(57)【要約】  被験対象のコレステロール値を低下させ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）酸化を阻害することができるリンゴ果皮抽出物を含む、心臓血管疾患を治療するための医薬組成物および栄養補助食品組成物ならびに方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験対象の心臓血管疾患を治療するための方法であって、リンゴ果皮抽出物を有効量投与して前記被験対象の心臓血管疾患を治療することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記リンゴ果皮抽出物が、ケルセチンに富んだリンゴ抽出物（ＱＡＥ）であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化が、前記被験対象において阻害されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法において、コレステロール値が、前記被験対象において低下することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、血液コレステロール値が、前記被験対象において低下することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法において、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、または高脂血症が、前記被験対象において治療されることを特徴とする方法。
【請求項７】
被験対象の心臓血管の健康を維持するための方法であって、ケルセチンに富んだリンゴ果皮抽出物（ＱＡＥ）を有効量投与することを含む方法。
【請求項８】
ケルセチンに富んだリンゴ抽出物（ＱＡＥ）を含むことを特徴とする医薬組成物または栄養補助食品組成物。
【請求項９】
被験対象の心臓血管疾患の治療、低密度リポタンパク質酸化の阻害、コレステロール値の低減、または心臓血管の健康の維持のための、請求項８に記載の医薬組成物または栄養補助食品組成物。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の組成物において、前記組成物が、機能性食品、健康補助食品、または食物製品もしくは飲料製品であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、二次治療薬の投与をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記二次治療薬が、コレステロール低下剤、抗酸化剤、アセチルサリチル酸、および／または心臓血管疾患の治療のための別の薬剤であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記二次治療薬が、スタチン、ビタミンＣ、および／またはビタミンＥであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法において、前記二次薬および前記リンゴ果皮抽出物が、同時に投与されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法において、前記二次薬および前記リンゴ果皮抽出物が、連続的に投与されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１０年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／３４９１７７号明細書に対する優先権を主張するものであり、この仮出願の内容全体は参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
本発明は、被験対象のコレステロール値を低下させ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化を阻害することができるリンゴ果皮抽出物を含む、心臓血管疾患を治療するための医薬組成物および栄養補助食品組成物ならびに方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アテローム性動脈硬化症および動脈硬化症などの心臓血管疾患は、世界中で、特に、現在では心臓血管疾患またはその合併症により癌よりも多くの米国人が毎年死亡している米国などの西洋諸国で益々増大している。コレステロール、特に酸化した低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の値の上昇は、動脈硬化症およびその関連疾患の主要な原因と認識されている（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２００８，４６：２９５−３１７）。
【０００４】
アテローム性動脈硬化症の現行の治療には、脂質を低下させる薬物および脂質代謝に影響を与える薬物が含まれ、これらの薬物としては、特に、スタチン、胆汁酸吸収阻害薬、コレステロール吸収阻害薬、フィブラート系薬剤、およびプロブコールなどの抗酸化剤が挙げられる（Ｚｉｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．，２００５，Ｂｒａｕｎｗａｌｄ’ｓ  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。これらの治療レジメンは、酸化したリポタンパク質がアテローム性動脈硬化症の主要な原因因子であるという理論に、少なくとも一部は基づいている。しかしながら、コレステロールの正確な酸化機構は、まだ完全には理解されていない。
【０００５】
さらに、大半の低コレステロール血症薬には望ましくない副作用がある。例えば、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ酵素阻害薬であるスタチンは、肝毒性および腎臓損傷ならびに筋肉痛および脱力感などの有害な副作用を示している（Ｖｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００２，２４０：９９−１０３）。同様に、プロブコール、Ν，Ν’−ジフェニレンジアミン、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、およびブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などの数多くの抗酸化剤が、高脂血症を治療するために投与されている。これらの医薬には、血中ＬＤＬコレステロール値を低下させ、酸化程度および病巣形成を低減するのに十分な抗酸化活性がある。しかしながら、これらにはその使用を制限する有害な副作用があることが知られている。
【０００６】
証拠の蓄積により、果物および野菜の毎日の摂取が心臓血管疾患の発症リスクの低減と関係することが示唆されてきた（Ａｐｒｉｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．，２００２，１３２：１９６９−７６；Ｌｏｔｉｔｏ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉ，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．，２００６，４１：１７２７−４６）。モモおよびセイヨウナシのような木に実る多くの果物と比較して、リンゴには、高含量の生理活性物質が含まれており（Ｌｅｏｎｔｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ，２００７，２９：１２３−３６）、西洋の人々により最も広く摂取される果物の１つである（Ｂｏｙｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｎｕｔｒ．Ｊ．，２００４，３：５）。リンゴに存在する、生理活性のある植物性化学物質が、リンゴの報告された健康有益性の大部分を説明するように思える。ケルセチングリコシドは、もっぱらリンゴ果皮に局在し（Ｂｏｙｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｎｕｔｒ．Ｊ．，２００４，３：５）、フリーラジカルスカベンジャーおよび遷移金属イオンのラジカルキレーターとして認識されている（Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｒｅｓ．，２００５，３９：１８５−１９４）。トリテルペンは、植物の中で最大でかつ最も広範囲にあるクラスの二次代謝産物であり（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｒｕｇｓ  Ｔｈｅｒ．，２００６，２０：３４９−５７）、リンゴ果皮中の主要クラスの別の生理活性物質である（Ｈｅ  ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００８，５６：９９０５−９９１０）。トリテルペンはまた、抗アテローム生成の特性を有することが知られている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｒｕｇｓ  Ｔｈｅｒ．，２００６，２０：３４９−５７）。
【０００７】
有害な副作用がなくかつ優れた生理活性能を有する抗酸化剤および／またはコレステロール低下剤を開発する必要がある。具体的には、天然供給源から抽出される、脂質およびコレステロールを低下させる代替的で安全な化合物の提供が望まれている。
【発明の概要】
【０００８】
被験対象の心臓血管疾患を治療するための、具体的には、コレステロール値を低下させ、かつ／または低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化を阻害するためのリンゴ果皮抽出物が本明細書に提供される。リンゴ果皮抽出物を含む医薬組成物および栄養補助食品組成物、例えば、ケルセチンに富んだリンゴ果皮抽出物ならびにこの抽出物を含有する健康補助食品および／または食物製品および飲料製品もまた提供される。
【０００９】
一実施形態では、被験対象の心臓血管疾患を治療するための方法であって、リンゴ果皮抽出物を有効量投与して被験対象の心臓血管疾患を治療することを含む方法が本明細書に提供される。リンゴ果皮抽出物は、例えば、ケルセチンに富んだリンゴ抽出物（ＱＡＥ）の場合もある。一部の態様では、被験対象において、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化が阻害され、かつ／またはコレステロール値が低下する。一態様では、被験対象の血中コレステロール値が低下する。別の態様では、被験対象の動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、および／または高脂血症が治療される。
【００１０】
別の実施形態では、被験対象における心臓血管の健康を維持するための方法であって、ケルセチンに富んだリンゴ果皮抽出物（ＱＡＥ）を有効量投与することを含む方法が本明細書に提供される。ケルセチンに富んだリンゴ抽出物（ＱＡＥ）を含む医薬組成物および栄養補助食品組成物もまた提供される。一態様では、本明細書に提供される組成物は、栄養補助食品、健康補助食品、または食物製品もしくは飲料製品とすることができる。
【００１１】
他の実施形態では、本発明の抽出物、組成物、および方法は、トリテルペンに富んだリンゴ抽出物（ＴＡＥ）を含む。
【００１２】
さらに別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、二次治療薬の投与をさらに含む。二次治療薬は、例えば、コレステロール低下剤、抗酸化剤、アセチルサリチル酸、および／または心臓血管疾患の治療のための別の薬剤とすることができる。二次治療薬の非限定例としては、スタチン、ビタミンＣ、および／またはビタミンＥが挙げられる。
【００１３】
一態様では、二次薬およびリンゴ果皮抽出物は、同時に投与される。別の態様では、二次薬およびリンゴ果皮抽出物は、連続的に投与される。
【００１４】
さて、本発明の特定の実施形態は、実施例を介して、また添付の図面に関連して以下に説明されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、リンゴ果皮中の主要な生理活性種の構造を示す。ここで、（ａ）はケルセチングリコシドの構造を示し、（ｂ）はウルソール酸の構造を示す。
【図２】図２は、ケルセチンに富んだリンゴ抽出物（ＱＡＥ）の種々の濃度によるＬＤＬ酸化阻害を示す。ここで、ＬＤＬ酸化はＡＡＰＨ（ａ）またはＣｕ２＋（ｂ）により誘導した。
