(57)【要約】  式（Ｉ）で表される新規なフルクトシル化プエラリンおよびその製造方法、並びに脳心血管疾病および／または癌関連疾病の治療用薬物の製造における使用。式（Ｉ）中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立して水素、メチル基、エチル基、ホルミル基、アセチル基、メチルアミノ基及び硫酸基から選択され、Ｒはフルクトースモノグリコシルまたは２〜５のフルクトースが接続したオリゴサッカリルである。フルクトシル基化プエラリンの製造方法は、水系または非水系におけるプエラリンからフルクトシル化プエラリンおよびオリゴサッカリルプエラリンへの生物学的変換を含む。【化１】2013540769.tif 000016
2013540769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）の構造を有するフルクトシル化プエラリン。
【化１】
2013540769.tif 000014
（Ｉ）
式中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立して水素、メチル基、エチル基、ホルミル基、アセチル基、メチルアミノ基及び硫酸基から選択され、；Ｒはフルクトースモノグリコシルまたは２〜５のフルクトースが接続したオリゴサッカリルであり、その構造は式（ＩＩ）に示す通りである：
【化２】
2013540769.tif 000015
（ＩＩ）
式中、ｎ＝０〜４である。
【請求項２】
フルクトシル化酵素活性を有する発酵液若しくは発酵液上澄み、または純化したフルクトシル化酵素若しくはその組換発現たんぱく質を使用して、プエラリンを含む変換液について生体内変換反応を行い、プエラリンをフルクトシル化プエラリンに変換することを含む、請求項１記載のフルクトシル化プエラリンの調製方法。
【請求項３】
変換終了後、変換液の中の菌体細胞または菌体たんぱく質などの不純物を除去し、その後樹脂精製により得られた目標留分を回転蒸発または冷凍乾燥し、フルクトシル化プエラリン粉末または結晶体を得ることを含む、請求項２に記載の調製方法。
【請求項４】
前記発酵液または発酵液上澄みが、フルクトシル化プエラリン活性を有する微生物の発酵により得られる；好ましいのは、前記微生物がアルスロバクタ・ニコチアナエ(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６)（ＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．：Ｍ２０１０１６４）である、請求項２または３に記載の調製方法。
【請求項５】
前記フルクトシル化酵素またはその組換発現たんぱく質がβ−Ｄ−フルクトフラノシダーゼまたはその組換発現たんぱく質であり；好ましいのは、前記β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼは関節胞子菌属細菌から由来し、その分子量は約６０ｋＤａ、Ｎ端前の５個のアミノ酸配列はそれぞれＡＴＥＰＶであることである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項６】
微生物の発酵に用いられる発酵培養基は以下を含み：サッカロース５〜８０ｇ／Ｌ、ペプトン５〜５０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．４〜４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２０．５〜５ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４０．１〜２ｇ／Ｌ、ｐＨ６〜８であり；好ましいのは、発酵条件が：２５〜４０℃、１０〜４００ｒｐｍ振とうフラスコで振盪または発酵槽で撹拌して通気し、回転速度通気量は１〜６ｖｖｍ、１０〜４００ｒｐｍ、発酵時間は６〜４８時間であり；更に好ましいのは、発酵培養基がサッカロース１５ｇ／Ｌ、ペプトン２５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２２ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４０．２ｇ／Ｌを含み、ｐＨ７．５であり；発酵条件が更に好ましいのが：３０℃、２４０ｒｐｍで振とうフラスコで１６時間振盪または発酵槽で撹拌して通気し、回転速度通気量は４ｖｖｍ、３００ｒｐｍで、６時間発酵することである、請求項２〜５のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項７】
前記生体内変換反応が水相または非水相において行われ；好ましいのは、前記水相変換が以下を含むことであり：１０〜４００ｒｐｍ振とうフラスコで振盪または発酵槽で撹拌し、プエラリン濃度は０．１ｇ／Ｌを上回る数値から飽和までであり、グリコシル供与体はフルクトースまたはサッカロースまたは２つの混合物であり、プエラリンとグリコシル供与体モル比は１：１〜１：２００であり、反応系の１０％〜５０％を占めるフルクトシル化酵素１０−１００Ｕ／ｍＬの発酵液または発酵液上澄みを加え、任意の１種類pH４〜８の緩衝溶液の中で行い、変換温度は２５〜４０℃、反応時間は６〜９６時間であり；好ましい条件は以下の通りであり：１０ｇ／Ｌプエラリン、１００ｇ／Ｌサッカロースをグリコシル供与体とし、２０％のフルクトシル化酵素３０Ｕ／ｍＬを含む発酵液上澄みを、１／１５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．８６のリン酸塩緩衝溶液の５Ｌ発酵槽の中に加え、３０℃、３００ｒｐｍで１２時間撹拌変換し；好ましいのは、前記非水相変換条件に以下を含むことであり：１０〜４００ｒｐｍ振とうフラスコで振盪または発酵槽で撹拌し、５〜５０％のジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、メタノール、アセトンまたはエタノールから選択した１種または数種の親水性有機溶剤を使い、プエラリン濃度は５〜２００ｇ／Ｌであり、プエラリン濃度は５〜１２０ｇ／Ｌ、グリコシル供与体はフルクトースまたはサッカロースまたは２つの混合物であり、プエラリンとグリコシル供与体のモル比は１：１〜１：２００であり、反応系の１０％〜５０％を占めるフルクトシル化酵素１０−１００Ｕ／ｍＬを含む発酵液または発酵液上澄みを加え、反応時間は６〜９６時間であり；好ましい条件は以下の通りであり：２０％のフルクトシル化酵素３０Ｕ／ｍＬを含む発酵液上澄みを、１／１５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．８６のリン酸塩緩衝溶液の５Ｌ発酵槽に加え、３０℃、３００ｒｐｍで７２時間撹拌変換する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項８】
前記樹脂精製はフルクトシル化プエラリンを含む変換液をＡＢ−８マクロ孔質樹脂の吸着により、選択として、例えば非水相変換であり、前記吸着は変換液における有機溶剤を低温蒸発して除去または有機溶剤を２％未満の体積比まで希釈した条件の下で行い；吸着後はまず溶離液で残りのグリコシル供与体を洗い落とし、また溶離液で勾配溶離または段階溶離してそれぞれフルクトシル化プエラリンを得て；さらに１０倍カラムベッド体積でｐＨ４〜４．５の蒸留水を使用して残りのグリコシル供与体を洗い落とし、その後５〜３０％のメタノールまたはエタノール溶液で勾配溶離または段階溶離してそれぞれフルクトシル化プエラリンを得る、請求項２〜７のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項９】
溶離液を使用し残りのプエラリンを洗い落として回収し；好ましいのは、１００％のメタノールまたはエタノールを使用して残りのプエラリンを洗い落として回収する、請求項２〜８のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１０】
請求項１記載のフルクトシル化プエラリンの脳心血管関連疾病および／または腫瘍関連疾病の治療用薬物の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物製薬技術分野に属し、具体的にプエラリンの新規誘導体、生体内変換法およびその薬物応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プエラリン（ｐｕｅｒａｒｉｎ）はマメ科の植物クズ（ｐｕｅｒａｒｉａｌｏｂａｔａ（ｗｉｌｌｄ．）Ｏｈｗｉ）およびシナクズ（Ｐ．ｔｈｏｍａｏｎｉｉ  Ｂｅｎｔｈ）から抽出し、分離して得られるイソフラボンＣ−グリコシドは、化学名が７，４’−ジヒドロキシ−８−β−Ｄ−グルコシドイソフラボンであり、白色で針状の結晶を呈し、水に溶けることができるが、溶解度は小さく（６．２４ｇ／Ｌ）、その水溶液は無色またはわずかな黄色で、分子量は４１６．３７である。プエラリンは漢方の葛根における主要な活性成分の１つであり、天然の低毒で有効な脳心血管系疾病の治療薬物であり、薬理作用は広範であり、臨床で血圧降下、心拍数の低下、心筋酸素消費量の減少に用いられており；冠状血管を拡張して、正常で虚血した心筋の代謝を改善し；脳循環、周囲血管および微循環に影響があり；この他、プエラリンはまた血糖、血中脂質降下、抗酸化、抗腫瘍などの作用がある（姚丹、丁選勝、「中国臨床薬理学と治療学」、２００８，１３，４６８−４７４）。
【０００３】
