(57)【要約】  本発明は、遺伝子およびゲノムに標的を設定し、植物で酵素活性およびタンパク質発現を改変することを目的とする。特に、本発明は、1つまたは2つ以上の内因性グリコシルトランスフェラーゼ（例えばN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ、およびα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）の活性を植物細胞で低下させる方法およびそのような方法によって得られる植物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的に改変されたニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）の植物細胞または前記改変植物細胞を含むニコチアナ・タバクムの植物であって、前記改変植物細胞が、N-アセチル-グルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内に第一の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変を含み、その結果、（i）改変植物細胞でグリコシルトランスフェラーゼの活性または発現が非改変植物細胞に比して低下し、さらに（ii）改変植物細胞で生産されるタンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはその両方が非改変植物細胞に比して低下する、前記植物細胞または植物細胞を含む植物。
【請求項２】
さらに、（a）β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変、または（b）α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変、または（a）および（b）の組合せを含む、請求項1に記載の改変されたニコチアナ・タバクムの植物細胞またはニコチアナ・タバクムの植物。
【請求項３】
さらに、第一の標的ヌクレオチド配列、第二の標的ヌクレオチド配列、第三の標的ヌクレオチド配列、または前述の標的ヌクレオチド配列の任意の2つ以上の組合せの対立遺伝子変種に改変を含む、請求項1に記載の改変されたニコチアナ・タバクムの植物細胞またはニコチアナ・タバクムの植物。
【請求項４】
第一の標的ヌクレオチド配列が、
a．配列番号：12、13、40、41、233、256、259、262、265、268、271、274、277、280から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも70％、特に少なくとも80％、特に少なくとも90％同一であるか、
b．配列番号：20、21、212、213、219、220、223、227、229、234、257、260、263、266、269、272、275、278、281から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、特に少なくとも98％、特に少なくとも99％同一である、
請求項1から3のいずれか1項に記載の改変されたニコチアナ・タバクムの植物細胞またはニコチアナ・タバクムの植物。
【請求項５】
第二の標的ヌクレオチド配列が、
a．配列番号：1、4、5および17から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも70％、特に少なくとも80％、特に少なくとも90％同一であるか、
b．配列番号：8および18から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、特に少なくとも98％、特に少なくとも99％同一である、
請求項2から4のいずれか1項に記載の改変されたニコチアナ・タバクムの植物細胞またはニコチアナ・タバクムの植物。
【請求項６】
第三の標的ヌクレオチド配列が、
a．配列番号：27、32、37および47から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも70％、特に少なくとも80％、特に少なくとも90％同一であるか、
b．配列番号：28、33、38および48から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、特に少なくとも98％、特に少なくとも99％同一である、
請求項2から5のいずれか1項に記載の改変されたニコチアナ・タバクムの植物細胞またはニコチアナ・タバクムの植物。
【請求項７】
植物が、受託番号NCIMB41802で寄託されたニコチアナ・タバクム栽培品種PM132である、請求項1から6のいずれか1項に記載の改変されたニコチアナ・タバクムの植物細胞またはニコチアナ・タバクムの植物。
【請求項８】
請求項1から7のいずれか1項に記載の改変されたニコチアナ・タバクムの植物の子孫であって、前記子孫植物が請求項1から7のいずれか1項に規定された少なくとも1つの改変を含み、グリコシルトランスフェラーゼの活性または発現が非改変植物に比して低下し、さらに（ii）改変植物で生産されるタンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたは両方が非改変植物に比して低下する、前記植物の子孫。
【請求項９】
異種タンパク質を生産する方法であって、前記方法が、請求項1から8のいずれか1項に規定された改変ニコチアナ・タバクムの植物細胞または植物に、異種タンパク質、特にワクチン抗原、サイトカイン、ホルモン、凝固タンパク質、アポリポタンパク質、ヒトの交換療法のための酵素、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物を導入する工程、異種タンパク質が生産されるように前記発現構築物を含む改変植物細胞を培養する工程、および場合によって前記植物細胞から植物を再生する工程、並びに前記植物およびその子孫を生長させる工程を含む、前記異種タンパク質を生産する方法。
【請求項１０】
以下のa−cを含むポリヌクレオチド： 
a．N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列が、
（i）配列番号：12、13、40、41、233、256、259、262、265、268、271、274、277および280から成る群から選択されるか、
（ii）配列番号：20、21、212、213、219、220、223、227、229、234、257、260、263、266、269、272、275、278および281から成る群から選択されるか、
（iii）（i）または（ii）のヌクレオチド配列と少なくとも95％、特に少なくとも98％、特に少なくとも99％同一であるか、
（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）のヌクレオチド配列またはその相補鎖から成るポリヌクレオチドプローブが特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる、
前記ヌクレオチド配列；
b．β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列が、
（i）配列番号：1、4、5、7および17から成る群から選択されるか、
（ii）配列番号：8および18から成る群から選択されるか、
（iii）（i）または（ii）のヌクレオチド配列と少なくとも95％、特に少なくとも98％、特に少なくとも99％同一であるか、
（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）のヌクレオチド配列またはその相補鎖から成るポリヌクレオチドプローブが特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる、
前記ヌクレオチド配列；
c．α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列が、
（i）配列番号：27、32、37および47から成る群から選択されるか、
（ii）配列番号：28、33、38および48から成る群から選択されるか、
（iii）（i）または（ii）のヌクレオチド配列と少なくとも95％、特に少なくとも98％、特に少なくとも99％同一であるか、
（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）のヌクレオチド配列またはその相補鎖から成るポリヌクレオチドプローブが特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる、
前記ヌクレオチド配列。
【請求項１１】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、
a．配列番号：214、215、217、218、221、222、224、228、230、235、258、264、267、270、273、276、279および282に示されるアミノ酸配列を提示するN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；
b．配列番号：9および19に示すアミノ酸配列を提示するβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ；
c．配列番号：29、34、39および49に示すアミノ酸配列を提示するα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ；
d．（i）、（ii）または（iii）のアミノ酸配列と少なくとも95％、特に少なくとも98％、特に少なくとも99％同一であるアミノ酸配列；
である、請求項10に記載のポリヌクレオチドによってコードされるグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１２】
請求項10に規定されたゲノムヌクレオチド配列の使用であって、前記使用が、
a．N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列、または
b．（a）の第一の標的ヌクレオチド配列およびβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列、または
c．（a）の第一の標的ヌクレオチド配列およびα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列、
d．（a）、（b）および（c）の全ての標的ヌクレオチド配列
内の標的部位を、
（i）N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの、またはN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼの、またはN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼの、またはN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼおよびα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼの活性または発現が、および場合によって少なくとも1つのその対立遺伝子変種の活性または発現が、改変を含む改変植物細胞で非改変植物細胞に比して低下し、さらに（ii）アルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはその両方が、改変を含む改変植物細胞のタンパク質のN-グリカンで非改変植物細胞に比して低下する改変のために同定する、前記ゲノムヌクレオチド配列の使用。
【請求項１３】
請求項10に規定されるゲノムヌクレオチド配列またはコード配列と選択的に結合する非天然ジンクフィンガータンパク質の、標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つで二本鎖切断を導入するジンクフィンガーヌクレアーゼを作製するための使用。
【請求項１４】
請求項1から8のいずれか1項で規定される改変植物細胞を含む植物から入手できる、異種タンパク質を含む植物組成物であって、前記異種タンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはその両方が、未改変植物細胞で生産されるものに比して低下する、前記植物組成物。
【請求項１５】
ヒト化糖タンパク質を生産する能力を有する改変植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物細胞またはニコチアナ・タバクム植物を生産する方法であって、前記方法が、
（i）タバコ植物細胞のゲノムで、（a）N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列、または（b）（a）の第一の標的ヌクレオチド配列、並びにβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼおよびα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列、または（c）第一の標的ヌクレオチド配列および第二の標的ヌクレオチド配列およびβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列、および場合によって（d）（a）、（b）もしくは（c）の、または前述の標的ヌクレオチド配列の任意の2つ以上の組合せの対立遺伝子変種を含むゲノム領域内の標的ヌクレオチド配列を改変する工程；
（ii）標的ヌクレオチド配列に改変を含む改変植物を同定、および場合によって選別する工程を含み、
ここで、改変植物または植物細胞で、（a）、（b）、（c）および（d）に規定したグリコシルトランスフェラーゼの活性または発現が、および場合によって少なくとも1つのその対立遺伝子変種の活性または発現が、改変植物または植物細胞で非改変植物細胞に比して低下し、さらに前記改変植物または植物細胞によって生産される糖タンパク質が、それらのN-グリカンでアルファ-1,3-結合フコース残基およびベータ-1,2-結合キシロース残基を欠く、前記植物生産方法。
【請求項１６】
標的ヌクレオチド配列が請求項10に規定するヌクレオチド配列を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
植物が、受託番号NCIMB41802で寄託された、ニコチアナ・タバクム栽培品種PM132である、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
タバコ植物または植物細胞のゲノムの改変が以下の工程を含む、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法：
a．ニコチアナ・タバクム植物または植物細胞の標的ヌクレオチド配列で、および場合によって少なくとも1つのその対立遺伝子変種で標的部位を同定する工程、
b．請求項10に規定したヌクレオチド配列を基にして、前記標的部位を認識し、さらにこの標的部位またはその近傍に結合する能力を有する変異導入オリゴヌクレオチドを設計する工程、および
c．タバコ植物または植物細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列とゲノムが改変される条件下で前記変異導入オリゴヌクレオチドを結合させる工程。
【請求項１９】
変異導入オリゴヌクレオチドが、ゲノム編集技術、特にジンクフィンガー媒介変異導入、チリング、相同組換え、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、またはメガヌクレアーゼ媒介変異導入または前述の技術の組合せで用いられる、請求項18に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物で特定の酵素の活性を改変することを目的とする。特に、本発明は植物の1つまたは2つ以上の内在性グリコシルトランスフェラーゼの活性を低下、阻害、または実質的に阻害するための方法、並びに前記方法によって得られる植物細胞および植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物および哺乳動物のN-グリコシル化プロセスの多くの局面は類似しており、それらプロセスは一般的に多数の連続的酵素工程を必要とする。しかしながら、植物の糖タンパク質および哺乳動物の糖タンパク質の成熟N-グリカン構造間の決定的な違いは、前記プロセスの最終工程時に付加される固有の単糖類にある。植物により生成されるタンパク質の成熟N-グリカン鎖は、典型的にはアルファ-1,3-結合フコース残基（α(1,3)-フコース）およびベータ-1,2-結合キシロース残基（β(1,2)-キシロース）を含み、前記はともに哺乳動物のN-グリカンには存在しない。
一般的には、N-グリコシル化は、グリコシル化されるタンパク質中のアスパラギン残基への前駆体Glc3-Man9-GlcNAc2オリゴ糖の付加で始まる。続いて前記グリコシル化タンパク質は、3つのグルコシダーゼ（グルコシダーゼI、グルコシダーゼIIおよびグルコシダーゼIII）で始まる多数の酵素によって小胞体（ER）中で連続的に処理されて、Man9-GlcNAc2-Asn N-グリカンを生じる。その後、マンノシダーゼI酵素は、マンノースに富むMan9-GlcNAc2-Asn N-グリカンをトリミングしてMan5-GlcNAc2-Asn N-グリカンを生成する。続いて、このグリコシル化タンパク質はERからcis-ゴルジネットワークへ輸送される。輸送は小胞および膜融合により媒介される。ER誘導小胞はER膜から出芽して分離し、cis-ゴルジネットワークと融合する。真核細胞のMan5-GlcNAc2-Asn N-グリカンはその後、多数のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの作用によりゴルジ装置内の種々の区画で成熟する。
【０００３】
ヒトを含む哺乳動物では、グリコシル化プロセスの最終工程時に、フコースはN-グリカンの非還元末端の基部N-アセチルグルコサミン残基にアルファ-1,6-結合で付加される（α(1,6)-フコース）。植物では、フコース（α(1,3)-フコース）はアルファ-1,3-結合で、およびキシロース（β(1,2)-キシロース）はベータ-1,2-結合でN-グリカンに付加される。フコース残基はフコシルトランスフェラーゼの作用によりN-グリカン鎖に付加される。より具体的には、植物では、アルファ-1,3-結合フコース（α(1,3)-フコース）は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）によって付加され、キシロースは、ベータ-1,2-結合キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）の作用により、トリマンノシル（Man3）コア構造のベータ-1,4-結合マンノース（β(1,4)-Man）にベータ-1,2-結合で付加される（β(1,2)-キシロース）。植物生成タンパク質のこれらの炭水化物の存在は、前記タンパク質の動物への導入時における前記タンパク質の免疫原性特性に影響する。したがって、これら異なるグリコシル化パターンは、ヒトを含む哺乳動物での植物生成タンパク質の治療的使用について問題を提起し、前記タンパク質の規制承認に影響を与える可能性がある。
【０００４】
タンパク質（例えばヒトで治療的に用いることができるタンパク質）の組換え体発現は、トランスジェニック植物の重要な応用となる。タバコの植物は組換えタンパク質の製造のためにこれまで考慮されてきた。しかしながらタバコは複雑なゲノムを有する。例えばニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）は、ニコチアナ・シルベストリス（N. sylvestris）とニコチアナ・トメントシホルミス（N. tomentosiformis）との間の複二倍体種間雑種と考えられている異質四倍体種であり、48個の染色体を有する。グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む各遺伝子について、多数の異なる対立遺伝子および変種が存在すると予想される。さらにまた、ニコチアナ・タバクムは今日までに知られているもっとも大きなゲノムの1つ（ほぼ4,500メガ塩基対）を有し、70％を超える“ジャンク”DNAの中に点在する30,000から50,000の遺伝子を含んでいる。したがってタバコのゲノムのサイズおよび複雑さは、遺伝子の発見、対立遺伝子および変種の同定、並びに特定の対立遺伝子または変種の標的設定改変に対して極め付きの難題を提起している。
植物（特にタバコの植物）で組換えタンパク質を製造するという可能性が与えられたとしたら、タンパク質のグリコシル化で活性を有する種々の内因性グリコシルトランスフェラーゼを同定する方法、およびそのようなグリコシルトランスフェラーゼの1つまたは2つ以上の活性を低下、阻害または実質的に阻害する方法が希求される。特に、該当植物のN-グリカンのアルファ-1,3-結合フコース残基、ベータ-1,2-結合キシロース残基を実質的に欠くタンパク質を生産する能力を有する植物および植物細胞を入手することが所望される。したがって、そのような植物によって生産されるタンパク質はヒトでの使用に対して好ましい免疫原性特性を有することができる。本発明の目的はこれらの要求を満たすことである。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の多様な実施態様において、（i）グリコシルトランスフェラーゼおよびそのフラグメントをコードする遺伝子配列、並びにそのような遺伝子配列の変種および対立遺伝子を同定する方法、（ii）前記遺伝子配列を改変する方法、および（iii）そのような配列によってコードされるグリコシルトランスフェラーゼの酵素活性を低下、阻害または実質的に阻害する方法が提供される。さらにまた提供されるものは、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド並びにそれらの変種および対立遺伝子、並びにそのフラグメントおよび変異体である。さらに本発明に包含されるものは、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列の改変のための標的部位、および植物細胞でグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列を改変するための組成物（例えばジンクフィンガードメインを含むタンパク質であるが、ただしこれらに限定されない）である。本発明はまた、1つまたは2つ以上の異種タンパク質を生産する、改変グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列を含む植物細胞または植物を使用する方法を提供する（前記植物細胞または植物では1つまたは2つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの酵素活性が低下、阻害または実質的に阻害されている）。本発明はまた、N-グリカンがベータ-1,2-結合のキシロースもしくはアルファ-1,3-結合のフコースまたはその両方を実質的に欠くタンパク質を有することを特徴とする植物または植物細胞を提供する。アルファ-1,3-結合フコース残基もしくはベータ-1,2-結合キシロース残基またはその両方を実質的に欠く1つまたは2つ以上の異種タンパク質を含む組成物（本発明の植物または植物細胞から入手できる）もまた本発明に包含される。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本出願の範囲で用いられる技術用語および表現には、一般的に植物生物学の関連分野でそれらに通常適用される意味が与えられるべきである。以下の用語の定義はいずれも本出願の全内容に当てはまる。“含む”という語は他の成分または工程を排除せず、不定冠詞の“a”または“an”は複数を排除しない。単一の工程は特許請求の範囲に列挙したいくつかの特質を有する複数の機能を満たすことができる。属性または値に関して“本質的に”、“約”、“ほぼ”などという用語はまた、特に当該特質を厳密にまたは当該値を厳密にそれぞれ規定する。ある数値または範囲に関して“約”という用語は、当該ある値または範囲の20％以内、10％以内または5％以内である値または範囲を指す。
本発明で用いられる“植物”という用語は、そのライフサイクルまたは発育の任意の時期における任意の植物およびその子孫を指す。
本発明で用いられる“植物細胞”は植物の構造的および生理学的ユニットを指す。植物細胞は、細胞壁をもたないプロトプラスト、単離された単一細胞もしくは培養された細胞、またはより高度な組織化されたユニット、例えば植物組織、植物器官または全植物（ただしこれらに限定されない）の形態であり得る。
本発明で用いられる“植物細胞培養”は、植物細胞（例えばプロトプラスト、細胞培養細胞、培養植物組織の細胞、外植片の細胞（ただしこれらに限定されない））の培養および花粉培養を包含する。
本発明で用いられる“植物材料”は、植物から得ることができる任意の固体、液体又は気体組成物または前記の組合せを指し、葉、茎、根、花もしくは花部分、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、挿穂、分泌物、抽出物、細胞もしくは組織培養、または植物の任意の他の部分もしくは生成物が含まれる。
本明細書で用いられる“植物組織”は、構造的または機能的ユニットとして組織化された植物細胞群を意味する。植栽または培養植物の任意の組織が含まれる。この用語には全植物、植物器官および種子が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本明細書で用いられる“植物器官”は植物の個別のまたは分化した部分、例えば根、茎、葉、花芽または胚に関する。
【０００７】
“ポリヌクレオチド”という用語はヌクレオチドのポリマーを指すために本明細書で用いられる。前記は、未改変または改変デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）であり得る。したがって、ポリヌクレオチドは、ゲノムDNA、相補性DNA（cDNA）、mRNAまたはアンチセンスRNAであり得るが、ただしこれらに限定されない。さらにまた、ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖のDNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるDNA、DNAおよびRNAを含むハイブリッド分子、または一本鎖および二本鎖領域の混合物を有するハイブリッド分子であり得る。さらにまた、ポリヌクレオチドはDNA、RNAまたはその両方を含む三本鎖領域を含むことができる。ポリヌクレオチドは、1つまたは2つ以上の改変塩基（例えばホスホチオエート）を含むことができ、さらにペプチド核酸（PNA）であってもよい。一般的には、本発明で提供されるポリヌクレオチドは、cDNA、ゲノムDNA、オリゴヌクレオチドもしくは個々のヌクレオチドまたは前述の組合せを単離またはクローニングしたフラグメントからアッセンブリングすることができる。
“ヌクレオチド配列”という用語は、ヌクレオチド（リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドが含まれるが、ただしこれらに限定されない）のポリマーの塩基配列を指す。本明細書で用いられる“遺伝子配列”という用語は、ポリペプチドまたは生物学的に活性なRNAをコードする核酸分子またはポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を指し、タンパク質のフラグメントしかコードしない部分的なコード配列のヌクレオチド配列を包含する。遺伝子配列はまた、遺伝子の発現に関し調節機能を有する、コード配列に対して上流または下流に位置する配列を、遺伝子のイントロン配列と同様に含むことができる。
【０００８】
本明細書で用いられる“異種配列”という用語は、問題の細胞または生物に固有のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの関係で天然には存在しない生物学的配列を指す。
本明細書で用いられる“異種タンパク質”という用語は、ある細胞によって生産されるが当該細胞に天然には存在しないタンパク質を指す。例えば、植物細胞で生産される異種タンパク質は哺乳動物またはヒトのタンパク質であり得る。異種タンパク質は、翻訳と同時のまたは翻訳後の改変で共有結合によりポリペプチドと結合したオリゴ糖鎖（グリカン）を含むことができる。非限定例として、そのようなタンパク質はタンパク質骨格のアスパラギン（Asn）と共有結合したオリゴ糖を含むことができ、前記オリゴ糖は、タンパク質骨格に結合する非還元末端に2つのN-アセチルグルコサミン（GlcNAc2）を有する少なくとも1つの3マンノシル（Man3）コア構造を含む（Man3-GlcNAc2-Asn）。特に、異種タンパク質は少なくとも1つのN-グリカンを含む。略語“GnT”はN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを指し、“Man”はマンノースを指し、“Glc”はグルコースを指し、“Xyl”はキシロースを指し、“Fuc”はフコースを指し、“GlcNAc”はN-アセチルグルコサミンを指す。
【０００９】
本明細書で用いられる“N-グリコシル化”という用語は、小胞体膜のドリコール部分から特異的なドリコール脂質結合前駆体オリゴ糖、Dol-PP-GlcNAc2- Man9-Glc3を、タンパク質骨格のAsn-Xaa-Ybb-Xaa配列モチーフの部分であるアスパラギン残基（Asn）の遊離アミノ基に転移することで開始し、Glc3-Man9-GlcNAc2-Asnグリコシル化タンパク質を生じるプロセスを指す（式中、Xaaはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ybbはセリン、スレオニンまたはシステインであり得る）。
本明細書で用いられる“N-グリカン”という用語は、種々のアスパラギン残基（それぞれタンパク質骨格中のAsn-Xaa-Ybb-Xaa配列モチーフの部分である）と結合する炭水化物を指す。
本明細書で用いられる“N-グリカンの非還元末端”という用語は、タンパク質骨格のアスパラギンと結合するN-グリカンの部分を指す。
【００１０】
本発明で用いられる“ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ” （β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）という用語は、キシロシルトランスフェラーゼ（EC2.4.2.38と称される）を指し、前記は、糖タンパク質のN-グリカンのトリマンノシルコア構造のベータ-1,4-結合マンノース（β(1,4)-Man）にキシロース（β(1,2)-Xyl）をベータ-1,2-結合で付加する。
本発明で用いられる“アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ”（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）という用語は、フコシルトランスフェラーゼ（EC2.4.1.214と称される）を指し、前記は、N-グリカンの非還元末端の基部N-アセチルグルコサミン残基にフコースをアルファ-1,3-結合で付加する（α(1,3)-フコース）。
本発明で用いられる“N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI”はEC2.4.1.101と称される酵素を指し、前記は、Man5-GlcNAc2-Asnオリゴマンノシル受容体の1-3アームのマンノースにN-アセチルグルコサミンを付加する。
【００１１】
本明細書で用いられる“低下する”または“低下”という用語は、約10％から約99％の低下、または少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％までの量または活性（例えば酵素活性、転写活性およびタンパク質発現であるがただしこれらに限定されない）の低下を指す。
本明細書で用いられる“実質的に阻害する”または“実質的阻害”という用語は、量または活性（例えば酵素活性、転写活性およびタンパク質発現であるがただしこれらに限定されない）の約90％から約100％の低下、または少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％までの低下を指す。
本明細書で用いられる“阻害する”または“阻害”という用語は、量または活性（例えば酵素活性、転写活性およびタンパク質発現であるがただし前記に限定されない）の約98％から約100％の低下、または少なくとも98％、少なくとも99％、特に100％の低下を指す。
【００１２】
本明細書で用いられる“ゲノム編集技術”は、生物のゲノム中のヌクレオチド配列の変更を生じる任意の方法を指す。前記方法は例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入、化学的変異導入、放射線変異導入、“チリング（tilling）”メガヌクレアーゼ媒介変異導入であるが、ただしこれらに限定されない。
本発明のある目的は、治療薬としての使用に適切な異種タンパク質を植物で生産することであり、そのような異種タンパク質は、それが存在すれば望ましくない免疫原性特性を起こし得る1つまたは2つ以上の炭水化物を欠く。いずれの理論にも拘束されないが、植物または植物細胞で生産される異種タンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-結合フコース、ベータ-1,2-結合キシロースまたはその両方の存在は、（i）植物または植物細胞で1つまたは2つ以上の本発明のグリコシルトランスフェラーゼの酵素活性を低下、阻害または実質的に阻害することによって、または（ii）植物または植物細胞で1つまたは2つ以上の本発明のグリコシルトランスフェラーゼの発現を低下、阻害または実質的に阻害することによって、または（i）および（ii）の両方によって低下または排除することができる。
【００１３】
具体的な実施態様では、本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、（i）N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、特に、糖タンパク質のN-グリカンの還元末端でMan5-GlcNAc2-Asnの1-3アームのマンノース残基へのN-アセチルグルコサミンの付加を触媒し、GlcNAc-Man5-GlcNAc2-Asnを生じるN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、（ii）フコシルトランスフェラーゼ、特に、N-グリカンへのフコース本体のアルファ-1,3−結合での付加、特に糖タンパク質のN-グリカンの非還元末端にある基部N-アセチルグルコサミンへのフコースのアルファ-1,3-結合（α(1,3)-結合）での付加を触媒して、例えばGlcNAc-Man3-Fuc-GlcNAc2-AsnまたはGlcNAc-Man3-Fuc-Xyl-GlcNAc2-Asn糖タンパク質（ただし前記に限定されない）を生じるフコシルトランスフェラーゼ、または（iii）キシロシルトランスフェラーゼ、特に、N-グリカンへのキシロース本体のベータ-1,2-結合での付加、特にN-グリカンのトリマンノシルコア構造のベータ-1,4-結合（β(1,4)-結合）マンノースへのキシロースのベータ-1,2-結合（β(1,2)-結合）での付加を触媒して、例えば
GlcNAc-Man3-Xyl-GlcNAc2-AsnまたはGlcNAc-Man3-Fuc-Xyl-GlcNAc2-Asn糖タンパク質（ただし前記に限定されない）を生じるキシロシルトランスフェラーゼである。特に、本発明のグリコシルトランスフェラーゼはタバコのグリコシルトランスフェラーゼである。特に、本発明のグリコシルトランスフェラーゼはニコチアナ・タバクムまたはニコチアナ・ベンタミアナ（N. benthamiana）のものである。
【００１４】
種々の実施態様で、本発明は、タバコ、ヒマワリ、エンドウ、アブラナ、サトウダイコン、ダイズ、レタス、チコリー、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、アルファルファ、アオウキクサ、コメ、トウモロコシ、およびニンジンに関する。特に、本発明は改変タバコ植物および改変タバコ細胞、ニコチアナ種の改変植物および改変細胞、並びに、特に改変したニコチアナ・ベンタミアナおよびニコチアナ・タバクムの植物並びにニコチアナ・タバクムの品種、育種交配系統および栽培品種、または改変したニコチアナ・ベンタミアナおよびニコチアナ・タバクム、ニコチアナ・タバクムの品種、育種系統および栽培品種の細胞を目的とする。
