(57)【要約】  本発明は、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の組職を組職培養して得た組職培養細胞株から遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用標準物質を製造する方法及び、前記標準物質を利用して遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率を分析する方法に関する。本発明による遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物を各々組職培養して得た組職培養細胞株を利用した遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用標準物質は、組職培養を通じて遺伝形質が同一な個体を無数に得ることができるので、大量に培養容量を増加させると、バッチ間の不均質性を排除した均一な質の標準物質を大量に確保することができる。また、既存の穀物粉末を使用して製造する標準物質とは異なり、培養細胞株の純度が立証されることにより、純度が１００％である遺伝子変形（ＧＭ）または遺伝子非変形（ｎｏｎ−ＧＭ）の標準物質を確保することができるという長所がある。したがって、一定な造成の標準物質を常に均一で安定的に供給することができる。
2013511980.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物を各々組職培養する段階と、
各々の組職培養細胞株を分離する段階と、含むことを特徴とする遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用標準物質を製造する方法。
【請求項２】
前記分離された遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の組職培養細胞株を所定割合で混合する段階を追加で含むことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用標準物質を製造する方法。
【請求項３】
遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物を各々組職培養して得た各々の組職培養細胞株からゲノムＤＮＡを抽出する段階を含むことを特徴とする遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用標準物質を製造する方法。
【請求項４】
前記各々のゲノムＤＮＡを所定割合で混合する段階を追加で含むことを特徴とする請求項３に記載の遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用標準物質を製造する方法。
【請求項５】
遺伝子変形植物を組職培養して得た組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、導入遺伝子の塩基序列に特異的なプライマーを製作して分析試料のＰＣＲを実行することを特徴とする遺伝子変形植物の混入有無分析方法。
【請求項６】
遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物を各々組職培養して得た組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを遺伝子変形植物の混入率分析用標準物質で利用して分析試料から得たＰＣＲ産物と比較することを特徴とする遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法。
【請求項７】
前記標準物質と分析試料から得たＰＣＲ産物を比較することは、リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を利用することを特徴とする請求項６に記載の遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法。
【請求項８】
前記標準物質と試料から得たＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ産物との比較は、標準物質を検出用プローブ、導入遺伝子検出用プライマー及び内在遺伝子検出用プライマーでＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを実行して蛍光を測定して算出された遺伝子コピー数に対するＰＣＲサイクル数を示す標準曲線を利用することにより実行されることを特徴とする請求項７に記載の遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法。
【請求項９】
前記標準曲線は、遺伝子変形植物を組職培養して得た組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを所定割合で希釈して相違である遺伝子コピー数を有する複数個の標準試料に対してＰＣＲを実行し、それから得た遺伝子コピー数に対するＰＣＲサイクル数を適用して算出されることを特徴とする請求項８に記載の遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法。
【請求項１０】
前記標準曲線は、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の組職培養細胞株から抽出した各々のゲノムＤＮＡを所定割合で混合して相違である遺伝子コピー数を有する複数個の標準試料に対してＰＣＲを実行し、それから得た遺伝子コピー数に対するＰＣＲサイクル数を適用して算出されることを特徴とする請求項８に記載の遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法。
【請求項１１】
前記標準物質と試料から得たＰＣＲ産物との比較は、１００％遺伝子変形植物のＤＮＡを検出用プローブ、導入遺伝子検出用プライマー及び内在遺伝子検出用プライマーでＰＣＲして測定した蛍光量を、前記標準曲線に代入して遺伝子コピー数を測定することで、下記式により補正係数を算出することを特徴とする請求項８に記載の遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法。
2013511980.tif 000011
【請求項１２】
前記遺伝子変形植物の試料内混入率は、分析試料を検出用プローブ、導入遺伝子検出用プライマー及び内在遺伝子検出用プライマーでＰＣＲして測定した蛍光量を、標準曲線に代入して算出した遺伝子コピー数を利用して測定されることを特徴とする請求項８又は請求項１１に記載の遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法。
【請求項１３】
前記遺伝子変形植物の試料内混入率は、下記混入率算式により測定されることを特徴とする請求項１２に記載の遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法。
2013511980.tif 000012
