(57)【要約】がん、例えば、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、およびリンパ腫を発症する素因を診断するための、本発明の目的とする方法が、本明細書に記載される。ある態様において、この診断法は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを測定する段階を含む。本発明は、がん、例えば、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、およびリンパ腫のような、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１に関連した疾患の治療において有用な治療剤をスクリーニングする方法をさらに提供する。本発明は、細胞増殖の阻害、およびＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１に関連した疾患の症状の治療または軽減の方法をさらに提供する。本発明は、二本鎖分子およびそれらをコードするベクターを含む生成物、ならびにそれらを含む組成物も特徴とする。さらに、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現、またはＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドの生物学的活性に対する効果を指標として使用して、肺癌の治療および／または予防のための物質を同定する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象由来の生物学的試料におけるＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルまたはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルのいずれかまたは両方を決定する段階を含む、対象においてがんを検出または診断する方法であって、
該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増加が、該対象ががんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有することを示し、
該発現レベルが、以下からなる群より選択される方法によって決定される、前記方法：
（ａ）ＷＨＳＣ１のｍＲＮＡまたはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡのいずれかまたは両方を検出する方法；
（ｂ）ＷＨＳＣ１遺伝子によってコードされるタンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質のいずれかまたは両方を検出する方法；および
（ｃ）ＷＨＳＣ１によってコードされるタンパク質の生物学的活性またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性のいずれかまたは両方を検出する方法。
【請求項２】
前記増加が正常対照レベルより少なくとも１０％高い、請求項１記載の方法。
【請求項３】
対象由来の生物学的試料が生検試料または血液試料である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
以下からなる群より選択される試薬を少なくとも１つ含む、がんを診断するためのキット：
（ａ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【請求項５】
試薬が、以下からなる群より選択される、請求項４記載のキット：
（ａ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡに対するプローブ；および
（ｂ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体。
【請求項６】
以下を含む、がんの治療もしくは予防、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験物質との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する試験物質を選択する段階。
【請求項７】
以下を含む、がんの治療もしくは予防、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子のいずれかまたは両方を発現している細胞と接触させる段階；  
（ｂ）ＷＨＳＣ１の発現レベルまたはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルのいずれかまたは両方を検出する段階；および
（ｂ）試験物質の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルまたはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルのいずれかまたは両方を低下させる試験物質を選択する段階。
【請求項８】
以下を含む、がんの治療もしくは予防、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるポリペプチドと接触させる段階；  
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される生物学的活性と比較して、該ポリペプチドの生物学的活性を抑制する試験物質を選択する段階。
【請求項９】
生物学的活性が、細胞増殖活性、メチルトランスフェラーゼ活性、またはＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、もしくはβカテニンポリペプチドに対する結合活性である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
以下を含む、がんの治療もしくは予防、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている細胞と、試験物質を接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下での発現または活性と比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる試験物質を選択する段階。
【請求項１１】
以下を含む、がんの治療もしくは予防、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質の存在下で、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβカテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物を、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）の、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβカテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つと、ＷＨＳＣ１ポリペプチドとの間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される結合と比較して、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβカテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つと、ＷＨＳＣ１ポリペプチドとの間の結合を阻害する試験物質を選択する段階。
【請求項１２】
センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、かつＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子であって、
前記センス鎖が配列番号：２９、３２、３５、および３８からなる群より選択される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が該標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、該センス鎖およびアンチセンス鎖が互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成する、前記二本鎖分子。
【請求項１３】
約１９〜約２５ヌクレオチド長である、請求項１２記載の二本鎖分子。
【請求項１４】
一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のポリヌクレオチド分子である、請求項１２または１３記載の二本鎖分子。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが、以下の一般式を有する、請求項１４記載の二本鎖分子：
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
式中、［Ａ］は配列番号：２９、３２、３５、および３８からなる群より選択される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ'］は前記標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖である。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか一項記載の二本鎖分子をコードするベクター。
【請求項１７】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせの各々を含み、かつ標的遺伝子の発現を阻害するベクターであって、
前記センス鎖核酸が配列番号：２９、３２、３５、および３８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖およびアンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成する、前記ベクター。
【請求項１８】
ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対する薬学的に有効な量の二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターと、薬学的に許容される担体とを対象に投与する段階を含む、対象においてがんを治療または予防する方法であって、
前記二本鎖分子が、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現している細胞へ導入された場合に、細胞増殖およびＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を阻害する、前記方法。
【請求項１９】
二本鎖分子が請求項１２〜１５のいずれか一項記載の二本鎖分子である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ベクターが請求項１６または１７記載のベクターである、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対する薬学的に有効な量の二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、がんの治療または予防のための組成物であって、
前記二本鎖分子が、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現している細胞へ導入された場合に、細胞増殖およびＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を阻害する、前記組成物。
【請求項２２】
二本鎖分子が請求項１２または１５のいずれか一項記載の二本鎖分子である、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
ベクターが請求項１６または１７記載のベクターである、請求項２１記載の組成物。
【請求項２４】
以下を含む、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβカテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物との間の結合を阻害するための物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質の存在下で、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβカテニンポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物を、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）の、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβカテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物と、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβカテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物と、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を阻害する試験物質を選択する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん、特に膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、またはリンパ腫を発症する素因を検出および診断する方法に関する。本発明はまた、ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１を過剰発現するがん、特に膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、またはリンパ腫を治療および予防するための候補物質をスクリーニングする方法にも関する。さらに、本発明は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を低減させる二本鎖分子およびその使用にも関する。
【０００２】
優先権
本出願は、開示内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる２０１０年２月３日に出願された米国特許出願第６１／３０１，０２５号および２０１０年１１月９日に出願された米国特許出願第６１／４１１，６８９号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
ヒストンのＮ末端尾部は、メチル化、アセチル化、およびリン酸化を含む翻訳後修飾に供されて、広範囲のレパートリーのクロマチン構造を生じる（非特許文献１、２）。本発明者らは、ＳＭＹＤ３、すなわちヒストンリジンメチルトランスフェラーゼが、細胞の増殖を刺激し、そのメチルトランスフェラーゼ活性を通じてヒトの発がんにおいて重要な役割を果たすことを以前に報告した（特許文献１、非特許文献３〜７）。Ｄｏｔ１／ＤＯＴ１Ｌを別として、あらゆるヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（ＨＫＭＴ）は、アミノ酸約１３０個のＳＥＴドメインを含む（非特許文献８）。ＳＥＴドメインは、もともとは、エピジェネティックなプロセスに関与する３種のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）タンパク質：位置効果のサプレッサー［Ｓｕ（ｖａｒ）３−９］；ＰｃＧタンパク質に属する眼色変異ｚｅｓｔｅのエンハンサー［Ｅ（Ｚ）］；およびホメオボックス遺伝子調節因子トリソラックス［ＴＲＸ］における共通ドメインとして同定された（非特許文献９）。ショウジョウバエＳｕ（ｖａｒ）３−９の哺乳動物ホモログであるＳｕｖ３９ｈ１およびＳｕｖ３９ｈ２は、ＨＫＭＴとして特徴付けられた最初のものであった。これらは、ヒストンＨ３のリジン９（Ｈ３Ｋ９）を特異的にメチル化する（非特許文献１０）。これまでのところ、ＳＥＴドメインを含む４０個近くのＨＫＭＴまたは潜在的なＨＫＭＴが同定されており、それらのいくつかは、ヒストンＨ３のコドン４、９、および２７または３６のリジン残基ならびにヒストンＨ４のリジン２０をメチル化することが示されている。ＨＫＭＴは、それらのＳＥＴドメイン内および隣接配列内の配列類似性によって、ならびに他の所定のタンパク質ドメインの存在のような他の構造的特徴に基づいて、いくつかの異なるファミリーに分類することができる（非特許文献８）。ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびそれらの生理学的機能に関する情報は蓄積されてきてはいるものの、ヒトの疾患へのそれらの関与は、大部分は依然としてはっきりしない。
【０００４】
ヒトの発がんにおいてＨＫＭＴが果たし得る役割を調査するために、本発明者らは、臨床組織におけるヒトＨＫＭＴの発現プロファイルを検査し、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルが、対応する正常組織における発現と比べて、様々な種類のがんにおいて有意に上方制御されていることを発見した。ＮＳＤ２としても公知のＷＨＳＣ１は、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群（ＷＨＳ）の候補遺伝子として同定された（非特許文献１１）。転座ｔ（４；１４）（ｐ１６．３；ｑ３２．３）を通じて、ＷＨＳＣ１が多発性骨髄腫に関与していることが示されている（非特許文献１１、１２）。ＷＨＳＣ１タンパク質は、酵母Ｈ３Ｋ３６特異的メチルトランスフェラーゼＳｅｔ２に高度に保存されているＡＷＳ−ＳＥＴ−ＰｒｏＳＥＴドメインを含む。マウスＷｈｓｃ１は、胚性幹細胞において細胞型特異的転写因子Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、およびＮａｎｏｇと結合することによって、ユークロマチンに沿ったＨ３Ｋ３６ｍｅ３分布を制御することが最近報告された（非特許文献１３）。ＮＳＤ３およびＷＨＩＳＴＬＥとしても公知のＷＨＳＣ１Ｌ１は、ＷＨＳＣ１遺伝子に関連しており、ＰＷＷＰ（ｐｒｏｌｉｎｅ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｐｒｏｌｉｎｅ）ドメインを有するタンパク質をコードしている（非特許文献１４）。ＷＨＳＣ１Ｌ１は染色体８ｐ１２中に位置しており、特に、機能的ドメインを含むこのタンパク質の３'領域において、ＷＨＳＣ１およびＮＳＤ１に対して強い配列類似性を示す（非特許文献１４、１５）。ＷＨＳＣ１Ｌ１は、ヒストンメチル化を媒介することによる転写抑制因子であることが公知であるが（非特許文献１６、１７）、このタンパク質の細胞機能は決定されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０７１１０２
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jenuwein T and Allis CD Science 293: 1074-1080, 2001.
【非特許文献２】Lachner M, et al. Nature 410: 116-120, 2001.
【非特許文献３】Hamamoto R, et al. Nat Cell Biol 6: 731-740, 2004.
【非特許文献４】Hamamoto R, et al. Cancer Sci 97: 113-118, 2006.
【非特許文献５】Kunizaki M, et al. Cancer Res 67: 10759-10765, 2007.
【非特許文献６】Silva FP, et al. Oncogene 27: 2686-2692, 2008.
【非特許文献７】Tsuge M, et al. Nat Genet 37: 1104-1107, 2005.
【非特許文献８】Volkel P and Angrand PO. Biochimie 89: 1-20, 2007.
【非特許文献９】Jenuwein T, et al. Cell Mol Life Sci 54: 80-93, 1998.
【非特許文献１０】Rea S, et al. Nature 406: 593-599, 2000.
【非特許文献１１】Stec I, et al. Hum Mol Genet 7: 1071-1082, 1998
【非特許文献１２】Chesi M, et al. Blood 1998;92:3025-34.
【非特許文献１３】Nimura K, et al. Genomics 2001;76:5-8.
【非特許文献１４】Stec I, et al. Genomics 2001;76:5-8.
【非特許文献１５】Douglas J, et al. Eur J Hum Genet 2005;13:150-3.
【非特許文献１６】Kim SM, et al. Biochem Biophys Res Commun 2006;345:318-23.
【非特許文献１７】Kim SM, et al. Exp Cell Res 2007;313:975-83.
【発明の概要】
【０００７】
ヒトの発がんにおいてＨＫＭＴが果たし得る役割を調査するために、本発明者らは、臨床組織におけるヒトＨＫＭＴの発現プロファイルを検査し、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルが、対応する正常組織と比べて、様々な種類のがんにおいて有意に上方制御されていることを発見した。
【０００８】
本発明において、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１が様々な種類のヒトがんにおいて過剰発現されていることが確認された。これらの遺伝子は成人正常器官ではほとんど発現されないため、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１は、有害作用が最小限の新規な治療アプローチのための適切な分子標的である。機能上、がん細胞株において内在性のＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１をｓｉＲＮＡによってノックダウンするとがん細胞増殖が大幅に抑制されたことから、がん細胞の生存能を維持する上でのこれらの遺伝子の不可欠な役割が実証された。
【０００９】
したがって、本発明は、生検試料または生検標本などの対象に由来する生物学的試料中のＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを決定することによって、対象におけるがん、特に膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、およびリンパ腫を診断するか、またはそれらに対する素因を決定する方法を特徴とする。ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルが正常対照レベルと比べて上昇している場合、その対象はがん、特に膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、およびリンパ腫に罹患しているか、またはそれらを発症するリスクを有することが示唆される。これらの方法において、ＷＨＳＣ１および／もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の転写物（すなわちｍＲＮＡ）を適切なプローブもしくはプライマーセットによって検出することができ、またはＷＨＳＣ１および／もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質を抗ＷＨＳＣ１抗体もしくは抗ＷＨＳＣ１Ｌ１抗体によって検出することができる。
【００１０】
本発明はさらに、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現またはそれらの遺伝子産物の活性を阻害する物質を同定する方法も提供する。さらに、本発明は、がん、例えば、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、リンパ腫などのＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１に関連した疾患を治療および／もしくは予防するための候補物質、またはＷＨＳＣ１および／もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を過剰発現する細胞の増殖を阻害する候補物質を同定する方法も提供する。ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルおよび／またはこれらの遺伝子産物（すなわち、タンパク質もしくはポリペプチド）の生物学的活性が、試験物質の非存在下でのものと比べて低下している場合、その試験物質がＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の阻害物質であり、例えば、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、およびリンパ腫のがん細胞のようなＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を過剰発現する細胞の増殖を阻害するのに使用され得ることが示唆される。このようなスクリーニングにおいて検出されるＷＨＳＣ１遺伝子産物の生物学的活性は、好ましくは、メチルトランスフェラーゼ活性、細胞増殖活性（細胞増殖を促進する活性）、またはＩＱＧＡＰ１、ＴＩＡＭ１、ＡＫＴ２、もしくはβ−カテニンに対する結合活性でよい。このようなスクリーニングにおいて検出されるＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子産物の生物学的活性は、好ましくは、メチルトランスフェラーゼ活性または細胞増殖活性（細胞増殖を促進する活性）でよい。
【００１１】
別の局面において、本発明は、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現および／またはＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の機能を阻害する物質を投与することによって、ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を過剰発現するがん細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。好ましくは、この物質は、阻害性核酸（例えば、アンチセンス、リボザイム、二本鎖分子）である。物質は、二本鎖分子を提供するための核酸分子またはベクターでよい。遺伝子の発現は、標的遺伝子を阻害するのに十分な量の二本鎖分子を標的細胞中に導入することによって、阻害することができる。本発明はまた、対象においてＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１を過剰発現するがん細胞の増殖を阻害するための方法も提供する。本発明は、がん、特に膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、およびリンパ腫を治療および／または予防するのに有用である。
【００１２】
別の局面において、本発明は、活性成分としての１種もしくは複数種の二本鎖分子またはそのような分子をコードするベクター、および薬学的に許容される担体を含む、がんを治療および／または予防するための薬学的組成物に関する。さらに、本発明はまた、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を対象とする二本鎖分子およびそのような分子をコードするベクターも提供する。本発明において提供される二本鎖分子は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を阻害し、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１を過剰発現するがん細胞中に導入された場合、それらの細胞の増殖を阻害する。好ましくは、このような分子は、ＷＨＳＣ１遺伝子の場合は配列番号：２９または３２に対応するヌクレオチド配列を標的とし、ＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の場合は配列番号：３５または３８に対応するヌクレオチド配列を標的とする。本発明の二本鎖分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、標的配列を含むヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は、標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。この分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。
【００１３】
具体的には、本発明は以下を提供する。
［１］対象由来の生物学的試料（すなわち、対象から得た試料）におけるＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルおよび／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、対象においてがんを検出または診断する方法であって、
該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増加が、該対象ががんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有することを示し、
該発現レベルが、以下からなる群より選択される方法によって決定される、前記方法：
（ａ）ＷＨＳＣ１のｍＲＮＡおよび／またはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡを検出する方法；
（ｂ）ＷＨＳＣ１遺伝子によってコードされるタンパク質および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質を検出する方法；および
（ｃ）ＷＨＳＣ１によってコードされるタンパク質の生物学的活性および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出する方法；
［２］前記増加が正常対照レベルより少なくとも１０％高い、［１］に記載の方法；
［３］対象由来の生物学的試料が生検試料または血液試料である、［１］に記載の方法；
［４］以下からなる群より選択される試薬を少なくとも１つ含む、がんを診断するためのキット：
（ａ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬；
［５］試薬が、以下からなる群より選択される、［４］に記載のキット：
（ａ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡに対するプローブ；および
（ｂ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体；
［６］以下を含む、がんの治療もしくは予防、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験物質との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する試験物質を選択する段階；
［７］以下を含む、がんの治療もしくは予防、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；  
（ｂ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｂ）試験物質の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを低下させる試験物質を選択する段階；
［８］以下を含む、がんの治療もしくは予防、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される生物学的活性と比較して、該ポリペプチドの生物学的活性を抑制する試験物質を選択する段階；
［９］生物学的活性が、細胞増殖活性、メチルトランスフェラーゼ活性、またはＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、もしくはβカテニンポリペプチドに対する結合活性である、［８］に記載の方法；
［１０］以下を含む、がんの治療もしくは予防、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている細胞と、試験物質を接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下での発現または活性と比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる試験物質を選択する段階；
［１１］以下を含む、がんの治療もしくは予防、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質の存在下で、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／もしくはβカテニンポリペプチド、またはそれらの機能的等価物を、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）の、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／またはβカテニンポリペプチドと、ＷＨＳＣ１ポリペプチドとの間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される結合と比較して、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／またはβカテニンポリペプチドと、ＷＨＳＣ１ポリペプチドとの間の結合を阻害する試験物質を選択する段階；
［１２］センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、かつＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子であって、
前記センス鎖が配列番号：２９、３２、３５、および３８からなる群より選択される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が該標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、該センス鎖およびアンチセンス鎖が互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成する、前記二本鎖分子；
［１３］約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［１２］に記載の二本鎖分子；
［１４］一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のポリヌクレオチド分子である、［１２］または［１３］に記載の二本鎖分子；
［１５］前記ポリヌクレオチドが、以下の一般式を有する、［１４］に記載の二本鎖分子：
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
式中、［Ａ］は配列番号：２９、３２、３５、および３８からなる群より選択される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ'］は前記標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖である；
［１６］［１２］〜［１５］のいずれか１つに記載の二本鎖分子をコードするベクター；
［１７］センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせの各々を含み、かつ標的遺伝子の発現を阻害するベクターであって、
前記センス鎖核酸が配列番号：２９、３２、３５、および３８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖およびアンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成する、前記ベクター；
［１８］ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対する薬学的に有効な量の二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターと、薬学的に許容される担体とを対象に投与する段階を含む、対象においてがんを治療または予防する方法であって、
前記二本鎖分子が、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現している細胞へ導入された場合に、細胞増殖およびＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を阻害する、前記方法；
［１９］二本鎖分子が［１２］〜［１５］のいずれか１つに記載の二本鎖分子である、［１８］に記載の方法；
［２０］ベクターが［１６］または［１７］に記載のベクターである、［１８］に記載の方法；
［２１］ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対する薬学的に有効な量の二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、がんの治療または予防のための組成物であって、
前記二本鎖分子が、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現している細胞へ導入された場合に、細胞増殖およびＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を阻害する、前記組成物；
［２２］二本鎖分子が［１２］〜［１５］のいずれか１つに記載の二本鎖分子である、［２１］に記載の組成物；
［２３］ベクターが［１６］または［１７］に記載のベクターである、［２１］に記載の組成物；ならびに
［２４］以下を含む、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、もしくはβカテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物との間の結合を阻害するための物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質の存在下で、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、もしくはβカテニンポリペプチド、またはその機能的等価物を、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチド間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、またはβカテニンポリペプチドと、ＷＨＳＣ１ポリペプチドとの間の結合を阻害する試験物質を選択する段階。
【００１４】
別の態様において、［１］対象由来の生物学的試料（すなわち、対象から得た試料）におけるＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルもしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルのいずれかまたは両方を決定する段階を含む、対象においてがんを検出または診断する方法であって、
該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増加が、該対象ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクを有することを示し、
該発現レベルが、以下からなる群より選択される方法によって決定される、前記方法が提供される：
（ａ）ＷＨＳＣ１のｍＲＮＡまたはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡのいずれかまたは両方を検出する方法；
（ｂ）ＷＨＳＣ１遺伝子にコードされるタンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるタンパク質のいずれかまたは両方を検出する方法；
（ｃ）ＷＨＳＣ１にコードされるタンパク質の生物学的活性またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性のいずれかまたは両方を検出する方法。
【００１５】
さらに、別の態様において、［７］以下の段階を含む、がんの治療もしくは予防、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法もまた提供される：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子のいずれかまたは両方を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）ＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルまたはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルのいずれかまたは両方を検出する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルまたはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルのいずれかまたは両方を低下させる試験物質を選択する段階。
【００１６】
さらに、別の態様において、［１１］以下の段階を含む、がんの治療または予防のための候補物質をスクリーニングする方法もまた提供される：
（ａ）試験物質の存在下で、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物を、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階、
（ｂ）段階（ａ）の、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つと、ＷＨＳＣ１ポリペプチドとの間の結合を検出する段階、ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される結合と比較して、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つと、ＷＨＳＣ１ポリペプチドとの間の結合を阻害する試験物質を選択する段階。
【００１７】
さらに、別の態様において、［２４］以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、もしくはβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物との間の結合を阻害するための物質をスクリーニングする方法もまた提供される：
（ａ）試験物質の存在下で、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物を、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物と、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下での結合と比較して、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物と、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を阻害する試験物質を選択する段階。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】ヒトのがんにおいて増加しているＷＨＳＣ１発現を示すグラフおよび写真を示す。（Ａ）ＷＨＳＣ１の発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって解析した。結果を箱ひげ図によって示している（中央値（５０％）を四角で囲んでいる）。相対的ｍＲＮＡ発現は、ＧＡＰＤＨ発現およびＳＤＨ発現に基づいて正規化した値を示す。統計学的解析のために、マンホイットニーＵ検定を使用した。（Ｂ）正常膀胱組織およびがん膀胱組織中のＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の免疫組織化学的染色。ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて対比染色を行った。倍率、１００倍および４００倍。
【図１−２】ヒトのがんにおいて増加しているＷＨＳＣ１発現を示すグラフおよび写真を示す。（Ｃ）正常組織と腫瘍組織との間のＷＨＳＣ１発現の比較。各試料のシグナル強度をｃＤＮＡマイクロアレイを用いて解析した。結果を箱ひげ図によって示している（中央値（５０％）を四角で囲んでいる）。統計学的解析のために、マンホイットニーＵ検定を使用した。（Ｄ）慢性骨髄性白血病、リンパ腫、肺癌（ＳＣＬＣ）、および乳癌の正常組織と腫瘍組織との間のＷＨＳＣ１Ｌ１発現の比較。各試料のシグナル強度をｃＤＮＡマイクロアレイを用いて解析した。結果を箱ひげ図によって示している（中央値（５０％）を四角で囲んでいる）。統計学的解析のために、マンホイットニーＵ検定を使用した。
【図２】ＷＨＳＣ１のタンパク質発現について標準的な免疫組織化学を用いて染色した膀胱組織の組織マイクロアレイ画像を示す。各切片の臨床的情報を組織写真の上に表している。ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて対比染色を行った。倍率４００倍。
【図３Ａ】ＷＨＳＣ１のタンパク質発現について標準的な免疫組織化学を用いて染色した肺組織の組織マイクロアレイ画像を示す。各切片の臨床的情報を組織写真の上に表している。ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて対比染色を行った。倍率４００倍。
【図３Ｂ】ＷＨＳＣ１のタンパク質発現について標準的な免疫組織化学を用いて染色した肺組織の組織マイクロアレイ画像を示す。各切片の臨床的情報を組織写真の上に表している。ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて対比染色を行った。倍率４００倍。
【図３Ｃ】ＷＨＳＣ１のタンパク質発現について標準的な免疫組織化学を用いて染色した肺組織の組織マイクロアレイ画像を示す。各切片の臨床的情報を組織写真の上に表している。ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて対比染色を行った。倍率４００倍。
【図３Ｄ】ＷＨＳＣ１のタンパク質発現について標準的な免疫組織化学を用いて染色した肺組織の組織マイクロアレイ画像を示す。各切片の臨床的情報を組織写真の上に表している。ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて対比染色を行った。倍率４００倍。
【図４Ａ】膀胱癌細胞および肺癌細胞の増殖へのＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の関与を示すグラフを示す。ＳＷ７８０細胞における２種のＷＨＳＣ１特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＷＨＳＣ１  １番および２番）ならびにＡ５４９細胞における２種のＷＨＳＣ１Ｌ１特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＷＨＳＣ１Ｌ１  １番および２番）による、ＷＨＳＣ１の内因性発現の抑制を示す定量的リアルタイムＰＣＲ。ＥＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＰ）およびｓｉ陰性対照（ｓｉＮＣ）を対照として使用した。ｍＲＮＡ発現レベルは、ＧＡＰＤＨ発現およびＳＤＨ発現に基づいて正規化した。値はｓｉＥＧＦＰを基準としている（ｓｉＥＧＦＰ＝１）。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤである。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定を用いて算出した（＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。
【図４Ｂ】膀胱癌細胞および肺癌細胞の増殖へのＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の関与を示すグラフを示す。２種の膀胱癌細胞株（ＳＷ７８０、ＲＴ４）および３種の肺癌細胞株（Ａ５４９、ＬＣ３１９、およびＳＢＣ５）の生存能に対する、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１のｓｉＲＮＡノックダウンの影響。相対的細胞数は、ｓｉＥＧＦＰで処理した細胞に対して正規化した値を示す（ｓｉＥＧＦＰ＝１）。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤである。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定を用いて算出した（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。
【図４Ｃ】膀胱癌細胞および肺癌細胞の増殖へのＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の関与を示すグラフを示す。Ａ５４９細胞およびＳＷ７８０細胞の細胞周期動態に対するｓｉＷＨＳＣ１の影響。フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）結合抗ＢｒｄＵおよび７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を結合させて染色した後、フローサイトメトリーによって細胞周期分布を解析した。
【図５−１】ＷＨＳＣ１がＩＱＧＡＰ１、ＴＩＡＭ１、ＡＫＴ２、およびβ−カテニンと相互作用したことを示す。（Ａ）ＷＨＳＣ１発現ノックダウン後のＳＷ７８０およびＡ５４９のｍＲＮＡ発現プロファイルの２次元教師なし階層的クラスター解析。差次的に発現された遺伝子をこの解析のために選択した。赤色、上方制御されている；緑色、下方制御されている。
