(57)【要約】  本明細書に記載の本発明は、葉酸を標的にするEC145結合体を調製するための改善されたプロセスと、この改善されたプロセスを用いて調製されるEC145結合体ならびに、この改善されたプロセスを用いて調製されるEC145結合体を含む薬学的組成物に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
2013526577.tif 000043
で表される化合物を、式
2013526577.tif 000044
（式中、Ｘは、ｐＨ８未満のバッファーの存在下、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールチオまたはヘテロアリールチオである）で表される化合物で処理する工程を含む、EC145を調製するためのプロセス。
【請求項２】
Ｘは、２−チオピリジニルまたは３−ニトロ−２−チオピリジニルである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
Ｘは、２−チオピリジニルである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記バッファーは、ｐＨが５．９〜６．３である、請求項１〜３のいずれかに記載のプロセス。
【請求項５】
前記バッファーは、ｐＨが５．９〜６．１である、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記バッファーは、リン酸バッファーである、請求項１〜５のいずれかに記載のプロセス。
【請求項７】
前記バッファーは、リン酸ナトリウムバッファーである、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
ｐＨ５．９〜６．３のリン酸ナトリウムバッファーの存在下、式
2013526577.tif 000045
で表される化合物を、式
2013526577.tif 000046
で表される化合物で処理する工程を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
アセトニトリルを含む溶液で前記処理を実施する、請求項１〜８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１０】
デスアセチルビンブラスチンヒドラジドを、前記式Ｙ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｘ（式中、Ｙは脱離基である）で表されるアシル化剤またはその酸付加塩で処理し、式
2013526577.tif 000047
で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、
前記式
2013526577.tif 000048
で表される化合物を、前記式
2013526577.tif 000049
で表される化合物を単離せずに、前記反応混合物で直接処理する工程と、をさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１１】
前記アシル化剤は、前記式
2013526577.tif 000050
で表されるアシル化剤またはその酸付加塩である、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記アシル化剤は、前記式
2013526577.tif 000051
で表され、酸付加塩の形態で導入される、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記アシル化剤は、前記式
2013526577.tif 000052
で表され、遊離塩基の形態で導入される、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１４】
アセトニトリルを含む溶媒中で、前記デスアセチルビンブラスチンヒドラジドが前記アシル化剤で処理される、請求項１０〜１３のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１５】
前記デスアセチルビンブラスチンヒドラジドは、高度に精製された形態で提供される、請求項１０〜１４のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１６】
デスアセチルビンブラスチンヒドラジドをアシル化剤で処理し、前記式
2013526577.tif 000053
で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、EC119を前記反応混合物で処理する工程とが、同一の反応容器で実施される、請求項１０〜１５のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１７】
EC145を含有する前記反応混合物を、クエン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液で希釈し、精製用のポリスチレン−ジビニルベンゼンポリマー樹脂カラムまたはカートリッジに通す工程をさらに含む、請求項１〜１６のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１８】
アセトニトリルとクエン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液とを含む移動相を用いて、前記EC145生成物を前記カラムまたはカートリッジから溶出する工程をさらに含む、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１９】
EC145を精製生成物として水溶液で得るために限外濾過を使用する工程をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２０】
どの工程で用いる水にも約０．９パーツパーミリオン（ｐｐｍ）を超えない濃度で溶存酸素が含まれる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載のプロセスによって調製される、EC145結合体。
【請求項２２】
式
2013526577.tif 000054
で表される化合物を、式
2013526577.tif 000055
（式中、Ｘは、バッファーの存在下、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールチオまたはヘテロアリールチオであり、前記バッファーは、ｐＨが５．９〜６．３である）で表される化合物で処理する工程を含むプロセスによって調製される、EC145結合体。
【請求項２３】
Ｘは、２−チオピリジニルである、請求項２２に記載の結合体。
【請求項２４】
前記プロセスが、
デスアセチルビンブラスチンヒドラジドを、式Ｙ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｘ（式中、Ｙは脱離基である）で表されるアシル化剤またはその酸付加塩で処理し、前記式
2013526577.tif 000056
で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、前記式
2013526577.tif 000057