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の組職を組職培養して得た組職培養細胞株から遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用標準物質を製造する方法及び、前記標準物質を利用して遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子変形植物（ＧＭＯ：Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ）とは、既存の作物育種による品種開発とは異なり、動植物または微生物の有用な遺伝子を人工的に分離、結合して生産性や機能性を増加させた生物体を総称するものである。一般的に、遺伝子変形植物の生産性を向上させて品質を強化するために除草剤抵抗性、耐虫性、耐病性、耐寒性、栄養増大などに関連された遺伝子を植物に導入している。
【０００３】
現在、世界的に一番多く商業化されている遺伝子変形植物では、トウモロコシ、豆があり、その他に、綿花、カノーラ、ジャガイモ、トマトなどの他の作物にも広く適用されている。しかし、遺伝子変形植物に対する安全性が科学的に検証されていないので、大韓民国の場合、遺伝子変形植物が３％以上混入された場合には、遺伝子変形植物であると表記するようにする表示制を施行しており、他の国でも混入許容値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）の差はあるが類似な実情である。
【０００４】
したがって、遺伝子変形植物の混入有無を測定する定性的な分析法の以外にも、混入率を定量的に測定する分析技術が要求されている。
【０００５】
遺伝子変形植物の定量分析法は、大きくタンパク質分析法とＤＮＡ分析法の二つに分類される。一般的に、遺伝子変形植物に導入された遺伝子から発現されるタンパク質を対象とするＥＬＩＳＡ法は、検出強度がＰＣＲ法に比べて落ち、熱処理などでタンパク質の変性が生ずる恐れがあるので限界がある。したがって、現在はリアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）法を利用して遺伝子変形植物に導入された遺伝子を定量する技術が主に利用されている。遺伝子変形植物の試料内の混入率をリアルタイムＰＣＲ法で定量するためには、遺伝子変形植物に導入された導入遺伝子のコピー数を比較することができる標準物質が必要である。
【０００６】
ＧＭＯ表示制の施行によって、遺伝子変形植物の混入許容値に対する分析の正確度、精密性などが非常に重要になっており、混入許容値に対する正確で精密な分析のためには分析に使用した標準物質が一番重要である。標準物質は長期間の保存可能性とその自体の安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）及び均質性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）も保障されなければならない。
【０００７】
現在、標準物質では、在来的な方式に基づいて各作物別遺伝子変形植物（ＧＭＯ）及び遺伝子非変形植物（ｎｏｎ−ＧＭＯ）の種子粉砕物を一定量ずつ重量によって混合して作った標準物質または遺伝子変形植物及び遺伝子非変形植物が一定量混合された試料から抽出した内在遺伝子及び導入遺伝子のアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を挿入して作った標準プラスミドが使われている。しかし、これら標準物質に対する信頼度については多い部分が改善される必要があり、特に、標準物質の製造時、開始試料の純度に対する情報とこれを立証する技術的な方法がないという問題点があった。したがって、一層安定的で均質に利用可能な標準物質の開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、開始試料の純度確保または立証の次元で、標準物質の信頼度を改善することで、本発明は、開始試料の純度が１００％で立証されただけではなく均質性まで確保された遺伝子変形植物の試料内の混入率分析用標準物質の製造方法及びこれを利用した遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物を各々組職培養する段階と、各々の組職培養細胞株を分離する段階と、を含む遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用標準物質の製造方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物を各々組職培養して得た各々の組職培養細胞株からゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）を抽出する段階を含む遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用標準物質を製造する方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、遺伝子変形植物を組職培養して得た組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、導入遺伝子の塩基序列に特異的なプライマーを製作して分析試料のＰＣＲを実行することを含む遺伝子変形植物の混入有無分析方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物を各々組職培養して得た組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを、遺伝子変形植物の混入率分析用標準物質として利用して試料から得たＰＣＲ産物と比較することを含む遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明による遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物を各々組職培養して得た組職培養細胞株を利用した遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用標準物質は、組職培養を通じて遺伝形質が同一な個体を無数に得ることができるので、大量に培養容量を増加させると、バッチ間の不均質性を排除した均一な質の標準物質を大量に確保することができる。また、既存の穀物粉末を使用して製造する標準物質とは異なり、培養細胞株の純度が立証されることにより、純度が１００％である遺伝子変形（ＧＭ）または遺伝子非変形（ｎｏｎ−ＧＭ）の標準物質を確保することができるという長所がある。したがって、一定な造成の標準物質を常に均一で安定的に供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、（ａ）は、発芽５日後に生成される大豆の子葉、（ｂ）は、発芽７日後に生成される一次葉がある大豆植物体を示す。
【図２】図２は、大豆の葉組織から来由されたカルス（左）と大豆のカルスから来由された液体懸濁培養細胞株の細胞顕微鏡写真（右）を示す。
【図３】図３は、３５Ｓ３ＦとＮＯＳ３Ｒ  ＰＣＲプライマーを使用した導入遺伝子のＰＣＲ結果を示す（Ｍ：分子量マーカーＤＮＡ、Ｇ：ＧＭ大豆ＤＮＡ、Ｎ：ｎｏｎ−ＧＭ大豆）。
【図４】図４は、大豆のゲノムＤＮＡの電気泳動結果を示す（Ｍ：分子量マーカーＤＮＡ、Ｇ：ＧＭ大豆ＤＮＡ、Ｎ：ｎｏｎ−ＧＭ大豆）。
【図５】図５は、Ｌｅｃ  ３ＦとＬｅｃ  １Ｒプライマーを使用した内在遺伝子のＰＣＲ結果を示す（Ｍ：分子量マーカーＤＮＡ、Ｇ：ＧＭ大豆ＤＮＡ、Ｎ：ｎｏｎ−ＧＭ大豆）。
