮及び神経軸索伸長を調節することが知られている、Ｒｈｏ関連コイルドキナーゼ（ｃｏｉｌｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）（ＲＯＣＫ）の阻害剤（Ｙ−２７６３２、Ｈ−１１５２又はファスジルなど）は、アポトーシス／アノイキスの阻害剤として使用することができ、したがって、多能性幹細胞、特に胚性幹細胞の生存及び／又は増殖速度を改善することができることを教示している。ＲＯＣＫ阻害剤の存在下において、幹細胞は、サブクローニング又は継代の前及び／又は後に、フィーダー細胞及び／又は血清なしで培養することができる。
【０００４】
細胞張力の発生を司る主要な細胞骨格モータータンパク質は、非筋ミオシンＩＩ（ミオシンＩＩと称される）である。Ｓｔｒａｉｇｈｔら（２００３）は、細胞質分裂を精査する試みにおいて、非筋ミオシンＩＩの特定の小分子阻害剤を同定した。この高活性の小分子は、細胞のブレブ形成を阻害し、ブレビスタチンと名付けられた。この化合物は、細胞浸透性、良性且つ、重要なことに、直ちに可逆的である。
【０００５】
Ｗａｌｋｅｒら（２０１０）は、ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）及び誘導多能性幹細胞を含めた、ヒト多能性幹細胞の生存を増強するためのブレビスタチンの使用を開示している。ブレビスタチンでの処理は、クローン密度及び浮遊条件下で、ヒト多能性幹細胞の生存率を増加させる。さらに、合成マトリックスとの併用で、ブレビスタチンは、幹細胞の自己再生のための規定された環境を支持する。
【０００６】
米国特許出願公開第２０１０／０２１６１８１号は、血清及びフィーダー細胞を含まない培地における、生存因子としてブレビスタチン又はＲＯＣＫ阻害剤を使用した、多能性幹細胞の培養を教示している。ここで、多数の細胞が、スピナーフラスコ又はバイオリアクターにおいて細胞を培養することによって産み出される。
【０００７】
付着依存性細胞は、細胞を浮遊条件下で培養しながら、細胞を成長させることができる表面積を増加させるマイクロキャリア（例えばビーズ）上でバイオリアクター中において大量に作製することができる。例えば、多能性及び胚性幹細胞を含めた、幹細胞の大規模な作製のための方法は、米国特許出願公開第２０１０／００９３０８３号から知られている。ここで、細胞は、複数のマイクロキャリアを含有する無血清培地において培養される。細胞は、マイクロキャリアに接着させられ、調節された条件下でバイオリアクターにおいて増殖される。培地を、幹細胞の増殖及び生存を促進する又は分化を防ぐ、追加の成分、例えば酵素ＧＳＫ３又はＭＥＫの阻害剤で補充することができる。増殖後、細胞を、酵素的又は非酵素的細胞解離試薬を使用してマイクロキャリアから分ける。しかしながら、細胞が十分な親和性を有するマイクロキャリアしか使用できないことは、この方法の難点である。
【０００８】
［発明の概要］
本発明の目的は、細胞が親和性を通常有さない又は低い親和性しか通常有さない支持体へのこれらの細胞の接着を促進するための方法を提供することである。
【０００９】
この目的は、細胞に非筋ミオシンＩＩ阻害剤ブレビスタチンを供給して、さもなければ細胞が十分な親和性を有さないであろう表面に細胞が付着できるようにすることによって、支持体への細胞の接着を促進する方法によって解決される。驚いたことに、細胞に阻害剤を供給すると、これらの細胞が、細胞が親和性を通常有さない又は低い親和性しか通常有さない表面に付着する能力が増大する。したがって、ブレビスタチンは、使用者が、浮遊培養のためのマイクロキャリア又はテフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）（登録商標）で被覆された表面などの特定の支持体への細胞の付着を促進できるようにする、一種のエンハンサーとして有利に使用することができる。したがって、ブレビスタチンは、細胞培養のための適した支持体の選択を広げるための有用なツールであり、マイクロキャリアへの細胞の付着に頼る細胞培養方法を最適化する、したがって著しく改善することができる。培養条件の改善及び最適化は、培養される細胞を接着させることができる支持体に関してはるかに多い選択肢があるので、容易になる。さらに、他の必要性のために最適化されているが、生細胞にとって通常適切な支持体ではない表面、例えば、いくつかの医療機器の表面にコロニーを形成することは、細胞にブレビスタチンを加えることによって達成することができる。したがって、阻害剤で細胞を処理すると、処理しなければこれらの細胞を培養するのに適さない表面に、これらの細胞が付着し且つ表面上で増殖する能力が得られる。本発明による方法によって、細胞を培養及び／又は増殖するのに適した支持体、例えばマイクロキャリア又は医療機器の選択の幅が、著しく広がる。
【００１０】
ブレビスタチンは、細胞培養に適用した場合、付着の不足によって誘発される細胞死を最小化し、単細胞培養を促進する小分子である。ＲＯＣＫ阻害剤と対照的に、ブレビスタチンは、非筋ミオシンＩＩの直接的な、非競合的阻害剤として働く。ブレビスタチンは、複合シグナルカスケードに干渉せず、むしろミオシン−ＡＤＰ−Ｐｉ複合体に結合することによって、非筋ミオシンＩＩ及びアクチンとのその相互作用を直接的に標的とする。重要なことに、ブレビスタチンは、ミオシンＩＩの容易に調整可能な可逆的（良性）阻害剤である。ブレビスタチンは、細胞がさもなければ十分な親和性を有さない表面に細胞、特に付着依存性細胞が付着する能力を増大させる。したがって、ブレビスタチンを、特定の支持体への細胞の付着の調節を可能にする接着トリガーとして使用することができる。さらに、ブレビスタチンは、さもなければ完全に付着に依存する細胞の浮遊生存を大いに増大させる。物質を、必要な場合に、培地に直ちに加えることができる。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、支持体は、非固着性材料（ｎｏｎ−ｓｔｉｃｋ  ｍａｔｅｒｉａｌ）である又は少なくとも部分的に非固着性材料で被覆されている。非固着性材料は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、商品名（ＤｕＰｏｎｔ）：テフロン（登録商標））、ポリフルオロエチレン（ＰＦＥ）、ペルフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、二酸化チタン化合物若しくは二酸化チタンを含む組成物、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。
