(57)【要約】本発明は、脂肪組織から単離した成熟脂肪細胞の均質集団を３次元培養基材上で培養する、脂肪細胞を培養する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織から単離した成熟脂肪細胞の均質集団を３次元培養基材上で培養する、脂肪細胞を培養する方法。
【請求項２】
３次元培養基材が、ヒドロゲルである請求項１に記載の脂肪細胞を培養する方法。
【請求項３】
３次元培養基材が、10〜30残基を含むペプチドの非共有的相互作用から形成されるヒドロゲルである請求項１または２に記載の脂肪細胞を培養する方法。
【請求項４】
ペプチドが、配列R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A (配列番号11)を含む請求項３に記載の脂肪細胞を培養する方法。
【請求項５】
脂肪組織が、１以上のヒト個体から採取された請求項１〜４のいずれか１項に記載の脂肪細胞を培養する方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項で定義される３次元培養基材と接触している脂肪組織から単離した成熟脂肪細胞の単培養物を含む脂肪細胞培養物。
【請求項７】
脂肪組織が、１以上のヒト個体から採取された請求項６に記載の脂肪細胞培養物。
【請求項８】
脂肪細胞代謝を調節する化合物をスクリーニングするための、請求項６または７で定義される脂肪細胞培養物の使用。
【請求項９】
脂肪分解を活性化する化合物をスクリーニングするための、請求項８に記載の脂肪細胞培養物の使用。
【請求項１０】
PPARγ2転写因子を活性化する化合物をスクリーニングするための、請求項８に記載の脂肪細胞培養物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞を培養する方法、脂肪細胞培養物および脂肪細胞代謝を調節する化合物をスクリーニングするためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
白色脂肪組織の肥大と関連する肥満の有病率が、一般的な集団において定常的に増加している。つまり、過体重または肥満の個体の割合は、フランスにおいて1997年から2003年の間に36.7%から41.6%まで増えた。さらに、フランスにおける肥満の有病率(30 kg/m2を超える肥満度指数(BMI)により定義される)は、2009年に14.5%であった。さらに、肥満は、特に心血管イベントを含む多くの病理的障害についての危険因子であり、その治療的処置がますます切迫している。
【０００３】
この流行に立ち向かうための主な軸は、肥満個体における規定食の改善および運動の増加であるが、他のアプローチ、特に外科的および薬物に基づくアプローチも模索されている。
現在の薬物に基づくアプローチは、主に、例えば腸による脂質の吸収を制限するか(オルリスタット)、または満腹の感覚を促進するか(シブトラミン)、もしくは食物摂取に関連する快感を低減する(リモナバン)ことにより、エネルギー摂取を低減することをねらいとする。
しかし、これらの方法の効果が限定的であり、またそれらの副作用(リモナバンは、重度の抑うつ障害を引き起こし得ると報告されている)により、特にシブトラミンおよびリモナバンは市場から撤退することになり、治療的オプションが非常に限定され、例えば脂質貯蔵を限定するか、または逆にその使用を促進するために脂肪細胞の代謝を調節することを可能にするその他のアプローチを模索することが必要になっている。
【０００４】
後者のアプローチは、しかし、ヒトにおけるインビボの状況を正しく反映する、脂肪細胞代謝を研究するためのインビトロまたは動物モデルがないことにより、対応することが困難になっている。
実際に、インビトロモデルに関して、特に単一の脂質液胞の存在を特徴とする成熟脂肪細胞(これは、白色脂肪組織を形成する)は特に壊れやすく、実際に、これらの細胞は、48時間未満で培養下でそれらの代謝的および分泌的特性を一般的に喪失する。
【０００５】
これらの困難を克服するために、よって、いくつかの培養系が提案されている。しかし、これらの培養物は、脂肪細胞に加えて、前駆脂肪細胞もしくは内皮細胞のような補助細胞型を含むか(Sondaら(2008) Endocrinology 149:4794〜4798)、または幹細胞(Choiら(2010) Tissue Engineering: Part C、Kangら(2007) Biomaterials 28:450〜458)もしくは前駆脂肪細胞(Dayaら(2007) Differentiation 75:360〜370、WO 2007/113591、Staceyら(2009) Tissue Engineering: Part A 15:3389〜3399)からインビトロで分化した脂肪細胞を用いて全般的に調製されており、その表現型は、脂肪組織から単離した成熟脂肪細胞のものと比較すると、かけ離れている(図１〜３を参照されたい)。