で表される化合物を、前記式
2013526577.tif 000058
で表される化合物を単離せずに、前記反応混合物で直接処理する工程と、をさらに含む、請求項２２または２３に記載の結合体。
【請求項２５】
前記アシル化剤は、前記式
2013526577.tif 000059
で表され、前記遊離塩基の形態で導入される、請求項２４に記載の結合体。
【請求項２６】
請求項２１〜２５のいずれかに記載した前記EC145結合体を、希釈剤、賦形剤またはキャリアと一緒に含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載の本発明は、葉酸を標的にするEC145結合体を調製するための改善されたプロセスと、この改善されたプロセスを用いて調製されるEC145結合体ならびに、この改善されたプロセスを用いて調製されるEC145結合体を含む薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
葉酸を標的にする医薬品が開発され、癌治療薬としての臨床試験がおこなわれている。EC145は、葉酸に結合する非常に強力なビンカアルカノイド細胞障害性化合物である、デスアセチルビンブラスチンヒドラジド（DAVLBH）を含む。EC145分子は、非小細胞肺癌（NSCLC）、卵巣癌、子宮内膜癌、腎癌など（卵管癌および原発性腹膜癌を含む）の上皮性腫瘍の表面に高レベルで見られる葉酸受容体を標的にする。EC145は、葉酸受容体を発現する腫瘍に結合し、正常組織を避けて癌細胞に直接ビンカ部分を送達すると考えられている。それがゆえに、結合時、EC145はエンドサイトーシスによって癌細胞に侵入し、DAVLBHを放出し、細胞死を引き起こすか細胞の機能を阻害する。EC145は、式
2013526577.tif 000002
で表され、ケミカルアブストラクツの登録番号７４２０９２−０３−１の物質である。本明細書で使用する場合、文脈に応じて、EC145という用語は、化合物またはその薬学的に許容される塩を意味する。この化合物は、イオン化した形態（プロトン化した形態を含む）の懸濁液、溶液または固体で存在してもよい。
【０００３】
EC145は、米国特許第７，６０１，３３２号および国際特許出願公開第ＷＯ２００７／０２２４９３号に開示されており、その特定の用途と、静脈内投与用の液性でｐＨ７．４のリン酸緩衝調製物が、ＷＯ２０１１／０１４８２１号に開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
米国特許第７，６０１，３３２号およびＷＯ２００７／０２２４９３号に開示された、EC145を調製するための手順は、EC145を最大数十ミリグラムなどの実験室規模で調製するのには適しているが、規模を大きくすると問題が生じることがある。
【０００５】
同公報に開示された手順では、式
2013526577.tif 000003
で表されるチオール（EC119として知られる）を用いて、チオスルホネート活性化またはピリジルジチオ活性化されたビンブラスチン中間体との間でジスルフィド結合を形成することで、EC145を調製する。たとえば、ジクロロメタン（DCM）にて、式
2013526577.tif 000004
で表されるカルバモイルジスルフィド中間体（CDSI）を調製した後、シリカゲルクロマトグラフィで単離した。その後、CDSIをテトラヒドロフラン（THF）に溶解させ、これをEC119の水溶液に加え、この溶液のｐＨを炭酸水素ナトリウムで調整して、EC119を可溶化した。反応終了時、少量の混合物（５〜１０ｍＬ）であれば、ロータリーエバポレータを用いてTHFを除去することができた。ただし、真空下で泡が出る操作には、規模が大きくなるとうまくいかないという問題があった。したがって、反応が終了したら混合物を水で希釈し、凍らせて、凍結乾燥させた。この粗固体を水に溶解させ、逆相クロマトグラフィで精製した。EC145のピークエリアが９０％を超えるクロマトグラフィの画分を合わせ、水で希釈し、凍結乾燥させた。典型的には、精製後の収率は３０〜４０％の範囲で、純度は９０〜９３％の範囲であった。凍結乾燥に伴う容積では、調製物がグラム単位を超える量になると、扱いが非常に難しくなった。
【０００６】
さらに、規模を大きくすると、ジスルフィド結合の形成時に遊離するメルカプトピリジンによる反応混合物の反応が進む際に、EC145の一部が分解されることがわかった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この分解は抑制可能であることがわかり、それが本発明の一態様を提供するものである。よって、一実施形態として、式
2013526577.tif 000005
で表される化合物を、式
2013526577.tif 000006
（式中、Ｘは、ｐＨ８未満のバッファーの存在下、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールチオまたはヘテロアリールチオである）で表される化合物で処理する工程を含む、EC145を調製するためのプロセスが提供される。このプロセスの一実施形態では、Ｘは、２−チオピリジニルまたは３−ニトロ−２−チオピリジニルである。このプロセスの一実施形態では、Ｘは、２−チオピリジニルである。
【０００８】
上記のいずれについても、一実施形態では、バッファーは、ｐＨが約７未満である。もうひとつの実施形態では、バッファーは、ｐＨが６．５未満である。もうひとつの実施形態では、バッファーは、ｐＨが５．９〜６．３である。もうひとつの実施形態では、バッファーは、ｐＨが５．９〜６．１である。
【０００９】
上記のいずれについても、一実施形態では、バッファーは、リン酸バッファーである。もうひとつの実施形態では、バッファーは、リン酸ナトリウムバッファーである。本明細書で開示するように、バッファーを用いると、炭酸水素ナトリウムを使用する場合よりも、ｐＨと分解の問題を制御しやすくなる。
【００１０】
上記のプロセスのもうひとつの実施形態は、ｐＨ５．９〜６．３のリン酸ナトリウムバッファーの存在下、式
2013526577.tif 000007
の化合物を式
2013526577.tif 000008
の化合物で処理する工程を含む。
【００１１】
上記のいずれについても、一実施形態は、アセトニトリルを含む溶液で処理を実施する、プロセスである。
【００１２】
上記のいずれについても、別の態様は、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドを、式Ｙ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｘ（式中、Ｙは脱離基である）で表されるアシル化剤またはその酸付加塩で処理し、式
2013526577.tif 000009
で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、
式
2013526577.tif 000010
で表される化合物を、式
2013526577.tif 000011