【図６】図６は、常用化されたプラスミドＤＮＡ基準物質を使用してリアルタイム定量ＰＣＲを実行した結果を示す図である。
【図７】図７は、常用化されたプラスミドＤＮＡ基準物質を使用してリアルタイム定量ＰＣＲを実行した結果から得た標準曲線を示す図である。
【図８】図８は、自体製造したプラスミドＤＮＡ基準物質を使用してリアルタイム定量ＰＣＲを実行した結果を示す図である。
【図９】図９は、自体製造したプラスミドＤＮＡ基準物質を使用してリアルタイム定量ＰＣＲを実行した結果から得た標準曲線を示す図である。
【図１０】図１０は、ＧＭ懸濁培養細胞株のゲノムＤＮＡ基準物質を使用してアルタイム定量ＰＣＲを実行した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、ＧＭ懸濁培養細胞株のゲノムＤＮＡ基準物質を使用してリアルタイム定量ＰＣＲを実行した結果から得た標準曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明で使われた「遺伝子変形植物の試料内混入率」とは、未知試料の全体量対比遺伝子変形植物が占める量の割合または特定作物の内在遺伝子と人為的に導入された変形遺伝子の割合を百分率（％）に換算して示した値を意味する。遺伝子変形植物の試料内混入率は、遺伝子変形植物に導入された導入遺伝子またはそれから発現されたタンパク質を利用して計算することができ、内在遺伝子またはそれから発現されたタンパク質に対する導入遺伝子の量またはコピー数、またはそれから発現されたタンパク質の割合を測定して、遺伝子変形植物が何％存在するかを相対的に測定することができる。「内在遺伝子」とは、各作物が本来から固有に保有している遺伝子を意味し、「導入遺伝子」とは、遺伝子変形植物に導入された外来遺伝子を意味する。
【００１６】
このような方法を通じて混入率を計算するので、標準物質を製造するにおいて使用する開始試料の純度がすべての定量結果に影響を及ぼしてバイアス（ｂｉａｓ）を提供するようになる。したがって、標準物質の製造時に使用される開始試料の純度が非常に重要な不確実性要因で作用することは自明である。本発明の以前には種子などの粉末を使用して標準物質を製造したので、純度が保障されないという短所があるにもかかわらず、純度に対する問題が解決できる現実的な方法がなかった。これは種子の遺伝的全数調査以外には純度を確認できる特別な方法がなく、全数調査は現実的に不可能なので、純度を立証することができなかったからである。
【００１７】
したがって、本発明は、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物を各々組職培養して得た各々の組職培養細胞株またはそれから抽出したゲノムＤＮＡを、遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用標準物質で利用することにより、初期試料の均質性を立証して保障する方法で標準物質製造に使用される開始試料の純度を立証した。組職培養技法を利用すれば、遺伝形質が同一な個体を無数に得ることができるので、標準物質の製造時にバッチ間の不均質性を排除して初期試料の均質性と純度を保障することができる。
【００１８】
本発明は、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物を各々組職培養する段階と、各々の組職培養細胞株を分離する段階と、を含む遺伝子変形植物の試料内混入率分析用標準物質を製造する方法を提供する。
【００１９】
本発明で使われた「標準物質」とは、遺伝子変形植物の混入有無または混入率を測定するための基準になる試料として、１００％遺伝子変形植物（１００％ＧＭＯ）で造成された試料や１００％の遺伝子非変形植物（１００％ｎｏｎ−ＧＭＯ）で造成された試料を各々意味し、遺伝子変形植物の混入率が既に所定割合で造成された試料を意味することもできる。
【００２０】
本発明の一具体例によれば、遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用標準物質は、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の特定組職を各々組職培養して得た純粋な遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の組職培養細胞株自体を、１００％ＧＭＯまたは１００％ｎｏｎ−ＧＭＯの標準物質で使用することができる。この場合、前記遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物各々の組職培養細胞株は、これに限定されるものではなで、例えば、凍結乾燥のような前処理後に保管または流通が可能である。
【００２１】
前記遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の特定組職を各々組職培養して得た純粋な遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の組職培養細胞株自体を純粋な形態で使用することもできるが、これらを所定割合で混合してそれを既知のＧＭＯ混入率を有する標準物質で製造しても良い。混入率が分かっている標準物質を製造し、これをリアルタイムＰＣＲで増幅させて標準曲線を算出し、分析試料のリアルタイムＰＣＲ増幅結果を標準曲線と対比することにより、分析試料の遺伝子変形植物混入率を容易に分析することができる。このような標準物質の場合、これに限定されるものではないが、例えば、遺伝子変形植物の混入率が各々０％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％または５％になるように製造することができる。
【００２２】
本発明の他の具体例によれば、遺伝子変形植物の試料内の混入率分析用標準物質を製造する方法は、前記分離された遺伝子変形植物または非遺伝子変形植物の組職培養細胞株を所定割合で混合する段階を追加で含むことができる。例えば、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の特定組職を各々組職培養して遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の組職培養細胞株を得て、前記分離された遺伝子変形植物と遺伝子非変形植物の組職培養細胞株を所定割合で混合してそれを既知のＧＭＯ混入率を有する標準物質として使用することができる。また、後述のように、前記組職培養細胞株からゲノムＤＮＡを抽出することにより、ゲノムＤＮＡを遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析に利用することができる。
【００２３】
また、本発明は、遺伝子変形植物または比喩電子変形植物を各々組職培養して得た各々の組職培養細胞株からゲノムＤＮＡを抽出する段階を含む遺伝子変形植物の試料内混入率分析用標準物質を製造する方法を提供する。
【００２４】
本発明の一具体例によれば、遺伝子変形植物の試料内混入有無または混入率分析用の標準物質は、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の特定組職を各々組職培養して得た遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の組職培養細胞株から各々のゲノムＤＮＡを抽出して１００％ＧＭＯまたは１００％ｎｏｎ−ＧＭＯのゲノムＤＮＡを標準物質で使用することができる。
