(57)【要約】  修飾している置換エチレン基またはベンジル基を有するFGF21の類似体は、糖尿病、異脂肪血症、肥満、循環器疾患、メタボリック症候群および/または非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)の治療または予防に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式A-B-C-D-の1つまたは2つの修飾基がFGF21化合物のN末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合している、FGF21化合物の誘導体[式中、
A-は、式I、IIまたはIII:
【化１】
2013532644.tif 000116
(式中、nは8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19であり、*は-B-への結合点である)
の成分であり;
-B-は、存在しないか、結合を表すか、-B1-、-B2-またはそれらの組み合わせから選択され、ここで、-B1-は、式IV、V、VIまたはVII:
【化２】
2013532644.tif 000117
(式中、*は-B2-または-C-への結合点であり、#はA-または-B2-への結合点である)
の成分であり;
-B2-は、式VIII、IXまたはX:
【化３】
2013532644.tif 000118
(式中、bは0、1または2であり、cは0、1または2であり、但し、cが0である場合はbは1または2であり、cが1または2である場合はbは0であり、*は-C-、-B1-または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)、
【化４】
2013532644.tif 000119
(式中、dは1または2であり、eは0、1または2であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)、または
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式X)
(式中、uは2、3または4であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)
の成分であるか、式VIIIおよび/または式IXおよび/または式Xの4つ以下の成分の組み合わせであり;
-C-は、存在しないか、結合を表すか、式XIまたはXII:
【化５】
2013532644.tif 000120
(式中、pは0、1、2、3、4、5または6であり、qは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
【化６】
2013532644.tif 000121
(式中、kは0、1、2、3、4、5、11または23であり、mは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分であり;
-D-は、式XIII、XIIIa、XIVまたはXV:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)、#-NH-CH(CH3)2-CH2-* (式XIIIa)、
【化７】
2013532644.tif 000122
(式中、rは1〜5の範囲の整数であり、sは0〜5の範囲の整数であり、yは0〜5の範囲の整数であり、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分であるか、これらの成分のうちの2つである]
またはそれらの製薬上許容可能な塩。
【請求項２】
A-が、式I、IIまたはIII:
【化８】
2013532644.tif 000123
(式中、nは8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19であり、*は-B-への結合点である)
の成分であり;
-B-が、存在しないか、結合を表すか、-B1-、-B2-またはそれらの組み合わせから選択され、ここで、-B1-は、式IV、V、VIまたはVII:
【化９】
2013532644.tif 000124
(式中、*は-B2-または-C-への結合点であり、#はA-または-B2-への結合点である)
の成分であり;
-B2-は、式VIII、IXまたはX:
【化１０】
2013532644.tif 000125
(式中、bは0、1または2であり、cは0、1または2であり、但し、cが0である場合はbは1または2であり、cが1または2である場合はbは0であり、*は-C-、-B1-または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)、
【化１１】
2013532644.tif 000126
(式中、dは1または2であり、eは0、1または2であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)、または
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式X)
(式中、uは2、3または4であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)
の成分であるか、式VIIIおよび/または式IXおよび/または式Xの4つ以下の成分の組み合わせであり;
-C-が、存在しないか、結合を表すか、式XIまたはXII:
【化１２】
2013532644.tif 000127
(式中、pは0、1、2、3、4、5または6であり、qは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
【化１３】
2013532644.tif 000128
(式中、kは0、1、2、3、4、5、11または23であり、mは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分であり;
-D-が、式XIII、XIVまたはXV:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)または
【化１４】
2013532644.tif 000129
(式中、rは1〜5の範囲の整数であるか、sは0〜5の範囲の整数であるか、yは0〜5の範囲の整数であり、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分である、式A-B-C-D-の1つまたは2つの修飾基がFGF21化合物のN末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合している、請求項1に記載のFGF21化合物の誘導体、またはそれらの製薬上許容可能な塩。
【請求項３】
Aが式(III)の成分である場合、-B-および-C-の少なくとも1つは存在し、かつ/または結合を示さない、請求項1または2に記載の誘導体。
【請求項４】
-B-および-C-が存在し、かつ結合を示さない、請求項1から2のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項５】
-D-が本明細書で定義されている式XIIIの成分ではない(言いかえれば、-D-は本明細書で定義されている式XIVまたはXVの成分である)、許容される範囲までの請求項1から4のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項６】
次式(1)〜(3):
【化１５】
2013532644.tif 000130
から選択される式A-B-C-D-の修飾基が共有結合している、請求項1から5のいずれか一項に記載のFGF21化合物の誘導体、または対応する誘導体のいずれか1つの製薬上許容可能な塩。
【請求項７】
1つだけの修飾基がFGF21化合物中のN末端アミノ酸のαアミノ基に結合している、請求項1から4のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項８】
2つの修飾基がFGF21化合物中のN末端アミノ酸のαアミノ基に結合している、請求項1から4のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項９】
上記実施例3、4、5および6に詳細に記載されている誘導体のいずれか1つであり、好ましくはN-alpha(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[Arg56、Arg59、Arg69、Arg122] Gly-FGF21; N-alpha-ビス-(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[Arg56、Arg59、Arg69、Arg122] Gly-FGF21; N-alpha-(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[K56R、K59R、K69R、D102T、D121Q、K122R、L166F、S167G、M168L、G170T] Ala-FGF21;またはN-alpha(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[S71C、N121Q、L166F、S167G、M168L、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E、des181] Ala-FGF21である、許容される範囲までの請求項1から8のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１０】
FGF21化合物が、配列番号1に対して、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、よりさらに好ましくは少なくとも95%の同一性を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１１】
請求項1から10のいずれか一項に記載の誘導体と、製薬上許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項１２】
医薬として使用するための、請求項1から11のいずれか一項に記載の誘導体または請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
糖尿病、異脂肪血症、肥満、循環器疾患、メタボリック症候群および/または非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)の治療または予防における医薬として使用するための、請求項1から10、12のいずれか一項に記載の誘導体または請求項11または12に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
治療上有効な量の請求項1から10、12のいずれか一項に記載の誘導体または請求項11または12に記載の医薬組成物を患者に投与する工程を含む、糖尿病、異脂肪血症、肥満、循環器疾患、メタボリック症候群および/または非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)に罹患している患者の治療方法。
【請求項１５】
上記で定義されている任意の新規FGF21類似体、特に、詳細に記載されているか、実施形態に記載されている新規FGF21類似体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繊維芽細胞増殖因子21(FGF21)、さらに詳しくは、式A-B-C-D-の修飾基が共有結合しているFGF21化合物の誘導体に関する。また本発明は、新規なFGF21類似体、ならびに、特に糖尿病、異脂肪血症、肥満、循環器疾患、メタボリック症候群および/または非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)を治療または予防するためのこれらのFGF21誘導体および類似体の製薬学的使用に関する。
【０００２】
本発明の誘導体は、例えば、より長期間にわたる低血糖値の維持能力、FGF21の生体内(in vivo)半減期の増強能力を持続させ、かつ/またはFGF21のクリアランスを低下させる。
【背景技術】
【０００３】
繊維芽細胞増殖因子は、成長中の組織および成体組織で発現されるポリペプチドである。これらは、例えば、代謝調節および細胞分化をはじめとする、様々な生理学的機序に関与している。20を超える繊維芽細胞増殖因子の全ファミリーが存在する(FGFファミリー)。FGF19、FGF21およびFGF23を含むFGFファミリーの3つのメンバーは、代謝調節に関与する内分泌腺因子として機能しているサブファミリーを形成する。
【０００４】
繊維芽細胞増殖因子21またはFGF-21(本明細書では略してFGF21)は、肝臓で優先的に発現され、ホルモン様の代謝効果を及ぼすことが明らかになっている。
【０００５】
例えば、FGF21は、マウス脂肪細胞でグルコース取込みを活性化すること、トランスジェニックマウスで過剰発現される場合に食餌誘導肥満からマウスを保護すること、ならびに糖尿病性げっ歯類に投与した場合に血糖値およびトリグリセリド値を低下させることが証明されている(Kharitonenkovら、J. Clin. Invest. (2005)、115:1627〜1635頁)。
【０００６】
また、血糖およびトリグリセリドに対するFGF21の低下作用は、糖尿病のサルでも明らかにされている。FGF21は、また、糖尿病のサルにおいて有意にLDLを低下させること、またHDLを増加させることも可能であった(Kharitonenkovら、Endocrinology (2007)、148(2):774〜81頁)。
【０００７】
食餌誘導肥満マウスおよびob/obマウスにおいて、FGF21は、さらに、主としてエネルギー消費の増加と脂肪過多の低減によって体重を減少させることが判明した(Coskunら、Endocrinology (2008)、149(12): 6018〜6027頁)。
【０００８】
これらの結果に基づき、FGF21は、糖尿病、異脂肪血症、肥満、循環器疾患およびメタボリック症候群を治療する可能性を有する薬剤として示唆された。メタボリック症候群には、インシュリン抵抗性、異脂肪血症、内臓肥満および高血圧症などの態様が含まれる。例えば、Grundyら、Circulation (2004)、(109): 433〜438頁のメタボリック症候群の定義を参照されたい。
【０００９】
さらにFGF21は、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)を治療し得る薬剤として使用することができる。上記引用のCoskunら、Endocrinology、2008年、およびXuら、Diabetes (2009、58(1):250〜9頁)を参照されたい。NAFLDは、Erickson、J. Lipid Res. (2009、50 (April supplement)、S412-16)によって定義されている。
【００１０】
Yieらは、受容体相互作用および活性化におけるFGF21のN末端およびC末端の役割を研究した。FEBS Letters、583 (2009)、19〜24頁を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開2001012628 A1号
【特許文献２】国際公開第2003/011213号
【特許文献３】国際公開第2006/065582号
【特許文献４】国際公開第2006/050247号
【特許文献５】国際公開第2003/061712号
【特許文献６】国際公開第2005/091944号
【特許文献７】国際公開第2006/028595号
【特許文献８】国際公開第2006/028714号
【特許文献９】国際公開第2008/121563号
【特許文献１０】国際公開第2009/083549号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Kharitonenkovら、J. Clin. Invest. (2005)、115:1627〜1635頁
【非特許文献２】Kharitonenkovら、Endocrinology (2007)、148(2):774〜81頁
【非特許文献３】Coskunら、Endocrinology (2008)、149(12): 6018〜6027頁
【非特許文献４】Grundyら、Circulation (2004)、(109): 433〜438頁
【非特許文献５】Xuら、Diabetes (2009、58(1):250〜9頁)
【非特許文献６】Erickson、J. Lipid Res. (2009、50 (April supplement)、412〜16頁)
【非特許文献７】Yieら、FEBS Letters、583 (2009)、19〜24頁
【非特許文献８】Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443〜453頁
【非特許文献９】MyersおよびW. Miller in Optimal Alignments in Linear Space」  CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11〜17頁
【非特許文献１０】W. R. PearsonおよびD. J. Lipman (1988)、「Improved Tools for Biological Sequence Analysis」、PNAS 85:2444〜2448頁
【非特許文献１１】W. R. Pearson (1990)  「Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA」、Methods in Enzymology 183:63〜98頁
【非特許文献１２】Nishimuraら、Biochim. Biophys. Acta 1492(1):203〜206頁  (2000)
【非特許文献１３】Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes、Robert K.  第3版、1994年
【非特許文献１４】Yie, J.ら: FGF21 N- and C-termini play different roles in receptor interaction and activation、FEBS Letters 583 (2009) 19〜24頁
【非特許文献１５】Micanovic R.ら: Different roles of N- and C- termini in the functional activity of FGF21. J. Cell. Physiol. 2009年5月; 219(2):227〜34頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
簡潔に言えば、本発明は下記の請求項1で定義されている通りである。
【００１４】
本発明は、式A-B-C-D-(式中、成分Aは脂肪酸またはその誘導体である)を有する1つまたは2つの修飾基がFGF21化合物に共有結合しているFGF21化合物の誘導体に関する。また本発明は、特に糖尿病、異脂肪血症、肥満、循環器疾患、メタボリック症候群および/または非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)を治療するための医薬組成物における本発明の誘導体の使用に関する。
【００１５】
本発明の誘導体は、例えば、より長期間にわたる低血糖値の維持能力、FGF21の生体内半減期の増強能力を持続させ、かつ/またはFGF21のクリアランスを低下させる。この持続型(protracted)FGF21誘導体は十分な生物活性を維持し、しかもさほど頻繁に投与しなくてもよい。本誘導体は、好ましくは、さらに改善された酸化安定性を有する。
【００１６】
定義
本明細書では「FGF21化合物」という用語は、天然ヒトFGF21、ならびにそれらの類似体を意味する。
【００１７】
天然ヒトFGF21タンパク質の配列は、アクセッション番号Q9NSA1でUNIPROTデータベースから利用可能である。この209アミノ酸前駆タンパク質は、シグナルペプチド(アミノ酸1〜28)および成熟タンパク質(アミノ酸29〜209)を含む。成熟タンパク質は、配列番号1(アミノ酸1〜181)として、シグナルペプチドは配列番号2(アミノ酸1〜28)として本明細書に挙げている。本明細書の配列番号1の146位で成熟タンパク質中のLeuの代わりにProを有する天然ヒトFGF21のアイソフォームまたは対立形質は、とりわけ、米国特許出願公開第2001012628 A1号から公知である(米国特許出願公開の配列番号2の第174残基)。本明細書の配列番号2の23位にあるLeuが欠失している、より短いシグナルペプチドを有する別のアイソフォームは、国際公開第2003/011213号から公知である(27アミノ酸残基のシグナルペプチドを有する国際公開公報の配列番号2を参照されたい)。したがって、天然ヒトFGF21の特定の例は次の通りである:配列番号1、置換L146Pを有する配列番号1、ならびに、上記に述べた27または28アミノ酸シグナルペプチドより始まる任意のこれらの配列。天然ヒトFGF21の好ましい例は成熟部分、すなわち、配列番号1とそのL146Pアイソフォームである。
【００１８】
例えば、FGF21の文脈において本明細書で言及されているような「類似体」という用語、すなわち、FGF21類似体は、天然FGF21から、特に配列番号1から、それらのアミノ酸配列を修飾することにより推定もしくは誘導される、または推定もしくは誘導され得るポリペプチドを意味する。そのような修飾、変更または改変としては、1個または複数のアミノ酸の置換、欠失および/または付加が挙げられる。例えば、アミノ酸は、C末端で、N末端で、またはアミノ酸配列の内部で付加および/または欠失されていてもよい。好ましくは、アミノ酸はC末端および/またはN末端で、より好ましくはN末端で付加および/または欠失される。また、C末端またはN末端に欠失アミノ酸があるアミノ酸配列は、当技術分野で公知のように、切断型配列と呼ぶこともできる。同じく、配列内部に付加されたアミノ酸は挿入と呼ぶことができる。本発明の一実施形態においては、FGF21類似体を得るための配列番号1の上記修飾数は11以下、好ましくは9以下、より好ましくは7以下、よりさらに好ましくは5以下、より一層好ましくは3以下である。「変異体」または「突然変異体」という用語は、「類似体」という用語の代わりに本明細書で時々用いられる。
【００１９】
FGF21類似体の一例は、成熟タンパク質(HPIP)の4つのN末端アミノ酸残基が除去されている天然成熟FGF21の切断型であり、これは、例えば、国際公開第2006/065582号に開示されている。この切断型は、野生型FGF21と同じレベルでマウス3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込みを刺激すると言われている。このタンパク質は、本明細書における配列番号1のアミノ酸5〜181のアミノ酸配列を有する。
【００２０】
FGF21類似体のさらなる例は、N末端Metを有する配列番号1のポリペプチド(「Met-FGF21」とも呼ばれ、または配列番号1の-1M((マイナス1)M)置換として表示される)である。FGF21化合物を大腸菌(E. coli)で発現させた場合、N末端Metが付加される。例えば、国際公開第2006/050247号の表6を参照されたい。
【００２１】
FGF21類似体の別の例は、修飾FGF21配列(突然変異タンパク質と呼ばれることが多い)であり、これらは、例えば、国際公開第2003/061712号、国際公開第2005/091944号、国際公開第2006/028595号、国際公開第2006/028714号、国際公開第2006/065582号、および国際公開第2008/121563号に開示されている。FGF21類似体のさらなる別の例は、本明細書の実施例部分、ならびに添付の特許請求の範囲において開示する。
【００２２】
