(57)【要約】本発明は、例えば、抗原特異的T細胞媒介性免疫応答を抑制することができる誘導寛容原性樹状細胞を含む組成物と、同組成物を作製および使用する方法を提供するものである。更に本発明は、誘導免疫原性樹状細胞を含む組成物と、同組成物を作製および使用する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ex vivoで未刺激T細胞をFoxp3+ T 調節性細胞に変化させることができる誘導寛容原性樹状細胞（DC）を含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物。
【請求項２】
ex vivoでエフェクターT細胞を削除することができる誘導寛容原性DCの集団を含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物。
【請求項３】
ex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時に共刺激分子の発現は増加させるがそれらの寛容原性表現型は保持する誘導寛容原性DCを含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物。
【請求項４】
ex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性に増加させない誘導寛容原性DCを含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物。
【請求項５】
前記誘導寛容原性DCが、ex vivoでエフェクターT細胞を削除することができる、請求項１、３、又は４に記載の組成物。
【請求項６】
前記誘導寛容原性DCが、未刺激T細胞をFoxp3 T調節性細胞にex vivoで変化させることができる、請求項２、３、又は４に記載の組成物。
【請求項７】
前記誘導寛容原性DCが、ex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時に共刺激分子の発現は増加させるがそれらの寛容原性表現型は保持する、請求項１、２、又は４に記載の組成物。
【請求項８】
前記誘導寛容原性DCが、ex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性に増加させない、請求項１、２、又は４に記載の組成物。
【請求項９】
前記誘導寛容原性DCが、ex vivoでエフェクターT細胞を削除することができ、ex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時に共刺激分子の発現は増加させるがそれらの寛容原性表現型は保持する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記誘導寛容原性DCが、ex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時に共刺激分子の発現は増加させるがそれらの寛容原性表現型は保持し、そしてex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性に増加させない、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記誘導寛容原性DCが、ex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時に共刺激分子の発現は増加させるがそれらの寛容原性表現型は保持し、そしてex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性に増加させない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記誘導寛容原性DCが、ex vivoでエフェクターT細胞を削除することができ、そしてex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性に増加させない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記誘導寛容原性DCが、ex vivoでエフェクターT細胞を削除することができ、ex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時に共刺激分子の発現は増加させるがそれらの寛容原性表現型は保持し、そしてex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性に増加させない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記DCがクラスＩＩ分子を発現し、但し前記クラスＩＩ分子のうちの少なくとも一部分が、T細胞寛容が望まれる相手の抗原を由来とする複数の抗原性ペプチドに結合している、請求項１乃至１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団をex vivoでレスピロスタティック寛容を促進する少なくとも一種の作用物質に接触させることにより作製された誘導寛容原性DCを含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも一種の作用物質が：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβ受容体アゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤及びスタチン；
ｉｖ）mTOR阻害剤、TGFβ受容体アゴニスト、及びスタチン；
ｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖｉ）プリン性受容体アンタゴニスト及びスタチン；
ｖｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、及びmTOR阻害剤、
ｖｉｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、及びTGFβ受容体アゴニスト；
ｉｘ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβ受容体アゴニスト及びスタチン；
ｘ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
ｘｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤；
ｘｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、スタチン；
ｘｉｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニスト；
ｘｉｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストと、スタチン
から成る群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団をex vivoで１０時間未満、プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、スタチン、及びDCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質から成る群より選択される少なくとも一種の作用物質に接触させることにより作製された抗原特異的誘導寛容原性DCを含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも一つの作用物質が更にTGFβアゴニストを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、ex vivoで、少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にDCに対して共刺激分子の発現は増加させるがそれらの寛容原性表現型は保持させるような少なくとも一種の作用物質に接触させることにより作製された誘導寛容原性DCを含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物。
【請求項２０】
樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、ex vivoで、ｉ）ex vivoで未刺激T細胞のFoxp3発現を誘導する、ｉｉ）ex
vivoでエフェクターT細胞を削除する、又はFoxP3-エフェクターT細胞をFoxP3+エフェクターT細胞に変化させる、から成る群より選択される少なくとも一つの効果をDCに有させる少なくとも一つの作用物質に接触させることにより作製された誘導寛容原性DCを含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物。
【請求項２１】
開始細胞集団又は誘導寛容原性DCを更に、T細胞寛容が望まれる相手である抗原に接触させる、請求項１６乃至２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１乃至２１のいずれかに記載の組成物を対象に投与するステップを含む、投与する方法。
【請求項２３】
誘導寛容原性DCを含む細胞集団を作製する方法であって、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、ex
vivoで、レスピロスタティック寛容を促進する少なくとも一種の作用物質に接触させるステップを含み、前記DCが、抗原特異的寛容誘導を特徴とする、方法。
【請求項２４】
前記少なくとも一種の作用物質が：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤及びスタチン；
ｉｖ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖｉ）プリン性受容体アンタゴニスト及びスタチン；
ｖｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、及びmTOR阻害剤、
ｖｉｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、及びTGFβアゴニスト；
ｉｘ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト及びスタチン；
ｘ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
ｘｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤；
ｘｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、スタチン；
ｘｉｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニスト；
ｘｉｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストと、スタチン
から成る群より選択される、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも一種の作用物質が：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｉｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
から成る群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも一種の作用物質がmTOR阻害剤及びTGFβアゴニストを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記mTOR阻害剤がラパマイシン又はその誘導体もしくは類似体を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記TGFβアゴニストが、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、及びこれらの混合物から成る群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも一種の作用物質がプリン性受容体アンタゴニストを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記プリン性受容体アンタゴニストが、P1、P2X、P2X7、及びP2Yから成る群より選択されるプリン性受容体に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記プリン性受容体アンタゴニストが酸化ATPである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
誘導寛容原性DCを含む細胞集団を作製する方法であって、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団をex vivoで１０時間未満、プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβ受容体アンタゴニスト、スタチン、及びDCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質から成る群より選択される少なくとも一種の作用物質を含む組成物に接触させるステップを含む、方法。
【請求項３３】
前記細胞を１乃至３時間、接触させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞を２時間、接触させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞を、レスピロスタティック寛容を促進する少なくとも一種の作用物質に接触させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞を、少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にDCに対して共刺激分子の発現は増加させるがそれらの寛容原性表現型は保持させるような少なくとも一種の作用物質に接触させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも一種の作用物質が：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβ受容体アゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤及びスタチン；
ｉｖ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖｉ）プリン性受容体アンタゴニスト及びスタチン；
ｖｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、及びmTOR阻害剤、
ｖｉｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、及びTGFβアゴニスト；
ｉｘ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト及びスタチン；
ｘ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
ｘｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤；
ｘｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、スタチン；
ｘｉｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニスト；
ｘｉｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストと、スタチン
から成る群より選択される、
請求項３５乃至３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも一種の作用物質が：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｉｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
から成る群より選択される、請求項３５乃至３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも一種の作用物質がmTOR阻害剤及びTGFβアゴニストを含む、請求項３５乃至３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
mTOR阻害剤がラパマイシン又はその誘導体もしくは類似体を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
TGFβアゴニストがTGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、及びこれらの混合物から成る群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも一種の作用物質がプリン性受容体アンタゴニストを含む、請求項３５乃至３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記プリン性受容体アンタゴニストが、P1、P2X、P2X7、及びP2Yから成る群より選択されるプリン性受容体に結合する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記プリン性受容体アンタゴニストが酸化ATPである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
誘導寛容原性DCを含む細胞集団を作製する方法であって、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、ex vivoで、前記DCに対して少なくとも一種のTLRアゴニストによるex vivoでの刺激時に共刺激分子の発現は増加させるがそれらの寛容原性表現型は保持させるような少なくとも一種の作用物質に接触させるステップを含み、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、方法。
【請求項４７】
前記少なくとも一種の作用物質が：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤及びスタチン；
ｉｖ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖｉ）プリン性受容体アンタゴニスト及びスタチン；
ｖｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、及びmTOR阻害剤；
ｖｉｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、及びTGFβアゴニスト；
ｉｘ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト及びスタチン；
ｘ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
ｘｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤；
ｘｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、スタチン；
ｘｉｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニスト；
ｘｉｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストと、スタチン、
から成る群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも一種の作用物質が：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｉｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
から成る群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも一種の作用物質がmTOR阻害剤及びTGFβアゴニストを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記mTOR阻害剤がラパマイシン又はその誘導体もしくは類似体を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記TGFβアゴニストがTGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、及びそれらの混合物から成る群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記少なくとも一種の作用物質がプリン性受容体アンタゴニストを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
前記プリン性受容体アンタゴニストが、P1、P2X、P2X7、及びP2Yから成る群より選択されるプリン性受容体に結合する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記プリン性受容体アンタゴニストが酸化ATPである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
誘導寛容原性DCを含む細胞集団を作製する方法であって、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、ex vivoで、ｉ）未刺激T細胞のFoxP3発現をex vivoで誘導する、ｉｉ）ex vivoでエフェクターT細胞を削除する、又は、FoxP3-エフェクターT細胞をFoxP3+エフェクターT細胞に変化させる、から成る群より選択される少なくとも一つの効果を前記DCに有させる少なくとも一種の作用物質に接触させるステップを含み、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、方法。
【請求項５６】
前記少なくとも一種の作用物質が：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤及びスタチン；
ｉｖ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖｉ）プリン性受容体アンタゴニスト及びスタチン；
ｖｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、及びmTOR阻害剤；
ｖｉｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、及びTGFβアゴニスト；
ｉｘ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト及びスタチン；
ｘ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
ｘｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤；
ｘｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、スタチン；
ｘｉｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニスト；
ｘｉｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストと、スタチン、
から成る群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記少なくとも一種の作用物質が：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｉｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
から成る群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくとも一種の作用物質がmTOR阻害剤及びTGFβアゴニストを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記mTOR阻害剤がラパマイシン又はその誘導体もしくは類似体を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記TGFβアゴニストがTGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、及びそれらの混合物から成る群より選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記少なくとも一種の作用物質がプリン性受容体アンタゴニストを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記プリン性受容体アンタゴニストが、P1、P2X、P2X7、及びP2Yから成る群より選択されるプリン性受容体に結合する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記プリン性受容体アンタゴニストが酸化ATPである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
開始細胞集団又は誘導寛容原性DCを、DCの分化を促進する少なくとも一種の作用物質に接触させるステップを含む、請求項２３乃至６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
誘導寛容原性DC又は開始細胞集団を、寛容が望まれる相手である抗原に接触させるステップを更に含む、請求項２３乃至６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
前記抗原が粗抗原である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗原が精製済み抗原である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗原が：一種以上の短ペプチド；一種以上のポリペプチド；ポリペプチド混合物；及び一種以上のタンパク質、のうちの一種以上を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記抗原が細胞ライセート又は組織ライセートを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記抗原が、食物を由来とする一種以上のペプチド、ポリペプチド、又はたんぱく質を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
前記抗原が、神経細胞又は組織を由来とする一種以上のペプチド、ポリペプチド、又はたんぱく質を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
前記抗原が、アレルゲン又はアレルゲンの混合物を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７３】
対象に誘導寛容原性DCを投与するステップを更に含む、請求項２３乃至７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
誘導寛容原性樹状細胞をエフェクターT細胞に接触させるステップを更に含む、請求項２３乃至７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
投与するステップの前に、誘導寛容原性DCが未刺激T細胞においてFoxp3発現を誘導する能力を検査するステップを更に含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
投与するステップの前に、誘導寛容原性DCがエフェクターT細胞を削除する、又は、FoxP3-エフェクターT細胞をFoxP3+エフェクターT細胞に変化させる能力を検査するステップを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
投与するステップの前に、少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時に細胞がそれらの寛容原性表現型を保持する能力を検査するステップを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
投与するステップの前に、DCが、少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を増加させられないことを検査するステップを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
エフェクターT細胞を、請求項１乃至２１のいずれかに記載の誘導寛容原性DCを含む組成物に接触させるステップを含む、抗原に対するTエフェクター細胞応答を低下させる方法。
【請求項８０】
接触させるステップがin
vivoで行われる、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
誘導免疫原性樹状細胞を含む組成物を作製する方法であって、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、ex vivoで、樹状細胞の酸素消費を増加させる刺激に接触させることで、誘導免疫原性樹状細胞を含む組成物を作製するステップを含む、方法。
【請求項８２】
前記開始集団は、完全に分化した樹状細胞を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
誘導免疫原性樹状細胞のミトコンドリア活性化を測定するステップを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞のミトコンドリア活性化は、少なくとも一種のTLRアゴニストによる処置時の細胞の酸素消費を判定することにより、測定される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
誘導免疫原性DC又は開始細胞集団を、エフェクターT細胞応答の増加が望まれる相手である抗原に接触させるステップを更に含む、請求項８１乃至８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
前記抗原が病原性生物又は毒素を由来とする、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗原は癌細胞を由来とする、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記抗原が粗抗原である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記抗原が精製済み抗原である、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
前記抗原が：一種以上の短ペプチド；一種以上のポリペプチド；又は一種以上のタンパク質、のうちの一つ以上を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
対象に前記細胞を投与するステップを更に含む、請求項８１乃至９０に記載の方法。
【請求項９２】
誘導免疫原性樹状細胞をエフェクターT細胞に接触させるステップを更に含む、請求項８１乃至９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記接触させるステップがin vivoで行われる、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
樹状細胞集団を、樹状細胞における酸素消費を増加させる免疫原性刺激に接触させるステップを含む、対象において抗原に対するTエフェクター細胞応答性を増加させる方法であって、この場合、誘導免疫原性DCは抗原特異的Tエフェクター細胞応答性を促進することで、対象において抗原に対するTエフェクター細胞応答性を増加させる、方法。
【請求項９５】
少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激に応答した細胞のミトコンドリア活性化を測定するステップを更に含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
誘導免疫原性DC又は開始細胞集団を、Tエフェクター細胞応答性の増加が望まれる相手である抗原に接触させるステップを含む、請求項９４又は９５に記載の方法。
【請求項９７】
樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む細胞集団を検査作用物質に接触させることで処置済み細胞を得るステップと、ミトコンドリア活性化に対する前記作用物質の効果を測定するステップとを含む、抗原特異的寛容を促進する作用物質を同定する方法であって、この場合、適したコントロールに比較して、処置済み細胞でミトコンドリア活性化を妨げる又は逆行させる作用物質が、抗原特異的T細胞寛容を促進する候補作用物質として選抜される、方法。
【請求項９８】
樹状細胞における酸素消費に対する作用物質の効果を測定し、酸素消費速度を減らす又は増加させない作用物質を選抜する、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記処置済み細胞がex vivoで未刺激T細胞をFoxp3+T調節性細胞に変化させる能力を検査するステップを更に含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
処置済み細胞が、ex vivo及び／又はin vivoでエフェクターT細胞を削除する能力を検査するステップを更に含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
処置細胞が、ex vivo及び／又はin vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの寛容原性表現型を保持する能力を検査するステップを更に含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
抗原特異的Tエフェクター細胞応答を促進する作用物質を同定する方法であって、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む細胞集団を検査作用物質に接触させるステップと、ミトコンドリア活性化に対する前記作用物質の効果を測定するステップとを含み、この場合、適したコントロールに比較してミトコンドリア活性化を増加させる作用物質が、抗原特異的TエフェクターT細胞応答を促進する候補作用物質として選抜される、方法。
【請求項１０３】
樹状細胞における酸素消費に対する作用物質の効果を測定し、酸素消費速度を増加させる作用物質を選抜する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
処置済みの細胞が、ex vivo及び／又はin vivoでエフェクターT細胞の数又は活性を増加させる能力を検査するステップを更に含む、請求項１０２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、言及をもってその内容全体をここに援用することとする、２０１０年３月５日出願の米国特許出願第61/311,023号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
政府の資金援助
ここに記載された研究は、少なくとも部分的に、米国国立保健研究所から付与された助成金HL056949、AI069259及びAI1072252による支援を受けた。従って米国政府は本発明において何らかの権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
抗原に対する適切な免疫応答には、刺激的刺激と抑制的刺激との間の繊細なバランスが必要である。このバランスは、多様な免疫細胞による応答を支配する。侵入してくる病原体による感染に対してホスト生物が成功裏に闘うには、充分な免疫刺激が必要であるが、免疫応答が過剰であると、ホスト組織への炎症性損傷が起きる場合があり、ホスト抗原に対する免疫応答が不適切であると自己免疫障害が起きる場合がある。
【０００４】
Steinman及び Cohnが１９７３年にそれらを発見して以来、樹状細胞（DC）は、生得性及び適応性免疫の調節因子としてのそれらの重要な役割がますます認識されてきた。DCは抗原を獲得し、プロセッシングし、T細胞へ提示する上で極めて巧妙である。適応性免疫の強力な刺激因子としてのそれらの役割に加え、DCは、多様な機序を通じてT細胞媒介性エフェクター応答を防止、阻害、又は調節することができ、その範囲は、幅広い減衰効果を発揮する多形質抗炎症性因子の産生から、調節性T細胞のアネルギー、枯渇、又は誘導に至る抗原特異的T細胞応答に渡る。
【０００５】
調節性T細胞（Tregs）は多数の細胞種に対して多能性の抗炎症効果を有する。特にそれらは、生得性及び適応性免疫細胞の活性化を制御する。抗原特異的態様で作用するTregsは、例えばエフェクターT細胞が、侵入してきた病原体に対して成功裏に攻撃をしかけた後などにエフェクターT細胞活性化及び機能を低下させ、あるいは自己抗原に対する反応性を抑制することで、自己免疫疾患を防ぐ。二つの下位集団のTregが、それらがin vivoで発生するときに位置によって分類されている。天然発生型のTreg（nTreg）は胸腺で発生し、末梢で自己反応性免疫応答を抑制するが、適応性Treg（aTreg）は末梢で従来のCD4+T細胞から発生し、例えば食物及び腸管フローラなどを由来とするものを含め、無害な抗原に対する寛容を確実にする。両方の下位集団のTreg細胞共に、高レベルのCD25及び転写因子Foxp3の発現を特徴とする。Tregがそれらの抑制機能を発揮する分子機序は、集中的な研究の対象である。現在のところ、Tregは、自己反応性エフェクターT細胞の抗原特異的展開及び／又は活性化を阻害し、TGFβ又はIL-10を含む抑制性サイトカインを分泌すると考えられている。異常な免疫応答を調節する際にTregsが果たす重要な役割が、Foxp3又はCD25のいずれかの変異が、急速に致命的となる自己免疫障害IPEX（免疫機能不全、ポリエンドクリノパチー、腸症Ｘ連鎖）症候群を含め、複数の致命的な自己免疫障害につながるという観察によって強調された。全身的免疫抑制なしで、抗原特異的な免疫調節を提供する可能性がそれらにはあるために、Tregは免疫性又は自己免疫障害に向けた細胞ベースの治療法での使用が考察されてきた。
【０００６】
樹状細胞を操作して、例えば未刺激T細胞をFoxp3+T細胞に変化させるそれらの能力、及び／又は、エフェクターT細胞を削除するそれらの能力など、それらの免疫原性を減らすため、あるいは、それらの寛容原性を増すための有効な手段は明らかにされていない。樹状細胞をex vivoで操作するこのような方法の開発は、抗原特異的免疫応答を促進する又は低下させる際に膨大な利益をもたらすであろう。
【０００７】
発明の概要
本発明は、少なくとも部分的に、以下の特徴：ｉ）未刺激T細胞をFoxp3+T調節性細胞にex vivoで変化させる能力；ｉｉ）エフェクターT細胞をex vivoで削除する能力；ｉｉｉ）少なくとも一つのTLRアゴニストによる刺激時にex vivoでそれらの寛容原性表現型を保持する能力（ある実施態様では、それらは、このような刺激に応答して共刺激性分子の発現を増加させる）；及び／又はｉｖ）少なくとも一つのTLRアゴニストによる刺激時にex
vivoでレスピロスタティック（原語：respirostatic）を保持する能力、のうちの少なくとも一つを持つ誘導寛容原性DCの発見に基づく。誘導寛容原性DCは、ex vivo及びin vivoにおける抗原特異的寛容誘導を特徴とし、例えば粗、精製済み、又は細胞固有性抗原源などを用いてex vivoで作製することができる。
【０００８】
これまで、寛容原性DCを作製しようという試みがなされてきたが、それらでは、ここで記載するのと同じ細胞種は作製されなかった。例えば、mTOR阻害剤ラパマイシンのみで処置されたDCは、天然CD4+CD25-T細胞をTreg細胞に変化させない（例えばTurnquist et al. 2007. J. Immunol. 178:7018-7031、７０２７ページの一番目のコラムを参照されたい）。これらの発見とは著しく対照的に、ここで提供するデータは、誘導寛容原性DCは天然CD4+CD25-T細胞をTreg細胞に、細胞増殖の不在下でも変化させることを示している（例えば実施例１を参照されたい）。加えて、Turnquist et al. の著者は、エフェクターT細胞の実際の枯渇（例えば、ここで誘導寛容原性DCを用いて実証する通り、培養物中で１日目乃至２日目に起きるものなど）を実証してはおらず、ラパマイシンのみで処置されたDCが、コントロールDCに比較してCD25+Fox3-細胞の数をそれらの培養物中で減少させることを実証している。実際の枯渇の証拠はないため、Turnquist
et al.がみとめた効果は、ｉ）ラパマイシンのみで処置されたDCの、T細胞に対して生存シグナルを提供する能力の低さ、及び／又は、ｉｉ）コントロールDCにより誘導される強力な増殖（ラパマイシンの処置なし）が原因かも知れない。
【０００９】
誘導寛容原性DCと、ラパマイシンのみで処置されたDCとの間のこれらの質的な違いに加え、誘導寛容原性DCの作製についてここで解説されたプロトコルの結果、ラパマイシンのみを用いて得られるよりも多くのTreg細胞が作製されるため、対象に投与するのに必要な規模での誘導寛容原性樹状細胞の作製が可能になる。
【００１０】
他の研究者も、寛容を促進するために未熟DCを用いようと試みてきた。しかしながら、本発明の誘導寛容原性DCとは対照的に、未熟DCは、例えばTLRアゴニストなど、活性化性刺激に暴露されたときに、それらの寛容原性表現型を維持しない。本発明の細胞がそれらの寛容表現型をこのような暴露時にも維持するという事実は、このような刺激をしばしば含む抗原の粗製剤を、ex vivoでの誘導寛容原性樹状細胞の作製に用いることができることを意味している。
【００１１】
加えて、誘導寛容原性DCの作製のためのプロトコルが開発されてきた。ある実施態様では、あるプロトコルは、一種以上のレスピロスタティック物質を利用してex vivoで樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を処置することで、ｉ）未刺激T細胞をFoxP3+CD4+調節性T細胞に変化させる、及び／又は、ｉｉ）エフェクターT細胞を削除する、ことにより、抗原特異的寛容を誘導することのできる誘導寛容原性DCを作製する。別の実施態様では、あるプロトコルは、ex vivoで樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を寛容原的に固定する少なくとも一種の作用物質を利用して、ｉ）未刺激T細胞をFoxP3+CD4+調節性T細胞に変化させる、及び／又は、ｉｉ）エフェクターT細胞を削除する、ことにより、抗原特異的寛容を誘導することのできる誘導寛容原性DCを作製する。
【００１２】
これらの発見により、なかでも、誘導寛容原性樹状細胞をex vivoで作製する方法、誘導寛容原性細胞の組成物、これらの誘導寛容原性樹状細胞組成物を投与する方法、及び、誘導寛容原性樹状細胞を作製するために用いることのできる作用物質をスクリーニングする方法、が入手可能となる。
【００１３】
加えて、本発明は、エフェクターT細胞応答をex vivo又はin vivoで刺激するために用いることのできる誘導免疫原性樹状細胞に関する。誘導免疫原性DCは、例えばエフェクターT細胞のex vivoでの数及び／又は活性を増加させるなど、それらの能力で実証できるように、非誘導DCよりも免疫原性が高い。加えて、誘導免疫原性DCを作製するためのプロトコルが開発されてきた。ある実施態様では、あるプロトコルは、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞をex vivoで処置するための一種以上の作用物質を利用することで、エフェクターT細胞の活性を増加させる、及び／又は、数を増加させることにより抗原特異的応答を促進することのできる誘導免疫原性DCを作製する。
【００１４】
更に本発明は、ex vivoで誘導免疫原性樹状細胞を作製する方法、誘導免疫原性樹状細胞の組成物、これらの誘導免疫原性樹状細胞組成物を投与する方法、及び、誘導免疫原性樹状細胞を作製するために用いることのできる作用物質をスクリーニングする方法、にも関する。
【００１５】
ある局面では、本発明は、未刺激T細胞をFoxP3+T調節性細胞にex vivoで変化させる誘導寛容原性樹状細胞（DC）を含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物に関する。
【００１６】
別の局面では、本発明は、エフェクターT細胞をex vivoで削除することのできる誘導寛容原性DCの集団を含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物に関する。
【００１７】
別の局面では、本発明は、少なくとも一種のTLRアゴニストによるex vivoでの刺激時に、共刺激分子の発現は増加させるがそれらの寛容原性表現型は保持する誘導寛容原性DCを含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物に関する。
【００１８】
別の局面では、本発明は、少なくとも一種のTLRアゴニストによるex vivoでの刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性で増加させない誘導寛容原性DCを含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物に関する。
【００１９】