【０００６】
よって、これらの系は、脂肪組織から単離した成熟脂肪細胞代謝を特異的および直接的に代表するものではないと考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、よって、生理的状況に近い、特にヒトの生理に近いこのような培養系を提供することである。
【０００８】
本発明は、脂肪組織から単離した成熟脂肪細胞を、他の細胞型の非存在下で、３次元培養基材を用いて培養でき、このようにして培養された脂肪細胞が、少なくとも48時間、新しく単離した成熟脂肪細胞のものと同様の表現型を保有することを本発明者らが驚くべきことに証明したことに基づく。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、よって、脂肪組織から単離した成熟脂肪細胞の均質集団を、３次元培養基材上で培養する、脂肪細胞を培養する方法に関する。
本発明は、３次元培養基材と接触している脂肪組織から単離した成熟脂肪細胞の単培養物(monoculture)を含む脂肪細胞培養物にも関する。
本発明は、脂肪細胞代謝を調節する化合物をスクリーニングするための、本発明による脂肪細胞培養物の使用にも関する。
【００１０】
本発明は、
-     スクリーニングされる化合物を、本発明による脂肪細胞培養物と接触させ、
-     前記脂肪細胞培養物の脂肪細胞代謝の少なくとも１つの代表的パラメータが、スクリーニングされる化合物と接触していない本発明による脂肪細胞培養物と比較して改変されているかを決定し、
-     化合物が脂肪細胞代謝の少なくとも１つの代表的パラメータを改変させるならば、該化合物を選択する、
脂肪細胞代謝を調節する化合物をスクリーニングする方法にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において意図するように、「成熟脂肪細胞」との表現は、分化脂肪細胞を表す。成熟脂肪細胞は、当業者により容易に同定され得る。特に、本発明による成熟脂肪細胞は、通常、単一の脂質液胞と、特にエピネフリンおよびノルエピネフリンのようなβ-アドレナリン作用薬により誘導可能な脂肪分解活性と、細胞外媒体から細胞内媒体へのグルコースおよび脂肪酸のインスリン誘導性輸送(この輸送は、特に、成熟脂肪細胞の形質膜内でのそれぞれGLUT-4およびCD36輸送体のインスリン依存性転位に関連する)により特に定義されるインスリンに対する感受性とを有する。本発明による成熟脂肪細胞は、顕著には、当業者に公知の前駆脂肪細胞特異的マーカーであるDelK1/Pref1の発現(リアルタイムPCRにより測定できる)が、本発明による成熟脂肪細胞において本質的に存在しないことにより、特に前駆脂肪細胞とは異なる。
【００１２】
本発明による成熟脂肪細胞は、脂肪組織から単離される。つまり、本発明による成熟脂肪細胞は、特に、前駆脂肪細胞のような脂肪細胞前駆体または全能性、多分化能(multipotent)もしくは多能性(pluripotent)の幹細胞のインビトロ分化に由来しない。
本発明による脂肪組織に関して、これは、任意の種の動物に由来できる。しかし、本発明による脂肪組織について、１以上のヒト個体から採取されたものが好ましい。
【００１３】
成熟脂肪細胞は、脂肪組織から、特に成熟脂肪細胞の低い密度を利用して、当業者に公知の多数の方法により単離できる。特に、脂肪組織は、コラゲナーゼを用いて処理し、消化の後に、綿織ガーゼを通してろ過できる。ろ過物を水性媒体中で放置して沈降させ、本発明による成熟脂肪細胞の均質集団を、浮遊細胞を採集することにより回収できる。
【００１４】
本明細書において意図するように、「成熟脂肪細胞の均質集団」は、特に、それがその他の細胞型、特に内皮細胞または前駆脂肪細胞を本質的に含まないことである。特に、本発明による成熟脂肪細胞の均質集団は、10%未満、より具体的には５%未満の成熟脂肪細胞以外の細胞、特に前駆脂肪細胞を含む。成熟脂肪細胞の均質集団中の前駆脂肪細胞の量は、例えばDelK1/Pref1のような前駆脂肪細胞特異的マーカーを発現する細胞の数を定量することにより決定できる。
【００１５】
本明細書において意図するように、「成熟脂肪細胞の単培養物」は、成熟脂肪細胞の均質集団の培養物である。
