(57)【要約】本発明は、ＴＬＲアゴニストのリン脂質結合体についての、例えばワクチンにおける、ならびに炎症、癌および病原体、例えば微生物、感染をはじめとする種々の障害を予防、抑制または処置するための、使用を提供する。本発明の結合体は、合成ＴＬＲ７アゴニストと直接連結しているか、またはリンカーを介してＴＬＲ７アゴニストと連結している、例えば、アミノ基、カルボキシ基もしくはスクシンアミド基を介して連結している、リン脂質高分子を含み得る。
2013525431.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において免疫応答を増強するための方法であって、該方法は、該哺乳動物に、式（Ｉ）：
【化１８】
2013525431.tif 000021
の化合物もしくはその互変異性体またはそれらの薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物を含む、有効量の組成物を投与する工程を包含し、式中、
Ｘ１は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲｃ−であり；
Ｒ１は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｃ６〜１０アリール、または置換Ｃ６〜１０アリール、Ｃ５〜９複素環、置換Ｃ５〜９複素環であり；
Ｒｃは、水素、Ｃ１〜１０アルキル、もしくは置換Ｃ１〜１０アルキルであるか；またはＲｃおよびＲ１は、それらが結合している窒素と一緒になって、複素環式環もしくは置換複素環式環を形成し；
各Ｒ２は、独立に、−ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（アルカノイル）、置換−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（アロイル）、置換−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ（カルボキシル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（アルコキシカルボニル）、置換−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ（カルバモイル）、ハロ、ニトロもしくはシアノであるか、またはＲ２は不在であり；
各ＲａおよびＲｂは、独立に、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、置換（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイル、アリール、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニルであり；ここで、
任意のアルキル基、アリール基または複素環式基上の置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルキル、ヒドロキシＣ１〜６アルキレン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキレン、アミノ、シアノ、ハロまたはアリールであり；
ｎは、０、１、２、３または４であり；
Ｘ２は、結合または連結基であり；ならびに
Ｒ３は、１または２個のカルボン酸エステルを含むリン脂質である、
方法。
【請求項２】
Ｒ３が、式：
【化１９】
2013525431.tif 000022
の基を含み、式中、Ｒ１１およびＲ１２は、各々独立に、水素またはアシル基であり、Ｒ１３は、負電荷または水素であり、ならびにｍは、１から８であり；波線は、結合の位置を示し；ＯＲ１２を保有する炭素原子での絶対配置は、Ｒ、Ｓまたはそれらの任意の混合である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍが、１である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１１およびＲ１２が、各々、オレオイル基である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ３のリン脂質が、２個のカルボン酸エステルを含み、および各カルボン酸エステルが、１、２、３または４部位の不飽和、エポキシ化、水酸化またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ３のリン脂質が、２個のカルボン酸エステルを含み、それらのカルボン酸エステルが、同じである、または異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記リン脂質の各カルボン酸エステルが、Ｃ８−Ｃ９に不飽和部位を有するＣ１７カルボン酸エステルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記リン脂質の各カルボン酸エステルが、Ｃ９−Ｃ１０に不飽和部位を有するＣ１８カルボン酸エステルである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
Ｘ２が、結合であるか、または鎖内に１から約１０個の原子を有する鎖であり、ここで、該鎖の原子は、炭素、窒素、硫黄および酸素からなる群より選択され、任意の炭素原子はオキソで置換されていることがあり、そして任意の硫黄原子が１または２個のオキソ基で置換されていることがある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｘ２が、Ｃ（Ｏ）、
【化２０】
2013525431.tif 000023
である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ３が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ３が、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンであり、およびＸ２が、Ｃ（Ｏ）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｘ１が、酸素である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｘ１が、硫黄または−ＮＲｃ−であり、ここで、Ｒｃは、水素、Ｃ１〜６アルキルまたは置換Ｃ１〜６アルキルであり、該アルキルの置換基は、ヒドロキシ、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、アミノ、シアノまたはアリールである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｘ１が、−ＮＨ−である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ１およびＲｃが一緒になって、複素環式環または置換複素環式環を形成する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ１およびＲｃが一緒になって、置換または非置換のモルホリノ、ピペリジノ、ピロリジノまたはピペラジノ環を形成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ１が、Ｃ１〜６アルコキシで置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキルである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ１が、水素、Ｃ１〜４アルキルまたは置換Ｃ１〜４アルキルである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ１が、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヒドロキシＣ１〜４アルキレンまたはＣ１〜４アルコキシＣ１〜４アルキレンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ１が、水素、メチル、エチル、メトキシエチルまたはエトキシエチルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｒ２が、ハロゲンもしくはＣ１〜４アルキルであるか、またはＲ２が、不在である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ２が、クロロ、ブロモ、メチルもしくはエチルであるか、またはＲ２が、不在である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｘ１が、Ｏであり、Ｒ１が、Ｃ１〜４アルコキシ−エチルであり、ｎが、０であり、Ｘ２が、カルボニルであり、およびＲ３が、１，２−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
式（Ｉ）の化合物が、
【化２１】
2013525431.tif 000024
である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
式（Ｉ）の化合物が、
【化２２】
2013525431.tif 000025
である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物が、一定量の抗原をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原が、微生物、タンパク質または胞子である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
抗原を投与する工程をさらに包含する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗原が、前記組成物と同時に投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗原が、前記組成物より前または後に投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗原が、微生物、タンパク質または胞子である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記投与が、微生物感染の予防、抑制または処置に有効である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記微生物が、細菌である、請求項２８、３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗原が、細菌胞子を含む、請求項２７または２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が、鼻腔内投与される、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物が、皮膚に投与される、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
投与される前記量が、感染の予防に有効である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
投与される前記量が、膀胱状態の予防、抑制または処置に有効である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
投与される前記量が、皮膚状態の予防、抑制または処置に有効である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
投与される前記量が、食欲不振または低体温症をもたらす結果とならない、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
投与される前記量が、Ｔｈ２免疫応答を誘導するが、有意なＴｈ１免疫応答を誘導しない、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物が、脂質二重層を形成するナノ粒子と前記化合物とを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
抗原または腫瘍関連抗原と、一定量の、請求項１に記載の式（Ｉ）を有する化合物もしくはその互変異性体；またはそれらの薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物とを含む組成物を含むワクチン。
【請求項４６】
脂質二重層の形成を含むナノ粒子と請求項１に記載の式（１）の化合物とを含む調製物。
【請求項４７】
水性媒体に分散された、請求項１〜２６のいずれかに記載の化合物と脂質とを含むナノ粒子を含む、ナノ粒子分散物であって、該ナノ粒子が少なくとも５０ｎｍから約３００ｎｍの平均値粒子直径を有する、ナノ粒子分散物。
【請求項４８】
前記脂質が、リン脂質である、請求項４７に記載のナノ粒子分散物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への参照）
この出願は、２０１０年４月３０日に出願された、米国出願第６１／３４３，５７３号（この開示は、参考として本明細書に援用される）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
（政府の権利に関する声明）
本明細書に記載される発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＡＩ０５６４５３およびＡＩ０７７９８９の下、政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
この１０年の間に、微生物病原体の先天的な認識の分子的な基本原理について、多くのことがわかってきた。一般に、多数の体細胞が、適応免疫系とは関係なく可能性ある病原体を検出する、広範なパターンの認識受容体を発現することは受け入れられている（非特許文献１参照のこと）。これらの受容体は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる微生物成分と相互作用すると考えられている。ＰＡＭＰの例として、グラム陽性細胞壁に由来するペプチドグリカン、リポテイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）、糖マンノース（微生物の炭水化物ではよく見られるが、ヒトでは稀である）、細菌ＤＮＡ、ウイルス由来の二本鎖ＲＮＡおよび真菌細胞壁由来のグルカンが挙げられる。ＰＡＭＰは、通常、（ａ）その哺乳動物宿主ではなく、微生物によるその発現、（ｂ）広範な病原体にわたった構造の保存および（ｃ）先天免疫を刺激する能力を含む特定の判定基準を満たす。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、ＰＡＭＰの検出において、また、微生物感染に対する初期反応において中心的な役割を果たすことがわかった。（非特許文献２参照のこと）。
【０００４】
１０種の哺乳動物ＴＬＲおよびいくつものそのアゴニストが同定されている。例えば、グアニンおよびウリジンリッチ一本鎖ＲＮＡが、ＴＬＲ７の天然リガンドとして同定されている（非特許文献３）。さらに、イミダゾキノリン、およびプリン様分子をはじめとする、ＴＬＲ７の幾つかの低分子量アクチベーターが同定されている（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。後者の中でも、９−ベンジル−８−ヒドロキシ−２−（２−メトキシエトキシ）アデニン（「ＳＭ」）は、強力で特異的なＴＬＲ７アゴニストとして同定されている。合成免疫調節物質Ｒ−８４８（レシキモド）は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方を活性化する。ＴＬＲ刺激は、共通のシグナル伝達カスケード（アダプタータンパク質ＭｙＤ８８、転写因子ＮＦ−ｋＢならびに炎症性サイトカインおよびエフェクターサイトカインを含む）を開始するが、特定の細胞種が特定のＴＬＲを産生する傾向がある。例えば、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９は、主に、樹状細胞（ＤＣ）中のエンドソームの内側面およびＢリンパ球で見られる（ヒトでは；マウスマクロファージは、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９を発現する）。他方、ＴＬＲ８は、ヒト血液単球において見られる（非特許文献７参照のこと）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊａｎｅｗａｙら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２年）２０：１９７頁
【非特許文献２】Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２年）１４：１０３頁
【非特許文献３】Ｄｉｅｂｏｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４年）３０３：１５２９頁
【非特許文献４】Ｈｅｍｍｉら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２年）３：１９１頁
【非特許文献５】Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３年）１８０：６６４６頁
【非特許文献６】Ｌｅｅら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００６年）８：１３２７頁
【非特許文献７】Ｈｏｒｎｕｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２年）１６８：４５３１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、安定な共有結合によってリン脂質高分子と連結している合成ＴＬＲ７アゴニスト（結合体）、すなわち、プロドラッグとして作用しない結合体、についての使用を提供する。結合体は、合成ＴＬＲ７アゴニストと直接連結しているか、またはリンカーを介してＴＬＲ７アゴニストと連結している、例えば、アミノ基、カルボキシ基もしくはスクシンアミド基を介して連結している、リン脂質高分子を含み得る。本発明の結合体は、ＴＬＲ７の活性を刺激することによりｉｎ  ｖｉｖｏで哺乳動物、例えば、ヒトの免疫系を活性化するのに有用である、広域スペクトルの、持続性、非毒性合成免疫刺激薬である。特に、本発明の結合体は、免疫応答を最適化し、一方で、結合体化していないＴＬＲ７アゴニストと関連する望ましくない全身性副作用を制限する。
【０００７】
したがって、本発明は、免疫応答、例えば、特異的抗原に対する免疫応答を増強する、または一般的な免疫応答を（特異的抗原の不在下で）誘導する方法を提供する。一実施形態では、結合体は、アジュバントとして作用し、そのため一般的な免疫応答ではなく特異的免疫応答と関連している。一実施形態では、結合体は、一般的な免疫刺激物質として作用する。一実施形態では、本方法は、それらだけには限らないが微生物感染、膀胱状態または皮膚状態をはじめとする障害を予防、抑制または処置するのに有効な量の、抗原および本発明の結合体を、それを必要とする哺乳動物に投与する工程を含む。本発明において有用な抗原の限定されない例として、それらだけには限らないが、単離されたタンパク質またはペプチド、例えば、ジペプチドもしくはトリペプチドなど；炭水化物（多糖）、ヌクレオチド、例えば、ＰＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡなど；細胞、脂質、微生物、例えば、ウイルス、細菌、真菌などが挙げられる。抗原は、不活性化された生物全体または微生物を含んでもよく、またはその小成分（ｓｕｂ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）などを含んでもよい。一実施形態において、抗原および結合体の投与に対する免疫応答は、抗原（結合体の不在下での）もしくは対応する結合体化していないＴＬＲ７アゴニストまたはそれらの組み合わせの投与と比較して増強される。一実施形態では、哺乳動物は、抗原と結合体とを含む組成物を投与される。一実施形態では、組成物は、局所投与、例えば、皮膚または鼻腔内投与される。別の実施形態では、組成物は、全身投与される。別の実施形態では、抗原および結合体は、別々に処方され、同時にまたは逐次的に投与される。
【０００８】
したがって、本発明は、一定量の本発明の結合体（例えば、単独で炎症反応を誘導し、かつ抗原に対する免疫応答の増強にも有効であるもの）を含む免疫原性組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、例えばヒトにおいて、毒性効果を及ぼし得る溶媒または保存料、例えば、ＤＭＳＯまたはエタノールを含まない。
【０００９】
本発明の結合体は、式（Ｉ）：
【００１０】
【化１】
2013525431.tif 000003
もしくはその互変異性体；
またはそれらの薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物
を有し、式中、
Ｘ１は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲｃ−であり；
Ｒ１は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｃ６〜１０アリール、または置換Ｃ６〜１０アリール、Ｃ５〜９複素環、置換Ｃ５〜９複素環であり；
Ｒｃは、水素、Ｃ１〜１０アルキル、もしくは置換Ｃ１〜１０アルキルであるか；またはＲｃおよびＲ１は、それらが結合している窒素と一緒になって、複素環式環もしくは置換複素環式環を形成し；
各Ｒ２は、独立に、−ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（アルカノイル）、置換−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（アロイル）、置換−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ（カルボキシル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（アルコキシカルボニル）、置換−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ（カルバモイル）、ハロ、ニトロもしくはシアノであるか、またはＲ２は不在であり；
各ＲａおよびＲｂは、独立に、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、置換（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイル、アリール、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニルであり；ここで、
任意のアルキル基、アリール基または複素環式基上の置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルキル、ヒドロキシＣ１〜６アルキレン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキレン、アミノ、シアノ、ハロまたはアリールであり；
ｎは、０、１、２、３または４であり；
Ｘ２は、結合または連結基であり；ならびに
Ｒ３は、１または２個のカルボン酸エステルを含むリン脂質である。
【００１１】
一実施形態において、本発明の組成物は、式（Ｉ）の化合物を含むナノ粒子を含む。本明細書において、ナノ粒子は、約３０ｎｍから約６００ｎｍ、または３０と６００の間の任意の整数を有する範囲の直径、例えば、直径約４０から約８０または約１００ｎｍから約１５０ｎｍをはじめとする約４０ｎｍから約２５０ｎｍを有する。ナノ粒子は、式（Ｉ）の化合物を混合し、それが自発的にナノ粒子を形成し得ることにより、または式（Ｉ）の化合物と脂質の調製物、例えば、それらだけには限らないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンもしくはコレステロールをはじめとするリン脂質とを混合し、それによってナノリポソームを形成することにより形成され得る。場合により、式（Ｉ）の化合物、脂質調製物およびグリコール、例えばプロピレングリコールを合わせる。
【００１２】
一実施形態では、結合体の単回用量は、免疫応答の刺激において極めて強力な活性を示し得る。さらに、結合体の低毒性のため、いくつかの状況では、より高い用量が、例えば、全身に投与され得るが、その他の状況下では、例えば、結合体の局在に起因してより低い用量を投与してもよい。