【図３】図３は、種々の濃度のＱＡＥによるＬＤＬ酸化阻害のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す。ここで、ＬＤＬ酸化はＣｕ２＋（Ａ）またはＡＡＰＨ（Ｂ）により誘導した。電気泳動は、５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して実施し、ゲルをバイオセーフ−クーマシーブルーを使用して染色した。レーン１＝陰性対照、レーン２＝陽性対照、レーン３＝参照として５ｍｇＬ−１のＴＢＨＱ、レーン４〜７＝エタノール中の０．１〜１００ｍｇＬ−１のＱＡＥ。
【図４】図４は、トリテルペンに富んだリンゴ抽出物（ＴＡＥ）の種々の濃度によるＬＤＬ酸化阻害を示す。ここで、ＬＤＬ酸化はＡＡＰＨ（ａ）またはＣｕ２＋（ｂ）により誘導した。
【図５】図５は、トリテルペンに富んだリンゴ抽出物（ＴＡＥ）の種々の濃度によるＬＤＬ酸化阻害のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す。ここで、ＬＤＬ酸化はＣｕ２＋（Ａ）またはＡＡＰＨ（Ｂ）により誘導した。電気泳動は、５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して実施し、ゲルをバイオセーフ−クーマシーブルーを使用して染色した。レーン１＝陰性対照、レーン２＝陽性対照、レーン３＝参照として５ｍｇＬ−１のＴＢＨＱ、レーン４〜７＝ＤＭＦ中の１〜１０００ｍｇＬ−１のＴＡＥ。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
被験対象の心臓血管疾患を治療するための、具体的には、コレステロール値を低下させ、かつ／または低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化を阻害するためのリンゴ果皮抽出物が本明細書に提供される。ケルセチンに富んだリンゴ果皮抽出物またはトリテルペンに富んだリンゴ抽出物（ＴＡＥ）ならびにこの抽出物を含有する健康補助食品および／または食物製品および飲料製品を含む医薬組成物および栄養補助食品組成物もまた提供される。
【００１７】
血中総コレステロール、特にＬＤＬ値の上昇およびＬＤＬ酸化は、心臓血管疾患にとって第一の危険因子と長い間考えられてきた。有害または望ましくない副作用を引き起こすことなく、血中コレステロール値を維持または制御するための天然の健康製品に大いなる関心が持たれている。リンゴは西洋の食事で最も広く摂取される果物であり、いくつかの植物性生理活性物質を含有することが知られている。例えば、フラボノイドおよびトリテルペンは、リンゴ果皮の主要な植物性化学物質の１つである（図１に示す）。
【００１８】
果皮中のポリフェノール含量は、果肉中よりも約２〜６倍高く（Ｂｏｙｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｎｕｔｒ．Ｊ．，２００４，３：５）、したがって、果皮抽出物には果肉抽出物よりも高い抗酸化活性がある（Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００５，５３：４９８９−４９９５）。いくつかのポリフェノールの中では、フラバノール（カテキンおよびオリゴマープロシアニジン）、ヒドロキシ桂皮酸、ジヒドロカルコン、フロボノール（ｆｌｏｖｏｎｏｌ）、およびアントシアニンが、赤リンゴ果皮に見出される主要な化合物である（Ｗｏｊｄｙｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００８，５６：６５２０−６５３０）。トリテルペンは、最も豊富にあるウルソール酸とともに（Ｃｅｆａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００６，５４：８０３−８０９）、リンゴ果皮中の別の主成分である（Ｈｅ  ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００８，５６：９９０５−９９１０）。
【００１９】
リンゴ果皮からの生理活性物質に富んだ２種の抽出物が、Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ＣｏｌｌｅｇｅのＴｒｅｅ−Ｆｒｕｉｔ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ研究室で調製された。ここで、抽出物の一方はケルセチンに富んだ抽出物（ＱＡＥ）であり、他方はトリテルペンに富んだ抽出物（ＴＡＥ）であった。これらの抽出物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬＤＬ酸化阻害を阻害する能力、およびｉｎ  ｖｉｖｏで高コレステロール血症および酸化ストレスのマーカーに影響を与える能力について検討された。これら抽出物の抗酸化効果が最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験され、次いで、食餌で誘導した高コレステロール血症のハムスターモデルにおけるコレステロールの代謝およびホメオスタシスに対するＱＡＥおよびＴＡＥの効果が検討された。両方の抽出物のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗酸化能も酸化ストレスのマーカーとして測定された。
【００２０】
我々は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトＬＤＬの酸化およびｉｎ  ｖｉｖｏでの動物モデルにおけるコレステロール代謝に対する、２種のリンゴ抽出物、ケルセチンに富んだリンゴ抽出物（ＱＡＥ）およびトリテルペンに富んだリンゴ抽出物（ＴＡＥ）の効果を本明細書に報告する。２種のリンゴ抽出物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣｕ２＋誘導およびペルオキシルラジカル誘導のＬＤＬ酸化を、それぞれ０．５〜５ｍｇＬ−１および５０〜２００ｍｇＬ−１の濃度で効果的に阻害した。我々は、その抗酸化特性に加えて、ＱＡＥがハムスターモデルにおける血中コレステロールを低下させることができることを示す。
【００２１】
したがって、被験対象のＬＤＬ酸化を阻害するための方法であって、被験対象にＱＡＥまたはＴＡＥを投与してＬＤＬ酸化を阻害することを含む方法が本明細書に提供される。一実施形態では、ＱＡＥおよび／またはＴＡＥを含むリンゴ果皮抽出物が投与される。別の実施形態では、ＬＤＬのフリーラジカル酸化が阻害される。さらに別の実施形態では、Ｃｕ２＋誘導および／またはペルオキシルラジカル誘導ＬＤＬ酸化が阻害される。別の態様では、被験対象の血清および／または肝臓コレステロール値が低下する。
【００２２】
その必要のある被験対象の血中コレステロールを低下させるための方法であって、被験対象にＱＡＥおよび／またはＴＡＥを投与することを含む方法が本明細書にさらに提供される。一実施形態では、ＱＡＥが被験対象に投与される。別の態様では、コレステロール代謝を調節するための方法であって、被験対象にＱＡＥおよび／またはＴＡＥを投与することを含む方法が提供される。一態様では、被験対象の血清および／またはコレステロール値を低下させる。
【００２３】
本発明は、アテローム斑の減少および／または総血清コレステロール、トリグリセリド、血清ＬＤＬコレステロール、および／または血清ＨＤＬコレステロール値の低減のための組成物および方法にさらに関する。
【００２４】
さらなる態様では、被験対象の心臓血管疾患を治療するための方法であって、被験対象にＱＡＥおよび／またはＴＡＥを投与することを含む方法が本明細書に提供される。一実施形態では、心臓血管疾患は、被験対象におけるＬＤＬ酸化の阻害、血清および／または肝臓のコレステロール値の低減、および／またはコレステロール代謝の調節によって治療または予防することができる。
【００２５】
「心臓血管疾患」とは、心臓、血液、およびリンパ管を含む循環系の一群の疾患を指す。心臓血管疾患は世界的に一番の死因である。最も一般的な心臓血管疾患は冠性心疾患および脳卒中である。本発明の方法によって予防または治療することができる心臓血管疾患の非限定例としては、冠性心疾患（心筋に供給する血管の疾患）、脳血管疾患（脳に供給する血管の疾患）、末梢動脈疾患（腕および脚に供給する血管の疾患）、リウマチ性心疾患（連鎖球菌に起因するリウマチ熱による心筋および心臓弁の損傷）、先天性心疾患（誕生時に存在する心臓構造の奇形）、深部静脈血栓症および肺塞栓症（心臓および肺に移動および移入し得る下肢静脈中の血餅）、高脂血症（過剰なＬＤＬなどの血中脂質量）、高血圧、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、心不全、心リズム欠陥、動脈硬化症、心臓発作、および脳卒中が挙げられる。心臓発作および脳卒中は、通常急性イベントであり、血液が心臓または脳に流れることを妨げる閉塞物によって主に引き起こされる。これに対する最も一般的な理由は、心臓または脳に供給する血管の内壁上の脂肪沈着物の蓄積である。脳卒中もまた、脳血管または血栓からの出血によって引き起こされ得る。
【００２６】
多くの様々な種類のリンゴが、これらに限定されないが、アンブロシア（Ａｍｂｒｏｓｉａ）、アーカンソー・ブラック（Ａｒｋａｎｓａｓ  ｂｌａｃｋ）、ブラエバーン（Ｂｒａｅｂｕｒｎ）、コートランド（Ｃｏｒｔｌａｎｄ）、エンパイアー（Ｅｍｐｉｒｅ）、フジ（Ｆｕｊｉ）、ジョナソン（Ｊｏｎａｔｈｏｎ）、ゴールデン・デリシャス（Ｇｏｌｄｅｎ  ｄｅｌｉｃｉｏｕｓ）、グラニー・スミス（Ｇｒａｎｎｙ  ｓｍｉｔｈ）、ガラ（Ｇａｌａ）、グラベンシュタイン（Ｇｒａｖｅｎｓｔｅｉｎ）、ハニークリスプ（Ｈｏｎｅｙｃｒｉｓｐ）、イダレッド（Ｉｄａｒｅｄ）、マッキントシュ（Ｍｃｉｎｔｏｓｈ）、ニュートン・ピピン（Ｎｅｗｔｏｗｎ  ｐｉｐｐｉｎ）、ノーザン・スパイ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｓｐｙ）、ピンク・レディー（Ｐｉｎｋ  ｌａｄｙ）、レッド・デリシャス（Ｒｅｄ  ｄｅｌｉｃｉｏｕｓ）、ローム・ビューティー（Ｒｏｍｅ  ｂｅａｕｔｙ）、ルセット（Ｒｕｓｓｅｔ）、スノー（Ｓｎｏｗ）、スパルタン（Ｓｐａｒｔａｎ）、およびワインサップ（Ｗｉｎｅｓａｐ）を含めて知られている。本明細書に記載のＱＡＥおよびＴＡＥ抽出物は、所望の任意のリンゴ種から調製することができると考えられる。当業者は、共通の一般知識を使用し、入手可能性、栄養素含量、コスト、皮むきの容易さ等のいくつかの要素に応じて、本発明の抽出物を調製するのに適したリンゴを選ぶことになる。
【００２７】
別の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、ケルセチン−３−Ｏ−ルチノシドおよび／またはウルソール酸など、リンゴ果皮抽出物の１つまたは複数の成分を含むことができる。
【００２８】
別の態様では、本明細書に記載のＱＡＥおよび／またはＴＡＥ抽出物を含む新規組成物が本明細書に提供される。例えば、経口投与に適した本発明の組成物は、それぞれが所定量の抽出物を含有するカプセル剤、カシェ剤、もしくは錠剤などの個別の単位として、または水中油型液状エマルジョン、油中水型液状エマルジョンとして、もしくは水溶液内のサプリメントとして提供することができる。口腔への局所投与に適した製剤には、抽出物を含むロゼンジ剤、ゼラチンおよび／またはグリセリンまたはスクロースおよびアカシアの中に抽出物を含むトローチ剤が含まれる。
【００２９】
本明細書に言及の抽出物に加えて、本発明の組成物は、当該組成物のタイプに関して当技術分野で従来からある他の添加物を含むことができることを理解されたい。例えば、経口投与に適した製剤は、甘味料、増粘剤、および香味料などのさらなる添加物を含むことができる。さらに、製剤は、水性または非水性の希釈剤中の有効成分の懸濁液、溶液、およびエマルジョン、シロップ、顆粒、または粉末の形態とすることもできる。
【００３０】
このような組成物は薬学のいずれの方法によっても調製することができるが、すべての方法は、有効成分または抽出物を、担体として必要な１つまたは複数の成分と合わせるステップを含む。一般に、組成物は、有効成分（例えば抽出物）を液体担体もしくは微粉固体担体またはその両方と均一にかつ細かく混合し、次いで、必要に応じて、生成物を所望の形態に成形することにより調製される。例えば、錠剤は、場合によっては１つまたは複数の副成分と共に、圧縮または成形することにより調製することができる。圧縮錠剤は、粉末または果粒などの流動性形態の有効成分を、場合によっては結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、界面活性剤、または分散剤と混合して、適切なマシン中で圧縮することにより調製することができる。湿製錠剤は、湿潤した粉末状化合物と不活性な液体希釈剤との混合物を、適切なマシン中で成形することにより作製することができる。例えば、一実施形態では、各錠剤は、抽出物を約２．５ｍｇ〜約５００ｍｇ含有することができ、各サッシェ剤またはカプセル剤は、抽出物を約２．５〜約５００ｍｇ含有することができる。別の実施形態では、心臓血管疾患の治療、ＬＤＬ酸化の阻害、またはコレステロール値の低減のための適切な投薬量範囲は、例えば、１日に、ｋｇ体重当たり化合物約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくはｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。
