(57)【要約】【課題】神経変性疾患に特徴的な自己抗体を検出する方法、並びにそれに使用する基板、マイクロアレイ、およびキットを提供することを目的とする。【解決手段】  検体から免疫グロブリン含有生体サンプルを得ることと、試験を実施し、生体サンプルに神経変性疾患に特徴的な自己抗体が一つ以上存在するか否かを決定することとを含む、前記検体における神経変性疾患に特徴的な自己抗体を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）検体から免疫グロブリン含有生体サンプルを得ることと
（ｂ）試験を実施し、生体サンプルに神経変性疾患に特徴的な自己抗体が一つ以上存在するか否かを決定することと
を含む、前記検体における神経変性疾患に特徴的な自己抗体を検出する方法。
【請求項２】
（ａ）検体から免疫グロブリン含有生体サンプルを得ることと
（ｂ）試験を実施し、前記生体サンプル中に神経変性疾患に特徴的な自己抗体が一つ以上存在するか否かを決定することと
（ｃ）前記疾患に特徴的な自己抗体が一つ以上存在する場合に神経変性疾患の診断をすることと
を含む、前記検体の神経変性疾患を診断する方法。
【請求項３】
（ａ）検体から免疫グロブリン含有生体サンプルを得ることと
（ｂ）試験を実施し、前記生体サンプル中に神経変性疾患に特徴的な自己抗体が一つ以上存在するか否かを決定することと
（ｃ）前記疾患に特徴的な自己抗体が一つ以上存在する場合に前記神経変性疾患の危険性がある検体であると診断をすることと
を含む、神経変性疾患を進行させる危険性がある検体を特定する方法。
【請求項４】
（ａ）検体から免疫グロブリン含有生体サンプルを得ることと
（ｂ）試験を実施し、前記生体サンプル中に神経変性疾患に特徴的な自己抗体が一つ以上存在するか否かを決定することと
（ｃ）前記サンプル内に存在する神経変性疾患に特徴的な自己抗体の検体特有の神経変性疾患に特徴的な自己抗体プロファイルを生成することと
を含む、神経変性疾患を進行させる危険性がある検体を特定する方法。
【請求項５】
前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性末梢神経症、視神経炎、血管性認知症、強迫性障害、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染に関連した小児自己免疫性神経精神疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、橋本脳症、視神経脊髄炎、腫瘍随伴症候群、辺縁系脳炎、ラスマン脳炎、橋本脳炎、嗜眠性脳炎、全身硬直症候群、連鎖球菌感染後運動障害、リウマチ熱、グルテン性腸炎、ＡＳＤ、失読症、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症／熱帯性痙性不全対まひ、重症筋無力症、Ｌａｍｂｅｒｔ―Ｅａｔｏｎ症候群、先天性多発性関節拘縮症からなる群から選ばれる、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項６】
前記検体はヒトである、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項７】
前記生体サンプルは、全血、血清、脳脊髄液、唾液、または痰からなる群から選ばれる、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項８】
前記試験は、前記自己抗原と前記自己抗体が免疫複合体を形成できる条件下で、疾患に特有の自己抗体に特有の一つ以上の自己抗原と接触させることと、免疫複合体が存在するか否かを調べること（免疫複合体の存在は神経変性疾患に特有の自己抗体の存在を示しており、免疫複合体の不存在は神経変性疾患に特有の自己抗体の不存在を示している）により実施する、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項９】
一つ以上の前記自己抗原は基板に付着している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
一つ以上の前記抗原はアレイの形である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記アレイはマイクロアレイである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基板は、ニトロセルロースでコートされたガラススライドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
神経変性疾患に特徴的な自己抗体が固定化された一つ以上の自己抗原が固定化された基板。
【請求項１４】
神経変性疾患の診断に特有の複数の個々にアドレス可能な自己抗原をその上に固定化した、請求項１３に記載の基板。
【請求項１５】
それぞれのパネルは特定の神経変性疾患に特徴的な自己抗原を含む、自己抗原の複数のパネルを有する、請求項１３に記載の基板。
【請求項１６】
前記基板がスライドまたはベッドである、請求項１３に記載の基板。
【請求項１７】
神経変性疾患に特有の自己抗体に特異的な一つ以上の自己抗原が固定化された基板を有するマイクロアレイ。
【請求項１８】
それぞれのパネルは、特定の神経変性疾患に特徴的な自己抗原を含む、自己抗原の複数のパネルを有する、請求項１７に記載のマイクロアレイ。
【請求項１９】
神経変性疾患に特徴的な自己抗体に特異的な一つ以上の自己抗原、および前記自己抗原が免疫グロブリン含有生体サンプル中の自己抗体へ結合していることを決定する手段を有するキット。
【請求項２０】
一つ以上の自己抗原が基板に固定化された、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患に特徴的な自己抗体を検出する方法およびそれに用いるマイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
自己抗体は自分自身のタンパク質抗原に対する、自己の免疫系によって作られる抗体である。抗体は通常体内の異種タンパク質または物質、典型的には病原体、これは感染性微生物である、に応答して生成される。通常、前記免疫系は体自身の細胞を認識し無視することができ、食物のような、環境中にある脅威とならない物質に対しては過剰に反応しない。
【０００３】
しかし、時に、前記免疫系は一つ以上の、体の通常の構成物を「自己」として認識しなくなることがある。これらの自己抗体は体自体の細胞、組織、および／または器官を攻撃し、炎症や損傷を引き起こす。
【０００４】
血清自己抗体は広くさまざまな神経性の疾患および症候群に関係があるとされてきた。神経結合性の自己抗体は、神経脅迫症、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染（“ＰＡＮＤＡＳ”）を伴う小児自己免疫性神経精神疾患、および橋本脳症を示す個体からの血清中で検出されてきた。統合失調症もまた神経表面の受容体に対するいくつかを含む自己抗体の発現に関係しているとされてきた。抗核抗体によって引き起こされることが知られている全身性エリテマトーデス（“ＳＬＥ”）は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩受容体（“ＮＭＤＡＲ”）と交差反応する抗ＤＮＡ抗体の小集団の存在と矛盾することなく認知および記憶障害の部分を有している様である。また、自閉症の子供の母親の脳反応性抗体は、妊娠中の哺乳類に投与されると子孫の行動異常を引き起こす。
【０００５】
さらに、神経変性疾患の間では、パーキンソン病、自閉症スペクトラム障害、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性末梢神経障害、視神経炎、血管性認知症、およびアルツハイマー病（“ＡＤ”）において自己抗体が見られる。ＡＤの場合では、ニューロン結合抗体を含めて、非脳および脳関連の標的に対する高い自己抗体力価を有する患者に関する多くの報告がある。さらに、アルドラーゼ、重ニューロフィラメントサブユニット、ヒストン、チューブリン、グリア細胞繊維性酸性タンパク質、およびＳ−１００を含む、いくつかの特定の自己抗体標的が特定されてきた。
【０００６】
アルツハイマー病（“ＡＤ”）は、劇的な記憶力と認知力の低下により明らかであるようにと進行性かつ壊滅的な神経変性疾患であり、ニューロンとシナプスの損失と関係している（Ｓｅｌｋｏｅ （２００２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８, ７８９−９１）。さらに重要な病理学的特徴として、神経原線維のもつれ、グリアの活性化および広範な炎症の発現だけでなく、ニューロン内、アミロイド斑、および脳血管壁へのアミロイドベータ（Ａβ）、特に４２−アミノ酸ペプチド（Ａβ４２）の堆積を含む（Ｓｃｈｗａｂ ｅｔ ａｌ. （２００８） Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ １３，３５９−６９； Ｔｈａｌ ｅｔ ａｌ. （２００８） Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １１５，５９９−６０９； Ｗｅｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ. （２００６） Ｖｉｔａｍ Ｈｏｒｍ７４，５０５‐３０）。ニューロン内へのＡb４２の堆積は病気の過程における初期に始まり、アミロイド斑とのもつれの形成が進み、ヒトＡＤと遺伝子組み換えマウスの脳におけるシナプスの損失と時間的・空間的に一致する（Ｄ’ Ａｎｄｒｅａ ｅｔ ａｌ. （２００１） Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３８，１２０−１３４； Ｎａｇｅｌｅ ｅｔ ａｌ. （２００２） Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １１０，１９９−２１１； Ｇｏｕｒａｓ ｅｔ ａｌ. （２０００）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏ. １５６，１５−２０）。このことからＡβ堆積物の緩やかな成長が広範囲に及ぶ樹枝状物を支える能力を徐々に損なわせ、それによって最終的に明確な病状を通じて明らかとなる初期のシナプス損失に寄与するのかもしれないという提案につながった。
【０００７】
研究により、非認知障害を有する年齢をマッチングした対象の対応する脳の領域でごくまれに観察されるにすぎなかった、死亡後のAD脳の組織切片に免疫グロブリン（Ｉｇ）−免疫陽性ニューロンがあるとの報告がなされた（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ. （２００２） Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ６１，１１００‐８； Ｂｏｕｒａｓ ｅｔ ａｌ. （２００５） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂrain Res Rev ４８，４７７−８７； Ｄ’ Ａｎｄｒｅａ （２００３） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｒｅv ９８２，１９−３０）。ＡＤ患者の血清中に特定の脳反応性自己抗体が存在することもまた報告されている（Ｂｏｕｒａｓ ｅｔ ａｌ. （２００５） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｒｅｖ ４８，４７７−８７； Ｋｕｌｍａｌａ ｅｔ ａｌ. （１９８７） Ｅｘｐ Ａｇｉｎｇ Ｒｅｓ １３，６７−７２； Ｍｅｃｏｃｃｉ ｅｔ ａｌ. （１９９３） Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ３４，３８ ０‐５； Ｍｅｃｏｃｃｉ ｅｔ ａｌ. （１９９５） Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ５７, １６５−７０； Ｗｅｋｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ. （２００２） Ｅｘｐ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ ３７, ９７１−９７９）。
【０００８】