【００１２】
好ましくは、支持体は、医療機器、好ましくはステント、パッチ又は人工血管若しくは器官の表面である。かかる機器は、例えば、血液細胞、タンパク質などの望まれない付着を避けるために、細胞培養に通常適さない材料でしばしば作られている又は被覆されているので、それらの機器に細胞でコロニーを形成することは通常困難である。しかしながら、かかる機器を移植片、代替組織、修復プローブなどとして使用できるように、機器を生細胞、好ましくは幹細胞で被覆することは時折望ましい。また、免疫系による移植片の拒絶反応は、移植片を自己細胞で被覆することによって効率的に抑制することができる。有利に、本発明に従って、これらの機器をいくつかの医療用途のために用意する及び改善するために、細胞にブレビスタチンを供給することによって、細胞が医療機器にコロニー形成することを可能にすることができる。
【００１３】
本発明の別の好ましい実施形態において、支持体は、複数のマイクロキャリアであり、前記支持体に付着した細胞を、浮遊条件下で培養することができる。本実施形態において、細胞を成長させることができる表面積が増加し、浮遊条件下、好ましくは適したバイオリアクターにおいて細胞を培養する間、マイクロキャリア、好ましくは適したビーズ上で細胞を大量に作製することができる。本発明に従って、そこから細胞が温度の変化によって、好ましくは温度を低下させることによって取り出される温度調節されたマイクロキャリアを含むがこれに限定されない、サイトデックス（Ｃｙｔｏｄｅｘ）（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＧＢ）、Ｈｉｌｌｅｘ（ＳｏｌｏＨｉｌｌ、ＵＳＡ）などの市販のマイクロキャリアを使用することができる。細胞増殖のために、増加している細胞数（ｃｅｌｌ  ｎｕｍｂｅｒ）に追加の付着面積を提供するために、現行の培養物に追加のマイクロキャリアを加えることができる。したがって、細胞培養物の増殖は、より多くのマイクロキャリアの単なる追加によって容易に達成される。ある種の用途に関して、異なったサイズのマイクロキャリアを使用することは有益であり得る。
【００１４】
本発明の別の好ましい実施形態において、細胞は、付着依存性細胞、特に成体幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞である。しかしながら、本発明による方法は、支持体への細胞型の親和性を、ブレビスタチンによって増大することができる全ての細胞型を含む。
【００１５】
ブレビスタチンは、浮遊培養において、細胞生存を増大し、細胞凝集を減少させるので、細胞を、好ましくは上記で概要を述べたようにマイクロキャリア上に固定化した、浮遊培養条件下で容易に増殖することができる。
【００１６】
いくつかの用途に関して、細胞が、血清が低減された又は無血清培地に懸濁されている場合に、有利なこともある。
【００１７】
本発明の特に好ましい実施形態において、細胞は、ブレビスタチンの存在下で凍結及び／又は解凍され、次いで前記支持体に接触させられる。有利に、ブレビスタチンは、この場合、細胞を安定化し、したがって、細胞を凍結及び／又は解凍する間、細胞への保護効果を有する。つまり、ブレビスタチンは、細胞の凍結保存回収を増加させ、ブレビスタチンを凍結前に加えることは、細胞を凍結保存するのに有益である。
【００１８】
したがって、本発明の重要な態様は、細胞がさもなければ十分な親和性を有さない支持体への細胞の接着を促進するためにブレビスタチンを使用することである。
【００１９】
本発明の別の重要な態様は、医療機器、好ましくはステント、パッチ又は人工血管若しくは器官の表面を、さもなければこの表面への親和性を有さない又は低い親和性しか有さない細胞で被覆するためにブレビスタチンを使用することである。
【００２０】
本発明のさらに重要な態様は、この表面への親和性を通常有さない又は低い親和性しか通常有さない細胞で被覆された少なくとも１つの表面を有する機器に関係する。表面は、非固着性材料、好ましくはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、商品名（ＤｕＰｏｎｔ）：テフロン（登録商標））、ポリフルオロエチレン（ＰＦＥ）、ペルフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、二酸化チタン化合物若しくは二酸化チタンを含む組成物、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。本発明の好ましい実施形態において、機器の表面は、付着依存性細胞、特に成体幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞で被覆されている。本発明の別の好ましい実施形態において、機器は、医療機器、好ましくはステント、パッチ又は人工血管若しくは器官である。
【００２１】
基本的に、本発明による概念は、細胞がさもなければ十分な親和性を有さない支持体への細胞の接着を促進し、浮遊培養中への細胞の転置の間、細胞死を防止／低減し、細胞生存を改善し、さもなければ適さない表面に細胞を再配置させ、最後に細胞、好ましくは付着依存性細胞の細胞増殖を増強するためのブレビスタチンの有益な使用に関する。培養におけるブレビスタチンの使用から利益を得る細胞型の範囲は、非常に広く、既知の治療上有用な細胞並びにヒト胚性幹細胞（ＨＥＳ）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）などの現在開発中の候補を含む。ＨＥＳ細胞は通常、集合体として成長し、増殖を可能にするためには頻繁な酵素的な分離を必要とする。しかしながら、このプロセスは、細胞死／喪失を欠点とし、ブレビスタチンの使用から実質的に利益を得ることができ、実際に、ブレビスタチンの使用は、ＨＥＳ細胞の完全な浮遊培養増殖へのステップであり得る。成体幹細胞及びｉＰＳ細胞の平面培養が、より頑強である一方で、継代の間、重要なことに、成体細胞の完全な浮遊培養増殖へのステップとして、ブレビスタチンの使用も有益である。多能性成体幹細胞の増殖が、特定の対象である一方で、この概念に関する細胞型は、幹細胞に限定されず、むしろ全ての付着依存性細胞型を含むべきである。
