(57)【要約】  一酸化窒素を調節放出することができる高分子伝達体及該伝達体で表面が被覆された人工体内挿入物に係り、該伝達体は、有機高分子の主鎖と、主鎖に共有結合で連結されており、ジアゼニウムジオレート作用基を有する側鎖と、を含む。該一酸化窒素調節放出用伝達体は、室温で液体などの流動性がある流体状態で存在し、生理的ｐＨ条件で、臨界温度以上に昇温するとき、ゾルからゲルに相転移を起こす。該相転移の臨界温度は、２５ないし３５℃の範囲にあり、該ゲルは、化学架橋がない水和ゲルである。
2013540132.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一酸化窒素の調節放出用伝達体であって、
前記伝達体は、
有機高分子の主鎖と、
前記主鎖に共有結合で連結され、ジアゼニウムジオレート作用基を有する側鎖と、を含む重合体を含み、
前記主鎖の骨格は、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、乳酸／グリコール酸共重合体、乳酸／エチレングリコール共重合体、乳酸−グリコール酸−エチレングリコール共重合体、乳酸−グリコール酸−プロピレングリコール−エチレングリコール共重合体、ε−カプロラクトン／エチレングリコール共重合体、３−ヒドロキシブチル酸／プロピレングリコール共重合体、フマル酸化プロピレン／エチレングリコール共重合体、有機ホスファゼン／エチレングリコール共重合体及びポリペプチド系ブロック共重合体からなる群から選択されるブロック共重合体を含み、
前記伝達体の前記重合体は、昇温するとき、ゾルからゲルに相転移を起こし、前記相転移の臨界温度は、２５ないし３５℃の範囲にあって、前記伝達体の前記重合体は、前記臨界温度以上の温度と生体内ｐＨ条件とで、化学架橋のない水和ゲルを形成する一酸化窒素調節放出用伝達体。
【請求項２】
前記主鎖の骨格は、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体であることを特徴とする請求項１に記載の一酸化窒素調節放出用伝達体。
【請求項３】
前記側鎖の骨格は、ポリエチレンイミン、ポリプロピルイミン、ポリペプチド及びキトサンからなる群から選択される重合体を含むことを特徴とする請求項１に記載の一酸化窒素調節放出用伝達体。
【請求項４】
前記水和ゲル内に、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、消炎剤、ビタミンＣ、アセチルサリチル酸、高脂血症剤、血栓溶解剤、抗血栓剤、ヘパリン、抗癌剤及び抗増殖活性を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択された少なくとも１種の薬理効果物質をさらに含むことを特徴とする請求項に１記載の一酸化窒素調節放出用伝達体。
【請求項５】
前記薬理効果物質は、前記伝達体に共有結合で連結されず、前記水和ゲル内に分散していることを特徴とする請求項４に記載の一酸化窒素調節放出用伝達体。
【請求項６】
前記薬理効果物質は、前記ジアゼニウムジオレート作用基の酸素原子に共有結合で連結された結合体であることを特徴とする請求項４に記載の一酸化窒素調節放出用伝達体。
【請求項７】
請求項１に記載の一酸化窒素調節放出用伝達体で表面が被覆された人工体内挿入物。
【請求項８】
前記人工体内挿入物は、ステント、カテーテル、導管、皮下移植片、化学センサ、心臓拍動器、移植血管片、傷用ドレッシング、男性器挿入物、挿入用心拍発生装置（ＩＰＧ）、挿入用心臓除細動器及び神経興奮器からなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の人工体内挿入物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一酸化窒素伝達体に係り、さらに具体的には、本発明は、一酸化窒素を調節放出することができる温度感応性一酸化窒素放出高分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、２０１０年４月１日から２０１１年２月２８日まで、韓国科学技術研究院が主管する大韓民国教育科学技術部の未来有望パイオニア研究事業である「Nitric oxide放出血液適合性ステント開発」（課題番号２０１００００２１７５）による結果物である。
【０００３】
一酸化窒素（ＮＯ：nitric （mon）oxide）は、多様な分野で有力な効能を示す生体調節物質である。一酸化窒素は、米国学術誌サイエンスが選定した１９９２年の「今年の分子」であり、１９９８年ノーベル生理医学賞の主な研究内容でもあった。一酸化窒素は、人体内で信号伝達物質、または免疫反応による産物として作用するが、その効果は、血管拡張、神経伝達、毛髪周期（hair cycle）の調節、反応性窒素含有中間体の生成、勃起調節、抗菌効果、抗ウイルス効果及び傷治癒など多方面にわたっている。
【０００４】
このような一酸化窒素の効能のうち、血管拡張効果が多くの関心を集めている。血管内皮では、一酸化窒素の形態で、周りの平滑筋に弛緩せよという信号を伝達し、これにより、血管が拡張され、さらに多くの血流が流れる。一酸化窒素はまた、血管平滑筋の収縮と成長とを阻み、内皮で、血小板の凝集と白血球付着とを防止することにより、血管の恒常性維持に貢献する。
【０００５】
ステント挿入を伴う血管成形術（angioplasty）は、心臓に向かう血管内に、脂肪塊が蓄積した患者らに施行する手術である。血管成形術では、血管内に小風船を入れて膨らませることにより、脂肪塊を血管壁に近く押しやって血管幅を広げる。そして、ステントと呼ばれるチューブ状の網状骨格（mesh scaffold）を血管内に挿入し、強制的に血管幅を維持する。血管壁が再び細くなることがあれば、再手術を受けなければならない場合もある。従って、ステントで、細胞成長と炎症とを防止することができる一酸化窒素などの薬物を調節放出することができれば、それは、手術の成功率を高めることができる好ましい方法でなる。
【０００６】
ステントなどの人工挿入物の表面で、一酸化窒素を放出することができる化合物は、さまざまな種類がある。例えば、有機窒酸塩やエステル、鉄−ニトロシル錯体、シドノミニン（sydnonimine）、Ｃ−ニトロソ化合物、Ｓ−ニトロソチオール（Ｓ−nitrosothiol，Ｒ−Ｓ−ＮＯ）がある。Ｓ−ニトロソチオールの場合、最も多く研究されてきたが、それを適用した挿入物で、一酸化窒素が生体内に放出されない場合もあり、銅イオン（Ｃｕ+）濃度によって放出速度が影響を受け、物質自体が安定することができず、純粋な状態で得ることが容易ではないという短所を有している。
【０００７】
従って、最近では、一酸化窒素をさらに効率に放出することができる新たな物質及び方法に係わる研究が進められている。そして、一酸化窒素放出がさらに効果的になるためには、かような人工挿入物表面で起こる放出の速度を調節することができる手段を有していなければならない。
【０００８】