【図５−２】ＷＨＳＣ１がＩＱＧＡＰ１、ＴＩＡＭ１、ＡＫＴ２、およびβ−カテニンと相互作用したことを示す。（Ｂ）ＷＨＳＣ１と相互作用するタンパク質の銀染色パターン。ｐＣＡＧＧＳ−ｎ３ＦＨ−ＷＨＳＣ１ベクターを２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。４８時間後、ＷＨＳＣ１と相互作用するタンパク質パートナーを抗ＦＬＡＧ免疫沈降法によって濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、銀染色した。対照レーンと比べて異なるバンドを切り出し、質量分析によって同定した。抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウェスタンブロットを実施して、ＦＬＡＧ−ＷＨＳＣ１の発現を確認した。（Ｃ）２９３Ｔ細胞溶解物から抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロース（ＳＩＧＭＡ）を用いて得た免疫沈殿物（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ）を、抗ＦＬＡＧ（ＷＨＳＣ１）抗体、抗ＩＱＧＡＰ１抗体、抗ＴＩＡＭ１抗体、抗ＡＫＴ２抗体、および抗β−カテニン抗体を用いて免疫ブロットした。（Ｄ）ＨＡ−β−カテニンベクターおよび３×ＦＬＡＧ−ＷＨＳＣ１ベクターを２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトし、ＮＥ−ＰＥＲ核および細胞質抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｃｎｔｉｆｉｃ）によって細胞溶解物を分画した。分画された溶解物から抗ＨＡアガロース（ＳＩＧＭＡ）を用いて得た免疫沈殿物を、抗ＦＬＡＧ抗体および抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロットした。ＵＨＲＦ１を核タンパク質のマーカーとして使用し、Ｒｈｏ  Ａを細胞質タンパク質のマーカーとして使用した。
【図５−３】ＷＨＳＣ１がＩＱＧＡＰ１、ＴＩＡＭ１、ＡＫＴ２、およびβ−カテニンと相互作用したことを示す。（Ｅ）ＦＬＡＧタグ付きＷＨＳＣ１をトランスフェクションした後のＨＣＴ１１６細胞の免疫細胞化学的解析。抗ＦＬＡＧ抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８［緑色］）、抗β−カテニン抗体、または抗活性型β−カテニン抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４［赤色］）、および４'，６'−ジアミジン−２'−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ［青色］）で細胞を染色した。
【図６】ＷＨＳＣ１がＷｎｔシグナル伝達経路を調節することを示す。（Ａ）ｐＣＡＧＧＳ−ＷＨＳＣ１ベクターによるトランスフェクション後の２９３Ｔ細胞におけるＴＯＰＦＬＡＨ解析およびＦＯＰＦＬＡＳＨ解析。ｍｏｃｋベクターを対照として使用した。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤである。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定を用いて算出した（＊＊、Ｐ＜０．０１）。（Ｂ）ｓｉＥＧＦＰ（対照）およびｓｉＷＨＳＣ１で処理した後のＳＷ７８０細胞およびＡ５４９細胞におけるＣＣＮＤ１のシグナル強度を、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｕ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって定量した。（Ｃ）ｓｉＥＧＦＰ（対照）およびｓｉＷＨＳＣ１で処理した後のＡ５４９細胞およびＳＢＣ５細胞における相対的ＣＣＮＤ１  ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって解析した。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤである。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定を用いて算出した（＊＊、Ｐ＜０．０１）。
【図７】２種の正常細胞株、１４種の膀胱癌細胞株、５種の肺癌細胞株、３種の肝臓癌細胞株、および３種の結腸癌細胞株におけるＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルを示す。定量的リアルタイムＰＣＲによって発現レベルを解析した。相対的ｍＲＮＡ発現は、ＧＡＰＤＨ発現およびＳＤＨ発現に基づいて正規化した値を示す。
【図８】２９種の正常組織におけるＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルを示す。ｃＤＮＡマイクロアレイによってシグナル強度を定量した。シグナル強度の対照としてＧＡＰＤＨ発現を示す。
【図９】７８種の正常組織におけるＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルを示す。データは、ＢｉｏＧＰＳ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｇｐｓ．ｇｎｆ．ｏｒｇ／＃ｇｏｔｏ＝ｇｅｎｅｒｅｐｏｒｔ＆ｉｄ＝５４９０４）から得た。シグナル強度の対照としてＧＡＰＤＨ発現を示す。
【図１０】ＷＨＳＣ１発現と肺癌の予後との相関関係を示す。（Ａ）肺ＡＤＣ組織、肺ＳＣＣ組織、および正常肺組織におけるＷＨＳＣ１陽性発現の代表的事例。倍率、１００倍および２００倍。（Ｂ）ＮＳＣＬＣ患者の全生存期間のカプラン・マイヤー推定値（Ｐ＝０．８６２９、ログ・ランク検定）。（Ｃ）３２８個の肺腫瘍組織におけるＷＨＳＣ１の陽性の割合。
【図１１】ＣＣＮＤ１遺伝子のプロモーター領域におけるＷＨＳＣ１ｗｔおよびＷＨＳＣ１［Δ］ＳＥＴに関するクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを示す。上のパネルは、ＣＣＮＤ１プロモーター領域の概略図を示す。ＰＣＲで増幅させた断片を、ＴＳＳに対するヌクレオチド番号に基づいて配置している（矢印）。中央のパネルは、ＷＨＳＣ１ｗｔタンパク質発現およびＷＨＳＣ１［Δ］ＳＥＴタンパク質発現の確認を示す。インプット試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫ブロットした。ＡＣＴＢ発現は内部対照であった。左下のパネルは、「実施例１」において説明するプライマー対を用いたリアルタイムＰＣＲ解析を示す。架橋および剪断されたクロマチンを抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）によって免疫沈降させた。結果は、インプットクロマチンに対する百分率として示している。右下のパネルは、リアルタイムＰＣＲを用いた、ＣＣＮＤ１プロモーター領域におけるＨ３Ｋ３６ｔｒｉＭｅ  ＣｈＩＰの定量を示す。架橋および剪断されたクロマチンを抗ｔｒｉＭｅＨ３Ｋ３６抗体（ａｂ９０５０、ａｂｃａｍ）によって免疫沈降させた。
【図１２】ｍｏｃｋベクター、ＷＨＳＣ１ｗｔベクター、およびＷＨＳＣ１［Δ］ＳＥＴベクターによるトランスフェクション後の２９３Ｔ細胞におけるＴＯＰＦＬＡＨ解析およびＦＯＰＦＬＡＳＨ解析を示す。ｍｏｃｋベクターを対照として使用した。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤである。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定を用いて算出した（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１）。
【図１３】ヒストンＨ３のリジン３６のトリメチル化を通した、ＷＨＳＣ１が媒介するβ−カテニン／ＴＣＦ−４依存性転写増大の提唱モデルを示す。
【図１４】膀胱癌細胞および肺癌細胞の増殖に対するβ−カテニンのノックダウン効果を示す。（Ａ）定量的リアルタイムＰＣＲによって解析した、ＨＣＴ１１６細胞、Ａ５４９細胞、ＳＢＣ５細胞、およびＳＷ７８０細胞におけるβ−カテニンの発現レベル。ｍＲＮＡ発現レベルは、ＧＡＰＤＨ発現およびＳＤＨ発現に基づいて正規化した。値はＨＣＴ１１６を基準としている（ＨＣＴ１１６＝１）。（Ｂ）Ａ５４９細胞において特異的ｓｉＲＮＡで処理した後のβ−カテニンの内因性発現の抑制を示す、定量的リアルタイムＰＣＲ。ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＮＣを対照として使用した。ｍＲＮＡ発現レベルは、ＧＡＰＤＨ発現およびＳＤＨ発現に基づいて正規化した。値はｓｉＥＧＦＰを基準としている（ｓｉＥＧＦＰ＝１）。（Ｃ）膀胱癌細胞株および肺癌細胞株の生存能に対する、β−カテニンノックダウンの影響。相対的細胞数は、ｓｉＥＧＦＰで処理した細胞に対して正規化した値を示す。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤである。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定を用いて算出した（＊、Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
態様の説明
本材料および本方法を説明する前に、本発明が、本明細書に記載された特定のサイズ、形、寸法、材料、方法論、プロトコル等に限定されず、これらがルーチンの実験法および最適化に従い変動し得ることを理解されたい。また、明細書中で使用される用語は、特定の形式または態様を記載するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されたい。
【００２０】
本明細書中で言及された各々の公開、特許、または特許出願の開示は、参照によりその全体が具体的に本明細書に組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなる記載も、先行発明のため、本発明がそのような開示に先行している資格を有しないことの承認として解釈されるべきではない。
【００２１】
他に規定のない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合には、定義を含む本明細書が優先される。
【００２２】
定義
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、本明細書で使用される場合、特に指定のない限り、「少なくとも１つの」を意味する。
【００２３】
物質（例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関して使用される「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、天然起源では通常含まれ得る物質を少なくとも１つ実質的に含まないことを示す。したがって、単離されたまたは精製された抗体とは、タンパク質（抗体）が由来する細胞もしくは組織起源に由来する、炭水化物、脂質、もしくはその他の混入タンパク質などの細胞物質を実質的に含まないか、または、化学合成された場合には、前駆化学物質もしくはその他の化学物質を実質的に含まない抗体をさす。「細胞物質を実質的に含まない」という用語には、ポリペプチドの単離元であるか、または組換えにより作製されたポリペプチドの元となる細胞の細胞成分からポリペプチドが分離されている、ポリペプチドの調製物が含まれる。したがって、細胞物質を実質的に含まないポリペプチドには、（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、または５％未満の異種タンパク質（本明細書中、「混入タンパク質」とも呼ばれる）を有するポリペプチドの調製物が含まれる。ポリペプチドが組換えにより作製される場合には、それは、好ましくは、培養培地も実質的に含まず、そのようなポリペプチドには、タンパク質調製物の容積の約２０％、１０％、または５％未満の培養培地を含むポリペプチド調製物が含まれる。ポリペプチドが化学合成によって作製される場合には、それは、好ましくは、前駆化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まず、そのようなポリペプチドには、タンパク質調製物の容積の（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％未満の、タンパク質の合成に関与する前駆化学物質またはその他の化学物質を含むポリペプチド調製物が含まれる。特定のタンパク質調製物が、単離または精製されたポリペプチドを含有していることは、例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色等の後の単一バンドの出現によって示され得る。好ましい態様において、本発明の抗体およびポリペプチドは、単離または精製されている。ｃＤＮＡ分子などの「単離された」または「精製された」核酸分子は、組換え技術によって作製された場合には、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まない可能性があり、または、化学合成された場合には、前駆化学物質もしくはその他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。好ましい態様において、本発明の抗体をコードする核酸分子は、単離または精製されている。
【００２４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーをさすために、同義的に本明細書中で使用される。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーのみならず、１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾された残基であるか、または対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的模倣体などの天然には存在しない残基である、アミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００２５】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸をさし、かつ、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体をさす。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされたもの、ならびに細胞内で翻訳後に修飾されたもの（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造（水素に結合したα炭素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をさす。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸と異なる構造を有するが、類似した機能を有する化学物質をさす。
【００２６】
アミノ酸は、本明細書中、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨された、それらの一般的に公知の３文字記号または１文字記号により言及される場合もある。
【００２７】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、特に具体的な指示がない限り同義的に使用され、ヌクレオチド残基のポリマーを意味する。これらの用語は、１つまたは複数のヌクレオチド残基が、改変残基、または対応する天然ヌクレオチドの人工の化学的模倣体のような非天然残基であるヌクレオチドポリマー、ならびに天然のヌクレオチドポリマーに適用される。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその組合せから構成されてよい。
【００２８】
「ヌクレオチド」という用語は、アミノ酸と同様に、天然および非天然のヌクレオチドを意味する。アミノ酸と同様に、ヌクレオチドは、一般に認められている１文字記号によって言及される。
【００２９】
他に規定されない限り、「がん」という用語は、ＷＨＳＣ１および／もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子、またはＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子のいずれか、または両方を過剰発現する任意のがんを意味する。ＷＨＳＣ１遺伝子を過剰発現するがんの例には、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、ＳＣＬＣ（ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、および軟部組織腫瘍が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を過剰発現するがんの例には、膀胱癌、乳癌、ＣＭＬ、リンパ腫、および肺癌（特にＳＣＬＣ）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３０】
阻害性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドという文脈における「特異的に阻害する」という用語は、剤またはリガンドがＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の発現または生物学的機能を阻害する能力を意味する。典型的には、特異的阻害は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の発現（例えば、転写もしくは翻訳）または測定される生物学的機能（例えば、細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）もしくは増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、アポトーシスの抑制）をバックグラウンドよりも少なくとも約２倍強く阻害し、好ましくは約１０倍強く、および最も好ましくは１００倍強く阻害する。発現レベルおよび生物学的機能のいずれかまたは両方は、処理細胞および未処理細胞、または処理前および処理後の細胞集団を比較する状況において、測定することができる。いくつかの態様において、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の発現または生物学的機能は、完全に阻害される。典型的には、特異的阻害とは、適切な統計学的試験による、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の発現または生物学的機能の統計学的に意味のある低減である（例えば、ｐ≦０．０５）。
【００３１】
ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の遺伝子およびタンパク質：
本発明は、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１をコードする遺伝子が、非がん組織と比べていくつかのがんにおいて過剰発現されているという発見に一部基づいている。
【００３２】
ＷＨＳＣ１（Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ−１）は、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群（ＷＨＳ）の同定された重要な領域中のいくつかの遺伝子のうちの１つによってコードされるタンパク質であり、公知である全ＷＨＳ症例において欠失しており、リンパ系多発性骨髄腫ではｔ（４；１４）転座によって調節不全にされている（Bergemann AD, et al. Trends Genet 21: 188-195, 2005, Stec I, et al. Hum Mol Genet 7: 1071-1082, 1998）。ＷＨＳＣ１タンパク質は、酵母Ｈ３Ｋ３６特異的メチルトランスフェラーゼＳｅｔ２に高度に保存されているＡＷＳ−ＳＥＴ−ＰｒｏＳＥＴドメインを含む（Sun XJ, et al. J Biol Chem 280: 35261-35271, 2005）。
【００３３】
ＷＨＳＣ１Ｌ１（Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  １−ｌｉｋｅ  １）は、ＷＨＳＣ１遺伝子に関連しており、ＰＷＷＰ（ｐｒｏｌｉｎｅ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｐｒｏｌｉｎｅ）ドメインを有するタンパク質をコードしている（Stec I, van Ommen GJ, den Dunnen JT. Genomics 2001;76:5-8）。ＷＨＳＣ１Ｌ１は染色体８ｐ１２中に位置しており、特に、機能的ドメインを含むタンパク質の３'領域において、ＷＨＳＣ１およびＮＳＤ１に対して強い配列類似性を示す（Stec I, van Ommen GJ, den Dunnen JT. Genomics 2001;76:5-8; Douglas J, Coleman K, Tatton-Brown K, et al. Eur J Hum Genet 2005;13:150-3）。
【００３４】
ＷＨＳＣ１の例示的なポリペプチド配列および核酸配列は、配列番号：２および１にそれぞれ示される。また、ＷＨＳＣ１Ｌ１の例示的なポリペプチド配列および核酸配列は、配列番号：４または５０、および配列番号：３または４９にそれぞれ示される。また、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の配列データは、次のＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号を通して入手可能である：
ＷＨＳＣ１：ＮＭ＿００１０４２４２４．２、ＮＭ＿００７３３１．１、ＮＭ＿１３３３３０．２、ＮＭ＿１３３３３１．２、ＮＭ＿１３３３３４．２、ＮＭ＿１３３３３５．３（これらの開示内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）、
ＷＨＳＣ１Ｌ１：ＮＭ＿０１７７７８．２、ＮＭ＿０２３０３４．１（これらの開示内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【００３５】
本発明のある局面によれば、機能的等価物もまた「ＷＨＳＣ１ポリペプチド」または「ＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチド」とみなされる。本明細書において、あるタンパク質（例えば、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチド）の「機能的等価物」は、そのタンパク質と同等の生物学的活性を有するポリペプチドである。すなわち、ＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の生物学的能力を保持している任意のポリペプチドが、本発明において、そのような機能的等価物として使用され得る。ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有していることが公知である。したがって、ＷＨＳＣ１タンパク質およびＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の機能的等価物は、好ましくは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を保持している。さらに、実施例において開示される結果から、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１が細胞増殖活性（細胞増殖を促進する活性）を有することが実証される。したがって、これらのタンパク質の機能的等価物は細胞増殖活性を保持している。さらに、ＷＨＳＣ１タンパク質の機能的等価物は、ＩＱＧＡＰ１、ＴＩＡＭ１、ＡＫＴ２、またはβ−カテニンに対する結合活性も保持し得る。好ましい態様において、ＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の機能的等価物は、ＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＣ１Ｌ１タンパク質の前述の生物学的活性のうちの１つまたは複数を保持している。
【００３６】
例えば、ＷＨＳＣ１タンパク質の機能的等価物の好ましい例には、ＷＨＳＣ１タンパク質のＳＥＴドメイン（例えば、配列番号：２の１０６６〜１１７９）を含むポリペプチドが含まれる。また、ＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の機能的等価物の好ましい例には、ＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質のＳＥＴドメイン（例えば、配列番号：５０の１１４８〜１２６１）を含むポリペプチドが含まれる。
【００３７】
ＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の機能的等価物には、ＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列と比べて、１つまたは複数のアミノ酸が置換されているか、欠失しているか、付加されているか、または挿入されているものが含まれる。あるいは、このポリペプチドは、それぞれのタンパク質の配列に対して少なくとも約８０％の相同性（配列同一性とも呼ばれる）、より好ましくは少なくとも約９０％〜９５％の相同性、多くの場合、約９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。他の態様において、このポリペプチドは、ＷＨＳＣ１遺伝子またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の天然に存在するヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされていてもよい。
【００３８】
本発明のポリペプチドは、それを作製するために使用された細胞もしくは宿主、または利用された精製法に依って、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態における変動を有することができる。にもかかわらず、本発明のヒトＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質のものと同等な機能を有する限り、それは本発明の範囲内である。
【００３９】
「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、核酸分子が、その標的配列、典型的には核酸の複雑な混合物中にある標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とは検出可能にハイブリダイズしない条件をさす。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範囲のガイドは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択される。Ｔｍとは、平衡状態で、標的に相補的なプローブの５０％が、標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ、核濃度での）温度である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡時に、プローブの５０％が占有される）。ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によっても、ストリンジェントな条件を達成することができる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションのため、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、以下のものが含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーションと、５０℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳによる洗浄。
【００４０】
本発明との関連において、ヒトＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件を、当業者はルーチンに選択することができる。例えば、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ  ｂｕｆｆｅｒ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を使用して、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを実施し、標識されたプローブを添加し、６８℃で１時間以上加熱することにより、ハイブリダイゼーションを実施することができる。例えば、低ストリンジェントな条件においては、以下の洗浄工程を実施することができる。例示的な低ストリンジェントな条件には、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが含まれ得る。多くの場合、高ストリンジェンシー条件が好んで使用される。例示的な高ストリンジェンシー条件には、２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳで２０分間、室温での３回の洗浄、次いで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０分間、３７℃での３回の洗浄、および１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０分間、５０℃での２回の洗浄が含まれ得る。しかしながら、温度および塩濃度などのいくつかの因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす場合があり、当業者は、必要なストリンジェンシーを達成するために適切に因子を選択することができる。
【００４１】
一般的に、タンパク質内の１つまたは複数のアミノ酸の改変は、そのタンパク質の機能に影響を与えないことが知られている。実際、ある特定のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質である、変異したまたは改変されたタンパク質は、元の生物学的活性を保持することが公知である（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984);Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982); Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。したがって、単一のアミノ酸もしくは少ない比率のアミノ酸を変える、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、および置換からなる群より選択される少なくとも１つの変異もしくは変化、または「保存的改変」であるとみなされるものであって、タンパク質の変化が類似の機能を有するタンパク質をもたらすものは、本発明との関連において許容可能であることを、当業者は認識するであろう。
【００４２】
タンパク質の活性が維持される限り、アミノ酸変異の数は特に限定されない。しかしながら、アミノ酸配列の５％以下を変えることが一般的に好ましい。したがって、好ましい一態様において、そのような変異体において変異させるべきアミノ酸の数は、一般的には、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１０アミノ酸以下、より好ましくは６アミノ酸以下、さらに好ましくは３アミノ酸以下である。
【００４３】
変異させられるアミノ酸残基は、好ましくは、アミノ酸側鎖の特性が保存される異なるアミノ酸に変異させられる（保存的アミノ酸置換として公知のプロセス）。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および以下の官能基または特徴を共通に有する側鎖である：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基を含有している側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子を含有している側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミドを含有している側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基を含有している側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族を含有している側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野で周知である。例えば、以下の８つの群は、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有している：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
【００４４】
そのような保存的に改変されたポリペプチドは、本発明に使用されるＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質に含まれる。しかしながら、本発明は、これらに限定されず、ＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質は、ＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の生物学的活性が少なくとも１つ保持される限り、非保存的改変を含む。さらに、改変されたタンパク質は、多型バリアント、種間相同体、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされるものを除外しない。
【００４５】
さらに、本発明のＷＨＳＣ１遺伝子またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子には、それぞれＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質のそのような機能的等価物をコードするポリヌクレオチドが包含される。ＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するためには、ハイブリダイゼーションに加えて、タンパク質をコードするＤＮＡの配列情報（配列番号：１または３または４９）に基づき合成されたプライマーを使用した、遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができる。ヒトＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の遺伝子およびタンパク質と機能的に等価なポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、それぞれ、通常、それらの元のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。「高い相同性」とは、典型的には４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％〜９５％以上の相同性をさす。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」のアルゴリズムに従い、決定され得る。
【００４６】
がんを診断するための方法：
本明細書において開示するように、ＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルは、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、および軟部組織腫瘍を含むいくつかのがんにおいて特異的に上昇していることが判明した（図１、２、３、表５）。さらに、ＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルもまた、膀胱癌、ＣＭＬ、肺癌（例えばＳＣＬＣ）、乳癌、およびリンパ腫を含むいくつかのがんにおいて特異的に上昇していることが判明した（図１、表５）。
【００４７】
したがって、本明細書において同定されるＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子、ならびにそれらの転写産物および翻訳産物は、上記のがんのようながんのマーカーとして診断に有用である。対象におけるがんの診断または検出は、対象由来の試料におけるＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを決定し、かつそのような発現レベルを正常試料中で検出される発現レベルと比較することによって行うことができる。好ましい態様において、診断または検出されるがんには、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ（例えば、肺腺癌、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ））、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、およびリンパ腫が含まれる。
【００４８】
あるいは、本発明は、対象由来の組織試料におけるがん細胞を検出または同定するための方法を提供し、該方法は、遺伝子の正常対照レベルと比較した発現レベルの増加が、該組織におけるがん細胞の存在または疑いを示す、対象由来の生物学的試料（すなわち、対象から得た試料）におけるＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む。
【００４９】
本発明によれば、対象の状態を検査するための中間的な結果が提供され得る。このような中間結果を追加的な情報と組み合わせて、対象が疾患に罹患しているかを医師、看護師、または他の実務者が診断するのを援助することができる。あるいは、本発明を用いて、対象由来の組織におけるがん細胞を検出し、対象が疾患に罹患しているかを診断するのに有用な情報を医師に提供することもできる。
【００５０】
例えば、本発明によれば、対象から得られた組織におけるがん細胞の存在に関して疑いがある場合、ＷＨＳＣ１遺伝子および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルに加えて、組織病変、血液中の公知の腫瘍マーカーのレベル、および対象の臨床経過などを含む疾患の異なる側面を考察することにより、臨床的判断に至ることができる。例えば、血液中のいくつかの周知の診断用がんマーカーには、ＡＣＴ、ＡＦＰ、ＢＣＡ２２５、ＢＦＰ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＣＡ１２５、ＣＡ１３０、ＣＡ６０２、ＣＥＡ、ＤＵＰＡＮ−２、ＩＡＰ、ＫＭＯ−１、α−マクログロブリン、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＮＳＥ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＳＣＣ、ｓＩＣＡＭ−１、ＳＬＸ、ＳＰ１、ＳＯＤ、Ｓｐａｎ−１、ＳＴＮ、ＴＫ活性、ＴＰＡ、ＹＨ−２０６、エラスターゼＩ、サイトケラチン−１９断片、およびＣＹＦＲＡ２１−１が含まれる。すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現解析の結果は、対象の疾患病期をさらに診断するための中間的な結果として役立つ。
【００５１】
具体的には、本発明は以下の方法［１］〜［１０］を提供する：
［１］対象由来の生物学的試料におけるＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルおよび／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、対象においてがんを検出または診断する方法であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該発現レベルの増加が、該対象ががんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有することを示す、前記方法；
［２］試料中のＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、対象由来の生物学的試料におけるがん細胞を検出する方法であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該発現レベルの増加が、試料中のがん細胞の存在または疑いを示す、前記方法；
［３］前記発現レベルが正常対照レベルより少なくとも１０％高い、［１］または［２］に記載の方法；
［４］前記発現レベルが、以下の中より選択される方法によって検出される、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法：
（ａ）ＷＨＳＣ１のｍＲＮＡおよび／またはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡを検出する方法；
（ｂ）ＷＨＳＣ１遺伝子にコードされるタンパク質および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるタンパク質を検出する方法；ならびに
（ｃ）ＷＨＳＣ１遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性を検出する方法；
［５］がんが、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、またはリンパ腫である、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の方法；
［６］前記発現レベルが、ｍＲＮＡを対象とするプローブとそのｍＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションレベルを検出することによって決定される、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の方法；
［７］前記発現レベルが、タンパク質に対する抗体とそのタンパク質との間の結合レベルを検出することによって決定される、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の方法；
［８］生物学的試料が生検試料もしくは生検標本、尿、痰、または血液を含む、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法；
［９］対象由来の生物学的試料が、上皮細胞を含む、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の方法；
［１０］対象由来の生物学的試料が、がん細胞を含む、［１］〜［９］のいずれか１つに記載の方法；
［１１］対象由来の生物学的試料が、がん上皮細胞を含む、［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の方法；ならびに
［１２］対象由来の生物学的試料が、膀胱、乳房、胆管、骨髄、食道、肝臓、肺、骨、膵臓、前立腺、腎臓、軟部組織、またはリンパ節に由来する細胞を含む、［１］〜［１１］のいずれか１つに記載の方法。
【００５２】
別の態様において、［１］対象由来の生物学的試料におけるＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルもしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルのいずれかまたは両方を決定する段階を含む、対象においてがんを検出または診断する方法であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該発現レベルの増加が、対象ががんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有することを示す、前記方法が提供される。
【００５３】
さらに、別の態様において、［２］試料中のＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルのいずれかまたは両方を決定する段階を含む、対象由来の生物学的試料におけるがん細胞を検出する方法であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該発現レベルの増加が、試料中のがん細胞の存在または疑いを示す、前記方法もまた提供される。
【００５４】
あるいは、別の態様において、［３］前記発現レベルが、以下の中より選択される方法によって検出される、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法もまた、提供される：
（ａ）ＷＨＳＣ１のｍＲＮＡまたはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡのいずれかまたは両方を検出する方法；
（ｂ）ＷＨＳＣ１遺伝子のいずれかにコードされるタンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるタンパク質または両方を検出する方法；および
（ｃ）ＷＨＳＣ１遺伝子のいずれかにコードされるタンパク質の生物学的活性またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性または両方を検出する方法。
【００５５】
がんを診断するまたはがん細胞を検出する方法を、以下に、より詳細に説明する。
【００５６】
本方法によって診断される、または生物学的試料の入手元である対象は、好ましくは、哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
診断を実施するためには、診断すべき対象から生物学的試料を収集することが好ましい。ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１の転写産物または翻訳産物を含む限り、任意の生物学的材料を、がんの診断またはがん細胞の検出のための生物学的試料として使用することができる。生物学的試料には、生検標本または試料などの、がんを診断することが望まれるかまたはがんに罹患していることが疑われる体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、生物学的試料は、上皮細胞、より好ましくは、がん性上皮細胞、またはがん性であることが疑われる組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含有している。さらに、必要であれば、得られた体組織および体液から細胞集団を精製し、次いで、それを生物学的試料として使用してもよい。
【００５８】
好ましい態様において、診断すべきがんには、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、およびリンパ腫が含まれるが、それらに限定されるわけではない。また、検出されるがん細胞には、膀胱癌細胞、乳癌細胞、胆管細胞癌細胞、ＣＭＬ細胞、食道癌細胞、ＨＣＣ細胞、ＮＳＣＬＣ細胞、ＳＣＬＣ細胞、骨肉腫細胞、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍細胞、およびリンパ腫細胞が含まれるが、それらに限定されるわけではない。このようながんを診断するためまたはこのようながん細胞を検出するために、対象から採取された以下の器官に由来する生物学的試料が、生物学的試料として使用され得る：
膀胱癌の場合は膀胱；
乳癌の場合は乳房；
胆管細胞癌の場合は胆管；
ＣＭＬの場合はリンパ球、リンパ球を含む血液試料、骨髄；
食道癌の場合は食道；
ＨＣＣの場合は肝臓；
ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣの場合は肺；
骨肉腫の場合は骨；
膵癌の場合は膵臓；
前立腺癌の場合は前立腺；
腎細胞癌の場合は腎臓；
軟部組織腫瘍の場合は軟部組織；ならびに
リンパ腫の場合はリンパ球またはリンパ節。
【００５９】
好ましくは、生物学的試料は、前述の器官においてがん性であると疑われる部位から採取され得る。したがって、膀胱、乳房、胆管、リンパ球、骨髄、食道、肝臓、肺、骨、膵臓、前立腺、腎臓、軟部組織、リンパ球、またはリンパ節から採取された生検組織または外科的に切除された組織が、本発明の生物学的試料として好ましい。
【００６０】
本発明によると、対象由来の生物学的試料におけるＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルが決定される。当技術分野で公知の方法を使用して、転写（核酸）産物レベルで、発現レベルを決定することができる。例えば、ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを使用して定量することができる。検出は、チップ上またはアレイ上で実施されてもよい。アレイの使用は、ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１を含む複数の遺伝子（例えば、様々ながんに特異的な遺伝子）の発現レベルを検出するために好ましい。当業者は、ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のｃＤＮＡをプローブとして使用することができる。必要であれば、色素、蛍光、および同位体などの好適な標識によりプローブを標識し、ハイブリダイズした標識の強度として、遺伝子の発現レベルを検出してもよい。
【００６１】
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）により、プライマーを使用して、ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１の転写産物を定量することもできる。そのようなプライマーも、利用可能な遺伝子の配列情報に基づき調製され得る。例えば、実施例で使用されるプライマー（ＷＨＳＣ１の場合は配列番号：９および１０、または１１および１２、ならびにＷＨＳＣ１Ｌ１の場合は配列番号：１３および１４、または１５および１６）が、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットによる検出のために利用され得るが、本発明はそれらに限定されない。
【００６２】