FGF21修飾の文脈において本明細書で言及されている「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語には、タンパク質生合成で細胞により使用され、遺伝子コードにより規定される20種の標準αアミノ酸、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが含まれる。またこの用語には、非標準アミノ酸、例えば、遺伝子コードによりコードされてもいるが、タンパク質においては稀である、セレノシステインおよびピロリシンなどが含まれる。タンパク質で確認される別の非標準アミノ酸、例えば、γ-カルボキシグルタミン酸およびヒドロキシプロリンは、翻訳後修飾により形成され得る。遺伝子コードによりコードされていない、非標準アミノ酸または非天然アミノ酸のさらなる例は、オルニチンおよびホスホセリンである。非標準アミノ酸のさらなる別の例は、化学合成によって製造されるアミノ酸をはじめとする合成アミノ酸であって、例えば、遺伝子コードによってコードされているアミノ酸のD-異性体、例えば、D-アラニン、D-グルタミン、D-ヒスチジンおよびD-ロイシン、Aib(α-アミノイソ酪酸)、Abu(α-アミノ酪酸)、Tle(tert-ブチルグリシン)、β-アラニン、3-アミノメチル安息香酸、アントラニル酸、des-アミノヒスチジン(略称DesaminoHis、代替名称イミダゾプロピオン酸、略称Impr)、アミノ酸のβ類似体、例えば、β-アラニン、2-アミノヒスチジン、β-ヒドロキシヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチルヒスチジン、α-フルオロメチルヒスチジン、α-メチルヒスチジン、α,α-ジメチルグルタミン酸、m-CF3-フェニルアラニン(略称m-CF3-Phe)、α,β-ジアミノプロピオン酸(略称Dap)、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニンまたは4-ピリジルアラニン、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、および(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸である。
【００２３】
本目的においては、標準アミノ酸の2種の認識コード(1文字および3文字)を同義で用いるか、時々、アミノ酸の名称を完全に細かく表記する。言うまでもなく、これらの用語は完全に同等であるとみなされる(例えば、S=Ser=セリン)。
【００２４】
例えば、FGF21の文脈において本明細書で言及される「誘導体」という用語、例えばFGF21誘導体は、本明細書では、A-B-C-D-と表される修飾基の付加により例示される、共有結合で修飾されているFGF21化合物を意味する。この用語は、それ自体は限定的ではなく、むしろ、構成FGF21ポリペプチド化合物それ自体になされる改変(「類似体」)と、側鎖のFGF21化合物に対する共有結合(それにより、化合物は「誘導体化される」)との間の区別をつけることを意図するので、記述的である。
【００２５】
命名法:類似体および誘導体は、当該技術事項の理解を容易にするのに最も適していると認められるものは何であろうと、ポリペプチド命名法、有機化学命名法および化学式、またはそれらの混合を同義的に使用して、本明細書で命名される。例えば、実施例3の誘導体は、N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]-メチル}ベンジル) [Arg56, Arg59, Arg69, Arg122]Gly-FGF21(ここで、[Arg56, Arg59, Arg69, Arg122] Gly-FGF21は、N末端アミノ酸Glyのα-アミノ基で4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジルにより修飾されていることを意味する)と命名することができる。しかし、この化合物はまた、下記の化合物
【００２６】
【化１】
2013532644.tif 000002
【００２７】
によりN末端のN-αで誘導体化された[Arg56, Arg59, Arg69, Arg122] Gly-FGF21として定義することもできる(式中、*は、前記N末端アミノ酸Glyのαアミノ基への結合点である)。
【００２８】
変異体命名法(類似体の命名法):FGF21の変異体(または類似体)は、当該技術事項の理解を容易にするのに最も適していると認められるものは何であろうと、ポリペプチド命名法、有機化学命名法および化学式、アミノ酸配列またはそれらの混合を同義的に使用して、本明細書で命名される。
【００２９】
例えば、変異体における置換は、「元のアミノ酸-位置-置換アミノ酸」として表示することができる。3文字コードまたは1文字コードを使用することができる。したがって、「K122C」または「Lys122Cys」の表記は、変異体とFGF21とを後述のようにアラインした場合(「アラインメント」)、変異体が、FGF21(配列番号1)中の122位のアミノ酸に対応する変異体のアミノ酸位置において、リシンのシステイン置換を含んでいることを意味する。
【００３０】
多重修飾(例えば置換)は、(コンマの後にスペースを入れて)コンマによって区切ることができるが、所望により角括弧で囲み、これらが同じ変異体に属することを明確にすることができる。実施例3において誘導体化される類似体は、例えば、「K56R, K59R, K69R, K122R Gly-FGF21」もしくは「(K56R, K59R, K69R, K122R) Gly-FGF21」と表示してもよく、または、「K56R, K59R, K69RおよびK122R、およびN末端Gを有する配列番号1」として記載することができる。この化合物を表示するさらにシンプルな方法は、交換されたアミノ酸を省略して、名称が「56R, 59R, 69R, 122R Gly-FGF21」となるようにすることである。置換および挿入が混合された形態にある多重修飾の伴う変異体の命名法に関して、化合物実施例2dを参照されたい。
【００３１】
代替修飾、例えば、規定の位置での代替置換は、例えば、「S181K,R」の表記にあるようにコンマで区切ることが可能である。前記表記は、181位のSerがLysまたはArgで置換され得ることを意味する。
【００３２】
伸長は、位置番号(C末端における連続した正の数とN末端における負の数)を付加することによって、または、より簡単には、当該伸長のアミノ酸を、それらの正確な配列を使用して、当該化合物(これは、関連する技術ポイントの理解を容易にするために、その際、慣用名(例えばFGF21)が付けられることが多い)に付加することによって、配列番号1を参照することにより記載することができる。例として、実施例2aの化合物は、配列番号1を参照することにより、-1位にGを、また変異K56R、K59R、K69R、K122Rを有する配列番号1のポリペプチド(FGF21)を示す。
【００３３】
変異体における挿入は、「挿入前のアミノ酸位置番号-インデックス-挿入アミノ酸」と示すことができる。挿入前のアミノ酸位置番号は、変異体とFGF21とを後述のようにアラインした場合(「アラインメント」)に生じる、ギャップの直前のFGF21(配列番号1)中のアミノ酸位置を意味する。アミノ酸に関し、3文字コードまたは1文字コードを使用することができる。インデックスはアルファベット順の小文字であり、例えば、規定によれば、最初の挿入アミノ酸残基については「a」、2番目の挿入アミノ酸残基については「b」、などである。したがって、「V169aT」(もしくは「Val169aThr」)、または簡単には「169aT」(もしくは「169aThr」)の表記は、全て、変異体とFGF21とを後述のようにアラインした場合(「アラインメント」)、変異体がFGF21(配列番号1)中の169位のバリンの後にトレオニンの挿入を含むことを意味する。
【００３４】
本発明の目的のために、2つのアミノ酸配列のアラインメントは、EMBOSSパッケージ(http://emboss.org)から得られるNeedleプログラムを使用して行うことができる。好ましいバージョンは2.8.0.である。Needleプログラムは、Needleman, S. B.およびWunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48、443〜453頁に記載されている包括的アラインメントアルゴリズムを実施する。使用する置換マトリクス(substitution matrix)はBLOSUM62、ギャップオープニングペナルティーは10であり、ギャップ伸長ペナルティーは0.5である。
【００３５】
本発明のFGF21類似体配列(「発明配列」;例えば、K56R、K59RおよびK69Rを有する配列番号1)と異なるアミノ酸配列(「外来配列」;例えば、配列番号1のFGF21配列)との間の同一性の程度またはパーセンテージは、どちらが最短であっても、「発明配列」の長さまたは「外来配列」の長さで割った、2つの配列のアラインメントにおける正確なマッチ数として計算される。その結果は、同一性パーセントで表される。
【００３６】
「発明配列」と「外来配列」が、オーバーラップの同一位置に同一のアミノ酸残基を有している場合に、正確なマッチが生じる(下記のアラインメントの例において、これは「*」によって表される)。配列の長さは、配列中のアミノ酸残基の数である(例えば、配列番号1の長さは181である)。
【００３７】
これは、上述の「発明配列」と「外来配列」のアラインメントの例である:
【数１】
2013532644.tif 000003
【００３８】
したがって、FGF21に対するこのFGF21類似体の同一性パーセンテージは、178/181×100%=98.3%である。代替法では、2つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、Needleman-Wunschアラインメントであるプログラム「align」によって決定することができる(すなわち、グローバルアラインメント)。配列は、デフォルトスコアマトリックスBLOSUM50を使用し、プログラムによってアラインされる。最初の残基のギャップに関するペナルティーは12であり、さらなる残基のギャップについては、ペナルティーは2である。Needleman-Wunschアルゴリズムは、Needleman, S.B.およびWunsch, CD.、(1970)、Journal of Molecular Biology、48: 443〜453頁に記載されており、alignプログラムはMyersおよびW. Miller in Optimal Alignments in Linear Space」  CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11〜17頁による。「Align」は、FASTAパッケージバージョンv20u6の一部である(W. R. PearsonおよびD. J. Lipman (1988)、「Improved Tools for Biological Sequence Analysis」、PNAS 85:2444〜2448頁、ならびにW. R. Pearson (1990)  「Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA」、Methods in Enzymology 183:63〜98頁を参照)。
【００３９】
本発明のFGF21化合物の誘導体またはFGF21類似体を含む医薬組成物は、さらに製薬上許容可能な担体を含んでいてもよい。注射の場合、担体は、所望により別の物質、例えば食塩水(生理的食塩水など)が補充された、水であってもよい。別の製薬上許容可能な薬剤、例えば、希釈剤および適切な緩衝剤を使用することもできる。必要に応じて、追加の製薬上許容可能な薬剤、例えば、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、充填剤、増量剤、アジュバント、保存剤、酸化防止剤、着色剤および/または着香料を使用することもできる。FGF21化合物の誘導体またはFGF21類似体は、当技術分野で公知のように、精製ポリペプチドもしくはその誘導体の形態で使用してもよく、または、適切な製薬上許容可能な添加剤を使用して製剤化することができる。医薬組成物は、当技術分野で公知の任意の方法で投与することが可能であり、例えば、静脈内(i.v.)で、または皮下(s.c.)で注射することができる。
【００４０】
FGF21化合物、例えばFGF21類似体の誘導体は、治療的または予防的に有効な量の医薬組成物中に含まれていてもよい。その量は、治療目的または予防目的、例えば、当該適応症状、治療を必要とする患者の症状、所望の投与経路などに依存する。当分野の熟練の医師は、当技術分野で日常的に行っているように、これらの要因に応じて用量を調節し、投与を調整しなければならない。
【００４１】
発明の目的
本発明の目的は、先行技術の欠点の少なくとも1つを解消もしくは改善すること、または有用な代替技術を提供することである。
【００４２】
本発明の別の態様は、ヒトFGF21と比較して、糖尿病の治療に対する改良された特性を有する、FGF21の類似体または誘導体の提供に関する。
【００４３】
本発明の別の態様は、ヒトFGF21と比較して、肥満の治療に対する改良された特性を有する、FGF21の類似体または誘導体の提供に関する。
【００４４】
本発明の別の態様は、ヒトFGF21と比較して、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)の治療に対して改良された特性を有する、FGF21の類似体または誘導体の提供に関する。
【００４５】
本発明の別の態様は、大腸菌などの細菌およびサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などの酵母菌において比較的容易に組換え体を調製することができる、FGF21の類似体または誘導体の提供に関する。
【００４６】
本発明の別の態様は、N末端分解に対して保護されているFGF21の類似体または誘導体の提供に関する。
【００４７】
本発明の別の態様は、ヒトFGF21と比較して、3T3-L1細胞におけるグルコース取込みに関して効力が増加した、FGF21の類似体または誘導体の提供に関する。
【００４８】
本発明の別の態様は、Met-FGF-21の平均半減期時間と比較して、平均半減期時間が延長された、FGF-21の類似体および誘導体の提供に関する(以下の実施例40を参照)。
【００４９】
本発明のさらなる目的は、高血圧症、重症疾患、メタボリック症候群、てんかん、癌、先端肥大症、異脂肪血症(高TG、高LDLおよび低HDC)、ならびに循環器疾患、例えばアテローム性動脈硬化および高コレステロール血症の治療に効果的に使用することができる化合物を提供することである。
【００５０】
より詳しくは、十分な数の上記態様に対処することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００５１】
本発明の詳細な説明
本発明は、式A-B-C-D-の1つまたは2つの修飾基がFGF21化合物中のN末端αアミノ基に共有結合しているFGF21化合物の誘導体[式中、
A-は、式I、IIまたはIII:
【００５２】
【化２】
2013532644.tif 000004
【００５３】
(式中、nは8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19であり、*は-B-への結合点である)
の成分であり;
-B-は、存在しないか、結合を表すか、-B1-、-B2-またはそれらの組み合わせから選択され、ここで、-B1-は、式IV、V、VIまたはVII:
【００５４】
【化３】
2013532644.tif 000005
【００５５】
(式中、*は-B2-または-C-への結合点であり、#はA-または-B2-への結合点である)
の成分であり;
-B2-は、式VIII、IXまたはX:
【００５６】
【化４】
2013532644.tif 000006
【００５７】
(式中、bは0、1または2であり、cは0、1または2であり、但し、cが0である場合はbは1または2であり、cが1または2である場合はbは0であり、*は-C-、-B1-または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)、
【００５８】
【化５】
2013532644.tif 000007
【００５９】
(式中、dは1または2であり、eは0、1または2であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)、または
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式X)
(式中、uは2、3または4であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)
の成分であるか、式VIIIおよび/または式IXおよび/または式Xの4つ以下の成分の組み合わせであり;
-C-は、存在しないか、結合を表すか、式XIまたはXII:
【００６０】
【化６】
2013532644.tif 000008
【００６１】
(式中、pは0、1、2、3、4、5または6であり、qは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
【００６２】
【化７】
2013532644.tif 000009
【００６３】
(式中、kは0、1、2、3、4、5、11または23であり、mは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分であり;
-D-は、式XIII、XIIIa、XIVまたはXV:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)、#-NH-CH(CH3)2-CH2-* (式XIIIa)、
【００６４】
【化８】
2013532644.tif 000010
【００６５】
(式中、rは1〜5の範囲の整数であるか、sは0〜5の範囲の整数であるか、yは0〜5の範囲の整数であり、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分であるか、これらの成分のうちの2つである]またはそれらの製薬上許容可能な塩に関する。
【００６６】
-D-が式XIII、XIIIa、XIVまたはXVの成分のうちの2つであるような場合には、これらの2つ成分は同一であっても異なっていてもよい。-D-が式XIII、XIIIa、XIVまたはXVの成分のうちの2つであるような場合、これらの2つの成分同士が連結されている結合点は、式XIII、XIIIa、XIVまたはXVの成分の1つから記号#によって識別される1つの結合点と、記号*によって識別される別の成分からの1つの結合点であり、この連結された成分において、*は1つの式XIII、XIIIa、XIVまたはXVの成分からFGF21化合物への結合点であり、#は別の成分から-C-への結合点である。
【００６７】
第1の部分が、存在しない(例えば、A-、-B-または-C-などの)文字により識別される第2の部分に結合されることが記載されているこれらの場合においては、前記の第1の部分は、存在する次の成分に結合される。一例を挙げれば、-D-と表示されている部分に関して、#が-C-への結合点であり、かつ-C-が存在しないことが記載されているならば、その時、-D-と表示されている部分の#により識別される結合点は、-B-と表示されている部分に結合される。
【００６８】
一態様においては、本発明は、式A-B-C-D-の1つまたは2つの修飾基がFGF21化合物中のN末端αアミノ基に共有結合しているFGF21化合物の誘導体[式中、
A-は、式I、IIまたはIII:
【００６９】
【化９】
2013532644.tif 000011
【００７０】
(式中、nは8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19であり、*は-B-への結合点である)
の成分であり;
-B-は、存在しないか、結合を表すか、-B1-、-B2-またはそれらの組み合わせから選択され、ここで、-B1-は、式IV、V、VIまたはVII:
【００７１】
【化１０】
2013532644.tif 000012
【００７２】
(式中、*は-B2-または-C-への結合点であり、#はA-または-B2-への結合点である)
の成分であり;
-B2-は、式VIII、IXまたはX:
【００７３】
【化１１】
2013532644.tif 000013
【００７４】
(式中、bは0、1または2であり、cは0、1または2であり、但し、cが0である場合、bは1または2であり、また、cが1または2である場合、bは0であり、*は-C-、-B1-または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)、
【００７５】
【化１２】
2013532644.tif 000014
【００７６】
(式中、dは1または2であり、eは0、1または2であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)、または
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式X)
(式中、uは2、3または4であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)
の成分であるか、式VIIIおよび/または式IXおよび/または式Xの4つ以下の成分の組み合わせであり;
-C-は、存在しないか、結合を表すか、式XIまたはXII:
【００７７】
【化１３】
2013532644.tif 000015
【００７８】
(式中、pは0、1、2、3、4、5または6であり、qは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
【００７９】
【化１４】
2013532644.tif 000016
【００８０】
(式中、kは0、1、2、3、4、5、11または23であり、mは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分であり;
-D-は、式XIII、XIVまたはXV:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)または
【００８１】
【化１５】
2013532644.tif 000017
【００８２】
(式中、rは1〜5の範囲の整数であるか、sは0〜5の範囲の整数であるか、yは0〜5の範囲の整数であり、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分である]
またはそれらの製薬上許容可能な塩に関する。
【００８３】
本発明の一実施形態においては、-D-は本明細書で定義されている式XIIIの成分ではない。言いかえれば、-D-は本明細書で定義されている式XIVまたはXVの成分である。
【００８４】
FGF21化合物の例は、配列番号1と比較した場合に、以下の修飾の少なくとも1つを含むFGF21類似体である: -1G、-1A、-1S、-1F、-1M、R17A、R17H、Q27E、Q28R、Q28E、A31E、R36A、R36H、K56R、K59R、K69R、S71C、D102E、D102N、D102T、N121Q、N121D、K122R、D159E、L166F、S167G、M168L、D169E、V169aT、des170、G170T、G170P、P171L、P171G、P171S、S172E、S172L、S172Q、Q173E、173aA、Q173A、G174A、G174V、Y179F、A180E、des181、S181K、S181Rおよび/または182G。
【００８５】
本明細書で定義されている修飾部分は、in vivoにおいてヒト血清アルブミンに結合する特定能力を有することが判明した。
【００８６】
さらに、本発明は、治療上の有効な量の本発明の類似体または誘導体と、製薬上許容可能な担体とを含む医薬組成物;ならびに、治療上有効な量の本発明の類似体、誘導体または組成物を患者に投与する工程を含む、糖尿病、異脂肪血症、肥満、循環器疾患、メタボリック症候群、および/または非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)に罹患している患者の治療方法に関する。
【００８７】
本発明の誘導体は、式A-B-C-D-の1つまたは2つの修飾基がFGF21化合物のN末端αアミノ基に共有結合している。
【００８８】