【００１５】
別の実施態様では、本発明は遺伝的に改変したニコチアナ・タバクムの品種、育種系統または栽培品種を提供する。本発明の方法によって改変できるニコチアナ・タバクムの品種、育種系統および栽培品種の非限定的な例には以下が含まれる：NCIMB（Aberdeeb, Scotland）に寄託されたN.タバクム受託番号PM016、PM021、PM92、PM102、PM132、PM204、PM205、PM215、PM216もしくはPM217、またはDAC Mata Fina、PO2、BY-64、AS44、RG17、RG8、HB04P、Basma Xanthi BX 2A、Coker 319、Hicks、McNair 944 (MN 944)、Burley 21K149、Yaka JB 125/3、Kasturi Mawar、NC 297、Coker 371 Gold、PO2、Wislica、Simmaba、Turkish Samsun、AA37-1、B13P、BU21 x Hoja Parado line 97交配によるF4、Samsun NN、Izmir、Xanthi NN、Karabalgar、DenizliおよびPO1。
【００１６】
ある実施態様では、改変した（すなわち遺伝的に改変した）ニコチアナ・タバクム植物細胞または本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように改変した植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物（その子孫を含む）は、さらに、（i）改変植物細胞でのグリコシルトランスフェラーゼの活性または発現が非改変植物細胞に比して低下、阻害または実質的に阻害されるように、および（ii）改変植物細胞で生産されるタンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはその両方が非改変植物細胞に比して低下するように、（a）第二のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの第二のコード配列の少なくとも1つの改変、または（b）N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変、または（a）および（b）の組合せを含む。具体的な実施態様では、第二のコード配列は第一の標的ヌクレオチド配列の対立遺伝子変種であるか、または第三の標的ヌクレオチド配列は第一または第二の標的配列の対立遺伝子変種である。
【００１７】
特にある実施態様では、本発明は、改変した（すなわち遺伝的に改変した）ニコチアナ・タバクムの植物細胞または前記改変植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物（その子孫を含む）に関し、この場合、前記改変植物細胞は、（i）改変植物細胞でのグリコシルトランスフェラーゼの活性または発現が非改変植物細胞に比して低下、阻害または実質的に阻害されるように、および（ii）改変植物細胞で生産されるタンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはその両方が非改変植物細胞に比して低下するように、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変を含む。
【００１８】
ある実施態様では、改変した（すなわち遺伝的に改変した）ニコチアナ・タバクムの植物細胞または本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように改変した植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物（その子孫を含む）は、さらに（a）β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変、または（b）α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変、または（a）および（b）の組合せを含む。ある実施態様では、改変した（すなわち遺伝的に改変した）ニコチアナ・タバクムの植物細胞または本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように改変した植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物（その子孫を含む）は、さらに、第一の標的ヌクレオチド配列、第二の標的ヌクレオチド配列、第三の標的ヌクレオチド配列、または前述の標的ヌクレオチド配列の任意の2つ以上の組合せの対立遺伝子変種の改変を含む。
【００１９】
ある実施態様では、本発明は、改変した（すなわち遺伝的に改変した）ニコチアナ・タバクムの植物細胞、または本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように改変した植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物（その子孫を含む）に関し、この場合、第一の標的ヌクレオチド配列は、（a）配列番号：12、13、40、41、233、256、259、262、265、268、271、274、277、280から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるか、（b）配列番号：20、21、212、213、219、220、223、227、229、234、257、260、263、266、269、272、275、278、281から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である。
【００２０】
ある実施態様では、本発明は、改変した（すなわち遺伝的に改変した）ニコチアナ・タバクムの植物細胞、または本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように改変した植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物（その子孫を含む）に関し、この場合、第二の標的ヌクレオチド配列は、（a）配列番号：1、4、5および17から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるか、（b）配列番号：8および18から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である。
【００２１】
ある実施態様では、本発明は、改変した（すなわち遺伝的に改変した）ニコチアナ・タバクムの植物細胞、または本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように改変した植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物に関し、この場合、第三の標的ヌクレオチド配列は、（a）配列番号：27、32、37および47から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるか、（b）配列番号：28、33、38および48から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である。
【００２２】
ある実施態様では、改変した（すなわち遺伝的に改変した）ニコチアナ・タバクムの植物細胞、または本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように改変した植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物（その子孫を含む）は、ニコチアナ・タバクム栽培品種PM132であり、その種子は、NCIMB Ltd.（ブダペスト条約による国際寄託機関、所在地：Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, 英国）に2011年1月6日に受託番号NCIMB41802で寄託された。別の実施態様では、改変した（すなわち遺伝的に改変した）ニコチアナ・タバクムの植物細胞、または本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように改変した植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物（その子孫を含む）は以下である：ニコチアナ・タバクム系統PM16（その種子は受託番号NCIMB41798で寄託された）；ニコチアナ・タバクム系統PM021（その種子は受託番号NCIMB41789で寄託された）；ニコチアナ・タバクム系統PM092（その種子は受託番号NCIMB41800で寄託された）；ニコチアナ・タバクム系統PM102（その種子は受託番号NCIMB41801で寄託された）；ニコチアナ・タバクム系統PM204（その種子は受託番号NCIMB41803でNCIMB Ltd.に2011年1月6日に寄託された）；ニコチアナ・タバクム系統PM205（その種子は受託番号NCIMB41804で寄託された）；ニコチアナ・タバクム系統PM215（その種子は受託番号NCIMB41805で寄託された）；ニコチアナ・タバクム系統PM216（その種子は受託番号NCIMB41806で寄託された）；およびニコチアナ・タバクム系統PM217（その種子は受託番号NCIMB41807で寄託された）。
【００２３】
本発明のさらに別の実施態様では、ニコチアナ・タバクム栽培品種PM132（受託番号NCIMB41802で寄託された）は、配列番号：256、259、262、265、268、271、274、277および280から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％または100％同一の標的ヌクレオチド配列を含む。前記配列を用いて、前記標的部位を認識しこれにまたはその近傍に結合することができる変異導入オリゴヌクレオチドを設計し、その結果、改変植物または植物細胞でグリコシルトランスフェラーゼ（および場合によって少なくとも1つのその対立遺伝子変種）の活性または発現は非改変植物細胞に比して低下、阻害または実質的に阻害され、さらに前記改変植物または植物細胞によって生産される糖タンパク質はそれらのN-グリカンでアルファ-1,3-結合フコース残基およびベータ-1,2-結合キシロース残基を欠く。
【００２４】
具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号：256に示される配列である。
別の具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号：259に示される配列である。
さらに別の具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号：262に示される配列である。
【００２５】
本発明のさらに別の実施態様では、ニコチアナ・タバクム栽培品種PM132（受託番号NCIMB41802で寄託された）は、配列番号：257、260、263、266、269、272、275、278および281から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％または100％同一の標的ヌクレオチド配列を含む。前記配列を用いて、前記標的部位を認識しこれにまたはその近傍に結合することができる変異導入オリゴヌクレオチドを設計し、その結果、改変植物または植物細胞のグリコシルトランスフェラーゼ（および場合によって少なくとも1つのその対立遺伝子変種）の活性または発現は、非改変植物細胞に比して低下、阻害または実質的に阻害され、さらに前記改変植物または植物細胞によって生産される糖タンパク質はそれらのN-グリカンでアルファ-1,3-結合フコース残基およびベータ-1,2-結合キシロース残基を欠く。
具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号：257に示される配列である。
別の具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号：260に示される配列である。
さらに別の具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号：263に示される配列である。
【００２６】
ある種の実施態様では、本発明は、本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように改変したニコチアナ・タバクムの植物の子孫に関する。前記子孫は以前に規定した改変の少なくとも1つを含み、その結果、グリコシルトランスフェラーゼの活性または発現は、非改変植物細胞に比して低下、阻害または実質的に阻害され、さらに（ii）前記改変植物によって生産されるタンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはその両方は非改変植物に比して低下する。
ある実施態様では、改変した（すなわち遺伝的に改変した）ニコチアナ・タバクム植物細胞または本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように改変した植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物（その子孫を含む）は、異種タンパク質を生産する方法で用いることができる。前記方法は以下の工程を含む：本明細書に規定した改変ニコチアナ・タバクムの植物細胞または植物に発現構築物（異種タンパク質、特にワクチン抗原、サイトカイン、ホルモン、凝固タンパク質、アポリポタンパク質、ヒトでの置換療法のための酵素、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチドを含む）を導入する工程；および異種タンパク質が生産されるように前記発現構築物を含む改変植物細胞を培養し、さらに場合によって前記植物細胞から植物を再生し、植物およびその子孫を生長させる工程。
【００２７】
ある実施態様では、本発明は、植物でタンパク質のN-グリコシル化において必要な1つまたは2つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの酵素活性を低下、阻害または実質的に阻害する方法を提供する。具体的には、前記方法は、1つまたは2つ以上のグリコシルトランスフェラーゼのコード配列、特にゲノムヌクレオチド配列を植物で改変する工程、および場合によって前記グリコシルトランスフェラーゼの1つまたは2つ以上の酵素活性または全部のグリコシルトランスフェラーゼ活性が低下、阻害または実質的に阻害された改変植物細胞を選別および／または単離する工程を含む。前記方法は、場合によってグリコシルトランスフェラーゼ、そのフラグメントまたはその対立遺伝子もしくは変種の同定を含むことができる。
【００２８】
特に、本発明は、ヒト化糖タンパク質を生産することができるニコチアナ・タバクム植物または植物細胞を生産する方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：
（i）タバコの植物細胞のゲノムで
a．N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列、または
b．（a）の第一の標的ヌクレオチド配列およびβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列、または
c．（a）の第一の標的ヌクレオチド配列および（b）の第二の標的ヌクレオチド配列およびβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列、および場合によって
d．(a)、(b)もしくは(c)、または前述の標的ヌクレオチド配列の任意の2つ以上の組合せの対立遺伝子変種を含むゲノム領域内の標的ヌクレオチドを改変する工程；
（ii）前記標的ヌクレオチド配列に改変を含む改変植物または植物細胞を同定する工程および場合によって選別する工程；
ここで、改変植物または植物細胞における（a）、（b）、（c）および（d）に規定したグリコシルトランスフェラーゼの活性または発現、並びに場合によって少なくとも1つのその対立遺伝子変種の活性または発現は、非改変植物細胞に比して低下、阻害または実質的に阻害され、さらに前記改変植物または植物細胞によって生産される糖タンパク質はそれらのN-グリカンでアルファ-1,3-結合フコース残基およびベータ-1,2-結合キシロース残基を欠いている。
【００２９】
特に、本発明は、ヒト化糖タンパク質を生産することができるニコチアナ・タバクム植物または植物細胞を生産する方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：
（i）タバコの植物細胞のゲノムで
a．N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列、または
b．（a）の第一の標的ヌクレオチド配列およびN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの配列をコードする第二の標的ヌクレオチド配列、または
c．（a）の第一の標的ヌクレオチド配列および（b）の第二の標的ヌクレオチド配列、およびN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列を改変する工程、
ここで第二または第三の標的ヌクレオチド配列、または第二および第三の標的ヌクレオチド配列は（a）の対立遺伝子変種を含み；
（ii）前記標的ヌクレオチド配列に改変を含む改変植物または植物細胞を同定する工程および場合によって選別する工程；
ここで、改変植物または植物細胞での（a）、（b）、および（c）に規定したグリコシルトランスフェラーゼの活性または発現は、非改変植物細胞に比して低下、阻害または実質的に阻害され、さらに前記改変植物または植物細胞によって生産される糖タンパク質はそれらのN-グリカンでアルファ-1,3-結合フコース残基およびベータ-1,2-結合キシロース残基を欠いている。
特に、本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように、ヒト化糖タンパク質を生産できるニコチアナ・タバクム植物または植物細胞を生産する方法では、タバコ植物または植物細胞のゲノムの改変は以下の工程を含む：
a．ニコチアナ・タバクム植物または植物細胞の標的ヌクレオチド配列で、および場合によって少なくとも１つのその対立遺伝子変種で標的部位を同定する工程、
b．本発明の標的ヌクレオチド配列を基にして、前記標的部位を認識しこれにまたはその近傍に結合することができる変異導入オリゴヌクレオチドを設計する工程、および
c．タバコ植物または植物細胞のゲノムで前記変異導入オリゴヌクレオチドを標的ヌクレオチド配列とゲノムが改変される条件下で結合させる工程。
【００３０】
ある実施態様では、変異導入オリゴヌクレオチドは、ゲノム編集技術、特にジンクフィンガー媒介変異導入、チリング、相同組換え、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、またはメガヌクレアーゼ媒介変異導入、または前述の技術の組合せで用いられる。
ある実施態様では、本発明は、本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように生産した、ニコチアナ・タバクム植物細胞または改変植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物に関する。
本発明の別の実施態様では、本発明にしたがっておよび本明細書に記載したようにヒト化糖タンパク質を生産できるように改変された植物は、ニコチアナ・タバクム栽培品種PM132（受託番号NCIMB41802で寄託された）である。
本発明のさらに別の実施態様では、ニコチアナ・タバクム栽培品種PM132で同定され、受託番号NCIMB41802で寄託され、前記標的を認識しこれにまたはその近傍に結合できる変異導入オリゴヌクレオチドを設計するために用いられる標的ヌクレオチド配列は、配列番号：256、259、262、265、268、271、274、277および280から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％または100％同一の配列である。
具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号：256に示す配列である。
本発明のさらに別の実施態様では、ニコチアナ・タバクム栽培品種PM132で同定され、受託番号NCIMB41802で寄託され、前記標的を認識しこれにまたはその近傍に結合できる変異導入オリゴヌクレオチドを設計するために用いられる標的ヌクレオチド配列は、配列番号：257、260、263、266、269、272、275、278および281から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％または100％同一の配列である。
具体的な実施態様では、前記標的ヌクレオチド配列は配列番号：257に示す配列である。
【００３１】
ある実施態様では、改変した（すなわち遺伝的に改変した）ニコチアナ・タバクム植物細胞、または本発明にしたがっておよび本明細書に記載したように改変した植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物（その子孫を含む）は、ニコチアナ・タバクム栽培品種PM132（受託番号NCIMB41802で寄託された）であり、前記はさらに、（a）β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変（前記配列は、配列番号：1、4、5および17並びに配列番号：8および18から成る群からそれぞれ選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である）、または（b）α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変（前記配列は、配列番号：27、32、37および47並びに配列番号：28、33、38および48から成る群からそれぞれ選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である）、または（a）および（b）の組合せを含む。
【００３２】
タバコのゲノムのサイズおよび複雑さ、並びに潜在的に多くの変種および対立遺伝子が存在するために、グリコシルトランスフェラーゼの遺伝子配列の同定には慎重な戦法を考案する必要があった。本発明にしたがえば、植物のグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列を同定する方法が提供される。具体的な実施態様では、本発明の方法は、（i）当分野で公知の方法にしたがって植物ゲノムのDNAライブラリー、例えば細菌人工染色体（BAC）ゲノムDNAライブラリーを構築する工程、（ii）ポリヌクレオチドプローブをゲノムDNAライブラリーのゲノム性クローン（例えばBACクローン）と、前記プローブが相同なヌクレオチド配列と結合することを可能にする条件下でハイブリダイズさせる工程、および（iii）前記プローブとハイブリダイズしたゲノム性DNAクローンを同定する工程を含む。プローブは、グリコシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列にしたがって設計される。ゲノム性DNAクローン（グリコシルトランスフェラーゼをコードする配列のフラグメントまたは部分を含む）のヌクレオチド配列は、当分野で公知の方法にしたがって配列を決定できる。
また別には、公知のグリコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含むポリヌクレオチド（例えば第一の植物ですでに同定されたもの）を用いて、第二の植物（例えばタバコの植物）のエクソン配列の収集物をスクリーニングすることができる。公知のグリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドと相同性を有するエクソン配列を用いて、第二の植物のゲノムDNAライブラリー（例えばタバコBACライブラリー）をスクリーニングするためのプローブを開発して、BACクローンを同定しさらに第二の植物のグリコシルトランスフェラーゼのゲノム配列を確定することができる。
【００３３】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードするゲノムヌクレオチド配列の同定を支援するために、特定の植物器官（例えば葉）で発現されることが判明しているエクソンのヌクレオチド配列のデータベースと前記ゲノムヌクレオチド配列をin silicoで比較する。所望の発現プロフィールと適合するゲノムヌクレオチド配列、例えば葉で発現する遺伝子または葉でのみ発現する遺伝子を更なる性状決定のために選択する。本発明のこの局面では同定プロセスを関連配列に集中させて、候補配列の数を減少させる。偽遺伝子、不活性な対立遺伝子または変種、特定の器官（例えば葉）で発現されない対立遺伝子または変種はしたがって排除される。
したがって、非限定的な例として、ニコチアナ・タバクムのベータ-(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントをコードするゲノムDNA配列は、ポリヌクレオチドプローブを用いてニコチアナ・タバクムBACライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。プローブは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のベータ-(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼと相同性を示すニコチアナの配列を編集することによってアッセンブリングできるタバコのベータ-(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼのエクソンのヌクレオチド配列にしたがって設計できる。エクソンの発現は、タバコのエクソンのポリヌクレオチドを含むマイクロアレイを用いてタバコの葉でそのmRNAを検出することによって試験することができる。
【００３４】
別の非限定的な例では、ニコチアナ・タバクムのアルファ-(1,3)-フコシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントをコードするゲノムDNA配列は、ポリヌクレオチドプローブを用いてニコチアナ・タバクムBACライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。プローブは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のアルファ-(1,3)-フコシルトランスフェラーゼと相同性を示すニコチアナの配列を同定し、さらにタバコのエクソンのポリヌクレオチドを含むマイクロアレイを用いてタバコの葉でエクソンの発現を検出することによって編集することができるタバコのアルファ-(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのエクソンのヌクレオチド配列にしたがって設計できる。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードするゲノムDNA配列を植物細胞で同定するまた別の方法を本発明の方法で用いることができる。本発明で開示するグリコシルトランスフェラーゼのポリヌクレオチド配列を用いて、これらのグリコシルトランスフェラーゼおよび関連する他のグリコシルトランスフェラーゼのさらに別の対立遺伝子を上記に開示した方法にしたがって同定することができる。
【００３５】
本発明の別の実施態様では、グリコシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントのコード配列を含むゲノムDNA配列は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする配列にしたがって設計される核酸プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって同定することができる。特に、以下のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを組み合わせて用い、本発明のグリコシルトランスフェラーゼのさらに別の対立遺伝子および他の関連するグリコシルトランスフェラーゼを同定することができる：
【００３６】
配列番号：2のフォワードプライマーおよび配列番号：3のリバースプライマー；
配列番号：10のフォワードプライマーおよび配列番号：11のリバースプライマー；
配列番号：15のフォワードプライマーおよび配列番号：16のリバースプライマー；
配列番号：23のフォワードプライマーおよび配列番号：24のリバースプライマー；
配列番号：25のフォワードプライマーおよび配列番号：26のリバースプライマー；
配列番号：30のフォワードプライマーおよび配列番号：31のリバースプライマー；
配列番号：35のフォワードプライマーおよび配列番号：36のリバースプライマー；
配列番号：45のフォワードプライマーおよび配列番号：46のリバースプライマー；
配列番号：231のフォワードプライマーおよび配列番号：232のリバースプライマー；
配列番号：236のフォワードプライマーおよび配列番号：237のリバースプライマー；
配列番号：238のフォワードプライマーおよび配列番号：239のリバースプライマー；
配列番号：240のフォワードプライマーおよび配列番号：241のリバースプライマー；
配列番号：242のフォワードプライマーおよび配列番号：243のリバースプライマー；
配列番号：244のフォワードプライマーおよび配列番号：245のリバースプライマー；
配列番号：246のフォワードプライマーおよび配列番号：247のリバースプライマー；
配列番号：248のフォワードプライマーおよび配列番号：249のリバースプライマー；
配列番号：250のフォワードプライマーおよび配列番号：251のリバースプライマー；
配列番号：252のフォワードプライマーおよび配列番号：253のリバースプライマー；
または
配列番号：254のフォワードプライマーおよび配列番号：255のリバースプライマー。
【００３７】
本発明は以下のプライマーを提供する：
contig gDNA_c1736055のフラグメントの増幅に配列番号：2および3に示す配列を有するプライマー；ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・ベンタミアナのGnTI-Bのフラグメントの増幅に配列番号：10および11に示す配列を有するプライマー；contig CHO_OF4335xn13f1のフラグメントの増幅に配列番号：15および16に示す配列を有するプライマー；ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・ベンタミアナのGnTI-Aのフラグメントの増幅に配列番号：23および24に示す配列を有するプライマー；contig CHO_OF3295xj17f1のフラグメントの増幅に配列番号：25および26に示す配列を有するプライマー；contig gDNA_c1765694のフラグメントの増幅に配列番号：30および31に示す配列を有するプライマー；contig_CHO_OF4881xd22dr1のフラグメントの増幅に配列番号：35および36に示す配列を有するプライマー；またはcontig CHO_OF4486xe11f1の増幅に配列番号：45および46に示す配列を有するプライマー；ニコチアナ・タバクムのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIのイントロ−エクソン配列を含むcontig gDNA_c1690982のフラグメントの増幅に配列番号：231および232に示す配列を有するプライマー；N.タバクムPM132のFABIJI-ホモローグの増幅に配列番号：236および237に示す配列を有するプライマー；N.タバクムPM132のCPO GnTIゲノム配列の増幅に配列番号：238および239に示す配列を有するプライマー；N.タバクムPM132のCAC80702.1ホモローグの増幅に配列番号：240および242に示す配列を有するプライマー；N.タバクムHicks BroadleafのGnTI配列の増幅に配列番号：242および243に示す配列を有するプライマー；N.タバクムHicks BroadleafのGnTI配列の増幅に配列番号：244および245に示す配列を有するプライマー；5'UTRおよびエクソン1から7を含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅に配列番号：246および247に示す配列を有するプライマー；エクソン4から13を含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅に配列番号：248および249に示す配列を有するプライマー；エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅に配列番号：250および251に示す配列を有するプライマー；エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅に配列番号：252および253に示す配列を有するプライマー；エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅に配列番号：254および255に示す配列を有するプライマー。
【００３８】
本発明はまた、配列番号2、3、10、11、15、16、23、24、25、26、30、31、35、36、45、または46、231、232、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254または255に示すプライマーの1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または長さが10塩基対以上のその部分配列を包含する。しかしながら、当業者は、例えばこれらの配列の伸長もしくは短縮、または伸長と短縮の併用、または特異的なヌクレオチド交換によってこれらのプライマー、プライマー配列およびプライマー対を改変および修正することができる。
上記に記載した本発明の方法に基づけば、本発明は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つのフラグメントをコードするヌクレオチド配列、特に配列番号：1、4、5、7、12、13、14、17、27、32、37、40、41および47、233を提供する。別の実施態様では、本発明は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つのフラグメントをコードするヌクレオチド配列、特に配列番号：256、259、262、265、268、271、274、277および280を提供する。別の実施態様では、本発明は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つのフラグメントをコードするヌクレオチド配列、特に配列番号：18、20、21、22、28、33、38、48、212、213、219、220、223、225、227、229、234を提供する。別の実施態様では、本発明は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つのフラグメントをコードするヌクレオチド配列、特に配列番号：257、260、263、266、269、272、275、278、281を提供する。
【００３９】
さらに本発明に含まれるものは、配列番号：1、4、5、7、12、13、14、17、27、32、37、40、41および47、233のいずれか1つのヌクレオチド配列と、配列番号：256、259、262、265、268、271、274、277および280のいずれか1つのヌクレオチド配列と、配列番号：18、20、21、22、28、33、38、48、212、213、219、220、223、225、227、229、234のいずれか1つのヌクレオチド配列と、配列番号：257、260、263、266、269、272、275、278、281のいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドである。さらにまた本発明に含まれるものは、（i）配列番号：1、4、5、7、12、13、14、17、27、32、37、40、41および47、233のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む核酸プローブ、または（ii）配列番号：1、4、5、7、12、13、14、17、27、32、37、40、41および47、233のいずれか1つのヌクレオチド配列の相補鎖を含む核酸プローブと、特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【００４０】
