(57)【要約】本発明は、シグナルペプチドをコードするセクション、異種性の酸化還元因子再生ポリペプチドを含むセクション、プロテアーゼ検出部位を含む随意のセクション、膜貫通リンカーをコードするセクション、およびオートトランスポーターのトランスポータードメインまたはそのバリアントをコードするセクションを含む、核酸分子に関する。核酸分子は、酸化還元因子再生酵素の発現を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構成要素：
（１）シグナルペプチドをコードするセグメント、
（２）異種性の酸化還元因子再生ポリペプチドを含むセグメント、
（３）随意に、プロテアーゼ認識部位をコードするセグメント、
（４）膜貫通リンカーをコードするセグメント、および
（５）オートトランスポーターまたはそのバリアントのトランスポータードメインをコードするセグメント
を含む、核酸分子。
【請求項２】
酸化還元因子再生ポリペプチドにより再生される酸化還元因子が、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ２、ヘム、金属イオン、グルタチオン、ピロロキノリン−キノン、リン酸ピリドキサール、チアミンピロリン酸およびアスコルベートを含む群より選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
酸化還元因子再生ポリペプチドが、１または２以上のフラビン補助因子を含む、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
酸化還元因子再生ポリペプチドが、ＮＡＤＨオキシダーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼを含む群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
酸化還元因子を再生するポリペプチドが、Lactobacillus brevis、Thermus thermophilus、Thermus aquaticus、Brevibacterium sp. KU139およびStreptococcus faecalisのＮＡＤＨオキシダーゼ、好ましくはLactobacillus brevisのＮＡＤＨオキシダーゼ、およびそのバリアントを含む群より選択される、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
オートトランスポーターのトランスポータードメインが、Ssp、Ssp-h1、Ssp-h2、PspA、PspB、Ssa1、SphB1、AspA/NalP、VacA、AIDA-I、IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA、AutA、Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、EspI、EaaA、EaaC、パータクチン、BrkA、Tef、Vag8、PmpD、Pmp20、Pmp21、AgA1プロテアーゼ、App、Hap、rOmpA、rOmpB、ApeE、EstA、Lip-1、McaP、BabA、SabA、AlpA、Aae、NanBおよびそのバリアントを含む群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
酸化還元因子再生ポリペプチドが酸素感受性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリペプチドを、その表面上に発現するか、または、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子を用いて形質転換された、細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞から得られる膜画分。
【請求項１１】
酸化還元因子を再生する方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項８に記載のポリペプチド、請求項１０に記載の膜調製品または請求項９に記載の細胞を提供すること、
（ｂ）請求項８に記載のポリペプチド、請求項１０に記載の膜調製品または請求項９に記載の細胞を、酸化還元因子を再生するポリペプチドの１または２以上の基質と接触させること、
ここで、１つの基質または幾つかの基質は、酸化還元因子を含む、
を含む、前記方法。
【請求項１２】
酸化還元因子の再生のための、請求項９に記載の細胞の、または請求項１０に記載の膜調製品の、または請求項８に記載のポリペプチドの、使用。
【請求項１３】
好ましくは水溶液を脱酸素することによる、該水溶液の酸化還元環境の調整のための、請求項９に記載の細胞の、または請求項１０に記載の膜調製品の、または請求項８に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１４】
その表面上に酸化還元因子再生ポリペプチドをディスプレイする細胞を生産するための方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸を細胞に導入すること、
（ｂ）随意に、前記細胞を、１または２以上の酸化還元反応性補欠分子族と接触させること
を含む、前記方法。
【請求項１５】
酸化還元因子依存的酵素の産物を生産する方法であって、以下の工程：
（ａ）酸化還元因子依存的酵素を提供すること、
（ｂ）請求項９に記載の細胞、請求項１０に記載の膜調製品または請求項８に記載のポリペプチドを提供すること、および
（ｃ）請求項９に記載の細胞、請求項１０に記載の膜調製品または請求項８に記載のポリペプチドの存在下において、酸化還元因子依存的酵素をその基質の１または２以上と接触させること、
ここで、請求項９に記載の細胞、請求項１０に記載の膜調製品または請求項８に記載のポリペプチドは、酸化還元因子依存的ポリペプチドが依存する酸化還元因子を再生するポリペプチドを含む、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（１）シグナルペプチドをコードするセグメント、（２）異種性の酸化還元因子再生ポリペプチドまたはそのバリアントをコードするセグメント、（３）随意に、プロテアーゼ認識部位をコードするセグメント、（４）膜貫通リンカーをコードするセグメント、および（５）オートトランスポーターまたはそのバリアントのトランスポータードメイン（autotransporter）をコードするセグメントを含む核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
全ての既知の酵素の約４分の１は、酸化還元酵素である。この群の酵素について、アルコール、アルデヒドおよびアミノ酸などのキラル化合物の合成、ポリマーの生産および修飾、最も変化に富んだ用途のためのバイオセンサーの生産、および有害物質の分解を含む、広範な用途が既に調査されている。酸化還元酵素の特徴は、それらが少なくとも１のポリペプチド鎖のみならず、１または２以上の酸化還元反応性基をも含み、これは、１または２以上の酸化還元反応性アミノ酸側鎖または補欠分子族であってもよいことである。
【０００３】
酸化還元酵素の基質は、代謝物および酸化還元因子を含む。酵素の補欠分子族と対照的に、これらの基質である酸化還元因子は、触媒としては作用せず、化学量論的な量において反応に参加し、他の基質と共に化学反応中に入る。酸化還元因子が、一般に、他の有機基質よりもはるかに高価であるという事実を考慮すると、酸化還元酵素を用いた工業的合成の実行可能性は、還元または酸化された好適な因子を提供する必要性のために限定される。この問題を解決するために、科学者らは、酸化還元因子を再生する酵素を用いることを提案して来た。例えば、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）およびＮＡＤＨオキシダーゼの使用またはグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の使用が、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの再生のために提案されている。大量のポリペプチドを繰り返し精製する必要性を避けるために、かかる酵素を数回の触媒作用サイクルのために好適なキャリア上に固定化することが可能な筈である。
【０００４】
残念ながら、酸化還元因子再生酵素は、特にそれらが固定化された酵素の形態である場合に、しばしば不安定である。
【０００５】