で表される化合物を単離せずに、当該反応混合物で直接処理する工程と、をさらに含む、プロセスである。脱離基Ｙは、ヒドラジドのアシル化に適した多数の脱離基のうちのいずれであってもよい。一実施形態では、Ｙは、カルボン酸との間または炭酸のモノエステルとの間で活性エステルを形成するアルコールの残基、たとえば４−ニトロフェノキシ残基、１−ベンゾトリアゾールイルオキシ残基または７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ残基である。一実施形態では、アシル化剤は、式
2013526577.tif 000012
で表されるアシル化剤またはその酸付加塩である。もうひとつの実施形態では、アシル化剤は、式
2013526577.tif 000013
で表され、酸付加塩の形態で導入される。アシル化剤を酸付加塩の形で導入する場合、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの塩基を用いて、これを遊離状態にする。もうひとつの実施形態では、アシル化剤は、式
2013526577.tif 000014
で表され、遊離塩基の形で導入される。
【００１３】
上記のいずれについても、一実施形態は、アセトニトリルを含む溶媒中で、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドがアシル化剤で処理されるプロセスである。
【００１４】
上記のいずれについても、一実施形態は、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドが高度に精製された形態で提供されるプロセスである。後述の実施例で説明するように、酢酸エチルおよびトルエンからの溶解／沈殿（結晶化と記載）を伴う手順を用いて、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドを高度に精製された固体として得るようにしてもよい。
【００１５】
上記のいずれについても、一実施形態は、EC119が高度に精製された形態で提供されるプロセスである。EC119は、Fmocを用いる固相法で合成される。まず、ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）の存在下、２−クロロトリチルクロリド樹脂とのエステル化によって、Fmoc-Cys(Trt)-OHを樹脂に結合させる。次に、０．１ＭのHOBtをジメチルホルムアミド（DMF）に加えた溶液で、この樹脂を６％ピペラジンで処理することによって、樹脂結合Cys(Trt)のFmoc保護基を除去する。この樹脂を、DMF、メチルｔ−ブチルエーテル（MTBE）で洗浄する。Fmoc-Asp(OtBu)-OHをＮ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）およびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）で樹脂に結合させる。このカップリング反応を、カイザーテストで監視する。以下、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Glu-OtBuを用いて、脱保護とカップリングとを繰り返す。N10-TFA-Pte-OHのカップリングでは、１．２当量のN10-TFA-Pte、１．２当量のPyBOP、１．２当量のHOBt、２．４当量のDIPEAを用いる。トリフルオロアセチル基を、DMFにて２％ヒドラジンで除去する。約８５％のトリフルオロ酢酸、１０％のエタンジチオール、２．５％のトリイソプロピルシラン、２．５％の脱イオン水を含有する切断試薬を用いて、ペプチドを樹脂から切断する。この反応では、t-Bu、Pbfとトリチル保護基も同時に除去される。この粗生成物をMTBEで沈殿させ、濾過して単離する。粗EC119の純度は約９０％である。調製については、実施例でさらに詳細に説明する。
【００１６】
上記のいずれについても、一実施形態は、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドをアシル化剤で処理し、式
2013526577.tif 000015
で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、EC119を当該反応混合物で処理する工程とが、同一の反応容器で実施されるプロセスである。
【００１７】
上記のいずれについても、一実施形態は、EC145を含有する反応混合物を、クエン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液で希釈し、精製用のポリスチレン−ジビニルベンゼンポリマー樹脂カラムまたはカートリッジに通す工程をさらに含む、プロセスである。このプロセスは、希釈と添加という一連の作業を可能にするものである。このような希釈と添加による手法では、反応混合物を緩衝食塩水で希釈し（希釈溶液用にアセトニトリル含有量１０％を目標にする）、この溶液をクロマトグラフィのカラムに通す必要がある。これによって、一連の限外濾過作業が必要なくなり、処理時間を約１２〜２４時間節約できる。もうひとつの実施形態は、アセトニトリルとクエン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液とを含む移動相を用いて、EC145生成物をカラムまたはカートリッジから溶出する工程をさらに含む。緩衝食塩水の移動相を用いると、クロマトグラフィの過程がいくつかの側面で改善される。まず、緩衝食塩水の移動相のイオン強度が高まることで、移動相と固定相とに生成物を分けることへの影響がおよぶ。固定相に対する生成物の親和性は、粗EC145に対するカラムのキャパシティが２倍を上回るほど高くなる。固定相の親和性が増すと、粗EC145をカラムに加えている間に生成物の漏れ（添加作業の際にカラムを流れる生成物の一部）が発生しなくなる。また、イオン強度が高くなると、クロマトグラフィのプロセスでの時間的動態が改善され、クロマグラフィで得られるピークの形状が、ガウシアン曲線に近似して画分のカットポイントを一層簡単に同定できるものになる。さらに、移動相に塩化ナトリウムを用いることで、保持容量と生成物の溶出領域が再現可能になる。
【００１８】
上記のいずれについても、一実施形態は、EC145を精製生成物として水溶液で得るために限外濾過を使用する工程をさらに含む、プロセスである。このプロセスを用いると、大規模な凍結乾燥に付随する時間的な損失と生成物の純度の損失（約１％）が生じることがない。また、このプロセスでは、０．２ミクロンのアブソリュートフィルターで濾過する別の実施形態に適した条件で、精製生成物が水溶液で提供される。この濾過は、濾過をしないプロセスよりも微生物数とエンドトキシン濃度を低減するものである。
【００１９】
本明細書のいずれかの実施形態に記載したようなプロセスに伴う潜在的な問題のひとつに、酸素によるEC145の分解がある。上記のいずれについても、一実施形態は、どの工程で用いる水にも約０．９パーツパーミリオン（ｐｐｍ）を超えない濃度で溶存酸素が含まれる、プロセスである。
【００２０】
本発明の一態様として、本明細書にて上述したプロセスによって調製される結合体EC145が、一実施形態として提供される。一実施形態は、式
2013526577.tif 000016
で表される化合物を、式
2013526577.tif 000017