自閉症スペクトラム障害(“ＡＳＤｓ”)は、自閉症、アスペルガー症候群、レット障害、および小児期崩壊性障害を含む一群の脳の発達障害である。ＡＤＳは通常最初の３６ヶ月間に発現される社会的な振る舞いやコミュニケーションによって特徴付けられる（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ： Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＡＮＤ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２０００））。自閉症患者のかなりの部分（２０〜３０％）は、自閉症退行の期間を経る、この間彼らは言語および行動技能において以前に獲得した事柄を失うことを経験する（Ｆｏｍｂｏｎｎｅ （２００３）ＪＡＭＡ ２８９，８７−８９）。どういうわけか、ＡＳＤの有病率は近年劇的に高まり、所見によると診断方法が向上したためではなく、むしろ環境的な偶然の要素を示唆するものとされる。ＡＳＤは現在子供１５０人に一人の割合で発症しており、その病因はほとんど知られていないがおそらく多数の要因からなっている（Ｆｏｍｂｏｎｎｅ，２００３）。
【０００９】
自閉症患者の神経病理学および神経画像検査の研究によって脳の大きさと重量が増大していることが報告されている（Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ. （１９９８） Ｐｓｙｃｈｏｌ Ｍｅｄ ２５，６３−７７； Ｋｅｍｐｅｒ ａｎｄ Ｂａｕｍａｎ （１９９８） Ｎｅｕｒｏｌ Ｃｌｉｎｉｃ １， １７５−８７； Ｐａｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ. （２００４） Ｂｒａｉｎ １２７，２５７２−２５８３） 。自閉症脳に関する多くの研究によって、特に海馬、鉤状回、扁桃体において、ニューロンサイズの全体的な低下およびニューロン充填密度の増加が報告されている（Ｋｅｍｐｅｒ ａｎｄ Ｂａｕｍａｎ，１９９３）。
【００１０】
ＡＳＤは特定の脳異常に関係しているとされてきた。神経学的観測および神経画像検査の研究から、小脳、小脳皮質、扁桃体、海馬、大脳基底核、および脳幹を含む、多くの脳領域が自閉症によって影響を受け得るとの証拠が提供されている（Ａｋｓｈｏｏｍｏｆｆ ｅｔ ａｌ., ２００２； Ａｃｏｓｔａ ａｎｄ Ｐｅａｒｌ （２００４） Ｓｅｍｉｎ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ １１, ２０５−２１３）。プルキンエ細胞および顆粒細胞に特徴が表れ、小脳異常もまたＡＳＤにおいて一般的である（Ｃｏｕｒｃｈｅｓｎｅ ｅｔ ａｌ.， ２００１）。
【００１１】
自己免疫および自己抗体がＡＳＤの病因に関係している（Ａｓｈｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ. （２００６） Ｊ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ８０，１‐１１； Ｗｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ. （２００７） Ａｎｎ Ｎ. Ｙ. Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１０７，７９ −９１； Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ. （２００７） Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ Ｉｍｍｕｎ ２１，３５１−３５７）。ニューロンへの自己抗体の結合は神経発達の正常なパターンを危険域まで妨害しうる。脳への反応性が高い自己抗体は自閉症の子供において報告されており、脳特異的自己抗体、リンパ球機能障害、異常サイトカイン調節、およびウイルス関連を含むいくつかの自己免疫要因が示唆されてきた（Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ｒｉｖａｓ （２００４） Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ３５５，５３−５６）。例えば、Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ｒｉｖａｓ（２００４）は自閉症の子供の血清に脳特異的自己抗体が含まれることを示している。４歳から１２歳までの６８人の自閉症患者を使った研究において、尾状核、大脳皮質、および小脳に対する自己抗体はそれぞれ自閉症の子供の４９％、１８％、９％に検出されたが、正常な子供には検出されなかった。別の研究では、トゥレット・シンドロームの子供が対線条体自己抗体を有しており、これらの抗体をラットの線条体に注入するとトゥレット・シンドロームに似た神経機能障害を引き起こすことを示している（Ｈａｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ. （２０００） Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ１１１，１９５−２０２）。セロトニン受容体、ミエリン塩基性タンパク質、軸索フィラメントタンパク質、小脳神経フィラメント、神経成長要因、脳内皮タンパク質、および他の未確認の脳タンパク質に対する抗体を含む、他の対脳自己抗体もまた自閉症患者において見つかっている。
【００１２】
対ニューロン自己抗体の存在と神経学的病気との間の強いつながりが、強迫性障害（ＯＣＤ）、トゥレット・シンドローム、ＰＡＮＤＡＳ、前がん状態といった連鎖球菌感染の場合の子供おいて、また認知障害と健忘の両方を示すＳＬＥの老年患者おいて示されている。（Ｓｗｅｄｏ ｅｔ ａｌ. （１９８９） Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １５４，１１０‐２； Ｋａlume et al. （２００４） Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ７７，８２−８９； Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ. （２００４） Ｊ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉ ２１７，２５−３０）。ＤｅＧｅｏｒｇｉｏ ｅｔ ｌ. ａ （２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ １１，１１８９−１１９３とＫｏｗａｌ ｅｔ ａｌ. （２００４） ｌｍｍｕｎｉｔｙ ２１，１７９−１８８は、ＳＬＥ患者の対ＤＮＡ抗体の小集団が、分子模擬によってグルタミン酸受容体（ＮＲ２ａおよびＮＲ２ｂ）のＮＭＤＡ（Ｎ−メチルーＤ−アスパレート）亜類型と交差反応し、外的および内的両面で神経損傷および死を誘導することを報告している。
【発明の概要】
【００１３】
一実施形態において、本発明は、検体から生体サンプルを得ることと、試験を実施し前記生体サンプルに神経変性疾患に特徴的な自己抗体が一つ以上存在するか否かを決定することと、を含む前記検体における神経変性疾患に特徴的な自己抗体を検出する方法を提供する。
【００１４】
他の実施形態において、本発明は、検体から生体サンプルを得ることと、試験を実施し前記生体サンプルに神経変性疾患に特徴的な自己抗体が一つ以上存在するか否かを決定することと、一つ以上の前記疾患に特徴的な自己抗体が存在する場合に前記神経変性疾患を診断することと、を含む前記検体の前記神経変性疾患を診断する方法を提供する。
【００１５】
他の実施形態において、本発明は、検体から生体サンプルを得ることと、試験を実施し前記生体サンプル中に神経変性疾患に特徴的な自己抗体が一つ以上存在するか否かを決定することと、前記神経疾患に特徴的な自己抗体が存在する場合には前記検体が前記神経変性疾患を進行させる危険性がある検体であると診断することと、を含む前記検体が神経変性疾患を進行させる危険性があると判定する方法を提供する。
【００１６】
他の実施形態において、本発明は、検体から生体サンプルを得ることと、試験を実施し前記生体サンプル中に神経変性疾患に特徴的な自己抗体が一つ以上存在するか否かを決定することと、前記サンプル中に存在する前記疾患に特徴的な自己抗体の検体特有の神経変性疾患に特有の自己抗体プロファイルを生成することと、を含む検体特有の神経変性疾患に特徴的な自己抗体プロファイルの生成方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の実施形態は、一つ以上の神経変性疾患に特徴的な一つ以上の自己抗原が固定される基板を提供する。
【００１８】
本発明の他の実施形態は、一つ以上の神経変性疾患に特徴的な自己抗体に特異的な一つ以上の自己抗原が固定された基板を含むマイクロアレイを提供する。
【００１９】
本発明の他の実施形態では、神経変性疾患に特徴的な自己抗体を検出するためのキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は実施例８で説明される診断ロジックをグラフで表したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明においては、自己反応性抗体としても知られる自己抗体が、年齢または病気の有無にかかわらずヒトの血清中に豊富かつ普遍的に存在していることが見出されている。いくつかは脳反応性であり、他は体全体の他の臓器中の標的に対して反応性を有する。いくつかの自己抗体は過去の病気および免疫系の活動の名残であるかもしれないが、本発明によると多くの自己抗体もまた現存のまたは進行中の疾患の結果として血液および脳脊髄液に存在することが発見されている。現存する疾患の早期検知および診断に有用なのはこの後ろ側のグループである。
【００２２】
長期および短期の疾患を含む、活性な神経変性疾患の存在は、進行中の病状（細胞タイプと臓器の両方に特有である）に関係する細胞損傷の結果としての細胞生成物の生産と放出の原因となる。これらは細胞生成物（そのほとんどはタンパク質）を放出し、その壊れた断片と病気に関係した翻訳後修飾が血液およびリンパの流れに入り、抗原として働き、免疫応答を引き起こす。この免疫応答によって血液中に比較的多くの自己反応性自己抗体が生成され現れることになる。体中の細胞は大量のタンパク質を共有しているが、自己抗体のうち比較的小さな小集団しか特定の疾患に関係した臓器に含まれる前記細胞、組織、および臓器に特異的に反応しない。本発明については、この応答によってそれぞれの疾患および関与する特定の細胞タイプに特徴的な疾患に特徴的な自己抗体プロファイルにつながることが発見された。加えて、併発症を有する個人においては、自己抗体の特定のパターンがこれらの併発、進行中疾患過程それぞれを反映していることが発見されている。
【００２３】
さらに、ニューロンおよびその補助的なグリア細胞を含む、脳特異的な標的に結合できる自己抗体は血液中では一般的であることが発見されており、実際それらは普遍的である。これら自己抗体の脳内におけるニューロンおよび／またはグリア細胞との結合は、これらの細胞とこれらが関与する機能にとって有害である。それは通常の細胞の機能を妨害するだけでなく、最終的にはニューロンとグリア細胞の死および脳からの永久的な欠失につながる。
【００２４】
脳組織の内部において一度のみ、自己抗体は適切な標的抗原をその表面に有しかつ露呈させている脳内のどの細胞にも選択的に結合できる。もし前記自己抗体標的が細胞表面に特に豊富であるなら、自己抗体の多くの分子の結合はこのタンパク質と交差結合し、これを固定する。もし前記標的が重要な受容体であるなら、前記標的および前記細胞は無能化され得、より広範な脳機能障害につながる。前記標的細胞がニューロンである場合、自己抗体の結合は、最終的に挙動、認知、記憶、および運動障害として顕著になりうる神経機能障害につながるかもしれない。前記標的がニューロンを補助するグリアル細胞である場合、この補助を失うと間接的にニューロンの機能を損なうことになるかもしれない。ゆえに、ヒトの血清中の特異的な脳反応性自己抗体は特異的脳細胞変性疾患のためにニューロンを危険な状態に追いやる可能性がある。ここにおいて本発明はヒトの生体サンプル中のこれら自己抗体の検出方法を提供する。
【００２５】
ゆえに一実施形態において、本発明は、検体からの免疫グロブリンを含む生体サンプルを得ることと、生体サンプル中の一つ以上の神経変性疾患に特徴的な自己抗体が存在するか否かを決定するために分析を行うことと、一つ以上の前記疾患に特徴的な自己抗体が存在する場合、前記検体が前記神経変性疾患の進行のために危険な状態にあることを特定することと、を含む前記検体の体内の神経変性疾患に特徴的な自己抗体を検出するための方法を提供する。
【００２６】
好ましい実施形態においては、前記神経変性疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性末梢神経症、視神経炎、血管性認知症、強迫性障害、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染に関連した小児自己免疫性神経精神疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、橋本脳症、視神経脊髄炎、腫瘍随伴症候群、辺縁系脳炎、ラスマン脳炎、橋本脳炎、嗜眠性脳炎、全身硬直症候群、連鎖球菌感染後運動障害、リウマチ熱、グルテン性腸炎、ＡＳＤ、失読症、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症／熱帯性痙性不全対まひ、重症筋無力症、Ｌａｍｂｅｒｔ―Ｅａｔｏｎ症候群、先天性多発性関節拘縮症からなる群から選ばれる。
