(57)【要約】本発明は、長期持続性エリスロポエチン製剤およびその使用方法に関し、製剤は１以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を有するベクターを含む遺伝学的に改変された微小器官を含み、前記核酸配列はエリスロポエチンをコードする。
2013532152.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長期持続性エリスロポエチン組成物であって、
エリスロポエチンを発現または分泌する少なくとも１つの遺伝学的に改変された微小器官を含み、
前記微小器官が、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含み、
前記ベクターが、１以上の調節配列に機能可能に結合されたエリスロポエチンをコードする核酸配列を含み、
当該組成物を対象に対して１８〜１５０ＵＩエリスロポエチン／対象の体重（Ｋｇ）／日の用量で投与することにより、前記対象のヘモグロビン濃度を増加させ、前記ヘモグロビン濃度が増加した状態を少なくとも１ヶ月間維持することができ、かつ、前記少なくとも１ヶ月のうちの少なくとも９０％の期間、前記ヘモグロビン濃度を１０〜１２ｇｍ／ｄＬに維持することができることを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１の組成物であって、
前記調節配列が、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、および／またはＳＶ４０ポリアデニル配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項１の組成物であって、
前記エリスロポエチンの発現が、エリスロポエチンの発現量の増加、発現期間の延長、またはその組み合わせについて最適化されていることを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１の組成物であって、
前記少なくとも１つの遺伝学的に改変された微小器官が、遺伝子組換え真皮微小器官であることを特徴とする組成物。
【請求項５】
ヒト対象の貧血を長期間に渡って治療するための薬剤を調製するための、長期持続性エリスロポエチン組成物の使用であって、
前記組成物が、エリスロポエチンを発現または分泌する少なくとも１つの遺伝学的に改変された微小器官を含み、
前記微小器官が、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含み、
前記ベクターが、１以上の調節配列に機能可能に結合されたエリスロポエチンをコードする核酸配列を含み、
ａ．前記薬剤のエリスロポエチン分泌量はインビトロで測定され；
ｂ．前記薬剤は、１８〜１５０ＵＩエリスロポエチン／前記対象の体重（Ｋｇ）／日の用量で投与することが可能であり；
ｃ．前記薬剤により、前記対象のヘモグロビン濃度を増加させ、前記ヘモグロビン濃度が増加した状態を少なくとも１ヶ月間維持することができ、かつ、前記少なくとも１ヶ月のうちの少なくとも９０％の期間、前記ヘモグロビン濃度を１０〜１２ｇｍ／ｄＬに維持することができることを特徴とする使用。
【請求項６】
請求項５の使用であって、
前記用量が、１８〜２５ＵＩエリスロポエチン／前記対象の体重（Ｋｇ）／日であることを特徴とする使用。
【請求項７】
請求項５の使用であって、
前記用量が、３５〜４５ＵＩエリスロポエチン／前記対象の体重（Ｋｇ）／日であることを特徴とする使用。
【請求項８】
請求項５の使用であって、
前記用量が、５５〜６５ＵＩエリスロポエチン／前記対象の体重（Ｋｇ）／日であることを特徴とする使用。
【請求項９】
請求項５の使用であって、
前記調節配列が、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、および／またはＳＶ４０ポリアデニル配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項１０】
請求項５の組成物であって、
前記エリスロポエチンの発現が、エリスロポエチン発現量の増加、発現期間の延長、またはその組み合わせに関して最適化されることを特徴とする使用。
【請求項１１】
請求項５の使用であって、
前記少なくとも１つの遺伝学的に改変された微小器官が、遺伝子組換え真皮微小器官であることを特徴とする使用。
【請求項１２】
請求項５の使用であって、
前記ヘモグロビン濃度が増加した状態が少なくとも１年間維持されることを特徴とする使用。
【請求項１３】
請求項５の使用であって、
前記薬剤を、貧血の治療に使用する前の少なくとも９日間、インビトロで維持するようにしたことを特徴とする使用。
【請求項１４】
請求項５の使用であって、
前記対象が、慢性腎疾患（ＣＫＤ）を患っている透析前の患者であることを特徴とする使用。
【請求項１５】
請求項５の方法であって、
前記対象が、末期腎不全を患っていることを特徴とする方法。
【請求項１６】
ヒト対象のヘモグロビン濃度を長期間に渡って増加させるための薬剤を調製するための、長期持続性エリスロポエチン組成物の使用であって、
前記組成物が、エリスロポエチンを発現または分泌する少なくとも１つの遺伝学的に改変された微小器官を含み、
前記微小器官が、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含み、
前記ベクターが、１以上の調節配列に機能可能に結合されたエリスロポエチンをコードする核酸配列を含み、
ａ．前記薬剤のエリスロポエチン分泌量はインビトロで測定され；
ｂ．前記薬剤は、１８〜１５０ＵＩエリスロポエチン／前記対象の体重（Ｋｇ）／日の用量を投与することが可能であり；
ｃ．前記薬剤により、前記対象のヘモグロビン濃度を増加させ、前記ヘモグロビン濃度が増加した状態を少なくとも１ヶ月間維持することができ、かつ、前記少なくとも１ヶ月のうちの少なくとも９０％の期間、前記ヘモグロビン濃度を１０〜１２ｇｍ／ｄＬに維持することができることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１つ以上の調節配列に機能可能に結合されるエリスロポエチンなどの治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を有するベクターを含む遺伝子組換え微小器官（micro-organ）を含む長期持続性治療製剤、およびそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療薬は、経口、経皮、吸入、注入、または徐放性のデポ剤で送達できる。しかし、送達方法は、薬剤が受容者にさらされる処理、頻回投与の要件、および利用できる分子サイズに関する制約に制限される。一部の方法では、治療薬の量が投与ごとに変わる。
【０００３】
ベクター（後で特有の宿主細胞の修飾に使用される）への目的核酸配列/フラグメントのサブクローニングを伴うタンパク質生成法は、さらなる精製段階のための目的タンパク質の生産を意図したものであり、発現されるタンパク質の量、タンパク質分泌、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、およびタンパク質の正確な折り畳み）などで制限される。さらに、高レベルのタンパク質生産を達成できる場合でも、大量の組換えタンパク質を生産し、コンタミがないように精製する必要がある。精製スキームの開発は、非常に長期にわたる過程である。そして、精製した組換えタンパク質が得られると、それを安定化させ、かつ動物またはヒトへの導入が許容されるように、さらに製剤化する必要がある。さらに、製剤化しても、精製組換えタンパク質には、維持および保存上の制限に起因する有限の保存期限がある。また、多くの場合、より多くのタンパク質の精製および製剤を繰り返す必要がある。適切な製剤を開発する過程は時間がかかり、困難で、費用もかかる。
【０００４】
こうして、高レベルの組換えタンパク質の取得と一般的に関係が有る長い時間と労力を要し、費用のかかる方法を必要とせずに、安価に、素早く生産される、その生物活性を維持するための必須翻訳後修飾を有する持続性タンパク質をベースとする治療用分子の必要性が広く認識されている。
【０００５】
一部の研究者は、遺伝子治療を通じて組換え遺伝子産物のインビボ発現を得ようと試みてきた。一般的に、組換え遺伝子産物を発現するようにインビボで細胞を翻訳するために、ウイルスをベースとするベクターが使用される。これらのウイルスベクターには、標的組織に影響を及ぼす生まれ持った能力などの有益な特性がある。しかし、レトロウイルスをベースとするベクターは、組換え産物発現（常在癌遺伝子を活性化する可能性がある）を可能にさせるための対象組織のゲノム内での融合を必要とし、活発に分裂している組織を翻訳するためのみに使用できる。多くの場合、ウイルスベクターは、長期導入遺伝子発現を持続することもできず、このことは、少なくとも一つには、二次宿主免疫反応によるそれらの排除に起因すると考えられる。
【０００６】
したがって、数週間以上持続する常に高い発現量を有する組換え遺伝子産物製剤と、疾患を処置するためにそれらの製剤を使用する方法とに対する当技術分野での必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態では、本発明は、遺伝学的に改変された微小器官を含む長期持続性治療用製剤を提供する。前記微小器官は、１つ以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を有するベクターを含み、前記核酸配列は治療用ポリペプチドをコードし、それによって前記製剤を投与することで、血中ヘモグロビン（「Ｈｂ」）濃度を基礎濃度以上に増加させ、前記増加が少なくとも１ヶ月間維持される。一実施形態では、ベクターはヘルパー依存性アデノウイルスベクターである。一実施形態では、治療用ポリペプチドがエリスロポエチンである。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、１つ以上の遺伝学的に改変された微小器官を提供することを含む、持続時間以上、必要としている対象に治療用ポリペプチドを提供する方法を示し、前記微小器官は、１つ以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を有する。また、前記遺伝学的に改変された微小器官を前記対象に移植する方法を示し、核酸配列は治療用ポリペプチドをコードし、それによって前記製剤はＨｂ濃度を基礎濃度以上に上昇させ、上昇は少なくとも１ヶ月間維持される。さらに別の実施形態では、上昇が１ヶ月間を超えて維持される。一実施形態では、ベクターはヘルパー依存性アデノウイルスベクターである。一実施形態では、治療用ポリペプチドがエリスロポエチンである。別の実施形態では、必要としている対象は貧血症を患っている。別の実施形態では、必要としている対象は感染症を患っている。別の実施形態では、必要としている対象は癌を患っている。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、１８〜１５０ＵＩエリスロポエチン／前記対象の体重（Ｋｇ）／日の有効量を提供する。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、Ｈｂ濃度が上昇した時間の少なくとも９０％の間、上昇したＨｂ濃度を１０〜１２ｇ／ｄｌ  Ｈｂの範囲内に維持する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の製剤によってインビトロで作り出される組換え最適化ヒトインターフェロン−α（ＩＦＮα）の濃度を示す。
【図２Ａ】本発明の製剤によってインビトロで作り出される組換えヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）の濃度を示す。ＨＤ−Ａｄ−ＣＡＧ−ｗｔ−ｈＥＰＯ  ＧＭＭＯ滴定である。希釈倍率１：２５、１：１００、１：１０００とＨＤ−Ａｄ−ＣＡＧ−ｗｔ−ｈＥＰＯウイルスの希釈倍率を上げながら、微小器官に形質導入を行った。Ａｄ５／ＣＭＶ／ｗｔ−ｈＥＰＯを、１：１０および１：５０の作用濃度に希釈した。
【図２Ｂ】本発明の製剤によってインビトロで作り出される組換えヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）の濃度を示す。異なる２つの皮膚、Ｈ−１およびＨ−２から作り出したＧＭＭＯの間の比較である。ＨＤ−Ａｄ−ＣＡＧ−ｗｔ−ｈＥＰＯ  １：２５で、微小器官に形質導入を行った。バーは、３〜４日ごとに回収および交換した培地中のＥＬＩＳＡで測定されたｈＥＰＯ濃度を示す。
【図３】ＥＰＯ発現弱毒アデノウイルスを含む最適化製剤とＥＰＯ発現アデノウイルス−５を含む微小器官とによるインビトロのピークのエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現量の割合を示す。ＨＤ−Ａｄ−ＣＡＧ−ｈＥＰＯ  １：２５、またはＡｄ５／ＣＭＶ／ｈＥＰＯ  １：１０で、微小器官に形質導入を行った。
【図４】最適化および非最適化ＥＰＯ発現弱毒アデノウイルスを含む製剤によるインビトロのエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現量を示す。ウイルス粒子１：１００の希釈倍率で、微小器官に形質導入を行った。バーは、３〜４日ごとに回収および交換した培地中のＥＬＩＳＡで測定されたｈＥＰＯ濃度を示す。
【図５】ＣＡＧまたはＣＭＶプロモーターのＥＰＯ発現弱毒アデノウイルスダウンストリームを含む製剤によるインビトロのエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現量を示す。
【図６Ａ】インビトロでの本発明の製剤によって、ＳＣＩＤマウスを用いたインビボで産生された組換えヒトエリスロポエチンの濃度と、ヘマトクリット値の関連する変動とを示す。マウス１０匹／群にＧＭＭＯを皮下移植した。アデノウイルスｈＥＰＯ、ヘルパー依存性アデノウイルスｈＥＰＯ、およびヘルパー依存性アデノウイルス最適化ｈＥＰＯで形質導入を行ったＧＭＭＯと、非形質導入ＧＭＭＯとを移植したマウスの血清中で測定されたｈＥＰＯ濃度（ｍＵ／ｍＬ）および対応する％ヘマトクリット値を示す。１０日ごとに、採血した。
【図６Ｂ】インビトロでの本発明の製剤によって、ＳＣＩＤマウスを用いたインビトロで産生された組換えヒトエリスロポエチンの濃度と、ヘマトクリット値の関連する変動とを示す。遠心分離法によってヘマトクリット値を測定し、ｈＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキットで血液中の血清ｈＥＰＯ濃度を測定した。非移植ＧＭＭＯの培養を続け、ＥＰＯの濃度を測定した。
【図７】ヒトの患者においてインビボで送達された投与量に対するピーク血清ＥＰＯ濃度の相関関係を示す。
【図８Ａ】注入せずに１〜２４ヶ月の期間中、６人の患者のうちの５人での治療濃度域（１０〜１２ｇ／ｄＬ）内の持続的ヘモグロビン応答を説明するｈＥＰＯ−ＧＭＭＯ低用量臨床群の結果概要を示す。
【図８Ｂ】注入せずに３〜１１ヶ月の期間中、７人の患者のうちの６人での治療濃度域（１０〜１２ｇ／ｄＬ）内の持続的ヘモグロビン応答を説明するｈＥＰＯ−ＧＭＭＯ中用量臨床群の結果概要を示す。
【図８Ｃ】注入せずに１〜４ヶ月の期間中、３人の患者のうちの２人での治療濃度域（１０〜１２ｇ／ｄＬ）内の持続的ヘモグロビン応答を説明するｈＥＰＯ−ＧＭＭＯ高用量臨床群の結果概要を示す。
【図９】患者１のヘモグロビン応答を示す。
【図１０Ａ】患者２の持続的ヘモグロビン応答を示す。
【図１０Ｂ】患者２におけるｈＥＰＯ−ＧＭＭＯ投与に対する反応での網状赤血球数を示す。
【図１０Ｃ】患者２においてｈＥＰＯ−ＧＭＭＯに反応した血清ＥＰＯ濃度を示す。
【図１１Ａ】患者３のヘモグロビン応答を示す。
【図１１Ｂ】推定最低状態のｈＥＰＯ−ＧＭＭＯ移植前のヘモグロビン濃度を示す。
【図１２】患者４の持続的ヘモグロビン応答を示す。
【図１３】患者６の持続的ヘモグロビン応答を示す。
【図１４】患者７の持続的ヘモグロビン応答を示す。
【図１５】治験患者の基準人口統計学的特性を示す。
【図１６】第２回投与による増加後のヘモグロビンおよび血清のＥＰＯ濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一部の実施形態では、本発明は、１つ以上の調節配列に機能可能に結合されたエリスロポエチンなどの治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を有するベクターを含む遺伝子組換え組織利用微小器官を含む長期持続性治療製剤、およびそれらの使用方法に関する。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、遺伝学的に改変された微小器官を含む長期持続性治療用製剤を提供する。微小器官は、１つ以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を含み、核酸配列は治療用ポリペプチドをコードし、治療用製剤を投与することで、ヘモグロビン（「Ｈｂ」）の濃度を上昇させ、この上昇が少なくとも１ヶ月間持続される。別の実施形態では、上昇が１ヶ月間を超えて維持される。別の実施形態では、ヘモグロビン濃度が上昇し、その上昇が６ヶ月間を超えて維持される。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、遺伝学的に改変された微小器官を含む長期持続性治療用製剤を提供する。前記微小器官は、１つ以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を含み、前記核酸配列は治療用ポリペプチドをコードし、製剤を投与することで、血中Ｈｂ濃度を基礎濃度以上に上昇させ、その上昇が少なくとも１ヶ月間持続され、ベクターはヘルパー依存性アデノウイルスベクターである。
【００１５】
本明細書中で使用されるように、用語「上昇したヘモグロビン濃度（increased hemoglobin levels）」は、必要としている対象への本発明の長期持続性治療用製剤の投与に反応した基礎濃度以上の血中Ｈｂ濃度の上昇を意味する。本明細書中で使用されるように、用語「上昇したヘモグロビン濃度」は、本願明細書で「ヘモグロビン応答（hemoglobin response）」と呼ばれることもある。
【００１６】
一実施形態では、Ｈｂ反応は、Ｈｂ濃度がＦＤＡ推奨範囲である１０〜１２ｇｍ／ｄＬの範囲に及ぶようなＨｂ濃度の上昇を意味する。一実施形態では、Ｈｂ濃度が９．５〜１２．６ｇｍ／ｄＬの範囲に及ぶ。一実施形態では、Ｈｂ濃度が９〜１３．２ｇｍ／ｄＬの範囲に及ぶ。一実施形態では、Ｈｂ濃度が８．５〜１３．８ｇｍ／ｄＬの範囲に及ぶ。一実施形態では、Ｈｂ濃度が８〜１４．４ｇｍ／ｄＬの範囲に及ぶ。
【００１７】
一部の実施形態では、上昇したＨｂ濃度が、Ｈｂ濃度が上昇している時間の少なくとも９０％の間、所定の範囲内に維持される。他の実施形態では、Ｈｂ濃度は時間の少なくとも８０％の間、維持される。さらに他の実施形態では、Ｈｂ濃度は時間の少なくとも７０％の間、維持される。
【００１８】
赤血球新生刺激因子製剤（ＥＳＡ）による処置を以前受けていた患者の場合、ＥＳＡ注入の代わりに「ヒトエリスロポエチン遺伝学的に改変された微小器官（human erythropoietin-genetically modified micro-organ）」（「ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯ」）を投与することで、その自然な最低状態へのＨｂ濃度の減少を防止する。一実施形態では、患者はＥＳＡによる処置を受けており、Ｈｂ反応は、患者の自然な最低状態と比較して、自然に生じるであろうＨｂ濃度の減少の防止、および上昇したＨｂ濃度の維持を意味する。一実施形態では、ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを投与することで、Ｈｂ濃度の減少を防止する。このように、Ｈｂ濃度を治療濃度域内に維持できる。
【００１９】
本明細書中で使用されるように、用語「赤血球新生（erythropoiesis）」とは、赤血球の形成または生成の過程のことに言及している。エリスロポエチンは、赤血球新生、つまり赤血球生成の調節における必須要素である。Ｈｂ反応の指標は、赤血球生成、つまり赤血球新生の指標でもある。
【００２０】
本明細書中で使用されるように、持続的「ヘモグロビン応答（hemoglobin response）」は、Ｈｂ応答の質と特性をすべて有する持続的「赤血球新生」と呼ばれることもある。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、遺伝学的に改変された微小器官を含む長期持続性治療用製剤を提供する。前記微小器官は、１つ以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を含み、前記核酸配列は治療用ポリペプチドをコードし、製剤を投与した後に血中Ｈｂ濃度は基礎濃度以上に上昇され、免疫応答性宿主でその上昇が１ヶ月間を超える間、持続される。
【００２２】
一実施形態では、免疫応答性宿主において核酸の発現量が基礎量の５％を超えて増加する。別の実施形態では、ベクターがヘルパー依存性アデノウイルスベクターである。
【００２３】
本発明は、長期持続性治療用製剤とその使用方法を提供するものであり、製剤は遺伝学的に改変された微小器官を含む。本明細書中で使用されるように、一実施形態では、用語「微小器官（micro-organ）」は、細胞生存および機能の助けとなる方法で調製した外植片から得られる、または同一である分離組織または器官の構造のことに言及している。一実施形態では、微小器官は少なくとも一部のインビボ構造を維持し、別の実施形態では、それが得られる組織または器官に類似している相互作用を維持する。一実施形態では、微小器官は損傷のない分離組織切片である。別の実施形態では、微小器官は、該微小器官が由来する組織または器官の微小構造と三次元構造とを保持し、微小器官内の細胞への十分な栄養素およびガスの受動拡散と、不十分な栄養素および／または廃棄物の蓄積による細胞毒性および同時細胞死を最小限に抑えるための微小器官の細胞から出た細胞廃棄物の拡散とを可能にするように選択された寸法を持つ。一実施形態では、微小器官は真皮組織の薄片である。
【００２４】
一実施形態では、微小器官は直径１〜２ｍｍ、長さ３０〜４０ｍｍである。別の実施形態では微小器官の直径が、例えば１〜３ｍｍ、１〜４ｍｍ、２〜４ｍｍ、０．５〜３．５ｍｍ、または１．５〜１０ｍｍであってもよい。別の実施形態では微小器官の直径が、例えば約２ｍｍまたは約１．５ｍｍであってもよい。別の実施形態では微小器官の長さが、５〜１００ｍｍ、１０〜６０ｍｍ、２０〜６０ｍｍ、２０〜５０ｍｍ、２０〜４０ｍｍ、２０〜１００ｍｍ、３０〜１００ｍｍ、４０〜１００ｍｍ、５０〜１００ｍｍ、６０〜１００ｍｍ、７０〜１００ｍｍ、８０〜１００ｍｍ、または９０〜１００ｍｍであってもよい。別の実施形態では微小器官の長さが、約２０ｍｍ、約３０ｍｍ、約４０ｍｍ、または約５０ｍｍであってもよい。一実施形態では微小器官が１．５ｃｍ２未満であり、別の実施形態では１ｃｍ２未満である。別の実施形態では直径が１．５ｃｍ未満であり、別の実施形態では長さが１．５ｃｍ未満である。
【００２５】
一実施形態では、微小器官は外植片である。一実施形態では、微小器官は組織由来である。別の実施形態では、微小器官は組織の切片または一部分またはパーツである。別の実施形態では、微小器官は器官の切片または一部分またはパーツである。微小器官は植皮片と区別することができ、その植皮片は、一実施形態では、インビボおよびインビトロで長期間生存するように特別に設計され、別の実施形態では、微小器官内の細胞への十分な栄養素およびガスの受動拡散と、一実施形態では不十分な栄養素および／または廃棄物の蓄積による細胞毒性および同時細胞死を最小限に抑える微小器官の細胞から出た細胞廃棄物の拡散とを可能にするようにその寸法が特別に選択されている。このように、一実施形態では、微小器官は植皮片ではない。別の実施形態では、微小器官は、分離細胞の一群と区別することができ、一実施形態では天然または人工の骨格上で成長し、微小器官は該微小器官が由来する組織または器官の微小構造および三次元構造を維持する。そのため、一実施形態では、微小器官は骨格上またはゲル内で成長した１種類以上の細胞ではない。
【００２６】
微小器官の詳細説明は米国公開番号２００３／０１５２５６２に記載されており、参照により本明細書に援用される。
【００２７】
先行特許出願（参照によりその全てが本明細書中に援用されるＷＯ０３／００６６６９、ＷＯ０３／０３５８５、ＷＯ０４／０９９３６３）で、微小器官について述べている。対象遺伝子産物を発現するように微小器官を修飾でき、長期間、自律的に機能する状態で体外に維持することができ、その後、疾患または障害の処置のために皮下または体内の他の場所に移植できる。一実施形態では、対象遺伝子産物を発現するように修飾された微小器官は治療用微小器官である。本発明の治療用微小器官は、インビトロおよびインビボで対象遺伝子産物の長期発現プロファイルを予想外にも示した。
【００２８】
本明細書中で使用されるように、用語「外植片（explant）」とは、一実施形態では、生物の本来の成長部位を取り除き、一定の期間、培地に置いた組織または器官あるいはその一部のことに言及している。一実施形態では、組織または器官は生存しており、別の実施形態では代謝的に活性のあるもの、またはその組み合わせである。本明細書中で使用されるように、一部の実施形態では、用語「外植片（explant）」を「微小器官（micro-organ）」または「微小器官外植片（micro-organ explant）」と同じ意味で使用できる。
【００２９】
本明細書中で使用されるように、一実施形態では、用語「微小構造（microarchitecture）」は、外植片がインビボで物質的および／または機能的に接触していた少なくとも１つの細胞または非細胞物質とのインビトロの物質的および／または機能的接触を維持する組織の細胞の一部またはすべてにおける外植片の特性のことに言及している。
【００３０】
別の実施形態では、微小器官外植片は、該外植片が由来する組織または器官の三次元構造を維持する。一実施形態では、微小器官外植片は、細胞−細胞、細胞−基質、および細胞−間質の相互作用などの空間的相互作用と、該外移植片が由来する組織の方向とを保持する。一実施形態では、上述のような空間的相互作用を保存することで、自己分泌および傍分泌の分泌、および、一実施形態では外植片に対する長期刺激を与えるその他の細胞外刺激などの外植片の生物学的機能の維持を可能にする。一実施形態では、微小器官外植片の細胞の少なくとも一部は、移植後、インビトロまたはインビボで、インビボで物質的および／または機能的に接触していた少なくとも１つの細胞または非細胞物質との物質的および／または機能的接触を維持する。一実施形態では、細胞の一部とは、個体群の細胞の少なくとも約５０％のことを言い、別の実施形態では少なくとも約６０％、別の実施形態では少なくとも約７０％、別の実施形態では少なくとも約８０％、別の実施形態では少なくとも約９０％以上のことに言及している。別の実施形態では、外植片の細胞は、分離元の器官または組織の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
【００３１】
