(57)【要約】  本発明は、タンパク質反応性色素を使用して、試料中のタンパク質をその分離に先立って標識するための方法であって、ａ）色素反応体（タンパク質反応性色素と反応性のもの）を含む標識用緩衝液にタンパク質を溶解するか或いは上記標識用緩衝液でタンパク質を希釈するか或いは上記標識用緩衝液で既存のタンパク質緩衝液を交換して混合物を形成する段階と、ｂ）上記混合物にタンパク質反応性色素を添加する段階と、ｃ）上記混合物をインキュベートする段階であって、上記色素による上記タンパク質の標識を５分以内に完了させることができ、上記タンパク質と上記色素反応体とが上記色素で測定可能な反応生成物を形成する段階と、ｄ）上記反応生成物を分離する段階とを含む方法に関する。本発明は、標識用緩衝液、色素、分子量マーカー及び試料ゲルローディング緩衝液を含む、タンパク質の前標識用キットにも関する。【選択図】  なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のタンパク質をその分離に先立ってタンパク質反応性色素で標識する方法であって、ａ）色素反応体（タンパク質反応性色素と反応性のもの）を含む標識用緩衝液にタンパク質を溶解するか或いは上記標識用緩衝液でタンパク質を希釈するか或いは上記標識用緩衝液で既存のタンパク質緩衝液を交換して混合物を形成する段階と、ｂ）上記混合物にタンパク質反応性色素を添加する段階と、ｃ）上記混合物をインキュベートする段階であって、上記色素による上記タンパク質の標識を１０分以内に完了させることができ、上記タンパク質と上記色素反応体とが上記色素で測定可能な反応生成物を形成する段階と、ｄ）上記反応生成物を分離する段階とを含む方法。
【請求項２】
前記タンパク質の標識が５分以内に完了する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質の標識が３０秒以内に完了する、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記色素反応体が、同じ試料タンパク質の反応性基（アミン、チオール又はカルボニル基など）に比して過剰に供給される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記色素と色素反応体との反応生成物の量をタンパク質分離後に測定し、異なる標識反応で標識されたタンパク質からのタンパク質シグナルとの相関に用いる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記色素反応体がアミンであって、Ｔｒｉｓ、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−１−プロパノール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、４−アミノ−１−ブタノール、３−アミノ−１−プロパノール、２−アミノエタノール、グリシン、リジン、ポリリジン、アラニン、モルホリン及びイミダゾールのようなアミンから選択される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記色素反応体がＴｒｉｓであり、前記標識用緩衝液が５０〜５０００ｍＭのＴｒｉｓ、好ましくは２００〜２０００ｍＭのＴｒｉｓを含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質反応性色素がシアニン色素のような蛍光色素である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記色素が、色素を水溶性にするためのスルホン酸基を含むシアニン色素である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記色素が、結合後にタンパク質のｐＩが変化しないように電荷が適合している、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記色素がＤＭＦ又はＤＭＳＯ中に分配されており、標識反応当たり一定量の色素を使用する、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記色素反応体が、アルブミン、アプロチニン又はＩｇＧのような、試料中のタンパク質以外のアミン含有タンパク質である、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記色素反応体が、標識タンパク質の分離前に色素反応体を分離できる官能基も含んでいる、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
標識反応の後に、標識試料を、試料の追加処理（電気泳動など）用に設計された第二の緩衝液と混合する、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記標識用緩衝液が界面活性剤も含んでおり、ＳＤＳ、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）及びノニルフェノールエトキシレートのような界面活性剤から選択される、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記標識用緩衝液が、界面活性剤ＳＤＳ及びＬＤＳのようなｃｍｃ濃度未満の陰イオン界面活性剤及び／又は２Ｍ以下の濃度の塩（ＮａＣｌなど）も含んでいる、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記標識用緩衝液が９Ｍ以下の濃度の尿素及びチオ尿素のような変性剤も含んでいる、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
