(57)【要約】  イネのＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の活性化による微量元素の含有量が、野生型に比べて増加した形質転換植物体、及び該形質転換植物体から生成された産物を含有する機能性食品である。
2013513381.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微量元素の含有量が増加している植物体であって、前記微量元素は、鉄、亜鉛及び銅からなる群から選択されたものである植物体。
【請求項２】
前記植物体は、イネ、麦またはトウモロコシであることを特徴とする請求項１に記載の植物体。
【請求項３】
前記植物体は、ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の発現が増加したものであることを特徴とする請求項１に記載の植物体。
【請求項４】
前記ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の発現増加は、ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の上流及び下流からなる群から選択された一つ以上の位置で、エンハンサーの挿入によってなされたことを特徴とする請求項３に記載の植物体。
【請求項５】
４個のＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーが連結された構造体が、ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の下流約１０ｋｂ内の位置に挿入されていることを特徴とする請求項４に記載の植物体。
【請求項６】
前記植物体は、種子受託番号ＫＣＴＣ １１５９７ＢＰで寄託されたＯｓＮＡＳ２−Ｄ１イネ(oryza sativa)、または種子受託番号ＫＣＴＣ １１５９８ＢＰで寄託されたＯｓＮＡＳ３−Ｄ１イネ(oryza sativa)であることを特徴とする請求項１に記載の植物体。
【請求項７】
請求項１に記載の植物体から生産された産物を含有する機能性食品。
【請求項８】
請求項１に記載の植物体から生産された産物を含有する薬学的組成物。
【請求項９】
前記組成物は、鉄、亜鉛、銅及びそれらの組み合わせからなる群から選択された物質の欠乏によって引き起こされる疾病を治療するためのものであることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記疾病は、鉄欠乏によって引き起こされた、貧血（anemia）、疲労（fatigue）、蒼白（pallor）、毛髪損傷（hair loss）、易刺激性（irritability）、弱気（weakness）、異食症（pica）、手足の爪割れ（brittle or grooved nails）、プランマー・ヴィンソン症候群（Plummer-Vinson syndrome）、損傷された免疫機能（impaired immune function）及びそれらの組み合わせ；亜鉛欠乏（zinc deficiency）によって引き起こされた、低亜鉛血症（hypozincemia）、毛髪損傷、皮膚損傷（skinlesion）、下痢、体組織の減退（wasting of body tissue）、腸性肢端皮膚炎（acrodermatitis enteropathica）、拒食症（anorexia）、認知機能及び運動機能の喪失（cognitive and motor function impairment）、無月経症（dysmenorrhea）及びそれらの組み合わせ；銅欠乏によって引き起こされた、貧血症（syndrome of anemia）、汎血球減少症（pancytopenia）、神経退化（neurodegeration）、メンケス病（Menkes disease）、痙縮（spasticity）、調和運動不能（ataxia）、神経障害（neuropathy）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されたことを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
外来エンハンサーを含む構造体を植物体に導入し、ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の発現が増加した植物体を得る段階を含む、鉄、亜鉛及び銅からなる群から選択された微量元素含有量が増加した植物体を製造する方法。
【請求項１２】
前記構造体を植物体に導入する段階は、花キャベツモザイクウイルスのプロモーターから由来した３５Ｓエンハンサーが挿入されたＴｉプラスミドを植物体に導入する段階であり、前記植物体を得る段階は、前記３５ＳエンハンサーがＯｓＮＡＳ２活性またはＯｓＮＡＳ３活性をコーディングする遺伝子の上流及び下流のうち、一つ以上の位置に挿入された植物体を選抜する段階であることを特徴とする請求項１１に記載の微量元素含有量が増加した植物体を製造する方法。
【請求項１３】
前記３５Ｓエンハンサーは、前記配列番号２または配列番号１１のアミノ酸配列をコーディングする遺伝子の下流約１０ｋｂ内の位置に挿入されることを特徴とする請求項１２に記載の微量元素含有量が増加した植物体を製造する方法 。
【請求項１４】
前記３５Ｓエンハンサーは、４コピーが連結されたものであることを特徴とする請求項１２に記載の微量元素含有量が増加した植物体を製造する方法。
【請求項１５】
前記植物体は、イネ(oryza sativa)であることを特徴とする請求項１１に記載の微量元素含有量が増加した植物体を製造する方法。
【請求項１６】
前記植物体は、種子受託番号ＫＣＴＣ １１５９７ＢＰで寄託されたＯｓＮＡＳ２−Ｄ１イネ(oryza sativa)、または種子受託番号ＫＣＴＣ １１５９８ＢＰで寄託されたＯｓＮＡＳ３−Ｄ１イネ(oryza sativa)であることを特徴とする請求項１１に記載の微量元素含有量が増加した植物体を製造する方法。
【請求項１７】
請求項１ないし請求項６のうち、いずれか１項に記載の植物体を、鉄及び亜鉛から構成される群から選択された一つ以上が不足した条件で生育させる段階を含む、植物体を生育させる方法。
【請求項１８】
請求項１ないし請求項６のうち、いずれか１項に記載の植物体を過量の重金属が存在する条件で生育させる段階を含む、植物体を生育させる方法。
【請求項１９】
前記重金属は、５ｍＭ以上の亜鉛、０．３ｍＭ以上の銅、または０．５ｍＭ以上のニッケルであることを特徴とする請求項１８に記載の植物体を生育させる方法。
【請求項２０】
請求項１ないし請求項６のうち、いずれか１項に記載の植物体を高いｐＨの条件で生育させる段階を含む植物体を生育させる方法。
【請求項２１】
前記ｐＨは８．５以上であることを特徴とする請求項２０に記載の植物体を生育させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体のＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ２遺伝子の活性化による微量元素の含有量が増加した形質転換植物体、及び前記形質転換植物体から生成された産物を含有する機能性食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
鉄は、地球上に存在する元素のうち、４番目に多くの量を占めているが、植物によって容易に利用できない。なぜならば、土壌で鉄は、ほとんどオキシ水酸化物（oxyhydrate）形態で存在し、溶解度も非常に低いためである。また、全世界土壌の約３０％は、塩基性を示す。このような性質を有する土壌で鉄は、溶解度がきわめて低いＦｅ2Ｏ3形態で存在し、植物の生長を困難にさせる（非特許文献１）。このように、鉄の不足は、植物に致命的な影響を及ぼす。特に、鉄の不足は、葉緑素の合成と葉緑体の発達とに影響を及ぼし、植物の生産量を減少させる。
【０００３】
鉄は、ヒトの健康にも重要な意味を有する。鉄は、細胞内のさまざまな機能に必要な必須不可欠な微量の金属元素のうち一つである。世界保健機構（ＷＨＯ）によれば、全世界人口の３０％ほどは、鉄不足による貧血にかかっており、そのほとんどは、開発途上国に集中している。亜鉛の不足は、植物の成長、ストレスに対する耐性及び葉緑素生成を阻害する。また、亜鉛は、ヒトの免疫反応に重要な役割を行い、感染に対する抵抗性を高め、細胞の生長、傷の回復に関与すると知られている。
【０００４】
植物は、２種の方法で鉄不足を克服すると知られている（非特許文献２）。ほとんどの植物は、Ｆｅ3+をＦｅ2+に還元させた後で吸収する一方、イネや麦のようなイネ科植物は、鉄が不足するとき、フィトシデオホア（phytosiderophore）という鉄結合物質を土壌に分泌してＦｅ3+を結合させて溶解度を高め、鉄とフィトシデオホアとの複合体（complex）を吸収する。
【０００５】
イネは、ヒトにとって重要な主食であり、多量の鉄を含有するイネ品種の開発は、ヒトの健康増進のために重要な意味を有する。従って、遺伝工学によって、鉄が多くのイネ品種を育成することは、伝統的な育種方法の限界を克服し、鉄不足による人類の健康問題を解決するための代案として提示されている（非特許文献３）。
【０００６】
このような努力の一環として、植物に本来存在する鉄保存蛋白質であるフェリチン（ferritin）の量を増加させて鉄含有量を高める方法が提示された（非特許文献４）。この方法は、豆のフェリチン遺伝子を胚乳特異的発現（endosperm−specific expression）を示すイネのグルテリン（glutelin）プロモーターを利用して形質転換させたものであり、生成されたイネ種子は、対照群に比べて、鉄含有量が３倍増加した（非特許文献５）。また、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）のフェリチン遺伝子をイネ種子で過発現させた結果、鉄含有量が２倍増加した（非特許文献６）。
【０００７】
特許文献１によれば、豆及びイネからフェリチンを発現する遺伝子を分離した後、イネ及びトウモロコシの種子保存蛋白質であるグロブリン、グルテリン及びゼインから分離された胚乳特異プロモーターと結合し、胚乳のみで特異的に発現する発現ベクターを製造し、この発現ベクターで形質転換させ、高濃度の鉄生産能を有したイネについて記述している。しかし、この方法は、イネ以外の作物である豆、トウモロコシなどから由来した遺伝子を利用するものである。
【０００８】
特許文献２によれば、ムギネ酸類生合成経路中の酵素であるニコチアナミンアミノ基転移酵素（ＮＡＡＴ：nicotianamine amintransferse）をコーディングする遺伝子をイネ科植物に導入し、鉄吸水性が改善されたイネ科植物を記述している。しかし、この方法は、ニコチアナミンアミノ基転移酵素をコーディングする遺伝子を利用するものである。
特許文献３によれば、ニコチアナミンのケト体を、２’−デオキシムギネ酸に還元する還元酵素をコーディングする遺伝子を導入し、鉄欠乏耐性が強化された植物を製造することを記述している。しかし、この方法は、ニコチアナミンのケト体を２’−デオキシムギネ酸に還元する還元酵素をコーディングする遺伝子を利用したものである。
【０００９】
一方、ニコチアナミン（ＮＡ：nicotianamine）は、植物体内に存在する金属元素と結合するキレータ（chelator）であり、金属元素の吸収と恒常性維持とに重要な役割を行う（非特許文献７）。ＮＡは、植物に存在するニコチアナミン合成酵素（ＮＡＳ：nicotianamine synthase）遺伝子によって、３個のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン分子から作られる。
【００１０】
