(57)【要約】  本発明は、ＡｐｏＡ、インターロイキン１５およびＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインの併用に基づいて被験体の生得免疫応答と適応免疫応答の双方を促進することができる組成物、ならびに患者において免疫応答を刺激するためのこれらの組成物の使用、および感染性疾患および新生物性疾患を治療するための治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）以下の群：
（ａ）ＡｐｏＡポリペプチド、または該ＡｐｏＡポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体を含んでなる、ポリペプチド、および
（ｂ）ＡｐｏＡポリペプチド、または該ＡｐｏＡポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体をコードする、ポリヌクレオチド
から選択される第一の成分、ならびに
（ｉｉ）以下の群：
（ａ）ＩＬ１５、またはＩＬ１５と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体、および
（ｂ）ＩＬ１５、またはＩＬ１５と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体をコードする、ポリヌクレオチド
から選択される第二の成分、ならびに
（ｉｉｉ）以下の群：
（ａ）ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメイン、またはＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体、および
（ｂ）ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメイン、またはＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体をコードする、ポリヌクレオチド
から選択される第三の成分
を一緒にまたは個別に含んでなる、組成物。
【請求項２】
第一の成分と第二の成分が単一分子の一部を形成し、
ａ．第一の成分および第二の成分がポリペプチドである場合には、該単一分子は、ＡｐｏＡポリペプチドまたは該ＡｐｏＡポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体、およびＩＬ１５またはＩＬ１５と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体を含んでなる融合タンパク質であり、
ｂ．第一の成分および第二の成分がポリヌクレオチドである場合には、該単一分子は、ＡｐｏＡポリペプチドまたは該ＡｐｏＡポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体を含んでなるポリペプチド、およびＩＬ１５またはＩＬ１５と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体を含んでなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記単一分子の第一の成分および第二の成分の配置が、
ａ．第一の成分が第二の成分に対してＮ末端または５’位にある、および
ｂ．第一の成分が第二の成分に対してＣ末端または３’位にある
からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
（ｉ）ＡｐｏＡポリペプチド、または該ＡｐｏＡポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体により形成される、領域Ａ、
（ｉｉ）ＩＬ１５、またはＩＬ１５と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体により形成される、領域Ｂ、および
（ｉｉｉ）ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメイン、またはＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体により形成される、領域Ｃ
を含んでなる、融合タンパク質。
【請求項５】
前記融合タンパク質におけるＮ末端からＣ末端方向の領域Ａ、ＢおよびＣの配置が、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｃ−Ｂ、Ｂ−Ａ−Ｃ、Ｂ−Ｃ−Ａ、Ｃ−Ａ−ＢおよびＣ−Ｂ−Ａからなる群から選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
領域Ａ、ＢおよびＣの間の結合の少なくとも１つがペプチドリンカーにより確立される、請求項４または５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ａ．ＡｐｏＡまたはＡｐｏＡと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体が、ヒト起源またはネズミ起源のものであり、
ｂ．ＩＬ１５またはＩＬ１５と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体が、ヒト起源またはネズミ起源のものであり、かつ／または
ｃ．ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインまたはＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体を含んでなるポリペプチドが、ヒト起源またはネズミ起源のものである、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物、または請求項４〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクターまたは遺伝子構築物。
【請求項１０】
請求項４〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項８に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載のベクター、または請求項９に記載の遺伝子構築物を含んでなる、宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜３および７のいずれか一項に記載の組成物、請求項４〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項８に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載のベクターもしくは遺伝子構築物、または請求項１０に記載の宿主細胞と、薬学上許容されるビヒクルとを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１２】
抗原特異的Ｔリンパ球の大量増殖を促進するin vitro法であって、事前にin vivoで該抗原に曝されたリンパ球集団を、請求項１〜３および７のいずれか一項に記載の組成物、請求項４〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項８に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載のベクターまたは遺伝子構築物、または請求項１０に記載の宿主細胞と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項１３】
リンパ球を前記Ｔリンパ球が曝された抗原と接触させることにより、リンパ球に事前にin vitro活性化が施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
医療用の、請求項１〜３および７のいずれか一項に記載の組成物、請求項４〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項８に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載のベクターまたは遺伝子構築物、または請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
被験体の免疫応答の刺激を必要とする疾患の治療を目的とした薬剤の製造のための、請求項１〜３および７のいずれか一項に記載の組成物、請求項４〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項８に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載のベクターまたは遺伝子構築物、または請求項１０に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１６】
免疫応答の刺激を必要とする疾患が、感染性疾患および新生物性疾患からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
新生物性疾患が、腫瘍および転移の群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、免疫学の分野、より具体的には、被験体の生得免疫応答と適応免疫応答の双方を促進することができる組成物の分野に関する。これらの組成物は、腫瘍および感染性疾患など、より大きな免疫系活性を必要とするあらゆる疾患を治療するのに有用である。
【０００２】
発明の背景
インターロイキン１５（ＩＬ１５またはＩＬ１５）は、ＮＫ、ＮＫＴ細胞およびＣＤ８  Ｔメモリーリンパ球の活性のための生命維持に必要なサイトカインである。これはα、βおよびγと呼ばれる３つのサブユニットからなる受容体を介してその機能を遂行する。サブユニットβおよびγは、ＩＬ−２受容体と共通である。ＩＬ１５受容体のα鎖はＩＬ１５に独特であり、サイトカインの細胞外媒質への放出に必要であり[Duitman, E.H., et al., Mol Cell Biol, 2008. 28:4851-61]、ＩＬ１５をサブユニットＩＬ１５ＲβおよびＩＬ１５Ｒγに「提示する」。
【０００３】
免疫系の刺激特性のために、このインターロイキンは、ＮＫ細胞の存在に依存する抗腫瘍特性(Suzuki, 2001, J. Leuokoc. Biol., 69:531-537)およびＴ細胞の存在に依存する抗腫瘍特性(Hazama, 1999, Br. J. Cancer., 80:1420-1426, Meazza, 2000, Int. J. Cancer, 87:574-581 and Klebanoff, 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101:1969-1974)を有する。ＩＬ１５はまた、ウイルス感染に対する保護、ならびに免疫および樹状細胞の発達におけるＴ細胞に基づく応答の拡大および維持にも関与する。
【０００４】
よって、ＩＬ１５は、免疫系が関与する疾患を治療するための有用な治療薬となり得る。しかしながら、ＩＬ１５の機能に関するin vivo研究は、１つには、組換えＩＬ１５が利用できないため、また、ＩＬ１５が天然遺伝子から発現される場合に見られる分泌レベルが低いために妨げられてきた。さらに、ほとんどのサイトカインは、それらがin vivoにおいて局部的かつ一時的に生産されることを考えれば、血漿半減期が極めて短い。結論として、in vivoにおけるＩＬ１５の使用は、比較的高用量で頻繁な投与を必要とし、治療に耐性のない癌患者に起こり得る種々の二次的作用をもたらす。
【０００５】
これらの欠点を克服するために、ＩＬ１５は抗ＣＤ４０、ＩＬ−７またはＩＬ−６抗体などの他の治療と組み合わせて用いられてきた[Chou, P.C., et al., 2009, Vet Immunol Immunopathol, 130:25-34; Lin, C.Y., et al., Cancer Lett, 2008. 272(2): p. 285-95; Zhang, M., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106:7513-8およびCha, E., et al., Breast Cancer Res Treat, 2009]。これらの組合せは、低用量のＩＬ１５で同等の効果を達成可能とする相乗効果を示す。
【０００６】
ＩＬ１５活性を増強するもう１つの可能性は、免疫グロブリンの定常領域とＩＬ１５受容体のα鎖の可溶性領域とを含んでなる融合タンパク質と同時投与することからなり、これはＩＬ１５活性に５０倍の増強をもたらす(Rubinstein M.P. et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9166-71およびStoklasek T.A. et al., 2006, J. Immunol.; 177:6072?80)。
【０００７】
最近、ＩＬ１５受容体α鎖のアミノ末端のアミノ酸１〜７７により形成されるポリペプチド（いわゆる「Ｓｕｓｈｉドメイン」）がＩＬ１５のアゴニストであることが実証された[Mortier, E., et al., J Biol Chem, 2006. 281(3): p. 1612-9]。よって、該ドメインとＩＬ１５を含む融合タンパク質の投与は、ＩＬ１５の場合よりも大きな抗腫瘍効果を示し、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の肺転移に６５％の低下をもたらし、ヌードマウスの盲腸に移植されたＨＣＴ−１１６ヒト腫瘍の転移数に減少をもたらす[Bessard, A., et al., Mol Cancer Ther, 2009. 8(9): p. 2736-45]。
【０００８】
望まない二次的作用を受けることなくＩＬ１５の効果の改善を達成するためのもう１つの選択肢は、その半減期を延長するために分子を改変することからなる。よって、ＵＳ２００６２５７３６１は、免疫グロブリンの定常領域と、投与後に非改変ＩＬ１５よりも長い血清半減期を示すＩＬ１５とを含んでなる融合タンパク質を記載している。
【０００９】
しかしながらやはり、当技術分野において、タンパク質がその免疫応答促進活性を維持し、ＩＬ１５に関連する二次的作用を可能な限り低減させることができるＩＬ１５の別の処方物が必要である。
【発明の概要】
【００１０】
第一の態様において、本発明は、
（ｉ）以下の群：
（ａ）ＡｐｏＡポリペプチド、または該ＡｐｏＡポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体を含んでなる、ポリペプチド、および
（ｂ）ＡｐｏＡポリペプチド、または該ＡｐｏＡポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体をコードする、ポリヌクレオチド
から選択される第一の成分、ならびに
（ｉｉ）以下の群：
（ａ）ＩＬ１５、またはＩＬ１５と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体、および
（ｂ）ＩＬ１５、またはＩＬ１５と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体をコードする、ポリヌクレオチド
から選択される第二の成分、ならびに
（ｉｉｉ）以下の群：
（ａ）ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメイン、またはＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体、および
（ｂ）ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメイン、またはＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体をコードする、ポリヌクレオチド
から選択される第三の成分
を一緒にまたは個別に含んでなる組成物に関する。
【００１１】
第二の態様において、本発明は、
（ｉ）ＡｐｏＡポリペプチド、または該ＡｐｏＡポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体により形成される、領域Ａ、
（ｉｉ）ＩＬ１５、またはＩＬ１５と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体により形成される、領域Ｂ、および
（ｉｉｉ）ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメイン、またはＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体により形成される、領域Ｃ
を含んでなる融合タンパク質に関する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターもしくは遺伝子構築物、本発明の融合タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明の遺伝子構築物を含んでなる宿主細胞に関する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、本発明の組成物、本発明の融合タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターまたは遺伝構築物、本発明の宿主細胞と、薬学上許容されるビヒクルとを含んでなる医薬組成物に関する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、抗原特異的Ｔリンパ球の大量増殖を促進するin vitro法であって、事前にin vivoで該抗原に曝されたリンパ球集団を、本発明の組成物、本発明の融合タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターまたは遺伝子構築物、本発明の宿主細胞と接触させることを含んでなる方法に関する。
【００１５】
さらに、本発明は、医療用の、または被験体の免疫応答の刺激を必要とする疾患の治療のための、本発明の組成物、本発明の融合タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターもしくは遺伝子構築物、本発明の宿主細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】時間ｔ（ｈ：時間）におけるｈＩＬ１５（ｎｇ／ｍＬ）の発現動態。Ｃ５７Ｂ１６マウス群にプラスミド、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５、ｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ、ｐｈＩＬ１５、ｐＡｐｏまたは生理食塩水（Ｓ）の流体力学的注射(hydrodynamic injection)を施した。８時間目、２４時間目、９６時間目、１６８時間目および２４０時間目に採血し、ｈＩＬ１５の血清濃度をＥＬＩＳＡアッセイにより分析した。各群動物２〜３匹を用いた代表的な実験の平均および平均標準偏差を示す。結果は反復測定ＡＮＯＶＡとその後のボンフェローニ検定により統計学的に比較した。他群と比較した場合、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５処置群の８時間目と２４時間目でｈＩＬ１５レベル間に有意差が見られた（ｐ＜０．００１）。
【図２】流体力学的注射によりｐＳｕｓｈｉと同時投与したｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５の機能的増殖アッセイ。ＣＴＬＬ２細胞を、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉでマウスを処置して２４時間後に得られた血清の希釈系で培養した。４８時間目に、トリチウム化チミジンのＣＴＬＬ２細胞への組込みを増殖指数（ｃ．ｐ．ｍ．）として調べたところ、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉで同時処置したマウス血清は、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５単独で処置したマウスの血清よりも高い増殖を誘導したことが見て取れた（ｐ＜０．００１）。各群動物４〜５匹を用いた代表的な実験の平均および平均標準偏差を示す。結果は、反復測定ＡＮＯＶＡにより統計学的に比較した。
【図３】ＣＤ８＋  Ｔ細胞の総数および総脾細胞に対するパーセンテージの経時的（ｔ（ｄ）、日）増加。Ｃ５７Ｂ１６マウス群に種々のプラスミド構築物の流体力学的注射を施し、３日目、４日目、５日目、６日目および７日目に犠牲にし、脾臓を摘出した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の数（Ａ）、総脾細胞に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージ（Ｂ）、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋メモリーＴ細胞の数（Ｃ）および総脾細胞に対するＣＤ８＋ＣＤ４４＋メモリーＴ細胞のパーセンテージ（Ｄ）を測定した。プラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉを投与したマウス群（黒四角）は、他群：ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５（□）、ｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ（▲）、ｐｈＩＬ１５（△）、ｐＡｐｏ（○）および生理食塩水ビヒクル（＊）よりも多数のＣＤ８＋  Ｔ細胞を示す。各群動物２匹を用いた代表的な実験の平均および平均標準偏差を示す。データは、反復測定ＡＮＯＶＡとその後の、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ群とｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ群を比較するボンフェローニ検定により分析した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図４】肝臓の総リンパ球に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージの経時的（ｔ（ｄ）、日）増加。Ｃ５７Ｂ１６マウスに種々の構築物を流体力学的に投与した。３日目、４日目、５日目、６日目および７日目に動物を犠牲にし、肝臓を単離した。総リンパ球に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージを測定した。プラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉ（黒四角）を投与したマウス群は、残りの群：ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５（□）、ｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ（▲）、ｐｈＩＬ１５（△）、ｐＡｐｏ（○）および生理食塩水ビヒクル（＊）よりも高いＣＤ８＋  Ｔ細胞パーセンテージを示した。各群動物２匹を用いた代表的な実験の平均および平均標準偏差を示す。データは、反復測定ＡＮＯＶＡとその後の、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ群とｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ群を比較するボンフェローニ検定により分析した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図５】ＣＤ８＋  Ｔ細胞の総数および末梢血リンパ球に対するパーセンテージの増加。Ｃ５７Ｂ１６マウスにｐｈＩＬ１５を用いた種々の構築物を流体力学的に投与した。３日目、４日目、５日目および６日目に採血し、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球のパーセンテージ（Ａ）、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋メモリーＴ細胞のパーセンテージ（Ｂ）、エフェクターメモリー細胞ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−のパーセンテージ（Ｃ）および中枢メモリー細胞ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋のパーセンテージ（Ｄ）を測定した。総ての供試集団において、プラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉを施すマウス群（黒四角）は、他群：ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５（□）、ｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ（▲）、ｐｈＩＬ１５（△）、ｐＡｐｏ（●）、ｐＳｕｓｈｉ（▽）および生理食塩水ビヒクル（＊）よりも高いパーセンテージのＣＤ８＋  Ｔ細胞を示した。各群動物３匹を用いた代表的な実験の平均および平均標準偏差を示す。データは、反復測定ＡＮＯＶＡとその後の、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ群とｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ群を比較するボンフェローニ検定により分析した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図６】皮下ＣＴ２６腫瘍モデルにおける構築物の経時的抗腫瘍効果（ｔ（ｄ）、日）。Ｂａｌｂ／ｃマウスに５×１０５のＣＴ２６細胞を皮下に施し、３日後にｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ、ｐｈＩＬ１５、ｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ、ｐＡｐｏまたは生理食塩水（Ｓ）で流体力学的に処置した。２日置きにデジタルカリパスを用いて腫瘍を測定し（ｍｍ２）（Ａ）、動物の生存時間を観察した（％ＳＶ）（Ｂ）。プラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉを投与したマウスは、他群のマウスよりも腫瘍増殖の遅延および高い生存率を示すことが見て取れた。各群動物８匹を用いた代表的な実験の平均および平均標準偏差を示す。