ある実施態様では、誘導寛容原性DCは、エフェクターT細胞をex vivoで削除することができ、この場合、誘導寛容原性DCは、未刺激T細胞をFox3T調節性細胞にex vivoで変化させることができる。ある実施態様では、誘導寛容原性DCは、ex vivoでの少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時に、共刺激分子の発現は増加させるが、それらの寛容原性表現型を保持するものである。ある実施態様では、誘導寛容原性DCは、ex vivoでの少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性で増加させない。ある実施態様では、誘導寛容原性DCは、ex vivoでエフェクターT細胞を枯渇させ、そしてex vivoでの少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時に共刺激分子の発現は増加させるが、それらの寛容原性表現型を保持する。
【００２０】
ある実施態様では、誘導寛容原性DCは、ex vivoでの少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時に共刺激分子の発現は増加させるが、それらの寛容原性表現型を保持すると共に、ex vivoでの少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性で増加させない。ある実施態様では、誘導寛容原性DCは、ex vivoでの少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時に共刺激分子の発現は増加させるが、それらの寛容原性表現型を保持すると共に、ex vivoでの少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性で増加させない。ある実施態様では、誘導寛容原性DCは、ex vivoでエフェクターT細胞を削除することができると共に、ex vivoでの少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性で増加させない。ある実施態様では、誘導寛容原性DCは、ex vivoでエフェクターT細胞を削除することができると共に、ex vivoでの少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時に共刺激分子の発現は増加させるが、それらの寛容原性表現型を保持すると共に、ex vivoでの少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性で増加させない。
【００２１】
ある実施態様では、DCはクラスＩＩ分子を発現し、そして前記クラスＩＩ分子の少なくとも一部分は、T細胞寛容が好ましい相手の抗原を由来とする複数の抗原性ペプチドに結合される。
【００２２】
別の局面では、本発明は、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団をex vivoでレスピロスタティック寛容を促進する少なくとも一種の作用物質に接触させることにより作製された誘導寛容原性DCを含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物に関する。
【００２３】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβ受容体アゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤及びスタチン；
ｉｖ）mTOR阻害剤、TGFβ受容体アゴニスト、及びスタチン；
ｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖｉ）プリン性受容体アンタゴニスト及びスタチン；
ｖｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、及びmTOR阻害剤、
ｖｉｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、及びTGFβ受容体アゴニスト；
ｉｘ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβ受容体アゴニスト及びスタチン；
ｘ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
ｘｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤；
ｘｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、スタチン；
ｘｉｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニスト；
ｘｉｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストと、スタチン、
から成る群より選択される。
【００２４】
ある局面では、本発明は、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団をex vivoで１０時間未満、プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、スタチン、及びDCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質から成る群より選択される少なくとも一種の作用物質に接触させることにより作製された抗原特異的誘導寛容原性DCを含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物に関する。
【００２５】
ある実施態様では、前記少なくとも一つの作用物質は更にTGFβアゴニストを含む。
【００２６】
別の局面では、本発明は、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、ex vivoで、少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にDCに対して共刺激分子の発現は増加させるがそれらの寛容原性表現型は保持させるような少なくとも一種の作用物質に接触させることにより作製された誘導寛容原性DCを含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物に関する。
【００２７】
別の局面では、本発明は、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、ex vivoで、ｉ）ex vivoで未刺激T細胞のFoxp3発現を誘導する、ｉｉ）ex
vivoでエフェクターT細胞を削除する、又はFoxP3-エフェクターT細胞をFoxP3+エフェクターT細胞に変化させる、から成る群より選択される少なくとも一つの効果をDCに有させる少なくとも一つの作用物質に接触させることにより作製された誘導寛容原性DCを含む組成物であって、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、組成物に関する。
【００２８】
ある実施態様では、開始細胞集団又は誘導寛容原性DCを更に、T細胞寛容が望まれる相手である抗原に接触させる。
【００２９】
ある実施態様では、投与する方法は、本発明の組成物を対象に投与するステップを含む。
【００３０】
ある実施態様では、本発明は、誘導寛容原性DCを含む細胞集団を作製する方法であって、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、ex vivoで、レスピロスタティック寛容を促進する少なくとも一種の作用物質に接触させるステップを含み、前記DCが、抗原特異的寛容誘導を特徴とする、方法に関する。
【００３１】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤及びスタチン；
ｉｖ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖｉ）プリン性受容体アンタゴニスト及びスタチン；
ｖｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、及びmTOR阻害剤；
ｖｉｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、及びTGFβアゴニスト；
ｉｘ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト及びスタチン；
ｘ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
ｘｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤；
ｘｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、スタチン；
ｘｉｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニスト；
ｘｉｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストと、スタチン、
から成る群より選択される。
【００３２】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｉｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
から成る群より選択される。
【００３３】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はmTOR阻害剤及びTGFβアゴニストを含む。
【００３４】
ある実施態様では、前記mTOR阻害剤はラパマイシン又はその誘導体もしくは類似体を含む。
【００３５】
ある実施態様では、前記TGFβアゴニストは、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、及びこれらの混合物から成る群より選択される。
【００３６】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニストを含む。
【００３７】
ある実施態様では、前記プリン性受容体アンタゴニストは、P1、P2X、P2X7、及びP2Yから成る群より選択されるプリン性受容体に結合する。
【００３８】
ある実施態様では、前記プリン性受容体アンタゴニストは酸化ATPである。
【００３９】
ある局面では、本発明は、誘導寛容原性DCを含む細胞集団を作製する方法であって、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団をex vivoで１０時間未満、プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβ受容体アンタゴニスト、スタチン、及びDCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質から成る群より選択される少なくとも一種の作用物質を含む組成物に接触させるステップを含む、方法に関する。
【００４０】
ある実施態様では、前記細胞を１乃至３時間、接触させる。ある実施態様では、前記細胞を２時間、接触させる。
【００４１】
ある実施態様では、前記DCは、抗原特異的寛容誘導を特徴とする。
【００４２】
ある実施態様では、前記細胞を、レスピロスタティック寛容を促進する少なくとも一種の作用物質に接触させる。
【００４３】
ある実施態様では、前記細胞を、少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にDCに対して共刺激分子の発現は増加させるがそれらの寛容原性表現型は保持させるような少なくとも一種の作用物質に接触させる。
【００４４】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤及びスタチン；
ｉｖ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖｉ）プリン性受容体アンタゴニスト及びスタチン；
ｖｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、及びmTOR阻害剤；
ｖｉｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、及びTGFβアゴニスト；
ｉｘ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト及びスタチン；
ｘ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
ｘｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤；
ｘｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、スタチン；
ｘｉｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニスト；
ｘｉｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストと、スタチン、
から成る群より選択される。
【００４５】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｉｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
から成る群より選択される。
【００４６】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はmTOR阻害剤及びTGFβアゴニストを含む。
【００４７】
ある実施態様では、mTOR阻害剤はラパマイシン又はその誘導体もしくは類似体を含む。
【００４８】
ある実施態様では、TGFβアゴニストはTGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、及びこれらの混合物から成る群より選択される。
【００４９】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニストを含む。
【００５０】
ある実施態様では、前記プリン性受容体アンタゴニストは、P1、P2X、P2X7、及びP2Yから成る群より選択されるプリン性受容体に結合する。
【００５１】
ある実施態様では、前記プリン性受容体アンタゴニストは酸化ATPである。
【００５２】
ある局面では、本発明は、誘導寛容原性DCを含む細胞集団を作製する方法であって、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、ex vivoで、前記DCに対して少なくとも一種のTLRアゴニストによるex vivoでの刺激時に共刺激分子の発現は増加させるがそれらの寛容原性表現型は保持させるような少なくとも一種の作用物質に接触させるステップを含み、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、方法に関する。
【００５３】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤及びスタチン；
ｉｖ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖｉ）プリン性受容体アンタゴニスト及びスタチン；
ｖｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、及びmTOR阻害剤；
ｖｉｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、及びTGFβアゴニスト；
ｉｘ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト及びスタチン；
ｘ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
ｘｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤；
ｘｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、スタチン；
ｘｉｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニスト；
ｘｉｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストと、スタチン、
から成る群より選択される。
【００５４】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｉｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
から成る群より選択される。
【００５５】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はmTOR阻害剤及びTGFβアゴニストを含む。
【００５６】
ある実施態様では、前記mTOR阻害剤はラパマイシン又はその誘導体もしくは類似体を含む。
【００５７】
ある実施態様では、前記TGFβアゴニストはTGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、及びそれらの混合物から成る群より選択される。
【００５８】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニストを含む。
【００５９】
ある実施態様では、前記プリン性受容体アンタゴニストは、P1、P2X、P2X7、及びP2Yから成る群より選択されるプリン性受容体に結合する。
【００６０】
ある実施態様では、前記プリン性受容体アンタゴニストは酸化ATPである。
【００６１】
ある局面では、本発明は、誘導寛容原性DCを含む細胞集団を作製する方法であって、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、ex vivoで、ｉ）未刺激T細胞のFoxP3発現をex vivoで誘導する、ｉｉ）ex vivoでエフェクターT細胞を削除する、又は、FoxP3-エフェクターT細胞をFoxP3+エフェクターT細胞に変化させる、から成る群より選択される少なくとも一つの効果を前記DCに有させる少なくとも一種の作用物質に接触させるステップを含み、前記DCが抗原特異的寛容誘導を特徴とする、方法に関する。
【００６２】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤及びスタチン；
ｉｖ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖｉ）プリン性受容体アンタゴニスト及びスタチン；
ｖｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、及びmTOR阻害剤；
ｖｉｉｉ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、及びTGFβアゴニスト；
ｉｘ）プリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト及びスタチン；
ｘ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
ｘｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤；
ｘｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、スタチン；
ｘｉｉｉ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニスト；
ｘｉｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストと、スタチン、
から成る群より選択される。
【００６３】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は：
ｉ）mTOR阻害剤及びTGFβアゴニスト；
ｉｉ）スタチン；
ｉｉｉ）mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチン；
ｉｖ）プリン性受容体アンタゴニスト；
ｖ）DCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質；
から成る群より選択される。
【００６４】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はmTOR阻害剤及びTGFβアゴニストを含む。
【００６５】
ある実施態様では、前記mTOR阻害剤はラパマイシン又はその誘導体もしくは類似体を含む。
【００６６】
ある実施態様では、前記TGFβアゴニストはTGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、及びそれらの混合物から成る群より選択される。
【００６７】
ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニストを含む。
【００６８】
ある実施態様では、前記プリン性受容体アンタゴニストは、P1、P2X、P2X7、及びP2Yから成る群より選択されるプリン性受容体に結合する。
【００６９】
ある実施態様では、前記プリン性受容体アンタゴニストは酸化ATPである。
【００７０】
ある実施態様では、本発明の方法は更に、誘導寛容原性DC又は開始細胞集団を、寛容が望まれる相手である抗原に接触させるステップを含む。
【００７１】
ある実施態様では、前記抗原は粗抗原である。ある実施態様では、前記抗原は精製済み抗原である。ある実施態様では、前記抗原は：一種以上の短ペプチド；一種以上のポリペプチド；ポリペプチド混合物；及び一種以上のタンパク質、のうちの一種以上を含む。ある実施態様では、前記抗原は細胞ライセート又は組織ライセートを含む。
【００７２】
ある実施態様では、前記抗原は、食物を由来とする一種以上のペプチド、ポリペプチド、又はたんぱく質を含む。ある実施態様では、前記抗原は、神経細胞又は組織を由来とする一種以上のペプチド、ポリペプチド、又はたんぱく質を含む。ある実施態様では、前記抗原は、アレルゲン又はアレルゲンの混合物を含む。
【００７３】
別の局面では、本発明の方法は、更に、対象に誘導寛容原性DCを投与するステップを含む。別の局面では、本発明の方法は更に、誘導寛容原性樹状細胞をエフェクターT細胞に接触させるステップを含む。
【００７４】
別の局面では、本発明の方法は更に、投与するステップの前に、誘導寛容原性DCが未刺激T細胞においてFoxp3発現を誘導する能力を検査するステップを含む。
【００７５】
別の局面では、本発明の方法は更に、投与するステップの前に、誘導寛容原性DCがエフェクターT細胞を削除する、又は、FoxP3-エフェクターT細胞をFoxP3+エフェクターT細胞に変化させる能力を検査するステップを含む。
【００７６】
別の局面では、本発明の方法は更に、投与するステップの前に、少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時に細胞がそれらの寛容原性表現型を保持する能力を検査するステップを含む。
【００７７】
別の局面では、本発明の方法は更に、投与するステップの前に、DCが、少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を増加させられないことを検査するステップを含む。
【００７８】
ある実施態様では、本発明は、エフェクターT細胞を本発明の誘導寛容原性DCを含む組成物に接触させるステップを含む、抗原に対するTエフェクター細胞応答を低下させる方法に関する。
【００７９】
ある実施態様では、接触させるステップはin vivoで行われる。
【００８０】
別の局面では、本発明は、誘導免疫原性樹状細胞を含む組成物を提供する方法であって、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、ex vivoで、樹状細胞の酸素消費を増加させる刺激に接触させることで、誘導免疫原性樹状細胞を含む組成物を作製するステップを含む、方法に関する。
【００８１】
ある実施態様では、前記開始集団は、完全に分化した樹状細胞を含む。
【００８２】
別の局面では、本発明の方法は更に、誘導免疫原性樹状細胞のミトコンドリア活性化を測定するステップを含む。
【００８３】
ある実施態様では、前記細胞のミトコンドリア活性化は、少なくとも一種のTLRアゴニストによる処置時の細胞の酸素消費を判定することにより、測定される。
【００８４】
別の局面では、本発明の方法は更に、誘導免疫原性DC又は開始細胞集団を、エフェクターT細胞応答の増加が好ましい相手である抗原に接触させるステップを含む。
【００８５】
ある実施態様では、前記抗原は病原性生物又は毒素を由来とする。
【００８６】
ある実施態様では、前記抗原は癌細胞を由来とする。
【００８７】
ある実施態様では、前記抗原は粗抗原である。ある実施態様では、前記抗原は精製済み抗原である。ある実施態様では、前記抗原は：一種以上の短ペプチド；一種以上のポリペプチド；又は一種以上のタンパク質、のうちの一つ以上を含む。
【００８８】
ある実施態様では、本発明の方法は更に、対象に前記細胞を投与するステップを含む。
【００８９】
ある実施態様では、本発明の方法は更に、誘導免疫原性樹状細胞をエフェクターT細胞に接触させるステップを含む。
【００９０】
ある実施態様では、前記接触させるステップはin vivoで行われる。
【００９１】
別の局面では、本発明は、樹状細胞集団を、樹状細胞における酸素消費を増加させる免疫原性刺激に接触させるステップを含む、対象において抗原に対するTエフェクター細胞応答性を増加させる方法に関し、この場合、誘導免疫原性DCは、Tエフェクター細胞応答性の増加が好ましい相手である抗原をそれらの表面上に示すことで、対象において抗原に対するTエフェクター細胞応答性を増加させる、方法に関する。
【００９２】
ある実施態様では、本発明の方法は更に、少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激に応答した細胞のミトコンドリア活性化を測定するステップを含む。
【００９３】
ある実施態様では、本発明の方法は更に、誘導免疫原性DC又は開始細胞集団を、Tエフェクター細胞応答性の増加が望まれる相手である抗原に接触させるステップを含む。
【００９４】
別の局面では、本発明は、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む細胞集団を検査作用物質に接触させることで処置済み細胞を得るステップと、ミトコンドリア活性化に対する前記作用物質の効果を測定するステップとを含む、抗原特異的寛容を促進する作用物質を同定する方法に関し、この場合、適したコントロールに比較して、処置済み細胞でミトコンドリア活性化を妨げる又は逆行させる作用物質が、抗原特異的T細胞寛容を促進する候補作用物質として選抜される。
【００９５】
ある実施態様では、樹状細胞における酸素消費に対する作用物質の効果を測定し、酸素消費速度を減らす又は増加させない作用物質を選抜する。
【００９６】
ある実施態様では、本発明の方法は更に、前記処置済み細胞がex vivoで未刺激T細胞をFoxp3+T調節性細胞に変化させる能力を検査するステップを含む。
【００９７】
ある実施態様では、本発明の方法は更に、処置済み細胞が、ex vivo及び／又はin vivoでエフェクターT細胞を削除する能力を検査するステップを含む。
【００９８】
ある実施態様では、本発明は更に、処置細胞が、ex vivo及び／又はin vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの寛容原性表現型を保持する能力を検査するステップを含む。
【００９９】
別の局面では、本発明は、抗原特異的Tエフェクター細胞応答を促進する作用物質を同定する方法であって、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む細胞集団を検査作用物質に接触させるステップと、ミトコンドリア活性化に対する前記作用物質の効果を測定するステップとを含み、この場合、適したコントロールに比較してミトコンドリア活性化を増加させる作用物質が、抗原特異的TエフェクターT細胞応答を促進する候補作用物質として選抜される、方法に関する。
【０１００】
ある実施態様では、樹状細胞における酸素消費に対する作用物質の効果を測定し、酸素消費速度を増加させる作用物質を選抜する。
【０１０１】
ある実施態様では、本発明の方法は更に、処置済みの細胞が、ex vivo及び／又はin vivoでエフェクターT細胞の数又は活性を増加させる能力を検査するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】ex vivoでの寛容原性DCによるFoxp3+Tregの分化。ａ）は、DCで寛容原性表現型を誘導する能力について化合物をスクリーニングするのに用いた手法の図である。ｂ）は、処置済みDCと一緒に５日間、同時培養した後に細胞内着色又はGFP発現で明らかになったFoxP3及びCD25発現細胞のパーセンテージ。ｃ）は、提示したマーカーについて染色した後に、樹状細胞との同時培養５日目のT細胞を示すフローサイトメトリーである。ｄ）は、Foxp3誘導に対するTCRシグナル伝達強度の役割を示す。多様な濃度のαCD3の存在下において、提示する通りに処置したDCとの同時培養５日目の単個CD4+CD11c-7AAD-細胞間のFoxp3+CD25+ 細胞の比率。ｅ）は、細胞周期遮断剤アフィジコリン（Aph）の存在下又は非存在下でDCと共に同時培養した様々な時点におけるT細胞の Foxp3 発現を示す。ｆ）は、天然発生型Treg（nTreg）及びitDC-誘導型Treg上でのFoxp3発現の比較を示す。ｇ）は、天然発生型Treg(nTreg) 及びitDC-誘導型Tregの表現型の比較を示す。ｈ）は、抑制検定のためのFoxp3+ 及びFoxp3- 細胞のFACSソーティング戦略を示す。ｉ）は抑制検定を示す。Foxp3+aTreg 又はFoxp3- Teff 及びDCとの同時培養株から分離されたTn細胞のCFSEプロファイル。ｊ）は、抑制細胞Treg、対、CFSEで標識した応答細胞Tn細胞の比率を様々にした、分離されたばかりのFoxp3+ nTreg の、分化したばかりの Tregに対する比較を示す。
【図２】ヒト寛容原性単球由来樹状細胞 (MoDC) はFoxp3-発現T細胞を誘導する。ａ）細胞表現型：投入されたTn細胞及びMoDCを示すフローサイトメトリ―と、提示した通りに処置されたMoDCとの同時培養後のT細胞のFoxp3及びCD25 発現プロファイルを示す。ｂ）は、５つの個別の実験の収集データを示す。p値は、通常の二方向ANOVA検定のボンフェローニのポスト検定を用いて計算された。ｃ）は、MoDCの表現型を示す。ｄ）は、ヒトTregを用いた抑制検定を示す。活性化マーカー (CD45RA-CD25+/-+Teff) 及び推定 Tregs (CD45RA-CD25 高) を発現するitMoDCにより活性化したT細胞を、高CD3の存在下で、MoDC 及び新鮮なCFSE-標識済み Tnと一緒に同時培養した。ヒストグラムでは、Teff又は推定aTregとの３日間の培養後のTn増殖の尺度であるCFSE希釈度 が示されている。
【図３】誘導寛容原性DCの表現型。ａ）は、提示した刺激で処置し、MHC CLII、CD80、CD86、又はICOSLについて染色したDCの平均蛍光強度(MFI)を示す。Ctrl：未処置；It: ラパマイシン／TGFβ；lps: リポ多糖。ｂ）は、誘導寛容原性DCの機能はToll様受容体−アゴニスト耐性であることを示す。DCをラパマイシン、プラスTGFβ及びTLR アゴニストで調製し、Foxp3誘導に対するそれらの効果を測定した。ｃ）は、DCサブセットに対するソーティング戦略を示す。ｄ）は、４つのCD11c+ DC 集団との同時培養後のFoxp3+CD25+ T 細胞のパーセンテージを示す。ｅ）は、DCにおけるラパマイシン(mTOR)経路の哺乳動物標的中の様々な因子の発現及びリン酸化状態を示す。ｆ）は、DCにおけるラパマイシン(mTOR)経路の哺乳動物標的中の様々な因子の発現及びリン酸化状態の動態を示す。ｇ）は、異なる由来のDCの比較を示す。GM-CSF又はFLT3L の存在下で分化させた骨髄由来DC（BMDC）を、脾臓 DC(SPDC)に対し、それらの、Tn上でのFoxp3発現誘導能について比較した。
【図４】itDCによる寛容誘導の機序。ａ）は、ラパマイシン／TGFβで処置し、そして選択的にIL-10(JES5-16E3)、IL10R (1B1.3a) 又はTGFβ (1D11) 又はアイソタイプ・コントロールに対して遮断したDCとの同時培養後のFoxp3+CD25+ 細胞のパーセンテージを示す。パネルb-g)において、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1 (IDO1)、エプスタイン−バーウィルス誘導遺伝子3 (EBI3)、FasL、IL-6、TSC1、PDL1 及び／又は PDL2 充分又は欠損 OVAp-負荷DCを、前の図面と同様に調整し、Fox3GFPx OT-II 動物由来のGFP-Tnを刺激するために用いた。結果は、培養５日目でのGFP+CD25+CD4+CD11c-7AAD- 細胞のパーセンテージを示す。
【図５】ex vivo のT細胞に対するitDCの効果は接触依存的であり、itDC:T 比の影響を受ける。a) は、Transwell 実験を示す。上側／下側チャンバーにOVAp-負荷DC を単独でプレートするか、又は、OTII+Tn (*) と組み合わせてプレートした。５日後にVα2+CD4+ 細胞中のCD25+Foxp3+ の存在をFACSで評価した。 b-c) では、上と同様のitDC及びTn の同時培養を行ったが、異なる組合せ及び比のDCを提示した通りに負荷した。50/20という表記は、コントロール又はLPS処置されたDCのitDCに対する比（即ち50:20）等を示す。d)は、itDCの寛容原性効果がitDC:Tnに依存することを示す。
【図６】ex vivoでのitDCによる抗原特異的T細胞の枯渇と、Foxp3発現の誘導。   a) は、Tn+DC 同時培養におけるOTII細胞の細胞充実度を示す。OVAp-負荷ctrlDC、itDC 及びlpsDCを用いてOTII+ Tnを活性化した。TCRβ+CD11cVα2+7AAD- 細胞の絶対数が示してある。点線はTn  の投入を表す。b) は、ctrlDCとの同時培養におけるT細胞数に対する正規化済みデータを示す。白色のシンボルは１日目に得られた結果を表し、塗り潰されたシンボルは、２日目の比を表す。c)  Tn は単独で放置される（Tnのみ）、か、又は提示したように様々なDC試料と混合されたことを示す。ある条件では、活性化αCD3 及びαCD28 MAbをプレート結合させて itDC (itDC+aCD3)の存在下でTnを最大に活性化させた。別の条件では、補足的なIL-2を０日目から開始して同時培養物に添加した (itDC+IL-2)。d) はitDC はTeff細胞数を減らすことを示す。lpsDCによる活性化後に得られ、その後全ての種類のDCの存在下で同時培養したTeff細胞を用いて、前と同様な実験を行った。図示するのは、提示した時点における総T細胞数である。 e) は、異なる量のDCを用いてTnを刺激したことを示す。図中に示すのは、提示した種類のDCと共に、提示した様々なDC対T細胞比で培養してから１日目及び２日目のTn (TCRβ+D11c-Va2+7AAD-) の総数である（我々の伝統的な方法は 1:10 のDC 対 Tn 比から成る）。
【図７】in vivoでのitDCによる抗原特異的T細胞の枯渇及びFoxp3発現の誘導。ａ）は、in vivoでの寛容原性DCによるFoxp3発現誘導を検査するための実験デザインの図である。b) は、静脈内注射後のDCのホーミングを示す。CD45.1+レシピエントに尾の静脈注射を通じて移送した後の多様な臓器における処置済みCD45.2+ DCの存在。c) は、早期の時点でのpopLN 由来の細胞の分析を示す。 d) は、CD4+Vα2+ 画分中のCD45.2+ 細胞のパーセンテージの定量を示す。 e) は、DCの注射から７日後（遅い時点）の動物のpopLN、ingLN 及びSpl 中のCD4+Vα2+ 細胞の分析を示す。 f) は、Foxp3誘導の時間経過及び定量を示す。g) は、CD4+Vα2+ 画分中の内因性CD45.2-細胞の中のFoxp3+CD25+細胞のパーセンテージの定量を示す。
【図８】疾患の経過に対するitDC投与の効果：  自己免疫、同種応答及びアレルギー性喘息のマウス・モデル。a) は、EAE 予防及び治療実験プロトコル（上側）；EAE 様々な処置群の平均スコア（下側）。b) は、予防又は治療プロトコルを用いたDC処置の直接的比較を示す。c) は、EAE処置群環の統計上有意差（p値）を示す。 d) は、個別の５つの個別の実験に関する収集データを示す。 e) は、前の図面に関するEAEのパラメータを示す。f) は、itDC療法の統計上の強健性を示す。 g) はCD4+生存単個細胞間の治療用DC注射後のTreg 及びTeff 細胞のパーセンテージ及び総数を示す。h) は、平均EAEスコアとTreg/Teff 比との間の相関関係を示す。i) は、MLRにおいてallo-Ag に応答したT細胞増殖のitDCによる阻害を示す。Balb/cDC（提供細胞）をCFSE-標識済みC57BL/6 T 細胞（応答細胞）と混合した。示差的に処置したF1 DC (104/ウェル)をいくつかのウェルに加えた。４日後、応答細胞の増殖をFACSで分析した。C57BL/6 応答細胞のみ（提供細胞無し）を陰性（刺激無し）又は陽性コントロール（抗CD3刺激あり）として用いた。 j) は、アレルギー性喘息モデル及びDC療法のプロトコルを示す。k)は、OVAで感作及び抗原刺激したC57/BL6  を未処置のままとする（ctrl）か、又は、様々な種類のDCを静脈内注射したことを示す。BAL液を、好酸球(CD11b+Gr1loSSC-Ahi) について評価した。l)はCD4+T 細胞を示す。m)は、アレルギー性喘息を誘発するためのHDM感作のプロトコルを示す。及び n) は、マウスをHDMに感作させ、メタコリン誘導性AHRを、DC処置後にD25上で測定したことを示す。
【図９】in vivoにおけるリンパ節ではFoxp3+ T 細胞の比率に対するラパマイシン直接的処置の効果なし。 a) は、養子移入させたOTII+ CD45.1+ 間又は内因性ポリクローナルVα2+CD4+ T 細胞間のFoxp3+細胞の比率は、OVAp のみ (10ug)、ラパマイシンのみ(1ug) 又は両者の組合せの局所注射の影響を受けないことを示す。 b) は、活性化抗CD3、LPS 又はラパマイシンを直接注射すると同様な結果が得られたことを示す。
【図１０】寛容原性DCを誘導するための付加的な化合物のスクリーニング。a) は、多様な寛容原性刺激で処置されたDCとの同時培養から５日後のCD4+CD11c-7AAD- 細胞のGFP発現を測定することにより同定されたFoxp3及びCD25発現細胞のパーセンテージを示す。 b) は、様々な作用物質を用いて誘導されたitDCの表現型を示す（MFI＝平均蛍光強度）。
【図１１】ミトコンドリアに対するDC活性化の効果。パネルa)は、コントロール及びLPS刺激樹状細胞における経時的なミトコンドリア呼吸（酸素消費速度）を示す。棒は、基底及び未結合状態における活性化：コントロールDC中のOCR比を反映する。 b) は、LPS処置後の、リアルタイムPCRによるPGC1amRNA の発現動態を示す。 c) は、未熟(4°C) 及びLPS-成熟(4h)DC中のミトコンドリアの代表的TEMを示す。 d) は、ミトコンドリア・クリスタの密度が、ミトコンドリア中の総クリスタ長(nm)：同じミトコンドリアの面積 (nm2) としたImageJソフトウェアを用いたTEM画像で判定されたことを示す。
【図１２】DCのOCR及び免疫原性。a) は、TLRアゴニストLPS (TLR4)、CpG(TLR9)、poly-IC (TLR3) 又はATP又はなしで２時間活性化した後の様々な種類のDCにおける正規化済みOCR（コントロールに対する）を示す。 b) は、DCにおけるoATPのOCRに対する効果を示す。c) は、ロテノンによりミトコンドリアの電子輸送を阻害すると、DC免疫原性が遮断されることを示す。CFSE標識済みOT-IIT細胞を、LPSのみか、又はLPSプラス1mMのロテノンと一緒に成熟させてあったOVAペプチド・パルス付加DCと一緒にインキュベートしたことを示す。コントロールDCをLPSで、OVA パルス付加なしで処置した。
【図１３】DCのスタチン処置による寛容原性機能の誘導。DCを、提示した通りに アトルバスタチン(Atorva、10uM)、プラバスタチン (Prava、50uM) 又は oATP (100μM) で、ラパマイシン、TGFβ及びLPS と組み合わせて、又は組み合わせずに処置した。これらの細胞を用いて OTIIxFoxp3GFPxCD45.1 Tnを活性化し、培養５日目に、Vα2+CD4+CD45.1+ 細胞間のCD25+Foxp3+細胞の存在をFACSで評価した。陽性コントロールは付加的な TGFβ及びIL-2 を加えた細胞培養株だった (ctrlDC+T2)。
【０１０３】
発明の詳細な説明
免疫応答の調節は、炎症性及び自己免疫障害の予防にとって中心的である。免疫系の下方調節は免疫抑制療法で達成することができるが、免疫系を概して抑制する作用物質は、感染及び癌を含め、他の障害に対象を罹りやすくする。特定の抗原に対する免疫応答の異常な活性化を制御するための手段は、特定の抗原に対する免疫応答の下方調節を可能にしながらも、その他の点では、侵入してくる病原体や腫瘍関連抗原に対して免疫系を機能的にしたままにするため、自己免疫障害の処置において主要な進歩となるであろう。反対に、免疫応答が好ましいような特定の抗原の免疫原性を特異的に高める方法は、例えばワクチン処置や、腫瘍抗原に対する応答性を高めるといった文脈など、好ましい免疫応答を促進する際に非常に有益であろう。
【０１０４】
DCは、T細胞媒介性エフェクター応答を刺激及び阻害する際に重要な役割を果たす。本発明は、少なくとも部分的には、以下の特徴：ｉ）誘導寛容原性DCは、ex vivo 及び in vivoで未刺激T細胞をFoxp3+T調節細胞に変化させることができる；ｉｉ）誘導寛容原性DCは ex vivo 及びin vivoでエフェクターT細胞を削除することができる；ｉｉｉ）誘導寛容原性DCは、ex vivo で少なくとも一つのTLRアゴニストによる刺激時にもそれらの寛容原性表現型を保持する（しかしある実施態様では、それらは、このような刺激に応答して共刺激分子の発現を増加させる）；及びｉｖ）誘導寛容原性DCは、ex vivoで少なくとも一つのTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性に増加させない、 のうちの少なくとも一つを持つ誘導寛容原性DCの発見に基づく。誘導寛容原性DCは、ex vivo及びin vivo で抗原特異的寛容誘導を特徴とし、例えば粗、精製済み、又は細胞内因性抗原源を用いるなどしてex vivoで作製することができる。
【０１０５】
更に本発明は、エフェクターT細胞応答を刺激するために用いることのできる誘導免疫原性樹状細胞も提供する。誘導免疫原性DCは、ex vivo で少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性で増加させるものであり、そしてある実施態様では、これは、細胞の更なる操作前に検査することができる。誘導免疫原性DCは、in vivo 及び ex vivo において未誘導のDCよりも免疫原性が高く、また、例えば粗もしくは精製済み抗原源などを用いてex vivo で作製することができる。
【０１０６】
Ｉ．  定義
本発明がより容易に理解され得るように、いくつかの用語をまず定義しておく。
【０１０７】
「樹状細胞（ここではDCとも言及される）」とは、抗原物質をプロセッシングし、免疫系の他の細胞、最も重要なものとしてT細胞、に対してそれを提示する抗原提示免疫細胞である。未熟DCはタンパク質抗原を捕獲してプロセッシングする働きをする。DCが抗原をエンドサイトーシスすると、それらは抗原をプロセッシングして小型のペプチドにし、この小型のペプチドがDC表面上に示されて、そこで抗原特異的T細胞に提示される。抗原の取り込み後、DCはリンパ節に遊走する。未熟樹状細胞は高度のエンドサイトーシス及び微飲作用機能を特徴とする。成熟中、DCは、Toll様受容体（TLR）を通じたシグナル伝達を含め、多様なシグナルによって促進されることができ、こうしてコグネートエフェクターT細胞（Teff）の活性化及び増殖を誘導する共刺激シグナルを発現することで、抗原に対するT細胞媒介性免疫応答を開始することができる。あるいはDCは、Teffが適切に活性化されないように、共刺激シグナルを提供できないままで（あるいは共阻害シグナルを提供しながらも）抗原を抗原特異的T細胞に提示する場合がある。このような提示は、例えば抗原を認識したT細胞の死又はアネルギーを引き起こすか、あるいは、調節性T細胞（Treg）の生成及び／又は発現を誘導し得る。
【０１０８】
用語「樹状細胞」には、未熟及び成熟樹状細胞に関係なく、分化樹状細胞が含まれる。これらの細胞は、特定の細胞表面マーカー（例えば CD11c、MHC クラスII、及び少なくとも低レベルのCD80 及びCD86）の発現で特徴付けることができる。加えて、樹状細胞は、それらのアロ応答及び混合型リンパ球反応（MLR）刺激能によっても機能的に特徴付けることができる。
【０１０９】
ここで用いられる場合の用語「樹状細胞前駆細胞」には、ex vivoで成熟して樹状細胞になることのできる、造血系骨髄前駆細胞、単球、又は未熟樹状細胞が含まれる。
【０１１０】
樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団は、寛容原性又は免疫原性になるように、ex vivoでの処置により「誘導」され得る。ある実施態様では、開始細胞集団を、例えばサイトカイン及び／又は成熟因子を用いる、当業で公知の方法を用いるなどして、誘導前、又は誘導の一部、又は誘導後に、樹状細胞に分化させる。ある実施態様では、誘導後の樹状細胞は、完全に分化した樹状細胞を含む。ある実施態様では、誘導後の樹状細胞は、未熟及び成熟樹状細胞の両者を含む。別の実施態様では、誘導後の樹状細胞は、成熟樹状細胞を濃縮してある。ある実施態様では、誘導後の樹状細胞はクラスＩＩ分子をそれらの表面上で発現する。別の実施態様では、誘導後の樹状細胞は、クラスＩＩ分子及び共刺激分子をそれらの表面上で発現する。
