(57)【要約】  原核生物により産生されるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(phenylalanine ammonia-lyase)(PAL)の変異体を本明細書中で提供する。そのような原核生物PAL変異体は、野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び/又は、低減された免疫原性を有する。更に、原核生物PALの組成物、及び生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体又は類似体、並びに、工業目的、及び治療目的、例えば、フェニルケトン尿症を含む高フェニルアラニン血症、及び癌を含む他の障害の治療目的のそのような組成物の製造方法、精製方法、配合方法及び使用方法を提供する。【選択図】図1【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)ペグ化アナベナ  バリアビリスフェニルアラニンアンモニア-リアーゼ(AvPAL)変異体の位置503及び565のシステイン残基がセリン残基(配列番号11)によって置換されており、該AvPAL変異体がポリエチレングリコールを含み、AvPAL変異体と該ポリエチレングリコールの比が約1:3であるAvPAL変異体と、
(b)(i)Tris-HCl、(ii)NaCl、(iii)L-フェニルアラニン (Phe)及び(iv)グリシン (Gly)を含む医薬として許容し得る担体と
を含む、配合物。
【請求項２】
前記ペグ化AvPAL変異体の濃度が約5から15mg/mLである、請求項1記載の配合物。
【請求項３】
Tris-HClの濃度が約5から15mMである、請求項1又は2記載の配合物。
【請求項４】
NaClの濃度が約120から150mMである、請求項1から3のいずれか一項記載の配合物。
【請求項５】
Pheの濃度が約0.5から1.5mMである、請求項1から4のいずれか一項記載の配合物。
【請求項６】
Glyの濃度が約1.0から100mM、約1.0から20mM又は20から100mMである、請求項1から5のいずれか一項記載の配合物。
【請求項７】
前記配合物のpHが約6.5から7.5である、請求項1から6のいずれか一項記載の配合物。
【請求項８】
前記配合物のpHが約7.0から7.6である、請求項1から7のいずれか一項記載の配合物。
【請求項９】
防腐剤としてm-クレゾールを更に含む、請求項1から8のいずれか一項記載の配合物。
【請求項１０】
m-クレゾールの濃度が約0.3%から0.5%(w/v)である、請求項9記載の配合物。
【請求項１１】
(a)ペグ化AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基がセリン残基(配列番号11)によって置換されており、該AvPAL変異体がポリエチレングリコールを含み、AvPAL変異体と該ポリエチレングリコールの比が約1:3であるペグ化AvPAL変異体と、
(b)(i)Tris-HCl、(ii)NaCl、(iii)Phe及び(iv)Glyを含む医薬として許容し得る担体と
を含む配合物であって、約7.3+/-0.3のpHを有する、前記配合物。
【請求項１２】
ペグ化AvPAL変異体の濃度が約10+/-5mg/mLである、請求項11記載の配合物。
【請求項１３】
Tris-HClの濃度が約10+/-5mMである、請求項11又は12記載の配合物。
【請求項１４】
NaClの濃度が約135+/-15mMである、請求項11から13のいずれか一項記載の配合物。
【請求項１５】
Pheの濃度が約1.0+/-0.5mMであり、Glyの濃度が約50.5+/-49.5mM、約10.5+/-9.5mM又は約60+/-40mMである、請求項11から14のいずれか一項記載の配合物。
【請求項１６】
防腐剤としてm-クレゾールを更に含む、請求項11から15のいずれか一項記載の配合物。
【請求項１７】
m-クレゾールの濃度が約0.4%+/-0.1%(w/v)である、請求項16記載の配合物。
【請求項１８】
(a)ペグ化AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基がセリン残基(配列番号11)によって置換されており、該AvPAL変異体がポリエチレングリコールを含み、AvPAL変異体と該ポリエチレングリコールの比が約1:3であるペグ化AvPAL変異体と、
(b)(i)約10+/-5mMのTris-HCl;(ii)約135+/-15mMのNaCl;(iii)約1+/-0.5mMのPhe;(iv)約50.5+/-49.5mM、約10.5+/-9.5mM又は約60+/-40mMのGly;及び(v)約0.4%+/-0.1%(w/v)のm-クレゾールを保存剤として含む医薬として許容し得る担体と
を含む配合物であって、約7.3+/-0.3のpHを有する、前記配合物。
【請求項１９】
前記ペグ化AvPAL変異体の保存寿命(T90)が、Pheの存在しない対応するペグ化AvPAL変異体配合物と比較して、4℃から42℃の間の温度で、1.5倍から10倍の間で増加する、請求項1から18のいずれか一項記載の配合物。
【請求項２０】
前記ペグ化AvPAL変異体のT90が、25℃において4倍から5倍の間、37℃において2倍から3倍の間、42℃において2倍から3倍の間、又はその組合せで増加する、請求項19記載の配合物。
【請求項２１】
最小限の凝集でペグ化アナベナ  バリアビリスフェニルアラニンアンモニア-リアーゼ(AvPAL)変異体を精製するための方法であって、
(a)該AvPAL変異体を含む細菌細胞を均質化によって溶解して、細胞溶解物を生成すること;
(b)該細胞溶解物を30から120分間にわたって65℃に加熱すること;
(c)加熱された細胞溶解物を遠心分離することであって、該AvPAL変異体を含む上澄みを保持すること;
(d)該上澄みをろ過して、沈殿物を除去すること;
(e)陰イオン交換(AIEX)カラム、続いて疎水性相互作用(HIC)カラムによる連続クロマトグラフィーによって、AvPAL変異体を汚染タンパク質から分離することであって、HICカラムからの溶出液が該AvPAL変異体を含むこと;
(f)該AvPAL変異体を含む該HICカラムからの該溶出液を限外ろ過又は限外ろ過/透析ろ過すること;
(g)ポリエチレングリコールと該AvPAL変異体とを混合することによって該AvPAL変異体をペグ化すること;
(h)限外ろ過/透析ろ過によって遊離ポリエチレングリコールを該ペグ化AvPAL変異体から除去すること;及び
(i)該ペグ化AvPAL変異体を配合することを含み、
該AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基がセリン残基(配列番号11)によって置換されており、該AvPAL変異体がポリエチレングリコールを含む、前記方法。
【請求項２２】
AvPAL変異体と前記ポリエチレングリコールの比が約1:3である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記AIEXカラムがToyopearl Giga Cap Q 650Mカラムである、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
前記HICカラムがToyopearl Butyl 650Mカラムである、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
ステップ(e)で得られた前記AvPAL変異体を含む前記HICカラムからの溶出液を凍結及び解凍することであって、グリセロール、スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール及びソルビトールからなる群から選択される１以上のポリオール又は糖を凍結の前に該HICカラム溶出液に添加することを更に含む、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリオールがグリセロールである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記グリセロールの濃度が10%(v/v)である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記糖がスクロースである、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