【００１３】
したがって、本発明は、医学療法において、例えば、細菌もしくはウイルス感染などの微生物感染の予防のためのワクチンにおいて使用するための、ならびに増強された免疫応答が示されるＴＬＲ７関連状態または症状（例えば、癌）を処置するための医薬の製造のための本発明の結合体を提供する。細菌感染として、それらだけには限られないが、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、エンテロコッカス属、バチルス属、コリネバクテリウム属、ノカルジア属、クロストリジウム属、放線細菌、リステリア属および放線細菌；マイコプラズマ属；大腸菌、サルモネラ属、赤痢菌属および他の腸内細菌科、マイコバクテリア、シュードモナス属、モラクセラ属、ヘリコバクター属、ステノトロホモナス属、デロビブリオ属（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）、酢酸菌（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、およびレジオネラ属の感染が挙げられ、ならびに淋菌、髄膜炎菌、ヒト結核菌、らい菌、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、レジオネラ・ニューモフィラ菌、緑膿菌、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、霊菌、ヘリコバクターピロリ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、チフス菌、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉの感染が挙げられる。ウイルス感染として、それらだけには限られないが、レンチウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、ライノウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルスまたはインフルエンザウイルス感染が挙げられる。本発明の結合体はまた、生物テロ防御（ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ）のために、例えば、炭素菌に対して使用できる。
【００１４】
本明細書において下記で記載されるように、抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の６日前の、マウスへの本発明の結合体および照射された炭疽菌胞子の単回の投与は、生存を延長した一方、複数回の投与は、抗原投与から３０日後の１００％生存をもたらす結果となった。
【００１５】
したがって、一実施形態では、本発明は、哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ヒツジまたはネコにおける細菌感染、例えば、グラム陽性菌感染を予防、抑制または処置するための方法を提供する。この方法は、哺乳動物に、細菌抗原と一定量の、式（Ｉ）：
【００１６】
【化２】
2013525431.tif 000004
を有する化合物
もしくはその互変異性体；
またはそれらの薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物
とを含む有効量の組成物を投与する工程を含み、式中、
Ｘ１は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲｃ−であり；
Ｒ１は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｃ６〜１０アリール、または置換Ｃ６〜１０アリール、Ｃ５〜９複素環、置換Ｃ５〜９複素環であり；
Ｒｃは、水素、Ｃ１〜１０アルキル、もしくは置換Ｃ１〜１０アルキルであるか；またはＲｃおよびＲ１は、それらが結合している窒素と一緒になって、複素環式環もしくは置換複素環式環を形成し；
各Ｒ２は、独立に、−ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（アルカノイル）、置換−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（アロイル）、置換−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ（カルボキシル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（アルコキシカルボニル）、置換−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ（カルバモイル）、ハロ、ニトロもしくはシアノであるか、またはＲ２は不在であり；
各ＲａおよびＲｂは、独立に、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、置換（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイル、アリール、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニルであり；ここで、
任意のアルキル基、アリール基または複素環式基上の置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルキル、ヒドロキシＣ１〜６アルキレン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキレン、アミノ、シアノ、ハロまたはアリールであり；
ｎは、０、１、２、３または４であり；
Ｘ２は、結合または連結基であり；ならびに
Ｒ３は、１または２個のカルボン酸エステルを含むリン脂質である。
【００１７】
さらに、本発明はまた、少なくとも１種の本発明のリン脂質結合体またはその薬学的に受容可能な塩を、薬学的に受容可能な希釈剤もしくは担体と組み合わせて、場合により、微生物の抗原などの選択された抗原の調製物、例えば、死滅した調製物もしくは抽出物、選択された微生物の単離されたタンパク質または選択された微生物の単離された炭水化物（多糖）と組み合わせて含む薬学的組成物を提供する。一実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも１種の本発明のリン脂質結合体またはその薬学的に受容可能な塩を水性溶媒、例えば、ＰＢＳ中で合わせることによって、または少なくとも１種の本発明のリン脂質結合体またはその薬学的に受容可能な塩とリン脂質の調製物とを、例えば、水性溶媒中で合わせることによって形成されたナノ粒子を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、脂質−（６）、ＰＥＧ−（８）または脂質−ＰＥＧ（９）ＴＬＲ７結合体の合成に用いたスキームを示す図である。（６）、（８）および（９）は、化合物の呼称を指す。
【図２−１】図２Ａ〜Ｄは、マウスマクロファージにおけるＴＬＲ７結合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫学的特徴づけの結果を描写する図である。一般に、ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０６／ｍＬ）（Ａ）、および野生型マウス（Ｂ〜Ｄ）またはＴＬＲ７欠損マウス（Ｃ〜Ｄ）からのＢＭＤＭ（０．５×１０６／ｍＬ）を結合体の系列希釈物とともに１８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、培養上清を採取した。ＳＭ（三角形）、６（灰色の丸）、８（塗りつぶした四角形）および９（Ｘ字形のもの）の系列希釈物は、１０μＭから出発して調製した（１：５の工程）；４ａ（灰色の菱形）は、０．１μＭから出発して系列希釈した（１：５の工程）。上清中のサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１２またはＴＮＦ−α）のレベルは、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）によって決定した。データは、三重反復の平均±ＳＥＭであり、３回の独立した実験の代表である。ＳＭと６との比較で二元配置ＡＮＯＶＡとボンフェローニ事後検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）によりＰ＜０．００１。野生型マクロファージの対応するデータと比較してスチューデントｔ検定によりＰ＜０．０１を示す。
【図２−２】図２Ａ〜Ｄは、マウスマクロファージにおけるＴＬＲ７結合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫学的特徴づけの結果を描写する図である。一般に、ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０６／ｍＬ）（Ａ）、および野生型マウス（Ｂ〜Ｄ）またはＴＬＲ７欠損マウス（Ｃ〜Ｄ）からのＢＭＤＭ（０．５×１０６／ｍＬ）を結合体の系列希釈物とともに１８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、培養上清を採取した。ＳＭ（三角形）、６（灰色の丸）、８（塗りつぶした四角形）および９（Ｘ字形のもの）の系列希釈物は、１０μＭから出発して調製した（１：５の工程）；４ａ（灰色の菱形）は、０．１μＭから出発して系列希釈した（１：５の工程）。上清中のサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１２またはＴＮＦ−α）のレベルは、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）によって決定した。データは、三重反復の平均±ＳＥＭであり、３回の独立した実験の代表である。ＳＭと６との比較で二元配置ＡＮＯＶＡとボンフェローニ事後検定によりＰ＜０．００１。野生型マクロファージの対応するデータと比較してスチューデントｔ検定によりＰ＜０．０１を示す。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、ヒトＰＢＭＣにおけるＴＬＲ７結合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫学的特徴づけの結果を描写する図である。ヒトＰＢＭＣ（２×１０６／ｍＬ）を結合体の系列希釈物とともに１８時間インキュベートした。ＳＭ（三角形）、６（灰色の丸）、８（塗りつぶした四角形）および９（Ｘ字形のもの）の系列希釈物は、１０μＭから出発して調製した（１：５の工程）；４ａ（灰色の菱形）は、０．１μＭから出発して系列希釈した（１：５の工程）。培養上清中のＩＬ−６（Ａ）およびＩＦＮα１（Ｂ）のレベルを二連でのＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって決定した。データは、平均±ＳＥＭであり、３回の独立した実験の代表である。効力の順序は、４ｂ＞６＞９＞ＳＭ＝８（化合物４ｂ、６、９およびＳＭについては二元配置ＡＮＯＶＡ検定によりＰ＜０．０００５；化合物８については二元配置ＡＮＯＶＡ検定によりＰ＝０．２。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＬＲ７結合体による炎症促進性サイトカイン誘導の動力学を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりｎ＝５）にＴＬＲ７結合体（ＳＭ、２００ｎｍｏｌ：４ａ、４０ｎｍｏｌ；６、２００ｎｍｏｌ；８、２００ｎｍｏｌ；９、２００ｎｍｏｌ）を静脈内注射した。血清サンプルを注射２、４、６、２４および４８時間後に採取した。ＴＮＦ−α（Ａ）およびＩＬ−６（Ｂ）のレベルをＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって測定した。データは、５匹のマウスの平均±ＳＥＭであり、２回の独立した実験の代表である。（Ｃ）対照未処置マウス。＊は、一元配置ＡＮＯＶＡ検定とボンフェローニ事後検定により未処置マウスと比較してｐ＜０．０５を示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＬＲ７結合体のアジュバント活性（ａｄｊｕｖａｎｉｃｉｔｙ）（例えば、免疫学的応答を開始する能力）を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（１群あたりｎ＝５）を、ＴＬＲ７結合体と混合した２０μｇのＯＶＡ（マウス１匹あたり１０ｎｍｏｌ当量の用量）を用いて０日目および７日目に皮下に免疫化した。０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、４２日目および５６日目に血清を採取した。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａをＥＬＩＳＡによって測定した（ＡおよびＢ）。５６日目にマウスを屠殺し、脾細胞をＲＰＭＩ  １６４０中のＯＶＡ（１００μｇ／ｍＬ）で３日間培養した。上清中のＩＦＮ−γレベルをＥＬＩＳＡによって測定した（Ｃ）。データは、５匹のマウス／群の平均±ＳＥＭであり、３回の独立した実験の代表である。＊および＋は、それぞれ、ビヒクルと混合したＯＶＡを用いて免疫化したマウスとの一元配置ＡＮＯＶＡ検定とダネットの事後比較（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）によるＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＬＲ７結合体のアジュバント活性（例えば、免疫学的応答を開始する能力）を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（１群あたりｎ＝５）を、ＴＬＲ７結合体と混合した２０μｇのＯＶＡ（マウス１匹あたり１０ｎｍｏｌ当量の用量）を用いて０日目および７日目に皮下に免疫化した。０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、４２日目および５６日目に血清を採取した。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａをＥＬＩＳＡによって測定した（ＡおよびＢ）。５６日目にマウスを屠殺し、脾細胞をＲＰＭＩ  １６４０中のＯＶＡ（１００μｇ／ｍＬ）で３日間培養した。上清中のＩＦＮ−γレベルをＥＬＩＳＡによって測定した（Ｃ）。データは、５匹のマウス／群の平均±ＳＥＭであり、３回の独立した実験の代表である。＊および＋は、それぞれ、ビヒクルと混合したＯＶＡを用いて免疫化したマウスとの一元配置ＡＮＯＶＡ検定とダネットの事後比較によるＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＬＲ７結合体のアジュバント活性（例えば、免疫学的応答を開始する能力）を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（１群あたりｎ＝５）を、ＴＬＲ７結合体と混合した２０μｇのＯＶＡ（マウス１匹あたり１０ｎｍｏｌ当量の用量）を用いて０日目および７日目に皮下に免疫化した。０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、４２日目および５６日目に血清を採取した。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａをＥＬＩＳＡによって測定した（ＡおよびＢ）。５６日目にマウスを屠殺し、脾細胞をＲＰＭＩ  １６４０中のＯＶＡ（１００μｇ／ｍＬ）で３日間培養した。上清中のＩＦＮ−γレベルをＥＬＩＳＡによって測定した（Ｃ）。データは、５匹のマウス／群の平均±ＳＥＭであり、３回の独立した実験の代表である。＊および＋は、それぞれ、ビヒクルと混合したＯＶＡを用いて免疫化したマウスとの一元配置ＡＮＯＶＡ検定とダネットの事後比較によるＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｃは、ＴＬＲ７結合体の起こり得る有害作用の評価の結果を描写する図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＴＬＲ７結合体と混合した２０μｇのＯＶＡを用いて免疫化した。５６日目にマウスを屠殺し、総脾細胞数を決定した（Ａ）。脾臓を採取し、組織学的検査に供した（×１００）（Ｂ）。注射部位の皮膚を注射２４時間後に調べた（Ｃ）。脾細胞数に関してＯＶＡおよびＴＬＲ７結合体を用いて免疫化したマウスとＯＶＡのみを用いて免疫化したマウスの間に有意差はなかった（Ａ）。ＴＬＲ７結合体と混合したＯＶＡを用いて免疫化したマウスからの脾臓の組織学的検査は、白脾髄の破壊および赤脾髄の細胞充実性の増加を一切示さなかった（Ｂ）。注射部位の皮膚は、目に見える発赤を一切有さなかった（Ｃ）。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｃは、ＴＬＲ７結合体の起こり得る有害作用の評価の結果を描写する図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＴＬＲ７結合体と混合した２０μｇのＯＶＡを用いて免疫化した。５６日目にマウスを屠殺し、総脾細胞数を決定した（Ａ）。脾臓を採取し、組織学的検査に供した（×１００）（Ｂ）。注射部位の皮膚を注射２４時間後に調べた（Ｃ）。脾細胞数に関してＯＶＡおよびＴＬＲ７結合体を用いて免疫化したマウスとＯＶＡのみを用いて免疫化したマウスの間に有意差はなかった（Ａ）。ＴＬＲ７結合体と混合したＯＶＡを用いて免疫化したマウスからの脾臓の組織学的検査は、白脾髄の破壊および赤脾髄の細胞充実性の増加を一切示さなかった（Ｂ）。注射部位の皮膚は、目に見える発赤を一切有さなかった（Ｃ）。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｃは、ＴＬＲ７結合体の起こり得る有害作用の評価の結果を描写する図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＴＬＲ７結合体と混合した２０μｇのＯＶＡを用いて免疫化した。５６日目にマウスを屠殺し、総脾細胞数を決定した（Ａ）。脾臓を採取し、組織学的検査に供した（×１００）（Ｂ）。注射部位の皮膚を注射２４時間後に調べた（Ｃ）。脾細胞数に関してＯＶＡおよびＴＬＲ７結合体を用いて免疫化したマウスとＯＶＡのみを用いて免疫化したマウスの間に有意差はなかった（Ａ）。ＴＬＲ７結合体と混合したＯＶＡを用いて免疫化したマウスからの脾臓の組織学的検査は、白脾髄の破壊および赤脾髄の細胞充実性の増加を一切示さなかった（Ｂ）。注射部位の皮膚は、目に見える発赤を一切有さなかった（Ｃ）。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、１Ｖ２７０の投与のタイムラインおよび１Ｖ２７０によって誘導された膀胱炎症を示す図である。
【図８】図８Ａ〜Ｄは、Ａｌｄａｒａと比較した１Ｖ２７０のクリーム処方物によるサイトカイン誘導の薬力学を描写する図である。
【図９】図９Ａ〜Ｆは、リン脂質結合体の肺投与後の肺および血清における局所サイトカイン誘導を示す図である。
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、リン脂質結合体化ＴＬＲ７アゴニストによる持続性局所免疫活性化を描写する図である。
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、単回の免疫化および抗原投与のタイムライン、ならびにリン脂質結合体化ＴＬＲ７アゴニストのアジュバント効果を示す図である。
【図１２】図１２Ａ〜Ｂは、複数回の免疫化および抗原投与のタイムライン、ならびにリン脂質結合体化ＴＬＲ７アゴニストのアジュバント効果を示す図である。
【図１３】図１３は、ＵＣ−１Ｖ２７０（図１中の化合物６）の構造を示す図である。
【図１４】図１４は、ＵＣ−１Ｖ２７０の自発的ナノ粒子形成を示す図である。ＵＣ−１Ｖ２７０をＰＢＳで５０μＭ（Ａ）または１００μＭ（Ｂ）に希釈し、時間をわたって粒径を測定した。ナノ粒子は、一般に、時間をわたって安定していた。いくつかの凝集体が、溶解度のほぼ上限である１００μＭで見られた。ＰＢＳ中のＵＣ−１Ｖ２７０の粒径は、比較的一定しており、濃度に関係なく約１１０ｎｍの平均直径を有した。
【図１５】図１５Ａ〜Ｆは、最小の全身性副作用での限局性のサイトカイン放出のＵＣ−１Ｖ２７０促進を示す図である。４匹のＡ／ＪマウスにＵＣ−１Ｖ２７０、結合体化していないＴＬＲ７アゴニスト（ＵＣ−１Ｖ２０９）、リン脂質または溶媒対照を種々の用量で鼻腔内投与した。ＢＡＬＦおよび血漿を２４時間後に採取し、マルチプレックスＬｕｍｉｎｅｘアッセイによってサイトカインレベルを決定した。バーは、平均を示す。
【図１６】図１６Ａ〜Ｃは、炭疽菌ワクチンアジュバントとしてのＵＣ−１Ｖ２７０での完全な長期保護を示す図である。（Ａ）１群あたり８匹の雌のＡ／Ｊマウスに、ＰＢＳ、照射された胞子（ＩＲＳ）のみ、ＵＣ−１Ｖ２７０のみ（１ｎｍｏｌ／マウス）、ＩＲＳ＋ＵＣ−１Ｖ２７０またはＩＲＳ＋ＣＴ（コレラ毒素；１μｇ／マウス）を２週間間隔で３回、鼻腔内投与し、最後の免疫化の４週間後に抗原投与した。（Ｂ）生存を３０日間追跡した。カプラン−マイヤー生存曲線およびログランク検定（ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）を実施して有意性を決定した。１群あたり合計１６匹のマウスを用いる２回の別個の実験からの結果をプールした。（Ｃ）マウスを感染後３０日の時点で屠殺した。脾臓を回収し、計量した。
【図１７−１】図１７Ａ〜Ｅは、生存マウスの胞子特異的Ｔｈ１７およびＴｈ１応答を示す図である。ワクチン接種後に感染から生き残ったマウスを３０日目に屠殺した。それらのマウスからの脾細胞（４００，０００／ウエル）を、ＩＲＳ（１０６／ウエル）とともに三連で５日間培養した。未感染のワクチン接種していないマウスからの脾細胞が対照として役立った。上清中のＩＬ−１２、ＩＬ−１７およびＴＮＦ−αをＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって測定した。ＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによって測定した。示されているデータは、２回の独立した実験からプールされたものである。
【図１７−２】図１７Ａ〜Ｅは、生存マウスの胞子特異的Ｔｈ１７およびＴｈ１応答を示す図である。ワクチン接種後に感染から生き残ったマウスを３０日目に屠殺した。それらのマウスからの脾細胞（４００，０００／ウエル）を、ＩＲＳ（１０６／ウエル）とともに三連で５日間培養した。未感染のワクチン接種していないマウスからの脾細胞が対照として役立った。上清中のＩＬ−１２、ＩＬ−１７およびＴＮＦ−αをＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって測定した。ＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによって測定した。示されているデータは、２回の独立した実験からプールされたものである。
【図１８】図１８は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７の枯渇が免疫化マウスを感染しやすくさせることを示す図である。雌Ａ／Ｊマウスに、示されているようにＩＲＳ＋ＵＣ−１Ｖ２７０（１ｎｍｏｌ／マウス）を３回、鼻腔内投与した。生炭疽菌胞子抗原投与の１日前に開始して１日２回、抗体（０．２ｍｇの抗ＩＬ−１７および０．１ｍｇの抗ＩＦＮγ）を与えた。生存を２４日間追跡した。カプラン−マイヤー生存曲線およびログランク検定を実施して有意性を決定した。
【図１９】図１９は、Ｐｈｏｓａｌ  ５０ＰＧ処方ＵＣ−１Ｖ２７０およびＰｈｏｓａｌ  ５０ＰＧなしのＵＣ−１Ｖ２７０（「非処方」と呼ぶ）を投与した動物におけるサイトカインレベルの比較を示す図である。Ａ／Ｊマウスに、非処方ＵＣ−１Ｖ２７０もしくはＰｈｏｓａｌ  ５０ＰＧ処方ＵＣ−１Ｖ２７０を示されている用量で、またはビヒクル（Ｖ１＝５％ＤＭＳＯ、Ｖ２＝１．２％Ｐｈｏｓａｌ  ５０ＰＧ）を鼻腔内投与した。血漿およびＢＡＬＦを２４時間後に採取し、サイトカインレベルをＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって分析した。処方されたＵＣ−１Ｖ２７０は、非処方ＵＣ−１Ｖ２７０と比較して、より有効に局所サイトカインを誘導した。全身サイトカイン誘導は同様であったがこれは、ＩＦＮ−γを除いてほとんど検出できない。