本発明の誘導体および本発明の類似体は、例えば、グルコース低下作用、異脂肪血症、肥満、循環器疾患、メタボリック症候群および/または非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)における改善に関して、ヒトFGF21の生物効果と同等かそれより優れた効果を有し得る。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
本発明の好ましい態様
下記は、本発明の誘導体、特に、式A-B-C-D-の1つだけの修飾基が、FGF21化合物のN末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合している、本発明の第1の態様の特定の実施形態である。
【００９０】
一実施形態においては、A-は、式I、IIまたはIII:
【００９１】
【化１６】
2013532644.tif 000018
【００９２】
(式中、nは8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19であり、*は-B-への結合点である)
の成分であり;
-B-は、存在しないか、結合を表すか、-B1-、-B2-またはそれらの組み合わせから選択され、ここで、-B1-は、式IV、V、VIまたはVII:
【００９３】
【化１７】
2013532644.tif 000019
【００９４】
(式中、*は-B2-または-C-への結合点であり、#はA-または-B2-への結合点である)
の成分であり;
-B2-は、式VIII、IXまたはX:
【００９５】
【化１８】
2013532644.tif 000020
【００９６】
(式中、bは0、1または2であり、cは0、1または2であり、但し、cが0である場合はbは1または2であり、cが1または2である場合はbは0であり、*は-C-、-B1-または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)、
【００９７】
【化１９】
2013532644.tif 000021
【００９８】
(式中、dは1または2であり、eは0、1または2であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)、または
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式X)
(式中、uは2、3または4であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)
の成分であるか、式VIIIおよび/または式IXおよび/または式Xの4つ以下の成分の組み合わせであり;
-C-は、存在しないか、結合を表すか、式XIまたはXII:
【００９９】
【化２０】
2013532644.tif 000022
【０１００】
(式中、pは0、1、2、3、4、5または6であり、qは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
【０１０１】
【化２１】
2013532644.tif 000023
【０１０２】
(式中、kは0、1、2、3、4、5、11または23であり、mは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分であり;
-D-は、式XIII、XIIIa、XIVまたはXV:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)、#-NH-CH(CH3)2-CH2-* (式XIIIa)、
【０１０３】
【化２２】
2013532644.tif 000024
【０１０４】
(式中、rは1〜5の範囲の整数であるか、sは0〜5の範囲の整数であるか、yは0〜5の範囲の整数であり、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分であり、またはこれらの式のうちの2つであり、
またはそれらの製薬上許容可能な塩である。
【０１０５】
別の実施形態においては、A-は、式I、IIまたはIII:
【０１０６】
【化２３】
2013532644.tif 000025
【０１０７】
(式中、nは8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19であり、*は-B-への結合点である)
の成分であり;
-B-は、存在しないか、結合を表すか、-B1-、-B2-またはそれらの組み合わせから選択され、ここで、-B1-は、式IV、V、VIまたはVII:
【０１０８】
【化２４】
2013532644.tif 000026
【０１０９】
(式中、*は-B2-または-C-への結合点であり、#はA-または-B2-への結合点である)
の成分であり;
-B2-は、式VIII、IXまたはX:
【０１１０】
【化２５】
2013532644.tif 000027
【０１１１】
(式中、bは0、1または2であり、cは0、1または2であり、但し、cが0である場合はbは1または2であり、cが1または2である場合はbは0であり、*は-C-、-B1-または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)、
【０１１２】
【化２６】
2013532644.tif 000028
【０１１３】
(式中、dは1または2であり、eは0、1または2であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)、または
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式X)
(式中、uは2、3または4であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)
の成分であるか、式VIIIおよび/または式IXおよび/または式Xの4つ以下の成分の組み合わせであり;
-C-は、存在しないか、結合を表すか、式XIまたはXII:
【０１１４】
【化２７】
2013532644.tif 000029
【０１１５】
(式中、pは0、1、2、3、4、5または6であり、qは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
【０１１６】
【化２８】
2013532644.tif 000030
【０１１７】
(式中、kは0、1、2、3、4、5、11または23であり、mは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分であり;
-D-は、式XIII、XIVまたはXV:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)または
【０１１８】
【化２９】
2013532644.tif 000031
【０１１９】
(式中、rは1〜5の範囲の整数であるか、sは0〜5の範囲の整数であるか、yは0〜5の範囲の整数であり、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分であり、
またはそれらの製薬上許容可能な塩である。
【０１２０】
一実施形態においては、A-は、式I:
【０１２１】
【化３０】
2013532644.tif 000032
【０１２２】
(式中、nは好ましくは12、14、16または18であり、より好ましくは、12、14または16であり、ここで、*は-B-への結合点である)
の成分である。
【０１２３】
別の実施形態においては、A-は、式I:
【０１２４】
【化３１】
2013532644.tif 000033
【０１２５】
(式中、nは好ましくは14、16または18であり、ここで、*は-B-への結合点である)
の成分である。
【０１２６】
一実施形態においては、-B-は、-B1-、好ましくは式IVまたはV:
【０１２７】
【化３２】
2013532644.tif 000034
【０１２８】
(式中、*は-B2-または-C-への結合点であり、#はA-または-B2-への結合点である)
の成分を含む。
【０１２９】
一実施形態においては、-B-は、-B2-、好ましくは式VIII:
【０１３０】
【化３３】
2013532644.tif 000035
【０１３１】
(式中、より好ましくは、cは0であり、かつbは2(γ-Glu)であるか、cは0であり、かつbは1(β-Asp)であり、ここで、*は-C-、-B1-、または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)
の1つまたは2つの成分を含む。
【０１３２】
一実施形態においては、-B-は、-B2-、好ましくは式VIII:
【０１３３】
【化３４】
2013532644.tif 000036
【０１３４】
(式中、より好ましくは、cは0であり、かつbは2であり、ここで、*は-C-、-B1-、または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)
の4つの成分を含む。
【０１３５】
一実施形態においては、-B-は、-B2-、好ましくは式IX:
【０１３６】
【化３５】
2013532644.tif 000037
【０１３７】
(式中、より好ましくは、dは1であり、かつeは2であるか、dは2で、かつeは1であり、ここで、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)
の1つまたは2つの成分を含む。
【０１３８】
一実施形態においては、-B-は、-B2-、好ましくは式X:#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式X)(式中、より好ましくは、uは3であり、ここで、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)の1つまたは2つの成分を含む。
【０１３９】
一実施形態においては、-C-は、式XI:
【０１４０】
【化３６】
2013532644.tif 000038
【０１４１】
(式中、好ましくは、qは0、1、2、3または4であり、より好ましくは、qは1または2であり、ここで、*は-D-への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分である。
【０１４２】
一実施形態においては、-C-は、式XI:
【０１４３】
【化３７】
2013532644.tif 000039
【０１４４】
(式中、好ましくは、pは1または2であり、より好ましくは、pは1であり、ここで、*は-D-への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分である。
【０１４５】
一実施形態においては、-C-は、式XI:
【０１４６】
【化３８】
2013532644.tif 000040
【０１４７】
(式中、pは1であり、かつqは1または2であり、好ましくは、pは1であり、かつqは2であり、ここで、*は-D-への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分である。
【０１４８】
一実施形態においては、-C-は、式XII:
【０１４９】
【化３９】
2013532644.tif 000041
【０１５０】
(式中、好ましくは、mは0、1または2であり、より好ましくは、mは1または2であり、ここで、*は-D-への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分である。
【０１５１】
一実施形態においては、-C-は、式XII:
【０１５２】
【化４０】
2013532644.tif 000042
【０１５３】
(式中、好ましくは、kは1、2、3、4、5または11であり、より好ましくは、kは5であり、よりさらに好ましくは、mは1であり、かつkは4、5または11であり、または最も好ましくは、mは1であり、かつkは5であり、ここで、*は-D-への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分である。
【０１５４】
一実施形態においては、-D-は、式XIII、XIIIa、XIVまたはXV:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)、
#-NH-CH(CH3)2-CH2-* (式XIIIa)、または、
【０１５５】
【化４１】
2013532644.tif 000043
【０１５６】
(式中、rは1〜5の範囲の整数であるか、sは0〜5の範囲の整数であるか、yは0〜5の範囲の整数であり、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分であるか、これらの成分のうちの2つである。
【０１５７】
-D-が式XIII、XIIIa、XIVまたはXVの成分のうちの2つであるような場合、これらの2つの成分は同一であっても、異なっていてもよい。-D-が式XIII、XIIIa、XIVまたはXVの成分のうちの2つであるような場合、これらの2つの成分同士が連結している結合点は式XIII、XIIIa、XIVまたはXVの成分の1つから記号#により識別される1つの結合点と、記号*により識別される別の成分からの1つの結合点であり、またこの連結されている成分において、*は式XIII、XIIIa、XIVまたはXVの成分の1つからFGF21化合物への結合点であり、#は別の成分から-C-への結合点である。
【０１５８】
一実施形態においては、-D-は、式XIII、XIVまたはXV:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)、または、
【０１５９】
【化４２】
2013532644.tif 000044
【０１６０】
(式中、rは1〜5の範囲の整数であるか、sは0〜5の範囲の整数であるか、yは0〜5の範囲の整数であり、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分である。
【０１６１】
本発明の一実施形態においては、-D-は本明細書で定義されている式XIIIの成分ではない。言いかえれば、-D-は本明細書で定義されている式XIVまたはXVの成分である。
【０１６２】
一実施形態においては、-D-は、式XIII:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)
(式中、好ましくは、rは1、2または3であり、より好ましくは、rは1であり、ここで、#は-C-への結合点であり、*はFGF21化合物への結合点である)
の成分である。
【０１６３】
一実施形態においては、-D-は、式XIV:
【０１６４】
【化４３】
2013532644.tif 000045
【０１６５】
(式中、好ましくは、sは0または1であり、より好ましくは、sは1であり、ここで、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分である。
【０１６６】
一実施形態においては、-D-は、式XV:
【０１６７】
【化４４】
2013532644.tif 000046
【０１６８】
(式中、好ましくは、yは0または1であり、より好ましくは、yは1であり、ここで、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分である。
【０１６９】
一実施形態において、-D-は、FGF21化合物のアルデヒドとの反応生成物であり、例えば、限定されるものではないが、式XVIまたはXVII:
#-NH-(CH2)t-CHO (式XVI)、
【０１７０】
【化４５】
2013532644.tif 000047
【０１７１】
(式中、#は-C-または-B-への結合点であり、tは1、2、3、4または5であり、より好ましくは、tは1、2または3であり、または最も好ましくは、tは1であり、または好ましくは、uは0または1であり、より好ましくは、uは1である)
の成分である。
【０１７２】
一実施形態においては、-D-は、FGF21化合物のアルデヒド前駆体との反応生成物であり(これはin situで活性化される)、例えば、限定されるものではないが、式XVIII:
【０１７３】
【化４６】
2013532644.tif 000048
【０１７４】
(式中、#は-C-または-B-への結合点であり、vは1、2、3、4または5であり、好ましくは、xは1または2であり、より好ましくは、vは1、2または3であり、好ましくは、xは1であり、または、最も好ましくは、vは1であり、かつxは1であり、ここで、*はFGF21化合物への結合点である)
の成分である。
【０１７５】
一実施形態においては、部分A-B-C-D-は、次式(1〜2):
【０１７６】
【化４７】
2013532644.tif 000049
【０１７７】
(式中、*はFGF21化合物への結合点である)、
または対応する誘導体の製薬上許容可能な塩から選択される。
【０１７８】
下記は、本発明の誘導体、特に、式A-B-C-D-の2つの修飾基がFGF21化合物のN末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合している、本発明の第2の態様の特定の実施形態である。
【０１７９】
一実施形態においては、A-は式I、IIまたはIII:
【０１８０】
【化４８】
2013532644.tif 000050
【０１８１】
(式中、nは8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19であり、*は-B-への結合点である)
の成分であり;
-B-は存在しないか、結合を表すか、-B1-、-B2-またはそれらの組み合わせから選択され、ここで、-B1-は、式IV、V、VIまたはVII:
【０１８２】
【化４９】
2013532644.tif 000051
【０１８３】
(式中、*は-B2-または-C-への結合点であり、#はA-または-B2-への結合点である)
の成分であり;
-B2-は、式VIII、IXまたはX:
【０１８４】
【化５０】
2013532644.tif 000052
【０１８５】
(式中、bは0、1または2であり、cは0、1または2であり、但し、cが0である場合はbは1または2であり、cが1または2である場合はbは0であり、*は-C-、-B1-または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)、
【０１８６】
【化５１】
2013532644.tif 000053
【０１８７】
(式中、dは1または2であり、eは0、1または2であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)、または
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式X)
(式中、uは2、3または4であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)
の成分であるか、式VIIIおよび/または式IXおよび/または式Xの4つ以下の成分の組み合わせであり;
-C-は、存在しないか、結合を表すか、式XIまたはXII:
【０１８８】
【化５２】
2013532644.tif 000054
【０１８９】
(式中、pは0、1、2、3、4、5または6であり、qは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
【０１９０】
【化５３】
2013532644.tif 000055
【０１９１】
(式中、kは0、1、2、3、4、5、11または23であり、mは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分であり;
-D-は、式XIII、XIIIa、XIVまたはXV:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)、#-NH-CH(CH3)2-CH2-* (式XIIIa)、
【０１９２】
【化５４】
2013532644.tif 000056
【０１９３】
(式中、rは1〜5の範囲の整数であり、sは0〜5の範囲の整数であり、yは0〜5の範囲の整数であり、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分であるか、またはこれらの成分のうちの2つであり、
またはそれらの製薬上許容可能な塩である。
【０１９４】
別の実施形態においては、A-は、式I、IIまたはIII:
【０１９５】
【化５５】
2013532644.tif 000057
【０１９６】
(式中、nは8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19であり、*は-B-への結合点である)
の成分であり;
-B-は、存在しないか、結合を表すか、-B1-、-B2-またはそれらの組み合わせから選択され、ここで、-B1-は、式IV、V、VIまたはVII:
【０１９７】
【化５６】
2013532644.tif 000058
【０１９８】
(式中、*は-B2-または-C-への結合点であり、#はA-または-B2-への結合点である)
の成分であり;
-B2-は、式VIII、IXまたはX:
【０１９９】
【化５７】
2013532644.tif 000059
【０２００】
(式中、bは0、1または2であり、cは0、1または2であり、但し、cが0である場合はbは1または2であり、cが1または2である場合はbは0であり、*は-C-、-B1-または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)、
【０２０１】
【化５８】
2013532644.tif 000060
【０２０２】
(式中、dは1または2であり、eは0、1または2であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)、または
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式X)
(式中、uは2、3または4であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)
の成分であるか、式VIIIおよび/または式IXおよび/または式Xの4つ以下の成分の組み合わせであり;
-C-は、存在しないか、結合を表すか、式XIまたはXII:
【０２０３】
【化５９】
2013532644.tif 000061
【０２０４】
(式中、pは0、1、2、3、4、5または6であり、qは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
【０２０５】
【化６０】
2013532644.tif 000062
【０２０６】
(式中、kは0、1、2、3、4、5、11または23であり、mは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分であり;
-D-は、式XIII、XIVまたはXV:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)または
【０２０７】
【化６１】
2013532644.tif 000063
【０２０８】
(式中、rは1〜5の範囲の整数であり、sは0〜5の範囲の整数であり、yは0〜5の範囲の整数であり、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分であり、
またはそれらの製薬上許容可能な塩である。
【０２０９】
一実施形態においては、A-は、式I:
【０２１０】
【化６２】
2013532644.tif 000064
【０２１１】
(式中、nは好ましくは12、14、16または18であり、より好ましくは、12、14または16であり、ここで、*は-B-への結合点である)
の成分である。
【０２１２】
別の実施形態においては、A-は、式I:
【０２１３】
【化６３】
2013532644.tif 000065
【０２１４】
(式中、nは好ましくは14、16または18であり、ここで、*は-B-への結合点である)
の成分である。
【０２１５】
一実施形態においては、-B-は、-B1-、好ましくは式IVまたはV:
【０２１６】
【化６４】
2013532644.tif 000066
【０２１７】
(式中、*は-B2-または-C-への結合点であり、#はA-または-B2-への結合点である)
の成分を含む。
【０２１８】
一実施形態においては、-B-は、-B2-、好ましくは式VIII:
【０２１９】
【化６５】
2013532644.tif 000067
【０２２０】
(式中、より好ましくは、cは0であり、かつbは2(γ-Glu)であるか、cは0であり、かつbは1(β-Asp)であり、ここで、*は-C-、-B1-、または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)
の1つまたは2つの成分を含む。
【０２２１】
一実施形態においては、-B-は、-B2-、好ましくは式IX:
【０２２２】
【化６６】
2013532644.tif 000068
【０２２３】
(式中、より好ましくは、dは1であり、かつeは2であるか、dは2であり、かつeは1であり、ここで、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)
の1つまたは2つの成分を含む。
【０２２４】
一実施形態においては、-B-は、-B2-、好ましくは式X:#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式X)(式中、より好ましくは、uは3であり、ここで、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)の1つまたは2つの成分を含む。
【０２２５】
一実施形態においては、-C-は、式XI:
【０２２６】
【化６７】
2013532644.tif 000069
【０２２７】
(式中、好ましくは、qは0、1、2、3または4であり、より好ましくは、qは1または2であり、ここで、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分である。
【０２２８】
一実施形態においては、-C-は、式XI:
【０２２９】
【化６８】
2013532644.tif 000070
【０２３０】
(式中、好ましくは、pは1または2であり、より好ましくは、pは1であり、ここで、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分である。
【０２３１】
一実施形態においては、-C-は、式XI:
【０２３２】
【化６９】
2013532644.tif 000071
【０２３３】
(式中、pは1であり、かつqは1または2であり、好ましくは、pは1であり、かつqは2であり、ここで、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分である。
【０２３４】
一実施形態においては、-C-は、式XII:
【０２３５】
【化７０】
2013532644.tif 000072
【０２３６】
(式中、好ましくは、mは0、1または2であり、より好ましくは、mは1または2であり、ここで、*は-D-への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分である。
【０２３７】
一実施形態においては、-C-は、式XII:
【０２３８】
【化７１】
2013532644.tif 000073
【０２３９】
(式中、好ましくは、kは1、2、3、4、5または11であり、より好ましくは、kは5であり、よりさらに好ましくは、mは1で、かつkは4、5または11であり、または最も好ましくは、mは1で、かつkは5であり、ここで、*は-D-への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分である。
【０２４０】
本発明の一実施形態においては、-D-は本明細書で定義されている式XIIIの成分ではない。言いかえれば、-D-は本明細書で定義されている式XIVまたはXVの成分である。
【０２４１】
一実施形態においては、-D-は、式XIII:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)
(式中、好ましくは、rは1、2または3であり、より好ましくは、rは1であり、ここで、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分である。
【０２４２】
一実施形態においては、-D-は、式XIV:
【０２４３】
【化７２】
2013532644.tif 000074
【０２４４】
(式中、好ましくは、sは0または1であり、より好ましくは、sは1であり、ここで、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分である。
【０２４５】
一実施形態においては、-D-は、式XV:
【０２４６】
【化７３】
2013532644.tif 000075
【０２４７】
(式中、好ましくは、yは1、2または3であり、より好ましくは、yは1であり、ここで、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分である。
【０２４８】
一実施形態において、-D-は、FGF21化合物のアルデヒドとの反応生成物であり、例えば、限定されるものではないが、式XVまたはXVI:
#-NH-(CH2)t-CHO (式XV)、
【０２４９】
【化７４】
2013532644.tif 000076
【０２５０】
(式中、#は-C-または-B-への結合点であり、tは1、2、3、4または5であり、より好ましくは、tは1、2または3であり、または最も好ましくは、tは1であり、または好ましくは、uは0または1であり、より好ましくは、uは1である)
の成分である。
【０２５１】
一実施形態においては、-D-は、FGF21化合物のアルデヒド前駆体との反応生成物であり(これはin situで活性化される)、例えば、限定されるものではないが、式XVII:
【０２５２】
【化７５】
2013532644.tif 000077
【０２５３】
(式中、#は-C-または-B-への結合点であり、vは1、2、3、4または5であり、好ましくは、xは1または2であり、より好ましくは、vは1、2または3であり、好ましくは、xは1であり、または、最も好ましくは、vは1で、かつxは1であり、ここで、*はFGF21化合物への結合点である)
の成分である。
【０２５４】
一実施形態においては、部分A-B-C-D-は、次式(1または3):
【０２５５】
【化７６】
2013532644.tif 000078
【０２５６】
(式中、*はFGF21化合物への結合点である)、
または対応する誘導体の製薬上許容可能な塩から選択される。
【０２５７】
一実施形態においては、修飾基は、N末端アミノ酸のαアミノ基に結合し、2つのアルキルアミン結合を形成する。
【０２５８】
一実施形態においては、本発明の化合物は、実施例3、4、5および6の化合物、好ましくは、下記のN-alpha(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[Arg56、Arg59、Arg69、Arg122] Gly-FGF21 (化合物I); N-alpha-ビス-(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[Arg56、Arg59、Arg69、Arg122] Gly-FGF21 (化合物II); N-alpha-(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[K59R、K69R、D102T、D121Q、K12NR、L166F、S167G、M168L、G170T] Ala-FGF21 (化合物III); N-alpha(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[S71C、N121Q、L166F、S167G、M168L、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E、des181] Ala-FGF21 (化合物IV)の化合物、または対応する誘導体の製薬上許容可能な塩である。
【０２５９】
下記は、構成FGF21化合物の構造により特性決定される、本発明の誘導体のさらなる特定の実施形態である:
【０２６０】
好ましくは、FGF21化合物は、配列番号1に対して、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、よりさらに好ましくは少なくとも95%の同一性を有する。
【０２６１】
好ましくは、FGF21化合物は、配列番号1と比較して、最大36のアミノ酸変化(修飾)、好ましくは、最大30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1のアミノ酸変化;より好ましくは、最大15、14、13、12、11または10のアミノ酸修飾;よりさらに好ましくは、最大9、8、7、6または5のアミノ酸修飾;または最も好ましくは、最大4、3、2または1のアミノ酸修飾を有する。
【０２６２】
一実施形態においては、FGF21化合物は、配列番号1と比較して、(a)以下の修飾: -1G、-1A、-1S、-1F、-1M、R17A、R17H、Q27E、Q28R、Q28E、A31E、R36A、R36H、K56R、K59R、K69R、S71C、D102E、D102N、D102T、N121Q、N121D、K122R、D159E、L166F、S167G、M168L、D169E、V169aT、des170、G170T、G170P、P171L、P171G、P171S、S172E、S172L、S172Q、Q173E、Q173aA、Q173A、G174A、G174V、Y179F、A180E、des181、S181K、S181Rおよび/または182Gの少なくとも1つを含む。
【０２６３】
一実施形態においては、FGF21化合物は、Y179F、A180Eおよびdes 181(i)を含み;好ましくは、それはさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(ii)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(iii)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)および(iii)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iii)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２６４】
一実施形態においては、FGF21化合物は、S71C(i)を含み、好ましくは、それはさらにY179F、A180Eおよびdes 181(ii)を含み;好ましくは、それはさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iv)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２６５】
一実施形態においては、FGF21化合物は、N121Q(i)、Y179F、A180Eおよびdes 181(ii)を含み;好ましくは、それはさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iv)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２６６】
一実施形態においては、FGF21化合物は、S71C(i)、N121Q(ii)を含み、好ましくは、それはさらにY179F、A180Eおよびdes 181(iii)を含み;好ましくは、それはさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iv)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(v)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(v)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iv)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２６７】
一実施形態においては、FGF21化合物は、N121Q(i)、Y179F、A180Eおよびdes 181(ii)を含み;好ましくは、それはさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iii)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２６８】
一実施形態においては、FGF21化合物は、S71C(i)、N121Q(ii)、Y179F、A180Eおよびdes 181(iii)を含み;好ましくは、それはさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iv)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(v)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(v)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(v)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２６９】
一実施形態においては、FGF21化合物は、Y179F、A180Eおよびdes 181(i)を含み;好ましくは、それはさらにdes 170、173aA、およびG174V(ii)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(iii)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)および(iii)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iii)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２７０】
一実施形態においては、FGF21化合物は、S71C(i)を含み、好ましくは、それはさらにY179F、A180Eおよびdes 181(ii)を含み;好ましくは、それはさらにdes 170、173aAおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iv)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２７１】
一実施形態においては、FGF21化合物は、N121Q(i)、Y179F、A180Eおよびdes 181(ii)を含み;好ましくは、それはさらにdes 170、173aAおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iii)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２７２】
一実施形態においては、FGF21化合物は、S71C(i)、N121Q(ii)、Y179F、A180Eおよびdes 181(iii)を含み;好ましくは、それはさらにdes 170、173aAおよびG174V(iv)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(v)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(v)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(v)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２７３】
一実施形態においては、FGF21化合物は、Y179FおよびA180E(i);好ましくは、それはさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(ii)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(iii)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)および(iii)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iii)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２７４】
一実施形態においては、FGF21化合物は、S71C(i)を含み、好ましくは、それはさらにY179FおよびA180E(ii)を含み;好ましくは、それはさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iv)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２７５】
一実施形態においては、FGF21化合物は、N121Q(i)、Y179FおよびA180E(ii)を含み;好ましくは、それはさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iv)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２７６】
一実施形態においては、FGF21化合物は、S71C(i)、N121Q(ii)を含み、好ましくは、それはさらにY179FおよびA180E(iii)を含み;好ましくは、それはさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iv)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(v)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(v)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iv)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２７７】
一実施形態においては、FGF21化合物は、N121Q(i)、Y179FおよびA180E(ii)を含み;好ましくは、それはさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iii)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２７８】
一実施形態においては、FGF21化合物は、S71C(i)、N121Q(ii)、Y179FおよびA180E(iii)を含み;好ましくは、それはさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iv)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(v)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(v)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(v)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２７９】
一実施形態においては、FGF21化合物は、Y179FおよびA180E(i)を含み;好ましくは、それはさらにdes 170、173aAおよびG174V(ii)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(iii)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)および(iii)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iii)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２８０】
一実施形態においては、FGF21化合物は、S71C(i)を含み、好ましくは、それはさらにY179FおよびA180E(ii)を含み;好ましくは、それはさらにdes 170、173aAおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iv)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２８１】
一実施形態においては、FGF21化合物は、N121Q(i)、Y179FおよびA180E(ii)を含み;好ましくは、それはさらにdes 170、173aAおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iii)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２８２】
一実施形態においては、FGF21化合物は、S71C(i)、N121Q(ii)、Y179FおよびA180E(iii)を含み;好ましくは、それはさらにdes 170、173aAおよびG174V(iv)を含み;より好ましくは、それはさらにL166F、S167GおよびM168L(v)を含み;最も好ましくは、それは(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(v)を含む。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(v)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０２８３】
一実施形態においては、FGF21化合物は146位にプロリンを有し、ここで、当該位置番号は配列番号1を意味し、これは先行技術から公知のFGF21の対立遺伝子野生型である。
【０２８４】
下記は、生物特性および化学特性によって特性決定される、本発明の誘導体のさらなる特定の実施形態である:
【０２８５】
一実施形態においては、本発明の誘導体は持続型である。
【０２８６】
本発明の誘導体は、好ましくは、許容される効力を有する(本明細書の実験セクションの実施例38を参照)。
【０２８７】
一実施形態においては、本発明の誘導体の効力は、Met-FGF21の効力の少なくとも1%、好ましくは少なくとも5%、より好ましくは少なくとも10%、よりさらに好ましくは少なくとも20%、または最も好ましくは少なくとも30%であり、この場合、この効力は3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込みを測定することにより決定される(実施例38を参照)。
【０２８８】
一実施形態においては、本発明の誘導体の効力は、Met-FGF21の効力に対し、少なくとも40%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、よりさらに好ましくは少なくとも70%である。
【０２８９】
一実施形態において、本発明の誘導体の効力は、Met-FGF21の効力に対し、さらに少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも100%、よりさらに好ましくは少なくとも110%、または最も好ましくは少なくとも120%であり得る(下記の実施例38を参照)。
【０２９０】
これらのそれぞれの実施形態については、本発明の誘導体の効力は、好ましくは、3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込みを測定することにより決定される。
【０２９１】
本発明の誘導体の効力は、Met-FGF21のEC50に対する誘導体のEC50として計算される。
【０２９２】
3T3-L1脂肪細胞は、マウス3T3-L1繊維芽細胞、好ましくはATCC CL-173由来である。
【０２９３】
本発明の誘導体の3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込みは、実施例38で概説したように測定することができる。
【０２９４】
一実施形態においては、本発明のFGF21類似体は、Met-FGF21の効力に対し、少なくとも1%の効力を有し、この場合、この効力は3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込みを測定することにより決定される(実施例38を参照)。