高血圧は、慢性循環器系疾患のうち、発生頻度が最も高い疾患であり、血圧上昇の重要なメカニズムであるレニン−アンジオテンシンシステム（ＲＡＳ：renin−angiotensin system）で重要な酵素であるアンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ：angiotensin converting enzyme）は、アンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ：angiotensin Ｉ）をアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ：angiotension II）に転換する酵素であり、転換されたＡｎｇＩＩが血管を収縮させて血圧を上昇させると知られている。従って、高血圧を改善する目的として、ＡＣＥ阻害剤が開発されて商用されているが、ニコチアナミンがＡＣＥ阻害剤として作用するということを示すさまざまな報告があった（非特許文献８）。
【００１１】
本発明者は、イネに本来存在するＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ２遺伝子を活性化させたときの微量元素の含有量が増加するということを明らかにして、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】大韓民国登録特許第１０−４７１６７９号公報
【特許文献２】大韓民国登録特許第１０−４５４０８３号公報
【特許文献３】大韓民国公開特許第１０−２００３−８４８９２号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Mori，Curr Opin Plant Biol 2：250−253，1999
【非特許文献２】Marschner et al.,J．Plant Nutr 9：3−7，1986
【非特許文献３】Qu et al.,Planta 222：225−233，2005
【非特許文献４】Theil et al.,Annu Rev Biochem 56：289−315，1997
【非特許文献５】Goto et al.,Nat Biotech 17：282−286，1999
【非特許文献６】Lucca et al.,Theor Appl Genet 102：392−397，2001
【非特許文献７】Douchkov et al.,Plant Cell Environ 28：365−374，2005
【非特許文献８】Usuda et al.,Plant Biotech J 7：87−95，2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、植物体自体に存在する遺伝子の活性化による微量元素の含有量が、野生型に比べて増加した形質転換植物体、及び前記形質転換植物体から生成された産物を含有する機能性食品を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の例示的具体例は、微量元素の含有量が増加した植物体を提供する。
本発明の他の例示的具体例は、前記の本発明の例示的具体例による植物体を、鉄及び亜鉛から構成される群から選択された一つ以上が不足した条件で生育させる段階を含む、植物体を生育させる方法を提供する。
本発明の他の例示的具体例は、前記の本発明の例示的具体例による植物体を、過量の重金属が存在する条件で生育させる段階を含む、植物体を生育させる方法を提供する。
本発明の他の例示的具体例は、前記植物体を含むか、あるいはそれから生成された産物を含有する機能性食品を提供する。
本発明の他の例示的具体例は、前記植物体を含むか、あるいはそれから生成された産物を含有する薬学的組成物を提供する。
本発明の他の例示的具体例は、微量元素含有量が増加した植物体を製造する方法を提供する。
本発明の他の例示的具体例は、前記のような植物体を高いｐＨ条件で生育させる段階を含む、植物体を生育させる方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の一具体例による植物体によれば、野生型（ＷＴ）に比べて増加した微量元素の含有量を有することができる。
また、本発明の一具体例による機能性食品によれば、野生型（ＷＴ）に比べて増加した微量元素の含有量を有しており、高い農業的及び栄養学的な利益を有することができる。
また、本発明の一具体例による微量元素含有量が増加した植物体を製造する方法によれば、微量元素含有量が増加した植物体を効果的に製造することができる。
また、本発明の一具体例による植物体を生育させる方法によれば、植物体を、鉄または亜鉛のような重金属が不足した量で含まれた生育条件、または銅、亜鉛またはニッケルのような重金属が過量に含まれた生育条件で植物体を生育させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｔ−ＤＮＡが挿入されたＤＮＡ構造体の一形態を示した図面である。
【図２Ａ】ＭＳ培地にそれぞれ０，１，１０，５００μＭ Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡを添加した培地で、７日間育ったイネの葉または根で、ＯｓＮＡＳ２遺伝子の発現様相を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを利用して分析したグラフである。
【図２Ｂ】イネ種子を１００μＭ Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡを添加していないＭＳ培地で７日間育てた後、１００μＭ Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡを添加した培地に移して生育させた後、一定の時間に、イネの葉及び根から抽出したＲＮＡから、ＯｓＮＡＳ２の発現を測定した結果である。
【図３】ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１及びその野生型（ＷＴ）について、ＯｓＮＡＳ２の発現量を比較したグラフである。
【図４】鉄及び亜鉛をいずれも含むＭＳ固体培地（ＭＳ）、鉄を含有しないＭＳ固体培地（Ｆｅ−）、亜鉛を含有しないＭＳ固体培地（Ｚｎ−）で育てた野生型（ＷＴ）及びＯｓＮＡＳ２−Ｄ１の表現型である。
【図５】ｐＨ８．５に合わせたＭＳ培地（ＭＳ／ｐＨ８．５）、ｐＨ８．５であって、鉄を含有しないＭＳ培地（Ｆｅ−／ｐＨ８．５）で生育させた野生型（ＷＴ）及びＯｓＮＡＳ２−Ｄ１の表現型及び伸長を示した図面である。
【図６】過量の亜鉛（５ｍＭ）、銅（０．３ｍＭ）またはニッケル（０．５ｍＭ）が添加されたそれぞれの固体ＭＳ培地で育てた野生型（ＷＴ）及びＯｓＮＡＳ２−Ｄ１の表現型である。
【図７】Ｔ−ＤＮＡが挿入されたＤＮＡ構造体の一形態を示した図面である。
【図８】ＭＳ培地及びＭＳ培地で、Ｆｅ、Ｚｎ、ＣｕまたはＭｎを含まない培地で育ったイネの葉または根で、ＯｓＮＡＳ１遺伝子の発現様相を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを利用して分析したグラフである。
【図９】ＭＳ培地及びＭＳ培地で、Ｆｅ、Ｚｎ、ＣｕまたはＭｎを含まない培地で育ったイネの葉または根で、ＯｓＮＡＳ２遺伝子の発現様相を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを利用して分析したグラフである。
【図１０】ＭＳ培地及びＭＳ培地で、Ｆｅ、Ｚｎ、ＣｕまたはＭｎを含まない培地で育ったイネの葉または根で、ＯｓＮＡＳ３遺伝子の発現様相を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを利用して分析したグラフである。
【図１１】ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１及びとその野生型（ＷＴ）、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ２及びその野生型（ＷＴ）で、ＯｓＮＡＳ３の発現量を比較したグラフである。
【図１２】鉄及び亜鉛をいずれも含有するＭＳ固体培地（ＭＳ）、鉄を含有しないＭＳ固体培地（Ｆｅ−）、亜鉛を含有しないＭＳ固体培地（Ｚｎ）で育てた野生型（ＷＴ）及びＯｓＮＡＳ３−Ｄ１の表現型及び白化現象を知るための葉を示したイメージである。
【図１３】過量の亜鉛（５ｍＭ）、銅（０．３ｍＭ）またはニッケル（０．５ｍＭ）が添加されたそれぞれの固体ＭＳ培地で育てた野生型（ＷＴ）とＯｓＮＡＳ３−Ｄ１との表現型及び伸長を示した図面である。
【図１４】ｐＨ８．５に合わせたＭＳ培地（ＭＳ／ｐＨ８．５）、ｐＨ８．５であって鉄を含有しないＭＳ培地（Ｆｅ−／ｐＨ８．５）で育てた野生型（ＷＴ）とＯｓＮＡＳ３−Ｄ１との表現型及び伸長を示した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の例示的具体例は、微量元素の含有量が増加した植物体を提供する。
前記植物体は、鉄、亜鉛及び銅から選択される一つ以上の金属含有量が野生型植物体に比べて増加しているものであってもよい。例えば、前記植物体は、鉄及び／または亜鉛が野生型植物体に比べて増加しているものであってもよい。前記金属含有量の増加した程度は、１０％以上、２０％以上、３０％以上、５０％以上または７０％以上であってもよい。
【００１９】
前記植物体は、ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ２遺伝子の発現が増加しているものであってもよい。前記ＯｓＮＡＳ２遺伝子は、配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ許可番号：ＡＢ０２３８１８）のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコーディングする遺伝子であってもよい。例えば、前記遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有するものであってもよい。しかし、前記ＯｓＮＡＳ２遺伝子は、ＯｓＮＡＳ２蛋白質活性を有するポリペプチドをコーディングするものであれば、いずれのものでも含まれる。例えば、ＯｓＮＡＳ２蛋白質活性を有する、前記配列番号２のような蛋白質の変異体が含まれてもよいが、それらの例に限定されるものではない。前記ＯｓＮＡＳ３遺伝子は、配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ許可番号：ＡＢ０２３８１９）のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコーディングする遺伝子であってもよい。例えば、前記遺伝子は、配列番号１０のヌクレオチド配列を有するものであってもよい。しかし、前記ＯｓＮＡＳ３遺伝子は、ＯｓＮＡＳ３蛋白質活性を有するポリペプチドをコーディングするものであれば、いずれも含まれる。例えば、ＯｓＮＡＳ３蛋白質活性を有する、前記配列番号１１のような蛋白質の変異体が含まれてもよいが、それらの例に限定されるものではない。
【００２０】
前記植物体は、単子葉植物であってもよい。例えば、イネ、麦及びトウモロコシである。前記植物体は、植物体全体、根、葉、種子及び前記植物体から分離された細胞であってもよい。また、前記植物体には、植物体から生産された種子も含まれる。
【００２１】
