(57)【要約】  本発明は、ｉＲＮＡ二重鎖剤のインビボ送達に都合よい、少なくとも１つのリガンドに結合したＲＮＡ剤のための効果的なモチーフを提供する。その上、本発明は、これらの組成物を製造する方法、並びに、例えば、様々な疾患状態の処置のための、これらの組成物を使用してこれらのｉＲＮＡ二重鎖剤を細胞中に導入する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子をインビボで発現抑制できるｉＲＮＡ二重鎖剤であって、
（ａ）センス鎖であり、
（ｉ）少なくとも２つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフと、
（ｉｉ）少なくとも１つのリガンドと、
を含むセンス鎖、および
（ｂ）アンチセンス鎖であり、
（ｉ）少なくとも２つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフ、
を含むアンチセンス鎖、
を含むｉＲＮＡ二重鎖剤において、
前記交互モチーフが二重鎖領域内にあり、組成物が必要に応じて１つ以上の突出部および／またはキャッピング基をさらに含む、
ｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項２】
前記アンチセンス鎖の５’炭素位置にホスフェートまたはホスフェート誘導体をさらに含む、請求項１記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項３】
少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合、または少なくとも１つのメチルホスホネートヌクレオシド間結合をさらに含む、請求項１記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項４】
前記化学修飾ヌクレオチドが、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ3、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロからなる群より選択される、請求項１記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項５】
前記化学修飾ヌクレオチドが２’−ＯＣＨ3および２’−Ｆである、請求項１記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項６】
前記突出部が、長さが少なくとも２つのヌクレオチドであり、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびそれらの組合せからなる群より選択され、必要に応じて、前記２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを含み、該２つのヌクレオチドは同じであって異なっても差し支えない、請求項１記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項７】
前記突出部が、標的ｍＲＮＡに対して不一致を形成し得るか、または標的ｍＲＮＡと完全に相補性であり得る、請求項１記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項８】
前記二重鎖領域が、１２〜３０の間のヌクレオチドの長さである、請求項１記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項９】
前記リガンドが前記センス鎖の３’末端に結合している、請求項１記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項１０】
（ａ）センス鎖であり、
（ｉ）交互２’−フルオロ修飾と、
（ｉｉ）３’末端にある少なくとも１つのリガンドと、
を含むセンス鎖、および
（ｂ）アンチセンス鎖であり、
（ｉ）交互２’−フルオロ修飾と、
（ｉｉ）リン酸化されている５’末端アンチセンスヌクレオチドと、
を含むアンチセンス鎖、
を含む、請求項１記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項１１】
少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合、または少なくとも１つのメチルホスホネートヌクレオシド間結合をさらに含む、請求項１０記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項１２】
前記化学修飾ヌクレオチドが、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ3、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロからなる群より選択される、請求項１０記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項１３】
前記化学修飾ヌクレオチドが２’−ＯＣＨ3および２’−Ｆである、請求項１０記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項１４】
前記突出部が、長さが少なくとも２つのヌクレオチドであり、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびそれらの組合せからなる群より選択され、必要に応じて、前記２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを含み、該２つのヌクレオチドは同じであって異なっても差し支えない、請求項１０記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項１５】
前記突出部が、標的ｍＲＮＡに対して不一致を形成し得るか、または標的ｍＲＮＡと完全に相補性であり得る、請求項１０記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項１６】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖がＺ−Ｘ−Ｙ構造を有する、請求項１０記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項１７】
前記二重鎖領域が、１２〜３０の間のヌクレオチドの長さである、請求項１０記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項１８】
前記リガンドが前記センス鎖の３’末端に結合している、請求項１０記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項１９】
式（Ｉ’）：
【化１】
2013541334.tif 000107
に示された構造を有する化合物を含むｉＲＮＡ二重鎖剤：
式中：
ＡおよびＢの各々は、各存在毎に独立して、Ｏ、Ｎ（ＲN）またはＳであり；
ＸおよびＹの各々は、各存在毎に独立して、Ｈ、保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−Ｒ1−Ｑ’−Ｒ2−ＯＰ（Ｚ”’）（Ｚ””）Ｏ−オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）−式（Ｉ）、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）−、または−Ｑ−Ｒであり；式中、オリゴヌクレオチドは、
（ａ）センス鎖であり、
（ｉ）交互２’−フルオロ修飾と、
（ｉｉ）少なくとも１つのリガンドと、
を含むセンス鎖、および
（ｂ）アンチセンス鎖であり、
（ｉ）交互２’−ハロゲン修飾と、
（ｉｉ）５’炭素位置でリン酸化されている第１の５’末端アンチセンスヌクレオチドと、
を含むアンチセンス鎖、
を含み；
Ｒは、Ｌ1であるか、または式（ＩＩ）〜（Ｖ）：
【化２】
2013541334.tif 000108
に示された構造を有し；
ｑ2A、ｑ2B、ｑ3A、ｑ3B、ｑ4A、ｑ4B、ｑ5A、ｑ5Bおよびｑ5Cは、各存在毎に独立して、０〜２０を表し、式中、反復単位は同じであっても、異なってもよく；
ＱおよびＱ’は、各存在毎に独立して、存在しないか、−（Ｐ7−Ｑ7−Ｒ7）p−Ｔ7−、または−Ｔ7−Ｑ7−Ｔ7'−Ｂ−Ｔ8'−Ｑ8−Ｔ8であり；
Ｐ2A、Ｐ2B、Ｐ3A、Ｐ3B、Ｐ4A、Ｐ4B、Ｐ5A、Ｐ5B、Ｐ5C、Ｐ7、Ｔ2A、Ｔ2B、Ｔ3A、Ｔ3B、Ｔ4A、Ｔ4B、Ｔ5A、Ｔ5B、Ｔ5C、Ｔ7、Ｔ7'、Ｔ8、およびＴ8'の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ2、ＣＨ2ＮＨ、またはＣＨ2Ｏであり；
Ｂは、−ＣＨ2−Ｎ（ＢL）−ＣＨ2−であり；
ＢLは、−ＴB−ＱB−ＴB'−Ｒxであり；
Ｑ2A、Ｑ2B、Ｑ3A、Ｑ3B、Ｑ4A、Ｑ4B、Ｑ5A、Ｑ5B、Ｑ5C、Ｑ7、Ｑ8、およびＱBは、各存在毎に独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ2、Ｎ（ＲN）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ”）、Ｃ≡Ｃ、またはＣ（Ｏ）の１つ以上により割り込まれていても、終わらされても差し支えなく；
ＴBおよびＴB'の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＣＨ2、ＣＨ2ＮＨ、またはＣＨ2Ｏであり；
Ｒx、親油性物質、ビタミン、ペプチド、炭水化物、エンドソーム溶解成分、ステロイド、テルペン、またはカチオン性脂質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ2A、Ｒ2B、Ｒ3A、Ｒ3B、Ｒ4A、Ｒ4B、Ｒ5A、Ｒ5B、Ｒ5C、Ｒ7の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒa）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒa）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化３】
2013541334.tif 000109
またはヘテロシクリルであり；
Ｌ1、Ｌ2A、Ｌ2B、Ｌ3A、Ｌ3B、Ｌ4A、Ｌ4B、Ｌ5A、Ｌ5B、およびＬ5Cの各々は、各存在毎に独立して、炭水化物であり；
Ｒ’およびＲ”の各々は、各存在毎に独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲN）2であり；
ＲNは、各存在毎に独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり；
Ｒaは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
Ｚ’、Ｚ”、Ｚ”’、およびＺ””の各々は、各存在毎に独立して、ＯまたはＳであり；
ｐは、各存在毎に独立して、０〜２０である。
【請求項２０】
前記ｉＲＮＡ二重鎖剤が、式（ＶＩ）
【化４】
2013541334.tif 000110
に示された構造を少なくとも１つ含む、請求項１９記載のｉＲＮＡ二重鎖剤：
式中：
Ｘ6およびＹ6の各々は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、ポリマー、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−Ｒ1−Ｑ’−Ｒ2−ＯＰ（Ｚ”’）（Ｚ””）Ｏ−オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）−式（Ｉ）もしくは−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）−であり；
Ｑ6は、存在しないか、または−（Ｐ6−Ｑ6−Ｒ6）v−Ｔ6−であり；
Ｐ6およびＴ6の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ2、ＣＨ2ＮＨ、またはＣＨ2Ｏであり；
Ｑ6は、各存在毎に独立して、存在しないか、置換アルキレンであり、ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ2、Ｎ（ＲN）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ”）、Ｃ≡Ｃ、またはＣ（Ｏ）の１つ以上により割り込まれていても、終わらされても差し支えなく； 
Ｒ6は、各存在毎に独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒa）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒa）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化５】
2013541334.tif 000111
またはヘテロシクリルであり；
Ｒ’およびＲ”の各々は、各存在毎に独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲN）2であり；
ＲNは、各存在毎に独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり；
Ｒaは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
Ｚ’、Ｚ”、Ｚ”’、およびＺ””の各々は、各存在毎に独立して、ＯまたはＳであり；
ｖは、各存在毎に独立して、０〜２０を表し；
ＲLは、親油性物質またはカチオン性脂質である。
【請求項２１】
ＲLが親油性物質である、請求項２０記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項２２】
ＲLがコレステロールである、請求項２０記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項２３】
ＲLが、
【化６】
2013541334.tif 000112
である、請求項２０記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項２４】
Ｒが、式（Ｖ）：
【化７】
2013541334.tif 000113
の構造を有する、請求項１９記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項２５】
Ｒが、
【化８】
2013541334.tif 000114
である、請求項２４記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項２６】
Ｒが、
【化９】
2013541334.tif 000115
である、請求項２４記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項２７】
前記化合物が、構造
【化１０】
2013541334.tif 000116
を有する、請求項１９記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項２８】
前記化合物が、構造
【化１１】
2013541334.tif 000117
を有する、請求項１９記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項２９】
前記化合物が、構造
【化１２】
2013541334.tif 000118
を有する、請求項１９記載のｉＲＮＡ二重鎖剤。
【請求項３０】
（ａ）センス鎖であり、
（ｉ）少なくとも２つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフと、
（ｉｉ）少なくとも１つのリガンドと、
を含むセンス鎖、および
（ｂ）アンチセンス鎖であり、
（ｉ）少なくとも２つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフ、
を含むアンチセンス鎖、
を含むｉＲＮＡ二重鎖剤を投与することによって、対象における特定の標的にポリヌクレオチドを送達する方法。
【請求項３１】
前記投与する工程が、筋肉内、気管支内、胸腔内、腹膜内、動脈内、リンパ管、静脈内、皮下、脳脊髄、またはそれらの組合せを含む投与手段により行われる、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
対象の特定の標的にポリヌクレオチドを送達する方法であって、前記対象に請求項１記載のｉＲＮＡ二重鎖剤を皮下で送達し、よって、前記ポリヌクレオチドが該対象の特定の標的に送達される工程を含む方法。
【請求項３３】
請求項１から２９いずれか１項記載のｉＲＮＡ二重鎖剤を単独でまたは薬学的に許容される担体または賦形剤と共に含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【優先権の主張】
【０００１】
本出願は、その内容をここに全て引用する、２０１０年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／３８３２５０号の優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ｉＲＮＡ二重鎖剤(duplex agent)のインビボ送達に都合よい、少なくとも１つのリガンドに結合したＲＮＡ剤のための効果的なモチーフ、並びにインビボ治療に使用するのに適したｉＲＮＡ組成物を提供する。その上、本発明は、これらの組成物を製造する方法、並びに、例えば、様々な疾患状態の処置のための、これらの組成物を使用してこれらのｉＲＮＡ二重鎖剤を細胞中に導入する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチド化合物には、医療における重要な治療用途がある。オリゴヌクレオチドは、特定の疾患の原因である遺伝子を発現抑制する(silence)ために使用できる。遺伝子発現抑制は、翻訳を阻害することによってタンパク質の形成を防ぐ。重要なことに、遺伝子発現抑制薬剤(gene-silencing agent)は、疾患に関連するタンパク質の機能を阻害する従来の小さい有機化合物に代わる有望な代替物である。ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡは、遺伝子発現抑制によってタンパク質の形成を防ぐオリゴヌクレオチドである。
【０００４】
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を遮断できるという観察を記述するためにＦｉｒｅと共同研究者により最初に作られた用語である（非特許文献１；非特許文献２）。短いｄｓＲＮＡが、脊椎動物を含む多くの有機体において遺伝子特異的な転写後遺伝子発現抑制を命令し、遺伝子機能を研究するための新たなツールを提供してきた。ＲＮＡｉは、遺伝子発現抑制のトリガーと相同のメッセンジャーＲＮＡを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼである、ＲＮＡ誘発遺伝子発現抑制複合体（ＲＩＳＣ）により媒介される。ＲＩＳＣは、二重鎖ＲＮＡトリガーに由来する短いＲＮＡ（約２２のヌクレオチド）を含有することが知られているが、この働きのタンパク質成分は未知のままであった。
【０００５】
ｓｉＲＮＡ化合物は、様々な診断目的と治療目的のための有望な薬剤である。ｓｉＲＮＡ化合物は、遺伝子の機能を特定するために使用できる。その上、ｓｉＲＮＡ化合物は、病原遺伝子を発現抑制することによって機能する新たなタイプの薬剤として大きな可能性を提供する。中枢神経系疾患、炎症性疾患、代謝異常、腫瘍学、感染性疾患、および眼疾患を含む多くの疾患の処置のための干渉性ＲＮＡ治療剤を開発するための研究が、現在進行中である。
【０００６】
ｓｉＲＮＡは、潜在的な抗ウイルス性治療剤として極めて効果的であることが示されており、数多くの公表された実例が最近見かけられる。ウイルス・ゲノムにおける標的に対して向けられたｓｉＲＮＡ分子は、インフルエンザ（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）（非特許文献６）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（非特許文献７）、Ｃ型肝炎ウイルス（非特許文献８；非特許文献９）、およびＳＡＲＳコロナウイルス（非特許文献１０）の動物モデルにおいてウイルス価を劇的に数桁も減少させる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Fire et al. (1998) Nature 391, 806-811
【非特許文献２】Elbashir et al. (2001) Genes Dev. 15, 188-200
【非特許文献３】Ge et al., (2004) Proc. Natl. Acd. Sci. USA,  101, 8676-8681
【非特許文献４】Tompkins et al. (2004) Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 101, 8682-8686
【非特許文献５】Thomas et al. (2005) Expert Opin. Biol. Ther. 5, 495-505
【非特許文献６】Bitko et al. (2005) Nat. Med. 11, 50-55
【非特許文献７】Morrissey  et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23, 1002-1007
【非特許文献８】Kapadia et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 2014-2018
【非特許文献９】Wilson et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 2783-2788
【非特許文献１０】Li et al. (2005) Nat. Med. 11, 944-951
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
インビボでの細胞への効率的な送達には、特異的ターゲティングおよび細胞外環境、特に血清タンパク質からの実質的な保護が必要である。特異的ターゲティングを行う方法の１つは、ｉＲＮＡ二重鎖剤に標的部分を結合させる(conjugate)ことである。この標的部分は、要求される標的部位にｉＲＮＡ二重鎖剤を標的にする上で役立つ。標的部分が送達を改善できる様式の１つは、受容体媒介エンドサイトーシス活性によるものである。この摂取機構は、膜構造の陥入による膜によって、または送達系の細胞膜による融合によって、包まれる区域の内部への、膜受容体に結合したｉＲＮＡ二重鎖剤の移動を含む。このプロセスは、特異的リガンドの受容体への結合後に、細胞表面または膜受容体の活性化によって開始される。ガラクトース、マンノース、マンノース−６−リン酸などの糖、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質などのペプチドおよびタンパク質、ビタミンＢ１２、インスリンおよび上皮成長因子（ＥＧＦ）を認識するものを含む、多くの受容体媒介エンドサイトーシス系が公知であり、研究されてきた。アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）は能力の高い受容体であり、これは、肝細胞上に非常に豊富にある。ＡＳＧＰ−Ｒは、Ｄ−ＧａｌよりもＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に５０倍高い親和性を示す。以前の研究では、ｎＭ親和性を達成するために、多価が必要であるのに対し、糖の中での間隔も重要であることが示されてきた。ターゲティングリガンドの使用に関する成功がいくつかあるが、そのような成功は、常にインビボ条件に転換される訳ではない。これまでの成功にもかかわらず、上述したオリゴヌクレオチド治療剤のインビボ送達の欠点に対処した、より良く効く受容体特異的リガンド結合ｉＲＮＡ二重鎖剤およびその調製方法が明確に必要とされている。本発明は、この非常に重要な目的に向けられる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ｉＲＮＡ二重鎖剤のインビボ送達に都合よい、少なくとも１つのリガンドに結合したＲＮＡ剤のための効果的なモチーフ、並びにインビボ治療に使用するのに適したｉＲＮＡ組成物を提供する。
【００１０】
１つの態様において、本発明は、少なくとも１つの炭水化物リガンド、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖に結合したｉＲＮＡ二重鎖剤の効果的なモチーフを提供する。これらの炭水化物結合ｉＲＮＡ二重鎖剤は、特に、肝臓の実質細胞を標的とする。１つの実施の形態において、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、複数の、好ましくは２つまたは３つの炭水化物リガンドを含む。１つの実施の形態において、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、１つ以上のガラクトース部分を含む。別の実施の形態において、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、少なくとも１つの（例えば、２つまたは３つ以上）ラクトース分子（ラクトースは、ガラクトースに結合したグルコースである）を含む。別の実施の形態において、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、少なくとも１つの（例えば、２つまたは３つ以上）Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−Ａｃ−グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、またはマンノース（例えば、マンノース−６−リン酸）を含む。１つの実施の形態において、ｉＲＮＡ二重鎖剤は少なくとも１つのマンノースリガンドを含む、このｉＲＮＡ二重鎖剤はマクロファージを標的とする。
【００１１】
１つの態様において、本発明は、炭水化物リガンドを含むｉＲＮＡ二重鎖剤を特徴とし、炭水化物リガンドの存在により、ｉＲＮＡ二重鎖剤の肝臓への送達を増加させることができる。それゆえ、炭水化物リガンドを含むｉＲＮＡ二重鎖剤は、肝臓において発現が望ましくない遺伝子を標的にするのに有用であり得る。例えば、炭水化物リガンドを含むｉＲＮＡ二重鎖剤は、肝炎ウイルス（例えば、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ａ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、Ｆ型肝炎、Ｇ型肝炎、またはＨ型肝炎）による核酸発現を標的にできる。
【００１２】
１つの態様において、本発明は、対象における特定の標的にポリヌクレオチドを皮下で送達する方法をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】様々な複合体と共に化学修飾モチーフを含有するＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡのインビボ遺伝子発現抑制を示すグラフ
【図１Ｂ】様々な複合体と共に化学修飾モチーフを含有するＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡのインビボ遺伝子発現抑制を示すグラフ
【図２】Ｃｈｏｌ−ＧａｌＮＡｃ３複合体と共に化学修飾モチーフを含有するＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡのインビボ遺伝子発現抑制を示すグラフ
【図３】ＧａｌＮＡｃ3複合体ＰＫ研究サンプルのＳＣ投与後のＰＤ−肝臓遺伝子発現抑制を示すグラフ：１００ｍｇ／ｋｇ、投与後２４、４８、９６および１６８時間
【図４】Ｃｈｏｌ−ＧａｌＮＡｃ３複合体と共に化学修飾モチーフを含有するＰＴＥＮ  ｓｉＲＮＡのインビボ遺伝子発現抑制を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ｓｉＲＮＡにおける二重鎖領域の交互モチーフ(alternating motif)をＧａｌＮＡｃ３含有リガンドと組み合わせることによって得られた優れた結果に基づく。特に、そのｓｉＲＮＡは、皮下または静脈内投与によって対象の標的部位に効果的に送達された。
【００１５】
１つの態様において、本発明は、標的遺伝子をインビボで発現抑制できるｉＲＮＡ二重鎖剤であって、
（ａ）センス鎖であり、
（ｉ）少なくとも２つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフと、
（ｉｉ）少なくとも１つのリガンドと、
を含むセンス鎖、および
（ｂ）アンチセンス鎖であり、
（ｉ）少なくとも２つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフ、
を含むアンチセンス鎖、
を含むｉＲＮＡ二重鎖剤において、
前記交互モチーフが二重鎖領域内にあり、組成物が必要に応じて１つ以上の突出部および／またはキャッピング基をさらに含む、
ｉＲＮＡ二重鎖剤を提供する。
【００１６】
１つの実施の形態において、本発明のｉＲＮＡ二重鎖剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合、または少なくとも１つのメチルホスホネートヌクレオシド間結合をさらに含む。
【００１７】
１つの実施の形態において、本発明のｉＲＮＡ二重鎖剤は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ3、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロからなる群より選択される化学修飾ヌクレオチドを含む。
【００１８】
１つの実施の形態において、本発明のｉＲＮＡ二重鎖剤は、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびそれらの組合せからなる群より選択される、長さで少なくとも２つのヌクレオチドを含む突出部を含み、必要に応じて、同じであって異なっても差し支えない前記２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを含む。この突出部は、標的ｍＲＮＡと不一致を形成できるか、または標的ｍＲＮＡと完全に相補性であり得る。
【００１９】
１つの実施の形態において、リガンドは、センス鎖の３’末端に結合される。
【００２０】
１つの実施の形態において、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、末端二重鎖安定性の特異修飾(differential modificationof the terminal duplex stability)（ＤＭＴＤＳ）をさらに含む。
【００２１】
末端二重鎖安定性の特異修飾（ＤＭＴＤＳ）
その上、本発明は、ＤＭＴＤＳおよびここに記載された別の要素を有するｉＲＮＡ剤を含む。例えば、本発明は、ここに記載されたｉＲＮＡ剤、例えば、反復性(palindromic)ｉＲＮＡ剤、非標準対合を有するｉＲＮＡ剤、ここに記載された遺伝子、例えば、肝臓において活性である遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、ここに記載された構成または構造を有するｉＲＮＡ剤、ここに記載された両親媒性送達薬剤に関連するｉＲＮＡ、ここに記載された薬物送達モジュールに関連するｉＲＮＡ、ここに記載されるように投与されるｉＲＮＡ剤、またはＤＭＴＤＳも包含する、ここに記載されるように配合されたｉＲＮＡ剤を含む。
【００２２】
ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の二重鎖の５’末端の領域において、二重鎖が解離するまたは溶解する傾向を増す（二重鎖結合の自由エネルギーを減少させる）ことにより最適化できる。このことは、例えば、アンチセンス鎖の５’末端の領域において二重鎖の解離するまたは溶解する傾向を増加させるサブユニットを含ませることによって、行うことができる。このことは、この５’末端の領域における二重鎖の解離するまたは溶解する傾向を増加させるリガンドの結合によっても、行うことができる。理論により拘束することを意図するものではないが、その効果は、ヘリカーゼなどの酵素の効果を促進すること、例えば、アンチセンス鎖の５’末端の近傍でその酵素の効果を促進することのためであろう。
【００２３】
本願の発明者等は、ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の二重鎖の３’末端の領域における、二重鎖の解離するまたは溶解する傾向を減少させる（二重鎖結合の自由エネルギーを増加させる）ことにより、最適化できることも発見した。このことは、アンチセンス鎖の３’末端の領域における二重鎖の解離するまたは溶解する傾向を減少させるサブユニットを含ませることによって、行うことができる。このことは、３’末端の領域における二重鎖の解離するまたは溶解する傾向を減少させるリガンドの結合によっても、行うことができる。
【００２４】
前記二重鎖の５’末端の解離する傾向を増加させる修飾は、単独で、またはここに記載された他の修飾と組み合わせて、例えば、この二重鎖の３’末端の解離する傾向を減少させる修飾と組み合わせて、使用しても差し支えない。同様に、前記二重鎖の３’末端の解離する傾向を減少させる修飾は、単独で、またはここに記載された他の修飾と組み合わせて、例えば、この二重鎖の５’末端の解離する傾向を増加させる修飾と組み合わせて、使用しても差し支えない。
【００２５】
二重鎖のＡＳ５’末端の安定性を減少させる
サブユニット対は、解離または溶解を促進させるそれらの傾向に基づいて（例えば、特定の対の結合または解離の自由エネルギーに基づいて、最も単純な手法は、個々の対の基準で対を調査することであるが、次の隣接する対または類似の分析を使用しても差し支えない）ランク付けすることができる。解離の促進に関して：
Ａ：Ｕが、Ｇ：Ｃよりも好ましく；
Ｇ：Ｕが、Ｇ：Ｃよりも好ましく；
Ｉ：Ｃが、Ｇ：Ｃよりも好ましく（Ｉ＝イノシン）；
不一致、例えば、非標準すなわち標準以外の対（ここのどこかに記載されたような）が、標準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対よりも好ましく；
普遍的塩基を含む対が、標準対よりも好ましい。
【００２６】
一般的なｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、以下のように図示することができる：
Ｓ  ５’  Ｒ1Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5［Ｎ］Ｎ-5Ｎ-4Ｎ-3Ｎ-2Ｎ-1Ｒ2  ３’
ＡＳ  ３’  Ｒ3Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5［Ｎ］Ｎ-5Ｎ-4Ｎ-3Ｎ-2Ｎ-1Ｒ4  ５’
Ｓ：ＡＳ  Ｐ1Ｐ2Ｐ3Ｐ4Ｐ5［Ｎ］Ｐ-5Ｐ-4Ｐ-3Ｐ-2Ｐ-1  ５’
Ｓはセンス鎖を表し；ＡＳはアンチセンス鎖を表し；Ｒ1は随意的な（かつ好ましくはない）５’センス鎖突出部を表し；Ｒ2は随意的な（好ましい）３’センス鎖突出部を表し；Ｒ3は随意的な（好ましい）３’アンチセンス鎖突出部を表し；Ｒ4は随意的な（かつ好ましくはない）５’アンチセンス鎖突出部を表し；Ｎはサブユニットを表し；［Ｎ］は、追加のサブユニット対が存在してもよいことを表し；Ｐxは、センスＮxおよびアンチセンスＮxの対を表す。突出部は、Ｐ図には示されていない。いくつかの実施の形態において、ここのどこかに記載されたように、３’ＡＳ突出部は領域Ｚに相当し、その二重鎖領域は領域Ｘに相当し、３’Ｓ鎖突出部は領域Ｙに相当する（この図は、ここのどこかに指針が提供されている最大または最小長さを暗示することを意図していない）。
【００２７】
二重鎖を形成する傾向を減少させる対は、ＡＳ鎖の５’末端での二重鎖における１つ以上の位置で使用されることが好ましい。末端対（ＡＳ鎖に関しては最も５’末端の側）はＰ-1と示され、二重鎖のそれに続く対の位置（ＡＳ鎖に関して３’方向に進む）は、Ｐ-2、Ｐ-3、Ｐ-4、Ｐ-5などと示される。二重鎖の形成を調節するために修飾する好ましい領域は、Ｐ-5からＰ-1まで、より好ましくは、Ｐ-4からＰ-1まで、より好ましくはＰ-3からＰ-1までである。Ｐ-1での修飾が、単独で、または他の位置での修飾、例えば、今特定した位置のいずれかでの修飾と共に、特に好ましい。列挙された領域の内の対の少なくとも１つ、より好ましくは２つ、３つ、４つ、または５つが、
Ａ：Ｕ
Ｇ：Ｕ
Ｉ：Ｃ
不一致対、例えば、非標準すなわち標準以外の対もしくは普遍的塩基を含む対の群から独立して選択されることが好ましい。
【００２８】
好ましい実施の形態において、解離を促進する対を達成するために必要なサブユニットにおける変更はセンス鎖において行われるが、いくつかの実施の形態において、その変更は、アンチセンス鎖に行われる。
【００２９】
好ましい実施の形態において、Ｐ-1からＰ-4までの対の少なくとも２つまたは３つが、解離を促進する対である。
【００３０】
好ましい実施の形態において、Ｐ-1からＰ-4までの対の少なくとも２つまたは３つが、Ａ：Ｕである。
【００３１】
好ましい実施の形態において、Ｐ-1からＰ-4までの対の少なくとも２つまたは３つが、Ｇ：Ｕである。
【００３２】
好ましい実施の形態において、Ｐ-1からＰ-4までの対の少なくとも２つまたは３つが、Ｉ：Ｃである。
【００３３】
好ましい実施の形態において、Ｐ-1からＰ-4までの対の少なくとも２つまたは３つが、不一致対、例えば、非標準すなわち標準以外の対である。
【００３４】
好ましい実施の形態において、Ｐ-1からＰ-4までの対の少なくとも２つまたは３つが、普遍的塩基を含む対である。
【００３５】
二重鎖のＡＳ３’末端の安定性を増加させる
