(57)【要約】導電層でコーティングされた複数のナノワイヤー（例えば、Ｓｉ  ＮＷ）を含む分子送達デバイス。ナノワイヤーで媒介される電気穿孔によって分子を送達するための方法も開示されている。本発明は、振幅が１０Ｖ未満の電圧波形により、一セットの導電性ナノワイヤーを集合的に細胞内電極として使用して、細胞を効率的に電気穿孔することができるという予期しない発見に基づく。一態様では、本発明は、（ｉ）担体と、（ｉｉ）表面の表面に付着した複数のナノワイヤーとを含む分子送達デバイスを特徴とする。担体は導電性であり、ナノワイヤーは導電層でコーティングされている。
2013541337.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面を有する担体と、
前記表面に付着した複数のナノワイヤーと
を備える分子送達デバイスであって、前記担体は、導電性であり、前記ナノワイヤーは、導電層でコーティングされている、分子送達デバイス。
【請求項２】
前記ナノワイヤーのそれぞれが、前記表面に対して実質的に垂直方向に沿って前記表面に付けられている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記ナノワイヤーのそれぞれが、半導体、化合物半導体、金属酸化物、金属、炭素、窒化ホウ素、またはこれらの組合せから形成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記半導体がシリコンである、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記ナノワイヤーのそれぞれが、高さ２０〜１０，０００ｎｍ、および直径１０〜５００ｎｍである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記高さが１００〜５，０００ｎｍであり、前記直径が５０〜２５０ｎｍである、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
前記高さが８００〜１，２００ｎｍであり、前記直径が７０〜１８０ｎｍである、請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
前記導電層が、金属、金属酸化物、半導体、化合物半導体、金属窒化物、またはこれらの組合せから形成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記ナノワイヤーの密度が、０．０５〜１０μｍ−２である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記密度が０．１〜５μｍ−２である、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記密度が０．２〜２μｍ−２である、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
細胞に分子を送達する方法であって、
表面を有する担体、および前記表面に付着した複数のナノワイヤーを提供するステップであって、前記担体およびナノワイヤーはともに導電性である、ステップと、
前記ナノワイヤーを前記細胞と接触させることによって、１つまたは複数のナノワイヤーを前記細胞内に貫通させるステップであって、前記細胞は、前記分子を含有する浴溶液中に浸漬されている、ステップと、
前記担体と前記浴溶液中の電極との間に電流波形または電圧波形を印加し、それによって、前記分子が、細胞膜上に一過性に形成された孔を通じて前記細胞内に入るステップと
を含む、方法。
【請求項１３】
前記ナノワイヤーが導電層でコーティングされている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、または小分子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記真核細胞が、初代細胞、形質転換細胞、または癌性細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記初代細胞が、ニューロン、神経芽細胞、β細胞、筋細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、単球、免疫細胞、幹細胞、または卵母細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記電圧波形の振幅が０．１〜１０Ｖである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記振幅が３〜７Ｖである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記振幅が４〜６Ｖである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞に分子を送達する方法であって、
表面を有する担体、およびそれぞれが第１の端部および第２の端部を有する複数の導電性ナノワイヤーを提供するステップであって、前記担体、および前記ナノワイヤーのそれぞれは、前記ナノワイヤーのそれぞれの前記第１の端部および第２の端部を除いて電気絶縁層でコーティングされており、前記第１の端部は、前記表面に付けられており、前記第２の端部は、導電層でコーティングされている、ステップと、
