(57)【要約】プローブおよびプローブ断片を再利用することによって増幅されたシグナルを提供する、試料中の核酸を検出するためのオリゴヌクレオチド。
2013511292.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）標的核酸を含有すると思われる試料を調製するステップと、
ｂ）前記試料、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに配列特異的エンドヌクレアーゼを含む反応混合物を調製するステップであって、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブは第１の配列および第２の配列をそれぞれ含み、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列は、前記標的核酸の非重複配列に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの第２の配列は互いに相補的であり、したがって前記配列特異的エンドヌクレアーゼによって認識される二重鎖制限部位を形成し、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブのうちの少なくとも１つは、前記制限部位の片側に配置された検出可能な標識および前記制限部位の反対側に配置された消光部分を含み、したがって、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列を前記標的核酸の非重複核酸配列と選択的にハイブリダイズさせ、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列を互いに選択的にハイブリダイズさせ、それによって前記二重鎖制限部位を形成し、その結果、前記標的核酸が前記試料中に存在していれば、前記配列特異的エンドヌクレアーゼが前記二重鎖を前記制限部位で切断し、前記標識の検出が可能となり、標的生物の核酸からおよび互いからオリゴヌクレオチドプローブの残りの部分を変性させる、ステップと
を含むことを特徴とする、試料中の標的核酸の存在または非存在を検出する方法。
【請求項２】
前記配列特異的エンドヌクレアーゼは、ＢｓｏＢＩ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ａｖａ  Ｉ、Ｎｃｉ  ＩおよびＦｎｕ  ４Ｈからなる群から選択される酵素であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記配列特異的エンドヌクレアーゼはＢｓｏＢＩであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応混合物は、熱サイクリングに供されて、前記標的核酸から切断されたオリゴヌクレオチドを変性させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
熱サイクリング温度は、融解曲線を基準として選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記反応混合物は、ｉ）前記標的核酸に対する第１のオリゴヌクレオチドプローブの融解温度、ｉｉ）前記標的核酸に対する第２のオリゴヌクレオチドプローブの融解温度、ならびにｉｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブで形成されたハイブリッドの融解温度よりも高いハイブリダイゼーション温度に維持されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記検出可能な標識は蛍光物質であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光物質はキサンテン色素であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記消光物質はローダミン色素であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応混合物は遮断プローブをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ａ）標的核酸を含有すると思われる試料を調製するステップと、
ｂ）前記試料、第１のオリゴヌクレオチドプローブ、第２のオリゴヌクレオチドプローブ、および第３のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに配列特異的エンドヌクレアーゼを含む反応混合物を調製するステップであって、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブは第１の配列および第２の配列をそれぞれ含み、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列は、前記標的核酸の非重複配列に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの第２の配列は互いに相補的であり、したがって二重鎖制限部位を形成し、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブは標識されておらず、第２のオリゴヌクレオチドプローブは第３の配列をさらに含み、その少なくとも一部分は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列と、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブが前記標的核酸と結合していない場合に第２のオリゴヌクレオチドプローブが第１のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることを妨げるヘアピンを形成し、第３の配列の一部分は、第３のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズして、二重鎖制限部位を形成し、第３のオリゴヌクレオチドプローブは、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第３の配列とハイブリダイズして前記二重鎖制限部位を形成する第１の配列の片側に配置された検出可能な標識と、第３のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１の配列の反対側に配置された消光部分とを含む非標的特異的オリゴヌクレオチドプローブであり、
前記標的核酸が前記試料中に存在していれば、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列を前記標的核酸の前記非重複配列と選択的にハイブリダイズさせ、
したがって、ヘアピンループの変性、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列間のハイブリダイゼーション、前記配列特異的エンドヌクレアーゼによる前記制限部位での前に形成された二重鎖の切断、第３の配列の第２のオリゴヌクレオチドプローブからの分離、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの標的核酸からの解離、ならびに複数のサイクルの：ｉ）第２のオリゴヌクレオチドプローブの第３の配列と第３のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション、したがって化学修飾された二重鎖制限部位の形成、ｉｉ）前記配列特異的制限エンドヌクレアーゼによる、前記化学修飾された二重鎖制限部位の一本鎖のニッキング、ｉｉｉ）標識の消光物質からの遊離、およびｉｖ）第３のオリゴヌクレオチドプローブの第２のオリゴヌクレオチドプローブの第３の配列からの解離を可能にし、
前記試料中の前記標的核酸の存在を示す、前記標識から生成されるシグナルを検出するステップと
を含むことを特徴とする、試料中の標的核酸の存在または非存在を検出する方法。
【請求項１２】
前記配列特異的エンドヌクレアーゼは、ＢｓｏＢＩ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ａｖａ  Ｉ、Ｎｃｉ  ＩおよびＦｎｕ  ４Ｈからなる群から選択される酵素であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記配列特異的エンドヌクレアーゼはＢｓｏＢＩであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記反応混合物は、熱サイクリングに供されて、前記標的核酸から切断されたオリゴヌクレオチドを変性させることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
熱サイクリング温度は、融解曲線を基準として選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応混合物は、ｉ）前記標的核酸に対する第１のオリゴヌクレオチドプローブの融解温度、ｉｉ）前記標的核酸に対する第２のオリゴヌクレオチドプローブの融解温度、ならびにｉｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブで形成されたハイブリッドの融解温度よりも高いハイブリダイゼーション温度に維持されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出可能な標識は蛍光物質であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光物質はキサンテン色素であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記消光物質はローダミン色素であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記化学修飾された制限部位は半修飾されていることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記反応混合物は遮断プローブをさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）標的核酸を含有すると思われる試料を調製するステップと、
ｂ）以下：
ｉ）前記試料、
ｉｉ）第１の配列および第２の配列を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、第１の配列および第２の配列を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブ、第１の配列および第２の配列を有する第３のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに
ｉｉｉ）配列特異的エンドヌクレアーゼ
を含む反応混合物を調製するステップであって、