【００３１】
予防量および／または治療量は経験的に決定することができ、治療されている被験対象に応じて、例えば被験対象の症状、体重などに応じて変動することになる。同様に、適切な投薬製剤および薬剤の投与方法は、当業者が容易に決定することができる。例えば、１日投薬量は、ある期間を通して１回、２回、またはそれ以上の回数で投与するのに適した形態で、１つ、２つ、またはそれ以上の用量に分割することができる。
【００３２】
本発明の抽出物、組成物、および方法は、他の適切な組成物および治療と併用することができると考えられる。したがって、本発明の組成物および方法では、本発明の抽出物は、単独でまたは外科手術、ホルモン療法、および／または他の治療薬と併用して投与することができる。
【００３３】
他剤との併用投与には、同時投与（第１および第２の薬剤の同時投与）および連続投与（第１の薬剤に続いて第２の薬剤を投与、または第２の薬剤に続いて第１の薬剤を投与）が含まれる。本明細書に記載の方法の範囲内で使用される薬剤の併用は、治療対象の症状または疾患に対して、相加的または相乗的治療効果を発揮することができる。本明細書に記載の方法の範囲内で使用される薬剤の併用はまた、単独で、すなわち他剤と併用することなく投与される場合に起こる、これらの薬剤の少なくとも１つと関連した有害作用を低減することができる。例えば、一方の薬剤の副作用の毒性が他方により減弱される場合、それによって、より高い投薬量、患者のコンプライアンスの改善、または治療アウトカムの改善が可能になる。医師は、より低い投薬量を使用し、したがって有害な副作用を最小限に抑えながら、それまでに認識されていた薬物の臨床的有益性を達成することができる。さらに、同時に投与され、異なる標的に作用する２種の薬剤は、相乗的に作用して、疾患進行または症候を緩和または寛解させることができる。
【００３４】
例えば、心臓血管疾患の治療、ＬＤＬ酸化の阻害、および／またはコレステロール値の低減のための多くの薬剤が知られており、また使用されている。本発明の組成物および方法と併用して使用することが考えられる治療薬の非限定例としては、スタチン、胆汁酸吸収阻害薬、コレステロール吸収阻害薬、フィブラート系薬剤、低コレステロール血症薬、高コレステロール血症薬、プロブコール、Ｎ，Ｎ’−ジフェニレンジアミン、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、およびブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などの抗酸化剤が挙げられる（Ｚｉｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．，２００５，Ｂｒａｕｎｗａｌｄ’ｓ  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。他の例としては、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、β−アドレナリン遮断薬、アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）、カルシウム拮抗薬、ニトログリセリン、血栓溶解薬、およびＰｌａｖｉｘ（登録商標）が挙げられる。
【００３５】
最も一般的なコレステロール低下薬は、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチンなどのスタチンである。コレステロールを低下させる別の種類の薬物は、コレセベラム、コレスチラミン、およびコレスチポールなどの樹脂剤である。フェノフィブレートおよびジェムフィブロジルなどのフィブラート系薬剤およびニコチン酸（ナイアシン）もまた、コレステロールを低下させるために使用される。
【００３６】
したがって、本発明の抽出物、組成物、および方法は、心臓血管疾患の予防または治療、ＬＤＬ酸化の阻害、および／またはコレステロール値の低減の作用が知られている他の医薬品または生理活性物質と同時にまたは連続して投与することができる。一実施形態では、その必要のある被験対象の心臓血管疾患の治療、ＬＤＬ酸化の阻害、および／またはコレステロール値の低減の方法であって、本発明の抽出物または組成物を含む第１の薬剤の有効量および第２の薬剤を投与することを含む方法が本明細書に提供される。第２の薬剤は、例えば、スタチンなどのコレステロール低下薬、プロブコール、ビタミンＣ、もしくはビタミンＥなどの抗酸化剤、ＡＳＡ、または当技術分野で知られている他の治療薬とすることができる。特定の実施形態では、第１および第２の薬剤は、同じ組成物または製剤に一緒にまとめられる。
【００３７】
一実施形態では、その必要のある被験対象のコレステロール値を低下させるための方法であって、本発明の抽出物または組成物を治療有効量投与することを含む方法が本明細書に提供される。
【００３８】
別の実施形態では、その必要のある被験対象のＬＤＬ酸化を阻害する方法であって、本発明の抽出物または組成物を治療有効量投与することを含む方法が本明細書に提供される。
【００３９】
さらに別の実施形態では、その必要のある被験対象の高脂血症を治療する方法であって、本発明の抽出物または組成物を治療有効量投与することを含む方法が本明細書に提供される。
【００４０】
さらにさらなる実施形態では、その必要のある被験対象の動脈硬化症を治療する方法であって、本発明の抽出物または組成物を治療有効量投与することを含む方法が本明細書に提供される。
【００４１】
別の実施形態では、その必要のある被験対象のアテローム性動脈硬化症を治療する方法であって、本発明の抽出物または組成物を治療有効量投与することを含む方法が本明細書に提供される。
【００４２】
不健康な食事、運動不足、ストレス、および喫煙などの行動危険因子が、大部分の心臓血管疾患の原因である。したがって、現代の生活様式によるこの望ましくない結果を、有効な天然成分を用いて打破することができれば、さらに好都合であろう。例えば、食物製品または飲料製品に組み込むことができる天然成分が提供できれば、そのような製品は日常的に摂取されるので、好都合となろう。あるいは、このような有効な天然成分を、健康補助食品に組み込むことも可能であろう。
【００４３】
したがって、本発明は、健康の改善または心臓血管疾患の治療用の栄養補助食品、健康補助食品、および／または食物製品もしくは飲料製品を製造するための、本発明の抽出物および組成物の使用にさらに関する。
【００４４】
本明細書で使用する用語「栄養補助食品」は、栄養用途および医薬用途の両分野における有用性を示す。したがって、新規の栄養補助食品抽出物および組成物は、食品および飲料へのサプリメントとしての使用、ならびにカプセル剤もしくは錠剤などの固体製剤、または溶液もしくは懸濁液などの液体製剤とすることができる医薬製剤または医薬品としての使用を見出すことができる。前述から明らかなように、栄養補助食品組成物という用語はまた、組成物および場合によっては炭水化物を含有する本抽出物を含む食品および飲料ならびに前述の有効な抽出物を含むサプリメント組成物、例えば健康補助食品を含む。
【００４５】
本明細書で使用する用語「健康補助食品」は、食餌の補充を意図する「健康補助成分」を含有し、口から摂取される製品を示す。これらの製品中の「健康補助成分」としては、ビタミン、ミネラル、薬草または他の植物成分、アミノ酸、ならびに酵素、器官組織、腺、および代謝産物などの物質を挙げることができる。健康補助食品はまた、抽出物であっても濃縮物であってもよく、錠剤、カプセル、軟ゲル、ゲルキャップ、液体、または粉末など多くの形態で与えることができる。健康補助食品はまた、バーなどの他の形態とすることもできるが、その場合、健康補助食品のラベル上の情報は、従来の食品としてまたはミールもしくは食餌の唯一のアイテムとしてその製品を表示することは一般にない。
【００４６】
マルチビタミンおよびミネラルサプリメントを本発明の栄養補助食品組成物に加えると、一部の食餌には欠けている必須栄養素を適当量得ることができる。マルチビタミンおよびミネラルサプリメントはまた、生活様式パターンおよびよくある不適切な食餌パターンによる栄養素の消失および欠乏に対する疾患予防および防止のために有用となり得る。さらに、αトコフェロール（ビタミンＥ）およびアスコルビン酸（ビタミンＣ）などの抗酸化剤によるオキシダントストレス制御は、心臓血管疾患の治療において有用となり得る。したがって、上記有効物質に加えてマルチビタミンサプリメントを摂取すると、十分バランスのとれた栄養を維持することができる。
【００４７】
さらに、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、および／またはカリウム（Ｋ＋）などのミネラルと本抽出物および組成物との組合せは、健康の改善および心臓血管疾患を含む疾患の治療に使用することができる。本発明のさらなる実施形態では、心臓血管の健康の維持を支援するのに適し、本発明の抽出物および組成物を含む、食物製品もしくは飲料製品またはその中に組み込むことができる成分が提供される。一実施形態では、許容可能な安定性および／または感覚受容特性、例えばまったくないかまたは許容可能なレベルの苦味などの良好な味を有する、食物製品もしくは飲料製品またはその中に組み込むことができる成分が提供される。
【００４８】
別の実施形態では、心臓血管疾患の予防を援助しかつ／または心臓血管の健康の維持を支援するなど、健康有益性を与える成分を高濃度含む食物製品または飲料製品が提供される。したがって、一実施形態では、心臓血管の健康維持のための機能性食物製品を製造するための、本抽出物およびその組成物の使用が提供される。本発明の抽出物および組成物のさらなる利点は、それらを食物製品または飲料製品に好都合に組み込んで、その安定性および／または感覚受容特性に許容できないほどの影響を与えることなく、機能性食物製品を製造することができることである。
【００４９】
本発明の「健康有益性薬（ｈｅａｌｔｈ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ａｇｅｎｔ）」は、健康有益性を与える、すなわち、健康面にプラスの効果を有する物質であるか、または、摂取された場合に、心臓血管の健康維持となる健康面の健全性を維持する助けとなる物質である。「健康有益性」とは、健康面にプラスの効果を有するか、または健康面の健全性を維持する助けとなることを意味する。
【００５０】
本発明の「機能性食物製品」は、本発明の抽出物および組成物が成分として有効量使用され、その結果、食物製品の消費者に顕著な健康有益性が得られる、ヒト摂取に適した食物製品または飲料製品として定義される。本発明の栄養補助食品はいずれの食品タイプでもよい。これらは、食物製品に加えて、香料、糖、果物、ミネラル、ビタミン、安定剤、増粘剤等の一般的な食品成分を適正量で含むことができる。
【００５１】
したがって、一実施形態では、本発明の抽出物および組成物は、心臓血管疾患を改善するために添加物として健康食品に使用することができる。ＱＡＥまたはＴＡＥ抽出物は、単独で、または食品に適した従来の手順および含量によって他の食品もしくは食品成分と組み合わせて、食品添加物として使用することができる。所望の用途（予防、健康管理、または治療）に応じて、有効な成分の組合せを、共通の一般知識および技術的に認められた方法を使用して当業者が決定するような比で調整することができる。
【００５２】
したがって、本発明の抽出物および組成物は、これらに限定されないが、肉、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー、スナック、クッキー、ピザ、パスタ、麺、ガム、乳製品（アイスクリーム、ミルクセーキ、ヨーグルト、またはミルクなど）、スープ、飲料、茶、アルコール、および複合ビタミン剤を含む任意の種類の食品に実際上添加することができる。本発明の健康食品または飲料組成物は、従来の食品および飲料の場合のように、種々の甘味料または天然炭水化物をさらに含むことができる。好ましくは、天然炭水化物としては、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、マルトースおよびスクロースなどの二糖類、デキストリンおよびシクロデキストリンなどの多糖類、ならびにキシリトール、ソルビトール、およびエリトリトールなどの糖アルコール類を挙げることができる。甘味料としては、タウマチンおよびステビオシドなどの天然物質、ならびにサッカリンおよびアスパルテームなどの合成物質を挙げることができる。
【００５３】