【図２０】図２０は、炭疽菌モデルにおける感染後の生存を示す図である。Ａ／Ｊマウスを、ＰＢＳもしくは２．５％Ｐｈｏｓａｌ  ５０ＰＧビヒクルのいずれかを単独で用いて、または示されているような多様な量の処方されたＵＣ−１Ｖ２７０もしくはＣＴと組み合わせて５×１０７  ＩＲＳを用いて鼻腔内免疫化した。最後の免疫化（２週間間隔で３回の免疫化）の３週間後に生炭疽菌胞子を用いてマウスに抗原投与した。処方されたＵＣ−１Ｖ２７０の３用量すべてが炭疽菌感染から動物を保護した。ＤＭＳＯ中の非処方１Ｖ２７０を使用する以前の研究において、１ｎｍｏｌ用量は有効であることが証明されたことに留意すること。対照的に、１０分の１の用量の処方されたＵＣ−１Ｖ２７０は、高い生存率を与えた。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
組成物は、重量ベースで少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９９％および９９．９％の特定の組成を組成物が含む場合に、特定の化合物または化合物の特定の形態（例えば、異性体）の「実質的にすべて」からなる。組成物は、各化合物（例えば、異性体）が、重量ベースで組成物の少なくとも約１０％に相当する場合に、化合物の「混合物」または同一化合物の形態の「混合物」を含む。本発明のＴＬＲ７アゴニストまたはその結合体は、酸性塩として、または塩基性塩として、ならびに遊離酸もしくは遊離塩基の形態で調製され得る。溶液中では、本発明の特定の化合物は、対イオンが、溶媒分子自体によって、または溶媒中に溶解もしくは懸濁しているその他のイオンから提供される両性イオンとして存在し得る。
【００２０】
本明細書において、用語「単離された」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏ物質と関連していないか、または天然に見られるものとは異なっている形態で存在するような、核酸分子、ペプチドまたはタンパク質またはその他の分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調製、単離および／または精製を指す。したがって、用語「単離された」とは、「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」におけるように、核酸に関連して用いられる場合は、同定され、その供給源では通常結合している少なくとも１種の夾雑物から分離された核酸配列を指す。単離核酸は、天然に見られるものとは異なっている形態または状況で存在する。対照的に、単離されていない核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、天然に存在する状態で見られる。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、隣接する遺伝子に接近して宿主細胞染色体上で見られる；ＲＮＡ配列（例えば、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列）は、多数のタンパク質をコードする多数のその他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中で見られる。したがって、ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成起源の、またはそのいくつかの組み合わせのポリヌクレオチドを含む「単離核酸分子」に関して、「単離核酸分子」とは、（１）「単離核酸分子」が天然に見られるポリヌクレオチドのすべてまたは一部と関連していないか、（２）天然には連結していないポリヌクレオチドと機能しうる形で連結しているか、または（３）より大きな配列の一部として天然に生じない。単離核酸分子は、一本鎖または二本鎖の形態で存在し得る。核酸分子が、タンパク質を発現するために利用される場合には、核酸は最小で、センスまたはコーディング鎖を含む（すなわち、核酸は一本鎖であり得る）が、センスおよびアンチセンス鎖の両方を含む場合もある（すなわち、核酸は二本鎖であり得る）。
【００２１】
本明細書において、用語「アミノ酸」とは、ＤまたはＬ型の天然のアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌ）、ならびに非天然アミノ酸（例えば、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート；馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、−メチル−アラニン、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシンおよびｔ−ブチルグリシン）の残基を含む。この用語はまた、従来のアミノ保護基（例えば、アセチルまたはベンジルオキシカルボニル）を保有する天然および非天然アミノ酸、ならびにカルボキシ末端で保護された天然および非天然アミノ酸（例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、フェニルまたはベンジルエステルまたはアミドのような；または−メチルベンジルアミドのような）を含む。その他の適したアミノおよびカルボキシ保護基は、当業者には公知である（例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８１年、およびそれに引用される参考文献を参照のこと）。例えば、アミノ酸は、カルボキシ末端、アミノ末端を介して、または例えば、システインの硫黄を介してなど、任意のその他の好都合な結合点を介して、式Ｉの化合物の残部に連結され得る。
【００２２】
用語「Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト」（ＴＬＲアゴニスト）とは、ＴＬＲと結合する分子を指す。合成ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲと結合し、受容体を活性化するよう設計された化合物である。
【００２３】
用語「核酸」とは、本明細書において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖またはより高度に凝集したハイブリダイゼーションモチーフおよびそれらの任意の化学修飾物を指す。修飾として、それだけには限らないが、核酸リガンド塩基に、または全体としての核酸リガンドに、さらなる電荷、分極率、水素結合形成、静電相互作用および流動性を取り込む化学基を提供するものが挙げられる。このような修飾として、それだけには限らないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホジエステル基修飾（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート）、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾、７位プリン修飾、８位プリン修飾、９位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換；主鎖修飾、メチル化、イソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどの異常な塩基対形成の組み合わせなどが挙げられる。核酸はまた、非天然塩基、例えば、ニトロインドールなどを含み得る。修飾はまた、ＢＨＱ、フルオロフォアまたは別の部分を用いたキャッピングなどの３’および５’修飾を含み得る。
【００２４】
「リン脂質」は、本明細書においてこの用語が用いられる場合、グリセロールヒドロキシル基に結合したリン酸基を有し、該リン酸基に対するエステルとしてアルカノールアミン基が結合している、一般式
【００２５】
【化３】
2013525431.tif 000005
のグリセロールモノ−またはジエステルを指し、この式中のＲ１１およびＲ１２は、各々独立に、水素またはアシル基であり、ならびにＲ１３は、ｐＨに依存して負電荷であるか、または水素である。Ｒ１３が負電荷であるとき、ナトリウムイオンなどの適した対イオンが存在し得る。例えば、アルカノールアミン部分は、ｍ＝１であるような、エタノールアミン部分であり得る。ＮＨ基が、ｐＨに依存して、プロトン化され、正に荷電されることがあるか、またはプロトン化されず、中性であることがあることも理解される。例えば、リン脂質は、負に荷電したホスフェートオキシアニオンおよび正に荷電しかつプロトン化された窒素原子を有する双性イオンとして存在することがある。ＯＲ１２を保有する炭素原子は、キラル炭素原子であり、そのためその分子は、Ｒ異性体、Ｓ異性体またはそれらの任意の混合物として存在し得る。式（ＩＩ）の化合物のサンプル中に等量のＲ異性体およびＳ異性体があるとき、そのサンプルは、「ラセミ化合物」と呼ばれる。例えば、下の実施例Ｉにおいて使用するような市販の製品１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンにおいて、Ｒ３基は、Ｒ絶対配置のものである、キラル構造
【００２６】
【化４】
2013525431.tif 000006
の基である。
【００２７】
リン脂質は、遊離分子であることもあり、または例えば下に示すように別の基に共有結合で連結されていることもある：
【００２８】
【化５】
2013525431.tif 000007
（ここで、波線は、結合点を示す）。
【００２９】
したがって、本明細書において式（Ｉ）の化合物のＲ３などの置換基がリン脂質であると述べられているとき、リン脂質基が、その構造によって指定されるように別の基に、例えば、本明細書に開示するようなＮ−ベンジル複素環式環系に結合されていることを意味する。リン脂質基の結合点は、構造的図示によるなど、特に別の指定がない限り、任意の化学的に実行可能な位置であってよい。例えば、上に示したリン脂質構造において、別の化学部分への結合点は、例えば、他の化学部分のカルボニル基への結合によるアミド基、例えば、
【００３０】
【化６】
2013525431.tif 000008
（式中、Ｒは、リン脂質が結合する他の化学部分を表す）
として、エタノールアミン窒素原子を介するものであってもよい。この結合されたアミド誘導体において、Ｒ１３基は、プロトンであることもあり、またはナトリウムイオンなどの対イオンと結合している負電荷であることもある。アルカノールアミン基のアシル化窒素原子は、もはや塩基性アミンではなく中性アミドであり、それ自体、生理ｐＨではプロトン化されない。
【００３１】
「アシル」基は、この用語が本明細書において用いられる場合、カルボニル基を保有する有機構造をいい、カルボニル基を介して、その構造が、例えば、「カルボン酸エステル」基を形成する、リン脂質のグリセロールヒドロキシル基に結合される。アシル基の例として、脂肪酸基、例えばオレオイル基、が挙げられ、従って、グリセロールヒドロキシル基とともに脂肪（例えば、オレオイル）エステルを形成する。したがって、Ｒ１１またはＲ１２が、両方ともではないが、アシル基であるとき、上に示したリン脂質は、モノ−カルボン酸エステルであり、およびＲ１１とＲ１２の両方がアシル基であるとき、上に示したリン脂質は、ジ−カルボン酸エステルである。
【００３２】
本発明の中では、式（Ｉ）の化合物またはその塩が、いずれか一方の原子が共有結合を形成する二原子間の水素原子の交換により２つの化合物が容易に相互変換できる互変異性現象を示すことがあることは、理解されるべきである。互変異性化合物は、互いに可動性の（ｍｏｂｉｌｅ）平衡状態で存在するので、それらを同じ化合物の異なる異性体形態と見なすことができる。本明細書中の式の描画が、可能な互変異性体形態のうちの１つだけを表す場合があることは、理解されるべきである。しかし、本発明が、任意の互変異性体形態を包含すること、かつ式の描画の中で用いられているいずれか一方の互変異性体形態だけに限定されないことも、理解されるべきである。本明細書中の式の描画は、可能な互変異性体形態の一方だけを表す場合があるが、本明細書が、本明細書に図示するのに好都合であった形態だけでなく、描かれている化合物のすべての可能な互変異性体形態を包含することは理解されるべきである。例えば、互変異性は、波線により示されるように結合したピラゾリル基によって示されることがある。両方の置換基が、４−ピラゾリル基と呼ばれるだろうが、異なる窒素原子がそれぞれの構造で水素原子を保有することは明らかである。
【００３３】
【化７】
2013525431.tif 000009
そのような互変異性は、置換ピラゾール、例えば、３−メチル、５−メチル、または３，５−ジメチルピラゾールなどでも起こり得る。互変異性のもう１つの例は、アミド−イミド（環式のときは、ラクタム−ラクチム）互変異性であり、例えば、環窒素原子に隣接する環酸素原子を保有する複素環式化合物において見られる。例えば、平衡：
【００３４】
【化８】
2013525431.tif 000010
は、互変異性の一例である。したがって、本明細書において一方の互変異性体として描写される構造は、他方の互変異性体も含むように意図される。
【００３５】
光学異性
本発明の化合物が１以上のキラル中心を含有するとき、該化合物は、純粋なエナンチオマー形態もしくはジアステレオマー形態でまたはラセミ混合物で存在することがあり、および純粋なエナンチオマー形態もしくはジアステレオマー形態としてまたはラセミ混合物として単離することができる。したがって、本発明は、本発明の化合物のあらゆる可能なエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ化合物またはそれらの混合物を含む。
【００３６】
キラル中心の存在の結果として生ずる異性体は、「エナンチオマー」と呼ばれる１対の重ね合わせることができない異性体を含む。純粋な化合物の単一のエナンチオマーは、光学的に活性である、すなわち、それらは、直線偏光の面を回転させることができる。単一のエナンチオマーは、ＣａｈｎーＩｎｇｏｌｄーＰｒｅｌｏｇシステムに従って示される。置換基の優先度は、原子量に基づいて順位付けされ、系統的手順によって決定して原子量が高いほど優先順位が高い。４つの基の優先順位が決定されると、分子は、最低順位の基が見る人から離れた方向に向くように配向される。このとき、他の基の降順の優先順位が右回りに進む場合、その分子は（Ｒ）と指定され、他の基の降順の優先順位が左回りに進む場合、その分子は（Ｓ）と指定される。スキーム１４における例において、ＣａｈｎーＩｎｇｏｌｄーＰｒｅｌｏｇ順位付けは、Ａ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｄである。最低順位の原子Ｄは、見る人から離れた方向に配向される。
【００３７】
【化９】
2013525431.tif 000011
本発明は、ジアステレオマー、ならびにそれらのラセミ形態および分割された、ジアステレオマー的におよびエナンチオマー的に純粋な形態、ならびにそれらの塩を包含するものとする。ジアステレオマー対は、順および逆相クロマトグラフィーならびに結晶化をはじめとする公知の分離技術によって分割され得る。
【００３８】
「単離された光学異性体」は、同じ式の対応する光学異性体（単数または複数）から実質的に精製された化合物を意味する。一実施形態では、単離された異性体は、重量で、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも９０％、９８％または９９％純粋である。
【００３９】
単離された光学異性体は、周知のキラル分離技術によってラセミ混合物から精製され得る。そのような方法に従って、本発明の化合物のラセミ混合物、またはそのキラル中間体は、適したキラルカラム、例えば、カラムのＤＡＩＣＥＬ（登録商標）ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ファミリーのシリーズ（ダイセル化学工業株式会社（Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）、日本、東京都）のメンバーを使用して、ＨＰＬＣによって９９％（重量％）純粋な光学異性体に分離される。前記カラムは、その製造業者の使用説明書に従って作動される。
【００４０】
本明細書において、「薬学的に受容可能な塩」は、親化合物が、その酸性塩または塩基性を作製することによって修飾されている、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に受容可能な塩の例として、それらだけには限られないが、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが挙げられる。薬学的に受容可能な塩として、例えば、非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性の塩または第四級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、このような従来の非毒性塩として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などといった無機酸に由来するもの；酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、ベヘン酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸などといった有機酸から調製される塩が挙げられる。
【００４１】
本発明において有用な化合物の薬学的に受容可能な塩は、塩基性部分または酸性部分を含む親化合物から、従来の化学的な方法によって合成してもよい。通常、このような塩は、水中、または有機溶媒中、またはこれら２つの混合物中で（通常、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルのような非水性媒体が使用され得る）、これらの化合物の遊離酸または塩基の形態を、化学量論量の適当な塩基または酸と反応させることによって調製できる。適した塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１４１８頁（１９８５年）において見られ、その開示内容は参考として本明細書に援用される。
【００４２】
本明細書に記載される式の化合物は、溶媒和物であることがあり、いくつかの実施形態では、水和物であることがある。用語「溶媒和物」は、固体化合物であって、その固体構造と結合している１以上の溶媒分子を有するものである固体化合物を指す。化合物が溶媒から結晶化されると、溶媒和物が形成し得る。１以上の溶媒分子が、凝固の際に固体結晶質マトリックスの一体部分になると、溶媒和物が形成する。本明細書に記載される化合物は、溶媒和物、例えば、エタノール溶媒和物であり得る。溶媒和物のもう１つのタイプが水和物である。同様に、「水和物」は、固体化合物であって、その固体または結晶構造と分子レベルで密接に結合している１以上の水分子を有する固体化合物を指す。化合物が水中で凝固または結晶化され、そこで１以上の水分子がその固体結晶質マトリックスの不可欠な部分になると、水和物が形成し得る。
【００４３】
語句「薬学的に受容可能な」は、本明細書において、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー性反応またはその他の問題または妥当な損益比に見合った合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適している、化合物、物質、組成物および／または投与形態を指すよう使用される。
【００４４】
特に断りのない限り、以下の定義が用いられる：ハロまたはハロゲンは、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードである。アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニルなどは、直鎖基および分岐基の両方を表すが、「プロピル」などの個々の基への言及は、直鎖基のみを包含し、「イソプロピル」などの分枝鎖異性体は具体的に言及される。アリールは、フェニル基または約９〜１０個の環原子を有し、少なくとも一方の環が芳香族であるオルト縮合した二環式炭素環式基を表す。Ｈｅｔは、ヘテロアリールであり得、これは、炭素および非過酸化物酸素（ｎｏｎ−ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｏｘｙｇｅｎ）、硫黄およびＮ（Ｘ）（ここで、Ｘは、存在しないか、Ｈ、Ｏ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、フェニルまたはベンジルである）からなる群から各々選択される１〜４個のヘテロ原子からなる５または６個の環原子を含有する単環式芳香族環の環炭素を介して結合している基、ならびに特にベンズ誘導体またはプロピレン、トリメチレンもしくはテトラメチレンジラジカルを縮合することよって誘導されたものに由来する約８〜１０個の環原子のオルト縮合した二環式複素環の基を包含する。
【００４５】
当業者には当然のことであるが、キラル中心を有する本発明の化合物は、光学的に活性な形態およびラセミ形態で存在し、単離され得る。多形を示す化合物もある。本発明は、本明細書に記載される有用な特性を有する、本発明の化合物の任意のラセミ形態、光学的に活性な形態、多形の形態もしくは立体異性体の形態、またはそれらの混合物を包含すると理解されるべきであり、光学的に活性な形態を調製する方法（例えば、再結晶化技術によるラセミ形態の分割によって、光学的に活性な出発物質からの合成によって、キラル合成によって、またはキラル固定相を用いるクロマトグラフィー分離によって）および本明細書に記載される標準試験を用いて、または当技術分野でよく知られているその他の同様の試験を用いてアゴニスト活性を決定する方法は、当技術分野でよく知られている。当業者ならば、本明細書に記載される化合物は、互いに種々の平衡状態で存在し得る、その種々の互変異性体を含むということも理解する。
【００４６】
本明細書において用語「処置する」および「処置すること」は、（ｉ）病的状態が発生するのを防ぐこと（例えば、予防）；（ｉｉ）病的状態を抑制することまたはその進行を停止させること；（ｉｉｉ）病的状態を軽減すること；ならびに／または（ｉｖ）状態の症状を改善すること、緩和すること、和らげることおよび除去することを指す。本明細書に記載される候補分子または化合物は、処方物または医薬中に一定量で存在することができ、この量は、例えば、生物学的効果をもたらすことができる、または状態、例えば、疾患の症状を改善すること、緩和すること、和らげること、軽減すること、減少させることもしくは除去することをもたらし得る量である。これらの用語はまた、細胞増殖速度を低減させることもしくは停止させること（例えば、腫瘍成長を遅延させることもしくは止めること）または増殖する癌細胞の数を低減させること（例えば、腫瘍の一部もしくはすべてを除去すること）をいう場合がある。これらの用語はまた、微生物に感染した系（例えば、細胞、組織もしくは被験体）における微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）（微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ））の力価を低減させること、微生物増殖速度を低減させること、微生物感染に関連した症状の数もしくは症状の影響を低減させること、および／またはその系から検出可能な量の微生物の除去することに適用される。微生物の例として、それらだけには限られないが、ウイルス、細菌および真菌が挙げられる。
【００４７】
本明細書において、用語「治療上有効な量」は、被験体において疾患もしくは障害を処置もしくは予防するための、または疾患もしくは障害の症状を処置するための、化合物の量または化合物の組み合わせの量を指す。本明細書において、用語「被験体」および「患者」は、本明細書に記載される方法による処置（例えば、化合物の投与）を受ける、または受けた個体を一般にいう。
【００４８】
「安定な化合物」および「安定な構造」とは、反応混合物からの有用な程度の純度への単離、および有効な治療剤への処方を乗り越えるのに十分に堅固である化合物を示すものとする。安定な化合物のみが、本発明によって考慮される。
【００４９】
ＴＬＲ７アゴニストおよび結合体ならびにそれらの使用
種々の実施形態において、本発明は、哺乳動物において微生物感染または状態、例えば、炎症に関連したもの、を予防、抑制または処置するための方法を提供する。これらの方法は、一定量の、式（Ｉ）：
【００５０】
【化１０】
2013525431.tif 000012
の化合物もしくはその互変異性体；
またはそれらの薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物
を含む有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与する工程を包含し、式中、