【０１１１】
ここで用いられる場合の用語「寛容原性樹状細胞」とは、例えば特定の抗原に対するエフェクターT細胞応答を減らすなどにより、抗原特異的T細胞媒介性免疫応答を抑制することのできる樹状細胞を言う。これは例えば、あるT細胞集団中で抗原特異的エフェクターT細胞に対する抗原特異的調節性T細胞の数を増やすなどにより、達成することができる。
【０１１２】
ここで用いられる場合の用語「誘導寛容原性DC」とは、ex vivoで誘導された寛容原性樹状細胞を言う。誘導寛容原性樹状細胞は、以下の特性：ｉ）誘導寛容原性DCは、未刺激T細胞をFoxp3+T調節性細胞にex vivo及びin vivoで変化させることができる；ｉｉ）誘導寛容原性DCは、エフェクターT細胞をex vivo及びin vivoで削除することができる；ｉｉｉ）誘導寛容原性DCは、少なくとも一つのTLRアゴニストによる刺激時にex vivoでそれらの寛容原性表現型を保持することができる（ある実施態様では、それらは、このような刺激に応答して共刺激性分子の発現を増加させる）；及び／又はｉｖ）誘導寛容原性DCは、少なくとも一つのTLRアゴニストによる刺激時にex vivoでそれらの酸素消費速度を一過性に増加させない、のうちの少なくとも一つを特徴とする寛容原性表現型を有する。
【０１１３】
誘導寛容原性DCは、ex vivo 及びin vivoでの抗原特異的寛容誘導を特徴とする。 ここで用いられる用語「抗原特異的寛容誘導」とは、ex vivoで誘導寛容原性樹状細胞によって発現させた一種以上の目的の抗原による、エフェクター CD4+ T細胞の寛容誘導を意味する。このような目的の抗原は、誘導寛容原性樹状細胞に（例えば生殖細胞系遺伝子産物として、又は、発現ベクターの産物として）発現させることができ、あるいは、ex vivoで誘導寛容原性樹状細胞（あるいは誘導前の樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞の開始集団）に接触させることができる。
【０１１４】
ここで用いられる場合の用語「免疫原性樹状細胞」とは、例えば特定の抗原に対するエフェクターT細胞応答を増加させるなどにより、ex vivo 又は in vivoでの抗原特異的T細胞媒介性免疫応答を亢進させることができる樹状細胞を言う。これは例えば、T細胞集団中の抗原特異的エフェクターT細胞の数を増加させる、及び／又は、抗原特異的エフェクターT細胞の活性を増加させるなどにより、達成することができる。
【０１１５】
ここで用いられる場合の用語「誘導免疫原性樹状細胞」とは、ex vivoで誘導された免疫原性DCを言う。誘導免疫原性樹状細胞は、未誘導のDCよりも免疫原性が高く、そしてある実施態様では、ex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度の一過性の増加を特徴とする表現型を有する。
【０１１６】
ここで用いられる用語「未刺激T細胞」とは、抗原による遭遇によって刺激を受けていないT細胞を言う。未刺激CD4+ T細胞は、例えば CD4+CD25-CD62LhighCD44lowFoxp3-として特徴付けられるCD4+細胞を濃縮するなど、当業で公知の方法を用いて単離することができる。
【０１１７】
ここで用いられる用語「調節性T細胞（又はT調節性細胞もしくはTreg）」とは、エフェクターT細胞を含む他のT細胞の活性化を負に調節するCD4+CD25+Foxp3+
T 細胞を言う。  Treg 細胞はエフェクターT細胞応答の持続的な抑制を特徴とする。
【０１１８】
ここで用いられる用語「エフェクターT細胞又はTeff」とは、調節性でなく、かつ抗原及び共刺激分子に遭遇したT細胞を言う。エフェクター細胞は、例えばサイトカイン産生など、活性化の特定のマーカーで特徴付けることができる。ある実施態様では、エフェクターT細胞はCD4+である。
【０１１９】
ここで用いられる用語「寛容原性刺激」とは、例えば樹状細胞を誘導して、ある集団中での抗原特異的調節性T細胞、対、抗原特異的エフェクターT細胞に対する比率を増加できるようにするなどにより、樹状細胞を誘導して寛容原性にする作用物質（又は物質の組合せ）を言う。ある実施態様では、抗原特異的調節性T細胞の増加は、ラパマイシンのみを用いて観察されるよりも統計上有意に高い。
【０１２０】
ここで用いられる用語「レスピロスタティック寛容を促進する作用物質」とは、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む細胞集団にex vivoで接触させたときに、ex vivoでの少なくとも一種のTLRアゴニストのよる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性に増加させない、誘導寛容原性樹状細胞を含む細胞集団を生じさせる少なくとも一種の作用物質を言う。これらの作用物質によって誘導された誘導寛容原性樹状細胞は、ｉ）未刺激T細胞を Foxp3+
T 調節性細胞にex vivo 及びin vivo で変化させる；ｉｉ） ex vivo 及びin vivoでエフェクターT細胞を削除する；及びｉｉｉ）ex vivoで少なくとも１種のTLRアゴニストによる刺激時に、DCはそれらの寛容原性表現型は保持しながらも、DC上の共刺激分子の発現は増加させる、のうちの少なくとも一つが可能である。
【０１２１】
ここで用いられる用語「レスピロスタティック」とは、ex vivo環境で測定したときに細胞のミトコンドリア活性を一過性で増加させず；そして、細胞によるTLRアゴニストに対する応答において細胞のミトコンドリア活性のその後の増加を阻害又は遮断するプロトコル又は試薬を言う。ある実施態様では、ミトコンドリア活性は、細胞の酸素消費を判定することにより測定される。ここで用いられる場合の「レスピロスタティック寛容原性プロトコル」とは、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞が、ｉ）ex vivoで未刺激T細胞をFoxp3+ T 調節性細胞に変化させる、及びｉｉ）ex vivoでエフェクターT細胞を削除する、のうちの少なくとも一つをそれらが行えるようにするように、ex vivo環境で処置されるプロトコルを言う。
【０１２２】
ここで用いられる用語「レスピロ刺激性」とは、ex vivo環境で測定したときに細胞のミトコンドリア活性を一過性で増加させ；そして、細胞によるTLRアゴニストに対する応答において細胞のミトコンドリア活性のその後の増加を阻害又は遮断しないプロトコル又は試薬を言う。ある実施態様では、ミトコンドリア活性は、細胞の酸素消費を判定することにより測定される。
【０１２３】
ここで用いられる用語「寛容原固定されている」とは、少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にも、誘導寛容原性樹状細胞がそれらの寛容原性表現型を維持するという事実を言う。「寛容原性固定プロトコル」とは、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を、ex vivo環境で、それらがｉ）ex vivoで未刺激T細胞をFoxp3+ T 調節性細胞に変化させる、及びｉｉ）エフェクターT細胞をex vivoで削除する、のうちの一つができるようにする寛容原性固定作用物質で、処置するプロトコルを言う。
【０１２４】
ここで用いられる用語「未刺激T 細胞をFoxp3+
T 調節性細胞に変化させる」とは、以前にはFoxp3を発現しなかった未刺激T細胞がToxp3を発現してTreg細胞になるように誘導されるように、例えば細胞分裂の非存在時などに、誘導寛容原性樹状細胞を含む細胞集団を誘導して、未刺激T細胞中の転写因子Foxp3の発現を誘導する能力を言う。Foxp3の発現に加え、T調節性細胞（Treg細胞）はCD25を発現し、エフェクターT細胞応答の持続的な抑制をすることができる。
【０１２５】
ここで用いられる用語「Toll様受容体又はTLR」とは、微生物由来の分子に対するパターン認識受容体として役立つと共に生来の免疫応答を刺激する一ファミリーの分子を言う。TLRのアゴニストには、TLRに応じて、例えばリポペプチド、糖脂質、リポタンパク質、二重鎖RNA、リポ多糖、フラゲリン、一本鎖RNA、及びCpGオリゴヌクレオチドがある。
【０１２６】
ここで用いられる、樹状細胞に発現させることのできる、用語「共刺激分子」とは、CD80、CD86、及びICOS リガンドなどの共刺激分子を言う。ある実施態様では、これらの分子は誘導寛容原性DCによって発現されるが、それでも尚、該細胞はそれらの寛容原性表現型を維持する。
【０１２７】
ここで用いられる用語「クラスＩＩ分子」とは、抗原提示細胞の表面上に見られる多型のヘテロ二量体型膜タンパク質を言う。クラスＩＩ分子は、Tリンパ球によって認識されるタンパク質抗原のペプチド・フラグメントに結合して表示する。クラスＩＩ分子は通常、細胞外タンパク質（例えばクラスＩＩ分子を発現する細胞によっては産生されない外因性のタンパク質など）を由来とするペプチドを表示し、該ペプチドは貪食細胞又はエンドサイトーシス・ベシクル中に内部移行してプロセッシングされるか、あるいは、細胞に直接接触した場合にはＭＨＣクラスＩＩのペプチド結合裂に結合することができる。
【０１２８】
ここで用いられる用語「粗抗原」とは、分子的に特徴付けられていない抗原を言う。例えば粗抗原製剤は細胞ライセート又は組織ライセートを含むであろう。別の実施態様では、粗抗原製剤は、タンパク質抽出物又はタンパク質混合物（例えばアレルゲン又はアレルゲン混合物）を含むであろう。
【０１２９】
ここで用いられる用語「内因性の抗原」とは、例えばクラスＩ分子又はｉｉ）クラスＩＩ分子と関連する、より通常はクラスＩ分子と関連するペプチドなど、細胞によって（例えば生殖系遺伝子の産物、自己タンパク質、又は自己ペプチドとして）産生され、T細胞によって認識され得る形で細胞表面上に提示されるポリペプチド又はペプチドを言う。
【０１３０】
ここで用いられる用語「精製済み抗原」とは、少なくとも部分的に精製されている抗原を言う。ある実施態様では、このような抗原は不要な物質を除くために精製されている。別の実施態様では、精製済み抗原は、分子的に特徴付けられた抗原である。例えばある実施態様では、精製済み抗原は、規定済みのペプチド又はこのようなペプチドの混合物を含むことができる。
【０１３１】
ＩＩ．  開始細胞集団
樹状細胞前駆細胞及び／又は樹状細胞を含む開始細胞集団を得るために、樹状細胞前駆細胞又は樹状細胞を含む細胞、組織又は臓器の試料を一体以上の対象から当業で公知の方法を用いて分離する。このような開始細胞集団は一体の対象から得ても、又は二体以上のドナーからプールしてもよい。
【０１３２】
ある実施態様では、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含む開始集団は脾臓組織を由来とする。ある実施態様では、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団は胸腺組織を由来とする。ある実施態様では、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団は骨髄を由来とする。ある実施態様では、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団は、例えば全血又は白血球除去法を用いるなどして、末梢血を由来とする。
【０１３３】
ある実施態様では、細胞の開始細胞集団は樹状細胞前駆細胞を含む。ある実施態様では、樹状細胞前駆細胞を含む細胞集団は、当業で公知の技術である標準的な単核細胞白血球除去法を用いて末梢血から採集することができる。こうして樹状細胞前駆細胞は、例えば逐次浮揚性密度勾配遠心分離ステップを用いるなどして、採集することができる。例えば、白血球除去法生成物を浮揚性密度溶液（比重 = 1.077 g/mL)上に積層させ、1,000 g で 20 分間、遠心分離することで、赤血球及び顆粒球を枯渇させることができる。界面の細胞を採集し、洗浄し、第二浮揚性密度溶液（比重 = 1.065 g/mL）上に積層させ、805 g で３０分間、遠心分離して、血小板並びに低密度の単球及びリンパ球を枯渇させる。その結果の細胞ペレットを、樹状細胞前駆細胞について濃縮する。
【０１３４】
別の実施態様では、樹状細胞を含む開始細胞集団を、当業で公知の方法を用いて得ることができる。このような集団は、骨髄樹状細胞（mDC）、形質球様樹状細胞（pDC）、及び／又は、単球から培養で生じた樹状細胞（例えばMO-DC、MDDC）を含んでいてもよい。
【０１３５】
ある実施態様では、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞は、このような細胞を含有する混合細胞集団由来（例えば循環から、又は組織もしくは臓器から）であってもよい。特定の実施態様では、DC及び／又は樹状細胞前駆細胞を含有する混合細胞集団は、DC及び／又は樹状細胞前駆細胞が細胞集団の 50% （例えば55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9% 又はそれ以上）を超える部分を構成するように濃縮される。いくつかの実施態様では、ここで解説する樹状細胞は、ある細胞集団中のいくつか又は全ての非樹状細胞から分離することにより、精製される。例示的な実施態様では、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含む開始集団が、例えば50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9% 又はそれ以上の純度など、少なくとも50%又はそれ以上の樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含有するように、細胞を精製することができる。
【０１３６】
ある実施態様では、引用をもってその内容全文をここに援用することとするCurrent Protocols in Immunology, Wiley Interscience, November 19,
2009, 又はWoo et al., Transplantation, 58:484 (1994)に解説された技術を用いて樹状細胞を分離することができる。当業者であれば、不当な実験なしでも、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含む細胞を単離する前述の方法に改変を実施することができる。ある実施態様では、例えば特定の樹状細胞の場合のCD11cなど、それらの表面上に存在する抗原に向けた蛍光活性化セル・ソーティングを用いて樹状細胞を精製することができる。ある実施態様では、開始細胞集団中に存在するDCはCD11cを発現するものである。別の実施態様では、開始細胞集団中に存在するDC及び／又は樹状細胞前駆細胞はクラスＩＩ分子を発現するものである。開始細胞集団を、当業で公知の技術を用いて多様な細胞表面マーカー（例えばCD11cを含む）の発現について観察してもよい。
【０１３７】
別の実施態様では、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含む細胞集団を、血液中にPBMCとして存在する多分化能細胞から得ることができる。大半は血液から容易に得られるが、多分化能細胞を、骨髄及び脾臓組織を含め、それらが常在するいずれの組織から得てもよい。これらの多分化能細胞は、典型的には、CD14、CD32、CD68 及びCD115 単球マーカーを発現し、CD83、p55 、又はCD40もしくはCD86などの付属分子はほとんど又は全く発現しない。
【０１３８】
ある実施態様では、樹状細胞前駆細胞を、誘導寛容原性又は誘導免疫原性樹状細胞を調製するためのプロトコルにおいて、少なくとも一種の作用物質による処置前、処置中、又は処置後に、樹状細胞に分化させることができる。GM-CSF 及びIL-4 又はIL-13の組合せなど、サイトカインの存在下で培養する場合、多分化能細胞は未熟樹状細胞を生じさせる。別の実施態様では、FLT3リガンドをこの目的のために用いることができる。例えばある実施態様では、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、DCの分化を促進する一種以上の作用物質の存在下でex vivo で培養することができる。ある実施態様では、GMCSF 又はIL-4 のうちの一つ以上を用いて、例えば１−１５日間、２−１０日間、３−９日間、４−８日間、又は５−６日間、あるいは充分な分化を得るためのこのような他の時間、培養するなどして、ex vivoでDCの発生を促進する。ある実施態様では、誘導樹状細胞は完全に分化している（誘導寛容原性樹状細胞又は誘導免疫原性樹状細胞を生じさせる処置誘導前、処置誘導中、又は処置誘導後に）。
【０１３９】
別の実施態様では、DC及び／又はDC前駆細胞を含む開始細胞集団をPBMCから得ることができる。例えばフィッコール・ハイパック[スウェーデン、ウプサラ、Pharmacia Biotech社]など、適した培地を通す示差的沈降などの方法を用いた、血液からPBMCを得る方法が公知であり、本発明での使用に適している。本発明のある好適な実施態様では、多分化能細胞は、血小板並びにT及びBリンパ球をPBMC集団から枯渇させることにより、得られる。多様な方法を用いて非多分化能細胞の枯渇を達成できよう。ある方法によれば、例えばT及び／又はBリンパ球など、除去しようとする細胞に特異的な抗体で、直接又は間接的に標識した免疫磁気ビーズを用いて、T及びB細胞をPBMC集団から除去してもよい。T細胞はまた、引用をもってここに援用することとするO'Dherty (1993)に解説されたように、ノイラミニダーゼ処置された赤血球でロゼットすることにより、PBMC集団から枯渇させてもよい。 
【０１４０】
ある実施態様では、３００万個の成熟樹状細胞を生じさせるために、ほぼ40 ミリリットルの血液を加工することができる。ある実施態様では、4 乃至8 x107
個の多分化能 PBMC はほぼ３００万個の成熟樹状細胞を生じさせる。
【０１４１】
上述したように、未熟樹状細胞の培養株は、多分化能細胞を、それらの分化を促進するサイトカインの存在下で、例えば１−１０日間、２−９日間、３−８日間、又は４−７日間など、所望の分化レベルを達成するのに充分な時間、培養することにより、得てもよい。一例としては、それぞれ約200乃至約2000 U/ml、約500乃至1000 U/ml、又は約800 U/ml (GM-CSF) 乃至1000 U/ml (IL-4) の濃度のGM-CSF及びIL-4の組合せが、有意な量の未熟樹状細胞を生ずるであろう。GM-CSF (10-200 ng/ml) 及びIL-4 (5-50 ng/ml) の組合せも用いることができる。培養されたばかりの細胞が、樹立培養株（２日間の培養後500 U/ml IL-4 ）よりも高い濃度のIL-4 (1000 U/ml)の存在下で培養されるように、培養の異なる段階でサイトカインの濃度を変えることも好ましいかも知れない。IL-13などの他のサイトカインがIL-4の代わりとなることも見出されるかも知れない。別の実施態様では、FLT3リガンドをこの目的のために用いることができる。この目的のための他のプロトコルは当業で公知である。
【０１４２】
接着性血液単核画分からこれらの未熟樹状細胞を得る方法が、両者とも引用をもってここに援用することとするRomani et al. (1994); 及びSallusto and Lanzavecchia, 1994) に解説されている。簡単に説明すると、リンパ球を枯渇させたPBMCを組織培養プレートに、GM-CSF
及びIL-4などのサイトカインをそれぞれ 約800 乃至1000 U/ml そして IL-4が約 1000 U/ml存在するような濃度で含有する完全培地中で約１００万個の細胞／cm2の密度になるようにプレートする。
【０１４３】
未熟樹状細胞のもう一つの源は、引用をもってここに援用することとするSteinmanらの国際出願PCT/US93/03141に解説された方法に従って調製された増殖性樹状細胞前駆細胞の培養物である。CD34+ 増殖性前駆細胞から調製された樹状細胞は成熟すると成熟した特徴を発現する樹状細胞になるため、それらは、それらが多分化能である発達段階を通じて継代する可能性が高い。
【０１４４】
ある実施態様では、未熟樹状細胞を樹状細胞成熟因子に接触させることにより、樹状細胞を含む開始樹状細胞集団を成熟樹状細胞の存在について濃縮することができる。ここで言及される場合の樹状細胞成熟因子は、単独で、又は、一種以上のアジュバント、TLR アゴニスト、CD40アゴニスト、インフラマソーム活性化剤、炎症性サイトカイン、又はこれらの組合せなど、未熟樹状細胞の成熟を引き起こすために別の作用物質と一緒に作用する一種以上の特異的物質であってもよい。
【０１４５】
ＩＩＩ．  誘導寛容原性樹状細胞
ある実施態様では、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、集団中に誘導寛容原性DCを生ずる一種以上の作用物質でex
vivoで刺激する。誘導寛容原性DCは、例えば細胞集団中で抗原特異的Treg細胞、対、抗原特異的エフェクターT細胞の比率を増加させるなどにより、DCによって提示される抗原に対するT細胞媒介性免疫応答を抑制することができる。抗原特異的Treg細胞の比率のこのような増加は数多くの方法で引き起こすことができる。より具体的には、誘導寛容原性樹状細胞は、以下の特性ｉ）誘導寛容原性DCは、ex vivo及びin vivoで未刺激T細胞をFoxp3+ T 調節性細胞に変化させることができる；ｉｉ）誘導寛容原性DCは、ex vivo 及び in vivoでエフェクターT細胞を削除することができる；ｉｉｉ）誘導寛容原性DCは、ex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にもそれらの寛容原性表現型を保持する（そしてある実施態様では、同じ刺激で共刺激分子の発現を増加させる）；及び／又はｉｖ）ex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にもそれらの酸素消費速度を一過性に増加させない、のうちの少なくとも一つで特徴付けられる寛容原性表現型を有する。ある実施態様では、誘導寛容原性DCは、上記の特性のうちの少なくとも２つを有する。別の実施態様では、誘導寛容原性DCは、上記の特性のうちの少なくとも３つを有する。更に別の実施態様では、誘導寛容原性DCは上記の特性の４つ全てを有する。
【０１４６】
未刺激T細胞のFoxp3+ Treg 細胞への変化
いくつかの実施態様では、寛容原性樹状細胞はex vivoで未刺激T細胞（例えばCD4+CD25- T 細胞）においてFoxp3 発現及び／又はCD25 発現を誘導することで、Tregを生成することができる。未刺激T細胞においてFoxp3発現を誘導することのできる寛容原性 DCは、外因性のサイトカインの存在下又は非存在下でFoxp3 発現を誘導することができる。例えばいくつかの実施態様では、Treg細胞の分化はIL-10及び／又は TGFβ独立である。ある実施態様では、誘導寛容原性DCによるFoxp3の誘導には細胞対細胞の接触が必要である。
【０１４７】
誘導寛容原性樹状細胞が未刺激T細胞をFoxp3+ 細胞に変化させる能力は、当業で公知の方法を用いてex vivo で測定することができる。例えば未刺激T細胞は、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を得たのと同じ対象から得ることができる。未刺激T細胞を、T細胞受容体媒介性刺激を誘導する作用物質（例えば、抗CD3又は超抗原などの汎T細胞刺激性作用物質）の存在下で、誘導寛容原性樹状細胞と一緒に充分な日数（例えば１−１０日間、２−８日間、又は３−６日間）、培養することができる。培養株中の細胞は、細胞内Foxp3発現について、抗体（例えばBiolegendTM社から市販のものなど）を用いて染色することができ、Foxp3を発現する細胞の数を定量し、適したコントロールに比較することができる。別の実施態様では、汎T細胞刺激性作用物質の代わりに、誘導寛容原性DCを、数多くの様々なHLA-DR及び-DQハロタイプを持つ個体由来の細胞によって認識される万能T細胞抗原又は万能T細胞エピトープに接触させることができる（例えば当業で解説されてきたように。このような万能抗原は、例えば病原体で解説されてきた。例えばGreenstein et al. 1992 J. Immunol
148:3970を参照されたい）。itDC対Tnの様々な比を用いてTreg分化をex vivoで誘導することができる。例えばitDCをTnと一緒に1:100、1:10、1:1、10:1、又は100:1、及びその範囲で同時培養することができる。例示的な実施態様では、itDCを１のDC：１０のTnの比で、Tnと一緒に同時培養することができる。
【０１４８】
ある実施態様では、誘導寛容原性DCは未刺激T細胞をFoxp3+Treg細胞に、T細胞による細胞分裂の非存在下で変化させることができる。ある実施態様では、投入された未刺激T細胞のFoxp3発現細胞へのこのような変化、例えば細胞周期の阻害剤又は活性化抗CD3抗体などの強力なTCRアゴニストなど、増殖を妨げる作用物質の存在下でこの検定を行うことができる。
【０１４９】
未刺激T細胞のFoxp3発現Treg細胞への変化に加え、いくつかの実施態様では、誘導寛容原性DCは、Foxp3＋CD25＋Treg細胞の展開及び／又は増殖をex
vivoで誘導することができる。これは、例えば細胞の増殖が妨げられない培養条件下でFoxp3＋細胞の数を測定し、適したコントロールと比較したときにFoxp3＋細胞数が増加していることを見出すなどにより、当業で公知の方法を用いて実証することができる。
【０１５０】
ある実施態様では、ここで解説する誘導寛容原性DCは、未刺激T細胞における持続的なFoxp3発現を誘導することができる。例えばいくつかの実施態様では、誘導寛容原性DCは、例えば少なくとも１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、又は３０日間あるいはそれ以上など、１０日間以上の期間にわたって持続する、未刺激T細胞でのFoxp3発現を誘導することができる。
【０１５１】
いくつかの実施態様では、誘導寛容原性DCは、CD4＋エフェクターT細胞でFoxp3発現を誘導することで、CD4＋エフェクターT細胞をTregに変化させることもできる。このようなエフェクターT細胞には、Th17型サイトカインを発現するT細胞、Th1型サイトカインを発現するT細胞、Th2型サイトカインを発現するT細胞、及びこれらの混合物を含めることができる。
【０１５２】
エフェクターT細胞の枯渇
いくつかの実施態様では、誘導寛容原性DCは、誘導寛容原性DCによって提示された抗原を認識したエフェクターT細胞の細胞死（即ち枯渇）又はエフェクター機能の喪失を誘導することができる。この能力により、誘導寛容原性DCは、抗原特異的エフェクターT細胞を直接、削除することにより、免疫応答を抑制又は減らすことができる。エフェクターT細胞の枯渇は、当業で公知の方法を用いて実証することができる。例えば上述したように、未刺激T細胞は、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を得たのと同じ対象から得ることができる。この未刺激T細胞を、誘導寛容原性樹状細胞と一緒に、T細胞媒介性刺激を誘導する作用物質（例えば抗CD3又は超抗原などの汎T細胞刺激性作用物質）の存在下で充分な日数（例えば１−１０日間、２−８日間、又は３−６日間）、同時培養することができる。多様な比のitDC対Tnを用いてTreg分化をex vivoで誘導することができる。例えば、itDCを、1:100、1:10、1:1、10:1、又は100:1、及びその範囲の比にしてTnと同時培養することができる。例示的な実施態様では、itDCをTnと、１のDC：１０のTnという比にして同時培養する。T細胞の数を培養中の１日目及び２日目に定量し、適したコントロールに比較することができる。別の実施態様では、汎T細胞刺激性作用物質の代わりに、誘導寛容原性TCを万能T細胞抗原又は万能T細胞エピトープに接触させることができる。エフェクターT細胞の数を例えば１日目及び／又は２日目などに定量して、細胞数に減少があるかどうかを判定することができる。
【０１５３】
ある実施態様では、誘導寛容原性DCは、培養一日目までにex vivoでTエフェクター細胞を削除することができる。ある実施態様では、誘導寛容原性DCは、培養二日目までにex
vivoでTエフェクター細胞を削除することができる。別の実施態様では、誘導寛容原性DCは、適したコントロールに比較して、ex vivoで１０％を超えるTエフェクター細胞を削除することができる。別の実施態様では、誘導寛容原性DCは、適したコントロールに比較して、ex vivoで２０％を超えるTエフェクター細胞を削除することができる。別の実施態様では、誘導寛容原性DCは、適したコントロールに比較して、ex vivoで３０％を超えるTエフェクター細胞を削除することができる。別の実施態様では、誘導寛容原性DCは、適したコントロールに比較して、ex vivoで４０％を超えるTエフェクター細胞を削除することができる。別の実施態様では、誘導寛容原性DCは、適したコントロールに比較して、ex vivoで５０％を超えるTエフェクター細胞を削除することができる。別の実施態様では、誘導寛容原性DCは、適したコントロールに比較して、ex vivoで６０％を超えるTエフェクター細胞を削除することができる。
【０１５４】
ある実施態様では、エフェクターT細胞は、アポトーシスが関与しない機序によって枯渇させられる。
【０１５５】
寛容原性固定
DC表面上のToll様受容体（TLR）を刺激するとDC活性化が促進されて、DCがエフェクターT細胞の増殖を誘導できるようになる。驚くべきことに、ここで解説する誘導寛容原性樹状細胞は、例えば少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激後など、成熟刺激にex vivoで接触させた後でも、それらの寛容原性誘導型を維持（寛容原性固定され）する。細胞の寛容原性表現型の存在は、例えば成熟刺激で処置した細胞がそれらの機能的な寛容原性表現型を保持しているかをここで解説するように確認するなどにより、機能的に実証することができる。
【０１５６】
ある実施態様では、成熟刺激で処置した誘導寛容原性樹状細胞は、共刺激分子の発現を（刺激前の共刺激分子の発現レベルに比較して）増加させるが、それらの寛容原性表現型は保持している。このような共刺激分子の例には、一種以上のCD80、CD86、及びICOSリガンドがある。別の実施態様では、成熟刺激で処置した誘導寛容原性樹状細胞は、（刺激前のクラスＩＩ分子の発現レベルに比較して）それらのクラスＩＩ分子の発現を増加させるが、それらの寛容原性表現型は保持している。
【０１５７】
寛容原性固定作用物質の例を以下により詳述する。ある実施態様では、少なくとも一種のこのような作用物質を寛容原性固定プロトコルで用いることができる。例えば、ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はmTOR阻害剤及びTGFβアゴニストを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はmTOR阻害剤及びスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はmTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニストを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニスト及びスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニスト及びmTOR阻害剤を含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、及びTGFβアゴニストを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト及びスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は、DCにおけるミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質を含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は、DCにおけるミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質とmTOR阻害剤を含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は、DCにおけるミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質とスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は、DCにおけるミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は、DCにおけるミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストと、スタチンを含む。ある実施態様では、寛容原性固定作用物質はラパマイシン単独からは成らない。別の実施態様では、寛容原性固定作用物質はmTOR阻害剤単独からは成らない。
【０１５８】
レスピロスタシス
本発明の誘導寛容原性DCは、レスピロスタティックであり、即ちそれらのミトコンドリア活性は、ex vivoでの少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時に一過性で増加しない。TLRアゴニストは、DCにおいてミトコンドリア活性化を増加させるように機能する。驚くべきことに、誘導寛容原性樹状細胞は、一種以上のTLRアゴニストによる刺激時にミトコンドリア活性化のこのような一過性の増加を示さない。
【０１５９】
ある実施態様では、酸素消費をミトコンドリア活性化の読み取り値として用いることができる。酸素消費速度（OCR）は、例えばシーホースXF24フラックス・アナライザーなどのアナライザーを用いる、あるいは、クラーク形電極を用いるなど、当業で公知の方法を用いて測定することができる。
【０１６０】
別の実施態様では、ミトコンドリア活性化の代替的読み取り値を測定することができる。例えば糖取り込み（誘導体化した糖を用いるなど）又は反応性酸素種の存在（DCF-DAを用いるなど）を測定することができる。別の実際態様では、（解糖の増加及び／又はミトコンドリア活性の低下で上昇する）乳酸生成を測定することができる。ある実施態様では、細胞外酸化速度（ECAR）が測定可能であり、解凍又はピルビン酸負荷による乳酸生成を反映するものである。シーホースSF24フラックス・アナライザーをこの目的のために用いることができる。更に別の実施態様では、（例えば市販のキットを用いる、あるいは、Nagel et al. 2010. Methods Mol. Biol. 645:123-31にあるように）細胞内ATP／ADP比を測定してもよい。ATPレベルの上昇及びADPレベルの低下は増殖中の細胞で認識されており、活性化の尺度である。
【０１６１】
別の実施態様では、ミトコンドリア活性化のマーカーである遺伝子の発現レベルを測定することができる。例えば、ある実施態様では、PGC-1a、PGC-1b、PRCのうちの一つ以上、あるいは、例えばエストロゲン関連受容体α、NRF-1、NRF-2、Sp1、YY1、CREB及びMEF-2/E-ボックス因子など、ミトコンドリア機能に関与する他の分子の発現のmRNAレベルを測定することができる。ある実施態様では、このような遺伝子又はその一部分の調節領域をレポータ遺伝子に作動可能に連結して測定を容易にしてもよい。
【０１６２】
ここで交換可能に用いられるように、用語「作動可能に連結された」及び「作動的に連結された」とは、当該ヌクレオチド配列が、ホスト細胞中でのヌクレオチド配列の発現が可能な態様で調節配列に連結されていることを意味するものと意図されている。調節配列は当業で公知であり、適したホスト細胞における所望のタンパク質の直接的な発現に向けて選択することができる。調節配列という用語は、プロモータ、エンハンサ、ポリアデニレーション・シグナル及び他の発現制御配列を含むものと意図されている。このような調節配列は当業者に公知であり、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition CSHL Press
(2001)などに解説されている。発現ベクターのデザインは、トランスフェクトしようとするホスト細胞、及び／又は、発現させたいタンパク質の種類及び／又は量といった因子に依るであろうことは理解されるはずである。調節配列には、数多くの種類のホスト細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を命令するもの、特定のホスト細胞でのみ、ヌクレオチド配列の発現を命令するもの（例えば組織特異的調節配列）、又は特定の条件下でのみ、ヌクレオチド配列の発現を命令するもの（例えば誘導性調節配列）がある。
【０１６３】
多種のレポータ遺伝子が当業で公知であり、本発明のスクリーニング検定での使用に適している。適したレポータ遺伝子の例には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質（及びその多様な変異型）、又はルシフェラーゼをコードするものがある。これらの遺伝子産物の活性を測定するための標準的な当方は当業で公知である。
【０１６４】
レスピロスタティック作用物質の例を以下により詳述する。ある実施態様では、少なくとも一種のこのような作用物質をレスピロスタティック・プロトコルで用いることができる。例えばある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はmTOR阻害剤及びTGFβアゴニストを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はmTOR阻害剤及びスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はmTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニストを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニスト及びスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニスト及びmTOR阻害剤を含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、及びTGFβアゴニストを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト及びスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はDCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質を含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はDCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤を含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はDCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、スタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はDCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はDCにおいてミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストと、スタチンを含む。ある実施態様では、レスピロスタティック作用物質はラパマイシン単独からは成らない。別の実施態様では、レスピロスタティック作用物質はmTOR阻害剤単独からは成らない。
【０１６５】
ＩＶ．  誘導寛容原性樹状細胞のex
vivoでの生成
本発明の誘導寛容原性DCは、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、例えばレスピロスタティック作用物質又は寛容原性固定作用物質など、少なくとも一種の寛容原性刺激に接触させることにより、ex vivoで生成される。
【０１６６】
寛容原性刺激
用語「寛容原性刺激」には、ここで用いられる場合、例えば樹状細胞を誘導して、ある細胞集団中の抗原特異的Treg細胞、対、抗原特異的Teff細胞の比率を増加させることができるようにするなどにより、単独又は組合せで、樹状細胞を誘導して寛容原性にする物質が含まれる。より具体的には、誘導寛容原性樹状細胞は、以下の特性ｉ）誘導寛容原性DCは、ex vivo及びin vivoで未刺激T細胞をFoxp3+T調節細胞に変化させることができる；ｉｉ）誘導寛容原性DCは、ex vivo及びin vivoでエフェクターT細胞を削除することができる；ｉｉｉ）誘導寛容先芸DCは、ex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの寛容原性表現型を保持する（ある実施態様では、それらは今日刺激性分子の発現を増加させる）；及び／又はｉｖ）誘導寛容原性DCは、ex vivoで少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの酸素消費速度を一過性に増加させない、のうちの少なくとも一つを特徴とする、DCにおける寛容原性表現型を誘導する一種以上の作用物質により生成される。
【０１６７】
寛容原性刺激の例には、（例えば酸素消費で測定したときに）ミトコンドリア活性化を増さない、又は、細胞内の電子輸送を中断させないものがある。他の寛容原性刺激の例には、誘導DCを寛容原性的に寛容原性表現型に固定するものがある。寛容原性刺激の例には、単独又は組合せで、ラパマイシンの哺乳動物性標的（mTOR）の阻害剤、TGFβ経路シグナル伝達のアゴニスト、スタチン、プリン性受容体経路アンタゴニスト、及び、ミトコンドリア電子輸送を阻害する作用物質、がある。ある実施態様では、寛容原性刺激はラパマイシン単独からは成らない。別の実施態様では、寛容原性刺激はmTOR阻害剤単独からは成らない。
【０１６８】
ある実施態様では、（例えば当業で公知の、以下に記載のもの、又は、ここで解説する方法で同定されたものなど）一種以上の寛容原性刺激による処置後、細胞を、例えば遠心分離及び／又は更なる操作前に洗浄するなどにより、作用物質から取り除いてもよい。作用物質の例を以下に更に詳述する。
【０１６９】
１．  mTOR阻害剤
ある例示的な実施態様では、本発明で使用する寛容原性刺激はmTOR阻害剤を含むか、又はmTOR阻害剤から成る。本発明を実施するのに適したmTOR阻害剤には、mTOR又はmTOR誘導性シグナル伝達の阻害剤又はアンタゴニストがある。mTOR阻害剤には、ラパマイシン及びその類似体、部分、又は誘導体、例えばテムシロリムス（CCI-779）、エヴェロリムス（RAD001）及びデフォロリムス（AP23573）がある。付加的なラパマイシン誘導体には、全て引用をもってその全文をここに援用することとする以下の特許に開示されたラパマイシンの42-及び／又は31-エステル及びエーテル：アルキルエステル（米国特許第4,316,885号）；アミノアルキルエステル（米国特許第4,650,803号）；フッ化エステル（米国特許第5,118,678号）；シリルエーテル（米国特許第5,120,842号）；アミノエステル（米国特許第5,130,307号）；アセタール（米国特許第5,51,413号）；アミノジエステル（米国特許第5,162,333号）；スルホン酸塩及びスルホン酸エステル（米国特許第5,177,203号）；エステル（米国特許第5,221,670号）；アルコキシエステル（米国特許第5,233,036号）；O-アリール、-アルキル、-アルケニル、及び-アルキニルエーテル（米国特許第5,258,389号）；カルボン酸エステル（米国特許第5,260,300号）；アリールカルボニル及びアルコキシカルボニルカルバメート（米国特許第5,262,423号）；カルバメート（米国特許第5,302,584号）；ヒドロキシエステル（米国特許第5,362,718号）；ヒンダードエステル（米国特許第5,385,908号）；複素環式エステル（米国特許第5,385,909号）；gem-二置換エステル（米国特許第5,385,910号）；アミノアルカン酸エステル（米国特許第5,389,639号）；ホスホリルカルバメートエステル（米国特許第5,391,730号）；カルバメートエステル（米国特許第5,411,967号）；カルバメートエステル（米国特許第5,434,260号）；アミジノカルバメートエステル（米国特許第5,463,048号）；カルバメートエステル（米国特許第5,480,988号）；カルバメートエステル（米国特許第5,480,989号）；カルバメートエステル（米国特許第5,489,680号）；ヒンダードN-オキシドエステル（米国特許第5,491,231号）；ビオチンエステル（米国特許第5,504,091号）；O-アルキルエーテル（米国特許第5,665,772号）；及びラパマイシンのPEGエステル（米国特許第5,780,462号）がある。これらのエステル及びエーテルの調製は上記の特許に開示されている。ラパマイシンンの27-エステル及びエーテルは、引用をもってその全文をここに援用することとする米国特許第5,256,790号に開示されている。ラパマイシンのオキシマー、ヒドラゾン、及びヒドロキシルアミンは、引用をもってその全文をここに援用することとする米国特許第5,373,014号、第5,378,836号、第5,023,264号、及び第5,563,145号に開示されている。これらのオキシマー、ヒドラゾン、及びヒドロキシルアミンの調製は前述の特許に開示されている。42-オキソラパマイシンの調製は、引用をもってその全文をここに援用することとする米国特許第5,023,263号に開示されている。
【０１７０】