サブユニット対は、安定性を促進させ、解離または溶解を阻害するそれらの傾向に基づいて（例えば、特定の対の結合または解離の自由エネルギーに基づいて、最も単純な手法は、個々の対の基準で対を調査することであるが、次の隣接する対または類似の分析を使用しても差し支えない）ランク付けすることができる。二重鎖の安定性の促進に関して：
Ｇ：Ｃが、Ａ：Ｕよりも好ましく；
ワトソン・クリック塩基対(Watson-Crick matches)（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）が、非標準すなわち標準以外の対よりも好ましく；
安定性を増加させる類似体が、ワトソン・クリック塩基対（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも好ましく；
２−アミノ−Ａ：Ｕが、Ａ：Ｕよりも好ましく；
２−チオＵまたは５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａが、Ｕ：Ａよりも好ましく；
Ｇ−クランプ（４つの水素結合を有するＣの類似体）：Ｇが、Ｃ：Ｇよりも好ましく；
グアニジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇが、Ｃ：Ｇよりも好ましく；
シュードウリジン：Ａが、Ｕ：Ａよりも好ましく；
結合を向上させる、糖修飾、例えば、２’修飾、例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ、またはＬＮＡは、非修飾部分よりも好ましく、二重鎖の安定性を向上させるために一方または両方の鎖に存在し得る。二重鎖を形成する傾向を増加させる対が、ＡＳ鎖の３’末端で二重鎖の位置の１つ以上で使用されることが好ましい。末端対（ＡＳ鎖に関しては最も３’末端の側）はＰ1と示され、二重鎖のそれに続く対の位置（ＡＳ鎖に関して５’方向に進む）は、Ｐ2、Ｐ3、Ｐ4、Ｐ5などと示される。二重鎖の形成を調節するために修飾する好ましい領域は、Ｐ5からＰ1まで、より好ましくは、Ｐ4からＰ1まで、より好ましくはＰ3からＰ1までである。Ｐ1での修飾が、単独で、または他の位置での修飾、例えば、今特定した位置のいずれかでの修飾と共に、特に好ましい。列挙された領域の内の対の少なくとも１つ、より好ましくは２つ、３つ、４つ、または５つが、
Ｇ：Ｃ
ワトソン・クリック塩基対（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも安定性を増加させる類似体を有する対
２−アミノ−Ａ：Ｕ
２−チオＵまたは５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａ
Ｇ−クランプ（４つの水素結合を有するＣの類似体）：Ｇ
グアニジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇ
シュードウリジン：Ａ
一方または両方のサブユニットが、結合を向上させる、糖修飾、例えば、２’修飾、例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ、またはＬＮＡを有する対
の群から独立して選択されることが好ましい。
【００３６】
好ましい実施の形態において、Ｐ1からＰ4までの対の少なくとも２つまたは３つが、二重鎖の安定性を促進する対である。
【００３７】
好ましい実施の形態において、Ｐ1からＰ4までの対の少なくとも２つまたは３つが、Ｇ：Ｃである。
【００３８】
好ましい実施の形態において、Ｐ1からＰ4までの対の少なくとも２つまたは３つが、ワトソン・クリック塩基対よりも安定性を増加させる類似体を有する対である。
【００３９】
好ましい実施の形態において、Ｐ1からＰ4までの対の少なくとも２つまたは３つが、２−アミノ−Ａ：Ｕである。
【００４０】
好ましい実施の形態において、Ｐ1からＰ4までの対の少なくとも２つまたは３つが、２−チオＵまたは５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａである。
【００４１】
好ましい実施の形態において、Ｐ1からＰ4までの対の少なくとも２つまたは３つが、Ｇ−クランプ：Ｇである。
【００４２】
好ましい実施の形態において、Ｐ1からＰ4までの対の少なくとも２つまたは３つが、グアニジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇである。
【００４３】
好ましい実施の形態において、Ｐ1からＰ4までの対の少なくとも２つまたは３つが、シュードウリジン：Ａである。
【００４４】
好ましい実施の形態において、Ｐ1からＰ4までの対の少なくとも２つまたは３つが、一方または両方のサブユニットが、結合を向上させる、糖修飾、例えば、２’修飾、例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ、またはＬＮＡを有する対である。
【００４５】
Ｇ−クランプおよびグアニジニウム−Ｇ−クランプが以下の文献に論じられている：Holmes and Gait, “The Synthesis of 2'-O-Methyl G-Clamp Containing Oligonucleotides and Their Inhibition of the HIV-1 Tat-TAR Interaction,” Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 22:1259-1262, 2003； Holmes et al., “Steric inhibition of human immunodeficiency virus type-1 Tat-dependent trans-activation in vitro and in cells by oligonucleotides containing 2'-O-methyl G-clamp ribonucleoside analogues,” Nucleic Acids Research, 31:2759-2768, 2003； Wilds, et al., “Structural basis for recognition of guanosine by a synthetic tricyclic cytosine analogue: Guanidinium G-clamp,” Helvetica Chimica Acta, 86:966-978, 2003； Rajeev, et al., “High-Affinity Peptide Nucleic Acid Oligomers Containing Tricyclic Cytosine Analogues,” Organic Letters, 4:4395-4398, 2002； Ausin, et al., “Synthesis of Amino- and Guanidino-G-Clamp PNA Monomers,” Organic Letters, 4:4073-4075, 2002； Maier et al., “Nuclease resistance of oligonucleotides containing the tricyclic cytosine analogues phenoxazine and 9-(2-aminoethoxy)-phenoxazine ("G-clamp") and origins of their nuclease resistance properties,” Biochemistry, 41:1323-7, 2002； Flanagan, et al., “A cytosine analog that confers enhanced potency to antisense oligonucleotides,” Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America, 96:3513-8, 1999。
【００４６】
二重鎖のＡＳ５’末端の安定性を減少させると同時に、二重鎖のＡＳ３’末端の安定性を増加させる
先に論じたように、ｉＲＮＡ剤は、二重鎖のＡＳ５’末端の安定性を減少させ、かつ二重鎖のＡＳ３’末端の安定性を増加させるように修飾できる。このことは、二重鎖のＡＳ５’末端における１つ以上の安定性減少修飾を、二重鎖のＡＳ３’末端における１つ以上の安定性増加修飾を組み合わせることによって行うことができる。したがって、好ましい実施の形態は、Ｐ-5からＰ-1まで、より好ましくは、Ｐ-4からＰ-1まで、より好ましくはＰ-3からＰ-1までの修飾を含む。Ｐ-1での修飾が、単独で、または他の位置での修飾、例えば、今特定した位置での修飾と共に、特に好ましい。二重鎖領域のＡＳ５’末端の列挙された領域の内の対の少なくとも１つ、より好ましくは２つ、３つ、４つ、または５つが、
Ａ：Ｕ
Ｇ：Ｕ
Ｉ：Ｃ
不一致対、例えば、非標準すなわち標準以外の対もしくは普遍的塩基を含む対、および
Ｐ5からＰ1まで、より好ましくは、Ｐ4からＰ1まで、より好ましくはＰ3からＰ1までにおける修飾
の群から独立して選択されることが好ましい。Ｐ1での修飾が、単独で、または他の位置での修飾、例えば、今特定した位置での修飾と共に、特に好ましい。二重鎖領域のＡＳ３’末端の列挙された領域の内の対の少なくとも１つ、より好ましくは２つ、３つ、４つ、または５つが、
Ｇ：Ｃ
ワトソン・クリック塩基対（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも安定性を増加させる類似体を有する対
２−アミノ−Ａ：Ｕ
２−チオＵまたは５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａ
Ｇ−クランプ（４つの水素結合を有するＣの類似体）：Ｇ
グアニジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇ
シュードウリジン：Ａ
一方または両方のサブユニットが、結合を向上させる、糖修飾、例えば、２’修飾、例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ、またはＬＮＡを有する対
の群から独立して選択されることが好ましい。
【００４７】
本発明は、ＤＭＴＤＳを有するｉＲＮＡ剤を選択する方法および製造する方法も含む。例えば、ｉＲＮＡ剤として使用するための候補の配列について標的配列をスクリーニングする場合、ここに記載されたＤＭＴＤＳ特性を有する配列、または所望のレベルのＤＭＴＤＳを提供するために、特にＡＳ鎖に対して、好ましくはできるだけ少ない変更で、修飾できる配列を選択することができる。
【００４８】
本発明は、候補のｉＲＮＡ剤配列を提供すること、およびＤＭＴＤＳ  ｉＲＮＡ剤を提供するためにＰ-5からＰ-1までの少なくとも１つのＰおよび／またはＰ5からＰ1までの少なくとも１つのＰを修飾することも含む。
【００４９】
ＤＭＴＤＳ  ｉＲＮＡ剤は、ここに記載された任意の方法に、例えば、ここに開示された任意の遺伝子を発現抑制するために、ここに記載された任意の疾患を処置するために、ここに記載された任意の配合部に、また一般に、ここのどこかに記載された方法および組成物においておよび／またはそれらに関して、使用することができる。ＤＭＴＤＳ  ｉＲＮＡ剤は、ここに記載された他の修飾、例えば、標的薬剤の結合または安定性を向上させる修飾の含有、例えば、鎖間の二重鎖構造を形成するために自己解離する一本鎖突出部（例えば、３’ＡＳ突出部および／または間３’Ｓ鎖突出部）の含有またはヌクレアーゼ抵抗性モノマーの含有を含んで差し支えない。
【００５０】
１つの態様において、本発明は、
（ａ）センス鎖であり、
（ｉ）少なくとも２つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフと、
（ｉｉ）少なくとも１つのリガンドと、
を含むセンス鎖、および
（ｂ）アンチセンス鎖であり、
（ｉ）少なくとも２つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフ、
を含むアンチセンス鎖、
を含む前記ｉＲＮＡ二重鎖剤を投与することによって、対象における特定の標的にポリヌクレオチドを送達する方法を提供する。
【００５１】
１つの実施の形態において、本発明のｉＲＮＡ二重鎖剤の送達は、筋肉内、気管支内、胸腔内、腹膜内、動脈内、リンパ管、静脈内、皮下、脳脊髄、またはそれらの組合せを含む投与手段により行われる。
【００５２】
１つの態様において、本発明は、対象の特定の標的にポリヌクレオチドを送達する方法であって、対象に本発明のｉＲＮＡ二重鎖剤を皮下で送達し、よって、そのポリヌクレオチドが対象の特定の標的に送達される工程を含む方法を提供する。
【００５３】
１つの態様において、本発明は、先の請求項のｉＲＮＡ二重鎖剤を単独でまたは薬学的に許容される担体または賦形剤と共に含む医薬組成物を提供する。
【００５４】
１つの態様において、ｉＲＮＡ二重鎖剤に炭水化物部分を結合させることにより、そのｉＲＮＡ二重鎖剤の１つ以上の性質を最適化できる。多くの場合、炭水化物部分は、ｉＲＮＡ二重鎖剤の修飾されたサブユニットに結合される。例えば、ｉＲＮＡ二重鎖剤の１つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を、別の部分、例えば、炭水化物リガンドが結合される非炭水化物（好ましくは環式）担体と交換できる。そのサブユニットのリボース糖がそのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、ここでは、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と称される。環式担体は、炭素環式環系（すなわち、全ての環原子は炭素原子である）、または複素環式環系（すなわち、１つ以上の環原子がヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であってよい）であってよい。環式担体は、単環式環系であっても、または２つ以上の環、例えば、縮合環を含んでもよい。環式担体は、完全に飽和された環系であっても、１つ以上の二重結合を含有してもよい。
【００５５】
１つの実施の形態において、リガンドは担体を介してポリヌクレオチドに結合される。その担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは２つの「骨格結合点」、および（ｉｉ）少なくとも１つの「テザリング(tethering)結合点」を含む。ここに用いたような「骨格結合点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または一般に、担体をリボ核酸の骨格、例えば、リン酸、または修飾リン酸、例えば、硫黄含有骨格に組み込むのに利用でき、それに適した結合を称する。「テザリング結合点」（ＴＡＰ）は、いくつかの実施の形態において、選択された部分に接続する環式担体の構成環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子から区別される）を称する。その部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖であって差し支えない。必要に応じて、選択された部分は、環式担体に、介在するテザー(tether)によって接続される。それゆえ、環式担体は、しばしば、官能基、例えば、アミノ基を含む、または一般に、別の化学物質、例えば、リガンドの構成環への含有またはテザリングに適した結合を提供する。
【００５６】
１つの態様において、本発明は、式（Ｃ１）
【化１】
2013541334.tif 000002
【００５７】
に示された構造を有する化合物を特徴とする。
【００５８】
ＡおよびＢの各々は、各存在毎に独立して、水素、保護基、必要に応じて置換された脂肪族、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、−Ｐ（Ｚ1）（Ｚ2）−Ｏ−ヌクレオシド、または−Ｐ（Ｚ1）（Ｚ2）−Ｏ−オリゴヌクレオチドであり；式中、Ｚ1およびＺ2の各々は、各存在毎に独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）または必要に応じて置換されたアルキルであり；式中、オリゴヌクレオチドは、
（ａ）センス鎖であり、
（ｉ）交互２’−フルオロ修飾と、
（ｉｉ）少なくとも１つのリガンドと、
を含むセンス鎖、および
（ｂ）アンチセンス鎖であり、
（ｉ）交互２’−ハロゲン修飾と、
（ｉｉ）５’炭素位置でリン酸化されている第１の５’末端アンチセンスヌクレオチドと、
を含むアンチセンス鎖、
を含む。
【００５９】
Ｊ1およびＪ2は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＲN、必要に応じて置換されたアルキル、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＰ（Ｎ（ＲP）2）Ｏ、またはＯＰ（Ｎ（ＲP）2）であり；
2013541334.tif 000003
【００６０】
は、環式基または非環式基であり；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択され；好ましくは、非環式基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
【００６１】
好ましい実施の形態において、リガンドは、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、多糖である。
【００６２】
１つの実施の形態において、前記化合物は、式（ＣＩＩ）
【化２】
2013541334.tif 000004
【００６３】
に示されたピロリン環系であり、式中、
Ｅは、存在しないか、またはＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ2、またはＳＯ2ＮＨであり；
Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17、およびＲ18の各々は、各存在毎に独立して、Ｈ、−ＣＨ2ＯＲa、またはＯＲbであり、
ＲaおよびＲbの各々は、各存在毎に独立して、水素、ヒドロキシル保護基、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアラルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、−Ｐ（Ｚ1）（Ｚ2）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ1）（Ｚ2）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ1）（Ｏ−リンカー−ＲL）−Ｏ−ヌクレオシド、または−Ｐ（Ｚ1）（Ｏ−リンカー−ＲL）−Ｏ−オリゴヌクレオチドであり；式中、オリゴヌクレオチドは、
（ａ）センス鎖であり、
（ｉ）交互２’−フルオロ修飾と、
（ｉｉ）少なくとも１つのリガンドと、
を含むセンス鎖、および
（ｂ）アンチセンス鎖であり、
（ｉ）交互２’−ハロゲン修飾と、
（ｉｉ）５’炭素位置でリン酸化されている第１の５’末端アンチセンスヌクレオチドと、
を含むアンチセンス鎖、
を含む。
【００６４】
Ｒ30は、各存在毎に独立して、−リンカー−ＲLまたはＲ31であり；
ＲLは、水素またはリガンドであり；
Ｒ31は、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（Ｎ（Ｒ32）2）（ＣＨ2）hＮ（Ｒ32）2であり；
Ｒ32は、各存在毎に独立して、Ｈ、−ＲL、−リンカー−ＲLまたはＲ31であり；
Ｚ1は、各存在毎に独立して、ＯまたはＳであり；
Ｚ2は、各存在毎に独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）または必要に応じて置換されたアルキルであり；
ｈは、各存在毎に独立して、１〜２０である。
【００６５】
ピロリン系クリック(click)担体について、Ｒ11は−ＣＨ2ＯＲaであり、Ｒ3はＯＲbであり；またはＲ11は−ＣＨ2ＯＲaであり、Ｒ9はＯＲbであり；またはＲ11は−ＣＨ2ＯＲaであり、Ｒ17はＯＲbであり；またはＲ13は−ＣＨ2ＯＲaであり、Ｒ11はＯＲbであり；またはＲ13は−ＣＨ2ＯＲaであり、Ｒ15はＯＲbであり；またはＲ13は−ＣＨ2ＯＲaであり、Ｒ17はＯＲbである。ある実施の形態において、ＣＨ2ＯＲaおよびＯＲbは、ジェミナル置換されていてもよい。４−ヒドロキシプロリン系担体について、Ｒ11は−ＣＨ2ＯＲaであり、Ｒ17はＯＲbである。したがって、ピロリン系および４−ヒドロキシプロリン系化合物は、結合の回転がその特定の連結部の周りに限られている、例えば、環の存在から制限が生じている、連結部（例えば、炭素−炭素結合）を含有してもよい。それゆえ、ＣＨ2ＯＲaおよびＯＲbは、先に描写した対の何れにおいても、互いに対してシスまたはトランスであってもよい。したがって、全てのシス／トランス異性体が明白に含まれる。前記化合物は、１つ以上の不斉中心も含んでよく、それゆえ、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として生じるであろう。前記化合物のそのような異性形態の全てが明白に含まれる（例えば、ＣＨ2ＯＲaおよびＯＲbを担持する中心は、両方とも、Ｒ配置を有し得；または両方とも、Ｓ配置を有し得；または一方の中心がＲ配置を有し得、他方の中心がＳ配置を有し得、またその逆も同様である）。
【００６６】
１つの実施の形態において、Ｒ11はＣＨ2ＯＲaであり、Ｒ9はＯＲbである。
【００６７】
１つの実施の形態において、Ｒbは固体担体である。
【００６８】
１つの実施の形態において、式（ＣＩＩ）の担体は、ホスホラミダイトである、すなわち、ＲaまたはＲbの一方が−Ｐ（Ｏ−アルキル）Ｎ（アルキル）2、例えば、−Ｐ（ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）Ｎ（ｉ−プロピル）2である。１つの実施の形態において、Ｒbが−Ｐ（Ｏ−アルキル）Ｎ（アルキル）2である。
【００６９】
実施の形態において、前記化合物は、式（ＣＩＩＩ）
【化３】
2013541334.tif 000005
【００７０】
に示されたリボース環系であり、式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲNまたはＣＲP2であり；
Ｂは、各存在毎に独立して、水素、必要に応じて置換された天然または非天然のヌクレオ塩基、−リンカー−ＲLと結合した必要に応じて置換された天然のヌクレオ塩基、または−リンカー−ＲLと結合した必要に応じて置換された非天然のヌクレオ塩基であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5の各々は、各存在毎に独立して、Ｈ、ＯＲ6、Ｆ、Ｎ（ＲN）2、または−Ｊ−リンカー−ＲLであり；
Ｊは、存在しないか、Ｏ、Ｓ、ＮＲN、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＳＯ、ＮＨＳＯ2、ＮＨＳＯ2ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ、、ＯＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＰ（Ｎ（ＲP）2）Ｏ、またはＯＰ（Ｎ（ＲP）2）であり；
Ｒ6は、各存在毎に独立して、水素、ヒドロキシル保護基、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアラルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、−Ｐ（Ｚ1）（Ｚ2）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ1）（Ｚ2）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ1）（Ｚ2）−式（ＣＩＩＩ）、−Ｐ（Ｚ1）（Ｏ−リンカー−ＲL）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ1）（Ｏ−リンカー−ＲL）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、または−Ｐ（Ｚ1）（Ｏ−リンカー−ＲL）−Ｏ−式（ＣＩＩＩ）であり；式中、オリゴヌクレオチドは、
（ａ）センス鎖であり、
（ｉ）交互２’−フルオロ修飾と、
（ｉｉ）少なくとも１つのリガンドと、
を含むセンス鎖、および
（ｂ）アンチセンス鎖であり、
（ｉ）交互２’−ハロゲン修飾と、
（ｉｉ）５’炭素位置でリン酸化されている第１の５’末端アンチセンスヌクレオチドと、
を含むアンチセンス鎖、
を含む。
【００７１】
ＲNは、各存在毎に独立して、Ｈ、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたアルキニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアラルキル、必要に応じて置換されたヘテロアリールまたはアミノ保護基であり；
ＲPは、各存在毎に独立して、Ｈ、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたアルキニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたシクロアルキル、または必要に応じて置換されたヘテロアリールであり；
ＲLは、水素またはリガンドであり；
Ｚ1およびＺ2の各々は、各存在毎に独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）または必要に応じて置換されたアルキルである；
但し、ＲLが少なくとも１つ存在するという条件で、さらにＲLが少なくとも１つはリガンドであるという条件である。
【００７２】
１つの実施の形態において、式（ＣＩ）の担体は、非環式基であり、「非環式担体」と称される。好ましい非環式担体は、以下の式（ＣＩＶ）または式（ＣＶ）に示された構造を有し得る。
【００７３】
１つの実施の形態において、前記化合物は、式（ＣＩＶ）
【化４】
2013541334.tif 000006
【００７４】
に示された構造を有する非環式担体であり、式中、
Ｗは、存在しないか、Ｏ、ＳおよびＮ（ＲN）であり、式中、ＲNは、各存在毎に独立して、Ｈ、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたアルキニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアラルキル、必要に応じて置換されたヘテロアリールまたはアミノ保護基であり；
Ｅは、存在しないか、またはＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ2、またはＳＯ2ＮＨであり；
ＲaおよびＲbの各々は、各存在毎に独立して、水素、ヒドロキシル保護基、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアラルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、−Ｐ（Ｚ1）（Ｚ2）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ1）（Ｚ2）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ1）（Ｏ−リンカー−ＲL）−Ｏ−ヌクレオシド、または−Ｐ（Ｚ1）（Ｏ−リンカー−ＲL）−Ｏ−オリゴヌクレオチドであり；式中、オリゴヌクレオチドは、
（ａ）センス鎖であり、
（ｉ）交互２’−フルオロ修飾と、
（ｉｉ）少なくとも１つのリガンドと、
を含むセンス鎖、および
（ｂ）アンチセンス鎖であり、
（ｉ）交互２’−ハロゲン修飾と、
（ｉｉ）５’炭素位置でリン酸化されている第１の５’末端アンチセンスヌクレオチドと、
を含むアンチセンス鎖、
を含む。
【００７５】
Ｒ30は、各存在毎に独立して、−リンカー−ＲLまたはＲ31であり；
ＲLは、水素またはリガンドであり；
Ｒ31は、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（Ｎ（Ｒ32）2）（ＣＨ2）hＮ（Ｒ32）2であり；
Ｒ32は、各存在毎に独立して、Ｈ、−ＲL、−リンカー−ＲLまたはＲ31であり；
Ｚ1は、各存在毎に独立して、ＯまたはＳであり；
Ｚ2は、各存在毎に独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）または必要に応じて置換されたアルキルであり；
ｈは、各存在毎に独立して、１〜２０であり；
ｒ、ｓおよびｔの各々は、各存在毎に独立して、０、１、２または３である。
【００７６】
ｒおよびｓが異なる場合、第三炭素は、ＲまたはＳ配置のいずれであっても差し支えない。好ましい実施の形態において、ｘおよびｙは１であり、ｚが０である（例えば、担体はセリノールに基づく）。非環式担体は、必要に応じて、例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルにより置換されていて差し支えない。
【００７７】
１つの実施の形態において、前記化合物は、式（ＣＶ）
【化５】
2013541334.tif 000007
【００７８】
に示された構造を有する非環式担体であり、式中、
Ｅは、存在しないか、またはＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ2、またはＳＯ2ＮＨであり；
ＲaおよびＲbの各々は、各存在毎に独立して、水素、ヒドロキシル保護基、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアラルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、−Ｐ（Ｚ1）（Ｚ2）−Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ1）（Ｚ2）−Ｏ−オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ1）（Ｚ2）−式（Ｉ）、−Ｐ（Ｚ1）（Ｏ−リンカー−ＲL）−Ｏ−ヌクレオシド、または−Ｐ（Ｚ1）（Ｏ−リンカー−ＲL）−Ｏ−オリゴヌクレオチドであり；式中、オリゴヌクレオチドは、
（ａ）センス鎖であり、
（ｉ）交互２’−フルオロ修飾と、
（ｉｉ）少なくとも１つのリガンドと、
を含むセンス鎖、および
（ｂ）アンチセンス鎖であり、
（ｉ）交互２’−ハロゲン修飾と、
（ｉｉ）５’炭素位置でリン酸化されている第１の５’末端アンチセンスヌクレオチドと、
を含むアンチセンス鎖、
を含む。
【００７９】
Ｒ30は、各存在毎に独立して、−リンカー−ＲLまたはＲ31であり；
ＲLは、水素またはリガンドであり；
Ｒ31は、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（Ｎ（Ｒ32）2）（ＣＨ2）hＮ（Ｒ32）2であり；
Ｒ32は、各存在毎に独立して、Ｈ、−ＲL、−リンカー−ＲLまたはＲ31であり；
Ｚ1は、各存在毎に独立して、ＯまたはＳであり；
Ｚ2は、各存在毎に独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）または必要に応じて置換されたアルキルであり；
ｈは、各存在毎に独立して、１〜２０であり；
ｒおよびｓの各々は、各存在毎に独立して、０、１、２または３である。ここに記載した環式担体に加え、ＲＲＭＳは、その内容を全ての目的でここに引用する、同一出願人による係属中の、２００４年８月１０日に出願された米国特許出願第１０／９１６１８５号、２００４年９月２１日に出願された米国特許出願第１０／９４６８７３号、２００４年１１月９日に出願された米国特許出願第１０／９８５４２６号、２００７年８月３日に出願された米国特許出願第１０／８３３９３４号、２００５年４月２７日に出願された米国特許出願第１１／１１５９８９号、および２００５年４月２９日に出願された米国特許出願第１１／１１９５３３号に記載された環式担体および非環式担体を含み得る。
【００８０】
したがって、１つの態様において、本発明は、式（Ｉ）
【化６】
2013541334.tif 000008
【００８１】
に示された構造を有するモノマーを特徴とし、式中、
ＡおよびＢの各々は、各存在毎に独立して、Ｏ、Ｎ（ＲN）またはＳであり；
ＲNは、各存在毎に独立して、ＨまたはＣ1〜Ｃ6アルキルであり；
ＸおよびＹの各々は、各存在毎に独立して、水素、保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−リンカーＯＰ（Ｚ”’）（Ｚ””）Ｏ−オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）−式（Ｉ）、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）−、または−リンカー−Ｒであり；式中、オリゴヌクレオチドは、
（ａ）センス鎖であり、
（ｉ）交互２’−フルオロ修飾と、
（ｉｉ）少なくとも１つのリガンドと、
を含むセンス鎖、および
（ｂ）アンチセンス鎖であり、
（ｉ）交互２’−ハロゲン修飾と、
（ｉｉ）５’炭素位置でリン酸化されている第１の５’末端アンチセンスヌクレオチドと、
を含むアンチセンス鎖、
を含む。
【００８２】
Ｒは、ＬGであるか、または以下：
【化７】
2013541334.tif 000009
【００８３】
に示された構造を有し；
ＬGは、各存在毎に独立して、リガンド、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、多糖であり；
Ｚ’、Ｚ”、Ｚ”’およびＺ””の各々は、各存在毎に独立して、ＯまたはＳである。
【００８４】
「リンカー」という用語は、化合物の２つの部分を接続する有機部分を意味する。リンカーは、概して、直接の結合、または酸素や硫黄などの原子、ＮＲ8、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ2、ＳＯ2ＮＨなどのユニット、または以下に限られないが、置換または未置換アルキル、置換または未置換アルケニル、置換または未置換アルキニル、１つ以上のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ2、Ｎ（Ｒ8）、Ｃ（Ｏ）により割り込まれていても、終わらされても差し支えない、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール、置換または未置換アリール、置換または未置換へテロアリール、置換または未置換ヘテロシクリルなどの原子の鎖を含み、式中、Ｒ8は、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。１つの実施の形態において、リンカーは、１〜２４の原子、好ましくは４〜２４の原子、好ましくは６〜１８の原子、より好ましくは８〜１８の原子、最も好ましくは８〜１６の原子である。
【００８５】
１つの実施の形態において、リンカーは、−［（Ｐ−Ｑ”−Ｒ）q−Ｘ−（Ｐ’−Ｑ”’−Ｒ’）q'］q"−Ｔ−であり、式中、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｐ’、Ｒ’およびＴの各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ2、ＣＨ2ＮＨ、ＣＨ2Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒa）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒa）−ＮＨ−、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化８】
2013541334.tif 000010
【００８６】
またはヘテロシクリルであり；
Ｑ”およびＱ”’の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、−（ＣＨ2）n−、−Ｃ（Ｒ1）（Ｒ2）（ＣＨ2）n−、−（ＣＨ2）nＣ（Ｒ1）（Ｒ2）−、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mＣＨ2ＣＨ2−、または−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−であり；
Ｘは、存在しないか、または開裂可能な連結基であり；
Ｒaは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
Ｒ1およびＲ2の各々は、各存在毎に独立して、Ｈ、ＣＨ3、ＯＨ、ＳＨまたはＮ（ＲN）2であり；
ＲNは、各存在毎に独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルまたはベンジルであり；
ｑ、ｑ’およびｑ”の各々は、各存在毎に独立して、０〜２０であり、反復ユニットは、同じでも異なっても差し支えなく；
ｎは、各存在毎に独立して、１〜２０であり；
ｍは、各存在毎に独立して、０〜５０である。
【００８７】
１つの実施の形態において、リンカーは、少なくとも１つの開裂可能な連結基を含む。
【００８８】
ある実施の形態において、リンカーは分岐リンカーである。分岐リンカーの分岐点は、少なくとも三価であってよいが、四価、五価または六価の原子、もしくは多価を示す基であってよい。ある実施の形態において、分岐点は、−Ｎ、−Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−Ｏ−Ｃ、−Ｓ−Ｃ、−ＳＳ−Ｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−Ｃ、または−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃであり、式中、Ｑは、各存在毎に独立して、Ｈまたは必要に応じて置換されたアルキルである。他の実施の形態において、分岐点は、グリセロールまたはグリセロール誘導体である。
【００８９】
開裂可能な連結基