一部の実施形態では、本発明の製剤はいずれも、本願明細書で述べられるような剤形または実施形態で遺伝学的に改変された微小器官（ＧＭＭＯ）を含む。一部の実施形態では、本発明の製剤はいずれも、本願明細書で述べられるような剤形または実施形態で遺伝学的に改変された微小器官から構成される。一部の実施形態では、本発明の組成物はいずれも、本願明細書で述べられるような剤形または実施形態で遺伝学的に改変された微小器官から本質的になる。一部の実施形態では、用語「含む（comprise）」とは、遺伝学的に改変された微小器官などの示された活性薬剤の含有のほか、製薬業界では公知のように、他の活性薬剤、および薬学的に許容される担体、賦形剤、皮膚軟化剤、安定化剤などの含有のことも言う。一部の実施形態では、用語「本質的に〜からなる（consist essentially of）」とは、唯一の有効成分が示された有効成分であるが、安定化、保存などのための他の化合物を含むことができるが、示された有効成分の治療効果に製剤が直接関与することはない組成物のことに言及している。一部の実施形態では、用語「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」とは、有効成分の放出を促進する成分のことに言及している場合がある。一部の実施形態では、用語「〜なる（consisting）」とは、有効成分および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物に言及している。
【００３２】
さらに、本明細書中で使用されるように、用語「含む（comprising）」は、系が列挙した要素を含むことを意味することを意図としているが、必要に応じたもの考えられるその他の要素を除外するものではない。句「本質的に〜からなる（consisting essentiallly of）」では、列挙した要素を含むが、方法の性能に不可欠な有意な影響を持つ可能性があるその他の要素を除外する方法を意味する。そのため、「〜からなる（consisting of）」は、その他のわずかな要素の以上のものを除外することを意味するものとする。これらの移行用語によって定義される実施形態が、本発明の範囲内である。
【００３３】
同様に、一部の実施形態では、本発明の方法のベクターまたは方法で使用するためのベクターは、１つ以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を含み、前記核酸配列は治療用ポリペプチドをコードする。別の実施形態では、ベクターは前記核酸配列から本質的になり、別の実施形態では、ベクターは前記核酸配列からなる。
【００３４】
微小器官を分離できる哺乳動物の例としては、ヒトおよびその他の霊長類、完全または部分的に交配した豚（例えば、小型豚および遺伝子組換え豚）などの豚、齧歯類などが挙げられる。微小器官はさまざまな器官の組織から処理でき、一実施形態では、その器官が皮膚、真皮、リンパ系、膵臓、肝臓、胆嚢、腎臓、消化管、気道、生殖器系、尿路、血液、膀胱、隔膜、前立腺、骨髄、胸腺、脾臓、またはその組み合わせである。これらの器官からの外植片は、ランゲルハンス島細胞、毛包、腺、上皮、および結合組織細胞、または取得元の器官の微小構造に似ている微小構造に配置されたその組み合わせを含むことができる。一実施形態では、外植片の取得元の器官の微小構造は、当技術分野で公知の材料、装置、および／または方法を用いた微小器官外植片で区別または識別できる。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、製剤と、遺伝学的に改変された微小器官を含むその使用方法を提供する。一実施形態では、用語「遺伝学的に改変された微小器官（genetically modified micro-organ）」または「ＧＭＭＯ」とは、少なくとも１つの遺伝子組換え遺伝子産物を発現する微小器官のことに言及したものである。その他の実施形態では、微小器官への言及が、非遺伝学的改変微小器官のことを必ずしも言うものではないが、場合によっては、当業者にとって文脈から明白になるため、遺伝学的に改変された微小器官のことも言うことがある。一実施形態では、句「遺伝子産物」とは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、および機能性ＲＮＡ分子に言及したものである。一実施形態では、核酸分子によってコードされた遺伝子産物が、対象に提供されるべき目的遺伝質産物である。前記遺伝子産物の例としては、移植対象の細胞によって通常は生成されるタンパク質、ペプチド、糖タンパク質、およびリポタンパク質が挙げられる。一実施形態では遺伝子産物が微小器官の採取元の生物、および／またはＧＭＭＯが移植される生物において天然に存在することはなく、別の実施形態では遺伝産物が天然に存在する。一実施形態では、ＧＭＭＯの遺伝子産物は、微小器官の１つ以上の細胞によって内因性発現された遺伝子産物に似ているか、同一である。一実施形態では、遺伝学的改変を行うことで、非遺伝学的改変微小器官で生成される遺伝子産物の量を増加させる。別の実施形態では、ＧＭＭＯによって発現される遺伝子産物は、微小器官の１つ以上の細胞によって内因性発現された遺伝子産物に似ていなく、同一でもない。別の実施形態では、核酸分子によってコードされた遺伝子産物が、対象遺伝子の発現を直接的または間接的に制御する分子をコードする。別の実施形態では、核酸分子によってコードされた遺伝子産物が、対象に提供されるべき目的遺伝質産物の発現量を上方調節または下方調節する。
【００３６】
別の実施形態では、微小器官の遺伝学的改変を行うことで、内在性遺伝子の発現プロファイルを修正できる。例えば、内在性遺伝子の発現を制御するためのエンハンサー、あるいは抑制または誘導調節エレメントを導入することで、このことを実現できる。
【００３７】
微小器官外植片を遺伝学的に改変するために、当該技術分野で公知のいずれの方法も使用できる。公知のとおり、ウイルスベクター、プラスミドベクター、線状ＤＮＡなどさまざまな異なるベクターのいずれか１つを使用して、治療薬をコードする外因性核酸フラグメントを標的細胞および／または組織に導入できる。例えば、感染、形質導入、トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、遺伝子銃遺伝子導入、融合性およびアニオン性リポソーム（カチオン性リポソームの使用に代わるもの）を用いたリポソーム遺伝子導入、直接注入、受容体媒介摂取、マグネットポレーション、超音波、またはこれらの組み合わせのほか、当該技術分野で公知のその他の方法を用いて、これらのベクターを挿入できる（詳細については、例えば次の参考文献を参照："Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989) and in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), or other standard laboratory manuals）。対象の配列をコードするポリヌクレオチドセグメントを、哺乳類細胞を形質導入することと、組換え生産物の発現を形質導入された細胞内へ向かわせることとに適した発現ベクターに結合できる。外因性核酸フラグメントの導入は、ベクターを微小器官の近傍に導入することで行われる。上記または当該技術分野で公知の方法を用いて外因性核酸フラグメントが細胞に組み込まれると、核酸フラグメントによってコードされた治療薬の生成および／または分泌速度を定量できる。一実施形態では、用語「外因性（exogenous）」とは、外部に由来した物質のこと、例えば、細胞または組織の外に由来した核酸に言及したものである。
【００３８】
一実施形態では、本発明の製剤と方法の微小器官はベクターを含み、一実施形態で組換え遺伝子発現を促進する。一実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡプラスミドまたは小環ＤＮＡ）、「弱毒性」ウイルスベクター、つまり外因性遺伝子なし（一実施形態では欠失によるものであり、別の実施形態では、遺伝子発現を妨げる遺伝子における挿入、置換、または欠失によるものである）、ヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤＡｄ）ベクター、またはアデノ関連ウイルスＡＡＶ（一実施形態では一本鎖であり、別の実施形態では二本鎖である）などの非免疫原性遺伝子導入剤である。別の実施形態では、組換え遺伝子発現によって、微小器官による遺伝子産物の毒性または免疫媒介性拒絶反応がなくなるように、前記製剤が選択される。一実施形態では、ベクターはウイルスによって生成され、別の実施形態では、ベクターはプラスミドである。一実施形態では、ウイルス由来ベクターはアデノウイルスから生成され、そのアデノウイルスは一実施形態ではヘルパー依存性アデノウイルスである。別の実施形態では、本願明細書の上記のように、ウイルス由来ベクターはアデノウイルス関連ベクターから生成される。
【００３９】
一実施形態では、用語「ベクター（vector）」または「発現ベクター（expression vector）」とは、複製できる場合に、細胞内への導入のために核酸配列を挿入できる担体分子に言及したものである。一実施形態では、核酸分子をＲＮＡな転写し、そのＲＮＡは、一部の実施形態では、その後にタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の事例では、例えばアンチセンス分子またはリボザイムの生成において、ＲＮＡ配列は翻訳されない。一実施形態では、発現ベクターは、特定の宿主細胞の機能可能に結合されたコード配列の転写および場合によっては翻訳に必要な核酸配列のことに言及している種々の「制御配列（regulatory sequence）」を含んでもよい。別の実施形態では、ベクターは複写源をさらに含む。本願明細書で使用される場合、用語「制御配列」は、「調節配列」と呼ばれることもある。一実施形態では、ベクターがシャトルベクターであってもよく、このシャトルベクターは、一実施形態では原核細胞と真核細胞の両方で増殖でき、別の実施形態では、ベクターを、選択される生物のゲノム内での融合を促進するように構成してもよい。他の実施形態では、ベクターは、例えばプラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルス、または人工染色体であってもよい。一実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、そのウイルスベクターは、一実施形態ではバクテリオファージ、哺乳類ウイルス、または植物ウイルスであってもよい。
【００４０】
一実施形態では、ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである。別の実施形態では、アデノウイルスはいかなる公知のセロタイプまたはサブグループであってもよい。
【００４１】
遺伝子導入ベクターとしてアデノウイルスベクターを用いる利点としては、その中規模のサイズのゲノム、操作しやすさ、高い力価、幅広い標的細胞範囲、および高い感染性である。アデノウイルスの両端は１００〜２００の塩基対逆方向反復（ＩＴＲ）を含み、この塩基対逆方向反復はウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。ゲノムの初期領域 （Ｅ）および後期領域（Ｌ）は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割されるさまざまな転写単位を含む。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび少しの細胞遺伝子の転写の調節に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現によって、ウイルスＤＮＡ複写のためのタンパク質を合成する。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複写、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフに関与する。ウイルスカプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じる１つの一次転写産物を有意に処理した後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．にある）は、感染の後期の間に特に効率的であり、このプロモーターにより生じるすべてのｍＲＮＡは、翻訳に好ましいｍＲＮＡにする５´−トリパ―タイトリーダー（ＴＰＬ）配列を持つ。
【００４２】
別の実施形態では、アデノウイルスベクターはヘルパー依存性アデノウイルスベクター（「ＨＤＡＤ」、「ＨＤ」または「ＨＤＡｄ」または「ＨＤ−Ａｄ」）であり、このヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、別の実施形態では、弱毒性、除去、ミニ、完全欠失、大容量、Δ、または疑似アデノウイルスと同義であり、別の実施形態では、ＤＮＡ複製をサポートする配列を除くすべてのウイルスコード配列が欠失しており、一実施形態ではアデノウイルス逆方向末端反復およびパッケージング配列（Ψ）を含む。別の実施形態では、ヘルパー依存性アデノウイルスはウイルスタンパク質を発現しない。一実施形態では、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターは、ベクターＤＮＡを複製およびパッケージするために必要なアデノウイルスのシス作用エレメントのみを含む。一実施形態では、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターは約５００ｂｐの野生型アデノウイルス配列を有する。別の実施形態では、アデノウイルスベクターは、２７．７ｋｂのゲノムサイズに対する最低必要条件を満たすためのスタッファーＤＮＡをさらに含み、このスタッファーＤＮＡは、一実施形態では、アデノウイルスカプシドへの効率的なパッケージングのために必要である。一実施形態では、最小限の反復配列を持つ非コード化哺乳類ＤＮＡが、スタッファーＤＮＡとして使用される。別の実施形態では、スタッファーＤＮＡは非哺乳類ＤＮＡを含み、この非哺乳類ＤＮＡは、一実施形態ではＨＰＲＴおよび／またはＣ３４６コスミッド配列である。
【００４３】
一実施形態では、ヘルパー依存性アデノウイルスは、高効率インビボ形質導入、一実施形態ではウイルスタンパク質の残留発現による慢性毒性を避けることで長期導入遺伝子発現を維持することが可能である高濃度導入遺伝子発現、またはその組み合わせを示す。別の実施形態では、ヘルパー依存性アデノウイルスは高力価生成能力、幅広い種類の細胞の効率的な感染能力、分裂および非分裂細胞に影響を及ぼす能力、またはその組み合わせを持つ。さらに別の実施形態では、本発明の方法用のヘルパー依存性アデノウイルスは、移植微小器官に対する強力な適応免疫反応を引き起こさず、この反応は、免疫応答性宿主での一実施形態では、アデノ特有ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の作成を特徴として、一実施形態では導入遺伝子発現期間を制限することになり、別の実施形態では数週間以内にアデノウイルスベクターを一掃することになる。さらに別の実施形態では、本発明の方法用のヘルパー依存性アデノウイルスは高濃度の細胞傷害性Ｔ細胞を生じず（一実施形態では、当該技術分野で公知のようにポジティブＣＤ８染色によって測定できる）、別の実施形態では高濃度のヘルパーＴ細胞を生じない（一実施形態では、当該技術分野で公知のようにポジティブＣＤ４染色法によって測定できる）。
【００４４】
別の実施形態では、ベクターゲノムは宿主細胞染色体に組み込まれないため、ヘルパー依存性アデノウイルスは、発癌性形質変換を引き起こす可能性がある生殖細胞系列移行および挿入突然変異のリスクが低い。一実施形態では、ヘルパー依存性アデノウイルスのクローン能力は非常に大きく（一実施形態では約３７ｋｂ、別の実施形態では約３４ｋｂ）、ゲノム遺伝子座全体、複数の導入遺伝子、および導入遺伝子発現を強化、延長、調節する大きなシス作用エレメントの提供を可能にする。
【００４５】
一実施形態では、本発明の組成物および方法用のヘルパー依存性アデノウイルス系は、PalmerとNg、2003 Mol Ther 8:846と、PalmerとNg、2004 Mol Ther 10:792とで述べられているものと同様であり、その全体が引用により援用される。一実施形態では、複製可能なアデノウイルスを生成するようにヘルパーアデノウイルスとヘルパー依存性アデノウイルスとの間の組換えを最小限に抑えるために、ヘルパー依存性アデノウイルス系のヘルパーウイルスコンポーネントのＥ３領域に挿入されるスタッファー配列がある。
【００４６】
一実施形態では、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含む本発明の製剤は、ＥＰＯおよびＩＦＮ−アルファの長期で高いインビトロ（図１、図２、および図６Ｂ）およびインビボ（図６Ａ）発現量を示す。別の実施形態では、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含む本発明の製剤は、アデノウイルス−５を含む微小器官と比較して、形質導入後の少なくとも１００日間、ピークＥＰＯ発現量の割合の増加を示す（図３）。理論で制限されずに、本発明の微小器官からの長期持続性、高濃度の遺伝子産物に寄与する要因の１つは、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターの使用であり、そのヘルパー依存性アデノウイルスベクターは組織に対して毒性を示さず、本発明の製剤内で非免疫原性である。
【００４７】
さらに別の実施形態では、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含む本発明の製剤は、少なくとも１ヶ月未満の間、インビボでのピークＥＰＯ発現量の割合の増加を示す（図１６）。さらに別の実施形態では、少なくとも２週間未満の間、インビボでのピークＥＰＯ発現量が増加する（図１０Ｃ）。
【００４８】
別の実施形態ではアデノウイルスベクターはＥ１欠失であり、さらに別の実施形態ではアデノウイルスベクターはＥ２、Ｅ３、Ｅ４、またはその組み合わせをさらに含む。
【００４９】
別の実施形態では、ウイルスベクターはアデノ関連ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。一実施形態では、ＡＡＶはパルボウイルスであり、アデノウイルスストックの汚染として発見される。いずれの疾患にも関係していない普遍的ウイルス（抗体が米国ヒト個体群の８５％に存在する）である。その複写がアデノウイルスなどのヘルパーウイルスの存在度に左右されるため、ディペンドウイルスとしても分類される。少なくとも９種類のセロタイプが分離されており、そのうちＡＡＶ−２が最も特徴付けられている。ＡＡＶは、直径２０〜２４ｎｍの２０面体ウイルス粒を形成するようにカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３にカプシドで包まれる一本鎖線状ＤＮＡを有する。
【００５０】
一実施形態では、ＡＡＶ  ＤＮＡは約４．７キロベースの長さである。一実施形態では、２つのオープンリーディングフレームを含み、２つのＩＴＲで両側に配置されている。ＡＡＶゲノムには２つの主要な遺伝子、ｒｅｐとｃａｐがある。ｃａｐ遺伝子はカプシドタンパク質ＶＰ１〜３をコードし、ｒｅｐ遺伝子はウイルス複製に関与するタンパク質をコードする。各ＩＴＲは、Ｔ字形ヘアピン構造を形成する。これらの末端反復は、染色体への組み込みのためのＡＡＶの唯一の必須シスコンポーネントである。そのため一実施形態では、ＡＡＶは、送達のために遺伝子のカセットによって除去および置換されるすべてのウイルスコード配列にベクターとして使用できる。
【００５１】
一実施形態では、発現ベクターとして組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を使用する場合、ベクターは１４５−ｂｐのＩＴＲを含み、当該ＩＴＲはＡＡＶゲノムのほんの６％であり、一実施形態では、４．５−ｋｂのＤＮＡ挿入を行うためにベクターに空間を空ける。
【００５２】
一実施形態では、ＡＡＶは、病原性と考えられないし、疾患にも関係していないため安全である。ウイルスコード配列を除去することで、ウイルス遺伝子発現に対する免疫反応を最小限に抑える。そのため、ｒＡＡＶは、炎症反応が有る場合でも最低限の炎症反応のみを引き起こす。別の実施形態ではＡＡＶベクターが二本鎖であり、さらに別の実施形態ではＡＡＶが自己相補的であり、一実施形態ではウイルス第二鎖ＤＮＡ合成の要求事項をバイパスし、一実施形態では初期導入遺伝子発現を生じる。
【００５３】
別の実施形態では、ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである。レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染細胞でそのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする一群の一本鎖ＲＮＡウイルスである。その後、結果として生じるＤＮＡはプロウイルスとして細胞染色体に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を管理する。組み込みによって、受容細胞およびその子孫細胞でウイルス遺伝子配列を保持する。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含む。ｇａｇ遺伝子からの上流に見られる配列は、ウイルス粒子にゲノムをパッケージングするための信号を含む。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５´および３´末端に存在する。これらは強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムでの組み込みにも必要である。
【００５４】
一実施形態では、レトロウイルスベクターを作るために、１つ以上の対象オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列をコードする核酸が、複製に欠陥があるウイルスを生成する特定ウイルス配列の代わりに、ウイルスゲノムに挿入される。ウイルス粒子を生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が作られる。レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と一緒にｃＤＮＡを含む組換えプラスミドがこの細胞株に導入される場合（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列によって、組換えプラスミドのＲＮＡ転写をウイルス粒子にパッケージできるようにして、その後、培地中に分泌する。その後、組換えレトロウイルスを含む培地を採取し、必要に応じて濃縮し、遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞を感染させることができる。しかし、組み込みと安定した発現には、宿主細胞の分割が必要である。
【００５５】
他の実施形態では、ウイルスベクターは  ワクシニアウイルス、レンチウイルス、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス、または単純ヘルペスウイルスなどのウイルスに由来する。
【００５６】
本発明の特定の実施形態では、核酸配列を有するベクターは、裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドを含んでもよい。細胞膜を物理的または化学的に透過処理する方法で、構造物の導入を行うことができる。一実施形態ではベクターが小環ＤＮＡであり、当該小環ＤＮＡは、一実施形態では、非ウイルス遺伝子導入のための超螺旋ＤＮＡ分子であり、複写の細胞起源でも、抗生物質耐性マーカーでもない。別の実施形態では、小環ＤＮＡは、プラスミド生成プロセス中の遺伝子導入ベクターからの細胞制御領域を含まない。そのため、遺伝子治療で使用される他のプラスミドよりも小さく、潜在的に安全性が高い。一実施形態では、小環ＤＮＡは高収量で生成し、精製が簡単で、堅固で持続的な導入遺伝子の発現を行う。
【００５７】
標準的な組換え方法を用いたベクターの構造は当該技術分野で公知である（例えば、次の参考文献を参照：Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, 1990) and Ausubel, et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1996)、両方とも参照することにより本書に援用される）。
【００５８】
別の実施形態では、ベクターは、マーカーポリペプチドをコードする異種核酸配列をさらに含む。マーカーポリペプチドは、例えばｙＥＣｉｔｒｉｎｅ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤＳ−Ｒｅｄ（赤色蛍光タンパク質）、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ／ＥＧＦＰ、ヒト成長ホルモン、または当該技術分野で公知のいくつかの他の受容タンパク質を含んでもよい。
【００５９】
別の実施形態では、ベクターは１つ以上の対象遺伝子を含んでもよい。そのため、一実施形態では、本発明のベクターは対象遺伝子を含んでもよく、一実施形態ではエリスロポエチンまたはインターフェロンアルファ２ｂであり、一実施形態ではマーカーを発現し、別の実施形態ではフレーム内でマーカーに結合され、一実施形態では対象遺伝子産物の識別を可能にし、別の実施形態では微小器官によって生成された対象遺伝子産物と微小器官外の宿主細胞によって内因的に生成された類似の遺伝子産物との区別を可能にする。
【００６０】
一実施形態では、本発明の治療用ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターが微小器官に導入される。当該技術分野で公知であり、カセットおよび／またはベクターを細胞に導入するための、そして本発明の方法に影響を及ぼすための方法が多くあり、以下のものを含むがこれに限定されるものでない：直接ＤＮＡ取り込み法、ならびに導入、エレクトロポレーション、またはリポソーム媒介トランスフェクションのリン酸カルシウム媒介およびＤＥＡＥ−デキストラン媒介方法を採用するウイルス、プラスミド、線状ＤＮＡ、またはリポソーム媒介導入、受容体媒介取り込み、およびマグネットポレーション方法（さらに詳細については、例えば次の参考文献を参照： "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989) and in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)、または他の標準実習マニュアル）。
【００６１】
一実施形態では、核酸をコートした粒子による衝撃が、裸のＤＮＡ発現構造物を細胞に導入する方法であってもよい。この方法は、細胞を死滅させずに細胞膜に穴を開け、ＤＮＡ被覆微小発射物を高速に加速さて細胞が入ることを可能にする能力に左右される。小さな粒子を加速させる装置がいくつか開発されている。そのような装置の１つは高圧放電に依存して電流を発生させることで原動力を生ずる。使用される微小発射物は、タングステンまたは金のビーズのような生物学的に不活性または生体適合性物質が含まれるものであった。理解すべき点は、これらの方法のいずれも所望の配列を細胞に導入するために用いられ、それによって生じた細胞がこの発明の方法を達成するために用いられることから発明の一部として考えられる、ということである。
