(57)【要約】本発明は、転写因子デコイの複合体、それらの細菌への送達、およびそれらの製剤に関する。具体的には、本発明は、核酸配列と、第四級アミン化合物から選択される１つ以上の送達部分と、アミノアルカンのアミノ成分が複素環式環のアミノ基形成部である、ビスアミノアルカンおよびその不飽和誘導体と、抗菌性ペプチドと、を含む、抗菌性複合体に属する。【選択図】図１０
2013519662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列および少なくとも１つの送達部分を含む抗菌性複合体であって、前記送達部分は、第四級アミン化合物；ビス−アミノアルカンおよびその不飽和誘導体であって、前記アミノアルカンのアミノ成分が、複素環式環のアミノ基形成部である、ビス−アミノアルカンおよびその不飽和誘導体；ならびに抗菌性ペプチドから選択される、抗菌性複合体。
【請求項２】
前記送達部分は、キノリンまたはアクリジンの第四級誘導体および抗菌性ペプチドから選択される、請求項１に記載の抗菌性複合体。
【請求項３】
前記送達部分は、ビス−キノリニウムである、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記送達部分は、デカリニウムまたはその類似体である、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
前記デカリニウム類似体のアルキル鎖は、８個〜１４個のメチル基を有する、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
前記アルキル鎖は、１０個または１２個のメチル基を有する、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
前記第四級アミン化合物は、１０，１０´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジクロライドである、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
前記第四級アミン化合物は、１０，１０´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジクロライドである、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
前記第四級アミン化合物ならびにビスアミノアルカンおよびその不飽和誘導体は、式（Ｉ）の化合物から選択され、
【化１】
2013519662.tif 000020
式中、Ｑは、
（ａ）以下の式を有する、Ｑ１基、
【化２】
2013519662.tif 000021
（ｂ）Ｑ２、Ｑ２−ＮＨ−、Ｑ２−Ｏ−、またはＱ２−Ｓ−基から選択され、式中、Ｑ２は、５個〜１４個の環員の単環式、二環式、および三環式複素芳香族基から選択され、そのうちの１個、２個、または３個は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子環員であるが、少なくとも１個の窒素環員が存在することを条件とし、前記複素芳香族基は、１個または２個の置換基Ｒ４ａによって随意に置換され、前記１個の窒素環員は、Ｎ−オキシドを形成してもよく、またはＣ１−４アルキル、フェニル−Ｃ１−４アルキル、またはジ−フェニル−Ｃ１−４アルキルで置換されて第四級基を形成してもよく、前記フェニル部分は、いずれの場合においても、１個または２個のハロゲン、メチル、またはメトキシ基で随意に置換され、
ｍは、０または１であり、
ｎは、０または１であり、
ｐおよびｑは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、１〜１２の整数であり、
Ａは、結合であるか、またはナフタレン、ビフェニル、テルフェニル、フェナントレン、フルオレン、スチルベン、Ｃ６Ｈ４（ＣＨ２）ｒＣ６Ｈ４基、Ｃ６Ｈ４−Ｃ≡Ｃ−Ｃ６Ｈ４基、ピリジン−２，６−ジイル−ビス（ベンゼン−１，４−ジイル）基、ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｓ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｔ−基、およびＣ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｕ−（Ｃ≡Ｃ）ｖ−基から選択され、式中、ｒは、０〜４であり、ｓは、０〜４であり、ｔは、０または１であり、ｕは、０〜４であり、ｖは、０または１であり、
ｎが１である時、Ｒ０、Ｒ１、およびＲ２は、それぞれＣ１−４アルキルから選択され、ｎが０である時、Ｎ、Ｒ１、およびＲ２は、共に５個〜１４個の環員の単環式、二環式、または三環式複素芳香族基を形成し、そのうちの１個は、窒素原子Ｎであり、０、１、または２個はさらに、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子環員であり、前記複素芳香族基は、１個または２個の置換基Ｒ４ｂによって随意に置換され、Ｒ３は、水素、Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、それぞれが１個または２個の置換基Ｒ４ｃによって随意に置換された３個〜７個の環員の単環式炭素環式基、Ｑ基、−ＮＨ−Ｑ２基、−Ｏ−Ｑ２基、および−Ｓ−Ｑ２基から選択され、
Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、およびＲ４ｃは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシル基；ニトロ；アミノ；モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ；ハロゲン；フェニル部分が１個もしくは２個のメトキシ、メチル、またはハロゲン置換基で随意に置換された、フェニル−Ｃ１−２アルキル；ウレイド；およびグアニジニルから選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項１０】
前記式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）によって表され、
【化３】
2013519662.tif 000022
式中、Ｒ１、Ｒ２、ｍ、ｐ、Ａ、ｑ、およびＲ３は、請求項９に記載の通りである、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
Ｒ３は、Ｑ１であり、ｎは、いずれの場合でも０であり、前記式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩ）によって表される、請求項１０に記載の複合体。
【化４】
2013519662.tif 000023
【請求項１２】
前記式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＶ）によって表され、
【化５】
2013519662.tif 000024
式中、
ｐおよびｑは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、１〜１２の整数であり、
Ａは、結合であるか、またはナフタレン、ビフェニル、テルフェニル、フェナントレン、フルオレン、スチルベン、Ｃ６Ｈ４（ＣＨ２）ｒＣ６Ｈ４基、Ｃ６Ｈ４−Ｃ≡Ｃ−Ｃ６Ｈ４基、ピリジン−２，６−ジイル−ビス（ベンゼン−１，４−ジイル）基、ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｓ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｔ−基、およびＣ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｕ−（Ｃ≡Ｃ）ｖ−基から選択され、式中、ｒは、０〜４であり、ｓは、０〜４であり、ｔは、０または１であり、ｕは、０〜４であり、ｖは、０または１であり、
Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、同一であるかまたは異なり、それぞれ、水素；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル、１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシ；ニトロ；アミノ；モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ；ハロゲン；フェニル部分が１個もしくは２個のメトキシ、メチル、またはハロゲン置換基で随意に置換された、フェニル−Ｃ１−２アルキル；ウレイド；およびグアニジニルから選択されるか、あるいはＲ９およびＲ１０が共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成し、Ｒ８ａ、Ｒ９ａ、およびＲ１０ａは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、水素；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシ；ニトロ；アミノ；モノおよびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ；ハロゲン；フェニル部分が１個もしくは２個のメトキシ、メチル、またはハロゲン置換基で随意に置換された、フェニル−Ｃ１−２アルキル；ウレイド；およびグアニジニルから選択されるか、あるいはＲ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成する、請求項９に記載の複合体。
【請求項１３】
前記式（ＩＶ）の化合物は、式（Ｖ）によって表され、
【化６】
2013519662.tif 000025
式中、
ｒは、２〜２４の整数であり、
Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、同一であるかまたは異なり、それぞれ、水素；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシ；ニトロ；アミノ；モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ；ハロゲン；フェニル部分が１個もしくは２個のメトキシ、メチル、またはハロゲン置換基で随意に置換された、フェニル−Ｃ１−２アルキル；ウレイド；およびグアニジニルから選択されるか、あるいはＲ９およびＲ１０が共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成し、Ｒ８ａ、Ｒ９ａ、およびＲ１０ａは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、水素；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシ；ニトロ；アミノ；モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ；ハロゲン；フェニル部分が１個もしくは２個のメトキシ、メチル、またはハロゲン置換基で随意に置換された、フェニル−Ｃ１−２アルキル；ウレイド；およびグアニジニルから選択されるか、あるいはＲ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成するが、
（ｉ）Ｒ１０およびＲ１０ａがどちらもハロゲンであるか、またはどちらもメチルであり、かつＲ９およびＲ９ａがどちらも水素である時に、Ｒ８およびＲ８ａのうちの少なくとも１つが水素、アミノ、またはジメチルアミノ以外であることと、
（ｉｉ）Ｒ９およびＲ１０が共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、４である）を形成し、かつＲ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、４である）を形成する時に、Ｒ８およびＲ８ａのうちの少なくとも１つがアミノ以外であることと、を条件とする、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
前記抗菌性ペプチドは、天然ペプチドである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１５】
前記抗菌性ペプチドは、天然ペプチドのペプチド模倣物または合成変異体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１６】
前記抗菌性ペプチドは、細菌細胞膜を透過性化する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１７】
前記抗菌性ペプチドは、デフェンシン、プロイロシジン（ｐｌｅｕｒｉｃｉｄｉｎｓ）、マガイニン、デルマセプチン、アピデシン、セクロピン、ミクロシン、およびペジオシンを含む群から選択される、請求項１５に記載の複合体。
【請求項１８】
前記抗菌性ペプチドは、グラミシジンおよびポリミキシンを含む群から選択される、請求項１７に記載の複合体。
【請求項１９】
前記抗菌性ペプチドは、細胞内標的を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２０】
前記複合体は、リンカーをさらに含む、請求項１９に記載の複合体。
【請求項２１】
前記リンカーは、カルボキシル基と第一級アミンとの架橋剤である、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２２】
前記リンカーは、ＥＤＣである、請求項２１または請求項２２に記載の複合体。
【請求項２３】
前記抗菌性ペプチドは、抗生物質、グリコペプチド抗生物質、ポリリシン等のカチオン性ポリペプチド、およびポリアルギニンを含む群から選択される、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２４】
前記抗菌性ペプチドは、ブフォリンまたはその誘導体である、請求項２３に記載の複合体。
【請求項２５】
前記核酸配列は、転写因子のための天然の細胞結合部位の配列を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２６】
前記天然の細胞結合部位は、細菌Ｓｉｇ結合部位の配列を含む、請求項２５に記載の複合体。
【請求項２７】
前記核酸配列は、配列番号９、１０、３０および３１、３９、４０または４１に示される配列を有する、請求項２６に記載の複合体。
【請求項２８】
前記天然の細胞結合部位は、細菌Ｆｕｒ結合部位の配列を含む、請求項２５に記載の複合体。
【請求項２９】
前記核酸配列は、配列番号１１、１２、または１３に示される配列を有する、請求項２８に記載の複合体。
【請求項３０】
ａ）転写因子のための天然の細胞結合部位の配列を含む、核酸配列と、
ｂ）１０，１０´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジクロライドと、
随意に、ｃ）抗菌性ペプチドと、を含む、抗菌性複合体。
【請求項３１】
前記核酸配列は、配列番号３０および３１に示される配列を有する、請求項３０に記載の複合体。
【請求項３２】
細菌感染の治療のための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の複合体の使用。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の複合体と、生理学的に許容される担体または賦形剤と、を含む、薬学的組成物または薬剤。
【請求項３４】
細菌感染の治療で使用するための、請求項３３に記載の薬学的組成物または薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列の複合体に関する。具体的には、本発明は、転写因子デコイの複合体、それらの細菌への送達、およびそれらの製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌増殖および毒性の制御は、特に医学的および獣医学的用途において、深刻化する問題をもたらし、公衆衛生にとって大きな課題になり得る。病原菌に対して使用するための抗生物質は、当技術分野でよく知られている。しかしながら、そのような抗生物質の広範な使用は、少なくとも１種の、場合によっては複数種の抗生物質に対する耐性を有する細菌（いわゆる、多剤耐性株）の出現を助長した。発見され、開発中である従来の抗生物質の数の減少によって、状況は悪化している。実際に、抗生物質耐性は、抗菌研究にとって大きな課題であり、販売中ならびに現在開発中の抗生物質の効力に対する脅威である。結果的に、細菌の拡散および感染に対処するために使用することができる、新しい抗菌剤に対する必要性がある。
【０００３】
ＤＮＡに基づく治療は、抗生物質耐性機構をコード化する遺伝子の発現を防止することによって、または必須もしくは適応遺伝子もしくはオペロンの発現を修飾することによって、または同様に毒性または病原性の発生を防止することによって成長を阻止することにより、可能性としてあらゆる病原体を治療するように設計することができるため、既存の抗菌治療の制限を克服する可能性を有する。加えて、細菌は、転写因子およびその同族結合部位の両方に影響を及ぼす同時突然変異を必要とするので、これらの薬剤に対する耐性を生じる可能性は低い。これは、特に、複数の必須遺伝子を制御する薬剤に当てはまる。代替として、遺伝子が構成的に発現されるように、遺伝子は、突然変異によって転写因子デコイ媒介性制御を回避する可能性がある。しかしながら、多数の遺伝子に同時に作用する転写因子デコイの場合、そうした遺伝子のうちの多くは、それらを構成的発現、すなわち可能性が低いと考えられる現象に切り替えるように、突然変異を獲得することが必要になる。
【０００４】
転写因子デコイ（ＴＦＤ）は、そのようなＤＮＡに基づく治療薬である。デコイオリゴヌクレオチドは、転写因子の結合部位を模倣し、後者がそれらの同族ゲノム標的に結合するのを防止するように設計されており、必然的な遺伝子発現の修飾を伴う（Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｚａｕ（２０００）、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ」１０６：１０７１−１０７５）。
【０００５】
ＴＦＤは、ＤＮＡに基づく他の治療薬を超える明白な利点を有する。それらの作用機構は単純で、かつ予測可能である。ＴＦＤは、転写因子を封鎖することによって遺伝子発現を制御し、細胞を特異的結合配列の十分なコピーであふれさせることによって、後者が促進因子に結合することを防止する（したがって、「デコイ」と称される）。これは、ｍＲＮＡの複雑な二次構造のため標的を画定することが困難である、アンチセンス戦略とは対照的である。アンチセンス手法と比較すると、ＴＦＤは、アンチセンス手法が発現の結果に対処するのに対して、迅速に作用して遺伝子の発現を防止するという、さらなる利点を有する。結果として、ＴＦＤは、非常に低い濃度で効果がある。ＴＦＤと転写因子との単一の相互作用は、別の場合であればアンチセンス手法のための標的を構成する何千ものｍＲＮＡのコピーを生じさせ得る、単一の遺伝子の転写を阻止することができるからである。
【０００６】
ＤＮＡに基づく他の治療薬としては、遺伝子治療のための導入遺伝子、アンチセンスおよびアンチジーン適用のためのオリゴヌクレオチド（Ｃｒｏｏｋｅ  Ｓ．Ｔ．（１９９８）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．８：１１５−１２２）、リボザイム、ＤＮＡザイム、アプタマー、および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Ｓｔｕｌｌ  Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１２：４６５−４８３；Ｐａｔｉｌ  Ｓ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｓｓ  Ｄ．Ｊ．（２００３）ＡＡＰＳ  Ｎｅｗｓｍａｇａｚｉｎｅ６：２７）を含有するプラスミドがある。ＤＮＡに基づく薬剤の大部分は、前臨床開発または臨床試験の初期段階にあるが、癌、エイズ、パーキンソン病およびアルツハイマー病等の神経疾患、および心血管疾患を含む、広範囲にわたる病気の薬物治療のための極めて有望な候補をもたらすために、近年、この分類の化合物が浮上してきている。
【０００７】
しかしながら、ＴＦＤをはじめとする、ＤＮＡに基づく治療薬の送達は、依然として重大な課題として残る。細胞膜は、タンパク質または核酸等の大きい親水性治療薬を送達する時に遭遇する主な障壁のうちの１つである。この問題を解決する大部分の取り組みは、真核生物細胞への送達、ヒトの癌の効果的な治療法の開発等に重点を置いている。真核生物では、異なる細胞内区画（核を含む）は、種々の細胞内区画を分離し、かつ細胞および細胞小器官からの溶質の流入および流出を防止する、生体膜によって保護される。これらの障壁は、細胞の維持に必須であるが、治療薬を細胞または細胞内の特定の細胞小器官に送達しようと試みる際には、重大な問題となる。