【図７】皮下ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるプラスミドの経時的抗腫瘍効果（ｔ（ｄ）、日）。Ｃ５７Ｂ１６マウスに５×１０５のＭＣ３８細胞を皮下投与し、６日後にｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ、ｐｈＩＬ１５、ｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ、ｐＡｐｏまたは生理食塩水（Ｓ）で流体力学的に処置した。２日置きにデジタルカリパスを用いて腫瘍を測定し（ｍｍ２）（Ａ）、動物の生存時間を観察した（％ＳＶ）（Ｂ）。プラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉを投与したマウスは、腫瘍増殖の遅延を示すことが見て取れた。代表的な実験の平均および平均標準偏差を示す。
【図８】脾臓内ＭＣ３８腫瘍モデルにおける種々のプラスミドの抗転移効果。Ｃ５７Ｂ１６マウスの脾臓内に５×１０５のＭＣ３８細胞を投与し、翌日、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ、ｐｈＩＬ１５、ｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ、ｐＡｐｏまたは生理食塩水（Ｓ）で流体力学的に処置した。１９日後、マウスを犠牲にし、Ｉ、肝臓転移または全身転移のために死に至ったマウス；ＩＩ、肝臓組織の一部に転移を示すマウス；ＩＩＩ、肝臓転移が無いマウスの３群に分けた。代表的な実験のデータを示す。
【図９Ａ】ＩＬ１５のα受容体に関する「ノックアウト」マウスにおける種々のプラスミドの効果。ＩＬ１５のα受容体を欠く４匹のマウスをプラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉ、ｐｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉ、ｐＡｐｏとｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５で流体力学的に処置した。動物を５日後に犠牲にし、脾臓を摘出し、分化に関するＣＤ３マーカーを用いたフローサイトメトリーによってＮＫ細胞およびＣＤ８＋  Ｔメモリーリンパ球の脾臓集団を測定した。この図には、非突然変異型Ｃ５７Ｂ１６マウスのＮＫ集団およびＣＤ８＋  Ｔメモリー集団も含まれる。供試マウスのＮＫ細胞（Ａ）、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球（Ｂ）およびＣＤ８＋ＣＤ４４＋部分集団（Ｃ）のパーセンテージを示す。総脾細胞に対する細胞のパーセンテージを示す。
【図９Ｂ】ＩＬ１５のα受容体に関する「ノックアウト」マウスにおける種々のプラスミドの効果。ＩＬ１５のα受容体を欠く４匹のマウスをプラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉ、ｐｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉ、ｐＡｐｏとｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５で流体力学的に処置した。動物を５日後に犠牲にし、脾臓を摘出し、分化に関するＣＤ３マーカーを用いたフローサイトメトリーによってＮＫ細胞およびＣＤ８＋  Ｔメモリーリンパ球の脾臓集団を測定した。この図には、非突然変異型Ｃ５７Ｂ１６マウスのＮＫ集団およびＣＤ８＋  Ｔメモリー集団も含まれる。供試マウスのＮＫ細胞（Ａ）、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球（Ｂ）およびＣＤ８＋ＣＤ４４＋部分集団（Ｃ）のパーセンテージを示す。総脾細胞に対する細胞のパーセンテージを示す。
【図９Ｃ】ＩＬ１５のα受容体に関する「ノックアウト」マウスにおける種々のプラスミドの効果。ＩＬ１５のα受容体を欠く４匹のマウスをプラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉ、ｐｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉ、ｐＡｐｏとｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５で流体力学的に処置した。動物を５日後に犠牲にし、脾臓を摘出し、分化に関するＣＤ３マーカーを用いたフローサイトメトリーによってＮＫ細胞およびＣＤ８＋  Ｔメモリーリンパ球の脾臓集団を測定した。この図には、非突然変異型Ｃ５７Ｂ１６マウスのＮＫ集団およびＣＤ８＋  Ｔメモリー集団も含まれる。供試マウスのＮＫ細胞（Ａ）、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球（Ｂ）およびＣＤ８＋ＣＤ４４＋部分集団（Ｃ）のパーセンテージを示す。総脾細胞に対する細胞のパーセンテージを示す。
【図１０】脾細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＮＫ１．１細胞の総数の増加。Ｃ５７Ｂ１６マウス群をプラスミド：１）ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏ；２）ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉの組合せ（ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ）；３）ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５；４）ｐｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉの組合せ（ｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ）；５）ｐｈＩＬ１５；および６）ｐＡｐｏの流体力学的注射により処置した。６日目に動物を犠牲にし、脾臓を摘出した。Ａ）総脾細胞集団；Ｂ）ＣＤ８＋  Ｔメモリーリンパ球（ＣＤ８＋ＣＤ３＋）；およびＣ）ＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋ＣＤ３＋）のフローサイトメトリー試験を行った。ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏを投与したマウスは、他群よりも総脾細胞に対してより多数のＣＤ８＋  Ｔ細胞を示した。各群動物２〜３匹を用いた代表的な実験の平均および平均標準偏差を示す。データは、一元配置ＡＮＯＶＡとその後の、ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏ群と、示されたタンパク質をコードするプラスミドを注射した残りの群を比較するボンフェローニ検定により分析した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１１】脾細胞の総数ならびに総脾細胞に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＮＫ細胞のパーセンテージの増加における、ＩＬ１５のヒトまたはネズミイソ型の比較効果。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群をプラスミド：１）ｐｍＩＬ１５；２）ｐｈＩＬ１５；３）ｐｍＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉの組合せ；および４）ｐｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉの組合せの流体力学的注射により処置した。４日後に動物を犠牲にし、脾臓を単離し、総脾細胞（Ａ）、脾細胞の総数に対するＣＤ８  Ｔ細胞（Ｂ）、および脾細胞の総数に対するＮＫ細胞を数えた（Ｃ）。各群動物１〜２匹を用いた代表的な実験の平均および平均標準偏差（適用可能な場合）を示す。データは、クラスカル−ウォリス(Kruskall-Wallis)検定とその後のダンの多重比較検定(Dunn’s multiple comparison test)により分析した。これらの図は、ｍＩＬ１５とｈＩＬ１５が脾臓における脾細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数を同様に刺激することを示す。
【図１２】脾臓（Ａ）および肝臓（Ｂ）におけるＮＫ細胞のパーセンテージに対するｍＳｕｓｈｉとｍＩＬ１５およびＡｐｏＡＩの融合の効果。Ｃ５７ＢＬ／６マウス群をプラスミド：１）ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏ（それぞれ１μｇ／マウス、２．５μｇ／マウスおよび５μｇ／マウスの異なる用量で投与）；および２）ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５とｐＡｐｏの組合せ（双方とも同じ３用量で投与）の流体力学的注射により処置した。４日後に動物を犠牲にし、脾臓（Ａ）および肝臓（Ｂ）を単離し、ＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋ＣＤ３＋）をマークした。総ての供試用量で、プラスミドｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏを投与したマウス群は他群よりも高いＮＫ細胞パーセンテージを示した。各群動物２〜３匹を用いた代表的な実験の各反復および平均を示す。データは、一元配置ＡＮＯＶＡのより分析した。
【図１３】皮下ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるｍＳｕｓｈｉとｍＩＬ１５およびＡｐｏＡＩの融合の抗腫瘍効果。Ｃ５７Ｂ１６マウスに５×１０５のＭＣ３８細胞を皮下投与し、８日後および１９日後にプラスミド：１）ｐＡｐｏ；２）ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏおよび３）ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉの組合せ（ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ）で流体力学的に処置した。腫瘍を２〜３日おきにデジタルカリパスを用いて測定した（ｍｍ２）。ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏを投与したマウスは、腫瘍増殖の遅延を示すことが見て取れた。各群動物５〜９を用いた代表的な実験の平均および標準偏差を示す。
【発明の具体的説明】
【００１７】
本発明者らは、驚くべきことに、ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメイン（以下ＩＬ１５αＲ−ｓｕｓｈｉ）とともにＡｐｏＡタンパク質と融合されたＩＬ１５を含んでなる融合タンパク質をコードする核酸の同時投与が、ＩＬ１５とＩＬ１５αＲ−ｓｕｓｈｉを一緒に投与した際に見られるものよりも高いＩＬ１５活性をもたらすことを見出した。このような高い活性は、本発明の実施例３に見られるようにより高く、より長いＩＬ１５の循環レベルが得られた結果であるだけでなく、ＣＴＬＬ２細胞の増殖誘導能（本発明の実施例４）、脾臓内ＣＤ８  Ｔリンパ球およびＣＤ８  Ｔメモリー細胞、ＣＤ８  Ｔ肝内リンパ球および血液ＣＤ８Ｔリンパ球の増殖促進能（本発明の実施例５）ならびに２つの実験腫瘍モデルにおけるより高い抗腫瘍効果（本発明の実施例７）および抗転移効果（本発明の実施例８）の結果でもある。
【００１８】
特定の理論に縛られることを望むものではないが、ＡｐｏＡとの融合タンパク質の形態でのＩＬ１５の投与から得られる相乗効果は、それらの表面でＡｐｏＡ受容体を発現する標的組織において、ＩＬ１５がこれまでに考えられていたものとは異なる、または補足的な組織に対してその作用を遂行し得るような形でＩＬ１５作用を果たす結果であると考えられる。この仮説は、ＩＬ１５のα受容体の遺伝子を欠失したマウスでも見られる相乗効果に対しても維持される。
【００１９】
より驚くべきは、ＩＬ１５およびＩＬ１５αＲ−ｓｕｓｈｉと融合したＡｐｏＡ１タンパク質を含んでなる三重融合融合タンパク質をコードし、その発現を可能とする核酸の投与は、ＩＬ１５をコードする核酸の単独もしくはＩＬ１５αＲ−ｓｕｓｈｉをコードする別の核酸と組み合わせた投与、またはＡｐｏＡ１とＩＬ１５の融合タンパク質をコードする核酸の単独もしくはＩＬ１５αＲ−ｓｕｓｈｉをコードする別の核酸と組み合わせた投与で得られるものよりもはるかに高いＣＤ８リンパ球およびＮＫ細胞の増殖をもたらすことが認められたことである。
【００２０】
本発明の組成物
よって、第一の態様において、本発明は、
（ｉ）以下の群：
（ａ）ＡｐｏＡポリペプチド、または該ＡｐｏＡポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体を含んでなる、ポリペプチド、および
（ｂ）ＡｐｏＡポリペプチド、または該ＡｐｏＡポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体をコードする、ポリヌクレオチド
から選択される第一の成分、ならびに
（ｉｉ）以下の群：
（ａ）ＩＬ１５、またはＩＬ１５と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体、および
（ｂ）ＩＬ１５、またはＩＬ１５と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体をコードする、ポリヌクレオチド
から選択される第二の成分、ならびに
（ｉｉｉ）以下の群：
（ｃ）ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメイン、またはＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体、および
（ｄ）ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメイン、またはＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体をコードする、ポリヌクレオチド
から選択される第三の成分
を一緒にまたは個別に含んでなる組成物に関する。
【００２１】
本発明において「組成物」とは、示された成分、言い換えれば、ポリペプチドＡｐｏＡ、ＩＬ１５およびＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインを含んでなる材料、ならびにその種々の成分の任意の量での組合せから直接的または間接的に得られる他のいずれかの生成物の組成物に関する。当業者ならば、その組成物は単一の処方物として処方されてもよいし、または組合せ製剤の形態で一緒に使用するために組み合わせることができるように各化合物の処方物として個別に提供されてもよいことを認識するであろう。該組成物は、各成分が個別に処方および包装されたパーツキットであってもよい。
【００２２】
本明細書において「タンパク質」とは、ポリペプチドと区別無く、種々のアミノ酸がペプチド結合またはジスルフィド架橋によって連結された任意の長さのアミノ酸鎖を意味する。
【００２３】
本発明において「ポリヌクレオチド」とは、不定数のモノマーにより形成されるポリマーに関し、ここで、モノマーは、リボヌクレオチドならびにデオキシリボヌクレオチドを含むヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、メチル化により修飾されたモノマーならびに非修飾型モノマーを含む。「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は本発明では区別無く用いられ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび組換えポリヌクレオチドを含む。本発明において、ポリヌクレオチドは、天然に見られるポリヌクレオチドに限定されず、非天然ヌクレオチド類似体およびヌクレオチド間結合が見られるポリヌクレオチドも含む。この種の非天然構造の限定されない例としては、糖がリボースとは異なるポリヌクレオチド、ホスホジエステル結合３’−５’および２’−５’が見られるポリヌクレオチド、逆転結合（３’−３’および５’−５’）が見られ、分岐構造を持つポリヌクレオチドが挙げられる。また、本発明のポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド(locked)核酸（ＬＮＡ）、メチルホスホネート、ホスホルアミダート、Ｃ１−Ｃ６アルキルホスホトリエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート型のＣ１−Ｃ４アルキルリン酸結合などの非天然ヌクレオチド間結合も含む。いずれにせよ、本発明のポリヌクレオチドは、天然ポリヌクレオチドと同様の方法で標的核酸とハイブリダイズする能力を保持する。
【００２４】
本発明の組成物の第一の成分
本発明の第一の成分は、ＡｐｏＡポリペプチドまたはその機能的に等価な変異体、およびＡｐｏＡポリペプチドまたはその機能的に等価な変異体をコードする核酸の群から選択される。
【００２５】
本明細書において「ＡｐｏＡポリペプチド」とは、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の一部を形成し、肝臓細胞表面の受容体と特異的に相互作用することができ、それによりＡｐｏＡタンパク質と連結しているこの器官に目的分子を輸送するその能力を保証するＡｐｏＡファミリーの任意のメンバーに関する。好ましくは、本発明において使用可能なＡｐｏＡ分子は、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶおよびＡｐｏＡ−Ｖ、またはその機能的に等価な変異体の群から選択される。
【００２６】
好ましい実施態様では、本発明において使用されるＡｐｏＡタンパク質はタンパク質ＡｐｏＡ−Ｉである。ＡｐｏＡ−Ｉは、本発明において、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の一部を形成する成熟型プレプロＡｐｏＡ−Ｉタンパク質として理解される。ＡｐｏＡ−Ｉは分泌シグナル配列を含む前駆体（プレプロＡｐｏＡ−Ｉ）として合成され、このシグナル配列が除去されて前駆体が次の段階へ進む。このシグナル配列は１８個のアミノ酸、６個のプロペプチド、そしてアミノ酸２４３個の成熟型タンパク質からなる。成熟型タンパク質としては、ペプチドシグナルを欠き、プロセシングを受けたものを用いるのが好ましい。好ましい実施態様では、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質はヒト起源であり、そのアミノ酸配列は配列番号１（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４７）に示されているものである。別の好ましい実施態様では、タンパク質ＡｐｏＡ−Ｉはネズミ起源、特にマウスのものであり、そのアミノ酸配列は配列番号２（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ００６２３）に示されているものである。別の好ましい実施態様では、ＡｐｏＡ−１タンパク質はネズミ起源、特にラットのものであり、そのアミノ酸配列は配列番号３（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４６３９）に示されているものである。
【００２７】
「ＡｐｏＡ−Ｉの機能的に等価な変異体」は、肝臓細胞に存在するＨＤＬ受容体を形成するいわゆる「スカベンジャー受容体クラスＢ  Ｉ型」（ＳＲ−ＢＩ）と相互作用するそれらの完全な能力を実質的に保持している、上述のＡｐｏＡ−Ｉ配列の１以上のアミノ酸の挿入、置換または欠失から得られる総てのポリペプチドを意味すると理解される。ＨＤＬ受容体と相互作用する能力は、本質的にMonaco et al (EMBO J., 1987, 6:3253-3260)に記載されているように、肝細胞の膜へのＡｐｏＡ−Ｉ結合試験か、または肝細胞膜の受容体へのＨＤＬの結合を阻害するＡｐｏＡ−Ｉもしくはその変異体の能力の測定によって決定される。好ましくは、肝細胞膜に結合するＡｐｏＡ−Ｉ変異体の解離定数は少なくとも１０−８Ｍ、１０−７Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍまたは１０−４Ｍである。
【００２８】
本発明において意図されるＡｐｏＡ−Ｉ変異体は、ＡｐｏＡ−Ｉポリペプチドと少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％または９５％の類似性または同一性を示すポリペプチドを含む。２つのポリペプチド間の同一性の程度は、コンピューターに実装されたアルゴリズムおよび当業者に広く知られている方法を用いて決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム(BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410)を用いて決定される。
【００２９】
好ましくは、本発明において使用されるＡｐｏＡ−Ｉ変異体は上述のＡｐｏＡ−Ｉに比べて高い血清半減期を示し、ＡｐｏＡ−Ｉの場合に見られるものよりも高い血清ＡｐｏＡ−Ｉレベルに到達させることができる。タンパク質、特に、ＡｐｏＡ−Ｉの血清半減期を決定する方法は当技術分野で公知であり、とりわけ、Eisenberg, S. et al (J. Lipid Res., 1973, 14:446-458)、Blum et al. (J. Clin. Invest., 1977, 60:795-807)およびGraversen et al (J Cardiovasc Pharmacol., 2008, 51:170-177)に記載されているマークタンパク質による代謝標識に基づく方法の使用が含まれる。高い半減期を示す前記変異体の一例として、例えば、ミラノ株（Ｒ１７３Ｃ突然変異を含む）として知られる変異体がある。
【００３０】
本発明の第一の成分は、ＡｐｏＡおよび上述のＡｐｏＡ変異体のうち少なくとも１つをコードする核酸であり得る。よって、ＡｐｏＡをコードする核酸の場合、それはＮＣＢＩ受託番号Ｘ０２１６２（配列番号４）の配列に相当するヒト起源のもの、ＮＣＢＩ受託番号Ｘ６４２６２（配列番号５）の配列に相当するネズミ起源のもの、ＮＣＢＩ受託番号Ｍ００００１（配列番号６）の配列に相当するラット起源のものであり得る。
【００３１】
当業者ならば、本発明の第一の成分を形成する核酸が細胞内で発現され、やがて媒体中に分泌される必要があり、そのため、ＡｐｏＡまたはその機能的に等価な変異体をコードする配列は５’末端に分泌シグナルをコードする配列を持てばよいことを認識するであろう。本発明において「分泌シグナル配列」という表現は、それらのＮ末端にその配列を有する総てのタンパク質を細胞の分泌経路へと誘導し得るアミノ酸配列を意味する。本発明において使用するのに好適なシグナル配列としては、とりわけ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、成長ホルモンＧＭ−ＣＳＦ、および免疫グロブリン、特に、ＩｇκまたはＩｇＶχのシグナル配列が挙げられる。好ましくは、本発明の成分Ａの一部を形成するシグナル配列は、それ自体従前に定義されたようなＡｐｏＡのシグナル配列である。
【００３２】
あるいは、本発明の第一の成分は、上述の配列のいずれかと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示す核酸であってもよく、ここで、同一性パーセンテージは、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴまたはＦＡＳＴＡ型のアルゴリズム（そのコンピューター実装はthe Wisconsin Genetics Software Package Release 7 (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)に見られ、Smith and Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2:482)、Needleman and Wunsch (J. Mol.. Biol. 1970, 48: 443)またはPearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 1988, 85:2444)のローカルアルゴリズムを用いる）を用いることで決定される（種々のパラメーターに関してデフォルト値を使用）。