成熟脂肪細胞の均質集団は、それが、インキュベートされている、すなわち集団を構成する細胞の生存を可能にする条件下でインビトロにおいて保存されている場合に、「培養されている」または「培養下にある」という。このような条件および適当な培養培地は、当業者に公知である。これらの培養培地は、集団を構成する細胞の生存を、少なくとも12時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも48時間確実にできる全ての要素、特に栄養素を含有するようなものである。例えば、集団は、DMEM/F12、１%ペニシリン-ストレプトマイシン、50 nMインスリン培地中で撹拌しながら、37℃および５% CO2雰囲気中で、培地を定期的に新しくしながらインキュベートできる。有利には、本発明による成熟脂肪細胞についての培養培地は、例えばフォルスコリンおよびデキサメタゾンのような成熟脂肪細胞の代謝活性を調節することを意図する化合物を含むことができる。さらに、成熟脂肪細胞の集団の培養は、少なくとも３時間、６時間、12時間、24時間または48時間行うことが好ましい。
【００１６】
本発明によると、成熟脂肪細胞は、脂肪細胞が基材と接触している場合、すなわちこれらが、基材上にあるかまたは基材上に接着している場合に、「３次元培養基材上で培養」されている。
【００１７】
ある具体的な実施形態において、本発明による脂肪細胞を培養する方法は、以下のステップを含む：
-     脂肪細胞の均質集団を３次元培養基材と接触させるステップと、
-     培養基材と接触している成熟脂肪細胞を、特に細胞の生存を特に少なくとも48時間可能にする条件下でインキュベートするステップ。
【００１８】
本発明による「３次元培養基材」は、細胞の３次元培養物を得るために適切な材料、特に生体適合性材料からなる。言い換えると、３次元培養基材は、特に、いくつかの重畳細胞層を得るために適切である。よって、２次元細胞層、すなわち細胞の単層の培養を可能にするだけの培養基材は、本発明による３次元培養基材でない。
好ましくは、本発明による３次元培養基材は、ヒドロゲルである。より好ましくは、本発明による３次元培養基材は、10〜30残基を含むペプチド、例えば配列R-A-D-Aの反復を含むペプチド、特に配列R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A (配列番号11)の非共有的相互作用から形成されるヒドロゲルである。ヒドロゲルを形成するペプチドは、例えば、ペプチドのＮ末端の端へのアセチル基の付加およびペプチドのＣ末端の端への-NH2基の付加により改変できる。よって、ペプチドは、配列：Ac-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-CONH2により表すことができる。特に好ましくは、本発明による３次元培養基材は、PuraMatrix(商標)ヒドロゲル(3DM, Inc.)である。
【００１９】
本発明によりスクリーニングできる化合物は、任意の型のものであってよい。特に、これらは、化学ライブラリーに由来する化合物であり得る。さらに、本発明による脂肪細胞培養物は、脂質分解を活性化する化合物もしくはPPARγ2転写因子を活性化する化合物；またはインスリン感受性を調節する化合物をスクリーニングするために用いることができる。
【００２０】
本明細書で意図するように、脂肪分解(または脂肪分解活性)、インスリン感受性またはPPARγ2転写因子活性は、脂肪細胞代謝の代表的パラメータである。
【００２１】
脂肪分解の決定は、当業者に公知の多数の方法により行うことができる。特に、脂肪分解活性は、本発明による脂肪細胞培養物により放出されるグリセロールおよび遊離脂肪酸の量を、特に分光光学法により、Lacasaら(1991) Endocrinology 128:747〜753に記載されるようにして測定することにより決定できる。脂肪細胞のインスリン感受性は、脂肪細胞におけるグルコース輸送の測定に従って、Woodら(2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 361:468〜473に記載されるようにして評価できる。PPARγ2転写因子活性は、細胞においてそれをコードするmRNAの量を、例えばRT-PCRまたはその特異的DNA部位への結合活性の直接的測定により、特にKeophiphathら(2009) J. Nutr. 139 : 2055〜2060に記載されるようにして決定することにより測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１〜３は、一方では脂肪組織から新しく単離した成熟脂肪細胞(黒色のバー)および他方ではLacasaらEndocrinology 148:868〜877に記載されるようにして前駆脂肪細胞のインビトロ分化により得られた脂肪細胞(白色のバー)における、リアルタイムPCRにより測定した、成熟脂肪細胞に特異的な３つのマーカー、すなわちPPARγ2、FABP4 (脂肪酸輸送体、その遺伝子はPPARγ2標的である)およびアディポカインの１つ、アディポネクチンの相対的発現レベル(ｙ軸、任意の単位)をそれぞれ表す。