一酸化窒素は、高濃度で毒性を有し、血管拡張剤であるので、身体内に過度に多くの量で存在すれば、循環システムの完璧な崩壊を起こす。従って、適切な濃度の一酸化窒素を周囲環境の信号によって、適切な速度で放出したり、あるいは必要な場合、放出を抑制・遅延させるが、周辺環境の所望しないノイズ性信号には放出特性が影響を受けない一酸化窒素放出用伝達体を開発すれば、人工挿入物の性能を大きく向上させることができる。既存の一酸化窒素伝達体の場合、序盤に放出される一酸化窒素の量が過多であって、持続的な放出を図りにくいという問題があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、体内挿入物のうち、一酸化窒素を遅延放出または調節放出することができる高分子一酸化窒素伝達体を提供するものである。
【００１０】
本発明はまた、前記高分子一酸化窒素伝達体を表面に含む体内人工挿入物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一側面によれば、一酸化窒素調節放出用伝達体が提供される。前記伝達体は、有機高分子の主鎖と、この主鎖に共有結合で連結されており、ジアゼニウムジオレート作用基を備えている側鎖と、を含む重合体である。前記伝達体は、常温で、液体などの流動性がある流体状態で存在していて、生体内ｐＨ条件で、臨界温度以上に昇温するとき、ゾルからゲルに相転移を起こすが、この相転移の臨界温度は、２５ないし３５℃の範囲にあって、前記ゲルは、化学架橋を含まない水和ゲル（hydrogel）である。
【００１２】
かような水和ゲルを得るために、前記伝達体中の主鎖の炭素骨格は、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、乳酸／グリコール酸共重合体、乳酸／エチレングリコール共重合体、乳酸−グリコール酸−エチレングリコール共重合体、乳酸−グリコール酸−エチレングリコール−エチレングリコール共重合体、ε−カプロラクトン／エチレングリコール共重合体、３−ヒドロキシブチル酸／プロピレングリコール共重合体、フマル酸化プロピレン／エチレングリコール共重合体、有機ホスファゼン／エチレングリコール共重合体及びポリペプチド系ブロック共重合体からなる群から選択されたブロック共重合体であってもよい。
【００１３】
前記伝達体の前記側鎖は、ポリエチレンイミン、ポリプロピルイミンにような２級アミン含有高分子；２級アミン含有ポリペプチド；及びキトサンのような生体高分子からなる群から選択された高分子であってもよい。
【００１４】
前記伝達体はまた、水和ゲル内部に薬理効果物質を追加して含んでもよい。前記薬理効果物質は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ：vascularendothelialgrowthfactor）、消炎剤、ビタミンＣ、アセチルサリチル酸、高脂血症剤、血栓溶解剤、抗血栓剤、ヘパリン、抗癌剤及び抗増殖活性を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【００１５】
前記薬理効果物質は、前記一酸化窒素伝達体と直接共有結合で連結されず、水和ゲル内部に単純分散しているか、あるいは前記伝達体側鎖のジアゼニウムジオレート作用基の酸素原子に共有結合で連結された結合体（conjugate）であってもよい。
【００１６】
本発明の他の側面によれば、表面に被覆された前記伝達体を含む体内人工挿入物が提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の一つ以上の実施形態において、温度感応性水和ゲル形態の一酸化窒素調節放出用伝達体が提供される。前記伝達体は、生体内環境で一酸化窒素を、さらに長時間にわたって安定しており、生体適合性あるように供給することができる。前記伝達体と、表面に被覆されたかような伝達体を含む人工体内挿入物は、動脈硬化など虚血性障害の治療、勃起調節、抗菌及び抗ウイルスの分野、並びに傷治癒を含んだ医療用途・健康用途に広く使われると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一実施形態で、一酸化窒素伝達体を構成するジアゼニウムジオレート作用基含有側鎖を合成するのに使われる反応器の模式図である。
【図２】本発明の一実施形態によるジアゼニウムジオレート作用基含有側鎖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】本発明の一実施形態によるジアゼニウムジオレート作用基含有側鎖の紫外線（ＵＶ）スペクトルを測定したグラフである。
【図４】本発明の一実施形態によるジアゼニウムジオレート作用基含有側鎖の一酸化窒素放出特性を示したグラフである。
【図５】本発明の一実施形態によるジアゼニウムジオレート作用基無含有主鎖−側鎖複合体の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図６】本発明の一実施形態によるジアゼニウムジオレート作用基無含有主鎖−側鎖複合体のゲル化特性を温度と濃度とによって分析したグラフである。
【図７】本発明の一実施形態による一酸化窒素伝達体の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図８】本発明の一実施形態による一酸化窒素伝達体の一酸化窒素放出特性を示したグラフである。
【図９】本発明の一実施形態による一酸化窒素調節放出用伝達体に形成されたゲルが、血管内皮細胞の成長を促進して血管平滑筋細胞の成長を抑制する特性を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００２０】
本発明の一実施形態によれば、人体内に位置する人工的な装置表面に被覆されたとき、温度感応性水和ゲルを形成することにより、一酸化窒素（ＮＯ）を調節放出することができる一酸化窒素（ＮＯ）調節放出用伝達体が提供される。
【００２１】
本発明の他の実施形態によれば、表面に被覆された前記伝達体を有する人工体内挿入物が提供される。
【００２２】
本発明の他の実施形態によれば、前記人工体内挿入物を含む体内挿入用医療装置が提供される。
【００２３】
本明細書で「調節放出」とは、一酸化窒素、または生体内条件で、一酸化窒素を即座に生成することができる活性化合物を、一酸化窒素供与体、人工体内挿入物または医療装置の表面で、予定した速度で放出することを指す。調節放出は、一酸化窒素または前記活性化合物が、前記供与体、前記挿入物または前記医療装置の表面から予測することができないほど間歇的に放出されたり、あるいはある生体内環境条件に接したとき、爆発的放出（burst）形態で放出されないという意味を内包する。しかし、温度感応性水和ゲル（thermosensitive hydrogel）が相転移温度以下の温度に接して水和ゲルが解体され、水和ゲル内部の生体活性化合物が、直接体内条件に露出される場合のように、あらかじめ設計によって予定された場合は例外である。一酸化窒素、または前述の活性化合物の調節放出のための伝達体の一部実施形態では、かような爆発的放出が、挿入物または医療装置を配置した初期に起きた後、遅い速度の放出が続くことが望ましい場合もある。前記放出速度は、定常状態（steadystate）を維持する放出（徐放型（timed release）、または第０次速度論的放出とも呼ばれる）、すなわち、いくらかの分量を等しく予定された時間の間放出（初期爆発的放出でもあり、そうではないこともある）する形態であるか、一方で、速度勾配（gradient）型放出であってもよい。勾配型放出とは、挿入物や医療装置の表面で放出される一酸化窒素や活性化合物の濃度が、経時的に変わるという意味を内包する。生体内環境条件に直接露出されたとき、一酸化窒素や、一酸化窒素を即座に生成することができる活性化合物の寿命は、非常に短いので、水和ゲル形態の一酸化窒素伝達体が、それら一酸化窒素分子または活性化合物分子の放出を遅らせることができれば、それも、本発明で定義する調節放出に該当する。