さらに、本発明の抽出物および組成物は、種々の栄養素、ビタミン、電解質、香味料、または着色剤、ならびにペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、保護コロイド、粘性促進剤、ｐＨ制御剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、または炭酸飲料のための炭酸化剤をさらに含むことができる。さらに、本発明の組成物は、天然果汁、果汁飲料、および野菜飲料を製造するための新鮮果肉を含むことができる。上述の成分は、独立してまたは組合せて使用することができる。
【００５４】
本発明の目的のために、次の用語が下記に定義される。
【００５５】
特許請求の範囲および／または本明細書において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて使用される場合、単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つの」を意味することもあるが、「１つまたは複数の」、「少なくとも１つの」、「１つまたは１より多くの」という意味と一致することもある。同様に、単語「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は少なくとも二番目またはそれより多くを意味することがある。
【００５６】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」などのｈａｖｉｎｇの任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅ」および「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」などのｉｎｃｌｕｄｉｎｇの任意の形態）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「ｃｏｎｔａｉｎ」および「ｃｏｎｔａｉｎｓ」などのｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの任意の形態）は、包含的すなわちオープンエンド形式であり、追加の列挙していない要素または工程ステップを除外しない。
【００５７】
用語「阻害」は、化学的または生化学的作用の実質的な緩慢化、妨害、抑制、防止、遅延、および／または阻止を意味するように意図される。
【００５８】
用語「阻害剤」は、化学的作用を実質的に緩慢化、妨害、抑制、防止、遅延、および／または阻止する化合物、薬物、または試剤を意味するように意図される。
【００５９】
用語「治療」または「治療する」は、被験対象における疾患状態の改善または被験対象における疾患もしくは病状に付随した症候の改善など、所望の薬理的および／または生理的な効果を得ることを意味するように意図される。この効果は、疾患またはそれに付随した症候を完全にまたは部分的に防止する点で予防的であることも、かつ／または疾患および／またはその疾患に起因する病態生理学的な影響を部分的にまたは完全に緩解させる点で治療的であることもある。本明細書で使用される場合、「治療」は、哺乳動物の疾患のいずれの治療も包含し、以下のこと、すなわち、（ａ）疾患に罹患する可能性が大きいがまだそれに罹患していると診断されていない個体にその疾患または症状が発症することを予防すること（心臓血管疾患を予防することなど）、（ｂ）疾患を阻害すること（例えば、その進行を阻止すること）、または（ｃ）疾患を緩和すること（例えば、その疾患に付随した症候を軽減すること）を含む。
【００６０】
用語「治療上有効」は、疾患もしくは病状に付随した症候を実質的に改善するか、または基礎疾患もしくは病状を改善、寛解、もしくは軽減するのに十分な薬剤量を意味するように意図される。例えば、心臓血管疾患の治療では、疾患のいずれの症候であっても軽減、予防、遅延、抑制、または阻止する薬剤であれば、治療上有効であろう。治療有効量の化合物により、疾患の発症を遅延、防止、もしくは予防するように、または疾患の症候を寛解するように、または疾患の期間を変更するように、その疾患を治療することができる。
【００６１】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの任意の特定用途の具体的な「有効量」は、使用する具体的な薬剤の活性、年齢、体重、健康状態、性別、および／または個体の食餌、投与時間、投与ルート、排泄速度、薬物併用、および治療している特定疾患の重症度を含む種々の要因に依存することになる。例えば、「有効量」は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＬＤＬ酸化の阻害またはコレステロールの低減を達成するのに必要な本発明の抽出物または組成物の量とすることができる。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「被験対象」はヒトを含めた哺乳動物を含む。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「担体」は、リン酸緩衝生理食塩水、水、生理食塩水、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのすべての溶媒を含む。治療上または薬学的に有効な物質に対するこのような媒体および試剤の使用は、当技術分野で周知である。二次的な有効成分も組成物に組み込むことができる。本発明の医薬組成物は、薬学的にまたは治療上有用な組成物を調製するための公知の方法に従って、製剤化することができる。製剤は、当業者に周知であり、容易に入手可能ないくつもの情報源に記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｒｔｉｎ  Ｅ  Ｗ（１９９５）Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ  ｅｄ．）は、本発明に関して使用することができる製剤を記載している。
【実施例】
【００６４】
本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解されるであろうが、これらの実施例は、本発明を説明するために提供されるものであり、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００６５】
他に定義されていない限り、または他に文脈上明確に指示されていない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価ないかなる方法および材料も、本発明の実践または試験において使用することができると理解されたい。
【００６６】
材料および方法
Ｉ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
植物原料。ＱＡＥは、「ジョナサン」×「ゴールデン・デリシャス」から生まれたリンゴ品種「ジョナゴールド」の果皮から抽出した。ＴＡＥは、「ジョナサン」×「ウェージナー」から生まれた品種である「イダレッド」リンゴの果皮から抽出した。リンゴ果皮は、商用パイ製造業者、Ａｐｐｌｅ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｆｏｏｄｓ  Ｉｎｃ．，Ｋｅｎｔｖｉｌｌｅ，Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ，Ｃａｎａｄａ  ｉｎ  ２００６から集めた。皮をむいた直後に、リンゴ果皮粉末を、Ｒｕｐａｓｉｎｇｈｅら（Ｒｕｐａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１０，５８：１２３３−１２３９）に記載のように、果皮から調製した。
【００６７】
化学薬品。ヒト血漿から単離したＬＤＬ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中）は、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。Ｐｅｒｏｘｏｑｕａｎｔ（商標）定量的過酸化物アッセイキットの脂質コンパティブルフォーミュレーションは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）から購入した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に必要な試薬は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドおよびエピカテキンは、Ｉｎｄｏｆｉｎｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏｕｇｈ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。オレアノール酸およびコロリン酸は、ＣｈｒｏｍａＤｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＢＨＴ、テトラ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）、硫酸銅、２−チオバルビツール酸（ＴＢＡ）、およびトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｎａｄａ  Ｌｔｄ．（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。９６穴マイクロプレートは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。他のすべての化学薬品および試薬は、最高級純度のものを上述の供給業者から購入した。ｉｎ  ｖｉｖｏケルセチン代謝産物は、Ｐａｕｌ  Ａ．Ｋｒｏｏｎ博士、プロジェクトリーダー（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｏｒｗｉｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｗｉｃｈ  ＮＲ４  ７ＵＡ  ＵＫからの贈与であった。
【００６８】
ＱＡＥおよびＴＡＥの調製。Ｒｕｐａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１０，５８：１２３３−１２３９により記載のＡＳＥ  ２の調製に準じて、ＱＡＥを調製した。ＱＡＥの原液は、９５％エタノールで調製し、−２０℃に保存した。アッセイを開始する前に、濃度に応じて、９５％エタノール中のＱＡＥの必要量を、各ホウケイ酸チューブ（１３×１０ｍｍ）中、窒素下で乾燥した。この抽出物は水溶性であるので、酸化誘導の前に、乾燥抽出物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびＬＤＬ混合物で再構成した。
【００６９】
ＴＡＥは、下記のように調製した。リンゴ果皮粉末２００ｇを、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）２Ｌによる還流下で、２時間加熱した。減圧および常温下で溶媒を除去した後に、緑色を帯びた固形残渣がフラスコに残留した。灰白色の固形抽出物が得られるまで繰り返して、残査をｎ−ヘキサンを用いて徹底的に洗浄し、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１５分間）し、着色色素から分離した。最終的に、抽出物をＮ２下で３０分間乾燥し、真空オーブン中に３３℃で一晩保持して、溶媒のいかなる痕跡も除去した。
【００７０】
ウルソール酸およびオレアノール酸の最高合計含有量を評価するための種々の方法を比較するために、それぞれの手順に対して、リンゴ果皮２０ｇをＥｔＯＡｃ２００ｍＬで抽出した。比較した方法は、還流下での２時間加熱、マイクロ波補助還流下での３０分間加熱、３０分間超音波処理、および室温での２４時間振盪であった。各抽出の終了時に、トリテルペノイドを含有するＥｔＯＡｃのアリコートを濾過し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために−２０℃に保存した。
【００７１】
ＴＡＥの原液は、１００％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で調製した。濃度に応じて、ＤＭＦ中のＴＡＥの必要量を、ＰＢＳおよびＬＤＬ反応混合物に別々に加えた。予備試験から、ＬＤＬ反応混合物中の１０％ＤＭＦは、ＬＤＬ酸化に対して顕著な効果を少しも示さないことがわかった。
【００７２】
２種の抽出物における成分化合物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析。Ｒｕｐａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１０，５８：１２３３−１２３９により記載のように、ＱＡＥ中の主要なフェノール化合物の組成を決定した。