前記ナノワイヤーを、前記分子を含有する浴溶液中に浸漬された前記細胞と接触させることによって、１つまたは複数のナノワイヤーを前記細胞内に貫通させるステップと、
一方が前記ナノワイヤーのそれぞれの前記第１の端部に接続され、他方が前記浴溶液中に配置された２つの電極間に電流波形または電圧波形を印加し、それによって前記分子が、細胞膜上に一過性に形成された孔を通じて前記細胞内に入るステップと
を含む、方法。
【請求項２２】
前記分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、または小分子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記真核細胞が、初代細胞、形質転換細胞、または癌性細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記初代細胞が、ニューロン、神経芽細胞、β細胞、筋細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、単球、免疫細胞、幹細胞、または卵母細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記電圧波形の振幅が０．１〜１０Ｖである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記振幅が３〜７Ｖである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記振幅が４〜６Ｖである、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１０年９月２９日に出願された米国仮出願第６１／３８７，６０４号および２０１１年３月１４日に出願された米国仮出願第６１／４５２，２８３号の両方の優先権を主張する。これらの先の出願は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府によって資金を提供された研究についての声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与された契約番号１ＤＰ１ＯＤ００３８９３−０１の下、政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
細胞内への外因性遺伝物質の送達は、ウイルスによって（例えば、アデノ随伴ベクター、またはレンチウイルスベクターを使用して）、化学的に（例えば、リン酸カルシウム、リポソーム、またはポリカチオンを使用して）、機械的に（例えば、微量注入）、およびまたは物理的に（例えば、電気穿孔）達成することができる。
【０００４】
これらの異なる送達方法の中で、電気穿孔は、２つの平行な電極の間に形成される均一電場内に細胞を配置することによって達成される。膜内外電位差が０．２５〜１Ｖ付近の閾値レベルを超えると、細胞膜の脂質二重層が再編成して親水性孔（一般に、直径が２０〜１２０ｎｍの間）を形成する。孔サイズより小さいあらゆる分子が、電気泳動または拡散によって細胞内に流れることができる。一般的に、溶液中に懸濁された細胞を電気穿孔するために、数マイクロ秒〜１ミリ秒続く１０００Ｖ付近のパルス（細胞サイズによって変動する）が要求される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この方法は、ある特定の細胞について有効に機能するが、小さな免疫細胞およびニューロンの電気穿孔は、それほど成功していない。電気穿孔のために小さな細胞またはニューロンに均一電場が印加されるとき、細胞膜の大部分にわたる電位は、破壊電位を超え、低い細胞生存度をもたらす。これらの細胞のための改善された電気穿孔法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、振幅が１０Ｖ未満の電圧波形により、一セットの導電性ナノワイヤーを集合的に細胞内電極として使用して、細胞を効率的に電気穿孔することができるという予期しない発見に基づく。
【０００７】
一態様では、本発明は、（ｉ）担体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）と、（ｉｉ）表面の表面に付着した複数のナノワイヤーとを含む分子送達デバイスを特徴とする。担体は導電性であり、ナノワイヤーは導電層でコーティングされている。
【０００８】
上述したデバイスにおいて使用される導電性担体は、導電性材料でコーティングされた表面を有する非導電性材料または半導電性材料から作製された担体とすることができ、この表面は、ナノワイヤーと電気的に連絡している。あるいは、これは、導電性材料から作製されてもよい。担体の材料の例として、半導体（例えば、ＳｉおよびＧｅ）、化合物半導体（例えば、ＩｎＰおよびＧａＡｓ）、金属酸化物（例えば、ＺｎＯ、ＩＴＯ、およびＩｒ酸化物）、ならびに金属（例えば、Ａｕ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｉｒ、およびＣｒ）が挙げられる。