【図２】図１〜３は、一方では脂肪組織から新しく単離した成熟脂肪細胞(黒色のバー)および他方ではLacasaらEndocrinology 148:868〜877に記載されるようにして前駆脂肪細胞のインビトロ分化により得られた脂肪細胞(白色のバー)における、リアルタイムPCRにより測定した、成熟脂肪細胞に特異的な３つのマーカー、すなわちPPARγ2、FABP4 (脂肪酸輸送体、その遺伝子はPPARγ2標的である)およびアディポカインの１つ、アディポネクチンの相対的発現レベル(ｙ軸、任意の単位)をそれぞれ表す。
【図３】図１〜３は、一方では脂肪組織から新しく単離した成熟脂肪細胞(黒色のバー)および他方ではLacasaらEndocrinology 148:868〜877に記載されるようにして前駆脂肪細胞のインビトロ分化により得られた脂肪細胞(白色のバー)における、リアルタイムPCRにより測定した、成熟脂肪細胞に特異的な３つのマーカー、すなわちPPARγ2、FABP4 (脂肪酸輸送体、その遺伝子はPPARγ2標的である)およびアディポカインの１つ、アディポネクチンの相対的発現レベル(ｙ軸、任意の単位)をそれぞれ表す。
【図４】図４は、３次元基材上に培養下で48時間維持した成熟脂肪細胞 (3D)および新しく単離した成熟脂肪細胞(D0)から調製し、次いで、aP2/FABP4脂肪細胞マーカーを指向する抗体および陽性対照(アクチン)を指向する抗体で標識した細胞溶解物の免疫電気泳動ゲルを表す。
【図５】図５および６は、培養時間(ｘ軸、日)の関数としての、(i)デキサメタゾン(Dex)の非存在下(白色のバー)および存在下(黒色のバー)において３次元培養基材(3D)で培養した、ならびに(ii)単層(2D)で培養した(灰色のバー)成熟脂肪細胞の基底脂肪分解活性およびフォルスコリン (FK)刺激脂肪分解活性(ｙ軸、任意の単位)のレベルをそれぞれ表す。ここに示す実験は、３回の反復実験の組の代表である。
【図６】図５および６は、培養時間(ｘ軸、日)の関数としての、 (i)デキサメタゾン(Dex)の非存在下(白色のバー)および存在下(黒色のバー)において３次元培養基材(3D)で培養した、ならびに(ii)単層(2D)で培養した(灰色のバー)成熟脂肪細胞の基底脂肪分解活性およびフォルスコリン (FK)刺激脂肪分解活性(ｙ軸、任意の単位)のレベルをそれぞれ表す。ここに示す実験は、３回の反復実験の組の代表である。
【図７】図７および８は、デキサメタゾン(Dex)の非存在下(白色のバー)および存在下(黒色のバー)において３次元培養基材(3D)で培養した成熟脂肪細胞により分泌されたレプチンおよびアディポネクチンの量(ｙ軸、pg/ml/24時間)をそれぞれ表す。ここに示す実験は、３回の反復実験の組の代表である。
【図８】図７および８は、デキサメタゾン(Dex)の非存在下(白色のバー)および存在下(黒色のバー)において３次元培養基材(3D)で培養した成熟脂肪細胞により分泌されたレプチンおよびアディポネクチンの量(ｙ軸、pg/ml/24時間)をそれぞれ表す。ここに示す実験は、３回の反復実験の組の代表である。
【図９】図９は、新しく単離した成熟脂肪細胞の抽出物(黒色のバー)および３次元培養基材において培養下に48時間維持した成熟脂肪細胞の抽出物(白色のバー)を用いて、リアルタイムPCRにより測定した脂肪細胞マーカーの相対的遺伝子発現(ｙ軸、任意の単位)を表す。
【図１０】図10は、インスリン(10 nM)の存在下で記載する時間にわたってインキュベートし、次いで、Aktのリン酸化された形を指向する抗体および陽性対照(アクチン)を指向する抗体を用いて標識した、３次元基材上で48時間培養下に維持した成熟脂肪細胞(3D)および新しく単離した成熟脂肪細胞(2D)から調製した細胞溶解物の免疫電気泳動ゲルを表す。
【実施例】
【００２３】
Ａ.材料および方法
１.材料
BD(商標) PuraMatrix(商標)ペプチドヒドロゲルは、BD Biosciences (Two Oak Park, Bedford, MA, USA)から得る。