特に、本発明の方法のために使用されるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、または低ストリンジェントな条件の下で、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーが、その標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件をさす。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的なハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高い温度で観察される。一般的に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。Ｔｍとは、平衡時に、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。概して標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡時に、プローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（またはその他の塩）であり、温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合には少なくとも約３０℃であり、より長いプローブまたはプライマーの場合には少なくとも約６０℃であるものである。ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によっても、ストリンジェントな条件を達成することができる。
【００６３】
あるいは、本発明の診断のために、翻訳産物を検出することもできる。例えば、ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の量を決定することができる。翻訳産物として該タンパク質の量を決定する方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体はモノクローナルであってもよいしまたはポリクローナルであってもよい。さらに、断片がＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質に対する結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を、検出のために使用することができる。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野で周知であり、本発明においては、そのような抗体およびそれらの等価物を調製するために、任意の方法を利用することができる。
【００６４】
翻訳産物に基づきＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質に対する抗体を使用した免疫組織化学分析を介して染色の強度を観察することができる。すなわち、強い染色の観察は、タンパク質の増加した存在を示し、同時に、この遺伝子の高い発現レベルを示す。
【００６５】
さらに、診断の正確性を改善するために、ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルに加えて、他のがん関連遺伝子、例えば、がんにおいて異なって発現されることが公知の遺伝子の発現レベルも決定することができる。
【００６６】
生物学的試料におけるＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を含むがんマーカー遺伝子の発現レベルは、対応するがんマーカー遺伝子の対照レベルから、例えば、１０％、２５％、もしくは５０％増加している場合；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上に増加している場合、増加していると見なされ得る。
【００６７】
疾患状態（がん性であるか非がん性であるか）が既知である対象から以前に収集され保管されていた試料を使用することによって、試験生物学的試料と同時に対照レベルを決定することができる。あるいは、疾患状態が既知である対象由来の試料において、以前に決定されたＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを分析することによって得られた結果に基づき、統計的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞からの発現パターンのデータベースであってもよい。さらに、本発明の一局面によると、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと、生物学的試料におけるＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを比較してもよい。患者由来の生物学的試料のものと類似した組織型に由来する参照試料から決定された対照レベルを使用することが好ましい。さらに、疾患状態が既知である集団におけるＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルの標準値を使用することが好ましい。標準値は、当技術分野で公知の任意の方法によって入手され得る。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を、標準値として使用することができる。
【００６８】
本発明の文脈において、がん性ではないことが既知の生物学的試料から決定された対照レベルは、「正常対照レベル」と呼ばれる。他方、対照レベルががん性生物学的試料から決定される場合、それは「がん性対照レベル」と呼ばれる。
【００６９】
ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して増加しているか、またはがん性対照レベルと類似している場合、対象は、がんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有すると診断され得る。さらに、複数のがん関連遺伝子の発現レベルが比較される場合、試料とがん性である参照との間の遺伝子発現パターンの類似性は、対象が、がんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有することを示す。
【００７０】
試験生物学的試料の発現レベルと対照レベルとの間の差は、細胞のがん性状態または非がん性状態によって発現レベルが異ならないことが既知の対照核酸、例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して標準化され得る。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
別の局面において、本発明は、対象由来の生物学的試料におけるＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルおよび／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、がんに罹患していると疑われる対象を特定する方法であって、
該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増加が、対象ががんに罹患していることを示し、
該発現レベルが、以下からなる群より選択される方法によって決定される、前記方法を提供する：
（ａ）ＷＨＳＣ１のｍＲＮＡまたはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡを検出する方法；
（ｂ）ＷＨＳＣ１遺伝子にコードされるタンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるタンパク質を検出する方法；および
（ｃ）ＷＨＳＣ１遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性を検出する方法。
【００７２】
別の局面において、本発明は、生物学的試料におけるＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルおよび／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、がん細胞を含むと疑われる、対象由来の生物学的試料を特定する方法であって、
該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増加が、生物学的試料ががん細胞を含むと疑われることを示し、
該発現レベルが、以下からなる群より選択される方法によって決定される、前記方法を提供する：
（ａ）ＷＨＳＣ１のｍＲＮＡまたはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡを検出する方法；
（ｂ）ＷＨＳＣ１遺伝子にコードされるタンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるタンパク質を検出する方法；および
（ｃ）ＷＨＳＣ１遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性を検出する方法。
【００７３】
ＷＨＳＣ１遺伝子またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルの決定は、前述した方法によって行うことができる。候補対象または疑わしい生物学的試料を特定した後、例えば、他の腫瘍マーカー、画像処理解析、病理学的観察などによって、このような候補対象または試料をさらに検査することができる。
【００７４】
がんを診断するためのキット：
本発明は、がんを診断するためのキットを提供する。好ましくは、がんは、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、およびリンパ腫である。具体的には、キットは、対象由来の生物学的試料におけるＷＨＳＣ１遺伝子および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを検出するための少なくとも１種の試薬を含み、この試薬は、以下からなる群より選択され得る：
（ａ）ＷＨＳＣ１遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＷＨＳＣ１遺伝子にコードされるタンパク質および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるタンパク質を検出するための試薬；ならびに
（ｃ）ＷＨＳＣ１遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【００７５】
あるいは、キットは、対象由来の生物学的試料におけるＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルまたはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルのいずれかまたは両方を検出するための少なくとも１種の試薬を含み、この試薬は、以下からなる群より選択され得る：
（ａ）ＷＨＳＣ１遺伝子のｍＲＮＡまたはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子のｍＲＮＡのいずれかまたは両方を検出するための試薬；
（ｂ）ＷＨＳＣ１遺伝子にコードされるタンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるタンパク質のいずれかまたは両方を検出するための試薬；および
（ｃ）ＷＨＳＣ１遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性のいずれかまたは両方を検出するための試薬。
【００７６】
ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬には、ＷＨＳＣ１  ｍＲＮＡまたはＷＨＳＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡに特異的に結合するか、またはそれを特定する核酸、例えば、ＷＨＳＣ１  ｍＲＮＡまたはＷＨＳＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡの一部分に対する相補的配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドの例は、ＷＨＳＣ１  ｍＲＮＡまたはＷＨＳＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブである。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要であれば、ＷＨＳＣ１  ｍＲＮＡまたはＷＨＳＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体マトリックス上に固定することができる。さらに、ＷＨＳＣ１  ｍＲＮＡまたはＷＨＳＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡを検出するための複数の試薬をキットに含めることもできる。
【００７７】
本発明のプローブまたはプライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。典型的には、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約２０００個、１０００個、５００個、４００個、３５０個、３００個、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、または２５個の、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１配列を含む核酸の連続したセンス鎖ヌクレオチド配列、またはＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１配列を含む核酸のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列、またはこれらの配列の天然の変異体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。特に、例えば、好ましい態様において、長さが５〜５０個のオリゴヌクレオチドが、検出すべき遺伝子を増幅するためのプライマーとして使用され得る。より好ましくは、長さが１５〜３０ｂのオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを検出することができる。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーの長さは、１５〜２５個より選択され得る。このようなオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを用いて遺伝子を検出するためのアッセイ手順、装置、または試薬は周知である（例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはＰＣＲ）。これらのアッセイにおいて、プローブまたはプライマーはまた、タグ配列またはリンカー配列も含んでよい。さらに、プローブまたはプライマーは、検出可能な標識または捕捉するための親和性リガンドで修飾されてもよい。あるいは、ハイブリダイゼーションに基づいた検出手順において、長さが数百個（例えば、約１００〜２００個）の塩基〜数千個（例えば、約１０００〜２０００個）の塩基であるポリヌクレオチドもまた、プローブ用に使用され得る（例えば、ノーザンブロットアッセイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ解析）。いくつかの態様において、プローブまたはプライマーのヌクレオチド配列は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の各転写物に特異的な領域より選択され得る。あるいは、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の両方の転写物を認識するプローブまたはプライマーもまた、両方の転写物を検出するのに適している。
【００７８】
本発明において、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１は有用な診断マーカーであるだけでなく、がん治療に適した標的でもあることが明らかにされている。したがって、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１を標的とするがん治療が、本発明によって実現され得る。本発明において、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１を標的とするがん治療とは、がん細胞における、ＷＨＳＣ１の活性および発現のいずれかもしくは両方、またはＷＨＳＣ１Ｌ１の活性および発現のいずれかもしくは両方の抑制または阻害を意味する。任意の抗ＷＨＳＣ１剤または抗ＷＨＳＣ１Ｌ１剤が、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１を標的とするがん治療のために使用され得る。本発明において、抗ＷＨＳＣ１剤または抗ＷＨＳＣ１Ｌ１剤には、活性成分として以下の物質が含まれる：
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）前記二本鎖分子をコードするＤＮＡ、または
（ｃ）前記二本鎖分子をコードするベクター。
【００７９】
さらなる好適な試薬は、ＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質を検出するための試薬でありうる。そのような試薬には、ＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質に対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナルであってもよいしまたはポリクローナルであってもよい。さらに、断片がＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質に対する結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を、試薬として使用することができる。前記タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野で周知であり、本発明においては、そのような抗体およびそれらの等価物を調製するために、任意の方法を利用することができる。さらに、直接結合または間接標識技術を介して、シグナル生成分子によって抗体を標識してもよい。標識、および抗体を標識して抗体とその標的との結合を検出する方法は、当技術分野で周知であり、任意の標識および方法を本発明のために利用することができる。さらに、ＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質を検出するための複数の試薬が、キットに含まれていてもよい。
【００８０】
さらに、生物学的試料において、例えば、発現されたＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質による細胞増殖活性を測定することによって、生物学的活性を決定してもよい。例えば、細胞を、対象由来の生物学的試料の存在下で培養し、次いで、増殖のスピードを検出するか、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することによって、生物学的試料の細胞増殖活性を決定することができる。さらに、ＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の生物学的活性を検出するための複数の試薬が、キットに含まれていてもよい。
【００８１】
キットは、前記試薬を複数含有していてもよい。さらに、キットは、ＷＨＳＣ１遺伝子またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を対象とするプローブまたはタンパク質に対する抗体を結合させるための固体マトリックスおよび試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性の対照試薬、ならびにＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含んでいてもよい。例えば、がんに罹患している対象またはがんに罹患していない対照対象から入手された組織試料が、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用のための説明を含む添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の材料をさらに含んでいてもよい。これらの試薬等は、ラベルを有する容器に入っていてもよい。好適な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラス、またはプラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。
【００８２】
本発明の一態様として、試薬がＷＨＳＣ１のｍＲＮＡまたはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡに対するプローブである場合、少なくとも１つの検出部位が形成されるよう、該試薬を多孔質ストリップなどの固体マトリックスの上に固定化することができる。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、核酸（プローブ）を各々が含有している複数の部位を含んでいてもよい。テストストリップは、陰性対照および／または陽性対照のための部位も含有していてもよい。あるいは、対照部位は、テストストリップから分離されたストリップの上に位置していてもよい。任意で、異なる検出部位は、固定化された核酸を、異なる量、含有していてもよい。すなわち、第１の検出部位に、より高い量を含有し、その後の部位に、より少ない量を含有していてもよい。試験試料の添加時、検出可能シグナルを示す部位の数が、試料中に存在するＷＨＳＣ１のｍＲＮＡまたはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡの量の定量的な指標を提供する。検出部位は、任意の適切に検出可能な形で配置され得、典型的には、テストストリップ幅にわたるバーまたはドットの形である。
【００８３】
本発明のキットは、陽性対照試料またはＷＨＳＣ１標準試料および／もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１標準試料をさらに含んでよい。本発明の陽性対照試料は、ＷＨＳＣ１陽性試料および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１陽性試料を採取し、次いで、ＷＨＳＣ１レベルおよび／またはＷＨＳＣ１Ｌ１レベルを分析することによって調製することができる。１つの態様において、ＷＨＳＣ１陽性組織試料またはＷＨＳＣ１Ｌ１陽性組織試料は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１を発現するがん細胞から構成され得る。このようながんには、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、またはリンパ腫が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００８４】
陽性対照試料のＷＨＳＣ１レベルおよび／またはＷＨＳＣ１Ｌ１レベルは、例えば、カットオフ値より高くてよい。例えば、陽性対照試料は、カットオフ値を決定し、かつカットオフ値より多い量のＷＨＳＣ１  ｍＲＮＡもしくはＷＨＳＣ１タンパク質、および／またはカットオフ値より多い量のＷＨＳＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡもしくはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質を含む試料を調製することによって、調製することができる。本明細書において、「カットオフ値」という語句は、正常範囲とがん性範囲を区分する値を意味する。例えば、当業者は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いてカットオフ値を決定することができる。
【００８５】
あるいは、本発明のキットは、カットオフ値の量のＷＨＳＣ１  ｍＲＮＡもしくはＷＨＳＣ１タンパク質を含むＷＨＳＣ１標準試料、および／またはカットオフ値の量のＷＨＳＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡもしくはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質を含むＷＨＳＣ１Ｌ１標準試料を含んでもよい。
【００８６】
あるいは、本発明のキットは、陰性対照試料を含む。陰性対照試料は、非がん細胞株もしくは非がん組織から調製することができ、またはカットオフ値より少ないＷＨＳＣ１  ｍＲＮＡもしくはＷＨＳＣ１タンパク質、および／またはカットオフ値より少ないＷＨＳＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡもしくはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質を含む試料を調製することによって、調製することができる。
【００８７】
別の局面において、本発明は、がんの診断において使用するための、ＷＨＳＣ１  ｍＲＮＡもしくはＷＨＳＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡを対象とするプローブもしくはプライマーセット、またはＷＨＳＣ１タンパク質もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質に対する抗体を提供する。
【００８８】
別の局面において、本発明は、ＷＨＳＣ１  ｍＲＮＡもしくはＷＨＳＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡを対象とするプローブもしくはプライマーセット、またはＷＨＳＣ１タンパク質もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質に対する抗体を含む、対象においてがんを診断するための試薬を提供する。
【００８９】
別の局面において、本発明は、がんの診断用の試薬を製造するための、ＷＨＳＣ１  ｍＲＮＡもしくはＷＨＳＣ１Ｌ１  ｍＲＮＡを対象とするプローブもしくはプライマーセット、またはＷＨＳＣ１タンパク質もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質に対する抗体の使用を提供する。
【００９０】
抗がん物質のスクリーニング：
本発明との関連において、本スクリーニング方法により同定される物質は、任意の化合物、またはいくつかの化合物を含む組成物でありうる。さらに、本発明のスクリーニング方法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験物質は、単一の化合物であっても、または化合物の組み合わせであってもよい。化合物の組み合わせを前記方法において使用する場合には、化合物を逐次的に接触させてもよいし、または同時に接触させてもよい。
【００９１】
任意の試験物質、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製されたタンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド物質、合成微小分子物質（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマー等などの核酸構築物を含む）、および天然物質を、本発明のスクリーニング方法において使用することができる。本発明の試験物質は、（１）生物学的ライブラリ、（２）空間的にアドレス可能なパラレルな固相または液相のライブラリ、（３）デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、および（５）アフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリ法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリ法の多数のアプローチのいずれかを使用して入手され得る。アフィニティークロマトグラフィー選択を使用する生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリに適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67）。分子ライブラリの合成法の例は、当技術分野で見い出され得る（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13;Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6;Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994;Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5;Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059; Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061;Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51）。化合物のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照されたい）、またはビーズ上（Lam, Nature 1991, 354: 82-4）、チップ上（Fodor, Nature 1993, 364: 555-6）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（米国特許第５，５７１，６９８号；第５，４０３，４８４号、および第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9）、もしくはファージ上（Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90;Devlin, Science 1990, 249: 404-6;Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82; Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10；米国特許出願第２００２１０３３６０号）に提示され得る。
【００９２】
その構造の一部が、付加、欠失、および／または置換により変換された物質は、本発明のスクリーニング方法によって入手される物質に含まれる。
【００９３】
さらに、スクリーニングされた試験物質がタンパク質である場合、タンパク質をコードするＤＮＡを入手するためには、タンパク質の全アミノ酸配列を決定して、タンパク質をコードする核酸配列を推定することもできるし、または入手されたタンパク質の部分アミノ酸配列を分析して、その配列に基づきオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、そのプローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを入手することもできる。入手されたＤＮＡは、がんを治療または予防するための候補である試験物質の調製における有用性に関して確認される。
【００９４】
本明細書に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験物質は、ＷＨＳＣ１タンパク質もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質に特異的に結合する抗体であってもよく、またはインビボで元のタンパク質の生物学的活性を欠く、ＷＨＳＣ１タンパク質もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の部分ペプチドに特異的に結合する抗体であってもよい。
【００９５】
本明細書において、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルおよび生物学的活性のいずれかまたは両方を抑制することにより、がん細胞の増殖が抑制されることが明らかにされる。したがって、ある物質がＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の発現および活性のいずれかまたは両方を抑制する場合、そのような抑制は、対象における潜在的治療効果を示している。本発明との関連において、潜在的治療効果とは、合理的な見込みのある臨床的な利点を意味する。このような臨床的な利点の例には、以下のものが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
（ａ）ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現減少、
（ｂ）対象におけるがんの大きさ、蔓延、もしくは転移能の低減、
（ｃ）がん形成の予防、または
（ｄ）がんの臨床症状の予防もしくは緩和。
【００９６】
試験物質ライブラリの構築は当技術分野で周知であるが、本スクリーニング方法のための試験物質の同定およびそのような物質のライブラリの構築におけるさらなる指針を以下に提供する。
【００９７】
（ｉ）分子モデリング：
試験物質ライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知の化合物の分子構造、および／またはＷＨＳＣ１タンパク質またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の分子構造の知識により容易になる。さらなる評価のために好適な試験物質を予備スクリーニングするための１つのアプローチは、試験物質とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングである。
【００９８】
コンピュータモデリング技術により、選択された分子の三次元原子構造の可視化、およびその分子と相互作用する新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元構築物は、典型的には、選択された分子のＸ線結晶学的分析またはＮＭＲイメージングからのデータに依存する。分子動力学は力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測可能にし、結合特異性を完全にするための化合物および標的分子の構造の実験的操作を可能にする。一方または両方に軽微な変化が加えられた場合に、分子−化合物相互作用がどのようになるかを予測するには、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型コンピュータが必要とされ、それらは、通常、分子設計プログラムと使用者との間のユーザーフレンドリーなメニュー方式のインターフェースと連結される。
【００９９】
上記に概説された分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭｍプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓが含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子動力学の機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、相互作用的構築、改変、可視化、および分子の互いの挙動の分析を可能にする。
【０１００】
Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66;Ripka, New Scientist 1988, 54-8;McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22;Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93;Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62；および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90など、多数の論文が特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングを検討している。
【０１０１】
化学物質をスクリーニングし図示するその他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.(Pasadena,Calif.)、Allelix, Inc.(Mississauga,Ontario,Canada)、およびHypercube, Inc.(Cambridge,Ontario)などの会社から入手可能である。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9; Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24; Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78; Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
【０１０２】
推定上の阻害剤が同定されたならば、以下に詳述されるように、同定された推定上の阻害剤の化学構造に基づき、任意の数のバリアントを構築するため、コンビナトリアルケミストリー技術を利用することができる。その結果得られた推定上の阻害剤または「試験物質」のライブラリは、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、およびリンパ腫などのがんの治療または予防のための候補物質を同定するため、本発明の方法を使用してスクリーニングされ得る。
【０１０３】
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成：
試験物質のコンビナトリアルライブラリは、既知の阻害剤に存在しているコア構造の知識を含む、合理的薬物設計プログラムの一部として作製され得る。このアプローチにより、ハイスループットスクリーニングを容易にする適度のサイズにライブラリを維持することが可能になる。あるいは、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を簡便に合成することにより、単純な、特に短い、重合体分子ライブラリを構築することもできる。この後者のアプローチの一例は、６アミノ酸長の全ペプチドのライブラリである。そのようなペプチドライブラリは、６アミノ酸配列のあらゆる順列を含み得る。この種類のライブラリは、線形コンビナトリアルケミカルライブラリと称される。
【０１０４】
コンビナトリアルケミカルライブラリの調製は、当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれかにより作製され得る。コンビナトリアルケミカルライブラリには、ペプチドライブラリ（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号；Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93;Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。化学的多様性ライブラリを作製するためのその他の化学を使用することもできる。そのような化学には、ペプチド（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えば、ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒｓ）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13）、ビニロガス（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、低分子化合物ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、オリゴカルバメート（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement;Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照されたい）、炭水化物ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22；米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン、Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号等を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
コンビナトリアルライブラリの調製のための装置は市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，  Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｒａｉｎｉｎ，  Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）、４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）、９０５０  Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）を参照されたい）。さらに、コンビナトリアルライブラリ自体も多数市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．、Ｔｒｉｐｏｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ、３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｅｘｔｏｎ，  ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，  ＭＤ等を参照されたい）。
【０１０６】
（ｉｉｉ）その他の候補：
別のアプローチは、ライブラリを作製するために組換えバクテリオファージを使用する。「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90;Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82;Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を使用すれば、極めて大きいライブラリを構築することができる（例えば、１０６〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用し、Ｇｅｙｓｅｎの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15;Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74）；およびＦｏｄｏｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，  ２５１：  ７６７−７３）がその例である。Ｆｕｒｋａら（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（米国特許第４，６３１，２１１号）、およびＲｕｔｔｅｒら（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験され得るペプチドの混合物を作製する方法を記載している。
【０１０７】
アプタマーは、特定の分子標的に強固に結合する核酸から構成された巨大分子である。ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（Science. 249:505-510 (1990)）は、アプタマーの選択のためのＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を開示している。ＳＥＬＥＸ法においては、核酸分子の大きなライブラリ（例えば、１０１５個の異なる分子）をスクリーニングに使用することができる。
【０１０８】
（１）ポリペプチドに基づいたスクリーニング：
本発明は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドを用いてがんの治療および／または予防に応用可能な候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１０９】
本発明のスクリーニング方法との関連において、使用すべきＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドは、例えば、精製されたポリペプチド、可溶性タンパク質、担体に結合された形態、または他のポリペプチドと融合された融合タンパク質でよい。さらに、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドは、組換えポリペプチド、自然界に由来するタンパク質またはその部分ペプチドでよい。
【０１１０】
改変ペプチドが元のポリペプチドの少なくとも１種の生物学的活性を保持している限りにおいて、天然のＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドのほかに、これらのポリペプチドの機能的等価物を、本発明のスクリーニングのために使用するＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに含めてよい。ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドの生物学的活性の例には、細胞増殖活性、メチルトランスフェラーゼ活性、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、またはβ−カテニンポリペプチドに対する結合活性が含まれるが、それらに限定されるわけではない。このような機能的等価物の好ましい例は、「ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の遺伝子およびタンパク質」と題した項において前述した。例えば、このような機能的等価物の好ましい例には、ＷＨＳＣ１ポリペプチドのＳＥＴドメイン（例えば、配列番号：２の１０６６〜１１７９）を含むポリペプチドが含まれる。また、ＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の機能的等価物の好ましい例には、ＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドのＳＥＴドメイン（例えば、配列番号：５０の１１４８〜１２６１）を含むポリペプチドが含まれる。
【０１１１】
前記ポリペプチドは、結合過程および結合された物質が元のポリペプチドおよび／または断片の生物学的活性を妨害しない限りにおいて、他の物質にさらに結合されてよい。使用可能な物質には、例えば、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマーなどが含まれる。これらの種類の修飾は、付加的な機能を与えるため、またはポリペプチドおよび断片を安定させるために実施され得る。本発明の方法のために使用されるポリペプチドは、従来の精製方法によって天然のタンパク質として自然界から、または選択されたアミノ酸配列に基づく化学合成を通じて、得ることができる。例えば、合成のために採用することができる従来のペプチド合成方法には、以下のものが含まれる：
１）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
２）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
３）ペプチド合成,丸善,1975;
４）ペプチド合成の基礎と実験,丸善,1985;
５）医薬品の開発  続第14巻（ペプチド合成）,広川書店,1991
６）ＷＯ９９／６７２８８；ならびに
７）Barany G.& Merrifield R.B., Peptides Vol. 2,「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【０１１２】
あるいは、ポリペプチドは、任意の公知の遺伝子工学的方法を本発明のポリペプチドの作製に適応させることによって、得ることもできる（例えば、Morrison J., J Bacteriology 1977, 132:349-51;Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(eds. Wu et al.)1983, 101:347-62）。例えば、最初に、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で（例えば、プロモーターを含む調節配列の下流に）含む適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞中に形質転換し、次いでその宿主細胞を培養して、そのタンパク質を産生させる。より具体的には、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードしている遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、またはｐＣＤ８など外来遺伝子を発現させるためのベクター中にその遺伝子を挿入することによって、宿主（例えば動物）細胞などにおいて発現させる。発現のために、プロモーターを使用することができる。一般に使用される任意のプロモーターを使用することができ、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby, Williamson(ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982, 83-141）、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 1990, 91:217-23）、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 1991, 108:193）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 1987, 152:684-704）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 1988, 8:466）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:3365-9）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen et al., J Mol Appl Genet 1982, 1:385-94）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 1989, 9:946）、およびＨＳＶ  ＴＫプロモーターなどが含まれる。ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドを発現させるための、宿主細胞中へのベクターの導入は、任意の従来の方法、例えば、エレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 1987, 15:1311-26）、リン酸カルシウム法（Chen et al., Mol Cell Biol 1987, 7:2745-52）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 1984, 12:5707-17; Sussman et al., Mol Cell Biol 1985, 4:1641-3）、およびリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）法（Derijard B, Cell 1994, 7:1025-37; Lamb et al., Nature Genetics 1993, 5:22-30; Rabindran et al., Science 1993, 259:230-4）などに従って実施することができる。