【００２４】
本明細書で「水和ゲル（hydrogel）」とは、小型分子（small molecule）ではない有機分子が、水分散媒中に懸濁された半固状の組織体（network）を指す。水和ゲル中の前記有機分子は、有機分子間に、物理的架橋（physical cross link）が形成された水不溶性組織体を形成する。本明細書で「温度感応性（thermosensitive）水和ゲル」とは、室温以下の温度では、水和ゲルを形成する有機分子が、水分散媒内で、流体、溶液、ゾル（sol）などの流動性ある流体で存在していて、臨界温度以上の所定の温度区間に該当する温度に昇温すれば、相転移を起こし、化学的架橋（chemical crosslink）のない水和ゲルを形成するものなどをいう。温度感応性水和ゲルは、その構成有機分子の種類によって、温度が上昇し、ゾル（または、他のタイプの流体）→ゲルの挙動を示したり、さらに複雑に、ゾル（または他のタイプの流体）→ゲル→ゾル（または他のタイプの流体）のような挙動を示すこともできる。温度感応性水和ゲルのゾル−ゲル相互転換は、具体的には、ｐＨと有機分子の濃度とによって影響を受ける。
【００２５】
本発明で「共重合体」とは、特別に指定しない場合、線形共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体、星状（star）共重合体など、全ての形態の共重合体を網羅する。また、特別に指定しない場合、前記共重合体の構成モノマーや反復単位の反復形態の数は、特別に制限されるものではない。例えば、エチレングリコール由来の反復単位をＥＧ、プロピレングリコール由来の反復単位をＰＧと表示するならば、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体としたとき、そこには、平均組成が（ＥＧ）ｍ（ＰＧ）ｎ形態であるランダム共重合体はもとより、（ＥＧ）ｍ（ＰＧ）ｎ組成の２ブロック共重合体、（ＥＧ）ｌ（ＰＧ）ｍ（ＥＧ）ｎ組成の３ブロック共重合体なども含まれるという意味である。また、例えば、乳酸−グリコール酸−エチレングリコール共重合体中の乳酸（またはラクチド）由来反復単位をＬ、グリコール酸（またはグリコリド）由来反復単位をＧとしたとき、前記共重合体は、平均組成が（Ｇ）ｌ（ＥＧ）ｍ（Ｌ）ｎのような組成の３ブロック共重合体はもとより、Ｇ反復単位とＬ反復単位とが混合したＧ／Ｌブロックと、エチレングリコールブロックとを含む（ＥＧ）ｌ（Ｇ／Ｌ）ｍ（ＥＧ）ｎのような組成の３ブロック共重合体も含まれる。ここで例として挙げたｌ、ｍ及びｎは、正の数である。
【００２６】
本明細書で「人工体内挿入物」、または短くして「挿入物」とは、ヒトまたは哺乳動物を含んだ動物の体内で、一酸化窒素放出によって生理効果が見られる位置にあり、その表面に、一酸化窒素調節放出用伝達体を備えることができる全ての品物を示す。かような挿入物は、人体または動物体内に、その一部分が挿入されている限り、必ずその物の全部が人体または動物体内に存在する必要はないが、例えば、チューブや電線などの連結部が人体の外に引き出されていてもよい。本明細書で「体内挿入用医療装置」または「医療装置」も、前述の「人工体内挿入物」に準じて、治療、施術、手術、診断及び検査のための装置を網羅する。体内挿入用医療装置も、その全体または一部が、所定期間の間、人体内に挿入されてもよい。例えば、体内挿入用医療装置の感知部（probe）やセンサだけが人体内に挿入される。
【００２７】
本発明の一酸化窒素調節放出用伝達体は、主鎖と、この主鎖に化学結合で連結された側鎖と、を含む重合体である。この化学結合は、一般的に共有結合であるが、これに限定されるものではない。例えば、ビオチン−アビジン相互作用のように、非共有結合性分子間力でも、共有結合に準ずる強度を有したものは、主鎖と側鎖とを連結する化学結合として作用することができる。本発明の伝達体で、側鎖は、生体内条件に露出されたとき、一酸化窒素を放出することができるジアゼニウムジオレート（diazeniumdiolate）作用基を、その側鎖または主炭素骨格の一部として有する。
【００２８】
前記伝達体は、化学結合で連結されたジアゼニウムジオレート作用基を有し、室温以下の温度では、ゾル（sol）や乳濁液、溶液、分散額、液体など流動性ある状態で存在していて、体内環境、すなわち、体内の通常的なｐＨ条件及びと温度条件に接すれば、相転移を起こして水和ゲルを形成する。従って、本発明の前記調節放出用伝達体は、温度感応性水和ゲルを形成することができる高分子として、液状で所望の体内のサイトに投与することができる、いわゆるインサイチュ（in situ）ゲルを作ることができて便利である。
【００２９】
ゲルは、固体の凝集的な特性、及び液体の拡散輸送の性質をいずれも備えている多孔性弾性固体である。かようなゲルの特性は、活性物質の調節放出において、非常に求められている。水和ゲルは、自然な生体軟質組職と、性質が類似しており、それらと共存性が良好であるので、体内挿入物に使用される。一酸化窒素発生作用基を有する前記伝達体は、人工体内挿入物や体内挿入用医療装置の表面に、所望の濃度と厚さとに容易に被覆される。この人工体内挿入物や体内挿入用医療装置が人体内に挿入されれば、この体内挿入物や医療装置中に備えられている本発明の伝達体は、水和ゲルとして存在し、反応性が高くて安定性の低い一酸化窒素が急激に減少せずに、それを徐々に放出させる。
【００３０】
前記伝達体で、その主鎖の炭素骨格が水和ゲルの形成に主な役割を受け持つ。望ましくは、本発明の前記一酸化窒素伝達体の主鎖を構成する重合体は、側鎖に連結される場合はもとより、側鎖に連結されていない独立的重合体として存在する場合にも、温度感応性水和ゲルを形成する。前記伝達体の主鎖の炭素骨格を構成する重合体の例の部分的なリストは、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、乳酸／グリコール酸共重合体、乳酸／エチレングリコール共重合体、乳酸−グリコール酸−エチレングリコール共重合体、乳酸−グリコール酸−プロピレングリコール−エチレングリコール共重合体、ε−カプロラクトン／エチレングリコール共重合体、３−ヒドロキシブチル酸／プロピレングリコール共重合体、フマル酸化プロピレン／エチレングリコール共重合体、有機ホスファゼン／エチレングリコール共重合体、ポリペプチド系ブロック共重合体、及び互いに連結されたそれら共重合体の少なくとも２種を含む共重合体を含んでもよい。前記伝達体の主鎖の炭素骨格が生分解性重合体であってもよい。また、前記伝達体の主鎖の炭素骨格は、非生分解性重合体に、生分解を促進または誘導するための作用基（例えば、エステル作用基）を含む反復単位を付着させた重合体や糖類など、生体分子の結合体（conjugate）であってもよい。前記付着させた重合体や前記生体分子の結合体の主鎖を有する伝達体も、温度感応性水和ゲルを形成することができる。その場合、前記非生分解性重合体は、前述の共重合体のうち選択されるという点は、当業者に自明であろう。
