(57)【要約】【課題】生理的ｐＨにおいて或いは血清中において可溶性の、多糖類／ＢＭＰ複合体を提供する。【解決手段】本発明は、多糖類／ＢＭＰ複合体であって、  前記ＢＭＰは、生理的ｐＨにて可溶性であるＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７から成る群より選択され、多糖類／ＢＭＰの質量比は１５未満であり、前記多糖類は、少なくとも１つが少なくとも１つの疎水基（Ａｈと示す）により置換されたカルボキシル官能基を有する多糖類群より選択され：  前記疎水基Ａｈは、少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖状の、枝分れ状の又は環状のアルキル鎖を有する疎水性アルコール又は疎水性酸より選択された疎水性化合物の残基であり、前記疎水基Ａｈは、前記疎水性化合物の少なくとも１つの反応性官能基と、リンカーアーム前駆体Ｒ’の反応性官能基との間のカップリングから生じた官能基Ｇによって、リンカーアームＲに結合しており、  前記リンカーアームＲは、前記リンカーアーム前駆体Ｒ’の反応性官能基と、アニオン性多糖類のカルボキシル官能基との間のカップリングから生じた結合Ｆによって、前記多糖類に結合しており、Ｒは、枝分れ状及び／又は不飽和であってもよく、Ｏ、Ｎ及び／又はＳの１つ以上のヘテロ原子を有していてもよい、１ないし１５個の炭素原子を有する鎖から成る少なくとも２価の基であって、且つ、少なくとも一方がアミン官能基であり、そして他方が、アルコール、酸又はアミン官能基から成る群より選択される同一の又は異なった官能基である、少なくとも２つの反応性官能基を有する前駆体Ｒ’から生じたものであり、  Ｆはアミド官能基であり、  Ｇは、アミド、エステル又はカルバメート官能基であり、  前記アニオン性多糖類の未置換のカルボキシル官能基は、カルボン酸カチオン、好ましくは、Ｎａ＋又はＫ＋のいずれかのアルカリ金属カチオンの形態にあり、  前記多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性であるカルボキシル官能基を有し、  前記ＢＭＰは、組換え体ヒトＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７及びその相同体から成る群より選択される、前記多糖類／ＢＭＰ複合体に関する。  本発明はまた、医薬製剤の製造のためのこれら複合体の使用にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類／ＢＭＰ複合体であって、
前記ＢＭＰは、生理的ｐＨにて可溶性であるＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７から成る群より選択され、多糖類／ＢＭＰの質量比は１５未満であり、前記多糖類は、少なくとも１つが少なくとも１つの疎水基（Ａｈと示す）により置換されたカルボキシル官能基を有する多糖類群より選択され：
前記疎水基Ａｈは、少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖状の、枝分れ状の又は環状のアルキル鎖を有する疎水性アルコール又は疎水性酸より選択された疎水性化合物の残基であり、前記疎水基Ａｈは、前記疎水性化合物の少なくとも１つの反応性官能基と、リンカーアーム前駆体Ｒ’の反応性官能基との間のカップリングから生じた官能基Ｇによって、リンカーアームＲに結合しており、
前記リンカーアームＲは、前記リンカーアーム前駆体Ｒ’の反応性官能基と、アニオン性多糖類のカルボキシル官能基との間のカップリングから生じた結合Ｆによって、前記多糖類に結合しており、Ｒは、枝分れ状及び／又は不飽和であってもよく、Ｏ、Ｎ及び／又はＳの１つ以上のヘテロ原子を有していてもよい、１ないし１５個の炭素原子を有する鎖から成る少なくとも２価の基であって、且つ、少なくとも一方がアミン官能基であり、そして他方が、アルコール、酸又はアミン官能基から成る群より選択される同一の又は異なった官能基である、少なくとも２つの反応性官能基を有する前駆体Ｒ’から生じたものであり、
Ｆはアミド官能基であり、
Ｇは、アミド、エステル又はカルバメート官能基であり、
前記アニオン性多糖類の未置換のカルボキシル官能基は、カルボン酸カチオン、好ましくは、Ｎａ＋又はＫ＋のいずれかのアルカリ金属カチオンの形態にあり、
前記多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性であるカルボキシル官能基を有し、
前記ＢＭＰは、組換え体ヒトＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７及びその相同体から成る群より選択される、
前記多糖類／ＢＭＰ複合体。
【請求項２】
前記ＢＭＰは、組換え体ヒトＢＭＰ−２群及びそれらの相同体から成る群より選択される、請求項１に記載の多糖類／ＢＭＰ複合体。
【請求項３】
前記ＢＭＰは、組換え体ヒトＢＭＰ−７群及びそれらの相同体から成る群より選択される、請求項１に記載の多糖類／ＢＭＰ複合体。
【請求項４】
前記カルボキシル官能基群を有する多糖類は、一般式Ｉ：
【化１】
2013511505.tif 000015
｛式中、
Ｌは、リンカーアームＱの前駆体と、前記多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリングから生じた結合であって、エステル、カルバメート又はエーテル官能基であり、
ｉは、前記多糖類の糖単位当りの置換基Ｌ−Ｑのモル分率を表し、
Ｑは、一般式ＩＩ：
【化２】
2013511505.tif 000016
〔式中、
１≦ａ＋ｂ＋ｃ≦６であり、且つ
０≦ａ≦３、
０≦ｂ≦３、
０≦ｃ≦３であり、
同一であっても又は異なっていてもよいＲ１及びＲ２は、−Ｈ、直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数１ないし３のアルキル基、−ＣＯＯＨ及び式ＩＩＩ：
【化３】
2013511505.tif 000017
（式中、
１≦ｄ≦３であり、且つ
同一であっても又は異なっていてもよいＲ’１及びＲ’２は、−Ｈ及び直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数１ないし３のアルキル基から成る群より選択される）
で表される基から成る群より選択される〕
で表される基より選択される｝
で表される１００の糖単位当り少なくとも１５のカルボキシル官能基群がグラフトされた中性多糖類から得られた合成多糖類であって、前記天然多糖類は、グリコシドモノマー間の結合が（１，６）−結合を有する多糖類群より選択される、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
前記多糖類は、グリコシドモノマー間の結合が（１，６）−結合を有する多糖類から成る群より選択される、請求項１ないし４のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
前記多糖類は、デキストラン及びプルランから成る群より選択される、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
前記多糖類は、式ＩＶ：
【化４】
2013511505.tif 000018
（式中、
Ａｈは、少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖状の、枝分れ状の又は環状のアルキル鎖を有する疎水性アルコール又は疎水性酸より選択された疎水性化合物の残基であって、前記疎水性化合物のヒドロキシド官能基又は酸官能基とＲの前駆体Ｒ’の反応性官能基との間のカップリングから生じたものであり、
Ｆはアミド官能基であり、
Ｇは、エステル官能基、又はカルバメート官能基、又はアミド官能基であり、
Ｒは、枝分れ状及び／又は不飽和であってもよく、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのいずれか１つ以上のヘテロ原子を有していてもよい、１ないし１５個の炭素原子を有する鎖から成る少なくとも２価の基であって、且つ、少なくとも一方がアミン官能基であり、そして他方が、アルコール、酸又はアミン官能基から成る群より選択された同一又は異なった基である、少なくとも２つの反応性官能基を有する前駆体Ｒ’から生じたものであり、
ｎ１は１又は２であり、
ｎ２は、Ｆ−Ｒ−Ｇ−Ａｈにより置換された多糖類のカルボキシル官能基のモル分率であって、０．０１ないし０．７であり、及び
前記多糖類のカルボキシル官能基がＦ−Ｒ−Ｇ−Ａｈにより置換されていない場合、前記多糖類の前記カルボキシル官能基（群）は、カルボン酸カチオン、好ましくは、Ｎａ＋又はＫ＋のいずれかのアルカリカチオンである。）
で表される多糖類より選択される、請求項１ないし６のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
Ａｈは、疎水性アルコールである、請求項１ないし７のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
前記疎水性アルコールは、枝分れ状の又は枝分れしていない、飽和の又は不飽和の、６ないし１８個の炭素原子を有するアルキル鎖からなるアルコール類より選択される、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
前記疎水性アルコールは、オクタノールである、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記疎水性アルコールは、ドデカノールである、請求項９に記載の複合体。
【請求項１２】
前記疎水性アルコールは、２−エチルブタノール又はイソヘキサノールである、請求項９に記載の複合体。
【請求項１３】
Ａｈは、疎水性酸である、請求項１ないし７のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１４】
前記疎水性酸は、脂肪酸より選択される、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
前記脂肪酸は、枝分れ状の又は枝分れしていない、飽和の又は不飽和の、６ないし５０個の炭素原子を有するアルキル鎖から成る酸から成る群より選択される、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１６】
ポリマー／ＢＭＰの質量比は、１０以下である、請求項１ないし１５のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１７】
前記ポリマー／ＢＭＰの質量比は、５以下である、請求項１ないし１５のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１８】
下記複合体：
４０ｋＤａの、オクタノールフェニルアラニネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−２，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、ジヘキサノールアスパルテートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−２，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、Ｎ−［２−（（２−オクタノイルアミノ−３−フェニル）プロパノイルアミノ）］エタンアミンにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−２，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−２，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、オクタノールロイシネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、ドデカノールグリシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、オクタノールグリシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−２，質量比＝６．２５、
１０ｋＤａの、オクタノールフェニルアラニネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−２，質量比＝６．２５、
４０ｋＤａの、ドデカノールアラニネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−２，質量比＝６．２５
から成る群より選択される、請求項１ないし７のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１９】
下記複合体：
４０ｋＤａの、オクタノールグリシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、オクタノールグリシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１２．３、
１０ｋＤａの、オクタノールグリシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、オクタノールグリシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝４、
１０ｋＤａの、ドデカノールグリシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、イソヘキサノールロイシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、オクタノールフェニルアラニネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、オクタノールフェニルアラニネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝４、