スクロースの濃度が10%(v/v)である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
前記AvPAL変異体を含む前記HICカラムからの溶出液の凍結を不連続温度ステップで実施する、請求項25記載の方法。
【請求項３１】
前記AvPAL変異体を含む前記HICカラムからの溶出液の解凍を不連続温度ステップで実施する、請求項25記載の方法。
【請求項３２】
前記AvPAL変異体を含む前記HICカラムからの溶出液の凍結及び解凍を不連続温度ステップで実施する、請求項25記載の方法。
【請求項３３】
ステップ(f)における透析ろ過緩衝液が、リン酸カリウム(Kpi)、及びtrans-桂皮酸(t-CA)及びグリセロールからなる１以上の薬剤を含む、請求項21記載の方法。
【請求項３４】
前記透析ろ過緩衝液が、50mMのKpi、10mMのt-CA、5%のグリセロール(pH8.5)を含む、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
ステップ(f)で得られた前記AvPAL変異体を含む前記HICカラムからの限外ろ過、又は限外ろ過/透析ろ過溶出液に非イオン性洗剤を添加する、請求項21記載の方法。
【請求項３６】
前記非イオン性洗剤がポリソルベート80(PS80)である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
前記PS80の濃度が0.02%である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
最小限の凝集でアナベナ  バリアビリスフェニルアラニンアンモニア-リアーゼ(AvPAL)変異体を精製するための方法であって、
(a)該AvPAL変異体を発現する細菌細胞を均質化によって溶解して、細胞溶解物を生成すること;
(b)該細胞溶解物を30から120分間にわたって65℃に加熱すること;
(c)加熱された細胞溶解物を遠心分離することであって、該AvPAL変異体を含む上澄みを保持すること;
(d)該上澄みをろ過して、沈殿物を除去すること;及び
(e)陰イオン交換(AIEX)カラム、続いて疎水性相互作用(HIC)カラムによる連続クロマトグラフィーによって、AvPAL変異体を汚染タンパク質から分離することであって、HICカラムからの溶出液が該AvPAL変異体を含むことを含み、
該AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基がセリン残基(配列番号11)によって置換されている、前記方法。
【請求項３９】
前記AIEXカラムがToyopearl Giga Cap Q 650Mカラムである、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
前記HICカラムがToyopearl Butyl 650Mカラムである、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)の欠乏によって全体的又は部分的に引き起こされる疾患を治療するための方法であって、PAHの欠乏を有する被験者に対して、請求項1から20のいずれか一項に記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４２】
前記疾患がフェニルアラニンレベルの上昇によって特徴付けられる、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
前記被験者が正常なPAH活性の約10%以下を有する、請求項41又は42記載の方法。
【請求項４４】
フェニルケトン尿症(PKU)を有する被験者を治療するための方法であって、請求項1から20のいずれか一項に記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物を該被験者に投与することを含み、該AvPAL変異体の投与が、該被験者の血漿におけるフェニルアラニン濃度を、該投与のない該濃度と比較して低下させるのに有効である、前記方法。
【請求項４５】
前記被験者が突然変異体PAHを有する、請求項41から44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
前記突然変異体PAHがPAHの触媒領域に突然変異を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
前記突然変異が、F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M E390G、A395P、P407S及びY414Cからなる群から選択される１以上の突然変異を含む、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
高フェニルアラニン血症(HPA)を有する妊婦を治療するための方法であって、請求項1から20のいずれか一項記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物を、タンパク質制限食と組み合わせて該女性に投与することを含み、該配合物とタンパク質制限食との併用投与が、該女性の血漿フェニルアラニン濃度を、該併用投与のない該濃度と比較して低下させるのに有効である、前記方法。
【請求項４９】
血漿フェニルアラニン濃度の上昇を治療する方法であって、血漿フェニルアラニンが増加した被験者に対して、請求項1から20のいずれか一項記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物を、該被験者の血漿フェニルアラニン濃度の減少をもたらすのに有効な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項５０】
PKUを有する幼児を治療する方法であって、請求項1から20のいずれか一項記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物を、該幼児の血漿フェニルアラニン濃度の減少をもたらすのに有効な量で該幼児に投与することを含み、該幼児が0から3歳の間であり、該幼児の血漿フェニルアラニン濃度が約360μMから約4800μMの間である、前記方法。
【請求項５１】
被験者の血漿フェニルアラニン濃度を減少させるための方法であって、請求項1から20のいずれか一項記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物を該被験者に投与することを含む、前記方法。
【請求項５２】
前記被験者の血漿フェニルアラニン濃度が、前記配合物の投与の前に約200μMを超えている、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
前記有効量が、前記被験者の血漿フェニルアラニン濃度を10%以上減少させる、請求項51又は52記載の方法。
【請求項５４】
前記被験者がPAH活性の欠乏を有する、請求項51から53のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
前記被験者が突然変異体PAHを有する、請求項51から54のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
前記突然変異体PAHがPAHの触媒領域に突然変異を含む、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
前記突然変異が、F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M E390G、A395P、P407S及びY414Cからなる群から選択される１以上の突然変異を含む、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
タンパク質制限食を前記被験者に投与することを更に含む、請求項51から57のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
前記被験者がPKUを有する、請求項51から58のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
前記PKUが古典的な重度PKUである、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
前記被験者が妊婦である、請求項51から60のいずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