第１のオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸配列に相補的な第１の配列および第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列に相補的な第２の配列を有し、第２の配列の第１の部分は、制限部位の化学修飾された一本鎖部分であり、第１のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列および第２の配列の一部分は二次構造を形成し、
第２のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的と直接ハイブリダイズしないプローブであり、第２のプローブの第１の配列の一部分は、第１のプローブの第２の配列の化学修飾された一本鎖部分に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列は、第３のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列に相補的であり、第２のプローブの第２の配列の一部分は、制限部位の化学修飾された一本鎖部分であり、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列および第２の配列は部分的に重複し、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列および第２の配列の少なくとも一部分は二次構造を形成し、
第３のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的と直接ハイブリダイズしないプローブであり、第１の配列は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの制限部位の化学修飾された一本鎖部分に相補的な一部分を含み、第１の配列上に配置された検出可能な標識または消光部分をさらに含み、第２の配列は、第１の配列の一部分とヘアピンループを形成し、第２の配列上に配置された検出可能な標識または消光部分を有し、その結果、前記消光部分が、第３のオリゴヌクレオチドプローブ上のその相対的位置のために、前記検出可能な標識のシグナルを遮断し、
前記標的核酸が前記試料中に存在していれば、前記標的核酸を第１のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列と選択的にハイブリダイズさせて、第１の複合体を形成させ、複数のサイクルで、ｉ）第１のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列の少なくとも一部分と第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列とを選択的にハイブリダイズさせて、第２の複合体を形成させ、ｉｉ）二重鎖制限部位の化学修飾された一本鎖を形成する第１のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列の一部分と第２のプローブ上の相補的配列とのハイブリダイゼーションによって形成された前記二重鎖制限部位の一本鎖部分を切断し、それによって、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列を第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列の非重複部分から分離させ、ｉｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドプローブを第１の複合体から解離させ、
複数のサイクルで、ｉ）第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列を第３のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列と選択的にハイブリダイズさせて、第３の複合体を形成させ、それによって、標識を消光物質から分離させ、シグナルを遊離させ、ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列の前記一部分と第３のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列上の相補的配列とのハイブリダイゼーションによって形成された一本鎖二重鎖制限部位を切断し、ｉｉｉ）標識を消光物質から遊離させ、ｉｖ）第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列を第３のオリゴヌクレオチドプローブから解離させ、
前記試料中の前記標的核酸の存在を示す、前記標識から生成されるシグナルを検出するステップと
を含むことを特徴とする、試料中の標的核酸の存在または非存在を検出する方法。
【請求項２３】
前記二次構造はヘアピンであることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記配列特異的エンドヌクレアーゼは、ＢｓｏＢＩ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ａｖａ  Ｉ、Ｎｃｉ  ＩおよびＦｎｕ  ４Ｈからなる群から選択される酵素であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記配列特異的エンドヌクレアーゼはＢｓｏＢＩであることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記検出可能な標識は蛍光物質であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記蛍光物質はキサンテン色素であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記消光物質はローダミン色素であることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸標的配列はヒトパピローマウイルス核酸であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
ヒトパピローマウイルス核酸はヒトパピローマウイルス１６型およびヒトパピローマウイルス５８型からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的核酸は配列番号２および配列番号３からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
第１のオリゴヌクレオチドプローブは配列番号１であり、第２のオリゴヌクレオチドプローブは配列番号２であり、第３のオリゴヌクレオチドプローブは配列番号３であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記化学修飾された制限部位は半修飾されていることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記反応混合物は遮断プローブをさらに含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示がこれによって参照により本明細書中に組み込まれる、２００９年１１月２３日に出願の米国特許仮出願第６１／２６３，５９６号明細書の出願日の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、試料中の標的核酸配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブおよび方法に関する。より詳細には、本発明は、標的核酸配列とハイブリダイズしている場合にのみ切断することができるオリゴヌクレオチドプローブに関する。プローブの切断により、プローブの再利用によるシグナル生成およびシグナル増幅の両方が直接または間接的にもたらされる。
【０００３】
標的核酸配列の同定は、生物学的研究および医療診断学のどちらにおいても非常に重要である。標的配列の検出を使用して、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を同定および／または類別する、ならびに突然変異を明らかにすることができる。
【０００４】
標的配列の検出および／または同定を達成することができる数々の方法および技法が当分野において存在する。たとえば、ポリヌクレオチド配列決定方法を使用して、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を決定することができる。配列決定に典型的に使用される方法には、非特許文献１のＳａｎｇｅｒのジデオキシ方法、または非特許文献２のＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの方法が含まれる。
【０００５】
また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用しても、試料中の標的配列の存在を検出することができる。ＰＣＲでは、標的核酸配列を増幅するために、標的配列の領域と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを利用する、増幅産物の生成は標的配列の存在の指標である。
【０００６】
標的核酸を同定する別の手法には、オリゴヌクレオチドプローブを標的核酸配列に対してハイブリダイズさせることを含み、ハイブリダイゼーションは標的核酸配列の存在の指標となる。
【０００７】
オリゴヌクレオチドプローブは、標的およびオリゴヌクレオチド中の塩基間に水素結合を形成することによって、標的核酸と結合する。一般的なＢ−ＤＮＡは、通常のアデニン−チミン（Ａ−Ｔ）およびグアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）のワトソンおよびクリックの塩基対を有し、それぞれの塩基の間には２個と３個の水素結合が形成される。従来のハイブリダイゼーション技術は、ワトソン−クリック水素結合を介して相補的標的核酸と結合する、配列特異的ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブの能力に基づいている。しかし、第１のヌクレオチドとのワトソン−クリック塩基対形成に関与していない原子が別のヌクレオチドと水素結合を形成することができる、他の種類のヌクレオチド間水素結合パターンが知られている。たとえば、チミン（Ｔ）は、アデニンとの水素結合を介してＡＴワトソン−クリック塩基対と結合し、それによってＴ−ＡＴの塩基三つ組を形成することができる。非特許文献３は、Ｔ−ＡＴおよびＣ−ＧＣの塩基三つ組中に存在する交互の水素結合を最初に記載している。より最近では、グアニンが中心チミンと水素結合しているＧ−ＴＡの塩基三つ組が観察されている。非特許文献４。
【０００８】
ワトソン−クリックおよび非ワトソン−クリックの水素結合の両方で標的核酸と結合することができるオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸と非常に安定した複合体を形成し、したがって、様々な研究および診断上の有用性を有する。
【０００９】
たとえば、オリゴヌクレオチドは、たとえば非特許文献５に記載のように、フィルターもしくは膜上に固定された、または組織中に存在する標的核酸のプローブとして使用することができる。しかし、この参考文献中に記載されているオリゴヌクレオチドプローブは、その低い結合安定性および選択性によって制約されている。
