(57)【要約】総数４８の試験モチーフに関する、ビオチン化および非ビオチン化配列、ハイブリッド・ペプチド−ペプトイド配列、分枝配列を含む、新規自己集合ペプチド（ＳＡＰ）群を記載し、短い平板ファイバーからねじれたリボン、ナノチューブおよび階層的自己集合マイクロメートル長のシートに渡る、ナノおよびマイクロスケールでの自発的自己集合構造の異種アンサンブルを示す。特に、最初に自発的に集合する本発明記載のＳＡＰは、驚くべきことに、中性ｐＨ緩衝液に曝露されると安定な固形足場を形成する。さらにこれらのＳＡＰは、ネズミおよびヒト神経幹細胞の接着、増殖および分化を可能にし、そして自己回復傾向を有する。これらはまた、中枢神経系において、毒性効果を発揮せず、出血を停止可能であり、そして神経再生を育成可能である。したがって、本発明記載のＳＡＰは、改善されたバイオマテリアルであり、既知のＳＡＰに代用可能な、したがって既知のＳＡＰに関連する不都合な点を克服する、非常に有効で、そして有用な代替物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
７〜１７アミノ酸を有するアミノ酸ドメインからなる自己集合ペプチド（ＳＡＰ）であって、前記ドメインが：
【化１】
2013525329.tif 000008
である、前記ペプチド。
【請求項２】
配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２２、４０、４１、４２、４４および４５からなる群より選択されるアミノ酸ドメインを有する、請求項１に記載された自己集合ペプチド。
【請求項３】
配列番号１、８、１０および１３からなる群より選択されるアミノ酸ドメインを有する、請求項１に記載された自己集合ペプチド。
【請求項４】
配列番号１４からなるアミノ酸ドメインを有し、プロピルアミンが３位のＧおよび４位のＦの間に存在する、請求項２に記載された自己集合ペプチド。
【請求項５】
配列番号１１からなるアミノ酸ドメインを有する、請求項２に記載された自己集合ペプチド。
【請求項６】
Ｎ末端が場合によってビオチン化されている、請求項２〜５のいずれか一項に記載された自己集合ペプチド。
【請求項７】
配列番号２、１５および１６からなる群より選択されるアミノ酸ドメインを有する、請求項１に記載された自己集合ペプチド。
【請求項８】
Ｎ末端が場合によってアセチル化されている、請求項７に記載された自己集合ペプチド。
【請求項９】
アミノ酸ドメインのグリシン数が１〜８である、請求項１〜８のいずれか一項に記載された自己集合ペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸ドメインのグリシン数が３〜６である、請求項９に記載された自己集合ペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載された自己集合ペプチドおよびヒドロゲル化成分を含む、ヒドロゲル。
【請求項１２】
少なくとも２つの、請求項１〜１０のいずれか一項に記載された自己集合ペプチドと同一のものを含む、自己集合ペプチドポリマー。
【請求項１３】
少なくとも２つの、請求項１〜１０のいずれか一項に記載された自己集合ペプチドと異なるものを含む、自己集合ペプチドポリマー。
【請求項１４】
医薬としての、請求項１２または１３記載の自己集合ペプチドポリマーの使用。
【請求項１５】
少なくとも２つの、請求項１〜１０のいずれか一項に記載された自己集合ペプチドと同一のものを含む、平板状ナノファイバー。
【請求項１６】
少なくとも２つの、請求項１〜１０のいずれか一項に記載された自己集合ペプチドと異なるものを含む、平板状ナノファイバー。
【請求項１７】
長さ５〜１０μｍである点で特徴付けられる、請求項１５または１６に記載された平板状ナノファイバー。
【請求項１８】
少なくとも２つの、請求項１５、１６または１７のいずれか一項に記載された平板状ナノファイバーで作製される、織り合わせ（ｉｎｔｅｒｗｏｖｅｎ）膜。
【請求項１９】
幅０．５〜４μｍである点で特徴付けられる、請求項１８に記載された織り合わせ膜。
【請求項２０】
２またはそれより多い、請求項１〜１０に記載されたペプチドと同一のものからなる自己集合ナノ構造物。
【請求項２１】
２またはそれより多い、請求項１〜１０に記載されたペプチドと異なるものからなる自己集合ナノ構造物。
【請求項２２】
空洞を有する、請求項２０または２１に記載された自己集合ナノ構造物。
【請求項２３】
分子薬物放出のための、請求項２０、２１または２２に記載された自己集合ナノ構造物の使用。
【請求項２４】
少なくとも１つの、請求項１２に記載されたポリマー、および医薬として生物活性のある賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１１に記載されたヒドロゲルの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養のための足場としての使用。
【請求項２６】
請求項１１に記載されたヒドロゲルの、二次元および三次元におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養のための使用。
【請求項２７】
請求項１１に記載されたヒドロゲルの、ヒト神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖および分化のための足場としての使用。
【請求項２８】
請求項１１に記載されたヒドロゲルの、ネズミ神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖および分化のための足場としての使用。
【請求項２９】
請求項１１に記載されたヒドロゲルの、ｉｎ  ｖｉｖｏ神経再生のための使用。
【請求項３０】
請求項１１に記載されたヒドロゲルの、止血のための使用。
【請求項３１】
請求項１１に記載されたヒドロゲルの、ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物送達のためのデバイスとしての使用。
【請求項３２】
請求項１１に記載されたヒドロゲルの、組織工学（ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）のための、使用。
【請求項３３】
請求項１１に記載されたヒドロゲルの、分子スイッチとしてのまたはバイオセンサーとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は合成ヒドロゲルの分野に関する。材料のこのポリマー種は、生物医学分野において、電気化学バイオセンシングにおいて、コンピュータ用の自己集合回路およびトランジスタにおいて、そしてその高い万能性のため、材料科学において、広範囲の適用を有する。
【背景技術】
【０００２】
主に軟質材料に基づくヒドロゲルは、三次元細胞培養、薬物送達および組織エンジニアリング（１〜３）において、広範囲の適用を有する。合成または天然ポリマーに基づくヒドロゲルの多くの例がある。
【０００３】
アガロース、コラーゲン、フィブリン、キトサン、およびヒアルロン酸を含む、天然由来ポリマーがヒドロゲルを形成可能である。その起源に関わらず、天然構成要素は、いくつかの不都合な点を有し、例えば移植前の精製によって除去不能な定義されない因子による、炎症反応を誘導する傾向および病原体伝達、異なるロット間の相当な度合いの変動性、ならびに特にヒトタンパク質が関与する場合、大規模な供給源を入手するのが困難であることが挙げられる。
【０００４】
合成ポリマーは、２つのタイプである可能性があり、小さい低分子量ペプチドで作製されるもの、およびポリ（エチレングリコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（ビニルアルコール）などの巨大分子モノマーで作製されるものがある。この第二の種類の合成ポリマーは、適切な条件下でヒドロゲルを形成しうる。しかし、その純度または化学的調整可能性にもかかわらず、巨大分子モノマーで作製されるこうした合成ヒドロゲルは、いくつかの不都合な点、例えば：生体適合性、生分解産物および移植に際する宿主反応を有する。さらに、所望の細胞反応を得るのに必要である生理活性モチーフ（３〜８量体ペプチド）での官能化は、通常、限定された数の短いペプチドに対してしか利用可能でない、厳しい反応で達成可能である。
【０００５】
合成であるが、天然に着想を得た、ヒドロゲルを形成可能な低分子量自己集合ペプチドに関連する研究が、近年、迅速に拡大されてきている。
【０００６】
容易に官能化しやすいナノ構造化材料として可能性があり、そして細胞培養、組織再生の誘発、ならびに生命科学を越えた他の適用、例えば電気化学センシング、分子エレクトロニクスおよび三次元ナノスケール系の構築に適した微小環境を生成可能であるため、自己集合低分子量ヒドロゲルの構築は、かなりの注目を集めてきている。
【０００７】
ペプチドに基づく足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）は、水素結合、静電相互作用またはπ−π相互作用を含む、水中での多様な非共有相互作用の形成を通じて、穏やかな溶媒条件で自己集合可能であるため、ヒドロゲル化に関して関心が示される候補である。これらの相互作用は、最終的に、組織だった超分子集合の形成を導き、こうした集合は、ナノファイバー、ナノチューブおよびナノ粒子を生じさせうる（７、８）。
【０００８】
したがって、合成であるが、天然に想起された、固形足場の発展のための有望な自己集合ペプチド種に属する、新規合成ペプチドに対する必要性の増加が感じられてきており：どちらも、分子設計、臨床における安全な使用、および臨床における合理的なスケールアップ産生を可能にする貴重な性質である。さらに、こうした新規ポリマーは、上記の不都合な点を克服する必要がある。
【０００９】
現在まで、合成ヒドロゲルを形成する、既知の自己集合短鎖ペプチドの大部分は、Ｎ末端が保護されている。
【００１０】
保護基を持たない自己集合水溶性合成短鎖オリゴペプチドから形成されるヒドロゲルの例はほとんど記載されてきていない：この中で、最も重要な種類は、ＵＳ７３７１７１９およびＵＳ６５４８６３０に記載されるものなどの、親水性および疎水性アミノ残基が交互であるペプチドを含む（７）。
【００１１】
実際、ＵＳ２００９０１６２４３７は、非修飾型で存在すると巨視的構造に自己集合する、疎水性および親水性アミノ酸を交互に含む、自己集合を仲介する第一のアミノ酸ドメイン；および単離された型では自己集合を仲介しない第二のアミノ酸ドメインを持ち、第二のアミノ酸ドメインが少なくとも１つの最小限の生物学的活性配列を含む、自己集合ペプチドを提供する。
【００１２】