【００６２】
一実施形態では、本発明の製剤および方法のベクターは、核酸配列を有する。本明細書中で使用されるように、用語「核酸（nucleic acid）」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、そして該当する場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）またはその類似物などのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのことに言及している。また、この用語は、同等物として、ヌクレオチド類似物から作られたＲＮＡまたはＤＮＡの類似物と、説明される実施形態に当てはまる場合には、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを包含するものと考えられる必要もある。この用語には、天然存在核酸塩基、糖、および共有結合インターヌクレオチド（骨格）連鎖のほか、同様に機能する非天然存在部分を有するオリゴヌクレオチドからも成るオリゴヌクレオチドが包含される。例えば、細胞取り込み強化、核酸標的のアフィニティー強化、ヌクレアーゼの存在下での安定性向上などの望ましい特性のため、多くの場合、前記修飾または置換オリゴヌクレオチドが天然型よりも望ましい。
【００６３】
一実施形態では、用語「核酸（nucleic acid）」または「オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）」は分子のことを言い、これには、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（哺乳類など）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、そして合成ＤＮＡ配列さえも含まれるが、これに限定されるものではない。当該用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列のことも言う。
【００６４】
当該技術分野で公知のどの合成または組換えプロセスでも核酸を生成できる。当該技術分野で公知の方法を用いて、生物物理的または生物学的な特性をするために、核酸をさらに修飾できる。例えば、ヌクレアーゼに対するその安定性を向上させる（例えば、「エンドキャッピング（end-capping）」）、その溶解性、または相補配列に対する結合親和性を変更するように、核酸を修飾できる。これらの核酸は、ベクター、発現カセット、プロモーター配列、対象遺伝子、またはその組み合わせを含んでもよい。別の実施形態では、その親油性を変更でき、そしてその導入のために用いられるシステムでの変動に影響を及ぼし、一実施形態では、当該配列が、皮膚またはその層のいずれかの中での保持、またはそれらからの浸透に求められているかどうかによる影響をさらに受ける場合がある。当該検討事項が、本発明で、そして記載された方法およびシステムで使用される化合物に影響を及ぼすことがある。
【００６５】
一実施形態では、当該技術分野で公知の方法によって、全体的または部分的にＤＮＡを４つのヌクレオチドから化学的に合成できる。前記方法は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（1985; Science 230:281-285）で述べられたものを含む。ＤＮＡの合成は、オーバーラッピング二本鎖オリゴヌクレオチドを調製し、隙間を埋め、そして末端同士を結合することによっても行うことができる（一般的に次の参考文献を参照：Sambrook et al. (1989; Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition. Cold Spring Habour Laboratory Press, New York)）。別の実施形態では、部位特異的突然変異生成によって、突然変異の不活性化を野生型ＤＮＡから行ってもよい（例えば、次の参考文献を参照： Zoller et al. (1982; DNA. 1984 Dec;3(6):479-88); Zoller (1983); and Zoller (1984; DNA. 1984 Dec;3(6):479-88); McPherson (1991; Directed Mutagenesis: A Practical Approach. Oxford University Press, NY）。当該技術分野で公知の方法で、得られたＤＮＡを増幅できる。１つの適した方法が、Ｓａｉｋｉ等が発表したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法である（(1988; Science. 1988 Jan 29;239(4839):487-491), Mullis et al., U.S. Pat. No.4,683,195, and Sambrook et al. (1989)）。
【００６６】
当該技術分野では、特定の目的を達成するために核酸を修正する方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）で開示されている。さらに、本発明の核酸配列は、対象タンパク質のための非コードであるヌクレオチド配列の１つ以上の部分を含むことができる。ＤＮＡ配列に変異（点突然変異によって生ずるものあるいは挿入、欠失、および置換等の誘導修飾によって生ずるもの）を起こさせ、該ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドの活性、半減期、または生産を高めることも、本明細書に包含される。
【００６７】
一実施形態では、本発明の製剤は核酸を含んでもよく、または別の実施形態では、本発明の方法が核酸の導入を含んでもよく、別の実施形態では核酸がベクターの一部である。
【００６８】
特定の発現ベクター系と、細胞に核酸を導入する方法との有効性を、後述のような当該技術分野で日常的に使用される標準的な手法で評価できる。
【００６９】
当業者によって評価されるように、タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列または遺伝子のフラグメントまたは誘導体は、完全な野生型遺伝子または配列と同様にまだ機能できる。同様に、核酸配列の構造は野生型配列と比較して変異を有し、それでも、これらの変異にもかかわらず、対象のタンパク質またはペプチド、またはそのフラグメントをコードし、同じ生物学的効果を示す野生型機能を保持する。これらの各々は、本発明の個別の実施形態を表す。
【００７０】
一実施形態では、遺伝子サイレンシングアプリケーションに本発明の製剤および方法を使用してもよい。一実施形態では、キメラ分子であり、２つ以上の化学的に異なる領域を含み、各々が少なくとも１つのヌクレオチドから作られるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を通じて、特定遺伝子の活性または機能が抑制または軽減される。
【００７１】
一実施形態では、キメラオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に対する高い耐性、高い細胞取り込み、および／または標的ポリヌクレオチドに対する高い結合親和性をオリゴヌクレオチドに与えるためにオリゴヌクレオチドが修飾される少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドの追加領域が  ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂させる能力がある酵素の基質として機能することができ、本発明の本態様に従って、特定配列の分解を通じた遺伝子サイレンシングの手段として機能する。ゲル電気泳動によって、必要に応じて、当該技術分野で公知の関連する核酸ハイブリダイゼーションによって、ＲＮＡ標的の開裂を普通に検出できる。
【００７２】
一実施形態では、当該技術分野で発表されているように（例えば、次の特許を参照：米国特許第５，０１３，８３０号；第５，１４９，７９７号；第５，２２０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；および第５，７００，９２２号）、２つ以上のオリゴヌクレオチドおよび／または修飾オリゴヌクレオチドの複合構造としてキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを形成でき、別の実施形態ではリボザイム配列を含んでもよい。
【００７３】
別の実施形態では、遺伝子発現を配列特異的に抑制する低分子干渉ＲＮＡの使用を通じて、遺伝子発現、活性、または機能の抑制が達成される。生物の１つの遺伝子に二本鎖（double stranded/duplex）ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を投与すると、影響を受けた細胞でのｍＲＮＡの急速分解によって特定遺伝子の発現を沈黙させることができる。このプロセスは、特異的ＲＮＡ阻害剤（ＲＮＡｉ）として機能するｄｓＲＮＡとともに、遺伝子サイレンシングと呼ばれる。ＲＮＡｉは、内在性ウイルスおよびトランスポゾン活性などの自然源に由来することがある。また、マイクロインジェクション（Fire et al. (1998) Nature 391: 806-11）を通じて、あるいは相補的ＲＮＡまたは折り曲げＲＮＡを作りながら遺伝子構造物による形質転換、あるいはその他ベクター（Waterhouse, P.M., et al. (1998). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13959-13964 and Wang, Z., et al. (2000). J. Biol. Chem. 275, 40174-40179）によって、細胞に人為的に導入することができる（Elbashir SM, et al (2001). Nature 411:494-498）。一実施形態では、ＲＮＡｉ媒介ｍＲＮＡ分解は二本鎖ＲＮＡを含み、他の実施形態では一本鎖ＲＮＡ、分離ＲＮＡ（部分的に精製したＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えによって生成したＲＭＡ）のほか、１つ以上のヌクレオチドの追加、削除、および／または変更による天然存在ＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡも含む。
【００７４】
一実施形態では、本発明の製剤および方法の核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。一実施形態では、用語「ポリペプチド」は、ペプチド（すなわち、アミド）結合によって結合されるアミノ酸残基を含む分子のことを言い、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を含む。したがって、一実施形態では、本発明のポリペプチドは共有結合アミノ酸の単独または複数の鎖を有してもよく、ジスルフィド結合を含む鎖内または鎖間結合をさらに含んでもよい。一実施形態では、一部のポリペプチドは複合高分子錯体のサブユニットも形成してもよい。一実施形態では、ポリペプチドは配座優先を有し、三次元構造を示すと期待できる。配座優先と三次元構造の両方は、ポリペプチドの一次（すなわち、アミノ酸）配列および／またはジスルフィド結合または他の共有結合または非共有結合鎖内または鎖間相互作用の存在（または欠如）によって通常定義される。
【００７５】
一実施形態では、用語「ペプチド」は、ペプチド類似体であるペプトイドおよびセミペプトイドなどのネガティブペプチド（分解物、合成的に合成したペプチド、または組換えペプチドのいずれか）および／またはペプチド模倣物（典型的には、合成的に合成したペプチド）のことを言い、例えば、ペプチドを体内にある間はより安定するように、あるいは細胞への浸透する能力がより高い状態にする修飾を有してもよい。そのような修飾としては、限定されるものではないが、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾（限定されるものではないが、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＦ＝ＣＨが含まれる）、主鎖修飾、および残基修飾が挙げられる。ペプチド模倣化合物を調製する方法は当該技術分野で公知であり、例えば次の文献で規定されており：Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)、ここで示されるように、参照することにより本書に援用される。
【００７６】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を、例えば、Ｎ−メチル化（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（Ｒはアルキル、例えばメチルである）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（Ｒは「通常（normal）」側鎖であり、炭素原子上にもともと存在する。）によって置換してもよい。これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った任意の結合で起こり得るもので、また同時に複数（２〜３）の場所でも起こり得る。
【００７７】
天然芳香族アミノ酸、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅは、ＴＩＣ、ナフチルアラニン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成非天然酸に代替してもよい。上記に加え、本発明のペプチドは、１つ以上の修飾アミノ酸または１つ以上の非アミノ酸モノマー（例えば、脂肪酸、複合糖質など）も含んでもよい。
【００７８】
一実施形態では、用語「アミノ酸（amino acid or amino acids）」は、２０種類の天然に存在するアミノ酸；例えばヒドロキシプロリン、ホスホセリン、およびホスホトレオニンを含み、多くの場合、インビボで翻訳後に修飾される前記アミノ酸；および２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシン、およびオルニチンを含むが、これに限定されるものではない他の異常アミノ酸を含むと考えられる。さらに、用語「アミノ酸（amino acid）」はＤ−およびＬ−アミノ酸を包含するものであってもよい。
【００７９】
本明細書中で使用されるように、用語「アミノ酸（amino acid）」は、別段の指定がある場合を除き、アミノ酸のＤまたはＬ立体異性体のことに言及している。さらに本発明の範囲内に含まれるものとしては、例えば精製野生型腫瘍抑制タンパク質の生物活性を有する同等のタンパク質または同等のペプチドがある。「同等のタンパク質（equivalent protein）」および「同等のポリペプチド（equivalent polypeptide）」は、天然に存在するタンパク質またはポリペプチドの線状配列から逸脱するが、その生物活性を変更しないアミノ酸置換を有する化合物のことに言及している。これらの同等物は、関連アミノ酸、例えば同様に変更したアミノ酸との１つ以上のアミノ酸の置き換え、または側鎖または官能基の置換または修飾によって、自然の配列と違う可能性がある。
【００８０】
ペプチドまたはポリペプチド、またはこれらをコードするＤＮＡ配列を、原核細胞または真核細胞などのさまざまな天然源または非天然源から得ることができる。一実施形態では、ソース細胞は野生型、組換え、または突然変異体であってもよい。別の実施形態では、多数のペプチドまたはポリペプチドは、細菌、酵母、または菌類などの微生物に対して、ウイルスに対して、動物（哺乳類、無脊椎動物類、は虫類、鳥類、および昆虫類を含む）に対して、あるいは植物細胞に対して内因性であってもよい。
【００８１】
別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは、ビリオン粒子の表面コート、特定の細胞溶解物、組織抽出物などのより特定の供給源から得てもよく、細胞膜上に発現されたそれらのポリペプチドに限られることもある。
【００８２】
別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは、特定の細胞または組織の種類、成長段階、または病状または病期から得られる。一実施形態では、病状または病期が癌であり、別の実施形態では病状が感染症であり、別の実施形態ではＨＩＶ感染症である。別の実施形態では病状が発育障害であり、さらに別の実施形態では病状が代謝障害である。
【００８３】
本発明のポリペプチドはどんな大きさであってもよい。予想されるように、ポリペプチドはさまざまな分子量を示すことができ、一部は１５０〜２００キロダルトン（ｋＤ）を超える。典型的には、ポリペプチドは約５，０００〜約１００，０００ダルトンの分子量を有してもよい。さらに他の物は、例えば、約１０，０００〜約７５，０００ダルトン、または約２０，０００〜約５０，０００ダルトンの狭い範囲に入ってもよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは１〜２５０の長さのアミン酸残基であってもよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは１０〜２００の長さのアミン酸残基であってもよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは５０〜１００の長さのアミン酸残基であってもよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは１〜２５０の長さのアミン酸残基であってもよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは１〜２５０の長さのアミン酸残基であってもよい。一実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドの最大サイズは、発現されるベクターによって決まり、一実施形態では約２０〜３７ｋＤ、２０〜２５ｋＤ、２５〜３０ｋＤ、３０〜３７ｋＤ、または３５〜３７ｋＤである。別の実施形態では、ポリペプチドが３４ｋＤの糖タンパク質である。
【００８４】
別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドがアゴニストである。別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドがアンタゴニストである。別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドが抗原である。別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドが酵素である。別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドが酵素または他の基質の活性剤である。別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドが酵素または他の基質の阻害剤である。別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドがホルモンである。別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドが調節タンパク質である。調節タンパク質は、遺伝子の発現および複製、酵素の能力、細胞とその環境の間の相互作用、およびその他多くの兆候を管理する多数の相互作用を命令する。別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドが細胞骨格タンパク質である。細胞骨格タンパク質は細胞の柔軟な骨格を形成し、細胞小器官および形成された物体の付着点を提供し、細胞の構成要素間のコミュニケーションを可能にする。別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドが毒素である。別の実施形態では、本発明の治療用核酸は１つ以上の自殺遺伝子をコードする。
【００８５】
別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは、アゴニスト、アンタゴニスト、抗原、酵素、酵素活性剤、酵素阻害剤、酵素基質、ホルモン、調節タンパク質、細胞骨格タンパク質、または毒素の機能性フラグメントである。「機能性フラグメント」は、ペプチドまたはポリペプチドの残りがない場合にでも、ペプチドまたはポリペプチドの機能の１つ以上を行う能力があるペプチドまたはポリペプチドの一部を示すように意図されている。一実施形態では、機能性フラグメントは、対象の標的との分子間相互作用を仲介するのに十分である。
【００８６】
別の実施形態では、ペプチドはＤＮＡまたはＲＮＡまたはそのフラグメントを結合させる。一実施形態では、ＲＮＡまたはＲＮＡが結合しているペプチドは、以下を含むがこれに限定されるものではない、公知の多くのうちのいずれであってもよい。すなわち、ベータ―ベータ―アルファ亜鉛フィンガータンパク質、核内受容体タンパク質、ループシートヘリックスタイプタンパク質、およびＧＡＬ４タイプタンパク質などの亜鉛フィンガータンパク質と；Ｃｒｏおよびリプレッサータンパク質、ＬａｃＩプリンリプレッサータンパク質（ＰｕｒＲ）、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ（ＤＮＡ認識領域）、ガンマ−デルタリコンビナーゼタンパク質（Ｃ−末端領域）、Ｈｉｎリコンビナーゼタンパク質、Ｔｒｐリプレッサータンパク質、ジフテリアｔｏｘリプレッサー、カタボライト遺伝子活性化タンパク質（ＣＡＰ）、ホメオドメイトタンパク質、ＲＡＰ１タンパク質、Ｐｒｄ対タンパク質、Ｔｃ３トランスポザーゼタンパク質、ＴＦＩＩＢファミリー、インターフェロン調節因子、転写因子ファミリー、およびＥＴＳ領域ファミリーバクテリオファージなどのヘリックスターンヘリックスタンパク質と；ベーシックジッパータンパク質およびジッパータイプタンパク質などのロイシンジッパータンパク質とが挙げられる。別の実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合ペプチドは、Ｃｒｅリコンビナーゼファミリー、パピローマウイルス−１  Ｅ２タンパク質、ヒストンファミリー、Ｅｂｎａ１核タンパク質ファミリー、Ｓｋｎ−１転写因子、高移動度群ファミリー、およびＭＡＤＳボックスファミリーなどの他のアルファヘリックスタンパク質と；ＴＡＴＡボックス結合タンパク質などのベータシートタンパク質と；Ｍｅｔリプレッサータンパク質、Ｔｕｓ複製終結タンパク質、組込み宿主因子タンパク質、超好熱菌ＤＮＡ結合タンパク質、Ａｒｃレプレッサー、転写因子Ｔドメインなどのベータヘアピン／リボンタンパク質と；Ｒｅｌホモロジー領域およびＳｔａｔファミリーなどのその他のタンパク質ファミリーであってもよい。別の実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合ペプチドは、メチルトランスフェラーゼタンパク質、ＰｖｕＩＩエンドヌクレアーゼタンパク質、エンドヌクレアーゼＶタンパク質、ＥｃｏＲＶエンドヌクレアーゼファミリー、ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼファミリー、ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼファミリー、ＤＮＡミスマッチエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩタンパク質、ＤＮＡポリメラーゼＴ７、ＤＮアーゼＩタンパク質、ＤＮＡポリメラーゼベータタンパク質、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ、メチルアデニン−ＤＮＡグリコシラーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＨＩＶ逆転写酵素などのトポイソメラーゼＩまたはウイルスタンパク質などの酵素であってもよい。
【００８７】
別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは、転写または翻訳活性化因子またはそのフラグメントである。別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは、転写または翻訳レプレッサーまたはそのフラグメントである。別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドが受容体またはそのフラグメントである。
【００８８】
一実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは、本願明細書に記載のペプチドまたはポリペプチドのいずれかの同族ペプチドを意味してもよい。「同族（cognate）」ペプチドは、別の分子と相互作用および／または結合するペプチドである。
【００８９】
本発明の他の実施形態にしたがって、組換え遺伝子産物を、対応する天然ポリヌクレオチドと比較して修飾ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドでコードしてもよい。
【００９０】
タンパク質に加えて、組換え遺伝子産物は、機能性ＲＮＡ分子も含んでもよい。
【００９１】
本発明の別の実施形態にしたがって、本発明の製剤および方法は、機能性ＲＮＡ分子を生成する微小器官を提供してもよい。機能性ＲＮＡ分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列、本願明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリボザイム、およびこれらと結合したリボザイム配列を有してもよい。前記リボザイムは、固相オリゴヌクレオチド合成を用いて簡単に合成できる。
【００９２】
リボザイムは、対象ｍＲＮＡコード化タンパク質の開裂による遺伝子発現の配列特有の阻害のために使用が増えている［Welch et al., “Expression of ribozymes in gene transfer systems to modulate target RNA levels.” Curr Opin Biotechnol. 1998 October; 9(5):486-96］。特定の標的ＲＮＡを開裂させるリボザイムを設計することの可能性によって、基礎研究と治療への応用の両方で貴重なツールを提供してきた。治療領域では、リボザイムは、感染症の標的ＲＮＡ、癌の癌遺伝子、および遺伝性疾患での特定体細胞変異に利用されてきた［Welch et al., “Ribozyme gene therapy for hepatitis C virus infection.” Clin Diagn Virol. Jul. 15, 1998; 10(2-3):163-71］。中でも注目すべきは、ＨＩＶ患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子治療プロトコルは既に第Ｉ相臨床試験中である。最近になって、リボザイムは、遺伝子組換え動物研究、遺伝子標的検証、および経路教育に使用されている。いくつかのリボザイムは、臨床試験のさまざまな段階中である。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ヒト臨床試験で研究された最初の化学合成リボザイムだった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、血管新生経路での重要成分であるＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮成長因子受容体）の形成を特に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．のほかにその他の会社も、動物モデルでの抗血管新生治療の重要性を示してきた。Ｃ型肝炎ウイルスを選択的に破壊するように設計されたリボザイムであるＨＥＰＴＡＺＹＭＥは、細胞培養試験でＣ型ウイルスＲＮＡの削減に有効であることが分かった。