他のmTOR阻害剤には、PI-103、XL765、Torin1、PP242、PP30、NVP-BEZ235、及びOSI-027号がある。付加的なmTOR阻害剤には、LY294002及びウォーツマニンがある。mTORの他の阻害剤は、引用をもってその内容全体をここに援用することとする米国特許第7,504,397号及び第7,659,274号、並びに特許公報US20090304692A1；US20090099174A1、US20060199803A1、WO2008148074A3に解説されている。
【０１７１】
ある実施態様では、mTOR阻害剤（例えばラパマイシン又はそのバリアントもしくは誘導体）を一種以上のスタチンと組み合わせて用いる。ある実施態様では、mTOR阻害剤（例えばラパマイシン又はそのバリアントもしくは誘導体）をTGFβ経路アゴニストと組み合わせて用いる
【０１７２】
ある例示的な実施態様では、本発明で用いられる寛容原性刺激は一種以上のTGFβアゴニストを含むか、又は一種以上のTGFβアゴニストから成る。本発明の実施に適したTGFβアゴニストには、TGFβシグナル伝達によって誘導される応答を刺激又は増強する物質が含まれる。ある実施態様では、TGFβ経路アゴニストは、TGFβ受容体媒介性シグナル伝達を調節することにより、作用する。別の実施態様では、TGFβ経路アゴニストは、例えばTGFβ様活性を有する低分子など、TGFβミメティックである（例えばGlaser et al. 2002. Molecular
Cancer Therapeutics 1:759-768に記載されたビアリールヒドロキサメート、A-161906、又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばスピルコスタチンA及びB又はジヘテロペプチン）。
【０１７３】
例示的な実施態様では、本発明を実施するのに有用なTGFβ受容体アゴニストは、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、これらのバリアント、及びこれらの混合物を含め、TGFβである。付加的なTGFβアゴニストは、引用をもってその内容全体をここに援用することとする特許公報No.US20090143394A1に解説されている。
【０１７４】
特定の実施態様では、誘導寛容原性DCを生成するために、前述のTGFβアゴニストをmTOR阻害剤の存在下で用いる。
【０１７５】
３．  スタチン
スタチンは、肝臓内でコレステロールの生成で中心的な役割を果たす酵素HMG-CoAを阻害することにより、コレステロール・レベルを低下させるために用いられるクラスの薬物であるHMG-CoAレダクターゼ阻害剤である。スタチンの例にはアトルバスタチン（リピトール及びトルバスト）、フルバスタチン（レスコール）、ロバスタチン（メバコール、アルトコール、アルトプレブ）、ピタバスタチン（リバロ、ピタバ）、プラバスタチン（プロバコール、セレクチン、リポスタット）、ロスバスタチン（クレストール）、シンバスタチン（ゾコール、リペックス）がある。ある実施態様では、誘導寛容原性樹状細胞を生成するために少なくとも一種のスタチンを単独で用いる。別の実施態様では、少なくとも一種のスタチンを、mTOR阻害剤と組み合わせて用いる。
【０１７６】
４．  プリン性受容体経路アンタゴニスト
ある例示的な実施態様では、本発明で用いる寛容原性刺激は一種以上のプリン性アゴニスト含むか、又は一種以上のプリン性アゴニストから成る。本発明を実施するのに適したプリン性受容体経路アンタゴニストには、プリン性受容体活性又はプリン性受容体シグナル伝達の阻害剤又はアンタゴニストが含まれる。具体的なプリン性受容体アンタゴニストには、プリン性受容体P1、P2X、P2X7、及び／又はP2Yの活性、又はこれらを通じたシグナル伝達を阻害する化合物が含まれる。これらの受容体は細胞外アデノシン三リン酸（ATP）に結合する。ある実施態様では、本発明を実施するために有用なプリン性受容体アンタゴニストは酸化ATP（oATP）である。
【０１７７】
他の実施態様では、本発明を実施するために有用なプリン性受容体アンタゴニストには、引用をもってその内容全体をここに援用することとする以下の米国特許：US7235549、US7214677、US7553972、US7241776、US7186742、US7176202、US6974812、US7071223、及びUS7407956に記載された化合物の一つ以上が含まれる。他の実施態様では、本発明を実施するために有用なプリン性受容体アンタゴニストには、引用をもってその内容全体をここに援用することとする以下の特許公報：WO2010018280A1、WO2008142194A1、WO2009074519A1、WO2008138876A1、WO2008119825A3、WO2008119825A2、WO2008125600A3、WO2008125600A2、WO06083214A1、WO03047515A3、WO03047515A2、WO03042191A1、WO2008119685A3、WO2008119685A2、WO06003517A1、WO04105798A1、WO2008116814A1、WO2007056046A1、WO2009132000A1、WO2009077559A3、WO2009077559A2、WO2009074518A1、WO2008003697A1、WO2007056091A3、WO2007056091A2、WO06136004A1、WO05111003A1、WO05019182A1、WO04105796A1、WO04073704A1、WO2009077362A1、US20070032465A1、WO2009053459A1、US20080009541A1、WO2007008157A1、WO2007008155A1、US20070105842A1、WO06017406A1、US20060058302A1、US20060018904A1、WO05025571A1、WO04105797A1、WO04099146A1、WO04058731A1、WO04058270A1、US20030186981A1、WO2009057827A1、US20080171733A1、WO2007002139C1、WO2007115192A3、WO2007115192A2、WO2007002139A3、WO2007002139A2、US20070259920A1、US20070049584A1、WO06086229A1、US20060247257A1、US20060052374A1、WO05014555A1、US20090220516A1、US20090042886A1、US20080207577A1、US20070281939A1、US20070281931A1、US20070249666A1、US20070232686A1、US20070142329A1、US20070122849A1、US20070082930A1、US20070010497A1、US20060217430A1、US20060211739A1、US20060040939A1、US20060025614A1、US20050009900A1、及び US20040180894A1に記載された化合物の一つ以上が含まれる。
【０１７８】
具体的な実施態様では、本発明を実施するために有用なプリン性受容体アンタゴニストには、oATP、スラニム、クロピドグレル、プラスグレル、チクロピジン、チカグレロル、A740003、A438079、ピリドキサールホスフェート-6-アゾフェニル-2′,4′-ジスルホン酸 (PPADS)、ピリドキサール 5′-ホスフェート (P5P)、ペルイオデート-酸化ATP、5-(N,N-ヘキサメチレン)アミロリド(HMA)、KN62 (1-[N,O-ビス(5-イソキノリンスルホニル)-N-メチル-l-チロシル]-4-フェニルピペラジン)、スラミン、2.クロロ-5-[[2-(2-ヒドロキシ-エチルアミノ)-エチルアミノ]-メチル]-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ-1-イルメチル)-ベンズアミド、2.クロロ-5-[3-[(3-ヒドロキシプロピル)アミノ]プロピル]-N-(トリシクロ[3.3.1.1]デカ-1-イルメチル)-ベンズアミド、(R)-2-クロロ-5-[3-[(2-ヒドロキシ-1-メチルエチル)アミノ]プロピル]-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ-1-イルメチル)-ベンズアミド、2.クロロ-5-[[2-[(2-ヒドロキシエチル)アミノ]エトキシ]メチル]-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ-1-イルメチル)-ベンズアミド、2.クロロ-5-[3-[3-(メチルアミノ)プロポキシ]プロピル]-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ-1-イルメチル)ベンズアミド、2.クロロ-5-[3-(3-ヒドロキシ-プロピルアミノ)-プロポキシ]-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ-1-イルメチル)-ベンズアミド、2.クロロ-5-[2-(3-ヒドロキシプロピルアミノ)エチルアミノ]-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ-1-イルメチル)-ベンズアミド、2.クロロ-5-[2-(3-ヒドロキシプロピルスルホニル)エトキシ]-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ-1-イルメチル)-ベンズアミド、2.クロロ-5-[2-[2-[(2-ヒドロキシエチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ-1-イルメチル)-ベンズアミド、2.クロロ-5-[[2-[[2-(1-メチル-1H-イミダゾール-4-イル)エチル]アミノ]エチル]アミノ]-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ-1-イルメチル)-ベンズアミド、2.クロロ-5-ピペラジン-1-イルメチル-N-(トリシクロ[3.3.1.1]デカ-1-イルメチル)-ベンズアミド、2.クロロ-5-(4-ピペリジニルオキシ)-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ-1-イルメチル)-ベンズアミド、2.クロロ-5-(2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプト-2-イルメチル)-N-(トリシクロ[3.3.1.1]デカ-1-イルメチル)-ベンズアミド、2.クロロ-5-(ピペリジン-4-イルスルフィニル)-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ-1-イルメチル)-ベンズアミド、5.クロロ-2-[3-[(3-ヒドロキシプロピル)アミノ]プロピル]-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ-1-イルメチル)-4-ピペリジンカルボキサミド、5.クロロ-2-[3-(エチルアミノ)プロピル]-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ-1-イルメチル)-4-ピリジンカルボキサミド、5.クロロ-2-[3-[(2-ヒドロキシエチル)アミノ]プロピル]-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ1-イルメチル)-4-ピリジンカルボキサミド、5.クロロ-2-[3-[[(2S)-2-ヒドロキシプロピル]アミノ]プロピル]-N-(トリシクロ[3.3.1.13,7]デカ-1-イルメチル)-4-ピリジンカルボキサミド、N-[2-メチル-5-(9-オキサ-3,7-ジアザビシクロ[3.3.1]ノ-3-イルカルボニル)フェニル]-トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン-1-アセトアミド、又はこれらの組合せがある。
【０１７９】
５．  電子輸送を中断させる他の作用物質
他の実施態様では、電子輸送を中断させる作用物質を用いて誘導寛容原性を樹状細胞で誘導することができる。このような作用物質には、例えばレテノン、アンチマイシンA、及びオリゴマイシンがある。
【０１８０】
６．  作用物質の組合せ
別の例示的な実施態様では、寛容原性刺激は、例えば作用物質のカクテル、例えば上述した作用物質のうちの二種以上など、作用物質の組合せを含むか、又は作用物質の組合せから成る。例示的な寛容原性刺激には、誘導寛容原性樹状細胞を生成するために使用することのできる少なくとも一種のレスピロスタティック又は寛容原性固定作用物質が含まれる。ある実施態様では、ある実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はmTOR阻害剤及びTGFβアゴニストを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はmTOR阻害剤及びスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はmTOR阻害剤、TGFβアゴニスト及びスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニストを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニスト及びスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニスト及びmTOR阻害剤を含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤及びTGFβアゴニストを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質はプリン性受容体アンタゴニスト、mTOR阻害剤、TGFβアゴニスト、及びスタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は、DCにおけるミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質を含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は、DCにおけるミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤を含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は、DCにおけるミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、スタチンを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は、DCにおけるミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストを含む。別の実施態様では、前記少なくとも一種の作用物質は、DCにおけるミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質と、mTOR阻害剤と、TGFβアゴニストとスタチンを含む。
【０１８１】
別の例示的な実施態様では、寛容原性刺激を、ｉ）mTOR阻害剤（例えばラパマイシン又はそのバリアントもしくは誘導体）；TGFβアゴニスト（例えばTGFβ）；ｉｉ）スタチン；mTOR阻害剤（例えばラパマイシン又はそのバリアントもしくは誘導体）、TGFβアゴニスト（例えばTGFβ）、及びスタチン；ｉｖ）プリン性受容体アンタゴニスト（例えばoATP）；及びｖ）DCにおけるミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質（例えばロテノン）から成る群より選択される作用物質の組合せを含むか、又は同組合せから成る。
【０１８２】
７．  寛容原性刺激の濃度
誘導寛容原性細胞を生成するための寛容原性刺激の代表的な濃度は、培養細胞の開始集団に対する刺激の力価測定と、ex vivoにおける誘導細胞の表現型検査とにより、当業者であれば容易に判定することができる。ある実施態様では、樹状細胞において酸素消費速度に対して所望の効果（即ち、速度に変化がないか、又は速度に低下がある）を有する作用物質濃度を選択する。別の実施態様では、Treg細胞の誘導に対して所望の効果を有する作用物質濃度を選択する。例示的な実施態様では、寛容原性刺激を、例えば1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は 1000 pM、約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は 1000 nM、約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は 1000μM、又は約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 mM、及びこれらの範囲など、1pM乃至10mMの濃度で用いる。別の実施態様では、寛容原性刺激を、例えば1 pg/mL、10 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、300 pg/mL、400 pg/mL、500 pg/mL、600 pg/mL、700 pg/mL、800 pg/mL、900 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL、500 ng/mL、600 ng/mL、700 ng/mL、800 ng/mL、900 ng/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、又は10 mg/mL、及びこれらの範囲、1
pg/mL 及び10 mg/mLの範囲で用いる。
【０１８３】
いくつかの実施態様では、mTOR阻害剤（例えばラパマイシン又はその誘導体もしくはバリアント）を寛容原性刺激として、例えば1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 pM、約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 nM、約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000μM、又は約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 mM、及びこれらの範囲など、1pM乃至10mMの濃度で用いる。例示的な実施態様では、ラパマイシンなどのmTOR阻害剤を1μMの濃度で用いる。他の実施態様では、mTOR阻害剤（例えばラパマイシン又はその誘導体もしくはバリアント）を、例えば1 pg/mL、10 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、300 pg/mL、400 pg/mL、500 pg/mL、600 pg/mL、700 pg/mL、800 pg/mL、900 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL、500 ng/mL、600 ng/mL、700 ng/mL、800 ng/mL、900 ng/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、又は10 mg/mL及びこれらの範囲の濃度で用いる。
【０１８４】
いくつかの実施態様では、一種以上のスタチンを寛容原性刺激として、例えば1 pg/mL、10 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、300 pg/mL、400 pg/mL、500 pg/mL、600 pg/mL、700 pg/mL、800 pg/mL、900 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL、500 ng/mL、600 ng/mL、700 ng/mL、800 ng/mL、900 ng/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、又は10 mg/mL、及びこれらの範囲など、1 pg/mL 及び10 mg/mL の濃度で用いる。別の実施態様では、スタチンを、例えば1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 pM、約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 nM、約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000μM、あるいは約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 mM、及びこれらの範囲など、1 pM 乃至10 mM の濃度で用いる。ある例示的な実施態様では、スタチンを約 10、30、50、75、100、又は300 uMの濃度で用いる。
【０１８５】
いくつかの実施態様では、TGFβアゴニストを寛容原性刺激として、例えば1 pg/mL、10 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、300 pg/mL、400 pg/mL、500 pg/mL、600 pg/mL、700 pg/mL、800 pg/mL、900 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/ml、30 ng/ml、50 ng/ml、75 ng/ml、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL、500 ng/mL、600 ng/mL、700 ng/mL、800 ng/mL、900 ng/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、10 mg/mL及びこれらの範囲など、1
pg/mL 及び10 mg/mLの濃度で用いる。 例示的な実施態様では、TGFβを寛容原性刺激として20
ng/mLの濃度で用いる。
【０１８６】
いくつかの実施態様では、プリン性受容体アンタゴニスト（例えばoATP）を寛容性刺激として、例えば1
pg/mL、10 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、300 pg/mL、400 pg/mL、500 pg/mL、600 pg/mL、700 pg/mL、800 pg/mL、900 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL、500 ng/mL、600 ng/mL、700 ng/mL、800 ng/mL、900 ng/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、又は10 mg/mL、及びこれらの範囲など、1 pg/mL及び10 mg/mLの濃度で用いる。別の実施態様では、プリン性受容体アンタゴニストを、例えば1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 pM、約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 nM、約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000μM、又は約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 mM、及びこれらの範囲など、1 pM 乃至10 mMの濃度で用いる。例示的な実施態様では、oATPを寛容原性刺激として
100 uM-1 mMの濃度で用いる。
【０１８７】
ミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質を寛容原性刺激として、例えば1 pg/mL、10 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、300 pg/mL、400 pg/mL、500 pg/mL、600 pg/mL、700 pg/mL、800 pg/mL、900 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL、500 ng/mL、600 ng/mL、700 ng/mL、800 ng/mL、900 ng/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、又は10 mg/mL、及びこれらの範囲など、1 pg/mL及び10 mg/mLの濃度で用いる。別の実施態様では、ミトコンドリア電子輸送を中断させる作用物質を寛容原性刺激として、例えば1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 pM、約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 nM、約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000μM、又は約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 mM、及びこれらの範囲など、1 pM 乃至10 mMの濃度で用いる。
【０１８８】
ある実施態様では、作用物質の組合せを用いる場合、それぞれの濃度を減らしてもよい。
【０１８９】
８．  暴露のタイミング
一般的には、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団の、少なくとも一種の寛容原性刺激への暴露は、例えば寛容原性表現型で実証したときなどに、誘導寛容原性樹状細胞が生成されるのに充分な時間、行われる。ある実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも１時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも２時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも３時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも４時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも５時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも６時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも７時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも８時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも８時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも９時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも１０時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも１１時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも１２時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも１３時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも１４時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも１５時間、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容性刺激に少なくとも１６時間、接触させる。
【０１９０】
別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容原性刺激に、例えば２乃至４８時間、３乃至２４時間、４乃至１６時間、５乃至１２時間、４乃至１０時間、５乃至８時間など、１乃至７２時間、接触させる。
【０１９１】
別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容原性刺激に少なくとも１時間、そして１０時間未満、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容原性刺激に少なくとも２時間、そして１０時間未満、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容原性刺激に少なくとも３時間、そして１０時間未満、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容原性刺激に少なくとも４時間、そして１０時間未満、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容原性刺激に少なくとも５時間、そして１０時間未満、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容原性刺激に少なくとも６時間、そして１０時間未満、接触させる。別の実施態様では、細胞を少なくとも一種の寛容原性刺激に少なくとも７時間、そして１０時間未満、接触させる。当業でこれまで教示又は示唆されたよりも短いインキュベーション時間を用いたこの実施態様は、付属の請求項の全てではなく、いくつかで用いられた。ある実施態様では、このような短いインキュベーション時間は、完全に分化した樹状細胞を含む、又は完全に分化した樹状細胞を濃縮した開始細胞集団（即ち、樹状細胞前駆細胞を処置して分化させた細胞集団）の処置に用いられる。ある実施態様では、このような短いインキュベーション時間は、このような短いインキュベーション時間は、樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団（即ち、樹状細胞前駆細胞を未処置のままとし、分化させていない細胞集団）の処置に用いられる。ある実施態様では、短いインキュベーション時間は生存細胞の収率を向上させ、mTor阻害剤（例えばラパマイシン及びそのバリアントもしくは誘導体）のみによる細胞の処置に用いることができる。加えて、これらの短いインキュベーション時間を用いて、例えばレスピロスタティック又は寛容原性固定作用剤などを用いて寛容原性樹状細胞を生成させることができる。
【０１９２】
Ｖ．  誘導免疫原性樹状細胞
ある実施態様では、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を、集団中のDCを誘導してより免疫原性にする一種以上の作用物質に接触させる。免疫原性刺激によって処置すると、DCはTeff細胞の活性化を増すことができるようになる。DCが、エフェクターT細胞の機能を上方調節する能力はまた、免疫原性DCの一集団を、例えば以下に論じるように、感染を有する、又は癌を有する、ワクチン処置中の対象などの対象に投与することができる方法も提供する。
【０１９３】
ある実施態様では、誘導免疫原性樹状細胞の機能的表現型を検査して、それらがTエフェクター細胞応答を亢進することができることを、更なる操作前に確認することができる。別の実施態様では、TLRアゴニストが、DCにおけるミトコンドリア活性化を増す能力を、誘導免疫原性樹状細胞の更なる操作前に、検査することができる。誘導寛容原性樹状細胞とは対照的に、誘導免疫原性樹状細胞は、一種以上のTLRアゴニストによる刺激時に、ミトコンドリア活性化の一過性の増加を示す。
【０１９４】
上述したように、ある実施態様では、酸素消費をミトコンドリア活性化の読み取り値として用いることができる。酸素消費速度（OCR）は、例えばシーホースXF24フラックス分析器又はクラーク電極などの分析器を用いるなど、当業で公知の方法を用いて測定することができる。
【０１９５】
別の実施態様では、ミトコンドリア活性化の代替的読み取り値を測定することができる。例えば糖取り込み（例えば誘導体化グルコースを用いて）又は反応性酸素種の存在（例えばDCF-DA）である。別の実施態様では、（解糖の増加及び／又はミトコンドリア活性の低下で上昇する）乳酸生成を測定することができる。ある実施態様では、細胞外酸性化速度（ECAR）を測定することができ、解凍又はピルビン酸回路の負荷による乳酸生成の反映とする。シーホースSF24フラックス分析器をこの目的のために用いることができる。更に別の実施態様では、細胞内ATP/ADP比を（例えば市販のキットを用いるか、あるいは、Nagel et al. 2010. Method Mol. Biol. 645:123-31にあるように）測定してもよい。ATPのレベル上昇及びADPのレベル低下が増殖性細胞で認識されており、活性化の尺度である。
【０１９６】
別の実施態様では、ミトコンドリア活性化のマーカーである遺伝子の発現レベルを測定することができる。例えばある実施態様では、例えばエストロゲン関連受容体α、NRF-1、NRF-2、Sp1、YY1、CREB及びMEF-2/Eボックス因子など、ミトコンドリア機能に関与するPGC-1a、PGC-1b、PRC、又は他の分子のうちの一つ以上の発現のmRNAレベルを測定することができる。上述したように、ある実施態様では、このような遺伝子又はその一部分の調節領域をレポータ遺伝子に作動可能に連結して測定を容易にしてもよい。
【０１９７】
ＶＩ．  誘導免疫原性樹状細胞のex vivo生成
本発明の誘導免疫原性樹状細胞は、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を少なくとも一種の免疫原性刺激に、例えば以下に詳述するように接触させることにより、生成される。
【０１９８】
免疫原性刺激
ここで用いられる用語「免疫原性刺激」には、単独又は組み合わせたときに、樹状細胞がエフェクターT細胞応答を亢進する能力を向上又は高める物質が含まれる。ある実施態様では、誘導免疫原性樹状細胞は、ある細胞集団中の抗原特異的Teff細胞の比率及び／又は活性を増加させる。免疫原性刺激の例には、（例えば酸素消費で測定したときに）ミトコンドリア活性化を増す、又は、ミトコンドリア内の電子輸送を脱共役させる、作用物質が含まれる。このような作用物質の例には、例えば単独又は別のTLRアゴニスト又は成熟刺激と組み合わせた、少なくとも一種のToll様受容体アゴニストが含まれる。一種以上の免疫原性刺激による処置後、細胞を、更なる操作前に、例えば遠心分離及び／又は洗浄により、作用物質から取り除いてもよい。本発明の免疫原性刺激は、酸素消費速度の亢進で実証される、樹状細胞のミトコンドリア機能の急速な（及び一過性の）増加を誘導するものである。このような刺激の例を以下に述べる：
【０１９９】
Ｉ．  Toll様受容体アゴニスト
ある実施態様では、TLRアゴニストは当業で公知である。別の実施態様では、TLRアゴニストは、目的のTLRによって媒介されるいくつかの生物学的活性の少なくとも閾値増加を引き起こす化合物を同定するスクリーニング検定を行うことによって、同定することができる。反対に、TLRによって媒介される生物学的活性を検出するようにデザインされた検定を行うのに用いられる場合には、当該化合物が生物学的活性の閾値増加を惹起できない場合に、TLRのアゴニストとして作用しないとして、ある化合物を同定できよう。生物学的活性の増加とは、適したコントロールで観察されるものに比べたときの、同じ生物学的活性の増加を言う。
【０２００】
ある実施態様では、TLR4のアゴニストを含む組成物を用いて免疫原性樹状細胞を誘導することができる。このようなアゴニストの例には、リポ多糖又はその合成バリアント（例えばMPL及びRC529）及び脂質Ａ又はその合成バリアント（例えばアミノアルキルグルコサミニド4-ホスフェート）がある。例えばCluff
et al. 2005 Infection and Immunity, p. 3044-3052:73; Lembo et al. The Journal of Immunology, 2008, 180, 7574-7581; Evans et al. 2003.
Expert Rev Vaccines 2:219-29を参照されたい。
【０２０１】
ある実施態様では、TLR3のアゴニストを含む組成物を用いて免疫原性樹状細胞を誘導することができる。このようなアゴニストの例は、一本鎖もしくは二本鎖RNA分子、これらの混合物、polyI:C、又はその誘導体、例えばpolyI:Cpolyアルギニン、又はポリアデニリル-ポリウリジル酸、即ちpoly(A):poly(U)、polyAU又はpolyA:Uなど、を含む核酸ベースの分子である。ここで言う核酸は、天然であっても、又は合成であってもよく、また、例えばKandimalla et al. ((2003) Nucl. Acid. Res.
31(9):2393-2400)にあるように天然ヌクレオチドの誘導体又は類似体であってもよい。
【０２０２】
好適なアゴニストは二本鎖RNAである。用語「二本鎖RNA」分子とは、治療上又は予防上有効な（合成の）二本鎖RNA化合物を指す。dsRNA
TLR3アゴニストはいずれの適した長さをも有することができる。好適には、dsRNA分子TLR3アゴニストは、少なくとも約10塩基対（bp）、20
bp、30 bp、50 bp、80 bp、100 bp、200 bp、400 bp、600 bp、800 bp 又は 1000 bpを有するとよい。ある局面では、dsRNA 分子は、30 bp、50 bp、80 bp、100 bp 又は 200 bp未満の鎖長を有する短いdsRNAである。別の実施態様では、dsRNA 分子は400 bp、600 bp、800 bp 又は 1000 bp未満の鎖長を有するより長いdsRNAである。別の実施態様では、sRNA 分子は1000 bpを超える鎖長を有する長いdsRNAである。ある局面では、dsRNA組成物は、複数の分子が異なる長さを有するようなdsRNA分子の異種の混合物を含む。好ましくは、dsRNA分子は少なくとも約10 bp、20 bp、30 bp、50 bp、80 bp、100 bp、200 bp、400 bp、600 bp、800 bp 又は1000 bpの平均的長さを有するとよい。別の実施態様では、dsRNA組成物は、dsRNA分子の少なくとも20%、50%、80%、90% 又は98% が少なくとも約10 bp、20 bp、30 bp、50 bp、80 bp、100 bp、200 bp、400 bp、600 bp、800 bp 又は1000 bpの長さを有するような複数のdsRNA分子を含む。ある好適な実施態様では、dsRNA組成物は、実質的に全ての分子が30 bp、50 bp、80 bp、100 bp 又は 200 bpを超えて鎖長が異ならないような実質的に同種のdsRNA分子の混合物を有する。
【０２０３】
このようなdsRNAの好適な例はホモpolyRNA、即ち、核鎖が基本的に同じ塩基の反復を含む；又は、ホモpolyRNA領域を含むようなdsRNA、である。塩基はいずれの天然発生型の塩基（例えばpolyA、polyU、polyC、polyG）又は非天然発生型（例えば化学合成又は修飾された）塩基（例えばpolyI）でもよい。ポリイノシン酸--ポリシチジル酸、即ちpoly(I):poly(C)又はpolyI:C及びポリアデニル酸-ポリウリジル酸、即ちpoly(A):poly(U)又はpolyA:Uは当業で公知であり、免疫細胞によるインターフェロン産生を誘導することが知られている。このように、ある実施態様では、本発明での使用に向くTLR3アゴニストは、ポリイノシン酸及びポリシチジル酸、ポリアデニル酸及びポリウリジル酸、ポリイノシン酸類似体及びポリシチジル酸、ポリイノシン酸及びポリシチジル酸類似体、ポリイノシン酸類似体及びポリシチジル酸類似体、ポリアデニル酸類似体及びポリウリジル酸、ポリアデニル酸及びポリウリジル酸類似体、並びにポリアデニル酸類似体及びポリウリジル酸類似体から成る群より選択される二本鎖核酸である。
【０２０４】
dsRNAの他の例には、米国特許第5,298,614号及び第6,780,429号に記載された核酸がある。これらの引例のそれぞれの開示を引用をもってここに援用することとする。TLR3アゴニストとして用いるのに適しているであろう他の核酸アゴニストは：Field et al.: Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 58, 1004, (1967); Field et
al.: Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 58, 2102, (1967); Field et al.: Proc. Nat.
Acad. Sci. U.S. 61, 340, (1968); Tytell et al.: Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 58,
1719, (1967); Field et al.: J. Gen. Physiol. 56, 905 (1970); De Clercq et al.:
Methods in Enzymology, 78, 291 (1981)に提供されている。ホモポリマー-ホモポリマー錯体を含む、数多くの合成核酸誘導体が解説されてきた（例えば poly I:C 又は poly A:U が親構造であるようなものなど、二本鎖核酸ポリマーであり、この場合これらのホモポリマー-ホモポリマー錯体は：（１）ポリイノシン酸-ポリ（5-ブロモシチジル酸）、ポリイノシン酸-ポリ（2-チオシチジル酸）、ポリ（7-デアザイノシン酸）-ポリシチジル酸、ポリ（7-デアザイノシン酸）-ポリ（5-ブロモシチジル酸）、及びポリイノシン酸-ポリ（5-チオウリジル酸）を例とする塩基修飾；（２）ポリ（2'-アジドイノシン酸）-ポリシチジル酸を例とする糖修飾；及び（３）ポリイノシン酸-ポリ（シチジル-5'-チオリン酸を含有する）を例とするリン酸修飾）である。解説されてきた他の合成核酸誘導体には、ポリ（アデニル酸-ウリジン酸）を例とする交換コポリマー；並びにポリイノシン酸-ポリ（シチジル酸-ウリジル酸）及びポリイノシン酸-ポリ（シチジル酸-4-チオウリジル酸）を例とするホモポリマー-コポリマー錯体がある。解説されてきた他の合成核酸誘導体には、ポリイノシン酸-ポリシチジル酸-ポリ-L-リジンカルボキシ-メチルセルロース錯体（「Poly ICLC」と呼ばれる）を例とする、合成核酸とポリカチオンとの錯体がある。合成核酸誘導体の更に別の例はポリイノシン酸-ポリ（1-ビニルシトシン）である。
【０２０５】
TLR3アゴニストの更に別の例は、
rIn: r (Cx, U 又は G)n
（式中、x は4乃至29の数値を有する、例えば
rIn: r (C12 U)nなど）などのポリリボイノシン酸及びポリリボシチジル酸／ウリジン酸の錯体によって形成されるdsRNAであるアンプリゲン（登録商標） （米国メリーランド州、ロックビルのHemispherx社）である。アンプリゲンに同様な挙動をする数多くのミスマッチdsRNAポリマーが研究されてきた；poly I: Cに基づくミスマッチdsRNA
は、ウラシル塩基又はグアニン塩基のうち、例えばこのような塩基の５のうち１つ乃至３０のうち１つなど、一部分を含有するポリイノシン酸及びポリシチジル酸の錯体が含まれている。他の形の天然及び／又は合成dsRNAに比較したときのミスマッチdsRNAの鍵となる治療上の利点は、Lampson
氏らが米国特許第 3,666,646号で解説したものなどの化合物に比べて報告された毒性低下である。
【０２０６】
二本鎖RNAの具体的な例には更に、ポリアデナール（Ipsen社）及びアンプリゲン（Hemispherx社）がある。ポリアデナールはpolyA/U RNA分子であり、即ち、polyA
鎖及びpolyU鎖を含有する。ポリアデナールはＢ型肝炎ウィルス（HBV）感染の強力な処置のために開発された。アンプリゲンはpolyI/polyC 化合物（又はpolyI/polyC12U RNA 分子を含むそのバリアント）である。アンプリゲンは例えばEP 281 380 又は EP 113 162に開示されている。アンプリゲンは癌、ウィルス感染及び免疫障害の処置について提案されてきた。それは主に筋痛脳脊髄炎（ME、又は慢性疲労症候群／慢性疲労免疫不全症候群、CFS/CFIDS)の強力な処置のために開発された。
【０２０７】
TLR3アゴニストはまた、例えば脂質、ペプチド、ポリペプチド、低分子等の有機又は無機物質であってもよく、単離されていても、他の物質との混合物中にあってもよい。TLR3アゴニスト候補は、例えば生成物のコンビナトリアル・ライブラリから選択できよう。ある好適な実施態様では、TLR3アゴニストは、TLR3受容体に対する抗体であり、TLR3受容体を活性化して全体的又は部分的受容体媒介性応答を誘導することができる。またTLR3アゴニストは、TLR3受容体に対する抗体の抗体フラグメント又は誘導体であって、TLR3受容体を活性化して全体的又は部分的受容体媒介性応答を誘導できるものでもよい。
【０２０８】
ある実施態様では、TLR9のアゴニストを含む組成物を用いて免疫原性樹状細胞を誘導することができる。このようなアゴニストに例にはCpGオリゴでオキシヌクレオチド
(ODN)（例えば米国特許第6,194,388号）がある。ここで用いられる場合の「CpG モチーフ」は、非メチル化シトシン-グアニン (CpG)ジヌクレオチドとして定義しておく。
【０２０９】
数多くの免疫刺激性ヌクレオチド配列が当業で解説されており、例えばサイトカイン分泌、抗体産生、NK細胞活性化及びT細胞増殖など、多様な局面の免疫応答を示す標準的な検定法を用いて容易に同定されよう。例えば米国特許第6,194,388号及び第6,207,646号；WO
98/52962；WO 98/55495；WO 97/28259；WO 99/11275；Krieg et al., 1995,
Nature 374:546-549; Yamamoto et al., 1992 J. Immunol. 148:4072-4076; Ballas et al.,
1996, J. Immunol. 157(5) 1840-1845; Klinman et al., 1997, PNAS
93(7):2879-83; Shimada et al., 1986, Jpn. J. Cancer Res. 77:808-816; Cowdery et
al., 1996, J. Immunol. 156:4570-75; Hartmann et al., 2000, J.