いくつかの機能モチーフが自己集合ペプチドに付着されてきている。骨髄ホーミングペプチド種のメンバーである機能モチーフ、ＢＭＨＰは、以下の配列ＰＦＳＳＴＫＴ（配列番号４８）を有し、そして神経幹細胞接着および分化を育成しうることが知られる（５）。ＢＭＰＨは、グリシン−スペーサーを介して、ＲＡＤＡ１６−Ｉ自己集合「コア」に連結されると、自己集合ペプチドＲＡＤＡ１６−Ｉナノファイバーに見られるβシート構造（１０）を安定化させうる。にもかかわらず、既知の自己集合ペプチドの大部分は、劣った力学特性を特徴とし、集合した際、非常に柔らかく、そして脆弱な足場を生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＵＳ７３７１７１９
【特許文献２】ＵＳ６５４８６３０
【特許文献３】ＵＳ２００９０１６２４３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の目的は既知のＳＡＰに関連する不都合な点を克服し、そしてこれに代用可能な改善されたＳＡＰを発見することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、７〜１７アミノ酸を有するアミノ酸ドメインからなる自己集合ペプチド（ＳＡＰ）であって、前記ドメインが：
【００１６】
【化１】
2013525329.tif 000002
【００１７】
である、前記ペプチドに関する。
【００１８】
本発明はしたがって、自己集合ペプチド（ＳＡＰ）の新規群であって、ＳＡＰが新規ペプチドからなり、総数４７の試験モチーフに関する、場合によってＮ末端でビオチン化されたおよびビオチン化されない、そしてＣ末端でアミド化されるかまたはされない、ハイブリッド・ペプチド−ペプトイド配列である、前記群に関する。配列番号１〜配列番号４７の配列を有するＳＡＰは、すべて直鎖ペプチドであるが、２つの同一ＧＧＧ分枝を持つ分枝ペプチドである配列番号４４は例外である。
【００１９】
本発明の目的のため、各ペプチドは、以下の詳細な説明に示すように、ペプチド同定番号および対応する配列番号を有する。
【００２０】
本発明はさらに、自己集合ペプチドおよびヒドロゲル化成分を含むヒドロゲルを記載する。
【００２１】
本発明のさらなる側面は、少なくとも２つの同一自己集合ペプチドを含む、自己集合ペプチドポリマーである。
【００２２】
本発明のさらにさらなる側面は、少なくとも２つの異なる自己集合ペプチドを含む、自己集合ペプチドポリマーである。
【００２３】
さらにさらなる側面は、医薬としての本発明の自己集合ペプチドポリマーの使用である。
【００２４】
本発明はさらに、少なくとも２つの同一自己集合ペプチドを含む、平板状ナノファイバーを記載する。
【００２５】
本発明はさらに、少なくとも２つの異なる自己集合ペプチドを含む、平板状ナノファイバーを記載する。
【００２６】
本発明のさらなる側面は、少なくとも２つの平板状ナノファイバーで作製される、複雑な織り合わせ（ｉｎｔｅｒｗｏｖｅｎ）膜である。
【００２７】
本発明のさらにさらなる側面は、本発明の２またはそれより多い同一ペプチドからなる自己集合ナノ構造である。
【００２８】
本発明のさらにさらなる側面は、本発明の２またはそれより多い異なるペプチドからなる自己集合ナノ構造である。
【００２９】
本発明のさらにさらなる側面は、少なくとも１つのポリマーおよび薬学的生理活性賦形剤を含む、薬学的組成物である。
【００３０】
本発明の特性および利点は、以下に報告する詳細な説明から、例示を目的としそして限定する目的ではなく提供する実施例から、そして添付の図から、明らかとなるであろう：
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、試験した配列の「推測的な」分類を示す。
【図２ａ】図２は、自己集合ペプチドのゲル化実験を示し、該実験において、ペプチド濃度に対する溶液Ｇ’動力学依存を示す；
【図２ｂ】３％濃度で溶解したペプチドＢ３の貯蔵係数（Ｇ’）は、２日後にプラトーに到達する（第２日〜第５日の間に７％の変動）一方、２％溶液の場合、第５日になお重大に増加する；
【図２ｃ】ｐＨシフト後の集合した足場（ペプチド４、Ｂ１５、Ｂ２２）および対照としての非集合ペプチドＢ７（Ｂｉｏｔ−ＰＦＳＳＴＫＴ−ＣＯＮＨ2）の静止液体溶液の貯蔵（Ｇ’）および損失（Ｇ”）係数の典型的な測定値；
【図２ｄ】図（２ｄ）は、ペプチド溶液（Ｇ’集合前）およびゲル化足場（Ｇ’集合後）の試験ペプチドに関する、同定番号および対応する配列番号の配列、ならびに貯蔵係数の平均値を示す。*１％で溶解し、そして試験したペプチド；“溶解７日後に試験したペプチド；**３％で溶解し、そして試験したペプチド；^２％で溶解し、そして試験したペプチド。
【図３ａ】図３は試験ペプチドの原子間力顕微鏡画像撮影の結果を示す。  図３ａ）自己集合ペプチドＢ６４、Ｂ６５、Ｂ６６およびＢ６７は、溶解１日後から、ねじれたナノファイバー形成を示し（６０ｎｍピッチ、左巻）、そしてまた、ＰＢＳに曝露されると自己集合してヒドロゲルを生じた。
【図３ｂ】自己集合ペプチドＢ１５、Ｂ２４、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ４０、Ｂ４１、Ｂ４２、Ｂ４４、Ｂ５４、Ｂ５８、５９および６１は、平らな平板状ファイバーに自己集合した；
【図３ｃ】自己集合ペプチド４、３７および６０は、ねじれたファイバーを生じた；
【図３ｄ】自己集合ペプチドＢ１０、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３およびＢ４３を示し、そしてこれらはねじれたファイバーを形成する；
【図３ｅ】自己集合ペプチドＢ１８、Ｂ１９、Ｂ２５、Ｂ２８、Ｂ２９、３０、３１、Ｂ４５、Ｂ５２、Ｂ５１、Ｂ５３およびＢ５０を示し、そしてこれらはねじれたファイバーを形成する；
【図３ｆ】（ｉ）Ｂ３、Ｂ１７、Ｂ２２、Ｂ２７、Ｂ３４、Ｂ３９、Ｂ４６、Ｂ４７、Ｂ４８およびＢ５７は階層的に自己集合してねじれた原線維を生じ；  図３ｆ）（ｉｉ）、ともにパッキングされてリボンを生じ；  図３ｆ）（ｉｉｉ）、直線管状構造に集合し；  図３ｆ）（ｉｖ）、そして最終的に平らなシートに再編成された。
【図４ａ】図４（ａ）は、Ｘ線回折パターンを示す。
【図４ｂ】Ｂ３ペプチドに関して記録された動径積分（ｒａｄｉａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）回折強度。最も大きなピークが２１Åおよび４．６Åに同定され、これらはおそらく、それぞれ、自己集合ファイバーの厚みおよび主な二次βシート構造を示す。５．２Åのピークは、積み重なった芳香族基間の距離に起因しうる。３．７Åのピークは、ＶＤＷ距離での鎖パッキングと解釈可能である。
【図４ｃ】１２のペプチドに関して、強度ピークを要約する。最強のピークは４．６Åであり、一方、３．７Åおよび２．３５Åのピークは、すべての試験ペプチドによって共有される。
【図４ｄ】ペプチドＢ２４のＣＤスペクトルは、およそ３５％のランダムコイルおよび６０％のベータ構造（２１０〜２３０ｎｍ波長領域）を示した。  他の試験ペプチドに関しても、同様の結果が得られた。
【図５】細胞培養実験の結果を示す。ｈＮＳＣを、溶液および多様なペプチド濃度のＢ３、４、Ｂ１５、Ｂ１７、Ｂ１９、Ｂ２２、Ｂ２４、Ｂ２５、Ｂ２７、Ｂ２８および３１由来の自己集合足場上で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで７日間培養した。  図５（ａ）細胞形態画像は、Ｂ２４の場合、枝分かれし、そして付着した細胞を、または３０および陰性対照（プラスチック）に示すように単一球状細胞を含む。  図５（ｂ）生存／死亡細胞アッセイは、陰性対照において、生存細胞の球状クラスターを、そしてＢ２２において、二極細胞を、そしてＢ２４において、非常に枝分かれした細胞の層を示した。  図５（ｃ）上述の自己集合足場上で７日間培養した細胞の細胞力価アッセイ（ｎ＝６）。特に、Ｂ１５およびＢ２４は、陰性対照と有意に異なる、最大の生存細胞集団を示した（それぞれ、Ｐ＜０．００２およびＰ＜０．００１；両側ｔ検定）。  図５（ｄ）Ｂ２４足場上で１４  ＤＩＶに渡って培養したＮＳＣは、ＧＦＡＰ（８７．７２％±０．４９％）、βＩＩＩチューブリン（１２．２７％±０．４９％）、ＭＡＰ２（９．５％±０．１％）およびＧａｌＣ／Ｏ４（１．６３％±０．３７％）マーカーに関して陽性を示した（ｎ＝４）。
【図６ａ】自己回復試験。  図６（ａ）ペプチドＢ１７に関する自己回復試験
【図６ｂ】ペプチドＢ２５に関する自己回復試験
【図６ｃ】ペプチドＫＬＤ−１２に関する自己回復試験。  ＰＢＳ添加後、破裂後、およびそれに続く３０分ごとの時点での、集合した足場の周波数掃引。（ａ）において、貯蔵係数は、１２０分で、破裂前の集合した足場のものと類似の値に戻り、（ｃ）において、破裂後のＧ’値は安定である。ＰＢＳ添加後のＢ２５の集合した足場の時間掃引試験（ｂ）：破裂後のＧ’値は、１００分で回復し、そして回復後、安定してプラトー状態であった。
【図７ａ】ｉｎ  ｖｉｖｏのＢ２４生体適合性。第一列：対照群に属する動物。第二列：治療動物。生理食塩水注入動物の脊髄中で自発的に起こる肝細胞腫（Ａ）は、Ｂ２４の注射を受けた動物（Ｆ）では防止された。生理食塩水治療およびＢ２４治療動物の注射部位でのヘマトキシリン−エオジン染色（それぞれＢおよびＧ）。対照群および治療動物において、本発明者らは、浸潤マクロファージ（それぞれＣおよびＨの緑色細胞）、アポトーシス細胞（それぞれＤおよびＩの緑色細胞）および変性神経線維（それぞれＥおよびＪの緑色細胞）が類似の濃度であることを検出した。細胞核（青色）はＤＡＰＩで染色される。スケールバー１００μｍ。
【図７ｂ】生理食塩水注入動物の脊髄中で自発的に起こる肝細胞腫（Ａ）は、Ｂ２４の注射を受けた動物（Ｆ）では防止された。生理食塩水治療およびＢ２４治療動物の注射部位でのヘマトキシリン−エオジン染色（それぞれＢおよびＧ）。対照群および治療動物において、本発明者らは、浸潤マクロファージ（それぞれＣおよびＨの緑色細胞）、アポトーシス細胞（それぞれＤおよびＩの緑色細胞）および変性神経線維（それぞれＥおよびＪの緑色細胞）が類似の濃度であることを検出した。細胞核（青色）はＤＡＰＩで染色される。スケールバー１００μｍ。
【図７ｃ】生理食塩水注入動物の脊髄中で自発的に起こる肝細胞腫（Ａ）は、Ｂ２４の注射を受けた動物（Ｆ）では防止された。生理食塩水治療およびＢ２４治療動物の注射部位でのヘマトキシリン−エオジン染色（それぞれＢおよびＧ）。対照群および治療動物において、本発明者らは、浸潤マクロファージ（それぞれＣおよびＨの緑色細胞）、アポトーシス細胞（それぞれＤおよびＩの緑色細胞）および変性神経線維（それぞれＥおよびＪの緑色細胞）が類似の濃度であることを検出した。細胞核（青色）はＤＡＰＩで染色される。スケールバー１００μｍ。
【図７ｄ】生理食塩水注入動物の脊髄中で自発的に起こる肝細胞腫（Ａ）は、Ｂ２４の注射を受けた動物（Ｆ）では防止された。生理食塩水治療およびＢ２４治療動物の注射部位でのヘマトキシリン−エオジン染色（それぞれＢおよびＧ）。対照群および治療動物において、本発明者らは、浸潤マクロファージ（それぞれＣおよびＨの緑色細胞）、アポトーシス細胞（それぞれＤおよびＩの緑色細胞）および変性神経線維（それぞれＥおよびＪの緑色細胞）が類似の濃度であることを検出した。細胞核（青色）はＤＡＰＩで染色される。スケールバー１００μｍ。