【００２５】
前記遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の組職培養細胞株から抽出した各々のゲノムＤＮＡ自体を純粋な形態で使用することもできるが、これらを定量した後の所定割合で混合してそれを既知のＧＭＯ混入率を有する標準物質で製造してもよい。混入率が分かっている標準物質を製造し、これをリアルタイムＰＣＲで増幅させて標準曲線を算出し、分析試料のリアルタイムＰＣＲ増幅結果を標準曲線と対比することにより、分析試料の遺伝子変形植物混入率を容易に分析することができる。このような標準物質の場合、これに限定されるものではないが、例えば、遺伝子変形植物の混入率が各々０％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％または５％がなるように製造することができる。
【００２６】
本発明の他の具体例によれば、遺伝子変形植物の試料内混入率分析用標準物質を製造する方法は、前記各々のゲノムＤＮＡＡを一定な割合で混合する段階を追加で含むことができる。例えば、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の特定組職を各々組職培養して得た遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の組職培養細胞株から抽出した各々のゲノムＤＮＡを所定割合で混合し、これを標準物質で使用することができる。
【００２７】
現在主に使われている標準物質は、遺伝子変形植物と遺伝子非変形植物が一定量混合された粉末試料やこれらの内在遺伝子及び導入遺伝子のアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を挿入して作った標準プラスミドである。特に、標準プラスミドには、内在遺伝子と導入遺伝子のＰＣＲアンプリコンが同一なプラスミド内に挿入されているので、前記標準プラスミドを大膓菌内で増殖させることにより、一定な状態の標準プラスミドを標準物質として無限供給することが可能である。しかし、粉末標準物質を使用する場合の純度に関する問題点は既に上述したようであり、プラスミドを大膓菌で増殖させる場合には、標準物質の製造に関するＩＳＯ国際規格の‘標準物質’の厳密な定義に一致しないので問題になる。これは、いわゆる「ｍａｔｒｉｘ  ｅｆｆｅｃｔ」と言う媒質効果に対する直接比較が不可能な異質的な二つの試料（植物ＤＮＡと大膓菌ＤＮＡ）を比較するようになるからである。このような媒質効果が分析結果にどのような影響を及ぼすかは予測しにくいので、可能であれば類似な媒質の標準物質を使用するように勧奨している。このような点で、プラスミドＤＮＡよりは本発明による植物から由来したゲノムＤＮＡ標準物質が媒質効果による異常結果の防止において有利であると言える。
【００２８】
さらに、本発明によって遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物を各々組職培養して得た組職培養細胞株自体またはこれらからゲノムＤＮＡを抽出して標準物質を製造する場合、直接該当植物の細胞から抽出した同一な遺伝形質を有する多数の培養細胞から均質な品質の標準物質を大量に製作することができる。したがって、一定で且つ均一な標準物質の供給が可能であり、これによって、純度が不確実な標準物質を使用した場合より正確な遺伝子変形植物の試料内混入率分析が可能である。
【００２９】
本発明の一実施形態によれば、本発明による組職培養は、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の特定組職の一部を適切な栄養と植物生長調節物質が含有された液体培地で液体培養して培養細胞株（カルス）を生産し、前記培養細胞株を継代培養することにより行うことができる。前記組職培養は、好ましくは、無菌状態で行われる。
【００３０】
本発明において前記培養細胞株からＤＮＡを抽出する方法は、当業界に公知されたどのような方法を使っても構わないが、これに限定されるものではないで、例えば、Ｍｅｔｈｏｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＭＯｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｏｄ  ｃｈａｉｎ  （Ａｎｋｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．  ８５（３），  ７５３）、またはＶａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ  （Ａｎｋｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．  ８５（３），  ８０９−８１５）に開示された方法により抽出することができる。
【００３１】
また、本発明は、遺伝子変形植物を組職培養して得た組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、導入遺伝子の塩基序列に特異的なプライマーを製作して分析試料のＰＣＲを実行することを含む遺伝子変形植物の混入有無分析方法を提供する。
分析試料から導入遺伝子に該当するＰＣＲ産物が増幅されたか否かを確認することにより、導入遺伝子を含む遺伝子変形植物が混入されているか否を定性的に分析することができる。または、前記分析試料のＰＣＲ産物を、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物をテンプレートとして実行したＰＣＲ産物と比較分析することにより、遺伝子変形植物の混入有無を定性的に分析することもできる。
【００３２】
また、本発明は、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物を各々組職培養して得た組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを、遺伝子変形植物の混入率分析用標準物質で利用して分析試料から得たＰＣＲ産物と比較することを含む遺伝子変形植物の試料内混入率分析方法を提供する。
【００３３】
本発明の一具体例において、前記標準物質と分析試料から得たＰＣＲ産物とを比較する方法は、これに限定されるものではないが、リアルタイム重合酵素連鎖反応（以下、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を利用することができる。
【００３４】
Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを利用する場合、内在遺伝子及び導入遺伝子のＤＮＡに特異的に結合する両方向プライマーと検出用プローブを利用してＰＣＲ増幅過程で発色される蛍光の量を測定することにより、内在及び導入遺伝子の量を算出することができる。この方法は、該当系統の植物が必ず有している内在遺伝子に対する外来導入遺伝子の相対的な割合を通じて遺伝子変形植物が何％含有されているかを分析する方法である。
【００３５】
この時、前記検出用プローブは、  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲの実行時に定量分析のために蛍光物質が塩基序列に導入されているプローブを意味する。検出用プローブの種類は、内在遺伝子及び導入遺伝子の種類によって当業者が適切に選択することができる。
