(57)【要約】  一本鎖ポリヌクレオチドに１個または複数個の塩基を付加するポリヌクレオチドデバイスが提供される。該デバイスの使用方法および該デバイスを含むキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖標的分子の伸長のためのデバイスであって、
前記デバイスは、構造１：
【化１】
2013511285.tif 000008
を含むポリヌクレオチドであり、
ここで、
Ｐは、プライマー配列であり、
Ｙは、生成物配列であり、
Ｒは、複製ブロック基であり、
Ｓは、ステム配列であり、
Ｌは、ループ領域であり、
Ｓ’は、Ｓにハイブリダイズする配列であり、
Ｙ’は、Ｙにハイブリダイズする配列であり、
ＳおよびＳ’のそれぞれは、前記デバイス中に存在していてもよく、Ｓ’の存在は、前記デバイス中のＳの存在によって決まり、
Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｓ’、およびＹ’はヘアピン構造を形成する、デバイス。
【請求項２】
一本鎖標的分子の伸長のためのデバイスであって、
前記デバイスが、構造２：
【化２】
2013511285.tif 000009
の第１のポリヌクレオチドと、
構造３：
【化３】
2013511285.tif 000010
の第２のポリヌクレオチドとを含み、
ここで、
Ｐは、プライマー配列であり、
Ｙは、生成物配列であり、
Ｒは、複製ブロック基であり、
Ｓは、ステム配列であり、
Ｙ’は、Ｙにハイブリダイズする配列であり、
Ｓ’は、Ｓにハイブリダイズする配列である、デバイス。
【請求項３】
配列Ｓおよび配列Ｓ’が、約２０℃〜約９５℃の温度で安定である二重構造を形成する、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
配列Ｓおよび配列Ｓ’が、約６０℃〜約７５℃の温度で安定である二重構造を形成する、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
Ｐは、約６塩基〜約３０塩基の長さの配列である、請求項１乃至４のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６】
Ｙは、プライマー配列Ｐと同一の配列ＰＹからなる、請求項１乃至５のいずれかに記載のデバイス。
【請求項７】
Ｙは、プライマー配列Ｐと同一の配列ＰＹを含む、請求項１乃至６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項８】
Ｙは、配列ＰＹとは異なるタグ配列Ｔをさらに含み、ここで配列ＴはＰＹに対して３’側に位置し、プライマー配列Ｐに対して５’側に位置する、請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
配列Ｔは、約１５塩基〜約５０塩基の長さの配列である、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
Ｙは、プライマー配列Ｐと同一でない追加の配列Ａからなる、請求項１乃至９のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１１】
配列Ａは、約１５塩基〜約５０塩基の長さの配列である、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記デバイスの配列の伸張をブロックする３’ブロック基Ｆを含み、ＦはＰに対して３’側に位置する、請求項１乃至１１のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１３】
Ｆは、アミノ基、リン酸塩、またはジデオキシヌクレオチドである、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
酵素によって切断されない、１または複数の修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項１乃至１３のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１５】
前記１または複数の修飾されたヌクレオチド間結合は、生成物配列Ｙに対して５’側に位置する、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
Ｙ’に対して５’に位置し、かつ約１塩基〜約２５塩基の長さのヌクレオチド配列を含む配列Ｘを含み、
Ｘは、（ｉ）Ｐにハイブリダイズしないか、（ｉｉ）Ｐの少なくとも一部分にハイブリダイズするか、または（ｉｉｉ）Ｐの少なくとも一部分に、およびＹの少なくとも一部分にハイブリダイズする、請求項１乃至１５のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１７】
Ｘは、Ｐの一部分のみにハイブリダイズするか、またはＰの一部分のみおよびＹの一部分のみにハイブリダイズする、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
Ｘは、Ｐにハイブリダイズせず、かつ約１塩基〜約１０塩基の長さのヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１９】
Ｒは、（ｉ）脱塩基部位であるか、（ｉｉ）修飾された塩基であるか、（ｉｉｉ）生成物配列Ｙには存在しないか、反応混合物に限界濃度で存在する塩基であるか、または（ｉｖ）スペーサーである、請求項１乃至１８のいずれかに記載のデバイス。
【請求項２０】
前記修飾された塩基は、Ｒまたはその先に対してポリメラーゼ活性を立体的に阻害する化学的部分を含む、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記修飾された塩基は、当該オリゴヌクレオチドの別の塩基に架橋された塩基である、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記修飾された塩基は、Ｓ’の塩基に架橋される、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記脱塩基部位は、配列Ｓ’または配列Ｙ’の塩基に特異的に結合しない、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記スペーサーは、ヘキサメチレングリコールスペーサー、ヘキシレングリコールスペーサー、または２−デオキシリボーススペーサーである、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２５】
Ｓの配列は、約０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、または約８０％〜約１００％のＧＣ含量を含む、請求項２乃至２４のいずれかに記載のデバイスの対。
【請求項２６】
前記第２のポリヌクレオチドは、前記第１のポリヌクレオチドの濃度より高い濃度で存在している、請求項２乃至２５のいずれかに記載のデバイスを含む組成物。
【請求項２７】
前記第２のポリヌクレオチドの濃度が、前記第１のポリヌクレオチドの濃度より２倍以上高い濃度である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１乃至２５のいずれかのデバイスのうちの少なくとも２種のデバイスを含む、組成物。
【請求項２９】
前記組成物中の前記少なくとも２種のデバイスは、生成物配列Ｙ１を含む第１のデバイスと、生成物配列Ｙ２を含む第２のデバイスとを含み、生成物配列Ｙ１はＹ２と異なる、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項１または２のデバイスのなかの複数種を含み、
前記複数種は、少なくとも３種のデバイスサブセットであって、１つのデバイスサブセットに属する各デバイスは配列Ｙの配列を含み、該配列Ｙの配列は、（ｉ）同じデバイスサブセットに属する別のデバイスの配列Ｙと同一であり、かつ（ｉｉ）前記複数種中の別のデバイスサブセットに属するデバイスの配列Ｙとは異なるものである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
請求項１乃至２５のいずれかに記載のデバイス、または請求項２０乃至２４のいずれかに記載の組成物、および一本鎖標的プライマーを伸長させる反応における該オリゴヌクレオチドまたは組成物の使用のための使用説明を含む、キット。
【請求項３２】
前記一本鎖標的分子を含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
ポリメラーゼおよび遊離ヌクレオチドを含む、請求項３１または３２のキット。
【請求項３４】
鎖置換ポリメラーゼを含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
実質的な等温状態の下で作用する鎖置換ポリメラーゼを含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３３乃至３５のいずれかに記載のキット。
【請求項３７】
５’エキソヌクレアーゼ活性をもたないポリメラーゼを含む、請求項３３乃至３６のいずれかに記載のキット。
【請求項３８】
複製ブロック基Ｒと接触すると、前記デバイスから解離するポリメラーゼを含む、請求項３３乃至３７のいずれかに記載のキット。
【請求項３９】
実質的な等温状態の下で前記デバイスから解離するポリメラーゼを含む、請求項３３乃至３８のいずれかに記載のキット。
【請求項４０】
シャペロン鎖置換分子を含む、請求項３３乃至３９のいずれかに記載のキット。
【請求項４１】
前記シャペロン鎖置換分子は、ヘリカーゼ、トランスフェラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
少なくとも２種のポリメラーゼを含み、少なくとも１種類のポリメラーゼは、校正ポリメラーゼである、請求項３３乃至４１のいずれかに記載のキット。
【請求項４３】
前記校正ポリメラーゼは、前記一本鎖標的分子から、１または複数の非テンプレート付加反応を介して付加される塩基を除去する、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
検出可能な標識と、伸張反応の伸張生成物にハイブリダイズする配列とを含む分子ビーコンを含む、請求項３３乃至４３のいずれかに記載のキット。
【請求項４５】
前記分子ビーコンは、前記生成物にハイブリダイズされないとき、ヘアピン構造を形成する、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
プローブを含む、請求項４４または４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記プローブは、検出可能な標識である、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
伸張生成物を切断する酵素を含む、請求項３３乃至４７のいずれかに記載のキット。
【請求項４９】
一本鎖標的分子を伸長させる方法であって、
前記一本鎖標的分子を、伸長反応混合物と接触させるステップであって、前記伸長反応混合物は、（ｉ）請求項１乃至２５のいずれかのデバイス、または請求項２６乃至４８のいずれかに記載の組成物と、（ｉｉ）ポリメラーゼと、（ｉｉｉ）遊離ヌクレオチドとを含む、該ステップを含み、
このとき伸長反応生成物が生成され、該伸長反応生成物は、前記デバイスの生成物配列Ｙに相補的な３’末端配列を有する一本鎖標的分子を含む、方法。
【請求項５０】
前記伸長反応混合物は、請求項１０に記載のデバイスを含み、
生成物配列Ｙは、約２０〜約３０塩基の長さの配列Ａからなり、前記伸長生成物は前記配列Ａに相補的な３’配列を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記伸長反応混合物は、請求項６に記載のデバイスを含み、
当該オリゴヌクレオチドの生成物配列Ｙは、前記デバイスのプライマー配列Ｐと同一な配列ＰＹからなり、このとき前記標的分子配列が前記プライマー配列Ｐに相補的であり、かつ前記反応生成物が前記プライマー配列Ｐに相補的な３’末端配列を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記伸長反応混合物は、請求項８に記載のデバイスを含み、
前記デバイスの生成物配列Ｙは、前記デバイスのプライマー配列Ｐと同一な配列ＰＹを含み、かつ配列ＰＹの配列とは異なるタグ配列Ｔをさらに含み、ここで配列ＴはＰＹに対して３’側に位置する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記伸長反応混合物は、請求項１乃至２５のいずれかのデバイスのなかの複数種を含み、
前記複数種は、少なくとも３種のデバイスサブセットであって、１つのデバイスサブセットに属する各デバイスは配列Ｙの配列を含み、該配列Ｙの配列は、（ｉ）同じデバイスサブセットに属する別のデバイスの配列Ｙと同一であり、かつ（ｉｉ）前記複数種中の別のデバイスサブセットに属するデバイスの配列Ｙとは異なるものであって、
前記伸長生成物は、前記複数種の配列Ｙのそれぞれに相補的な配列を含む３’末端を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法は、実質的な等温状態の下で実施される、請求項４９乃至５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記方法は、約０℃〜約７５℃の範囲の温度で実施される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記方法は、第１の温度で行われる１以上のステップと、第２の温度で行われる１以上のステップとを含み、前記第２の温度は、前記第１の温度より約２５℃以上高い、請求項４９乃至５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記第１の温度は、約６０℃〜約７５℃の範囲内にあり、前記第２の温度は、約８５℃〜約１００℃の範囲内にある、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリメラーゼが前記第２の温度において前記デバイスから解離する、解離ステップを含む、請求項５６または５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＤＮＡ複製は、生命において中心的な役割を果たす。特殊な酵素−ＤＮＡポリメラーゼ、およびいくつかの補助タンパク質を利用し、細胞やウイルスは初期の生物の遺伝情報を正確にコピーしてその複数の複製物を作りだす。
【０００２】
ポリヌクレオチドの複製は、多くの生体外核酸診断および研究ツールにおいて重要な役割を果たしている。長年にわたり、ポリヌクレオチド複製は、従来のゲルをベースにした配列解析（サンガー法）や、より新しい高度な並列ポリヌクレオチドシークエンシング技術（例えば、Ｓｏｌｅｘａプラットフォーム）を含む、ポリヌクレオチド配列解析の鍵となる反応として利用されてきた。
【０００３】
ポリヌクレオチド複製はまた、いくつかの現在の遺伝子型決定方法の一部である。それはマイクロアレイ解析のためにポリヌクレオチドを蛍光色素で標識するためにも頻繁に使用され、またプライムドｉｎ  ｓｉｔｕ標識（ＰＲＩＮＳ）を用いたｉｎ  ｓｉｔｕ検出に使用される。
【０００４】
しかし、ポリヌクレオチド複製の最も重要な用途の１つは増幅である。その例としては、以下に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、ヘリカーゼ依存増幅法（ＨＤＡ）、単一プライマー等温増幅法（ＳＰＩＡ）などが挙げられる。
【０００５】
ポリヌクレオチド増幅方法の多くが、複数回反復されるプライマー伸長反応に基づいている。この目的を達成するためには、核酸テンプレートからポリヌクレオチド重合生成物を解離させることが重要である。ＰＣＲ法では、このような解離は、二重のポリヌクレオチドの生成物を９５℃まで反復して加熱することにより達成される。ＳＤＡ、ＨＤＡ、およびＳＰＩＡなどの他の方法では、伸長された生成物の解離は、例えば制限エンドヌクレアーゼ若しくはニッカーゼ（ＳＤＡ）、ＲＮａｓｅ  Ｈ（ＳＰＩＡ）、またはヘリカーゼ（ＨＤＡ）などの追加の酵素によって促進される。
【０００６】
ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）は、二本鎖ポリヌクレオチドまたは追加の酵素を熱変性させることなく環状のポリヌクレオチドテンプレートの複製を複数回達成することができる、独特なプライマー伸長反応の一例である。ＲＣＡの生成物は反復配列（ｃＡ）ｎであって、ここでＡは環状テンプレートの配列であり、ｃＡがその相補配列である。ただし、この手法は、この種の伸長生成物の合成のみに限定されている。ＲＣＡは、例えば、ｃＡＢＣまたは（ｃＡＢＣ）ｎのような、より複雑な配列の組み合わせの合成には用いることができない（尚、Ａ、Ｂ、およびＣのそれぞれは独特の配列であって、ｃＡＢＣはＡＢＣの相補配列である）。この（ｃＡＢＣ）ｎのような分子の合成についてのＲＣＡの制約は、当該技術で使用される環状ポリヌクレオチドテンプレートの製造には特別な環状化と精製の手順が必要となり、この結果テンプレートのサイズひいては伸長生成物のサイズが制約されるという事実に因ることが多いが、ｃＡＢＣのような非反復配列の合成についての制限は、環状ＤＮＡの複製を制御することが困難であることに起因する。ＲＣＡのもう１つの欠点は、標的ポリヌクレオチドの一部分のみが伸長され、他の部分は未反応（非伸長）のままになることである。
【０００７】
上記の観点から、当該技術分野において、プライマー伸長の効率的な方法であって、（ｉ）複数回のポリヌクレオチドテンプレートの複製が、二本鎖ポリヌクレオチドを熱変性させず、かつ伸長生成物をテンプレートから解離させるための追加の酵素を使用せずに達成され、（ｉｉ）合成された伸長生成物の種類（例えば、複雑さ、サイズ）は、複雑なテンプレートの製造手順によって制約されず、かつ（ｉｉｉ）意図した標的分子のそれぞれが均等に分布する方式で伸長される、該方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一本鎖標的分子の伸長のためのデバイスが提供される。いくつかの態様では、前記デバイスは、構造１：
【化１】
2013511285.tif 000002
を含むポリヌクレオチドであり、
ここで、
Ｐは、プライマー配列であり、
Ｙは、生成物配列であり、
Ｒは、複製ブロック基であり、
Ｓは、ステム配列であり、
Ｌは、ループ領域であり、
Ｓ’は、Ｓにハイブリダイズする配列であり、
Ｙ’は、Ｙにハイブリダイズする配列であり、