【００２７】
本発明の好ましい一実施形態において、検体はヒトである。
【００２８】
本発明の好ましい一実施形態において、免疫グロブリン含有生物サンプルは血清、全血、ＣＳＦ、唾液、または痰である。血液サンプルは、静脈穿刺、または指先穿刺を含む当技術分野で周知の方法によって得られてもよい。ＣＳＦは腰椎穿刺を含む当技術分野で周知の方法によって得られてもよい。血液から血清を得るために、血液サンプルを入手し、すべての細胞と血小板を沈殿させるのに十分なスピードで遠心させ、これにより得られた上澄みから分析に用いる血清を取り出す。痰および唾液サンプルは当技術分野の周知の方法によって採取してもよい。前記生体サンプルは適切な緩衝剤によって希釈してもよい。
【００２９】
好ましい一実施形態において、前記生体サンプルに一つ以上の神経変性疾患に特徴的な自己抗体が存在するかどうかを決定するために使用される分析は、前記生体サンプルを前記自己抗原および前記自己抗体の免疫複合体が形成可能な条件下において、神経変性疾患に特徴的な自己抗体に特異的な一つ以上の自己抗原を有する生体サンプルに付着させることによって実施する。
【００３０】
神経変性疾患に特徴的な自己抗体に特異的な自己抗体は、年齢をマッチングし、無疾患対照検体からの免疫グロブリン含有サンプルに存在する自己抗体を有する神経変性疾患を有する検体から得られた免疫グロブリン含有サンプルに存在する自己抗体を比較することによって特定できるかもしれない。前記疾患を有する前記検体からのサンプルには存在するが前記対照検体からのサンプルには存在しない前記標的抗原は、前記疾患に特徴的な自己抗体の識別標識を提供する。前記サンプルは好ましくは血清である。
【００３１】
例えば、単一の試験スライドに滴下された何千もの実寸大またはほとんど実寸大のヒトタンパク質を含むタンパク質マイクロアレイは、マイクロアレイ上の抗原標的に反応性を有する患者のサンプル中の自己抗体を特定するために用いられてもよい。対照サンプルの自己抗体も同様にして特定してよい。前記患者の自己抗体のプロファイルは、前記対照自己抗体のプロファイルと比較することにより、前記疾患に特徴的な自己抗体および対応する自己抗原を決定し得る。
【００３２】
神経変性疾患に特徴的な自己抗体および自己抗原を特定するために有用なタンパク質マイクロアレイは、当技術分野において周知の方法により作られても、購入してもよい。市販のタンパク質マイクロアレイは、例として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｖ5.0を含むが、これはｔｈｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ２５ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎと同時に使用されることが好ましい。
【００３３】
このようなタンパク質マイクロアレイを調査しスキャンするため、および結果として得られるデータの診断上の重要性を決定するための方法は、例えば、Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ ｅｔ ａｌ. （２００２） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９，６ ５６７−６５７により、当技術分野の通常の知識を有するものに知られており開示されている。一度、前記神経変性疾患に特徴的な前記自己抗体が前記の方法により特定されれば、前記の特定および診断方法において対応する抗原が特定され使用のために選択される。
【００３４】
自己抗原はタンパク質抗原、前記疾患に特徴的な自己抗体によって認識される一つ以上の抗原決定基を有するそのポリペプチド断片、または前記疾患に特徴的な自己抗体によって認識される抗原決定基ペプチド模倣薬を含む。前記自己抗原は天然現から精製してもよく、当技術分野で周知の方法によって組み換えによりまたは合成により生産されてもよく、また融合タンパク質でもよい。前記自己抗原は無細胞翻訳系を使用して体外で生産してもよい。好ましい一実施形態においては、前記自己抗原は哺乳類または昆虫の発現系において生産され正確な折り畳みと機能を確保している。これらの方法のすべては高いスループット生産のために自動化されていてもよい。
【００３５】
免疫複合体の検出のための分析および条件は当業者によって知られている。このような分析は、例えば、競争分析、直接反応分析、およびサンドイッチタイプ分析を含む。前記分析は定量的でも定性的であってもよい。好ましい一実施形態において、前記分析には、マイクロタイターまたはマイクロ分析プレート、スライド、電磁ビーズ、非電磁ビーズ、カラム、マトリックス、膜、計深棒、フィルター、膜、ピン、またはシートといった前記自己抗原に直接または間接に付着できる固相または基板が使用され、またポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、または他の合成ポリマー、セルロースといった自然ポリマー、セルロースアセテートまたはニトロセルロースといった自然ポリマー誘導体、およびガラス、例えばガラス繊維を含んでもよい。前記基板は好ましくは表面に固定された複数の個々にアドレス可能な自己抗原を有する。前記個々にアドレス可能な自己抗原は、好ましくは表面に固定され列を形成している。前記基板は、フィルム、シート、若しくはプレートといった適切な形態で使用してもよく、または紙、ガラス、プラスチック、フィルム、または布といった適切な不活性担体上に被覆、接着、または積層してもよい。好ましい実施形態においては、前記基板はスライドまたは電磁ビーズである。
【００３６】
前記補助材または基板に自己抗原を付着させる方法は当技術分野において周知であり、共有結合性および非共有結合性相互作用を含む。例として、適用するタンパク質の多孔質表面への拡散があり、そのようなハイドロゲルはハイドロゲル構造内で非修飾タンパク質が非共有結合することを可能とする。共有結合法は安定した結合を提供し、広範なタンパク質に適用できる。タンパク質上のタグ（例えば、ヘキサヒスチジン／Ｎｉ-ＮＴＡまたはビオチン／アビジン）と前記基板表面に固定化されたパートナー試薬を使用した生物学的補修法は安定した結合を提供し、前記タンパク質を特異的かつ再現性のある配向で結合する。ある好ましい実施形態においては、前記自己抗体を前記補助材または化学的に誘導体化されたガラスといった基板上に被覆するまたはスポットされる。より好ましい実施形態においては、ニトロセルロースをコートしたガラススライドを使用する。
【００３７】
ある好ましい実施形態においては、前記自己抗原は列を形成して提供され、好ましくはマイクロアレイである。タンパク質マイクロアレイは当技術分野において周知であり、例えばＨａｌｌ ｅｔ ａｌ. （２００７） Ｍｅｃｈ Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ １２８： １６１−１６７ ａｎｄ Ｓｔｏｅｖｅｓａｎｄｔ ｅｔ ａｌ （２００９） Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ６： １４５−１５７にレビューされており、前記開示内容は、その全体を参照することによってここに取り込まれている。マイクロアレイは、自己抗原をコンタクトスポッタまたは非コンタクトマイクロアレイヤを使用して処理した顕微鏡スライドといった基板上に、精製した自己抗原を固定することによって調製してもよい。マイクロアレイは対応するＤＮＡ配列から直接その場で細胞を用いることなく合成することにより生産してもよい。
【００３８】
アレイ上にスポットされる自己抗原の外部生産および精製に適した方法としては、例えば、Ｖｅｎｋａｔａｒａｍ ｅｔ ａｌ. （２００８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７：６５９０−６６０１に開示されているように、バクテリア内での発現が、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ. （２００７） Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. １４２： １０５−１２４に開示されているように、イースト菌内での発現が、例えば、Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ. （１９９９） １５ ＧｌｙｃｏｃｏｎｊＪ １６： １０９−１２３に開示されているように、昆虫の細胞内での発現が、例えば、Ｓｐａｍｐｉｎａｔｏ ｅｔ ａｌ. （２００７） Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ８：１３７−１４６に開示されているように、哺乳類の細胞内での発現が含まれる。
【００３９】
その場（「チップ上」）でのタンパク質生産方法のために適した方法が、例えば、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ. （２００６） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ ２３２８：１−１４ ａｎｄ Ｈｅ ｅｔ ａｌ. （２００８） Ｃｕｒｒ. Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９：４‐９に開示されている。
【００４０】
タンパク質が同時に発現し、並行してアレイ表面に固定される他の方法もまた当技術分野において周知であり、本発明に合わせて使用することができる。例えば、タンパク質その場配列（ＰＩＳＡ）法（Ｈｅ ｅｔ ａｌ. （２００１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：ｅ７３）においては、溶液状態または固定された状態で、タンパク質はＤＮＡから直接作られ、それらはタグ配列を認識することによって作成されるためアレイ表面に付着した状態になる。前記タンパク質は細胞がない系、一般的にウサギの網状赤血球またはE. coli S30、を使用することにより体外でも並行して発現し、共役転写および翻訳を行う。この方法においては、タンパク質の発現は、前記タグに結合可能な固定試薬によって前もって被覆されている表面上で行われる。ゆえに、それぞれのタンパク質が翻訳された後、同時にまた近接した表面に特異的に固定された状態になる、一方でその他の材料はその後洗い流される。マイクロアレイは、スポット前に前記ＤＮＡと前記無細胞溶解系を混合することによって、または最初のＤＮＡスポットに続けて前記発現系をスポットする多重スポット技術（ＭＩＳＴ）のいずれかによってガラススライド上に直接生成してよい。
【００４１】
核酸プログラマブルタンパク質配列（ＮＡＰＰＡ）（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ. （２００４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：８６−９０）として知られている系においては、固定した（溶液と逆に）ＤＮＡテンプレートからの転写および翻訳によってＤＮＡ入れるをタンパク質配列に変換することができる。この方法においては、ＧＳＴ融合体としての前記タンパク質をコードするビオチン化ｃＤＮＡプラスミドがアビジンで覆われたスライド上に、補足体として働く対ＧＳＴ抗体と一緒にプリントされる。前記ｃＤＮＡ配列はさらにウサギの網状赤血球溶血液によって覆われることによりタンパク質を発現する。これらは、それぞれのＤＮＡスポットに近接した前記抗体によってトラップされる。前記タンパク質はｃＤＮＡと同様な配置をもって前記抗体によって固定される。この技術によって前記固定されたタンパク質がＤＮＡおよび固定試薬と共に存在するタンパク質配列が生成される。
【００４２】
タンパク質配列を生成するための他の好適な方法は、ＤＮＡ配列からのタンパク質配列（ＤＡＰＡ）法である。その場でのタンパク質配列のためのこの方法は、ＤＮＡから離れた表面上の「純粋な」タンパク質配列を生成するためのテンプレートとして固定されたＤＮＡ配列を使用し、同一のＤＮＡテンプレートからタンパク質配列の封数のコピーを生産することもできる（Ｈｅ ｅｔ ａｌ. （２００８） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，５： １７５‐７）。無細胞タンパク質合成は二つの表面（例えば、ガラススライド）の間に保持された膜の中で行われる、そのうち一つはＤＮＡ分子が配列され、もう一方の表面は翻訳されたタンパク質を補足する特異的な試薬を保持している。個々の、標識がついたタンパク質は前記配列されたＤＮＡから並行して合成され、間隙を拡散し、反対側表面上の標識を有する試薬との相互作用を通して固定されることによってタンパク質配列を形成する。前記ＤＮＡが決められた位置に決められた量あることを正確に反映する不連続なスポットが生成される。前記ＤＮＡを再利用することによって前記タンパク質の複製コピーを得ることができる。