前記女性にタンパク質制限食を投与することを更に含む、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
前記被験者が0から3歳である、請求項51から60のいずれか一項記載の方法。
【請求項６４】
癌を有する被験者を治療するための方法であって、請求項1から20のいずれか一項記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物の治療有効量を該被験者に投与することを含む、前記方法。
【請求項６５】
前記有効量が、前記被験者の血液、血清又は血漿フェニルアラニン濃度を検出レベル未満の濃度から20μMと60μMとの間の濃度の範囲まで減少させる、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
前記癌が、肺癌、脳癌、中枢神経系の癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌、頭及び首の癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄腫、小児癌又は抵抗性癌である、請求項64又は65記載の方法。
【請求項６７】
前記癌が転移性黒色腫である、請求項64又は65記載の方法。
【請求項６８】
前記癌に由来する細胞の増殖及び/又は生存が、フェニルアラニンの制限又は欠失に感受性のある、請求項64から67のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
癌治療薬又は標的化癌治療薬を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを更に含む、請求項64から68のいずれか一項記載の方法。
【請求項７０】
前記被験者にタンパク質制限食を投与することを更に含む、請求項64から69のいずれか一項記載の方法。
【請求項７１】
前記有効量が、前記被験者の血液、血清又は血漿フェニルアラニン濃度を検出レベル未満の濃度から約20μM未満の濃度の範囲まで減少させる、請求項64から70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７２】
前記有効量が、前記被験者の血液、血清又は血漿フェニルアラニン濃度を検出レベル未満の濃度から約10μM未満の濃度の範囲まで減少させる、請求項64から71のいずれか一項記載の方法。
【請求項７３】
癌を有する被験者の血液、血清又は血漿フェニルアラニン濃度を減少させるための方法であって、請求項1から20のいずれか一項記載の配合物、又は請求項21から37のいずれか一項により精製されたペグ化AvPAL変異体を含む配合物の治療有効量を該被験者に投与することを含む、前記方法。
【請求項７４】
前記有効量が、前記被験者の血液、血清又は血漿フェニルアラニン濃度を検出レベル未満の濃度から20μMと60μMとの間の濃度の範囲まで減少させる、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
前記被験者がヒトである、請求項41から74のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（分野）
原核生物フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(phenylalanine ammonia-lyase)(PAL)変異体に関連する組成物を、原核生物PALの免疫原性及び/又はタンパク質分解感受性を低減させながら原核生物PALの触媒活性及び/又は安定性を向上させるためのそのような組成物の最適化を含めて本明細書中で提供する。また、治療目的、例えば、フェニルケトン尿症(phenylketonuria)(PKU)を含む高フェニルアラニン血症(hyperphenylalaninemia)(HPA)、及び癌を含む他の障害の治療目的の原核生物PAL変異体のそのような最適な組成物の使用を本明細書中で提供する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)は、植物［Koukolらの文献, J. Biol. Chem. 236:2692-2698 (1961); Hansonらの文献, The Enzymes 7:75-166 (1972); Poppeらの文献, Curr. Org. Chem. 7:1297-1315 (2003)］、ある真菌類［Raoらの文献, Can. J. Biochem. 4512:1863-1872 (1967); Abellらの文献, Methods Enzymol. 142:242-253 (1987)］、及び、細菌［Bezansonらの文献, Can. J. Microbiol. 16:147-151 (1970); Xiangらの文献, J. Biol. Chem. 277:32505-32509 (2002); Hillらの文献, Chem. Commun. 1358-1359 (2003)］に広く分布している非哺乳動物酵素であり、大腸菌(Escherichia coli)において組換えにより生産される。
【０００３】
アナベナ  バリアビリス(Anabaena variabilis)(Av)及びノストック  パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)(Np)の2つのシアノバクテリア菌株由来のPALが、細菌(例えば大腸菌(Escherichia coli (E. coli))にてクローン化及び発現されており、インビトロ及びインビボでPAL酵素活性を示すことが証明された(例えば、米国特許第7,531,341号;同第7,534,595号;同第7,537,923号;及び7,560,263号参照)。ペグ化組換えアナベナ  バリアビリスPAL(rAvPAL-PEG)も産生されており、rAvPALタンパク質は、ポリエチレングリコール(PEG)の共有結合によって誘導体化されて、その半減期を増大し、その薬物動態プロファイルを最適化し、及び/又はその免疫原性を低減した(同上)。rAvPAL-PEGは、フェニルアラニンを代謝することが証明されており、PKUを含むHPAなどのフェニルアラニンのレベルの上昇に伴う障害又は疾患の患者のための、並びに癌治療における酵素置換治療薬(enzyme substitution therapy)(EST)として開発されている(同上)。
【０００４】
PALには、潜在的に様々な治療への適用があるが、PALの利用は、低減された比活性及びタンパク質分解不安定性によって制限され得る。他の治療タンパク質と同様に、酵素治療としてのPALの利用は、免疫原性及びタンパク質分解感受性等のいくつかの欠点が伴う［Vellardの文献, Curr. Opin. Biotechnol. 14:1-7 (2003)参照］。更に、高フェニルアラニン血症によって特徴付けられる障害において血漿フェニルアラニンレベルの正常な幾分狭い範囲内への制御を達成及び維持するために、基質親和性と酵素活性との間にデリケートなバランスが必要とされる。これらのパラメーターの改善に向けた取り組みは、このタンパク質に関する構造及び生化学についての知識の不足により、未だ行われていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、PKUを含むHPA及び癌を含む他の疾患の治療を含む治療用途のための、強力な触媒活性、長い生物学的半減期、高い生化学的安定性、及び／又は、低減された免疫原性を含む、最適な動力学特性を具備するPAL分子の必要性が残されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（概要）
原核性物又は細菌PALは、PKUを含むHPA、及び癌を含む他の障害に対する効果的な治療薬として役立つことができる。より強力な触媒活性、高い生化学的安定性、並びに、治療への適用のための、低減された免疫原性、及び／又は、長い生物学的半減期等の向上された特性を具備する、原核生物PALの組成物、及び、生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体又はその類似体を本明細書中で提供する。また、原核生物PAL、及び生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体又は類似体、並びに、保存剤及び／又は安定化剤を含んだ医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物及び配合物を本明細書中で提供する。また、原核生物PAL、及び生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体又は類似体の製造方法及び精製方法、並びに、PKUを含むHPA及び癌を含む他の疾患の治療を含む治療目的のそのような組成物の使用方法を本明細書中で提供する。