（式中、Ｘは、バッファーの存在下、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールチオまたはヘテロアリールチオであり、このバッファーは、ｐＨが５．９〜６．３である）で表される化合物で処理する工程を含むプロセスによって調製される、EC145結合体である。上記の一実施形態では、Ｘは、２−チオピリジニルである。上記の結合体の別の実施形態では、このプロセスは、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドを、式Ｙ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｘ（式中、Ｙは脱離基である）で表されるアシル化剤またはその酸付加塩で処理し、式
2013526577.tif 000018
で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、
式
2013526577.tif 000019
で表される化合物を、式
2013526577.tif 000020
で表される化合物を単離せずに、当該反応混合物で直接処理する工程と、をさらに含む。
【００２１】
上記の別の実施形態は、アシル化剤が式
2013526577.tif 000021
で表され、遊離塩基の形態で導入される、結合体２４である。
【００２２】
本発明の一態様として、上述の実施形態のいずれかに記載した上記のEC145結合体を、希釈剤、賦形剤またはキャリアと一緒に含む薬学的組成物が、一実施形態として提供される。
【００２３】
＜関連出願へのクロスリファレンス＞
本出願は、２０１０年５月１９日にファイルされた米国仮特許出願第６１／３４６，４４４号および２０１０年６月３日にファイルされた同第６１／３５１，０２２号の優先権の利益を主張するものであり、それぞれを本明細書に援用する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
本発明の実施形態について、以下に列挙する項によってさらに説明する。  
１．  式
2013526577.tif 000022
で表される化合物を、式
2013526577.tif 000023
（式中、Ｘは、ｐＨ８未満のバッファーの存在下、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールチオまたはヘテロアリールチオである）で表される化合物で処理する工程を含む、EC145を調製するためのプロセス。
【００２５】
２．  Ｘは、２−チオピリジニルまたは３−ニトロ−２−チオピリジニルである、第１項に記載のプロセス。
【００２６】
３．  Ｘは、２−チオピリジニルである、第１項に記載のプロセス。
【００２７】
３．１  バッファーは、ｐＨが約７未満である、第１項〜第３項のいずれかに記載のプロセス。
【００２８】
３．２  バッファーは、ｐＨが６．５未満である、第１項〜第３項のいずれかに記載のプロセス。
【００２９】
４．  バッファーは、ｐＨが５．９〜６．３である、第１項〜第３項のいずれかに記載のプロセス。
【００３０】
５．  バッファーは、ｐＨが５．９〜６．１である、第４項に記載のプロセス。
【００３１】
６．  バッファーは、リン酸バッファーである、第１項〜第５項に記載のプロセス。
【００３２】
７．  バッファーは、リン酸ナトリウムバッファーである、第６項に記載のプロセス。
【００３３】
８．  ｐＨ５．９〜６．３のリン酸ナトリウムバッファーの存在下、式
2013526577.tif 000024
で表される化合物を、式
2013526577.tif 000025
で表される化合物で処理する工程を含む、第１項に記載のプロセス。
【００３４】
９．  アセトニトリルを含む溶液で処理を実施する、第１項〜第８項のいずれかに記載のプロセス。
【００３５】
１０．  デスアセチルビンブラスチンヒドラジドを、式Ｙ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｘ（式中、Ｙは脱離基である）で表されるアシル化剤またはその酸付加塩で処理し、式
2013526577.tif 000026
で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、
式
2013526577.tif 000027
で表される化合物を、式
2013526577.tif 000028
で表される化合物を単離せずに、当該反応混合物で直接処理する工程と、をさらに含む、第１項〜第９項のいずれかに記載のプロセス。
【００３６】
１０．１  Ｙは、カルボン酸との間または炭酸のモノエステルとの間で活性エステルを形成するアルコールの残基である、第１０項に記載のプロセス。
【００３７】
１０．２  Ｙは、４−ニトロフェノキシ残基、１−ベンゾトリアゾールイルオキシ残基または７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ残基である、第１０項に記載のプロセス。
【００３８】
１１．  アシル化剤は、式
2013526577.tif 000029
で表されるアシル化剤またはその酸付加塩である、第１０項に記載のプロセス。
【００３９】
１２．  アシル化剤は、式
2013526577.tif 000030
で表され、酸付加塩の形態で導入される、第１１項に記載のプロセス。
【００４０】
１３．  アシル化剤は、式
2013526577.tif 000031
で表され、遊離塩基の形態で導入される、第１１項に記載のプロセス。
【００４１】
１４．  アセトニトリルを含む溶媒中で、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドがアシル化剤で処理される、第１０項〜第１３項のいずれかに記載のプロセス。
【００４２】
１５．  デスアセチルビンブラスチンヒドラジドは、高度に精製された形態で提供される、第１０項〜第１４項のいずれかに記載のプロセス。
【００４３】
１６．  デスアセチルビンブラスチンヒドラジドをアシル化剤で処理し、式
2013526577.tif 000032
で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、EC119を当該反応混合物で処理する工程とが、同一の反応容器で実施される、第１０項〜第１５項のいずれかに記載のプロセス。
【００４４】
１７．  EC145を含有する反応混合物を、クエン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液で希釈し、精製用のポリスチレン−ジビニルベンゼンポリマー樹脂カラムまたはカートリッジに通す工程をさらに含む、第１項〜第１６項のいずれかに記載のプロセス。
【００４５】
１８．  アセトニトリルとクエン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液とを含む移動相を用いて、EC145生成物をカラムまたはカートリッジから溶出する工程をさらに含む、第１７項に記載のプロセス。
【００４６】
１９．  EC145を精製生成物として水溶液で得るために限外濾過を使用する工程をさらに含む、第１項〜第１８項のいずれか１項に記載のプロセス。
【００４７】
２０．  どの工程で用いる水にも約０．９パーツパーミリオン（ｐｐｍ）を超えない濃度で溶存酸素が含まれる、第１項〜第１９項のいずれか１項に記載のプロセス。