【００９３】
前述のように、一実施形態では、本発明の製剤および方法の核酸は、治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を有する治療用製剤を提供する。一実施形態では、用語「治療用（therapeutic）」とは、必要としている対象に提供された時に有益な効果を提供する分子のことに言及している。場合によっては、分子は、対象での当該分子の欠如または存在の減少を元に戻すように機能するという点において効果的である。一実施形態では、治療用タンパク質は、必要なタンパク質の内因性ヌルまたはミスセンス変異を持つ対象の場合などで、対象中に欠如しているタンパク質である。他の実施形態では、内因性タンパク質は突然変異され、機能性タンパク質の提供によって補正される非機能性タンパク質を生成する。他の実施形態では、異種タンパク質の発現は低内因性発現量の付加的なものであり、所定のタンパク質の発現を累積的に増加させる。他の実施形態では、分子は、細胞または宿主を機能するための重要な要素の発現または分泌またはその他を提供するシグナル伝達カスケードを刺激する。
【００９４】
一実施形態では、用語「治療用製剤（therapeutic formulation）」は、診断に、別の実施形態では治療に、あるいは別の実施形態では緩和に、あるいは別の実施形態では処置に、あるいは別の実施形態では疾患、障害、病状、または感染の予防に使用できる物質のことに言及している。一実施形態では、本発明の「治療用製剤」は、適用される標的の構造または機能に影響を与える物質のことに言及している。
【００９５】
別の実施形態では、本発明の「治療用製剤（therapeutic formulation）」は、疾患または障害を患う対象に投与されるとその症状を緩和する分子である。一実施形態では本発明の「治療用製剤」が合成分子であり、また別の実施形態では自然界で発見された源から分離された天然に存在する化合物である。
【００９６】
一実施形態では、治療用ポリペプチドがエリスロポエチンである。一実施形態では、エリスロポエチンによって示される有益な効果はＨｂ濃度増加である。一実施形態では、エリスロポエチンによって示される有益な効果は貧血症の処置である。
【００９７】
別の実施形態では、治療用ポリペプチドがインターフェロンアルファであり、一実施形態ではインターフェロンアルファ２ｂである。一実施形態では、前記治療用ポリペプチドがその他の治療用ポリペプチドである。
【００９８】
一実施形態では、「処置（treatment）」とは、治療的処置と予防対策の両方を意味し、その目的は上述のような標的とされる病状または障害を防止または低下させることである。そのため、一実施形態では、処置することには、疾患、障害、または病状に関連した症状に直接的に影響を与えるまたは治療すること、抑制すること、阻害すること、予防すること、重症度を下げること、発病を遅らせること、軽減すること、またはその組み合わせを含む。そのため、一実施形態では、「処置する（treating）」とは、特に進行を遅らせること、寛解を早めること、寛解を誘導すること、寛解を増進すること、回復を加速すること、効果を高めること、代替の治療法に対する耐性を軽減すること、またはその組み合わせのことに言及している。一実施形態では、「予防する（preventing）」とは、特に発症を遅らせること、疾患の再発を防止すること、再発の回数または頻度を減らすこと、発症の潜伏間隔を長くすること、またはその組み合わせのことに言及している。一実施形態では、「抑制する（suppressing）」または「阻害する（inhibition）」とは、特に症状の重症度を軽減すること、急性発症の重症度を軽減すること、症状の回数を減らすこと、疾患に関連した症状の発生率を下げること、症状の潜伏期間を短縮すること、症状を改善すること、二次的症状を軽減すること、二次感染を減らすこと、患者生存期間を延ばすこと、またはその組み合わせのことに言及している。
【００９９】
一実施形態では、症状とは一次症状のことであり、別の実施形態では二次症状である。一実施形態では、「一次（primary）」とは、特定の疾患の直接的な結果である症状のことに言及している。また、一実施形態では、「二次（secondary）」とは、主因に由来する、またはその結果生じる症状のことに言及している。一実施形態では、本発明で用いる化合物は、疾患に関連した一次症状または二次症状または二次性合併症を処置する。別の実施形態では、「症状（symptoms）」は、疾患または病状の兆候であってもよい。
【０１００】
一実施形態では、治療用核酸が治療用ペプチドをコードしてもよく、一実施形態では酵素、酵素補助因子、細胞毒性タンパク質、抗体、チャネルタンパク質、輸送タンパク質、成長因子、ホルモン、サイトカイン、受容体、ムチン、界面活性剤、アプタマー、またはホルモンを含んでもよい。別の実施形態では、治療用ポリペプチドが上述の分類の１つ以上であってもよい。別の実施形態では、治療用核酸は、後述のように機能性ＲＮＡをコードしてもよい。
【０１０１】
一実施形態では、用語「抗体（antibody）または抗体フラグメント（antibody fragment）」とは、インタクトな抗体分子のほか、エピトープに結合できるＦａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、およびＦｖなどのその機能性フラグメントのことに言及している。一実施形態では、Ｆａｂフラグメントとは、インタクトな軽鎖、および重鎖の一部を得るために酵素パパインによる全抗体の消化によって生成できる抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含むフラグメントのことに言及している。一実施形態では、Ｆａｂ´フラグメントとは、インタクトな軽鎖、および重鎖の一部を得るためにペプシンによる全抗体の処置、続いて還元によって得ることが可能な抗体分子の一部のことに言及している。抗体分子あたり２つのＦａｂ´フラグメントを得てもよい。一実施形態では、（Ｆａｂ´）２とは、続いて還元を行わずに酵素ペプシンによって全抗体を処置することで得ることが可能な抗体のフラグメントのことに言及している。別の実施形態では、Ｆ（ａｂ´）２は、２つのジスルフィド結合によって結合している２つのＦａｂ´フラグメントである。一実施形態では、Ｆｖは、軽鎖の可変領域と、２つの鎖として発現される重鎖の可変領域とを含む遺伝子組換えフラグメントのことを言ってもよい。一実施形態では、抗体フラグメントは、軽鎖の可変領域と、重鎖の可変領域とを含み、遺伝子的に結合した一本鎖分子としての適切なポリペプチドリンカーによって結合された遺伝子組換え分子である一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）であってもよい。
【０１０２】
これらのフラグメントを作成する方法は当該技術分野で公知である（例えば、参照することにより本書に援用される次の参考文献を参照：Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988）。
【０１０３】
一実施形態では、抗体はエピトープを認識し、当該エピトープとは、別の実施形態において、抗体のパラトープが結合する抗原上の抗原決定基のことに言及している。他の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸または炭水化物側鎖などの化学的に活性な分子の表面基群から成ってもよく、他の実施形態では、特定の三次元構造特性を示してもよく、および／または他の実施形態では、特定の電荷特性を示してもよい。
【０１０４】
一実施形態では、認識されるエピトープが病原体に由来するものであり、別の実施形態では病原性細胞、または別の実施形態では異常に発現されたタンパク質に由来するものであり、当該異常発現とは、別の実施形態において、発現の場所、数、またはその組み合わせのことを言ってもよい。
【０１０５】
抗体フラグメントの別の形態は、１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。対象抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を作成することで、ＣＤＲペプチド（「最小認識単位（minimal recognition unit）」）を入手可能である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することで、前記遺伝子を調製する。例えば、次の参考文献を参照：Larrick and Fry, Methods, 2: 106-10, 1991。
【０１０６】
一実施形態では、抗体には殺腫瘍性があり、したがって特定の癌に効果的である。殺腫瘍活性を持つ抗体も当該技術分野では公知であり、そのいずれかを使用することが本発明の実施形態を表してもよく、ＩＭＣ−Ｃ２２５、ＥＭＤ７２０００、ＯｖａＲｅｘ  Ｍａｂ  Ｂ４３．１３、抗ガングリオシドＧ（Ｄ２）抗体ｃｈ１４．１８、ＣＯ１７−１Ａ、トラスツズマブ、ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ、ｓｃ−３２１、ＡＦ３４９、ＢＡＦ３４９、ＡＦ７４３、ＢＡＦ７４３、ＭＡＢ７４３、ＡＢ１８７５、抗Ｆｌｔ−４ＡＢ３１２７、ＦＬＴ４１−Ａ、リツキシマブ、２Ｃ３、ＣＡＭＰＡＴＨ  １Ｈ、２Ｇ７、アルファＩＲ−３、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＭＤＸ−４４７、抗ｐ７５  ＩＬ−２Ｒ、抗ｐ６４  ＩＬ−２Ｒ、および２Ａ１１を含む。
【０１０７】
一実施形態では、本発明の「治療用核酸（therapeutic nucleic acid）」は、抗高血圧剤、抗鬱薬、抗不安薬、抗凝固薬、 抗痙攣薬、血糖降下薬、充血除去薬、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、抗炎症薬、抗精神病薬、向知性薬、コレステロール降下薬、抗肥満薬、自己免疫疾患治療薬、性的不能治療薬、抗菌および抗真菌薬、催眠薬、抗パーキンソン病薬、抗生物質、抗ウイルス薬、抗腫瘍薬、精神安定剤、鎮静薬、栄養剤、βブロッカー、吐剤、鎮吐薬、利尿剤、抗凝固薬、強心剤、アンドロゲン、コルチコイド、同化剤、成長ホルモン分泌促進剤、抗感染薬、冠拡張薬、炭酸脱水酵素阻害薬、抗原虫薬、胃腸薬、セロトニン拮抗薬、麻酔薬、血糖降下薬、ドーパミン作動薬、抗アルツハイマー病治療薬、抗腫瘍薬、抗血小板薬、およびグリコーゲンホスホリラーゼ阻害薬として機能する分子をコードしてもよく、あるいは「治療用ポリペプチド」が当該分子であってもよい。
【０１０８】
一実施形態では、本発明の「治療用製剤」には抗菌性、抗ウイルス性、抗真菌性、または寄生虫性がある。別の実施形態では、治療用製剤は細胞毒性または抗癌活性を示す。別の実施形態では、治療用製剤が免疫賦活性である。別の実施形態では、治療用製剤は炎症または免疫反応を阻害する。
【０１０９】
一実施形態では、治療用核酸は、インターフェロンまたはインターロイキンまたはそれらの受容体などのサイトカインをコードしてもよく、あるいは治療用ポリペプチドが当該サイトカインであってもよい。サイトカインまたは適切なものの発現の欠如が、疾患に対する感受性に関与してきた。そして、発現を増大させることが、さまざまな感染症に対する耐性につながることがある。例えば、感染症、または自己免疫疾患でＴｈ１タイプ発現パターンまたはＴｈ２パターンになるように免疫反応にバイアスをかけることなどの有益な効果を生じるように、サイトカインの発現パターンを変更してもよく、変更された発現パターンは宿主にとって有益であることを示すことがある。
【０１１０】
別の実施形態では、治療用核酸は、グリコーゲン貯蔵または分解に関与するものなどの酵素をコードしてもよく、あるいは治療用ポリペプチドが当該酵素であってもよい。別の実施形態では、治療用タンパク質は、例えばＣＦＴＲなどのイオン輸送体、またはグルコース輸送体、または発現が不足または不適切であるとさまざまな疾患を生じる他の輸送体などの輸送体を含む。
【０１１１】
別の実施形態では、治療用核酸は、癌関連事象の進行を変える腫瘍抑制化合物またはアポトーシス促進化合物を復号化し、あるいは治療用ポリペプチドは当該化合物である。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明の治療用核酸が免疫調節タンパク質をコードしてもよく、あるいは治療用ポリペプチドが免疫調節タンパク質であってもよい。一実施形態では、免疫調節タンパク質は、サイトカイン、ケモカイン、補体、あるいは成分、例えばインターロイキン１〜１５、インターフェロンアルファ、ベータ、もしくはガンマ、腫瘍壊死因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ケモカイン（例えば、好中球活性化タンパク質（ＮＡＰ）、マクロファージ化学誘引活性化因子（ＭＣＡＦ）、ＲＡＮＴＥＳ、マクロファージ炎症性ペプチドＭＩＰ−１ａおよびＭＩＰ−１ｂ）、または補体成分を含む。
【０１１３】
別の実施形態では、本発明の治療用核酸が成長因子または組織促進因子をコードしてもよく、あるいは治療用ポリペプチドが成長因子または組織促進因子であってもよい。一実施形態では、治療用化合物は骨形成タンパク質、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−９、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、６０Ａ、またはＶｇｒ−１である。別の実施形態では、治療用核酸は、ＲＮＡを、または神経再生または修復を促進するペプチドをコードする。そして、ＮＧＦまたは他の成長因子を含んでもよい。別の実施形態では、治療用ポリペプチドは神経再生または修復を促進する。そして、ＮＧＦまたは他の成長因子を含んでもよい。
【０１１４】
別の実施形態では、治療用核酸は以下の物質をコードしてもよく、また治療用ポリペプチドは以下の物質であってもよい。すなわち、天然または非天然インスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、ホルモン、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ２、エラスターゼ、アミラーゼ、血液凝固因子、ＵＤＰグルクロン酸転移酵素、オルニチントランスカルバモイラーゼ、シトクロムｐ４５０酵素、アブノシンデアミナーゼ、血清胸腺因子、胸腺液性因子、チモポエチン、成長ホルモン、ソマトメジン、共刺激因子、抗体、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮成長因子、肝臓赤血球生成因子（ヘパトポイエチン）、肝細胞成長因子、インターロイキン、インターフェロン、負の成長因子、線維芽細胞増殖因子、αファミリーの形質転換成長因子、βファミリーの形質転換成長因子、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、セロチニン、サブスタンスＰ、転写因子、またはその組み合わせ。
【０１１５】
別の実施形態では、遺伝子はレポーター遺伝子を含む。一実施形態では、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質をコードする。一実施形態では、蛍光タンパク質はｙＥＣｉｔｒｉｎｅまたは黄色蛍光タンパク質である。一実施形態では、蛍光タンパク質は  クラゲ緑色蛍光タンパク質またはその突然変異体または変異形である。別の実施形態では、ＧＭＭＯはレポーター遺伝子以外の遺伝子またはレポータータンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。
【０１１６】
別の実施形態では、レポーター遺伝子は薬剤耐性を与える。一実施形態では、当業者によって評価されるように、レポーター遺伝子は例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、またはその他などの抗体に対する耐性を与える。別の実施形態では、抗生物質抵抗性遺伝子は、ネオマシン（ｎｅｏ）、ブラストサイジン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン、フレオマイシン、Ｔｎ９１７、ゲンタマイシン、およびブレオマイシンに対する耐性を与える遺伝子を含んでもよい。ネオマシン耐性遺伝子の例としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ１１をコードするトランスボゾンＴｎ５のネオマシン耐性遺伝子であり、Ｇ４１８およびカナマイシンを含むさまざまな抗体に対する耐性を与える。別の実施形態では、レポーターはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ）であり、クロラムフェニコールに対する耐性を与える。
【０１１７】
一実施形態では、本発明の製剤および方法は、ウイルス感染症の予防または治療介入用であり、また別の実施形態では細菌性、寄生性、または真菌性感染症またはその組み合わせの予防または治療介入用である。
【０１１８】
本発明の本態様に従って、本発明の製剤および方法は疾患の予防または治療介入用である。一実施形態では、そのために対象が処置される疾患は以下のものを含んでもよいが、これに限定されるものではない。すなわち、筋ジストロフィー；癌；心血管疾患；高血圧；感染症；腎疾患；アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、クロイツフェルトヤコブ病などの神経変性疾患；狼瘡、関節リウマチなどの自己免疫疾患；心内膜炎；グレーブス病；ＡＬＤ；喘息または?胞性線維症などの呼吸器疾患；骨粗鬆症、関節疾患などの骨疾患；肝疾患；乾癬または湿疹などの皮膚疾患；眼疾患；耳鼻咽喉疾患；トゥレット症候群、統合失調症、鬱病、自閉症、または脳卒中などの他の神経疾患；またはグリコーゲン貯蔵症または糖尿病などの代謝性疾患。当然のことながら、本発明の製剤を通じて、そして本発明の方法に従って達成できる、特定タンパク質の発現による疾患、治療用タンパク質の提供、薬剤の提供、特定タンパク質の発現の阻害などは、本発明の一部と考えることである。
【０１１９】
一実施形態では、本発明の製剤および方法のベクターは、１つ以上の調節配列に機能可能に結合される核酸配列を有する。一実施形態では、微小器官の細胞に導入される細胞核酸分子は、核酸によってコードされる遺伝子産物の細胞内での発現に適した形態である。その結果、一実施形態では、核酸分子は、遺伝子（またはその一部）の転写に必要なコード化調節配列を有する。遺伝子産物がタンパク質またはペプチドである場合、核酸分子の転写に必要な核酸分子コード化調節配列を有する核酸分子は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル信号、コードしたタンパク質またはペプチドの運搬に必要な配列、例えば一実施形態では細胞または分泌物の表面にタンパク質またはペプチドを輸送するためのＮ末端シグナル配列を有する。
【０１２０】
遺伝子産物（例えば、プロモーターおよびエンハンサー配列）の発現を調節するヌクレオチド配列は、遺伝子産物が発現される細胞の種類と、遺伝子産物の目標発現量とに基づいて選択される。例えば、プロモーターに結合された遺伝子の細胞種特定発現を与えることが公知であるプロモーターを使用できる。筋芽細胞発現に対して特異的なプロモーターを、対象遺伝子に結合し、その遺伝子産物の筋肉特有発現を与えることができる。当該技術分野で公知である筋肉特有調節エレメントは、ジストロフィン遺伝子から上流の領域を含む（Klamut et al., (1989) Mol. Cell Biol.9:2396), the creatine kinase gene (Buskin and Hauschka, (1989) Mol. Cell Biol. 9:2627) and the troponin gene (Mar and Ordahl, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:6404）。ケラチン遺伝子における負の応答エレメントは、転写抑制を仲介する（Jho Sh et al, (2001). J. Biol Chem）。他の種類の細胞に特異的な調節エレメントは当該技術分野で公知である（例えば、肝臓特異的発現に対するアルブミンエンハンサー；膵島細胞特異的発現に対するインスリン調節エレメント；神経ジストロフィン、神経エノラーゼ、およびＡ４アミロイドプロモーターを含むさまざまな神経細胞特異的調節エレメント）。あるいは、ウイルス性調節エレメントなど、さまざまな異なる種類の細胞における遺伝子の構成的発現を指示する調節エレメントを使用できる。遺伝子発現を推進するために一般的に使用されるウイルス性プロモーターの例としては、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、およびシミアンウイルス４０由来のもの、ならびにレトロウイルスＬＴＲが挙げられる。あるいは、それに結合された遺伝子の誘導発現を行う調節エレメントを使用できる。誘導調節エレメント（例えば、誘導プロモーター）を使用することによって、細胞における遺伝子産物の生成の調節が可能になる。真核細胞で用いる潜在的に有益な誘導調節系の例としては、ホルモン調節エレメント（例えば、Mader, S. and White, J. H. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607を参照)、合成リガンド調節エレメント（例えば、Spencer, D. M. et al 1993) Science 262:1019-1024を参照)、およびイオン照射調節エレメント（例えば、Manome, Y. Et al. (1993) Biochemistry 32:10607-10613; Datta, R. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:1014-10153を参照）が挙げられる。本発明に従って、作成してもよい追加の組織特異的または誘導調節系も使用できる。
【０１２１】
一実施形態では本発明の調節配列がＣＭＶプロモーターを含んでもよい。また、別の実施形態では調節配列がＣＡＧプロモーターを含んでもよい。一実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス即時型初期エンハンサーと組換えトリベータアクチンプロモーターと第１イントロンを組み合わせた複合プロモーターである。一実施形態では、調節配列は、シミアンウイルス（ＳＶ）−４０ポリアデニル配列を含んでもよく、一実施形態では、大部分のメッセンジャーＲＮＡ分子が真核生物のその３´末端で終端とされる機構である。一実施形態では、ポリアデノシン（ｐｏｌｙ−Ａ）テールはエクソヌクレアーゼからｍＲＮＡ分子を保護し、転写終結、核からのｍＲＮＡの輸送、および転写にとって重要である。別の実施形態では、本発明の製剤は１つ以上の調節配列を含んでもよい。
【０１２２】
一実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化配列とともにＣＭＶまたはＣＡＧプロモーターを含む本発明の製剤は、ＥＰＯおよびＩＦＮ−アルファの長期にわたり高いインビトロ発現量（図１、図５、および図６Ｂ）およびインビボ発現量（図６Ａ）を示す。理論に制限されることになく、本発明の微小器官からの長期持続性、高濃度の遺伝子産物に寄与する要因の１つは、プロモーターとしてＣＭＶ、あるいはＣＡＧを使用することであり、構成遺伝子発現の促進において、微小器官外植片で特に効果的である。
【０１２３】
一実施形態では、用語「プロモーター（promoter）」とは、一実施形態にてコード配列のすぐ上流であり、遺伝子の基底転写および／または調節された転写にとって重要であるＤＮＡ配列のことに言及している。一実施形態では、本発明のプロモーターは、対象遺伝子に機能可能に結合される。別の実施形態では、プロモーターは、内在性プロモーターの突然変異体であり、通常、適切な環境の下で対象遺伝子の発現に関係がある。
【０１２４】
一実施形態では、組成物のプロモーター、および本発明の方法で用いるプロモーターは、調節可能なプロモーターである。別の実施形態では、調節可能なプロモーターとは、遺伝子下流の発現が、特定プロモーターからの発現を刺激する特定条件の発生または提供に応じて生じることによるプロモーターのことに言及している。一部の実施形態では、前記条件が発現を直接オンにする。あるいは、他の実施形態では、発現に対する障害を取り除く。一部の実施形態では、前記条件が発現をオフにするか、減少させる。
【０１２５】
一実施形態では、前記条件は、特定の温度、栄養素、栄養素の欠如、金属の存在、または当業者には公知であるような刺激または環境因子を含んでもよい。一実施形態では、調節可能なプロモーターはガラクトース（例えば、ＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＧＡＬ１０）、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１））、グルコース（例えば、アルコール脱水素酵素ＩＩ（ＡＤＨ２））、リン酸塩（例えば、酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５））によって調節されてもよい。別の実施形態では、当業者には公知であるように、調節可能なプロモーターをヒートショック（ヒートショックプロモーター）、またはＩＰＴＧまたはテトラサイクリンなどの化学薬品、またはその他によって活性化させてもよい。当然のことながら、調節可能なプロモーターおよび前記調節の条件は、本発明のベクター、核酸、および方法によって含まれ、その実施形態を意味する。
【０１２６】
一実施形態では、本発明の製剤および方法の核酸は、治療用ポリペプチドまたは核酸の濃度を基礎濃度よりも少なくとも５％増加させる。別の実施形態では、治療用ポリペプチドまたは核酸の濃度は、基礎濃度よりも少なくとも７％、別の実施形態では少なくも１０％、別の実施形態では少なくも１５％、別の実施形態では少なくも２０％、別の実施形態では少なくも２５％、別の実施形態では少なくも３０％、別の実施形態では少なくも４０％、別の実施形態では少なくも５０％、別の実施形態では少なくも６０％、別の実施形態では少なくも７５％、別の実施形態では少なくも１００％、別の実施形態では少なくも１２５％、別の実施形態では少なくも１５０％、別の実施形態では少なくも２００％増加される。さらに別の実施形態では、本発明の製剤および方法は、投与時に治療用ポリペプチドまたは核酸の濃度を増加させ、その後、治療用ポリペプチドまたは核酸の濃度は基礎濃度またはそれに近い濃度に戻る。一実施形態では、基礎濃度またはそれに近い濃度に戻るのは、治療用ポリペプチドまたは核酸の投与１ヶ月以内である。