【００３３】
あるいは、本発明の組成物の第一の成分は、ＡｐｏＡ、または従前に定義された種々の哺乳類のＡｐｏＡに相当する天然配列のいずれかと特異的にハイブリダイズし得るその変異体をコードするポリヌクレオチドである。本発明において「標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド」は、厳格な条件でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを意味するものと理解され、この厳格な条件とは、例えばおよそ６５℃の温度で、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５％デンハート溶液および１００μｇ／ｍｌ濃度の非特異的変性ＤＮＡの溶液、およびイオン強度が等価な他の任意の溶液中、特異的ハイブリダイズを可能とし、その後、例えば０．２％ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの溶液、およびイオン強度が等価な他の任意の溶液の存在下での洗浄工程が続く条件を意味するものと理解される。しかしながらやはり、これらの厳格な条件は、当業者により、ハイブリダイズさせる配列の大きさ、ＧＣ含量および他のパラメーターに従って適合させることができる。適当なハイブリダイゼーション条件を選択するのに好適な方法は、Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)により記載されている。
【００３４】
本発明の組成物の第二の成分
本発明の第二の成分は、ＩＬ１５またはその機能的に等価な変異体、およびＩＬ１５またはその機能的に等価な変異体をコードする核酸の群から選択される。
【００３５】
本発明において「ＩＬ１５」または「ＩＬ−１５」とは、その単離、クローニングおよび配列がGrabstein et al. (US5747024 and Grabstein et al., 1994, Science 246: 965-968)に記載されているサイトカインを意味する。ＩＬ１５は、天然ＩＬ１５のアミノ酸配列を有する任意のポリペプチド形態を含む。本発明の組成物および融合タンパク質の一部を形成する、使用可能なＩＬ１５の例としては、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター）ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジおよび類似のもののＩＬ１５が挙げられる。本発明の組成物および融合タンパク質の一部を形成し得る哺乳類のＩＬ１５ポリペプチドとしては、限定されるものではないが、ヒト起源のＩＬ１５（そのアミノ酸配列はＰ４０９３３（配列番号７）で示されるものである）；マウスＩＬ１５（そのアミノ酸配列はＰ４８３４６（配列番号８）で示される）、ラットＩＬ１５（そのアミノ酸配列はＰ９７６０４（配列番号９）で示される）、ネコＩＬ１５（そのアミノ酸配列はＯ９７６８７（配列番号１０）で示される）およびウシＩＬ１５（そのアミノ酸配列はＱ２８０２８（配列番号１１）で示されるものである）が挙げられる。
【００３６】
「ＩＬ１５の機能的に等価な変異体」は、上述のＩＬ１５配列のいずれかの１以上のアミノ酸の挿入、置換または欠失から得られ、かつ、ＩＬ１５の機能の少なくとも１つを実質的に完全な状態で保持する総てのポリペプチドを意味するものと理解され、ここで、該機能は下記のものから選択される。
【００３７】
・ＩＬ１５の変異体の存在下での末梢血単核細胞集団と抗原ペプチドとのインキュベーションに基づく、例えば、Montes, et al, (Clin. Exp. Immunol., 2005, 142:292-302)により記載されている方法によって測定されるＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を促進する能力。
【００３８】
・樹状細胞、マクロファージおよび好中球によりトランスで提供された後にＮＫ細胞の活性化を促進する能力。樹状細胞に関するこの能力は、ＩＬ１５の存在下でＣＤ５６＋  ＮＫ細胞の一部におけるトリチウム化チミジンの組込みを測定することによるか、またはＧＭ−ＣＳＦサイトカインのＮＫ細胞分泌を測定することによって決定することができる。双方のＩＬ１５機能を決定するための方法はCarson, W. et al. (J. Exp. med., 1994, 180:1395-1403)により記載されている。
【００３９】
・Demirci et al. (Cell Mol Immunol. 2004, 1:123-8)により記載されているような、Ｂ細胞前駆体におけるＦａｓにより媒介されるアポトーシスを阻害するＩＬ１５の能力（ＴＵＮＥＬなどのアポトーシスを測定するための標準的技術またはゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によるＤＮＡ断片の測定を用いて決定することができる）。
【００４０】
本発明において意図されるＩＬ１５の変異体は、上述の哺乳類のＩＬ１５ポリペプチドと少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％または９５％の類似性または同一性を示すポリペプチドを含む。２つのポリペプチド間の同一性の程度は、コンピューターに実装されたアルゴリズムおよび当業者に広く知られている方法を用いて決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム(BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410)を用いて決定される。
【００４１】
本発明の第二の成分は、天然ＩＬ１５および上述のＩＬ１５の変異体のうち少なくとも１つをコードする核酸であり得る。哺乳類ＩＬ１５をコードする核酸は核酸リポジトリから回収することができ、限定されるものではないが、その配列が受託番号Ｕ１４４０７（ヒト、配列番号１２）、Ｕ１４３３２（マウス、配列番号１３）、Ｕ６９２７２（ラット、配列番号１４）、ＡＦ１０８１４８（ネコ、配列番号１５）およびＵ４２４３３（ウシ、配列番号１６）により定義されるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４２】
前記ポリヌクレオチドは前述の配列のいずれかと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示すものを含み、同一性パーセンテージは上述のアルゴリズムの１つによって決定される。
【００４３】
あるいは、本発明の第二の成分を形成するポリヌクレオチドは、従前に定義されたポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドである。標的配列と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの能力を決定するための方法は、本発明の第一の成分に関して詳細に記載されている。
【００４４】
当業者ならば、本発明の第二の成分を形成する核酸は、ＩＬ１５または機能的に等価な変異体の媒体中への分泌を可能とするシグナル配列と機能的に結合されて見られることを認識するであろう。本発明において使用するのに好適なシグナル配列には、本発明の第一の成分に関して従前に記載されたものが含まれる。好ましくは、本発明の組成物の第二の成分の一部を形成するシグナル配列は、従前に定義されたＩＬ１５自体のシグナル配列または免疫グロブリンの１つ、特に、ＩｇκまたはＩｇＶχのシグナル配列である。
【００４５】
本発明の組成物の第三の成分
本発明の第三の成分は、ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインまたはその機能的に等価な変異体の群から選択される。
【００４６】
本発明において「ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメイン」（以下、ＩＬ１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ）という表現は、ＩＬ１５受容体α鎖の細胞外領域に見られ、ＩＬ１５受容体α鎖の遺伝子の第一エキソンに見られる最初のシステインで始まり、ＩＬ１５受容体α鎖の遺伝子のエキソン４によりコードされるシステインで終わる配列に相当するアミノ酸配列を意味する。あるいは、Ｓｕｓｈｉドメインは、シグナル配列の後のＩＬ１５受容体α鎖の最初のシステイン残基で始まり、前述の配列のシグナル配列の後の４番目のシステイン残基で終わる配列と定義される。本発明において使用するのに好適なＳｕｓｈｉドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号ＮＰ＿００２１８０の配列に相当するヒト起源ＩＬ１５受容体α鎖に由来するＳｕｓｈｉドメイン（そのＳｕｓｈｉドメインは配列：
CPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS LKC（配列番号１７）
に相当する）およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ６０８１９の配列に相当するマウスＩＬ１５受容体α鎖に由来するＳｕｓｈｉドメイン（そのＳｕｓｈｉドメインは配列：
CPPPV SIEHADIRVK NYSVNSRERY VCNSGFKRKA GTSTLIECVI NKNTNVAHWT TPSLKC（配列番号１８）
に相当する）を含む。
【００４７】
「ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインの機能的に等価な変異体」は、上述のヒト起源またはネズミＳｕｓｈｉドメイン配列のいずれかの配列の１以上のアミノ酸の挿入、置換または欠失から得られ、かつ、ＩＬ１５に対する実質的に完全な結合能を保持し、Mortier et al. (J. Biol. Chem., 2006, 281:1612-1619)により記載されているように、低親和性ＩＬ１５受容体を発現する細胞（例えば、Ｍｏ−７ｅまたは３２Ｄβ系統由来の細胞）におけるＩＬ１５の増殖効果を高める総てのポリペプチドを意味するものと理解される。
【００４８】
本発明において意図されるＩＬ１５Ｒα−ｓｕｓｈｉの変異体は、上述のポリペプチドと少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％または９５％の類似性または同一性を示すポリペプチドを含む。２つのポリペプチド間の同一性の程度は、コンピューターに実装されたアルゴリズムおよび当業者に広く知られている方法を用いて決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム(BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410)を用いて決定される。
【００４９】
本発明の第三の成分は、上述のような少なくとも１つのＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメイン（天然）およびその変異体をコードする核酸であり得る。哺乳類ＩＬ１５Ｒα−ｓｕｓｈｉをコードする核酸は、核酸レポジトリに見られる対応するα鎖の配列から回収することができ、限定されるものではないが、ヒトＩＬ１５受容体α鎖（ＮＣＢＩ受託番号：Ｕ３１６２８、配列番号１９）およびマウスＩＬ１５受容体α鎖（ＮＣＢＩ受託番号：Ｕ２２３３９、配列番号２０）のＩＬ１５Ｒα−ｓｕｓｈｉをコードする配列が含まれる。
【００５０】
前記ポリヌクレオチドは、上述の配列のいずれかと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示すものを含み、同一性パーセンテージは上述のアルゴリズムのいずれかを用いて決定される。
【００５１】
あるいは、本発明の第三の成分を形成するポリヌクレオチドは、従前に定義されたポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドである。標的配列と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの能力を決定する方法は、本発明の第一の成分に関して詳細に記載されている。
【００５２】
当業者ならば、本発明の第二の成分を形成する核酸がＳｕｓｈｉドメインまたはその機能的に等価な変異体の媒体中への分泌を可能とするシグナル配列と機能的に結合されて見られることを認識するであろう。本発明において使用するのに好適なシグナル配列には、本発明の組成物の第一の成分に関して従前に記載されたものが含まれる。好ましくは、本発明の組成物の第二の成分の一部を形成するシグナル配列は、従前に定義されたＩＬ１５自体のシグナル配列または免疫グロブリンの１つ、特に、ＩｇκまたはＩｇＶχのシグナル配列である。
【００５３】
好ましい実施態様では、本発明の組成物の第三の成分は、配列番号２１として定義される配列を含んでなるまたはからなり、ヒトＩＬ１５ＲＡ受容体のＳｕｓｈｉドメインと、その前にその固有のシグナルペプチド（配列番号２２）を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００５４】
本発明の組成物は、種々の種に由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドにより形成され得る。しかしながら好ましい実施態様では、これら３つの成分は、同じ動物種に由来する。好ましい実施態様では、３つの成分はヒト起源のものである。別の好ましい実施態様では、３つの成分はネズミ起源のものである。
【００５５】
第一の成分および第二の成分が単一分子を形成する組成物
本発明の著者らは、本発明の組成物の第一の成分と第二の成分が単一分子の一部を形成する場合にＩＬ１５の抗腫瘍活性に対する相乗効果が得られることを見出した。この場合、本発明の組成物は第一の成分（上記で定義される第一の成分と第二の成分を含んでなることになる）および第二の成分（上記で定義される第三の成分に相当する）により形成されるバイナリー組成物である。当業者ならば、組成物の第一の成分および第二の成分がポリペプチドであれば、該単一分子は、（ｉ）ＡｐｏＡポリペプチドまたはその機能的に等価な変異体と（ｉｉ）ＩＬ１５またはその機能的に等価な変異体とを含んでなる融合タンパク質であることを認識するであろう。
【００５６】
本発明において「融合タンパク質」とは、異なるまたは異種のタンパク質に由来する２以上の領域を含んでなるポリペプチドを意味する。
【００５７】
あるいは、組成物の第一の成分および第二の成分が双方ともポリヌクレオチドである場合、該単一分子は、（ｉ）ＡｐｏＡポリペプチドまたはその機能的に等価な変異体を含んでなるポリペプチドと、（ｉｉ）ＩＬ１５またはその機能的に等価な変異体を含んでなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００５８】
この場合、第一の成分および第二の成分がペプチド性のものである際には、本発明は、第一の成分が第二の成分に対してＮ末端にある組成物、および第一の成分が第二の成分に対してＣ末端にある組成物を意図する。
【００５９】
第一の成分および第二の成分がポリヌクレオチド性である場合、本発明は、第一の成分が第二の成分に対して５’位にある組成物、および第一の成分が第二の成分に対して３’位にある組成物を意図する。
【００６０】
いずれの場合でも、第一の成分と第二の成分は直接結合させることができ、言い換えれば、第一の成分のＣ末端を第二の成分のＮ末端と結合させるか、または第二の成分のＣ末端を第一の成分のＮ末端と結合させるか、または第一の成分の３’末端を第二の成分の５’末端と結合させることができ、および第二の成分の３’末端が第一の成分の５’末端と結合されている組成物。
【００６１】
あるいは、別の態様において、本発明は、第一の成分および第二の成分の融合がペプチドリンカーを介して（第一の成分および第二の成分がポリペプチド性である場合）またはペプチドリンカーをコードする配列を介して（第一の成分および第二の成分がポリヌクレオチド性である場合）行われる組成物を意図する。
【００６２】
本発明において「ペプチドリンカー」、「リンカー」、「コネクター」、「スペーサー」またはその文法的に等価な表現は、２つの分子を接続し、多くの場合、接続された分子に機能的構成を獲得させる分子を意味する。リンカーペプチドは好ましくは、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸またはおよそ１００個のアミノ酸を含んでなる。
【００６３】
本発明において好適なリンカーとしては、
・グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択される２以上のアミノ酸を含んでなるリンカー、例えば、限定されるものではないが、Muller, K.M. et al. (Methods. Enzimology, 2000, 328: 261-281)により記載されている配列SGGTSGSTSGTGST（配列番号２３）、AGSSTGSSTGPGSTT（配列番号２４）、GGSGGAP（配列番号２５）およびGGGVEGGG（配列番号２６）のリンカー；
・テトラネクチンのβシートを形成するテトラネクチンの残基５３〜５６、およびテトラネクチンのターンを形成する残基５７〜５９に基づくリンカー(Nielsen, B.B. et al., FEBS Lett. 412: 388-396, 1997)、例えば、配列GTKVHMK（配列番号２７）のリンカー；
・アミノ酸１９９２〜２１０２に相当するヒトフィブロネクチンのリンカーシート３の部分配列、例えば、アミノ酸番号２０３７〜２０４９に相当するリンカーPGTSGQQPSVGQQ（配列番号２８）に基づくリンカー（中でもアミノ酸２０３８〜２０４２残基に相当する部分配列断片GTSGQ（配列番号２９）がより好ましい）；
・ネズミＩｇＧ３の上流ヒンジ領域のアミノ酸１０残基の配列に基づくリンカー、例えば、コイルドヘリックスの手段による二量体抗体の作製に用いられている配列PKPSTPPGSS（配列番号３０）のリンカー(Pack P. and Pluckthun, A., 1992, Biochemistry 31:1579-1584)；
・配列APAETKAEPMT（配列番号３１）のリンカーペプチド；
・配列GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ（配列番号３２）のリンカーペプチド；
・配列GAPのリンカーペプチド
が挙げられる。
【００６４】
あるいは、本発明の結合体の２成分は、その配列がプロテアーゼの切断標的を含み、それにより、成分（ｉｉ）からのＡｐｏＡ−Ｉの分離を可能とするペプチドによって接続されていてもよい。本発明のポリペプチドに組み込むのに好適なプロテアーゼ切断部位としては、エンテロキナーゼ（切断部位DDDDK配列番号３３）、Ｘａ因子（切断部位IEDGR、配列番号３４）、トロンビン（切断部位LVPRGS、配列番号３５）、ＴＥＶプロテアーゼ（切断部位ENLYFQG、配列番号３６）、ＰｒｅＳｃｉｓｓｓｉｏｎプロテアーゼ（切断部位LEVLFQGP、配列番号３７）、インテインおよび類似のものがあげられる。好ましい実施態様では、切断部位は、腫瘍組織、炎症組織または肝臓（結合体がひと度肝臓に達するとＡｐｏＡと成分（ｉｉ）の分離が起こる形）で発現されるプロテアーゼの切断部位である。好ましい実施態様では、リンカーはマトリックスメタロプロテイナーゼ９認識部位（切断部位LFPTS、配列番号３８）を含む。
【００６５】
本発明を、第一の成分と第二の成分の融合から得られる成分（ＡｐｏＡとＩＬ１５との融合タンパク質）および第三の成分（ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメイン）の双方が核酸の形態で用いられる組成物を用いて例示したが、本発明は両成分が核酸である組成物に限定されず、別法として第一の成分および／または第二の成分がポリペプチドである組成物も意図する。よって、本発明は、
・ＡｐｏＡおよびＩＬ１５により形成される融合タンパク質を含んでなるポリペプチドと、ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインを含んでなるポリペプチド；
・ＡｐｏＡおよびＩＬ１５により形成される融合タンパク質を含んでなるポリペプチドと、ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
・ＡｐｏＡおよびＩＬ１５により形成される融合タンパク質を含んでなるポリペプチドとＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
・ＡｐｏＡおよびＩＬ１５により形成される融合タンパク質を含んでなるポリペプチドとＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド
により形成される組成物を意図する。
【００６６】
本発明の組成物の一部を形成する成分間の比率は、各特定の場合に用いられる第一の成分および第二の成分の誘導剤ならびに必要とされる使用によって異なる。よって、本発明は、２成分間の量の比率が５０：１〜１：５０の間、特に、２０：１〜１：２０の間、１：１０〜１０：１の間、または５：１〜１：５の間の範囲であり得る組成物を意図する。
【００６７】
第一の成分および第二の成分が単一分子を形成する組成物の場合、単一分子の一部を形成する成分は同じ種に由来するのが好ましいが、各成分は異なる種に由来してもよい。よって、好ましい実施態様では、ＡｐｏＡまたはその機能的に等価な変異体はヒト起源のものであり、ＩＬ１５またはその機能的に等価な変異体はヒト起源のものである。別の好ましい実施態様では、ＡｐｏＡまたはその機能的に等価な変異体はネズミ起源のものであり、ＩＬ１５またはその機能的に等価な変異体はネズミ起源のものである。
【００６８】
好ましい実施態様では、組成物の第一の成分を形成する単一分子は、GAP配列を示すリンカーにより隔てられているヒト起源ＡｐｏＡＩポリペプチドとヒト起源ＩＬ１５により形成される。該融合物をコードするポリヌクレオチドは、本発明において配列番号３９として識別される配列を示す。
【００６９】
別の好ましい実施態様では、組成物の第一の成分を形成する単一分子は、GAP配列を示すリンカーにより隔てられているネズミ起源ＡｐｏＡＩポリペプチドとヒト起源ＩＬ１５により形成される。該融合物をコードするポリヌクレオチドは、本発明において配列番号４０として識別される配列を示す。
【００７０】
別の好ましい実施態様では、組成物の第一の成分を形成する単一分子は、GAP配列を示すリンカーにより隔てられているネズミ起源ＡｐｏＡＩポリペプチドとネズミ起源ＩＬ１５により形成される。該融合物をコードするポリヌクレオチドは、本発明において配列番号４１として識別される配列を示す。
【００７１】
ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインまたはその機能的に等価な変異体を含んでなるポリペプチドは、ヒト起源またはネズミ起源のものであり得る。しかしながらやはり、単一分子を形成する成分が双方ともヒト起源であれば、ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインまたはその機能的に等価な変異体もヒト起源であるのが好ましい。あるいは、単一分子を形成する成分が双方ともネズミ起源であれば、ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインまたはその機能的に等価な変異体もネズミ起源であるのが好ましい。
【００７２】
別の態様において、本発明は、ＡｐｏＡまたはその機能的に等価な変異体とＩＬ１５またはその機能的に等価な変異体を含んでなる融合タンパク質を意図する。「ＡｐｏＡ」、「ＩＬ１５」、「ＡｐｏＡの機能的に等価な変異体」、「ＩＬ１５の機能的に等価な変異体」は上記で詳細に説明したが、融合タンパク質の場合にも本質的に同様に用いられる。
【００７３】
融合タンパク質は、ＩＬ−１５のＮ末端にポリペプチドＡｐｏＡを示してもよいし、またはＡｐｏＡのＮ末端にポリペプチドＩＬ−１５を示してもよい。同様に、両成分は直接連結されていてもリンカーにより連結されていてもよく、このリンカーは本発明に記載されているいずれのリンカーであってもよい。また、これらの成分は、本発明が、ヒト起源ＡｐｏＡとＩＬ１５の融合物、ネズミ起源ＡｐｏＡとＩＬ１５の融合物、およびＡｐｏＡがヒト起源であってＩＬ１５がネズミ起源である場合のＡｐｏＡとＩＬ１５の融合物、ＡｐｏＡがネズミ起源であってＩＬ１５がヒト起源である場合のＡｐｏＡとＩＬ１５の融合物を意図するように、ヒトまたはネズミ起源のものであってよい。
【００７４】
本発明の好ましい実施態様では、ＡｐｏＡとＩＬ１５の融合タンパク質は、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１の配列を有するポリペプチドに相当する。
【００７５】
本発明の融合タンパク質
別の態様において、本発明は、
（ｉ）ＡｐｏＡポリペプチド、または該ＡｐｏＡポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体により形成される、領域Ａ、
（ｉｉ）ＩＬ１５、またはＩＬ１５と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体により形成される、領域Ｂ、および