【００４８】
２１．  第１項〜第２０項のいずれかに記載のプロセスによって調製される、EC145結合体。
【００４９】
２２．  式
2013526577.tif 000033
で表される化合物を、式
2013526577.tif 000034
（式中、Ｘは、バッファーの存在下、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールチオまたはヘテロアリールチオであり、このバッファーは、ｐＨが５．９〜６．３である）で表される化合物で処理する工程を含むプロセスによって調製される、EC145結合体。
【００５０】
２３．  Ｘは、２−チオピリジニルである、第２２項に記載の結合体。
【００５１】
２４．  上記のプロセスが、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドを、式Ｙ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｘ（式中、Ｙは脱離基である）で表されるアシル化剤またはその酸付加塩で処理し、式
2013526577.tif 000035
で表される化合物を含む反応混合物を形成する工程と、式
2013526577.tif 000036
で表される化合物を、式
2013526577.tif 000037
で表される化合物を単離せずに、当該反応混合物で直接処理する工程と、をさらに含む、第２２項または第２３項に記載の結合体。
【００５２】
２５．  アシル化剤は、式
2013526577.tif 000038
で表され、遊離塩基の形態で導入される、第２４項に記載の結合体。
【００５３】
２６．  第２１項〜第２５項のいずれかに記載した上記のEC145結合体を、希釈剤、賦形剤またはキャリアと一緒に含む、薬学的組成物。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「アルキル」という用語は、任意に分枝状または環状で、任意に置換され、あるいは、ヘテロアルキルとして酸素、硫黄または窒素原子を含むものであってもよい、炭素原子の鎖を含む。また、特定の実施形態では、アルキルは、Ｃ１〜Ｃ６およびＣ１〜Ｃ４など、長さが都合よく限定されている旨も理解できよう。例示としてのアルキル基として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロヘキシルなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「アリール」という用語は、単環および多環の芳香族炭素環基を含み、それぞれ任意に置換されていてもよい。本明細書に記載の例示としての芳香族炭素環基は、フェニル、ナフチルなどであるが、これらに限定されるものではない。本明細書で使用する場合、「ヘテロアリール」という用語は、芳香族複素環基を含み、それぞれ任意に置換されていてもよい。例示としての芳香族複素環基として、２−ピリジニル、３−ニトロ−２−ピリジニルなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
「任意に置換された」という表現は、本明細書で使用する場合、水素原子が任意に置換されたラジカルの他の官能基に代わる置換を含む。このような他の官能基としては、例示的に、ハロ、ニトロなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
本明細書に記載するような薬学的組成物は、EC145の非経口投与に適するようにした薬学的組成物を意味する。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態をさらに例示するものである。しかしながら、以下の例示的な実施例は、いかなる形にも本発明を限定するものとは解釈されるべきものではない。溶媒、試薬、保護基などに対して一般に用いられる略号を、本明細書でも使用する。カルバモイルジスルフィド中間体（carbamoyl disulfide intermediate）（４）に対しては、CDSIという表記を使用する。
【００５９】
実施例で分画と試料の評価に用いるHPLC法には、以下のものを含む。  
EC145-CMC-IP-0001
試料調製物：８ＭのグアニジンＨＣｌを用いて約０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した希釈物質
カラム：Waters XBridge BEH C18、３．５μｍ、２．１×１００ｍｍ
移動相：Ａ）５００ｍＭの炭酸水素アンモニウム、ｐＨ９．２；Ｂ）７５：２５アセトニトリル−メタノール．
注入容量：１０μＬ
ＵＶ検出：２８０ｎｍ
カラム温度：５０℃
試料温度５℃
勾配:        時間(分)      流速(mL/分)            %A          %B
0.0            0.55                  95            5
0.5            0.55                  95            5
1.0            0.55                  80            20
5.0            0.55                  73.5          26.5
21.0          0.55                    71.5        28.5
27.0          0.55                    70          30
29.0          0.55                    55          45
30.0          0.55                    30          70
33.0          0.55                    30          70
33.1          0.75                    95          5
40.0          0.75                    95          5
【００６０】
EC145-CMC-AM-0001（バージョン２．３）
試料調製物：リン酸緩衝食塩水または１：１アセトニトリル水（v/v）を用いて約１ｍｇ／ｍＬまで希釈した希釈物質
カラム：Waters Symmetry C18、３．５μｍ、４．６×７５ｍｍ
移動相：Ａ）１０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７．５；Ｂ）アセトニトリル
注入容量：１０μＬ
ＵＶ検出：２８０ｎｍ
カラム温度：２５℃
試料温度５℃
勾配:        時間(分)      流速(mL/分)            %A            %B
0.0          1.0                  85              15
20.0          1.0                  50              50
25.0          1.0                  20              80