４０ｋＤａの、オクタノールバリネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、エタノールアミンラウレートエステルにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、ジヘキサノールアスパルテートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、コレステロールロイシネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、オクタノールフェニルアラニネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、３，７−ジメチル−１−オクタノールフェニルアラニネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、２−（２−アミノエトキシ）エチルオクタノエートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、２−（２−アミノエトキシ）エチルドデカノエートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、Ｎ−［２−（（２−オクタノイルアミノ−３−フェニル）プロパノイルアミノ）］エタンアミンにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、Ｎ−［２−（（２−オクタノイルアミノ−３−フェニル）プロパノイルアミノ）］エタンアミンにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝４、
１０ｋＤａの、Ｎ−（２−アミノエチル）オクタンアミドにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝４、
１０ｋＤａの、ジドデカノールアスパルテートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドにより変性されたデキストランカルバメートＮ−メチル（ナトリウムカルボキシレート）／ＢＭＰ−７，質量比＝４、
１０ｋＤａの、イソヘキサノールフェニルアラニネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、ベンジルフェニルアラニネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、イソヘキサノールフェニルアラニネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０
から成る群より選択される、請求項１ないし７のうちいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２０】
請求項１ないし１７及び１９のうちいずれか１項に記載の両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体を含有する治療用組成物。
【請求項２１】
請求項１ないし１８のうちいずれか１項に記載の両親媒性多糖類／ＢＭＰ−２複合体を含有する治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成タンパク質であるＢＭＰ−７及びＢＭＰ−２の製剤の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨及び軟骨形成の機構に伴う成長因子である。ＢＭＰはまた、骨形成タンパク質（ＯＰ）としても知られており、１９６５年にＵｒｉｓｔにより最初に特定された（非特許文献１）。皮質骨から単離されたこれらタンパク質は、多種の動物の骨形成を誘発し得る（非特許文献１）。
【０００３】
ＢＭＰは、翻訳後成熟の後に１０４ないし１３９残基の長さを有するプロペプチドの形態で発現する。それらは互いに相同性の高い配列を有しており、且つ類似の三次元構造を有している。特に、それらは、所謂“システイン集団（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｋｎｏｔ）”を形成する分子内ジスルフィド架橋に包含される６個のシステイン残基を有している（非特許文献２及び３）。ＢＭＰのうちの数種はまた、ダイマーの形成に関与する分子間ジスルフィド架橋に包含される７番目のシステインをも有している（非特許文献２）。
【０００４】
それらの活性形態において、ＢＭＰは、Ｉｓｒａｅｌ等により記載されるように、ホモダイマーとして及びヘテロダイマーとしてさえ会合する（非特許文献４）。ダイマー状ＢＭＰは、ＢＭＰＲ型の膜透過受容体と相互作用する（非特許文献５）。この認識は、特にＳｍａｄタンパク質を含有する細胞内シグナルカスケード反応の原因とあり、それによって標的遺伝子の活性化又は抑制化をもたらす。
【０００５】
幾種かのヒト組換体ＢＭＰ、特にｒｈＢＭＰ−２及びｒｈＢＭＰ−７は、ヒトの生体内での骨形成を誘発する能力を明確に示しており、そして幾つかの医療用途のため承認されている。
【０００６】
このように、ヒト組換体ＢＭＰ−２、即ち国際的な一般名に従うとジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ  ａｌｆａ）は、米国ではインフーズ（ＩｎＦｕｓｅ）（登録商標）、そして欧州ではインダクトＯｓ（ＩｎｄｕｃｔＯｓ）（登録商標）の名称で販売される製品中に配合されている。この製品は、腰椎融合に対して、及び“非結合”骨折に対する脛骨の骨再生に対して処方される。腰椎の融合に対するインフーズの場合には、外科的処置はまず第一に、ｒｈＢＭＰ−２溶液を用いてコラーゲンスポンジを浸し、そしてその後、腰椎間に前もって移植された中空ケージであるＬＴケージにそのスポンジを置くことからなる。
【０００７】
ＢＭＰ−７、即ち国際的な一般名に従うとエプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ  ａｌｆａ）は、骨芽細胞へと分化させる間葉細胞の分化に対して直接的及び間接的な役割を担っている（非特許文献６）。従って、組換え体ヒトＢＭＰ−７は、２つの製品、即ち脛骨の開裂骨折に対するＯＰ−１インプラント（ＯＰ−１Ｉｍｐｌａｎｔ）及び腰椎融合に対するＯＰ−１パテ（ＯＰ−１Ｐｕｔｔｙ）の基盤を形成している。ＯＰ−１インプラントは、ｒｈＢＭＰ−７及び０．９％生理的食塩水に吸収されたコラーゲンを含有する粉末から成る。得られたペーストはその後、外科的処置中に骨折部に適用される。ＯＰ−１パテは、一方がｒｈＢＭＰ−７及びコラーゲンを含み、他方がカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む、２種類の粉末の形態にある。外科的処置中に、ＣＭＣは０．９％生理的食塩水によって再構成され、そしてｒｈＢＭＰ−７及びコラーゲンと混合される。得られたペーストは、治療部位に適用される。にもかかわらず、これらＢＭＰ−７をベースとした製品は人道的な製品の地位を有しているので、ＦＤＡの部分における唯一の限定認可の対象である。この限定認可の主要な理由は、標準治療（代表的標準）であると考えられる自己移植よりも僅かに劣る効果、及びＢＭＰ−７に対する抗体の強い生成である。
【０００８】
骨成長におけるＢＭＰ−７の役割の他に、ＢＭＰ−７が軟骨成長及び修復において重要な役割を果たしていることが証明されている。動物実験によって、ＯＰ−１が、軟骨性病変、関節病及び椎間板変性病の他に、種々の型の軟骨病の軟骨修復を可能にすることが証明されている（非特許文献７）。
【０００９】
最後に、ＢＭＰ−７は、腎臓発達の間の上皮細胞への間葉細胞の転換に不可欠であるモルフォゲンであるので、ＢＭＰ−７の別の確立した主要な役割は腎臓成長に関する。この特性が、慢性腎線維症により損傷を受けた腎臓の修復における可能性のある治療用途を見出した（非特許文献８及び９）。
【００１０】
肝臓再生（非特許文献１０；非特許文献１１）、角膜再生（非特許文献１２）のための、及びまた、脳卒中（非特許文献１３）、心筋梗塞（非特許文献１４）、慢性閉塞性肺疾患（非特許文献１５）、脊髄損傷病変（非特許文献１６）、パーキンソン病（非特許文献１７）、及びまた重篤な低肢虚血（非特許文献１８；非特許文献１９）のためのその使用のような多くの他の用途が、文献に記載されている。
【００１１】
しかしながら、これら用途のためには、該タンパク質の凝集をもたらしてしまう生理的ｐＨでのＢＭＰ−７の低溶解性の問題を解決することが必要である。生理的条件下でのＢＭＰ−７の低溶解性及び凝集体の形成は、活性タンパク質の生物学的利用能が低下してしまうために、局所用途についてのその使用が問題となっている。注射部位でのＢＭＰ−７の沈澱が副作用を生じてしまうために、生理的条件下でのＢＭＰ−７のこの低溶解性は、静脈投与であるか皮下投与であるかにかかわらず、ＢＭＰ−７の全身用途についてはより一層問題となっている。さらには、タンパク質凝集体の形成が、抗体形成を含む免疫学的反応をもたらしてしまうことも既知である。
【００１２】
ＢＭＰ−７の場合には、これらの免疫学的反応の発現は、製剤の投与部位に依存している。即ち、ＢＭＰ−７が、腰椎の後側方固定術（ｆｕｓｉｏｎ）、関節内注射及び皮下注射に使用される場合には、免疫学的反応が観察される。他方、ＢＭＰ−７が、静脈内に、又は椎間板内に注射される場合には、反応が観察されない（非特許文献２０）。再生用途のためのＢＭＰ−７の使用中のこれら免疫学的反応は、Ｃ−Ｊ  Ｈｗａｎｇ他による文献に記載されている（非特許文献２１及び２２）。ＢＭＰ−７を用いてこうして治療され、そして生物活性を無効にしてしまう抗ＢＭＰ−７抗体を発現する患者は、治療の効能の低下に悩むという危険性に陥る。さらには、これら抗体はまた、内因性ＢＭＰ−７と反応する可能性もあり、その活性を無効にしてしまい、そのため、副作用の危険性を高めてしまう。
【００１３】
ＢＭＰ−２に関しては、ＢＭＰ−２凍結乾燥物の溶解及び注射用製剤の安定性は、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５９８３２において既に言及されている。今まで、文献に記載されているＢＭＰ−２の全身用途の数は限られているが、心筋再生のように幾つかが言及されている（非特許文献２３）。
【００１４】
さらには、高濃度のＢＭＰ−２又はＢＭＰ−７によって生じる副作用を回避するために、及びまた、これらタンパク質のコストにより、最少量のＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７を含有する効果的な製剤を得る必要があることが明らかである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第２００７／００１５７０１号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｕｒｉｓｔ  ＭＲ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６５；１５０，８９３
【非特許文献２】Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒ  Ｃ．２００４  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９；２８７，１０３
【非特許文献３】Ｓｃｈｌｕｎｅｇｇｅｒ  ＭＰ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３；２３１，４４５
【非特許文献４】Ｉｓｒａｅｌ  ＤＩ，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，１９９６，１３（３−４），２９１
【非特許文献５】Ｍｕｎｄｙ他  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，  ２００４，２２（４），２３３
【非特許文献６】Ｃｈｅｎｇ  Ｈ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００３，８５Ａ  １５４４−１５５２
【非特許文献７】Ｃｈｕｂｉｎｓｋａｙａ，Ｓ．他，Ｉｎｔ．Ｏｒｔｈｏｐ．２００７，３１（６），７７３−７８１
【非特許文献８】Ｚｅｉｓｂｅｒｇ，Ｍ．他，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００５，２８０（９），８０９４−８１００
【非特許文献９】Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｈ他，Ｆａｓｅｂ  ２００７，２１，２５６−２６４
【非特許文献１０】Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｋ他，Ｇｕｔ  ２００７，５６，７０６−７１４
【非特許文献１１】Ｇｅｓｓｎｅｒ，Ｏ．Ａ他，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００８，２３，１０２４−１０３５
【非特許文献１２】Ｓａｉｋａ  Ｓ．他，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ２００５，８５，４７４−４８６
【非特許文献１３】Ｃｈａｎｇ  Ｃ−Ｆ他，Ｓｔｒｏｋｅ  ２００３，３４，５５８−５６４
【非特許文献１４】Ｚｅｉｓｂｅｒｇ  Ｅ．Ｍ．他，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｅｃｉｎｅ２００７，１３，Ｎ°８，９５２−９６１
【非特許文献１５】Ｍｙｌｌａｒｎｉｅｍｉ  Ｍ．他，Ａｍ  Ｊ  ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００８，１７７，３２１−３２９
【非特許文献１６】Ｄｅ  Ｒｉｖｅｒｏ  Ｖａｃｃａｒｉ，Ｊ．Ｐ．他，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００９，４６５，２２６−２２９