用いた抗カベオリン-1 (N-20, SC-894)および抗CD36 (1.BB.3414, CS-70642)１次抗体は、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)から得る。Cy3と結合した対応する抗体は、GE Healthcare (Little Chalfont, UK)から得る。
【００２４】
２.単離成熟脂肪細胞の調製
成熟脂肪細胞は、ヒト脂肪組織のコラゲナーゼ処理により単離する。肥満でない(BMI＜30)若年女性(＜45歳)の皮下ヒト脂肪組織を、消化培地(DMEM、２%本質的脂肪酸フリーアルブミン(A6003, Sigma, St Louis, MI, USA)、１mg/mlコラゲナーゼＡ(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany))中で、ポリプロピレンチューブ中で２mlの消化培地あたり１gの組織の割合で切り刻む。チューブを30分間撹拌しながら(200サイクル/分) 37℃に置く。消化の後に、綿織ガーゼを通して培地をろ過する。成熟脂肪細胞を、５分間浮遊させてデカントのために放置し、次いで、５容量の10%スクロースで３回洗浄する。最後の洗浄の終わりに、スクロースを除去し、成熟脂肪細胞をPuraMatrix(商標)ヒドロゲルに組み込む準備ができている。
【００２５】
３.成熟脂肪細胞含有ヒドロゲルの調製
製造業者により推奨されるように、ヒドロゲルを30分間音波処理して、その粘度を低減させる。次いで、ゲルを20%スクロースでV/V希釈し、次いで、気泡を除去するために1000 gにて５分間遠心分離する。洗浄した成熟脂肪細胞をこの混合物に迅速に加え、ピペットを用いて穏やかに吸引することによりホモジナイズする。脂肪細胞/ゲル混合物を次いで、ウェルあたり100μlの割合で96ウェル培養プレートに分配する。非常に迅速に、インキュベーション培地(150μl) (DMEM/F12、１%ペニシリン-ストレプトマイシン、50 nMインスリン) (DMI)をウェルに加え、プレートを、37℃にて５% CO2雰囲気下のインキュベーターに入れる。30分後に、DMI培地を新しくする。培地の交換を２回反復する。次の日に、DMI培地を交換し、この操作を毎日反復する。いくつかの実験では、DMIは、100 nMデキサメタゾン(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)または100 nMのロシグリタゾン(Merck, Nottingham, UK)を含有する。
【００２６】
４.脂肪分解活性の測定
ヒドロゲル/脂肪細胞の組み合わせを含有するウェルを最初に150μlのKrebs-Ringer培地(115 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM CaCl2、1.2 mM KH2PO4、1.2 mM MgSO4、20 mM NaHCO3)、５mMグルコース、３%本質的脂肪酸フリーアルブミン(KRB/ALB)で洗浄して、ヒドロゲルを平衡化する。0.1% DMSOまたは10μMフォルスコリン(Sigma)のいずれかを含有する100μlのKRB/ALBをウェルに分配する。プレートを、次いで、インキュベーターに４時間入れる。培地を試料として採取し、70℃に10分間おいて、グリセロールアッセイに干渉し得る脂肪細胞酵素を不活性化する。放出されたグリセロールを、分光光度法(グリセロールアッセイキット、R-Biopharm)により、Lacasaら(1991) Endocrinology 128:747〜753に記載されるようにしてアッセイする。
【００２７】
５.アディポカイン分泌の測定
DMI培地を、培地の最後の交換の24時間後に試料として採取する。アディポカイン(レプチン、アディポネクチン)のアッセイを、この培地(100μl)に対して直接、ELISA法(Duoset, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)を製造業者により記載されるようにして用いて行う。
【００２８】
６.遺伝子発現の測定
DMI培地を、ウェルから迅速に取り出し、ゲル/脂肪細胞の組み合わせを、溶解バッファーを用いて、１mlの溶解バッファー/１mlのゲル/脂肪細胞の組み合わせの割合でホモジナイズする。次いで、クロロホルムを用いる予めの脱脂質処理とともにRNeasy抽出キット(Qiagen, Courtaboeuf, France)をLacasaら(2007) Endocrinology 148:868〜877に記載されるようにして用いてRNAを抽出する。トータルRNA (１μg)を、次いで、Lacasaら(2007) Endocrinology 148:868〜877に記載されるようにしてcDNAに転写する。用いたプライマーのリストを表１に示す。リアルタイムPCRアッセイを、25 ngのcDNAならびにセンスおよびアンチセンスプライマーを用い、SybergreenユニバーサルPCRミックス(Applied Biosystems, Minneapolis, MN, USA)を用いて行い、検出装置(Applied Biosystems)において測定する。全ての値は、RPLPOリボソームタンパク質の発現に対して標準化する。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