Sanjustら（1997年）は、Thermus aquaticusからのＮＡＤＨオキシダーゼを、多様なキャリア上に固定化し、可溶性の酵素と固定化された酵素との動力学的特性を比較した。固定化された酵素が、可溶性の酵素より低い熱安定性を有することが見出された。HummelおよびRiebel（2003年）は、ＮＡＤＨオキシダーゼを再生するための、Lactobacillus brevisから精製された可溶性のＮＡＤＨオキシダーゼの使用を記載する。彼らは、当該酵素が、迅速な酸化的不活化に向かう傾向を有し、これはおそらく、タンパク質の触媒作用の中心における酸化に対して感受性のあるシステイン残基の存在に起因することを示す。したがって、還元剤（１ｍＭのＤＴＴまたはメルカプトエタノール）の使用が、酵素の触媒能力を維持するために重要なこととして記載される。AhmedおよびClaiborne（1992年）は、Streptococcus faecalis 10C1からＦＡＤ含有ＮＡＤＨオキシダーゼを精製し、ホロ−オキシダーゼ（holo-oxidase）を安定化するために２ｍＭのＤＴＴの存在が必要であることを教示する。El-Zahabら（2004年）（LeeおよびPing（2007）により検証されている）は、酸化還元因子再生酵素、例えばグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の、固体支持体上、狭義にはナノ多孔性シリカガラス上への固定化を記載する。彼らは、しかし、どのようにして前記酵素を安定化し得るかについては記載していない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、プラスミドpAT-NOxの制限酵素地図を示す。
【図２】図２は、ＳＤＳゲルを示し、これは、E. coliの外膜におけるNADHオキシダーゼおよびホールセル消化を通した方向を示す。Ｍ）分子量標準；１）E. coli UT5600（DE3）；２）E. coli UT5600（DE3）pAT-NOx、誘導されていないもの；３）E. coli UT5600（DE3）pAT-NOx、誘導されたもの；４）E. coli UT5600（DE3）pAT-NOx、誘導され、プロテイナーゼＫにより消化されたもの；５）E. coli UT5600（DE3）pAT-NOx、誘導され、トリプシンにより消化されたもの。
【０００７】
【図３】図３は、各々の場合において１ｈの誘導後の、Ａ）E. coli UT5600（DE3）pAT-NOx、およびＢ）E. coli BL21（DE3）pAT-NOxを用いたＮＡＤＨオキシダーゼアッセイの後の上清の吸光スペクトルを示す。
【図４】図４は、各々の場合において４ｈの誘導後の、Ａ）E. coli UT5600（DE3）pAT-NOx、およびＢ）E. coli BL21（DE3）pAT-NOxを用いたＮＡＤＨオキシダーゼアッセイの後の上清の吸光スペクトルを示す。
【０００８】
【図５】図５は、各々の場合において２０ｈの誘導後の、Ａ）E. coli UT5600（DE3）pAT-NOx、およびＢ）E. coli BL21（DE3）pAT-NOxを用いたＮＡＤＨオキシダーゼアッセイの後の上清の吸光スペクトルを示す。
【図６】図６は、マイクロタイタープレート上で、Ｍ９培地中で培養後のE. coli BL21（DE3）pAT-NOxを用いて行われたＮＡＤＨオキシダーゼアッセイの結果を示す。図は、３４０ｎｍにおける消光の経時的な減少を示す。
【０００９】
【図７】図７は、７週間より長く＋８℃において保存されていたNOXホールセル生体触媒についての結果を示す。保存前の細胞［Ａ］、ならびに１週間［Ｂ］、２週間［Ｃ］、３週間［Ｄ］、４週間［Ｅ］、５週間［Ｆ］、６週間［Ｇ］および７週間［Ｈ］にわたり保存されていた細胞を用いて活性アッセイを行った。
【００１０】
【図８】図８は、７週間より長く−１８℃において保存されていたNOXホールセル生体触媒についての結果を示す。保存前の細胞［Ａ］、ならびに１週間［Ｂ］、２週間［Ｃ］、３週間［Ｄ］、４週間［Ｅ］、５週間［Ｆ］、６週間［Ｇ］および７週間［Ｈ］にわたり保存されていた細胞を用いて活性アッセイを行った。
【００１１】
【図９】図９は、７週間より長く−７０℃において保存されていたNOXホールセル生体触媒についての結果を示す。保存前の細胞［Ａ］、ならびに１週間［Ｂ］、２週間［Ｃ］、３週間［Ｄ］、４週間［Ｅ］、５週間［Ｆ］、６週間［Ｇ］および７週間［Ｈ］にわたり保存されていた細胞を用いて活性アッセイを行った。
【００１２】
【図１０】図１０は、安定性アッセイのために７週間より長くにわたり保存されていた試料中の細胞カウントの決定を示す。これは、−１８℃（■）において保存されていた試料における細胞カウントの減少、ならびに＋８℃（・）において保存されていた試料、および−７０℃（▲）において保存されていた試料における細胞カウントの減少を示す。細胞カウントを決定するために、保存された部分試料から５０μｌを取得し、連続希釈を準備するために用いた。１０−９および１０−１０希釈の各々の５０ｍｌを、３０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上に播種した。プレートを、３７℃において終夜インキュベートし、翌日コロニーをカウントした。細胞カウント／ｍｌを、コロニー形成単位の数に基づいて計算した。
【００１３】
【図１１】図１１は、周期的に５回繰り返されたアッセイにおけるNOXホールセル生体触媒のリサイクル性（recyclability）を示す。◆＝宿主株E. coli BL21（DE3）、■＝E. coli BL21（DE3）pAT-NOx。狭義においては、第１［Ａ］、第２［Ｂ］、第３［Ｃ］、第４［Ｄ］および第５［Ｅ］のサイクルにおけるＮＡＤＨの濃度の減少の測光法による決定が示される。
【００１４】
【図１２】図１２は、生体触媒であるE. coli BL21（DE3）pAT-NOxを用いるＮＡＤ＋の再生、狭義においては、ホールセル生体触媒であるE. coli BL21（DE3）pAT-NOx（■）による、および再生系（・）における、ＮＡＤＨの転換を示す。E. coli BL21（DE3）pAT-NifAf（Δ）を、対照として用いた。ＮＡＤＨの消光を、３４０ｎｍにおいてモニタリングした。細胞の消光を、５９０ｎｍにおいてモニタリングした。評価は、差Ｅ３４０−Ｅ５９０を計算することにより行った。ＡＬＤＨは６０ｍＵ、細胞はＯＤ１であり、２００μＭのＮＡＤＨを用いて反応を開始させた。
【００１５】
【図１３】図１３は、ＮＡＤ＋の再生、狭義においては、特にＡＬＤＨ反応の間のまたはE. coli BL21（DE3）pAT-NOxを用いるＡＬＤＨ反応の間の、３４０ｎｍにおける経時的な消光の関数としてのＮＡＤＨの濃度を示す。細胞カウントに相対的な比率Ｅ３４０／Ｅ５９０を計算することにより、ＮＡＤＨの濃度を正規化した。ＡＬＤＨは３０ｍＵ、E. coli BL21（DE3）pAT-NOxはＯＤ５、E. coli BL21（DE3）はＯＤ１であり、４００μＭのＮＡＤ＋を用いて反応を開始させた。
【発明の概要】
【００１６】
したがって、本発明の目的は、酸化還元因子再生活性を有する剤を提供することであって、ここで、その活性の供給源は、基質分子にとって容易にアクセス可能であるのみならず、数回の触媒工程を可能にするために、繰り返し新たな剤を生産することを必要とすることなく、容易に増幅、リサイクルおよび再生することができる。本発明の別の目的は、それ自体において、または阻害性の金属イオンなどの潜在的に不活化する化学物質の存在下において、または酸性もしくは塩基性のｐＨにおいて、対応する酵素の元の形態より、動力学、熱安定性、貯蔵能力および安定性に関して優れた特性を有する酸化還元因子再生活性を有する剤を提供することである。本発明の特定の目的は、酸素もしくは酸素放出剤の存在下において、または酸化条件下において、安定な酸化還元因子再生活性を示す剤であって、その安定性が対応する酵素の下の形態のものよりも優れているものを提供することである。
【００１７】
本発明者らは、驚くべきことに、オートトランスポーター系を用いることにより、ホールセルの表面上およびそれら自体の中に酸化還元因子再生酵素を発現させることができること、それらが酸素の存在ならびに多様な温度および条件に関して驚くほどに安定であることを見出した。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、酸化還元因子再生酵素は、多様な溶液および緩衝化剤中において多様な条件下において、インキュベートされて、極めて長時間にわたり安定性を維持することができることを見出した。
【００１８】
オートディスプレイ（autodisplay）は、細菌の表面上に組換えタンパク質を提示させるための洗練されたツールである。この発現系は、Ｖ型分泌系に属するオートトランスポーターのタンパク質ファミリーの分泌機構に基づく。
【００１９】