【非特許文献１７】Ｈａｒｖｅｙ  Ｂ．Ｋ．他，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００４，１０２２，８８−９５
【非特許文献１８】Ｍｏｒｅｎｏ−Ｍｉｒａｌｌｅｓ  Ｉ．他，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２００９，１６，１９５−２０１
【非特許文献１９】Ｄａｖｉｄ  Ｌ．他，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００９，２０，２０３−２１２
【非特許文献２０】ＯＰ−１  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｒｅｐｏｒｔ，ＦＤＡ  ＳｔｒｙｋｅｒＢｉｏｔｅｃｈ  Ｂｒｉｅｆｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｍａｒｃｈ，３１  ２００９  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｍｅｅｔｉｎｇ
【非特許文献２１】Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｓｐｉｎｅ  １３：４８４−４９３，２０１０
【非特許文献２２】Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  １０：４４３−４５１，２００９
【非特許文献２３】Ｂｏｒｎ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｒｏｍ  ｌｏｃａｌ  ｔｏ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｅｄｓ  Ｓ．Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ  及び  Ｋ．Ｓａｍｐａｔｈ，２００８，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，ｐ３１７−３３７
【非特許文献２４】Ｓｗｅｎｃｋｉ−Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，Ｂ．他，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００８，５７（２），３１２−３１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
カンパニー  セントコール（ｃｏｍｐａｎｙ  Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）により開発された、中性ｐＨでのＢＭＰ−７の低溶解度の問題に応答するための解決法の１つは、ＢＭＰ−７の一次構造を変性することから成っている（非特許文献２４）。しかしながら、該解決法は、変性された新規タンパク質の毒性の可能性を生じ、且つ、生物活性の変性を生じ得るＢＭＰ−７とその受容体との間の相互作用の変性を引き起こしてしまうために、満足できるものではない。
【００１８】
特許文献１に記載される、中性ｐＨでのＢＭＰ−７の低溶解度に対する他の提案された解決法は、１つ以上のポリエチレングリコール鎖をＢＭＰ−７に共有結合的にグラフトさせることから成る（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓａｍｕｅｌ他，特許文献１）。かかる解決法もまた、ＢＭＰ−７が化学的に変性され、このことが、天然のものと比較してその生物活性に対して重大な変性を引き起こしてしまうために、満足できるものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
出願人は、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５９８３２において、ＢＭＰ−２の化学変性に頼ることなくＢＭＰ−２を用いて、生理的ｐＨでの同様の溶解度の問題を解決することを可能にした解決法を、既に記載している。かかる解決法は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン及びイソロイシン、及びアルコール、エステル、その脱カルボキシル化誘導体及びアミド誘導体から成る群より選択される天然源の疎水性アミノ酸から成る群より選択される疎水基を有する両親媒性多糖類を用いることから成る。
【００２０】
驚くべきことに、出願人は、幾つかの多糖類が、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７と複合体を形成するという事実の他に、低い多糖類／ＢＭＰ質量比でもって、生理的ｐＨにてこれら成長因子を可溶化し得ることを証明した。
【００２１】
それらはまた、ＢＭＰ−７製剤の免疫原性を低減させることをも可能にしている。
【００２２】
さらには、これら複合体は、生理的条件下だけでなく、相当の希釈血清中でも安定であるという利点を有している。
【００２３】
これら多糖類はまた、リオプロテクタント（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）となる特性を有しており、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７の完全性を維持し得る一方で、凍結乾燥プロセス中の凝集現象を回避し得る。
【００２４】
本発明は、多糖類／ＢＭＰ複合体であって、前記ＢＭＰは、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７から成る群より選択され、前記複合体は、生理的ｐＨにて可溶性であり、ここで、前記多糖類／ＢＭＰ質量比は１５未満であり、前記多糖類は、少なくとも１つが少なくとも１つの疎水基（Ａｈと示す）により置換されたカルボキシル官能基を有する多糖類群より選択され：
前記疎水基Ａｈは、少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖状の、枝分れ状の又は環状のアルキル鎖を有する疎水性アルコール又は疎水性酸より選択された疎水性化合物の残基であり、前記疎水基Ａｈは、前記疎水性化合物の少なくとも１つの反応性官能基と、リンカーアーム前駆体Ｒ’の反応性官能基との間のカップリングから生じた官能基Ｇによって、リンカーアームＲに結合しており、
前記リンカーアームＲは、前記リンカーアーム前駆体Ｒ’の反応性官能基と、アニオン性多糖類のカルボキシル官能基との間のカップリングから生じた結合Ｆによって、前記多糖類に結合しており、Ｒは、枝分れ状及び／又は不飽和であってもよく、Ｏ、Ｎ及び／又はＳの１つ以上のヘテロ原子を有していてもよい、１ないし１５個の炭素原子を有する鎖から成る少なくとも２価の基であって、且つ、少なくとも一方がアミン官能基であり、そして他方が、アルコール、酸又はアミン官能基から成る群より選択される同一の又は異なった官能基である、少なくとも２つの反応性官能基を有する前駆体Ｒ’から生じたものであり、
Ｆはアミド官能基であり、
Ｇは、アミド、エステル又はカルバメート官能基であり、
前記アニオン性多糖類の未置換のカルボキシル官能基は、カルボン酸カチオン、好ましくは、Ｎａ＋又はＫ＋のいずれかのアルカリ金属カチオンの形態にあり、
前記多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性であるカルボキシル官能基を有し、
前記ＢＭＰは、組換え体ヒトＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７及びその相同体から成る群より選択される、
前記多糖類／ＢＭＰ複合体、に関する。
【００２５】
一の態様において、ＢＭＰは、組換え体ヒトＢＭＰ−２群及びそれらの相同体から成る群より選択される。
【００２６】
一の態様において、ＢＭＰは、組換え体ヒトＢＭＰ−７群及びそれらの相同体から成る群より選択される。
【００２７】
一の態様において、多糖類／ＢＭＰの質量比は、１０未満である。
【００２８】
一の態様において、多糖類／ＢＭＰの質量比は、５未満である。
【００２９】
一の態様において、多糖類／ＢＭＰの質量比は、３未満である。
【００３０】
一の態様において、カルボキシル官能基群を有する多糖類は、一般式Ｉ：
【化１】
2013511505.tif 000002
｛式中、
Ｌは、リンカーアームＱの前駆体と、前記多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリングから生じた結合であって、エステル、カルバメート又はエーテル官能基であり、
ｉは、前記多糖類の糖単位当りの置換基Ｌ−Ｑのモル分率を表し、
Ｑは、一般式ＩＩ：
【化２】
2013511505.tif 000003
〔式中、
１≦ａ＋ｂ＋ｃ≦６であり、且つ
０≦ａ≦３、
０≦ｂ≦３、
０≦ｃ≦３であり、
同一であっても又は異なっていてもよいＲ１及びＲ２は、−Ｈ、直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数１ないし３のアルキル基、−ＣＯＯＨ及び式ＩＩＩ：
【化３】
2013511505.tif 000004
（式中、
１≦ｄ≦３であり、且つ
同一であっても又は異なっていてもよいＲ’１及びＲ’２は、−Ｈ及び直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数１ないし３のアルキル基から成る群より選択される）
で表される基から成る群より選択される〕
で表される基より選択される｝
で表される１００の糖単位当り少なくとも１５のカルボキシル官能基群がグラフトされた中性多糖類から得られた合成多糖類であって、前記天然多糖類は、グリコシドモノマー間の結合が（１，６）−結合を有する多糖類群より選択される。
【００３１】
一の態様において、ａ＋ｂ＋ｃ≦５である。
【００３２】
一の態様において、ａ＋ｂ＋ｃ≦４である。
【００３３】
一の態様において、ｉは０．１ないし３である。
【００３４】
一の態様において、ｉは０．２ないし１．５である。
【００３５】
一の態様において、多糖類は、グリコシドモノマー間の結合が（１，６）−結合を有する多糖類から成る群より選択される。
【００３６】
一の態様において、多糖類は、デキストラン及びプルランから成る群より選択される。
【００３７】
一の態様において、グリコシドモノマー間の結合が（１，６）−結合を有する多糖類から成る群より選択される多糖類は、デキストランである。
【００３８】
一の態様において、多糖類は、グリコシドモノマー間の結合が（１，６）−結合及び（１，４）−結合を有する多糖類から成る群より選択される。
【００３９】
一の態様において、グリコシドモノマー間の結合が（１，６）−結合及び（１，４）−結合を有する多糖類は、プルランである。
【００４０】
一の態様において、本発明に従う多糖類は、Ｌ−Ｑ基が、下記基から成る群より選択され、Ｌが上記の意味を有することを特徴とする。
【化４】
2013511505.tif 000005
【００４１】
一の態様において、本発明に従う多糖類は、Ｌ−Ｑ結合が、下記基から成る群より選択され、Ｌが上記の意味を有することを特徴とする。
【化５】
2013511505.tif 000006
【００４２】
一の態様において、本発明に従う多糖類は、Ｌ−Ｑ結合が、下記基から成る群より選択され、Ｌが上記の意味を有することを特徴とする。
【化６】
2013511505.tif 000007
【００４３】
一の態様において、多糖類は、式（ＩＶ）：
【化７】
2013511505.tif 000008
（式中、
Ａｈは、少なくとも６個の炭素原子を有する直鎖状の、枝分れ状の又は環状のアルキル鎖を有する疎水性アルコール又は疎水性酸より選択された疎水性化合物の残基であって、前記疎水性化合物のヒドロキシル官能基又は酸官能基とＲの前駆体Ｒ’の反応性官能基との間のカップリングから生じたものであり、
Ｆはアミド官能基であり、
Ｇは、エステル官能基、又はカルバメート官能基、又はアミド官能基であり、
Ｒは、枝分れ状及び／又は不飽和であってもよく、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのいずれか１つ以上のヘテロ原子を有していてもよい、１ないし１５個の炭素原子を有する鎖から成る少なくとも２価の基であって、且つ、少なくとも一方がアミン官能基であり、そして他方が、アルコール、酸又はアミン官能基から成る群より選択された同一又は異なった基である、少なくとも２つの反応性官能基を有する前駆体Ｒ’から生じたものであり、
ｎ１は１又は２であり、
ｎ２は、Ｆ−Ｒ−Ｇ−Ａｈにより置換された多糖類のカルボキシル官能基のモル分率であって、０．０１ないし０．７であり、及び
前記多糖類のカルボキシル官能基がＦ−Ｒ−Ｇ−Ａｈにより置換されていない場合、前記多糖類の前記カルボキシル官能基（群）は、カルボン酸カチオン、好ましくは、Ｎａ＋又はＫ＋のいずれかのアルカリカチオンである。）
で表される多糖類より選択される。
【００４４】
一の態様において、ｎ２は、０．０２ないし０．５である。
【００４５】
一の態様において、ｎ２は、０．０５ないし０．３である。
【００４６】
一の態様において、ｎ２は、０．１ないし０．２である。
【００４７】
一の態様において、ｎ１は１であり、且つ、基Ｒの前駆体Ｒ’は２つの反応性官能基を有する。
【００４８】
一の態様において、Ｆはアミド官能基であり、Ｇはエステル官能基であり、Ｒ’はアミノ酸であり、且つ、Ａｈは疎水性アルコール残基である。
【００４９】
一の態様において、Ｆはアミド官能基であり、Ｇはカルバメート官能基であり、Ｒ’はジアミンであり、且つ、Ａｈは疎水性アルコール残基である。
【００５０】
一の態様において、Ｆはアミド官能基であり、Ｇはアミド官能基であり、Ｒ’はジアミンであり、且つ、Ａｈは疎水性酸残基である。
【００５１】
一の態様において、２つの反応性官能基を有する、基Ｒの前駆体Ｒ’は、アミノ酸より選択されることを特徴とする。
【００５２】
一の態様において、アミノ酸は、αアミノ酸より選択される。
【００５３】
一の態様において、αアミノ酸は、天然のαアミノ酸より選択される。