【００４３】
配列製造方法にはロボットによる接触印刷、インクジェット、ピエゾ電子スポット、および光リソグラフィーが含まれる。例えば、外的に生産し精製した本発明に係る精製した自己抗体は、高品質のタンパク質マイクロアレイ生産を提供するために、柔軟タンパク質マイクロアレイインクジェットプリンティングシステム（例えば、ＡｒｒａｙＪｅｔ，Ｒｏｓｌｉｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）を使用することによりマイクロアレイ基板にスポットしてもよい。自己抗体の正確な横列縦列が結合された自己抗体は、結合した特徴的な自己抗体の存在および量の両方を示す検知可能なスポットに変換されうる。
【００４４】
前記マイクロアレイの生産は、前記自己抗原の三次元の形態を保持できるように設計された市販の複製用緩衝剤を用いて実施することが好ましい。好ましい一実施形態においては、マイクロアレイ用の基板はニトロセルロースが被覆されたガラススライドである。
【００４５】
前記分析は当技術分野で周知の方法であって、自己抗原と自己抗体からなる免疫複合体の形成および前記免疫複合体の検出が可能な条件下で一つ以上の自己抗原が生体サンプルと接する方法によって実施される。前記免疫複合体の存在および量は、標識に基づく検出方法や標識なしの方法を含む当技術分野で周知の方法によって検出されてもよい。例えば、標識に基づく検出方法にはシグナル発現化合物を含む指示試薬に結合する二次抗体の添加を含む標識に基づく検出方法が含まれる。前記二次抗体は抗ヒトＩｇＧ抗体であってよい。指示試薬には、補助因子、阻害剤、および磁性粒子の他に発色物質、酵素複合体といった触媒、フルオレセインやローダミンといった蛍光材料、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウム、ルテニウム、およびルミノールといった化学発光化合物、放射性元素、直接観察標識が含まれる。
【００４６】
酵素複合体の例には、アルカリ（性）ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびベーターガラクトシダーゼが含まれる。標識なし検出の方法には表面プラズモン共鳴、カーボナノチューブおよびナノワイヤ、並びに干渉分光計が含まれる。標識に基づく、および標識なしの検出方法は、当技術分野で周知であって、例えば、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ. （２００７） ａｎｄ ｂｙ Ｒａｙ ｅｔ ａｌ. （２０１０） Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １０：７３１−７４８によって開示されている。検出は、当技術分野で周知であって使用された標識に好適なスキャン法と関連する分析ソフトウェアによって実施してもよい。
【００４７】
本発明の好ましい一実施形態においては、蛍光標識法および検出法を使用することにより免疫複合体を検出する。市販のスライドスキャナ（例えば、Ｇｅｎｅｐｉｘ ４０００Ｂ スライドスキャナー （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ.））と関連する分析ソフトウェアを使用してもよい。好ましい一実施形態においては、前記免疫複合体（例えば、Ａｌｅｘａ―Ｆｌｕｏｒ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））は蛍光標識された抗ヒト抗体によって探られ、それぞれのタンパク質スポットの蛍光強度をマイクロアレイスキャナーによって測定される。市販のソフトウェア（ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ５．０ ソフトウェア（Ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））は前記スキャナによって生成されたデジタル画像から個々の特徴の実効メジアンピクセル強度を抽出するために使用してもよい。データは、同じ配列を有する異なる領域における複数の同一対照スポットのメジアン値を比較することによって規格化してもよい。
【００４８】
免疫複合体の検出は、生体サンプル中に神経変性に特徴的な自己抗体が存在していることを示しており、つまり神経変性疾患の確定診断である。
【００４９】
本発明における他の実施形態は、検体から免疫グロブリン含有生体サンプルを得ることと、生体サンプルに一つ以上の神経変性疾患に特徴的な自己抗体があるか否かを決定するための試験を実施することと、一つ以上の前記疾患に特徴的な自己抗体が存在する場合に前記疾患の診断をすることと、を含む検体の神経変性疾患を診断する方法を提供する。
【００５０】
好ましい実施形態においては、前記神経変性疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性末梢神経症、視神経炎、血管性認知症、強迫性障害、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染に関連した小児自己免疫性神経精神疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、橋本脳症、視神経脊髄炎、腫瘍随伴症候群、辺縁系脳炎、ラスマン脳炎、橋本脳炎、嗜眠性脳炎、全身硬直症候群、連鎖球菌感染後運動障害、リウマチ熱、グルテン性腸炎、ＡＳＤ、失読症、HTLV-1関連脊髄症／熱帯性痙性不全対まひ、重症筋無力症、Lambert-Eaton症候群、先天性多発性関節拘縮症からなる群から選ばれる。
【００５１】
好ましい実施形態において、前記検体はヒトである。
【００５２】
好ましい実施形態において、前記免疫グロブリン含有生体サンプルは血清、全血、ＣＳＦ、唾液、または痰である。血液サンプルは、静脈穿刺、または指先穿刺を含む当技術分野で周知の方法によって得られてもよい。ＣＳＦは腰椎穿刺を含む当技術分野で周知の方法によって得られてもよい。血液から血清を得るために、血液サンプルを入手し、すべての細胞と血小板を沈殿させるのに十分なスピードで遠心させ、これにより得られた上澄みから分析に用いる血清を取り出す。痰および唾液サンプルは当技術分野の周知の方法によって採取してもよい。前記生体サンプルは適切な緩衝剤によって希釈してもよい。
【００５３】
好ましい一実施形態において、検体の神経変性疾患の診断に使用する分析は、前記自己抗原と前記自己抗体が免疫複合体を形成可能な条件で、前記サンプルを神経変性疾患に特徴的な自己抗体に特異的な一つ以上の自己抗原に付着させ、前記免疫複合体の存在を検出することにより実施し、これは上に詳述されている。自己抗原は配列、または好ましくはマイクロアレイの形で供給されてよい。
【００５４】
本発明の他の実施形態は神経変性疾患に特徴的な自己抗体に特異的な一つ以上の自己抗原が固定された基板を提供する。前記発明はまた、他の実施形態において、神経変性疾患に特徴的な自己抗体に特異的な一つ以上の自己抗原が固定された基板を含むマイクロアレイを提供する。前記基板およびマイクロアレイは上述のようにつくられ、神経変性疾患に特徴的な自己抗体プロファイルの作成および神経変性疾患の診断に有用である。自己抗原はタンパク質抗原、または前記疾患に特徴的な自己抗体によって認識される一つ以上の抗原決定基を含むそのポリペプチド若しくはペプチド断片、または前記疾患に特徴的な自己抗体によって認識される抗原決定基ペプチド模倣薬を含んでもよい。前記基板およびマイクロアレイは、それぞれの神経変性疾患に特徴的な少なくとも一つの自己抗原を含み、好ましくはそれぞれの神経変性疾患に特徴的な約２から約３０の自己抗原を含む。
【００５５】
前記基板およびマイクロアレイは、複数の自己抗原のパネルであって、それぞれのパネルは特定の神経変性疾患に特徴的な自己抗原を含む。このような複数の基板および複数のパネルによって同じ分析において一つ以上の神経変性疾患の診断が可能となり、また神経変性疾患の区別もまた可能となる。
【００５６】
好ましい実施形態においては、前記神経変性疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性末梢神経症、視神経炎、血管性認知症、強迫性障害、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染に関連した小児自己免疫性神経精神疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、橋本脳症、視神経脊髄炎、腫瘍随伴症候群、辺縁系脳炎、ラスマン脳炎、橋本脳炎、嗜眠性脳炎、全身硬直症候群、連鎖球菌感染後運動障害、リウマチ熱、グルテン性腸炎、ＡＳＤ、失読症、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症／熱帯性痙性不全対まひ、重症筋無力症、Ｌａｍｂｅｒｔ―Ｅａｔｏｎ症候群、先天性多発性関節拘縮症からなる群から選ばれる。
【００５７】
さらにある実施形態において、本発明はサンプル中の神経変性疾患に特徴的な自己抗体を検出するためのキットを提供する。前記キットは神経変性疾患に特徴的な自己抗体に特異的な一つ以上の自己抗原を有し、また前記自己抗原がサンプル中の自己抗体への結合していることを決定する手段を有する。前記キットはまた、前記キットの前記一つ以上の自己抗原が神経変性疾患の特定に使用できることを示す標識を有する包装材を有してもよい。このようなキットは、緩衝剤、制御剤、検出剤などといった当業者が知っている他の構成要素を含んでもよい。前記キットは神経変性疾患に特徴的な自己抗体の検出および神経変性疾患の診断に有用である。
【００５８】
アルツハイマー病
アルツハイマー病（ＡＤ）に特徴的な自己抗体は、タンパク質またはペプチド抗原に特異的に結合し、またアルツハイマー病をＡＤを有していない対照検体から区別するために使用できる診断用の指示薬である自己抗体としてここでは定義されている。潜在的に有用な診断用の指示薬とされてきたタンパク質抗原は次の表１に示される。表１のタンパク質抗原は当技術分野で認められた名称およびデータベース識別番号によって識別されている。前記データベース識別番号は公衆に利用可能なタンパク質データベースである全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）を参照しており、当業者に広く知られ受け入れられている。
【００５９】
【表１−１】
2013528799.tif 000002
【００６０】
【表１−２】
2013528799.tif 000003
【００６１】
【表１−３】
2013528799.tif 000004
【００６２】
【表１−４】
2013528799.tif 000005
【００６３】
【表１−５】
2013528799.tif 000006
【００６４】
【表１−６】
2013528799.tif 000007
【００６５】
【表１−７】
2013528799.tif 000008
【００６６】
【表１−８】
2013528799.tif 000009
【００６７】
【表１−９】
2013528799.tif 000010
【００６８】
【表１−１０】
2013528799.tif 000011
【００６９】
【表１−１１】
2013528799.tif 000012
【００７０】
【表１−１２】
2013528799.tif 000013
【００７１】
【表１−１３】
2013528799.tif 000014
【００７２】
【表１−１４】
2013528799.tif 000015
【００７３】
【表１−１５】
2013528799.tif 000016
【００７４】
【表１−１６】
2013528799.tif 000017
【００７５】
【表１−１７】
2013528799.tif 000018
【００７６】
【表１−１８】
2013528799.tif 000019
【００７７】
【表１−１９】
2013528799.tif 000020
【００７８】
【表１−２０】
2013528799.tif 000021
【００７９】
【表１−２１】
2013528799.tif 000022
【００８０】
【表１−２２】
2013528799.tif 000023
【００８１】
【表１−２３】
2013528799.tif 000024
【００８２】
【表１−２４】
2013528799.tif 000025
【００８３】
【表１−２５】
2013528799.tif 000026