現在、プエラリン製剤にはプエラリン注射液、点眼剤、ローヤルゼリー注射剤があり、実際の使用においては主に注射で投薬し臨床に応用している（呉燕紅、蘇子仁、頼小平など、「漢方新薬と臨床薬理」、２００４，１５（４）２５９−２６１）。プエラリンは水の中での溶解度は比較的低く、臨床への応用には助溶剤を加え、溶解度を向上させる必要がある。現在、臨床に応用されているプエラリン注射液は大多数が高濃度プロピレングリコールを加えて助溶剤とする必要があるが、コストが増加するだけでなく、また薬液の粘度が大きすぎるために、生産の際に濾過の上で面倒が発生し、同時に不溶性異物が増加し、人体に一定の毒性副作用が発生し、投薬の安全性が低下するという結果になっている。応用の便宜のために、プエラリンの溶解性と生物利用度を改善する必要がある。関連する文献報道によると、現在の方法は主にプエラリンに対しグリコシル化構造改変または特殊剤型を使用することによりプエラリンの溶解性を有効的に改善する。これまでに、国内外でのプエラリンのグリコシル化構造改変に関する報道は、以下の通り：２００４年、Ｌｉなど（Ｌｉ  Ｄ，Ｐａｒｋ  Ｓ  Ｈ，Ｓｈｉｍ  Ｊ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄ  Ｒｅｓ，２００４，３３９，２７８９−２７９７）が初めて体外酵素法グリコシル化プエラリンを報道し、好熱性バシラスから由来する麦芽糖アミラーゼを触媒、合成し、Ｃ−６”アルコール性水酸基上のグリコシルのグリコシル基−α−（１，６）−プエラリン（ＣＡＳＲＮ：８２４９５９−７５−３）およびマルトシル基−α−（１，６）−プエラリン（ＣＡＳＲＮ：８２４９５９−７６−４）を得た。触媒反応は１％（ｗ／ｖ）プエラリン、３％（ｗ／ｖ）可溶性でんぷんをグリコシル供与体とする条件の下、５５℃で４５分反応し、製品変換率は７０％に達した。２つの変換生成物は調製液体クロマトグラフで分離、純化した後、測定を経て、その水溶性はプエラリンと比べてそれぞれ１４倍と１６８倍に増えた。蒋潔蓉など（Ｊｉａｎｇ  Ｊ  Ｒ，Ｙｕａｎ  Ｓ，Ｄｉｎｇ  Ｊ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，８１，６４７−６５７）はミクロバクテリウムオキシダングリコシル化プエラリンを利用し、７−Ｏ−グルコシドプエラリン（ＣＡＳＲＮ：１１６３２４９−０６−６）と７−Ｏ−イソマルトシルフラクトシドプエラリン（ＣＡＳＲＮ：１１６３２４９−０７−７）を得た。触媒反応は４ｇ／Ｌプエラリン、５０ｇ／Ｌサッカロースをグリコシル供与体とする条件の下、３０℃で４８時間反応し、７−Ｏ−グルコシドプエラリンのモル転換率は４０％で、７−Ｏ−イソマルトシルフラクトシドプエラリンのモル転換率は５％であった。２つの変換生成物は調製液体クロマトグラフで分離、純化した後、測定を経て、その水溶性はプエラリンと比べてそれぞれ１８倍と１００倍に増えた。Ｈｕａｎｇなど（Ｈｕａｎｇ  Ｗ，Ｏｃｈｉａｉ  Ｈ，Ｚｈａｎｇ  Ｘ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄ  Ｒｅｓ，２００８，３４３，２９０３−２９１３）はアセチル基ガラクトシダーゼを利用し、トリマンノースアセチルアミノ基グルコースオキサゾリンをグリコシル供与体とし、２０％のＤＭＳＯにおいてプエラリンについ��グリコシル化変換を行い、相応するグリコシド化合物Ｐｕｅｒａｒｉｎ−ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３（ＣＡＳＲＮ：１０９３１３５−９０−０）。触媒反応は、４．１６ｇ／Ｌプエラリン、１３ｇ／Ｌトリマンノースアセチルアミノ基グルコースオキサゾリンをグリコシル供与体とする条件の下、２３℃で２時間反応し、Ｐｕｅｒａｒｉｎ−ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３モル変換率は６０％であるが、前記グリコシド化生成物の調製および関連する性質についてはまだ報道が見られない。Ｃｈｏｉなど（Ｃｈｏｉ  Ｃ  Ｈ，Ｋｉｍ  Ｓ  Ｈ，Ｊａｎｇ  Ｊ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ，２０１０，９０：１１７９−１１８４）は好熱性バシラスから由来する麦芽糖アミラーゼ（ＢＳＭＡ）に由来するグリコシル化プエラリンを利用し、それぞれグリコシル基−α−（１，６）−プエラリン、マルトシル基−α−（１，６）−プエラリンとグリコシル基−α−（１，３）−プエラリン（ＣＡＳＲＮ：１２１９９３７−７３−１）を得て、１０ｇ／Ｌプエラリンの時、生成物総転換率は５６．７％であった。Ｙｕなど（Ｙｕ  Ｃ  Ｇ，Ｘｕ  Ｈ  Ｄ，Ｈｕａｎｇ  Ｇ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，８６：８６３−８７０）は４０％のエタノールでミクロバクテリウムオキシダンを処理した後、細胞の透過性を変え、ミクロバクテリウムオキシダンは７−Ｏ−グルコシドプエラリンを７−Ｏ−フルクトシドプエラリン（ＣＡＳＲＮ：１２２３０９１−９３−７）に変えることができた。張連文など（中国特許出願番号：２００９１００６８８５５．７；公開番号：ＣＮ１０１５７５６３１Ａ）はガラクトースを酵素グリコシル化プエラリンに転移させ、触媒反応が９．１２ｇ／Ｌプエラリン、４ｇ／Ｌ  ＵＤＰ−ガラクトースをグリコシル供与体とする条件の下、ガラクトース基−α−（１，４）−プエラリン（ＣＡＳＲＮ：１１９６６７７−６０−７）を得て、その溶解度はプエラリンの１２倍であった。
【０００４】
プエラリンはグリコシル化の後、水溶性が顕著に向上し、グリコシル化改変後、分子構造の変化はプエラリンの薬効に影響を与えないが、高濃度投薬のプエラリングリコシル化合物を提供した。関連する報道は以下の通りであった：Ｃｈｕｎｇなど（Ｃｈｕｎｇ  Ｍ  Ｊ，Ｓｕｎｇ  Ｎ  Ｊ，Ｐａｒｋ  Ｃ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００８，５７８，１５９−１７０）は等モルのグリコシル基−α−（１，６）−プエラリン（ＣＡＳＲＮ：８２４９５９−７５−３）とマルトシル基−α−（１，６）−プエラリン（ＣＡＳＲＮ：８２４９５９−７６−４）の混合物を水溶性プエラリングリコシル化生成物とし、ＨｅｐＧ２細胞とＣ５７  ＢＬ／６Ｊマウスにおける薬理実験では以下の通り明らかになった：水溶性プエラリングリコシル化生成物はプエラリンと同様の抗酸化活性および低密度リポタンパクの酸化作用を低下させる薬効を維持した。蒋潔蓉など（Ｊｉａｎｇ  Ｊ  Ｒ，Ｙｕａｎ  Ｓ，Ｄｉｎｇ  Ｊ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，８１，６４７−６５７）が７−Ｏ−グルコシドプエラリン（ＣＡＳＲＮ：１１６３２４９−０６−６）で行った体外薬物代謝動態学の実験では以下の通り明らかとなった：７−Ｏ−グルコシドプエラリンはプエラリンと比較してよりよい薬物代謝動態学性能を表し、７−Ｏ−グルコシドプエラリンの血漿半減期（ｔ１／２）と平均滞留時間（ＭＲＴ）はそれぞれプエラリンの２倍と２．８倍であり、前記性能は７−Ｏ−グルコシドプエラリンの生体利用効率を増加させる可能性があった。袁生など（中国特許出願番号：２００７１００２１７００．９）は７−Ｏ−グルコシドプエラリンまたは７−Ｏ−イソマルトシルフラクトシドプエラリンおよびその薬物組成物で脳心血管疾病の治療と予防に用いる薬物を製造した。張連文など（中国特許出願番号：２００９１００６８８５５．７；公開番号：ＣＮ１０１５７５６３１Ａ）は大動脈血管平滑筋を生理学的モデルとし、プエラリンとガラクトース基−α−（１，４）−プエラリンを血管平滑筋の緩和作用について比較を行い、ガラクトース基−α−（１，４）−プエラリンの緩和作用がプエラリンより優れていることを発見した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】中国特許公開ＣＮ１０１５７５６３１Ａ号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「中国臨床薬理学と治療学」、２００８，１３，４６８−４７４
【非特許文献２】「漢方新薬と臨床薬理」、２００４，１５（４）２５９−２６１
【非特許文献３】Ｃａｒｂｏｈｙｄ  Ｒｅｓ，２００４，３３９，２７８９−２７９７
【非特許文献４】Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，８１，６４７−６５７
【非特許文献５】Ｃａｒｂｏｈｙｄ  Ｒｅｓ，２００８，３４３，２９０３−２９１３
【非特許文献６】Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ，２０１０，９０：１１７９−１１８４
【非特許文献７】Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，８６：８６３−８７０
【非特許文献８】Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００８，５７８，１５９−１７０
【非特許文献９】Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，８１，６４７−６５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
プエラリンは水溶性が比較的劣っていることから、生体内変換法を使用してプエラリングリコシル化改変を行う時、変換前のプエラリン濃度はおしなべて比較的低く（いずれも１０ｇ／Ｌ以下）、生成物のモル転換率も比較的低く（いずれも７０％以下）、これらの限界性は得られた充分な生成物に脳心血管および腫瘍関連の疾病の薬理実験を行い、且つ後期の工業化生産にかなりの難易度をもたらした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記技術問題を解決するため、本発明の目的は新型のフルクトシル化プエラリンを提供することである。
【０００９】
本発明のもう１つの目的は、前記フルクトシル化プエラリンの調製方法であり、具体的に、アルスロバクタ・ニコチアナエ（ラテン語学名：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６、分類名：アルスロバクタ・ニコチアナエ  ＸＭ６、２０１０年６月２９日に中国典型培養物保存センターに保存、住所：中国  武漢  武漢大学、郵便番号：４３００７２、保存番号：ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１０１６４）で水相または非水相においてフルクトシル化プエラリンを生体内変換する。
【００１０】
本発明のまたもう１つの目的は、前記フルクトシル化プエラリンを脳心血管関連の疾病を治療する薬物の調製に提供する用途である。
【００１１】
本発明のさらにもう１つの目的は前記フルクトシル化プエラリンを腫瘍関連の疾病を治療する薬物の調製に提供する用途である。
【００１２】
本発明の目的は以下の技術法案により実現する。
【００１３】
一方で、本発明はフルクトシル化プエラリンを提供し、前記フルクトシル化プエラリンは以下の式（Ｉ）が示す構造である：
【００１４】
【化１】
2013540769.tif 000003
（Ｉ）
【００１５】
式中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立して水素、メチル基、エチル基、ホルミル基、アセチル基、メチルアミノ基及び硫酸基から選択され、；Ｒはフルクトースモノグリコシルまたは２〜５のフルクトースが接続したオリゴサッカリルであり、その構造は式（ＩＩ）に示す通りである：
【００１６】
【化２】
2013540769.tif 000004
（ＩＩ）
【００１７】
式中、ｎ＝０〜４である。
【００１８】
もう一方で、本発明は前記フルクトシル化プエラリンの調製に用いる方法を提供し、前記方法にはフルクトシル化酵素活性を有する発酵液または発酵液上澄みまたは純化したフルクトシル化酵素またはその組換発現たんぱく質を使用して、プエラリンを含む変換液について生体内変換反応を行い、プエラリンをフルクトシル化プエラリンに変換することを含む。