【０００８】
大部分のカチオンは、膜の疎水性内部によってもたらされる大きい自由エネルギー障壁のため、特定の担体システムを伴わずに細胞膜を通過することができない。細胞によって選択的に蓄積および保持されるために、カチオン性化合物は、水性から疎水性環境に移動する時の自由エネルギーの変化を低減するために、十分な親油性およびその正電荷の非局在化が必要である。これは、化合物が、原形質およびミトコンドリア膜を受動的に横断して、膜電位に応答して蓄積することを可能にする。
【０００９】
真核細胞の中へのタンパク質の輸送は、主にエンドサイトーシスを通して媒介される。これは、大きい極性分子が細胞膜の中に包み込まれることによって吸収される、高度に組織化された輸送システムである。ファゴサイトーシスおよびピノサイトーシスは、エンドサイトーシスの非受容体媒介形態である一方で、受容体媒介エンドサイトーシスは、被覆されたピットを形成するように細胞質膜を内向きに折り畳む、より特異的な活性イベントである。この場合、タンパク質または他のトリガー粒子は、細胞の原形質膜の中の受容体／リガンドに係止するか、または例えば電荷相互作用に起因する、細胞の表面との非特異的相互作用による。この時に初めて、粒子が包み込まれる。これらの内向きに出芽する小嚢は、細胞質小嚢を形成するように出芽する。
【００１０】
インビボおよびインビトロで、これらの障壁を横断して生物活性分子を転座させるために、種々の技術が開発されてきた。エレクトロポーレーションおよびマイクロインジェクションは、物質を細胞の中に導入することができるようになる前に細胞膜の破壊を必要とし、したがって、限られた量の細胞に限定されるので、これらの方法をインビボで使用することは厳しく、非現実的である。
【００１１】
エンドサイトーシス経路の使用は魅力的であるが、１つの重大な欠点は、リソソーム活性が起こる前にエンドソーム脱出が確実にもたらされることである。リポソームのカプセル化および受容体媒介エンドサイトーシスはまた、それらの標的の不足および低送達率によって限定される。今まで行われた大部分の調査作業は、ｓｉＲＮＡ分子の真核生物細胞への送達に重点を置いていた。通常用いられる手法は、治療薬を細胞内の適切な標的に方向付ける、共有結合的に付着させた標的ペプチドを伴うリポソームまたは複合体を形成するためのものである。
【００１２】
そのような送達機構のための脂質成分を選択する時には、多数の考慮すべき問題がある。脂質様成分は、概してカチオン性であり、次の３つの機能を有する。
１．送達をより達成可能にするために、核酸を縮合する。
２．ヌクレアーゼによる分解、または原形質タンパク質による非特異的吸収等から核酸を保護する。および
３．リン酸塩主鎖の負電荷を遮蔽する。
第３点は、電荷を低減または伴わない合成主鎖を使用することによって克服することができる。
【００１３】
加えて、リポソームまたは複合体は、特定の理想的な物理的性質を必要とする。
１．塩または生体液の双方における良好な安定性。これは、粒子間の引力または反発力を測定するζ電位で定量化することができる。
２．細菌の場合、理想的には５０ｎｍ〜１００ｎｍの間の狭いサイズ分布。
３．低い毒性。ただし、大部分のトランスフェクション剤（脂質、脂溶性カチオン）は、適度なレベルの毒性を示す。
４．商品のコスト等の問題を含めて、生産が現実的である。
【００１４】
真核生物送達に使用されるペプチドは、概して、膜を透過性化すること、標的細胞上の特定の受容体を介して細胞浸透性であること、または単純に、カチオン性（例えばポリアルギニン）であることが知られている。細胞浸透性を伴うペプチドの使用は、複数の利点を有するが、それは主に、ペプチド配列に対して行うことができる、種々の修飾に起因する。これは、異なる細胞サブドメインに対応する担体のエンジニアリングを可能にし、および／または多種多様なカーゴを輸送することが可能である。
【００１５】
膜転座剤の分類は、細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）である。ＣＰＰは、インビトロで異なる細胞器官にアクセスするための穏やかかつ効果的なツールであるだけでなく、インビボでの複数の薬剤の細胞送達に使用され、有望な結果を得ている。
【００１６】
ＣＰＰは、概して、３０個未満のアミノ酸から成り、正味正電荷を有し、また、原形質膜を転座させて、見かけ上エネルギーに依存しない様式で、複数の異なるカーゴを細胞質および核の中に輸送する能力を有する。転座は、種々のエンドサイトーシス阻害因子または低温によって影響を及ぼされない、未知の機構を介して起こる（Ｌａｎｇｅｌ，Ｕ．，ｅｄ．（２００２）Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００１７】
ＣＰＰという用語は、合成細胞透過性ペプチド、タンパク質形質導入ドメイン、膜転座配列を含むが、これらは全て、細胞膜を転座させ、細胞内部へのアクセスを得る能力を有する。
【００１８】
特に細菌への送達に影響を及ぼす可能性を伴う他のペプチドの分類は、抗菌性を伴うものである。抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）、細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）、非リボソーム的に合成されたペプチド、およびグリコペプチドが挙げられる。本明細書では、この種類の全てのペプチドは、抗菌性タンパク質（ＡＢＰ）と称する。
【００１９】
ＡＭＰは、バクテリオシンと称される細菌源から誘導するか、またはヒト、両生類、昆虫等を含む、高等真核生物源から誘導することができる。特に重要なＡＭＰは、生体膜の透過性を増加させることができるか、または細胞内標的に到達するように膜を横断して転座させる能力を有するものである。ＡＭＰは、概して、構造的な類似点に基づいて、次の５つの非相互排他的な下位群に分けられる（Ｂｒｏｇｄｅｎ、２００５  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：２３８−２５０）。
１．一般的に、亜鉛と複合体化され、グラム陰性およびグラム陽性細菌に対して活性を有する小ペプチドである、アニオンペプチド。
２．４０個未満のアミノ酸であり、システインが欠失し、２つのα螺旋領域間の中央ヒンジ領域を特徴とする、線状カチオン性α螺旋ペプチド（ブフォリン等）。
３．プロリンおよびアルギニンの豊富なアピデシン等の、特異的アミノ酸に関して富化された、カチオン性ペプチド。
４．システイン基間のジスルフィド結合の形成により、ベータシートを形成する、アニオン性およびカチオン性ペプチド。
５．より大きいタンパク質の断片である、アニオン性およびカチオン性ペプチド。
【００２０】
ＡＭＰが微生物の死滅に影響を及ぼす機構は、多様であり、特定の下位群に限定されない。大部分は、細胞の透過性化を助長する孔をそれらの膜の中に形成することによって、細菌を死滅させる。透過性化には、次の３つの明白な機構があり、ペプチドの特異的性質か、または使用されるペプチドの濃度の影響のいずれかであり得る。
１．例えばマガイニン、メリチンによるトロイダル孔の形成。
２．例えばデルマセプチンＳ、セクロピン、またはメリチンによるカーペットの形成。
３．例えばアラメシシンによる、バレルステーブの形成。
【００２１】
最終的な標的が膜ではなく、本質的に、ＡＭＰが膜を横断して転座させることが必要である、細胞内である、いくつかのＡＭＰを説明してきた。これらのペプチド、またはそれらに倣った合成ペプチドを、治療薬等の代替のカーゴを送達するために使用することが可能であるので、この転座させる能力は、特に重要である。したがって、これらのＡＭＰは、それらの細胞内死滅のモードに従って分類することができる。
１．例えばブフォリン、ブフォリンＩＩおよび類似体、ならびにタキプレシンによる核酸の結合。
２．例えばアニオンペプチドによる細胞内含有物の凝集。
３．例えばミクロシン２５による隔膜形成。
４．例えばメルサシジンによる細胞壁合成。
５．例えばリューロシジンおよびデルマセプチンによる核酸合成の阻害。
６．例えばリューロシジンおよびデルマセプチンによるタンパク質合成の阻害。
７．例えばアピデシンによる酵素活性の阻害。
【００２２】
非リボソーム的に合成されたペプチドは、構造的に多様であり得る。それらは、しばしば、環化または分岐され、ヒドロキシアラニンまたはヒドロキシセリンを生産するように修飾された非標準アミノ酸またはアミノ酸を含有し、ヒドロキシル化、ハロゲン化、またはグリコシル化を受けることができる（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ．ａｌ．，（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１８０５−１８１０）。これらのペプチドの大部分は、それらの膜を透過性化することによって細菌の成長を阻害する。
【００２３】
ペプチドおよび核酸の細菌への送達の課題は、真核生物細胞に関して遭遇するものと類似しているが、細胞成分は異なる。具体的には、細菌は、治療薬を細胞の中に移動させるのに役立つエンドサイトーシス機構を有しない。しかしながら、明らかな利点は、細菌が核区画を有しないことであり、よって、細菌ゲノムへのアクセスを得るためには治療薬を細胞質の中に送達すれば十分である。したがって、真核生物送達システムの代替物を開発する必要がある。これらは、膜を透過性化することによって細胞への侵入を得る方法を見つけることを伴う。実験室の設定では、ＤＮＡの細胞の中への送達（トランスフェクション）は、細胞膜を破壊するアニオンバッファで細胞を処理するか、電荷分布に干渉するか、最も一般的には、カルシウムイオンを含有するバッファのいずれかによって達成される。代替として、電気穿孔法が使用され、細胞は、低伝導性を伴うバッファの中で調製され、全てではないが細胞の一部の細菌膜に過渡的な孔を産生するために、高い電圧が使用され、小数の細胞のトランスフェクションをもたらす。
【００２４】
動物モデルまたは臨床設定のいずれにおいても、ＤＮＡ治療薬を細菌に送達するために、いずれかの方法を使用することは、明らかに非実用的である。インビボのトランスフェクションは、膜に損傷を与えること、および以降の孔または突出を通して入口を生じさせることが知られている、合成カチオン性ペプチドまたはＡＢＰに治療薬を共役することによって達成されてもよい。付加的に、膜を通して転座させるＡＢＰのいくつかの能力は、確かな送達戦略を開発する際の別の代替物である。
【００２５】
送達ペプチドを使用する真核生物モデルを発端として、細菌送達ペプチドの理想的な特徴は、以下を含む。
１．真核生物ではなく原核生物に最適化されている、細菌特異性／選好。
２．耐性を引き出す可能性が低いこと。例えばその外膜の電荷密度を変えるＭＲＳＡによって抵抗を受ける可能性がある、カチオン性ペプチド。
３．細菌への一般的な送達システムとして使用するための、広域活性。および
４．宿主毒性が低い、またはない。
【００２６】
同様に、脂質様輸送分子の使用は、細菌膜の特異的構造に合うようにする必要がある。例えば、グラム陰性細菌は、外膜および内膜を有し、それらはどちらも治療薬が細菌に送達される前に克服する必要がある。
【発明の概要】
【００２７】
この背景に対して、本発明は、ＴＦＤ等の核酸配列の製剤および細菌への送達のための解決策を提供する。
【００２８】
具体的には、本発明は、核酸配列および１つ以上の送達部分を含む、抗菌性複合体に属する。発明者らは、自らの能力で何らかの抗菌性活性を有する送達部分が理想的であることを見出した。具体的には、単一または複数の送達部分は、核酸配列と組み合わせた時に、相乗効果的な抗菌効果を示すはずである。換言すれば、送達部分および核酸配列の組み合わせは、核酸配列または送達部分単独の効果と比較した時に、強化された抗菌効果を示すはずである。
【００２９】
送達部分は第四級アミン化合物ならびにビスアミノアルカンおよびその不飽和誘導体から選択されてもよく、「アミノアルカン」という用語は、本明細書で使用される場合、複素環式環の一部を形成するアミノ基（好ましくは、第三級アミノ基）を指す。
【００３０】
例示的なそのような化合物は、式（Ｉ）の化合物であり、
【００３１】
【化１】
2013519662.tif 000003
式中、Ｑは、
（ａ）以下の式を有する、Ｑ１基、
【００３２】
【化２】
2013519662.tif 000004
（ｂ）Ｑ２、Ｑ２−ＮＨ−、Ｑ２−Ｏ−、またはＱ２−Ｓ−基から選択され、式中、Ｑ２は、５個〜１４個の環員の単環式、二環式、および三環式複素環芳香族基から選択され、そのうちの１個、２個、または３個は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子環員であるが、少なくとも１つの窒素環員が存在することを条件とし、複素芳香族基は、１個または２個の置換基Ｒ４ａによって随意に置換され、１個の窒素環員は、Ｎ−オキシドを形成してもよく、またはＣ１−４アルキル、フェニル−Ｃ１−４アルキル、またはジ−フェニル−Ｃ１−４アルキルで置換されて第四級基を形成してもよく、フェニル部分は、いずれの場合においても、１個または２個のハロゲン、メチル、またはメトキシ基で随意に置換され、
ｍは、０または１であり、
ｎは、０または１であり、
ｐおよびｑは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、１〜１２の整数であり、
Ａは、結合であるか、またはナフタレン、ビフェニル、テルフェニル、フェナントレン、フルオレン、スチルベン、Ｃ６Ｈ４（ＣＨ２）ｒＣ６Ｈ４基、Ｃ６Ｈ４−Ｃ≡Ｃ−Ｃ６Ｈ４基、ピリジン−２，６−ジイル−ビス（ベンゼン−１，４−ジイル）基、ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｓ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｔ−基、およびＣ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｕ−（Ｃ≡Ｃ）ｖ−基から選択され、式中、ｒは、０〜４であり、ｓは、０〜４であり、ｔは、０または１であり、ｕは、０〜４であり、ｖは、０または１であり、
ｎが１である時、Ｒ０、Ｒ１、およびＲ２は、それぞれＣ１−４アルキルから選択され、ｎが０である時、Ｎ、Ｒ１、およびＲ２は、共に５個〜１４個の環員の単環式、二環式、または三環式複素環芳香族基を形成し、そのうちの１個は、窒素原子Ｎであり、０、１、または２個はさらに、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子環員であり、複素環芳香族基は、１個または２個の置換基Ｒ４ｂによって随意に置換され、Ｒ３は、水素、Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、それぞれが１個または２個の置換基Ｒ４ｃによって随意に置換された３個〜７個の環員の単環式炭素環式基、Ｑ基、−ＮＨ−Ｑ２基、−Ｏ−Ｑ２基、および−Ｓ−Ｑ２基から選択され、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、およびＲ４ｃは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシル基；ニトロ；アミノ；モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ；ハロゲン；フェニル部分が１個もしくは２個のメトキシ、メチル、またはハロゲン置換基で随意に置換された、フェニル−Ｃ１−２アルキル；ウレイド；およびグアニジニルから選択される。
【００３３】
好ましい一実施形態では、Ｑは、Ｑ１基である。
【００３４】
【化３】
2013519662.tif 000005
【００３５】
故に、式（Ｉ）内の１つの好ましい下位化合物群は、式（ＩＩ）によって表され、
【００３６】
【化４】
2013519662.tif 000006
式中、Ｒ１、Ｒ２、ｍ、ｐ、Ａ、ｑ、およびＲ３は、式（Ｉ）に記載の通りである。
【００３７】
式（ＩＩ）内の１つの好ましい下位化合物群（Ｒ３は、Ｑ１であり、ｎは、いずれの場合でも０である）は、式（ＩＩＩ）によって表すことができ、
【００３８】
【化５】
2013519662.tif 000007
式中、Ｒ１、Ｒ２、ｍ、ｐ、Ａ、およびｑは、式（Ｉ）に記載の通りである。
【００３９】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の化合物では、ｍが１である時、窒素原子Ｎは第四級窒素でなければならない。故に、式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の化合物（式中、ｍは、１である）は、対イオンとして、例えば、鉱酸、スルホン酸、およびカルボン酸から誘導されるアニオンといった、１つ以上のアニオンを含むことになる。
【００４０】
Ｎ、Ｒ１、およびＲ２は、ともに５個〜１４個の環員の単環式、二環式、または三環式複素環芳香族基を形成する時、典型的に、該基は通常、唯一のヘテロ原子環員としての窒素原子Ｎを含有するか、またはＮ、Ｏ、およびＳから選択される第２のヘテロ原子環員を含有する。
【００４１】
Ｎ、Ｒ１、およびＲ２が、共に単環式、二環式、または三環式複素環芳香族基を形成する時、窒素原子Ｎは、芳香族環の一部を形成する。好ましい複素環芳香族基は、単環式芳香族環；どちらの環も芳香族である二環式複素環式環；１つの窒素含有環が芳香族であり、かつ他の環が非芳香族である二環式複素環式環；および窒素含有環を含む２つの環が芳香族であり、かつ他の環が非芳香族である三環式環である。
【００４２】
Ｎ、Ｒ１、およびＲ２が、共に５個〜１４個の環員の単環式、二環式、または三環式複素環基を形成する時、複素環基は、好ましくは、キノリン；イソキノリン；アクリジン；テトラヒドロアクリジンおよびその環同族体；ピリジン；ベンゾイミダゾール；ベンゾキサゾール；およびベンゾチアゾールから選択される。テトラヒドロアクリジンの環同族体は、化合物が以下のコア構造を含有していることを意味し、
【００４３】
【化６】
2013519662.tif 000008
式中、ｙは、１または３である。テトラヒドロアクリジンは、化合物が、上記のコア構造を有し、式中、ｙが２である化合物を意味する。
【００４４】
好ましい実施形態では、送達部分は、キノリンまたはアクリジン、具体的には、１，２，３，４−テトラ−ヒドロ−９−アミノ−アクリジンの第四級誘導体である。１，２，３，４−テトラ−ヒドロ−９−アミノ−アクリジンの好適な誘導体は、米国特許第ＵＳ３５１９６３１号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。特に重要なのは、米国特許第ＵＳ３５１９６３１号の実施例１７〜２５に例示される化合物および式、ならびにその類似体である。好適なキノリン誘導体は、デカリニウムおよびその類似体等のビスキノリニウム化合物である。
【００４５】
デカリニウム（図１）は、ビスキノリニウム化合物であり、穏やかな抗微生物性を有し、３０年にわたって、市販のうがい薬、局所軟膏、経口および膣ペイント、ならびに咽喉炎錠剤中の抗微生物剤として使用されてきた。さらに、局所静菌剤であり、カルシウムチャネルの阻害因子、抗真菌薬剤（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１５：３４２２−３４２９）、結核の阻害因子（Ｇｕｉｔｅｒｒｅｚ−Ｌｕｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．１４：６４３−６５２）、およびプロテインキナーゼＣの阻害因子（ＰＫＣ；Ａｂｅｙｗｉｃｋｒａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１４：７７９６−７８０３）としても試験が行われてきた。
【００４６】
また、ＤＮＡに基づく治療薬およびｐａｘｃｉｔｏｌ等の従来の薬物をインビトロの実験でミトコンドリアに送達するために、デカリニウムが使用されてきた。これらの実験では、デカリニウムは、乾燥膜法によってボラソームとして調製された。すなわち、デカリニウムは、メタノール等の有機溶媒中に溶解し、真空中で完全に乾燥し、そして、水性溶液中に再懸濁し、その後、超音波振動処理してボラソームを形成し、続いて、ＤＮＡと混合して複合体を形成する。これらの複合体は、ミトコンドリアの外膜を伴う複合体の融合を含むと考えられる機構によって、ＤＮＡをミトコンドリアに送達することが可能であることが示されている（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ａｎｄ  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ  ２００１  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．４９：１２７−１４９；Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ７５：４０１−４０８）。ミトコンドリアの膜構造は、細菌の中に起こるものと同一ではないが、類似している。これは、インビボ設定で細菌に治療薬を送達するのにデカリニウムが好適であり得るという可能性を高める。しかしながら、デカリニウムとともに形成した複合体は、生理学的バッファおよび生体液の存在下で、希釈に対して経時的に不安定である。