【０００７】
本明細書中で用いられる“細菌PAL”及び“原核生物PAL”は、(1)ストレプトマイセス マリチムス(Streptomyces maritimus)［EncP（配列番号5、図4）としても公知である］、ノストック パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)［配列番号2（図4）］、アナベナ バリアビリス(Anabaena variabilis)［配列番号4（図4）］、アナシィスティス ニダランス(Anacystis nidulans)［Lofflehardtの文献, Z. Naturforsch. 31(ll-12):693-9 (1976)］、フォトラブダス ルミネセンス(Photorabdus luminescens) TT01［Williamsらの文献, Microbiology 151:2543-2550 (2005)］、及びストレプトマイセス バルチチラタス(Streptomyces verticillatus)［Bezansonらの文献, Can. J. Microbiol. 16(3):147-51 (1970)］を含む、これらに限定されない、原核生物由来の野生型PAL；(2)同様の（すなわち、少なくとも50％）フェニルアラニンの触媒活性を保持し、例えば、増加された触媒活性、高い生化学的安定性、増大された半減期、及び／又は低減された免疫原性を示すことができる、そのような野生型PAL酵素のフラグメント、突然変異体、変異体又は類似体；及び、(3)例えば、増大された半減期及び／又は低減された免疫原性等のこれらに限定されない他の有利な効果を奏する他の化学的部位(chemical moieties)に結合している、そのような野生型PAL酵素、又は、そのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体の化学修飾物；と互換的に用いられる。例えば、治療目的の、原核生物PAL、及び、そのフラグメント、突然変異体、変異体、類似体又は化学修飾物の製造方法及び使用方法に関する言及は、すべてのそのような野生型PAL、又は、そのフラグメント、突然変異体、変異体、類似体若しくは化学修飾物の製造方法、使用方法、又は配合方法を言及することを意味するものである。
【０００８】
第1の態様において、原核生物PAL、及び、その生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体又はその類似体、並びに、医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物を本明細書中で提供する。1つの実施態様は、ノストック パンクチフォルメ由来の原核生物PAL（配列番号２）、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類似体である。他の実施態様は、アナベナ バリアビリス由来の原核生物PAL（配列番号４）、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類似体である。野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び／又は低減された免疫原性を有する原核生物PAL変異体を本明細書中で提供する。
【０００９】
特定の実施態様においては、原核生物PAL変異体は、ロドスポリディウム トルロイデスPAL(RtPAL)由来のPALにおけるSer210、Ala−Ser−Gly三成分系(211−213)、Asp214、Leu215、Asn270、Val269、Leu266、Leu134、His137、Lys468、Glu496、Gln500に対応する位置又は、これらの活性部位残基の保存的置換で野生型の活性部位を保持し、該211−213のAla−Ser−Gly三成分系が、フェニルアラニンの結合部位であるとされている。
【００１０】
原核生物PAL変異体は、タンパク質を含み、１以上のアミノ酸（例えばシステイン）残基が、他のアミノ酸(例えばセリン)残基によって置換されて、インビボにおいて、低減された酵素活性、増大された免疫原性、及び／又は、低減された生物利用性等の他の不利な影響と関連し得るタンパク質凝集を低減させる。原核生物PAL変異体の１以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸によって置換されており、当該置換が、野生型PALと比較して、フェニルアラニン変換活性を増加させ、及び／又は、免疫原性を低減させる、医薬組成物を本明細書中で提供する。
【００１１】
ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の１以上のアミノ酸残基は、他のアミノ酸残基によって置換されている。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の１以上のシステイン残基は、セリン残基によって置換されている。一部の実施態様においては、原核生物PAL変異体は、アナベナ バリアビリスPAL(AvPAL)である。他の実施態様においては、AvPAL変異体の１以上のシステイン残基は、位置64、318、503及び565のシステイン残基からなる群より選択されるセリン残基によって置換されている。特定の実施態様においては、AvPAL変異体の位置565のシステイン残基は、セリン残基によって置換されている。一部の実施態様においては、AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基は、セリン残基によって置換されている。
【００１２】
原核生物PAL変異体は、融合タンパク質を含むこともでき、該PAL酵素は、半減期を増大させることで当技術分野において公知であるサルベージエピトープ(salvage epitope)を保持するイムノグロブリン又はそのフラグメントの天然の又は改変された定常領域等の他の異種ポリペプチドに融合されている。
【００１３】
また、他の有利な効果を奏する化学的部位に結合している、そのような原核生物PALポリペプチドの化学修飾物を本明細書中で提供する。例えば、ポリペプチドとの水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）の非特異的又は部位特異的な（例えばN末端）結合は、半減期を改善することが当技術分野において公知であり、化学的部位の結合も又、免疫原性を低減させ、及び／又は、プロテアーゼ耐性を改善し得る。
【００１４】
ある実施態様においては、原核生物PAL変異体は、水溶性ポリマーを含む。一部の実施態様においては、原核生物PAL変異体は、ポリエチレングリコールを含む。他の実施態様においては、原核生物PAL変異体は、AvPAL変異体であり、AvPALとポリエチレングリコールの比が、約１：３（１：３ AvPAL:PEG）である。特定の実施態様においては、原核生物PAL変異体は、AvPAL変異体であり、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比が、約１：３（１：３ AvPAL:PEG）であり、かつ、AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基は、セリン残基によって置換されている。
【００１５】
ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の１以上のアミノ酸残基は、リジン残基によって置換されている。原核生物PAL変異体における追加的なリジン残基のペグ化(pegylation)は、低減された免疫原性、増加された触媒活性、及び／又は、改善された生化学的安定性を有する酵素とすることができる。特定の理論に結び付くことなしに、原核生物PALの活性部位（例えば、AvPALの位置78）の／付近のチロシン残基は、酵素活性を低減させるペグ化の部位となり得ると仮定されている。1つの実施態様においては、酵素活性に必要ではない、原核生物PAL変異体の活性部位の／付近の１以上のアミノ酸は、リジン残基によって置換される。特定の理論に結び付くことなしに、活性部位の／付近の置換されたリジン残基のペグ化は、立体的にチロシン残基（例えば、AvPALの位置78）のペグ化を妨害すると仮定されている。