【００８４】
【表１−２６】
2013528799.tif 000027
【００８５】
他の好ましい実施形態において、前記検体およびマイクロアレイは、自己抗原として、表２のタンパク質抗原の少なくとも一つ、前記ＡＤに特徴的な自己抗体によって認識される一つ以上の抗原決定基を有するポリペプチドまたはそのペプチド断片、または前記ＡＤに特徴的な自己抗体によって認識される抗原決定基ペプチド模倣薬を有してもよい。表２−５中のタンパク質抗原は、データベースによる識別だけでなく当技術分野で受け入れられた名前によって認識されている。データベース識別番号は、公衆に利用可能なタンパク質データベースである全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）を参照しており、当業者に広く知られ受け入れられている。
【００８６】
【表２−１】
2013528799.tif 000028
【００８７】
【表２−２】
2013528799.tif 000029
【００８８】
他の実施形態においては、前記検体およびマイクロアレイは、自己抗原として、表３のタンパク質抗原の少なくとも一つ、前記ＡＤに特徴的な自己抗体によって認識される一つ以上の抗原決定基を有するポリペプチドまたはそのペプチド断片、または前記ＡＤに特徴的な自己抗体によって認識される抗原決定基ペプチド模倣薬を有してもよい。
【００８９】
【表３】
2013528799.tif 000030
【００９０】
本発明の一態様の他の実施形態において、前記マイクロアレイは、ＦＥＲＭ領域を有するタンパク質８（ＦＲＭＤ８）を有し、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ４１（ＲＰＬ４１）、ペンタトリコペプチド反復配列を含むタンパク質２（ＰＴＣＤ２）、およびＡＤに特徴的な自己抗体によって認識される一つ以上の抗原決定基を有する造血ＳＨ２領域含有タンパク質（ＨＳＨ２Ｄ）またはその断片、または前記ＡＤに特徴的な自己抗体によって認識される抗原決定基ペプチド模倣薬を有する。他の実施形態において、前記マイクロアレイは、ＡＤに特徴的な自己抗原によって認識されるひとつ以上の抗原決定基を有する、ＦＥＲＭ領域含有タンパク質８（ＦＲＭＤ８）および造血ＳＨ２領域含有タンパク質またはその断片を有する。
【００９１】
本発明の好ましい一実施形態において、前記検体およびマイクロアレイは、抗原として、表４の少なくとも一つのタンパク質抗原または、ＡＤに特徴的な自己抗体によって認識される一つ以上の抗原決定基を有するその断片、または前記ＡＤに特徴的な自己抗体によって認識される抗原決定基ペプチド模倣薬を含んでもよい。本発明の他の好ましい実施形態において、前記検体およびマイクロアレイは表４のすべてのタンパク質抗原を有する。
【００９２】
【表４】
2013528799.tif 000031
【００９３】
［パーキンソン病］
本発明の他の実施形態において、前記マイクロアレイはＡＤに特徴的ではないがパーキンソン病（ＰＤ）に特徴的である自己抗体と反応する自己抗原も有するため、ＰＤとＡＤを区別することができる。ＡＤではなくＰＤに特徴的な自己抗原には、例えば、表５のタンパク質並びに、ＰＤに特徴的な自己抗体によって認識される一つ以上の抗原決定基およびＰＤに特徴的な自己抗体によって認識される抗原決定基ペプチド模倣薬を含むその断片が含まれる。
【００９４】
【表５】
2013528799.tif 000032
【実施例】
【００９５】
以下の実施例によって本発明をさらに説明する。
【００９６】
（実施例１）材料と方法
動物：Ｓｗｉｓｓ―Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ(ハドソン、ニューヨーク州)から入手し、生後３−６ヶ月で実験に使用した。ＳｐｒａｇｕｅーＤａｗｌｅラットもまたＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ (ハドソン，ニューヨーク)から入手し、生後７−９週間で使用した。どちらも１２時間の明／暗周期とともに不断給餌と水でAALAC認定の生態動物園の中で飼育した。動物の使用はUMDNJ IACUによる審査および認可を受けた。
【００９７】
ヒトの脳組織：突発性ＡＤ（ｎ＝２３、年齢範囲＝７１−８８）を持つ患者からの脳組織と、年齢をマッチングした神経学的に正常な個人（ｎ＝１４，年齢範囲＝６９−８３）の脳組織をハーバード脳組織提供センター（ベルモント、ＭＡ）、共同ヒト組織ネットワーク（フィラデルフィア、ＰＡ）、ＵＣＬＡ組織提供センター（ロサンゼルス、ＣＡ）、およびＳｌｉｄｏｍｉｃｓ（チェリーヒル、ＮＪ）から入手した。死後経過時間は２４時間未満でありＡＤの病理学的確認は国立老化研究所とレーガン研究所のＡＤの神経病理学的評価のための診断基準に関するワーキンググループによって定義された基準に基づいて評価された（Ｈｙｍａｎ ａｎｄ Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ （１９９７） Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ５６，１０９５‐７）。繰り返しのパラフィン包埋と切断のためにホルマリン漬け組織を確立された手順に沿って処理した。対照組織は最小限に局所的な微視的ＡＤ様の神経病理学を示した。
【００９８】
抗体：Ａβ４２抗体はＭｉｌｌｉｐｏｒｅＩｎｔｅｍａｔｉｏｎａｌ(テメキュラ，カリフォルニア州）（ポリクローン、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＢ５０７８Ｐ、希釈＝１：５０）およびＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ (サンディエゴ，カリフォルニア州)（ポリクローン、Ｃａｔ．Ｎｏ．４７６７，希釈＝１：５０）から入手した。免疫組織化学のためのビオチニル化抗ヒトＩｇＧ抗体はＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ(バーリンゲン，カリフォルニア)（ｈｏｓｔ： ｇｏａｔ，
Ｃａｔ．Ｎｏ.ＰＫ−６１０３，希釈＝１：１００）。ウエスタンブロッティング法のためのペルオキシダーゼ接合抗ヒトｉＧｇ抗体はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ロックフォード，イリノイ州）（ホスト：ヤギ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３１４１０、希釈＝１：２００，０００）から入手した：次の抗体は器官型マウス脳切片培養の処理のために使用した。抗アルファ７ニコチンアセチルコリン受容体（Ｃ−２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタクルス、カリフォルニア州）；抗ＧｌｕＲ２（ポリクローナルＮ１９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，サンタクルス、カリフォルニア）；抗ベータチューブリン（Ｄ−１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，サンタクルス、カリフォルニア）。これらの抗体の特異性はウエスタンブロット法によって確認した。
【００９９】
ヒト血清：ヒト血清サンプル［ＡＤ（ｎ＝５２、年齢範囲＝６１−９７歳）；年齢マッチ調整（ｎ＝２８、年齢範囲＝５１−８６）；若年健康調節（ｎ＝２８、年齢範囲＝１９−３０歳）］はＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ (ウィルミントン，デラウエア州)から入手した。サンプルは数字によってコード化されており、次の情報が含まれている：患者の年齢と性別、検知可能な神経疾患の有無、神経疾患がある場合には病気の重篤度と推定死後経過時間の表示。これらサンプルの使用はＵＭＤＮＪ ＩＲＢによって承認されている。
【０１００】
免疫組織化学：免疫組織化学は前述のパラフィン漬けの脳組織を用いて実施した（Ｄ’Ａｎｄｒｅａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３８，１２０−３４； Ｎａｇｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１０，１９９−２１１）。簡潔に述べると、キシレンを用いて組織からパラフィンを除去し、段階的連続的に濃度が薄くなるエタノールを通して水に戻した。クエン酸塩緩衝剤中で切片をマイクロ波にさらすことによって抗原性を高めた。内因性のペルオキシダーゼは０．３％Ｈ２Ｏ２中で３０分間処理することによって急冷した。切片を阻止血清中で培養し、適切な希釈状態で１時間室温で主要抗体によって処理した。ＰＢＳ中でよくすすいだ後、ビオチンで標識した第二抗体を３０分間適用した。切片はアビジンペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ City，CA）で処理し、３−３−ジアミノベンジジンー４−ＨＣＬ（ＤＡＢ）／Ｈ２Ｏ２（Ｉｍｍ−Ｐａｃｔ−ＤＡＢ）（Ｖｅｃｔｏｒ）によって可視化した。次に切片をヘマトキシリンによって軽く対比染色し、徐々に濃度を濃くしたエタノールによって脱水し、キシレンで洗浄し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ中で標本にした。対照には免疫なし血清または主要抗体の除去によって処理された脳切片が含まれる。標本は試験されＮｉｋｏｎ ＦＸＡ顕微鏡によって写真撮影され、デジタル画像はＮｉｋｏｎ ＤＸＭ１２００Ｆデジタルカメラを用いて記録し、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ（Ｐｈａｓｅ ３ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｇｌｅｎ Ｍｉｌｌｓ，ＰＡ）とＣｅｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ画像解析ソフトを使用して処理、解析された。
【０１０１】
生体ラット脳タンパク質の調製：ラット脳タンパク質断片の調製のために、新しいラット脳組織を−８０℃の保管庫から取り出し、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド、５０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝溶液中にｐＨ７．４、１０．０ｍｌ／ｇの割合で、５ｍｌ／ｇの割合のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス，ミズーリ州）とともに置いた。事前に冷やしておいたＤｏｕｎｃｅホモジェナイザー（Ａｒｒｏｗ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ.，ヒルサイド，ニュージャージー州）をセッティング４にして、脳サンプルをホモジェナイザーにかけた。次に、スウィングローターを装着したＢｅｃｋｍａｎ ＣＳ−６Ｒ(Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ，ブレア，カリフォルニア州)遠心機を用いて４℃で１０分間、脳サンプルを３０００ｒｐｍで遠心し無傷細胞と大きな残屑を得た。上澄み液は全脳タンパク質断片として保持した。タンパク質濃度はブラッドフォード分析を使用して決定した。
【０１０２】
ウエスタンブロッティング法による自己抗体標的の検出：血清自己抗体の脳膜標的の決定を行うためにウエスタンブロッティング法を実施した。第一に、１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド分離ゲルをＭｉｎｉ ＰＲＯＴＥＡＮ ３Ｓｙｓｔｅｍ（１６５−３３０２、ＢｉｏＲａｄ，ヘラクレス，カリフォルニア州）を使用してキャストし、積層ゲル（４．０％）を重ねた。１００μｇのタンパク質サンプルをサンプル緩衝溶液に加え、ＰａｇｅＲｕｌｅｒTM Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ Ｐｌｕｓ （ＳＭＩ８１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｇｌｅｎ Ｂｕｍｉｅ，ＭＤ）とともにゲルに適用した。次にタンパク質を１３０Ｖで７分間断片化した後、分解時間の残渣のために１００Ｖで実施した。タンパク質を続けてＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＲＰＮ３０３２Ｄ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）に移し７５分間１８０ｍＡで処理した。４℃で一晩培養するために、ブロットはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）に溶解した５．０％の無脂肪乾燥乳にブロックされた後、ヒト血清サンプル（主要抗体）に移され、ブロッキング溶液中で１：５００に希釈された。翌朝、ブロットをＰＢＳ−Ｔ中でよくすすぎ、適当に希釈したペルオキシダーゼ結合性の二次抗体に置き、４℃で１時間培養した。次にブロットをＰＢＳ−Ｔ中で完全にすすぎ、さらに素早く蒸留水ですすぎリン酸緩衝溶液を除去した。次にブロットをＰｉｅｒｃｅ活性化化学発光（ＥＣＬ）検体（３２１０６，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）とオートラジオグラフィーフィルム（ＸＡＲ ＡＬＦ１８２４，Ｌａｂ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，リビングストン，ニュージャージー州）を使用して培養した。前記血清サンプルのためのそれぞれのウエスタンブロット法を３つ一組で実施した。