【００３１】
特に、前記伝達体の主鎖の炭素骨格は、ブロック共重合体であってもよい。例えば、前記ブロック共重合体は、ＡＢＡ型ブロック共重合体であってもよい。温度感応性水和ゲルを形成することができる高分子として、ＡＢＡ型ブロック共重合体よりさらに複雑なブロック共重合体も知られている。
【００３２】
水和ゲルを形成することができるＡＢＡ型ブロック共重合体は、親水性ブロックまたはセグメント（segment）と、疎水性ブロックまたはセグメントと、を有する。昇温するとき、水和ゲルを形成する温度感応性高分子は、可逆的にゲルを形成したり、あるいは前記水和ゲルは、温度によって、前記重合体に解体（dissociation）される。なぜならば、ほとんどの前記温度感応性高分子は、化学架橋を含まないからである。高温で水和ゲルを形成する原動力は、高温で疎水性相互作用のサイズ増大である。かような高分子は、ほぼ自己組み立てを行って物理的架橋を形成する。
【００３３】
水和ゲルを形成することができる有機高分子は、当該技術分野に周知であるので、ここでそれ以上述べない。当技術分野の当業者であるならば、前記一酸化窒素伝達体の用途に合わせて、適切な温度で相転移し、適切な温度範囲において水和ゲル状態で維持される高分子を、前述の種類の共重合体のうち選択し、当技術分野の当業者であるならば、前記高分子を、必要な場合、改質して水和ゲルを形成することができるであろう。
【００３４】
前記伝達体の主鎖に使用されるブロック共重合体は、３ブロック共重合体、例えば、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）共重合体であってもよい。商業的に入手することができる３ブロック共重合体として、ドイツＢＡＳＦ社のPluronicＦ１２７（登録商標）が使用され、その平均組成は、（ＥＧ）99−（ＰＧ）65−（ＥＧ）99（分子量１２，６００）である。PluronicＦ１２７は、米国食品医薬品庁（ＦＤＡ）より、ヒトへの使用を承認した生体適合性・生体吸水性高分子である。
【００３５】
特に、前記伝達体の主鎖は、約４，６００ないし約１２，６００範囲の分子量を有する前述のＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ ３ブロック共重合体である。
【００３６】
前記伝達体の側鎖は、主鎖に化学結合で連結された重合体であり、前記伝達体は、一酸化窒素を生成・放出するジアゼニウムジオレート作用基を、その重合体側鎖の骨格の一部に含むとか、あるいは側鎖作用基として含む。
【００３７】
一酸化窒素は、光、熱、湿度の条件が最適からはずれる場合、極めて反応性が高い（labile）。前記一酸化窒素調節放出用伝達体の主鎖は、水和ゲルを形成する主な役割を果たすので、前記伝達体が一酸化窒素を生成することができる作用基を主鎖に含み難い。従って、適切な長さを有し、水和ゲル形成を妨害せず、一酸化窒素を生成・放出することができる作用基を有する前記伝達体の側鎖が、前記伝達体の主鎖に化学結合で連結され、それによって、一酸化窒素の体内放出時間が延長される。
【００３８】
前記伝達体の側鎖のジアゼニウムジオレート（diazeniumdiolate）作用基はまた、ノノエート（ＮＯＮＯａｔｅ）でも呼ばれ、その一般式は、ＲＲ’Ｎ−Ｎ（Ｏ）＝ＮＯＲ”と示すことができる。ジアゼニウムジオレート化合物は、固体形態で安定して保管することができ、水に対する溶解度が高く、ノノエート作用基が連結された残部の構造によって、放出速度や放出方式などの放出形態が調節される。また、ジアゼニウムジオレート化合物は、生体温度及びｐＨ条件で分解されるだけではなく、ｐＨによって、多様な形態に放出される。前記ジアゼニウムジオレート作用基を含む伝達体は、ジアゼニウムジオレート作用基当たり２分子の一酸化窒素を放出するので、相対的に高濃度の一酸化窒素を放出することができる。
【００３９】
ジアゼニウムジオレートは、次の化学式１に示したように、２級アミンに一酸化窒素を反応させて得ることができる。
【００４０】
【化１】
2013540132.tif 000003
【００４１】
ジアゼニウムジオレート作用基を含む側鎖は、多様な方法で製造される。例えば、その骨格中に２級アミン窒素を含む鎖（すなわち、前記化学式１で、Ｒ1−Ｎ−Ｒ2が骨格内で、当該側鎖の主なる長手方向に沿って連結されている場合）が、前記伝達体の側鎖として使用される。代案としては、前記伝達体の側鎖は、その側鎖に２級アミン窒素を有するオリゴ重合体を使用して製造される。
【００４２】
代案としては、２級アミン窒素を含むかかるオリゴ重合体を、主鎖に化学結合で連結した後、前記オリゴ重合体が連結された有機高分子に、一酸化窒素を反応させて得ることができる。
【００４３】
前記化学式１のＲ1及びＲ2に該当する作用基を改質することにより、ジアゼニウムジオレートの一酸化窒素放出特性が調節される。化学式１に示したように、ジアゼニウムジオレートは、電子密度が高い酸素原子を有するので、ジアゼニウムジオレートの酸素原子に、他の薬理活性物質が連結された結合体（conjugate）の形態で、一酸化窒素以外の他の活性物質を、前記伝達体の側鎖内に含めることもできる。
【００４４】
本発明の一実施形態で、前記伝達体の側鎖の炭素骨格は、例えば、ポリプロピルイミン、ポリリシンのような２級アミン含有高分子、及びキトサンなどのような生体高分子のうち選択することができる。さらに具体的な一実施形態において、前記伝達体の側鎖の炭素骨格は、ポリエチレンイミン骨格であり、例えば、分岐（branched）ポリエチレンイミン（ｂＰＥＩ）であってもよい。本発明の一具体的実施形態で、前記伝達体の側鎖は、（主鎖に連結されず、独立して存在する場合を仮定したときの）分子量が２５，０００以下であるポリエチレンイミン重合体であってもよい。前記伝達体の側鎖の分子量が前記範囲にあれば、体内細胞内で、前記伝達体の毒性が防止される。特に、前記ポリエチレンイミン重合体の分子量は、１２，０００以下である。
【００４５】
他の実施形態で、前記分岐ポリエチレンイミンが、主鎖骨格との化学的結合のための側鎖残基（side chain residue）を分岐部分（branched portion）に含む。特に、この側鎖残基は、１級アルキレンアミンであってもよい。前記アルキレンアミンは、ｂＰＥＩの鎖骨格の一部を構成する窒素原子に、前記アルキレンアミンの炭素原子を介して連結されている。これと係わり、このｂＰＥＩは、非分岐エチレンイミン反復単位と共に、分岐エチレンイミン反復単位を共に含むことが溶解度側面で望ましい。
【００４６】
本発明の１つの具体的な実施形態で、前記伝達体の側鎖を構成するｂＰＥＩは、以下の化学式２に表示される重合体であってもよい。
【００４７】
【化２】
2013540132.tif 000004
【００４８】