（ｉｉｉ）ＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメイン、またはＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的に等価な変異体により形成される、領域Ｃ
を含んでなる融合タンパク質に関する。
【００７６】
該融合タンパク質の領域Ａは本発明の組成物の第一の成分と本質的に同じであり、このことはそれが上記で詳細に記載されていることを意味する。
【００７７】
該融合タンパク質の領域Ｂは本発明の組成物の第二の成分と本質的に同じであり、このことはそれが上記で詳細に記載されていることを意味する。
【００７８】
該融合タンパク質の領域Ｃは本発明の組成物の第三の成分と本質的に同じであり、このことはそれが上記で詳細に記載されていることを意味する。
【００７９】
当業者ならば、本発明の融合タンパク質が領域Ａ、ＢおよびＣの種々の配置を示し得ることを認識するであろう。よって、本発明は、
・領域ＡがＮ末端にあり、領域Ｂが中央にあり、領域ＣがＣ末端にある融合タンパク質、
・領域ＡがＮ末端にあり、領域Ｃが中央にあり、領域ＢがＣ末端にある融合タンパク質、
・領域ＢがＮ末端にあり、領域Ａが中央にあり、領域ＣがＣ末端にある融合タンパク質、
・領域ＢがＮ末端にあり、領域Ｃが中央にあり、領域ＡがＣ末端にある融合タンパク質、
・領域ＣがＮ末端にあり、領域Ａが中央にあり、領域ＢがＣ末端にある融合タンパク質、および
・領域ＣがＮ末端にあり、領域Ｂが中央にあり、領域ＡがＣ末端にある融合タンパク質
を意図する。
【００８０】
また、領域Ａ、Ｂおよび／またはＣは直接結合されていてもよく、言い換えれば、ある領域のＣ末端アミノ酸が別の領域のＮ末端アミノ酸にペプチド結合によって連結されている。あるいは、種々の領域がペプチドリンカーによって連結されている。本発明の融合タンパク質に好適なリンカーは本発明の組成物で用いられるものと本質的に同じであり、上記に詳細に記載されている。当業者ならば、これら３つの領域のうち２つだけがリンカーにより連結されているか、３つの領域がリンカーにより連結されているかによって１または２つのペプチドリンカーを含み得ることを認識するであろう。
【００８１】
好ましい実施態様では、融合タンパク質はＣ−Ｂ−Ａ型の配置を示し、言い換えれば、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＩＬ１５ＲαのＳｕｓｈｉドメイン領域Ｃ）、ＩＬ１５（領域Ｂ）およびＡｐｏＡＩ（領域Ａ）を含んでなる。いっそうより好ましい実施態様では、領域ＣとＢはGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ型リンカー（配列番号３２）により隔てられている。別の実施態様では、領域ＢとＡはGAP型リンカーにより隔てられている。いっそうより好ましい実施態様では、領域ＣとＢはGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ型リンカー（配列番号３２）により隔てられ、領域ＢとＡはGAP型リンカーにより隔てられている。
【００８２】
本発明の融合タンパク質は領域Ａ、ＢおよびＣがネズミ起源のものである融合タンパク質で例示されるが、当業者ならば、本発明が上述の領域の種々の変異体の中でも、領域Ａ、ＢおよびＣのそれぞれが異なる起源のものである融合タンパク質を意図することを認識するであろう。
【００８３】
よって、好ましい実施態様では、該融合タンパク質は、ヒト起源またはネズミ起源の領域Ａ、ヒト起源またはネズミ起源の領域Ｂ、ヒト起源またはネズミ起源の領域Ｃを含んでなる。いっそうより好ましい実施態様では、これらの３つの領域は同じ生物体に由来する。よって、いっそうより好ましい実施態様では、領域Ａ、ＢおよびＣはネズミ起源のものである。別の好ましい実施態様では、領域Ａ、ＢおよびＣはヒト起源のものである。
【００８４】
好ましい実施態様では、該融合タンパク質は、３つの成分がヒト起源のものであり、かつ、領域ＣとＢならびに領域ＢとＡの双方がペプチドリンカーにより接続されているＣ−Ｂ−Ａ型の配置を示す。好ましい実施態様では、該融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ヒトＩＬ１５ＲαのＳｕｓｈｉドメイン（領域Ｃ）、ヒトＩＬ１５（領域Ｂ）およびヒトＡｐｏＡＩ（領域Ａ）を含んでなる。いっそうより好ましい実施態様では、領域ＣとＢはGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ型リンカーにより隔てられている。別の実施態様では、領域ＢとＡはGAP型リンカーにより隔てられている。いっそうより好ましい実施態様では、領域ＣとＢはGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ型リンカーにより隔てられ、領域ＢとＡはGAP型リンカーにより隔てられている。好ましい実施態様では、該融合タンパク質は配列番号４２で定義される配列を含んでなる。
【００８５】
別の好ましい実施態様では、該融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ネズミＩＬ１５ＲαのＳｕｓｈｉドメイン（領域Ｃ）、ネズミＩＬ１５（領域Ｂ）およびネズミＡｐｏＡＩ（領域Ａ）を含んでなる。いっそうより好ましい実施態様では、領域ＣとＢはGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ型リンカーにより隔てられている。別の実施態様では、領域ＢとＡはGAP型リンカーにより隔てられている。いっそうより好ましい実施態様では、領域ＣとＢはGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ型リンカーにより隔てられ、領域ＢとＡはGAP型リンカーにより隔てられている。好ましい実施態様では、該融合タンパク質は配列番号４３で定義される配列を含んでなる。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクターおよび宿主細胞
別の態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを意図する。本発明の融合タンパク質が細胞外媒体からその機能を遂行することを考えれば、ポリヌクレオチドは、融合タンパク質の分泌経路への接近および融合タンパク質の媒体中への分泌を可能とするシグナル配列とともに本発明の融合タンパク質をコードすることが便利である。該融合タンパク質とともに用いるのに好適なシグナル配列としては、融合タンパク質成分のいずれかのシグナル配列（ＡｐｏＡのシグナル配列、ＩＬ１５のシグナル配列、もしくはＩＬ１５受容体α鎖のシグナル配列）または本発明の組成物の第一の成分に関して上述されたいずれかのシグナル配列、言い換えれば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、成長ホルモン、ＧＭ−ＣＳＦおよび免疫グロブリンの好適なシグナル配列、特に、ＩｇκまたはＩｇＶχのシグナル配列の双方が含まれる。
【００８７】
好ましい実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ヒト起源Ｓｕｓｈｉドメイン、ヒト起源ＩＬ１５およびヒト起源ＡｐｏＡ１を含んでなる融合タンパク質または結合体をコードする、配列番号４４で定義される配列を含んでなり、ここで、このＳｕｓｈｉドメインとＩＬ１５は配列GGSGGGGSGGGSGGGGSLQのリンカーにより隔てられ、ＩＬ１５とＡｐｏＡ１は配列GAPのリンカーにより隔てられ、この融合物の前にヒト起源ＩＬ−１５受容体α鎖のシグナル配列がある。
【００８８】
好ましい実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ネズミ起源Ｓｕｓｈｉドメイン、ネズミ起源ＩＬ１５およびネズミ起源ＡｐｏＡ１を含んでなる融合タンパク質または結合体をコードする配列番号４５として示される配列を含んでなり、ここで、ＳｕｓｈｉドメインとＩＬ１５は配列GGSGGGGSGGGSGGGGSLQのリンカーにより隔てられ、ＩＬ１５とＡｐｏＡ１は配列GAPのリンカーにより隔てられ、この融合物の前にネズミ起源ＩＬ−１５受容体α鎖のシグナル配列がある。
【００８９】
本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、発現の調節領域と機能的に連結し、それにより遺伝子構築物を作出することができる。よって、別の態様において、本発明は本発明のポリヌクレオチドを含んでなる遺伝子構築物に関する。好ましくは、該構築物は、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する配列の操作的制御下に置かれた本発明のポリヌクレオチドを含んでなる。当業者ならば、本発明のポリヌクレオチドが標的組織の核に接近し、核内で転写および翻訳されて生物学的に活性な融合タンパク質を生じなければならないことを認識するであろう。
【００９０】
基本的に、いずれのプロモーターも、そのプロモーターがポリヌクレオチドを発現させる細胞に適合した条件で、本発明の遺伝子構築物に使用することができる。よって、本発明を実施するのに好適なプロモーターとしては、限定されるものではないが、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ＣＭＶ、鳥類肉腫ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスなどの真核生物ウイルスのゲノムに由来するもの、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ領域、免疫グロブリン遺伝子プロモーター、アクチン遺伝子プロモーター、ＥＦ−１α遺伝子プロモーターといった構成プロモーター、ならびにテトラサイクリン系、ＮＦκＢ／紫外線系、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系および熱ショック遺伝子プロモーターといった、タンパク質の発現が分子または外因性シグナルの付加に依存する誘導プロモーター、ＷＯ／２００６／１３５４３６に記載されているＲＮＡポリメラーゼＩＩの調節可能なプロモーターならびに特異的組織プロモーターが挙げられる。
【００９１】
本発明のポリヌクレオチドまたはそれらを含んでなる遺伝子構築物はベクターの一部を形成し得る。よって、別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物を含んでなるベクターに関する。当業者ならば、このようなベクターは、結合体を精製するのに好適な種々の異種生物において好適なポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、または発現ベクターの増幅および取得に好適なクローニングベクターであり得るので、使用可能なベクターのタイプに関して制限はないことを認識するであろう。よって、本発明において好適なベクターとしては、原核生物の発現ベクター（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥＩ、ｐＣＲＩ、ＲＰ４、ファージおよび「シャトル」ベクター（ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８など）など）、酵母発現ベクター（２−ｍｉｃｒａプラスミド型ベクター、組込型プラスミド、ＹＥＰベクター、動原体プラスミドおよび類似のもの、昆虫細胞の発現ベクター（ｐＡＣ系およびｐＶＬ系ベクターなど）、植物の発現ベクター（ｐＩＢＩ系、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ系、ｐＡＶＡ系、ｐＣＡＭＢＩＡ系、ｐＧＳＡ系、ｐＧＷＢ系、ｐＭＤＣ系、ｐＭＹ系、ｐＯＲＥ系および類似のもののベクターなど）、ならびにｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ  ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦＩ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸＩ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴＩなどの非ウイルスベクターの他、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルスならびにレトロウイルスおよびレンチウイルス）に十分基づく優れた真核細胞における発現ベクターが挙げられる。
【００９２】
本発明のベクターは前記ベクターによる形質転換、トランスフェクションまたは感染に感受性のある細胞を形質転換、トランスフェクトまたは感染させるために使用可能である。該細胞は原核生物であっても真核細胞であってもよい。例として、該ＤＮＡ配列が導入されるベクターは、宿主細胞に導入された際に、その細胞のゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体（染色体群）と一緒に複製するプラスミドまたはベクターであり得る。該ベクターは当業者に公知の従来法（Sambrook et al., 2001, 前掲）によって得ることができる。
【００９３】
よって、別の態様において、本発明は、本発明により提供された構築物またはベクターでその細胞を形質転換、トランスフェクトまたは感染可能であったポリヌクレオチド、遺伝子構築物またはベクターを含んでなる細胞に関する。形質転換細胞、トランスフェクト細胞または感染細胞は当業者に公知の従来法（Sambrook et al., 2001, 前掲）によって得ることができる。特定の実施態様では、該宿主細胞は適当なベクターでトランスフェクトされた、または適当なベクターに感染させた動物細胞である。
【００９４】
本発明の結合体の発現に好適な宿主細胞としては、限定されるものではないが、哺乳類、植物、昆虫、真菌および細菌の細胞が挙げられる。細菌細胞としては、限定されるものではないが、バチルス属、ストレプトミセス属およびブドウ状球菌属の種などのグラム陽性細菌の細胞、ならびにエシェリキア属およびシュードモナス属の細胞などのグラム陰性菌の細胞が挙げられる。真菌細胞としては、好ましくは、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)およびハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)などの酵母細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、限定されるものではないが、ショウジョウバエおよびＳｆ９細胞のものが挙げられる。植物細胞としては、とりわけ、穀類、薬用植物または観賞植物または球根などの作物由来の細胞が挙げられる。本発明に好適な哺乳類細胞としては、上皮細胞系統（ブタなど）、骨肉腫細胞系統（ヒトなど）、神経芽腫細胞系統（ヒトなど）、上皮癌（ヒトなど）、グリア細胞（ネズミなど）、肝臓細胞系統（サルなど）ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、２９３細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、ヒトＥＣＣ系ＮＴＥＲＡ−２細胞、ｍＥＳＣ系のＤ３細胞、ヒト胚幹細胞（ＨＳ２９３およびＢＧＶ０１、ＳＨＥＦ１、ＳＨＥＦ２およびＨＳ１８１など）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３Ｔ細胞、ＲＥＨ細胞およびＭＣＦ−７細胞、およびｈＭＳＣ細胞が挙げられる。
【００９５】
本発明のin vitro法
抗原感作Ｔリンパ球の増殖を促進するＩＬ１５の能力はすでに記載されている。例えば、単離されたリンパ球の集団を同定された抗原に事前に曝したものをＩＬ１５と接触させるとリンパ球の増殖が高まることが実証されている。この大量増殖されたリンパ球集団を養子免疫療法に用い、それにより、これを次にその最初の集団を得た患者に再投与することができる。従って、別の態様において、本発明は、事前に前記抗原に曝されたリンパ球の集団を本発明の組成物、本発明の融合タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の遺伝子構築物、または本発明の宿主細胞と接触させることを含む、抗原特異的Ｔリンパ球の大量増殖を促進するin vitro法に関する。
【００９６】
「大量増殖」とは、本発明では、増殖と区別して用いられ、細胞分裂または細胞成長として理解されるべきである。大量増殖は、Transplantation (1999) 67: 605-613に記載されている方法などの広く知られている方法を用いて測定することができる。
【００９７】
本発明において「抗原特異的Ｔリンパ球」という表現は、特定の抗原を認識することができるリンパ球集団を意味する。一般に、リンパ球は該抗原に曝された患者から単離される。あるいは、抗原は米国特許第６８２８１５０号または同第６７８７１５４号に記載されているような人工抗原提示系においてリンパ球集団と接触させてもよい。
【００９８】
本明細書において「抗原」とは、その抗原に不寛容である被験体において免疫応答を誘発し得る任意の物質を意味する。抗原は被験体自身に由来するものであっても（この場合、それは自己抗原である）、または同種抗原、言い換えれば、同じ種の個体から得られた抗原であってもよい。あるいは、抗原は異種抗原、言い換えれば、異なる種の個体に由来する抗原であってもよい。
【００９９】
本発明の方法において使用可能なリンパ球としては、限定されるものではないが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、Ｔヘルパー細胞、リンホカイン活性化細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬＳ）、ＮＫ細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞ならびに様々な量の前述の１以上の細胞を含んでなる細胞集団が挙げられる。好ましい実施態様では、リンパ球はＣＴＬである。次に本発明の方法を用いてin vitroで大量増殖を行うためのＣＴＬを得るのに好適な方法は当業者に広く知られ、限定されるものではないが、末梢血、臍帯血、リンパ球含有組織からの単離が挙げられる。好ましい実施態様では、リンパ球は特定の疾患を有する患者のリンパ節からのドレナージにより単離される。
【０１００】
リンパ球が単離されたら、それらをリンパ球が大量増殖を行うのに好適な条件で本発明の組成物、本発明の融合タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の遺伝子構築物または本発明の宿主細胞と接触させる。抗原特異的ＣＴＬの大量増殖のための一般的条件は、周知の方法[例えば、Carter J. et al., Immunology, 57 (1), 123-129, (1996)]に従って確立することができ、当業者により慣例的に至適化することができる。一般に、リンパ球と本発明の組成物、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、遺伝子築物または宿主細胞との接触は、該細胞に好適な培地でリンパ球を培養する手段によって行われる。該細胞は従来の条件下、最小基本培地またはＲＰＭＩ  １６４０培地を含む、リンパ球の成長に好適な培地中で培養することができる。細胞成長を促進するために、血清、例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清および抗生物質、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンをはじめとする必要な増殖因子および生存因子を添加してもよい。リンパ球は、成長を助けるのに必要な条件、例えば約３７℃の好適な温度および例えば空気＋５％ＣＯ２の雰囲気で維持する。
【０１０１】
好ましい実施態様では、リンパ球は、in vitroでそれらの活性化を促進するために本発明の化合物を用いて刺激する前に、それらのリンパ球をそれらが特異的な抗原と接触させることによって処理することができる。これは免疫抑制物質を産生する腫瘍を有する患者の場合に特に必要である。これを達成するには、リンパ球の培養物を適当な抗原で刺激することが必要である。一般に、この抗原は、Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介してシグナルが誘導される形でＴ細胞に提示される。好ましくは、抗原は抗原提示細胞の手段によってＴ細胞に提示され得る。
【０１０２】
本発明において「抗原提示細胞」という表現は、抗原をＴリンパ球に提示する手段によって免疫応答の創出に寄与する細胞を意味する。抗原提示細胞としては、樹状細胞、単核食細胞、Ｂリンパ球またはランゲルハンス細胞を含む。抗原提示細胞は例えば骨髄、血液、胸腺、表皮、肝臓または胎児肝臓から単離することができる。
【０１０３】
抗原が腫瘍抗原である場合、自己腫瘍および／または組換え腫瘍抗原の抽出物を使用することができる。病原体由来の抗原である場合には、大量増殖前のリンパ球の活性化は、病原体感染細胞、例えば病原体の抗原を提示するウイルスを用いて行うことができる。
【０１０４】
本発明の抗原特異的ＣＴＬ大量増殖のための方法では、本発明の組成物、融合タンパク質による細胞の処置は抗ＣＤ３抗体、好ましくは、ヒトモノクローナル抗ＣＤ３抗体、より好ましくはＯＫＴ３の存在下で行うのが好ましい。大量増殖過程の抗ＣＤ３抗体の濃度は特に限定されず、例えば、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬである。それに加えて、またはその代わりに、細胞を抗ＣＤ２８抗体、より好ましくはヒトモノクローナル抗ＣＤ２８抗体と同時培養してもよい。それに加えて、またはその代わりに、細胞をレクチンなどのリンパ球刺激因子と同じ培養することもできる。また、これらの成分の１以上を固相に固定化することもできる。
【０１０５】
また、本発明の抗原特異的ＣＴＬの大量増殖法では、状況に応じて細胞をフィーダー細胞と同時培養することもできる。基本的に、フィーダー細胞が本発明のタンパク質もしくは組成物と、またはＣＴＬ増殖を促進する能力において前段落に記載した薬剤と共働する条件で使用することができるフィーダー細胞の種類に関して制限はない。好ましくは、好適なフィーダー細胞としては、限定されるものではないが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および自己または非自己ＥＢＶ−Ｂ細胞が挙げられる。通常、好ましくは、Ｘ線またはマイトマイシンなどの細胞傷害性薬剤で処置することによってそれらの増殖能を事前に消失させたフィーダー細胞が処理される。
【０１０６】
本発明の方法に従って得られたリンパ球集団の細胞傷害活性は周知の方法を用いて測定することができる。例えば、マークされた標的細胞の溶解を誘発するリンパ球の能力を測定すること、およびマークされた物質の放出を測定することが可能である。あるいは、細胞傷害活性は、リンパ球または標的細胞により産生されるサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γ）のレベルを特定することによって測定することができる。あるいは、細胞傷害活性は、リンパ球を、第一の蛍光分子でマークされた細胞傷害性リンパ球の特異的抗体、および抗原ペプチドと第二の蛍光分子でマークされた主要組織適合性複合体により形成される複合体と接触させた後、両分子でマークされた細胞をフローサイトメトリーの手段によって検出することにより測定することができる。
【０１０７】
本発明の方法に従って大量培養されるリンパ球集団は、養子免疫療法のために、言い換えれば、特異的抗原に対してより高い免疫応答を必要とする被験体に再投与するために特に有用である。好ましくは、Ｔリンパ球は自己に使用され、言い換えれば、そのＴリンパ球が最初に抽出された被験体に再投与される。
【０１０８】
本発明の医薬組成物
本発明の組成物、ポリヌクレオチドおよび融合タンパク質は、ＩＬ１５の長期投与を必要とする疾患を治療するのに有用である。よって、別の態様において、本発明は、治療上有効な量の本発明による組成物、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクターまたは宿主細胞と薬学上許容される賦形剤またはビヒクルとを含んでなる医薬製剤に関する。
【０１０９】
本発明において用いるのに好適な賦形剤としては、糖類、デンプン類、セルロース類、ガム類およびタンパク質が挙げられる。好ましい実施態様では、本発明の医薬組成物は、固体（例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、顆粒剤、坐剤、再構成して液体形とすることができる結晶性または非晶質無菌固体など）、液体（例えば、溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル剤、ローション、軟膏(unguent)など）または半固体（ゲル、軟膏(ointment)、クリームおよび類似のもの）として投与するための医薬形に処方される。本発明の医薬組成物は、限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内(intratecal)、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所的、舌下または直腸経路を含む任意の経路により投与することができる。有効成分の種々の投与形、用いる賦形剤およびそれらの製造方法の修正については、Tratado de Farmacia Galenica, C. Fauli i Trillo, Luzan 5, S.A. de Ediciones, 1993およびRemington’s Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 20th edition, Williams & Wilkins PA, USA (2000)に見出すことができる。薬学上許容されるビヒクルの例は当技術の現状において公知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション（油／水エマルションなど）、種々のタイプの湿潤剤、無菌溶液などが挙げられる。このようなビヒクルを含んでなる組成物は当技術の現状において公知の従来法によって処方することができる。