【００１９】
好ましいのは、前記方法はまた変換終了後、変換液の中の菌体細胞または菌体たんぱくなどの不純物を除去し、樹脂精製により得られた目標留分を回転蒸発または冷凍乾燥後にフルクトシル化プエラリン粉末または結晶体を得ることを含むことである。
【００２０】
好ましいのは、前記発酵液または発酵液上澄みはフルクトシル化プエラリン活性を有する微生物の発酵により得ることであり；さらに好ましいのは、前記微生物がアルスロバクタ・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６）（ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１０１６４）であることである。
【００２１】
好ましいのは、微生物の発酵に用いられる発酵培養基には以下のものが含まれることである：サッカロース５〜８０ｇ／Ｌ、ペプトン５〜５０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．４〜４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２０．５〜５ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４０．１〜２ｇ／Ｌ、ｐＨ６〜８；発酵条件は以下の通りであることが好ましく：２５〜４０℃、１０〜４００ｒｐｍ振とうフラスコで振盪または発酵槽で撹拌して通気し、回転速度通気量は１〜６ｖｖｍ、１０〜４００ｒｐｍで、発酵時間は６〜４８時間であり；さらに好ましいのは、発酵培養基はサッカロース１５ｇ／Ｌ、ペプトン２５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２２ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４０．２ｇ／Ｌを含み、ｐＨ７．５を含み；発酵条件はさらに以下の通りが好ましく：３０℃、２４０ｒｐｍで振とうフラスコで１６時間振盪または発酵槽で撹拌して通気し、回転速度通気量は４ｖｖｍ、３００ｒｐｍで、発酵時間は６時間である。
【００２２】
好ましいのは、前記生体内変換反応は水相または非水相において行うことで；そのうち、前記水相変換条件には以下を含む：１０〜４００ｒｐｍで振とうフラスコで振盪または発酵槽で撹拌し、プエラリン濃度は０．１ｇ／Ｌより上から飽和までとし、グリコシル供与体はフルクトースまたはサッカロースまたは２つの混合物とし、プエラリンとグリコシル供与体モル比は１：１〜１：２００、反応系の１０％〜５０％を占める発酵液または発酵液上澄み（フルクトシル化酵素１０〜１００Ｕ／ｍＬを含む）を加え、任意の一種類ｐＨ４〜８の緩衝溶液の中で行い、変換温度は２５〜４０℃であり、反応時間は６〜９６時間あり；好ましい条件は以下の通りである：１０ｇ／Ｌプエラリン、１００ｇ／Ｌサッカロースをグリコシル供与体とし、２０％の発酵液上澄み（フルクトシル化酵素３０Ｕ／ｍＬを含む）を、１／１５ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ６．８６）の５Ｌ発酵槽の中に加え、３０℃、３００ｒｐｍで１２時間撹拌変換を行う。
【００２３】
前記非水相変換条件は以下のものが含まれる：１０〜４００ｒｐｍ振とうフラスコで振盪または発酵槽で撹拌し、５〜５０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、メタノール、アセトンまたはエタノールから選択した一種または数種の親水性有機溶剤を使い、プエラリン濃度は５〜２００ｇ／Ｌとし、好ましいプエラリン濃度は５〜１２０ｇ／Ｌとし、グリコシル供与体はフルクトースまたはサッカロースまたは２つの混合物とし、プエラリンとグリコシル供与体のモル比は１：１〜１：２００、１０％〜５０％の発酵液または発酵液上澄み（フルクトシル化酵素１０〜１００Ｕ／ｍＬを含む）を加え、任意の一種類ｐＨ４〜８の緩衝溶液の中で、変換温度は２５〜４０℃ で、反応時間は６〜９６時間とし；好ましい条件は以下の通り：２０％のＤＭＳＯ、１０７．５ｇ／Ｌプエラリンを使用し、３５０ｇ／Ｌサッカロースをグリコシル供与体とし、２０％の発酵液上澄み（フルクトシル化酵素３０Ｕ／ｍＬを含む）を１／１５ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ６．８６）の５Ｌ発酵槽に加え、３０℃、３００ｒｐｍで７２時間撹拌変換する。
【００２４】
好ましいのは、前記樹脂精製はフルクトシル化プエラリンを含む変換液をＡＢ−８マクロ孔質樹脂の吸着により、選択として、例えば非水相変換であり、前記吸着は変換液における有機溶剤を低温蒸発して除去または有機溶剤を２％未満の体積比まで希釈した条件の下で行い；吸着後はまず溶離液で残りのグリコシル供与体を洗い落とし、また溶離液で勾配溶離または段階溶離してそれぞれフルクトシル化プエラリンを得ることであり；さらに好ましいのは、１０倍カラムベッド体積でｐＨ４〜４．５の蒸留水を使用して残りのグリコシル供与体を洗い落とし、その後５〜３０％のメタノールまたはエタノール溶液で勾配溶離または段階溶離してそれぞれフルクトシル化プエラリンを得ることである。
【００２５】
好ましいのは、前記方法がまた溶離液で残りのプエラリンを洗い落として回収することを含むことであり；さらに好ましいのは、１００％メタノールまたはエタノールで残りのプエラリンを洗い落として回収することである。
【００２６】
好ましいのは、前記フルクトシル化酵素またはその組換発現たんぱく質はβ−Ｄ−フルクトフラノシダーゼまたはその組換発現たんぱく質であることである。
【００２７】
さらに好ましいのは、前記β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼは関節胞子菌属細菌から由来し、その分子量は約６０ｋＤａ、Ｎ端前の５個のアミノ酸序列はそれぞれＡＴＥＰＶであることである。
【００２８】
もう一方で、本発明はまた前記フルクトシル化プエラリンを脳心血管関連の疾病を治療する薬物を調製する用途を提供する。
【００２９】
さらにもう一方で、本発明は前記フルクトシル化プエラリンを腫瘍関連の疾病を治療する薬物を調製する用途を提供する。
【００３０】
好ましいのは、前記薬物は注射剤または内服製剤であることである。
【００３１】
以下は本発明の詳細な説明であり：
本発明の目的に達するため、本申請は以下の技術法案を採用する：
本発明の実施方法に基づき、本発明は式（Ｉ）が示す新型のフルクトシル化プエラリンを提供する：
【００３２】
【化３】
2013540769.tif 000005
（Ｉ）
【００３３】
式中、Ｒ１とＲ２のそれぞれ選択された置換基は水素基、メチル基、エチル基、ホルミル基、アセチル基、メチルアミノ基と硫酸基の中の一種類である。
【００３４】
式（Ｉ）の中の、Ｒは式（ＩＩ）が示す通りである：
【００３５】
【化４】
2013540769.tif 000006
(II)
【００３６】
式中、ｎ＝０〜４。Ｒはフルクトースモノグリコシルまたは２から５のフルクトースが接続したオリゴサッカリルである。
【００３７】
前記化合物は酵素法により調製され、例えばクロマトグラフ、液体抽出、再結晶方法といった各種の通常方法を用い、純化を行うことができる。前記化合物の構造は元素分析、赤外線スペクトル、可視紫外スペクトル、核磁気共鳴、単結晶X線回折の手段により表すことができる。
【００３８】
本発明のもう１つの実施方法に基づき、本発明はフルクトシル化プエラリンを生体内変換する方法を提供する。
【００３９】
本発明はプエラリンフルクトシル化酵素活性を有する発酵液、または発酵液上澄み（細胞外酵素）、または前記酵素の組換発現たんぱく質を使用し、プエラリンを含む水相または非水相変換液の中に加え、プエラリンをフルクトシル化プエラリンに変換し；変換が終了後、変換液の中の菌体細胞または菌体酵素たんぱく質は加熱により沈殿し、遠心除去し；その後変換液はAB-8マクロ孔質樹脂により分離を行い、目標留分を回転蒸発または冷凍乾燥後にフルクトシル化プエラリン粉末または結晶体を得る。
【００４０】
前記プエラリンフルクトシル化活性を有する微生物菌種は全てのフルクトシル化プエラリンの微生物またはグリコシドヒドロラーゼ、特にアルスロバクタ・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｎｉａｎａｅ  ＸＭ６）（ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１０１６４）でよい。
【００４１】
前記プエラリンフルクトシル化活性を有する細胞外酵素、または前記酵素の組換発現たんぱく質はβ−Ｄ−フルクトフラノシダーゼまたはβ−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ組換発現たんぱく質である。
【００４２】
前記β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼは関節胞子菌属細菌から発生する。
【００４３】
前記培養基の栄養物質には特別な制限がなく、微生物の生長に適したあらゆる栄養媒質でもよく、例えばあらゆるでんぷん、グルコース、トウモロコシ粉、サッカロースを炭素源とし、コーンスチープリカー、大豆ケーキ粉、落花生ケーキ粉などを窒素源の培養基としてもよい。前記発酵培養に用いる培養基は：サッカロース５−８０ｇ／Ｌ、ペプトン５−５０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．４−４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２０．５−５ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４０．１−２ｇ／Ｌ、ｐＨ６−８である。
【００４４】
前記発酵培養に用いる条件は：２５〜４０℃、１０〜４００ｒｐｍ振とうフラスコで振盪または５Ｌ発酵槽で撹拌して通気し、回転速度通気量は１〜６ｖｖｍ、１０〜４００ｒｐｍで、発酵時間は６−４８時間である。
【００４５】
前記生体内変換法、変換反応は水相または非水相の中で行ってもよく、変換温度の範囲は２５〜４０℃で、１０〜４００ｒｐｍ振とうフラスコで振盪または５Ｌ発酵槽で撹拌し、反応時間は６〜９６時間である。（１）水相変換条件は以下の通り：プエラリン濃度は０．１ｇ／Ｌより上から飽和まで、グリコシル供与体はフルクトースまたはサッカロースまたは２つの混合物、プエラリンとグリコシル供与体のモル比は１：１〜１：２００、任意の１種のｐＨ４〜８の緩衝溶液における；（２）非水相変換条件は以下の通り：５〜５０％の親水性有機溶剤ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、メタノール、アセトン、エタノールを使用し、プエラリン濃度は５〜２００ｇ／Ｌ、好ましいプエラリン濃度は５〜１２０ｇ／Ｌ、グリコシル供与体はフルクトースまたはサッカロースまたは２つの混合物、プエラリンとグリコシル供与体のモル比は１：１〜１：２００、任意の１種のｐＨ４〜８の緩衝溶液における；