【０１０３】
マウス器官型脳切片培養物および処理：器官型生体マウス脳切片培養物（ＭＢＯＣｓ）をＳｔｏｐｐｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ. ３７，１７３−82.の手法を用いて調製した。これらの培養物中のニューロンは外因性のＡβ４２（１００ｎＭＡβ４２への曝露４時間未満で検出される）を蓄積することが証明されている（Ｂａｈｒ ｅｔ ａｌ.，（１９９８）Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ．３９７，１３９−４７；Ｈａｒｒｉｓ−Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，１０３６６−７４；Ｍａｌｏｕｆ，（１９９２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．１３，５４３−５１；Ｓｔｏｐｐｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１））。Ｓｗｉｓｓ―Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（生後３−６ヶ月）の脳を無菌状態で隔離し、３０ｍｍＭｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＣＭ培養インサート（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＣＭ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）に配置したＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパーを使用し所望の脳領域を通る横軸冠状切片（厚さ０．５−０．７５ｍｍ）を調製し、無血清培地（ＤＭＥＭ）中で軽く（１時間）または処理前に一晩２５％不活性化ウマ血清、２５％Ｈａｎｋｓ’ＢＳＳ、５０％ＤＭＥＭ、２５ｍｇ／ｌペニシリン−ストレプトマイシン中で安定させた。安定化後、培養物をＡβ４２ペプチド（１００ｎＭ）、抗ＧｌｕＲ２抗体（１：２５０希釈）、ヒト血清サンプル（１：５００希釈）、抗α７ｎＡＣｈＲ抗体（１：１０００希釈）、抗βチューブリン抗体（１：２００希釈）を含む、無血清培地（ＤＭＥＭのみ）または完全培地（２５％不活性化ウマ血清、２５％Ｈａｎｋｓ’ＢＳＳ、５０％ＤＭＥＭ、２５ｍｇ／ｌペニシリン−ストレプトマイシン）に曝露した。対照切片には培地のみを添加した。ＭＢＯＣは５％ＣＯ２富化雰囲気中、３７℃で最長７２時間処理した。Ａβ４２は、（Ｚａｇｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ.（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.３０９，１８９-２０４）の方法を使用して単量体の形に可溶化した。
【０１０４】
画像解析：ヒト血清またはα７ｎＡＣｈＲまたは抗ＧｌｕＲ２に対する抗体を有するまたは有しないＡβ４２ １００ｎＭで処理したＭＢＯＣｓ中のＡβ４２の蓄積の程度は定量的免疫組織化学によって決定した。上述のように処理されたＭＢＯＣを第一に同様の条件下で抗Ａβ４２抗体を用いて免疫染色した。次にＮｉｋｏｎＣＣＤカメラと画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Pro PlusとCell Profiler）を備えたＮｉｋｏｎＦＸＡ顕微鏡を使用して同様の照明とカメラセッティングの下、画像を記録した。Ａβ４２陽性細胞当たりの細胞内のＡβ４２陽性堆積物の相対量を決定し、異なる処理グループの間で比較した。細胞内Ａβ４２量の違いの重要性は、学生のｔ−試験によって決定された。免疫組織化学の対照は非免疫血清または検出抗体のみを含む。
【０１０５】
（実施例２）ヒト血清中の脳反応性自己抗体
ＡＤ患者（ｎ＝５２、年齢範囲＝６１−９７歳）、年齢マッチングした、認知症でない対照検体（ｎ＝２８、年齢範囲５１−８６歳）、および若年健康個体（ｎ＝２８、年齢範囲１９−３０歳）からの血清を脳反応性自己抗体の存在を確認するために試験した。ウエスタン分析のために、各血清は、成体マウスからの全細胞ホモジェネートから得られるタンパク質を調べることにより脳反応性自己抗体の存在を確認するための試験をした。結果から、試験した３グループからのすべての血清に脳反応性自己抗体の存在が確認された。それぞれの血清サンプルから生成した免疫活性タンパク質バンドは、平均＝５．１±３．１（ＡＤ血清（ｎ＝５２））；７．４±４．０（年齢マッチングした血清（ｎ＝２８））；６．０±３．８（若年健康調節血清（ｎ＝２８））のように全３検体グループについて、似ていた。同様の結果が、ヒト血清をマウスとヒトの脳タンパク質を調べるのに使用した際に得られている。ウエスタンブロット法で求めた見かけの分子量に基づくと、２，３の潜在的に共通のタンパク質バンドが上記３検体グループの中および間で見いだされた。
【０１０６】
（実施例３）ＡＤの病状を示す脳領域のＩｇＧ活性ニューロン
死後のＡＤ脳内のＩｇ活性ニューロンが報告されてきた（Ｂｏｕｒａｓ ｅｔ ａｌ. （２００５） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｒｅｖ. ４８，４７７−８７； Ｃｌｉｆｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ. （２００７） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ. １１４２，２２３‐３６； Ｄｅａｎｅ ａｎｄ Ｚｌｏｋｏｖｉｃ （２００７） Ｃｕｒｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｒｅｓ. ４，１９ １‐７； Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ ｅｔ ｌ. ａ （１９８９） Ｊ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ. ４４，M１２８−３０； Ｋａｌａｒｉａ （１９９９） Ａｎｎ ＮＹＡｃａｄ Ｓｃｉ. ８９３，１１３−１２５； Ｋｕｌｍａｌａ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｅｘｐ Ａｇｉｎｇ Ｒｅｓ １３：６７−７２； Ｌｏｅｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ. （１９９７） Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ. ２２，２０９−１4; Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ. （２００２） Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ. ６１，1100-8）。この実施例では、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた免疫組織化学によって、２３個のＡＤおよび１４歳に年齢マッチ調節した脳内にＩｇＧ免疫活性な脳の構成部位が有るかを確認する試験を実施した。免疫標識した細胞体と樹状突起の幹を有するＩｇＧ活性ニューロンは試験したすべての脳で見つかった。ＩｇＧ活性ニューロンは、対応する年齢マッチ調節した脳よりもＡＤ脳において遥かに豊富で、広範に存在し、かつ強く免疫染色されている。後者において、ＩｇＧ活性ニューロンは、離散した個々の細胞として、またＩｇＧ活性細胞が完全に欠如した脳組織の比較的大きな領域によって隔離された小さな細胞の塊として見いだされることが最も多かった。ＡＤ脳において、ＩｇＧ活性ニューロンは、ＡＤ関連の病状変化に影響を受けやすいことが知られる脳領域で特に豊富であった（例えば、側頭葉、内嗅皮質、海馬）。ＡＤおよび調節された脳において、ＩｇＧ免疫活性は錐体神経細胞に一貫してまた選択的に関係しており、またこれらの細胞は、時に近くに存在するＩｇＧ陽性および陰性のニューロンによるＩｇＧ免疫標識の強度においてしばしば顕著な個人差を示した。神経ＩｇＧ免疫染色強度において同様の変動が海馬のニューロンにおいて見いだされた。錐体神経細胞において、ＩｇＧ免疫活性は細胞体および主要樹状幹の近辺において最も顕著であった。ほとんどのより小さなニューロンにおいては、錐体細胞の間に散在したより小さなニューロン、星状細胞、および小グリア細胞はＩｇＧ陰性であった。試験した２３個のＡＤ脳のうち３つにおいて、星状膠細胞と錐体神経細胞の両方がＩｇＧ陽性であったが、これは年齢マッチングした脳においては観察されなかった。
【０１０７】
（実施例４）ＩｇＧ免疫活性とＡβ４２の堆積の間の関係
死後ＡＤ脳組織の切片をヒトＩｇＧとＡβ４２に特異的な抗体を用いて調べた。軽いＡＤ症状を示している大脳皮質と海馬の領域（すなわち、アミロイド斑がほとんどない隔離されたニューロン内Ａβ４２堆積を有する領域）において、Ａβ４２免疫活性ニューロンはまた強いＩｇＧ免疫染色を示した。二セットの連続した部位が免疫染色され、ＡＤ脳の大脳皮質におけるＡβ４２とＩｇＧの相対分布が明らかになった。軽いＡＤ症状を示す領域において、ＩｇＧとＡβ４２の両方は両方の部位に現れる同じニューロンに共局在化していた。同様に、より進んだ症状（ニューロンとアミロイド斑内のＡβ４２の堆積の増加かから判断して）を示す皮質領域において、間質およびニューロン内のＩｇＧの量は大幅に増加した。錐体ニューロン内のＡβ４２に富む物質の核近くでの典型的で大きな堆積に加え、これらの細胞の主要な樹状突起幹は多くの均一サイズのＡβ４２陽性顆粒を頻繁に含んでいた。これらの結果は錐体ニューロン内でのニューロン内Ａβ４２堆積とＩｇＧ免疫標識が時間的、空間的に一致することを実証している。
【０１０８】
（実施例５）ヒト血清抗体と生体ニューロンの反応性
ヒト血清抗体と生体ニューロン表面の反応性（すなわち結合性）を試験するために、成体マウス脳の器官型（脳切片）培養物（ＭＢＯＣｓ）を希釈したヒト血清を含むまたは含まない雰囲気において最長７２時間保持した。ＭＢＯＣｓは成体脳の組織学的構造を最長数週間適切な条件下で保持し、外因性、溶解性のＡβ４２ペプチドを吸収、蓄積するニューロンを含むことが示された（Ｂａｈｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ―Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）； Ｍａｌｏｕｆ （１９９２); Ｓｔｏｐｐｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）。ＭＢＯＣｓ中のヒトＩｇＧのニューロンへの結合は、抗ヒトＩｇＧ抗体を使用した免疫組織化学によって検出された。血清で処理した対照が内在性のＩｇＧ免疫活性を示さなかった一方、培地でのヒト血清の添加は生体成体マウスのニューロンを強く選択的にＩｇＧ免疫標識するという結果になった。ヒト血清処理したＭＢＯＣｓ中のＩｇＧ免疫染色バックグラウンドのパターンは、樹状突起物および／またはシナプス結合もまたＩｇＧ活性であるかもしれないことを示唆している。上記の死後のヒトＡＤ脳にみられるように、ＭＢＯＣｓの大脳皮質の錐体ニューロンは一貫してもっとも強く免疫活性な細胞であった。
【０１０９】
（実施例６）外因性Ａβ４２の内在化への自己抗体の影響