【００１０】
別の例には、溶液相検出方法が含まれる。均一アッセイと呼ばれることもある、いくつかの溶液相検出方法が知られている。当分野で使用する用語「均一」とは、ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドプローブをプローブ−標的のハイブリッドから分離せずに行う方法をいう。多くの場合、これらの方法は、多くの蛍光標識の蛍光が、オリゴヌクレオチドプローブのコンホメーションまたは近隣の化学環境によって影響を受け得ることによる。
【００１１】
Ｌｉｖａｋらの特許文献１は、標的核酸配列を同定する方法を開示している。この方法では、蛍光レポーター分子およびレポーター分子の蛍光を消光することができる消光分子を含むオリゴヌクレオチドプローブを利用する。この方法によるオリゴヌクレオチドプローブは、プローブがハイブリダイズしておらず、消光分子が、レポーター分子の蛍光を消光するために十分にレポーター分子に近い場合に、少なくとも１つの一本鎖コンホメーションで存在するように構築されている。また、オリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸とハイブリダイズしており、消光分子が、レポーター分子の蛍光を消光するために十分にレポーター分子に近く配置されていない場合にも、少なくとも１つのコンホメーションで存在する。これらのハイブリダイズしたおよびハイブリダイズしていないコンホメーションを採用することによって、プローブ上のレポーター分子および消光分子は、プローブがハイブリダイズしている場合およびハイブリダイズしていない場合に異なる蛍光シグナル強度を示す。その結果、この方法は、レポーター分子、消光分子、またはそれらの組合せの蛍光強度の変化に基づいて、特定の標的核酸配列の存在を決定することを可能にする。この手法の制約は、シグナル増幅が可能となっておらず、その結果、低い標的濃度が検出不能であることである。さらに、この方法は、高いバックグラウンドシグナルによって本質的に特徴づけられている。
【００１２】
Ｔｙａｇｉらの特許文献２は、核酸標的配列を検出するための単分子および二分子のハイブリダイゼーションプローブを開示している。プローブには、標的相補的配列、標的配列の非存在下で閉じたコンホメーションでプローブを保持している親和性対、またはプローブが閉じたコンホメーションにある場合に相互作用する標識対、または特定の単分子プローブに対しては非相互作用性標識のいずれかが含まれる。標的と標的相補的配列とのハイブリダイゼーションは、プローブを開いたコンホメーションへとシフトさせる。このシフトは、標識対の相互作用の低下、または非相互作用性標識によるシグナルの減少によって検出することができる。特定の単分子プローブは、わずか１ヌクレオチドの差異によって、標的と非標的配列との間を識別することができる。この手法の制約は、シグナル増幅が可能となっておらず、その結果、低い標的濃度が検出不能であることである。さらに、この方法は、高いバックグラウンドシグナルによって本質的に特徴づけられている。
【００１３】
Ｎａｚａｒｅｎｋｏらの特許文献３は、直鎖状もしくはヘアピンのプライマーまたは遮断オリゴヌクレオチドとすることができる、標識した核酸増幅オリゴヌクレオチドを記載している。特許文献３によって開示されているオリゴヌクレオチドは、分子エネルギー移行対のドナーおよび／またはアクセプター部分で標識されている。この部分は、ドナーによって放射される蛍光エネルギーがアクセプターによって吸収されるように、蛍光物質とすることができる。アクセプターは、ドナー部分とは異なる波長の蛍光を発する蛍光物質であってもよく、または、これは非蛍光の暗い消光物質であってもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、ドナー部分およびアクセプター部分が増幅産物内に組み込まれるように構成されている。また、本発明は、核酸増幅プライマーを用いて増幅産物を直接検出するための方法およびキットも提供する。標識した直鎖状プライマーを使用する場合、エキソヌクレアーゼを用いた処理または特定の温度を使用することによる処理により、組み込まれていないプライマーを分離する必要性が排除される。この「閉管」法は、増幅産物による持ち越し汚染の可能性を大きく低下させ、試料の高スループットを提供し、また、完全に自動とすることができる。
【００１４】
Ｄｉａｍｏｎｄらの特許文献４は、プリン／ピリミジン水素結合を介して標識したポリヌクレオチドと結合したプローブポリヌクレオチドの複合体を含有する診断試薬を記載している。プローブは、生体試料の標的配列と結合することができる標的結合領域を含有する。特許文献４は、標的ヌクレオチド配列を含有する試料との接触が、最初は標的とプローブの標的結合領域の一本鎖部分との間の結合を引き起こす方法をさらに記載している。その後、標識されたポリヌクレオチドは生じた複合体から置換される。脱離した標識されたポリヌクレオチドの検出により、試料中の標的ヌクレオチド配列の存在および濃度の関数である値が得られる。
【００１５】
Ｈｏｇａｎらの特許文献５は、標的核酸配列とハイブリダイズする少なくとも２つの別々の標的特異的領域を有する少なくとも１つの核酸鎖と、標的核酸とハイブリダイズしないが、互いにハイブリダイズすることができる相補的領域を保有する、少なくとも２つの明白に異なるアーム領域とを有する、核酸ハイブリダイゼーションプローブを記載している。これらの領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下において、標的核酸の非存在下では相補的アーム領域は互いにハイブリダイズしないが、標的核酸の存在下では、プローブの標的特異的領域は標的核酸とアニーリングし、相補的アーム領域は互いにアニーリングし、それによって標的核酸配列の検出に有用な分枝状核酸構造が形成されるように設計されている。Ａｌａｊｅｍらの特許文献６は、標的核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）が放出され、続く増幅サイクルで利用可能となるという点で特許文献５に記載されているものより改良されたものとして提示されている。
【００１６】
上述の方法は、フィルターまたは膜上に固定された核酸を標的とするためにオリゴヌクレオチドプローブを使用する非特許文献５によって記載されているものなどの単純なオリゴヌクレオチドプローブ検出方法より実施することは複雑でないが、一部の制約が依然として当てはまる。たとえば、特許文献１に記載されているものなどの実施が容易な方法では、一部の例では非標的配列とのハイブリダイゼーションも陽性結果を与えるため、偽陽性結果が与えられる可能性がある。
【００１７】
一般的に、上記方法は低いシグナルおよび高いバックグラウンドによって特徴づけられている。特許文献５は、鋳型の再利用によるシグナル増幅、および、それによって用いられるオリゴヌクレオチドのアーム領域の長さの適切な選択によるバックグラウンド低下を教示している。より正確な結果を生じることを目的とした方法は、多くの場合、実施することはより複雑である。
【００１８】
発癌性ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出は、多数の関連する遺伝子型およびＨＰＶゲノムの不均一性のために、重大な課題となっている。現在、ＦＤＡに認可されたＨＰＶの高リスク株のスクリーニングアッセイは２つしか存在しない（Ｑｉａｇｅｎのハイブリッド捕捉２高リスクＨＰＶ  ＤＮＡ試験（Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ２  Ｈｉｇｈ−Ｒｉｓｋ  ＨＰＶ  ＤＮＡ  Ｔｅｓｔ）（ｄｉｇｅｎｅ  ＨＣ２）、ＨｏｌｏｇｉｃのＣｅｒｖｉｓｔａ  ＨＰＶ）。標的ＤＮＡ中の配列変動を克服し、確実に包括的な株を網羅するために、ＨＣ２アッセイでは複数の長いＲＮＡに基づいたプローブを利用する。しかし、この設計の性質により、Ｄｉｇｅｎｅアッセイは低い特異性という問題を有し、ＨＰＶの様々な低リスク遺伝子型と交差反応を示す。核酸標的の増幅に基づいた、ＨＰＶを検出するための他のアッセイは、配列の不均一性を考慮するために縮重プライマーおよびプローブを用いる必要性によって複雑となっている。一緒に混合した場合、そのようなオリゴヌクレオチドのカクテルは、プライマー二量体の短いアンプリコンの生成をもたらす可能性があり、標的特異的な増幅および検出の効率を減じる、非特異的なプライマー相互作用を生じやすい。このことが１つの理由で、ＨＰＶ  ＤＮＡのリアルタイムのプローブに基づいた増幅および検出は幅広く実施されておらず、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８などに記載のような個々の遺伝子型の検出、または非特許文献９、非特許文献１０などに記載のような単一の反応において３個までの遺伝子型の検出を含む限定された多重化アッセイ様式に一般に限定されている。挿入色素ＳＹＢＲグリーンを使用したＰＣＲ増幅産物のリアルタイム検出が報告されているが、この技術は信頼性のある臨床診断のために十分な特異性を欠いており、典型的には、陽性結果の正確な解釈に融解曲線の解析を必要とする。このアッセイは非特許文献１１および非特許文献１２に記載されている。
【００１９】
プライマーとプローブとの間の潜在的な相互作用によって課されるアッセイ設計の制約に加えて、現在利用可能なＰＣＲ機器は、多重反応の検出に４から６個の光チャネルしか提供していない。その結果、１４個すべてのＨＰＶの高リスク遺伝子型の特異的検出には、典型的には複数の別々のＰＣＲが必要とされ、これにより機器のスループットが限定され、上流の検体処理、アッセイ品質管理および試薬製造に対して潜在的に不利な影響を与える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第５，８７６，９３０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９２５，５１７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８６６，３３６号明細書
【特許文献４】米国特許第４，７６６，０６２号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４５１，５０３号明細書
【特許文献６】米国特許第６，８８７，６６２号明細書
【特許文献７】米国特許第６，７４３，５８２号明細書
【特許文献８】米国特許第５，８４６，７２６号明細書
【特許文献９】米国特許第５，９１９，６３０号明細書
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977)
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【非特許文献３０】"Methods in Enzymology" Vol. 1-317 Academic Press
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