開裂可能な連結基は、細胞の外では十分に安定であるが、標的細胞中に進入した際に、開裂されて、リンカーが一緒に保持している２つの部分を解放するものである。好ましい実施の形態において、開裂可能な連結基は、対象の血液中におけるよりも、標的細胞中で、または第１の標準状態（例えば、細胞内状態を模倣するまたは表すように選択できる）で、もしくは第２の標準状態（例えば、血液中または血清中に見られる状態を模倣するまたは表すように選択できる）で、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍速く開裂される。
【００９０】
開裂可能な連結基は、開裂剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解系分子の影響を受けやすい。一般に、開裂剤は、血清中または血液中よりも、細胞の内部でより高いレベルまたは活性で見つかるか、またはより優勢である。そのような分解系剤の例としては、例えば、酸化または還元酵素、もしくは還元によって酸化還元開裂可能な連結基を分解できる、細胞中に存在するメルカプタンなどの還元剤を含む、特定の基質について選択された、または基質特異性を持たない酸化還元剤；エステラーゼ；酸性環境を作り出せるエンドソームまたは作用物質、例えば、５以下のｐＨを生じるもの；一般的な酸として機能することによって、酸性開裂可能な連結基を分解または加水分解できる酵素、ペプチダーゼ（基質特異性であり得る）、およびホスファターゼが挙げられる。
【００９１】
ジスルフィド結合などの開裂可能な連結基は、ｐＨの影響を受け得る。ヒトの血清のｐＨは７．４であるのに対し、平均的な細胞内ｐＨは、わずかに低く、約７．１〜７．３に及ぶ。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、５．０辺りのさらにより酸性のｐＨを有する。あるリンカーは、好ましいｐＨで開裂される開裂可能な連結基を有し、それによって、細胞内部のリガンドから、または細胞の所望の区画中に、陽イオン脂質を放出する。
【００９２】
リンカーは、特定の酵素によって開裂可能である開裂可能な連結基を含み得る。リンカー中に組み込まれる開裂可能な連結基のタイプは、標的とすべき細胞に依存し得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーによって、陽イオン脂質に連結できる。肝臓細胞は、エステラーゼが豊富であり、したがって、リンカーは、エステラーゼが豊富ではないタイプの細胞中よりも、肝臓細胞中において、より効率的に開裂される。エステラーゼが豊富な他の細胞のタイプとしては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
【００９３】
肝臓細胞および滑膜細胞などの、ペプチダーゼが豊富な細胞のタイプを標的にする場合、ペプチド結合を含有するリンカーを使用できる。
【００９４】
一般に、候補の開裂可能な連結基の適性は、分解剤（または分解状態）の、候補の連結基を開裂する能力を試験することによって評価することができる。血液中におけるまたは他の非標的組織と接触するときの、開裂に抵抗する能力についての候補の開裂可能な連結基を試験することも望ましいであろう。それゆえ、第１の条件が標的細胞中の開裂を示すように選択され、第２の条件が他の組織または生物学的流体、例えば、血液または血清中の開裂を示すように選択されている、第１と第２の条件の間での開裂に対する相対的な感受性を判定することができる。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または動物全体において行うことができる。無細胞条件または培養条件で初期評価を行い、動物全体におけるさらなる評価を確認することが有用であろう。好ましい実施の形態において、有用な候補の化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ状態）と比べて、細胞中において少なくとも２、４、１０または１００倍速く開裂される。
【００９５】
酸化還元開裂可能な連結基
開裂可能な連結基の１つの部類は、還元または酸化の際に開裂される酸化還元開裂可能な連結基である。還元で開裂可能な連結基の例に、ジスルフィド連結基（−Ｓ−Ｓ−）がある。候補の開裂可能な連結基が、適切な「還元で開裂可能な連結基」であるか、または例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的薬剤に使用するのに適しているかを判定するために、ここに記載された方法に目を向けることができる。例えば、候補は、細胞中、例えば、標的細胞中に観察されるであろう開裂の速度を模倣する、当該技術分野に公知の試薬を使用して、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、または他の還元剤と一緒のインキュベーションにより評価することができる。候補は、血液または血清条件を模倣するように選択された条件下で評価しても差し支えない。好ましい実施の形態において、候補の化合物は、血液中で多くとも１０％しか開裂されない。好ましい実施の形態において、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビボ条件下）と比べて、細胞中において少なくとも２、４、１０または１００倍速く分解される。候補化合物の開裂速度は、細胞内培地を模倣するように選択された条件下で、細胞外培地を模倣するように選択された条件と比べて、標準的な酵素反応速度アッセイを使用して決定できる。
【００９６】
ホスフェート系開裂可能な連結基
ホスフェート系開裂可能な連結基は、リン酸基を分解または加水分解する作用物質によって開裂される。細胞中でリン酸基を開裂する作用物質の例には、細胞中のホスファターゼなどの酵素がある。ホスフェート系連結基の例には、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−がある。好ましい実施の形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施の形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価できる。
【００９７】
酸開裂可能な連結基
酸開裂可能な連結基は、酸性条件下で開裂される連結基である。好ましい実施の形態において、酸開裂可能な連結基は、約６．５以下のｐＨ（例えば、約６．０、５．５、５．０、またはそれ未満）の酸性環境において、または一般酸として機能できる酵素などの作用物質によって、開裂される。細胞中で、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官は、酸開裂可能な連結基の開裂環境を提供できる。酸開裂可能な連結基の例としては、以下に限られないが、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸開裂可能な基は、一般式−Ｃ＝ＮＨ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または−ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施の形態は、エステルの酸素に結合した炭素（アルコキシ基）がアリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルやｔ−ブチルなどの第三アルキル基である場合である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価できる。
【００９８】
エステル系連結基
エステル系開裂可能な連結基は、細胞中のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素により開裂される。エステル系開裂可能な連結基の例としては、以下に限られないが、アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル開裂可能な連結基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価できる。
【００９９】
ペプチド系開裂基
ペプチド系開裂可能な連結基は、細胞中のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素により開裂される。ペプチド系開裂可能な連結基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じるようにアミノ酸の間に形成されたペプチド結合である。ペプチド系開裂可能な基はアミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質を生成するためにアミノ酸の間に形成される特別なタイプのアミド結合である。ペプチド系開裂可能な基は、概して、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生成するペプチド結合（すなわち、アミド結合）にかぎられ、アミド官能基全体を含むわけではない。ペプチド系開裂可能な連結基は、一般式−ＮＨＣＨＲAＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲBＣ（Ｏ）−を有し、式中ＲAおよびＲBは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価できる。ここに用いたように、「炭水化物」は、各炭素原子に酸素、窒素または硫黄原子が結合している、少なくとも６つの炭素原子を有する１つ以上の単糖ユニット（直鎖、分岐鎖または環式であってよい）から構成されたそれ自体が炭水化物である化合物；または各炭素原子に酸素、窒素または硫黄原子が結合している、少なくとも６つの炭素原子を有する１つ以上の単糖ユニット（直鎖、分岐鎖または環式であってよい）から構成された炭水化物部分をその一部として有する化合物を称する。代表的な炭水化物としては、糖（単糖、二糖、三糖および約４〜９の単糖ユニットを含有するオリゴ糖）、およびデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ガムなどの多糖が挙げられる。特別な単糖としては、Ｃ5以上（好ましくはＣ5〜Ｃ8）の糖が挙げられ；二糖および三糖としては、２つまたは３つの単糖ユニット（好ましくはＣ5〜Ｃ8）を有する糖が挙げられる。
【０１００】
「単糖」という用語は、アロース、アルトロース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリトルロース、フルクトース、Ｄ−フシトール、Ｌ−フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、Ｄ−ガラクトサミニトール、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース−６−リン酸、グロース、グリセルアルデヒド、Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノース−ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース−６−リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロースおよびキシルロースの基を包含する。単糖は、Ｄ型であっても、Ｌ型であっても差し支えない。単糖は、さらに、デオキシ糖（アルコール性ヒドロキシ基が水素で置換されている）、アミノ糖（アルコール性ヒドロキシ基がアミノ基で置換されている）、チオ糖（アルコール性ヒドロキシ基がチオールで置換されている、またはＣ＝ＯがＣ＝Ｓで置換されている、または環形態の環酸素が硫黄で置換されている）、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖（環炭素が窒素で置換されている）、イミノ糖（環酸素が窒素で置換されている）、ホスファノ糖（環酸素がリンで置換されている）、ホスファ糖（環炭素がリンで置換されている）、Ｃ−置換単糖（非末端炭素原子で水素が炭素で置換されている）、不飽和単糖、アルジトール（カルボニル基がＣＨＯＨ基で置換されている）、アルドン酸（アルデヒド基がカルボキシ基で置換されている）、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダン酸などであってよい。アミノ糖としては、アミノ単糖、好ましくは、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン(kansosamine)、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン(purpurosamine)、ロドサミンが挙げられる。単糖などは、さらに置換されても差し支えないことが理解される。
【０１０１】
「二糖」、「三糖」、および「多糖」という用語は、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、２−デオキシリボース、２−デオキシグルコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース(evemitrose)、フルクトオリゴ糖、ガルトオリゴ糖(galto-oligosaccharide)、ゲンチアノース、ゲンチオビオース、グルカン、グルコーゲン、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β−マルトース、マルトリオース、マンナン−オリゴ糖、マンニノトリオース、メレチトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、ニゲロース、ノジリミシン、ノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α，α−トレハロース、トラハロサミン、ツラノース、チベロース、キシロビオース、ウンベリフェロースなどの基を包含する。さらに、「二糖」、「三糖」、および「多糖」などは、さらに置換されても差し支えないことが理解される。二糖には、アミノ糖およびその誘導体、特に、Ｃ−４’位で誘導体化されたミカミノースまたはＣ−６’位で誘導体化された４デオキシ−３−アミノグルコースも含まれる。
【０１０２】
１つの実施の形態において、前記化合物は、式（Ｉ’）：
【化９】
2013541334.tif 000011
【０１０３】
に示された構造を有し、式中、
ＡおよびＢの各々は、各存在毎に独立して、Ｏ、Ｎ（ＲN）またはＳであり；
ＸおよびＹの各々は、各存在毎に独立して、Ｈ、保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−Ｒ1−Ｑ’−Ｒ2−ＯＰ（Ｚ”’）（Ｚ””）Ｏ−オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）−式（Ｉ）、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）−、または−Ｑ−Ｒであり；式中、オリゴヌクレオチドは、
（ａ）センス鎖であり、
（ｉ）交互２’−フルオロ修飾と、
（ｉｉ）少なくとも１つのリガンドと、
を含むセンス鎖、および
（ｂ）アンチセンス鎖であり、
（ｉ）交互２’−ハロゲン修飾と、
（ｉｉ）５’炭素位置でリン酸化されている第１の５’末端アンチセンスヌクレオチドと、
を含むアンチセンス鎖、
を含む。
【０１０４】
Ｒは、Ｌ1であるか、または式（ＩＩ）〜（Ｖ）：
【化１０】
2013541334.tif 000012
【０１０５】
に示された構造を有し；
ｑ2A、ｑ2B、ｑ3A、ｑ3B、ｑ4A、ｑ4B、ｑ5A、ｑ5Bおよびｑ5Cは、各存在毎に独立して、０〜２０を表し、式中、反復単位は同じであっても、異なってもよく；
ＱおよびＱ’は、各存在毎に独立して、存在しないか、−（Ｐ7−Ｑ7−Ｒ7）p−Ｔ7−、または−Ｔ7−Ｑ7−Ｔ7'−Ｂ−Ｔ8'−Ｑ8−Ｔ8であり；
Ｐ2A、Ｐ2B、Ｐ3A、Ｐ3B、Ｐ4A、Ｐ4B、Ｐ5A、Ｐ5B、Ｐ5C、Ｐ7、Ｔ2A、Ｔ2B、Ｔ3A、Ｔ3B、Ｔ4A、Ｔ4B、Ｔ5A、Ｔ5B、Ｔ5C、Ｔ7、Ｔ7'、Ｔ8、およびＴ8'の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ2、ＣＨ2ＮＨ、またはＣＨ2Ｏであり；
Ｂは、−ＣＨ2−Ｎ（ＢL）−ＣＨ2−であり；
ＢLは、−ＴB−ＱB−ＴB'−Ｒxであり；
Ｑ2A、Ｑ2B、Ｑ3A、Ｑ3B、Ｑ4A、Ｑ4B、Ｑ5A、Ｑ5B、Ｑ5C、Ｑ7、Ｑ8、およびＱBは、各存在毎に独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ2、Ｎ（ＲN）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’）、Ｃ≡Ｃ、またはＣ（Ｏ）の１つ以上により割り込まれていても、終わらされても差し支えなく；
ＴBおよびＴB'の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＣＨ2、ＣＨ2ＮＨ、またはＣＨ2Ｏであり；
Ｒx、親油性物質（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール）、ペプチド、炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖）、エンドソーム溶解成分、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、またはカチオン性脂質であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ2A、Ｒ2B、Ｒ3A、Ｒ3B、Ｒ4A、Ｒ4B、Ｒ5A、Ｒ5B、Ｒ5C、Ｒ7の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒa）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒa）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化１１】
2013541334.tif 000013
【０１０６】
またはヘテロシクリルであり；
Ｌ1、Ｌ2A、Ｌ2B、Ｌ3A、Ｌ3B、Ｌ4A、Ｌ4B、Ｌ5A、Ｌ5B、およびＬ5Cの各々は、各存在毎に独立して、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖であり；
Ｒ’およびＲ”の各々は、各存在毎に独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲN）2であり；
ＲNは、各存在毎に独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり；
Ｒaは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
Ｚ’、Ｚ”、Ｚ”’、およびＺ””の各々は、各存在毎に独立して、ＯまたはＳであり；
ｐは、各存在毎に独立して、０〜２０である。
【０１０７】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ’）は構造
【化１２】
2013541334.tif 000014
【０１０８】
を有する。
【０１０９】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ’）は構造
【化１３】
2013541334.tif 000015
【０１１０】
を有する。
【０１１１】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ’）は構造
【化１４】
2013541334.tif 000016
【０１１２】
を有する。
【０１１３】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ’）は構造
【化１５】
2013541334.tif 000017
【０１１４】
を有する。
【０１１５】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ’）は構造
【化１６】
2013541334.tif 000018
【０１１６】
を有する。
【０１１７】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化１７】
2013541334.tif 000019
【０１１８】
である。
【０１１９】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化１８】
2013541334.tif 000020
【０１２０】
である。
【０１２１】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化１９】
2013541334.tif 000021
【０１２２】
である。
【０１２３】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化２０】
2013541334.tif 000022
【０１２４】
である。
【０１２５】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化２１】
2013541334.tif 000023
【０１２６】
である。
【０１２７】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化２２】
2013541334.tif 000024
【０１２８】
である。
【０１２９】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化２３】
2013541334.tif 000025
【０１３０】
である。
【０１３１】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化２４】
2013541334.tif 000026
【０１３２】
である。
【０１３３】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化２５】
2013541334.tif 000027
【０１３４】
である。
【０１３５】
いくつかの好ましい実施の形態において、Ｒは
【化２６】
2013541334.tif 000028
【０１３６】
である。
【０１３７】
いくつかの好ましい実施の形態において、Ｒは
【化２７】
2013541334.tif 000029
【０１３８】
である。
【０１３９】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は、構造
【化２８】
2013541334.tif 000030
【０１４０】
を有する。
【０１４１】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化２９】
2013541334.tif 000031
【０１４２】
である。
【０１４３】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーは、構造
【化３０】
2013541334.tif 000032
【０１４４】
を有する。
【０１４５】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーは、構造
【化３１】
2013541334.tif 000033
【０１４６】
を有する。
【０１４７】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーは、構造
【化３２】
2013541334.tif 000034
【０１４８】
を有する。
【０１４９】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーは、構造
【化３３】
2013541334.tif 000035
【０１５０】
を有する。
【０１５１】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーは、構造
【化３４】
2013541334.tif 000036
【０１５２】
を有する。
【０１５３】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーは、構造
【化３５】
2013541334.tif 000037
【０１５４】
を有する。
【０１５５】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化３６】
2013541334.tif 000038
【０１５６】
である。
【０１５７】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化３７】
2013541334.tif 000039
【０１５８】
である。
【０１５９】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化３８】
2013541334.tif 000040
【０１６０】
である。
【０１６１】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化３９】
2013541334.tif 000041
【０１６２】
である。
【０１６３】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化４０】
2013541334.tif 000042
【０１６４】
である。
【０１６５】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化４１】
2013541334.tif 000043
【０１６６】
である。
【０１６７】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化４２】
2013541334.tif 000044
【０１６８】
である。
【０１６９】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化４３】
2013541334.tif 000045
【０１７０】
である。
【０１７１】
いくつかの実施の形態において、Ｒは
【化４４】
2013541334.tif 000046
【０１７２】
である。
【０１７３】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は、構造
【化４５】
2013541334.tif 000047
【０１７４】
を有する。
【０１７５】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は、構造
【化４６】
2013541334.tif 000048
【０１７６】
を有する。
【０１７７】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は、構造
【化４７】
2013541334.tif 000049
【０１７８】
を有する。
【０１７９】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は、構造
【化４８】
2013541334.tif 000050
【０１８０】
を有する。
【０１８１】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は、構造
【化４９】
2013541334.tif 000051
【０１８２】
を有する。
【０１８３】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は、構造
【化５０】
2013541334.tif 000052
【０１８４】
を有する。
【０１８５】
いくつかの好ましい実施の形態において、Ｌ2AおよびＬ2Bの両方とも同じである。
【０１８６】
いくつかの実施の形態において、Ｌ2AおよびＬ2Bの両方とも異なる。
【０１８７】
いくつかの好ましい実施の形態において、Ｌ3AおよびＬ3Bの両方とも同じである。
【０１８８】
いくつかの実施の形態において、Ｌ3AおよびＬ3Bの両方とも異なる。
【０１８９】
いくつかの好ましい実施の形態において、Ｌ4AおよびＬ4Bの両方とも同じである。
【０１９０】
いくつかの実施の形態において、Ｌ4AおよびＬ4Bの両方とも異なる。
【０１９１】
いくつかの好ましい実施の形態において、Ｌ5A、Ｌ5BおよびＬ5Cの全てが同じである。
【０１９２】
いくつかの実施の形態において、Ｌ5A、Ｌ5BおよびＬ5Cの内の２つが同じである。
【０１９３】
いくつかの実施の形態において、Ｌ5AおよびＬ5Bが同じである。
【０１９４】
いくつかの実施の形態において、Ｌ5AおよびＬ5Cが同じである。
【０１９５】
いくつかの実施の形態において、Ｌ5BおよびＬ5Cが同じである。
【０１９６】
別の態様において、本発明は、式（Ｉ）の少なくとも１つのモノマーを含むｉＲＮＡ二重鎖剤を特徴とする。
【０１９７】
いくつかの実施の形態において、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、式（Ｉ）の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのモノマー、より好ましくは、式（Ｉ）の１つ、２つまたは３つのモノマー、より好ましくは、式（Ｉ）の１つまたは２つのモノマー、さらにより好ましくは、式（Ｉ）のたった１つのモノマーを含む。
【０１９８】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーの全ては、二本鎖ｉＲＮＡ二重鎖剤の同じ鎖上にある。
【０１９９】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーは、ｉＲＮＡ二重鎖剤の別個の鎖上にある。
【０２００】
いくつかの実施の形態において、ｉＲＮＡ二重鎖剤における式（Ｉ）の全てのモノマーは同じである。
【０２０１】
いくつかの実施の形態において、ｉＲＮＡ二重鎖剤における式（Ｉ）のモノマーは全て異なる。
【０２０２】
いくつかの実施の形態において、ｉＲＮＡ二重鎖剤における式（Ｉ）のいくつかのモノマーのみが同じである。
【０２０３】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーは、ｉＲＮＡ二重鎖剤において互いに隣り合っている。
【０２０４】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーは、ｉＲＮＡ二重鎖剤において互いに隣り合っていない。
【０２０５】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーは、ｉＲＮＡ二重鎖剤の５’末端、３’末端、内部位置、３’末端と５’末端の両方、５’末端と内部位置の両方、３’末端と内部位置の両方、および３つの位置の全て（５’末端と３’末端と内部位置）にある。
【０２０６】
いくつかの好ましい実施の形態において、ＲXはコレステロールである。
【０２０７】
いくつかの好ましい実施の形態において、ＲXはリトコール酸である。
【０２０８】
いくつかの好ましい実施の形態において、ＲXはオレイルリトコール酸である。
【０２０９】
いくつかの好ましい実施の形態において、ＲXは構造
【化５１】
2013541334.tif 000053
【０２１０】
を有する。
【０２１１】
いくつかの好ましい実施の形態において、ＢLは構造
【化５２】
2013541334.tif 000054
【０２１２】
を有する。
【０２１３】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化５３】
2013541334.tif 000055
【０２１４】
を有する。
【０２１５】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化５４】
2013541334.tif 000056
【０２１６】
を有する。
【０２１７】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化５５】
2013541334.tif 000057
【０２１８】
を有する。
【０２１９】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化５６】
2013541334.tif 000058
【０２２０】
を有し、式中、ＹはＯまたはＳであり、ｎは３〜６である。
【０２２１】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化５７】
2013541334.tif 000059
【０２２２】
を有し、式中、ＹはＯまたはＳであり、ｎは３〜６である。
【０２２３】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化５８】
2013541334.tif 000060
【０２２４】
を有する。
【０２２５】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化５９】
2013541334.tif 000061
【０２２６】
を有し、ＸはＯまたはＳである。
【０２２７】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化６０】
2013541334.tif 000062
【０２２８】
を有し、ＲはＯＨまたはＮＨＣＯＯＨである。
【０２２９】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化６１】
2013541334.tif 000063
【０２３０】
を有し、ＲはＯＨまたはＮＨＣＯＯＨである。
【０２３１】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーは、式（ＶＩＩ）
【化６２】
2013541334.tif 000064
【０２３２】
のリンカーを通じてｉＲＮＡ二重鎖剤に連結されており、ＲはＯまたはＳである。
【０２３３】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化６３】
2013541334.tif 000065
【０２３４】
を有し、ＲはＯＨまたはＮＨＣＯＯＨである。
【０２３５】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化６４】
2013541334.tif 000066
【０２３６】
を有する。
【０２３７】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化６５】
2013541334.tif 000067
【０２３８】
を有し、ＲはＯＨまたはＮＨＣＯＯＨである。
【０２３９】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化６６】
2013541334.tif 000068
【０２４０】
を有し、ＲはＯＨまたはＮＨＣＯＯＨである。
【０２４１】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化６７】
2013541334.tif 000069
【０２４２】
を有し、ＲはＯＨまたはＮＨＣＯＯＨである。
【０２４３】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）は構造
【化６８】
2013541334.tif 000070
【０２４４】
を有し、ＲはＯＨまたはＮＨＣＯＯＨである。
【０２４５】
いくつかの実施の形態において、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、式（Ｉ）のモノマーに加えて、式（ＶＩ）
【化６９】
2013541334.tif 000071
【０２４６】
に示された構造を持つモノマーを有し、式中、
Ｘ6およびＹ6の各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、ポリマー、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−Ｒ1−Ｑ’−Ｒ2−ＯＰ（Ｚ”’）（Ｚ””）Ｏ−オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）−式（Ｉ）もしくは−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）−であり；式中、オリゴヌクレオチドは、
（ａ）センス鎖であり、
（ｉ）交互２’−フルオロ修飾と、
（ｉｉ）少なくとも１つのリガンドと、
を含むセンス鎖、および
（ｂ）アンチセンス鎖であり、
（ｉ）交互２’−ハロゲン修飾と、
（ｉｉ）５’炭素位置でリン酸化されている第１の５’末端アンチセンスヌクレオチドと、
を含むアンチセンス鎖、
を含む。
【０２４７】
Ｑ6は、存在しないか、または−（Ｐ6−Ｑ6−Ｒ6）v−Ｔ6−であり；
Ｐ6およびＴ6の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ2、ＣＨ2ＮＨ、またはＣＨ2Ｏであり；
Ｑ6は、各存在毎に独立して、存在しないか、置換アルキレンであり、ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ2、Ｎ（ＲN）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’）、Ｃ≡Ｃ、またはＣ（Ｏ）の１つ以上により割り込まれていても、終わらされても差し支えなく； 
Ｒ6は、各存在毎に独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒa）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒa）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化７０】
2013541334.tif 000072
【０２４８】
またはヘテロシクリルであり；
Ｒ’およびＲ”の各々は、各存在毎に独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲN）2であり；