【０００９】
用語「ナノワイヤー」（または以下で「ＮＷ」）は、１ｎｍ〜１μｍの範囲の直径を有するワイヤー、ロッド、または錐体の形状での材料を指す。本明細書では、錐体は、０〜９０度（例えば、０〜１５度）の範囲の半角を有する。ＮＷは、表面に対して実質的に垂直方向（すなわち、６０〜９０度）に沿って表面に付着していることが好ましい。これらは、２０〜１０，０００ｎｍ（例えば、１００〜５，０００ｎｍ、および８００〜１，２００ｎｍ）の高さ、１０〜５００ｎｍ（例えば、５０〜２５０ｎｍ、および７０〜１８０ｎｍ）の直径、ならびに１μｍ２当たり０．０５〜１０ワイヤー（例えば、１μｍ２当たり０．１〜５ワイヤー、および１μｍ２当たり０．２〜２ワイヤー）の密度を有することができる。これらは、半導体（例えば、ＳｉおよびＧｅ）、化合物半導体（例えば、ＧａＡｓおよびＩｎＰ）、金属酸化物（例えば、ＺｎＯ）、金属（例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｉｒ、Ｐｔ）、炭素、窒化ホウ素、またはこれらの組合せから形成することができる。
【００１０】
ＮＷ上にコーティングされる導電層、および担体は、金属（例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ｉｒ、Ａｌ、Ｗ、Ｔｉ、およびＦｅ）、金属酸化物（例えば、Ｉｒ酸化物、ＩＴＯ、およびＺｎＯ）、半導体（例えば、ＳｉおよびＧｅ）、化合物半導体（例えば、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＡｓ、およびＧａＮ）、金属窒化物（例えば、ＴｉＮ、ＺｒＮ、およびＴａＮ）、またはこれらの組合せから形成することができる。
【００１１】
化合物半導体は、２種以上の元素から形成することができ、例えば、ＩＶ−ＩＶ半導体（例えば、ＳｉＣおよびＳｉＧｅ）、ＩＩＩ−Ｖ半導体（例えば、ＡｌＮ、ＡｌＰ、ＡｌＧａＡｓ、ＧａＮ、ＧａＡｓ、ＩｎＰ、およびＩｎＧａＡｓ）、ＩＩ−Ｖ半導体（例えば、Ｚｎ３Ｓｂ２およびＣｄ３Ａｓ２）、ＩＩ−ＶＩ半導体（例えば、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、およびＣｄＴｅ）、ＩＶ−ＶＩ半導体（例えば、ＳｎＳおよびＰｂＳｎＴｅ）、Ｉ−ＶＩ半導体（例えば、Ｃｕ２Ｓ）、Ｉ−ＶＩＩ半導体（例えば、ＣｕＣｌ）、ならびに酸化物半導体（例えば、ＳｎＯ２、ＣｕＯ、およびＣｕ２Ｏ）などである。別段の明言のない限り、本発明の電気デバイスに使用される半導体には、その固有形態（すなわち、純粋形態）、およびドープ形態（すなわち、１つまたは複数のドーパントを含有する）の両方が含まれる。用語「組合せ」は、２種以上の成分の混合物、合金、または適当な反応生成物を指す。例えば、「シリコンと金属の組合せ」は、シリコンと金属の混合物、または金属のケイ化物である場合がある。
【００１２】
別の態様では、本発明は、細胞内に外因性分子を送達する方法に関する。この方法は、（ｉ）表面を有する担体、およびこの表面に付着した複数のＮＷを提供するステップであって、担体およびＮＷのそれぞれは、導電性であるステップと、（ｉｉ）ＮＷを細胞と接触させることによって、細胞内にＮＷを貫通させるステップと、（ｉｉｉ）浴溶液中で担体と電極の間に電流波形または電圧波形を印加するステップとを含む。結果として、分子は、細胞膜中に一過性に形成された孔を通じて細胞内に入る。導電性ＮＷは、（１）導電性材料でコーティングされた表面を有し、この表面は、ＮＷが付けられている担体の表面と電気的にコミュニケートしている非導電性材料もしくは半導電性材料製、または（２）導電性材料製とすることができる。
【００１３】
この方法で使用されるデバイスは、この方法において使用されるＮＷが、導電層でコーティングされていても、コーティングされていなくてもよいことを除いて、上述したものと同じである。
【００１４】
送達される分子は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ならびにｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含めたＲＮＡ）、タンパク質、多糖、または小分子とすることができる。用語「小分子」は、様々な薬物分子、蛍光色素、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、およびペプチドを含めた、１０００Ｄａ未満の分子量を有する任意の分子を指す。
【００１５】
細胞は、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）であっても、真核細胞（例えば、酵母細胞およびヒト細胞）であってもよい。ヒト細胞は、初代細胞、形質転換細胞（例えば、ＨＥＫ細胞）、または癌性細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）とすることができる。初代細胞は、卵母細胞、ニューロン、神経芽細胞、β細胞、筋細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト（ｋｅｒｏｔｉｎｏｃｙｔｅ）、単球、免疫細胞、または幹細胞とすることができる。免疫細胞は、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞、および樹状細胞とすることができる。幹細胞は、胚性幹細胞であっても、成体幹細胞（例えば、造血幹細胞および間葉幹細胞）であってもよい。各生物学的な細胞は、２つ以上のＮＷによって貫通されることが好ましい。