【００３６】
本発明の一実施形態によれば、標準物質を検出用プローブと導入遺伝子検出用プライマー及び内在遺伝子検出用プライマーでＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを実行して蛍光を測定することにより、遺伝子コピー数に対するＰＣＲサイクル数を示す標準曲線を算出し、これを分析試料から得たＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ産物と比較することにより、遺伝子変形植物の試料内混入率を分析することができる。
【００３７】
本発明の一具体例において、前記標準曲線は、遺伝子変形植物を組職培養して得た組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを所定割合で希釈して相違である遺伝子コピー数を有する複数個の標準試料に対してＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを実行し、これから得た遺伝子コピー数に対するＰＣＲサイクル数を適用して算出されるものであってもよい。
【００３８】
本発明の他の具体例において、前記標準曲線は、遺伝子変形植物または遺伝子非変形植物の組職培養細胞株から抽出した各々のゲノムＤＮＡを所定割合で混合して相違である遺伝子コピー数を有する複数数の標準試料に対してＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを実行し、これから得た遺伝子コピー数に対するＰＣＲサイクル数を適用して算出されるものであってもよい。
【００３９】
すなわち、遺伝子変形植物の試料内混入率が分かっている多数の標準物質を、一つの標準物質のＤＮＡを適切に希釈してコピー数を一定な間隔で作るか、遺伝子変形植物と遺伝子非変形植物のＤＮＡを所定割合で混合して一定な混入率を有するように製造した多数個の試料に対してＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを実行すれば、ＰＣＲサイクル数による蛍光の程度を測定することができる。この時、蛍光シグナルが増加し始める地点のサイクル数をＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）と言う。この値は、試料の初期濃度（遺伝子コピー数）と一番再現性ある相関関係を示す時点として、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを利用した定量的な分析において一番重要な数値である。Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲにおいて標準曲線は、Ｃｔ値における標準物質の遺伝子コピー数をログ（ｌｏｇ）値に換算した値をＸ軸、前記遺伝子コピー数に対するＰＣＲサイクル数をＹ軸にして作成する。分析試料の蛍光量をこの標準曲線に適用すれば、分析試料の遺伝子コピー数が分かる。
【００４０】
より具体的に、本発明の一実施形態によれば、遺伝子変形植物の試料内混入率の分析は、１００％遺伝子変形植物のＤＮＡを検出用プローブ、導入遺伝子検出用プライマー及び内在遺伝子検出用プライマーでＰＣＲを実行して測定した蛍光量を、前記標準曲線に代入して遺伝子コピー数を測定することにより、下記式により算出した補正係数を利用して一層正確に遺伝子変形植物の試料内混入率を測定することができる。一般的に、１００％遺伝子変形植物内にはもとより内在遺伝子と導入遺伝子のコピー数が同一に存在することではないので、内在遺伝子と導入遺伝子の割合を利用して相対的な定量を行う時には、１００％遺伝子変形植物における内在遺伝子と導入遺伝子のコピー数の割合とＤＮＡ抽出過程でＰＣＲ増幅効率に影響を及ぼすことができる要素などを補正するために補正係数（Ｃｆ：ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）を使用する。補正係数とは、一つの遺伝子変形植物における導入遺伝子と内在遺伝子との間のＤＮＡコピー数の割合を意味する。
【００４１】
【数１】
2013511980.tif 000003
【００４２】
しかし、一つの遺伝子変形植物系統内にも多数の品種があり、遺伝子非変形植物にも多数の品種があるので、補正係数もどのような品種を利用したかによって影響を受けることができる。
【００４３】
より具体的に、本発明の一実施形態によれば、遺伝子変形植物の試料内混入率は、分析試料を検出用プローブ、導入遺伝子検出用プライマー及び内在遺伝子検出用プライマーでＰＣＲを実行して測定した蛍光量を標準曲線に代入することにより測定することができ、より具体的には、下記混入率計算式により測定することができる。
【００４４】
【数２】
2013511980.tif 000004
【００４５】
Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを通じた蛍光量の定量的な測定方法は、これに限定されるものではないが、例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ法、Ｔａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｐｒｏｂｅ法または  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ法を使用することができる。
【００４６】
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ法は、ＰＣＲ反応により生成されたＰＣＲ産物であるＤＮＡの二重螺旋の副溝（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）に結合して蛍光を放出する試薬であるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用して、これにより発生する蛍光量を測定する方法である。検出される蛍光量は増幅されたＤＮＡの量に比例するので、定量測定手段になることができる。
【００４７】
Ｔａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅ法は、プローブの５'末端にリポーター蛍光を付けて３ '末端にはクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を付け、ＰＣＲが進行される時、５ '末端のリポーター蛍光が落ちながら出す固有の蛍光を定量する方式である。このプローブ序列は、ターゲットの固有の塩基序列として特定産物にのみ付いて、ＰＣＲ反応がなければ、３ '末端のクエンチャーにより蛍光が抑制される。ＰＣＲ反応に比例して蛍光の量も累積増加するので、定量測定手段になることができる。