さらにまた本発明に含まれるものは、（i）配列番号：256、259、262、265、268、271、274、277および280のいずれか1つのヌクレオチド配列、または（ii）配列番号：256、259、262、265、268、271、274、277および280のいずれか1つのヌクレオチド配列の相補鎖を含む核酸プローブと、特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【００４１】
さらにまた本発明に含まれるものは、（i）配列番号：257、260、263、266、269、272、275、278、281のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む核酸プローブ、または（ii）配列番号：257、260、263、266、269、272、275、278、281のいずれか1つのヌクレオチド配列の相補鎖を含む核酸プローブと、特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【００４２】
さらにまた本発明に含まれるものは、（i）配列番号：18、20、21、22、28、33、38、48、212、213、219、220、223、225、227、229、234のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む核酸プローブ、または（ii）配列番号：18、20、21、22、28、33、38、48、212、213、219、220、223、225、227、229、234のいずれか1つのヌクレオチド配列の相補鎖を含む核酸プローブと、特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【００４３】
さらにまた本発明に含まれるものは、上記に開示したポリヌクレオチドのフラグメントである。
本発明のポリヌクレオチドのフラグメント（オリゴヌクレオチドまたはプライマーを含むが、ただしこれらに限定されない）は、少なくとも長さが16ヌクレオチドであり得る。種々の実施態様では、フラグメントは、長さが少なくとも約20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000の、またはそれより大きい連続したヌクレオチドであり得る。或いは、フラグメントは、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの約10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000の、またはそれより大きい連続したアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントはまた、機能的ドメイン（例えばシグナル配列および酵素の活性部位）をコードするポリヌクレオチドのコード領域の部分と同様に、発明のグリコシルトランスフェラーゼのイントロンまたはエクソンも指すことができる。多くのそのようなフラグメントを本発明のポリヌクレオチドの同定用核酸プローブとして用いることができる。
【００４４】
本発明はさらに、上記で同定した本発明のポリヌクレオチドによってコードされるグリコシルトランスフェラーゼに関し、前記グリコシルトランスフェラーゼは以下のa−dである：
a．配列番号：214、215、217、218、221、222、224、228、230、235、258、264、267、270、273、276、279および282に示すアミノ酸配列を提示するN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；
b．配列番号：9および19に示すアミノ酸配列を提示するβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ；
c．配列番号：29、34、39および49に示すアミノ酸配列を提示するα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ；
d．（i）、（ii）または（iii）のアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％同一であるアミノ酸配列。
【００４５】
本発明のある実施態様では、本明細書で規定するゲノムヌクレオチド配列を用いて、（i）N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの、またはN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼの、またはN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼの、またはN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼおよびα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼの、および場合によって少なくとも1つのその対立遺伝子変種の活性または発現が、非改変植物細胞に比して改変を含む改変植物細胞で低下し、さらに（ii）アルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはその両方が、非改変植物細胞に比して改変を含む改変植物細胞のタンパク質のN-グリカンで低下する改変のために、
（a）N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列、または
（b）（a）の第一の標的ヌクレオチド配列およびβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列、または
（c）（a）の第一の標的ヌクレオチド配列およびα(1,3)-フコシルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列、または
（d）（a）、（b）および（c）の全ての標的ヌクレオチド配列において標的部位が同定される。
【００４６】
本発明のある実施態様では、本明細書で規定するゲノムヌクレオチド配列を用いて、（i）改変を含む改変植物細胞のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの、または2つ以上のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの活性または発現が、非改変植物細胞に比して低下し、さらに（ii）アルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはその両方が改変を含む改変植物細胞のタンパク質のN-グリカンで非改変植物細胞に比して低下する改変のために、
（a）N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列、または
（b）（a）の第一の標的ヌクレオチド配列および第二のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列、または
（c）（a）の第一の標的ヌクレオチド配列および第三のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列、または
（d）（a）、（b）および（c）の全ての標的ヌクレオチド配列において標的部位が同定される。  第二または第三のヌクレオチド配列、または第二および第三のヌクレオチド配列は第一のヌクレオチド配列の対立遺伝子変種であり得る。
本発明の具体的な実施態様では、本明細書に規定するゲノムヌクレオチド配列またはコード配列と選択的に結合する非天然のジンクフィンガータンパク質は、標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つで二本鎖の切断を導入するジンクフィンガーヌクレアーゼを作製するために用いられる。
【００４７】
別の実施態様では、本発明は、本明細書に開示したコード配列の上流および下流で見出される調節領域に向けられる（前記領域は本明細書で提供するゲノム配列から容易に決定および単離される）。そのような調節領域に含まれるものは、プロモーター配列、上流アクチベーター配列および本明細書で同定される遺伝子の発現を調整する調節タンパク質の結合部位であるが、ただしこれらに限定されない。
RNAi、shRNA（McIntyre and Fanning (2006), BMC Biotechnology 6:1）、リボザイム、アンチセンスヌクレオチド配列（アンチセンスDNAまたはアンチセンスRNAの如きもの）、siRNA（(Hannon (2003), Rnai: A Guide to Gene Silencing, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA)、および本発明のグリコシルトランスフェラーゼのゲノムDNA配列に対応するPNAもまた意図される。
【００４８】
具体的な実施態様では、本発明は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ、そのフラグメント、変種または対立遺伝子型をコードする4つの遺伝子配列；ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ、そのフラグメント、変種または対立遺伝子型をコードする2つの遺伝子配列；およびN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI、そのフラグメント、変種または対立遺伝子型をコードする1つの遺伝子配列を提供する。特に、本発明のグリコシルトランスフェラーゼは葉で発現される。
【００４９】
2つ以上の核酸またはタンパク質配列の関係で“パーセント同一”という用語は、最大一致を求めて比較およびアラインメントを実施し、以下の配列比較アルゴリズムを用いるかまたは目視精査によって測定したとき、同じであるかまたは具体的なパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じである2つ以上の配列または部分配列を指す。“同一”という用語は、本明細書ではヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の関係で、互いに少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、 詳しくは少なくとも70％、少なくとも75％、より詳しくは少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％同一である2つの配列を言うために用いられる。
【００５０】
互いに比較されるべき2つの配列の長さが異なる場合、配列同一性は、好ましくはより長い配列のヌクレオチド残基と同一であるより短い方の配列のヌクレオチド残基のパーセンテージに一致する。本明細書で用いられるように、2つの配列間のパーセント同一は、ギャプの数および各ギャップの長さを考慮しつつ（ギャップは2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要がある）、それら配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／総位置数ｘ100）。配列の比較および2つの配列間のパーセント同一の決定は、下記に記載する数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。例えば、配列同一性は、コンピュータプログラム、例えばベストフィット（Bestfit）プログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711）を用いて通常的に決定できる。ベストフィットは、スミスとウォーターマン（Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489）の局所相同性アルゴリズム（2つの配列間で最高の配列同一性を有するセグメントを見出そうとする）を利用する。ベストフィットまたは別の配列アラインメントプログラムを用いて、具体的な配列が本発明の参照配列と例えば95％同一性を有するか否かを決定するとき、パラメーターは、好ましくは同一性パーセンテージが参照配列の全長にわたって計算されるように、および参照配列のヌクレオチドの総数の5％までの相同性ギャップが許容されるように調節される。ベストフィットを用いるときは、いわゆる最適パラメーターは、好ましくはそれらの既定値（“規定”値）のままにしておく。与えられた配列と本発明の上記記載の配列間の比較で出現する逸脱は、例えば付加、欠失、置換、挿入または組換えによって生じ得る。そのような配列比較は、好ましくはまた“fasta20u66”プログラム（バージョン2.0u66（1998年9月）、William R. Pearson and the University of Virginia（以下もまた参照されたい：W.R. Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98；添付例およびhttp://workbench.sdsc.edu/）を用いて実施できる。本目的のためには“規定値”のパラメーター設定を用いることができる。
【００５１】
配列比較によって比較されるべき2つのヌクレオチド配列が実体において相違するか否かは、短い方の配列および前記短い方の配列とマッチする長い方の配列の当該部分と関係する。換言すれば、比較される配列がおなじ長さをもたないとき、同一性の程度は、好ましくは、長い方の配列のヌクレオチド残基と同一である短い方のヌクレオチド残基のパーセンテージ、または短い方の配列のヌクレオチド配列と同一である長い方の配列のヌクレオチドのパーセンテージと関係する。これに関して、当業者はより短い配列と“マッチする”より長い配列の該当部分を容易に決定できる。
【００５２】
本明細書に記載したヌクレオチドまたはアミノ酸配列と少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、詳しくは少なくとも70％、少なくとも75％、より詳しくは少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％同一性を有するヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、これら配列の対立遺伝子、誘導体または変種（好ましくは類似の生物学的機能を有する）であり得る。それらは、天然に存在する変種、例えば対立遺伝子配列、他の生態型、品種、種など、または突然変異に由来する配列であり得る。変異は天然に生じたものであるか、または意図的な変異導入方法によって発生させたものであり得る。さらにまた、変種は合成により生成された配列でもよい。対立遺伝子変種は、天然に存在する変種でも、または合成により生成された変種でも、または組換えDNA技術によって生成された変種でもよい。上記に記載したポリヌクレオチドの偏向は、例えば欠失、置換、付加、挿入もしくは組換え、または挿入および組換えによって生成され得る。“付加”という用語は、少なくとも1つのヌクレオチド残基またはアミノ酸をある配列の末端へ付加することを指し、一方、“挿入”は少なくとも1つのヌクレオチド残基またはアミノ酸をある配列内に挿入することを指す。
【００５３】
2つの核酸配列が実質的に同一であるというまた別の指標は、当該2つのポリヌクレオチドがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするということである。“特異的にハイブリダイズする”という語句は、ある分子が複合混合物（例えば全細胞DNAまたはRNA）中に存在するときに、前記配列がストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列とのみ結合し、二重体を形成しまたはハイブリダイズすることを指す。“実質的に結合する”とは核酸プローブと標的核酸間における相補的ハイブリダイゼーションを指し、ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを緩和して標的核酸配列の所望の検出を達成することによって受容され得る小さなミスマッチを含む。
本明細書で提供されるポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力を有するポリヌクレオチド配列は、例えば植物のゲノムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーから単離できる。特に、そのようなポリヌクレオチドは植物起源であり、特に好ましくはニコチアナ属に属する植物（特にニコチアナ・ベンタミアナまたはニコチアナ・タバクム）に由来する。或いは、そのようなヌクレオチド配列は遺伝的操作または化学的合成によって調製できる。
【００５４】
ハイブリダイズする能力を有するポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載したポリヌクレオチド配列、またはその部分もしくは逆相補鎖を用いることによって、例えば標準的方法にしたがってハイブリダイズすることによって同定および単離することができる（例えば以下を参照されたい：Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA）。列挙した配列番号に示したものと同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはその部分もしくはフラグメントは、例えばハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブとして用いられるフラグメントはまた、通常の合成技術によって調製される合成フラグメントでもよい（その配列は本発明のヌクレオチド配列の配列と実質的に同一である）。
【００５５】
核酸のハイブリダイゼーション実験（例えばサザンおよびノーザンハイブリダイゼーション）の関係で“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”および“ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件”は配列によって左右され、異なる環境パラメーターの下で多様である。より長い配列はより高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの重点的な手引は以下で見出される：Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York. Generally。一般的には、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、個々の配列について規定のイオン強度およびpHにおける熱融解点よりも約5℃低くなるように選択される。典型的には“ストリンジェントな条件”下では、プローブはその標的部分配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない。
【００５６】
熱融解点は、完全にマッチするプローブと（既定のイオン強度およびpHにおいて）標的配列の50％がハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、個々のプローブの融解温度（Tm）と等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットでフィルター上の相補的な100を超える残基を有する相補性核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、42℃の1mgヘパリン含有50％ホルムアミドで、ハイブリダイゼーションは一晩実施される。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、72℃の0.15MのNaClで約15分である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、65℃で15分間の0.2倍SSCの洗浄である（SSC緩衝液の記述については上掲書（Sambrook）を参照されたい）。低ストリンジェンシー洗浄がしばしば高ストリンンジェンシー洗浄に先行し、バックグラウンドのプローブシグナルが除去される。例えば100を超えるヌクレオチドの二重体のための中等度のストリンジェンシー洗浄の例は、45℃で15分間の1倍SSCである。例えば100を超えるヌクレオチドの二重体のための低ストリンジェンシー洗浄の例は、40℃で15分間の4−6倍SSCである。短いプローブ（例えば約10から50ヌクレオチド）のためには、ストリンジェントな条件は、pH7.0から8.3で典型的には約1.0M未満の塩濃度のNaイオン、典型的には約0.01から1.0MのNaイオン濃度を必要とし、温度は典型的には少なくとも約30℃である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定化剤（例えばホルムアミド）の添加により達成できる。一般的には、個々のハイブリダイゼーションアッセイで無関係のプローブについて観察されるシグナル対ノイズ比の2倍の（または高い）シグナル対ノイズ比は特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一であるならばやはり実質的に同一である。このようなことは、例えば核酸のコピーが、遺伝暗号によって許容される最大のコドン縮退を用いて作製されるときに生じる。
【００５７】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を同定した後で、本発明はさらに、植物または植物細胞でヌクレオチド配列を改変して、グリコシルトランスフェラーゼの酵素活性の低下、阻害もしくは実質的阻害またはグリコシルトランスフェラーゼの発現レベルの低下を示す植物または植物細胞を作製する方法を提供する。前記酵素活性の低下、阻害もしくは実質的阻害または発現レベルの変化は、天然に存在する植物細胞、非改変植物細胞、または本発明の方法によって改変されていない植物細胞（前記のいずれの植物細胞もコントロールとして用いることができる）のそれに対して相対的である。そのようなコントロールに対する酵素活性または発現レベルの比較は当分野で公知の任意の方法によって実施できる。
【００５８】
改変植物細胞または改変植物という用語は、本明細書では遺伝的改変植物細胞または遺伝的改変植物という用語と相互に用いられる。前記用語は、当分野で公知の方法（化学的変異導入またはゲノム編集技術（例えば本明細書で詳細に記載される技術）を含むがただしこれらに限定されない）を適用することによって、植物細胞ゲノム内に含まれるヌクレオチド配列の1つに変異または改変を含むように人工的に改変された植物細胞およびそのような改変植物細胞を含む植物を指す。
当分野で公知の多くの方法を用いて、本発明のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を変異させることができる。遺伝子配列にランダムに変異を導入する方法は、化学的変異導入（例えばEMS変異導入および放射線照射変異導入であるがただし前記に限定されない）であり得るが、ただし前記に限定されない。細胞に標的設定変異を導入する方法には、ゲノム編集技術、特にジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入、チリング（targeting induced local lesion in genomes, tilling：ゲノム内標的設定局所病巣誘導）、相同組換え、オリゴヌクレオチド特異的変異導入およびメガヌクレアーゼ媒介変異導入が含まれるが、ただしこれらに限定されない（チリングは以下に記載されている：McCallum et al., Plant Physiol, June 2000, Vol. 123, pp. 439-442；およびHenikoff et al., Plant Physiology, 2004, 135:630-636）。変異した遺伝子配列をスクリーニングする当分野で公知の多くの方法を用いて、変異を同定または確認することができる。
【００５９】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入の一般的な利用は当分野で公知であり、特許公開公報、例えばWO02057293、WO02057294、WO0041566、WO0042219および WO2005084190（ただし前記に限定されない）に記載されている（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。メガヌクレアーゼ媒介変異導入の一般的な利用は当分野で公知であり、特許公開公報、例えばWO96/14408、WO2003025183、WO2003078619、WO2004067736、WO2007047859およびWO2009059195（ただし前記に限定されない）に記載されている（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
【００６０】
本発明の方法はしたがって、変異導入（例えば化学的変異導入または放射線照射変異導入）を適用することによって、植物細胞で本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする配列を改変する工程を含む。本発明の別の方法は、遺伝子編集技術、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入、チリング（ゲノム内標的設定局所病巣誘導）、相同組換え、オリゴヌクレオチド特異的変異導入およびメガヌクレアーゼ媒介変異導入（ただしこれらに限定されない）を適用することによって、本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする配列内の標的部位を改変する工程を含む。
多数のグリコシルトランスフェラーゼ、変種および対立遺伝子が植物細胞内で活性を有し得るとしたら、前記酵素活性の低下、実質的阻害または完全な阻害を達成するためには、グリコシルトランスフェラーゼをコードする2つ以上の遺伝子配列を植物細胞内で改変するべきであると考えられる。本発明の好ましい実施態様では、改変は当分野で公知の1つまたは2つ以上のゲノム編集技術を適用することによって実施される。本発明の改変植物細胞は多数の手法によって作製できる。
【００６１】
本発明のある実施態様では、第一のグリコシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントを植物細胞でコードする第一の遺伝子配列が改変され、続いて、前記第一のグリコシルトランスフェラーゼの活性の低下を示す改変植物細胞の同定または単離が実施される。改変された第一のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む改変植物細胞を続いて変異導入に付し、第二のグリコシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントをコードする第二の遺伝子配列が改変される。前記に続いて、第二のグリコシルトランスフェラーゼの活性の低下、または第一の改変のみを保持する細胞のグリコシルトランスフェラーゼ活性に比して更なるグリコシルトランスフェラーゼ活性の低下を示す改変植物細胞が同定または単離される。同定後に改変植物細胞を単離することができる。この段階で入手される改変植物細胞は、2つのグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの2つの変種もしくは対立遺伝子をコードする2つの遺伝子に2つの改変を含む。
本発明の改変植物細胞または改変植物は、非改変植物または植物細胞で生成されるグリコシルトランスフェラーゼとは異なる分子量を有する変異グリコシルトランスフェラーゼの生成によって同定できる。変異グリコシルトランスフェラーゼは、非改変植物または植物細胞で生成されるグリコシルトランスフェラーゼの切端型または伸長型であり、改変植物または植物細胞の同定を容易にするマーカーとして用いることができる。前記ポリペプチドの切端または伸長は、典型的にはコード配列における終止配列の導入または、また別の読み枠内の終止コドンの使用を引き起こす読み枠におけるシフトから生じる。
【００６２】
本発明ではさらに、前記改変植物細胞は、他のグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの他の変種もしくは対立遺伝子をコードする遺伝子、例えば第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、または第八のグリコシルトランスフェラーゼまたはその変種もしくは対立遺伝子の1回または2回以上の連続改変に付される。改変に付される第一の遺伝子配列は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼ、例えばベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼまたはN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ただしこれらに限定されない）をコードすることが意図される。グリコシルトランスフェラーゼまたはその対立遺伝子をコードする第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、または第八の遺伝子配列は、それぞれ独立してベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼまたはN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼであり得る。酵素活性の低下または酵素活性の阻害もしくは実質的阻害を示す改変植物細胞は、それぞれ本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする1、2、3、4、5、6、7、8または9つ以上の改変遺伝子配列を含むことができ、前記グリコシルトランスフェラーゼはそれぞれ別個にベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼまたはN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼであり得る。
【００６３】
したがって、本発明は、2つまたは3つ以上の改変ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼゲノムDNA配列、2つまたは3つ以上の改変アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼゲノムDNA配列、または2つまたは3つ以上の改変N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼゲノムDNA配列を含む改変植物細胞を提供する。1つまたは2つ以上の改変ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼゲノムDNA配列および1つまたは2つ以上の改変N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼゲノムDNA配列を含む改変植物細胞が包含される。1つまたは2つ以上の改変アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼゲノムDNA配列および1つまたは2つ以上の改変N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼゲノムDNA配列を含む改変植物細胞もまた提供される。1つまたは2つ以上の改変アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼゲノムDNA配列および1つまたは2つ以上の改変ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼゲノムDNA配列を含む改変植物細胞が包含される。
【００６４】
2つ以上の改変グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列を含む改変植物または植物細胞を作製する別の手法は2つの異なる植物の交配を必要とし、前記2つの植物の各々は1つまたは2つ以上の異なる改変グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列を含む。交配に用いられる改変植物は上記に記載した本発明の方法によって作製できる。
交配または上記に記載したゲノム改変で用いられる改変植物または植物細胞は、改変植物または植物細胞における（i）1つまたは2つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの活性の低下または検出不能；（ii）1つまたは2つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの発現の低下または検出不能；（iii）植物タンパク質または異種タンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-結合フコース、ベータ-1,2-結合キシロースまたはその両方のレベルの低下または検出不能；（iv）高マンノース型N-グリカンの増加または蓄積によって同定または選別することができる。
【００６５】
本発明のある実施態様では、改変植物または植物細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入によって作製できる。ジンクフィンガーDNA結合ドメインまたはモチーフは、ベータ-ベータ-アルファ（ββα）構造に折り畳まれる約30アミノ酸から成り、
前記構造のアルファ-ヘリックス（α-ヘリックス）はDNA二重らせんに挿入される。本発明で用いられる“アルファ-ヘリックス”（α-ヘリックス）は、右巻きまたは左巻きらせんのタンパク質二次構造モチーフを指し、前記モチーフではアミノ酸の各N-H基の水素は、第一のアミノ酸に対して-4位のアミノ酸のC=O基と結合する。本明細書で用いられる“ベータ-バレル”（β-バレル）は2つのベータ鎖（β-鎖）を含むタンパク質二次構造モチーフを指し、前記モチーフでは、第一の鎖は第二の鎖と水素結合して閉鎖構造を形成する。本明細書で用いられる“ベータ-ベータ-アルファ（ββα）構造”は、2つのアンチパラレルβ-鎖および1つのα-ヘリックスを含むβ-バレルから成るタンパク質の構造を指す。本発明で用いられる“ジンクフィンガーDNA結合ドメイン”は、亜鉛イオンを含み、特異的な3塩基対のDNA配列と結合することができるタンパク質ドメインを指す。本明細書で用いられる“非天然ジンクフィンガーDNA結合ドメイン”という用語は、改変されるべきDNAを含む細胞または生物では存在しないジンクフィンガーDNA結合ドメインを指す。
【００６６】
標的DNA内の3塩基対配列と結合するジンクフィンガーDNA結合ドメインまたはモチーフ内の重要なアミノ酸は、アルファ-ヘリックス（α-ヘリックス）の先頭に対してアミノ酸-1、+1、+2、+3、+4、+5および+6である。ジンクフィンガーDNA結合ドメインまたはモチーフのα-ヘリックスの先頭に対して-1、+1、+2、+3、+4、+5および+6位のアミノ酸をベータ-バレル（β-バレル）骨格を維持しながら改変して、異なる3塩基対配列と結合する新規なDNA結合ドメインまたはモチーフを作製できる。そのような新規な結合ドメインは、非天然のジンクフィンガーDNA結合ドメインであり得る。α-ヘリックスの開始部に対して-1、+1、+2、+3、+4、+5および+6位のアミノ酸による3塩基対配列の認識の他に、これらのアミノ酸のいくつかはまた、前記3塩基対配列認識部位の外側の塩基対と相互作用できる。2、3、4、5、6または7つ以上のジンクフィンガーDNA結合ドメインまたはモチーフを組み合わせることによって、より長いDNA配列と特異的に結合するジンクフィンガータンパク質を作製することができる。例えば、2つのジンクフィンガーDNA結合ドメインまたはモチーフを含むジンクフィンガータンパク質は、特異的な6塩基対配列を認識でき、さらに4つのジンクフィンガーDNA結合ドメインまたはモチーフを含むジンクフィンガータンパク質は、特異的な12塩基対配列を認識できる。ジンクフィンガータンパク質は、2つもしくは3つ以上の天然のジンクフィンガーDNA結合ドメインまたはモチーフ、または2つもしくは3つ以上の非天然のジンクフィンガーDNA結合ドメインまたはモチーフ（選別方法（例えばファージディスプレー選別、細菌性2ハイブリッド選別または細菌性1ハイブリッド選別を含むがただしこれらに限定されない）と一対にして、切端もしくは伸長または位置特異的変異導入により天然または野生型ジンクフィンガータンパク質から誘導される）、または天然および非天然のジンクフィンガーDNA結合ドメインの任意の組合せを含むことができる。本文脈で用いられる“切端”は、天然のジンクフィンガータンパク質で見出されるジンクフィンガーDNA結合ドメインまたはモチーフの総数よりも少ないドメインまたはモチーフを含むジンクフィンガータンパク質を指す。本文脈で用いられる“伸長”は、天然のジンクフィンガータンパク質で見出されるジンクフィンガーDNA結合ドメインまたはモチーフの総数よりも多いドメインまたはモチーフを含むジンクフィンガータンパク質を指す。ジンクフィンガータンパク質と結合するゲノム配列内ポリヌクレオチド配列を選択する技術は当分野で公知であり、本発明で用いることができる。そのようなポリヌクレオチド配列と結合する非天然ジンクフィンガータンパク質を構築する方法もまた当業者には公知であり、本発明で用いることができる。