ＳおよびＳ’のそれぞれは、前記デバイス中に存在していてもよく、Ｓ’の存在は、前記デバイス中のＳの存在によって決まり、
Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｓ’、およびＹ’はヘアピン構造を形成する。
【０００９】
別の態様では、一本鎖標的分子の伸長のための前記デバイスは、構造２：
【化２】
2013511285.tif 000003
の第１のポリヌクレオチドと、
構造３：
【化３】
2013511285.tif 000004
の第２のポリヌクレオチドとを含み、
ここで、
Ｐは、プライマー配列であり、
Ｙは、生成物配列であり、
Ｒは、複製ブロック基であり、
Ｓは、ステム配列であり、
Ｙ’は、Ｙにハイブリダイズする配列であり、
Ｓ’は、Ｓにハイブリダイズする配列であり、
ＹおよびＹ’とＳおよびＳ’は二重構造を形成する。
【００１０】
前記デバイスの一態様では、配列Ｓおよび配列Ｓ’が、約０℃〜約９５℃の温度（例えば、約２０℃〜約９５℃、約３７℃〜約９５℃、約６０℃〜約７０℃、または約６０℃〜約７５℃）で安定である二重構造を形成する。
【００１１】
前記デバイスの別の態様では、配列Ｐは、約６塩基〜約３０塩基の長さの配列である。
【００１２】
前記デバイスの別の態様では、配列Ｙは、プライマー配列Ｐと同一の配列ＰＹからなる。前記デバイスの別の態様では、配列Ｙは、プライマー配列Ｐと同一の配列ＰＹを含む。
【００１３】
前記デバイスのさらに別の態様では、配列Ｙは、配列ＰＹとは異なるタグ配列Ｔをさらに含み、ここで配列ＴはＰＹに対して３’側に位置し、プライマー配列Ｐに対して５’側に位置する。
【００１４】
前記デバイスのさらに別の態様では、配列Ｔは、約１５塩基〜約５０塩基の長さの配列である。
【００１５】
前記デバイスのさらに別の態様では、配列Ｙは、プライマー配列Ｐと同一でない追加の配列Ａからなる。一実施形態では、配列Ａは、約１５塩基〜約５０塩基の長さの配列である。
【００１６】
別の態様では、前記デバイスは、前記デバイスの配列の伸張をブロックする３’ブロック基Ｆを含み、前記デバイスにおいてブロック基Ｆは配列Ｐに対して３’側に位置する。各種実施形態では、ブロック基Ｆは、アミノ基、リン酸塩、またはジデオキシヌクレオチドである。
【００１７】
さらに別の態様では、前記デバイスが１または複数の非切断可能な結合、例えば、酵素によって切断されない、１または複数の修飾されたヌクレオチド間結合を含む。別の態様では、前記デバイスは、配列Ｙ’に対して５’に位置し、かつ約１塩基〜約２５塩基の長さのヌクレオチド配列を含む配列Ｘを含み、ここで配列Ｘは、（ｉ）配列Ｐにハイブリダイズしないか、（ｉｉ）Ｐの少なくとも一部分にハイブリダイズするか、または（ｉｉｉ）配列Ｐの少なくとも一部分に、および配列Ｙの少なくとも一部分にハイブリダイズする。各種実施形態では、Ｘは、Ｐの一部分のみにハイブリダイズするか、またはＰの一部分のみおよびＹの一部分のみにハイブリダイズする。他の態様では、Ｘは、Ｐにハイブリダイズせず、かつ約１塩基〜約１０塩基の長さのヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
前記デバイスの別の態様では、Ｒは、（ｉ）脱塩基部位であるか、（ｉｉ）修飾された塩基であるか、（ｉｉｉ）生成物配列Ｙには存在しないか、反応混合物に限界濃度で存在する塩基であるか、または（ｉｖ）スペーサーである。一実施形態では、前記修飾された塩基は、Ｒまたはその先に対してポリメラーゼ活性を立体的に阻害する化学的部分を含む。別の実施形態では、前記修飾された塩基は、当該オリゴヌクレオチドの別の塩基に架橋された塩基である。さらに別の実施形態では、前記修飾された塩基は、Ｓの塩基に架橋される。さらに別の実施形態では、前記脱塩基部位は、配列Ｓ’または配列Ｙ’の塩基に特異的に結合しない。他の実施形態では、前記スペーサーは、ヘキサメチレングリコールスペーサー、ヘキシレングリコールスペーサー、または２−デオキシリボーススペーサーである。
【００１９】
前記デバイスの別の態様では、配列Ｓは、約７０％〜約１００％、または約０％〜約１００％のＧＣ含量を含む。
【００２０】
また、２つのポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載する、構造２の第１のポリヌクレオチドおよび構造３の第２のポリヌクレオチド）を有するデバイスを含み、前記第２のポリヌクレオチドは、前記第１のポリヌクレオチドの濃度より高い濃度で存在している組成物も提供される。前記組成物の別の態様では、前記第２のポリヌクレオチドの濃度が、前記第１のポリヌクレオチドの濃度より２倍以上高い濃度である。
【００２１】
別の実施形態では、本明細書に開示されるデバイスのうちの少なくとも２種のデバイスを含む組成物が提供される。一態様では、前記組成物中の前記少なくとも２種のデバイスは、生成物配列Ｙ１を含む第１のデバイスと、生成物配列Ｙ２を含む第２のデバイスとを含み、生成物配列Ｙ１はＹ２と異なる。別の態様では、前記組成物は、本明細書に開示されるデバイスのなかの複数種を含み、前記複数種は、少なくとも３種のデバイスサブセットであって、１つのデバイスサブセットに属する各デバイスは配列Ｙの配列を含み、該配列Ｙの配列は、（ｉ）同じデバイスサブセットに属する別のデバイスの配列Ｙと同一であり、かつ（ｉｉ）前記複数種中の別のデバイスサブセットに属するデバイスの配列Ｙとは異なるものである。
【００２２】
本明細書に記載されるデバイス、および／または本明細書に記載される組成物、および一本鎖プライマーを伸長させる反応における該デバイスまたは組成物の使用のための使用説明を含む、キットも提供される。一態様では、前記キットは、前記一本鎖標的分子を含む。別の態様では、前記キットは、ポリメラーゼおよび遊離ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、前記キットは、鎖置換ポリメラーゼ（例えば、鎖置換活性を有するポリメラーゼ）を含む。他の態様では、前記キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせを含む。特定の態様では、前記キットは、５’エキソヌクレアーゼ活性をもたないポリメラーゼを含む。
【００２３】
特定の態様では、前記キットは、複製ブロック基Ｒと接触すると、前記デバイスから解離するポリメラーゼを含む。特定の態様では、前記キットは、等温状態の下で前記デバイスから解離するポリメラーゼを含む。さらに別の態様では、前記キットは、シャペロン鎖置換分子（例えば、ヘリカーゼ、トランスフェラーゼ、または一本鎖結合タンパク質）を含む。
【００２４】
別の態様では、前記キットは、少なくとも２種のポリメラーゼを含み、少なくとも１種類のポリメラーゼは、校正ポリメラーゼである。前記校正ポリメラーゼは、それが存在する場合、前記一本鎖標的分子から、１または複数の非テンプレート付加反応を介して付加される塩基を除去する。
【００２５】
別の態様では、前記キットは、検出可能な標識と、伸張反応の伸張生成物にハイブリダイズする配列とを含む分子ビーコンを含む。前記キットのさらに別の態様では、前記分子ビーコンは、前記生成物にハイブリダイズされないとき、ヘアピン構造を形成する。
【００２６】
他の態様では、前記キットは、伸長反応の伸長生成物にハイブリダイズする配列を含むプローブを含み、前記プローブは、選択に応じて検出可能な標識を含む。さらに別の態様では、前記キットは、伸張生成物を切断する酵素を含む。
【００２７】
別の態様では、一本鎖標的分子を伸長させる方法が提供され、前記方法は、前記一本鎖標的分子を、伸長反応混合物と接触させるステップであって、前記伸長反応混合物は、（ｉ）本明細書に記載されるデバイス、または本明細書に記載される組成物と、（ｉｉ）ポリメラーゼと、（ｉｉｉ）遊離ヌクレオチドとを含む、該ステップを含み、このとき伸長反応生成物が生成され、該伸長反応生成物は、前記デバイスの生成物配列Ｙに相補的な３’配列を有する一本鎖標的分子を含む。
【００２８】
前記方法の一態様では、前記伸長反応混合物は、デバイスであって、その生成物配列Ｙは、約２０〜約３０塩基の長さの配列Ａからなり、前記伸長生成物は前記配列Ａに相補的な３’末端配列を含む、該デバイスを含む。
【００２９】
前記方法の別の態様では、前記伸長反応混合物は、デバイスであって、オリゴヌクレオチドの生成物配列Ｙは、前記デバイスのプライマー配列Ｐと同一な配列ＰＹからなり、このとき前記標的分子配列が前記プライマー配列Ｐに相補的であり、かつ前記反応生成物が前記プライマー配列Ｐに相補的な３’末端配列を有する、該デバイスを含む。
【００３０】
前記方法の別の態様では、前記伸長反応混合物は、デバイスであって、その生成物配列Ｙは、前記デバイスのプライマー配列Ｐと同一な配列ＰＹを含み、かつ配列ＰＹの配列とは異なるタグ配列Ｔをさらに含み、ここで配列ＴはＰＹに対して３’側に位置する、該デバイスを含む。
【００３１】
前記方法の別の態様では、前記伸長反応混合物は、本明細書に記載されるデバイスのなかの複数種を含み、前記複数種は、少なくとも３種のデバイスサブセットであって、１つのデバイスサブセットに属する各デバイスは配列Ｙの配列を含み、該配列Ｙの配列は、（ｉ）同じデバイスサブセットに属する別のデバイスの配列Ｙと同一であり、かつ（ｉｉ）前記複数種中の別のデバイスサブセットに属するデバイスの配列Ｙとは異なるものであって、前記伸長生成物は、前記複数種の配列Ｙのそれぞれに相補的な配列を含む３’末端を有する。
【００３２】
他の態様では、前記方法は、実質的な等温状態の下で実施される。特定の態様では、前記方法は、約６０℃〜約７５℃の範囲の温度で実施される。別の態様では、前記方法は、第１の温度で行われる１以上のステップと、第２の温度で行われる１以上のステップとを含み、前記第２の温度は、前記第１の温度より約２５℃以上高い。特定の態様では、前記第１の温度は、約６０℃〜約７５℃の範囲内にあり、前記第２の温度は、約８５℃〜約１００℃の範囲内にある。特定の態様では、前記方法は、前記ポリメラーゼが前記第２の温度において前記デバイスから解離する、解離ステップを含む。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本明細書において開示されるのは、ポリメラーゼの存在下において一本鎖ポリヌクレオチド分子の３’末端への１つまたは複数のポリヌクレオチド配列の付加を触媒する、ポリヌクレオチドデバイスである。該デバイスの使用方法も提供される。標準的なプライマー伸長反応と本発明のデバイスによって触媒される反応との間の大きな違いは、前者の場合には、反応はテンプレートの複製が完了した時点で終了するが、後者の場合は複数の反応が単一のステップで統合的に生じて、長いポリヌクレオチド分子のプログラム合成が行えることである。
【００３４】
特定のメカニズムに拘束されることなく、本明細書に記載されるデバイスは、初めに該デバイスの一本鎖領域で標的配列にハイブリダイズすることにより、その機能を発揮する。この一本鎖領域即ちプライマー配列Ｐは、プライマー配列Ｐに対して５’側に位置する生成物配列Ｙと、その全体または一部が生成物配列Ｙに相補的である配列Ｙ’とのハイブリダイゼーションによって、および選択に応じて、Ｙ（およびＲ）の５’側に位置するステム配列と、その全体または一部がステム配列Ｓに相補的である配列Ｓ’とのハイブリダイゼーションによって形成される、二本鎖領域に隣接している。ポリメラーゼの存在下でかつ適切な条件の下で、標的配列は伸長して、生成物配列Ｙに相補的な配列を付加する。生成物配列Ｙは、ポリメラーゼ活性のためのテンプレートとして機能する。標的配列が伸長されると、それはデバイスの二本鎖領域における配列Ｙ’を置換する。複製ブロック基Ｒに達するまで、標的配列の伸長が続行される。標的配列の伸長が完了すると、配列Ｙ’の鎖転移が、伸長された標的配列（この時点では、生成物配列Ｙと２重になっている）を置換し、配列Ｙと配列Ｙ’との間での二本鎖の二重構造が復元される。次いで伸長された標的配列がデバイスから解離する。このプロセスは一態様において、同一のデバイスまたは異なるデバイスを用いて、伸長プロセスの生成物がその同一のデバイスまたは異なるデバイスのプライマー配列Ｐにハイブリダイズし得る配列で終了しない限り、反復される。
【００３５】
特定の態様では、該デバイスは、一本のポリヌクレオチド、または２以上のポリヌクレオチドの組み合わせである。
【００３６】
一態様では、該デバイスが、標準的なオリゴヌクレオチド合成技術を用いて合成される。該デバイスは、種々の態様において、特定のポリヌクレオチド配列を一本鎖分子（例えば、以下に限定されないが、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦのそれぞれを独特のポリヌクレオチド配列としたときのＡＢＣＤＥＦ）に付加するのに便利である。あるいは、別の態様では、本明細書において提供される該デバイスは反復配列（例えば、Ｘを標的分子の末端に位置する特定のポリヌクレオチド配列としたときのＸＸＸＸＸＸ）をつくりだすのに有用である。さらに別の態様では、該デバイスは、（ＡＢＣＤＥＦ）ｎなどのポリヌクレオチド配列を、標的分子に付加するために使用される。さらに別の態様では、提供される該デバイスおよびその使用方法により、標的分子の集団においてすべてのポリヌクレオチドの末端が一様に伸長される。
【００３７】
Ｉ．一般構造式
従って、一本鎖プライマー（例えば一本鎖標的分子）の伸長を可能にするデバイスが提供される。第１の実施形態では、該デバイスは、構造１：
【化４】
2013511285.tif 000005
を含み、
ここで、
Ｐは、プライマー配列であり、
Ｙは、生成物配列であり、
Ｒは、複製ブロック基であり、
Ｓは、ユニバーサルステム配列であり、
Ｌは、ループ領域であり、
Ｓ’は、Ｓにハイブリダイズする配列であり、
Ｙ’は、Ｙにハイブリダイズする配列であり、
ＳおよびＳ’のそれぞれは、前記デバイス中に存在していてもよく、Ｓ’の存在は、前記デバイス中のＳの存在によって決まり、
Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｓ’、およびＹ’はヘアピン構造を形成する。
【００３８】
この単一ポリヌクレオチドのデバイスでは、ヘアピン二次構造は、標的がプライマー配列Ｐに対しハイブリダイズできる条件の下で安定である。特定の実施形態では、当該ヘアピン構造が、標的の伸長プロセスを通して安定的に維持される。
【００３９】
別の実施形態では、一本鎖プライマーの伸長のためのポリヌクレオチドの対が提供され、該ポリヌクレオチドの対は、構造２：
【化５】
2013511285.tif 000006
の第１のポリヌクレオチドと、
構造３：
【化６】
2013511285.tif 000007
の第２のポリヌクレオチドとを含み、
ここで、
Ｐは、プライマー配列であり、
Ｙは、生成物配列であり、
Ｒは、複製ブロック基であり、
Ｓは、ユニバーサルステム配列であり、
Ｙ’は、Ｙにハイブリダイズする配列であり、
Ｓ’は、Ｓにハイブリダイズする配列であり、
ＹおよびＹ’とＳおよびＳ’は二重構造を形成する。
【００４０】
この２以上のポリヌクレオチドを含むデバイスの実施形態では、配列Ｙと配列Ｙ’との間で形成される二重構造が、標的がプライマー配列Ｐに対しハイブリダイズできる条件の下で安定である。一態様では、該デバイスのポリヌクレオチドが、少なくとも配列Ｓと配列Ｓ’との間の相互作用による会合度を維持する。一態様では、デバイスのポリヌクレオチドは、伸長プロセス全体にわたって会合されたままに維持されるが、他の態様では、特定の場合にデバイスのポリヌクレオチドは完全に解離する。特定の態様では、デバイスのポリヌクレオチドの再会合は、反応条件を制御することにより、および／または構造２のポリヌクレオチドの濃度と比較してモル過剰量の構造３を有するポリヌクレオチドを提供することによって促進される。
【００４１】
ＩＩ．構造上の特徴
Ａ．プライマー配列Ｐ
上述したように、プライマーの配列Ｐは、該デバイスにおいて、少なくとも標的分子の３’末端が該デバイスにハイブリダイズする際の対象となる配列である。一態様において、標的分子の３’末端とプライマー配列Ｐとは１００％相補的である。別の態様において、標的分子の３’末端とプライマー配列Ｐとは、相補性が１００％未満であるが、標的分子のポリメラーゼ伸長を可能にする適切な条件下で２つの配列が安定的にハイブリダイズする程度に十分に相補的である。さらに他の態様では、標的分子の全体は、プライマーの配列Ｐと１００％相補的である。別の態様において、標的分子の全体は、プライマー配列Ｐとの相補性は１００％未満であるが、その標的分子の全体が適切な条件下で安定してプライマーの配列Ｐにハイブリダイズする程度に十分に相補的である。
【００４２】
さまざまな態様において、プライミング配列ＰはＸ塩基〜Ｙ塩基の長さを有し、ここでＸは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であり、Ｙは、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００である。一態様では、該デバイスのプライミング配列Ｐは、約５塩基〜約１５塩基の長さを有し、別形態では、該デバイスのプライミング配列Ｐは、約５塩基〜約３０塩基、約５塩基〜約４５塩基、または約５塩基〜約６０塩基の長さを有する。他のさまざまな実施形態では、プライミング配列Ｐは、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、３９塩基、４０塩基、４１塩基、４２塩基、４３塩基、４４塩基、４５塩基、４６塩基、４７塩基、４８塩基、４９塩基、５０塩基、５１塩基、５２塩基、５３塩基、５４塩基、５５塩基、５６塩基、５７塩基、５８塩基、５９塩基、６０塩基、６１塩基、６２塩基、６３塩基、６４塩基、６５塩基、６６塩基、６７塩基、６８塩基、６９塩基、７０塩基、７１塩基、７２塩基、７３塩基、７４塩基、７５塩基、７６塩基、７７塩基、７８塩基、７９塩基、８０塩基、８１塩基、８２塩基、８３塩基、８４塩基、８５塩基、８６塩基、８７塩基、８８塩基、８９塩基、９０塩基、９１塩基、９２塩基、９３塩基、９４塩基、９５塩基、９６塩基、９７塩基、９８塩基、９９塩基、１００塩基、またはそれ以上の塩基数の長さを有する。
【００４３】
Ｂ．生成物配列Ｙ
生成物配列Ｙは、デバイスにおけるポリメラーゼテンプレートであり、生成物配列Ｙの相補配列は、伸長された標的分子に付加される配列である。
【００４４】
