(57)【要約】  本発明は、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オン(式１)のラセミ体(R/S)、又はその光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物(enantiomeric excess mixture)を調製する方法を提供する。当該方法は、a)適切な条件下、適切な補因子の存在下、式(III)の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンを、適切なオキシドレダクターゼ、又はその適切な変異体と反応させる工程；及びb) 3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンのラセミ体(R/S)、又はその光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物(enantiomeric excess mixture)を単離する工程；を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)
【化１】
2013541942.tif 000018
の化合物を生産する方法であり：
a)適切な条件下、適切な補因子の存在下で維持することにより、式(III)
【化２】
2013541942.tif 000019
の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンを、選択的にケトンを還元してアルコールを形成する適切な酵素と反応させる工程；及び
b)適切な中間体を単離する工程；
を含む方法。
【請求項２】
前記適切な酵素がオキシドレダクターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記適切な酵素がケトレダクターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記適切な酵素が短鎖デヒドロゲナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記適切な酵素がアルコールデヒドロゲナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記適切な酵素がアルドケトレダクターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記適切な酵素が、サッカロマイケス(saccharomyces)、ロドトルラ(rhodotorula)、ピキア(pichia)及びE.コリ(E.coli)から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記適切な酵素が、サッカロマイケス・セレウィシアエ(saccharomyces cervisiae)、ロドトルラ・ルブラ(rhodotorula rubra)、ピキア・メタノリカ(pichia methanolica)及びE.コリ(E.coli)から選択される種から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記適切な酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13のいずれかに記載のヌクレオチド配列にコードされている、請求項１〜８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素をコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13のいずれかに記載のヌクレオチド、又はその変異体が、ベクター中にクローニングされ、適切な組換え全細胞中で前記酵素が発現される、請求項１〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換え全細胞が、更に、酸化NAD(P)から補因子を再生産する機能を有するポリペプチドを共発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記全細胞が、MTCC 5642、MTCC 5643、MTCC 5644、MTCC 5645、MTCC 5646、MTCC 5647、MTCC 5648、MTCC 5649、MTCC 5650、MTCC 5651、MTCC 5652、MTCC 5653、MTCC 5654から選択される、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記全細胞が、
a)宿主細胞中で前記ベクターの複製及び維持を制御する1つ以上の領域；
b)オキシドレダクターゼをコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号１３のいずれかに記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列又はその変異体と動作可能に連結した第一のプロモーター；
c)補因子を再生産する機能を有するポリペプチドをコードする配列番号７に記載のヌクレオチド配列と動作可能に連結した第二のプロモーター；
d)適切な抗生物質マーカー；
を含む発現ベクターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
式(I)の適切な中間体
【化３】
2013541942.tif 000020
を生産する方法であり：
a)適切な条件下、適切な補因子の存在下で維持することにより、式(III)
【化４】
2013541942.tif 000021
の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンを、立体選択的にケトンを還元してアルコールを形成する適切な全細胞と反応させる工程；及び
b)適切な中間体を単離する工程；
を含む方法。
【請求項１５】
前記全細胞が、MTCC 5642、MTCC 5643、MTCC 5644、MTCC 5645、MTCC 5646、MTCC 5647、MTCC 5648、MTCC 5649、MTCC 5650、MTCC 5651、MTCC 5652、MTCC 5653、MTCC 5654から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記補因子が、酵素に基づく再生産系により持続的に再生産され、当該酵素が、適切な補基質(co-substrate)を酸化することにより補因子を再生産する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記補因子の再生産に採用される酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、亜リン酸デヒドロゲナーゼから選択される、請求項１又は１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記補因子の再生産に採用される酵素が、配列番号７に記載のヌクレオチド配列又はその変異体にコードされるグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記補因子が、基質に基づく補因子再生産系により持続的に再生産され、当該酵素が、適切な補基質を酸化することにより補因子を再生産する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素が、オキシドレダクターゼ、ケトレダクターゼ、短鎖デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアルドケトレダクターゼから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記補基質がイソプロピルアルコールである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記式(III)の濃度が0.1〜30%w/vから選択される、請求項1又は14のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記補因子が、NAD(P)H及びNAD(P)である、クレーム１に記載の方法。
【請求項２４】
前記pHが、5〜9、又は7〜8に維持される、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
a)複製を制御する1つ以上の領域
b)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号１３のいずれかに記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列又はその変異体と動作可能に連結した適切なプロモーター
c)抗生物質マーカー
を含む、キラルアルコールを生産するベクター。
【請求項２６】
配列番号７に記載のポリヌクレオチド配列、又はその変異体を更に含む、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
pET11aZBG5.1.1, pET11aZBG6.4.1, pET11aZBG2.0.1, pET11aZBG25.1.1, pET11aZBG8.1.1, pET11aZBG13.1.1, pET27bZBG5.1.1, pET27bZBG2.0.1, pET27bZBG8.1.1, pET27bZBG2.0.9, pET27bZBG13.1.1, pET27bZBG2.0.8, pET27bZBG2.0.11, pET27bZBG2.0.5, pET27bZBG1.1.22, pET27bZBG1.1.2, pET27bZBG2.0.4から選択される、オキシドレダクターゼ酵素を発現する請求項２３に記載のベクター。
【請求項２８】
pET27bZBG2.0.9である、オキシドレダクターゼを発現する請求項３１に記載のベクター。
【請求項２９】
pET27bZBG13.1.1である、グルコースデヒドロゲナーゼを発現する請求項２３に記載のベクター。
【請求項３０】
pZRC2G-2ZBG2.0.9C1である、オキシドレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼを発現する請求項２３に記載のベクター。
【請求項３１】
【化５】
2013541942.tif 000022
のいずれかの化合物。
【請求項３２】
式(II)の化合物を生産する方法であり：
a)式(Ib)
【化６】
2013541942.tif 000023
の(S)-3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを、塩化メタンスルホニルと反応させることにより、式(IVa)
【化７】
2013541942.tif 000024
の化合物を取得する工程； 
b)アジ化ナトリウムを使用して、式(IVa)の化合物を、式(Vb)
【化８】
2013541942.tif 000025
の化合物に変換する工程；
c)式(Vb)の化合物が、Pd/c及び水素化ホウ素ナトリウムを使用して、式(II)の化合物に変換される工程；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを調製するための酵素的還元プロセスに関する。特に、本発明は、を調製するための立体選択的な(stereoselective)酵素的還元プロセスに関する。本発明は、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。更に、本発明は、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は、所望の酵素的還元の過程で補因子を再生産する、基質ベース又は酵素ベースの系により補因子を再生産する系を開示する。
【背景技術】
【０００２】
式(I)
【化１】
2013541942.tif 000002
の3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンは、産業上有用な化合物である、式(II)
【化２】
2013541942.tif 000003
の(2R)-4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ [1,2,4]-トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-アミン(シタグリプチン)を生産するための重要な中間体である。
【０００３】
WO 03004498及び米国特許第6699871は、ベータ-アミノテトラヒドロトリアゾロ[4,3-a]ピラジンのクラスを開示しており、これらはDPP-IVの阻害剤である。本明細書は、以下の式
【化３】
2013541942.tif 000004
で表される化合物を開示する。
【０００４】
特に、WO 03004498は、(2R)-4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5, 6-ジヒドロ [1,2,4]-トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-アミン(シタグリプチン)を開示する。
【０００５】
WO 2010032264(WO’264)は、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを開示している。また、WO’264は、化学的還元方法を用いた、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンの調製方法にも関し、当該還元は、適切なホウ素を含有する還元剤により、適切な溶媒中、酸の存在下、又は非存在下で実施され、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンが取得される。かかるプロセスを下記スキームに記載する。
【化４】
2013541942.tif 000005
【０００６】
更に、WO’264は、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オン(式I)のラセミ体を提供するのみで、式(I)のラセミ体からR又はS型を調製する化学プロセスは提供されていない。
【０００７】
加えて、WO 2010032264は、最終生成物中に微量金属を残し、医薬生産物の製造で問題になる、金属触媒の使用を記載している。
【０００８】
従って、かかる化学プロセスは、大スケールでの扱いが困難で環境負荷が大きい高価な溶媒や他の化学物質を使用し、式(I)の化合物を低コストで調製するのに不十分である。
【０００９】
更に、前記生産方法の欠点は、再分離工程の過程で、理論上全材料の50%しか単離されたラセミ混合物から純粋な鏡像異性体を単離できないことである。故に、50%の材料が無駄になってコストが高くなり、環境面でも不利である。また、この不要な異性体の再利用は、格別の操作及びコストを必要とする。
【００１０】
故に、式(I)の化合物を、低コストかつ低環境負荷で、光学活性体のR及びSに再分離する方法の開発について、高い満たされていないニーズが存在する。
【００１１】
生物工学の出現により、鏡像異性体として純粋な化合物を取得する酵素的方法の開発が可能となった。酵素は、良好なキラル純度で一方の鏡像異性体のみを生産する特異的な立体選択能力を有する。
【００１２】
酵素が還元触媒として機能する本発明の酵素的還元方法は、当該技術分野で一般的な金属触媒の使用と比較して、環境面で有利である。また、酵素の使用は、WO2010032264のような触媒を使用する方法よりも低コストである。
【００１３】
本明細書中、酵素的還元の使用による、式(I)の化合物の、ラセミ(R/S)体、又は光学活性体(S)又は(R)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物(enantiomeric excess mixture)を調製するプロセスを開示する。また、本明細書中、鏡像異性体として高純度の、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンの(S)及び(R)鏡像異性体を開示する。
【００１４】
また、本明細書は、対応するケト化合物の立体選択的酵素還元による、式(I)の化合物の(R)及び(S)型を調製する方法にも関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、式(I)
【化５】
2013541942.tif 000006
の化合物を生産する方法を提供し、当該方法は：
a)適切な条件下、適切な補因子の存在下で維持することにより、式(III)
【化６】
2013541942.tif 000007
の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オン、又はその金属イオン塩を、立体選択的にケトンを還元してアルコールを形成する適切な酵素又はその変異体と反応させる工程；及び
b)適切な中間体を単離する工程；
を含む。
【００１６】
一つの態様において、本発明は、(S)-3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを提供する。
【００１７】
一つの態様において、本発明は、(R)-3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを提供する。
【００１８】
一つの態様において、本発明は、(S)-3-(メタンスルホニルオキシ)-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを提供する。
【００１９】
一つの態様において、本発明は、(R)-3-(メタンスルホニルオキシ)--1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを提供する。
【００２０】
一つの態様において、本発明は、(S)-3-アジド-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを提供する。
【００２１】
一つの態様において、本発明は、(R)-3-アジド-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを提供する。
【００２２】
一つの態様において、本発明は、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オン(式I)の、ラセミ(R/S)体、又は光学活性体(S)又は(R)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を調製する方法を提供し、当該方法は：
a) 適切な条件下で維持することにより、式(III)
【化７】
2013541942.tif 000008
の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オン又はその金属イオン塩を、立体選択的にケトンを還元してアルコールを形成する適切な酵素又はその変異体と反応させて、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンの、ラセミ(R/S)体、又は光学活性体(S)又は(R)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を調製する工程を含む。