グラム陰性細菌において、オートトランスポーター経路は、細胞表面へのタンパク質の輸送のため、および細胞外空間へのタンパク質の分泌のために形成される（JoseおよびMeyer、2007年）。オートトランスポータータンパク質は、前駆体タンパク質として合成され、これは、細胞表面への輸送のための全ての構造的要求を満たす（Jose、2006年）。それらは、Ｎ末端シグナルペプチドと共に合成され、これはＳｅｃ経路の典型であり、これが内膜を超えることを可能にする。シグナルペプチドのトランケーションの後で周辺質の内部に入った後、前駆体のＣ末端部分は、ポリン様構造、いわゆるβバレルとして該膜中へ折りたたまれる。この孔を通して、Ｎ末端に結合したパッセンジャードメインは、表面へ移動される（Joseら、2002年）。そこで、それは、タンパク質自己分解により（autoproteolytically）、またはさらなるプロテアーゼにより、切断される場合もあり、または細胞のエンベロープ上にトランスポータードメインを介してアンカリングされたままである場合もある。天然のパッセンジャーを組換えタンパク質で置き換えることは、その表面移動をもたらす。このために、遺伝子操作技術を用いて、表面への無制限のアクセスのために必要な、シグナルペプチド、組換えパッセンジャー、βバレルおよびその間のリンカー領域からなる非天然の前駆体を構築することが必要である。この方法において、AIDA-Iオートトランスポーターが、多様なパッセンジャードメインの効率的な表面ディスプレイのために既に首尾よく用いられている（Hendersonら、2004）。オートディスプレイ系により、活性酵素上でのサブユニットの自己会合、例えば２量体酵素ソルビトールデヒドロゲナーゼによるものが観察されている（Jose、2002年；Joseおよびvon Schwichow、2004年）。
【００２０】
特に、オートディスプレイ技術は、E. coliおよび他のグラム陰性細菌の外膜の表面上での特定のタンパク質のための発現の方法であり、ここで、オートディスプレイ系は、オートトランスポータータンパク質の天然の分泌機構に基づく（A. Banerjeeら（2002））。組換えパッセンジャータンパク質の輸送は、単純に、通常の遺伝子操作技術を用いての、リーディングフレームにおける、オートディスプレイベクターのシグナルペプチドと移動ドメイン（translocating domain）との間への、そのコード配列の挿入により行われてもよい。シグナルペプチドは、コレラトキシンのサブユニットから得てもよく、それを非天然のプロモーターと組み合わせてもよい。その結果として、外膜を通して移動されるべきパッセンジャータンパク質は、E. coli（AIDA-I）の外膜上に、オートトランスポーターと称される別のタンパク質との組換え融合タンパク質として発現される（Jose、2006年）。オートトランスポータータンパク質のＣ末端部分は、E. coliの外膜内でポリン様構造（βバレル）を形成する。このポリン様構造が、組換えパッセンジャータンパク質がE. coliの外膜の表面へ移動することを可能にする（Jose、1995年、2006年、2007年）。
【００２１】
酸化還元補因子再生ポリペプチドの固定化の概念は、SarborskyおよびOgletreeが、その炭水化物残基の活性化を介したグルコースオキシダーゼの固定化を記載した1974年までさかのぼる。Joseら（1995年）により初めて記載されたオートディスプレイ系の概念もまた、１５年以上にわたり知られている。しかし、酸化還元因子再生酵素の固定化のためのオートトランスポーター系の使用は、本発明者らの知識の及ぶ限りにおいて、先行技術により教示も提案もなされていない。
【００２２】
本発明の目的は、独立クレームの対象物により解決される。好ましい態様は、従属クレームにおいて見出すことができる。
【００２３】
本発明の目的は、第１の側面（これはさらに第１の側面の第１の態様である）によれば、（１）シグナルペプチドをコードするセグメント、（２）異種性の酸化還元因子再生ポリペプチドまたはそのバリアントを含むセグメント、（３）随意に、プロテアーゼ認識部位をコードするセグメント、（４）膜貫通リンカーをコードするセグメント、および（５）オートトランスポーターまたはそのバリアントのトランスポータードメインをコードするセグメントを含む核酸分子により解決される。
【００２４】
本発明の好ましい態様において、核酸分子は、発現調節配列に機能的に連結する。好ましい態様において、用語「発現調節配列」は、ここで用いられる場合、好ましくは発現調節配列の下流において、核酸分子の発現レベルを調節することができる核酸配列を指す。発現調節配列は、例えばプロモーターであってもよい。当業者は、発現を調節するために好適な配列、およびこれらの配列を核酸分子に機能的に連結させるための方法に精通している。
【００２５】
本発明の好ましい態様において、核酸分子は、組換えプラスミドの一部である。好ましい態様において、核酸分子は、配列番号１またはそのバリアントを含む。
【００２６】
本発明の好ましい態様において、用語「異種性」は、ここで用いられる場合、遺伝子操作技術を用いて、例えば、発現調節配列と、通常ではこの発現調節配列の制御下にはない発現されるべき配列とを一緒に連結することにより、または元の配列に対して点変異を有する配列を用いることにより構築された核酸を指す。コンストラクトの１つのセグメントのみが異種性として指定された場合であっても、このことは、その結果として、全コンストラクトが異種性であるという意味を含む。当業者は、遺伝子操作技術に精通している。別の好ましい態様において、用語「異種性」は、ここで用いられる場合、発現調節配列に連結するポリペプチドをコードする核酸、および／または融合した配列であって、発現調節配列とは異なる生物に由来し、発現されるべきであるものを指す。別の好ましい態様において、用語「異種性」は、酸化還元因子再生ポリペプチドとの関連においてここで用いられる場合、酸化還元因子再生ポリペプチドをコードする核酸セグメントが、トランスポータードメインまたは発現調節配列または膜貫通リンカーなどの少なくとも１のさらなるセグメントとして、別の生物から得られたか取得されたことを意味する。例えば、酸化還元因子再生ポリペプチドは、それがLactobacillus brevisから得られたが、全ての他の配列はE. coliから得られた場合、異種性である。別の好ましい態様において、用語「異種性」は、ここで用いられる場合、異種性であると指定される核酸配列は、この核酸配列の発現または増幅のために用いられる宿主または意図される宿主と異なる生物に由来する。
【００２７】
本発明の好ましい態様において、用語「シグナルペプチド」は、ここで用いられる場合、アミノ酸配列、好ましくはポリペプチドのＮ末端におけるアミノ酸配列であって、当該ポリペプチドが、それが宿主細胞の細胞質中で発現される場合、細胞の特定の区画、好ましくは細胞質とは異なる区画へ移動される効果を有するものを指す。特に好ましい態様において、宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞であり、シグナルペプチドは、形成中または完成したポリペプチドが、グラム陰性細菌細胞の周辺質または外膜へ移動する効果を有する。
【００２８】
本発明の好ましい態様において、用語「プロテアーゼ認識部位」は、ここで用いられる場合、ポリペプチド中の特定のアミノ酸配列モチーフを指し、ここで、前記プロテアーゼのこの配列モチーフは、ポリペプチドに結合してこれを切断するように、特異的に認識される。
【００２９】
本発明の好ましい態様において、用語「膜貫通リンカー」は、ここで用いられる場合、可橈性のポリペプチドセグメントであって、オートトランスポータードメインを酸化還元因子再生ポリペプチドに連結させるために役立つものであるが、酸化還元因子再生ポリペプチドの独立した折りたたみおよび／または輸送を可能にするために十分に可橈性であるものを指す。
【００３０】
本発明の好ましい態様において、用語「オートトランスポーターのトランスポータードメイン」とは、核酸分子の発現産物が、これが細胞内で、好ましくは細菌の細胞質において、リボゾームにより合成され、細胞の外膜に、好ましくは外膜の細胞の周囲に露出した側面に移動される場合に、これを得るために用いることができるドメインを指す。特に好ましい態様において、トランスポータードメインは、前記発現産物が外膜の外側の表面上に配置されるという効果を有する。本発明の好ましい態様において、オートトランスポーターのトランスポータードメインは、細胞の外膜上に位置するタンパク質であり、ＮＡＤＨオキシダーゼをコードするセグメントは、トランスポータードメインのあるドメイン、ループもしくは何らかの他の部分の一部であるか、またはそれに融合しており、それにより、ＮＡＤＨオキシダーゼは、細胞の表面上に提示される。本発明の別の好ましい態様において、オートトランスポーターのトランスポータードメインは、ポリペプチドを細胞の表面上にディスプレイするために用いることができる系のタンパク質である。特に好ましい態様において、トランスポータードメインは、AIDA-I型のグラム陰性細菌細胞の、オートトランスポーター経路としても指定される、オートディスプレイ系のトランスポータードメインである。
【００３１】