Immunol. 164(3):1617-24を参照されたい。
【０２１０】
免疫刺激性ヌクレオチド配列は多様な長さのものでよいが、６塩基又は塩基対を超える長さが好ましい。免疫刺激性ヌクレオチド配列は、例えば3' OH 又は5' OH 基の修飾、ヌクレオチド塩基の修飾、糖成分の修飾、及びリン酸環の修飾など、修飾を含むことができる。免疫刺激性ヌクレオチド配列は一本鎖又は二本鎖DNAでよく、また一本鎖もしくは二本鎖RNA又は他の修飾ポリヌクレオチドでもよい。免疫刺激性ヌクレオチド配列は一つ以上の反復性領域を含んでも、又は含まなくともよい。
【０２１１】
免疫刺激性ヌクレオチド配列は従来のポリヌクレオチド単離法を用いて単離することができ、あるいは、限定はしないが、酵素法、化学法及びより大きなオリゴヌクレオチド配列の分解を含め、当業で公知の技術及び核酸合成装置を用いて合成することもできる。（例えば Ausubel et al.,
1987 and Sambrook et al., 1989を参照されたい）。
【０２１２】
本発明の方法において有用な免疫刺激性ヌクレオチド配列の例には、限定はしないが、各々を引用をもってここに援用することとする米国特許第6,218,371号；米国特許第 6,194,388号；米国特許第6,207,646号；米国特許第6,239,116 号及びＰＣＴ公報 No.
WO 00/06588（アイオワ大学）；ＰＣＴ公報 No. WO 01/62909；ＰＣＴ公報 No. WO 01/62910; ＰＣＴ公報 No. WO 01/12223; ＰＣＴ公報 No. WO 98/55495；及びＰＣＴ公報No. WO 99/62923（Dynavax
Technologies Corporation社）に開示されたものがある。
【０２１３】
米国特許第6,194,388 号（アイオワ大学）は、少なくとも以下の式： 5'X1X2CGX3X43'
（式中、C 及びG はメチル化しておらず、式中、X1X2 は GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT、及びTpG、から成る群より選択されるジヌクレオチドであり、そして X3X4 は、 TpT、CpT、ApT、TpG、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA 及び CpAから成る群より選択されるジヌクレオチドであり、そして式中、少なくとも一つのヌクレオチドはリン酸骨格修飾を有する）を含むオリゴヌクレオチド配列を含む免疫刺激性核酸を開示している。細胞内への取り込みを容易にためには免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含有する CpG は、８乃至４０塩基対の大きさであることが記載されている。この式の範囲内にある免疫刺激性オリゴヌクレオチドは本請求項記載の方法において有用であろう。
【０２１４】
WO 99/62923は、本発明に関係して用いてもよい免疫刺激性ヌクレオチド配列の更なる例を開示している。具体的には、C-5及び／又はC-6を電子吸引部分に添加する修飾がCG残基になされた中央CG配列を含む６量体配列又は６量体ヌクレオチドを含む修飾免疫刺激性ヌクレオチド配列が開示されている。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、in vivo分解に対してそれらを比較的に耐性にする構造修飾によって安定化させることができる。安定化する修飾の例には、ホスホロチオエート修飾（即ちリン酸の酸素のうちの少なくとも一つを硫黄に置換する）、非イオン性DNA類似体、例えばアルキル-及びアリール-ホスホネート（このとき荷電ホスホネート酸素はアルキル又はアリールで置換される）、ホスホジエステル及びアルキルホスホトリエステル（このとき荷電酸素部分はアルキル化されている）がある。例えばテトラエチレングリコール又はヘキサエチレングリコールなど、いずれか一端又は両端にジオールを含有するオリゴヌクレオチドも、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性であることが示されている（米国特許第 No. 6,194,388 号（アイオワ大学））。
【０２１５】
更に免疫刺激性ヌクレオチド配列を送達複合体に被包又は結合してもよく、そうすることにより、標的細胞表面への結合親和性が高くなる、及び／又は、標的細胞による細胞内取り込みが増す。免疫刺激性ヌクレオチド配列送達複合体の例には、ステロール（例えばコレステロール）、脂質（例えば陽イオン性脂質、ビロゾーム又はリポソーム）、又は標的細胞特異的結合剤（例えば標的細胞特異的受容体によって認識されるリガンド）との結合が含まれる。好適な複合体は、標的細胞による内部移行前の著しい離脱を防ぐために、in vivoで充分に安定でなくてはならない。しかしながら、前記複合体は、オリゴヌクレオチドが機能的な形で遊離するように、細胞内で適した条件下で開裂しなければならない（米国特許第 6,194,388号；WO 99/62923）。
【０２１６】
ある特に好適な実施態様では、TLRアゴニストは、Hemmi
et al., 2000, Nature 408: 740-745 及びBauer et al., 2001,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9237-9242に記載されたものなどのTLR9のアゴニストである。TLR-9で知られているリガンドは、今日までのところ、マウス（TCCATGACGTTCCTGATGCT) (SEQ ID NO: 5) ではCpG 1668、そしてヒトでは CpG 2006 (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT) (SEQ ID
NO: 1)などのCpGモチーフを含有する非メチル化オリゴヌクレオチド配列である (Bauer et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 98: 9237-9242)。TLR9の更なるアゴニストを以下に挙げる：
CpG
2006: TCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 1) 
CPG
2216: GGGGGACGATCGTCGGGGGG (SEQ ID NO: 2) 
AAC-30:
ACCGATAACGTTGCCGGTGACGGCACCACG (SEQ ID NO: 3) 
GAC-30:
ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACG (SEQ ID NO: 4) 
【０２１７】
２．  ミトコンドリアを離脱させて最大のミトコンドリア呼吸を誘導する作用物質。
エネルギー基質の酸化がミトコンドリア内で起きると、内側のミトコンドリア膜全体でプロトン勾配が生じ、このプロトン勾配が F0F1-ATPase
で用いられて ATPがADPから再合成される。このように、酸素消費はATP合成に共役している（ミトコンドリア共役）。プロトンがミトコンドリアの内側膜を通って循環するときにATP合成酵素を迂回するとATPの代わりに熱が生じる（ミトコンドリア脱共役）。脱共役剤の例には、2,4-ジニトロフェノール(DNP)、C6H4N2O5
及びカルボニルシアニドP-(トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン (FCCP)がある。
【０２１８】
３．  作用物質の組合せ
別の例示的な実施態様では、免疫原性刺激は、例えば作用物質のカクテルなど、作用物質の組合せを含むか、又は作用物質の組合せから成る。ある実施態様では、このような作用物質の組合せは、少なくとも一種のtoll様受容体アゴニストを含む。ある実施態様では、このような作用物質の組合せは、二種以上のtoll様受容体アゴニストの組合せを含む。ある実施態様では、免疫原性樹状細胞の誘導の組成物は、異なるTLRをそれぞれが認識する少なくとも二種の作用物質を含む。ある実施態様では、免疫原性樹状細胞の誘導の組成物は、同じTLRをそれぞれが認識する少なくとも二種の作用物質を含む。
【０２１９】
４．  免疫原性刺激の濃度
誘導免疫原性樹状細胞のための免疫原性刺激の代表的濃度は、例えばそれらがエフェクターT細胞応答を亢進する能力によって判定するなど、誘導免疫原性樹状細胞を生成するのに必要な刺激量を力価測定することにより、当業者であれば容易に判断することができる。ある実施態様では、樹状細胞において酸素消費速度に対して所望の効果（即ち速度を増す）を有する作用物質濃度を選択する。別の実施態様では、誘導免疫原性樹状細胞の免疫原性表現型を促進する作用物質濃度を選択する。例示的な実施態様では、免疫原性刺激を例えば1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は 1000 pM、約1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は 1000 nM、約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は 1000μM、又は約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 mM、及びこれらの範囲など、1 pM 乃至10 mMの濃度で用いる。他の実施態様では、免疫原性刺激を、例えば1 pg/mL、10 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、300 pg/mL、400 pg/mL、500 pg/mL、600 pg/mL、700 pg/mL、800 pg/mL、900 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL、500 ng/mL、600 ng/mL、700 ng/mL、800 ng/mL、900 ng/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、又は 10 mg/mL及びこれらの範囲など、1
pg/mL 及び 10 mg/mLの濃度で用いる。
【０２２０】
ＶＩＩ．  抗原への選択的暴露
本発明の誘導寛容原性又は誘導免疫原性樹状細胞は、目的の抗原を内因的に発現してもよく（例えば抗原は、例えば自己タンパク質、ポリペプチド又はペプチドなどの生殖細胞系遺伝子産物などの内因的抗原であってもよい）、この場合、それらを更に修飾する必要はないであろう。例えば、ある実施態様では、アロ抗原への寛容が望まれる場合、寛容が望まれる相手であるアロ抗原を内因的に発現する誘導寛容原性DCは、目的の抗原を発現させるために操作する必要はないであろう。
【０２２１】
ある実施態様では、目的の抗原（例えば外因性抗原）に対する抗原特異的T細胞媒介性免疫応答を調節するために、目的の抗原をまだ発現していないためにT細胞によって認識され得ない樹状細胞を、目的の抗原を発現するにするか、あるいは、例えばこの樹状細胞が当該抗原をそれらの表面上にT細胞への提示に向けて表示する（例えばプロセッシング後又はMHCに直接結合させた後に）ように、当該抗原に浸す又は当該抗原と共に培養するなどにより、目的の抗原と接触させる。
【０２２２】
ある実施態様では、誘導樹状細胞を、例えば浸すか、又はパルシングすることにより、抗原と直接接触させることができる。別の実施態様では、当該細胞が抗原を発現するものでも、あるいは、抗原が発現してDC表面上にMHC分子の文脈で提示されるように、目的の抗原を命令する発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることにより、抗原を発現するように操作してもよい。
【０２２３】
従ってある実施態様では、寛容原性又は免疫原性刺激による処置前、処置中、及び／又は処置後に、細胞を抗原に暴露する。ある実施態様では、細胞を寛容原性又は免疫原性刺激で誘導する前に、細胞を抗原に暴露する。別の実施態様では、細胞を寛容原性又は免疫原性刺激で誘導した後に、細胞を抗原に暴露する。抗原は、数多くのタンパク質、ポリペプチド、及び／又はペプチド（例えばライセート又は抽出物）を含む粗製剤であっても、一種以上の精製済みタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含んでもよい。このようなタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、天然発生したものでも、化学合成したものでも、又は組換えにより発現させたものでもよい。
【０２２４】
例えば、ある実施態様では、例えば二種以上のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含むなど、異種である抗原にタンパク質を接触させる。ある実施態様では、このようなタンパク質抗原は細胞ライセート、抽出物又はたんぱく質の他の複合混合物である。別の実施態様では、細胞を接触させる抗原は、数多くの異なる免疫原性ペプチドを含むタンパク質を含むか、又はこのようなタンパク質から成る。ある実施態様では、細胞をインタクト抗原に接触させ、該抗原をこの細胞にプロセッシングさせる。別の実施態様では、例えば、免疫原性ペプチドの混合物などの抗原の精製済み成分に細胞を接触させるが、該成分を更にプロセッシングさせても、あるいは細胞上のMHC分子に直接結合させてもよい。
【０２２５】
ある実施態様では、例えば抗原−抗体複合体(Fanger 1996)、Ag-Ig 融合タンパク質 (You
et al. 2001) 又は熱ショックタンパク質−ペプチドコンストラクト(Suzue K 1997, Arnold-Schild 1999,
Todryk 1999)を作製するなどにより、DC上の表面受容体に抗原を標的決定する。別の実施態様では、Ag (Ignatius 2000)、腫瘍細胞由来アポトーシス性小体 (Rubartelli 1997, Albert 1998a,
Albert 1998b)、陽イオン性フソジェニック（原語：fusogenic ）ペプチド (Laus 2000) との陽イオンリポソームの結合などの非特異的標的決定法を用いることができる。
【０２２６】
いくつかの実施態様では、抗原は、樹状細胞によってエンドサイトーシスされ、プロセッシングされ、そして提示され得るポリペプチドを含むか、又はこのようなポリペプチドから成る。他の実施態様では、該抗原は、プロセッシングの必要なしで樹状細胞によって提示され得る短鎖ペプチドを含む、又はこのような短鎖ペプチドから成る。短鎖ペプチド抗原は、樹状細胞表面上のMHCクラスII分子に結合することができる。いくつかの実施態様では、短鎖ペプチド抗原は、樹状細胞表面上のMHCクラスII分子に予め結合している抗原に置換することができる。このように、当該抗原は樹状細胞によってプロセッシングされて提示されても、あるいは、プロセッシングされることなく、樹状細胞表面上のMHC分子に結合してもよい。樹状細胞によって提示され得るペプチドは、T細胞への提示に向けてMHC分子（例えばクラスII分子）の文脈で表面上に現れるであろう。これは（例えば細胞へのT細胞応答を測定するなどにより）機能的にも、又は、当業で公知の方法を用いて抗原−ＭＨＣ複合体を検出することによっても、実証することができる。
【０２２７】
ある実施態様では、二種以上のタンパク質又は二種以上のポリペプチド又は二種以上のペプチドを含む抗原に細胞を接触させるが、該抗原には、無関係の（不要な）タンパク質ポリペプチド、又はペプチドを取り除くための精製はされておらず、該細胞は、プロセッシングされて提示された抗原を提示する。別の実施態様では、樹状細胞に接触させるために用いられる抗原は、一個の短鎖ペプチド又はポリペプチド、あるいは、例えば混入ペプチド又はポリペプチドから単離されているなど、実質的に純粋なペプチド又はポリペプチドの混合物を含むか、又はこのような短鎖ペプチド又はポリペプチドあるいは混合物から成る。同様に、抗原は、実質的に純粋であり、混入ポリペプチド又はペプチドから単離された単一のポリペプチド又はペプチドであってもよい。このような短鎖ペプチド及びポリペプチドは、当業で公知の適した方法によって得ることができる。例えば、短鎖ペプチド又はポリペプチドは、組換えにより発現させることも、複合タンパク質抗原から精製することも、あるいは合成により生成させることもできる。
【０２２８】
代替的には、細胞に接触させるために用いる抗原は、例えば１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、２０種、３０種、４０種、５０種、１００種又はそれ以上の短鎖」ペプチド又はポリペプチドなど、２種以上の短鎖ペプチド又はポリペプチドの混合物を含むか、又はこのような混合物から成る。更に細胞に接触させるために用いる抗原は、ポリペプチドのより複雑な混合物を含むか、又はこのような混合物から成ることができる。短鎖ペプチド又はポリペプチドの混合物を使用すると、数多くの別個のペプチド又はポリペプチドに対する抗原特異的T細胞媒介性免疫応答を調節することができる誘導樹状細胞集団の調製が可能になる。これは、例えば阻害しようとする免疫応答が、例えば食物、花粉、ちりダニ、又は特定の細胞種など、複合抗原に対する免疫応答である場合に好ましい。いくつかの場合には、当該抗原は細胞抽出物又は細胞ライセートを含む。他の実施態様では、当該抗原は組織抽出物又は組織ライセートを含む。
【０２２９】
他の実施態様では、当該抗原はアレルギー応答に関連する。このような実施態様では、樹状細胞を接触させる抗原は一種以上のアレルゲン（例えばそれを由来とする一種以上のポリペプチド又はペプチド）を含むことができる。ある実施態様では、抗原は、例えば食物タンパク質（例えば卵、牛乳、小麦、大豆、ナッツ、種子類、魚、貝、又はグルテンなどの食物を由来とする一種以上のタンパク質ペプチド又はポリペプチド）、花粉、カビ、ちりダニ、又は特定の細胞種もしくは、薬物又は化学物質への暴露で改変された細胞、など、複合抗原である。
【０２３０】
他の実施態様では、抗原は、例えば動物の鱗屑、毛髪、尿又は分泌物のうちの一つ以上など、動物物質を含む。別の実施態様では、抗原は昆虫物質を含む。
【０２３１】
他の実施態様では、当該抗原は、食物を由来とする一種以上のペプチド又はポリペプチドを含むか、又はこのようなペプチド又はポリペプチドから成る。更に他の実施態様では、当該抗原は、花粉を由来とする一種以上のペプチド又はポリペプチドを含む。他の実施態様では、当該抗原は、ちりダニを由来とする一種以上のペプチド又はポリペプチドを含む。他の実施態様では、当該抗原は、グルテンを由来とする一種以上のペプチド又はポリペプチドを含む。他の実施態様では、当該抗原は、ミエリンを由来とする一種以上のペプチド又はポリペプチドを含む。
【０２３２】
例示的な実施態様では、前述の方法で樹状細胞を接触させる抗原（又は抗原のうちの一つ）は、例えばエフェクターT細胞によって標的化されるなど、当該疾患を持つ対象の免疫系によって標的化された抗原であり、このような標的化は、疾患の進行に寄与するものである。
【０２３３】
ある実施態様では、当該抗原はセリアック病（CD）に関連する。このような実施態様では、樹状細胞を接触させる抗原は、小麦、ライ、又はオオムギを由来とすることができる。例示的な実施態様では、当該抗原は、グルテン又はグリアジン、あるいは、A-グリアジンの約アミノ酸57からアミノ酸73まで延びるアミノ酸など、これらの部分又は混合物を含むことができる。
【０２３４】
他の実施態様では、抗原はＩ型糖尿病に関連する。このような実施態様では、樹状細胞を接触させる抗原は、膵臓の島細胞を由来とする一種以上のペプチド又はポリペプチドであってよく、例えば細胞又は組織ライセート又は抽出物；タンパク質又はポリペプチド又はペプチドの混合物；又は一種以上の精製済みタンパク質、ポリペプチド又はペプチドであってよい。
【０２３５】
他の実施態様では、抗原は多発性硬化症に関連する。このような実施態様では、樹状細胞を接触させる抗原は、神経細胞又は組織由来の一種以上のペプチド又はポリペプチドであってよい。例えば、抗原は軸索、樹状突起、神経細胞体、乏突起膠細胞、グリア細胞、小膠細胞、シュワン細胞由来であってよい。具体的な実施態様では、抗原はミエリン、又は例えばミエリン塩基性タンパク質などのその成分であってもよい。
【０２３６】
他の実施態様では、抗原は原発性胆汁性肝硬変に関連する。このような実施態様では、樹状細胞を接触させる抗原は、例えば細胞又は組織ライセート又は抽出物など、胆管細胞を由来とする一種以上のペプチド又はポリペプチドであってよい。
【０２３７】
本発明の方法で用いることのできる他の抗原には、当業者であれば想到することができる。例えば、数多くの自己免疫障害が特定のタンパク質に関連付けられてきたが、このような免疫応答で重要な具体的なペプチド抗原は未知である。タンパク質又はタンパク質混合物を本発明の方法では抗原として用いることができるため、当業者であれば、特定の抗原への免疫応答を調節するために、どんな抗原又は抗原混合物を用いて樹状細胞に結合させるかを容易に判断することができよう。
【０２３８】
ヒトで抗原特異的療法に対して以前、試みがなされてきたが、それらは成功しなかった。それは少なくとも部分的には、関係する抗原の分子上の種類が、通常は不明であると共に、その多様なHLAレパートリーが異なる抗原性ペプチドを得意とするような患者間では、異なる可能性が高いからである。ここで記載する通りの誘導樹状細胞を使用することにより、樹状細胞成熟因子を含むであろう粗抗原製剤（例えば細胞ライセート又はタンパク質抽出物）中に抗原を存在させることができる。例えば、ここに記載する誘導寛容原性樹状細胞は、それらの表現型が寛容原性固定されている限り、このような抗原製剤への暴露時にも免疫原性にならない。
【０２３９】
別の実施態様では、即ちDCの免疫原性亢進が好ましい場合には、前述の方法で細胞を接触させる抗原製剤は、例えば癌細胞由来の抗原、又は病原性物質（例えば細菌、ウィルス、又は他の病原性生物）由来の抗原、あるいは毒素など、対する免疫応答が好ましい抗原を含む。
【０２４０】
幅広い抗原量を用いて、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞又は誘導樹状細胞を含む開始細胞集団に接触させることができる。例えば、いくつかの実施態様では、1 pg/mL及び10 mg/mLの範囲の濃度の抗原に細胞を接触させる。例示的な実施態様では、樹状細胞を1 pg/mL、10 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、300 pg/mL、400 pg/mL、500 pg/mL、600 pg/mL、700 pg/mL、800 pg/mL、900 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL、500 ng/mL、600 ng/mL、700 ng/mL、800 ng/mL、900 ng/mL、1μg/mL、10μg/mL、30μg/ml、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、or 10 mg/mL、及びこれらの範囲の抗原に接触させる。ある実施態様では、樹状細胞を10μg/mLの抗原に接触させる。他の実施態様では、細胞を、例えば1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 pM、約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は1000 nM、約 1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900 又は 1000μM、又は約1、10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900  又は1000 mM、及びこれらの範囲など、1
pM 乃至10 mMの濃度の抗原に接触させる。 
【０２４１】
ある実施態様では、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団又を、適した条件（例えば5%のCO2雰囲気中で３７℃など）下で例えば１乃至７２時間など、細胞表面に抗原を提示させるのに充分な時間、抗原と一緒に同時培養することができる。例えばある実施態様では、細胞を抗原と一緒に、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、20、24、30、35、40、45、48、50、55、60、70、又は72 時間など、約１乃至７２時間、又は、樹状細胞による抗原のプロセッシング及び提示が可能になる、あるいは、樹状細胞上へのペプチド抗原の結合が可能になる他の時間、同時培養する。このような接触は、DCの誘導前又は誘導後、そして更なる操作前に行われてもよい。
【０２４２】
ＶＩＩＩ．  細胞の選択的な更なる操作
いくつかの実施態様では、誘導樹状細胞を、対象に投与する前に一種以上の成熟刺激に接触させることができる。成熟刺激による処置により、誘導寛容原性樹状細胞の場合にはそれらの寛容原性を遮断することなく樹状細胞の抗原提示能を高めることができ、あるいは誘導免疫原性樹状細胞の場合には免疫原性を更に高めることができる。このような成熟刺激には、限定はしないが、アジュバント、TLRアゴニスト、CD40アゴニスト、インフラソーム活性物質、又は炎症性サイトカイン及びこれらの組合せを含めることができる。成熟刺激による樹状細胞の処置は、誘導前、誘導中又は誘導及び／又は抗原との接触後に行うことができる。
【０２４３】
ある実施態様では、細胞のミトコンドリア呼吸を検査して、誘導作用物質による処置が適した応答を引き起こすことを確認することができる。例えばある実施態様では、細胞によるO2 消費（酸素消費速度；OCR)
を測定することができる。この場合、誘導免疫原性樹状細胞を検査してO2 消費が増加していることを確認することができ、そして誘導寛容原性樹状細胞を検査してO2消費が減少している又は増加していないことを確認することができる。OCR は、例えばクラーク電極のシーホースXF24フラックス分析器などの分析器を用いるなどして測定することができる。
【０２４４】
別の実施態様では、異なる検定を用いて、ミトコンドリア機能に対する作用物質の効果を確認することもできる。例えばある実施態様では、PGC-1a、PGC-1b、PRC、又はミトコンドリア機能に関与する他の分子、例えばエストロゲン関連受容体α、NRF-1、NRF-2、Sp1、YY1、CREB 及び MEF-2/E-ボックス因子のうちの一つの発現のmRNAレベルを測定することができる。例えば、免疫原性刺激に暴露した誘導免疫原性樹状細胞を検査して、PGC-1a mRNAのレベルが増加していることを確認することができ、あるいは、寛容原性刺激に暴露した誘導寛容原性樹状細胞を検査して、PGC-1a mRNAのレベルが増加又は減少しないことを確認することができる。当業で公知の他のミトコンドリア機能検査方法もこの目的のために用いることができる。
【０２４５】
例えば、DC代謝の代替的読み取り値を測定することができる。例えば、糖取り込み（例えば誘導体化グルコースを用いるなど）を測定することができ、また反応性酸素種（例えばDCF-DAを用いるなど）の存在も同様に測定することができる。別の実施態様では、（解糖の増加及び／又はミトコンドリア機能の低下で上昇する）乳酸生成を測定することができる。ある実施態様では、細胞外酸性化速度 (ECAR) を測定することができ、解糖又はピルビン酸過負荷による乳酸生成を反映とする。シーホースSF24 フラックス分析器をこの目的のために用いることができる。更に別の実施態様では、細胞内 ATP/ADP 比を（例えば市販のキットを用いたり、あるいは、 Nagel et al.  2010.  Methods Mol. Biol. 645:123-31にある通りに）測定してもよい。ATPレベルの上昇及びADPレベルの低下が増殖性細胞で認識されており、活性化の尺度である。
【０２４６】
別の実施態様では、誘導寛容原性樹状細胞の機能をex vivoで検査して、誘導作用物質による処置が適した細胞応答を引き起こすことを確認することができる。例えば、ある実施態様では、誘導寛容原性樹状細胞がTreg細胞をex vivoで誘導する能力を、対象への誘導寛容原性DCの投与前に、例えばここで記載した通りの誘導DCに暴露してある細胞集団におけるFoxp3発現を測定することにより、測定することができる。
【０２４７】
別の実施態様では、誘導寛容原性樹状細胞が以下の特性のうちの少なくとも一つを有するかどうかを、当業で公知及び／又はここに記載する方法を用いてex vivoで検査することができるｉ）ex vivoで未刺激T細胞をFoxp3+ T 調節細胞に変換する能力；ｉｉ）ex vivoで エフェクターT細胞を削除する能力；ｉｉｉ）ex vivoにおいて共刺激分子を発現するが、少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にそれらの寛容原性表現型を保持する能力；及び／又はｉｖ）ex vivoにおいて少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時にレスピロスタティックのままでいる能力。
【０２４８】
別の実施態様では、誘導免疫原性樹状細胞の機能をex vivoで検査して、誘導作用物質による処置が適した細胞応答を引き起こすことを確認することができる。例えばある実施態様では、誘導免疫原性樹状細胞がex vivoで（例えば細胞表面マーかの染色で測定したときの）Teff細胞数又は（例えば増殖の増加、活性化マーカーの上方調節で測定したときの）活性化を増加させる能力、（サイトカイン産生又は細胞毒性を測定することによる）エフェクター／記憶分化を増加させる能力を、誘導DCの対象への投与前に測定することができる。
【０２４９】
ＩＸ．  細胞を投与する方法
ある実施態様では、本発明の誘導樹状細胞（例えば誘導寛容原性樹状細胞又は誘導免疫原性樹状細胞）を対象に適した経路で投与する。 ある実施態様では、このような投与の結果、対象に治療上の利益がある。ある実施態様では、本発明の誘導樹状細胞を用いて疾患又は障害を処置することができる。別の実施態様では、誘導DCを抗原特異的免疫応答を亢進する（誘導免疫原性樹状細胞）又は抑制する（誘導寛容原性樹状細胞）ための医薬の調製に用いることができる。
【０２５０】
ある実施態様では、対象は哺乳動物である。ある実施態様では、対象はヒトである。別の実施態様では、対象は家畜である。
【０２５１】
ある実施態様では、投与は例えば非経口（例えば皮下、くも膜下、心室内、筋肉内、又は腹腔内注射、気管内注射、又は静脈内点滴）；局所（例えば経皮、眼内、又は鼻腔内）；又は肺（例えば粉末又はエーロゾルの吸入又は通気による）であってよい。投与は急速（例えば注射）であっても、又は経時的（例えば遅い輸注又は徐放性調合物の投与）であってもよい。別の実施態様では、誘導DCをレシピエントに、同種移植片への注射、又は、同種移植片を移植する外科的領域に注射すること、あるいはこれらのいずれかの組合せにより、投与してもよい。
【０２５２】
ある実施態様では、本発明の誘導樹状細胞を静脈内投与する。別の実施態様では、本発明の誘導樹状細胞を吸入により投与する。更に別の実施態様では、本発明の誘導樹状細胞を皮下投与する。
【０２５３】
ある実施態様では、本発明の誘導樹状細胞を投与用に調合する。細胞の投与（例えば薬学的投与）用に適した担体又は賦形剤は細胞生存に適合性があるものであり、当業で公知である。このような担体は選択的には、緩衝剤、又は、細胞生存を促進する補助剤を含めてもよい。ある実施態様では、投与しようとする細胞を、例えば生存促進因子又は薬剤など、一種以上の付加的な作用物質と一緒に調合する。ある実施態様では、細胞の生存にとって適合性ある液体の担体と一緒に、細胞を調合する。
【０２５４】
ある対象に投与しようとする誘導樹状細胞の量は当業者が決定することができる。ある実施態様では、細胞量は１回の用量当り約105 乃至約 1010 個の範囲の細胞とすることができる。例示的な実施態様では、誘導樹状細胞を一回の用量当り、約105、106、107、108、109、又は 1010 個の細胞の量にして投与する。他の例示的な実施態様では、例えば5 x 105、5 x 106、5 x 107、5 x 108、5 x 109、又は5 x 1010 個の細胞など、中間の細胞量を用いる。いくつかの実施態様では、対象は一回分の用量の誘導樹状細胞を投与される。他の実施態様では、対象は複数回の用量を投与される。複数回の用量は同時に投与されてもよく、又はそれらは数日間かけて間隔を置かれてもよい。例えば一回目の用量を投与後、対象には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、30、45、60、又はそれ以上の日数の間隔をあけて、次の用量の誘導樹状細胞を投与してもよい。当業者には明白であろうが、細胞の量と、投与に適した時点は、疾患の持続時間及び重篤度を含む因子に応じて患者毎に様々であろう。投与にとって適した投薬量及び時間を決定するには、当業者は、例えば対象における障害の進行や、ex vivoでのエフェクターT細胞機能などに対する投与の結果を観察するために、従来の臨床用及び研究用手段を用いてもよい。このような手段には、例えば炎症、Teffエフェクター細胞活性、同種移植片機能等を観察及び評価するための公知の生化学的及び免疫学的検査が含まれる。
【０２５５】
誘導樹状細胞の予防的投与を、疾患の発症前に開始することができ、あるいは治療的投与を、障害が確立した後に開始してもよい。
【０２５６】
ある実施態様では、誘導寛容原性DCの投与を、例えば同種移植片の投与前などに執り行う。例示的な実施態様では、誘導寛容原性樹状細胞を、限定はしないが、同種移植から 30、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、又は0 日前を含め、一回以上の回数、投与する。加えて又は代替的には、誘導寛容原性DCを、移植後の同種移植片レシピエントに投与することができる。例示的な実施態様では、誘導寛容原性樹状細胞を、限定はしないが、同種移植片移植から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、30日後等を含め、一回以上の回数、投与する。