【図７ｅ】生理食塩水注入動物の脊髄中で自発的に起こる肝細胞腫（Ａ）は、Ｂ２４の注射を受けた動物（Ｆ）では防止された。生理食塩水治療およびＢ２４治療動物の注射部位でのヘマトキシリン−エオジン染色（それぞれＢおよびＧ）。対照群および治療動物において、本発明者らは、浸潤マクロファージ（それぞれＣおよびＨの緑色細胞）、アポトーシス細胞（それぞれＤおよびＩの緑色細胞）および変性神経線維（それぞれＥおよびＪの緑色細胞）が類似の濃度であることを検出した。細胞核（青色）はＤＡＰＩで染色される。スケールバー１００μｍ。
【図７ｆ】生理食塩水注入動物の脊髄中で自発的に起こる肝細胞腫（Ａ）は、Ｂ２４の注射を受けた動物（Ｆ）では防止された。生理食塩水治療およびＢ２４治療動物の注射部位でのヘマトキシリン−エオジン染色（それぞれＢおよびＧ）。対照群および治療動物において、本発明者らは、浸潤マクロファージ（それぞれＣおよびＨの緑色細胞）、アポトーシス細胞（それぞれＤおよびＩの緑色細胞）および変性神経線維（それぞれＥおよびＪの緑色細胞）が類似の濃度であることを検出した。細胞核（青色）はＤＡＰＩで染色される。スケールバー１００μｍ。
【図７ｇ】生理食塩水注入動物の脊髄中で自発的に起こる肝細胞腫（Ａ）は、Ｂ２４の注射を受けた動物（Ｆ）では防止された。生理食塩水治療およびＢ２４治療動物の注射部位でのヘマトキシリン−エオジン染色（それぞれＢおよびＧ）。対照群および治療動物において、本発明者らは、浸潤マクロファージ（それぞれＣおよびＨの緑色細胞）、アポトーシス細胞（それぞれＤおよびＩの緑色細胞）および変性神経線維（それぞれＥおよびＪの緑色細胞）が類似の濃度であることを検出した。細胞核（青色）はＤＡＰＩで染色される。スケールバー１００μｍ。
【図７ｈ】生理食塩水注入動物の脊髄中で自発的に起こる肝細胞腫（Ａ）は、Ｂ２４の注射を受けた動物（Ｆ）では防止された。生理食塩水治療およびＢ２４治療動物の注射部位でのヘマトキシリン−エオジン染色（それぞれＢおよびＧ）。対照群および治療動物において、本発明者らは、浸潤マクロファージ（それぞれＣおよびＨの緑色細胞）、アポトーシス細胞（それぞれＤおよびＩの緑色細胞）および変性神経線維（それぞれＥおよびＪの緑色細胞）が類似の濃度であることを検出した。細胞核（青色）はＤＡＰＩで染色される。スケールバー１００μｍ。
【図７ｉ】生理食塩水注入動物の脊髄中で自発的に起こる肝細胞腫（Ａ）は、Ｂ２４の注射を受けた動物（Ｆ）では防止された。生理食塩水治療およびＢ２４治療動物の注射部位でのヘマトキシリン−エオジン染色（それぞれＢおよびＧ）。対照群および治療動物において、本発明者らは、浸潤マクロファージ（それぞれＣおよびＨの緑色細胞）、アポトーシス細胞（それぞれＤおよびＩの緑色細胞）および変性神経線維（それぞれＥおよびＪの緑色細胞）が類似の濃度であることを検出した。細胞核（青色）はＤＡＰＩで染色される。スケールバー１００μｍ。
【図７ｊ】生理食塩水注入動物の脊髄中で自発的に起こる肝細胞腫（Ａ）は、Ｂ２４の注射を受けた動物（Ｆ）では防止された。生理食塩水治療およびＢ２４治療動物の注射部位でのヘマトキシリン−エオジン染色（それぞれＢおよびＧ）。対照群および治療動物において、本発明者らは、浸潤マクロファージ（それぞれＣおよびＨの緑色細胞）、アポトーシス細胞（それぞれＤおよびＩの緑色細胞）および変性神経線維（それぞれＥおよびＪの緑色細胞）が類似の濃度であることを検出した。細胞核（青色）はＤＡＰＩで染色される。スケールバー１００μｍ。
【図８】ｉｎ  ｖｉｖｏでの神経再生のＢ２４評価：脊髄の長軸方向切片。ａ）βＩＩＩチューブリンおよびＧＡＰ−４３神経マーカーに関して染色された神経線維は、術後１ヶ月で、Ｂ２４の注入自己集合足場に浸潤した（アスタリスクは足場を指す）。ｂ）移植された足場内の再生神経線維の束を示す高拡大画像。細胞核はＤＡＰＩで標識される。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の自己集合ペプチド（ＳＡＰ）は、７〜１７アミノ酸を有するアミノ酸ドメインからなり、前記ドメインは：
【００３３】
【化２】
2013525329.tif 000003
【００３４】
である。
【００３５】
上述のように、本発明の目的のため、各ペプチドは、以下の表１にしたがったペプチド番号および対応する配列番号を有する：
【００３６】
【表１】
2013525329.tif 000004
【００３７】
本発明の自己集合ペプチド（ＳＡＰ）は、表１に定義するアミノ酸配列を有し、該表において、一文字ＩＵＰＡＣアミノ酸コードを用いる（すなわちＧはアミノ酸グリシンに対応し、Ｐはアミノ酸プロリンに対応する）。各ＳＡＰは、表１において上に報告するようなペプチド番号および対応する配列番号を有する。
【００３８】
各ＳＡＰは、対応する派生ＳＡＰを有し、これはＮ末端およびＣ末端アミドでのビオチン化またはアセチル化を伴うアミノ酸配列である。
【００３９】
ビオチン化ペプチドは「Ｂ＋番号」で名付けられる。他のペプチドは、番号のみである。
【００４０】
本発明のＳＡＰは、総数４７の試験モチーフに関する、場合によってＮ末端でビオチン化されたおよびビオチン化されない配列、そしてＣ末端でアミド化されるかまたはされない、ハイブリッド・ペプチド−ペプトイド配列である。本発明のＳＡＰは、すべて直鎖ペプチドであるが、２つの同一ＧＧＧ分枝を持つ分枝ペプチドである配列番号４４は例外である。
【００４１】
本発明の主題は、したがって、低分子量自己集合ペプチドの新規群である。
【００４２】
これらの自己集合ペプチドは、合成起源であり、そしてしたがって多量に製造することが容易であり、そしてこれらを化学的にそして生物学的に修飾することも可能である。こうした修飾によって、科学者が細胞接着および増殖を促進する超構造を構築する可能性が生じる。
【００４３】
これらのペプチドは、合成起源である利点を有し、そしてしたがって、移植前の精製によって除去不能な定義されない因子による、炎症反応を誘導する傾向および病原体伝達、異なるロット間の相当な度合いの変動性、ならびに大規模な供給源を入手するのが困難であることなどの、天然ペプチドで見られる不都合な点を伴わない。
【００４４】
本発明の低分子量自己集合ペプチドは、合成であるが天然に想起されたヒドロゲルを形成可能であり、そして驚くべきことに、容易に官能化し、そして細胞培養、組織再生の誘発、ならびに生命科学を越えた他の適用、例えば電気化学センシング、コンピュータ用の自己集合回路およびトランジスタ、ならびに三次元ナノスケール系の構築に適した微小環境を生成可能である、ヒドロゲルを形成可能である。
【００４５】
中性ｐＨ緩衝剤に曝露されると、最初の自発的な、そして濃度依存性の自己集合プロセスが、固形足場形成に向かって加速し、足場の剛性はペプチド配列に応じて、３桁に渡る。
【００４６】
驚くべきことに、本発明記載のＳＡＰは、こうした異種配列の群を提示するにもかかわらず、多くの異なるそして階層的に凝集したナノおよびミクロ構造を自発的に形成する。これらのペプチドは、ベータ構造（ベータシートおよびベータターン）に集合し、Ｐｈｅ残基およびファイバーのテール間の芳香族相互作用、静電反発（Ｌｙｓは、ｐＨ駆動性自己集合を得ることを可能にする）、水素結合形成（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）を提示する。大部分のペプチドにおいて、ｐＨは、水中で自発的に起こる自己集合現象を加速する。
【００４７】
本発明のペプチドは、驚くべきことに、メソスケールで、自己回復傾向を示し、実際、ヒドロゲルは、機械的破裂後に、固形足場を再形成し、最初の剛性を回復する。
【００４８】
実際、自己集合足場の剛性の回復に関しては、本発明のペプチドは、多数の階層レベルで自己集合する。
【００４９】
自己回復傾向が見られているペプチドは、例えば、Ｂ３、４、Ｂ１５、Ｂ１７、Ｂ２２、Ｂ２４、Ｂ２５、Ｂ２７および３１（配列番号１、２、７、８、１０、１１、１２、１３および１６）であり、有用な戦略による薬物送達に使用可能なマイクロスケールの管状構造を生じ、こうした戦略は、自己集合前に医薬装填溶液中にペプチドを溶解し、遠心分離を通じて、集合した足場を分離し、そして自己回復集合足場をｉｎ  ｖｉｖｏで注入する工程からなる。
【００５０】
好ましい態様において、自己集合ペプチドは、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０および２１からなる群より選択されるアミノ酸ドメインを有する。
【００５１】
さらに好ましい態様において、本発明の自己集合ペプチドは、プロピルアミンが３位のＧおよび４位のＦの間に存在する、配列番号１４からなるからなるアミノ酸ドメインを有する。ｎ−プロピルアミンとしてもまた知られるプロピルアミンは、化学式Ｃ3Ｈ9Ｎを持つアミンである。
【００５２】
さらにより好ましい態様において、自己集合ペプチドは、Ｎ末端が場合によってビオチン化されている、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０および２１からなる群より選択されるアミノ酸ドメインを有する。
【００５３】
さらにより好ましい態様において、自己集合ペプチドは、Ｎ末端が場合によってビオチン化されている、配列番号１、８、１０および１３からなる群より選択されるアミノ酸ドメインを有する。
【００５４】
さらにより好ましい態様において、自己集合ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸ドメインを有し、より好ましくは、Ｎ末端が場合によってビオチン化されている。
【００５５】
さらなる態様において、本発明の自己集合ペプチドは、配列番号２、１５および１６からなる群より選択されるアミノ酸ドメインを有する。
【００５６】
さらにさらなる態様において、本発明の自己集合ペプチドは、Ｎ末端がアセチル化されている、配列番号２、１５および１６からなる群より選択されるアミノ酸ドメインを有する。
【００５７】
さらにさらなる態様において、本発明の自己集合ペプチドは、配列番号１、８、１０、１２および１３からなる群より選択されるアミノ酸ドメインを有する。
【００５８】
さらなる態様において、本発明の自己集合ペプチドは、アミノ酸ドメインに３〜８のグリシン数を有する。
【００５９】
好ましい態様において、本発明の自己集合ペプチドは、アミノ酸ドメインに３〜６のグリシン数を有する。
【００６０】
スペーサーのグリシン数を増加させることによって、ビオチンはより高い自由度を獲得し水素結合形成および／またはスタッキングのため、より優れた曝露および自己配向が可能になり、したがって自己集合を支持する。これが、３〜８、好ましくは３〜６の範囲のグリシンが、多数のナノおよびマイクロ構造の階層的形成に強く影響を及ぼしうる理由である。