【０２９５】
一実施形態においては、本発明のFGF21類似体は、Met-FGF21の効力に対し、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも20%、よりさらに好ましくは少なくとも30%、または最も好ましくは少なくとも40%の効力を有する。
【０２９６】
一実施形態においては、本発明のFGF21類似体は、Met-FGF21の効力に対し、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、よりさらに好ましくは少なくとも80%、または最も好ましくは少なくとも90%の効力を有する。
【０２９７】
一実施形態においては、本発明のFGF21類似体は、Met-FGF21の効力に対し、少なくとも100%、好ましくは少なくとも120%、より好ましくは少なくとも140%、よりさらに好ましくは少なくとも160%、または最も好ましくは少なくとも180%の効力を有する。
【０２９８】
一実施形態においては、本発明のFGF21類似体は、Met-FGF21の効力に対し、少なくとも200%、好ましくは少なくとも250%、より好ましくは少なくとも300%、よりさらに好ましくは少なくとも350%、または最も好ましくは少なくとも400%、より一層好ましくは少なくとも500%、またはさらに少なくとも600%、特に少なくとも1000%の効力を有する。
【０２９９】
効力は、本明細書のFGF21誘導体に関して記載したように決定される。
【０３００】
本発明のFGF21類似体は、ビヒクル対照に対し、db/dbマウスにおける血糖を低下させることができる。
【０３０１】
一実施形態においては、本発明の誘導体の血糖は、mMでの平均血糖測定に基づいて、対応するビヒクル対照に対し、少なくとも1%、好ましくは少なくとも2%、より好ましくは少なくとも3%、よりさらに好ましくは少なくとも4%、または最も好ましくは少なくとも5%低下する。
【０３０２】
一実施形態において、本発明のFGF21誘導体は、10nM未満、好ましくは5nM未満、特に好ましくは2nM未満、よりさらに好ましくは約1nM未満のHSA欠乏pERK-HEK293-β-klotho [EC50(nM)]値を有する(下記の試験(実施例39)を参照)。
【０３０３】
一実施形態においては、本発明の誘導体は、マウスに皮下(s.c.)投与した場合、少なくとも1.5時間、好ましくは少なくとも2時間、より好ましくは少なくとも4時間、よりさらに好ましくは少なくとも5時間、または最も好ましくは少なくとも6時間のT1/2を有する(以下の実施例40を参照)。
【０３０４】
一実施形態においては、本発明の誘導体は、マウスに皮下(s.c.)投与した場合、少なくとも10時間、好ましくは少なくとも15時間、より好ましくは少なくとも24時間、または最も好ましくは少なくとも48時間のT1/2を有する。マウスはdb/dbマウスであり、好ましくはレプチン受容体欠損マウスである。
【０３０５】
一実施形態においては、本発明の誘導体の用量は0.5mg/kgであるが、0.1〜1.0mg/kgの範囲の用量で使用することもできる。
【０３０６】
別の実施形態においては、本発明の誘導体は、ミニブタにi.v.投与した場合、少なくとも15時間、好ましくは少なくとも20時間、より好ましくは少なくとも30時間、よりさらに好ましくは少なくとも40時間、または最も好ましくは少なくとも50時間のT1/2を有する。
【０３０７】
本発明の誘導体は、ミニブタにi.v.投与した場合、少なくとも60時間、好ましくは少なくとも70時間、より好ましくは少なくとも75時間のT1/2をさらに有していてもよい。ミニブタは、好ましくは、正常な雄性Gottingenミニブタである。各処置群におけるブタの数はn=3〜4が好ましい。ブタは12〜15月齢が好ましく、より好ましくは体重は約25kgである。ブタには、好ましくは0.1mg/kgの単回静注用量で投与するのが好適である(約5nmol/kg)。
【０３０８】
本発明の誘導体および類似体、ならびに比較用のFGF21化合物の血漿濃度は、当技術分野で公知の任意の適切な方法により測定することができる。好ましいアッセイは、BioVendorからカタログ番号RD191108200Rで入手できる、Fibroblast Growth Factor-21 Human ELISAである(例えば、BioVendor GmbH, Im Neuenheimer Feld 583, D-69120 Heidelberg, Germany)。
【０３０９】
本発明の誘導体は、db/dbマウスの血糖値に対してin vivoで効果を有する(下記の実施例41参照)。
【０３１０】
本発明の誘導体は、ビヒクル対照に対し、db/dbマウスにおけるin vivoの血糖を低下させることができる。
【０３１１】
一実施形態において、本発明の誘導体の血糖値は、最終用量の誘導体を投与した後、24時間、好ましくは48時間低下する。
【０３１２】
一実施形態において、本発明の誘導体の血糖値は、mMでの平均血糖測定に基づいて、対応するビヒクル対照に対し、少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、より好ましくは少なくとも20%、よりさらに好ましくは少なくとも25%、または最も好ましくは少なくとも30%低下する。
【０３１３】
一実施形態においては、本発明の誘導体の血糖値は少なくとも35%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも45%、または最も好ましくは少なくとも50%低下する。
【０３１４】
本発明の誘導体は、好ましくは、許容される効力および持続型半減期を有する。
【０３１５】
一実施形態においては、本発明の誘導体は、マウスにおいてs.c.投与した場合、少なくとも1.5時間、好ましくは少なくとも2時間、より好ましくは少なくとも4時間、よりさらに好ましくは少なくとも5時間、または最も好ましくは少なくとも6時間のT1/2を有し、しかも、同時に、本明細書の実施形態のいずれか1つに記載した効力を有する(実施例40参照)。
【０３１６】
一実施形態においては、本発明の誘導体は、マウスにおいてs.c.投与した場合、少なくとも10時間、好ましくは少なくとも15時間、より好ましくは少なくとも24時間、または最も好ましくは少なくとも48時間のT1/2を有し、しかも、同時に、本明細書の実施形態のいずれか1つに記載した効力を有する。
【０３１７】
一実施形態においては、本発明の誘導体は、ミニブタにおいてi.v.投与した場合、少なくとも15時間、好ましくは少なくとも20時間、より好ましくは少なくとも30時間、よりさらに好ましくは少なくとも40時間、または最も好ましくは少なくとも50時間のT1/2を有し、しかも、同時に、本明細書の実施形態のいずれか1つに記載した効力を有する。
【０３１８】
一実施形態においては、本発明の誘導体は、ミニブタにおいてi.v.投与した場合、少なくとも60時間、好ましくは少なくとも70時間、より好ましくは少なくとも75時間のT1/2を有し、しかも、同時に、本明細書の実施形態のいずれか1つに記載した効力を有する。
【０３１９】
用語の「安定性のある」または安定性とは、本明細書に記載したように決定される、効力を意味する。
【０３２０】
一実施形態においては、H2O2でインキュベーションした後の本発明の類似体の効力は、H2O2を使用しないこと以外は同様に処理されたMet-FGF21に対し、少なくとも15%、好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、よりさらに好ましくは少なくとも40%、または最も好ましくは少なくとも50%である。
【０３２１】
FGF21化合物(FGF21類似体を含む)、および本発明のFGF21化合物の誘導体は、類似化合物について記載されているようにして調製することができる。より詳しくは、以下の詳細な実際の実施例、およびそのような化合物の調製について記載されている別の刊行物を参照されたい。
【０３２２】
下記の実施例1および2では、大腸菌におけるFGF21およびFGF21類似体のクローニングおよび発現について記載する。あるいは、FGF21およびFGF21類似体(場合によりN末端伸長のあるもの)は、以下のように酵母において発現させることができる。
【０３２３】
N末端アミノ酸伸長を含むFGF21は、サッカロマイセス・セレビシエで発現させることができる。一実施形態においては、これは、PMT2、PEP4およびYPS1が破壊されている株を作出する、株の設計が必要である。この株は、それぞれの遺伝子座で特定の組込みがなされる相同組換えを利用する従来の技術を用いて設計することができる。N末端伸長を含むFGF21は、サッカロマイセス・セレビシエ中で維持され得るサッカロマイセス・セレビシエ発現ベクターにコードされる。FGF21類似体を分泌経路へ導くために、シグナルペプチドを含むプレプロ配列(例えば、MFαプレプロリーダー配列)を組換え発現ベクター中に提供することができる。この配列は、正確なリーディングフレームでFGF21類似体をコードするDNAに連結される。このシグナルペプチドは、確実に培地へ分泌させる。FGF21類似体配列の上流でかつ隣接して、二塩基性アミノ酸配列が、FGF21類似体からのプレプロ配列を確実に切断するように配置され、その後、培地へ分泌される。この切断は、KEX2活性により生じると考えられる。FGF21類似体は、培地から回収することができる。
【０３２４】
FGF化合物の誘導体およびFGF21類似体は、所望により、インシュリンなどの別の医薬と一緒に製剤化することができる。
【０３２５】
上記記述をまとめ、かつ補足するための本発明の特定の実施形態は下記の通りである:
【０３２６】
1. 式A-B-C-D-の修飾基がFGF21化合物のN末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合している、FGF21化合物の誘導体[式中、
A-は、式I、IIまたはIII:
【０３２７】
【化７７】
2013532644.tif 000079
【０３２８】
(式中、nは8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19であり、*は-B-への結合点である)
の成分であり;
-B-は、存在しないか、結合を表すか、-B1-、-B2-またはそれらの組み合わせから選択され、ここで、-B1-は、式IV、V、VIまたはVII:
【０３２９】
【化７８】
2013532644.tif 000080
【０３３０】
(式中、*は-B2-または-C-への結合点であり、#はA-または-B2-への結合点である)
の成分であり;
-B2-は、式VIII、IXまたはX:
【０３３１】
【化７９】
2013532644.tif 000081
【０３３２】
(式中、bは0、1または2であり、cは0、1または2であり、但し、cが0である場合はbは1または2であり、cが1または2である場合はbは0であり、*は-C-、-B1-または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)、
【０３３３】
【化８０】
2013532644.tif 000082
【０３３４】
(式中、dは1または2であり、eは0、1または2であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)、または
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式X)
(式中、uは2、3または4であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)
の成分であるか、式VIIIおよび/または式IXおよび/または式Xの4つ以下の成分の組み合わせであり;
-C-は、存在しないか、結合を表すか、式XIまたはXII:
【０３３５】
【化８１】
2013532644.tif 000083
【０３３６】
(式中、pは0、1、2、3、4、5または6であり、qは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
【０３３７】
【化８２】
2013532644.tif 000084
【０３３８】
(式中、kは0、1、2、3、4、5、11または23であり、mは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分であり;
-D-は、式XIII、XIIIa、XIVまたはXV:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)、#-NH-CH(CH3)2-CH2-* (式XIIIa)、
【０３３９】
【化８３】
2013532644.tif 000085
【０３４０】
(式中、rは1〜5の範囲の整数であり、yは0〜5の範囲の整数であり、sは0〜5の範囲の整数であり、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分でありか、これらの成分のうちの2つである]
またはそれらの製薬上許容可能な塩。
【０３４１】
2. A-が、式I、IIまたはIII:
【０３４２】
【化８４】
2013532644.tif 000086
【０３４３】
(式中、nは8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19であり、*は-B-への結合点である)
の成分であり;
-B-が、存在しないか、結合を表すか、-B1-、-B2-またはそれらの組み合わせから選択され、ここで、-B1-は、式IV、V、VIまたはVII:
【０３４４】
【化８５】
2013532644.tif 000087
【０３４５】
(式中、*は-B2-または-C-への結合点であり、#はA-または-B2-への結合点である)
の成分であり;
-B2-は、式VIII、IXまたはX:
【０３４６】
【化８６】
2013532644.tif 000088
【０３４７】
(式中、bは0、1または2であり、cは0、1または2であり、但し、cが0である場合はbは1または2であり、cが1または2である場合はbは0であり、*は-C-、-B1-または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)、
【０３４８】
【化８７】
2013532644.tif 000089
【０３４９】
(式中、dは1または2であり、eは0、1または2であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)、または
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式X)
(式中、uは2、3または4であり、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)
の成分であるか、式VIIIおよび/または式IXおよび/または式Xの4つ以下の成分の組み合わせであり;
-C-が、存在しないか、結合を表すか、式XIまたはXII:
【０３５０】
【化８８】
2013532644.tif 000090
【０３５１】
(式中、pは0、1、2、3、4、5または6であり、qは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
【０３５２】
【化８９】
2013532644.tif 000091
【０３５３】
(式中、kは0、1、2、3、4、5、11または23であり、mは0、1、2、3、4、5または6であり、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分であり;
-D-が、式XIII、XIVまたはXV:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)または
【０３５４】
【化９０】
2013532644.tif 000092
【０３５５】
(式中、rは1〜5の範囲の整数であり、yは0〜5の範囲の整数であり、sは0〜5の範囲の整数であり、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分である、式A-B-C-D-の修飾基がFGF21化合物のN末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合している、実施形態1に記載のFGF21化合物の誘導体、またはそれらの製薬上許容可能な塩。
【０３５６】
3. Aが式(III)の成分である場合、-B-および-C-の少なくとも1つは存在し、かつ/または結合を示さない、実施形態1の誘導体。
【０３５７】
4. -B-および-C-が存在し、かつ結合を示さない、可能な範囲の実施形態1から3のいずれかの誘導体。
【０３５８】
5. A-が式I、IIまたはIII:
【０３５９】
【化９１】
2013532644.tif 000093
【０３６０】
(式中、nは12、14または16であり、*は-B-への結合点である)
の成分である、可能な範囲の実施形態1から4のいずれかに記載の誘導体。
【０３６１】
6. -A-が式I:
【０３６２】
【化９２】
2013532644.tif 000094
【０３６３】
(式中、nは本明細書で定義されている通りであり、*は-B-への結合点である)
の成分である、可能な範囲の実施形態1から5のいずれかに記載の誘導体。
【０３６４】
7. nが12、14、16または18であり、好ましくは12、14または16である、可能な範囲の実施形態1から6のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３６５】
8. nが14、16または18であり、好ましくは14または16である、可能な範囲の実施形態1から7のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３６６】
9. A-が式Iの成分であり、好ましくはnが13であるものである、可能な範囲の実施形態1から8のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３６７】
10. -B-が-B1-を含み、好ましくは式IVまたはV:
【０３６８】
【化９３】
2013532644.tif 000095
【０３６９】
(式中、*は-B2-または-C-への結合点であり、#はA-または-B2-への結合点である)
の成分を含む、可能な範囲の実施形態1から9のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３７０】
11. -B-が-B2-であり、好ましくは式VIII:
【０３７１】
【化９４】
2013532644.tif 000096
【０３７２】
(式中、より好ましくは、cは0であり、かつbは2であるか、cが0であり、かつbは1であり、ここで、*は-C-、-B1-または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)
の1つまたは2つの成分である、可能な範囲の実施形態1から10のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３７３】
12. -B-は-B2-であり、好ましくは式VIII:
【０３７４】
【化９５】
2013532644.tif 000097
【０３７５】
(式中、より好ましくは、cは0であり、かつbは2であり、ここで、*は-C-、-B1-または別の-B2-への結合点であり、#はA-、-B1-または別の-B2-への結合点である)
の4つの成分である、可能な範囲の実施形態1から11のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３７６】
13. -B-が-B2-であり、より正確には式IX:
【０３７７】
【化９６】
2013532644.tif 000098
【０３７８】
(式中、好ましくは、dは1であり、かつeが2であるものであり、ここで、*は-C-または-B1-への結合点であり、#はA-または-B1-への結合点である)
の成分である、可能な範囲の実施形態1から12のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３７９】
14. -B-が結合である、可能な範囲の実施形態1から13のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３８０】
15. -C-が式XI:
【０３８１】
【化９７】
2013532644.tif 000099
【０３８２】
(式中、好ましくは、qは0、1、2、3または4であり、より好ましくは、qは1または2であり、よりさらに好ましくは、qは2であり、pは本明細書で定義された通りであり、ここで、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#が-B-への結合点である)
の成分である、可能な範囲の実施形態1から14のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３８３】
16. -C-が式XI:
【０３８４】
【化９８】
2013532644.tif 000100
【０３８５】
(式中、好ましくは、pは1または2であり、より好ましくは、pは1であり、qは本明細書で定義された通りであり、ここで、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分である、可能な範囲の実施形態1から15のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３８６】
17. pが1であり、qが1または2であり、好ましくは、pが1であり、qが2である、可能な範囲の実施形態1から16のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３８７】
18. -C-が式XII:
【０３８８】
【化９９】
2013532644.tif 000101
【０３８９】
(式中、好ましくは、mは0、1または2であり、より好ましくは、mは1または2であり、kは本明細書で定義された通りであり、ここで、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-B-への結合点である)
の成分である、可能な範囲の実施形態1から17のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３９０】
19. -C-が式XII:
【０３９１】
【化１００】
2013532644.tif 000102
【０３９２】
(式中、好ましくは、kは1、2、3、4、5または11であり、より好ましくは、kは5であり、mは本明細書で定義された通りであり、ここで、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#が-B-への結合点である)
の成分である、可能な範囲の実施形態1から18のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３９３】
20. -C-が式XII:
【０３９４】
【化１０１】
2013532644.tif 000103
【０３９５】
(式中、mは1で、かつkは4、5または11であり、好ましくは、mは1で、かつkは5であり、mは本明細書で定義された通りであり、ここで、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#が-B-への結合点である)
の成分である、可能な範囲の実施形態1から19のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３９６】
21. -D-が式XIII、XIIIa、XIVまたはXV:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)、#-NH-CH(CH3)2-CH2-* (式XIIIa)、
【０３９７】
【化１０２】
2013532644.tif 000104
【０３９８】
(式中、rは1〜5の範囲の整数であり、yは0〜5の範囲の整数であり、sは0〜5の範囲の整数であり、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分であるか、これらの成分のうちの2つである、可能な範囲の実施形態1から20のいずれか1つに記載の誘導体。