【００１６】
そのような原核生物PAL変異体は、本明細書中で提供する方法に従って分離及び精製され、そのために、原核生物PAL酵素を治療で用いることが可能な量存在する。ある実施態様においては、完全な又は野生型原核生物PALのcDNAコード化が用いられる。しかしながら、他の実施態様においては、生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体又はその類似体のcDNAコード化を用いることができる。また、構造に基づく分子設計技術のアプローチ、及び／又は、PALの化学的に修飾された（例えばペグ化）形態によって得られる最適化された原核生物PALの組成物を本明細書中で提供する。特定の実施態様は、治療用途に適切な、改善された比活性、増大された安定性、低減された免疫原性、及び／又はタンパク質分解感受性を有する原核生物PALの最適な組成物を意図するものである。1つの実施態様においては、PALは、改善された比活性、増大された安定性、低減された免疫原性、及び／又はタンパク質分解感受性を有するノストック パンクチフォルメPALのペグ化された形態である。別の実施態様においては、PALは、改善された比活性、増大された安定性、低減された免疫原性、及び／又はタンパク質分解感受性を有するアナベナ バリアビリス PALのペグ化された形態である。
【００１７】
様々な実施態様においては、PAL変異体のペグ化は、PAL:PEG又はPEG:PALの比に関して記載される。本明細書中で用いられているように、かつ他に指定する場合を除いて、「PAL:PEG」の比は、ペグ化反応におけるPEG分子に対するPAL変異体上のリジン残基の比を指す。同様に、本明細書中で用いられているように、かつ他に指定する場合を除いて、「PEG:PAL」の比は、ペグ化反応におけるPAL変異体上のリジン残基に対するPEG分子の比を指す。
【００１８】
1つの実施態様においては、免疫原性が低減されたペグ化原核生物PAL変異体が提供される。別の実施態様は、免疫原性が低減されたノストック  パンクチフォルメPAL(Nostoc punctiforme PAL)(NpPAL)変異体のペグ化形態である。更に別の実施態様は、免疫原性が低減されたAvPAL変異体のペグ化形態である。特定の実施態様は、NpPAL又はAvPAL変異体と水溶性ポリマー、例えばPEGとを反応させることによってペグ化が達成されるNpPAL又はAvPAL変異体を意図するものである。ある実施態様においては、ペグ化は、NpPAL又はAvPAL変異体とPEGとを、少なくとも1:1、少なくとも1:1.5、少なくとも1:2、少なくとも1:3又は少なくとも1:4のPAL:PEGの比で一度反応させることによって達成される。1つの実施態様においては、原核生物PAL変異体は、AvPAL変異体であり、ペグ化は、1:3のPAL:PEG比を用いて達成される。
【００１９】
ある実施態様においては、ペグ化原核生物PAL変異体は、AvPAL変異体であり、AvPALの位置503及び565のシステイン残基がセリン残基(配列番号11)で置換されている。
【００２０】
ある実施態様においては、野生型原核生物PALの生物学的に活性のある部位が、PALの動力学的特性を最適化するように改質される。1つの実施態様においては、原核生物PAL変異体は、血漿フェニルアラニンレベルを低下させるとともに、約120μMから約240μMの最適範囲内に維持するのに十分な活性を有する。他の実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、少なくとも約0.1s-1、又は約0.5s-1を超えるkcatである。ある実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、少なくとも約0.2s-1、又は約1.0s-1を超えるkcatである。他の実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、約10μMから約1000μMのKmである。他の実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、約100μMから約1000μMのKmである。1つの実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、野生型PALのそれの約2倍から約1000倍の酵素活性を示す。他の実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、野生型PALのそれより約10%から100%高い酵素活性を示す。そのような生物学的に活性のある原核生物PAL変異体を、部位特異的突然変異誘発などによる当該技術分野で既知の方法を使用して形成することができる。また、ヒトなどの哺乳類におけるPAH活性の欠乏の治療のための医薬品の製造における、フェニルアラニンを代謝する(すなわち、フェニルアラニンを別の物質に変換する)原核生物PAL変異体、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体の使用、並びにPAH活性の欠乏の治療に使用するための、原核生物PAL変異体を含む医薬組成物を本明細書中で提供する。
【００２１】
ある実施態様においては、野生型原核生物PALの生物学的に活性のある部位は、PALの動力学特性を最適化するように改質することができる。1つの実施態様においては、原核生物PAL変異体は、当技術分野において公知の標準的な検出方法を用いて、検出感度未満から約20μM〜60μMの範囲、例えば約20μM未満、又は約10μM未満に被験者の血漿のフェニルアラニンレベルを低減させるのに十分な活性を有する。他の実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、少なくとも約0.1s-1、例えば約0.5s-1より高く、1.0s-1より高いkcatである。一部の実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、少なくとも約0.4s-1、例えば約2.0s-1より高く、又は4.0s-1より高いkcatである。他の実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、約10μM〜約2000μMのKmである。一部の実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、約10μM〜約1000μMのKmである。他の実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、約10μM〜約500μMのKmである。更に他の実施態様においては、生物学的に活性のある原核生物PAL変異体は、野生型PALの少なくとも約50％から約10倍超の酵素活性を示す。そのような生物学的な活性のある原核生物PAL変異体は、部位特異的突然変異誘発等の当技術分野において周知の方法を用いて形成することができる。被験者（例えばヒト被験者）の癌の予防又は治療のための薬剤の調製においてフェニルアラニンを代謝する（すなわち、フェニルアラニンを他の物質に変換する）原核生物PAL変異体、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類似体、及び、被験者（例えばヒト被験者）の癌の予防又は治療での使用のための原核生物PAL変異体、又は、生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類似体を含む医薬組成物の使用を本明細書中で提供する。ある実施態様においては、該薬剤は、ヒト被験者の癌の予防のためのものである。
【００２２】
ある実施態様においては、医薬組成物は、高度に精製された細菌由来の原核生物PAL変異体、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体若しくはその類似体を単独で、又は医薬として適切な担体と組み合わせて含む。ある実施態様においては、調製物は、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％又は99.9％より高い純度で、原核生物PAL変異体を含む。他の実施態様においては、原核生物PAL変異体の相対的比活性は、野生型原核生物PALの比活性の少なくとも約50％、又は野生型原核生物PALの比活性の約110％超である。
【００２３】