【００４６】
前記フルクトシル化プエラリンを含む変換液はＡＢ−８マクロ孔質樹脂の吸着により、変換液中の有機溶剤を低温蒸発して除去または有機溶剤を２％より低い体積比まで希釈した条件の下で吸着を行い；第一溶離液は１０倍のカラムベッド体積でｐＨ４〜４．５の蒸留水（酢酸はｐＨを調節する）で残りのグリコシル供与体を洗い落とし、第二溶離液は５〜３０％のメタノールまたはエタノール溶液で勾配溶離または段階溶離でそれぞれフルクトシル化プエラリンを得て、第三溶離液は１００％のメタノールまたはエタノールで残りのプエラリンを洗い落として回収する。
【００４７】
前記樹脂精製を経て得られたフルクトシル化プエラリン溶液について、回転蒸発または冷凍乾燥の後にフルクトシル化プエラリン粉末または結晶を得る。
【００４８】
本発明のもう一種類の実施方法に基づき、本発明は新型プエラリングリコシル化誘導体を脳心血管関連の疾病を治療する薬物を調製する用途を提供する。
【００４９】
本発明のモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンを用いあらゆる薬剤学で説明される剤型の薬物を製造することができ；前記で説明されている剤型の中で注射剤または内服製剤であることが好ましい。
【００５０】
本発明の化合物モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンを用いたラット心筋虚血Ｔ波振幅変化試験は以下の通り示している：被験サンプルのモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの用量はそれぞれ１２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇでありいずれも脳下垂体後葉より誘発されるＴ波振幅を顕著に減少することができ、且つＴ波の減少幅はプエラリンより小さいことについて、被験サンプルモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンがプエラリンと比べてより有効に心筋虚血作用を防止することができることを説明している。本発明の化合物モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンを使用して心筋虚血のラットに対する心拍数の実験結果は、脳下垂体後葉に注射後２分以内に各グループのラットはいずれも心拍数が明らかに下降し、２〜１０分で各グループの心拍数が回復を始めていることを示している。対照グループと比べて、被験サンプルのモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの異なる用量のグループはいずれも心筋虚血ラットの心拍数の回復を速めることができ、且つモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの低用量のグループの回復時間はプエラリングループよりも速い。被験サンプルのモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは心筋虚血が引き起こす心拍数異常に対し一定の治療効果があることを説明している。本発明が説明しているフルクトシル化プエラリンは脳心血管疾病を治療する薬物を調製することができる。
【００５１】
本発明のもう一種類の実施方法に基づき、本発明は新型プエラリングリコシル化誘導体を腫瘍関連の疾病を治療する薬物を調製する用途を提供する。
【００５２】
本発明のモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンを用いあらゆる薬剤学で説明される剤型の薬物を製造することができ；説明される剤型の中で注射剤または内服製剤であることが好ましい。
【００５３】
本発明の化合物モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンを使用しヒトの乳腺癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とヒトの慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２の体外増殖抑制に対する試験は以下の通り示している：モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは作用してから４８時間後にいずれもＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞数を減らすことができる。同じ時間における対照グループを比較すると、モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの容量が５０μｍｏｌ／Ｌに達する時に差異があり（Ｐ＜０．０５）、用量が１０μｍｏｌ／Ｌの時に顕著的な差異があり（Ｐ＜０．０１）、用量が１５０と２００μｍｏｌ／Ｌに達する時に前記差異は極めて顕著であり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の抑制率はそれぞれ４４．０４％と５９．４２％達し、モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは明らかにヒトの乳腺癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の増殖を抑制することができ、且つ抑制率は用量の増加に伴い増加することを説明している。モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンが作用してから４８時間後にいずれもＫ５６２細胞の細胞数を減少させることができる。同じ時間における対照グループを比較すると、モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの容量が低用量１μｍｏｌ／Ｌの時にその結果には顕著な差異があり（Ｐ＜０．０５）、用量が１００、１５０と２００μｍｏｌ／Ｌの時に前記差異は極めて顕著で（Ｐ＜０．００１）、Ｋ５６２細胞の抑制率はそれぞれ１６．４１％と２９．８４％と４６．４１％に達することについて、モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンが明らかにヒトの慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２の増殖を抑制することができ、且つ抑制率は用量の増加に伴い増加することを説明している。被験サンプルのモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは体外で腫瘍細胞に対し一定の抑制効果を有することを説明している。本発明が説明しているフルクトシル化プエラリンは腫瘍疾病を治療する薬物を調製することができる。
【発明の効果】
【００５４】
従来の技術と比べ、本発明が有する有益な効果は以下の通りである：まず、本発明者は新しいフルクトシル化プエラリンを発明し、実験によりこれらの新型プエラリン誘導体は心筋虚血により起こる心拍異常に対し一定の治療作用を有し、有効的に脳心血管の疾病の治療に用いることができることを証明し、且つ実験は同時に新型プエラリン誘導体が体外でヒトの乳腺癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とヒトの慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２に対し顕著な抑制作用があり、腫瘍の疾病の治療に用いることができることを証明し、これはプエラリングリコシル化誘導体を薬物とする由来を豊富にするが、従来のプエラリングリコシル化誘導体でのこの方面の報道は見られない；
【００５５】
次に、プエラリンと比べて、この新型フルクトシル化プエラリンの溶解度はよりよく、薬理活性が高く、プエラリン製品の欠陥を補っており、薬の使用の安全性は向上し、治療効果が向上し、よりよい発展の見込みを有する新薬製品であり；さらに、本発明者は前記新型フルクトシル化プエラリンの生体内変換法を提供している。従来の生体内変換法を使用しプエラリングリコシル化の改変を行う時、プエラリンの水溶性が比較的劣っているため、プエラリン濃度はおしなべて比較的低く（いずれも１０ｇ／Ｌ以下）、製品のモル転換率も比較的低いが（いずれも７０％以下）、本発明の生体内変換法を使用すると、得られるモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン濃度は１１１．７ｇ／Ｌに達し、基質変換率は９０％以上に達し、従来の技術に存在する技術課題を解決し、前記生成物を使用して脳心血管および腫瘍関連の疾病の薬理試験および後期の工業化生産を行うことに有利である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
添付図の要約説明
以下に、添付図と合わせて本発明の実施例を詳細に説明し、そのうち：
【図１】水相生体内変換プエラリンのＨＰＬＣクロマトグラムを表し、前記図の中で：保持時間１４．９１０ｍｉｎのピークはプエラリンで、保持時間１０．１３１ｍｉｎのピークはモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンで、保持時間６．１３０ｍｉｎのピークはジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンで、保持時間５．４０９ｍｉｎのピークはトリフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンで、保持時間５．１４４ｍｉｎのピークはテトラフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンで、保持時間４．９６８ｍｉｎのピークはペンタフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンであり；
【図２】非水性生体内変換プエラリンのＨＰＬＣクロマトグラムを表し、前記図の中で：保持時間１３．７３５ｍｉｎのピークはプエラリンで、保持時間７．４５０ｍｉｎのピークはモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンで、保持時間４．６０３ｍｉｎのピークはジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンで、保持時間４．１９２ｍｉｎのピークはトリフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンであり；