【００１６】
電気シグナルは、電流シグナルまたは電圧シグナルとすることができる。電圧波形の振幅は、０．１〜１０Ｖ（例えば、３〜７Ｖおよび４〜６Ｖ）である。用語「波形」は、時間の関数としての電圧（または電流）振幅のプロットである。これは、正方形、三角形、のこぎり歯、または正弦曲線の形状におけるパルスについての一般用語である。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、外因性分子を細胞内に送達する方法に関する。この方法は、（ｉ）電気的に絶縁された層でコーティングされた表面を有する担体と、それぞれが第１の端部および第２の端部を有し、第１の端部および第２の端部を除いて電気絶縁層でコーティングされた複数の導電性ナノワイヤーであって、第１の端部が表面に付けられ、第２の端部が導電層でコーティングされた導電性ナノワイヤーとを提供するステップと、（ｉｉ）ナノワイヤーを、分子を含有する浴溶液中に浸漬された細胞と接触させることによって、１つまたは複数のナノワイヤーを細胞内に貫通させるステップと、（ｉｉｉ）一方がナノワイヤーのそれぞれの第１の端部に接続され、他方が浴溶液中に配置された２つの電極間に電流波形または電圧波形を印加するステップとを含む。結果として、分子は、細胞膜上に一過性に形成された孔を通じて細胞内に入る。
【００１８】
この方法で使用される担体は、半導体（例えば、Ｓｉ）、化合物半導体（例えば、ＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＧａＮ、およびＧａＰ）、またはダイヤモンドで形成することができる。これは、電気的に絶縁された層でコーティングされている。この方法で使用されるＮＷは、ＮＷのそれぞれの２つの端部間の領域が電気的に絶縁された層でコーティングされていることを除いて、上述したものと同じである。さらに、各ＮＷは、電圧波形によって個々にアドレス可能となり得る。電気絶縁層は、酸化物（例えば、シリカ、アルミナ、およびハフニウム酸化物）、窒化物（例えば、窒化ケイ素）、またはこれらの組合せから形成される。あるいは、電気絶縁層は、有機物質、例えば、パリレン（例えば、パリレンＣ、Ｎ、ＡＦ−４、ＳＦ、ＨＴ、Ａ、ＡＭ、ＶＴ−４、またはＣＦ）、ポリジメチルシロキサン、メタクリル酸メチル、フォトレジスト（例えば、ＳＵ−８）、および電子ビームレジスト（例えば、ポリメチルメタクリレート、ＺＥＰ−５２０、および水素シルセスキオキサン）などから形成される。
【００１９】
細胞は、上述したように、原核細胞および真核細胞とすることができる。送達される分子は、核酸、タンパク質、多糖、または小分子とすることもできる。電気シグナルは、電流シグナルまたは電圧シグナルとすることができる。電圧波形の振幅は、０．１〜１０Ｖである。
【００２０】
２つの上述したＮＷベースの電気穿孔法の１つの利点は、分子送達を達成するのに要求される低い電圧波形、すなわち、振幅が１０Ｖ未満であることである。これは、商業的な電気穿孔システムによって使用されるものの約１００分の１である。要求電圧を下げることは、器具使用をより手軽にするだけでなく、これは、細胞死を引き起こし得るアーク放電の可能性も減少させる。さらに、これらの方法は、これらの形状（例えば、サイズ）、または電圧パルス（例えば、振幅およびパルス持続時間）を変更することによって、ほとんどすべての真核細胞および原核細胞に分子を送達するのに使用することができる。
【００２１】
原核細胞に移行すると、大規模な並列の抗生物質スクリーニングを含めた豊富な新規用途が可能になる。シリコンウエハー上のＮＷは、量産することができる。このハイスループット、低コスト生産は、本発明の送達方法の広範囲の用途を可能にする。
【００２２】
１つまたは複数の実施形態の詳細を、以下の付随する説明において示す。他の態様、特徴、および利点は、以下の図面、実施形態の詳細な説明、およびまた、添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１ａは、垂直Ｓｉ  ＮＷのアレイの頂部で培養され、固定されたヒト線維芽細胞の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像であり、図１ｂは、白金コーティングされたＳｉ  ＮＷのＳＥＭ画像であり、図１ｃは、導電性ＮＷの先端部における電場増強の有限要素シミュレーションを示すピクチャーである。スケールバー：（ａ）１０μｍ、（ｂ）２００ｎｍ、および（ｃ）２００ｎｍ。