【００２３】
一つの態様において、本発明は、
4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ [1,2,4]-トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-アミンのラセミ(R/S)体又は光学活性体(S)又は(R)を鏡像異性体的に高純度で合成するための重要な中間体である、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを調製するための立体選択的酵素的還元方法を提供する。
【００２４】
一つの態様において、本発明は、式(III)の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5- トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンを、適切な酵素及びその変異体と、そして任意で他の補因子と反応させ、そして当該溶液を、好ましくは撹拌しながら、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オン(式(I))が、酵素的還元により、そのラセミ(R/S)体、又は光学活性体(S)又は(R)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物に変換されるのに十分な時間維持することによる、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンのラセミ(R/S)体、又は光学活性体(S)又は(R)を調製する方法を提供する。
【００２５】
一つの態様において、本発明は、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンの(R)鏡像異性体を提供する。
【００２６】
他の態様において、本発明は、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンの(S)鏡像異性体を提供する。
【００２７】
一つの態様において、本発明は、シタグリプチンを調製する方法を提供する。
【００２８】
当該方法は、(S)-3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オン又はそのフォームの鏡像体過剰混合物を(S)-3-(メタンスルホニルオキシ)-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンに変換する工程を含み、当該産物は、更に、((R)-3-アジド-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンに変換され得て、そして最後に、(R)-4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-アミン(シタグリプチン)に変換され得る。
【００２９】
一つの態様において、本発明は、シタグリプチンを調製する方法を提供する。当該方法は、上記のように調製された光学的に純粋な3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンをシタグリプチンに変換する工程を含む。
【００３０】
本発明の一つの態様は、本発明に使用される酵素のアミノ酸配列を提供する。
【００３１】
本発明の一つの態様は、本発明に使用される酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００３２】
本発明の更なる他の態様は、サッカロマイケス(Saccharomyces)、ピロコッカス(Pyrococcus)、クプリアウィドゥス(Cupriavidus)、ロドトルラ(Rhodotorula)、ピキア(Pichia)及びＥ．コリ(E. coli)種に由来する、オキシドレダクターゼ酵素、並びにそのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を提供する。
【００３３】
本発明の更なる態様は、オキシドレダクターゼ酵素活性を有する所望のポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターを提供する。
【００３４】
本発明の尚も他の態様は、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及びNAD(P)からNAD(P)Hのように、酸化された補因子から還元された補因子を生産する酵素活性を有する第二のポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチド配列を有する多シストロン性発現ベクターを提供する。
【００３５】
従って、本発明の一つの態様は、オキシドレダクターゼ酵素及び還元された補因子を生産する酵素活性を有するポリペプチドを共発現する方法を提供する。
【００３６】
本発明の尚も他の態様は、基質会合(substrate coupled)又は酵素会合(enzyme coupled)系から選択される、補因子再生産系を提供する。
【００３７】
本発明の更なる態様は、式(III)の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5- トリフルオロフェニル)ブタン-2-オン、又はその金属イオン塩を、サッカロマイケス・セレウィシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピロコッカス・フリオスス(Pyrococcus furiosus)、ロドトルラ・ムキラギノサ(Rhodotorula mucilaginosa)、クプリアウィドゥス・ネカトー(Cupriavidus necator)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)及びE.コリ(E. coli)由来のオキシドレダクターゼ酵素の存在下で還元することによる、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンのラセミ体(R/S)、又はその光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産する方法を提供する。
【００３８】
本発明の尚も更なる態様は、式(III)の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5- トリフルオロフェニル)ブタン-2-オン又はその金属イオン塩を全細胞生体触媒を使用して還元することによる、3,3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンのラセミ体(R/S)、又はその光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産する方法を提供する。かかる態様において、全細胞は、MTCC 5642, MTCC 5643, MTCC 5644, MTCC 5645, MTCC 5646, MTCC 5647, MTCC 5648, MTCC 5649, MTCC 5650, MTCC 5651, MTCC 5652, MTCC 5653, 及びMTCC 5654から選択される。
【００３９】
本発明の他の態様は、E.コリ(E. coli)形質転換細胞中に所望のオキシドレダクターゼ酵素活性を有するポリペプチドを過剰発現することを提供する。
【００４０】
他の態様において、本発明は、(S)-3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを提供する。
【００４１】
一つの態様において、本発明は、(R)-3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを提供する。
【００４２】
一つの態様において、本発明は、(S)-3-(メタンスルホニルオキシ)-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを提供する。
【００４３】
一つの態様において、本発明は、(R)-3-(メタンスルホニルオキシ)--1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを提供する。
【００４４】
一つの態様において、本発明は、(R)-3-アジド-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを提供する。
【００４５】
一つの態様において、本発明は、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オン(式I)のラセミ体(R/S)、又はその光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を調製する方法を提供する。当該方法は、a)適切な条件下、適切な補因子の存在下、式(III)
【化８】
2013541942.tif 000009
の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オン又はその金属イオン塩を、適切なオキシドレダクターゼ、又はその適切な変異体と反応させる工程；及び
b) 3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンのラセミ体(R/S)、又はその光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を単離する工程；
を含む。
【００４６】
一つの態様において、本発明の酵素は、補因子NAD(P)の存在下で機能し、当該補因子は、酵素会合系又は基質会合系により再生産される。また、本発明は、オキシドレダクターゼ活性を有する適切なポリペプチドをコードする遺伝子のみ、又は追加で前記補因子を酵素的に再生産する機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えベクターを提供する。前記ベクターは適切な宿主細胞に形質転換される。
【００４７】
一つの態様において、本発明は、シタグリプチンを調製する方法を提供する。
【００４８】
前記方法は、(S)-3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オン又はその鏡像体過剰混合物を、(S)-3-(メタンスルホニルオキシ)-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンに変換し、当該産物は、更に、((R)-3-アジド-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンに変換され、最後に、(R)-4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-アミン(シタグリプチン)に変換され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１はpET11aオキシドレダクターゼを示す(配列番号１，２，３，４，５及び７)。
【００５０】
【図２】図２は、pET27bオキシドレダクターゼを示す(配列番号1,3,5,6,7,8,9,10,11,12,13)。
【００５１】
【図３】図３は、pZRC2G-2オキシドレダクターゼを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
アミノ酸配列番号１〜１３及びそれらに対応するヌクレオチド配列番号１４〜２６を以下に示す。アミノ酸配列番号１〜１３への言及は、それらに対応するヌクレオチド配列番号１４〜２４をも含むものと理解されたい。
【００５３】
配列
配列番号１
アミノ酸配列
MKRVNAFNDLKRIGDDKVTAIGMGTWGIGGRETPDYSRDKESIEAIRYGLELGMNLIDTAEFYGAGHAEEIVGEAIKEFEREDIFIVSKVWPTHFGYEEAKKAARASAKRLGTYIDLYLLHWPVDDFKKIEETLHALEDLVDEGVIRYIGVSNFNLELLQRSQEVMRKYEIVANQVKYSVKDRWPETTGLLDYMKREGIALMAYTPLEKGTLARNECLAKIGEKYGKTAAQVALNYLIWEENVVAIPKASNKEHLKENFGAMGWRLSEEDREMARRCV
配列番号１４（配列番号１に対応）
DNA配列
ATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCATATGAAACGCGTGAATGCCTTTAATGATCTGAAACGCATTGGTGATGATAAAGTTACCGCAATTGGTATGGGCACCTGGGGTATTGGTGGTCGTGAAACACCGGATTATAGCCGTGATAAAGAAAGCATTGAAGCCATTCGTATTGGTGGTCGTGAAACACCGGATTATAGCCGTGATAAAGAAAGCATTGAAGCCATTCGTTATGGTCTGGAACTGGGCATGAATCTGATTGATACCGCAGAATTTTATGGTGCAGGCCATGCAGAAGAAATTGTTGGCGAAGCCATCAAAGAATTTGAACGCGAGGATATCTTTATTGTTAGCAAAGTGTGGCCGACCCATTTTGGTTATGAAGAAGCCAAAAAAGCAGCACGTGCAAGTTATATTGGCGTGAGCAACTTTAATCTGGAACTGCTGCAGCGTAGCCAAGAAGTTATGCGCAAATACGAAATTGTTGCCAACCAGGTGAAATATAGCGTTAAAGATCGTTGGCCTGAAACCACCGGTCTGCTGGATTATATGAAACGTGAAGGTATTGCACTGATGGCATATACACCGCTGGAAAAAGGCACCCTGGCACGTAATGAATGTCTGGCCAAAATTGGCGAAAAATATGGTAAAACCGCAGCACAGGTTGCACTGAATTATCTGATCTGGGAAGAAAATGTTGTTGCAATTCCGAAAGCCAGCAACAAAGAACATCTGAAAGAAAATTTTGGTGCAATGGGTTGGCGTCTGAGCGAAGAGGATCGTGAAATGGCACGTCGTTGTGTTTAA
【００５４】
配列番号２
アミノ酸配列
MNWEKVPQELYTRLGSSGLQISKIIVGCMSFGTKAWGGDWVLEDEDEIFAIMKKAYDQGIRTFDTADSYSNGVSERLLGKFIRKYNIDRSKLVILTKVFFPAPEEYESFSFFNHNFPGHELVNRSGLSRKHILDSAAASVERLGTYIDVLQIHRYDPNTPAEETMEALNDCIKQGLTRYIGASTMRAYQFIKYQNVAEKHGWAKFISMQSYYSLLYREEEAELIAYCNETGVGLIPWSPNAGGFLTRPVSKQDTARSASGAAALYGLEPFSEADKAIIDRVEELSKKKGVSMASVALAWVISKNSWPIIGFSKPGRVDDALDGFKLKLTEEDIKFLEEPYVPKPLPRLYSVIL
配列番号１５（配列番号２に対応）
DNA配列
ATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCATATGAATTGGGAAAAAGTGCCGCAGGAACTGTATACCCGTCTGGGTAGCAGCGGTCTGCAGATTAGCAAAATTATTGTGGGTTGTATGAGCTTTGGCACCAAAGCATGGGGTGGTGATTGGGTTCTGGAAGATGAAGATGAAATTTTTGCCATTATGAAAAAAGCCTATGATCAGGGTATTCGTACCTTTGATACCGCAGATAGCTATAGCAATGGTGTTAGCGAACGTCTGCTGGGTAAATTCATCCGCAAATACAACATTGATCGCAGCAAACTGGTTATTCTGACCAAAGTTTTTTTTCCGGCACCGGAAGAATATGAAAGCTTCAGCTTTTTTAACCATAACTTTCCGGGTCATGAACTGGTTAATCGTAGCGGTCTGAGCCGTAAACATATTCTGGATAGCGCAGCAGCAAGCGTTGAACGTCTGGGCACCTATATTGATGTTCTGCAGATCCATCGTTATGATCCGAATACACCGGCTGAAGAAACAATGGAAGCCCTGAACGATTGTATTAAACAGGGTCTGACCCGTTATATTGGTGCAAGCACCATGCGTGCCTATCAGTTCATTAAATATCAGAACGTGGCCGAAAAACATGGTTGGGCCAAATTTATTAGCATGCAGAGCTATTATAGCCTGCTGTATCGTGAAGAAGAAGCAGAACTGATTGCCTATTGCAATGAAACCGGTGTTGGTCTGATTCCGTGGAGCCCGAATGCCGGTGGTTTTCTGACCCGTCCGGTTAGCAAACAGGATACCGCACGTAGCGCAAGCGGTGCAGCAGCACTGTATGGTCTGGAACCGTTTAGCGAAGCAGATAAAGCCATTATTGATCGTGTGGAAGAACTGAGCAAAAAAAAAGGTGTTAGCATGGCAAGCGTTGCACTGGCATGGGTTATTAGCAAAAACAGCTGGCCGATTATTGGTTTTAGCAAACCGGGTCGTGTTGATGATGCACTGGATGGCTTTAAACTGAAACTGACCGAAGAGGATATCAAATTCCTGGAAGAACCGTATGTTCCGAAACCGCTGCCTCGTCTGTATAGCGTTATTCTGTAA
【００５５】
配列番号３
アミノ酸配列
MSQGRKAAERLAKKTVLITGASAGIGKATALEYLEASNGDMKLILAARRLEKLEELKKTIDQEFPNAKVHVAQLDITQAEKIKPFIENLPQEFKDIDILVNNAGKALGSDRVGQIATEDIQDVFDTNVTALINITQAVLPIFQAKNSGDIVNLGSIAGRDAYPTGSIYCASKFAVGAFTDSLRKELINTKIRVILIAPGLVETEFSLVRYRGNEEQAKNVYKDTTPLMADDVADLIVYATSRKQNTVIADTLIFPTNQASPHHIFRG
配列番号１６（配列番号３に対応）
DNA配列
ATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCATATGAGCCAGGGTCGTAAAGCAGCAGAACGTCTGGCAAAAAAAACCGTTCTGATTACCGGTGCAAGCGCAGGTATTGGTAAAGCAACCGCACTGGAATATCTGGAAGCAAGCAATGGCGATATGAAACTGATTCTGGCAGCACGTCGTCTGGAAAAACTGGAAGAACTGAAAAAAACCATCGATCAGGAATTTCCGAACGCAAAAGTTCATGTTGCACAGCTGGATATTACCCAGGCAGAAAAAATCAAACCGTTTATCGAAAATCTGCCGCAGGAATTCAAAGATATCGATATTCTGGTGAATAATGCAGGTAAAGCACTGGGTAGCGATCGTGTTGGTCAGATTGCAACCGAAGATATCCAGGATGTGTTTGATACCAATGTGACCGCACTGATTAATATTACACAGGCCGTTCTGCCGATTTTTCAGGCAAAAAACAGCGGTGATATTGTGAATCTGGGTAGCATTGCAGGTCGTGATGCATATCCGACCGGTAGCATTTATTGTGCAAGCAAATTTGCAGTTGGTGCATTTACCGACAGTCTGCGCAAAGAACTGATTAATACCAAAATCCGCGTTATTCTGATTGCACCGGGTCTGGTTGAAACCGAATTCAGCCTGGTTCGTTATCGTGGTAATGAAGAACAGGCCAAAAACGTGTATAAAGATACCACACCGCTGATGGCAGATGATGTTGCCGATCTGATTGTTTATGCAACCAGCCGTAAACAGAATACCGTTATTGCCGATACCCTGATTTTTCCGACCAATCAGGCATCTCCGCATCATATTTTTCGTGGTTAA
【００５６】
配列番号４
アミノ酸配列
MTQRIAYVTGGMGGIGTAICQRLAKDGFRVVAGCGPNSPRREKWLEQQKALGFDFIASEGNVADWDSTKTAFDKVKSEVGEVDVLINNAGITRDVVFRKMTRADWDAVIDTNLTSLFNVTKQVIDGMADRGWGRIVNISSVNGQKGQFGQTNYSTAKAGLHGFTMALAQEVATKGVTVNTVSPGYIATDMVKAIRQDVLDKIVATIPVKRLGLPEEIASICAWLSSEESGFSTGADFSLNGGLHMG
配列番号１７（配列番号４に対応）
DNA配列
ATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCATATGACCCAGCGTATTGCCTATGTTACCGGTGGTATGGGTGGTATTGGCACCGCAATTTGTCAGCGTCTGGCAAAAGATGGTTTTCGTGTTGTTGCAGGTTGTGGTCCGAATTCTCCGCGTCGTGAAAAATGGCTGGAACAGCAGAAAGCACTGGGTTTTGATTTTATTGCCAGCGAAGGTAATGTTGCAGATTGGGATAGCACCAAAACCGCCTTTGATAAAGTTAAAAGCGAAGTGGGTGAAGTTGATGTGCTGATTAACAATGCAGGTATTACCCGTGATGTTGTGTTTCGCAAAATGACCCGTGCCGATTGGGATGCAGTTATTGATACCAATCTGACCAGCCTGTTTAATGTTACCAAACAGGTGATTGATGGTATGGCAGATCGTGGTTGGGGTCGTATTGTTAATATTAGCAGCGTGAATGGTCAGAAAGGTCAGTTTGGTCAGACCAATTATAGCACCGCAAAAGCAGGTCTGCATGGTTTTACAATGGCACTGGCACAGGAAGTTGCAACCAAAGGCGTTACCGTTAATACCGTTTCTCCGGGTTATATTGCCACCGATATGGTTAAAGCAATTCGTCAGGATGTGCTGGATAAAATTGTTGCCACCATTCCGGTTAAACGTCTGGGTCTGCCGGAAGAAATTGCAAGCATTTGTGCATGGCTGAGCAGCGAAGAAAGCGGTTTTAGCACAGGTGCAGATTTTAGCCTGAATGGTGGTCTGCACATGGGTTAA
【００５７】
配列番号５
アミノ酸配列
MSSPSDGPFPKATPQLPNSVFDMFSMKGKVTAITGGGGGIGFAAAEAIAEAGGDVALLYRSAPNMEERSAELAKRFGVKVKSYQCEVTEHESVKQAIEAVEKDFGRLDCYIANAGGGVPGSINPDYPLEAWHKTQSVNLHSTFYAARECARIFKAQGSGSFIATTSISARIVNVPYDQPAYNSSKAAVVHFCRSLARDWRNFARVNTISPGFFDTPMGPSDKAVEDVLYQKSVLGRAGDVKELKAAYLYLASNASTYTTGADLLIDGGYCLT
配列番号１８（配列番号５に対応）
DNA配列
ATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCATATGAGCAGCCCGTCTGATGGTCCGTTTCCGAAAGCAACACCGCAGCTGCCGAATAGCGTTTTTGACATGTTTAGCATGAAAGGTAAAGTTACCGCAATTACCGGTGGTGGTGGTGGCATTGGTTTTGCAGCAGCAGAAGCAATTGCCGAAGCCGGTGGTGATGTTGCACTGCTGTATCGTAGCGCACCGAATATGGAAGAACGTAGCGCAGAACTGGCAAAACGTTTTGGTGTGAAAGTGAAAAGCTATCAGTGCGAAGTTACCGAACATGAAAGCGTTAAACAGGCAATTGAAGCCGTGGAAAAAGATTTTGGTCGCCTGGATTGTTATATTGCAAATGCGGGTGGTGGTGTTCCGGGTAGCATTAATCCGGATTATCCGCTGGAAGCATGGCATAAAACCCAGAGCGTTAATCTGCATAGCACCTTTTATGCAGCACGTGAATGCGCACGTATTTTTAAAGCACAGGGCAGCGGTAGCTTTATTGCAACCACCTCTATTAGCGCACGTATTGTGAATGTTCCGTATGATCAGCCTGCATATAATAGCAGCAAAGCAGCCGTTGTTCATTTTTGTCGTAGCCTGGCACGTGATTGGCGTAATTTTGCCCGTGTTAATACCATTAGCCCTGGTTTTTTTGATACCCCGATGGGTCCGAGCGATAAAGCAGTTGAAGATGTGCTGTATCAGAAAAGCGTTCTGGGTCGTGCCGGTGATGTTAAAGAACTGAAAGCAGCATATCTGTATCTGGCAAGCAATGCAAGCACCTATACCACCGGTGCAGATCTGCTGATTGATGGTGGTTATTGTCTGACCTAA
【００５８】
配列番号６
アミノ酸配列
MVPKFYKLSNGFKIPSIALGTYDIPRSQTAEIVYEGVKCGYRHFDTAVLYGNEKEVGDGIIKWLNEDPGNHKREEIFYTTKLWNSQNGYKRAKAAIRQCLNEVSGLQYIDLLLIHSPLEGAVDEGLVKSIGVSNYGKKHIDELLNWPELKHKPVVNQIEISPWIMRQELADYCKSKGLVVEAFAPLCHGYKMTNPDLLKVCKEVDRNPGQVLIRWSLQHGYLPLPKTKTVKRLEGNLAAYNFELSDEQMKFLDHAP
配列番号１９（配列番号６に対応）
DNA配列
ATGGTTCCTAAGTTTTACAAACTTTCAAACGGCTTCAAAATCCCAAGCATTGCTTTGGGAACCTACGATATTCCAAGATCGCAAACAGCCGAAATTGTGTATGAAGGTGTCAAGTGCGGCTACCGTCATTTCGATACTGCTGTTCTTTATGGTAATGAGAAGGAAGTTGGCGATGGTATCATTAAATGGTTGAACGAAGATCCAGGGAACCATAAACGTGAGGAAATCTTCTACACTACTAAATTATGGAATTCGCAAAACGGATATAAAAGAGCTAAAGCTGCCATTCGGCAATGTTTGAATGAAGTCTCGGGCTTGCAATACATCGATCTTCTTTTGATTCATTCGCCACTGGAAGGTTCTAAATTAAGGTTGGAAACTTGGCGCGCCATGCAAGAAGCGGTTGATGAAGGATTGGTTAAGTCTATAGGGGTTTCCAACTATGGGAAAAAGCACATTGATGAACTTTTGAACTGGCCAGAACTGAAGCACAAGCCAGTGGTCAACCAAATCGAGATATCACCTTGGATTATGAGACAAGAATTAGCAGATTACTGTAAATCTAAAGGTCTCGTCGTCGAAGCCTTTGCCCCATTGTGTCACGGCTACAAAATGACTAATCCAGATTTATTAAAAGTTTGCAAAGAGGTGGACCGTAATCCAGGTCAAGTTTTGATTCGTTGGTCTTTACAACACGGTTATTTACCACTACCGAAGACTAAAACTGTGAAGAGGTTAGAAGGTAACCTTGCAGCCTACAACTTTGAACTGTCAGACGAACAGATGAAATTTCTTGATCATCCTGATGCTTATGAGCCTACCGATTGGGAATGCACAGACGCGCCATAA
【００５９】
配列番号７
アミノ酸配列
配列番号２０（配列番号７に対応）
DNA配列
ATGTATACCGACCTGAAAGATAAAGTTGTTGTTGTGACCGGTGGTAGCAAAGGTCTGGGTCGTGCAATGGCAGTTCGTTTTGGTCAGGAACAGAGCAAAGTTGTTGTGAATTATCGCAGCAATGAAGAAGAAGCCCTGGTTGGTCAGGAACAGAGCAAAGTTGTTGTGAATTATCGCAGCAATGAAGAAGAAGCCCTGGCCAAAGAAGAGGACGTTGTTAATCTGGTTGAAACCGCAGTTAAAGAATTTGGCACCCTGGATGTGATGATTAATAATGCCGGTGTTGAAAATCCGGTTCCGAGCCATGAACTGAGCCTGGAAAATTGGAATCAGGTGATTGATACCAATCTGACCGGTGCATTTCTGGGTAGCCGTGAAGCCATTAAATATTTTGTGGAAAATGATATTAAAGGCAATGTGATCAATATGAGCAGCGTTCATGAAATGATTCCGTGGCCTCTGTTTGTTCATTATGCAGCAAGCAAAGGTGGTATGAAACTGATGACCGAAACCCTGGCACTGGAATATGCACCGAAAGGTATTCGTGTGAATAATATTGGTCCGGGTGCAATTGATACCCCGATCAATGCAGAAAAATTTGCAGATCCGGAACAGCGTGCAGATGTTGAAAGCATGATTCCGATGGGTTATATTGGCAATCCGGAAGAAATTGCAAGCGTTGCAGCATTTCTGGCAAGCAGCCAGGCAAGCTATGTTACCGGTATTACCCTGTTTGCAGATGGTGGTATGACCAAATATCCGAGCTTTCAGGCAGGTCGTGGTTAATAA
【００６０】
配列番号８
アミノ酸配列
MTDLFKPLPEPPTELGRLRVLSKTAGIRVSPLILGGASIGDAWSGFMGSMNKEQAFELLDAFYEAGGNCIDTANSYQNEESEIWIGEWMASRKLRDQIVIATKFTGDYKKYEVGGGKSANYCGNHKRSLHVSVRDSLRKLQTDWIDILYIHWWDYMSSIEEVMDSLHILVQQGKVLYLGVSDTPAWVVSAANYYATSHGKTPFSVYQGKWNVLNRDFERDIIPMARHFGMALAPWDVMGGGRFQSKKAMEERKKNGEGLRTFVGGPEKIAEEHGTESVTAIAIAYVRSKAKNVFPLIGGRKIEHLKQNIEALSIKLTPEQIEYLESIVPFDVGFPKSLIGDDPAVTKKLSPLTSMSARIAFDN
配列番号２１（配列番号８に対応）
DNA配列
ATGACTGACTTGTTTAAACCTCTACCTGAACCACCTACCGAATTGGGACGTCTCAGGGTTCTTTCTAAAACTGCCGGCATAAGGGTTTCACCGCTAATTCTGGGAGGAGCTTCAATCGGCGACGCATGGTCAGGCTTTATGGGCTCTATGAATAAGGAACAGGCCTTTGAACTTCTTGATGCTTTTTATGAAGCTGGAGGTAATTGTATTGATACTGCAAACAGTTACCAAAATGAAGAGTCAGAGATTTGGATAGGTGAATGGATGGCATCAAGAAAACTGCGTGACCAGATTGTAATTGCCACCAAGTTTACCGGAGATTATAAGAAGTATGAAGTAGGTGGTGGTAAAAGTGCCAACTACTGTGGTAATCACAAGCGTAGTTTACATGTGAGTGTGAGGGATTCTCTCCGCAAATTGCAAACTGATTGGATTGATATACTTTACATTCACTGGTGGGATTATATGAGTTCAATCGAAGAAGTTATGGATAGTTTGCATATTTTAGTTCAGCAGGGCAAGGTCCTATATTTAGGAGTATCTGATACACCTGCTTGGGTTGTTTCTGCGGCAAATTACTACGCTACATCTCATGGTAAAACTCCTTTTAGCGTCTATCAAGGTAAATGGAATGTATTGAACAGGGACTTTGAGCGTGATATTATTCCAATGGCTAGGCATTTTGGTATGGCTCTAGCCCCATGGGATGTCATGGGAGGTGGAAGATTTCAGAGTAAAAAAGCAATGGAAGAACGGAAGAAGAATGGAGAGGGTCTGCGTACTTTTGTGGGTGGCCCCGAACAAACAGAATTGGAGGTTAAAATCAGCGAAGCATTGACTAAAATTGCTGAGGAACATGGAACAGAGTCTGTTACTGCTATCGCTATTGCCTATGTTCGCTCTAAAGCGAAAAATGTTTTCCCATTGATTGGAGGAAGGAAAATTGAACATCTCAAGCAGAACATTGAGGCTTTGAGTATTAAATTAACACCGGAACAAATAGAATACCTGGAAAGTATTGTTCCTTTTGATGTTGGCTTTCCCAAAAGTTTAATAGGAGATGACCCAGCGGTAACCAAGAAGCTTTCACCCCTCACATCGATGTCTGCCAGGATAGCTTTTGACAATTAG
【００６１】
配列番号９
アミノ酸配列
MCDSPATTGKPTILFIADPCETSATLNSKAFKEKFRILRYQLDTKEAFLNFLERHEQDKICAIYAGFPAFKKIGGMTRSIIEHKSFPRKNLKCIVLCSRGYDGWDLDTLRKHEIRLYNYQDDENEKLIDDLKLHQVGNDVADCALWHILEGFRKFSYYQKLSRETGNTLTARAKAAEKSGFAFGHELGNMFAESPRGKKCLILGLGSIGKQVAYKLQYGLGMEIHYCKRSEDCTMSQNESWKFHLLDETIYAKLYQFHAIVVTLPGTHCNPGLILVNLGRGKILDLRAVSDALVTGRINHLGLDVFNKEPEIDEKIRSSDRLTSITPHLGSATKDVFEQSCELALTRILRVVSGEAASDEHFSRVV
配列番号２２（配列番号９に対応）
DNA配列
ATGTGCGATTCTCCTGCAACGACTGGAAAGCCTACTATTCTTTTCATCGCAGATCCGTGCGAAACATCAGCCACACTTAATTCCAAGGCATTCAAAGAGAAGTTCAGGATCTTGCGCTATCAGCTGGACACCAAAGAAGCATTTCTTAACTTTTTAGAAAGGCATGAACAAGACAAAATATGTGCCATTTATGCTGGGTTTCCGGCATTCAAAAAAATCGGTGGGATGACTCGAAGTATCATCGAACACAAGTCATTTCCAAGGAAAAATTTAAAATGTATCGTGCTTTGCTCAAGAGGTTACGACGGATGGGATCTGGATACATTACGCAAGCATGAAATTCGATTATACAACTACCAAGACGATGAAAATGAAAAATTGATAGACGATTTAAAGCTTCATCAAGTCGGTAATGATGTGGCAGATTGTGCCTTGTGGCACATTCTGGAGGGCTTTAGAAAGTTCTCCTATTACCAAAAACTTAGTAGAGAAACTGGAAATACATTAACTGCAAGGGCGAAAGCTGCAGAAAAGAGCGGATTTGCTTTTGGCCATGAACTGGGGAATATGTTTGCTGAATCACCAAGAGGAAAGAAATGCTTAATTCTTGGTTTAGGAAGTATTGGAAAGCAAGTAGCCTACAAGTTGCAATACGGGCTAGGAATGGAAATACATTATTGCAAAAGAAGCGAAGATTGCACAATGAGTCAAAACGAAAGCTGGAAATTTCATTTGCTAGATGAAACAATATATGCAAAACTATACCAGTTTCATGCAATCGTGGTCACATTGCCGGGAACTCCACAAACAGAACATTTAATCAACAGGAAATTTTTGGAACACTGCAATCCAGGCCTAATTTTAGTCAACTTGGGAAGAGGTAAAATTTTGGACTTGCGGGCTGTTTCTGACGCCTTGGTAACGGGACGAATCAACCATCTCGGTTTAGACGTCTTTAATAAAGAACCAGAAATAGATGAAAAAATCAGATCTTCTGATAGACTTACTTCAATTACTCCGCATTTGGGTAGTGCGACAAAGGATGTTTTTGAGCAAAGTTGTGAACTGGCATTGACAAGAATCTTACGGGTAGTGTCTGGGGAAGCCGCAAGCGATGAGCATTTCTCCCGTGTAGTTTGA
【００６２】
配列番号１０
アミノ酸配列
MSSLVTLNNGLKMPLVGLGCWKIDKKVCANQIYEAIKLGYRLFDGACDYGNEKEVGEGIRKAISEGLVSRKDIFVVSKLWNNFHHPDHVKLALKKTLSDMGLDYLDLYYIHFPIAFKYVPFEEKYPPGFYTGADDEKKGHITEAHVPIIDTYRALEECVDEGLIKSIGVSNFQGSLIQDLLRGCRIKPVALQIEHHPYLTQEHLVEFCKLHDIQVVAYSSFGPQSFIEMDLQLAKTTPTLFENDVIKKVSQNHPGSTTSQVLLRWATERLLGNLEIEKKFTLTEQELKDISALNANIRFNDPWTWLDGKFPTFA
配列番号２３（配列番号１０に対応）
DNA配列