【００５４】
一の態様において、天然のαアミノ酸は、ロイシン、アラニン、イソロイシン、グリシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン及びアスパラギン酸より選択される。
【００５５】
一の態様において、２つの反応性官能基を有する、基Ｒの前駆体Ｒ’は、ジアミンより選択されることを特徴とする。
【００５６】
一の態様において、ジアミンは、エチレンジアミン及びリシン並びにその誘導体から成る群より選択される。
【００５７】
一の態様において、基Ｒの前駆体Ｒ’は、アルコールアミンより選択されることを特徴とする。
【００５８】
一の態様において、アルコールアミンは、エタノールアミン、アミノ−２−プロパノール、イソプロパノールアミン、３−アミノ−１，２−プロパンジオール、ジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トロメタミン（トリス）及び２−（２−アミノエトキシ）エタノールから成る群より選択される。
【００５９】
一の態様において、アルコールアミンは、還元アミノ酸から成る群より選択される。
【００６０】
一の態様において、還元アミノ酸は、アラニノール、バリノール、ロイシノール、イソロイシノール、プロリノール及びフェニルアラニノールから成る群より選択される。
【００６１】
一の態様において、アルコールアミンは、荷電したアミノ酸から成る群より選択される。
【００６２】
一の態様において、荷電したアミノ酸は、セリン及びスレオニンから成る群より選択される。
【００６３】
一の態様において、ｎ１は２であり、且つ、基Ｒの前駆体Ｒ’は３つの反応性官能基を有する。
【００６４】
一の態様において、３つの反応性官能基を有する前駆体Ｒ’は、２つのアミン官能基を有するアミノ酸より選択される。
【００６５】
２つのアミン官能基を有するアミノ酸は、リシン、５−ヒドロキシリシン、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、オルニチン及びｐ−アミノフェニルアラニンから成る群より選択される。
【００６６】
一の態様において、少なくとも３つの反応性官能基を有する前駆体Ｒ’は、アルコール官能基を有するアミノ酸より選択される。
【００６７】
アルコール官能基を有するアミノ酸は、セリン、スレオニン、チロシン、ホモセリン及びαメチルセリンから成る群より選択される。
【００６８】
一の態様において、３つの反応性官能基を有する前駆体Ｒ’は、アルコールアミンより選択される。
【００６９】
アルコールアミンは、トロメタミン（トリス）、３−アミノ−１，２−プロパンジオール、トリエタノールアミン、ヒドロキシメチルチロシン、チロシノール、セリノール（２−アミノ−１，２−プロパンジオール）及びスレオニノールから成る群より選択される。
【００７０】
一の態様において、３つの反応性官能基を有する前駆体Ｒ’は、トリアミンより選択される。
【００７１】
一の態様において、トリアミンは、２−（アミノメチル）−２−メチル−１，３−プロパンジアミン及びトリス（２−アミノエチル）アミンから成る群より選択される。
【００７２】
一の態様において、疎水性アルコールは、６ないし１８個の炭素原子を有する、枝分れ状の又は枝分れしていない、飽和の又は不飽和のアルキル鎖から成るアルコールより選択される。
【００７３】
一の態様において、疎水性アルコールは、１８個より多くの炭素原子を有する、枝分れ状の又は枝分れしていない、飽和の又は不飽和のアルキル鎖から成るアルコールより選択される。
【００７４】
一の態様において、疎水性アルコールは、オクタノールである。
【００７５】
一の態様において、疎水性アルコールは、ドデカノールである。
【００７６】
一の態様において、疎水性アルコールは、２−エチルブタノールである。
【００７７】
一の態様において、脂肪アルコールは、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、ブチルアルコール及びオレイルアルコール及びラノリンより選択される。
【００７８】
一の態様において、疎水性アルコールは、コレステロール誘導体より選択される。
【００７９】
一の態様において、コレステロール誘導体は、コレステロールである。
【００８０】
一の態様において、疎水性アルコールは、メントール誘導体より選択される。
【００８１】
一の態様において、疎水性アルコールは、そのラセミ体にあるメントールである。
【００８２】
一の態様において、疎水性アルコールは、メントールのＤ異性体である。
【００８３】
一の態様において、疎水性アルコールは、メントールのＬ異性体である。
【００８４】
一の態様において、疎水性アルコールは、トコフェロールより選択される。
【００８５】
一の態様において、トコフェロールは、αトコフェロールである。
【００８６】
一の態様において、αトコフェロールは、αトコフェロールのラセミ化合物である。
【００８７】
一の態様において、トコフェロールは、αトコフェロールのＤ異性体である。
【００８８】
一の態様において、トコフェロールは、αトコフェロールのＬ異性体である。
【００８９】
一の態様において、疎水性アルコールは、アリール基を有するアルコールより選択される。
【００９０】
一の態様において、アリール基を有するアルコールは、ベンジルアルコール及びフェネチルアルコールより選択される。
【００９１】
一の態様において、疎水性アルコールは、ゲラニオール、β−シトロネロール及びファルネソールから成る群の不飽和脂肪アルコールより選択される。
【００９２】
一の態様において、疎水性アルコールは、３，７−ジメチル−１−オクタノールである。
【００９３】
一の態様において、疎水性酸は、脂肪酸より選択される。
【００９４】
一の態様において、脂肪酸は、６ないし５０個の炭素原子を有する、枝分れ状の又は枝分れしていない、飽和の又は不飽和のアルキル鎖から成る酸から成る群より選択される。
【００９５】
一の態様において、脂肪酸は、直鎖状脂肪酸から成る群より選択される。
【００９６】
一の態様において、直鎖状脂肪酸は、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、カプリン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、トリコサン酸、リグノセリン酸、ヘプタコサン酸、オクタコサン酸及びメリシン酸から成る群より選択される。
【００９７】
一の態様において、脂肪酸は、不飽和脂肪酸から成る群より選択される。
【００９８】
一の態様において、不飽和脂肪酸は、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、α−リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸及びドコサヘキサエン酸から成る群より選択される。
【００９９】
一の態様において、脂肪酸は、胆汁酸及びその誘導体から成る群より選択される。
【０１００】
一の態様において、胆汁酸及びその誘導体は、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸及びケノデオキシコール酸から成る群より選択される。
【０１０１】
一の態様において、本発明は、下記複合体：
４０ｋＤａの、オクタノールフェニルアラニネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−２，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、ジヘキサノールアスパルテートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−２，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−２，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、オクタノールロイシネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、ドデカノールグリシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、オクタノールグリシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−２，質量比＝６．２５、
４０ｋＤａの、オクタノールフェニルアラニネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−２，質量比＝６．２５、
４０ｋＤａの、ドデカノールアラニネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−２，質量比＝６．２５
から成る群より選択される多糖類／ＢＭＰ−２複合体に関する。
【０１０２】
一の態様において、本発明は、下記複合体：
４０ｋＤａの、オクタノールグリシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、オクタノールグリシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１２．３、
１０ｋＤａの、オクタノールグリシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、オクタノールグリシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝４、
１０ｋＤａの、ドデカノールグリシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、イソヘキサノールロイシネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、オクタノールフェニルアラニネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、オクタノールフェニルアラニネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝４、
４０ｋＤａの、オクタノールバリネートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、エタノールアミンラウレートエステルにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、ジヘキサノールアスパルテートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、コレステロールロイシネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、オクタノールフェニルアラニネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、３，７−ジメチル−１−オクタノールフェニルアラニネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、２−（２−アミノエトキシ）エチルオクタノエートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、２−（２−アミノエトキシ）エチルドデカノエートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、Ｎ−［２−（（２−オクタノイルアミノ−３−フェニル）プロパノイルアミノ）］エタンアミンにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、Ｎ−［２−（（２−オクタノイルアミノ−３−フェニル）プロパノイルアミノ）］エタンアミンにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝４、
１０ｋＤａの、Ｎ−（２−アミノエチル）オクタンアミドにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
４０ｋＤａの、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝４、
１０ｋＤａの、ジドデカノールアスパルテートにより変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドにより変性されたデキストランカルバメートＮ−メチル（ナトリウムカルボキシレート）／ＢＭＰ−７，質量比＝４、
１０ｋＤａの、イソヘキサノールフェニルアラニネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、ベンジルフェニルアラニネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０、
１０ｋＤａの、イソヘキサノールフェニルアラニネートにより変性されたデキストランメチルカルボキシレート／ＢＭＰ−７，質量比＝１０
から成る群より選択される多糖類／ＢＭＰ−７に関する。
【０１０３】
本発明はまた、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体を含有する治療用組成物にも関する。
【０１０４】
本発明はまた、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−２複合体を含有する治療用組成物にも関する。
【０１０５】
用語“治療用組成物”とは、ヒト用又は動物用医薬において使用され得る組成物を意味することを意図する。
【０１０６】
一の態様において、本発明に従う医薬組成物は、溶質、ゲル、クリーム、凍結乾燥物、粉末又はペーストの形態であり得る局所適用される組成物である。
【０１０７】
一の態様において、本発明に従う医薬組成物は、溶質の形態であり得る、静脈投与又は皮下投与のために全身適用される組成物である。
【０１０８】
本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ複合体とともに配合され得る賦形剤の性質は、生薬薬理学の専門家の通常の知識に従い、その提供形態に従って選択される。