【００６７】
本発明の具体的な実施態様では、本発明のグリコシルトランスフェラーゼのコード配列の一部分または全部を含むゲノムDNA配列は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入によって改変される。ゲノムDNA配列は、ジンクフィンガータンパク質結合のために固有の部位について検索される。或いは、ゲノムDNA配列は、ジンクフィンガータンパク質結合のために固有の2つの部位について検索され、この場合、両部位は向かい合う鎖上に互いに近接して存在する。前記2つのジンクフィンガータンパク質標的部位は0、1、2、3、4、5、6または7塩基対以上分離し得る。ジンクフィンガータンパク質結合部位は、グリコシルトランスフェラーゼのコード配列またはグリコシルトランスフェラーゼの発現を制御する調節エレメント（例えばグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター領域であるが、ただし前記に限定されない）内にあってもよい。特に、一方または両方のジンクフィンガータンパク質は非天然のジンクフィンガータンパク質である。
【００６８】
したがって、本発明は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼ（例えばベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメント、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメント、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントであるが、ただしこれらに限定されない）と結合するジンクフィンガータンパク質を提供する。好ましい実施態様では、ジンクフィンガータンパク質は、本発明のニコチアナ・タバクムのグリコシルトランスフェラーゼと結合する。
【００６９】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列（例えばゲノムDNA配列）をジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入によって変異させる方法が意図され、前記は場合によって1つまたは2つ以上の以下の工程を含む：（i）遺伝子配列内の異なる標的部位と選択的に結合する少なくとも2つのジンクフィンガータンパク質を提供する工程；（ii）工程（i）の2つの異なる非天然ジンクフィンガータンパク質の1つおよびヌクレアーゼを含む異なるジンクフィンガーヌクレアーゼをそれぞれコードし、植物細胞で作動可能な発現制御配列が作動できるように連結された2つの発現構築物を構築する工程；（iii）植物細胞に前記2つの発現構築物を導入する工程（前記植物細胞内で異なる2つのジンクフィンガーヌクレアーゼが生成され、その結果、二本鎖切断が植物細胞のゲノム内のゲノムDNA配列内の少なくとも1つの標的部位にまたはその近傍に導入される）。2つの発現構築物の植物細胞への導入は同時にまたは連続的に実施することができ、場合によって第一の構築物を取り入れた細胞の選別を含むことができる。
本明細書で用いられる二本鎖切断（DSB）は、DNAまたはRNAの両方の鎖の切断を指す。二本鎖切断は、標的部位の1つから5塩基対から1500塩基対未満、特に5塩基対から200塩基対未満、特に5塩基対から20塩基対未満離れた部位のゲノムDNA配列で生じ得る。二本鎖切断は、標的部位でのまたは標的部位近くでのゲノムDNA配列の変異をもたらす非相同性末端結合を促進することができる。本明細書で用いられる“非相同性末端結合”（NHEJ）は、相同性鋳型を必要としない直接連結によって二本鎖切断を修復する修復メカニズムを指し、したがって二本鎖切断が生じる前の配列に比して突然変異誘導性であり得る。
【００７０】
本方法は場合によってさらに、（iv）前記二本鎖切断の上流のヌクレオチド配列に相同な少なくとも第一の領域および前記二本鎖切断の下流のヌクレオチド配列に相同な第二の領域を含むポリヌクレオチドを植物細胞に導入する工程を含む。前記ポリヌクレオチドは、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列と一致するヌクレオチド配列を含むことができ、前記配列は欠失または異種ヌクレオチド配列の挿入を含む。前記ポリヌクレオチドは、したがって標的部位でのまたは標的部位近くでの相同組換えを促進し、異種配列のゲノムへの挿入、またはゲノムからゲノムDNA配列の欠失をもたらすことができる。植物細胞内で生成されたゲノムDNA配列は、発現された変異グリコシルトランスフェラーゼの酵素活性を破壊する変異、初期翻訳停止コドン、またはプレmRNAのmRNAへの適切なプロセッシングを妨げる配列モチーフを含み、遺伝子の発現低下または不活化をもたらすことができる。タンパク質をコードする遺伝子配列を変異させることによってタンパク質合成を破壊する方法は当業者には公知である。
【００７１】
本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、N-グリコシル化に必要な遺伝子（例えば本発明のグリコシルトランスフェラーゼであるが、ただし前記に限定されない）の遺伝子配列と結合するジンクフィンガータンパク質をコードする第一のヌクレオチド、および非特異的エンドヌクレアーゼ（例えばタイプIISエンドヌクレアーゼに属するものであるが、ただし前記に限定されない）をコードする第二のポリヌクレオチドの融合物を作製することによって構築することができる。タイプIISエンドヌクレアーゼは互いに離れて存在する認識ドメインとエンドヌクレアーゼ切断ドメインを有する制限酵素で、前記酵素は認識部位から離れた部位のDNAを切断する。タイプIISエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、AarI、BaeI、CdiI、DrdII、EciI、FokI、FauI、GdiII、HgaI、Ksp632I、MboII、Pfl1108I、Rle108I、RleAI、SapI、TspDTIまたはUbaPIであり得るが、ただし前記に限定されない。
【００７２】
融合タンパク質を設計および構築する方法、タイプIISエンドヌクレアーゼの配列認識ドメインからエンドヌクレアーゼのドメインを選別および分離する方法、ジンクフィンガータンパク質とエンドヌクレアーゼとの融合タンパク質を含むジンクフィンガーヌクレアーゼを設計および構築する方法は当分野では公知であり、本発明で用いることができる。具体的な実施態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインはFokIのヌクレアーゼである。ジンクフィンガータンパク質とFokIのヌクレアーゼとの融合タンパク質は2つの塩基対から成るスペーサーを含むことができる。或いは、スペーサーは3、4、5、6、または7以上の塩基対から成り得る。ある特徴では、本発明は、第一のジンクフィンガーヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼが第二のジンクフィンガーヌクレアーゼと接触するときにダイマーを形成することができるように7塩基対スペーサーを有する融合タンパク質を提供する。この場合、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを構成する2つのジンクフィンガータンパク質は、標的DNA配列の上流および下流に結合することができる。ダイマー形成時に、ジンクフィンガーヌクレアーゼは標的ヌクレオチド配列に二本鎖切断を導入することができ、その後に、非相同性末端結合および二本鎖切断の両側にフランキングする領域と相同性を有する外因性ヌクレオチド配列による相同性組換えが続く。
さらに別の実施態様では、本発明はジンクフィンガータンパク質およびエンハンサータンパク質を含む融合タンパク質（前記はジンクフィンガーアクチベーターを生じる）を提供する。ジンクフィンガーアクチベーターを用いて、植物細胞で標的遺伝子（例えば植物細胞でのN-グリコシル化で必要とされる遺伝子であるが、ただし前記に限定されない）の転写をアップレギュレートまたは活性化することができる。前記には以下の工程が含まれる：（i）プロモーターまたは標的遺伝子のコード配列に影響を及ぼすように連結されている配列内の領域と結合するジンクフィンガータンパク質を本発明の方法にしたがって操作する工程；（ii）前記ジンクフィンガータンパク質と転写活性化因子との融合タンパク質を作製する工程；（iii）植物細胞で活性を有するプロモーターの制御下で前記ジンクフィンガーアクチベーターをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物を作製する工程；（iv）前記遺伝子構築物を植物細胞に導入する工程；および（v）植物細胞を培養してジンクフィンガーアクチベーターを発現させる工程；および（vi）標的遺伝子の発現増加を示す植物細胞の性状を決定する工程。本発明で有用な標的遺伝子は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの発現を調節するタンパク質または核酸をコードする遺伝子である。
【００７３】
さらに別の実施態様では、本発明は、ジンクフィンガータンパク質および遺伝子リプレッサーを含む融合タンパク質（前記はジンクフィンガーリプレッサーを生じる）を提供する。ジンクフィンガーリプレッサーを用いて、植物で遺伝子（例えば植物細胞でN-グリコシル化に必要とされる遺伝子であるが、ただし前記に限定されない）の転写をダウンレギュレートまたは抑制することができる。前記には以下の工程が含まれる：（i）プロモーターまたはグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子に影響を及ぼすように連結されている配列内の領域と結合するジンクフィンガータンパク質を本発明の方法にしたがって操作する工程；および（ii）前記ジンクフィンガータンパク質と転写リプレッサーとの融合タンパク質を作製する工程；および（iii）前記植物細胞で活性を有するプロモーターの制御下で前記ジンクフィンガーリプレッサーをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を本発明の方法にしたがって作製する工程；および（iv）前記遺伝子構築物を植物細胞に本発明の方法にしたがって導入する工程；および（v）ジンクフィンガーリプレッサーを発現させる工程；および（vi）標的遺伝子の転写を低下させた植物細胞の性状を決定する工程。ジンクフィンガーリプレッサーを用いて、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの発現レベルを植物細胞で低下させることができる。
【００７４】
さらに別の実施態様では、本発明は、ジンクフィンガータンパク質およびメチラーゼを含む融合タンパク質（前記はジンクフィンガーメチラーゼを生じる）を提供する。ジンクフィンガーメチラーゼを用いて、植物細胞でN-グリコシル化に必要とされる遺伝子の発現を、N-グリコシル化に必要な前記遺伝子（例えば本発明のグリコシルトランスフェラーゼであるが、ただし前記に限定されない）のプロモーター領域内の領域をメチル化することによってダウンレギュレートまたは阻害することができる。前記には以下の工程が含まれる：（i）N-グリコシル化で必要とされる遺伝子のプロモーター内の領域と結合するジンクフィンガータンパク質を本発明の方法にしたがって操作する工程；および（ii）前記ジンクフィンガータンパク質とメチラーゼとの融合タンパク質を作製する工程；および（iii）植物細胞で活性を有するプロモーターの制御下で前記ジンクフィンガーメチラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を本発明の方法にしたがって作製する工程；および（iv）前記遺伝子構築物を植物細胞に本発明の方法にしたがって導入する工程；および（v）ジンクフィンガーメチラーゼを発現させる工程；および（vi）植物細胞で本発明のグリコシルトランスフェラーゼの発現を低下させるか、または実質的に発現させない植物細胞の性状を決定する工程。
【００７５】
本発明の種々の実施態様では、ジンクフィンガータンパク質は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの調節配列と結合するように、本発明の方法にしたがって選択することができる。前記グリコシルトランスフェラーゼは、植物のN-グリコシル化で必要とされるグリコシルトランスフェラーゼ、例えばN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、またはフコシルトランスフェラーゼ、より具体的にはN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI、ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ、またはアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（ただしこれらに限定されない）であり得る。より具体的には、植物のN-グリコシル化に必要な遺伝子の調節配列には転写開始部位、開始コドン、エクソンの領域、エクソン‐イントロン境界部、ターミネーターまたは終止コドンが含まれ得る。ジンクフィンガータンパク質はヌクレアーゼ、活性化因子またはリプレッサータンパク質と融合させることができる。
【００７６】
本発明の種々の実施態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、本発明のグリコシルトランスフェラーゼのゲノムDNA配列の調節領域、コード領域、または非コード領域に二本鎖切断を導入し、前記グリコシルトランスフェラーゼの発現レベルの低下、阻害もしくは実質的阻害、または前記グリコシルトランスフェラーゼ活性の低下、阻害もしくは実質的阻害をもたらす。
植物細胞で内因性グリコシルトランスフェラーゼ酵素の活性を低下、阻害または実質的に阻害する本発明の方法は、グリコシルトランスフェラーゼの酵素活性が低下、阻害または実質的に阻害された改変細胞を選別する工程を含む。
【００７７】
さらに別の実施態様では、本発明は、本発明の遺伝子配列またはそのフラグメントを、前記配列内の標的部位を同定し、（i）グリコシルトランスフェラーゼの活性を低下、阻害または実質的に阻害するか；または（ii）植物細胞の1つまたは2つ以上のタンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースレベルを低下させることができるように、植物細胞でのグリコシルトランスフェラーゼの発現を改変するために使用することを意図する。本発明の遺伝子配列上のそのような標的部位を同定するために、ある回数参照DNAデータベース内で発生し、規定数のヌクレオチド（本明細書ではスペーサー配列と称する）によって分離されているジンクフィンガータンパク質の2つの結合標的部位の選別が可能なDNAデータベース内サフィックスアレイを用いて、固定長のスペーサー配列によって分離されてある2つの固定長サブストリングDNAモチーフの出現について、入力クェリー配列のスクリーニングを可能にするコンピュータプログラムが提供される。前記遺伝子配列は、ゲノムDNAまたはcDNA配列、例えばアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ、ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼまたはN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのゲノムDNAまたはcDNA配列（ただし前記に限定されない）であり得る。特に前記遺伝子配列は、ニコチアナ種、例えばニコチアナ・タバクム（ただし前記に限定されない）の遺伝子配列である。
【００７８】
特に、前記コンピュータプログラムを用いて、本発明のニコチアナ・タバクム遺伝子配列を2つのジンクフィンガータンパク質結合部位について検索できる。この場合、ジンクフィンガータンパク質の各々は4つのジンクフィンガーDNA結合ドメインを含み、2つのジンクフィンガータンパク質結合部位は0、1、2または3塩基対によって離されている。本発明の他の実施態様では、前記コンピュータプログラムを用いて、1対のジンクフィンガーヌクレアーゼの設計のために2つのジンクフィンガータンパク質の標的部位を予想することができる。本発明の他の実施態様では、メガヌクレアーゼの標的部位を予想するためにコンピュータプログラムが用いられる。さらに本発明に含まれるものは、本発明の遺伝子配列に存在する標的部位（前記は上述のコンピュータプログラムによって予想されるものである）、およびゲノム編集技術（本発明に記載されてあるか、当分野で公知である）による植物または植物細胞での遺伝子配列の改変におけるそれらの使用である。
【００７９】
本発明の種々の実施態様で、植物細胞で有効な発現制御配列に作動できるように連結されたコード配列を含む発現構築物が植物細胞に導入され、異種タンパク質の発現が促進される。“作動できるように連結される”とは、制御配列および発現されるべきDNA配列が、転写および転写物の翻訳を許容する態様で結合および配置される連結を指す。具体的な実施態様では、発現構築物は、非天然のジンクフィンガータンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ジンクフィンガーリプレッサー、ジンクフィンガーアクチベーターを生成するために用いられる。本発明の他の実施態様では、発現構築物は、商業的に関心をもたれる異種タンパク質、例えば哺乳動物またはヒトのタンパク質の生産のために用いられる。改変される植物では、発現構築物が染色体DNAに組み込まれてあるか、または発現構築物が染色体外に保持されるかどちらかが意図される。さらにまた、異種タンパク質を生産するために用いられる改変植物では、異種タンパク質のコード配列を含む組換え転写ユニットが染色体DNAに安定的に組み込まれるか、または組換え転写ユニットが限定的期間の間染色体外に保持されることが意図される。
【００８０】
植物および植物細胞で活性を有する調節エレメントを含む発現構築物は公知であり、植物ウイルスのプロモーターおよびターミネーター配列、例えばカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターおよびターミネーター領域、プラストシアニンプロモーターおよびターミネーター領域、またはユビキチンプロモーターもしくはターミネーター領域（ただしこれらに限定されない）を含むことができる。本発明の具体的な実施態様では、第一のジンクフィンガーヌクレアーゼのコード配列はあるプロモーターおよびターミネーター配列の制御下でクローニングでき、さらに第二のジンクフィンガーヌクレアーゼのコード配列は第二のプロモーターおよびターミネーター配列の制御下でクローニングすることができる（前記はともに植物細胞で活性を有する）。両方のジンクフィンガーヌクレアーゼ発現構築物はまた、同じプロモーターおよびターミネーター配列によって制御可能で、さらに2つのジンクフィンガーヌクレアーゼのコード配列を1つのベクター内または別々のベクター内に配置することもできる。
【００８１】
本明細書で用いられるように、“形質転換”という用語は、ある生物（例えば植物細胞であるが、ただし前記に限定されない）へのポリヌクレオチドの移転を指す。形質転換ポリヌクレオチドを含む宿主生物は、“トランスジェニック”生物と称される。植物の形質転換の方法には、アグロバクテリウム媒介形質転換（De Blaere et al., Meth. Enzymol. 1987, 143:277）および粒子加速または“遺伝子銃”形質転換技術（Klein et al., Nature, London 1987, 327:70-73；US 4,945,050）が含まれるが、ただし前記に限定されない。
【００８２】
多くの植物細胞形質転換プロトコルおよび、外来DNAを植物細胞に導入し、それによって前記外来DNAに含まれる遺伝子の発現を可能にする多くの方法が知られている。発現構築物を植物細胞に導入するベクターは二元性ベクターでもよく、前記はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）形質転換により植物細胞に導入することができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス形質転換系は当業者に公知である。植物細胞への感染およびトランスフェクション用のアグロバクテリウム・ツメファシエンス株は知られている。本発明の目的のために適切に用いることができるアグロバクテリウム・ツメファシエンス株は、GV3101またはAgl0、Agl1、LBA4404、または植物細胞に感染し植物細胞核にT-DNAを移転することができる任意の他のAch5またはC58アグロバクテリウム・ツメファシエンス株である。
【００８３】
非限定的な例では、アグロバクテリウム媒介形質転換は以下のように実施できる。植物発現ベクター（例えば2つのジンクフィンガーヌクレアーゼを発現する発現カセットを含む二元性ベクターで、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼはタバコのグリコシルトランスフェラーゼゲノム遺伝子配列を標的とすることができる1対を構成する）を、当分野で報告されている標準的な方法を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス株に導入することができる。文献（Murashige & Skoog, Physiol Plant, 1962 15(3): 473-497）にしたがって、適切な抗生物質を含む液体ブロスで組換えアグロバクテリウム・ツメファシエンス株を一晩増殖させ、細胞を遠心沈殿によって収集し、上清をデカントし、さらに新しい培養液に再懸濁させることができる。無菌的に生長させたタバコ植物の葉の外植片を標準的な方法（Horschら（1985）を参照）にしたがって形質転換し、当分野で報告されている適切な条件下でペトリ皿のMurashige & Skoog（1962）の培地にて2日間共培養した。2日間共培養した後、外植片は、選別のために適量のカナマイシンを含み抗生物質バンコマイシンおよびセフォタキシム、並びにナフタレン酢酸およびベンザミノプリンホルモンを補充した選択培地に静置することができる。二元性ベクターはアグロバクテリウム・ツメファシエンス株に導入できる。或いは、二元性ベクターは、植物の葉の外植片（特にタバコの葉の外植片）の形質転換に適した他のアグロバクテリウム・ツメファシエンス株または前記の誘導株に導入してもよい。或いは、外植片は、苗木、胚軸もしくは茎組織、または形質転換に馴染みやすい任意の他の組織でもよい。発現カセットを含む二元性ベクターの導入はアグロバクテリウム・ツメファシエンス株を用いるトランスフェクションにより実施される。
【００８４】
或いは、導入は、粒子ボンバードメントを用いるか、または当業者に公知で通常的に用いられる任意の代替植物形質転換方法を用いて実施してもよい。例えば、粒子銃またはバイオリスティック粒子デリバリー系を用いて外来DNAをタングステン粒子または金粒子にローディングし、前記をヘリオス（Helios）PDS 1000/Heバイオリスティック粒子デリバリー系を用いて植物細胞に導入できる。
【００８５】
非限定的な例として、植物細胞のトランスフェクション後の植物の再生および選別は本発明の範囲内で以下のように実施できる。上記に記載したトランスフェクション後に得られたトランスジェニック植物細胞は、当分野で報告されている標準的な方法（例えば以下を参照されたい：Horsch et al., 1985, Science 227:1229）にしたがってシュートおよび苗木に再生できる。ゲノムDNAをシュートまたは苗木から、例えばパワープラントDNA単離キット（PowerPlant DNA単離キット；Mo Bio Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA）を用いることによって単離できる。標的領域を含むDNAフラグメントは、遺伝子配列を用い当分野で報告されている標準的な方法にしたがって増幅できる。リストに挙げた配列番号で規定したプライマー対を用いて標的領域を含むフラグメントを増幅できることは、当業者には明白であろう。続いて、標準的なシークエンシングプロトコルを用いてPCR生成物をそれらの全体にわたって配列決定し、標的部位（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ標的部位）の、または標的部位周辺の変異または改変を原型配列と比較することによって同定できる。
【００８６】
本発明のゲノムヌクレオチド配列の改変は以下のように性状が決定される：グリコシルトランスフェラーゼのコード領域を植物細胞の改変の標的にした後、改変細胞から入手したmRNAから合成したcDNAをクローニングしてシークェンシングを実施し、改変が存在することを確認できる。対応する配列のオープンリーディングフレームの破壊をもたらすことができるいずれの欠失も、機能的酵素の生合成に悪影響を及ぼし得ることは当業者には明白であろう。
【００８７】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼの各々の活性は酵素アッセイを用いて測定できる。本発明のグリコシルトランスフェラーゼの活性は、Man5-GlcNAc2-Asnオリゴマンノシルレセプターの1−3アーム上のマンノースへのN-アセチルグルコサミンの添加；アルファ-1,3-結合のフコース実体のN-グリカンへの添加、特に糖タンパク質の非還元末端の基部N-アセチルグルコサミンへのアルファ-1,3-結合のフコースの添加；またはベータ-1,2-結合のキシロース実体のN-グリカンへの添加、特にN-グリカンのトリマンノシルコア構造のβ(1,4)-結合マンノースへのβ(1,2)-結合のキシロースの添加であり得るが、ただし前記に限定されない。グリコシルトランスフェラーゼは、例えば植物からミクロソーム（グリコシルトランスフェラーゼに富む）を単離することによって、植物から単離することができる。酵素活性は、酵素アッセイ並びに特異的基質および供与体分子（例えば供与体としてUDP-[14C]-キシロース）およびベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性の測定のための受容体としてGlcNAcβ-1-2-Man-α1-3-[Man-α1-6]Man-β-O-(CH2)8-COOH3またはGlcNAcβ-1-2-Man-α1-3-(GlcNAc-β1-2-Man-α1-6)Man-β1-4GlcNAc-β1-4(Fuc-α1-6)GlcNAc-IgG糖タンパク質を用いて測定できる。
【００８８】
特に、ミクロソームは、十分に生長した初期開花期の成熟植物、特にタバコ植物の新鮮な葉から以下のようにして単離できる：中心葉脈を取り除き、葉を小片に切断し、予備冷却したステンレススチールのウォーリング（Waring）ブレンダーにてミクロソーム単離緩衝液（例えば250mMソルビトール、5mM Tris、2mM DTTおよび7.5mM EDTAを含み、1MのMes (2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸を用いてpH7.8に設定される）中で均質化する。プロテアーゼ阻害剤混合物またはカクテル、例えばコンプリートミニ（Complete Mini；Roche Diagnostics）を添加する。新鮮重量のタバコの葉のために氷冷ミクロソーム単離緩衝液を使用する。ナイロン布でろ過し、さらにソーバル（Sorvall）SS34ローターを用い4℃にて10分12,000 gで遠心分離することによって細屑および葉の素材を除去する。ミクロソームを含む上清を新しい遠心管に移し、固定角度のセントリコン（Centrikon）TFT55.38ローターを用いセントリコンT-2070超遠心機により4℃にて60分100,000 gで遠心分離する。ミクロソームを含むペレットを、グリセロール（最終濃度4％）を添加したミクロソーム単離緩衝液（EDTA無し）中で再懸濁する。前記をベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）活性の測定に用いることができる。
【００８９】
非限定的な例として、ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)キシロシルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子の活性は以下のように確定できる：cDNA配列を哺乳動物の発現ベクターでクローニングし、哺乳動物細胞でエレクトロポレーションを実施することができる（前記細胞は、通常では内因性糖タンパク質のN-グリカンにベータ-1,2-キシロース（β(1,2)-キシロース）をもたない）。補完試験は、N-グリカンのベータ-1,2-キシロース（β(1,2)-キシロース）を認識する抗体で細胞を染色することによって可視化できる。前記抗体は、例えばウサギ抗セイヨウワサビペルオキシダーゼ抗体（例えばArt. No.AS07267（Agrisera AB, Vannas, Sweden））であり、前記はN-グリカンタンパク質と結合したキシロース残基と特異的に交差反応する。或いは、キシロシルトランスフェラーゼ酵素アッセイは、キシロシルトランスフェラーゼ活性を欠く適切な宿主系でベータ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）cDNAを発現させたときに得られる組換えタンパク質に関して実施することができる。キシロシルトランスフェラーゼアッセイは、反応混合物（以下を含む：10mMカコジル酸緩衝液（pH7.2）、4mM ATP、20 mM MnCl2、0.4％トリトン（Triton）X-100、0.1mM UDP-[14C]-キシロースおよび1mM GlcNAcβ-1-2-Man-α1-3-[Man-α1-6]Man-β-O-(CH2)8-COOH3）中で受容体としてGlcNAcβ-1-2-Man-α1-3-(GlcNAc-β1-2-Man-α1-6)Man-β1-4GlcNAc-β1-4(Fuc-α1-6)GlcNAc-IgG糖タンパク質を用いて実施できる。
【００９０】
本発明の改変グリコシルトランスフェラーゼまたは関心のある異種タンパク質を植物または植物細胞から容易に単離するために、当分野で公知の多くの技術および精製案を用いることができる。非限定例として、Hisタグ、GSTおよびマルトース結合タンパク質は、容易に入手できる親和性カラムを提供するペプチドである（前記カラムにそれらペプチドを結合および溶出させることができる）。したがって、ペプチドがN-末端Hisタグ（例えばヘキサヒスチジン（His.sub.6タグ））である場合は、異種タンパク質は、金属キレート樹脂（例えばニッケルニトリロ酢酸（Ni-NTA）、ニッケルイミノ二酢酸（Ni-IDA）およびコバルト含有樹脂（Co-樹脂））を含むマトリックスを用いて精製することができる。例えば以下を参照されたい：Steinert et al. (1997) QIAGEN News 4:11-15。ペプチドがGSTである場合、異種タンパク質はグルタチオン‐アガロースビーズ（Sigma or Pharmacia Biotech）を含むマトリックスを用いて精製できる。タンパク質フラグメントがマルトース結合タンパク質（MBP）である場合は、改変グリコシルトランスフェラーゼまたは異種タンパク質は、アミロースを用いて誘導されたアガロース樹脂を含むマトリックスを用いて精製できる。
【００９１】
本発明の改変グリコシルトランスフェラーゼまたは関心のある異種タンパク質と結合できる分子の非限定的な他の例は以下から選択できる：アプタマー（Klussmann (2006), The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and their applications, Wiley-VCH, USA）、抗体（Howard and Bethell (2000) Basic Methods in Antibody Production and Characterization, Crc. Pr. Inc；Hansson, Immunotechnology 4 (1999), 237-252；Henning, Hum Gene Ther. 13 (2000), 1427-1439）、アフィボディ、レクチン、トリネクチン（Phylos Inc., Lexington, Massachusetts, USA；Xu, Chem. Biol. 9 (2002), 933）、アンチカリン（EPB1 1 017 814）など。
【００９２】
本発明の種々の実施態様で、本発明は、改変植物、改変植物組織、改変植物由来の植物素材、改変植物細胞もしくは改変植物組織、または改変植物に由来する植物組成物を提供する（前記は、N-グリカンにおけるアルファ-1,3-結合フコース、ベータ-1,2-結合キシロース、またはその両方のレベルがで低下または検出不能である異種タンパク質を含む）。他の実施態様では、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ活性が低下しているかまたは実質的に存在しない、改変植物、改変植物組織、改変植物由来の植物素材、改変植物細胞もしくは改変植物組織、または改変植物に由来する植物組成物を提供する。本発明の改変植物は、改変細胞および非改変細胞を含むことができる。本発明の改変植物の全ての細胞が改変を含むことは要求されない。
異種タンパク質は当分野で公知の技術によって濃縮、単離または精製することができる。したがって、本発明は、異種タンパク質が濃縮された植物組成物、または異種タンパク質が当該植物または植物細胞に出現する濃度に比してより高濃度の異種タンパク質を含む植物組成物を提供する。さらにまた提供されるものは、植物細胞（特にニコチアナ細胞）から得られる異種タンパク質（異種タンパク質と結合したN-グリカンに低レベルまたは検出不能レベルのアルファ-1,3-結合フコースおよび／またはベータ-1,2-結合キシロースを含む）および担体（例えば医薬的に許容できる担体）を含む医薬組成物または化粧組成物である。
【００９３】
改変植物細胞で発現できる異種タンパク質は、ワクチンで使用される抗原（病原体のタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、原虫タンパク質、線虫タンパク質を含むが、ただしこれらに限定されない）；酵素（ヒトの疾患の治療に使用される酵素、、工業的に使用される酵素を含むが、ただしこれらに限定されない）；サイトカイン；サイトカインレセプターのフラグメント；血液タンパク質；ホルモン；ホルモンレセプターのフラグメント、リポタンパク質；抗体または抗体フラグメントであり得る。
“抗体”という用語は以下を指す：モノクローナル抗体、マルチ特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単鎖Fvs（scFv）、単鎖抗体、一ドメイン抗体、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合Fvs（sdFv）および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメント。特に、抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち抗原結合部位を含む分子が含まれる。免疫グロブリン分子はいずれのタイプ（例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、クラス（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）またはサブクラスでもよい。