【０１２７】
一実施形態では、本発明の製剤による治療用ポリペプチドまたは核酸の発現は、一実施形態において本発明の治療用製剤が投与または接触されていない宿主または細胞培養で発現される濃度である「基礎濃度（basal level）」と比較して増加する。
【０１２８】
別の実施形態では、本発明の製剤および方法は、治療用ポリペプチドまたは核酸の濃度を約２０００ｎｇ／日に、別の実施形態では約１５００ｎｇ／日に、別の実施形態では約１０００ｎｇ／日に、別の実施形態では約７５０ｎｇ／日に、別の実施形態では約５００ｎｇ／日に、別の実施形態では約２５０ｎｇ／日に、別の実施形態では約１５０ｎｇ／日に、別の実施形態では約１００ｎｇ／日に、別の実施形態では約７５ｎｇ／日に、別の実施形態では約５０ｎｇ／日に、別の実施形態では約２５ｎｇ／日に増加させる。別の実施形態では、本発明の製剤および方法は、治療用ポリペプチドの濃度を２０〜７０ｍＵ／ｍＬに、別の実施形態では５０〜１００ｍＵ／ｍＬに、別の実施形態では５〜２０ｍＵ／ｍＬに、別の実施形態では１００〜２００ｍＵ／ｍＬに、別の実施形態では１０〜７０ｍＵ／ｍＬに、別の実施形態では５〜８０ｍＵ／ｍＬに増加させる。別の実施形態では、本発明の製剤および方法は、治療用ポリペプチドの濃度を５００〜１０００ｍＵ／ｍＬに、別の実施形態では２５０〜７５０ｍＵ／ｍＬに、別の実施形態では５００〜５０００ｍＵ／ｍＬに増加させる。
【０１２９】
一実施形態では、本発明の製剤および方法の核酸は、一実施形態ではヘマトクリット値である機能性マーカーの濃度を基礎濃度よりも少なくとも５％増加させる。別の実施形態では、機能性マーカーの濃度は、基礎濃度よりも少なくとも７％、別の実施形態では少なくも１０％、別の実施形態では少なくも１５％、別の実施形態では少なくも２０％、別の実施形態では少なくも２５％、別の実施形態では少なくも３０％、別の実施形態では少なくも４０％、別の実施形態では少なくも５０％、別の実施形態では少なくも６０％、別の実施形態では少なくも７５％、別の実施形態では少なくも１００％、別の実施形態では少なくも１２５％、別の実施形態では少なくも１５０％、別の実施形態では少なくも２００％増加される。
【０１３０】
一実施形態では、本発明の製剤は、「長期持続性（long-lasting）」であり、このことは、一実施形態において治療用ポリペプチドまたは核酸の分泌、発現、生成、循環、または持続を増加させることが可能な製剤のことに言及している。一実施形態では、治療用ポリペプチドまたは核酸の発現量が、少なくとも１ヶ月間、別の実施形態では少なくとも６ヶ月間、基礎量よりも増加される。
【０１３１】
本発明の別の実施形態では、本発明の治療用製剤は、「長期持続性（long-lasting）」であり、このことは、機能性マーカーの分泌、発現、生成、循環、または持続を増加させることが可能な製剤のことに言及している。一実施形態では、機能性マーカーがヘマトクリットである。別の実施形態では、機能性マーカーがＨｂである。さらに別の実施形態では、例えばヘマトクリットまたはＨｂである機能性マーカーの濃度は、少なくとも２週間、別の実施形態では少なくとも３週間、別の実施形態では少なくとも４週間、別の実施形態では少なくとも５週間、別の実施形態では少なくとも６週間、別の実施形態では少なくとも８週間、別の実施形態では少なくとも２ヶ月間、別の実施形態では少なくとも２ヶ月間、別の実施形態では少なくとも２ヶ月間、別の実施形態では少なくとも３ヶ月間、別の実施形態では少なくとも４ヶ月間、別の実施形態では少なくとも５ヶ月間、別の実施形態では少なくとも７ヶ月間、別の実施形態では少なくとも８ヶ月間、別の実施形態では少なくとも９ヶ月間、別の実施形態では少なくとも１０ヶ月間、別の実施形態では少なくとも１１ヶ月間、別の実施形態では少なくとも１年間、増加される。別の実施形態では、治療用ポリペプチドまたは核酸の濃度は、少なくとも４〜６ヶ月間増加される。
【０１３２】
一実施形態では、治療用ポリペプチドまたは核酸をコードする核酸配列は、治療用ポリペプチドまたは核酸の発現量を増加させるために最適化され、別の実施形態では、治療用ポリペプチドまたは核酸の発現期間を延長するために、あるいは別の実施形態ではその組み合わせの発現期間を延長するために、最適化される。
【０１３３】
一実施形態では、用語「最適化（optimized）」とは、一実施形態にて遺伝子発現での変化であり、別の実施形態ではタンパク質発現の変化である求められる変化のことに言及している。一実施形態では、最適化された遺伝子発現は、遺伝子発現の最適化された調節である。別の実施形態では、最適化された遺伝子発現は、遺伝子発現の増加である。本態様に従って、そして一実施形態では、野生型と比較して遺伝子発現の２倍〜１０００倍の増加が期待される。別の実施形態では、遺伝子発現の２倍〜５００倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の２倍〜１００倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の２倍〜５０倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の２倍〜２０倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の２倍〜１０倍の増加、別の実施形態では遺伝子発現の３倍〜５倍の増加が期待される。
【０１３４】
別の実施形態では、最適化された遺伝子発現は、特定の環境条件での遺伝子発現の増加であってもよい。別の実施形態では、最適化された遺伝子発現は、遺伝子発現の減少をふくんでもよく、一実施形態では特定の環境条件下に限ってもよい。
【０１３５】
別の実施形態では、最適化された遺伝子発現は、遺伝子発現の期間延長である。本態様に従って、そして一実施形態では、野生型と比較して遺伝子発現の期間の２倍〜１０００倍の延長が期待される。別の実施形態では、遺伝子発現の期間の２倍〜５００倍の延長、別の実施形態では遺伝子発現の期間の２倍〜１００倍の延長、別の実施形態では遺伝子発現の期間の２倍〜５０倍の延長、別の実施形態では遺伝子発現の期間の２倍〜２０倍の延長、別の実施形態では遺伝子発現の期間の２倍〜１０倍の延長、別の実施形態では遺伝子発現の期間の３倍〜５倍の延長が期待される。別の実施形態では、遺伝子発現の期間延長は非ベクター発現対照における遺伝子発現と比較され、あるいは野生型ベクター発現対照における遺伝子発現と比較される。
【０１３６】
一実施形態では、哺乳類細胞の発現は、転写サイレンシング、短いｍＲＮＡ半減期、選択的スプライシング現象、早期ポリアデニル化、非効率的な核翻訳、希少ｔＲＮＡプールの状態によって妨げられる。哺乳類発現の多くの問題の原因は、多くの重要な哺乳類遺伝子の自家発現も含む導入遺伝子をコードしているメッセージの中に見いだされる。哺乳類ＲＮＡの最適化としては、シス作用エレメントの修飾、そのＧＣコンテンツの適応、哺乳類細胞の非制限ｔＲＮＡプールに対するコドンバイアスの修正、内部相同領域の回避、およびＲＮＡｉの除外が挙げられる。
【０１３７】
そのため、一実施形態では、注意深く設計した合成遺伝子を頼りにする場合、半減期が延長された安定したメッセージ、構造的核外輸送、および哺乳類宿主内での高濃度タンパク質産生が期待できる。
【０１３８】
したがって、一実施形態において、遺伝子を最適化することは、コドンの利用を宿主遺伝子のコドンバイアスに適応させること（ここで、宿主遺伝子は、一実施形態では、ヒト（Homo sapiens）遺伝子である）；ＧＣ含有量が非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）の領域を調整すること；以下のシス活性配列のモチーフの一つ以上を回避することを、必然的に伴う。すなわち、内部ＴＡＴＡ−ボックス、Ｃｈｉ部位およびレボソーム浸入部位；ＡＴ−リッチまたはＧＣ−リッチ配列伸長；ＡＲＥ、ＩＮＳ、ＣＲＳ配列エレメント；反復配列およびＲＮＡ二次構造；潜在性スプライスドナーおよびアクセプター部位、分岐点；あるいはそれらの組み合わせである。一実施形態では、遺伝子は、ヒト細胞での発現のために最適化される。別の実施形態では、遺伝子は微小器官での発現のために最適化される。さらに別の実施形態では、遺伝子は真皮細胞での発現のために最適化される。さらに別の実施形態では、遺伝子発現の最適化には、発現ベクターにおける遺伝子の隣接領域および／または他の領域に配列エレメントを追加することを必要とする。遺伝子発現を最適化するために追加してもよい配列エレメントとしては、例えばマトリックス結合領域（ＭＡＲ）、特殊クロマチン構造（ＳＣＳ）、およびウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が挙げられる。
【０１３９】
一実施形態では、本願明細書で示したように、ＥＰＯなどの最適化遺伝子は、弱毒性アデノウイルスから発現された非最適化ＥＰＯまたはアデノウイルス５ベクターから発現された非最適化ＥＰＯの両方と比較して長期間、ピーク発現量の割合が高い状態を維持する（図３および４）。
【０１４０】
一実施形態では、用語「遺伝子（gene）」は、コード配列に前（５´非コード配列）または後（３´非コード配列）の調節配列を有する特定タンパク質として発現することが可能な核酸フラグメントのことに言及している。「天然遺伝子（native gene）」は、独自の調節配列とともに自然界で見られるような遺伝子のことに言及している。「キメラ遺伝子（chineric gene）」は、自然界でともに見られない調節配列およびコード配列を含み、天然遺伝子ではない遺伝子のことに言及している。その結果、キメラ遺伝子は、さまざまな源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源であるが、自然界で見つかるものとは異なるように配置された調節配列およびコード配列を含んでもよい。「内在性遺伝子（endogenous gene）」は、生物のゲノムにおける自然な位置にある天然遺伝子のことに言及している。「外来（foreign）」遺伝子は、宿主生物では通常見つからないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子のことに言及している。外来遺伝子は、非天然生物に挿入される天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでもよい。「導入遺伝子（transgene）」は、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子である。
【０１４１】
一実施形態では、治療用核酸は、ＲＮＡ分子（センスまたはアンチセンス）、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、その組み合わせ、または他の後で修飾されたポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。本発明の一実施形態では、対象遺伝子は組織試料で自然に発現されてもよい。本発明の別の実施形態では、組織試料は、少なくとも１つの細胞が、細胞によって自然に発現されていないか、細胞内に変更された発現プロファイルを有する対象遺伝子を発現するように遺伝子組換えされてもよい。一実施形態では、本発明の治療用核酸は米国特許出願第１０／３７６，５０６号に記載のタンパク質をコードしてもよく、あるいは治療用ポリペプチドが当該タンパク質であってもよく、その特許のすべての全体の内容が引用により援用される。
【０１４２】
一実施形態では、遺伝子学的改変微小器官は遺伝子組換え真皮微小器官である。「真皮（dermal）」微小器官（「ＤＭＯ」）は複数の真皮構成要素を含んでもよく、一実施形態では、真皮は表皮の下にある皮膚の一部である。これらの構成要素は、皮膚線維芽細胞、上皮細胞、他の種類の細胞、毛包の基底部、神経終末部、汗腺および皮脂腺、ならびに血管およびリンパ管を含んでもよい。一実施形態では真皮微小器官が脂肪組織を含んでもよく、別の実施形態では真皮微小器官が脂肪組織を含まなくてもよい。
【０１４３】
本発明の一部の実施形態では真皮微小器官が表皮基底層の組織を含んでもよく、必要に応じて皮膚の他の表皮層を含んでもよい。他の実施形態では、真皮微小器官が基底層組織を含まない。本発明の別の実施形態では、真皮微小器官が表皮層を含まない。さらに別の実施形態では、真皮微小器官が不完全な基底層組織を含む。さらに別の実施形態では、真皮微小器官が数層の表皮組織を含んでもよい。さらに別の実施形態では、真皮微小器官が真皮への表皮の陥入を含んでもよい。さらに別の実施形態では、真皮微小器官が汗腺および／または毛包などの追加の構成要素を含んでもよい。
【０１４４】
本発明の一実施形態では、ＤＭＯが真皮の断面全体を含む。本発明の別の実施形態では、真皮微小器官が真皮の断面の一部を含む。別の実施形態では、ＤＭＯが真皮の断面の大部分、すなわち真皮乳頭層および真皮網状層を含む真皮の層および構成要素の大部分を含む。別の実施形態では、ＤＭＯが一次真皮組織を含むが、脂肪組織も含んでもよい。本発明の一部の実施形態では、ＤＭＯがケラチンを生成しないか、またはごく少量のケラチンしか生成しない。その結果、移植者への移植の後、例えば皮下または皮内移植の後の角質?腫の形成を防止する。前記微小器官の摘出、培養下での維持、移植を含む真皮微小器官に関する詳細はＰＣＴ特許出願番号ＷＯ２００４／０９９３６３に記載されており、その全体が引用により援用される。
【０１４５】
別の実施形態では、本発明は、１つ以上の遺伝学的に改変された微小器官を提供することを含む、持続時間以上、必要としている対象に治療用ポリペプチドを提供する方法を示し、前記微小器官は、１つ以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を有する。また、前記遺伝学的に改変された微小器官を前記対象に移植する方法を示し、前記核酸配列は治療用ポリペプチドをコードし、それによって、治療用核酸またはポリペプチドの発現量は基礎濃度よりも５％を上回って増加し、前記増加は１ヶ月間を超えて維持される。別の実施形態では、本発明は、１つ以上の遺伝学的に改変された微小器官を提供することを含む、持続時間以上、必要としている対象に治療用ポリペプチドを提供する方法を示し、前記微小器官は、１つ以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を有する。また、前記遺伝学的に改変された微小器官を前記対象に移植する方法を示し、前記核酸配列は治療用ポリペプチドをコードし、前記ベクターはヘルパー依存性アデノウイルスベクターである。別の実施形態では、本発明は、１つ以上の遺伝学的に改変された微小器官を提供することを含む、持続時間以上、必要としている対象に治療用ポリペプチドを提供する方法を示し、前記微小器官は、１つ以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を有する。また、前記遺伝学的に改変された微小器官を前記対象に移植する方法を示し、前記核酸配列は治療用ポリペプチドをコードし、前記ベクターはヘルパー依存性アデノウイルスベクターである。
【０１４６】
別の実施形態では、本願明細書で前述した方法は、必要としている対象に治療用核酸を提供し、治療用核酸またはペプチドの発現量は基礎量よりも５％を上回って増加し、前記増加は１時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１８時間、１日間、または２日間を超えて維持され、前記ベクターはヘルパー依存性アデノウイルスベクターまたはその組み合わせである。
【０１４７】
一実施形態では、本発明は本願明細書にて前述したように治療用製剤を提供し、治療用ポリペプチドがエリスロポエチンであるか、治療用核酸がエリスロポエチンをコードする。別の実施形態では、本発明は、遺伝学的に改変された微小器官を含む長期持続性エリスロポエチン製剤を提供する。前記微小器官は、１つ以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を有するベクターを含み、前記核酸配列はエリスロポエチンをコードし、それによって前記製剤はエリスロポエチン濃度を基礎濃度よりも５％を上回って増加し、前記エリスロポエチン濃度の増加が１ヶ月間を超えて持続する。別の実施形態では、製剤はエリスロポエチン濃度を基礎濃度よりも５％を上回って増加し、前記エリスロポエチン濃度の増加が１ヶ月未満の間継続する。さらに別の実施形態では、本発明は、必要としている対象に治療用製剤を提供する方法を示し、治療用ポリペプチドがエリスロポエチンであるか、治療用核酸がエリスロポエチンをコードする。さらに別の実施形態では、本発明は、必要としている対象にエリスロポエチンを提供する方法を提供する。
【０１４８】
別の実施形態では、本発明は、以下を含み、持続期間にわたり必要としている対象にエリスロポエチンを送達する方法を提供する。つまり、１つ以上の遺伝学的に改変された微小器官を提供することと、ここで前記微小器官は１つ以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を有するベクターを含み；ならびに前記対象に前記遺伝学的に改変された微小器官を移植することと、ここで上記核酸配列はエリスロポエチンをコードし、それによってエリスロポエチン濃度は基礎濃度よりも５％を上回って増加し、前記エリスロポエチンの増加が１ヶ月間を超えて継続する。別の実施形態では、エリスロポエチン濃度は基礎濃度よりも５％以上増加させられ、前記エリスロポエチン濃度の増加は１ヶ月未満の間継続する。
【０１４９】
さらに別の実施形態では、本発明は、以下を含み、持続期間にわたり必要としている対象での新しい血球の形成を誘導する方法を提供する。つまり、１つ以上の遺伝学的に改変された微小器官を提供することと、ここで前記微小器官は１つ以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を有するベクターを含み；ならびに前記対象に前記遺伝学的に改変された微小器官を移植することと、ここで上記核酸配列はエリスロポエチンをコードし、それによってエリスロポエチン濃度は基礎濃度よりも５％を上回って増加し、前記エリスロポエチンの増加が１ヶ月間を超えて継続する。さらに別の実施形態では、エリスロポエチン濃度は基礎濃度よりも５％を上回って増加し、前記エリスロポエチン濃度の増加は１ヶ月未満の間継続する。
【０１５０】
一実施形態では、エリスロポエチン（ＥＰＯ）が、赤血球への赤血球前駆細胞の成熟で必要とされる糖タンパク質ホルモンである。一実施形態では、エリスロポエチンが、循環している赤血球の量の調節において不可欠である。天然に存在するエリスロポエチンは、腎臓および肝臓によって生成され、血液中を循環し、一実施形態では低酸素症に応えて骨髄での赤血球細胞の生成を促進する。
【０１５１】
一実施形態では、本発明の組成および方法のＥＰＯは、ヒトまたは動物の尿から抽出されるＥＰＯと同様の糖鎖負荷パターンを含んでもよく、別の実施形態では血漿から抽出されるＥＰＯと同様の糖鎖負荷パターンを含んでもよい。 
【０１５２】
エリスロポエチンをコードする遺伝子の同定、クローニング、および発現は、米国特許出願第５，７５６，３４９号；第５，９５５，４２２号；第５，６１８，６９８号；第５，５４７，９３３号；第５，６２１，０８０号；第５，４４１，８６８号；および第４，７０３，００８号に記載されており、参照することにより本書に援用される。組換えエリスロポエチンプラスミドを含む哺乳類細胞の増殖を支えた細胞培地からの組換えエリスロポエチンの精製についての詳細は、Ｌａｉ等によって米国特許出願第４，６６７．０１６号に記載されており、参照することにより本書に援用される。エリスロポエチンをコードする遺伝子によって形質転換された宿主細胞からインビトロでのタンパク質産物の発現を伴う遺伝子組換え技術によって精製された組換えエリスロポエチンを、慢性腎不全を引き起こす貧血症の処置に使用してきた。最近、ＥＰＯは、腎不全の貧血、ジドブジン（ＡＺＴ）処置を受けた患者でのＨＩＶ感染症に関連した貧血、および癌化学治療に関連した貧血の処置に使用されている。腎不全に続発する貧血の処置においてｒｈｕ−ＥＰＯの投与が日常的になっており、週３回投与で５０〜７５ｕ／ｋｇの用量を用いて、ヘマトクリット値を徐々に回復させ、輸血依存を排除する。
【０１５３】
多くの細胞表面および真核細胞によって生成される分泌タンパク質は、グリコシル化と呼ばれる１つ以上のオリゴ糖群によって修飾され、このことがタンパク質の安定性、分泌、および細胞内局在化のほかに生物活性にも著しく影響を及ぼす可能性がある。一実施形態では、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列番号１〜１６５を有するヒトの尿由来のエリスロポエチンと組換えエリスロポエチン（哺乳類細胞で発現される）の両方とも、糖タンパク質の総分子量の約４０％をともに構成する３つのＮ−結合型および１つのＯ−結合型のオリゴ糖鎖を含む。一実施形態では、非グリコシル化エリスロポエチンが、グリコシル化形態と比較してインビボの活性を大きく低下させたが、インビトロの活性は維持した。一実施形態では、組成物のものであり、本発明の方法で用いるＥＰＯは完全にグリコシル化され、別の実施形態では一部のグリコシル化残基を含み、さらに別の実施形態ではグリコシル化されない。
【０１５４】
一実施形態では、ＥＰＯ遺伝子は野生型ＥＰＯ遺伝子であってもよく、別の実施形態ではＥＰＯ遺伝子が修飾されてもよい。一実施形態では、修飾ＥＰＯ遺伝子を最適化してもよい。
【０１５５】
一実施形態では、ＥＰＯ遺伝子は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号で記載のものに対応する核酸配列を有する。すなわち、Ｘ０２１５８；ＡＦ２０２３１２；ＡＦ２０２３１１；ＡＦ２０２３０９；ＡＦ２０２３１０；ＡＦ０５３３５６；ＡＦ２０２３０６；ＡＦ２０２３０７；またはＡＦ２０２３０８。あるいは、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号に記載のものに対応するタンパク質配列をコードする。すなわち、ＣＡＡ２６０９５；ＡＡＦ２３１３４；ＡＡＦ１７５７２；ＡＡＦ２３１３３；ＡＡＣ７８７９１；またはＡＡＦ２３１３２。別の実施形態では、ＥＰＯ前駆遺伝子は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号で記載のものに対応する核酸配列を有する。すなわち、ＮＭ＿０００７９９；Ｍ１１３１９；ＢＣ０９３６２８；またはＢＣ１１１９３７。あるいは、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号で記載のものに対応するタンパク質配列をコードする。すなわち、ＮＰ＿０００７９０；ＡＡＡ５２４００；ＡＡＨ９３６２８；またはＡＡＩ１１９３８。別の実施形態ではＥＰＯ遺伝子が配列番号：７で示されるような核酸配列を有し、さらに別の実施形態ではＥＰＯ遺伝子が配列番号：８で示されるようなアミノ酸配列を有する。別の実施形態ではＥＰＯ遺伝子が配列番号：７で示されるようなものに相同である核酸配列を有し、さらに別の実施形態ではＥＰＯ遺伝子が配列番号：８で示されるようなものに相同であるアミノ酸配列を有する。
【０１５６】
一実施形態では、貧血を患う対象の処置に本発明を使用してもよい。一実施形態では、貧血が「赤血球中の酸素運搬Ｈｂ量の病的欠如（a pathologic deficiency in the amount of oxygen-carrying Hb in the red blood cells）」と定義される。貧血の症状としては、疲労、日常機能を果たす能力低下、認知機能の障害、頭痛、目まい、胸痛および息切れ、吐き気、鬱、痛み、またはその組み合わせが挙げられる。一実施形態では、貧血が予後不良または死亡率上昇に関連している。
【０１５７】
多くの場合、貧血は腎臓からのエリスロポエチンの生成減少による腎不全の結果である。別の実施形態では、貧血は、癌浸潤、リンパ腫または白血病、または骨髄置換のための骨髄による赤血球（エリスロイド）生成低下によって引き起こされる。貧血の他の原因としては、大出血または異常月経などの過剰出血による失血；外科手術、放射線治療、化学療法、免疫療法、またはその組み合わせなどの癌治療；癌性骨髄の浸潤または置換；一実施形態では赤血球の分解または破壊である溶血の増加；エリスロポエチンの濃度低下、またはその組み合わせを含む。一実施形態では、貧血とはファンコニ貧血のことを言い、ファンコニ貧血は、一実施形態では骨髄不全（再生不良性貧血）および多くの場合に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を引き起こす遺伝性貧血である。別の実施形態では、貧血は、ダイアモンドブラックファン貧血、正球性貧血、再生不良性貧血、鉄欠乏性貧血、ビタミン欠乏性貧血、鉄芽球性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、慢性疾患の貧血、腎不全および透析での貧血、またはその組み合わせのことに言及している。別の実施形態では、糖尿病対象の処置に本発明の長期持続性ＥＰＯ製剤が用いられる。本態様および一実施形態にしたがって、特にインスリン投与、一実施形態ではスルホニル尿素薬であり、一実施形態では特にグルコトロール、グリブリド、グリナーゼ、およびアマリール；グルコファージ、特にレズリン、アクトス、およびアバンディアを含むチアゾリジンジオン；その組み合わせを含む、経口血糖降下薬を含む当該技術分野で公知の糖尿病の他の処置と併用して本発明のＥＰＯ製剤を使用してもよい。別の実施形態では、慢性腎疾患を患う対象の処置に本発明の長期持続性ＥＰＯ製剤が使用され、さらに別の実施形態では、末期腎不全を患う対象の処置に使用される。別の実施形態では、前記疾患または病状の影響を受けやすい対象に本発明の製剤が使用される。
【０１５８】
当然のことながら、貧血の原因、ならびに貧血の原因が分かっているかどうかにかかわらず、貧血の処置に本発明の製剤および方法を使用してもよい。
【０１５９】
一実施形態では、その製剤および方法は効果的なＥＰＯ治療を提供する。
【０１６０】
用語「効果的なＥＰＯ治療（effective EPO therapy）」は、患者のＨｂ濃度を治療濃度域内にするのに十分なＥＰＯの量を意味する。一実施形態では、「効果的なＥＰＯ治療」とは、必要としている対象での赤血球新生の増加のことに言及している。一実施形態では、「効果的なＥＰＯ治療」とは、必要としている対象での赤血球新生の減少の防止のことに言及している。本明細書中で使用されるように、用語「効果的なＥＰＯ治療」は、本願明細書でエリスロポエチンの「効果的な用量（effective dosage）」または「効果的な投与量（effective dose）」と呼ばれることもある。
【０１６１】