【図２】図２ａおよび図２ｂは、それぞれ、いずれのパルスも印加してない（対照）、および５．７５Ｖの振幅を有する一連の電圧パルスを印加した、ＨＥＫ２９３細胞のＨｏｅｃｈｓｔ核標識を示す２つの蛍光画像であり、図２ｃおよび図２ｄは、それぞれ、パルスをまったく印加しない（対照）後、および５．７５Ｖの振幅を有する一連の電圧パルスを印加した後のＨＥＫ２９３細胞中の非膜浸透性緑色蛍光色素（カルセイン）の非存在および存在を示す２つの蛍光画像であり、図２ｅおよび図２ｆは、それぞれ、パルスをまったく印加しない（対照）後、および５．７５Ｖの振幅を有する一連の電圧パルスを印加した後の死細胞の染色を示す２つの蛍光画像であり、図２ｇは、細胞の蛍光強度を示すヒストグラムであり、図２ｈは、トランスフェクション効率および細胞生存度を示す棒グラフである。
【図３】図３ａは、シリコンオンインシュレーターで製作した、一セットの先端がＰｔのＮＷ電極の走査電子画像であり（挿入図は、ＮＷ電極の拡大図であり、絶縁酸化物の終端を、ＮＷの基部に見ることができる）、図３ｂは、ＮＷ電極の頂部で培養されたＨＥＫ２９３細胞の微分干渉コントラスト画像である。左下から近づいていることが見られるパッチピペットを使用することによって、電気穿孔を介して細胞内に注入される電流をモニターする。図３ｃは、Ｓｉ  ＮＷ電極に印加された電圧波形を示す図であり、図３ｄおよび図３ｅは、それぞれ、４．５Ｖおよび５．５Ｖの振幅を有する電圧波形に応答して細胞内に注入された電流の振幅を示す図である。
【図４】図４ａは、頂部で培養されたＨＥＫ２９３細胞を有するＳｉ  ＮＷ電極を示す明視野像であり、図４ｂは、赤色蛍光色素が電気穿孔を介して単一の細胞に送達された後の同じ領域の蛍光画像であり、図４ｃは、核の対応する蛍光画像であり、図４ｄは、上記３つの画像の重ね合わせである。矢印は、Ｓｉ  ＮＷの位置を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ＮＷベースの電気穿孔デバイス、および細胞内に外因性分子を電気穿孔する方法に関する。
【００２５】
本発明において使用されるＮＷは、導電性であり、好ましくは、担体に垂直に付けられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ電気穿孔について、細胞は、このようなＮＷ担体上で直接培養し、または別の担体上で培養し、ＮＷと密接に接触させることができる。あるいは、このようなＮＷ担体を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕ生体分子送達のために移植することができる。
【００２６】
１つまたは複数のＮＷの一方の端部は、細胞の基底膜を貫通し、その内部に位置する。細胞内部にその端部がある一セットのこれらのＮＷは、細胞が浸漬された浴溶液中で、細胞外電極と対になった細胞内電極または傍細胞電極として集合的に作用する。電位または電流がこの対の電極にわたって印加されるとき、各ＮＷの細胞内端部は、ＮＷ先端部の曲率半径と同等の領域（一般的に、直径が１００ｎｍ未満）に電場を集束させることができる。電場のこのナノスケール集束は、電気穿孔プロトコールの開発に追加の自由度を加える。電場分布は、垂直ＮＷの密度、アスペクト比、および曲率半径をリソグラフィーで調整することによって制御することができる。閾値電位を超える細胞膜の部分的範囲を決定し、したがって、細胞、特に、トランスフェクトすることが困難な細胞（例えば、幹細胞および免疫細胞）の効率的で低毒性の電気穿孔を可能にすることができる。さらに、電圧および電流レベル、パルス持続時間、ならびにパルス数を最適化することによって、所望レベルの効率および生存度を達成することができる。
【００２７】
一実施形態では、ＮＷおよびこれらの担体の両方が導電性である。ＮＷは、担体上に均等に広げられている。ＮＷは、（Ｓｈａｌｅｋら、２０１０年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１０７巻、１８７０〜１８７５年）に記載されているように、ハイスループット様式で導電性Ｓｉウエハー上に製作することができる。次いでこれらのＮＷを金属でコーティングすることができ、これにより、ＮＷの導電率が増強される。分子送達は、ＮＷ担体の頂部で細胞を培養し、担体と浴溶液中の電極との間に電流波形または電圧波形を印加することによって達成することができる。生体分子送達に要求される振幅は、わずかに数ボルトである。担体頂部の細胞のほとんどすべてが電気穿孔され、生存可能なままである。
【００２８】
ＮＷおよび担体は、導電性材料、半導体材料、および絶縁材料、例えば、シリコン、酸化ケイ素、窒化ケイ素、炭化ケイ素、酸化鉄、酸化アルミニウム、酸化イリジウム、タングステン、ステンレス鋼、銀、白金、金、およびガラスなどを含めた任意の材料から形成することができる。導電層は、細胞毒性が低い材料（例えば、金、銀、および白金）から形成される。
【００２９】
別の実施形態では、Ｓｉ  ＮＷは、個々のセットが、細胞内に生体分子を部位特異的に送達することを可能にするように、担体上で成長させられる。各個々のセットは、他のセットから電気的に絶縁されている。同じセット内のＮＷのみが、他のセットから独立して電気的に接続され、電圧波形によってアドレス可能である。細胞のクラスターの中で、１個の細胞のみが垂直ＮＷの１つの個々にアドレス可能なセットの頂部にあり、電気穿孔を介して蛍光色素を受け取る。このようにして、相互作用系内で個々の細胞に特定の摂動をもたらすことによって、細胞間相互作用または細胞−ネットワーク相互作用を試験することができる。