【図３】モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの１Ｈ  ＮＭＲクロマトグラムを表す；
【図４】モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの１３Ｃ  ＮＭＲクロマトグラムを表す；
【図５】モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのＨ−Ｈ  ＣＯＳＹクロマトグラムを表す；
【図６】モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのＣ−Ｈ  ＨＳＱＣクロマトグラムを表す；
【図７】モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの高分解能質量クロマトグラムを表す；
【図８】プエラリンの１Ｈ  ＮＭＲクロマトグラムを表す；
【図９】プエラリンの１３Ｃ  ＮＭＲクロマトグラムを表す；
【図１０】ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの１Ｈ  ＮＭＲクロマトグラムを表す；
【図１１】ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの１３Ｃ  ＮＭＲクロマトグラムを表す；
【図１２】ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのＨ−Ｈ  ＣＯＳＹクロマトグラムを表す；
【図１３】ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのＣ−Ｈ  ＨＳＱＣクロマトグラムを表す；
【図１４】ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの高分解能質量クロマトグラムを表す；
【図１５】トリフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのマススペクトラムを表す；
【図１６】テトラフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのマススペクトラムを表す；
【図１７】ペンタフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのマススペクトラムを表す；
【発明を実施するための形態】
【００５７】
生体材料の保存情報
学名：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｎｉａｎａｅ  ＸＭ６、分類名：アルスロバクタ・ニコチアナエ  ＸＭ６、２０１０年６月２９日に中国典型培養物保存センタに保存、住所：中国  武漢  武漢大学、郵便番号：４３００７２、保存番号：ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１０１６４。
【００５８】
理解できるのは、ここで説明する特定の実施方法は例を挙げた方法により表すもので、それを決して本発明に対する制限とはしない。本発明の範囲に乖離しない状況の下で、本発明の主な特徴は各種実施方法に用いることができる。本分野の技術者は、通常の実験を用いるだけで、多くの同等物が全て本文で説明する特定の手順に応用できることを意識または確認できるであろうこれらの同等物は本発明の範囲内にあると認識され、且つ特許請求によりカバーされる。
【００５９】
以下の実施例において、詳細に説明されていない各種のプロセスと方法は本分野における周知の通常の方法である。使用した試薬の由来、商品名およびその構成成分を列挙する必要のあるものは、いずれも最初に現れる際に記し、その後同様の試薬の使用で特に説明がない場合は、いずれも最初に記した内容と同じである。
【実施例】
【００６０】
実施例１：水相生体内変換プエラリンを使用しフルクトシル化プエラリンを得た
４０ｍＬ発酵培養の培養基２（培養基の構成については表１を参照のこと）を２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃の高圧蒸気で２０分間滅菌後、アルスロバクタ・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｎｉａｎａｅ  ＸＭ６）（ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１０１６４。）に組み込み、３０℃、１８０ｒｐｍで１６時間振盪、発酵培養し植種液として５Ｌの発酵槽に接種し、接種量は５体積%、発酵槽に入れる液量は３Ｌ、発酵槽の滅菌方法は振とうフラスコと同様とした。３０℃、３００ｒｐｍで発酵培養し、通気量は３ｖｖｍで、６時間発酵培養（ＯＤは約１０前後）した後、８０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上澄み酵素液を収集し、上澄み酵素液内に含まれているフルクトシル化酵素３０Ｕ／ｍＬを測定した。そのうち、酵素活性の測定には以下の方法を採用した：
【００６１】
基質溶液の調製は：０．４ｇプエラリン、１０ｇサッカロースを１００ｍＬ、１／１５ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ６．８６）に充分溶解させた。反応系：２ｍＬ、１／１５ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ６．８６）を取り１８ｍＬの基質溶液に加え、３０℃の中に置いて１０分間反応させた後、直ちに１００μＬを取り出し９００μＬのメタノールに加えて反応を終止させ、ブランクコントロールとした。同時に別途２ｍＬの酵素液を取って１８ｍＬの基質溶液に加え、３０℃の中に置いて１０分間反応させた後、直ちに１００μＬを取り出して９００μＬのメタノールに加えて反応を終止させ、サンプルとした。その後ＨＰＬＣで測定を行った。酵素活性単位の定義は：３０℃の条件の下、毎分１μｍｏｌプエラリンを変換するのに必要な酵素量を１活力単位（１Ｕは即ち１μｍｏｌ／ｍｉｎ）とする。比活性の定義は（Ｕ／ｍＬ）：単位体積（ｍＬ）酵素液中に具有する酵素活性（Ｕ）の数である。
【００６２】
６００ｍＬの上澄み酵素液を総体積３０００ｍＬに１０ｇ／Ｌプエラリン（南京沢朗医薬科技有限責任公司から購入）、１００ｇ／Ｌサッカロース、１／１５ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ６．８６）を含む５Ｌ発酵槽の中に加え、３０℃、３００ｒｐｍでプエラリングリコシル化反応を行い、１２時間後、４５℃で２時間加熱して変換反応を終止させた。変換液はＨＰＬＣにより検出され、フルクトシル化プエラリンの変換率は９５％に達した。結果参考図１。
【００６３】
前記フルクトシル化プエラリンを含む変換液はＡＢ−８マクロ孔質樹脂の吸着（クロマトグラフィーカラム４０×６００ｍｍ、流速１０ｍＬ／ｍｉｎ）を経て、その後１０倍のカラムベッド体積でｐＨ４〜４．５の蒸留水（氷酢酸はｐＨを調節）で残りのグリコシル供与体を洗い落とし、続いて５％〜３０％のメタノール溶液で勾配溶離し、それぞれフルクトシル化プエラリン（純度＞９７％）を得て、最後に１００％のメタノールで洗い落とし色素とプエラリンを除去した。
【００６４】
純度＞９７％のフルクトシル化プエラリンをそれぞれ４５℃で回転蒸発または冷凍乾燥させた後にモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン粉末または結晶７．９ｇ、ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン粉末または結晶１６．８ｇ、トリフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン粉末または結晶３．３ｇ、テトラフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン粉末または結晶３．２ｇ、ペンタフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン粉末または結晶２．２ｇを得た。
【００６５】
測定により、２５℃の時、モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン溶解度は２６．０ｇ／Ｌ、ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの溶解度は２８０．８ｇ／Ｌであり、それぞれ同じ条件の下でのプエラリンの溶解度（５．２ｇ／Ｌ）の５倍と５４倍であった。
【００６６】
前記モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは：ＨＲ−ＭＳ：ｍ／ｚ５７７．１５６３［Ｍ−Ｈ］−、元素構成はＣ２７Ｈ２９Ｏ１４（図７）で、Ｍ−Ｈ計算値は５７７．１５５７で；ＤＭＳＯの１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲ化学シフトの特徴はそれぞれ以下の通り：
【００６７】
1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ: 8.29 (1H, s, H-2), 7.93 (1H, d, J=8.7Hz, H-5), 6.98 (1H, d, J=8.7 Hz, H-6), 7.40 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2'/H-6'), 6.80 (2H, d, J=8.7 Hz, H-3'/H-5'), 9.48 (1H, s, 4'-OH), 4.81 (1H, d, J=9.1 Hz, H-1''), 3.93-3.96 (2H, m, H-2''/H-4'''), 3.79-3.89 (2H, m, H-5''/H-6'''), 3.48-3.61 (3H, m,H-6''，H-5'''，H-6'''), 3.29-3.42 (6H, m, H-3'', H-4'', H-6''，2H-1''', H-3''')（図３、図５、図６）
13C-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ: 174.9, 160.9, 157.1, 152.6, 130.0, 126.2, 123.0, 122.5, 114.9, 112.5, 116.8, 104.1(C-2'''), 82.1 (C-5'''), 79.7, 78.4, 76.7,75.1 (C-5''), 73.4, 70.7, 70.3, 62.3 (C-6''), 61.5(C-6'''), 61.1（図４）。
【００６８】
プエラリンの１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲ化学シフトの特徴はそれぞれ以下の通り：