Ｘ１は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲｃ−であり；
Ｒ１は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｃ６〜１０アリール、または置換Ｃ６〜１０アリール、Ｃ５〜９複素環、置換Ｃ５〜９複素環であり；
Ｒｃは、水素、Ｃ１〜１０アルキル、もしくは置換Ｃ１〜１０アルキルであるか；またはＲｃおよびＲ１は、それらが結合している窒素と一緒になって、複素環式環もしくは置換複素環式環を形成し；
各Ｒ２は、独立に、−ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（アルカノイル）、置換−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（アロイル）、置換−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ（カルボキシル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（アルコキシカルボニル）、置換−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ（カルバモイル）、ハロ、ニトロもしくはシアノであるか、またはＲ２は不在であり；
各ＲａおよびＲｂは、独立に、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、置換（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイル、アリール、アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニルであり；ここで、
任意のアルキル基、アリール基または複素環式基上の置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルキル、ヒドロキシＣ１〜６アルキレン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキレン、アミノ、シアノ、ハロまたはアリールであり；
ｎは、０、１、２、３または４であり；
Ｘ２は、結合または連結基であり；ならびに
Ｒ３は、１または２個のカルボン酸エステルを含むリン脂質である。
場合により、前記組成物は、抗原をさらに含む。一実施形態において、抗原を有する組成物は、式（Ｉ）の化合物を有する組成物の投与と同時に、投与より前にまたは後に、投与される。
【００５１】
例えば、Ｒ３は、式
【００５２】
【化１１】
2013525431.tif 000013
の基を含み得、式中、Ｒ１１およびＲ１２は、各々独立に、水素またはアシル基であり、Ｒ１３は、負電荷または水素であり、ならびにｍは、１から８であり；波線は、結合の位置を示し；ＯＲ１２を保有する炭素原子での絶対配置は、Ｒ、Ｓまたはそれらの任意の混合である。
【００５３】
例えば、ｍは、１であり、その結果、グリセロホスファチジルエタノールアミンを与えることがある。さらに具体的には、Ｒ１１およびＲ１２は、各々、オレオイル基であり得る。
【００５４】
種々の実施形態において、Ｒ３のリン脂質は、２個のカルボン酸エステルを含むことがあり、各カルボン酸エステルは、１、２、３または４部位の不飽和、エポキシ化、水酸化またはそれらの組み合わせを含む。
【００５５】
種々の実施形態において、Ｒ３のリン脂質は、２個のカルボン酸エステルを含むことがあり、それらのカルボン酸エステルは、同じであるか、または異なる。さらに具体的には、前記リン脂質の各カルボン酸エステルは、Ｃ８−Ｃ９に不飽和部位を有するＣ１７カルボン酸エステルであり得る。あるいは、前記リン脂質の各カルボン酸エステルは、Ｃ９−Ｃ１０に不飽和部位を有するＣ１８カルボン酸エステルであり得る。
【００５６】
種々の実施形態において、Ｘ２は、結合であるか、または鎖内に１から約１０個の原子を有する鎖であり得、ここで、該鎖の原子は、炭素、窒素、硫黄および酸素からなる群より選択され、任意の炭素原子がオキソで置換されていることがあり、そして任意の硫黄原子が１または２個のオキソ基で置換されていることがある。前記鎖には、１個以上のシクロアルキル、アリール、ヘテロシクリルまたはヘテロアリール環が散在していることがある。
【００５７】
種々の実施形態において、Ｘ２は、Ｃ（Ｏ）であり得るか、または
【００５８】
【化１２】
2013525431.tif 000014
のいずれかであり得る。
【００５９】
種々の実施形態において、Ｒ３は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）であり得る。
【００６０】
種々の実施形態において、Ｒ３は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンであり得、およびＸ２は、Ｃ（Ｏ）であり得る。
【００６１】
種々の実施形態において、Ｘ１は、酸素であり得る。
【００６２】
種々の実施形態において、Ｘ１は、硫黄であり得るか、または−ＮＲｃ−（ここで、Ｒｃは、水素、Ｃ１〜６アルキルまたは置換Ｃ１〜６アルキルであり、該アルキル置換基は、ヒドロキシ、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、アミノ、シアノもしくはアリールである）であり得る。さらに具体的には、Ｘ１は、−ＮＨ−であり得る。
【００６３】
種々の実施形態において、Ｒ１およびＲｃは一緒になって、複素環式環または置換複素環式環を形成し得る。さらに具体的には、Ｒ１およびＲｃは一緒になって、置換または非置換のモルホリノ、ピペリジノ、ピロリジノまたはピペラジノ環を形成し得る。
【００６４】
種々の実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１〜６アルコキシで置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキルであり得る。
【００６５】
種々の実施形態において、Ｒ１は、水素、Ｃ１〜４アルキルまたは置換Ｃ１〜４アルキルであり得る。さらに具体的には、Ｒ１は、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヒドロキシＣ１〜４アルキレンまたはＣ１〜４アルコキシＣ１〜４アルキレンであり得る。さらにいっそう具体的には、Ｒ１は、水素、メチル、エチル、メトキシエチルまたはエトキシエチルであり得る。
【００６６】
種々の実施形態において、Ｒ２は、不在であり得るか、またはＲ２は、ハロゲンもしくはＣ１〜４アルキルであり得る。さらに具体的には、Ｒ２は、クロロ、ブロモ、メチルまたはエチルであり得る。
【００６７】
種々の実施形態において、Ｘ１は、Ｏであり得、Ｒ１は、Ｃ１〜４アルコキシ−エチルであり得、ｎは、１であり得、Ｒ２は、水素であり得、Ｘ２は、カルボニルであり得、およびＲ３は、１，２−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）であり得る。
【００６８】
種々の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、
【００６９】
【化１３】
2013525431.tif 000015
であり得る。
【００７０】
種々の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、上の構造のＲ−エナンチオマー：
【００７１】
【化１４】
2013525431.tif 000016
であり得る。
【００７２】
種々の実施形態において、前記微生物は、細菌であり、すなわち、前記抗原は、細菌胞子を含み得る。
【００７３】
種々の実施形態において、前記量は、感染を予防するのに有効である。
【００７４】
種々の実施形態において、前記哺乳動物は、ヒトであり得る。
【００７５】
種々の実施形態において、前記組成物を鼻腔内投与することができ、または皮膚に投与することができる。
【００７６】
種々の実施形態において、ＩＶ２７０などのリン脂質結合体は、ＷＯ  ２０１０／０８３３３７に記載されているもの（この開示内容は、参考として本明細書に援用される）などのナノ粒子に組み込まれ得る。
【００７７】
種々の実施形態において、ＩＶ２７０などのリン脂質結合体は、水性媒体中の、脂質および／またはリン脂質との組み合わせでの上記リン脂質結合体のナノ粒子懸濁物の形態（例えば、ナノリポソーム）で調製され得る。ナノリポソームは、サブミクロンの二重層脂質小胞である（Ｍｏｚａｆａｒｉによる、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６０５巻、Ｖ．Ｗｅｉｓｓｉｎｇ（編集）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓにおける第２章を参照のこと；この開示内容は参考として本明細書に援用される）。ナノリポソームは、より大きな表面積を提供し、ならびに溶解度、バイオアベイラビリティーおよびターゲッティングを増加させることができる。
【００７８】
脂質は、種々のヘッド基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）部分を有する脂肪酸誘導体である。トリグリセリドは、３個の脂肪酸および１個のグリセロール分子（各炭素原子上にヒドロキシル基［ＯＨ］を有する三炭素アルコール）から作製される脂質である。モノ−およびジグリセリドは、脂肪酸のグリセリルモノ−およびジ−エステルである。リン脂質は、グリセロール分子の第一のヒドロキシルが、脂肪酸の代わりに極性ホスフェート含有基を有することを除いて、トリグリセリドと同様である。リン脂質は、両親媒性であり、親水性（水溶性）の基と疎水性（脂溶性）の基の両方を有する。リン脂質のヘッド基は、親水性であり、その脂肪酸テール（アシル鎖）は、疎水性である。ヘッド基のホスフェート部分は、負に荷電している。
【００７９】
脂質および／またはリン脂質分子に加えて、ナノリポソームは、それらの構造内にステロールなどの他の分子を含有し得る。ステロールは、殆どの天然膜の重要な成分であり、ナノリポソーム二重層へのステロールの組み込みは、これらの小胞の特性の大きな変化をもたらし得る。脂質小胞の製造に最も広範に使用されているステロールは、コレステロール（Ｃｈｏｌ）である。コレステロールは、単独では二重層構造を形成しないが、それをリン脂質膜に非常に高濃度で、例えば、１：１までのモル比またはさらには２：１までのモル比のコレステロール  対  リン脂質（例えばホスファチジルコリン（ＰＣ））で組み込むことができる（１１）。コレステロールは、ナノリポソーム構造において、脂質二重層の流動性を調節することによりそれらの小胞の安定性を増加させるために使用される。一般に、コレステロールは、リン脂質のアシル鎖の結晶化を防止することおよびそれらの移動に対する立体障害をもたらすことによってリン脂質膜の流動性を調節する。これは、ナノリポソームの安定性に寄与し、脂質膜の溶質に対する透過性を低減させる。
【００８０】
ナノリポソームの物理化学的特性は、ｐＨ、イオン強度および温度をはじめとするいくつかの要因に依存する。一般に、脂質小胞は、捕捉された材料に対して低い透過性を示す。しかし、高温では、それらは、それらの透過性を変える相転移を受ける。ナノリポソームのリン脂質成分は、重要な熱特性を有する、すなわち、それらは、それらの最終的な融点（Ｔｍ）より低い温度で相転移（Ｔｃ）を受け得る。ゲル−液晶転移温度としても公知であるＴｃは、脂質二重層がその規則的なパッキングの大半を失う一方でその流動性が増加する温度である。リン脂質化合物および脂質二重層の相転移温度は、次のパラメータに依存する：極性ヘッド基；アシル鎖の長さ；炭化水素鎖の飽和度；ならびに懸濁媒体の性質およびイオン強度。一般に、Ｔｃは、鎖長減少によって、アシル鎖の不飽和によって、ならびに分岐鎖および嵩高いヘッド基（例えば、シクロプロパン環）の存在によって低下される。
【００８１】
水和されたリン脂質分子は、それら自体で、ファンデルワールスおよび親水性／疎水性相互作用によって二重層構造の形態に配列する。この過程で、リン脂質分子の親水性ヘッド基は、水相のほうを向き、一方、単層の各々の疎水性領域は、その膜の中間で互いと向き合う。リポソームおよびナノリポソームの形成が、自発的な過程でないこと、およびエネルギー障壁を克服するために十分なエネルギーを系に投入しなければならないことに留意されるべきである。言い換えると、適切な量のエネルギーが供給されると、レシチンなどのリン脂質が水中に入ったときに脂質小胞が形成され、その結果として二重層構造を形成する。エネルギーの（例えば、超音波処理、均質化、加熱などの形態での）投入は、結果として、二重層小胞の形態に脂質分子を配列させて、水性相における熱力学的平衡を達成する。
【００８２】
例えば、コレステロールなどの脂質またはホスファチジルコリンなどのリン脂質との混合物としてＩＶ２７０などの本発明の化合物を含む組成物を、ナノ粒子形態に分散させることができ、この場合、脂質またはリン脂質ナノ粒子は、それらと結合したＴＬＲ７リガンド結合体を含有する。ナノ粒子組成物とは、ナノ粒子を含む組成物を意味し、ナノ粒子は、この用語が本明細書において用いられる場合、直径が約１〜１０００ｎｍの粒子をいう。下の実施例ＩＶにおいて論ずるように、ナノ粒子／ナノリポソーム組成物は、ＩＶ２７０およびホスファチジルコリン調製物Ｐｈｏｓａｌ  ５０  ＰＧ（登録商標）を使用して調製される。
【００８３】
一実施形態において、本発明は、ＴＬＲアゴニストの活性が、関係しており、その作用が望まれる、ヒトなどの哺乳動物における病状または症状を予防または処置するための予防的または治療的方法を提供する。本方法は、このような治療を必要とする哺乳動物に、抗原および有効量の本発明の結合体またはその薬学的に受容可能な塩を投与する工程を含む。処置に適している病状または症状の限定されない例として、癌、微生物感染または疾患、例えば皮膚もしくは膀胱の疾患が挙げられる。一実施形態では、本発明の結合体を、細菌、ウイルス、癌細胞または癌特異的ペプチドに対するワクチンを調製するために、ＣＮＳ刺激薬として、または生物テロ防御のために使用することができる。したがって、本発明は、医学療法において単独でまたは他の治療薬とともに使用するための（例えば、抗癌剤として、細菌性疾患を予防、抑制または処置するために、Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎などのウイルス性疾患を予防、抑制または処置するために、および一般に、免疫応答を増強するための薬剤として使用するための）結合体を提供する。
【００８４】
一実施形態では、本発明は、有効量の癌抗原および本発明のＴＬＲ７アゴニストリン脂質結合体を投与することによって癌を予防、抑制または処置するための方法を提供する。この癌は、インターフェロン感受性癌、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、黒色腫または腎臓癌などであり得る。処置され得る特定の癌として、黒色腫、表在型膀胱癌、日光角化症、上皮内新生物および基底細胞皮膚癌、扁平上皮などが挙げられる。さらに、本発明の方法は、例えば、日光角化症または上皮内新生物、家族性ポリポーシス（ポリープ）、子宮頚部異形成、子宮頸癌、表在型膀胱癌、および感染と関連している任意のその他の癌（例えば、リンパ腫カポジ肉腫または白血病）などといった前癌状態のための処置を含む。
【００８５】
一実施形態では、本発明は、哺乳動物に、グラム陽性菌の細菌抗原と一定量の合成ＴＬＲ７アゴニストリン脂質結合体とを含む有効量の組成物を投与する工程を含む、哺乳動物においてグラム陽性菌感染を予防または抑制するための方法を提供する。一実施形態では、合成ＴＬＲ７アゴニストリン脂質結合体は、炭疽菌の１種以上の抗原とともに投与される。一実施形態では、合成ＴＬＲ７アゴニストリン脂質結合体は、黄色ブドウ球菌の１種以上の抗原とともに投与される。表１は、黄色ブドウ球菌の例示的抗原を提供する。本発明のワクチンは、迅速かつ効果的な免疫応答を予想外に提供し得る。
【００８６】
【表１】
2013525431.tif 000017
本発明のＴＬＲ７アゴニストリン脂質結合体またはそのような化合物の薬学的に受容可能な塩を含む処置に適しているだろう他の障害として、それらだけには限られないが、多発性硬化症、狼瘡、関節リウマチ、クローン病などが挙げられる。
【００８７】
ＴＬＲアゴニスト結合体は、例えばＴＬＲ７アゴニストから形成される、ホモ官能性ＴＬＲアゴニストを含み得る。ＴＬＲアゴニストは、７−チア−８−オキソグアノシニル（ＴＯＧ）部分、７−デアザグアノシニル（７ＤＧ）部分、レシキモド部分またはイミキモド部分であり得る。別の実施形態では、ＴＬＲアゴニスト結合体は、ヘテロ官能性ＴＬＲアゴニストポリマーを含み得る。ヘテロ官能性ＴＬＲアゴニストポリマーは、ＴＬＲ７アゴニストおよびＴＬＲ３アゴニストまたはＴＬＲ９アゴニスト、または３種すべてのアゴニストを含み得る。
【００８８】
一実施形態では、本発明は、以下：
【００８９】
【化１５】
2013525431.tif 000018
の結合体もしくはその互変異性体またはその薬学的に受容可能な塩を提供し、式中
Ｘ１は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲｃ−であり；
ここで、Ｒｃは、水素、Ｃ１〜１０アルキルもしくはＣ３〜６シクロアルキルによって置換されたＣ１〜１０アルキルであるか、またはＲｃおよびＲ１は、窒素原子と一緒になって、複素環式環もしくは置換複素環式環を形成してもよく、ここで、置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルキル、ヒドロキシＣ１〜６アルキレン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキレンまたはシアノであり；
Ｒ１は、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｃ６〜１０アリールまたは置換Ｃ６〜１０アリール、Ｃ５〜９複素環、置換Ｃ５〜９複素環であり；ここで、アルキル、アリールまたは複素環式基上の置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルキル、ヒドロキシＣ１〜６アルキレン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキレン、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールであり；
各Ｒ２は、独立に、−ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（アルカノイル）、置換−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（アロイル）、置換−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ（カルボキシル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（アルコキシカルボニル）、置換−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ（カルバモイル）、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン−ＮＲａＲｂ、−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、ハロ、ニトロまたはシアノであり；
各ＲａおよびＲｂは、独立に、水素、（Ｃ１〜６）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜６６）アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜６）アルキル、（Ｃ１〜６）アルカノイル、ヒドロキシ（Ｃ１〜６）アルキル、アリール、アリール（Ｃ１〜６）アルキル、アリール、アリール（Ｃ１〜６）アルキル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ（Ｃ１〜６）アルキルまたは（Ｃ１〜６）アルコキシカルボニルであり；Ｘ２は、結合または連結基であり；Ｒ３は、１つまたは２つのカルボン酸エステルを含むリン脂質であり；ｎは、０、１、２、３または４である。
【００９０】
化合物が、酸性塩または塩基性塩を形成するのに十分に塩基性または酸性である場合には、塩としての化合物の使用は適当であり得る。受容可能な塩の例として、生理学的に受容可能な陰イオンを形成する酸を用いて形成される有機酸付加塩、例えば、トシレート、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩およびα−グリセロリン酸塩がある。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩および炭酸塩をはじめとする、適した無機塩もまた形成され得る。
【００９１】
受容可能な塩は、当技術分野で周知の標準手順を用いて、例えば、アミンなどの十分に塩基性の化合物を、生理学的に受容可能な陰イオンを与える適した酸と反応させることによって得てもよい。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムもしくはリチウム）またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩も作製してよい。
【００９２】
アルキルとして、直鎖または分岐Ｃ１〜１０アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、１−メチルプロピル、３−メチルブチル、ヘキシルなどが挙げられる。
【００９３】
低級アルキルとして、直鎖または分岐Ｃ１〜６アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピルなどが挙げられる。
【００９４】
用語「アルキレン」とは、二価直鎖または分岐炭化水素鎖（例えば、エチレン：−ＣＨ２−ＣＨ２−）を指す。
【００９５】
Ｃ３〜７シクロアルキルとして、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなど、およびアルキル置換Ｃ３〜７シクロアルキル基、好ましくは、直鎖または分岐Ｃ１〜６アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはペンチルおよびＣ５〜７シクロアルキル基、例えば、シクロペンチルまたはシクロヘキシルなどといった基が挙げられる。
【００９６】
低級アルコキシとして、Ｃ１〜６アルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシまたはプロポキシなどが挙げられる。
【００９７】
低級アルカノイルとして、Ｃ１〜６アルカノイル基、例えば、ホルミル、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、ペンタノイルまたはヘキサノイルなどが挙げられる。
【００９８】
Ｃ７〜１１アロイルとして、ベンゾイルまたはナフトイルなどの基が挙げられる。
【００９９】
低級アルコキシカルボニルとして、Ｃ２〜７アルコキシカルボニル基、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニルまたはプロポキシカルボニルなどが挙げられる。
【０１００】
低級アルキルアミノ基とは、Ｃ１〜６アルキル基によって置換されたアミノ基、例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、ブチルアミノなどを意味する。
【０１０１】
ジ（低級アルキル）アミノ基とは、同一または異なるＣ１〜６アルキル基で置換されたアミノ基（例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ）を意味する。
【０１０２】
低級アルキルカルバモイル基とは、Ｃ１〜６アルキル基によって置換されたカルバモイル基（例えば、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、プロピルカルバモイル、ブチルカルバモイル）を意味する。
【０１０３】
ジ（低級アルキル）カルバモイル基とは、同一または異なるＣ１〜６アルキル基によって置換されたカルバモイル基（例えば、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル）を意味する。
【０１０４】
ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子などのハロゲン原子を意味する。