30.0          1.0                  20              80
31.0          1.0                  85              15
41.0          1.0                  85              15
【００６１】
実施例１
EC119の調製
2013526577.tif 000039
Fmocを用いる固相法で、以下のようにしてEC119を合成する。
【００６２】
１回目のカップリング
２−クロロトリチルクロリド樹脂をペプチド合成容器に加える。DMFで膨潤させる（樹脂１０ｍＬ／ｇ）。DMFで２回洗浄する（樹脂１０ｍＬ／ｇ）。０．８当量のFmoc-Cys(Trt)-OHのDCM／DMF溶液を加える。２当量のDIPEAを加える。３０分間攪拌する。メタノール（樹脂１ｇあたり１ｍＬ）を加え、１０分間攪拌する。DMFで３回洗浄する。MTBEで３回洗浄する。DMFで３回洗浄する。６％ピペラジンを０．１Ｍ  HOBtのDMF溶液に加え、１０〜２０分間攪拌する。６％ピペラジンを０．１Ｍ  HOBtのDMF溶液に加え、１０〜２０分間攪拌する。DMFで３回洗浄する。MTBEで３回洗浄する。カイザーテストを実施して、カップリングが終了していることを確認する。
【００６３】
２回目のカップリング
DMFで３回洗浄する（樹脂１０ｍＬ／ｇ）。２当量のFmoc-Asp(OtBu)-OHのDMF溶液を加える。２当量のHOBtのDMF溶液を加える。２当量のDICを加える。１．５〜３時間攪拌する。カイザーテストでカップリングを確認する。MTBEで２回洗浄する。DMFで２回洗浄する。６％ピペラジンを０．１Ｍ  HOBtのDMF溶液に加え、１０〜２０分間攪拌する。６％ピペラジンを０．１Ｍ  HOBtのDMF溶液に加え、１０〜２０分間攪拌する。DMFで３回洗浄する。MTBEで３回洗浄する。カイザーテストを実施する。
【００６４】
３回目のカップリング
DMFで３回洗浄する。２当量のFmoc-Asp(OtBu)-OHのDMF溶液を加える。２当量のHOBtのDMF溶液を加える。２当量のDICを加える。１．５〜３時間攪拌する。カイザーテストでカップリングを確認する。MTBEで２回洗浄する。DMFで２回洗浄する。６％ピペラジンを０．１Ｍ  HOBtのDMF溶液に加え、１０〜２０分間攪拌する。６％ピペラジンを０．１Ｍ  HOBtのDMF溶液に加え、１０〜２０分間攪拌する。DMFで３回洗浄する。MTBEで３回洗浄する。カイザーテストを実施する。
【００６５】
４回目のカップリング
DMFで洗浄する。２当量のFmoc-Arg(Pbf)-OHのDMF溶液を加える。２当量のHOBtのDMF溶液を加える。２当量のDICを加える。１．５〜３時間攪拌する。カイザーテストでカップリングを確認する。MTBEで２回洗浄する。DMFで２回洗浄する。６％ピペラジンを０．１Ｍ  HOBtのDMF溶液に加え、１０〜２０分間攪拌する。６％ピペラジンを０．１Ｍ  HOBtのDMF溶液に加え、１０〜２０分間攪拌する。DMFで３回洗浄する。MTBEで３回洗浄する。カイザーテストを実施する。
【００６６】
５回目のカップリング
DMFで３回洗浄する。２当量のFmoc-Asp(OtBu)-OHのDMF溶液を加える。２当量のHOBtのDMF溶液を加える。２当量のDICを加える。１．５〜３時間攪拌する。カイザーテストでカップリングを確認する。MTBEで２回洗浄する。DMFで２回洗浄する。６％ピペラジンを０．１Ｍ  HOBtのDMF溶液に加え、１０〜２０分間攪拌する。６％ピペラジンを０．１Ｍ  HOBtのDMF溶液に加え、１０〜２０分間攪拌する。DMFで３回洗浄する。MTBEで３回洗浄する。カイザーテストを実施する。
【００６７】
６回目のカップリング
DMFで３回洗浄する。２当量のFmoc-Glu-OtBuのDMF溶液を加える。２当量のHOBtのDMF溶液を加える。２当量のDICを加える。カイザーテストでカップリングを確認する。MTBEで２回洗浄する。DMFで２回洗浄する。６％ピペラジンを０．１Ｍ  HOBtのDMF溶液に加え、１０〜２０分間攪拌する。６％ピペラジンを０．１Ｍ  HOBtのDMF溶液に加え、１０〜２０分間攪拌する。DMFで３回洗浄する。MTBEで３回洗浄する。カイザーテストを実施する。
【００６８】
７回目のカップリング
DMFで３回洗浄する。１．２当量のN10-TFA-Pte-OHを最小量のＤＭＳＯに入れた溶液を加える。１．２当量のHOBtのDMF溶液を加える。１．２当量のPyBOPのDMF溶液を加える。２．４当量のDIPEAを加える。３〜５時間攪拌する。カイザーテストでカップリングを確認する。DMFで２回洗浄する。MTBEで２回洗浄する。
【００６９】
脱保護−トリフルオロアセチル基の除去
DMFで２回洗浄する。２％ヒドラジンのDMF溶液を加え、５分間攪拌する。２％ヒドラジンのDMF溶液を加え、５分間攪拌する。２％ヒドラジンのDMF溶液を加え、５分間攪拌する。DMFで３回洗浄する。MTBEで３回洗浄する。樹脂を室温にて真空下で乾燥させる。
【００７０】
樹脂からの切断
８５％のTFA、２．５％のトリイソプロピルシラン、２．５％の水、１０％のエタンジチオールを含有する切断試薬（樹脂１０ｍＬ／ｇ）を、フラスコに入れる。混合物を氷槽で冷却する。樹脂を加えて、室温にて２〜３時間反応させる。これを濾過し、濾液を回収する。濾液を冷たいMTBEに加える（濾液１ｍＬあたりMTBEを１０ｍＬ）。０〜５℃で３０±１０分間攪拌する。沈殿した生成物を、多孔度が中程度ガラスフィルターで濾過する。沈殿物を冷たいMTBEで３回洗浄する。生成物を室温にて真空下で乾燥させる。窒素下、−２０℃で保管する。
【００７１】
精製
分取用HPLCで、逆相C18カラム（６インチのカラム、２．８ｋｇ、１０μｍ、１００Å）を使用して、粗EC119を精製する。移動相は、０．５％ＮＨ４ＯＡｃ（Ａ）と０．５％ＮＨ４ＯＡｃ／ＡＣＮ（１：４）（Ｂ）である。４０ｇの粗EC119を１〜５％TFAに溶解させ、１μｍのガラス製フィルターで濾過し、６インチのカラムに通す。画分を回収し、HPLC分析用に試料を得る。回収直後に窒素下で５０％ＡｃＯＨを用いて各画分のｐＨを３〜４に調整し、生成物を沈殿させる。沈殿した生成物を遠心し、０．１％ＡｃＯＨで洗浄し、さらに処理するまで２〜８℃で保管する。遠心操作時、容器を窒素で置換して酸化の可能性を抑える。プール基準は、純度で≧９８％、D-Arg4、D-Glu2、D-Asp3の異性体≦０．２５％、その他の不純物≦０．５％である。D-Asp5、D-Asp6、D-Cysの異性体は、Ｐｒｅｐ−HPLCでは除去できないため、合成段階で抑制しておく必要がある。プール基準を満たす物質を、できるだけすみやかに凍結乾燥させる（EC119溶液および湿った沈殿物は不安定である）。最終生成物の純度は９８％を超える。固相合成および精製を含めて、純粋なEC119の全体としての収率は、約４０％である。生成物を窒素下で茶色のガラス瓶に充填し、−２０℃で保管する。
【００７２】
実施例２
Ａ．  硫酸ビンブラスチンからデスアセチルビンブラスチンヒドラジドへの一般的な変換
2013526577.tif 000040
材料