【００６９】
1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ: 8.33 (1H, s, H-2), 7.97 (1H, d, J=8.8Hz, H-5), 7.01 (1H, d, J=8.8 Hz, H-6), 7.41 (2H, d, J=8.8 Hz, H-2'/H-6'), 6.83 (2H, d, J=8.8 Hz, H-3'/H-5'), 9.52 (1H, s, 4'-OH), 4.85 (1H, d, J=9.0 Hz, H-1''), 4.05 (1H, s,H-2''), 3.52, 3.75 (2H, m, 2H-6''), 3.26-3.36 (3H, m, H-3'', H-4'', H-5'')（図８）
13C-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ: 175.1, 161.2, 157.2, 152.7, 130.1, 126.4, 123.2, 122.6, 117.0, 115.19, 112.7, 81.8 (C-5''), 78.8, 73.6, 71.0, 70.6, 61.5 (C-6'')（図９）。
【００７０】
前記ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは：ＨＲ−ＭＳ：ｍ／ｚ７３９．２０８０［Ｍ−Ｈ］−、元素構成はＣ３３Ｈ３９Ｏ１９（図１４）で、Ｍ−Ｈ計算値は７３９．２０８６で；ＤＭＳＯの１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲ化学シフトの特徴はそれぞれ以下の通り：
【００７１】
1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ: 8.29 (1H, s, H-2), 7.95 (1H, d, J=8.7Hz, H-5), 6.97 (1H, d, J=8.8 Hz, H-6), 7.40 (2H, d, J=8.6 Hz, H-2'/H-6'), 6.80 (2H, d, J=8.8 Hz, H-3'/H-5'), 9.48 (1H, s, 4'-OH), 4.81 (1H, d, J=9.2 Hz, H-1''), 3.92-3.99 (3H, m, H-2''，H-4''', H-4''''), 3.69-3.87 (4H, m, H-6''，H-5''，H-5'''，H-6''''), 3.48-3.58 (5H, m, H-6''，H-3'''，H-6'''，H-5''''，H-6'''')，3.25-3.42 (8H, m, H-3'', H-4'', 2H-1''', H-6'''，2H-1''''，H-3'''')（図１０、図１２、図１３）。
13C-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ: 174.7, 160.7, 156.9, 152.4, 129.8, 126.0, 122.9, 122.4, 116.6, 114.8, 112.3, 104.2, 104.0, 81.9 (C-5''''), 80.1, 79.6, 78.3, 76.3,76.0, 75.5 (C-5'''), 75.1 (C-5''), 73.3, 70.6, 70.4, 62.7 (C-6''), 62.4 (C-6'''), 62.0 (C-6'''')，61.1, 60.8,（図１１）。
【００７２】
トリフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ９２５．３［Ｍ＋Ｎａ］＋で、元素構成はＣ３９Ｈ５０Ｏ２４Ｎａ（図１５）；テトラフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ１０６４．３［Ｍ−Ｈ］−で、元素構成はＣ４５Ｈ５９Ｏ２９（図１６）；ペンタフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ１２２６．５［Ｍ−Ｈ］−で、元素構成はＣ５１Ｈ６９Ｏ３４（図１７）である。
【００７３】
実施例２：非水相生体内変換プエラリンを使用しフルクトシル化プエラリンを得た
４０ｍＬの発酵培養した培養基２（培養基構成は表１を参照のこと）を２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃の高圧蒸気で２０分間滅菌した後、アルスロバクタ・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６）（ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１０１６４）に組み込み、３０℃、１８０ｒｐｍで１６時間振盪、発酵培養し植種液として５Ｌの発酵槽に接種し、接種量は５％、発酵槽に入れる液量は３Ｌとし、発酵槽の滅菌方法は振とうフラスコと同様の３０℃、３００ｒｐｍ発酵培養で、通気量３ｖｖｍで、6時間発酵培養をした（ＯＤは約１０前後）後、８０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上澄み酵素液を収集して、上澄み酵素液に含まれるフルクトシル化酵素３０Ｕ／ｍＬを測定した。
【００７４】
６００ｍＬ上澄み酵素液を総体積３０００ｍＬに１０７．５ｇ／Ｌプエラリン、３５０ｇ／Ｌサッカロース、２０％ＤＭＳＯを含む１／１５ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ６．８６）の５Ｌ発酵槽に加え、３０℃、３００ｒｐｍで振盪変換させ、７２時間後、４５℃で２時間加熱して変換反応を終止させた。変換液はＨＰＬＣにより検出され：モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは１１１．７ｇ／Ｌに達し、ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは２８．３ｇ／Ｌに達し、トリフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは２．３ｇ／Ｌに達し、フルクトシル化プエラリン誘導体の生体内変換率は９０％に達した。結果参考図２。
【００７５】
前記フルクトシル化プエラリンを含む変換液を１０倍に希釈後、ＡＢ−８マクロ孔質樹脂の吸着（クロマトグラフィーカラム４０×６００ｍｍ、流速１０ｍＬ／ｍｉｎ）を経て、その後１０倍のカラムベッド体積でｐＨ４〜４．５の蒸留水（氷酢酸はｐＨを調節）で残りのグリコシル供与体を洗い落とし、続いて５％〜３０％のメタノール溶液で勾配溶離し、それぞれフルクトシル化プエラリン（純度＞９７％）を得て、最後に１００％のメタノールで洗い落とし色素とプエラリンを除去した。
【００７６】
純度＞９７％のフルクトシル化プエラリンをそれぞれ４５℃で回転蒸発または冷凍乾燥後モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン粉末または結晶２７０ｇ、ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン粉末または結晶６８ｇ、トリフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン粉末または結晶５ｇを得た。
【００７７】
実施例３：  非水相生体内変換プエラリンを使用しフルクトシル化プエラリンを得た
４０ｍＬの発酵培養した培養基２（培養基構成は表１を参照のこと）を２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃の高圧蒸気で２０分間滅菌した後、アルスロバクタ・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６）（ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１０１６４）に組み込み、３０℃、１８０ｒｐｍで１６時間振盪して発酵培養後（ＯＤは約１０前後）、８０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上澄み酵素液を収集して、上澄み酵素液に含まれるフルクトシル化酵素は３０Ｕ／ｍＬであった。
【００７８】
４ｍＬの上澄み酵素液を総体積２０ｍＬに１０７．５ｇ／Ｌプエラリン、３５０ｇ／Ｌサッカロース、２０％ＤＭＳＯを含むリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ６．８６）の２５０ｍＬ共栓三角フラスコに加え、３０℃、１８０ｒｐｍで振盪変換させ、７２時間後、４５℃で２時間加熱して変換反応を終止させた。変換液はＨＰＬＣにより検出され：モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは１１１．７ｇ／Ｌに達し、ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは２８．３ｇ／Ｌに達し、トリフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは２．３ｇ／Ｌに達し、フルクトシル化プエラリン変換率は９０％に達した。
【００７９】
前記フルクトシル化プエラリンを含む変換液を１０倍に希釈後、ＡＢ−８マクロ孔質樹脂の吸着（クロマトグラフィーカラム２０×６００ｍｍ、流速１０ｍＬ／ｍｉｎ）を経て、その後１０倍のカラムベッド体積でｐＨ４〜４．５の蒸留水（氷酢酸はｐＨを調節）で残りのグリコシル供与体を洗い落とし、続いて５％−３０％のメタノール溶液で勾配溶離し、それぞれフルクトシル化プエラリン（純度＞９７％）を得て、最後に１００％のメタノールで洗い落とし色素とプエラリンを除去した。純度＞９７％のフルクトシル化プエラリンをそれぞれ４５℃で回転蒸発または冷凍乾燥後モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン粉末または結晶１．８ｇ、ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン粉末または結晶０．５ｇ、トリフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン粉末または結晶０．０３ｇを得た。
【００８０】
実施例４：異なる発酵と変換条件が生成物形成に与える影響