【００４７】
したがって、特に好ましい一実施態様では、複合体は、デカリニウム類似体を含む。このようにして、（希釈および塩の存在の双方に対して）強化された安定性を有しながら、さらにデカリニウムに類似したまたは改善された毒性プロファイルを有する、デカリニウム化合物を設計することが可能である。そのような類似体は、蛍光染料ＳＹＢＲグリーンを除外してＤＮＡを結合する能力、動的光散乱法で測定し電子顕微鏡法で視覚化した時の、形成された粒子のサイズ、ならびに高濃度の塩、希釈、および長期間にわたる貯蔵におけるそれらの安定性等の（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１：９１−９６）、種々の生理化学的パラメータによって試験を行った時に、より安定した複合体を形成することが説明されている（化合物７、Ｇａｌａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．［Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）３５：３５３６−３５４６］）。
【００４８】
デカリニウムおよびその類似体の例は、式（ＩＶ）の化合物であり、
【００４９】
【化７】
2013519662.tif 000009
式中、ｐおよびｑは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、１〜１２の整数であり、
Ａは、結合であるか、またはナフタレン、ビフェニル、テルフェニル、フェナントレン、フルオレン、スチルベン、Ｃ６Ｈ４（ＣＨ２）ｒＣ６Ｈ４基、Ｃ６Ｈ４−Ｃ≡Ｃ−Ｃ６Ｈ４基、ピリジン−２，６−ジイル−ビス（ベンゼン−１，４−ジイル）基、ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｓ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｔ−基、およびＣ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｕ−（Ｃ≡Ｃ）ｖ−基から選択され、式中、ｒは、０〜４であり、ｓは、０〜４であり、ｔは、０または１であり、ｕは、０〜４であり、ｖは、０または１であり、
Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、同一であるかまたは異なり、それぞれ、水素；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシ；ニトロ；アミノ；モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ；ハロゲン；フェニル部分が１個もしくは２個のメトキシ、メチル、またはハロゲン置換基で随意に置換された、フェニル−Ｃ１−２アルキル；ウレイド；およびグアニジニルから選択されるか、あるいはＲ９およびＲ１０がともに連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成し、Ｒ８ａ、Ｒ９ａ、およびＲ１０ａは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、水素；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシ；ニトロ；アミノ；モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ；ハロゲン；フェニル部分が１個もしくは２個のメトキシ、メチル、またはハロゲン置換基で随意に置換された、フェニル−Ｃ１−２アルキル；ウレイド；およびグアニジニルから選択されるか、あるいはＲ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中ｗは、３〜５である）を形成する。
【００５０】
式（ＩＶ）内では、化合物の１つのサブセットは、Ａが、結合であるか、ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｓ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｔ−基であるか、またはＣ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｕ−（Ｃ≡Ｃ）ｖ−基である、サブセットである。このサブセット内で、好ましくは、Ａは、結合である。すなわち、２つのキノリン環の窒素原子間に延在する、飽和アルキレン鎖がある。
【００５１】
Ａが結合である時に、典型的に、ｐおよびｑの合計は、３〜２２の範囲であり、好ましくは６〜２０の範囲であり、より好ましくは、８〜１８の範囲である。特定の例は、ｐ＋ｑ＝８、ｐ＋ｑ＝９、ｐ＋ｑ＝１０、ｐ＋ｑ＝１１、ｐ＋ｑ＝１２、ｐ＋ｑ＝１３、ｐ＋ｑ＝１４、ｐ＋ｑ＝１５、ｐ＋ｑ＝１６、ｐ＋ｑ＝１７、またはｐ＋ｑ＝１８である。
【００５２】
前述の実施形態および化合物のサブセットのそれぞれにおいて、Ｒ８およびＲ８ａは、好ましくは、それぞれ、水素、Ｃ１−４アルコキシ、ニトロ、アミノ、モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、およびグアニジニルから選択される。
【００５３】
より好ましくは、Ｒ８およびＲ８ａは、それぞれ、水素、Ｃ１−４アルコキシ、アミノ、およびグアニジニルから選択される。
【００５４】
さらに好ましくは、Ｒ８およびＲ８ａは、それぞれメトキシおよびアミノから選択される。
【００５５】
一実施形態では、Ｒ８およびＲ８ａは、どちらもアミノである。
【００５６】
別の実施形態では、Ｒ８およびＲ８ａは、どちらもメトキシである。
【００５７】
別の実施形態では、Ｒ８およびＲ８ａは、どちらもグアニジニルである。
【００５８】
前述の実施形態および化合物のサブセットのそれぞれにおいて、好ましくは、
Ｒ９が水素であり、
Ｒ９ａが水素であり、
Ｒ１０が、水素、アミノ、および１つ以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ１０ａが、水素、アミノ、および１つ以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択されるか、または
Ｒ９およびＲ１０が共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成する、および／または
Ｒ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成する。
【００５９】
より好ましくは、
Ｒ９が水素であり、
Ｒ９ａが水素であり、
Ｒ１０が、水素、アミノ、メチル、およびトリフルオロメチルから選択され、
Ｒ１０ａが、水素、アミノ、メチル、およびトリフルオロメチルから選択されるか、または
Ｒ９およびＲ１０が共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成する、および／または
Ｒ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成する。
【００６０】
式（ＩＶ）内の１つの特に好ましい化合物群では、
Ａが結合であり、
ｐおよびｑの合計が８〜１８の範囲であり、
Ｒ８およびＲ８ａが、それぞれ、水素、Ｃ１−４アルコキシ、アミノ、およびグアニジニルから選択され、
Ｒ９が水素であり、
Ｒ９ａが水素であり、
Ｒ１０が、水素、アミノ、および１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ１０ａが、水素、アミノ、および１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択されるか、または
Ｒ９およびＲ１０が共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成し、および／または
Ｒ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成する。
【００６１】
式（ＩＶ）内の別の特に好ましい化合物群では、
Ａが結合であり、
ｐおよびｑの合計が８〜１８の範囲であり、
Ｒ８およびＲ８ａが、それぞれ、グアニジニルであり、
Ｒ９が水素であり、
Ｒ９ａが水素であり、
Ｒ１０が、水素、アミノ、および１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ１０ａが、水素、アミノ、および１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択されるか、または
Ｒ９およびＲ１０がともに連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成し、および／または
Ｒ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成する。
【００６２】
式（ＩＶ）内の別の特に好ましい化合物群では、
Ａが結合であり、
ｐおよびｑの合計が８〜１８の範囲であり、
Ｒ８およびＲ８ａが、それぞれ、水素、Ｃ１−４アルコキシ、およびアミノから選択され、
Ｒ９が水素であり、
Ｒ９ａが水素であり、
Ｒ１０が、水素、アミノ、および１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択され、
Ｒ１０ａが、水素、アミノ、および１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキルから選択されるか、または
Ｒ９およびＲ１０が共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成し、および／または
Ｒ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成する。
【００６３】
この群内のより好ましい化合物は、
Ａが結合であり、
ｐおよびｑの合計が８〜１８の範囲であり、
Ｒ８およびＲ８ａが、それぞれ、水素、メトキシ、およびアミノから選択され、
Ｒ９が水素であり、
Ｒ９ａが水素であり、
Ｒ１０が、水素、アミノ、メチル、およびトリフルオロメチルから選択され、
Ｒ１０ａが、水素、アミノ、メチル、およびトリフルオロメチルから選択されるか、または、
Ｒ９およびＲ１０が共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成し、および／または
Ｒ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成するものである。
【００６４】
式（ＩＶ）内では、１つの好ましい化合物群は、式（Ｖ）によって表されてもよく、
【００６５】
【化８】
2013519662.tif 000010
式中、
ｒは、２〜２４の整数であり、
Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、同一であるかまたは異なり、それぞれ、水素；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシ；ニトロ；アミノ；モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ；ハロゲン；フェニル部分が１個もしくは２個のメトキシ、メチル、またはハロゲン置換基で随意に置換された、フェニル−Ｃ１−２アルキル；ウレイド；およびグアニジニルから選択されるか、あるいはＲ９およびＲ１０が連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成し、Ｒ８ａ、Ｒ９ａ、およびＲ１０ａは、同一であるかまたは異なり、それぞれ、水素；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルキル；１個以上のフッ素原子で随意に置換されたＣ１−４アルコキシ；ニトロ；アミノ；モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ；ハロゲン；フェニル部分が１個もしくは２個のメトキシ、メチル、またはハロゲン置換基で随意に置換された、フェニル−Ｃ１−２アルキル；ウレイド；およびグアニジニルから選択されるか、あるいはＲ９ａおよびＲ１０ａが共に連結して、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、３〜５である）を形成するが、
（ｉ）Ｒ１０およびＲ１０ａがどちらもハロゲンであるか、もしくはどちらもメチルであり、かつＲ９およびＲ９ａがどちらも水素である時に、Ｒ８およびＲ８ａのうちの少なくとも１つが水素、アミノ、もしくはジメチルアミノ以外であること、または
（ｉｉ）Ｒ９およびＲ１０が共に連結し、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（ｗは、４である）を形成し、かつＲ９ａおよびＲ１０ａが共に連結し、アルキレン鎖（ＣＨ２）ｗ（ｗは、４である）を形成する時に、Ｒ８およびＲ８ａの少なくとも１つはアミノ以外であることを条件とする。
【００６６】
好ましくは、ｒは、８〜２０の整数、より好ましくは、１０〜１８の整数であり、例えば、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１８のいずれか１つの整数である。
【００６７】
式（Ｖ）内の１つの化合物群では、Ｒ８およびＲ８ａは、メトキシおよびグアニジニルから選択される。この化合物群内で、Ｒ９およびＲ９ａは、典型的に、どちらも水素であり、Ｒ１０およびＲ１０ａは、典型的に、水素、メチル、トリフルオロメチル、およびアミノから選択される。
【００６８】
式（Ｖ）内の別の化合物群では、Ｒ８およびＲ８ａは、水素、アミノ、モノ−およびジ−Ｃ１−４アルキルアミノ、メトキシ、ならびにグアニジニルから選択され、Ｒ９およびＲ９ａは、どちらも水素であり、Ｒ１０およびＲ１０ａは、どちらもトリフルオロメチルである。
【００６９】
別の実施形態では、類似体は、１０，１０´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジクロライド（図２）であってもよい。この化合物は、Ｇａｌａｎａｋｉｓ他ではカルシウムチャネルの潜在的阻害因子として調査されていたが、そこでの元の表記（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）３５：３５３６−３５４６）から、本明細書では化合物７を指す。化合物は、その後、ＤＮＡ治療薬のミトコンドリアへの送達のための薬剤として試験が行われ（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．１１：９１−９６）、その刊行物では、化合物７の類似体によって形成される複合体の有利な安定性が報告されている。さらなる論文（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．１６：２４９−２６４）は、化合物７の類似体が、デカリニウムと比較して、インビトロでより低い毒性を有することを報告している。
【００７０】
より長いアルキル鎖を伴うデカリニウムの類似体が、さらに低い毒性を示したので、異なる鎖長さを伴う類似体が検討された（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．１６：２４９−２６４）。したがって、好ましくは、デカリニウム類似体のアルキル鎖は、８個〜１４個のメチル基を有するが、アルキル鎖の中に、３個のメチル基しか含有しない鎖（Ｇａｌａｎｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３５９２−３５９５）、および３６個ものメチル基を含有する他の脂溶性カチオン（Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３９：４０６３−４０６７）の例がある。より好ましくは、アルキル鎖は、１０個または１２個のメチル基を有する。結果として、化合物７の類似体は、アルキル鎖の中に１２個のメチル基を伴って設計され、以下、化合物７＿１２と称する。
【００７１】
別の好適な類似体は、以下、化合物７＿１２で示される、１０，１０´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジクロライド（図３）である。化合物７＿１２は、化合物７から誘導され、化合物７のＣ１０アルキル鎖ではなく、Ｃ１２アルキル鎖を有する。
【００７２】
デカリニウムの他の好適な類似体には、以下が挙げられる。
１−デカニル−２−メチル−４−アミノキノリニウムヨージド
１−ブチル−２−メチル−４−アミノキノリニウムヨージド
１，１，１−トリエチル−１−（１０−ヨードデカン−１−イル）アンモニウムヨージド
１−［１−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム−１−イル）−２−メチル−４−アミノキノリニウムジヨージド
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（４−アミノピリジニウム）ジヨージド
１−（４−ペンチン−１−イル）−４−アミノピリジニウムクロライド
１，１´−（デカ−４，６−ジイン−１，１０−ジイル）ビス（４−アミノピリジニウム）ジクロライドデハイドレート
２，２´−Ｎ，Ｎ−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（２，４−ジアミノピリジン）［化合物８］
２，２´−Ｎ，Ｎ−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（２−アミノピリジン）
２，２´−Ｎ，Ｎ−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（１−メチル−２−アミノピリジニウム）ジヨージド
１−（４−ペンチン−１−イル）−２−メチル−４−アミノキノリニウムヨージド
１，１´−（デカ−４，６−ジイン−１，１０−ジイル）ビス（４−アミノ−２−メチルキノリニウム）ジヨージドハイドレート
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（キノリニウム）ジヨージド
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジブロマイドハイドレート
２，２´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（キノリン）
２，２´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（１−メチルキノリニウム）ジヨージドハイドレート
２，２´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（４−メトキシキノリン）
２，２´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（１−メチル−４−メトキシキノリニウム）ジヨージド
２，２´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（１−メチルキノリニウム）ジヨージド
２，２´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（イソキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（４−ブロモイソキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（１Ｈ−ベンゾイミダゾール）
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（３−メチルベンゾイミダゾリウム）ジヨージドヘミハイドレート
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（２−メチルベンゾイミダゾール）
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（２，３−ジメチルベンゾイミダゾリウム）ジヨージド
１，１０−ビス［Ｎ−（アクリジン−９−イル）アミノ］デカンジヒドロクロリドジハイドレート
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［４−アミノ−２−メチルキノリニウム］ジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［４−アミノキノリニウム］ジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［４−Ｎ，Ｎ，ジメチルアミノキノリニウム］ジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［２−メチルキノリニウム］ジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［キノリニウム］ジヨージド