したがって、一般的な光学的チャネルを使用して単一の多重反応においてＨＰＶの高リスク株を検出するためのアッセイおよび方法が模索されている。また、中等度から高度に豊富な核酸標的配列（たとえばＨＰＶの高リスク株のＤＮＡ）を検出するための、高度の多重化を行いやすく、偽陽性結果をもたらす可能性のある雑多なＤＮＡポリメラーゼ酵素の使用を必要としないフォーマットの、シグナル増幅およびバックグラウンド低下のための改良された方法も模索されている。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、オリゴヌクレオチドプローブ、および均一な等温の多重化適合性のシグナル増幅システムを使用した標的核酸を検出する方法に関する。一実施形態では、標的核酸は中等度に高い濃度から高濃度で存在する。本明細書中に記載の方法は、プローブハイブリダイゼーションおよび制限によるシグナル増幅（Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｒｏｂｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ：ＳＡＰＨｙＲ）と呼ばれる。
【００２４】
好ましい実施形態では、この方法は、制限エンドヌクレアーゼの良好に特徴づけられた一本鎖ＤＮＡニッキング活性を利用する。制限エンドヌクレアーゼの一例は酵素ＢｓｏＢＩである。反応温度とプローブ融解温度との間の関係性は、切断されたオリゴヌクレオチド断片の周期的生成が生じるように選択する。これらの断片は、二次的な周期的切断反応をさらに誘発して、シグナル（蛍光）を生じさせる。
【００２５】
一実施形態では、本方法は、標的核酸を含有すると思われる試料を調製することによって、試料中の標的核酸の存在または非存在を検出する。標的核酸が存在する場合、標的核酸を検出するアッセイのための試料を調製する方法は、当業者に周知であるので、本明細書中では詳述しない。試料からの核酸抽出の一例は、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｌａｋｅｓニュージャージー州に位置するＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）からのＸＴＲ（商標）技術を用いたＢＤ  Ｖｉｐｅｒ（商標）システムである。
【００２６】
試料から抽出した核酸を、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブを有する反応混合物、ならびに配列特異的エンドヌクレアーゼと合わせ、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブは、第１の配列および第２の配列をそれぞれ有する。第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列は、標的核酸の非重複配列に相補的である。第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブそれぞれの第２の配列は互いに相補的であり、配列特異的エンドヌクレアーゼによって認識される二重鎖制限部位を形成する。第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブのうちの少なくとも１つは、制限部位の片側に配置された検出可能な標識および制限部位の反対側に配置された消光部分を有する。この相対的な配置により、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列を標的核酸の非重複配列と選択的にハイブリダイズさせ、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列を互いに選択的にハイブリダイズさせる。これらのプローブのハイブリダイゼーションは二重鎖制限部位を形成し、その結果、標的核酸が試料中に存在していれば、配列特異的エンドヌクレアーゼが二重鎖を制限部位で切断する。このようにプローブを切断することにより、標識の検出が可能となる。また、プローブの切断はまた、標的核酸および互いからオリゴヌクレオチドプローブの残りの部分を変性させる。
【００２７】
第２の実施形態では、調製した試料を、第１のオリゴヌクレオチドプローブ、第２のオリゴヌクレオチドプローブ、および第３のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに配列特異的エンドヌクレアーゼも有する反応混合物中に合わせる。第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブは、第１の配列および第２の配列をそれぞれ有する。第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列は、標的核酸の非重複配列に相補的である。第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブそれぞれの第２の配列は、少なくとも部分的に互いに相補的であり、プローブが標的とハイブリダイズする際に二重鎖制限部位を形成し、それによって第１のプローブおよび第２のプローブを互いに近接させる。好ましくは、第１のプローブおよび第２のプローブのうちの少なくとも１つは、標的配列とハイブリダイズしていない場合にヘアピン立体配置を有し、それによって、標的核酸の非存在下でプローブが互いにハイブリダイズしないことが確実となる。第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブは標識されておらず、また、第２のオリゴヌクレオチドプローブは第３の配列も有する。第３の配列の少なくとも一部分は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列と、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸と結合していない場合に第２のオリゴヌクレオチドプローブが第１のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることを妨げるヘアピンを形成する。第３の配列の少なくとも一部分は、第３のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズして、二重鎖制限部位を形成する。第３のオリゴヌクレオチドプローブは、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第３の配列とハイブリダイズして二重鎖制限部位を形成する第１の配列の片側に配置された検出可能な標識を有する非標的特異的オリゴヌクレオチドプローブである。また、第３のオリゴヌクレオチドプローブは、第３のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列の反対側に配置された消光部分も有する。
【００２８】
本実施形態では、標的核酸が試料中に存在する場合は、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列を、（ヘアピン構造を変性させることによって）標的核酸の非重複配列と選択的にハイブリダイズさせる。ヘアピンループの変性は、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列間のハイブリダイゼーション、配列特異的エンドヌクレアーゼによる制限部位での前に形成された二重鎖の切断、第３の配列の第２のオリゴヌクレオチドプローブからの分離、ならびに第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの標的核酸からの解離を可能にする。その後、以下が反応混合物中で、複数のサイクルで起こる：ｉ）第２のオリゴヌクレオチドプローブの第３の配列と第３のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション、したがって化学修飾された二重鎖制限部位の形成、ｉｉ）配列特異的制限エンドヌクレアーゼによる、化学修飾された二重鎖制限部位の一本鎖のニッキング、ｉｉｉ）標識の消光物質からの遊離、ｉｖ）第３のオリゴヌクレオチドプローブの第２のオリゴヌクレオチドプローブの第３の配列からの解離。その後、そのようにして遊離された標識を、検出可能な標識（たとえば蛍光物質）の存在を検出するための従来の技術を使用して検出し、シグナルの検出が試料中の標的核酸の存在を示す。
【００２９】
図４Ａ〜Ｄを参照して記載した第３の実施形態では、標的核酸を含有すると思われる抽出した核酸を、第１の配列および第２の配列を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ１）、第１の配列および第２の配列を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ２）、第１の配列および第２の配列を有する第３のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ３）、ならびに配列特異的エンドヌクレアーゼと合わせる。
【００３０】
明確にするために、本実施形態中の配列は、図４Ａ〜Ｄ中の模式的な配列の表示に従って記載する）。これらの表示は、配列の組成または配列の長さを示すことを意図せず、単に配列の説明とその模式的な表示との間の関連として提供する。本実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ１）は、標的核酸配列に相補的な第１の配列（ｂ’−ｉ’）および第２のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ２）の第１の配列（ａ’−ｆ’）に相補的な第２の配列（ａ−ｃ’）を有する。第１のプローブの第２の配列（ａ−ｃ’）の第１の部分（ｄ−ｅ）は、制限部位の化学修飾された一本鎖部分である。化学修飾された制限部位は、本明細書中にさらに詳述されている。第１のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ１）の第１の（ｂ’−ｉ’）配列の一部分および第２の（ａ−ｃ’）配列のすべてが二次構造（たとえばヘアピン）を形成する。
【００３１】
第２のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ２）は、標的と直接ハイブリダイズしないプローブであり（これは数個の標的特異的ヌクレオチドを有し得るが、標的特異的配列の長さは、反応条件下で標的と安定したハイブリッドを形成するには短すぎる）、第２のプローブ（Ｐ２）の第１の配列（ａ’−ｆ’）の一部分（ｄ’−ｅ’）は、第１のプローブ（Ｐ１）の第２の配列（ａ−ｃ’）の化学修飾された一本鎖部分（ｄ−ｅ）に相補的である。第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列（ｂ−ｅ’）は、第３のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ３）の第１の配列（ｂ’−ｅ）に相補的であり、第２のプローブの第２の配列（ｂ−ｅ’）の一部分（ｄ−ｅ）は、制限部位の化学修飾された一本鎖部分である。第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列および第２の配列は部分的に重複し（ｅ’−ｆ’）、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列の少なくとも一部分（ｂ’−ｄ’部分）および第２の配列の少なくとも一部分（ｂ−ｅ’部分）が二次構造（たとえばヘアピン）を形成する。