【００２２】
本明細書では、「非筋ミオシンＩＩの阻害剤」又は「ミオシンＩＩ阻害剤」は、ミオシンＩＩを直接的に標的とすることによって非筋ミオシンＩＩの機能を阻害する分子又は複数の分子である。したがって、本発明の概念は、非筋ミオシンＩＩに直接的に影響する阻害剤を含む。ブレビスタチン、又はその任意の類似体若しくは誘導体は、かかる阻害剤の一例である。しかしながら、本発明は、この例に限定されず、非筋ミオシンＩＩに及ぼす同様の効果を有する他の阻害剤を含むことができる。
【００２３】
本明細書では、「付着依存性細胞」は、液体に浮遊させた場合には一般には生存可能でなく、生き残り且つ成長するためには、固体の支持体に接着しなければならない細胞である。
【００２４】
本明細書では、「体性幹細胞」としても知られている、「成体幹細胞」は、自己再生の能力があり、多くの異なる細胞型、特に生じる組織又は器官の全ての細胞型の子孫を産み出すことができる多分化能の細胞である。「成体幹細胞」は、間葉系幹細胞、造血幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞及びそれらの変形を含むが、これらに限定されない。本明細書では、「成体幹細胞」は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を含まない。
【００２５】
本明細書では、「誘導多能性幹細胞」（ｉＰＳ細胞）は、特異的な転写因子の発現を誘導することによって再プログラムされた、非多能性体細胞由来の多能性の細胞である。多能性であるので、ｉＰＳ細胞は、胚性幹細胞と同様である。
【００２６】
本明細書では、「胚性幹細胞」は、３つ全ての胚葉（内胚葉、外胚葉及び中胚葉）及び生殖系列細胞に分化する能力がある多能性の細胞である。
【００２７】
本発明を、図を参照して、さらに例示的に詳細に記載する。
【００２８】
図１は、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）の細胞凝集（Ａ：顕微鏡写真）、細胞生存（Ｂ：棒グラフ）及びアポトーシス（Ｃ：棒グラフ）に及ぼすブレビスタチンの効果を示す図である。細胞凝集（Ａ）、細胞生存（Ｂ）及びアポトーシス（Ｃ）を、最大７日、異なるブレビスタチン濃度の存在又は非存在下でアッセイした。ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７５３２）を、正の対照として使用した。細胞を、接着性成長を支持しないディープウェルに加えた。異なる濃度のブレビスタチン及びＹ−２７６３２を、ＢＭ−ＭＳＣ（１０％ＦＢＳを含有する培地）に関して浮遊（ディープウェル、１３０ＲＰＭ）及び接着（６ウェル）培養において試験した。ブレビスタチンが、細胞集合を防止又は少なくとも大いに低減し、細胞生存を可能にし、間葉系幹細胞のディープウェル培養におけるアポトーシスを減少させることが明らかである。
Ａ：１０μΜブレビスタチンでの処理は、細胞クラスター形成を防止するのに対して、対照細胞（ＤＭＳＯ、ＰＢＳ）及び１０μΜ未満のブレビスタチンで処理された細胞は、単一の凝集体を形成した。
Ｂ：生細胞を、色素排除アッセイ（ヨウ化プロピジウム）を使用して、ＦＡＣＳによって定量化した。対照培養物（ＤＭＳＯ、ＰＢＳ）と対照的に、５μΜを超えるブレビスタチンで処理された細胞は、平面培養における細胞と同様のある程度の生存能力を示した（約９０％）。ブレビスタチンの生存増大効果は、１０μΜでピークに達し、ブレビスタチンのより高い及びより低い濃度の両方で減少する、濃度依存性と思われた。
Ｃ：アポトーシス細胞を、アネキシンＶアッセイ（ヨウ化プロピジウム）を使用して、ＦＡＣＳによって定量化した。対照培養物（ＤＭＳＯ、ＰＢＳ）と対照的に、１０μΜブレビスタチンで処理された細胞は、アポトーシスに対して保護された。
【００２９】
図２は、様々な阻害剤濃度で処理し、接着／静置条件（Ａ）又は浮遊／振とう条件（Ｂ）下で培養したＢＭ−ＭＳＣのアネキシンＶ染色及び後のＦＡＣＳ分析によって明らかになった、アポトーシスレベルを示す図である。ここで、ブレビスタチンは、浮遊培養における細胞死を排除し、Ｙ−２７６３２の抗アポトーシス効果に匹敵する又はＹ−２７６３２の抗アポトーシス効果よりも強い抗アポトーシス効果を示すことが明らかである。５μΜ未満のブレビスタチンは、限定された効果だけを有し、最も大きい効果は、１０μΜで達成される。
【００３０】
図３は、様々な阻害剤濃度で処理し、接着／静置条件（Ａ）又は懸濁／振とう条件（Ｂ）下で培養したＢＭ−ＭＳＣのヨウ化プロピジウム及び後のＦＡＣＳ分析によって明らかになった、細胞死率を示す図である。この分析は、ブレビスタチンが、特に１０〜５０μΜの濃度、１０μΜでの最適条件で、細胞死を著しく排除することを示す。
【００３１】
図４．１〜４．３は、プロピジウム濃度によって明らかになった、ディープウェルにおける浮遊／振とう条件下で培養した細胞周期プロファイル（Ｇ１／Ｇ０及びＧ２）を示す図である。ＢＭ−ＭＳＣ培養物に、ＢｒｄＵを連続的に組み込ませ、異なる時点（最大３日）で試料採取した。大部分の細胞は、Ｇ１／Ｇ０期にある（非常に高密度な培養物）が、存在するいくつかのＧ２細胞もある。＞４Ｎ細胞の非存在（多核細胞は検出されない）。結果として、浮遊培養における細胞周期に及ぼすブレビスタチンの有意な効果はない。
【００３２】
図５．１〜５．３は、様々な阻害剤濃度で処理された細胞のヨウ化プロピジウム及び後のＦＡＣＳ分析によって明らかになった、６ウェルにおける静置条件下で培養した細胞周期プロファイル（Ｇ１／Ｇ０及びＧ２）を示す図である。ＢＭ−ＭＳＣ培養物に、ＢｒｄＵを連続的に組み込ませ、異なる時点（最大３日）で試料採取した。大部分の細胞は、Ｇ１／Ｇ０期にある（非常に高密度な培養物）が、存在するＧ２細胞もある。＞４Ｎ細胞の非存在（多核細胞は検出されない）。接着Ｔフラスコ培養（Ｇ２／Ｍ）における連続的な処理中に、細胞周期のわずかな減速が観察された。