【００３０】
ＮＷの上にコーティングされる絶縁層は、細胞毒性が低い材料（例えば、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、および窒化ケイ素）から形成される。
【００３１】
担体上にＮＷのアレイを得るために、２つの手法が広く使用されている。１つは、前駆体材料からＮＷを成長させることを本質的に伴う、いわゆるボトムアップ手法である。例えば、化学蒸着法（ＣＶＤ）を採用して、ＮＷ成長プロセスは、担体の頂部に触媒またはシード粒子（通常、１ｎｍから数百ナノメートルの直径を有する）を配置またはパターン形成することから始まり、次に、前駆体材料が触媒またはシード粒子に添加され、粒子が前駆体で飽和した状態になると、ＮＷは、デバイスのエネルギーを最小にする形状で成長し始める。前駆体、担体、触媒／シード粒子（例えば、担体上のサイズ、密度、および堆積方法）、ならびに成長条件を変更することによって、ＮＷを、選択した部位に、様々な材料、サイズ、および形状で作製することができる。別の手法であるトップダウンプロセスは、支持担体から既定の構造を除去する（例えば、エッチングによって）ことを本質的に伴う。例えば、ＮＷが形成される部位がソフトマスク（例えば、フォトレジスト）中に、最初にパターン形成され、このソフトマスクは、後続のエッチングの間にＮＷが形成される部位を保護するか、またはハードマスクをパターン形成するのに使用され、エッチングステップがその後実施されることによって（湿式または乾式）、パターン形成された部位が３次元ワイヤーにされる。
【００３２】
異なる細胞型への分子送達の効率は、ＮＷサイズまたは密度を変更することによって操作することができる。
【００３３】
上述した電気穿孔法の企図された使用には、以下のことが含まれる。
【００３４】
（１）特に、トランスフェクトすることが困難な細胞へのハイスループット生体分子送達。用途には、トランスフェクション、細胞の再プログラミング、幹細胞分化、ならびに細胞内および細胞間シグナル伝達カスケードのプロービングが含まれる。
【００３５】
（２）相互作用している細胞のネットワークまたはシステム内の生体分子の細胞特異的送達。
【００３６】
（３）再懸濁することが難しい接着細胞（ニューロンなど）の電気穿孔。
【００３７】
（４）同じ細胞への異なる用量の同じ分子、または様々な用量の異なる分子を用いた、異なる時点での繰り返しの電気穿孔。細胞内電極として細胞膜を貫通するＮＷは、細胞生存度を損なわないので、これらの細胞は電気穿孔と電気穿孔との間でＮＷ担体上に残ることができる。
【００３８】
さらに詳述することなく、上記説明は、本発明を適切に使用可能にしたと考えられる。したがって以下の実施例は、単に例示的であり、形はどうあれ決して本開示の残りを限定するものでないと解釈されるべきである。本明細書に引用される刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）
電気穿孔のためのＮＷ電極担体の製作
シリコン担体上のＮＷのアレイを、厚さ２００ｎｍの熱的に成長させた酸化ケイ素層でコーティングされたシリコンウエハーをドライエッチングすることによって形成した。大きい面積にわたってＮＷを製作するために、コロイド金ナノ粒子（平均直径１００ｎｍ、Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａから購入、購入した試料を約１７倍濃縮した後に使用）を、３％のポリメチル−メタクリレート（ＰＭＭＡ）のクロロベンゼン溶液中に再懸濁して懸濁液を形成した。次いで、シリコンウエハーに懸濁液を３０００ＲＰＭでスピンコーティングすることによって、ウエハー表面上に厚さ１００ｎｍのＰＭＭＡ−ナノ粒子膜を生成した。次いで、ウエハーを、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）デバイス（ＮＥＸＸ  ＤＥＶＩＣＥＳ  ＣＩＲＲＵＳ  １５０）内で、ＣＦ４プラズマで３分間処理することによって、金ナノ粒子の直下にはない領域内の酸化ケイ素をエッチングした。次いで、金ナノ粒子をＴＦＡ金エッチング液でエッチングにより除去して、分離された酸化ケイ素ドットのパターンを生成した。シリコンウエハーを覆うパターンは、垂直ＮＷを形成するのにウエハーをエッチングするためのマスクとして作用した。ウエハーを、別のＲＩＥデバイス（ＳＵＲＦＡＣＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＤＥＶＩＣＥＳ  ＩＣＰ  ＲＩＥ）内で、誘導結合ＨＢｒ：Ｏ２プラズマで１０分間エッチングすることによって、垂直に整列したＳｉ  ＮＷのアレイを形成した（平均長：１０００ｎｍ；平均直径：１５０ｎｍ；密度：０．５ワイヤー／μｍ２）。５：１の緩衝酸化物エッチング液中にウエハーを浸漬することによって、酸化ケイ素マスクを除去した。ウエハーを電子ビーム蒸発器内に直ちに装填し、そこで、ＮＷおよび担体の表面を１００ｎｍのＰｔでコーティングした。ウエハーの裏面への金属接触を、同様の様式で作製した。