【００６１】
好ましい側面において、本発明は、９〜１４アミノ酸を有するアミノ酸ドメインからなる自己集合ペプチド（ＳＡＰ）であって、前記ドメインが：
【００６２】
【化３】
2013525329.tif 000005
【００６３】
である前記ペプチドに関する。
【００６４】
さらなる好ましい側面において、本発明は、７〜１７アミノ酸を有するアミノ酸ドメインからなる自己集合ペプチド（ＳＡＰ）であって、前記ドメインが：
【００６５】
【化４】
2013525329.tif 000006
【００６６】
である、前記ペプチドに関する。
【００６７】
好ましい態様において、本発明は、自己集合ペプチドおよびヒドロゲル化成分を含む、ヒドロゲルに関する。
【００６８】
好ましい態様にしたがって、自己集合ペプチドポリマーは、本発明の少なくとも２つの同一自己集合ペプチドを含む。
【００６９】
本発明のさらなる側面は、少なくとも２つの異なる自己集合ペプチドを含む自己集合ペプチドポリマーである。
【００７０】
本発明のさらにさらなる態様は、医薬としての自己集合ペプチドポリマーの使用に関する。
【００７１】
本発明はさらに、少なくとも２つの同一自己集合ペプチドを含む平板状ナノファイバーに関する。
【００７２】
本発明はさらに、少なくとも２つの異なる自己集合ペプチドを含む平板状ナノファイバーに関する。
【００７３】
さらなる態様にしたがって、本発明は、長さ５〜１０μｍである点で特徴付けられる、平板状ナノファイバーに関する。
【００７４】
さらにさらなる態様にしたがって、本発明は、少なくとも２つの平板状ナノファイバーで作製される、複雑な織り合わせ膜に関する。
【００７５】
さらにより好ましい態様において、本発明は、幅０．５〜４μｍの複雑な織り合わせ膜に自己集合する、長さ１０μｍの平板状ナノファイバーに関する。
【００７６】
本発明のペプチドは、驚くべきことに、自己凝集し、そしてナノスケールで、平板状ファイバーからねじれたコイルおよび階層的に集合したシートに渡る構造を取るよう配置され、集合した足場の高い機械的剛性を示す。
【００７７】
本発明のさらなる態様は、したがって、２またはそれより多い同一ペプチドからなる自己集合ナノ構造に関する。
【００７８】
本発明のさらなる態様は、２またはそれより多い異なるペプチドからなる自己集合ナノ構造に関する。
【００７９】
本発明のさらなる態様は、空洞を有する自己集合ナノ構造、および小分子薬物の放出のためのこうした自己集合ナノ構造の使用に関する。
【００８０】
こうした小分子薬物は、足場空洞に閉じ込められて、そして次第に自己集合ナノ構造の純表面電荷と弱く相互作用し、こうして緩慢に放出されることも可能である。
【００８１】
さらに、ある程度のビオチンがストレプトアビジンと結合するのに利用可能であるため（タグ化試験をｉｎ  ｖｉｖｏで行って、動物において生体吸収時間を追跡するのに成功した）、ストレプトアビジンまたはアビジンをリンカーとして用いることによって、ビオチン化官能モチーフあるいはビオチン化医薬またはサイトカインで、ビオチン化ペプチドを官能化して、ｉｎ  ｖｉｖｏで緩慢な送達を得てもよい。
【００８２】
さらにより好ましい態様において、本発明は、本発明記載の少なくとも１つのポリマーおよび薬学的生理活性賦形剤を含む、薬学的組成物に関する。
【００８３】
例示的な薬学的に許容されうる賦形剤には、投与および投薬の特定の型に適するような、あらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散剤または懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固形結合剤、潤滑剤等が含まれる。
【００８４】
さらに、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養のための足場として使用するためのヒドロゲルの使用に関する。
【００８５】
さらに、本発明は、二次元および三次元のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養のためのヒドロゲルの使用に関する。これらのヒドロゲルは、細胞外マトリックスの線維状構成要素に非常に類似であり、このため、二次元（２Ｄ）および三次元（３Ｄ）での細胞培養を補助することが可能である。
【００８６】
本発明のさらなる側面は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養およびｉｎ  ｖｉｖｏ神経組織再生に関する潜在能力を評価するための、ヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖および分化のための足場としての、本発明記載のヒドロゲルの使用である。
【００８７】
本発明のさらにさらなる側面は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養およびｉｎ  ｖｉｖｏ神経組織再生に関する潜在能力を評価するための、ネズミ神経幹細胞（ｈＮＳＣ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖および分化のための足場としての、本発明記載のヒドロゲルの使用である。
【００８８】
さらにさらなる側面において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ神経再生のための、本発明記載のヒドロゲルの使用に関する。
【００８９】
さらにさらなる側面において、本発明は、止血のための、本発明記載のヒドロゲルの使用に関する。
【００９０】
さらにさらなる側面において、本発明は、再生医学適用における、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで医薬を送達するための、組織エンジニアリングのための、そして組織再生を誘発するための、請求項４記載のヒドロゲルの使用に関する。
【００９１】
本発明の自己集合ペプチドを用いて、多様な組織欠損および疾患を治療することも可能である。表面に増殖しているかまたは内部に被包された細胞を伴うかまたは伴わないかいずれかのヒドロゲルを、例えば外科的にまたは任意の他のタイプの適切な方法を用いて、体内に移植することも可能である。経口、経皮、筋内、静脈内、および皮下を含む他の経路が使用可能である。当業者は、適切な送達技術を選択することが可能であろう。
【００９２】
一般的に、本発明のＳＡＰは、組織に対する傷害または損傷を伴う、いかなる状況においても有用でありうる。こうした傷害は、手術、外傷、腫瘍、変性疾患、あるいは他の疾患または状態の結果として起こりうる。傷害は、細胞の死を伴う可能性もあるが、そうである必要はない。ＳＡＰは、組織に構造および／または機能的完全性を回復する、すなわち傷害前に存在した機能的または構造的状態に組織を回復するのを補助するのに有用である。特定の傷害は、組織の再生または修復を妨害可能な物理的バリアを生じうる。こうしたバリアには、壊死、空洞化、または瘢痕組織形成の領域を含むことも可能である。本発明の特定の態様において、傷害部位で本明細書記載の材料を導入すると、傷害またはバリア部位に近位の位置から、傷害またはバリア部位に遠位の位置に、細胞または組織が増殖することが可能になる。
【００９３】
本発明の特定のＳＡＰを用いて、疾患または臓器変性の影響を寛解させるか、臓器または他の体構造に対する傷害を修復するか、あるいは臓器または他の体構造を形成することも可能である。こうした臓器または体構造には、必ずしも限定されるわけではないが、血管組織、脳、神経組織、末梢神経、軟骨、食道、ファロピウス管、心臓、腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、膀胱、骨、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気道、尿管、尿道、子宮、および皮膚が含まれる。
【００９４】
また、本発明のＳＡＰを、美的および美容的技術において使用するための注入剤として、皮膚学において用いて、皺および加齢の大部分の一般的な徴候に対抗することも可能である。
【００９５】
皮膚の若々しい側面を回復し、そして細い線および皺を減少させるために、本発明記載のＳＡＰを、特にヒドロゲルの形で、注入材料として用いてもよい。
【００９６】
一般的に、多様なデバイスを用いて、傷害部位に本発明のヒドロゲルを導入してもよい。シリンジを通じた送達は、１つの好適な技術である。また、カテーテルによって、または手術部位で直接、ＳＡＰを導入してもよい。本発明の他の態様において、ヒドロゲル形成がｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こることを可能にし、そしてヒドロゲルを体内に導入する。
【００９７】
本発明の自己集合ペプチドを用いて、例えば血管形成術などの処置後、傷害部位の血管内皮層の形成を促進させることも可能である。また、これらを、例えば血管移植片またはステントなどのデバイスのためのコーティング材料として用いて、内皮形成を促進することも可能である。別のアプローチにおいて、ＳＡＰは、人工血管などの人工的導管の内表面上に層を形成する。自己集合したペプチドによって形成される層上で、内皮細胞をしばらく培養する。細胞は、ＥＣＭ構成要素を分泌する。次いで、細胞を除去し、細胞によって合成されたＥＣＭ分子を含有する損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）基底膜層を残すことも可能である。
【００９８】
本発明のさらにさらなる側面は、ｐＨ、濃度および温度に感受性がある、分子スイッチまたはデバイスとしてのこうしたペプチドの使用である。
【００９９】
得られた新規ペプチドの自己集合現象を、本明細書に記載する実施例１〜６に例示しそして示す。
【実施例】
【０１００】
実施例１
本発明のペプチドの合成および精製
ＡＡＰＴＥＣペプチド合成装置を用いて、標準的フルオレニルメトキシカルボニル固相技術を用いて、本発明の各ペプチドを、０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。リンクアミド樹脂（０．６ｍｍｏｌ／ｇ置換）を用いて、Ｃ末端アミドを産生し；アミノ酸を、０．４Ｍ  ＨｏＢｔを含む０．４Ｍ  ＮＭＰ中に溶解し；ＤＭＳＯ溶液中の０．４Ｍ  ＨｏＢｔを伴う０．５Ｍビオチンをビオチン化工程に用いた。
【０１０１】