【００４８】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｐｒｏｂｅ法は、珍しいヘアピン（ｈａｉｒ−ｐｉｎ）のステムとループ（ｓｔｅｍ−ａｎｄ−ｌｏｏｐ）構造として、中心のループ部分はターゲットに相補的な塩基序列で構成され、両末端は各々４乃至７塩基対の相補的な塩基序列としてステム構造を形成する。５ '末端には、リポーター蛍光が付いており、３'末端にはクエンチャーでＤＡＢＳＹＬが付いているので、これらヘアピン構造がターゲットに付いていない場合には、構造的にリポーターが蛍光を出すことができない一方、ターゲットに結合するようになれば、ＰＣＲの進行によって増加する特定産物にループ部位が付くようになり、ヘアピン構造がとけながらクエンチャーの影響圏から脱したリポーターが発散する蛍光を測定して定量する方法である。
【００４９】
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ法は、ターゲット序列内のお互いに隣接した２個のプローブを使用する。この場合、一つのプローブの３ '末端には供与体形光が付いており、他のプローブの５'末端には収容体形光が付いているので、これらプローブがお互いに隣接する場合のみ、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）が発生して供与体の放射光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｌｉｇｈｔ）が収容体励起光（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｌｉｇｈｔ）で作用することができる。すなわち、近接した供与体形光から伝達されたエネルギーにより収容体蛍光が蛍光を発するようになり、その蛍光の量はＰＣＲ産物に付いたプローブの量に比例増大して間接的定量測定手段になることができる。
【００５０】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。下記の実施形態は、本発明の内容を例示するだけで、本発明の範囲が下記実施形態に限定されるものではない。本発明の実施形態は、当業界で平均的な知識を有した者に本発明をより完全に説明するために提供するものである。
【００５１】
<実施例１>  組職培養細胞株の製造
ＧＭ大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）が混合された米国産大豆を無作為で選別して発芽させて栽培した後、個体別、組職別に遺伝子分析を通じてＧＭ大豆であるか否かを決定した。
暗所で大豆を発芽させて土壌に植えた後、培養室（明／暗：１６／８時間、２２／１８℃、湿度８０％）で１週程度成長させると、一次葉（ｐｒｉｍａｒｙ  ｌｅａｆ）が形成され、この植物体の葉を収穫して質量を測定して液体窒素で急冷させた後、ゲノムＤＮＡを抽出してＧＭであるか否かを遺伝子増幅を通じて決定した。
【００５２】
ＧＭであるか否かは、ＧＭ大豆の変形遺伝子であるグリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）系列の除草剤に対する抵抗性遺伝子（ＥＰＳＰＳ：５−ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌ  ｓｈｉｋｉｍａｔｅ-３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）を含むＤＮＡ試片をＰＣＲ増幅して決定した。ＧＭ  ＤＮＡの同一なサイズのバンドが増幅された試料はＧＭ大豆、同一なサイズのバンドが増幅されなかった試料はｎｏｎ−ＧＭ大豆試料であることを確認したし、このような方法を通じてＧＭ大豆またはｎｏｎ−ＧＭ大豆の懸濁培養細胞株を確保して分離された細胞株で培養、維持した。各細胞株は、一つの葉から由来した後、個別的な容器内で培養して維持したので、他の細胞が混入されるか汚染される可能性が全くない。これを通じて、１００％ＧＭ細胞のみで構成されたＧＭ大豆の懸濁培養細胞株と１００％ｎｏｎ−ＧＭ細胞のみで構成されたｎｏｎ−ＧＭ大豆の懸濁培養細胞株を確保した。
【００５３】
前記１００％ＧＭ大豆と１００％ｎｏｎ−ＧＭ大豆から由来した葉を各々ブリーチ（ｂｌｅａｃｈ）と７０％エタノールで表面殺菌して次のＬＳ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ  ＆  Ｓｋｏｏｇ）培地（ＢＡＰは除外）でカルスを誘導したし、誘導されたカルスは次のＬＳ固体培地で培養するかフィタゲル（ｐｈｙｔａｇｅｌ）を除外した液体培地で懸濁培養した。
【００５４】
ＬＳ培地造成は次のようである。：  ＬＳ塩４．４ｇ／Ｌ、スクロース３％（３０ｇ／Ｌ）、ＢＡＰ（６−ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ）３ｍｇ／ｍｌ、２,４−Ｄ（２,４ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ−Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ）０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｐｈｙｔａｇｅｌ０．３％（３ｇ／Ｌ）。
【００５５】
固体培地のカルスは、３〜４週に一回新しい培地に移し、懸濁培養細胞株は、１０日に一回ずつ新しい培地に移した。これらの培養条件は、２５℃、暗条件であり、懸濁培養細胞株は、２００ｒｐｍで振湯培養した。
【００５６】
図１の（ａ）は、発芽５日後に生成される大豆の子葉、（ｂ）は、発芽７日後に生成される一次葉がある大豆植物体を示す。
【００５７】
図２は、大豆の葉組織から来由されたカルス（左）と大豆のカルスから来由された液体懸濁培養細胞株の細胞顕微鏡写真（右）を示す。
【００５８】
図３は、ＧＭ  ＤＮＡと表示した矢印にしたがって、同一サイズのバンドが増幅された試料は導入遺伝子を有するＧＭ大豆であり、同一サイズのバンドが増幅されなかった試料は導入遺伝子がないｎｏｎ−ＧＭ大豆であることを示す。
【００５９】
<実施例２>  組職培養細胞株からゲノムＤＮＡ抽出
ゲノムＤＮＡの抽出は、多くの常用化された植物ＤＮＡ抽出キットを、製造社（Ｑｉａｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａなど）が提案する方法のとおりに使用するかまたは多少変形させて使用するか、食品医薬品安全庁で告示した‘食品の基準及び規格 'のうち‘第１０．一般試験法の中で遺伝資材組合食品の試験法'に記述されたＣＴＡＢ方法を容量を減らした方法で変形して使用した。
【００６０】
抽出したゲノムＤＮＡは、図４のような形態を示した。前記ＤＮＡは、紫外線での吸光度を測定して純度を確認した後に使用した（食品医薬品安全庁告示参照）。
【００６１】
<実験例１>  遺伝子変形植物の混入有無の定性分析
定性分析は、ＧＭ大豆の変形遺伝子であるグリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）系列の除草剤に対する抵抗性遺伝子（ＥＰＳＰＳ：５−ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌ  ｓｈｉｋｉｍａｔｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）を含むＤＮＡ試片をＰＣＲ増幅することにより実行した。
【００６２】
遺伝子増幅を通じて試料がＧＭであるか否かを判別することは、食品医薬品安全庁から告示された方法により行うか、次のような条件で実行した。次の条件で実行する場合には、増幅産物は、約２ｋｂ程度のサイズを示し、その外に陽性対照区では、内在遺伝子であるレクチン（ｌｅｃｔｉｎ）を確認する方法を使用する。