７.免疫蛍光法
DMI培地を除去してPBSで洗浄した後に、ゲル/脂肪細胞の組み合わせを、96ウェルプレートのウェルに入れ、４%パラホルムアルデヒド(PAF)で１時間固定する。PBS/0.1Mグリシンバッファーを用いる処理によりPAFを不活性化した後に、細胞を、PBS/３%アルブミン中の0.1% Triton X-100を用いて周囲温度にて５分間透過にする。非特異的部位をPBS/３%アルブミンバッファーを用いて４時間、周囲温度にてブロックし、次いで、１次抗体を加え、インキュベーションを４℃にて14時間継続する。６回の洗浄の後に(１時間)、ゲル/脂肪細胞の組み合わせを２次抗体と４時間、周囲温度にて暗所でインキュベートする。ゲル/脂肪細胞の組み合わせを、次いで、洗浄し(１時間)、このゲルの断片を、スライドとカバーガラスとの間のマウンティング媒体(Fluomount, Birmingham, Alabama, USA)上に置く。スライドを蛍光により24時間後に調べる。
【００３１】
８.免疫電気泳動法
DMI培地を除去してPBSで洗浄した後に、ゲル/脂肪細胞の組み合わせを、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤との混合物(CompleteミニおよびPhosphostop, Roche Diagnostics)を含有する１容量の溶解バッファー(PBS、２% IGEPAL、0.2% SDS、１%デオキシコール酸ナトリウム)に迅速に溶解する。ホモジネートを、次いで、４℃に15分間保持し、次いで、5000 gにて10分間遠心分離する。細胞溶解物を次いで回収し、Laemmliバッファー中で希釈し、Lacasaら(2007) Endocrinology 148:868〜877に記載されるようにして電気泳動に供する。タンパク質をセルロースメンブレン上に移した後に、Ponceauレッドを用いる染色により、装填量およびトランスファーの質を確認できる。次いで、メンブレンを、１次抗体と４℃にて14時間インキュベートする。次いで、洗浄を行った後に、メンブレンを２次抗体(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)とインキュベートする。シグナルを、化学発光(Detection ECL, GE Healthcare)により検出し、デンシトメトリーにより定量する。
【００３２】
９.インスリン感受性の測定
前日にインスリンを枯渇させたヒドロゲル/脂肪細胞を含有するウェルを、インキュベーション培地(150μl) (DMEM/F12および10 nM インスリン)とともにインキュベートする。次いで、プレートをインキュベーター中に15〜30分間入れる。ゲル/脂肪細胞の組み合わせを、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤との混合物(CompleteミニおよびPhosphostop, Roche Diagnostics)を含有する１容量の溶解バッファー(PBS、２% IGEPAL、0.2% SDS、１%デオキシコール酸ナトリウム)に迅速に溶解する。ホモジネートを、次いで、４℃に15分間保持し、次いで、5000 gにて10分間遠心分離する。溶解物を次いで回収し、Laemmliバッファー中で希釈し、以前に記載したようにして電気泳動に供する。メンブレンを、次いで、それぞれAktのSer473のレベルにてリン酸化された形を指向する１次抗体(ref. G7441, Promega)またはアクチンを指向する１次抗体(陽性対照) (MAB1501R, Millipore)とともに４℃にて14時間インキュベートする。次いで、洗浄を行った後に、メンブレンを２次抗体(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)とインキュベートする。シグナルを、化学発光(Detection ECL, GE Healthcare)により検出し、デンシトメトリーにより定量する。
【００３３】
Ｂ.結果
１.成熟脂肪細胞集団の均質性