１，６−ビス［Ｎ−（１−メチルキノリニウム−２−メチル）アミノ］ヘキサンジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［１−アミノイソキノリニウム］ジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［２−メチルベンゾオキサゾリウム］ジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［２−メチルベンゾチアゾリウム］ジヨージド
１，１´−（１，１０−デカンジイル）ビス［２−アミノ−１−メチルベンゾイミダゾリウム］ジヨージド
１，１´−［（Ｅ）−５−デセン−１，１０−ジイル］ビス［４−アミノ−２−メチルキノリニウム］、ジヨージド
１，１´−［（Ｚ）−５−デセン−１，１０−ジイル］ビス［４−アミノ−２−メチルキノリニウム］、ジヨージド
１，１´−（１，１２−ドデカンジイル）ビス［４−アミノ−２−メチルキノリニウム］、ジヨージド
１，１´−（１，１４−テトラデカンジイル）ビス［４−アミノ−２−メチルキノリニウム］、ジヨージド
１，１´−（１，１６−ヘキサデカンジイル）ビス［４−アミノ−２−メチルキノリニウム］、ジヨージド
Ｎ−デシル−４−アミノキナルジニウムヨージド
１，１´−［ビフェニル−３，３´−ジイルビス（メチレン）］−ビス（４−アミノキノリニウム）
ジブロマイドハイドレート（４）、１，１´−［ビフェニル−４，４´−ジイルビス（メチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジトリフルオロアセテート
１，１´−（フェナントレン−３，６−ジイルビス（メチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドハイドレートエタノエート
１，１´−［フルオレン−２，７−ジイルビス（メチレン）］−ビス（４−アミノキノリニウム）ジトリフルオロアセテート
１，１´−［メチレンビス（ベンゼン−１，４−ジイルメチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドハイドレート
１，１´−［エチレンビス−（ベンゼン−１，４−ジイルメチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドハイドレート
（Ｚ）−１，１´−［スチルベン−４，４´−ジイルビス（メチレン）］−ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドセスキハイドレート
（Ｅ）−１，１´−［スチルベン−４，４´−ジイルビス（メチレン）］ビス−（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドジハイドレート
１，１´−［アセチレン−１，２−ジイルビス（ベンゼン−１，４−ジイルメチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドセスキハイドレート
１，１´−［プロパン−１，３−ジイルビス（ベンゼン−１，４−ジイルメチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドヘミハイドレートエタノエート
１，１´−［ピリジン−２，６−ジイルビス（ベンゼン−１，４−ジイルメチレン）］−ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドハイドレート
１，１´−［ブタン−１，４−ジイルビス（ベンゼン−１，４−ジイルメチレン）］ビス−（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドハイドレート
１，１´−［１，１：４´，１´´−テルフェニル−４，４´´−ジイルビス（メチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドトリハイドレート
１，１´−［ナフタレン−２，６−ジイル（ビス（メチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドハイドレート
１，１´−［ベンゼン−１，４−ジイルビス（メチレン）］−ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドジハイドレート
１，１´−［ベンゼン−１，３−ジイルビス（メチレン）］ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドヘミハイドレート
１，１´−（プロパン−１，３−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（ブタン−１，４−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（ペンタン−１，５−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（ヘキサン−１，６−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（オクタン−１，８−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジヨージド
１，１´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジブロマイドヘミハイドレート
１，１０−ビス［Ｎ−（２−メチルキノリン−４−イル）アミノ］デカン
１，１２−ビス［Ｎ−（２−メチルキノリン−４−イル）アミノ］ドデカン
１，１０−ビス［（２−メチルキノリン−４−イル）アミノ］デカン
１，１２−ビス［（２−メチルキノリン−４−イル）アミノ］ドデカン
１，１０−ビス（Ｎ−キノリン−４−イルアミノ）デカン
４，４´−［デカン−１，１０−ジイルビス（オキシ）］ビス［キノリン］
４，４´−［デカン−１，１０−ジイルビス（チオ）］ビス［キノリン］
４，４´−ドデカン−１，１２−ジイルビス［キノリン］
１，８−ビス（Ｎ−キノリン−４−イルジアミノ）オクタン
１，８−ビス［Ｎ−（１−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］オクタンジヨージドハイドレート
１，１０−ビス［Ｎ−（１−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］デカンジヨージド
４，４´−［デカン−１，１０−ジイルビス（オキシ）］ビス［１−メチルキノリニウム］ジヨージド
４，４´−［デカン−１，１０−ジイルビス（チオ）］ビス［１−メチルキノリニウム］ジヨージドハイドレート（１０）。
１，１´−ジメチル−４，４´−ドデカン−１，１２−ジイルビス［キノリニウム］ジヨージド
４，４´−デカン−１，１０−ジイルビス［キノリン］
１，１´−ジメチル−４，４´−デカン−１，１０−ジイルビス［キノリニウム］ジヨージド
１，１０−ビス［Ｎ−（１−ベンジルキノリニウム−４−イル）アミノ］デカンジブロマイド
１，１０−ビス［Ｎ−（１−ベンジル−２−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］−デカンビス（トリフルオロアセテート）
１，１２−ビス［Ｎ−（１−ベンジル−２−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］−ドデカンビス（トリフルオロアセテート）
１−［Ｎ−（１−ベンジル−２−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］−１０−［Ｎ´−（２−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］デカンビス（トリフルオロアセテート）
１−［Ｎ−（１−ベンジル−２−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］−１２−（Ｎ´−（２−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］ドデカンビス（トリフルオロアセテート）−３，５−ジメトキシベンジルヨージド
１，１０−ビス［Ｎ−［１−（３，５−ジメトキシベンジル）−２−メチルキノリニウム−４−イル］アミノ］デカンビス（トリフルオロアセテート）
１−［Ｎ−［１−（３，５−ジメトキシベンジル）−２−メチルキノリニウム−４−イル］アミノ］−１０−［Ｎ´−（２−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］デカンビス（トリフルオロアセテート）
１，１´−（３−ヨードプロピリデン）ビス［ベンゼン］
１，１０−ビス［Ｎ−［１−（３，３−ジフェニルプロプ−１−イル）−２−メチルキノリニウム−４−イル］アミノ］デカンビス（トリフルオロアセテート）
４，７−ジクロロ−１−メチルキノリニウムヨージド
１，１０−ビス［Ｎ−（７−クロロ−１−メチルキノリニウム−４−イル）アミノ］−デカンジヨージドジハイドレート。
【００７３】
デカリニウムおよびその塩は、例えば（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）から市販されている。好適な類似体を作製する方法は、ＷＯ  ９７／４８７０５、Ｇａｌａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：５９５−６０６、Ｇａｌａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：３５３６−３５４６、Ｇａｌａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３５９２−３５９５、Ａｂｅｙｗｉｃｋｒａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１４：７７９６−７８０３、Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：１４１３−１４１７、およびＣａｍｐｏｓ  Ｒｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：４２４７−４２５４に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。特に、化合物７の合成は、上記Ｇａｌａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）に記載されており、化合物７＿１２の合成は、そこから誘導されてもよい。
【００７４】
式（ＩＶ）および（Ｖ）の化合物は、上記に記載および参照されるようなデカリニウムを調製するための既知の方法に類似した方法によって調製されてもよい。
【００７５】
例えば、式（ＩＶ）および（Ｖ）の化合物は、式（ＶＩ）のキノリン化合物の式ｌ−（ＣＨ２）ｒ−ｌの化合物との反応によって調製することができる。
【００７６】
【化９】
2013519662.tif 000011
反応は、典型的に、例えば１２０℃〜１６０℃の範囲（例えば、約１５０℃）といった高温で行われる。
【００７７】
式（ＶＩ）のキノリン化合物は、市販されており、または当業者によく知られている標準的な方法、もしくはそれに類似した方法によって作製することができる。例えば、Ｊｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈによる、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２；Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ、Ｖｏｌｕｍｅｓ１−８、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、Ｊｅｒｅｍｉａｈ  Ｐ．Ｆｒｅｅｍａｎ編集（ＩＳＢＮ：０−４７１−３１１９２−８）、１９９５；Ｆｉｅｓｅｒｓ’Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｖｏｌｕｍｅ  １−１７、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、Ｍａｒｙ  Ｆｉｅｓｅｒ編集（ＩＳＢＮ：０−４７１−５８２８３−２）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ．Ｒ．Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２０１０を参照されたい。
【００７８】
式（ＶＩ）の化合物（式中、Ｒ８は、アミノであり、Ｒ９およびＲ１０は、ともに連結してアルキレン鎖（ＣＨ２）Ｗを形成する）は、以下の反応順序によって調製することができる。
【００７９】
【化１０】
2013519662.tif 000012
【００８０】
アミノ基は、次いで、標準的な方法、例えば、ジアゾ化とその後のザントマイヤー反応とによって、他の官能基に変換されてもよい。
【００８１】
核酸配列は、オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列であってもよい。オリゴヌクレオチド配列は、概して、リン酸ジエステル結合によって接合された最高２０個の線状配列として認識されている一方で、ポリヌクレオチド配列は、典型的に、２０個以上のヌクレオチドを有し、様々な量の内部折り畳みを伴う１本鎖または２本鎖であってもよい。また、主鎖は、分子の電荷を低減するか、または生体液中でのその安定性を増加させることが既知の合成化学を組み込むように修飾されてもよい。これらの例には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、連結核酸（ＬＮＡ）、モルホリノオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００８２】
一実施形態では、核酸配列は、転写因子のための天然の細胞結合部位の配列を含む。そのような配列は、転写因子デコイ（ＴＦＤ）と称される。好ましくは、デコイは、細菌Ｓｉｇ結合部位の配列を含む。代替として、デコイは、細菌Ｆｕｒ結合部位の配列を含む。
【００８３】
好適なＴＦＤ配列の例は、配列番号１１、１２、１３、３２、３３、３９、４０、４１、４２、４３、および４４で提供される。
【００８４】
ＴＦＤは、ナノモル濃度で効果的であり、１ｎＭという低濃度においてインビトロおよびインビボで細菌の成長を防止するのに有効であったが、特定の細菌に対して、および患者等のより複雑な設定では、より高い濃度が必要になり得ると予想される。よって、好ましい範囲は、したがって、約１０〜１００ｎＭの間、および最高で約１μΜである。該範囲は、２０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、およびその中間（例えば、２７．２ｎＭ）等の、約１０ｎＭ〜１μΜの間の濃度を含むことが理解されるであろう。
【００８５】
送達部分が、デカリニウムまたはその類似体等の式（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかの化合物である場合、複合体は、どちらも異なる比率を使用して、核酸と化合物（例えば、デカリニウムまたはその類似体）との間に形成される。該比率は、一般的に、Ｎ／Ｐ比と称され（例えば、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ８：３４９３−３５０２を参照されたい）、核酸の中の負に帯電したリン酸塩原子１個あたりの、またはいかなるリン酸塩原子も存在しない時はヌクレオチド１個あたりの、送達分子の中の正に帯電した窒素原子の数を画定する。典型的に、複合体は、０．１〜１の間のＮ／Ｐ比（電荷中和を達成するのに十分である）で、デカリニウム（またはその類似体）とＴＦＤとの間に形成される。本発明は、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、およびその中間（例えば、０．２３）等の、０．１〜１の間の比率を含むことが理解されるであろう。
【００８６】
細菌をインビトロでトランスフェクションさせることが可能な複合体は、動物実験では良好な耐容性を示す。さらに、そのような複合体の成分は、既知の最大耐量（ＭＴＤ）を下回る濃度で使用されてもよい。最大耐量（ＭＴＤ）は、明白な毒性を生じない最高１日用量である。ＭＩＣは、一群の試験動物に投与された時に、長期生存性に関していかなる測定可能な影響も有しない化合物の量として、動物実験によって推定することができる。例えば、Ｎ／Ｐ比が１である１μΜの１００のヌクレオチドＴＦＤを含有する複合体を投与することは、約３ｍｇ／ｋｇのデカリニウム類似体の用量を与える。このデカリニウム類似体の用量は、実質的に、デカリニウムのＭＴＤを下回ることが理解されるであろう。化合物７等のデカリニウムの類似体は、デカリニウムより少ないインビトロでの毒性を示す（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．１６：２４９−２６４）。デカリニウムは、マウスでは、１５ｍｇ／ｋｇのＭＴＤを有するので（Ｇａｍｂｏａ−Ｖｕｊｉｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８２：２３１−２３５）、複合体が、良好な耐容性を示すことが予測される。好適な濃度を算出して、調製することは、当業者の相応な技術および知識の範囲内である。
【００８７】
代替の実施形態では、抗菌性複合体は、核酸配列と、抗菌性ペプチドとを含む。抗菌性ペプチドという用語は、抗微生物性ペプチド、細胞浸透性ペプチド、非リボソーム的に合成されたペプチド、およびグリコペプチドを含み、包含する。
【００８８】
抗微生物性ペプチド（ＡＭＰ；宿主防御ペプチドとも呼ばれる）は、多様かつ広く普及した古代および自然の抗菌物質である。それらは、生来の免疫反応の進化的に保存された成分で、あらゆる種類の生命の中で見られる。抗微生物性ペプチドに対する標的を表し得る、原核生物細胞と真核生物細胞との間には、根本的な差が存在する。これらのペプチドは、新しい治療薬としての可能性を示す、有力な広域抗生物質である。抗微生物性ペプチドは、グラム陰性およびグラム陽性細菌（従来の抗生物質に対して耐性を示す株を含む）、マイコバクテリウム（ヒト型結核菌を含む）、エンベロープウイルスおよび菌類を死滅させることが実証された。大多数の従来の抗生物質とは異なり、抗微生物性ペプチドはまた、免疫調節物質として機能することによって耐量を強化する能力を有し得ると思われる。
【００８９】
抗微生物性ペプチドは、概して、１２個〜５０個のアミノ酸である。これらのペプチドは、アルギニン、リシン、または酸性環境ではヒスチジン、および疎水性残基の大部分（概して、＞５０％）によって提供される、２つ以上の正に帯電した残基を含む。これらの分子の二次構造は、次の４つのテーマに従う。ｉ）α−螺旋構造、ｉｉ）２つ以上のジスルフィド結合の存在によるβ−鎖化構造、ｉｉｉ）ペプチド鎖の単一のジスルフィド結合および／または環化の存在によるβ−ヘアピンまたはループ構造、ｉｖ）拡張構造。これらのペプチドのうちの多くは、自由溶液中で構造化されず、生物学的膜に区切った時にそれらの最終的な構成に折り重なる。ペプチドは、螺旋分子の片側に沿って整列した親水性アミノ酸残基と、反対側に沿って整列した疎水性アミノ酸残基とを含有する。抗微生物性ペプチドのこの両親媒性は、ペプチドを、膜脂質二分子層に区切ることを可能にする。これらのペプチドは、膜透過性化から細胞質標的の範囲に及ぼす作用まで、種々の抗微生物活性を有する。
【００９０】
抗微生物性ペプチドが細菌を死滅させる作用のモードは、様々であり、膜の破壊、代謝の干渉、および細胞質成分の標的化を含む。ペプチドと標的微生物との間の初期接触は、大部分の細菌表面がアニオンであるので、静電的である。それらのアミノ酸組成物、両親媒性、カチオン性電荷、およびサイズは、それらが、膜二分子層に付着してその中に挿入されて、「バレルステーブ」、「カーペット」、または「トロイダル孔」機構の細孔を形成することを可能にする。細胞に浸透すると、ペプチドは、細胞が生きるために必須である細胞内分子に結合し、それによって、細胞壁合成を阻害し、細胞質膜を改変し、オートリシンを活性化し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質合成を阻害し、特定の酵素を阻害する。しかしながら、多くの場合、死滅の正確な機構は、知られていない。多数の従来の抗生物質とは対照的に、これらのペプチドは、静菌性（細菌成長阻害因子）ではなく殺菌性（細菌キラー）であると思われる。
【００９１】
細菌細胞および宿主細胞の抗微生物性ペプチドとの競合において、抗微生物性ペプチドは、哺乳動物細胞に対して細菌細胞と優先的に相互作用し、これは、それらが、哺乳動物細胞に対する重大な毒性を伴わずに、微生物を死滅させることを可能にする。細菌膜の表面は、哺乳動物細胞よりも負に帯電するので、抗微生物性ペプチドは、細菌膜および哺乳類の細胞膜に対して異なる親和性を示す。
【００９２】