本発明の一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療は患者に少なくとも１つのヒトＥＰＯ−ＧＭＭＯ（ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯ）を移植することで達成される。別の実施形態では、効果的なＥＰＯ治療は患者に少なくとも２つのｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを移植することで達成される。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療は患者に少なくとも３つのｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを移植することで達成される。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療は患者に少なくとも４つのｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを移植することで達成される。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療は患者に少なくとも５つのｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを移植することで達成される。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療は患者に少なくとも６つのｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを移植することで達成される。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療は患者に少なくとも７つ以上のｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを移植することで達成される。
【０１６２】
本明細書中で使用されるように、用語「治療濃度域（therapeutic window）」とは、必要としている対象でのＨｂの目標とする濃度を意味する。一実施形態では、治療濃度域とは、１０ｇｍ／ｄＬ〜１２ｇｍ／ｄＬの範囲内のＨｂ濃度のことに言及している。一実施形態では、Ｈｂ濃度が９．５〜１２．６ｇｍ／ｄＬの範囲内である。一実施形態では、Ｈｂ濃度が９〜１３．２ｇｍ／ｄＬの範囲内である。一実施形態では、Ｈｂ濃度が８．５〜１３．８ｇｍ／ｄＬの範囲内である。一実施形態では、Ｈｂ濃度が８〜１４．４ｇｍ／ｄＬの範囲内である。
【０１６３】
一実施形態では、必要としている対象がヒトである。一実施形態では、必要としている対象が腎臓病患者である。別の実施形態では、必要としている対象が末期腎不全を患っている。さらに別の実施形態では、必要としている対象が慢性腎疾患（ＣＫＤ）を患っている。さらに別の実施形態では、必要としている対象が透析前ＣＫＤを患っている。別の実施形態では、必要としている対象が糖尿病患者である。
【０１６４】
本発明の一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療によって患者のＨｂ濃度（「Ｈｂ」）を治療濃度域にする。本発明の別の実施形態では、効果的なＥＰＯ治療によって患者のＨｂ濃度を治療濃度域の±１０％の範囲内にする。本発明の別の実施形態では、効果的なＥＰＯ治療によって患者のＨｂ濃度を治療濃度域の±２０％の範囲内にする。
【０１６５】
本明細書中で使用されるように、用語「効果的な用量」または「効果的な投与量」は、１日あたり少なくとも１回のＧＭＭＯによって発現される治療用ポリペプチドの有効量のことに言及している。
【０１６６】
一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、１８〜１５０ＵＩ／患者のＫｇ体重／日である。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、２０〜４０ＵＩ／患者のＫｇ体重／日である。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、４０〜６０ＵＩ／患者のＫｇ体重／日である。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、６０〜８０ＵＩ／患者のＫｇ体重／日である。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、８０〜１００ＵＩ／患者のＫｇ体重／日である。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、１００〜１２０ＵＩ／患者のＫｇ体重／日である。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、１２０〜１５０ＵＩ／患者のＫｇ体重／日である。
【０１６７】
別の実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、１８〜２５ＵＩ／患者のＫｇ体重／日（低用量）である。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、３５〜４５ＵＩ／患者のＫｇ体重／日（中用量）である。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、５５〜６５ＵＩ／患者のＫｇ体重／日（高用量）である。
【０１６８】
一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、２０ＩＵ／患者のＫｇ体重／日である。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、４０ＩＵ／患者のＫｇ体重／日である。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、６０ＩＵ／患者のＫｇ体重／日である。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、８０ＩＵ／患者のＫｇ体重／日である。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、１００ＩＵ／患者のＫｇ体重／日である。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、１２０ＩＵ／患者のＫｇ体重／日である。一実施形態では、効果的なＥＰＯ治療のための用量は、１５０ＩＵ／患者のＫｇ体重／日である。
【０１６９】
一実施形態では、少なくとも１つのｈＥＰＯ−ＧＭＭＯの移植の反応によって、少なくとも１ヶ月間、Ｈｂ濃度の上昇が持続される。一実施形態では、少なくとも１つのｈＥＰＯ−ＧＭＭＯの移植の反応によって、少なくとも２ヶ月間、Ｈｂ濃度の上昇が持続される。一実施形態では、少なくとも１つのｈＥＰＯ−ＧＭＭＯの移植の反応によって、少なくとも３ヶ月間、Ｈｂ濃度の上昇が持続される。一実施形態では、少なくとも１つのｈＥＰＯ−ＧＭＭＯの移植の反応によって、少なくとも４ヶ月間、Ｈｂ濃度の上昇が持続される。一実施形態では、少なくとも１つのｈＥＰＯ−ＧＭＭＯの移植の反応によって、少なくとも５ヶ月間、Ｈｂ濃度の上昇が持続される。一実施形態では、少なくとも１つのｈＥＰＯ−ＧＭＭＯの移植の反応によって、少なくとも６ヶ月間、Ｈｂ濃度の上昇が持続される。一実施形態では、少なくとも１つのｈＥＰＯ−ＧＭＭＯの移植の反応によって、６ヶ月間を超えてＨｂ濃度の上昇が持続される。一実施形態では、少なくとも１つのｈＥＰＯ−ＧＭＭＯの移植の反応によって、９ヶ月間を超えてＨｂ濃度の上昇が持続される。一実施形態では、少なくとも１つのｈＥＰＯ−ＧＭＭＯの移植の反応によって、１年間以上、Ｈｂ濃度の上昇が持続される。
【０１７０】
一実施形態では、本発明の製剤および方法を、貧血の処置に有効な他の処置と併用して投与してもよい。一実施形態では、他の処置としては、鉄分サプリメント、ビタミンＢ１２サプリメント、エリスロポエチンの追加供給源、アンドロゲン、Ｇ−ＣＳＦなどの成長因子、またはその組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、本発明の製剤および方法を、血液および骨髄細胞移植などの他の処置と併用して投与してもよい。
【０１７１】
一実施形態では、本発明は本願明細書にて前述したように治療用製剤を提供し、治療用ポリペプチドがインターフェロンであるか、治療用核酸がインターフェロンをコードし、一実施形態では当該インターフェロンがインターフェロンアルファであり、一実施形態ではインターフェロンアルファ２ａである。別の実施形態では、本発明は、遺伝学的に改変された微小器官を含む長期持続性インターフェロン−アルファ製剤を提供する。前記微小器官は、１つ以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を有するベクターを含み、前記核酸配列はインターフェロン−アルファをコードし、それによって前記製剤はインターフェロン−アルファ濃度を基礎濃度よりも５％を上回って増加し、前記インターフェロン−アルファ濃度の増加が１ヶ月間以上持続する。別の実施形態では、本発明は、必要としている対象に治療用製剤を提供する方法を示し、治療用ポリペプチドがインターフェロンであるか、治療用核酸がインターフェロンをコードし、一実施形態では当該インターフェロンがインターフェロンアルファであり、一実施形態ではインターフェロンアルファ２ａである。別の実施形態では、本発明は、必要としている対象に治療用ポリペプチドを提供する方法を示し、治療用ポリペプチドがインターフェロンであり、一実施形態では当該インターフェロンがインターフェロンアルファであり、一実施形態ではインターフェロンアルファ２ａである。
【０１７２】
一実施形態では、インターフェロンは、抗ウイルス、抗増殖および抗炎症効果などの細胞に多面発現効果を生じさせることができる多機能サイトカインである。インターフェロンに対するこれらの細胞反応のために、インターフェロン−アルファおよびインターフェロン−ベータは、多発性硬化症、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびいくつかの種類の癌などのウイルス性、増殖性、および炎症性疾患の処置において臨床的に有用であることが分かった。インターフェロン治療には、その他の炎症性疾患、ウイルス性疾患および増殖性疾患の処置に使用できる可能性があってもよい。そのため、インターフェロンを必要としている対象は、上記疾患または病状の１つまたはすべてを持ってもよい。
【０１７３】
インターフェロンには、アルファ（α）、ベータ（β）、およびガンマ（γ）の３つの主要な分類がある。それらの抗ウイルスおよび抗腫瘍形成特性に加えて、インターフェロンはマクロファージおよびナチュラルキラーリンパ球を活性化し、主要組織適合性複合体糖タンパク質クラスＩおよびＩＩを強化する。インターフェロン−αは、白血球（Ｂ−細胞およびＴ−細胞）によって分泌される。インターフェロン−βは線維芽細胞によって分泌され、インターフェロン−γはＴ−細胞およびナチュラルキラーリンパ球によって分泌される。
【０１７４】
一実施形態では、治療用ポリペプチドがインターフェロンアルファであり、別の実施形態ではインターフェロンベータであり、また別の実施形態ではインターフェロンガンマである。別の実施形態では、治療用ポリペプチドが、以下を含むがこれに限定されるものではない、インターフェロンアルファのサブタイプである。つまり、１、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１６、１７、または２１。別の実施形態では、治療用ポリペプチドが、インターフェロンオメガ、イプシロン、カッパ、またはその同族体である。別の実施形態では、治療用ポリペプチドが、インターフェロンラムダまたはその同族体である。別の実施形態では、治療用ポリペプチドが、以下を含むがこれに限定されるものではない、インターフェロンアルファのサブタイプである。つまり、インターロイキン（ＩＬ）２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、またはＩＬ２９。別の実施形態では、治療用ポリペプチドが、インターフェロンゼータ、ニュー、タウ、またはその同族体である。
【０１７５】
一実施形態では、ＩＦＮは特定の細胞表面受容体複合体に結合し、一実施形態ではそれが、ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２鎖を含むインターフェロンアルファ受容体（ＩＦＮＡＲ）であり、別の実施形態ではそれがインターフェロンガンマ受容体（ＩＦＮＧＲ）複合体であり、ＩＦＮＧＲ１およびＩＦＮＧＲ２サブユニットを含み、別の実施形態では、ＩＬ１０Ｒ２およびＩＦＮＬＲ１を含む受容体複合体である。一実施形態では、インターフェロンはＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を通って信号を送る。
【０１７６】
一実施形態では、本発明の製剤および方法のインターフェロンがインターフェロンアルファである。別の実施形態では、本発明の製剤および方法のインターフェロンがインターフェロンアルファ２ｂである。一実施形態では、ＩＦＮ−アルファ−２ｂが、ヒト白血球からのＩＮＦ−アルファ−２ｂのための遺伝子を含む組換え非グリコシル化１６５−アミノ酸アルファインターフェロンタンパク質である。ＩＦＮ−アルファ−２ｂは、１９，２７１ダルトン（１９．２７１ｋＤａ）の分子量を持つタイプＩ、水溶性インターフェロンである一実施形態では、ＩＦＮ−アルファ−２ｂは、ＨＰＬＣ分析で測定して約２．６ｘ１０８（２億６０００万）国際単位／ｍｇの比活性度を有する。
【０１７７】
一実施形態では、ＩＦＮ−アルファ−２ｂはタイプＩインターフェロンの１つであり、これは大型ヘリカルサイトカインスーパーファミリーに属し、成長ホルモン、インターロイキン、いくつかのコロニー刺激因子、およびその他いくつかの調節分子を含む。すべてが、ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２として公知である細胞表面受容体複合体と相互作用して、さまざまなシグナル伝達経路を活性化することで細胞活性のレギュレータとして機能する。インターフェロンは、細胞での抗ウイルスおよび抗増殖反応を引き起こす。
【０１７８】
一実施形態では、有毛細胞白血病、性病イボ、カポジ肉腫、慢性非Ａ型肝炎、非Ｂ型肝炎、Ｂ型肝炎、またはその組み合わせの予防または処置に、本発明の長期持続性ＩＦＮ−アルファ製剤を使用してもよい。別の実施形態では、上記疾患または病状の１つの影響を受けやすい、または本願明細書に記載のような感染性病原体にさらされた、またはさらされるであろう対象に本発明の長期持続性ＩＦＮ−アルファ製剤を投与してもよい。別の実施形態では、Ｃ型肝炎の予防または処置に本発明の長期持続性ＩＦＮ−アルファ製剤を使用してもよい。本態様に従って、そして一実施形態では、特にリバビリン、インターフェロン、ペグインターフェロン、またはその組み合わせを含む他のＣ型肝炎処置と同時または交互に、本発明の製剤を投与してもよい。
【０１７９】
別の実施形態では、長期持続性ＩＦＮ−アルファ製剤を、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、表在性膀胱癌、皮膚癌（特に基底細胞癌および悪性黒色腫を含む）、腎細胞癌、卵巣癌、低悪性度リンパ球および皮膚Ｔ細胞リンパ腫、および神経膠腫を含む他のさまざまな細胞増殖障害に、単独または化学療法薬との併用で、使用または評価してもよい。別の実施形態では、肺癌、結腸直腸癌、および乳癌から生じる固形腫瘍の予防または処置に、単独または他の化学療法薬との併用で、長期持続性ＩＦＮ−アルファ製剤を使用してもよい。別の実施形態では、多発性硬化症の予防または処置に長期持続性ＩＦＮ−アルファ製剤を使用してもよい。別の実施形態では、組織球性疾患の予防または処置に、長期持続性ＩＦＮ−アルファ製剤を使用してもよく、一実施形態ではその組織球性疾患がエルドハイムチェスター病（ＥＣＤ）であり、一実施形態では、体の結合組織を攻撃する死に至る可能性があり、一実施形態では組織球の過剰生産によって生じる障害であり、一実施形態では、疎性結合組織に集積し、それを厚く、高密度にする。別の実施形態では、重度眼性ベーチェット病の予防または処置に長期持続性ＩＦＮ−アルファ製剤を使用してもよい。
【０１８０】
一実施形態では、インターフェロンアルファ遺伝子は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号で記載のものに対応する核酸配列を有する。すなわち、Ｋ０１９００；Ｍ１１００３；またはＭ７１２４６。あるいは、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号で記載のものに対応するタンパク質配列をコードする。すなわち、ＡＡＡ５２７１６；ＡＡＡ５２７２４；またはＡＡＡ５２７１３。一実施形態では、インターフェロンベータ遺伝子は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号で記載のものに対応する核酸配列を有する。すなわち、Ｍ２５４６０；ＡＬ３９０８８２；またはＣＨ２３６９４８。あるいは、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号で記載のものに対応するタンパク質配列をコードする。すなわち、ＡＡＣ４１７０２；ＣＡＨ７０１６０；またはＥＡＬ２４２６５。一実施形態では、インターフェロンガンマ遺伝子は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号で記載のものに対応する核酸配列を有する。すなわち、Ｊ００２１９；ＡＦ５０６７４９；ＮＭ＿０００６１９；またはＸ６２４６８。あるいは、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号で記載のものに対応するタンパク質配列をコードする。すなわち、ＡＡＢ５９５３４；ＡＡＭ２８８８５；ＮＰ＿０００６１０；またはＣＡＡ４４３２５。別の実施形態ではインターフェロンアルファ遺伝子がＳＥＱ  ＩＤ番号：９で示されるような核酸配列を有し、さらに別の実施形態ではインターフェロンアルファ遺伝子がＳＥＱ  ＩＤ番号：１０で示されるようなアミノ酸配列を有する。別の実施形態ではインターフェロンアルファ遺伝子が配列番号：９で示されるようなものに相同である核酸配列を有し、さらに別の実施形態ではインターフェロンアルファ遺伝子が配列番号：１０で示されるようなものに相同であるアミノ酸配列を有する。
【０１８１】
別の実施形態では、本発明は、以下を含み、持続期間にわたり必要としている対象にインターフェロン−アルファを送達する方法を提供する。つまり、１つ以上の遺伝学的に改変された微小器官を提供することと、ここで前記微小器官は１つ以上の調節配列に機能可能に結合された核酸配列を有するベクターを含み；ならびに前記対象に前記遺伝学的に改変された微小器官を移植することと、ここで上記核酸配列はインターフェロン−アルファをコードし、それによってインターフェロン−アルファ濃度は基礎濃度よりも５％を上回って増加し、前記インターフェロン−アルファの増加が１ヶ月間を超えて継続する。
【０１８２】
一実施形態では、本発明の製剤および方法は、当該核酸によってコードされる治療用ポリペプチドの発現量、期間、またはその組み合わせを高めるように最適化された核酸を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号：１に対して８５％を上回る相同性を有する核酸配列、当該核酸配列を有するベクター、および当該ベクターを含む細胞を提供する。
【０１８３】
別の実施形態では、本発明は、配列番号：２に対して８５％を上回る相同性を有する核酸配列、当該核酸配列を有するベクター、および当該ベクターを含む細胞を提供する。
【０１８４】
本明細書中で使用されるように、用語「相同性（homology）」は、核酸配列に関連する場合に、対応する天然核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列におけるヌクレオチドの割合を示す。
【０１８５】
一実施形態では、「相同性（homology）」、「同族体（homologue）」、または「同族の（homologous）」は、どんな場合にでも、一実施形態では、言及される配列が示された配列と少なくとも７０％の一致を示すことを意味する。別の実施形態では、核酸配列が、示された配列と少なくとも７２％の一致を示す。別の実施形態では、核酸配列が、示された配列と少なくとも７５％の一致を示す。別の実施形態では、核酸配列が、示された配列と少なくとも７７％の一致を示す。別の実施形態では、核酸配列が、示された配列と少なくとも８０％の一致を示す。別の実施形態では、核酸配列が、示された配列と少なくとも８２％の一致を示す。別の実施形態では、核酸配列が、示された配列と少なくとも８５％の一致を示す。別の実施形態では、核酸配列が、示された配列と少なくとも８７％の一致を示す。別の実施形態では、核酸配列が、示された配列と少なくとも９０％の一致を示す。別の実施形態では、核酸配列が、示された配列と少なくとも９２％の一致を示す。別の実施形態では、核酸配列が、示された配列と少なくとも９５％以上の一致を示す。別の実施形態では、核酸配列が、示された配列と少なくとも９５％〜１００％の一致を示す。同様に、特定の配列との一致についての言及には、本願明細書で定義されるようなものとの直接的な一致のほか、相同性も含む。
【０１８６】
相同性は、配列アライメントに関するコンピュータアルゴリズムによって、当該技術分野で公知である方法によって決定してもよい。例えば、核酸配列相同性のコンピュータアルゴリズム分析には、例えばＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ強化アライメントユーティリティ）、ＧＥＮＰＥＰＴ、およびＴＲＥＭＢＬパッケージなどのいくつものソフトウェアパッケージの利用を含んでもよい。
【０１８７】
相同性を決定する他の方法としては、当該技術分野で公知である方法の核酸配列ハイブリダイゼーションの決定を通じたものである（例えば次の参考文献を参照：“Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1985); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Volumes 1-3) Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y）。一実施形態では、適度な条件から厳しい条件の下でハイブリダイゼーションの方法を行ってもよい。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、以下を含む溶液中、４２℃で一晩中インキュベーションを行うものである。つまり、１０〜２０％ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘ  デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬ変性剪断サケ精子ＤＮＡ。
【０１８８】
一実施形態では、本発明は、微小器官を含む治療用製剤とその使用方法を提供する。一実施形態では、治療用微小器官の調製は、（ａ）ドナー対象からの複数の微小器官外植片、一群の細胞を含む複数の微小器官外植片のそれぞれ、取得元の器官の微小構造を維持し、微小器官外植片の細胞への十分な栄養素とガスの拡散と、微小器官外植片中の栄養の不足と廃棄物の蓄積ための細胞毒性と付随の死とを最小限に抑えるための、微小器官外植片から出る細胞廃棄物の拡散とを可能にするために選択された寸法を同時に持つ複数の微小器官外植片のそれぞれを得ること；（ｂ）複数の遺伝学的に改変された微小器官外植片を得るために複数の微小器官外植片の遺伝子を組換えること、当該微小器官は少なくとも１つのアミノ酸で異なるタンパク質を含み、分泌する；（ｃ）複数の受容対象に多量の遺伝学的に改変された微小器官外植片を移植することを含む。
【０１８９】
微小器官の調製方法と遺伝学的に改変された微小器官に処理する方法は特許番号ＷＯ２００４／０９９３６３で開示されており、その全体が引用により援用される。微小器官は、三次元微小器官においてすべての細胞への栄養素とガスの拡散と、外植片からの細胞廃棄物の十分な拡散とを確実に行うように定義される組織寸法を含む。ウイルスまたは非ウイルスベクターを用いて、したがって遺伝学的に改変された微小器官を作成して微小器官の細胞内に目的遺伝子候補を組み込む制御生体外形質導入が起こるとすぐ、微小器官の生体外での維持を長期間継続でき、一実施形態では最小限の培地中で維持される。
【０１９０】
一実施形態では、微小器官は、本願明細書で後述されるようにドリルおよびコアリング針を用いて採取される。別の実施形態では、微小器官は、皮膚をピンと張った状態に保ち、コアリングドリルの挿入中にスリットを空けるために真空を利用する採取システムを用いて採取される。別の実施形態では、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ０４／０９９３６３記載のツールおよび方法を含むが、これに限定されるものではない、真皮層を採取するために使用できるツールを使用して、適切な大きさの微小器官を採取してもよい。
【０１９１】
遺伝学的に改変された微小器官またはバイオポンプを作成するための微小器官内への組換え拡散の組み込みを、当該技術分野で公知のさまざまな方法を通じて達成できる。核酸構造を利用して、微小器官細胞を安定的、一時的に形質導入できる。安定した形質導入では、核酸分子が微小器官細胞ゲノムに組み込まれる。そのため安定した遺伝形質を示す。一時的な形質導入では、核酸分子はエピソームとして形質導入した細胞内で維持され、細胞によって発現されるが、ゲノムには組み込まれない。前記エピソームは、エピソームの減少によって形質導入した細胞が細胞を迅速に分割する場合に一時的な発現に至る、あるいは形質導入した細胞が非分割細胞である場合に長期発現に至る可能性がある。
【０１９２】
典型的には、核酸配列は、本願明細書で上述されるように微小器官に配列を導入する推奨方法によって、特定ベクター内でサブクローンされる。希望する核酸セグメントが特定のベクターにサブクローンされると、それによって組換えベクターになる。
【０１９３】
一実施形態では、微小器官は遺伝学的改変の前後に３２℃でインキュベートされ、別の実施形態では３７℃でインキュベートされる。別の実施形態では、微小器官は３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３８℃、３９℃、４０℃、２８℃、３０℃、３１℃、２５℃、４２℃、または４５℃でインキュベートされる。
【０１９４】
一実施形態では、微小器官は遺伝学的改変の前後にＣＯ２１０％の雰囲気下でインキュベートされ、別の実施形態ではＣＯ２５％の雰囲気下でインキュベートされる。別の実施形態では、微小器官はＣＯ２１２％、ＣＯ２１５％、ＣＯ２１７％、またはＣＯ２２０％の雰囲気下でインキュベートされる。別の実施形態では、微小器官はＣＯ２２％、ＣＯ２６％、ＣＯ２７％、ＣＯ２８％、またはＣＯ２９％の雰囲気下でインキュベートされる。
【０１９５】
別の実施形態では、インキュベーション温度、ＣＯ２濃度、またはその組み合わせを、遺伝学的改変の前、間、および後で１種類の温度または濃度に維持してもよく、別の実施形態では、インキュベーション温度、ＣＯ２濃度、またはその組み合わせを、微小器官の遺伝学的改変の前、間、および後で調節してもよい。
【０１９６】
別の実施形態では、微小器官は湿度８５〜１００％でインキュベートされ、一実施形態では湿度９５％であり、別の実施形態では湿度９０％であり、また別の実施形態では湿度９８％である。
【０１９７】