ＲNは、各存在毎に独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり；
Ｒaは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
Ｚ’、Ｚ”、Ｚ”’、およびＺ””の各々は、各存在毎に独立して、ＯまたはＳであり；
ｖは、各存在毎に独立して、０〜２０を表し；
ＲLは、親油性物質（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、もしくはフェノキサジン）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール）、ペプチド、炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖）、エンドソーム溶解成分、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、またはカチオン性脂質である。
【０２４９】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）の１つ以上、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのモノマーに加えて、式（ＶＩ）の１つ以上、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのモノマーが、前記ｉＲＮＡ二重鎖剤中に存在する。
【０２５０】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）の１つのモノマーおよび式（ＶＩ）の１つのモノマーのみが、前記ｉＲＮＡ二重鎖剤中に存在する。
【０２５１】
いくつかの実施の形態において、ＲLはコレステロールである。
【０２５２】
いくつかの実施の形態において、ＲLはリトコール酸である。
【０２５３】
いくつかの実施の形態において、ＲLはオレイルリトコール酸である。
【０２５４】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーは、式（ＶＩ）のモノマーと共有結合している。
【０２５５】
いくつかの好ましい実施の形態では、式（Ｉ）のモノマーは、リン酸結合、例えば、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合を介して、式（ＶＩ）のモノマーと結合している。
【０２５６】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーは、式（ＶＩ）のモノマーを介してｉＲＮＡ二重鎖剤に結合される。
【０２５７】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーは、ｉＲＮＡ二重鎖剤と式（ＶＩ）のモノマーとの間に介在している。
【０２５８】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーおよび式（ＩＩ）のモノマーは互いに直接結合している。
【０２５９】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーおよび式（ＩＩ）のモノマーは互いに直接結合していない。
【０２６０】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーおよび式（ＶＩ）のモノマーは、二重鎖ｉＲＮＡ二重鎖剤の別個の鎖上にある。
【０２６１】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーおよび式（ＶＩ）のモノマーは、ｉＲＮＡ二重鎖剤の反対の末端上にある。
【０２６２】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーおよび式（ＶＩ）のモノマーは、ｉＲＮＡ二重鎖剤の同じ末端上にある。
【０２６３】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーまたは式（ＶＩ）のモノマーの一方は内部位置にあるのに対し、他方は、ｉＲＮＡ二重鎖剤の末端位置にある。
【０２６４】
いくつかの実施の形態において、式（Ｉ）のモノマーおよび式（ＶＩ）のモノマーは両方とも、ｉＲＮＡ二重鎖剤の内部位置にある。
【０２６５】
いくつかの好ましい実施の形態において、式（ＶＩ）のモノマーは構造
【化７１】
2013541334.tif 000073
【０２６６】
を有する。
【０２６７】
いくつかの実施の形態において、本発明のｉＲＮＡ二重鎖剤は、
【化７２−１】
2013541334.tif 000074
【化７２−２】
2013541334.tif 000075
【化７２−３】
2013541334.tif 000076
【化７２−４】
2013541334.tif 000077
【０２６８】
からなる群より選択され、式中、
リガンドは、ＰＫ調節物質であり、Ｘ＝ＯまたはＳであり、Ｙ＝ＯまたはＳであり、ＰＥＧは、分子量（ＭＷ）２００〜１００，０００の、ω−ＯＨ  ＰＥＧ、ω−アミノＰＥＧ、ω−メトキシＰＥＧ、ω−ＳＨ ＰＥＧ、ω−プロパルギルＰＥＧ、ω−アジドＰＥＧ、およびω−リガンドＰＥＧである。
【０２６９】
エンドソーム溶解成分
二重層膜を容易には横切ることができない、巨大分子薬物および親水性薬物分子については、細胞のエンドソーム／リソソーム区画に閉じ込めることが、それらの作用部位に効果的に送達する上での最大の障害であると考えられる。近年、この問題に対処するために、多くの手法や戦略が工夫されてきた。リポソーム製剤については、融合性脂質を製剤中に使用することが最も一般的な手法となっている（Singh, R. S., Goncalves, C. et al. (2004). On the Gene Delivery Efficacies of pH-Sensitive Cationic Lipids via Endosomal Protonation. A Chemical Biology Investigation. Chem. Biol. 11, 713-723.）。プロトン化および／またはｐＨ誘導性の立体構造変化を通じてｐＨ感受性のエンドソーム溶解活性を示す他の成分としては、荷電したポリマーおよびペプチドが挙げられる。その例が、Hoffman, A. S., Stayton, P. S. et al. (2002). Design of "smart" polymers that can direct intracellular drug delivery. Polymers Adv. Technol. 13, 992-999； Kakudo, Chaki, T., S. et al. (2004). Transferrin-Modified Liposomes Equipped with a pH-Sensitive Fusogenic Peptide: An Artificial Viral-like Delivery System. Biochemistry 436, 5618-5628； Yessine, M. A. and Leroux, J. C. (2004). Membrane-destabilizing polyanions: interaction with lipid bilayers and endosomal escape of biomacromolecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 56, 999-1021； Oliveira, S., van Rooy, I. et al. (2007). Fusogenic peptides enhance endosomal escape improving siRNA-induced silencing of oncogenes. Int. J. Pharm. 331, 211-4.に見出すことができる。これらは、リポソームまたはリポプレックスなどの、薬物送達系との関連で一般に使用されてきた。リポソーム製剤を用いる、葉酸受容体を介する送達については、例えば、ｐＨ感受性の融合性ペプチドがリポソームに組み込まれ、摂取の過程での薬物の放出を改善することによって活性を向上させることが示されている（Turk, M. J., Reddy, J. A. et al. (2002). Characterization of a novel pH-sensitive peptide that enhances drug release from folate-targeted liposomes at endosomal pHs. Biochim. Biophys. Acta 1559, 56-68）。
【０２７０】
ある実施の形態では、本発明のエンドソーム溶解成分は、ｐＨ依存性の膜活性および／または融合性を示すポリカチオン性のペプチドまたはペプチド模倣体であってもよい。ペプチド模倣体は、ペプチドを模倣するよう設計された、タンパク質様の小さい鎖であってよい。ペプチド模倣体は、分子の特性を変化させるために既存のペプチドを修飾すること、もしくは自然ではないアミノ酸またはその類似体を用いてペプチド様分子を合成することによって生じるであろう。ある実施の形態では、これらは、ペプチドと比較して、安定性および／または生物学的活性が向上している。ある実施の形態では、エンドソーム溶解成分は、エンドソームｐＨ（例えば、ｐＨ５〜６）で活性のある立体構造をとる。「活性のある」立体構造とは、エンドソーム溶解成分が、エンドソームの溶解および／または本発明のモジュラー組成物、もしくはその成分の細胞のエンドソームから細胞質への輸送を促進する立体構造のことである。
【０２７１】
化合物のライブラリーについては、溶血アッセイを用いて、中性ｐＨに対するエンドソームｐＨでのそれらの示差的な膜活性についてスクリーニングしてもよい。この方法で単離される有望な候補は、本発明のモジュラー組成物の成分として使用してよい。本発明の組成物および方法で使用されるエンドソーム溶解成分を同定する方法は、化合物のライブラリーを提供する工程；血液細胞をライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、接触が起こる培地のｐＨが制御される工程；これらの化合物が中性ｐＨ（例えば、約ｐＨ７〜８）に対して、低いｐＨ（例えば、約ｐＨ５〜６）で血液細胞の示差溶解を誘導するか否かを判定する工程を含み得る。
【０２７２】
例示のエンドソーム溶解成分としては、ＧＡＬＡペプチド（Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972）、ＥＡＬＡペプチド（Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586）、およびそれらの誘導体（Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68）が挙げられる。ある実施の形態では、エンドソーム溶解成分は、ｐＨの変化に応答して電荷またはプロトン化が変化する化学基（例えば、アミノ酸）を含有してもよい。エンドソーム溶解成分は、線状または分岐状であってもよい。エンドソーム溶解成分の例示の一次配列としては、Ｈ2Ｎ−（ＡＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＡＡＡＧＧＣ）−ＣＯ2Ｈ；Ｈ2Ｎ−（ＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＡＡＡＧＧＣ）−ＣＯ2Ｈ；およびＨ2Ｎ−（ＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡ）−ＣＯＮＨ2が挙げられる。
【０２７３】
ある実施の形態では、複数のエンドソーム溶解成分を本発明のｉＲＮＡ二重鎖剤に組み込んでもよい。いくつかの実施の形態では、これには、式（Ｉ）のモノマーに加えて、複数の同じエンドソーム溶解成分をｉＲＮＡ剤に組み込むことを伴う。他の実施の形態では、これには、式（Ｉ）のモノマーに加えて、２つ以上の異なるエンドソーム溶解成分をｉＲＮＡ二重鎖剤に組み込むことを伴う。
【０２７４】
これらのエンドソーム溶解成分は、例えば、エンドソームｐＨで立体構造を変化させることによって、エンドソームからの脱出を仲介し得る。ある実施の形態では、エンドソーム溶解成分は、中性ｐＨでランダムコイル立体構造をとって存在し、エンドソームｐＨで両親媒性ヘリックスへと再編成してもよい。この立体構造転移の結果として、これらのペプチドがエンドソームの脂質膜に入り込み、エンドソームの内容物を細胞質へと漏れ出させ得る。立体構造転移はｐＨ依存性であるので、エンドソーム溶解成分は、血液中（ｐＨ約７．４）を循環する間、ほとんどまたは全く融合活性を示すことができない。融合活性は、エンドソーム溶解成分による脂質膜の破壊を引き起こす活性と定義される。融合活性の一例は、エンドソーム溶解成分によるエンドソーム膜の破壊であり、これは、エンドソームの溶解、または本発明のモジュラー組成物（例えば、核酸）の１つ以上の成分のエンドソームから細胞質への漏出および輸送をもたらす。
【０２７５】
本明細書に記載された溶血アッセイに加えて、適切なエンドソーム溶解成分は、当業者により、他の方法を用いて試験および同定することができる。例えば、ｐＨ環境に応答する（例えば、ｐＨ環境によって電荷を変化させる）化合物の能力を、常法によって（例えば、細胞アッセイで）試験することができる。ある実施の形態では、試験化合物を、細胞と混合するかまたは細胞と接触させ、例えば、エンドサイトーシスによって、細胞に試験化合物を取り込ませる。次いで、接触させた細胞からエンドソーム調製物を作製し、このエンドソーム調製物を対照細胞からのエンドソーム調製物と比較することができる。対照細胞と比べた、接触させた細胞由来のエンドソーム画分の変化（例えば、減少）は、試験化合物が融合剤として機能できることを示す。あるいは、接触させた細胞と対照細胞を、例えば、顕微鏡法（例えば、光学顕微鏡法または電子顕微鏡法）で評価して、細胞内のエンドソーム個体群の違いを決定することができる。試験化合物および／またはエンドソームに標識付けて、例えば、エンドソームの漏出を定量化することができる。
【０２７６】
別のタイプのアッセイでは、本明細書に記載されたｉＲＮＡ二重鎖剤を、１つ以上の試験融合剤または推定融合剤を用いて構築する。ｉＲＮＡ二重鎖剤は、可視化しやすいように標識付けることができる。一旦ｉＲＮＡ剤が細胞に取り込まれたら、エンドソームからの脱出を促進するエンドソーム溶解成分の能力を、エンドソーム調製物の調製によって、または細胞の細胞質中の標識ｉＲＮＡ二重鎖剤を可視化することができる顕微鏡技術によって評価することができる。ある他の実施の形態では、遺伝子発現の阻害、または任意の他の生理的パラメータを、エンドソーム脱出の代用マーカーとして使用してもよい。
【０２７７】
他の実施の形態において、円偏光二色性分光法を用いて、ｐＨ依存的な構造転移を示す化合物を同定することができる。
【０２７８】
２段階アッセイを実施することもできる。この２段階アッセイにおいては、第１のアッセイで、試験化合物だけでｐＨの変化に応答する能力を評価し、第２のアッセイで、試験化合物を含むモジュラー組成物がｐＨの変化に応答する能力を評価する。
【０２７９】
ペプチド
本発明に使用するのに適したペプチドは、天然ペプチド、例えば、ｔａｔペプチドまたはアンテナペディアペプチド、合成ペプチド、またはペプチド模倣体であって差し支えない。さらに、ペプチドは、修飾ペプチドであって差し支えなく、例えば、ペプチドは、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸を含むこともできる。ペプチド模倣体（ここではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと類似の規定された３次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体のオリゴヌクレオチドへの結合は、細胞による認識および吸収を高めることなどによって、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的分布に影響を及ぼし得る。ペプチド部分またはペプチド模倣体部分の長さは、約５〜５０アミノ酸、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸であって差し支えない（例えば、表１参照）。
【表１】
2013541334.tif 000078
【０２８０】
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅからなる）疎水性ペプチドであり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束されたペプチド、または架橋されたペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性の膜転位配列（ＭＴＳ）を含むことができる。例示の疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰを有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ）も標的化部分であって差し支えない。このペプチド部分は、細胞膜を横断して、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きな極性分子を運ぶことができる、「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）およびショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質由来の配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）は、送達ペプチドとして機能することができることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチドなどの、ＤＮＡのランダムな配列によってコードすることができる（Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991）。脂質に連結されたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、またはＲＧＤ模倣体などの細胞標的化ペプチドであることが好ましい。ペプチド部分の長さは、約５のアミノ酸〜約４０のアミノ酸の範囲に及び得る。ペプチド部分は、例えば、安定性または直接的な立体構造特性を増大させるために、構造的修飾を有することができる。下記の構造的修飾のいずれを利用しても差し支えない。
【０２８１】
ＲＧＤペプチド部分は、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用することができる（Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む、様々な他の組織の腫瘍への標的化を促進することができる（Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001）。ＲＧＤペプチドは、脂質粒子の腎臓への標的化を促進することが好ましい。ＲＧＤペプチドは、線状または環状であって差し支えなく、かつ修飾する（例えば、特定の組織への標的化を促進するためにグリコシル化またはメチル化する）ことができる。例えば、グリコシル化されたＲＧＤペプチドは、αvβ3を発現する腫瘍細胞を標的とすることができる（Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001）。
【０２８２】
増殖細胞に濃縮されているマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ＲＧＤを含有するペプチドおよびペプチド模倣体は、癌細胞、特に、ＩvＪ3インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。このように、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、並びに合成ＲＧＤ模倣体を使用することができる。ＲＧＤに加えて、Ｉv−Ｊ3インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管新生を制御するために使用することができる。
【０２８３】
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、細菌細胞または真菌細胞などの微生物細胞、もしくはヒト細胞などの哺乳類細胞を透過することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α−ヘリックス線状ペプチド（例えば、ＬＬ−３７もしくはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−ディフェンシン、β−ディフェンシン、もしくはバクテネシン）、または優勢なアミノ酸を１種または２種しか含有しないペプチド（例えば、ＰＲ−３９またはインドリシジン）であり得る。細胞透過ペプチドは、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含むこともできる。例えば、細胞透過ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインとＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳとに由来する、ＭＰＧなどの、２つの部分からなる両親媒性ペプチドであり得る（Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003）。
【０２８４】
ｉＲＮＡ二重鎖剤
ｉＲＮＡ二重鎖剤は、標的遺伝子と十分に相同な領域を含み、かつヌクレオチドに関して、ｉＲＮＡ剤またはその断片がこの標的遺伝子の下方調節を仲介することができるほどの十分な長さであるべきである。（説明しやすくするために、本明細書では、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドという用語を、ＲＮＡ剤の１つ以上のモノマーサブユニットに関して使用する場合がある。本明細書での「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語の用法は、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代用物の場合、修飾ヌクレオチド、または１つ以上の位置での代用物置換部分も示すことができるということが理解されよう。）したがって、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、標的ＲＮＡに対して少なくとも部分的に、およびいくつかの実施の形態では、完全に、相補的な領域であるか、またはこのような領域を含む。ｉＲＮＡ二重鎖剤と標的の間に完全な相補性がある必要はないが、その対応性は、ｉＲＮＡ二重鎖剤、またはその開裂産物が、例えば、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のＲＮＡｉ開裂によって、配列特異的な発現抑制を導くことが可能となる程度に十分でなければならない。相補性、すなわち、標的鎖との相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。特にアンチセンス鎖において、完全な相補性がたいてい望ましいが、いくつかの実施の形態は、特にアンチセンス鎖において、（標的ＲＮＡに対して）１つ以上の、または例えば、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、もしくはそれより少ない不一致を含むことができる。特にアンチセンス鎖における不一致は、末端領域で最も許容され、かつ、存在する場合は、末端領域（単数または複数）において、例えば、５’末端および／または３’末端から６つ、５つ、４つ、または３つのヌクレオチド以内であり得る。センス鎖に要求されるのは、分子の全体的な二本鎖の性質を維持するためにアンチセンス鎖と十分に相補的であることのみである。
【０２８５】
本明細書の他の箇所で論じられるように、またその全体が参照により組み入れられる文献において、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、たいてい、修飾されているか、またはヌクレオシド代用物を含む。ｉＲＮＡ二重鎖剤の一本鎖領域は、たいてい、修飾されているか、またはヌクレオシド代用物を含み、例えば、不対領域またはヘアピン構造の領域（例えば、２つの相補的な領域を繋ぐ領域）は、修飾またはヌクレオシド代用物を有することができる。例えば、エキソヌクレアーゼに対して、ｉＲＮＡ等に重鎖剤の１つ以上の３'末端または５'末端を安定化する修飾またはアンチセンスｓｉＲＮＡ剤がＲＩＳＣに入るように有利に働く修飾も想定される。修飾としては、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサ（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ１２、無塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特別なビオチン試薬またはフルオレセイン試薬（これらは、ホスホラミダイトとして生じ、ＤＭＴ保護ヒドロキシル基を別に有して、ＲＮＡ合成の最中に複数のカップリングを可能にする）が挙げられる。
【０２８６】
ｉＲＮＡ二重鎖剤としては次のようなものが挙げられる：インターフェロン応答を誘発するのに十分な長さの分子（これらは、Ｄｉｃｅｒ（Bernstein et al. 2001. Nature, 409:363-366）によって開裂され、ＲＩＳＣ（ＲＮＡｉ−誘導発現抑制複合体）内に入ることができる）；およびインターフェロン応答を誘発しない程度に十分に短い分子（これらの分子もＤｉｃｅｒによって開裂され、および／またはＲＩＳＣ内に入ることができる）、例えば、ＲＩＳＣ内に入ることができる大きさの分子（例えば、Ｄｉｃｅｒ開裂産物に類似した分子）。インターフェロン応答を誘発しない程度に十分に短い分子を、本明細書では、「ｓｉＲＮＡ剤またはより短いｉＲＮＡ二重鎖剤」と呼ぶ。本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ剤またはより短いｉＲＮＡ二重鎖剤」は、例えば、ヒト細胞内で有害なインターフェロン応答を誘導しないぐらい十分に短い、例えば、６０、５０、４０、または３０未満のヌクレオチド対の二重鎖領域を有するＲＮＡ二重鎖剤（例えば、二本鎖ＲＮＡ剤または一本鎖剤）を称する。ｓｉＲＮＡ剤、またはその開裂産物は、例えば、標的ＲＮＡに対してＲＮＡｉを誘導することによって、標的遺伝子を下方調節することができ、この場合、標的は内在性の標的ＲＮＡまたは病原体の標的ＲＮＡを含み得る。
【０２８７】
ｓｉＲＮＡ剤の各鎖の長さは、３０、２５、２４、２３、２２、２１、または２０以下のヌクレオチドであって差し支えない。鎖の長さは、少なくとも１９のヌクレオチドであってもよい。例えば、各鎖の長さは、２１〜２５の間のヌクレオチドであることができる。ｓｉＲＮＡ剤は、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対の二重鎖領域、および１つ以上の突出部、もしくは１つまたは２つの、２〜３ヌクレオチドの３'突出部を有してもよい。
【０２８８】
１つの実施の形態において、ｉＲＮＡ二重鎖剤はヘアピンである。ｉＲＮＡ二重鎖剤におけるヘアーは、少なくとも１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対またはそれと等しい二重鎖領域を有する。この二重鎖領域の長さは、２００、１００、または５０以下であってよい。ある実施の形態において、二重鎖領域の長さの範囲は、１２〜３０、１７から２３、１９から２３、および１９から２１のヌクレオチド対である。このヘアピンは、いくつかの実施の形態において３末端で、ある実施の形態において、ヘアピンのアンチセンス鎖で、一本鎖突出部または末端不対領域を有してもよい。いくつかの実施の形態において、突出部の長さは２〜３のヌクレオチドである。
【０２８９】
二本鎖ｉＲＮＡ二重鎖剤のアンチセンス鎖の長さは、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または６０のヌクレオチド、またはそれに等しくてもよい。このアンチセンス鎖の長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド以下であってもよい。長さの範囲は、１７から２５、１９から２３、および１９から２１のヌクレオチドであってよい。
【０２９０】
二本鎖ｉＲＮＡ二重鎖剤のセンス鎖の長さは、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または６０のヌクレオチド、またはそれに等しくてもよい。このセンス鎖の長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド以下であってもよい。長さの範囲は、１７から２５、１９から２３、および１９から２１のヌクレオチドであってよい。
【０２９１】
二本鎖ｉＲＮＡ二重鎖剤の二本鎖部分の長さは、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、または６０のヌクレオチド、またはそれに等しくてもよい。この二本鎖部分の長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド以下であってもよい。長さの範囲は、１２〜３０、１７から２３、１９から２３、および１９から２１のヌクレオチド対であってよい。
【０２９２】
多くの実施の形態において、ｄｓ ｉＲＮＡ二重鎖剤は、内在性分子によって（例えば、Ｄｉｃｅｒによって）開裂されて、より小さいｄｓ ｉＲＮＡ二重鎖剤（例えば、ｓｉＲＮＡ剤）を産生することができるくらいに十分大きい。
【０２９３】
二本鎖ｉＲＮＡ二重鎖剤のアンチセンス鎖とセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましいであろう。センス鎖とアンチセンス鎖は、同じ修飾または同じ部類の修飾を有することもあれば、異なる修飾を有することもあり、例えば、場合によっては、センス鎖のみを修飾することが望ましい場合がある。例えば、センス鎖を不活性化するために、センス鎖のみを修飾することが望ましい場合があり、例えば、センス鎖を不活性化して、活性のあるｓｉＲＮＡ／タンパク質またはＲＩＳＣの形成を妨げるために、センス鎖を修飾することができる。これは、センス鎖の５’−リン酸化を妨げる修飾によって（例えば、５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いる修飾によって）行うことができる（Nykaenen et al., (2001) ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107, 309-321.参照）。例えば、単に５'−ＯＨをＯ−ＭｅではなくＨによって置換することなどの、リン酸化を妨げる他の修飾も使用しても差し支えない。あるいは、大きな嵩張る基を５’−ホスフェートに付加して、ホスホジエステル結合に変えてもよいが、ホスホジエステラーゼがこのような結合を開裂して、機能的なｓｉＲＮＡ  ５’末端を放出し得るので、これはあまり望ましくないであろう。アンチセンス鎖修飾としては、５’リン酸化、並びに本明細書で論じられた任意の他の５’修飾、特に、一本鎖ｉＲＮＡ分子に関する節において先に論じられた５’修飾が挙げられる。
【０２９４】
ｄｓ ｉＲＮＡ二重鎖剤が、分子の一方または両方の末端で一本鎖領域または不対領域を含むように、センス鎖とアンチセンス鎖を選択し得る。したがって、ｄｓ ｉＲＮＡ二重鎖剤は、突出部、例えば、１つまたは２つの５’突出部、または３’突出部、もしくは２〜３ヌクレオチドの３’突出部を含有するように対形成した、センス鎖とアンチセンス鎖を含んでもよい。多くの実施の形態は、３’突出部を有する。あるｓｉＲＮＡ剤は、一本鎖突出部を有し、いくつかの実施の形態では、各末端に１つまたは２つまたは３つのヌクレオチドの長さの３’突出部を有する。突出部は、一方の鎖が他方の鎖よりも長いこと、または同じ長さの２つの鎖が食い違っていることの結果として生じ得る。５’末端はリン酸化されていてもよい。
【０２９５】
いくつかの実施の形態では、二重鎖領域の長さは、例えば、上で論じられたｓｉＲＮＡ剤の範囲において、１５と３０の間、または１８、１９、２０、２１、２２、および２３のヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡ剤は、長いｄｓ ｉＲＮＡから天然のＤｉｃｅｒによって処理された産物と長さおよび構造が類似していることがあり得る。ｓｉＲＮＡ剤の２つの鎖が結合（例えば、共有結合）している実施の形態も含まれる。ヘアピン、または所要の二本鎖領域、および３’突出を与える他の一本鎖構造も本発明の範囲内にある。
【０２９６】
ｄｓ ｉＲＮＡ二重鎖剤およびｓｉＲＮＡ剤を含む、本明細書に記載された単離されたｉＲＮＡ二重鎖剤は、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写物）の発現抑制を仲介することができる。便宜上、このようなｍＲＮＡを、本明細書では、発現抑制すべきｍＲＮＡとも呼ぶ。このような遺伝子を標的遺伝子とも呼ぶ。一般に、発現抑制すべきＲＮＡは、内在性遺伝子または病原体遺伝子である。さらに、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ）、およびウイルスＲＮＡを標的とすることもできる。
【０２９７】
ここに用いたように、「ＲＮＡｉを仲介する」という語句は、配列特異的な様式で、標的ＲＮＡを発現抑制する能力を称する。理論に束縛されることを望まないが、発現抑制では、ＲＮＡｉの機構またはプロセスおよびガイドＲＮＡ（例えば、２１から２３のヌクレオチドのｓｉＲＮＡ剤）が使用されると考えられている。
【０２９８】
ここに用いたように、「特異的にハイブリダイズ可能な」または「相補的な」は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子の間で安定かつ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。特異的結合には、特異的結合が所望される条件下で、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的処置の場合には、生理的条件下で、またはインビトロアッセイの場合には、そのアッセイが行なわれる条件下で、非標的配列に対するオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性が必要とされる。非標的配列は、概して、少なくとも５つのヌクレオチドが異なっている。
【０２９９】
１つの実施の形態では、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、ｉＲＮＡ二重鎖剤が標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生を発現抑制するように、標的ＲＮＡ、例えば、標的ｍＲＮＡに対して「十分に相補的」である。別の実施の形態では、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、標的ＲＮＡに対して「厳密に相補的」であり、例えば、標的ＲＮＡとｉＲＮＡ二重鎖剤は、例えば、厳密に相補的な領域でワトソン−クリック塩基対のみからできたハイブリッドを形成するようにアニールする。「十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに厳密に相補的な（例えば、少なくとも１０のヌクレオチドの）内部領域を含むことができる。さらに、いくつかの実施の形態では、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、単一ヌクレオチドの相違を特異的に区別する。この場合、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、厳密な相補性が、単一ヌクレオチドの違いがある（例えば、７ヌクレオチド以内の）領域に見られる場合のみにＲＮＡｉを仲介する。
【０３００】
ここに用いたように、「オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、１００、２００、３００、または４００未満のヌクレオチドの長さの核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を称する。
【０３０１】
本明細書で論じられるＲＮＡ剤としては、未修飾のＲＮＡ、ならびに、例えば、効力を改善するために修飾されたＲＮＡ、およびヌクレオシド代用物のポリマーが挙げられる。未修飾のＲＮＡは、核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分が、天然に存在する、例えば、ヒトの体内に天然に存在するのと同じかまたは実質的に同じである分子を称する。当技術分野では、稀であるかまたは通常とは異なるが、天然に存在するＲＮＡを修飾ＲＮＡと呼ぶことが多く、例えば、Limbach et al., (1994) Summary:  the modified nucleosides of RNA, Nucleic Acids Res.  22: 2183-2196を参照されたい。（典型的には転写後修飾の結果であることが明白なので）修飾ＲＮＡと呼ばれることが多い、このような稀であるかまたは通常とは異なるＲＮＡは、本明細書で使用される「未修飾のＲＮＡ」という用語の範囲内にある。修飾ＲＮＡは、１つ以上の核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分が、天然に存在するものと異なる、例えば、ヒトの体内に存在するものと異なる分子を称する。これらは修飾「ＲＮＡ」と称されるが、当然、修飾されているのでＲＮＡではない分子を含むことになる。ヌクレオシド代用物とは、リボリン酸骨格が非リボリン酸構築物で置換されている分子のことであり、この非リボリン酸構築物は、ハイブリダイゼーションが、リボリン酸骨格の場合に見られるのと実質的に同様（例えば、リボリン酸骨格の非荷電模倣物）であるように、塩基が正しい空間的関係性で提示されることを可能にする。上記の全ての例が本明細書で論じられる。