好ましい態様において、アミノ酸または核酸配列のバリアントは、本出願において、本発明の文脈において、例えば名称もしくは寄託番号により、または用語「〜のバリアント」により明示的に、または、例えば機能の記載により黙示的に言及される。好ましい態様において、用語「バリアント」は、ここで用いられる場合、参照物として用いられるアミノ酸に６０、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるアミノ酸または核酸配列を含む。好ましい態様において、用語「バリアント」は、アミノ酸配列に関して、参照配列に対して１つの保存的アミノ酸置換または幾つかの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、用語、アミノ酸配列または核酸配列の「バリアント」は、アミノ酸配列または核酸配列の活性セグメントおよび／またはフラグメントを含む。好ましい態様において、用語「活性セグメント」は、ここで用いられる場合、全長のアミノ酸または核酸配列よりも短いが、なお必須の生物学的活性、例えばＮＡＤＨオキシダーゼとしての少なくとも一部を有する、アミノ酸配列または核酸配列を指す。好ましい態様において、用語、核酸の「バリアント」は、好ましくはストリンジェントな条件下において参照の核酸配列にハイブリダイズする、相補鎖の核酸を含む。ハイブリダイズ反応のストリンジェンシーは、当業者により、容易に決定することができ、通常は、プローブの長さ、洗浄温度および塩濃度の関数としての実験により計算したものである。一般に、完全なアニーリングのために、より長いプローブは、より高い温度を必要とし、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイズは、一般に、相補鎖がその鎖の融点よりも低い温度を有する環境にある場合、変性したＤＮＡの再生能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相補性の程度が高いほど、適用することができる相対的温度は高くなる。したがって、より高い相対的温度は、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、一方、より低い温度は、このストリンジェンシーを減少させる。ハイブリダイズ反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明は、Ausubelら（1995）において見出すことができる。別の好ましい態様において、用語、核酸またはアミノ酸の「バリアント」とは、少なくともある程度まで、参照の核酸またはアミノ酸と同じ生物学的活性および／または機能を有する核酸またはアミノ酸を指す。好ましい態様において、用語、核酸配列の「バリアント」とは、ここで用いられる場合、参照アミノ酸配列と類似のアミノ酸配列をコードする別の核酸配列を指す。
【００３２】
本発明の好ましい態様において、用語「酸化還元因子」とは、ここで用いられる場合、酸化還元反応性である、すなわち、生理学的条件下において酸化または還元され得る有機化合物を指す。好ましい態様において、酸化還元因子は、何らの酸化還元反応性アミノ酸側鎖をも含まない。好ましい態様において、酸化還元因子は、遊離の酸化還元因子であり、すなわち、ペプチドのフレームまたはペプチドに共有結合していない。
【００３３】
好ましい態様において、酸化還元因子は、０．８５以下（すなわち、高くとも０．６Ｖ）、０．５、０．４、０．２、０、−０．１、−０．１５、−０．２、−０．２５、−０．３または−０．４Ｖの、標準的な還元電位を有する。特に好ましい態様において、酸化還元因子は、−０．３２５〜−０．２Ｖの標準的な還元電位を有する。ことさらに特に好ましい態様において、酸化還元因子は、−０．３５〜−０．３の標準的な還元電位を有する。
【００３４】
好ましい態様において、用語「酸化還元因子再生ポリペプチド」とは、ここで用いられる場合、酸化還元因子の再生を触媒するポリペプチドを指す。好ましい態様において、用語「酸化還元因子を再生する」とは、ここで用いられる場合、その還元された形態において化学合成における還元剤として作用する酸化された酸化還元因子を還元するための能力、または、その酸化された形態において化学合成における酸化剤として作用する還元された酸化還元因子を酸化するための能力を指す。別の好ましい態様において、用語「酸化還元因子を再生する」とは、ここで用いられる場合、酸化還元因子の酸化還元する前の状態、好ましくは酸化還元因子が基質として用いられる目的の合成物のためにそれを用いることができる状態への復活を指す。例えば、反応において消費されるＮＡＤ＋は、ＮＡＤＨをＮＡＤ＋へ酸化することにより再生することができる。
【００３５】
本発明の第１の側面の第２の態様（これはまた、第１の態様の一態様を表わす）において、酸化還元因子再生ポリペプチドにより再生される酸化還元因子は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ２、ヘム、金属イオン、グルタチオン、ピロロキノリン−キノン（ＰＱＱ）、リン酸ピリドキサール、チアミンピロリン酸およびアスコルベートを含む群より選択される。金属イオンとして、限定されないが、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｍｎ、ＣｒおよびＭｇイオンが挙げられる。
【００３６】
好ましい態様において、前述の酸化還元因子の各々は、一方の形態のみが明示的に言及された場合であっても、酸化および還元された形態の両方、または対応する共役する酸化還元対の形態、例えば酸化還元因子ＮＡＤＨの場合はＮＡＤＨおよびＮＡＤ＋の両方を有する。
【００３７】
本発明の第１の側面の第３の態様（これはまた、第１および第２の態様の一態様を表わす）において、酸化還元因子再生ポリペプチドは、１または２以上のフラビン補因子を含む。
【００３８】
好ましい態様において、用語「フラビン補因子」は、ここで用いられる場合、イソアロキサジン環系に基づく酸化還元反応性補因子を指す。好ましい態様において、フラビン補因子は、その酸化および還元形態の両方における、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびフラビン−アデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を含む群より選択される。
【００３９】
本発明の第１の側面の第４の態様（これはまた、第１〜第３の態様の一態様を表わす）において、酸化還元因子再生ポリペプチドは、ＮＡＤＨオキシダーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含む群より選択される。
【００４０】
本発明の第１の側面の第５の態様（これはまた、第１〜第４の態様の一態様を表わす）において、酸化還元因子再生ポリペプチドは、属Lactobacillus、Thermus、BrevibacteriumおよびStreptococcusからのNADHオキシダーゼ、好ましくはLactobacillus brevisのＮＡＤＨオキシダーゼ、およびそのバリアントを含む群より選択される。
【００４１】
本発明の第１の側面の第６の態様（これはまた、第１〜第５の態様の一態様を表わす）において、オートトランスポーターのトランスポータードメインは、Ssp、Ssp-h1、Ssp-h2、PspA、PspB、Ssa1、SphB1、AspA/NalP、VacA、AIDA-I、IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA、AutA、Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、EspI、EaaA、EaaC、パータクチン、BrkA、Tef、Vag8、PmpD、Pmp20、Pmp21、AgA1プロテアーゼ、App、Hap、rOmpA、rOmpB、ApeE、EstA、Lip-1、McaP、BabA、SabA、AlpA、Aae、NanBおよびそのバリアントを含む群より選択される。
【００４２】
本発明の別の好ましい態様において、用語「オートトランスポーターのトランスポータードメイン」は、ここで用いられる場合、前記のタンパク質がトランスポータードメインのアミノ酸配列中に挿入されているかまたはこれと融合されている場合、細胞の表面上のトランスポータードメイン、特に、酸化還元因子再生ポリペプチドとは異なるポリペプチドをディスプレイするドメインを含む。
【００４３】
好ましくは、酸化還元因子再生ポリペプチドは、オートトランスポーターのトランスポータードメインと融合している。本発明によるオートトランスポーターのトランスポータードメインは、オートトランスポーターの任意のトランスポータードメインであってよく、好ましくは、β−バレル構造を形成することができる。β−バレル構造の詳細な記載およびβ−バレルオートトランスポーターの好ましい例は、WO 97/35 022において開示され、参照により本記載の部分を形成する。Hendersonら（2004年）は、好適なオートトランスポータードメインを有するオートトランスポータータンパク質を記載する（要約は、Hendersonら（2004年）の表１において示される）。Hendersonら（2004年）の開示は、参照により本記載の部分を形成する。