一実施形態では、当該技術分野で公知の方法を用いて、治療用核酸またはポリペプチドの濃度を検出してもよい。特定の発現ベクター系と、細胞に核酸を導入する方法との有効性を、当該技術分野で日常的に使用される標準的な手法で評価できる。例えば、細胞に導入されたＤＮＡをフィルターハイブリダイゼーション法（サザンブロット法）によって検出でき、導入されたＤＮＡの転写によって生成されるＲＮＡを、例えばノーザンブロット法、リボヌクレアーゼプロテクション法、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出できる。遺伝子産物は、適切な分析法、例えば、特定抗体などによる生成されたタンパク質の免疫学的検出、または酵素的分析などの遺伝子産物の機能活性を検出する機能分析によって、検出できる。一実施形態では、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、またはラジオイムノアッセイを用いて、タンパク質を検出してもよい。細胞によって発現される対象遺伝子産物を簡単に分析できない場合、使用される調節エレメントおよびベクターに結合されたレポーター遺伝子を用いて、発現系を先ず最適化できる。レポーター遺伝子は、簡単に検出可能な遺伝子産物をコードしている。そのため、系の有効性を評価するために使用できる。当該技術分野で使用される標準レポーター遺伝子として、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、およびヒト成長ホルモンをコードする遺伝子が挙げられる。
【０１９８】
そのため、一実施形態では、治療用ポリペプチドまたは核酸発現量がインビトロで測定され、別の実施形態では治療用ポリペプチドまたは核酸発現量がインビボで測定される。一実施形態では、ポリペプチドまたは核酸発現量（一実施形態ではＥＰＯ濃度であり、別の実施形態ではＩＦＮ−アルファ濃度である）をインビトロで測定することで、インビトロでの微小器官による治療薬の分泌量の測定を通じた、患者に移植される微小器官の数を測定すること；治療薬のインビトロでの生成量と分泌量とインビボの血清中濃度の関係を推定すること；測定した分泌量と推定した関係に基づいて移植される治療用製剤の量を測定することを可能にする。
【０１９９】
本発明の好適な実施形態では、ポリヌクレオチドは、微小器官の細胞内で発現される内在性遺伝子、または微小器官に導入される追加組換え遺伝子を転写または翻訳を調節するトランス作用またはシス作用エンハンサーまたはサプレッサーエレメントを含むことができる。哺乳類細胞に利用できる好適な翻訳または転写調節エレメントの多数の例が、当該技術分野で公知である。
【０２００】
例えば、転写調節エレメントは、特定のプロモーターからの転写の活性化に必要なシス作用またはトランス作用エレメントを含む［（Carey et al., (1989), J. Mol. Biol. 209:423-432; Cress et al., (1991), Science 251:87-90; and Sadowski et al., (1988), Nature 335:5631-564）］。
【０２０１】
カリフラワーモザイクウイルス転写アクティベーター（ＴＡＶ）が転写アクティベーターを裏付ける［例えば、次の最高文献を参照： Futterer and Hohn, (1991), EMBO J. 10:3887-3896］。この系で、ビシストロニックｍＲＮＡが生成される。すなわち、同じプロモーターから同じｍＲＮＡに２つのコード化領域が転写される。ＴＡＶが存在しないと、リボソームによって最初のシストロンのみが翻訳されるが、ＴＡＶを発現する細胞では両方のシストロンが翻訳される。
【０２０２】
一般的に実践されている遺伝子ノックイン法を通じて、シス作用調節エレメントのポリヌクレオチド配列を、微小器官の細胞に導入できる。遺伝子ノックイン／アウト法の検討については、例えば次の参考文献も情報を提供する。米国特許第５，４８７，９９２号、第５，４６４，７６４号、第５，３８７，７４２号、第５，３６０，７３５号、第５，３４７，０７５号、第５，２９８，４２２号、第５，２８８，８４６号、第５，２２１，７７８号、第５，１７５，３８５号、第５，１７５，３８４号、第５，１７５，３８３、第４，７３６，８６６号、ならびに、Burke and Olson, Methods in Enzymology, 194:251-270, 1991; Capecchi, Science 244:1288-1292, 1989; Davies et al., Nucleic Acids Research, 20 (11) 2693-2698, 1992; Dickinson et al., Human Molecular Genetics, 2(8):1299-1302, 1993; Duff and Lincoln, “Insertion of a pathogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the human APP gene and expression in ES cells”, Research Advances in Alzheimer´s Disease and Related Disorders, 1995; Huxley et al., Genomics, 9:742-750 1991; Jakobovits et al., Nature, 362:255-261 1993; Lamb et al., Nature Genetics, 5: 22-29, 1993; Pearson and Choi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:10578-82; Rothstein, Methods in Enzymology, 194:281-301, 1991; Schedl et al., Nature, 362: 258-261, 1993; Strauss et al., Science, 259:1904-1907, 1993, ＷＯ９４／２３０４９、ＷＯ９３／１４２００、ＷＯ９４／０６９０８、およびＷＯ９４／２８１２３。
【０２０３】
組換え産物の生成だけを評価するためには、内在性配列のダウンレギュレーションも必要な場合がある。このような目的で、内在性配列不活性化の方法としてアンチセンスＲＮＡを利用してもよい。内在性ｍＲＮＡ配列に補完的な配列をコードする外来性ポリヌクレオチドは、微小器官の細胞内で転写される。当該技術分野で公知の実践方法で遺伝子ノックアウト技術を通じて、ダウンレギュレーションに影響を与えることもできる（“Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988)）
【０２０４】
組換え産物の過剰発現も必要な場合がある。過剰発現は、それぞれのベクターで１つ以上のコード配列の大量コピーを行うことで実現してもよい。これらの外来性ポリヌクレオチド配列を、発現を調節する哺乳類発現ベクターの適切なプロモーターの転写制御下に置くことができる。別の実施形態では、同じ遺伝子または複数の関連遺伝子の複数コピーを、ポリヌクレオチドまたは核酸発現を増やす手段として使用してもよい。一実施形態では、一実施形態でマトリックス付着領域（ＭＡＲ）またはスキャツフォールド付着領域（ＳＡＲ）であるＤＮＡエレメントによって発現が安定化される。
【０２０５】
一実施形態では、アデノウイルスベクターが、本発明の組成物のベクター、および本発明の方法で用いるベクターである。アデノウイルスベクターがベクターとして使用される実施形態では、一実施形態で、ヘルパー依存性アデノウイルス系を使用して、微小器官を形質転換するための治療用ポリペプチドまたは核酸発現ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを調製してもよい。一実施形態では、前記ヘルパー依存性アデノウイルス系は、PalmerとNg、2003 Mol Ther 8:846と、PalmerとNg、2004 Mol Ther 10:792とで述べられている通りであり、その全体が引用により援用される、本発明の製剤の調製に使用されるヘルパー依存性アデノウイルス、ヘルパーウイルス、および産生細胞株を含む。
【０２０６】
一実施形態では、Ａｄ５  ＤＮＡフラグメントによりヒト胎児腎臓細胞から形質導入され、Ｅ１タンパク質を構造的に発現する２９３と称されるヘルパー細胞株を使用して、複製欠損アデノウイルスベクターを作成し、増殖させる。別の実施形態では、ヘルパー細胞株が、ヒト筋細胞、造血細胞、または他のヒト胎児間葉または上皮細胞に由来してもよい。あるいは、ヘルパー細胞が、ヒトアデノウイルスに対して許容状態である他の哺乳類種の細胞に由来してもよい。前記細胞としては、例えばベロ細胞または他のサル胎児間葉または上皮細胞が挙げられる。
【０２０７】
一実施形態では、微小器官は、数時間から数ヶ月に及ぶことがある一定期間、体外で維持される。一実施形態では、体外での維持は、ウイルスベクターを用いて体外での遺伝子操作後の微小器官の維持、すなわちＧＭＭＯの維持のことに言及している。別の実施形態では、体外での維持は、その遺伝子操作の前の微小器官の維持のことに言及している。
【０２０８】
一実施形態では、遺伝学的に改変された微小器官が移植前の数日間維持され、別の実施形態では数週間維持される。一実施形態では、微小器官が移植前の９〜１４日間維持される。一実施形態では、微小器官が移植前の２〜４週間維持される。一実施形態では、微小器官が移植前の３週間維持される。一実施形態では、微小器官が移植前の４週間以上維持される。さらに他の実施形態では、微小器官が少なくとも９日間維持される。
【０２０９】
理論によって制限されることなく、一実施形態では、前記インキュベーションによって、細胞を処理して、ウイルスベクター形質導入の結果として現れる、一実施形態ではウイルスカプシドであるウイルスタンパク質を破壊できる。一実施形態では、前記カプシドタンパク質の代謝回転が２〜３日以内に生じる。そのため、一実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質は１０日目まで体外でほとんど残らない。一実施形態では、ウイルスカプシドが破壊されることで、本発明の製剤の免疫原性をさらに下げ、対象遺伝子の発現量および発現期間を上げる。別の実施形態では、前記インキュベーションによって、インビトロで初期ＨＤ−Ａｄベクター誘導先天性免疫応答が生じることが可能である。一実施形態では、アデノ遺伝子転写がない状態では２４時間を超えて継続しない。別の実施形態では、一実施形態ではリンパ球浸潤、別の実施形態ではＡｄ特異ＣＴＬの導入を主に特徴とする、通常、転写能力のある第一世代Ａｄベクターに続く後期適応反応は、ＨＤ−Ａｄベクターでは誘発されない。
【０２１０】
一実施形態では、感染粒子（ｉｐ）１．６〜３ｘ１０９／ｍＬ、３〜４ｘ１０１２ウイルス粒子／ｍＬ、または２ｘ１０１１ウイルス粒子／ｍＬの用量で体外微小器官がウイルスベクターにさらされる。別の実施形態では、１ｘ１０３〜１ｘ１０１２ウイルス粒子／ｍＬ、別の実施形態では１ｘ１０３〜１ｘ１０９ウイルス粒子／ｍＬ、別の実施形態では１ｘ１０６〜１ｘ１０９ウイルス粒子、別の実施形態では１ｘ１０６〜１ｘ１０１２ウイルス粒子／ｍＬの用量で、体外微小器官がウイルスベクターにさらされる。一実施形態では、微小器管内の対象に投与されるウイルス粒子／対象の体重１ｇの投与量は１ｘ１０３未満であり、別の実施形態では１ｘ１０２未満ウイルス粒子／対象の体重１ｇであり、また別の実施形態では１ｘ１０１未満ウイルス粒子／対象の体重１ｇである。
【０２１１】
一実施形態では、成長因子を使用して、微小器官の細胞の数を増やす。一実施形態では、移植前にインビトロ発現を評価でき、発現した組換えタンパク質のインビトロ−インビボ相関研究の可能性を有効にする。
【０２１２】
本発明の一部の実施形態では、移植される遺伝子組換え細胞を含む組織試料の量は、以下のうちの１つ以上から測定される。すなわち、規制指針、特定臨床プロトコル、または類似対象の人口統計に基づき前記対象に日常的に投与される対象治療薬の対応量；注入または他の経路を通じて以前に摂取した場合には同じ対象に対して特異的な対象タンパク質などの治療薬の対応量；体重、年齢、健康状態、臨床状態、他の同様の対象への遺伝子組換え細胞の投与を含む前の組織細胞からの薬物動態データ、その対象への遺伝子組換え細胞の投与を含む前の組織試料に対する反応、またはその組み合わせなどの対象データ。そのため、一実施形態では、１つ以上の微小器官による遺伝子産物の発現量がインビトロで測定され、インビトロとインビボの治療用ポリペプチドまたは核酸発現量の関係が測定、推定され、計算または推定した関係に基づいて特定の患者に移植される微小器官の数が測定される。前述のように治療薬の用量を調節してもよい（ＷＯ２００４／０９９３６３）。
【０２１３】
一実施形態では、微小器官または遺伝学的に改変された微小器官を、宿主への移植が必要になるまでの指定期間、インビトロで維持してもよい。一実施形態では、微小器官または遺伝学的に改変された微小器官を、１〜７日間、１〜８週間、または１〜４ヶ月間、培地で維持または保存してもよい。別の実施形態では、組織試料を取り囲む培地上澄みに残った治療薬を分離し、同じまたは異なる対象に注入または塗布できる。
【０２１４】
あるいは、またはさらに、遺伝学的に改変された微小器官を当該技術分野で公知の方法で冷凍保存（０℃、−２０℃、−８０℃、−１９６℃）できる。例えば、限定されるものではないが、組織試料からの作成直後または遺伝子変化直後に、ＤＭＥＭ含有１０％ＤＭＳＯ中で徐々に凍らせる。
【０２１５】
本発明の製剤の投与は、必要とする対象への移植によってもよい。一実施形態では、本発明の製剤を、希望部位での微小器官の局在化をもたらす方法または経路で治療または予防する疾患または障害の影響を受けている器官または系に移植してもよい。別の実施形態では、移植した製剤の位置は、疾患または障害の影響を受けている器官または系から遠位であってもよい。そのため、一実施形態では組換えタンパク質が局所的に解放され、別の実施形態では組換えタンパク質がリンパ系に拡散し、一実施形態では、組換えタンパク質が最終的に全身に分布することもある。そのため、本発明は、必要としている対象の一部に現れる疾患または障害を処置するためのさまざまな濃度での治療用製剤の使用法を提供する。
【０２１６】
本態様にしたがって、そして一実施形態では、本発明の製剤を腫瘍内に移植してもよい。別の実施形態では、腫瘍から遠位の部位に製剤を移植してもよく、一実施形態では特定の種類の腫瘍の転移と関連がある。別の実施形態では、本発明の製剤を対象の腎臓に移植してもよく、一実施形態では被膜下移植である。別の実施形態では、本発明の製剤は腹腔鏡下で移植される。
【０２１７】
一実施形態では、本発明の製剤を、一時的な病状の急性処置のために１回移植してもよく、あるいは特に疾病が進行、再発、または悪化する場合に、２回以上移植してもよい。一実施形態では、本発明の製剤を１つ以上同時に投与してもよく、あるいは別の実施形態では交互に投与してもよい。一実施形態では、交互の方法を疾患の段階または期によって決定してもよい。
【０２１８】
一実施形態では、微小器官が、微小器官の細胞の少なくとも一部が生き残る方法で対象の希望する場所に移植される。本発明の一実施形態では、細胞の少なくとも約５％、本発明の別の実施形態では少なくとも約１０％、本発明の別の実施形態では少なくとも約２０％、本発明の別の実施形態では少なくとも約３０％、本発明の別の実施形態では少なくとも約４０％、本発明の別の実施形態では少なくとも約５０％以上が、対象への投与後に生き残る。対象への投与後の細胞の生存期間が、数時間、例えば２４時間〜数日ほどの短時間、数週間から数ヶ月または数年ほどの長期間になる可能性がある。
【０２１９】
受容対象に微小器官を移植することで、組換え産物の継続的な投与量を提供する。例えば移植した組織内での血管の形成を促進する宿主内での効率的な組み込みのために、移植前に微小器官を調製してもよい。そのため、製造後、すぐに組換え産物を抹消受容者循環に送ってもよい。あるいは、細胞付着を防止し、宿主内に効果的に組み込まれるように、移植前に微小器官を調製してもよい。血管形成を防止する方法の例としては、絹またはナイロン、あるいは例えばＧＯＲＥ−ＴＥＸバッグ（Terrill P J, Kedwards S M, and Lawrence J C. (1991) The use of GORE-TEX bags for hand bums. Burns 17(2): 161-5）などの他の材質、あるいは例えばテフロン（登録商標）などの細胞付着を防止する材質でコートされた他の多孔質膜の市販細胞非透過性直径制限生物学的メッシュバッグ内への微小器官の包装が上げられる。
【０２２０】
微小器官によって生成される遺伝子産物をその後、例えば、タンパク質性生物医薬品などの薬物などの化合物の制御された送達を行うための高分子デバイスを通じて送達できる。生分解性と非生物分解性の両方のポリマーを含むさまざまな生体適合性ポリマー（ヒドロゲルを含む）を使用し、特定の目的部位で本発明に即して微小器官の遺伝子産物の持続放出のための移植片を形成できる。前記移植片の作成は、一般的に当該技術分野で公知である（例えば、次の参考文献を参照： Concise Encyclopedia of Medical & Dental Materials, ed. By David Williams (MIT Press: Cambridge, Mass., 1990); Sabel et al. U.S. Pat. No. 4,883,666; Aebischer et al. U.S. Pat. No. 4,892,538; Aebischer et al. U.S. Pat. No. 5,106,627; Lim U.S. Pat. No. 4,391,909; and Sefton U.S. Pat. No. 4,353,888）。一実施形態では、ＧＭＭＯはカプセル化される。別の実施形態では、ＧＭＭＯはカプセル化されない。
【０２２１】
本発明にしたがった遺伝学的に改変された微小器官の移植は、標準的な外科的法を通じて、または微小器官の投与に適したゲージの針を採用する特別に適応されたシリンジを利用する哺乳類の目的とする組織部位への微小器官調合液の注入を通じて、達成できる。別の実施形態では、移植される微小器官のためにカテーテルが採用される。一実施形態では、ＰＣＴ国際特許出願番号ＷＯ２０４／０９９３６３に記載の移植方法のいずれかを使用してもよく、本発明の実施形態と考えられる。
【０２２２】
一実施形態では、微小器官は、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、または胃内に移植される。一実施形態では、用語「移植される（implanted）」とは、分層または全層皮膚移植として移植されることを除く。移植片拒絶および／または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を避けるために移植前または移植中に取られる措置を提供する微小器官の調製に同種異系および異種組織も利用できるが、本発明の一実施形態では、移植に利用されるドナー微小器官を、好適には受容動物の器官組織（すなわち自己移植）、または同系動物から調製される。本明細書中で使用されるように、ＧＶＨＤとは、受容宿主に対する移植免疫反応によって生じる組織移植（移植片）の結果である移植片対宿主病のこと言う。さらに具体的には、移植片対宿主病は、受容者を異物と認識して、受容者の細胞を攻撃するドナーＴ−リンパ球（Ｔ細胞）によって引き起こされる。移植片の拒絶反応またはＧＶＨＤを防止または緩和する多数の方法は当該技術分野で公知であり、本発明の方法で使用してもよい。一実施形態では、豚−ヒト移植などの異種移植が用いられる場合など、宿主による免疫的攻撃を受ける組織内での細胞群の移植を促進するため、微小器官を挿入するか、または再補充可能、非生分解性、または生分解性デバイスなどの免疫保護材質でカプセル化し、その後、受容対象に移植してもよい。
【０２２３】
別の実施形態では、移植に利用されるドナー微小器官は、好適には受容者とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致しているドナーから調製され、一実施形態では、ＨＬＡがヒトでの主要組織適合複合体である。一実施形態では、ドナーと受容者が、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子、クラスＩＩ  ＭＨＣ遺伝子、またはその組み合わせで一致する。一実施形態では、クラスＩ  ＭＨＣ遺伝子はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃを含み、一実施形態ではクラスＩ  ＭＨＣ遺伝子が不一致だと移植片注入のリスクを高める。また、一実施形態では、クラスＩＩ  ＭＨＣ遺伝子はＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１を含み、一実施形態ではクラスＩＩ遺伝子が不一致だとＧＶＨＤのリスクを高める。別の実施形態では、ドナーと受容者が、ＨＬＤ−ＤＭとＨＬＡ−ＤＯ遺伝子で一致する。
【０２２４】
一実施形態では、一実施形態では加熱、抗ウイルス薬、細胞によるウイルス代謝回転を促進する薬剤などの使用である物理的方法などの当該技術分野で公知の方法を通じて、体外での細胞からのウイルス代謝回転または排出が高められる。
【０２２５】
一実施形態では、本発明の長期持続性製剤が核酸またはペプチド発現の濃度および期間を高め、核酸またはポリペプチドの濃度は無期限に上昇したままではない。
【０２２６】
細胞の一時的形質導入、または迅速に代謝回転する細胞を必要とする他の方法とは対照的に、本発明の長期持続性ＥＰＯ製剤は、これ以上複製しない細胞を含む。そのため、ＥＰＯ製剤は安定した構造物から安定したタンパク質を生成し、既に特徴付けられたタンパク質を生成し続けることが期待される。
【実施例】
【０２２７】
実験材料および方法
【０２２８】
材料および機器リスト
【０２２９】
産生培地を使用して微小器官を増殖させた。当該培地は、１％グルタミンを含み、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（RAFA labs，注射用）および０．１％アンフォテリシンＢ（BMS,Fungizone I.V.）（培地中最終濃度２．５μｇ／ｍＬのアンフォテリシンＢ）が添加されたＤＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ培地（高グルコース４，５００ｍｇ／Ｌおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；Hi-Clone Cat# SH3A1448.02）を含む。一部の実験では、１０％血清代替物添加物（SSS,Irvine Scientific,Cat # 99193）、１０％自己移植ヒト血清、または１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳまたはＦＣＳ）を産生培地に添加した。
【０２３０】
真皮微小器官の採取-同心針法
【０２３１】
ヒト真皮微小器官を、ドナーの下腹部の領域の皮膚部分から採取した。上皮の採取を防止するため、微小器官を採取する皮膚領域の片側で皮膚角質層を通って真皮に入る浅い切り込み（深さ１〜２ｍｍ）を直線に沿って切開し、最初の切り込みから３０ｍｍ離れて平行な同様の切り込みを切開した。切り込みの距離で微小器官の長さを決定し、実験中は一貫してその距離とした。
【０２３２】
無菌食塩水を充填した１ｍＬ注射器に取り付けられた小ゲージ（通常、２２ＧＡ）の皮下注射針を、最初の切り込みにある剥き出しにされた真皮に挿入し、反対側の切り込みで真皮から出るように必要に応じて針に角度を付けた状態で、反対側の切り込みに向けて採取部位の真皮に沿って移動させた。
【０２３３】
次に、ガイド針の長さに沿った外皮を、外科クランプで挟んだ。真皮に埋め込まれた針をわずかに持ち上げ、その周囲の皮膚部分を引き上げ、挿入した皮下注射針の先端の下のフック形デバイスを使用して、挟む前に皮膚の持ち上げを支援する。出口の部分から突き出るガイド針の先端を、市販のドリル（Aesculap Micro Speed GD 650,GD 657など）で支えられるコアリング針（直径１〜３ｍｍ、Point Technologies,CO USA）の鋭利な先端に挿入する。少量の無菌食塩水を注射器からコアリング針に注入する。ドリルを作動させ、高速（通常、３０００〜７０００ＲＰＭ）でコアリング針を回転させ、回転中、ドリルとコアリング針をガイド入りの軸に沿って手動で前に進め、コアリング針の内径とおおよそ同じ外径を持つ長さ３０〜４０ｍｍの円筒状真皮コア（真皮微小器官）を切開する。通常、真皮微小器官はガイド針に取り付けられたままで、コアリング針内から引き抜き、産生培地（本願明細書で上述のように）に置き、コアリング針を皮膚から取り外す。
【０２３４】
ピンセットを用いて、１０００μＬの産生培地を含む２４ウェルプレートのラベルの付いた１つのウェルに各微小器官を移す。破片を取り除くため、各微小器官に対して１０００μＬの追加培地交換を２回行う。その後、２４時間、３２℃、１０％ＣＯ２、湿度９５％以下に平衡化されたインキュベーターへ１０００μＬの産生培地に微小器官を含むプレートを移す。
【０２３５】
ウイルス形質導入
【０２３６】
ウイルスを保存するため、必要とする総液量が少ない小さなウェルを持つ４８ウェルプレートのウェルに、形質導入のために各微小器官を移した。内部の微小器官をかき乱さずに、各ウェルから培地を注意深く取り除いた。前臨床実験中、以下の３種類の異なるベクターを試験した。すなわち、１．６〜３ｘ１０９感染粒子（ｉｐ）／ｍＬの第一世代アデノウイルス（Molecular Medicine）、約３〜４ｘ１０１２ウイルス粒子／ｍＬのヘルパー依存性アデノウイルス（Baylor）、または約２ｘ１０１１ウイルス粒子／ｍＬのアデノ関連ウイルス（ペンシルベニア大学）、組換えヒトＥＰＯ遺伝子、最適化組換えヒトＥＰＯ遺伝子、または最適化ＩＦＮ−アルファ遺伝子を含むそれぞれを、ＦＣＳを含むか含まないＤＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ（Gibco Cat#42430-025）で１：１０、１：２５、１：５０、１：１００、１：５００、または１：１０００にそれぞれ希釈した。４８ウェルプレートの各ウェルを、ウイルスの希釈液の１つ１００μＬで満たした。ＣＯ２インキュベーターの中にプレートを置き、２時間、３００ｒｐｍのデジタルマイクロタイターシェーカーで撹拌し、さらに振とうせずに１６〜２２時間インキュベーションを行って形質導入を促進させた。
【０２３７】
形質導入後、形質導入した微小器官を２４ウェルプレートに移し、その後、産生培地（ＦＣＳなし）１ｍＬで３回洗浄し、形質導入されなかったウイルス粒子を取り除いた。洗浄後、標準高湿度ＣＯ２インキュベーターの中の１ｍＬの産生培地に、湿度９５％、１０％ＣＯ２、３２℃でバイオポンプを維持した。ウイルスベクターの除去７２時間後、産生培地を新鮮な培地と置き換え、分泌組換えタンパク質濃度に関して使用済み培地の一定分量を分析した。
【０２３８】
体外（ex vivo）微小器官維持
【０２３９】
３〜４日ごとに、使用済み産生培地を回収し、分泌組換えタンパク質の濃度とグルコース濃度を、バイオポンプの生存能力とともに評価した。２４ウェルプレートに新鮮な産生培地を添加した。
【０２４０】
分泌タンパク質測定
【０２４１】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（Quantikineヒトエリスロポエチン；R&D Systems；ヒトインターフェロンアルファＥＬＩＳＡキット、PBL Biomedical Laboratories）を用い、メーカーの指示に従って、ヒトＥＰＯ（ｈＥＰＯ）およびＩＦＮα濃度および分泌量を分析した。
【０２４２】
グルコース測定
【０２４３】
Sigma-Aldrich Corporation GAGO20グルコース（ＧＯ）分析キットを用い、メーカーの指示に従って、組織グルコース消費を評価した。
【０２４４】
ヘマトクリット測定
【０２４５】