【０３０２】
以下の考察の大部分は、一本鎖分子について言及するものである。本発明の多くの実施の形態では、二本鎖ｉＲＮＡ二重鎖剤（例えば、部分的二本鎖ｉＲＮＡ二重鎖剤）が想定されている。したがって、以下に記載される一本鎖構造からできた二本鎖構造（例えば、２つの別々の分子が接触して二本鎖領域を形成している場合、または分子内対形成によって二本鎖領域が形成されている場合（例えば、ヘアピン構造））は、本発明の範囲内にある。長さについては、本明細書の他の箇所で記載されている。
【０３０３】
核酸はサブユニットのポリマーであるので、以下に記載される修飾の多く（例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾）は、核酸内で繰り返される位置で生じる。修飾が核酸中のこれらの位置全てで生じる場合もあるが、多くの場合、そうではない。一例として、修飾は、３’末端位置または５’末端位置でのみで生じ得、末端領域で、例えば、末端ヌクレオチド上の位置でまたは鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチドでのみ生じ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその両方で生じ得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域でのみ生じても、またはＲＮＡの一本鎖領域でのみ生じてもよい。例えば、非結合Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端で生じてもよく、末端領域で、例えば、末端ヌクレオチド上の位置でまたは鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチドでのみ生じても、または二本鎖領域と一本鎖領域において、特に末端で生じてもよい。５’末端（単数または複数）をリン酸化することができる。
【０３０４】
いくつかの実施の形態では、例えば、安定性を高めるために、突出部に特定の塩基を含めるか、または一本鎖突出部（例えば、５’突出部もしくは３’突出部、もしくはその両方）に修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが可能である。例えば、突出部にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいことがある。いくつかの実施の形態では、３’突出部または５’突出部中の塩基の全てまたはいくつかを、例えば、本明細書に記載される修飾を用いて、修飾する。修飾としては、例えば、リボース糖の２’ＯＨ基での修飾の使用、例えば、リボヌクレオチドの代わりとしてのデオキシリボヌクレオチド（例えば、デオキシチミジン）の使用、およびリン酸基での修飾（例えば、ホスホロチオエート修飾）が挙げられる。突出部が標的配列と相同である必要はない。
【０３０５】
修飾およびヌクレオチド代用物を以下で論じる。
【化７３】
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【０３０６】
上記の式ＶＩＩに示す足場(scaffold)は、リボ核酸の一部を表す。塩基性成分は、リボース糖、塩基、末端リン酸、およびリン酸ヌクレオチド間リンカーである。塩基が、天然の塩基、例えば、アデニン、ウラシル、グアニン、またはシトシンである場合、糖は、（図示したように）未修飾の２’ヒドロキシルリボース糖であり、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは全てＯであり、式ＶＩＩは、天然の未修飾オリゴリボヌクレオチドを表す。
【０３０７】
未修飾のオリゴリボヌクレオチドは、いくつかの用途では最適とは言えない場合があり、例えば、未修飾のオリゴリボヌクレオチドが、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を受けやすい可能性がある。ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解することができる。しかしながら、上記ＲＮＡ成分の１つ以上に対する化学修飾は、改善された特性を付与することができ、例えば、ヌクレアーゼに対してオリゴリボヌクレオチドをより安定にすることができる。
【０３０８】
修飾核酸およびヌクレオチド代用物は、以下のうちの１つ以上を含むことができる：
（ｉ）非結合（ＸおよびＹ）リン酸酸素の一方もしくは両方、および／または結合（ＷおよびＺ）リン酸酸素の１つ以上の改変（例えば、置換）（リン酸が末端位置にある場合、位置ＷまたはＺの一方は、天然に存在するリボ核酸中ではさらなる元素にリン酸を結合しない。しかしながら、用語方を単純化するために、別記される場合を除き、核酸の５’末端のＷ位と核酸の３’末端の末端Ｚ位とは、本明細書で使用される「結合リン酸酸素」という用語の範囲内にある）；
（ｉｉ）リボース糖の構成成分（例えば、リボース糖の２’ヒドロキシル）の改変（例えば、置換）；
（ｉｉｉ）リン酸部分（括弧Ｉ）の、「デホスホ(dephospho)」リンカーによる大規模な置換；
（ｉｖ）天然に存在する塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボース−リン酸骨格（括弧ＩＩ）の置換または修飾；
（ｖｉ）ＲＮＡの３’末端または５’末端の修飾（例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、またはＲＮＡの３’末端もしくは５’末端のいずれかへの、部分（例えば、蛍光標識部分）の結合）。
【０３０９】
この文脈で使用される、置換、修飾、改変などの用語は、プロセス限定を意味するものではなく、例えば、修飾とは、対照リボ核酸または天然に存在するリボ核酸から始めて、それを、修飾リボ核酸を産生するように修飾しなければならないことを意味ものではなく、修飾とは、単に、天然に存在する分子との違いを意味するものである。
【０３１０】
いくつかの化学物質の実際の電子構造は、ただ１つの標準的な型（すなわち、ルイス構造）によって適切に表すことはできないことが理解される。理論に束縛されることを望まないが、その代わりに、実際の構造は、集合的に共鳴型または共鳴構造として知られている、２つ以上の標準的な型のあるハイブリッドまたは加重平均であり得る。共鳴構造は、個別の化学物質ではなく、紙の上でのみ存在する。共鳴構造は、特定の化学物質に対する結合電子および非結合電子の配置または「局在」という点においてのみ相互に異なる。ある共鳴構造が他のものよりも高い程度でハイブリッドに寄与することが可能である。したがって、本発明の実施の形態についての記載および図示される説明は、特定の種に対する主要な共鳴型として当技術分野で認識されているものに関してなされる。例えば、任意のホスホロアミデート（非結合酸素の窒素による置換）は、上記の図においてＸ＝ＯおよびＹ＝Ｎによって表されよう。
【０３１１】
具体的な修飾を以下に詳細に論じる。
【０３１２】
リン酸基
リン酸基は、負に荷電した種である。電荷は、２つの非結合酸素原子（すなわち、上記式１中のＸおよびＹ）に均等に分布している。しかしながら、リン酸基は、酸素原子の１つを異なる置換基で置換することによって修飾しても差し支えない。ＲＮＡリン酸骨格に対するこの修飾の１つの結果は、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴリボヌクレオチドの耐性の増大であり得る。したがって、理論に束縛されることを望まないが、いくつかの実施の形態では、非荷電リンカーかまたは非対称の電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかを生じさせる改変を導入することが望ましい可能性がある。
【０３１３】
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非結合酸素が硫黄に置換されている。ＸまたはＹの一方のみが改変される状況とは異なり、ホスホロジチオエートにおけるリン中心はアキラルであり、アキラルはオリゴリボヌクレオチドのジアステレオマーの形成を妨害する。ジアステレオマー形成により、個々のジアステレオマーがヌクレアーゼに対してさまざまな耐性を示す調製物が生じ得る。さらに、キラルリン酸基を含有するＲＮＡのハイブリダイゼーション親和性は、対応する未修飾のＲＮＡ種と比べてより低い可能性がある。したがって、理論に束縛されることを望まないが、ジアステレオマー混合物を産生することができないという点で、キラル中心を排除するＸとＹの両方に対する修飾（例えば、ホスホロジチオエート形成）が望ましいであろう。したがって、Ｘは、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルもしくはアリールである）のいずれか１つであり得る。したがって、Ｙは、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルもしくはアリールである）のいずれか１つであり得る。Ｘおよび／またはＹを硫黄で置換することが可能である。
【０３１４】
リン酸リンカーは、結合酸素（すなわち、上記式１中のＷまたはＺ）を、窒素（架橋ホスホラロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換することによって修飾することもできる。置換は、末端の酸素（位置Ｗ（３’）または位置Ｚ（５’））で生じ得る。Ｗを炭素で置換すること、またはＺを窒素で置換することが可能である。
【０３１５】
候補となる薬剤を、以下に記載するように好適性について評価することができる。
【０３１６】
糖基
修飾ＲＮＡは、リボ核酸の糖基の全てまたはいくつかの修飾を含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多数の異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換することができる。理論によって束縛されるものではないが、ヒドロキシルはもはや、２’アルコキシドイオンを形成するように脱プロトン化できないので、安定性の向上が予測される。２’アルコキシドは、リンカーのリン原子への分子内求核攻撃による分解を触媒することができる。重ねて、理論によって束縛されることを望まないが、２’位でのアルコキシド形成が可能でない改変を導入することが、いくつかの実施の形態に対して望ましい可能性がある。
【０３１７】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋によって同じリボース糖の４’炭素に結合されている「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ2；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ2）nＡＭＩＮＥ（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ2；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）が挙げられる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＰＥＧ誘導体である、ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3）のみを含有するオリゴヌクレオチドが堅固なホスホロチオエート修飾で修飾されたものに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは注目すべきことである。
【０３１８】
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわち、デオキシリボース糖、これは、部分的にｄｓのＲＮＡの突出部に特に関連する）；ハロ（例えば、フルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ2；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ）nＣＨ2ＣＨ2−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ2；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；並びにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニル（これらは任意で、例えば、アミノ官能基で置換されていてもよい）が挙げられる。ある実施の形態の他の置換基としては、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ3、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロが挙げられる。
【０３１９】
糖基は、リボース中の対応する炭素の立体化学的配置とは反対の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素を含有することもできる。したがって、修飾ＲＮＡは、糖として、例えば、アラビノースを含有するヌクレオチドを含んで差し支えない。
【０３２０】
修飾ＲＮＡは、Ｃ−１’にヌクレオ塩基を欠く「無塩基」糖を含むこともできる。これらの無塩基糖は、構成成分の糖原子の１つ以上における修飾をさらに含有することもできる。
【０３２１】
ヌクレアーゼ耐性を最大にするために、２’修飾を、１つ以上のリン酸リンカー修飾（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わせて使用することができる。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、２つ以上の異なる修飾を含有するオリゴヌクレオチドである。
【０３２２】
候補となる修飾を下記のように評価することができる。
【０３２３】
リン酸基の置換
リン酸基は、リン以外のものを含有する接続部（上記式１中の括弧Ｉ参照）で置換することができる。理論によって束縛されることを望まないが、荷電したホスホジエステル基はヌクレアーゼ分解における反応中心なので、これを中性の構造模倣物で置換することは、向上したヌクレアーゼ安定性を付与するはずであると考えられている。重ねて、理論によって束縛されることを望まないが、いくつかの実施の形態において、荷電したリン酸基が中性部分に置換される改変を導入することが望ましい可能性がある。
【０３２４】
リン酸基を置換することができる部分の例としては、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。ある実施の形態では、置換には、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が含まれてもよい。
【０３２５】
候補となる修飾を下記のように評価することができる。
【０３２６】
リン酸骨格の置換
リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシドまたはヌクレオチドの代用物（式１中の括弧ＩＩ参照）で置換されているオリゴヌクレオチド模倣足場を構築することもできる。理論によって束縛されることを望まないが、繰り返し荷電された骨格が存在しなければ、ポリアニオンを認識するタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）への結合が減少すると考えられている。重ねて、理論によって束縛されることを望まないが、いくつかの実施の形態において、塩基が中性の代用骨格によって連結される改変を導入することが望ましい可能性がある。
【０３２７】
例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）というヌクレオシド代用物が挙げられる。ある実施の形態では、ＰＮＡ代用物を使用してもよい。
【０３２８】
候補となる修飾を下記のように評価することができる。
【０３２９】
末端修飾
オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を修飾することができる。このような修飾は、分子の３’末端、５’末端、または両方の末端においてなされ得る。これらの修飾は、末端のリン酸全体または末端リン酸基の１つ以上の原子の修飾または置換を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を、他の機能的分子実体、例えば、標識部分、例えば、フルオロフォア（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素もしくはＣｙ５色素）または保護基（例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素、もしくはエステルをベースにしたもの）に結合することができる。機能的分子実体は、リン酸基および／またはスペーサを介して糖に取り付けることが可能である。スペーサの末端原子は、リン酸基の結合原子または糖のＣ−３’もしくはＣ−５’のＯ基、Ｎ基、Ｓ基、もしくはＣ基に接続するかまたはこれらに置き換わることできる。あるいは、スペーサは、ヌクレオチド代用物（例えば、ＰＮＡ）の末端原子に接続するかまたはこれに置き換わることができる。これらのスペーサまたはリンカーとしては、例えば、−（ＣＨ2）n−、−（ＣＨ2）nＮ−、−（ＣＨ2）nＯ−、−（ＣＨ2）nＳ−、Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＯＨ（例えば、ｎ＝３または６）、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、もしくはモルホリノ、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を挙げることができる。「スペーサ／リン酸−機能的分子実体−スペーサ／リン酸」という配列が、ｉＲＮＡ二重鎖剤の２つの鎖の間に介在するとき、この配列は、ヘアピン型ＲＮＡ剤中のヘアピンＲＮＡループの代わりになり得る。３’末端は−ＯＨ基とすることができる。理論に束縛されることを望まないが、特定の部分の結合は、輸送特性、ハイブリダイゼーション特性、および特異性を改善することができると考えられている。重ねて、理論に束縛されることを望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端の改変を導入することが望ましいであろう。末端修飾の他の例としては、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ-４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋錯体）が挙げられる。
【０３３０】
末端修飾は、本明細書の他の箇所で論じられるように、活性を調節するため、または分解に対する耐性を調節するためを含む、多くの理由のために加えることができる。活性を調節するために有用な末端修飾には、リン酸またはリン酸類似体による５’末端の修飾が含まれる。例えば、ある実施の形態では、ｉＲＮＡ二重鎖剤、とりわけアンチセンス鎖は、５’リン酸化されているか、または５’プライム末端にホスホリル類似体を含む。５’リン酸修飾には、ＲＩＳＣを介した遺伝子発現抑制と適合可能なものが含まれる。好適な修飾としては、５’モノホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’ジホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’トリホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’モノチオホスフェート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄置換モノホスフェート、ジホスフェート、およびトリホスフェートの任意のさらなる組合せ（例えば、５’−α−チオトリホスフェート、５’−γ−チオトリホスフェートなど）、５’−ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’）が含まれる。
【０３３１】
末端修飾は、分解に対する耐性を増大させるのに有用であり得る。
【０３３２】
末端修飾は、分布をモニタするためにも有用であり得るが、このような場合、付加すべき基としては、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン）またはＡｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ ４８８）が挙げられる。末端修飾は、摂取を増強するためにも有用であり得るが、このために有用な修飾にはコレステロールが含まれる。末端修飾は、ＲＮＡ剤を別の部分に架橋するためにも有用であり得るが、このための有用な修飾にはマイトマイシンＣが含まれる。
【０３３３】
候補となる修飾を下記のように評価することができる。
【０３３４】
塩基
アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルは、ＲＮＡに見られる最も一般的な塩基である。これらの塩基は、改善された特性を有するＲＮＡを提供するために修飾または置換することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、これらの塩基を用いて、または合成および天然のヌクレオ塩基（例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン(nubularine)、イソグアニシン(isoguanisine)、またはツベルシジン）および上記の修飾のいずれか１つを用いて調製することができる。あるいは、上記の塩基および「汎用的な塩基」のいずれかの置換類似体または修飾類似体を利用することができる。例としては、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンならびにグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ4−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基が挙げられる。さらなるプリンおよびピリミジンとしては、米国特許第３６８７８０８号明細書に開示されているもの、the Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されているもの、およびEnglisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されているものが挙げられる。
【０３３５】
一般に、塩基の変化は、安定性を促進するためには使用されないが、他の理由のために有用である可能性があり、例えば、いくつかのもの（例えば、２，６−ジアミノプリンおよび２アミノプリン）は蛍光性である。修飾塩基は、標的特異性を低下させることがあり得る。このことは、ｉＲＮＡ二重鎖剤の設計において考慮されるであろう。
【０３３６】
候補となる修飾を下記のように評価することができる。
【０３３７】
候補ＲＮＡの評価
候補ＲＮＡ剤（例えば、修飾ＲＮＡ）を、そのＲＮＡ剤または修飾分子および対照分子を適当な条件に曝露し、選択された特性の存在について評価することによって、選択された特性について評価することができる。例えば、分解物質に対する耐性は、以下のように評価することができる。候補となる修飾ＲＮＡ（および対照分子、通常は未修飾形態）を、分解的な条件、例えば、分解作用物質（例えば、ヌクレアーゼ）を含む環境に曝露することができる。例えば、生物学的試料、例えば、治療的使用において遭遇し得る環境、例えば、血液または細胞画分（例えば、無細胞ホモジネートまたは破砕された細胞）と類似の生物学的試料を使用することができる。その後、候補および対照を、多数の手法のいずれによって、分解に対する耐性について評価しても差し支えない。例えば、候補および対照を、例えば、放射性標識もしくは酵素標識、または蛍光標識（例えば、Ｃｙ３もしくはＣｙ５）を用いて、曝露の前に標識付けることができる。対照ＲＮＡおよび修飾ＲＮＡを、分解作用物質、および必要に応じて、対照（例えば、不活化された（例えば、熱不活化された）分解作用物質）とともにインキュベーションすることができる。その後、物理学的パラメータ（例えば、修飾分子および対照分子のサイズ）を決定する。これらのパラメータを、物理学的方法によって（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはサイズ分画カラムによって）、その分子がそのもとの長さを維持していたかどうかを評価するために決定するか、または機能的に評価することができる。あるいは、ノーザンブロット分析を用いて、未標識の修飾分子の長さを検定することができる。
【０３３８】
機能的アッセイを用いて、候補薬剤を評価することもできる。機能的アッセイは、修飾によって、遺伝子発現を抑制する分子の能力が変化するか否かを決定するために、最初に、または前の非機能的アッセイ（例えば、分解に対する耐性についてのアッセイ）の後で適用することができる。例えば、細胞（例えば、マウスまたはヒトの細胞などの哺乳類細胞）に、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）を発現するプラスミドと、その蛍光タンパク質をコードする転写物に相同な候補ＲＮＡ剤を同時トランスフェクションすることができる（例えば、国際公開第００／４４９１４号パンフレット参照）。例えば、ＧＦＰ ｍＲＮＡに相同な修飾ｄｓｉＲＮＡは、トランスフェクションに候補ｄｓｉＲＮＡを含めなかった対照細胞（例えば、ＲＮＡ剤が添加されなかった対照、および／または未修飾ＲＮＡが添加された対照）と比較して、細胞の蛍光の減少についてモニタすることによって、ＧＦＰ発現を阻害する能力について検定することができる。遺伝子発現に対する候補薬剤の効力は、修飾ｄｓ ｉＲＮＡ剤および未修飾ｄｓ ｉＲＮＡ剤の存在下での細胞の蛍光を比較することによって評価することができる。
【０３３９】
代わりの機能的アッセイにおいて、内在性マウス遺伝子（例えば、ｃ−ｍｏｓなどの母性発現遺伝子）に相同な候補ｄｓ ｉＲＮＡ剤を未成熟のマウス卵母細胞に注入して、インビボで遺伝子発現を阻害するｉＲＮＡ剤の能力を評価することができる（例えば、国際公開第０１／３６６４６号パンフレット参照）。卵母細胞の表現型（例えば、第ＩＩ中期での停止を維持する能力）を、ＲＮＡ剤が発現を阻害する指標としてモニタすることができる。例えば、ｄｓ ｉＲＮＡ剤によるｃ−ｍｏｓ ｍＲＮＡの開裂は、卵母細胞に中期での停止を抜け出させ、単為生殖的発生を開始させるであろう（Colledge et al. Nature 370: 65-68, 1994; Hashimoto et al. Nature, 370:68-71, 1994）。標的ＲＮＡレベルに対する修飾ＲＮＡ剤の効果は、陰性対照と比較して、標的ｍＲＮＡのレベルの減少について検定するためのノーザンブロット法によって、または標的タンパク質のレベルの減少につい検定するためのウエスタンブロット法によって確認することができる。対照としては、ＲＮＡ剤が添加されない細胞、および／または未修飾ＲＮＡが添加される細胞が挙げられる。
【０３４０】
定義
「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素のうちの任意の基を称する。「アルキル」という用語は、表示された数の炭素原子を含み、必要に応じてＮ、Ｏ、またはＳが挿入され得る、直鎖または分岐鎖であり得る飽和および不飽和の非芳香族炭化水素鎖（これらは、プロピル、アリル、またはプロパルギルを含むが、これらに限定されない）を称する。例えば、Ｃ1〜Ｃ10は、この基がその中に１〜１０個（含む）の炭素原子を有し得ることを意味する。「アルコキシ」という用語は、−Ｏ−アルキル基を称する。「アルキレン」という用語は、二価アルキル（すなわち、−Ｒ−）を称する。「アルキレンジオキソ」という用語は、−Ｏ−Ｒ−Ｏ−（式中、Ｒはアルキレンを表す）という構造の二価種を称する。「アミノアルキル」という用語は、アミノで置換されたアルキルを称する。「メルカプト」という用語は、−ＳＨ基を称する。「チオアルコキシ」という用語は、−Ｓ−アルキル基を称する。
【０３４１】
「アリール基」という用語は、各環の０個、１個、２個、３個、または４個の原子が、置換基によって置換され得る、６炭素の単環式または１０炭素の二環式の芳香環系を称する。アリール基の例としては、フェニル、ナフチルなどが挙げられる。「アリールアルキル」または「アラルキル」という用語は、アリールで置換されたアルキルを称する。「アリールアルコキシ」という用語は、アリールで置換されたアルコキシを称する。
【０３４２】
本明細書で用いられる「シクロアルキル」という用語は、３から１２個の炭素、例えば、３から８個の炭素、および例えば、３から６個の炭素を有する、飽和または部分飽和の環式炭化水素基を含み、シクロアルキル基はさらに、必要に応じて置換されていてもよい。シクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４３】
「ヘテロアリール」という用語は、単環式の場合には１〜３個のヘテロ原子を、二環式の場合には１〜６個のヘテロ原子を、または三環式の場合には１〜９個のヘテロ原子を有する、５〜８員の芳香族単環式環系、８〜１２員の芳香族二環式環系、または１１〜１４員の芳香族三環式環系を称し、そのヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、単環、二環、または三環の場合、炭素原子と、それぞれ、１〜３個、１〜６個、または１〜９個のＮ、Ｏ、またはＳのヘテロ原子）、そこで、各環の０個、１個、２個、３個、または４個の原子は、置換基によって置換されていてもよい。ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリルなどが挙げられる。「ヘテロアリールアルキル」という用語または「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルキルを称する。「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルコキシを称する。
【０３４４】
「ヘテロシクリル」という用語は、単環式の場合には１〜３個のヘテロ原子を、二環式の場合には１〜６個のヘテロ原子を、または三環式の場合には１〜９個のヘテロ原子を有する、５〜８員の非芳香族単環式環系、８〜１２員の非芳香族二環式環系、または１１〜１４員の非芳香族三環式環系を称し、そのヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、単環、二環、または三環の場合、炭素原子と、それぞれ、１〜３個、１〜６個、または１〜９個のＮ、Ｏ、またはＳのヘテロ原子）、そこで、各環の０個、１個、２個、または３個の原子は、置換基により置換されていてもよい。ヘテロシクリル基の例としては、トリゾリル、テトラゾリル、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホニル、テトラヒドロフラニルなどが挙げられる。
【０３４５】
「オキソ」という用語は、炭素に結合した場合にはカルボニルを、窒素に結合した場合にはＮ−オキシドを、および硫黄に結合した場合にはスルホキシドまたはスルホンを形成する酸素原子を指す。
【０３４６】
「アシル」という用語は、アルキルカルボニル置換基、シクロアルキカルボニル置換基、アリールカルボニル置換基、ヘテロシクリルカルボニル置換基、またはヘテロアリールカルボニル置換基を称し、これらはいずれも、置換基によってさらに置換されていてもよい。
【０３４７】
「置換された」という用語は、所定の構造中の１つ以上の水素基と、以下に限られないが：
ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルフォニル、アルキルスルフォニルアルキル、アリールスルフォニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、複素環式、および脂肪族を含む、特定の置換基の基との置換を称する。置換基をさらに置換することができることが理解される。
【０３４８】
パリンドローム
本発明のｉＲＮＡ二重鎖剤は、２つ以上のＲＮＡ領域を標的とすることができる。例えば、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、ハイブリダイズするのに互いに十分に相補的な第１の配列と第２の配列を含むことができる。第１の配列は第１の標的ＲＮＡ領域に相補的であることができ、第２の配列は第２の標的ＲＮＡ領域に相補的であることができる。ｉＲＮＡ二重鎖剤の第１の配列と第２の配列が異なるＲＮＡ鎖上にあることができ、かつ第１の配列と第２の配列の間の不一致が、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満であり得る。ｉＲＮＡ二重鎖剤の第１の配列と第２の配列が同じＲＮＡ鎖上にあることができ、かつ関連する実施の形態では、ｉＲＮＡ二重鎖剤の５０％よりも多く、６０％よりも多く、７０％よりも多く、８０％よりも多く、９０％よりも多く、９５％よりも多く、または１％よりも多くが、２分子の形態であることができる。ｉＲＮＡ二重鎖剤の第１の配列と第２の配列は、互いに完全に相補的であることができる。
【０３４９】
第１の標的ＲＮＡ領域が第１の遺伝子によってコードされることができ、かつ第２の標的ＲＮＡ領域が第２の遺伝子によってコードされることができ、または第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域が単一遺伝子由来のＲＮＡの異なる領域であることができる。第１の配列と第２の配列は、少なくとも１つのヌクレオチド異なり得る。
【０３５０】
第１と第２の標的ＲＮＡ領域は、遺伝子の第１と第２の配列変異体（例えば、第１と第２の対立遺伝子）によってコードされる転写物上にあることができる。これらの配列変異体は、例えば、突然変異、または多型であることができる。第１の標的ＲＮＡ領域は、第２の標的ＲＮＡ領域と比べて、ヌクレオチドの置換、挿入、もしくは欠失を含むことができ、または第２の標的ＲＮＡ領域は、第１の標的領域の突然変異体または変異体であることができる。
【０３５１】
第１と第２の標的ＲＮＡ領域は、ウイルスＲＮＡ領域またはヒトＲＮＡ領域を含むことができる。第１と第２の標的ＲＮＡ領域は、オンコジーンの変異転写物上にあることもでき、または腫瘍抑制遺伝子転写物の異なる突然変異を含むこともできる。さらに、第１と第２の標的ＲＮＡ領域は、遺伝子変異のホットスポットに対応することができる。
【０３５２】
本発明の組成物は、ｉＲＮＡ二重鎖剤分子の混合物を含むことができる。例えば、１つのｉＲＮＡ二重鎖剤が、ハイブリダイズするのに互いに十分に相補的な第１の配列と第２の配列を含有することができ、さらに、第１の配列が第１の標的ＲＮＡ領域に相補的であり、かつ第２の配列が第２の標的ＲＮＡ領域に相補的である。その混合物は、ハイブリダイズするのに互いに十分に相補的な第３の配列と第４の配列を含む少なくとも１つの追加のｉＲＮＡ二重鎖剤種を含むこともでき、この場合、第３の配列が第３の標的ＲＮＡ領域に相補的であり、かつ第４の配列が第４の標的ＲＮＡ領域に相補的である。さらに、第１または第２の配列が、第３または第４の配列に対して、互いにハイブリダイズできるのに十分に相補的であることができる。第１と第２の配列は同じまたは異なるＲＮＡ鎖上にあることができ、第３と第４の配列は同じまたは異なるＲＮＡ鎖上にあることができる。
【０３５３】
標的ＲＮＡ領域は、ウイルスまたはヒトＲＮＡの変異体配列であることができ、ある実施の形態では、標的ＲＮＡ領域の少なくとも２つが、オンコジーンまたは腫瘍抑制遺伝子の変異体転写物であることができる。標的ＲＮＡ領域は、遺伝子のホットスポットに対応することができる。
【０３５４】
ｉＲＮＡ二重鎖剤組成物を作製する方法は、その領域が（例えば、ヒトにおける）高度の変異性または突然変異頻度を有する、標的遺伝子（例えば、ウイルス遺伝子もしくはヒト遺伝子、またはオンコジーンもしくは腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ５３）のＲＮＡの領域に関する情報を入手または提供することを含むことができる。さらに、その領域内の複数のＲＮＡ標的に関する情報を入手または提供することができ、その場合、各々のＲＮＡ標的が、遺伝子の異なる変異体または突然変異体（例えば、ｐ５３ ２４８Ｑおよび／またはｐ５３ ２４９Ｓをコードするコドンを含む領域）に対応する。第１の配列が（例えば、２４９Ｑをコードする）複数の変異体ＲＮＡ標的のうちの第１の標的と相補的であり、第２の配列が（例えば、２４９Ｓをコードする）複数の変異体ＲＮＡ標的のうちの第２の標的と相補的であり、かつ第１と第２の配列がハイブリダイズするのに十分に相補的であり得るように、ｉＲＮＡ二重鎖剤を構築することができる。
【０３５５】
例えば、標的遺伝子中の共通の突然変異体を同定するために、配列分析を使用して、高度の変異性または突然変異頻度を有する標的遺伝子の領域を同定することができる。高度の変異性または突然変異頻度を有する標的遺伝子の領域は、個体群由来の標的遺伝子についての遺伝子型情報を入手または提供することによって同定することができる。
【０３５６】
互いにハイブリダイズするのに十分に相補的な第１と第２の配列を有するｉＲＮＡ二重鎖剤を提供することによって、標的遺伝子の発現を調節する（例えば、下方調節または抑制）することができる。さらに、第１の配列が第１の標的ＲＮＡ領域に相補的であることができ、かつ第２の配列が第２の標的ＲＮＡ領域に相補的であることができる。
【０３５７】