【００３３】
図６は、ブレビスタチン処理を有さない、Ｌｕｍｏｘ−ｂｉｏｆｏｉｌバッグの疎水性側上で培養したＢＭ−ＭＳＣ（対照）を示す図である。＜０．１％ＤＭＳＯでの処理４８ｈ後に観察されたコロニー及び付着した細胞を示す。細胞の著しい付着は、観察されなかった。
【００３４】
図７は、Ｌｕｍｏｘ−ｂｉｏｆｏｉｌバッグの疎水性側上で培養したＢＭ−ＭＳＣを示す図である。１０μΜブレビスタチンでの処理４８ｈ後に観察されたコロニー及び付着した細胞を示す。著しい数の細胞が、疎水性表面に付着している。したがって、図６（対照）と比較した場合、ブレビスタチンでの処理は、この表面へのＢＭ−ＭＳＣの増加した親和性をもたらす。
【００３５】
図８は、細胞を転置する間、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）に及ぼすブレビスタチン及びＹ−２７６３２の効果を反映する棒グラフである。サブコンフルエントなＢＭ−ＭＳＣを、４ｈの前処理（１０μΜブレビスタチン又は１０μΜ  Ｙ−２７６３２対対照）及び後のトリプシン／ＥＤＴＡでの３７℃で３分間のインキュベーションに供した。特定の被覆を有さない組織培養フラスコの表面からの細胞の転置後、細胞総数（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ）を決定した（Ａ）。対照条件（ブレビスタチンを有さない）におけるよりも、少ない細胞が、ミオシンＩＩ阻害下で転置される。転置された細胞は、薬物処理条件において凝集体を欠いている。したがって、ブレビスタチン及びＹ−２７６３２の両方が、細胞転置及び凝集に対する保護効果を示す、すなわち細胞は、支持体に安定に付着したままであり、容易に洗い落とすことができない。細胞を、再び播種し（同じ密度：５０００細胞／ｃｍ２で全ての条件）、薬物を含まない培地においてさらに７日間培養した。７日後、細胞総数（Ｂ）及び生存率（Ｃ）を、決定した。ＢＭ−ＭＥＣを、支持体から転置し、さらなる培養のために再び播種した場合、ブレビスタチンは、細胞に及ぼす著しい保護効果を有し、その結果、７日間の培養日後に増殖及び生存率が増大される。後の薬物を含まない継代（７日目）における、転置前のブレビスタチン処理による細胞増殖（収率及び生存能力）における増加及びＹ−２７６３２処理に関してより少ない増加も、観察された。
【００３６】
図９は、マイクロキャリアに付着した骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）のグルコース消費量（Ａ）、乳酸産生（ｌａｃｔａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）（Ｂ）及び細胞数（Ｃ）を示す棒グラフである。ＢＭ−ＭＳＣを、１０μΜブレビスタチンの存在又は非存在下での浮遊培養のために、マイクロキャリア上に播種し、６日間増殖させておいた。撹拌せずに２４時間のインキュベート後、培養物を、試料採取し、細胞総数、グルコース消費量及び細胞播種を決定した。撹拌しながらさらに５日間のインキュベート後、グルコース消費量（Ａ）、乳酸産生（Ｂ）、細胞総数（Ｃ）及びキャリア上での細胞播種（キャリア上での細胞のＤＡＰＩ染色、図１１）を再び決定した。２４時間後、細胞播種は、対照と比較して、ブレビスタチンの存在下で顕著に増加した。ブレビスタチンが、６日後、ＢＭ−ＭＳＣのグルコース消費量及び乳酸産生の両方に及ぼす効果を有さないように思われる一方で、細胞数は、阻害剤での処理後、著しく増加する。したがって、ブレビスタチンは、細胞に及ぼす保護効果を有し、その結果、マイクロキャリア上での６日間の成長後に増殖が増大される。
【００３７】
図１０は、６日間のインキュベート後の図９によるマイクロキャリアの顕微鏡写真である（キャリア上でのＢＭ−ＭＳＣのＤＡＰＩ染色）。ここで、ブレビスタチンの存在下（Ｂ）で、阻害剤の非存在下（Ａ、対照）よりもはるかに多い細胞が、マイクロキャリアに接着することが明白に示される。
【００３８】
図１１は、被覆された培養皿上で培養したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の顕微鏡写真である。細胞を、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）で被覆された培養皿上で、血清又は動物由来成分を含有しない規定Ｘ−ＶＩＶＯ培地において培養した。Ａ：阻害剤での処理なし（対照）、Ｂ：１０μΜブレビスタチンでの一過性の処理（左の顕微鏡写真：４倍の倍率、右の顕微鏡写真：１０倍の倍率）、Ｃ：ブレビスタチンの投与中止後１日の培養物。Ｘ−ＶＩＶＯにおけるｈＥＳＣの分割後の付着は、低かった（Ａ：５〜１５％）。培養物を分割した際（ＥＤＴＡ継代）、培地を、１０μΜのブレビスタチンで補充した。これは、Ｘ−ＶＩＶＯにおけるブレビスタチンを含まないｈＥＳＣ培養物の分割後付着と比較して、ｈＥＳＣの付着を劇的に増加させた（Ｂ：８０〜９５％）。実際、個別化したｈＥＳＣでさえも、非常によく付着した。培養物の培地を、２４ｈ後、ブレビスタチンを含まないＸ−ＶＩＶＯと交換し、どのように細胞が、ブレビスタチンなしで付着したままで増殖するのかを調べた。ここで、著しい変化は、観察されなかった（Ｃ）。
【００３９】
図１２は、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）に及ぼすブレビスタチン（Ｂｂ、（−）鏡像異性体）の効果を反映する棒グラフである。ＭＳＣを、リペレント性（ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ）のテフロン（登録商標）箔上で、１０μΜ  Ｂｂで、４日間培養し、箔に付着した細胞を、４日目に計数した。棒は、ウェル毎の細胞の数を表す。対照培養物：阻害剤を有さないＤＭＳＯ又はＰＢＳにおけるＢＭ−ＭＳＣ。対照と比較してのミオシン阻害下での細胞収率における有意な増加が、観察された。したがって、ＢＭ−ＭＳＣは、テフロン（登録商標）箔に付着し且つその上で増殖する。
【００４０】