特定の態様では、生成物配列ＹはＸ塩基〜Ｙ塩基の長さを有し、ここでＸは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５であり、Ｙは、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００である。別の態様では、生成物配列Ｙは約１０塩基〜約７５塩基の長さを有する。別形態では、配列Ｙは、約１０塩基〜約７０塩基、約１０塩基〜約６５塩基、約１０塩基〜約６０塩基、約１０塩基〜５５塩基、約１０塩基〜約５０塩基の長さ、約１０塩基〜約４５塩基の長さ、約１０塩基〜約４０塩基の長さ、約１０塩基〜約３５塩基の長さ、約１０塩基〜約３０塩基の長さ、約１０塩基〜約２５塩基の長さ、約１０塩基〜約２０塩基の長さ、または約１０塩基〜約１５塩基の長さを有する。さまざまな他の実施形態では、生成物配列Ｙは、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、３９塩基、４０塩基、４１塩基、４２塩基、４３塩基、４４塩基、４５塩基、４６塩基、４７塩基、４８塩基、４９塩基、５０塩基、５１塩基、５２塩基、５３塩基、５４塩基、５５塩基、５６塩基、５７塩基、５８塩基、５９塩基、６０塩基、６１塩基、６２塩基、６３塩基、６４塩基、６５塩基、６６塩基、６７塩基、６８塩基、６９塩基、７０塩基、７１塩基、７２塩基、７３塩基、７４塩基、７５塩基、７６塩基、７７塩基、７８塩基、７９塩基、８０塩基、８１塩基、８２塩基、８３塩基、８４塩基、８５塩基、８６塩基、８７塩基、８８塩基、８９塩基、９０塩基、９１塩基、９２塩基、９３塩基、９４塩基、９５塩基、９６塩基、９７塩基、９８塩基、９９塩基、１００塩基、またはそれ以上の塩基数の長さを有する。
【００４５】
１．配列ＰＹ
特定の態様では、生成物配列Ｙは、プライミング配列Ｐと同一である配列ＰＹからなる。別形態では、生成物配列Ｙは、プライミング配列Ｐと同一である配列ＰＹを含む。生成物配列ＹがＰＹである実施形態では、標的分子を伸長させると、標的分子に追加されたプライマー配列Ｐの相補配列が生ずる。得られた伸長生成物は、その３’末端がプライミング配列Ｐに相補的な配列（ｃＰ）で終了していることから、標的分子は同一の反応混合物中で複数回伸長させることができ、各伸長反応によって、プライマー配列Ｐに相補的な配列（ｃＰ）が標的に付加される。従って、いくつかの実施形態では、合成された伸長生成物は、構造５’−ｃＰ（ＰＹ）ｎ−３’を含み、この構造は５’−（ｃＰ）ｍ−３’（式中、ｎ＋１＝ｍ）と同一である。
【００４６】
さまざまな態様において、配列ＰＹはＸ塩基〜Ｙ塩基の長さを有し、ここでＸは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であり、Ｙは、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００である。一態様では、該デバイスの配列ＰＹは約５塩基〜約１５塩基の長さを有し、別形態では、該デバイスの配列ＰＹは、約５塩基〜約３０塩基、約５塩基〜約４５塩基、または約５塩基〜約６０塩基の長さを有する。さまざまな他の実施形態では、配列ＰＹは、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、３９塩基、４０塩基、４１塩基、４２塩基、４３塩基、４４塩基、４５塩基、４６塩基、４７塩基、４８塩基、４９塩基、５０塩基、５１塩基、５２塩基、５３塩基、５４塩基、５５塩基、５６塩基、５７塩基、５８塩基、５９塩基、６０塩基、６１塩基、６２塩基、６３塩基、６４塩基、６５塩基、６６塩基、６７塩基、６８塩基、６９塩基、７０塩基、７１塩基、７２塩基、７３塩基、７４塩基、７５塩基、７６塩基、７７塩基、７８塩基、７９塩基、８０塩基、８１塩基、８２塩基、８３塩基、８４塩基、８５塩基、８６塩基、８７塩基、８８塩基、８９塩基、９０塩基、９１塩基、９２塩基、９３塩基、９４塩基、９５塩基、９６塩基、９７塩基、９８塩基、９９塩基、１００塩基、またはそれ以上の塩基数の長さを有する。
【００４７】
２．タグ配列Ｔ
特定の態様では、生成物配列Ｙは、配列ＰＹと、配列ＰＹとは異なるタグ配列Ｔとを含む。上記のように、ＰＹはプライマー配列Ｐと同一である。タグ配列Ｔは、ＰＹに対して３’側に、Ｐ（３’−Ｐ−Ｔ−ＰＹ−５’）に対して５’側に位置する。生成物配列Ｙが３’−Ｔ−ＰＹ−５’である実施形態では、標的配列は、プライマー配列Ｐにハイブリダイズするプライマー配列Ｐの相補配列（ｃＰ）から伸長されて、タグ配列Ｔの相補配列（ｃＴ）、およびプライマー配列Ｐの相補配列と同一である配列ＰＹの相補配列（ｃＰＹ）を含むようになる。生成物配列ＹがＰＹである反応における場合と同様に、この反応の伸長生成物は、３’配列として５’−ｃＰ−ｃＴ−ｃＰＹ−３’を有し、伸長生成物のｃＰＹ配列の部分はプライマー配列Ｐに相補的であることから、伸長された標的配列を、同じ反応混合物中で複数回さらに伸長させて、複数の５’−ｃＴ−ｃＰＹ−３’の複製を標的分子に付加することができる。典型的な態様では、デバイスのプライマー配列Ｐは第１回目に合成された伸長生成物のｃＰＹに結合し、伸長の第２回目では、伸長生成物が配列５’ｃＰ−（ｃＴ−ｃＰＹ）２−３’を含む。デバイスのプライマー配列Ｐは第２回目に合成された伸長生成物のｃＰＹに結合し、伸長の第３回目では、伸長生成物が配列５’−ｃＰ−（ｃＴ−ｃＰＹ）３−３’を含む。従って、いくつかの実施形態では、合成された伸長生成物が構造５’−ｃＰ−（ｃＴ−ｃＰＹ）ｎ−３’を含む。
【００４８】
さまざまな態様において、タグ配列ＴはＸ塩基〜Ｙ塩基の長さを有し、ここでＸは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であり、Ｙは、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００である。他の態様では、タグ配列Ｔは約１０塩基〜約７５塩基の長さ、約１０塩基〜約７０塩基、約１０塩基〜約６５塩基、約１０塩基〜約６０塩基、約１０塩基〜約５５塩基、約１０塩基〜約５０塩基、約１０塩基〜約４５塩基、約１０塩基〜約４０塩基、約１０塩基〜約３５塩基、約１０塩基〜約３０塩基、約１０塩基〜約２５塩基、約１０塩基〜約２０塩基、または約１０塩基〜約１５塩基の長さを有する。さまざまな他の実施形態では、タグ配列Ｔは、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、３９塩基、４０塩基、４１塩基、４２塩基、４３塩基、４４塩基、４５塩基、４６塩基、４７塩基、４８塩基、４９塩基、５０塩基、５１塩基、５２塩基、５３塩基、５４塩基、５５塩基、５６塩基、５７塩基、５８塩基、５９塩基、６０塩基、６１塩基、６２塩基、６３塩基、６４塩基、６５塩基、６６塩基、６７塩基、６８塩基、６９塩基、７０塩基、７１塩基、７２塩基、７３塩基、７４塩基、７５塩基、７６塩基、７７塩基、７８塩基、７９塩基、８０塩基、８１塩基、８２塩基、８３塩基、８４塩基、８５塩基、８６塩基、８７塩基、８８塩基、８９塩基、９０塩基、９１塩基、９２塩基、９３塩基、９４塩基、９５塩基、９６塩基、９７塩基、９８塩基、９９塩基、１００塩基、またはそれ以上の塩基数の長さを有する。
【００４９】
３．追加の配列Ａ
該デバイスの別の実施形態では、生成物配列Ｙは、プライミング配列Ｐと同一でない追加の配列Ａを含む。いくつかの実施形態では、Ｙは追加の配列Ａからなる。伸張された標的分子は、配列Ａに相補的な３’末端配列を有する。この実施形態では、追加の配列Ａと同一なプライマー配列Ｐを有する同一の反応混合物中に別のデバイスがない場合、１つの反応混合物中で当該配列の一回の複製ｃＡのみが標的分子に付加される。従って、いくつかの実施形態では、合成された伸張生成物は構造５’−ｃＰ−ｃＡ−３’を含む。
【００５０】
特定の態様では、該追加の配列ＡはＸ塩基〜Ｙ塩基の長さを有し、ここでＸは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５であり、Ｙは、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００である。別の態様では、追加の配列Ａは約２０塩基〜約３０塩基の長さを有する。他の実施形態では、付加される配列Ａは、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、３９塩基、４０塩基、４１塩基、４２塩基、４３塩基、４４塩基、４５塩基、４６塩基、４７塩基、４８塩基、４９塩基、５０塩基、５１塩基、５２塩基、５３塩基、５４塩基、５５塩基、５６塩基、５７塩基、５８塩基、５９塩基、６０塩基、６１塩基、６２塩基、６３塩基、６４塩基、６５塩基、６６塩基、６７塩基、６８塩基、６９塩基、７０塩基、７１塩基、７２塩基、７３塩基、７４塩基、７５塩基、７６塩基、７７塩基、７８塩基、７９塩基、８０塩基、８１塩基、８２塩基、８３塩基、８４塩基、８５塩基、８６塩基、８７塩基、８８塩基、８９塩基、９０塩基、９１塩基、９２塩基、９３塩基、９４塩基、９５塩基、９６塩基、９７塩基、９８塩基、９９塩基、１００塩基、またはそれ以上の塩基数の長さを有する。
【００５１】
Ｃ．内部ブロック基Ｒ
該デバイスは、さまざまな実施形態において、以下に限定されないが、脱塩基部位、修飾された塩基、若しくは生成物配列Ｙに含まれていない塩基（または塩基群）であるか、それらを含む内部複製ブロック基Ｒをさらに含むか、あるいは対応する相補的デオキシヌクレオチド三リン酸Ｒ’が限界濃度で反応混合物中に存在するか、または反応混合物中には存在しない。
【００５２】
本明細書において利用される用語「脱塩基部位」とは、１以上のリン酸塩に結合しているペントース基を含む点で、ヌクレオチドと構造上類似しているが、塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミンなど）を含まない点でヌクレオチドと異なる、単位化合物を含む分子をさす。いくつかの態様では、脱塩基部位は、１〜３個のリン酸基に結合したリボースまたはデオキシリボースである。いくつかの態様では、該脱塩基部位は、上記のように、ポリヌクレオチドと同様相互に結合した２以上の単位化合物を含む分子である。ポリメラーゼは、脱塩基部位に接触すると、当該部位には塩基テンプレートがないので一本鎖標的分子にヌクレオチドを付加しなくなる。
【００５３】
ブロック基Ｒが修飾された塩基である態様では、該修飾された塩基は、一態様において、ブロック基Ｒに対してポリメラーゼ結合を立体的に阻害する化学的部分を含む。典型的な態様では、Ｒは、ストレプトアビジン分子と複合体形成したビオチニル化塩基である。
【００５４】
あるいは、該修飾された塩基は、該デバイスの別の塩基に架橋した塩基であり、特定の態様では、該修飾された塩基は、Ｓ’の塩基に架橋した、またはＹ’に対して３’側かつＹに対して５’側に位置する任意の他の塩基に架橋したものである。特定の態様では、該修飾された塩基は、該デバイスの別の塩基（例えば、Ｓ’の塩基、またはＹ’に対して３’側かつＹに対して５’側に位置する任意の他の塩基）とソラレン鎖間架橋を形成する。ブロック基Ｒが脱塩基部位である態様において、この脱塩基部位は、Ｓ’またはＹ’の塩基に特異的は結合しない。
【００５５】
任意の複製ブロック基は、そのブロック基が該デバイスの構造に組み込まれ得るものである限りＲ基として使用することが意図されていることを、当業者は理解されよう。典型的な態様では、Ｒ基は、該デバイスがポリメラーゼ即ち一本鎖標的分子に結合していないときにそのデバイスがヘアピン構造または二重構造を形成するのを妨げない、任意の複製ブロック基である。いくつかの態様において、Ｒ基は、ポリメラーゼを、例えば実質的に等温条件下で、約０℃〜約９５℃、約２０℃〜約９５℃、約３７℃〜約９５℃、約６０℃〜約７５℃の範囲内の温度で、デバイスから解離させる任意の複製ブロック基である。
【００５６】
上記の観点から、内部複製ブロック基Ｒは、いくつかの実施形態においては、二官能性スペーサー（例えば、α，ω−ジオールを含む二官能性スペーサー）などのスペーサーである。いくつかの態様において、内部複製ブロック基は、構造ＨＯ−ｋ−ＯＨを含み、式中、ｋは直鎖状または分岐アルキレン鎖、直鎖状又は分岐アルケニレン鎖、または直鎖状または分枝アルキニレン鎖を表し、ｋは１〜１０個の炭素原子、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の炭素原子を含む。いくつかの態様において、内部複製ブロック基Ｒは、Ｃ１−Ｃ１０アルキレングリコールスペーサー、デオキシリボースのスペーサーである。特定の態様では、内部複製ブロック基Ｒは、ヘキサメチレングリコールスペーサー、ヘキシレングリコールスペーサー、または２−デオキシリボーススペーサーである。他のスペーサーも当技術分野で知られている。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００５／０１２４９９号を参照されたい。
【００５７】
Ｄ．ステム配列Ｓ
いくつかの実施形態において、該デバイスはステム配列Ｓをさらに含み、ステム配列は、それが存在する場合には該デバイスの二本鎖部分の一部である。ステム配列Ｓは、該デバイスの二本鎖部分における配列Ｓ’の全部または一部に対して相補的であり、ステム配列Ｓは配列Ｓ’にハイブリダイズする。いくつかの態様では、ステム配列Ｓおよび配列Ｓ’は、約０℃〜約９５℃、約２０℃〜約９５℃、約３７℃〜約９５℃の温度範囲内（例えば、約４０℃〜約８５℃の範囲内、約４５℃〜約８０℃の範囲内、約５０℃〜約７５℃の範囲内、約６０℃〜約７５℃の範囲内）の温度で安定な二重構造を形成する。特定の態様では、ステム配列Ｓは、約０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、または約８０％〜約１００％のＧＣ含量を含む。特定の態様では、該デバイスは、構造２の第１のポリヌクレオチドと、構造３の第２のポリヌクレオチドとを含み、ステム配列Ｓが約０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、または約８０％〜約１００％のＧＣ含量を含む。
【００５８】
さまざまな態様において、ステム配列ＳはＸ塩基〜Ｙ塩基の長さを有し、ここでＸは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５であり、Ｙは、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００である。他の態様では、ステム配列Ｓは約５塩基〜約２５塩基の長さ、約５塩基〜約２０塩基、または約５塩基〜約１５塩基の長さを有する。他の態様では、ステム配列Ｓは、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、３９塩基、４０塩基、４１塩基、４２塩基、４３塩基、４４塩基、４５塩基、４６塩基、４７塩基、４８塩基、４９塩基、５０塩基、５１塩基、５２塩基、５３塩基、５４塩基、５５塩基、５６塩基、５７塩基、５８塩基、５９塩基、６０塩基、６１塩基、６２塩基、６３塩基、６４塩基、６５塩基、６６塩基、６７塩基、６８塩基、６９塩基、７０塩基、７１塩基、７２塩基、７３塩基、７４塩基、７５塩基、７６塩基、７７塩基、７８塩基、７９塩基、８０塩基、８１塩基、８２塩基、８３塩基、８４塩基、８５塩基、８６塩基、８７塩基、８８塩基、８９塩基、９０塩基、９１塩基、９２塩基、９３塩基、９４塩基、９５塩基、９６塩基、９７塩基、９８塩基、９９塩基、１００塩基、またはそれ以上の塩基数の長さを有する。
【００５９】
Ｅ．ループ配列Ｌ
該デバイスが１本の核酸分子である本発明の態様においては、ループ配列Ｌが存在する。ループ配列Ｌは、一本鎖核酸デバイスがそれ自体の上に折り畳まれてヘアピン二次構造を形成するのを可能にするのに十分な長さであり、ヘアピン二次構造では、ステム配列Ｓはそれが存在するとき配列Ｓ’にハイブリダイズでき、生成物配列Ｙは配列Ｙ’にハイブリダイズできる。
【００６０】
さまざまな態様において、ループ配列Ｌは約１塩基〜約１５塩基の長さ、約１塩基〜約１４塩基の長さ、約１塩基〜約１３塩基の長さ、約１塩基〜約１２塩基の長さ、約１塩基〜約１１塩基の長さ、約１塩基〜約１０塩基の長さ、約１塩基〜約９塩基の長さ、約１塩基〜約８塩基の長さ、約１塩基〜約７塩基の長さ、約１塩基〜約６塩基の長さ、または約１塩基〜約５塩基の長さを有する。あるいは、ループ配列Ｌは、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、３９塩基、４０塩基、４１塩基、４２塩基、４３塩基、４４塩基、４５塩基、４６塩基、４７塩基、４８塩基、４９塩基、５０塩基、５１塩基、５２塩基、５３塩基、５４塩基、５５塩基、５６塩基、５７塩基、５８塩基、５９塩基、６０塩基、６１塩基、６２塩基、６３塩基、６４塩基、６５塩基、６６塩基、６７塩基、６８塩基、６９塩基、７０塩基、７１塩基、７２塩基、７３塩基、７４塩基、７５塩基、７６塩基、７７塩基、７８塩基、７９塩基、８０塩基、８１塩基、８２塩基、８３塩基、８４塩基、８５塩基、８６塩基、８７塩基、８８塩基、８９塩基、９０塩基、９１塩基、９２塩基、９３塩基、９４塩基、９５塩基、９６塩基、９７塩基、９８塩基、９９塩基、１００塩基、またはそれ以上の塩基数の長さを有する。
【００６１】
Ｆ．ステム配列Ｓ’
該デバイス中にステム配列Ｓが存在する態様では、該デバイスは、上記のようにその全部または一部がステム配列Ｓに対して相補的であり、デバイスの二重領域の一部をなすステム配列Ｓ’をさらに含み、配列Ｓ’はステム配列Ｓにハイブリダイズする。上記のように、いくつかの態様では、ステム配列Ｓおよび配列Ｓ’は、約０℃〜約９５℃、約２０℃〜約９５℃、約３７℃〜約９５℃の温度範囲内（例えば、約４０℃〜約８５℃の範囲内、約４５℃〜約８０℃の範囲内、約５０℃〜約７５℃の範囲内、約６０℃〜約７５℃の範囲内）の温度で安定な二重構造を形成する。特定の態様では、配列Ｓ’は、約０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、または約８０％〜約１００％のＧＣ含量を含む。特定の態様では、該デバイスは、構造２の第１のポリヌクレオチドと、構造３の第２のポリヌクレオチドとを含み、配列Ｓ’が約０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、または約８０％〜約１００％のＧＣ含量を含む。
【００６２】
さまざまな態様において、配列Ｓ’はＸ塩基〜Ｙ塩基の長さを有し、ここでＸは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５であり、Ｙは、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００である。他の態様では、配列Ｓ’は約５塩基〜約２５塩基の長さ、約５塩基〜約２０塩基、または約５塩基〜約１５塩基の長さを有する。他の態様では、配列Ｓ’は、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、３９塩基、４０塩基、４１塩基、４２塩基、４３塩基、４４塩基、４５塩基、４６塩基、４７塩基、４８塩基、４９塩基、５０塩基、５１塩基、５２塩基、５３塩基、５４塩基、５５塩基、５６塩基、５７塩基、５８塩基、５９塩基、６０塩基、６１塩基、６２塩基、６３塩基、６４塩基、６５塩基、６６塩基、６７塩基、６８塩基、６９塩基、７０塩基、７１塩基、７２塩基、７３塩基、７４塩基、７５塩基、７６塩基、７７塩基、７８塩基、７９塩基、８０塩基、８１塩基、８２塩基、８３塩基、８４塩基、８５塩基、８６塩基、８７塩基、８８塩基、８９塩基、９０塩基、９１塩基、９２塩基、９３塩基、９４塩基、９５塩基、９６塩基、９７塩基、９８塩基、９９塩基、１００塩基、またはそれ以上の塩基数の長さを有する。いくつかの態様では、配列Ｓ’はステム配列Ｓと同じ長さを有する。