標識前にタンパク質ジスルフィド架橋を切断するため、ＤＴＴ又はｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）のような還元剤及び適宜ＩＡＡのようなアルキル化剤で試料を前処理する、請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
試料中のタンパク質の分離前に試料中のタンパク質を標識するためのキットであって、標識用緩衝液を、色素反応体、タンパク質反応性色素、分子量マーカー及び試料ゲルローディング緩衝液と共に含むキット。
【請求項２０】
前記色素が、ＤＭＦ又はＤＭＳＯのような無水有機溶剤中で予製した保存安定性蛍光色素である、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
前記色素が水溶性であって乾燥形態で予製されている、請求項１９記載のキット。
【請求項２２】
前記色素が、標識後にタンパク質のｐＩを変化させない、請求項１９乃至請求項２１のいずれか１項記載のキット。
【請求項２３】
前記標識用緩衝液が、２００〜２０００ｍＭの濃度のＴｒｉｓなど、高濃度の色素反応体を含む、請求項１９乃至請求項２２のいずれか１項記載のキット。
【請求項２４】
前記標識用緩衝液が、アルブミン又はアプロチニンのような、標識すべきタンパク質とは異なるタンパク質色素反応体を含む、請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載のキット。
【請求項２５】
標識後に、標識用緩衝液及び試料ローディング緩衝液を別個の停止液で置き換える、請求項１９乃至請求項２４のいずれか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を分離・分析する前の試料中のタンパク質の色素標識法に関する。本発明は、標識用緩衝液、色素、分子量マーカー及び試料ゲルローディング緩衝液からなる標識キットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光色素によるタンパク質の標識は、タンパク質の追跡及び定量化のための方法として好んで使われている。蛍光標識は良好な感度と広い線形検出域をもたらす。蛍光標識は、タンパク質染色法の簡便な代替法であり、放射性標識よりも安全な選択肢である。
【０００３】
色素及び標識条件の選択は用途に依存する。免疫学的用途（例えば抗体の標識）には、高いシグナル強度を得ることが重要であり、色素／タンパク質比はその目的に合わせて最適化される。電気泳動では、高いシグナル強度とシャープな電気泳動バンドを得るために、適当な色素／タンパク質比を用いる必要がある。さらに、等電点（ＩＥＦ）電気泳動では、タンパク質の等電点を変化させないように適合した電荷の色素を用いる必要がある。電気泳動のための前標識は周知である（例えば、“Electrophoresis” by Anthony T. Andrews, Clarendon Press, Oxford, 1986参照）。
【０００４】
タンパク質のアミン、つまりリジンε−ＮＨ２基とα−ＮＨ２  Ｎ末端基の双方を標識するのが一般的である。アミン反応性蛍光色素を用いるタンパク質の標識は、第一級アミンを含まない緩衝液中で実施するのが通常である。しかし、第一級アミンである２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）は幾つかの魅力的な特徴（例えば、低価格、非毒性及び最適標識ｐＨでの良好な緩衝能）を有しており、標識用緩衝液中低濃度で使用されてきた。例えば、２Ｄディファレンスゲル電気泳動（ＤＩＧＥ）には、１０〜４０ｍＭ、場合によっては最高５０ｍＭのＴｒｉｓ中での色素標識が製造業者から推奨されている。
【０００５】
しかし、タンパク質アミンの蛍光前標識は、ＤＩＧＥ  ＣｙＤｙｅ（商標）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを用いる２Ｄ電気泳動でのタンパク質の定量分析の最高水準のものとなっているが、従来のクーマシー及び銀染色は１Ｄ電気泳動ゲルの分析に依然として広く使用されている。１Ｄスラブゲル用の市販前標識キットがないのは、一つには、現在の標識法の技術的限界のためである。
【０００６】
主な技術的限界は、現在の標識プロトコルがすべて、数多くの手作業工程（例えば、タンパク質の総タンパク質濃度の予備測定、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）への色素の溶解、緩衝強度を低くするための試料の変更又は希釈、最適ｐＨを得るための試料と標識用緩衝液の混合、色素及びタンパク質の体積を所望のタンパク質／色素比に調整すること、氷上での３０分間の標識反応、標識後の停止液の添加混合など）で時間がかかることである。標識に必要な時間を最小限に抑えることができれば極めて望ましい。
【０００７】
もう一つの主な限界は、蛍光を用いる定量化には、関心タンパク質の蛍光シグナルを既知量の基準タンパク質からのシグナルと比較する必要があることである。しかし、多くの場合、標識反応は試料の内容物（例えば、試料ｐＨ、塩、変性剤、還元剤及び界面活性剤など）に大きく依存する。反応性及び拡散係数の異なるタンパク質が、限定された量の色素に対して競合する可能性もある。かかる試料では、あるタンパク質からのシグナル応答は試料中の他のタンパク質に依存するが、これは望ましくない。そこで、標識法がロバストであること、つまり試料組成によって影響されないことが極めて重要である。ロバストなプロトコルを得るには、例えば緩衝液の交換、タンパク質濃度の増大、同一条件下で標識反応が実施されるように担保するためなどの、時間のかかる工程が追加されるのが通例であった。ｐＨ誤差、温度誤差及びピペット操作誤差に起因する試料間のばらつきを最小限に抑えることも望ましい。結論として、迅速でロバストな標識プロトコル並びに標識効率を示す内部反応標準に対する大きなニーズが存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７／０３０５２１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】WESTERMEISTER et al. “Difference Gel Electrophoresis Based on Lys/Cys Tagging,” 2008, Methods in Molecular Biology vol 424, “2D PAGE:Sample Preparation and Fractionation, vol 1, pages 73-85,; Paragraphs 3.21 and 3.4