【０２５７】
いくつかの実施態様では、誘導寛容原性樹状細胞の投与に、一種以上の付加的な作用物質の投与を伴わせることができる。例えば、誘導寛容原性DCを一種以上の免疫抑制剤と一緒に投与することができる。ここで解説する誘導寛容原性樹状細胞療法と組み合わせて用いることのできる免疫抑制剤の例には、限定はしないが、インターロイキン-10などのサイトカイン、及び／又は、 例えばコルチコステロイド、メトトレキセート、NSAIDs、フィンゴリモド、ナタリズマブ、アレムツズマブ、抗CD3、シクロスポリンＡ及びタクロリウムス (FK506)などの薬剤がある。好適な実施態様では、誘導寛容原性樹状細胞の使用により、現在の標準的な処置よりも免疫抑制剤の用量を全体に低くして投与することができるため、副作用が抑えられる。
【０２５８】
他の実施態様では、誘導免疫原性樹状細胞の投与に、一種以上の免疫刺激剤の投与を伴わせることができるここで解説する誘導免疫原性樹状細胞療法と組み合わせて用いることのできる免疫刺激剤の例には、限定はしないが、サイトカイン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF）などのアジュバント、インターフェロン、イミキモド、細菌由来の細胞膜画分、IL-12、多様なケモカイン、合成シトシンリン酸-グアノシン（CpG）、オリゴデオキシヌクレオチド及びグルカンがある。
【０２５９】
従って、いくつかの実施態様では、本発明は、誘導寛容原性樹状細胞の集団をエフェクターT細胞に接触させることで、ある抗原に対するエフェクターT細胞応答性を低下させるステップを含む、抗原に対するエフェクターT細胞応答性を低下させる方法を提供するものである。ある実施態様では、接触させるステップは対象内で行われ、本方法は、対象に誘導寛容原性樹状細胞集団を、Tエフェクター細胞応答性を低下させるのに充分な量、投与するステップを含む。いくつかの態様では、本方法は選択的に、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞又は誘導寛容原性樹状細胞を含む開始細胞集団を抗原に接触させるステップを含む。
【０２６０】
別の実施態様では、本発明は、誘導免疫原性樹状細胞の集団を対象に、抗原に対するTエフェクター細胞応答性を高めるのに充分な量、投与するステップを含む、対象における前記抗原に対するTエフェクター応答性を高める方法を提供するものである。ある実施態様では、接触させるステップを対象内に行われ、本方法は、誘導免疫原性樹状細胞の集団を、Tエフェクター細胞応答を高めるのに充分な量、対象に投与するステップを含む。いくつかの実施態様では、本方法は選択的に、樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞又は誘導免疫原性樹状細胞を含む開始細胞集団を抗原に接触させるステップを含む。
【０２６１】
いくつかの実施態様では、誘導樹状細胞を、この誘導樹状細胞を投与しようとする対象から得ることができる。従っていくつかの実施態様では、本発明は、対象において抗原に対する抗原特異的Tエフェクター細胞応答性を低下させる又は上昇させる方法を提供するものであり、本方法は、樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞を含む開始細胞集団を対象から分離するステップと、前記細胞集団を寛容原性又は免疫原性刺激及び選択的に抗原に接触させることで、誘導寛容原性又は免疫原性樹状細胞の集団を生成するステップと、前記誘導樹状細胞集団を対象に、例えば前記抗原に対するTエフェクター細胞応答性を低下させる又は上昇させるのに充分な量など、投与するステップとを含む。他の実施態様では、樹状細胞を、誘導樹状細胞を投与しようとする対象以外の、又は同対象に加えて、一体、又は二体以上の個体から得ることができる。
【０２６２】
ある実施態様では、誘導寛容原性DCを同種移植片ドナーから（例えばここで解説する通り）生成し、同種移植前、同種移植中、又は同種移植後に、この同種移植レシピエントに輸注してもよい。ある実施態様では、臓器ドナー由来のこれらの同種誘導寛容原性DCは、レシピエントが認識することになる抗原を内因的な発現するため、付加的な抗原に接触させる必要がない。更に別の実施態様ではドナー及びレシピエントDCの両者を誘導した後、相互に混合して、レシピエントDCがアロ抗原をドナーDCから獲得するようにする。
【０２６３】
別の実施態様では、移植片レシピエント由来の樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞を寛容原性刺激で誘導して、更に、同種移植片ドナー由来の細胞又は抗原と接触させる。従って、いくつかの実施態様では、同種移植片ドナー由来の細胞又は組織由来の細胞ライセート又は細胞抽出物を用いて、誘導前の樹状細胞及び／又は樹状細胞前駆細胞に、あるいは、同種移植片レシピエントへの誘導寛容原性樹状細胞の投与前の誘導寛容原性樹状細胞に、接触させる。他の実施態様では、同種移植片ドナー由来の細胞又は組織から分離された精製済みもしくは部分的に精製済みのポリペプチドの製剤を抗原として用いる。更に別の実施態様では、DCを全同種細胞に、タンパク質抽出物ではなく抗原として接触させることができる。ある実施態様では、細胞又はタンパク質抽出物を、例えば移植しようとする細胞又は組織など、特定の細胞又は組織種から得る。
【０２６４】
同種移植片へのTエフェクター細胞応答を妨げるために、誘導寛容原性樹状細胞を同種移植片を受け取る前の同種移植片レシピエントに予防的に投与することができる。代替的には、又は付加的に、同種移植片に対するTエフェクター細胞応答を低下させるために、誘導寛容原性樹状細胞を、同種移植片を受け取るのと同時又はその後の同種移植片レシピエントに治療的に投与することができる。
【０２６５】
同様に、別の実施態様では、GvHDを予防する又は処置するために、骨髄移植（BMT）レシピエントに、（上に記載した通りに誘導した）自己由来及び／又は異種アロ-Ag提示誘導寛容原性DCを輸注することができよう。
【０２６６】
ある実施態様では、例えば望ましくない抗原特異的エフェクターT細胞応答によって媒介されるなど、望ましくない免疫応答によって少なくとも部分的に媒介される疾患又は障害に罹患した対象に、誘導寛容原性DCを投与することができる。例えばある実施態様では、炎症に関連する疾患又は障害を有する対象に、誘導寛容原性DCを投与することができる。ある実施態様では、自己免疫に関連する疾患又は障害を有する対象に、誘導寛容原性DCを投与することができる。ある実施態様では、本発明の樹状細胞を対象に投与する方法により、対象において所望の効果が生じる。例えば前述の方法を用いて、炎症のある、又は自己免疫障害を有する対象において、抗原特異的Tエフェクター細胞応答を低下させることができる。ある実施態様では、抗原特異的エフェクターT細胞応答を低下させると、対象の状態が向上する。
【０２６７】
ある実施態様では、本発明は、例えば炎症性応答又は自己免疫障害など、望ましくない抗原特異的免疫応答を処置する方法を提供するものであって、同方法は、誘導寛容原性樹状細胞集団を、それを必要とする対象に、症状を処置又は軽減するのに充分な量、投与するステップを含む。具体的な実施態様では、前述の方法を用いて、例えばT細胞媒介性障害を有する対象においてなど、抗原に対する有害なエフェクターT細胞免疫応答を特徴とする炎症性障害又は自己免疫障害の症状を処置又は軽減する。これらの実施態様では、対象は、炎症性障害又は自己免疫障害を有する、又は発症するリスクがある。
【０２６８】
例示的な実施態様では、誘導寛容原性DCによる処置が有益であろう障害には、限定はしないが、視神経脊髄炎を含む多発性硬化症；１型糖尿病；セリアック病；原発性胆汁性肝硬変；リウマチ様関節炎；乾癬；ベーチェット病；全身性エリテマトーデス（SLE）；植物、動物、微生物、薬物、エーロゾル、化学物質又は植物を由来とするアレルゲンに対する、又は、有機もしくは無機物質を由来とする抗原に対するアレルギーを含むアレルギー；セリアック病；甲状腺炎；膠原病；脈管炎；アテローム性硬化症；心筋炎；アレルギー性喘息；遅延型過敏症、アトピー性皮膚炎；全身性強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患（IBD）；クローン病；潰瘍性大腸炎；外科的組織再潅流損傷、心筋梗塞などの心筋虚血状態、心臓停止、心臓手術後の再潅流、及び経皮的経腔的大動脈血管形成術後の狭窄、卒中、及び腹腔大動脈瘤；卒中に続発する脳浮腫；頭蓋外傷；血液量減少性ショック；先端仮死；成人呼吸不全症候群；急性肺損傷；ベーチェット病；皮膚筋炎；多発性筋炎；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；変形性関節症；ループス腎炎；シェーグレン症候群；自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性肝疾患；アジソン病；白血球漏出が関与する疾患；中枢神経系（CNS）炎症性障害；筋委縮性側索硬化症 (ALS)；ギラン-バレー症候群；多発性神経筋炎；敗血症又は外傷に続発する多臓器損傷症候群；アルコール性肝炎；細菌性肺炎；腎炎を含む抗原−抗体複合体媒介性疾患；敗血症；サルコイドーシス；組織／臓器移植に対する免疫病理学的応答；胸膜炎、歯槽炎、脈管炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、びまん性汎細気管支炎、過敏性肺炎、特発性肺線維症 (IPF)、及び嚢胞性線維症を含む肺の炎症；乾癬性関節炎；視神経脊髄炎、ギラン-バレー症候群（GBS）、及びCOPDがある。
【０２６９】
ある実施態様では、所望の免疫応答の不足が少なくとも部分的に媒介する疾患又は障害に罹患した対象に、誘導免疫原性DCを投与することができる。例えば、ある実施態様では、ウィルス、細菌、又は寄生生物などの感染性物質を有する対象に、誘導免疫原性DCを投与することができる。別の実施態様では、感染性物質又はワクチン抗原などに対して、アジュバントとしてエフェクターT細胞応答を高めるなどのために、正常な免疫応答を持つ対象に投与を行うことができる。
【０２７０】
他の実施態様では、前述の方法を用いて、癌を有する対象において免疫応答を高めることができる。例えば本発明は、癌を有する対象においてTeff応答を高める方法を提供するものであり、本方法は、誘導免疫原性樹状細胞集団を、それを必要とする対象に、所望の抗原に対する抗原特異的Teff細胞応答を高めるのに充分な量、投与するステップを含む。
【０２７１】
ある実施態様では、本発明の樹状細胞を対象に投与する方法の結果、対象において所望の効果が挙がる。例えば前述の方法を用いて、対象における抗原特異的Tエフェクター細胞応答を低下（誘導寛容原性樹状細胞の場合）させる、あるいは、対象における抗原特異的Tエフェクター細胞応答を高める（誘導免疫原性樹状細胞の場合）ことができる。ある実施態様では、抗原特異的エフェクターT細胞応答を亢進させると、対象の状態が向上する。
【０２７２】
ＸＩ．  スクリーニング方法
ある実施態様では、本発明は、DCにおいてミトコンドリア機能を直接又は間接的に亢進する作用物質、又は、レスピロスタティック寛容、又は寛容原性固定を誘導する作用物質、を同定することに関する。ここで記載するように、ミトコンドリア機能を亢進する作用物質を用いると誘導免疫原性DCを生成でき、他方、レスピロスタティック寛容又は寛容原性固定を促進する作用物質を用いると誘導寛容原性DCを生成することができる。
【０２７３】
ある実施態様では、本発明のスクリーニング方法は、例えば天然発生型の哺乳動物（例えばマウス又はヒト）樹状細胞又は樹状細胞前駆細胞（例えば天然発生したものであるか、又は、遺伝子改変されたもの）など、樹状細胞などの細胞を利用する。ある実施態様では、スクリーニング方法で用いる細胞を、一種以上の異種遺伝子を発現するようにトランスフェクトするか、又は、トランスジェニック動物を由来とする。
【０２７４】
ここで上に記載した通りの誘導寛容原性DC又は誘導免疫原性DCの機能を確認するために用いられたのと同様な検定法を、樹状細胞を誘導するのに用いることのできる新規な化合物を同定するためのスクリーニング法にも用いることができる。
【０２７５】
例えば、ある実施態様では、樹状細胞を検査作用物質で処置して、細胞のミトコンドリア活性化を検査することで、所望の応答を引き起こす作用物質を同定することができる。例えば、ミトコンドリア活性化を増す作用物質は、誘導免疫原性樹状細胞を生成するために潜在的に有用であり、そしてミトコンドリア活性化を減少させる、又は増加させない（そしてある実施態様では、その後のTLRアゴニストへの暴露時に酸素消費の一過性の増加を減少させる又は阻害する）作用物質は、誘導寛容原性樹状細胞を生成するために潜在的に有用である。
【０２７６】
例えばある実施態様では、細胞のO2 消費（酸素消費速度；OCR）を、ミトコンドリア活性化の指標として測定することができる。この場合、誘導免疫原性樹状細胞を検査してO2消費の増加を確認することができ、そして誘導寛容原性樹状細胞を検査して、少なくとも一種のTLRアゴニストによる刺激時などに、O2消費が減少する、又は、増加しないことを確認することができる。OCRは、例えばシーホースXF24フラックス分析器などの分析器を用いるなどして、測定することができる。
【０２７７】
別の実施態様では、DC代謝の代替的読み取り値を測定することができる。例えば（誘導体化グルコースを用いて）糖取り込み又は（DCF-DAを用いて）反応性酸素種の存在である。別の実施態様では、（解糖増加及び／又はミトコンドリア活性低下で上昇する）乳酸生成を測定することができる。ある実施態様では、細胞外酸性化速度 (ECAR) を測定することができ、解糖又はピルビン酸過負荷による乳酸生成の反映とする。シーホースSF24フラックス分析器をこの目的のために用いることができる。更に別の実施態様では、細胞内 ATP/ADP比を（例えば市販のキットを用いるか、又はNagel et al.  2010.  Methods Mol. Biol. 645:123-31にある通りに）測定してもよい。ATPレベルの増加及びADPレベルの減少が増殖性細胞で認識されており、活性化の尺度である。
【０２７８】
別の実施態様では、異なる検定を用いて、ミトコンドリア機能に対する化合物の効果を検査することもできる。例えばある実施態様では、PGC-1a、PGC-1b、PRC、又は、例えばエストロゲン受容体α、NRF-1、NRF-2、Sp1、YY1、CREB 及びMEF-2/E-ボックス因子などのミトコンドリア機能に関与する他の分子のうちの一つ以上の発現のmRNAレベルを測定することができる。例えば、免疫原性刺激に暴露した樹状細胞を検査してPGC-1a mRNA のレベルが上昇することを確認することができ、あるいは、寛容原性刺激に暴露した樹状細胞を検査して、PGC-1a mRNAのレベルが減少することを確認することができる。ある実施態様では、このような遺伝子の調節領域又はその一部分をレポータ遺伝子に作動可能に連結してもよい。
【０２７９】
ここで交換可能に用いられるように、用語「作動可能に連結されて」及び「作動的に連結されて」は、当該ヌクレオチド配列が調節配列に、このヌクレオチド配列のホスト細胞（又は細胞抽出物）による発現が可能可能な態様で連結されていることを意味するものと、意図されている。調節配列は当業で公知であり、適したホスト細胞での所望のタンパク質の発現を命令するように選択することができる。調節配列という用語は、プロモータ、エンハンサ、ポリアデニレーション・シグナル及び他の発現制御因子を含むものと、意図されている。このような調節配列は当業者に公知であり、例えば Molecular Cloning:  A
Laboratory Manual, Third Edition CSHL Press (2001)に解説されている。発現ベクターのデザインは、トランスフェクトしようとするホスト細胞の選択及び／又は発現させたいタンパク質の種類及び／又は量といった因子に依るであろうことは理解されるはずである。調節配列には、数多くの種類のホスト細胞内でヌクレオチド配列の構成的発現を命令するもの、特定のホスト細胞内でのみヌクレオチド配列の発現を命令するもの（例えば組織特異的調節配列）又は特定の条件下でのみヌクレオチド配列の発現を命令するもの（例えば誘導性調節配列）がある。
【０２８０】
多様なレポータ遺伝子が当業で公知であり、本発明のスクリーニング検定で用いるのに適している。適したレポータ遺伝子の例には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質（及びその多様な変異型）、又はルシフェラーゼをコードするものがある。これらの遺伝子産物の活性を測定するための標準的な方法は当業で公知である。
【０２８１】
ある実施態様では、検査化合物の存在下における指標細胞内のレポータ遺伝子の発現レベルは、検査化合物の非存在下における指標細胞内のレポータ遺伝子の発現レベルよりも高く、この検査化合物は、PGC-1a、PGC-1b、PRCの発現、及び／又は、例えば、エストロゲン関連受容体α、NRF-1、NRF-2、Sp1、YY1、CREB 及びMEF-2/E-ボックス因子など、ミトコンドリア機能に関与する一種以上の他の分子の発現を刺激する化合物として同定される。別の実施態様では、検査化合物の存在下における指標細胞内のレポータ遺伝子の発現レベルは、検査化合物の非存在下における指標細胞内のレポータ遺伝子の発現レベルよりも低く、この検査化合物は、これらの分子のうちの一つ以上の発現を阻害する化合物として同定され、従ってミトコンドリア機能の阻害剤である。
【０２８２】
多様な検査化合物を、ここで解説するスクリーニング検定法を用いて評価することができる。用語「検査化合物」は、本発明の検定法で用いられると共に、ミトコンドリア活性化に影響を与える上でのそれらの能力について検定される試薬又は検査物質を含む。例えば複数の化合物など、二種以上の化合物を、それらのミトコンドリア呼吸又は遺伝子発現の調節能について、スクリーニング検定法で同時に検査することができる。用語「スクリーニング検定法」は、好ましくは、ある一つの化合物が読み取り値に影響を与える能力を検査する検査ではなく、選択された読み取り値に複数の化合物が影響を与える能力検査する検定法を言う。好ましくは、当該の検定法は、スクリーニングの対象となる効果を有することがそれまで未知の化合物を同定するものであるとよい。ある実施態様では、高スループットのスクリーニングを用いて、ある化合物の活性について検定することができる。
【０２８３】
いくつかの実施態様では、検査しようとする化合物をライブラリー由来とすることができる（即ち、化合物ライブラリーのメンバーである）。ペプチド・ライブラリーの使用は当業ではよく確立されているが、ベンゾジアゼピン（Bunin et al. (1992).  J. Am. Chem. Soc.
114:10987; DeWitt et al. (1993).  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909）、ペプトイド（Zuckermann. (1994).  J. Med. Chem.  37:2678）、オリゴカルバメート（Cho et al.  (1993).  Science. 261:1303- ）、及びヒダントイン (DeWitt et al. 上掲）などの他の化合物の混合物の生成を可能にする新規な技術が開発されてきた。
【０２８４】
分子上の多様性を生じさせるために用いる方法例は当業で公知であり、多くのレビューが公開されており、例えば Shreiber, S.  2009  Nature 457, 153-154; Barry,C.E.I.
(2003), 2, 137-150. ; Braeckmans,K. et al. (2003) Encoded microcarrier beads
signal the way to better combinatorial libraries and biological assays. Mod.
Drug Dis., 6, 28-30, 32; Charmot,D. (2003) Actualite Chimique, 11-16;
Edwards,P.J. (2003), 6, 11-27; Fassina,G., & Miertus,S. (2003) Chimica
Oggi, 21, 28-31; Hermkens,P.H.H., & Muller,G. (2003). Ernst Schering
Research Foundation Workshop, 42, 201-220.; Hisamoto,H., Kikutani,Y., &
Kitamori,T. (2003) Microchip-based organic synthesis. Shokubai, 45, 252-256;
Hughes,D. (2003). Nature Reviews Genetics, 4, 432-441; Jensen,K.J., &
Nielsen,J. (2003) Bioorganic and combinatorial chemistry. Part 1. Dansk Kemi,
84, 21-24; Kobayashi,N., & Okamoto,Y. (2003) Farumashia, 39, 769-773.;
Lam,K.S., Liu,R., Miyamoto,S., Lehman,A.L., & Tuscano,J.M. (2003). Account.
Chem. Res., 36, 370-377; Langer,T., & Krovat,E.M. (2003), 6, 370-376;
Liu,R., Enstrom,A.M., & Lam,K.S. (2003). Experimental Hematology (New York,
NY, United States), 31, 11-30.;Mario Geysen,H., Schoenen,F., Wagner,D., &
Wagner,R. (2003) Nature Reviews Drug Discovery, 2, 222-230; Nefzi,A.,
Ostresh,J.M., & Houghten,R.A. (2003). EXS, 93, 109-123.; New,D.C.,
Miller-Martini,D.M., & Wong,Y.H. (2003). Phytotherapy Research, 17,
439-448. Pinilla,C., Appel,J.R., Borras,E., & Houghten,R.A. (2003) Nature
Medicine (New York, NY, United States), 9, 118-122; Schwardt,O., Kolb,H., &
Ernst,B. (2003) Current Topics in Medicinal Chemistry (Hilversum, Netherlands),
3, 1-9.; Sehgal,A. (2003). Curr. Med. Chem., 10, 749-755に公開されている。これらのレビューの内容を引用をもってここに援用することとする。
【０２８５】
本発明の化合物は、生物学的ライブラリ：空間指定可能なパラレル固相又は液相ライブラリ、逆重層積分を要する合成ライブラリ法、「ワン-ビーズ・ワン-コンパウンド」ライブラリ法、及びアフィニティ・クロマトグラフィ選抜を用いた合成ライブラリ法を含め、当業で公知のコンビナトリアル・ライブラリー法における多くのアプローチのいずれを用いても得ることができる。生物学的ライブラリ法はペプチド・ライブラリに限られるが、他の４つの方法はペプチド、非ペプチド・オリゴマー又は化合物の低分子ライブラリに適用可能である (Lam, K.S. (1997)  Anticancer
Drug Des. 12:145)。分子ライブラリの合成のための他の方法例は当業で見られ、例えばErb et al. (1994). 
Proc. Natl. Acad. Sci. USA  91:11422- ; Horwell et al.
(1996) Immunopharmacology 33:68- ; 及びGallop et al. 
(1994);  J. Med. Chem.  37:1233-に見られる。
【０２８６】
化合物のライブラリは液体中 (e.g., Houghten (1992) Biotechniques
13:412-421), 又はビーズ上 (Lam
(1991) Nature 354:82-84)、チップ上 (Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌上 (Ladner USP 5,223,409)、胞子上 (Ladner USP '409)、プラスミド上 (Cull et al. (1992) Proc
Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) 又はファージ上 (Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin
(1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc.
Natl. Acad. Sci.  87:6378-6382);
(Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310)に提示させることができる。更に別の実施態様では、コンビナトリアル・ポリペプチドをcDNAライブラリから作製する。ある実施態様では、検査用のcDNAは、例えばレトロ-、レンチ-、又はアデノウィルス・ライブラリなど、ウィルス・ライブラリに発現させることができる。別の実施態様では、当業で公知の方法を用いて開発されたRNAi ライブラリをスクリーニングすることができる。
【０２８７】
活性についてスクリーニングすることのできる化合物例には、限定はしないが、ペプチド、核酸、糖質、有機低分子、及び天然生成物抽出物ライブラリがある。
【０２８８】
候補／検査化合物には、例えば、１）Ig-テイルド融合ペプチド及びランダム・ペプチド・ライブラリーのメンバー（例えばLam, K.S.
et al. (1991) Nature 354:82-84; Houghten, R. et al. (1991)
Nature 354:84-86を参照されたい）を含む、可溶性ペプチドなどのペプチド、及びD-及び／又はL-配置アミノ酸から成るコンビナトリアル化学由来分子ライブラリ；２）ホスホペプチド（例えばランダム及び部分的縮重、指定ホスホペプチド・ライブラリ、例えば  Songyang, Z. et al.
(1993) Cell 72:767-778を参照されたい）；３）抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト化抗イディオタイプ、キメリック、及び一本鎖抗体や、 Fab、F(ab')2、Fab発現ライブラリ・フラグメント、及び抗体のエピトープ結合フラグメント）；４）低有機及び無機分子（例えばコンビナトリアル及び天然生成物ライブラリから得られた分子）；５）酵素（例えばエンドリボヌクレアーゼ、ヒドロラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、シンサターゼ、イソメラーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、オキシド-レダクターゼ及びATPases）、又はRNAi 分子がある。
【０２８９】
本発明の検査化合物は、生物学的ライブラリ：空間指定可能なパラレル固相又は液相ライブラリ、逆重層積分を要する合成ライブラリ法；「ワン-ビーズ・ワン-コンパウンド」ライブラリ法；及びアフィニティ・クロマトグラフィ選抜を用いた合成ライブラリ法を含め、当業で公知のコンビナトリアル・ライブラリ法における多くのアプローチのいずれを用いても得ることができる。生物学的ライブラリ法はペプチド・ライブラリに限られるが、他の４つの方法はペプチド、非ペプチド・オリゴマー又は化合物の低分子ライブラリに適用可能である (Lam, K.S. (1997)  Anticancer
Drug Des. 12:145)。
【０２９０】
分子ライブラリの合成のための他の方法例は当業で見られ、例えばDeWitt et al.
(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al.
(1994).  Proc. Natl. Acad. Sci.
USA  91:11422- ; Zuckermann et al. (1994) J.
Med. Chem. 37:2678;
Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 33:2061; 及び Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233に見られる。
【０２９１】
化合物のライブラリは液体中 (e.g., Houghten (1992) Biotechniques
13:412-421), 又はビーズ上 (Lam
(1991) Nature 354:82-84)、チップ上 (Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌上 (Ladner USP 5,223,409)、胞子上 (Ladner USP '409)、プラスミド上 (Cull et al. (1992) Proc
Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) 又はファージ上 (Scott and Smith (1990) Science 249:386-390；Devlin (1990) Science 249:404-406;
Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.  87:6378-6382; Felici (1991) J.
Mol. Biol. 222:301-310；Ladner上掲)に提示させることができる。
【０２９２】
別の実施態様では、細胞に対する目的の化合物の効果を、適したコントロール（例えば未処置の細胞、又は、コントロール化合物で処置した細胞、あるいは、生物学的応答を調節しない担体）に比較する。
【０２９３】
別の実施態様では、ここで前述した多様な方法の一つなどにより、ミトコンドリア呼吸を直接又は間接的に調節する検査化合物を同定し、その選択された検査化合物（又は「目的の化合物」）をその後、更に二次的なスクリーニング検定法で評価することができる。
【０２９４】
ある実施態様では、ミトコンドリア呼吸を調節することが見出された化合物を更に、例えば当業で公知の方法を用いるなどにより、例えばex vivoで未刺激T細胞をTregに変化させる能力、エフェクター細胞をex vivoで削除する能力、又は反対に、（例えば増殖の増加、及び／又は、活性化マーカーの上方調節などで測定したときの）ex vivoでのT細胞活性化及び／又は（例えばサイトカイン産生、細胞毒性の増加等で測定したときの）ex
vivoでのエフェクター／記憶分化を検査することで、DCがT細胞に与える能力を調節するそれらの能力について検査する。
【０２９５】
本スクリーニング検定法で同定された化合物は、樹状細胞の誘導を調節する方法で用いることができる。このような化合物を、それらを細胞に接触させる前に（上に記載した）医薬組成物として調合することが好ましいであろうことは理解されよう。
【実施例】
【０２９６】
実施例
以下の材料及び方法を本実施例で用いた：
【０２９７】
マウス及びマウス細胞
C57/B6、OTIIxRAG1-/-、CX3CR1-GFP、Fas リガンド欠損
(FasLKO)、インドールアミン-ピロール 2,3-ジオキシゲナーゼ欠損 (IDOKO)、IL-6KO、IL-10KO 及び結節硬化症タンパク質1条件付きノックアウト (TSC1lox/lox) マウスをJackson
Laboratories 又はTaconic Farmsから得た。
【０２９８】
当業で解説された以下のマウス株を用いた：TCR トランスジェニック
(Bettelli, E., M. Pagany, H.L. Weiner, C. Linington, R.A. Sobel, and V.K.
Kuchroo. 2003. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific T cell receptor
transgenic mice develop spontaneous autoimmune optic neuritis. The Journal of experimental medicine
197:1073-1081); Foxp3GFP レポータマウス (Bettelli E, Carrier Y, Gao W,
Korn T, Strom TB, Oukka M, Weiner HL, Kuchroo VK. Reciprocal
developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and
regulatory T cells. Nature.
2006 May 11;441(7090):235-8);  L7
TCR トランスジェニックマウス (Maloy, K.J., C. Burkhart, G.
Freer, T. Rulicke, H. Pircher, D.H. Kono, A.N. Theofilopoulos, B. Ludewig, U.
Hoffmann-Rohrer, R.M. Zinkernagel, and H.
Hengartner. 1999. Qualitative and quantitative requirements for CD4+ T
cell-mediated antiviral protection. J Immunol 162:2867-2874);  CD274 欠損(PDL1-/-)、CD273 欠損 (PDL2-/-)
及びCD274/273 二重欠損動物
(PDL1L2-/-)(Francisco, L.M., V.H. Salinas, K.E.