次いで、ペプチドを樹脂から切断し、そして４ｍｌの９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％水および２．５％トリイソプロピルシランで脱保護した。切断したペプチドを沈殿させ、冷たいジエチルエーテルで数回洗浄し、そして２０〜２５％のアセトニトリル溶液中に溶解した後、凍結乾燥して、そして−２０℃で保存した。分析および半調製用Ｃ１８カラムを装備した、バリアン・ギャラクシー（Ｖａｒｉａｎ  Ｇａｌａｘｉｅ）系を用いた逆相ＨＰＬＣによって、未精製ペプチドを分析し、そして精製した。溶出剤は、水中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（緩衝液Ａ）およびアセトニトリル中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（緩衝剤Ｂ）であった。出発条件は、０％緩衝液Ａおよび１００％緩衝液Ｂであり、そして緩衝液Ｂ中の線形増加で勾配を発展させた。４０分間で、勾配は４５％緩衝液Ｂになった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（４８００アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて、ペプチドの分子量を確認した。
【０１０２】
図１の主配列変動の略図
アセチル化ＢＭＨＰ配列（Ａｃ−ＰＦＳＳＴＫＴ−ＣＯＮＨ２）およびＧｌｙ付加型（Ａｃ−ＧＧＧＰＦＳＳＴＫＴ−ＣＯＮＨ）を合成し、そして精製して、蒸留水中およびリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中、マクロスケールで溶解した際、膜または足場の形成における傾向を評価した。
【０１０３】
水溶性ビタミンであるビオチンは、細胞シグナル伝達、遺伝子発現、およびクロマチン構造に関連する、多くの重要な生化学的代謝反応および経路の補因子として作用する（１０）。伸長状態から折りたたまれた状態に渡る、ビオチンの多くのコンホメーション・アンサンブルが溶液中で見出されてきている（１１）。後者の構造は、ウレイド基およびバレリル・カルボン酸側鎖の間の水素結合によって安定化される。配列番号１をビオチンでタグ化し（ペプチドＢ３：Ｂｉｏｔ−ＧＧＧＰＦＳＳＴＫＴ−ＣＯＮＨ２）、粘性でそして不透明な溶液を得て（３％ｗ／ｖ濃度）、中性ｐＨ緩衝液に曝露すると、これは固形足場にシフトした。その結果、発見されたＳＡＰの各残基／特徴の重要性を評価するため、ペプチドＢ３の特定の変動に相当する４８のさらなる新規ペプチド（図１）を合成した。
【０１０４】
詳細には、ビオチンをトリプトファン（ペプチド４、３０、３１）、フェニルアラニン（ペプチド３７、５９、６１）またはチロシン（ペプチド６０）で置換した。他の修飾は、分子主鎖により高い直線性を与えるため、アラニン（ペプチドＢ１５、Ｂ１９、Ｂ２４、３０および３１、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ４０、Ｂ４１、Ｂ４２、Ｂ４４、Ｂ５０、Ｂ５１、Ｂ５２、Ｂ５４、Ｂ５５、Ｂ５７）またはプロピルアミン（ペプチドＢ２８）でのプロリン置換を含む。Ｂ２８（配列番号１４）は、ペプトイド残基、プロピルアミンを有し、これは、プロリン・アミノ酸の代わりに３位のＧおよび４位のＦの間に挿入される：これによって、プロリンの特徴的なα−炭素を含まずに、側鎖に同じ数の炭素原子があることが保証される。側鎖部分で生物活性モチーフによって容易に官能化されうる、最近広く関心を集めているオリゴマー種である、ペプチドおよびペプトイドで作製された新規ハイブリッド配列（１２）を設計することを視野に入れて（ｉｎ  ｏｐｔｉｃ  ｏｆ）、プロピルアミンを試験する選択をした。これらのＳＡＰを官能化するための別のオプションは、ＲＧＤ（１３）またはＩＫＶＡＶのような細胞接着モチーフを、Ｇｌｙスペーサーを介して、Ｃ末端に付加することであった（ペプチドＢ１８、Ｂ１９、Ｂ５２、Ｂ５３、Ｂ５４、５９）。自己集合の際の水素結合形成セリンの重要性を、アラニンでの置換を通じて評価した（ペプチドＢ２４、３０、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ４１、Ｂ４２、Ｂ４４、Ｂ４６、Ｂ５４、Ｂ５５、Ｂ５２、Ｂ５０、Ｂ５１、Ｂ５７）。また、Ｂ４７およびＢ４８において、セリンをシステインで置換した。
【０１０５】
セリン８をグルタミン酸で置換する（Ｂ１７）か、あるいはリジンを反対の電荷の残基で置換する（Ｂ１０およびＢ１２）か、または中性残基で置換する（Ｂ１１、Ｂ１３およびＢ４３）ことによって、中性ｐＨでのペプチド総純電荷を変化させた。また、リジンを正荷電アルギニンで置換した（Ｂ２２）。フェニルアラニンをトリプトファン（Ｂ２７、Ｂ３２）、チロシン（Ｂ３９）またはアラニン（Ｂ４０）で置換した。Ｇスペーサー長（Ｎ末端およびＢＭＨＰ断片の間）は、０（Ｂｉｏｔ−ＰＦＳＳＴＫＴ−ＣＯＮＨ２）から、１（Ｂ２９、Ｂ５０）、３（ペプチドＢ３）および５残基（ペプチドＢ２５およびＢ５１）で多様であった。最初の配列の場合、ナノおよびメソスケール両方では自己集合が検出されなかったが、ペプチドＢ３、Ｂ２５、Ｂ２９、Ｂ５０およびＢ５１ではこれは当てはまらなかった。集合したナノ構造間のノットとして作用する分枝ペプチド（Ｂ５８）を導入して、こうして、他の直線ペプチドのいずれかとともに溶解した際、他のヒドロゲルの生物医学特性を改変した。配列内の異なる位で、リジンをシフトした（Ｂ６４、Ｂ６５、Ｂ６６、Ｂ６７）。
【０１０６】
提唱される修飾のいくつかをともに組み合わせて、あるとすれば相乗効果を評価した。
【０１０７】
実施例２
レオロジー試験
制御ストレスＴＡインスツルメンツ（ＴＡＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）ＡＲ−２０００ｅｘレオメーター（ＴＡインスツルメンツ）を用いて、本発明のペプチドに関してレオロジー特性を決定した。円錐および平面形状（アクリル円錐直径、２０ｍｍ；角度、１°；トランケーション・ギャップ（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｇａｐ）３４μｍ）を用いた。２５℃の一定に監視した温度で、すべての測定値を得た。各試料に関して、予備的歪み（ｓｔｒａｉｎ）掃引を行って、線形粘弾性領域を定義し、係数が歪みから独立であることを確実にした。ＰＢＳ（１ｘ）を添加した後の時間掃引を一定の角周波数（ω＝１Ｈｚ）で記録した。ペプチド水溶液および自己集合足場の両方に関して、１％の制御された歪みで、発振モードにある装置を用いて、周波数掃引を行った。線形内挿によって破裂最終：開始点を計算し、そして次いで、それぞれ線形領域におけるおよび材料破裂時のＧ’モードの交点を決定した。１〜１００Ｈｚ領域、およびｎ＝３の独立の反復実験の間で、Ｇ’値を平均した。自己回復試験中、１Ｈｚ発振周波数で、歪み掃引（０．０１％〜１０００％歪み範囲）を適用することによって、自己集合足場を引き裂いた。歪み掃引工程の前および後に、周波数掃引モード（１％歪み）で、または時間掃引モード（１Ｈｚおよび１％歪み）で、Ｇ’値を記録し、３０分ごとに、または時間掃引試験の場合は、３０秒ごとに、続く観察を行った。１〜１００Ｈｚ範囲で平均した、すべてのペプチドに関する値を図２ｄに報告する。ＳＡＰすべてにおいて、ＰＢＳ添加の前後で測定した貯蔵係数間の相違は、２〜４桁に渡り、足場ゲル化中に劇的な生物力学的変化が起こることが証明された。ペプチドＢ３（１％）は、固形の固い足場（Ｇ’＝２９１７Ｐａ）を生じ、イオン電荷が、正荷電リジン残基によって与えられる静電反発を遮蔽し、そして自発的な継続自己集合プロセスを加速することが可能であるという見解を裏付け、該ペプチドは、第１日で、すでに粘性で（Ｇ’＝６７Ｐａ）そして不透明な溶液を生じる。柔らかい足場を生じる（１００Ｐａ〜１０００Ｐａ範囲）ペプチドには、ペプチド４、Ｂ１９、Ｂ２５、Ｂ２８および３０が含まれた。逆に、固形の固い足場を生じるＳＡＰは、Ｂ１５、Ｂ２２、Ｂ２４、Ｂ２７および３１（５０００Ｐａ〜９０００Ｐａ範囲）である。
【０１０８】
さらに、Ｂ１５の場合、プロリン置換は、固い固形足場（Ｇ’＝８５００Ｐａ）を生じず、一方、Ｂ２４に関しては、セリン７が水素結合形成に役割を果たすため、自己集合において重要であるが、プロリンおよびセリン７を２つのアラニンで同時置換すると、全体の足場剛性がペプチドＢ３より高い値（Ｇ’＝６５０２Ｐａ）になった。他方、ペプトイド残基でのプロリン置換（Ｂ２８）は、集合した足場の剛性を減少させ、そしてゲル化のために最低限必要なペプチド濃度を増加させた（すなわち３％ｗ／ｖ）。
【０１０９】
Ｇ−スペーサー変動は最終足場剛性に影響を及ぼし（Ｂ２５）、一方、これが存在しないと、試験ペプチドがいかなる足場を形成することも妨げられた。
【０１１０】
トリプトファンでビオチンを置換すると（ペプチド４および３０）、Ｇ’が劇的に減少し（それぞれ、Ｂ３およびＢ２４と比較した場合）、そしてｐＨシフトの前のペプチド溶液の粘性増分率が劇的に減少した。ビオチン欠失は、そのかわり、いかなる足場形成も妨げた（ペプチド２）。
【０１１１】
本発明のペプチドのマクロスケール性質決定およびレオロジー
合成ペプチドはすべて、蒸留水および酸（０．１Ｍ  ＨＣｌ）溶液中で、１％  ｗ／ｖ濃度で可溶性である。ペプチドＢ１０、Ｂ１１、Ｂ１２およびＢ１３は、水に溶解すると直ちに自己集合する。
【０１１２】
試験したペプチド溶液の外見は、図２ａ（Ｉ）に示すように、透明な溶液を生じるペプチド（例えば４、Ｂ１５、Ｂ１９、Ｂ２５、Ｂ２８、３０）から、溶解１日〜７日後に不透明になる試料（例えばＢ３、Ｂ１７、Ｂ２２、Ｂ２４、Ｂ２７、３１）に渡った。溶解後の最初の週に渡って、大部分の溶液の粘性が増加したが、水中で１０日経った後、マクロスケールでは認識可能な変化は起こらなかった。ＰＢＳ（１ｘ）に曝露した際、以下のペプチドは、図２ａ（ＩＩ）と類似の固形足場を生じた：Ｂ３、４、Ｂ１５、Ｂ１７、Ｂ１９、Ｂ２２、Ｂ２４、Ｂ２５、Ｂ２７、Ｂ２８、３０、３１、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、３７、Ｂ３９、Ｂ４０、Ｂ４１、Ｂ４２、Ｂ４３、Ｂ４４、Ｂ４５、Ｂ４６、Ｂ４７、Ｂ４８、Ｂ５０、Ｂ５１、Ｂ５２、Ｂ５３、Ｂ５４、Ｂ５７、Ｂ５８、５９、６０、６１、Ｂ６４およびＢ６５（図１中の黒いフォント）。
【０１１３】
円錐および平面レオメーターを用いて、合成ペプチドの機械特性を試験した。最初に、濃度増分に対するペプチド水溶液のＧ’依存性およびその結果の凝集動力学を図２ｂに示すように評価した。明らかに、ペプチドＢ３は、３％濃度に関しては、溶解日（第０日）から始まって、第２日にプラトーに達し、そして２％濃度で溶解すると、第５日になお増加する、異なる平均Ｇ’値（１〜６０Ｈｚ周波数範囲で平均する）を示す。これは、貯蔵係数増分率が、ペプチド濃度とともに増加することを示す。
【０１１４】