ATGTCTTCACTGGTTACTCTTAATAACGGTCTGAAAATGCCCCTAGTCGGCTTAGGGTGCTGGAAAATTGACAAAAAAGTCTGTGCGAATCAAATTTATGAAGCTATCAAATTAGGCTACCGTTTATTCGATGGTGCTTGCGACTACGGCAACGAAAAGGAAGTTGGTGAAGGTATCAGGAAAGCCATCTCCGAAGGTCTTGTTTCTAGAAAGGATATATTTGTTGTTTCAAAGTTATGGAACAATTTTCACCATCCTGATCATGTAAAATTAGCTTTAAAGAAGACCTTAAGCGATATGGGACTTGATTATTTAGACCTGTATTATATTCACTTCCCAATCGCCTTCAAATATGTTCCATTTGAAGAGAAATACCCTCCAGGATTCTATACGGGCGCAGATGACGAGAAGAAAGGTCACATCACCGAAGCACATGTACCAATCATAGATACGTACCGGGCTCTGGAAGAATGTGTTGATGAAGGCTTGATTAAGTCTATTGGTGTTTCCAACTTTCAGGGAAGCTTGATTCAAGATTTATTACGTGGTTGTAGAATCAAGCCCGTGGCTTTGCAAATTGAACACCATCCTTATTTGACTCAAGAACACCTAGTTGAGTTTTGTAAATTACACGATATCCAAGTAGTTGCTTACTCCTCCTTCGGTCCTCAATCATTCATTGAGATGGACTTACAGTTGGCAAAAACCACGCCAACTCTGTTCGAGAATGATGTAATCAAGAAGGTCTCACAAAACCATCCAGGCAGTACCACTTCCCAAGTATTGCTTAGATGGGCAACTCAGAGAGGCATTGCCGTCATTCCAAAATCTTCCAAGAAGGAAAGGTTACTTGGCAACCTAGAAATCGAAAAAAAGTTCACTTTAACGGAGCAAGAATTGAAGGATATTTCTGCACTAAATGCCAACATCAGATTTAATGATCCATGGACCTGGTTGGATGGTAAATTCCCCACTTTTGCCTGA
【００６３】
配列番号１１
アミノ酸配列
MANPTVIKLQDGNVMPQLGLGVWQASNEEVITAIQKALEVGYRSIDTAAAYKNEEGVGKALKNASVNREELFITTKLWNDDHKRPREALLDSLKKLQLDYIDLYLMHWPVPAIDHYVEAWKGMIELQKEGLIKSIGVCNFQIHHLQRLIDETGVTPVINQIELHPLMQQRQLHAWNATHKIQTESWSPLAQGGKGVFDQKVIRDLADKYGKTPAQIVIRWHLDSGLVVIPKSVTPSRIAENFDVWDFRLDKDELGEIAKLDQGKRLGPDPDQFGG
配列番号２４（配列番号１１に対応）
DNA配列
ATGGCTAATCCAACCGTTATTAAGCTACAGGATGGCAATGTCATGCCCCAGCTGGGACTGGGCGTCTGGCAAGCAAGTAATGAGGAAGTAATCACCGCCATTCAAAAAGCGTTAGAAGTGGGTTATCGCTCGATTGATACCGCCGCGGCCTACAAGAACGAAGAAGGTGTCGGCAAAGCCCTGAAAAATGCCTCAGTCAACAGAGAAGAACTGTTCATCACCACTAAGCTGTGGAACGACGACCACAAGCGCCCCCGCGAAGCCCTGCTCGACAGCCTGAAAAAACTCCAGCTTGATTATATCGACCTCTACTTAATGCACTGGCCCGTTCCCGCTATCGACCATTATGTCGAAGCATGGAAAGGCATGATCGAATTGCAAAAAGAGGGATTAATCAAAAGCATCGGCGTGTGCAACTTCCAGATCCATCACCTGCAACGCCTGATTGATGAAACTGGCGTGACGCCTGTGATAAACCAGATCGAACTTCATCCGCTGATGCAACAACGCCAGCTACACGCCTGGAACGCGACACACAAAATCCAGACCGAATCCTGGAGCCCATTAGCGCAAGGAGGGAAAGGCGTTTTCGATCAGAAAGTCATTCGCGATCTGGCAGATAAATACGGCAAAACCCCGGCGCAGATTGTTATCCGCTGGCATCTGGATAGCGGCCTGGTGGTGATCCCGAAATCGGTCACACCTTCACGTATTGCCGAAAACTTTGATGTCTGGGATTTCCGTCTCGACAAAGACGAACTCGGCGAAATTGCAAAACTCGATCAGGGCAAGCGTCTCGGTCCCGATCCTGACCAGTTCGGCGGCTAA
【００６４】
配列番号１２
アミノ酸配列
MAIPAFGLGTFRLKDDVVISSVITALELGYRAIDTAQIYDNEAAVGQAIAESGVPRHELYITTKIWIENLSKDKLIPSLKESLQKLRTDYVDLTLIHWPSPNDEVSVEEFMQALLEAKKQGLTREIGISNFTIPLMEKAIAAVGAENIATNQIELSPYLQNRKVVAWAKQHGIHITSYMTLAYGKALKDEVIARIAAKHNATPAQVILAWAMGEGYSVIPSSTKRKNLESNLKAQNLQLDAEDKKAIAALDCNDRLVSPEGLAPEWD
配列番号２５（配列番号１２に対応）
DNA配列
ATGGCTATCCCTGCATTTGGTTTAGGTACTTTCCGTCTGAAAGACGACGTTGTTATTTCATCTGTGATAACGGCGCTTGAACTTGGTTATCGCGCAATTGATACCGCACAAATCTATGATAACGAAGCCGCAGTAGGTCAGGCGATTGCAGAAAGTGGCGTGCCACGTCATGAACTCTACATCACCACTAAAATCTGGATTGAAAATCTCAGCAAAGACAAATTGATCCCAAGTCTGAAAGAGAGCCTGCAAAAATTGCGTACCGATTATGTTGATCTGACGCTAATCCACTGGCCGTCACCAAACGATGAAGTCTCTGTTGAAGAGTTTATGCAGGCGCTGCTGGAAGCCAAAAAACAAGGGCTGACGCGTGAGATCGGTATTTCCAACTTCACGATCCCGTTGATGGAAAAAGCGATTGCTGCTGTTGGTGCTGAAAACATCGCTACTAACCAGATTGAACTCTCTCCTTATCTGCAAAACCGTAAAGTGGTTGCCTGGGCTAAACAGCACGGCATCCATATTACTTCCTATATGACGCTGGCGTATGGTAAGGCCCTGAAAGATGAGGTTATTGCTCGTATCGCAGCTAAACACAATGCGACTCCGGCACAAGTGATTCTGGCGTGGGCTATGGGGGAAGGTTACTCAGTAATTCCTTCTTCTACTAAACGTAAAAACCTGGAAAGTAATCTTAAGGCACAAAATTTACAGCTTGATGCCGAAGATAAAAAAGCGATCGCCGCACTGGATTGCAACGACCGCCTGGTTAGCCCGGAAGGTCTGGCTCCTGAATGGGATTAA
【００６５】
配列番号１３
アミノ酸配列
MPATLHDSTKILSLNTGAQIPQIGLGTWQSKENDAYKAVLTALKDGYRHIDTAAIYRNEDQVGQAIKDSGVPREEIFVTTKLWCTQHHEPEVALDQSLKRLGLDYVDLYLMHWPARLDPAYIKNEDILSVPTKKDGSRAVDITNWNFIKTWELMQELPKTGKTKAVGVSNFSINNLKDLLASQGNKLTPAANQVEIHPLLPQDELINFCKSKGIVVEAYSPLGSTDAPLLKEPVILEIAKKNNVQPGHVVISWHVQRGYVVLPKSVNSTEDFEAINNISKEKGEKRVVHPNWSPFEVFK
配列番号２６（配列番号１３に対応）
DNA配列
ATGCCTGCTACTTTACATGATTCTACGAAAATCCTTTCTCTAAATACTGGAGCCCAAATCCCTCAAATAGGTTTAGGTACGTGGCAGTCGAAAGAGAACGATGCTTATAAGGCTGTTTTAACCGCTTTGAAAGATGGCTACCGACACATTGATACTGCTGCTATTTACCGTAATGAAGACCAAGTCGGTCAAGCCATCAAGGATTCAGGTGTTCCTCGGGAAGAAATCTTTGTTACTACAAAGTTATGGTGTACACAACACCACGAACCTGAAGTAGCGCTGGATCAATCACTAAAGAGGTTAGGATTGGACTACGTAGACTTATATTTGATGCATTGGCCTGCCAGATTAGATCCAGCCTACATCAAAAATGAAGACATCTTGAGTGTGCCAACAAAGAAGGATGGTTCTCGTGCAGTGGATATCACCAATTGGAATTTCATCAAAACCTGGGAATTAATGCAGGAACTACCAAAGACTGGTAAAACTAAGGCCGTTGGAGTCTCCAACTTTTCTATAAATAACCTGAAAGATCTATTAGCATCTCAAGGTAATAAGCTTACGCCAGCTGCTAACCAAGTCGAAATACATCCATTACTACCTCAAGACGAATTGATTAATTTTTGTAAAAGTAAAGGCATTGTGGTTGAAGCTTATTCTCCGTTAGGTAGTACCGATGCTCCACTATTGAAGGAACCGGTTATCCTTGAAATTGCGAAGAAAAATAACGTTCAACCCGGACACGTTGTTATTAGCTGGCACGTCCAAAGAGGTTATGTTGTCTTGCCAAAATCTGTGAATCCCGATCGAATCAAAACGAACAGGAAAATATTTACTTTGTCTACTGAGGACTTTGAAGCTATCAATAACATATCGAAGGAAAAGGGCGAAAAAAGGGTTGTACATCCAAATTGGTCTCCTTTCGAAGTATTCAAGTAA
【００６６】
本明細書中、「酵素」は、所望の酵素活性を示す、ポリヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドを指す。「酵素」は、本明細書中、特段の言及が無い限り、下記で定義する、適切な「変異体」をも含み得る。
【００６７】
「変異体」は、１つ以上のヌクレオチドが、付加、欠失、置換又は挿入した上記ヌクレオチド配列に由来するポリペプチドを指す。本明細書中で使用されるとき、「オキシドレダクターゼ」又は「オキシドレダクターゼ酵素」は、任意で補因子の助けを借りて、立体選択的にケトンを還元して対応するアルコールを形成する反応を触媒する酵素を指す。
【００６８】
本明細書中、「補因子」は、所望の反応を触媒する酵素と協調して機能する有機化合物を指す。例えば、補因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP＋)、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)、及びそれらの任意の誘導体又は類似体である。
【００６９】
本明細書中、「発現コンストラクト」は、所望の遺伝子のヌクレオチド配列及び所望の遺伝子の発現を制御する配列を含む。
【００７０】
本明細書中、「単シストロン性発現コンストラクト」は、単一の遺伝子を発現する発現コンストラクトを意味する。
【００７１】
本明細書中、「多シストロン性発現コンストラクト」は、２つ以上の遺伝子を発現する単一の発現コンストラクトを意味する。
【００７２】
本明細書中、「酵素会合補因子再生産系」は、反応の過程で、発現ベクターが、酸化されたNAD(P)から還元された補因子を再生産する能力を有する酵素的ポリペプチドを発現することを意味する。
【００７３】
本明細書中、「基質会合補因子再生産系」は、反応の過程で、酸化されたNAD(P)から還元された補因子を再生産する能力を有する適切な基質H+供与体を使用することを意味する。
【００７４】
pET11aZBG5.1.1は、Genbank ID No. NP_579689.1の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、アンピシリン薬物耐性マーカーを利用するpET11a中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００７５】
pET11aZBG6.4.1は、Genbank ID No. YP_399703.1の配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、アンピシリン薬物耐性マーカーを利用するpET11a中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００７６】
pET11aZBG2.0.1は、Genbank ID No. NP_013953.1の配列番号３のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、アンピシリン薬物耐性マーカーを利用するpET11a中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００７７】
pET11aZBG25.1.1は、Genbank ID No. AAA21973.1の配列番号４のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、アンピシリン薬物耐性マーカーを利用するpET11a中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００７８】
pET11aZBG8.1.1は、Genbank ID No. BAH28833.1の配列番号５のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、アンピシリン薬物耐性マーカーを利用するpET11a中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００７９】
pET11aZBG13.1.1は、Genbank ID No. AAX31145.1の配列番号７のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、アンピシリン薬物耐性マーカーを利用するpET11a中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００８０】
pET27bZBG5.1.1は、Genbank ID No. NP_579689.1の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００８１】
pET27bZBG2.0.1は、Genbank ID No. NP_013953.1の配列番号３のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００８２】
pET27bZBG8.1.1は、Genbank ID No. BAH28833.1の配列番号５のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００８３】
pET27bZBG2.0.9は、Genbank ID No. NP_012630.1の配列番号６のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００８４】
pET27bZBG13.1.1は、Genbank ID No. AAX31145.1の配列番号７のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００８５】
pET27bZBG2.0.8は、Genbank ID No. NP_014068の配列番号８のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００８６】
pET27bZBG2.0.11は、Genbank ID No. NP_011330の配列番号９のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００８７】
pET27bZBG2.0.5は、Genbank ID No. NP_011972.1の配列番号１０のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００８８】
pET27bZBG1.1.22は、Genbank ID No. ACB04098.1の配列番号１１のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００８９】
pET27bZBG1.1.2は、Genbank ID No. ACB01380.1の配列番号１２のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００９０】
pET27bZBG2.0.4は、Genbank ID No. NP_014763.1の配列番号１３のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。
【００９１】
本明細書中、「全細胞」は、ブタペスト条約に従い寄託された受入れ番号MTCC 5642, MTCC 5643, MTCC 5644, MTCC 5645, MTCC 5646, MTCC 5647, MTCC 5648, MTCC 5649, MTCC 5650, MTCC 5651, MTCC 5652, MTCC 5653, MTCC 5654の組み換えE.コリ(E.coli)を意味する。
【００９２】
「金属イオン塩」とは、Na, K, Li, Ca, Mg, Cu及びCsとの塩を指す。
【００９３】
本発明は、式(I)
【化９】
2013541942.tif 000010
の適切な中間体を調製する方法を提供し、当該方法は：
a)適切な条件下、適切な補因子の存在下で維持することにより、式(III)
【化１０】
2013541942.tif 000011
の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オン、又はその金属イオン塩を、立体選択的にケトンを還元してアルコールを形成する適切な酵素と反応させる工程；及び
b)適切な中間体を単離する工程；
を含む。
【００９４】
本発明の方法は、以下の式：
【化１１】
2013541942.tif 000012
の反対のキラリティの3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンの2つの鏡像異性体を提供する。
【００９５】
本発明は、式(III)の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オン又はその金属イオン塩の酵素的還元による、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オン(式(I)) の、ラセミ(R/S)体又はその光学活性(R又はS)体(それぞれ式(Ia)及び(Ib))のいずれかを調製する方法に関し、当該方法は：
式(III)
【化１２】
2013541942.tif 000013