【０１１３】
ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドはまた、従来のインビトロの翻訳系を用いてインビトロで作製することもできる。
【０１１４】
（ｉ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに結合する物質のスクリーニング：
本発明において、ＷＨＳＣ１遺伝子の過剰発現は、正常器官ではほとんど発現されないのにもかかわらず、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍においては検出された（図１、２、３、および表５）。さらに、ＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の過剰発現は、正常器官ではほとんど発現されないのにもかかわらず、膀胱癌、乳癌、ＣＭＬ、肺癌（例えばＳＣＬＣ）、およびリンパ腫においては検出された（図１および表５）。したがって、ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子ならびにこれらの遺伝子によってコードされるポリペプチドを用いて、本発明は、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに結合する物質をスクリーニングする方法を提供する。ＷＨＳＣ１遺伝子およびＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子ががんにおいて発現されるため、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに結合する物質は、がん細胞の増殖を抑制し、したがって、がんを治療または予防するのに有用であると予想される。したがって、本発明はまた、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドを用いて、がん細胞の増殖を抑制する候補物質をスクリーニングするための方法、およびがんを治療または予防するための候補物質をスクリーニングするための方法も提供する。特に、このスクリーニング方法の態様は、以下の段階を含む：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）ポリペプチドと試験物質との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）ポリペプチドに結合する試験物質を選択する段階。
【０１１５】
あるいは、本発明によれば、がんの治療または予防に対する試験物質または試験化合物の潜在的治療効果もまた、評価または推定することができる。いくつかの態様において、本発明は、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の過剰発現に関連したがんの治療または予防に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供する：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）ポリペプチドと試験物質との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）潜在的治療効果と試験物質の相関関係を明らかにする段階であって、物質がポリペプチドに結合する場合、潜在的治療効果が示される、段階。
【０１１６】
本発明の方法を、以下に、より詳細に説明する。
【０１１７】
スクリーニングに使用されるＷＨＳＣ１ポリペプチド（すなわちＷＨＳＣ１遺伝子によりコードされるポリペプチド）またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチド（すなわちＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によりコードされるポリペプチド）は、組換えポリペプチドもしくは自然界由来のタンパク質、またはそれらの部分ペプチドであり得る。試験物質と接触させられるポリペプチドは、例えば、精製されたポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
【０１１８】
タンパク質、例えば、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに結合するタンパク質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドを使用してスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。そのようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により、特に、以下のように実施され得る。ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする遺伝子は、該遺伝子をｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、およびｐＣＤ８などの外来遺伝子用の発現ベクターに挿入することにより、宿主（例えば、動物）細胞等において発現される。
【０１１９】
発現に使用されるプロモーターは、一般に使用され得る任意のプロモーターであってよく、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141 (1982)）、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91: 217-23 (1990)）、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108: 193 (1991)）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466 (1988)）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 (1987)）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94 (1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946 (1989)）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター等を含み得る。
【０１２０】
外来遺伝子を発現させるための宿主細胞への遺伝子の導入は、任意の方法、例えば、エレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52 (1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17 (1984);Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3 (1984)）、リポフェクチン法（Derijard B., Cell 76: 1025-37 (1994);Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30 (1993):Rabindran et al., Science 259: 230-4 (1993)）等に従い実施され得る。
【０１２１】
ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、その特異性が明らかなモノクローナル抗体のエピトープを導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位（すなわちエピトープ）を含む融合タンパク質として、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によりコードされるポリペプチドを発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを使用することができる（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３：  ８５−９０  （１９９５））。マルチクローニング部位の使用により、例えば、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現し得るベクターが、市販されている。また、融合によりポリペプチドの特性が変化しないよう、数個〜十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することにより調製された融合タンパク質も使用され得る。ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−タグ）、インフルエンザ凝集ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７−タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−タグ）、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープと、これらを認識するモノクローナル抗体とを、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。
【０１２２】
免疫沈降においては、適切な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物に、これらの抗体を添加することにより、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチド、該ポリペプチドとの結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。免疫沈降は、上記エピトープに対する抗体を使用する以外に、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに対する、上記のように調製され得る抗体を使用して実施されてもよい。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、例えば、プロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースにより、免疫複合体を沈降させることができる。ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によりコードされるポリペプチドが、ＧＳＴなどのエピトープとの融合タンパク質として調製される場合には、グルタチオン−セファロース４Ｂなどのこれらのエピトープと特異的に結合する物質を使用して、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに対する抗体を使用する場合と同様に免疫複合体を形成させることができる。
【０１２３】
免疫沈降は、例えば、文献中の方法に従ってまたは準じて実施され得る（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988)）。
【０１２４】
免疫沈降したタンパク質の分析には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般に使用され、結合したタンパク質は、適切な濃度を有するゲルを使用して、タンパク質の分子量により分析され得る。ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色または銀染色などの一般の染色法によって検出することが困難であるため、細胞を、放射性同位体３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを含有している培養培地中で培養し、細胞内のタンパク質を標識し、タンパク質を検出することにより、タンパク質の検出感度を改善することができる。タンパク質の分子量が明らかである場合には、標的タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製し、その配列を決定することができる。
【０１２５】
ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに結合するタンパク質を、該ポリペプチドを使用してスクリーニングする方法として、例えばウエストウエスタンブロット分析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90 (1991)）を使用することができる。具体的には、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに結合するタンパク質を発現すると予想される培養細胞から、ｃＤＮＡライブラリを、ファージベクター（例えば、ＺＡＰ）を使用して調製し、ＬＢ−アガロース上でタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質をフィルター上に固定し、精製され標識されたＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドを上記フィルターと反応させ、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに結合したタンパク質を発現しているプラークを標識によって検出することにより、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに結合するタンパク質を入手することができる。ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの間の結合を利用するか、またはＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体、もしくはＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドと融合させられるペプチドもしくはポリペプチド（例えば、ＧＳＴ）を利用することにより、標識され得る。放射性同位体または蛍光等を使用する方法も、使用することができる。
【０１２６】
あるいは、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)」）。
【０１２７】
ツーハイブリッドシステムにおいては、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドをＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合させ、酵母細胞において発現させる。ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに結合するタンパク質を発現すると予想される細胞からのｃＤＮＡライブラリを、ライブラリが、発現された場合にＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域に融合するよう、調製する。次いで、ｃＤＮＡライブラリを上記酵母細胞に導入し、ライブラリに由来するｃＤＮＡを、検出された陽性クローンから単離する（本発明のポリペプチドに結合するタンパク質が酵母細胞において発現される場合、その２つの結合がレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンを検出可能にする）。上記の単離されたｃＤＮＡを大腸菌に導入し、タンパク質を発現させることにより、ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を調製することができる。レポーター遺伝子としては、ＨＩＳ３遺伝子に加えて、例えば、Ａｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等も使用することができる。
【０１２８】
アフィニティークロマトグラフィーを使用して、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する物質をスクリーニングすることもできる。例えば、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化し、この本発明のポリペプチドに結合可能なタンパク質を含有している試験物質をカラムにアプライする。本明細書中の試験物質は、例えば、細胞抽出物、細胞溶解物等であり得る。試験物質を負荷した後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドに結合した物質を調製することができる。試験物質がタンパク質である場合には、入手されたタンパク質のアミノ酸配列を分析し、配列に基づきオリゴＤＮＡを合成し、オリゴＤＮＡをプローブとして使用してｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを入手する。
【０１２９】
本発明においては、結合した物質を検出または定量化する手段として、表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーを使用してもよい。そのようなバイオセンサーを使用した場合、極微量のポリペプチドのみを使用して、標識することなく、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドと試験物質との間の相互作用を、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサーを使用して、本発明のポリペプチドと試験物質との間の結合を評価することが可能である。
【０１３０】
タンパク質だけでなくＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質に結合する化学物質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するための、固定化されたＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドを合成化学物質または天然物質バンクまたはランダムファージペプチドディスプレイライブラリに曝露した場合に結合する分子をスクリーニングする方法、およびコンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットを使用したスクリーニング方法（Wrighton et al., Science 273: 458-64 (1996);Verdine, Nature 384: 11-13 (1996);Hogan, Nature 384: 17-9 (1996)）が当業者に周知である。
【０１３１】
（ｉｉ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドの生物学的活性を抑制する物質のスクリーニング：
本発明において、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドは、がん細胞の細胞増殖を促進する活性を有する（図４）。さらに、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有することが公知である。ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドががん細胞の生存において非常に重要な役割を果たすことが本明細書において実証されたため、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドのそれらの生物学的活性を抑制する物質は、がん治療のための候補薬物であることができる。したがって、本発明は、ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１を発現するがん細胞の増殖を抑制する物質をスクリーニングするための方法、ならびに前述の生物学的活性を指標として用いて、がんを治療または予防するための候補物質をスクリーニングするための方法を提供する。本発明の方法によってスクリーニングされる物質は、がんがＷＨＳＣ１および／またはＷＨＣ１Ｌ１の過剰発現に関連している限り、任意のがんのための候補薬物であることができる。例えば、ＷＨＳＣ１過剰発現に関連したがんには、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、および軟部組織腫瘍が含まれるが、それらに限定されるわけではない。また、例えば、ＷＨＳＣ１Ｌ１過剰発現に関連するがんには、膀胱癌、乳癌、ＣＭＬ、肺癌（例えばＳＣＬＣ）、およびリンパ腫が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１３２】
具体的には、本発明は、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるポリペプチドを用いて、がんを治療および／または予防するための候補物質をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下で検出されるポリペプチドの生物学的活性と比較して、該ポリペプチドの生物学的活性を抑制する試験物質を選択する段階。
【０１３３】
あるいは、本発明は、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるポリペプチドを用いて、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下で検出されるポリペプチドの生物学的活性と比較して、該ポリペプチドの生物学的活性を抑制する試験物質を選択する段階。
【０１３４】
本発明によれば、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドの生物学的活性（例えば、細胞増殖活性もしくはメチルトランスフェラーゼ活性）の抑制に対する試験物質の治療効果、またはがんを治療もしくは予防するための候補物質を評価することができる。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドもしくはそれらの断片を用いて、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドの生物学的活性を抑制するための候補物質、またはがんを治療もしくは予防するための候補物質をスクリーニングする方法も提供する：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階；および
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは断片の生物学的活性を検出する段階、および
（ｃ）（ｂ）の生物学的活性と試験物質の治療効果の相関関係を明らかにする段階。
【０１３５】
あるいは、いくつかの態様において、本発明は、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の過剰発現に関連したがんの治療または予防に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供する：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは断片の生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）潜在的治療効果と試験物質の相関関係を明らかにする段階であって、試験物質の非存在下で検出される前記ポリペプチドまたは断片の生物学的活性と比較して、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドまたは断片の生物学的活性を物質が抑制する場合、潜在的治療効果が示される、段階。
【０１３６】
このようながんには、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、およびリンパ腫が含まれる。本発明において、治療効果は、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性と相関関係があり得る。例えば、試験物質が、試験物質の非存在下で検出されるレベルと比べて、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性を抑制または阻害する場合、その試験物質は、治療効果を有する候補物質として同定または選択され得る。あるいは、試験物質が、試験物質の非存在下で検出されるレベルと比べて、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性を抑制も阻害もしない場合、その試験物質は、有意な治療効果を有さない物質として同定され得る。
【０１３７】
本発明の方法を、以下に、より詳細に説明する。
【０１３８】
ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の生物学的活性を有する限り、任意のポリペプチドを本発明のスクリーニング方法のために使用することができる。このような生物学的活性には、例えば、細胞増殖活性（細胞増殖を促進する活性）およびメチルトランスフェラーゼ活性が含まれる。例えば、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質を使用することができ、これらのタンパク質に機能的に等価なポリペプチドもまた、使用することができる。このようなポリペプチドは、細胞において内因性または外因性に発現させることができる。
【０１３９】
このスクリーニング方法によって単離される物質は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによって、そのポリペプチドの機能を阻害する分子を意味する。該用語は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１をコードする遺伝子の発現を低減させるか、または阻害する分子も意味する。さらに、このスクリーニング方法によって単離された物質は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドと分子（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）とのインビボでの相互作用を阻害する物質の候補である。
【０１４０】
本発明のスクリーニング方法において検出される生物学的活性が細胞増殖活性である場合、それは、例えば、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドを発現している細胞を調製し、試験物質の存在下でその細胞を培養し、細胞周期等を測定して細胞増殖のスピードを決定することにより、および、細胞の生存またはコロニー形成活性を測定することにより、検出され得る。ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１を発現している細胞の増殖のスピードを低下させる物質を、がんを治療および／または予防するための候補物質として選択する。
【０１４１】
より具体的には、方法は、以下の段階を含む：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１を過剰発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）細胞増殖活性を測定する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される細胞増殖活性と比較して、細胞増殖活性を低下させる試験物質を選択する段階。
【０１４２】
好ましい態様において、本発明の方法は、以下の段階をさらに含みうる：
（ｄ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１を全くまたはほとんど発現していない細胞に対して影響を全くまたはほとんど及ぼさない試験物質を選択する段階。
【０１４３】
本発明のスクリーニング方法において検出される生物学的活性がメチルトランスフェラーゼ活性である場合、メチルトランスフェラーゼ活性は、基質のメチル化に適した条件下で、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドを基質（例えば、ＷＨＳＣ１の場合はＬｙｓ−３６を含むヒストンＨ３断片、ＷＨＳＣ１Ｌ１の場合はＬｙｓ−４および／またはＬｙｓ−２７を含むヒストンＨ３断片）（Kim SM, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Jun 23;345(1):318-23)）および補助因子（例えばＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）と接触させ、基質のメチル化のレベルを検出することによって決定することができる。
【０１４４】
本発明において、メチルトランスフェラーゼ活性を用いたスクリーニング方法は、以下の［１］〜［７］に記載の方法を包含する：
［１］以下の段階を含む、がんを治療もしくは予防するため、またはがん細胞増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質の存在下で、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子にコードされるポリペプチドを基質および補助因子と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）の基質のメチル化レベルを検出する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して、基質のメチル化レベルを抑制する試験物質を選択する段階；
［２］基質が、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドのための少なくとも１つのメチル化領域を含むヒストンまたはその断片である、［１］に記載の方法；
［３］基質が、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドのための少なくとも１つのメチル化領域を含むヒストンＨ３またはその断片である、［２］に記載の方法；
［４］メチル化領域が、ヒストンＨ３のリジン４、２７、または３６である、［３］に記載の方法；
［５］補助因子がＳ−アデノシルメチオニンである、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の方法；
［６］段階（ａ）がメチル化の促進剤の存在下で行われる、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の方法；および
［７］メチル化の促進剤がＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨＨ）である、［６］に記載の方法。
【０１４５】
本発明において、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性は、当技術分野において公知の方法によって決定することができる。例えば、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドおよび基質を、適切なアッセイ条件下で、標識されたメチル供与体と共にインキュベートすることができる。例えば、ヒストンＨ３ペプチド、およびＳ−アデノシル−［メチル−１４Ｃ］−Ｌ−メチオニン、またはＳ−アデノシル−［メチル−３Ｈ］−Ｌ−メチオニンが、好ましくは、このような基質およびメチル供与体としてそれぞれ使用され得る。ヒストンＨ３ペプチドへの放射性標識物質の移動は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびフルオログラフィーによって検出することができる。あるいは、反応に続いて、ろ過によってヒストンＨ３ペプチドをメチル供与体から分離させ、フィルター上に保持された放射性標識物質の量をシンチレーション計数によって定量することもできる。メチル供与体に結合させることができる他の適切な標識、例えば、発色性標識および蛍光性標識、ならびにヒストンおよびヒストンペプチドへのこれらの標識の移動を検出する方法は、当技術分野において公知である。
【０１４６】
あるいは、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性は、未標識のメチル供与体（例えばＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）およびメチル化されたヒストンまたはヒストンペプチドを選択的に認識する試薬を用いて決定することもできる。例えば、基質のメチル化を可能にする条件下でのＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチド、基質、およびメチル供与体のインキュベーション後に、メチル化された基質を免疫学的方法によって検出することができる。メチル化された基質を認識する抗体を用いた任意の免疫学的技術が、検出のために使用され得る。例えば、メチル化ヒストンに対する抗体が市販されている（ａｂｃａｍ  Ｌｔｄ．）。メチル化ヒストンを認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡまたはイムノブロッティングが、本発明のために使用され得る。
【０１４７】
本発明において、物質のメチル化の促進剤を使用することができる。ＳＡＨＨまたはその機能的等価物は、メチル化の好ましい促進剤のうちの１つである。この剤は、物質のメチル化を促進し、それによって、より高感度でメチルトランスフェラーゼ活性を決定することができる。促進剤の存在下で、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１を基質および補助因子と接触させることができる。
【０１４８】
さらに、メチルトランスフェラーゼ活性を検出する本発明の方法は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドを発現する細胞を調製し、試験物質の存在下で細胞を培養し、例えば、メチル化領域に特異的に結合する抗体を用いて、ヒストンのメチル化レベルを決定することによって、実施することができる。
【０１４９】
より具体的には、この方法は、以下の段階を含み得る：
［１］試験物質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１を発現する細胞と接触させる段階；
［２］ヒストンＨ３のメチル化レベルを検出する段階；および
［３］試験物質の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して、メチル化レベルを低下させる試験物質を選択する段階。
【０１５０】
あるいは、いくつかの態様において、本発明はまた、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の過剰発現に関連したがんの治療または予防に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法も提供する：
（ａ）ヒストンＨ３のメチル化を可能にする条件下で、試験物質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）ヒストンＨ３のメチル化レベルを検出する段階；および
（ｃ）潜在的治療効果と試験物質の相関関係を明らかにする段階であって、候補物質としての試験物質の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して、試験物質がヒストンＨ３のメチル化レベルを低下させる場合、潜在的治療効果が示される、段階。
【０１５１】
本明細書において定義される「生物学的活性を抑制する」とは、試験物質の非存在下での生物学的活性と比較して、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドの生物学的活性の、好ましくは少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、およびさらにより好ましくは９０％の抑制である。
【０１５２】
好ましい態様において、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドのいずれかまたは両方を発現しない対照細胞が使用される。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドのいずれかもしくは両方またはその断片を用いて、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１のいずれかもしくは両方を過剰発現する細胞の増殖を阻害するための候補物質、またはＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１のいずれかもしくは両方に関連した疾患を治療もしくは予防するための候補物質をスクリーニングする方法も提供する：
（ａ）試験物質の存在下で、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドのいずれかもしくは両方またはその機能的断片を発現する細胞、ならびにＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドのいずれかまたは両方もその機能的断片も発現しない対照細胞を培養する段階；
（ｂ）タンパク質を発現する細胞および対照細胞の生物学的活性を検出する段階；ならびに
（ｃ）対照細胞において、および前記試験物質の非存在下で検出される増殖と比較して、タンパク質を発現する細胞における生物学的活性を阻害する試験化合物を選択する段階。
【０１５３】
（ｉｉｉ）ＷＨＳＣ１ポリペプチドとその結合タンパク質との間の結合を阻害する物質のスクリーニング：
本発明によって、ＷＨＳＣ１ポリペプチドが、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドと相互に作用することが確認された。ＷＨＳＣ１ポリペプチドの発がんへの関与に加えて、これらのポリペプチドもまた発がんに関与していることが公知であるため、ＷＨＳＣ１ポリペプチドとこれらのポリペプチドとの間の相互作用は、がん細胞増殖にとって重要であるとみなされる。したがって、上記の相互作用を阻害する物質は、がん細胞の増殖および／または生存を阻害するのに有用であり、したがって、がんを治療または予防するのに有用であると予想される。したがって、本発明は、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、またはβ−カテニンポリペプチドとのＷＨＳＣ１ポリペプチドの結合活性に基づいて、がんを治療または予防するための候補物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明はまた、がん細胞の増殖および／または生存を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法も提供する。具体的には、本発明のスクリーニング方法は、以下の段階を含む：
（ａ）試験物質の存在下で、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／もしくはβ−カテニンポリペプチドまたはその機能的等価物をＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）の、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／もしくはβ−カテニンポリペプチドまたはその機能的等価物とＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される結合と比較して、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／もしくはβ−カテニンポリペプチドまたはその機能的等価物とＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を阻害する試験物質を選択する段階。
【０１５４】
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、以下の段階を含む：
（ａ）試験物質の存在下で、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物を、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）の、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物と、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される結合と比較して、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物と、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を阻害する試験物質を選択する段階。
【０１５５】
本発明によって、がん細胞増殖の阻害に対する試験物質の治療効果、またはＷＨＳＣ１に関連した疾患を治療もしくは予防するための候補物質を評価することができる。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物を用いて、細胞増殖を阻害するための候補物質もしくはＷＨＳＣ１に関連した疾患を治療もしくは予防するための候補物質をスクリーニングする方法、またはＷＨＳＣ１に関連した疾患に対する試験物質の治療効果を評価する方法も提供する：
（ａ）試験物質の存在下で、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／もしくはβ−カテニンポリペプチドまたはその機能的等価物をＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）の、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／もしくはβ−カテニンポリペプチドまたはその機能的等価物とＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）の結合と試験物質の治療効果との相関関係を明らかにする段階。
【０１５６】
あるいは、本発明はまた、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物を用いて、ＷＨＳＣ１を過剰発現する細胞の増殖を阻害するための候補物質もしくはＷＨＳＣ１に関連した疾患を治療もしくは予防するための候補物質をスクリーニングする方法、またはＷＨＳＣ１に関連した疾患に対する試験物質の治療効果を評価する方法も提供する：
（ａ）試験物質の存在下で、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物を、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）の、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物と、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）の結合と試験物質の治療効果との相関関係を明らかにする段階。
【０１５７】
あるいは、いくつかの態様において、本発明はまた、以下の段階を含む、がんの治療または予防に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法も提供する：
（ａ）試験物質の存在下で、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物を、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）の、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物と、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）で検出された結合レベルを、試験物質の非存在下で検出される結合レベルと比較する段階；ならびに
（ｄ）潜在的治療効果と試験物質の相関関係を明らかにする段階であって、試験物質が結合レベルを低下させる場合、潜在的治療効果が示される、段階。
【０１５８】
本発明において、治療効果は、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物に対する、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物の結合活性と相関関係があり得る。例えば、試験物質が、試験物質の非存在下で検出される結合活性と比較して、上記のポリペプチドに対するＷＨＳＣ１ポリペプチドの結合活性を抑制または阻害する場合、その試験物質は、治療効果を有する候補物質として同定または選択され得る。あるいは、試験物質が、試験物質の非存在下で検出されるレベルと比較して、上記のポリペプチドに対するＷＨＳＣ１ポリペプチドの結合活性を抑制も阻害もしない場合、その試験物質は、有意な治療効果を有さないものとして同定される。
【０１５９】
本発明の結果において、ＷＨＳＣ１ポリペプチドとＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／もしくはβ−カテニンポリペプチドまたはその機能的等価物との結合活性を抑制することにより、がん細胞増殖を低減できることが示唆される。したがって、結合活性を抑制する候補物質をスクリーニングすることによって、がんを治療または予防する可能性を有する候補物質を同定することができる。これらの候補物質ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療剤を同定するための二次的なスクリーニングおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
【０１６０】
本発明によって、ＷＨＳＣ１ポリペプチドが、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／またはβ−カテニンポリペプチドと相互作用することが見出された。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１ポリペプチドとＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／またはβ−カテニンポリペプチドとの間の結合を阻害する物質をスクリーニングする方法も提供する：
（ａ）試験物質の存在下で、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／もしくはβ−カテニンポリペプチドまたはその機能的等価物をＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／もしくはβ−カテニンポリペプチドまたはその機能的等価物とＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される結合と比較して、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／もしくはβ−カテニンポリペプチドまたはその機能的等価物とＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を阻害する試験物質を選択する段階。
【０１６１】
あるいは、本発明はまた、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１ポリペプチドと、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つとの間の結合を阻害する物質をスクリーニングする方法も提供する：
（ａ）試験物質の存在下で、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物を、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物と、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を検出する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される結合と比較して、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つまたはその機能的等価物と、ＷＨＳＣ１ポリペプチドまたはその機能的等価物との間の結合を阻害する試験物質を選択する段階。
【０１６２】
本発明のスクリーニング方法で使用するためのＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、およびβ−カテニンポリペプチドは、それらのポリペプチドのアミノ酸配列データまたはそれらのポリペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列データに基づき、後述するような当技術分野において周知の方法によって調製することができる。
【０１６３】
ＩＱＧＡＰ１（ＩＱ  ｍｏｔｉｆ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １ｐｒｏｖｉｄｅｄ）は、ＩＱＧＡＰファミリーのメンバーである。ＩＱＧＡＰ１ポリペプチドは１９０ｋＤａのタンパク質であり、４個のＩＱドメイン、１個のカルポニン相同ドメイン、１個のＲａｓ−ＧＡＰドメイン、および１個のＷＷドメインを含む。これは、細胞骨格の構成要素と、細胞接着分子と、ならびに細胞の形態および運動性を調節するためのいくつかのシグナル伝達分子と相互作用する。ＩＱＧＡＰ１ポリペプチドは、がん細胞の浸潤に関係している可能性が高い。ＩＱＧＡＰ１遺伝子の典型的なヌクレオチド配列およびＩＱＧＡＰ１ポリペプチドの典型的なアミノ酸配列は、配列番号：３９および配列番号：４０にそれぞれ示す。これらの配列データはまた、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３８７０によっても入手可能である。