【００７３】
抽出物の成分化合物およびｉｎ  ｖｉｖｏのケルセチン代謝産物の調製。ＱＡＥの７種の主要成分化合物、すなわち、クロロゲン酸、フロリジン、エピカテキン、シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシド、ケルセチン、ケルセチン−３−Ｏ−ガラクチシド（ｇａｌａｃｔｉｓｉｄｅ）、およびケルセチン−３−Ｏ−グルコシドを３濃度、０．０５、５、および５０ｍｇＬ−１で使用した。これらの化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。ＬＤＬ酸化生成物の濃度応答性阻害を検討するために、ケルセチンおよびケルセチン−３−Ｏガラクトシドを、それらの活性に基づいて使用した。３種のｉｎ  ｖｉｖｏケルセチン代謝産物、すなわち、ケルセチン−３’−スルフェート、ケルセチン−３−グルクロン酸、およびイソラムネチン−３−グルクロン酸を１００％メタノールに溶解し、０．０５、５、および５０ｍｇＬ−１濃度を試験のために使用した。濃度応答性ＬＤＬ酸化を検討するために、活性に基づいて、ケルセチン代謝産物を１つ選択した。
【００７４】
ＴＡＥの２種の主要成分の純粋化合物であるウルソール酸およびコロリン酸ならびにウルソール酸の異性体であるオレアノール酸を使用して、濃度応答性ＬＤＬ酸化阻害を検討した。オレアノール酸は、天然に最も豊富な異性体であり、ウルソール酸から分離することが困難であるため、選択した。化合物をＤＭＦに溶解して、必要な濃度に応じて希釈し調製した。
【００７５】
ＱＡＥを使用して実施するアッセイのために、反応混合物容量の１０％を誘導溶液から構成し、容量の残部（９０％）をＰＢＳおよびＬＤＬ反応混合物から構成した。ＴＡＥを使用して実施するアッセイのために、反応混合物容量の１０％をＴＡＥ／ＤＭＦ溶液から構成し、残部（８０％）をＰＢＳおよびＬＤＬ反応混合物から構成した。成分化合物およびケルセチンのｉｎ  ｖｉｖｏ代謝産物を使用して実施するアッセイのために、反応混合物の１０％をメタノール、ＤＭＳＯ、またはＤＭＦのいずれかで構成し、別の１０％を誘導システムから構成し、容量の残部をＰＢＳおよびＬＤＬ溶液から構成した。
【００７６】
ＬＤＬの調製。固有の抗酸化物質を除去するために、購入したＬＤＬを、Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄセルロース透析チューブ（タイプＴ３膜、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、０．１３８Ｍ  ＮａＣｌおよび０．００２７Ｍ  ＫＣｌ（２５℃でｐＨ７．４）を含有するＰＢＳに対して、４℃で２４時間透析した。緩衝液は６時間ごとに交換した。透析したＬＤＬは直ちに使用したか、または窒素下暗所で−８０℃にて保存し、２〜３週以内に使用した。透析したＬＤＬのタンパク質含量は、標準としてウシ血清アルブミンを使用して、ローリー法（Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５１，１９３：１６５−２７５）により測定した。
【００７７】
ＬＤＬ酸化誘導。２つの酸化誘導法、すなわち、硫酸銅および２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）を使用した。両方の誘導システムに対して、１００μｇ／ｍＬの最終ＬＤＬタンパク質濃度を使用した。最終濃度１０μΜのＣｕ２＋の存在下および最終濃度５ｍＭのＡＡＰＨの存在下でそれぞれ、３７℃で４時間、暗所にてＬＤＬを酸化した。実験単位は、ブランク、陽性対照（誘導はするが、抗酸化剤処理はしない）、陰性対照（誘導も処理もしない）、および種々の濃度のＱＡＥまたはＴＡＥのいずれかからそれぞれなり、Ｃｕ２＋またはＡＡＰＨのいずれかにより誘導した。酸化は、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液と１ｍＭブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）溶液との１：１混合物を添加して終結させた。
【００７８】
ＱＡＥの７種の主要成分化合物であるクロロゲン酸、フロリジン、エピカテキン、シアニジン−３−Ｏ−ガラクトシド、ケルセチン、ケルセチン−３−Ｏ−ガラクトシド、およびケルセチン−３−Ｏ−グルコシド、ならびに３種のｉｎ  ｖｉｖｏケルセチン代謝産物を、５０、５、および０．０５ｍｇＬ−１の３濃度で試験して、ＬＤＬ酸化阻害レベルを検討した。最も有効な純粋化合物およびケルセチン代謝産物を選択した後、濃度応答性ＬＤＬ酸化阻害を検討した。ＴＡＥの２種の主要成分およびウルソール酸の異性体であるオレアノール酸もまた使用して、濃度応答性を検討した。このセクションの前半に説明したように、それと同じ濃度のＣｕ２＋およびＡＡＰＨを使用し、ＥＤＴＡとＢＨＴとの１：１混合物により酸化を終結させた。
【００７９】
チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳアッセイ）の測定。ＴＢＡＲＳは、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．，２００７，７２：Ｓ５２２−Ｓ５２７の方法に少し改変を加えて測定した。ＬＤＬ酸化を終結させた後、ＴＢＡ試薬（０．２Ｍ  ＮａＯＨ中の０．６７％チオバルビツール酸（ＴＢＡ）試薬および２０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ））を、反応混合物に添加し、徹底的に混合した。この混合物を９５℃で３０分間インキュベートして、ピンク色のクロモゲンを発色させた。室温に冷却した後、チューブを１５００ｇで１５分間遠心分離し、ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．Ｃａｎａｄａ）を使用して蛍光を測定した。使用した励起波長および発光波長は、それぞれ５３２ｎｍおよび５９０ｎｍであった。ＴＢＡＲＳ活性は、陽性対照と比較してＬＤＬ酸化のパーセント阻害（式１）として表現された。式中、Ｆは蛍光である。
パーセント阻害（％）＝１００（Ｆ陽性対照−Ｆ試料）／（Ｆ陽性対照）  （１）
【００８０】
このようにして、一次および二次酸化生成物形成の測定は、パーセントＬＤＬ酸化阻害として表現した。式（１）はまた、次のように書くこともできる。すなわち、％阻害＝１００（Ａ（＋ｖｅ）対照−Ａ試料）／Ａ（＋ｖｅ）対照、式中、Ａは吸光度であり、（＋）ｖｅ対照は誘導システム、基質を含むが、処理なしの対照である。
【００８１】
脂質ヒドロペルオキシドの測定（第一鉄キシレノールオレンジアッセイ）。ヒドロペルオキシドの形成を、Ｐｅｒｏｘｏｑｕａｎｔ（商標）定量的過酸化物アッセイキットの脂質コンパティブルフォーミュレーションにより測定した。ＬＤＬ酸化をＣｕ２＋またはＡＡＰＨにより誘導し、３７℃で４時間、暗所にてインキュベートした。ヒドロペルオキシドを、製造業者の説明書に従って測定した。ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して、５９５ｎｍの吸光度を測定した。ヒドロペルオキシドの活性は、陽性対照と比較してＬＤＬのパーセント阻害（式１）として表現した。
【００８２】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥについては、１０％ＳＤＳと共に５％ゲルを使用した。ＬＤＬタンパク質１６μｇを、異なる４濃度のＱＡＥおよびＴＡＥと共に、個別にインキュベートし、１０μΜ  Ｃｕ２＋または１５ｍＭ  ＡＡＰＨのいずれかを使用して、３７℃で４時間、酸化を誘導した（最終反応容量は５０μＬであった）。テトラ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ、５ｍｇＬ−１）を参照として使用した。ＥＤＴＡ／ＢＨＴ溶液を用いてＬＤＬ試料の酸化を終結させた後、試料をＬａｅｍｍｌｉ（商標）試料緩衝液（２−メルカプトエタノール５０μＬをＬａｅｍｍｌｉ（商標）試料緩衝液９５０μＬと混合した）を用いて１：１で希釈し、１００℃で５分間加熱してタンパク質を変性させた。その後、各試料２０μＬを、ウェルに別々にロードし、ゲルを１９０Ｖで約４５分間泳動させた。泳動完了後、ゲルをバイオセーフクーマシーブルー染色剤で染色し、記録した。
【００８３】
統計分析。測定はすべて三つ組で行い、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表現した。実験はすべて、別々の日に２回実施して再現性をチェックした。一元配置分散分析を、一般線形モデル（ＳＡＳ  Ｖ８，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して、実施したすべての実験について個別に実施した。応答変数として、パーセント阻害を使用した。正規性および定数分散の仮定を、Ａｎｄｅｒｓｏｎ−Ｄａｒｌｉｎｇ検定を使用しかつ残差対適合を調べて検定した。独立性は無作為化によって達成した。ＴＡＥ処理におけるＣｕ２＋誘導二次生成物についての正規性を得るために、濃度を平方根に変換した。この特定のデータセットについては、その結果を逆変換してから表示した。ｐ≦０．０５で有意差があった場合に、多重平均比較をＴｕｋｅｙ’ｓ  ｈｏｎｅｓｔｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ検定により実施した。
【００８４】
ＩＩ．ハムスターモデルのｉｎ  ｖｉｖｏ研究
化学薬品および装置。生理活性物質に富んだ２種のリンゴ抽出物を除く、ハムスター用の食餌材料はすべて、Ｄｙｅｔｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入した。血清脂質プロフィールは、商用キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して分析し、肝臓脂質は、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ，ＵＳＡ）のキットを用いて分析した。血清および肝臓の抗酸化状態の検討に必要な化学薬品および試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｎａｄａ  Ｌｔｄ．（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。
【００８５】
動物および食餌。実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｔｏｗｎ，Ｐｒｉｎｃｅ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｉｓｌａｎｄ（ＰＥＩ）で実施した。倫理的承認は、Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＣＵＣ）  ａｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｉｎｃｅ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｉｓｌａｎｄ（ＵＰＥＩ），Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｔｏｗｎ，ＰＥＩ，Ｃａｎａｄａ  ａｎｄ  Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ（ＮＳＡＣ），Ｔｒｕｒｏ，Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ，Ｃａｎａｄａから得た。実験は、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅのガイドラインに準拠して行った。
【００８６】
体重１００〜１２０ｇの雄性ゴールデンシリアンハムスター６０匹を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から購入し、ケージに別々に収容し、１２時間の明／暗サイクルのもとに置いた。２週間の順応期間の間、通常のげっ歯類用固形飼料を動物に給餌し、食餌および水を自由に摂取させた。その後、ハムスターの体重を測定して、それぞれ１５匹の動物群にランダムに割り当てた後、食餌療法試験を開始した。ハムスターに３０日間実験食を給餌した。正常対照（ＮＣ）として、ΑＩＮ  ９３−Ｇフォーミュレーションに準拠したカゼイン−コーンスターチ−スクロースをベースとした食餌を動物に給餌した。アテローム生成対照（ＡＣ）の食餌については、０．１５％のコレステロールをＮＣ食餌に添加した。実験処置群には、５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量でＱＡＥまたはＴＡＥのいずれかを添加したＡＣ食餌を給餌した。試験食は毎週調製して、−２０℃に保存した。