の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オン又はその金属イオン塩を、適切な条件下で維持することにより、ケトンを立体選択的に還元してアルコールを形成する適切な酵素及びその変異体と反応させることにより、3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンの、ラセミ(R/S)体、又は光学活性体(S)又は(R)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を取得する工程を含む。
【００９６】
本発明の一つの態様において、前記所望の酵素活性を有するポリペプチド及びその変異体は、適切な細菌、酵母又は真菌から単離され得る。一つの態様において、前記酵素活性を有する適切なポリペプチドは、オキシドレダクターゼから選択される。好ましい態様において、前記適切な酵素は、アルドケトレダクターゼから選択される。他の態様において、前記適切な酵素は、デヒドロゲナーゼから選択される。一つの態様において、NAD(P)+依存的レダクターゼは、サッカロマイケス(Saccharomyces)種に由来される。他の好ましい態様において、NAD(P)+依存的レダクターゼは、サッカロマイケス・セレウィシアエ(Saccharomyces cerevisiae)に由来し、Genebank ID No. NP_012630.1を有する。他の好ましい態様において、NAD(P)+依存的レダクターゼは、サッカロマイケス・セレウィシアエ(Saccharomyces cerevisiae)に由来し、Genebank ID No. NP_013953.1, NP_014763.1, NP_011972.1, NP_014068及びNP_011330を有する。
【００９７】
好ましい態様において、適切な酵素は、短鎖デヒドロゲナーゼである。そのような短鎖デヒドロゲナーゼの例として、NAD(P)+/NAD(P)H+依存的アルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。他の態様において、前記短鎖デヒドロゲナーゼは、NAD(P)H依存的3-キヌクリジノンレダクターゼから選択される。一つの態様において、NAD(P)H依存的3-キヌクリジノンレダクターゼは、ロドトルラ(Rhodotorula)種から選択される。好ましい態様において、NAD(P)H依存的3-キヌクリジノンレダクターゼはロドトルラ・ムキラギノサ(Rhodotorula mucilaginosa)に由来し、Genebank ID No. BAH28833.1を有する。
【００９８】
他の態様において、前記酵素は、適切なアルドケトレダクターゼから選択される。そのようなアルドケトレダクターゼの例として、アルドースレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、カルボニルレダクターゼ及びケトレダクターゼが挙げられる。好ましい態様において、前記ケトレダクターゼは、ピキア(Pichia)種に由来する。好ましい態様において、NAD(P)+依存的ケトレダクターゼは、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)に由来し、Genebank ID No. AAW06921.1を有する。
【００９９】
他の態様において、前記アルドースレダクターゼは、ピロコッカス(Pyrococcus)種に由来する。そのような態様において、アルドースレダクターゼハ、ピロコッカス・フリオスス(yrococcus furiosus)に由来し、Genebank ID No. NP_579689.1を有する。
【０１００】
他の態様において、前記アセトアセチルレダクターゼは、クプリアウィドゥス(Cupriavidus)種に由来する。そのような態様において、アルドースレダクターゼは、クプリアウィドゥス・ネカトー(Cupriavidus necator)に由来し、Genebank ID No. AAA21973.1を有する。
【０１０１】
他の好ましい態様において、アルドースレダクターゼは、好ましくは2，5-ジケト-D-グルコン酸レダクターゼBであり、エスケリキア・コリ(Escherichia coli)に由来し、Genebank ID No. YP_002998068.1を有する。
【０１０２】
他の好ましい態様において、アルドースレダクターゼは、好ましくは2，5-ジケト-D-グルコン酸レダクターゼAであり、エスケリキア・コリ(Escherichia coli)に由来し、Genebank ID No. ACB04098.1を有する。
【０１０３】
一つの態様において、所望の酵素活性を有するポリペプチド又はそれらの変異体をコードする遺伝子は適切なベクターにクローニングされてもよい。、当該ベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、及びシャトルベクターから選択されてもよい。そのようなベクターは、典型的には、調節エレメント、例えばlacUV5プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、lppプロモーター、tufBプロモーター、recAプロモーター、又はpLプロモーター等を有し、そして好ましくは、本発明のポリヌクレオチドと動作可能に連結した発現単位を含む発現ベクターとして採用される。
【０１０４】
所望の酵素活性を有するポリペプチド又はそれらの変異体をコードする遺伝子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13に記載の配列、又はそれらの変異体から選択される。好ましい態様において、オキシドレダクターゼ酵素活性を有するこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Sambrook et al, Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (2001)に記載の周知技術に従い、クローニングベクターコンストラクトpET11a又はpET27bにクローニングされる。当該コンストラクトベクターは、以後、pET11aZBG5.1.1, pET11aZBG6.4.1, pET11aZBG2.0.1, pET11aZBG25.1.1, pET11aZBG8.1.1, pET11aZBG13.1.1, pET27bZBG5.1.1, pET27bZBG2.0.1, pET27bZBG8.1.1, pET27bZBG2.0.9, pET27bZBG13.1.1, pET27bZBG2.0.8, pET27bZBG2.0.11, pET27bZBG2.0.5, pET27bZBG1.1.22, pET27bZBG1.1.2, 及びpET27bZBG2.0.4と称される。
【０１０５】
加えて、これらのベクターは、更に、NAD、NADP、NADH、NADPH等の補因子を再生産できる酵素をコードする遺伝子を含む。
【０１０６】
「調節エレメント」は、本明細書中、機能的プロモーター、及び何らかの転写エレメント(例えばエンハンサー、CCAATボックス、TATAボックス、SPI部位)を有するヌクレオチド配列を指す。
【０１０７】
本発明のポリヌクレオチドは、プロモーター及びエンハンサー等の調節エレメントと連結しており、これらの調節エレメントは、当該ポリヌクレオチドの発現を制御出来る。かかる調節エレメントが宿主細胞によって様々であることは、当業者にとって周知である。
【０１０８】
一つの態様において、本発明は、所望のオキシドレダクターゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の単シストロン性発現コンストラクトを提供する。あるいは、当該ヌクレオチド配列の単シストロン性発現コンストラクトは、反応の過程で酸化したNAD(P)から補因子を生産する能力を有するポリペプチドをコードする。
【０１０９】
そのような態様において、ヌクレオチド配列にコードされるオキシドレダクターゼポリペプチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号１３から選択され、NAD(P)H/NAD(P)から選択される補因子と会合して、
式(III)の化合物を還元することにより、光学的に純粋な式(I)の化合物、又はそのラセミ(R/S)体、又はその光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産する。ここで、当該補因子は、反応媒体中に外的に添加され、又は酵素/基質会合再生産系により取得される。
【０１１０】
一つの態様において、本発明の方法は、所望のオキシドレダクターゼ酵素活性を有するポリペプチド、及び反応の過程で酸化されたNAD(P)から補因子を再生産する能力を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の多シストロン性発現コンストラクトを提供する。
【０１１１】
そのような態様において、本発明で開示されている配列番号1〜１３(配列番号７を除く)から選択されるオキシドレダクターゼポリペプチドの配列は、NAD(P)H/NAD(P)から選択される補因子と会合して、式(III)の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5- トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンを還元することにより、3,3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]-トリアゾロ-[4,3-a]-ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンのラセミ(R/S)体、又はその光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産する。ここで、当該補因子を再生産する酵素は、同一のベクター中で、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と共発現される。
【０１１２】
一つの態様において、前記ベクターは、本発明で開示される配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13又はその変異体から選択されるオキシドレダクターゼポリペプチドと、反応の過程で酸化したNAD( P)から補因子を再生産する能力を有するポリペプチドとを共発現し、当該ベクターは：
a)宿主細胞中で前記ベクターの複製及び維持を制御する1つ以上の領域；
b)オキシドレダクターゼをコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号１３のいずれかに記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列又はその変異体と動作可能に連結した第一のプロモーター；
c)補因子を再生産する機能を有するポリペプチドをコードする配列番号７に記載のヌクレオチド配列又はその変異体と動作可能に連結した第二のプロモーター；
d)適切な抗生物質マーカー；
を含む
【０１１３】
一つの態様において、前記遺伝子の位置は変化してもよく、更に、上記(b)及び(c)の位置は入れ替わってもよい。
【０１１４】
一つの態様において、ベクターは、pET11aZBG5.1.1, pET11aZBG6.4.1, pET11aZBG2.0.1, pET11aZBG25.1.1, pET11aZBG8.1.1, pET11aZBG13.1.1, pET27bZBG5.1.1, pET27bZBG2.0.1, pET27bZBG8.1.1, pET27bZBG2.0.9, pET27bZBG13.1.1, pET27bZBG2.0.8, pET27bZBG2.0.11, pET27bZBG2.0.5, pET27bZBG1.1.22, pET27bZBG1.1.2, pET27bZBG2.0.4から選択される。
【０１１５】
本発明において、所望のオキシドレダクターゼ酵素活性を有するポリヌクレオチド又はその変異体を含む単シストロン性又は多シストロン性ベクターは、当該技術分野で周知のように、リン酸カルシウム法を使用してトランスフェクションされる。宿主細胞は、細菌、酵母、カビ、植物細胞、及び動物細胞から選択される。好ましい態様において、宿主細胞は、エスケリキア・コリ(Escherichia coli)等の細菌である。そのような態様において、上記所望のポリペプチドは、E.コリ中で過剰発現される。
【０１１６】
本発明の好ましい態様において、式(I)の化合物、その光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産する方法が提供され、当該方法は：
a)適切な溶媒中に式(III)の化合物又はその金属イオン塩を溶解させる工程；
b)式(III)の化合物又はその金属イオン塩を、適切な条件下、適切な補因子の存在下で、適切なオキシドレダクターゼ酵素と反応させる工程；
c)任意で反応の過程でpHを維持する工程；
d)式(I)の化合物の、光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を単離する工程；
を含む。
【０１１７】
前記反応に適したオキシドレダクターゼ酵素は、本発明に開示の配列番号に記載の配列と、50%以上の類似性/同一性を有する。
【０１１８】
一つの態様において、前記補因子は、反応媒体中に外的に添加される。他の態様において、前記補因子は、酵素会合再生産系により取得される。酵素会合再生産系に使用される酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、亜リン酸デヒドロゲナーゼから選択される。１つの好ましい態様において、前記酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼである。一つの態様において、オキシドレダクターゼ酵素は、単シストロン性ベクター中で発現される。他の態様において、オキシドレダクターゼ酵素は、単一の発現系中の多シストロン性ベクター中で、グルコースデヒドロゲナーゼと共発現される。好ましい態様において、当該発現系は、細菌、例えばエスケリキア・コリ(Escherichia coli)である。
【０１１９】
他の態様において、本発明で開示される、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、及びバイ列番号１３に記載のオキシドレダクターゼポリペプチド(ヌクレオチド配列にコードされる)、又はその変異体は、NAD(P)H/NAD(P)から選択される補因子と会合して、式(III)の化合物を還元することにより、式(I)の化合物の、光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産する。ここで、前記補因子は、基質会合再生産系により再生産される。
【０１２０】
基質会合再生産系は、エタノール、2-プロパノール、4-メチル-2-ペンタノール、2-ヘプタノール、2-ペンタノール、2-ヘキサノールから選択される補基質(co-substrate)を含む。好ましい態様において、基質会合再生産系に使用される補基質は、2-プロパノールである。
【０１２１】
更に、基質会合再生産系は、1つ以上の酵素の作用を必要とする。好ましい態様において、基質会合再生産系は、本発明で開示される配列番号に記載のポリペプチド配列を有する酵素の作用を必要とする。好ましい態様において、本発明で開示される配列番号に記載のポリペプチド配列を有するポリペプチド又はその変異体は、単シストロン性ベクター中で発現する。
【０１２２】
好ましい態様において、NAD(P)H等の還元された補因子は、本発明で開示される配列番号に記載のポリペプチド配列を有する酵素による2-プロパノールの脱水素化によるアセトンの生産により再生産される。更に、還元された補因子は、前記酵素と会合して、酸塩基触媒機構により、基質と反応する。故に、このプロセスにおいて、還元された補因子NAD(P)Hは、同一のオキシドレダクターゼ酵素によるアルコールの脱水素化により、持続的に再生産される。
【０１２３】
一つの態様において、式(I)の光学的に純粋な化合物、又はその光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物は、適切な反応条件で、
本発明で開示される、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13に記載の配列、又はその変異体から選択される所望の配列を有するポリペプチドを含有する無細胞系を用いて、式(III)の化合物を還元することにより生産される。当該無細胞系は、本発明で開示される、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13に記載の配列、又はその変異体から選択される所望の配列を有するオキシドレダクターゼ酵素及びその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を有する単シストロン性ベクターを有し、所望の補因子が外的に添加される。あるいは、前記無細胞系は、
本発明で開示される、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13に記載の配列、又はその変異体から選択される所望の配列を有するオキシドレダクターゼ酵素及びその変異体、並びに酸化したNAD(P)から補因子を再生産する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む多シストロン性ベクターを含有する、宿主細胞の溶解物から取得される。
【０１２４】
任意で、前記無細胞抽出物は、凍結乾燥又は噴霧乾燥等の当業者に周知の手段により、凍結乾燥又は乾燥されて、水分が除去されてもよい。このような手段により取得された粉末は、本発明で開示される配列番号に記載のポリペプチド配列を有する1つ以上のオキシドレダクターゼ及びその変異体を含有しており、当該粉末は、式(III)の化合物、又はその金属イオン塩を還元することにより、光学的に純粋な式(I)の化合物、その光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産するのに使用される。
【０１２５】
一つの態様において、適切な反応条件下、式(III)の化合物を還元することによる、光学的に純粋な式(I)の化合物、その光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物の生産は、全細胞生体触媒を用いて行われ、当該触媒は、配列番号1及び14、配列番号2及び15、配列番号3及び16、配列番号4及び17、配列番号5及び18、配列番号6及び19、配列番号8及び21、配列番号9及び22、配列番号10及び23、配列番号11及び24、配列番号12及び25、並びに配列番号13及び26に記載の配列を有する、１つ以上の所望のポリペプチド若しくはポリヌクレオチド、又はそれらの変異体を有し、補因子は、反応の過程で外的に添加されてもよい。
【０１２６】
好ましい態様において、本発明は、式(I)の化合物、その光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産する方法を提供し、当該方法は、