ｉＲＮＡ二重鎖剤は、第１の変異体ＲＮＡ標的領域に相補的な第１の配列と第２の変異体ＲＮＡ標的領域に相補的な第２の配列とを含むことができる。この第１と第２の変異体ＲＮＡ標的領域は、標的遺伝子（例えば、ウイルス遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、またはオンコジーン）の第１と第２の変異体または第１と第２の突然変異体に対応することができる。第１と第２の変異体標的ＲＮＡ領域は、標的遺伝子の対立遺伝子変異体、突然変異体（例えば、点突然変異体）、または多型を含むことができる。第１と第２の変異体ＲＮＡ標的領域は、遺伝子のホットスポットに対応することができる。
【０３５８】
複数のｉＲＮＡ二重鎖剤（例えば、パネルまたはバンク）を提供することができる。
【０３５９】
他の実施の形態
また別の実施の形態では、ｉＲＮＡ剤は、例えば、細胞に送達される外来のＤＮＡ鋳型から、インビボで細胞において産生される。例えば、ＤＮＡ鋳型をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５３２８４７０号明細書）によって、または定位注射（例えば、Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057参照）によって、対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放性マトリクスを含むことができる。例えば、ＤＮＡ鋳型は、２つの転写ユニット、すなわち、ｉＲＮＡ二重鎖剤の上部の鎖を含む転写物を産生するものと、ｉＲＮＡ二重鎖剤の下部の鎖を含む転写物を産生するものとを含むことができる。鋳型が転写されると、ｉＲＮＡ二重鎖剤が産生され、プロセシングを受けて遺伝子発現抑制を仲介するｓｉＲＮＡ剤断片となる。
【０３６０】
生理学的効果
本明細書に記載されるｉＲＮＡ二重鎖剤は、治療上の毒性の決定が、ｉＲＮＡ二重鎖剤と、ヒト配列および非ヒト動物配列の両方との相補性によってより容易になされるように設計することができる。これらの方法により、ｉＲＮＡ二重鎖剤は、ヒト由来の核酸配列および少なくとも１種類の非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳類（例えば、齧歯類、反芻類、または霊長類）由来の核酸配列に完全に相補的である配列からなることができる。例えば、非ヒト哺乳類は、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、サル、ピグミーチンパンジー(Pan Paniscus)、ナミチンパンジー(Pan troglodytes)、アカゲザル(Macaca mulatto)、またはカニクイザル(Cynomolgus monkey)であることができる。ｉＲＮＡ二重鎖剤の配列は、非ヒト哺乳類およびヒトの相同遺伝子（例えば、オンコジーンまたは腫瘍抑制遺伝子）内の配列に相補的であることができる。非ヒト哺乳類におけるｉＲＮＡ二重鎖剤の毒性を決定することによって、ヒトにおけるｉＲＮＡ二重鎖剤の毒性を推定することができる。より厳しい毒性試験のためには、ｉＲＮＡ二重鎖剤を、ヒトおよび２種類以上（例えば、２種類または３種類またはそれより多く）の非ヒト動物に対して相補的とすることができる。
【０３６１】
本明細書に記載された方法は、ヒトに対するｉＲＮＡ二重鎖剤の任意の生理学的効果、例えば、任意の望ましくない効果（例えば、毒性効果）、または任意の有益な、もしくは所望の効果と相関させるために使用することができる。
【０３６２】
ｉＲＮＡ調製物は、別の薬剤、例えば、別の治療剤またはｉＲＮＡを安定化させる薬剤、例えば、ｉＲＮＡと複合体を形成してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて配合することができる。さらに他の薬剤としては、キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ2+などの二価陽イオンを除去するため）、塩、ＮＲａｓｅ阻害剤（例えば、ＲＮａｓｉｎ（登録商標）などの広い特異性のＮＲａｓｅ阻害剤）などが挙げられる。
【０３６３】
送達経路
ｉＲＮＡを含む組成物は種々の経路で対象に送達することができる。例示的な経路としては、静脈内経路、局所経路、経直腸経路、経肛門経路、経膣経路、経鼻経路、経肺経路、および経眼経路が挙げられる。
【０３６４】
本発明のｉＲＮＡ分子は、投与に適した医薬組成物中に組み入れることができる。このような組成物は、典型的には、１種類以上のｉＲＮＡと薬学的に許容される担体とを含む。ここに用いたように、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬品の投与に適合する任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張な吸収遅延剤などを含むことが意図されている。薬学的活性のある物質としてこのような媒体および薬剤を使用することは、当技術分野で周知である。従来の媒体および薬剤がいずれも活性化合物に適合しない場合を除き、組成物に従来の媒体および薬剤を使用することが考えられる。また、補助的な活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
【０３６５】
本発明の組成物は、局所処置または全身処置のどちらが所望されるかによって、かつ処置すべき領域によって、多くの方法で投与され得る。投与は、局所（経眼、経膣、経直腸、経鼻、経皮を含む）、経口、または非経口であってよい。非経口投与としては、静脈内点滴、皮下注射、腹腔内注射、もしくは筋肉内注射、または髄腔内投与もしくは脳室内投与が挙げられる。
【０３６６】
投与の経路および部位は標的化を増大させるように選択してもよい。例えば、筋細胞を標的とする場合、対象となる筋肉に筋肉内注射することは、論理的な選択であろう。肺細胞は、エアロゾル形態のｉＲＮＡを投与することによって標的とし得る。血管内皮細胞は、バルーン・カテーテルをｉＲＮＡでコーティングし、機械的にＤＮＡを導入することによって標的とすることができる。
【０３６７】
投薬量
１つの態様では、本発明は、対象（例えば、ヒトの対象）に、ｉＲＮＡ二重鎖剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤を投与する方法を特徴とする。本方法は、単位用量のｉＲＮＡ二重鎖剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ剤であって、（ａ）二本鎖部分が１９〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）長、例えば、２１〜２３ｎｔであり、（ｂ）標的ＲＮＡ（例えば、内在性標的ＲＮＡまたは病原体標的ＲＮＡ）に相補的であり、かつ必要に応じて（ｃ）少なくとも１つの１〜５ヌクレオチド長の３’突出部を含むものを投与することを含む。１つの実施の形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり１．４ｍｇ未満、または体重１ｋｇ当たり１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１ｍｇ未満、および体重１ｋｇ当たり２００ナノモル未満のＲＮＡ剤（例えば、約４．４×１０16コピー）、または体重１ｋｇ当たり１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ナノモル未満のＲＮＡ剤である。
【０３６８】
規定量は、疾患または障害、例えば、標的ＲＮＡに関連する疾患または障害を、処置または予防するのに有効な量であり得る。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内または筋肉内）、吸入投与、または局所適用によって投与することができる。いくつかの実施の形態では、投薬量は、体重１ｋｇあたり２、１、または０．１ｍｇ未満であってもよい。
【０３６９】
いくつかの実施の形態では、単位用量は、１日に１回未満の頻度、例えば、２、４、８または３０日毎よりも低い頻度で投与される。別の実施の形態では、単位用量は、頻繁には投与されない（例えば、規則正しい頻度では投与されない）。例えば、単位用量は、単回で投与されてもよい。
【０３７０】
１つの実施の形態では、有効用量が他の従来の治療モダリティで投与される。１つの実施の形態では、対象はウイルス感染症であり、モダリティは、ｉＲＮＡ二重鎖剤（例えば、ｓｉＲＮＡ剤）以外の抗ウイルス剤である。別の実施の形態では、対象はアテローム性動脈硬化症であり、有効用量のｉＲＮＡ二重鎖剤（例えば、ｓｉＲＮＡ剤）が、組み合わせて、例えば、外科的介入（例えば、血管形成術）の後に投与される。
【０３７１】
１つの実施の形態では、対象に、初回用量および１回以上の維持用量のｉＲＮＡ二重鎖剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へ処理され得るより大きなｉＲＮＡ二重鎖剤、もしくはｉＲＮＡ二重鎖剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤、またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を投与する。維持用量は、通常、初回用量よりも少ない（例えば、初回用量より半分未満）。維持投与計画は、対象を、１日に体重１ｋｇ当たり０．０１μｇから１．４ｍｇの範囲、例えば、１日に体重１ｋｇ当たり１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇの用量で処置することを含む。維持用量は、例えば、５、１０、または３０日毎に１回しか投与されない。さらに、処置投与計画は、ある期間に亘り継続するが、その期間は、特定の疾患の性質、その重症度、および患者の全体的な状態によって変わる。ある実施の形態では、投薬は、１日に１回以下、例えば、２４、３６、４８時間、またはそれを上回る時間に１回以下、例えば、５または８日毎に１回以下しか送達されなくてもよい。処置後、患者を、状態の変化および疾患状態の症状の緩和について、モニタすることができる。患者が現在の投薬量レベルに対してはっきりと応答しない場合、化合物の投薬量を増大させてもよいし、または疾患状態の症状の緩和が認められる場合、疾患状態が取り除かれている場合、もしくは望ましくない副作用が認められる場合には、用量を減らしてもよい。
【０３７２】
有効用量は、特定の状況下で所望されるか、または適切と考えられるように、単回投与でまたは２回以上の投与で投与することができる。繰り返しの注入または頻繁な注入を容易にすることが望ましい場合には、送達装置（例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、嚢内、もしくは関節内））またはリザーバを埋め込むことが望ましいことがある。
【０３７３】
１つの実施の形態では、前記組成物は、複数のｉＲＮＡ二重鎖剤種を含む。別の実施の形態では、ｉＲＮＡ二重鎖剤種は、天然に存在する標的配列に関して別のｉＲＮＡ二重鎖剤種と重複せずかつ隣接しない配列を有する。別の実施の形態では、複数のｉＲＮＡ二重鎖剤種は、天然に存在する異なる標的遺伝子に特異的である。別の実施の形態では、ｉＲＮＡ二重鎖剤は対立遺伝子特異的である。
【０３７４】
本願の発明者等は、ここに記載されたｉＲＮＡ二重鎖剤を、哺乳類、特に、非ヒト霊長類またはヒトなどの大型の哺乳類に様々な様式で投与できることを発見した。
【０３７５】
１つの実施の形態において、ｉＲＮＡ二重鎖剤（例えば、ｓｉＲＮＡ剤）の組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラスとしてまたは拡散注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、口腔内、舌下、経内視鏡、経直腸、経口、経膣、局所、経肺、鼻腔内、尿道、または経眼で行われる。投与は、対象者によって、または別の人（例えば、医療提供者）によって行われ得る。医薬品は、一定用量で、または定量を送達するディスペンサー中に提供され得る。選択される送達様式については、以下により詳細に論じる。
【０３７６】
本発明は、本明細書に記載されたｉＲＮＡ二重鎖剤を直腸投与または直腸送達するための方法、組成物およびキットを提供する。
【０３７７】
したがって、本明細書に記載されたｉＲＮＡ二重鎖剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へ処理され得るより大きなｉＲＮＡ二重鎖剤、またはｉＲＮＡ二重鎖剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤、またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）、例えば、本明細書に記載された治療的有効量のｉＲＮＡ二重鎖剤、例えば、４０未満のヌクレオチド、例えば、３０未満のヌクレオチドの二本鎖領域を有し、１つまたは２つの１〜３ヌクレオチドの一本鎖３’突出部を有するｉＲＮＡ二重鎖剤は、直腸投与（例えば、直腸から下部大腸または上部大腸に導入）することができる。この手法は、炎症性障害、望ましくない細胞増殖を特徴とする障害、例えば、ポリープまたは大腸癌を治療する際に、特に有用である。
【０３７８】
１つの態様において、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、該細胞に本発明のｉＲＮＡ二重鎖剤を提供する工程を含む方法を提供する。１つの実施の形態では、標的遺伝子は、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ-Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ-２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ-１遺伝子、β-カテニン遺伝子、ｃ-ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子の突然変異、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子の突然変異、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子の突然変異、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子の突然変異、ＲＡＳ遺伝子の突然変異、カベオリンＩ遺伝子の突然変異、ＭＩＢ Ｉ遺伝子の突然変異、ＭＴＡＩ遺伝子の突然変異、Ｍ６８遺伝子の突然変異、腫瘍抑制因子遺伝子の突然変異、およびｐ５３腫瘍抑制因子遺伝子の突然変異からなる群から選択される。
【０３７９】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例はさらに制限するものとみなされるべきではない。本明細書の全体を通じて引用された、参考文献、係属特許出願、および公開特許は全て、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
【実施例】
【０３８０】
実施例１．炭水化物複合体構成ブロック１１０および１１２の合成
【化７４】
2013541334.tif 000080
【０３８１】
１０１の調製：
ガラクトサミンペンタアセテート１００(５２．００ｇ、１３３．６３ミリモル)を、周囲温度でジクロロエタン（３００ｍＬ）中に採取した。そこに、ＴＭＳＯＴｆ（４４．５５ｇ、２００．４４ミリモル）を添加し、この混合物を５０℃で９０分間、水浴中で撹拌し、加熱を停止し、混合物を室温で一晩撹拌した。これを、氷冷した重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ入れ、ジクロロメタンで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物を高真空下で一晩乾燥させて、化合物を暗色の粘性物質（４４．５０ｇ、定量的）として得た。これを、さらに精製することなく、次の反応に使用した。1Ｈ ＮＭＲとＭＡＬＤＩで生成物の形成を確認した。ＭＳ：Ｃ14Ｈ19ＮＯ8の計算値３２９．１１；実測値３５２．１（Ｍ＋Ｎａ）。
【０３８２】
１０２の調製：
化合物１０１（４３．７０ｇ、１３３．５６ミリモル）とベンジルエステル（４１．７１ｇ、２００．３４ミリモル）をジクロロエタン（３００ｍＬ）に溶解させ、そこに分子ふるい（５０ｇ）を添加し、３０分間撹拌した。そこにＴＭＳＯＴｆ（１４．５０ｇ、６６．７８ミリモル）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。これを、氷冷した重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ入れ、ジクロロメタンで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー（勾配溶出：２０〜１００％の酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、所要の化合物を淡褐色の粘着性の液体（６０．５０ｇ、８６％）として得た。1Ｈ ＮＭＲ、13Ｃ ＮＭＲ ＭＳ：Ｃ26Ｈ35ＮＯ11の計算値５３７．２２；実測値５６０．２１（Ｍ＋Ｎａ）。
【０３８３】
１０３の調製：
化合物１０２（６０．００ｇ、１１１．６８ミリモル）を、メタノール／酢酸エチルの混合物に溶解させ、アルゴンで脱気した。Ｐｄ／Ｃ（６．００ｇ、１０質量％、Ｄｅｇｕｓｓａ、ウェットタイプ）を添加し、バルーン圧下で一晩水素化した。小型のセライトパッドに通して濾過し、メタノールで洗浄し、高真空下で一晩乾燥させて、生成物（４８．８５ｇ、９８％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ、13Ｃ ＮＭＲ ＭＳ：Ｃ19Ｈ29ＮＯ11の計算値４４７．１７；実測値４６９．９（Ｍ＋Ｎａ）。
【０３８４】
１０４の調製：
化合物１０１（４２．３０ｇ、１２８．４３ミリモル）とアジドエタノール（２６ｇ、１９２．４５ミリモル）をジクロロエタン（３００ｍＬ）に溶解させ、そこに分子ふるい（５０ｇ）を添加し、３０分間撹拌した。そこにＴＭＳＯＴｆ（１４．２９ｇ、６４．２１ミリモル）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。これを、氷冷した重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ入れ、ジクロロメタンで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー（勾配溶出：２０％〜１００％の酢酸エチル／ヘキサン、次いで５％〜１０％のメタノール／酢酸エチル）で精製して、所要の化合物を淡褐色の粘着性の液体（５９．２３ｇ、９１．００％）として得た。1Ｈ ＮＭＲ、13Ｃ ＮＭＲ ＭＳ：Ｃ20Ｈ32Ｎ4Ｏ11の計算値５０４．２１；実測値５２７．１（Ｍ＋Ｎａ）。
【０３８５】
１０５の調製：
化合物１０４（９．３３ｇ、１８．５０ミリモル）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解させ、そこにＰＰｈ3（５．９７ｇ、２２．２ミリモル）を添加し、混合物を４８時間撹拌した。出発材料が完全に消失したことをＴＬＣで確認した。水（１ｍＬ、５５ミリモル）を添加し、さらに２４時間撹拌した。ＴＦＡ（２．８５ｍＬ、２３．１２ミリモル）とトルエン（４０ｍＬ）を添加し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をトルエンと２回共蒸発させ（２×４０ｍＬ）、高真空下で乾燥させた。これを同日中に次の反応に使用した。ＭＳ：Ｃ20Ｈ34Ｎ2Ｏ11の計算値４７８．２２；実測値５００．８（Ｍ＋Ｎａ）。
【化７５】
2013541334.tif 000081
【０３８６】
１０７の調製：
化合物１０６（ＪＯＣ ２００２）（６．９４ｇ、１４．７３ミリモル）とモノｂｏｃプロピルアミン（１０．２６ｇ、５８．８９ミリモル）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させ、そこにＨＢＴＵ（１７．２６ｇ、４５．５０ミリモル）とＤＩＥＡ（１５．３６ｍＬ、８８．１４ミリモル）を添加し、一晩撹拌した。反応混合物を氷と水の混合物中に入れ、ジクロロメタンで抽出し、重炭酸ナトリウム溶液、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次いで２％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、生成物を白色の綿毛状の固体（１０．４９ｇ、７６％）として得た。ＭＳ：Ｃ45Ｈ77Ｎ7Ｏ14の計算値９３９．５５；実測値９４０．５３（Ｍ＋Ｈ）。
【０３８７】
１０８の調製：
化合物１０７（２．４０ｇ、２．５６ミリモル）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、そこにＴＦＡ／ＤＣＭの混合物（１：４、１０ｍＬ）を添加し、３０分間撹拌した。反応を質量スペクトルでモニタした。１００ｍＬのトルエンを添加し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をトルエンと２回共蒸発させ（２×１００ｍＬ）、高真空下で乾燥させて、化合物をそのＴＦＡ塩（白色の粘性物質、２．４７ｇ、９９％）として得た。これを、さらに精製することなく、次の反応に使用した。ＭＳ：Ｃ30Ｈ53Ｎ7Ｏ8の計算値６３９．４０；実測値６４０．４５（Ｍ＋Ｈ）。
【０３８８】
１０９の調製：
ＧａｌＮＡｃ酸１０３（４．００ｇ、８．９９ミリモル）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させ、そこにＨＢＴＵ（３．７５ｇ、９．８８ミリモル）、ＨＯＢｔ（１．３４ｇ、９．８８ミリモル）、およびＤＩＥＡ（５ｍＬ、３．２当量）を添加し、３〜４分間撹拌した。そこに１０８（２．４７ｇ、２．５０ミリモル）のＤＭＦ溶液を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、重炭酸ナトリウム溶液（５０ｍＬ）、水（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次いで勾配溶出５％〜１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、生成物１０９を白色の固体（４．２０ｇ、８７％）として得た。ＭＳ：Ｃ87Ｈ134Ｎ10Ｏ38の計算値１９２６．８９；実測値１９４９．５（Ｍ＋Ｎａ）。
【０３８９】
１１０の調製：
ＧａｌＮＡｃ誘導体１０９（７．５０ｇ、４．１８ミリモル）を、アルゴンで脱気したメタノール（５０ｍＬ）中に入れた。Ｐｄ／Ｃ（０．８００ｇ、１０質量％ Ｄｅｇｕｓｓａタイプ、ウェットタイプ）と数滴の酢酸を添加し、混合物をバルーン圧下で一晩水素化した。反応混合物を小型のセライトパッドに通して濾過し、メタノールで洗浄した。ＴＦＡ（０．４６５ｍＬ、５．２２ミリモル）を添加し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をトルエンと共蒸発させ（２回）、高真空下で一晩乾燥させて、化合物をＴＦＡ塩（淡黄色の固体、７．３０ｇ、９９％）として得た。ＭＳ：Ｃ79Ｈ128Ｎ10Ｏ36の計算値１７９２．８５；実測値１８１５．９（Ｍ＋Ｎａ）。
【化７６】
2013541334.tif 000082
【０３９０】
１１１の調製：
トリカルボン酸１０６（２．１７ｇ、４．６２５ミリモル）とアミン（１８．５０ミリモル、先の反応からの粗製物）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＴＢＴＵ（５．３４ｇ、１６．６３ミリモル）、ＨＯＢｔ（２．２４ｇ、１６．５９ミリモル）、およびＤＩＥＡ（５．６４ｍＬ、３２．３６ミリモル）を添加し、反応混合物を２４時間撹拌した。２４時間撹拌した後、追加量のＤＩＥＡ（４ｍＬ）を添加し、撹拌を続けた。４８時間後、溶媒を減圧下で除去し、残留物をジクロロメタンに溶解させ、１Ｍのリン酸溶液、重炭酸ナトリウム溶液、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次いで３％〜１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の化合物１１１を白色の固体（５．８０ｇ、６８％）として得た。ＭＳ：Ｃ81Ｈ125Ｎ7Ｏ41の計算値１８５１．７９；実測値１８７４．２０（Ｍ＋Ｎａ）。
【０３９１】
１１２の調製：
ＧａｌＮＡｃ誘導体１１１（５．７５ｇ、３．０９ミリモル）を、アルゴンで脱気したメタノール（１００ｍＬ）中に入れた。Ｐｄ／Ｃ（０．６００ｇ、１０質量％ Ｄｅｇｕｓｓａ、ウェットタイプ）と数滴の酢酸を添加し、混合物をバルーン圧下で３６時間水素化した。反応混合物を小型のセライトパッドに通して濾過し、メタノールで洗浄した。ＴＦＡ（０．３５４ｍＬ、１．２５当量）とトルエン（３０ｍＬ）を添加し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をトルエンと共蒸発させ（２回）、高真空下で一晩乾燥させて、化合物をＴＦＡ塩（５．７０ｇ、粗製物）として得た。ＭＳ：Ｃ81Ｈ125Ｎ7Ｏ41の計算値１７１７．７５；実測値１７４０．５（Ｍ＋Ｎａ）。
【０３９２】
実施例２．炭水化物複合体１１８の合成
【化７７】
2013541334.tif 000083
【０３９３】
１１５の調製：
ヒドロキシプロリンアミン（３．００ｇ、７．１５ミリモル）とドデカン二酸モノメチルエステル（１．７４８ｇ、７．１５ミリモル）をＤＭＦ（５０ｍＬ）中に一緒に入れた。そこにＨＢＴＵ（３．２５ｇ、８．５６ミリモル）とＤＩＥＡ（３．７ｍＬ、２１．２４ミリモル）を添加し、反応物を一晩撹拌した。反応混合物を氷水混合物中に注ぎ入れ、ＤＣＭで抽出した。重炭酸溶液、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー（５０％酢酸エチル／ヘキサン、酢酸エチル、次いで５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出）で精製して、所要の化合物１１５を白色の固体（４．３０ｇ、９３％）として得た。ＭＳ：Ｃ39Ｈ51ＮＯ7の計算値６４５．３７；実測値６４６．３５（Ｍ＋Ｈ）。
【０３９４】
１１６の調製：
化合物１１５（４．２５ｇ、６．５８ミリモル）をＴＨＦ／ＤＣＭ／水の混合物（５０ｍＬ、２：１：１）に溶解させた。ＬｉＯＨ（１．９０ｇ、４５．２ミリモル）を添加し、混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、酢酸を添加して、反応混合物を中和した。溶媒を除去し、残留物をＤＣＭで抽出した。このＤＣＭ溶液にＴＥＡ（過剰）を添加し、溶液を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、所要の生成物１１６をそのＴＥＡ塩（４．１５ｇ、８６％）として得た。ＭＳ：Ｃ38Ｈ49ＮＯ7の計算値６３１．３５；実測値６３０．３４（Ｍ−Ｈ）。
【０３９５】
１１７の調製：
化合物１１６（１．３０ｇ、２．０６ミリモル）とＨＢＴＵ（０．８２１ｇ、１．０５当量）をＤＭＦ（３０ｍＬ）中に一緒に採取した。そこにＤＩＥＡ（１．０７ｍｌ、３当量）を添加し、混合物を３〜４分間撹拌した。アミン１１０（３．００ｇ、１．５８ミリモル）の溶液、次いで１当量のＤＩＥＡを添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残留物をＤＣＭに溶解させ、重炭酸と水で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。残留物をクロマトグラフィー（まず酢酸エチル、次いで５％〜２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出）で精製して、生成物１１７を白色の固体（３．３５ｇ、８８％）として得た。ＭＳ：Ｃ117Ｈ175Ｎ11Ｏ42の計算値２４０６．１９；実測値２４２９．１０（Ｍ＋Ｎａ）。
【０３９６】
固体担体１１８の調製：
化合物１１７（３．３０ｇ、１．３７モル）、無水コハク酸（０．２７４ｇ、２当量）、およびＤＭＡＰ（０．５０１ｇ、３当量）をＤＣＭに溶解させ、一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、水と冷えた希釈クエン酸溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。残留物を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩を、そのＴＥＡ塩としてのオフホワイトの固体（３．８１ｇ）として得た。ＭＳ：Ｃ121Ｈ179Ｎ11Ｏ45の計算値２５０６．２１；実測値２５２９．２０（Ｍ＋Ｎａ）。コハク酸塩（２．２０ｇ、０．８７７ミリモル）とＨＢＴＵ（０．３３４ｇ、０．８７７ミリモル）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（０．４５７ｍＬ、２．６２ミリモル）を添加し、反応物を３〜４分間旋回させた。そこにポリスチレン担体（１２．３０ｇ）を添加し、混合物を２４時間振盪させた。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で２時間乾燥させた。これを２５％のＡｃ2Ｏ／Ｐｙ混合物で３０分間キャッピングした。同じ洗浄／乾燥手順を繰り返して、固体担体１１８（１３．１０ｇ、５０．５  モル／ｇの装填量）を得た。
【０３９７】
実施例３．炭水化物複合体１２２の合成
【化７８】
2013541334.tif 000084
【０３９８】
１１９の調製：
Ｚ−アミノカプロン酸（２．１９ｇ、８．２５ミリモル）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（３．１３ｇ、８．２５ミリモル）とＤＩＥＡ（７．１９ｍＬ、５．００当量）を添加し、混合物を数分間撹拌した。ＧａｌＮＡｃアミン１１２（１０．１０ｇ、５．５２ミリモル）を５０ｍＬのＤＭＦに溶解させ、前記混合物に添加し、４８時間撹拌した。生成物の形成についてＴＬＣとＭＡＬＤＩを確認した。溶媒を除去し、残留物をＤＣＭに溶解させ、ＮａＨＣＯ3溶液と水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。残留物をクロマトグラフィー（酢酸エチルによる溶出、次いで５％〜１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭの勾配溶出）で精製して、所要の化合物１１３をオフホワイトの固体（６．２０ｇ、５７％）として得た。ＭＳ：Ｃ87Ｈ136Ｎ8Ｏ42の計算値１９６４．８８；実測値１９８７．７５（Ｍ＋Ｎａ）。
【０３９９】
１２０の調製：
化合物１１９（６．１０ｇ、３．１０ミリモル）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解させ、そこに１ｍＬの酢酸を添加した。反応混合物を脱気し、そこにＰｄ／Ｃ（０．７００ｇ、１０質量％ Ｄｅｇｕｓｓａ、ウェットタイプ）を添加し、バルーン圧下で３６時間水素化した。反応混合物を小型のセライトパッドに通して濾過し、ＭｅＯＨで洗浄した。そこに１．２５当量のＴＦＡとトルエン（５０ｍＬ）を添加し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をトルエンと２回共蒸発させ、高真空下で一晩乾燥させて、所要の化合物をオフホワイトの固体（６．１０ｇ、定量的）として得た。この化合物を、さらに精製することなく、そのまま次の反応に使用した。ＭＳ：Ｃ79Ｈ130Ｎ8Ｏ40の計算値１８３０．８４；実測値１８５３．８１（Ｍ＋Ｎａ）。
【化７９】
2013541334.tif 000085
【０４００】
１２１の調製：
化合物１１６（５．０６ｇ、６．９０ミリモル）、ＧａｌＮＡｃアミン１１２（１０．５５ｇ、５．７５６ミリモル）、ＴＢＴＵ（２．４４ｇ、１．１当量）、およびＨＯＢｔ（１．０２５ｇ、１．１当量）をＤＭＦ（１００ｍＬ）中に一緒に採取した。そこにＤＩＥＡ（６ｍＬ、３４．５１ミリモル）を添加し、混合物を４８時間撹拌した。反応をＴＣＬとＭＡＬＤＩでモニタした。溶媒を減圧下で除去した。残留物をＤＣＭに溶解させ、重炭酸と水で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。残留物をクロマトグラフィー（まず酢酸エチル、次いで３％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出）で精製して、生成物１２１をオフホワイトの固体（１０．５０ｇ、７９％）として得た。ＭＳ：Ｃ111Ｈ166Ｎ8Ｏ45の計算値２３３１．０９；実測値 ２３５４．０３（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４０１】
１２２の調製：
化合物１２１（２．００ｇ、０．８５７ミリモル）、無水コハク酸（０．１８６ｇ、２当量）、ＤＭＡＰ（０．３１４ｇ、３当量）をＤＣＭ中に一緒に採取し、一晩撹拌する。溶媒を除去し、残渣を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩をそのＴＥＡ塩として得る。コハク酸塩（２．００ｇ、０．８５７ミリモル）とＨＢＴＵ（０．３２５ｇ、０．８５７ミリモル）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させる。そこにＤＩＥＡ（０．４５０ｍＬ、２．５７ミリモル）を添加し、反応物をを３〜４分間旋回させる。そこにポリスチレン担体（１０．００ｇ）を添加し、混合物を２４時間振盪させる。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄し、これを無水酢酸でキャッピングして、固体担体１２２を得る。
【０４０２】
実施例４．炭水化物複合体１２８の合成
【化８０】
2013541334.tif 000086
【０４０３】
１２５の調製：
アミン１２３（２．７５ｇ、４．６１ミリモル）とヘキサン二酸モノエチル（０．８８６ｇ、５．０９ミリモル）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（２．０９ｇ、５．５１ミリモル）とＤＩＥＡ（２．８８ｍＬ、１６．５３ミリモル）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物を氷水混合物中に注ぎ入れ、ＤＣＭで抽出し、重炭酸溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー（５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン、ＥｔＯＡｃ、次いで５％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出）で精製して、所要の生成物を綿毛状の白色の固体（２．２５ｇ、６５％）として得た。ＭＳ：Ｃ40Ｈ52Ｎ2Ｏ8Ｓ2の計算値７５２．３２；実測値７５３．３１（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４０４】
１２６の調製：
化合物１２５（２．２０ｇ、２．９７ミリモル）をＴＨＦ／水の混合物（２０ｍＬ、２：１）に溶解させた。ＬｉＯＨ（０．１８７ｇ、４．４５ミリモル）を添加し、混合物を４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニタし、４時間後に冷却し、クエン酸を添加して、反応混合物の反応を停止させた。溶媒を除去し、残留物をＤＣＭで抽出し、水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。残留物をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ、３％〜２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物１２６（０．７５０ｇ、３５％）をそのＴＥＡ塩として得た。ＭＳ：Ｃ38Ｈ48Ｎ2Ｏ8Ｓ2の計算値７２４．２９；実測値７２３．２８（Ｍ−Ｈ）。
【０４０５】
１２７の調製：
化合物１２６（１．００８ｇ、１．３９０ミリモル）、１１０（１．９０４ｇ、１．００７ミリモル）、およびＨＢＴＵ（０．４００ｇ、１．０５４ミリモル）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（０．５２５ｍＬ、３当量）を添加し、反応物を２日間撹拌した。反応混合物をＴＬＣとＭＡＬＤＩでモニタした。溶媒を除去し、残留物をＤＣＭに溶解させ、水と重炭酸溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。その後、これをクロマトグラフィー（まず酢酸エチル、次いで３％〜１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を綿毛状のオフホワイトの固体（１．９０ｇ、７６％）として得た。ＭＳ：Ｃ117Ｈ174Ｎ12Ｏ43Ｓ2の計算値２４９９．１２；実測値２５２２．１２（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４０６】
固体担体１２８の調製：
化合物１２７（２．００ｇ、０．８００ミリモル）、無水コハク酸（０．１６０ｇ、２当量）、ＤＭＡＰ（０．３００ｇ、３当量）をＤＣＭ中に一緒に採取し、一晩撹拌する。溶媒を除去し、残留物を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩をそのＴＥＡ塩として得る。化合物１２７（２．００ｇ、０．７６９ミリモル）とＨＢＴＵ（０．２９０ｇ、０．７６９ミリモル）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させる。そこにＤＩＥＡ（０．５００ｍＬ、３ミリモル）を添加し、反応物を３〜４分間旋回させる。そこにポリスチレン担体（１０．００ｇ）を添加し、混合物を２４時間振盪させる。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄し、これを無水酢酸でキャッピングして、固体担体１２８を得る。