【００８７】
アテローム生成試験食の基本組成を下表１に示す。正常対照に対しては、コレステロールを添加しなかった。生理活性物質に富んだ２種の食餌については、必要量の生理活性物質を、上述の食餌に個別に添加した。
2013528163.tif 000003
【００８８】
生理活性物質に富んだリンゴ果皮抽出物の調製。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究に使用したリンゴ果皮抽出物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に使用したものと同じ抽出物とした。抽出物は上記のように調製した。
【００８９】
血液試料および組織試料の収集および保存。Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，２００８，２０１：１０１−１０７による報告の手順に従って、食物摂取量を毎日記録し、動物の体重を毎週測定した。動物の行動を毎日観察して記録した。屠殺の７２時間前に、０．５ｍＬに溶解した［１３Ｃ］コレステロール０．１８ｍｇを頚静脈を介して動物に注射した。外科手術の後、動物の回復を観察し、それぞれのケージに戻した。３０日目の屠殺の２時間前に、酸化重水素０．５ｍＬを腹腔内注射により動物に投与した。イソフルラン吸入薬により動物を麻酔して、血液を血清チューブに収集し、室温で２時間凝固させた後、氷上に置いた。血清を遠心分離により分離して、−８０℃に保存した。肝臓、腎臓、脳、および腸を解剖し、ＰＢＳですすいで洗浄して、秤量し、液体窒素中で瞬間冷凍して、分析まで−８０℃に保存した。
【００９０】
血清脂質および肝臓脂質の分析。血清のＴＣおよびＴＧは、酵素キットを使用して直接測定した。ＨＤＬの測定のために、非ＨＤＬを沈殿緩衝液により血清から沈殿させた。この沈殿をＰＢＳに溶解し、非ＨＤＬ分画を定量した。これらの測定すべてについて、製造業者の説明書に従った。
【００９１】
肝臓脂質は、前述（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，２００８，２０１：１０１−１０７）のように抽出した。手短に言えば、肝臓０．５ｇを秤量し、メタノール１５ｍＬが入った５０ｍＬのガラスチューブに移した。チューブを５５℃で１５分間振盪した。次いで、ヘキサン：クロロホルム（４：１、ｖ：ｖ）２４ｍＬを水２ｍＬと共に加えた。この試料を１５分間振盪した後、チューブを遠心分離し、その上清を集めた。この抽出工程をさらに２回繰り返し、上清を一緒にプールして窒素ガス下で乾燥した。乾燥した脂質をイソプロピルアルコールに再溶解し、脂質プロフィールの分析のために使用した。肝臓の総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、および遊離コレステロール（ＦＣ）は、酵素キットを使用して直接測定し、コレステロールエステル（ＣＥ）は、総コレステロール（ＴＣ＝ＦＣ＋ＣＥ）から遊離コレステロールを減算して評価した。
【００９２】
血清および肝臓の抗酸化状態の測定。血清抗酸化剤活性は、Ｒｕｐａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，２００８，１０７：１２１７−１２２４により記載のＦｅｒｒｉｃ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｐｏｗｅｒ（ＦＲＡＰ）アッセイにより測定した。手短に言えば、３００ｍｍｏｌＬ−１の酢酸緩衝液（ｐＨ３．６）、１０ｍｍｏｌＬ−１のＴＰＴＺ溶液、および２０ｍｍｏｌＬ−１の塩化第二鉄溶液を、１０：１：１の比で混合して、ＦＲＡＰワーキングアッセイ試薬（ＷＲ）を調製した。ＦＲＡＰ−ＷＲはアッセイ直前に調製し、ＴＰＴＺ溶液は分析を行う当日に調製した。１ｍＭのＴｒｏｌｏｘ標準原液は、Ｔｒｏｌｏｘ２５ｍｇをメタノール１００ｍＬに溶解して調製し、必要になるまで−８０℃に保存した。この原液を適宜メタノール中に希釈して、検量線を作成するために１００〜１０００μΜの種々の濃度のＴｒｏｌｏｘを調製した。分析前に、ＦＲＡＰ−ＷＲおよび試料を３７℃に加温した。分析のために、ブランク、標準、または試料２０μｌを、９６穴透明ポリスチレンプレート中で、ＦＲＡＰ−ＷＲ１８０μｌと反応させた。ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡプレートリーダーを、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．Ｃａｎａｄａ）を使用してプログラムし、ＦＲＡＰ−ＷＲの注入および３秒間の振盪の６分後に、５９５ｎｍの吸光度を読み取るようにした。血清のＦＲＡＰ値は、Ｔｒｏｌｏｘ当量（μΜ）として表現した。
【００９３】
血清中の二次酸化生成物の形成は、Ｂａｌａｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８，５８：３５６−３６３によるチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）アッセイにより測定した。手短に言えば、２０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）２５０μＬを、血清５０μＬおよびＴＢＡ試薬２５０μＬに加え、１００℃で３０分間インキュベートした。放冷した後、試料を１０００×ｇで２０分間遠心分離し、その上清をＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．Ｃａｎａｄａ）により５３５ｎｍでＴＢＡＲＳについて分析した。１〜１００μｍｏｌＬ−１（μΜ）濃度の１，１，３，３−テトラメトキシプロパン（ＴＥＰ）を使用して、標準曲線を作成し、血清のＴＢＡＲＳ濃度をＴＥＰ当量（μＭ）として評価した。
【００９４】
肝臓ＴＢＡＲＳは、Ｂｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｙｕｒｖｅｄａ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，１：１８−２４、およびＲｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０１０，４７：７２−７８により記載の方法を少し改変して測定した。手短に言えば、肝臓試料０．５ｇを秤量して、氷冷ＰＢＳ５ｍＬと共にホモジナイズし、その内容物を１３０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清（２５０μＬ）をＴＣＡ５００μＬと混合し、攪拌した。次いで、ＴＢＡ試薬５００μＬを添加して撹拌し、ウォーターバス中で１００℃にて３０分間インキュベートした。肝臓試料は二つ組で分析し、血清ＴＢＡＲＳ分析と同様に吸収を読み取った。１〜２５μΜのＴＥＰ標準を検量線に使用し、肝臓のＴＢＡＲＳ濃度をｎｍｏｌｇ−１肝臓組織として表現した。
【００９５】
統計分析。データはすべて平均±標準偏差として表現し、各処置群は１５匹の動物で構成した。正規性および定数分散の仮定を、Ａｎｄｅｒｓｏｎ−Ｄａｒｌｉｎｇ検定を使用しかつ残差対適合を調べて検定した。独立性は無作為化によって達成した。各分析について、Ｍｉｎｉｔａｂ  １５（Ｍｉｎｉｔａｂ  Ｉｎｃ．，ＰＡ，ＵＳＡ）統計ソフトウェアにより、一般線形モデルを使用する一元配置分散分析を実施した。ｐ≦０．０５で処置群間に有意差があった場合には、ＳＡＳ  Ｖ８（Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して、最小二乗平均検定（ＰＤＩＦＦ）による多重平均比較を実施した。
【００９６】
実施例１  ＱＡＥおよびＴＡＥの組成
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定されたＱＡＥの総ポリフェノール含量は、５６．５ｍｇ／ｇであった（表２Ａ）。これまでの研究と一致して、ＱＡＥ中の主要な化合物群は、フラボノール、フラバン−３−オール、アントシアニン、ジヒドロカルコン、およびフェノール酸であった（Ｒｕｐａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１０，５８：１２３３−１２３９；Ｈｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｒｕｐａｓｉｎｇｈｅ，Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．，２００９，４：Ｃ６９３−Ｃ６９９）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定された、ＴＡＥ中の総トリテルペン含量は、５２６ｍｇ／ｇ抽出物乾燥重量（５２．６％）であった（表２Ｂ）。存在した主要な５環性トリテルペンは、ウルソール酸およびコロリン酸であり、濃度はそれぞれ３７７．３０および１４９．０７ｍｇ／ｇ乾燥重量であった。
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【００９７】
実施例２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＱＡＥおよびＴＡＥによる一次および二次ＬＤＬ酸化生成物の阻害
ＱＡＥを、Ｃｕ２＋およびＡＡＰＨのそれぞれの存在下で、ＬＤＬ反応混合物と共にインキュベートし、ＬＤＬ酸化のＱＡＥによる防止レベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定した。その結果から、ＬＤＬでは、ＡＡＰＨ誘導酸化よりもＣｕ２＋誘導酸化がＱＡＥにより良好に防止されることがわかった（図２、表３）。ＡＡＰＨ誘導一次酸化生成物のＱＡＥによる最大防止は約５５％であった。Ｃｕ２＋誘導一次酸化生成物の場合は、８５％を超える防止が０．５〜１０ｍｇＬ−１の間の濃度でＱＡＥについて観察された。Ｃｕ２＋誘導二次酸化生成物の最大終結点は、１ｍｇＬ−１においてであったが、０．５〜１０ｍｇＬ−１の間に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。両方の誘導システムにおいて、一次酸化に関し、濃度が１０〜２５ｍｇＬ１を超えた場合に、ＱＡＥは酸化促進剤になった。
【００９８】
二次酸化生成物のパーセント阻害も、同様の濃度応答性挙動を示した。一次酸化について上記に示されたように、両誘導システムにより誘導される二次酸化生成物に対する酸化促進効果が１０ｍｇＬ−１を超える濃度でＱＡＥについて観察することができた。Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｆｒｅｅ．Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ，１９９５，８：１２５−１２６による報告のように、抗酸化化合物は、その最適濃度範囲より低い濃度でも、またはそれより高い濃度でも有効ではない。抗酸化化合物は、低濃度では、十分な防止を与えることができず、一方高濃度では、酸化促進剤として作用する。この現象は、ＬＤＬが種々の濃度のＱＡＥとインキュベートされる場合に、明確に観察された。ＱＡＥはいくつかのポリフェノール化合物から構成されているので、個々の化合物の抗酸化活性およびそれらの相乗効果が、ＱＡＥの抗酸化活性全体の原因となっている可能性がある。
【００９９】
図２からわかるように、ＬＤＬ酸化がＣｕ２＋により誘導される場合、０．５〜５ｍｇＬ−１のＱＡＥ濃度で、脂質の一次および二次酸化生成物の８５％超が阻害された。２５ｍｇＬ−１を超える濃度では、ＬＤＬはもはや保護されず、酸化促進効果が示された。ＡＡＰＨ誘導の下では、ＱＡＥは、一次酸化生成物を十分に防止しなかった。しかしながら、５〜１０ｍｇＬ−１の濃度で完全酸化阻害が示された（図２および３）。
【０１００】
ＱＡＥに比較して、ＴＡＥは、いくつかの予備試験を実施した後（データ提示せず）、はるかに高い濃度がＬＤＬ酸化の阻害に必要であった。ＴＡＥ活性の検討における無視できない制限として、その疎水的性質があった。ＬＤＬ懸濁液は完全に水性であったので、適合性のある溶媒系を見出すことは困難を伴った。エタノール、メタノール、ジメチルスルホキシド、およびＤＭＦなどの少数の溶媒系を検討した後、ＤＭＦが最も適合性のある溶媒であることが見出された。この溶媒では、ＴＡＥは完全に可溶性であり、かつＬＤＬ粒子は破壊されなかった。１０％ＤＭＦでは、最高濃度のＴＡＥ（５００ｍｇＬ−１）でも１００％の溶解性が示され、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで観察されるように、ＬＤＬ粒子の分解も示さなれなかった。
【０１０１】