例えば、オートトランスポーターのトランスポータードメインは、以下から選択することができる：Ssp（P09489、S. marcescens）、Ssp-h1（BAA33455、S. marcescens）、Ssp-h2（BAA11383、S. marcescens）、PspA（BAA36466、P. fluorescens）、PspB（BAA36467、P. fluorescens）、Ssa1（AAA80490、P. haemolytica）、SphB1（CAC44081、B. pertussis）、AspA/NalP（AAN71715、N. meningitidis）、VacA（Q48247、H. pylori）、AIDA-I（Q03155、E. coli）、IcsA（AAA26547、S. flexneri）、MisL（AAD16954、S. enterica）、TibA（AAD41751、E. coli）、Ag43（P39180、E. coli）、ShdA（AAD25110、S. enterica）、AutA（CAB89117、N. meningitidis）、Tsh（I54632、E. coli）、SepA（CAC05786、S. flexneri）、EspC（AAC44731、E. coli）、EspP（CAA66144、E. coli）、Pet（AAC26634、E. coli）、Pic（AAD23953、E. coli）、SigA（AAF67320、S. flexneri）、Sat（AAG30168、E. coli）、Vat（AAO21903、E. coli）、EpeA（AAL18821、E. coli）、EatA（AAO17297、E. coli）、EspI（CAC39286、E. coli）、EaaA（AAF63237、E. coli）、EaaC（AAF63038、E. coli）、パータクチン（P14283、B. pertussis）、BrkA（AAA51646、B. pertussis）、Tef（AAQ82668、B. pertussis）、Vag8（AAC31247、B. pertussis）、PmpD（O84818、C. trachomatis）、Pmp20（Q9Z812、C. pneumoniae）、Pmp21（Q9Z6U5、C. pneumoniae）、IgA1プロテアーゼ（NP_283693、N. meningitidis）、App（CAC14670、N. meningitidis）、IgA1プロテアーゼ（P45386、H. influenzae）、Hap（P45387、H. influenzae）、rOmpA（P15921、R. rickettsii）、rOmpB（Q53047、R. rickettsii）、ApeE（AAC38796、S. enterica）、EstA（AAB61674、P. aeruginosa）、Lip-1（P40601、X. luminescens）、McaP（AAP97134、M. catarrhalis）、BabA（AAC38081、H. pylori）、SabA（AAD06240、H. pylori）、AlpA（CAB05386、H. pylori）、Aae（AAP21063、A. actinomycetemcomitans）、NanB（AAG35309、P. haemolytica）およびこれらのオートトランスポーターのバリアント。オートトランスポータータンパク質の例の各々について、オートトランスポーターを得ることができる好適なGenBank寄託番号および種の例を、丸括弧内に示す。オートトランスポーターのトランスポータードメインは、好ましくはE. coliのAIDA-Iタンパク質またはそのバリアント、例えば、Niewertら（2001年）により記載されたものである。AIDAオートトランスポーター系は、浮腫病およびいわゆる離乳後と診断されたブタからのE. coli分離株においてF18およびtx2eに連結される。
【００４４】
上で示されるオートトランスポーター配列のバリアントは、例えば、膜貫通セグメントに属さないβ−バレルのループ構造におけるアミノ酸配列を改変することにより、得ることができる。随意に、表面ループをコードする核酸を、全体的に欠失させてもよい。さらに、両親媒性のβ−プリーツシート構造内で、保存的アミノ酸置換、すなわち、親水性アミノ酸の別の親水性アミノ酸への置換および／または疎水性アミノ酸の別の疎水性アミノ酸への置換を行ってもよい。好ましくは、バリアントは、アミノ酸レベルにおいて、対応する天然に存在するオートトランスポータードメインの配列と、特にβ−プリーツシート構造の領域において、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【００４５】
本発明の第１の側面の第７の態様（これはまた、第１〜第６の態様の一態様を表わす）において、酸化還元因子再生ポリペプチドは、酸素感受性である。好ましい態様において、用語「酸素感受性」は、ここで用いられる場合、対応するポリペプチドは、対応するポリペプチドが、好ましくは通常の、すなわち大気中で生じる濃度における酸素の存在下において、迅速に非活性化されることを意味する。さらに好ましい態様において、用語「酸素感受性」は、ここで用いられる場合、対応するポリペプチドが、溶液中および他の相の両方において、大気中での濃度または条件下における酸素に、少なくとも３０分間にわたり露出された場合、好ましくはそのｋｃａｔに関して、その活性の少なくとも１０、２０、３０、４０、好ましくは５０、ことさら特に好ましくは８０％を失う。
【００４６】
別の態様において、酸化還元因子再生ポリペプチドは、可溶性ポリペプチドである。好ましい態様において、用語「可溶性ポリペプチド」は、ここで用いられる場合、その天然の環境において膜に結合していないポリペプチドを指す。例えば、細胞質性タンパク質であるLactobacillus brevisのＮＡＤＨオキシダーゼは、可溶性ポリペプチドである。別の好ましい態様において、酸化還元因子再生ポリペプチドは、膜結合ポリペプチド、すなわち、細胞膜または膜内在性タンパク質に共有的または非共有的に結合または接着したポリペプチドである。例えば、呼吸鎖の複合体ＩＶは、膜結合ポリペプチドである。
【００４７】
第２の側面によれば、本発明の目的は、本発明の第１の側面の一態様による核酸分子によりコードされるポリペプチドにより解決される。好ましい態様において、ポリペプチドは、配列番号２またはそのバリアントを含む。
【００４８】
第３の側面によれば、本発明の目的は、その表面上に第２の側面によるポリペプチドを発現するか、または本発明の第１の側面の一態様による核酸分子を用いて形質転換された細胞により、解決される。
【００４９】
好ましい態様において、用語「細胞」は、用語「宿主細胞」と交換可能に用いられ、ここで用いられる場合、ポリペプチドを発現することができる細胞を指す。かかる細胞はまた、「ホールセル触媒または生体触媒」として指定される。別の好ましい態様において、細胞または宿主細胞は、原核細胞、好ましくはグラム陰性細菌細胞、とりわけ特に好ましくはE. coli細胞である。別の例示的態様において、細胞は真核細胞である。別の好ましい態様において、細胞または宿主細胞は、原核生物の胞子である。
【００５０】
第４の側面において、本発明の目的は、膜画分により解決され、これは、本発明の第３の側面による細胞から得られる。
【００５１】
細菌細胞は、多数の区画を含み、これらは、疎水性膜により互いに分離されている。グラム陽性細菌細胞は、細胞膜を有し、これは、細胞の内部である細胞質を区切る。細胞膜は、ペプチドグリカン層により囲まれている。対照的に、グラム陰性細菌は、細胞膜に加えて、外膜と称される別の膜を所有する。用語「表面」は、ここで用いられる場合、好ましくは、周囲環境に対して露出された微生物の層を指し、ここで、周囲環境は、例えば、目的の細胞の培養のために用いられる液体培養培地である。とりわけ特に好ましい態様において、本発明によるポリペプチドは、グラム陰性細菌細胞の外膜の外側において発現される。好ましい態様において、本発明によるポリペプチドは、グラム陰性細菌細胞の外膜の内側において発現される。別の好ましい態様において、本発明によるポリペプチドは、スフェロプラストの外側において発現され、ここで、それは、外膜が取り除かれているグラム陰性細菌細胞である。当業者は、スフェロプラストを生産するために用いることができる方法に精通している。別の好ましい態様において、本発明によるポリペプチドは、グラム陽性細菌細胞の外側において発現される。したがって、用語「表面上にディスプレイされる」および「表面上に発現される」は、ここで用いられる場合、類義語である。
【００５２】
本発明の好ましい態様において、交換可能に用いられている２つの用語、膜画分または膜調製品は、好ましくは触媒として活性な状態における、本発明の第１の側面による酸化還元因子再生ポリペプチドを含む。用語「膜画分」および「膜調製品」は、ここで用いられる場合、好ましくは、膜の構成要素、好ましくはグラム陰性細菌の外膜の構成要素が濃縮された産物を指す。当業者は、膜調製品を生産するために用いることができるプロトコルおよび方法に精通する。例えば、細菌細胞は、培養から収集して、例えば凍結および融解のサイクル、超音波処理、溶解バッファー中での再懸濁などにより、溶解し、その後、細胞の膜画分を単離するために分画遠心することができる。本発明の好ましい態様において、膜調製品は、外膜の調製品、すなわち、細胞質、内膜および周辺質などの他の膜および区画の成分と比較して外膜の成分が濃縮されている調製品である。当業者は、外膜またはその構成要素を単離または濃縮するために用いることができるプロトコルおよび方法、例えば細菌細胞のリゾチーム処理およびその後の遠心分離の工程に精通する。好ましい態様において、膜画分は、処理された膜画分であってよく、すなわち、例えば膜画分のタンパク質構成要素を精製することにより、または膜画分を可溶化して、および／または小胞中の膜画分の構成要素を取り上げることにより、膜画分の内容および特性が改変されている。本発明の好ましい態様において、膜画分は、例えば容器またはカラムの表面上に、固定化されていてもよい。