【００６３】
Ｇ．配列Ｙ’
該デバイスは、さらに、特定の態様では生成物配列Ｙに相補的である配列Ｙ’を有する。Ｙ’のＹに対するハイブリダイゼーションによりデバイスの二重領域が生ずる。特定の態様では、配列Ｙ’は、その全長さにわたって生成物配列Ｙに対して相補的である。他の態様では、配列Ｙ’はその一部の長さのみ生成物配列Ｙに対して相補的である。
【００６４】
いくつかの態様では、配列Ｙ’は、Ｙ配列とＹ’配列との間で形成される二重構造の安定性を高める塩基修飾を含む。そのような修飾の例としては、ＲＮＡ塩基、ＬＮＡ塩基、およびＰＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
特定の態様では、配列Ｙ’はＸ塩基〜Ｙ塩基の長さを有し、ここでＸは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５であり、Ｙは、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００である。他の態様では、生成物配列Ｙは約１０塩基〜約７５塩基の長さを有する。別形態では、配列Ｙ’は、約１０塩基〜約７０塩基、約１０塩基〜約６５塩基、約１０塩基〜約６０塩基、約１０塩基〜５５塩基、約１０塩基〜約５０塩基の長さ、約１０塩基〜約４５塩基の長さ、約１０塩基〜約４０塩基の長さ、約１０塩基〜約３５塩基の長さ、約１０塩基〜約３０塩基の長さ、約１０塩基〜約２５塩基の長さ、約１０塩基〜約２０塩基の長さ、または約１０塩基〜約１５塩基の長さを有する。さまざまな他の実施形態では、配列Ｙ’は、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、３９塩基、４０塩基、４１塩基、４２塩基、４３塩基、４４塩基、４５塩基、４６塩基、４７塩基、４８塩基、４９塩基、５０塩基、５１塩基、５２塩基、５３塩基、５４塩基、５５塩基、５６塩基、５７塩基、５８塩基、５９塩基、６０塩基、６１塩基、６２塩基、６３塩基、６４塩基、６５塩基、６６塩基、６７塩基、６８塩基、６９塩基、７０塩基、７１塩基、７２塩基、７３塩基、７４塩基、７５塩基、７６塩基、７７塩基、７８塩基、７９塩基、８０塩基、８１塩基、８２塩基、８３塩基、８４塩基、８５塩基、８６塩基、８７塩基、８８塩基、８９塩基、９０塩基、９１塩基、９２塩基、９３塩基、９４塩基、９５塩基、９６塩基、９７塩基、９８塩基、９９塩基、１００塩基、またはそれ以上の塩基数の長さを有する。いくつかの態様では、配列Ｙ’は、生成物配列Ｙと同じ長さを有する。
【００６６】
Ｈ．配列Ｘ
別の実施形態では、該デバイスは、いくつかの態様においてプライミング配列Ｐの一部分にハイブリダイズする配列Ｘを、選択に応じて含む。該デバイス中では、配列Ｘは配列Ｙ’に対して５’側に位置する。特定のメカニズムによって制約されることなく、配列Ｘの存在が、標的配列がプライマー配列Ｐにハイブリダイズする際の特異性を向上させることが仮定されている。これとは別に、またはこれに加えて、配列Ｘの存在が、標的配列の伸長が終了したときの伸長した標的配列の該デバイスからの解離の速度および／または程度を向上させる。特定の態様では、配列Ｘが、Ｐの５’末端にハイブリダイズする。別の態様では、配列Ｘは、プライマー配列Ｐの少なくとも一部分にハイブリダイズする。いくつかの態様では、配列Ｘはプライマー配列Ｐの一部分のみに対してハイブリダイズする。いくつかの態様では、配列Ｘはプライマー配列Ｐの５’末端のみに対してハイブリダイズする。さらに別の実施形態では、配列Ｘは、プライマー配列Ｐの少なくとも一部分および生成物配列Ｙの少なくとも一部分にハイブリダイズする。いくつかの態様では、配列Ｘは、プライマー配列Ｐの一部分のみおよび生成物配列Ｙの一部分のみにハイブリダイズする。いくつかの態様では、配列Ｘは、プライマー配列Ｐの５’末端のみおよび生成物配列Ｙの３’末端のみにハイブリダイズする。
【００６７】
さまざまな実施形態において、配列Ｘは、該デバイス中のいずれの配列にもハイブリダイズしない。そのような実施形態では、配列Ｘは５’フラップとみなすことができる。特定のメカニズムによって制約されることなく、配列Ｘの存在が、標的配列の伸長が終了したときの伸長した標的配列の該デバイスからの解離の速度および／または程度を向上させることが仮定されている。
【００６８】
さまざまな実施形態において、配列ＸはＸ塩基〜Ｙ塩基の長さを有し、ここでＸは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上である。別の態様では、配列Ｘは、約１塩基〜約２０塩基、約１塩基〜約１５塩基、または約１塩基〜約１０塩基の長さを有する。特定の態様では、配列Ｘは、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、またはそれ以上の塩基数の長さを有する。
【００６９】
Ｉ．ブロック基Ｆ
本発明のデバイスは、プライマー配列Ｐに対し３’側に位置するブロック基Ｆを、選択に応じて有する。ブロック基Ｆは、プライマー配列Ｐ上でのＤＮＡポリメラーゼ伸長をブロック、即ちプライマー配列Ｐの長さの伸長を妨げる。ブロック基Ｆが存在する場合、ブロック基Ｆは特定の態様において、３’アミノ基、３’リン酸塩、またはジデオキシヌクレオチド、６炭素グリコールスペーサー（一態様では、６炭素グリコールスペーサーがヘキサンジオールである）、および逆位デオキシチミジン（ｄＴ）である。任意のポリメラーゼブロック基を、プライミング配列Ｐに対し３’側に配置できることを、当業者は理解されよう。例えば、３’ヒドロキシル基はポリメラーゼ活性のために必要であるが、プライマー配列Ｐの３’末端に位置する３’ヒドロキシル基以外の任意の基は有用なブロック基となることは当業者には理解される。
【００７０】
Ｊ．鎖保護
いくつかの態様では、該デバイスは酵素による切断から保護される。典型的な態様では、該デバイスは、糖−リン酸結合の代わりに１以上の非切断結合（例えば、酵素によって切断されない修飾されたヌクレオチド間結合）を含む。いくつかの態様において、該デバイスは、１以上の非切断結合（例えば、本明細書に記載される修飾された主鎖を含む修飾されたポリヌクレオチドの結合のいずれか）を含む。特定の態様では、前記１以上の非切断結合、例えば修飾されたヌクレオチド間結合は、生成物配列Ｙの５’に位置する。
【００７１】
ＩＩＩ．物理的性質
特定の態様では、配列Ｓと配列Ｓ’との間の二本鎖領域は伸長反応の間に解離することなく維持される。あるいは、配列Ｓと配列Ｓ’の間の二本鎖領域は解離なく維持されないが、任意の時点に、その配列Ｓと配列Ｓ’とは二本鎖構造にある可能性が、そうでない可能性より高い。二本鎖立体構造を維持するべく、または伸長反応中の任意の時点で二本鎖立体構造が存在する可能性がより高くなるようにするべく、配列Ｓと配列Ｓ’を設計および合成する方法を、当業者は容易に理解されよう。
【００７２】
例えば、限定を意図しないが、配列Ｓと配列Ｓ’との間に形成された二本鎖領域の安定性は、ＧＣ含量を高くすることで増加する。従って、特定の態様では、配列Ｓおよび配列Ｓ’が、約０％〜約１００％の、約７０％〜約１００％の、または約８０％〜約１００％のＧＣ含量を有する。
【００７３】
別の実施例では、上記のように、２つのポリヌクレオチドを含む本発明のデバイスに関して、一方のポリヌクレオチドが他方のポリヌクレオチドのモル過剰で存在し、その２つのポリヌクレオチドが混合物中でハイブリダイズする傾向をもたされている。種々の態様では、構造３に示すポリヌクレオチドが、上記のイオン構造２のポリヌクレオチドの濃度と比較して、２倍、３、倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ以上のモル過剰で存在している。
【００７４】
特定の態様では、本発明のデバイスにおける二本鎖領域が安定化する可能性を向上させるように伸長反応の反応条件を変更することは、当業者には理解されよう。変更の対象となる反応条件パラメータには、例えば、塩濃度およびｐＨが含まれる。その伸長生成物が最終的に反応混合物中のデバイスから置換すなわち脱ハイブリダイズされ、デバイスの二本鎖領域がさらに伸長反応する前に改変されるという要件を考慮して、反応混合物の温度と、プライマー配列Ｐと標的分子、プライマー配列Ｐおよび生成物配列Ｙと伸長生成物、生成物配列Ｙと配列Ｙ’、ステム配列Ｓと配列Ｓ’、生成物配列Ｙおよびステム配列Ｓと配列Ｙ’および配列Ｓ’の間に形成される二本鎖領域のいずれかの安定性と関するバランスがとられる。
【００７５】
いくつかの態様において、ＳとＳ’との間の相互作用は、変性条件（例えば約９４℃〜１００℃）にさらされると中断するが、該相互作用は、温度が約７５℃以下に下がると復元される。
【００７６】
ＩＶ．デバイスのポリヌクレオチド
本明細書中で使用される、標的分子としての「ポリヌクレオチド」という用語は、用語「オリゴヌクレオチド」と区別なく同義で使用されている。本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」またはその複数形は、本明細書に記載され、当技術分野でも知られているように、その修飾型のヌクレオチドと区別することなく用いられる。特定の事例では、当分野において、重合させ得るヌクレオチドの修飾物と同様に天然のヌクレオチドを包含する用語「核酸塩基」を用いる。
【００７７】
所定の配列を有するデバイスのためのポリヌクレオチドの製造方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．１９８９）およびＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，１ｓｔ  Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照されたい。固相合成法は、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドの両方のために好ましい（ＤＮＡを合成する公知の方法は、ＲＮＡを合成するためにも有用である）。オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドは、酵素的に調製することもできる。
【００７８】
種々の態様において、提供される方法には、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡまたは２つのタイプの組み合わせであるポリヌクレオチドの使用が含まれる。また、ポリヌクレオチドの修飾型は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を有するものを含む本発明のデバイスにおいて想定されている。修飾されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、以下、本明細書中に詳細に記載されている。
【００７９】
Ｖ．修飾されたポリヌクレオチド
修飾されたポリヌクレオチドの具体例としては、修飾された主鎖、または非天然ヌクレオシド間結合を含むものが挙げられる。修飾された主鎖を有するポリヌクレオチドには、主鎖中にリン原子を保持するもの、および主鎖中にリン原子を有していないものがある。ヌクレオシド主鎖にリン原子を有していない修飾されたポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の意味の範囲内であると考えられる。
【００８０】
リン原子をその中に含む修飾されたポリヌクレオチド主鎖としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、およびキラルホスホネートを含む）、ホスフィナート、ホスホラミデート（３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含む）、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合された類似体、ならびにその中の１以上のヌクレオチド間結合が３’から３’、５’から５’、または２’から２’への結合である、逆の極性を有するものが挙げられる。また、逆の極性を有するポリヌクレオチドであって、３’最末端ヌクレオチド間結合において、単一の３’から３’への結合、すなわち、無塩基であり得る単一の逆のヌクレオシド残基（ヌクレオチドが、欠失しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）を含むものも想定されている。塩、混合塩、および遊離酸の形態のものも想定されている。上記リン含有結合の調製法を開示する代表的な米国特許としては、米国特許第：３，６８７，８０８号；４，４６９，８６３号；４，４７６，３０１号；５，０２３，２４３号；５，１７７，１９６号；５，１８８，８９７号；５，２６４，４２３号；５，２７６，０１９号；５，２７８，３０２号；５，２８６，７１７号；５，３２１，１３１号；５，３９９，６７６号；５，４０５，９３９号；５，４５３，４９６号；５，４５５，２３３号；５，４６６，６７７号；５，４７６，９２５号；５，５１９，１２６号；５，５３６，８２１号；５，５４１，３０６号；５，５５０，１１１号；５，５６３，２５３号；５，５７１，７９９号；５，５８７，３６１号；５，１９４，５９９号；５，５６５，５５５号；５，５２７，８９９号；５，７２１，２１８号；５，６７２，６９７号および５，６２５，０５０号が挙げられ、これらの全内容は参照により組み込まれる。
【００８１】
リン原子をその中に含まない修飾されたポリヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルが混合されたヌクレオシド間結合、または１つ以上の、短鎖ヘテロ原子の、もしくはヘテロ環式の、ヌクレオシド間結合により形成される主鎖を有する。これらには、モルホリノ結合を有するもの；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；および混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他のものが挙げられる。例えば、米国特許第：５，０３４，５０６号；５，１６６，３１５号；５，１８５，４４４号；５，２１４，１３４号；５，２１６，１４１号；５，２３５，０３３号；５，２６４，５６２号；５，２６４，５６４号；５，４０５，９３８号；５，４３４，２５７号；５，４６６，６７７号；５，４７０，９６７号；５，４８９，６７７号；５，５４１，３０７号；５，５６１，２２５号；５，５９６，０８６号；５，６０２，２４０号；５，６１０，２８９号；５，６０２，２４０号；５，６０８，０４６号；５，６１０，２８９号；５，６１８，７０４号；５，６２３，０７０号；５，６６３，３１２号；５，６３３，３６０号；５，６７７，４３７号；５，７９２，６０８号；５，６４６，２６９号および５，６７７，４３９号などを参照されたい。これらの全内容は参照により組み込まれる。
【００８２】
さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチド模倣剤において、該ヌクレオチド単位の１以上の糖および／または１以上のヌクレオシド間結合の両方が、「非天然の」基により置換される。一態様では、この実施形態がペプチド核酸（ＰＮＡ）であるとする。ＰＮＡ化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖主鎖は、アミド含有主鎖で置換される。例えば、米国特許第：５，５３９，０８２号；５，７１４，３３１号ならびに５，７１９，２６２号、およびＮｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００を参照されたい。これらの開示内容は、参照により組み込まれる。
【００８３】
さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチドが、ホスホロチオエート主鎖を有するもの、およびヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオシド、および上記で引用された米国特許第５，４８９，６７７号および第５，６０２，２４０号に記載された−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−を含む。また、米国特許第５，０３４，５０６号に記載されたモルホリノ主鎖構造を有するポリヌクレオチドも想定されている。
【００８４】