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上述の技術的問題を解決する方法及び組成物を提供する。本発明者らは、蛍光色素を消費する化合物（色素反応体と呼ぶ。）の存在下で標識反応を実施できることを見出した。適当な反応性の色素反応体を適当な色素／色素反応体比で標識反応に配合することによって、例えば、電気泳動に適した低タンパク質修飾レベルが得られるように標識反応を制御することができる。試料は、タンパク質を含有する混合物であればどのようなものであってもよい。標識反応のインキュベーション時間は５分未満とすることができ、タンパク質濃度を予め測定しておく必要はない。
【００１１】
本発明は、タンパク質の標識、分離及び定量分析のための方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、迅速でタンパク質分離後の正確な定量分析が可能な標識法を提供する。本方法は、高い速度と感度が必要とされる分析用途に特に有用である。
【００１２】
そこで、第一の態様では、本発明は、アミン反応性、チオール反応性又はカルボニル反応性色素を含むタンパク質反応性色素を用いて、試料中のタンパク質をその分離に先立って標識する方法であって、ａ）色素反応体（タンパク質反応性色素と反応性のもの）を含む標識用緩衝液にタンパク質を溶解するか或いは上記標識用緩衝液でタンパク質を希釈するか或いは上記標識用緩衝液で既存のタンパク質緩衝液を交換して混合物を形成する段階と、ｂ）上記混合物にタンパク質反応性色素を添加する段階と、ｃ）上記混合物をインキュベートする段階であって、上記色素による上記タンパク質の標識を１０分以内に完了させることができ、上記タンパク質と上記色素反応体とが上記色素で測定可能な反応生成物を形成する段階と、ｄ）上記反応生成物を分離する段階とを含む方法に関する。
【００１３】
一実施形態では、色素反応体は、同じ試料タンパク質の反応性基（アミン、チオール又はカルボニル基など）に比して過剰に供給される。
【００１４】
反応生成物の測定方法は、選択されるタンパク質反応性色素に依存し、例えば蛍光色素を用いる場合には、得られた反応生成物の蛍光を測定する。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、色素と色素反応体との反応生成物の量をタンパク質分離後に測定し、異なる標識反応で標識されたタンパク質からのタンパク質シグナルとの相関に用いる。
【００１６】
好ましくは、色素反応体はアミンであり、Ｔｒｉｓ、４−アミノ−１−ブタノール、３−アミノ−１−プロパノール、２−アミノ−１−プロパノール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノエタノール、グリシン、リジン、アラニン、モルホリン及びイミダゾールのようなアミンから選択される。標識用緩衝液の色素反応体は、５０〜５０００ｍＭのＴｒｉｓ、好ましくは２００〜２０００ｍＭのＴｒｉｓを含んでいてもよい。
【００１７】
別の実施形態では、色素反応体は、ポリリジン、アルブミン、アプロチニン又は免疫グロブリン（ＩｇＧ）のようなアミン含有ポリマーである。
【００１８】
タンパク質反応性色素は、好ましくは、アミン反応性色素のような蛍光色素である。好ましい蛍光色素はシアニン色素である。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のための一実施形態では、シアニン色素は、色素を水溶性にするための１個以上のスルホン酸基を含む。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの別の実施形態では、色素は、結合後にタンパク質のｐＩが変化しないように電荷が適合している。ＩＥＦ電気泳動では、色素は、好ましくは、結合後にタンパク質のｐＩが変化しないように電荷が適合している。色素はＤＭＦ又はＤＭＳＯ中で予製（pre-dispense）してもよい。
【００１９】
色素反応体は、標識タンパク質の分離前に色素反応体を分離できるにする官能基を含んでいてもよい。
【００２０】
標識反応の後に、標識試料を、試料の追加処理（例えば電気泳動など）用に設計された第二の緩衝液と混合してもよい。かかる緩衝液の具体例は、１２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ６．８、４％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１７％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー（ＢＦＢ）及び２００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。
【００２１】
標識用緩衝液は界面活性剤を含んでいてもよく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）及びノニルフェノールエトキシレート（例えばＮＰ−４０）のような界面活性剤から選択される。標識用緩衝液が陰イオン界面活性剤を含んでいる場合、界面活性剤の濃度は好ましくは臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）未満である。
【００２２】
標識用緩衝液は、２Ｍ以下の濃度の塩（ＮａＣｌなど）を含んでいてもよい。標識用緩衝液は、９Ｍ以下の濃度の変性剤（尿素及びチオ尿素など）を含んでいてもよい。