【００３２】
第３のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ−３）は、標的と直接ハイブリダイズしないプローブであり（これは数個の標的特異的ヌクレオチドを有し得るが、標的特異的配列の長さは、反応条件下で標的と安定したハイブリッドを形成するには短すぎる）、第１の配列（ｂ’−ｅ）は、第２のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ２）の制限部位の化学修飾された一本鎖部分（ｄ−ｅ）に相補的な一部分（ｄ’−ｅ’）を含み、第１の配列上に配置された検出可能な標識（２６４）または消光物質（２６６）部分をさらに含み、第２の配列（ｄ−ｋ）は、第１の配列（ｂ’−ｅ）の一部分（ｂ’−ｄ’）とヘアピンループを形成し、第２の配列上に配置された検出可能な標識（２６４）または消光部分（２６６）を有し、その結果、消光部分が、第３のオリゴヌクレオチドプローブ中のその相対的位置のために、検出可能な標識のシグナルを遮断する。
【００３３】
本実施形態では、標的核酸が試料中に存在する場合は、標的核酸と第１のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ１）の第１の配列（ｂ’−ｉ’）とを選択的にハイブリダイズさせて、第１の複合体（Ｐ１：Ｔ）を形成させる。さらに、本方法は、複数のサイクルで、ｉ）第１のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ１）の第２の配列（ａ−ｃ’）の少なくとも一部分（ａ−ｆ）と第２のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ２）の第１の配列（ａ’−ｆ’）とを選択的にハイブリダイズさせて、第２の複合体（Ｐ２：Ｐ１：Ｔ）を形成させ、ｉｉ）二重鎖制限部位の化学修飾された一本鎖を形成する第１のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列（ａ−ｃ’）の一部分（ｄ−ｅ）と第２のプローブ（Ｐ２）上の相補的配列（ａ’−ｆ’）とのハイブリダイゼーションによって形成された二重鎖制限部位の一本鎖部分（ｄ’−ｅ’）を切断し、それによって、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列（ｂ−ｅ’）を第２のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ２）の第１の配列の非重複部分（ａ’−ｄ’）から分離させ、ｉｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドプローブを第１の複合体（Ｐ１：Ｔ）から解離させる。
【００３４】
さらに、本実施形態によれば、複数のサイクルで、ｉ）第２のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ２）の第２の配列（ｂ−ｅ’）を第３のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ３）の第１の配列（ｂ’−ｅ）と選択的にハイブリダイズさせて、第３の複合体を形成させ、それによって、標識を消光物質から分離させ、シグナルを遊離させ、ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列の一部分（ｂ−ｅ’）と第３のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列上の相補的配列（ｂ’−ｅ）とのハイブリダイゼーションによって形成された一本鎖（ｄ’−ｅ’）二重鎖制限部位を切断し、ｉｉｉ）標識を消光物質から遊離させ、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列（ｂ−ｅ’）を第３のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｐ３）の残りから解離させる。この方法では、標識から生成されたシグナルが検出され、これは試料中の標的核酸の存在を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】２つの標的特異的プローブならびに２つのプローブが標的核酸と形成する複合体を利用する本発明の一実施形態を例示する図である。
【図１Ｂ】２つの標的特異的プローブならびに２つのプローブが標的核酸と形成する複合体を利用する本発明の一実施形態を例示する図である。
【図２Ａ】３つのプローブを利用し、そのうちの１つが非標的特異的標識したレポータープローブであるが、プローブが標的と結合していない場合に二次構造を保有しない方法を例示する図である。
【図２Ｂ】３つのプローブを利用し、そのうちの１つが非標的特異的標識したレポータープローブであるが、プローブが標的と結合していない場合に二次構造を保有しない方法を例示する図である。
【図２Ｃ】３つのプローブを利用し、そのうちの１つが非標的特異的標識したレポータープローブであるが、プローブが標的と結合していない場合に二次構造を保有しない方法を例示する図である。
【図３Ａ】３つのプローブを利用し、１つの標的特異的プローブがヘアピン構造を備えており、標的特異的プローブ間の標的非依存的ハイブリダイゼーションを遮断する、本発明の第３の実施形態を例示する図である。
【図３Ｂ】３つのプローブを利用し、１つの標的特異的プローブがヘアピン構造を備えており、標的特異的プローブ間の標的非依存的ハイブリダイゼーションを遮断する、本発明の第３の実施形態を例示する図である。
【図３Ｃ】３つのプローブを利用し、１つの標的特異的プローブがヘアピン構造を備えており、標的特異的プローブ間の標的非依存的ハイブリダイゼーションを遮断する、本発明の第３の実施形態を例示する図である。
【図３Ｄ】３つのプローブを利用し、１つの標的特異的プローブがヘアピン構造を備えており、標的特異的プローブ間の標的非依存的ハイブリダイゼーションを遮断する、本発明の第３の実施形態を例示する図である。
【図４Ａ】１つのプローブのみが標的特異的である第４の実施形態を例示する図である。
【図４Ｂ】１つのプローブのみが標的特異的である第４の実施形態を例示する図である。
【図４Ｃ】１つのプローブのみが標的特異的である第４の実施形態を例示する図である。
【図４Ｄ】１つのプローブのみが標的特異的である第４の実施形態を例示する図である。
【図５】図４Ａ〜４Ｄに記載の３つのプローブの一例を例示する図である。
【図６】遮断プローブを用いる本発明の一実施形態を例示する図である。
【図７Ａ】ＨＰＶ−１６の標的配列を例示する図である。
【図７Ｂ】ＨＰＶ−５８の標的配列を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、オリゴヌクレオチドの組および標的核酸配列の検出に使用することができるオリゴヌクレオチドの組を用いる方法を対象とする。具体的には、本発明の方法を使用して、鋳型配列（複数可）とアニーリングした場合に、その間に固有（内在性）の切断部位を形成するオリゴヌクレオチドプローブを利用することによって、特定の標的核酸配列の存在または非存在を検出することができる。その後に続くこの切断部位の切断により、検出可能なシグナルの生成および標的核酸配列からの１つまたは複数のオリゴヌクレオチドの解離がもたらされ、したがって鋳型の再利用およびシグナル増幅が可能となる。
【００３７】
本発明によるオリゴヌクレオチドおよび方法の原理および実施は、図面および添付の説明を参照してより良好に理解されるであろう。
【００３８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用が、以下の説明に記載されているまたは実施例によって例示される詳細に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態または様々な方法で実施または実行することができる。また、本明細書中で用いる語句および用語は説明を目的とするものであり、限定的であるとみなされるべきでないことを理解されたい。
【００３９】
本明細書中で使用する用語「オリゴヌクレオチド」および「プローブ」ならびに語句「オリゴヌクレオチドプローブ」は、互換性があるように使用され、１つまたは複数の部分的二本鎖コンホメーションを示すことができる一本鎖核酸分子または一本鎖核酸分子のアセンブリをいう。そのような分子（複数可）は、本明細書中にさらに記載するように、一本鎖または二本鎖（適切な変性後）の標的核酸配列の存在または非存在を検出するために、本発明に従って使用することができる。
【００４０】
全体にわたって使用する用語「鋳型」または語句「標的核酸配列」とは、メッセンジャーＲＮＡなどの天然に一本鎖形態にあるもの、またはＤＮＡなどの一本鎖形態へと変性されたもののいずれかである核酸鋳型をいう。本発明による標的核酸配列は、粗、部分精製または精製した形態とすることができ、その起源に応じて様々な度合の複雑度を有し得る。本明細書中で使用する、特定の標的核酸配列は、単一のヌクレオチド、たとえば点突然変異、またはさらには複数のヌクレオチドが別の特定の標的核酸配列と異なり得る。
【００４１】
本明細書中で使用する語句「相補的または実質的に相補的」とは、事前に決定された温度およびイオン強度のハイブリダイゼーション条件ならびに／または鋳型の存在下で塩基対形成し得る配列をいう。具体的には、「相補的または実質的に相補的」とは、少なくとも７０％相補的、さらに好ましくは少なくとも８０％相補的、有利には９０％から１００％相補的であることをいう。「完全に相補的」とは１００％相補的であることをいう。
【００４２】
本明細書中で使用する用語、ヘアピンとは、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡにおけるステム−ループの分子内塩基対形成を説明するために使用する。ヘアピンまたはヘアピンループは、互いに少なくとも実質的に相補的である、同じプローブの２つの領域から形成される。ヌクレオチド配列中では、相補的配列は、塩基対形成して、対を形成しないループで終わる二重らせんの「ステム」を形成する。
【００４３】