４０ｍＬの発酵培養した培養基（培養基構成は表１を参照のこと）を２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃の高圧蒸気で２０分間滅菌した後、アルスロバクタ・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６）（ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１０１６４）に組み込み、異なる発酵条件の下（発酵条件は表２を参照のこと）振盪して発酵培養後、８０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上澄み酵素液を収集して、上澄み酵素液に含まれるフルクトシル化酵素は１０−１００Ｕ／ｍＬであった。２０％の上澄み酵素液を変換システムに加え、異なる変換条件の下（変換条件は表２を参照のこと）、振盪して変換した後に４５℃で２時間加熱して変換反応を終止させ、変換液をＨＰＬＣにより検出させた。
【００８１】
異なる菌種の発酵条件および変換条件は、プエラリングリコシル化生成物の形成にいずれも異なる影響を与え、表１と表２では異なる条件の下でプエラリングリコシル化反応を行う時に主な生成物、モノフルクトシル化プエラリンとジフルクトシル化プエラリンのモル転換率の変化について列挙している。
【００８２】
【表１】
2013540769.tif 000007
【００８３】
【表２】
2013540769.tif 000008
【００８４】
表２の結果から分かる通り、非水相変換の長所は変換システムにおいてプエラリン濃度が１２０ｇ／Ｌまで増やせることにあり、好ましい非水相変換条件の下、非水相変換率は９０％にまで達することができ、変換生成物の濃度は顕著に向上し（１０７．５ｇ／Ｌ  プエラリンの時、変換総生成物は１４０ｇ／Ｌ以上に達することが可能）、且つ溶剤の選択と変換生成物の比率調整により、非水相変換のこれらの優勢が工業化生産に有利に働くことが可能になる。
【００８５】
実施例５：モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの血液における代謝動態学実験
１．測定器具とクロマトグラムの条件
ＨＰＬＣ分析はＤＩＯＮＥＸを採用し、クロマトグラフカラムはＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＳ  Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｕｍ，５ｕｍ）で、サンプリング体積は２０μＬ、カラム温度は３０℃で、検出器はＵＶＤ１７０Ｕで、検出波長は２５４ｎｍで、移動相は：Ａ、水、Ｂ、クロマトグラム級メタノール、Ａ：Ｂ＝８０：２０、流速１ｍＬ／ｍｉｎである。
【００８６】
２．実験動物
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ＳＤラット）、体重１８０−２２０ｇ、雌雄各半分、南通大学医学実験センターより提供、生産許可証明番号：ＳＣＸＫ（蘇）２００８００１０。
【００８７】
３．  実験方法
３．１  サンプル採集
ＳＤラットを無作為に２組に分け、各組５匹、実験前には１２時間絶食させた。プエラリンおよびモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンはそれぞれ２０％の１，２プロピレングリコール生理食塩水に溶解させ、５０ｍｇ／ｋｇの用量に基づきラットの尾にプエラリンとモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンを静脈注射した。服用後、ｔ＝０ｍｉｎ、４ｍｉｎ、７ｍｉｎ、１７ｍｉｎ、４０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、１８０ｍｉｎの後、目のふちで０．５ｍＬの血液を採集しヘパリンナトリウム処理をした遠心分離管に置き、直ちに３０００ｒｐｍの条件の下で１５ｍｉｎ遠心分離し、血漿を分離して分析に備えた。
【００８８】
３．２  サンプル処理
精密に血漿１００μＬを取り試験管の中に入れ、さらに４００μＬメタノールを加えてたんぱく質を沈殿し、ボルテックスミキサーで５分間混合し、その後１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄み液をＨＰＬＣ分析に用いた。
【００８９】
３．３  データ分析
３．２で調製したプエラリンおよびモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンサンプルの血漿濃度に基づき外部標準法を使用し計算して得られた。得られたデータは薬物代謝動態学統計ソフトを用いて分析した。
【００９０】
4.  結果
プエラリンおよびモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの主な代謝動態学パラメータ（表３）から分かる通り、モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのｔ１／２、Ｍｒｔ（０−ｔ）とＭＲＴ（０−∞）の値は明らかにプエラリンを上回り、プエラリン誘導体生物が血液中に留まる時間がプエラリンと比べて延長できており、従ってそれが体内において比較的長い作用時間を有することに有益となっていることが明らかになった。同時にプエラリン誘導体のＡＵＣ（０−ｔ）とＡＵＣ（０−∞）値は顕著にプエラリンを上回っており、プエラリン誘導体がプエラリンと比べてより高い生体利用度を有することが明らかになった。
【００９１】
【表３】
2013540769.tif 000009
【００９２】
実施例６：モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのラットの急性心筋虚血に対する保護作用の実験
１．実験材料
脳下垂体後葉注射液は南京新百薬業有限公司から購入し、生理食塩水注射液は南京小営薬業有限公司から購入し、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、無水エタノールはいずれもクロマトグラフィックグレードを使用した。プエラリンは南京沢朗医薬科技有限責任公司から購入し、モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは本発明方法により調製し、高速液体クロマトグラフにより検出した純度は９９％以上であった。
【００９３】
２．実験動物
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ＳＤラット）、体重１８０−２２０ｇ、雌雄各半分、南通大学医学実験センターより提供、生産許可証明番号：ＳＣＸＫ（蘇）２００８００１０。
【００９４】
３．実験方法
脳下垂体後葉に敏感なＳＤラット５０匹を選んで適応飼育を３日した後、無作為に溶剤グループ、プエラリングループとモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン低、中、高３グループに分け、各グループのSDラットは１０匹とした。与える薬物はいずれも１０％のプロピレングリコール溶液を用いて溶解し、いずれも０．５ｍＬ投薬し、溶剤グループはプロピレングリコール生理食塩水溶液を使用し、プエラリングループはプエラリンプロピレングリコール生理食塩水溶液を使用し、用量は５０ｍｇ／ｋｇとし、モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリングループはプロピレングリコール生理食塩水溶液を使用し、用量は１２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇとした。投薬してから５分後、各グループのラットの静脈にＰｉｔ  ０．５Ｕ／ｋｇをゆっくりと注射して急性心筋虚血のモデルを作り、Ｐｉｔの注射後１５ｓ、３０ｓ、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１０ｍｉｎの時の各グループのラットの心電図変化を観察し、以上の各時点での心拍数とＴ波の振幅変化を計算した。
【００９５】
４．統計方法
データは表示を使用し、ｔ検査を使用した。Ｐ＜０．０５、差異が顕著的であることを示し；Ｐ＜０．０１の場合、差異は非常に顕著であることを示し；Ｐ＜０．００１の場合、差異が極めて顕著であることを示している。
【００９６】
５．結果
５．１  プエラリン誘導体がラットの心筋虚血のT波振幅変化に与える影響
【００９７】
【表４】
2013540769.tif 000010
【００９８】
実験結果により、被験サンプルのモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの用量はそれぞれ１２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇでありいずれも脳下垂体後葉から誘発されるＴ波振幅が顕著的に減少し、且つＴ波の減少幅がプエラリンを下回っていることについて、被験サンプルのモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンはプエラリンと比べてより有効的に心筋虚血を防止できる作用があることが分かった。
【００９９】
５．２  プエラリン誘導体の心筋虚血ラットの心拍数に与える影響
【０１００】
【表５】
2013540769.tif 000011
【０１０１】
実験結果により、脳下垂体後葉に注射後２分以内に各グループのラットにいずれも心拍数の明らかな下降が現れ、２〜１０分で各グループの心拍数は回復し始めたことが分かった。対照グループと比べて、被験サンプルのモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの異なる用量のグループはいずれも心筋虚血ラットの心拍数の回復を速めることができ、且つモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの低用量のグループの回復時間はプエラリングループよりも速かった。被験サンプルのモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは心筋虚血が引き起こす心拍数異常に対し一定の治療効果があることを説明している。
【０１０２】
実施例７：  モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの腫瘍細胞増殖に対する抑止作用の実験
１．細胞株と薬品
ヒトの乳腺癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、上海復蒙基因（遺伝子）生物科技有限公司より購入し；ヒトの慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２は、中国科学院上海細胞研究所細胞庫より購入し；プエラリンは、南京沢朗医薬科技有限責任公司より購入し；モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは本発明の方法により調製し、高速液体クロマトグラフにより検出した純度は９９％以上であった。
【０１０３】
２．実験薬物と溶剤調製