【００２３】
標識反応前にタンパク質ジスルフィド架橋を切断するため、ＤＴＴ又はｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）のような還元剤及び任意成分としてヨードアセトアミド（ＩＡＡ）のようなアルキル化剤を用いて試料を前処理してもよい。
【００２４】
第二の態様では、本発明は、標識用緩衝液、色素、分子量マーカー及び試料ゲルローディング緩衝液を含むタンパク質標識用キットにも関する。標識用緩衝液は、アミン（例えばＴｒｉｓ）及び任意成分として塩（例えばＮａＣｌ）及び任意成分として界面活性剤（例えばＳＤＳ）及び任意成分として変性剤（例えば尿素）を含んでいてもよい。マーカーは、電気泳動後の分子量決定に使用される。試料ローディング緩衝液は、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ＳＤＳ、グリセロール、追跡用色素及び任意成分としてＤＴＴのような還元剤を含んでいてもよい。
【００２５】
本発明は、試料中のタンパク質の分離に先立って試料中のタンパク質を標識するための保存安定性キットであって、標識用緩衝液、無水有機溶剤（ＤＭＦ又はＤＭＳＯなど）中で予製した蛍光色素、分子量マーカー及び試料ゲルローディング緩衝液を含むキットを提供する。本キットは６ヵ月以上の有効期間を有する。
【００２６】
標識反応が迅速であることに加えて、本発明の新規なアプローチには幾つかの利点がある。第一に、色素反応体の反応性及び色素／色素反応体比は、望ましいレベルのタンパク質修飾が得られるように選択される。低タンパク質濃度では、色素／色素反応体比によってタンパク質修飾レベルを制御する。こうして、一定量の色素をｎｇ／μｌ未満の濃度レベルまでの様々な濃度のタンパク質試料と混合することに基づくロバストな方法が得られる。標識反応での高い色素／タンパク質比にもかかわらず、色素反応体との競合反応の結果タンパク質の修飾が制御され、バンドの広がりもバンドシフトもない狭いタンパク質バンド、並びにタンパク質量に対する蛍光シグナルの線形応答曲線が得られる。そのため、定量化のための較正曲線を作成する場合、標識前にタンパク質濃度を予め測定しておく必要がない。第二に、色素反応体の反応性及び色素／色素反応体比は、色素に対するタンパク質競合を最小限に抑えるように選択される。第三に、色素反応体は、分離及びその後の色素−色素反応体複合体からの蛍光シグナルの測定が可能な物理化学的特性を有する。このシグナルは、標識反応の内部標準として役立ち、関心タンパク質の蛍光シグナルと比較される。その結果、本方法は、温度及びｐＨのわずかな差異に影響されない。
【００２７】
色素反応体は、標識のための最適ｐＨで高い緩衝能を有する化合物とすることができる。これによって、試料組成物の範囲を広げることができる。緩衝能が高いことから、多くの場合、標識前に標識用緩衝液で試料を直接希釈することができる。
【００２８】
上述の通り、タンパク質試料は、タンパク質の可溶化及び変性のための界面活性剤、アミン緩衝液及び任意成分として塩（例えばＮａＣｌ）を含有する標識用緩衝液で希釈し得る。標識用緩衝液は、変性剤（例えば尿素及び／又はチオ尿素）を含んでいてもよい。適宜、試料タンパク質緩衝液は標識用緩衝液で交換される。色素は標識用緩衝液中のタンパク質に添加され、標識反応は室温で５分以内に完了させることができる。ＳＤＳ、グリセロール、追跡色素、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液及び任意成分としてタンパク質を還元するためのＤＴＴからなる電気泳動用試料ローディング緩衝液を添加する。この試料ローディング緩衝液は、水平式及び垂直式ゲル電気泳動のいずれにも使用できる。混合物は、タンパク質を十分に変性するため適宜３〜５分間加熱される。試料をゲルに添加する。これら少数の工程と迅速プロトコルによって、本方法は後染色法よりも迅速な代替法となる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】１００ｍＭ重炭酸緩衝液（Ａ、Ｃ）ｐＨ８．５又は３００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．５（Ｂ、Ｄ）標識用緩衝液のいずれかを用いてＣｙ（商標）５で標識した低分子量（ＬＭＷ）マーカータンパク質の走査像を示す図である。標識は５分間（Ａ、Ｂ）及び３０分間（Ｃ、Ｄ）実施した。いずれの標識用緩衝液も０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）を含んでいる。
【図２】３２５ｐｍｏｌ／５０μｇタンパク質の一定の色素／タンパク質比を用いるプロトコル（Ａ）又は色素／タンパク質比を変化させるプロトコル（Ｂ）のいずれかを用いた標識プロトコルの比較を示す図である。試料はＣｙ５で標識したＬＭＷタンパク質である。標識は、０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）を含む１２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．５中で実施した。
【図３】標識反応における色素に対するタンパク質競合をＴｒｉｓ緩衝液がどのように低減させるかを示す図である。これは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）試料にラクトアルブミン（ＬＧ）を添加し、標識用緩衝液に３０又は３００ｍＭのＴｒｉｓのいずれかを用いて標識した後のＢＳＡ  Ｃｙ５シグナルの低下を測定することによって観測した。