図１３は、臍帯血由来の幹細胞（ＣＢ−ＵＳＳＣ）に及ぼすブレビスタチン（Ｂｂ、（−）鏡像異性体）の効果を反映する棒グラフである。ＵＳＳＣを、リペレント性のテフロン（登録商標）箔上で、１０μΜ  Ｂｂで、４日間培養し、箔に付着した細胞を、４日目に計数した。棒は、ウェル毎の細胞の数を表す。対照培養物：阻害剤を有さないＤＭＳＯ又はＰＢＳにおけるＣＢ−ＵＳＳＣ。対照と比較してのミオシン阻害下での細胞収率における高度に有意な増加が、観察された。したがって、ＣＢ−ＵＳＳＣは、テフロン（登録商標）箔に付着し且つその上で増殖する。
【００４１】
図１４は、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）に及ぼすブレビスタチン（Ｂｂ、（−）鏡像異性体）の効果を反映する棒グラフである。ＭＳＣを、リペレント性のテフロン（登録商標）箔上で、１０μΜ  Ｂｂで、コンフルエンシーに達するまで培養し、箔に付着した細胞を、細胞播種後６日目に計数した。棒は、ウェル毎の細胞の数を表す。対照培養物：阻害剤を有さないＤＭＳＯ又はＰＢＳにおけるＢＭ−ＭＳＣ。ＢＭ−ＭＳＣは、テフロン（登録商標）箔上に、完全にコンフルエントな層を形成しない。対照と比較してのミオシン阻害下での細胞収率における相違がなく、４日間の実験との明白な不一致は、より長い培養期間（６日間対４日間）及び／又は増加した最初の細胞数（２倍の付着細胞量は、その上に播種するためのＥＣＭの分泌においてより効率的であった）によって引き起こされた。
【００４２】
図１５は、臍帯血由来の幹細胞（ＣＢ−ＵＳＳＣ）に及ぼすブレビスタチン（Ｂｂ、（−）鏡像異性体）の効果を反映する棒グラフである。ＵＳＳＣを、リペレント性のテフロン（登録商標）箔上で、１０μΜ  Ｂｂで、コンフルエンシーに達するまで培養し、箔に付着した細胞を、細胞播種後６日目に計数した。棒は、ウェル毎の細胞の数を表す。対照培養物：阻害剤を有さないＤＭＳＯ又はＰＢＳにおけるＣＢ−ＵＳＳＣ。ＵＳＳＣは、ミオシン阻害下で、テフロン（登録商標）箔上に、コンフルエントな層を形成し、対照培養物と比較してのミオシン阻害下での細胞収率における有意な増加が、観察された。
【００４３】
図１６は、低血清ＥＧＭ２＋Ｄｅｘ−培地（３％血清）において培養した臍帯血由来の幹細胞（ＣＢ−ＵＳＳＣ）に及ぼすブレビスタチン（Ｂｂ、（−）鏡像異性体）の効果を反映する棒グラフである。ＵＳＳＣを、リペレント性のテフロン（登録商標）箔皿上で、１０μΜ  Ｂｂで、培養し、細胞播種後４日目に計数した。棒は、ウェル毎の細胞の数を表す。対照培養物：阻害剤を有さないＤＭＳＯ又はＰＢＳにおけるＣＢ−ＵＳＳＣ。ＵＳＳＣは、ミオシン阻害剤処理下での有意に増大された増殖を示す。血清が低減された（ＥＧＭ２）培地におけるテフロン（登録商標）箔上でのＵＳＳＣ付着及び増殖は、ミオシン阻害によって増大される。
【００４４】
図１７は、無血清ＭＳＣＧＭ−ＣＤ培地において培養した臍帯血由来の幹細胞（ＣＢ−ＵＳＳＣ）に及ぼすブレビスタチン（Ｂｂ、（−）鏡像異性体）の効果を反映する棒グラフである。ＵＳＳＣを、リペレント性のテフロン（登録商標）箔皿上で、１０μΜ  Ｂｂで、培養し、細胞播種後４日目に計数した。棒は、ウェル毎の細胞の数を表す。対照培養物：阻害剤を有さないＤＭＳＯ又はＰＢＳにおけるＣＢ−ＵＳＳＣ。ＵＳＳＣは、ミオシン阻害に関係なく、無血清培地におけるテフロン（登録商標）箔に付着するが、有意に増殖することに失敗する。対照と比較してのミオシン阻害下での細胞収率における明白な増加は、観察されなかった。
【００４５】
図１８は、ＰＴＦＥ容器（ＰＴＦＥ＝ポリテトラフルオロエチレン、商品名（ＤｕＰｏｎｔ）：テフロン（登録商標））上の、臍帯血由来の染色された幹細胞（ＣＢ−ＵＳＳＣ）の写真である。
Ａ）ＤＭＳＯ対照、
Ｂ）ＰＢＳ対照、
Ｃ）１０μΜ（−）ブレビスタチン。
ＵＳＳＣを、リペレント性のＰＴＦＥ容器材料上で、１０μΜ  Ｂｂで、３日間培養し、対照培養物と比較した。対照と比較して、ミオシン阻害下で著しく増大された細胞伸展が観察されたが、凝集体形成は観察されなかった。
【００４６】
図１９は、ミオシン阻害を有する又は有さない、凍結保存前及び後のヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ｈＥＳＴ）の生細胞密度（棒）及び回収率（三角形）を示す図である（ＢＢ＝ブレビスタチン）。
【００４７】
図２０は、凍結保存した細胞を解凍した後２及び４日のヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＴ）の平均総数を示す棒グラフである。通常は、細胞クラスターのみを凍結保存することができ、単一ＥＳ細胞は凍結保存できない。この図は、ミオシン阻害が、凍結保存後に単一細胞生存率を有意に増大することを示す。
【００４８】
要約すれば、図１９及び２０は、ブレビスタチンが、単一ｈＥＳＣの凍結保存回収を、ｈＥＳＣクラスターの回収の同等レベルまで増加させることを示す。さらに、凍結前にブレビスタチンを加えることは、単一ｈＥＳＣを凍結保存するのに有益である。
【００４９】
上記で示した実験データによれば、ブレビスタチンなどの非筋ミオシンＩＩの直接的な阻害剤は、細胞培養、特に、付着依存性細胞の培養に及ぼすいくつかの正の効果を有することが明らかになる。例えば、直接的なミオシンＩＩ阻害剤は、
浮遊培養における細胞生存を増大し、
浮遊培養における細胞凝集を減少させ、
さもなければ細胞培養に適さない支持体への付着及び支持体上での増殖を促進し、
特定の支持体への細胞の接着を調節するためのツールを提供し、
細胞転置の間、保護効果を有し、
細胞を凍結及び／又は解凍する間、細胞に及ぼす保護効果を有し、
細胞選別（例えばＦＡＣＳ）の間、保護効果を有し、
臍帯血及び骨髄ＭＮＣ−単離物（一次組織）からの最初の細胞付着を改善し、
ミオシン阻害は、テフロン（登録商標）箔上での、ＢＭ−ＭＳＣの中程度の増大された播種及びＣＢ−ＵＳＳＣの強い増大された付着をもたらし、
ミオシン阻害は、ＣＢ−ＵＳＳＣを有するテフロン（登録商標）上でのコンフルエントな成長につながり、
ＭＳＣ−ＧＭ（無血清培地）における無血清条件下での播種は、ミオシン阻害によって、正に影響され、且つ