a)適切な溶媒中に式(III)の化合物又はその金属イオン塩を溶解させる工程；
b)式(III)の化合物又はその金属イオン塩を、オキシドレダクターゼ酵素と、補因子を再生する能力を有するポリペプチドとを共発現する発現ベクターを含有する組換え全細胞と反応させる工程、ここで、当該オキシドレダクターゼ酵素は、本発明で開示される配列番号に記載のポリペプチド配列から選択される配列を有し、又はその変異体である；
c)反応の過程でpHを維持する工程；
d)式(I)の化合物、その光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を単離する工程；
を含む。
【０１２７】
そのような態様において、前記全細胞は、受入れ番号MTCC 5642, MTCC 5643, MTCC 5644, MTCC 5645, MTCC 5646, MTCC 5647, MTCC 5648, MTCC 5649, MTCC 5650, MTCC 5651, MTCC 5652, MTCC 5653, MTCC 5654組み換えE.コリ(E.coli)であり、当該細胞は、本発明で開示される配列番号に記載の所望のポリペプチド配列を有するポリペプチド又はその変異体、及びNAD(P)Hの還元型を生産する能力を有するポリペプチドを発現する。
【０１２８】
尚も他の態様において、光学的に純粋な式(I)の化合物、その光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物は、適切な反応条件下、式(III)の化合物、又はその金属イオン塩を、単離及び精製された、本発明で開示される配列番号に記載のポリペプチド配列を有する所望のポリペプチド、又は本発明で開示される配列番号に記載のポリペプチド配列と５０％以上の類似性を有する変異体と反応させることにより取得される。
【０１２９】
本発明の一つの一般的態様において、式(III)のケトンは、好ましくは、0.1〜30% W/Vの量で使用される。好ましい態様において、前記ケトンの量は、10%  W/Vである。本発明の方法は、水溶液系で実施される。そのような態様において、酵素的還元が行われる当該反応混合物の水性部分は、好ましくは、緩衝剤を含有する。そのような緩衝剤の濃度範囲は、50〜200mMで、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸緩衝剤、Tris緩衝剤から選択される。pHは5〜9に維持され、反応温度は約15〜50℃に維持される。好ましい態様において、pH値は7〜8で、温度範囲は、25〜40℃である。
【０１３０】
あるいは、前記反応は、有機溶媒と組み合わせられた水性溶媒中で実施されてもよい。そのような溶媒として、中性のpHで緩衝能を有する緩衝剤が挙げられ、リン酸緩衝剤及びTris-HCl緩衝剤から選択される。あるいは、酸及びアルカリの使用により、反応の過程でのpHの変動が所望の範囲内で維持される場合は、緩衝剤は必要ではない。有機溶媒は、n-ブタノール、イソプロピルアルコール、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、n-ヘキサン、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド、及びアセトニトリル等から選択される。他の態様において、前記反応は、反応の過程でのpHの変動を所望の範囲内で維持するる酸及びアルカリの存在下、緩衝剤なしで実施される。あるいは、当該反応は、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド及びアセトニトリル等の水混和性溶媒からなる混合溶媒系中で実施され得る。
【０１３１】
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13から選択されるポリペプチド配列を有する所望の酵素活性を有するポリペプチド、又はその変異体は、凍結乾燥され、水に再懸濁された粗溶解物の形態で、5 mg/mL以上の濃度で使用される。
【０１３２】
更に、そのような態様において、任意で、NAD(P)Hの酵素的還元により形成されたNAD(P)は、エタノール、2-プロパノール、4-メチル-2-ペンタノール、2-ヘプタノール、2-ペンタノール、2-ヘキサノールから選択される補基質の酸化により、再びNAD(P)Hに変換され得る。更に、補因子NAD(P)又はNAD(P)Hの濃度は、0.001mM〜100mMである。
【０１３３】
一つの好ましい態様において、式(III)の化合物又はその金属イオン塩の還元は、本発明で開示される配列番号のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド又はその変異体により実施される。
【０１３４】
他の態様において、式(III)の化合物又はその金属イオン塩の還元は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13から選択されるポリペプチド配列を有する所望の酵素活性を有するポリペプチド又はその変異体と、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、亜リン酸デヒドロゲナーゼから選択されるポリペプチドとの組み合わせにより実施される。
【０１３５】
そのような態様において、前記補因子は、その濃度がケト基質の0.1〜10倍となるように、適切な濃度のグルコースデヒドロゲナーゼの存在下、補基質として使用されるグルコースの酸化により再生される。そのような態様において、前記酵素の濃度は、凍結乾燥され、水に再懸濁された粗溶解物の形態で、5 mg/mL以上である。
【０１３６】
本発明において、式(I)の化合物、又はその光学活性体(S又はR)、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を調製する方法は、組み換え宿主細胞、組み換え宿主細胞から取得した無細胞抽出/粗溶解物、又は無細胞抽出/粗溶解物又は組み換え宿主細胞から単離された所望の酵素を用いた様々な方法により実施出来る。
【０１３７】
反応が終了して産物が形成された後、当該産物は、当該技術分野で公知の方法で単離される。
【０１３８】
上記のように取得された(S)又は (R)-3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オン又はそれらの鏡像体過剰混合物は、シタグリプチン調製用の中間体に適している。
【０１３９】
(S)-3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンは、塩化メタンスルホニルと反応して(S)-3-(メタンスルホニルオキシ)-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンに変換され、更にアジ化ナトリウムと反応して((R)-3-アジド-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンに変換され、更に、Pd/c及び水素化ホウ素ナトリウムを使用して、(R)-4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-アミン(シタグリプチン)に変換され得る。同様に、(R)-4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-アミンは、(R)-3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンから取得できる。
【０１４０】
他の態様において、式(II)の化合物の調製に使用できる、新規な中間体の式(IVa)の光学活性体(S)及び式(IVb)の光学活性体(R)、又はそれらの鏡像体過剰混合物が提供される。
【化１３】
2013541942.tif 000014
【０１４１】
他の態様において、式(II)の化合物の調製に使用できる、新規な中間体の式(Va)の光学活性体(S)及び式(Vb)の光学活性体(R)、又はそれらの鏡像体過剰混合物が提供される。
【化１４】
2013541942.tif 000015
【０１４２】
本発明は、更に、下記実施例により例示される。下記実施例は、本発明を例示することを目的としており、本発明の範囲を限定することを目的としない。
【実施例】
【０１４３】
実施例１
化学的に合成されたオキシドレダクターゼ及び補因子再生産酵素のクローニング及び遺伝子発現解析
配列番号1、2、3、4、5及び7に示されたポリペプチド配列から推定されるDNA配列は、E.コリ中での発現にコドンが最適化され、pET11aプラスミドベクター中にクローニングされた。各ケースにおいて、繋ぎ合わされたDNAは、更にコンピーテントE.コリ細胞内に形質転換され、当該形質転換混合物を、アンピシリンを含有するLuria寒天プレート上にプレーティングした。陽性クローンは、アンピシリン耐性により上記プレート上で増殖可能であることに基づいて同定が可能であった。当該陽性クローンから取得したプラスミドDNAを、更に制限酵素で消化した。所望の長さの断片を生じる消化されたプラスミドDNA試料を、推定陽性クローンとした。各DNA配列において、そのような推定陽性クローンの１つをヌクレオチド配列解析に供して、化学合成に使用したDNA配列と100%の類似性を有することが判明した。これらの配列番号１、２、３、４、５及び７の配列に対応するpET11aクローンはそれぞれ、表1Aに記載したように名づけられた。これらのクローンから単離されたプラスミドDNAは、E.coli発現宿主であるBL21(DE3)に形質転換され、アンピシリン含有Luria寒天プレート上にプレーティングされ、そして37℃で一昼夜インキュベーションされた。各クローンのコロニーを各プレートからピックアップし、これらをアンピシリン含有Luria Broth中で培養し、培養物からプラスミドDNAを単離し、更に、これらを制限酵素を用いた制限消化解析に供して、クローンが所望のものであることを確認した。また、これらの培養物を、適切な濃度(0.01〜2mM)のIPTGを用いた発現誘導に供した。同時にIPTG誘導を行った培養物を溶解し、遠心分離して清澄溶解物を取得し、これをSDS-PAGEにかけて、適切なサイズのポリペプチドの発現が誘導されることを確認した。制限酵素断片の確認及び発現解析の後、これらのクローンの新鮮な培養物をグリセロールストックとして調製した。これらのクローンを、以後の生体触媒試験における配列番号１、２、３、４、５及び７の酵素的ポリペプチドの供給源として使用した。
【０１４４】
より環境負荷の小さい方法を構築するために、都合の良い抗生物質のクラスが選択され、アンピシリンに代えてカナマイシン耐性遺伝子を有するベクターのpET27 b (+)において、上記酵素の幾つかのサブクローニングが行われた。pET27 b (+)は、抗生物質耐性遺伝子以外は全てpET11aと類似している。要約すると、pET11aクローン由来のプラスミドDNAをクローニング酵素NdeI-BamHIで消化して、所望の遺伝子をベクターから切り出した。これらの酵素による消化の後、表1に示す配列番号１、３、５及び７に対応する配列のDNAを、クローニング酵素NdeI-BamHIで予め消化したpET27b(+)と繋ぎ合わせた。当該繋ぎ合わされたDNAを更にコンピーテントE.コリTop10F’細胞に形質転換し、当該形質転換混合物を、カナマイシンを含有するLuria寒天プレート上にプレーティングした。陽性クローンは、カナマイシン耐性により上記プレート上で増殖可能であること、及びプラスミドDNA試料が上記クローニング酵素により所望の長さの断片を生じることに基づいて同定され、そのようなクローンは推定陽性クローンとして選択された。pET27bの推定陽性クローンの1つが選択され、表1Aに記載のように名づけられた。これらのpET27bクローンから単離されたプラスミドDNAは、E.coli発現宿主であるBL21(DE3)に形質転換され、カナマイシン含有Luria寒天プレート上にプレーティングされ、そして37℃で一昼夜インキュベーションされた。このプレートからピックアップされたコロニーをカナマイシン含有Luria Broth中で培養し、培養物からプラスミドDNAを単離し、更に、これらを制限酵素を用いた制限消化解析に供して、クローンが所望のものであることを確認した。また、これらの培養物を、適切な濃度(0.01〜2mM)のIPTGを用いた発現誘導に供した。同時にIPTG誘導を行った培養物を溶解し、遠心分離して清澄溶解物を取得し、これをSDS-PAGEにかけて、適切なサイズのポリペプチドの発現が誘導されることを確認した。制限酵素断片の確認及び発現解析の後、これらのクローンの新鮮な培養物をグリセロールストックとして調製した。これらのクローンを、以後の生体触媒試験における配列番号１、３、５及び７の酵素的ポリペプチドの供給源として使用した。
【０１４５】
実施例２
ゲノムDNA由来のオキシドレダクターゼ酵素のクローニング及び発現解析
表１に記載の配列番号６、８、９、１０及び１３に示されるポリペプチド配列から推定されるS.セレウィシアエのDNA配列、並びに配列番号１１及び１２に示されるポリペプチド配列から推定されるE.コリのDNA配列を、表１Bに記載の各プライマーを用いてPCRで増幅した。これらの増幅されたPCR産物を精製し、制限酵素で消化して、所望のPCR産物の生成を確認した。配列番号９、１１、１２及び１３に対応する正しいバンドサイズのPCR産物を、NdeI-BamHIクローニング酵素で消化して、同じくNdeI-BamHIで消化したベクターpET27bと繋ぎ合わせた。また、配列番号６、８及び１０に対応する正しいバンドサイズのPCR産物を、NdeIで消化したブラントベクターpET27bと繋ぎ合わせた。当該繋ぎ合わされたDNAを更にコンピーテントE.コリ細胞に形質転換し、当該形質転換混合物を、カナマイシンを含有するLuria寒天プレート上にプレーティングした。陽性クローンは、カナマイシン耐性により上記プレート上で増殖可能であること、及びプラスミドDNA試料が上記クローニング酵素により所望の長さの断片を生じることに基づいて同定され、そのようなクローンは推定陽性クローンとして選択された。配列番号６、８、９、１０、１１、１２、１３の推定陽性クローンの1つが選択され、表1Aに記載のように名づけられた。これらのプレートからピックアップされたコロニーをカナマイシン含有Luria Broth中で培養し、培養物からプラスミドDNAを単離し、更に、これらを制限酵素を用いた制限消化解析に供して、クローンが所望のものであることを確認した。また、これらの培養物を、適切な濃度(0.01〜2mM)のIPTGを用いた発現誘導に供した。IPTG誘導を行った培養物を溶解し、遠心分離して清澄溶解物を取得し、これをSDS-PAGEにかけて、適切なサイズのポリペプチドの発現が誘導されることを確認した。制限酵素断片の確認及び発現解析の後、これらのクローンの新鮮な培養物をグリセロールストックとして調製した。これらのクローンを、以後の生体触媒試験における配列番号６、８、９、１０、１１、１２、１３の酵素的ポリペプチドの供給源として使用した。
【０１４６】
オキシドレダクターゼ及び補因子再生産酵素の共発現のためのプラスミドpZRC2G-2ZBG2.0.9c1の構築
E.コリでの発現に最適化された配列番号７に示されるポリペプチド配列から推定されるDNA配列が組み込まれたpET27bプラスミドベクターpET27bZBG13.1.1を、pET27bZBG2.0.9ベクター(表1A参照)から推定されるDNA配列番号６の他のDNA発現カセットのクローニング及び発現に使用した。当該ベクターにおいて、配列番号６及び７の両方のポリペプチドが、単一の宿主系において発現される。T7プロモーター、RBS及びZBG2.0.9遺伝子を有する発現コンストラクトは、pET27bZBG2.0.9をテンプレートとして、Duetプライマーフォワード１及びリバース１を用いて増幅された。かかるT7プロモーター、RBS及びZBG2.0.9遺伝子を有するPCR産物を精製した後、RBS及びZBG2.0.9遺伝子は、Bpu1102I制限酵素部位を有するフォワードF2及びリバースR1プライマーを用いて再び増幅された。取得されたPCR産物を、Bpu1102Iで消化し、予めBpu1102Iで消化したpET27bZBG13.1.1と繋ぎ合わせた。当該繋ぎ合わされたDNAを更にコンピーテントE.コリTop10F’細胞に形質転換し、当該形質転換混合物を、カナマイシンを含有するLuria寒天プレート上にプレーティングした。陽性クローンは、カナマイシン耐性により上記プレート上で増殖可能であること、及びプラスミドDNA試料が上記クローニング酵素により所望の長さの断片を生じることに基づいて同定され、そのようなクローンの１つは陽性クローンとして選択され、pZRC2G-2ZBG2.0.9c1と名づけられた。このクローンから単離されたプラスミドDNAは、E.コリ発現宿主BL21(DE3)に形質転換され、カナマイシン含有Luria寒天プレート上にプレーティングされ、そして37℃で一昼夜インキュベーションされた。このプレートからピックアップされたコロニーをカナマイシン含有Luria Broth中で培養し、培養物からプラスミドDNAを単離し、更に、これらを制限酵素を用いた制限消化解析に供して、クローンが所望のものであることを確認した。また、これらの培養物を、適切な濃度(0.01〜2mM)のIPTGを用いた発現誘導に供した。同時にIPTG誘導を行った培養物を溶解し、遠心分離して清澄溶解物を取得し、これをSDS-PAGEにかけて、適切なサイズのポリペプチドの発現が誘導されることを確認した。制限酵素断片の確認及び発現解析の後、pZRC2G-2ZBG2.0.9c1 BL21(DE3)として知られるこのクローンの新鮮な培養物をグリセロールストックとして調製した。このクローンpZRC2G-2ZBG2.0.9c1 BL21(DE3)を、以後の生体触媒試験における配列番号６及び７の酵素的ポリペプチドの供給源として使用した。
【０１４７】
【表１】
2013541942.tif 000016
【０１４８】
実施例４
撹拌フラスコ条件での酵素の調製
実施例１、２及び３で取得した組換え/形質転換E.コリクローンを、水1Lあたり10gのペプトン、5gの酵母抽出物、10gのNaClを含有する50mlのLuria Bertani(LB)培地中、16時間、37℃、200rpmで撹拌しながら培養した。配列番号1, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12及び13のクローンの培養では75μg/mlのカナマイシンが、そして配列番号２、４及び5のクローンの培養では100μg/mlのアンピシリンが添加された。これらの培養物は、1, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12及び13のクローンにおいて75μg/mlのカナマイシンが、そして配列番号２、４及び5のクローンにおいて100μg/mlのアンピシリンが添加された750mlのLB培地への播種に使用された。培養物のOD600が0.6〜0.8に達したときに2mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いてタンパク質の発現を誘導し、引き続き16時間、37℃、200rpm撹拌で培養した。15分、7000rpm、4℃で遠心分離することにより細胞を回収し、上澄みを捨てた。細胞ペレットを冷やした100mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)(KPB)に再懸濁し、上記と同様に回収した。洗浄された細胞を、1mg/mlのリソザイム、1mMのPMSF及び1mMのEDTAを含有する10容の冷やした100mM  KPB(pH7.0)に再懸濁し、当該均一な懸濁物を、4℃に維持しながら、超音波装置(Sonics)による細胞の溶解に供した。清澄な粗溶解上澄(無細胞抽出物)を凍結乾燥(VirTis、80〜25mtorrの減圧下、-80〜-60℃、48〜72時間)して、粗凍結乾燥粉末を、更なる酵素反応のために4℃以下で保存した。