【００５３】
第５の側面によれば、本発明の目的は、以下の工程を含む酸化還元因子を再生する方法により解決される：ａ）本発明の第２の側面によるポリペプチド、第４の側面による膜調製品または第３の側面による細胞を提供すること、およびｂ）前記第２の側面によるポリペプチド、第４の側面による膜調製品または第３の側面による細胞を、少なくとも１の酸化還元因子再生ポリペプチドの基質と接触させること。好ましい態様において、工程ａ）および／または工程ｂ）は、還元剤の不在下において、および／または酸化環境において、行われる。
【００５４】
本発明の第６の側面によれば、本発明の目的は、第３の側面による細胞または第４の側面による膜画分または第２の側面によるポリペプチドを、酸化還元因子を再生するために用いることにより、解決される。
【００５５】
本発明の第７の側面によれば、本発明の目的は、本発明の第３の側面による細胞、第４の側面による膜調製品および第２の側面によるポリペプチドの、好ましくは前記水溶液を脱酸素することによる、水溶液の酸化還元環境の調節のための使用により、解決される。
【００５６】
本発明の好ましい態様において、用語「水溶液の酸化還元環境を調節する」とは、ここで用いられる場合、水溶液中での酸化還元条件、すなわち溶液が化合物を酸化または還元する能力に対して、直接的に作用する、任意の手段を指す。本発明の好ましい態様において、用語「水溶液を脱酸素する」とは、ここで用いられる場合、前記溶液中の酸素の濃度を減少させるために使用することができる任意の手段を指す。当業者は、水溶液の酸素濃度を測定するために用いることができる方法、例えば酸素電極の使用に精通する。
【００５７】
第８の側面によれば、本発明の目的は、酸化還元因子再生ポリペプチドをその表面上にディスプレイする細胞を提供する方法により解決され、該方法は、（ａ）本発明の第１の側面の一態様による核酸を、細胞に導入すること、およびｂ）随意に、前記細胞に１または２以上の酸化還元反応性補欠分子族を接触させることを含む。
【００５８】
第９の側面によれば、本発明の目的は、以下の工程を含む、酸化還元因子依存的ポリペプチドの生産をもたらす方法により解決される：ａ）酸化還元因子依存的酵素を提供すること、および（ｂ）第２の側面によるポリペプチドが、酸化還元因子依存的ポリペプチドが依存する酸化還元因子を再生できるように、本発明の第３の側面による細胞、第４の側面による膜調製品および第２の側面によるポリペプチドの存在下において、酸化還元因子依存的ポリペプチドを、その基質の１または２以上と接触させること。好ましい態様において、用語「酸化還元因子依存的ポリペプチド」とは、ここで用いられる場合、補助因子、補欠分子族または好ましくは基質として酸化還元因子を要求する生物学的活性、好ましくは酵素活性を有するポリペプチドを指す。
【００５９】
別の好ましい態様において、本発明の目的は、本発明の第３の側面による細胞、第４の側面による膜調製品および第２の側面によるポリペプチド、および酸化還元因子依存的ポリペプチド、および酸化還元因子を含む組成物により解決される。一態様において、酸化還元因子依存的ポリペプチドは、オートトランスポーター系を用いてディスプレイされる。すなわち、その発現は、以下を含む核酸によりもたらされる：（１）単一のペプチドをコードするセグメント、（２）好ましくは異種性酸化還元因子再生ポリペプチドまたはそのバリアントを含むセグメント、（３）随意に、プロテアーゼ認識部位をコードするセグメント、（４）膜貫通リンカーをコードするセグメント、および（５）オートトランスポーターまたはそのバリアントのトランスポータードメインをコードするセグメント。
【実施例】
【００６０】
本発明は、限定するものとして理解されるべきではない以下の図面および例によってさらに説明され、これらから、本発明のさらなる特徴、態様、側面および利点を見出すことができる。
【００６１】
例
セリンプロテアーゼ、トリプシンまたはタンパク質キナーゼＫの存在下において細菌をインキュベートすることにより、パッセンジャー、ここではＮＡＤＨオキシダーゼの表面局在を検出することが可能である。トリプシンおよびプロテイナーゼＫは、それらのサイズに起因してE. coliの外膜を通過することができないので、これらのプロテアーゼの存在下におけるホールセルのインキュベーションは、外膜の表面上に位置するタンパク質のみが消化される効果を有する。したがって、表面上に位置するパッセンジャーは消化されるが、膜に組み込まれたタンパク質構成要素は、酵素の攻撃に対して保護されており、したがって無傷のままである。このことは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認することができる。酵素の方向は、ホールセル消化に基づいて評価した。図２は、ＩＰＴＧによる発現の誘導後のE. coli株UT5600（DE3）pAT-NOxの単離された外膜、ならびにホールセル消化の後の単離された外膜を示す。ＩＰＴＧによる誘導の後で、約１００ｋＤａの予想された融合タンパク質を外膜において検出することができた（トラック３）。トリプシンによるホールセルの消化は、初めはほぼ等しい強度であったOmpF/CおよびOmpAを表わすバンドと比較して、対応するバンドの強度の減少をもたらし、これにより、タンパク質が膜の外側に対して向けられていることを確認した（トラック４および５）。ＮＡＤＨオキシダーゼがオートディスプレイ系を用いてE. coliの表面上にディスプレイされることを示すことができた。
【００６２】
例２：ＮＡＤＨオキシダーゼ活性をモニタリングするための増殖および試験条件の確立
ＮＡＤＨオキシダーゼの活性を、測光アッセイにより決定した。ＮＡＤＨは、２つの、すなわち２６０ｎｍおよび３４０ｎｍの波長において消光の最大値を示すが、一方、ＮＡＤ＋は、２６０ｎｍにおいて１つのみの最大値を示す。この違いを、ＮＡＤＨのＮＡＤ＋への酸化の測光法によるモニタリングのために利用する。酵素の正しい折りたたみならびにＦＡＤの取り込みを可能にするために、用いた栄養培地または緩衝液にＦＡＤを添加した。
【００６３】
NOX生体触媒の培養
２０ｍｌのＬＢ培地（１５μｇ／ｍｌのカナマイシン）に、対応する株のグリセリン培養物１０μｌを植菌し、３７℃および毎分２００回転で終夜インキュベートした。メインの培養をセッティングするため、１００ｍｌのＬＢ培地（１５μｇ／ｍｌのカナマイシン、１０μＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのメルカプトエタノール）に、２．５ｍｌの終夜培養物を播種した。ＯＤ５７８＝０．６において、５０ｍｌの培養物を、１ｍＭのＩＰＴＧにより誘導した。ＮＡＤＨオキシダーゼの場合、さらに１０μＭのＦＡＤを添加した。培養物を、１ｈ、４ｈまたは２０ｈ、３０℃および毎分２００回転で誘導した。培養物のもう半分は誘導せず、しかし他においては誘導した培養物と正確に同じ方法において処理した。
【００６４】
ＮＡＤＨオキシダーゼアッセイのための細胞の調製
誘導の後で、細胞を、初めに氷上で１５分間保存し、次いで、毎分５０００回転で１０ｍｉｎの遠心分離による沈降物として分離した。沈降物を、２０ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１０μＭのＦＡＤ中で２回洗浄した。次いで、細胞のＯＤを、同じ緩衝液により５０に調整した。
【００６５】
ＮＡＤＨオキシダーゼアッセイ
ＮＡＤＨオキシダーゼ活性を検出するためのアッセイを、０．１Ｍ硫酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＤＴＴおよび基質として１００μＭのＮＡＤＨを含んだ１ｍｌの試料を用いて行った。細胞を、最終ＯＤ５７８＝１においてアッセイに用いた。室温における１時間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離により試料から取り除いた。上清のスペクトルを、２００〜４００ｎｍの間の波長において記録した。
【００６６】
第１に、両方の株について、ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子の発現を１ｈにわたり誘導した。図３におけるＵＶスペクトルは、これらの条件下において酵素活性を検出することが不可能であったことを示す。なぜならば、ＮＡＤＨは、プラスミドを含まない宿主細胞により既に酸化されており、これが３４０ｎｍにおける消光の最大値の消失をもたらしたからである。添加された酵素は、細胞により取り込まれるか、または細胞により分泌された酵素により転換される。いずれの効果も、ここでの細胞について見出されるような、指数増殖期において細胞が示す高い代謝率により説明することができる。
【００６７】