【００６３】
導入遺伝子を確認しようとする場合には、ＰＣＲチューブに正方向プライマー３５Ｓ  ３Ｆ（ＡＡＧＡＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＧＡＣＡ、１０μＭ）２μＬ、逆方向プライマーＮＯＳ  ３Ｒ（ＡＴＧＴＡＴＡＡＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＣＴＡＡＴＣＡ、１０μＭ）２μＬ、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）２μＬ、１０ｘｂｕｆｆｅｒ２μＬ、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）２μＬ、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）０．２μＬを入れて、テンプレートＤＮＡでゲノムＤＮＡは、約５０ｎｇになるように添加し、残りは、蒸溜水で満たして総２０μＬを使用した。ＰＣＲ反応は、変性段階（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）、９４℃、３ｍｉｎ;  ３５サイクルの増幅段階（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）、（９４℃、２０ｓｅｃ；  ６０℃、３０ｓｅｃ；  ７２℃、２ｍｉｎ）、最終伸長段階（ｆｉｎａｌ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）、７２℃、１０ｍｉｎの条件でｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｙｃｌｅｒＰＴＣ−０２２５（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して実行した。
【００６４】
内在遺伝子を確認する場合には、擡頭に特異的なレクチン（ｌｅｃｔｉｎ）遺伝子を使用したし、すべての条件は同一にしてプライマーだけを次のように使用した。正方向プライマーでは、Ｌｅｃ  ３Ｆ（ＧＡＣＴＡＧＡＧＴＧＣＴＡＣＡＡＡＴＧＣＴＴＡＴＣ）を、逆方向プライマーでは、Ｌｅｃ  １Ｒ（ＧＧＣＡＴＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＡＡＧＧＡ）を使用した。
【００６５】
図３は、導入遺伝子のＰＣＲ実行結果を示す。ＧＭ  ＤＮＡと同一なサイズのバンドが増幅された試料は、変形遺伝子を有するＧＭ大豆であり、ＧＭ  ＤＮＡと同一なサイズのバンドが増幅されなかった試料は、変形遺伝子がないｎｏｎ−ＧＭ大豆である。
【００６６】
図５は、内在遺伝子のＰＣＲ実行結果を示す。内在遺伝子の場合、ＧＭＯ、ｎｏｎ-ＧＭに関係なくいつも陽性のＰＣＲ結果が出る。
【００６７】
<実験例２>  組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡの純度検証
本発明によるＧＭ大豆の組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡの純度を検証するために、遺伝子変形植物の混入率を定量分析するためのリアルタイム定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を実行した。分析試料のＧＭ混入率を決定するためには、上述のように内在遺伝子に対する導入遺伝子の相対的な割合を求めなければならないので、リアルタイムで遺伝子の増幅程度を観察するｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを使用した。本実験例では、ＡＢＩ  ７９００ＨＴを使用してすべての実験を実行したし、実験の基本的なデザイン及びプライマー、プローブなどの実験構成要素は、食品医薬品安全庁の規格に出た内容によって使用した。
【００６８】
まず、既にコピー数が分かっている常用化されたプラスミドＤＮＡ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ、Ｊａｐａｎ）を標準曲線を描くための基準物質で使用し、実施例１及び実施例２によって、１００％ＧＭ大豆の組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを分析試料で使用して、リアルタイム定量ＰＣＲを実行した。
【００６９】
図６は、既にコピー数が分かっている常用化されたプラスミドＤＮＡを基準物質として濃度別に内在遺伝子を増幅した結果を示す。２５００００から２０コピーの間でＤＮＡ基準物質を添加して濃度間の間隔が一定で且つ反復性がある結果を得た。これは、ＧＭ遺伝子の結果においても同一な傾向が見られた。
【００７０】
これに対して、１００％ＧＭ大豆の組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを分析試料で使用して標準曲線から来由されたＧＭ相対定量値が１００％に近接した結果を得たかを確認した。
【００７１】
図７は、図６のＤＮＡ濃度から来由された標準曲線とそれにより計算された内在遺伝子の量（赤色ｘで表示）を示す実験結果として、３回反復実験を行った結果を示す。回帰線の連関性は０．９９以上を示し、ＧＭ混入率は約１０８％±２．６％（相対標準偏差）を示したことから、よほど正確な結果であることを確認した。
【００７２】
次に、常用化されたプラスミド基準物質の代りに本発明者らが自体的に製造して既にコピー数が分かっているプラスミドＤＮＡを補正曲線を描くための基準物質で使用し、実施例１及び実施例２によって、１００％ＧＭ大豆の組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを分析試料で使用して、以前と同様にリアルタイム定量ＰＣＲを実行した。
【００７３】
図８は、本発明者らが自体的に製造してコピー数が既に分かっているプラスミドＤＮＡを基準物質で使用して同一な実験を繰り返した結果を示す。１００００００から１０００コピーの間でＤＮＡ基準物質を添加して濃度間の間隔が一定で且つ反復性がある結果を得た。内在遺伝子の結果においても同一な傾向が見られた。
【００７４】
これに対して、１００％ＧＭ大豆の組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを分析試料で使用して標準曲線から来由されたＧＭ相対定量値が１００％に近接した結果を得たかを確認した。
【００７５】
図９は、図８のＤＮＡ濃度から来由された標準曲線とそれにより計算されたＧＭ遺伝子の量（赤色ｘで表示）を示す実験結果として、３回反復実験を行った結果を示す。回帰線の連関性は０．９９以上を示し、ＧＭ混入率は約１０５％±５．５％（相対標準偏差）を示したことから、よほど正確な結果であることを確認した。
【００７６】
<実験例３>  組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを標準物質で使用した分析試料内の遺伝子変形植物の混入率定量分析