【００９４】
本発明の具体的な実施態様では、本発明は、低レベルまたは検出不能レベルのアルファ-1,3-フコース、ベータ-1,2-キシロースまたはその両方を含むN-グリカンを含む異種タンパク質を生産する方法を提供する。前記方法は、本発明の改変植物細胞で異種タンパク質のコード配列を含むポリヌクレオチドを発現させて異種タンパク質を生産する工程を含む。前記方法は以下の工程を含む：（i）異種タンパク質のコード配列を含むポリヌクレオチドを本発明の改変植物細胞に導入する工程、（ii）前記ポリヌクレオチドを発現させて、改変植物細胞で異種タンパク質を生産する工程、および場合によって（iii）前記改変植物細胞から異種タンパク質を単離する工程。前記方法はさらに、異種タンパク質のコード配列を含むポリヌクレオチドを含む改変植物細胞を培養する工程を含む。前記方法は場合によって、異種タンパク質のコード配列を含むポリヌクレオチドを含む改変植物細胞を植物組織、植物器官または植物に発育させる工程、および前記植物組織、植物器官および植物を培養または生長させる工程を含む。前記植物細胞は、水性媒体中の無菌的条件下で細胞培養として増殖した細胞、または単子葉植物の細胞（例えばソルガム、トウモロコシ、コムギ、コメ、アワ、オオムギまたはアオウキクサであるが、ただしこれらに限定されない）、または双子葉植物の細胞（例えばヒマワリ、エンドウマメ、アブラナ、サトウダイコン、ダイズ、レタス、チコリー、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、アルファルファ、ニンジンまたはタバコ）であってもよい。本発明のタバコ細胞はニコチアナ植物細胞、特にニコチアナ・ベンタミアナまたはニコチアナ・タバクム、ニコチアナ・タバクムの品種、育種交配系統および栽培品種、または改変したニコチアナ・ベンタミアナおよびニコチアナ・タバクム、ニコチアナ・タバクムの品種、育種系統および栽培品種から成る群から選択されるニコチアナ植物細胞であり得る。
【００９５】
別の実施態様では、本発明は、ニコチアナ・タバクムの品種、育種交配系統および栽培品種の遺伝的改変細胞を提供する。本発明の方法で改変できるニコチアナ・タバクムの品種、育種交配系統および栽培品種の非限定的な例には以下が含まれる：N.タバクム受託番号PM016、PM021、PM92、PM102、PM132、PM204、PM205、PM215、PM216またはPM217（NCIMB（Aberdeen, Scotland）に寄託）、またはDAC Mata Fina、PO2、BY-64、AS44、RG17、RG8、HB04P、Basma Xanthi BX 2A、Coker 319、Hicks、McNair 944（MN 944）、Burley 21、K149、Yaka JB 125/3、Kasturi Mawar、NC 297、Coker 371 Gold、PO2、Wislica、Simmaba、Turkish Samsun、AA37-1、B13P、BU21 x Hoja Parado系統97の交配によるF4、Samsun NN、Izmir、Xanthi NN、Karabalgar、DenizliおよびPO1。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、好ましくは医薬的に許容できる担体を含む。“医薬的に許容できる担体”とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包剤または任意のタイプの処方補助剤を意味する。本明細書で用いられる“非経口的”という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および動脈内注射および輸液を含む投与態様を指す。担体は、非経口担体、より具体的には受容者の血液と等張な溶液であり得る。そのような担体ベヒクルの例には、水、食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が含まれる。非水性ベヒクル、例えば不揮発性油およびオレイン酸エチルもまたリポソーム同様に本明細書では有用である。担体は適切には少量の添加物、例えば等張性および化学的安定性を強化する物質を含む。そのような物質は用いられる用量および濃度では受容者に無害であり、以下が含まれる：緩衝液（例えばリン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩または他の有機酸もしくはそれらの塩）；抗酸化剤（例えばアスコルビン酸）；低分子量（約10残基未満）の(ポリ)ペプチド、例えばポリアルギニンまたはトリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニン；単糖類、二糖類および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤、例えばEDTA；糖アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール；対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート、ポロキサマーまたはPEG。
【００９７】
本発明の好ましい実施態様では、植物細胞のグリコシルトランスフェラーゼ活性を低下させる方法が提供され、前記方法は、植物細胞のゲノム内のゲノムヌクレオチド配列を改変する工程を含む（この場合、前記ゲノムヌクレオチド配列は、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、特にN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI；フコシルトランスフェラーゼ、特にアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ；またはキシロシルトランスフェラーゼ、特にベータ-1,２-キシロシルトランスフェラーゼ；または前述のタンパク質のフラグメントのコード配列を含む）。具体的な実施態様では、本発明は、植物細胞のグリコシルトランスフェラーゼ活性を低下させる方法を提供し、前記方法は、植物細胞のゲノム内のゲノムヌクレオチド配列を改変する工程を含む。この場合、前記ゲノムヌクレオチド配列は以下を含む：（i）配列番号：1、4、5、7、12、13、14、17、27、32、37、40、41、または47に示すヌクレオチド配列から成るヌクレオチド配列；（ii）配列番号：1、4、5、7、12、13、14、17、27、32、37、40、41、または47に示すヌクレオチド配列と少なくとも95％、特に少なくとも98％、特に少なくとも99％同一のヌクレオチド配列；（iii）（i）もしくは（ii）またはその相補鎖から成るポリヌクレオチドプローブが、特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列。本発明はさらに、改変植物細胞を同定および場合によって選別する工程を含み、前記改変細胞では、そのゲノムヌクレオチド配列が改変植物細胞で改変されてあるグリコシルトランスフェラーゼの活性または改変植物細胞の総グリコシルトランスフェラーゼ活性は、非改変植物細胞に比して低下されてある。植物細胞のグリコシルトランスフェラーゼ活性を低下させる本方法は、ヒマワリ、エンドウ、アブラナ、サトウダイコン、ダイズ、レタス、チコリー、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、アルファルファ、アオウキクサ、コメ、トウモロコシ、ニンジンまたはタバコの細胞に応用できる。特に、グリコシルトランスフェラーゼ活性を低下させる植物細胞は、ニコチアナ種、特に、ニコチアナ・ベンタミアナまたはニコチアナ・タバクム、またはその栽培品種の細胞である。
【００９８】
本発明の以下の実施態様はそれらに限定されるものではなく、本発明の特徴を詳述するために含まれる。具体的な実施態様では、本発明はさらに、以下の工程もまた含む方法を提供する：（a）グリコシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントのコード配列を含むゲノムヌクレオチドを植物細胞のゲノムで同定する工程であって、特に前記ゲノムヌクレオチド配列は、配列番号：2のフォワードプライマーおよび配列番号：3のリバースプライマー；配列番号：10のフォワードプライマーおよび配列番号：11のリバースプライマー；配列番号：15のフォワードプライマーおよび配列番号：16のリバースプライマー；配列番号：23のフォワードプライマーおよび配列番号：24のリバースプライマー；配列番号：25のフォワードプライマーおよび配列番号：26のリバースプライマー；配列番号：30のフォワードプライマーおよび配列番号：31のリバースプライマー；配列番号：35のフォワードプライマーおよび配列番号：36のリバースプライマー；配列番号：45のフォワードプライマーおよび配列番号：46のリバースプライマー；または配列番号：231のフォワードプライマーおよび配列番号：232から成る群から選択される少なくとも１対のオリゴヌクレオチドによるポリメラーゼ連鎖反応を用いることによって同定することができる、前記工程、および（b）植物細胞でグリコシルトランスフェラーゼの活性または発現が非改変植物細胞に比して低下するような改変のために前記ゲノムヌクレオチド内の標的部位を同定する工程。
【００９９】
別の実施態様では、本発明は単離ポリヌクレオチドを提供し、前記単離ポリヌクレオチドは、配列番号：1、4、5、7、12、13、14、17、27、32、37、40、41または47に示すヌクレオチド配列；配列番号：1、4、5、7、12、13、14、17、27、32、37、40、41または47に示すヌクレオチド配列に示すヌクレオチド配列と少なくとも95％、特に少なくとも98％、特に少なくとも99％同一のヌクレオチド配列；または（i）もしくは（ii）のヌクレオチド配列またはその相補鎖から成るポリヌクレオチドプローブが特にストリンジェントな条件下で前記単離ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にするヌクレオチド配列を含む。さらに提供されるものは、本発明のゲノムヌクレオチド配列の使用であって、前記使用は、（i）改変を含む改変植物細胞で、グリコシルトランスフェラーゼの活性または発現が非改変植物細胞に比して低下するか、または（ii）アルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはその両方が、改変を含む改変植物細胞のタンパク質のN-グリカンで非改変植物細胞に比して低下するような改変のためにゲノムヌクレオチド配列内の標的部位を同定するためである。本発明はまた植物細胞のグリコシルトランスフェラーゼ活性を低下させる方法を提供し、前記方法は、本発明のゲノムヌクレオチド配列を用いて、ゲノムヌクレオチド配列内の標的部位を、（i）改変を含む改変植物細胞で、グリコシルトランスフェラーゼの活性または発現が非改変植物細胞に比して低下するか、または（ii）アルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはその両方が、改変を含む改変植物細胞のタンパク質のN-グリカンで非改変植物細胞に比して低下するように改変するために同定する工程を含む。
【０１００】
本発明はまた、植物細胞のゲノムがジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入によって改変される植物細胞の改変方法を提供し、前記方法は、（a）ゲノムヌクレオチド配列内で改変のための異なる標的部位と選択的に結合する少なくとも2つの非天然ジンクフィンガータンパク質を同定および作製する工程；（b）その各々が1つのヌクレアーゼおよび少なくとも2つの非天然ジンクフィンガータンパク質の1つを含む少なくとも2つの融合タンパク質を、二本鎖切断が植物ゲノム内のゲノムヌクレオチド配列内に、特にゲノムヌクレオチド配列内の標的部にまたは標的部位近くに導入できるように植物細胞で発現する工程；および場合によって（c）前記二本鎖切断の上流の配列と相同性を有する第一の領域および前記二本鎖切断の下流の領域と相同性を有する第二の領域を含むヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、ゲノム内のDNAと前記ポリヌクレオチドが組換えを生じることができるように植物細胞に導入する工程を含む。さらにまた本発明に含まれるものは、1つまたは2つ以上の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは2つ以上の発現構築物を含む細胞である。
【０１０１】
本発明はまた、改変植物細胞または改変植物細胞を含む植物を提供し、この場合、前記改変植物細胞は、グリコシルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントをコードするゲノムヌクレオチド配列に、特に、配列番号：1、4、5、7、12、13、14、17、27、32、37、40、41、47、233、または配列番号：256、259、262、265、268、271、274、277、280または配列番号：257、260、263、266、269、272、275、278、281に示すゲノムヌクレオチド配列のいずれか1つに、または上記配列の任意の組合せに少なくとも1つの改変を含み、さらに、（i）改変植物細胞の総グリコシルトランスフェラーゼ活性、またはそのゲノムヌクレオチド配列が改変されたグリコシルトランスフェラーゼの活性または発現が非改変植物細胞に比して低下するか、または（ii）改変植物細胞で生産されたタンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはその両方が非改変植物細胞に比して低下する。
【０１０２】
本発明はまた以下の工程を含む異種タンパク質の生産方法を提供する：配列番号：1、4、5、7、12、13、14、17、27、32、37、40、41、47、233、または配列番号：18、20、21、22、28、33、38、48、212、213、219、220、223、225、227、229、234、または配列番号：256、259、262、265、268、271、274、277および280、または配列番号：257、260、263、266、269、272、275、278、281に示すゲノムヌクレオチド配列に、または上記配列の任意の組合せに改変を含む改変植物細胞に、異種タンパク質（特にワクチン抗原、サイトカイン、ホルモン、凝固タンパク質、免疫グロブリンまたはそのフラグメント）をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物を導入する工程、および前記発現構築物を含む改変植物細胞を、前記異種タンパク質が生産されるように培養する工程、および場合によって前記植物細胞から植物を再生し、さらに植物およびその子孫を生長させる工程。本発明はまた以下の工程を含む異種タンパク質を生産する方法を提供する：（i）配列番号：1、4、5、7、12、13、14、17、27、32、37、40、41、47、233、または配列番号：18、20、21、22、28、33、38、48、212、213、219、220、223、225、227、229、234、または配列番号：256、259、262、265、268、271、274、277および280、または配列番号：257、260、263、266、269、272、275、278、281に示すゲノムヌクレオチド配列の少なくとも1つ、または上記配列の任意の組合せ内の改変、および（ii）異種タンパク質（特にワクチン抗原、サイトカイン、ホルモン、凝固タンパク質、免疫グロブリンまたはそのフラグメント）をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物を含む改変植物細胞を、異種タンパク質の生産をもたらす条件下で培養する工程。本発明の方法でさらに含まれるものは、改変植物細胞からまたは改変植物細胞を含む植物から異種タンパク質を濃縮または単離する工程である。本発明はまた、改変植物細胞を含む植物から得られる異種タンパク質を含む植物組成物を意図し、前記改変植物細胞は、配列番号：1、4、5、7、12、13、14、17、27、32、37、40、41、47、233、または配列番号：18、20、21、22、28、33、38、48、212、213、219、220、223、225、227、229、234、または配列番号：256、259、262、265、268、271、274、277および280、または配列番号：257、260、263、266、269、272、275、278、281に示すゲノムヌクレオチド配列、または上記配列の任意の組合せ内に改変を含み、この場合、異種タンパク質のN-グリカンのアルファ-1,3-フコースまたはベータ-1,2-キシロースまたはそに両方が非改変植物細胞で生産されたものに比して低下する。
【０１０３】
前記記述および実施例では、本配列表に提示する以下の配列が参照されている：
配列番号：1はcontig gDNA_c1736055のヌクレオチド配列である；
配列番号：2は、ニコチアナベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）イントロン‐エクソン配列を含むcontig gDNA_c1736055のフラグメントの増幅に適切なNGSG10043フォワードプライマーのヌクレオチド配列である；
配列番号：3は、ニコチアナベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）イントロン‐エクソン配列を含むcontig gDNA_c1736055のフラグメントの増幅に適切なNGSG10043リバースプライマーのヌクレオチド配列である；
配列番号：4は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種1を含むNtPMI-BAC-TAKOMI_6のヌクレオチド配列の塩基対1−6,000である；
配列番号：5は、NtPMI-BAC-TAKOMI_6のベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）変種1のコードフラグメントのゲノムヌクレオチド配列である；
配列番号：6は、ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種1の上流NtPMI-BAC-TAKOMI_6のプロモーター領域のヌクレオチド配列である；
配列番号：7は、プライマーセットNGSG10043によって増幅され、NtPMI-BAC-TAKOMI_6を同定するためのプローブとして用いられた、NtPMI-BAC-TAKOMI_6のフラグメントのヌクレオチド配列である；
配列番号：8は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種1のcDNA配列である；
配列番号：9は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）タンパク質変種1のアミノ酸配列である；
配列番号：10は、ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・ベンタミアナのフラグメントGnTI-Bの増幅のためのプライマー配列Big3FNである；
【０１０４】
配列番号：11は、ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・ベンタミアナのフラグメントGnTI-Bの増幅のためのプライマー配列Big3RNである；
配列番号：12は、ニコチアナ・タバクムのフラグメントGnTI-Bの3504 bpゲノムフラグメントのヌクレオチド配列である；
配列番号：13は、ニコチアナ・タバクムのフラグメントGnTI-Bの2283 bpゲノムフラグメントのヌクレオチド配列である；
配列番号：14は、ニコチアナ・タバクムのフラグメントGnTI-Bの3765 bpゲノムフラグメントのヌクレオチド配列である；
配列番号：15は、ニコチアナベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）イントロン‐エクソン配列を含む、contig CHO_OF4335xn13f1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10046フォワードプライマーのヌクレオチド配列である；
配列番号：16は、ニコチアナベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）イントロン‐エクソン配列を含むcontig CHO_OF4335xn13f1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10046リバースプライマーのヌクレオチド配列である；
配列番号：17は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種2を含むNtPMI-BAC-SANIKI_1のヌクレオチド配列の塩基対15,921−23,200である；
配列番号：18は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）変種2のcDNA配列である；
配列番号：19は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）タンパク質変種2のアミノ酸配列である；
配列番号：20は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bの部分的cDNA配列変種1である；
【０１０５】
配列番号：21は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bの部分的cDNA配列変種1である；
配列番号：22は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bの部分的cDNA配列変種1である；
配列番号：23は、ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・ベンタミアナのフラグメントGnTI-Aの増幅のためのプライマー配列Big1FNである；
配列番号：24は、ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・ベンタミアナのフラグメントGnTI-Aの増幅のためのプライマー配列Big1RNである；
配列番号：25は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）イントロン‐エクソン配列を含むcontig CHO_OF3295xj17f1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10041フォワードプライマーのヌクレオチド配列である；
配列番号：26は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）イントロン‐エクソン配列を含むcontig CHO_OF3295xj17f1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10041リバースプライマーのヌクレオチド配列である；
配列番号：27は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種1を含むNtPMI-BAC-FETILA_9のヌクレオチド配列の塩基対2,961−10,160である；
配列番号：28は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種1のcDNAである；
配列番号：29は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）タンパク質変種1のアミノ酸配列である；
配列番号：30は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）イントロン‐エクソン配列を含むcontig gDNA_c1765694のフラグメントの増幅に適切なNGSG10032フォワードプライマーのヌクレオチド配列である；
【０１０６】
配列番号：31は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）イントロン‐エクソン配列を含むcontig gDNA_c1765694のフラグメントの増幅に適切なNGSG10032リバースプライマーのヌクレオチド配列である；
配列番号：32は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種2を含むNtPMI-BAC-JUMAKE_4のヌクレオチド配列の塩基対1,041−7,738である；
配列番号：33は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種2の部分的cDNA配列である；
配列番号：34は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）タンパク質変種2の部分的アミノ酸配列である；
配列番号：35は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）イントロン‐エクソン配列を含むcontig CHO_OF4881xd22r1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10034フォワードプライマーのヌクレオチド配列である；
配列番号：36は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）イントロン‐エクソン配列を含むcontig CHO_OF4881xd22r1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10034リバースプライマーのヌクレオチド配列である；
配列番号：37は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種3を含むNtPMI-BAC-JEJOLO_22のヌクレオチド配列の塩基対19,001−23,871である；
配列番号：38は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種3の部分的cDNA配列である；
配列番号：39は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）タンパク質変種3の部分的アミノ酸配列である；
配列番号：40は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Aの3152 bpゲノムフラグメントのヌクレオチド配列である；
【０１０７】
配列番号：41は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Aの3140 bpゲノムフラグメントのヌクレオチド配列である；
配列番号：42は、メガヌクレアーゼ媒介変異導入のための、配列番号：5のエクソン2内の固有の22 bp標的配列である；
配列番号：43は、パリンドローム型の配列番号：42の左半分を表す第一の誘導体標的である；
配列番号：44は、パリンドローム型の配列番号：42の右半分を表す第二の誘導体標的である；
配列番号：45は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）イントロン‐エクソン配列を含むcontig CHO_OF4486xe11f1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10035フォワードプライマーのヌクレオチド配列である；
配列番号：46は、ニコチアナアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）イントロン‐エクソン配列を含むcontig CHO_OF4486xe11f1のフラグメントの増幅に適切なNGSG10035リバースプライマーのヌクレオチド配列である；
配列番号：47は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種4を含む、NtPMI-BAC-JUDOSU_1のヌクレオチド配列の塩基対1−11,000である；
配列番号：48は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種4の部分的cDNA配列である；
配列番号：49は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）タンパク質変種4の部分的アミノ酸配列である；
配列番号：50は、実施例1において配列番号：5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで4ヒットを有する15塩基対ヌクレオチド配列である；
【０１０８】
配列番号：51は、実施例1において配列番号：5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで5ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である；
配列番号：52は、実施例1において配列番号：5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで5ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である；
配列番号：53は、実施例1において配列番号：5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで5ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である；
配列番号：54は、実施例1において配列番号：5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで5ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である；
配列番号：55は、実施例1において配列番号：5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで5ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である；
配列番号：56は、実施例1において配列番号：5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで4ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である；
配列番号：57は、実施例1において配列番号：5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで3ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である；
配列番号：58は、実施例1において配列番号：5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで4ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である；
配列番号：59は、実施例1において配列番号：5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで3ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である；
配列番号：60は、実施例1において配列番号：5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで4ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である；
【０１０９】
配列番号：61は、実施例1において配列番号：5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで4ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である；
配列番号：62は、実施例1において配列番号：5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで5ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である；
配列番号：63は、実施例1において配列番号：5に関して出力されたタバコゲノムデータベースで5ヒットを示す15塩基対ヌクレオチド配列である；
配列番号：64は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：65は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：66は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：67は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：68は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：69は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：70は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
【０１１０】
配列番号：71は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：72は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：73は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：74は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：75は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：76は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：77は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：78は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：79は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：80は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
【０１１１】
配列番号：81は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：82は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：83は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：84は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：85は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：86は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：87は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：88は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：89は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：90は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
【０１１２】