コレステロールは、通常、膜安定化物質として哺乳類の細胞膜の中に広く分布しているが、細菌細胞膜の中には存在しないことがよく知られている。これらのコレステロールの存在はまた、概して、脂質二分子層の安定化のため、またはコレステロールとペプチドとの間の相互作用のため、抗微生物性ペプチドの活性も低減する。したがって、哺乳動物細胞のコレステロールは、抗微生物性ペプチドによる攻撃から細胞を保護する。
【００９３】
加えて、膜電位は、ペプチドと脂質との相互作用に影響を及ぼすことがよく知られている。細胞膜の外葉と内葉との間には、負の膜電位が存在する。この内部の負膜電位は、おそらくは、正に帯電したペプチドの膜の中への挿入を促進することによって、膜透過性化を促進する。比較すると、細菌細胞の膜電位は、通常の哺乳動物細胞の膜電位よりも負であり、よって、細菌膜は、正に帯電した抗微生物性ペプチドによって攻撃され易い。
【００９４】
前述のように、ＡＭＰは、一意的かつ多様な分子群であり、それらのアミノ酸組成および構造に基づいて下位群に分けられる。既知の多数のＡＭＰのデータベースは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｂｃｍ．ｕｎｉｔｓ．ｉｔ／〜ｔｏｓｓｉ／ｐａg１．ｈｔｍで見つけることができる。抗感染性を伴うペプチドの他の群としては、非リボソームペプチドが挙げられ、その例には、グラミシジンが挙げられ、その下位群として、ペプチド（一般的に、環式である）がグリコシル化された、グリコペプチド抗生物質を伴うものが挙げられる。これらの例には、ポリミキシンが挙げられる。
【００９５】
本発明者らは、これらの全てのペプチドの機能分類を行った。該ペプチドは、殺菌の機構に基づいてＡＭＰと区別するために、本明細書では抗菌性ペプチド（ＡＢＰ）と称され、細胞浸透性ペプチド、非リボソーム的に合成されたペプチド、およびグリコペプチド等の他の分類の抗菌剤から誘導されるペプチドを含む。本発明は、天然および非天然の合成ペプチドを包含することが理解されるであろう。
【００９６】
分類Ｉ。ＡＢＰであり、これは、膜活性（ポリミキシン、グラミシジン）であり、外膜に穴を開けるのに十分な損傷を引き起こすことによって侵入に影響を及ぼして、そこを通って大分子が通過することができる、細菌内膜の突出（または「気泡」）を形成することを可能にする。これらのペプチドのうちいくつかは、病院で使用されているが、それらが真核生物膜にも損傷を与えるので、毒性に対する懸念がある。
【００９７】
抗菌性ペプチドに対する耐性の割合は著しく低く、これらのペプチドは、本質的に広く普及している。この分類は、大部分がカチオン性であるので、耐性機構は、細菌の外膜に関する電荷密度の変化という形態をとり、実験室では、そのような変化が見られた。したがって、耐性の相対的に低い発生率は、ＡＢＰが、抵抗することが困難であるのではなく、それほど有効ではないという事実を反映し得る。
【００９８】
分類ＩＩ。これは、非常に小さい分類である。これらのＡＢＰは、膜に損傷を与えないが、代わりに細胞内標的を有する。したがって、ペプチドは、それらの標的に到達するように、細菌膜を通して転座させなければならない。結果として、それらは、溶血等を引き起こす真核生物膜への損傷を与えないので、分類ＩのＡＢＰよりも著しく毒性が低い。それらは、カチオン性であるが、膜を横断する能力は、それらの電荷だけではなく、ほとんど未定儀のままである他の広範な構造的性質にも基づくと予想される。結果として、耐性機構は、そのような機構が細菌膜自体の疎水性を変えることを必要とするので、起こる可能性は低いと考えられる。
【００９９】
転座が可能であるＡＢＰの例は、ブフォリンおよび先端を切断した形のブフォリンＩＩ（ＢＦ２）である。このペプチドは、病原菌に対して（弱い）広いスペクトル活性を示す（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２４５−８２５０）。それは、真核生物膜を転座させるために、さらには２８ｋＤａのペプチド（ＧＦＰ）をヒト細胞系に送達するために使用されてきたが（Ｔａｋｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１３１０−１３１５）、これは、エンドサイトーシスを介したものであり、おそらくは、ペプチドのカチオン性に起因する。
【０１００】
ＡＢＰは、グラミシジン等の天然のペプチド、またはブフォリンであってもよい。代替として、ＡＢＰは、ペプチド模倣物、またはブフォリンＩＩもしくはポリミキシンノナペプチド等の天然のペプチドの合成変異体であってもよい。
【０１０１】
生体膜を透過性化する能力を有する抗微生物性ペプチドの例は、Ｐａｐａｇｉａｎｎｉ  他（（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２１：４６５−４９９）で提供されており、デフェンシン、ｐｌｅｕｒｉｃｉｄｉｎ、マガイニン、デルマセプチン、アピデシン、セクロピン、ミクロシン、およびペジオシンが挙げられる。
【０１０２】
生体膜を透過性化する能力を有する抗菌性ペプチドの例は、Ｖａｒｒａ他（（１９９２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５６：３９５−４１１）で提供されており、ランチビオティック、グリコペプチド抗生物質、ポリリシン等のカチオン性ポリペプチド、およびポリアルギニンが挙げられる。
【０１０３】
ＡＢＰの種類および特性を表１に要約する。
【０１０４】
【表１】
2013519662.tif 000013
【０１０５】
ＡＢＰは、静電または共有結合連結によって、核酸に連結されてもよい。具体的には、ＡＢＰの死滅の機構が、膜透過性化ではなく細胞内標的を介したものである場合、複合体は、理想的には、核酸配列とＡＢＰとの間に、好適なリンカーまたは架橋剤等の、共有結合連結を含む。好適なリンカーの例は、カルボキシル基を第一級アミンに連結するものである。例えば、好適なリンカーは、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）であってもよい。
【０１０６】
ＥＤＣは、アミド結合を得るために第一級アミンの連結のためのカルボキシル活性化剤としての使用が知られており、このカルボジイミドの一般的な使用は、タンパク質の核酸への架橋である。
【０１０７】
ＡＢＰは、それ自体が抗微生物活性を有するが、そのようなペプチドは、ＴＦＤと組み合わせた時に、細菌増殖を防止するように相乗的に作用することが分かっている。ＡＢＰは、静菌効果を有するものもあれば、接触時に死滅させるものもある。ペプチドの亜致死濃度がＴＦＤの侵入を可能にすることが分かっている。ペプチドは、ＴＦＤに対してより弱くする応力を細菌に加え、次いで、成長停滞または細胞死を引き起こす応力を阻止する。
【０１０８】
複合体は、ＡＢＰが典型的にそれらの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の５〜１０倍低い濃度であるように調製される。化合物のＭＩＣは、細菌の目に見える成長を防止するその化合物の最小濃度である。典型的に、ＭＩＣは、細菌の摂取培養液を一連の濃度の化合物で一晩インキュベートする、希釈法によって判定され、成長を防止するものがＭＩＣとみなされる。好適な濃度を算出して、調製することは、当業者の相応な技術および知識の範囲内である。
【０１０９】
さらなる実施形態では、本発明の抗菌性複合体は、ａ）核酸配列と、ｂ）アミノアルカンのアミノ成分が複素環式環の一部を形成するアミノ基である、第四級アミン化合物もしくはビスアミノアルカン、またはその不飽和誘導体と、ｃ）抗菌性ペプチドと、を含む。
【０１１０】
別の表現では、本発明の抗菌性複合体は、ａ）核酸配列と、ｂ）キノリンまたはアクリジンの第四級誘導体と、ｃ）抗菌性ペプチドと、を含む。
【０１１１】
特に好ましい実施形態では、抗菌性複合体は、ａ）転写因子デコイと、ｂ）デカリニウム類似体と、随意にｃ）抗微生物性ペプチドと、を含む。
【０１１２】
さらなる態様では、本発明は、１つ以上の細菌性感染症の治療のための好適な製剤中の本発明の複合体の使用に属する。
【０１１３】
具体的には、本発明は、本明細書に記載されるように製剤化される核酸配列を投与することを含む、被検体の細菌感染を治療するための方法を提供する。被検体は、ヒトまたは動物であってもよい。本発明はまた、医療で使用するための、例えば被検体の細菌感染を治療または防止する際に使用するための、本明細書に記載されるように製剤化される核酸配列、および細菌感染を治療するための薬剤の製造のために本明細書に記載されるように製剤化される核酸配列の使用を提供する。
【０１１４】
本発明はさらに、核酸配列と、核酸配列と、送達部分が第四級アミン化合物から選択される、少なくとも１つの送達部分と；アミノアルカンのアミノ成分が複素環式環の一部を形成するアミノ基である、ビスアミノアルカンおよびその不飽和誘導体と；抗菌性ペプチドおよび生理学的に許容される担体または賦形剤と、を含む、薬学的組成物または薬剤に関する。組成物は、付加的に、１つ以上の抗生物質または他の抗菌性化合物もしくは組成物を含んでもよい。
【０１１５】
標的遺伝子の発現に対して予測可能な効果を示し、かつ静菌または殺菌効果を有するために必要な核酸配列の数は、細胞１個あたりわずか約５０００個とすることができる。１００万個もの細菌細胞が、わずか１ｎＭのＴＦＤで効率的に死滅させられることが分かっており（ＷＯ／２０１０／０３８０８３）、０．００１％未満のトランスフェクション効率が死滅を達成するのに十分であることを示唆している。アンチセンス等の細菌性感染症に取り組む他の核酸に基づく戦略と比較すると、細胞を死滅させるために必要なこの分子の数は、１００〜１０００倍少ない。これは、アンチセンス手法およびＴＦＤは、どちらも遺伝子を阻害するように作用するが、ＴＦＤが初期の段階で転写を阻止するのに対し、アンチセンスは、最も一般的な反復法で、転写の生成物（数千個ものｍＲＮＡ分子）を立体配置的に阻止することを、一部反映するものである。第２に、ＴＦＤは、正に誘発されるので生存のためにスイッチを入れる必要がある、必須遺伝子を標的にするように設計され、正に調節される（転写因子は、それ自体の生成を推進する）。インビトロで、この後者の特徴は、遺伝子が誘導されない時に比較的に少数の転写因子のコピーが存在する可能性があり、よって、少数のＴＦＤが誘発を阻止することができる。
【０１１６】
治療状況では、細菌集団の自然な多様性のため、または遺伝子がすでに誘発されているため、細胞１個あたりにより多くの転写因子があってもよい。この状況では、治療効果を見て、有益な効果を得るには用量を１００倍に（１００ｎＭに）増加させ、またはトランスフェクション効率を改善すれば（２桁）十分であると推定するためには、さらに多くのＴＦＤが必要となることが予想される。トランスフェクションは、蛍光顕微鏡を使用して定量化されてもよい（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：１３−２８）。
【０１１７】
本発明による、および本発明に従って使用するための薬学的組成物は、活性成分として、またはそれに加えて、薬剤として許容される賦形剤もしくは希釈剤、任意の好適な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、被覆剤、可溶化剤、または当業者によく知られている他の材料を含んでもよい。そのような材料は、無毒であるべきで、活性成分の有効性に干渉するべきでない。治療的使用のための許容される担体または希釈剤は、薬剤の技術分野でよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）で説明されている。担体または他の材料の正確な性質は、経口であるか、または例えば皮膚、皮下、もしくは静脈の注射によるものであり得る投与経路に依存する。
【０１１８】
活性成分は、送達部分と複合体化（または製剤化）された、ＴＦＤ等の、核酸配列として確定され、送達部分は、送達部分は、第四級アミン化合物；アミノアルカンのアミノ成分が複素環式環の一部を形成するアミノ基である、ビスアミノアルカンおよびその不飽和誘導体；および抗菌性ペプチドから選択される。複合体／製剤では、第四級アミン化合物、ビスアミノアルカン、またはデカリニウムもしくはその類似体等のその不飽和誘導体は、ボラソームの形態である。「ボラソーム」という用語は、化合物が超音波振動処理を受けた後の誘導体の小胞を説明するために、この明細書で使用される（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ａｎｄ  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ  （２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．４９：１２７−１４９）。
【０１１９】
本発明の抗菌性複合体を細菌感染の部位に送達するために、種々の方法が使用されてもよい。インビボおよび／またはインビトロ送達のための方法には、頬もしくは経口送達、静脈送達、感染症への直接注射、または間接注射（例えば、皮下、腹膜内、または他の注射方法）、局所塗布、水性もしくは媒体溶液中の直接露出、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウム、電気穿孔法、ＤＥＡＥ−デキストランに基づくもの、および脂質で媒介されたもの）、トランスジェニック発現（例えば、マイクロインジェクションによって送達されるデコイ発現システム、胚性幹細胞発生、またはレトロウイルス導入）、または当技術分野で知られている他の一般に使用される核酸送達システムのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。投与は、抗生物質の好適な用量と組み合わせてもよく、抗生物質は、核酸配列と同時に投与されてもよく、または別々であってもよい。
【０１２０】
経口投与のための薬学的組成物は、タブレット、カプセル、粉末、または液状であってもよい。タブレットは、ゼラチンまたはアジュバント等の固体担体を含んでもよい。液体薬学的組成物は、概して、水、石油、動物もしくは植物油、鉱物油、または合成油等の液体担体を含む。生理食塩水、ブドウ糖もしくは他の単糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコール等のグリコールが含まれてもよい。
【０１２１】
静脈、皮膚、もしくは皮下注射、または疾患部位での注射の場合、活性成分は、ピロゲンを含まず、好適なｐＨ、張度、および安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形態となる。当業者は、例えば、塩化ナトリウム等の等張ビヒクル、リンゲル液、ラクトリンゲル液、防腐剤、安定剤、バッファ、抗酸化剤を使用して好適な溶液を調製することが可能であり、および／または必要に応じて他の添加剤を含んでもよい。
【０１２２】
いくつかの応用では、薬学的製剤が必要とされない場合がある。例えば、本発明の抗菌性複合体は、賦形剤および／または担体を必要とせずに、それ自体で医薬として耐容性を示し得る。
【０１２３】
代替として、抗菌性複合体は、抗菌性消毒剤として使用するのに好適であり得、よって、好適な水性の形態で必要とされ得る。その場合、複合体は、水性および有機溶媒、ならびにそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。
【０１２４】
本発明の抗菌性複合体は、種々の細菌性感染症が起こるヒトの体内のどこでも、それらを治療するために使用されてもよい。細菌感染の５つの一般的な領域を説明することができる。
【０１２５】
気道感染症は、最も一般的なものであり、上気道感染症は、熱帯適用またはエアロゾル調製で治療することができる、耳、咽喉、および鼻腔を含む。下気道感染症は、一連の細菌病原体によって引き起こされる肺炎、気管支炎、嚢胞性線維症の感染性合併症を含む。
【０１２６】
地域社会および医療活動双方における共通の問題は、尿路感染症であり、尿が感染した状態になり、抗菌剤が、膀胱、平伏、尿管、および腎臓に進入することが必要である。
【０１２７】
消化器官は、感染症にかかり易く、そこでは、細菌は、粘膜侵襲または毒素生成のいずれかによって病気を引き起こし、その例には、コレラの流行が挙げられ、抗生物質は、使用する時に、摂取されるか、または静注で投与される。
【０１２８】
局所塗布によって治療することができる皮膚および軟部組織感染症は、外傷または火傷の後にありがちで、微生物の定着および移入を可能にし、どちらも局所化された、または組織を通して迅速に拡散する感染症をもたらす。皮膚感染症の原因となる微生物は、しばしば、表皮感染症（膿痂疹）、蜂巣炎（血液に拡散する可能性があるより深在性の感染症）、および壊死性筋膜炎（しばしば生命に危険のある急速進行性感染症）を引き起こす、化膿連鎖球菌等の、通常の皮膚フローラから生じる。
【０１２９】
最後に、細菌性髄膜炎等の中央神経系の感染症は、治療が血液脳障壁に浸透しなければならず、また病原菌も有するので、おそらくは治療が最も困難である。
【０１３０】
本発明の抗菌性複合体は、核酸配列が細菌細胞をより敏感にする１つ以上の抗生物質、および／または別の抗菌剤と組み合わせて使用されてもよい。好適な抗生物質は、同時係属出願第ＷＯ  ２００９／０４４１５４号および第ＷＯ  ２０１０／０３８０８３号に記載されている。その中で提供されるリストが包括的でなくてもよいことが理解されるであろう。本発明は、任意の好適な抗生物質、抗菌性化合物、または組成物を含む。
【０１３１】
抗生物質または抗菌性化合物は、本発明の抗菌性複合体と同時に、その前に、またはその後に投与されてもよい。抗生物質／抗菌性化合物、および抗菌性複合体は、同じまたは別個の組成物で投与されてもよい。したがって、本発明は、本明細書で識別および／または説明される抗菌性複合体が、１つ以上の抗生物質または他の抗菌性治療と組み合わせて被検体に投与される、組み合わせ治療を含む。組成物は、付加的に、１つ以上の抗生物質または他の抗菌性化合物もしくは組成物を含んでもよい。
【０１３２】
本発明によって包含される好適なＴＦＤおよび／またはそれらの標的を以下に列記する。本明細書で提供される配列は、１本鎖の結合部位を例証する。しかしながら、自然の、および本発明のＴＦＤでは、配列は、２本鎖であることが理解されるであろう。本明細書で列記される配列に対する相補鎖は、例えばＪｏｓｅｐｈ  ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤａｖｉｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌによる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、２００１から明確かつ容易に導出可能である。
【０１３３】
ＷｈｉＢ７
スメグマ菌ｓｔｒ  ＭＣ２  １５５の中の天然のＷｈｉＢ７結合部位は、以下を含む。
５´−ＣＡＣＣＡＧＣＣＧＡ  ＡＡＡＧＧＣＣＡＣＧ  ＧＡＣＣＣＧＣＡＧＴ  ＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣ  ＣＧＴＧＧＣＣＡＴＴ  ＴＴＴＧＴＣＧＧＡＣ  ＣＣＣＣＣＧＡＧＡＡ  ＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣ  ＡＧＧＡＴＣＣＡＴＣ  ＡＧＣＴＣＡＧＡＣＡ  ＧＡＴＣＡＣ−３´（配列番号１）
【０１３４】
ＷｈｉＢ７  ＴＦＤ：
５´−ＴＧＧ  ＣＣＡ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＧＣＧ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＴＧＧ  ＣＣＴ−３´（配列番号２）
【０１３５】
ＦａｄＲ
大腸菌Ｋ１２の天然のＦａｄＲ結合部位は、以下の配列を含む。
５´−ＡＧＴＡＡＧＴＴＴＣ  ＧＡＡＴＧＣＡＣＡＡ  ＴＡＧＣＧＴＡＣＡＣ  ＴＴＧＴＡＣＧＣＣＧ  ＡＡＣＡＡＧＴＣＣＧ  ＡＴＣＡＧＣＣＡＴＴ  ＴＡＡ−３´（配列番号３）
【０１３６】
ＦａｄＲ  ＴＦＤの１つの例は、以下の配列を含む。
５´−ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＡＡＣ  ＴＧＡ  ＴＣＧ  ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＧＴＧ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＴＣＡ−３´（配列番号４）
【０１３７】
ＹｖｃＧ／ＹｖｃＦ
黄色ブドウ球菌のＹｙｃＦおよびＹｙｃＧの天然の結合部位（ＬｙｔＭおよびＳｓａ促進因子における）は、以下を含む。
【０１３８】
ＹｙｃＦ＿ＬｙｔＭ
５´−ＧＣＴＡＴＴＴＴＧＴＡＡＴＧＡＣＡＡＴＧＴＡＡＴＧＡＧＴＴＴＡＧＴＡＡＡＡＡ−３´（配列番号５）
【０１３９】
ＹｙｃＦ＿ＳｓａＡ
５´−ＡＴＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＴＡＡＣＡＧＡＣＴＴＡＴＴＴＴＡ−３´（配列番号６）
【０１４０】
ＹｙｃＧ／ＹｙｃＦ  ＴＦＤ配列には、以下が挙げられる。
ＬｙｔＭ  ＴＦＤ  ５´−ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＣＡＡ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＡＧＴ  ＡＡＡ  ＡＡ  ３´（配列番号７）