【０１１０】
あるいは、本発明の組成物および化合物は、組成物がＡｐｏＡタンパク質もしくはＡｐｏＡと第二の成分（ＩＬ１５またはＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメイン）の融合物を含んでなる場合、または本発明がＡｐｏＡ、ＩＬ１５およびＩＬ１５ＲＡのＳｕｓｈｉドメインを含んでなる融合タンパク質を意図する場合に、ナノリポ粒子(nanolipoparticle)として処方することができる。ナノリポ粒子の形成は高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主成分であるＡｐｏＡに基づく。
【０１１１】
本発明において「ナノリポ粒子」とは、「リポタンパク質」または「リポタンパク質粒子」に等しく、区別無く用いることができる。ナノリポ粒子は、アポタンパク質、リン脂質および遊離コレステロールにより形成される極性外層に覆われた非極性脂質（エステル化コレステロールおよびトリグリセリド）の核により形成される任意の水溶性粒子を意味するものと理解される。
【０１１２】
ナノリポ粒子またはリポタンパク質はそれらの密度に応じて、カイロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤ）、中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に分類される。リポタンパク質の種々の特徴を表１に示す。
【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
さらに特定の実施態様では、ナノリポ粒子は、上記の表に示された組成を有すること、およびタンパク質画分を形成するアポリポタンパク質がＡｐｏＡ、ＡｐｏＣ、ＡｐｏＤおよびＡｐｏＥであることを特徴とするＨＤＬ型リポタンパク質である。
【０１１５】
ナノリポ粒子は、当技術分野で公知の従来法によって得ることができる。例として、ナノリポ粒子は、in vitroにおいて、Lerch et al. (Vox Sang, 1996, 71: 155-164)に記載されているように融合タンパク質にコレステロールおよびホスファチジルコリンを加えることにより、またはin vivoにおいて、肝臓において本発明の結合体を発現する非ヒト動物を用いてナノリポ粒子を形成させる（なお、これらのナノリポ粒子は血清中に分泌され、血清から単離することができる）ことによって得ることができる。
【０１１６】
核酸（本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは遺伝子構築物）を含んでなる本発明の医薬組成物の場合、本発明は、該核酸を投与するために特別に調製された医薬組成物を意図する。該医薬組成物はこのような核酸を裸の形態で、言い換えれば、その核酸を生物体のヌクレアーゼによる分解から保護する化合物が存在しない状態で含んでなってよく、トランスフェクションに用いられる試薬に関連する毒性を排除するという利点を伴う。裸の化合物の好適な投与経路としては、血管内、腫瘍内、頭蓋内、腹腔内、脾臓内、筋肉内、網膜下、皮下、粘膜、局所および経口経路が含まれる(Templeton, 2002, DNA Cell Biol., 21:857-867)。あるいは、コレステロールに結合された、またはＨＩＶ−１のＴＡＴタンパク質に由来するＴａｔペプチド、キイロショウジョウバエ(D.melanogaster)アンテナペディアタンパク質のホメオドメインの第三ヘリックス、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質、アルギニンのオリゴマー、およびWO07069090 (Lindgren, A. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21:99-103, Schwarze, S.R. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21:45-48, Lundberg, M et al., 2003, Mol. Therapy 8:143-150およびSnyder, E.L. and Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res. 21:389-393)に記載されているものなどのペプチドといった、細胞膜を介する移動を促進し得る化合物に結合された、リポソームの一部を形成する核酸を投与することができる。あるいは、プラスミドベクターまたはウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスもしくはレトロウイルス（ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づくウイルスなど）もしくはレンチウイルス（ＨＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ）に基づくベクターの一部を形成するポリヌクレオチドを投与することができる。
【０１１７】
別の実施態様では、本発明の組成物、融合タンパク質およびポリヌクレオチドは、Liu, F., et al., (Gene Ther, 1999, 6:1258-66)により記載されているようないわゆる「流体力学的投与」によって投与することもできる。前述の方法に従い、これらの化合物は生物体の血管に高速かつ大容量で導入され、より広い分布で高いレベルのトランスフェクションをもたらす。細胞内接近の有効性は投与される流体の容量および注入速度によって異なることが実証されている(Liu et al., 1999, Science, 305:1437-1441)。マウスにおいて、投与は３〜５秒かけて１ｍｌ／体重１０ｇという値に至適化されている(Hodges et al., 2003, Exp. Opin. Biol. Ther, 3:91-918)。ポリヌクレオチドの流体力学的投与後のin vivoにおける細胞トランスフェクションを可能とする厳密な機構は完全には知られていない。マウスの場合、尾静脈による投与は心拍よりも速い律動で起こり、投与された流体の上大静脈への蓄積をもたらすと考えられる。この流体は次に器官の血管に接近し、その後、前述の血管内の開口部(fenestration)を経て管外空間に接近する。このようにして、ポリヌクレオチドは血液と混合する前に標的器官の細胞と接触するようになり、それにより、ヌクレアーゼによる分解の可能性を軽減する。
【０１１８】
本発明の組成物は体重１キログラム当たり１０ｍｇ未満、好ましくは、体重１キログラム当たり５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５もしくは０．００００１ｍｇ未満、体重１キログラム当たり薬剤２００ｎｍｏｌ未満、言い換えれば、およそ４．４×１０１６コピー、または体重１キログラム当たり１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５もしくは０．０７５ｎｍｏｌの用量で投与することができる。この単位用量を注射、吸入または局所投与によって投与することができる。本発明の二官能性ポリヌクレオチドおよび組成物は標的ｍＲＮＡが発現される器官に直接投与することができ、この場合には器官当たり０．００００１ｍｇ〜３ｍｇ、または好ましくは器官当たり０．０００１〜０．００１ｍｇの間、器官当たり約０．０３〜３．０ｍｇ、器官当たり約０．１〜３．０ｍｇまたは器官当たり０．３〜３．０ｍｇの間の用量が投与される。
【０１１９】
用量は治療される症状の重篤度および応答によって異なり、数日から数ヶ月、またはその症状に緩和が見られるまで様々であり得る。至適用量は、患者生物体における薬剤濃度を周期的に測定することにより決定することができる。至適用量は従前のin vitroまたは動物モデルにおけるin vivo試験で得られたＥＣ５０値から決定することができる。単位用量は１日１回または１日１回未満、好ましくは２、４、８または３０日おきに１回未満で投与することができる。あるいは、初期量の後に１回または数回の維持量を、一般に初期量よりも少ない量で投与することもできる。維持計画は０．０１μｇ〜１．４ｍｇ／ｋｇ体重／日の間、例えば１、０．１、０．０１、０．００１または０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で患者を治療することを含み得る。維持量は、好ましくは５、１０または３０日おきに多くて１回投与する。この治療を、患者が患っている変調のタイプ、その重篤度および患者の状態に応じて異なる時間継続しなければならない。治療後には、その治療に応答しない疾患の場合には用量を引き上げるべきかどうか、またはその疾病の改善もしくは望まない二次的作用が見られる場合には用量を引き下げるべきかどうかを決定するために患者の展開をモニタリングしなければならない。
【０１２０】
１日用量は、特定の状況に応じて１回用量または２回以上の用量で投与することができる。反復投与または頻繁な投与が要される場合には、ポンプ、半永久的カテーテル（静脈内、腹腔内、大槽内または関節内）またはリザーバーなどの投与デバイスを移植することが勧められる。
【０１２１】
本発明の組成物および融合タンパク質の治療的使用
さらなる態様において、本発明はまた、医療において用いるための本発明の組成物、融合タンパク質およびポリヌクレオチドに関する。
【０１２２】
本発明の組成物は、in vivoにおいて脾臓内、肝臓および末梢血ＣＤ８リンパ球の増殖を促進すること（本発明の実施例５参照）、種々の結腸直腸腺癌モデルにおいて抗腫瘍効果を提供すること（実施例６および７参照）、および抗代謝効果を実証すること（実施例８参照）ができる。これらの効果はＩＬ１５のＮＫ細胞活性を増進する能力に関する証拠と相まって、生得（ＮＫ細胞媒介型）または適応（ＣＤ８リンパ球媒介型）免疫応答の刺激から利益を受け得る患者を治療するための本発明の化合物および組成物の使用を可能とする。
【０１２３】
よって、別の態様において、本発明は、被験体の免疫応答の刺激に使用するための本発明の組成物、本発明の融合タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターもしくは遺伝子構築物、本発明の宿主細胞に関する。
【０１２４】
好ましくは、本発明の組成物、本発明の融合タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターもしくは遺伝子構築物、または本発明の宿主細胞は、抗原に応答した免疫系の活性化を必要とする疾患を治療するためにも用いられる。
【０１２５】
あるいは、本発明は、抗原に対する被験体の免疫応答を刺激することまたは免疫系の活性化を必要とする疾患を治療することを目的とする薬剤の製造のための、本発明の組成物、本発明の融合タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターもしくは遺伝子構築物、または本発明の宿主細胞の使用に関する。
【０１２６】
あるいは、本発明は、抗原に対する被験体の免疫応答を刺激するまたは免疫系の活性化を必要とする疾患を治療する方法であって、該被験体に本発明の組成物、本発明の融合タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターもしくは遺伝子構築物、または本発明の宿主細胞を投与することを含んでなる方法に関する。
【０１２７】
本発明において「被験体の免疫応答を刺激する」とは、その応答が初めて起こる個体での特定の抗原に対する免疫応答の誘導、ならびにその免疫応答がすでに起こったことがある被験体における免疫応答の再活性化を意味する。免疫応答は生得免疫応答ならびに適応免疫応答の双方を含むことができ、体液型応答または細胞型応答のいずれかを含み得る。
【０１２８】
よって、本発明の化合物および組成物の、特定の抗原に対する被験体の免疫応答を増強する能力は、生物体において該抗原の存在に関連する疾患を治療するのに有用であり得、その疾患としては、ウイルス抗原を取り扱う場合にはウイルス感染により引き起こされる疾患、細菌抗原を取り扱う場合には細菌感染により引き起こされる疾患、真菌抗原を取り扱う場合には真菌感染により引き起こされる疾患、アレルゲンを取り扱う場合にはアレルギー、寄生虫抗原を取り扱う場合には寄生虫感染により引き起こされる疾患、および／または腫瘍細胞特異的抗原を取り扱う場合には腫瘍が含まれる。よって、好ましい実施態様では、免疫系の活性化を必要とする疾患は感染性疾患および新生物性疾患の群から選択される。
【０１２９】
本発明の化合物および組合せを用いて治療することができるウイルス感染により引き起こされる疾患としては、限定されるものではないが、ＨＩＶ−１ウイルス（ＡＩＤＳ）の感染により引き起こされる疾患；単純ヘルペスウイルス（単純ヘルペス、性器ヘルペス）、サイトメガロウイルス（単球増加症、網膜炎、肝炎）、エプスタイン・バーウイルス（感染性単球増加症、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌）および水痘帯状疱疹（鶏痘、帯状疱疹）のウイルスなどのヒトヘルペスウイルスにより引き起こされる疾患；Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルスにより引き起こされる疾患；呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスなどのパラミクソウイルスにより引き起こされる疾患；黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎のウイルスまたは日本脳炎ウイルスなどのフラビウイルスおよびロタウイルスにより引き起こされる疾患が挙げられる。本発明の化合物および組合せを用いて治療することができる他のタイプのウイルス感染は、Fundamental Virology, second edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991)に詳細に記載されている。
【０１３０】
本発明の化合物および組合せを用いて治療することができる細菌感染により引き起こされる疾患としては、限定されるものではないが、エシェリキア属(Escherichia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、サルモネラ菌属(Salmonella)、ブドウ状球菌(Staphylococcus)、赤痢菌属(Shigella)、リステリア属(Listeria)、エーロバクター属(Aerobacter)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、クレブシェラ属(Klebsiella)、プロテウス属(Proteus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、連鎖球菌属(Streptococcus)、クラミジア属(Chlamydia)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、ナイセリア属(Neisseria)、クロストリジウム属(Clostridium)、バチルス属(Bacillus)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、マイコバクテリア属(Mycobacterium)、カンピロバクター属(Campylobacter)、ビブリオ属(Vibrio)、セラチア属(Serratia)、プロビデンシア属(Providencia)、クロモバクテリウム属(Chromobacterium)、ブルセラ属(Brucella)、エルシニア属(Yersinia)、ヘモフィラス属(Haemophilus)またはボルデテラ属(Bordetella)の微生物により引き起こされる疾患が挙げられる。
【０１３１】
本発明の化合物および組合せを用いて治療することができる真菌感染により引き起こされる疾患としては、限定されるものではないが、カンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラズマ症、クリプトコッカス髄膜炎および類似のものが挙げられる。
【０１３２】
本発明の化合物および組合せを用いて治療することができる寄生虫感染としては、限定されるものではないが、マラリア、ニューモシスチス・ジロヴェチ(Pneumocystis jiroveci)による感染、肺炎、睡眠病、リーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症およびトリパノソーマ属(trypanosoma)が挙げられる。
【０１３３】
本発明の化合物および組成物を用いて治療することができるアレルギー型障害としては、限定されるものではないが、花粉（樹木、草本、雑草および牧草の花粉のアレルゲン）に曝されることにより引き起こされるアレルギー、昆虫アレルゲン（吸入性アレルゲン、唾液由来のアレルゲン、および毒）、ふけおよび動物体毛アレルゲンおよび食物アレルゲンに曝されることにより引き起こされるアレルギーが挙げられる。
【０１３４】
本発明の結合体および組成物はまた、過増殖性疾患を治療するためにも好適である。本発明において「増殖性疾患」という表現は、不適切に高いレベルの細胞分裂、不適切に低いレベルのアポトーシスまたはその双方により引き起こされる、またはそれを原因とする疾患を含み、原発性腫瘍ならびに転移の双方を含む。「原発性腫瘍」とは、その腫瘍が起源する原発部位の腫瘍を意味する。本発明において「転移」とは、腫瘍が腫瘍の元の原発部位以外の生物組織に拡大するプロセスを意味する。
【０１３５】
本発明において「過増殖性疾患の治療」または「腫瘍の治療」とは、癌もしくは腫瘍の症候、合併症または生化学的徴候の出現を抑制する、もしくは遅延させるため、その症候を緩和するため、または例えば転移の出現などのその増殖および進行を抑制または阻害するための本発明の化合物および組成物の投与を意味するものと理解される。この治療は、疾患の出現を遅延させるため、またはその臨床徴候もしくは無症状症候の顕在化を抑制するための予防的処置、または疾患の顕在化の後もしくは手術もしくは放射線療法によるその治療に関連する症候を除去もしくは緩和するための治療的処置であり得る。
【０１３６】
本発明において治療される癌はいずれのタイプの癌または腫瘍であってもよい。これらの腫瘍または癌としては、限定されるものではないが、結腸、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部および泌尿生殖器に存在する悪性腫瘍、より詳しくは、小児急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞性癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂・尿管癌、原発性中枢神経系リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、脳星状細胞腫、頸部癌、小児（原発性）肝細胞性癌、小児（原発性）肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視覚経路・視床下部神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽細胞腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児テント上原始神経外胚葉性・松果体腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟組織肉腫、小児視覚経路・視床下部神経膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌、子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連の腫瘍、癌分泌膵臓癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼の癌、女性の乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管腫瘍、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍腫瘍、トリコ白血病(tricoleukaemia)、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸管癌、眼内黒色腫、膵島細胞癌、膵島細胞性膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性の乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽細胞腫、黒色腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、原発転移性扁平上皮性頸部癌、転移性扁平上皮性頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病(myelogenous leukaemia)、骨髄性白血病(myeloid leukaemia)、骨髄増殖性障害、副鼻腔・鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、頬咽頭癌、悪性線維性骨肉腫−Ｚ、骨肉腫−Ｗ、悪性線維性組織球腫、悪性線維性骨肉腫／骨の組織球腫、上皮性卵巣癌、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、紫斑病、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞種、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂・尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、類肉腫症、肉腫、セザリー症候群、皮膚癌��小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮性頸部癌、胃癌、松果体・テント上原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂・尿管移行上皮癌、移行腎盂・尿管癌、絨毛腫瘍、腎盂・尿管細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視経路・視床下部神経膠腫、外陰癌、ワルデンストロームマクログロブリン血症、ビルムス腫瘍および他のいずれかの過増殖性疾患、ならびに前記器官系に存在する新生物が挙げられる。
【０１３７】
本発明のワクチン組成物
本発明の化合物および組成物はまた、抗原に対する患者の応答を増強するためのワクチンのけるアジュバントとしても有用である。よって、別の態様において、本発明は、抗原と本発明による組成物、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクターまたは宿主細胞とを含んでなるワクチン組成物に関する。
【０１３８】
本発明において「ワクチン」または「ワクチン組成物」とは、少なくとも１つの抗原を含んでなり、その抗原に対する被験体の免疫応答の活性化を可能等する組成物を意味する。このようなワクチンの目的は、細胞ならびに抗体の双方によって媒介される免疫を活性化することである。好ましくは、細胞性免疫には、Ｔ細胞応答、主として、ＣＤ４＋  Ｔ細胞により媒介される応答、および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞の応答の刺激が含まれる。
【０１３９】
本明細書において「アジュバント」とは、免疫系を活性化して、ワクチンに対して、アジュバントを含まないワクチンを投与する場合の結果として得られるものよりも強力かつ有効な免疫応答を可能とする免疫学的薬剤を意味する。アジュバントに対する典型的な応答としては、限定されるものではないが、免疫系細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、抗原提示細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞）の活性化、増殖および／または分化、マーカーおよびサイトカインの発現の増大または低下、ＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ力価の刺激、巨脾症（脾臓細胞充実性の増大）、過形成、種々の組織における浸潤物の形成、ならびに標準的技術を用いて当業者が定量できる他のタイプの応答が含まれる。
【０１４０】
よって、本発明の組合せおよび化合物と併用可能なワクチンとしては、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原およびアレルゲンまたは環境抗原および腫瘍抗原の群から選択される１以上の抗原を提示するワクチンが含まれる。