前記植物体において、ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の発現を増加させることは、細胞内に存在する内在的遺伝子の発現を増加させることと関連した分野で公知の任意方法によってなされたものであってもよい。例えば、トランスポーザブル要素（ＴＥ：transposable element）や、Ｔ−ＤＮＡのような挿入要素（insertion element）を植物体のゲノム内に導入する挿入突然変異法が使われてもよい。挿入突然変異法は、挿入された要素が遺伝子確認のためのタグ（tag）として作用するという利点がある。また、変形された挿入突然変異法が使われてもよい。変形された挿入突然変異法の一例は、前記タグされる遺伝子と、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）または緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のようなリポーター遺伝子とを融合させることを含む遺伝子捕獲システム（gene trap system）である。このシステムによれば、発現様相に基づいて、遺伝子を確認することができる。プロモーターのないリポーターの挿入は、正常遺伝子機能を破壊するだけではなく、挿入されたリポーター遺伝子の方向が合えば、リポーターが発現され、挿入された遺伝子の発現を反映するので、有用なプロモーター分離も可能である。変形された挿入突然変異法の他の例は、活性化タグシステム（activation tagging system）である。このシステムは、マルチマー化されたＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーを含むＴ−ＤＮＡまたはＴＥ（transposable element）を使用する。エンハンサーは、方向に関係なく、コーディング領域から相当な距離でも機能を果たすために、隣接する遺伝子の転写活性化を引き起こし、優性機能獲得突然変異体（dominant gain-of-function mutations）を形成させることができる。前記方法によって形成された突然変異体のうち、ＯｓＮＡＳ２遺伝子の発現の増加した個体を選抜することによって、前記植物体を得ることができる（Jung et al.,Plant Physiology 130：1636−1644）。前記ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーは、例えば、配列番号１２のヌクレオチド配列を有するものであってもよい。前記植物体は、例えば、前記ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の発現を増加させるために、エンハンサーの導入されたもの、または前記遺伝子のコピー数が増幅されたものであってもよい。前記エンハンサーの例としては、ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサー（Cauliflower mosaic virus ３５Ｓ enhancer）またはそれらの連結体（例えば、４個の連結体）であって、それらエンハンサーは、ベクター、例えば、ｐＧＡ２７１５（Jung et al.,Plant Physiology 130：1636−1644）及びｐＧＡ２７７２（Jung et al.,Plant J 45：123−132，2006）のような活性化タグベクター（activation tagging vector）によって、植物体のゲノム内に導入されるものであってもよい。前記エンハンサーは、選択されたエンハンサーの特性によって、前記ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子と適切な位置に配置されてもよい。例えば、前記ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の５’，３’または５’及び３’の末端に隣接（flank）したり、離隔されて位置しうる。例えば、前記エンハンサーは、ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーであり、前記ＯｓＮＡＳ２遺伝子の下流（downstream）、例えば、遺伝子の中止コードンからの下流に約１０ｋｂ以内、例えば、約２．０６ｋｂに導入されたものであってもよい。また、前記��ンハンサーは、ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーであり、前記ＯｓＮＡＳ２遺伝子の上流（upstream）、例えば、遺伝子の開始コードンから上流に約１０ｋｂ以内、例えば、約２．０６ｋｂに導入されたものであってもよい。例えば、前記エンハンサーは、ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーであり、前記ＯｓＮＡＳ３遺伝子の下流（downstream）、例えば、遺伝子の中止コードンからの下流に１０ｋｂ以内、例えば、１．５ｋｂ及び／または１．９ｋｂに導入されたものであってもよい。また、前記エンハンサーは、ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーであり、前記ＯｓＮＡＳ３遺伝子の上流（upstream）、例えば、遺伝子の開始コードンから上流に１０ｋｂ以内、例えば、１．５ｋｂ及び／または１．９ｋｂに導入されたものであってもよい。前記エンハンサーは、単独または複数個が連結しているものであってもよい。例えば、前記エンハンサーは、４個コピーのＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーが連続して連結されているものであってもよい。
【００２２】
植物体に、外来核酸構造体、例えば、エンハンサーを導入する方法は、公知である。例えば、前記構造体の導入は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｔｉプラスミド、電気穿孔（electroporation）及び衝撃法（bombardment）を介して導入されてもよい。また、植物体に外来核酸構造体を導入することは、特定の位置に位置特異的に導入したり、ランダムに導入した後、特定の形質を有する植物体を選抜することによってなされてもよい。
【００２３】
前記植物体の一例は、種子受託番号：ＫＡＣＣ ９８００８Ｐ、種子受託番号：ＫＡＣＣ ９８００４ＰまたはＫＡＣＣ ９８００５Ｐで寄託されたイネであってもよい。前記植物体の他の例は、種子受託番号ＫＣＴＣ １１５９７ＢＰで寄託されたＯｓＮＡＳ２−Ｄ１イネ（Oryza sativa）、または種子受託番号ＫＣＴＣ １１５９８ＢＰで寄託されたＯｓＮＡＳ３−Ｄ１イネ（Oryza sativa）であってもよい。前記イネは、鉄及び亜鉛の含有量が野生型イネに比べて増加している。また、前記イネは、亜鉛、銅またはニッケルが増加した条件で、耐性を有して生育可能である。
【００２４】
本発明の他の例示的具体例は、重金属に対して耐性を有する植物体を提供する。前記植物体については、前記の通りである。前記重金属は、亜鉛、銅及びニッケルから選択される一つ以上であってもよい。前記耐性の程度は、５ｍＭ以上の亜鉛、０．３ｍＭ以上の銅または０．５ｍＭ以上のニッケルで生育しうるものであってもよい。
【００２５】
本発明の他の例示的具体例は、前記の本発明の例示的具体例による植物体を、鉄及び亜鉛から構成される群から選択された一つ以上が不足した条件で生育させる段階を含む、植物体を生育させる方法を提供する。前記鉄及び亜鉛の濃度は、例えば、鉄及び亜鉛が含まれていないＭＳ培地、またはそれと類似した条件で培養するものであってもよい。
【００２６】
本発明の他の例示的具体例は、前記の本発明の例示的具体例による植物体を過量の重金属が存在する条件で生育させる段階を含む、植物体を生育させる方法を提供する。前記重金属は、５ｍＭ以上の亜鉛、０．３ｍＭ以上の銅または０．５ｍＭ以上のニッケルであってもよい。
【００２７】
本発明の他の例示的具体例は、前記植物体を含むか、あるいはそれから生成された産物を含有する機能性食品を提供する。前記機能性食品は、鉄、亜鉛及び銅から選択された一つ以上が増加しているものである。前記機能性食品は、前記植物体の種子、例えば、コメを含むか、あるいはそれから加工された産物であってもよい。
【００２８】
本発明の他の例示的具体例は、前記植物体を含むか、あるいはそれから生成された産物を含有する薬学的組成物を提供する。前記植物体は、根、葉、茎、種及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよい。また、前記産物は根、葉、茎、種及びそれらの組み合わせからなる群から選択される植物体を加工して得られるものであってもよい。例えば、前記植物体を物理的または化学的に処理して得られるものであってもよい。例えば、前記産物は、前記植物体を蒸熟、粉砕、抽出、分離精製及びそれらの組み合わせから選択される一つ以上の過程を経て得られるものであってもよい。
【００２９】
前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤または担体を含んでもよい。前記担体または希釈剤は、当業界に公知の任意の担体であってもよい。前記担体または希釈剤は、一般的な賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤のうち、１種または２種以上を選択的に使用することができる。例えば、前記組成物を錠剤あるいは硬質カプセル剤などの固形剤形に製造する場合、賦形剤として、非晶質セルロース、乳糖、低置換度ヒドロキシセルロースなどが使われ、崩壊剤として、澱粉グルコール酸ナトリウム、無水リン酸一水素カルシウムなどが使われてもよい。結合剤としては、ポリビニルピロリドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどが使われる、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、タルクなどから選択して使用することができる。
【００３０】
前記組成物は、顆粒剤、散剤、液剤、錠剤、カプセル剤または乾燥シロップ剤などの経口用製剤、または注射剤などの非経口用剤形に製剤化可能であるが、かような剤形に限定されるものではない。望ましくは、前記組成物は、顆粒、錠剤またはカプセル剤の形態であるか、あるいは液剤または注射剤の形態である。
【００３１】
前記組成物で使われる前記植物体またはその産物の治療学的に有効な量は、前記植物体中の微量元素の含有量、及びそれを必要とする個体の年齢、性別、疾病の軽重及び体重などの状況を判断して、当業者が容易に決定することができる。例えば、前記植物体または産物がコメである場合、前記量は、一日１００ｇないし５００ｇ、例えば、１００ｇないし４００ｇ、１００ｇないし３００ｇ、２００ｇないし３００ｇ、または１５０ないし３００ｇである。
【００３２】
前記組成物は、経口または非経口で投与可能である。例えば、前記組成物は、経口、例えば、一般的な食事を介して経口的に投与可能である。また、前記投与は、１日１回または数回に分けて投与可能である。
【００３３】
前記組成物は、鉄、亜鉛、銅及びそれらの組み合わせから選択される物質の不足によって引き起こされる疾病を治療するためのものであってもよい。前記疾病は、鉄欠乏症状であってもよい。前記鉄欠乏症状は、例えば、貧血（anemia）、疲労（fatigue）、蒼白（pallor）、毛髪損傷（hair loss）、易刺激性（irritability）、弱気（weakness）、異食症（pica）、手足の爪割れ（brittle or grooved nails）、プランマー・ヴィンソン症候群（Plummer-Vinson syndrome）及び損傷された免疫機能（impaired immune function）を含む。前記疾病は、亜鉛欠乏（zinc deficiency）によって引き起こされる症状を含む。前記疾病は、低亜鉛血症（hypozincemia）でもある。低亜鉛血症は、代謝要求に必要な亜鉛が十分ではない状態をいう。亜鉛欠乏症状は、毛髪損傷、皮膚損傷（skin lesion）、下痢、体組織の減退（wasting of body tissue）である。腸性肢端皮膚炎（acrodermatitis enteropathica）、拒食症（anorexia）、認知機能及び運動機能の喪失（cognitive and motor function impairment）及び無月経症（dysmenorrhea）を含む。前記疾病は、銅欠乏によって引き起こされる疾病である。銅欠乏は、貧血症（syndrome of anemia）または汎血球減少症（pancytopenia）、神経退化（neurodegeration）、メンケス病（Menkes disease）、痙縮（spasticity）、調和運動不能（ataxia）及び神経障害（neuropathy）である。