【０１４９】
実施例５
4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンを還元するオキシドレダクターゼのスクリーニング
E.コリ中で過剰発現させた実施例１及び２の様々なオキシドレダクターゼ遺伝子が、WO2010/032264に記載のように調製されたオキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンの酵素的還元能力についてスクリーニングされた。スクリーニングにおいて、約240mgの誘導された細胞から取得されたオキシドレダクターゼの粗凍結乾燥粉末が、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、7.6mMβニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ナトリウム塩(NADP+)又は9mMβニコチンアミドアデニンジヌクレオチド遊離酸(NAD+)、10mg(0.0246ミリモル) 4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンを含有する反応混合物に添加された。当該均一なスクリーニング反応混合物を、24〜48時間、37℃±0.5℃、200rpmで撹拌してインキュベーションした。反応終了後、反応混合物を等量の酢酸エチルで抽出した。分離した有機槽を回収し、対応する化学合成された3-ヒドロキシ-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンを参照して、薄層クロマトグラフィーで解析した。HPLCにより更に純度を解析し、また、スクリーニングされた粗凍結乾燥酵素により調製された形成されたアルコールの鏡像体選択性を判定するために、下記のキラルHPLC法によりキラル純度を解析した。
【０１５０】
キラルHPLC解析は、Chiralcel OJ’H(250 x 4.6mm, 5μ)で実施され、5μlの試料が、移動相がn-ヘキサンであるカラムにロードされ、30℃で、アルコール(90:10)中0.05%TFAで溶出された当該カラムは、流速0.8 mL/minで50分間稼働した。保持時間で２つのピークが見られ、化学合成されたラセミアルコール3-ヒドロキシ-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンの解析開始後、ピーク1(P1)が約31.0分で、第二のピーク(P2)が約35．0であった。同一の方法論が、酵素的に調製されたアルコール産物のキラル構造の判定に適用された、その結果を、表２に示す。
【０１５１】
【表２】
2013541942.tif 000017
【０１５２】
実施例６
発酵槽レベルでの酵素の調製−pET27bZBG2.0.9
発酵は、グルコース10g/L、クエン酸1.7g/L、酵母抽出物10g/L、リン酸二水素カリウム13.3g/L、リン酸二水素アンモニウム4 g/L、硫酸マグネシウム７水和物1.2g/L、微量金属溶液20ml/L (0.162g/L塩化鉄６水和物、0.0094g/L塩化亜鉛、0.12g/L塩化コバルト、0.012g/Lモリブデン酸ナトリウム２水和物、0.006 g/L塩化カルシウム２水和物、2.40 g/L塩化銅２水和物、0.5g/Lホウ酸含有)及び硫酸カナマイシン75mg/Lを含有する増殖培地10Lを入れた30L発酵槽中で、撹拌及び通気をしながら実施された。遅発指数増殖を示すpET27bZBG2.0.9による組換えE.コリを発酵槽に播種し、OD600を0.5に設定した。通気は5〜15 L/minで行われ、溶存酸素が 50〜70%サチュレーションで維持され、200〜1000rpmで撹拌された。培養物のpHは、12.5%(v/v)水酸化アンモニウム溶液を用いて6.8±0.2で維持された。培養物の増殖は、グルコース700g/L、酵母抽出物50g/L、微量金属20ml/L、硫酸マグネシウム７水和物10g/Lを含有する培養培地のフィード溶液を用いて維持された。タンパク質の発現は、OD600が50.0±2.0に達した時点で、DCW(乾燥細胞重量)1gあたり最終濃度0.1mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いて誘導された。発酵は、更に、グルコース200g/L酵母抽出物200g/L及び硫酸カナマイシン750mg/Lを含有する生産培地のフィード溶液を用いて、12±2時間続行された。この培養物を10〜15℃までゆっくり冷やし、6500rpm、30分、4℃の遠心分離で液体成分を回収した。細胞ペレットは、0.05Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、8000mpm、30分、4℃で遠心分離して回収された。細胞は、生体触媒的変換に使用されるまで、4℃で保存され、あるいは50mM KPB緩衝液(pH7.0)中20%グリセロール等の適切な凍結防止剤を用いて-70℃で保存された。
【０１５３】
粗凍結乾燥酵素の調製のため、細胞ペレットは、予冷した10容の0.05Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁された。当該均一な単一細胞の調製物を、1000±100 psig、4℃で高圧ホモジナイザーに２回通して、細胞を破壊した。得られたホモジネートを、8000rpm、120分の遠心分離により清澄した。当該清澄な上澄を回収し、凍結乾燥(VirTis、80〜25mtorrの減圧下、-80〜-60℃、48〜72時間)して、粗凍結乾燥粉末を、更なる酵素反応のために4℃以下で保存した。
【０１５４】
実施例７
発酵槽レベルでの酵素の調製- pZRC2G-2ZBG2.0.9C1
発酵は、グルコース10g/L、クエン酸1.7g/L、酵母抽出物10g/L、リン酸二水素カリウム13.3g/L、リン酸二水素アンモニウム4 g/L、硫酸マグネシウム７水和物1.2g/L、微量金属溶液20ml/L (0.162g/L塩化鉄６水和物、0.0094g/L塩化亜鉛、0.12g/L塩化コバルト、0.012g/Lモリブデン酸ナトリウム２水和物、0.006 g/L塩化カルシウム２水和物、2.40 g/L塩化銅２水和物、0.5g/Lホウ酸含有)及び硫酸カナマイシン75mg/Lを含有する増殖培地10Lを入れた30L発酵槽中で、撹拌及び通気をしながら実施された。遅発指数増殖を示す所望の遺伝子を有する(実施例3に示される)組換えE.コリを発酵槽に播種し、OD600を0.5に設定した。通気は5〜15 L/minで行われ、溶存酸素が 50〜70%サチュレーションで維持され、200〜1000rpmで撹拌された。
【０１５５】
通気は5〜15 L/minで行われ、溶存酸素が 50〜70%サチュレーションで維持され、200〜1000rpmで撹拌された。培養物のpHは、12.5%(v/v)水酸化アンモニウム溶液を用いて6.8±0.2で維持された。培養物の増殖は、グルコース700g/L、酵母抽出物50g/L、微量金属20ml/L、硫酸マグネシウム７水和物10g/L、硫酸カナマイシン750mg/Lを含有する培養培地のフィード溶液を用いて維持された。タンパク質の発現は、OD600が50.0±2.0に達した時点で、DCW(乾燥細胞重量)1gあたり最終濃度0.1mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いて誘導された。発酵は、更に、グルコース200g/L酵母抽出物200g/L及び硫酸カナマイシン750mg/Lを含有する生産培地のフィード溶液を用いて、12±2時間続行された。この培養物を10〜15℃までゆっくり冷やし、6500rpm、30分、4℃の遠心分離で液体成分を回収した。細胞ペレットは、0.05Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、8000mpm、30分、4℃で遠心分離して回収された。細胞は、生体触媒的変換に使用されるまで、4℃で保存され、あるいは50mM KPB緩衝液(pH7.0)中20%グリセロール等の適切な凍結防止剤を用いて-70℃で保存された。
【０１５６】
粗凍結乾燥酵素の調製のため、細胞ペレットは、予冷した10容の0.05Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁された。当該均一な単一細胞の調製物を、1000±100 psig、4℃で高圧ホモジナイザーに２回通して、細胞を破壊した。得られたホモジネートを、8000rpm、120分の遠心分離により清澄した。当該清澄な上澄を回収し、凍結乾燥(VirTis、80〜25mtorrの減圧下、-80〜-60℃、48〜72時間)して、得られた粗凍結乾燥粉末を、更なる酵素反応のために4℃以下で保存した。
【０１５７】
実施例８
オキシドレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性
実施例2及び3で取得されたpET27bZBG2.0.9及びpZRC2G-2ZBG2.0.9C1の清澄粗溶解物のオキシドレダクターゼ活性は、340nm、25℃で、NAD(P)H依存的アッセイにおいて、分光光度法によりアッセイされた。標準アッセイ混合物は、100mM KPB (pH 7.0)、0.1mM NAD(P)H、及び2.5mM 4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-2-オンからなる。当該混合物1mlにオキシドレダクターゼの粗溶解物100μlを添加して、10分間反応をモニタリングした。酵素1ユニット(U)は、1分間で1μモルのNAD(P)Hを生産するのに必要な酵素の量として定義された。pET27bZBG2.0.9の無細胞抽出物の酵素活性は0.15U/mlと判定され、pZRC2G-2ZBG2.0.9C1は0.09U/mlと判定された。
【０１５８】
実施例１で取得された清澄粗溶解物のグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)活性は、340nm、25℃で、NAD(P)H依存的アッセイにおいて、分光光度法によりアッセイされた。準アッセイ混合物は、100mM KPB (pH 7.8)、2mM NAD(P)、及び0.1Mグルコースからなる。当該混合物1mlに適切に希釈した粗溶解物100μlを添加して、10分間反応をモニタリングした。酵素1ユニット(U)は、1分間で1μモルのNAD(P)Hを酸化するのに必要な酵素の量として定義された。pET27bZBG13.1.1の無細胞抽出物の酵素活性は47U/mlと判定され、pZRC2G-2ZBG2.0.9C1は45.0U/mlと判定された。
【０１５９】
実施例９
酵素会合補因子再生系においてオキシドレダクターゼを使用した、4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンナトリウム塩からの4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンの合成
温度計、流入口、pHセンサー及びオーバーヘッドスターラーを取り付けた250mlの丸底フラスコに、100mlの水に溶解したグルコース6.28g(0.0349モル)及びβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸二ナトリウム塩(10mg)を充填した。実施例4のグルコースデヒドロゲナーゼ凍結乾燥粉末(pET27bZBG13.1.1、12.5g)を当該反応混合物に添加し、懸濁物を得た。50mlの水に懸濁した実施例6に記載のように調製された細胞50g(pET27BZBG2.0.9)を当該反応混合物に添加し、均一な調製物を撹拌条件下、25〜30℃でインキュベートした。10g(0.02331モル)の基質、即ち4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンのナトリウム塩はWO2010/032264に記載のように調製され、部分的に添加された。当該反応はpH駆動的であり(pHが7.0〜8.0に維持されなければならない)、当該基質は本質的に塩基性であるから、当該反応混合物への基質の添加は、制御され、NaOHの存在下、3〜4時間にわたり、段階的に行われ、当該反応混合物の総量は200mlになる。当該反応の進行は、TLCで観察された。25〜30時間にかけて、徐々に基質が消滅し、生産物のスポットが見られるようになった。反応混合物は、等量の酢酸エチルで2回抽出され、当該溶媒を蒸発させて、所望の生産物が60%の収率で取得された。
【０１６０】
前記生産物は、更にHPLC解析にかけられて対応するアルコールがHPLC純度>90%を示し、続いてキラルHPLC解析(実施例5に記載)では、単一の鏡像異性体が>99%の鏡像体過剰を示した。
【０１６１】
キラルHPLC解析でP1として生じた、当該酵素的に合成されたアルコールのキラル構造は、下記実施例19で示した検討に基づいて、(S)であることが判明した。
【０１６２】
実施例１０
オキシドレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼを共発現する全細胞触媒の粗溶解物を使用した、4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンナトリウム塩からの(S)-3-ヒドロキシ-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンの合成
温度計、流入口、pHセンサー及びオーバーヘッドスターラーを取り付けた1000mlの丸底フラスコに、50mlの水に溶解したグルコース6.28g(0.0349モル)及びβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸二ナトリウム塩(10mg)を充填した。実施例7に記載のように調製された細胞50gを水500mlに懸濁して、細胞溶解に供し、そして得られた清澄無細胞抽出物を、前記反応混合物中に添加した。当該均一な反応調製物を25〜30℃、撹拌条件下でインキュベートした。
グルコースデヒドロゲナーゼ凍結乾燥粉末(pET27bZBG13.1.1、12.5g)を当該反応混合物に添加し、懸濁物を得た。50mlの水に懸濁した実施例6に記載のように調製された細胞50g(pET27BZBG2.0.9)を当該反応混合物に添加し、均一な調製物を撹拌条件下、25〜30℃でインキュベートした。10g(0.02331モル)の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンのナトリウム塩はWO2010/032264に記載のように調製され、部分的に前記反応混合物に添加され、上記実施例９に記載したように、pHが7.0〜8.0に維持された。当該反応の進行は、TLCで観察された。25〜30時間にかけて、基質材料はほとんど消滅し、生産物のスポットが見られるようになった。反応混合物は、等量の酢酸エチルで2回抽出され、当該溶媒を蒸発させて、所望の生産物が72%の収率で取得された。
【０１６３】
前記生産物は、更にHPLC解析にかけられて対応するアルコールがHPLC純度>90%を示し、続いてキラルHPLC解析(実施例5に記載)では、単一の鏡像異性体が>99%の鏡像体過剰を示した。
【０１６４】
キラルHPLC解析でP1として生じた、当該酵素的に合成されたアルコールのキラル構造は、下記実施例19で示した検討に基づいて、(S)であることが判明した。
【０１６５】
実施例１１
オキシドレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼを共発現する全細胞触媒の粗溶解物を使用した、4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンナトリウム塩からの(S)-3-ヒドロキシ-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンの、大スケールでの合成
温度計、流入口、pHセンサー及びオーバーヘッドスターラーを取り付けた1000mlの丸底フラスコに、100mlの水に溶解したグルコース(15.66g、0.087モル)及びβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸二ナトリウム塩(12.5mg)を充填した。水250mlに懸濁した、実施例7に記載のように調製された細胞250gを水250mlを当該反応混合物に添加し、続いてトルエン12.5mlを添加した。当該均一な反応調製物を25〜30℃、撹拌条件下でインキュベートした。25g(0.5827モル)の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンのナトリウム塩はWO2010/032264に記載のように調製され、部分的に前記反応混合物に添加され、上記実施例９に記載したように、pHが7.0〜8.0に維持された。当該反応の進行は、TLCで観察された。25〜30時間にかけて、出発材料はほとんど消滅し、生産物のスポットが見られるようになった。反応混合物は、等量の酢酸エチルで2回抽出され、当該溶媒を蒸発させて、所望の生産物が72%の収率で取得された。
【０１６６】
当該酵素的に調製されたアルコール産物は、融点(m.p.)、比旋光度 (SOR)、赤外線スペクトル(IR)及び核磁気共鳴分光(NMR)及びESI-MS等、様々な公知のツールにより解析された。それらの結果を以下に示す。
SOR [α]D25:  23.2o (c = 1, CHCl3) 
IR (cm-1): 3468, 1626, 1519 
ESI-MS: 409 (M+H)+ 
1H NMR (400 MHz, DMSO-D6):  δ 2.45-2.49 (m, 1H), 2.65-2.78 (m, 3H), 3.89-3.99 (m, 2H), 4.01-4.09 (m, 2H), 4.21-4.22 (m, 1H), 4.86-5.05 (オーバーラップm, 3H), 7.38-7.47 (m, 2H)
13C NMR (100 MHz, DMSO-D6): δ？ 35.4, 37.4, 38.3, 40.1, 41.4, 42.2, 43.0, 43.7, 67.3, 105.4, 114.5, 117.1, 119.5, 123.0, 142.3, 144.4, 146.5, 148.8, 151.0, 154.6, 156.9, 170.2. 