それでもなお、観察時間を一定に維持して、３％ｗ／ｖであらかじめ（前日）溶解したペプチド溶液の貯蔵係数を測定した。実験当日にさらに１％ｗ／ｖに希釈した（別に明記しない限り）これらのペプチド溶液、およびＰＢＳを添加した後に形成された足場の測定値を得た。提唱される標準条件が、自己集合の異なる動力学を所持するＳＡＰのこうした異種アンサンブルのいくつかに関して最適でなかった場合（例えば、信頼性を持って使用者が取り扱うには粘性が高すぎる溶液であるか、または足場ゲル化が劣っている場合）、ペプチド濃度を増加させる（Ｂ１９、Ｂ２８、３０および３１）か、またはｐＨを変化させることによって足場形成を誘発するより前に、自発的な自己集合が起こるまでもう少し待ち（４、Ｂ２７および３０）、あるいは粘性が高すぎる溶液を使用者が再現可能に取り扱うことが困難であるため、逆に、濃度を低下させた（Ｂ３、Ｂ２２およびＢ２４）。
【０１１５】
自己集合足場の散在断片の溶液を生じるＢ１０、Ｂ１１、Ｂ１２およびＢ１３に関しては、測定は信頼性がなく、そして報告しなかった。
【０１１６】
アミノ酸配列：Ｂｉｏｔ−ＰＦＳＳＴＫＴ−ＣＯＮＨ２を有する対照ペプチドＢ７は、マクロスケール観察で固形足場を生じず、そして図２ｃ）において、中性ｐＨ緩衝液を添加した後、いかなる安定したＧ’増加も示さず、そして非常に低く、そして線形でないＧ’およびＧ”値によって特徴付けられた。他のペプチドに関しては、安定な線形周波数反応（１〜１００Ｈｚ範囲）が検出され、Ｇ’値（材料の弾力特性に相当する）は、Ｇ”値（材料の粘性特性に相当する）よりはるかに高く：したがって固形構造の典型的な反応に類似していた（図２ｃを参照されたい）。
【０１１７】
実施例３
原子間力顕微鏡検査
本発明の各ペプチドを原子間力顕微鏡によって分析した。画像撮影１日前に、３％ｗ／ｖの濃度でペプチドを蒸留水（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））中に溶解した。画像および測定値を第１日、第３日、第７日などに収集した（最大観察時間は溶解後３０日であった）。画像撮影当日、ペプチド溶液を希釈し（ファイバー密度が高すぎる場合は、１対３またはそれより高い比で）、これらの溶液の２μｌを白雲母（ｍｉｃａ  ｍｕｓｃｏｖｉｔｅ）支持体上に置き、そして室温で２分間維持した。次いで、雲母表面を蒸留水でリンスして、ゆるく結合したペプチドを取り除き、そして溶液を３０分間蒸発させた。単一光線シリコンカンチレバープローブ（ビーコ（Ｖｅｅｃｏ）ＲＴＥＳＰ：共鳴周波数３００ＫＨｚ、名目上の先端曲率半径１０ｎｍ、力定数４０Ｎ／ｍ）を用いて、マルチモード・ナノスコープＩＩＩａ（デジタル・インスツルメンツ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））によって、タッピング（ｔａｐｐｉｎｇ）TMモードでＡＦＭ画像を収集した。必要な場合、画像（１０２４ｘ１０２４解像度）を平坦化に供した。平板状ナノファイバーを検出し、そしてファイバーの高さが１〜１．５ｎｍの間であった場合、すなわち先端半径（１０ｎｍ）よりはるかに小さかった場合、先端コンボリューション効果を以下の式で修正した：
【０１１８】
【数１】
2013525329.tif 000007
【０１１９】
式中、Δｘは、幅広がり効果であり、ｈはナノファイバーの高さであり、そしてｒｔは先端半径である。
【０１２０】
１００を越える測定に関して平均した平均値として、結果を表す。
【０１２１】
本発明のペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像撮影および性質決定
ナノおよびマイクロスケールでの自発的自己集合の詳細な性質決定には、合成されたペプチドすべてのＡＦＭでの画像撮影が必要であった。自己集合ペプチドは、図３に示すような６つのカテゴリーにグループ分け可能な多様な構造を生じさせた。
【０１２２】
自己集合ペプチドＢ６４、Ｂ６５、Ｂ６６およびＢ６７は、溶解１日後以降、ねじれたナノファイバーを形成し（６０ｎｍピッチ、左巻）、そしてまたＰＢＳへの曝露に際して自己集合してヒドロゲルを生じた（図３ａ）。
【０１２３】
プロリン不含ペプチドＢ１５、Ｂ２４、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ４０、Ｂ４１、Ｂ４２、Ｂ５４、Ｂ５８、５９、Ｂ４４および６１は、平板状の長いファイバー（長さ５μｍ〜１０μｍの範囲）を生じた。ナノファイバーの高さは１．６ｎｍおよびその倍数であり、一方、幅は８〜９ｎｍおよびその倍数であり、横方向でともに固定されたファイバーによって生じた（図３ｂ）。平均ファイバー寸法は、試験した時点で有意に変化しなかった（溶解後最長１０日間）。
【０１２４】
ペプチド４、３７および６０の場合、おそらく、Ｂ１５およびＢ２４で画像撮影されたものと類似のコイル化されたより薄い中間フィラメントで作製された、より厚いファイバー（最小幅３０ｎｍ）が画像撮影された。さらに、大部分ねじれたファイバーが存在し（図３ｃを参照されたい）、１００〜１５０ｎｍの範囲の左巻ピッチが示された（最上部から最上部の水平距離として測定）。同じねじれたファイバーの輪郭形状において、高さは２．５ｎｍおよび倍数（傾斜の底部で測定）であり、垂直スパンは５ｎｍ（最上部から底部への垂直距離として登録）であった。特に、第１日、第３日、および第１０日の選択した観察時点で、画像化されたファイバーの密度（すなわち、画像化視野あたりのファイバー数）は、長期に渡って増加し、ペプチド４の粘性増分の以前観察された緩慢な動力学と一致した。
【０１２５】
ペプチドＢ１８、Ｂ１９、Ｂ２５、Ｂ２８、Ｂ２９、３０、３１、Ｂ４５、Ｂ５０、Ｂ５１、Ｂ５２およびＢ５３に関して、類似であるが、異なる特徴を持つファイバーが見られた（図２ｅ）。このセットのペプチドにおいて、ねじれたファイバーの幅は１５ｎｍおよび３０ｎｍであり、一方、高さは６ｎｍ（底部）−１１ｎｍ（最上部）および１２ｎｍ（底部）−１９ｎｍ（最上部）にグループ分けすることが可能であり、最上部および底部のファイバーの間におよそ６ｎｍの垂直スパンを生じた（３０の場合はわずか２ｎｍ）。左巻のねじれたファイバーのピッチは、Ｂ２８を除き（このファイバーピッチは３０ｎｍ〜４０ｎｍの範囲であった）、８０ｎｍ〜１１０ｎｍの間の測定値だった。ペプチドＢ２５の場合、隣り合ってパッキングされたファイバーが時に見られるが、この事実は、水蒸発を通じて調製された試料の副作用に過ぎない可能性があった。溶解後、最初の数日間は、Ｂ１９はまた、平板な中間体ファイバーも形成し、これは最終的に数日後、巻いた状態になる（ｗｒａｐｐｅｄ）。ペプチド３１に関しては、中間体ファイバー（高さ３．６ｎｍ〜４．３ｎｍ；ピッチ：３５ｎｍ）は、次第にともにパッキングされ、類似の最終的なナノファイバーを生じる。
【０１２６】
扱いにくいため、やむをえず、ペプチドＢ１０、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３およびＢ４３を一緒にグループ分けし、これらに関しては、図３ｄに見られうるように、少なくとも、凝集した左巻のねじれたファイバーのいくつかの散在した塊の画像撮影を許した。この場合、中性または負の総純荷電によって生じる即時自己集合は、直ちに、フィラメントをともに束にし、固形足場を作製する能力を低下させた。
【０１２７】
最後の群において、ペプチドＢ３、Ｂ１７、Ｂ２、Ｂ２７、Ｂ３４、Ｂ３９、Ｂ４６、Ｂ４７、Ｂ４８およびＢ５７の中間体左巻ねじれ原線維（図３ｆ（Ｉ）；幅８．５ｎｍおよび倍数；高さ２〜２．８ｎｍ；Ｂ３およびＢ２２に関しては、２８〜３０ｎｍピッチ、Ｂ１７およびＢ２７に関しては９０〜１１０ｎｍ）は横に並び、そして左および右両方のターンによって特徴付けられる、より大きなリボン様の長い構造に階層的に自己編成し（非常に可変性のピッチおよび１２μｍより長い構造を特徴とする）（図３ｆ（ＩＩ））、この構造は、らせん状にコイルを巻いて、まっすぐな管状構造を（図３ｆ（ＩＩＩ））、そして最終的に二層または多層の平らなシートを形成し（図３ｆ（ＩＶ））、それぞれ、３〜３．６ｎｍ（３ｆ（ＩＩＩ））および６．４または１４ｎｍ（３ｆ（ＩＶ））もの高さの構造を形成した。特に最後の群において、階層的自己集合の動力学は、溶解後、最長１０日間まで明らかに検出可能であり（より小さい原線維の後に、より大きなリボン、管状構造および平らなシートが続いた）：その後、数平方ミクロンと同程度に大きい、成長しつつある微小構造が、試料調製によって影響を受け、したがってここでは論じない。
【０１２８】
ＳＡＰのこの最後の群のメンバーに関しては、すべて、ビオチン、グリシンのトリプレット、Ｂ５７ペプチドを除いてプロリン５、６位の芳香族残基、セリン７またはセリン８（Ｂ５７を除く）および１０位の正荷電残基（またはＢ５７に関しては８位）が存在することが共通である。したがって、一般的に、以下の一般配列、ｂｉｏ−ＧＧＧ−ＰＸ1ＳＸｘＸｘＸ3Ｘｘ（式中、Ｘ1＝芳香族残基；  Ｘｘ＝水素結合形成残基；  Ｘ3＝正荷電残基）は、実際に、多数レベルの配置で、階層的に自己集合可能である。このタイプの自己集合が行われる、より一般的な仕様を明らかにするには、類似の残基での他の置換が必要であろう。
【０１２９】
二ペプチドＰｈｅ−Ｐｈｅは、管状構造を形成し、これは構造形成のための芳香族相互作用の重要性（１４）を直接示し、そして自己集合超構造において、テトラペプチドのプロリンおよびフェニルアラニン残基の相対的な位置に対する依存は、ファイバー形成におけるピロリジン−芳香族およびπ−π相互作用の非常に重要な役割を示唆する。
【０１３０】
実施例４
Ｘ線回折分析（ＸＲＤ）
本発明の各ペプチドをＸ線回折で分析した。
【０１３１】
多波長異常回折および単色巨大分子結晶学ビームライン８．３．１で、ローレンス・バークレー国立研究所（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のアドバンスト・ライト・ソース（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ）で、Ｘ線回折データを収集した。ビームライン８．３．１は、２．４〜１８ｋｅＶのエネルギー範囲の５テスラの単極超屈曲（ｓｕｐｅｒｂｅｎｄ）供給源を有する。１．１１５９Åの波長で、３ｘ３ＣＣＤアレイ（ＡＤＳＣ  Ｑ３１５ｒ）検出装置を用いて、データを収集した。前日に３％ｗ／ｖ濃度で溶解したＳＡＰのバルク試料に対して、２００ｍｍ距離、４０ｓ曝露時間、および１°振動でデータセットを収集した。部分的に可溶性であるペプチドの場合、より高い濃度を採用し、そして不溶性試料を廃棄した。ペプチドファイバー含有溶液を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、生じた濃縮溶液を０．２〜０．３ｍｍ直径のナイロンループ上に滴下した。ベヘン酸銀（ＡｇＢＥ）標準を用いて、イゴールプロ（Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏ）６．０において、データをプロセシングした。
【０１３２】
円二色性（ＣＤ）分析