本発明の他の例示的具体例は、微量元素含有量が増加した植物体を製造する方法を提供する。
【００３４】
前記方法の一例は、外来エンハンサーを含む構造体を植物体に導入し、ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の発現が増加した植物体を得る段階を含む。エンハンサー、植物体、前記構造体を植物体に導入する方法、及びＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子については、前記の通りである。前記ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の発現が増加したか否かは、当業界に公知の方法によってなされてもよい。例えば、直接的な酵素活性測定、核酸増幅方法によるＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子のｍＲＮＡ水準の測定、または発現された蛋白質の量を測定することによってなされる。前記核酸増幅方法には、ＲＴ−ＰＣＲなどを含んだＰＣＲが含まれる。前記蛋白質の量測定には、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティングのような免疫学的方法が使われてもよい。前記方法は、前記ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の発現が増加するか否かということと共に、鉄、亜鉛及び銅から選択された一つ以上が野生型に比べて増加したか否かを決定する段階をさらに含んでもよい。鉄及び／または亜鉛の含有量を測定する方法は、公知である。
【００３５】
例えば、前記方法は、花キャベツモザイクウイルスのプロモーターから由来した３５Ｓエンハンサーが挿入されたＴｉプラスミドを植物体導入する段階と、前記３５ＳエンハンサーがＯｓＮＡＳ２活性またはＯｓＮＡＳ３活性をコーディングする遺伝子の上流及び下流のうち、一つ以上の位置に挿入された植物体を選抜する段階と、を含むものである。
前記Ｔｉプラスミドは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに含まれた円形プラスミドであり、植物体に遺伝物質を導入するために使われる。前記３５ＳエンハンサーをＴｉプラスミドに導入することは、適切な制限酵素及びリガーゼなどを使用して、当業者が容易に製造することができる。前記３５Ｓエンハンサーは、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの左側及び／または右側の境界（border）に位置しうる。前記３５Ｓエンハンサーは、一つ以上、例えば、４個が隣接しているものであってもよい。例えば、ｐＧＡ２７１５ベクターまたはｐＧＡ２７７２ベクターによって挿入されてもよい。前記Ｔｉプラスミドを植物体に導入することは、Ｔｉプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入し、Ｔｉプラスミドが導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスを植物体に感染させることによって、なされてもよい。一般的に、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域が植物体の染色体に挿入される。
【００３６】
前記方法は、前記３５ＳエンハンサーがＯｓＮＡＳ２活性またはＯｓＮＡＳ３活性をコーディングする遺伝子の上流及び下流のうち、一つ以上の位置に挿入された植物体を選抜する段階を含む。「ＯｓＮＡＳ２活性」とは、３分子のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを、３ Ｓ−メチル−５’−チオアデノシン＋ニコチアナミンに転換させたり、あるいはその逆に転換させる反応を触媒する活性を意味する。望ましくは、前記ＯｓＮＡＳ２活性は、配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質によるものであってもよい。前記ＯｓＮＡＳ２活性をコーディングする遺伝子には、配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質をコーディングする遺伝子、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列を有するものであってもよい。前記３５Ｓエンハンサーが、ＯｓＮＡＳ２をコーディングする遺伝子の上流及び下流のうち一つ以上の位置に挿入されたか否かということは、配列分析または核酸増幅によってなされてもよい。前記植物体は、望ましくは、イネ（oryza sativa）である。例えば、前記３５Ｓエンハンサーは、ＯｓＮＡＳ２活性をコーディングする配列番号１の塩基配列の下流約２．０６ｋｂに挿入されてもよい。
【００３７】
「ＯｓＮＡＳ３活性」とは、３分子のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを、３ Ｓ−メチル−５’−チオアデノシン＋ニコチアナミンに転換させたり、あるいはその逆に転換させる反応を触媒する活性を意味する。望ましくは、前記ＯｓＮＡＳ３活性は、配列番号１１のアミノ酸を有する蛋白質によるものであってもよい。前記ＯｓＮＡＳ３活性をコーディングする遺伝子には、配列番号１１のアミノ酸を有する蛋白質をコーディングする遺伝子、例えば、配列番号１０のヌクレオチド配列を有するものであってもよい。前記３５Ｓエンハンサーが、ＯｓＮＡＳ３をコーディングする遺伝子の上流及び下流のうち一つ以上の位置に挿入されたか否かということは、配列分析または核酸増幅によってなされてもよい。前記植物体は、望ましくは、イネ（oryza sativa）である。例えば、前記３５Ｓエンハンサーは、ＯｓＮＡＳ３活性をコーディングする配列番号１０の塩基配列の下流約１．５ｋｂまたは約１．９ｋｂに挿入されてもよい。
【００３８】
図１は、Ｔ−ＤＮＡが挿入されたＤＮＡ構造体の一形態を示したものである。図１で、ＡＴＧからＴＧＡまでのボックスで表示された部分は、ＯｓＮＡＳ２遺伝子のエクソンを示す。Ｔ−ＤＮＡは、ＯｓＮＡＳ２遺伝子のＴＧＡ終結コードンの後、約２．０６ｋｂに挿入可能である（ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１形質転換植物体）。
【００３９】
図６は、Ｔ−ＤＮＡが挿入されたＤＮＡ構造体の一形態を示したものである。図６で、ＡＴＧからＴＧＡまでのボックスで表示された部分は、ＯｓＮＡＳ３遺伝子のエクソンを示す。Ｔ−ＤＮＡは、ＯｓＮＡＳ３遺伝子のＴＧＡ終結コードンの後、約１．５ｋｂに挿入可能である（ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１形質転換植物体）。また、Ｔ−ＤＮＡは、ＯｓＮＡＳ３遺伝子のＴＧＡ終結コードンの後、約１．９ｋｂに挿入可能である（ＯｓＮＡＳ３−Ｄ２形質転換植物体）。
【００４０】
本発明の他の例示的具体例は、前記のような植物体を高いｐＨ条件で生育させる段階を含む、植物体を生育させる方法を提供する。
前記ｐＨは、８．５ないし１４、例えば、８．５ないし１２であってもよい。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明について、実施例によって詳細に説明する。しかし、本発明は、下記実施例によって制限されるものではない。
実施例１：ＯｓＮＡＳ２遺伝子の発現が活性化された形質転換植物体の分離
（１）イネに存在するニコチアナミン合成酵素２（ＯｓＮＡＳ２）遺伝子の発現分析
イネには、３個のニコチアナミンシンターゼ（nicotianamine synthase）（ＯｓＮＡＳ１、ＯｓＮＡＳ２、ＯｓＮＡＳ３）が存在し、酵素としての活性があることが報告されている（Inoue et al.,Plant J 36：366−381，2003）。外部から供給した鉄の濃度によるＯｓＮＡＳ２遺伝子の発現程度を調べた。イネの種子を、ＭＳ培地（０．１μＭ ＣｕＳＯ4、１００μＭ Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ、３０μＭ ＺｎＳＯ4、１０μＭ ＭｎＳＯ4を含む）と、それぞれ０μＭ、１μＭ、１０μＭ及び５００μＭのＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡが添加されたＭＳ培地とでイネ種子を発芽させ、７日間生育させた。また、イネ種子を、１００μＭ Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡを添加していないＭＳ培地で７日間生育させた後、１００μＭ Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡを添加したＭＳ培地に植え移して生育させ、ＯｓＮＡＳ２の発現変化を確認した。
イネの根及び葉からＲＮＡを準備し、その発現程度を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで分析した。ＰＣＲ条件は、９５℃で１分を維持した後、９４℃で１５秒、５６℃で１０秒及び７２℃で１０秒を４５回反復した。使用したプライマーは、次の通りである。発現対照群として、イネアクチン１遺伝子を増幅した。
【００４２】
プライマー配列
ＯｓＮＡＳ２−フォワードプライマー：５’−ＣＧＴＣＴＧＡｇｔｇｃｇｔｇｃａｔａｇｔａ−３’（配列番号３）
ＯｓＮＡＳ２−リバースプライマー：５’−ＧＡＡＧＣＡＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＣＧＡＴＡ−３’（配列番号４）
ＯｓＡｃｔ１−フォワードプライマー：５’−ＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＴＡＴＣＣＡＴ−３’（配列番号５）
ＯｓＡｃｔ１−リバースプライマー：５’−ＴＡＣＴＣＡＧＣＣＴＴＧＧＣＡＡＴＣＣＡＣＡ−３’（配列番号６）
【００４３】
その結果を図２Ａ及び図２Ｂに示した。図２Ａ及び図２Ｂで、縦軸は、イネアクチン１遺伝子の発現量を基準に発現程度を示している。
図２Ａから分かるように、ＯｓＮＡＳ２遺伝子は、イネが鉄を含まない培地で育つ場合、葉では強く誘導されたが、１μＭ以上のＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡを含む培地では、発現していない。根では、鉄を含まない培地で育った場合が発現が最も高く、鉄の濃度が上昇するほど、発現は低減した。図２Ｂは、１００μＭのＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡを培地に供給し、経時的なＯｓＮＡＳ２の発現を示したものである。図２Ａ及び図２Ｂで使われるイネは、トンジンイネである。
【００４４】
（２）ＯｓＮＡＳ２遺伝子の発現が活性化された形質転換植物体の製造及び分離
形質転換イネを製造するための構造体として、Ｔ−ＤＮＡベクターであるｐＧＡ２７１５ベクターを利用した（Jeong et al.,Plant Physiol 130：1636−1644，2002）。前記ベクターは、右側境界に隣接し、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）リポーター遺伝子を含んでおり、左側境界に隣接し、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター由来テトラマー化された転写エンハンサーを含む。前記ｐＧＡ２７１５ベクターを、アグロバクテリウムに形質転換させ、形質転換されたアグロバクテリウムを利用して、野生型のトンジンイネに形質転換し、ｐＧＡ２７１５が形質導入されたイネ植物体集団を製造した（Lee et al.,J Plant Biol 42：310−316，1999；Jeong et al.,Plant Physiol 130：1636−1644，2002；Jeong et al.,Plant Journal 45：123−132，2006）。