【０１０５】
アリールとは、Ｃ６〜１０単環式または縮合環状アリール基、例えば、フェニル、インデニルまたはナフチルなどを指す。
【０１０６】
複素環の、または複素環とは、少なくとも１個のヘテロ原子、例えば、０〜３個の窒素原子ＮＲＣ、０〜１個の酸素原子（−Ｏ−）および０〜１個の硫黄原子（−Ｓ−）を含有する、単環式飽和複素環式基または不飽和単環式または縮合複素環式基を指す。飽和単環式複素環式基の限定されない例として、５または６員の飽和複素環式基、例えば、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、モルホリニル、ピペリジル、ピペラジニルまたはピラゾリジニルが挙げられる。不飽和単環式複素環式基の限定されない例として、５または６員の不飽和複素環式基、例えば、フリル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、チエニル、ピリジルまたはピリミジニルが挙げられる。不飽和縮合複素環式基の限定されない例として、不飽和二環式複素環式基、例えば、インドリル、イソインドリル、キノリル、ベンゾチゾリル、クロマニル、ベンゾフラニルなどが挙げられる。Ｈｅｔ基は、飽和複素環式基または不飽和複素環式基、例えば、ヘテロアリール基であり得る。
【０１０７】
ＲｃおよびＲ１は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、複素環式環を形成してもよい。複素環式環の限定されない例として、５または６員の飽和複素環式環、例えば、１−ピロリジニル、４−モルホリニル、１−ピペリジル、１−ピペラジニルまたは１−ピラゾリジニル、５または６員の不飽和複素環式環、例えば、１−イミダゾリルなどが挙げられる。
【０１０８】
Ｒ１のアルキル、アリール、複素環式基は、１以上の置換基で場合により置換されていてもよく、ここで置換基は、同一であっても異なっていてもよく、低級アルキル；シクロアルキル、ヒドロキシル；ヒドロキシＣ１〜６アルキレン、例えば、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチルまたは３−ヒドロキシプロピル；低級アルコキシ；Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキル、例えば、２−メトキシエチル、２−エトキシエチルまたは３−メトキシプロピル；アミノ；アルキルアミノ；ジアルキルアミノ；シアノ；ニトロ；アシル；カルボキシル；低級アルコキシカルボニル；ハロゲン；メルカプト；Ｃ１〜６アルキルチオ、例えば、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオまたはブチルチオ；置換Ｃ１〜６アルキルチオ、例えば、メトキシエチルチオ、メチルチオエチルチオ、ヒドロキシエチルチオまたはクロロエチルチオ；アリール；置換Ｃ６〜１０単環式または縮合環状アリール、例えば、４−ヒドロキシフェニル、４−メトキシフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニルまたは３，４−ジクロロフェニル；５〜６員の不飽和複素環、例えば、フリル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、チエニル、ピリジルまたはピリミジニル；および二環式不飽和複素環、例えば、インドリル、イソインドリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、クロマニル、ベンゾフラニルまたはフタリミノを含む。特定の実施形態では、１以上の上記の基が、式の種々のその他の基の置換基として明確に排除される場合もある。
【０１０９】
Ｒ２のアルキル、アリール、複素環式基は、１以上の置換基で場合により置換されていてもよく、ここで、置換基は、同一であっても異なっていてもよく、ヒドロキシル；Ｃ１〜６アルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシまたはプロポキシ；カルボキシル；Ｃ２〜７アルコキシカルボニル、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニルまたはプロポキシカルボニル）およびハロゲンを含む。
【０１１０】
Ｒｃのアルキル、アリール、複素環式基は、１以上の置換基で場合により置換されていてもよく、ここで、置換基は、同一であっても異なっていてもよく、Ｃ３〜６シクロアルキル；ヒドロキシル；Ｃ１〜６アルコキシ；アミノ；シアノ；アリール；置換アリール、例えば、４−ヒドロキシフェニル、４−メトキシフェニル、４−クロロフェニルまたは３，４−ジクロロフェニル；ニトロおよびハロゲンを含む。
【０１１１】
ＲｃおよびＲ１およびそれらが結合している窒素原子と一緒になって形成された複素環式環は、１以上の置換基で場合により置換されていてもよく、ここで、置換基は同一であっても異なっていてもよく、Ｃ１〜６アルキル；ヒドロキシＣ１〜６アルキレン；Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキレン；ヒドロキシル；Ｃ１〜６アルコキシ；およびシアノを含む。Ｘ１の特定の値は、硫黄原子、酸素原子または−ＮＲｃ−である。
【０１１２】
別の特定のＸ１は、硫黄原子である。
【０１１３】
別の特定のＸ１は、酸素原子である。
【０１１４】
別の特定のＸ１は、−ＮＲｃ−である。
【０１１５】
別の特定のＸ１は、−ＮＨ−である。
【０１１６】
Ｒｃの特定の値は、水素、Ｃ１〜４アルキルまたは置換Ｃ１〜４アルキルである。
【０１１７】
一緒になったＲ１およびＲｃの特定の値は、それらが形成する場合には、複素環式環または置換複素環式環である。
【０１１８】
一緒になったＲ１およびＲｃの別の特定の値は、置換または非置換のモルホリノ、ピペリジノ、ピロリジノまたはピペラジノ環である。
【０１１９】
Ｒ１の特定の値は、水素、Ｃ１〜４アルキルまたは置換Ｃ１〜４アルキルである。
【０１２０】
別の特定のＲ１は、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、４−ヒドロキシブチル、２−アミノエチル、３−アミノプロピル、４−アミノブチル、メトキシメチル、２−メトキシエチル、３−メトキシプロピル、エトキシメチル、２−エトキシエチル、メチルチオメチル、２−メチルチオエチル、３−メチルチオプロピル、２−フルオロエチル、３−フルオロプロピル、２，２，２−トリフルオロエチル、シアノメチル、２−シアノエチル、３−シアノプロピル、メトキシカルボニルメチル、２−メトキシカルボニルエチル、３−メトキシカルボニルプロピル、ベンジル、フェネチル、４−ピリジルメチル、シクロヘキシルメチル、２−チエニルメチル、４−メトキシフェニルメチル、４−ヒドロキシフェニルメチル、４−フルオロフェニルメチルまたは４−クロロフェニルメチルである。
【０１２１】
別の特定のＲ１は、水素、ＣＨ３−、ＣＨ３−ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−、ヒドロキシＣ１〜４アルキレンまたはＣ１〜４アルコキシＣ１〜４アルキレンである。
【０１２２】
Ｒ１の別の特定の値は、水素、ＣＨ３−、ＣＨ３−ＣＨ２−、ＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−またはＣＨ３−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−である。
【０１２３】
Ｒ２の特定の値は、ハロゲンまたはＣ１〜４アルキルである。
【０１２４】
Ｒ２の別の特定の値は、クロロ、ブロモ、ＣＨ３−またはＣＨ３−ＣＨ２−である。
【０１２５】
アルキル、アリールまたは複素環式基上の置換のための特定の置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルキル、ヒドロキシＣ１〜６アルキレン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキレン、Ｃ３〜６シクロアルキル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである。
【０１２６】
Ｘ２の特定の値は、結合または最大約２４個の原子を有する鎖であり；ここで、その原子は、炭素、窒素、硫黄、非過酸化物酸素およびリンからなる群から選択される。任意の炭素原子がオキソ基を保有することがあり、任意の硫黄原子が１または２個のオキソ基を保有することがある。前記鎖には、１個以上のシクロアルキル、アリール、ヘテロシクリルまたはヘテロアリール環が散在していることがある。
【０１２７】
Ｘ２の別の特定の値は、結合または約４〜約１２個の原子を有する鎖である。
【０１２８】
Ｘ２の別の特定の値は、結合または約６〜約９個の原子を有する鎖である。
【０１２９】
Ｘ２の別の特定の値は、カルボニル（Ｃ（Ｏ））基である。
【０１３０】
Ｘ２の一定の限定されない例として、−（Ｙ）ｙ−、−（Ｙ）ｙ−Ｃ（Ｏ）Ｎ−（Ｚ）ｚ−、−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）Ｎ−（ＣＨ２）ｚ−、−（Ｙ）ｙ−ＮＣ（Ｏ）−（Ｚ）ｚ−、−（ＣＨ２）ｙ−ＮＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｚ−が挙げられ、ここで、各ｙ（下付き文字）およびｚ（下付き文字）は、独立に、０から２０であり、各ＹおよびＺは、独立に、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ  Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニルであり、該アルキル、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル（ａｌｋｃｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、Ｈｅｔ、アリールまたは複素環式基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである。一定の実施形態では、リンカーは、−Ｃ（Ｙ’）（Ｚ’）−Ｃ（Ｙ’’）（Ｚ’’）−リンカーであることもあり、ここで、各Ｙ’、Ｙ’’、Ｚ’およびＺ’’は、独立に、水素Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ  Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニルであり、前記アルキル、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル（ａｌｋｃｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、Ｈｅｔ、アリールまたは複素環式基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである。
【０１３１】
Ｘ２の別の特定の値は、以下である
【０１３２】
【化１６】
2013525431.tif 000019
Ｘ２の別の特定の値は、以下である
【０１３３】
【化１７】
2013525431.tif 000020
特定の抗原として、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、体物質、または、微生物などの細胞がある。
【０１３４】
特定のペプチドは、２〜約２０個のアミノ酸残基を有する。
【０１３５】
別の特定のペプチドは、１０〜約２０個のアミノ酸残基を有する。
【０１３６】
特定の抗原として、炭水化物が挙げられる。
【０１３７】
特定の抗原として、微生物がある。特定の微生物として、ウイルス、細菌または真菌がある。
【０１３８】
特定の細菌として、炭疽菌、リステリア菌、野兎病菌、サルモネラ属またはブドウ球菌属がある。特定のサルモネラ属として、ネズミチフス菌または腸炎菌がある。特定のブドウ球菌属として、黄色ブドウ球菌が挙げられる。
【０１３９】
特定のウイルスとして、ＲＳＶおよびインフルエンザウイルスをはじめとするＲＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスの産物またはヘルペスウイルスをはじめとするＤＮＡウイルスがある。特定のＤＮＡウイルスとして、Ｂ型肝炎ウイルスがある。
【０１４０】
本発明は、必要に応じて、抗原であっても抗原でなくてもいい他の活性薬剤（例えば、リバビリン、ミゾリビンおよびミコフェノール酸モフェチル）と組み合わせた、本発明のＴＬＲ７アゴニストリン脂質結合体を含む組成物を含む。その他の限定されない例が知られており、米国公開特許出願第２００５０００４１４４号に開示されている。
【０１４１】
本発明の化合物およびこれらの化合物のうちの１つ以上を有する処方物を調製するのに有用な中間体を調製するための方法は、本発明のさらなる実施形態として提供される。本発明の化合物を調製するのに有用な中間体もまた、本発明のさらなる実施形態として提供される。
【０１４２】
本発明の結合体を有する組成物の投与、例えば、本発明のリン脂質結合体と別の活性薬剤とを有する組成物の投与、または本発明のリン脂質結合体を有する組成物および別の活性薬剤を有する組成物の投与は、任意の適した投与経路、特に、非経口的に、例えば、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、髄腔内に、脳室内に、尿道内に、胸骨内に、頭蓋内に、筋肉内にまたは皮下によるものであり得る。このような投与は、単回ボーラス注射、複数回の注射として、または短期間もしくは長期間の注入としてであり得る。特定の処方物の同等の、または変動する投与量の時間をわたっての周期的な非経口送達のために、埋め込み可能なデバイス（例えば、埋め込み可能な注入ポンプ）を使用してもよい。このような非経口投与のために、本化合物（結合体または他の活性薬剤）は、水または別の適した溶媒または溶媒の混合物中の、滅菌溶液として処方され得る。溶液は、溶液を血液、酢酸、クエン酸および／またはリン酸およびそれらのナトリウム塩などの緩衝剤ならびに保存料と等張にするために、塩、糖（特にグルコースまたはマンニトール）などのその他の物質を含んでもよい。
【０１４３】
単独でまたはその他の活性薬剤と組み合わせでの本発明のリン脂質結合体は、薬学的組成物として処方し、選択された投与経路、すなわち、経口的に、または非経口的に、静脈内、筋肉内、局所または皮下経路に適合した種々の形態で、ヒト患者などの哺乳動物宿主に投与してよい。
【０１４４】
したがって、単独でのまたは別の活性薬剤、例えば抗原と組み合わせでの上記リン脂質は、薬学的に受容可能なビヒクル、例えば、不活性の希釈剤または同化可能な食用担体と組み合わせて、全身に、例えば、経口的に投与してよい。それらは、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤に圧縮してもよく、または患者の食事の食品と直接組み込んでもよい。経口治療的投与には、場合により活性化合物と組み合わせでの結合体を、１種以上の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用してもよい。このような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含まなければならない。組成物および調製物のパーセンテージは、もちろん、変わってもよく、所与の単位投与形態の重量の約２〜約６０％の間であり得ることが好都合である。このような有用な組成物中の結合体および場合によりその他の活性化合物の量は、有効投与量レベルが得られるようなものである。
【０１４５】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、以下：トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびスクロース、フルクトース、ラクトースもしくはアスパルテームなどの甘味剤またはペパーミント、ウィンターグリーン油などの矯味矯臭剤を含んでよく、またはチェリー香料（ｃｈｅｒｒｙ  ｆｌａｖｏｒｉｎｇ）を加えてもよい。単位投与形態がカプセル剤である場合、上記の種類の物質に加えて、さらに、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含み得る。コーティングとして、またはそうでなければ、固体単位投与形態の物理的形状を修飾するために、種々のその他の物質が存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、ゼラチン、ろう、シェラックまたは糖などでコーティングしてもよい。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、保存料としてメチルおよびプロピルパラベン、色素およびチェリーまたはオレンジ矯味矯臭薬（ｆｌａｖｏｒ）などの香料を含んでもよい。もちろん、任意の単位投与形態を調製するのに用いられる任意の物質は、薬学的に受容可能であり、使用される量で実質的に非毒性でなくてはならない。さらに、場合により別の活性化合物との組み合わせでの上記リン脂質結合体は、持続放出調製物およびデバイスに組み込んでもよい。
【０１４６】
場合により別の活性化合物との組み合わせでの上記リン脂質結合体はまた、注入または注射によって、静脈内に、または腹腔内に投与してよい。場合により別の活性化合物またはその塩との組み合わせでの上記リン脂質結合体の溶液は、非毒性界面活性剤と場合により混合されていてもよい水で調製してもよい。分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチンおよびそれらの混合物中で、かつ油中で調製してもよい。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存料を含む。
【０１４７】
注射または注入に適した薬学的投与形態は、場合によりリポソームにカプセル化された、滅菌注射用もしくは注入用溶液または分散物の即時調製に適合した有効成分を含む、滅菌水溶液もしくは分散物または滅菌散剤を含み得る。すべての場合において、最終的な投与形態は、製造および保存条件下で、滅菌、流動性かつ安定でなくてはならない。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステルおよびそれらの適した混合物を含む溶媒または液体分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、または界面活性剤の使用によって維持され得る。保存中の微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、緩衝剤または塩化ナトリウムを含めるのが有用であり得る。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物における使用によってもたされ得る。
【０１４８】
滅菌注射溶液は、必要な量の化合物（単数または複数）を、必要に応じて、上記に列挙される種々のその他の成分とともに適切な溶媒中に組み込むことと、それに続く、フィルター滅菌によって調製する。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌散剤の場合には、１つの調製方法として、真空乾燥および凍結乾燥技術があり、これは、予め濾過滅菌された溶液中に存在する有効成分および任意のさらなる所望の成分の散剤が得られる。
【０１４９】
局所投与のために、別の活性化合物と必要に応じて組み合わせた上記リン脂質結合体は、純粋な形態（例えば、それらが液体である場合には）で適用してもよい。しかし、通常、それらを、固体であっても液体であってもよい皮膚科学的に受容可能な担体と組み合わせて、組成物または処方物として皮膚に投与することが望まれる。
【０１５０】
有用な固体担体として、タルク、クレイ、微晶質セルロース、シリカ、アルミナなどの微細に分割した固体が挙げられる。有用な液体担体として、本化合物を、場合により非毒性界面活性剤の補助のもと、有効なレベルで溶解または分散できる、水、アルコールまたはグリコールまたは水−アルコール／グリコールブレンドが挙げられる。所与の使用のための特性を最適化するために、香料（ｆｒａｇｒａｎｃｅ）および抗菌剤などのアジュバントを加えてもよい。得られた液体組成物は、吸収パッドから適用してもよく、包帯またはその他の包帯材を含浸させるために使用してもよく、ポンプ型またはエアゾール噴霧器を用いて罹患領域に噴霧してもよい。
【０１５１】
また、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、修飾セルロースまたは修飾無機物質などの増粘剤を液体担体とともに使用して、使用者の皮膚へ直接塗布するための、塗ることができるパスタ剤、ゲル、軟膏、石鹸などを形成してもよい。
【０１５２】
さらに、一実施形態では、本発明は、吸入送達のための別の活性化合物と必要に応じて組み合わせた上記リン脂質結合体の種々の投与処方物を提供する。例えば、処方物は、定量吸入器、乾燥散剤吸入器およびネブライザーなどの装置におけるエアゾール使用のために設計してもよい。
【０１５３】
化合物を、皮膚に送達するために使用できる有用な皮膚科学用組成物の例は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｊａｃｑｕｅｔら（米国特許第４，６０８，３９２号）、Ｇｅｒｉａ（米国特許第４，９９２，４７８号）、Ｓｍｉｔｈら（米国特許第４，５５９，１５７号）およびＷｏｒｔｚｍａｎ（米国特許第４，８２０，５０８号）を参照のこと。
【０１５４】
有用な投与量は、動物モデルにおいて、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性およびｉｎ  ｖｉｖｏ活性を比較することによって調べることができる。マウスおよびその他の動物における有効な投与量を、ヒトへ外挿する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第４，９３８，９４９号参照のこと。本発明の化合物の、ＴＬＲアゴニストとして作用する能力は、当技術分野では周知である薬理学的モデル、例えば、Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：６６４６頁（２００３年）によって開示された手順を用いて調べることができる。
【０１５５】
通常、ローションなどの液体組成物中の別の活性化合物と必要に応じて組み合わせた上記リン脂質結合体の濃度は、約０．１〜２５重量％、例えば、約０．５〜１０重量％となる。ゲルまたは散剤などの半固体または固体組成物中の濃度は、約０．１〜５重量％、例えば、約０．５〜２．５重量％となる。
【０１５６】
有効成分は、約０．５〜約７５μＭ、例えば、約１〜５０μＭ、例えば、約２〜約３０μＭの活性化合物のピーク血漿濃度を達成するよう投与してよい。これは、例えば、場合により生理食塩水中、有効成分０．０５％〜５％溶液の静脈内注入、または約１〜１００ｍｇの有効成分を含有するボーラスとしての経口投与によって達成され得る。望ましい血液レベルは、約０．０１〜５．０ｍｇ／Ｋｇ／時間を提供するよう連続注入によって、または約０．４〜１５ｍｇ／ｋｇの有効成分（複数可）を含有する間欠的注入によって維持され得る。
【０１５７】
処置において使用するために必要とされる、別の活性化合物またはその活性な塩もしくは誘導体と必要に応じて組み合わせた上記リン脂質結合体の量は、選択される個々の塩に応じてだけでなく、投与経路、処置されている状態の性質ならびに患者の年齢および状態に応じても変わり、最終的には、主治医または臨床医の判断による。しかし、通常、適した用量は、約０．５〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇ／日、例えば、約１０〜約７５ｍｇ／体重１ｋｇ／日、例えば、３〜約５０ｍｇ／受容者の体重１ｋｇ／日の範囲、例えば、６〜９０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、例えば、１５〜６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる。
【０１５８】
別の活性化合物と必要に応じて組み合わせた上記リン脂質結合体は、例えば、単位投与形態あたり５〜１０００ｍｇ、好都合には、１０〜７５０ｍｇ、最も好都合には、５０〜５００ｍｇの有効成分を含有する単位投与形態で投与されることが好都合であり得る。
【０１５９】