【図４】１２％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルで泳動したＣｙ５前標識ＵＶ照射ＨｅＬａ細胞ライセート（約２４μｇ）を示す図である。細胞ライセートは、３００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．５及び０．２Ｍ  ＮａＣｌ及び０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）中で標識した。試料を次いでフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブランに移し、ウェスタンブロット分析を行った。プロービングに際しては、マウス由来の一次抗体ｐ−ＥＲＫモノクローナルＡｂを適用し、次いでＣｙ（商標）３ヤギ−α−マウス抗体（二次Ａｂ）を適用した。ＰＶＤＦメンブランはＣｙ５中（Ｂ）及びＣｙ３中（Ｃ）でスキャンした。細胞ライセートはＣｙ５画像に見られ、プローブリン酸化タンパク質はＣｙ３画像で検出される。
【図５】Ｃｙ５  ＮＨＳエステル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ＰＡ１５１０１）が、冷凍保存でも冷蔵保存でも、ＤＭＳＯ及びＤＭＦ中で８ヵ月間安定であることを示す図である。対照試料はＤＭＳＯ中で新たに調製し、同じ量の色素及びタンパク質を標識反応に使用して標識効率を評価した。ＬＭＷマーカーは、３００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．５、０．２Ｍ  ＮａＣｌ及び０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）中で標識した。低分子量マーカー中の各タンパク質について３回の実験の平均Ｃｙ５シグナル強度（図６）は、冷蔵保存（４℃〜８℃）では標識効率のわずかな減少を示しているが、冷凍保存（−２０℃）では対照試料に比して効率の減少はない。
【図６】Ｃｙ５  ＮＨＳエステル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ＰＡ１５１０１）が、冷凍保存でも冷蔵保存でも、ＤＭＳＯ及びＤＭＦ中で８ヵ月間安定であることを示す図である。対照試料はＤＭＳＯ中で新たに調製し、同じ量の色素及びタンパク質を標識反応に使用して標識効率を評価した。ＬＭＷマーカーは、３００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．５、０．２Ｍ  ＮａＣｌ及び０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）中で標識した。低分子量マーカー中の各タンパク質について３回の実験の平均Ｃｙ５シグナル強度（図６）は、冷蔵保存（４℃〜８℃）では標識効率のわずかな減少を示しているが、冷凍保存（−２０℃）では対照試料に比して効率の減少はない。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
ある種の標識法では、標識前に全タンパク質濃度を決定しておく必要がある。この工程が必要となる理由は、タンパク質及び色素濃度が低すぎると標識が不十分となってシグナル／ノイズ比が低下することである。色素／タンパク質比は、バンドの広がりも余分なバンドも生じずに、感度をできるだけ高めるため、蛍光色素と反応するタンパク質残基の割合ができるだけ高くなるように選択すべきである。しかし、タンパク質濃度を予め求めておくのには、時間と手間がかかるだけでなく、タンパク質濃度を決定するために現在使用されている方法（２Ｄ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、ＵＶ及びビウレット式の方法）は試料中のアミン含有量と相関しない。試料のアミノ酸組成は、試料中に存在する主要なタンパク質の組成に応じて、広い限度内で変化することがある。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ統計に基づけば、平均的なタンパク質は５．２％のリジン残基を含有するが、高移動性タンパク質１及び４（ＨＭＧ−１及びＨＭＧ−４）は２０．１％のリジンを含有し、ペプシンＡ及びペプシノーゲンＣのリジン含有量はゼロ又はゼロに近い。ＵＶ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ又はビウレットベースの方法を用いて決定されるタンパク質濃度に基づく量のＣｙＤｙｅ  ＮＨＳエステルを投与しても、色素に結合することになるアミン残基の割合を適当に制御することにはならない。特定のタンパク質から生じるシグナル強度は、変動する試料組成と共に広い限度内で変化することがある。その結果、試料のアミン含有量とＣｙＤｙｅ  ＮＨＳエステルの添加された量間の関係が非最適になることが非常に多い。したがって、標識に先立つタンパク質濃度の測定をはずすことが望ましい。
【００３１】
本発明の方法は、標識に先立ってタンパク質濃度を決定する必要性を除き、色素に対するタンパク質競合を最小限に抑えて、もっぱら色素／タンパク質比の固定化に基づく標識法に比してよりロバストで再現性のある方法をもたらす。本方法は、異なる組成の試料中に存在する類似する又は同一のタンパク質の濃度を比較したほうがよい場合に、理想的アプローチをなす。
【００３２】
別の実施形態では、標識のために利用可能なリジンの濃度は、例えばフルオレサミン又はＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）アッセイを使用して、標識に先立って決定され、必要であれば色素の量は調整される。
【００３３】
標識に続いて、標識タンパク質及び／又はタンパク質断片は、電気泳動、クロマトグラフィー、免疫アッセイ及び質量分析を含むが、これらに限定されない技法を使用して分離される。蛍光シグナルは、１０5までの広いダイナミックレンジを与える蛍光走査装置又は撮像装置（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＴｙｐｈｏｏｎ（商標）走査装置）により検出される。
【００３４】