本発明の各ペプチドの遠紫外ＣＤスペクトルを、アビブ（Ａｖｉｖ）６２ＤＳ分光計上、室温で、１９０ｎｍ〜２６０ｎｍの間で記録する。蒸留水中、１ｍｍ水晶キュベット中で、すべての測定を行った。スペクトルは、３回のスキャンの集積由来である。試料を含まない緩衝液のブランクスペクトルを減じる。０．０２％、０．０４％および０．０６％  ｗ／ｖ濃度のペプチド試料のＣＤスペクトルを、水中に溶解した１日後に収集する。スペクトルを２ｎｍ段階で記録し、４秒にわたって平均し、そしてデルタ・イプシロン単位に標準化する。既知のタンパク質の３３のベース・スペクトルを用いて、ＣＤスペクトル・デコンボリューション・ソフトウェア２．１を用いることによって、タンパク質構造をデコンボリューションした。
【０１３３】
本発明のペプチドのＸ線回折（ＸＲＤ）データおよびＣＤ性質決定
ＸＲＤ研究のため、以下のペプチドを試験した：Ｂ３、４、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ１５、およびＢ１９、Ｂ２５、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ４７、Ｂ４８、Ｂ５３。３％濃度での実験の前日に溶解した試料の測定を行った。試験したペプチドの大部分は、等方性リングを生じ、最大強度はおよそ４．７Å距離であり、これは通常、β鎖間の水素結合スペーシングに起因し、典型的には、並置されていないβシート形成ファイバーのものである（図４ａを参照されたい）。別の明らかに可視であるリングは、３〜１．７ｎｍ距離間隔で見られた。さらに、パターンの動径積分によって、典型的にはパッキングされたペプチド側鎖のファンデルワールス距離にあたる３．７〜３．８Å、および４．７Åピークの二次と見なされる２．３〜２．４Åの、すべてのペプチドに共有される他の回折ピークが明らかになった（図４ｂ）。にもかかわらず、これらの最大値は、４．７Åピークに比較すると、はるかにより弱い強度のシグナルを生じた。
【０１３４】
特に、Ｂ３、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ３４、Ｂ４７、Ｂ５３ペプチドは、２．１ｎｍに中程度の強度ピークを示し（図５ａの矢印）、一方、ペプチドＢ１９および４は、それぞれ、２．８６ｎｍおよび２．３５ｎｍでピークを生じた。Ｂ１５、Ｂ３３、Ｂ４８において、最大値は１．７３ｎｍで検出された。Ｂ２５では１．９６ｎｍにピークを有した。ありうる原線維が、単純に検出されていないＢ１９、ならびに信頼性があるＡＦＭ測定が得られないＢ１２およびＢ１３以外、１．５ｎｍより大きな距離でのピークは、ＡＦＭを介して測定したナノファイバーの高さと一致した。異なる高さは、異なる分子配置と似て、ねじれたまたは平板状のファイバーを生じ、あるいはより高レベルの自己編成では、リボン様の管状構造を生じた。最後に、Ｂ３におけるような５．２Åのピーク、あるいは一般的にＢ１２、Ｂ１３、Ｂ１５、Ｂ１９、Ｂ２５、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ４７、Ｂ４８およびＢ５３に関する５Å〜８Åの間のピークは、分子間芳香族相互作用と解釈可能であり：この相互作用は、ペプチド４において、トリプトファンでビオチンを置換した場合には見られない。円二色性（ＣＤ）分光測定研究を行って、以下の自己集合ペプチドによって自発的に形成される二次構造を評価した：Ｂ３、４、Ｂ１５、Ｂ１７、Ｂ１９、Ｂ２２、Ｂ２４、Ｂ２５  Ｂ２７、Ｂ２８、３１、３０、Ｂ３３。純水に溶解した、試験したペプチドはすべて、ひとたびデコンボリューションすると、５０％より多いβ構造の存在を生じるスペクトル（ペプチドＢ２４に関して図４ｂに示すものに類似）を示し、したがって、距離が４．７Åとする先の解釈が支持された。
【０１３５】
実施例５
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験：神経幹細胞植え付けおよび画像撮影
先に記載されるように、神経前駆体培養を確立し、そして拡大する（１５、１６）。中枢神経系から、特に受胎１０．５週のヒト脳の間脳および大脳皮質から、ヒト神経幹細胞（ＮＳＣ）を単離した。初代組織を得る様式は、欧州移植ネットワーク（ＮＥＣＴＡＲ）のガイドラインにしたがう。
【０１３６】
先に採用された方法論（５）にしたがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を行った。簡潔には、９６マルチウェル内で、先に集合させた、各集合足場の表面上に、細胞（６ｘ１０4細胞／ｃｍ2の濃度）を植え付けた。まず、神経子孫分化を増進するために添加するβＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した基本培地で細胞を培養した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで３日後（ＤＩＶ）、βＦＧＦ培地を白血病阻害因子（ＬＩＦ、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））（２０ｎｇ／ｍｌ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））（２０ｎｇ／ｍｌ）と交換した。新鮮な培地を３日ごとに添加した。陽性および陰性対照は、それぞれ、カルトレックス（Ｃｕｌｔｒｅｘ）−ＢＭＥ（登録商標）基質（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））（基本培地中１：１００希釈）および未処置底部ウェル表面からなった。
【０１３７】
ＰＢＳ中の２．０μＭカルセインＡＭおよび４．０μＭエチジウムホモ二量体を含有する染色溶液と、１０日間培養した細胞を、３７℃で６０分間インキュベーションし、そして倒立蛍光顕微鏡（ツァイス（Ｚｅｉｓｓ））によって視覚化することによって、生存／死亡細胞画像撮影（モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））を得た。
【０１３８】
セルタイター（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ）９６（登録商標）水性増殖アッセイ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン）を通じて、プロメガ・プロトコルにおいて推奨されるように、７ＤＩＶで細胞生存度を定量化した。細胞数および吸光度値の間の線形反応を較正した後、４９０ｎｍ波長で、Ｖｍａｘマイクロプレート読み取り装置（モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、カリフォルニア州サニーベール）を用いることによって、増殖した細胞集団を定量化した（ｎ＝６）。平均±平均の標準誤差として報告した値を、細胞を含まずに、同じ基質および細胞培地からなる、それぞれの対照に対してブランク処理した（ｂｌａｎｋｅｄ）。
【０１３９】
分化した表現型を評価するため、細胞を１４ＤＩＶに、βＩＩＩチューブリン（コバンス（Ｃｏｖａｎｃｅ）、１：７５０）、ＧＦＡＰ（ケミコン、１：３０００）、ＭＡＰ２（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、１：２００）、ＧａｌＣ（ケミコン、１：２００）およびＯ4（ケミコン、１：２００）に関して染色し、続いて、Ｃｙ３（ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、１：１０００）およびアレクサ（Ａｌｅｘａ）４８８（モレキュラー・プローブ、１：１０００）二次抗体でマークした。詳細には、細胞をパラホルムアルデヒド４％で１５分間固定し、ＰＢＳ／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１０分間透過処理し、そしてＰＢＳ／２０％正常ヤギ血清で１時間ブロッキングした。試料をＰＢＳ／一次抗体の１０％正常ヤギ血清溶液で一晩インキュベーションし、そして＋４℃で一晩インキュベーションした。ＰＢＳで数回洗浄した後、ＰＢＳ／１０％正常ヤギ血清で希釈した二次抗体を１時間適用した。細胞核をＤＡＰＩで対比染色し、試料をフルオロセーブ（ＦｌｕｏｒＳａｖｅ）試薬（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））でマウントし、そして試料を視覚化し、そして蛍光顕微鏡で分析した。４回の独立の実験において、陽性細胞を計数することによって、βＩＩＩチューブリン+、ＧＦＡＰ+、ＧａｌＣ+／Ｏ4+およびＭＡＰ２+細胞を定量化した。
【０１４０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養のための足場
細胞培養のための、そしてより一般的には、再生医学のための、提唱されるＳＡＰの潜在能力を評価するため、ＲＡＤＡ１６−Ｉ様ペプチドに関してすでに開発されている、二次元細胞培養プロトコルを適応させた（５）。簡潔には、プレーティングの１日前に、機械的に解離させたヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ）をＢ３、４、Ｂ１５、Ｂ１７、Ｂ１９、Ｂ２２、Ｂ２４、Ｂ２５、Ｂ２７、Ｂ２８、３０、３１の自己集合足場上に、そして非コーティング組織培養プラスチックウェル上に（陰性対照）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで植え付け、そして１週間培養した。位相差画像撮影によって、増殖した細胞クラスター（Ｂ１７、Ｂ２２およびＢ２８の場合）から、分枝細胞（Ｂ３、Ｂ１５および３１）、接着および分化しているｈＮＳＣ（Ｂ２４）に渡る、多様なペプチド上での培養ｈＮＳＣの異質の度合いの展開が明らかになった（図５ａを参照されたい）。
【０１４１】
カルセイン−ＡＭ標識された生存細胞およびエチジウムホモ二量体標識された死亡細胞の画像撮影は、プラスチックの場合、丸い形状のクラスターを形成する高生存細胞（図５ｂ）を示し、ほとんど分枝しない凝集体に積み上がる（ｃｌａｍｐｅｄ）（Ｂ２２）か、またはゲル上部表面全体に分布した（Ｂ２４）。死亡細胞（赤い点）はごくわずかな割合であり、これらの材料のありうる細胞傷害効果の反証となるようである。
【０１４２】
図５ｃに要約するセルタイター・アッセイ結果は、陰性対照に比較して、大部分の基質がｈＮＳＣ生存度を改善することを示した。特にＢ２４は、７ＤＩＶで生存ＮＳＣの最高値を示す一方、１４ＤＩＶでのβＩＩＩチューブリン+、ＭＡＰ２+、ＧａｌＣ+／Ｏ４+およびＧＦＡＰ+細胞の割合（図５ｄ）は、動物抽出物で得られた標準的ｈＮＳＣ分化データと匹敵した（５）。
【０１４３】
大部分の自己集合足場において、ｈＮＳＣ増殖および分化を刺激することがすでに証明されている元来のＢＭＨＰ配列（５）は、ここでは細胞膜受容体結合に関して、必須の残基において完全には曝露されないかまたは修飾されているようであり（Ｂ１７、Ｂ２２、Ｂ２５、Ｂ２７、３０）：特にＢ３、Ｂ１７、Ｂ２２およびＢ２７では、階層的凝集が、ＰＦＳＳＴＫＴ様モチーフを複雑な構造内に「埋没」させ、全活性配列の正しい曝露を損なう可能性がある。これは、βシート・ナノファイバーがおそらく、官能モチーフのより優れた溶媒曝露を可能にする、Ｂ２４およびＢ１５には当てはまらない。