【０１４１】
ＳｓａＡ  ＴＦＤ  ５´−ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  Ａ  ３´（配列番号８）
【０１４２】
シグマ５４またはＳｉｇＢ
黄色ブドウ球菌および肺炎桿菌の天然の結合部位は、以下を含む。
【０１４３】
ＳＡ＿ｓｉｇ：５´−ＴＴＡＴＴＡＴＡＴＡ  ＣＣＣＡＴＣＧＡＡＡ  ＴＡＡＴＴＴＣＴＡＡ  ＴＣＴＴＣ−３´（配列番号９）
【０１４４】
ＫＰ＿ｓｉｇ：５´−ＣＣＧＡＴＡＡＧＧＧ  ＣＧＣＡＣＧＧＴＴＴ  ＧＣＡＴＧＧＴＴＡＴ−３´（配列番号１０）
【０１４５】
Ｆｕｒ
黄色ブドウ球菌および大腸菌のＦｕｒ結合のコンセンサス配列は、以下を含む。
【０１４６】
ＳＡ＿ｆｕｒ：５´−ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＡＧＴ  ＴＡＡ  ＣＣＣ  ＴＴ−３´（配列番号１１）。Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（２００１）１８３：４６８）に記載されているようなコンセンサス配列（「Ｆｕｒ  ＢＯＸ」）。
【０１４７】
ＥＣ＿ｆｕｒ：５´−ＧＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＴＣＡＴＴＡＴＣ−３´（配列番号１２）。ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）２８３：５３７に記載されているようなコンセンサス配列。
【０１４８】
ヘリコバクターピロリの天然結合配列は、以下を含む。
ＨＰ＿ｆｕｒ：５´−ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＣＣＡ  ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＴＡＧ  ＣＡＴ  ＡＡＡ  ＴＧＡ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＡＡＡ−３´（配列番号１３）
【０１４９】
ＴｃｄＲ
ディフィシル菌のコンセンサス結合部位は、以下を含む。
５´−ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＡＧ  ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ａ  ＴＴ−３´（配列番号１４）。Ｄｕｐｕｙ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．（２００６）５５：１１９６に記載されているようなコンセンサス配列（ＴｃｄＲ、配列中、〜３５および〜１０のボックスに下線あり）
【０１５０】
Ｖｆｒ
緑膿菌のコンセンサスおよび２つの天然の結合部位は、以下の通りである。
【０１５１】
ＰＡ＿Ｖｆｒ：５´−ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  ＧＡＴ  ＣＡＣ  ＡＴＴ  Ｔ−３´（配列番号１５）。
Ｋａｎａｃｋ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００６）５５：１１９６に記載されているようなコンセンサス配列。
【０１５２】
ＰＡ＿ＴｏｘＡ：５´−ＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡ  ＴＣＣＡＧＴＴＣＡＴ  ＡＡＡＴＣＣ−３´（配列番号１６）
【０１５３】
ＰＡ  ＲｅｇＡ：５´−ＧＴＡＡＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧ−３´（配列番号１７）
【０１５４】
ＮｔｒＣ
肺炎桿菌の天然の結合部位は、以下を含む。
５´−ＧＣＴＴＴＧＣＡＣＴＡＣＣＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＡＡＡＣＧＡＴＣＧＣＴ−３´（配列番号１８）
【０１５５】
ＡｒｓＲ
天然結合配列の例は、以下を含む。
ＨＰ＿ＡｍｉＥ：５´−ＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡ  ＴＧＡＴＴＡＡＡＧＴ  ＴＴＴＣＡＴＡＴＴＣ  ＡＴＴＡＴＡＡＡＴＣ  ＣＧＴＴＴＡＣＡＣＡ  ＡＴＴＡＴＴ−３´（配列番号１９）
【０１５６】
ＨＰ＿ＲｏｃＦ：５´−ＧＡＡＡＴＴＧＴＴＣ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴ  ＣＣＡＴＴＴＧＣＴＴ  ＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴ  ＧＧＴＴＧＴＴＡＡＴ  ＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧ  Ａ−３´（配列番号２０）
【０１５７】
グリコペプチド耐性コンセンサス配列（ＧＩＳＡ）
例えば、ｔｃａＡの促進因子に見られる、既知の毒性の正の調節因子である、コンセンサス配列（Ｍａｋｉ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（２００４）４８：１９５３）の例が、本発明の抗菌性複合体で使用されてもよい。
【０１５８】
ＳＡ＿ＴｃａＡ：５´−ＴＧＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡ−３´（配列番号２１）
【０１５９】
ＡｑｒＡ
毒性と関連付けられる調節剤であるＡｇｒによって正に調節される遺伝子に見られるモチーフの配列の例（Ｄｕｎｍａｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００１）１８３：７３４１）は、以下の通りである。
【０１６０】
ＳＡ＿Ａｇｒ＿２０９３：５´−ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＡＡＣ  ＡＧＧ  ＡＧＴ  ＡＡ−３´（配列番号２２）
【０１６１】
ＳＡ＿Ａｇｒ＿１２６９：５´−ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＴ−３´（配列番号２３）
【０１６２】
黄色ブドウ球菌Ｓｉｇ  ＴＦＤの好適なプライマー配列は、以下の通りである。
ＳＡｓｉｇＢ  ＦＯＲ：ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  Ｔ  ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  Ａ（配列番号２４）；および
ＳＡＳｉｇＢ  ＲＥＶ：ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＧＡＡ  ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  Ｃ  Ａ（配列番号２５）
【０１６３】
黄色ブドウ球菌Ｆｈｕ  ＴＦＤの好適なプライマー配列は、以下の通りである。
ＳＡｆｈｕ  ＦＯＲ：ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＡＧＴ  ＴＡＡ  ＣＣＣ  ＴＡ（配列番号２６）；および
ＳＡｆｈｕ  ＲＥＶ：ＡＧＧ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＡＡ  ＴＡＧ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＴＡＧ  ＴＡ（配列番号２７）
【０１６４】
黄色ブドウ球菌ＳｓａＡ  ＴＦＤの好適なプライマー配列は、以下の通りである。
ＳｓａＡ  ＦＯＲ：ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  Ａ（配列番号２８）；および
ＳｓａＡ  ＲＥＶ：ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＴＴＡ  ＣＡＡ  ＡＴＴ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  Ａ（配列番号２９）
【０１６５】
Ｓｉｇ亜鈴型ＴＦＤ（ＳＡ３  ＴＦＤと称される）を形成するために、以下のリン酸化オリゴヌクレオチドを合成してもよい。
ＳｉｇＤＢ＿ＳＡ３：ＣＴＴＧＧ  ＴＴＴＴＴ  ＣＣＡＡＧ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  Ｔ  ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＡＴＡ（配列番号３０）；および
ＳｉｇＤＢ＿ＳＡ３：Ｐ−ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＣＧＧ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＧＡＡ  ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  Ｃ（配列番号３１）
【０１６６】
ＷａｌＲ＿ＴＦＤを形成するために使用されるオリゴヌクレオチドの対の配列は、以下の通りである。
ＷａｌＲ１：５´−Ｐ−ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＧ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＴＡＡ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＣＡＧ  ＴＡＣ−３´（配列番号３２）；および
ＷａｌＲ２：５´−Ｐ−ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＧＴＡ  ＣＴＧ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＣＴＴ  ＴＴＡ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＡＣＴ  ＣＡＴ  ＴＣＡ  ＴＴＡ−３´（配列番号３３）
【０１６７】
ＴＦＤの他の好適なプライマーは、以下を含む。
ｆａｂＢｆ：５´−ｔｃｔ  ｔｔａ  ａａｔ  ｇｇｃ  ｔｇａ  ｔｅｇ  ｇａｃ  ｔｔｇ−３´（配列番号３４）；および
ｆａｂＢｒ：５´−ａｇｔ  ａａｇ  ｔｔｔ  ｃｇａ  ａｔｇ  ｃａｃ  ａａｔ  ａｇｅ  ｇｔａ−３´（配列番号３５）
【０１６８】
Ｋｓ５４ｆ：Ｐ−ＣＣＧ  ＡＴＡ  ＡＧＧ  ＧＣＧ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  ＴＴＧ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＴＡＴ  Ａ（配列番号３６）；および
Ｋｓ５４ｒ：Ｐ−ＡＴＡ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  ＣＧＧ  Ａ（配列番号３７）
【０１６９】
ＷａＩＲ  ＴＦＤのコンセンサス配列は、ＷがＡまたはＴである、ＴＧＴ  ＷＡＷ  ＮＮＮ  ＮＮＴ  ＧＴＡ  ＡＷ（配列番号３８）であってもよい。
【０１７０】
ＳｉｇＢ  ＴＦＤのコンセンサス配列は、ＫがＧまたはＴであり、ＷがＡまたはＴである、ＧＫＴ  ＴＷＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＫ  ＧＧＴ  ＡＷ（配列番号３９）であってもよい。
【０１７１】
ＫＰ  ｓｉｇ  ＴＦＤ配列の例は、ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＴＴＴ  ＣＧＣ  Ｔ（配列番号４０）である。
【０１７２】
ＫＰ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤのコンセンサス配列は、ＷがＡまたはＴである、ＴＧＧ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＷＴＴ  ＴＧＣ  Ｗ（配列番号４１）であってもよい。
【０１７３】
そのようなＴＦＤは、同時係属出願第ＷＯ  ２００９／０４４１５４号および第ＷＯ  ２００９／０４４１５４号に記載されているように、調製および試験されてもよい。
【０１７４】
以下、本発明を限定的でない実施例および図によりさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】デカリニウムの化学構造を示す図である。
【図２】１０，１０´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（９−アミノ−１、２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジクロライドの化学構造を示す図である。
【図３】１０，１０´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジクロライドの化学構造を示す図である。
【図４】動的光散乱法で測定した、１００μΜのｓＣ７ボラソームのサイズ分布を示す図である。
【図５】動的光散乱法で測定した、１００μΜのｓＣ７＿１２ボラソームのサイズ分布を示す図である。
【図６】ＴＦＤに対する化合物７ボラソームの結合を測定するための、ＳＹＢＲグリーンＤＮＡ結合アッセイを示す図である。
【図７】ＴＦＤに対する化合物７＿１２ボラソームの結合を測定するための、ＳＹＢＲグリーンＤＮＡ結合アッセイを示す図である。
【図８】化合物７のボラソームおよびＳｉｇ＿ＴＦＤとともに形成した複合体の安定性を定量化するための、ＳＹＢＲグリーンＤＮＡ結合アッセイ示す図である。
【図９Ａ】化合物７のボラソームおよびＳｉｇ＿ＴＦＤとともに形成したＴＦＤ複合体の電子顕微鏡写真である。
【図９Ｂ】化合物７のボラソームおよびＳｉｇ＿ＴＦＤとともに形成したＴＦＤ複合体の電子顕微鏡写真である。
【図１０】化合物７とともに形成したＳｉｇ複合体を伴うＥＭＲＳＡ−１５の成長遅延を示す、インビトロのバイオアッセイを示す図である。
【図１１】化合物７とともに形成したＥＣ＿Ｆｕｒ複合体を伴う大腸菌の成長遅延を示す、インビトロのバイオアッセイを示す図である。
【図１２】化合物７＿１２とともに形成したＳｉｇ複合体を伴うＥＭＲＳＡ−１５の成長遅延を示す、インビトロのバイオアッセイを示す図である。
【図１３】ヘアピンＳｉｇ  ＴＦＤ／化合物７＿１２複合体対スクランブルされた複合体およびＭＲＳＡ株の成長に関する空の対照の効果を示す、光学密度に対する経過時間のグラフである。
【図１４】ヘアピンＳｉｇ  ＴＦＤ／デカリニウム複合体対スクランブルされた複合体およびＭＲＳＡ株の成長に関する空の対照の効果を示す、光学密度に対する経過時間のグラフである。
【図１５】ＳＡ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ／化合物７複合体、ＳＡ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ／化合物７＿１２複合体、または食塩液で治療したマウスの体重増加を例証するグラフであり、ａ）およびｂ）は、独立した実験の繰り返しを示す。
【図１６】化合物７＿１２、ＳＡ＿ＳｉｇＴＦＤ／化合物７＿１２複合体、ＳＡ＿Ｓｉｇ＿ＳｃｒＴＦＤ／化合物７＿１２複合体、ＳＡ＿ＳｉｇＴＦＤ、バンコマイシン、またはビヒクルによるマウスの治療の後の、腎臓組織の負担を示す棒グラフである。
【図１７】グラミシジンと混合したＳｉｇ  ＴＦＤを伴うＥＭＲＳＡ−１５の成長遅延を示す、インビトロのバイオアッセイを示す図である。
【図１８】ブフォリンＩＩと混合したＳｉｇ  ＴＦＤを伴うＥＭＲＳＡ−１５の成長遅延を示す、インビトロのバイオアッセイを示す図である。
【図１９】化合物７とともに形成したブフォリンＩＩ誘導体化複合体による、染料標識したオリゴヌクレオチドのＭＲＳＡへの送達を確認する、蛍光顕微鏡検査を示す図である。
【図２０】ポリミキシンと混合したＥＣ＿Ｆｕｒ  ＴＦＤを伴う大腸菌の成長遅延を示す、インビトロのバイオアッセイを示す図である。
【図２１】化合物７とともに形成したブフォリンＩＩ誘導体化複合体による、染料標識したオリゴヌクレオチドのＭＲＳＡへの送達を確認する、蛍光顕微鏡検査を示す図である。
【図２２】化合物７とともに形成したブフォリンＩＩ誘導体化Ｓｉｇ  ＴＦＤ複合体を伴うＥＭＲＳＡ−１５の成長遅延を示す、インビトロのバイオアッセイを示す図である。
【０１７６】
（配列の簡単な説明）
配列番号１−スメグマ菌ｓｔｒ  ＭＣ２  １５５の天然のＷｈｉＢ７結合部位
配列番号２−ＷｈｉＢ７転写因子デコイ
配列番号３−大腸菌Ｋ１２の天然のＦａｄＲ結合部位
配列番号４−ＦａｄＲ転写因子デコイ
配列番号５−黄色ブドウ球菌のＹｙｃＦ／ＹｙｃＧの天然結合部位
配列番号６−黄色ブドウ球菌のＹｙｃＦ／ＹｙｃＧの天然結合部位
配列番号７−ＬｙｔＭデコイ
配列番号８−ＳｓａＡデコイ
配列番号９−黄色ブドウ球菌のＳｉｇＢの天然結合部位
配列番号１０−肺炎桿菌のＳｉｇＢの天然結合部位
配列番号１１−黄色ブドウ球菌のＦｕｒ結合のコンセンサス配列
配列番号１２−大腸菌のＦｕｒ結合のコンセンサス配列
配列番号１３−ヘリコバクターピロリのＦｕｒの天然結合配列
配列番号１４−ディフィシル菌のＴｃｄＲのコンセンサス結合部位
配列番号１５−緑膿菌のＶｆｒのコンセンサス結合部位
配列番号１６−緑膿菌のＶｆｒの天然結合部位
配列番号１７−緑膿菌のＶｆｒの天然結合部位
配列番号１８−肺炎桿菌のＮｔｒＣの天然結合部位
配列番号１９−ヘリコバクターピロリのＡｒｓＲの天然結合配列
配列番号２０−ヘリコバクターピロリのＡｒｓＲの天然結合配列
配列番号２１−黄色ブドウ球菌のグリコペプチド耐性のコンセンサス配列
配列番号２２−黄色ブドウ球菌のＡｇｒ結合モチーフ
配列番号２３−黄色ブドウ球菌のＡｇｒ結合モチーフ
配列番号２４および２５−ＳＡｓｉｇＢ  ＴＦＤのＰＣＲ調製のための順方向および逆方向プライマー配列
配列番号２６および２７−ＳＡｆｈｕ  ＴＦＤのＰＣＲ調製のための順方向および逆方向プライマー配列
配列番号２８および２９−ＳｓａＡ  ＴＦＤのＰＣＲ調製のための順方向および逆方向プライマー配列
配列番号３０−リン酸化Ｓｉｇ亜鈴型ＴＦＤオリゴヌクレオチド配列
配列番号３１−リン酸化Ｓｉｇ亜鈴型ＴＦＤオリゴヌクレオチド配列
配列番号３２−ＷａＩＲの結合部位を組み込んだリン酸化オリゴヌクレオチド
配列番号３３−ＷａＩＲの結合部位を組み込んだリン酸化オリゴヌクレオチド
配列番号３４および３５−ＦａｂＢ促進因子の順方向および逆方向プライマー
配列番号３６および３７−肺炎桿菌のσ５４因子の認識配列を含有するＴＦＤの順方向および逆方向プライマー
配列番号３８−ＷａＩＲ  ＴＦＤコンセンサス配列
配列番号３９−ＳｉｇＢ  ＴＦＤコンセンサス配列
配列番号４０−ＫＰ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ配列
配列番号４１−ＫＰ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤコンセンサス配列
配列番号４２−グラム陰性Ｓｉｇ  ＴＦＤヘアピン配列
配列番号４３および４４−スクランブルされた黄色ブドウ球菌Ｓｉｇ結合部位の順方向および逆方向プライマー
配列番号４５および４６−ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクトルからの標的配列の増幅に使用される、順方向および逆方向プライマー
配列番号４７および４８−ＷｈｉＢ７ＴＦＤのための順方向および逆方向プライマー
配列番号４９−ＳＡ  ＳｉｇヘアピンＴＦＤ配列
配列番号５０−ＳＡ＿ＳＩＧスクランブル化ヘアピンＴＦＤ配列
配列番号５１−ブフォリンＩＩペプチド配列
配列番号５２−Ｔｅｆで誘導体化したＳＡＳｉｇ  ＴＦＤ
【０１７７】
実施例１．デカリニウム類似体およびＴＦＤを伴う複合体の形成
Ｗｅｉｓｓｉｇ他は、ＤＮＡをミトコンドリアに送達するために、デカリニウム（ＤＱＡ）を使用できることを示した（ＷＯ９９／０１３０９６）。超音波振動処理によって、ＤＱＡは、リン脂質小胞に類似した、直径が約７０ｍｍ〜７００ｍｍの間の球状の凝集体を形成する。これらの凝集体は、ＷＯ９９／０１３０９６では「ＤＱＡソーム」と称し、ＷｅｉｓｓｉｇおよびＴｏｒｃｈｉｌｉｎでは「ボラソーム」と称した（（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．４９：１２７−１４９）。「ボラソーム」という用語は、この明細書では、化合物が超音波振動処理を受けた後のＤＱＡおよびその類似体の小胞を説明するために使用される。
【０１７８】
複合体は、好適な送達化合物と自己組織化された転写因子デコイ（ＴＦＤ）オリゴヌクレオチドから成る。ＴＦＤオリゴヌクレオチドは、長さが４０〜１００のヌクレオチドであり、天然のリン酸の主鎖を持つ。それは、標的とされた転写因子のための結合部位を形成するために、自己アニールし、５´および３´末端を保護するために、自然に形成するヘアピンを有する。その例を以下に示す（ＧＮ＿ＳＩＧ＿ＨＰ）。