【０１６４】
ＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １）は、マウスＴリンパ腫細胞株において浸潤および転移を誘発する遺伝子として同定されている。ＴＩＡＭ１は、Ｒａｃ特異的グアニンヌクレオチド交換因子であり、Ｒｈｏ様ＧＴＰアーゼＲａｃを特異的に活性化する。ＴＩＡＭ１−Ｒａｃシグナル伝達は、がん細胞の細胞遊走、浸潤、および転移に影響を及ぼす。ＴＩＡＭ１遺伝子の典型的なヌクレオチド配列およびＩＱＧＡＰ１ポリペプチドの典型的なアミノ酸配列は、配列番号：４１および配列番号：４２にそれぞれ示す。これらの配列データはまた、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３２５３によっても入手可能である。
【０１６５】
ＡＫＴ２（ｖ−ａｋｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｈｙｍｏｍａ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２）は、ＳＨ２様（Ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ２−ｌｉｋｅ）ドメインを含むセリン／トレオニンキナーゼのサブファミリーに属するタンパク質をコードする推定上のがん遺伝子である。ＡＫＴ２ポリペプチドは、いくつかの公知のタンパク質をリン酸化することができる一般的プロテインキナーゼである。ＡＫＴ２遺伝子の典型的なヌクレオチド配列およびＡＫＴ２ポリペプチドの典型的なアミノ酸配列は、配列番号：４３および配列番号：４４にそれぞれ示す。これらの配列データはまた、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＮＭ＿００１６２６によっても入手可能である。
【０１６６】
β−カテニンは、接着結合（ＡＪ）を構成するタンパク質の複合体の一部分である。β−カテニンは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路に関与しており、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の異常な活性化は、発がんを誘発するとみなされている。β−カテニン遺伝子の典型的なヌクレオチド配列およびβ−カテニンポリペプチドの典型的なアミノ酸配列は、配列番号：４５、５１、または５２および配列番号：４６にそれぞれ示す。これらの配列データはまた、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＮＭ＿００１０９８２０９、ＮＭ＿００１０９８２１０、またはＮＭ＿００１９０４によっても入手可能である。
【０１６７】
ＷＨＳＣ１ポリペプチドとＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／またはβ−カテニンポリペプチドとの間の結合を阻害する物質をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。あるいは、当業者に周知の多くの方法が、ＷＨＳＣ１ポリペプチドと、ＩＱＧＡＰ１、ＴＩＡＭ１、ＡＫＴ２、およびβ−カテニンからなる群より選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つとの間の結合を阻害する物質をスクリーニングするのに使用され得る。例えば、スクリーニングは、細胞系のようなインビトロのアッセイ系として実施することができる。より具体的には、最初にＷＨＳＣ１ポリペプチド、またはＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／もしくはβ−カテニンポリペプチド、のいずれかを支持体に結合させ、かつ、他方のタンパク質を、試験物質と共にそれに添加する。次に、この混合物をインキュベートし、洗浄し、支持体に結合されたこの他方のタンパク質を検出および／または測定する。
【０１６８】
タンパク質を結合するのに使用され得る支持体の例には、例えば、アガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖；ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれ；好ましくは、上記の材料から調製された市販のビーズおよびプレート（例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど）が使用され得る。ビーズを使用する場合、カラム中にこれらを詰めることができる。あるいは、磁性ビーズの使用も当技術分野において公知であり、これにより、磁気を用いて、ビーズに結合されたタンパク質を容易に単離することが可能になる。
【０１６９】
支持体へのタンパク質の結合は、例えば化学的結合および物理的吸着などの日常的な方法に従って行うことができる。あるいは、タンパク質は、そのタンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体に結合され得る。さらに、支持体へのタンパク質の結合は、アビジンおよびビオチンを用いて行うこともできる。
【０１７０】
タンパク質間の結合は、好ましくは、緩衝液中で実施され、緩衝液の例には、リン酸緩衝液およびトリス緩衝液が含まれるがそれらに限定されるわけではない。しかしながら、選択される緩衝液は、タンパク質間の結合を阻害してはならない。
【０１７１】
本発明との関連において、表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーが、結合されたタンパク質を検出または定量するための手段として使用され得る。このようなバイオセンサーが使用される場合、タンパク質間の相互作用は、ごくわずかな量のポリペプチドを用い、かつ標識せずに、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅのようなバイオセンサーを用いてＷＨＳＣ１ポリペプチドとＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／またはβ−カテニンポリペプチドとの間の結合を評価することが可能である。
【０１７２】
あるいは、ＷＨＳＣ１ポリペプチド、またはＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／もしくはβ−カテニンポリペプチド、のいずれかを標識することもでき、結合されたタンパク質の標識を用いて、結合されたタンパク質を検出または測定することができる。具体的には、これらのタンパク質のうちの１つを前標識した後、標識されたタンパク質を、試験物質の存在下でもう一方のタンパク質と接触させ、次いで、洗浄後に、結合されたタンパク質を標識に従って検出または測定する。
【０１７３】
放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ）、蛍光性物質（例えば、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、ローダミン）、およびビオチン／アビジンを非限定的に含む標識物質が、本発明の方法においてタンパク質を標識するために使用され得る。タンパク質が放射性同位体で標識される場合、検出または測定は、液体シンチレーションによって実施することができる。あるいは、酵素で標識されたタンパク質は、酵素の基質を添加して、色の生成のような基質の酵素的変化を吸光光度計で検出することによって、検出または測定することができる。さらに、蛍光性物質が標識として使用される場合は、蛍光光度計を用いて、結合されたタンパク質を検出または測定することができる。
【０１７４】
さらに、ＷＨＳＣ１ポリペプチドとＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／またはβ−カテニンポリペプチドとの間の結合はまた、そのポリペプチドに対する抗体を用いて検出または測定することもできる。例えば、支持体上に固定されたＷＨＳＣ１ポリペプチドを試験物質ならびにＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／またはβ−カテニンポリペプチドと接触させた後、この混合物をインキュベートおよび洗浄し、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、またはβ−カテニンポリペプチドに対する抗体を用いて、検出または測定を行うことができる。あるいは、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、および／またはβ−カテニンポリペプチドを支持体上に固定することもでき、ＷＨＳＣ１ポリペプチドに対する抗体を抗体として使用することができる。
【０１７５】
本発明のスクリーニングにおいて抗体を使用する場合、抗体は、好ましくは、前述の標識物質のうちの１つで標識され、その標識物質に基づいて検出または測定される。あるいは、ＷＨＳＣ１ポリペプチド、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、またはβ−カテニンポリペプチドに対する抗体を、標識物質で標識された２次抗体で検出するための１次抗体として使用することもできる。さらに、本発明のスクリーニングにおいてタンパク質に結合される抗体は、プロテインＧカラムまたはプロテインＡカラムを用いて検出または測定することもできる。
【０１７６】
本発明のスクリーニング方法において使用するためのポリペプチドは、標準的な手順を用いて組換えによって作製することができる。例えば、関心対象のポリペプチドをコードする遺伝子は、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、およびｐＣＤ８など外来遺伝子用の発現ベクター中にその遺伝子を挿入することによって、動物細胞において発現させることができる。発現用に使用するためのプロモーターは、一般に使用され得る任意のプロモーターでよく、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby, Williamson(ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141,(1982)）、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91, 217-23(1990)）、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108:193(1991)）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152:684-704(1987)）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8:466-72(1988)）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84:3365-9(1987)）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1:385-94(1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9:946-58(1989)）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーターなどが含まれる。外来遺伝子を発現させるための、動物細胞中への遺伝子の導入は、任意の従来の方法、例えば、エレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15:1311-26(1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7:2745-52(1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12:5707-17(1984); Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4:1641-3(1984)）、リポフェクチン法（Derijard B, Cell 76:1025-37(1994); Lamb et al., Nature Genetics 5:22-30(1993):Rabindran et al., Science 259:230-4(1993)）などに従って実施することができる。ポリペプチドは、特異性が明らかにされているモノクローナル抗体のエピトープをポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に導入することによって、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含む融合タンパク質として発現させることもできる。あるいは、市販のエピトープ−抗体系を使用することもできる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。マルチクローニング部位を用いることにより、例えば、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合タンパク質を発現できるベクターが市販されている。
【０１７７】
融合によって元のポリペプチドの特性を変更しないように、数個〜十数個のアミノ酸から構成される小さなエピトープのみを導入することによって調製された融合タンパク質もまた、本明細書において提供される。ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−タグ）、インフルエンザ凝集体ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７−タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−タグ）、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープおよびそれらを認識する抗体が、ポリペプチド間の結合活性を検出するためのエピトープ−抗体系として使用され得る（Experimental Medicine 13:85-90(1995)）。
【０１７８】
本発明のスクリーニング方法において使用するための抗体は、当技術分野において周知の技術を用いて調製することができる。調製された抗体に対する抗原は、任意の動物種に由来してよいが、好ましくは、ヒト、マウス、ウサギ、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。抗原として使用されるポリペプチドは、組換えによって作製され得るか、または天然供給源から単離され得る。免疫化抗原として使用するためのポリペプチドは、完全なタンパク質または完全なタンパク質に由来する部分ペプチドでよい。
【０１７９】
任意の哺乳動物を抗原で免疫化することができる；しかしながら、好ましくは、細胞融合に使用される親細胞との適合性が考慮に入れられる。一般に、げっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）の動物が使用される。げっ歯目の動物には、例えば、マウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目の動物には、例えば、野ウサギ、ナキウサギ、およびウサギが含まれる。霊長目の動物には、例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）のサル（旧世界ザル）が含まれる。
【０１８０】
動物を抗原で免疫化するための方法は、当技術分野において周知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫化するための標準的な方法である。より具体的には、抗原は、適切な量のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水などにおいて希釈および懸濁させることができる。望ましければ、抗原懸濁液を、適切な量のフロイント完全アジュバントのような標準的アジュバントと混合し、エマルジョンにし、次いで哺乳動物に投与することができる。好ましくは、それに続いて、適切な量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を４日〜２１日毎に数回投与する。適切な担体もまた、免疫化のために使用され得る。前述の免疫化の後、血清を、標準的な方法により、所望の抗体の量の増加に関して検査する。
【０１８１】
ポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して検査した免疫化哺乳動物から血液を採取することによって、かつ任意の従来の方法によってその血液から血清を分離することによって、調製することができる。ポリクローナル抗体には、ポリクローナル抗体を含む血清、ならびに血清から単離されたポリクローナル抗体を含む画分が含まれる。免疫グロブリンＧまたはＭは、例えば、目的のポリペプチドと結合されたアフィニティーカラムを用いて、このポリペプチドのみを認識する画分から調製することができ、かつプロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムを用いてこの画分をさらに精製することができる。
【０１８２】
モノクローナル抗体を調製するために、前述したように抗原で免疫化し、かつ血清中の所望の抗体のレベル上昇を確認した哺乳動物から免疫細胞を採取し、それらを細胞融合に供する。細胞融合のために使用される免疫細胞は、好ましくは脾臓から得られる。上記の免疫細胞と融合させるための他の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは、融合された細胞を薬物によって選択するための後天的性質を有する骨髄腫細胞が含まれる。
【０１８３】
上記の免疫細胞および骨髄腫細胞は、公知の方法、例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎらの方法（Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73:3-46(1981)）に従って融合することができる。
【０１８４】
細胞融合により得られる、結果として生じるハイブリドーマは、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）のような標準的な選択培地中でそれらを培養することによって選択することができる。細胞培養は、典型的には、ＨＡＴ培地中で数日間〜数週間、すなわち、所望のハイブリドーマを除く他の細胞（非融合細胞）すべてを死滅させるのに充分な期間、継続する。次いで、標準的な限界希釈を実施して、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングする。
【０１８５】
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫化する上記の方法のほかに、ＥＢウイルスに感染されたもののようなヒトリンパ球をインビトロで、抗原、そのような抗原を発現する細胞、またはそれらの溶解物で免疫化してもよい。次いで、免疫化されたリンパ球を、Ｕ２６６のような無期限に分裂することができるヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、抗原に結合できる所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得る（日本特許公開特許公報  特開昭（ＪＰ−Ａ）６３−１７６８８号）。
【０１８６】
得られたハイブリドーマをマウスの腹腔中に続いて移植することができ、腹水を取り出すことができる。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法、プロテインＡカラムもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または目的の抗原を担持するアフィニティーカラムによって、精製することができる。
【０１８７】
ＷＨＳＣ１ポリペプチド、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、またはβ−カテニンポリペプチドに対する抗体は、本発明のスクリーニング方法においてだけでなく、「がんを診断するための方法」において説明したように生物学的試料中のがんマーカーとしてのポリペプチドの検出にも使用され得る。それらはさらに、関心対象のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補にもなり得る。さらに、アンタゴニストの候補となるこのような抗体は、後述するように、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、および軟部組織腫瘍を含む、ＷＨＳＣ１ポリペプチドに関係した疾患の抗体治療に適用することもできる。
【０１８８】
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子工学技術を用いて組換えによって調製することもできる（例えば、ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＬＴＤによって英国で出版されたBorrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies(1990)を参照されたい）。例えば、ある抗体をコードするＤＮＡを、その抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクター中に挿入し、かつ宿主細胞中に導入して、組換え抗体を調製することができる。このような組換え抗体は、本発明のスクリーニングにおいても使用することができる。
【０１８９】
さらに、スクリーニングなどにおいて使用される抗体は、元の結合活性を保持している限り、抗体の断片または修飾抗体であることができる。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈ鎖およびＬ鎖に由来するＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている）でよい（Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-83(1988)）。より具体的には、抗体断片は、パパインまたはペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって作製することができる。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクター中に挿入し、適切な宿主細胞中で発現させることもできる（例えば、Co et al., J Immunol 152:2968-76(1994); BetterおよびHorwitz, Methods Enzymol 178:476-96(1989); PluckthunおよびSkerra, Methods Enzymol 178:497-515(1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121:652-63(1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121:663-9(1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9:132-7(1991)を参照されたい）。
【０１９０】
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような様々な分子と結合させることによって修飾することができる。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾方法は、当技術分野において慣習的である。
【０１９１】
前述のようにして得られた抗体を、均一になるまで精製することができる。例えば、抗体の分離および精製は、一般のタンパク質に対して使用される分離方法および精製方法に従って実施することができる。例えば、抗体は、適切に選択し、かつ組み合わせられた、アフィニティークロマトグラフィーのようなカラムクロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動などによって、分離および単離することができる（Antibodies:A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)）。しかしながら、本発明はこれらに限定されるわけではない。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。使用され得る例示的なプロテインＡカラムには、例えば、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびセファロースＦ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
【０１９２】
アフィニティークロマトグラフィーを別として、例示的なクロマトグラフィーには、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーなどが含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)）。クロマトグラフィー処置は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって実施することができる。
【０１９３】
あるいは、細胞を使用するツーハイブリッドシステムを、ポリペプチド間の結合活性を検出または測定するのに使用することもできる（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)」）。
【０１９４】
ツーハイブリッドシステムでは、例えば、ＷＨＳＣ１ポリペプチドは、ＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合されており、酵母細胞において発現される。ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチド、またはβ−カテニンポリペプチドは、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域に融合され、同様に、試験物質の存在下で酵母細胞において発現される。あるいは、ＩＱＧＡＰ１ポリペプチド、ＴＩＡＭ１ポリペプチド、ＡＫＴ２ポリペプチドポリペプチド、またはβ−カテニンポリペプチドがＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合されてもよく、ＷＨＳＣ１ポリペプチドがＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域に融合されてもよい。２種のポリペプチドの結合によりレポーター遺伝子が活性化されて、陽性クローンが検出可能になる。レポーター遺伝子としては、ＨＩＳ３遺伝子に加えて、例えば、Ａｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などが使用され得る。
【０１９５】
（２）遺伝子発現に基づいたスクリーニング：
（ｉ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を変更する物質のスクリーニング：
本発明において、ｓｉＲＮＡによってＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の発現を低減させると、がん細胞増殖が阻害される（図４）。したがって、本発明は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を阻害する物質は、がん細胞の増殖を抑制すると予想され、したがって、がんを治療または予防するのに有用である。例えば、ＷＨＳＣ１の発現を阻害する物質は、限定されるわけではないが、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、および軟部組織腫瘍を含むがんを治療または予防するための候補治療剤であり得る。また、ＷＨＳＣ１Ｌ１の発現を阻害する物質は、限定されるわけではないが、膀胱癌、乳癌、ＣＭＬ、肺癌（例えばＳＣＬＣ）、およびリンパ腫を含むがんを治療または予防するための候補治療剤であり得る。したがって、本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する物質をスクリーニングするための方法、およびがんを治療または予防するための候補物質をスクリーニングするための方法も提供する。本発明との関連において、このようなスクリーニング方法は、例えば、以下の段階を含み得る：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子のいずれかまたは両方を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）ＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルもしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルのいずれかまたは両方を検出する段階；および
（ｂ）試験物質の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルもしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルのいずれかまたは両方を低下させる試験物質を選択する段階。
【０１９６】
あるいは、いくつかの態様において、本発明はまた、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の過剰発現に関連したがんの治療または予防に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法も提供する：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子のいずれかまたは両方を発現する細胞と接触させる段階；ならびに
（ｂ）潜在的治療効果と試験物質の相関関係を明らかにする段階であって、物質が対照と比較して、ＷＨＳＣ１遺伝子の発現レベルもしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルのいずれかまたは両方を低下させる場合、潜在的治療効果が示される、段階。
【０１９７】
本発明の方法を、以下により詳細に説明する。
【０１９８】
ＷＨＳＣ１遺伝子を発現する細胞には、例えば、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、および軟部組織腫瘍から樹立された細胞株が含まれる。また、ＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現する細胞には、例えば、膀胱癌、乳癌、ＣＭＬ、肺癌（例えばＳＣＬＣ）、およびリンパ腫から樹立された細胞株が含まれる。このような細胞は、前述した本発明のスクリーニングのために使用され得る。ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルは、当業者に周知の方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫染色、およびフローサイトメトリー解析によって推定することができる。本明細書において定義する「発現レベルの低下」とは、物質の非存在下での発現レベルと比べて、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルの好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％のレベル低下、およびさらにより好ましくは少なくとも９５％のレベル低下である。本明細書における物質には、化学物質、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対する二本鎖分子（例えばｓｉＲＮＡ）、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対するアンチセンス核酸などが含まれる。二本鎖ヌクレオチドの調製方法は、以下の項において説明する。本発明のスクリーニング方法において、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを低下させる物質を、がんの治療または予防に使用するための候補物質として選択することができる。
【０１９９】
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、以下の段階を含み得る：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の転写調節領域およびその転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを測定する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される発現または活性と比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる試験物質を選択する段階。
【０２００】
あるいは、いくつかの態様において、本発明はまた、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の過剰発現に関連したがんの治療または予防に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法も提供する：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の転写調節領域およびその転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）潜在的治療効果と試験物質の相関関係を明らかにする段階であって、試験物質が該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる場合、潜在的治療効果が示される、段階。
【０２０１】
好適なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例えば、レポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ属の一種（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）の赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が含まれ、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等を含む。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の転写調節領域と接続することにより調製され得る。本明細書中のＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の転写調節領域は、転写開始部位から少なくとも５００ｂｐ上流、好ましくは１，０００ｂｐ、より好ましくは５，０００ｂｐまたは１０，０００ｂｐ上流までの領域である。転写調節領域を含有しているヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離されてもよいし、またはＰＣＲによって増幅させられてもよい。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をこれらの遺伝子のいずれか１つの転写調節領域と接続することにより調製され得る。転写調節領域を同定するための方法、およびアッセイプロトコルも周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
【０２０２】
レポーター構築物を含有しているベクターを、宿主細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野で周知の方法により（例えば、ルミノメーター、吸光度計、フローサイトメーター等を使用して）検出する。本明細書中で定義される「発現または活性を低下させる」とは、レポーター遺伝子の発現または活性の、物質の非存在下と比較した、好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の低下、およびさらにより好ましくは少なくとも９５％の低下である。
【０２０３】
（ｉ）ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに結合するか；（ｉｉ）ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドの生物学的活性（例えば、細胞増殖活性もしくはメチルトランスフェラーゼ活性）を抑制／低減させるか；または（ｉｉｉ）ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを低下させる試験物質をスクリーニングすることによって、がん（例えば、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、またはリンパ腫）を治療または予防する潜在能力を有する候補物質を同定することができる。これらの候補物質ががんを治療または予防する潜在能力は、がんに対する治療的物質を同定するための二次的なスクリーニングおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドに結合する物質が、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドの前述の活性を阻害する場合、このような物質は、ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１の過剰発現に関連したがんに対して特異的な治療効果を有すると結論付けることができる。
【０２０４】
本発明において、ＷＨＳＣ１によって調節される下流遺伝子が同定された。ｓｉＲＮＡによってＷＨＳＣ１発現レベルを抑制するとがん細胞増殖が阻害されたように、ＷＨＳＣ１ポリペプチドは、発がんに関係する経路に関与している。したがって、下流遺伝子の発現レベルを調節する物質は、がんを治療または予防するのに有用であり得る。したがって、本発明はまた、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、および軟部組織腫瘍などのがんを治療または予防するための候補物質をスクリーニングする方法も提供する。１つの態様において、がんを治療または予防するための候補物質をスクリーニングする方法は、以下の段階を含み得る：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１の下流遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；ならびに
（ｂ）候補物質の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＷＨＳＣ１の下流遺伝子の発現レベルを低下させる物質を選択する段階。
【０２０５】
あるいは、いくつかの態様において、本発明はまた、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１の過剰発現に関連したがんの治療または予防に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法も提供する：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１の下流遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；ならびに
（ｂ）潜在的治療効果と試験物質の相関関係を明らかにする段階であって、物質が対照と比較して、ＷＨＳＣ１の下流遺伝子の発現レベルを低下させる場合、潜在的治療効果が示される、段階。
【０２０６】
さらに、本発明において、表８に示す遺伝子が、ＷＨＳＣ１によって調節される下流遺伝子として同定された。したがって、本発明の方法において発現レベルに基づいて検出され得る下流遺伝子は、表８で説明する１種または複数種の遺伝子であり得る。例えば、ＣＣＮＤ１の発現は、ＷＨＳＣ１発現の調節によって調節されることが確認された（図６）。
【０２０７】
したがって、本発明は、以下の段階を含む、がんを治療または予防するための候補物質をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１およびＣＣＮＤ１を発現する細胞と接触させる段階；ならびに
（ｂ）試験物質の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＣＣＮＤ１の発現レベルを低下させる試験物質を選択する段階。
【０２０８】
あるいは、いくつかの態様において、本発明はまた、以下の段階を含む、ＷＨＳＣ１の過剰発現に関連したがんの治療または予防に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法も提供する：
（ａ）試験物質を、ＷＨＳＣ１およびＣＣＮＤ１を発現する細胞と接触させる段階；ならびに
（ｂ）潜在的治療効果と試験物質の相関関係を明らかにする段階であって、物質が対照と比較して、ＣＣＮＤ１の発現レベルを低下させる場合、潜在的治療効果が示される、段階。
【０２０９】
ＣＣＮＤ１遺伝子の発現レベルは、ＣＣＮＤ１のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列のデータを用いて、前述した方法（「がんを診断するための方法」を参照されたい）のような当技術分野において周知の方法によって検出することができる。ＣＣＮＤ１の典型的なヌクレオチド配列は配列番号：４７に示し、典型的なアミノ酸配列は配列番号：４８に示す。これらの配列データはまた、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０５３０５６によっても入手可能である。
【０２１０】
二本鎖分子：
本明細書で使用される場合、「単離二本鎖分子」という用語は標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を意味し、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ、例えばＤＮＡとＲＮＡとの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡとの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む。
【０２１１】
本明細書で使用される場合、標的配列とは、その遺伝子を発現している細胞中に二本鎖分子が導入された場合に標的遺伝子の完全ｍＲＮＡの翻訳の抑制をもたらすであろう、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列内またはｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド配列である。標的遺伝子のｍＲＮＡ配列内またはｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド配列は、標的配列に対応する配列を有する二本鎖分子が、その遺伝子を発現している細胞において、その遺伝子の発現を阻害する場合、標的配列であると決定され得る。標的配列がｃＤＮＡ配列によって示される場合、二本鎖ｃＤＮＡのセンス鎖配列、すなわち、ｍＲＮＡ配列がＤＮＡ配列へと変換された配列が、標的配列を定義するために使用される。二本鎖分子は、標的配列に対応する配列を有するセンス鎖と、標的配列の相補配列を有するアンチセンス鎖とから構成され、アンチセンス鎖は、相補配列においてセンス鎖とハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成する。
【０２１２】
本明細書において、「〜に対応する」とは、標的配列を、二本鎖分子のセンス鎖を構成する核酸の種類へ変換することを意味する。例えば、標的配列がＤＮＡ配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖がＲＮＡ領域を有する場合、ＲＮＡ領域内の塩基「ｔ」は塩基「ｕ」に交換される。他方、標的配列がＲＮＡ配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖がＤＮＡ領域を有する場合、ＤＮＡ領域内の塩基「ｕ」は「ｔ」に交換される。例えば、標的配列が配列番号：２９、３２、３５、または３８で示されるＤＮＡ配列であり、二本鎖分子のセンス鎖がＲＮＡから構成される場合、「標的配列に対応する配列」は、「ＣＡＧＡＵＣＵＡＣＡ  ＣＡＧＣＧＧＡＵＡ」（配列番号：２９の場合）、「ＧＵＵＡＡＵＵＧＧＣ  ＡＵＡＵＧＧＡＡＵ」（配列番号：３２の場合）、「ＣＵＣＡＣＡＡＡＵＧ  ＧＧＵＡＵＣＣＡＵ」（配列番号：３５の場合）、または「ＧＵＡＣＵＧＡＡＡＵ  ＵＣＧＧＡＧＡＣＡ」（配列番号：３８の場合）」である。
【０２１３】
また、二本鎖分子のアンチセンス鎖についての標的配列に対する相補配列は、アンチセンス鎖を構成する核酸の種類により定義され得る。例えば、標的配列が配列番号：２９、３２、３５、または３８で示されるＤＮＡ配列であり、二本鎖分子のアンチセンス鎖がＲＮＡから構成される場合、「標的配列に対する相補配列」は、「ＵＡＵＣＣＧＣＵＧ  ＵＧＵＡＧＡＵＣＵＧ」（配列番号：２９の場合）、「ＡＵＵＣＣＡＵＡＵ  ＧＣＣＡＡＵＵＡＡＣ」（配列番号：３２の場合）、「ＡＵＧＧＡＵＡＣＣ  ＣＡＵＵＵＧＵＧＡＧ」（配列番号：３５の場合）、または「ＵＧＵＣＵＣＣＧＡ  ＡＵＵＵＣＡＧＵＡＣ」（配列番号：３８の場合）である。二本鎖分子は、標的配列に対応する配列およびその相補配列に加えて、２〜５ヌクレオチド長の１個もしくは２個の３'オーバーハング（例えば、ｕｕ）、および／またはヘアピン構造を形成するためのセンス鎖とアンチセンス鎖とを連結するループ配列を有し得る。
【０２１４】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ二本鎖ＲＮＡ分子をさす。ＤＮＡが、ＲＮＡが転写される鋳型である技術を含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。あるいは、ｓｉＲＮＡは、処置すべき細胞に直接導入してもよい。対象にｓｉＲＮＡを導入する方法は、当技術分野において周知である。例えば、送達物質と併用したｓｉＲＮＡの投与は、ｓｉＲＮＡの導入に好ましい。
【０２１５】
ｓｉＲＮＡは、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方を含む。単一の転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列および相補的なアンチセンス核酸配列の両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＲＮＡを構築してもよい。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれであってもよい。
【０２１６】
本明細書で使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列から構成され、かつその相補的な配列を介して共にアニーリングして二本鎖ＲＮＡ分子を形成している、２つのＲＮＡ分子の構築物をさす。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含み得る。
【０２１７】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに相補的である第１および第２の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成される、ステム−ループ構造を有するｓｉＲＮＡをさす。該領域の相補性および配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第１および第２の領域はループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠如によって生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【０２１８】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成される二本鎖ポリヌクレオチド分子を意味し、ＲＮＡおよびＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ。本明細書において、ハイブリッドは、ＤＮＡから構成されるポリヌクレオチドとＲＮＡから構成されるポリヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、キメラは、二本鎖分子を含む鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含有し得ることを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方を含む。単一の転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的なアンチセンス核酸配列の両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築してもよい。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれであってもよい。
【０２１９】
本明細書で使用される場合、標的配列のセンス鎖とは、ある遺伝子を発現している細胞へ本発明の二本鎖核酸分子が導入された場合に完全ｍＲＮＡの翻訳の抑制をもたらすであろう、その遺伝子のｍＲＮＡ配列内またはｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド配列である。遺伝子のｍＲＮＡ配列内またはｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド配列は、標的配列に対応する配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドが、その遺伝子を発現している細胞において、その遺伝子の発現を阻害する場合、標的配列であると決定され得る。遺伝子発現を抑制する二本鎖ポリヌクレオチドは、標的配列と、２〜５ヌクレオチド長の３'オーバーハング（例えば、ｕｕ）とからなり得る。
【０２２０】