配列番号：91は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：92は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：93は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：94は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：95は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：96は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：97は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：98は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：99は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：100は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
【０１１３】
配列番号：101は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：102は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：103は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：104は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：105は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：106は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：107は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：108は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：109は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：110は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
【０１１４】
配列番号：111は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：112は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：113は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：114は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：115は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：116は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：117は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：118は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：119は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：120は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：121は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：122は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：123は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：124は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：125は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：126は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：127は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：128は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：129は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：130は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
【０１１５】
配列番号：131は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：132は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：133は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：134は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：135は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：136は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：137は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：138は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：139は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：140は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
【０１１６】
配列番号：141は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：142は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：143は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：144は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：145は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：146は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：147は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：148は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：149は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：150は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
【０１１７】
配列番号：151は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：152は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：153は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：154は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：155は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：156は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：157は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：158は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：159は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：160は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
【０１１８】
配列番号：161は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：162は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：163は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：164は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：165は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：166は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：167は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：168は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：169は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：170は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
【０１１９】
配列番号：171は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：172は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：173は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：174は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：175は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：176は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：177は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：178は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：179は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：180は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
【０１２０】
配列番号：181は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：182は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：183は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：184は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：185は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：186は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：187は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：188は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：189は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：190は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
【０１２１】
配列番号：191は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：192は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：193は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：194は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：195は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：196は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：197は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：198は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：199は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：200は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
【０１２２】
配列番号：201は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：202は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：203は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：204は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：205は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：206は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：207は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：208は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：209は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：210は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
【０１２３】
配列番号：211は、実施例1において配列番号：5およびタバコゲノム配列アッセンブリーのために実行された0ヒット閾値を示す24塩基対配列である；
配列番号：212は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A変種1の部分的cDNA配列である；
配列番号：213は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A変種1の部分的cDNA配列である；
配列番号：214は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B cDNA変種1の部分的アミノ酸配列である；
配列番号：215は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B cDNA変種1の部分的アミノ酸配列である；
配列番号：216は、ニコチアナ・ベンタミアナフラグメントGnTI-B cDNA変種1の部分的アミノ酸配列である；
配列番号：217は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A cDNA変種1の部分的アミノ酸配列である；
配列番号：218は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A cDNA変種1の部分的アミノ酸配列である；
配列番号：219は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bの部分的cDNA配列変種2である；
配列番号：220は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bの部分的cDNA配列変種3である；
【０１２４】
配列番号：221は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B cDNA変種2の部分的アミノ酸配列である；
配列番号：222は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B cDNA変種1の部分的アミノ酸配列である；
配列番号：223は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bの部分的cDNA配列変種2である；
配列番号：224は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B cDNA変種2の部分的アミノ酸配列である；
配列番号：225は、ニコチアナ・ベンタミアナフラグメントGnTI-Bの部分的cDNA配列変種2である；
配列番号：226は、ニコチアナ・ベンタミアナフラグメントGnTI-B cDNA変種2の部分的アミノ酸配列である；
配列番号：227は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A変種2の部分的cDNA配列である；
配列番号：228は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A cDNA変種2の部分的アミノ酸配列である；
配列番号：229は、ニコチアナ・タバクムGnTI-A変種2の部分的 cDNA配列である；
配列番号：230は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A cDNA変種2の部分的アミノ酸配列である；
【０１２５】
配列番号：231は、ニコチアナ・タバクムN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIイントロン‐エクソン配列を含むcontig gDNA_c1690982のフラグメントの増幅に適切なNGSG12045フォワードプライマーのヌクレオチド配列である；
配列番号：232は、ニコチアナ・タバクムN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIイントロン‐エクソン配列を含むcontig gDNA_c1690982のフラグメントの増幅に適切なNGSG12045リバースプライマーのヌクレオチド配列である；
配列番号：233は、ニコチアナ・タバクムN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI遺伝子変種2を含むNtPMI-BAC-FABIJI_1のヌクレオチド配列の塩基対1−15,000である；
配列番号：234は、ニコチアナ・タバクムN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI遺伝子変種2の予想されるcDNA配列である。
配列番号：235は、ニコチアナ・タバクムN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI遺伝子変種2のアミノ酸配列である。
配列番号：236は、N.タバクムPM132のFABIJI-ホモローグの増幅のためのプライマー配列FABIJI-フォワードである；
配列番号：237は、N.タバクムPM132のFABIJI-ホモローグの増幅のためのプライマー配列FABIJI-リバースである；
配列番号：238は、N.タバクムPM132のCPO GnTIゲノム配列の増幅のためのプライマー配列CPO-フォワードである；
配列番号：239は、N.タバクムPM132のCPO GnTIゲノム配列の増幅のためのプライマー配列CPO-リバースである；
配列番号：240は、N.タバクムPM132のCAC80702.1ホモローグの増幅のためのプライマー配列CAC80702.1-フォワードである；
【０１２６】
配列番号：241は、N.タバクムPM132のCAC80702.1ホモローグの増幅のためのプライマー配列CAC80702.1-リバースである；
配列番号：242は、N.タバクムHicks BroadleafのGnTI配列の増幅のためのプライマー配列FABIJI-1ホモローグ-フォワードである；
配列番号：243は、N.タバクムHicks BroadleafのGnTI配列の増幅のためのプライマー配列FABIJI-1ホモローグ-リバースである；
配列番号：244は、N.タバクムHicks BroadleafのGnTI配列の増幅のためのプライマー配列FABIJI-1ホモローグ-フォワードである；
配列番号：245は、N.タバクムHicks BroadleafのGnTI配列の増幅のためのプライマー配列FABIJI-1ホモローグ-リバースである；
配列番号：246は、5'UTRおよびエクソン1から7を含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC181Fである；
配列番号：247は、5'UTRおよびエクソン1から7を含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC190Rである；
配列番号：248は、エクソン4から13を含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC191Fである；
配列番号：249は、エクソン4から13を含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC192Rである；
配列番号：250は、エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC193Fである；
【０１２７】
配列番号：251は、エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC187Rである；
配列番号：252は、エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC193Fである；
配列番号：253は、エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC188Rである；
配列番号：254は、エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC193Fである；
配列番号：255は、エクソン12から19および3'UTRを含むN.タバクムPM132のgDNAの増幅のためのプライマー配列PC189Rである；
配列番号：256は、N.タバクムPM132のゲノムFABIJI-ホモローグのヌクレオチド配列である；
配列番号：257は、N.タバクムPM132のコード配列のヌクレオチド配列である；
配列番号：258は、N.タバクムPM132のFABIJI-ホモローグのアミノ酸配列である；
配列番号：259は、N.タバクムPM132のゲノムCPO-gDNAのヌクレオチド配列である；
配列番号：260は、N.タバクムPM132 CPO遺伝子の予想されるコード領域のヌクレオチド配列である；
【０１２８】
配列番号：261は、N.タバクムPM132 CPO遺伝子のコード領域の予想されるアミノ酸配列である；
配列番号：262は、N.タバクムPM132 CAC80702.1ホモローグのヌクレオチド配列である；
配列番号：263は、N.タバクムPM132 CAC80702.1ホモローグのヌクレオチド配列である；
配列番号：264は、N.タバクムPM132 CAC80702.1ホモローグの予想されるアミノ酸配列である；
配列番号：265は、N.タバクムPM132の GnTI contig 1#5のヌクレオチド酸配列である；
配列番号：266は、予想されるGnTIコード領域contig 1#5のヌクレオチド酸配列である；
配列番号：267は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#5の予想されるアミノ酸配列である；
配列番号：268は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#8のヌクレオチド酸配列である；
配列番号：269は、予想されるGnTIコード領域contig 1#8のヌクレオチド酸配列である；
配列番号：270は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#8の予想されるアミノ酸配列である；
【０１２９】
配列番号：271は、N.タバクムPM132のGnTI  contig 1#9のヌクレオチド酸配列である；
配列番号：272は、予想されるGnTIコード領域contig 1#9のヌクレオチド酸配列である；
配列番号：273は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#の予想されるアミノ酸配列である；
配列番号：274は、N.タバクムPM132のGnTI  T10 702のヌクレオチド酸配列である；
配列番号：275は、予想されるGnTIコード領域T10 702のヌクレオチド酸配列である；
配列番号：276は、N.タバクムPM132のGnTI T10 702の予想されるアミノ酸配列である；
配列番号：277は、N.タバクムPM132のGnTI  contig 1#6のヌクレオチド酸配列である；
配列番号：278は、予想されるGnTIコード領域contig 1#6のヌクレオチド酸配列である；
配列番号：279は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#6の予想されるアミノ酸配列である；
配列番号：280は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#2ヌクレオチド酸配列である；
配列番号：281は、予想されるGnTIコード領域contig 1#2のヌクレオチド酸配列である；
配列番号：282は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#2の予想されるアミノ酸配列である。
【実施例】
【０１３０】
以下の実施例は例証として提供され、制限として提供されるのではない。特段の指示がなければ、本発明は、分子生物学、植物生物学、バイオインフォマティクス、および植物交配の通常的な技術および方法を利用する。
【０１３１】
実施例1：ニコチアナ・タバクムβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ変種1のゲノム配列の同定
本実施例は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）のゲノムヌクレオチド配列をどのようにして同定できるかを例証する。
タバコBACライブラリー：細菌人工染色体（BAC）ライブラリーを以下のようにして調製する。温室で生長させたニコチアナ・タバクム植物の品種ヒックスブロードリーフ（Hicks Broad Leaf）の葉から核酸を単離する。標準的方法にしたがって高分子量DNAを核酸から単離し、BamHIおよびHindIIIで部分的に消化し、BACベクターpINDIGO5のBamHIまたはHindIII部位でクローニングする。挿入物の平均の長さが135メガ塩基対である320,000を超えるクローンが得られる（前記クローンの全長はタバコゲノムのほぼ9.7倍をカバーする）。
【０１３２】
タバコゲノム配列のアッセンブリー：ランダムに採取した多数のBACクローンをSangerの方法を用いてシークェンシングに付し、平均長が550塩基対の1,780,000を超える未加工配列を得る。大腸菌（Escherichia coli）形質転換用のMcr+株を用いることによってメチルフィルタリングを適用し、低メチル化DNAのみを単離する。CELERAゲノムアッセンブラーを用いて全配列をアッセンブリングし、200,000を超えるコンティーグおよび596,970のシングル配列を含む、800,000を超える配列を得る。コンティーグのサイズは120から15,300塩基対で、平均長は1,100塩基対である。
【０１３３】
タバコエクソンアレイの開発および解析：タバコEST公開データベースおよびBACシークェンシングから得たメチルフィルタリング実施配列を一緒にして比較することによって、272,342エクソンが同定される。これらエクソンの各々について、4つの25-merオリゴヌクレオチドを設計し、タバコエクソンアレイの構築に用いる。エクソンアレイは、標準的プロトコルを用いアフィメトリックス（Affymetrix；Santa Clara, USA）によって作製する。272,432のエクソンのうちで11が、公開データベースで注釈を付与されたベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子配列と相同性を有すると同定される。前記11のエクソンは6つのコンティーグに属する。標準的なハイブリダイゼーションプロトコルおよび解析ツールを用いて、これら11のエクソンのうち10がタバコの葉の組織で活性を有するようである。もっとも高い発現値を示すコンティーグ（gDNA_c1736055）をBACクローン同定用プライマーの設計のために選択し、完全なゲノムDNA配列を得る．配列番号：1はcontig gDNA_c1736055の完全な配列である。
【０１３４】
プライマー設計：プライマー3（Rozen and Skaletsky, 2000）を用いてcontig gDNA_c1736055のためのプライマー対NGSG10043を、対を構成する両プライマーが250から500塩基対の算定長の生成物でエクソン-非コード配列境界を取り巻くような態様で設計する。NGSG10043は以下のように設計される：プライマー配列番号：2は、プラス鎖の推定的開始コドンに先行するgDNA_c1736055の非翻訳部分に位置し、プライマー配列番号：3は前記配列の予想されるエクソン部分に位置し特異性を改善する。プライマー配列番号：2および配列番号：3を含むプライマー対NGSG10043をBACライブラリーのスクリーニングに用いる。この手法は、ゲノムに存在する多様な多数の変種および対立遺伝子の識別に有用であり得る。
【０１３５】
BACライブラリーのスクリーニング：DNAは、一定の配列と相同性を有する個々のクローンの同定を促進するために三次元的態様でプールしたBACクローンから単離される。PCRおよび標準的なBACスクリーニング手順を用いプライマー対NGSG10043により完全なBACライブラリーをスクリーニングし、期待通りのフラグメントサイズを示す単一コロニーを同定する。これらのBACクローンの1つ、NtPMI-BAC-TAKOMI_6を更なる解析のために選択し、ゲノムシークェンサーFLX系（Genome Sequencer FLX System；Roche Diagnostics Corporation）で454シークェンシングを用いてNtPMI-BAC-TAKOMI_6の精製DNAの配列を決定した。ニュブラーアッセンブラー（Newbler assembler；454 Life Sciences, Branford, USA）並びにTAIRによる注釈およびUniprotの記載事項を用いて非加工NtPMI-BAC-TAKOMI_6配列の全てをアッセンブリングして、28,936塩基対のコンティーグ、257B4-contig00006が同定される。前記は、シロイヌナズナのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（AT5G55500.1；TAIR受託遺伝子2173891）と相同性を示す配列を含む。配列番号：4は、NtPMI-BAC-TAKOMI_6の6,000塩基対フラグメントを開示する。前記は、シロイヌナズナの遺伝子AT5G55500.1（配列番号：5）と相同性を示すマイナス鎖上の約3,465塩基対のフラグメントとともに推定的終止コドンに続く1,430塩基対のフラグメントおよび予測される遺伝子（配列番号：6）の推定的開始コドンに先行する1,140塩基対を含む。プライマーセットNGSG10043を用いて増幅させたNtPMI-BAC-TAKOMI_6の358塩基対フラグメントは配列番号：7に提示されている。
【０１３６】
β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子配列の同定：シロイヌナズナのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子配列と相同性を示すNtPMI-BAC-TAKOMI_6の6,000塩基対ゲノム配列は、遺伝子発見プログラムAugustus（University of Gottingen, Gottingen, Germany）およびFgeneSH（Softberry Inc., Mount Kisco, USA）（後者のプログラムは真核細胞のゲノム配列を予測する）によりさらに注釈を与えられる。両遺伝子発見プログラムは初め公知のタバコ遺伝子について向けられていた。シロイヌナズナAT5G55500.1と相同性を示す3,430塩基対フラグメントがオーバーラップする、AugustusおよびFgeneSH予測遺伝子は、公知のβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼcDNAおよびアミノ酸配列と比較することによってさらに手作業で注釈が付される。配列番号:8は配列番号:5と関連するcDNA配列を開示する。配列番号:8は終止コドンを含む1,572塩基対を含み、523アミノ酸ポリペプチド（配列番号:9）をコードする。
【０１３７】
タバコベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子の構造：ゲノムDNA配列（配列番号:5）とベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）cDNA配列（配列番号:8）との比較によって、以下のように結論される：ゲノム遺伝子のコード配列は、マイナス鎖に3つのエクソン（配列番号：4のマイナス鎖上で4,894から約4,196（開始コドン−エクソン1）、約2,899から2,750（エクソン2）および約2,152から1,430（エクソン3−終止コドン）に広がる）および2つの介在イントロンを含む。
【０１３８】
実施例2：ニコチアナ・タバクムベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）変種2の同定
ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種2は実施例1に記載したように同定されるが、ただしcontig CHO_OF4335xn13f1に基づくプライマー対NGSG10046（配列番号：15および16）がそれぞれ用いられる。配列番号：12は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種2を含むNtPMI-BAC-GEJUJO_2のヌクレオチド配列の塩基対60,001−65,698を提示する。配列番号：13は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種2のcDNA配列を提示する。配列番号：17は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種2を含むNtPMI-BAC-SANIKI_1のヌクレオチド配列の塩基対15,921−23,200を提示する。配列番号：18は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種2のcDNA配列を提示し、配列番号：19は、ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）タンパク質変種2のアミノ酸配列を提示する。