ＥＧＭ２−ＭＶにおける血清が低減された条件下での播種及び増殖は、ミオシン阻害によって、正に影響される。
【００５０】
本発明の別の態様は、細胞の高収率作製及び低損傷剥離のための適した支持体を選択することを可能にする、支持体への細胞、特に付着依存性細胞の接着を調節するための方法を提供することである。特に、支持体への細胞の接着が、細胞に、非筋ミオシンＩＩを直接的に阻害する阻害剤分子を供給することによって調節される方法が、提供される。細胞に阻害剤を供給すると、供給しなければ細胞が十分な親和性を有さない表面にこれらの細胞が付着する能力が増大する。したがって、非筋ミオシンＩＩを直接的に阻害する阻害剤分子を、使用者が、浮遊培養のためのマイクロキャリアなどの特定の支持体への細胞の付着を調節することを可能にする、一種のトリガーとして有利に使用することができる。さらに、本発明による阻害剤は、細胞培養のための適した支持体の選択を広げるための有用なツールであり、マイクロキャリアへの細胞の付着に頼る細胞培養方法を最適化し、したがって著しく改善することができる。
【００５１】
好ましくは、支持体への細胞の接着は、細胞に阻害剤分子を供給することによって促進される。阻害剤で細胞を処理すると、処理しなければこれらの細胞を培養するのに適さない表面に細胞が付着し且つそのような表面で増殖する能力が得られる。つまり、本発明による方法において、細胞を培養及び／又は増殖するのに適した支持体、例えばマイクロキャリアの選択が、著しく広がる。したがって、培養条件の改善及び最適化は、培養される細胞を接着させることができる支持体に関してはるかに多い選択肢があるので、容易になる。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態によれば、支持体は、複数のマイクロキャリアであり、前記支持体に付着した細胞は、浮遊条件下で培養される。本実施形態において、細胞を成長させることができる表面積が増加し、浮遊条件下、好ましくは適したバイオリアクターにおいて細胞を培養する間、マイクロキャリア、好ましくは適したビーズ上で細胞を大量に作製することができる。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、細胞は、付着依存性細胞、特に成体幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞である。しかしながら、本発明による方法は、支持体への細胞型の親和性が、非筋ミオシンＩＩを直接的に阻害する阻害剤によって影響を及ぼされ得る全ての細胞型を含む。
【００５４】
本発明の１つの重要な態様は、上記の表面への細胞の接着を調節するためのブレビスタチンの使用である。
【００５５】
本発明の別の態様において、細胞を増殖するための方法であって、（ａ）細胞を懸濁するステップと、（ｂ）細胞が、複数のマイクロキャリアの表面に付着することを可能にするステップと、（ｃ）浮遊条件下で、マイクロキャリアに付着した細胞を培養するステップとを含む方法が提供される。本発明によれば、ステップ（ａ）において、細胞を懸濁する前及び／又は間、細胞は、非筋ミオシンＩＩを直接的に阻害する阻害剤分子で処理される。この方法において、細胞を成長させることができる表面積が著しく増加し、浮遊条件下、好ましくは適したバイオリアクターにおいて細胞を培養する間、マイクロキャリア、好ましくは適したビーズ上で細胞を大量に作製することができる。阻害剤は、マイクロキャリアへの細胞の接着を促進し、さもなければ細胞が親和性を有さない又は十分な親和性を有さない表面に、細胞、好ましくは付着依存性細胞が付着する能力を増大させる。
【００５６】
いくつかの態様において、細胞は、ステップ（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの前に、凍結及び解凍される。驚いたことに、本発明による方法の過程で、細胞を凍結及び解凍することは、増殖の間、細胞の接着及び生存の改善をもたらし、細胞の収率を、著しく増加させることができる。ここでまた、ミオシンＩＩ阻害剤は、細胞が凍結及び解凍される際、細胞に及ぼす保護効果を有する。
【００５７】
好ましい実施形態によれば、細胞は、付着依存性細胞、特に成体幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞である。しかしながら、本発明による方法は、非筋ミオシンＩＩを直接的に阻害する阻害剤の存在下で効率的に増殖することができる、全ての細胞型を含む。
【００５８】
本発明の別の重要な態様は、複数のマイクロキャリアに接着した細胞を増殖するためのブレビスタチンの使用であって、前記マイクロキャリアに付着した細胞が、浮遊条件下で培養される使用である。
【００５９】
本発明の別の態様において、組織から細胞を単離するための方法であって、（ａ）非筋ミオシンＩＩを直接的に阻害する阻害剤分子の存在下で、前記組織を解離するステップと、（ｂ）組織から解離した細胞から対象の細胞を単離するステップとを含む方法が提供される。驚いたことに、本発明による阻害剤は、一次単離物からの細胞の生存及び回収を著しく改善することが明らかになった。したがって、組織に埋め込まれた状態から浮遊状態への細胞の移行が改善されることは、本発明による方法の利点である。したがって、細胞を単離する間、阻害剤分子で細胞を処理することは、より高い収率をもたらし、時折、組織からの新規な細胞型の同定を可能にする。
【００６０】
対象の細胞を単離した後、これらの細胞を、さらなる使用のためにより多い数の細胞を作製するために、浮遊培養条件下で増殖することができる。好ましくは、対象の細胞は、非筋ミオシンＩＩを直接的に阻害する阻害剤分子の存在下で増殖する。
【００６１】
対象の細胞は、付着依存性細胞、特に成体幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞とすることができる。付着依存性細胞が単離された場合、前記阻害剤分子の非存在下で、付着依存性細胞培養条件下で付着依存性細胞を増殖することが適し得る。
【００６２】