【０１４４】
ビオチン不含ペプチド４および３１は、ビオチン化ペプチドに匹敵する結果を生じた。
【０１４５】
Ｂ１９において採用されるＲＧＤモチーフの付加は、概念実証と見なすことも可能であり、陰性対照とは有意に異なる結果を生じ（Ｐ＜０．００２：両側ｔ検定）、特定のセットの選択した残基を用いて、ペプチド自己集合を妨げることなく、これらのＳＡＰを有効に官能化可能でありうる。
【０１４６】
Ｂ２８は、部分的に非天然の配列であるにも関わらず、他のペプチドのものと匹敵する細胞集団を達成した。
【０１４７】
Ｂ２４は、中枢神経系の３つの主な細胞表現型である、ニューロン（βＩＩＩチューブリンおよびＭＡＰ２マーカー）、星状細胞（ＧＦＡＰマーカー）およびオリゴデンドロサイト（ＧａｌＣ／Ｏ4マーカー）に向かうｈＮＳＣ分化を支持した。
【０１４８】
総合すると、これらの結果は、これらのＳＡＰが、ｈＮＳＣ生存、展開および分化を育成することが可能であることを立証し：この性質は、２Ｄおよび３Ｄ細胞培養ならびに再生医学のためのツールとしてのこれらの潜在能力を増加させる。
【０１４９】
実施例６
自己回復材料
興味深いことに、自己集合ペプチドの大部分はまた、その自己回復傾向、すなわち予歪（ｐｒｅ−ｓｔｒａｉｎｅｄ）集合ゲルのものと類似の粘弾特性を持つ完全に形成されたヒドロゲルにスイッチバックする能力に関しても検証された。円錐および平面レオメーターにおいて、ＰＢＳ（１ｘ）の添加を通じて、固形足場を得た；本発明者らは、貯蔵係数を測定し、破裂が生じるまで、そして破裂したはるかに後まで、試料を歪み掃引（０．０１％〜１０００％）に供した（すなわちＧ’値の突然の低下を監視した）。次いで、試料をそのまま残し（これらをＰＢＳで水和したまま）、そして０．１Ｈｚ〜６０Ｈｚの範囲で周波数掃引試験を通じて、３０分ごとにＧ’値を測定した。陰性対照として、よく知られたＳＡＰであるＫＬＤ−１２を試験した（４、６）。ペプチドＢ１７（１％  ｗ／ｖ濃度）に関しては、図６ａに見られうるように、破裂の１２０分後の最初のＧ’値の完全な回復まで、次第に増加することが検出され、一方、ＫＬＤ−１２の場合、貯蔵係数値は、破壊直後に登録されたものと類似であった（図６ｃ）。図６ｂにおいて、時間掃引モードで、３０秒ごとに１Ｈｚおよび１％歪みで、自己回復に関してペプチドＢ２５（３％ｗ／ｖ濃度）を評価した。Ｇ’の値は１００分後に回復し（１０００Ｐａ）、そして長期に渡って安定してプラトーであった。ペプチドＢ３、Ｂ２２、Ｂ２５およびＢ２７に関しては、６０’から２４０’の範囲で、破裂後、異なる時間間隔で、完全な回復が得られた。多数の独立の実験によって、異なる時間範囲ではあるが、Ｂ１９およびＢ２８を除くすべての自己集合ペプチドに関して、類似の結果が確認された。
【０１５０】
さらに、透明なキュベット（図２ａに見られるようなもの）においてあらかじめ自己集合させた足場をピペットチップによって攪拌し、そして続いてボルテックスすることによって、多数のおよび連続した機械的破壊を得た。傾けることによって、破裂に関して試料をチェックした。最大４時間の後、試料はすべて固形化ゲル外見に戻った。この回復は、随意、反復可能であった。
【０１５１】
自己回復現象は、おそらく高レベル凝集構造（シートおよびリボン様構造）のメソスケールでの再編成であることに言及しなければならない：ＡＦＭでの高倍率画像化で見られる、より小さい原線維状構造は、これらの試験において保存される。上に言及したペプチドから生じる足場は、階層的自己凝集のより高いレベルで、集合したナノ構造間で、すなわちまっすぐな管状ファイバーおよびシートの間で形成される一過性物理的架橋によって形成されるようである。
【０１５２】
実施例７
組織エンジニアリング適用のための足場
本発明記載のＳＡＰをｉｎ  ｖｉｖｏで用いた際、該ＳＡＰが何らかの毒性を示すかどうか試験するため、本発明者らは、ラットの脊髄内へのＢ２４の多数回注射に対する組織反応を評価した。ＥＣガイドライン（ＥＣ理事会指示８６／６０９、１９８７）、イタリア動物実験規制（Ｄｅｃｒｅｔｏ  Ｌ．  ｖｏ  １１６／９２）、およびミラノ−ビコッカ大学の動物飼育および使用委員会によって認可されたプロトコル（ＩＡＣＵＣ  ３７／０７）にしたがって、動物が関与するすべての方法を行った。
【０１５３】
２００〜２５０グラムの雌スプレーグ・ドーリーラット（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を２つの群に分けた：１）生理食塩水溶液の注射を投与される動物（対照群、ｎ＝３）および２）Ｂ２４で治療した動物（ｎ＝３）。長期観察（1ヶ月）の場合、Ｂ２４の同様の注射を用いた（ｎ＝２）。ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｍｇ）の腹腔内注射でラットを麻酔した。Ｔ９−Ｔ１０レベルで脊髄を曝露し、そして椎弓切除後、マイクロマニピュレーターを通じて保持されたハミルトンシリンジを用いて、Ｂ２４（１％水溶液）または生理食塩水溶液を動物に注射した。５００μｍの距離で溶液を送達し、そして総用量３μｌに関して、各０．５μｌの２回の注射を各間隔で行った。注射後、筋肉を縫合し、そして皮膚を創傷クリップで閉鎖した。鎮痛剤（カプロフェン、５ｍｇ／ｋｇ）および抗生物質（エンロフロキサシン、５ｍｇ／ｋｇ）でラットを毎日治療した。手術３日後（毒性試験）または手術１ヶ月後（神経再生試験）、４％パラホルムアルデヒドの経心腔灌流によって動物を屠殺した。脊髄を除去し、ＯＣＴ中に包埋し、凍結し、そして１６μｍ厚の長軸方向切片にスライスした。免疫蛍光分析のため、切片を透過処理し、そしてＰＢＳ／０．３％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）で、室温で１時間ブロッキングした。次いで、ＰＢＳ／０．３％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１％ＮＧＳ中で希釈した以下の一次抗体と切片を１６時間インキュベーションした：抗ＣＤ６８（１：５００、セロテック（Ｓｅｃｏｔｅｃ））、抗βＩＩＩチューブリン（１：４００、コバンス）、抗増殖関連タンパク質４３（ＧＡＰ−４３）（１：２００、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））および抗ＳＭＩ３２（１：１０００、コバンス）。ＰＢＳ／０．３％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１％ＮＧＳ中で希釈したヤギ抗マウス・アレクサ４８８（モレキュラー・プローブ；１：１０００）および抗ウサギＣｙ３（ジャクソン、１：１０００）二次抗体を用いて、切片を１時間インキュベーションすることによって、シグナルを検出した。細胞核をＤＡＰＩ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））で対比染色し、そして切片をフルオロセーブ（カルビオケム）でマウントした。短期組織化学分析のため、切片をヘマトキシリン／エオジンで染色した。ｉｎ  ｓｉｔｕ細胞死検出キット（ロシュ）を、製造者の指示にしたがって用いて、タネル・アッセイを行った。ツァイス・アポトーム・オブザーバー（Ａｐｏｔｏｍｅ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ）Ｚ．１で画像を撮影した。
【０１５４】
各染色に関して、各動物あたり、注入部位の６枚の連続切片に対して分析を行った。
【０１５５】
驚くべきことに、Ｂ２４は、対照群で見られる、マイクロインジェクション後の肝細胞腫生理学的形成を防止した（それぞれ、図７Ｆ、Ｇおよび７Ａ、Ｂ）。注射３日後、Ｂ２４注射動物の脊髄組織は、生理食塩水注射動物（ぞれぞれ図７Ｃ、Ｄ）に比較した際、注射領域中および領域周囲に、ごくわずかな数の浸潤マクロファージおよびアポトーシス細胞を示した（それぞれ図７Ｈ、Ｉ）。神経フィラメントＨ脱リン酸化神経線維は、生理食塩水注射およびＢ２４治療動物に等しく存在した（図７Ｅ、Ｊ）。要約すると、Ｂ２４は、生理食塩水注射動物に比較して、実験手術による肝細胞腫形成を防止し、有意なマクロファージ浸潤またはアポトーシス細胞死のいずれも増進させず、そして神経線維変性を悪化させなかった。
【０１５６】
注射１ヶ月後、Ｂ２４で作製された足場は、脊髄において、いかなる慢性炎症も発揮しなかった：それとは逆に、βＩＩＩチューブリンおよびＧＡＰ−４３ニューロンマーカーに陽性である再生神経線維（図８ａ）によって広く侵襲されている。特に、新規に形成された軸索束が、移植された足場の内部に浸潤した（図８ｂ）。
【０１５７】
総合すると、これらの結果は、試験したペプチドの認識されうるｉｎ  ｖｉｖｏ生体適合性を、および神経再生適用のための足場としての潜在能力を明示する。
【０１５８】
本発明にしたがった、そして実施例１〜７にしたがって作製された、新規自己集合ペプチドは、平板状ナノファイバーを形成し、これは驚くべきことに、穏やかな条件において、幅が数ミクロンの複雑な織り合わせ膜に自己集合する。興味深いことに、こうした新規ペプチドはまた、自己回復特性を有し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養および組織再生、薬物送達、止血化合物、および他の非医学適用、例えば分子スイッチおよびｐＨ感受性デバイスのための足場などの異なる適用に使用可能である。
【０１５９】
上記説明および上記実施例から、本発明にしたがって記載され、そして得られる産物によって達成される利点が明らかである。
【０１６０】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
2013525329.tif 000015
【図３ｃ】
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【図３ｄ】
2013525329.tif 000017
【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図７ｇ】
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【図７ｈ】
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【図７ｉ】
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【図７ｊ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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