本明細書中で使用する語句「好熱性制限酵素」とは、特定の核酸配列を認識および切断する制限エンドヌクレアーゼである。好熱性制限酵素は熱に対する感受性が低い。そのような酵素は、約５０℃以上の反応温度を有する。適切な好熱性制限エンドヌクレアーゼの一例はＢｓｏＢ１制限エンドヌクレアーゼである。これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼ制限部位（ＲＥＲＳ）を切断する。そのような制限部位は、すべて参照により本明細書中に組み込まれている特許文献７、特許文献８および特許文献９に記載されている。ＢｓｏＢ１は、ある程度の度合の縮重（すなわち変動）で配列を切断する。ＢｓｏＢ１によって切断される縮重配列は周知であり、ｃｔｃｇａｇ、ｃｃｃｇａｇ、ｃｃｃｇｇｇおよびｃｔｃｇｇｇが含まれる。これらのＲＥＲＳ配列は、一本鎖形態にある場合は酵素によって切断されない。しかし、ＲＥＲＳ配列がその相補体とハイブリダイズしている場合、これは制限エンドヌクレアーゼによって切断可能である。必要な相補性の度合は、具体的なＲＥＲＳに応じてある程度変動する。しかし、一般に、６個の塩基対の制限部位では、部位中にミスマッチが存在しないことが好ましい（ただし、たとえばＢｓｏＢＩは、１、３、４または６位でない限りはミスマッチを有することができる）。切断可能なＲＥＲＳ配列のうちの１つが化学修飾されている場合では、化学修飾されていないＲＥＲＳ配列のみが酵素の存在下で切断される。ＢｓｏＢＩは、半修飾されたＲＥＲＳを認識することができ、修飾されていない鎖を切断することができる制限酵素の一例であるが、それだけには限定されないがＨｉｎｃ  ＩＩ、Ａｖａ  Ｉ、Ｎｃｉ  ＩおよびＦｎｕ  ４Ｈを含めた、これらの特性を有する他の酵素が知られている。
【００４４】
修飾された制限部位プローブが本発明での使用に企図される。ハイブリダイズしたプローブの一方の鎖の認識部位に修飾を導入することによって、修飾された鎖の酵素的切断を妨げることができる。そのような修飾の一例は、制限エンドヌクレアーゼによって切断されるＲＥＲＳ配列に相補的なプローブ配列上に導入されるチオエート修飾である。修飾の結果、制限部位の一方の鎖のみが切断される。このことは、プローブを複数のサイクルで使用する本発明との関連で重要である。この手法は、インキュベーションを通してより高い濃度の反応物質から恩恵を受け、したがってより高い生成物の形成効率をもたらす。当業者は多くの化学修飾された制限部位を認識しており、それらは本明細書中に詳述しない。当業者は、すべての制限部位が一本鎖ニッキングをもたらす化学修飾を受け入れるわけではないことを理解されよう。したがって、本明細書中に記載の一本鎖ニッキングをもたらすために、特定の酵素のためのＲＥＲＳ配列のみを化学修飾することができる。
【００４５】
本発明の特定の実施形態では、化学修飾された制限部位は再利用されたプローブの一部である。特定の実施形態は、標的配列の検出から生じるシグナルをさらに増幅するためにプローブを再利用することを企図する。標的／プローブの複合体を変性させると、切断されていないプローブがさらなる使用のために再利用される。対形成したプローブの最初の生成と同様、制限エンドヌクレアーゼは、対形成したプローブの２つのメンバーがハイブリダイズして二本鎖制限部位を形成する場合にのみ、完全な制限部位（５’−−−−３’）を認識および切断する。しかし、ここでも、ハイブリダイズしたプローブの対の修飾されていない鎖のみが切断される。プローブの融解温度（選択した反応温度で）は、化学修飾されていないプローブが切断された場合に、少なくとも切断されたプローブがその複合体から変性されるように選択される。他の実施形態では、一本鎖の化学修飾されていない制限部位のニッキングによって、すべてのプローブが標的から変性する。
【００４６】
一部の実施形態では、検出を可能にするために、本発明のオリゴヌクレオチドプローブアセンブリは、好ましくは１つまたは複数の検出部分でタグ付けする。しかし、以下にさらに詳述されているように、本発明による検出は、標的と結合するオリゴヌクレオチド（複数可）上にそのような検出部分を取り込ませずに達成することもできることを理解されたい。むしろ、標的との結合は、非標的特異的レポータープローブと結合するプローブ断片を与え、レポータープローブはこのプローブ断片とハイブリダイズする。
【００４７】
本明細書中に詳述するように、プローブおよびその制限産物の検出は、任意の従来の検出機構を使用して達成される。たとえば、同じ鎖の制限部位に隣接する蛍光レポーター色素および消光基を使用することができる。消光物質は、蛍光基によって放射されたエネルギーを捕捉することができ、したがって、２つの基が互いに十分に近い限り、蛍光基を励起させた際に蛍光が放射されない。当業者は、消光およびシグナル伝達部分をどちらも有するプローブ（シグナル伝達部分からのシグナルは、消光部分のある程度近くにある場合に消光され、間隔が増加した際にシグナルが放射される）または２つのシグナル伝達部分を有するプローブ（距離が増加した場合にシグナルが減少または中止される）を構成するための検討事項を十分に認識しているであろう。消光部分をシグナル伝達部分に十分に近接して保つために、プローブをヘアピンとして構成することができる。この構造では、配列の折り畳まれた部分は、消光部分を、シグナル伝達部分に、配列がそのように折り畳まれていなかった場合よりも近づける。そのような立体配置では、シグナル伝達部分は、ヘアピンが変性した際にシグナルを放射し、したがって、消光部分をシグナル伝達部分から分離することができる。プローブがＲＥＲＳ配列を有する場合、制限エンドヌクレアーゼがＲＥＲＳを切断し、消光部分を有するプローブの一部分を、シグナル伝達部分を有するプローブの一部分から遊離させる。これにより、消光部分がシグナル伝達部分からさらに分離され、したがって、さらなるシグナルがシグナル伝達部分から放射されることを可能にする。当業者は、シグナルの消光およびシグナルの放射の両方を達成するために必要な分離の量を認識しているであろう。ＲＥＲＳ配列を配置した場合、使用する制限酵素に応じて、典型的には４〜１８個の塩基のスペーサーが蛍光レポーター色素と消光基との間に必要である。酵素的切断の際、蛍光レポーター色素および消光基は互いに分離し、溶液中に分散される。その結果、蛍光基から消光物質へのエネルギー移行が存在せず、蛍光を検出し得る。
【００４８】
反応が進行するにつれて蛍光を検出し得るため、増幅のリアルタイム測定が可能である。蛍光増加の強度および速度は、混合物中に存在する標的分子の数および増幅速度の推定を可能にし得る。
【００４９】
上述のように、本発明のプローブは多くの蛍光／消光物質またはドナー／アクセプターの組合せを利用し得る。ドナーがフルオレセインを含めたキサンテン色素群からのものであり、消光物質がローダミン色素群（たとえば６−ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡ）からのものである組合せが、当分野で一般的に使用されている。Ｃｙ５およびＲＯＸは、使用することができる別の色素の対である。たとえばフルオレセイン／ローダミン対などの２つのシグナル伝達部分を用いる場合、フルオレセインドナーが励起され、ローダミンアクセプターにエネルギーを移行し、これが特徴的な波長で蛍光を放射し、それによって検出が可能となる。フルオレセインとローダミンとの間の距離が増加した場合、検出されるシグナルは減少し、またはシグナルは検出されない。
【００５０】
また、ＤＡＢＣＹＬおよびＱＳＦ−７などの非蛍光消光物質も使用することができる。これらの消光物質は、蛍光色素の選択においてより高い度合の柔軟性を可能にする。色素対の選択は、２つが近接している場合に消光物質が蛍光色素のエネルギーを吸収することを必要とする。色素分離の際の蛍光の増加が可能な限り大きいことが好ましい（様々なエネルギー移行系で３〜２０倍の蛍光の増加が報告されている）。１つの蛍光色素のみを使用する場合、最も高い蛍光強度を有する（通常は幅広い発光スペクトルを有する）色素を選択するべきである。同じ標的の２つの別個の領域の検出のために、同じ蛍光／消光基を保有する２つのプローブを設計した場合は、アッセイの感度が増加し得る。あるいは、異なる組合せの蛍光／消光物質色素を利用する場合は、異なる標的を標的とした２つまたはそれ以上のプローブを使用することもできる。しかし、２つまたはそれ以上の蛍光色素を使用する場合、様々な色素の蛍光を区別するためにアッセイの感度が損なわれ得る。これは、様々な色素の蛍光が重ならないような、より狭い発光スペクトルの検出によって行い得る。
【００５１】
以下の段落は、従来技術によって教示されているが、以下にさらに強調する一定の制約とともに本発明の教示に従って使用されるオリゴヌクレオチドプローブを記載しており、これらの制約は、シグナルの増幅および／またはバックグラウンドシグナルの低下のために優位な標的核酸の検出をもたらす。
【００５２】
図１Ａは、標的特異的プローブ１０および２０を使用するための第１の実施形態を例示し、イメージング部分は標的に特異的である。図１Ａでは、（ａ）および（ｅ）によって表される配列は、標的配列（ａ’）および（ｅ’）に特異的である。配列（ｃ）および（ｃ’）は、好熱性制限酵素の制限部位を提供するために選択する。好熱性制限エンドヌクレアーゼの一例はＢｓｏＢ１である。
【００５３】
図１Ｂは、図１Ａに模式的に例示したプローブ１０および２０から形成された複合体を例示する。プローブ１０および２０は、標的２１とカップリングしたプローブ１０の融解温度（ＴmA）または標的２１とカップリングしたプローブ２０の融解温度（ＴmB）よりも低い反応温度（ＴHyb）で、そのそれぞれの標的配列（ａ’）および（ｅ’）とハイブリダイズする。ＴHybは、ＴmAまたはＴmBのうちの少なくとも１つよりも高いため、プローブ１０および／または２０は、プローブとして標的に周期的にオンとオフをする：標的の複合体が形成し、プローブ１０または２０のうちの少なくとも１つが切断され、そのプローブは標的２１または標的／プローブの複合体より変性することとなる。一部の実施形態では、このプローブサイクリングには温度サイクリングが伴い、および／または温度サイクルによって達成される。このプローブサイクリングは、より多くのプローブが標的とハイブリダイズすることを可能にすることによって、シグナル増幅を促進する。当業者は、融解／ハイブリダイゼーション温度は配列の長さおよび組成の関数であることを認識されよう。当業者は、所定のＴHybでの使用に適した配列長および配列組成を選択することができる。
【００５４】
本実施形態では、複合体の３つのハイブリダイズした部分の融解温度とハイブリダイゼーション温度との間の熱力学的関係は、ＴmC＜［ＴmAまたはＴmB］＜ＴHybである（式中、ＴmCは、プローブ１０および２０それぞれの領域（ｂ  ｃ  ｄ）および（ｂ’  ｃ’  ｄ’）の間に形成されたハイブリッドの融解温度である）。この関係は、標的核酸配列の非存在下において溶液中でプローブ１０：プローブ２０の複合体が形成されることを妨げる。好ましい実施形態では、配列は、塩基スタッキングを用いて複合体を与えるように選択する。当業者は、塩基スタッキングが図１Ｂに例示した複合体の安定性に寄与する様式を認識するであろう。
【００５５】
（ａ）および（ｅ）とそのそれぞれの標的とのハイブリダイゼーションは、相補的領域（ｂ）および（ｂ’）、（ｃ）および（ｃ’）ならびに（ｄ）および（ｄ’）を近接させ、ハイブリダイゼーションが起こって二本鎖制限部位６０を保有する三重複合体が形成されるようにその局所的濃度を増加させる。その後、この新しく形成された制限部位６０は、適切な酵素（たとえばＢｓｏＢ１）によって切断されて、蛍光物質７０を消光物質８０から分離させ、これにより、標的依存的に蛍光が生成される。
【００５６】
好ましい実施形態では、（ａ）：（ａ’）または（ｅ）：（ｅ’）の融解温度Ｔmは、（ｂ、ｃ、ｄ）：（ｂ’、ｃ’、ｄ’）の融解温度よりも高い。反応は、（ｂ、ｃ、ｄ）：（ｂ’、ｃ’、ｄ’）二重鎖の標的非依存的な形成を妨げるために高温のＴHybで実施する。また、本実施形態では、反応経過の全体にわたって酵素活性の維持を確実にするために、制限酵素は好熱性でもある。