第2の態様においては、治療目的における原核生物PAL組成物を用いる方法を本明細書中で提供する。1つの実施態様においては、原核生物PAL変異体を含む医薬組成物の治療有効量を、PAH活性の欠乏によって全体的又は部分的に引き起こされる障害の治療を必要とする被験者に投与することによって当該障害を治療する方法を本明細書中で提供する。PAH活性の正常なレベルと比較して、例えば、50%以下、25%以下又は10%以下又は1%以下のようなPAH活性の欠乏を観察することができ、それは、フェニルアラニンレベルの上昇、例えば、高フェニルアラニン血症、軽度フェニルケトン尿症又は古典的な重度フェニルケトン尿症として現れ得る。ある実施態様においては、該疾患はPKUである。
【００２４】
特定の実施態様においては、被験者は、突然変異フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(phenylalanine hydroxylase)(PAH)を有すると診断された被験者である。突然変異PAHは、PAHの触媒領域における突然変異を含み得る。例示的なそのような突然変異としては、突然変異F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M E390G、A395P、P407S及びY414Cが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２５】
正常な濃度を超える(例えば、180μM又は360μM)を超える)血漿フェニルアラニンを有する被験者を治療する方法であって、原核生物PAL変異体を、被験者の血漿フェニルアラニン濃度の減少をもたらすのに有効な量で被験者に投与することを含む方法も意図するものである。一部の実施態様においては、被験者は、原核生物PAL変異体の投与前に、180μMを超える血漿フェニルアラニン濃度を有する。ある実施態様においては、被験者は、120μMから200μMの血漿フェニルアラニン濃度を有する。他の実施態様においては、被験者は、200μMから600μMの血漿フェニルアラニン濃度を有する。更に他の実施態様においては、被験者は、600μMから1200μMの血漿フェニルアラニン濃度を有する。治療すべき更に別のクラスの被験者は、1200μMを超える無制限の血漿フェニルアラニン濃度を有する被験者である。
【００２６】
特定の実施態様においては、被験者は、1200μMを超える血漿フェニルアラニン濃度を有する幼児などの幼児である。フェニルケトン尿症を有する幼児を治療する方法であって、原核生物PAL変異体組成物を、幼児の血漿フェニルアラニン濃度の減少をもたらすのに有効な量で投与することを含む方法を本明細書中で提供する。一部の実施態様においては、幼児は、0から3歳である。1つの実施態様においては、幼児は、約360μMから約4800μMの血漿フェニルアラニン濃度を有する。一部の実施態様においては、原核生物PAL変異体の投与の前に、幼児は、約1200μMのフェニルアラニン濃度を有し、原核生物PAL変異体を投与すると、血漿フェニルアラニン濃度が、例えば約1000μMに減少する。他の実施態様においては、原核生物PAL変異体の投与の前に、幼児は、約800μMのフェニルアラニン濃度を有し、原核生物PAL変異体を投与すると、血漿フェニルアラニン濃度が、例えば約600μMに減少する。更なる実施態様においては、PAL変異体の投与の前に、幼児は、約400μMのフェニルアラニン濃度を有し、PAL変異体を投与すると、血漿フェニルアラニン濃度が、例えば約300μMに減少する。ある実施態様において、本明細書で意図する治療方法は、幼児の血漿フェニルアラニン濃度を約120μMから約360μM又は約120μMから約240μMの範囲に低減させる。
【００２７】
また、HPAを有する妊婦を治療するための方法であって、被験者に原核生物PAL変異体を単独で、又はタンパク質制限食と組み合わせて投与することを含み、原核生物PAL変異体の単独又はタンパク質制限食と組み合わせた投与は、併用投与しない場合の濃度と比較して被験者の血漿におけるフェニルアラニン濃度を低下させるのに有効である方法を本明細書で意図するものである。一部の実施態様においては、被験者は、180μMを超えるが600μM未満の無制限の血漿フェニルアラニン濃度を有する。他の実施態様においては、被験者は、500μMを超えるが1200μM未満の無制限の血漿フェニルアラニン濃度を有する。更に他の実施態様においては、被験者は、1200μMを超える無制限の血漿フェニルアラニン濃度を有する。例えば1200μMを超える血漿フェニルアラニン濃度を有する妊娠した被験者は、妊娠を意図する出産可能年齢の女性である被験者と同様に、この種の治療にとって特に魅力的な候補である。被験者が1200μMを超える血漿フェニルアラニン濃度を有する実施態様においては、該方法は、タンパク質制限食を被験者に投与することを場合により更に含み得る。
【００２８】
また、被験者における古典的な重度PKUを治療する方法であって、原核生物PAL変異体、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体を被験者に投与することを含み、原核生物PAL変異体の投与は、原核生物PALを投与しない場合の濃度と比較して、被験者の血漿におけるフェニルアラニン濃度を低下させるのに有効である方法を本明細書中で提供する。ある実施態様においては、本明細書中で提供される方法による治療に向けて選択される被験者は、該治療薬を投与しない場合に1800μMを超える濃度などの高い血漿Phe濃度を有する。他の実施態様は、治療薬治療をしない場合に1000μMを超える血漿フェニルアラニン濃度を有する被験者を意図するものである。ある実施態様においては、本明細書中で提供される併用投与方法は、被験者の血漿フェニルアラニン濃度を600μM未満に減少させる。1つの実施態様においては、それは、500μM未満に減少される。別の実施態様においては、併用投与は、被験者の血漿フェニルアラニン濃度を約120μM未満から約360μM未満の範囲に減少させる。別の実施態様においては、被験者の血漿フェニルアラニン濃度は、約120μMから約240μMの範囲に低減される。
【００２９】
1つの実施態様においては、PAH活性の欠乏によって特徴付けられる障害を有する被験者(例えば、高フェニルアラニン血症、軽度フェニルケトン尿症又は古典的な重度フェニルケトン尿症、正常濃度を上回るフェニルアラニンを有する被験者、1200μMを超える血漿フェニルアラニン濃度を有する幼児、又はフェニルアラニン血症を有する妊婦)を治療するための方法であって、原核生物PAL変異体及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物の治療有効量を被験者に投与することを含み、原核生物PAL変異体は、野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性及び/又は低減した免疫原性を有し、被験者の血液、血清又は血漿におけるフェニルアラニン濃度を上記の範囲に低減するのに有効である方法を本明細書中で提供する。いくつかの実施態様においては、原核生物PAL変異体の１以上のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって置換されており、該置換は、野生型PALと比較して、フェニルアラニン変換活性を高め、及び/又は免疫原性を低減させる。一部の実施態様においては、原核生物PAL変異体の１以上のシステイン残基が、別のアミノ酸残基によって置換されている。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の１以上のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている。1つの実施態様においては、原核生物PAL変異体は、AvPAL変異体である。一部の実施態様においては、AvPAL変異体の１以上のシステイン残基が、位置64、318、503及び565のシステイン残基からなる群から選択されるセリン残基、位置565のセリン残基、又は位置503及び565のセリン残基によって置換されている。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体は、水溶性ポリマーを含む。ある実施態様においては、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。特定の実施態様においては、原核生物PAL変異体は、AvPAL変異体であり、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比は、約1:3である(AvPAL変異体:PEG=1:3)。1つの実施態様においては、原核生物PAL変異体は、AvPAL変異体であり、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比は、約1:3であり(AvPAL変異体:PEG=1:3)、AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている。