阻害剤分子は、ブレビスタチンとすることができる。ブレビスタチンは、細胞培養に適用した場合、付着の不足によって誘発される細胞死を最小化し、単細胞培養を促進する小分子である。ＲＯＣＫ阻害剤と対照的に、ブレビスタチンは、非筋ミオシンＩＩの直接的な、非競合的阻害剤として働く。ブレビスタチンは、複合シグナルカスケードに干渉せず、むしろミオシン−ＡＤＰ−Ｐｉ複合体に結合することによって、非筋ミオシンＩＩ及びアクチンとのその相互作用を直接的に標的とする。重要なことに、ブレビスタチンは、ミオシンＩＩの容易に調整可能な可逆的（良性）阻害剤である。ブレビスタチンは、さもなければ付着にもっぱら依存する細胞の浮遊生存を大いに増大する。物質を、必要な場合に、培地に直ちに加えることができ、物質の効果は、物質を除去することによって直接的及び即時に完全に可逆的である。分子は、懸濁の最初の段階の間、細胞死を最小化することによって、浮遊培養に向かっての移行において、並びに抽出、すなわち組織に埋め込まれた状態又は適所から浮遊状態への移行の間、細胞死を最小化することによって、組織から新規な細胞を同定することにおいて、重大なツールである。
【００６３】
ブレビスタチンを、付着依存性細胞を単離するために有益に使用して、特に組織に埋め込まれた状態から浮遊状態への移行の間、付着依存性細胞の収率を増大することができることは、本発明の重要な態様である。
【００６４】
本発明の別の重要な態様は、付着依存性細胞、好ましくは成体幹細胞、特に間葉系幹細胞に及ぼす成長因子の効果を増大するためのブレビスタチンの使用である。
【００６５】
本発明のさらに重要な態様は、付着依存性細胞、好ましくは成体幹細胞、特に間葉系幹細胞の無血清培養の間、付着因子を置き換えるためのブレビスタチンの使用である。
【００６６】
非筋ミオシンＩＩを直接的に阻害する阻害剤分子、好ましくはブレビスタチンでの細胞の処理は、細胞の特徴に本質的に影響を及ぼし、処理された細胞は、処理されていない細胞の特性及び能力とは異なる新規な特性及び能力を示す。結果的に、ミオシンＩＩ阻害剤で処理された細胞は、少なくともある程度、異なる形態及び生化学的組成を有する新規な種類の細胞である。
【００６７】
したがって、本発明は、本発明の方法に従って増殖又は単離された細胞、好ましくは幹細胞、より好ましくは成体幹細胞、特に間葉系幹細胞も含む。つまり、本発明は、非筋ミオシンＩＩを直接的に阻害する阻害剤分子、好ましくはブレビスタチンの存在下で培養又は単離された全ての細胞に関する。
【００６８】
さらに、本発明による方法から独立して、本発明は、非筋ミオシンＩＩを直接的に阻害する阻害剤分子、好ましくはブレビスタチンで処理された又はこの阻害剤分子の存在下で培養された、任意の細胞、好ましくは幹細胞、より好ましくは成体幹細胞、特に間葉系幹細胞を含む。
【００６９】
本発明は、本発明による、少なくとも１つの細胞、好ましくは幹細胞、より好ましくは成体幹細胞、特に間葉系幹細胞を含む組成物をさらに含む。本発明の好ましい実施形態において、前記組成物は、細胞の生存能力を保証するのに適した細胞培地又は別の溶液を含むことができる。しかしながら、本発明は、かかる組成物に限定されない。例えば、本発明による組成物は、適した保護物質に懸濁された凍結した細胞を代わりに含むことができる。
【００７０】
本発明は、少なくとも１つの細胞、好ましくは幹細胞、より好ましくは成体幹細胞、特に間葉系幹細胞、及び非筋ミオシンＩＩを直接的に阻害する少なくとも１つの阻害剤分子、好ましくはブレビスタチンを含む組成物も含む。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態において、本発明による組成物の少なくとも１つは、本質的に血清を欠いている。例えば、組成物は、ブレビスタチンを含む無血清培地における間葉系幹細胞の懸濁液を含むことができる。
【００７２】
本発明による細胞及び／又は組成物は、非医学的な実験用のキット中に又は医薬製剤の一部として含まれることができる。
【００７３】
参考文献
Ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，２９９，１７４３−１７４７
Ｗａｌｋｅｒ，Ａ．，Ｓｕ，Ｈ．，Ｃｏｎｔｉ，Ｍ．Ａ．，Ａｄｅｌｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｓ．，Ｓａｔｏ，Ｎ．：Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１０，ＤＣＩ：１０．１０３８，ｎｃｏｍｍｓ１０７４
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）の細胞凝集（Ａ：顕微鏡写真）、細胞生存（Ｂ：棒グラフ）及びアポトーシス（Ｃ：棒グラフ）に及ぼすブレビスタチンの効果を示す図である。
【図２Ａ】様々な阻害剤濃度で処理し、接着／静置条件（Ａ）又は浮遊／振とう条件（Ｂ）下で培養したＢＭ−ＭＳＣのアネキシンＶ染色及び後のＦＡＣＳ分析によって明らかになった、アポトーシスレベルを示す図である。
【図２Ｂ】様々な阻害剤濃度で処理し、接着／静置条件（Ａ）又は浮遊／振とう条件（Ｂ）下で培養したＢＭ−ＭＳＣのアネキシンＶ染色及び後のＦＡＣＳ分析によって明らかになった、アポトーシスレベルを示す図である。
【図３Ａ】様々な阻害剤濃度で処理し、接着／静置条件（Ａ）又は浮遊／振とう条件（Ｂ）下で培養したＢＭ−ＭＳＣのヨウ化プロピジウム及び後のＦＡＣＳ分析によって明らかになった、細胞死率を示す図である。
【図３Ｂ】様々な阻害剤濃度で処理し、接着／静置条件（Ａ）又は浮遊／振とう条件（Ｂ）下で培養したＢＭ−ＭＳＣのヨウ化プロピジウム及び後のＦＡＣＳ分析によって明らかになった、細胞死率を示す図である。
【図４−１】プロピジウム濃度によって明らかになった、ディープウェルにおける浮遊／振とう条件下で培養した細胞周期プロファイル（Ｇ１／Ｇ０及びＧ２）を示す図である。
【図４−２】プロピジウム濃度によって明らかになった、ディープウェルにおける浮遊／振とう条件下で培養した細胞周期プロファイル（Ｇ１／Ｇ０及びＧ２）を示す図である。
【図４−３】プロピジウム濃度によって明らかになった、ディープウェルにおける浮遊／振とう条件下で培養した細胞周期プロファイル（Ｇ１／Ｇ０及びＧ２）を示す図である。