化学式２のｂＰＥＩの適切な分子量範囲は、２５，０００以下、例えば、１２，０００以下である。商業的に入手することができるｂＰＥＩにおいて、ｘ：ｙの比は、ほぼ１：２である。
【００４９】
前記伝達体の側鎖を構成するｂＰＥＩに、ジアゼニウムジオレート作用基をどれほど多く導入しなければならないかということは、特別な制限がない。２級アミンのジアゼニウムジオレートへの転換比率は、典型的な場合、５０％以上ほどであるが、必ずしもこの比率に制限されるものではない。可能な限りジアゼニウムジオレートの転換率を高くすることがしばしば望ましいが、平均的技術者であるならば、得られる最終伝達体の製品に、所望の一酸化窒素放出特性によって、２級アミンのジアゼニウムジオレートへの転換反応の条件を調節することにより、転換率を上昇させたり低下させることができる。
【００５０】
本発明の一特定実施形態で、前記化学式２のｂＰＥＩは、前記伝達体の側鎖の中間体として使用され、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ共重合体は、前記伝達体の主鎖の中間体として使用される。これと関連して、前記分岐ポリエチレンイミンの側鎖残基での１級アミンの窒素は、クロロホルム酸エステル（chloroformate ester）を使用し、前記３ブロック共重合体末端の酸素に、カルバン酸連結部（carbamate linkage）を介して連結される。前記一酸化窒素調節放出用伝達体は、生体内温度とｐＨ条件とで水和ゲルを形成するが、ここで、生体内温度とｐＨ条件は、当業者が必要によって、適切な範囲で設定することができる。例えば、人体内の生体内温度とｐＨ条件は、次の通りである：昇温するとき、ゾルからゲルに相転移を起こす相転移の臨界温度は、約２５ないし約３５℃の範囲であり、ｐＨは、約５．５ないし約８．０である。
【００５１】
一般的に、水和ゲルの形成のために、前記伝達体を含む水分散液が、人工体内挿入物または体内挿入用医療装置の表面に被覆される。水和ゲルの相転移温度は、水分散媒中の一酸化窒素調節放出用伝達体の濃度によっても変わりもする。被覆のための伝達体の分散濃度は、当分野の平均的技術者が、水和ゲルの所望の機械的物性、化学的物性と放出速度特性とに合わせて適切に決定される。全ての伝達体高分子に対して、一括的に適切な分散濃度を決定することは困難であるが、前記伝達体の適切な分散温度は、伝達体で使用された物質によって異なり、約１０ないし約３０％の範囲であってもよい。例えば、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール主鎖とエチレンイミン側鎖とを有するｂＰＥＩからなる一酸化窒素伝達体の量は、分散液全体重量基準で、約１５ないし約２５重量％の範囲である。
【００５２】
前記伝達体は、一酸化窒素以外にも、他の薬理効果物質をさらに含んでもよい。かような薬理効果物質は、伝達体に化学結合で連結された結合体（conjugate）形態で伝達体に固定されもし、または水和ゲル中に、化学結合なしに分散していることもある。前記薬理効果物質は、前記伝達体の側鎖のジアゼニウムジオレート作用基の酸素原子に、共有結合的に固定される。例えば、前記薬理効果物質の適切な固定方式は、Ｏ−アルキル化である。例えば、ジアゼニウムジオレートの負電荷に、正電荷を帯びる薬理効果物質またはその誘導体が電気的に結合される。前記薬理効果物質は、伝達体を分散させる分散媒（水または水溶液）中に含まれ、水和ゲル形成後に徐々に放出される。
【００５３】
前記追加的薬理効果物質の例は、特別に限定されるものではないが、血栓形成や血液凝固を防止する物質、抗酸化剤、消炎剤及び傷治癒促進物質を含んでもよい。これら薬理効果物質は、相乗効果を示すので、一酸化窒素放出ステントとして使用される伝達体内に望ましく使用される。特に、前記薬理効果物質の例は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ：vascularendothelialgrowthfactor）、消炎剤、ビタミンＣ、アセチルサリチル酸、高脂血症剤、血栓溶解剤、抗血栓剤、ヘパリン、抗癌剤及び抗増殖活性を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００５４】
本発明の他の実施形態によれば、一酸化窒素調節放出用伝達体で表面が被覆された人工体内挿入物及び体内挿入用医療装置が提供される。
【００５５】
前記人工体内挿入物及び体内挿入用医療装置は、一酸化窒素の調節放出が、挿入物や医療装置本来の効果を向上させるのに役に立つ場合はもとより、ただ、一酸化窒素、または一酸化窒素と追加的薬理効果物質との放出自体を目的にする場合に使用される。特に、一酸化窒素は、血管平滑筋の弛緩効果以外にも、傷治癒促進及び神経伝達調節の効果がある。また、一酸化窒素は、殺菌及び抗ウイルス効果も有する。特に、一酸化窒素は、ヒトパピローマウイルス（ｈＰＶ：human papillomavirus）に対する抗ウイルス効果にすぐれる。
【００５６】
また、前記伝達体は、血液に接触する化学センサの機能を補助する用途に使用されるか、あるいはそれ自体が一酸化窒素の濃度を測定する化学センサの一部として機能することもできる。その場合、ジアゼニウムジオレート作用基を有さずに、２級アミンを有する側鎖を含む主鎖−側鎖重合体が、人工体内挿入物及び体内挿入用医療装置の表面に被覆される。人体内で生成された一酸化窒素が形成された水和ゲル内に侵透する場合、それは、主鎖−側鎖重合体中の２級アミンと反応し、ジアゼニウムジオレートを生成する。これと関連し、前記伝達体は、生成されたジアゼニウムジオレートの量を定量的に測定することにより、化学センサと作用することができる。前記人工体内挿入物または体内挿入用医療装置の例は、ステント、カテーテル（catheter）、皮下移植片（subcutaneous implant）、化学センサ、導管（lead）、心臓拍動器（pacemaker）、移植血管片（vascular graft）、傷用ドレッシング（dressing）、男性器挿入物（penile implant）、挿入用シムバック発生装置（ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅｐｕｌｓｅｇｅｎｅｒａｔｏｒ、ＩＰＧ）、挿入用心臓除細動器（cardiac defibrillator）と神経興奮器（nerve stimulator）を含んでもよい。
【００５７】
人工体内挿入物または体内挿入用医療装置の表面上に、前記一酸化窒素調節放出用伝達体を被覆することは、本技術分野で周知の方法を使用して実行される。それらの方法は、本技術分野の平均的技術者であるならば、前記伝達体の用途に合うように、適切に選択することができるので、ここで説明しないことにする。例えば、前記被覆工程は、人工体内挿入物または体内挿入用医療装置を、前記伝達体を含む溶液中に浸漬して実行される。代案としては、前記被覆工程は、人工体内挿入物または体内挿入用医療装置を、前記伝達体で表面処理して実行される。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明の１以上の実施形態を、下記の実施例を参照してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、例示的な目的で提供されるものであり、本発明の範囲を制限するためのものではない。