本明細書で使用される場合、「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列から構成され、かつ該相補的な配列を介して共にアニーリングして二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成している、２つの分子の構築物をさす。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の一方または両方が、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成されるか（キメラ分子）、またはもう１つの選択肢として分子の一方がＲＮＡから構成され、もう一方がＤＮＡから構成される（ハイブリッド二本鎖）。
【０２２１】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的である第１および第２の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成される、ステム−ループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡをさす。該領域の相補性および配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第１および第２の領域はループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠如によって生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【０２２２】
本明細書で使用される場合、「単離核酸」は、その元の環境（例えば、天然物の場合は自然環境）から取り出した核酸であり、したがって、その自然状態から合成的に変化させた核酸である。本発明において、単離核酸の例としてはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその誘導体が挙げられる。
【０２２３】
標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１に対する二本鎖分子は、遺伝子の通常一本鎖であるｍＲＮＡ転写物と結合し、それにより、翻訳に干渉し、したがって、タンパク質の発現を阻害することにより、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子によってコードされるＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の産生を減少させるかまたは阻害する。本明細書中で証明される通り、いくつかのがん細胞株におけるＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の発現はｄｓＲＮＡによって阻害された（図４）。したがって、本発明は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現している細胞へ導入された場合に、その遺伝子の発現を阻害することができる単離された二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、後述されるものなどのｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムによって設計され得る。
【０２２４】
ＷＨＳＣ１遺伝子についての標的配列は、例えば配列番号：２９および３２のヌクレオチド配列を含み、標的配列は、例えば配列番号：３５および３８のヌクレオチド配列を含む。
【０２２５】
具体的には、本発明は、以下の［１］〜［１８］に記載の二本鎖分子を提供する：
［１］互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成され、細胞に導入された場合にＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のインビボ発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子；
［２］配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列にマッチするｍＲＮＡに対して作用する、［１］に記載の二本鎖分子；
［３］センス鎖が、配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含有している、［１］に記載の二本鎖分子；
［４］約１００ヌクレオチド未満の長さを有する、［３］に記載の二本鎖分子；
［５］約７５ヌクレオチド未満の長さを有する、［４］に記載の二本鎖分子；
［６］約５０ヌクレオチド未満の長さを有する、［５］に記載の二本鎖分子；
［７］約２５ヌクレオチド未満の長さを有する、［６］に記載の二本鎖分子；
［８］約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有する、［７］に記載の二本鎖分子；
［９］介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドから構成される、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の二本鎖分子；
［１０］一般式：５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'（式中、［Ａ］は配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列に対応する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］と相補的な配列を含むアンチセンス鎖である）を有する、［９］に記載の二本鎖分子；
［１１］ＲＮＡから構成される、［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の二本鎖分子；
［１２］ＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成される、［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の二本鎖分子；
［１３］ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１２］に記載の二本鎖分子；
［１４］センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１３］に記載の二本鎖分子；
［１５］ＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１２］に記載の二本鎖分子；
［１６］アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５'末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方がＲＮＡである、［１５］に記載の二本鎖分子；
［１７］隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドから構成される、［１６］に記載の二本鎖分子；ならびに
［１８］１つまたは２つの３'オーバーハングを含有する、［２］に記載の二本鎖分子。
【０２２６】
本発明の二本鎖分子は以下でより詳細に説明される。
【０２２７】
細胞において標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖分子を設計する方法が知られている（例えば米国特許第６，５０６，５５９号（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい）。例えば、ｓｉＲＮＡを設計するためのコンピュータプログラムは、Ａｍｂｉｏｎのウェブサイトから入手可能である（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）。
【０２２８】
コンピュータプログラムは、以下のプロトコルに基づき、二本鎖分子に対する標的ヌクレオチド配列を選択する。
【０２２９】
標的部位の選択：
１．  転写産物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、それぞれのＡＡの存在とその３'側に隣接した１９個のヌクレオチドとを記録する。Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．は、５'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ）および開始コドン近くの領域（７５塩基以内）に対してｓｉＲＮＡを設計することを避けることを推奨している。これは、これらの領域に調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体が、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
２．  潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）とを比較し、他のコード配列との相同性が大きい任意の標的配列を考慮から外す。基本的には、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でのＮＣＢＩサーバーにあるＢＬＡＳＴを用いる（Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25(17):3389-402）。
３．  合成のために適格である標的配列を選択する。評価するために、遺伝子の長さに沿って標的配列をいくつか選択するのが一般的である。
【０２３０】
上記のプロトコルを使用して、本発明の単離二本鎖分子の標的配列を、以下のように設計した。
ＷＨＳＣ１遺伝子に関して、配列番号：２９または３２、および
ＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に関して、配列番号：３５または３８。
【０２３１】
上述の標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ、標的遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力について調査した。したがって、本発明はＷＨＳＣ１遺伝子に関して、配列番号：２９または３２の配列、ＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に関して、配列番号：３５または３８の配列を標的とする二本鎖分子を提供する。
【０２３２】
本発明の二本鎖分子は単一の標的ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子配列を対象としてもよく、または複数の標的ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子配列を対象としてもよい。
【０２３３】
ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の前記標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子には、標的配列に対応する核酸配列、および／または標的配列の相補配列を含有している、単離されたポリヌクレオチドが含まれる。ＷＨＳＣ１遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例には、配列番号：２９もしくは３２の標的配列に対応する配列、および／またはそのような標的配列の相補配列を含有しているものが含まれる。また、ＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例には、配列番号：３５もしくは３８の標的配列に対応する配列、および／またはそのような標的配列の相補配列を含有しているものが含まれる。
【０２３４】
一態様において、二本鎖分子は二本のポリヌクレオチドから構成され、一方のポリヌクレオチドは、標的配列に対応する配列、すなわち、センス鎖を有し、もう一方のポリペプチドは、標的配列の相補配列、すなわち、アンチセンス鎖を有する。このセンス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成する。そのような二本鎖分子の例には、ｄｓＲＮＡおよびｄｓＤ／Ｒ−ＮＡが含まれる。
【０２３５】
別の態様において、二本鎖分子は、標的配列に対応する配列、すなわち、センス鎖と、標的配列の相補配列、すなわち、アンチセンス鎖との両方を有するポリヌクレオチドから構成される。一般に、センス鎖およびアンチセンス鎖は、介在鎖によって連結されており、互いにハイブリダイズすることでヘアピンループ構造を形成する。そのような二本鎖分子の例には、ｓｈＲＮＡおよびｓｈＤ／Ｒ−ＮＡが含まれる。
【０２３６】
換言すると、本発明の二本鎖分子は、標的配列のヌクレオチド配列を有するセンス鎖ポリヌクレオチドと、標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドとから構成されており、両ポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成する。これらのポリヌクレオチドを含む二本鎖分子において、鎖の一方または両方のポリヌクレオチドの一部分はＲＮＡであり得、標的配列がＤＮＡ配列により定義される場合、標的配列内およびその相補配列内のヌクレオチド「ｔ」は、「ｕ」に交換される。
【０２３７】
本発明の１つの態様において、本発明のそのような二本鎖分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖から構成されるステムループ構造を含む。センス鎖およびアンチセンス鎖はループによって連結されていてよい。従って、本発明は、介在一本鎖によって連結されているかまたは介在一本鎖に隣接しているセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成された二本鎖分子も提供する。
【０２３８】
本発明において、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を標的とする二本鎖分子は、配列番号：２９、３２、３５、および３８の中から選択される配列を標的配列として有し得る。好ましい態様において、標的配列は配列番号：２９、３２、３５、または３８の配列である。従って、本発明の二本鎖分子の好ましい例は、配列番号：２９、３２、３５、または３８に対応する配列およびそれらの相補配列において互いにハイブリダイズするポリヌクレオチド、ならびに配列番号：２９、３２、３５、または３８に対応する配列およびそれらの相補配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【０２３９】
しかしながら、本発明はこの例に限定されず、上述の標的配列における軽微な改変は、改変された分子がＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を抑制する能力を保持する限りは許容可能である。本明細書において、核酸配列と関連して使用される「軽微な改変」という句は、配列に対する１つ、２つ、またはいくつかの置換、欠失、付加、または挿入を示す。
【０２４０】
本発明の文脈において、核酸配列における置換、欠失、付加、および／または挿入に対し適用される「いくつか」という用語は、３〜７個、好ましくは３〜５個、さらに好ましくは３〜４個、さらに好ましくは３個の核酸残基を意味しうる。
【０２４１】
本発明によれば、本発明の二本鎖分子は、実施例で利用される方法を用いて、その能力に関して試験することができる。本明細書の以下の実施例では、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子のｍＲＮＡの様々な部分のセンス鎖、またはそれに対して相補的なアンチセンス鎖から構成される二本鎖分子を、標準的な方法に従って、がん細胞株におけるＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子産物の産生を低減させる能力に関して、インビトロで試験した。さらに、例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞に比べた、候補二本鎖分子と接触させた細胞におけるＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子産物の低減は、例えば、実施例１における「定量的ＲＴ−ＰＣＲ」の項で述べられたＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡ用のプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより検出することができる。インビトロでの細胞ベースのアッセイにおいてＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子産物の産生を低減する配列は、続いて、細胞増殖に及ぼすこれらの阻害効果に関して試験することができる。インビトロでの細胞ベースのアッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列は、続いて、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子産物の産生の低減およびがん細胞増殖の低減を確認するために、がんを有する動物、例えばヌードマウス異種移植片モデルを用いて、これらのインビボ能力に関して試験することができる。
【０２４２】
単離ポリヌクレオチドがＲＮＡまたはそれらの誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。本明細書で使用される場合、「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチドユニット間のワトソンクリック型またはフーグスティーン型の塩基対合を表し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的なまたは化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じように互いに結合することができる。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんどまたは全くミスマッチを含有しない安定二本鎖を形成する。さらに、本発明の単離ポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。好ましい態様において、このような二本鎖は１０個のマッチ毎にわずか１個のミスマッチしか含有していない。特に好ましい態様では、二本鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二本鎖はミスマッチを含有しない。
【０２４３】
ポリヌクレオチドは、好ましくは、１０００ヌクレオチド未満の長さを有する。例えば、ポリヌクレオチドは、５００、２００、１００、７５、５０、または２５ヌクレオチド未満の長さを有する。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対する二本鎖分子を形成させるのに、または二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡを調製するのに有用である。ポリヌクレオチドが、二本鎖分子を形成させるために使用される場合、ポリヌクレオチドは、１９ヌクレオチドより長くてもよく、好ましくは、２１ヌクレオチドより長く、より好ましくは、約１９〜２５ヌクレオチドの長さを有する。あるいは、本発明の二本鎖分子は、センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズすることで、５００、２００、１００、７５、５０、または２５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成するような二本鎖分子であってもよい。好ましくは、二本鎖分子は、約１９〜約２５ヌクレオチド対の長さを有する。さらに、二本鎖分子のセンス鎖は、好ましくは、５００、２００、１００、７５、５０、３０、２８、２７、２６、２５個未満のヌクレオチドを含み得、より好ましくは、約１９〜約２５個のヌクレオチドを含む。
【０２４４】
二本鎖分子が細胞へ導入された場合、二本鎖分子は、ＲＩＳＣ複合体のための、ｍＲＮＡ内の相同配列を同定するためのガイドとして機能する。同定された標的ＲＮＡが、ダイサーのヌクレアーゼ活性により切断され分解され、そのことによって、二本鎖分子は、最終的には、ＲＮＡによってコードされたポリペプチドの産生（発現）を減少させるかまたは阻害する。従って、本発明の二本鎖分子は、ストリンジェントな条件の下で、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする一本鎖を生成する能力によって定義され得る。本明細書において、二本鎖分子から生成された一本鎖とハイブリダイズするｍＲＮＡの部分は、「標的配列」または「標的核酸」または「標的ヌクレオチド」と呼ばれる。本発明において、「標的配列」のヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡのＲＮＡ配列のみならず、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡのＤＮＡ配列を使用して示されてもよい。
【０２４５】
本発明の二本鎖分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含有し得る。当技術分野において公知の化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性、および／または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に取り込むことができる他の種類の化学修飾にも気づくであろう（ＷＯ２００３／０７０７４４、ＷＯ２００５／０４５０３７）。一態様では、分解耐性の改善または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、非限定的に、ホスホロチオエート結合、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上）、２'−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２'−デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５'−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ塩基残基の組み込みが挙げられる（米国特許出願第２００６０１２２１３７号）。
【０２４６】
別の態様では、二本鎖分子の安定性を向上させるために、または標的指向化効率を増大させるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、非限定的に、二本鎖分子の２つの相補鎖間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３'または５'末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチド、ならびに２'−デオキシリボヌクレオチドが挙げられる（ＷＯ２００４／０２９２１２）。別の態様では、標的ｍＲＮＡにおける、および／または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性の増減に修飾を用いることができる（ＷＯ２００５／０４４９７６）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、または５−プロピルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デザプリン、７−アルキルプリン、または７−アルケニルプリンに置換することができる。別の態様では、二本鎖分子が３'オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３'末端のヌクレオチドオーバーハングヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに置き換えることができる（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200）。さらに詳細には、公開文献、例えば米国特許出願第２００６０２３４９７０号が利用可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られた分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持していれば、任意の公知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に利用することができる。
【０２４７】
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る（例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合物、すなわちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）およびＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）から構成されるハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方または両方上でＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成することができる。
【０２４８】
ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に該標的遺伝子の発現を阻害することが可能であれば、センス鎖がＤＮＡであり、アンチセンス鎖がＲＮＡであるか、またはその反対のいずれであってもよい。好ましくは、センス鎖のポリヌクレオチドがＤＮＡであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドがＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に該標的遺伝子の発現を阻害する活性があれば、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡから構成されるか、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡおよびＲＮＡから構成されるか、のいずれであってもよい。二本鎖分子の安定性を向上するためには、分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有する事が好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、分子は発現の十分な阻害を誘導する範囲内でＲＮＡである事が必要である。
【０２４９】
キメラ型二本鎖分子の好ましい例では、二本鎖分子の上流部分領域（すなわちセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列に隣接する領域）はＲＮＡである。好ましくは、上流部分領域は、センス鎖の５'側（５'末端）およびアンチセンス鎖の３'側（３'末端）を示す。あるいは、センス鎖の５'末端および／またはアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域が、上流部分領域と称される。すなわち、好ましい態様では、アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５'末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方がＲＮＡから構成される。例えば、本発明のキメラまたはハイブリッド型の二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖：５'−［−−−ＤＮＡ−−−］−３'
３'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５'：アンチセンス鎖、
センス鎖：５'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３'
３'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５'：アンチセンス鎖、および
センス鎖：５'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３'
３'−（−−−ＲＮＡ−−−）−５'：アンチセンス鎖。
【０２５０】
上流部分領域は、好ましくは、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内で、標的配列またはこれに対する相補配列の末端から数えて９個〜１３個のヌクレオチドから構成されるドメインである。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の好ましい例としては、ポリヌクレオチドの少なくとも上流半分の領域（センス鎖では５'側領域およびアンチセンス鎖では３'側領域）がＲＮＡであり、もう半分がＤＮＡである、１９個〜２１個のヌクレオチド鎖長を有するものが挙げられる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現阻害効果が非常に高くなる（米国特許出願第２００５０００４０６４号）。
【０２５１】
本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えば低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびＤＮＡおよびＲＮＡからなる低分子のヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成することができる。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる、タイトなヘアピンターン（ｔｉｇｈｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｔｕｒｎ）を作る、ＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分けられる。一般的に、ヘアピン構造は、細胞機構によってｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡに切断され、続いてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に適合するｍＲＮＡと結合してこれを切断する。
【０２５２】
任意のヌクレオチド配列から構成されるループ配列は、ヘアピンループ構造を形成するために、センス配列とアンチセンス配列との間に位置し得る。したがって、本発明は、一般式５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'（式中、［Ａ］は標的配列に対応する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］は［Ａ］に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である）を有する二本鎖分子も提供する。標的配列は、例えば、
ＷＨＳＣ１に関して、配列番号：２９または３２のヌクレオチド配列、および
ＷＨＳＣ１Ｌ１に関して、配列番号：３５または３８のヌクレオチド配列
の中から選択され得る。
【０２５３】
本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、二本鎖分子が標的となるＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を抑制する能力を保持していれば、これらの例から改変された配列であってもよい。［Ａ］領域は［Ａ'］領域とハイブリダイズし、［Ｂ］領域から構成されるループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、すなわちループ配列は、好ましくは３〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は、ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｂ／ｔｂ＿５０６．ｈｔｍｌから入手可能な配列の中から選択することができる。さらに、２３個のヌクレオチドからなるループ配列は活性ｓｉＲＮＡも提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100(4): 1639-44, Epub 2003 Feb 10；および
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4(6): 457-67。
【０２５４】
ヘアピンループ構造を有する本発明の好ましい二本鎖分子の例は以下に示される。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣ、およびＵＵＣＡＡＧＡＧＡの中から選択することができるが、本発明はこれらに限定されない：
ＣＡＧＡＵＣＵＡＣＡＣＡＧＣＧＧＡＵＡ−［Ｂ］−  ＵＡＵＣＣＧＣＵＧＵＧＵＡＧＡＵＣＵＧ（標的配列  配列番号：２９に関する）；
ＧＵＵＡＡＵＵＧＧＣＡＵＡＵＧＧＡＡＵ−［Ｂ］−ＡＵＵＣＣＡＵＡＵＧＣＣＡＡＵＵＡＡＣ（標的配列  配列番号：３２に関する）；
ＣＵＣＡＣＡＡＡＵＧＧＧＵＡＵＣＣＡＵ−［Ｂ］−ＡＵＧＧＡＵＡＣＣＣＡＵＵＵＧＵＧＡＧ（標的配列  配列番号：３５に関する）；および
ＧＵＡＣＵＧＡＡＡＵＵＣＧＧＡＧＡＣＡ−［Ｂ］−ＵＧＵＣＵＣＣＧＡＡＵＵＵＣＡＧＵＡＣ（標的配列  配列番号：３８に関する）。
【０２５５】
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、いくつかのヌクレオチドを３'オーバーハングとして標的配列のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端に付加することができる。３'オーバーハングを構成するヌクレオチドの好ましい例は「ｔ」および「ｕ」を含むがこれらに限定されない。付加されるヌクレオチドの数は少なくとも２、概して２〜１０、好ましくは２〜５である。付加されるヌクレオチドは二本鎖分子のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端で一本鎖を形成する。二本鎖分子が単一のポリヌクレオチドからなってヘアピンループ構造を形成する場合、３'オーバーハング配列を単一のポリヌクレオチドの３'末端に追加することができる。
【０２５６】
二本鎖分子を調製するための方法は特に限定されないが、当技術分野で公知の化学合成方法を使用するのが好ましい。化学合成方法に従って、センスおよびアンチセンスの一本鎖ポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングの具体的な例では、合成一本鎖ポリヌクレオチドは好ましくは少なくとも約３：７、より好ましくは約４：６、および最も好ましくは実質的に等モル量（すなわち約５：５のモル比）のモル比で混合される。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の通常利用される方法によって精製することができる。精製方法の例としては、アガロースゲル電気泳動を利用するか、または残存一本鎖ポリヌクレオチドが、例えば適当な酵素による分解によって任意で取り除かれる方法が挙げられる。
【０２５７】
あるいは、二本鎖分子は、コーディング配列に近接している、適切な細胞において二本鎖分子の発現を指示する調節配列（例えば、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニットまたはヒトＨ１  ＲＮＡプロモーター）を含有しているベクターへ、コーディング配列をクローニングすることにより、細胞内で転写されてもよい。二本鎖分子のコーディング配列に隣接する調節配列は、発現が独立に、または時間的にもしくは空間的様式で調節され得るよう、同一であってもよいし、または異なっていてもよい。二本鎖分子を産生することができるベクターの詳細は、以下に記載される。
【０２５８】
本発明の二本鎖分子を含有するベクター：
本明細書に記載の二本鎖分子を１つまたは複数含有するベクター、および該ベクターを含有する細胞も本発明に包含される。
【０２５９】
具体的には、本発明は、以下の［１］〜［１１］に記載のベクターを提供する：
［１］細胞に導入された場合にＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のインビボ発現および細胞増殖を阻害する二本鎖分子をコードするベクターであって、
前記分子が、互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成される、前記ベクター；
［２］配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列にマッチするｍＲＮＡに対して作用する二本鎖分子をコードする、［１］に記載のベクター；
［３］センス鎖が、配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列に対応する配列を含有している、［１］に記載のベクター；
［４］約１００ヌクレオチド未満の長さを有する二本鎖分子をコードする［２］または［３］に記載のベクター；
［５］約７５ヌクレオチド未満の長さを有する二本鎖分子をコードする［４］に記載のベクター；
［６］約５０ヌクレオチド未満の長さを有する二本鎖分子をコードする［５］に記載のベクター；
［７］約２５ヌクレオチド未満の長さを有する二本鎖分子をコードする［６］に記載のベクター；
［８］約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有する二本鎖分子をコードする［７］に記載のベクター；
［９］二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］〜［８］のいずれか１つに記載のベクター；ならびに
［１０］一般式５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'（式中、［Ａ］は配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である）を有する二本鎖分子をコードする、［９］に記載のベクター。
［１１］センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせの各々を含み、かつ標的遺伝子の発現を阻害するベクターであって、センス鎖核酸が、配列番号：２９、３２、３５、および３８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖核酸が、センス鎖に相補的な配列からなり、センス鎖およびアンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成する、前記ベクター。
【０２６０】
本発明のベクターは、好ましくは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入された場合に、ベクターが前記分子を発現するであろうことを示す。好ましい態様では、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節要素を含む。したがって、ある態様において、発現ベクターは本発明の核酸配列をコードし、その核酸配列の発現に適合される。そのような本発明のベクターは、本発明の二本鎖分子を生成するのに使用でき、またはがんを治療するための有効成分として直接使用することができる。
【０２６１】
本発明のベクターは、例えば、両方の鎖が（ＤＮＡ分子の転写によって）発現されるような様式で調節配列がＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１配列と機能的に連結するように、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１配列を発現ベクターにクローニングすることによって生成することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングされたＤＮＡの３'末端と隣接するプロモーター配列）によって転写され、ｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えばクローニングされたＤＮＡの５'末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがインビボでハイブリダイズし、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生成する。あるいは、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする２つのベクター構築物は、センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ発現した後、二本鎖分子構築物を形成するために利用する。さらに、クローニングされた配列は二次構造（例えばヘアピン）を有する構築物、すなわち標的遺伝子のセンス配列および相補的なアンチセンス配列の両方を含有するベクターの単一転写産物をコードすることができる。
【０２６２】
本発明のベクターは、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するためにそのようなものを具備することもできる（例えば相同的な組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号、同第５，８０４，５６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，６７９，６４７号、およびＷＯ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡベースの送達技術の例としては、「ネイキッドＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が挙げられる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【０２６３】
本発明のベクターは例えば、ウイルスベクターまたは細菌ベクターを含む。発現ベクターの例としては、弱毒化ウイルス宿主、例えばワクシニアまたは鶏痘が挙げられる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を含む。標的遺伝子を発現する細胞に導入すると、組換えワクシニアウイルスは前記分子を発現し、それにより細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例としてはカルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）が挙げられる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および生成に有用である。例としては、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が挙げられる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【０２６４】
本発明の二本鎖分子を使用した、がん細胞の増殖の阻害もしくは低下、またはがんの治療の方法：
本発明において、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子用のｄｓＲＮＡを、細胞増殖を阻害する能力について試験した。ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子用のｄｓＲＮＡは、いくつかのがん細胞株において遺伝子の発現を効果的にノックダウンし、同時に、細胞増殖を抑制した（図４）。
【０２６５】
従って、本発明は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現の阻害を介して、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の機能不全を誘導することにより、細胞増殖を阻害するための方法を提供する。ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を特異的に標的とする、前記の本発明の二本鎖分子のいずれかによって阻害され得る。ＷＨＳＣ１遺伝子に対する二本鎖分子またはそのような分子をコードするベクターによって増殖が阻害され得るがん細胞の例には、好ましくは、例えば、膀胱癌細胞、乳癌細胞、胆管細胞癌細胞、ＣＭＬ細胞、食道癌細胞、ＨＣＣ細胞、ＮＳＣＬＣ細胞、ＳＣＬＣ細胞、骨肉腫細胞、膵癌細胞、前立腺癌細胞、腎細胞癌細胞、および軟部組織腫瘍細胞が含まれる。ＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対する二本鎖分子またはそのような分子をコードするベクターによって増殖が阻害され得るがん細胞の例には、好ましくは、例えば、膀胱癌細胞、乳癌細胞、ＣＭＬ細胞、肺癌細胞（例えば、ＳＣＬＣ細胞）、およびリンパ腫細胞が含まれる。
【０２６６】
本発明の二本鎖分子およびそのような分子をコードするベクターの、がん細胞の細胞増殖を阻害する能力は、それらが、がんの治療および／または予防のための方法のために使用され得ることを示す。例えば、ＷＨＳＣ１遺伝子に対する二本鎖分子またはそれらをコードするベクターは、好ましくは、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、および軟部組織腫瘍の治療および／または予防において使用され得る。また、例えば、ＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対する二本鎖分子またはそれらをコードするベクターは、好ましくは、膀胱癌、乳癌、ＣＭＬ、肺癌（例えば、ＳＣＬＣ）、およびリンパ腫の治療および／または予防において使用され得る。従って、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子は正常器官においては最小限にしか発現していないため（図１、２、３）、本発明は、ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対する二本鎖分子、またはそれらの分子を発現するベクターを投与することにより、有害作用なしに、がんを有する患者を治療するための方法を提供する。
【０２６７】
具体的には、本発明は、以下の［１］〜［３３］に記載の方法を提供する：
［１］ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を過剰発現している細胞におけるその遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する少なくとも１種の単離された二本鎖分子を投与する段階を含む、がん細胞の増殖の阻害、ならびにがんの治療および／または予防のための方法であって、
前記がん細胞またはがんが、ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現しており、
前記二本鎖分子が、互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成される、前記方法；
［２］ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対する薬学的に有効な量の二本鎖分子またはそれをコードするベクターと、薬学的に許容される担体とを、対象へ投与する段階を含む、対象におけるがんの治療および／または予防の方法であって、
前記二本鎖分子が、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現している細胞へ導入された場合に細胞増殖およびＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を阻害する、前記方法；
［３］二本鎖分子が、配列番号：２９、３２、３５、および３８の標的配列にマッチするｍＲＮＡにおいて作用する、［１］または［２］に記載の方法；
［４］センス鎖が、配列番号：２９、３２、３５、および３８の標的配列に対応する配列を含有している、［１］または［２］に記載の方法；
［５］がんが、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、またはリンパ腫である、［１］〜［４］のいずれかの方法；
［６］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド未満の長さを有する、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の方法；
［７］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド未満の長さを有する、［６］に記載の方法；
［８］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド未満の長さを有する、［７］に記載の方法；
［９］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド未満の長さを有する、［８］に記載の方法；
［１０］二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有する、［９］に記載の方法；
［１１］二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の方法；
［１２］二本鎖分子が一般式５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'（式中、［Ａ］は配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である）を有する、［１１］に記載の方法；
［１３］二本鎖分子がＲＮＡである、［１］〜［１２］のいずれか１つに記載の方法；
［１４］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含有している、［１］〜［１２］のいずれか１つに記載の方法；
［１５］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドおよびＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１４］に記載の方法；
［１６］センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、それぞれ、ＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１５］に記載の方法；