細胞を静止増殖期（stationary growth phase）へ移行させ、それによりそれらの一次代謝を最少化するために、発現の誘導を、第１に、４ｈまで延長した。添加されたＮＡＤＨが、再び宿主細胞により酸化されたことが見出された（図４）。しかし、pAT-NOxを含む細胞のＮＡＤＨ酸化活性は、プラスミドを含まない宿主細胞の活性を上回った。さらに、誘導していない細胞と誘導した細胞との間の定量的差異を検出することができた。
【００６８】
２０ｈまで誘導時間を延長した後、プラスミドを含まない宿主細胞のＮＡＤＨの酸化は、もはや検出することができなくなり、これは、図５において示すとおり、細胞なしの陰性対照の場合はＮＡＤＨの消光の最大値が以前と同様に存在するという事実から観察することができる。今や、いわゆる「静止状態の細胞」（静止期における細胞）について、表面上に位置するＮＡＤＨオキシダーゼによる、添加されたＮＡＤＨの酸化を検出することが可能であった。E. coli BL21（DE3）とE. coli UT5600（DE3）との間の多くの差異は、明らかである。E. coli BL21（DE）pAT-NOxの場合、誘導されていない細胞は、供給されたＮＡＤＨの約半分をＮＡＤ＋に変換するが、一方、誘導された細胞は、全ての利用可能なＮＡＤＨを変換する。誘導されていない細胞の活性は、ＮＡＤＨオキシダーゼの発現のために用いられるＴ７系が「密（dense）」でないこと、すなわち、Ｔ７プロモーターの抑制が完全でなく、これは、誘導されていない状態においてすら、Ｔ７ポリメラーゼによる遺伝子の低い発現をもたらすこと、に基づいて説明することができる。対照的に、E. coli UT5600（DE3）は、誘導されていない状態において活性を示さないが、誘導された細胞は、ＮＡＤＨの約半分のみを変換する。
【００６９】
これらの結果は、オートトランスポーター系を用いて、Lactobacillus brevisのフラボタンパク質−ＮＡＤＨオキシダーゼをE. coliの表面上にその活性形態において発現させることができることを証明する。その後のアポ酵素におけるＦＡＤの組み込みは、正しく進行するものと観察され、ＦＡＤの添加のみを必要とする。ここまでの全ての測定は、アッセイをセッティングするため、および酵素の活性をモニタリングすることを可能にする条件を見出すための、質的性質のものであった。
【００７０】
ＮＡＤＨの酸化を経時的に測定することによる酵素活性の量的モニタリングのために、可能な限り多くの試料の平衡観察を可能にするために、光学アッセイをマイクロタイタープレートに移した。
【００７１】
最少培地（Ｍ９）における細胞の培養
１０ｍｌのＭ９培地（１５μｇ／ｍｌのカナマイシン）に、対応する株のグリセリン培養物２０μｌを植菌し、３７℃および毎分２００回転で終夜インキュベートした。メインの培養物、１６０ｍｌのＭ９（１５μｇ／ｍｌのカナマイシン）に植菌するために、終夜全培養物を用いた。７ｈにわたる培養物の初期増殖の後、１ｍＭのＩＰＴＧおよび炭素源として０．２％のラクトースを培養物の半分に添加した。さらに、１０μＭのＦＡＤをＮＡＤＨオキシダーゼのために添加した。誘導は、１６ｈにわたり３０℃および毎分２００回転で行った。ＩＰＴＧは、培養物のもう半分には添加しなかったが、他においてはこれらの培養物を正確に同じ方法において処理した。
【００７２】
活性アッセイのための細胞の調製
誘導の後、細胞を、第１に氷上で１５分間保存し、次いで毎分５０００回転での１０ｍｉｎの遠心分離による沈降物として分離した。沈降物を、２０ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１０μＭのＦＡＤ中で２回洗浄した。次いで、細胞を、同じ緩衝液によりＯＤ５７８＝１０に調整した。
【００７３】
マイクロタイタープレート上でのＮＡＤＨオキシダーゼアッセイ
９６ウェルのマイクロタイタープレートについてのＮＡＤＨオキシダーゼアッセイを、１ウェルあたり２４０μｌの試料において、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液中で行った。細胞を、ＯＤ５７８＝１がアッセイにおいて達成されるような量において用いた。反応を開始させるために、２００μＭのＮＡＤＨを添加した。０、３、７、１５、３０、４５または６０分間の室温におけるインキュベートの後で、アッセイを、マイクロタイタープレート中で３４０ｎｍにおいて観察した（Mithras、Berthold Technologies）。細胞の沈降を避けるために、消光を測定する前にプレートを振盪した。緩衝液中で対応するＯＤを有する細胞懸濁物を参照物として用いた。
【００７４】
一連の試験に基づいて、ＮＡＤＨオキシダーゼホールセル触媒の生産を、ｉ）活性がより高くなるように、ｉｉ）誘導された細胞と誘導されていない細胞との間の差異が増大するように、およびｉｉｉ）ナンセンス対照については低い活性しか存在しないように、最適化することができた。特に、ＮＡＤＨオキシダーゼを測定するために用いられる培養物は、最適状態でなければならないことが見出された。図６は、「方法」セクションにおいて記載されるような、標準的な条件下において行われたＮＡＤＨオキシダーゼアッセイの結果を示す。
【００７５】
増殖および試験条件に関連する多様な因子が、この酵素活性の改善に寄与する。既に、より大規模における使用を目的として、細胞の増殖を、複雑なＬＢ培地の代わりに既定のＭ９培地を用いるように改変した。誘導の間に、ラクトースを炭素源として添加し、細胞をより早くに約０．３５のＯＤ５７８において誘導した。通常では０．６におけるより後での誘導は、Ｍ９培地における過剰に長い増殖を必要とする結果を有し、これは、自発的な細胞溶解と、ナンセンス対照および誘導されていない対照の両方が基質として供給されたＮＡＤＨを酸化する効果とをもたらす。このことは、細胞溶解の結果として放出される酵素に起因する可能性が非常に高い。
【００７６】
ＮＡＤＨオキシダーゼアッセイを、今や、上記のように、マイクロタイタープレートにおいて、細胞懸濁液中で直接行い、観察した。このことは、取り扱いを遥かに容易にし、データは、より再現可能である。
【００７７】
しかし、酵素活性の絶対値の決定は、可能でない。測光法により決定される酵素の活性は、ランベルト・ベールの法則から計算される。この式を適用することが可能であるためには、キュベットまたは９６ウェルプレートの層の厚みが既知でなければならない。このパラメーターは、現在の試験のセットアップにおいては決定することができない。したがって、ＮＡＤＨオキシダーゼの活性を、光度計により、１ｃｍの既定の層の厚みを有するキュベットを用いて測定した。その結果として、ベール・ランベルトの法則を適用することができる。３０℃の温度において、ＬＢ培地中の活性について１２．２３ｍＵ／ｍｌを見出した。Ｍ９培地中での３０℃での活性は、幾らかより高く、すなわち１６．３８ｍＵ／ｍｌであった。Hummelら（2003年）の研究において、単純な様式において精製された酵素の活性は、１０〜１５Ｕ／ｍｇとして示された。
【００７８】
例３：ＮＡＤＨオキシダーゼホールセル触媒の安定性および保存能力の試験
ＮＡＤＨオキシダーゼホールセル触媒の保存能力および安定性を調査するために、誘導された細胞を、冷蔵庫中で８℃において、または冷凍庫中で−１８℃または−７０℃において保存した。これらの細胞を、毎週、ＮＡＤＨオキシダーゼアッセイにより、３つの複製における試料を用いてチェックした。
【００７９】
保存のために意図される細胞を、遺伝子発現の誘導の後で、リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）で２回洗浄し、この緩衝液中でＯＤ５７８＝１０に調整し、部分試料に分割して、８週間にわたる＋８℃での保存に供した。細胞を−１８℃または−７０℃で保存する場合は、２０％のグリセリンをフリージングバッファーに添加した。活性アッセイのために、２００μｌの試料中の細胞を、前述の緩衝液でＯＤ５７８＝１まで希釈し、次いで、０．２ｍＭのＮＡＤＨを添加して反応を開始させた。ＮＡＤＨのＮＡＤへの酸化を、３つの複製における試料において、λｍａｘ＝３４０ｎｍにおける消光の減少を測定することによりモニタリングした。保存の間に起こる細胞溶解の効果を考慮するために、宿主株E. coli BL21（DE3）を、同じ方法において保存し、ホールセル生体触媒BL21（DE3）pAT-NOXと同じ型の活性アッセイに供した。
【００８０】
図７におけるグラフは、８℃で保存された多様な世代の細胞懸濁液中のＮＡＤＨの濃度の減少を示す。予測されたとおり、対照として用いられた宿主株E. coli BL21（DE3）は、保存の前に何らのＮＡＤＨ活性も示さない。しかし、これらの宿主細胞について、たった１週間の保存の後で、アッセイにおいてＮＡＤＨの濃度の明らかな減少が見出され、この減少は、保存時間が長くなるほどにより明白となる。この推定されたＮＡＤＨオキシダーゼ活性は、細菌細胞の溶解（これは、経験に基づいて、細胞が８℃で保存された場合に比較的早く始まる）により説明することができる。冷蔵庫中でこの温度において保存された細胞は、数日後に既に溶液の粘性の増大を示し、完全に再懸濁することができない。この増大した粘性は、細胞溶解の間の染色体ＤＮＡの放出に起因し得る。さらに、細胞の溶解の結果として、酵素が放出され、これは明らかに、アッセイにおいて基質として用いられるＮＡＤＨを酸化する。この効果はまた、ＮＡＤＨオキシダーゼホールセル触媒E. coli BL21（DE3）pAT-NOXの保存、およびその後の活性アッセイの場合においても観察される。保存時間が長くなると、冷蔵庫中で細胞の溶解により引き起こされるＮＡＤＨの酸化が、保存の前に測定された触媒の活性を上回るであろう。したがって、ＮＡＤＨオキシダーゼホールセル触媒を冷蔵庫中で保存することは推奨され得ない。