【００５９】
＜実施例１＞
ジアゼニウムジオレート作用基を含む分岐ポリエチレンイミン（ｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅ）
１級アミン側鎖を有する反復単位と、エチレンイミンの反復単位との共重合体である３種の分岐ポリエチレンイミン（ｂＰＥＩ）（それぞれ、重量平均分子量６００；１０，０００；２５，０００）を（米国Polysciences社、アミノ基の比率は、およそ約１級：２級：３級＝２５：５０：２５）、それぞれ０．５ｇずつ、それぞれの１００ｍＬビーカーに入れて１０ｍＬのメタノールと２０ｍＬのテトラハイドロピュとは、（ＴＨＦ）を加えて３０分間撹拌した。
【００６０】
各ｂＰＥＩ内の含有された１級〜３級全体アミンの量のような当量であるメトキシ化ナトリウム（ＮａＯＭｅ）０．６３ｇをメタノール１０ｍＬに溶解させ、その混合物を前記ｂＰＥＩを込めたビーカーのそれぞれに入れた。前記ビーカーを反応器中に入れ、反応器の内部を２０ｐｓｉのアルゴン気体で２回パージ（purge）した。その後、８０ｐｓｉの一酸化窒素を反応器に入れ、３日間放置して、ｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅを生成した。かような反応に使用される反応器を、図１に図示した。生成されたｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅは、ジエチルエーテルで沈澱させて分離した。
【００６１】
化学式３はｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅの生成過程を示した反応式である。化学式３で、２級アミン反復単位（反復単位数ｙ）のうち一部は、塩基下で一酸化窒素と反応し、ジアゼニウムジオレート作用基に変わり（反復単位数ｚ）、残りは、反応せずに２級アミンとして残る（反復単位数ｗ）。
【００６２】
【化３】
2013540132.tif 000005
【００６３】
生成されたｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅの特性分析
１）ジアゼニュムジオルレート作用基形成の確認
得られたそれぞれのｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅが、実際にジアゼニウムジオレート作用基を有するか否かということを、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を介した定量で決定した。図２は、前記反応生成物の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル結果である。化学式３のｂＰＥＩ分子で、３級アミンのα−水素（図２で、ａ位置）は、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルで、δ＝２．６ｐｐｍで示されるが、ジアゼニウムジオレート作用基が生成されれば、以前の３級アミンのα−水素は、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルで、δ＝３．１ｐｐｍ（図２のｂ位置）で示される。図２に示したように、生成物のＮＭＲスペクトルを分析した結果、ｂＰＥＩの２級アミンのうち、分子量６００であるｂＰＥＩ（ｂＰＥＩ６００）の場合は、１５．３％（図２（ａ）参照）、分子量１０，０００であるｂＰＥＩ（ｂＰＥＩ１０Ｋ）の場合は、１３．８％（図２（ｂ）参照）、分子量２５，０００であるｂＰＥＩ（ｂＰＥＩ２５Ｋ）の場合は、１６．０％（図２（ｃ）参照）がジアゼニウムジオレートに転換されたということを確認した。以下の明細書記載で、図２（ａ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルで確認した分子量６００のｂＰＥＩジアゼニウムジオレートは、ｂＰＥＩ６００−ＮＯＮＯａｔｅ、図２（ｂ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルで確認した分子量１０，０００のｂＰＥＩジアゼニウムジオレートは、ｂＰＥＩ１０Ｋ−ＮＯＮＯａｔｅ、及び図２（ｃ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルで確認した分子量１０，０００のｂＰＥＩジアゼニウムジオレートは、ｂＰＥＩ２５Ｋ−ＮＯＮＯａｔｅとそれぞれ略称する。
【００６４】
２）ジアゼニウムジオレートの分光分析
ｂＰＥＩの２級アミンからジアゼニウムジオレート作用基が生成されれば、紫外線吸光分析で、一般的に２５０ないし２６０ｎｍ近傍で吸収ピークが示される。図３は、２００ないし４００ｎｍで合成したｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅの紫外線スペクトルを測定したグラフである。図３で、ｂＰＥＩ６００、ｂＰＥＩ１０Ｋ及びｂＰＥＩ２５Ｋは、それぞれ反応前の分子量６００；１０，０００及び２５，０００のｂＰＥＩであり、ｂＰＥＩ６００−ＮＯ、ｂＰＥＩ１０Ｋ−ＮＯ及びｂＰＥＩ２５Ｋ−ＮＯは、それぞれそれらの当該ジアゼニウムジオレート化物を示す。図３に図示されたように、紫外線分光の結果、ｂＰＥＩ６００−ＮＯ、ｂＰＥＩ１０Ｋ−ＮＯ及びｂＰＥＩ２５Ｋ−ＮＯの吸収ピークが、反応前のｂＰＥＩとは異なり、２５０ないし２６０ｎｍで示されるということを確認した。
【００６５】
３）一酸化窒素放出の分析
一酸化窒素放出分析は、一般的な検出方法であるGriess分析法（Ｈ．Ｈ．Ｈ．Ｗ．Schmidt and Ｍ．Kelm、inMethodsinNitricOxideResearch、ｅｄ．Ｍ．Feelish and Ｊ．Ｓ．Stamler、Wiley＆Sons、New York、１９９６参照）を使用して行った。反応性の大きい一酸化窒素は、反応溶媒中の酸素や水気と反応して二酸化窒素を生成し、この二酸化窒素は、スルファニルアミド（sulfanilamide）と反応して活性化され、さらにこの活性化された物質は、ナフチレンジアミンと反応し、波長５４８ｎｍの光を吸収するアゾ化合物を生成する。
【００６６】
かような原理を使用して、前記で合成した３種のｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅを分析した結果は、図４に図示されている。図４の略語説明は、前記図３での説明と同一である。一酸化窒素の放出プロファイルは、ｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅの分子量によって著しい違いを示していないが、ｂＰＥＩ分子量１０，０００のｂＰＥＩ１０Ｋ−ＮＯＮＯａｔｅが、ｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅのうち初期放出量が最も多く、最も早く放出し、約２４時間の間一酸化窒素を放出した。ｂＰＥＩ２５Ｋ−ＮＯＮＯａｔｅは、初期放出量は二番目に多く、約１１時間の間放出した。ｂＰＥＩ６００−ＮＯＮＯａｔｅの初期放出量は最も少なく、ｂＰＥＩ６００−ＮＯＮＯａｔｅは、最も長い時間の間（５４時間）、一酸化窒素を徐々に放出した。従って、後続実験は、ｂＰＥＩ６００−ＮＯＮＯａｔｅを利用して行った。