【００５７】
また、ハイブリダイズした領域（ａ）：（ａ’）および（ｅ）：（ｅ’）中の対形成した塩基のスタッキングも、三次プローブ：標的の複合体の安定性を増強させ得る。対形成した塩基のスタッキングは、すべて参照により組み込まれる非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５に記載されている。任意選択で、多重反応では、領域（ｂ−ｄ）および（ｂ’−ｄ’）の配列は、多重反応中の様々なプローブ組間の、プローブ１０および２０の標的非依存的なハイブリダイゼーションの潜在性を低下させるために、それぞれのプローブ対に特異的である。プローブ２０および標識したプローブ１０のうちの一方または両方は、２つのプローブが標的非依存的にハイブリダイゼーションすることを妨げるヘアピン構造で構成することができる。しかし、以下にさらに詳述するように、本実施形態で達成可能なシグナル増幅の遅い動力学を考慮すると、ヘアピン構造を用いてプローブを構成することは、使用をさらに制約する。
【００５８】
図１Ａ〜Ｂに例示した実施形態の１つの不利点は、プローブ１０および２０が標的をサイクルに出し入れする速度である。本実施形態では、蛍光の蓄積は、切断されたプローブが標的から解離することならびにプローブ１０および２０が標的とハイブリダイゼーションして追加の複合体を形成することに依存する。本実施形態を鎖置換増幅（ＳＤＡ）と比較すると、ＳＤＡでは、倍加時間は約３０秒であり（非特許文献１６を参照）、リアルタイムの蛍光に基づいたシステムにおける増幅された標的の検出は、約１０8個の切断されたプローブ分子の蓄積を必要とする。したがって、１０3個の標的分子の入力レベルから、１０5倍の増幅が必要であり（標的のそれぞれのコピーが１個のプローブ分子の切断をもたらすと仮定する）、約ｌｏｇ１０5回のサイクル（倍加）をｌｏｇ２で除算し、すなわち約１６．６×３０秒＝８．５分間かかる。対照的に、図１Ａ〜Ｂに例示した実施形態では、約３秒のサイクル時間を仮定すると（すなわちＳＤＡのそれの１／１０）、１０3個の標的コピーから１０8個の切断されたプローブを生成するために必要な時間は、１０8÷１０3×３秒＝３００，０００秒＝８３．３時間によって得られ、これは、ほとんどの応用には許容されない時間の長さである。
【００５９】
好ましい実施形態では、二次的な、プローブ切断の自続的な方法 (self-sustaining means) が、切断されたプローブの蓄積速度を増加させる。これらの実施形態は、プローブの切断を誘発する機構を提供する。これらの実施形態では、標的と、特定の実施形態では１つまたは複数のプローブを連続的に再利用する。特定の実施形態では、再利用された構成要素は、追加の分析物特異的ハイブリダイゼーション事象を必要とせずに、追加のプローブ切断のラウンドを誘導する。
【００６０】
自続的なプローブ切断 (Self-sustaining probe cleavage) は図２Ａ〜２Ｃに例示されている。本実施形態では、３つのプローブ、すなわちプローブ１０、プローブ２０およびプローブ２２が存在する。プローブ１０は、標的核酸上の配列（ａ’）の相補体である第１の配列（ａ）を有する。また、プローブ１０は、プローブ２０上の配列ｂ’、ｃ’およびｄ’とハイブリダイズする配列（ｂ、ｃおよびｄ）も有する。
【００６１】
図２Ａでは、プローブ１０もプローブ２０も、レポーター（図１Ａおよび１Ｂに例示した蛍光物質７０および消光物質８０）を備えていない。その代わりに、プローブ２０は、非特異的な標識したレポータープローブ２２上の相補的配列（ｅ）とハイブリダイズする配列（ｅ’）が備えられている。
【００６２】
図２Ａ〜Ｃは、その一方が切断を妨げるためにチオエート化されている２つのＢｓｏＢＩ制限部位を有する５’末端を含むように改変されているプローブ２０を例示する。プローブ１０および２０とその相補的配列との標的非依存的ハイブリダイゼーション（（ｂ、ｃ、ｄ）：（ｂ’、ｃ’、ｄ’））を最小限にするために、反応を、標的特異的プローブ領域（ａ）および（ｇ’）の融解温度Ｔm以上である高温ＴHybで実施する。
【００６３】
プローブ１０中の（ａ）およびプローブ２０中の（ｇ’）と標的中のその相補的標的配列（ａ’およびｇ）とのハイブリダイゼーションにより、プローブ１０の領域（ｂ、ｃ、ｄ）およびプローブ２０の（ｂ’、ｃ’、ｄ’）を近接させ、次に、それらのハイブリダイゼーションおよび二本鎖制限部位６０の形成をもたらす。制限部位６０は、ＢｓｏＢＩ酵素によって切断されて、プローブ１０中に相補体を有さないプローブ２０（ｄ’、ｅ’、ｆ’）から一本鎖断片２３を放出する。プローブ２０の断片２３（ｄ’、ｅ’、ｆ’）は、標識したレポータープローブ２２（ｄ、ｅ、ｆ）の配列に相補的である。図２Ｂに例示するように、断片（ｄ’、ｅ’、ｆ’）とレポータープローブ２２とのハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｚａｔｉｏｎ）は、半チオエート化されたＢｓｏＢＩ制限部位９０の形成をもたらす。この二重鎖の修飾されていない（標識した）鎖は、図２Ｃに例示するように、ＢｓｏＢＩ酵素によってニックが入って断片２４（ｄ）および２５（ｅ、ｆ）を生じ、これはその相補的配列から解離し、それによって蛍光物質７０および消光物質８０を分離し、標的依存的に蛍光を生成する。本実施形態の重要な一態様は、チオエート化されたＤＮＡ鎖（ｆ’、ｄ’、ｅ’）が、さらなる分析物特異的プローブハイブリダイゼーションに依存せずに、さらなるラウンドのプローブハイブリダイゼーションおよび一本鎖ニッキングを受け、それによって蛍光の蓄積をもたらす能力である。複数の標的分析物を検出する多重化応用では、レポータープローブ２２は、複数の分析物特異的プローブ２０の配列の５’末端に相補的な普遍的な配列を含み得る。すなわち、複数の異なる標的特異的プローブ２０がその５’末端で同一の配列（ｆ’、ｅ’、ｄ’）を有する。
【００６４】
図２Ａ〜２Ｃに記載の機構は本発明の概念を説明するための教授法ツールとして有用であるが、この機構は、領域（ａ）および（ｇ’）に相補的な配列の非存在（すなわち標的の非存在）下で、溶液中の（ｂ、ｃ、ｄ）と（ｂ’、ｃ’、ｄ’）とのハイブリダイゼーションが原因で標的非依存的なシグナルの可能性をもたらす。いったん、この複合体が形成されると、制限部位６０が切断され、これにより標的の存在に非依存的に断片（ｄ’、ｅ’、ｆ’）が生成され、これは偽陽性を与える。
【００６５】
第２の実施形態は標的非依存的なシグナルの潜在性を軽減させ、図３Ａ〜Ｄに例示されている。本実施形態では、プローブ２０は、安定したヘアピン構造１００を有するように構成されている。ヘアピン１００は、２つのプローブが溶液中に遊離している場合に、プローブ１０の３’末端とのハイブリダイゼーションを遮断する。ヘアピン構造は２つのＲＥＲＳ配列、６０および９０を有することに留意されたい。これらのＲＥＲＳ配列は少なくとも部分的にヘアピン構造のループ内に位置しており、好ましくは同じ制限エンドヌクレアーゼの縮重認識配列であるように構成されているため、制限酵素による切断に感受性のある二本鎖制限部位を形成しない。２つのプローブ１０、２０が、それぞれの（標的）配列へ共にハイブリダイゼーションされる時、すなわち、領域（ａ）および（ｇ’）が、そのそれぞれの標的配列（ａ’）および（ｇ）にハイブリダイゼーションするのは、二本鎖ヘアピンが変性している状態にある。図３Ｂを参照して、プローブ１０および２０が特定の標的とハイブリダイズしている場合、プローブ１０（すなわち配列ｂ、ｃ、ｄ）および２０（すなわち配列ｂ’、ｃ’、ｄ’）の２つの相補的末端配列の局所的濃度は十分に高いため、（ｂ、ｃ、ｄ）：（ｂ’、ｃ’、ｄ’）の分子間ハイブリダイゼーションが起こる。図３Ａに例示した立体配置では、プローブ１０および２０はどちらも配列ｂを有することに留意されたい。（ｂ’）と示した配列ｂの相補体はプローブ２２の中にある。ヘアピン構造１００は、溶液中に遊離しており、標的とハイブリダイズしていないプローブ２０が、普遍的な標識したレポータープローブ２２(the Universal labeled Reporter Probe 22)と結合しないようにする。プローブ１０およびプローブ２２は、それぞれの相補的配列（ｂ、ｃ、ｄおよびｂ’、ｃ’、ｄ’）を有するが、それ以外は、どちらも溶液中に遊離している場合にハイブリダイズしないように構成されている。代替実施形態では、プローブ１０もヘアピンを有する。いったん、プローブ１０および２０が標的との結合のために近接すると、プローブ１０中の（ｂ、ｃ、ｄ）とプローブ２０中の（ｂ’、ｃ’、ｄ’）とのハイブリダイゼーションが起こる。これは図３Ｂに例示されている。ハイブリダイゼーションにより、制限酵素（ＢｓｏＢ１）によって切断されて、標識したレポータープローブ２２中の（ｂ’、ｅ）に相補的な断片２３（ｄ’、ｅ’、ｂ）を生じる、二本鎖認識部位６０が生じる。
【００６６】
プローブ２０の断片２３（ｄ’、ｅ’、ｂ）とプローブ２２とのハイブリダイゼーションにより二本鎖の半チオエート化された制限部位９０が作製され、これは、プローブ２２に対応する鎖上の制限酵素によってニックが入る。図３Ｄを参照して、１つのニックが入った断片１１０は配列（ｂ’）および消光部分８０を有する。消光部分８０の一例はＤａｂｃｙｌである。しかし、これは一例にすぎず、当業者は、以前に記載のように多くの適切な消光部分を認識するであろう。レポータープローブ２２の他方のニックが入った断片１２０は蛍光部分７０（たとえば蛍光物質）を保有する。
【００６７】
レポータープローブ２２のニックが入った断片１１０、１２０をプローブ２０のその相補的断片２３（ｂ、ｅ’、ｄ’）および互いから解離させることにより、蛍光の生成および一本鎖プローブＢの断片２３（ｂ、ｅ’、ｄ’）の再生がもたらされる。その後、ＤＮＡ２３の保護された（たとえばチオエート化された）一本鎖断片は、さらなるラウンドの自己再生プローブハイブリダイゼーションおよび一本鎖切断を受けることができ、蛍光シグナルの蓄積（および増幅）がもたらされる。
【００６８】
図４Ａ〜４Ｄを参照して、標識していないヘアピンプローブ２００を、標的特異的な蛍光の生成における中間体として使用する。プローブ２００は、標的配列２０１（ｂ−ｉ）の一部分の相補体である第１の配列（ｂ’−ｉ’）を有する。プローブ２００は、制限部位２０５の一本鎖のチオエート化された部分である一部分（ｄ−ｅ）を有する第２の配列（ａ−ｃ’）を有する。第１のオリゴヌクレオチドプローブ２００の第１の配列（ｂ’−ｉ’）の一部分および第２の配列（ａ−ｃ’）全体がヘアピン構造を形成することに留意されたい。ヘアピンには、標的結合配列と結合するプローブ２００の配列の一部分が含まれるため、プローブ２００と標的２０１とのハイブリダイゼーションにより、プローブ２００のヘアピンを変性させる（すなわちハイブリダイズしなくなる）。一本鎖のチオエート化された制限部位は制限エンドヌクレアーゼによって消化されない（すなわちニックが入らない）。
【００６９】