Brown, V.K. Vanguri, G.J. Freeman, V.K. Kuchroo, and A.H. Sharpe. 2009. PD-L1
regulates the development, maintenance, and function of induced regulatory T
cells. The Journal of experimental medicine 206:3015-3029);
CCR2-RFP レポータ動物 (Saederup et al. Selective
chemokine receptor usage by central nervous system myeloid cells in CCR2-red
fluorescent protein knock-in mice. PLoS ONE (2010) vol. 5 (10) pp. e13693); 及び エプスタイン-バー-ウィルス誘導遺伝子3 欠損動物
(EBI3KO, Collison et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to
regulatory T-cell function. Nature (2007)
vol. 450 (7169) pp. 566-9)。
【０２９９】
未刺激CD4+ T 細胞を、様々な遺伝的背景の若いマウス（６乃至８週齢）のリンパ節（LN）及び脾臓の単個細胞懸濁液から単離し、磁気陰性選抜（MACS, Miltenyi）用にCD4+ T 細胞濃縮キットを用いて濃縮した。文章又は図面中に示した場合には、Foxp3GFP レポータ動物由来のT細胞はMACS 陰性選抜法により精製され、次に、抗-CD4 APC-Cy7 (GK1.5)、抗-CD25- PerCPCy5.5 (PC61)、抗-CD62L-APC モノクローナル抗体
(MEL-14) 及び抗-CD44 PE-Cy7 (IM7)で染色してCD4+CD25-CD62LhighCD44lowFoxp3GFP- 細胞をACSAria システム（BD
Biosciences社）を用いて単離した。 代替的には、Tn を、記憶T細胞及び内因性の天然発生型 Treg (nTreg) の存在しないRAG1欠損動物 (RAG1-/-) から得た。MACS-精製済みCD4+ T 細胞（野生型、トランスジェニック又はRAG1-/- 動物由来に関係なく）及びFACSソート済み
CD4+CD25-CD62LhighCD44lowFoxp3GFP- をTnと言及する。
【０３００】
場合によっては、それらのex vivo (1μM) 及びin vivo
(10μM）での増殖を追跡するために、10%のFCSを含有するRPMI培地に入れた細胞質染料カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルジエステル (CFSE, Invitrogen社)と一緒に３７℃で１０分間、インキュベートすることにより、TnをCFSEで標識する。
【０３０１】
ヒト細胞の調製
全末梢血単核細胞 (PBMC) を健康な個体からインフォームド・コンセント後に緑色キャップ付きヘパリン処置済み試験管内に by Ficoll-Hypaque (GE Healthcare社) 勾配遠心分離によって分離した。未刺激CD4+ T 細胞をPBMCから陰性分離キット
(MACS, Miltenyi Biotec社)で単離した。精製済み細胞のほぼ
94% は CD4+CD25-Foxp3GFP-CD62L+CD44lowだった。単球由来DC (BMDC)を得るために、単球をPBMCから磁気陰性選抜 (MACS, Miltenyi Biotec社) を用いた陰性選抜により精製し、GM-CSF
(100ng/ml) 及びIL-4 (15ng/ml)の存在下で６日間、培養した。この培養後、採集された細胞のほぼ９０％は CD11c+ MHC CLII+ MoDCだった。寛容原性MoDC (itMoDC)を誘導するために、MoDC
培養株に、培養の最後の２日間、ラパマイシン (1nM) 及びTGFβ(2ng/ml)を添加した。免疫原性MoDCを得るために、単球培養株には培養の最後に日にLPS (lpsMoDC、1μg/ml) を添加した。
【０３０２】
抗体及び試薬
マウス抗原に対する以下の抗体をBD Biosciences社から得た：抗CD3 (145-2c11)、抗-CD103-PE
(M290)、抗-CD152-PE (UC10-4F10-11)、抗-IL10R (1B1.3a)、抗-IL10
(JES5-16E3)、抗-IAb- PE (AF6-120.1)、抗-CD80-PE (16-10A1)、抗-CD86-PE (GL1)、抗-CD195
(CCR5、C34-3448)、抗-CD11c-FITC (HL-3)、抗-CD317-APC (PDCA-1、JF05- 1C2.4.1)、抗-CD197-PE
(CCR7、4B12)、抗-CD8α-APCCy7
(53-6.7)、抗-CD62LAPC (MEL-14)、抗-CD4 APCCy7 (GK1.5) 及び抗-CD25-PerCPCy5.5 (PC61)。
【０３０３】
マウス抗原に対する以下の抗体をeBiosciences社から得た: 抗-Foxp3-Alexa
647 (FJK-16s)、抗-CD274-PE (PDL1、MIH5)、抗-CD273-PE
(PD-L2、TY25)、抗-CD275-PE (ICOSL、HK5.3)、抗- 41BBL-PE
(TKS-1)、抗-CD11b-PECy7 (M1/70) 及び抗-CD44 PE-Cy7 (IM7)。抗-GITR-PE-Cy7 (YGITR 765) はBiolegend社から得られ、そして抗-TGFβ (1B11) はR&D システムズ社から得られた。
【０３０４】
ヒト抗原に対する以下の抗体をeBioscience社から得た: 抗-HLA-DR
(L243)、抗-Foxp3 (206D)、抗-CD4 (RPA-T4)、抗-CD11c
(3.9)、抗-CD14 (61D3)、抗-CD25 (B696)、抗-CD40 (5C3)、抗-CD45RO (UCHL1) 抗-CD62L (Dreg 56)、抗-CD80 (2D10) 及び抗-CD83
(HB15e)。
【０３０５】
ヒト抗原に対する以下の抗体をBD Biosciences 社から得たHLA-ABC (G46-2.6)、抗-CD1a (HI149)、抗-CD3
(OKT3)、抗-CD32 (抗-FcRII、)、抗-CD54 (HA58)、抗-CD86
(2331)、抗-CD137L (41BBL、C65-485) 抗-CD196
(CCR6、11A9)、抗-CD197 (CCR7、3D12)、抗-CD205 (DEC-205、MG38)、抗-CD209 (DC-SIGN、DCN46)、抗-CD273 (PD-L2、MIH18) 及び抗-CD274 (PD-L1、MIH1)。
【０３０６】
以下の抗体を、ウェスタン・ブロット分析に向けてCell Signaling technology 社から得た： 抗-Akt (5G3)、 抗-p308Akt (244F9)、 抗-p473Akt (193H12)、 抗-p389S6K (108D2)、 抗-S6K (49D7)、 pS6 (D57.2.2E)、 抗-S6 (54D2)、 抗-4EBP1 (53H11)、 抗-p4EBP1 (174A9)。
【０３０７】
アフィジコリン、ラパマイシン、全-trans レチノイン酸、LPS、アトルバスタチン、プラバスタチン、過ヨウ素酸酸化ATP (oATP)、 5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミド-1-β-4-リボフラノシド
(AICAR)、 スラニム、 カルボニルシアニド P-(トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン(FCCP)、オリゴミシン,2’,3'-O-(4-ベンゾイル)ベンゾイル ATP (BzATP) 及びロテノンはSigma社から得られた。TGFβはR&D社から得られ、そして組換えヒトIL-2はRoche社から得られた。ジモザン、Pam3Cys、 Poly I:C、フラゲリン、イミキモド、R848、CL097 及びCpGはInvivogen社 （カリフォルニア州サンディエゴ）から得られた。 
【０３０８】
酸素消費測定
ミトコンドリア酸素消費速度 (OCR) はYSI 5300 クラーク型電極 (米国オハイオ州イェロー・スプリングズ、Yellow Springs Instrument社) 又は XF24
Extracellular Flux 分析器（マサチューセッツ州ビレリカ、Seahorse Bioscience社）をメーカーのプロトコルに従って用いることで測定された。初代培養DC (106 個の細胞／ウェル) は実験で解説された通りに用いられた。
【０３０９】
マウス樹状細胞の精製及び処置
樹状細胞（DC）を動物の脾臓から精製した。場合によっては、これらの動物に、DCを展開させるためにFLT3-リガンドを産生する黒色腫細胞系を接種した(FLT3Lm)。これらの動物の脾臓を採集し、３０分間、３７℃でRoche社のリベラーゼCI(250μg/ml)を用いて消化した。EDTAを添加した低温のHBSS中で解離させた脾臓から細胞懸濁液を得た。細胞を二重磁気陽性選抜法 (MACS) を用いてソートし、約98% CD11c+の純度に達させた。DCは、様々な時間、組織培養条件下 (37°C, 5%CO2) 又は氷上で様々な組合せのLPS
(1μg/ml)、ラパマイシン (10nM)、TGFβ、TGFβ (2ng/ml、Rapa/TGF)、全-trans レチノイン酸 (100nM)、プリン性受容体アゴニスト
ATP (1mM) 及び Bz-ATP (100μM)、プリン性受容体アンタゴニスト
oATP (100μM) 及びスラニム (100μM)、アデノシン一リン酸キナーゼ刺激剤 AICAR (100μM) 及び、ATPを触媒する酵素アピラーゼ 
(200U/ml) 、ミトコンドリア修飾因子であるFCCP (1μM) 及びロテノン (1μM)、アトルバスタチン
(100nM) 及びプラバスタチン (100nM)と一緒にインキュベートされた。細胞をよく（最高６回）洗浄し、Tnを活性化させるために用いた。適する場合には、DCにオブアルブミンタンパク質 (OVAp、100μg/ml)、オブアルブミンペプチド (OVA323-339 、1μM)、ミエリン乏突起膠細胞ペプチド
(MOG35-55, 10μg/ml) 又はVSV-G415-433 ペプチド (1μM)を負荷した。
【０３１０】
いくつかの実験では、DCを骨髄前駆細胞
(BMDC)から得た。骨髄前駆細胞は、メスのマウス（８週齢；１回の独立した実験当り１種の遺伝子型当り５匹のマウス）の大腿骨及び脛骨プールから、20 mM HEPES 緩衝液、2 mM L-グルタミン、2.5μg/ml ゲンタマイシンスルフェート、及び8% (v/v) FBSを添加した氷温の完全RPMI 1640 培養基で洗浄することで採集し、凝集物を、氷温の培養基中に繰り返しピペットすることでやさしく撹拌した。細胞を 400 x g で１０分間、8°Cで遠心分離した後、氷温の二価の無カチオンPBS (pH 7.4)中で二回、洗浄し、細胞を再懸濁させ、ACK 緩衝液（150 mM
NH4Cl、1.0 mM KHCO3 及び0.1 mM Na2EDTA、pH 7.4) 中で３分間、室温で溶解させることで赤血球を取り除いた。この溶解反応を、氷温の培養基の添加と、400 x g での１０分間、 8°Cでの遠心分離で停止させた。10 mM EDTA、0.1% BSA、及び10 mM HEPESを含有するPBS中に細胞を再懸濁させ、 200 x g で１０分間、 8°C で２回、遠心分離して血小板を枯渇させた。次に細胞ペレットを培養基に再懸濁させ、６-ウェル組織培養株クラスターに、１ウェル当り2.5 x 105 の密度で、総量4 mlになるように播種した。細胞は、37°C
で、5% CO2/95% の空気の無菌ろ過雰囲気中と、と完全に加湿したインキュベータ内で培養された。培養株を０日目と４８日目毎にIL-4 (10 ng/ml) 及びGM-CSF (25 ng/ml) の組合せでパルス負荷して、未熟な骨髄系DCを増殖させた。培養８日後、未熟DCを採集し、洗浄し、 8 x 105 個の細胞／ml の密度に12-ウェルの培養皿に総量2.0 mlになるように播種した。GM-CSFを８日間の代わりにFLT3L （100 ng/mL、ニュージャージー州ロッキー・ヒル、Peprotech社） を９日間、用いたこの手法の変更例も用いた。
【０３１１】
Ex vivo でのTreg 分化及び細胞内染色
マウス又はヒトTnをDC (3x105
個の細胞／ml) に、野生型動物由来のポリクローナルTnとヒト細胞を用いた場合には活性化抗-CD3（マウスには2c11、そしてヒト細胞にはOKT3）の存在下で混合することで、細胞培養条件 (RPMI 10%FCS、非必須アミノ酸、Hepes 緩衝液、ペニシリン及びストレプトマイシン中、3x106 個の細胞／ml、37°C、5%CO2 )で活性化させた。TCRトランスジェニック動物由来のTnはタンパク質又はペプチド負荷 DC （上述した通り）を用いて活性化させた。
【０３１２】
この同時培養の様々な時点で、細胞を洗浄し、それらの表現型を評価するために調製した。表面染色に向けて、細胞をPBS 及びPBS-FCS 1%
又はPBS-BSA 2% （洗浄媒質） で続けて二回、洗浄し、同じ媒質中で染色した。細胞内染色には、細胞を洗浄し、可透過性化し、BD Biosciences 社のキットをメーカーの指示に従って用いて染色した。非特異的染色はFc 受容体遮断性Ab
(CD16/CD32)を用いて遮断した。細胞を染色緩衝液中で二回、洗浄し、データを FACSCantoと用いて取得した。多様な比の itDC 対 Tn を用いてTreg分化をex vivoで誘導することができる。例えば itDC をTn と一緒に 1:100、1:10、1:1、10:1、又は100:1、及びこれらの範囲で同時培養することができる。例示的な実施態様では、 itDC を Tnと一緒に 1 DC:
10 Tnの比で同時培養する。
【０３１３】
マウス抑制検定
トランスジェニック-レポータ株CD45.2xOTIIxFoxp3GFP
由来のTnを、前に示した通りにFACS
ソートし、 TGFβ及びIL-2を添加したOVA323-339-負荷CD45.2+ itDC 又は ctrlDC に５日間、混合した。次に、GFP-CD11c-7AAD- (エフェクター、Teff 細胞) 及び GFP+CD11c-7AAD- 細胞 (Treg) を FACS 精製し、単離したばかりのCD45.1+CFSE-標識TnにOVA323-339-負荷した未処置DCの存在下で混合した。４日後に増殖をCFSE 希釈検定で評価した。
【０３１４】
ヒト抑制検定
前述した通りにヒトMoDCを単離し、処置し、自己由来又は同種 Tn（抗-CD3の存在下で）を活性化するために用いた。５日後に細胞を採集し、7AAD-CD11c-CD4+ 細胞に含まれていた CD25high (Treg) 及びCD25low-neg (Teff) をFACSソートした。自己由来の低温保存されたPBMC (10%DMSO中、90% FCS) を用いて新しいバッチのTn 及びctrlMoDCを作製した。マウス実験と同様に、これらのTn をCFSE 標識し、ctrlMoDC (及び抗-CD3) により活性化Treg 又は Teffの存在下又は非存在下で活性化させた。４日後にTnの増殖を FACS により、7AAD-CD11c-CD4+CFSE+ 細胞上の通門で評価した。
【０３１５】
混合白血球反応
脾臓未処置Balb/c DC（提供細胞）を CFSE-標識済みC57BL/6
Tn （応答細胞；各集団、 105 個の細胞）に混合した。示差的に処置したBalb/cxC57BL/6 (F1) DC (104/ウェル) をいくつかのウェルに加えた。４日後、応答側のCD4+TCRb+H-2Db+7AAD-CD11c- 細胞の増殖をFACSにより分析したCFSE希釈により測定した。
【０３１６】
トランスウェル実験
いくつかの実験では、同時培養をトランスウェル系（組織培養トランスウェル・プレート、0.4-μm ポア・サイズ；イタリア、ミラノ、Costar社） を用いて反復して、Foxp3 上方調節のためには、直接的な接触がitDC 及びTn 間に必要かどうかを判断した。上述した通りにDC を単離及び処置してTnを活性化させた。様々な組合せのDC-T
同時培養株を最上部（インサート）及び最下部の区画で用いた。
【０３１７】
マウスでの多発性硬化症モデル：  EAEプロトコル
C57/BL6動物を標準的なプロトコルに従ったEAEにより、100μg／マウスのMOG35-55 をCFAに入れた乳濁液を皮下注射することで誘導し、100ng／マウスの百日咳毒素 (PTx) を０日目及び２日目に静脈内注射した。EAEの採点は以下の指針を含んでいた。スコア１：弛緩性の尾。スコア２：歩行不正、歩行脆弱。スコア３：一本の四肢麻痺。スコア４：二本の四肢麻痺。スコア５：瀕死。スコア６：死亡。
【０３１８】
OVA誘導性実験的喘息のマウス・モデル
マウス (C57BL/6; 6-8 w.o.) に、報告された通り (Ohkawara Y, Lei XF, Stampfli MR, Marshall
JS, Xing Z, Jordana M. Cytokine and eosinophil responses in the lung,
peripheral blood, and bone marrow compartments in a murine model of
allergen-induced airways inflammation. Am
J Respir Cell Mol Biol. 1997 May;16(5):510-20)に、総量0.5mgの無菌PBSに入れた4mgの水酸化アルミニウムに4℃で一晩、吸着させた10μgのOVA (Sigma-Aldrich社) を腹腔内注射することで感作させた。マウスは５日間あけて２回、そして８日後に連続する三日間、OVAp (100μg) を鼻腔投与することで抗原刺激した。OVAp 抗原刺激開始の４８時間前に、感作済みマウスをitDCs 又はctrlDC (10x106 i.v.)で処置した。３回目のOVA刺激から７２時間後にマウスをと殺し、気管支肺胞洗浄 (BAL) を前に解説された通り (Alvarez D, Harder G, Fattouh R,
Sun J, Goncharova S, Stampfli MR, Coyle AJ, Bramson JL, Jordana M. Cutaneous
antigen priming via gene gun leads to skin-selective Th2 immune-inflammatory
responses. J Immunol. 2005 Feb
1;174(3):1664-74)に行った。簡単に説明すると、肺を解剖し、気管にポリエチレン・チューブ (BD Biosciences社)をカヌーレ挿入し、肺をPBS (0.5 ml)で二回、洗浄した。血球計数器を用いて総BAL細胞数を盲検的に判定し、300
rpm で２分間の細胞遠心分離（Shandon社製）でスミアを調製した。BAL スミアには、Protocol
Hema 3 染料セット (Fisher-Scientific社)で染色した。BAL スミアの示差的な細胞数を、少なくとも３００−５００個の白血球から標準的な血球学的基準を用いて盲検的に判定すすることで、細胞を好中球、好酸球、又は単核細胞に分類した。BAL細胞は、好酸球(CD11b+,
SSC-hi, Gr1-lo) 及びT細胞 (CD3+,
CD4+)の計数のためのフローサイトメトリに向けても染色された。
【０３１９】
HDM-誘導性実験的喘息のマウス・モデル
マウス (Balb/c 6-8 w.o.) をハウスダストダニ (HDM) 抽出物に以前に報告された通り
(Fattouh R, Al-Garawi A, Fattouh M, Arias K, Walker TD, Goncharova S, Coyle AJ,
Humbles AA, Jordana M. Eosinophils are dispensable for allergic remodeling and
immunity in a model of house dust mite-induced airway disease Am J Respir Crit Care Med. 2011 Jan
15;183(2):179-88)に感作させた。HDM 抽出物 (Greer
Laboratories, Lenoir, NC) を無菌の生理食塩水 (2.5 mg のタンパク質／ml)に再懸濁させ、10μlを、イソフルラン麻酔したマウスに鼻腔内投与した（鼻腔内投与当り25μgの総HMD抽出物タンパク質）。マウスを鼻腔内投与を通じて連続５日間、暴露した後に２日間を休止として合計５週間、HDM抽出物に暴露した。DCを採集し、上述した通りにラパマイシン及びTGFβで処置し、HDM (30μg/ml)で負荷した。静脈内 DC
療法（被処置又はコントロール）はHDM暴露の第一週後から２４時間後に開始し、合計４回のDC処置期間の実験プロトコル全体にわたって毎週、続行した (10x106 DC を各処置期間中、静脈内送達した)。肺機能測定はDC-処置及び未処置マウスや未刺激コントロールマウスで、５週間のHDM暴露後２４時間、以下に記載する通りに行われた。
【０３２０】
マウスにおける気道反応性亢進（AHR）の測定
肺機能の測定をFlexivent システム(カナダ、ケベック州モントリオール、Scireq社)を用いて行って気道の反応性亢進を判定した(Fattouh R, Al-Garawi A, Fattouh
M, Arias K, Walker TD, Goncharova S, Coyle AJ, Humbles AA, Jordana M.
Eosinophils are dispensable for allergic remodeling and immunity in a model of
house dust mite-induced airway disease. Am J Respir Crit Care Med. 2011 Jan 15;183(2):179-88)。マウスはキシラジン (12 mg/kg 腹腔内) 及びペントバルビタール
(70 mg/kg 腹腔内)で麻酔した。麻酔したマウスを気管切開し、カヌーレ挿入し、１分毎に１５０呼吸で一回呼吸量6 ml/kg を換気させた。肺機能測定中の自発的呼吸を抑制するために、麻酔後のマウスに臭化パンクロニウム (2 mg/kg 腹腔内)を注射した。増分量の噴霧化メタコリン（生理食塩水中0、3.13、12.5、25、及び 50 mg/ml ）を用いて総肺耐性
(cmH2O.s/ml) をスナップショット-150 摂動法によって判定した。各メタコリン用量毎に１３のデータ点を採集し、0.93を超える判定係数のデータのみを解析に含めた。この手法中のマウスの生存を心電図を用いて同時に観察し、解析中に死亡したマウスは解析から省いた。耐性は、噴霧化生理食塩水後に判定された基線耐性測定値を超えた変化のパーセントで表されている。
【０３２１】
実施例１：  ex vivoでの誘導寛容原性DCによるFoxp3+ Tregs の分化
寛容原性化合物をスクリーニングして、それらがDCを押印してTnを誘導してTreg表現型及び機能を獲得させる能力について調べた。寛容原性機能を持つDCを選抜する一次的な基準は、適した候補を特定するために、T細胞に対するFoxp3上方調節の表現型読み取り値から成る。ラパマイシン及びTGFβの組合せが、Tn上でFoxp3発現を惹起させる寛容原性DCを誘導する上で著しく優れた能力を有することが見出された。これらのT細胞は、Tregに特徴的な表現型及び機能（抑制）を有していた。重要なことに、誘導寛容原性DC (itDC) は、例えば活性化抗-CD3など、細胞周期又は強力なTCRアゴニストの阻害剤を用いて増殖が妨げられた場合でも、Tnの投入集団中でFoxp3発現を上方調節することができた。
【０３２２】
ａ）誘導寛容原性DCを特定するスクリーニング戦略。DCを、通常の動物か、又は、FLT3Lを発現する黒色腫細胞株を接種してDCをin vivoで増殖させるようにした動物から採集した。多様な寛容原性処置後に、これらのDCを用いてTnを多様な時間量、TCR刺激（抗原又はポリクローナル活性化抗CD3）の存在下でex vivoで刺激した。Foxp3 の発現はDCの寛容原性機能の指標である。
【０３２３】
ｂ）化合物のスクリーニング。  DCを２乃至１６時間、氷上又は組織培養条件下（37°C、5%CO2) で、様々な組合せのレチノイン酸 (100nM)、ラパマイシン
(100ng/ml) 及びTGFβ (2ng/ml)と一緒にインキュベートした。TnのドナーTCRトランスジェニック株に応じて、OVAp、OVA323-339、MOG35-55、VSV-G415-433 （材料及び方法で解説した通り）をこのインキュベーションで用いた。処置後、DC をよく洗浄した（最高６回）。Tn
は通常の C57BL/6 動物、Foxp3GFP レポータ動物、OTIIxFoxp3GFP、2D2xFoxp3GFP
又は L7xFoxp3GFP トランスジェニック×レポータ・マウスからMACS 及びFACS ソーティングにより、前に示された通りに分離された。いくつかの条件では、TGFβ及びIL-2 (両者とも20ng/ml )をT-DC同時培養株に陽性コントロール (+TGF/IL2)として添加した。ポリクローナルTn
を用いた場合、抗-CD3 抗体（1μg/ml) をDCとの関連から活性化刺激として役立てた。CD45.1+ 又はCD45.2+ 動物を DC及びTnのドナーとして用いた（実験全体にわたって交換した）。この手法を図１ａに概略して示す。図１ｂは、DCとの同時培養５日後の細胞内染色及び表面染色によって同定された、又は、CD4+CD11c- 細胞のGFP発現を測定することによって同定されたFoxp3 及びCD25 発現細胞のパーセンテージを示す。いくつかの実験では、7AAD 染色を用いて死亡細胞を特定した。P値は、通常の二方向ANOVA
検定 (* = p<0.05, ** = p<0.01, *** =
p<0.001)のボンフェローニ・ポスト検定を用いて計算された。その結果は、５個の異なる個別の実験を表し、各点は三重試験のうちの一つである。DC条件付けのこのスクリーニングにより、DCをラパマイシン及びTGFβの組合せで処置することは、DCに寛容原性能を押印する上で著しく優れた能力を有することが判明する。このことは、未刺激T細胞上でのFoxp3発現を測定することで評価された。細胞分裂ではなく、コグネートAg又は抗-CD3による活性化が、TnでFoxp3が誘導されるのに必要である（以下を参照されたい）。更に、itDCは、それらがコグネート・ペプチドでパルスされたか、又は全タンパク質でパルスされたかに関係なく、抗原特異的TnでFoxp3を誘導した。
【０３２４】
ｃ）Foxp3+Tregの表現型及び分化動態。  DC をCD45.1+ 遺伝子導入動物の脾臓から前に記載された通りに分離及び精製した。未処置、コントロールDC (ctrlDC)、リポポリ多糖処置、免疫原性DC (lpsDC、1μg/ml)、又はラパマイシン及びTGFβ（itDCの誘導物質例)(100ng/ml
及び20ng/ml)を２時間、組織培養条件下（37°C、5% CO2）でインキュベートした。ポリクローナルTnはCD45.2+マウスからMACS 及びFACSにより前に解説された通りに分離され、それらの増殖プロファイルを評価するためにCFSE（材料及び方法を参照されたい）で標識された。場合によっては、TGFβ及びIL-2
(20ng/ml) を Tn-DC同時培養株に陽性コントロールとして添加した (ctrlDC+TGF/IL2)。全てのTn-DC 同時培養株に1μg/ml の活性化抗-CD3を添加した。図１ｃは、提示したマーカーについて染色した後の培養５日目のCD4+CD11c-CD42.1+ 細胞を示す（Foxp3を検出するために細胞内染色を行った）。この図は３つの個別の実験の代表的プロットを示す。これらの結果は、itDC 又は陽性コントロールctrlDC+TGF/IL2の存在下において、Tn は、ctrlDC 及びlpsDCに比較したときに著しく低い増殖率と高いFoxp3及びCD25 発現率を示す、Tregに似た表現型を獲得することを実証している。
【０３２５】
ｄ）Foxp3誘導体に対するTCRシグナル伝達強度の役割。  実施例１ｃと同じ条件下で細胞を精製し、培養し、採集し、分析した。様々な濃度のαCD3抗体(2c11) を、それらのTn刺激能及びFoxp3発現惹起能について検査した。同時培養５日目における単個CD4+CD11c-7AAD-細胞中のFoxp3+CD25+ 細胞の比率を図１ｄに示す。各点は、二つの代表である、一個の独立した実験の三重試験の平均に相当する。この実験は、Foxp3発現は、強力なTCR刺激が提供された場合でもitDCによって達成できることを示している。
【０３２６】
ｅ）  ex vivoにおける寛容原性DCによるFoxp3+ Treg の誘導の動態。細胞周期遮断剤であるアフィジコリン（Aph）(4μg/ml)の存在下又は非存在下で、実施例１ｃと同じ条件下で細胞を精製し、培養し、採集し、分析した。図１ｅは、２つの独立した実験の代表的結果を含む。プロットは、培養の様々な時点における単個CD4+CD11c- CD45.1+ 細胞を示す。これらの結果は、Foxp3発現の誘導なTnの最初の集団内で起きること、そして、５日目の出力はその大部分でFoxp3の上方調節と、そしておそらくはこれらのFoxp3+T細胞の増殖とを表すことを示している。
【０３２７】
f, g)Treg
vs nTregの表現型。 実施例１ｃと同じ条件下で細胞を精製し、培養し、採集し、分析した。Tn 及び天然発生型 Treg
(nTreg) をFoxp3GFPxCD45.1 レポータ x 遺伝子導入マウスからFoxp3GFP-
Tn 又は既存の天然発生型Foxp3GFP+ Treg (CD4+ CD62Lhigh
CD44low CD25+ Foxp3GFP+、nTreg) のMACS及びFACS ソーティングで分離し、様々な種類の DC により、活性化抗-CD3の存在下で活性化させた。培養５日後に、itDC 又は陽性コントロール（TGFβ及びIL-2）により誘導されたTregの表現型を活性化Treg
(ctrlDCを持つ)に比較した。図１ｆは、示したDC集団との同時培養後の、CD4+CD11c-CD45.1+7AAD- 細胞中のFoxp3+CD25+ 細胞のパーセンテージを示す（３つの独立した実験の代表的結果）。図１ｇに示されたプロットは、DCで指示されたTreg又はnTreg （Foxp3+CD25+
CD4+CD45.1+7AAD- 細胞）上の、示したマーカーの発現を示す。CD103と例外として、itDCで刺激されたTreg は、nTregに比較するとGITR、CD152、CD25、CD127、CD62L の大変似た発現を示す。
【０３２８】
ｈ）Foxp3+ 細胞のFACSソーティング戦略。 CD45.1+ 動物由来のDCを組織培養媒質 (ctrlDC)のみ、ラパマイシン(100ng/ml)
及びTGFβ
(2ng/ml)(itDC)、LPS (1μg/ml、lpsDC) 及びOVA323-339 （材料及び方法で解説した通りに）を加えた組織培養条件（37°C、5%CO2）下で２時間、インキュベートした。処置後、DC を３回、洗浄した。TnをCD45.2xOTIIxFoxp3GFP動物から MACS 及びFACS により、前に示した通りに分離した。いくつかの条件では、TGFβ及びIL-2（両者とも20ng/ml ）をT-DC 同時培養物に陽性コントロールとして加えた（ctrlDC+TGF/IL2）。itDC 又はctrlDC+TGFβ/IL-2との培養５日後に、T細胞を二つの主要な集団にGFPの発現に従って分散させた。これらの細胞をFACS-ソーティングし、Tnの増殖に対するそれらの抑制能を検査するために用いた。
【０３２９】
i)
Foxp3+ 細胞は抑制するがFoxp3- 細胞は抑制しない。  GFP+ Treg 及びGFP- 活性化エフェクターT細胞 (Teff) を実施例１ｈで解説した通りに得た。OVAp 及びOTII+CD45.1+ Tn を等しく負荷した二回目のCD45.1+DC をソーティングし、CFSE
(TnCFSE) で染色し、それぞれ抑制検定の読み取り値又はコントロールとして用いた。これらの分離したばかりのCD45.1+ Tn を、分化後のCD45.2+ Foxp3GFP+ Treg 及びFoxp3GFP- Teff 細胞と一緒に図１ｉに示した通りに培養した。TnCFSE のCFSEプロファイルをFACS
(CD4+Vα2+CD45.1+CD11c-7AAD- 細胞)で評価した。図１ｉに示す、これらの結果は、itDCによる刺激後にFoxp3を発現するT細胞（レポータGFPを用いて同定される）は、ex vivoでTnに対して抑制活性を有することを実証するものである。Foxp3を発現しない同じ培養物由来の、分離したばかりのTn （図示せず）又はTeff
細胞はこの抑制活性を有さない。
【０３３０】
ｊ）Tregの抑制機能はTn対Treg比に依存する。  CD45.2+Foxp3GFP+ Treg を上述したように分離し、分離したばかりのCD45.2+Foxp3GFP+ nTreg に、それらの抑制能について、様々な抑制細胞Treg 対応答細胞CD45.1+TnCFSEにして比較した。図１ｊは、同時培養４日目のCD45.1+CD4+TCRVα2+CD11c-7AAD- T 細胞の２つの実験の代表的プロットを示す。これらの結果は、itDCで刺激されたFoxp3+
Treg の抑制活性はnTreg に匹敵し、部分的には Treg 対 Tn 細胞の比に依存することを示している。
【０３３１】
実施例２：  ヒト誘導単球由来樹状細胞 (itMoDC)
単球及び未刺激CD4+ T 細胞を、様々なドナーの末梢血単核細胞 (PBMC) から磁気陰性選抜によって精製した。単球は、上述した通りの標準的プロトコルを用いてDCに分化させた（単球はPBMC
から、MACSによる磁気陰性選抜法を用いた磁気選抜により精製され、GM-CSF (100ng/ml) 及びIL-4 (15ng/ml)の存在下で６日間、培養され、それらの分化中、示した処置で配合された（材料及び方法を参照されたい）。図２ａは、投入Tn 細胞及び MoDC（左側パネル）と、示した通りにMoDCで活性化させた後のT細胞のFoxp3 及びCD25 の発現プロファイルを示す(ctrl−未処置；it−ラパマイシン／TGFβ；lps−リポ多糖)。図２ｂは、５つの独立した異なる実験から採った集積データを示す。各ドットは異なるTn細胞ドナーを表す（３重試験の平均）。MoDC 及びTnはそれぞれ５及び２１の異なるドナーから分化させた。P 値は通常の二方向ANOVA検定のボンフェローニ・ポスト検定を用いて計算された (* = p<0.05, ** = p<0.01,
*** = p<0.001)。これらの実験は、ヒトDCをラパマイシン及びTGFβで処置すると、他のDCとは著しく異なるFoxp3誘導能がヒトTnで惹起されることを示している。驚くべきことに、一パネルの共刺激分子に関する、これらの様々なサブセットのDCの表現型は、図２ｃに示す通り、とても似ていた。抑制機能がitMoDCによって誘導されたのかどうかを検査するために、活性化T 細胞
(CD45RA-CD25+/-、Teff) 及び推定Treg (CD45RA-CD25high) をFACSソートし、MoDC及び新鮮なCFSE-標識済みTn の、抗-CD3との同時培養株に加えた。図２ｄのヒストグラムは、CD25- (Teff) 又はCD25high (Treg)との３日間の培養後のTn（増殖）に対するCFSE希釈度を示す。従って、ヒトitDC-誘導性Foxp3+ T細胞は、同時培養されたTnの増殖を抑制した。
【０３３２】
実施例３：  itDCの表現型