【０１０９】
このように、本発明に従う組成物が、ペースト又はセメントの形態にある場合には、例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リン酸三カルシウム及びコラーゲンのような生成物から得られる。
【０１１０】
製剤のパラメータを調節するために、例えば、ｐＨを調節するための緩衝剤、等張性を調節するための薬剤、パラヒドロキシ安息香酸メチル、パラヒドロキシ安息香酸プロピル、ｍ−クレゾール又はフェノールのような保存剤、又は塩酸Ｌ−リシンのような抗酸化剤のような他の賦形剤が、本発明において使用され得る。
【０１１１】
本発明に従うと、治療用組成物は、およそ１０ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７又はＢＭＰ−２の投与を可能にすることを特徴とする。
【０１１２】
本発明に従うと、治療用組成物は、およそ５ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７又はＢＭＰ−２の投与を可能にすることを特徴とする。
【０１１３】
本発明に従うと、治療用組成物は、およそ２ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７又はＢＭＰ−２の投与を可能にすることを特徴とする。
【０１１４】
本発明に従うと、治療用組成物は、およそ１ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７又はＢＭＰ−２の投与を可能にすることを特徴とする。
【０１１５】
本発明に従うと、治療用組成物は、およそ０．２ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７又はＢＭＰ−２の投与を可能にすることを特徴とする。
【０１１６】
本発明はまた、生体内での骨形成誘発用の治療用組成物の製造のための、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体又は両親媒性多糖類／ＢＭＰ−２複合体の使用にも関する。
【０１１７】
本発明はまた、軟骨再生誘発用の治療用組成物の製造のための、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体又は両親媒性多糖類／ＢＭＰ−２複合体の使用にも関する。
【０１１８】
本発明はまた、腎臓再生誘発用の治療用組成物の製造のための、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体の使用にも関する。
【０１１９】
本発明はまた、肝臓再生誘発用の治療用組成物の製造のための、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体の使用にも関する。
【０１２０】
本発明はまた、角膜再生誘発用の治療用組成物の製造のための、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体の使用にも関する。
【０１２１】
本発明はまた、脳卒中を治療するための治療用組成物の製造のための、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体の使用にも関する。
【０１２２】
本発明はまた、心筋梗塞を治療するための治療用組成物の製造のための、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体の使用にも関する。
【０１２３】
本発明はまた、抹消動脈障害を治療するための治療用組成物の製造のための、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体の使用にも関する。
【０１２４】
本発明はまた、慢性閉塞性肺疾患を治療するための治療用組成物の製造のための、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体の使用にも関する。
【０１２５】
本発明はまた、重篤な低肢虚血を治療するための治療用組成物の製造のための、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体の使用にも関する。
【０１２６】
本発明はまた、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体又は両親媒性多糖類／ＢＭＰ−２複合体を含有する治療用組成物を治療部位に投与することから成る、ヒト又は動物用途の治療方法にも関する。
【０１２７】
本発明はまた、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体を含有する治療用組成物を静脈内投与することから成る、ヒト又は動物用途の治療方法にも関する。
【０１２８】
本発明はまた、本発明に従う両親媒性多糖類／ＢＭＰ−７複合体を含有する治療用組成物を皮下投与することから成る、ヒト又は動物用途の治療方法にも関する。
【０１２９】
本発明に従う医薬組成物は、液体形態、水溶液、又は粉末形態、又は凍結乾燥物、インプラント若しくはフィルムの形態である。それらはまた、当業者に既知のかんようの医薬用賦形剤をも含有する。
【０１３０】
病状及び投与態様に応じて、本医薬組成物は、それらをゲル、スポンジ、注射液、飲用液、リオック（ｌｙｏｃ）等の形態で配合し得る賦形剤を有利に含有し得る。
【０１３１】
本発明はまた、ステントの、移植可能な生体材料のフィルム若しくはコーティングの、又はインプラントの形態で投与され得る、上記本発明に従う医薬組成物にも関する。
【０１３２】
一の態様において、本発明は、下記組成である、生理的ｐＨにて１ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７を含有する液体医薬組成物に関する。
１ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７に相当する、質量比４の多糖類／ＢＭＰ−７複合体、
１０ｍＭのリン酸緩衝液、
７．１％のトレハロース（浸透剤）
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】組成物Ｃ１を用いて観察した抗ｒｈＢＭＰ−７ＩｇＧ力価を示す図である。
【図２】組成物Ｃ２を用いて観察した抗ｒｈＢＭＰ−７ＩｇＧ力価を示す図である。
【実施例】
【０１３４】
実施例１：オクタノールグリシネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー１の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、オクタノールグリシネートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
およそ４０ｋｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するデキストラン（フルカ（Ｆｌｕｋａ））８ｇ（即ち、ヒドロキシル官能基の１４８ｍｍｏｌ）を水中に溶解して、４２ｇ／Ｌとした。１０Ｎ  ＮａＯＨの１５ｍＬ（１４８ｍｍｏｌのＮａＯＨ）を、該溶液に添加した。該混合物を３５℃とし、そしてその後、クロロ酢酸ナトリウムの２３ｇ（１９８ｍｍｏｌ）を添加した。反応媒体の温度を０．５℃／分にて６０℃まで上げ、そしてその後、６０℃にて１００分間維持した。該反応媒体を、２００ｍＬの水を用いて希釈し、酢酸を用いて中和し、そして、６倍量の水に対する５ｋＤ  ＰＥＳメンブランに通して限外濾過によって精製した。乾燥抽出物により最終溶液をアッセイして、ポリマー濃度を決定し；そしてその後、５０／５０（Ｖ／Ｖ）の酸／塩基滴定法によりアッセイして、メチルカルボキシレートによる置換度を決定した。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー］＝３１．５ｍｇ／ｇであった。
酸／塩基滴定法に従うと：メチルカルボキシレート官能基によるヒドロキシル官能基の置換度は、糖単位当り１．０４であった。
【０１３５】
ナトリウムデキストランメチルカルボキシレート溶液を、プロライト（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ）樹脂（アニオン性）に通して、デキストランメチルカルボン酸を得、それをその後、１８時間凍結乾燥した。
デキストランメチルカルボン酸の８ｇ（メチルカルボン酸官能基の３７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中に溶解して７８ｇ／Ｌとし、そしてその後、０℃に冷却した。オクタノールグリシネートパラトルエンスルホン酸塩の２．５９ｇ（７．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中に懸濁して、１００ｇ／Ｌとした。トリエタノールアミンの０．７３ｇ（７．２ｍｍｏｌ）をその後、該懸濁液に添加した。一旦、ポリマー溶液を０℃とし、ＮＭＭの４．１６ｇ（４１ｍｍｏｌ）及びＥｔＯＣＯＣｌの４．４７ｇ（４１ｍｍｏｌ）をその後添加した。１０分間の反応後、オクタノールグリシネート溶液を添加し、そして該媒体を１０℃にて４５分間維持した。該媒体をその後５０℃に加熱した。３０℃にて、６００ｇ／Ｌのイミダゾール水溶液及び４０ｍＬの水を添加した。５０℃での１時間３０分の攪拌後、得られた溶液を、６倍容量の０．９％ＮａＣｌ溶液、３倍容量の０．０１Ｎ  水酸化ナトリウム、８倍容量の０．９％ＮａＣｌ溶液、そしてその後の３倍容量の水に対する１０ｋＤ  ＰＥＳメンブランに通して限外濾過した。該ポリマー溶液の濃度を乾燥抽出物により決定した。該溶液のフラクションを凍結乾燥し、そしてＤ２Ｏでの１Ｈ  ＮＭＲにより解析して、オクタノールグリシネートのアミドに転換された酸官能基の比率を決定した。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー１］＝３０．２ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、オクタノールグリシネートにて変性された酸のモル分率は、０．２１であった。
【０１３６】
実施例２：オクタノールグリシネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー２の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、オクタノールグリシネートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
１０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法を用いて、オクタノールグリシネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー２］＝３０．６ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、オクタノールグリシネートにて変性された酸のモル分率は、０．１６であった。
【０１３７】
実施例３：ドデカノールグリシネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー３の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、ドデカノールグリシネートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
１０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、ドデカノールグリシネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー３］＝２３．６ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、ドデカノールグリシネートにて変性された酸のモル分率は、０．１０であった。
【０１３８】
実施例４：イソヘキサノールロイシネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー４の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、イソヘキサノールロイシネートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
１０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、イソヘキサノールロイシネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー４］＝１２．３ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、イソヘキサノールロイシネートにて変性された酸のモル分率は、０．１８であった。
【０１３９】
実施例５：オクタノールフェニルアラニネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー５の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、オクタノールフェニルアラニネートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
４０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、オクタノールフェニルアラニネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー５］＝３０．２ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、オクタノールフェニルアラニネートにて変性された酸のモル分率は、０．１８であった。
【０１４０】