【図５−１】様々な阻害剤濃度で処理された細胞のヨウ化プロピジウム及び後のＦＡＣＳ分析によって明らかになった、６ウェルにおける静置条件下で培養した細胞周期プロファイル（Ｇ１／Ｇ０及びＧ２）を示す図である。
【図５−２】様々な阻害剤濃度で処理された細胞のヨウ化プロピジウム及び後のＦＡＣＳ分析によって明らかになった、６ウェルにおける静置条件下で培養した細胞周期プロファイル（Ｇ１／Ｇ０及びＧ２）を示す図である。
【図５−３】様々な阻害剤濃度で処理された細胞のヨウ化プロピジウム及び後のＦＡＣＳ分析によって明らかになった、６ウェルにおける静置条件下で培養した細胞周期プロファイル（Ｇ１／Ｇ０及びＧ２）を示す図である。
【図６】ブレビスタチン処理を有さない、Ｌｕｍｏｘ−ｂｉｏｆｏｉｌバッグの疎水性側上で培養したＢＭ−ＭＳＣ（対照）を示す図である。
【図７】Ｌｕｍｏｘ−ｂｉｏｆｏｉｌバッグの疎水性側上で培養したＢＭ−ＭＳＣを示す図である。
【図８Ａ】細胞を転置する間、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）に及ぼすブレビスタチン及びＹ−２７６３２の効果を反映する棒グラフである。
【図８Ｂ】細胞を転置する間、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）に及ぼすブレビスタチン及びＹ−２７６３２の効果を反映する棒グラフである。
【図８Ｃ】細胞を転置する間、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）に及ぼすブレビスタチン及びＹ−２７６３２の効果を反映する棒グラフである。
【図９Ａ】マイクロキャリアに付着した骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）のグルコース消費量（Ａ）、乳酸産生（ｌａｃｔａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）（Ｂ）及び細胞数（Ｃ）を示す棒グラフである。
【図９Ｂ】マイクロキャリアに付着した骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）のグルコース消費量（Ａ）、乳酸産生（ｌａｃｔａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）（Ｂ）及び細胞数（Ｃ）を示す棒グラフである。
【図９Ｃ】マイクロキャリアに付着した骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）のグルコース消費量（Ａ）、乳酸産生（ｌａｃｔａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）（Ｂ）及び細胞数（Ｃ）を示す棒グラフである。
【図１０】６日間のインキュベート後の図９によるマイクロキャリアの顕微鏡写真である（キャリア上でのＢＭ−ＭＳＣのＤＡＰＩ染色）。
【図１１Ａ】被覆された培養皿上で培養したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の顕微鏡写真である。
【図１１Ｂ】被覆された培養皿上で培養したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の顕微鏡写真である。
【図１１Ｃ】被覆された培養皿上で培養したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の顕微鏡写真である。
【図１２】骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）に及ぼすブレビスタチン（Ｂｂ、（−）鏡像異性体）の効果を反映する棒グラフである。
【図１３】臍帯血由来の幹細胞（ＣＢ−ＵＳＳＣ）に及ぼすブレビスタチン（Ｂｂ、（−）鏡像異性体）の効果を反映する棒グラフである。
【図１４】骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）に及ぼすブレビスタチン（Ｂｂ、（−）鏡像異性体）の効果を反映する棒グラフである。
【図１５】臍帯血由来の幹細胞（ＣＢ−ＵＳＳＣ）に及ぼすブレビスタチン（Ｂｂ、（−）鏡像異性体）の効果を反映する棒グラフである。
【図１６】低血清ＥＧＭ２＋Ｄｅｘ−培地（３％血清）において培養した臍帯血由来の幹細胞（ＣＢ−ＵＳＳＣ）に及ぼすブレビスタチン（Ｂｂ、（−）鏡像異性体）の効果を反映する棒グラフである。
【図１７】無血清ＭＳＣＧＭ−ＣＤ培地において培養した臍帯血由来の幹細胞（ＣＢ−ＵＳＳＣ）に及ぼすブレビスタチン（Ｂｂ、（−）鏡像異性体）の効果を反映する棒グラフである。
【図１８】ＰＴＦＥ容器（ＰＴＦＥ＝ポリテトラフルオロエチレン、商品名（ＤｕＰｏｎｔ）：テフロン（登録商標））上の、臍帯血由来の染色された幹細胞（ＣＢ−ＵＳＳＣ）の写真である。
【図１９】ミオシン阻害を有する又は有さない、凍結保存前及び後のヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ｈＥＳＴ）の生細胞密度（棒）及び回収率（三角形）を示す図である（ＢＢ＝ブレビスタチン）。
【図２０】凍結保存した細胞を解凍した後２及び４日のヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＴ）の平均総数を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ）】
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【図１０Ｂ）】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ）】
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【図１８Ｂ）】
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【図１８Ｃ）】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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