薬液の貯蔵：８．３２ｍｇのプエラリン粉末を秤取し、２ｍＬのＤＭＳＯに溶かして、１０ｍｍｏｌ／Ｌのプエラリンを調製し；１１．５６ｍｇのモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン粉末を秤取し、２ｍＬのＤＭＳＯに溶かして、１０ｍｍｏｌ／Ｌのモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンを調製し；０．２２μｍのフィルタで濾過して、１０００μＬ／ｄｏｆｆで個別方法して、−２０℃で保存して、同時に０．２２μｍフィルタで高濃度ＤＭＳＯを濾過し、対照グループのために備える。
【０１０４】
細胞培養液：ＲＰＭＩ−１６４０培養基（粉剤）を１包取って、８００ｍＬの三回蒸留水に溶かし、マグネチックスターラーで少なくとも３０分、完全に溶解するまで撹拌し、ＮａＨＣＯ３を２ｇ追加し、充分に溶解後１Ｌに定容した。０．２２ｐｍ孔径のフィルタで濾過して除菌し、血清を加え、血清の最終濃度を１０％にして、４℃で保存した。
【０１０５】
ＰＢＳリン酸塩緩衝溶液：８００ｍＬ蒸留水の中に８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＰＯ４と０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４を溶解し、ＨＣｌを使用して溶液のｐＨ値を７．４に調節し、水を加えて１Ｌに定容し、高圧蒸気で２０分滅菌し、低温で保存する。
【０１０６】
ＭＴＴ応用液：５００ｍｇのＭＴＴ粉剤を秤取して、１００ｍＬのＰＢＳに溶かし、撹拌して溶解後、０．２２ｐｍ孔径のフィルタで濾過して除菌し、個別包装の後、４℃で光を避けて保存する。
【０１０７】
ライシス溶液（ｌｙｓｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）：ＳＤＳを２５ｇ、イソプロパノールを１２．５ｍＬ、濃塩酸を２．５ｍＬ取り、三回蒸留水を使用して１Ｌに定容し、低温で保存する。
【０１０８】
３．主要な試薬と測定器具
高速液体クロマトグラフ（アメリカダイアナ  型番：Ｐ６００）；マイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社  型番：ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＡＸ  １９０／ＧＥＭＩＮＩＸＳ）；ＣＯ２培養器（Ｆｏｒｍａ社型番：３１１１）；低速遠心機（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ  型番：ＰＩＣＯ−１７）；倒立顕微鏡（ｌｅｉｃａ社  型番：ＤＭＬＬ）；オービタルシェーカー（南京大学儀器（測定器具）公司  型番：ＴＹ−８０Ｓ）；ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）；仔牛血清（ＧｉｂａｃｏＢＲＬ社）；ＲＰＭＩ１６４０（アメリカＧｉｂｃｏ社）；ペニシリンＧナトリウム塩（ＡＭＲＥＳＣＯ社）；硫酸ストレプトマイシン（ＡＭＲＥＳＣＯ社）；Ｔｒｙｐｓｉｎ（ＡＭＲＥＳＣＯ社）；ＭＴＴ（ＡＭＲＥＳＣＯ社）。
【０１０９】
４．細胞培養
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は体積分率が１０％不活化ウシ胎児血清、１００ＵペニシリンとストレプトマイシンのＲＰＭＩ−１６４０完全培養基を含んでおり、３７℃で５％のＣＯ２飽和湿度の培養器で培養した。
【０１１０】
Ｋ−５６２細胞は体積分率が１０％の不活化仔牛血清、１００ＵペニシリンとストレプトマイシンのＲＰＭＩ−１６４０完全培養基を含んでおり、３７℃で５％のＣＯ２飽和湿度の培養器で培養した。
【０１１１】
５．実験方法
５．１  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞毒性試験
対数増殖期のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（使い捨て培養ビン）を取り、培養液を捨てた。１０ｍＬのＰＢＳを加えて１回洗い、ＰＢＳを捨てた後、３ｍＬ  ０．２５％のトリプシン−０．０４％のＥＤＴＡを加えて、３７℃で３分間消化後、その中に５ｍＬの完全培養基を加え中和反応し、吹き付けた後に細胞を１５ｍＬ遠心分離管に入れ、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。細胞懸濁液を調合し、適量の完全培養基で細胞濃度を３×１０４／ｍＬに調整した。細胞を９６穴培養プレートに加え、各穴に細胞懸濁液１８０μＬずつを加え、培養プレートを細胞培養器（３７℃、５％、ＣＯ２）に入れルーチン培養した。細胞が５０−７０％に増殖してから各濃度の薬液を加えた。１０ｍｍｏｌ／Ｌプエラリンとモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン貯蔵液を取り、ＰＢＳを用いて薬液を１０００、５００、１００、５０、１０、５、１と０．１μｍｏｌ／Ｌまで段階希釈し、各穴に薬を２０μＬ加えて、薬物の最終濃度をそれぞれ１００、５０、１０、５、１、０．５、０．１と０．０１μｍｏｌ／Ｌとした。ＤＭＳＯ溶剤対照グループを２０μＬ  ＰＢＳ中に相応する薬物を含む溶剤に加え、ブランクコントロールグループに２μＬのＰＢＳを加えた。各薬物濃度に６個の複孔を設けた。培養プレートを細胞培養器に戻して、４８時間後に２０μＬのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）溶液を加え、引き続き培養器の中で４時間培養後、逆さにして上澄みを捨て、吸水紙で叩いて乾かし、各穴に２００μＬのＤＭＳＯを加え、振動機で光を避けて１５分間振動させ、結晶体を充分に溶解させた。全自動マイクロプレートリーダを使用して４９０ｎｍの下で吸光度を測定し、平均抑制率を計算し、抑制率（％）＝（対照グループＡ４９０−実験グループＡ４９０）／対照グループＡ４９０）とし、重複して３回実験を行った。
【０１１２】
５．２  Ｋ５６２細胞毒性試験
対数増殖期のＫ−５６２細胞を取り濃度を１×１０５個／ｍＬに調整して、９６穴培養プレートに接種して、各孔に細胞懸濁液９０ｕＬを加えて、実験グループは異なる最終濃度（１、５、１０、２０、５０、１００、１５０、２００μｍｏｌ／Ｌ）のプエラリンとモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンで処理し、各穴に薬を１０ｕＬ加えて、ＤＭＳＯ溶剤対照グループを２０μＬ  ＰＢＳ中に相応する薬物を含む溶剤に加え、ブランクコントロールグループに２μＬのＰＢＳを加えた。各薬物濃度に６個の複孔を設けた。培養プレートを細胞培養器に戻し、４８時間後に２０μＬのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）溶液を加え、引き続き培養器の中で４時間培養後、各穴にライシス溶液（ｌｙｓｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００ｕＬを加え、一晩結晶が充分溶解するのを待った。振とう器で２０分間振とうして全自動マイクロプレートリーダを使って４９０ｎｍの下で吸光度を測定し、平均抑制率を計算し、抑制率（％）＝（対照グループＡ４９０−実験グループＡ４９０）／対照グループＡ４９０）とし、重複して３回実験を行った。
【０１１３】
６．統計処理
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３ソフト内の関連分析とＳｔｕｄｅｎｔ  ｔを使用して検査をし、データはｘ±ＳＤ表示を採用した。
【０１１４】
７．実験結果
７．１  プエラリン誘導体がヒトの乳腺癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の増殖に与える影響
【０１１５】
【表６】
2013540769.tif 000012
【０１１６】
ＭＴＴ法で分析後の統計結果（表６を参照のこと）は、プエラリンとモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンが作用してから４８時間後にいずれもＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞数が減少することを説明している。同じ時間における対照グループを比較すると、モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの容量が５０μｍｏｌ／Ｌの時に差異があり（Ｐ＜０．０５）、用量が１００μｍｏｌ／Ｌの時に顕著な差異があり（Ｐ＜０．０１）、用量が１５０と２００μＬの時に前記差異は極めて顕著であり（Ｐ＜０．００１）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の抑制率はそれぞれ４４．０４％と５９．４２％に達し、モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンが明らかにヒトの乳腺癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の増殖を抑制し、且つ抑制率は用量の増加に従い増加することを説明している。
【０１１７】
７．２  プエラリン誘導体のヒトの慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２の増殖に与える影響
【０１１８】
【表７】
2013540769.tif 000013
【０１１９】
ＭＴＴ法で分析後の統計結果（表７を参照のこと）は、プエラリンとモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンが作用してから４８時間後にいずれもＫ５６２細胞の細胞数が減少することを説明している。同じ時間における対照グループを比較すると、モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの容量が低用量の１μｍｏｌ／Ｌの時にその結果に顕著的な差異があり（Ｐ＜０．０５）、用量が１００、１５０と２００μｍｏｌ／Ｌの時に前記差異は極めて顕著性があり（Ｐ＜０．００１）、Ｋ５６２細胞の抑制率はそれぞれ１６．４１％と２９．８４％と４６．４１％に達し、モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは明らかにヒトの慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２の増殖を抑制することができ、且つ抑制率は用量の増加に伴い増加することを説明している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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