【０３９９】
22. -D-が式XIII、XIVまたはXV:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)、
【０４００】
【化１０３】
2013532644.tif 000105
【０４０１】
(式中、rは1〜5の範囲の整数であり、yは0〜5の範囲の整数であり、sは0〜5の範囲の整数であり、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分である、可能な範囲の実施形態1から21のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４０２】
23. -D-が式XIII:
#-NH-(CH2)r-CH2-* (式XIII)
(式中、好ましくは、rが1、2または3であり、より好ましくは、rが1であり、ここで、*はFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分である、可能な範囲の実施形態1から22のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４０３】
24. -D-が式XIV:
【０４０４】
【化１０４】
2013532644.tif 000106
【０４０５】
(式中、好ましくは、sが0または1であり、より好ましくは、sが1であり、ここで、*は-D-またはFGF21化合物への結合点であり、#は-C-への結合点である)
の成分である、可能な範囲の実施形態1から23のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４０６】
25. -D-が本明細書で定義されている式XIIIの成分ではない(言いかえれば、-D-が本明細書で定義されている式XIVまたはXVの成分である)、可能な範囲の実施形態1から24のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４０７】
26. 式A-B-C-D-の修飾基が次式(1)〜(3):
【０４０８】
【化１０５】
2013532644.tif 000107
【０４０９】
(式中、*はFGF21化合物への結合点である)
から選択される、可能な範囲の実施形態1から25のいずれか1つに記載の誘導体、または対応する誘導体のいずれか1つの製薬上許容可能な塩。
【０４１０】
27. 修飾基(A-B-C-D-)を1つだけ有する、可能な範囲の実施形態1から26のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４１１】
28. 同一であるか異なる2つの修飾基(A-B-C-D-)を有する、可能な範囲の実施形態1から27のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４１２】
29. 1つまたは2つの修飾基(A-B-C-D-)を有する、可能な範囲の実施形態1から28のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４１３】
30. 本明細書の実施例3、4、5および6の誘導体、好ましくは下記: N-alpha(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[Arg56、Arg59、Arg69、Arg122] Gly-FGF21 (化合物I); N-alpha-ビス-(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[Arg56、Arg59、Arg69、Arg122] Gly-FGF21 (化合物II); N-alpha-(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[K56R、K59R、K69R、D102T、D121Q、K122R、L166F、S167G、M168L、G170T] Ala-FGF21 (化合物III); N-alpha(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[S71C、N121Q、L166F、S167G、M168L、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E、des181] Ala-FGF21 (化合物IV);または対応する誘導体の製薬上許容可能な塩から選択される化合物である、可能な範囲の実施形態1から29のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４１４】
31. 本明細書の実施例3、4、5および6の誘導体、好ましくは下記: N-alpha(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[Arg56、Arg59、Arg69、Arg122] Gly-FGF21 (化合物I); N-alpha-ビス-(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[Arg56、Arg59、Arg69、Arg122] Gly-FGF21 (化合物II); N-alpha(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル)[S71C、N121Q、L166F、S167G、M168L、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E、des181] Ala-FGF21 (化合物IV);または対応する誘導体の製薬上許容可能な塩から選択される化合物である、可能な範囲の実施形態1から30のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４１５】
32. FGF21化合物が配列番号1に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、よりさらに好ましくは少なくとも95%の同一性を有する、可能な範囲の実施形態1から31のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４１６】
33. FGF21化合物が、配列番号1と比較して、最大36のアミノ酸修飾、好ましくは最大30、25、20、15、10もしくは5のアミノ酸変化、または最大30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1のアミノ酸変化;より好ましくは、最大15、14、13、12、11または10のアミノ酸修飾;よりさらに好ましくは、最大9、8、7、6もしくは5のアミノ酸修飾;または最も好ましくは、最大4、3、2もしくは1のアミノ酸修飾を有する、可能な範囲の実施形態1から32のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４１７】
34. FGF21化合物が配列番号1のアミノ酸配列を含む、可能な範囲の実施形態1から33のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４１８】
35. FGF21化合物が、配列番号1と比較して、以下の修飾:-1G、-1A、-1S、-1F、-1M、R17A、17H、Q27E、A31E、R36A、R36H、S71C、D102E、D102N、D102T、N121Q、des121N、N121D、D159E、L166F、S167G、M168L、D169E、V169aT、des170、G170T、P171L、P171G、S172E、S172L、Q173E、173aA、Q173A、G174A、G174V、Y179F、A180E、des181、S181Kおよび/またはS181Rの少なくとも1つを含み、好ましくは、前記FGF21化合物が前記修飾の少なくとも3つを含み、より好ましくは前記修飾の少なくとも5つを含む、可能な範囲の実施形態1から34のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４１９】
36. FGF21化合物が、配列番号1と比較して、以下の修飾:-1G、-1A、-1S、-1F、-1M、R17A、17H、Q27E、A31E、R36A、R36H、S71C、D102E、D102N、D102T、N121Q、des121N、N121D、D159E、L166F、S167G、M168L、D169E、V169aT、des170、G170T、P171L、P171G、S172E、S172L、Q173E、173aA、Q173A、G174A、G174V、Y179F、A180E、S181Kおよび/またはS181Rの少なくとも1つを含み、好ましくは、前記FGF21化合物が前記修飾の少なくとも3つを含み、より好ましくは前記修飾の少なくとも5つを含み、よりさらに好ましくは少なくとも7つの修飾を含む、可能な範囲の実施形態1から35のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４２０】
37. FGF21化合物が、配列番号1と比較して、以下の修飾:-1G、-1A、-1S、-1F、-1M、R17A、17H、Q27E、A31E、R36A、R36H、K56R、K59R、K69R、S71C、D102E、D102N、D102T、N121Q、des121N、N121D、K122R、D159E、L166F、S167G、M168L、D169E、V169aT、des170、G170T、P171L、P171G、S172E、S172L、Q173E、173aA、Q173A、G174A、G174V、Y179F、A180E、des181、S181Kおよび/またはS181Rの少なくとも1つを含み、好ましくは、前記FGF21化合物が前記修飾の少なくとも3つを含み、より好ましくは前記修飾の少なくとも5つを含み、よりさらに好ましくは少なくとも7つの修飾を含む、可能な範囲の実施形態1から36のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４２１】
38. FGF21化合物が、配列番号1と比較して、以下の修飾:-1G、-1A、-1S、-1F、-1M、R17A、17H、Q27E、A31E、R36A、R36H、K56R、K59R、K69R、S71C、D102E、D102N、D102T、N121Q、des121N、N121D、K122R、D159E、L166F、S167G、M168L、D169E、V169aT、des170、G170T、P171L、P171G、S172E、S172L、Q173E、173aA、Q173A、G174A、G174V、Y179F、A180E、des181、S181K、S181Rおよび/または182Gの少なくとも1つを含み、好ましくは、前記FGF21化合物が前記修飾の少なくとも3つを含み、より好ましくは前記修飾の少なくとも5つを含み、よりさらに好ましくは少なくとも7つの修飾を含む、可能な範囲の実施形態1から37のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４２２】
39. FGF21化合物がY179F、A180Eおよびdes181(i)を含み;好ましくは、FGF21化合物がさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(ii)を含み;より好ましくは、FGF21化合物がさらにL166F、S167GおよびM168L(iii)を含み;最も好ましくは、FGF21化合物が(i)、(ii)および(iii)を含む、可能な範囲の実施形態1から38のいずれか1つに記載の誘導体。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iii)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０４２３】
40. FGF21化合物がS71C(i)を含み;好ましくは、FGF21化合物がY179F、A180Eおよびdes181(ii)をさらに含み;好ましくは、FGF21化合物がP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iii)をさらに含み;より好ましくは、FGF21化合物がL166F、S167GおよびM168L(iv)をさらに含み;最も好ましくは、FGF21化合物が(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む、可能な範囲の実施形態1から39のいずれか1つに記載の誘導体。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iv)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０４２４】
41. FGF21化合物がN121Q(i)、Y179F、A180Eおよびdes181(ii)を含み;好ましくは、FGF21化合物がさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、FGF21化合物がさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、FGF21化合物が(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む、可能な範囲の実施形態1から40のいずれか1つに記載の誘導体。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iii)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０４２５】
42. FGF21化合物がS71C(i)、N121Q(ii)、Y179F、A180Eおよびdes181(iii)を含み;好ましくは、FGF21化合物がさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iv)を含み;より好ましくは、FGF21化合物がさらにL166F、S167GおよびM168L(v)を含み;最も好ましくは、FGF21化合物が(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(v)を含む、可能な範囲の実施形態1から41のいずれか1つに記載の誘導体。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(v)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０４２６】
43. FGF21化合物がY179FおよびA180E(i)を含み;好ましくは、FGF21化合物がさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(ii)を含み;より好ましくは、FGF21化合物がさらにL166F、S167GおよびM168L(iii)を含み;最も好ましくは、FGF21化合物が(i)、(ii)および(iii)を含む、可能な範囲の実施形態1から42のいずれか1つに記載の誘導体。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iii)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０４２７】
44. FGF21化合物がS71C(i)を含み;好ましくは、FGF21化合物がさらにY179FおよびA180E(ii)を含み;好ましくは、FGF21化合物がさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、FGF21化合物がさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、FGF21化合物が(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む、可能な範囲の実施形態1から43のいずれか1つに記載の誘導体。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iv)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０４２８】
45. FGF21化合物がN121Q(i)、Y179FおよびA180E(ii)を含み;好ましくは、FGF21化合物がさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、FGF21化合物がさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、FGF21化合物が(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む、可能な範囲の実施形態1から44のいずれか1つに記載の誘導体。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iii)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０４２９】
46. FGF21化合物がS71C(i)、N121Q(ii)、Y179FおよびA180E(iii)を含み;好ましくは、FGF21化合物がさらにP171L、S172E、Q173AおよびG174V(iv)を含み;より好ましくは、FGF21化合物がさらにL166F、S167GおよびM168L(v)を含み;最も好ましくは、FGF21化合物が(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(v)を含む、可能な範囲の実施形態1から45のいずれか1つに記載の誘導体。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(v)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０４３０】
47. FGF21化合物がY179F、A180Eおよびdes181(i)を含み;好ましくは、FGF21化合物がさらにdes170、173aAおよびG174V(ii)を含み;より好ましくは、FGF21化合物がさらにL166F、S167GおよびM168L(iii)を含み;最も好ましくは、FGF21化合物が(i)、(ii)および(iii)を含む、可能な範囲の実施形態1から46のいずれか1つに記載の誘導体。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iii)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０４３１】
48. FGF21化合物がS71C(i)を含み;好ましくは、FGF21化合物がさらにY179F、A180Eおよびdes181(ii)を含み;好ましくは、FGF21化合物がさらにdes170、173aAおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、FGF21化合物がさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、FGF21化合物が(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む、可能な範囲の実施形態1から47のいずれか1つに記載の誘導体。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iv)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０４３２】
49. FGF21化合物がN121Q(i)、Y179F、A180Eおよびdes181(ii)を含み;好ましくは、FGF21化合物がさらにdes170、173aAおよびG174V(iii)を含み;より好ましくは、FGF21化合物がさらにL166F、S167GおよびM168L(iv)を含み;最も好ましくは、FGF21化合物が(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む、可能な範囲の実施形態1から48のいずれか1つに記載の誘導体。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(iv)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０４３３】
50. FGF21化合物がS71C(i)、N121Q(ii)、Y179F、A180Eおよびdes181(iii)を含み;好ましくは、FGF21化合物がさらにdes170、173aAおよびG174V(iv)を含み;より好ましくは、FGF21化合物がさらにL166F、S167GおよびM168L(v)を含み;最も好ましくは、FGF21化合物が(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(v)を含む、可能な範囲の実施形態1から49のいずれか1つに記載の誘導体。これらのそれぞれの実施形態(i)〜(v)は、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含んでいてもよい。
【０４３４】
51. FGF21化合物が、配列番号1と比較して、以下の修飾:-1G、-1A、-1S、-1F、-1M、R17A、17H、Q27E、A31E、R36A、R36H、S71C、D102E、D102N、D102T、N121Q、des121N、N121D、D159E、L166F、S167G、M168L、D169E、V169aT、des170、G170T、P171L、P171G、S172E、S172L、Q173E、173aA、Q173A、G174A、G174V、Y179F、A180E、des181、S181Kおよび/またはS181Rの少なくとも1つを含み、好ましくは、前記FGF21化合物が前記修飾の少なくとも3つを含み、より好ましくは前記修飾の少なくとも5つを含み、よりさらに好ましくは少なくとも7つの修飾を含む、可能な範囲の実施形態1から50のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４３５】
52. FGF21化合物が、配列番号1と比較して、以下の修飾:-1G、-1A、-1S、-1F、-1M、R17A、17H、Q27E、A31E、R36A、R36H、S71C、D102E、D102N、D102T、N121Q、des121N、N121D、D159E、L166F、S167G、M168L、D169E、V169aT、des170、G170T、P171L、P171G、S172E、S172L、Q173E、173aA、Q173A、G174A、G174V、Y179F、A180E、S181Kおよび/またはS181Rの少なくとも1つを含み、好ましくは、前記FGF21化合物が前記修飾の少なくとも3つを含み、より好ましくは前記修飾の少なくとも5つを含み、よりさらに好ましくは少なくとも7つの修飾を含む、可能な範囲の実施形態1から51のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４３６】
53. FGF21化合物がN121Qを含み、N末端アミノ酸M、G、S、FまたはA(例えば-1A)を場合により含む、可能な範囲の実施形態1から52のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４３７】
54. FGF21化合物が配列番号1のアミノ酸配列を含む、可能な範囲の実施形態1から53のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４３８】
55. FGF21化合物が146位でプロリンを有し、ここで、位置番号は配列番号1を意味する、可能な範囲の実施形態1から54のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４３９】
56. マウスにおいてs.c.投与した場合、少なくとも1.5時間、好ましくは少なくとも2時間、より好ましくは少なくとも4時間、よりさらに好ましくは少なくとも5時間、または最も好ましくは少なくとも6時間のT1/2を有する、可能な範囲の実施形態1から55のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４４０】