【０１３９】
実施例3：ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-キシロシルトランスフェラーゼ）変種1から4
ニコチアナ・タバクムの4つのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種を、プライマー対NGSG10032（配列番号：30および31）、NGSG10034（配列番号：35および36）、NGSG10035（配列番号：56および46）およびNGSG10041（配列番号：25および26）を用いて本質的に実施例1に記載したように同定する。配列番号：27は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種1を含むNtPMI-BAC-FETILA_9のヌクレオチド配列の塩基対2,961−10,160を提示し、配列番号：28は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種1のcDNA配列を提示し、配列番号：29は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）タンパク質変種1のアミノ酸配列を提示する。配列番号：32は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種2を含むNtPMI-BAC-JUMAKE_4のヌクレオチド配列の塩基対1,041−7,738を提示し、配列番号：33は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種2の部分的cDNA配列を提示し、配列番号：34は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）タンパク質変種2の部分的アミノ酸配列を提示する。配列番号：37は、ニコチアナ・タバクムの部分的なアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種3を含むNtPMI-BAC-JEJOLO_22のヌクレオチド配列の塩基対9,001−23,871を提示し、配列番号：38は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種3の部分的cDNA配列を提示し、配列番号：39は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）タンパク質変種3の部分的アミノ酸配列を提示する。配列番号：47は、ニコチアナ・タバクムのアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種4を含むNtPMI-BAC-JUDOSU_1のヌクレオチド配列の塩基対1−11,000を提示し、配列番号：48は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子変種4の部分的cDNA配列を提示し、配列番号：49は、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）タンパク質変種4の部分的アミノ酸配列を提示する。
【０１４０】
実施例4：ジンクフィンガーヌクレアーゼ標的部位の選別のための検索プロトコル
本実施例は、遺伝子発現の改変ツールを開発するために、与えられた遺伝子のゲノムヌクレオチド配列を検索し、与えられた遺伝子配列内の固有の標的部位の出現について与えられたゲノムデータベースと比較してスクリーニングする態様を例証する。本発明の方法（下記に開示するものを含む）によって同定される標的部位、配列モチーフ、および植物での改変における対応遺伝子配列の前記部位またはモチーフの使用が本発明に包含される。
【０１４１】
検索アルゴリズム：与えられたスペーサーサイズで分離された2つの固定長のサブストリングDNAモチーフのデータベース（例えば実施例1のタバコゲノム配列アッセンブリー）内での出現について、サフィックスアレイを用いて入力クェアリー（標的）ヌクレオチド配列をスクリーニングすることを可能にするコンピュータプログラムを開発する。サフィックスアレイ構築物および検索は、公開のlibdivsufsortライブラリー2.0.0 (http://code.google.com/p/libdivsufsort/)を利用する。前記は任意の入力ストリングをBurrows-Wheeler変換ストリングに直接変換する。前記プログラムは全ての入力（標的）ヌクレオチド配列をスキャンし、選択したDNAデータベース内に選択した回数より少ない回数で生じる全てのサブストリングの組合せを報告する。
【０１４２】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入のためのクェアリー配列における標的部位の選別：ジンクフィンガーDNA結合ドメインは3塩基対ヌクレオチド配列を認識する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、1、2、3、4、5、6または7つ以上のジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むジンクフィンガータンパク質およびタイプIIS制限酵素の非特異的ヌクレアーゼを含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、標的配列に二本鎖切断を導入できる。二本鎖切断を導入するために、1対のジンクフィンガーヌクレアーゼ（そのうちの一方は標的配列のプラス（上方）鎖と結合し、他方は0、1、2、3、4、5、6または7つ以上のヌクレオチドで分離された同じ標的配列のマイナス（下方）鎖と結合する）が要求される。2つの固定長サブストリングDNAモチーフの各々について複数の3を用いることによって、前記プログラムを用いて、与えられたスペーサー長で分離された2つのジンクフィンガータンパク質標的部位を同定することができる。
【０１４３】
プログラム入力：
1．標的クェアリーDNA配列
2．選択されるべきDNAデータベース
3．第一のサブストリングDNAモチーフの固定サイズ
4．スペーサーの固定サイズ
5．第二のサブストリングDNAモチーフの固定サイズ
6．プログラム入力4だけ分離された、プログラム入力3および5の組合せがプログラム入力2の選択DNAデータベースで出現する閾値回数
【０１４４】
プログラムの出力：
1．プログラム入力6の閾値を最大として各配列についてデータベース内で前記配列が生じる回数を含むヌクレオチド配列リスト
【０１４５】
実施例5：6塩基対に固定された第一および第二のサブストリング、3塩基対に固定されたスペーサーおよび5ヒットの最大閾値による、タバコゲノム配列アッセンブリーにおけるニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）変種1ヌクレオチド配列内の標的部位の選別
【０１４６】
プログラム入力：
1．標的クェアリーDNA配列としてニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）配列番号：5
2．検索されるべきDNAデータベースとして実施例1のタバコゲノム配列アッセンブリー
3．固定6塩基対の第一のサブストリングDNAモチーフ
4．固定3塩基対のスペーサー
5．固定6塩基対の第二のサブストリングDNAモチーフ
6．プログラム入力4だけ分離された、プログラム入力3および5の組合せがプログラム入力2の選択DNAデータベースにおいて出現する5ヒットを最大とする閾値回数
【０１４７】
プログラムの出力：
ACCGTA NNN GGCGAC (配列番号：50): 4ヒット
CCGTAT NNN GCGACG (配列番号：51): 5ヒット
TATCCG NNN ACGGCG (配列番号：52): 5ヒット
GCGAGG NNN GTGCTA (配列番号：53): 5ヒット
TCTCGT NNN GGCGAG (配列番号：54): 5ヒット
CGGTTA NNN GTAGGA (配列番号：55): 5ヒット
AGTTAG NNN GCGCCG (配列番号：56): 4ヒット
CGTGGC NNN CAGGGT (配列番号：57): 3ヒット
CCTTAC NNN ACGTCT (配列番号：58): 4ヒット
GGCCAT NNN GGGGGC (配列番号：59): 3ヒット
GCCATA NNN GGGGCG (配列番号：60): 4ヒット
GCACGG NNN TCCGAG (配列番号：61): 4ヒット
GCGAAT NNN GGCGCC (配列番号：62): 5ヒット
本実施例は、その各々のジンクフィンガータンパク質が、与えられた標的配列（配列番号：5、ATG-開始コドンからTAA-終止コドンまでの完全なβ(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼのゲノム配列を含み、3つのエクソンおよび2つのイントロンを収納する）に対して、2つの固定された6塩基対の長いDNA結合ドメインを固定された3塩基対の介在スペーサー配列と一緒に含むいずれのジンクフィンガーヌクレアーゼ対も、タバコゲノム配列内で少なくとも3つの別の部位を標的とするであろうということを立証する。本実施例はまた、13対のみがタバコゲノム内で5回以下の回数で生じ、他の全ての対は6回以上生じることを立証する。
【０１４８】
実施例6：ニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）変種1のコード配列のエクソン2フラグメントにおけるジンクフィンガーヌクレアーゼゲノム編集のための標的部位の選別
本実施例は以下を例証する：
1．配列番号：5のニコチアナ・タバクムのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）変種1のエクソン2におけるジンクフィンガー媒介変異導入のための標的部位リストがどのように編纂されたか、
2．コード配列に変異を導入する、対を構成する2つのジンクフィンガーヌクレアーゼの設計のために1対の標的部位がどのように選択された、
3．プログラムの出力をどのように用いて1対のジンクフィンガーヌクレアーゼを開発したか。
【０１４９】
プログラム入力：
1．標的クェアリー配列として塩基対2,750から2,899（マイナス鎖がコード配列）の配列番号：5のエクソン2フラグメント
2．検索されるべきDNAデータベースとして実施例1のタバコゲノム配列アッセンブリー
3．固定12塩基対サイズの第一のサブストリングDNAモチーフ
4．固定0塩基対サイズのスペーサー
5．固定12塩基対サイズの第二のサブストリングDNAモチーフ
6．最大閾値回数が1回である選択DNAデータベースにおける出現
【０１５０】
プログラムの出力：
タバコゲノムデータベース内で最大1回の出現を閾値とするプログラムによって作製された、エクソン2について12-0-12の設計による24全ての塩基対配列（上記の入力設定に関して最初の数は第一のサブストリングの固定長を、第二の数はスペーサーの固定長を、第三の数は第二のサブストリングの固定長を表す）は以下のとおりである：
TTTTCATTTCAG  TGGATTGAGGAG (配列番号：63): 0ヒット
TTTCATTTCAGT  GGATTGAGGAGC (配列番号：64): 0 ヒット
TTCATTTCAGTG  GATTGAGGAGCC (配列番号：65): 0 ヒット
TCATTTCAGTGG  ATTGAGGAGCCG (配列番号：66): 0 ヒット
CATTTCAGTGGA  TTGAGGAGCCGT (配列番号：67): 0 ヒット
ATTTCAGTGGAT  TGAGGAGCCGTC (配列番号：68): 0 ヒット
TTTCAGTGGATT  GAGGAGCCGTCA (配列番号：69): 0 ヒット
TTCAGTGGATTG  AGGAGCCGTCAC (配列番号：70): 0 ヒット
TCAGTGGATTGA  GGAGCCGTCACT (配列番号：71): 0 ヒット
CAGTGGATTGAG  GAGCCGTCACTT (配列番号：72): 0 ヒット
AGTGGATTGAGG  AGCCGTCACTTT (配列番号：73): 0 ヒット
GTGGATTGAGGA  GCCGTCACTTTT (配列番号：74): 0 ヒット
TGGATTGAGGAG  CCGTCACTTTTG (配列番号：75): 0 ヒット
GGATTGAGGAGC  CGTCACTTTTGA (配列番号：76): 0 ヒット
GATTGAGGAGCC  GTCACTTTTGAT (配列番号：77): 0 ヒット
ATTGAGGAGCCG  TCACTTTTGATT (配列番号：78): 0 ヒット
TTGAGGAGCCGT  CACTTTTGATTA (配列番号：79): 0 ヒット
TGAGGAGCCGTC  ACTTTTGATTAC (配列番号：80): 0 ヒット
GAGGAGCCGTCA  CTTTTGATTACA (配列番号：81): 0 ヒット
AGGAGCCGTCAC  TTTTGATTACAC (配列番号：82): 0 ヒット
GGAGCCGTCACT  TTTGATTACACG (配列番号：83): 0 ヒット
GAGCCGTCACTT  TTGATTACACGA (配列番号：84): 0 ヒット
AGCCGTCACTTT  TGATTACACGAT (配列番号：85): 0 ヒット
GCCGTCACTTTT  GATTACACGATT (配列番号：86): 0 ヒット
CCGTCACTTTTG  ATTACACGATTT (配列番号：87): 0 ヒット
CGTCACTTTTGA  TTACACGATTTG (配列番号：88): 0 ヒット
GTCACTTTTGAT  TACACGATTTGA (配列番号：89): 0 ヒット
TCACTTTTGATT  ACACGATTTGAG (配列番号：90): 0 ヒット
CACTTTTGATTA  CACGATTTGAGT (配列番号：91): 0 ヒット
ACTTTTGATTAC  ACGATTTGAGTA (配列番号：92): 0 ヒット
CTTTTGATTACA  CGATTTGAGTAT (配列番号：93): 0 ヒット
TTTTGATTACAC  GATTTGAGTATG (配列番号：94): 0 ヒット
TTTGATTACACG  ATTTGAGTATGC (配列番号：95): 0 ヒット
TTGATTACACGA  TTTGAGTATGCA (配列番号：96): 0 ヒット
TGATTACACGAT  TTGAGTATGCAA (配列番号：97): 0 ヒット
GATTACACGATT  TGAGTATGCAAA (配列番号：98): 0 ヒット
ATTACACGATTT  GAGTATGCAAAC (配列番号：99): 0 ヒット
TTACACGATTTG  AGTATGCAAACC (配列番号：100): 0 ヒット
【０１５１】
TACACGATTTGA  GTATGCAAACCT (配列番号：101): 0 ヒット
ACACGATTTGAG  TATGCAAACCTT (配列番号：102): 0 ヒット
CACGATTTGAGT  ATGCAAACCTTT (配列番号：103): 0 ヒット
ACGATTTGAGTA  TGCAAACCTTTT (配列番号：104): 0 ヒット
CGATTTGAGTAT  GCAAACCTTTTC (配列番号：105): 0 ヒット
GATTTGAGTATG  CAAACCTTTTCC (配列番号：106): 0 ヒット
ATTTGAGTATGC  AAACCTTTTCCA (配列番号：107): 0 ヒット
TTTGAGTATGCA  AACCTTTTCCAC (配列番号：108): 0 ヒット
TTGAGTATGCAA  ACCTTTTCCACA (配列番号：109): 0 ヒット
TGAGTATGCAAA  CCTTTTCCACAC (配列番号：110): 0 ヒット
GAGTATGCAAAC  CTTTTCCACACA (配列番号：111): 0 ヒット
AGTATGCAAACC  TTTTCCACACAG (配列番号：112): 0 ヒット
GTATGCAAACCT  TTTCCACACAGT (配列番号：113): 0 ヒット
TATGCAAACCTT  TTCCACACAGTT (配列番号：114): 0 ヒット
ATGCAAACCTTT  TCCACACAGTTA (配列番号：115): 0 ヒット
TGCAAACCTTTT  CCACACAGTTAC (配列番号：116): 0 ヒット
GCAAACCTTTTC  CACACAGTTACC (配列番号：117): 0 ヒット
CAAACCTTTTCC  ACACAGTTACCG (配列番号：118): 0 ヒット
AAACCTTTTCCA  CACAGTTACCGA (配列番号：119): 0 ヒット
AACCTTTTCCAC  ACAGTTACCGAT (配列番号：120): 0 ヒット
ACCTTTTCCACA  CAGTTACCGATT (配列番号：121): 0 ヒット
CCTTTTCCACAC  AGTTACCGATTG (配列番号：122): 0 ヒット
CTTTTCCACACA  GTTACCGATTGG (配列番号：123): 0 ヒット
TTTTCCACACAG  TTACCGATTGGT (配列番号：124): 0 ヒット
TTTCCACACAGT  TACCGATTGGTA (配列番号：125): 0 ヒット
TTCCACACAGTT  ACCGATTGGTAT (配列番号：126): 0 ヒット
TCCACACAGTTA  CCGATTGGTATA (配列番号：127): 0 ヒット
CCACACAGTTAC  CGATTGGTATAG (配列番号：128): 0 ヒット
CACACAGTTACC  GATTGGTATAGT (配列番号：129): 0 ヒット
ACACAGTTACCG  ATTGGTATAGTG (配列番号：130): 0 ヒット
CACAGTTACCGA  TTGGTATAGTGC (配列番号：131): 0 ヒット
ACAGTTACCGAT  TGGTATAGTGCA (配列番号：132): 0 ヒット
CAGTTACCGATT  GGTATAGTGCAT (配列番号：133): 0 ヒット
AGTTACCGATTG  GTATAGTGCATA (配列番号：134): 0 ヒット
GTTACCGATTGG  TATAGTGCATAC (配列番号：135): 0 ヒット
TTACCGATTGGT  ATAGTGCATACG (配列番号：136): 0 ヒット
TACCGATTGGTA  TAGTGCATACGT (配列番号：137): 0 ヒット
ACCGATTGGTAT  AGTGCATACGTG (配列番号：138): 0 ヒット
CCGATTGGTATA  GTGCATACGTGG (配列番号：139): 0 ヒット
CGATTGGTATAG  TGCATACGTGGC (配列番号：140): 0 ヒット
GATTGGTATAGT  GCATACGTGGCA (配列番号：141): 0 ヒット
ATTGGTATAGTG  CATACGTGGCAT (配列番号：142): 0 ヒット
TTGGTATAGTGC  ATACGTGGCATC (配列番号：143): 0 ヒット
TGGTATAGTGCA  TACGTGGCATCC (配列番号：144): 0 ヒット
GGTATAGTGCAT  ACGTGGCATCCA (配列番号：145): 0 ヒット
GTATAGTGCATA  CGTGGCATCCAG (配列番号：146): 0 ヒット
TATAGTGCATAC  GTGGCATCCAGG (配列番号：147): 0 ヒット
ATAGTGCATACG  TGGCATCCAGGG (配列番号：148): 0 ヒット
TAGTGCATACGT  GGCATCCAGGGT (配列番号：149): 0 ヒット
AGTGCATACGTG  GCATCCAGGGTT (配列番号：150): 0 ヒット
【０１５２】
GTGCATACGTGG  CATCCAGGGTTA (配列番号：151): 0 ヒット
TGCATACGTGGC  ATCCAGGGTTAC (配列番号：152): 0 ヒット
GCATACGTGGCA  TCCAGGGTTACT (配列番号：153): 0 ヒット
CATACGTGGCAT  CCAGGGTTACTG (配列番号：154): 0 ヒット
ATACGTGGCATC  CAGGGTTACTGG (配列番号：155): 0 ヒット
TACGTGGCATCC  AGGGTTACTGGC (配列番号：156): 0 ヒット
ACGTGGCATCCA  GGGTTACTGGCT (配列番号：157): 0 ヒット
CGTGGCATCCAG  GGTTACTGGCTT (配列番号：158): 0 ヒット
GTGGCATCCAGG  GTTACTGGCTTG (配列番号：159): 0 ヒット
TGGCATCCAGGG  TTACTGGCTTGC (配列番号：160): 0 ヒット
GGCATCCAGGGT  TACTGGCTTGCC (配列番号：161): 0 ヒット
GCATCCAGGGTT  ACTGGCTTGCCC (配列番号：162): 0 ヒット
CATCCAGGGTTA  CTGGCTTGCCCA (配列番号：163): 0 ヒット
ATCCAGGGTTAC  TGGCTTGCCCAG (配列番号：164): 0 ヒット
TCCAGGGTTACT  GGCTTGCCCAGT (配列番号：165): 0 ヒット
CCAGGGTTACTG  GCTTGCCCAGTC (配列番号：166): 0 ヒット
CAGGGTTACTGG  CTTGCCCAGTCG (配列番号：167): 0 ヒット
AGGGTTACTGGC  TTGCCCAGTCGG (配列番号：168): 0 ヒット
GGGTTACTGGCT  TGCCCAGTCGGC (配列番号：169): 0 ヒット
GGTTACTGGCTT  GCCCAGTCGGCC (配列番号：170): 0 ヒット
GTTACTGGCTTG  CCCAGTCGGCCA (配列番号：171): 0 ヒット
TTACTGGCTTGC  CCAGTCGGCCAC (配列番号：172): 0 ヒット
TACTGGCTTGCC  CAGTCGGCCACA (配列番号：173): 0 ヒット
ACTGGCTTGCCC  AGTCGGCCACAT (配列番号：174): 0 ヒット
CTGGCTTGCCCA  GTCGGCCACATT (配列番号：175): 0 ヒット
TGGCTTGCCCAG  TCGGCCACATTT (配列番号：176): 0 ヒット
GGCTTGCCCAGT  CGGCCACATTTG (配列番号：177): 0 ヒット
GCTTGCCCAGTC  GGCCACATTTGG (配列番号：178): 0 ヒット
CTTGCCCAGTCG  GCCACATTTGGT (配列番号：179): 0 ヒット
TTGCCCAGTCGG  CCACATTTGGTT (配列番号：180): 0 ヒット
TGCCCAGTCGGC  CACATTTGGTTT (配列番号：181): 0 ヒット
GCCCAGTCGGCC  ACATTTGGTTTT (配列番号：182): 0 ヒット
CCCAGTCGGCCA  CATTTGGTTTTT (配列番号：183): 0 ヒット
CCAGTCGGCCAC  ATTTGGTTTTTG (配列番号：184): 0 ヒット
CAGTCGGCCACA  TTTGGTTTTTGT (配列番号：185): 0 ヒット
AGTCGGCCACAT  TTGGTTTTTGTA (配列番号：186): 0 ヒット
GTCGGCCACATT  TGGTTTTTGTAG (配列番号：187): 0 ヒット
TCGGCCACATTT  GGTTTTTGTAGA (配列番号：188): 0 ヒット
CGGCCACATTTG  GTTTTTGTAGAT (配列番号：189): 0 ヒット
GGCCACATTTGG  TTTTTGTAGATG (配列番号：190): 0 ヒット
GCCACATTTGGT  TTTTGTAGATGG (配列番号：191): 0 ヒット
CCACATTTGGTT  TTTGTAGATGGC (配列番号：192): 0 ヒット
CACATTTGGTTT  TTGTAGATGGCC (配列番号：193): 0 ヒット
ACATTTGGTTTT  TGTAGATGGCCA (配列番号：194): 0 ヒット
CATTTGGTTTTT  GTAGATGGCCAT (配列番号：195): 0 ヒット
ATTTGGTTTTTG  TAGATGGCCATT (配列番号：196): 0 ヒット
TTTGGTTTTTGT  AGATGGCCATTG (配列番号：197): 0 ヒット
TTGGTTTTTGTA  GATGGCCATTGT (配列番号：198): 0 ヒット
TGGTTTTTGTAG  ATGGCCATTGTG (配列番号：199): 0 ヒット
GGTTTTTGTAGA  TGGCCATTGTGA (配列番号：200): 0 ヒット
【０１５３】
GTTTTTGTAGAT  GGCCATTGTGAG (配列番号：201): 0 ヒット
TTTTTGTAGATG  GCCATTGTGAGG (配列番号：202): 0 ヒット
TTTTGTAGATGG  CCATTGTGAGGT (配列番号：203): 0 ヒット
TTTGTAGATGGC  CATTGTGAGGTA (配列番号：204): 0 ヒット
TTGTAGATGGCC  ATTGTGAGGTAT (配列番号：205): 0 ヒット
TGTAGATGGCCA  TTGTGAGGTATG (配列番号：206): 0 ヒット
GTAGATGGCCAT  TGTGAGGTATGT (配列番号：207): 0 ヒット
TAGATGGCCATT  GTGAGGTATGTT (配列番号：208): 0 ヒット
AGATGGCCATTG  TGAGGTATGTTT (配列番号：209): 0 ヒット
GATGGCCATTGT  GAGGTATGTTTG (配列番号：210): 0 ヒット
ATGGCCATTGTG  AGGTATGTTTGA (配列番号：211): 0 ヒット
最小数のヒット＝0は、実施例1のタバコゲノムデータベースで当該配列が存在しないことを意味する。固有のDNA結合ドメインの設計のために、検索配列がDNAデータベースに存在することを条件にして閾値を1に設定する。検索配列がデータベースに存在しない場合は、閾値を0に設定する。高い配列同一性を有する多数の遺伝子座が存在する場合、2、3または4以上の閾値の設定は、標的グリコシルトランスフェラーゼのためのジンクフィンガーヌクレアーゼの作製に適した出力が得られることは当業者には明白であろう。同様なスコア表を、固定長サブストリングDNAモチーフ、閾値設定および固定長スペーサーの任意の組合せについて構築することができる。
【０１５４】
1対のジンクフィンガーDNA結合ドメインドメインの開発：コード配列への変異導入は細胞の機能的タンパク質の生産能力に直接影響を及ぼすことができることは当業者には明白であろう。出力配列を配列番号：5のDNA配列（配列番号：8のベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）変種1タンパク質を直接コードする）の部分に対してアラインメントすることができる。エクソン‐イントロン境界への変異導入もまた、プレmRNAのmRNAへの正確なプロセッシングを損ない潜在的に酵素活性を破壊することができることは当業者には明白であろう。この目的のために、エクソン2の両端に位置する出力配列を配列番号：5の非コード部分に対してアラインメントする。次に、2つのサブストリングを分離し、2つのサブストリングDNA配列の一方の相補鎖を作製しこれを逆向きにする。例えばプログラムの出力TCCACACAGTTA CCGATTGGTATA（配列番号：127）について、一方のジンクフィンガータンパク質はTCCACACAGTTAに結合し、対応するヌクレオチド配列、配列番号：127を標的とする1対のジンクフィンガーヌクレアーゼを最終的に構成する他方のものはTATACCAATCGGである。次にこれらのジンクフィンガータンパク質の標的配列を3塩基対のサブセットに分割し、それらの各サブセットがジンクフィンガーDNA結合ドメインの標的となる。TCCACACAGTTAの場合、これはTCC-ACA-CAG-TTAであり、TATACCAATCGGの場合、これはTAT-ACC-AAT-CGGである。ジンクフィンガーDNA結合ドメインは、モジュール設計によりジンクフィンガーヌクレアーゼを作製する方法と同様に公知である（Wrightらの論文（2006）を参照されたい）。与えられた3塩基対配列のためのジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むジンクフィンガープラスミドは公知であり、例えばアドジーン社のカタログを参照されたい（Addgene Inc. 1 kendall Square, Cambridge, MA, USA）。ACAヌクレオチド配列のためのジンクフィンガーDNA結合ドメインは例えばPGEKPYKCPECGKSFSSPADLTRHQRTHであり、AATヌクレオチド配列を認識しこれと結合するジンクフィンガーDNA結合ドメインは、例えばPGEKPYKCPECGKSFSTTGNLTVHQRTHであり得る。
【０１５５】
実施例7：ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いるベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子の標的設定変異導入
ジンクフィンガーヌクレアーゼ発現カセットの開発：タバコのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）変種1（配列番号：5）の変異導入のために、エクソン2に特異的でかつ各々が配列番号：5の12bp配列と結合する、1対のジンクフィンガーDNA結合ドメインを実施例6に記載したように選択する。FokI制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインと融合させた前記1対のジンクフィンガーDNA結合ドメインをコードする合成遺伝子配列を、コドン偏向に適合させることによってタバコ細胞での最適発現を得ることができるように構築する。最初に、ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）変種1遺伝子の第一の標的配列のジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）変種1遺伝子の第二の標的配列のジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼを、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーターの下流およびCaMV35Sターミネーターの上流で標準的クローニング方法にしたがってクローニングする。続いて、この遺伝子発現カセットをpBINPLUS-誘導二元性ベクターでクローニングして植物発現カセットを作製する。合成遺伝子配列は、3'-オーバーラップ合成オリゴヌクレオチドを用いるPCRによって、またはリン酸化した相補性オリゴヌクレオチドを含むフラグメントの結合によって、当分野で報告されている標準的な方法にしたがって作製できる。本構成では、コドン偏向はタバコ細胞での発現のために最適化される。他の構成では、コドン偏向は最適化できない。本構成では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子は、カリフラワー35Sプロモーターおよびターミネーター配列の制御下でクローニングされる。他の構成では、遺伝子は、ササゲモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、アルファルファのプラストシアニンプロモーター、またはタバコ植物細胞で活性な任意の他のプロモーター、およびノパリンシンターゼターミネーター配列、プラストシアニンターミネーター配列、またはタバコ植物細胞で転写ターミネーターとして機能する任意の他の配列の制御下でクローニングできる。両方の遺伝子を1つの二元性ベクターでクローニングしても別々にクローニングしてもよい。本構成では、発現カセットはpBINPLUS二元性ベクターでクローニングされる。他の構成では、カセットはpBIN19ベクターまたは任意の他の二元性ベクターでクローニングされる。さらに別の構成では、発現カセットは、粒子ボンバードメントによりタバコ細胞に導入されるベクターまたは植物ウイルス発現ベクターでクローニングすることができる。
【０１５６】
タバコ細胞のトランスフェクション：両方のジンクフィンガーヌクレアーゼ発現カセットを含むベクターを、当分野で標準的な方法を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス株LBA4404（pAL4404）に導入する。組換えアグロバクテリウム・ツメファシエンス株を適切な抗生物質を含む液体ブロスで一晩増殖させ、遠心分離によって細胞を収集し、上清をデカントし、さらにMurashige & Skoog (1962)にしたがい、20g/Lのシュクロースを含む新しい培養液に再懸濁し、1 OD595に調整する。無菌的に生長させたタバコの植物の葉の外植片を標準的方法（Horshら（1985）を参照されたい）にしたがって形質転換し、さらにMurashige & Skoog (1962)にしたがい20g/Lのシュクロースおよび7g/Lの精製寒天を含む培地で、当分野で記載されている適切な条件下でペトリ皿にて2日間共培養する。2日間の共培養の後、外植片を選別培地に静置する（選別培地は、選別用カナマイシンおよび200mg/Lのバンコマイシンおよび 200mg/Lノセフォタキシム、1g/L NAAおよび0.1g/L BAPホルモンを含む）。本実施例では、二元性ベクターはLBA4404（pAL4404）に導入される。他の実施例では、二元性ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株Agl0、Agl1、GV3101もしくは任意の他のACH5、またはタバコの葉の外植片の形質転換に適切なC58由来アグロバクテリウム・ツメファシエンス株に導入できる。本実施例では、葉の外植片はトランスフェクトされる。他の実施態様では、芽移植片は苗木、胚軸もしくは茎組織、または形質転換が容易な任意の他の組織であり得る。本実施例では、二元性ベクターは、発現カセットを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス株によるトランスフェクションによって導入される。他の実験では、発現カセットは粒子ボンバードメントを用いて導入され得る。
【０１５７】
タバコ細胞のトランスフェクション後のタバコ植物の再生および解析：当分野で記載されている標準的な方法（例えばHorschら（1985）を参照されたい）にしたがって、トランスジェニックタバコ細胞をシュートまたは苗木に再生する。例えばパワープラントDNA単離キット（Mo Bio Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA）を用いることによって、ゲノムDNAをシュートまたは苗木から単離する。標的領域を含むDNAフラグメントを配列番号：4の遺伝子配列を用い当分野で記載されている標準的方法にしたがい増幅する。配列番号：2および配列番号：3のペアを用いて標的領域を含むフラグメントを増幅できることは当業者には明白であろう。標準的な配列決定プロトコルを用いて、PCR生成物をその全体にわたってシークェンシングし、さらに配列番号：4の原型配列と比較することによってジンクフィンガーヌクレアーゼ標的部位の、またはその周辺の変異および／または改変を同定する。
【０１５８】
変異の性状決定：本例では、ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）のコード領域が標的とされ、観察される一切の変異の効果が、変異配列の予想される翻訳生成物を配列番号：8の原型cDNA配列およびその予想アミノ酸配列（配列番号：9）と比較される。対応する配列のオープンリーディングフレームの破壊をもたらすいずれの欠失も機能的タンパク質の合成に悪影響をもたらし得ることは当業者には明白であろう。オープンリーディングフレームの予想される破壊をもたらすベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子配列変異体を含む植物を、ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）酵素アッセイに付し、測定酵素活性の変異を示さない原型植物の酵素活性と比較する。