各種形態では、オリゴ中の二つの連続したモノマー間の結合が、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＨ−、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、−Ｓｉ（Ｒ”）２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）２−、−ＰＯ（ＢＨ３）−、−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）２−、−ＰＯ（Ｒ”）−、−ＰＯ（ＯＣＨ３）−、および−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−から選択された２−４個望ましくは３個の基／原子からなり、ここでＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ”はＣ１−６−アルキルおよびフェニルから選択される。そのような結合の典型的な例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続するモノマーへの結合として用いられるときＲ５を含む）、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＳ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｃ（＝ＮＲＨ）−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝（後続するモノマーへの結合として用いられるときＲ５を含む）、−ＣＨ２−Ｏ−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＲＨ、−Ｏ−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続するモノマーへの結合として用いられるときＲ５を含む）、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−；−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ  Ｈ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ”）２−Ｏ−などが挙げられ；これらのうち−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（���）２−Ｏ−Ｏ−Ｐ（−Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ  Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＣＨ３）−Ｏ−、および−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−について、ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ”はＣ１−６−アルキルおよびフェニルから選択されるものであることが、本発明において意図されている。さらなる代表的な例は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３４３−３５５およびＳｕｓａｎ  Ｍ．ＦｒｅｉｅｒおよびＫａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ２５：ｐｐ４４２９−４４４３に記載されている。
【００８５】
ポリヌクレオチドの他のさらなる修飾型は米国特許出願第２００４０２１９５６５号に詳細に記載されており、この開示内容全体は参照により組み込まれる。
【００８６】
修飾ポリヌクレオチドは、１個または複数の置換糖部も選択に応じて含有する。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、２’位に以下のものの１つを含む。即ち、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルであり、式中アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１−Ｃ１０アルキルまたはＣ２−Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルでもよい。他の実施形態では、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２が含まれ、式中ｎおよびｍは１から約１０である。他のオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のものの１つを含む。即ち、Ｃ１−Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入基、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、オリゴヌクレオチドの薬物動力学特性を改善する基、および類似の性質を有する他の置換基である。一態様では、修飾部には２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、別名２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ）（Ｍａｒｔｉｎら、１９９５、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、７８、４８６−５０４）、即ちアルコキシアルコキシ基が含まれる。他の修飾部には、本明細書の以下の実施例に記載する、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、別名２’−ＤＭＡＯＥ、および本明細書の以下の実施例にやはり記載する、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野での別名２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥ）、即ち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２が含まれる。
【００８７】
さらに他の修飾部には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。２’−修飾部は、アラビノ（上向き）位またはリボ（下向き）位にあってもよい。一態様では、２’−アラビノ修飾部は２’−Ｆである。類似の修飾部をオリゴヌクレオチド上の他の位置、例えば、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’連結オリゴヌクレオチド中の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位に作製してもよい。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部などの糖模倣部を有してもよい。例えば、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号および第５，７００，９２０号を参照されたい。これらの開示内容全体は参照により組み込まれる。
【００８８】
一態様では、糖の修飾部には、２’−ヒドロキシ基が、糖環の３’または４’炭素原子に連結され、それにより二環性糖部を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる。特定の態様における連結部は、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、式中ｎは１または２である。ＬＮＡおよびその調製は、国際公開第９８／３９３５２号および国際公開第９９／１４２２６号に記載されている。
【００８９】
ポリヌクレオチドは、塩基の修飾または置換も含み得る。本明細書で使用する場合、「非修飾」または「天然」塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然塩基が含まれる。さらなる修飾塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）などのＧクランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などの三環性ピリミジンが挙げられる。修飾塩基は、プリンまたはピリミジン塩基が他のヘテロ環で代替された塩基、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンも包含し得る。さらなる塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されたもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．ｅｄ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９０に開示されたもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、１９９１、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、３０：６１３で開示されたもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，１５章，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２８９−３０２、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３で開示されたものが含まれる。こうした塩基のうち特定のものは、結合親和性の増加に有用であり、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニ��ウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含め、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６−１．２℃高めることが示されており、ある種の態様では、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせられる。米国特許第３，６８７，８０８号、第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第６，００５，０９６号、第５，７５０，６９２号および第５，６８１，９４１号を参照されたい。これらの開示内容全体は参照により組み込まれる。
【００９０】
「修飾塩基」または類似の他の用語は、天然塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルおよび／またはチミン）と対を形成できる、および／または非天然塩基と対を形成できる構成物を指す。特定の態様では、修飾塩基は、１５、１２、１０、８、６、４もしくは２℃、またはそれ未満のＴｍ差を示す。例示的な修飾塩基は、欧州特許第１０７２６７９号および国際公開第９７／１２８９６号に記載されている。
【００９１】
「核酸塩基」とは、天然核酸塩基のアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）、ならびに非天然核酸塩基を意味し、非天然核酸塩基は、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、ならびにＢｅｎｎｅｒらの米国特許第５，４３２，２７２号およびＳｕｓａｎ  Ｍ．ＦｒｅｉｅｒおよびＫａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ、１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．２５、ｐｐ４４２９−４４４３に記載の「非天然」核酸塩基などである。従って、用語「核酸塩基」は、既知のプリンおよびピリミジンヘテロ環だけでなく、それらのヘテロ環類縁体および互変異性体も包含する。さらなる天然および非天然核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎら）、Ｓａｎｇｈｖｉ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｓ．Ｔ．ＣｒｏｏｋｅおよびＢ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３の１５章、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、３０：６１３−７２２（特に６２２および６２３頁、ならびに各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９０，８５８−８５９頁、Ｃｏｏｋ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、１９９１，６，５８５−６０７を参照されたい）に開示されたものを包含する。さらに、用語「ヌクレオシド塩基」または「塩基単位」は、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基でないが、ヌクレオシド塩基として働くことができる一定の「ユニバーサル塩基」を含め、核酸塩基のように働くことができる、ヘテロ環化合物などの化合物を包含することを意図している。ユニバーサル塩基として特に挙げられるものは、３−ニトロピロール、場合により置換されているインドール（例えば、５−ニトロインドール）および場合により置換されているヒポキサンチンである。望ましい他のユニバーサル塩基には、当技術分野で公知のユニバーサル塩基を含めた、ピロール、ジアゾールまたはトリアゾール誘導体が挙げられる。
【００９２】
ＶＩ．標的分子
種々の態様において、本発明のデバイスで使用するための標的分子は一本鎖ポリヌクレオチドである。別の態様において、標的分子は、３’末端オーバーハング配列を有する二本鎖分子である。いずれの実施形態においても、標的分子の３’一本鎖末端は、デバイスのプライマーの配列Ｐにハイブリダイゼーションが可能な程度にプライマー配列Ｐに十分に相補的である。種々の態様において、標的分子の３’一本鎖末端はデバイスのプライマー配列Ｐに対する相補性が１００％であるか、あるいは、標的分子の３’一本鎖末端はデバイスのプライマー配列Ｐに対する相補性が１００％未満である。
【００９３】
種々の態様において、標的分子は、標的分子の３’末端がデバイスのプライマー配列Ｐに対して自由にハイブリダイズするような形で支持体に結合される。いくつかの態様における支持体は固体支持体であって、ビーズ、プレート、ディッシュ、チューブ、キャピラリーチューブ、ニードル、ウェル、紙、スライド、チップ、フィルタ、膜などであるが、これらに限定されない。特定の態様では、固体支持体は、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン）、ガラス、ナイロン、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデンなどを含むか、被覆された１つまたは複数の面を有する。
【００９４】
ＶＩＩ．組成物および使用
Ａ．単一の伸長生成物
本明細書に記載のデバイスを１または複数含む組成物が提供される。一態様では、本発明の組成物は２つ以上のデバイスを含み、すべてのデバイスが同種、即ち組成物中のすべてのデバイスにおける生成物配列Ｙが同一であり、すべてのデバイスが標的分子を同一の付加配列を有するべく伸長させる。
【００９５】
Ｂ．複数の伸長生成物
別の態様においては、組成物中の少なくとも２つのデバイスが同一でない組成物が提供され、すなわち、あるデバイスにおける生成物配列Ｙが別のデバイスにおける生成物配列Ｙとは異なっており、該組成物中の少なくとも２つのデバイスが標的分子を異なる付加配列を有するべく伸長させる組成物が提供される。
【００９６】
組成物のこのタイプの一態様では、組成物における２つのデバイスは連続して同一の標的分子を伸長し、最初の伸長反応の生成物の３’伸長配列によって、この最初の伸長反応の生成物が組成物内において２番目のデバイスによるさらなる伸長に適したものとなることが意図されている。
【００９７】
限定を意図しない例示として、デバイス内の各配列の点からこの組成物について説明すると、組成物が２つのデバイスを備えており第１のデバイスはプライマー配列Ｐ１および生成物配列Ｙ１を有し、第２のデバイスはプライマー配列Ｐ２と生成物配列Ｙ２を有する。第１のデバイスにおけるプライマー配列Ｐ１に相補的な３’末端を有する標的分子の存在下で、該標的分子は伸長されて、第１伸長生成物におけるＹ１に相補的な配列（ｃＹ１）を有するものとなる。ｃＹ１が第２のデバイスにおけるプライマー配列Ｐ２に相補的である場合は、Ｙ１に相補的な３’配列（ｃＹ１）を有するこの第１の伸長生成物はさらに伸長することができるようになり、これによって第２の伸長生成物の製造が可能となる。このとき、第１の伸長反応からのｃＹ１配列は伸長されて、第２のデバイスが付加された生成物配列Ｙ２に相補的な配列（ｃＹ２）を含むものとなる。この種の反応においては、２つの別々の伸長反応の後、最終伸長生成物は、プライマー配列Ｐ１に相補的な３’末端配列（ｃＰ１）、それに続く配列ｃＹ１およびｃＹ２（それぞれ配列Ｙ１およびＹ２に相補的な配列）を３’末端に有する。
【００９８】
第１の伸長反応の伸長生成物を、第２のデバイスによるさらなる伸長に適したものにでき、第２のデバイスによる第２の伸長反応の伸長生成物を、第３のデバイスによるさらなる伸長に適したものにでき、以下同様にできるように、組成物において任意の数の異なるデバイスを提供できることを、当業者は容易に理解されよう。本発明の組成物においては、任意の数のデバイスの使用が想定されている。
【００９９】
Ｃ．一本鎖標的分子の伸長
本明細書に開示されるデバイスおよび組成物は、標的分子、例えば一本鎖分子、少なくとも一本鎖の部分を含む標的分子の伸長を目的として設計される。従って本発明は、前記一本鎖標的分子を、伸長反応混合物と接触させるステップを含む一本鎖標的分子を伸長させる方法であって、前記伸長反応混合物は、（ｉ）本願発明によるデバイス、または本願発明によるデバイスを含む組成物と、（ｉｉ）ポリメラーゼと、（ｉｉｉ）遊離ヌクレオチドとを含み、このとき伸長反応生成物が生成され、該伸長反応生成物は、前記デバイスの生成物配列Ｙに相補的な３’配列を有する一本鎖標的分子を含む、該方法を提供する。
【０１００】
一本鎖標的分子を伸長する方法で使用される伸長反応混合物は、本明細書に記載するデバイスのいずれかを含むことができ、いくつかの態様では、該方法で使用するデバイスの選択は、所望の伸長反応生成物のタイプや、後述する標的分子の伸長の最終的な目的に応じて決まる。典型的な態様では、該デバイスは、構造１のポリヌクレオチドである。他の典型的な態様では、該デバイスは、構造２の第１のポリヌクレオチドと構造３の第２のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド対またはポリヌクレオチドセットである。
【０１０１】
該方法のいくつかの態様では、伸長反応混合物がデバイスを含み、該デバイスは、生成物配列Ｙは、プライマー配列Ｐと同一でない追加の配列Ａからなり、該配列Ａは、約１０塩基〜約５０塩基（例えば、約２０塩基〜約３０塩基）の長さの配列であり、該方法を実行したとき生成される伸長生成物は、配列Ａに相補的な３’末端配列を含むようになるようなデバイスである。
【０１０２】
該方法のいくつかの態様では、伸長反応混合物がデバイスを含み、該デバイスは、生成物配列Ｙは、該デバイスのプライマー配列Ｐと同一での配列ＰＹからなり、標的分子配列がプライマー配列Ｐに対して相補的であり、反応生成物がプライマー配列Ｐに対して相補的な３’末端配列を含むようになるようなデバイスである。
【０１０３】
いくつかの態様では、伸長反応混合物がデバイスを含み、該デバイスは、デバイスの生成物配列Ｙは、該デバイスのプライマー配列Ｐと同一の配列ＰＹを含み、かつ配列ＰＹとは異なるタグ配列Ｔをさらに含み、配列ＴはＰＹに対して３’側に位置するようなデバイスである。
【０１０４】