【００６７】
＜実施例２＞
ジアゼニウムジオレート作用基を含まない主鎖−側鎖複合体
（１）Ｆ１２７−ｂＰＥＩの合成
分子量１２，６００のPluronicＦ１２７（ＢＡＳＦ社登録商標）１０．０ｇを、２５０ｍＬ丸底フラスコに入れ、これを塩化メチレン７０ｍＬ中に溶解させた。次に、前記フラスコを窒素でパージした。後続として、１．２９ｇのクロロホルム酸パラニトロフェニル（ｐ−ＮＰＣ）を塩化メチレン７０ｍＬ中に溶解させ、この混合溶液を、滴下漏斗（dropping funnel）中に入れた。PluronicＦ１２７を窒素雰囲気下で撹拌しながら、ここに、ｐ−ＮＰＣを前記フラスコに滴下させ、それらの間で１２時間反応を進め、末端活性化されたPluronicＦ１２７を得た。この生成物の分離は、ジエチルエーテル沈澱法を使用した。次に、末端活性化されたPluronicＦ１２７にｂＰＥＩを反応させ、その末端にｂＰＥＩを連結させた。Ｆ１２７−ｂＰＥＩの合成スキームは、以下の化学式４に図示してある。化学式４で、Ｆ１２７−ｂＰＥＩは、ｂＰＥＩが末端に結合されたPluronicＦ１２７を示す。
【００６８】
【化４】
2013540132.tif 000006
【００６９】
さらに具体的には、前述の末端活性化されたPluronicＦ１２７を、過量のｂＰＥＩ６００と反応させるが、当量重量比を、それぞれ１：１．５、１：３及び１：１０にし、ジアゼニウムジオレート作用基を含まない３種の主鎖−側鎖複合体（それぞれ、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ０．８、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ１．０及びＦ１２７−ｂＰＥＩ１．３）を生成した。
【００７０】
Ｆ１２７−ｂＰＥＩ０．８は、次のように合成した：ｂＰＥＩ６００４３ｍｇ（１．５当量）を１００ｍＬ丸底フラスコに入れ、次に、２０ｍＬの塩化メチレンと、１ｍＬのトリエチレンイミンとの中に溶解した。前記フラスコを、次に窒素でパージした。前述の末端活性化PluronicＦ１２７０．６ｇ（１当量）を２０ｍＬの塩化メチレンに溶解させ、滴下漏斗内に移した。ｂＰＥＩを含む結果混合物を、氷バス（ice bath）の窒素雰囲気で撹拌しながら、前記末端活性化PluronicＦ１２７を、前記フラスコに滴下し、それら間の反応を１２時間進め、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ０．８を得た。合成されたＦ１２７−ｂＰＥＩは、ＭＷＣＯ dialysis １００００の分離膜に透析して不純物を除去し、凍結乾燥させて最終生成物を収得した。Ｆ１２７−ｂＰＥＩ１．０及びＦ１２７−ｂＰＥＩ１．３は、それぞれ８６ｍｇのｂＰＥＩ６００（３当量）と、末端活性化PluronicＦ１２７０．６ｇ（１当量）とを使用したこと；２８９ｍｇのｂＰＥＩ６００（１０当量）と、末端活性化PluronicＦ１２７０．６ｇ（１当量）とを使用したこと；を除き、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ０．８と同一の方法で合成した。
【００７１】
生成されたＦ１２７−ｂＰＥＩの特性分析
（１）PluronicＦ１２７とｂＰＥＩとの結合確認
前記３種の主鎖−側鎖複合体で、PluronicＦ１２７とｂＰＥＩとがカルバン酸連結部を介して連結されたか否かということは、1Ｈ−ＮＭＲを介した定量で決定した。前記３種の生成された主鎖−側鎖複合体の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、図５に示した。一般的には、図５でａとｃで表示したように、PluronicＦ１２７は、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルがメチル水素（ａ）とメチレン水素（ｃ）とに大別される。プロピレングリコールから誘導された反復単位のメチル水素ａの1Ｈ−ＮＭＲシグナルは、δ＝１．１５ｐｐｍで示され、残りのメチレン水素ｃの1Ｈ−ＮＭＲシグナルは、δ＝３．２ないし４．０ｐｐｍで示される。また、ｂＰＥＩの炭素結合水素ｂの1Ｈ−ＮＭＲシグナルは、δ＝２．６ｐｐｍ近傍で示される。図５で（１）は、反応していないPluronicＦ１２７、（２）は、生成されたＦ１２７−ｂＰＥＩ０．８、（３）は、生成されたＦ１２７−ｂＰＥＩ１．０、そして（４）は、生成されたＦ１２７−ｂＰＥＩ１．３の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルをそれぞれ示す。図５の結果から、PluronicＦ１２７の主鎖の末端ヒドロキシ基のうち、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ０．８は、４０．０％、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ１．０は、５０．０％、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ１．３は、６２．５％がｂＰＥＩに結合しているということを確認した。
【００７２】
２）ゲル形成の確認
PluronicＦ１２７とｂＰＥＩとからなる前記主鎖−側鎖複合体が、PluronicＦ１２７のように、温度感応性水和ゲルを形成することができるか、そしてそうであるならば、ゲル化特性にいかなる変化があるということを見るために、ゲル化試験を行った。さまざまな濃度（質量％）で、水に分散され主鎖−側鎖複合体を隅々見たとき、溶液が流れれば、溶液（ゾル）状態と判断し、流れなければ、ゲル状態と判断することにより、温度及び濃度によるゾル−ゲル存在いかんを記録した（inverted gelation test）。試験結果は、図６にグラフで示した。生成された主鎖−側鎖複合体は、いずれもPluronicＦ１２７よりさらに低い濃度でもゲルを形成することができた。安定性の側面では、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ０．８、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ１．０及びＦ１２７−ｂＰＥＩ１．３は、この順序で安定したゲルを形成した。従って、３種の複合体は、いずれも伝達体を製造する用途に適する前駆体として使用される。
【００７３】
＜実施例３＞
ジアゼニウムジオレート作用基を有する伝達体Ｆ１２７−ｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅ
（１）Ｆ１２７−ｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅの合成