【００４０】
（実施例２）
ＮＷアレイ上での細胞のプレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）
８０〜１００％の間でコンフルエントなＨＥＫ２９３細胞または線維芽細胞を、トリプシン処理を５分間行うことによって、培養フラスコから取り出した。培地で酵素をクエンチした後、細胞を再懸濁して１００万細胞／ｍＬの濃度にした。次に、実施例１で調製された、垂直にエッチングされたＮＷを有するシリコン担体が入っている４８ウェル細胞培養プレートの各ウェルに細胞懸濁液２００μＬを添加した。細胞培養プレートをインキュベーター（５％のＣＯ２、９０％の相対湿度）内に配置した。インキュベーションを１５分行った後、追加の培地１５０μＬを添加した。追加のインキュベーションを１８時間行った後、試料を画像化した。図１ａに示したように、ヒト線維芽細胞は、担体に付着し、多数のＮＷによって貫通されているにもかかわらず生細胞として広がっていた。
【００４１】
（実施例３）
ＮＷ電気穿孔を介した分子送達
上述した方法を使用して、実施例１で調製された、垂直にエッチングされたＮＷを有するシリコン担体の頂部に、ＨＥＫ２９３細胞をプレーティングおよび培養した。担体への裏面電気接触を形成することによって、ＮＷ電極を接地した。細胞培養液を囲繞するＰＤＭＳウェルを使用することによって、１ｎＭの膜不透過性色素（カルセイン）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の溶液を閉じ込めた。Ａｇ／ＡｇＣｌ対電極を、ＮＷ担体の約０．５ｃｍ上に、ＰＢＳ中に配置した。二相性１００Ｈｚの矩形波電圧トレインを、対電極とＮＷ担体の間に０．４秒間印加し、３０秒後に電圧トレインを繰り返した。３０秒後に、色素が加えられたＰＢＳから担体を取り出し、清潔なＰＢＳに通して洗浄し、画像化した。電圧パルスの振幅は、対照実験および送達実験について、それぞれ０Ｖおよび５．７５Ｖであった。細胞生存度をアッセイするために、電気穿孔した後に、ＥｔｈＤ−１中で、室温で２０分間細胞をインキュベートし、蛍光で画像化した。膜が電気穿孔から回復しなかった、またはさもなければ多孔質であった細胞は、ＥｔｈＤ−１が核ＤＮＡに結合しているために強い核蛍光を示す。これらの細胞は、死んでいるとしてカウントし、Ｈｏｅｃｈｓｔ核標識を介してカウントした細胞の全数と比較した。
【００４２】
図２に示したように、このＮＷ電気穿孔法は、ＨＥＫ２９３細胞内への膜不浸透性色素（カルセイン）の送達において９７％超の効率を呈し、８５％超の細胞生存度を維持した。さらに、細胞は、ＮＷ担体頂部で生存可能なままであり、必要であれば、繰り返して電気穿孔することができた。
【００４３】
（実施例４）
個々にアドレス可能なＮＷ電極の製作
シリコン担体上のＳｉ  ＮＷのアレイを、いくつかのリソグラフィーステップ、エッチングステップ、および堆積ステップを介して形成した。
【００４４】
最初に、電子ビームリソグラフィー（ＥＢＬ）を介してエッチマスクを画定した。シリコンオンインシュレーターウエハーに、ＸＲ−１５４１  ６％固体ネガティブＥビームレジスト（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）を２０００ＲＰＭでコーティングすることによって、厚さ約２００ｎｍのレジストの層を生成した。次いで、ウエハーを２２５℃で２分間ベークした後、電子ビームに曝露した。Ｒａｉｔｈ−１５０  ＥＢＬツールを使用することによって、ＮＷ形成が望まれる位置に直径１００ｎｍの円を画定した。１０００μＣ／ｃｍ２の線量で曝露した後、ウエハーを２２５℃で４分間、再びベークした。次いでパターンを、２５％のテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）中で１５秒間現像した。現像後に残ったレジストは、後続のエッチングプロセスのためのハードマスクとして作用した。ＨＢｒ：Ｏ２の誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）をＩＣＰ−ＲＩＥシステム（ＳＵＲＦＡＣＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ）内で１０分間印加することによって、Ｓｉ  ＮＷのアレイを得た（平均長：１０００ｎｍ；平均直径：１５０ｎｍ；密度：０．５ワイヤー／μｍ２）。次いで、４９％のフッ化水素酸中にウエハーを浸漬することによって、レジストマスクを除去した。次いで、８００℃でＳｉＯ２の低圧化学蒸着法（ＬＰＣＶＤ）を使用してＮＷを絶縁した。ＮＷ先端部のＳｉＯ２を除去するために、Ｓ１８１８フォトレジスト（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ）を３０００ＲＰＭでスピニングし、Ｏ２プラズマ（Ｕｎａｘｉｓ  ＲＩＥ）を使用してストリップバック（ｓｔｒｉｐ  ｂａｃｋ）し、Ｓｉ担体上に５００ｎｍの膜を残した。次いで、この層の上に突出するＮＷの先端部を、ＣＦ４プラズマを使用してエッチングすることによって（ＳＴＳ  ＩＣＰ−ＲＩＥ）、先端部を覆っているＳｉＯ２を除去した。次いで、デバイスを１分のＯ２プラズマデスカムで処理し、その後、緩衝酸化物エッチング液（ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｏｘｉｄｅ  ｅｔｃｈ）（ＢＯＥ）５：１中に１０秒間浸漬した。次いで担体を熱蒸発器内に装填し、そこで電子ビーム蒸発器を使用して７０ｎｍ蒸着した。次いでレジストを、８０℃でＲｅｍｏｖｅｒ  ＰＧ（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）を使用して数時間溶解させ、ＮＷ先端部のみに金属層を残した。