いくつかの態様では、伸長反応混合物が本願発明によるデバイスのなかの複数種を含み、該複数種のデバイスは、少なくとも３種のデバイスサブセットであって、１つのデバイスサブセットに属する各デバイスは配列Ｙの配列を含み、該配列Ｙの配列は、（ｉ）同じデバイスサブセットに属する別のデバイスの配列Ｙと同一であり、かつ（ｉｉ）前記複数種中の別のデバイスサブセットに属するデバイスの配列Ｙとは異なるものであって、前記伸長生成物は、前記複数種の配列Ｙのそれぞれに相補的な配列を含む３’末端であり、例えば、前記伸長生成物は、前記複数種が最終的に連続して付加されたタンデム配列Ｙに相補的な配列を含む３’末端を有するようなデバイスである。
【０１０５】
本明細書に開示する方法で使用される伸長反応混合物に関して、ポリメラーゼは、既存のテンプレートに対して新しいポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）の重合を触媒することが中心機能である任意の酵素である。典型的な態様では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、ＤＮＡポリメラーゼＩＶ）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、鎖置換型ポリメラーゼ（例えば鎖置換活性を示すポリメラーゼ）である。いくつかの態様においては、鎖置換活性が限定的である。別の態様では、鎖置換活性が強力である。いくつかの態様では、ポリメラーゼは限定的か強力な鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼであり、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ｅｘｏ−）のクレノウフラグメント、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）ＩＩ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの大フラグメント、ＤｉｓｐｌａｃｅＡｃｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５’ｅｘｏ−）、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｅｘｏ−）などが挙げられる。いくつかの態様において、該ポリメラーゼは、本明細書中の「キット」と題する項に記載されたもののいずれかである。
【０１０６】
本明細書で提供される方法で使用される伸長反応混合物に関して、遊離ヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の遊離（例えば、未重合）ヌクレオチド、例えば以下に限定しないが、天然のヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、および本明細書に記載する修飾された形態（例えば、修飾された塩基を含むヌクレオチド、修飾されたポリヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド）のものであり得る。いくつかの態様では遊離ヌクレオチドは、混合物中に含められてもよい、異なる種類のヌクレオチドの組み合わせである。典型的な態様では、その組み合わせは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、および、選択に応じてｄＵＴＰを含んでいる。いくつかの態様において、該組み合わせは、各種の遊離塩基を等量（例えば等モル量）ずつ含む。いくつかの態様では、１以上の遊離ヌクレオチドが限界量で存在し、いくつかの態様では、伸長混合物中に存在する１以上の遊離ヌクレオチドが、内部複製ブロック基Ｒの相補的ヌクレオチドである。本明細書において「限界量」とは、別の遊離ヌクレオチドの約１／２またはそれ以下、約１／３またはそれ以下、約１／５またはそれ以下、約１／１０またはそれ以下、約１／２０またはそれ以下、約１／３０またはそれ以下、約１／５０またはそれ以下、約１／１００またはそれ以下の量をさす。
【０１０７】
典型的な態様では、本明細書中に開示される一本鎖標的分子を伸長させる方法が、伸長反応生成物が生成されるような伸長反応を生じさせるのに適した条件下で行われる。そのような条件は当技術分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１；Ｗｈｉｔｅ，Ｂｒｕｃｅ  Ａ．，ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９７；ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００３；ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ，ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ：ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３；Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１９９７などを参照されたい。
【０１０８】
該方法は、いくつかの態様において、実質的に等温条件下で行われる。本明細書中で使用される用語「実質的に等温条件」は、単一の温度、ｔが基本的に維持されている条件、すなわちその温度が約−１０％ｔ℃〜約＋１０％ｔ℃の範囲内に維持される条件をさす。特定の態様では、該方法が実質的に等温条件下で行われ、該方法は約０℃〜９５℃、約２０℃〜９５℃、約３７℃〜約９５℃、約６０℃〜約７５℃での範囲内の温度で実施される。
【０１０９】
別の態様において、該方法は実質的に等温条件下では行われず、該方法は１回以上の熱サイクルを含む。特定の態様では、この方法は、第１の温度で行われる１以上のステップと、第２の温度で行われる１以上のステップとを含み、前記第２の温度は、前記第１の温度より約２５℃以上高い。典型的な態様では、前記第１の温度は、約６０℃〜約７５℃の範囲内にあり、前記第２の温度は、約８５℃〜約１００℃の範囲内にある。いくつかの態様では、前記方法は、ポリメラーゼが前記第２の温度においてデバイスから解離する、解離ステップを含む。
【０１１０】
Ｄ．伸長生成物の検出
いくつかの態様において、一本鎖標的分子を伸長する方法であって、１以上の追加のステップを含む、該方法が提供される。典型的な態様において、該方法は、伸長反応生成物を検出するステップ、選択に応じて伸長反応生成物を定量するステップを含む。
【０１１１】
一態様において、配列Ｙのタグ配列Ｔは、配列Ｔに相補的な配列（ｃＴ）を含むような標的分子の伸長を可能とし、伸長生成物の配列ｃＴはプローブに結合するようにデザインされる。一態様において、該プローブは配列特異的プローブである。別の態様において、プローブは検出可能な標識であるか、検出可能な標識を含む。プローブが伸長生成物における配列ｃＴに結合するが、ｃＰＹには結合しない態様においては、配列ｃＴ−ｃＰＹの複数のコピーが標的の一本鎖ポリヌクレオチドに付加され、プローブが選択に応じて配列のｃＴ部分におけるｃＴ−ｃＰＹ伸長生成物の各コピーに結合する。
【０１１２】
別の態様において、該デバイスの追加の配列Ａは、配列Ａに相補的な配列（ｃＡ）を含むような標的分子の伸長を可能とし、伸長生成物の配列ｃＡはプローブに結合するようにデザインされる。一態様において、該プローブは配列特異的プローブである。別の態様において、プローブは検出可能な標識であるか、検出可能な標識を含む。
【０１１３】
該プローブは、例えば配列ｃＴまたはｃＡを介して、伸長反応生成物にハイブリダイズするのに適した任意の長さであり得る。いくつかの態様において、該プローブは、デバイスの配列Ｔまたは配列Ａと同じ長さを有する。特定の態様では、該プローブは約１０〜約５０塩基長、例えば約１５〜約４０塩基、約２０〜約３０塩基の長さであり得る。
【０１１４】
いくつかの態様において、該プローブは一本鎖ポリヌクレオチドである。他の態様では、該プローブの少なくとも一部分は二重構造を形成する。たとえば、いくつかの態様では、該プローブの少なくとも一部分は、特定の態様においてほどかれ（例えば、一本鎖になる）、その後伸長反応生成物に結合するヘアピン構造を形成する。従って、いくつかの態様では、該プローブは分子ビーコンである。
【０１１５】
プローブの検出可能な標識は、当技術分野で公知のいずれかのものであり得、例えば、以下に限定されないが、ラジオアイソトープ（例えば、ユーロピウム１５２、バリウム１３３、カドミウム１０９、５７Ｃｏ、６０Ｃｏ、５４Ｍｎ、２２Ｎａ、６５Ｚｎ、テクニウム９９ｍ、ストロンチウム９０、タリウム２０４、１４Ｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ）、蛍光体（例えば、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、アミノクマリン、ＦＡＭ、６−カルボキシフルオレセイン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、フルオレセイン、ＨＥＸ、Ｃｙ３、ＴＲＩＴＣ、Ｒ−フィコエリスリン、ローダミンレッド−Ｘ、タマラ、Ｒｏｘ、テキサスレッド、アロフィコシアニン、ＴｒｕＲｅｄ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５  ５８１、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、および元素粒子（例えば、金、銅、銀）などが挙げられる。
【０１１６】
いくつかの態様において、検出可能な標識により伸長反応生成物の定量が可能になる。典型的な態様では、放射性同位元素の放射能量または蛍光体の蛍光量は、伸長反応生成物の量と相関するか、または伸長反応生成物の長さと相関する。後者の場合、放射能または蛍光体の量は、いくつかの態様では、伸長反応生成物が構造５’−ｃＰ−（ｃＴ−ｃＰＹ）ｎ−３’であるときのｎと相関する。
【０１１７】
別の態様では、提供される組成物は、デバイスによって生成された伸長生成物を検出する１以上のプローブまたはマーカーを含む。一態様では、生成物配列Ｙに相補的な伸長生成物（ｃＹ）に結合するプローブまたはマーカーが含められる。一態様では、プローブまたはマーカーは、伸長反応の生成物の３’末端と同一の配列Ｙ’には結合しない。一態様では、プローブまたはマーカーは、伸長反応の生成物を検出するべく、伸長生成物にのみ結合する。一実施形態において、プローブまたはマーカーは、伸長生成物の３’末端に結合する。
【０１１８】
組成物のためのプローブまたはマーカーには、伸長反応の生成物に結合するときにのみ検出可能であるものが含まれる。一態様では、プローブまたはマーカーは、伸長生成物に結合したときシグナルを生成する。別の態様では、プローブまたはマーカーが伸長生成物に結合していないときには、プローブやマーカーのシグナルがクエンチングされる。
【０１１９】
いくつかの態様では、プローブまたはマーカーは、プローブや分子ビーコンがその標的、例えば伸長反応生成物にハイブリダイズされるまで、検出可能な標識からシグナルが発せられるのを防止するクエンチング部分を含む、分子ビーコンである。クエンチング部分は当技術分野で知られている。例えば、Ｌｉｖａｋら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．４：３５７−３６２（１９９５）を参照されたい。本発明の実施で使用されることが想定される、クエンチャーの限定を意図しない例としては、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ−１、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ−２、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ、Ｚｅｎクエンチャー、およびＤａｂｃｙｌ．Ｇ−ｂａｓｅなどが挙げられる。
【０１２０】
上記の点から、いくつかの態様では、本明細書に開示する方法は、プローブ、分子ビーコン、またはその組合せの１以上を用いて伸長反応生成物を検出および／または定量する１以上のステップを含む。従って、いくつかの態様において、本明細書に記載する組成物およびキットは、本明細書中に記載するもののいずれかのプローブ、分子ビーコン、またはその組み合わせを含む。
【０１２１】
Ｅ．生成物の増幅
本発明のデバイスを１以上利用した方法では、標的分子および少なくとも１つのデバイスが準備される。反応において標的分子が伸長されて、デバイスにおける生成物配列Ｙに相補的な配列が付加された標的分子が得られる。一態様では、標的分子に付加される配列は、プライマー配列Ｐに相補的な配列（ｃＰ）と生成物配列Ｙに相補的な配列（ｃＹ）との接合部に切断部位を有し、デバイスのプライマー配列Ｐに相補的な配列ｃＰＹ３’をｃＹに導入する。該反応の伸長生成物がデバイスから解離された後、伸長生成物を切断部位で切断して、その反応混合物中でデバイスを用いて再度伸長される２つの生成物を得る。このプロセスを所望の回数反復して、標的配列を指数関数的に増幅する。
【０１２２】
一態様では、反応混合物は、増幅生成物に結合しそれを検出する、本明細書に記載するプローブも含む。該プローブは、特定の態様では、検出可能な標識、例えば増幅生成物の検出および定量を可能とする本明細書に記載のいずれかを含む。
【０１２３】
追加のまたは代替的な態様において、反応混合物は、さらに、伸長生成物を切断する、例えばプライマーの配列Ｐに相補的な配列（ｃＰ）と生成物配列Ｙに相補的な配列（ｃＹ）との間の接合部の切断部位において切断する酵素を含む。典型的な態様では、切断部位はｄＵ塩基を含む。従って、いくつかの態様において、本明細書に記載する組成物およびキットは、伸長生成物を切断する酵素を含む。
【０１２４】
ＶＩＩＩ．用途
本発明のデバイスは、一本鎖ポリヌクレオチド、または二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖末端領域（重複による一本鎖か、一時的に生ずる一本鎖かを問わない）の伸長が必要な用途において多数の使用法を有することを、当業者は理解されよう。
【０１２５】
［タグ付け化合物］
例えば、用途のなかには、プライマー配列Ｐにハイブリダイズする十分に長い一本鎖領域を有する、または変性してプライマー配列Ｐにハイブリダイズする一本鎖領域を提供できるポリヌクレオチドが伸張して独特のおよび／または検出可能な配列を備えるものが含まれる。独特のおよび／または検出可能な配列には、検出配列にハイブリダイズするもの、および／または特定の標識に結合するものが含まれる。これらの、および他の用途では、標的配列は、各種実施形態において、（ｉ）溶液中に、（ｉｉ）第２の化合物と結合即ち複合体形成して、または（ｉｉｉ）例えば固体支持体に固定されて存在する。
第２の化合物は、プライマー配列Ｐにハイブリダイズする一本鎖ポリヌクレオチドを含む任意の化合物であって、当該一本鎖ポリヌクレオチドの存在が、天然に（すなわち、自然界にみられるように）化合物と結合しているものであっても、または当該一本鎖ポリヌクレオチドが化合物と結合していて、自然界ではみられないものであってもよい。この一本鎖標的と該化合物との結合は、特定の態様では共有結合であって、他の態様では、一本鎖標的と該化合物との結合は、非共有結合である。
【０１２６】
典型的な態様では、前記第２の化合物は、前記デバイスおよび標的分子と異なる任意の分子（化学的または生化学的、天然または非コード化）である。典型的な第２の化合物としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、染色体、ＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ）、ポリマー、細胞、ウイルス、細菌、プリオン、毒素などが挙げられるが、これらに限定されない。第２の化合物の増幅および検出は、本明細書に記載の説明に従って、本願発明のデバイスを使用して達成することができる。
【０１２７】
一本鎖の標的分子が固定されている態様では、一本鎖標的は、種々の態様において、粒子、細胞、ウイルス、細胞内小器官または表面に結合されている。一本鎖標的と粒子または表面との間の結合は、特定の態様では共有結合であり、他の態様では、一本鎖標的と粒子または表面との結合は非共有結合である。一本鎖標的ポリヌクレチドは、いくつかの態様では、固定化の際にランダムに配置され、他の態様では、一本鎖標的分子は特定の位置に配置される。一態様では、一本鎖標的分子は、固定化される際に整列配置される。一本鎖標的分子が整列配置されるいくつかの態様では、整列配置される一本鎖標的分子はすべて同一の配列であり、他の態様では、整列配置される一本鎖標的分子が同一の配列ではない。
【０１２８】
固定化された一本鎖標的ポリヌクレオチドは、特定の態様では、複数のコピーにおいて固定化され、かつすべての一本鎖標的ポリヌクレオチドが同一であるか、または基本的に同一である配列を有する。他の態様では、一本鎖標的ポリヌクレオチドは、異なる配列を有する少なくとも１つの他の一本鎖標的ポリヌクレオチドとともに固定化される。同様に、一本鎖標的分子が整列配置されるいくつかの態様では、整列配置された一本鎖標的分子はすべて同一の配列であり、他の態様では、整列配置された一本鎖標的分子が同一の配列ではない。
【０１２９】
特定の態様では、標的配列は固体支持体の表面に固定化される。固体支持体は、本明細書に開示するもののいずれかであり得る。いくつかの態様では、本明細書に記載する組成物またはキットは、１以上の標的配列が固定される固体支持体を含む。従って、いくつかの態様では、一本鎖標的分子を伸張させる方法が、前記一本鎖標的分子が固定された固体支持体を、伸長反応混合物と接触させるステップを含む。
【０１３０】
［診断方法］
従って、本願発明のデバイスは、診断方法において有用である。典型的な実施形態では、デバイスは遺伝子変異（例えば、点突然変異、欠失、染色体異常、トリヌクレオチド反復障害）、遺伝子の有無、または遺伝子もしくは染色体の複数のコピーの存在を検出する方法で使用される。該方法は、種々の態様において、医学的状態または疾病の診断のために用いられ、そのような医学的状態または疾病としては、例えば、癌や、遺伝性疾患、例えば、２２ｑ１１．２欠失症候群、アンジェルマン症候群、カナバン病、セリアック病、シャルコー・マリー・トゥース病、色覚異常、猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダウン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ヘモクロマトーシス、血友病、クラインフェルター症候群、神経線維腫症、フェニルケトン尿症、多発性嚢胞腎疾患、プラダー・ウィリー症候群、鎌状赤血球症、テイ・サックス病、ターナー症候群などが挙げられる。