【００３０】
一部の実施態様は、疾患症候を効果的に改善するために、治療すべき生物体、例えば、哺乳類又はヒトのニーズに合わせて投与量を最適化することを含む。原核生物PAL変異体を毎日1回投与、毎日複数回投与、毎週1回投与又は毎週複数回投与で投与することができる。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体治療は、連続的でなく、原核生物PAL変異体は、被験者の血漿フェニルアラニン濃度が、例えば360μM未満に減少するまで毎日投与される。ある実施態様においては、被験者の血漿フェニルアラニン濃度が毎日監視され、血漿フェニルアラニン濃度の10%の増加が観察されたときに原核生物PAL変異体が投与される。他の実施態様においては、投与が毎週1回送達される。少なくとも0.001 mg/kg、0.005 mg/kg、0.01 mg/kg又は0.05 mg/kgの投与量が意図され、毎週0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg以上の範囲であり得る。ある実施態様においては、投与量は、2mg/kg/週、1mg/kg/週、0.1mg/kg/週又は0.01mg/kg/週である。
【００３１】
同等の投与量を送達する経口、桂皮、経粘膜、肺内(エアロゾル化を含む)、筋肉内、皮下又は静脈内を含む様々な非経口又は経口投与経路を意図するものである。髄腔内、脳内、心室内、腰椎穿刺、又は大槽などの、関節又はCSFへの直接的なボーラス注射又は注入による投与も具体的に意図するものである。ある実施態様において、投与は、皮下又は経口送達される。
【００３２】
遺伝子治療を含む、ヒト被験者における原核生物PAL変異体活性を高める他の手段も意図するものである。原核生物PAL変異体遺伝子の移入は、ウイルスベクター、相同的組換え又は直接的なDNA注射を含む、当該技術分野で既知の様々な手段を介して可能である。PAH欠乏に影響された細胞にインビボで投与することができる原核生物PAL変異体又はその生物学的に活性のある突然変異体又は類似体のすべて又は一部をコードする核酸配列を特徴とする実施態様もこの態様の範囲内にある。
【００３３】
また、他の実施態様においては、原核生物PAL変異体、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類似体は、タンパク質制限食と組み合わせて投与することができる。本明細書中の方法において投与される当該タンパク質制限食は、フェニルアラニン制限食であり、該被験者の全Phe摂取が、１日当たり600mg未満に制限されるものである。他の実施態様においては、タンパク質制限食は、フェニルアラニン制限食であり、その全フェニルアラニン(Phe)が、１日当たり300mg未満に制限されるものである。更に、別の実施態様においては、タンパク質制限食は、１以上のアミノ酸（例えば、チロシン、バリン、イソロイシン及び／又はロイシン等であるが、これらに限定されない）で補われる。
【００３４】
また、原核生物PAL変異体、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類似体、及び、医薬として許容し得る担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物を意図するものである。医薬組成物は、医療的なタンパク質補給物(medical protein supplement)を更に含むことができる。他の実施態様において、原核生物PAL変異体組成物は、幼児用配合物の一部である。更に、別の実施態様においては、タンパク質補給物は、フェニルアラニンを含まない。当該タンパク質補給物は、20mg/100g補給物の濃度のL−チロシン、L−グルタミン、L−カルニチン、40mg/100g補給物の濃度のL−タウリン、及びセレンで強化することができる。更に、当該タンパク質補給物は、ミネラル（例えば、カルシウム、リン及びマグネシウム）の推奨される一日量を含むことができる。更にまた、当該タンパク質補給物は、L−ロイシン、L−プロリン、L−リジン酢酸塩、L−バリン、L−イソロイシン、L−アルギニン、L−アラニン、グリシン、L−アスパラギン一水和物、L−トリプトファン、L−セリン、L−スレオニン、L−ヒスチジン、L−メチオニン、L−グルタミン酸、及びL−アスパラギン酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸の推奨される一日量を含んでもよい。また、当該補給物は、ビタミンA、D及びEの推奨される一日量で強化されてもよい。タンパク質補給物は、当該補給物の少なくとも40％のエネルギーを提供する脂肪含量を有することができる。そのような補給物は、粉末状補給物、又はプロテインバーの形態で提供することができる。
【００３５】
また、原核生物PAL変異体を含む医薬組成物の治療有効量を被験者に投与することによって様々な形態の癌を治療する方法を本明細書中で提供する。幅広い実施態様において、癌は、癌に由来する細胞の増殖及び/又は生存がフェニルアラニンの制限又は欠失に感受性のある癌である。ある実施態様においては、癌は、肺癌、脳若しくは中枢神経系の癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌又は転移性黒色腫である。他の実施態様においては、癌は、頭及び首の癌、卵巣癌、子宮癌、白血病(例えば、急性骨髄性白血病若しくは急性リンパ芽球性白血病)又は骨髄腫である。更に他の実施態様においては、癌は、小児癌又は抵抗性癌(すなわち、癌治療薬若しくは標的化癌治療薬に対して抵抗性を有することが証明された癌)である。
【００３６】
また、原核生物PAL変異体を含む医薬組成物の治療有効量を被験者に投与することによってパーキンソン病(PD)を治療する方法を本明細書中で提供する。
【００３７】
第3の態様において、原核生物PAL変異体、及び、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体又はその類似体、並びに、安定化剤を含んだ医薬として許容し得る担体を含む、原核生物PAL変異体の医薬組成物又は配合物を本明細書中で提供する。ある実施態様においては、安定化剤は、L−フェニルアラニン、又はその構造類似体である。ある実施態様においては、安定化剤は、L−フェニルアラニン、trans−桂皮酸及び安息香酸からなる群より選択される。ある実施態様においては、安定化剤はL−フェニルアラニンである。ある実施態様においては、安定化剤はtrans−桂皮酸である。ある実施態様においては、安定化剤は安息香酸である。また、そのような医薬組成物又は配合物を用いる癌の治療方法を本明細書中で提供する。
【００３８】
特定の実施態様においては、医薬組成物又は配合物は、原核生物PAL変異体、及び医薬として許容し得る担体を含み、該原核生物PAL変異体がAvPAL変異体であり、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比が、約１：３（１：３ AvPAL:PEG）であり、AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されており、かつ、医薬として許容し得る担体が安定化剤である。ある実施態様においては、安定化剤は、L−フェニルアラニン、又はその構造類似体である。他の実施態様においては、安定化剤は、L−フェニルアラニン、trans−桂皮酸及び安息香酸からなる群より選択される。ある実施態様においては、安定化剤はL−フェニルアラニンである。ある実施態様においては、安定化剤はtrans−桂皮酸である。また、そのような医薬組成物又は配合物を用いる、フェニルケトン尿症を含む高フェニルアラニン血症の治療方法を本明細書中で提供する。
【００３９】