本実施例では、ウエスタンブロット法と免疫組織化学調製において上で示した脳組織において上で実証したとおり、ヒト血清中の抗体と齧歯類脳のタンパク質との交差反応性の特性を用いる。ＭＢＯＣｓを他の血清を含まない培地に１：５０で希釈した個々のヒト血清サンプルの存在下または不存在下において１００ｎＭ Ａβ４２中で１，３，２４，４８および７２時間処理し、ニューロン内のＡβ４２の相対量を２４時間処理したＭＢＯＣｓについて画像解析を使用して定量した。１００ｎＭ Ａβ４２のみで２４時間処理したＭＢＯＣｓはヒトＩｇＧ免疫染色を示さず、ほんのわずかにＡβ４２免疫活性を示した。１００ｎＭ Ａβ４２のみで２４時間処理したＭＢＯＣｓは全くヒトＩｇＧ免疫染色を示さず、ほんのわずかにＡβ４２免疫活性を示すだけだった。一方で、ＭＢＯＣｓがヒト血清自己抗体とＡβ４２ペプチドに２４時間さらされると、錐体ニューロンを同じ時間だけＡβ４２ペプチドまたは血清のみで処理した対照よりも細胞内Ａβ４２蓄積量に劇的な増加がみられた。これらのニューロン内で、Ａβ４２陽性物質はニューロン周核体と樹状幹の近くに濃縮された高密度の細胞質顆粒に局在化した。処理後２４時間後の加増解析を用いたＭＢＯＣｓ中のニューロン内Ａβ４２の層大量の測定によって１００ｎＭ Ａβ４２を含む培地中へのヒト血清の添加がＡβ４２だけで処理した細胞に対するニューロンＡβ４２免疫活性を何倍にも向上させることを明らかにした。ＭＢＯＣｓにおける細胞の大量死とＡβ４２負荷ニューロンの欠失についてのモルフォロジー的証拠は観察されなかった。
【０１１０】
（実施例７）ニューロン表面タンパク質を標的とする精製抗体による外因性Ａβ４２の内在化への影響
ニューロン細胞表面、アルファ７ニコチンアセチルコリン受容体（α７ｎＡＣｈＲ）、およびグルタミン酸塩Ｒ２（ＧｌｕＲ２）受容体上で豊富に発現することが知られる二つのニューロン受容体に対する市販の抗体でＭＢＯＣｓを２４時間処理した。両抗体はニューロン内Ａβ４２蓄積物の増加に効果があり、さらに錐体ニューロン選択的でありＡβ４２のみで処理した培養物にみられる水準よりもはるかに高水準である。ＩｇＧのニューロン細胞表面反応性が外因性Ａβ４２の内在化を向上させるために必要であるかどうかを調べるために、ＭＢＯＣｓを、１００ｎＭ Ａβ４２と共に、普通の細胞内タンパク質、ベータチューブリンで処理することも行った。ベータチューブリンでの処理では、１００ｎＭ Ａβ４２のみでの処理と同様のニューロンＡβ４２堆積水準という結果になった。
【０１１１】
（実施例８）ＡＤに特徴的な自己抗体の識別
ウエスタン分析
以上に開示したように、ウエスタン分析を用いて個々のヒト血清中の脳反応性自己抗体の有無の生化学的確認を実施した。さらに、上記のようにヒトの自己抗体に対して免疫活性であるラット脳タンパク質を使用して、ＡＤを持つ患者からの血清、年齢マッチングしたニューロン学的に普通の対照と若年健康個体の間で血清を比較した。推定分子量のみに基づくと、結果として得られる個々の標的タンパク質の分子量分布は、Ａ．Ｉ．Ｓｏｌｖｅｒ（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｆｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）というパターン認識コンピュータープログラムを用いて分析した。
【０１１２】
自己抗体標的タンパク質の分子量分布の特定のパターンの認識に基づくと、Ａ．Ｉ．ＳｏｌｖｅｒはＡＤ患者の血清を年齢マッチング調節した若年健康検体からのものと９８％の確率で区別した。この実施例は、血液中に、脳タンパク質標的抗原に結合するＡＤ−特異的タンパク質抗体の存在を実証している。次に、タンパク質マイクロアレイ基板を使用し、効果的にＡＤ診断することに役立つ自己抗体の特定の部分集合とそれらの標的タンパク質を特定するために使用した。
【０１１３】
マイクロアレイの製造
特徴的な抗体の特定とタンパク質マイクロアレイ診断の効果の証明に用いられるタンパク質マイクロアレイ基板は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Microarray v5.0であった。これはタンパク質と相互作用スクリーニングするための何千もの精製ヒトタンパク質を含む高密度なタンパク質マイクロアレイである。それぞれのヒトオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、バキュロウイルス発現系を使用しており、昆虫細胞から精製され、ニトロセルロースコートされたガラススライド上に複製プリントされたＮ−末端ＧＳＴ融合タンパク質として発現する。診断上のニーズに最も合っているため、免疫応答性バイオマーカープロファイリングアプリケーションを使用した。すべての試薬と材料は直接Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを通じて購入した。推奨されるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｒｏｔｏ Ａｒｒａｙプロトコールは常に強固に結合し、全体を参照することにより組み込まれる。
【０１１４】
マイクロアレイスキャン
前記タンパク質マイクロアレイは推奨されるＡｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘ ４０００ｂ撮像装置を使用してスキャンされた。個々のスライドを撮像装置に挿入し、１００％のレーザー強度、６３５ｎｍ励起波長、ＰＭＴ６００、および５μｍピクセルサイズを使用してスキャンした。前記撮像装置をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手したＧｅｎｅｐｉｘ Ａｒｒａｙ Ｌｉｓｔ （.ＧＡＬ）ファイルと同期することにより画像からデータを抽出した。ＧＡＬファイルはタンパク質マイクロアレイ上のすべてのスポットの場所を示し、同定し、またＧｅｎｅｐｉｘ Ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって使用されアレイ上のすべての特徴についてのピクセル強度情報を含むファイルを生成する。Ｇｅｎｅｐｉｘ Ｐｒｏはさらに、テキストのみのスプレッドシートフォーマットのマイクロアレイ上のそれぞれのタンパク質スポットにつてのすべてのピクセル強度データをリスト化するＧＰＲ（Ｇｅｎｉｐｉｘ Ｐｉｘｅｌ Ｒｅｓｕｌｔｓ）ファイルを作成する。それが、データ分析のためにＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒにインポートされたＧＰＲファイルである。
【０１１５】
規格化
前記マイクロアレイをＡｘｏｎ Ｇｅｎｉｐｉｘ ４０００b撮像装置でスキャンすることにより個々のマイクロアレイデータを取得し、Ｇｅｎｅｐｉｘ Ｐｒｏソフトウェアで初期定量化を実施した後、そのデータをマイクロアレイ間で比較できるように規格化した。このために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの適正化ソフトウェア、Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ；より詳しくは、免疫応答性Ｂｉｏｍａｋｅｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｔｏｏｌｂｏｘアプリケーションを使用した。それぞれのマイクロアレイのｇｐｒファイルをプログラムにインポートし、解析し、線形モデルに規格化した。
【０１１６】
線形モデルへのデータフィッティングはメジアンのようなM-estimatorを用いて反復加重最小二乗法といった手法によるロバスト回帰を通して実施した。前記線形モデルは対数変換シグナルを使用して変動を見積もり、修正している。それぞれのスポットについて、スライドｉ（＝１，．．．ｎｓ，）上サブアレイｊ（＝１，．．．，４８）中のタンパク質の特徴ｋ（＝１，．．．，ｎｆ）の複製ｒ（＝１，２）であり、次のモデルがフィットした：
【０１１７】
【数１】
2013528799.tif 000033
【０１１８】
（式中yijkはｌｏｇ２スケールで観測されるシグナル、αはスライド効果、βｊはサブアレー／ブロック効果（プリンティングピン効果を含む）、τｋはタンパク質の特徴の“ｔｒｕｅ”シグナル（異なる濃度でプリントされた異なるタンパク質含有量）、εｉｊｋｒは誤差、εｉｊｋｒ〜Ｎ（０，σ２）と過程する。対照タンパク質を使用してこれらの効果についての係数を見積もった後、それぞれのスポットについてその元となるスケールにおいて前記規格化したシグナルは以下のように計算される：
【０１１９】
【数２】
2013528799.tif 000034
【０１２０】
規格化後、前記マイクロアレイデータを誤差と個々の変動に合わせて完全に調整し、形式的な解析を開始した。診断上の重篤度はこの調整されたデータから決定する。
【０１２１】
データ解析
マイクロアレイ蛍光データの診断上の重要性を決定する方法として多くの一般に認められた方法がある。我々の結果の再現性と正確性を保証するために、データは３つの独立した明確な方法を用いて別々に３回解析した。前記方法はもっとも信頼でき、一貫して使用でき、また同様の研究において一般に使用されている方法から選択されている。前記方法は、Ｍ−Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ法、Ｎｅａｒｅｓｔ Ｓｈｒｕｎｋｅｎ Ｃｅｎｔｒｏｉｄ法、Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔ Ｄｅｃｉｓｉｏｎ―Ｍａｋｉｎｇ Ｔｒｅｅｓ法である。これらそれぞれの偏りのない統計的定量化方法を生かすためにＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ，ＰＡＭ，ａｎｄ Ｒ’ｓ Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔ をそれぞれ使用した。これらのプログラムによって前記タンパク質マイクロアレイデータを評価し、どのタンパク質がアルツハイマー病の診断に最も重要かを決定する。前記リストはそれぞれを完全に反映しており、ゆえにタンパク質マイクロアレイが正確な診断に有用であることを実証している。前記統計手法、関連するプログラム、および得られた結果を下に示す。
【０１２２】
Ｍ−統計解析
Ｇｅｎｅｐｉｘ Ｐｒｏにより得られた前記生蛍光データを解釈し、規格化すると共に、Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒを使用し、それぞれのタンパク質の診断上の重要性を評価するために順に使用されるＭ−統計を生成した。要するに、Ｍ−統計を使用し、比較グループ内でのこの調査について観測された最も高いシグナル値よりも高いタンパク質のシグナル値を有する１グループ（例えば、アルツハイマー対照）における試験数を決定した。サイズｎｘのグループｘと比較したサイズｎｙのグループｙについての前記Ｍオーダー統計は次の式で与えられる：
【０１２３】
【数３】
2013528799.tif 000035
【０１２４】
（式中、ｘ（ｉ）は、該グループｘのｉｔｈの最大値、ａｂｏｖｅとｂｅｔｗｅｅｎは計算パラメータである。ｐ値はＭｉ以上のＭ値を有する確率として計算される。Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒはもっとも低いｐ値のＭ統計を選択し、相当するｐ値とタンパク質保有率の推定と一緒に、このＭｍａｘ値とオーダーを報告した。該値はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ Ｗｏｒｋｂｏｏｋフォーマットで見られ、フィルターをかけられグループ差の最も効果的な指標のリスト、つまりもっともよい診断上の標識となるタンパク質、を提供した。）
【０１２５】
ＰＡＭ（マイクロアレイ予測解析）
タンパク質マイクロアレイ結果と得られたタンパク質の重要性を解釈する他の方法がＰＡＭ、またはマイクロアレイ予測解析である。ＰＡＭはＮｅａｒｅｓｔ Ｓｈｒｕｎｋｅｎ Ｃｅｎｔｒｏｉｄ法を使用するクラス予測のための統計手法である。これはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ Ｍａｃｒｏで動作し、マイクロアレイ結果の同定に広く使用されてきた（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ ｅｔ ａｌ. （２００２） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ ９９：６５６７−６５７２）。前記プログラムは、それぞれのクラスをもっともよく同定し、ゆえに重要な診断上の指標として利用される蛍光データの特定の部分集合を同定するのに使用された。要するに、前記手法はそれぞれのクラスの標準化重心を計算した。これはそのタンパク質についてのクラス内標準偏差によって分けられたそれぞれのクラス内のタンパク質についての平均蛍光である。重心は「収縮した」つまり閾値で約分され、誤差と異常値を減らしている。それぞれ新しいサンプルの前記マイクロアレイ蛍光はそれぞれの収縮クラス重心と比較され、最も近い重心が、距離の二乗で、最も近いクラスが新たなサンプルとして予測されるクラスであった。この情報に基づくと、ＰＡＭは診断上の重要度順に提示されたタンパク質のリストを生成した。