［１７］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡのキメラである、［１４］に記載の方法；
［１８］アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５'末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡから構成される、［１７］に記載の方法；
［１９］隣接する領域が９〜１３ヌクレオチドから構成される、［１８］に記載の方法；
［２０］二本鎖分子が１個または２個の３'オーバーハングを含有している、［１］〜［１９］のいずれか１つに記載の方法；
［２１］二本鎖分子またはベクターが、該分子に加え、トランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む組成物に含有されている、［１］〜［２０］のいずれか１つに記載の方法；
［２２］二本鎖分子がベクターによってコードされる、［１］に記載の方法；
［２３］ベクターによってコードされる二本鎖分子が、配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列にマッチするｍＲＮＡにおいて作用する、［２２］に記載の方法；
［２４］ベクターによってコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列に対応する配列を含有している、［２３］に記載の方法；
［２５］がんが、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、またはリンパ腫である、［２２］〜［２４］のいずれか１つに記載の方法；
［２６］ベクターによってコードされる二本鎖分子が約１００ヌクレオチド未満の長さを有する、［２２］〜［２５］のいずれか１つに記載の方法；
［２７］ベクターによってコードされる二本鎖分子が約７５ヌクレオチド未満の長さを有する、［２６］に記載の方法；
［２８］ベクターによってコードされる二本鎖分子が約５０ヌクレオチド未満の長さを有する、［２７］に記載の方法；
［２９］ベクターによってコードされる二本鎖分子が約２５ヌクレオチド未満の長さを有する、［２８］に記載の方法；
［３０］ベクターによってコードされる二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有する、［２９］に記載の方法；
［３１］ベクターによってコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［２２］〜［３０］のいずれか１つに記載の方法；
［３２］ベクターによってコードされる二本鎖分子が一般式５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'（式中、［Ａ］は配列番号：２９、３２、３５、および３８の標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である）を有する、［３１］に記載の方法；ならびに
［３３］ベクターによってコードされる二本鎖分子が、該分子に加え、トランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む組成物に含有されている、［２２］〜［３２］のいずれか１つに記載の方法。
【０２６８】
さらに、別の態様において、［１］ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を過剰発現している細胞におけるその遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する少なくとも１種の単離された二本鎖分子を投与する段階を含む、
（ａ）がん細胞の増殖の阻害、
（ｂ）がんの治療、ならびに
（ｂ）がんの予防
からなる群より選択される目的のための方法であって、
前記がん細胞またはがんが、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子のいずれかまたは両方を発現しており、
前記二本鎖分子が、互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成される、前記方法が提供される。
【０２６９】
さらに、別の態様において、［２］ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対する薬学的に有効な量の二本鎖分子またはそれをコードするベクターと、薬学的に許容される担体とを、対象へ投与する段階を含む、対象におけるがんの治療および予防のいずれかまたは両方の方法であって、前記二本鎖分子が、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現している細胞へ導入された場合に細胞増殖およびＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を阻害する、前記方法も、提供される。
【０２７０】
本発明の方法を、以下に、より詳細に説明する。
【０２７１】
ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現している細胞の増殖は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対する二本鎖分子、該分子を発現するベクター、またはそれらを含有している組成物と、細胞を接触させることにより阻害され得る。さらに、細胞をトランスフェクション剤と接触させることもできる。好適なトランスフェクション剤は当技術分野で公知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、その細胞が、分子に曝露されていない細胞と比較して、より低い速度で増殖するか、または減少した生存能を有することを示す。細胞増殖は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、ＭＴＴ細胞増殖アッセイを使用して、測定され得る。
【０２７２】
細胞が、本発明の二本鎖分子の標的遺伝子を発現しているかまたは過剰発現している限り、任意の種類の細胞の増殖が、本発明の方法によって抑制され得る。ＷＨＳＣ１遺伝子を過剰発現している例示的な細胞には、例えば、膀胱癌細胞、乳癌細胞、胆管細胞癌細胞、ＣＭＬ、食道癌細胞、ＨＣＣ細胞、ＮＳＣＬＣ細胞、ＳＣＬＣ細胞、骨肉腫細胞、膵癌細胞、前立腺癌細胞、腎細胞癌細胞、および軟部組織腫瘍が含まれる。ＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を過剰発現している例示的な細胞には、例えば、膀胱癌細胞、乳癌細胞、ＣＭＬ細胞、肺癌細胞（例えば、ＳＣＬＣ細胞）、およびリンパ腫細胞が含まれる。
【０２７３】
従って、ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１の過剰発現に関連した疾患に罹患しているかまたはそれを発症するリスクを有する患者は、少なくとも１種の本発明の二本鎖分子、その分子を発現する少なくとも１種のベクター、またはそれらの分子を含有している組成物を投与することにより治療され得る。例えば、がん患者が、本発明の方法により治療され得る。がんの種類は、診断される腫瘍の特定の種類に応じて、標準的な方法により同定され得る。より好ましくは、本発明の方法により治療される患者は、ＲＴ−ＰＣＲまたはイムノアッセイにより、患者由来の生検標本または試料におけるＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を検出することにより選択される。好ましくは、本発明の治療の前に、対象由来の生検標本または試料は、当技術分野において公知の方法、例えば、免疫組織化学的分析またはＲＴ−ＰＣＲのような、「がんを診断するための方法」の項に記載される方法により、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の過剰発現について確認される。
【０２７４】
細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子は、該分子と対応するｍＲＮＡ転写産物との間の結合を達成する形態で、細胞に直接導入することができる。あるいは、上記のように、二本鎖分子をコードするＤＮＡは、ベクターとして細胞に導入することができる。二本鎖分子またはベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤、例えばＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｗａｋｏ  ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を利用することができる。
【０２７５】
治療は、臨床的利点、例えばＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現の低減、または対象におけるがんのサイズ、蔓延、もしくは転移能の減少をもたらす場合に、「有効」とみなされる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、治療ががんの形成を遅らせるもしくは防ぐか、またはがんの臨床症状を防ぐかもしくは緩和するという意味である。有効性（Ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓｎｅｓｓ）は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の公知の方法に関連して求められる。
【０２７６】
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量でＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のｍＲＮＡを分解することが理解される。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、本発明の二本鎖分子によって、触媒的様式で標的ｍＲＮＡの分解が起こると考えられている。したがって、標準的ながん治療に比べて、治療効果を発揮するためにがん部位またはその近くに送達されることが必要な二本鎖分子は有意に少ない。
【０２７７】
当業者は、例えば対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状、および他の状態；投与経路；ならびに投与が局所的または全身的のいずれであるかなどの因子を考慮して、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を容易に求めることができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、がん部位またはその近くにおいて約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭである細胞内濃度である。より多くのまたはより少ない量の二本鎖分子を投与することができることが意図される。特定の状況において必要とされる正確な用量は、当業者により容易にかつルーチン的に決定されうる。
【０２７８】
本発明の方法は、ＷＨＳＣ１および／またはＷＨＳＣ１Ｌ１を発現しているがんの増殖または転移を阻害するために使用され得る。例えば、ＷＨＳＣ１を発現しているがんには、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、および軟部組織腫瘍が含まれる。例えば、ＷＨＳＣ１Ｌ１を発現しているがんには、膀胱癌、乳癌、ＣＭＬ、肺癌（例えば、ＳＣＬＣ）、およびリンパ腫が含まれる。特に、ＷＨＳＣ１の標的配列（好ましくは、配列番号：２９もしくは３２）またはＷＨＳＣ１Ｌ１の標的配列（好ましくは、配列番号：３５もしくは３８）に対応するヌクレオチド配列を含有している二本鎖分子が、がんの治療のために特に好ましい。
【０２７９】
がんを治療するために、本発明の二本鎖分子は、本発明の二本鎖分子とは異なる薬学的物質と併用して対象に投与することもできる。あるいは、本発明の二本鎖分子は、がんを治療するために設計された別の治療法と併用して対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、がんを治療するまたはがん転移を予防するのに現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術、および化学療法剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、またはタモキシフェンを用いた治療）と併用して投与することができる。
【０２８０】
本方法において、本発明の二本鎖分子は、送達試薬と共にネイキッド二本鎖分子として、または該二本鎖分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとしてのいずれかで対象に投与することができる。
【０２８１】
本発明の二本鎖分子と共に投与するのに好適な送達試薬としては、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）、またはリポソームが挙げられる。好ましい送達試薬はリポソームである。
【０２８２】
リポソームは、特定の組織、例えば肺の腫瘍組織への二本鎖分子の送達に役立ち、二本鎖分子の血中半減期も増大させ得る。本発明における使用に好適なリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、概してこれには、中性または負に帯電したリン脂質およびステロール、例えばコレステロールが含まれる。一般的には、所望のリポソームサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期などの因子を考慮して、脂質の選択が導かれる。リポソームを調製するのに、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号（その開示全体が参照により本明細書に引用される）で記載されるような様々な方法が知られている。
【０２８３】
好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、リポソームをがん部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍または血管内皮細胞に広まった受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が好ましい。
【０２８４】
特に好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを避けるように改変される。一態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
【０２８５】
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用される場合、オプソニン化阻害部分は、例えば脂質−可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、膜と化学的にまたは物理的に接着する場合に、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えば米国特許第４，９２０，０１６号（その開示内容全体は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および網内系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分を用いて改変されたリポソームは、非改変リポソームよりも非常に長く循環中に留まる。この理由から、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
【０２８６】
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性」微小血管系によって送り込まれる組織中で集積することが知られている。したがって、そのような微小血管系の欠陥を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍は、効率的にこれらのリポソームを集積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減が、肝臓および脾臓における有意な集積を防ぐことによって、ステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分を用いて改変された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
【０２８７】
リポソームを改変するのに好適なオプソニン化阻害部分は、好ましくは、分子量が約５００ダルトン〜約４０，０００ダルトン、およびより好ましくは約２，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンの水溶性ポリマーであり得る。そのようなポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびＰＥＧまたはＰＰＧステアレート；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドン；直鎖、分岐、または樹状のポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えばカルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド、例えばガングリオシドＧＭ１が挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、もしくはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン；アミノ化多糖またはオリゴ糖（直鎖状または分岐状）；または、例えばカルボン酸基の結果として生じた連結を有するカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
【０２８８】
好ましくは、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を用いて改変したリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
【０２８９】
オプソニン化阻害部分は、多くの公知の技術のいずれか１つによってリポソーム膜と結合することができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、６０℃でＮａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば３０：１２の比のテトラヒドロフランおよび水を用いて、還元アミノ化によってステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０２９０】
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で検討されている。少なくとも１種の本発明の二本鎖分子を発現するそのようなベクターもまた、直接、またはＭｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（例えばポリリシン）、またはリポソームを含む好適な送達試薬と共に、投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者のがん領域に送達する方法は当技術分野の技術範囲内である。
【０２９１】
本発明の二本鎖分子は、二本鎖分子をがん部位に送達するのに好適な任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば、二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。
【０２９２】
好適な腸内投与経路としては、経口、直腸、または鼻腔内送達が挙げられる。
【０２９３】
好適な非経口投与経路としては、血管内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管系へのカテーテル点滴注入）；周囲組織および組織内への注射（例えば腫瘍周囲および腫瘍内注射）；皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによって）；例えばカテーテルもしくは他の留置装置（例えば、多孔性、非孔性、またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント）による、がん部位の領域またはその近くの領域への直接適用；ならびに吸入が挙げられる。二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、がんの部位でまたはその近くで行われることが好ましい。
【０２９４】
本発明の二本鎖分子は、単回投与または複数回の投与で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入によるものである場合、注入は、単回の持続投与で行うか、または複数回の注入によって送達することができる。組織に直接的に行われる物質の注射は、がん部位、またはがん部位の近くで行うことが好ましい。がん部位の組織にまたはがん部位の近くの組織に物質を複数回注射することが特に好ましい。
【０２９５】
当業者は容易に、本発明の二本鎖分子を所定の対象に投与するのに適当な投与計画を決定することもできる。例えば、二本鎖分子は、例えばがん部位でのまたはその近くでの単回注射または沈着として、対象に１回で投与することができる。あるいは、二本鎖分子は、約３日〜約２８日、より好ましくは約７日〜約１０日の間、１日１回または２回、対象に投与することができる。好ましい投与計画では、二本鎖分子は１日１回７日間、がん部位にまたはその近くに注射される。投与計画に複数回の投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与計画全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことが理解される。
【０２９６】
本発明において、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を過剰発現しているがんは、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）該二本鎖分子をコードするＤＮＡ、および
（ｃ）該二本鎖分子をコードするベクター：
からなる群より選択される少なくとも１種の活性成分により治療され得る。
【０２９７】
がんには、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、またはリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。従って、活性成分としての本発明の二本鎖分子の投与の前に、処置されるがん細胞またはがん組織におけるＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルが、同一器官の正常細胞と比較して増強されていることを確認することが好ましい。従って、１つの態様において、本発明は、
（ｉ）治療すべきがんを有する対象から得られたがん細胞またはがん組織におけるＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを決定する段階；
（ｉｉ）ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルを正常対照と比較する段階；ならびに
（ｉｉｉ）正常対照と比較してＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を過剰発現しているがんを有する対象へ、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）該二本鎖分子をコードするＤＮＡ、および
（ｃ）該二本鎖分子をコードするベクター：
からなる群より選択される少なくとも１種の成分を投与する段階
を含み得る、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を過剰発現しているがんを治療する方法を提供する。あるいは、本発明は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を過剰発現しているがんを有する対象への投与において使用するための、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）該二本鎖分子をコードするＤＮＡ、および
（ｃ）該二本鎖分子をコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも１種の成分を含む薬学的組成物も提供する。換言すると、本発明は、対象由来のがん細胞またはがん組織におけるＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルを決定する段階であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較したレベルの増加が、対象が本発明の二本鎖分子により治療され得るがんを有することを示す、前記段階を含み得る、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）該二本鎖分子をコードするＤＮＡ、または
（ｃ）該二本鎖分子をコードするベクター
により治療すべき対象を特定するための方法をさらに提供する。
【０２９８】
本発明のがんを治療する方法は、以下にさらに詳細に説明されるであろう。
【０２９９】
本発明により治療される対象は、好ましくは、哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【０３００】
本発明によると、対象から得られたがん細胞またはがん組織におけるＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルが決定される。発現レベルは、当技術分野において公知の方法を使用して、転写産物（ｍＲＮＡ）レベルで決定され得る。例えば、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）、チップまたはアレイ、プローブ、ＲＴ−ＰＣＲが、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の転写産物レベルを決定するために使用され得る。
【０３０１】
あるいは、翻訳産物（ポリペプチドまたはタンパク質）が、本発明の治療のため検出されてもよい。例えば、観察されたタンパク質の量が決定され得る。
【０３０２】
翻訳産物に基づき、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現レベルを検出するための別の方法として、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質に対する抗体を使用した免疫組織化学的分析によって、染色の強度が測定されてもよい。すなわち、この測定において、強力な染色は、タンパク質の存在／レベルの増加を示し、同時に、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の高い発現レベルを示す。
【０３０３】
ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドの検出または測定の方法は、上記のように例示され得る（がんを診断するための方法）。
【０３０４】
本発明の二本鎖分子を含有している組成物：
上記に加えて、本発明は、本発明の二本鎖分子またはその分子をコードするベクターを含む薬学的組成物も提供する。
【０３０５】
具体的には、本発明は、以下の組成物［１］〜［３３］を提供する：
［１］ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１の発現および細胞増殖を阻害する単離された二本鎖分子を含む、がん細胞の増殖の阻害、およびがんの治療のための組成物であって、
前記がん細胞およびがんが、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現しており、
前記分子が、互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成される、前記組成物；
［２］ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対する薬学的に有効な量の二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、がんの治療および／または予防のための組成物であって、
前記二本鎖分子が、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現している細胞へ導入された場合に細胞増殖およびＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を阻害する、前記組成物；
［３］二本鎖分子が、配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列にマッチするｍＲＮＡにおいて作用する、［１］または［２］に記載の組成物；
［３］二本鎖分子、センス鎖が、配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列に対応する配列を含有している、［１］または［２］に記載の組成物；
［５］がんが、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、またはリンパ腫である、［１］に記載の組成物；
［６］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド未満の長さを有する、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の組成物；
［７］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド未満の長さを有する、［６］に記載の組成物；
［８］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド未満の長さを有する、［７］に記載の組成物；
［９］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド未満の長さを有する、［８］に記載の組成物；
［１０］二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有する、［９］に記載の組成物；
［１１］二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の組成物；
［１２］二本鎖分子が一般式５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'（式中、［Ａ］は配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖配列であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である）を有する、［１１］に記載の組成物；
［１３］二本鎖分子がＲＮＡである、［１］〜［１２］のいずれか１つに記載の組成物；
［１４］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１］〜［１２］のいずれか１つに記載の組成物；
［１５］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドおよびＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１４］に記載の組成物；
［１６］センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、それぞれ、ＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１５］に記載の組成物；
［１７］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡのキメラである、［１４］に記載の組成物；
［１８］アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５'末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡから構成される、［１５］に記載の組成物；
［１９］隣接する領域が９〜１３ヌクレオチドから構成される、［１８］に記載の組成物；
［２０］二本鎖分子が１個または２個の３'オーバーハングを含有している、［１］〜［１９］のいずれか１つに記載の組成物；
［２１］トランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む、［１］〜［２０］のいずれかの組成物；
［２２］二本鎖分子がベクターによってコードされる、［１］〜［２１］のいずれか１つに記載の組成物；
［２３］ベクターによってコードされる二本鎖分子が、配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列にマッチするｍＲＮＡにおいて作用する、［２２］に記載の組成物；
［２４］ベクターによってコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列に対応する配列を含有している、［２２］に記載の組成物；
［２５］がんが、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、またはリンパ腫である、［２２］〜［２４］のいずれか１つに記載の組成物；
［２６］ベクターによってコードされる二本鎖分子が約１００ヌクレオチド未満の長さを有する、［２２］〜［２５］のいずれか１つに記載の組成物；
［２７］ベクターによってコードされる二本鎖分子が約７５ヌクレオチド未満の長さを有する、［２６］に記載の組成物；
［２８］ベクターによってコードされる二本鎖分子が約５０ヌクレオチド未満の長さを有する、［２７］に記載の組成物；
［２９］ベクターによってコードされる二本鎖分子が約２５ヌクレオチド未満の長さを有する、［２８］に記載の組成物；
［３０］ベクターによってコードされる二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有する、［２９］に記載の組成物；
［３１］ベクターによってコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、［２２］〜［２９］のいずれか１つに記載の組成物；
［３２］二本鎖分子が一般式５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'（式中、［Ａ］は配列番号：２９、３２、３５、または３８の標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である）を有する、［３１］に記載の組成物；ならびに
［３３］トランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む、［２２］〜［３２］のいずれか１つに記載の組成物。
【０３０６】
さらに、別の態様において、［２］ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子に対する薬学的に有効な量の二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための組成物であって、前記二本鎖分子が、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現している細胞へ導入された場合に細胞増殖およびＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を阻害する、前記組成物が提供される。
【０３０７】
本発明の適切な組成物が、さらに詳細に以下に記載される。
【０３０８】
本発明の二本鎖分子は、好ましくは、当技術分野で公知の技術に従って、対象に投与する前に薬学的組成物として調合することができる。本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌でありかつパイロジェンを含まないことを特徴とする。本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」は、ヒトおよび獣医学的使用のための製剤を含む。本発明の薬学的組成物を調製する方法は、例えばRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.(1985)（その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載のように当技術分野の技術範囲内である。
【０３０９】
本発明の薬学的組成物は、生理学的または薬学的に許容可能な担体媒体と組み合わせて、本発明の二本鎖分子もしくはこの分子をコードするベクター（例えば０．１重量％〜９０重量％）、または該分子の生理学的に許容可能な塩を含有する。好ましい生理学的または薬学的に許容可能な担体媒体は、水、緩衝水、通常の生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
【０３１０】
さらに、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物においてリポソーム中に含有され得る。リポソームの詳細に関しては、「二本鎖分子を使用した、がんの治療の方法」の項を参照されたい。
【０３１１】
本発明の薬学的組成物は、従来の薬学的賦形剤および／または添加剤も含み得る。好適な薬学的賦形剤としては、例えば安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、およびｐＨ調整剤が挙げられる。好適な添加剤としては、例えば生理学的に生体適合性がある緩衝剤（例えば塩酸トロメタミン）、キレート剤（ｃｈｅｌａｎｔ）の添加物（例えばＤＴＰＡもしくはＤＴＰＡ−ビスアミド）もしくはカルシウムキレート錯体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、または任意でカルシウム塩もしくはナトリウム塩の添加物（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、もしくは乳酸カルシウム）が挙げられる。本発明の薬学的組成物は、液体形態での使用のために包装されていても、または凍結乾燥されていてもよい。
【０３１２】
固体組成物には、従来の非毒性固体担体、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。
【０３１３】
例えば、経口投与用の固体薬学的組成物は、上記で列挙された担体および賦形剤のいずれかと、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子とを含み得る。エアロゾル（吸入）投与用の薬学的組成物は、上記のようにリポソームに封入された０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子と、噴霧剤とを含み得る。所望に応じて、担体、例えば鼻腔内送達ではレシチンが含まれ得る。
【０３１４】
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のインビボ機能を阻害しない限り、他の薬学的に活性のある成分を含有することができる。例えば本発明の組成物は、がんを治療するのに従来使用される化学療法剤を含有することができる。
【０３１５】
別の態様において、本発明は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を特徴とするがんの治療および／または予防用の薬学的組成物の製造における、本発明の二本鎖分子の使用も提供する。例えば、本発明は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現しているがんの治療用の薬学的組成物の製造のための、細胞におけるＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子の使用に関し、該分子は、互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とを含み、かつ配列番号：２９、３２、３５、または３８の配列を標的とする。
【０３１６】
あるいは、本発明は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を過剰発現している細胞におけるこの遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子と共に薬学的または生理学的に許容可能な担体を調合するための段階を含む、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を特徴とするがんの治療および／または予防用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスをさらに提供し、該分子は、活性成分として、互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とを含み、かつ配列番号：２９、３２、３５、または３８の配列を標的とする。
【０３１７】
あるいは、本発明はさらに、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を発現するがんの治療における使用のための、本発明の二本鎖核酸分子も提供する。
【０３１８】
別の態様において、本発明はまた、活性成分を薬学的または生理学的に許容可能な担体と混和するための段階を含む、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子の発現を特徴とするがんの治療および／または予防用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスも提供し、該活性成分は、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を過剰発現している細胞におけるこの遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子であり、該分子は、互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とを含み、かつ配列番号：２９、３２、３５、または３８の配列を標的とする。
【０３１９】
以降に、実施例を参照しながら本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、以下の材料、方法、および例は本発明の局面を例示したものに過ぎず、これらは本発明の範囲を限定する意図はない。したがって、本明細書に記載されるものと類似する、または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができる。
【０３２０】
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料を以下で説明する。本明細書に記載される全ての公報、特許出願、特許、および他の参照は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。矛盾が生じた場合は、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０３２１】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【０３２２】
実施例１：一般的方法
膀胱組織試料およびＲＮＡ調製
膀胱切開術または経尿道的膀胱腫瘍切除術（ＴＵＲＢＴ）のいずれかの際に、原発性尿路上皮癌の外科的標本１２０例を収集し、液体窒素中で急速凍結させた。正常膀胱尿路上皮組織の標本２２例を、悪性病変の証拠がない患者の巨視的に正常な膀胱尿路上皮の区域から収集した。厚さ７μｍの５つの連続切片を、各組織から切り出し、製造業者のプロトコルに従い、Ｈｉｓｔｏｇｅｎｅ（商標）染色溶液（Ａｒｃｔｕｒｕｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して染色し、無関係のコンサルタント泌尿組織病理学者が細胞充実性および腫瘍悪性度について評価した。次いで、スライドを、Ｐｉｘ  Ｃｅｌｌ  ＩＩレーザーキャプチャー顕微鏡（Ａｒｃｔｕｒｕｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したマイクロダイセクションに移した。この技術は、関心対象の細胞の上で熱可塑性フィルムを融解させ、それに細胞を接着させるため、低出力の赤外レーザーを利用する。さらに、炎症細胞浸潤の程度（低、中、および高）によって、切片の悪性度を決定した。著しい炎症細胞浸潤を示す試料は、排除した（Wallard M et al.Br J Cancer 94:569-577,2006）。
【０３２３】
およそ１０，０００個の細胞を、各組織の間質コンパートメントおよび上皮／腫瘍コンパートメントの両方から顕微解剖した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  Ｃｒａｗｌｅｙ，  ＵＫ）を使用して抽出した。著しい炎症細胞浸潤を含有している腫瘍または間質の著しい炎症区域を含む、がんまたは間質の区域は、コンタミネーションを防止するため、回避した（Wallard M et al. Br J Cancer 94:569-577,2006）。全ＲＮＡを逆転写し、下記のようにｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。そのような小規模な試料からのＲＮＡの収量は低いため、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）定量化は実施せず、無処置の出発ＲＮＡの量の正確な尺度として、内在性１８Ｓ  ＣＴ値についての補正を使用した。マイクロダイセクションの精度を検証するため、ビメンチンおよびウロプラキン用のプライマーおよびプローブを調達し、製造業者の指示に従い、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した（Ａｓｓａｙｓ  ｏｎ  ｄｅｍａｎｄ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）。ビメンチンは、間葉系由来細胞に主として発現しており、間質マーカーとして使用された。ウロプラキンは、尿路上皮分化のマーカーであり、最大９０％もの上皮由来腫瘍で保存されている（Olsburgh J et al.J Pathol 199:41-49,2003）。実施例における組織の使用は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ｓｈｉｒｅ  Ｌｏｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｒｅｆ  ０３／０１８）によって承認された。
【０３２４】
組織マイクロアレイのための肺組織試料
腫瘍切除前に抗がん治療を受けていない患者に由来する原発性非ＳＣＬＣ（ＮＳＣＬＣ）組織試料および切除縁に近接するその対応する正常組織は、インフォームドコンセントの上で以前に入手されたものであった（Kato T,et al.Cancer Res 2005;65:5638-46、Kikuchi T,et al.Oncogene 2003;22:2129-205、Taniwaki M,et al.Int J Oncol 2006;29:567-75）。全ての腫瘍を、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｃｅｒの病理学的なＴＮＭ分類に基づき病期決定した。組織マイクロアレイにおける免疫染色のため使用された、ホルマリン固定された原発性肺腫瘍および近接正常肺組織試料は、Ｓａｉｔａｍａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｉｔａｍａ，Ｊａｐａｎ）で根治手術を受けた患者３２８人から入手されたものであった（Ishikawa N, et al.Clin Cancer Res 2004;10:8363-70、Ishikawa N, et al.Cancer Res 2007;67:11601-11）。当研究にとって適格となるよう、以下の基準を全て満たす患者から腫瘍試料を選択した：（ａ）組織学的に確認された病期（ｐＴ１〜ｐＴ３、ｐＮ０〜ｐＮ２、およびｐＭ０のみ）を有する原発性ＮＳＣＬＣに罹患していた患者；（ｂ）根治手術を受けたが、術前処置は受けていない患者；（ｃ）彼らのうち、陽性リンパ節転移（ｐＮ１、ｐＮ２）を有するＮＳＣＬＣ患者は、外科的切除後、白金に基づく補助化学療法により処置されたが、ｐＮ０を有する患者は、補助化学療法を受けなかった；および（ｄ）臨床的な追跡データが入手可能であった患者。本研究および言及された全ての臨床的材料の使用は、個々の機関の倫理委員会によって承認された。
【０３２５】
細胞培養
全ての細胞株を次の適切な培地で単層で増殖させた：ＩＭＲ−９０、２５３Ｊ、２５３Ｊ−ＢＶ、ＨＴ１１９７、ＨＴ１３７６、Ｊ８２、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭＵＣ３膀胱癌細胞、およびＳＢＣ５小細胞肺癌細胞にはイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）；５６３７膀胱癌細胞、ならびにＡ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、およびＬＣ３１９非小細胞肺癌細胞、ならびにＳＮＵ４７５肝細胞癌細胞にはＲＰＭＩ１６４０培地；ＥＪ２８膀胱癌細胞、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ非小細胞肺癌細胞、ＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞、および２９３Ｔ細胞にはダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）；ＲＴ４およびＴ２４膀胱癌細胞ならびにＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞にはＭｃＣｏｙ'ｓ  ５Ａ培地；ＳＷ７８０細胞およびＳＷ４８０細胞には１０％ウシ胎仔血清および１％抗生物質／抗真菌溶液（Ｓｉｇｍａ）が補足されたＬｅｉｂｏｖｉｔｚ'ｓ  Ｌ−１５。ＬｏＶｏ細胞は、２０％ウシ胎仔血清および１％抗生物質／抗真菌溶液（Ｓｉｇｍａ）が補足されたＨａｍ'ｓ  Ｆ−１２培地で培養した。ＳＡＥＣ細胞は、５２μｇ／ｍｌウシ下垂体抽出物、０．５ｎｇ／ｍｌヒト組換えＥＧＦ、０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、０．５μｇ／ｍｌエピネフリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、５μｇ／ｍｌインスリン、０．１ｍｇ／ｍｌレチノイン酸（ＲＡ）、６．５ｎｇ／ｍｌトリヨードチロ二ン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン／アンホテリシンＢ（ＧＡ−１０００）、および５０μｇ／ｍｌ脂肪酸不含ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が補足された小気道上皮細胞基本培地で維持した。全ての細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２を含むか（ＩＭＲ−９０、ＳＡＥＣ、５６３７、２５３Ｊ、２５３Ｊ−ＢＶ、ＥＪ２８、ＨＴ１１９７、ＨＴ１３７６、Ｊ８２、ＲＴ４、ＳＣａＢＥＲ、Ｔ２４、ＵＭＵＣ３、Ａ５４９、Ｈ２１７０、ＬＣ３１９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＳＢＣ５、２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＮＵ４７５、Ｈｕｈ７、およびＬｏＶｏ）またはＣＯ２を含まない（ＳＷ７８０およびＳＷ４８０）湿潤空気中で維持した。製造業者のプロトコルに従い、ＦｕＧＥＮＥ６（ＲＯＣＨＥ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、細胞をトランスフェクトした。