itDCの、提示分子及び共刺激分子のそれらの発現における表現型や、サブセット中の組成を調べた。ctrlDC and itDC間には、それらが分離されたばかりのものか、又は、成熟表現型の発現（提示分子及び共刺激分子）又は機能（Foxp3の誘導）についてtoll様受容体（TLR）アゴニストで刺激されたどうかに関係なく、著しい違いは観察できなかった。対照的に、著しい違いがDCサブセット同士の間ではTnでFoxp3を誘導するそれらの基礎能力の間に存在する。しかしながら、全てのDCサブセットは、ラパマイシン及びTGFβ処置には似た応答をする（Foxp3-誘導能の倍増）。分子解析により、itDCはラパマイシン（mTOR）経路の不活性な哺乳動物標的を有することが判明した。GM-CSF及びIL-4を用いて骨髄前駆細胞（BMDC）を分化させて得られたDCは、ラパマイシン及びTGFβで処置したときに乏しい寛容原性機能しか生じなかった。しかしながら、ラパマイシン及びTGFβ処置後のFLT3Lの存在下での分化では、Tn上でFoxp3発現を誘導する能力を持ったBMDCが誘導された。
【０３３３】
ａ）提示分子及び共刺激分子の発現。
マウスDCを実施例１ｈで解説した通りに精製及び処置したが、通常の組織培養条件で一晩、インキュベートした。細胞を採集し、図３ａで示したように染色した。CD11c+7AAD- 細胞上の提示したマーカーの平均蛍光強度の平均(+/- 標準偏差)を示す（結果は、三つの独立した実験の三重試験の平均であり、代表である）。p値は、通常の二方向ANOVA検定のボンフェローニ・ポスト検定を用いて計算された。これらの結果は、itDCの表現型は 主要組織適合複合体 CLII 発現及び共刺激分子CD80、CD86 及びICOSLの発現については、それらのコントロール相対物に匹敵することを実証ている。同様に、CD40、CD134L
(OX40L)、CD137L (4-1BBL)、CD273 (PD-L2) 及びCD274
(PD-L1)、CD276 (B7-H3)、B7-H4、ICAM1-3、LFA-1、α4β7インテグリン、CCR2、CCR4、CCR5、CD196
(CCR6)、CD197 (CCR7)、CCR9、CX3CR1、CXCR3 及びCXCR4 の発現レベルはitDC 及びctrlDC （LPSによる成熟前又は成熟後、図示せず）間では区別がつかなかった。重要なことに、 itDC は、TLRアゴニストの存在下では高レベルの提示及び共刺激分子を獲得することができるようであり、それらが成熟表現型を獲得することができることを示唆している。
【０３３４】
ｂ）成熟及び未熟itDCの機能。  実施例１ｈで解説した通りに、DC を正常な動物から分離し、処置し、OVApを負荷し、OTIIxFoxp3GFP 動物由来のTnを刺激するために用いた。提示した場合には、toll様受容体アゴニストをラパマイシン及びTGFβ（itDC＋）と同時に添加した。ある条件では、ラパマイシン及びTGFβ処置による２時間の処置から２時間前にLPSを添加した（ＬＰＳ  ２ｈ）。ラパマイシン及びTGFβ処置の前及び処置中にitDCを複数のTLRアゴニストに暴露しても、成熟マーカーの上方調節にも係わらず、寛容原性は変わらなかった（図３ｂ）（上を参照されたい）。
【０３３５】
ｃ）DCサブセットのためのソーティング戦略。  異なるDCサブセットがTn上でFoxp3発現を誘導する能力を検査するために、DCを、黒色腫産生性FLT3Lを接種した動物から分離し、FACSソーティングし、図３ｃでここに記載した戦略を用いてCD11c+B220+PDCA1+ (pDC) 及びCD11c+B220-PDCA1-: CD11b+CD8α- (CD11b+)、CD11b-CD8α+ (CD8α+)、及び CD11b-CD8α- (DN) を得た。
【０３３６】
ｄ）DCサブセットの相対的寛容原性の比較。DCサブセットを上に記載した通り（又は逆）に処置及びソーティングし、実施例３ｂの通りにOTII+Foxp3GFP- 細胞を活性化するために用いた。TnでFoxp3を誘導するそれらの能力を分析すると（図３ｄ）、未処置のDCですら、Tregを誘導する特徴的な基礎能力を有し、pDC≧CD8α＋
>> CD11b+ = CD8α-CD11b- (DN)であることが判明した。しかしながら、ラパマイシン及びTGFβで処置すると、各サブセットの寛容原性は実質的に亢進されたことから、全てのDCはこの条件付けに感受性であることが示された。
【０３３７】
図３ｂ及び３ｄの結果は、培養５日目のFoxp3GFP+CD25+CD4+CD11c-7AAD- 細胞のパーセンテージを表す。p値はすべて、一方向もしくは二方向ANOVA検定のボンフェローニ・ポスト検定を用いて計算された。
【０３３８】
ｅ）itDC中のmTOR経路の状態。  DCを前の図面の通りに分離及び処置して、itDC、lpsDC 及びctrlDCを得た。更なるコントロールとして、分離されたばかりのDCを氷上（４℃）に維持したものを含めた。６時間後に細胞を溶解させ、ウェスタン・ブロットで分析して示した種を調べた（左側）。図３ｅの結果は、予想通り、mTOR S6、S6K 及び4EBP1の顆粒の標的のリン酸化に証左されるように、LPSによる処置でmTOR経路の活性化が増すことを示している。これらの因子の基礎リン酸化及びリン酸化増加は、ラパマイシン及びTGFβによる処置で完全に遮断された。Aktの活性化には影響はほとんど観察できないか、又は全く観察することができない。
【０３３９】
ｆ）itDC中のmTOR経路の状態：動態。  DCを前の図面の通りに分離及び処置して、itDC、lpsDC 及びctrlDCを得た。更なるコントロールとして、分離されたばかりのDCを氷上（４℃）に維持したものを含めた。様々な時点で細胞を溶解し、ウェスタン・ブロットで分析して示した種を調べた（左側）。図３ｆの結果は、予想通り、mTOR S6、S6K 及び 4EBP1の顆粒の標的のリン酸化に証左されるように、LPSによる処置でmTOR経路の活性化が増すことを示している。これらの因子の基礎リン酸化及びリン酸化増加は、ラパマイシン及びTGFβによる処置で完全に遮断された。
【０３４０】
ｇ）由来の異なるDC間の比較：  骨髄細胞を８日間、標準的なプロトコルに従ってGM-CSF及びIL-4 又は FLT3L の存在下で培養して、骨髄由来DC (BMDC、材料及び方法を参照されたい)を得た。これらの細胞のいくつかを６日目に更に二日間、ラパマイシン(5ug/ml)
及びTGFβ(2ng/ml)
で処置してitDCを得るか、又は、E. coli由来のリポ多糖と配合した
(it/lpsDC、1ug/ml)。全ての細胞に採集から２４時間前にOVAp を与えて、OTII+Foxp3GFP-CD45.1+ Tnを活性化させた。この同時培養の５日後にVα2+CD4+CD45.1+
細胞中のCD25+Foxp3+
の存在をFACSで評価した。陽性コントロールは、更なるTGFβ及びIL-2 を添加した細胞培養株（ctrlDC+T2）だった。これらの結果は、FLT3Lの存在下でBM前駆細胞から得られたBMDCは、Tn上でFoxp3を誘導する上で脾臓DCと同様な能力を有するが、GM-CSF の存在下で得られたBMDCは有さないことを示している。
【０３４１】
実施例４：  itDCによる寛容誘導の機序
itDCがTn上でFoxp3発現を誘導する能力における、複数の寛容原性因子の関与を、遮断抗体を用いてそれらの発現が欠損した動物からDCを得ることで評価した。その結果は、itDC 機能は、DCによるIL-6、IL-10、TGFβ、FasL TSC1、EBI3 及びIDO1の産生とは独立であることを示している。
【０３４２】
実施例１ｈで前に解説した通りの、様々な種類のOVAp-負荷DC及びOTII+Foxp3GFP-
Tn を含有する同様な培養を、10μg/ml の遮断性抗IL-10 (JES5-16E3) 及び抗IL10R (1B1.3a) (+aIL-10) 、及び／又は、遮断性抗TGFβ (1D11、aTGF) 又はアイソタイプ・コントロール
(+Ctrl Ig)を添加することで行った。ある条件では、IL-10 欠損 (-/-) 動物をDCのドナーとして用いた。結果を図４ａに示すが、同図において各点は独立した実験及び三重試験の平均を表す。これらの結果は、Tn細胞におけるFoxp3の刺激には、itDCによるIL-10又はTGFβの分泌は関与しないことを実証している。
【０３４３】
加えて、IDO1（図４ｂ）、EBI3 （図４ｃ）、FasL （図４ｄ）、IL-6 （図４ｅ）充分又は欠損DCを上の通りに条件付けしたときには、グループ間で何の有意な違いも観察されなかった。同様に、CD11c-Creトランスジェニック動物をTSC1lox/lox
条件付けノックアウト動物に交配して、mTOR活性を制御する因子であるTSC1を欠失させることで、全てのDCがTSC1発現を欠く (tsc1lox/lox)、一方のみの機能的アレルを発現する (tsc1+/lox) 又は両方を発現する (tsc1+/+)動物を得た場合にも、itDCがTn上のFoxp3発現を誘導する能力には何の違いも観察されなかった（図４ｆ）。動物はすべて同腹仔だった。しかしながら、プログラムされた死1受容体 (PD1)、PDL1、PDL2 又は両者の発現を欠く動物由来のDCを用いた場合には、Foxp3発現を惹起する能力の低下が観察された（図４ｇ）。
【０３４４】
これらの実験は、itDCは、IL-6、IL-10、TGFβ、FasL TSC1、EBI3 及びIDO1とは独立に、部分的にPD1経路を通じてTn上のFoxp3発現を誘導することを示している。
【０３４５】
実施例５：  ex vivoでのT細胞に対するitDCの効果は、接触依存的であり、itDC:T 細胞比によって影響される
Ex vivoでのそれらの同時培養中の、Tnに対するitDCの効果をより良好に特徴付けるために、実施例１ｈのそれと同様な実験を、トランスウェル実験を用いて、又は、itDCを免疫原性lpsDCと配合して、行って、T細胞生存率がこれらの同時培養で影響を受けるかどうか、又は、細胞接触が、itDCによるTn上のFoxp3誘導に必要であるかどうかを判定した。
【０３４６】
図５ａにおいて、正常なCD45.2+ 動物由来のDCを前の実験通りに分離し、OVApを負荷し、処置してctrlDC、lpsDC及びitDCを作製し、活性化OTII+Foxp3GFP-CD45.1+
Tn をトランスウェル・チャンバー内に作成するために用いた。DCを単独で、又は、 Tn
(*) と組み合わせて上側／下側チャンバーに入れた。Vα2+CD4+CD45.1+
細胞中のCD25+Foxp3+ の存在を５日後にFACSで評価した。これらの実験は、Foxp3発現の上方調節を達成するためには、itDC 及びTn 間に直接的な接触が必要であることを示している。更に、免疫原性lpsDC の存在はitDCがFoxp3 発現を誘導することの妨げとはならなかった。実際、図５ｂでは、上と同様のitDC及びTn の同時培養を行ったが、提示するように、DCの異なる組合せ及び比を用いた。Vα2+CD4+CD45.1+ 細胞中へのCD25+Foxp3+
の存在を５日後にFACSにより評価した。 50
itDC 対 50 ctrlDCの比 又は lpsDC 又はそれより低い比では検出可能な違いはなかった。興味深いことに、これらの実験では、誘導されるTregの比率は、itDCの半分を用いた場合に低くなる。しかしながら、100 lpsDC 毎に1 という少ないitDCでTn上でFoxp3+ 発現を誘導することができたことは（図５ｃ）、itDC は、完全に免疫原性のDCが大部分であっても寛容原性事象を惹起することができることを示唆している。Foxp3+ Treg の比率は、itDCを加える量を多くする又は少なくすることで、それぞれ減らす（図５ｃ）又は増やす（図５ｄ）ことができるため、itDC の寛容原性効果は itDC:Tn 比に依存的である。
【０３４７】
実施例６：  ex vivoのitDCによる抗原特異的T細胞の枯渇及びFoxp3発現の誘導
未刺激 (Tn) 及びエフェクターT細胞 (Teff)上でのitDC効果を更に特徴付けるために、
DCにOVAp を負荷し、前に記載した通りに示差的に条件付けして、免疫原性 (ctrlDC < lpsDC) 又は寛容原性 (itDC) 表現型を惹起した。DCを用いてOVA-特異的OTII+ Tnを活性化した。lpsDC 及びctrlDC を含有する同時培養株では強力なT細胞増殖が３日目に開始し、TGFβ及びIL-2 をctrlDC （ctrlDC+T2；図６ａ）に添加した場合には更に明白だった。対照的に、itDCに暴露してあったTn の増殖は低かった。興味深いことに、T細胞数も３日目より前に劇的に変化した。用いたDCサブセットに関係なく、最初の二日間にTnに著しい収縮があった。１日目及び２日目中のT細胞数を慎重に比較すると、itDCがあることで、ctrlDCに比較してTnに最高２倍のTn喪失があったことが判明した（ctrDCに正規化、図６ｂ）。更に、細胞を培養物中に単独で放置した場合に生き延びたTn数に比較すると、ctrlDC
及びlpsDC の存在は何の効果もなく、他方、itDC
及びLPS-活性化itDC
(it/lpsDC) はT細胞の劇的な更なる喪失を引き起こした（図６ｃ）。itDCのこの効果は、血小板結合型活性化aCD3 プラスaCD28による同時の強力な刺激でも可逆的ではなかったが、更なるIL-2でT細胞数が部分的に回復した（図６ｃ）。重要なことに、活性化TeffをitDCと同時培養した場合にも、著明なT細胞枯渇が観察された。しかしながら、Teff数は２日目にしか影響を受けなかった（図６ｄ）。
【０３４８】
更なる実験により、itDCがTnに及ぼすT細胞枯渇効果はT 細胞 : itDC 比に依存ずることが判明した（図６ｅ）。最も低い比 （我々の標準的な検定に比べて１０倍多いDC数を反映する1:1）では、生存Tnは７５％を超える減少を見せた（図４ｄ）。対照的に、itDCの、TnでのFoxp3誘導能は Tn : itDC比 （実施例５ｂ及び５ｄ）の変化の影響をごく僅かにしか受けなかったことから、itDCが従来のT細胞を削除する機序とTregを誘導する機序は別個である可能性が示唆された。
【０３４９】
図６ａ）  ex vivoでのTn生存の動態。   DC にOVA タンパク質を負荷し、50μg/ml のラパマイシン及び20ng/ml のTGFβ(R+T)、又は LPS (1μg/ml) で処置し、洗浄してそれぞれitDC
及びlpsDCを得た。いくつかのDCはR+T 及びLPS
(it/lpsDC)で同時処置した。コントロール (ctrlDC) は、各試薬に用いた溶媒のみで同一に培養した。陽性コントロールとして、TGFβ及びIL-2 をTn-ctrlDC同時培養株
(ctrlDC+T2)に添加してFoxp3 を直接誘導した（図６ａ）。点線は投入されたTnを表す。
【０３５０】
図６ｂ）  itDCにより誘導されるTnの選択的な早期消失。  前の図面のデータは、ctrlDCとの同時培養におけるT細胞数に正規化されている。白色の記号は１日目に得られた結果を表し、塗り潰された記号は２日目の比を表す。
【０３５１】
図６ｃ）  TCR刺激はitDCの有害な効果を克服しない。  OTII+Foxp3GFP- Tnを、様々な種類のOVAp-負荷DC により前の図面の通りに刺激した（図６ｃ）。Tn は単独のままとする（Tnのみ）か、又は、提示した通りに異なるDC試料と混合された。ある条件では、活性化aCD3 及びaCD28 MAbs をプレートに結合させることで、itDC (itDC+aCD3)の存在下でTnを最大に活性化させた。別の条件では、補助的なIL-2 を同時培養株に０日目に開始して添加した (itDC+IL-2)。
【０３５２】
図６ｄ）  itDCはTeff細胞数を減少させる。  培養の５日間かけてlpsDC で活性化させた後に、提示したDCサブセットの存在下で同時培養したTnを用いて、前と同様な実験を行った。
【０３５３】
図６ｅ）  itDC:T 比はT細胞の消失に影響を与える。  itDCによるT細胞枯渇が培養物中に存在するitDCの数に依存するかどうかを評価するために、Tnを様々な数のOVAp-パルス負荷itDCと一緒に同時培養した。図面は、１日目及び２日目のTnの総数を示す。標準的な検定における当該比は、1 DC 対 10 T 細胞 (1x104
DC 及び1x105 Tn)を用いた。
【０３５４】
図６ａ、６ｃ、６ｄ及び６ｅに示すのはTGFβ+CD11c-Vα2+7AAD- 細胞数である。
【０３５５】
実施例７：  in vivoにおけるitDCによる抗原特異的T細胞の枯渇及びFoxp3発現の誘導
in vivoでitDCがどのように抗原特異的Tnに影響を与えるかを評価するために、CD45.2+ OTII+RAG1-/- Tn をCD45.1+ C57BL/6 レシピエントに静脈内注射した後、OVApを負荷した、示差的に処置したCD45.2+
DCを足蹠注射した。Tnは前に解説した通りにRag1-/-xOTII
動物から分離された。DC は実施例１ｈで解説された通りに分離され、OVApの存在下で処置された。様々な種類のDCを後ろ足の足蹠に皮下注射したが、他方、Tn細胞は静脈内注射した。１群当り３匹の動物を提示した時点でと殺し、それらの骨髄（BM）、膝窩（注射部位を排液する）及び鼠蹊部リンパ節（それぞれpopLN 及びingLN）並びに脾臓 (Spl) を採集した。導入細胞の存在について細胞懸濁液を分析した。この実験デザインの概略図を図７ａに示す。
【０３５６】
全DC種の泳動能を検査して、in
vivoで観察されたいずれかの効果がそれらのホーミングの違いで説明できることを除外した。 従って、FLT3Lを産生する黒色腫細胞株を接種されたCD45.1+ 動物由来のDCを前に解説した通りに分離及び処置してctrlDC、itDC 及びlpsDCを得た。これらの細胞に異なる染料又は細胞追跡剤で示差的に標識して、静脈内（図７ｂ）又は足蹠皮下注射（図示せず）後の提示した臓器におけるそれらの存在を検出した。異なる時点（１乃至３日、図示せず）でそれらを養子移入した後では、群間で有意な違いは検出できなかった。
【０３５７】
popLN由来の細胞を示す図７ｃに初期の時点を示す。左側のパネルはCD4+7AAD- 細胞を示し、右側のパネルはCD4+Vα2+7AAD- 細胞を示す。左側のパネルのパーセンテージは（黒い文）はCD4+CD45.2+Vα2+7AAD- を養子移入させたTn細胞のことである。図７ｃの右側のパネルはCD4+Vα2+ 7AAD- 細胞の通門である。パーセンテージは、内因性 CD45.2- T 細胞（灰色）及び養子移入した CD45.2+ (黒色)Tnを言う。図７ｄは、CD4+Vα2+ 画分中の移入したCD45.2+細胞のパーセンテージの定量を示す。 図７ｅは、DCを注射してから７日後（遅い時点）の動物のpopLN、ingLN 及びSpl中の内因性CD45.2-（灰色）及び養子移入した CD45.2+ （黒色） CD4+Vα2+ 細胞の三つの個別の実験の代表的プロットを示す。図７ｃ及び７ｄの集積データを図７ｆに示す。図７ｇの定量は内因性細胞 (CD45.2-)中のFoxp3+細胞の比率を示す。これらのデータは、itDC注射後のFoxp3の誘導は抗原特異的T細胞に限られること、即ち、Tregのポリクローナル増加はないことを示している。
【０３５８】
p値はすべて、通常の二方向ANOVA検定のボンフェローニ・ポスト検定を用いて計算された (* = p<0.05, ** = p<0.01,
*** = p<0.001)。
【０３５９】
これらの結果は、itDCの注射は健康な動物においてT細胞レパートリーの構成にとって著名な結果を有することを示している。非itDCを注射すると抗原特異的Tnの強力な活性化及び増殖が起きたが、他方、itDC注射は反対の効果を有し、即ち、これらのTnの量を減らし、残った細胞でFoxp3発現を誘導した。OTII+ 細胞数での低下は２日目に開始した誘導寛容原性DCのレシピエントの組織すべてで明白だった。この効果は、４日目及び７日目という、誘導寛容原性DCではなく、LPS処置細胞及びコントロールDCが強力なOTII+ T 細胞増殖を誘導した日に、より著明となった。Foxp3発現の誘導はそれより後に起き、５日目に開始した。この効果は、内因性Vα2+CD45.2-
Treg に変化がないままだったため、抗原特異的であった（図７ｇ）。
【０３６０】
実施例８：  疾患の経過に対するitDC投与の効果：自己免疫、同種応答及びアレルギー性喘息のマウスモデル。
自己免疫のモデル：実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）
C57/BL6 動物に、標準的なプロトコルに従って０日目及び２日目に100μg／マウスのMOG35-55 を溶かしたCFA乳液及び100ng／マウスの注射することでEAEを誘導した。免疫処置より８日前に（予防的、−８日目）又は１２日後（治療的、＋１２日目）に、動物に図８ａ（上側）に示すように107 DCを静脈内注射した。107 DC は実施例１ｂで示すように処置され、EAEを誘導するために用いたのと同じペプチドを負荷する(MOG+) か、又は負荷しなかった (MOG-)。いくつかの条件では、細胞の1/10 に注射した (106、1/10 MOG+。採点は疾患の発症から行われた（１２日目）。予防プロトコル（Prev）又は治療プロトコル（Ther）を用いたDC処置の直接的比較を図８ｂ及び図８ｃに挙げる。処置 (Tx)、発病率(Incid)、最大スコア (Max Score)。図８ｃは、EAE処置群同士の統計上有意差（p値）を示す (* = p<0.05, ** = p<0.01,
*** = p<0.001)。
【０３６１】
図８ｄ、８ｅ及び８ｆは、５つの独立した実験の集積データの同じパラメータを示す（１群当り５匹の動物、群合計当り２４匹の動物）。
【０３６２】
これらの結果は、itDCによる処置には、DCが特異抗原中に存在する(MOG+)必要がある可能性を示している。疾患のピーク時の処置は、このEAEモデルでは予防的介入よりも有効である。
【０３６３】
EAEに対するitDCの効果を更に調べるために、動物に免疫処置し、前に記載した通りに治療的に処置し、DC注射から５日後に動物をと殺した。頸部のLN及び脾臓を採集し、細胞をMOG35-55 で一晩、再刺激した。調節性T細胞 (Treg、CD25+Foxp3+ 及び／又はIL10+ 及び／又はTGFβ＋) 及びエフェクターT細胞 (Teff、IFNγ+ and/or IL-17+)の染色を行った。図８ｇは、治療用DC注射後のCD4＋生存単個細胞中のTreg及びTeff細胞のパーセンテージ及び総数を示す。
【０３６４】
T細胞表現型をEAEスコアと相関させるために、実験の終わりに動物をランダム化してそれらの臓器を採集し、MOG35-55 で一晩、再刺激した後にTeff 細胞 (IL-17+ 及び／又は IFNγ及び／又は TNFα)又はTreg 細胞 (CD25+Foxp3+ 及び／又は IL-10+
及び／又はTGFβ)の存在について調査した。脾臓、中枢神経系（CNS、脳及び脊髄）、リンパ節（頸部、上腕、鼠蹊部、腸間膜、図示せず）及び骨髄を採集した。図８ｈは、動物毎に各点がTreg／Treff比に対して平均EAEスコアの数値をプロットして表す相関プロットを示す。実線はベスト・フィット線を表し、点線は９５％信頼帯を示す。これらの結果は、回復中（DC注射後、又は注射なし）の動物が、高Treg／Teff比と、より低いスコアの疾患との間で著しく高い相関を有することを示している。
【０３６５】
p値はすべて、通常の二方向ANOVA検定のボンフェローニ・ポスト検定を用いて計算された (* = p<0.05, ** = p<0.01,
*** = p<0.001)。
【０３６６】
まとめると、これらのデータは、itDC処置は、おそらくはこの疾患を誘導及び維持するTeff細胞の消失を通じて、そして自己抗原に対する寛容を確実にするTregを刺激することにより、EAEの進行を有効に制止することを実証するものである。
【０３６７】
同種反応のモデル：混合型白血球反応 (MLR)
脾臓未処置Balb/c DC（提供細胞）をCFSE-標識C57BL/6 T 細胞（応答細胞；各集団の105 個の細胞）と混合した。示差的に処置したF1 (BalbxB6) DC (104/ウェル) をいくつかのウェルに添加した。４日後、応答細胞の増殖をFACSで分析した。C57BL/6
応答細胞のみ（提供細胞なし）を陰性（刺激無し）又は陽性コントロール（抗-CD3 刺激あり)として用いた。図８ｉ中のx軸ラベルは培養物中のF1
DCの存在及び状態のことである。itDCは、それらがLPSで活性化されているかいないか、そして更なるLPS-成熟化DC
(matDC)の存在下又は非存在下にあるかに関係なく、寛容原性であることに留意されたい。別の実験で（図示せず）、alb/c 及びC57BL/6 ドナー由来のitDCもT細胞増殖を減衰したが、その程度はF1ドナー由来のitDCよりも小さかった。
【０３６８】
アレルギー性喘息のモデル
アレルギー性喘息におけるitDCの効果を検査するために、材料及び方法で解説した通りにC57/BL6マウスをOVAに感作させて抗原刺激した。D11に、動物を未処置とする（ctrl）か、又は107
OVAp-負荷ctrlDC又はitDCを静脈内注射した。D18に動物をと殺した（図８ｊ）。BAL 液を好酸球 (CD11b+Gr1loSSC-Ahi、図８ｋ) 及びCD4+
T 細胞について評価した（図８ｌ）。最後の抗原刺激から３日後、itDCレシピエントの気管支肺胞液中の気道好酸球及びCD4+ リンパ球が減少していたことから、itDCは外因性抗原への病的応答を処置するために有用ではないかという発想と合致した。図８ｎは、マウスにハウスダストダニ（HDM、材料及び方法を参照されたい）を１週間に５日、鼻腔内的に、毎週５週間（HDM）、感作させ、メタコリン誘導性気道反応亢進（AHR、材料及び方法に解説した通り） をD25に測定した実験結果を示す（図８ｍ）。毎回のHDM刺激（毎週６日目、合計４回の処置）セット後のHDM-パルス負荷itDC 注射によりAHR応答が減衰したことから、itDcは治療効果を遺伝的背景（B6 及びBalb/c）に関係なく、そして炎症及び呼吸機能の両方のレベルで発揮することが示唆された。ここで、HDMはこれらのダニ由来の粗抽出物であり、ペプチド及び精製済みタンパク質で現在まで用いられているプロトコルとは反対に、抗原の複雑な混合物の代表であることに注目することが重要である。ここで提示した結果は、itDCは、このような製剤を用いて寛容原性効果を惹起することができることを示唆しており、これらは、免疫障害の過程で関連する抗原をプロセッシング及び提示することができるという構想と合致するものである。
【０３６９】
実施例９：  invivoのリンパ節においてFoxp3細胞の比率に対してラパマイシンの直接的処置には効果なし
TnをOTIIxCD45.1
ドナーから分離してCD45.2+ レシピエントに注射した。翌日、動物の後ろ足の足蹠にコントロールの生理食塩水 (PBS)、OVAp のみ (10ug)、ラパマイシンのみ
(1ug) 又は両者の組合せを注射した。５日後に排膿性膝窩及び非排膿性上腕リンパ節を抽出し、移入性 (CD45.1+) 又は内因性 (CD45.1-) Vα2+CD4+ 細胞中のCD25+Foxp3+にの存在について分析した。図９ａに示すように、養子移入した又は内因性T細胞には何の効果も観察できなかった。
【０３７０】
同様な実験を行って、in vivoのリンパ節でのFoxp3＋T細胞の比率に対するラパマイシンの直接的処置の効果を評価した。TnをCD45.1+ ドナーから分離し CD45.2+ レシピエントに注射した。翌日、動物の後ろ足の足蹠にコントロールの生理食塩水(PBS)、活性化抗-CD3 抗体 (10ug)、E. coli
(LPS、1ug) 由来のリポ多糖及びラパマイシン (1ug)を注射した。提示した時点で排膿性膝窩リンパ節を抽出し、提示した時点のVα2+CD4+CD45.1+細胞中のCD25+Foxp3+
の存在について分析した。図９ｂに示すように、Foxp3の量に何の違いも検出できなかった。
【０３７１】
実施例１０：  寛容原性DCを誘導するための更なる化合物のスクリーニング。
ａ）oATPはDCに寛容原性機能を誘導する。
DCを、正常なC57/BL6動物、又は、９日前にFLT3L産生性黒色腫を接種した動物の脾臓から得た抗CD11c結合ビーズ（ほぼ９８％純粋）による二重陽性選抜を用いたMACSにより精製した（材料及び方法を参照されたい）。DC はLPS (1μg/ml)、ラパマイシン
(10nM) 及びTGFβ（2ng/ml、Rapa/TGF）；プリン性受容体アゴニスト
ATP (1mM) 又は Bz-ATP (100μM)；プリン性受容体アンタゴニスト酸化 ATP (oATP、100μM) 又はスラニム（100μM）；又はアデノシン一リン酸キナーゼ (AMPK) 刺激剤 AICAR (100μM) 、又は、ATPを触媒する酵素アピラーゼ  (200U/ml) と一緒に２時間、組織培養条件(37°C,
5%CO2)下でインキュベートされた。メンドリオブアルブミンタンパク質 (OVAp、100μg/ml) をこのインキュベーションでDCを負荷するために用いた。処置後、DCをよく（最高６回）洗浄した。CD4+CD62Lhigh CD44low CD25-
Foxp3GFP- 細胞のFACSソーティングにより、Tnを OTIIxFoxp3GFPレポータ×トランスジェニックマウスから分離した (Tn Foxp3-)。CD45.1+ 又はCD45.2+ 動物をDC 及びTn （実験にわたって交換した）のドナーとして用いた。図１０ａは、処置済みDCと一緒に同時培養してから５日後のCD4+CD11c-7AAD- 細胞のGFP発現を測定することにより明らかにされたFoxp3 及びCD25 発現細胞のパーセンテージを示す。図１０ａは、５個の異なる独立した実験の結果を要約したものであり、図中、各点は三重試験の平均を表す。このDC条件付けスクリーニングにより、pATPによるDC処置はDCに寛容原性能を著しく押印することが明らかである。この能力は、ラパマイシン及びTGFβの組合せのそれに匹敵するか、又は超えるものである。
【０３７２】
ｂ）oATP 及び
AICARによる成熟の遮断： DC を分離し、６時間、４度
(ctrlDC 4C) 又は培養物に維持して ctrlDC (37C)、lpsDC itDC 及びit/lpsDCを作製した。同時に、細胞をプリン性受容体アゴニスト ATP (1mM) 及びBz-ATP (100μM)、プリン性受容体アンタゴニスト酸化ATP (oATP、100μM) 及びスラニム (100μM)、アデノシン一リン酸キナーゼ (AMPK) 刺激剤 AICAR
(100μM)及び、ATPを触媒する酵素アピラーゼ 
(200U/ml) で処置した。６時間後に細胞を採集し、提示したマーカーの発現をFACSで評価した。これらの実験は、oATP
及び AICAR はDC成熟を遮断することを示している。
【０３７３】
実施例１１：  ミトコンドリアに対するDC活性化の効果
O2 消費速度 (OCR) に対するDC活性化の効果を検査することで、OCRの増加と免疫原性増加とを相関づけようと試みた。事実、成熟シグナルを投与された数時間後にはコントロールDCはそれらのOCRを劇的に増加させたが、この増加はR+T 処置された寛容原性樹状細胞では起きなかった。図１ｋのパネル（ａ）は、コントロール及びLPS刺激樹状細胞での経時的なミトコンドリア呼吸（酸素消費速度）を示す。基礎及び未結合のOCR比の両者ともLPS後に増加した。一晩 (o/n) の成熟後は、lpsDC のOCRは減少した。
【０３７４】
パネルＢでは、PGC-1αの発現動態を、Y1-PGC-1α転写複合体はミトコンドリア酸化機能を制御するという事実に基づいて測定した。リアルタイムPCRを未処置（コントロール）及びLPS-処置済みDCに行い、GAPDHに正規化した。加えて、ミトコンドリアの透過型電子顕微鏡検査をコントロール及びLPS-処置済みDCに行い、パネルCに示す。パネルDは、ImageJソフトウェアを用いてミトコンドリア中のクリステ全長（nm）：同じミトコンドリアの面積（nm2）として判定した、活性化DC中のミトコンドリア・クリステの密度増加を示す。
【０３７５】
実施例１２：  DCのOCR及び免疫原性
高濃度の（細胞内ATPレベル及びATP放出の両方を制御するmTORと同様に、インフラソームを活性化させる）細胞外ATP はTLRアゴニストと同様にDC内のOCRレベルを上昇させた（図１２ａ）。oATP がitDC 機能を惹起し（図１０ａ）、成熟を遮断する（図１０ｂ）能力を念頭に、次に、この試薬を用いてATP受容体（ATPR）を遮断するとDCのOCRが減少するかどうかを検査した（図１２ｂ）。oATPで処置した細胞は、それらのコントロールに比較して、それらがLPSと一緒に同時処置されたかどうかに関係なく、OCRの減少を実証している。ミトコンドリア呼吸複合体Ｉの阻害剤であるロテノンによる、ミトコンドリア呼吸の直接的な阻害の効果を調べた。図１２ｃにしめすように、ミトコンドリア内の電子輸送をロテノンにより阻害すると、DC免疫原性が遮断される。CFSE標識されたOT-II T細胞を、LPSのみ又はLPS+1mMのロテノンで成熟させたOVAペプチド・パルス負荷DC と一緒にインキュベートした。コントロールDCをLPSで、OVA パルス負荷なしで処置した。T細胞増殖をCFSE 希釈によりD3に分析した。ロテノンの存在下でLPSで処置してあった抗原パルス負荷DCは、コントロールDCよりも遥かに小さいT細胞増殖を誘導した。対照的に、トランスウェル化学走性検定（図示せず）では、成熟マーカー (CD80、C86、MHC-II) とCCL21への遊走にDCサブセット間で違いはなかったことから、ロテノンはDCにとって毒性ではないことが示唆された。
【０３７６】
実施例１３：  DCのスタチン処置による寛容原性機能の誘導。
正常な動物由来のDCを、前の実験の通りでに分離し、OVApを負荷し、処置してctrlDC、lpsDC 及びitDCを作製した。加えて、細胞をアトルバスタチン (Atorva、10uM), プラバスタチン (Prava、50uM) 又はoATP (100μM) をラパマイシン、TGFβ及びLPSと組み合わせたもの又は組み合わせないもので、提示した通りに処置した。これらの細胞を用いてOTII+Foxp3GFP-CD45.1+ Tn を活性化し、５日後に培養物中でVα2+CD4+CD45.1+ 細胞中のCD25+Foxp3+ の存在をFACSで評価した。陽性コントロールは、付加的なTGFβ及びIL-2 を加えた細胞培養株 (ctrlDC+T2)だった。これらの実験は、スタチン処置が、 TLR アゴニストのLPSの存在に耐性であるラパマイシン及びTGFβの組合せと同様に、DCに対して寛容原性機能を惹起することを示している。
【０３７７】
均等物
本発明は、ここでは特定の実施例及び実施例のみを参照して解説されている。本発明のあらゆる可能な実施例及び実施態様を解説し尽そうという努力はなされていない。実際のところ、当業者であれば、多様な追加、削除、変形及び他の変更を、以下の請求項に限定された通りの本発明の意図された精神及び範囲から逸脱することなく、上述の実施例及び実施態様に行うことができることは理解されよう。このような追加、削除、変形及び他の変更は全て、以下の請求の範囲内に包含されるものと、意図されている。
【図１Ａ】
2013521002.tif 000002
【図１Ｂ】
2013521002.tif 000003
【図１Ｃ】
2013521002.tif 000004
【図１Ｄ】
2013521002.tif 000005
【図１Ｅ】
2013521002.tif 000006
【図１Ｆ】
2013521002.tif 000007
【図１Ｇ】
2013521002.tif 000008
【図１Ｈ】
2013521002.tif 000009
【図１Ｉ】
2013521002.tif 000010
【図１Ｊ】
2013521002.tif 000011
【図２Ａ】
2013521002.tif 000012
【図２Ｂ】
2013521002.tif 000013
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【図８Ｍ】
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【図８Ｎ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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