【００４５】
形質導入されたイネ植物体から分離されたゲノムＤＮＡに係わり、逆転ＰＣＲ（inverse ＰＣＲ）を介して、ｐＧＡ２７１５ベクター中のＴ−ＤＮＡが挿入された位置を確認した。その結果、Ｔ−ＤＮＡがＯｓＮＡＳ２遺伝子の周辺に挿入された１個の形質転換植物体（ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１）を分離した。
ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１形質転換植物体は、ＯｓＮＡＳ２遺伝子の下流約２．０６ｋｂに、３５Ｓエンハンサーを左側境界部位に含むＴ−ＤＮＡが挿入されている。図１は、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１で、Ｔ−ＤＮＡの挿入位置を示したものである。
【００４６】
実施例２：形質転換植物体でのＯｓＮＡＳ２の発現増加
前記実施例１で選別されたＯｓＮＡＳ２−Ｄ１の遺伝型をＰＣＲを介して決定した。ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１のＴ２世代個体の葉からゲノムＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲのテンプレートＤＮＡとして使用した。ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１に係わっては、２個の遺伝子特異的プライマーＦ（５’−ＡＣＣＴＴＡＣＴＣＣＣＣＣＧＡＡＣＴＡＡ−３’：配列番号７）及びプライマーＲ（５’−ＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＣ−３’：配列番号８）、並びにＴ−ＤＮＡ特異的プライマーＲＢ（５’−ＣＡＡＧＴＴＡＧＴＣＡＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＣＡＣ−３’：配列番号９）を使用した。発現量を知るために、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１の同型接合体、及びそれぞれの野生型イネ、すなわち、トンジンイネ（ＷＴ）の、１００μＭ Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡを添加したり、あるいは添加していない培地で７日間育った幼苗（seedling）の葉及び根、枝葉（flag leaves）、１０ｃｍサイズの花（flower）及び未成熟種子（immature seeds）からＲＮＡを分離し、逆転写酵素を利用して、それぞれのｃＤＮＡを製造した。製造したｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号１、２のプライマーを利用して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを遂行し、ＯｓＮＡＳ２遺伝子転写量を比較し、その結果を図３に示した。図３で、縦軸は、イネアクチン１遺伝子転写量に係わる相対的な転写量を示したものである。
図３でのように、ＯｓＮＡＳ２遺伝子の発現は、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１では、野生型（ＷＴ）に比べて、実験したあらゆる条件で増加した。
【００４７】
実施例３：形質転換植物体の種子でのニコチアナミン量の増加
ＯｓＮＡＳ２遺伝子の発現の増加が、作用酵素の産物であるニコチアナミン量の増加に係わる影響を知るために、種子でニコチアナミン量(nicotiamine)を測定した。種子を、マルチビーズショッカー（商標登録）（安井器械（株）、大阪）を利用して細かく砕いた後、２０ｍｇの粉から、４００μｌの８０％エタノールを利用して、１５分間３回にわたってニコチアナミンを抽出した。抽出されたニコチアナミンを、ＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳを利用して、定量的分析を行った。その結果を下記表１に示した。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
表１から分かるように、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１種子のニコチアナミン量は、野生型に比べて約１９．８倍増加した。
【００５０】
実施例４：形質転換植物体での微量元素含有量の測定
ＯｓＮＡＳ２遺伝子の活性化が、イネの微量元素蓄積に及ぼす影響を知るために、野生型（ＷＴ）、形質転換植物体であるＯｓＮＡＳ２−Ｄ１で微量元素を測定した。野生型と形質転換植物体との成熟した種子及び枝葉（flag leaves）を試料として使用し、微量元素測定方法は、Lee et al.,Plant Physiol 150：786−800，2009に記載された方法を参考にした。試料を７０℃で２日間乾燥させ、乾燥量を記録し、得た試料を１１Ｎ ＨＮＯ3 １ｍｌで、３日間１８０℃オーブンで分解させた。希釈した後、原子吸収分光分析法（ＡＡＳ：atomic absorption spectroscopy）（ＳｐｅｃｔｒＡＡ−８００，Ｖａｒｉａｎ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって、試料内微量元素鉄と亜鉛との含有量を測定した。表２は、形質転換植物体中の微量元素含有量を示している。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
表２から分かるように、成熟した種子で、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１は野生型に比べて、鉄は３．０倍、亜鉛は２．７倍、銅は１．２倍増加した。枝葉では、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１が野生型と比較するとき、鉄と亜鉛とは１．４倍、銅は１．５倍増加した。
【００５３】
実施例５：鉄と亜鉛とが不足した条件での形質転換植物体の幼苗表現型分析
鉄と亜鉛とが不足した条件で、ＯｓＮＡＳ２遺伝子の活性化が及ぼす影響を調べた。鉄と亜鉛とを両方含有するＭＳ固体培地、鉄を含有しないＭＳ固体培地（Ｆｅ−）、亜鉛を含有しないＭＳ固体培地（Ｚｎ−）で、野生型（ＷＴ）及びＯｓＮＡＳ２−Ｄ１を発芽させ、８日間生育させて幼苗表現型を観察した。その結果を表３に示した。また、表現型の伸長と葉緑素の含有量とを測定して、表３に示した。葉緑素の測定は、葉を採取し、重さを測定し、８０％アセトンを利用して抽出した。液体窒素を利用して凍らせた後、細かく砕いた葉と８０％アセトンとを十分に混ぜ（葉１００ｍｇ当たり１ｍｌ ８０％アセトン添加）、氷に１５分放置後、１５，０００ｇで遠心分離し、上澄み液を分周し、６６６ｎｍ及び６４６ｎｍで吸光度を測定した後、Arnon，Plant Physiol 24：1−15，1949に記載された方法で、葉緑素ａと葉緑素ｂとを含む葉緑素の量を測定した。
【００５４】
【表３】
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【００５５】
図４及び表３から分かるように、鉄と亜鉛とをいずれも含有する培地（ＭＳ）条件では、前記の通り、表現型の違いを示していない。しかし、鉄を含有しない培地（Ｆｅ−）条件では、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１は、野生型（ＷＴ）に比べて、高さも高く、葉緑素も、野生型（ＷＴ）に比べて、５０％以上増加し、鉄不足の代表的症状である白化現象（chlorosis）も、さらに少なく進んでいた。従って、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１は、野生型に比べて、鉄が不足した生育条件で、さらに耐えるということが分かる。亜鉛を含有しない培地条件（Ｚｎ−）でも、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１は、野生型（ＷＴ）に比べて、生長速度が速かった。従って、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１は、野生型（ＷＴ）に比べて、亜鉛が不足した生育条件でも、さらに望ましく育つということが分かる。
前記実験結果を検証するために、それぞれの条件で、幼苗時期の野生型（ＷＴ）及びＯｓＮＡＳ２−Ｄ１の茎と根とを採取し、鉄と亜鉛との濃度を、前記実施例４と同じ方法で測定した。その結果を表４に示した。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
図３から分かるように、鉄と亜鉛とを両方含有する培地（ＭＳ）条件では、前記で調べたように、表現型の差はなかった。しかし、表４から分かるように、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１は、野生型（ＷＴ）に比べて、鉄の濃度が茎と根とで、それぞれ１．６倍、１．４倍増加し、亜鉛の濃度は、茎と根とで、それぞれ１．８倍、１．４倍増加した。また、鉄を含有しない培地条件では、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１は、野生型（ＷＴ）に比べて、鉄の濃度が茎と根とで、それぞれ１．９倍、１．８倍増加し、亜鉛の濃度は、茎と根とで、１．７倍、１．５倍増加した。また、亜鉛を含有しない培地条件でも、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１は、野生型（ＷＴ）に比べて、亜鉛の濃度が茎と根とで、いずれも１．７倍増加し、鉄の濃度は、茎と根とで、それぞれ１．５倍、１．７倍増加した。従って、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１は、鉄または亜鉛が不足した生育条件で、さらに耐えるということが分かる。
【００５８】
実施例６：ｐＨが高い条件での形質転換植物体の表現型観察
土壌のｐＨは、植物に必要な元素の溶解度に多くの影響を及ぼす。例えば、ｐＨが８．０以上であるならば、鉄は、溶解度が低いＦｅ2Ｏ3形態に変化し、植物が正常に利用及び吸収することができない状態となる。その結果、鉄不足現象を起こすことになる。
ｐＨ８．５に合わせたＭＳ培地（ＭＳ／ｐＨ８．５）で、野生型（ＷＴ）及びＯｓＮＡＳ２−Ｄ１を発芽させ、１０日間生育させて表現型を観察した。また、鉄を含有しないＭＳ培地（Ｆｅ−／ｐＨ８．５）でも、同じ方法を実施して表現型を観察した。表現型と植物体の伸長とを図５に示した。図５から分かるように、ｐＨ８．５に合わせたＭＳ培地（ＭＳ／ｐＨ８．５）で、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１が野生型（ＷＴ）に比べ、伸長も大きく、かつさらに耐えるということが分かる。かような結果は、鉄を含有しないＭＳ培地（Ｆｅ−／ｐＨ８．５）で、さらに明らかに示された。
【００５９】
実施例７：過量の重金属が含まれていた条件での形質転換植物体の表現型分析
ＯｓＮＡＳ２活性化が、過量の重金属処理時に発生する毒性にいかなる影響を与えるかを調べた。過量の亜鉛（５ｍＭ）、銅（０．３ｍＭ）またはニッケル（０．５ｍＭ）がそれぞれ添加された固体ＭＳ培地で、野生型（ＷＴ）及びＯｓＮＡＳ２−Ｄ１を発芽させ、１０日間育て、幼苗表現型を観察した。表現型、植物体の伸長及び重金属の濃度を、図６及び表５に示した。
【００６０】