【０３２６】
ｃＤＮＡマイクロアレイを使用したがんにおける発現プロファイリング
本発明者らは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））のＵｎｉＧｅｎｅデータベースから選択された３６，８６４種のｃＤＮＡを用いて、網羅的なゲノムｃＤＮＡマイクロアレイを確立した。このマイクロアレイシステムは、以前に記載されたのと本質的に同様に構築された（Kikuchi T et al. Oncogene 22:2192-2205,2003、Kitahara O et al. Cancer Res 61:3544-3549,2001、Nakamura T et al.Oncogene 23:2385-2400,2004）。簡単に説明すると、様々なヒト器官から単離されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として使用したＲＴ−ＰＣＲによって、ｃＤＮＡを増幅した；いかなる反復配列またはポリ（Ａ）配列を含まないアンプリコンの長さは、２００〜１１００ｂｐの範囲であった。多くの種類の腫瘍および対応する非新生物組織を、以前に記載されたように、８μｍで調製した（Kitahara O et al. Cancer Res 61:3544-3549,2001）。全部で３０，０００〜４０，０００種のがん細胞または非がん細胞を、製造業者のプロトコルに従って、ＥＺ  ｃｕｔシステム（ＳＬ  Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して選択的に収集した。全ＲＮＡの抽出、Ｔ７に基づく増幅、およびプローブの標識を、以前に記載されたように実施した（Kitahara O et al. Cancer Res 61:3544-3549,2001）。次いで、各々のがん組織および非がん組織に由来する２回増幅ＲＮＡ（ａＲＮＡ）の一定分量２．５μｇを、それぞれ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰまたはＣｙ５−ｄＣＴＰにより標識した。
【０３２７】
定量的リアルタイムＰＣＲ
以前に記載されたように、本発明者らは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ'ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて膀胱癌組織１２１例および正常膀胱組織２４例を調製した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応のため、全てのヒトＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）、ヒトＳＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）、ヒトＷＨＳＣ１、およびヒトＷＨＳＣ１Ｌ１用の特異的プライマーを設計した（プライマー配列は表１に記載）。製造業者のプロトコルに従って、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を使用して、ＰＣＲ反応を実施した。ＵＮＧを含まない５０％  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）、各５０ｎＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマー、ならびに２μｌの逆転写ｃＤＮＡを適用した。増幅条件は、まず、９５℃５分、次いで、９５℃１０秒、５５℃１分、および７２℃１０秒から各々なる４５サイクルであった。この後、融解曲線を描くため、９５℃で１５秒間、６５℃で１分間、試料をインキュベートし、５０℃に１０秒間冷却した。標的遺伝子増幅用の反応条件は、上記の通りであり、逆転写されたＲＮＡ  ５ｎｇを各反応において使用した。
【０３２８】
（表１）定量的ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマー配列
2013518560.tif 000002
【０３２９】
免疫組織化学染色
ヒト膀胱組織の切片を、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）ＡＢＣキット（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＣＡ，ＵＳＡ）により染色した。簡単に説明すると、キシレンにより脱パラフィン処理され脱水された切片の内在性ペルオキシダーゼ活性を、０．３％Ｈ２Ｏ２／メタノールによる処理により阻害した。周囲温度で３０分間、加湿チャンバー内で３％ＢＳＡと共に切片をインキュベートすることにより、非特異的結合をブロッキングし、続いて、５００倍希釈のウサギポリクローナル抗ＷＨＳＣ１（ＨＰＡ０１５８０１，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）抗体と共に４℃で一夜インキュベートした。切片をＰＢＳ（−）により２回洗浄し、１％ＢＳＡを含有しているＰＢＳ（−）において、５００倍希釈のヤギ抗ウサギビオチン化ＩｇＧおよび５００倍希釈のヤギ抗マウスビオチン化ＩｇＧと共に周囲温度で３０分間インキュベートし、次いで、ＡＢＣ試薬と共に３０分間インキュベートした。特異的な免疫染色を３，３'−ジアミノベンジジンにより可視化した。段階的なアルコールおよびキシレンによる洗浄によりスライドを脱水し、カバーガラスにマウントした。核の対比染色のため、ヘマトキシリンを使用した。
【０３３０】
膀胱腫瘍および肺腫瘍ならびに正常ヒト組織におけるＷＨＳＣ１の発現パターンを、以前に記載されたように免疫組織化学により調査した（Unoki M,et al. Br J Cancer 2009;101:98-105）。簡単に説明すると、パラフィン包埋された膀胱腫瘍標本および正常ヒト組織のスライドを、抗原賦活液、高ｐＨ９（Ｓ２３６７，Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）において高圧下で処理し（１２５℃３０秒）、ペルオキシダーゼブロッキング試薬により処理し、次いで、タンパク質ブロッキング試薬（Ｋ１３０，Ｘ０９０９，Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）により処理した。組織切片をウサギ抗ＷＨＳＣ１ポリクローナル抗体（ＨＰＡ０１５８０１，１：２５，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ウサギ抗ＷＨＳＣ１Ｌ１ポリクローナル抗体（ＨＰＡ００５６５９，１：２５，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、または正常ウサギＩｇＧ（１：２５，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）と共にインキュベートし、続いて、ＨＲＰ標識二次抗体（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）と共にインキュベートした。発色基質（Ｄａｋｏ液体ＤＡＢ色素原；Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）により抗原を可視化した。最後に、細胞質から核を識別するため、２０秒間、マイヤーヘマトキシリン（武藤化学株式会社、東京、日本）により組織標本を染色した。
【０３３１】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
ヒトＷＨＳＣ１およびヒトＷＨＳＣ１Ｌ１の転写物を標的とするためのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖を、ＳＩＧＭＡ  Ｇｅｎｏｓｙｓから購入した。ｓｉＥＧＦＰ、および３種の異なるオリゴヌクレオチド二重鎖の混合物であるｓｉネガティブコントロール（ｓｉＮＣ）を、対照ｓｉＲＮＡとして使用した。ｓｉＲＮＡ配列は表２に記載される。ｓｉＲＮＡ二重鎖（１００ｎＭ 最終濃度）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、７２時間、膀胱癌細胞株および肺癌細胞株へトランスフェクトし、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁堂、熊本、日本）を使用して、細胞生存能を調査した。
【０３３２】
（表２）ｓｉＲＮＡ配列
2013518560.tif 000003
【０３３３】
フローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳ）
細胞周期におけるＷＨＳＣ１の役割を調査するため、ＳＷ７８０細胞およびＡ５４９細胞をｓｉＷＨＳＣ１（ｓｉＷＨＳＣ１＃１、ｓｉＷＨＳＣ１＃２）または対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＮＣ）により処理し、３７℃で７２時間、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。一定分量１×１０５個の細胞をトリプシン処理により収集し、製造業者の指示に従い（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、ヨウ化プロピジウムにより染色した。詳細な細胞周期状態について、ＭｕｌｔｉＣｙｃｌｅ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓソフトウェア（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いたＦＡＣＳｃａｎ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）により、細胞を分析した。細胞周期のＧ０／Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期にある細胞の割合を、少なくとも２０，０００個のゲーティングされていない細胞から決定した。
【０３３４】
さらなる詳細のため、細胞周期動態を決定し、増殖中の細胞のＤＮＡへのＢｒｄＵの取り込みを測定するため、５'−ブロモ−２'−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）フローキット（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用した。製造業者のプロトコルに従って、アッセイを実施した。簡単に説明すると、細胞（１ウェル当たり２×１０５個）を６ウェル組織培養プレートに一夜播種し、１０％ＦＢＳ含有培地中の最適濃度のｓｉＲＮＡにより７２時間処理し、続いて、１０μＭ  ＢｒｄＵを添加し、さらに３０分間インキュベーションを続けた。各処理点毎に３連のウェルから浮遊細胞および付着細胞の両方をプールし、パラホルムアルデヒドおよび界面活性剤サポニンを含有している溶液で固定し、３７℃で１時間、ＤＮａｓｅと共にインキュベートした（各試料当たり３０μｇ）。ＦＩＴＣ標識抗ＢｒｄＵ抗体（洗浄緩衝液中５０倍希釈；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を添加し、室温で２０分間インキュベーションを続けた。細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、全ＤＮＡを７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ；各試料当たり２０μＬ）により染色し、続いて、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）を使用したフローサイトメトリー分析を行い、全ＤＮＡ含量（７−ＡＡＤ）をＣＸＰ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒ．２．２（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）により決定した。
【０３３５】
下流遺伝子の解明のためのマイクロアレイハイブリダイゼーションおよび統計分析
精製された全ＲＮＡを標識し、製造業者の指示に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０オリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）にハイブリダイズさせた。プローブシグナル強度をＲＭＡおよび分位数（Ｑｕａｎｔｉｌｅ）により正規化した（ＲおよびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒを使用）。次に、実験間のばらつきによるシグナル強度の変動を推定した。各実験を反復し（１および２回）、中間点がｌｏｇ２（（強度１＋強度２）／２）＝５、７、９、１１、１３、および１５である強度範囲のセットの各々について、ｌｏｇ２（強度２／強度１）の標準偏差（ｓｔｄｅｖ）を計算した。本発明者らは、式ｓｔｄｅｖ（ｌｏｇ２（強度２／強度１））＝ａ＊（ｌｏｇ２（（強度１＋強度２）／２））＋ｂを使用して強度のばらつきをモデル化し、最小二乗法を使用してパラメータａおよびｂを推定した。これらの値を使用して、強度変動の標準偏差を計算した。次いで、各プローブのシグナル強度を、ｓｉＷＨＳＣ１（ＥＸＰ）と対照（ＥＧＦＰ／ＦＦＬｕｃ）（ＣＯＮＴ）との間で比較し、ｚスコア：ｌｏｇ２（強度ＥＸＰ／強度ＣＯＮＴ）／（ａ＊（ｌｏｇ２（（強度ＥＸＰ＋強度ＣＯＮＴ）／２））＋ｂ）を計算することにより上方／下方制御について試験した。各プローブの最終Ｐ値を計算するため、複製セットについて得られたＰ値を乗じた。これらの手法を各比較：ｓｉＥＧＦＰ対ｓｉＷＨＳＣ１、ｓｉＦＦＬｕｃ対ｓｉＷＨＳＣ１、およびｓｉＥＧＦＰ対ｓｉＦＦＬｕｃにそれぞれ適用した。本発明者らは、以下の基準を同時に満たすものとして、上方制御された遺伝子セットおよび下方制御された遺伝子セットを決定した：（１）ＥＧＦＰ対ｓｉＷＨＳＣ１について、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ偽発見率（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ／ＦＤＲ）≦０．０５である、（２）ＦＦＬｕｃ対ｓｉＷＨＳＣ１について、ＦＤＲ≦０．０５であり、調節方向が（１）と同一である、（３）ＥＧＦＰ対ＦＦＬｕｃが（１）および（２）と反対の方向を有するか、またはＥＧＦＰ対ＦＦＬｕｃについて、Ｐ＞０．０５である。最後に、本発明者らは、上方制御された遺伝子セットおよび下方制御された遺伝子セット間のオーバーラップの確率を計算する超幾何分布検定、および無作為抽出された別の遺伝子リストに対して比較された各ＧＯカテゴリを使用して、パスウェイ解析を実施した。本発明者らは、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベースにより定義された「生物学的過程（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）」（８５７カテゴリ）の各カテゴリにおいて、同定された上方／下方制御された遺伝子が有意に濃縮されているか否か（ＦＤＲ≦０．０５）を試験するため、それらに検定を適用した。
【０３３６】
クロマチン免疫沈降アッセイ（ＣｈＩＰ）
製造業者のプロトコルに従って、ＣｈＩＰ  Ａｓｓａｙキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、ＣｈＩＰアッセイを実施した。簡単に説明すると、ｐＣＡＧＧＳ−ｎ３ＦＣベクター（ｍｏｃｋ）、ｐＣＡＧＧＳ−ｎ３ＦＣ−ＷＨＳＣ１ｗｔベクター（ＷＨＳＣ１ｗｔ）、およびｐＣＡＧＧＳ−ｎ３ＦＣ−ＷＨＳＣ１［Δ］ＳＥＴベクター（ＷＨＳＣ１［Δ］ＳＥＴ）によるトランスフェクションから４８時間後、ＷＨＳＣ１の断片とクロマチン複合体とを、抗ＦＬＡＧ抗体により免疫沈降させた。ＷＨＳＣ１ｗｔまたはＷＨＳＣ１［Δ］ＳＥＴに結合したＤＮＡ断片を溶出させた後、その量を定量的リアルタイムＰＣＲ反応に供した。プライマー配列は表３に示される。
【０３３７】
（表３）ＣｈＩＰアッセイ用のプライマー配列
2013518560.tif 000004
【０３３８】
ＴＯＰＦＬＡＳＨレポーターおよびＦＯＰＦＬＡＳＨレポーターの活性についてのルシフェラーゼアッセイ
製造業者のプロトコルに従って、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ルシフェラーゼアッセイを実施した。２９３Ｔ細胞を２４ウェルマイクロプレートで培養し、適当な組み合わせで、ｍｏｃｋベクター、ｐＣＡＧＧＳ−ＷＨＳＣ１ベクター、ＴＯＰＦＬＡＳＨベクター、ＦＯＰＦＬＡＳＨベクター、および内部対照として使用されたｐＲＬ−ＴＫベクターによりコトランスフェクトした。分析のためトランスフェクションから２４時間後に細胞を溶解させ、ルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，Ｂａｄ  Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりルシフェラーゼ活性を測定した。さらに、２９３Ｔ細胞を２４ウェルマイクロプレートで培養し、適当な組み合わせで、ｐＣＡＧＧＳ−ｎ３ＦＣベクター（ｍｏｃｋ）、ｐＣＡＧＧＳ−ｎ３ＦＣ−ＷＨＳＣ１ｗｔベクター（ＷＨＳＣ１ｗｔ）、ｐＣＡＧＧＳ−ｎ３ＦＣ−ＷＨＳＣ１［Δ］ＳＥＴベクター（ＷＨＳＣ１［Δ］ＳＥＴ）、ＴＯＰＦＬＡＳＨベクター、ＦＯＰＦＬＡＳＨベクター、および内部対照として使用されたｐＲＬ−ＴＫベクターによりコトランスフェクトした。分析のためトランスフェクションから４８時間後に細胞を溶解させ、ルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，Ｂａｄ  Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりルシフェラーゼ活性を測定した。
【０３３９】
実施例２：臨床がん組織におけるＷＨＳＣ１の過剰発現
英国人臨床膀胱癌試料の小規模なサブセットにおけるヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ遺伝子のレベルの調査を通して、本発明者らは、がん試料ではＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１が非がん試料と比較して有意に過剰発現していることを見出した。その後、本発明者らは、膀胱癌試料１２０例および正常対照試料２２例（英国人）を分析し、腫瘍細胞においてＷＨＳＣ１発現レベルが正常細胞と比較して有意に上昇していることを確認した（いずれもＰ＝０．０００２、マンホイトニーＵ検定、図１Ａ）。ＷＨＳＣ１発現は進行期（ｐＴ３およびｐＴ４）において高いようであったが、腫瘍悪性度、転移状態、性別、再発状態、および喫煙歴による腫瘍の細分類では、他の要因における有意差は認められなかった（表４）。さらに、正常細胞と比較した腫瘍細胞におけるＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルの有意な上昇が確認された（いずれもＰ＜０．０００１、マンホイトニーＵ検定）。腫瘍悪性度、転移状態、性別、再発状態、および喫煙歴による腫瘍の細分類では、発現レベルの有意差は認められなかった（表５）。膀胱組織におけるＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１のタンパク質発現レベルを評価するため、本発明者らが抗ＷＨＳＣ１抗体および抗ＷＨＳＣ１Ｌ抗体を使用した免疫組織化学的分析を実施したところ、悪性細胞の核において強い染色が観察されたが、非新生物組織における染色は弱いかまたは存在しなかった（図１Ｂ）。さらに、多数の臨床試料の以前のマイクロアレイ発現分析（Kikuchi T et al. Oncogene 22:2192-2205,2003、Nakamura T et al. Oncogene 23:2385-2400,2004、Nishidate T et al. Int J Oncol 25:797-819,2004、Takata R et al. Clin Cancer Res 11:2625-2636,2005）は、ＷＨＳＣ１発現が、膀胱癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、および膵癌を含む様々な種類のがんにおいて有意に上方制御されており、乳癌、ＣＭＬ、リンパ腫、および肺癌においてはＷＨＳＣ１Ｌ１発現の上昇も観察されることを示した（図１Ｃ、表６）。
【０３４０】
（表４）臨床膀胱組織におけるＷＨＳＣ１発現レベルの統計分析
2013518560.tif 000005
【０３４１】
（表５）臨床膀胱組織におけるＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルの統計分析
2013518560.tif 000006
【０３４２】
（表６）ｃＤＮＡマイクロアレイにより分析されたがん組織におけるＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の発現＊
2013518560.tif 000007
＊同一患者に由来する、腫瘍組織と、対応する非新生物組織との間で、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１のシグナル強度を比較した。
【０３４３】
実施例３：ＷＨＳＣ１タンパク質は多数の膀胱腫瘍組織および肺腫瘍組織において有意に上方制御されていた
膀胱組織におけるＷＨＳＣ１のタンパク質発現レベルをさらに検証するため、膀胱組織切片２９例を使用した組織マイクロアレイ実験を実施したところ（図２、表７）、１７例において強い染色が検出され、９例において弱いかまたは中程度の染色が観察された。さらに、本発明者らは、本発明者らのリアルタイムＰＣＲの結果と一致して、ＷＨＳＣ１タンパク質発現レベルと臨床病理学的特徴との間に有意な関係を見出さなかった。さらに、本発明者らは、組織マイクロアレイにより、様々な組織学的な種類の肺腫瘍組織において、ＷＨＳＣ１の発現レベルを測定した（図３、表８）。調査した腫瘍組織切片６２例のうち、本発明者らは１９例において強い染色を観察し、２４例において弱いかまたは中程度の染色を観察した。ＷＨＳＣ１発現と臨床成績との関連をさらに詳細に分析するため、本発明者らは、さらに、アーカイブの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）３２８個を含有している腫瘍組織マイクロアレイを実施した（図１０）。ＷＨＳＣ１染色は１７４例（５３．０％）で陽性、１５４例（４７．０％）で陰性であった。一方、ＷＨＳＣ１陽性と任意の患者の特徴との間には統計的有意性は観察されなかった（表９）。次いで、予後とＷＨＳＣ１発現との関連を評価するため、単変量解析を適用したが、統計的有意性は観察されなかった（ログランク検定によりＰ＝０．８６２９；図１０Ｂおよび表１０）。これらの結果は、ＷＨＳＣ１が、臨床的特徴とは無関係に、肺癌において高頻度に過剰発現されており、予後マーカーとしては機能しないことを明らかにしている。
【０３４４】
（表７）組織マイクロアレイにおける膀胱組織の臨床病理学的特徴
2013518560.tif 000008
（−）発現陰性
（＋）低いかまたは中程度の発現
（＋＋）高発現
【０３４５】
（表８）組織マイクロアレイにおける肺組織の臨床病理学的特徴
2013518560.tif 000009
（−）発現陰性
（＋）低いかまたは中程度の発現
（＋＋）高発現  
【０３４６】
（表９）ＮＳＣＬＣにおけるＷＨＳＣ１陽性と患者の特徴との間の関連（ｎ＝３２８）
2013518560.tif 000010
略語：ＡＤＣ、腺癌；ＳＣＣ、扁平上皮癌；その他、大細胞癌（ＬＣＣ）＋腺扁平上皮癌（ＡＳＣ）
＊ＡＤＣ  対  非ＡＤＣ
ＮＳ、有意性なし
【０３４７】
（表１０）ＮＳＣＬＣを有する患者における予後因子のコックス比例ハザードモデル解析
2013518560.tif 000011
略語：ＡＤＣ、腺癌
＊Ｐ＜０．０５
ＮＳ、有意性なし
【０３４８】
実施例４：ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１はがん細胞の増殖を調節する
ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の上昇した発現が、がん細胞の増殖において何らかの重要な役割を果たすか否かを調査するため、本発明者らは、ＷＨＳＣ１（ｓｉＷＨＳＣ１＃１、＃２）およびＷＨＳＣ１Ｌ１（ｓｉＷＨＳＣ１Ｌ１＃１、＃２）の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖を調製し、各々をがん細胞へトランスフェクトした。定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、様々な種類のがん細胞におけるＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルを調査したところ、その結果、様々な種類のがん細胞においてこれらの遺伝子が多量に発現されていることが確認された（図７）。図４Ａに示されるように、各ｓｉＲＮＡは、ｓｉＥＧＦＰ対照およびｓｉＮＣ対照と比較して、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の発現を効果的に下方制御した。その後、細胞計数キットシステムにより、がん細胞の増殖に対するｓｉＲＮＡの効果を調査したところ（図４Ｂ）、２種の膀胱癌細胞株および３種の肺癌細胞株への２種の独立のｓｉＷＨＳＣ１およびｓｉＷＨＳＣ１Ｌ１のトランスフェクションが、ｓｉＥＧＦＰまたはｓｉＮＣによるものと比較して、それらの増殖を有意に抑制することが見出された。また、がん細胞の詳細な細胞周期状態を分析するため、ＢｒｄＵおよび７−ＡＡＤ染色を実施したところ、ＷＨＳＣ１のノックダウンの後、Ｓ期にあるがん細胞の割合が有意に低下し（図４Ｃ）、Ｇ２／Ｍ期にある細胞の割合が増加することが確認され、このことから、ＷＨＳＣ１のノックダウンがＧ２／Ｍ停止を誘導し得ることが示された。これらの結果は、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１が、がん細胞の増殖調節において重要な役割を果たしており、ＷＨＳＣ１がＧ２／Ｍ移行のための必須因子であることを明らかにしている。
【０３４９】
実施例５：ＷＨＳＣ１はＷｎｔカスケード、ＪＮＫカスケード、ＭＡＰキナーゼカスケード、細胞周期、およびＤＮＡ複製の調節を通して発がんに寄与し得る
ＷＨＳＣ１の下流のシグナル経路を同定するため、本発明者らは、マイクロアレイ発現分析を実施した。ＳＷ７８０癌細胞およびＡ５４９癌細胞におけるＷＨＳＣ１のノックダウンの後、本発明者らは、ｓｉＷＨＳＣ１＃１による処理から２４時間後に、ＳＷ７８０およびＡ５４９から全ＲＮＡを単離した。これらの細胞の発現プロファイルを、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＨＧ−Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙを使用して、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＦＦＬｕｃ）により処理された細胞と比較した。ＷＨＳＣ１のノックダウンにより、統計的に７４遺伝子の発現が減少し、１遺伝子の発現が増加し、従って、これらの７５遺伝子が、ＷＨＳＣ１のノックダウンにより影響を受ける下流遺伝子であることが示唆された（図５Ａ、表１１）。本発明者らは、数種の無作為に選択された下流遺伝子候補の下方制御を検証することができたため、再現性が示された。
【０３５０】
Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベースを使用して下流候補を決定するためのシグナル経路解析（方法；表１１）は、ＷＨＳＣ１が、Ｗｎｔカスケード、ＪＮＫカスケード、ＭＡＰキナーゼカスケード、細胞周期、およびＤＮＡ複製を調節し得ることを示した。従って、ＷＨＳＣ１発現の機能異常は、部分的にはこれらの経路の調節を通して、ヒトの発がんに寄与している可能性が高い。
【０３５１】
（表１１）ＷＨＳＣ１のノックダウンにより影響を受ける出力比
2013518560.tif 000012
【０３５２】
実施例６：ＷＨＳＣ１はＩＱＧＡＰ１、ＴＩＡＭ１、ＡＫＴ２、およびβカテニンと相互作用し得る
タンパク質相互作用を同定するため、本発明者らは、次に、免疫沈降質量分析（ＩＰ−ＭＳ）を実施し、ＩＱＧＡＰ１、ＴＩＡＭ１、およびＡＫＴ２がＷＨＳＣ１と相互作用することを見出した（図５Ｂ）。本発明者らは、さらに、特異抗体を使用した免疫共沈降アッセイを実施し、各相互作用を検証した（図５Ｃ）。ＩＱＧＡＰ１およびＴＩＡＭ１は、βカテニンタンパク質との相互作用を通してＷｎｔシグナル伝達経路に関与するため、本発明者らは、ＷＨＳＣ１とβカテニンとの相互作用の可能性を検討し、図５Ｃに示されるように、それらの相互作用を確認した。興味深いことに、核／細胞質分画後の免疫沈降分析は、ＷＨＳＣ１とβカテニンとの相互作用が核画分において特異的に観察されることを示した（図５Ｄ）。さらに、本発明者らは、ＷＨＳＣ１およびβカテニンが核に共局在していることを確認し（図５Ｅ）、このことから、それらが核において協力的に作用していることが示された。
【０３５３】
次いで、本発明者らは、ＴＯＰＦＬＡＳＨレポーターおよびＦＯＰＦＬＡＳＨレポーターの分析を適用し、ＷＨＳＣ１の過剰発現がＴＯＰＦＬＡＳＨレポーター活性を有意に増強し得ることを検出し（図６Ａ）、このことから、ＷＨＳＣ１がβカテニン／Ｔｃｆ−４活性を正に調節し得ることが示された。さらに、本発明者らは、マイクロアレイデータにより、ｓｉＷＨＳＣ１による処理の後、βカテニン／Ｔｃｆ−４複合体の重要な下流遺伝子であるＣＣＮＤ１の発現が減少することも確認し（図６Ｂ）、そのデータはリアルタイムＰＣＲ分析によっても検証された（図６Ｃ）。重要なことに、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベースを使用した下流候補を決定するためのシグナル経路解析（方法；表１２）は、ＷＨＳＣ１が、ＭＡＰキナーゼ経路およびＪＮＫ経路に加え、Ｗｎｔシグナル伝達経路も調節する可能性を有することを示した。
【０３５４】
次に、ＣＣＮＤ１遺伝子のプロモーター領域を標的とする５種の異なるプライマーを使用したクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析を実施した。図６Ｂに示されるように、野生型ＷＨＳＣ１および酵素不活（ｅｎｚｙｍｅ−ｄｅａｄ）ＷＨＳＣ１の両方がその領域に完全に結合し、特に、転写開始部位に近い位置との強い結合を示した（図１１）。酵素不活ＷＨＳＣ１（ＷＨＳＣ１［Δ］ＳＥＴ）は、野生型ＷＨＳＣ１（ＷＨＳＣ１ｗｔ）より弱い結合を示す傾向があった。一方、ＣＣＮＤ１遺伝子のプロモーター領域におけるＨ３Ｋ３６ｍｅ３レベルは、野生型ＷＨＳＣ１によるトランスフェクションの後、有意に増加したが、ＷＨＳＣ１［Δ］ＳＥＴトランスフェクションの場合には上昇が観察されなかった。Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３状態は、野生型ＷＨＳＣ１蓄積の状態と相関する可能性が高かった。これらの結果は、ＷＨＳＣ１がＣＣＮＤ１のプロモーター領域と結合し、ヒストンＨ３リジン３６を直接トリメチル化し得ることを示唆している。結果として、ＣＣＮＤ１発現は転写的に活性化される。さらに、ＴＯＰＦＬＡＳＨレポーターおよびＦＯＰＦＬＡＳＨレポーターの分析を適用したところ、野生型ＷＨＳＣ１の過剰発現がＴＯＰＦＬＡＳＨレポーター活性を有意に増強するが（図１２）、酵素不活ＷＨＳＣ１はその活性を示さないことが検出され、このことから、ＷＨＳＣ１がβカテニン／Ｔｃｆ−４活性を正に調節し得ることが示された。これらの結果は、ＷＨＳＣ１がβカテニンとの相互作用を通してＷｎｔシグナル伝達経路を調節することを示しており、ＷＨＳＣ１がヒトの発がんに寄与する機序を指摘している。
【０３５５】
（表１２）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのマイクロアレイデータに基づくＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ経路解析
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【０３５６】
考察
ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼであるＷＨＳＣ１が、いくつかのがんの種類において上方制御されており、Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節を通してがん細胞の増殖調節において重要な役割を有している可能性が高いことが、本明細書において証明される。ＷＨＳＣ１は、現在、２種のさらなるメンバー：核受容体結合ＳＥＴドメインタンパク質１（ＮＳＤ１）およびＷＨＳＣ１Ｌ１を含んでいる遺伝子ファミリーのメンバーであり、それらはいずれも７０〜７５％のＷＨＳＣ１との配列同一性を示す。ＡＭＬにおいては、再発性のｔ（５；１１）（ｑ３５；ｐ１５．５）転座がＮＳＤ１をヌクレオポリン９８（ＮＵＰ９８）に融合する（Cerveira N, et al. Leukemia 2003;17:2244-7）。ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１は、インビボでＡＭＬを誘導し、インビトロで骨髄幹細胞の自己再生を持続させることが示された（Wang GG, et al. Nat Cell Biol 2007;9:804-12）。機構的には、ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１複合体は、ＨｏｘＡ７およびＨｏｘＡ９に近接するゲノム要素に結合し、ヒストンＨ３  Ｌｙｓ３６（Ｈ３Ｋ３６）メチル化およびヒストンアセチル化の調節を通して、分化の間、ＥＺＨ２により媒介されるＨｏｘ−Ａ遺伝子座の転写抑止を維持する（Wang GG, et al. Nat Cell Biol 2007;9:804-12）。
【０３５７】
重要なことに、メチルトランスフェラーゼ活性の不活化をもたらすＮＵＰ９８  ＦＧリピートドメインの欠失またはＮＳＤ１の変異のいずれかは、Ｈｏｘ−Ａ遺伝子活性化および骨髄前駆細胞不死化の両方を妨げ、このことから、ＮＳＤ１のメチルトランスフェラーゼ活性が、腫瘍発生において重要な役割を果たしている可能性が高いことが示された。ＮＳＤ１に加え、本発明者らは、ＷＨＳＣ１Ｌ１が数種の腫瘍において過剰発現されており、その発現の調節異常がヒトの発がんに関与し得ることを見出した。これらのデータは、ヒストンメチルトランスフェラーゼのファミリー（ＮＳＤ１、ＷＨＳＣ１、およびＷＨＳＣ１Ｌ１）の異常な発現が、ヒトの発がんにおいて重要であることを示している。
【０３５８】
ＩＱＧＡＰ１は、複数のタンパク質相互作用ドメインを含有し、βカテニンに化学量論的に結合する１９０ｋＤａのタンパク質である（Kuroda S, et al. Science 1998;281:832-5）。ＳＷ４８０結腸癌細胞におけるＩＱＧＡＰ１の過剰発現は、核内のβカテニンの量を増加させ、βカテニンにより媒介される転写活性化を増強した（Briggs MW, et al. J Biol Chem 2002;277:7453-65）。βカテニン機能に対するＩＱＧＡＰ１の異なる効果は、悪性細胞の増殖能（ＴＣＦ／ＬＥＦにより調節されるプロモーターの転写の増強による）および転移の可能性（細胞間接着の低下による）の両方を増加させるよう協同する（Briggs MW, et al. J Biol Chem 2002;277:7453-65）。他方、ＴＩＡＭ１（Ｔ細胞リンパ腫侵襲転移誘導タンパク質１）の過剰発現は、高度に侵襲性の乳房腫瘍（Adam L, et al. J Biol Chem 2001;276:28443-50）および結腸癌（Liu L, et al. World J Gastroenterol 2005;11:705-7; Minard ME, et al. Clin Exp Metastasis 2006;23:301-13）において見出された。Ｗｎｔ経路刺激により、βカテニンはＴＩＡＭ１と複合体を形成し得、それが、ＴＣＦ／ＬＥＦを含有しているプロモーター結合複合体によりＷｎｔ標的遺伝子のプロモーターへと動員されて、ＧＤＰと結合したＲａｃ１を不活化する。次いで、ＴＩＡＭ１が、ＧＤＰのＧＴＰへの交換を触媒することによりＲａｃ１を活性化し、それにより、Ｗｎｔにより誘導される転写因子複合体に対するＲａｃ１の刺激効果を媒介する。これは、ＣＣＮＤ１のような無制限の細胞増殖を促進するものを含む、Ｗｎｔ標的遺伝子のサブセットの転写の増強をもたらす（Buongiorno P, et al. Mol Cancer 2008;7:73）。この研究において、本発明者らは、ＷＨＳＣ１がＩＱＧＡＰ１、ＴＩＡＭ１、およびβカテニンと相互作用し得ることを見出し、一連の実験は、ＷＨＳＣ１ががん細胞におけるＷｎｔシグナル伝達経路を調節し得ることを暗示している。Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節異常は、肺癌および膀胱癌を含む、多くのヒトがんに関与していることが報告されている（Minna JD, et al. Cancer Cell 2002;1:49-52;Yue W, Sun Q, Dacic S, et al. Carcinogenesis 2008;29:84-92;Thievessen I, et al. Br J Cancer 2003;88:1932-8）。総合すると、本明細書に開示されたデータは、ＷＨＳＣ１が広範囲のヒトがんにおいて過剰発現されていることを示しており、このことは、Ｗｎｔシグナル伝達経路のＷＨＳＣ１依存性の調節異常機序が、ヒトの発がんにおける重要な因子のうちの１つであることを示している。
【０３５９】
発現分析は、正常組織におけるＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルが極めて低いことを示した（図８）。ＢｉｏＧＰＳデータベースも、多くの種類の組織におけるこれらの遺伝子の発現が極めて低いことを明らかにした（図９）。様々な種類のがんにおけるＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルは、対応する非新生物組織におけるレベルより有意に高いため、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１は、新規がん治療の開発のための有望な標的である。さらに、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のいずれかのノックダウンは、数種のがん細胞の増殖を抑制したため、これらの酵素は、がん細胞の増殖調節において重要な役割を有しているようである。データは、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１用の阻害物質が、がんの分子標的治療のための理想的な候補であることを示している。
【０３６０】
ｗｉｎｇｌｅｓｓ／ｉｎｔ（Ｗｎｔ）シグナル伝達経路は、脊椎動物および無脊椎動物において細胞の増殖および分化を調節する。βカテニンは、Ｗｎｔシグナル伝達経路およびＥカドヘリン−カテニン複合体における二重機能性分子である。βカテニンは、核内に蓄積するにつれ、細胞接着分子としての機能を失い、それにより、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性化され、ＣＣＮＤ１のような標的遺伝子の転写が開始される。Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節異常は、膀胱癌および肺癌を含む、多くのヒトがんに関与していることが報告されている（33-37 Mazieres J, et al. Cancer Lett 2005;222:1-10、Minna JD, et at. Cancer Cell 2002;1:49-52、Thievessen I, et al. Br J Cancer 2003;88:1932-8、Urakami S, et al. Clin Cancer Res 2006;12:383-91、Yue W, et al. Carcinogenesis 2008;29:84-92）。Ｗｎｔシグナル伝達経路の構成的な活性化を促進する変異はがんをもたらす。最も周知の例は、患者が結腸および直腸にポリープを示す、常染色体優性遺伝性疾患である家族性腺腫性ポリポージス（ＦＡＰ）である。この疾患は、細胞増殖の増加により腺腫性病変をもたらすＷｎｔ経路の異常な活性化を促進する、ＡＰＣの短縮により、最も高頻度に引き起こされる（Nishisho I, et al. Science 1991;253:665-9）。βカテニンの変異も散発性結腸癌において見出されている（Giles RH, et al. Biochim Biophys Acta 2003;1653:1-24）。反対に、様々な種類のがんにおいてＷｎｔシグナル伝達の調節異常が暗示されているが（Nusse R. Cell Res 2005;15:28-32 Paul S, et al. Neoplasma 2008;55:165-76）、そのような変異は、膀胱癌および肺癌を含む、多数のがんにおいて稀であるようである（Mazieres J, et al. Cancer Lett 2005;222:1-10、Ohgaki H, et al. Cancer Lett 2004;207:197-203、Ueda M, et al. Br J Cancer 2001;85:64-8）。事実は、いくつかのその他の因子も、ヒトの発がんにおいてＷｎｔ経路を調節し得ることを示している。
【０３６１】
この研究において、ＷＨＳＣ１が、核内でβカテニンと相互作用して、ＣＣＮＤ１のプロモーター領域においてヒストンＨ３のリジン３６（Ｈ３−Ｋ３６）におけるトリメチル化を促進し得ることが見出された（図１３）。一般に、メチル化されたＨ３−Ｋ３６は、活発な転写の領域において豊富であり（Ｐｏｋｈｏｌｏｋ  ＤＫ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２００５；１２２：５１７−２７）、これは、転写伸長（Xiao T, et al. Genes Dev 2003;17:654-63）およびオルタナティブスプライシング（Luco RF, et al. Science;327:996-1000）にも関連づけられている。ＡＭＬにおいては、再発性のｔ（５；１１）（ｑ３５；ｐ１５．５）転座が、ＷＨＳＣ１のファミリー遺伝子であるＮＳＤ１をヌクレオポリン９８（ＮＵＰ９８）に融合する（Cerveira N, et al. Leukemia 2003;17:2244-7）。ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１は、インビボでＡＭＬを誘導し、インビトロで骨髄幹細胞の自己再生を持続させることが示された（Wang GG, et al. Nat Cell Biol 2007;9:804-12）。機構的には、ＮＵＰ９８−ＮＳＤ１複合体は、ＨｏｘＡ７およびＨｏｘＡ９に近接するゲノム要素に結合し、Ｈ３−Ｋ３６トリメチル化を維持して、Ｈｏｘ−Ａ遺伝子座の転写抑止を防止する。重要なことに、メチルトランスフェラーゼ活性の不活化をもたらすＮＵＰ９８  ＦＧリピートドメインの欠失またはＮＳＤ１の変異のいずれかは、Ｈｏｘ−Ａ遺伝子活性化および骨髄前駆細胞不死化の両方を妨げ、このことから、ＮＳＤ１依存性のＨ３−Ｋ３６メチル化が、腫瘍発生において重要な役割を果たしている可能性が高いことが示された。これと一致して、ＷＨＳＣ１は、Ｈ３−Ｋ３６トリメチル化の維持を通して、βカテニンの転写活性を協力的に強制することが証明された。これは、ＷＨＳＣ１依存性のＨ３−Ｋ３６メチル化が、βカテニンと相乗的に腫瘍発生を促進し得ることを暗示しており、エピジェネティック調節を通したヒトの発がんにおけるＷｎｔ経路調節異常の新規機序が提示された。
【０３６２】
発現分析は、βカテニンが膀胱癌細胞株および肺癌細胞株のみならず、ヒト結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６においても多量に発現されていることを示した（図１４Ａ）。がん細胞の増殖調節におけるβカテニンの重要性を解明するため、本発明者らは、βカテニンを標的とする特異的なｓｉＲＮＡを使用したノックダウン実験を調査した（図１４ＢおよびＣ）。βカテニンのノックダウンの後、膀胱癌細胞および肺癌細胞の増殖速度は有意に抑制され、このことから、Ｗｎｔ／βカテニン経路がこれらの細胞の増殖調節において重要な役割を果たし得ることが示された。ＷＨＳＣ１は膀胱癌および肺癌の他にも、膵癌および乳癌のような様々な種類のがんにおいて過剰発現されているため、この研究において提示されたＷｎｔ／βカテニン経路の調節異常は他のがんにおいても観察される可能性がある。興味深いことに、フローサイトメトリーによる細胞周期分析は、ＷＨＳＣ１のノックダウンがＳ期にあるがん細胞の細胞集団を減少させ、Ｇ２／Ｍ期にあるものを増加させたことを明らかにした。実際、βカテニンを含むＷＮＴ／βカテニン経路の構成要素が、紡錘体または中心体に局在し、有糸分裂進行の調節に関与しているとの証拠が蓄積されてきており（Bahmanyar S et al. Genes Dev 2008;22:91-105、Hadjihannas MV, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;13:10747-52）、このことは、ＷＨＳＣ１もＷｎｔ／βカテニン経路との相互作用を通してがん細胞のＭ期を調節し得ることを示している。
【０３６３】
さらに、βカテニンがＷＨＳＣ１依存性のメチル化の基質として機能する可能性を検証するため、インビトロメチルトランスフェラーゼアッセイを実施したが、陽性シグナルは観察されなかった（データ非提示）。従って、ＷＨＳＣ１のメチル化活性によるβカテニンの転写調節は、現在のところ、Ｈ３−Ｋ３６メチル化に基づいているようである。
【０３６４】
前述のように、ＮＳＤ１は、ＡＭＬにおいて腫瘍発生を促進することが報告され（Wang GG, et al. Nat Cell Biol 2007;9:804-12）、様々な種類のがんにおけるＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルが、対応する非新生物組織におけるレベルより有意に高いことが確認された。これらのデータにより、本発明者らは、メチルトランスフェラーゼのファミリー（ＮＳＤ１、ＷＨＳＣ１、およびＷＨＳＣ１Ｌ１）の異常な発現が、ヒトの発がんにおいて重要であり得ることを提唱する。特に、発現分析は、正常組織におけるＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１の発現レベルが有意に低いことを示し（図８）、ＢｉｏＧＰＳデータベースも多くの種類の組織におけるこれらの遺伝子の発現が極めて低いことを明らかにしたため（図９）、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１は、新規がん治療の開発のための有望な標的となる可能性が高い。ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１のいずれかのノックダウンは数種のがん細胞の増殖を抑制したため、これらの酵素はがん細胞の増殖調節において重要な役割を有しているようである。データは、ＷＨＳＣ１およびＷＨＳＣ１Ｌ１用の阻害物質が、がんの分子標的治療のための理想的な候補であり得ることを暗示している。メチルトランスフェラーゼ阻害剤の開発は最近開始されたばかりであり（Greiner D, et al. Nat Chem Biol 2005;1:143-5、Kubicek S, et al. Mol Cell 2007;25:473-81）、さらなる研究によって、近い将来、このアプローチの有用性が確実となり得る。
【０３６５】
産業上の利用可能性
本発明者らは、ＷＨＳＣ１またはＷＨＳＣ１Ｌ１遺伝子を特異的に標的とする二本鎖核酸分子によってがん細胞増殖が抑制されることを示した。従って、二本鎖核酸分子は、抗がん薬に有用である。ＷＨＳＣ１もしくはＷＨＳＣ１Ｌ１タンパク質の発現を阻止するか、またはその活性を防止する剤は、抗がん剤、特に、膀胱癌、乳癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、食道癌、ＨＣＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、軟部組織腫瘍、またはリンパ腫の治療のための抗がん剤として治療的に利用可能であり得る。
【０３６６】
本発明を、詳細に、その具体的な態様を参照しながら説明したが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な変化および変更がなされ得ることが、当業者には明らかであろう。本明細書中に言及された刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照は、全て、参照によりその全体が組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、限定されることを意図しない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2013518560.tif 000020
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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2013518560.tif 000037
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