所望の用量は、単回用量で、または適当な間隔で投与される分割量として、例えば、１日あたり２、３、４もしくはそれより多い小用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）として提示されることが好都合であり得る。小用量自体を、例えば、いくつかの別個の軽く間隔をあけた投与、例えば、吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）からの複数回吸入に、または眼への複数の液滴の投与によってさらに分割してもよい。用量およびおそらくは投薬頻度もまた、個々の患者の年齢、体重、状態および応答に応じて変わる。通常、本明細書に記載される状態のための、活性薬剤の合計１日用量範囲は、単回または分割量中、約５０ｍｇ〜約５０００ｍｇであり得る。一実施形態において、１日用量範囲は、単回または分割量で、約１００ｍｇ〜約４０００ｍｇ、例えば、約１０００〜３０００ｍｇであるべきである（例えば、６時間毎に経口投与される化合物７５０ｍｇ）。これは、癌細胞を死滅させるのに有効であり得る、約５００〜７５０μＭの血漿レベルを達成し得る。患者の管理では、治療は、より低い用量で開始され、患者の全体的な応答に応じて増加されるべきである。
【０１６０】
上記のように、別の活性化合物と組み合わせたリン脂質結合体を含む組成物は、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジおよびブタ動物）およびおそらくは、同様にその他の動物における疾患または障害の処置または予防において有用である。特定の化合物に応じて、組成物は、例えば、癌、感染を処置するために、適応免疫（例えば、抗体産生、Ｔ細胞活性化など）を増強するために、ワクチンとして、および／または中枢神経系を刺激するために有用である。
【０１６１】
抗原とともにリン脂質結合体を、それを必要とする被験体に投与して、１種以上の炎症性障害を処置することができる。以下で用いられる場合、用語「処置すること」、「処置」および「治療効果」は、炎症反応を低減させること、抑制することまたは停止させること（予防すること）（例えば、抗体生産または特定の抗原に対する抗体の量を遅延させることまたは止めること）、炎症を起こした組織の量を低減させること、および炎症状態を完全にまたは部分的に緩和することをいい得る。炎症状態として、限定ではないが、アレルギー、喘息、自己免疫障害、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患、ミオパチー（例えば、全身性硬化症、皮膚筋炎、多発性筋炎および／または封入体筋炎との組み合わせで）、骨盤腹膜炎、再灌流障害、関節リウマチ、移植拒絶反応、血管炎、および白血球障害（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（例えば、チェディアック−東症候群、慢性肉芽腫症）が挙げられる。一定の自己免疫障害もまた、炎症性障害である（例えば、関節リウマチ）。いくつかの実施形態では、炎症性障害は、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、ミオパチー、骨盤腹膜炎、再灌流障害、移植拒絶反応、血管炎および白血球障害からなる群より選択される。一定の実施形態では、炎症状態として、それらだけには限られないが、気管支拡張症、細気管支炎、嚢胞性線維症、急性肺損傷、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、アテローム性動脈硬化症および敗血症性ショック（例えば、多臓器不全を伴う敗血症）が挙げられる。いくつかの実施形態では、炎症状態は、アレルギー、喘息、ＡＲＤＳおよび自己免疫障害からなる群より選択される状態ではない。一定の実施形態では、炎症状態は、胃腸管の炎症、脳の炎症、皮膚の炎症および関節の炎症からなる群より選択される状態ではない。一定の実施形態では、炎症状態は、好中球媒介障害である。
【０１６２】
本明細書に記載される化合物を、それを必要とする被験体に投与して、１種以上の自己免疫障害を処置できる可能性がある。このような処置において、用語「処置すること」、「処置」および「治療効果」は、自己免疫応答を低減させること、抑制することまたは停止させること（例えば、抗体生産または特定の抗原に対する抗体の量を遅延させることまたは止めること）、炎症を起こした組織の量を低減させること、および自己免疫障害を完全にまたは部分的に緩和することをいい得る。自己免疫障害として、限定ではないが、自己免疫性脳脊髄炎、大腸炎、自己免疫性インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、ならびにヴェグナー肉芽腫症および高安動脈炎が挙げられる。このような疾患について化合物を試験するためのモデルとして、限定ではないが、（ａ）（ｉ）ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチドによって誘発されたＣ５ＢＬ／６、（ｉｉ）ＳＪＬマウスＰＬＰ１３９−１５１、または１７８−１９１ＥＡＥ、および（ｉｉｉ）自己免疫性脳脊髄炎についてのＭＯＧまたはＰＬＰペプチドによって誘発されたＥＡＥの養子移入モデル；（ｂ）自己免疫性ＩＤＤＭについての非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス；（ｃ）大腸炎についてのデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎モデルおよびトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）誘発大腸炎モデル；ならびに（ｄ）ヴェグナー肉芽腫症および高安動脈炎についてのモデルとしての全身性小血管炎障害（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｍａｌｌ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）が挙げられる。本明細書に記載される化合物を投与して、次の障害のうちの１つ以上を処置できる可能性がある：急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）；アディソン病；円形脱毛症；強直性脊髄炎；抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）；自己免疫性溶血性貧血；自己免疫性肝炎；自己免疫性内耳疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｉｎｎｅｒ  ｅａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）；水疱性類天疱瘡；セリアック病（ｃｏｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）；シャーガス病；慢性閉塞性肺疾患；クローン病（特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の２つのタイプのうちの１つ）；皮膚筋炎；１型糖尿病；子宮内膜症；グッドパスチャー症候群；グレーヴス病；ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）；橋本病；化膿性汗腺炎；特発性血小板減少性紫斑病；間質性膀胱炎；エリテマトーデス；混合結合組織病；限局性強皮症；多発性硬化症（ＭＳ）；重力筋無力症；ナルコレプシー；神経性筋強直症；尋常性天疱瘡；悪性貧血；多発性筋炎；原発性胆汁性肝硬変；関節リウマチ；統合失調症；強皮症；シェーグレン症候群；側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても公知）；潰瘍性大腸炎（特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の２つのタイプのうちの１つ）；血管炎；白斑；およびヴェグナー肉芽腫症。いくつかの実施形態では、自己免疫障害または疾患は、クローン病（Ｃｈｒｏｈｎｓ  ｄｉｓｅａｓｅまたはＣｈｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、関節リウマチ、狼瘡および多発性硬化症からなる群より選択される障害または疾患ではない。
【０１６３】
リン脂質結合体および抗原を、それを必要とする被験体に投与して、該被験体における免疫応答を誘導することができる。免疫応答は、一定の実施形態では、外来抗原（例えば、病原体感染）に対して被験体によって自動的に生成され得る。いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書に記載されるリン脂質結合体と共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）され、ここで、被験体において抗原に対する免疫応答が開始される。一定の実施形態では、抗原は、特定の細胞増殖性状態（例えば、特異的癌抗原）または特定の病原体（例えば、グラム陽性細菌壁抗原または黄色ブドウ球菌抗原）に対して特異的であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物は、被験体に投与されたとき、副作用（例えば、巨脾腫）を殆ど乃至は全く誘導しない。一定の実施形態では、組成物は、約１０ナノメートルから約１０００ナノメートルの粒子を形成し、ときとして、組成物は、約１００ナノメートルから約４００ナノメートルの平均、平均値または呼び寸法を有する粒子を形成する。
【０１６４】
リン脂質結合体および抗原を、それを必要とする被験体に投与して、１種以上の細胞増殖性障害を処置できる可能性がある。このような処置において、用語「処置すること」、「処置」および「治療効果」は、細胞増殖速度を低減させることまたは停止させること（例えば、腫瘍成長を遅延させることまたは止めること）、増殖する癌細胞の数を低減させること（例えば、腫瘍の一部またはすべてを除去すること）および細胞増殖状態を完全にまたは部分的に緩和することをいい得る。細胞増殖性状態として、それらだけには限られないが、結腸直腸、乳房、肺、肝臓、膵臓、リンパ節、結腸、前立腺、脳、頭頸部、皮膚、肝臓、腎臓および心臓の癌が挙げられる。癌の例として、造血系起源の（例えば、骨髄系、リンパ系もしくは赤血球系統、またはそれらの前駆細胞から生ずる）過形成／新生物細胞が関与する疾患である造血新生物形成障害（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）が挙げられる。前記疾患は、低分化型急性白血病（ｐｏｏｒｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、例えば、赤芽球性白血病（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）および急性巨核芽球性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）から生ずる場合もある。さらなる骨髄性障害として、それらだけには限定されないが、急性前骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．、１１：２６７−２９７頁（１９９１年）におけるＶａｉｃｋｕｓ、Ｃｉｒｔ．Ｒｅｖ．に総説されている）が挙げられ；リンパ系悪性疾患として、それらだけには限定されないが、Ｂ系統ＡＬＬおよびＴ系統ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられる。さらなる形態の悪性リンパ腫として、それらだけには限定されないが、非ホジキンリンパ腫およびその変形、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリード−ステルンベルグ病（Ｒｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）が挙げられる。特定の実施形態では、細胞増殖性障害は、非内分泌腫瘍（ｎｏｎ−ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ）、または内分泌腫瘍（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ）である。非内分泌腫瘍の例示的な例として、それらだけには限定されないが、腺癌、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、巨細胞腫、膵管内乳頭腫瘍（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｍｕｃｉｎｏｕｓ  ｎｅｏｐｌａｓｍ）、ムチン性嚢胞腺癌、膵芽腫、漿液性嚢胞腺腫、充実性および偽乳頭状腫瘍（ｐｓｅｕｄｏｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｕｍｏｒ）が挙げられる。内分泌腫瘍は、ランゲルハンス島細胞腫瘍であり得る。
【０１６５】
細胞増殖性状態はまた、例えば、湿疹、円板状エリテマトーデス、扁平苔癬、硬化性苔癬、菌状息肉症、光線皮膚症（ｐｈｏｔｏｄｅｒｍａｔｏｓｅ）、バラ色ひこう疹、乾癬をはじめとする皮膚の炎症状態などの、炎症性状態を含む。例えばアジポサイトの増殖などの肥満に関連した細胞増殖性状態も含まれる。
【０１６６】
細胞増殖性状態はまた、例えば、後天性免疫不全症候群、アデノウイルス科感染、アルファウイルス感染、アルボウイルス感染、ボルナ病、ブンヤウイルス科感染、カリシウイルス科感染、水痘、コロナウイルス科（Ｃｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）感染、コクサッキーウイルス感染、サイトメガロウイルス感染、デング熱、ＤＮＡウイルス感染、膿瘡、接触感染性、脳炎、アルボウイルス、エプスタイン−バーウイルス感染、伝染性紅斑、ハンタウイルス感染、出血熱、ウイルス性、肝炎、ウイルス性、ヒト、単純ヘルペス、帯状疱疹、耳帯状疱疹、ヘルペスウイルス科感染、伝染性単核球症、インフルエンザ、例えばトリまたはヒトにおけるもの、ラッサ熱、麻疹、伝染性軟属腫、おたふくかぜ、パラミクソウイルス科（ｏａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）感染、サシチョウバエ熱、ポリオーマウイルス感染、狂犬病、ＲＳウイルス感染、リフトバレー熱、ＲＮＡウイルス感染、風疹、遅発型ウイルス病、痘瘡、亜急性硬化性全脳炎、腫瘍ウイルス感染、いぼ、西ナイル熱、ウイルス性疾患及び黄熱病をはじめとするウイルス性疾患を含む。例えば、ＳＶ４０形質転換ウイルスの大型Ｔ抗原は、ＵＢＦに対して作用し、それを活性化させ、その他のウイルスタンパク質をＰｏｌ  Ｉ複合体に動員し、それによって細胞増殖を刺激して、ウイルス増殖を確実にする。細胞増殖性状態はまた、血管新生に関連した状態（例えば、癌）ならびにアジポサイトおよびその他の脂肪細胞の増殖によって生ずる肥満に関連した状態を含む。
【０１６７】
細胞増殖性状態はまた、高血圧、バルーン血管形成術、弁膜症および心筋梗塞などの心臓ストレス（ｃａｒｄｉａｃ  ｓｔｒｅｓｓ）の結果として生ずる心臓の状態を含む。例えば、心筋細胞は、心室壁の大部分を構成する心臓内の分化筋細胞であり、血管平滑筋細胞は、血管を裏打ちする。両方とも筋細胞タイプであるが、心筋細胞および血管平滑筋細胞は、それらの収縮、成長および分化メカニズムが異なる。心筋細胞は、心臓形成後間もなく最終分化状態になり、したがって、分裂能力を失うが、平滑筋細胞は、収縮性表現型から増殖性表現型への修飾を継続的に受け続ける。例えば、高血圧、バルーン血管形成術、弁膜症および心筋梗塞などの種々の病態生理的ストレスのもとで、心臓および血管は、形態学的成長関連変化を受け、これは、心臓機能を低下させることがあり、および最終的には心不全で現れることがある。したがって、リン脂質結合体および抗体を、心臓の状態の処置に有効な量で投与する工程によって心臓の細胞増殖性状態を処置するための方法を本明細書において提供する。リン脂質結合体および抗原を、心臓ストレスが発生するもしくは検出される前または発生したもしくは検出された後に投与してもよいし、または例えば、高血圧、バルーン血管形成術、弁膜症もしくは心筋梗塞の発生もしくは検出後に投与してもよい。投与により、血管筋細胞および／または平滑筋細胞の増殖を減少させることができる。
【０１６８】
本発明を、以下の限定されない例によってさらに説明する。
【実施例】
【０１６９】
実施例Ｉ
本明細書に記載される化学合成スキームは、図１中の化合物を指すときはカッコ内の番号、および反応工程（例えば、加える化学物質（単数もしくは複数）および／または反応条件）を指すときにはカッコ内の文字を用いる。例えば、（ａ）は、化合物（１）と合わせ、反応させたときに化合物（２）を形成する結果となり得る、反応物の添加を含む反応工程を指す。各反応工程についての反応条件および加える化合物は、：（ａ）水素化Ｎ，Ｎ’−メチルエチレンジアミノアルミニウムリチウム（Ｃｈａ，Ｊ．ら（２００２年））。水素化Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミノアルミニウムリチウムによる芳香族ニトリルのアルデヒドへの選択的変換（Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２３、１６９７−１６９８頁）、ＴＨＦ、０℃；（ｂ）ＮａＩ、クロロトリメチルシラン、ＣＨ３ＣＮ、ｒ．ｔ．；（ｃ）ＰＢＳ、ｒ．ｔ．；（ｄ）ＮａＯＨ：ＥｔＯＨ  １：１、還流；（ｅ）ＤＯＰＥ、ＨＡＴＵ、トリエチルアミン、ＤＭＦ／ＤＣＭ  １：１、ｒ．ｔ．；（ｆ）Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−アジドエチル）ノナエチレングリコール、ＨＡＴＵ、トリエチルアミン、ＤＭＦ、ｒ．ｔ．；（ｇ）４ペンチン酸、アスコルビン酸ナトリウム、Ｃｕ（ＯＡｃ）２、ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＴＨＦ  ２：２：１、ｒ．ｔ．；および（ｈ）ＤＯＰＥ、ＨＡＴＵ、トリエチルアミン、ＤＭＦ／ＤＣＭ  １：１、ｒ．ｔ．である。
【０１７０】
４−（（６−アミノ−２−（２−メトキシエトキシ）−８−オキソ−７Ｈ−プリン−９（８Ｈ）−イル）メチル）安息香酸（図１、化合物５参照のこと）の合成。２０ｍＬの１：１  エタノール：水混合物を０．１０ｇ（０．２８ｍｍｏｌ）の４−（（６−アミノ−８−メトキシ−２−（２−メトキシエトキシ）−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル）ベンゾニトリル（図１、化合物１参照のこと）に加え、合わせたものを８時間還流した。その反応混合物を放置して冷却し、濃ＨＣｌでｐＨ２に酸性化した。その水溶液をＤＣＭ（３×２０ｍＬ）でさらに抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させて、８−オキソ−９−安息香酸（化合物５）、８−メトキシ−９−安息香酸および安息香酸８−オキソ−９−エチルの混合物を得た。乾燥したら、生成物をＣＨ３ＣＮ（２５ｍＬ）に溶解し、ＮａＩ（０．１４ｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を加えた（図１、反応工程（ｂ））。攪拌しながらこの溶液に１２μＬ（０．９６ｍｍｏｌ）のクロロトリメチルシランを滴下した。反応混合物を４０℃で４時間加熱し、次いで、冷却し、濾過し、水（２０ｍＬ）、次いで、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）で洗浄して、白色固体を８５％の収率で得た。得られた生成物に関して核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を行って、次の結果を得た、１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  （ｐｐｍ）：  １０．３３  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．６５  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．９２  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．２４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．５６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．２５  （ｓ，  ３Ｈ）。ＨＰＬＣでの保持時間（Ｒｔ）＝１４．３分。ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：Ｃ１６Ｈ１７Ｎ５Ｏ５についての計算値  ｍ／ｚ［Ｍ＋１］３６０．３４；実測値３６０．２４。
【０１７１】
２−（４−（（６−アミノ−２−（２−メトキシエトキシ）−８−オキソ−７Ｈ−プリン−９（８Ｈ）−イル）メチル）ベンズアミド）エチル２，３−ビス（オレオイルオキシ）プロピルホスフェート（図１、化合物６参照のこと）の合成。１ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルメタンアミド（ＤＭＦ）中の０．０２２ｇ（０．０６ｍｍｏｌ）の化合物５の溶液に、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（０．０２６ｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）および無水トリエチルアミン（ＴＥＡ）（１７．０μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。無水１：１  ジクロロメタン（ＤＣＭ）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（０．０５ｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）の溶液を調製し、反応混合物にゆっくりと加えた（図１反応工程（ｅ））。その反応混合物を完了まで室温で攪拌し、次いで、真空蒸発させた。ＤＣＭ中１５％メタノール（ＭｅＯＨ）を使用してフラッシュクロマトグラフィーによって生成物を精製して、０．０３８ｇの白色固体を５８％の収率で得た。得られた生成物に関してＮＭＲ分析を行って、次の結果を得た、１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  （ｐｐｍ）：  ９．７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．６１  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．３０  （ｍ，  ４Ｈ），  ５．０５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．８８  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．２６  （ｍ，  ４Ｈ），  ４．０６  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．５７  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．３５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．２６  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．２３  （ｍ，  ４Ｈ），  １．９５  （ｍ，  ８Ｈ），  １．４６  （ｍ，  ４Ｈ），  １．２２  （ｍ，  ４０Ｈ），  ０．８３  （ｍ，  ６Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰イオンモード）：Ｃ５７Ｈ９２Ｎ６Ｏ１２Ｐについての計算値  ｍ／ｚ［Ｍ−１］１０８３．３５；実測値１０８３．７５。
【０１７２】