【０１２６】
ＰＡＭを使用し、表６で以下に示した対照の血清とアルツハイマー病の血清を区別する上で重要な上位５０種のタンパク質のリストを生成した。
【０１２７】
【表６−１】
2013528799.tif 000036
【０１２８】
【表６−２】
2013528799.tif 000037
【０１２９】
Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔ
結果を確認するために使用した第三の定量法はＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔである。これはオープンソースの分類アルゴリズムであり、Ｒを通り、これは意思決定木を使う。これら分類の木それぞれはデータのブートストラップサンプルを用いて構築され、それぞれの分かれ目で変数の候補集合はランダム部分集合であった。Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔは様々な優位性のいくつかの量を直接返し、分類における変数の関連度合に関係していた。ゆえに、このケースにおいて、それは特定の診断に対する、タンパク質の相対的な重要性の評価を提供した。
【０１３０】
もっとも信頼できる方法は、木の結節における変数の値がランダムに順番を入れ替えたときに分類の正確さが低下することに基づいており、これは変化する重要度の測定であった。変数の重要性の他の評価方法はＧｉｎｉ不純物に基づくものであった。毎回、結節の分かれ目は、親結節よりも小さいその二つの子孫結節の前記Ｇｉｎｉ不純物の指標である変数ｍ上につくった。森のすべての木上のそれぞれの各変数についての前記Ｇｉｎｉの減少を加え合わせたものは、順列の重要性を図る方法としばしば非常に一致する。
【０１３１】
前記マイクロアレイ上のそれぞれのタンパク質スポットの前記相対蛍光単位値は、Ｇｅｎｅｐｉｘ ＰｒｏとＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒによって計算されたとおりに、Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔにインポートした。前記予測モデルをＲパッケージとすべての初期設定を使用して実行し、最良のマイクロアレイ分析結果は除いた。平均のバグによる誤差の計算値がほんの６．６７％であるため、前記アルゴリズムは、上記の評価方法に基づいてタンパク質の重要性を迅速に評価することができた。
【０１３２】
結果
三つの異なる、偏りのない統計方法を使用して、マイクロアレイデータ中の個々の自己抗体の診断上の重要性を評価した、そしてそれらはそれぞれをほぼ完全に反映した。前記３つの結果リストは診断上重要な同じ自己抗体を考慮し、それらを同じ重要性とした。３つすべてに共通する結論は非常に信頼できる。アルツハイマー病の指標として使用できる自己抗体を含む、これらの方法によって決定されたすべてのタンパク質抗原のリストは、下に表７で示した。タンパク質識別番号、オープンリーディングフレーム番号、それぞれのタンパク質に共通の番号、その病状の特定、およびＭー統計によって計算された相対ｐ値が含まれている。
【０１３３】
【表７−１】
2013528799.tif 000038
【０１３４】
【表７−２】
2013528799.tif 000039
【０１３５】
【表７−３】
2013528799.tif 000040
【０１３６】
【表７−４】
2013528799.tif 000041
【０１３７】
【表７−５】
2013528799.tif 000042
【０１３８】
【表７−６】
2013528799.tif 000043
【０１３９】
【表７−７】
2013528799.tif 000044
【０１４０】
【表７−８】
2013528799.tif 000045
【０１４１】
【表７−９】
2013528799.tif 000046
【０１４２】
【表７−１０】
2013528799.tif 000047
【０１４３】
【表７−１１】
2013528799.tif 000048
【０１４４】
【表７−１２】
2013528799.tif 000049
【０１４５】
【表７−１３】
2013528799.tif 000050
【０１４６】
【表７−１４】
2013528799.tif 000051
【０１４７】
【表７−１５】
2013528799.tif 000052
【０１４８】
【表７−１６】
2013528799.tif 000053
【０１４９】
【表７−１７】
2013528799.tif 000054
【０１５０】
【表７−１８】
2013528799.tif 000055
【０１５１】
【表７−１９】
2013528799.tif 000056
【０１５２】
【表７−２０】
2013528799.tif 000057
【０１５３】
【表７−２１】
2013528799.tif 000058
【０１５４】
【表７−２２】
2013528799.tif 000059
【０１５５】
【表７−２３】
2013528799.tif 000060
【０１５６】
【表７−２４】
2013528799.tif 000061
【０１５７】
【表７−２５】
2013528799.tif 000062
【０１５８】
【表７−２６】
2013528799.tif 000063
【０１５９】
【表７−２７】
2013528799.tif 000064
【０１６０】
【表７−２８】
2013528799.tif 000065
【０１６１】
【表７−２９】
2013528799.tif 000066
【０１６２】
【表７−３０】
2013528799.tif 000067
【０１６３】
【表７−３１】
2013528799.tif 000068
【０１６４】
【表７−３２】
2013528799.tif 000069
【０１６５】
【表７−３３】
2013528799.tif 000070
【０１６６】
【表７−３４】
2013528799.tif 000071
【０１６７】
【表７−３５】
2013528799.tif 000072
【０１６８】
【表７−３６】
2013528799.tif 000073
【０１６９】
【表７−３７】
2013528799.tif 000074
【０１７０】
【表７−３８】
2013528799.tif 000075
【０１７１】
【表７−３９】
2013528799.tif 000076
【０１７２】
【表７−４０】
2013528799.tif 000077
【０１７３】
【表７−４１】
2013528799.tif 000078
【０１７４】
【表７−４２】
2013528799.tif 000079
【０１７５】
【表７−４３】
2013528799.tif 000080
【０１７６】
【表７−４４】
2013528799.tif 000081
【０１７７】
【表７−４５】
2013528799.tif 000082
【０１７８】
【表７−４６】
2013528799.tif 000083
【０１７９】
【表７−４７】
2013528799.tif 000084
【０１８０】
【表７−４８】
2013528799.tif 000085
【０１８１】
【表７−４９】
2013528799.tif 000086
【０１８２】
【表７−５０】
2013528799.tif 000087
【０１８３】
【表７−５１】
2013528799.tif 000088
【０１８４】
【表７−５２】
2013528799.tif 000089
【０１８５】
特定された指標の小さな部分集合を使用することにより、ＡＤを非常に効率よく診断することができた。表４に示した２０のタンパク質マイクロアレイ蛍光値を使用してブラインドサンプルをアルツハイマー患者または対照として分類した。次の式を用いて、それぞれの診断指標の閾値を計算した：
【０１８６】
【数４】
2013528799.tif 000090
【０１８７】
診断指標の閾値を越える診断指標の蛍光値は陽性の結果として記録される。表４の抗原を使用した時に、可能性がある２０の診断指標のうちの４つ以上に陽性結果があることは、そのサンプルがアルツハイマー病患者からのものであることを高い確率で示している。可能性がある２０の診断指標のうちの４つ未満の陽性結果は、サンプルが健康な対照からのものであることを高い確率で示している（図１参照）。この診断ロジックを伴う初期の結果は次の通りである：
アルツハイマー病（ＡＤ）対すべての対照
（表４の２０の生物指標）
（図１参照）
Ｎ＝９０（ＡＤ５０，対照４０）
全誤差率：４．４４％
【０１８８】
【表８】
2013528799.tif 000091
【０１８９】
（実施例９）アルツハイマー病の診断
統計的多重分析プログラム（Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ，ＰＡＭ，Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔ）によって非常に重要と評価され、単一基板でよく機能した２０種の抗体とそれぞれの抗原を選択した。前記抗体を表８にリスト化した。
【０１９０】
【表９】
2013528799.tif 000092
【０１９１】
これら２０種の生物標識（表４と表８にリスト化された）と上で説明した単純な診断上のロジックを使用することにより、アルツハイマー病の血清サンプルと対照血清サンプルを９５％以上の効率で識別することができた。
【０１９２】
また表３のうちわずか４つの生物標識を使用することによって正確に診断をすることも可能である。これらの診断指標の診断効率をＡＤ、ミニメンタルステート試験（ＭＭＳＥ）ＡＤ、高ＭＭＳＥ ADについて評価した。結果を以下に示す。
【０１９３】
アルツハイマー病（ＡＤ）対すべての対照
Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔ：
Ｎ＝９０（ＡＤ５０，対照４０）
全誤差率：７．７８％
【０１９４】
【表１０】
2013528799.tif 000093
【０１９５】
マイクロアレイ予測解析（ＰＡＭ）：
Ｎ＝９０（ＡＤ５０，対照４０）
全誤差率：７．８％
【０１９６】
【表１１】
2013528799.tif 000094
【０１９７】
低ＭＭＳＥ ＡＤ対すべての対照
（低ＭＭＳＥ ＡＤサンプルはＭＭＳＥ＜１５である）
Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔ：
Ｎ＝５５（低ＭＭＳＥ ＡＤ１５，対照４０）
全誤差率：７．２６％
【０１９８】
【表１２】
2013528799.tif 000095
【０１９９】
マイクロアレイ予測解析（ＰＡＭ）：
Ｎ＝３０（低ＭＭＳＥ ＡＤ１５，対照１５）
全誤差率：９．９％
【０２００】
【表１３】
2013528799.tif 000096
【０２０１】
高ＭＭＳＥ ＡＤ対すべての対照
（高ＭＭＳＥ ＡＤ，対照４０）
全誤差率：１０．６７％
【０２０２】
【表１４】
2013528799.tif 000097
【０２０３】
マイクロアレイ予測解析（ＰＡＭ）：
Ｎ＝７０（高ＭＭＳＥ ＡＤ３５，対照３５）
全誤差率：１２．８％
【０２０４】
【表１５】
2013528799.tif 000098
【０２０５】
表３と５にリストされた生物標識の組合せ（全部で９個の診断指標）を用い、ＡＤとパーキンソン病の診断の効率の評価も実施した。結果を以下に示した。
【０２０６】
アルツハイマー病（ＡＤ）対パーキンソン病（ＰＫ）
Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔ：
Ｎ＝７９（ＡＤ２９，対照２９）
全誤差率：１２．０７％
【０２０７】
【表１６】
2013528799.tif 000099
【０２０８】
マイクロアレイ予測解析（ＰＡＭ）：
Ｎ＝５８（ＡＤ２９，対照２９）
全誤差率：１２．０％
【０２０９】
【表１７】
2013528799.tif 000100
【０２１０】
表４の２０種の抗原を使用すると９５％以上の正確性をもって、また表３の４種の抗体を使用すると９０％以上の正確性を持って、ＡＤと対照を識別することができると断定されたが、わずかこれら４種の指標ではアルツハイマー病と、パーキンソン病のような他の神経変性疾患の正確な識別は可能とならなかった。正確な識別には表５の抗原を含むことが必要である。しかし、実際には、この識別はしばしば必要とされない、というのはアルツハイマーと疑われる疾患を有する患者は記憶および認知障害を有している一方、初期のパーキンソン病患者には認知および／または記憶障害の訴えを伴わない震えがもっともよくみられるためである。
【０２１１】
ここに引用したすべての参考文献はそれらの全体を参照することにより組み込まれている。
【図１】
2013528799.tif 000101
【国際調査報告】
2013528799.tif 000102