【０１７９】
【化１１】
2013519662.tif 000014
【０１８０】
代替の構成では、ＴＦＤのいずれかの末端の小さいヘアピンループが、分子を分解から保護し、亜鈴型（ＤＢ）形状をＴＦＤに与えるように作用する。
【０１８１】
材料および方法
送達化合物の調製。１５ｍｇの各化合物（Ｓｙｇｎａｔｕｒｅ  Ｌｔｄ．）を１０ｍｌのメタノール中に溶解し、回転式蒸発器を使用して完全に乾燥し、そして、１０ｍＭの最終濃度まで、５ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４に再懸濁した。化合物７は、容易に溶解して、透明な淡黄色の溶液を与える。化合物７＿１２は、１時間にわたって超音波処理器の浴槽の中に配置した後に溶解して、不透明な淡黄色の溶液を形成した。どちらの溶液も、ＭＳＥ  Ｓｏｎｉｐｒｅｐ１５０を使用して、氷上でのプローブ超音波振動処理を受けさせた。使用条件：６０サイクルの３０秒オン（振幅１０ミクロン）および６０秒オフ。この処理の後、化合物７＿１２の試料は、完全に透明であった。どちらの試料も、遠心分離して破片を除去し、ｓＣ７（超音波振動処理された化合物７）またはｓＣ７＿１２（超音波振動処理した化合物７＿１２）と称する。このステップは、小胞または「ボラソーム」を形成した。
【０１８２】
亜鈴型ＴＦＤ複合体の調製。２μｇのＴＦＤ（単量体環を形成するために結紮した３２ｂｐのオリゴヌクレオチド）を、１ｍｌの５ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４のバッファ、またはＬＢブロス（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉブロス：１％（ｗ／ｖ）のバクト−トリプトン、５％（ｗ／ｖ）のバクト−イーストエキス、５％（ｗ／ｖ）のＮａＣＩ）のいずれかと混合し、次いで、室温で、１〜１０μｌの間のｓＣ７か、またはｓＣ７＿１２のいずれかと混合した。
【０１８３】
ヘアピンＴＦＤ複合体の調製。オリゴヌクレオチドを、１ｍＭの濃度（すなわち、１８０μｌ中に１８０ｎモル）で水中に懸濁した。懸濁液を水中で１０μΜに希釈し、乾熱ブロックの中で２分間９５℃に加熱し、その後に、懸濁液を熱から取り除き、室温まで冷却することができるようにした。ＴＦＤが適切にアニールされたことを確認するために、１μｌのＴＦＤを、１μｌの１０×  ＮＥＢバッファ１、６μｌの水、および１μｌのＥｘｏｎｕｄｅａｓｅ  Ｉ（ＮＥＢ）と混合した。対照混合物は、１μｌのＴＦＤを取り除いている。混合物を、３％低融点アガロースゲルおよび０．５×  ＳＹＢＲグリーンで着色したＴＡＥ上で分離する前に、３０分間３７℃でインキュベートした。正しいＴＦＤ立体配座を、エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性によって確認した。
【０１８４】
送達複合体を調製するために、１０ｍｇの化合物を１２．５ｍｌの５ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．５中に懸濁し（最終濃度０．８ｍｇ／ｍｌ）、超音波振動処理によって溶解した（氷上で３０サイクル、３０秒オン、３０秒オフ、１０μ）。結果として生じる溶液の吸光度は、３２７ｎｍで測定して、正確な濃度を確立した。１２．５μｌの送達化合物を、４０μｌの１０μΜのＴＦＤおよび４４７．５μｌの５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）と混合し、微小プローブを取り付けたＭＳＥ１５０Ｓｏｎｉｐｒｅｐを使用して、氷浴中で超音波振動処理した。３０秒オン（出力５０％、約１０μ）および３０秒オフで、３０サイクルの超音波振動処理を行った。
【０１８５】
ＤＮＡ結合アッセイ。小胞で結合されているＴＦＤの割合を判定するために、ＳＹＢＲグリーン結合アッセイを使用した。ＴＦＤ複合体は、バッファが５μｌの１０分の１希釈のＳＹＢＲグリーンＩ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＤＭＳＯで調製される１０，０００×ストック）を含有する適応で、Ｈｅｐｅｓバッファ中で前述のように形成した。蛍光を測定して（λＥＸ  ４９７ｎｍ、λＥＭ  ５２０ｎｍ）、ＳＹＢＲグリーンのＴＦＤへの結合を反応停止させるために、どのくらいのボラソームを添加する必要があるのかを判定した。
【０１８６】
サイズ判定。ボラソームのサイズは、Ｄｙｎａｐｒｏ  Ｔｉｔａｎ  ＤＬＳ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して、動的光散乱法によって判定した。
【０１８７】
粒子の視覚化。粒子のサイズは、電子顕微鏡を使用して測定した。試料は、撮像前にウラニル酢酸塩で直接着色した。
【０１８８】
結果
１．１  ｓＣ７ボラソームのサイズ分布
ｓＣ７ボラソームは、１０ｍＭの濃度で、５ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ中で調製した。ボラソームは、それらのサイズ分布を動的光散乱法によって測定する前に、同じバッファ中で１０００倍に希釈した。質量による大部分の材料は、３μｍを超える直径を有し、非特異的な凝集体または塵埃によって引き起こされたものである。残りの粒子は、６８ｎｍの平均直径を有した（図４）。これは、サイズ分布が１６９ｎｍ±５０ｎｍであると推定し、分布は狭いとコメントしていた、公表された小胞のサイズ分布（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．１１：９１−９６：表Ｉ、化合物７を参照されたい）とは若干異なる。ｓＣ７ボラソームの値は、異なる実験パラメータおよび測定機器が差に反映され得るが、公表された値により近い。実際に、希釈物であるにもかかわらずｓＣ７ボラソームが安定していたという事実は、それらが、希釈中に単量体に戻るので（１０ｎｍ未満の直径を有する）、デカリニウム溶液の超音波振動処理によって形成されたボラソームを超えて安定性を増加させたことを示している。
【０１８９】
ｓＣ７およびｓＣ７＿１２ボラソーム（１．２節を参照されたい）の直径を表２に一覧表で表す。
【０１９０】
表２．ＳＹＢＲグリーンの固定濃度のＴＦＤへの結合を反応停止させるために必要な、ｓＣ７およびｓＣ７＿１２ボラソームの最小濃度の計算値
【０１９１】
【表２】
2013519662.tif 000015
【０１９２】
１．２  ｓＣ７＿１２ボラソームのサイズ分布
ｓＣ７＿１２ボラソームは、１０ｍＭの濃度で、５ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ中で調製した。ボラソームは、それらのサイズ分布を動的光散乱法によって測定する前に、同じバッファ中で１０００倍に希釈した。１．１節に記載されているように、大きい材料からの信号は、無視した。残りの粒子は、４８．４ｎｍまたは１９７．７ｎｍの平均直径を有し、１：２．５の比で存在した（図５）。これは、ｓＣ７ボラソームの直径と、大幅に異なっていた。しかしながら、粒子は、類似した濃度のデカリニウムとともに形成したものについて他で報告されたものよりも良好なサイズ分布を有し、化合物７から形成されたボラソームについてＷｅｉｓｓｉｇによって得られたものと同等であった（Ｗｅｉｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．１１：９１−９６）。
【０１９３】
１．３  ＤＮＡ結合アッセイによる、ｓＣ７およびｓＣ７＿１２のＴＦＤへの最適な結合条件の確立
ＳＹＢＲグリーンＩ染料は、特に２本鎖ＤＮＡと結合して、結合すると強い蛍光信号が得られる。異なる濃度および種類のボラソームの存在下で信号の変化を測定することによって、ボラソームによって除去された染料のため、ＳＹＢＲグリーン結合を反応停止させるために必要なボラソームの最小量を計算することができた。これは、蛍光信号に添加されるボラソームの量をプロットした滴定曲線の線状部分から、外挿法によって達成した。２μｇ  ＴＦＤ／ｍｌの固定濃度を使用することで、ｓＣ７ボラソームの最小濃度が、６．１３μｇ／ｍｌであることが分かった（図６）。これらの濃度では、モノマーＣ７によるいかなる反応停止も見られなかった。
【０１９４】
ｓＣ７＿１２ボラソームの最小濃度は、９．２６μｇ／ｍｌであることが分かった（図７）。
【０１９５】
ＴＦＤ複合体の調製では、必要とされる最小量のボラソームを使用した。そのような濃度はまた、ボラソームの調製の間で試料間のばらつきが可能な限り少なくなることを確実にするためにも使用した。全体的に、約２０％のばらつきが見られ、生体機能へのいかなる観察可能な影響もなかった。
【０１９６】
複合体の安定性は、ＳＹＢＲグリーン染料結合による正規化された蛍光を観察することによって測定した。ｓＣ７ボラソームとともに形成したＴＦＤ複合体の滴定曲線は、４℃で貯蔵した時に、７２時間を超えて一定のままであり（図８）、ここで例証された条件が、形成された複合体の安定性の相当な改善を提供することを示している。
【０１９７】
１．４  ｓＣ７ボラソームおよびＴＦＤ複合体の電子顕微鏡写真撮像
ｓＣ７ボラソームとＴＦＤとの間で形成されたＴＦＤ複合体を、酢酸ウラニルで陰性染色して、電子顕微鏡によって視覚化した。２つの実施例を図９Ａおよび９Ｂに示す。５０〜１００ｎｍの間の円形粒子がはっきりと見え、濃染された内部には細粒があり、その内部には、ＤＮＡの凝縮体であり得る細粒がはっきりと分かる。
【０１９８】
実施例２．化合物７ボラソームのＴＦＤの送達は、ＭＲＳＡを死滅させる
材料および方法
結紮（ＤＢ−ＴＦＤ）によるＴＦＤ亜鈴型の調製
２つのオリゴヌクレオチドを合成し、それぞれ、黄色ブドウ球菌代替のシグマタンパク質のための認識部位の１つの鎖を含有している。分子のいずれかの末端では、小さいヘアピンループが、分子を分解から保護するように作用した。各オリゴヌクレオチドは、２５０ｐｍｏｌ／μｌの濃度で、ｄＨ２Ｏ中で再懸濁した。Ｓｉｇ亜鈴型ＴＦＤ（Ｓｉｇ  ＴＦＤと称する）を形成するために、以下のリン酸化したオリゴヌクレオチドを合成した。
【０１９９】
配列番号３０−ＳｉｇＤＢ１：ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＧＴＡ  ＴＡＴ  ＡＡＴ  Ａ
【０２００】
配列番号３１−ＳｉｇＤＢ２：Ｐ−ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＣＧＧ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＧＡＡ  ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  Ｃ
【０２０１】
アニールする時に、これらは以下の分子を形成した。
【０２０２】
【化１２】
2013519662.tif 000016
【０２０３】
３０μｌの各オリゴヌクレオチドを、２７μｌのｄＨ２Ｏと混合し、以下のＰＣＲプログラムを使用してアニールした。アニール：９５℃で３分間、−０．１℃／ｓで８℃まで冷却して終了。続いて、１０μｌの１０×  ＮＥＢリガーゼバッファ、および３μｌのＨＣ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を添加した。混合物は、１６℃で一晩インキュベートした。次いで、材料をＴ７エキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で十分に消化して、未結紮オリゴヌクレオチドを全て除去し、そして、エタノール沈殿を２回行うことによって回収した。スクランブルされたバージョンのＳｉｇ結合部位（Ｓｃｒ  ＴＦＤと称する）を含有する、ＤＢ＿ＴＦＤも調製した。この場合、使用するリン酸化プライマーは、以下の通りとした。
【０２０４】
配列番号４３−ＳｉｇＳｃｒ＿ＳＡ１：ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＴＡＧ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  Ｔ  ＴＴＴ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＴＡＴ
【０２０５】
配列番号４４−ＳｉｇＳｃｒ＿ＳＡ２：ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  Ａ
【０２０６】
複合体の形成
２μｇのいずれかのＴＦＤを結合するために必要なｓＣ７ボラソームの最小量は、経験的に確立され、適切な量のボラソームを、５ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４中でＴＦＤと混合して、複合体を形成した。ＴＦＤナノ粒子の希釈物は、以降のバイオアッセイで使用した。
【０２０７】
９６ウェルプレートにおける成長研究の実行
臨床的に単離されたＭＲＳＡ株の成長への影響を判定するために、Ｓｉｇ  ＴＦＤまたはｓＣ７ボラソームと混合したＳｃｒ  ＴＦＤから成る複合体を使用して、成長アッセイを行った。９６ウェルプレートを使用して、細菌細胞の成長への影響を判定するためアッセイを行った。各ウェルは、ＬＢ媒体から成る２００μｌのブロスを含有する。１μｌの種々の濃度のＴＦＤ複合体を各ウェルに加え、黄色ブドウ球菌の細菌増殖への影響は、インキュベーション中に周期的にブロスの吸光度を測定することによって観察した。プレートは、振盪しながら３７℃でインキュベートし、（４５０ｎＭでの）吸光度読み取り値は、プレートリーダーを使用して取り込んだ。
【０２０８】
結果
２．１  ＴＦＤ複合体は、インビトロでＭＲＳＡを効率的に死滅させることができる
ＴＦＤ複合体は、「Ｓｉｇ  ＴＦＤ」と呼ばれる、ＭＲＳＡ細胞を死滅させることが知られているＴＦＤ、または対照としてのスクランブルされたバージョンの「Ｓｃｒ  ＴＦＤ」を使用して、ｓＣ７ボラソームとともに調製した。ＬＢブロスに接種して、５×１０５／ｍｌの最終濃度の細胞を提供するために、ＭＲＳＡ株ＥＭＲＳＡ１５を使用した。２００μｌアリコートを、９６ウェルプレートのウェルに分配した。ウェルは、デカリニウム類似体（ｓＣ７対照）の任意の抗菌効果について、様々な濃度のＳｉｇ  ＴＦＤ複合体、Ｓｃｒ  ＴＦＤ複合体、対照としての同等の濃度のｓＣ７ボラソームを補充したか、またはウェルを処理しなかった（図１０）。どちらのＴＦＤ複合体も、５００ｎｇ／ｍｌの濃度のｓＣ７と、５μｇ／ｍｌのＴＦＤとを含有した。ｓＣ７対照は、５００ｎｇ／ｍｌの濃度のボラソームで構成した。
【０２０９】
細胞成長は、未処理の試料、ｓＣ７対照、および対照複合体（Ｓｃｒ  ＴＦＤから成る）について本質的に類似していた。しかしながら、Ｓｉｇ  ＴＦＤ複合体は、細菌増殖を防止した。したがって、ｓＣ７ボラソームとＳｉｇＴＦＤとの組み合わせは、ＭＲＳＡ株を死滅させたが、対照ＴＦＤ複合体は死滅させなかった。これは、複合体がＭＲＳＡに効果的に治療ＴＦＤを送達していることに起因した。送達作用単独では、膜の損傷が同時に起こり、対照複合体も、同等の量のｓＣ７ボラソームも細胞成長に影響を及ぼさなかったので、細菌を死滅させなかった。
【０２１０】
実施例３．化合物７ボラソームによるＴＦＤの送達は、大腸菌を死滅させる
材料および方法
ＰＣＲによるＦｕｒ  ＴＦＤの調製
Ｆｕｒ  ＴＦＤは、大腸菌の中のＦａｂＢ遺伝子の上流に起こる脂肪酸合成酵素（ＦａｄＲ）の転写調節因子のための結合部位を組み込むように設計した。ＦａｂＢ遺伝子は、脂肪酸合成に関与する酵素をコード化する（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（２００５）１８３：５２９２）。促進因子配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドは、以下の通りとした。
【０２１１】
配列番号３４−ｆａｂＢｆ  ５´−ｔｃｔ  ｔｔａ  ａａｔ  ｇｇｃ  ｔｇａ  ｔｃｇ  ｇａｃ  ｔｔｇ−３´
配列番号３５−ｆａｂＢｒ  ５´−ａｇｔ  ａａｇ  ｔｔｔ  ｃｇａ  ａｔｇ  ｃａｃ  ａａｔ  ａｇｃ  ｇｔａ−３´
【０２１２】
例えば、結果として生じる断片は、ｐＧＥＭＴＥａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の中に結紮され、ＰＣＲ  ＴＦＤは、挿入物の真横に位置するベクターの主鎖にアニールするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅によって合成した。
【０２１３】
配列番号４５  ＴＥｆ：５´−ｇｇｃ  ｃｇｃ  ｃａｔ  ｇｇｃ  ｇｇｃ  ｃｇｃ  ｇｇｇ  ａａｔ  ｔｃ−３´
配列番号４６  ＴＥｒ：５´−ａｇｇ  ｃｇｇ  ｃｃｇ  ｃｇａ  ａｔｔ  ｃａｃ  ｔａｇ  ｔｇ−３´
【０２１４】
ＰＣＲ生成物は、エタノール沈殿し、５００〜１０００ｎｇ／μｌの濃度のＴＥバッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣＩ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）中で再懸濁した。
【０２１５】
マイコバクテリウムスメグマチスから分離させたゲノムＤＮＡとの増幅反応で使用した時に、類似したサイズのＰＣＲ断片を生じさせる配列を有する、対照ＴＦＤも生成した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りとした。
【０２１６】
配列番号４７−ＷｈｉＢ７．ｆ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＣＣＡ  ＣＧＧ
配列番号４８−ＷｈｉＢ７．ｒ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＴＧＧ  ＣＣＡ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＧＴＧ
【０２１７】
結果
３．１．ＴＦＤ複合体は、インビトロで大腸菌を効率的に死滅させることができる
ＴＦＤ複合体は、大腸菌、ＥＣ  Ｆｕｒ、および対照ＴＦＤであるＥＣ  ＦｕｒＳｃｒ  ＴＦＤに対して活性であることが知られているＴＦＤとともに形成した。実験は、実施例２．１に記載されているように行い、類似した結果が得られた（図１１）。ここでも、結果は、ｓＣ７ボラソームおよびＥＣ  Ｆｕｒ  ＴＦＤとともに形成した複合体が、鉄を制限した媒体中で大腸菌（株ＤＨ１０Ｂ）の成長を防止したことを示している。
【０２１８】
実施例４．化合物７＿１２ボラソームによるＴＦＤの送達は、ＭＲＳＡを死滅させる
材料および方法
ＴＦＤ複合体は、ｓＣ７＿１２ボラソームを使用したことを除いて、Ｓｉｇ  ＴＦＤまたはＳｃｒ  ＴＦＤとともに、実施例２に記載されているように形成した。結果として生じたＴＦＤ複合体は、ＭＲＳＡ株ＥＭＲＳＡ１５の成長を防止する際のそれらの活性について試験を行った。
【０２１９】
結果
４．１  ＴＦＤ複合体は、インビトロでＭＲＳＡを効率的に死滅させることができる
ＴＦＤ複合体は、「Ｓｉｇ  ＴＦＤ」と呼ばれる、ＭＲＳＡ細胞を死滅させることが知られているＴＦＤ、および対照としてのスクランブルされたバージョンの「Ｓｃｒ  ＴＦＤ」を使用して、ｓＣ７＿１２ボラソームとともに調製した。ＬＢブロスに接種して、５×１０５／ｍｌの最終濃度の細胞を提供するために、ＭＲＳＡ株ＥＭＲＳＡ１５を使用した。２００μｌアリコートを、９６ウェルプレートのウェルに分配した。ウェルは、デカリニウム類似体（ｓＣ７＿１２対照）の任意の抗菌性効果について、様々な濃度のＳｉｇ  ＴＦＤ複合体、Ｓｃｒ  ＴＦＤ複合体、対照としての同等の濃度のｓＣ７＿１２ボラソームを補充したか、またはウェルを処理しなかった（図１２）。どちらのＴＦＤ複合体も、８００ｎｇ／ｍｌ（１．３μΜ）の濃度のｓＣ７＿１２と、５μｇ／ｍｌ（１５３ｎＭ）のＴＦＤとを含有した。ｓＣ７＿１２対照は、８００ｎｇ／ｍｌの濃度のボラソームで構成した。
【０２２０】
細胞成長は、未処理の試料、ｓＣ７＿１２対照、および対照複合体（Ｓｃｒ  ＴＦＤを含む）について本質的に類似していた。しかしながら、Ｓｉｇ  ＴＦＤ複合体は、細菌増殖を防止した。したがって、ｓＣ７＿１２ボラソームとＳｉｇ  ＴＦＤとの組み合わせは、ＭＲＳＡ株を死滅させたが、対照ＴＦＤ複合体は死滅させなかった。これは、複合体がＭＲＳＡに効果的に治療ＴＦＤを送達していることに起因した。送達作用単独では、膜の損傷が同時に起こり、対照複合体も、同等の量のｓＣ７＿１２ボラソームも細胞成長に影響を及ぼさなかったので、細菌を死滅させなかった。
【０２２１】
実施例５．種々の送達化合物によるヘアピンＴＦＤの送達は、ＭＲＳＡを死滅させる
ヘアピンＴＦＤ  ＳＡ  Ｓｉｇ、およびデカリニウム化合物７または化合物７＿１２のいずれかを含有するＴＦＤ複合体を、実施例１で提示した方法を用いて調製した。形成された小胞のサイズ分布は、標準的な方法論を用いたＭａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｚｅｒを使用して測定したものを、以下の表３に提示する。
【０２２２】
【表３】
2013519662.tif 000017
【０２２３】