別の実施形態は、標識から電気泳動のためにゲルに試料を添加するまでの時間が著しく減少されたキット及び方法を提供する。これは、一部には、標識反応時間を氷上で３０分から室温で３０秒に減少させることにより達成される。色素反応体の添加により、従来の停止液を使用する必要はなくなる。代わりに、標識試料は、標識のすぐ後で試料ローディング緩衝液と混合される。キットは、使用者に、標識用緩衝液中でタンパク質試料と直接混合する予製された色素も提供する。蛍光色素は従来、パッケージにされ乾燥状態で販売され、使用者は標識に先立って有機溶剤を添加する。しかし、色素は、完全な標識活性をもったまま無水ＤＭＳＯ又はＤＭＦ中で長期間低温保存することができることを我々は見出した。これによって、標識に先立って色素をＤＭＳＯ又はＤＭＦ中で再構成しなければならない段階が省かれる。ＤＭＳＯは無毒性の有機溶剤なので、これを使用するのが好ましい。
【００３５】
別の実施形態では、色素の大きな割合を消費する過剰なアミン含有化合物の存在下でのタンパク質試料とＣｙＤｙｅ  ＮＨＳエステルの反応は、試料のタンパク質含有量を極めて迅速に感度良く決定するものとしても使用することができる。必要なのは、ＣｙＤｙｅタグ付きタンパク質を、添加されたアミンと色素ＮＨＳエステル間の反応から生じる化合物から分離する迅速で簡単な方法である。簡単な解決策は、カラム又は類似物においてキャプチャとして使用することができる官能基を含有する一級アミンを使用することである。この方法は、試料中の反応性リジンの含有量を測定するので、ＤＩＧＥ実験に先立つタンパク質決定には理想的であるはずである。
【００３６】
別の実施形態では、タンパク質はアミン反応性蛍光色素を用いて標識される。反応性アミノ基を有する色素反応体が標識混合物に添加される。その後に、反応体はタンパク質から分離され、色素反応体複合体を検出する。蛍光シグナルの強度はタンパク質のシグナルと比較される。色素反応体は、タンパク質（例えばアプロチニン）又はアミン（例えばＴｒｉｓ）であってよいが、これらに限定されない。
【００３７】
一実施形態では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための標識は水溶性スルホン化色素を用いて実施することができる。したがって、色素は、乾燥形態で又は有機溶剤中で投与することができ、利用者は、標識に先立ってＤＭＦ又はＤＭＳＯを添加して色素を再構成する必要がない。
【００３８】
別の実施形態では、電荷の適合した色素を使用して、ＩＥＦ電気泳動でもＳＤＦＳ−ＰＡＧＥでもタンパク質のｐＩを変更することなくタンパク質を標識する。
【００３９】
別の実施形態では、タンパク質はアミン反応性蛍光色素を用いて標識される。反応性アミノ基を有する色素反応体は標識混合物に添加される。反応体は緩衝化合物であり、標識混合物中において７〜１１の間隔でｐＨを維持する。追加の実施形態では、反応体は８〜９の間隔でｐＨを維持する。
【００４０】
ＳＤＳ電気泳動の別の実施形態では、色素反応体は、適当な反応性を有するアミノ基に加えて、反応体の他に反応体と色素間の反応で形成される生成物も試料適用後に確実に陰極に運ばれるように、正荷電基を有する。この組合せは、基本的な適用が使用されるＩＥＦ用途に先立っても適当であるはずである。
【００４１】
ＳＤＳ電気泳動の別の実施形態では、スルホン酸基を含有する色素は負荷電反応生成物を与え、色素反応体生成物は、色素反応体シグナルの測定を可能にし又は走査に先立って色素反応体をゲルと離れさせる陽極に向かって先端に運ばれる。
【００４２】
ＩＥＦ電気泳動の別の実施形態では、電荷の適合した色素を使用して、タンパク質のｐＩを変更することなくタンパク質を標識する。試料は、妨害を防ぐために陽極側で適用され、色素反応体生成物は陽極に向けて運ばれるはずである。これを確実にするには、色素反応体は反応性アミノ基及び最小の２つの酸性基を含有する必要がある。２つの可能な例は、アスパラギン酸及びグルタミン酸である。
【００４３】
一実施形態では、標識用緩衝液は、標識反応に対する試料塩の効果を最小限に抑えるためにＮａＣｌを含む。塩イオンは標識反応に影響を与え得ることを我々は見出した。例えば、標識用緩衝液にＮａＣｌを添加すると、スルホン化された負荷電モノ反応性Ｃｙ５  ＮＨＳエステルを使用する一部のタンパク質ではグラム当たりのＣｙ５シグナルが増加する。ＮａＣｌは、その後の電気泳動に影響を与えることなく標識用緩衝液において０．５Ｍまで添加することができることも我々は見出した。標識用緩衝液にＮａＣｌを含むと、ある場合には標識が一層ロバストになり、すなわち、標識用緩衝液で希釈すると試料の最初の塩濃度に対する感受性が低くなる。
【００４４】
本明細書において使用される用語「色素反応体」とは、蛍光色素と共有結合を形成することができる化合物のことである。使用される化学物質は、ＣｙＤｙｅ  ＮＨＳエステルを消費する過剰な反応体も反応体とＮＨＳエステル間の反応から生じる生成物も電気泳動分離を妨げないように選択される。
【実施例】
【００４５】
材料
Ｃｙ５：Ｃｙ５の保存液は、モノ反応性Ｃｙ５  ＮＨＳエステル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ＰＡ１５１０１）又はＣｙ５−ＤＩＧＥ  ＮＨＳエステル（２５８０１０−８５  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を、無水ＤＭＦ（２２７０５６  Ｓｉｇｍａ）又は無水ＤＭＳＯ（２７６８５５  Ｓｉｇｍａ）のいずれかにおいて０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で溶解することにより調製した。
【００４６】