【０４０７】
実施例５．炭水化物複合体１３６の合成
【化８１】
2013541334.tif 000087
【０４０８】
１３１の調製：
マンノーストリクロロアセトイミデート１２９（１５．００ｇ、２０．２４ミリモル）とアジドアルコール（４．２５ｇ、１．２当量）をトルエンに溶解させ、２回共沸させた。残留物を高真空下で一晩乾燥させた。そこに無水ジエチルエーテル（３０ｍＬ）と分子ふるい（１０ｇ）を添加した。反応混合物を氷水浴中で冷却した。そこにＴＭＳＯＴｆ（０．５ｍＬ、０．１当量）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。反応をＴＬＣでモニタし、ＴＥＡで反応停止させた。分子ふるいを濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をクロマトグラフィー（２０％〜５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を無色の液体（８．３６ｇ、５５％）として得た。ＭＳ：Ｃ40Ｈ39Ｎ3Ｏ12の計算値７５３．２５；実測値７７６．２３（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４０９】
１３２の調製：
化合物１３１（８．３０ｇ、１１．０１ミリモル）を無水ＴＨＦ（７０ｍＬ）に溶解させ、そこにＰＰｈ3（３．４６ｇ、１．２当量）を添加し、混合物を周囲温度で２日間撹拌した。そこに水（１ｍＬ）を添加し、混合物をさらに２４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニタした。そこにトリフルロ酢酸（１．０６ｍＬ、１．２５当量）とトルエン（５０ｍＬ）を添加した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をトルエンと２回共蒸発させ、高真空下で乾燥させた。これを、さらに精製することなく、そのまま次の反応に使用した。ＭＳ：Ｃ40Ｈ41ＮＯ12の計算値７２７．２６；実測値７５０．２３（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４１０】
１３３の調製：
トリカルボン酸（１１．０５ｇ、２３．４５ミリモル）とアミン（６８．１９ｇ、９４ミリモル、先の反応からの粗製物）をＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解させた。そこにＴＢＴＵ（２７．０９ｇ、８４ミリモル）、ＨＯＢｔ（１１．３４ｇ、８４ミリモル）、およびＤＩＥＡ（２８ｍＬ、１６０ミリモル）を添加し、反応混合物を２４時間撹拌した。２４時間撹拌した後、追加量のＤＩＥＡ（２８ｍＬ）を添加し、撹拌を続けた。４８時間後、溶媒を減圧下で除去し、残留物をジクロロメタンに溶解させ、１Ｍのリン酸溶液、重炭酸ナトリウム溶液、および水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次いで３％〜１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の化合物１３３を白色の固体（４１．９５ｇ、６７％）として得た。ＭＳ：Ｃ141Ｈ146Ｎ4Ｏ44の計算値２５９８．９３；実測値２６２１．８９（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４１１】
１３４の調製：
化合物１３３（３．０５ｇ、１．１７６ミリモル）をＤＣＭ／ＭｅＯＨの混合物に溶解させた。そこに５０当量のギ酸アンモニウム、次いでの５％のＰｄ／Ｃ（１．５ｇ、５０質量％）を添加し、周囲温度で８時間撹拌した。これを小型のセライトパッドに通して濾過し、ＭｅＯＨ／ＤＣＭで洗浄し、溶媒を除去し、残留物を高真空下で一晩乾燥させて、化合物を白色の固体（２．６５ｇ、９２％）として得た。ＭＳ：Ｃ133Ｈ140Ｎ4Ｏ42の計算値２４６４．８９；実測値２４８７．９２（Ｍ＋Ｎａ）。
【化８２】
2013541334.tif 000088
【０４１２】
１３５の調製：
マンノースアミン（２．０７６ｇ、０．８４２ミリモル）、１１６（０．７４０ｇ、１．００ミリモル）、およびＴＢＴＵ（０．０．３５３ｇ、１．１当量）、およびＨＯＢｔ（０．１４９ｇ、１．１当量）をＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（０．０．８６９ｍＬ、５当量）を添加し、反応物を２日間撹拌した。反応混合物をＴＬＣとＭＡＬＤＩでモニタした。溶媒を除去し、残留物をＤＣＭに溶解させ、水と重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。その後、これをクロマトグラフィー（まず酢酸エチル、次いで２％〜４％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を綿毛状のオフホワイトの固体（１．４８ｇ、５７％）．ＭＳ：Ｃ71Ｈ187Ｎ5Ｏ48の計算値３０７８．２３；実測値３１０１．２５（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４１３】
固体担体１３６の調製：
化合物１１７（２．１０ｇ、０．６８１ミリモル）、無水コハク酸（０．１３６ｇ、２当量）、およびＤＭＡＰ（０．２４９ｇ、３当量）をＤＣＭに溶解させ、一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、水と冷えた希釈クエン酸溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。残留物を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩を、そのＴＥＡ塩としてのオフホワイトの固体（１．５６ｇ）として得た。ＭＳ：Ｃ175Ｈ191Ｎ5Ｏ51の計算値２５０６．２１；３１７８．２５；実測値３２０１．２０（Ｍ＋Ｎａ）。コハク酸塩（１．００ｇ、０．３０５ミリモル）とＨＢＴＵ（０．１３８ｇ、１．２当量）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（０．５０ｍＬ、過剰）を添加し、反応物を３〜４分間旋回させた。そこにポリスチレン担体（６．０５ｇ）を添加し、混合物を２４時間振盪させた。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で２時間乾燥させた。これを２５％のＡｃ2Ｏ／Ｐｙ混合物で３０分間キャッピングした。同じ洗浄／乾燥手順を繰り返して、固体担体１３６（６．７０ｇ、４２マイクロモル／ｇ装填量）を得た。
【０４１４】
実施例６．炭水化物複合体１４３の合成
【化８３】
2013541334.tif 000089
【０４１５】
１３８の調製：
マンノーストリクロロアセトイミデート１２９（１５．２３ｇ、２０．５５ミリモル）と１３７（４．３６ｇ、１．０２当量）をトルエンに溶解させ、２回共沸させた。残留物を高真空下で一晩乾燥させた。そこに無水ジエチルエーテル（３０ｍＬ）と分子ふるい（１０ｇ）を添加した。反応混合物を氷水浴中で冷却した。そこにＴＭＳＯＴｆ（０．５ｍＬ、０．１当量）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。反応をＴＬＣでモニタし、ＴＥＡで反応停止させた。分子ふるいを濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をクロマトグラフィー（ヘキサン、１５％〜２５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を無色の液体（１４．５２ｇ、９０％）として得た。ＭＳ：Ｃ46Ｈ42Ｏ12の計算値７８６．２７；実測値８０９．２５（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４１６】
１３９の調製：
マンノースベンジルエステル（１４．３０ｇ、１８．１７ミリモル）を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解させ、そこに２滴の酢酸を添加した。脱気し、Ｐｄ／Ｃ（１．５０ｇ、１０質量％ Ｄｅｇｕｓｓａ  ウェットタイプ）を添加し、バルーン圧下で２４時間水素化した。反応をＴＬＣとＭＡＬＤＩでモニタした。これを小型のセライトパッドに通して濾過し、酢酸エチルで洗浄した。溶媒を除去し、残留物を高真空下で乾燥させて、化合物を無色のオイル（１１．２０ｇ、９０％）として得た。ＭＳ：Ｃ39Ｈ36Ｏ12の計算値６９６．２２；実測値７１９．１８（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４１７】
１４１の調製：
ヒドロキシプロリンアミン１４０（３．８２ｇ、７．１８ミリモル）、１４１（５．００ｇ、７．１８ミリモル）、およびＨＢＴＵ（２．６５ｇ、７．１８ミリモル）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（３．６５ｍＬ、５当量）を添加し、反応物を３時間撹拌した。反応混合物をＴＬＣでモニタした。溶媒を除去し、残留物をＤＣＭに溶解させ、水と重炭酸溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。その後、これをクロマトグラフィー（まず、酢酸エチル、次いで５％〜１０％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）で精製して、所要の生成物を白色の固体（４．０８ｇ、４６％）として得た。ＭＳ：Ｃ71Ｈ74Ｎ2Ｏ16の計算値１２１０．５０；実測値１２３３．４０（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４１８】
固体担体１４３の調製：
化合物１４１（２．００ｇ、１．６５２ミリモル）、無水コハク酸（０．３３０ｇ、２当量）、ＤＭＡＰ（０．６０４ｇ、３当量）をＤＣＭ中に一緒に採取し、一晩撹拌する。溶媒を除去し、残留物を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩をそのＴＥＡ塩１４２として得る。コハク酸塩（２．００ｇ、１．５２６ミリモル）とＨＢＴＵ（０．５７８ｇ、１．５２６ミリモル）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させる。そこにＤＩＥＡ（１．３２ｍＬ、５当量）を添加し、反応物を３〜４分間旋回させる。そこにポリスチレン担体（１０．００ｇ）を添加し、混合物を２４時間振盪させる。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄し、これを無水酢酸でキャッピングして、固体担体１４３を得る。
【０４１９】
実施例７．炭水化物複合体１５２の合成
【化８４】
2013541334.tif 000090
【０４２０】
１４６の調製：
化合物１４４（２６．５５ｇ、６４．０６ミリモル）と１４５（１０．００ｇ、５３．４３ミリモル）をＤＭＦ（１５０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（２４．１２ｇ、６４ミリモル）とＤＩＥＡ（４６ｍＬ、５当量）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、混合物を氷冷水に添加し、エーテルと酢酸エチルの混合物で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（２０％〜５０％の酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体（２３．２０ｇ、７４％）として得た。ＭＳ．Ｃ32Ｈ45Ｎ3Ｏ7のＭＷ計算値：５８３．７２、実測値５８４．７３（Ｍ＋Ｈ）。
【０４２１】
１４７の調製：
化合物１４６（３．３０ｇ、５．６５ミリモル）を酢酸エチル／ＭｅＯＨの混合物に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（５００ｍｇ）を触媒として用いて、バルーン圧下で一晩水素化した。小型のセライトパッドに通して濾過し、溶媒を除去し、この生成物を、さらに精製することなく、次の反応に使用した。ＭＳ．Ｃ16Ｈ33Ｎ3Ｏ3のＭＷ計算値：３１５．２５、実測値３１６．２６（Ｍ＋Ｈ）。
【０４２２】
１４８の調製：
化合物１４７（５．６５ミリモル）とＧａｌＮＡｃ酸１０３（５．８１ｇ、１２．９９ミリモル）をＤＭＦ（８０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（４．９７ｇ、１３．１０ミリモル）とＤＩＥＡ（７．００ｍＬ，３当量）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。溶媒を除去し、残留物をＤＣＭに溶解させ、水とブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ、次いで３％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体（５．２５ｇ、７９％）として得た。ＭＳ．Ｃ54Ｈ87Ｎ5Ｏ23のＭＷ計算値：１１７３．５８、実測値１１９６．６０（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４２３】
１４９の調製：
二分岐のＧａｌＮＡｃ誘導体１４８（５．１５ｇ、４．４０ミリモル）を１５ｍＬの無水ＤＣＭに溶解させ、そこに３ｍＬのアニソールと３０ｍＬのＴＦＡを添加し、この反応混合物を周囲温度で２時間撹拌した。ＴＬＣで確認し、反応混合物にトルエンを添加し、溶媒を減圧下で除去した。トルエンと２回共蒸発させ、残留物をＤＣＭに溶解させ、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗生成物を濾過カラム（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を薄茶色の固体（４．４０ｇ、９１％）として得た。ＭＳ．Ｃ50Ｈ79Ｎ5Ｏ23のＭＷ計算値：１１１７．５２、実測値１１４０．６２（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４２４】
１５０の調製：
二分岐のＧａｌＮＡｃ酸１４９（４．３０ｇ、３．８４ミリモル）とヒドロキシプロリンアミン１５３（２．２５ｇ、１．１当量）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（１．４６ｇ、３．８４ミリモル）とＤＩＥＡ（３．３ｍＬ）を添加し、反応混合物を３時間撹拌した。溶媒を除去し、残留物をＤＣＭに溶解させ、水と重炭酸で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（３％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を白色の固体（３．２５ｇ、５２％）として得た。ＭＳ．Ｃ82Ｈ117Ｎ7Ｏ27のＭＷ計算値：１６３１．８０、実測値１６５４．４５（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４２５】
１５１の調製：
化合物１５０（３．３０ｇ、２．０２ミリモル）、無水コハク酸（０．４０４ｇ、２当量）、ＤＭＡＰ（０．７４０ｇ、３当量）をＤＣＭ（３０ｍＬ）中に一緒に採取し、一晩撹拌する。溶媒を除去し、残留物を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩をそのＴＥＡ塩１５１として得る。ＭＳ．Ｃ86Ｈ121Ｎ7Ｏ30のＭＷ計算値：１７３１．８２、実測値１７５３．８７（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４２６】
固体担体１５２の調製：
コハク酸塩１５１（２．０２ミリモル）とＨＢＴＵ（０．８４２ｇ、１．１当量）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（１．５０ｍＬ、過剰）を添加し、反応物を３〜４分間旋回させた。そこにポリスチレン担体（２８ｇ）を添加し、混合物を一晩振盪させた。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で２時間乾燥させた。これを２５％のＡｃ2Ｏ／Ｐｙ混合物で３０分間キャッピングした。同じ洗浄／乾燥手順を繰り返して固体担体１５２（３０．１０ｇ、３０マイクロモル／ｇ装填量）を得た。
【０４２７】
実施例８．炭水化物複合体１６１の合成
【化８５】
2013541334.tif 000091
【０４２８】
１５５の調製：
ヒドロキシプロリンアミン１５３（１０．００ｇ、１８．７６ミリモル）と１５４（４．９８ｇ、１８．７６ミリモル）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（７．８３ｇ、２０．６４ミリモル）とＤＩＥＡ（９．８１ｍＬ、５６．２９ミリモル）を添加し、反応物を２時間撹拌した。ＴＬＣで確認し、混合物を氷冷水に添加し、エーテルと酢酸エチルの混合物で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（０％〜１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体（１３．２０ｇ、９０％）として得た。ＭＳ．Ｃ46Ｈ57Ｎ3Ｏ8のＭＷ計算値：７７９．４１、実測値７８０．４２（Ｍ＋Ｈ）。
【０４２９】
１５６の調製：
化合物１５５（１３．００ｇ、１６．６６ミリモル）を酢酸エチル／ＭｅＯＨの混合物に溶解させ、少量のトリエチルアミンの存在下、Ｐｄ／Ｃ（１．５０ｇ）を触媒として用いて、バルーン圧下で一晩水素化した。小型のセライトパッドに通して濾過し、溶媒を除去し、この生成物を、さらに精製することなく、次の反応に使用した（９．９３ｇ、９２％）。ＭＳ．Ｃ38Ｈ51Ｎ3Ｏ6のＭＷ計算値：６４５．３８、実測値６４６．４０（Ｍ＋Ｈ）。
【０４３０】
１５７の調製：
化合物１５６（９．９０ｇ、１５．３３ミリモル）とジＣｂｚリシン（６．３６ｇ、１５．３３ミリモル）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（６．１１ｇ、１５．３３ミリモル）とＤＩＥＡ（８ｍＬ、過剰）を添加し、反応物を２時間撹拌した。ＴＬＣで確認し、混合物を氷冷水に添加し、エーテルと酢酸エチルの混合物で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（０％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体（１３．１０ｇ、８３％）として得た。ＭＳ．Ｃ60Ｈ75Ｎ5Ｏ11のＭＷ計算値：１０４１．５５、実測値１０４２．５７（Ｍ＋Ｈ）。
【０４３１】
１５８の調製：
化合物１５７（１２．９０ｇ、１２．３７ミリモル）を酢酸エチル／ＭｅＯＨの混合物に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１．３０ｇ）を触媒として用いて、バルーン圧下で水素化した。３時間後にＴＬＣで確認し、小型のセライトパッドに通して濾過し、溶媒を除去し、この生成物を、さらに精製することなく、次の反応に使用した。ＭＳ．Ｃ44Ｈ63Ｎ5Ｏ7のＭＷ計算値：７７３．４７、実測値７７４．５０（Ｍ＋Ｈ）。
【０４３２】
１６０の調製：
化合物１５８（２．３２ｇ、３ミリモル）とグルコース酸１５９（４．５０ｇ６．４５ミリモル）をＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（２．４４ｇ、６．４５ミリモル）とＤＩＥＡ（３．３６ｍＬ、３当量）を添加し、反応物を２時間撹拌し、反応混合物を氷冷水中に入れ、ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ、次いで０％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体（５．４０ｇ、８５％）として得た。ＭＳ．Ｃ122Ｈ131Ｎ5Ｏ29のＭＷ計算値：２１２９．８９、実測値２１５２．９０（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４３３】
固体担体１６１の調製：
化合物１６０（５．２０ｇ、２．４４ミリモル）、無水コハク酸（０．４８８ｇ、２当量）、およびＤＭＡＰ（０．８９４ｇ、３当量）をＤＣＭに溶解させ、一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、水と冷えた希釈クエン酸溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。残留物を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩を、そのＴＥＡ塩としてのオフホワイトの固体として得た。ＭＳ：Ｃ126Ｈ135Ｎ5Ｏ32のＭＷ計算値：２２２９．９１、実測値２２５２．５０（Ｍ＋Ｎａ）。コハク酸塩（２．４４ミリモル）とＨＢＴＵ（０．９２５ｇ、１．２当量）をＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（１．２７ｍＬ、過剰）を添加し、反応物を３〜４分間旋回させた。そこにポリスチレン担体（２４ｇ）を添加し、混合物を２４時間振盪させた。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で２時間乾燥させた。これを２５％のＡｃ2Ｏ／Ｐｙ混合物で３０分間キャッピングした。同じ洗浄／乾燥手順を繰り返して、固体担体１６１（２７ｇ、３１マイクロモル／ｇ装填量）を得た。
【０４３４】
実施例９．炭水化物複合体１６５および１６６の合成
【化８６】
2013541334.tif 000092
【０４３５】
１６３の調製：
化合物１５８（５．４０ｇ、６．９７ミリモル）とマンノース酸１３９（９．９６ｇ １４．３０ミリモル）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（５．４２ｇ、１４．３０ミリモル）とＤＩＥＡ（７．４５ｍＬ、過剰）を添加し、反応物を２時間撹拌し、反応混合物を氷冷水に注ぎ、ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ、次いで２％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体（９．２０ｇ、６２％）として得た。ＭＳ．Ｃ122Ｈ131Ｎ5Ｏ29のＭＷ計算値：２１２９．８９、実測値２１５２．６５（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４３６】
固体担体１６５の調製：
化合物１６３（３．２０ｇ、１．４０８ミリモル）、無水コハク酸（０．２８３５ｇ、２当量）、およびＤＭＡＰ（０．５１６ｇ、３当量）をＤＣＭに溶解させ、一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、水と冷えた希釈クエン酸溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。残留物を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩を、そのＴＥＡ塩としてのオフホワイトの固体として得た。ＭＳ：Ｃ126Ｈ135Ｎ5Ｏ32のＭＷ計算値：２２２９．９１、実測値２２５２．９０（Ｍ＋Ｎａ）。コハク酸塩（１．４０８ミリモル）とＨＢＴＵ（０．６４０ｇ、１．２当量）をＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（１．２２ｍＬ、過剰）を添加し、反応物を３〜４分間旋回させた。そこにポリスチレン担体（２０ｇ）を添加し、混合物を２４時間振盪させた。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で２時間乾燥させた。これを２５％のＡｃ2Ｏ／Ｐｙ混合物で３０分間キャッピングした。同じ洗浄／乾燥手順を繰り返して、固体担体１６１（２３．２ｇ、５４．７マイクロモル／ｇ装填量）を得た。
【０４３７】
１６６の調製：
化合物１６３（４．０１ｇ、１．８８ミリモル）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解させ、ＤＩＥＡ（０．６５ｍＬ、３．７５ミリモル）を添加した。この混合物にアミダイト試薬（０．６２９ｍＬ、２．８２２ミリモル）を添加し、反応混合物を１５分間撹拌した。ＴＬＣで確認し、反応混合物を分液漏斗に移し、水と重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。粗生成物をクロマトグラフィー（３０％〜８０％のアセトン／ＤＣＭ）で精製して、生成物（４．２０ｇ、９６％）を得た。31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ＝１４８．１９、１４７．７９、１４７．３３。ＭＳ．Ｃ131Ｈ148Ｎ7Ｏ30ＰのＭＷ計算値：２３３０．００、実測値２３５３．２０（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４３８】
実施例１０．炭水化物複合体構成ブロックの合成
１７１、１７２、１７３、および１７４の合成：
構成ブロック１７１と１７２は、１０３の合成手順と同様の手順を用いて合成する。構成ブロック１７３と１７４は、１０５の合成手順と同様の手順を用いて合成する。
【化８７】
2013541334.tif 000093
【０４３９】
１８０の合成：
構成ブロック１８０は、１１０の合成手順と同様の手順を用いて合成する。
【化８８】
2013541334.tif 000094
【０４４０】
構成ブロック１８８の合成：
【化８９】
2013541334.tif 000095
【０４４１】
実施例１１．炭水化物複合体の合成
【化９０】
2013541334.tif 000096
【０４４２】
構成ブロック１８０をアミン１８３、１８５および１８８と結合させて、それぞれ、炭水化物複合体１８９、１９０および１９１を提供する。
【化９１】
2013541334.tif 000097
【０４４３】
２０１の調製：
マンノース（１０．００ｇ、５５．５３ミリモル）とデシノール（１００ｇ、溶媒）とＣＳＡ（５００ｍｇ）を１１０℃で、油浴で一晩撹拌した。デシノールの色は一晩で濃い茶色になった。デシノールの大部分を減圧下で完全蒸留した。残留物をＤＣＭに溶解させ、ＴＥＡで中和した。この溶液を水で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物を小型のシリカゲルパッドによる濾過（初めに酢酸エチル、次に１０％〜１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、生成物（７．５２ｇ、４２％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ ＭＨｚ）δ＝５．９０〜５．７５（ｍ，１Ｈ），５．０２〜４．８５（ｍ，２Ｈ），４．００〜３．３０（ｍ，７Ｈ），２．１０〜１．９４（ｍ，２Ｈ），１．６０〜１．４９（ｍ，２Ｈ），１．４１〜１．２０（ｍ，１２Ｈ）。
【０４４４】
２０３の調製：
化合物２０１（０．１７２ｇ、０．５４１ミリモル）をアルゴン雰囲気下で無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。そこにＭＳを添加し、反応物を氷浴中で冷却した。ＢＦ3・Ｅｔ2Ｏ（１０μｌ）を反応混合物に撹拌しながら転化した。ガラクトーストリクロロアセトイミデート２０２（１．００ｇ．１．３５ミリモル）を１５分かけて滴下して添加した。反応をＴＬＣでモニタし、アクセプターがなくなった時点で、反応物をＴＥＡで反応停止させ、ＤＣＭで希釈し、ＭＳを濾過で除去し、乾燥させた。残留物をクロマトグラフィー（勾配溶出１０％〜４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を白色の綿毛状の固体（０．５５０ｇ、６９％）として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ＝７．９５〜７．２０（ｍ，４０Ｈ），５．９０〜５．５０（ｍ，７Ｈ），５．３５（ｄ，Ｊ＝８．０５Ｈｚ，１Ｈ），５．１７（ｄ，Ｊ＝８．０６Ｈｚ，１Ｈ），４．９８〜４．８１（ｍ，３Ｈ），４．６５〜４．０９（ｍ，９Ｈ），３．８１〜３．４２（ｍ，５Ｈ），３．２０（ｂｓ，１Ｈ），２．７９（ｂｓ，１Ｈ），２．０１〜１．８８（ｍ，２Ｈ），１．３０〜０．９２（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１００ＭＨｚ）δ＝１６６．２８，１６６．２０，１６５．８８，１６５．７６，１６５．６６，１６５．６４，１６５．４０，１３９．３４，１３４．０４，１３３．８２，１３３．７１，１３３．６６，１３３．４２，１３３．３０，１３０．２１，１２９．９９，１２９．８６，１２９．７０，１２９．５９，１２９．２８，１２９．０３，１２９．００，１２８．９４，１２８．７７，１２８．７３，１２８．６３，１２８．６１，１２８．５４，１２８．４７，１２８．４４，１１４．３７，１０２．７４，１０２．６８，９８．８１，８５．２７，７２．４３，７１．９６，７１．３７，７１．３１，７１．０１，７０．３０，７０．２６，７０．０５，６８．３１，６８．２３，６７．４１，６６．１１，６２．６３，６２．０８，３３．９６，２９．６５，２９．５８，２９．５３，２９．５８，２９．０８，２６．２０。ＭＳ．Ｃ84Ｈ82Ｏ24について計算された分子量、計算値１４７４．５２、実測値１４９７．６０（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４４５】
２０４の調製：
化合物２０３（０．１０４ｇ、０．０７ミリモル）をＤＣＭ／Ｐｙ（１０ｍＬ、１：１）とＡｃ2Ｏ（０．５ｍＬ、過剰）とＤＭＡＰ（０．０５０ｇ）の混合物に溶解させ、反応物を一晩撹拌した。反応物をＭｅＯＨで反応停止し、溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー（勾配溶出１０％〜３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を白色の綿毛状の固体（０．１０８ｇ、９９％）として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ＝８．１０〜７．２０（ｍ，４０Ｈ），５．９９（ｄｄ，Ｊ＝３．１，７．８Ｈｚ，２Ｈ），５．８８〜５．７５（ｍ，２Ｈ），５．７０（ｄｄ，Ｊ＝７．８２，１０．４３Ｈｚ，１Ｈ），５．６５〜５．４７（ｍ，２Ｈ），５．１０〜４．０７（ｍ，１３Ｈ），３．９０〜３．８０（ｍ，１Ｈ），３．６９〜３．６１（ｍ，１Ｈ），３．３６〜３．２８（ｍ，１Ｈ），２．９８〜２．８１（ｍ，１Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），２．１０〜２．０１（ｍ，４Ｈ），１．３５（ｓ，３Ｈ），１．４２〜１．２０（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１００ＭＨｚ）δ＝１７０．１２，１７０．０８，１６６．１６，１６５．６７，１６５．６４，１６５．４８，１６５．４６，１６４．７８，１３９．２９，１３３．８０，１３３．７０，１３３．７０，１３３．５４，１３３．４４，１３３．４１，１３３．３５，１３０．１３，１３０．０２，１２９．９２，１２９．６９，１２９．５８，１２９．４９，１２９．４０，１２９．１５，１２９．１０，１２８．８８，１２８．８３，１２８．７９，１２８．７３，１２８．６６，１２８．４７，１２８．４０，１１４．３５，１０２．３２，９９．５８，９６．６４，７４．５１，７２．１１，７１．９１，７１．４６，７１．２１，６９．７８，６９．７２，６９．５１，６９．２８，６８．１９，６８．０３，６７．８２，６７．１２，６１．９７，６１．８３，３３．９４，２９．６３，２９．６１，２９．５５，２９．４９，２９．２７，２９．２０，２９．０５，２６．１１，２１．０６，２０．０２。ＭＳ：Ｃ88Ｈ86Ｏ26について計算された分子量、計算値１５５８．５４、実測値１５８１．８（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４４６】
２０５の調製：
化合物２０５（１．３６ｇ、０．８７３ミリモル）をジオキサン：水の混合物（４０ｍＬ、３：１）に溶解させた。反応混合物に、ルチジン（０．２０３ｍＬ、２当量）、次いでＯｓＯ4溶液（１ｍＬ。０．０５Ｍのｔブタノール溶液）を添加した。過ヨウ素酸ナトリウム（０．７７４ｇ、４当量）を添加し、室温で４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニタし、出発材料が消費された時点で、混合物を水で希釈し、ＤＣＭ（３回）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を全て除去し、残留物を次の反応に直接使用した。上記の反応からの残留物をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させ、そこにオキソン（０．５９０ｇ、１．０５当量）を添加し、周囲温度で３時間撹拌した。出発材料が消費された時点で、２ｍＬの１ＭのＨＣｌを添加し、酢酸エチルで希釈した。水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー（勾配抽出０％〜４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を白色の固体（１．０８ｇ、７９％）として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、４００ＭＨｚ）δ＝１１．９６（ｓ，１Ｈ），８．００〜７．２３（ｍ，４０Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝３．４１Ｈｚ，１Ｈ），５．８２（ｄ，Ｊ＝３．１７Ｈｚ，１Ｈ），５．７９〜５．６３（ｍ，２Ｈ），５．５６（ｄｄ，Ｊ＝８．００，１０．０１Ｈｚ，１Ｈ），５．４１（ｄｄ，Ｊ＝８．００，１０．０１Ｈｚ，１Ｈ），５．２５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），５．１５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．９０〜４．３５（ｍ，７Ｈ），４．１０〜３．５５（ｍ，４Ｈ），３．３０〜３．２０（ｍ，１Ｈ），２．９６〜２．８７（ｍ，１Ｈ），２．１８〜２．１０（ｍ，２Ｈ），１．９６（ｓ，３Ｈ），２．０１〜１．９５（ｍ，１Ｈ），１．５１〜１．３９（ｍ，２Ｈ），１．２７（ｓ，３Ｈ），１．２０〜１．０１（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１００ＭＨｚ）δ＝１７８．６８，１７８．４８，１７０．２６，１７０．１６，１６６．２５，１６５．７８，１６５．７３，１６５．７０，１６５．５４，１６５．５３，１６４．８３，１３３．８５，１３３．７５，１３３．６０，１３３．４９，１３０．１８，１３０．０８，１２８．８５，１２９．６１，１２９．５２，１２９．４４，１２９．２０，１２９．１３，１２８．９１，１２８．８９，１２８．８１．１２８．７８，１２８．７１，１２８．５１，１２８．４５，１０２．３４，９９．６７，９６．６５，７４．６０，７２．１７，７１．９４，７１．４９，７１．２１，６９．８２，６９．７９，６９．５９，６９．３７，６８．２２，６８．１１，６７．８１，６７．２０，６４．５５，６１．９９，６１．８５，６０．５９，４４．０６，３３．９６，３０．７９，２９．３９，２９．３１，２９．２４，２９．２０，２９．１７，２９．０８，２６．０８，２４．８５，２４．７９，２２．２０，２１．２４，２１．１１，２０．０７。ＭＳ：Ｃ87Ｈ84Ｏ28について計算された分子量、計算値１５７６．５１、実測値１５９９．５０（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４４７】
２０６の調製：
化合物２０５（０．８５０ｇ、０．５３９ミリモル）、ヒドロキシプロリンアミン（０．３００ｇ、０．５６３ミリモル）、およびＨＢＴＵ（０．２６５ｇ、０．６９８ミリモル）をアルゴン雰囲気下でＤＭＦに溶解させた。そこにＤＩＥＡ（０．２８１ｍＬ、３当量）を添加し、周囲温度で３時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニタし、出発材料が消費された時点で、混合物を氷水混合物中に注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出し、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー（まず酢酸エチル、次いで勾配溶出３％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、生成物を淡黄色の固体（１．０９ｇ、９６％）として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ＝８．００〜７．１０（ｍ，５３Ｈ），６．９０〜６．８０（ｍ，４Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝３．４１Ｈｚ，１Ｈ），５．８２（ｄ，Ｊ＝３．１７Ｈｚ，１Ｈ），５．７９〜５．６３（ｍ，２Ｈ），５．５６（ｄｄ，Ｊ＝８．００，１０．０１Ｈｚ，１Ｈ），５．４１（ｄｄ，Ｊ＝８．００，１０．０１Ｈｚ，１Ｈ），５．２５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），５．１５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．９７（ｄ，Ｊ＝４．１５Ｈｚ，１Ｈ），４．９０〜４．８０（ｍ，３Ｈ），４．７０〜４．３０（ｍ，７Ｈ），４．２０〜４．００（ｍ，２Ｈ），３．９５〜３．８５（ｍ，２Ｈ），３．７０（ｓ，６Ｈ），３．６９〜３．５０（ｍ，１Ｈ），３．３０〜３．２０（ｍ，２Ｈ），２．９６〜２．８７（ｍ，１Ｈ），２．１８〜２．１０（ｍ，２Ｈ），１．９６（ｓ，３Ｈ），２．０１〜１．９５（ｍ，１Ｈ），１．５１〜１．３９（ｍ，２Ｈ），１．２７（ｓ，３Ｈ），１．２０〜１．０１（ｍ，２０Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ＝１７１．８７，１７０．８５，１６９．４６，１６９．０４，１６５．２５，１６５．２１，１６５．０９，１６４．９５，１６４．４８，１６４．５３，１６２．２９，１５８．０９，１５７．９７，１４５．０８，１３５．８７，１３５．７３，１３４．０４，１３３．７４，１３３．５６，１２９．６０，１２９．１８，１２９．０６，１２８．９１，１２８．８４，１２８．８１，１２８．７５，１２８．６７，１２８．６３，１２８．５２，１２８．４１，１２７．７７，１２７．５８，１１３．１９，１１３．０９，１０２．３０，９９．６０，９６．６０，８５．１０，７５．６８，７１．４８，７０．０２，６９．８１，６８．９９，６８．５８，６６．５５，６１．８６，６＝５４．９６，４５．７４，３８．２７，３６．３２，３５．７６，３５．４６，３４．１５，３０．７４，２８．６９，２６．２０，２５．３４，２６．２０，２５．３４，２４．１５，２０．４８，１９．５４。ＭＳ：Ｃ119Ｈ122Ｎ2Ｏ32について計算された分子量、計算値２０９０．８０、実測値２０１３．９０（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４４８】