【００８１】
細胞を−１８℃で保存する場合、状況は異なる（図８）。陰性対照として用いられた宿主細胞について、大型冷凍庫中での−１８℃での保存の後で、結果的なＮＡＤＨの酸化は存在しないが、一方、ＮＡＤＨオキシダーゼホールセル触媒は、８週間後ですらなおＮＡＤＨオキシダーゼ活性を示し、これは、正規分布に関して、初期の活性に匹敵する。
【００８２】
ホールセル生体触媒の−７０℃での７週間にわたる保存により、活性の有意な減少は観察されない（図９）。この場合における宿主細胞の溶解もまた、除外することができる。したがって、ホールセル生体触媒を−７０℃で保存することが推奨される。
【００８３】
一方で、生体触媒の活性と並行して、生細胞カウントを決定した。結果を図１０において示す。＋８℃における保存により、生細胞カウントは、初めの４週間以内に３桁において減少する。保存がさらに３週間続くと、その後の生細胞カウントは、相対的に一定であり続ける。この形の曲線はまた、−１８℃または−７０℃における生体触媒の保存によっても観察される。しかし、この場合において、初めの４週間の間の生細胞カウントの減少は、２桁のみであった。生細胞カウントの減少は、７週間の期間にわたり、生体触媒の活性と相関しない。生細胞カウントは、−１８℃または−７０℃における保存により減少するが、活性はほぼ一定であり続ける。しかし、この試験は、大型冷凍庫（−１８℃または−７０℃）における保存が、冷蔵庫中での＋８℃における保存よりも好ましいことを示す。
【００８４】
例４：ホールセル生体触媒のリサイクル性の調査
３０分間の期間にわたる５サイクルにおけるＮＡＤＨの変換に関するホールセル触媒E. coli BL21（DE3）pAT-NOxのリサイクル性を決定した。このアッセイについて、遺伝子発現の誘導の後で、細胞をリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）で２回洗浄し、この緩衝液中で最終ＯＤ５７８＝１０に調整した。活性を決定するために、２００μｌの試料中の細胞を、マイクロタイタープレート中で前述の緩衝液でＯＤ５７８＝１まで希釈し、次いで、０．２ｍＭのＮＡＤＨを添加して反応を開始させた。ＮＡＤＨのＮＡＤへの酸化を、３つの複製における試料において、λｍａｘ＝３４０ｎｍにおける消光の減少を測定することによりモニタリングした。リサイクルのために、反応の完了後に細胞を遠心分離により落とし沈殿させ、１６０μ１のリン酸カリウム緩衝液中で再懸濁した。再度、０．２ｍＭのＮＡＤＨを添加して反応を開始させ、酸化を測光法によりモニタリングした。この手順を全５サイクルにわたり繰り返した。処理の間に起こり得る細胞溶解の影響を考慮するために、陰性対照として宿主株E. coli BL21（DE3）を、ホールセル生体触媒BL21（DE3）と同じアッセイに供した。
【００８５】
生体触媒を含まない宿主細胞を、対照として用いた。図１１において観察することができるように、宿主細胞は、何らＮＡＤＨを変換しない。第１のサイクル（Ａ）において、ホールセル生体触媒は、存在するＮＡＤＨのほぼ１００％を３０分以内に変換する。さらなるサイクルにおいて、変換および変換速度は減少する。最後のサイクル（第５サイクル、Ｄ）において、３０％少ないＮＡＤＨがインキュベート時間内に変換される。細胞懸濁液の遠心分離が、後のサイクルにおける活性の減少の原因であるかもしれない。遠心力は、細胞に対する、特にその表面上に発現される分子に対する機械的ストレスを表わす。
【００８６】
例５：ホールセル生体触媒E. coli BL21（DE3）pAT-NOxを用いるＮＡＤＨのＮＡＤ＋への再生
この試験は、ホールセル生体触媒E. coli BL21（DE3）pAT-NOxをＮＡＤ＋還元酵素のための再生系として用いることができるか否かを調査するために行った。これは、ホールセル生体触媒およびＮＡＤ＋還元酵素であるアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）を含む系を用いて試験した。ＡＬＤＨは、アルデヒドを対応するカルボン酸へと酸化し、したがってＮＡＤ＋をＮＡＤＨへと還元する酵素の群に属する。ＮＡＤＨの濃度を測光法によりモニタリングした。
【００８７】
図１２から観察することができるように、予測されたとおり、ホールセル生体触媒E. coli BL21（DE3）pAT-NOxを含む試料中のＮＡＤＨの濃度は、持続的に減少する。対照的に、組換え酵素ＡＬＤＨが生体触媒に添加される場合、ＡＬＤＨにより持続的にＮＡＤＨへと還元されるＮＡＤ＋が、生体触媒E. coli BL22（DE3）pAT-NOxにより再生されるにつれ、ＮＡＤ＋とＮＡＤＨとの間に平衡が確立される。したがって、この系は平衡にある。E. coli BL21（DE3）-NitAfは、いわゆるナンセンス対照として役立った。図１２からも観察することができるように、これらの細胞は、その表面上に、ＮＡＤＨを酸化することができないA. faecalisからのニトリラーゼをディスプレイする。
【００８８】
図１３は、グラフの上半分において、ＡＬＤＨにより媒介されるＮＡＤＨの増加を示す。ＮＡＤ＋を再生するための生体触媒E. coli BL21（DE3）pAT-NOxの添加に関して、ＮＡＤＨの濃度（３４０ｎｍにおける消光として決定される）を細胞カウントに関して標準化することができるように、宿主株E. coli BL21（DE3）が既にこの反応に添加されている。ＡＬＤＨ反応への生体触媒E. coli BL21（DE3）pAT-NOxの添加の後、ＡＬＤＨにより形成されたＮＡＤＨが持続的にＮＡＤ＋へと再酸化されたため、ＮＡＤＨの経時的なさらなる増加は見出されなかった。したがって、この系は平衡にある。
【００８９】
供給源の詳細
先行技術の多様な文書に対する引用がなされる場合、これらの文書は、それらの全体において、参照により本明細書の部分を形成する。引用された先行技術の文書についての完全な書誌の詳細を、以下に示す：
【００９０】
Sanjustら(1997), Biochem Mol Biol Int (3), 555-62.
HummelおよびRiebel (2003), Biotechnol Lett. (1), 51-4.
AhmedおよびClaiborne (1992), J. Biol. Chem. 267(36): 25822-9.
El-Zahabら(2004), Appl Biochem Biotechnol., 117(3), 165-74.
LeeおよびPing (2007), Biotechnology Adv 25, 369-384.
JoseおよびMeyer (2007), Microbiol Mol Biol Rev 71 (4), 600-19.
Jose (2006), Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 69, 607-614.
Joseら(2002), J. Biotechnol. 2002, 95, 257-268.
Joseら(1995), Mol. Microbiol., (2), 378-80.
Ausubelら(1995), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers.
【００９１】
Hendersonら(2004), Microbiol. and Molecular Biology Reviews, 68(4), 692-744.
Joseおよびvon Schwichow (2004), ChemBioChem, 5, 491-499.
Banerjeeら(2002), Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002, 60, 33-44.
SarborskyおよびOgletree (1974), Biochem Biophys Res Commun., 61(1): 210-6.
"Export Systems for recombinant proteins" International Patent Application WO 97/35 022.
Niewertら(2001) Diarrhea. Clin. Diagn. Lab. Immunol. (1): 143-149; 9.
【００９２】
明細書において、配列表において、クレームにおいて、および／または図面において開示される本発明の特徴は、単独で、および任意の組み合わせにおいて、本発明をその多様な形態において実施するために、法律的に適切である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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