試料：低分子量（ＬＭＷ）マーカータンパク質Ｋｉｔ（１７−０４４６−０１  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ラクトアルブミン（Ｌ５３８５  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及びウシ血清アルブミン（Ａ７６３８  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液に又は直接標識用緩衝液のいずれかに溶解した。ＨｅＬａライセート（ＳＣ  ２２２１）及びｐ−ＥＲＫ（ＳＣ  ７３８３）はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製であった。
【００４７】
２×試料ローディング緩衝液：０．１２５ＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ６．８、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１７．４％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＦＢ及び０．２Ｍ  ＤＴＴの溶液を使用した。化学物質のｔｒｉｓ、グリセロール、ＳＤＳ、ＢＦＢ、及びＤＴＴはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製であった。
【００４８】
電気泳動：ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルＰｈａｓｔＧｅｌ（商標）、ＥｘｃｅｌＧｅｌ（商標）及びＧｅｎｅｇｅｌは、使用説明書に従って、Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ（商標）、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（商標）及びＧｅｎｅＰｈｏｒ電気泳動装置上に流した。１２％ｔｒｉｓ−グリシンゲル（ＥＣ６００５５  Ｂｏｘ  ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、使用説明書に従って、ＭｉｎｉＶＥ  垂直電気泳動システム上に流した。ゲルは、Ｔｙｐｈｏｏｎ（商標）スキャナーを使用して走査し、ある場合には続いて比較のためにクーマシーを用いて後染色した。
【００４９】
ウェスタンブロッティング：ＴＥ２２Ｍｉｎｉ  ｔａｎｋ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｕｎｉｔ及びＡｍｅｒｓｈａｍ（商標）Ｈｙｂｏｎｄ（商標）ブロッティング紙を、使用説明書に従ってウェスタンブロッティングに使用した。
【００５０】
標識プロトコル：
１．タンパク質を標識用緩衝液に溶解するか或いはタンパク質を標識用緩衝液で希釈する。
２．色素をタンパク質混合物に添加し３０秒から１０分の時間インキュベートする。幾つかの試料を並行して標識する場合は、５〜１０分の時間間隔を使用する。
３．試料を２×試料ローディング緩衝液と等容量で混合する。
４．試料を９５℃で３〜５分間加熱する（適宜）。
５．試料を電気泳動ゲルに適用する。
【００５１】
必要な場合、タンパク質試料の緩衝液は、例えば、ゲル濾過又は透析を使用して、標識に先立って標識用緩衝液に交換することができる。試料は、電気泳動前又はその最中のタンパク質再酸化の結果としてのバンドの広がりを最小限に抑えるために段階４の後ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で適宜処理する。
【００５２】
実施例１：色素反応体としてのＴｒｉｓ
本発明者らは、Ｔｒｉｓは標識用緩衝液において高濃度で使用することができることを見出した（図１〜６参照）。重炭酸塩のようなアミンのない緩衝液に比して標識用緩衝液中でＴｒｉｓを使用することにより、図１の矢印により示される、電気泳動先端近くのタンパク質Ｃｙ５−シグナル及びＣｙ５−Ｔｒｉｓ複合体から出る測定可能なシグナルが減少する。したがって、非タンパク質結合Ｃｙ５のシグナルは、標識反応の内部標準として使用することができる。低分子量マーカータンパク質は、１００ｍＭ重炭酸緩衝液（Ａ、Ｃ）ｐＨ８．５及び３００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．５緩衝液（Ｂ、Ｄ）中で５分間（Ａ、Ｂ）及び３０分間（Ｃ、Ｄ）標識した。両緩衝液は０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）を含有していた。続いて、タンパク質は試料ローディング緩衝液と混合し、電気泳動ゲル上で分離した。Ｃｙ５走査像は、両緩衝液で非常に類似するバンドパターンを示している。５分間対３０分間ではＣｙ５シグナルパターンに違いはなく、標識反応が５分以内に完了していることを示している。
【００５３】
図２は、３２５ｐｍｏｌ／５０μｇタンパク質の一定の色素／タンパク質比（Ａ）及び色素／タンパク質比を変化させるプロトコル（Ｂ）を使用する２つの標識プロトコルの比較を示している。標識は、５分の標識時間を使用して、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを有する１２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．５中で実施した。Ｂ系列では、標識反応におけるタンパク質濃度は、０．１ｎｇ／μｌから２．０ｎｇ／μｌまで変化させ、一定量の３２５ｐｍｏｌ色素を反応体積１０μｌにおいて使用した。高い色素／タンパク質比にもかかわらず、制御されたタンパク質修飾レベルでタンパク質を標識することが可能であった。このことは、高い理論的色素／タンパク質比にもかかわらず、バンドの広がりも検出可能なゲル上の位置の移動もないという事実により証明されており、これは色素の加水分解及び／又はＴｒｉｓと色素との副反応がタンパク質標識反応と競合することを示している。さらに、標識プロトコルにより、較正曲線を使用する正確な定量化が可能になる。図２は、線形ラクトアルブミンＣｙ５シグナル対標識反応における全タンパク質の濃度を示している。全タンパク質量（重量）に対するラクトアルブミン量の比は一定であり、ほぼ１／５であった。したがって、このプロトコルは、タンパク質濃度の前決定の必要性をなくす。１２．５％ポリアクリルアミドゲル及び６μｌのゲルへの試料添加体積を使用する検出限界は、ｎｇ未満であった。