【０１５９】
ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）活性のアッセイ：初期開花期の十分に生長した成熟植物から以下のようにミクロソームを単離する。中心葉脈を取り除き、、葉を小片に切断し、予備冷却したステンレススチールのウォーリングブレンダーにてミクロソーム単離緩衝液（250mMソルビトール、5mM Tris、2mM DTTおよび7.5mM EDTA；1MのMes (2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸を用いてpH7.8に設定）中で均質化する。プロテアーゼ阻害剤カクテル（Complete Mini；Roche Diagnostics）を添加し、新鮮重量のタバコの葉1g当たり3mLの氷冷ミクロソーム単離緩衝液を使用する。88μmのナイロン布でろ過し、さらにソーバルSS34ローターを用い4℃にて10分12,000 gで遠心分離することによって細屑および葉の素材を除去する。ミクロソームを含む上清を新しい遠心管に移し、固定角度のセントリコンTFT55.38ローターでセントリコンT-2070超遠心機により4℃にて60分100,000 gで遠心分離する。ミクロソームを含むペレットを、グリセロール（最終濃度4％）を添加したミクロソーム単離緩衝液（EDTA無し）中で再懸濁する。キシロシルトランスフェラーゼ酵素活性は、25μLの反応混合物（以下を含む：10 mMカコジル酸緩衝液（pH 7.2）、4 mM ATP、20 mM MnCl2、0.4% Triton X-100、0.1 mM UDP-[14C]-キシロースおよび1 mM GlcNAcβ-1-2-Man-α1-3-[Man-α1-6]Man-β-O-(CH2)8-COOH3）中で、受容体としてGlcNAcβ-1-2-Man-α1-3-(GlcNAc-β1-2-Man-α1-6)Man-β1-4GlcNAc-β1-4(Fuc-α1-6)GlcNAc-IgG グリコペプチドを用いて測定される。
【０１６０】
実施例8：一本鎖メガヌクレアーゼを用いるベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）の標的設定変異導入
タバコのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）変種1のエクソン2を切断するI-Crel誘導体の操作：タバコのベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）変種1遺伝子（配列番号：5）のエクソン2の変異導入のために、エクソン2内の第一の固有22bp標的配列を選択する。これは、スペーサーのために0塩基対固定サイズ並びに第一および第二のサブストリングDNAモチーフのために合計22bpを用い、実施例4の検索プロトコルにしたがって実施できる。しかしながら本例では、固有の22bp配列は、実施例6の出力を用いて選択され、さらに出力配列の配列番号：64の最後の2bpを廃棄しその結果以下の配列が得られる：TTTTCATTTCAGTGGATTGAGG。パリンドローム形の配列番号：42の左右の半分を表す2つの誘導標的が設計される。配列番号：43（TTTTCATTTCATGAAATGAAAA）は左半分を表し、配列番号：44（CCTCAATCCTCGTGGATTGAGG）は右半分を表す。文献（Smith et al. (2006), Nucleic Acid Res. 34:e149）に記載されたように、これら2つのパリンドローム標的配列誘導体（配列番号：43、配列番号：44）に対して新規な特異性を有する変異エンドヌクレアーゼについて、コンビナトリアルI-Crel変異体ライブラリーをスクリーニングする。本例では、一本鎖ヌクレアーゼは標的配列、配列番号：42のために開発される。他の例では、当業者は強制的ヘテロダイマーメガヌクレアーゼを開発できる。本例では、I-Crel第まーメガヌクレアーゼは、配列番号：42を標的とする22bpの特異的変異エンドヌクレアーゼの開発のための足場として用いられる。他の例では、他の足場を用いて、エクソン2の部分配列を標的とする変異エンドヌクレアーゼが開発できる。例えばI-HmuI、I-HmuII、I-BasI、I-TevIII、I-CmoeI、I-PpoI、I-SspI、I-SceI、I-CeuI、I-MsoI、I-DmoI、H-DreI、PI-SceIまたはPI-PfuIであるが、ただしこれらに限定されない。
【０１６１】
一本鎖メガヌクレアーゼ発現カセットの開発：配列番号：43および44に対し特異性を有する機能的な変異エンドヌクレアーゼを用い、本質的にGrizotら（2009）が記載したように配列番号：42に対し特異性を有する一本鎖メガヌクレアーゼを設計する。配列番号：42の左部分を標的とする第一のエンドヌクレアーゼ（配列番号：43）のC-末端部分を、配列番号：42の右半分を標的とする第二のエンドヌクレアーゼ（配列番号：44）のN-末端部分と、長さおよび配列が異なる一連のリンカーを用い結合し、前記タンパク質の活性を判定する。本質的に実施例7で述べたように、機能的タンパク質を用いて、タバコでの発現、タバコ細胞のトランスフェクション並びに改変ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）活性を有する変異配列およびタバコ植物のスクリーニングのための遺伝子構築物が設計される。
【０１６２】
実施例9：改変タバコ植物の交配による変異遺伝子座の一体化
タバコ植物を温室条件下で生長させる。種々の改変タバコ植物に存在する変異遺伝子座は交配によって一体化される。交配のために、花粉が飛散する前に花の発達の6−10ステージでタバコの花を除雄する（Koltunow et al., 1990, The Plant Cell 2: 1201-1224）。受容植物の除雄した雌ずいを開花期に類似する発達段階で供与植物の花粉で受粉させ、受粉花に個々に袋をかけて交差受粉を予防する。交配は、供与体および受容体として親1を、さらに受容体および供与体として親2をそれぞれ用いて両方向で実施し、潜在的な受精に関する問題を回避する。種子を採集し、実施例7に記載したように子孫植物をシークェンシングおよび酵素活性によって変異について解析する。一体化された変異を有する植物を成熟するまで生長させ、自家受粉させ子孫植物を以前のようにシークェンシングおよび酵素活性によって変異について解析する。変異が一体化した植物を選別し、自家受粉させ、それらの子孫をホモ接合性について解析する。ホモ接合植物を選別する。交配によって種々の改変タバコ植物に存在するベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子配列の変異遺伝子座を一体化するか、または種々の植物に存在するアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子配列の変異遺伝子座を一体化するか、またはベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）遺伝子配列およびアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子配列の変異遺伝子座を一体化して、ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）酵素活性の無い、アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）酵素活性の無い、またはベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ（β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ）酵素活性も無くアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ（α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ）酵素活性も無いタバコ植物を作製できることは当業者には明白であろう。
【０１６３】
実施例10：ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・ベンタミアナN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIのゲノム配列の同定
本実施例は、PCRを用いてN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIのゲノムヌクレオチド配列を同定する態様を例証する。
高分子量DNAをニコチアナ・ベンタミアナおよびニコチアナ・タバクムの核から標準的プロトコルにしたがって単離する。プライマーセットを開発し、公知のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの配列を基にして、約3100bp（GnTI-A）および3500bp（GnTI-B）フラグメントを増幅する。用いられるプライマーセットは、フラグメントGnTI-Aの増幅にはプライマー配列、配列番号：23（Big1FN）およびプライマー配列、配列番号：24（Big1RN）であり、フラグメントGnTI-Bの増幅にはプライマーセット、配列番号：10プライマー配列Big3FNおよび配列番号：11プライマー配列Big3RNである。PCRは、標準的プロトコルを用い高分子量ゲノムDNAで実施する。ニコチアナ・タバクムのフラグメントGnTI-A並びにニコチアナ・ベンタミアナおよびニコチアナ・ベンタミアナのフラグメントGnTI-Bを標準的プロトコルにしたがって配列を決定する。ニコチアナ・ベンタミアナの高分子量DNAを用いてフラグメントGnTI-Aに一致するヌクレオチドフラグメントは増幅されない。
【０１６４】
配列番号：40は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Aのゲノムフラグメントに対応する3152bpヌクレオチド配列を開示する。
配列番号：41は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Aのゲノムフラグメントに対応する3140bpヌクレオチド配列を開示する。
配列番号：212は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A（配列番号：40）の部分的cDNA配列変種1を開示し、配列番号：227はFgeneSHによって予想される部分的cDNA配列変種2を開示する。
配列番号：213および229は、FgeneSHによって予想されるニコチアナ・タバクムGnTI-A（配列番号：41）の部分的cDNA配列変種1および2を開示する。
配列番号：217および配列番号：228は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A cDNA変種1（配列番号：213）および変種2（配列番号：229）の予想される部分的アミノ酸配列を開示する。
配列番号：218および配列番号：230は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-A cDNA変種1（配列番号：213）および変種2（配列番号：229）の予想される部分的アミノ酸配列を開示する。
配列番号：12は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bのゲノムフラグメントに対応する3504bpのヌクレオチド配列を開示する。
配列番号：13は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-Bのゲノムフラグメントに対応する2283bpのヌクレオチド配列を開示する。
配列番号：14は、ニコチアナ・ベンタミアナフラグメントGnTI-Bのゲノムフラグメントに対応する3765bpのヌクレオチド配列を開示する。
配列番号：20は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B（配列番号：12）の部分的cDNA配列変種1を開示し、配列番号：219は部分的cDNA配列変種2を、配列番号：220はニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B（配列番号：12）の部分的cDNA配列変種3をFgeneSHによって予測されるように開示する。
配列番号：214および配列番号：221および配列番号：222は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B cDNA変種1（配列番号：20）、変種2（配列番号：219）および変種3（配列番号：220）の予想される部分的アミノ酸配列をそれぞれ開示する。
配列番号：21は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B（配列番号：13）の部分的cDNA配列変種を開示し、配列番号：223はFgeneSHによって予想される部分的cDNA配列変種を開示する。
配列番号：215および配列番号：224は、ニコチアナ・タバクムフラグメントGnTI-B cDNA変種1（配列番号：21）および変種2（配列番号：223）の予想される部分的アミノ酸配列をそれぞれ開示する。
配列番号：22は、ニコチアナ・ベンタミアナフラグメントGnTI-B（配列番号：14）の部分的cDNA配列変種1を開示し、配列番号：225はFgeneSHによって予想される部分的cDNA配列変種2を開示する。
配列番号：216および配列番号：226は、ニコチアナ・ベンタミアナフラグメントGnTI-B cDNA変種1（配列番号：22）および変種2（配列番号：225）の予想されるアミノ酸配列をそれぞれ開示する。
【０１６５】
実施例11：ニコチアナ・タバクムN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI（GnTI）変種の同定
contig gDNA_c1690982を基にしたプライマー対NGSG12045（配列番号：231および232）を用いて、ニコチアナ・タバクムN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの遺伝子変種2のゲノムヌクレオチド配列を、実施例1に記載した方法によって同定する。配列番号：233は、ニコチアナ・タバクムのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの遺伝子変種2を含む、BACクローン、BAC-FABIJI_1のゲノムヌクレオチド配列の15,000塩基対を表す。配列番号：233内のイントロンおよびエクソンの位置はFgeneSHおよびAugustusを用いて予想され、さらに配列番号：234はN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの遺伝子変種2の予想されるcDNA配列を提供する。配列番号：235は、配列番号：234に示されるcDNA配列のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの遺伝子変種2の一文字アミノ酸配列を表す。
【０１６６】
実施例12：ニコチアナ・タバクムPM132のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの配列の同定
実施例10および11では、N.タバクムのいくつかのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI遺伝子配列が同定されている。配列番号：12は、N.タバクムPM132のGnTI遺伝子の一部分を含む3504bpゲノム領域のヌクレオチド配列を開示する。配列番号：40は、N.タバクムPM132のGnTI遺伝子の一部分を含む3152bpゲノム領域のヌクレオチド配列を開示する。配列番号：13は、N.タバクムPO2のGnTI遺伝子の一部分を含む2283bpゲノム領域のヌクレオチド配列を開示する。配列番号：41は、N.タバクムPO2のGnTI遺伝子の一部分を含む3140bpゲノム領域のヌクレオチド配列を開示する。配列番号：233は、N.タバクムHicks BroadleafのGnTIの全コード領域（“FABIJI”）を5’および3’UTRとともに含む15,000bpゲノムヌクレオチド配列を開示する。
上述のように、完全なGnTIをコードする唯一のGnTI遺伝子配列はN.タバクムHicks Broadleafから得られたものである（配列番号：233）。PM132は、本発明の方法で使用されるニコチアナ・タバクムの好ましい品種の1つである。PM132の種子は、受託番号NCIMB41802によりNCIMB Ltd.（ブダペスト条約による国際寄託機関、所在地：Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, United Kingdom）に2011年1月6日に寄託された。
【０１６７】
FABIJIホモローグ：N.タバクムPM132のFABIJIホモローグの完全な遺伝子を含むゲノム配列が、プライマー配列番号：236、配列番号：237、配列番号：242、配列番号：243、配列番号：244および配列番号：245を用いて同定される。配列番号：256は、FABIJIのコード配列を含むN.タバクムPM132のゲノム領域のヌクレオチド配列を開示する。配列番号：257は、N.タバクムPM132のFABIJIホモローグのコード領域のヌクレオチド配列を開示する。配列番号：258は、N.タバクムPM132のFABIJIホモローグの予想されるアミノ酸配列を示す。
【０１６８】
CAC80702.1ホモローグ：EMBL-CDS: CAC80702.1（受託番号AJ249883.1）は、N.タバクムSamsun NNから得られたGnTIのcDNA配列を開示する。N.タバクムPM132のCAC80702.1のホモローグは、プライマー配列、配列番号：240および配列番号：241を用いてクローニングされる。本明細書の下記に示す、さらに追加される配列が、プライマー配列、配列番号：246、配列番号：247、配列番号：248、配列番号：249、配列番号：250、配列番号：251、配列番号：252、配列番号：253、配列番号：254および配列番号：255を用いてクローニングされる。
配列番号：262は、CAC80702.1のホモローグをコードするN.タバクムPM132のゲノム領域のヌクレオチド配列を開示する。配列番号：263は、N.タバクムPM132のホモローグのコード領域のヌクレオチド配列を開示する。配列番号：264は、N.タバクムPM132のCAC80702.1ホモローグの予想されるアミノ酸配列を開示する。
【０１６９】
GnTI偽遺伝子CPO：配列番号：238および配列番号：239の配列を有するプライマーをPCR増幅で用いて、実施例10に記載したように、フラグメントGnTI-AおよびGnTI-Bを含むN.タバクムPM132のゲノム配列を同定する。配列番号：259は、N.タバクムPM132のGnTI様遺伝子（今後はCPOと称される）のヌクレオチド配列を開示する。配列番号：260は、N.タバクムPM132のCPO遺伝子の予想されるコード領域を開示する。配列番号：261は、N.タバクムPM132のCPO遺伝子の予想されるアミノ酸配列を開示する。終止コドンがCPOコード配列（配列番号：259）で同定され、前記はGnTIのC-末端部分と一致し、CPOが偽遺伝子であることを示唆する。この示唆は、CPOをコードするcDNAクローン（N.タバクムPM132の葉の材料から調製）の欠如によって支持される
【０１７０】
追加されるN.タバクムPM132のGnTI配列：配列番号：265は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#5のヌクレオチド酸配列を開示する。配列番号：266は、GnTIコード領域contig 1#5のヌクレオチド酸配列を開示する。配列番号：267は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#5によってコードされる推定的タンパク質のアミノ酸配列を開示する。配列番号：268は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#8のヌクレオチド配列を開示する。配列番号：269は、GnTIコード領域contig 1#8のヌクレオチド酸配列を開示する。配列番号：270は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#8によってコードされる推定的タンパク質のアミノ酸配列を開示する。配列番号：271は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#9のヌクレオチド酸配列を開示する。配列番号：272は、GnTIコード領域contig 1#9のヌクレオチド酸配列を開示する。配列番号：273は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#9によってコードされる推定的タンパク質のアミノ酸配列を開示する。配列番号：274は、N.タバクムPM132のGnTI T10 702のヌクレオチド酸配列を開示する。配列番号：275は、T10 702のGnTIコード領域のヌクレオチド酸配列を開示する。配列番号：276は、N.タバクムPM132のGnTI T10 702によってコードされる推定的タンパク質のアミノ酸配列を開示する。配列番号：277は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#6のヌクレオチド酸配列を開示する。配列番号：278は、GnTIコード領域contig 1#6のヌクレオチド酸配列を開示する。配列番号：279は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#6によってコードされる推定的タンパク質のアミノ酸配列を開示する。配列番号：280は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#2のヌクレオチド酸配列を開示する。配列番号：281は、GnTIコード領域contig 1#2のヌクレオチド酸配列を開示する。配列番号：282は、N.タバクムPM132のGnTI contig 1#2によってコードされる推定的タンパク質のアミノ酸配列を開示する。
【０１７１】
上記に記載した配列の多くを用いて、N.タバクムPM132の植物細胞または全植物でN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI活性をダウンレギュレートまたはノックアウトする。前記ダウンレギュレーションまたはノックアウトは以下によって達成される（ただしこれらに限定されない）：RNAi技術、化学的誘導遺伝子導入またはゲノム編集技術、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介ノックアウト、メガヌクレアーゼ媒介ノックアウト、変異原性ヌクレアーゼ媒介ノックアウトまたは他のタバコにおけるゲノム編集技術（ただしこれらに限定されない）。
【０１７２】
本明細書で開示されるゲノム配列で同定される調節エレメントを用いて、植物（例えばタバコ並びにその多様な種および栽培変種であるが、ただし前記に限定されない）での異種タンパク質の発現を駆動することができる。GnTIコード配列を用いて、生物（例えば植物細胞、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞または昆虫細胞であるが、ただしこれらに限定されない）でN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIを生産することができる。終止コドンを含むN.タバクムPM132のCPO配列を用いて、当該タンパク質のC-末端部分を欠くGnTI様酵素を生産することができる。さらに意図されるものは、終止コドンの欠失または置換であり、それによってリーディングフレームを回復させて酵素的に活性なGnTI酵素をコードするコード配列を得ることである。
【０１７３】
12.1材料および方法
12.1.1 GnTIのゲノム配列およびcDNA配列のFABIJIホモローグを得る方法
ゲノムDNAは、CTAB系抽出方法を用いてN.タバクムPM132の葉の組織から抽出される。N.タバクムPM132の葉を液体窒素中ですり潰して粉末にする。RNA抽出キット（Qiagen）を用い、供給業者の指示にしたがいながらRNAを200mgの粉末から抽出する。続いて1μgの抽出RNAをDNaseI（NEB）で処理する。500ngのDNase処理RNAから出発して、AMV-逆転写酵素（Invitrogen）を用いてcDNAを合成する。続いて第一鎖のcDNAサンプル10倍希釈して、PCR鋳型として供する。植物cDNAまたはgDNAは、マスターサイクラー（Mastercycler）グラジエントマシーン（Ependorf）によって増幅する。反応は50μL（25 μl の2ｘ フション（Phusion）マスターミックス（Finnzyme）、20 μlの水、1μLの稀釈cDNAおよび表に列挙したプライマー（10μM）の各々2μLを含む）で実施する。サーモサイクラーの条件は、供給業者の指示にしたがい設定し、アニーリング温度として58℃を用いる。PCRの後、生成物の3’末端をアデニル化する。50μLの2X Taqマスターミックス（NEB）を前記PCR反応に添加し、これらを72℃で10分間インキュベートする。続いてPCR精製キット（Qiagen）を用いてPCR生成物を精製する。精製した前記生成物をTOPO-TAクローニングキット（Invitrogen）を用いてpCR2.1でクローニングする。TOPO反応物でTOP10大腸菌を形質転換する。個々のクローンを液体培地へ採取し、培養物からプラスミドDNAを調製し、プライマーM13およびM13Rによるシークェンシングに用いる。配列データは、Contig Express and AlignXソフトウェア（Vector NTI, Invitrogen）を用いて編集する。アッセンブリングしたコンティーグを既知配列と比較する。
【０１７４】
表1：GnTIゲノム配列およびcDNA配列を得るためにPCRで用いられるプライマー配列
2013526844.tif 000002
【０１７５】
12.1.2 N.タバクムPM132 FABIJIホモローグの同定に関連する方法
表2：GnT1のためにHicks Broadleaf BACに由来するゲノムFABIJIホモローグのスクリーニングに用いられるプライマー
2013526844.tif 000003
N.タバクムPM132のシークェンシングRT-PCRフラグメントから得られたヌクレオチド配列は、N.タバクムHicks Broadleafの 完全なゲノムFABIJI_1配列に対してアラインメントされる。
配列番号：256：N.タバクムPM132-FABIJIのゲノムDNA配列
【０１７６】
2013526844.tif 000004
【０１７７】
2013526844.tif 000005
【０１７８】
2013526844.tif 000006
【０１７９】
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【０１８０】
2013526844.tif 000008
【０１８１】
配列番号：257：FABIJIのN.タバクムPM132コード配列
【０１８２】
2013526844.tif 000009
【０１８３】
配列番号：258：FABIJIのN.タバクムPM132のタンパク質配列
【０１８４】
2013526844.tif 000010
【０１８５】
12.1.3 N.タバクムPM132 CPOのGnTI配列を得る方法
ゲノムDNAは、CTAB系抽出方法を用いてN.タバクムPM132の葉の組織から抽出される。N.タバクムPM132の葉を液体窒素中ですり潰して粉末にする。RNA抽出キット（Qiagen）を用い、供給業者の指示にしたがいながらRNAを200mgの粉末から抽出する。続いて1μgの抽出RNAをDNaseI（NEB）で処理する。500ngのDNase処理RNAから出発して、AMV-逆転写酵素（Invitrogen）を用いてcDNAを合成する。続いて第一鎖のcDNAサンプル10倍希釈して、PCR鋳型として供する。植物cDNAまたはgDNAは、マスターサイクラーグラジエントマシーン（Ependorf）によって増幅する。反応は50μL（25 μl の2ｘ フションマスターミックス（Finnzyme）、20 μlの水、1μLの稀釈cDNAおよび表に列挙したプライマー（10μM）の各々2μLを含む）で実施する。サーモサイクラーの条件は、供給業者の指示にしたがい設定し、アニーリング温度として58℃を用いる。PCRの後、生成物の3’末端をアデニル化する。50μLの2X Taqマスターミックス（NEB）を前記PCR反応に添加し、これらを72℃で10分間インキュベートする。続いてPCR精製キット（Qiagen）を用いてPCR生成物を精製する。精製した前記生成物をTOPO-TAクローニングキット（Invitrogen）を用いてpCR2.1でクローニングする。TOPO反応物でTOP10大腸菌を形質転換する。個々のクローンを液体培地へ採取し、培養物からプラスミドDNAを調製し、プライマーM13およびM13Rによるシークェンシングに用いる。配列データは、Contig Express and AlignXソフトウェア（Vector NTI, Invitrogen）を用いて編集する。アッセンブリングしたコンティーグを既知配列と比較する。
【０１８６】
表3：CPO配列を得るためにPCRで用いられるプライマー配列
2013526844.tif 000011
【０１８７】
12.1.4 CPOホモローグの同定に関連する方法
シークェンシングは、N.タバクムPM132品種およびN.タバクムPO2品種由来のgDNAの増幅によって得られたオーバーラップPCRフラグメントで以下のプライマーを用いて実施される：
表4： N.タバクムPM132品種およびN.タバクムPO2品種由来gDNAを得るためにPCRで用いられるプライマー
2013526844.tif 000012
【０１８８】
N.タバクムPM132 cDNAライブラリーのスクリーニング：ゲノムCPO配列に一致するcDNAは得られず、ゲノムCPOは実際には偽遺伝子であることが示唆された。FABIJIまたは前記と高度に同一であるものおよびCAC80702.1と一致するcDNAは得られた。
【０１８９】
表5：N.タバクムPM132から単離したゲノムDNAおよびcDNAライブラリーでのPCRにより、N.タバクムHicks Broadleaf BACライブラリーで同定されたGnTIクローンの要旨
2013526844.tif 000013
ヌクレオチド配列は、以下のプライマーを用いてPM132（その種子は受託番号NCIMB 41802で寄託された）およびN.タバクムPO2品種のgDNAの増幅によって得られたオーバーラップPCRフラグメントのシークェンシングによって確認される：
表6：N.タバクムPM132およびN.タバクムPO2品種からgDNAを得るためにPCRで用いられるプライマー
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配列番号：259：CPO遺伝子由来gDNA
【０１９０】
2013526844.tif 000015
【０１９１】
2013526844.tif 000016
【０１９２】
2013526844.tif 000017
【０１９３】
配列番号：260：CPO遺伝子由来の予想されるコード領域
【０１９４】
2013526844.tif 000018
【０１９５】
配列番号：261：CPO遺伝子によってコードされる推定的タンパク質
【０１９６】
2013526844.tif 000019
【０１９７】
12.1.5 N.タバクムPM132および他のGnTI配列におけるCAC80702.1ホモローグの同定に関連する方法
実施例1に記載したN.タバクムHicks Broadleaf BACライブラリーをCAC80702と相同な配列を有するクローンについてスクリーニングする。BACクローンは全く同定されなかった。GnTI配列と相同性を有するN.タバクムPM132のさらに別のヌクレオチド配列が同定され、下記に開示される。
N.タバクムPM132の同定された個々のGnTI配列変種は以下のとおりである：
配列番号：262：N.タバクムPM132 CAC80702.1ホモローグ
【０１９８】
2013526844.tif 000020
【０１９９】
配列番号：263：コードN.タバクムPM132 CAC80702.1ホモローグ
【０２００】
2013526844.tif 000021
【０２０１】
配列番号：264：N.タバクムPM132 CAC80702.1ホモローグによってコードされる推定的タンパク質
【０２０２】
2013526844.tif 000022
【０２０３】
配列番号：265：Contig 1#5
【０２０４】
2013526844.tif 000023
【０２０５】
配列番号：266：コードContig 1#5
【０２０６】
2013526844.tif 000024
【０２０７】
配列番号：267：Contig 1#5によってコードされる推定的タンパク質
【０２０８】
2013526844.tif 000025
【０２０９】
配列番号：268：Contig 1#8
【０２１０】
2013526844.tif 000026
【０２１１】
配列番号：269：コードContig 1#8
【０２１２】
2013526844.tif 000027
【０２１３】
配列番号：270：Contig 1#8によってコードされる推定的タンパク質
【０２１４】
2013526844.tif 000028
【０２１５】
配列番号：271：Contig 1#9
【０２１６】
2013526844.tif 000029
【０２１７】
配列番号：272：コードContig 1#9
【０２１８】
2013526844.tif 000030
【０２１９】
配列番号：273：Contig 1#9によってコードされる推定的タンパク質
【０２２０】
2013526844.tif 000031
【０２２１】
配列番号：274：T10 702
【０２２２】
2013526844.tif 000032
【０２２３】
配列番号：275：コードT10 702
【０２２４】
2013526844.tif 000033
【０２２５】
配列番号：276：T10 702によってコードされる推定的タンパク質
【０２２６】
2013526844.tif 000034
【０２２７】
配列番号：277：Contig 1#6
【０２２８】
2013526844.tif 000035
【０２２９】
配列番号：278：コードContig 1#6
【０２３０】
2013526844.tif 000036
【０２３１】
配列番号：279：Contig 1#6によってコードされる推定的タンパク質
【０２３２】
2013526844.tif 000037
【０２３３】
配列番号：280：Contig 1#2
【０２３４】
2013526844.tif 000038
【０２３５】
配列番号：281：コードContig 1#2
【０２３６】
2013526844.tif 000039
【０２３７】
配列番号：282：Contig 1#2によってコードされる推定的タンパク質
【０２３８】
2013526844.tif 000040
【０２３９】
*適切な場合には、上記配列番号においてコード配列には下線が付され、開始および終止コドンは太字で示される。
これまで本発明を詳細にかつ上述のように説明してきたが、そのような説明は例証および例示であって限定的なものではない。変更および改変は以下の特許請求の範囲内で当業者が為し得るものであることは理解されよう。多様な刊行物および特許が本明細書を通して引用されている。それら刊行物および特許の各々の開示内容は参照によりその全体が本明細書に含まれる・
【０２４０】
寄託：以下の種子サンプルは、ブダペスト条約の規定の下に、フィリップ・モリス・プロダクツ社（Philip Morris Products S.A.）の名義でNCIMB（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland, UK）に2011年1月6日に寄託された。
2013526844.tif 000041
【配列表】
2013526844000001.app
【国際調査報告】
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