当該技術分野で公知のように、National Committee for Clinical Laboratory Standards（ＮＣＣＬＳ）で推奨される参照方法を用いた遠心分離を用いて、ヘマトクリット濃度を分析した。ヘマトクリットを測定するため、試験管に入れた全血を５分間、１０〜１５，０００×ｇで遠心分離し、赤色細胞（充填赤血球と呼ばれる）をペレット状にし、毛細管中の試料の全長に対する充填赤血球の柱の比率を、１０分以内の遠心分離で、グラフィックリーディングデバイスを用いて測定した。
【０２４６】
ヘモグロビン測定
【０２４７】
Ｈｂ、ヘマトクリット、白血球、赤血球、ＭＣＶ、ＭＣＨ、網状赤血球、および血小板の数を測定する全般的な血液評価の一部としてＨｂ濃度を測定した。例えば、自動化されたSeimens  ＡＤＶＩＡプラットフォームを使用して完全な血球数を測定してもよい。２種類の方法、標準シアンメトヘモグロビン比色法とフローサイトメトリーでＨｂを評価した。
【０２４８】
微小器官移植−ＳＣＩＤ
【０２４９】
一部の実験では、微小器官が生存できるかを解明するために組織グルコース消費を評価した後、遺伝子組換えまたは対照微小器官を、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに皮下移植した。体重約２５グラムのオスとメスのＳＣＩＤマウスに、希釈ケタセット（ケタミンＨＣｌ）（４００μＬケタセットと６００μＬ食塩水）で麻酔をかけ、対照またはＥＰＯ−発現微小器官を、微小器官形質導入１０日後に皮下移植した。
【０２５０】
微小器官移植−ヒト
【０２５１】
臨床試験中、インフォームドコンセントの署名、臨床検査、病歴、健康診断、ＥＣＧ、および併用薬付属資料を含む患者スクリーニング期間の後に、遺伝子組換えまたは対照微小器官を患者に皮下または皮内移植した。ヒト臨床試験に関して本願明細書で示される結果では、第「０」日目は移植の日である。さらに、微小器官が生存可能かを解明するために、組織グルコース消費に関してＧＭＭＯおよび対照微小器官を分析した。対照またはＥＰＯ−発現微小器官を皮下または皮内移植した。
【０２５２】
実施例１  ＧＭＭＯによってインビトロで生成されるＥＰＯおよびＩＦＮα濃度
【０２５３】
上記のように微小器官を調製し、上記のようにＣＡＧプロモーターに結合された最適化ＩＦＮα遺伝子を発現するヘルパー依存性アデノウイルスベクターで形質導入した。その後、培地でＧＭＭＯを維持し、生成したＩＦＮαの濃度をＥＬＩＳＡで評価した。最適化されたＩＦＮα−発現微小器官は採取後の少なくとも４０日間、１０００ｎｇ／日を上回るＩＦＮαをインビトロで生成し（図１）、組換えｈＥＰＯ−発現微小器官は採取後の少なくとも１４２日間、１０００ｎｇ／日以上のｈＥＰＯをインビトロで生成した（図２Ａ−Ｂ）。
【０２５４】
最適化されたｈＥＰＯをコードする弱毒性アデノウイルスベクターを含むＧＭＭＯは、ｈＥＰＯをコードするアデノウイルス−５ベクターを含む微小器官と比較して、２００日間を超えて、高い割合のピーク発現を維持した（図３）。最適化されたｈＥＰＯをコードする弱毒性アデノウイルスベクターを含む微小器官も、最適化されていないｈＥＰＯをコードする弱毒性アデノウイルスベクターを含む微小器官よりも長い期間、高い割合のピーク発現を維持した（図４）。最終的に、ＣＡＧプロモーターのｈＥＰＯ下流をコードする弱毒性アデノウイルスベクターを含む微小器官は、ＣＭＶプロモーターのｈＥＰＯ下流をコードする弱毒性アデノウイルスベクターを含む微小器官と比較して、形質導入後の日数の関数としてより顕著に高まる高いｈＥＰＯ発現量を示した（図５）。
【０２５５】
実施例２  インビトロおよび移植ＳＣＩＤマウス血清中で維持されたヒトＥＰＯ発現ＧＭＭＯにより産生されるＥＰＯ濃度
【０２５６】
ＥＰＯ−発現微小器官を上記のように調製した。培地での計９日間の後、微小器官あたりで生成されるＥＰＯの量を測定し、この値を使用して、同等量のＥＰＯを発現する微小器官で各マウスに移植することを決定した。第１０日目に、２つの微小器官を各ＳＣＩＤマウスに皮下移植し、第１０日目の後に行われる最初の測定では、ＳＣＩＤマウスの血清中で測定されるｈＥＰＯの量は基礎量よりも有意に高かった。量は移植後少なくとも２１６日の時点で高いままであり、少なくとも１５７日間、ＳＣＩＤマウスでヘマトクリット値を有意に高めた（図６Ａ）。移植したＥＰＯ−発現微小器官と同時に同じドナーから生成された移植していないＥＰＯ−発現微小器官は、インビトロで高いＥＰＯ生成量を継続的に維持した（図６Ｂ）。インビボ（図６Ａ）とインビトロ（図６Ｂ）の両方で、最適化されたｈＥＰＯ遺伝子を含むベクターで形質導入された微小器官は、組換えｈＥＰＯで形質導入されたものよりも高濃度のＥＰＯを生成した。非ＥＰＯ−生成微小器官が移植された対照ＳＣＩＤマウスは、移植前と比較して微小器官移植後、血清ＥＰＯ濃度の増加を示さず、ヘマトクリット値の有意な変化を示さなかった（図６Ａ）。陽性対照として使用されるＥＰＯ−発現アデノウイルス−５を含む微小器官は、ＥＰＯ−発現最適化または非最適化弱毒性アデノウイルスを含む微小器官に対する１：１００の力価と比較して、１：１０の力価で使用した。
【０２５７】
実施例３  ヒトＥＰＯ−発現ＧＭＭＯの移植によって生成されるヘモグロビン（Ｈｂ）濃度増加−ヒト臨床試験
【０２５８】
臨床試験概要
【０２５９】
下記臨床試験では貧血、透析前慢性腎疾患（ＣＫＤ病期３〜４）患者に協力を求めた。ＣＫＤ病期は、［血清クレアチニンから糸球体濾過量（ＧＦＲ）を推定するための腎疾患における食事の見直し（ＭＤＲＤ）研究方程式］ＭＤＲＤ−ＧＦＲに基づく。基準としてトランスフェリン飽和率％（ＴＳＡＴ％）とフェリチン（ｎｇ／ｍＬ）の測定値を用いて、参加患者は鉄欠乏性ではなかった。患者は、ＥＰＯ−依存状態に対して未経験であるか、あるいはＥＰＯ−依存性の場合、赤血球生成促進薬（ＥＳＡ）の使用を少なくとも４週間にわたり停止する。本明細書中で使用されるように、用語「患者（patient）」は、「対象（subject）」と呼ばれることもある。
【０２６０】
Ｈｂ基礎値の測定のために、未経験参加者の事前の３０日の値から基礎Ｈｂの平均値を測定するか、基礎値を、最後のＥＳＡ注入後１００日の推定最低値から、そして可能な場合には過去のＨｂ値と比較して、決定した。図１１Ａおよび１１Ｂは、移植前のＨｂ値と推定最低値を示す。移植後のＨｂ値も示される。第−３０日目、第−９日目、および移植の日（第０日目）の基礎測定値、すなわち、赤血球数、Ｈｂ、Ｈｃｔ（％）、絶対網状赤血球数、血清中ＥＰＯ濃度（ｍＵ／ｍＬ）、鉄状態を収集した。
【０２６１】
有効性の評価は、ＥＰＯ濃度、Ｈｂ、およびヘマトクリットを測定し、網状赤血球を、最初の２週間は週に３回計数し、その後、第６週まで週に２回計数し、さらにその後は毎週１回計数した。評価基準には、Ｈｂ応答および効果持続期間を含んだ。
【０２６２】
図１５は、上記試験の参加者の人口統計データを示す。
【０２６３】
臨床試験の安全性結果は、臨床の場での遺伝学的に改変された微小器官の使用の利点を支援する。特に、安全性結果は以下の内容を示した。すなわち、（ａ）処置を受けた患者に有害事象がない；（ｂ）治療が簡潔で、良好な忍容性を示した；（ｃ）抗ＥＰＯ抗体形成の証拠がない（処置の前、間、および後に血液試料を試験し、処置の結果としてのＥＰＯ抗体の増加は観察されなかった）；および（ｄ）今まで血清ＥＰＯ濃度は６０ｍＵ／ｍＬを超えなかった。
【０２６４】
臨床試験−単回投与
【０２６５】
第Ｉ相臨床試験をイスラエルで行い、慢性腎疾患（ＣＫＤ）を患い、ＩＩＩ期およびＩＶ期の透析前貧血患者に、本発明の持続型（長期持続性治療用製剤）の自己移植ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを移植した。ＧＭＭＯ−ｈＥＰＯによる単回移植処置によって、３〜１６ヶ月を上回る効果的なＥＰＯ治療を行った。第Ｉ／ＩＩ相ＧＭＭＯ  ｈＥＰＯ臨床試験の承認は、イスラエルの保健省によって承認され、Hadassah MedicalCenterとSourasky Tel Aviv Medical Centerで実施された。後の米国での臨床試験を容易にするため、ＦＤＡの規制基準および臨床規格に従って臨床試験を実施した。
【０２６６】
患者を、１８〜２５ＩＵ／ｋｇ／日（低用量）または３５〜４５ＩＵ／ｋｇ／日（中容量）または５５〜６５ＩＵ／ｋｇ／日（高用量）で処置した。図７は、投与されたＥＰＯ用量（ＩＵ／ｋｇ／日）に対する基礎値を上回る血清ＥＰＯ上昇の正味のピークの相関関係を示す。
【０２６７】
結果からは、１８〜２５ＩＵ／ｋｇ／日の低用量投与、３５〜４５ＩＵ／ｋｇ／日の中用量投与、５５〜６５ＩＵ／ｋｇ／日の高用量投与を用いた患者の大部分でＨｂ濃度（Ｈｂ）が１０〜１２ｇ／ｄＬの範囲（治療濃度域）で維持されることが示された。図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃは、治療濃度域内の持続的Ｈｂ応答が１〜２４ヶ月間継続したことを示す。この持続的Ｈｂ応答結果は、ＥＰＯの注入と無関係である。
【０２６８】
試験には年齢２１〜８２歳の男性および女性の患者を含めた。
【０２６９】
患者１はＥＰＯ未経験患者だった。患者１に対するＥＰＯ臨床試験の臨床的統計および詳細には以下の内容を含む。すなわち、８２歳男性；４期ＣＫＤ患者；ＧＦＲ  ２１ｍＬ／ｍｉｎ、適切な鉄貯蔵（トランスフェリン飽和率３３％、フェリチン３４０ｎｇ／ｍＬ）；および低用量ＥＰＯ（１８〜２５ＩＵ／ｋｇ／日）を投与−ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを２回投与。
【０２７０】
処置に関するコメントとしては、以下のものが挙げられる。すなわち、有害事象なし；良好なＨｂ応答；試験プロトコルに則った頻繁な血液サンプリングと追跡調査来院に疲れるが満足した−４．５ヶ月後に早期終了を要請した。
【０２７１】
図９は、１３１日間の患者１での持続的Ｈｂ応答を示す。
【０２７２】
患者２はＥＰＯ依存性患者だった。患者２に対するＥＰＯ臨床試験の臨床的統計および詳細には以下の内容を含む。すなわち、７１歳男性；３期ＣＫＤ患者；１８ヶ月間ＥＰＯ依存性、１０日ごとに６０００ＩＵを投与、ＥＰＯ処置の少なくとも４０日前に最終投与；ＧＦＲ  ５７ｍＬ／ｍｉｎ、適切な鉄貯蔵（トランスフェリン飽和率２６％、フェリチン１０５ｎｇ／ｍＬ）；および低用量ＥＰＯ（１８〜２５ＩＵ／ｋｇ／日）を投与−ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを２回投与。
【０２７３】
処置に関するコメントとしては、以下のものが挙げられる。すなわち、有害事象なし；治療に満足した；良好なＨｂ応答；１２ヶ月の追跡調査にわたって良好に完了。患者は身体機能が活発で、現在の処置の後、さらに高い用量への再登録を依頼した。
【０２７４】
図１０Ａは、２年間、患者２で治療濃度域内に維持された継続的Ｈｂ応答を示す。図１０Ｂおよび１０Ｃはそれぞれ、患者２の２００日間以上にわたる網状赤血球数およびＥＰＯ濃度を示す。
【０２７５】
患者３はＥＰＯ依存性患者だった。患者３に対するＥＰＯ臨床試験の臨床的統計および詳細には以下の内容を含む。すなわち、５８歳男性；４期ＣＫＤ患者；１６ヶ月間ＥＰＯ依存性、週に１回、５０００ＩＵを投与、ＥＰＯ処置の少なくとも３９日前に最終投与；ＧＦＲ  ２６ｍＬ／ｍｉｎ、適切な鉄貯蔵（トランスフェリン飽和率２３％、フェリチン２４３ｎｇ／ｍＬ）；および低用量ＥＰＯ（１８〜２５ＩＵ／ｋｇ／日）を投与−ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを４回投与。
【０２７６】
処置に関するコメントとしては、以下のものが挙げられる。すなわち、有害事象なし；良好なＨｂ応答；基礎Ｈｂ濃度よりも最大２ｇｍ／ｄＬの上昇。現在の用量では目標濃度が維持されなかった。追加ＥＰＯ注入を受けるために、患者が介在する試験を終了した。
【０２７７】
図１１Ａは、９２日間、患者３で目標治療濃度域のすぐ下に維持された継続的Ｈｂ応答を示す。
【０２７８】
患者４はＥＰＯ未経験患者だった。患者４に対するＥＰＯ臨床試験の臨床的統計および詳細には以下の内容を含む。すなわち、５７歳女性；３期ＣＫＤ患者；ＥＰＯ未経験；ＧＦＲ  ３２ｍＬ／ｍｉｎ、適切な鉄貯蔵；および低用量ＥＰＯ（１８〜２５ＩＵ／ｋｇ／日）を投与−ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを５回投与。
【０２７９】
処置に関するコメントとしては、以下のものが挙げられる。すなわち、有害事象はなく、良好なＨｂ応答。
【０２８０】
図１２は、２２４日間の患者４での治療濃度域内の持続的Ｈｂ応答を示す。
【０２８１】
患者５はＥＰＯ依存性患者だった。患者５に対するＥＰＯ臨床試験の臨床的統計および詳細には以下の内容を含む。すなわち、５１歳女性；４期ＣＫＤ患者；多発性嚢胞腎；ＥＰＯ依存性、３週間あたり１回、６０μｇのアラネスプを投与、ＥＰＯ処置の少なくとも１１３日前に最終投与；ＧＦＲ  １８ｍＬ／ｍｉｎ、適切な鉄貯蔵（トランスフェリン飽和率３９％、フェリチン３７１ｎｇ／ｍＬ）；および低用量ＥＰＯ（１８〜２５ＩＵ／ｋｇ／日）を投与−ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを６回投与。
【０２８２】
処置に関するコメントとしては、以下のものが挙げられる。すなわち、有害事象なし；一時的なＨｂ応答、不十分；および第３５日目に臨床試験を中止。
【０２８３】
患者６はＥＰＯ依存性患者だった。患者６に対するＥＰＯ臨床試験の臨床的統計および詳細には以下の内容を含む。すなわち、４０歳女性；４期ＣＫＤ患者；多発性嚢胞腎−移植の候補者；６週間ＥＰＯ依存性、週に２回、２０００ＩＵを投与、ＥＰＯ処置の少なくとも２９日前に最終投与；ＧＦＲ  ２５ｍＬ／分、適切な鉄貯蔵（トランスフェリン飽和率３３％）；および低用量ＥＰＯ（１８〜２５ＩＵ／ｋｇ／日）を投与−ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを４回投与。
【０２８４】
処置に関するコメントとしては、以下のものが挙げられる。すなわち、有害事象なし；良好なＨｂ応答；腎機能が悪化；追加ＥＰＯ注入を実施。患者の臨床試験を中止し、透析に移行した。
【０２８５】
図１３は、８９日間の患者６での治療濃度域内の持続的Ｈｂ応答を示す。
【０２８６】
患者７はＥＰＯ未経験患者だった。患者７に対するＥＰＯ臨床試験の臨床的統計および詳細には以下の内容を含む。すなわち、７７歳男性；４期ＣＫＤ患者；ＥＰＯ未経験；ＧＦＲ  １９ｍＬ／ｍｉｎ、適切な鉄貯蔵；および中用量ＥＰＯ（３５〜４５ＩＵ／ｋｇ／日）を投与−ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを８回投与。
【０２８７】
処置に関するコメントとしては、以下のものが挙げられる。すなわち、有害事象はなく、低応答者だった。
【０２８８】
図１４は、１７２日間の患者７での大部分は治療濃度域内の持続的Ｈｂ応答を示す。
【０２８９】
本試験の結果から、低用量および中用量のｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを投与された患者の血液が長期間、治療濃度域内の持続的Ｈｂ濃度を示すことが示される。さらに、患者に有害事象はなく、処置中または処置後に不快症状は報告されなかった。
【０２９０】
臨床試験−２回目の投与で増加された用量
【０２９１】
患者１０は、２回の低用量投与による処置を受けたＥＰＯ依存性患者だった。初回投与は第０日目に行われ、続いて２回目投与が第７０日目に行われた。図１６は、初回投与によって、１０ｍＵ／ｍＬの基礎値よりも２〜５ｍＵ／ｍＬのＥＰＯ濃度の上昇を持続し、Ｈｂは８．８ｇ／ｄＬの最低値に対して１０．２ｇ／ｄＬだったことを示す。２回目用量の投与後、Ｈｂの明らかな増加とともに、ＥＰＯ血清中濃度および網状赤血球で同様のピーク応答が観察された。
【０２９２】
２回目投与による結果からは、再処置は実行可能で、安全で、効果的であることが示された。
【０２９３】
要約
【０２９４】
示された臨床試験からは、約１８〜２５ＩＵ／ｋｇ／日、３４〜４５ＩＵ／ｋｇ／日、および５５〜６５ＩＵ／ｋｇ／日の用量で示された実行可能性とともに、ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯが安全であり、処置は変動する用量の影響を受けやすいことが示される。意外にも、ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯの単回投与によって、大部分の患者に対して少なくとも３ヶ月〜２４ヶ月以上の間、治療濃度域（１０〜１２ｇ／ｄＬ血中Ｈｂ）内の継続的Ｈｂ応答を示した。
【０２９５】
繰り返し投与は安全で有効であることが示されている。同時に、ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯの皮下移植によって、その治療を必要とする対象にＥＰＯの継続的供給源を提供することが示されている。そのため、ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯの皮下移植は、ＥＳＡの頻繁なボーラス注入の方法と比較して、必要とする患者への有効な継続的処置の代替案の提供で有意に進歩している。
【０２９６】
実施例４  ＳＣＩＤマウスでの前臨床毒性試験
【０２９７】
Harlan Biotech Israelで医薬品安全性試験実施基準（ＧＬＰ）毒性試験を行った。本試験の目的は、慢性腎疾患での長期薬物送達のための持続性供給源としての使用目的に関して、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスでの単回皮下移植後の試験製品Ｂｉｏｐｕｍｐ  ＨＤＡｄ−ｈＥＰＯの潜在的な毒性作用を評価することだった。
【０２９８】
毒性試験の設計を詳細に見直し、ＦＤＡの前臨床部門の代表の同意を受け、その結果実施した。
【０２９９】
ＳＣＩＤマウスの比較的に短い寿命（およそ１８ヶ月）を考慮して、表１に示した継続期間が、提案された臨床試験を支援するための毒性学的安全性を試験するのに妥当だと判断した。
【０３００】
【表１】
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【０３０１】
最初の群では、各動物が、３００〜４５０ＩＵ  ＥＰＯ／日の範囲で分泌されるＢｉｏｐｕｍｐ（ＧＭＭＯ）の一部を投与された。
【０３０２】
２番目の群は移植された対照群だった。各動物は、真皮非形質導入微小器官の同様のサイズの一部を投与された。
【０３０３】
「微小器官なし（no micro-organ）」対照群としての３番目の群では、各動物は、対照群として同一の皮下関連処置による処置を受けたが、移植は受けなかった。
【０３０４】
臨床兆候：観察期間全体を通じて、注意深い臨床検査を行い、少なくとも毎日１回、試験中のすべての動物について記録した。観察としては、皮膚、毛皮、眼、粘膜の変化、分泌および排泄（例えば下痢）の発生、および自律神経活動が挙げられる。歩きぶり、姿勢、および処理に対する反応の変化のほか、突飛な振る舞い、体の震え、痙攣、睡眠、および昏睡の存在も観察し、記録した。
【０３０５】
体重：無作為化手順で試験のすべての動物の個々の体重測定を行い、続いて、皮下移植／疑似手術の前、２日後、およびその後、週１回の頻度で体重測定を行った。
【０３０６】
食物消費：試験のすべての動物に対して、順化期間中に食物消費量の測定を行い、その後、週１回の頻度で、観察期間全体を通して測定した。
【０３０７】
血液試料の採取（暫定出血セッション）：すべての動物が血液学および生化学パラメーターに関する暫定出血セッションを受け、単回皮下移植の日から１３〜１５日ごとに行った。試験内の均一性を維持するために、試験のすべての動物は暫定出血セッションを受けた。血液試料は、数ある中でもヘマトクリット（ＨＣＴ）値を測定する目的に役立った。
【０３０８】
剖検および肉眼検査：最初に毒性評価に登録されたすべての動物は、詳細な剖検および肉眼的病理検査を受けた。
【０３０９】
器官／組織収集、体重、および固定：予定された剖検セッション中にすべての器官／組織を収集した。
【０３１０】
結果：
【０３１１】
試験製品の処置を受けたメスマウスは、試験の第７日目にケージ内で死亡しているのが見つかった。さらに、試験製品の処置を受けたオスマウスは、第５２日目に死亡しているが見つかった。試験製品、対照製品、または疑似手術を受けた群のいずれにもさらなる死亡は起きなかった（予備を含み）。
【０３１２】
観察期間全体を通じて、試験製品、対照製品、または疑似手術を受けた生き残った動物の間には、処置に関連する明らかな反応は観察されなかった。
【０３１３】
試験製品自体によるｈＥＰＯの継続的分泌を考慮して、試験製品処置を受けた動物で、観察期間全体を通じたＨＣＴ値の上昇が記録された。それぞれの疑似手術を受けた平均群の値に対して第１５日目、第２８日目、第４３日目、第５７日目、および第７０日目に、試験製品の処置を受けた群で、統計上有意に増加した（ｐ，０．０５およびｐ，０．０１）ＨＣＴ値が明らかになった。
【０３１４】
本試験の条件の下で得られた組織病理学的所見を考慮して、１２週の最長暴露期間のために３００〜４５０ＩＵ／動物／日の用量で長期薬物送達のための持続性供給源としてＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに皮下移植される、試験製品Ｂｉｏｐｕｍｐ  ＨＤＡｄ−ｈＥＰＯは、３つの予定終了時点すべてで観察された薬理学的に関連した変化のみと関連しているという結論を出すことができる。
【０３１５】
当業者にとっては当然ながら、本発明は上記で特に示され、述べられた内容に限定されるものではない。もっと正確に言えば、本発明の範囲は以下に続く請求項によって定義される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年2月15日(2013.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長期持続性エリスロポエチン組成物であって、
エリスロポエチンを発現または分泌する少なくとも１つの遺伝学的に改変された微小器官を含み、
前記微小器官が、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含み、
前記ベクターが、１以上の調節配列に機能可能に結合されたエリスロポエチンをコードする核酸配列を含み、
当該組成物を対象に対して１８〜１５０ＵＩエリスロポエチン／対象の体重（Ｋｇ）／日の用量で投与することにより、前記対象のヘモグロビン濃度を増加させ、前記ヘモグロビン濃度が増加した状態を少なくとも１ヶ月間維持することができ、かつ、前記少なくとも１ヶ月のうちの少なくとも９０％の期間、前記ヘモグロビン濃度を１０〜１２ｇｍ／ｄＬに維持することができることを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１の組成物であって、
前記調節配列が、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、および／またはＳＶ４０ポリアデニル配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項１の組成物であって、
前記エリスロポエチンの発現が、エリスロポエチンの発現量の増加、発現期間の延長、またはその組み合わせについて最適化されていることを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１の組成物であって、
前記少なくとも１つの遺伝学的に改変された微小器官が、遺伝子組換え真皮微小器官であることを特徴とする組成物。
【請求項５】
ヒト対象の貧血を長期間に渡って治療するための薬剤を調製するための、長期持続性エリスロポエチン組成物の使用であって、
前記組成物が、エリスロポエチンを発現または分泌する少なくとも１つの遺伝学的に改変された微小器官を含み、
前記微小器官が、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含み、
前記ベクターが、１以上の調節配列に機能可能に結合されたエリスロポエチンをコードする核酸配列を含み、
ａ．前記薬剤のエリスロポエチン分泌量はインビトロで測定され；
ｂ．前記薬剤は、１８〜１５０ＵＩエリスロポエチン／前記対象の体重（Ｋｇ）／日の用量で投与することが可能であり；
ｃ．前記薬剤により、前記対象のヘモグロビン濃度を増加させ、前記ヘモグロビン濃度が増加した状態を少なくとも１ヶ月間維持することができ、かつ、前記少なくとも１ヶ月のうちの少なくとも９０％の期間、前記ヘモグロビン濃度を１０〜１２ｇｍ／ｄＬに維持することができることを特徴とする使用。
【請求項６】
請求項５の使用であって、
前記用量が、１８〜２５ＵＩエリスロポエチン／前記対象の体重（Ｋｇ）／日であることを特徴とする使用。
【請求項７】
請求項５の使用であって、
前記用量が、３５〜４５ＵＩエリスロポエチン／前記対象の体重（Ｋｇ）／日であることを特徴とする使用。
【請求項８】
請求項５の使用であって、
前記用量が、５５〜６５ＵＩエリスロポエチン／前記対象の体重（Ｋｇ）／日であることを特徴とする使用。
【請求項９】
請求項５の使用であって、
前記調節配列が、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、および／またはＳＶ４０ポリアデニル配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項１０】
請求項５の組成物であって、
前記エリスロポエチンの発現が、エリスロポエチン発現量の増加、発現期間の延長、またはその組み合わせに関して最適化されることを特徴とする使用。
【請求項１１】
請求項５の使用であって、
前記少なくとも１つの遺伝学的に改変された微小器官が、遺伝子組換え真皮微小器官であることを特徴とする使用。
【請求項１２】
請求項５の使用であって、
前記ヘモグロビン濃度が増加した状態が少なくとも１年間維持されることを特徴とする使用。
【請求項１３】
請求項５の使用であって、
前記薬剤を、貧血の治療に使用する前の少なくとも９日間、インビトロで維持するようにしたことを特徴とする使用。
【請求項１４】
請求項５の使用であって、
前記対象が、慢性腎疾患（ＣＫＤ）を患っている透析前の患者であることを特徴とする使用。
【請求項１５】
請求項５の使用であって、
前記対象が、末期腎不全を患っていることを特徴とする使用。
【請求項１６】
ヒト対象のヘモグロビン濃度を長期間に渡って増加させるための薬剤を調製するための、長期持続性エリスロポエチン組成物の使用であって、
前記組成物が、エリスロポエチンを発現または分泌する少なくとも１つの遺伝学的に改変された微小器官を含み、
前記微小器官が、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含み、
前記ベクターが、１以上の調節配列に機能可能に結合されたエリスロポエチンをコードする核酸配列を含み、
ａ．前記薬剤のエリスロポエチン分泌量はインビトロで測定され；
ｂ．前記薬剤は、１８〜１５０ＵＩエリスロポエチン／前記対象の体重（Ｋｇ）／日の用量を投与することが可能であり；
ｃ．前記薬剤により、前記対象のヘモグロビン濃度を増加させ、前記ヘモグロビン濃度が増加した状態を少なくとも１ヶ月間維持することができ、かつ、前記少なくとも１ヶ月のうちの少なくとも９０％の期間、前記ヘモグロビン濃度を１０〜１２ｇｍ／ｄＬに維持することができることを特徴とする使用。
【国際調査報告】
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