57. マウスにおいてs.c.投与した場合、少なくとも10時間、好ましくは少なくとも15時間、より好ましくは少なくとも24時間、または最も好ましくは少なくとも48時間のT1/2を有する、可能な範囲の実施形態1から56のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４４１】
58. Met-FGF21の効力に対し、少なくとも1%、好ましくは少なくとも5%、より好ましくは少なくとも10%、よりさらに好ましくは少なくとも20%、または最も好ましくは少なくとも30%の効力を有し、効力が3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込みを測定することにより決定することができる、可能な範囲の実施形態1から57のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４４２】
59. Met-FGF21の効力に対し、少なくとも40%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、よりさらに好ましくは少なくとも70%の効力を有する、可能な範囲の実施形態1から58のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４４３】
60. Met-FGF21の効力に対し、少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも100%、よりさらに好ましくは少なくとも110%、または最も好ましくは少なくとも120%の効力を有する、可能な範囲の実施形態1から59のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４４４】
61. 効力が、Met-FGF21の効力に対し、少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも100%、よりさらに好ましくは少なくとも110%、または最も好ましくは少なくとも120%である、可能な範囲の実施形態1から60のいずれか1つに記載の誘導体;
【０４４５】
62. 効力が、Met-FGF21の効力に対し、少なくとも100%、好ましくは少なくとも120%、より好ましくは少なくとも140%、よりさらに好ましくは少なくとも160%、または最も好ましくは少なくとも180%である、可能な範囲の実施形態1から61のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４４６】
63. 効力が、Met-FGF21の効力に対し、少なくとも200%、好ましくは少なくとも250%、より好ましくは少なくとも300%、よりさらに好ましくは少なくとも350%、または最も好ましくは少なくとも400%、より一層好ましくは少なくとも500%、またさらには少なくとも600%、特に少なくとも1000%である、可能な範囲の実施形態1から62のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４４７】
64. 効力がMet-FGF21のEC50に対する誘導体のEC50として計算される、可能な範囲の実施形態1から63のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４４８】
65. 3T3-L1脂肪細胞がマウス3T3-L1繊維芽細胞、好ましくはATCC CL-173由来である、可能な範囲の実施形態1から64のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４４９】
66. 3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込みが本明細書の実施例38で概説されているように測定される、可能な範囲の実施形態1から65のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４５０】
67. FGF21誘導体が、約10nM未満、好ましくは約5nM未満、特に好ましくは約2nM未満、よりさらに好ましくは約1nM未満のHSA欠乏pERK-HEK293-β-klotho [EC50(nM)]値を有する(本明細書の実施例39に記載の試験を参照)、可能な範囲の実施形態1から66のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４５１】
68. ビヒクル対照に対し、db/dbマウスにおけるin vivoでの血糖を低下させることができる、可能な範囲の実施形態1から67のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４５２】
69. 誘導体の最終用量が投与された後、血糖が24時間、好ましくは48時間低下する、可能な範囲の実施形態1から68のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４５３】
70. 血糖が、mMでの平均血糖測定に基づいて、対応するビヒクル対照に対し、少なくとも約10%、好ましくは少なくとも約15%、より好ましくは少なくとも約20%、よりさらに好ましくは少なくとも約25%、または最も好ましくは少なくとも約30%低下する、可能な範囲の実施形態1から69のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４５４】
71. 血糖が少なくとも35%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも45%、または最も好ましくは少なくとも50%低下する、可能な範囲の実施形態1から70のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４５５】
72. (i)db/dbマウスが雄性、9〜11週齢であり、(ii)誘導体がs.c.投与され、(iii)誘導体用量が0.2〜1.0mg/kg、好ましくは0.2、0.4、0.6、0.8または1.0mg/kgの範囲にあり、(iv)誘導体がPBSに溶解され、(v)誘導体が毎日1回、好ましくは1日、2日および3日に1回投与され、(vi)ビヒクル対照が、好ましくは250ul/50gマウスのPBSで処置され、かつ/または、(vii)血糖が、好ましくはBiosen 5040などのグルコースアナライザーを使用して、グルコースオキシダーゼ法を用いて測定される、可能な範囲の実施形態1から71のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４５６】
73. ビヒクル対照がMet-FGF21で置き換えられる、可能な範囲の実施形態1から72のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４５７】
74. (i)誘導体およびMet-FGF21が両方ともPBS(pH7.2)中に溶解され、かつ/または、(ii)誘導体およびMet-FGF21の濃度が1mg/mLである、可能な範囲の実施形態1から73のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４５８】
75. 実施例3、4および5に記載されている特定の誘導体のいずれか1つである、可能な範囲の実施形態1から74のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４５９】
76. ビヒクル対照に対し、db/dbマウスにおける血糖を低下させることができる、可能な範囲の実施形態1から75のいずれか1つに記載のFGF21誘導体。
【０４６０】
77. ヒトに投与した場合、mMでの平均血糖測定に基づいて、対応するビヒクル対照に対し、少なくとも1%、好ましくは少なくとも2%、より好ましくは少なくとも3%、よりさらに好ましくは少なくとも4%、または最も好ましくは少なくとも5%、血糖が低下する、可能な範囲の実施形態1から76のいずれか1つに記載のFGF21誘導体。
【０４６１】
78. 血糖低下作用を決定する場合に以下の態様を使用することができる、可能な範囲の実施形態1から77のいずれか1つに記載のFGF21誘導体:(i)db/dbマウスが雄性、9〜11週齢であり、(ii)類似体がs.c.投与され、(iii)類似体用量が0.1〜1.0mg/kg、好ましくは0.1、0.2、0.4、0.6、0.8または1.0mg/kgの範囲にあり、(iv)類似体が毎日1回、好ましくは1日、2日および3日に1回投与され、かつ/または、(v)血糖が、好ましくはBiosen 5040などのグルコースアナライザーを使用して、グルコースオキシダーゼ法を用いて測定される。
【０４６２】
79. FGF化合物が上記実施例2(すなわち、2a〜2d)に記載されている特定の類似体のいずれか1つである、可能な範囲の実施形態1から78のいずれか1つに記載のFGF誘導体。
【０４６３】
80. 実施形態1から79のいずれか1つに記載の誘導体と製薬上許容可能な担体とを含む組成物。
【０４６４】
81. 医薬としての使用に関して可能な範囲の実施形態1から80のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４６５】
82. 糖尿病、異脂肪血症、肥満、循環器疾患、メタボリック症候群および/または非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)の治療または予防における医薬として使用するための実施形態1から81のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４６６】
83. 糖尿病、異脂肪血症、肥満、循環器疾患、メタボリック症候群および/または非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)の治療または予防における医薬の製造で使用するための実施形態1から82のいずれか1つに記載の誘導体。
【０４６７】
84. 実施形態1から83のいずれか1つに記載の誘導体の治療上有効な量を患者に投与する工程を含む、糖尿病、異脂肪血症、肥満、循環器疾患、メタボリック症候群および/または非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)に罹患している患者の治療方法。
【０４６８】
85. 実施形態1から84のいずれか1つに記載の誘導体の治療上有効な量を患者に投与する工程を含む、集中治療を必要とする患者の治療方法。
【０４６９】
86. 本明細書に記載の実施形態、態様および請求項の任意の新規な組み合わせ。
【０４７０】
各種参考文献が本明細書中に引用されているが、それらの開示内容は、参照によりそれら全体を援用するものとする。
【０４７１】
本明細書に記載の条項(clauses)および実施形態の1つまたは複数を、場合により下記の請求項の1つまたは複数と組み合わせることによりさらなる実施形態が得られ、本発明は、前記の条項、実施形態および請求項のあらゆる可能性のある組み合わせに関する。
【０４７２】
以下の実施例は限定によるものではなく、事例として提示されるものである。
【０４７３】
(実施例)
以下の実施例は、本発明を説明するためのものである。
【０４７４】
略語
以下の略語を下記で用いる、アルファベット順: AcOHは酢酸であり、CVはカラム容量であり、DCMはジクロロメタンであり、DIPEAはジイソプロピルエチルアミンであり、DPBSはダルベッコリン酸緩衝生理食塩水であり、DVBはジビニルベンゼンであり、EtOHはエタノールであり、EtOAcは酢酸エチルであり、HEPESは4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸であり、HPβCDはヒドロキシプロピルβシクロデキストリンであり、HPLCは高速液体クロマトグラフィーであり、IBMXは3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり、Inpはイソニペコチン酸であり、IPTGはイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドチェック(check)であり、LCMSは液体クロマトグラフィー質量分析であり、MALDI-TOF MSは、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectroscopy)であり、NaAcは酢酸ナトリウムであり、OtBuはtert.ブチルエステルであり、PBSはリン酸緩衝生理食塩水であり、RTは室温であり、TFAはトリフルオロ酢酸であり、THFはテトラヒドロフランであり、Trisはトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンまたは2-アミノ-2-ヒドロキシメチルプロパン-1,3-ジオールであり、Trxはトラネキサム酸であり、TSTUはO-(N-スクシミジル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートであり、UPLCは超高速液体クロマトグラフィー(Ultra Performance Liquid Chromatography)である。
【０４７５】
一般法
LCM法1(LCMS1)
Agilent Technologies LC/MSD TOF (G1969A)質量分析計を使用して、Agilent 1200シリーズHPLC系より溶離した後の試料の質量を同定した。タンパク質スペクトルのディコンボリューションは、Agilent製のタンパク質確認ソフトウェアで計算した。
溶離液:
A: 0.1%トリフルオロ酢酸を含む水
B: 0.1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル
カラム:Zorbax 5u、300SB-C3、4.8×50mm
勾配:15分かけて25%〜95%のアセトニトリル
【０４７６】
LCM法2(LCMS2)
Waters Micromass ZQ質量分析計を使用して、Waters Alliance HT HPLC系より溶離した後の試料の質量を同定した。
溶離液:
A: 0.1%トリフルオロ酢酸を含む水
B: 0.1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル
カラム:Phenomenex、Kinetex C18 50  ×  4.60mm id 2.6μm、100AA
勾配:1.0ml/分で7.5分かけて10%〜90%のB
【０４７７】
(実施例1)
FGF21のクローニングおよび発現
ヒトFGF21に関するDNA配列およびアミノ酸配列は、例えば、Nishimuraら  Biochim. Biophys. Acta 1492(1):203〜206頁  (2000)により開示されている。また、これらの配列は、それぞれ、アクセッション番号EMBL:AB021975およびUNIPROT:Q9NSA1で公的データベースから利用可能である。
【０４７８】
分泌用の28アミノ酸のシグナルペプチドを含む天然ポリペプチドを合成する:
1   MDSDETGFEH SGLWVSVLAG LLLGACQAHP IPDSSPLLQF GGQVRQRYLY
51  TDDAQQTEAH LEIREDGTVG GAADQSPESL LQLKALKPGV IQILGVKTSR
101 FLCQRPDGAL YGSLHFDPEA CSFRELLLED GYNVYQSEAH GLPLHLPGNK
151 SPHRDPAPRG PARFLPLPGL PPALPEPPGI LAPQPPDVGS SDPLSMVGPS
201 QGRSPSYAS
【０４７９】
上記のイタリック体で示したシグナルペプチドは、配列番号2として添付の配列表中に含まれている。残りの181アミノ酸からなる成熟FGF21ポリペプチドは、配列番号1として配列表中に含まれている。
【０４８０】
成熟FGF21ポリペプチドは、シグナルペプチドは含まないが、付加されたN末端メチオニンまたはN末端Met-Ala(これは大腸菌内で処理され、N末端Ala (-1Ala)を生じる)を含む、細胞内タンパク質として大腸菌においてクローニングし、発現させた。より詳しくは、3’-末端にMetに関するATGコドンを、ならびに、3’-末端および5’-末端にそれぞれNde1およびBamH1の制限酵素切断部位を含む550bpコード領域をファージT7プロモーターの制御下で発現ベクターpET 11cへNde1-BamH1中で挿入し、大腸菌B BL21(DE3)を形質転換させた。細胞は、OD450 0.5までLB培地  amp 100ug/mL中で増殖させ、37℃で4時間、0.3mMのIPTGを用いて発現を誘導した。細胞の粗抽出物は、FGF21発現を解析するため、超音波処理により調製した。
【０４８１】
クーマシー染色SDS-PAGEにより、可溶性上清画分で主として同定されたFGF21の発現が成功していたこと、不溶性ペレット中にはほとんどなかったことが示された。こうして発現したFGF21(Met-FGF21)(化合物A)のMW計算値は19.5kDであるが、それは25kDのタンパク質としてゲル上で移動した。これは恐らく、タンパク質の移動を遅らせる高含有量のプロリンによるものと思われる。
【０４８２】
(実施例2)
FGF21類似体のクローニング、発現および精製
以下のMet-FGF21の類似体を当技術分野で公知のようにして設計し、実施例1で一般的に記載したように大腸菌で発現させた:
2a) [K56R、K59R、K69R、K122R] Gly-FGF21。
2b) [Q28R、K56R、K59R、K69R、D102T、D121Q、K122R、L166F、S167G、M168L、G170T] Ala-FGF21。
2c) [S71C、N121Q、L166F、S167G、M168L、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E、des181] Ala-FGF21。
2d) [S71C、N121Q、L166F、S167G、M168L、des170、173aA、G174V、Y179F、A180E、des181] Ala-FGF21。
2e) [S71C、N121Q、L166F、S167G、M168L、173aA、G174V、Y179F、A180E、des181] Ala-FGF21。
2f) [N121Q、L166F、S167G、M168L、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E、des181] Ala-FGF21。
2g) [N121Q] Met-FGF21。
2h) [N121Q] Ala-FGF21。
2i) [N121Q、L166F、S167G、M168L、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E、des181] Phe-FGF21。
【０４８３】
同一類似体を、サッカロマイセス・セレビシエにおいて、それ自体は公知であって、この生物に好適である方法によって発現させ、調製することができる。
【０４８４】
実施例1〜2に記載のように調製したFGF21ポリペプチドおよびその類似体は、以下のようにして、または類似の技術を使用して、さらに精製した。
【０４８５】
10mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)中の大腸菌のスラリー(20%w/v)を超音波で処理した(5分間氷上で3秒のオン/オフ間隔)。ポリペプチドを遠心分離(30分間、10,000×g)によりペレット形成させ、50mMのTris(pH8.0)中で超音波処理により再溶解させ、残渣を遠心分離(30分間、10,000×g)により除去した。得られた上清中のポリペプチドは、Protein Purificationで一般に概説されているように、Q Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare)を使用するアニオン交換クロマトグラフィー(50mM Tris(pH8.0)、50〜250mM NaCl)により精製した。原理および実施系列:Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes、Robert K.  第3版、1994年。場合によっては、さらなる精製を、50mMのTris(pH8.0)および200mMのNaClを用いて操作する、HiLoad 26/60 Superdex pg 75カラム(GE Healthcare)を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーにより実施した。保存のため、ポリペプチドをDPBSSに移し、冷凍保存した。
【０４８６】
(実施例3)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
アルデヒド含有の修飾基は、下記に記載のように合成することが可能であり、FGF21およびそれらの類似体は、下記に記載されているようにかかる修飾基で誘導体化することができる。
【０４８７】
17-[(S)-1-カルボキシ-3-(2-{2-[(2-{2-[(4-ホルミルベンジルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチル-カルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピルカルバモイル]ヘプタデカン酸の調製
t-Bu-N-(4-ホルミルベンジル)カーバメート(100mg)を1時間TFA/DCM(1:1)で処理した。混合物を真空で濃縮し、トルエンで共濃縮した(2回)。残渣をTHF(2.5ml)中に溶解させ、17-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イルオキシカルボニル-メトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}メトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ヘプタデカン酸(国際公開第2009/083549号で既に記載されていたように調製したもの、320mg)を含むTHF(5ml)溶液を加えた。DIPEA(0.5ml)をゆっくりと加えた。130分後、混合物を真空濃縮した。残渣をEtOAcおよび1N HCl中に溶解させた。有機層を1NのHClおよびブラインで抽出した。有機層を脱水し(Na2SO4)、真空濃縮し、白色固体として表題化合物を得た。これは、それ以上精製を行うことなく使用した。収率234mg(72%)。
LCMS2:理論的質量:851.0、実測値:851.5(M+1)。
【０４８８】
(K56R, K59R, K69R, K122R) Gly-FGF21誘導体  N-α-(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [Arg56, Arg59, Arg69, Arg122]Gly-FGF21 (化合物I)の調製
実施例1および2で一般的に記載したように調製したK56R, K59R, K69R, K122R Gly-FGF21類似体中のN末端Gly残基(K56R, K59R, K69RおよびK122R、ならびにN末端Gを含む配列番号1)は、以下の試薬:
【０４８９】
【化１０６】
2013532644.tif 000108
【０４９０】
を用いてαアミノ基で修飾した。
K56R, K59R, K69R, K122R Gly-FGF21を含むPBS緩衝液(2mg、0.32ml、102nmol)の6.3mg/ml溶液に、17-[(S)-1-カルボキシ-3-(2-{2-[(2-{2-[(4-ホルミルベンジルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピルカルバモイル]ヘプタデカン酸の調製物を含む1M NaAc(6.1ul、1.5eq)の20mg/ml溶液を加えた。pHは10%AcOHで6.0に調節した。15分後、1MのNaCNBH3(7ul)を加えた。混合物を0.5時間RTで静置し、次いで、一晩5℃で保存した。混合物を20mM Tris、5%EtOH、pH7.5で希釈し、A-緩衝液:20mM Tris、5% EtOH、pH7.5、およびB-緩衝液:20mM Tris、0.5M NaCl、5%EtOH、pH7.5を用いて2mlの流速で、5CVに対して勾配0〜20%のBを、60CVに対して勾配20〜80%のBを使用し、MonoQ 5/50 GLのアニオン交換クロマトグラフィーにより精製した。化合物は、HiPrep 26/10脱塩カラム上でDPBS緩衝液にバッファー交換した。回収画分は、viva spin限外濾過装置MWCOで濃縮した。3000gで10.000 Da。