【０１４１】
本発明の組合せおよび化合物と併用可能なワクチンに用いるのに好適なウイルス抗原としては、ＨＩＶ−１抗原（ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０、ｇｐ４０、ｐ２４、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｒｅｖなど）、ヒトヘルペスウイルス（ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＫ、ｇＥもしくはｇＤまたはそれらの誘導体）または前初期タンパク質（ＶＨＳ１またはＶＨＳ２のＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３６）、サイトメガロウイルス、特にヒトサイトメガロウイルス（ｇＢまたはその誘導体）、エプスタイン・バーウイルス（ｇｐ３５０またはその誘導体）、水痘帯状疱疹ウイルス（ｇｐＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＥ６３）、またはＢ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎の表面抗原または肝炎の核抗原）、Ｃ型肝炎ウイルス（例えば、核抗原Ｅ１、ＮＳ３またはＮＳ５）、呼吸器合胞体ウイルスなどのパラミクソウイルス（タンパク質ＦおよびＧまたはそれらの誘導体）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス（タンパク質Ｅ１およびＥ２）、鶏痘ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、ｅｇ  Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７）、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）またはインフルエンザウイルス（タンパク質ＨＡ、ＮＰ、ＮＡもしくはＭ、またはその組合せ）に感染した細胞、ロタウイルス抗原（ＶＰ７ｓｃおよび他のロタウイルス成分）、ならびに類似のもの（ウイルス抗原のさらなる例としてはFundamental Virology, second edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 199)を参照）が挙げられる。
【０１４２】
本発明の化合物および組合せと併用可能なワクチンに用いるのに好適な細菌抗原または誘導体としては、ナイセリア属(Neisseria)の種、例えば、淋菌(N. gonorrhea)および髄膜炎菌(N. meningitidis)の抗原（トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉＩＣおよびアドヘシン）；化膿連鎖球菌(S. pyogenes)の抗原（Ｍタンパク質またはその断片およびＣ５Ａプロテアーゼなど）；アガラクチア(S. agalactiae)、Ｓ．ミュータンス(S. mutans)の抗原；軟性下疳菌(H. ducreyi)の抗原；Ｍ．カタラーリス(M. catarrhalis)（ブランハメラ・カタラーリス(Branhamella catarrhalisとしても知られる）を含むモラクセラ属(Moraxella)の種の抗原（低分子量および高分子量アドヘシンおよびインベーシン）；ボルデテラ属(Bordetella)の種、例えば、百日咳菌(B. pertussis)、例えば、パラ百日咳菌(Parapertussis)およびＢ．ブロンキセプチカ(B. bronchiseptica)の抗原（パータクチン、百日咳毒素またはその誘導体、微細線維性血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、フィムブリエなど）；結核菌(M. tuberculosis)、ウシ結核菌(M. bovis)、らい菌(M. leprae)、鳥結核菌(M. avium)、パラ結核菌(M. paratuberculosis)、スメグマ菌(M. smegmatis)を含むマイコバクテリア種の抗原；レジオネラ属(Legionella)の種、例えば、Ｌ．ニューモフィラ(L. pneumophila)の抗原（例えば、ＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、−Ｂまたは−Ｃ、ＭＰＴ  ４４、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ４５、ＨＳＰＩＯ、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ  ７５、ＨＳＰ９０、１９ｋＤａのＰＰＤ［Ｒｖ３７６３］、３８ｋＤａのＰＰＤ［Ｒｖ０９３４］）；エシェリキア属(Escherichia)の種、例えば、腸内毒素原性大腸菌の抗原（例えば、定着因子、熱不安定性毒素またはその誘導体、耐熱性毒素またはその誘導体）、腸管出血性大腸菌および腸管病原性大腸菌の抗原（例えば、志賀毒素と類似の毒素またはその誘導体）；ビブリオ属(Vibrio)の種、例え
ば、コレラ菌(V. cholera)の抗原（例えば、コレラ毒素またはその誘導体）；赤痢菌属(Shigella)の種、例えば、Ｓ．ソネイ(S. sonnei)、志賀赤痢菌(S. dysenteriae)、Ｓ．フレックスネリ(S. flexnerii)の抗原；エルシニア属(Yersinia)の種、例えば、Ｙ．エンテロコリチカ(Y. enterocolitica)の抗原（例えば、Ｙｏｐタンパク質）；ペスト菌(Y. pestis)、Ｙ．シュードツベルクローシス(Y. pseudotuberculosis)の抗原；カンピロバクター属(Campylobacter)の種、例えば、Ｃ．ジェジュニ(C. jejuni)の抗原（例えば、毒素、アドヘシンおよびインベーシン）；サルモネラ菌属(Salmonella)の種、例えば、チフス菌(S. typhi)、パラチフス菌(S. paratyphi)、豚コレラ菌(S. choleraesuis)、腸炎菌(S. enteritidis)の抗原；リリステリア属(Listeria)の種、例えば、ステリア菌(L. monocytogenes)の抗原；ヘリコバクター属(Helicobacter)の種、例えば、ピロリ菌(H. pylori)の抗原（例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）；シュードモナス(Pseudomonas)属の種、例えば、緑膿菌(P. aeruginosa)の抗原；ブドウ状球菌属(Staphylococcus)の種、例えば、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)の抗原；腸球菌属(Enterococcus)の種、例えば、糞便連鎖球菌(E. faecalis)、フェシウム菌(E. faecium)の抗原；クロストリジウム(Clostridium)属の種、例えば、破傷風菌(C. tetani)の抗原（例えば、破傷風毒素およびその誘導体）；ボツリヌス菌(C. botulinum)の抗原（例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体）、Ｃ．ディフィシル(C. difficile)の抗原（例えば、クロストリジウムＡまたはＢ毒素およびそれらの誘導体）；バチルス属(Bacillus)の種、例えば、炭疽菌(B. anthracis)の抗原（例えば、炭疽毒素およびその誘導体）；コリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種、例えば、ジフテリア菌(C. diphtheriae)の抗原（例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体）；ボレリア属(Borrelia)の種、例えば、Ｂ．ブルグドルフェリ(B. Burgdorferi)の抗原（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）；Ｂ．ガリニ(B. garinii)の抗原（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．アフゼリ(B. afzelii)の抗原（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．アンデルソンフィ(B. andersonfi)の抗原（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ヘルムシ(B. hermsii)の抗原；エーリキア属(Ehrlichia)の種、例えば、Ｅ．エクイ(E. equi)の抗原およびヒト顆粒球エーリキア症の薬剤；リケッチア属(Rickettsia)の種、例えば、斑点熱リケッチア(R. rickettsii)の抗原；クラミジア属(Chlamydia)の種、例えば、トラコーマクラミジア(C. trachomatis)の抗原（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）；肺炎クラミジア(Chlamydia pneumoniae)の抗原（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、オウム病クラミジア(C. psittaci)の抗原；レプトスピラ属(Leptospira)の種、例えば、Ｌ．インテロガンス(L. interrogans)の抗原；トレポネーマ属(Treponema)の種、例えば、梅毒トレポネーマ(T. pallidum)の抗原（例えば、希少外膜タンパク質）、Ｔ．デンチコラ(T. denticola)、Ｔ．ハイオジセンテリアエ(T. hyodysenteriae)の抗原；プラスモジウム属(Plasmodium)の種、例えば、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)の抗原；トキソプラズマ属(Toxoplasma)の種およびトキソプラズマ原虫(T. gondii)の抗原（例えば、ＳＡＧ２、ＳＡＧＳ、Ｔｇ３４）；エントアメーバ属(Entamoeba)の種、例えば、赤痢アメーバ(E. histolytica)の抗原；バベシア属(Babesia)の種、例えば、Ｂ．ミクロチ(B. microti)の抗原；トリパノソーマ属(Trypanosoma)の種、例えば、クルーズトリパノソーマ(T. cruzi)の抗原；ジアルジア属(Giardia)の種、例えば、ランブル鞭毛虫(G. lamblia)の抗原；リーシュマニア属(leishmania)の種、例えば、森林型熱帯リーシュマニア(L. major)の抗原；ニューモシスチス属(Pneumocystis)の種、例えば、Ｐ．カリニ(P. carinii)の抗原；トリコモナス属(Trichomonas)の種、例えば、膣トリコモナス(T. vaginalis)の抗原；住血球虫属(Schisostoma)の種、例えば、マンソン住血球虫(S. Mansoni)の抗原が挙げられる。
【０１４３】
カンジダ属(Candida)の種、例えば、Ｃ．アルビカンス(C. albicans)；クリプトコッカス属(Cryptococcus)の種、例えば、Ｃ．ネオフェルマンス(C. neoformans)などの酵母の、またはそれに由来する抗原；結核菌(M. tuberculosis)の抗原（Ｒｖ２５５７、Ｒｖ２５５８、ＲＰＦ：Ｒｖ０８３７ｃ、Ｒｖ１８８４ｃ、Ｒｖ２３８９ｃ、Ｒｖ２４５０、Ｒｖ１００９、ａｃｅＡ（Ｒｖ０４６７）、ＰｓｔＳ１、（Ｒｖ０９３２）、ＳｏｄＡ（Ｒｖ３８４６）、１６ｋＤａｌのＲｖ２０３１ｃ、Ｔｂ  Ｒａ１２、Ｔｂ  Ｈ９、Ｔｂ  Ｒａ３５、Ｔｂ３８−１、Ｅｒｄ  １４、ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬ、ｍＴＴＣ２およびｈＴＣＣ１など）；クラミジアの抗原、例えば、高分子量タンパク質（ＨＭＷＰ）、ＯＲＦ３（文献ＥＰ３６６４１２）および推定膜タンパク質(possible membrane proteins)（Ｐｍｐ）；連鎖球菌属(Streptococcus)の種、例えば、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)の抗原（ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリジン、コリン結合タンパク質、タンパク質抗原ニューモリシン、およびその変異型解毒化誘導体）；ヘモフィルス属(Haemophilus)の種、例えば、Ｈ．インフルエンザ(H. influenzae)Ｂ型に由来する抗原（例えば、ＰＲＰおよびその結合体）；分類不能Ｈ．インフルエンザの抗原（ＯＭＰ２６、高分子量アドヘシン、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄおよびリポタンパク質Ｄ、ならびにフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド、またはその多重コピー変異体または融合タンパク質）；熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)に由来する抗原（ＲＴＳ．Ｓ、ＴＲＡＰ、ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、ｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０およびプラスモジウム属(Plasmodium)の種におけるその類似体など）。
【０１４４】
本発明の化合物および組合せと併用可能なワクチンに用いるのに好適な真菌抗原としては、限定されるものではないが、例えば、カンジダ真菌抗原；ヒストプラズマ真菌抗原の成分、例えば、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）およびヒストプラズマ真菌抗原の他の成分；クリプトコッカス真菌抗原、例えば、莢膜多糖類およびクリプトコッカス真菌抗原の他の成分；球虫類の真菌抗原、例えば、小球体の抗原、および球虫類の真菌抗原の他の成分；ならびに輪癬、例えば、トリコフィチンの真菌抗原、および球虫類の真菌抗原の他の成分が挙げられる。
【０１４５】
本発明の化合物および組合せと併用可能なワクチンに用いるのに好適な原虫抗原としては、限定されるものではないが、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)の抗原、例えば、娘虫体表面抗原、種虫表面抗原、種虫周囲抗原、配偶子母細胞／配偶子表面抗原、全血抗原ｐｆ、５５／ＲＥＳＡおよびプラズモイド抗原の他の成分；トキソプラズマの抗原、例えば、ＳＡＧ−Ｉ、ｐ３０およびトキソプラズマ抗原の他の成分；住血球虫の抗原、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、パラミオシンおよび住血球虫抗原の他の成分；リーシュマニアの抗原およびリーシュマニア・テールズ(Leishmania tales)の他の抗原、例えばｇｐ６３、リポホスホグリカンおよびその関連タンパク質ならびにリーシュマニア抗原の他の成分；ならびにクルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)の抗原、例えば、７５〜７７ｋＤａの抗原、５６ｋＤａの抗原およびトリパノソーマ抗原の他の成分が挙げられる。
【０１４６】
本発明の化合物および組合せと併用可能なワクチンに用いるのに好適なアレルゲンまたは環境抗原としては、限定されるものではないが、花粉アレルゲン（樹木、草本、雑草および牧草の花粉のアレルゲン）、昆虫アレルゲン（唾液および毒に由来する吸入性アレルゲン）、ふけおよび動物体毛アレルゲンおよび食物アレルゲンなどの天然で産生されるアレルゲンに由来する抗原が挙げられる。樹木、牧草および草本由来の重要な花粉アレルゲンは、ブナ目(Fagales)、モクセイ目(Oleales)、マツ目(Pinales)およびスズカケノキ(Platanaceae)の分類目（とりわけ、カバノキ(Betula)、ハンノキ(Alnus)、ハシバミ(Corylus)、シデ(Carpinus)およびオリーブ(Olea)、ヒマラヤスギ(CryptomeriaおよびJuniperus)、バナナノキ(Platanus)を含む、イネ目（とりわけ、ドクムギ属(Lolium)、アラガエリ属(Phleum)、イチゴツナギ属(Poa)、ギョウギシバ属(Cynodon)、カモガヤ属(Dactylis)、シラゲガヤ属(Holcus)、クサヨシ属(Phalaris)、ライムギ属(Secale)およびモロコシ属(Sorghum)を含む）、キク目(Asterales)およびイラクサ目(Urticales)（とりわけ、ブタクサ属(Ambrosia)、ヨモギ属(Artemisia)およびヒカゲミズ属(Parietaria)を含む）に起源する。使用可能な他のアレルゲン性抗原としては、ヒョウヒダニ属(Dermatophagoides)およびシワダニ属(Euroglyphus)のイエダニ類、貯蔵庫ダニ、例えば、レピドグリフィス(Lepidoglyphys)、ニクダニ(Glycyphagus)およびコナダニ(Tyrophagus)のアレルゲン、ゴキブリ、小昆虫およびノミ類、例えば、チャバネゴキブリ(Blatella)、クロゴキブリ(Periplaneta)、ユスリカ(Chironomus)およびイヌノミ(Ctenocepphalides)のアレルゲン、ネコ、イヌおよびウマなどの哺乳類のアレルゲン、鳥類のアレルゲン、毒物アレルゲン、例えば、ハナバチ類（ミツバチ(Apidae)上科）、カリバチ類およびアリ類（オオアリ(Formicoidae)上科）を含む膜翅目(Hymenoptera)の分類目のものなどの、昆虫の刺咬に起源するアレルゲンが挙げられる。使用可能なさらなるアレルゲン性抗原としては、アルテルナリア属(Alternaria)およびクラドスポリウム属(Cladosporium)などの吸入性の真菌アレルゲンが挙げられる。
【０１４７】
本発明の化合物および組合せと併用可能なワクチンに用いるのに好適な腫瘍抗原としては、限定されるものではないが、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−００１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびその抗原エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびその抗原エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞／ＣＤ３−V鎖受容体、ＭＡＧＥファミリーの腫瘍抗原（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、ＧＡＧＥファミリーの腫瘍抗原（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２ｌｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、１３−カテニン、γ−カテニン、ｐｌ２Ｏｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅ１１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、結腸タンパク質腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、イディオタイプＩｇ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ヒト乳頭腫ウイルスタンパク質などのウイルス産物、Ｓｍａｄファミリーの腫瘍抗原、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶによりコードされる核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７、およびｃ−ｅｒｂＢ−２、急性リンパ芽球性白血病（ｅｔｖ６、ａｍｌｌ、シクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（イディオタイプＩｇ）、神経膠腫（Ｅ−カドヘリン、ａ−カテニン、１３−カテニン、７−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱癌（ｐ２ｌｒａｓ）、胆管癌（ｐ２ｌｒａｓ）、乳癌（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、頸部癌（ｐ５３、ｐ２ｌｒａｓ）、結腸癌（ｐ２ｌｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＭＵＣファミリー）、結腸直腸癌（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−００１７−１Ａ／ＧＡ７３３、ＡＰＣ）、絨毛癌（ＣＥＡ）、上皮細胞癌（シクロフィリンｂ）、胃癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫（ｌｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、肺癌（ＣＥＡ、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ細胞由来白血病（シクロフィリンｂ）、黒色腫（ｐ１５タンパク質、ｇｐ７５��癌胎児性抗原、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｃｄｃ２７、ＭＡＧＥ−３、ｐ２ｌｒａｓ、ｇｐ１００Ｐｍｅ１１１７）、骨髄腫（ＭＵＣファミリー、ｐ２ｌｒａｓ）、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、鼻咽頭癌（ｌｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、卵巣癌（ＭＵＣ  ファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前立腺癌（前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびその抗原エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、腎臓癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、頸部および食道の扁平上皮細胞癌（ヒト乳頭腫ウイルスタンパク質などのウイルス産物）、精巣癌（ＮＹ−ＥＳ０−１）およびＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープｓ）が挙げられる。
【０１４８】
本発明の組成物の成分、具体的には、ＡｐｏＡとＩＬ１５の融合物または該融合物をコードするポリヌクレオチド、およびＩＬ１５受容体α鎖のＳｕｓｈｉドメインまたは該ドメインをコードする核酸は単一の処方物として（例えば、一定量の各成分を含んでなる錠剤またはカプセル剤として）提供することができ、あるいはそうでなければ、一緒に、逐次に、または個別に投与するために後に組み合わせる個別の処方物として提供することもできる。本発明の組成物はまた、この処方物を、成分が個別に処方され、同じ容器に包装されているパーツキットとして意図する。
【０１４９】
当業者ならば、本発明の組成物の第一の成分および第二の成分の処方は同様であってよく、言い換えれば、同じ投与経路による投与を可能とする類似の方法で（例えば、錠剤または丸剤として）処方される。本発明の異なる成分が別個に処方される実施態様では、それらの２成分はブリスターパックで提供することができる。各ブリスターにはその日に消費すべき薬剤が含まれる。薬剤を１日に数回投与する必要がある場合には、各回の投与に相当する薬剤をブリスターパックの別のセクションに配置し、好ましくは、それらを投与する必要のある時刻を、ブリスターパックの各セクションに付記することができる。あるいは、本発明の組成物の成分を、異なる成分が異なった投与がなされるように異なった様式で処方することもできる。よって、例えば、第一の成分を経口投与用の錠剤またはカプセル剤として処方し、第二の成分を静脈投与用に処方することができる。
【０１５０】
本発明の組成物は、限定されるものではないが、静脈内、経口、鼻腔、非経口、局所、経皮、直腸および類似の投与を含む、当業者に公知の方法に従って投与される。
【０１５１】
以下、本発明を下記の実施例によって説明するが、これらの実施例は単に例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１５２】
実施例１  プラスミドの起源および構築
１．１  ＲＮＡの抽出
全マウス肝臓ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬(Sigma, Madrid, Spain)を用い、個々のサンプルから単離した。サンプルの濃度および純度を、分光光度計(Biophotometer, Eppendorf)にて２６０および２８０ｎｍで吸光度を測定した（３２０ｎｍでバックグラウンド補正）。
【０１５３】
１．２  全ｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ合成
全ＲＮＡ（３μｇ）をＤＮアーゼＩで処理し、ＲＮアーゼＯＵＴの存在下、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴを用いて逆転写を行ってｃＤＮＡを得た（総ての試薬は、Invitrogen, Carfsbed, CA）。全肝臓ｃＤＮＡ  ２５μｌを得た。この反応物を３７℃で１時間インキュベートし、９５℃で１分間変性させ、４℃にした。これらのサンプルはすぐにＰＣＲに用いるか、−２０℃で保存した。