４−（（６−アミノ−８−ヒドロキシ−２−（２−メトキシエトキシ）−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル）−Ｎ−（３２−アジド−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０−デカオキサドトリアコンチル）ベンズアミド（図１、化合物７参照のこと）の合成。無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物５（０．１００ｇ、０．２７８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＡＴＵ（０．１１７ｇ、０．３０６ｍｍｏｌ）および無水ＴＥＡ（７７．０１４μＬ、０．５５６ｍｍｏｌ）を加えた（図１、反応工程（ｆ）参照のこと）。無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＯ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−アジドエチル）ノナエチレングリコール（０．１５０ｇ、０．３０６ｍｍｏｌ）の溶液を調製し、反応混合物にゆっくりと加えた。その反応混合物を完了まで室温で攪拌し、次いで、真空蒸発させた。ＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨを使用してフラッシュクロマトグラフィーによって生成物を精製して、０．２２４ｇの不透明油状物を９３％の収率で得た。ＨＰＬＣでの保持時間＝１２分。得られた生成物に関してＮＭＲ分析を行って、次の結果を得た、１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  （ｐｐｍ）：  １０．０１  （ｓ，  １Ｈ），  ８．４５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．４９  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．９０  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．２５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．５７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．５  （ｍ，  ３６Ｈ），  ３．４  （Ｍ，  ６Ｈ），  ３．２６  （ｓ，  ３Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：Ｃ３８Ｈ６１Ｎ９Ｏ１４についての計算値  ｍ／ｚ［Ｍ＋１］８６８．９４；実測値８６８．５９。
【０１７３】
３−（１−（１−（４−（（６−アミノ−８−ヒドロキシ−２−（２−メトキシエトキシ）−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル）フェニル）−１−オキソ−５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−デカオキサ−２−アザテトラトリアコンタン−３４−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロパン酸（図１、化合物８参照のこと）の合成。化合物７（０．２１８ｇ、０．２５１ｍｍｏｌ）および４−ペンチン酸（０．０７４ｇ、０．７５３ｍｍｏｌ）を１：１  ｔ−ブタノール：Ｈ２Ｏ（３ｍＬ）に溶解した（図１、反応工程（ｇ）参照のこと）。１：１  ｔ−ブタノール：Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）中のアスコルビン酸ナトリウム（０．０２ｇ、１００ｍｍｏｌ）およびＣｕ（ＯＡｃ）２（０．００９ｇ、５０ｍｍｏｌ）を反応混合物にゆっくりと加え、ＴＬＣによって化合物７が完全に反応するまで室温で攪拌した。生成物をＤＣＭ（１０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１０ｍＬ）で抽出し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させて、０．２３０ｇの不透明油状物を９５％の収率で得た。ＨＰＬＣでの保持時間＝１１．５分。得られた生成物に関してＮＭＲ分析を行って、次の結果を得た、１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  （ｐｐｍ）：  １３．４８  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．７５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．２３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２９，  ２Ｈ），  ４．８８  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．４１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．１２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．２３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．７４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．１２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．５７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．５１  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．４２  （ｍ，  ３６Ｈ），  ３．２６  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．７９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．２４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５６  Ｈｚ，  ２Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：Ｃ４３Ｈ６７Ｎ９Ｏ１６についての計算値  ｍ／ｚ［Ｍ＋１］９６６．０４；実測値９６６．６７。
【０１７４】
実施例ＩＩ
分子量が２００〜４００ｋＤの種々のプリン、ピリミジンおよびイミダゾキノリンは、ＴＬＲ７を活性化することがわかっており、特異的ＴＬＲ７リガンドである化合物は、モル濃度に基づいて、イミキモドよりも１００〜１０００倍強力であった（Ｌｅｅら、下記）。これらのＴＬＲアゴニストは、ヌクレオチドの通常の成分と構造的に極めて類似しているので、ＴＬＲアゴニストが、反復投与後にハプテンの免疫反応を誘導する可能性は極めて低い。
【０１７５】
実験方法
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法
サイトカイン誘導のｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定を、マウス白血病単球マクロファージ細胞系、ＲＡＷ２６４．７を使用して実施した。Ｒａｗ２６４．７マウスをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、ＤＭＥＭ完全培地［１０％熱不活化ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを補足した、ダルベッコ変性イーグル培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）］で培養した。Ｗｕ，Ｃ．Ｃら、「Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｏｆ  ａ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ７  ｌｉｇａｎｄ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４：３９９０頁（２００７年）に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６およびＴＬＲ７欠損マウスからＢＭＤＭを調製した。
【０１７６】
一般に、ＲＡＷ２６４．７細胞またはＢＭＤＭを種々の濃度の結合体とともに１８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、培養上清を採取した。上清中のサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１２またはＴＮＦ−α）のレベルをＥＬＩＳＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）によって決定し（Ｃｈｏ，Ｈ．Ｊら、「Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ａ  Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」［コメント参照のこと］、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：５０９頁（２０００年））、結果を図２Ａ〜Ｄに提示した。データは、三重反復の平均±ＳＥＭであり、３回の独立した実験の代表である。これらのサイトカインの最小検出レベルは、１５ｐｇ／ｍＬであった。
【０１７７】
ＴＮＦαレベルを、上で説明したように、約１×１０６／ｍＬ  ＲＡＷ２６４．７細胞を様々な結合体または対照とともにインキュベートすることによって測定した（図２Ａ参照）。ＩＬ−６およびＩＬ−１２のレベルは、上述のように、０．５×１０６／ｍＬ  ＢＭＤＭを様々な結合体または対照とともにインキュベートすることによって測定した（図２Ｂ〜Ｄ参照）。結合体をストック溶液（ＳＭ、ならびに化合物（６）、（８）および（９）については１０μｍ、化合物（４ａ）については０．１μｍ）として調製し、それらから系列希釈物（１：５）を調製した。
【０１７８】
ＢＭＤＭは、本明細書に記載される合成スキームを用いて合成したＴＬＲ７結合体のエンドトキシン汚染レベルを評価するためにも使用した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（ＬＰＳ非応答性変異体）またはＣ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ（野生型）に由来する０．５×１０６／ｍＬ  ＢＭＤＭをＴＬＲ７結合体（１０μＭ  ＳＭ、０．１μＭ  化合物４ａ、１０μＭ  化合物６、１０μＭ  化合物８または１０μＭ  化合物９）とともに１８時間インキュベートした。培養上清中のＩＬ−６またはＩＬ−１２レベルをＥＬＩＳＡによって測定し、結果を図２Ｂに提示した。各々のＴＬＲ７結合体は、ＴＬＲ４変異体および野生型マウスの両方において類似したＩＬ−６レベルを誘導した。これは、これらの結合体のＬＰＳ汚染が最小であることを示す。
【０１７９】
ヒト血液末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｔｈｅ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入したヒトバッフィーコートから、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔら、「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ＤＮＡ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６９：６１５６頁（２００１年）に記載されているように単離した。ＰＢＭＣ（１×１０６／ｍＬ）を種々の濃度のＴＬＲ７結合体とともに１８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、培養上清を採取した。上清中のサイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦ−μまたはＩＦＮα１）のレベルをＬｕｍｉｎｅｘビーズアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって決定し、結果を図３Ａ〜Ｂに提示した。データは、三重反復の平均±ＳＥＭであり、３回の独立した実験の代表である。ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮα１の最小検出レベルは、それぞれ、６ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬおよび１５ｐｇ／ｍＬであった。
【０１８０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ方法
ＴＬＲ７結合体による炎症促進性サイトカイン（ｐｒｏ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）誘導の薬物動態を、６から８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用して検査した。マウスにＴＬＲ７アゴニストおよびそれらの結合体（マウス１匹あたり４０ｎｍｏｌ  化合物（４ａ）または２００ｎｍｏｌ  ＳＭおよび化合物（６）、（８）または（９））を静脈内注射した。血液サンプルを注射２、４、６、２４または４８時間後に採取した。血清を分離し、使用まで−２０℃で保存した。血清中のサイトカイン（例えば、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α）のレベルをＬｕｍｉｎｅｘビーズマイクロアッセイによって測定し、結果を図４Ａ〜Ｂに提示した。データは、５匹のマウスの平均±ＳＥＭであり、２回の独立した実験の代表である。ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの最小検出レベルは、それぞれ、５ｐｇ／ｍＬおよび１０ｐｇ／ｍＬである。
【０１８１】
ＴＬＲ７結合体による免疫反応開始（例えば、アジュバント活性（ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ））も検査した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（ｎ＝５）を、約１０ｎｍｏｌの種々のＴＬＲ７結合体と混合した２０μｇ  オボアルブミン（ＯＶＡ）を用いて、０日目および７日目に皮下に免疫化した。ここで、１０ｎｍｏｌは、結合体のＴＬＲ７部分についての投与量の目標であり、実際の量は、各結合体の実際の化学式に依存する。ＴＬＲ−９活性化免疫刺激性オリゴヌクレオチド配列（ＩＳＳ−ＯＤＮ；１０１８）をＴｈ１誘導アジュバントの陽性対照として使用した（Ｒｏｍａｎ，Ｍら、Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ−１−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、３：８４９頁（１９９７年））。血清を０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、４２日目および５６日目に採取した。生理食塩水を用いてまたはビヒクルと混合したＯＶＡを用いて免疫化したマウスは、対照として役立った。マウスを５６日目に屠殺し、脾細胞および組織学的スライドの調製のために脾臓を回収した。約２００マイクロリットルの２．５×１０６／ｍＬ脾臓細胞ストックを、丸底組織培養マイクロタイタープレートの総容積２００μＬのＲＰＭＩ  １６４０完全培地［１０％熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを補足した、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）］に三連で分注し、１００μｇ／ｍＬ  ＯＶＡでまたは培地のみで再刺激した。いくつかの実験では、注射部位を、免疫化２４時間後に、炎症の徴候または局所反応について検査した。マウスを、毎週、免疫化に対して潜在的な「病気」応答の尺度として活動について観察し、計量した。脾臓回収に加えて、肺、肝臓、心臓および腎臓も５６日目に採取し、１０％緩衝化ホルマリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）で固定し、パラフィンに包埋した。５μｍ厚の切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、顕微鏡下で評価した。
【０１８２】
ＩｇＧサブクラス（およびいくつかの実施形態では、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ２）の抗ＯＶＡ抗体を、Ｃｈｏ，Ｈ．Ｊら、「Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ａ  Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」［コメント参照のこと］、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：５０９頁（２０００年）に記載されているように、ＥＬＩＳＡによって測定し、結果を図５Ａおよび５Ｂに提示した。各ＥＬＩＳＡプレートは、標準曲線を生成するために予め定量された血清の力価測定を含んだ。この標準の力価を、バックグラウンドの２倍である吸光度の読取値を与える血清の最高の希釈倍数として計算した。種々の血清サンプルを１：１００希釈で試験した。結果は、標準血清の単位／ｍＬに基づいて計算してｍＬあたりの単位数で表現したものであり、各群における５匹の動物の平均＋ＳＥＭを表す。＊およびＴは、それぞれ、ビヒクルと混合したＯＶＡを用いて免疫化されたマウスと比較した一元配置ＡＮＯＶＡによるＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１を示す。
【０１８３】
回収した脾臓から脾細胞を調製した。次いで、脾細胞培養物（１００μｇ／ｍＬ  ＯＶＡでまたは培地のみで再刺激したもの）を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、７２時間後に上清を回収した。培養上清中のＩＦＮαのレベルをＥＬＩＳＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）により、製造業者の使用説明書に従って測定し（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈら、Ｐｒｅｐｒｉｍｉｎｇ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、２２：８５頁（２０００年））、結果を図５Ｃに示した。各群における平均の総脾臓細胞数を計算し、ＰＢＳ免疫化群と比較して脾臓細胞増殖をモニターした。データは、５匹のマウスの平均±ＳＥＭであり、３回の独立した実験の代表である。
【０１８４】
ＴＬＲ７結合体の起こり得る有害作用の評価を、三部構成の分析（ｔｈｒｅｅ−ｆｏｌｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（全脾細胞の計数、組織学的検査、ならびに注射領域と処置したマウスの全身の健康状態および挙動の両方の視覚的観察）によって実施した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＴＬＲ７結合体と混合した２０μｇのＯＶＡ、ビヒクルまたは対照アゴニスト（オリゴヌクレオチド配列ＩＳＳ−ＯＤＮ）を用いて免疫化した。５６日目にマウスを屠殺し、総脾細胞数を計数し、結果を図６Ａに提示した。脾臓を採取し、図６Ｂ（倍率＝１００ｘ）に示したように、組織学的検査に供した。図６Ｃに示したように、注射部位の皮膚を注射の２４時間後に調べた。計数された脾細胞数に関して、ＯＶＡおよびＴＬＲ７結合体を用いて免疫化したマウスとＯＶＡのみを用いて免疫化したマウスの間に有意差はない（図６Ａ参照のこと）。ＴＬＲ７結合体と混合したＯＶＡを用いて免疫化したマウスからの脾臓の組織学的検査は、白脾髄の破壊および赤脾髄の細胞充実性増加を一切示さなかった（図６Ｂ参照のこと）。注射部位の皮膚は、目に見える発赤および緑内障反応（ｇｌａｕｃｏｍａｔｏｕｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を有さなかった（図６Ｃ参照のこと）。
【０１８５】
いくつかの実験では、統計学評価を実施して、観察された結果の統計的有意性を決定した。統計ソフトウェアパッケージ（Ｐｒｉｓｍ  ４．０、ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を、回帰分析をはじめとする統計的分析のために使用した。データをプロットし、群間の均一標準偏差を有するガウス分布を想定して非線形回帰によりフィッティングした。アジュバント活性実験では、群間の統計的な差を、二元配置ＡＮＯＶＡとボンフェローニポスト検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）によって分析して、対照マウスとＯＶＡを用いて免疫化されたものとを比較した。Ｐの値＜０．０５を、統計的に有意と見なした。
【０１８６】
結果および考察
化学合成
化合物（１）からの化合物（４）の合成により、５：１  ＵＣ１Ｖ１５０対ＭＳＡタンパク質の一貫した結合体化比を得た（Ｗｕ，Ｃ．Ｃら、「Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｏｆ  ａ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ７  ｌｉｇａｎｄ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４：３９９０頁（２００７年））。化合物（１）の９−ベンジルニトリルの塩基性加水分解（図１、反応工程（ｄ））により、多用途の安息香酸官能基（化合物（５））が得られ、結合体（６）、（８）および（９）の組み立てを可能にする。その安息香酸を、ＴＥＡの存在下、無水ＤＭＦ中、ＨＡＴＵでの活性化によってＤＯＰＥとカップリングさせ（図１、反応工程（ｅ））、化合物６を５８％の収率で得た。
【０１８７】
試験のために適した溶媒に化合物（６）を溶解することが難しいため、ＰＥＧスペーサーをカップリングさせて、改善された溶解度を得た。容易に入手できるアミン／アジド二官能性ＰＥＧを、ＴＦＡの存在下、無水ＤＭＦ中、ＨＡＴＵでの活性化によって安息香酸にカップリングさせた（図１、反応工程（ｆ）参照のこと、結果として化合物（７）が得られる）。４−ペンチン酸での銅（Ｉ）触媒アジド−アルキン付加環化による１，２，３−トリアゾールの形成（図１、反応工程（ｇ））によって、化合物（８）を９５％の収率で得た。最後に、ＤＯＰＥ（図１、反応工程（ｈ））および化合物（８）でのＨＡＴＵ活性化アミド形成によって化合物（９）を調製した。
【０１８８】
脂質結合体化ＴＬＲ７アゴニストによるサイトカイン誘導のｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定
ＴＬＲ７アゴニスト化合物（４ａ）は、マウス血清アルブミンと共有結合させたとき、結合体化していない薬物（ＳＭ）と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで１０またはそれ以上高いサイトカイン誘導効力を示した（Ｗｕ，Ｃ．Ｃら、「Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｏｆ  ａ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ７  ｌｉｇａｎｄ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４：３９９０頁（２００７年））。類似したアッセイを用いて、脂質−ＴＬＲアゴニスト結合体（図１、化合物６）、ＰＥＧ−ＴＬＲ７アゴニスト結合体（図１、化合物８）およびＰＥＧ−脂質（図１、化合物９）結合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を、マウスマクロファージ細胞系、ＲＡＷ２６４、および初代骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を使用して比較した。それぞれの細胞を、系列希釈したＴＬＲ７結合体で１８時間刺激し、培地に放出されたサイトカインのレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、結合体化していないＴＬＲ７アゴニスト（ＳＭ）と比較した（図２Ａ、パネルＡ〜Ｄ参照のこと）。
【０１８９】