図６及び表５から分かるように、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１は、野生型に比べて、高さも高く、白化現象がさらに遅く進んでいた。かような結果は、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１が、野生型（ＷＴ）に比べて、過量の重金属による毒性に対する耐性が向上しているということを示している。
【００６１】
【表５】
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【００６２】
特に、過量の亜鉛、銅及びニッケルを含有する固体ＭＳ培地で育てたとき、茎と根との亜鉛、銅及びニッケル濃度を、前記実施例４と同じ方法で測定し、その結果を表６に示した。
【００６３】
【表６】
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【００６４】
表６から分かるように、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１は、野生型（ＷＴ）に比較して、茎と根とで、亜鉛は１．４倍、１．５倍、ニッケルは１．４倍、銅は、それぞれ１．４倍、１．２倍増加した。
【００６５】
実施例７：鉄の生物学的利用度（bioavailability）調査
ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１の種子の鉄増加が、種子摂取時に吸収されて利用される鉄の生物学的利用度の増加いかんを知るために、マウス食餌分析（mouse feeding assay）を行った。
生後３週間になったメスＢａｌｂ／ｃマウスに、鉄が十分な飼料（ＡＩＮ−９３Ｇ Purified Diet−４５ｍｇＦｅ／ｋｇ飼料、Control Diet（ＣＤ））と、鉄が不足した飼料（modified ＡＩＮ−９３Ｇ diet containing iron ３ｍｇ／ｋｇ飼料、Iron−depleted Diet（ＩＤ））を供給した。２週間後、この２グループのネズミから血液を採取した。これは、貧血を誘発すると同時に、貧血の程度を知るために、血液のヘモグロビン（Ｈｂ）とヘマトクリット（Ｈｃｔ）とを測定するためである。測定結果、鉄が不足した飼料を食べさせたネズミのヘモグロビン（Ｈｂ）とヘマトクリット（Ｈｃｔ）との数値が、鉄が十分な飼料を食べさせたネズミに比べて、それぞれ７５及び６５％に減少した（表７）。これは、鉄が不足した飼料を食べさせたとき、貧血が誘発されるということが分かった。この後、鉄分が不足した飼料を食べさせたネズミを２グループに分け、第１グループ（野生型、ＷＴ、ｎ＝１０）は、野生型（ＷＴ）種子からなったコメを食べさせ、第２グループ（ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１、ｎ＝９）は、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１の種子からなったコメを食べさせた。そして、初めから正常飼料を食べさせたネズミグループを、対照群（controlグループ、ＣＤ）として測定した。コメを食べさせた後、１週間、２週間、４週間が経過した後で血液を採取して、ＨｂとＨｃｔとを測定した。その結果を表８に示した。表８のように、野生型（ＷＴ）またはＯｓＮＡＳ２−Ｄ１の種子からなったコメを食べさせる前は、マウスのＨｂとＨｃｔは、有意性ある違いを示さなかった。１週間経過後、２グループのＨｂとＨｃｔとを測定した結果、第２グループは、第１グループに比べて、ＨｂとＨｃｔとの若干の増加を示した。さらに、１週間経過後、ＨｂとＨｃｔとを測定した結果、この場合、第２グループは、第１グループに比べて、ＨｂとＨｃｔとの顕著な増加を示し、正常飼料を食べさせたグループと類似した数値を示し、さらに２週間経過後の第２グループのＨｂとＨｃｔは、第１グループに比べて顕著に高く、鉄が十分な飼料を食べさせたグループと類似していた。
【００６６】
【表７】
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【００６７】
【表８】
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【００６８】
実施例８：亜鉛の生物学的利用度（bioavailability）調査
ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１の種子の亜鉛増加が、種子摂取時に吸収されて利用される亜鉛の生物学的利用度の増加いかんを知るために、マウス食餌分析（mouse feeding assay）を行った。
体重が約１３ｇほどのマウスに、亜鉛が十分な飼料（３０ｍｇ  Ｚｎ／ｋｇ飼料、Control Diet（ＣＤ））と、亜鉛が不足した飼料（modified ＡＩＮ−９３Ｇ diet containing zinc ３ｍｇ／ｋｇ飼料、Zinc−depleted Diet（ＺＤ））を供給した。２週間後、この２グループのネズミから血液を採取し、亜鉛の含有量を測定した。測定結果、亜鉛が不足した飼料を食べさせたネズミの血液内亜鉛数値が、亜鉛が十分な飼料を食べさせたネズミに比べて、６６％に減少した（表９）。
【００６９】
【表９】
2013513381.tif 000011
【００７０】
その後、亜鉛が不足した飼料を食べさせたネズミを３グループに分け、第１グループは、亜鉛が十分な正常飼料（Ｚｎ−／ＣＤ、ｎ＝１０）を食べさせ、第２グループは、野生型（ＷＴ）種子からなったコメを食べさせ（Ｚｎ−／ＷＴ、ｎ＝１０）、第３グループは、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１の種子からなったコメを食べさせた（Ｚｎ−／ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１）。対照群として、初めから正常飼料を食べさせたネズミグループの亜鉛数値を測定した。正常飼料とコメとを食べさせてから、２日、６日、１０日、１５日、２０日そして３０日に血液を採取し、亜鉛の数値の回復程度を測定した。その結果を表１０に示した。表１０でのように、正常飼料やコメを食べさせてから２日目後から、亜鉛の数値が増加することが分かった。しかし、その回復速度を見れば、ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１種子を食べさせたグループは、１０日で正常飼料を食べさせたグループと亜鉛数値が類似したが、野生型種子を食べさせたグループは、３０日が過ぎても、依然として低い数値を示している。また、亜鉛が不足した飼料を食べさせていて、正常飼料に替えたグループは、２０日ほど経ってこそ、初めから正常飼料を食べさせたグループと類似した亜鉛数値を示した。
【００７１】
【表１０】
2013513381.tif 000012
【００７２】
本発明者らは、前記の実施例から得られた、微量金属の含有量が増加したイネ品種ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１を、２００９年４月３０日付けで、国立農業科学院農業遺伝資源センターに特許種子を寄託し、種子受託番号ＫＡＣＣ ９８００８Ｐを付与された。
また、本発明者らは、前記の実施例から得られた、微量金属の含有量が増加したイネ品種ＯｓＮＡＳ２−Ｄ１を、２００９年１１月１８日付けで、ブダペスト条約による国際寄託機関（International Depositary Authority）の韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ：Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology）に種子を寄託し、種子受託番号ＫＣＴＣ １１５９７ＢＰを付与された。
【００７３】
実施例９：ＯｓＮＡＳ３遺伝子の発現が活性化された形質転換植物体の分離
（１）イネに存在する３個のニコチアナミン合成酵素遺伝子の発現分析
イネには、３個のニコチアナミンシンターゼ（nicotianamine synthase）（ＯｓＮＡＳ１、ＯｓＮＡＳ２、ＯｓＮＡＳ３）が存在し、酵素としての活性があることが報告されている（Inoue et al．、Plant J 36：366−381，2003）。微量元素の有無による、前記３個の遺伝子の発現程度を調べた。イネの種子を、ＭＳ（Murashige and Skoog）培地（０．１μＭ ＣｕＳＯ4、１００μＭ Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ、３０μＭ ＺｎＳＯ4、１０μＭ ＭｎＳＯ4を含む）で発芽させ、７日間育てた。同じ方法で、０．１μＭ ＣｕＳＯ4、１００μＭ Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ、３０μＭ ＺｎＳＯ4、または１０μＭ ＭｎＳＯ4のないＭＳ培地でイネ種子を発芽させ、７日間育てた。イネの根及び葉からＲＮＡを準備し、その発現程度を、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで分析した。ＰＣＲ条件は、９５℃で１分を維持した後、９４℃で１５秒、５６℃で１０秒及び７２℃で１０秒を４５回反復した。使用したプライマーは、次の通りである。発現対照群として、イネアクチン１遺伝子を増幅した。
【００７４】
プライマー配列
ＯｓＮＡＳ１−フォワードプライマー：５’−ＡＣＴＣＣＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＣＡＴＴＴＴ−３’（配列番号１３）
ＯｓＮＡＳ１−リバースプライマー：５’−ＧＧＴＴＧＡＣＧＴＡＧＴＴＧＣＣＧＴＡＧＴＡ−３’（配列番号１４）
ＯｓＮＡＳ２−フォワードプライマー：５’−ＧＴＧＡＴＣＡＡＣＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＴ−３’（配列番号１５）
ＯｓＮＡＳ２−リバースプライマー：５’−ＴＧＡＣＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＴＧＣＴＴＴＣ−３’（配列番号１６）
ＯｓＮＡＳ３−フォワードプライマー：５’−ＧＴＧＡＴＣＡＡＣＴＣＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１７）
ＯｓＮＡＳ３−リバースプライマー：５’−ＴＣＡＧＴＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＡＡ−３’（配列番号１８）
ＯｓＡｃｔ１−フォワードプライマー：５’−ＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＴＡＴＣＣＡＴ−３’（配列番号２３）
ＯｓＡｃｔ１−リバースプライマー：５’−ＴＡＣＴＣＡＧＣＣＴＴＧＧＣＡＡＴＣＣＡＣＡ−３’（配列番号２４）
【００７５】
その結果を、図８、図９及び図１０に示した。図８、図９及び図１０で、縦軸は、イネアクチン１遺伝子の発現量を基準に発現程度を示している。
図８、図９及び図１０から分かるように、ＯｓＮＡＳ１遺伝子とＯｓＮＡＳ２遺伝子は、イネが鉄を含まない培地で育つ場合、鉄を十分に含む培地で育った場合に比べて、相対的に、葉で強く発現が誘導され、根では、その誘導程度が弱く増加した。一方、ＯｓＮＡＳ３遺伝子は、イネが鉄を含まない培地で育つ場合、鉄を十分に含む培地で育った場合に比べて、根で２倍ほど強く発現が誘導されたが、葉では、鉄が不足した条件では、発現がかえって減少した。これは、ＯｓＮＡＳ３が、ＯｓＮＡＳ１及びＯｓＮＡＳ２とは異なる役割を行うと推測され、ＯｓＮＡＳ３を標的遺伝子として選択した。図８、図９及び図１０で使われるイネは、トンジンイネである。
【００７６】
（２）ＯｓＮＡＳ３遺伝子の発現が活性化された形質転換植物体の製造及び分離