実施例６：オクタノールグリシネートにて変性されたナトリウムデキストランスクシネート  ポリマー６の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、オクタノールグリシネートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｈａｖｅｓ他による文献（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｈａｖｅｓ，Ｍａｎｕｅｌ他，Ｐｏｌｙｍｅｒ  １９９８，３９（１３），２７５１−２７５７）に記載の方法に従い、１０ｋＤの質量平均分子量を有するデキストラン（ファルマコスモス（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ））より出発して、ナトリウムデキストランスクシネートを得た。グリコシド単位当りの酸官能基の割合は、ＮａＯＤ／Ｄ２Ｏでの１Ｈ  ＮＭＲに従うと、１．４であった。
実施例１に記載されるのと同様の方法により、オクタノールグリシネートにて変性されたナトリウムデキストランスクシネートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー６］＝２３．６ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、ドデカノールグリシネートにて変性された酸のモル分率は、０．１０であった。
【０１４１】
実施例７：オクタノールバリネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー７の合成  
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、オクタノールバリネートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
４０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、オクタノールバリネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー７］＝３３．２ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、オクタノールバリネートにて変性された酸のモル分率は、０．０８であった。
【０１４２】
実施例８：エタノールアミンラウレートエステルにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー８の合成  
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、エタノールアミンラウレートエステルパラトルエンスルホン酸塩を得た。
４０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、エタノールアミンラウレートエステルにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー８］＝２１．２ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、エタノールアミンラウレートエステルにて変性された酸のモル分率は、０．０９であった。
【０１４３】
実施例９：ジヘキサノールアスパルテートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー９の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、ジヘキサノールアスパルテートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
４０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、ジヘキサノールアスパルテートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー９］＝３１．１ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、ジヘキサノールアスパルテートにて変性された酸のモル分率は、０．０７５であった。
【０１４４】
実施例１０：ドデカノールグリシネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー１０の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、ドデカノールグリシネートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
４０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、ジドデカノールグリシネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー１０］＝２５．３ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、ドデカノールグリシネートにて変性された酸のモル分率は、０．１であった。
【０１４５】
実施例１１：オクタノールロイシネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー１１の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、オクタノールロイシネートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
４０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、オクタノールロイシネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー１１］＝３２．９ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、オクタノールロイシネートにて変性された酸のモル分率は、０．１０であった。
【０１４６】
実施例１２：コレステロールロイシネートにて変性されたデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー１２の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、コレステロールロイシネートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
１０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、コレステロールロイシネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー１２］＝２５．８ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、コレステロールロイシネートにて変性された酸のモル分率は、０．０３であった。
【０１４７】
実施例１３：オクタノールフェニルアラニネートにて変性されたデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー１３の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、オクタノールフェニルアラニネートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
１０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、オクタノールフェニルアラニネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー１３］＝３６．９ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、オクタノールフェニルアラニネートにて変性された酸のモル分率は、０．２であった。
【０１４８】
実施例１４：３，７−ジメチル−１−オクタノールフェニルアラニネートにて変性されたデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー１４の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、３，７−ジメチル−１−オクタノールフェニルアラニネートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
１０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、３，７−ジメチル−１−オクタノールフェニルアラニネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー１４］＝２４．３ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、３，７−ジメチル−１−オクタノールフェニルアラニネートにて変性された酸のモル分率は、０．１であった。
【０１４９】
実施例１５：２−（２−アミノエトキシ）エチルオクタノエートにて変性されたデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー１５の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、２−（２−アミノエトキシ）エチルオクタノエートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
１０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、２−（２−アミノエトキシ）エチルオクタノエートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー１５］＝２０．３ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、２−（２−アミノエトキシ）エチルオクタノエートにて変性された酸のモル分率は、０．２であった。
【０１５０】
実施例１６：２−（２−アミノエトキシ）エチルドデカノエートにて変性されたデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー１６の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、２−（２−アミノエトキシ）エチルドデカノエートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
１０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、２−（２−アミノエトキシ）エチルドデカノエートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー１６］＝２５．６ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、２−（２−アミノエトキシ）エチルドデカノエートにて変性された酸のモル分率は、０．１であった。
【０１５１】
実施例１７：Ｎ−［２−（（２−オクタノイルアミノ−３−フェニル）プロパノイルアミノ）］エタンアミンにて変性されたデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー１７の合成
Ｌ−フェニルアラニンエチルエステル塩酸塩（バケム（Ｂａｃｈｅｍ））、及びカプリル酸（シグマ（Ｓｉｇｍａ））より出発して、刊行物（Ａ  Ｐａｌ他，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００７，６３，７３３４−７３４８）に記載される方法に従い、Ｎ−オクタノイルフェニルアラニンを得た。
Ｎ−オクタノイルフェニルアラニン及びエチレンジアミン（ロス（Ｒｏｔｈ））より出発して、刊行物（Ｒ  Ｐａｕｌ他，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９６２，２７，２０９４−２０９９及びＤ．Ｊ．Ｄａｌｅ他，Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．２００２，６，７６７−７７２）に記載される方法に従い、Ｎ−［２−（（２−オクタノイルアミノ−３−フェニル）プロパノイルアミノ）］エタンアミン塩酸塩を得た。
１０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、Ｎ−［２−（（２−オクタノイルアミノ−３−フェニル）プロパノイルアミノ）］エタンアミンにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー１７］＝１９．９ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、Ｎ−［２−（（２−オクタノイルアミノ−３−フェニル）プロパノイルアミノ）］エタンアミンにて変性された酸のモル分率は、０．１であった。
【０１５２】
実施例１８：Ｎ−（２−アミノエチル）オクタンアミドにて変性されたデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー１８の合成
米国特許第２３８７２０１号（１９４５）に記載の方法に従い、エチレンジアミン（ロス）及びカプリル酸（シグマ）より出発して、Ｎ−（２−アミノエチル）オクタンアミドを得た。
１０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、Ｎ−（２−アミノエチル）オクタンアミドにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー１８］＝２４．８ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、Ｎ−（２−アミノエチル）オクタンアミドにて変性された酸のモル分率は、０．２であった。