【０１３１】
いくつかの態様において、該診断方法は、その場診断の方法である。典型的な実施形態では、該診断方法は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）コピー解析のために本願発明のデバイスを使用するステップを含む。特定の態様では、１以上の標的配列が、固体支持体に部分的に固定化される。特定の態様では、標的配列が、固体支持体に固定されておらず、かつ本願発明のデバイスのプライマー配列Ｐにハイブリダイズする一本鎖部分を含む。いくつかの態様では、標的配列を、本明細書の開示内容に従って伸張して増幅し、増幅生成物は、検出可能な標識を含むプローブ（例えば分子ビーコン）を用いて検出し、必要に応じて定量化する。
【０１３２】
［タンパク質マイクロアレイ解析］
本願発明のデバイスは、抗体アレイを用いたタンパク質解析においても有用である。典型的な実施形態では、デバイスは、タンパク質混合物の１種以上のタンパク質の有無を検出し、選択に応じてタンパク質混合物中に存在するタンパク質を定量し、および／またはタンパク質混合物中に存在するタンパク質を同定するために用いられる。タンパク質混合物は、例えば病気の細胞（例えば、癌細胞）のライセートであり得、タンパク質混合物中のタンパク質の有無ならびにタンパク質の量と種類は、被検体の病気の指標となる。典型的な態様では、タンパク質混合物中のタンパク質を、一本鎖標的分子の混合物で標識し、標識されたタンパク質を既知の抗体のアレイと接触させる。タンパク質混合物の非結合成分をアレイから洗い流し、伸張生成物に結合し、かつ検出可能な標識を含むプローブと組み合わせて本願発明のデバイスを使用して、抗体−タンパク質複合体を出する。
【０１３３】
［ポリヌクレオチドの合成およびそれを含む配列］
本願発明のデバイスは、ポリヌクレオチドの合成方法においても有用である。典型的な実施形態では、該デバイスは、Ｙに相補的な配列（ｃＹ）を含むポリヌクレオチドの作製のために用いられる。特定の態様では、本願発明のデバイスを、固相遺伝子合成方法において使用し、該デバイスは、複数種のデバイスサブセットを含む組成物として提供され、各サブセットはデバイスの複数のコピーを含み、かつ各サブセットは、他のサブセットに属するデバイスの配列とは異なる配列Ｙを含む。いくつかの態様では、該組成物は、本明細書中の「複数の伸長生成物」と題する項に記載されたものに従っている。
【０１３４】
代替的な態様では、本願発明のデバイスをオリゴヌクレオチドのアレイを構築するのに用いる。典型的な態様では、固定化された一本鎖標的分子のアレイを含む固体支持体を、１以上のデバイス、またはそれとポリメラーゼとを含む組成物に接触させる。該デバイスは一本鎖標的分子にプライマー配列Ｐを介して結合し、ポリメラーゼの活性によって一本鎖の標的分子の長さを伸張させ、本明細書に記載されるように、一本鎖標的分子がデバイスの配列Ｙに相補的な配列を含むようにする。いくつかの態様では、「複数の伸張生成物」と題する項に記載する説明に従って、複数回の伸張を異なるデバイスを用いて行う。
【０１３５】
本願発明のデバイス、組成物、およびキットのさらなる用途は、本明細書の実施例の項に記載する。
【０１３６】
ＩＸ．キット
本発明はさらに、本発明のデバイスと、標的分子を伸張する伸長反応でデバイスを使用するための使用説明を含むキットを提供する。特定の態様では、標的分子が一本鎖分子である。他の態様では、標的分子が、キットのデバイスにおけるプライマー配列Ｐに相補的な３’末端オーバーハング配列を有する二本鎖である。
【０１３７】
いくつかの態様では、前記キットは、ポリメラーゼおよび／または遊離ヌクレオチドをさらに含む。ポリメラーゼは、既存のテンプレートに対して新しいポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）の重合を触媒することが中心機能である任意の酵素である。典型的な態様では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、ＤＮＡポリメラーゼＩＶ）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様では、該ポリメラーゼは天然のポリメラーゼであり、例えば、好熱菌（Ｔａｑ）ポリメラーゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、逆転写酵素（例えば、ＨＩＶ逆転写酵素）などが挙げられる。
【０１３８】
別の実施形態では、該ポリメラーゼは、あらゆる生物において天然には発生しない、またはいずれの生物にも由来するものではない遺伝子組み換えポリメラーゼである。遺伝子組み換えポリメラーゼは、典型的な態様では、天然のポリメラーゼにおいて、該ポリメラーゼの１または複数の態様を改変する１箇所以上のアミノ酸の変化をもたせたものである。遺伝子改変したポリメラーゼは、いくつかの態様では、鎖置換活性が高められた、および／または重合終了時におけるテンプレート鎖からの解離が増加した天然ポリメラーゼの変異体である。
【０１３９】
特定の態様では、前記キットは、５’エキソヌクレアーゼ活性をもたないポリメラーゼを含む。
【０１４０】
いくつかの態様では、前記キットは、鎖置換活性を示すポリメラーゼ、すなわち鎖置換ポリメラーゼを含む。いくつかの態様においては、鎖置換活性が限定的である。別の態様では、鎖置換活性が強力である。いくつかの態様では、ポリメラーゼは限定的か強力な鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼであり、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ｅｘｏ−）のクレノウフラグメント、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）ＩＩ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの大フラグメント、ＤｉｓｐｌａｃｅＡｃｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼポリメラーゼ（５’ｅｘｏ−）、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｅｘｏ−）などが挙げられる。
【０１４１】
本発明を実施するために使用される酵素であって、エキソヌクレアーゼ活性の欠如について、エキソヌクレアーゼ活性を除去するために改変することができるか、またはそのすべての固有のエキソヌクレアーゼ活性をナノシンセサイザーの機能によってブロックすることができる、該酵素の、限定しない他の例としては、例えば、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ（商標）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＩＩ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉｒｅ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  ＬｏｎｇＡｍｐ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（標準的Ｔａｑバッファー（Ｍｇフリー）添付）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（標準的Ｔａｑバッファー添付）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  ＩＩバッファー（Ｍｇフリー）添付）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファー添付）、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｇフリーバッファー添付）、Ｐｈｉｒｅ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉｒｅ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、ＬｏｎｇＡｍｐ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、完全長Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファー添付）、９゜Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｇフリーバッファー添付）、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＩＩ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、���ｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ  ＩＶ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）γ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、大フラグメントＤＮＡポリメラーゼ  Ｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（未改変）、ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、およびＥ．ｃｏｌｉ由来Ｐｏｌｙ（Ａ）ポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
いくつかの態様において、ポリメラーゼは耐熱性ポリメラーゼである。別の態様では、ポリメラーゼは非耐熱性ポリメラーゼである。いくつかの態様において、ポリメラーゼは中温性ポリメラーゼである。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、約０℃〜約９５℃、約２０℃〜約９５℃、約３７℃〜約９５℃、または約６０℃〜約７５℃の範囲内の温度で熱安定性である。
【０１４３】
いくつかの態様では、ポリメラーゼは、複製ブロック基Ｒに接触したときデバイスから解離する。特定の態様では、ポリメラーゼは、実質的に等温条件の下で複製ブロック基Ｒに接触したときデバイスから解離する。典型的な態様では、約０℃〜約９５℃、約２０℃〜約９５℃、約３７℃〜約９５℃、または約６０℃〜約７０℃の範囲内の温度で複製ブロック基Ｒに接触したときポリメラーゼはデバイスから解離する。
【０１４４】
いくつかの態様において、前記キットは、伸長反応の全体の効率を向上させる追加の分子を含む。典型的な態様において、キットは、シャペロン鎖置換分子、例えば、ヘリカーゼ、トランスフェラーゼ、または一本鎖結合タンパク質を含む。他の典型的な態様において、前記キットは、少なくとも２種のポリメラーゼを含み、少なくとも１種類のポリメラーゼは、校正ポリメラーゼである。前記校正ポリメラーゼは、１または複数の非テンプレート付加反応を介して付加される前記一本鎖標的分子から塩基を除去する。いくつかの他の態様では、前記キットはさらに、反応生成物を切断する酵素を含む。
【０１４５】
いくつかの態様では、前記キットは、検出可能な標識と、伸長反応の伸長生成物にハイブリダイズする配列とを含む分子ビーコンを含む。典型的な態様では、前記分子ビーコンは、生成物にハイブリダイズしていないときヘアピン構造を形成する。
【０１４６】
いくつかの態様では、前記キットはプローブを含み、該プローブは選択に応じて検出可能な標識を含む。他の態様では、前記キットは、ここに記載のものをさらに含む。以下の実施例は、本発明を単に例示するものであり、あらゆる意味でその範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１４７】
［実施例１］
本願発明のデバイスを、一態様においては、当技術分野で公知であり通常実施されている化学合成法によって調製する。民間の施設がこの種の化学合成のために広く利用可能である。
【０１４８】
［実施例２］
この実施例では、本願発明のデバイスを用いたアレイをベースにしたポリヌクレオチドの検出および分析方法を説明する。
【０１４９】
複数のステムループプローブを、マイクロアレイを形成するように整列配置した形で固体支持体上に固定化し、各プローブは、（ｉ）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列、および（ｉｉ）本願発明のデバイスのプライマー配列Ｐにハイブリダイズする配列を含むものとする。各プローブは、その標的ポリヌクレオチドと接触していないときは、ステムループ構造を形成している。ステムループプローブの一端は、固体支持体に固定化され、他方の端は、本願発明のデバイスのプライマー配列Ｐにハイブリダイズする配列を含む。間の部分は、標的ポリヌクレオチドと接触していないときはステムループ構造を形成し、標的ポリヌクレオチドが存在する場合には、それと二重構造を形成する。デバイスのプライマー配列Ｐにハイブリダイズする配列を含む末端は、標的ポリヌクレオチドが結合され、ステムループプローブがステムループ構造を形成していない場合にのみ、デバイスへの結合にアクセス可能である。該マイクロアレイを、非標的ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド混合物と接触させ、標的ポリヌクレオチドが適切なステムループプローブにハイブリダイズできる条件の下でインキュベートする。混合物のハイブリダイズしていない成分は、選択に応じてアレイから洗い流す。ステムループプローブの適切な末端に結合するプライマー配列Ｐを有する本願発明のデバイスをマイクロアレイと接触させ、ポリメラーゼおよび遊離ヌクレオチドを一本鎖プライマー伸長反応のために追加する。伸長反応生成物に結合する蛍光標識プローブをアレイに追加し、標的ポリヌクレオチドの存在を表す蛍光シグナルを検出する。
【０１５０】
この実施例では、ステムループアレイプローブへのＤＮＡまたはＲＮＡのハイブリダイゼーションに基づくマイクロアレイ核酸分析結果を実証した。該プローブは、標的ポリヌクレオチドの結合時にその立体構造を変更し、これが本願発明のデバイスを介した増幅プロセスをトリガーする。この方法は、アレイプローブの設計と、および診断や研究の用途のためのマイクロアレイ上での非標識核酸の高感度かつ特異的な検出のためのシグナル増幅検出方法との新たな組み合わせを提供する。この方法は、分子診断、法医学、バイオハザード（例えば、生物兵器）の検出に応用することができる。
【０１５１】
上記に従って、いくつかの態様では、本願発明のデバイスを含む組成物またはキットは、この実施例で説明するアレイをさらに含む。
【０１５２】
［実施例３］
この実施例では、本願発明のデバイスを使用した複数のポリヌクレオチドサンプル解析のための方法を説明する。
【０１５３】
サンプルＤＮＡ（ＤＮＡ１）と対照ＤＮＡ（ＤＮＡ２）を、本願発明のデバイスの第１のセットとともにインキュベートし、ＤＮＡ１あるいはＤＮＡ２の３’末端（例えば、ＤＮＡ１−ＵおよびＤＮＡ２−Ｕ）にユニバーサル配列Ｕを含むようにＤＮＡ１とＤＮＡ２のそれぞれを伸長させる。この方法で使用される第１のセットの各デバイスは、８−１２塩基のランダム配列を含むプライマー配列Ｐと、追加の配列Ａを含む生成物配列Ｙとを含み、追加の配列ＡはＵの相補配列（ｃＵ）を含む。
【０１５４】
ＤＮＡ１−ＵとＤＮＡ２−Ｕの形成の後、デバイスの第２のセットを用いてさらなる伸長を行う。第２のセットは、ＤＮＡ１およびＤＮＡ２のそれぞれについてその生成物配列Ｙが異なるタグ配列Ｔを含む、ＤＮＡ２のデバイスと異なるＤＮＡ１のデバイスを含む。ＤＮＡ１のデバイスのＹ配列はＴ１−ＰＹを含み、ＤＮＡ２のデバイスのＹ配列はＴ２−ＰＹを含む。ＤＮＡ１のデバイスのＰＹはＤＮＡ２のそれと同一である−ＰＹ配列は、Ｐと同一であり、かつＵに対して相補的である。第２のセットのデバイスを用いた伸長をｎ回行うと、ＤＮＡ１は配列ｃＰ−（ｃＴ１−ｃＰＹ）ｎを含み、ＤＮＡ２は配列ｃＰ−（ｃＴ２−ｃＰＹ）ｎを含む。第２のセットのデバイスで生成されたＤＮＡ１およびＤＮＡ２の伸長生成物をアレイと接触させる。未結合の成分をアレイから洗い流す。該アレイを、検出可能な標識を含み、ｃＴ１またはｃＴ２にハイブリダイズするプローブに接触させる。アレイを洗浄し、検出可能な標識からのシグナルを検出する。アレイ上のシグナルの位置に基づきおよび／または異なるシグナルを有するプローブの使用によってシグナルの差を特定し、ＤＮＡ１またはＤＮＡ２と相関させることができる。
【０１５５】
いくつかの態様では、上記の方法を、４種の異なるＤＮＡ分子：ＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３、およびＤＮＡ４を用いて実行する。各ＤＮＡ分子は、本願発明のデバイスの第１のセットを上記説明に従って用いて、Ｕ配列を含むように伸長させる。ＤＮＡ１−Ｕ、ＤＮＡ２−Ｕ、ＤＮＡ３−Ｕ、およびＤＮＡ４−Ｕを、各ＤＮＡ分子について独特のデバイスサブセットを含むデバイスの第２のセットと接触させる。要点を上記したように、ＤＮＡ１のためのデバイスはタグ配列Ｔ１を有し、ＤＮＡ２のためのデバイスはタグ配列Ｔ２を含み、ＤＮＡ３のためのデバイスはタグ配列Ｔ３を含み、ＤＮＡ４のためのデバイスはタグ配列Ｔ４を含む。デバイスの第２のセットを用いた伸長をｎ回行うと、ＤＮＡ１は配列ｃＰ−（ｃＴ１−ｃＰＹ）ｎを含み、ＤＮＡ２は配列ｃＰ−（ｃＴ２−ｃＰＹ）ｎを含み、ＤＮＡ３は配列ｃＰ−（ｃＴ３−ｃＰＹ）ｎを含み、ＤＮＡ４は配列ｃＰ−（ｃＴ４−ｃＰＹ）ｎを含む。
【０１５６】
伸長されたＤＮＡ分子をアレイにハイブリダイズさせ、アレイをストリンジェントに洗浄する。いくつかの態様では、第１の検出可能な標識を含む第１のプローブにアレイを接触させ、第１のプローブをＤＮＡ１のｃＴ１にハイブリダイズさせる。未結合のプローブをアレイから洗浄して落とし、第１のプローブからのシグナルを検出する。第１のプローブからのシグナルがクエンチングさると同時に、第２の検出可能な標識を含む第２のプローブにアレイを接触させ、第２のプローブをＤＮＡ２のｃＴ２にハイブリダイズさせる。プローブ付加、シグナル検出、および次のプローブをアレイに加えるのと同時のプローブクエンチングというこれらのステップを、第４のプローブのシグナルを検出するまで適切なプローブを用いて反復する。
【０１５７】