【０１５４】
１．３  ネズミアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ｍＡｐｏＡ１）ｃＤＮＡのクローニングおよびプラスミドｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１の取得
ｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１（ｐＡｐｏ）は、ネズミアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａｐｏａ１）と、その前にその固有のシグナルペプチドを含んでなり、サイトメガロウイルスプロモーターと機能的に連結されているポリペプチドをコードする配列番号１の配列を含んでなる。
【０１５５】
センスプライマーＦｗＡＴＧｍＡｐｏＡ１：5’-ATGAAAGCTGTGGTGCTGGC-3’（配列番号４６）、および
アンチセンスプライマーＲｖＴＧＡｍＡｐｏＡ１：5’-TCACTGGGCAGTCAGAGTCT-3’（配列番号４７）
を設計した。
【０１５６】
ＢｉｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(Bioline, London, UK)を用い、全肝臓ｃＤＮＡに対するＰＣＲ）：２７２０サーマルサイクラー(Applied Biosystems, Foster City, US)にて、９４℃５分、９４℃４０秒を３０サイクル、５５℃４０秒および７２℃４０秒、その後、７２℃７分によってｍＡｐｏＡ１のｃＤＮＡを増幅した（総ヌクレオチド７９５、７２ヌクレオチドはシグナルペプチドをコードし、７２３ヌクレオチドは天然タンパク質をコードする）。このＰＣＲ産物を１％アガロースＤ−１  ｌｏｗ  ＥＥＯアガロースゲル(Pronadisa, Madrid, Spain)で泳動させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いてゲル断片を精製した。精製したｍＡｐｏＡ１  ｃＤＮＡを、製造者の説明書に従って発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ (Invitrogen, Carfsbed, CA)にクローニングした。これをｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１またはｐＡｐｏと呼称する。最後に、得られた配列を配列決定により確認した。
【０１５７】
１．４  ヒトインターロイキン１５（ｈＩＬ１５）ｃＤＮＡのクローニングおよびプラスミドｐＣＭＶ−ｈＩＬ１５の取得
ｐＣＭＶ−ｈＩＬ１５（ｐｈＩＬ１５）は、ヒトＩＬ１５と、その前にＩｇＶχ鎖のシグナルペプチドを含んでなり、サイトメガロウイルスプロモーターに機能的に連結されているポリペプチドをコードする配列番号２の配列を含んでなる。
【０１５８】
センスプライマーＦｗＡｓｃＩｈＩＬ１５：5’-AATAATGGCGCGCCGAACTGGATAGATG-3’（配列番号４８）（５’に酵素ＡｓｃＩの制限部位を構成する９ヌクレオチド(GGCGCGCCC)の配列を導入する）および
アンチセンスプライマーＲｖＮｏｔＩｈＩＬ１５：5’-GTTCATCAACACGTCCTGAGCGGCCGC-3’（配列番号４９）（５’に酵素ＮｏｔＩの制限部位を構成する８ヌクレオチド(GCGGCCGC)の配列を導入する）
を設計した。
【０１５９】
ｈＩＬ１５のｃＤＮＡを、発現プラスミドｐＶｋＬ／ＩＬ−１５ＩＲＥＳｎｅｏ(Meazza et al. Eur. J. Immunol. 1997; 27: 1049-1054）に対するＰＣＲにより増幅した（総ヌクレオチド３４５）。このプラスミドは、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下に、ヒト成熟型ＩＬ１５と、その前にＩｇＶχ鎖をコードする配列を含む。これを表すためにｐＣＭＶ−ｈＩＬ５またはｐｈＩＬ１５の用語を用いる。
【０１６０】
ＰＣＲは、ＰＣＲクローニング酵素(Stratagene, Cedar Creek, TX, US)を用いて行った。増幅条件は、２７２０サーマルサイクラー(Applied Biosystems Foster City, US)にて、９５℃２分、９５℃４０秒を３０サイクル、５７℃３０秒および７２℃４５秒、その後、７２℃７分とした。このＰＣＲ産物を１％アガロースＤ−１  ｌｏｗ  ＥＥＯアガロースゲル(Pronadisa, Madrid, Spain)で泳動させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いてゲル断片を精製した。精製したｈＩＬ１５  ｃＤＮＡを製造者の説明書に従って発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ(Invitrogen, Carfsbed, CA)にクローニングした。これをｐＴｒｃＨｉｓ２−ｈＩＬ１５と呼称する。最後に、得られた配列を配列決定により確認した。
【０１６１】
１．５  ｍＡｐｏＡ１とｈＩＬ１５の遺伝子融合物をコードするプラスミドｐＣＭＶ−Ａｐｏ−ｈＩＬ１５（ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５）の構築
ｐＣＭＶ−Ａｐｏ−ｈＩＬ１５（ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５）は、ネズミアポリポタンパク質Ａ−ＩがＧＡＰリンカーによってヒトＩＬ１５と連結され、サイトメガロウイルスプロモーターと機能的に連結されたものを含んでなる融合タンパク質をコードする配列番号４０の配列を含んでなる。
【０１６２】
アンチセンスプライマーＲｖＡｓｃＩｍＡｐｏＡ１：5’-GGCGCGCCCTGGGCAGTCAGAGTCTCGC-3’（配列番号５０）（ＡｐｏＡ１遺伝子の３’に酵素ＡｓｃＩの制限部位を構成する９ヌクレオチド(GGCGCGCCC)の配列を導入し、停止コドンを除去する）を設計した。この付加された制限配列は、この構成タンパク質にある特定の可動性を与える短いリンカーペプチドGAPに翻訳される。
【０１６３】
増幅は、鋳型としてｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１（実施例１．３参照）、ならびにプライマーＦｗＡＴＧｍＡｐｏＡ１およびＲｖＡｓｃＩｍＡｐｏＡ１をＢｉｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素(Bioline, London, UK)とともに用い、２７２０サーマルサイクラー(Applied Biosystems Foster City, US)にて、９４℃５分、９４℃４０秒を３０サイクル、５７℃４０秒および７２℃４０秒、その後、７２℃７分のＰＣＲによって行った。このＰＣＲ産物（８０４ヌクレオチド）を１％アガロースＤ−１  ｌｏｗ  ＥＥＯアガロースゲル(Pronadisa, Madrid, Spain)で泳動させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いてゲル断片を精製した。精製したｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩ  ＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ(Invitrogen, Carfsbed, CA）にクローニングした。これをｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩと呼称する。最後に、得られた配列を配列決定により確認した。
【０１６４】
並行して、鋳型としてｐＴｒｃＨｉｓ２−ｈＩＬ１５（実施例１．４参照）を用い、これをＡｓｃＩ酵素およびバッファー４(New England Biolabs)を用いて３７℃で５０分消化した。この消化産物を１％アガロースＤ−１  ｌｏｗ  ＥＥＯアガロースゲル(Pronadisa, Madrid, Spain)で泳動させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いてゲル断片を精製した。精製したＤＮＡ  ＡｓｃＩ−ｈＩＬ１５−ｐＴｒｃＨｉｓ２を、酵素ＮｏｔＩ、１×ＢＳＡおよびバッファー３(New England Biolabs)を用いて３７℃で５０分消化した。この消化産物を１％アガロースＤ−１  ｌｏｗ  ＥＥＯアガロースゲル(Pronadisa, Madrid, Spain)で泳動させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いてゲル断片を精製して精製ＤＮＡ  ＡｓｃＩ−ｈＩＬ１５−ＮｏｔＩ（３４５ヌクレオチド）を得た。
【０１６５】
遺伝子融合を行うために、プラスミドｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１−ＡｓｃＩを、ＡｓｃＩ酵素およびバッファー４(New England Biolabs)を用いて３７℃で５０分消化した。この消化産物を１％アガロースＤ−１  ｌｏｗ  ＥＥＯアガロースゲル(Pronadisa, Madrid, Spain)で泳動させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いてゲル断片を精製した。精製したｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１  ＤＮＡを次にＮｏｔＩ酵素、１×ＢＳＡおよびバッファー３(New England Biolabs)を用い、ｐｃＤＮＡ  ３．１  Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡの骨格に存在する制限部位を利用して３７℃で５０分消化した。この消化産物を１％アガロースＤ−１  ｌｏｗ  ＥＥＯアガロースゲル(Pronadisa, Madrid, Spain)で泳動させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いてゲル断片を精製した。ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ  ｐＣＭＶ−ｍＡｐｏＡ１により開環したベクターを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ高濃度と、バッファー溶液として２×Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎバッファー(Promega Madison, Wl, U.S.)を用い、この混合物を室温で１０分インキュベートして、１：３（ベクター：挿入配列）の比率で挿入配列ＡｓｃＩ−ｈＩＬ１５−ＮｏｔＩと結合させた。次に、Ｔｏｐ１０細菌(Invitrogen, Carfsbed, CA)を形質転換させた。形質転換細菌をアンピシリン含有ＬＢ培地の入ったペトリプレートでのそれらの増殖に関して選択した（ベクターはこの抗生物質に対する耐性遺伝子を含むため）。陽性細菌からＭｉｎｉＰｒｅｐ法(Qiagen, Germany)を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した後、２μｇの前記プラスミドをＡｓｃＩ／ＰｍｅＩ酵素(New England Biolabs)で消化し、その後、その消化物を１％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、挿入配列の存在を確認した。得られた６６６９ｎｔのプラスミドを以下、ｐＣＭＶ−Ａｐｏ−ｈＩＬ１５またはｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５と呼称する。
【０１６６】
１．６  ｐＳｕｓｈｉプラスミドの起源
本発明においてｐＣＭＶ−Ｓｕｓｈｉ（ｐＳｕｓｈｉ）と呼称するプラスミドは、Duitmann et al. (Duitman, E.H., et al., Mol Cell Biol, 2008; 28: 4851-4861)に従前に記載されている、この研究の著者らにより厚意により提供されたプラスミドＩＬ−１５ＲΔＭＤに相当する。
【０１６７】
ｐＣＭＶ−Ｓｕｓｈｉ（ｐＳｕｓｈｉ）は、ネズミＩＬ１５受容体α鎖（ＩＬ１５ｒａ）のＳｕｓｈｉドメインと、その前にＩｇκのシグナルペプチドを含んでなり、サイトメガロウイルスプロモーターに機能的に連結されているポリペプチドをコードする配列番号２０の配列を含む。
【０１６８】
１．７  ネズミインターロイキン１５（ｍＩＬ１５）ｃＤＮＡのクローニングおよびプラスミドｐＣＭＶ−ｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５（ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５）の取得
ｐＣＭＶ−ｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５（ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５）は、GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ型（配列番号３２）のフレキシブルリンカーによってネズミＩＬ１５と結合されたネズミＩＬ１５受容体α鎖（ＩＬ１５ｒａ）のＳｕｓｈｉドメインを含んでなるポリペプチドをコードする配列を含んでなる。
【０１６９】
ネズミＩＬ１５に融合されたＳｕｓｈｉドメインと、その後に３’は１つのＮｈｅＩ制限部位、そして５’はもう１つのＸｈｏＩ制限部位が隣接した２つの停止コドンをコードする遺伝子はGENEART AG (GENEART AG, BioPark, Josef-Engert-Straβe 11, 93053 Regensburg, Germany)により合成され、これをプラスミドｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ  Ａ(Invitrogen, Frankfurter Straβe 129B, 64293 Darmstadt, Germany)に導入した。
【０１７０】
ネズミＩＬ１５に融合されたＳｕｓｈｉドメインの発現はサイトメガロウイルスプロモーターの制御下にあり、その分泌がＩｇκ鎖Ｖ−Ｊ２シグナルペプチドの下で指示される。
【０１７１】
１．８  ｍＳｕｓｈｉ、ｍＩＬ１５およびｍＡｐｏＡ１の遺伝子融合物をコードするプラスミドｐＣＭＶ−ｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏＡ１（ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５-ｍＡｐｏ）の構築
ｐＣＭＶ−ｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏＡ１は、ネズミＩＬ１５受容体α鎖（ＩＬ１５ｒａ）のＳｕｓｈｉドメイン、ネズミＩＬ１５、およびネズミアポリポタンパク質Ａ−Ｉを含んでなる融合タンパク質をコードする配列番号４５の配列を含んでなる。
【０１７２】
プライマーは、ネズミＩＬ１５と融合されたＳｕｓｈｉ配列を増幅すると同時に、この遺伝子の３’にＡｓｃＩ酵素の制限部位を構成する９ヌクレオチド(GGCGCGCCC)の配列をつなぎ、停止コドンを除去するように設計された。この付加された制限配列は、５’にＡｓｃＩ配列を含むＡｐｏ配列とのクローニングを可能とし、構成タンパク質にある特定の可動性を与える短いGAPリンカーペプチドに翻訳される。
【０１７３】
プライマーは、
Ｆｗ  Ｓｕｓｈｉ：5’-ATGGAGACAGACACCCTGCTG-3’（配列番号５１）；
Ｒｖ  ＩＬ１５  ＡｓｃＩ：5’-GGGCGCGCCGCTGGTGTTGATGAACAT-3’（配列番号５２）
であった。
【０１７４】
この配列を、鋳型として前記実施例に記載されているｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５と、プライマーＦｗ  ＳｕｓｈｉおよびＲｖ  ＩＬ１５  ＡｓｃＩを、酵素ＢｉｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(Bioline, London, UK)とともに用い、２７２０サーマルサイクラー(Applied Biosystems Foster City, US）にて、９４℃１分、９４℃３０秒を３０サイクル、５８℃３０秒および７２℃４５秒、その後、７２℃２分のＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物を１％アガロースＤ−１  ｌｏｗ  ＥＥＯアガロースゲル(Pronadisa, Madrid, Spain)で泳動させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いてゲル断片を精製した。精製したＤＮＡを、製造者の説明書に従って発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ(Invitrogen, Carfsbed, CA)にクローニングした。これをｐＣＭＶ−ｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ＡｓｃＩと呼称する。最後に、得られた配列を配列決定により確認した。
【０１７５】
遺伝子融合を行うため、プラスミドｐＣＭＶ−ｍＩＦＮ−ＡｓｃＩ−ｍＡｐｏ（特許出願ＷＯ２００９１５０２８４に記載、ｍＩＦＮとｍＡｐｏの間に融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる）を、バッファー４(New England Biolabs)中、３７℃で５０分、酵素ＡｓｃＩおよびＮｃｏＩで消化した。この消化産物を１％アガロースＤ−１  ｌｏｗ  ＥＥＯアガロースゲル(Pronadisa, Madrid, Spain)で泳動させ、ＩＦＮ配列を含まない開環ベクターを含有する上方のバンドをゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いて精製した。プラスミドｐＣＭＶ−ｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ＡｓｃＩを、同じ酵素および条件を用いて消化した。この場合には、ｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５断片を含有する下方のバンドを精製した。精製した両断片を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ高濃度と、バッファー溶液として２×Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎバッファー(Promega Madison, Wl, U.S.)を用い、この混合物を室温で１０分インキュベートして、１：３（ベクター：挿入配列）の比率で結合させた。次に、Ｔｏｐ１０細菌(Invitrogen, Carfsbed, CA)を形質転換させた。形質転換細菌をアンピシリン含有ＬＢ培地の入ったペトリプレートでのそれらの増殖に関して選択した（ベクターはこの抗生物質に対する耐性遺伝子を含むため）。陽性細菌からＭｉｎｉＰｒｅｐ法(Qiagen, Germany)を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した後、２μｇの前記プラスミドをＡｓｃＩ／ＰｍｅＩ酵素(New England Biolabs)で消化し、その後、その消化物を１％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、挿入配列の存在を確認した。得られたプラスミドを以下、ｐＣＭＶ−ｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏＡ１またはｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５-ｍＡｐｏと呼称する。
【０１７６】
実施例２  実験モデル
２．１  動物
実験は、５〜７週齢の間の雌免疫適格ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス(Harlan, Barcelona, Spain)で行った。ＩＬ１５Ｒα遺伝子の「ノックアウト」マウスを用いた(Lodolce et al. IL15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity 1998; 9: 669-676)。動物は、外部病原体の無い特殊条件下で、動物実験の倫理規則に従って取扱った。
【０１７７】
２．２  動物の取扱い
各ＤＮＡプラスミド（１０μｇ）を１．８ｍｌ生理食塩水血清０．９％(Braun)に再懸濁させ、２７．５Ｇの針と２．５ｍｌのシリンジ(Becton-Dickinson, Spain)を用いて、尾静脈から流体力学的注射により導入した。イソフルラン(Forane, Abbott)で吸入麻酔した後、眼窩後方から血液サンプルを得た。９．１ｘｇで５分間の２連続遠心分離によって血清を回収し、−２０℃で保存した。ケタミン(Imalgene)およびキシラジン(Rompun)の９：１混合物２００μｌ／マウスの腹腔内注射により非経口麻酔を行った。
【０１７８】
２．３細胞系統
ＣＴ２６細胞系統はＢＡＬＢ／Ｃマウス結腸直腸腺癌に由来し、発癌物質Ｎ−ニトロウス−Ｎ−メチル−ウレタンにより誘発されたものである。
【０１７９】
ＭＣ３８系統はネズミ腺癌に由来する。
【０１８０】
双方とも、５６℃で不活化した１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００ｍｇ／ｍｌペニシリン、１％β−メルカプトエタノール５．１０−３を添加した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。記載の細胞を加湿インキュベートチャンバーにて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。培養プレートおよび培養ボトルはGreiner Bio-one (Esse, Germany)により供給された。
【０１８１】
２．４  ｈＩＬ１５の測定
ｈＩＬ１５の血清レベルを、ＮＵＮＣ  ＭａｘｉＳｏｒｐ平底９６穴プレートで製造者の説明書に従ってＥＬＩＳＡキット（ヒトＩＬ１５セット、BD BiosiencesSan Diego, CA, US）を用い、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。
【０１８２】
２．５  フローサイトメトリー
細胞集団をフローサイトメトリーにより調べた。この趣意で、眼窩後方ならびに動物の脾臓およびから得た血液を用いた。固形器官を１５分間、コラゲナーゼおよびＤＮアーゼ溶液とともにインキュベートして細胞崩壊を促進し、これはＣｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ（著作権）(BC Falcon, Bedford, MA, US)の助けで行った。肝臓リンパ球を、３５％Ｐｅｒｃｏｌｌ（著作権）溶液(GE Heathcare, Uppsala, Sweden)中、ｔｈｅ細胞懸濁液の遠心分離により単離した。各肝臓当たり、以下の試薬：１．６ｍＬのＰＢＳ  １０×、１５．８ｍＬのパーコール（著作権）、２００Ｕのヘパリン(Mayne Pharma, Madrid, Spain)および２８ｍＬのＲＰＭＩ(Gibco, Invitrogen, Grand Island, NY, US)を用いた。
【０１８３】
総ての供試細胞懸濁液を５分間Ｔｒｉｓ  ＮＨ４Ｃｌバッファーで処理し、赤血球を溶解させた。
【０１８４】
細胞を５０μＬのＰＢＳに再懸濁させ、暗所にて４℃で１０分間、対応する抗体の混合物とともにインキュベートした。その後、２回の洗浄を行い、それらをＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（著作権）サイトメーター(BD Bioscience, San Diego, CA, US)で分析した。続いてのデータ解析はＦｌｏｗ  Ｊｏプログラムバージョン５．７．２を用いて行った。
【０１８５】
用いた抗体はＮＫ１．１−ＰＥ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ４４−ＡＰＣ、ＣＤ６２Ｌ−ＰＥ、ＣＤ８−ＰＥＣｙ７およびＮＫ１．１−ＡＰＣ(BD-Pharmamingen, BD Bioscience, San Diego, CA, US)であった。
【０１８６】
２．６  統計学的データ解析
データは、Ｐｒｉｓｍ  ５コンピュータープログラム(GraphPad Software, Inc.)を用いて統計学的に解析した。腫瘍出現に関するデータはカプラン・マイヤーグラフに記録した。種々の時点での供試データを反復測定ＡＮＯＶＡとその後のボンフェローニ検定により解析した。有意な値をｐ＜０．０５とみなした。
【０１８７】
実施例３  プラスミド構築物の流体力学的投与後のｈＩＬ１５の循環レベル
マウス血清中のヒトｈＩＬ１５のレベルを調べるため、マウス２〜３匹の群を配置し、各マウスに１０μｇの対応するプラスミド（またはプラスミドの組合せ）を流体力学的に投与した。各群に注射されたプラスミドは、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ、ｐｈＩＬ１５、ｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ、ｐＡｐｏまたは生理食塩水（Ｓ）であった。