【０１５３】
実施例１９：Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドにて変性されたデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー１９の合成
米国特許第２３８７２０１号（１９４５）に記載の方法に従い、エチレンジアミン（ロス）及びドデカン酸（シグマ）より出発して、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドを得た。
４０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー１９］＝１５．７ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドにて変性された酸のモル分率は、０．１であった。
【０１５４】
実施例２０：ジドデカノールアスパルテートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー２０の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、ジドデカノールアスパルテートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
１０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法により、ジドデカノールアスパルテートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー２０］＝２０ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、ジドデカノールアスパルテートにて変性された酸のモル分率は、０．０５であった。
【０１５５】
実施例２１：Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドにて変性されたデキストランカルバメートＮ−メチル（カルボン酸ナトリウム）  ポリマー２１の合成
米国特許第２３８７２０１号（１９４５）に記載の方法に従い、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドを得た。
およそ１０ｋｇ／ｍｏｌの質量平均分子量を有するデキストラン（バケム（Ｂａｃｈｅｍ））１１．５ｇ（即ち、ヒドロキシル官能基の０．２１ｍｏｌ）を、ＤＭＦ／ＤＭＳＯ混合物中に溶解した。該混合物を、攪拌しながら１３０℃に上げ、そしてイソシアナト酢酸エチル１３．７５ｇ（０．１１ｍｏｌ）を徐々に入れた。１時間の反応後、該媒体を水中に希釈し、そして０．１Ｎ  ＮａＯＨ、０．９％ＮａＣｌ及び水に対する５ｋＤ  ＰＥＳメンブランに通すジフィルトレーション（ｄｉｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により精製した。乾燥抽出物により最終溶液をアッセイして、ポリマー濃度を決定し；そしてその後、５０／５０（Ｖ／Ｖ）の水／アセトン中の酸／塩基滴定法によりアッセイして、カルボキシレート電荷による置換度を決定した。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー］＝３８．９ｍｇ／ｇであった。
酸／塩基滴定法に従うと：カルバメートＮ−メチルカルボキシレート官能基によるヒドロキシル官能基の置換度は、糖単位当り１．０８であった。
【０１５６】
デキストランカルバメートＮ−メチル（カルボン酸ナトリウム）溶液を、プロライト樹脂（アニオン性）に通して、デキストランカルバメートＮ−メチルカルボン酸を得、それをその後、１８時間凍結乾燥した。
デキストランカルバメートＮ−メチルカルボン酸の５ｇをＤＭＦ中に溶解して、５０ｇ／Ｌとし、そしてその後、０℃に冷却した。その後、ＮＭＭの２．２２ｇ（２２ｍｍｏｌ）及びＥｔＯＣＯＣｌの２．３８ｇ（２２ｍｍｏｌ）を添加した。１０分間の反応後、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドの０．４５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）を添加し、そして、該媒体を１０℃にて４５分間維持した。その後、該媒体を５０℃に加熱した。３０℃にて、６００ｇ／Ｌのイミダゾール水溶液及び２５ｍＬの水を添加した。５０℃での１時間３０分の攪拌後、得られた溶液を、０．１Ｎ  ＮａＯＨ、０．９％ＮａＣｌ及び水に対する１０ｋＤ  ＰＥＳメンブランに通して限外濾過した。該ポリマー溶液の濃度を、乾燥抽出物により決定した。該溶液のフラクションを凍結乾燥し、そしてＤ２Ｏでの１Ｈ  ＮＭＲにより解析して、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドのアミドに転換された酸官能基の比率を決定した。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー２１］＝１７．８ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、Ｎ−（２−アミノエチル）ドデカンアミドにて変性された酸のモル分率は、０．１であった。
【０１５７】
実施例２２：イソヘキサノールフェニルアラニネートにて変性されたデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー２２の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、イソヘキサノールフェニルアラニネートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
１０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法を用いて、イソヘキサノールフェニルアラニネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー２２］＝２８．１ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、イソヘキサノールフェニルアラニネートにて変性された酸のモル分率は、０．２であった。
【０１５８】
実施例２３：ベンジルフェニルアラニネートにて変性されたデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー２３の合成
ベンジルフェニルアラニネート塩酸塩（バケム）を用い、１０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１に記載されるのと同様の方法を使用して、ベンジルフェニルアラニネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー２３］＝４７．７ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、ベンジルフェニルアラニネートにて変性された酸のモル分率は、０．４５であった。
【０１５９】
実施例２４：比較例１，疎水基にて変性されていないデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー２４の合成
４０ｋＤａの質量平均分子量を有するデキストランより出発して、実施例１の第一部で記載されるとおりに、ナトリウムデキストランメチルカルボキシレートを得た。疎水基にて変性された酸のモル分率はゼロであった。
【０１６０】
実施例２５：ドデカノールアラニネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート  ポリマー２５の合成
特許文献（森憲治他，米国特許第４８２６８１８号）に記載の方法に従い、ドデカノールアラニネートパラトルエンスルホン酸塩を得た。
実施例１に記載されるとおりに得られたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート溶液を、プロライト樹脂（アニオン性）に通して、デキストランメチルカルボン酸を得、それをその後、１８時間凍結乾燥した。
デキストランメチルカルボン酸の５ｇ（メチルカルボン酸官能基の２３．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中に溶解して、４５ｇ／Ｌとし、そしてその後、０℃に冷却した。ドデカノールアラニネートパラトルエンスルホン酸塩の１．９９ｇ（４．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中に懸濁して、１００ｇ／Ｌとした。その後、トリエチルアミンの０．４７ｇ（４．６ｍｍｏｌ）を該懸濁液に添加した。一旦、該ポリマー溶液を０℃とし、その後、ＮＭＭの２．３５ｇ（２３．２ｍｍｏｌ）及びＥｔＯＣＯＣｌの２．５２ｇ（２３．２ｍｍｏｌ）を添加した。１０分間の反応後、ドデカノールアラニネート懸濁液を添加した。その後、該媒体を４℃にて１５分間維持した。その後、該媒体を３０℃に加熱した。一旦、３０℃にて、イミダゾール溶液（水９．３ｍＬ中に３．２ｇ）を該反応媒体に添加した。該ポリマー溶液を、１０倍容量の０．９％ＮａＣｌ溶液そしてその後の５倍容量の水に対する１０ｋＤ  ＰＥＳメンブランに通して限外濾過した。該ポリマー溶液の濃度を、乾燥抽出物により決定した。該溶液のフラクションを凍結乾燥し、そしてＤ２Ｏでの１Ｈ  ＮＭＲにより解析して、ドデカノールアラニネートにて変性された酸官能基の比率を決定した。
乾燥抽出物に従うと：［変性ポリマー］＝２２ｍｇ／ｇであった。
１Ｈ  ＮＭＲに従うと：糖単位当りの、ドデカノールアラニネートにて変性された酸のモル分率は、０．１９であった。
【０１６１】
実施例２６：共電気泳動（ｃｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によるポリマーに対するＢＭＰ−７の親和性
ＢＭＰ−７／ポリマー複合体の製造
０．５ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７溶液の５μＬを、１０ｍｇ／ｍＬのポリマー溶液（Ｐｏｌ）の２．５μＬに、及び１０×泳動緩衝液（トリスアセテート，ｐＨ７）の１０μＬに、添加した。該溶液を、水を用いて１００μＬとした。該溶液は、２５μｇ／ｍＬのＢＭＰ−７濃度、及び１／１０のＢＭＰ−７／Ｐｏｌ比を有していた。
【０１６２】
ＢＭＰ−７／ポリマー複合体の実証
その後、ＢＭＰ−７／Ｐｏｌ溶液の２μＬを、水８μＬ及び５×充填緩衝液の２μＬ（水中のグリセロール、トリスアセテート及びブロモフェノールブルー）に添加した。ＢＭＰ−７の５０ｎｇ及びポリマーの５００ｎｇを含有するこの１２μＬを、０．８％アガロースゲルのウェルに入れた。泳動槽を閉じ、そして発電器を３０Ｖに設定した。泳動を１時間続けた。
泳動後、室温にて２時間の毛細管現象によって、転写器内に置いたＰＶＤＦメンブラン上に、ゲルを転写した（アペレックスシステム（Ａｐｅｌｅｘ  ｓｙｓｔｅｍ））。室温にて４５分間、ＰＢＳＴを含有する５％のＢＳＡを用いて、メンブランを飽和し、そしてその後、一次ＢＭＰ−７抗体とともにインキュベートし（４℃にて一晩）、そして最後に、ウサギ抗ヤギＨＲＰ−結合二次抗体とともにインキュベートした（室温にて１時間）。  現像は、ＨＲＰとＯｐｔｉ−４ＣＮとの反応により行った。反応生成物が可視領域で吸収するため、着色が十分となってから現像を止めた。
ＢＭＰ−７がポリマーと複合体を形成した場合は、該複合体は沈積点の０．７ｃｍにて単一スポットの形態で検出される（泳動はアノードに向かう）。ＢＭＰ−７が単独であるか、又はポリマーと複合体を形成しなかった場合は、沈積部位で検出され、それ故泳動されない。
【０１６３】
結果を下記表にまとめる。
【表１】
2013511505.tif 000009
【０１６４】
実施例２７：ポリマー／ＢＭＰ−７の質量比が１０の、中性ｐＨでのＢＭＰ−７の溶解性
生理的ｐＨにおける種々のポリマーの溶解能を実証するために、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）の溶解性試験を開発した。ＢＭＰ−７は酸性ｐＨにて可溶性であり、生理的ｐＨでは、およそ２、３μｇ／ｍＬの、非常に低い溶解性の限界を有する。
本願において記載されるポリマーを該試験に用いた。該試験は、酸性ｐＨにて、例えばｐＨ３の１０ｍＭ乳酸緩衝液にて、ＢＭＰ−７溶液を用いることから成る。ＢＭＰ−７は、２．４７ｍｇ／ｍＬの初期濃度であった。かかるＢＭＰ−７溶液の２．０２ｍＬを、ｐＨ７．４の１８ｍＭのリン酸緩衝液を含有する１８．５ｍｇ／ｍＬのポリマー溶液の２．７ｍＬと混合した。５ｍＬの容量の最終製剤を得るために、混合後、１Ｎ水酸化ナトリウム及び水の混合物を添加することによって、最終的なｐＨを生理的ｐＨに調節した。凝集体の存在を検出するために、目視観察、濁度及び動的光散乱によって、製剤を解析した。
【０１６５】
種々の溶液に対する結果を、下記表にまとめる。
【表２】
2013511505.tif 000010
【０１６６】
かかる試験によって、新規ファミリーポリマーによる、生理的ｐＨにおけるＢＭＰ−７の溶解性の改良を実証し得た。他方、３０ｍｇ／ｍＬの濃度の未変性のナトリウムデキストランメチルカルボキシレートによってさえも、清澄なＢＭＰ−７溶液を得ることが出来なかった。
【０１６７】
実施例２８：ポリマー／ＢＭＰ−７質量比が４の、中性ｐＨでのＢＭＰ−７の溶解性
生理的ｐＨにおける種々のポリマーの溶解能を実証するために、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）の溶解性試験を開発した。ＢＭＰ−７は酸性ｐＨにて可溶性であり、生理的ｐＨでは、数μｇ／ｍＬの桁の、非常に低い溶解性の限界を有する。
本願において記載されるポリマーを該試験に用いた。比較として、仏国特許第０７０２３１６号に記載の２種のポリマーを用いた：
比較例１：フェニルアラニンにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート。