プローブ２００は、相補的標的とハイブリダイズして、熱力学的により安定したヘテロ二重鎖複合体２１０を形成する。図４Ｂを参照して、複合体２１０はヘアピンプローブ２３０とハイブリダイズしている。ヘアピンプローブ２３０は、複合体２１０の配列（ａ−ｆ）とハイブリダイズする第１の配列（ａ’−ｆ’）を有する。プローブ２３０は、第３のオリゴヌクレオチドプローブ２６０上の第１の配列（ｂ’−ｅ）に相補的であり、それとハイブリダイズする第２の配列（ｂ−ｅ’）を有する（図４Ｄ）。第１の配列の全体および第２の配列の一部は、第２のオリゴヌクレオチドプローブ２３０のヘアピン構造（ｂ−ｂ’）を形成する。プローブ２３０の第１の配列（ａ’−ｆ’）の一部分２５５（ｄ’、ｅ’）は、複合体２４０中のプローブ２００の第２の配列（ｃ’−ａ）の一部分２０５（ｄ、ｅ）と共に制限部位を形成する。プローブ２３０の第２の配列（ｂ−ｅ’）の一部分２５０（ｄ−ｅ）は、プローブ２６０の第１の配列（ｂ’−ｅ）の一部分２６２（ｄ’−ｅ’）と共に、半チオエート化された制限部位を形成する（図４Ｄ）。
【００７０】
プローブ２３０のハイブリダイゼーションは、熱力学的に好適な三重構造２４０（プローブ２３０：プローブ２００：標的２０１）を形成する。プローブ２３０は、保護された（たとえばチオエート化された）制限部位２５０および保護されていない（たとえばチオエート化されていない）制限部位２５５をどちらも保有する。制限部位の保護されていない鎖２５５のニッキングは、プローブ２００から解離する小断片２４２（ｄ’−ａ’）および２４４（ｂ−ｅ’）の形成をもたらす、図４Ｃ参照。
【００７１】
図４Ｄに示すように、断片２４４（ｂ−ｅ’）は、標識したヘアピンレポータープローブ２６０の第１の配列（ｂ’−ｅ）に相補的である。その相補的配列の長さが原因で、２４４とプローブ２６０とのハイブリダイゼーションは、プローブ２６０のヘアピン構造の維持よりも熱力学的に好適である。その結果、プローブ２６０中の分子内塩基対形成が破壊され、複合体２７０（プローブ２６０：小断片２４４）の形成がもたらされる。また、プローブ２６０はシグナル伝達部分２６４（たとえば蛍光物質）および消光部分２６６も有する。プローブ２６０中の分子内塩基対形成の分裂はシグナル伝達部分２６４を消光部分２６６から分離させ、シグナルの増加がもたらされる。その後、保護されていない制限部位２６２（ｄ’−ｅ’）が制限エンドヌクレアーゼによってニックが入り、蛍光物質２６４および消光物質２６６がさらに分離され、これは蛍光のさらなる増加をもたらす。断片２４４（ｂ−ｅ’）はプローブ２６０の切断された部分から変性し、別のプローブ２６０と自由に結合し、ここで、以下のサイクルが繰り返される：ｉ）ハイブリダイゼーションによる複合体２７０の形成、ｉｉ）半チオエート化された二重鎖制限部位の保護されていない鎖（ｄ’−ｅ’）の切断、およびプローブ２３０の断片２４４の放出。
【００７２】
図５は、図４Ａ〜Ｄに例示した実施形態で使用するためのプローブ２００、２３０および２６０の具体的な配列番号の一実施形態である。プローブ２００は、ＨＰＶ１６標的に特異的な５８merである。プローブ２００は配列番号１である。ＨＰＶ１６標的は配列番号２である。ＨＰＶ−１６の標的配列は図７Ａに例示されている。ＨＰＶ１６配列（太字の斜体で強調）はプローブ２００の３’末端の２７個のヌクレオチドに相補的であり、それとハイブリダイズする（図５、配列番号１）。
【００７３】
プローブ２００はＨＰＶ−５８標的ともハイブリダイズすることが企図される。ＨＰＶ−５８標的は図７Ｂに例示されている。これは図７Ｂ中の配列番号３である。ＨＰＶ−５８配列中の強調した配列は、小文字によって指定した５個のミスマッチのヌクレオチドが散在した、２００（図５）との相補性領域（大文字のヌクレオチドによって示す）を含有する。Ｐ１：標的の複合体の形成中の、２００のヘアピンを展開させる自由エネルギーのコストを考慮した、三状態平衡モデル（非特許文献１７）に基づいた計算は、典型的な反応温度（約５０℃）下で２００とハイブリダイズした、一致した標的（ＨＰＶ−１６）の画分が、ハイブリダイズするミスマッチの標的（ＨＰＶ−５８）の画分よりも約１０，０００倍高くなることを示す。したがって、このモデルは、ミスマッチ（ＨＰＶ−５８）の標的のシグナルが、一致した（ＨＰＶ−１６）標的と比較してはるかにより低いことを予測する。
【００７４】
プローブ２００中のヌクレオチド１〜１８はプローブ２００中のヌクレオチド３１〜４８に相補的であり、プローブ２００中でヘアピン構造を形成する。プローブ２００中のチオエート化されたＲＥＲＳ配列２０５は、ヌクレオチド１９から２４であり、配列ｃｔｃｇｇｇであり、ＢｓｏＢＩによる切断を受けやすい配列のうちの１つである。しかし、その化学修飾のために、ＲＥＲＳ配列２０５は、プローブ２３０中の２５５と二重鎖制限部位を形成する際に切断されない。上述のように、プローブ２００が標的配列と近接して配置された際、熱力学平衡は、プローブ２００が標的配列と複合体を形成するのに有利なように、ヘアピンの変性に偏りやすい。プローブ２００は約−１３．０８６ｋｃａｌ／モルに等しいｄＧ値を有する。本明細書中に報告したｄＧ値は、非特許文献１８、非特許文献１９に従って計算した。この値はプローブの二次構造の自由エネルギーであり、所定の条件の組（塩濃度、温度、ＤＮＡ濃度など）下のヘアピンの相対的安定性を示す。値が高ければ高いほど（よりマイナス）、ヘアピンを変性させるためにより多くのエネルギーが必要である。
【００７５】
当業者は、プローブの設計、特に等温プロセスにおいて考慮される多くの要因を認識している。具体的には、制限エンドヌクレアーゼは、それが最適に活性である、定義された温度範囲を有する。したがって、制限エンドヌクレアーゼは等温プロセスの温度に基づいて選択される。また、プローブの安定性は温度の関数である。より長いプローブ（すなわち、標的配列に対してより多くの相補的ヌクレオチドを有するもの）は、より短いプローブ（すなわち、より少ない相補的ヌクレオチドを有するもの）よりも高い温度でハイブリダイズする。プローブの組成（すなわち、配列を構成する詳細なヌクレオチド）がプローブの融解温度およびハイブリダイゼーション温度に影響を与える。また、多くの他の要因もプローブの設計に影響を与え、これらは当業者に周知である。図５に例示した実施形態では、等温プロセス温度は約５５℃から約６０℃の範囲である。
【００７６】
プローブ２３０は、配列番号４として例示した４５merである。プローブ２３０中、ヌクレオチド１７から４５がプローブ２００のヌクレオチド２から３０に相補的であり、それに特異的である。ヌクレオチド１から１４および２５〜３７がプローブ２３０のヘアピンを形成する。プローブ２３０のヌクレオチド１０から１５が保護されたＲＥＲＳ配列２５０であり、ヌクレオチド２３から２８が保護されていないＲＥＲＳ配列２５５である。保護されていない制限部位２５５は、プローブ２００上の保護された制限部位２０５の相補体である。前述のように、ＲＥＲＳ配列２５０はＲＥＲＳ配列２５５に縮重する。上述のように、プローブ２３０が複合体２１０（プローブ２００：標的配列２０１）と近接して配置された際、熱力学平衡は、複合体２１０と複合体２４０を形成することを支持して、ヘアピンの変性に有利に働く。この観点から、プローブ２３０のｄＧの値は−１０．７９ｋｃａｌ／モルである。
【００７７】
プローブ２６０のヌクレオチド配列（シグナル伝達および消光部分を有さない）は、４０merの配列番号５として例示されている。ヌクレオチド１から１７は、プローブ２３０の断片２４４上のヌクレオチド７から２３に相補的であり、それと結合する（プローブ２３０が制限エンドヌクレアーゼによってニックが入って、複合体２４０から変性される断片２４２および２４４が形成された後）。プローブ２６０は−１２．０５９ｋｃａｌ／モルのｄＧ値を有する。熱力学は、プローブ２６０がプローブ２３０からの断片２４４に近接することで、プローブ２６０のヘアピン（ヌクレオチド１１〜２４とその相補的配列のヌクレオチド２８〜４０によって形成）が変性し、ヘアピンの展開が引き起こされるようなものである。プローブ２６０は、ヌクレオチド９から１４に保護されていないＲＥＲＳ配列２６２を有する。これは、断片２４４のチオエート化されたＲＥＲＳ配列２５０（ヌクレオチド１０から１５）に相補的であり、それとアラインメントする。生じる二本鎖制限部位は制限エンドヌクレアーゼによってニックが入り、プローブ２６０の２つの断片が作製される。ヌクレオチド１から９によって定義される第１の断片はシグナル部分２６４（たとえば蛍光物質）を保有する。ヌクレオチド１０から４０によって定義される第２の断片は消光部分２６６を保有する。
【００７８】
図６は、プローブハイブリダイゼーションの特異性を増強させるために遮断プローブを使用する、さらなる実施形態を例示する。遮断配列３２０は、標的配列３１０の一部分とのハイブリダイゼーションについてプローブ３００と競合する。遮断配列３２０をプローブ３００によって置換することは、競合するハイブリッド配列（ａ、ｂ）：（ａ’、ｂ’）および（ｂ、ｃ）：（ｂ’、ｃ’）の相対的熱力学的安定性に依存する。特異性を最大限にするために、プローブ３００は、配列（ｂ、ｃ）および標的３１０中の（ｂ’、ｃ’）の間の完璧な相補性のみが遮断プローブ３２０の置換をもたらすように設計されている。そのような遮断技術の原理は、本明細書中に記載のすべての実施形態に適用可能である。遮断プローブ３２０の使用によって提供される１つの利点は、完璧に一致した標的配列およびミスマッチの標的配列の間のプローブのＴmの差異が小さい、一塩基多型を検出するための実施形態にある。そのような遮断プローブは、図６に例示するように標的配列に、または１つもしくは複数の標的特異的プローブに部分的に相補的であるように設計し得る。後者の場合、プローブとその特異的な標的とのハイブリダイゼーションは、プローブと遮断オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションよりも熱力学的に好適であり、それによって、標的特異的プローブの存在下で遮断プローブが標的から置換されることを促進する。
【００７９】
一般に、本明細書中で使用した命名法は、分子学、生化学、微生物学および組換えＤＮＡの技術において慣用のものである。そのような技術は文献中に十分に記載されている。たとえば、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９および非特許文献３０を参照されたい。
【００８０】
本発明は、その具体的な実施形態と併せて記載されているが、多くの代替、改変および変形が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および幅広い範囲内にあるすべてのそのような代替、改変および変形を包含することが意図される。本明細書中で言及したすべての出版物、特許および特許出願は、それぞれの個々の出版物、特許または特許出願を、本明細書中に参照により組み込まれていると具体的にかつ個々に示される場合と同程度に、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる。さらに、本出願における任意の参考文献の引用または特定は、かかる参考文献が本発明の従来技術として利用可能であるということの承認であると解釈されるべきでない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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