【００５４】
標識反応でタンパク質が色素をめぐって競合することが起こり得る。しかし、Ｔｒｉｓ濃度を高くすると、色素に対するタンパク質競合は減少する。図３は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）試料にラクトアルブミン（ＬＧ）を添加し、標識後のＢＳＡ  Ｃｙ５シグナルの低下を測定することによって観察された色素に対するタンパク質競合を示している。Ｃｙ５及びＢＳＡの量は標識系列では一定に保たれ、ＬＧはＢＳＡに過剰に（重量で９倍量）添加された。図１（左）は、３００ｍＭ（レーンＡ及びＢ）並びに３０ｍＭ（レーンＣ及びＤ）Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．５で標識された４つの試料のＣｙ５走査像を示している。３００ｍＭのＴｒｉｓ標識用緩衝液はタンパク質競合を著しく減少させ、より正確なＬＧ／ＢＳＡ比（約１０）を与えている。三通りの試料をＰａｓｔＧｅｌｓ８〜２５％とＧｅｎｅＧｅｌｓ１２．５％上の両方に流し、ＢＳＡからのクーマシーシグナルの相対的標準偏差（Ｎ＝２４）は８％であった。この実験では、高濃度のＴｒｉｓを使用する場合には、Ｃｙ５色素に対するタンパク質競合が減少することが示されている。タンパク質競合の減少は、標識反応で０．１〜１μｇ／μｌ間のタンパク質濃度及び範囲０．５〜５ｎｍｏｌのＣｙ５量並びに反応体積８０μｌを使用して観察された。
【００５５】
標識用緩衝液中の高いＴｒｉｓ濃度は、標識複合体試料、例えば、細胞ライセートの場合でも理想的である。標識用緩衝液（３００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．５及び０．２Ｍ  ＮａＣｌ、及び０．１％  ｗ／ｖ  ＳＤＳ）の高い緩衝能により、標識に先立った試料と標識用緩衝液の容易な混合が可能になる。図４は、ＨｅＬａライセートの効率的で迅速な標識の結果を示しており、このために蛍光スキャナーを使用するメンブラン上の目標タンパク質ｐ−ＥＲＫと全タンパク質含有量の両方の定量的検出が可能になる。
【００５６】
実施例２：色素反応体としての３−アミノ−１−プロパノール
この実施例では、３−アミノ−１−プロパノールを、標識反応で色素反応体として１〜３００ｍＭ濃度で使用した。標識タンパク質、ベータラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン及びウシ炭酸脱水酵素は、すべてが良好なシグナル／ノイズ比で検出された。色素反応体アミンとＣｙＤｙｅ  ＮＨＳエステル間の反応生成物は負電荷を帯びており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの間、陽極へ向けて運ばれた。
【００５７】
さらに、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノエタノール、及びモルホリンを含む幾つかの小さなアミンが、標識反応で試験され、タンパク質と、色素とアミンの反応生成物の両方から検出可能なシグナルを生じた。
【００５８】
実施例３：色素反応体としてのアミラーゼタンパク質
この実施例では、タンパク質アミラーゼが、目標ＬＭＷタンパク質に比して、標識反応で過剰に存在していた。標識反応におけるアミラーゼとＣｙ５の量は一定に保たれ、ＬＭＷタンパク質の量は変化させた。ＬＭＷタンパク質とアミラーゼの両方が簡単に検出することができ、ＬＭＷタンパク質の妨げとなるバンドの広がりはなかった。アミラーゼタンパク質のシグナルを使用して、異なる標識反応で標識された目標タンパク質からのシグナルを相関することができた。
【００５９】
実施例４：ＤＭＳＯ中の予製色素を用いた前標識キット
本発明者らは、Ｃｙ５  ＮＨＳエステルが、無水有機溶剤（ＤＭＳＯなど）中に溶解され、冷凍庫で冷保存される場合には非常に安定していることを見出した。図５及び図６は、Ｃｙ５  ＮＨＳエステルを冷凍庫（−２０℃）において８ヶ月間を越えて貯蔵し、それでも完全な標識効率を示すことができることを示している。この発見により、タンパク質標識キット中の色素の新規の処方が可能になる。
【００６０】
これらの実施例は、迅速な標識が、標識用緩衝液において、高濃度の色素反応体、これらの実施例では反応性アミンを使用して実施することができることを示している。標的化緩衝液中で高濃度のアミンを使用して得られる、
緩衝能がより良好である結果として、標識に最適なｐＨを得るための試料の希釈が簡単であり、
色素に対するタンパク質競合の低減の結果として、タンパク質の定量化が正確であり、標識反応後の色素反応体について別個の停止液を使用する必要がなく、通常は３７５ｍＭのＴｒｉｓであるゲル緩衝液に適合するより良好な伝導性の結果として標識後緩衝液を交換する必要がないなど、幾つかの重要な利点がある。
【００６１】
さらに、発明者らは、標識に先立つ全タンパク質濃度の前測定の必要性を取り除く標識プロトコルを見出した。反応当たり一定量の色素及びタンパク質標識に利用することができる色素の量を制御する色素反応体を使用すれば、狭いバンド及びバンド位置の無移動、及び試料中の広範囲のタンパク質濃度（ｎｇ／μｌ未満からμｇ／μｌまで）に対する線形応答曲線（シグナル対タンパク質の量）を得ることができる。
【００６２】
本発明は、標識用緩衝液を、色素反応体、保存安定性色素、分子量マーカー及び試料ゲルローディング緩衝液と共に含む、電気泳動に先立ってタンパク質を前標識するための新規のキットにも関する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2013528185.tif 000011
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