比較例２：ロイシンにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート。
該試験は、酸性ｐＨにて、例えばｐＨ３の１０ｍＭ乳酸緩衝液にて、ＢＭＰ−７溶液を用いることから成る。ＢＭＰ−７は、２．４７ｍｇ／ｍＬの初期濃度であった。かかるＢＭＰ−７溶液の２．０２ｍＬを、ｐＨ７．４の１８ｍＭのリン酸緩衝液を含有する７．３ｍｇ／ｍＬのポリマー溶液の２．７ｍＬと混合した。５ｍＬの容量の最終製剤を得るために、混合後、１Ｎ水酸化ナトリウム及び水の混合物を添加することによって、最終的なｐＨを生理的ｐＨに調節した。凝集体の存在を検出するために、目視観察、濁度及び動的光散乱によって、製剤を解析した。
【０１６８】
種々の溶液についての結果を、下記表にまとめる。
【表３】
2013511505.tif 000011
【０１６９】
かかる試験によって、新規ファミリーポリマーによる、生理的ｐＨにおけるＢＭＰ−７の溶解性の改良を実証し得た。他方、３０ｍｇ／ｍＬの濃度の未変性のナトリウムデキストランメチルカルボキシレートによってさえも、清澄なＢＭＰ−７溶液を得ることが出来なかった。
【０１７０】
実施例２９：ポリマー／ＢＭＰ−７の質量比が１の、中性ｐＨにおけるＢＭＰ−７の溶解性
生理的ｐＨにおける種々のポリマー及び質量比が１のポリマー／ＢＭＰ−７の溶解能を実証するために、ＢＭＰ−７の溶解性試験を開発した。
該試験は、酸性ｐＨにて、例えばｐＨ３の１０ｍＭ乳酸緩衝液にて、ＢＭＰ−７溶液を用いることから成る。ＢＭＰ−７は、２．４７ｍｇ／ｍＬの初期濃度であった。かかるＢＭＰ−７溶液の２．０２ｍＬを、ｐＨ７．４の１８ｍＭのリン酸緩衝液を含有する１．８ｍｇ／ｍＬのポリマー溶液の２．８ｍＬと混合した。５ｍＬの容量の最終製剤を得るために、混合後、１Ｎ水酸化ナトリウム及び水の混合物を添加することによって、最終的なｐＨを生理的ｐＨに調節した。凝集体の存在を検出するために、目視観察、濁度及び動的光散乱によって、製剤を解析した。結果は、ポリマー１及びポリマー５が、質量比１のポリマー／ＢＭＰ−７について、生理的ｐＨにおいてＢＭＰ−７を完全に溶解させ得たことを示した。
【０１７１】
実施例３０：質量比が１０のポリマー／ＢＭＰ−２におけるＢＭＰ−２凍結乾燥物の溶解性
生理的ｐＨにおける種々のポリマーの溶解能を実証するために、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）の溶解性試験を開発した。ショ糖（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、グリシン（シグマ）、グルタミン酸（シグマ）、塩化ナトリウム（リーデル−デ−ハーン（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ−Ｈａｅｎ））及びポリソルベート８０（フルカ）を含有する緩衝液中に、ＢＭＰ−２を溶解した。水酸化ナトリウムを添加することにより、該溶液をｐＨ４．５に調節し、その後、凍結乾燥した。２８３．２ｍｇの凍結乾燥物は、およそ１２ｍｇのＢＭＰ−２を含有していた。
本願において記載されるポリマーを該試験中で用いた。
該試験は、０．６２ｍｇのＢＭＰ−２を含有する凍結乾燥物の１４．５ｍｇを正確に１ｍＬフラスコに入れることから成る。その後、生理的ｐＨにある１．５ｍｇ／ｍＬの最終的なＢＭＰ−２濃度を達成するために、４１０μＬの溶液を用いて凍結乾燥物を溶解した。ローラー上で低速で１５分間攪拌後、溶液の外観を記録した。
【０１７２】
ＢＭＰ−２を有する種々の溶液についての結果を、下記表にまとめる。
【表４】
2013511505.tif 000012
【０１７３】
実施例３１：ポリマー／ＢＭＰ−２質量比が６．２５のＢＭＰ−２凍結乾燥物の溶解性
生理的ｐＨにおける種々のポリマーの溶解能を実証するために、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）の溶解性試験を開発した。ショ糖（シグマ）、グリシン（シグマ）、グルタミン酸（シグマ）、塩化ナトリウム（リーデル−デ−ハーン）及びポリソルベート８０（フルカ）を含有する緩衝液中に、ＢＭＰ−２を溶解した。水酸化ナトリウムを添加することにより、該溶液をｐＨ４．５に調節し、その後、該溶液を凍結乾燥した。２８３．２ｍｇの凍結乾燥物は、およそ１２ｍｇのＢＭＰ−２を含有していた。
本発明に従うポリマーを該試験に用いた。比較として、仏国特許第０７０２３１６号に記載のポリマーである、エチルフェニルアラニネートにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートもまた、該試験において用いた。
該試験は、０．１６８ｍｇのＢＭＰ−２を含有する凍結乾燥物の４ｍｇを正確に導入することから成る。その後、生理的ｐＨにある０．８ｍｇ／ｍＬの最終的なＢＭＰ−２濃度を達成するために、２１０μＬの水溶液を用いて凍結乾燥物を溶解し、最終的なポリマー濃度を５ｍｇ／ｍＬとした。
ローラー上で低速で５分間攪拌後、溶液の外観を記録した。
【０１７４】
種々の溶液についての結果を、下記表にまとめる。
【表５】
2013511505.tif 000013
【０１７５】
水を添加すると、清澄なＢＭＰ−２溶液が生じたが、酸性ｐＨとなった。
該試験によって、本発明に従うポリマーを用いたことによって、生理的ｐＨでのＢＭＰ−２の溶解性の改善が実証され得た。他方、エチルフェニルアラニネートにて変性されたナトリウムデキストランメトキシカルバメートによっては、清澄なＢＭＰ−２溶液を得ることができなかった。
【０１７６】
実施例３２：ＢＭＰ−７に対するポリマーの凍結乾燥保護（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）効果
ＢＭＰ−７の完全性を維持するポリマーの性能を試験するために、これらの製剤の凍結乾燥試験を行った。凍結乾燥は、タンパク質にストレスを与える方法であり、そのため、その方法中、頻繁にタンパク質の凝集を生じる。一例として、実施例２７とポリマー５とから得られる製剤を凍結乾燥した。その後、かかる凍結乾燥物を、注射水を用いてもどして最初の濃度とした。その後、該溶液を解析し、そして動的光散乱によって最初の溶液と比較した。該解析によって、２つの溶液は同一であり、そしてそれ故に、凍結乾燥がタンパク質のいかなる凝集をも引き起こさなかったことが示された。
【０１７７】
実施例３３：生理的ｐＨでの、且つ１ｍｇ／ｍＬを超える濃度でのＢＭＰ−７の溶解性
該試験の目的は、生理的ｐＨにて、且つ１ｍｇ／ｍＬを超える濃度にて、ＢＭＰ−７を可溶化することである。
３．４５ｍｇ／ｍＬのポリマー１を含有する１ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７溶液を得るために、２ｍｇ／ｍＬの、且つ酸性ｐＨの５．５ｍＬ容量のＢＭＰ−７溶液を、６．９ｍｇ／ｍＬの濃度のポリマー２溶液の５．５ｍＬと混合した。その後、慣用の凍結乾燥法を用いて該溶液を凍結乾燥した。
その後、ＢＭＰ−７濃度が５ｍｇ／ｍＬであり、且つポリマー濃度が１７．３ｍｇ／ｍＬである製剤を得るために、１０ｍＭリン酸塩緩衝液を用いて溶液に戻し、そして１Ｎ  水酸化ナトリウム溶液を添加することにより生理的ｐＨに調節した。
得られた溶液は、凝集物の存在を示唆しない完全な清澄であり、それにより、動的光散乱解析を確認した。
【０１７８】
実施例３４：希釈によるＢＭＰ−７製剤の安定性
該試験の目的は、生体媒体への製剤の注射、例えばヒト又は動物に対する皮下投与又は静脈投与の場合をシミュレートすることである。とりわけ、注射後に、製剤は、ｐＨ７．４を有する体液による希釈を受ける。
酸性ｐＨ（ｐＨ３）にて１ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７製剤を、希釈係数１０のｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中に注射した。注射の間、タンパク質の沈澱により生じる、溶液の濁度を観察した。ＰＢＳ中のＢＭＰ−７のこの凝集を、動的光散乱測定によって、確認した。
かかる同様の試験において、同程度のＢＭＰ−７濃度（即ち、１ｍｇ／ｍＬ）でポリマー１ないし１１の１つについての実施例２７及び２８に記載される製剤が用いられても、濁りは観察されなかった。動的光散乱測定は、かかる試料において凝集物が無いことを実証していた。
それ故に、ＢＭＰ−７／ポリマー製剤は、生理的ｐＨにて可溶性且つ液体であるばかりか、生理的ｐＨでの希釈に耐え得る一方で、凝集現象を防止し得るという利点を有しており、このことは、注射用医薬製品の開発の点で、特に有利である。
【０１７９】
実施例３５：２種のＢＭＰ−７組成物の免疫原性
数種の動物種にＢＭＰ−７の免疫学的活性が予測され得ることが示された。これらのうち、ウサギ後側方固定術モデルが臨床前モデルであった。該モデルを、本発明のポリマーとの複合体の形態にあるＢＭＰ−７の免疫学的影響の低下を評価するために保有した（ＯＰ−１  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｒｅｐｏｒｔ，ＦＤＡ  ＳｔｒｙｋｅｒＢｉｏｔｅｃｈ  Ｂｒｉｅｆｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｍａｒｃｈ，３１  ２００９  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｍｅｅｔｉｎｇ）。
【０１８０】
後側方腰部固定モデル（Ｌ５−Ｌ６にて関節固定）を、国際公開第２０１０／０５８１０６号に記載される実験プロトコルに従い、ウサギに対して実施した。ウサギを各々４匹の２つのグループに分け、第一グループをＢＭＰ−７単独（６５０μｇ）を含有する２つのコラーゲンスポンジとともに移植して、インプラント１とし、第二グループをポリマーとのＢＭＰ−７複合体（ＢＭＰ−７の６５０μｇ）を含有する２つのコラーゲンスポンジとともに移植して、インプラント２とした。
【０１８１】
インプラントＩは、０．８１ｍｇ／ｍＬの濃度のｐＨ３．５の５％ラクトース緩衝液中のＢＭＰ−７溶液の８００μＬ、即ち、２２５０μＬの容量を有するＩ型の架橋コラーゲンスポンジ中に、６５０μｇのＢＭＰ−７投与量を沈澱させることにより、製造した。
インプラント２は、１．６３ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７、即ちＢＭＰ−７の６５０μｇ、２０ｍｇ／ｍＬのポリマー１、即ちポリマー１の８ｍｇ、０．２３Ｍもリン酸ナトリウム、即ち、９２μｍｏｌ、及び０．６２Ｍの重炭酸ナトリウム、即ち２４８μｍｏｌ含有溶液の４００μＬ、そしてその後の、０．３８Ｍの塩化カルシウム含有溶液の４００μＬ、即ち１５３μｍｏｌを用いた、２２５０μＬの容量を有するＩ型の架橋コラーゲンスポンジの逐次含浸後に得られた。添加後、各々の溶液を１５分間、スポンジと接触させ続けた。これら含浸期間後に、スポンジを移植準備した。
【０１８２】
全ての動物に対し、移植前（０日目）、手術後１０日目、３２日目、３９日目及び６８日目に、血清を採取した。試料を−８０℃にて保存した。文献に記載されるプロトコルに従い（Ａ．Ｒ．Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００４，２８９（１−２），１−１６）、ＥＬＩＳＡ法を用いて、採取したウサギ血清中のｒｈＢＭＰ−７に直接対するウサギＩｇＧ抗体の濃度を測定した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２μｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−７を、４℃にて一晩、アッセイプレート上に吸着させた。該プレートを、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ溶液にて飽和したＰＢＳを用いて２回洗浄し、そして、０．０６％のｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳを用いて３回洗浄した。０．１％のＢＳＡ及び０．０６％のｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中に、ウサギ血清を１／４０まで希釈した。正の対照を、ＩｇＧアイソタイプのウサギ抗ｒｈＢＭＰ−７抗体の溶液とした（供給先：ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ），参照５００−Ｐ１９８）。負の対照を、健康な未処理のウサギ由来の２０の血清の混合物とした。検出抗体を、アルカリホスファターゼと結合したロバ抗ウサギＩｇＧ抗血清とした（供給先：クリニサイエンス（Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅ），参照６４４０−０５）。該試験の抗体検出閾値は、偽陽性の５％により１６０ｎｇ／ｍＬであった。プレート内及びプレート間の変動性は５％未満であった。
【０１８３】
結果は、２匹のウサギ（ウサギ１２及び１４）について測定された抗ｒｈＢＭＰ−７ＩｇＧ力価の大きな上昇を示し、１匹のウサギ（ウサギ１１）について緩やかな一時的な上昇を示し、そして組成物Ｃ１についての１匹のウサギ（ウサギ１３）について反応が無かった。組成物Ｃ２を用いて観察した抗ｒｈＢＭＰ−７ＩｇＧ力価は全ての時間において閾値未満であり、下記表及び図１及び２をご参照あれ。
【表６】
2013511505.tif 000014
【０１８４】
表１：組成物Ｃ１又は組成物Ｃ２を用いて浸した２つのコラーゲンスポンジの移植後、数回にわたりウサギ血清において測定した抗ｒｈＢＭＰ−７ＩｇＧの濃度。
【図１】
2013511505.tif 000019
【図２】
2013511505.tif 000020
【国際調査報告】
2013511505.tif 000021
2013511505.tif 000022
2013511505.tif 000023
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