Ｃｕ２＋誘導二次酸化生成物について、５０〜２００ｍｇＬ−１の濃度範囲で、８５％を超えるＬＤＬ酸化阻害が観察された（図４；表３）。２００ｍｇＬ−１を超える濃度で、ＴＡＥは、Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｆｒｅｅ．Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ，１９９５，８：１２５−１２６により説明された抗酸化的挙動に続き、ＴＢＡＲＳ生成を増加させる酸化促進効果を示した。ＱＡＥと同様に、ＴＡＥは、Ｃｕ２＋誘導ＬＤＬ酸化と比較して、ＡＡＰＨ誘導ＬＤＬ酸化を十分に防止しないことが観察された（表３）。一般に、抗酸化剤濃度がその最適値より大きい場合、抗酸化剤は酸化可能な基質に対して損傷効果を及ぼすことがある（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｆｒｅｅ．Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ，１９９５，８：１２５−１２６）。これにより、基質の酸化をさらに進行させる酸化促進効果が生じる。興味深いことに、Ｃｕ２＋およびＡＡＰＨ誘導一次ＬＤＬ酸化生成物の両方について、最高濃度（５００ｍｇＬ−１）でもＴＡＥの酸化促進効果はないことが観察された。これにより、一次酸化生成物阻害において、この抽出物の酸化促進濃度が５００ｍｇＬ−１より大きいことが示され得る。
【０１０２】
ＡＡＰＨ誘導一次生成物および二次酸化生成物に関してＴＡＥが与える防止レベルは、ＱＡＥよりも相当低いものであった。しかしながら、Ｃｕ２＋誘導酸化生成物は、顕著に阻害された（図４および５）。８５％を超える防止は、１５０ｍｇＬ−１より高濃度で得られた。５００ｍｇＬ−１のＴＡＥでも、ヒドロペルオキシド生成に対する酸化促進効果がないことは注目に値する。
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【０１０３】
実施例３  ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＱＡＥの成分化合物およびｉｎ  ｖｉｖｏケルセチン代謝産物による二次ＬＤＬ酸化生成物の阻害
ＱＡＥの主要成分化合物および３種のｉｎ  ｖｉｖｏケルセチン代謝産物によるＴＢＡＲＳ生成阻害の結果を表４に示す。予備試験では、５０、５、および０．０５ｍｇＬ−１の３濃度を各化合物について使用し、５０ｍｇＬ−１が、最高レベルの酸化阻害（データを提示せず）を与える最も有効な濃度であった。ＱＡＥの成分化合物は、ＡＡＰＨおよびＣｕ２＋誘導ＬＤＬ酸化を異なるレベルで防止し、クロロゲン酸、ケルセチン、およびケルセチン誘導体は、両誘導システムに対して良好に（８５％超）作用した（表４）。フロロジン（Ｐｈｌｏｒｏｄｚｉｎ）、エピカテキン、およびシアニジン−３−Ｏ−ガラクトシドは、Ｃｕ２＋誘導酸化については有望な結果を示したが、ＡＡＰＨ誘導酸化についてはそうではなかった。全体として、ＱＡＥの成分化合物はすべて、Ｃｕ２＋誘導ＬＤＬ酸化を完全に阻害した。
【０１０４】
Ｔｓａｏおよび共同研究者（Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００５，５３：４９８９−４９９５）は、ケルセチングリコシドは中程度の抗酸化活性を有するが、フラバン−３−オールおよびプロシアニジンは、リンゴ果皮および果肉中の全抗酸化活性に対して最大の寄与をしていると報告したが、本研究は異なる結果を示した。一部の研究では、抗酸化活性に対するフロリジンの寄与は少ないとの報告があり（Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００５，５３：４９８９−４９９５；Ｌｕ  ａｎｄ  Ｆｏｏ，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，２０００，６８：８１−８５）、これは、本研究のＡＡＰＨ誘導ＬＤＬ酸化においては確認されたが、Ｃｕ２＋誘導酸化においては確認されなかった。多くのフラボノイドのサブクラスの中では、リンゴ果皮から単離されたケルセチン誘導体およびフラバン−３−オールが、高いペルオキシルラジカルスカベンジング活性を示した（Ｈｅ  ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００８，５６：９９０５−９９１０；Ｌｕ  ａｎｄ  Ｆｏｏ，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，２０００，６８：８１−８５）。この発見は、ペルオキシルラジカル誘導ＬＤＬ酸化が、エピカテキンおよびケルセチン誘導体により７０％超阻害された本研究の結果により確認された。全体として、ＱＡＥの成分化合物はすべて、５０ｍｇＬ−１で、ＬＤＬ酸化を５０％を超えて効果的に阻害した。
【０１０５】
ケルセチン代謝産物による防止は、５０ｍｇＬ−１において、他のケルセチン誘導体よりも弱いものであった。これらの結果（表４）から、ケルセチン−３−グルクロン酸が、ＬＤＬ酸化を最も良好に防止することが示されたので、ＬＤＬ酸化に対するその濃度応答関係について試験した。比較のために、ケルセチンおよびケルセチン−３−Ｏ−ガラクトシドも同じ濃度で使用した。ケルセチンは、１ｍｇＬ−１を超える濃度で、Ｃｕ２＋誘導ＬＤＬ酸化を８０％超防止し、５ｍｇＬ−１を超える濃度で、ＡＡＰＨ誘導ＬＤＬ酸化を８０％超防止した（表５）。５ｍｇＬ−１を超えるケルセチン−３−Ｏ−ガラクトシド濃度により、両誘導システムについて、８５％を超えるＬＤＬ酸化阻害が得られた（表５）。ＡＡＰＨ誘導ＬＤＬ酸化に対するケルセチン−３−グルクロン酸による防止は、１ｍｇＬ−１を超える濃度では、Ｃｕ２＋誘導ＬＤＬ酸化（表５）に比較して、かなり弱いものであった。Ｈｏｕおよび共同研究者によれば（Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，２００４，１２９：２０９−１９）、ケルセチングリコシドは、Ｃｕ２＋およびＡＡＰＨ誘導ＬＤＬ酸化に対する有効な抗酸化剤であるが、親アグリコンほど有効ではなかった。本研究の結果はこの発見と一致しなかった。ＡＡＰＨ誘導ＬＤＬ酸化阻害では、アグリコンよりもグリコシドが優れていたが、Ｃｕ２＋誘導酸化阻害では、これら３種のケルセチン化合物の間で有意差がなかった。
【０１０６】
ケルセチンは、フリーラジカルスカベンジャーおよび遷移金属イオンのラジカルキレーターとして認識されている（Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｒｅｓ．，２００５，３９：１８５−１９４）。ケルセチンは、吸収および代謝変換の後でも、血漿脂質のＣｕ２＋誘導過酸化に対する抗酸化活性を有することが示されている（ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９８，４３０：４０５−４０８）。ケルセチン投与により、ｉｎ  ｖｉｖｏで脂質過酸化が防止されることも報告されている。大動脈に蓄積されるケルセチン−３−グリコシドでは、ケルセチン−３−グリコシドと共に高コレステロールの食餌を給餌されたウサギにおいて、ＴＢＡＲＳおよびコレステロールエステルヒドロペルオキシドが顕著に低いことが示された（Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｒｅｓ．，２００５，３９：１８５−１９４）。ケルセチン化合物は、腸細胞および肝臓の両方において、メチル化、グルクロノ結合、およびスルホ結合誘導体に代謝される（Ｐｅｒｅｚ−Ｖｉｚｃａｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｒｅｓ．，２００６，４０：１０５４−１０６５）。Ｂ環のカテコール構造、およびＢ環のＯ−ジヒドロキシル基以外の位置での結合が、他の２種のｉｎ  ｖｉｖｏ代謝産物と比較して優れた抗酸化活性を示す原因であると考えられる（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９９，３７２：３４７−３５４；Ｌｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００８，５６：３６０９−３６１５）。本研究の発見は、Ｌｏｋｅおよび共同研究者により報告された結果を確認する（Ｌｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００８，５６：３６０９−３６１５）。彼らの報告によると、ＬＤＬがホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート活性化好中球とインキュベートされた場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ代謝産物は、親分子と比較して顕著に低い阻害活性を示す（Ｌｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００８，５６：３６０９−３６１５）。さらに、彼らの発見が示すところでは、ケルセチン−３−Ｏ−グルクロニドは、３’−０−メチル−ケルセチン、３’−Ｏ−メチルケルセチン−３−Ｏ−グルクロニド、およびケルセチン−３’−Ｏ−スルフェートよりも、脂質過酸化を減少させるのに極めて有効である（Ｌｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００８，５６：３６０９−３６１５）。
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【０１０７】
実施例４  ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＴＡＥ成分化合物による二次ＬＤＬ酸化生成物の阻害
ＴＡＥの２種の主要成分化合物は、ウルソール酸およびコロリン酸であり、このうち前者の方が豊富であった。オレアノール酸がウルソール酸の最も豊富な異性体であり、かつＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりこれらを互いに識別することが困難なため、両異性体について濃度応答性ＬＤＬ酸化阻害を検討した。Ｃｕ２＋誘導ＬＤＬ酸化を、オレアノール酸でもコロリン酸でもなく、ウルソール酸がある程度防止できることは注目に値する（表６）。３種の化合物はすべて、Ｃｕ２＋誘導ＬＤＬ酸化よりもＡＡＰＨ誘導ＬＤＬ酸化を良好に防止する。ケルセチン化合物と比較すると、このＬＤＬ酸化の防止は相当弱いものであった。ＡＡＰＨ誘導ＬＤＬ酸化のより大きな防止は、３００ｍｇＬ−１濃度のウルソール酸により得られた（表６）。ＴＡＥはＣｕ２＋誘導ＬＤＬ酸化を効果的に阻害したが、その成分化合物の反応は逆であった。最大のＬＤＬ酸化阻害がウルソール酸により得られたにもかかわらず、その構造異性体であるオレアノール酸は有効ではなかった。オレアノール酸は、１０〜１００ｍｇＬ−１で、ＡＡＰＨ誘導ＬＤＬ酸化を約３０％防止し、ウルソール酸は、１００ｍｇＬ−１を超える濃度で、４０％を超える防止を与えた。まとめると、これら２種の異性体は、１０〜５００ｍｇＬ−１の幅広い濃度範囲で相乗的に有効であった。Ａｎｄｒｉｋｏｐｏｕｌｏｓおよび共同研究者（Ａｎｄｒｉｋｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．，２００３，１７：５０１−５０７）は、ウルソール酸およびオレアノール酸は、ＬＤＬ酸化に対して同等レベルの防止を与えると述べているが、これは本発見と一致しない。彼らはさらに、２種の化合物の構造的相違が生物活性に影響を及ぼさないことに注目した。コロリン酸は、ウルソール酸およびオレアノール酸と比較して、中間の有効性を示したが、Ｃｕ２＋誘導ＬＤＬ酸化の防止をまったく示さなかった。ＡＡＰＨ誘導ＬＤＬ酸化阻害に対するコロリン酸の有効濃度は、２００ｍｇＬ−１超であり、この濃度で４０％を超える阻害が得られた（表６）。
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【０１０８】