硫酸ビンブラスチン：ＵＳＰ；ＦＷ＝９０９．０５ｇ／モル；メタノール：無水；ヒドラジン：無水；ＦＷ＝３２ｇ／ｍｏｌ；脱イオン水；酢酸エチル：LC/GC grade；トルエン：LC/GC grade；リン酸二水素ナトリウム：≧９９．０％；ＦＷ＝１２０ｇ／モル；リン酸水素ナトリウム：≧９９．０％；ＦＷ＝１４２ｇ／モル；塩化ナトリウム：reagent grade；ＦＷ＝５８．４ｇ／モル；硫酸ナトリウム：無水；５−ノルボルネン−２−カルボン酸
【００７３】
手順
反応、抽出作業、単離を窒素下またはアルゴン下で実施する。加圧濾過器を用いて硫酸ナトリウムを除去し、生成物を捕捉する。クエンチと洗浄に用いる塩化ナトリウム溶液に、溶存酸素濃度が０．９ｐｐｍ以下になるまで窒素またはアルゴンを通気する。  
硫酸ビンブラスチンと無水メタノールを、アルゴンでパージした反応器に投入する。５−ノルボルネン−２−カルボン酸と無水ヒドラジンを、反応器に加える。混合物を攪拌し、固体の溶解後、混合物を６０℃のあたりまで加熱する。HPLC分析によって、反応が終了したら、混合物を冷却し、クエンチし、酢酸エチルに抽出する。乾燥後、生成物を酢酸エチルおよびトルエンから結晶化する。固体を真空下で一晩、室温にて乾燥させる。  
緩衝ＮａＣｌに、１０．０ｇのＮａＣｌ、７．１０〜７．３０ｇのＮａＨ２ＰＯ４、４．４０〜４．６０ｇのＮａ２ＨＰＯ４、９０ｍＬの水を含有する。溶液にアルゴンまたは窒素を通気する（溶存酸素含有量＜０．９ｐｐｍ）。  
単離後の典型的な収率は、理論最大値の５０〜６０％である。
【００７４】
Ｂ．EC145のプロセスの工程２および３
2013526577.tif 000041
工程２および工程３のプロセス
材料
デスアセチルビンブラスチンヒドラジド：ＦＷ＝７６８．９ｇ／ｍｏｌ；２０．５ｇ、２６．７ｍｍｏｌ；混合炭酸塩（３）：ＦＷ＝３８４．９ｇ／ｍｏｌ；１０．７ｇ、２７．８ｍｍｏｌ；アセトニトリル：適量：トリエチルアミン：ＦＷ＝１０１．２ｇ／ｍｏｌ；２．６７ｇ、２６．４ｍｍｏｌ；Ｎａ２ＰＯ４・７Ｈ２Ｏ：４７．８４ｇ；EC119：２９．９ｇ  ２８．６ミリモル；０．５Ｎ  ＨＣｌ：適量；ＷＦＩ：適量
【００７５】
手順
このプロセスで用いる水はすべて、注射用水（ＷＦＩ）である点に注意されたい。
【００７６】
適当な容器をアルゴンでパージする。２０．５±０．３ｇのデスアセチルビンブラスチンヒドラジドを投入する。この投入量は、活性によって調節されている。すなわち、仮に活性が９０．０％であったとすると、投入量は２２．８ｇとなろう。１０．７±０．２ｇの混合炭酸塩を投入する（活性によって調節）。８００±３０ｍＬのアセトニトリルと、２．６７±０．１１ｇのトリエチルアミンを投入する。アルゴン下、１０〜１４℃で２０〜２８時間、混合する。HPLC用の試料を取得する（EC145-CMC-AM-0001、バージョン２．３）。想定した結果は、CDSIとヒドラジドの比が≧２５：１である。そうでない場合、アルゴン下、１０〜１４℃で２〜４時間混合を継続し、再び試料を取得する。
【００７７】
７８０〜８２０ｍＬの水に、溶存酸素濃度が０．９ｐｐｍ未満になるまでアルゴンを通気する。溶存酸素濃度を記録する。４７．８±０．５ｇのリン酸水素ナトリウム七水和物を脱酸素水に溶解させる。好適な容器に、２９．８±０．５ｇのEC119を加える（投入量は、活性によって調節されている）。リン酸ナトリウム溶液をEC119に加え、アルゴン下で攪拌する。溶液のｐＨを測定し、必要に応じて０．５ＮのＨＣｌでｐＨを５．８〜６．２に調整する。
【００７８】
緩衝EC119溶液を反応混合物に加える。アルゴン下、２０〜２５℃で６０〜７５分間、混合する。HPLC用の試料を取得する（EC145-CMC-AM-0001、バージョン２．３）。EC145とCDSIの比が≧２５：１である場合は、先に進む。そうでなければ、アルゴン下、２０〜２５℃で混合を継続し、再び試料を取得する。EC145とCDSIの比が≧２５：１であれば、先に進む。そうでなければ、さらに１ｇのEC119を加え、アルゴン下、２０〜２５℃で３０分間混合し、再び試料を取得する。
【００７９】
６．９Ｌ〜７．１Ｌの２５ｍＭリン酸バッファー、１８５〜１９５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２〜７．５を、溶存酸素濃度が０．９ｐｐｍ未満になるまでアルゴンを通気した水から調製する。このバッファーで反応混合物を希釈する。かすかな状態をこえた曇りが混合物に生じたら、この生成物の溶液を濾過する必要がある（Whatman Polycap TC75またはTC150、０．４５または１．０ミクロン）。この濾過は、生成物をBiotageカラムに通しながら実施してもよい。
【００８０】
液体クロマトグラフィによる精製
Biotage 150M、C18カートリッジを使用する。このサイズのカートリッジは、現在説明しているサイズの２倍の反応混合物を収容することができる。  
カラムの調製：
ａ．  カラムを、
ｉ．  アセトニトリル１２〜１３Ｌ
ｉｉ．  アセトニトリル８０％と水２０％（v/v）で１２〜１３Ｌ
ｉｉｉ．  アセトニトリル５０％と水５０％（v/v）で１２〜１３Ｌ
ｉｖ．  アセトニトリル１０％と水９０％（v/v）で１２〜１３Ｌ
でフラッシュする。
【００８１】
精製：
２５ｍＭのリン酸バッファー（１８５〜１９５ｍｍｏｌ）ＮａＣｌ、ｐＨ７．３〜７．５を調製する。  
バッファーに溶存酸素含有量が≦０．９ｐｐｍになるまでアルゴンを通気する。  
【００８２】
調製：１０％アセトニトリルの緩衝食塩水溶液（v/v）４１Ｌ；１６％アセトニトリルの緩衝食塩水溶液（v/v）１３Ｌ、２７％アセトニトリルの緩衝食塩水溶液（v/v）５２Ｌ  
移動相溶液の溶存酸素含有量を確認する。溶存酸素含有量が０．９ｐｐｍを超える場合、移動相に溶存酸素濃度が≦０．９ｐｐｍになるまでアルゴンまたは窒素を通気する。  
カラムを１０％アセトニトリル移動相２６〜２７Ｌでフラッシュする。  
生成物の溶液をカラムに通す。  
以下の一連の移動相を用いて、生成物を溶出する。  
ｉ．  １０％アセトニトリル移動相１３〜１４Ｌ
ｉｉ．  １６％アセトニトリル移動相１３Ｌ
ｉｉｉ．  ２７％アセトニトリル移動相５１〜５２Ｌ
注：インラインのＵＶ検出器が役に立つ。生成物は、２７％アセトニトリル移動相１５〜１９Ｌから開始して、溶出領域８〜１３Ｌで溶出される。
【００８３】
画分の評価
ｉ．  HPLC法EC145-CMC-IP-0001
ｉｉ．  通過画分＝≧９７．０％EC145および不純物なし≧０．８％
【００８４】
実施後のカラム処理：
カラムを１回だけ再利用することができる。カラムを２回目の実施に用いる場合、ｉｉ〜ｉｖを実施する。
ｉ．  カラムを１２〜１３Ｌの１：１アセトニトリル／水でフラッシュする
ｉｉ．  カラムを２０〜２２Ｌのアセトニトリルでフラッシュする
ｉｉｉ．  カラム調製工程ｉｉ〜ｉｖを繰り返す
【００８５】
限外濾過
適量の水に、溶存酸素濃度が０．９ｐｐｍ未満になるまでアルゴンまたは窒素を通気する。クロマトグラフィの通過画分を合わせ、等量の通気後の水で希釈する。Millipore社の再生セルロース膜を公称ＭＷカットオフ１０００（カタログ番号CDUF002LA）で用いて限外濾過装置をアセンブルし、９Ｌの脱酸素水ですすぐ。生成物溶液の限外濾過を開始する。背圧３０〜５０ｐｓｉを維持する。保持液容量が２〜３Ｌになるまで限外濾過を継続する。１１〜１２Ｌの脱酸素水を加える。保持液容量が２〜３Ｌになるまで限外濾過を継続する。１１〜１２Ｌの脱酸素水を加える。保持液容量が２〜３Ｌになるまで限外濾過を継続する。８〜１０Ｌの脱酸素水を加える。保持液容量が２Ｌになるまで限外濾過を継続する。限外濾過のエンドポイントについては、保持液の試料をＧＣと濃度で分析して判断しなければならない。仕様はEC145を１ミリグラムあたりアセトニトリル≦５０マイクログラムである。達成されていない場合、もう１サイクル限外濾過を実施する。