長いアルキル鎖ＣＰＧ２０７の調製：
ヒドロキシ誘導体２０６（０．５５０ｇ、０．２６３ミリモル）をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させ、そこに無水コハク酸（０．０７８ｇ、３当量）とＤＭＡＰ（０．１２８ｇ、４当量）を添加し、一晩撹拌した。ＴＬＣによって反応が完了したことが示された。反応混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、冷えた希釈クエン酸溶液と水で連続的に洗浄し（２回）、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、高真空下で乾燥させて、コハク酸塩を得た。ＰＰｈ3（０．９０ｇ、１．３当量）、ＤＭＡＰ（０．０４８ｇ、１．５当量）、および前工程からのコハク酸塩を、アセトニトリルとＤＣＭの混合物（６ｍＬ）に溶解させた。上記の溶液にＤＴＮＰ（０．０８６ｇ、１．０５当量）のＤＣＭ（１ｍＬ）溶液を添加した。混合物を３〜４分間ゆっくりと振盪させた。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ｌｃａａ ＣＰＧ、１．４０ｇ、１３３マイクロモル／ｇ）を混合物に添加し、２時間穏やかに振盪させた。ＣＰＧを濾過し、濾液が無色の状態である間、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１：９）の混合物、およびＤＣＭで連続的に洗浄し、乾燥させた。乾燥したＣＰＧを別のフラスコに移し、穏やかに振盪させながら、ＴＥＡ（１ｍＬ）の存在下、ピリジン（２５％）中のＡｃ2Ｏで１５分間処理した。最後に、ＣＰＧを濾過し、ＤＣＭ、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９：１）、次いでＤＣＭ、およびエーテルで洗浄した。ＣＰＧ２０７を真空下で一晩乾燥させ、報告されている通りに装填量を測定した（１．４８ｇ、装填量３６マイクロモル／ｇ）。
【化９２】
2013541334.tif 000098
【０４４９】
化合物２１７は、報告されている手順に従って合成した（Martin, C.; Karen, P.; Laurence, V. Chem. Pharm. Bull. 2004, 52, 965-971.）。
【０４５０】
２１８の調製：
１−デシノール（０．３００ｇ、１．９２ミリモル）とトリクロロアセトイミデート２１７（２．３３ｇ、１．２当量）をアルゴン雰囲気下で無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。そこにＭＳを添加し、反応物を氷浴で冷却した。ＢＦ3・Ｅｔ2Ｏ（３０μｌ）を反応混合物に撹拌しながら添加した。反応をＴＬＣでモニタし、受容体が反応し終わったら、反応物をＴＥＡで反応停止させ、ＤＣＭで希釈し、ＭＳを濾過により除去し、乾燥させた。残留物をクロマトグラフィー（勾配溶出１０〜４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、化合物を白色の綿毛状の固体（２．０１ｇ、８６％）として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ＝７．８０〜８．１２（ｍ，１０Ｈ），７．６０〜７．７８（ｍ，４Ｈ），７．１８〜７．６０（ｍ，２１Ｈ），６．２０〜６．０５（ｍ，２Ｈ），５．６０〜５．９１（ｍ，５Ｈ），５．１０〜５．４３（ｍ，３Ｈ），３．８０〜５．０２（ｍ，７Ｈ），３．４０-３．５６（ｍ，１Ｈ），１．９５-２．１０（ｍ，４Ｈ），１．００〜１．６０（ｍ，１１Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１００ＭＨｚ）δ＝１６９．８９，１６６．５１，１６６．４０，１６６．３５，１６６．３２，１６６．２４，１６６．１０，１６６．０３，１６５．９９，１６５．９６，１６５．８６，１６５．６１，１６５．４６，１６６．３８，１６５．３４，１６５．２７，１６５．２３，１６３．６８，１３９．３６，１３３．７１，１３３．６７，１３３．５６，１３３．４０，１３３．２７，１３３．２１，１３０．１２，１３０．０５，１２９．９８，１２９．９５，１２９．９２，１２９．８８，１２９．８０，１２９．７７，１２９．７３，１２９．６８，１２９．６２，１２９．５５，１２９．５０，１２９．４７，１２９．４１，１２９．４０，１２９．２９，１２９．１４，１２９．１１，１２９．０３，１２８．９６，１２８．８７，１２８．８４，１２８．８３，１２８．７８，１２８．７６，１２８．６３，１２８．５６，１２８．５４，１２８．４８，１２８．３７，１２８．２６，１１４．３３，１１４．２６，１００．９２，１００．８４，９７．０４，９６．５２，７５．３６，７５．１７，７４．８４，７３．３７，７２．９５，７２．９０，７２．８１，７２．５７，７２．５０７，７１．９４，７１．５８，７１．０５，７０．３７，７０．２７，７０．１９，７０．０６，６９．８６，６９．２４，６９．１９，６９．０２，６３．７１，６３．５６，６３．２０，６２．９３，６２．６９，３３．９６，３３．９１，３２．９３，２９．６０，２９．５３，２９．５０，２９．４６，２９．４２，２９．３３，２９．３０，２９．２２，２９．１４，２９．０６，２９．００。ＭＳ．Ｃ71Ｈ68Ｏ18について計算された分子量、計算値１２０８．４４、実測値１２３１．４（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４５１】
２１９の調製：
化合物２１８（７．２６ｇ、６ミリモル）をジオキサン：水の混合物（１００ｍＬ、３：１）に溶解させた。反応混合物に、ルチジン（０．７ｍＬ、２当量）を、次いでＯｓＯ4溶液（５ｍＬ、０．０５Ｍのｔブタノール溶液）を添加した。過ヨウ素酸ナトリウム（５．１１ｇ、４当量）を添加し、室温で４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニタし、出発材料が消費された時点で、混合物を水で希釈し、ＤＣＭで抽出し（３回）、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を全て除去し、残留物を次の反応に直接使用した。上記の反応からの残留物をＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶解させ、そこにオキソン（３．８６ｇ、１．０５当量）を添加し、そして周囲温度で３時間撹拌した。出発材料が消費された時点で、１０ｍＬの１ＭのＨＣｌを添加し、酢酸エチルで希釈した。水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー（勾配溶出２０％〜４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物２１９を白色の固体（５．５０ｇ、７５％）として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、４００ＭＨｚ）δ＝１２．００（ｂｓ，１Ｈ），８．４２〜７．１０（ｍ，３５Ｈ），６．１０〜４．５（ｍ，１３Ｈ），４．２０〜３．３０（ｍ，３Ｈ），２．２０〜２．０３（ｍ，３Ｈ），１．５０〜０．８（１１Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、１００ＭＨｚ）δ＝１７４．５５，１７４．５１，１６９．１３，１６５．５９，１６５．５２，１６５．３９，１６５．２７，１６５．２４，１６５．１４，１６４．９９，１６４．８８，１６４．７５，１６４．７０，１６４．６６，１６４．６０，１６４．５４，１６４．５０，１６２．９２，１６５．５９，１６５．５１，１６５．３９，１６５．２７，１６５．２４，１６５．１４，１６４．９９，１６４．８８，１６４．７５，１６４．７０，１６４．６０，１６４．５４，１６４．５０，１３３．８０，１３３．７１，１３３．５８，１３３．４２，１３３．２９，１３３．１５，１２９．８８，１２９．４２，１２９．３６，１２９．２９，１２９．２３，１２９．２０，１２９．１２，１２９．０７，１２９．０５，１２９．０３，１２８．９１，１２８．８８，１２８．７２，１２８．５９，１２８．４８，１２８．３８，９９．９６，９９．２９，９９．２２，９５．９６，９５．６４，９５．２２，９３．１０，７５．６１，７４．８６，７４．５７，７４．３７，７４．１５，７３．５９，７３．１４，７２．５８，７１．４６，７１．１５，７０．４８，７０．３１，７０．０９，６９．９７，６９．００，６８．８７，６８．２２，６７．８１，６３．６５，６２．４９，６０．７３，５９．７６，４３．０１，３３．６８，３３．６２，３２．５４，２８．８４，２８．８２，２８．６１，２８．５５，２８．４７，２８．４０，２５．４７，２５．２１，２４．５２，２４．４３，２０．４５。ＭＳ．Ｃ70Ｈ66Ｏ20について計算された分子量、計算値１２２６．４１、実測値１２４９．４（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４５２】
２２０の調製：
化合物２１９（１．６５ｇ、１．３７ミリモル）、ヒドロキシプロリンアミン（０．９４５ｇ、１．３当量）、およびＨＢＴＵ（０．６２３ｇ、１．６４ミリモル）をアルゴン雰囲気下でＤＭＦに溶解させた。そこにＤＩＥＡ（０．７１ｍＬ、３当量）を添加し、周囲温度で３時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニタし、出発材料が消費された時点で、混合物を氷水混合物中に注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出し、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー（まず酢酸エチル、次いで勾配溶出３％〜１０％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）で精製して、生成物２２０を淡黄色の固体（１．５５ｇ、６５％）として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、４００ＭＨｚ）δ＝８．２０〜７．３２（ｍ，３５Ｈ），７．３２〜７．１０（ｍ，９Ｈ），６．９０〜６．８２（ｍ，４Ｈ），６．００〜５．６３（ｍ，４Ｈ），５．４１〜５．３７（ｍ，１Ｈ），５．２０-〜５．０３（ｍ，２Ｈ），４．９８（ｄ，Ｊ＝４．１５Ｈｚ，１Ｈ），４．９０（ｄ，Ｊ＝４．１５Ｈｚ，１Ｈ），４．８８〜４．０５（ｍ，９Ｈ），３．７０（ｓ，６Ｈ），３．６５〜２．９３（ｍ，１０Ｈ），２．２０〜０．８０（ｍ，２２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、１００ＭＨｚ）δ＝１７１．８１，１７０．９４，１７０．９０，１７０．８４，１６５．５６，１６５．５３，１６５．４９，１６５．１９，１６５．１２，１６４．８７，１６４．７２，１６４．６３，１６４．５８，１６４．４６，１５８．０９，１５８．０３，１５７．９６，１４５．０８，１４４．７４，１３５．８７，１３５．７３，１３５．４８，１３５．４２，１３３．８０，１３３．５７，１３３．４２，１３３．２９，１２９．６０，１２９．５５，１２９．２６，１２９．２０，１２９．０４，１２９．００，１２８．８７，１２８．７４，１２８．６９，１２８．５９，１２８．３６，１２８．３４，１２８．２７，１２８．０２，１２７．８６，１２７．７７，１２７．５７，１２６．７４，１２６．５６，１１３．１９，１１３．０９，９９．２６，９５．９４，８５．７７，８５．１０，７４．８３，７３．５８，７２．５５，７１．４３，７０．４４，７０．０７，６９．０１，６８．８７，６８．５８，６８．１９，６７．４５，６５．１９，６３．２９，６３．４８，６３．３３，６２．４７，５９．７５，５５．５９，５４．９９，５４．９６，５３．４４，４４．５６，３８．２１，３６．３０，３５．７６，３５．４１，３４．１５，３２．５２，３０．７４，３０．１５，２９．０９，２８．８４，２８．６６，２８．５６，２８．５２，２６．１８，２５．２７，２５．２２，２４．５４，２４．１４．２１．２２，２０．７５，２０．７１，１８．５９，１４．０７，１３．５４。ＭＳ．Ｃ102Ｈ104Ｎ2Ｏ24について計算された分子量、計算値１７４０．７０、実測値１２６３．７（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４５３】
長いアルキル鎖ＣＰＧ２２１の調製：
ヒドロキシ誘導体２２０（１．５０ｇ、０．８６２ミリモル）をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解させ、そこに無水コハク酸（０．１７４ｇ、２当量）とＤＭＡＰ（０．３１６ｇ、３当量）を添加し、一晩撹拌した。ＴＬＣによって反応が完了したことが示された。反応混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、冷えた希釈クエン酸溶液と水で連続的に洗浄し（２回）、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、高真空下で乾燥させて、コハク酸塩を得た。前工程からのコハク酸塩とＨＢＴＵ（０．３９２ｇ、１．２当量）をＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（０．４５０ｍＬ）を添加し、混合物をアルゴン雰囲気下で５分間撹拌した。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ｌｃａａ ＣＰＧ、５．３０ｇ、１３３マイクロモル／ｇ）を混合物に添加し、２時間穏やかに振盪させた。ＣＰＧを濾過し、ＤＭＦ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨの混合物、およびＤＣＭで連続的に洗浄し、乾燥させた。乾燥したＣＰＧを別のフラスコに移し、穏やかに振盪させながら、ＴＥＡ（１ｍＬ）の存在下、ピリジン（２５％）中のＡｃ2Ｏで１５分間処理した。最後に、ＣＰＧを濾過し、ＤＣＭ、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９：１）、次いでＤＣＭ、およびエーテルで洗浄した。ＣＰＧ２２１を真空下で一晩乾燥させ、報告されている通りに装填量を測定した（５．６２ｇ、装填量：４２マイクロモル／ｇ）。
【化９３】
2013541334.tif 000099
【０４５４】
ヒドロキシ誘導体２２０（０．２００ｇ、０．１１５ミリモル）を無水ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解させ、そこにＤＩＥＡ（０．８０ｍＬ）とクロロアミダイト試薬（０．０６８ｍＬ）を添加し、一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニタし、溶媒を減圧下で除去し、（ＴＥＡで中和した）シリカゲルカラムに直接充填した。まず２：１（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）、次いでＥｔＯＡｃで溶出して、生成物（０．１５０ｇ、６７％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ＝７．１０〜８．１２（ｍ，４８Ｈ），６．８５〜６．７５（ｍ，４Ｈ）６．１０（ｔ，Ｊ＝１０．１９Ｈｚ，１Ｈ），５．８０〜５．６０（ｍ，３Ｈ），５．３３〜５．２０（ｍ，２Ｈ），５．００〜４．０６（ｍ，１２Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．９０〜３．０５（ｍ，１６Ｈ），２．８０〜１．０１（２７Ｈ）。31Ｐ（ＣＤＣｌ3、１６１ＭＨｚ）δ＝１４５．８３，１４５．４１，１４４．９５。ＭＳ．Ｃ111Ｈ121Ｎ4Ｏ25について計算された分子量、計算値１９４０．８１、実測値１９６３．８０（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４５５】
実施例１２．ＲＮＡ合成および二重鎖アニーリング
１．オリゴヌクレオチド合成：
オリゴヌクレオチドは全て、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成機またはＡＢＩ ３９４合成機で合成された。別記されない限り、市販の制御多孔質ガラス固体担体（ｄＴ-ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社製）と、標準的な保護基を有するＲＮＡホスホラミダイト、すなわち、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、オリゴヌクレオチド合成に使用した。２’−Ｆホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−フルオロ−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルオロ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイトは、Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入した。１０％のＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中、０．２Ｍの濃度で使用したグアノシンを除いて、ホスホラミダイトは全て、アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）中、０．２Ｍの濃度で使用した。１６分の連結／再利用時間を使用した。活性剤は、５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）であり、ＰＯ−酸化については、ヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ−酸化については、２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１ ｖ／ｖ）中のＰＡＤＳ（２％）を使用した。
【０４５６】
リガンドが結合した鎖を、対応するリガンドを含有する固体担体を用いて合成した。例えば、配列の３’−末端での炭水化物部分／リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃについて）の導入は、対応する炭水化物固体担体を用いて合成を開始することによって行った。同様に、３’−末端のコレステロール部分は、コレステロール担体上で合成を開始することによって導入した。一般に、リガンド部分を、先の実施例に記載されたような最適なテザーを介してトランス−４−ヒドロキシプロリノールに連結させて、ヒドロキシプロリノール−リガンド部分を得た。その後、ヒドロキシプロリノール−リガンド部分を、コハク酸トリンカーを介して固体担体と連結させるか、または標準的なホスフィチル化条件によってホスホラミダイトに転化し、所望の炭水化物複合体構成ブロックを得た。詳細については実施例１〜１１を参照されたい。フルオロフォア標識ｓｉＲＮＡを、対応するホスホラミダイトまたは固体担体（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入）から合成した。オレイルリトコール酸（ＧａｌＮＡｃ）3ポリマー担体は、３８．６マイクロモル／グラムの装填量で自家生産した。マンノース（Ｍａｎ）3ポリマー担体も、４２．０マイクロモル／グラムの装填量で自家生産した。
【０４５７】
所望の位置での、例えば、配列の５’−末端での、最適なリガンドの結合は、別記されない限り、標準的なホスホラミダイト連結条件下で、対応するホスホラミダイトを、成長中の鎖に連結させることによって行った。固体に結合したオリゴヌクレオチドに対する、５-（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール活性剤の存在下でのホスホラミダイトの０．１Ｍ無水ＣＨ3ＣＮ溶液の延長１５分の連結。報告されている通りに（１）標準的なヨウ素水を用いて、または結合したオリゴヌクレオチドの１０分の酸化待ち時間を伴う、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）を用いた処理によって、ヌクレオチド間ホスファイトからホスフェートへの酸化を行なった。ホスホロチオエートは、ＤＤＴＴ（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入）、ＰＡＤＳ、および／またはボーケージ試薬などの硫黄転移試薬を用いて、ホスファイトからホスホロチオエートへの酸化によって導入した。コレステロールホスホラミダイトは、自家合成し、ジクロロメタン中、０．１Ｍの濃度で使用した。コレステロールホスホラミダイトの連結時間は、１６分であった。
【０４５８】
３’−コレステロール−３’−炭水化物を含有するオリゴヌクレオチドの合成を、コレステロールホスホラミダイトの、所望の炭水化物を担持する固体担体への連結と、それに続くヌクレオシドホスホラミダイトへの連結によって行った。第２のリガンドを含むまたは含まないＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを、対応するＰＥＧ−ＮＨＳエステルのアミノ結合配列への合成後結合によって得た。アミノリンカーを、対応するトランス−４−ヒドロキシプロリノールに基づくアミノリンカーまたは市販のアミノリンカーを用いて、配列中の所望の位置に導入した。例えば、３’−ＰＥＧ−３’−ＧａｌＮＡｃ含有オリゴヌクレオチドの合成を、トランス−４−ヒドロキシプロリノールアミノリンカーホスホラミダイトの、所望のＧａｌＮＡｃを担持する固体担体への連結と、それに続くヌクレオシドホスホラミダイトへの連結によって行った。こうして得られたオリゴヌクレオチドを、配列の性質に応じて、重炭酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ７．５〜９での、ＰＥＧ−ＮＨＳエステルとの合成後結合に供した。
【０４５９】
２．脱保護Ｉ（ヌクレオ塩基脱保護）
合成が完了した後、担体を１００ｍｌのガラスビン（ＶＷＲ）に移した。オリゴヌクレオチドを、８０ｍＬのエタノールアンモニアの混合物［アンモニア：エタノール（３：１）］を用いて、５５℃で６．５時間、塩基とリン酸基を同時に脱保護しながら担体から開裂した。ビンを氷上で短時間冷却し、その後、エタノールアンモニア混合物を濾過して、新しい２５０ｍＬのビンに入れた。ＣＰＧを２×４０ｍＬ部のエタノール／水（１：１ ｖ／ｖ）で洗浄した。その後、ロータリーエバポレーター（ｒｏｔｏ−ｖａｐ）で混合物の容量を約３０ｍＬにまで減らした。その後、混合物をドライアイス上で凍結させ、真空下、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃで乾燥させた。
【０４６０】
３．脱保護ＩＩ（２’ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥した残留物を２６ｍｌのトリエチルアミンとトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ・３ＨＦ）またはピリジン−ＨＦとＤＭＳＯ（３：４：６）に再懸濁し、６０℃で９０分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ-ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。その後、反応を５０ｍｌの２０ｍＭの酢酸ナトリウムで停止させ、ｐＨを６．５に合わせ、精製するまでフリーザーで保存した。
【０４６１】
４．分析
精製する前に、オリゴヌクレオチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。緩衝液とカラムの選択は、配列および／または結合されるリガンドの性質によって決まる。
【０４６２】
５．炭水化物が結合したオリゴヌクレオチドのＰＥＧ化
アミノリンカーで官能化されたオリゴヌクレオチドを、ｐＨ７．５と９．０の間の重炭酸ナトリウム緩衝液中で、所望の分子量のＰＥＧ-ＮＨＳエステルで処理した。反応の進行は、ＨＰＬＣでモニタした。反応が完了した後、ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣで精製し、ＭＳで分析した。
【０４６３】
６．ＨＰＬＣ精製
リガンドが結合したオリゴヌクレオチドを逆相分取ＨＰＬＣで精製した。結合されていないオリゴヌクレオチドを、自家で充填したＴＳＫゲルカラムでの陰イオン交換ＨＰＬＣで精製した。緩衝液は、１０％のＣＨ3ＣＮ中の２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ａ）と１０％のＣＨ3ＣＮ、１ＭのＮａＢｒ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ｂ）であった。全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥させた。約０．１５ ＯＤの脱塩オリゴヌクレオチドを水で１５０μｌに希釈し、その後、ＣＧＥとＬＣ／ＭＳ分析用の特殊なバイアルにピペットで分注した。化合物は、最終的に、ＬＣ-ＥＳＭＳとＣＧＥで分析した。
【０４６４】
７．ｓｉＲＮＡ調製
ｓｉＲＮＡの調製のために、等モル量のセンス鎖とアンチセンス鎖を１×ＰＢＳ中、９５℃で５分間加熱し、ゆっくりと室温まで冷ませた。二重鎖の完全性は、ＨＰＬＣ分析で確認した。
【表２−１】
2013541334.tif 000100
【表２−２】
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【表２−３】
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【０４６５】
実施例１３：ａｐｏＢ  ｓｉＲＮＡへの様々な化学修飾によるインビトロ発現抑制活性
各修飾ｓｉＲＮＡに関するＩＣ５０を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸを使用した標準的なリバーストランスフェクションによってＨｅｐ３Ｂ細胞において決定した。手短に言えば、ウェル当たり０．５μＬの「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ」ＲＮＡｉＭａｘ（カリフォルニア州、カールスバッド所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号１３７７８−１５０）に加えた１０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＮと共に、９６ウェルプレートに、ウェル当たり５μＬのｓｉＲＮＡ二重鎖剤に５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＮを加え、室温で１５〜２０分間インキュベーションすることによって、リバーストランスフェクションを行った。インキュベーション後、次いで、１２，０００〜１５，０００のＨｅｐ３Ｂ細胞を含有する、抗生物質を含まない１００μＬの完全増殖培地を各ウェルに添加した。細胞を、溶解とｂＤＮＡ（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）によるＡｐｏＢおよびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの解析の前に、５％のＣＯ2雰囲気において３７℃で２４時間インキュベーションした。１０ｎＭから０．６ｐＭに及ぶ７種類の異なるｓｉＲＮＡ濃度を、ＩＣ５０を決定するために評価し、ＡｐｏＢトランスフェクト細胞に関するＡｐｏＢ／ＧＡＰＤＨを、１０ｎＭのＬｕｃ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞に正規化した。
【０４６６】
2013541334.tif 000103
【０４６７】
実施例１４：親ａｄ−３６９８  ｓｉＲＮＡに対する様々なモチーフを有するコレステロール−（ＧａｌＮＡｃ）3結合ａｐｏＢ  ｓｉＲＮＡのインビボ発現抑制活性
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹／群、８〜１０週齢、マサチューセッツ州所在のＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）におけるＡｐｏＢ−Ｃｈｏｌ／ＧａｌＮＡｃ３  ｓｉＲＮＡの静脈内ボーラス投与を、１０μｌ／ｇの用量容積で２７Ｇ針を使用した少量尾静脈注射によって行った。一回１００ｍｇ／ｋｇの用量を投与し、４８時間後にマウスを殺した。肝臓を採取し、液体窒素で瞬間冷凍し、その後、−８０℃で保存した。
【０４６８】
ｂＤＮＡ解析：
６８５０ Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ，Ｉｎｃ社製）を用いて、凍結した肝臓をすり潰し、解析するまで粉末を−８０℃で保存した。プロトコルに従って、分岐ＤＮＡ技術をベースとしたＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ １．０  Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（米国、カリフォルニア州、フレモント所在のＰａｎｏｍｉｃｓ）を用いて、ＡｐｏＢとＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを検出した。１０〜２０ｍｇの凍結した肝臓の粉末を、１０００ｕｌの０．３ｕｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＰＲＫ０９２）を含む組織／細胞溶解溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＴＣ０９６Ｈ）中、６５℃で４０分間溶解させた。その後、１０ｕｌの溶解産物を９０ｕｌの溶解作用試薬（２容積の水に１容積の溶解混合原液）に添加し、マウスＡｐｏＢおよびマウスＧＡＰＤＨに特異的なプローブセットを含むＰａｎｏｍｉｃｓ捕捉プレート（米国所在のＰａｎｏｍｉｃｓ）上で、５５℃で一晩インキュベーションした。その後、プロトコルに従って、捕捉プレートにシグナルの増幅と検出のための処理を施し、化学発光を、マイクロプレートルミノメーターＶｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）で相対光単位（ＲＬＵ）として読み取った。肝臓溶解産物におけるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ対ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの比を、各処置群について平均化し、ＰＢＳで処置した対照群と比較した。
【０４６９】
結果：
図２に示されるように、親ＡＤ−３６９８  ｓｉＲＮＡと比較して、コレステロール−（ＧａｌＮＡｃ）3が結合したｓｉＲＮＡ（ＡＤ−２７８１８）を有する交互モチーフによる処置は、ＡｐｏＢ転写物レベルの低下（ＰＢＳ対照群に対して正規化したときに、より小さいＡｐｏＢ対ＧＡＰＤＨ転写物比で示される、約６５％対約４０％）をもたらし、コレステロール−（ＧａｌＮＡｃ）3が結合したｓｉＲＮＡを有する交互モチーフが、優れたノックダウンを有することを示した。
【表３】
2013541334.tif 000104
【０４７０】
実施例１５：マウスＰＫ研究
プロトコル：
マウスに、静脈注射または皮下注射により１０ｕｌ／ｇの用量容積（時点当たりｎ＝２）で１００ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ複合体を投与した。下記の表に示された各時点で、２匹のマウスを殺し、血液を、肝門静脈を通じて採血し、Ｋ2ＥＤＴＡ被覆管に採取し、反転により混合し、濡れた氷上に置いた。次いで、この動物を生理食塩水で潅流し、肝臓を採取し、液体窒素で瞬間凍結した。血液を、採血直後の遠心分離（４℃で１０分間の２，０００ｇ）により血漿に処理した。血漿サンプルを赤血球から分離し、−８０℃で保存するために、エッペンドルフ（登録商標）チューブに分取した。
【０４７１】
６８５０ Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ，Ｉｎｃ社製）を用いて、凍結した肝臓をすり潰し、解析するまで粉末を−８０℃で保存した。Ａｔｔｏｐｒｏｂｅアッセイを使用して、肝臓組織１ｇ当たりかつ血漿ｍＬ当たりのｓｉＲＮＡの量を計量した。
【０４７２】
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【０４７３】
図３は、７日目までの持続性発現抑制に関するＡＤ−２７８１８のＳＣおよびＩＶ投与について同様のレベルの発現抑制を示す。約６５％のＡｐｏＢが、ＡＤ−２７８１８（ＧａｌＮＡｃ3）のＳＣ投与の９６時間後に発現抑制する。
【０４７４】
実施例１６：親ＡＤ−３６９８  ｓｉＲＮＡに対する、様々なモチーフを有するコレステロール−（ＧａｌＮＡｃ）3結合ＰＴＥＮ  ｓｉＲＮＡのインビボ発現抑制活性
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹／群、８〜１０週齢、マサチューセッツ州所在のＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）におけるＰＴＥＮ−Ｃｈｏｌ／ＧａｌＮＡｃ３  ｓｉＲＮＡの静脈内ボーラス投与を、１０μｌ／ｇの用量容積で２７Ｇ針を使用した少量尾静脈注射によって行った。マウスに一回１００、７５、５０または２５ｍｇ／ｋｇの用量を静脈投与し、そのマウスを４８時間後に殺した。肝臓を採取し、液体窒素で瞬間冷凍し、その後、−８０℃で保存した。
【０４７５】
ｂＤＮＡ解析：
６８５０ Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ，Ｉｎｃ社製）を用いて、凍結した肝臓をすり潰し、解析するまで粉末を−８０℃で保存した。プロトコルに従って、分岐ＤＮＡ技術をベースとしたＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０  Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（米国、カリフォルニア州、フレモント所在のＰａｎｏｍｉｃｓ）を用いて、ＰＴＥＮとＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを検出した。１０〜２０ｍｇの凍結した肝臓の粉末を、１０００ｕｌの０．３ｕｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＰＲＫ０９２）を含む組織／細胞溶解溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＴＣ０９６Ｈ）中に６５℃で４０分間溶解させた。その後、１０ｕｌの溶解産物を９０ｕｌの溶解作用試薬（２容積の水に１容積の溶解混合原液）に添加し、マウスＰＴＥＮおよびマウスＧＡＰＤＨに特異的なプローブセットを含むＰａｎｏｍｉｃｓ捕捉プレート（米国所在のＰａｎｏｍｉｃｓ）上で、５５℃で一晩インキュベーションした。その後、プロトコルに従って、捕捉プレートにシグナルの増幅と検出のための処理を施し、化学発光を、マイクロプレートルミノメーターＶｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）で相対光単位（ＲＬＵ）として読み取った。肝臓溶解産物におけるＰＴＥＮ  ｍＲＮＡ対ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの比を、各処置群について平均化し、ＰＢＳで処置した対照群と比較した。
【０４７６】
結果：
図４に示されるように、コレステロール−（ＧａｌＮＡｃ）3が結合したＰＴＥＮ  ｓｉＲＮＡを有する交互モチーフによる処置は、ＰＴＥＮ転写物レベルの低下（ＰＢＳ対照群に対して正規化したときに、より小さいＰＴＥＮ対ＧＡＰＤＨ転写物比で示される）をもたらし、コレステロール−（ＧａｌＮＡｃ）3が結合したｓｉＲＮＡを有する交互モチーフが、優れたノックダウンを有することを示した。最良のＰＴＥＮ−Ｃｈｏｌ／ＧａｌＮＡｃ３複合体は、最良の対応するＡｐｏＢ複合体と類似のインビボにおける有効性を示すことが分かり、その複合体と組み合わされたモチーフは配列に依存しないことを示唆している。
【表４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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