【０１６７】
前記生産物は、更にHPLC解析にかけられて対応するアルコールがHPLC純度96.1%を示し、続いてキラルHPLC解析(実施例5に記載)では、単一の鏡像異性体が99.7%のキラル純度を示した。
【０１６８】
キラルHPLC解析でP1として生じた、当該酵素的に合成されたアルコールのキラル構造は、下記実施例19で示した検討に基づいて、(S)であることが判明した。
【０１６９】
実施例１２
(S)-3-(メタンスルホニルオキシ)-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンの化学的調製
乾燥した25ml丸底フラスコに、(S)-3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オン (0.25 g)及びジクロロメタンを25〜30℃で充填し、そして当該反応混合物は０〜5℃に冷却された。続いて、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA, 0.21mL)を、0〜5℃で、当該反応混合物に徐々に添加した。その後、ジクロロメタンに溶解した塩化メタンスルホニル(0.076mL)を0〜5℃で徐々に添加し、当該反応混合物を、0〜5℃で1.5時間撹拌した。再びジクロロメタンに溶解した塩化メタンスルホニル(0.038mL)を0〜5℃で徐々に添加し、当該反応混合物を、0〜5℃で1.0時間撹拌した。反応混合物はジクロロメタンで希釈され、分液漏斗に移された。当該反応混合物を、希塩酸、飽和重炭酸ナトリウム、水及びブラインで洗浄した。有機層が回収され、無水硫酸ナトリウムで脱水された。溶媒が減圧下で蒸発されて、標記化合物が取得された (重量0.298 g、収率100 %、HPLC純度91.5 %)。
【０１７０】
実施例１３
(S)-3-(メタンスルホニルオキシ)-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンの化学的調製
乾燥した100ml丸底フラスコに、(S)-3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オン(4.0g)及びジクロロメタンを25〜30℃で充填し、そして当該反応混合物は０〜5℃に冷却された。続いて、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA, 3.3mL)を、0〜5℃で、当該反応混合物に徐々に添加した。その後、ジクロロメタンに溶解した塩化メタンスルホニル(1.2mL)を0〜5℃で徐々に添加し、当該反応混合物を、0〜5℃で1.5時間撹拌した。再びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA, 1.7mL)及びジクロロメタンに溶解した塩化メタンスルホニル(0.6mL)を0〜5℃で添加し、当該反応混合物を、0〜5℃で1.0時間撹拌した。反応混合物はジクロロメタンで希釈され、分液漏斗に移された。当該反応混合物を、希塩酸、飽和重炭酸ナトリウム、水及びブラインで洗浄した。有機層が回収され、無水硫酸ナトリウムで脱水された。溶媒が減圧下で蒸発されて、標記化合物が取得された (重量4.7g、収率98.5%、HPLC純度95.8%、HPLCキラル純度>99.5%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-D6):δ・2.82-3.13 (m, 7H), 3.95-3.96 (m, 2H), 4.06-4.15 (m, 1H), 4.19-4.24(m,1H), 4.88-4.93 (m, 1H), 4.98-5.03 (m, 1H), 5.16-5.21 (m, 1H), 7.44-7.55 (m, 2H)
IR(cm-1): 3043, 1658, 1525  ESI-MS: 487 (M+H)+ 
SOR [α]D25:  11.5o (c = 1, CHCl3) 
【０１７１】
実施例１４
(R)-3-アジド-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンの化学的調製
25ml丸底フラスコに、(S)-3-(メタンスルホニルオキシ)-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オン (0.280 g)及びジメチルホルムアミド(1mL)を充填した。続いて、当該反応混合物に、25〜30℃でアジ化ナトリウム(93mg)を添加し、そして当該反応混合物を、40〜42℃で2時間撹拌した。3時間後、アジ化ナトリウム(37mg)を添加し、当該反応混合物を、更に3時間、40〜42℃で撹拌した。続いて、当該反応混合物を、25〜30℃まで冷却した。当該反応混合物に再びアジ化ナトリウム(37mg)を添加し、14時間25〜30℃で撹拌した。反応混合物を冷水に浸した。これを酢酸エチルで抽出した。有機層を水及びブライン溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を減圧下で蒸発させ、標記化合物を取得した (重量0.228 g、収率91.6%、HPLC純度21.4 %)。
【０１７２】
(R)-3-アジド-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンの化学的調製
100ml丸底フラスコに、(S)-3-(メタンスルホニルオキシ)-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オン (4.0 g)及びジメチルホルムアミド(10mL)を充填した。続いて、当該反応混合物に、25〜30℃でアジ化ナトリウム(1.32g)を添加し、そして当該反応混合物を、40〜42℃に加熱して2時間撹拌した。3時間後、アジ化ナトリウム(0.530g)を添加し、当該反応混合物を、更に3時間、40〜42℃で撹拌した。続いて、当該反応混合物を、25〜30℃まで冷却した。当該反応混合物に再びアジ化ナトリウム(0.530g)を添加し、14時間25〜30℃で撹拌した。反応混合物を冷水に浸した。これを酢酸エチルで抽出した。有機層を水及びブライン溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を減圧下で蒸発させ、標記化合物を取得した (重量3.2g、収率91.6%)。
【０１７３】
実施例１６純粋な(R)-3-アジド-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]- トリアゾロ[4,3-a] ピラジン-7(8H)-イル]-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンの化学的調製
粗(R)-3-アジド-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]- トリアゾロ[4,3-a] ピラジン-7(8H)-イル]-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オン(3.1 g)を、シリカゲル(100〜200メッシュ)のカラムクロマトグラフィーにより精製し、溶出液としてDIPE:EA (4:6)を使用した(重量0.565g、HPLC純度83.0%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ・2.61-2.70 (m, 2H), 2.82-2.94 (m, 2H), 3.98-4.26 (overlapping m, 5H), 4.95-5.10 (overlapping m, 2H), 6.93-6.97 (m, 1H), 7.10-7.16 (m, 1H)
IR(cm-1): 2121, 1664, 1521  ESI-MS: 434 (M+H)+ 
SOR [α]D25:  (-) 3.3o (c = 1, CHCl3) 
【０１７４】
実施例１７
(R)-4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-アミン(式II)の化学的調製
25mlの丸底フラスコに、(R)-3-アジド-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オン (0.210 g)、メタノール及び5%Pd/C(42mg)を取った。当該反応混合物を0〜5℃に冷却した後、NaBH4 (55mg)を添加した。当該反応混合物を25〜30℃まで加熱して、25〜30℃で４〜６時間撹拌した。当該反応混合物に、水及びハイフロスーパーセルを添加した。これを濾過し、メタノールで洗浄した。濾液を50mlの一首丸底フラスコに取った。溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物を酢酸エチルに溶解させ、水及びブライン溶液で洗浄した。有機層を回収し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を減圧下で蒸発させて、粗(R)-4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-アミン(重量140mg、HPLC純度30.7 %)を取得した。通常のクロマトグラフィー精製を行い、純粋な産物を取得した(重量6 mg、キラル純度92 %)。
【０１７５】
実施例１８
(R)-4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-アミン(式II)の化学的調製
25mlの丸底フラスコに、(R)-3-アジド-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オン (1.35 g)、メタノール及び5%Pd/C(270mg)を取った。当該反応混合物を0〜5℃に冷却した後、NaBH4 (355mg)を添加した。当該反応混合物を25〜30℃まで加熱して、25〜30℃で42時間撹拌した。当該反応混合物に、水、メタノール及びハイフロスーパーセルを添加し、5〜10分間撹拌した。これを濾過し、メタノールで洗浄した。濾液を100mlの一首丸底フラスコに取った。溶媒を減圧下で蒸発させて、粗(R)-4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-アミンを取得した。通常の酸塩基精製を行い、純粋な産物を取得した(重量0.852g、HPLC純度92.8%、キラルHPLC純度>99.5%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 2.58-2.80 (m, 2H), 2.82-2.95 (m, 2H), 3.64-3.69 (m, 1H), 3.70-3.98 (m, 1H), 4.07-4.22 (m, 3H), 4.88-5.06 (m, 2H), 6.88-6.94 (m, 1H), 7.10-7.16 (m, 1H)
IR(cm-1): 1649, 1518  
ESI-MS: 408 (M+H)+
【０１７６】
実施例１９
化合物のキラル構造の判定
アミン化合物(実施例17及び18)のキラル構造は、4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-アミンのラセミ体及びその(R)異性体（シタグリプチンとして知られる市販の薬物）のキラルHPLC解析により同定された。実施例17及び18において取得された産物のRTは、キラルHPLC解析におけるシタグリプチンの公知の(R)異性体のRTと一致した。従って、上記実施例の最終アミン産物は(R)異性体であることが判明した。
【０１７７】
(R)-4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-アミンの調製は、古典的な化学原則に基づく、有機合成の分野で周知の変換ステップによっても説明出来る。
【０１７８】
実施例17及び18において、4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-アミンの(R)異性体は、古典的な化学で周知である構造の保持を伴う還元反応を経て、(R)-3-アジド-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンから取得された。従って、保持化学(retention chemistry)の使用は、実施例14、15及び16で生産された化合物が(R)構造に基づくことを保証する。
【０１７９】
同様に、実施例14、15及び16において、(R)-3-アジド-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンは、(S)-3-(メタンスルホニルオキシ)-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンから、古典的な化学において周知である、キラル中心における構造の反転を伴う求核置換反応により調製された。従って、反転化学(inversion chemistry)は、実施例12及び13で生産された化合物が(S)構造に基づくことを保証する。
【０１８０】
最後に、実施例１２及び１３において、(S)-3-(メタンスルホニルオキシ)-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-1-オンは、(S)-3-ヒドロキシ-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5 トリフルオロフェニル)- ブタン-1-オンから、古典的な化学で周知であるキラル中心上の構造の保持により取得された。従って、保持化学は、実施例9、10及び11で生産された化合物が(S)構造に基づくことを保証する。この構造は、実施例5においても、ピーク1として記載されている。故に、実施例5のP1は、キラルアルコールの(S)構造、(S)-3-ヒドロキシ-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5 トリフルオロフェニル)- ブタン-1-オンを表していると結論付けられる。同様に、実施例19で議論されていた、ラセミキラルアルコールの3-ヒドロキシ-1-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1-(2,4,5 トリフルオロフェニル)- ブタン-1-オンのキラル解析におけるもう一つのピークであるピーク2(P2)は、当該キラルアルコールの(R)構造を表していると結論付けられる。
【図１】
2013541942.tif 000026
【図２】
2013541942.tif 000027
【図３】
2013541942.tif 000028
【配列表】
2013541942000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月19日(2013.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)
【化１】
2013541942.tif 000029
の化合物を生産する方法であり：
a)適切な条件下、適切な補因子の存在下で維持することにより、式(III)
【化２】
2013541942.tif 000030
の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンを、選択的にケトンを還元してアルコールを形成する酵素と反応させる工程；及び
b)適切な中間体を単離する工程；
を含む方法。
【請求項２】
前記酵素がオキシドレダクターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素がケトレダクターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が短鎖デヒドロゲナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素がアルコールデヒドロゲナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素がアルドケトレダクターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素が、サッカロマイケス(saccharomyces)、ロドトルラ(rhodotorula)、ピキア(pichia)及びE.コリ(E.coli)から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素が、サッカロマイケス・セレウィシアエ(saccharomyces cervisiae)、ロドトルラ・ルブラ(rhodotorula rubra)、ピキア・メタノリカ(pichia methanolica)及びE.コリ(E.coli)から選択される種から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13のいずれかに記載のヌクレオチド配列にコードされている、請求項１〜８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素をコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13のいずれかに記載のヌクレオチド、又はその変異体が、ベクター中にクローニングされ、適切な組換え全細胞中で前記酵素が発現される、請求項１〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換え全細胞が、更に、酸化NAD(P)から補因子を再生産する機能を有するポリペプチドを共発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記全細胞が、MTCC 5642、MTCC 5643、MTCC 5644、MTCC 5645、MTCC 5646、MTCC 5647、MTCC 5648、MTCC 5649、MTCC 5650、MTCC 5651、MTCC 5652、MTCC 5653、MTCC 5654から選択される、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記全細胞が、
a)宿主細胞中で前記ベクターの複製及び維持を制御する1つ以上の領域；
b)オキシドレダクターゼをコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号１３のいずれかに記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列又はその変異体と動作可能に連結した第一のプロモーター；
c)補因子を再生産する機能を有するポリペプチドをコードする配列番号７に記載のヌクレオチド配列と動作可能に連結した第二のプロモーター；
d)適切な抗生物質マーカー；
を含む発現ベクターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
式(I)の適切な中間体
【化３】
2013541942.tif 000031
を生産する方法であり：
a)適切な条件下、適切な補因子の存在下で維持することにより、式(III)
【化４】
2013541942.tif 000032
の4-オキソ-4-[3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル]-1- (2,4,5-トリフルオロフェニル)ブタン-2-オンを、立体選択的にケトンを還元してアルコールを形成する全細胞と反応させる工程；及び
b)適切な中間体を単離する工程；
を含む方法。
【請求項１５】
前記全細胞が、MTCC 5642、MTCC 5643、MTCC 5644、MTCC 5645、MTCC 5646、MTCC 5647、MTCC 5648、MTCC 5649、MTCC 5650、MTCC 5651、MTCC 5652、MTCC 5653、MTCC 5654から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記補因子が、酵素に基づく再生産系により持続的に再生産され、当該酵素が、適切な補基質(co-substrate)を酸化することにより補因子を再生産する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記補因子の再生産に採用される酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、亜リン酸デヒドロゲナーゼから選択される、請求項１又は１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記補因子の再生産に採用される酵素が、配列番号７に記載のヌクレオチド配列又はその変異体にコードされるグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記補因子が、基質に基づく補因子再生産系により持続的に再生産され、当該酵素が、適切な補基質を酸化することにより補因子を再生産する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素が、オキシドレダクターゼ、ケトレダクターゼ、短鎖デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアルドケトレダクターゼから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記補基質がイソプロピルアルコールである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記式(III)の濃度が0.1〜30%w/vから選択される、請求項1又は14のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記補因子が、NAD(P)H及びNAD(P)である、クレーム１又は１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記pHが、5〜9、又は7〜8に維持される、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
a)複製を制御する1つ以上の領域
b)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号１３のいずれかに記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列又はその変異体と動作可能に連結した適切なプロモーター
c)抗生物質マーカー
を含む、式(I)のキラルアルコールを生産するベクター。
【請求項２６】
配列番号７に記載のポリヌクレオチド配列、又はその変異体を更に含む、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
pET11aZBG5.1.1, pET11aZBG6.4.1, pET11aZBG2.0.1, pET11aZBG25.1.1, pET11aZBG8.1.1, pET11aZBG13.1.1, pET27bZBG5.1.1, pET27bZBG2.0.1, pET27bZBG8.1.1, pET27bZBG2.0.9, pET27bZBG13.1.1, pET27bZBG2.0.8, pET27bZBG2.0.11, pET27bZBG2.0.5, pET27bZBG1.1.22, pET27bZBG1.1.2, pET27bZBG2.0.4から選択される、オキシドレダクターゼ酵素を発現する請求項２５に記載のベクター。
【請求項２８】
pET27bZBG2.0.9である、オキシドレダクターゼを発現する請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
pET27bZBG13.1.1である、グルコースデヒドロゲナーゼを発現する請求項２７に記載のベクター。
【請求項３０】
pZRC2G-2ZBG2.0.9C1である、オキシドレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼを発現する請求項２７に記載のベクター。
【請求項３１】
【化５】
2013541942.tif 000033
のいずれかの化合物。
【請求項３２】
式(II)の化合物を生産する方法であり：
a)式(Ib)
【化６】
2013541942.tif 000034
の(S)-3-ヒドロキシ-1-(3-(トリフルオロメチル)-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)-4-(2,4,5-トリフルオロフェニル) ブタン-1-オンを、塩化メタンスルホニルと反応させることにより、式(IVa)
【化７】
2013541942.tif 000035
の化合物を取得する工程； 
b)アジ化ナトリウムを使用して、式(IVa)の化合物を、式(Vb)
【化８】
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の化合物に変換する工程；
c)式(Vb)の化合物が、Pd/c及び水素化ホウ素ナトリウムを使用して、式(II)の化合物に変換される工程；
を含む方法。
【国際調査報告】
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