【００８６】
充填した物質が６〜１２ｍｇ／ｍＬになるように、API溶液の濃度を調整しなければならない。限外濾過の終了時、１リットルの水で装置をすすぐ。したがって、必要に応じて、限外濾過を継続するか、水を加える。生成物の溶液を限外濾過装置から排出したら、この限外濾過装置を１Ｌの脱酸素水ですすいで、生成物の溶液と合わせる。  
すすぎ液を生成物の溶液と合わせた後、この溶液を０．２ミクロンのアブソリュートフィルターで濾過しなければならず、この濾液を充填する（不活性気体中で実施）。  
単離した生成物の典型的な収率は、理論最大値の５０〜６０％である。
【００８７】
実施例３
EC145のプロセスの工程２および３
2013526577.tif 000042
工程２および工程３のプロセス
材料
デスアセチルビンブラスチンヒドラジド：ＦＷ＝７６８．９ｇ／ｍｏｌ；１．００ｇ、１．３０ｍｍｏｌ；混合炭酸塩（３）：ＦＷ＝３４８．４ｇ／ｍｏｌ；０．４４５ｇ、１．２８ｍｍｏｌ；アセトニトリル：適量：Ｎａ２ＰＯ４：１．１０ｇ；EC119：１．４６ｇ  １．４０ミリモル；０．５Ｎ  ＨＣｌ：適量；ＷＦＩ：適量
【００８８】
手順
このプロセスで用いる水はすべて、ＷＦＩである点に注意されたい。  
適当な容器をアルゴンでパージする。１．００±０．０２ｇのデスアセチルビンブラスチンヒドラジドを投入する。この投入量は、活性によって調節されている。すなわち、仮に活性が９０．０％であったとすると、投入量は１．１１ｇとなろう。０．４４５±０．００５ｇの混合炭酸塩を投入する（活性によって調節）。４６±１ｍＬのアセトニトリルを投入する。アルゴン下、１０〜２０℃で２２〜２３時間、混合する。HPLC用の試料を取得する（EC145-CMC-AM-0001、バージョン２．３）。想定した結果は、CDSIとヒドラジドの比が≧２０：１である。そうでない場合、アルゴン下、１０〜２０℃で２〜３時間混合を継続し、再び試料を取得する。
【００８９】
４１ｍＬの水に、溶存酸素濃度が０．９ｐｐｍ未満になるまでアルゴンを通気する。溶存酸素濃度を記録する。１．１０±０．０．０７ｇのリン酸水素ナトリウムを脱酸素水に溶解させる。好適な容器に、１．４６±０．０３ｇのEC119を加える（投入量は、活性によって調節されている）。リン酸ナトリウム溶液をEC119に加え、アルゴン下で攪拌する。溶液のｐＨを測定し、必要に応じて０．５ＮのＨＣｌでｐＨを５．９〜６．３に調整する。
【００９０】
緩衝EC119溶液を反応混合物に加える。アルゴン下、２０〜２５℃で６０〜７５分間、混合する。HPLC用の試料を取得する（EC145-CMC-AM-0001、バージョン２．３）。EC145とCDSIの比が≧２０：１である場合は、先に進む。そうでなければ、アルゴン下、１３〜２３℃で混合を継続し、再び試料を取得する。EC145とCDSIの比が≧２５：１であれば、先に進む。そうでなければ、さらに１ｇのEC119を加え、アルゴン下、１３〜２３℃で３０分間混合し、再び試料を取得する。
【００９１】
溶存酸素濃度が０．９ｐｐｍ未満になるまでアルゴンを通気した水から、３９９〜４０１ｍＬの０．０２ｍＭクエン酸緩衝、０．１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液、ｐＨ５．７〜６．５を調製する。反応混合物をこのバッファーで希釈する。かすかな状態をこえた曇りが混合物に生じたら、この生成物の溶液を濾過する必要がある（Whatman Polycap TC75またはTC150、０．４５または１．０ミクロン）。この濾過は、生成物をBiotageカラムに通しながら実施してもよい。
【００９２】
液体クロマトグラフィによる精製
ポリスチレン−ジビニルベンゼンポリマー樹脂を充填したBiotageカートリッジを使用する。  
カラムの調製：
ｂ．  カラムを、
ｉ．  アセトニトリル
ｉｉ．  アセトニトリル５０％と水５０％（v/v）
ｉｉｉ．  アセトニトリル１０％と水９０％（v/v）
でフラッシュする。
【００９３】
精製：
クエン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ６．０〜６．６を調製する。  
バッファーに、溶存酸素含有量が≦０．９ｐｐｍになるまでアルゴンを通気する。
【００９４】
調製：１２％アセトニトリルの緩衝塩化ナトリウム水溶液（v/v）；１６％アセトニトリルの緩衝塩化ナトリウム水溶液（v/v）、２２．５％アセトニトリルの緩衝塩化ナトリウム水溶液（v/v）。  
移動相溶液の溶存酸素含有量を確認する。溶存酸素含有量が０．９ｐｐｍを超える場合、移動相に、溶存酸素濃度が≦０．９ｐｐｍになるまでアルゴンまたは窒素を通気する。  
カラムを１０％アセトニトリル移動相でフラッシュする。  
生成物の溶液をカラムに通す。  
以下の一連の移動相を用いて、生成物を溶出する。  
ｉｖ．  １６％アセトニトリル移動相．
ｖ．  ２２．５％アセトニトリル移動相．
【００９５】
画分の評価
ｉｉｉ．  HPLC法EC145-CMC-IP-0001
ｉｖ．  通過画分＝≧９７．０％EC145および不純物なし≧０．８％
【００９６】
限外濾過
適量の水に、溶存酸素濃度が０．７ｐｐｍ未満になるまでアルゴンまたは窒素を通気する。クロマトグラフィの通過画分を合わせ、等量の通気後の水で希釈する。Millipore社の再生セルロース膜を公称ＭＷカットオフ１０００で用いて限外濾過装置をアセンブルし、脱酸素水ですすぐ。生成物溶液の限外濾過を開始する。背圧３０〜５０ｐｓｉを維持する。保持液容量が元の容量の約２０％になるまで限外濾過を継続する。脱酸素水を保持液に加える。保持液容量が元の容量の約２０％になるまで限外濾過を継続する。脱酸素水を保持液に加える。保持液容量が元の容量の約２０％になるまで限外濾過を継続する。脱酸素水を保持液に加える。保持液容量が元の容量の約２０％になるまで限外濾過を継続する。限外濾過のエンドポイントについては、保持液の試料をＧＣと濃度で分析して判断しなければならない。仕様はEC145を１ミリグラムあたりアセトニトリル≦５０マイクログラムである。達成されていない場合、もう１サイクル限外濾過を実施する。
【００９７】
充填した物質が約１２ｍｇ／ｍＬになるように、API溶液の濃度を調整しなければならない。限外濾過の終了時、水で装置をすすぐ。したがって、必要に応じて、限外濾過を継続するか、水を加える。生成物の溶液を限外濾過装置から排出したら、この限外濾過装置を脱酸素水ですすいで、生成物の溶液と合わせる。
【００９８】
すすぎ液を生成物の溶液と合わせた後、この溶液を０．２ミクロンのアブソリュートフィルターで濾過しなければならず、この濾液を充填する（不活性気体中で実施）。  
単離した生成物の典型的な収率は、理論最大値の５０〜６０％である。
【国際調査報告】
2013526577.tif 000060
2013526577.tif 000061