トリテルペノイド化合物は、非低下または非銅キレート化合物である（Ａｎｄｒｉｋｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｆｏｏｄｓ，２００２，５：１−７）。ある研究では、ウルソール酸、ウバオール、およびオレアノール酸（１０〜２０μΜ）を含む種々のトリテルペノイド化合物である、オリーブオイル中の微量成分が、平均として表現すると、４０％を超えるＬＤＬ酸化防止を示した（Ａｎｄｒｉｋｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｆｏｏｄｓ，２００２，５：１−７）。別の研究では、ウルソール酸が抗酸化活性をまったく示さず、またＬＤＬにおいて、α−トコフェロールに対する保護をまったく与えないことが確認された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１，１２：１４４−１５２）。本研究の結果から、ＴＡＥに存在する３種の化合物はすべて、Ｃｕ２＋誘導ＬＤＬ酸化に対する阻害効果が弱かったので、トリテルペン化合物は金属イオンキレーターとして作用しないことが明らかとなった。Ａｌｌｏｕｃｈｅらによる研究（Ａｌｌｏｕｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２０１０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｆｃｔ．２０１０．０７．０２２）は、オレアノール酸について、抗酸化特性も抗トロンビン特性も発見されなかった本研究の発見を補足するものであった。対象とする３種のトリテルペンの構造を検討すると、コロリン酸の構造には、Ｃ−２位およびＣ−３位の２つの隣接した水酸基がある。したがって、コロリン酸は、プロトンを供与し、より良好な抗酸化活性を示す点から、ＬＤＬ酸化を良好に防止することができると予測される。コロリン酸と同様の構造を有する別の５環性トリテルペンであるマスリン酸は抗酸化効果を示した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ．Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ，２００６，７７，５３４−５３７）。これら２種のトリテルペン分子の主な相違は、Ｃ−１９位およびＣ−２０位にある。
【０１０９】
実施例５  ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、２種の抽出物によるＬＤＬタンパク質分解の阻害
陰性および陽性対照と比較して、ＬＤＬのアポリポタンパク質の分解レベルを検出するために、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを実施した（図３および５）。陰性対照（レーン２）は、酸化による分解が最小レベルであるアポリポタンパク質からなっていた。２つの対照と比較すると、４つの異なるＱＡＥ濃度による処理によって、種々のレベルの酸化的ＬＤＬ分解が起こることがわかる（図３）。陰性対照と比較すると、両誘導システムの下で、高濃度のＱＡＥでは、低濃度よりもＬＤＬタンパク質分解が少ないことが示された。ＴＡＥは、ＡＡＰＨ誘導／ペルオキシルラジカル媒介による分解からＬＤＬを保護する能力が弱いことが明確にわかる（図５）。Ｃｕ２＋媒介ＬＤＬ分解では、陰性および陽性対照と比較すると、様々な程度の保護が観察され得る。陰性および陽性対照と比較すると、高濃度のＴＡＥほど、使用した参照（５ｍｇＬ−１のＴＢＨＱ）よりもＬＤＬ酸化を良好に防止した。
【０１１０】
要約すると、ケルセチンに富んだリンゴ果皮抽出物（ＱＡＥ）、トリテルペンに富んだリンゴ果皮抽出物（ＴＡＥ）、それらの成分化合物、および３種の選択されたｉｎ  ｖｉｖｏケルセチン代謝産物について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）酸化を阻害する能力を検討した。ＱＡＥは、０．５〜１０ｍｇＬ−１で８５％を超える酸化阻害を示し（ｐ＜０．０５）、２５ｍｇＬ−１以上の濃度では、酸化促進効果が顕著であった。ケルセチン、ケルセチン−３−Ｏ−ガラクトシド、およびケルセチン−３−グルクロン酸は、５〜５０ｍｇＬ−１で有効であり（８０％を超える阻害、ｐ＜０．０５）、酸化促進効果はまったく示さなかった。ＴＡＥは、１５０〜５００ｍｇＬ−１で、Ｃｕ２＋誘導脂質ヒドロペルオキシド生成を８５％超阻害し、酸化促進効果は観察されなかった。約５０％のＣｕ２＋誘導ＬＤＬ  ＴＢＡＲＳが、５０〜２００ｍｇＬ−１で阻害された（ｐ＜０．０５）。ＴＡＥ成分化合物の中では、コロリン酸およびオレアノール酸と比較して、ウルソール酸がペルオキシル−ラジカル誘導ＬＤＬ酸化を阻害するのに有効であった。全体として、２種の抽出物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酸化から効果的にＬＤＬを保護した。
【０１１１】
これらの発見から、ＱＡＥに富んだ抽出物、ＴＡＥに富んだ抽出物、およびそれらの組成物は、ＬＤＬ酸化の阻害、血漿および／または肝臓のコレステロール値の低減、および／または被験対象の心臓血管疾患の治療のために使用することができることが示唆される。
【０１１２】
実施例６  ハムスターモデルにおける食物摂取量および体重に対する２種の抽出物の効果
食餌で誘導された高コレステロール血症の動物が、一般に、ヒトコレステロール代謝の研究のために使用される。ハムスターは、食餌で誘導されたアテローム性動脈硬化の影響を研究するのに好適な動物モデルと考えられる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ，２００３，３８：１６５−１７０）。ハムスターにおける血漿リポタンパク質に対する食餌性コレステロールの影響が、ヒトにおけるものと類似することが示されている。健常ヒトに食餌性コレステロールを曝露すると、血漿総コレステロール（ＴＣ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ）が増加することが示され、同様の変化が食餌性コレステロールに曝露された健常ハムスターでも観察された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｎｕｔｒ．Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．，２００９，５３：９２１−９３０）。
【０１１３】
我々は、ハムスターモデルを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるコレステロール代謝の調節に対するリンゴ抽出物およびリンゴ果皮生理活性物質の効果を研究した。
【０１１４】
処置群のそれぞれに処置用食餌を割り当てる前は、動物の平均体重は１１２．７３±０．１３ｇであった。実験食餌を導入し、２８日間継続した後で、動物の体重は、処置群の間で有意に変化しなかった（ｐ＞０．０５）。動物の食餌摂取量は、各週とも処置群の間で有意差はなかった（ｐ＞０．０５）（表７）。４つの処置群の平均体重は１３２．０７±１．２６ｇであった（表８）。体重（ｇ）について、各週とも処置群の間で有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。これらの結果から、食餌処置によって、試験期間の間に動物の食餌摂取量または体重増加量が影響を受けなかったことがわかる。
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【０１１５】
実施例７  血清および肝臓の脂質レベルに対する２種の抽出物の効果
ハムスターの血清脂質プロフィールを表９に示す。ＱＡＥ食餌は、ＡＣ食餌に比較して、血清非ＨＤＬコレステロール値を低下させた（ｐ＜０．０５）。血液のＴＣ、ＴＧ、およびＨＤＬコレステロールの濃度に、ＱＡＥ、ＡＣ、およびＮＣ群の間で差があった。非ＨＤＬコレステロール値は、ＮＣおよびＱＡＥを給餌されたハムスターの間では、有意差がなかった（ｐ＝０．００５）。
【０１１６】
驚くべきことに、ＴＡＥ食餌群がＡＣ群に比べて有意に高いＴＧおよびＴＣ値を示すことを我々は見出した（ｐ＜０．０５）。ＨＤＬ−Ｃ値および非ＨＤＬ−Ｃ値では、ＴＡＥ食餌群およびＡＣ食餌群の間で有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。
【０１１７】
肝臓脂質プロフィールについては、肝臓ＴＧに関し、処置群のいずれの間にも有意差はなかった（ｐ＝０．９９４）（表１０）。ＴＣについては、ＡＣと２種の生理活性物質に富んだ食餌との間では有意差がなかったが、前述の３群はすべて、ＮＣ群とは有意差があった（ｐ＜０．０００１）。ＦＣ値は、ＱＡＥ食餌については、ＮＣと有意差がなかったが、ＴＡＥ食餌はＡＣ食餌と差があった（ｐ＝０．０１２５）。
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【０１１８】
実施例８  血清および肝臓の抗酸化状態
血清ＦＲＡＰおよびＴＢＡＲＳ値について、処置群のいずれの間にも有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。しかしながら、ＴＡＥ食餌を給餌されたハムスターでは、他の３群に比較して、肝臓のＴＢＡＲＳ（ＭＤＡ）値が上昇したので、肝臓ＴＢＡＲＳ値には有意差があった（表１１）。
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【０１１９】
要約すると、本研究は、ｉｎ  ｖｉｖｏコレステロール代謝に対する２種のリンゴ抽出物の影響を検討するために実施した。６０匹の雄性ゴールデンシリアンハムスターを、ケージに別々に収容した。２週間の順応期間の後に、ハムスターを４群に分け、正常対照（ＮＣ）としてはＡＩＮ−９３Ｇ純粋食、アテローム生成対照（ＡＣ）としては０．１５％コレステロールを添加した普通食、ケルセチンに富んだリンゴ抽出物（ＱＡＥ）（５０ｍｇ／ｋｇ体重／日）を補充したアテローム生成食餌、およびトリテルペンに富んだリンゴ抽出物（ＴＡＥ）（５０ｍｇ／ｋｇ体重／日）を補充したアテローム生成食餌をそれぞれ４週間給餌した。ＱＡＥ食餌は、ＡＣに比較して、血清ＴＣおよび非高密度リポタンパク質コレステロール（非ＨＤＬ）値を低下させた（ｐ＜０．０５）。対照的に、ＴＡＥ食餌は、ＡＣ食餌に比較して、血清ＴＣ値を増加させた（ｐ＜０．０５）。２種のリンゴ果皮抽出物は、血清トリグリセリドおよびＨＤＬ値、ならびに血清チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）およびｆｅｒｒｉｃ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｐｏｗｅｒなどのｉｎ  ｖｉｖｏ酸化ストレスバイオマーカーに影響を与えなかった。ＱＡＥもＴＡＥも、肝臓ＴＢＡＲＳ、ＴＣ、遊離コレステロール、およびトリグリセリドに影響を与えなかった。結論として、ＱＡＥは、その抗酸化特性に加えて血中コレステロールを低下させることができ、ＴＡＥもまたコレステロール代謝に効果がある。
【０１２０】
全体として、我々は、ＱＡＥおよびケルセチン誘導体がＬＤＬ酸化に対する強力な抗酸化活性を有することを明確に実証した。ＱＡＥ食餌は、ＡＣ群に比較して、血清ＴＣを１２．６％、非ＨＤＬ−Ｃを３０．７％効果的に低下させた。ＨＤＬ−Ｃ値は、ＮＣ群と比較して３６．８％増加した。
【０１２１】
種々のｉｎ  ｖｉｖｏモデルで、コレステロール代謝に対する新鮮リンゴ、凍結乾燥リンゴ、およびリンゴ抽出物の効果を試験する研究が多数行われてきた。０．３％コレステロールを給餌されたラットに１５％凍結乾燥リンゴを導入すると、０．３％コレステロールのみを給餌された対照動物に比べ、血漿コレステロール値は９．３％低下するが、ＴＧ値は有意差がないことが示された（Ａｐｒｉｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００１，７５：４４５−４５２）。このリンゴ食餌は、凍結乾燥リンゴ全体からなっているため、繊維を５〜１０％および糖を１１〜１２％含有していた。したがって、低コレステロール血症に効果があることが知られているペクチンならびにフルクトースおよび糖の効果がこの結果に寄与した可能性がある。対照的に、本研究で使用されたＱＡＥ処理食餌は、抽出されたリンゴポリフェノールから主としてなっており、繊維および糖を含有せず、主要成分化合物はケルセチン誘導体であった。
【０１２２】
さらに、我々は、血清脂質プロフィールの変量が、ＱＡＥ処置動物よりもＴＡＥ処置動物において高いことを見出した。血清ＴＧおよびＴＣについては、ＴＡＥ処置動物の値はＡＣ群より一層高かった。
【０１２３】
本発明の特定の実施形態が実施例に記載されているが、本発明の変更および改変を当業者が想到することは明らかである。本発明の実施形態は、実施例により限定されることを意図するものではない。当業者が想到するこのような変更および改変は、以下の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内にあることを特に理解されたい。例えば、一実施形態の一部として説明または記載された形態を、別の実施形態で使用して、さらなる実施形態を得ることができる。したがって、本発明は、特許請求の範囲内に入るような変更および変形ならびにその等価物を包含することを意図するものである。
【０１２４】
本明細書で引用されたすべての文書および文献は、それらの内容全体を参照によって本明細書に組み込むものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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