LCMS1:理論的質量=20413.1、実測値20413.4。
【０４９１】
(実施例4)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
(K56R, K59R, K69R, K122R) Gly-FGF21誘導体N-α-ビス-(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [Arg56, Arg59, Arg69, Arg122] Gly-FGF21 (化合物II)の調製
実施例1および2で一般的に記載したように調製したK56R, K59R, K69R, K122R Gly-FGF21類似体中のN末端Gly残基(K56R、K59R、K69RおよびK122R、ならびにN末端Gを含む配列番号1)は、以下の試薬:
【０４９２】
【化１０７】
2013532644.tif 000109
【０４９３】
を用いてαアミノ基で修飾した。この化合物は、5当量の17-[(S)-1-カルボキシ-3-(2-{2-[(2-{2-[(4-ホルミルベンジルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピルカルバモイル]ヘプタデカン酸を使用し、実施例3に記載されているように調製した。
LCMS1:理論的質量=21248.2、実測値21248.9。
【０４９４】
(実施例5)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
(K56R, K59R, K69R, D102T, D121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21誘導体  N-α-(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [K56R, K59R, K69R, D102T, D121Q, K122R, L166F S167G, M168L, G170T] Ala-FGF21 (化合物III)の調製
実施例1および2で一般的に記載したように調製したK56R, K59R, K69R, D102T, D121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T Ala-FGF21類似体中のN末端Ala残基(K56R, K59R, K69R, D102T, D121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170TおよびN末端Aを含む配列番号1)は、以下の試薬:
【０４９５】
【化１０８】
2013532644.tif 000110
【０４９６】
を用いてαアミノ基で修飾した。この化合物は、5当量の17-[(S)-1-カルボキシ-3-(2-{2-[(2-{2-[(4-ホルミルベンジルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピルカルバモイル]ヘプタデカン酸を使用し、実施例3に記載されているように調製した。
LCMS1:理論的質量=20485.2、実測値20485.5。
【０４９７】
(実施例6)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α-(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] Ala-FGF21 (化合物IV)の調製
実施例1および2で一般的に記載したように調製したS71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181 Ala-FGF21類似体中のN末端Ala残基(S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181およびN末端Aを含む配列番号1)は、以下の試薬:
【０４９８】
【化１０９】
2013532644.tif 000111
【０４９９】
を用いてαアミノ基で修飾した。この化合物は、pH6.0で5当量の17-[(S)-1-カルボキシ-3-(2-{2-[(2-{2-[(4-ホルミルベンジルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)-プロピルカルバモイル]ヘプタデカン酸を使用し、実施例3に記載されているように調製した。
LCMS1:理論的質量=20329.14、実測値20329.14。
【０５００】
同様に、以下の実施例における本発明のFGF21誘導体を調製することができる。
【０５０１】
(実施例7)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] Gly-FGF21 (化合物V)
【０５０２】
(実施例8)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] Gly-FGF21 (化合物VI)
【０５０３】
(実施例9)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α-ビス(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] Gly-FGF21 (化合物VII)
【０５０４】
(実施例10)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α-ビス(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] Gly-FGF21 (化合物VIII)
【０５０５】
(実施例11)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q, L166F, S167G, M168L, des170, 173aA, G174V, Y179F, A180E, des181] Gly-FGF21 (化合物IX)
【０５０６】
(実施例12)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, des170, 173aA, G174V, Y179F, A180E, des181] Gly-FGF21 (化合物X)
【０５０７】
(実施例13)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α-ビス(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q, L166F, S167G, M168L, des170, 173aA, G174V, Y179F, A180E, des181] Gly-FGF21 (化合物XI)
【０５０８】
(実施例14)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α-ビス(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, des170, 173aA, G174V, Y179F, A180E, des181] Gly-FGF21 (化合物XII)
【０５０９】
(実施例15)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] Ala-FGF21 (化合物XIII)
【０５１０】
(実施例16)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q, L166F, S167G, M168L, des170, 173aA, G174V, Y179F, A180E, des181] Ala-FGF21 (化合物XIV)
【０５１１】
(実施例17)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, des170, 173aA, G174V, Y179F, A180E, des181] Ala-FGF21 (化合物XV)
【０５１２】
(実施例18)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] Ser-FGF21 (化合物XVI)
【０５１３】
(実施例19)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] Ser-FGF21 (化合物XVII)
【０５１４】
(実施例20)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q, L166F, S167G, M168L, des170, 173aA, G174V, Y179F, A180E, des181] Ser-FGF21 (化合物XVIII)
【０５１５】
(実施例21)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, des170, 173aA, G174V, Y179F, A180E, des181] Ser-FGF21 (化合物XIX)
【０５１６】
(実施例22)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] Phe-FGF21 (化合物XX)
【０５１７】
(実施例23)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] Phe-FGF21 (化合物XXI)
【０５１８】
(実施例24)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q, L166F, S167G, M168L, des170, 173aA, G174V, Y179F, A180E, des181] Phe-FGF21 (化合物XXII)
【０５１９】
(実施例25)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, des170, 173aA, G174V, Y179F, A180E, des181] Phe-FGF21 (化合物XXIII)
【０５２０】
(実施例26)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] Met-FGF21 (化合物XXIV)
【０５２１】
(実施例27)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] Met-FGF21 (化合物XXV)
【０５２２】
(実施例28)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q, L166F, S167G, M168L, des170, 173aA, G174V, Y179F, A180E, des181] Met-FGF21 (化合物XXVI)
【０５２３】
(実施例29)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, des170, 173aA, G174V, Y179F, A180E, des181] Met-FGF21 (化合物XXVII)
【０５２４】
(実施例30)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q] Gly-FGF21  (化合物XXVII)
【０５２５】
(実施例31)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α-ビス(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q] Gly-FGF21 (化合物XXIX)
【０５２６】
(実施例32)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q] Ala-FGF21 (化合物XXX)
【０５２７】
(実施例33)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q] Ser-FGF21 (化合物XXXI)
【０５２８】
(実施例34)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q] Phe-FGF21 (化合物XXXII)
【０５２９】
(実施例35)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
N-α(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) [N121Q] Met-FGF21 (化合物XXXIII)
【０５３０】
(実施例36)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
Met-FGF21誘導体N-α-ビス-(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) Met-FGF21 (化合物XXXIV)の調製
実施例1および2で一般的に記載したように調製したMet-FGF21類似体中のN末端Met残基は、以下の試薬:
【０５３１】
【化１１０】
2013532644.tif 000112
【０５３２】
を用いてαアミノ基で修飾した。この化合物は、1.2当量の17-[(S)-1-カルボキシ-3-(2-{2-[(2-{2-[(4-ホルミルベンジルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピルカルバモイル]ヘプタデカン酸を使用し、実施例3に記載されているように調製した。
【０５３３】
(実施例37)
FGF21化合物の修飾基によるN末端での誘導体化
Met-FGF21誘導体N-α-(4-{[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]メチル}ベンジル) Met-FGF21 (化合物XXXV)の調製
実施例1および2で一般的に記載したように調製したMet-FGF21類似体中のN末端Gly残基(配列番号1およびN末端M)は、以下の試薬:
【０５３４】
【化１１１】
2013532644.tif 000113
【０５３５】
を用いてαアミノ基で修飾した。この化合物は、1M NaAc(6.1ul、1.5eq)中の1.5当量の17-[(S)-1-カルボキシ-3-(2-{2-[(2-{2-[(4-ホルミルベンジルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピルカルバモイル]ヘプタデカン酸を使用し、実施例3に記載されているように調製した。pHは10%AcOHで6.0に調節し、その後8mgのヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンを添加した。15分後に、1M NaCNBH3(7ul)を添加した。混合物を2時間RTで静置し、分析した。
LCMS1:理論的質量=20374.2、実測値20375.25。
【０５３６】
(実施例38)
効力アッセイ-3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込み
本発明のFGF21化合物の生物活性または効力を決定するために以下のアッセイを使用した。
【０５３７】
マウス3T3-L1繊維芽細胞(例えば、ATCCから入手可能、カタログ番号CL-173)を基本培地(10%ウシ胎児血清(FBS)およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM(4500mg/lグルコース))で維持する。細胞はコンフルエンスにならないようにし、(目視により)コンフルエンシーが約60%に達する前に継代しなければならない(新しいバイアルに移す)。
【０５３８】
グルコース取込みアッセイのために、細胞は、24ウェルプレートに80,000細胞/ウェルでプレーティングするか、96ウェルプレートに20,000細胞/ウェルでプレーティングし、細胞がコンフルエンシーに達した際に(調製された分化した脂肪細胞を得ること目的とした高密度)、培地を基本培地から、トログリタゾン(Troglitazone)、IBMX、デキサメタゾン(市販されているもの、例えばSigma製)およびヒトインスリン(市販されているもの、例えばNovo Nordisk A/S製)を含有する基本培地に取り換える。
【０５３９】
細胞は、分化開始7〜14日後、好ましくは7〜10日後に用いる。細胞を、基本培地中、FGF21ポリペプチドまたは本発明の誘導体を用いて濃度を増大させて(0〜300nM)、20時間刺激する。3H-デオキシグルコース(以下において:トレーサーという)を添加する前に、細胞を加温(約37℃)アッセイバッファー(1mM MgCl2および2mM CaCl2を含むPBS)、HEPESおよび0.1%ヒト血清アルブミン)で洗浄し、細胞をトレーサーと1時間インキュベートする。このインキュベーションは、氷冷アッセイバッファーで2回洗浄することにより終止する。細胞をトリトンX-100で溶解させ、溶解物を96ウェルプレートに移し、microscint-40(市販のもの、例えばPerkin Elmer製)を加え、トレーサーの量をTOPカウンター(例えば、Perkin Elmer製のパッカードトップカウンター)でカウントする。当該ポリペプチドのEC50を計算する。下記のTable 1(表1)に示す結果は、Met-FGF21のEC50(効力)に対する本発明のFGF21化合物のEC50(効力)を示す。
【０５４０】
【表１】
2013532644.tif 000114
【０５４１】
(実施例39)
HEK293/β-klotho Erkリン酸化アッセイ
Erkリン酸化アッセイは、ヒトβ-Klothoで安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞において実施した。HEK293T/β-klotho安定細胞を96ウェルプレート上30000細胞/ウェルで播種した。2日後、新鮮培地を加え、2時間後、さらにFGF21タンパク質を加えた。このプレートを12分間インキュベートした。トータルERKリン酸化は、メーカーの使用説明書に従ってAlphaScreen SureFire Phospho-ERK1/2アッセイキット(Perkin Elmer, Waltham, MA)を使用して評価し、シグナル検出には、AlphaScreen HTS Turbo optionを備えたEnVision Multilabel Microplate Reader Model 2103 (Perkin Elmer)を使用した。データは、GraphPad Prismバージョン5.02を使用し、4-パラメーターロジスティックス非線形回帰分析から決定された平均+/- S.E.M. EC50値として表す。参考文献:Yie, J.ら: FGF21 N- and C-termini play different roles in receptor interaction and activation, FEBS Letters 583 (2009) 19〜24頁、および、Micanovic R.ら: Different roles of N- and C- termini in the functional activity of FGF21. J. Cell. Physiol. 2009年5月; 219(2):227〜34頁。
【０５４２】
【表２】
2013532644.tif 000115
【０５４３】
(実施例40)
FGF21化合物に関するin vivo試験-薬物動態
ミニブタ
Met-FGF21の薬物動態プロファイルは、正常な雄性Gottingenミニブタ(n=4)で試験することができる(8〜15月齢、体重約18〜30kg)。試験対象の化合物の血漿濃度を14日間モニターする。Met-FGF21を単回静注用量0.1mg/kgとして投与する(約5nmol/kg)。
【０５４４】
比較化合物Met-FGF21の平均半減期(T1/2)は、標準偏差2.7時間を有する10.8時間であると判定された。
【０５４５】
本発明のFGF21化合物の薬物動態プロファイルは、正常な雄性Gottingenミニブタ(n=4)で試験する(8〜15月齢、体重約18〜30kg)。血漿濃度を19日間モニターする。化合物は単回静注用量0.01〜0.5mg/kgとして投与する。
【０５４６】
試験対象の化合物の平均半減期(T1/2)を決定する。
【０５４７】
FGF21化合物の血漿濃度は、Fibroblast Growth Factor-21 Human ELISA (BioVendorから入手可能、カタログ番号RD191108200R)を使用して決定することができる。薬物動態の算出には、PC系ソフトウェア、Pharsight Corportion, Cary N.C.のWinNonLinバージョン5.2を使用することができる。
【０５４８】
この試験で、本発明のFGF21誘導体の持続効果を確認する。
【０５４９】
(実施例41)
FGF21化合物のin vivo試験-薬効
db/dbマウスは2型糖尿病に関するマウスモデルである。このマウスはレプチン受容体を欠損しており、高血糖症、インシュリン抵抗性、過食症および肥満により特徴づけられる。
【０５５０】
本発明によるFGF21類似体および誘導体の血糖に対する効果の測定には、雄性db/dbマウス(9〜10週齢)を使用することができる。
【０５５１】
化合物は、50mMリン酸塩、145mM NaCl、0.05% Tween-80(pH=7.4)中に0.1mg/kg(2ml/kg)とし、7日間毎日1回s.c.投与することができる(n=7〜9)。それぞれビヒクル処理群(対照)は、50mMリン酸塩、145mM NaCl、0.05% Tween-80(pH=7.4)(2ml/kg)とし、7日間毎日1回s.c.投与により処置される。非空腹時血糖は、投与前と、再度投与7日後2時間に測定することができる。血糖は、グルコースオキシダーゼ法に基づき、グルコースアナライザー(Biosen 5040)を使用して測定することができる。
【０５５２】
ここに引用された刊行物、特許出願および特許を含む全ての文献は、あたかも、それぞれの文献が個別に、かつ詳しく参照により援用され、またその全内容が本明細書に(法律により許容される最大範囲まで)本明細書に記載されているのと同程度まで、参照により本明細書により援用される。
【０５５３】
本明細書における特許文献の引用および援用は単に便宜上行われているにすぎず、そのような特許文献の有効性、特許性、および/または権利行使性についての見解を反映させるものではない。本明細書における参考文献の言及は、これらが先行技術を構成するということを承認するものではない。
【０５５４】
本明細書においては、全ての表題および副題は便宜的に使用されているにすぎず、いかなる場合も本発明を限定するものとは解釈すべきでない。
【０５５５】
本明細書で提供しているあらゆる例、または例示的な語(例えば、「など」)の使用は、本発明を適切に例示することを意図しているにすぎず、他に特段の指示のない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中のいかなる語も、特許請求されていないいかなる要素も本発明の実施に必須であることを示しているものと解すべきではない。
【０５５６】
本明細書では、「含む(comprise)」という用語は、「含む(include)」、「含有する(contain)」または「包括する(comprehend)」を広く意味していると理解されたい(EPOガイドライン(C)、III、4.13を参照)。
【０５５７】
本発明は、適用される法律に許容される範囲まで、ここに提供されている請求項および条項に列挙された主題の全ての変更形態および均等物を含む。
【配列表】
2013532644000001.app
【国際調査報告】
2013532644.tif 000131
2013532644.tif 000132
2013532644.tif 000133