【０１８８】
８時間目、２４時間目、９６時間目、１６８時間目および２４０時間目に血清サンプルを採取し、それらのｈＩＬ１５濃度をＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイにより測定した。ＡｐｏＡ１を発現する対照プラスミドを施したマウスの血清は検出可能なレベルのｈＩＬ１５を含んでいなかった（図１）。ｈＩＬ１５を発現するプラスミドを注射したマウスは８時間目に最大ｈＩＬ１５濃度を示し、急速に低下した（図１）。しかしながら、ＡｐｏＡ１−ｈＩＬ１５をコードするプラスミドを施したマウス（ｐＳｕｓｈｉプラスミドの同時感染を伴うまたは伴わない）は８時間目に最高血清ｈＩＬ１５濃度を示し、２４時間まで増加を維持した。１６８時間目では、ｐｈＩＬ１５を注射したマウスで見られたものとは対照的に、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５を注射したマウスではｈＩＬ１５をなお検出することができた（図１）。従って、融合タンパク質ＡｐｏＡ１−ｈＩＬ１５を発現する構築物は、より高く、かつ、より持続的なｈＩＬ１５の循環レベルを達成する。
【０１８９】
結論として、プラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５の流体力学的投与は、ｐｈＩＬ１５の投与によってもたられるものをはるかに超えるｈＩＬ１５の高い血清濃度を誘導する。
【０１９０】
実施例４  ＣＴＬＬ２細胞における機能アッセイ
ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５プラスミドの薬力学的効果を調べるため、増殖のためにＩＬ−２またはＩＬ１５を必要とするＣＴＬＬ２細胞(Meazza et al. Expression of two interleukin-15 mRNA isoforms in human tumors does not correlate with secretion: role of different signal peptides. Eur J Immunol 1997; 27: 1049-1054)を用いて機能アッセイを行った。
【０１９１】
これらのプラスミドを流体力学的注射のより投与し、２４時間目に血清サンプルを得た。血清を熱変性（５６℃４５分）により除補体し、４８時間ＣＴＬＬ２細胞培養物に加え、細胞増殖をトリチウム化チミジンで測定した。ｈＩＬ１５の血清濃度は、市販のＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを用いて測定した。等モル量のｈＩＬ１５に関して、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉｓで処置したマウス血清は、より強いＣＴＬＬ２細胞増殖を誘導した（図２）。
【０１９２】
従って、ｐＳｕｓｈｉプラスミドとｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５の同時投与はその生物学的効果を高めると結論付けられる。ｈＩＬ１５と融合したＡｐｏＡ１のプラスミド構築物は、ＩＬ１５ＲαのＳｕｓｈｉドメイン（ｐＳｕｓｈｉ）をコードするプラスミドを投与した場合よりもより高いＣＴＬＬ２細胞増殖誘導果を示した。
【０１９３】
実施例５  ＣＤ８リンパ球増殖の刺激
流体力学的注射の手段により肝臓で発現された構築物の潜在的免疫賦活効果を調べるため、まず、脾臓のＣＤ８  Ｔ細胞数の増加を分析した。このために、プラスミドを流体力学的に注射し、３日後、４日後、５日後、６日後および７日後に、脾臓を解離させて単細胞懸濁液を得、総細胞を数え、ＣＤ８  Ｔリンパ球を抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ４４抗体で標識した後に、多色フローサイトメトリーにより分析した。プラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉを一緒に注射した場合には、他の処置よりも高い程度で脾臓のＣＤ８  Ｔリンパ球数が増加した（図３Ａ）。同様のことが、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４４ｈｉ細胞として測定されるメモリーＣＤ８  Ｔリンパ球の数にも起こった（図３Ｃ）。総脾細胞に対するＣＤ８  ＴおよびＣＤ８メモリー細胞のパーセンテージもまた、プラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉを投与したマウス群では他の群に比べて高かった（図３Ｂおよび３Ｄ）。
【０１９４】
種々のプラスミドで処置したマウスの肝臓に存在するリンパ球に対するＣＤ８  Ｔリンパ球のパーセンテージも分析した。このために、プラスミドを流体力学的に注射し、３日目、４日目、５日目、６日目および７日目に肝臓を解離させ、リンパ球をＰｅｒｃｏｌｌ（著作権）溶液での遠心分離により単離し、ＣＤ８  Ｔリンパ球を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ８抗体で標識した後に、それらのリンパ球をフローサイトメトリーにより分析した。プラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉを一緒に投与したマウスは、残りの群のマウスよりも、肝臓において高いＣＤ８  Ｔリンパ球パーセンテージを示した（図４）。
【０１９５】
次に、種々のプラスミドで処置したマウスの末梢血に存在するリンパ球に対するＣＤ８  Ｔリンパ球のパーセンテージを分析した。このために、プラスミドを流体力学的に注射し、３日目、４日目、５日目および６日目に血液サンプルを得、ＣＤ８  Ｔリンパ球を抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４４抗体および抗ＣＤ６２Ｌ抗体で標識した。それらのリンパ球をフローサイトメトリーにより分析した。プラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉを一緒に投与したマウスは、処置後５日目および６日目に残りの群のマウスよりも末梢血において高いパーセンテージのＣＤ８  Ｔリンパ球を示した（図５Ａ）。この群（図５Ｂ）でも、また、ｔｈ部分集団であるＣＤ８  Ｔエフェクターメモリー細胞（ＣＤ８＋  ＣＤ４４＋  ＣＤ６２Ｌ−）およびＣＤ８中枢メモリー細胞（ＣＤ８＋  ＣＤ４４＋  ＣＤ６２Ｌ＋）（図５Ｃおよび５ｄ）でも、より高いパーセンテージのＣＤ８  Ｔメモリーリンパ球（ＣＤ８＋  ＣＤ４４＋）が見られた。
【０１９６】
ＣＤ８  Ｔリンパ球の数およびパーセンテージの検討は、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉの投与が、脾臓、肝臓および末梢血において、他のプラスミドの投与よりも豊富なＣＤ８  Ｔリンパ球集団を誘導することを示す。具体的には、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉの投与は、脾臓、肝臓および血液において、構築物ｐｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉの投与よりも有意に高いＣＤ８  Ｔリンパ球集団をもたらす。
【０１９７】
実施例６  皮下ＣＴ２６腫瘍モデルに対するＡｐｏＡ１およびｈＩＬ１５に基づく構築物の抗腫瘍効果
流体力学的に注射したＡｐｏＡ１およびｈＩＬ１５に基づく構築物の抗腫瘍効果を調べるために、結腸直腸腺癌に由来するＣＴ２６細胞系統によって誘発されるＢａｌｂ／ｃマウスの皮下腫瘍モデルを選択した。マウス１匹当たり５×１０５細胞を皮下注射し、３日目にＡｐｏＡ１、ｈＩＬ１５およびＳｕｓｈｉに基づき種々の構築物で処置した。腫瘍サイズは、デジタルカリパスで週に２回２つの直径の積を計算して測定した。サイズが２４６ｍｍ２を超えたところでマウスを犠牲にした。
【０１９８】
ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉで処置したマウス群で腫瘍増殖の遅延が見られたが、これは統計学的に有意なものではなかった（図６Ａ）。ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉで処置したマウスの２５％が腫瘍接種後５０日生存し、目に見える腫瘍は無かった（図６Ｂ）。ｐＡｐｏプラスミドで処置したマウスの１４％が生存し、同様にｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５で処置したマウスの１１％が生存した。他の処置群のマウスでこの腫瘍に生き残ったものは無かった。これらのデータは、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉによる処置は皮下ＣＴ２６腫瘍モデルにおいてある種の抗腫瘍効果を有することを示す。
【０１９９】
実施例７  皮下ＭＣ３８腫瘍モデルに対するＡｐｏＡ１およびｈＩＬ１５に基づく構築物の抗腫瘍効果
ＡｐｏＡ１およびｈＩＬ１５に基づく構築物の抗腫瘍効果の検討を継続するために、別の皮下腫瘍モデルを選択した。Ｃ５７Ｂ１６マウスに５×１０５細胞のＭＣ３８系統を皮下注射し、６日目に腫瘍結節を有するマウスに対し、ＡｐｏＡ１、ｈＩＬ１５およびＳｕｓｈｉに基づく種々の構築物で処置した。腫瘍サイズはデジタルカリパスで週に２回２つの直径の積を計算して測定し、サイズが２４６ｍｍ２を超えたところでマウスを犠牲にした。
【０２００】
ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉで処置したマウス群で腫瘍増殖の遅延が見られたが、これは統計学的に有意なものではなかった（図７ａ）。ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉで処置したマウスの３７．６％が腫瘍接種後６４日生存し、目に見える腫瘍は無かった（図７ｂ）。ｐＡｐｏプラスミドで処置したマウスの１６．７％が生存し、同様にｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５で処置したマウスの４０％、ｐｈＩＬ１５で処置したマウスの１７％、および生理食塩水（Ｓ）単独を施したマウスの３３％が生存した。ｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ群のマウスに生存したものは無かった。
【０２０１】
これらのデータは、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉによる処置が皮下ＭＣ３８腫瘍モデルに対してある種の抗腫瘍効果を有することを示す。
【０２０２】
実施例８  脾臓内ＭＣ３８腫瘍モデルに対するＡｐｏＡ１およびｈＩＬ１５に基づく構築物の抗転移効果
ＡｐｏＡ１およびｈＩＬ１５に基づく構築物の抗腫瘍効果の検討を、肝臓転移を生じる腫瘍細胞の脾臓内注射モデルを用いて継続した。
【０２０３】
Ｃ５７Ｂ１６マウスに、マウス１匹当たり５×１０５細胞のＭＣ３８系統を脾臓内注射し、翌日、ＡｐｏＡ１、ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉに基づく種々の構築物で処置した。
【０２０４】
１９日目にマウスを犠牲にし、肝臓に存在する転移の数を観察した。転移数に応じてマウスを次の３群に分けた：Ｉ  広範囲の肝臓転移または全身転移のために死亡したマウス（一見して健常な肝臓組織が観察できない）；ＩＩ  肝臓組織の一部に転移を示すマウス；ＩＩＩ  肝臓転移がないマウス。
【０２０５】
ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉで処置したマウス群では、７１％が肝臓転移を示さなかったのに対し、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５で処置したマウスでは３０％、ｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉｄで処置したマウスでは２５％、生理食塩水（Ｓ）を施したマウスでは２０％、およびｐｈＩＬ１５群とｐＡｐｏ群では０％であった（図８）。
【０２０６】
これらのデータから、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉの投与は、脾臓内ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて調べた他の構築物よりも効果的な抗転移効果を有すると結論付けられる。
【０２０７】
実施例９  ＩＬ１５α受容体「ノックアウト」マウスに対するＡｐｏＡ１およびｈＩＬ１５に基づく構築物の投与の効果
ＩＬ１５α受容体を欠くマウスに対するＡｐｏＡ１およびｈＩＬ１５に基づく構築物の免疫賦活効果の検討を継続した。これらのマウスは、ＮＫ細胞を欠き、メモリーＣＤ８  Ｔ細胞の量が少ないことから、特徴的な表現型を示す(Lodolce et al. Immunity 1998; 9: 669-676)。
【０２０８】
この実験の目的は、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉがこの表現型を改変することができるかどうかを観察することであった。４匹のマウスに、１匹にはプラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉを、１匹にはプラスミドｐｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉを、１匹にはプラスミドｐＡｐｏを、最後に１匹にはｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５を注射した。５日目にマウスを犠牲にし、脾臓を摘出し、ＮＫ細胞およびＣＤ８  Ｔメモリーリンパ球の脾臓集団をフローサイトメトリーにより調べた（図９）。
【０２０９】
プラスミドｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉで処置したマウスが示したＮＫ細胞パーセンテージは１．０２％であり、ｐＡｐｏで処置したマウスの場合（０．３９％）よりはるかに高かった。ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉで処置したマウスのＣＤ８  Ｔメモリーリンパ球については、総脾細胞に対して１．４７％のＣＤ８＋  ＣＤ４４＋細胞が存在した。このパーセンテージはｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５構築物単独で達成されたものと同等である。この実験は、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５およびｐＳｕｓｈｉ構築物による処置が、ＩＬ１５α受容体「ノックアウト」マウスの表現型を部分的に回復させ、試験下の残りの構築物で見られたものよりも高いＮＫおよびＣＤ８  Ｔメモリー細胞の脾臓パーセンテージが得られることを示す。
【０２１０】
実施例１０  Ｓｕｓｈｉ、ＩＬ１５およびＡｐｏＡ１の融合物に基づく三重構築物の投与の効果
実施例１．８．に記載の三重構築物によるプラスミドｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏのセイン剤的免疫賦活効果を調べるために、実施例５の記載と同様にして、新たなＣＤ８リンパ球増殖試験を行った。
【０２１１】
このために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス群を確立し（各処置群２〜３匹）、供試プラスミド（２．５μｇ／マウス）を流体力学的に注射した。６日後、脾臓を解離させて単細胞懸濁液を得、総細胞を数え、ＣＤ８  Ｔリンパ球を抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ４４抗体で標識し、ＮＫ細胞を抗ＣＤ３抗体、抗ＮＫ１．１抗体で標識した後に、多色フローサイトメトリーにより分析した。
【０２１２】
種々の群で供試したプラスミドは、
・ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏ；
・ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉの組合せ（ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ）；
・ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５；
・ｐｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉの組合せ（ｐｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ）；
・ｐｈＩＬ１５；および
・ｐＡｐｏ
であった。
【０２１３】
この試験では、三重融合タンパク質をコードするｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏプラスミドで処置した動物群で、残りの処置群よりも著しく高い脾細胞数の増殖が見られた（図１０Ａ）。同様に、ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏによる処置は、他の処置で見られたものよりも極めて有意に高いＣＤ８  Ｔリンパ球数（図１０Ｂ）およびＮＫ細胞数（図１０Ｃ）の増殖を誘導した。
【０２１４】
実施例１１  マウス脾臓におけるＣＤ８  ＴおよびＮＫ細胞増殖の刺激に対する、ネズミＩＬ１５をコードする構築物およびヒトＩＬ１５をコードする構築物の効果
ｍＩＬ１５分子およびｈＩＬ１５分子をコードする構築物の、脾細胞数に対する刺激活性について、対応するプラスミドを流体力学的注射（１０μｇ／マウス）により、ｐＳｕｓｈｉプラスミドの同時投与を伴ってまたは伴わずに投与することによる比較試験を行った。４日後に、脾臓を解離させて単細胞懸濁液を得、総細胞を数え、ＣＤ８  Ｔリンパ球を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ８抗体で標識し、ＮＫ細胞を抗ＮＫ１．１抗体および抗ＣＤ−３抗体で標識した後に、多色フローサイトメトリーにより分析した。
【０２１５】
プラスミドｐｍＩＬ１５およびプラスミドｐｈＩＬ１５の注射は同等数の脾細胞、ならびに同等パーセンテージのＣＤ８  ＴおよびＮＫ細胞を誘導した（図１１）。同様に、プラスミドｐｍＩＬ１５またはｐｈＩＬ１５をｐＳｕｓｈｉと同時投与した場合では、ヒトタンパク質をコードするプラスミドを注射したマウスの脾臓はより高いパーセンテージのＣＤ８  Ｔ細胞およびＮＫ細胞を示すことが認められたが、この傾向は統計学的に有意であると言えなかった（ラスカル−ウォリス検定）。
【０２１６】
実施例１２  脾臓および肝臓におけるＮＫ細胞のパーセンテージに対するｍＳｕｓｈｉとｍＩＬ１５およびＡｐｏとの融合の効果
三重融合タンパク質をコードするプラスミドｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏは、脾臓および肝臓のＮＫ細胞の数を、プラスミドｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５をプラスミドｐＡｐｏと同時に投与する場合よりも高い程度で増大させる。
【０２１７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス群を確立し、供試プラスミドを流体力学的に注射した。
・ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏ、用量１μｇ／マウス；
・ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏ、用量２．５μｇ／マウス；
・ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏ、用量５μｇ／マウス；
・ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５とｐＡｐｏの組合せ、用量１μｇ／マウス；
・ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５とｐＡｐｏの組合せ、用量２．５μｇ／マウス；および
・ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５とｐＡｐｏの組合せ、用量５μｇ／マウス。
【０２１８】
４日後に、脾臓を解離させて単細胞懸濁液を得、肝臓のリンパ細胞をＰｅｒｃｏｌｌ（著作権）による遠心分離によって単離した。ＮＫ細胞を抗ＮＫ１．１抗体および抗ＣＤ−３抗体で標識し、多色フローサイトメトリーにより分析した。ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏ注射は、脾臓および肝臓において、ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５とｐＡｐｏの同時投与（ｐＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ−１５＋ｐＡｐｏ）の場合よりも高いＮＫ細胞パーセンテージの存在を誘導した（図１２）。
【０２１９】
実施例１３  皮下ＭＣ３８腫瘍モデルに対するＳｕｓｈｉ、ＩＬ１５およびＡｐｏＡ１に基づく三重構築物の抗腫瘍効果
実施例１．８に記載の三重構築物によるｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏプラスミドの抗腫瘍効果の検討を継続するために、皮下腫瘍モデルを選択した。Ｃ５７Ｂ１６マウスに５×１０５細胞のＭＣ３８系統を皮下注射し、８日目および１９日目に種々の構築物で処置した。種々の処置群での供試プラスミドは、
・ｐＡｐｏ；
・ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏ；
・ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５とｐＳｕｓｈｉの組合せ（ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ）
であった。
【０２２０】
このために、腫瘍結節を有するＣ５７ＢＬ／６マウス群を確立した：５匹はｐＡｐｏで、８匹はｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏで、９匹はｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉで、供試プラスミドｐＡｐｏ（１μｇ／マウス）、ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏ（１μｇ／マウス）およびｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉ（１０μｇ／マウス１匹）を流体力学的に注射することにより処置した。腫瘍サイズは、デジタルカリパスで週に２回２つの直径の積を計算して測定し、サイズが２４６ｍｍ２を超えたところでマウスを犠牲にした。
【０２２１】
三重融合タンパク質をコードするｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏで処置したマウス群で腫瘍増殖の遅延が見られたが、これは統計学的に有意なものではなかった（図１３）。ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏで処置したマウスの３３．３％は、試験の終了時（接種２９日後）に目に見える腫瘍を示さず、４０ｍｍ２を超える表在腫瘍を示したマウスは３３．３％だけであった。ｐＡｐｏプラスミドで処置したマウスは、犠牲当日（２９日目）、２０％が目に見える腫瘍を示し、８０％のマウスが４０ｍｍ２を超える腫瘍を示したが、ｐＡｐｏ−ｈＩＬ１５＋ｐＳｕｓｈｉで処置したマウスでは、試験の終了時（２９日目）に腫瘍を持たないものはなく、三重融合物の用量よりも１０倍高い用量の各プラスミドを施したにもかかわらず、８０％のマウスが４０ｍｍ２を超える腫瘍を持っていた。
【０２２２】
これらのデータは、ｐｍＳｕｓｈｉ−ｍＩＬ１５−ｍＡｐｏによる処置が皮下ＭＣ３８腫瘍モデルに対してある種の抗腫瘍効果を有することを示す。
【図１】
2013513377.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2013513377.tif 000010
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2013513377.tif 000013
【図１０】
2013513377.tif 000014
【図１１】
2013513377.tif 000015
【図１２】
2013513377.tif 000016
【図１３】
2013513377.tif 000017
【配列表】
2013513377000001.app
【国際調査報告】
2013513377.tif 000018
2013513377.tif 000019
2013513377.tif 000020
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2013513377.tif 000022
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