本発明による組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを標準物質で使用して、遺伝子変形植物の混入率を定量分析するためのリアルタイム定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を実行した。実験方法は、実験例２と同一であり、但し、実験例２を通じて１００％ＧＭ割合に近接したと検証された組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを標準物質で使用したし、既にＧＭ混入率が分かっている試料（５％ＧＭ大豆ＥＲＭ、ＩＲＭＭ−４１０Ｓ−５）を分析試料で使用した。
【００７７】
図１０は、本発明による１００％ＧＭ大豆の組職培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを標準物質として濃度別に内在遺伝子を増幅した結果を示す。ＤＮＡ濃度１０ｎｇ／μＬから０．０８ｎｇ／μＬの間でＤＮＡを添加して反復性のある結果を得た。
【００７８】
図１１は、図１０のゲノムＤＮＡ濃度から来由された標準曲線とそれにより計算されたＧＭ遺伝子の量（赤色ｘで表示）を示す実験結果として、３回反復実験を行った結果、回帰線の連関性は約０．９９を示した。該当ＥＲＭの認証値である４．７６％±０．４７％（相対標準偏差）と少しの差はあるが、ＧＭ混入率（％）が比較的近接した値である約４％を示した。多様な濃度を使用する実験を進行すれば、認証値に一層近接した混入率が得られると予想される。
【００７９】
<実験例４>  補正係数の算出
ＧＭ遺伝子変形植物は、各々の多様なコピー数の導入遺伝子を有しているので、内在遺伝子との関係において各ＧＭ遺伝子変形植物別に補正が必要である。遺伝子変形植物の混入率を決定するための補正係数は、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を実施して算出した。既にコピー数が分かっている常用化されたプラスミドＤＮＡ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ、Ｊａｐａｎ）と自体的に製造してコピー数が既に分かっているプラスミドＤＮＡとを標準曲線を描くための基準物質で使用し、実施例１及び実施例２によって、１００％ＧＭ大豆の顕濁培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを分析試料で使用したし、導入遺伝子検出用プライマー及び内在遺伝子検出用プライマーを使用してリアルタイム定量ＰＣＲを実施した。補正係数の算出に使われた内在遺伝子は、大豆に特異的なレクチン（ｌｅｃｔｉｎ）遺伝子であり、内在遺伝子検出用正方向プライマーでは、Ｌｅ１ｎ０２−５'（ＧＣＣＣＴＣＴＡＣＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡ）を使用し、逆方向プライマーでは、Ｌｅ１ｎ０２−３'（ＧＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＡＧＣＣＴＴＴＴＴ）を使用した。検出用プローブでは、Ｌｅ１−Ｔａｑ（ＦＡＭ−ＡＧＣＴＴＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＡＣ−ＴＡＭＲＡ）を使用した。導入遺伝子は、ＲＲＳ遺伝子であり、導入遺伝子検出用正方向プライマーでは、ＲＲＳ０１−５'（ＣＣＴＴＴＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＴＧＧ）を使用し、逆方向プライマーでは、ＲＲＳ０１−３'（ＧＡＣＴＴＧＴＣＧＣＣＧＧＧＡＡＴＧ）を使用し、検出用プローブでは、ＲＲＳ−Ｔａｑ（ＦＡＭ−ＣＧＣＡＡＣＣＧＣＣＣＧＣＡＡＡＴＣＣ−ＴＡＭＲＡ）を使用した。
【００８０】
補正係数は、基準物質の標準曲線から分析試料の導入遺伝子と内在遺伝子のコピー数を求めた後、次の式により算出した。
【００８１】
【数３】
2013511980.tif 000005
【００８２】
表１、既にコピー数が分かっている常用化されたプラスミドＤＮＡ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ、Ｊａｐａｎ）を基準物質で使用して算出した補正係数結果を示し、補正係数は１．０８であった。
【００８３】
【表１】
2013511980.tif 000006
【００８４】
表２は、自体的に製造した既にコピー数が分かっているプラスミドＤＮＡを基準物質で使用して算出した補正係数結果を示し、補正係数は１．０５であった。
【００８５】
【表２】
2013511980.tif 000007
【００８６】
<実験例５>  補正係数の適用による分析試料のＧＭ混入率決定
遺伝子変形植物の混入率を定量分析するために、既にコピー数が分かっている常用化されたプラスミドＤＮＡ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ、Ｊａｐａｎ）と自体的に製造してコピー数が既に分かっているプラスミドＤＮＡとを標準曲線を描くための基準物質で使用し、１００％ＧＭ大豆の顕濁培養細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを分析試料で使用してリアルタイム定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を実行した。前記二つの基準物質の標準曲線から分析試料の導入遺伝子と内在遺伝子のコピー数を求めた後、実験例４から算出した補正係数を適用してＧＭ混入率を決定し、１００％に近接した結果を得たかを確認した。補正係数を適用してＧＭ混入率を決定する計算式は次のようである。
【００８７】
【数４】
2013511980.tif 000008
【００８８】
表３は、既にコピー数が分かっている常用化されたプラスミドＤＮＡ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ、Ｊａｐａｎ）を基準物質で使用し、実験例４から算出した補正係数１．０８適用してＧＭ混入率を決定した結果である。ＧＭ混入率は約１００．０３％として、ＧＭ相対定量値が１００％によほど近接して出た結果であることを確認した。
【００８９】
【表３】
2013511980.tif 000009
【００９０】
表４は、自体的に製造した既にコピー数が分かっているプラスミドＤＮＡを基準物質で使用し、実験例４から算出した補正係数１．０５を適用してＧＭ混入率を決定した結果である。ＧＭ混入率は約９９．８％として、ＧＭ相対定量値が１００％によほど近接に出た結果であることを確認した。
【００９１】
【表４】
2013511980.tif 000010
【図１】
2013511980.tif 000013
【図２】
2013511980.tif 000014
【図３】
2013511980.tif 000015
【図４】
2013511980.tif 000016
【図５】
2013511980.tif 000017
【図６】
2013511980.tif 000018
【図７】
2013511980.tif 000019
【図８】
2013511980.tif 000020
【図９】
2013511980.tif 000021
【図１０】
2013511980.tif 000022
【図１１】
2013511980.tif 000023
【国際調査報告】
2013511980.tif 000024
2013511980.tif 000025
2013511980.tif 000026
2013511980.tif 000027