形質転換イネを製造するための構造体として、Ｔ−ＤＮＡベクターであるｐＧＡ２７１５ベクターを利用した（Jeong et al.,Plant Physiol 130：1636−1644，2002）。前記ベクターは、右側境界に隣接し、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）リポーター遺伝子を含んでおり、左側境界に隣接し、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター由来テトラマー化された転写エンハンサーを含む。前記ｐＧＡ２７１５ベクターをアグロバクテリウムに形質転換させ、形質転換されたアグロバクテリウムを利用して、野生型であるトンジンイネに形質転換し、ｐＧＡ２７１５が形質導入されたイネ植物体集団を製造した（Lee et al.,J Plant Biol 42：310−316，1999；Jeong et al.,Plant Physiol 130：1636−1644，2002）。
【００７７】
形質導入されたイネ植物体から分離されたゲノムＤＮＡに対して、逆転ＰＣＲ（inverse ＰＣＲ）を介して、ｐＧＡ２７１５ベクター中のＴ−ＤＮＡが挿入された位置を確認した。その結果、Ｔ−ＤＮＡがＯｓＮＡＳ３遺伝子の周辺に挿入された２つの形質転換植物体が分離した。
【００７８】
そのうち、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１形質転換植物体は、ＯｓＮＡＳ３遺伝子の下流約１．５ｋｂに、３５Ｓエンハンサーを左側境界部位に含むＴ−ＤＮＡが挿入されており、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ２形質転換植物体は、下流約１．９ｋｂに、３５Ｓエンハンサーを左側境界部位に含むＴ−ＤＮＡが挿入されているのである。図７は、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１とＯｓＮＡＳ３−Ｄ２とでのＴ−ＤＮＡの挿入位置を示したものである。
【００７９】
実施例１０：形質転換植物体でのＯｓＮＡＳ３の発現増加
前記実施例９で選別されたＯｓＮＡＳ３−Ｄ１とＯｓＮＡＳ３−Ｄ２との遺伝型を、ＰＣＲを介して決定した。ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１とＯｓＮＡＳ３−Ｄ２とのＴ２世代個体の葉からゲノムＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲのテンプレートＤＮＡとして使用した。ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１については、２個の遺伝子特異的プライマーＦ２（５’−ＴＴＴＡＧＧＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＧＴＴＡＣＴ−３’、配列番号１９）及びＲ２（５’−ＣＴＧＴＡＡＣＡＣＴＴＴＡＡＣＧＣＡＣＣＡＡ−３’、配列番号２０）、並びにＴ−ＤＮＡ特異的プライマーＲＢ（５’−ＣＡＡＧＴＴＡＧＴＣＡＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＣＡＣ−３’、配列番号２１）を使用した。ＯｓＮＡＳ３−Ｄ２については、２個の遺伝子特異的プライマーＦ２（配列番号１９）及びＲ３（５’−ＧＧＣＴＴＧＣＴＣＴＴＧＴＣＡＴＡＧＧＣ−３’、配列番号２２）、並びにＴ−ＤＮＡ特異的プライマーＲＢ（配列番号２１）を使用した。
【００８０】
発現量を知るために、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１とＯｓＮＡＳ３−Ｄ２との同型接合体及びそれぞれの野生型イネ、すなわち、トンジンイネ（ＷＴ）の１０日齢の葉からＲＮＡを分離し、逆転写酵素を利用してそれぞれのｃＤＮＡを製造した。製造したｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号１７と１８とのプライマーを利用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、ＯｓＮＡＳ３遺伝子転写量を比較し、その結果を図１１に示した。図１１で、縦軸は、イネアクチン１遺伝子転写量に係わる相対的な転写量を示したものである。
【００８１】
図１１でのように、ＯｓＮＡＳ３遺伝子の発現は、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１では、野生型（ＷＴ）に比べて約６０倍増加し、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ２では、野生型（ＷＴ）に比べて約３０倍増加した。
【００８２】
実施例１１：形質転換植物体での微量元素含有量の測定
ＯｓＮＡＳ３遺伝子の活性化が、イネの微量元素蓄積に及ぼす影響を知るために、野生型（ＷＴ）、形質転換植物体であるＯｓＮＡＳ３−Ｄ１及びＯｓＮＡＳ−Ｄ２での微量元素を測定した。野生型と形質転換植物体との成熟した種子及び枝葉（flag leaves）を試料として使用し、微量元素測定方法は、Kim et al.,Physiol Plant 116：368−372，2002に記載された方法を参考にした。試料を７０℃で２日間乾燥させ、乾燥量を記録し、得た試料を、１１Ｎ ＨＮＯ3 １ｍｌで３日間１８０℃オーブンで分解させた。希釈した後、原子吸収分光分析法（ＡＡＳ：atomic absorption spectroscopy）（Solaar ９８９，Unicam Atomic Abosorption、Cambridge、ＵＫ）によって、試料内微量元素である鉄、亜鉛、銅、マンガンの含有量を測定した。その結果を下記表１１に示した。
【００８３】
【表１１】
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【００８４】
表１１でのように、銅及びマンガンの量は、大きい変化を示していない。ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１の場合、野生型（ＷＴ）に比べ、鉄は１．５倍、亜鉛は１．４倍増加し、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ２の場合、鉄と亜鉛とが野生型（ＷＴ）に対比して、１．２倍増加した。成熟した種子で、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１とＯｓＮＡＳ３−Ｄ２との枝葉では、鉄と亜鉛との量が明確に増加した。種子では、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１の場合、野生型（ＷＴ）に比べ、鉄は２．９倍、亜鉛は２．２倍、銅は１．７倍増加した。種子では、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ２の場合、野生型に比べ、鉄は１．７倍、亜鉛は１．５倍、銅は１．３倍増加した。
【００８５】
実施例１２：鉄と亜鉛とが不足した条件での形質転換植物体の幼苗表現型分析
鉄と亜鉛とが不足した条件で、ＯｓＮＡＳ３遺伝子の活性化が及ぼす影響を調べた。鉄と亜鉛とを両方含有するＭＳ固体培地、鉄を含有しないＭＳ固体培地、亜鉛を含有しないＭＳ固体培地で、野生型（ＷＴ）及びＯｓＮＡＳ３−Ｄ１を発芽させて８日間育て、幼苗表現型を観察した。その結果を図１２に示した。また、表現型の伸長と、葉緑素の含有量とを測定し、下記表１２に示した。葉緑素の測定は、葉を採取して重さを測定し、８０％アセトンを利用して抽出した。液体窒素を利用して凍らせた後、細かく砕いた葉と８０％アセトンとをよく混ぜ（葉１００ｍｇ当たり１ｍｌ  ８０％アセトン添加）、氷に１５分放置後、１５，０００ｇで遠心分離し、上澄み液を分注し、６６６ｎｍ及び６４６ｎｍで吸光度を測定した後、Arnon，Plant Physiol 24：1−15，1949に記載された方法で、葉緑素ａと葉緑素ｂとを含む葉緑素の量を測定した。
【００８６】
【表１２】
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【００８７】
図１２及び表１３でのように、鉄と亜鉛とをいずれも含有する培地（ＭＳ）条件では、植物体の高さも類似しており、表現型の違いを示していない。しかし、鉄を含有しない培地（Ｆｅ−）条件では、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１は、野生型（ＷＴ）に比べて高さも高く、葉緑素も、野生型（ＷＴ）に比べて５０％以上増加し、鉄不足の代表的症状である白化現象（chlorosis）もさらに少なく進んでいる。従って、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１は、野生型に比べて、鉄が不足した生育条件でさらに耐えるということが分かる。亜鉛を含有しない培地条件（Ｚｎ−）でも、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１は、野生型（ＷＴ）に比べ、生長速度が速かった。従って、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１は、野生型（ＷＴ）に比べて、亜鉛が不足した生育条件でも、さらに育つということが分かる。
【００８８】
前記実験結果を検証するために、それぞれの条件で、幼苗時期の野生型（ＷＴ）及びＯｓＮＡＳ３−Ｄ１の茎と根とを採取し、鉄と亜鉛との濃度を前記実施例１１と同じ方法で測定した。その結果を表１３に示した。
【００８９】
【表１３】
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【００９０】
表１３でのように、鉄と亜鉛とをいずれも含有する培地（ＭＳ）条件では、前記で調べた通り、表現型の違いは見られない。しかし、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１は、野生型（ＷＴ）に比べ、鉄の濃度が茎と根とで、それぞれ１．７倍、１．６倍増加し、亜鉛の濃度は、茎と根とで、それぞれ２倍、１．６倍増加した。また、鉄を含有しない培地条件では、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１は、野生型（ＷＴ）に比べ、鉄の濃度が茎と根とで、それぞれ２．２倍、２倍増加した。また、亜鉛を含有しない培地条件でも、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１は、野生型（ＷＴ）に比べ、亜鉛の濃度が茎と根とで、いずれも１．４倍増加した。従って、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１は、鉄または亜鉛が不足した生育条件で、さらに耐えるということが分かる。
【００９１】
実施例１３：過量の重金属が含まれていた条件での形質転換植物体の表現型分析
ＯｓＮＡＳ３活性化が、過量の重金属処理時に発生する毒性に、いかなる影響を与えるかを調べた。過量の亜鉛（５ｍＭ）、銅（０．３ｍＭ）またはニッケル（０．５ｍＭ）がそれぞれ添加された固体ＭＳ培地で、野生型（ＷＴ）及びＯｓＮＡＳ３−Ｄ１を発芽させて１０日間育て、幼苗表現型を観察した。表現型と植物体の伸長とを図１３に示した。
【００９２】
図１３でのように、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１は、野生型に比べて高さも高く、白化現象がさらに少なく進んでいる。かような結果は、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１が野生型（ＷＴ）に比べ、過量の重金属による毒性に対する耐性が向上しているということを示している。特に、過量の亜鉛を含有する固体ＭＳ培地で育てたとき、茎と根との亜鉛濃度を、前記実施例１１と同じ方法で測定し、その結果を表１４に示した。
【００９３】
【表１４】
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【００９４】