この実施例により、本願発明の特別なデバイスを用いて特定のＤＮＡ反復配列を異なるＤＮＡサンプルに付加し、サンプルをプールし、プールしたサンプルを１個のマイクロアレイにハイブリダイズさせ、次いで連続したハイブリダイゼーション−除去反応（反復特異的な蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブおよびクエンチャーを用いるもの）によって各ＤＮＡサンプルについての情報を回収することを基礎にした複数式ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション解析が実地に行われた。この方法により、飛躍的にアレイ解析のコストを低減させ、複数サンプルデータの比較を改善させ、マイクロアレイ解析のスループットを向上させる新規なＤＮＡマイクロアレイ解析ツールが提供される。この方法では、ＤＮＡを直接標識するのではなく間接的に標識する方法が用いられる。
【手続補正書】
【提出日】平成23年5月4日(2011.5.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖標的分子の伸長のためのデバイスであって、
前記デバイスは、構造１：
【化１】
2013511285.tif 000011
を含むポリヌクレオチドであり、
ここで、
Ｐは、プライマー配列であり、
Ｙは、生成物配列であり、
Ｒは、複製ブロック基であり、
Ｓは、ステム配列であり、
Ｌは、ループ領域であり、
Ｓ’は、Ｓにハイブリダイズする配列であり、
Ｙ’は、Ｙにハイブリダイズする配列であり、
ＳおよびＳ’のそれぞれは、前記デバイス中に存在していてもよく、Ｓ’の存在は、前記デバイス中のＳの存在によって決まり、
Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｓ’、およびＹ’はヘアピン構造を形成し、
Ｙは、プライマー配列Ｐと同一の配列ＰＹを含むか、または配列ＰＹからなる、デバイス。
【請求項２】
一本鎖標的分子の伸長のためのデバイスであって、
前記デバイスが、構造２：
【化２】
2013511285.tif 000012
の第１のポリヌクレオチドと、
構造３：
【化３】
2013511285.tif 000013
の第２のポリヌクレオチドとを含み、
ここで、
Ｐは、プライマー配列であり、
Ｙは、生成物配列であり、
Ｒは、複製ブロック基であり、
Ｓは、ステム配列であり、
Ｙ’は、Ｙにハイブリダイズする配列であり、
Ｓ’は、Ｓにハイブリダイズする配列であり、
Ｙは、プライマー配列Ｐと同一の配列ＰＹを含むか、または配列ＰＹからなる、デバイス。
【請求項３】
配列Ｓおよび配列Ｓ’が、約２０℃〜約９５℃の温度で安定である二重構造を形成する、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
配列Ｓおよび配列Ｓ’が、約６０℃〜約７５℃の温度で安定である二重構造を形成する、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
Ｐは、約６塩基〜約３０塩基の長さの配列である、請求項１乃至４のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６】
Ｙは、配列ＰＹとは異なるタグ配列Ｔをさらに含み、ここで配列ＴはＰＹに対して３’側に位置し、プライマー配列Ｐに対して５’側に位置する、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項７】
配列Ｔは、約１５塩基〜約５０塩基の長さの配列である、請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
前記デバイスの配列の伸張をブロックする３’ブロック基Ｆを含み、ＦはＰに対して３’側に位置する、請求項１乃至７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項９】
Ｆは、アミノ基、リン酸塩、またはジデオキシヌクレオチドである、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
酵素によって切断されない、１または複数の修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項１乃至９のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１１】
前記１または複数の修飾されたヌクレオチド間結合は、生成物配列Ｙに対して５’側に位置する、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
Ｙ’に対して５’に位置し、かつ約１塩基〜約２５塩基の長さのヌクレオチド配列を含む配列Ｘを含み、
Ｘは、（ｉ）Ｐにハイブリダイズしないか、（ｉｉ）Ｐの少なくとも一部分にハイブリダイズするか、または（ｉｉｉ）Ｐの少なくとも一部分に、およびＹの少なくとも一部分にハイブリダイズする、請求項１乃至１１のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１３】
Ｘは、Ｐの一部分のみにハイブリダイズするか、またはＰの一部分のみおよびＹの一部分のみにハイブリダイズする、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
Ｘは、Ｐにハイブリダイズせず、かつ約１塩基〜約１０塩基の長さのヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１５】
Ｒは、（ｉ）脱塩基部位であるか、（ｉｉ）修飾された塩基であるか、（ｉｉｉ）生成物配列Ｙには存在しないか、反応混合物に限界濃度で存在する塩基であるか、または（ｉｖ）スペーサーである、請求項１乃至１４のいずれかに記載のデバイス。
【請求項１６】
前記修飾された塩基は、Ｒまたはその先に対してポリメラーゼ活性を立体的に阻害する化学的部分を含む、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記修飾された塩基は、当該オリゴヌクレオチドの別の塩基に架橋された塩基である、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記修飾された塩基は、Ｓ’の塩基に架橋される、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記脱塩基部位は、配列Ｓ’または配列Ｙ’の塩基に特異的に結合しない、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記スペーサーは、ヘキサメチレングリコールスペーサー、ヘキシレングリコールスペーサー、または２−デオキシリボーススペーサーである、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項２１】
Ｓの配列は、約０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、または約８０％〜約１００％のＧＣ含量を含む、請求項２乃至２０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項２２】
前記第２のポリヌクレオチドは、前記第１のポリヌクレオチドの濃度より高い濃度で存在している、請求項２乃至２０のいずれかに記載のデバイスを含む組成物。
【請求項２３】
前記第２のポリヌクレオチドの濃度が、前記第１のポリヌクレオチドの濃度より２倍以上高い濃度である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１乃至２１のいずれかのデバイスのうちの少なくとも２種のデバイスを含む、組成物。
【請求項２５】
前記組成物中の前記少なくとも２種のデバイスは、生成物配列Ｙ１を含む第１のデバイスと、生成物配列Ｙ２を含む第２のデバイスとを含み、生成物配列Ｙ１はＹ２と異なる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
請求項１または２のデバイスのなかの複数種を含み、
前記複数種は、少なくとも３種のデバイスサブセットであって、１つのデバイスサブセットに属する各デバイスは配列Ｙの配列を含み、該配列Ｙの配列は、（ｉ）同じデバイスサブセットに属する別のデバイスの配列Ｙと同一であり、かつ（ｉｉ）前記複数種中の別のデバイスサブセットに属するデバイスの配列Ｙとは異なるものである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
少なくとも２つのデバイスを含む組成物であって、
各デバイスは、
（ｉ）構造１：
【化４】
2013511285.tif 000014
を含むポリヌクレオチドであり、
ここで、
Ｐは、プライマー配列であり、
Ｙは、生成物配列であり、
Ｒは、複製ブロック基であり、
Ｓは、ステム配列であり、
Ｌは、ループ領域であり、
Ｓ’は、Ｓにハイブリダイズする配列であり、
Ｙ’は、Ｙにハイブリダイズする配列であり、
ＳおよびＳ’のそれぞれは、前記デバイス中に存在していてもよく、Ｓ’の存在は、前記デバイス中のＳの存在によって決まり、
Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｓ’、およびＹ’はヘアピン構造を形成するものか、または
（ｉｉ）構造２：
【化５】
2013511285.tif 000015
の第１のポリヌクレオチドと、
構造３：
【化６】
2013511285.tif 000016
の第２のポリヌクレオチドとを含み、
ここで、
Ｐは、プライマー配列であり、
Ｙは、生成物配列であり、
Ｒは、複製ブロック基であり、
Ｓは、ステム配列であり、
Ｙ’は、Ｙにハイブリダイズする配列であり、
Ｓ’は、Ｓにハイブリダイズする配列であるものか、
のいずれかであり、
前記組成物の各デバイスは、プライマー配列Ｐと同一でない追加の配列Ａからなる生成物配列Ｙを含み、
前記組成物は、プライマー配列Ｐ１および生成物配列Ｙ１を含む第１のデバイスと、プライマー配列Ｐ２および生成物配列Ｙ２を含む第２のデバイスとを含み、Ｐ１はＰ２と異なり、Ｙ１はＹ２と異なり、Ｙ１の相補配列は、プライマー配列Ｐ２に相補的である、組成物。
【請求項２８】
複数種のデバイスを含み、
前記複数種は、少なくとも３種のデバイスサブセットであって、１つのデバイスサブセットに属する各デバイスは配列Ｙの配列を含み、該配列Ｙの配列は、（ｉ）同じデバイスサブセットに属する別のデバイスの配列Ｙと同一であり、かつ（ｉｉ）前記複数種中の別のデバイスサブセットに属するデバイスの配列Ｙとは異なるものである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１乃至２１のいずれかに記載のデバイス、または請求項２２乃至２８のいずれかに記載の組成物、および一本鎖標的プライマーを伸長させる反応における該デバイスまたは組成物の使用のための使用説明を含む、キット。
【請求項３０】
前記一本鎖標的分子を含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
ポリメラーゼおよび遊離ヌクレオチドを含む、請求項２９または３０のキット。
【請求項３２】
鎖置換ポリメラーゼを含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
実質的な等温状態の下で作用する鎖置換ポリメラーゼを含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３１乃至３３のいずれかに記載のキット。
【請求項３５】
５’エキソヌクレアーゼ活性をもたないポリメラーゼを含む、請求項３１乃至３４のいずれかに記載のキット。
【請求項３６】
複製ブロック基Ｒと接触すると、前記デバイスから解離するポリメラーゼを含む、請求項３１乃至３５のいずれかに記載のキット。
【請求項３７】
実質的な等温状態の下で前記デバイスから解離するポリメラーゼを含む、請求項３１乃至３６のいずれかに記載のキット。
【請求項３８】
シャペロン鎖置換分子を含む、請求項３１乃至３７のいずれかに記載のキット。
【請求項３９】
前記シャペロン鎖置換分子は、ヘリカーゼ、トランスフェラーゼ、または一本鎖結合タンパク質である、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
少なくとも２種のポリメラーゼを含み、少なくとも１種類のポリメラーゼは、校正ポリメラーゼである、請求項３１乃至３９のいずれかに記載のキット。
【請求項４１】
前記校正ポリメラーゼは、前記一本鎖標的分子から、１または複数の非テンプレート付加反応を介して付加される塩基を除去する、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
検出可能な標識と、伸張反応の伸張生成物にハイブリダイズする配列とを含む分子ビーコンを含む、請求項３１乃至４１のいずれかに記載のキット。
【請求項４３】
前記分子ビーコンは、前記生成物にハイブリダイズされないとき、ヘアピン構造を形成する、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
プローブを含む、請求項４２または４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記プローブは、検出可能な標識である、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
伸張生成物を切断する酵素を含む、請求項３１乃至４５のいずれかに記載のキット。
【請求項４７】
一本鎖標的分子を伸長させる方法であって、
前記一本鎖標的分子を、伸長反応混合物と接触させるステップであって、前記伸長反応混合物は、（ｉ）請求項１乃至２１のいずれかのデバイス、または請求項２２乃至２８のいずれかに記載の組成物と、（ｉｉ）ポリメラーゼと、（ｉｉｉ）遊離ヌクレオチドとを含む、該ステップを含み、
このとき伸長反応生成物が生成され、該伸長反応生成物は、前記デバイスの生成物配列Ｙに相補的な３’配列を有する一本鎖標的分子を含む、方法。
【請求項４８】
前記伸長反応混合物は、請求項３０Ａの組成物を含み、
前記第１のデバイスを用いた第１の伸長反応から生成された伸長生成物は、前記第２のデバイスを用いた第２の伸長反応によってさらに伸長され、
前記伸長反応生成物は、３’末端配列５’（ｃＰ１−ｃＹ１−ｃＹ２）３’を含み、
ｃＰ１はＰ１に相補的な配列であり、ｃＹ１はＹ１に相補的な配列であり、ｃＹ２はＹ２に相補的な配列である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記伸長反応混合物は、請求項３０Ｂの組成物を含み、
第１のデバイスサブセットに属するデバイスを用いた第１の伸長反応から生成された伸長生成物は、第２のデバイスサブセットに属するデバイスを用いた第２の伸長反応によってさらに伸長され、
第２の伸長反応から生成された伸長生成物は、第３のデバイスサブセットに属するデバイスを用いて伸長される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
（ｉ）前記伸長反応混合物は、ｎ種のデバイスサブセットを含み、
（ｉｉ）前記方法は、前記伸長反応で用いられるデバイスの追加の配列Ａに相補的な配列が標的分子の３’末端に連続して付加される、ｎ回の伸長反応を含み、
（ｉｉｉ）ｎ回目の伸長反応から生成された伸長反応生成物は、異なるｎ種の付加された配列を含み、付加された配列のそれぞれは、各デバイスサブセットのデバイスの追加の配列Ａに相補的な配列である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記伸長反応混合物は、請求項１または２のデバイスを含み、
前記デバイスの生成物配列Ｙは、そのデバイスのプライマー配列Ｐと同一な配列ＰＹからなり、
前記標的分子配列の少なくとも一部分が前記プライマー配列に相補的であり、
前記伸長反応生成物は、前記プライマー配列Ｐに相補的な３’末端配列を有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
ｎ回の伸長反応を含み、
前記ｎ回の伸長反応から生成された伸長反応生成物は、（ｎ＋１）個のｃＰ配列を含み、ｃＰは、前記プライマー配列Ｐに相補的な配列である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記伸長反応混合物は、請求項８に記載のデバイスを含み、
前記デバイスの生成物配列Ｙは、前記デバイスのプライマー配列Ｐと同一な配列ＰＹを含み、かつ配列ＰＹの配列とは異なるタグ配列Ｔをさらに含み、ここで配列ＴはＰＹに対して３’側に位置する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
ｎ回の伸長反応を含み、
前記ｎ回の伸長反応から生成された伸長反応生成物は、ｃＰと、それに続くｎ個の（ｃＴ−ｃＰ）配列を含み、ｃＰは、前記プライマー配列Ｐに相補的な配列であり、ｃＴ−ｃＰは、タグ配列Tに相補的な配列であり、それに前記プライマー配列Ｐに相補的な配列が続く、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記伸長反応混合物は、請求項１乃至５、８、９、および１２乃至２５のいずれかのデバイスのなかの複数種を含み、
前記複数種は、少なくとも３種のデバイスサブセットであって、１つのデバイスサブセットに属する各デバイスは配列Ｙの配列を含み、該配列Ｙの配列は、（ｉ）同じデバイスサブセットに属する別のデバイスの配列Ｙと同一であり、かつ（ｉｉ）前記複数種中の別のデバイスサブセットに属するデバイスの配列Ｙとは異なるものであって、
前記伸長生成物は、前記複数種の配列Ｙのそれぞれに相補的な配列を含む３’末端を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記方法は、実質的な等温状態の下で実施される、請求項４７乃至５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記方法は、約０℃〜約７５℃の範囲の温度で実施される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記方法は、第１の温度で行われる１以上のステップと、第２の温度で行われる１以上のステップとを含み、前記第２の温度は、前記第１の温度より約２５℃以上高い、請求項４７乃至５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記第１の温度は、約６０℃〜約７５℃の範囲内にあり、前記第２の温度は、約８５℃〜約１００℃の範囲内にある、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポリメラーゼが前記第２の温度において前記デバイスから解離する、解離ステップを含む、請求項５８または５９に記載の方法。
【国際調査報告】
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