Ｆ１２７−ｂＰＥＩ０．４６ｇを１００ｍＬビーカーに入れ、５．３Ｍのメトキシ化ナトリウム０．２３ｍＬ、メタノール２．０７ｍＬ、テトラヒドロフラン２．３ｍＬを入れた。このビーカーを、図１に図示した反応器中に入れ、２０ｐｓｉのアルゴンで２回パージした。その後、８０ｐｓｉの一酸化窒素を前記反応器に加え、前記反応器を３日間維持した。この反応の生成物をジエチルエーテルで沈澱させて分離した。この反応スキームは以下の化学式５に示した。
【００７４】
【化５】
2013540132.tif 000007
【００７５】
Ｆ１２７−ｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅの特性確認
１）ジアゼニウムジオレート作用基形成の確認
Ｆ１２７−ｂＰＥＩ１．３−ＮＯＮＯａｔｅにジアゼニウムジオレート作用基が生成されたか否かということは、ＮＭＲを介した定量で決定した。1Ｈ−ＮＭＲスペクトル結果を図７に図示した。一般的に、Ｆ１２７−ｂＰＥＩは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルで３個の位置でピークを有する。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルで、PluronicＦ１２７のプロピレングリコールから誘導された反復単位のメチル水素のピーク（図７のａ）は、δ＝１．１５ｐｐｍで示され、メチレン水素のピーク（図７のｃ）は、δ＝３．２ないし４．０ｐｐｍで示される。また、1Ｈ−ＮＭＲで、ｂＰＥＩのメチレン水素（図７のｂ）は、一般的に、δ＝２．６ｐｐｍ近傍で示されるが、ｂＰＥＩのメチレン水素のうちジアゼニウムジオレート作用基について、α−位置のメチレン水素（図７のｄ）は、δ＝２．９ｐｐｍ近傍で示される。
【００７６】
図７で（１）は、生成されたＦ１２７−ｂＰＥＩ０．８−ＮＯＮＯａｔｅ、（２）は、生成されたＦ１２７−ｂＰＥＩ１．０−ＮＯＮＯａｔｅ、（３）は、生成されたＦ１２７−ｂＰＥＩ１．３−ＮＯＮＯａｔｅの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルをそれぞれ示す。ＮＭＲ分析の結果、伝達体製造過程で、反応前の前記主鎖−側鎖複合体の２級アミン基のうち、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ０．８−ＮＯＮＯａｔｅの場合は、３５．１％、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ１．０−ＮＯＮＯａｔｅの場合は、３３．１％、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ１．３−ＮＯＮＯａｔｅの場合は、３５．１％がそれぞれジアゼニウムジオレート作用基に転換されたということを確認した。
【００７７】
２）水和ゲル形成実験
Ｆ１２７−ｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅ伝達体について、温度感応性水和ゲル形成実験を行った結果、図６に示したＦ１２７−ｂＰＥＩ複合体の場合と類似して水和ゲルを形成するということを確認した（データ示さず）。前述の３種のＦ１２７−ｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅは、いずれもＦ１２７−ｂＰＥＩと共に、温度感応性水和ゲルを安定して形成した。
【００７８】
３）一酸化窒素放出の分析
ｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅでのように、Griess分析法で水和ゲルを形成したＦ１２７−ｂＰＥＩ−ＮＯＮＯａｔｅ伝達体の一酸化窒素の放出を分析した。図８に、分析結果を図示した。ｂＰＥＩ６００−ＮＯＮＯａｔｅで、全ての放出一酸化窒素の半減期は、１分以内（図８）であったが、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ０．８−ＮＯＮＯａｔｅ、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ１．０−ＮＯＮＯａｔｅ及びＦ１２７−ｂＰＥＩ１．３−ＮＯＮＯａｔｅの全ての放出一酸化窒素の半減期は、約１．６時間ないし２．４時間の範囲にあり、これは、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ０．８−ＮＯＮＯａｔｅ、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ１．０−ＮＯＮＯａｔｅ及びＦ１２７−ｂＰＥＩ１．３−ＮＯＮＯａｔｅが、ｂＰＥＩ６００−ＮＯＮＯａｔｅより１００倍以上の遅い速度で一酸化窒素を放出するということを意味する。
【００７９】
４）細胞毒性試験
Ｆ１２７−ｂＰＥＩ０．８−ＮＯＮＯａｔｅ水和ゲルについて、細胞毒性実験（日本DOJINDO社のＣＣＫ−８キットで分析）を行った。試験群では、血管内皮細胞株（cell lines）であるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ：humanumbilicalveinendothelialcells）、または血管平滑筋（ＳＭＣ）細胞株である管状動脈平滑筋細胞（coronaryarterysmoothmusclecell）をＦ１２７−ｂＰＥＩ０．８−ＮＯＮＯａｔｅ水和ゲル上で培養し、培養された細胞数を測定した。対照群として、同じ細胞を一般的な２４ウェルプレートの上で培養した。試験結果は、図９に図示した。図９のデータは、平均値／標準偏差（ｎ＝３）でもって表示される。ｔテストを使用して統計分析を行った。記号＊＊及び＊＊＊は、それぞれｐ＜０．００１及びｐ＜０．０００１のレベルでの水準での統計的有意性を示す。
【００８０】
図９を参照すれば、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ０．８−ＮＯＮＯａｔｅはＨＵＶＥＣの増殖においてＦ１２７及びＦ１２７−ｂＰＥＩ０．８媒介増殖によって達成された値に比べ、それぞれ４８．１％及び２６．１％の向上を示した。また、ＳＭＣの増殖は、Ｆ１２７及びＦ１２７−ｂＰＥＩ０．８−被覆されたプレートに比べ、Ｆ１２７−ｂＰＥＩ０．８−ＮＯＮＯａｔｅ−被覆されたプレート上で、それぞれ３５．０％及び８０．８％ほど大きく低下した。
【００８１】
図９に図示された結果から、前記一酸化窒素調節放出用伝達体が、ＨＵＶＥＣ及びＳＭＣに対して差別的な生理効果を示すということが確認された。従って、前記伝達体が多くの可能用途のうち、ステントに使用される場合、再狭窄（restenosis）を安定して効率的に防止することができる。
【００８２】
以上で説明した例示的な実施例は、説明的な意味にのみ考慮されなければならず、限定的な目的に考慮されてはならないということは言うまでもない。各実施形態内での特徴または側面の説明は、一般的に他の実施形態での他の類似の特徴または側面についても、適用可能であると考慮されなければならない。
【図１】
2013540132.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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