表１４でのように、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１は、茎で野生型（ＷＴ）に比べ、２．３倍高い亜鉛濃度を示した。
【００９５】
実施例１４：ｐＨが高い条件での形質転換植物体の表現型観察
土壌のｐＨは、植物に必要な元素の溶解度に多くの影響を及ぼす。例えば、ｐＨが８以上であるならば、鉄は、溶解度の低いＦｅ2Ｏ3形態に変化し、植物が正常に利用及び吸収することができない状態となる。その結果、鉄不足現象を起こすことになる。
【００９６】
ｐＨ８．５に合わせたＭＳ培地（ＭＳ）で、野生型（ＷＴ）及びＯｓＮＡＳ３−Ｄ１を発芽させて１０日間育て、表現型を観察した。また、鉄を含有しないＭＳ培地（Ｆｅ−）（ｐＨ８．５）でも、同じ方法を実施し、表現型を観察した。表現型と植物体の伸長とを図１４に示した。
【００９７】
図１４でのように、ｐＨ８．５に合わせたＭＳ培地（ＭＳ／ｐＨ８．５）で、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１が、野生型（ＷＴ）に比べて伸長も大きく、さらに耐えるということが分かる。かような結果は、鉄を含有しないＭＳ培地（Ｆｅ−／ｐＨ８．５）でさらに明らかに示された。
【００９８】
実施例１５：生物学的利用度（bioavailability）調査
ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１の種子で増加した鉄含有量が、動物での鉄吸収に及ぼす影響を確認するためには、前記種子をエサにして、マウス食餌分析（mouse feeding assay）を介して鉄の生物学的利用度を確認した。
【００９９】
生後３週間になったメスＢａｌｂ／ｃマウスに、鉄が十分な飼料（ＡＩＮ−９３Ｇ Purified Diet−４５ｍｇＦｅ／ｋｇ飼料）と、鉄が不足した飼料（modified ＡＩＮ−９３Ｇ diet containing iron ３ｍｇ／ｋｇ飼料）を供給した。２週間後、この２グループのネズミから血液を採取した。これは、貧血を誘発すると同時に、貧血の程度を知るために、血液のヘモグロビン（Ｈｂ）とヘマトクリット（Ｈｃｔ）とを測定するためである。測定結果、鉄が不足した飼料を食べさせたネズミのヘモグロビン（Ｈｂ）とヘマトクリット（Ｈｃｔ）との数値が、鉄が十分な飼料を食べさせたネズミに比べ、それぞれ７７％及び７９％減少した（表１５）。これは、鉄が不足した飼料を食べさせたとき、貧血が誘発されるということである。
【０１００】
この後、鉄分が不足した飼料を食べさせたネズミを２グループに分け、第１グループ（野生型、ＷＴ、ｎ＝１０）は、野生型（ＷＴ）種子からなったコメを食べさせ、第２グループ（ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１、ｎ＝９）は、ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１の種子からなったコメを食べさせた。２週間経過後、血液を採取してＨｂとＨｃｔとを測定した。同じ方法でコメを食べさせ、さらに２週間経過後に血液を採取し、ＨｂとＨｃｔとを測定した。その結果を表１６に示した。
【０１０１】
表１６でのように、野生型（ＷＴ）またはＯｓＮＡＳ３−Ｄ１の種子からなったコメを食べさせる前、マウスのＨｂとＨｃｔは、有意性ある違いを示していない。２週間経過後、２グループのＨｂとＨｃｔとを測定した結果、第２グループは、第１グループに比べて、ＨｂとＨｃｔとの顕著な増加を示した。さらに２週間経過後、ＨｂとＨｃｔとを測定した結果、この場合にも、第２グループは、第１グループに比べて、ＨｂとＨｃｔとの顕著な増加を示した。
【０１０２】
【表１５】
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【０１０３】
【表１６】
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【０１０４】
本発明者らは、前記の実施例から得られた微量金属の含有量が増加したイネ品種ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１とＯｓＮＡＳ３−Ｄ２とを２００８年７月１４日付けで農業生命工学研究院に特許種子を寄託し、それぞれ種子受託番号ＫＡＣＣ ９８００４Ｐ及びＫＡＣＣ ９８００５Ｐを付与された。
【０１０５】
本発明者らはまた、前記の実施例から得られた、微量金属の含有量が増加したイネ品種ＯｓＮＡＳ３−Ｄ１を２００９年１１月１８日付けでブダペスト条約による国際寄託機関（International Depositary Authority）の韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ：Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology）に種子を寄託し、種子受託番号ＫＣＴＣ １１５９８ＢＰを付与された。
【０１０６】
本明細書で引用された配列番号１ないし２４の配列は、配列目録ファイルを介して提出し、前記配列目録ファイルの内容は、その全体が援用によって、本明細書に含まれるものである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2013513381.tif 000026
【図１１】
2013513381.tif 000027
【図４】
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【図５】
2013513381.tif 000029
【図６】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年12月18日(2012.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微量元素の含有量が増加している植物体として、前記微量元素は鉄、亜鉛及び銅からなる群から選択されたものである植物体であって、前記植物体は、イネ（oryza sativa）であり、ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の上流及び下流からなる群から選択された一つ以上の位置で、エンハンサーの挿入によって、ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の発現が増加した植物体。
【請求項２】
４個のＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーが連結された構造体が、ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の下流約１０ｋｂ内の位置に挿入されていることを特徴とする請求項１に記載の植物体。
【請求項３】
前記植物体は、種子受託番号ＫＣＴＣ １１５９７ＢＰで寄託されたＯｓＮＡＳ２−Ｄ１イネ、または種子受託番号ＫＣＴＣ １１５９８ＢＰで寄託されたＯｓＮＡＳ３−Ｄ１イネであることを特徴とする請求項１または２に記載の植物体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物体から生産された産物を含有する機能性食品。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物体から生産された産物を含有する薬学的組成物。
【請求項６】
前記組成物は、鉄、亜鉛、銅及びそれらの組み合わせからなる群から選択された物質の欠乏によって引き起こされる疾病を治療するものであることを特徴とする請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記疾病は、鉄欠乏によって引き起こされた、貧血（anemia）、疲労（fatigue）、蒼白（pallor）、毛髪損傷（hair loss）、易刺激性（irritability）、弱気（weakness）、異食症（pica）、手足の爪割れ（brittle or grooved nails）、プランマー・ヴィンソン症候群（Plummer-Vinson syndrome）、損傷された免疫機能（impaired immune function）及びそれらの組み合わせ；亜鉛欠乏（zinc deficiency）によって引き起こされた、低亜鉛血症（hypozincemia）、毛髪損傷、皮膚損傷（skin lesion）、下痢、体組織の減退（wasting of body tissue）、腸性肢端皮膚炎（acrodermatitis enteropathica）、拒食症（anorexia）、認知機能及び運動機能の喪失（cognitive and motor function impairment）、無月経症（dysmenorrhea）及びそれらの組み合わせ；銅欠乏によって引き起こされた、貧血症（syndrome of anemia）、汎血球減少症（pancytopenia）、神経退化（neurodegeration）、メンケス病（Menkes disease）、痙縮（spasticity）、調和運動不能（ataxia）、神経障害（neuropathy）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
外来エンハンサーを含む構造体を植物体に導入し、ＯｓＮＡＳ２遺伝子またはＯｓＮＡＳ３遺伝子の発現が増加した植物体を得る段階を含む、鉄、亜鉛及び銅からなる群から選択された微量元素含有量が増加した植物体を製造する方法であって、前記植物体は、イネであり、前記構造体を植物体に導入する段階は、花キャベツモザイクウイルスのプロモーターから由来した３５Ｓエンハンサーが挿入されたＴｉプラスミドを植物体に導入する段階であり、前記植物体を得る段階は、前記３５ＳエンハンサーがＯｓＮＡＳ２活性またはＯｓＮＡＳ３活性をコーディングする遺伝子の上流及び下流のうち、一つ以上の位置に挿入された植物体を選抜する段階である、微量元素含有量が増加した植物体を製造する方法。
【請求項９】
前記３５Ｓエンハンサーは、前記配列番号２または配列番号１１のアミノ酸配列をコーディングする遺伝子の下流約１０ｋｂ内の位置に挿入されることを特徴とする請求項８に記載の微量元素含有量が増加した植物体を製造する方法。
【請求項１０】
前記３５Ｓエンハンサーは、４コピーが連結されたものであることを特徴とする請求項８または９に記載の微量元素含有量が増加した植物体を製造する方法。
【請求項１１】
前記植物体は、種子受託番号ＫＣＴＣ １１５９７ＢＰで寄託されたＯｓＮＡＳ２−Ｄ１イネ、または種子受託番号ＫＣＴＣ １１５９８ＢＰで寄託されたＯｓＮＡＳ３−Ｄ１イネであることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の微量元素含有量が増加した植物体を製造する方法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物体を、鉄及び亜鉛から構成される群から選択された一つ以上が不足した条件で生育させる段階を含む、植物体を生育させる方法。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物体を過量の重金属が存在する条件で生育させる段階を含む、植物体を生育させる方法であって、前記重金属は、５ｍＭ以上の亜鉛、０．３ｍＭ以上の銅、または０．５ｍＭ以上のニッケルである植物体を生育させる方法。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物体を、ｐＨ８．５以上の条件で生育させる段階を含む植物体を生育させる方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
【表４】
2013513381.tif 000034
【国際調査報告】
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