培養に用いた脂肪組織から単離した成熟脂肪細胞の集団中に存在する混入前駆脂肪細胞の割合を、リアルタイムPCRにより、前駆脂肪細胞特異的マーカーDelK1/Pref1の発現を測定することにより決定した。
この測定は、用いた成熟脂肪細胞集団が、５%未満の前駆脂肪細胞(およそ４%)を含むので、本質的に均質であることを示す。
【００３４】
２.脂肪細胞タンパク質の検出
ヒドロゲルで形成された３次元基材において培養した成熟脂肪細胞は、膜タンパク質CD36およびカベオリン-1の免疫蛍光標識の後に単房性の外観を示すので、このことは、脂肪細胞膜タンパク質の検出の可能性を証明する。さらに、脂肪細胞溶解物は、細胞質の脂肪細胞タンパク質aP2/FABP4およびアクチンの検出により示されるように(図４)、免疫電気泳動により分析できる。
【００３５】
３.脂肪分解活性
脂肪分解活性を、基底条件下および10μMのフォルスコリンで刺激した条件下で、ヒドロゲル中に７日間維持した成熟脂肪細胞について測定する。この活性を、新しく単離した同じ細胞のものとも比較する。図５および６に示す結果は、基底脂肪分解活性(図５)およびフォルスコリン刺激脂肪分解活性(図６)が、新しく単離した脂肪細胞のものと同じ程度であり、５〜７日間一定のままであることを示す。さらに、培養培地中のデキサメタゾン(合成グルココルチコイド)の存在は、基底および刺激された活性を改変しない。
【００３６】
４.アディポカイン:アディポネクチンおよびレプチンの分泌
アディポネクチン(図７)およびレプチン(図８)の分泌を、デキサメタゾン(合成グルココルチコイド)の存在下または非存在下でヒドロゲル中に７日ほど長く維持した成熟脂肪細胞について測定する。さらに、図７に示すように、レプチンの分泌は、デキサメタゾンの非存在下で培養している間に減少するが、この分泌は、グルココルチコイドの存在下で増加し、よって、これらのホルモンに対する応答が、培養下の脂肪細胞において機能的なままであることを証明する。その部分についてのアディポネクチンの分泌は、７日間一定のままである(図８)。
【００３７】
５.脂肪細胞遺伝子発現
脂肪細胞遺伝子の発現を、新しく単離した成熟脂肪細胞とヒドロゲル中に２日間維持した同じ細胞との間で比較する。図９は、アディポカイン(レプチンおよびアディポネクチン)、主要脂肪細胞転写因子PPARγ2ならびにその標的遺伝子aP2/FABP4およびLPLの発現が一定のままであることを示す。
【００３８】
６.インスリン感受性の測定
脂肪細胞は、主要タンパク質同化ホルモンであるインスリンの好ましい標的である。ヒト脂肪細胞において、インスリンは、グルコース消費を刺激し、トリグリセリドの合成の増加を引き起こし、他方、これらの脂質の分解を阻害する。Akt酵素は、セリン473のリン酸化によりその活性化を引き起こす(Ser473 Akt)インスリンの代謝的効果を伝達する。よって、Aktリン酸化のレベルは、細胞のインスリン感受性の指標である。
インスリン(10 nM)は、Aktリン酸化を、新しく単離した脂肪細胞(2D)およびヒドロゲル中に48時間維持したもの(3D)において同一の様式で刺激し、よって、このことは、これらの細胞のインスリンに対する応答の良好な維持を示す(図10)。
【００３９】
結論
グルココルチコイドおよびチアゾリニジンジオン(thiazolinidinediones)を補充し得るインキュベーション培地を用いてヒドロゲルの３次元培養基材において維持した成熟脂肪細胞は、新しく単離した脂肪細胞のものに匹敵する脂肪分解活性およびアディポカイン(レプチンおよびアディポネクチン)分泌活性を示す。さらに、ヒドロゲル中に維持した成熟脂肪細胞は、少なくとも７日間、グルココルチコイド(これは、脂肪細胞代謝および発達に必須のホルモンである(Macfarlaneら(2008) J. Endocrinol. 197:189〜204))に対して応答する能力を保持する。
よって、この系は、脂肪分解活性または例えば脂肪細胞特異的転写因子PPARγ2を活性化する活性を有する薬理学的化合物をスクリーニングするために用いることができる。
【００４０】
さらに、本発明者らは、本発明によるヒドロゲルの３次元培養基材中に維持した成熟脂肪細胞が、新しく単離した成熟脂肪細胞と比較して、少なくとも２日間、それらのインスリン感受性を保持することを示した。このことにより、本発明による脂肪細胞培養物が、インビボでの成熟脂肪細胞を代表するモデルであることが確認される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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