化合物（４ａ）（例えば、ＴＬＲ７−ＭＳＡ結合体）が、結合体化していないアゴニストと比較したとき、サイトカイン誘導物質として１００倍より強力であることは以前に証明されているが、脂質―ＴＬＲ７結合体は、結合体化していないアゴニストのモル濃度レベルに正規化したとき、１０倍より強力であった。ＰＥＧ−ＴＬＲ７結合体（化合物８）は、結合体化していないＴＬＲ７（ＳＭ）と比較して低い効力を示し、脂質のＰＥＧ−ＴＬＲ７結合体への結合体化（脂質ＰＥＧ−ＴＬＲ７）（化合物９）は、それらの効力を、結合体化していないＴＬＲ７（ＳＭ）の類似したレベルに回復させた。上記結合体化形態において最高レベルでの、ＴＬＲ７結合体化を含まない、実質的に同様の濃度のＭＳＡ、脂質またはＰＥＧを陰性対照として使用し、それらは、ＲＡＷ２６４．７細胞およびＢＭＤＭにおいて、それぞれ、最小のサイトカインレベルを誘導したか、または全く誘導しなかった（データは示さない）。
【０１９０】
上記結合体化した形態のＴＬＲ７アゴニストが、ＴＬＲ７なしでのマクロファージ刺激とは対照的に、単独でマクロファージ刺激を誘導するかどうかを評価するために、野生型およびＴＬＲ７欠損マウス（ＴＬＲ７−ＫＯまたはノックアウトマウス）に由来するＢＭＤＭを化合物（４ａ）、（６）、（８）、（９）およびＳＭで処理した。化合物（４ａ）、（６）、（８）、（９）およびＳＭは、ＩＬ−１２およびＩＬ−６を殆どまたは全く誘導しなかったが、これらの結合体は、野生型ＢＭＤＭにおいて活性であった。これは、このアゴニスト活性がこれらの結合体のＴＬＲ７活性に起因したことを示す（図２Ｃ〜Ｄ参照のこと）。エンドトキシン評価（図２Ｂ、および上で説明したもの）は、アゴニスト活性がこれらの結合体のＴＬＲ７活性に起因したという結論をさらに裏づけた（例えば、ＩＬ−６のレベルの有意な統計的な差を生じさせなかった）。
【０１９１】
ヒト細胞における免疫学的活性をさらに調査するために、３人のドナーからのヒトＰＢＭＣをＴＬＲ７結合体で処理し、ＩＬ−６およびＩＦＮα１のレベルをＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって決定した（図３Ａ〜Ｂ）。この実験では、ＴＬＲ７と結合体化させたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（４ｂ）をＭＳＡ−結合体（４ａ）の代わりに使用した。ＴＬＲ７結合体効力の順序は、マウスマクロファージにおいて観察された順序と同様であった（（４ｂ）＞（６）＞（９）＞／＝ＳＭ＞（８））（図３Ａ）。化合物の効力の一貫した傾向がすべてのドナーからのＰＢＭＣにおいて観察された。化合物（４ａ）とは異なり、化合物（４ｂ）（例えば、ＴＬＲ７−ＨＳＡ結合体）は、ヒトＰＢＭＣにおいて最小のＩＦＮａ１レベルを誘導した（３人のドナーにおいて観察された）（図３Ｂ）。
【０１９２】
ＴＬＲ結合体による炎症促進性サイトカインの誘導のｉｎ  ｖｉｖｏ動力学
ＴＬＲ７結合体のｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫学的特性を比較するために、Ｃ５７ＢＬ／５マウスにＴＬＲ７アゴニスト結合体を静脈内に受容させ、血清中の炎症促進性サイトカインの動力学を研究した（図４Ａおよび４Ｂ）。以前の研究（Ｗｕ，Ｃ．Ｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４：３９９０頁（２００７年））に基づき、化合物（４ａ）を、化合物ＳＭ、（６）、（８）および（９）（動物１匹あたり２００ｎｍｏｌ）より低い濃度（動物１匹あたり４０ｎｍｏｌ）で使用した。すべてのＴＬＲ７結合体について注射後２時間でＴＮＦαおよびＩＬ−６の最大誘導が観察された（それぞれ、図４Ａ〜Ｂ）。結合体化していないＴＬＲ７（ＳＭ）によって誘導されたサイトカインのレベルは、２時間後に急速に下降した。化合物（４ａ）、（６）および（９）によるサイトカイン誘導は、６時間まで持続された。化合物（８）は、低いＩＬ−６レベルしか誘導せず（図４Ｂ参照のこと）、注射後のどの時点においても、ＴＮＦαの有意な誘導を有さなかった（図４Ｂ参照のこと）。生理食塩水、ＭＳＡまたはＤＯＰＥを与えた対照マウスからの血清は、検出可能なサイトカインレベルを殆どまたは全く示さなかった（データは示さない）。
【０１９３】
脂質−ＴＬＲ７結合体は急速な、長く続く液性（ｈｕｍｅｒａｌ）応答を促進する
アジュバント活性の効率を、ワクチンが誘導する抗原特異的ＩｇＧのレベルおよびアイソタイプ、特に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の測定によって評価した（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．Ｒ．およびＣｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｌ．、「ＴＨ１  ａｎｄ  ＴＨ２  ｃｅｌｌｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７：１４５頁（１９８９年））。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（１群あたり動物ｎ＝５）を、ＴＬＲ７結合体と混合したＯＶＡ（オボアルブミン）を用いて皮下に免疫化した。ＩＳＳ−ＯＤＮを強力なＴｈ１アジュバント陽性対照として使用した。生理食塩水またはＯＶＡおよびビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）を用いて免疫化したマウスを陰性対照として使用した。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ血清誘導動力学を０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、４２日目および５６日目にＥＬＩＳＡによってモニターした（図５Ａ〜Ｂ）。化合物（４ａ）または化合物（６）と混合したＯＶＡを用いて免疫化したマウスでは、１４日という早期にＩＧサブクラスの抗体の誘導が観察された（図５Ａ参照のこと）。図５Ａに示したように、ＯＶＡ／化合物（６）混合物を用いて免疫化したマウスでは、抗ＯＶＡ  ＩｇＧ２ａレベルが継続的に増加したが、ＯＶＡ／化合物（４ａ）混合物で免疫化したマウスでのレベルは、その後、下降した。これらのデータは、化合物（４ａ）または（６）と組み合わせたＯＶＡで免疫化したマウスの脾臓細胞による増進されたＯＶＡ特異的ＩＦＮα分泌と一致する（図５Ｃ参照のこと）。
【０１９４】
有害作用のＩｎ  ｖｉｖｏ評価
ＴＬＲ７アゴニスト（ＳＭ）は、マウスにおける食欲不振作用および低体温症を誘導することがあり（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔら、「Ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｏｒｅｘｉａ  ａｎｄ  ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ  ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ７」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．」、２９５：Ｒ１２３頁（２００８年））、それに起因してマウスの体重が減少する。したがって、実験プロトコールの一部として、脂質−ＴＬＲ７アゴニスト結合体を用いて免疫化したマウスの体重および（注射部位での）皮膚反応をモニターした。マウスにおいて食欲低下反応を誘導する、結合体化していないＴＬＲ７アゴニスト（ＳＭ）の最小用量は、粘膜投与でマウス１匹あたり５０ｎｍｏｌであった（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２９５：Ｒ１２３頁（２００８年））。アジュバント実験のための用量（マウス１匹あたり１０ｎｍｏｌ）は、ＴＬＲ７アゴニストに起因する病気反応を回避するように選択した。化合物（６）と混合したＯＶＡを用いて免疫化したマウスの平均体重と生理食塩水を注射したマウスの平均体重の間に有意差は観察されなかった（データは示さない）。
【０１９５】
ＴＬＲ７の慢性投与はまた、骨髄性細胞の増殖を誘導した（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ，Ｓら、「Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ＴＬＲ７  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ，  ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ  ＨＩＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ」、Ｂｌｏｏｄ、１１３：３７７頁（２００９年）。脾臓細胞の総数を脾臓骨髄性細胞増殖の指標として計算した（図６Ａ参照のこと）。脾細胞の総数に関して、ＯＶＡ、ＴＬＲ７アゴニスト結合体および生理食塩水対照を用いて免疫化したマウスの間に有意差はなかった（図６Ｂ参照のこと）。ＴＬＲ７アゴニストと混合したＯＶＡを用いて免疫化したマウスからの脾臓の組織学的検査は、白脾髄（胚芽中心）の構造上の破壊も赤脾髄の細胞充実性の増加も示さなかった（図６Ｂ参照のこと）。さらに、各群から採取した肝臓、肺、心臓および腎臓サンプルの組織学的検査において有意差は観察されなかった（データは示さない）。脂質−ＴＬＲ７結合体の注射部位におよび注射部位付近に肉眼で見える発赤および緑内障反応もなかった（図６Ｃ参照のこと）。
【０１９６】
結論
結合体化していないＴＬＲ７（ＳＭ）は、水溶液中で不溶性である。水への溶解度は、薬物の拡散を増加させることまたは細胞への取り込みを促進させることにより、薬物の有効性の制御に一定の役割を果たし得る。ＰＥＧ化は、薬物の溶解度を向上させ、免疫原性を減少させることができる（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．およびＭｅｒｏ，Ａ、「Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ」、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、２２：３１５頁（２００８年））。ＰＥＧ化は、薬物安定性、血液中の結合体の保持時間を増加させることもでき、タンパク質分解および腎排泄を低減させることができる（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．およびＭｅｒｏ，Ａ、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、２２：３１５頁（２００８年））。ＴＬＲ７をＰＥＧと結合体化させると（例えば、化合物（８））、溶解度は劇的に向上する（データは示さない）。しかし、サイトカイン誘導効力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（図２Ａ、パネルＡおよびＢ）およびｉｎ  ｖｉｖｏ（図４Ａおよび４Ｂ）で、非修飾ＴＬＲ７アゴニストと比較して減弱される。ＤＯＰＥへのさらなる結合体化（化合物（９））によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも活性を回復することができる。化合物（９）は、Ｔｈ２免疫応答（ＩｇＧ１レベルによって示される）を誘導することができるが、最小のＴｈ１応答（ＩｇＧ２ａレベルによって示される）を示す。
【０１９７】
ＴＬＲ７アゴニスト結合体化合物（４ａ）（ＭＳＡ結合体）および（６）（脂質結合体）は、ＩｇＧ２ａ力価の急速な上昇を促進した（図５Ａ）。ＭＳＡ−ＴＬＲ７結合体（化合物（４ａ））を用いて免疫化したマウスにおけるＩｇＧ２ａのレベルは、最後の免疫化の３週間後に下降したが、脂質ＴＬＲ７結合体（化合物（６））と混合したＯＶＡを用いて免疫化したマウスは、持続され、かつさらに加速される抗原特異的ＩｇＧ２ａレベルを示した（図５Ａ）。化合物（４ａ）は、ＩｇＧ２ａのレベルを維持することができなかったが、化合物（４ａ）と混合したＯＶＡを用いて免疫化したマウスにおける脾臓細胞によるＯＶＡ特異的ＩＦＮ−γの分泌は、比較的高レベルを維持した（図５Ｃ）。別個の免疫プロフィールを与える異なる部分と結合体化させた同じＴＬＲ７アゴニストは、例えば、感染および自己免疫疾患などの別個の疾患カテゴリーを処置するためのアジュバントの設計に有用であり得る。
【０１９８】
ＴＬＲ７アゴニストの種々の結合体を合成し、それらがｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ両方で別個の免疫学的プロフィールを有することが判明した。報告するＴＬＲ７アゴニスト結合体の物理的特性の多様性は、異なる疾患の処置でのより広範な適用を可能にする。水溶性結合体は、全身投与のための経路を提供し得る。脂質含有結合体は、隣接免疫細胞の持続的刺激（例えば、感染性疾患のためのアジュバントの適用）を必要とする局所投与に適切であり得る。脂質部分は、膀胱または皮膚の上皮を通っての薬物の透過を促進することができ、そのため膀胱または皮膚障害の処置に有益であり得る。脂質またはＰＥＧ部分へのＴＬＲ７アゴニストの結合体化は、感染、癌または自己免疫疾患の臨床的処置を拡大する有望な戦略であり得る。
【０１９９】
先天免疫系の細胞上のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性化は、抗原特異的獲得免疫応答を開始させ、増幅させ、方向づける。したがって、ＴＬＲを刺激するリガンドは、可能性のある免疫アジュバントを代表する。多用途の安息香酸官能基によりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、脂質または脂質−ＰＥＧと結合体化させた強力なＴＬＲ７アゴニストを有する各結合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで特徴的な免疫学的プロフィールを提示することができる。例えば、マウスマクロファージおよびヒト末梢血単核細胞において、脂質−ＴＬＲ７結合体は、遊離ＴＬＲ７リガンドよりも少なくとも１００倍強力であった。結合体をｉｎ  ｖｉｖｏで全身投与したとき、脂質および脂質−ＰＥＧ  ＴＬＲ７結合体は、非修飾ＴＬＲ７アクチベーターと比較して、持続したレベルの血清中免疫刺激性サイトカインをもたらした。これらのデータは、ＴＬＲ７リガンドの免疫刺激活性が、結合体化によって増幅され得ることおよび集中され得ること、したがって、これらの薬剤についての可能性のある治療適用の幅を広げる可能性があることを示している。
【０２００】
実施例ＩＩＩ
１Ｖ２７０による膀胱炎症の誘導
Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはカスパーゼ１欠損を、１５０ｎｍｏｌの１Ｖ２７０でまたはビヒクルのみで、２日間隔で３回、膀胱内処置した。１セットのマウスを１回目の処置の２４時間後に屠殺した（図７）。別のセットのマウスを３回目の処置の２４時間後に屠殺した。最初の処置後、単核細胞の浸潤が観察され、３回目の処置後には単核細胞の浸潤が増加した。この浸潤は、カスパーゼ１欠損マウスでは検出されなかった。
【０２０１】
１Ｖ２７０の皮膚適用による全身サイトカイン誘導
Ａｑｕａｐｈｏｒ中の５％１Ｖ２７０を調製し、薬力学を、ＵＣＳＤ  Ｍｏｏｒｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒの薬局から得た５％Ａｌｄａｒａクリームと比較した。研究の１日前、６から８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの側腹部を剪毛した。軟膏／クリームを１平方インチの面積に塗布した。塗布後２時間、４時間、６時間、２４時間および４８時間の時点で血清を採取した。５％  １Ｖ２７０は、Ａｌｄａｒａクリーム（５％）のものに匹敵するレベルのＩＬ−６およびＴＮＦａを全身誘導した（図８）。
【０２０２】
炭疽菌感染を予防するための１Ｖ２７０の肺（粘膜）適用
１Ｖ２７０は、肺投与により局所炎症を誘導する。局所炎症を開始させるリン脂質結合体化ＴＬＲ７の能力を研究するために、６から８週齢の雌Ａ／Ｊマウスに、ＰＢＳ中５％ＤＭＳＯ中の１Ｖ２７０（動物１匹あたり０．５ｎｍｏｌ、１ｎｍｏｌ、２ｎｍｏｌまたは４ｎｍｏｌ）を鼻腔内投与した。投与２時間後にマウスを屠殺し、血清および気管支洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ）（ＢＡＬＦ）を採取した。ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＴＮＦａのレベルをＬｕｍｉｎｅｘビーズアッセイによって決定した。２から４ｎｍｏｌの１Ｖ２７０は、ＢＡＬＦ中で局所炎症性サイトカインを誘導した（図９）。これらのサイトカインのレベルは、血清中のものより高かった。
【０２０３】
１Ｖ２７０によって誘導される炎症は持続性である。１Ｖ２７０によって開始される炎症が、結合体化していないＴＬＲ７アゴニストより長く持続するかどうかをさらに調査した。Ａ／Ｊマウスに１０ｎｍｏｌ／動物の１Ｖ２７０を鼻腔内に受容させ、投与の２４時間、４８時間および７２時間後にＢＡＬＦを採取した。１Ｖ２７０は、４８時間までＩＬ−１２およびＴＮＦａを誘導することができた（図１０）。
【０２０４】
炭疽菌感染を予防するための１Ｖ２７０のワクチン適用。１Ｖ２７０は、抗原、オボアルブミン、とともに投与すると、強力なアジュバントとなる。炭疽菌感染に対する１Ｖ２７０のアジュバント有効性を評価するために、マウスに、照射した炭疽菌胞子（ＩＲＳ）（Ｗｕら、ＰＮＡＳ、１０４：３９９０頁（２００７年））を１Ｖ２７０と混合して投与した。ワクチン接種スケジュールを最適化するために、２つの実験を実施した；短期実験（図１１）および長期実験（図１２）。
【０２０５】
短期実験（図１１）では、Ａ／Ｊマウスを、０．５ｎｍｏｌ、１ｎｍｏｌまたは２ｎｍｏｌの１Ｖ２７０を伴うＩＲＳで処置し、ワクチン接種６日後に炭疽菌Ｓｔｅｒｎｅ株の胞子を用いて抗原投与した。対照マウスには、ＩＲＳまたは１Ｖ２７０（４ｎｍｏｌ／動物）を与えた。ＩＲＳと混合した１ｎｍｏｌの１Ｖ２７０で処置したマウスの半数超が１５日目に生存していたが、０．５ｎｍｏｌまたは２ｎｍｏｌでは生存しなかった。したがって、その後の長期実験では動物１匹あたり１ｎｍｏｌを使用した。
【０２０６】
長期実験（図１２）では、マウスを、ＩＲＳと混合した１Ｖ２７０を用いて２週間間隔で３回、鼻腔内で処置した。コレラ毒素を陽性対照として使用した。なぜならそれは公知の有効な粘膜アジュバントであるからである。対照マウスを１Ｖ２７０、ＩＲＳまたはビヒクル（ＰＢＳ）で処置した。すべてのマウスを、最後のワクチン接種の４週間後に炭疽菌胞子を用いて鼻腔内に抗原投与した。１Ｖ２７０と混合したＩＲＳを用いてワクチン接種したマウスでは、３０日目に１００％生存が観察され、これは、ＣＴをアジュバントとして与えたマウスよりわずかに有効であった。
【０２０７】
実施例ＩＶ
１Ｖ２７０のナノ粒子処方物
Ｐｈｏｓａｌ  ５０  ＰＧ処方物。１Ｖ２７０をＰｈｏｓａｌ  ５０  ＰＧ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  Ｇｍｂｈ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、ドイツ）に溶解して、２０ｘに濃縮した溶液を作製した。Ｐｈｏｓａｌ  ５０ＰＧ−１Ｖ２７０混合物を、ｎａｎｏｐｕｒｅ水でさらに希釈（１：１９）して、５％Ｐｈｏｓａｌ  ５０  ＰＧ：水懸濁物を作製した。その懸濁物を激しくボルテックスし、超音波浴で１０分間、超音波処理した。プローブソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ  １８５）を３０％出力で用いて、懸濁物を過熱しないように間で１０秒停止させながら１０秒間隔で合計３０秒間、その懸濁物をさらに超音波処理した。最後に、懸濁物を、シリンジ押出器（ｓｙｒｉｎｇｅ  ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を合計１０回、前後させて１００ｎｍフィルターに通した。最終ナノ粒子をＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒで分析して、サイズ分布を確認した。得られた粒子をナノリポソーム（サブミクロン二重層脂質小胞）と呼ぶことができる（Ｍｏｚａｆａｒｉによる、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６０５巻、Ｖ．Ｗｅｉｓｓｉｎｇ（編集）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓにおける第２章を参照のこと；この開示内容は参考として本明細書に援用される）。ナノリポソームは、より広い表面積を提供し、かつ溶解度、バイオアベイラビリティーおよびターゲッティングを増加させることができる。
【０２０８】
ＵＶ−１Ｖ２７０粒子をＰＢＳで５０μＭ（Ａ）または１００μＭ（Ｂ）に希釈し、時間をわたって粒径を測定した。図１４に示したように、ナノ粒子は、一般に、時間をわたって安定していた。いくつかの凝集体が、溶解度のほぼ上限である１００μＭで観察された。ＰＢＳ中のＵＶ−１Ｖ２７０の粒径は、比較的一定しており、濃度に関係なく平均して約１１０ｎｍであった。
【０２０９】
実施例Ｖ
４匹のＡ／ＪマウスにＵＣ−１Ｖ２７０（ナノ粒子）、結合体化していないＴＬＲ７アゴニスト（ＵＣ−１Ｖ２０９）、リン脂質のみまたは溶媒対照（ＰＢＳまたは５％未満のＤＭＳＯ）を鼻腔内投与した。ＢＡＬＦおよび血漿を２４時間後に採取し、マルチプレックスＬｕｍｉｎｅｘアッセイによってサイトカインレベルを決定した。ＵＣ−１Ｖ２７０は、最小の全身性副作用で局在化サイトカイン放出を促進した（図１５）。
【０２１０】
炭疽菌ワクチンアジュバントとしてのＵＣ−１Ｖ２７０の有効性を決定するために、１群あたり８匹の雌Ａ／ＪマウスにＰＢＳ、ＩＲＳのみ、ＵＣ−１Ｖ２７０のみ（ナノ粒子；１ｎｍｏｌ／マウス）、ＩＲＳ＋ＵＣ−ＩＶ２７０またはＩＲＳ＋ＣＴ（コレラ毒素；１μｇ／マウス）のいずれかを２週間間隔（ｉｎｔｅｎｄｓ）で３回鼻腔内投与し、最後の免疫化の４週間後に抗原投与した（図１６Ａ）。３０日まで生存を追跡した（図１６Ｂ）。感染後３０日の時点で屠殺したマウスから脾臓を回収し、計量した（図１６Ｃ）。
【０２１１】
生存マウスの胞子特異的Ｔｈ１７およびＴｈ１応答を決定するために、ワクチン接種後の感染から生き残ったマウスから脾細胞（４００，０００／ウエル）をＩＲＳ（１０６／ウエル）で三連で５日間培養し、未感染のワクチン接種していないマウスからの脾細胞を対照として役立てた。ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ応答を測定した（図１７）。
【０２１２】
ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７が生存に重要であるかどうかを検出するために、雌Ａ／ＪマウスにＩＲＳ＋ＵＣ−１Ｖ２７０（１ｎｍｏｌ／マウス）を鼻腔内投与し、生炭疽菌胞子の抗原投与の１日前に開始して１日２回、抗ＩＬ−１７抗体および抗ＩＦＮγ抗体を与えた。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７の枯渇は、免疫化マウスを感染しやすくさせる（図１８）。
【０２１３】
まとめると、ＵＣ−１Ｖ２７０および死滅炭疽菌胞子での粘膜免疫化は、マウスを肺炭疽菌感染から完全に保護した。粘膜免疫化は、胞子特異的Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞免疫応答を誘導し、ならびにインターフェロン−γおよびインターロイキン−１７が感染に対する耐性に必要とされることが判明した。
【０２１４】
単一薬剤としてのＰｈｏｓａｌ処方１Ｖ２７０は、局所サイトカインを誘導したが、ＩＦＮ−ｇを除いて全身サイトカイン誘導は殆ど検出できなかった（図１９）。照射した胞子（ＩＲＳ）と一緒にアジュバントとして使用したとき、３用量すべてが動物を保護した（図２０）。１ｎｍｏｌが有効性を示した、ＤＭＳＯ中の１Ｖ２７０の使用とは対照的に、はるかに低い用量のＰｈｏｓａｌ処方１Ｖ２７０の使用が有意な保護をもたらした。
【０２１５】
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許および特許文書は、まるで、参照により個々に組み込まれるように、参考として本明細書に援用される。いずれかの矛盾がある場合には、本明細書中の任意の定義を含めた本開示内容に従う。本発明は、種々の特定の、好ましい実施形態および技術を参照して記載されている。しかし、本発明の趣旨および範囲内にとどまりながら、多数の変法および改変を行うことができるということは理解されなければならない。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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