【００４５】
個々にアドレス可能なＮＷ電極を作製するために、３０００ＰＲＭでウエハー上にＳ１８１８フォトレジスト（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ）をスピニングすることによって、電極路（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｔｒａｃｔ）をパターン形成した。１１５℃で１分間ウエハーをベークした後、ＵＶ接触リソグラフィーを使用して電極同士間の領域を露光した。次いで、露光されたレジストを、ＭＦ−３１９（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ）を使用して現像した。残っているレジストは、Ｃ４Ｆ８：ＳＦ６プラズマを使用するＳｉ担体のＩＣＰ−ＲＩＥエッチング（ＳＴＳ）のためのマスクとして役割を果たした。Ｒｅｍｏｖｅｒ  ＰＧを用いてレジストをストリップした後、原子層堆積（ＡＬＤ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＮａｎｏＴｅｃｈ）を使用して、担体を１００ｎｍのＡｌ２Ｏ３でコーティングした。接触リソグラフィーを使用して、直径２０ミクロンの面積をＮＷの周囲で露光し、ならびに接触パッドのための１×０．５ｍｍの面積を露光した。現像後、これらの領域中のＡｌ２Ｏ３を、ＴｒａｎｓＥｔｃｈ（Ｔｒａｎｓｅｎｅ）を使用して除去した。フォトレジストを除去し、再び塗布し、接触領域単独を露光および現像した。ＢＯＥ  ５：１を使用してこれらの領域中のＳｉＯ２をストリップした後、Ｐｔ層を以前のように蒸着し、フォトレジストをストリップした。
【００４６】
（実施例５）
電気穿孔を介して注入されるイオン電流
実施例４で調製した個々にアドレス可能なセットの垂直ＮＷを有するシリコン担体頂部にＨＥＫ２９３細胞をプレーティングおよび培養した。電圧パルスをＮＷ電極（細胞外溶液中のＡｇ／ＡｇＣｌ電極から約０．５ｃｍ離れた）に印加しながら、電圧クランプモードで従来のパッチクランプ測定を実施することによって膜貫通電流を測定した。図３に示したように、５．５Ｖの低い振幅を有する外部電圧波形は、透過化された細胞膜を通るイオン電流を作り出す。
【００４７】
（実施例６）
部位特異的生体分子送達
実施例４で調製した個々にアドレス可能なセットの垂直ＮＷを有するシリコン担体頂部にＨＥＫ２９３細胞をプレーティングおよび培養した。細胞特異的送達は、４．５Ｖの振幅を用いて、図３と同様の電圧刺激の後に達成された。細胞外溶液は、１ｍｇ／ｍＬの膜不透過性蛍光色素（Ａｌｅｘａ  ６４７）を含有するＰＢＳであった。電圧パルスの後、ＰＢＳを通して細胞を数回洗浄した後、蛍光画像化を行った。図４に示したように、細胞不透過性蛍光色素は、電圧波形を印加した後、個々にアドレス可能なセットの垂直ＮＷの頂部の個々のＨＥＫ２９３細胞に送達された。
【００４８】
他の実施形態
本明細書に開示した特徴のすべては、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示した各特徴は、同じ目的、等価な目的、または同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えることができる。
【００４９】
したがって、別段の特別な明言のない限り、開示した各特徴は、単に、一般的な一連の等価な特徴または同様の特徴の例である。
【００５０】
上記説明から、当業者は、本発明の本質的な特性を容易に確認することができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および改変を行うことによって、本発明を様々な使用法および条件に適応させることができる。したがって、他の実施形態も、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１ａ】
2013541337.tif 000003
【図１ｂ】
2013541337.tif 000004
【図１ｃ】
2013541337.tif 000005
【図２】
2013541337.tif 000006
【図３】
2013541337.tif 000007
【図４】
2013541337.tif 000008
【国際調査報告】
2013541337.tif 000009
2013541337.tif 000010
2013541337.tif 000011
2013541337.tif 000012
2013541337.tif 000013