小胞のサイズ分布は、異なる配列のＴＦＤが使用された時に変化しないことが分かった。ＳＡ、ＳＩＧ  ＨＰ（黄色ブドウ球菌の中の代替のシグマ因子と結合するように標的化された）の配列は、以下の通りである。
【０２２４】
配列番号４９−５´−ｇｃｇ  ａａｇ  ｃｇａ  ａｇａ  ｔｔａ  ｇａａ  ａｔｔ  ａｔｔ  ｔｃｃ  ａｔｇ  ｇｇｔ  ａｔａ  ｔａａ  ｔａｃ  ｔｔｇ  ｇｔｔ  ｔｔｔ  ｃｃａ  ａｇｔ  ａｔｔ  ａｔａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｔｇｇ  ａａａ  ｔａａ  ｔｔｔ  ｃｔａ  ａｔｃ  ｔｔｃ−３´
【０２２５】
５．１．化合物７＿１２と複合体化されたＳＡ＿ＳＩＧ＿ＨＰ  ＴＦＤの有効性
ＴＦＤ複合体は、一方がいかなるＴＦＤも含有しないもの（空）で、もう一方がＴＦＤ  ＳＡ＿ＳＩＧ＿Ｓｃｒ＿ＨＰを含有するスクランブルされたバージョンのＳＡ  ＳＩＧ  ＨＰ（スクランブル）である、２つの対照スネアと同じく、実施例１に記載されているように調整し、以下の配列を有する。
【０２２６】
配列番号５０−５´−ｇｃｇ  ａａｇ  ｃａｔ  ｃｔｔ  ｇｔａ  ｔｇｃ  ａａａ  ｔａｇ  ａａｔ  ｇａａ  ｔａａ  ｔａｇ  ｔｔｔ  ｇａｃ  ｔｔｇ  ｇｔｔ  ｔｔｔ  ｃｃａ  ａｇｔ  ｃａａ  ａｃｔ  ａｔｔ  ａｔｔ  ｃａｔ  ｔｃｔ  ａｔｔ  ｔｇｃ  ａｔａ  ｃａａ  ｇａｔ−３´
【０２２７】
１μｌの各送達複合体を、１μｌあたり３×１０６コロニー形成単位で、１μｌのＭＲＳＡ株ＥＭＳＲＡ１５のグリセロールストックを接種した、２００μｌのＬＢブロスに添加した。培養液は、穏やかに振盪しながら３７℃で成長させ、培養液の光学密度を、３０分間隔でプレートリーダーで測定した。
【０２２８】
図１３に示される、光学密度に対する経過時間のプロットは、Ｓｉｇ複合体が、５００ｎｇ／ｍｌの化合物７＿１２および２０ｐｍｏｌのＴＦＤで、ＭＲＳＡ株の成長を効果的に防止したことを実証している。Ｓｃｒ複合体（どちらも類似した濃度の化合物７＿１２およびＴＦＤ）で処理した細菌は、空の対照および未処理の試料のどちらよりもゆっくりと成長した。これは、以前の実験で観察されているが、スクランブルされたＴＦＤを細胞に送達する作用によって成長が減速されたためと解釈される。ＳＡ＿ＳＩＧ＿ＨＰも同じだが、そのＴＦＤが応力反応を阻害する時に、細胞は回復できない。空の対照および未処理の試料の成長は、区別できなかった。
【０２２９】
したがって、黄色ブドウ球菌の必須経路を阻止するように設計される、ＳＩＧ＿ＳＡ＿ＨＰ  ＴＦＤを含有する複合体は、細菌細胞にとって致命的であるが、スクランブルされたバージョンのＴＦＤまたは送達ビヒクル単独の送達は、効果がない。
【０２３０】
５．２．デカリニウムと複合体化されたＳＡ＿ＳＩＧ＿ＨＰの有効性
ＴＦＤ複合体は、使用されるデカリニウムの濃度が化合物７＿１２の濃度よりも６倍高かったことを除いて、上記の５．１節に記載したように調整した。同様に、２つの対照スネアを調製し、一方は、いかなるＴＦＤも含有しないもの（空）とし、もう一方は、ＴＦＤ  ＳＡ＿ＳＩＧ＿Ｓｃｒ＿ＨＰを含有するスクランブルされたバージョンのＳＡ  ＳＩＧ  ＨＰ（スクランブル）とした。
【０２３１】
１μｌの各送達複合体を、１μｌあたり３×１０６コロニー形成単位で、１μｌのＭＲＳＡ株ＥＭＳＲＡ１５のグリセロールストックを接種した、２００μｌのＬＢブロスに添加した。培養液は、穏やかに振盪しながら３７℃で成長させ、培養液の光学密度を、３０分間隔でプレートリーダーで測定した。図１４に示される、光学密度に対する経過時間のプロットは、Ｓｉｇ抗菌剤が、３μｇ／ｍｌの化合物７＿１２および１０ｐｍｏｌのＴＦＤで、ＭＲＳＡ株の成長を効果的に防止したことを実証している。Ｓｃｒ抗菌剤（どちらも類似した濃度のデカリニウムおよびＴＦＤ）で処理した細菌は、空の対照および未処理の試料のどちらよりもゆっくりと成長した。これは、以前の実験で観察されているが、スクランブルされたＴＦＤを細胞に送達する作用によって成長が減速されたためと解釈される。ＳＡ＿ＳＩＧ＿ＨＰも同じだが、そのＴＦＤが応力反応を阻害する時に、細胞は回復できない。空の対照および未処理の試料の成長は、区別できなかった。
【０２３２】
したがって、黄色ブドウ球菌の必須経路を阻止するように設計される、ＳＩＧ＿ＳＡ＿ＨＰ  ＴＦＤを含有する複合体は、細胞にとって致命的であるが、スクランブルされたバージョンのＴＦＤ、または送達ビヒクル単独の送達は、効果がない。
【０２３３】
実施例６．マウス敗血症モデルにおけるＭＲＳＡ治療時の化合物Ｃ７＿１２によるＳＡ  Ｓｉｇ  ＴＦＤの有効性
この研究で使用したマウス（雄のＣＤ１マウス）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｍａｒｇａｔｅ  ＵＫ）によって供給され、特異的病原体のないもの（送達時に１６〜１８ｇ）であった。全てのマウスの体重は、実験の開始時に２２〜２５ｇであった。
【０２３４】
６．１．耐容性研究
動物は、１治療群あたり２匹のマウスの群で治療を行い、したがって、研究全体で６匹の動物を使用した。全てのマウスは、研究の１日目に計量し、ランダムに箱の中に配置した。マウスは、１０ｍｌ／ｋｇで静脈内投与される、以下の治療を受けた。
・１００μΜのＳＡ  Ｓｉｇ  ＴＦＤ（２ｍｇ／ｍｌ；配列番号９）、および５２５μΜの生理食塩水中の化合物７（０．３１５ｍｇ／ｍｌ）；
・１００μΜのＳＡ  Ｓｉｇ  ＴＦＤ（２ｍｇ／ｍｌ；配列番号９）、および５２５μΜの生理食塩水中の化合物７＿１２（０．３１５ｍｇ／ｍｌ）；および
・生理食塩水単独。
ＴＦＤおよび送達分子の濃度は、予測された効果的な用量よりも約１０倍高くなるように選択した。
【０２３５】
マウスは、１００時間の期間にわたり、治療後に毎日計量した後に、安楽死させた。肺、肝臓、脾臓および腎臓を取り出し、視覚的に検査し、計量した。図１５は、独立した実験の繰り返しを示す指標ａ）およびｂ）で、３つの群全ての体重増加を示す。
【０２３６】
対照治療（生理食塩水）と、ＴＦＤおよび送達化合物の組み合わせで治療したものとの間には、いかなる有意な差も見られなかった。したがって、静脈内投与の後、全ての治療は、良好な耐容性を示した。いかなる深刻なイベントも報告されなかった。治療の後、マウスは、いかなる苦痛の徴候も伴わずに飲食した。治療したマウスの体重増加は、ビヒクル対照と同じであった。解剖したところ、腎臓、肺、肝臓、または消化管にはいかなる全体的な異常も示さなかった。腎臓、肺、および肝臓の重量は、正常な範囲内であった。全ての試験化合物は、耐容性を示し、この耐容性研究で用いられる最大用量までさらに投薬するのに好適である。
【０２３７】
６．２．組織負荷研究
動物は、１治療群あたり８匹のマウスの群で治療を行い、したがって、この研究全体で４８匹の動物を使用した。黄色ブドウ球菌ＥＭＲＳＡ１６の２つの１０ｍｌの培養液を調製し、３７℃で一晩、オービタルシェーカー上に配置した（２２０ｒｐｍ）。翌日、この黄色ブドウ球菌ＥＭＲＳＡ１６培養液をシェーカーから取り出し、ペレット化し、２回洗浄し、その後、０．１３２の光学密度（１．５×１０８ｃｆｕ／ｍｌ）まで食塩水中で再懸濁した。次いで、この黄色ブドウ球菌ＥＭＲＳＡ１６の保存溶液を、さらに生理食塩水中で１：１．５希釈（１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ）し、すなわちマウス１匹あたり２．０×１０７個の細菌とした。
【０２３８】
４８匹の全てのマウスは、次いで、マウスの尾静脈への静脈内注射によって、０．２ｍｌの１．０×１０８／ｍｌの懸濁液で感染させた。また、接種後の残りの懸濁液中の１ｍｌあたりの黄色ブドウ球菌ＥＭＲＳＡ１６の細菌数を数えて、感染負荷を確認した。
【０２３９】
マウスは、感染後１時間、９時間、および１７時間に化合物またはビヒクルのいずれかで治療を行ったが、１時間後にだけバンコマイシンを投与した。治療は、下記に表３に一覧表で表されるように、化合物７＿１２および種々のＴＦＤとともに調製された抗生物質複合体の組み合わせであった。
【０２４０】
【表４】
2013519662.tif 000018
【０２４１】
感染から２５時間後、全ての動物を計量し、次いで、安楽死させた。直ちに腎臓を取り出し、氷冷した無菌リン酸緩衝生理食塩水（＋０．０５％のＴｗｅｅｎ８０）中で均質化した。器官ホモジェネートを、ＣＬＥＤ寒天培地上で定量的に培養し、最高３日間にわたって３７℃でインキュベートし、コロニー数を数えた。培養負荷からのデータは、Ｓｔａｔｓ  Ｄｉｒｅｃｔを用いて、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定によって分析した。
【０２４２】
６．３．組織負荷研究
投与される感染用量は、比較的に急性の感染、すなわち、治療に敏感である感染を確立するために、マウス１匹あたり３．７×１０７個の細菌を目標とした。マウスは、（Ａ）送達化合物（化合物Ｃ７＿１２）単独、（Ｂ）１ｎＭのＳＡ＿Ｓｉｇ／化合物７＿１２複合体、（Ｃ）１ｎＭのスクランブルされた対照複合体、（Ｄ）１ｎＭのＳＡ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ単独、（Ｅ）コロニー形成単位（ｃｆｕ）２倍の低減を達成するのに十分な濃度で使用される、バンコマイシン、または（Ｆ）ビヒクルのいずれかの全身注射で治療した。治療の後、マウスを死亡させ、測定した腎臓内に負荷が見つかった（図１６）。
【０２４３】
結果の統計的分析は、Ｓｉｇスネアで抗菌治療したマウスが、バンコマイシンによって達成した負荷に類似した低減を達成した。全ての他の対照は、ビヒクル治療に対して類似した負担を示す（表４）。
【０２４４】
表４．インビボの統計学的分析結果。Ｋｒｕｓａｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ：Ｓｉｇ  ＴＦＤ複合体の全ての対比較（Ｄｗａｓｓ−Ｓｔｅｅｌ−Ｃｈｒｉｔｃｈｌｏｗ−Ｆｌｉｇｎｅｒ）
【０２４５】
【表５】
2013519662.tif 000019
【０２４６】
この実験でのＳｉｇ複合体は、インビトロおよびインビボの双方で、ＭＲＳＡに対してナノモル濃度で迅速な殺菌活性を有することが分かった。
【０２４７】
実施例７．抗菌性ペプチドによって媒介されるＴＦＤの送達
材料および方法
以下の抗菌性ペプチドを、ＴＦＤを細菌細胞に送達する能力について検定した。グラミシジン、ポリミキシンノナペプチド（どちらもＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入）、およびブフォリンＩＩ（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２４５−８２５０）。典型的に、実施例１に記載されるような１μｇのＳｉｇ  ＤＢ−ＴＦＤおよびＳｉｇＳｃｒ  ＤＢ−ＴＦＤを、総容量５μｌの５０ｍＭのＮａＣｌ中で、０．２〜５μｇのグラミシジンと混合した。このうち１μｌを、０．３光学密度（６００ｎｍでの吸光度）という元の密度でＥＭＲＳＡ−１５のグリセロールストックの１／１００希釈で接種した、２００μｌのＬＢブロスに添加して、９６ウェルプレートのウェルに等分した。実験は、３通り行った。プレートは、振盪しながら３７℃でインキュベートし、（４５０ｎＭでの）吸光度読み取り値は、プレートリーダーを使用して取り込んだ。
【０２４８】
結果
７．１．グラミシジンは、ＴＦＤを黄色ブドウ球菌に効果的に送達する
１μｇのＳｉｇ  ＤＢ−ＴＦＤを、ＥＭＲＳＡ−１５および１５０ｎｇ／ｕｌのグラミシジンを接種したＬＢ媒体に添加し、いかなる細菌増殖ももたらさなかった。対照的に、ＴＦＤ単独、グラミジン単独、またはスクランブルされたバージョンのＤＢ−ＴＦＤと混合したものは、未処理の対照と同様に成長した（図１７）。
【０２４９】
７．２．ブフォリンＩＩは、ＴＦＤを黄色ブドウ球菌に効果的に送達する
２１個のアミノ酸のブフォリンＩＩペプチドは、以下の配列で構成した。ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ（配列番号５１）。ブフォリンＩＩと混合したＳｉｇ  ＴＦＤは、膜活性抗微生物性ペプチドブフォリンＩＩと混合した時にＥＭＲＳＡ−１５の成長を抑制し、インビトロアッセイの９６ウェルプレートにおいて細菌の成長を防止した。Ｓｉｇ  ＴＦＤの配列のスクランブルされたバージョンである対照ＴＦＤ（Ｓｃｒ）は、未処理のブロスまたはペプチド単独で処理した細胞と比較した時に、成長に対していかなる識別可能な影響も有しなかった（図１８）。
【０２５０】
代替として、蛍光標識したオリゴヌクレオチドを、ＴＦＤの代用として使用した。これは、いかなるＴＦＤ分子として予測された活性も有しないが、蛍光標識したオリゴヌクレオチドは、蛍光標識を組み込んでおり、よって、その摂取は、蛍光顕微鏡によって観察することができる（図１９）。
【０２５１】
７．３．ポリミキシンは、ＴＦＤを大腸菌に効果的に送達する
グラム陰性の活性抗微生物性環式グリコペプチドポリミキシンと混合した時に、ＥＣ  Ｆｕｒ  ＴＦＤは、ＤＨ５ａの成長を抑制し、鉄を制限した媒体を使用して、９６ウェルプレートのインビトロアッセイで、細菌の成長を防止した。対照ＴＦＤ、すなわちＦｕｒ  ＴＦＤと同じサイズの無関係な配列であるＷｈｉＢ７  ＴＦＤは、未処理のブロスまたはペプチド単独で処理した細胞と比較した時に、成長に対していかなる識別可能な影響も有しなかった（図２０）。
【０２５２】
実施例８．ブフォリンＩＩと共役させたＴＦＤ／デカリニウム複合体の送達
材料および方法
抗微生物性ペプチドを伴う複合体の誘導体化
ＴＦＤ複合体は、架橋剤ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、抗微生物性ペプチドブフォリンＩＩで誘導体化し、その後、製造業者によって説明される２ステップの連結プロトコルに適応させる。
【０２５３】
ブフォリンＩＩペプチドは、合成し、凍結乾燥し、そして、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１ＭのＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、０．５ＭのＮａＣＩ、ｐＨ６．０）中で１ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。１ｍｌのこの溶液を、０．４ｍｇのＥＤＣおよび１.１ｍｇのスルホＮＨＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、５〜１２０分間（最も一般的には３０分間）室温でインキュベートした。インキュベーション後、１．４μｌの２−メルカプトエタノールを添加して、ＥＤＣを反応停止させた。組み込まれていないＥＤＣおよびスルホＮＨＳは、低分子量カットオフ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、２Ｋ  ＭＷＣＯ）を伴う、管を使用した透析によって、ペプチド試料から除去した。
【０２５４】
濃縮したＴＦＤ複合体は、実施例２および３に記載されている技術を使用して調製した。１．５ｍｇ／ｍｌの濃度の３５μｌのＴＦＤを、１３０μｌのＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理食塩水；０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．２、０．１５ＭのＮａＣＩ）および３．１５ｍｇ／ｍｌの濃度の３５μｌの超音波振動処理した化合物７（ボラソーム）と混合した。典型的に、９０μｌの濃縮したＴＦＤ複合体を、１０μｌの誘導体化したブフォリンＩＩと混合し、室温で２時間にわたって反応させた。反応物を、１０ｍＭのヒドロキシルアミンの添加によって反応停止させた。
【０２５５】
バイオアッセイでの使用前に、誘導体化したＴＦＤナノ粒子を、適切な濃度に希釈した。
【０２５６】
代替として、蛍光で標識したオリゴヌクレオチドをＴＦＤの代用として使用した。これは、いかなるＴＦＤ分子として予測された活性も有しないが、蛍光標識したオリゴヌクレオチドは、蛍光標識を組み込んでおり、よって、その摂取は、蛍光顕微鏡によって観察することができる。
【０２５７】
結果
８．１．ブフォリンＩＩで誘導体化したＴＦＤ複合体は、オリゴヌクレオチドを黄色ブドウ球菌に効果的に送達する
誘導体化したＴＦＤ複合体は、ＴＦＤを、５´末端にフルオレセイン染料を含有した、蛍光標識したオリゴヌクレオチドＴｅｆで置換したことを除いて、記載されているように形成した。オリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りであった。
【０２５８】
配列番号５２−Ｔｅｆ−フルオレセイン−ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＡＣ  ＴＡＧ  ＴＧＡ。
【０２５９】
誘導体化した複合体を、ＭＲＳＡ株ＥＭＲＳＡ−１５を接種した２００μｌのＬＢブロスに添加し、３７℃で振盪しながら一晩成長させた。翌朝、細胞を遠心分離によって採取し、等しい容量のＰＢＳ中で４回洗浄した。細菌懸濁液の滴を、顕微鏡用スライド上に配置して、空気乾燥した。細胞は、次いで、スライドにブンゼン炎を通過させることによって熱定着させた。次いで、スライドをレフラーメチレンブルー（水：メタノール：１％（ｗ／ｖ）ＫＯＨの６９：３０：１（ｖ／ｖ）の溶液中に５ｍｇ／ｍｌのメチレンブルー）の溶液に浸し、１分間放置し、その後に、過剰な溶液を水で洗浄し、Ｃａｉｒｎ  ＣＣＤ蛍光顕微鏡を使用して細胞を視覚化した。
【０２６０】
明視野（蛍光なし）の図では、細菌が互いに凝集していることをはっきり見ることができ（図２１）、蛍光の図では、送達に影響を及ぼす誘導体化したナノ粒子と一致して、標識したオリゴヌクレオチドが内在化されたことを見ることができる。誘導体化した複合体を伴わずに培養液中で成長させた細菌は、いかなる蛍光も示さなかった。
【０２６１】
８．２．ブフォリンＩＩで誘導体化したＴＦＤ複合体は、ＭＲＳＡの細菌増殖を防止することができる
Ｓｉｇ  ＴＦＤまたは（実施例２のように）対照としてＳｃｒ  ＴＦＤを含有した、誘導体化した複合体を生成した。誘導体化した複合体のストック中のＴＦＤ成分の濃度は、８μΜであり、複合体は、希釈して、１６ｎＭのＴＦＤおよび１．８μΜの化合物７の作業濃度を得た。
【０２６２】
この濃度では、Ｓｉｇ  ＴＦＤを含有する誘導体化した複合体は、ＭＲＳＡ株の成長を完全に防止した一方で、対照ＴＦＤを含有する誘導体化した複合体は、成長を防止しなかった。実際に、成長は、未処理の試料に類似しおり、ｓＣ７は、１．８μΜの化合物７ボラソームを含有するブロスを制御する（図２２）。
【０２６３】
したがって、ブフォリンＩＩで誘導体化した複合体は、Ｓｉｇ  ＴＦＤを病原菌に送達して成長を防止する。さらに、使用される複合体の有効濃度は、誘導体化していない複合体のものよりも低かった（４．１節）。
【０２６４】
実施例９
他のデカリニウム類似体を伴う複合体の形成
本明細書に記載された一般的な合成方法に従うことによって、以下のデカリニウム類似体を調製した。
【０２６５】
１０，１０´−（オクタン−１，８−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジヨージド、
１０，１０´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジヨージド、
１０，１０´−（テトラデカン−１，１４−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジヨージド、
１０，１０´−（オクタデカン−１，１８−ジイル）ビス（９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジニウム）ジヨージド、
５，５´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（１１−アミノ−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６Ｈ−シクロヘプタ［ｂ］キノリニウム）ジヨージド、
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジヨージド、
１，１´−（ドデカン−１，１２−ジイル）ビス（４−アミノキノリニウム）ジヨージド、
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（４−メトキシキノリニウム）ジヨージド、および
１，１´−（デカン−１，１０−ジイル）ビス（２−アミノキノリニウム）ジヨージド。
【０２６６】
上記に列記した化合物は、本発明に従ってさらなる複合体を調製するために、実施例１〜８に記載されている方法で使用してもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１２】
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【図１６】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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