第4の態様においては、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比が約1:3(AvPAL:PEG=1:3)であり、AvPAL変異体の１以上のシステイン残基がセリン残基によって置換されたペグ化AvPAL変異体と、(少なくとも2つなどの)１以上の安定化剤、及び場合により防腐剤(すなわち抗菌剤)を含む医薬として許容し得る担体との医薬組成物又は配合物を本明細書中で提供する。該配合物におけるペグ化AvPAL変異体の濃度は、約1から50mg/mL(約0.016から0.8mM)、例えば、約5から20mg/mL(約0.08から0.33mM)又は5から15mg/mL(約0.08から0.25mM)であり得る。ある実施態様においては、医薬組成物及び配合物は、Tris-HCl、若しくは緩衝剤などのその同等物、及び/又はNaCl、若しくは等張性調整剤などのその同等物を含む。配合物におけるTris-HCl又はその同等物の濃度は、約5から50mM、例えば、約5から20mM又は約5から15mMであり得る。配合物におけるNaCl又はその同等物の濃度は、約100から200mM、例えば、約120から170mM又は約120から150mMであり得る。配合物のpHは、約ｐＨ6.0〜8.0、例えば、約ｐＨ6.5〜7.5又は約ｐＨ7.0〜7.6であり得る。ある実施態様においては、安定化剤は、L-フェニルアラニン(phenylalanine)(Phe)又はその構造類似体、及びグリシン(glycine)(Gly)又はその構造類似体である。配合物におけるPhe又はその構造類似体の濃度は、約0.1から10mM、例えば、約0.5から5mM又は約0.5から1.5mMであり得る。配合物におけるGly又はその構造類似体の濃度は、約0.1から100mM、例えば、約1.0から100mM、約1.0から20mM又は約20から100mMであり得る。例えば、配合物におけるGlyの濃度は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90又は100 mMであり得る。ある実施態様においては、防腐剤は、m-クレゾール又はその構造類似体である。配合物におけるm-クレゾール又は構造類似体の濃度は、約0.1%から1%(w/v)、例えば、約0.1%から0.5%(w/v)又は約0.3%から0.5%(w/v)であり得る。ある実施態様において、安定化剤はPhe及びGlyであり、防腐剤はm-クレゾールである。本明細書中で提供する組成物又は配合物において、AvPAL変異体、安定化剤、緩衝剤、等張剤、防腐剤、及び/又は本明細書中で提供される他の成分の任意の組合せ、並びに関連するpH値及び濃度を意図するものである。また、そのような医薬組成物又は配合物を使用してHPA、例えばPKU又は癌を治療する方法を提供する。
【００４０】
特定の実施態様においては、医薬組成物又は配合物は、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比が約1:3(AvPAL:PEG=1:3)であり、AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基がセリン残基によって置換されたペグ化AvPAL変異体と、緩衝剤としてのTris-HCl、等張剤としてのNaCl、安定化剤としてのPhe及びGly、並びに場合により防腐剤(すなわち抗菌剤)としてのm-クレゾールを含む医薬として許容し得る担体とを含む。1つの実施態様においては、配合物におけるペグ化AvPAL変異体の濃度は、約10+/-5mg/mL(約0.16+/-0.08mM)である。ある実施態様においては、配合物におけるTris-HClの濃度は、約10mM+/-5mMである。他の実施態様においては、配合物のpHは、約7.3+-0.3である。別の実施態様においては、配合物におけるNaClの濃度は、約135 mM+/-15 mMである。ある実施態様においては、配合物におけるPheの濃度は、約1+/-0.5mMである。ある実施態様においては、配合物におけるGlyの濃度は、約10.5+/-9.5mMである。他の実施態様においては、配合物におけるGlyの濃度は、約60+/-40mMである。他の実施態様においては、配合物におけるGlyの濃度は、約50.5+/-49.5mMである。ある実施態様においては、配合物は、防腐剤としてm-クレゾールを含む。別の実施態様においては、配合物におけるm-クレゾールの濃度は、約0.4%+/-0.1%(w/v)である。上記濃度及びpH値の組合せも意図するものである。また、そのような医薬組成物又は配合物を使用してHPA、例えばPKU、又は癌を治療する方法を提供する。
【００４１】
第5の態様において、酵素を治療で用いることが可能な量の、組換え原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類似体を製造する方法を本明細書中で提供する。一部の実施態様においては、PALは、ストレプトマイセス(Streptomyces)、ソランギウム(Sorangium)、シュードモナス(Pseudomonas)、並びに、ノストック(Nostoc)及びアナベナ(Anabaena)等のシアノバクテリアを含むが、これらに限定されない、細菌由来である。ある実施態様においては、PALは、細菌種ストレプトマイセス マリチムス(Streptomyces maritimus)、ストレプトマイセス ウェルティキラツス(S. verticillatus)、ソランギウム セルロサム(Soragium cellulosum)、ノストック パンクチフォルメ、ノストク  トバカム(Nostoc tobacum)、アナベナ バリアビリス又はシュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)由来である。一部の実施態様においては、PALは、シアノバクテリア種のノストック パンクチフォルメ、又はアナベナ バリアビリス由来である。特定の実施態様においては、PALは、アナベナ バリアビリス由来である。他の実施態様においては、原核生物PAL酵素活性は、HAL活性をコードする又はPAL−HALモチーフを特徴とするともされるが、HALとは異なる重要なPAL残基を有する、配列からのcDNA又はDNA配列を用いて生じさせる。
【００４２】
広い実施態様においては、本方法は、すべての又は一部の原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体をコードするcDNA又はDNAを、その発現に適切な細胞に形質転換するステップを含む。1つの実施態様においては、発現ベクターを用いて、DNAをその発現に適切な細胞又は細胞系に移す。特定の実施態様においては、cDNA又はDNAは、大腸菌に形質転換され、組換え原核生物PALが、任意に、融合タンパク質として過剰発現する。更なる実施態様においては、原核生物PALの製造方法は、次のステップを含む：(a)種培養物(seed culture)を生産するのに適切な密度まで、適切な増殖培地において、すべての原核生物PAL、又は生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体をコードする、cDNA又はDNAで形質転換された細胞を増殖させるステップ、(b)バイオリアクターに形質転換された細胞を導入するステップ、(c)バイオリアクターに適切な増殖培地を供給するステップ、及び、(d)酵素を含むトランスフェクトされた細胞を培地から分離するステップ。
【００４３】
1つの実施態様においては、組換え原核生物PAL、又は、生物学的に活性のあるそのフラグメント、突然変異体、変異体若しくはその類似体はN末端標識（例えばオクタヒスチジル標識）を有する又は有しないで、IPTG（イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド）等の誘導プロモーターを用い、ベクター、例えばpIBX1［Suらの文献, Appl. Environ. Microbiol. 62:2723-2734 (1996)］、又はpET28a（Invitrogen社製）において、大腸菌BLR(DE3)/pLysS（Novagen社製)、又は大腸菌BL21(DE3)/pLysS（Invitrogen社製）細胞において過剰発現される。特定の実施態様においては、原核生物PALの製造方法は、次のステップを含む：(1)バイオリアクター／発酵槽のための種培養物を、グリセロールストックから振盪フラスコにて増殖させるステップ；(2)供給バッチモードに制御されたバイオリアクターへそのような種培養物を導入するステップ；(3)当該培養物を、70〜100のOD600の細胞密度になるまで（〜22−25時間）、グルコース補足培地で、pH7.8、20％より高い溶存酸素、1200rpm以内の攪拌、30℃で増殖させるステップ；(4)当該培養物を0.4mM IPTGで誘導するステップ；(5)活性の変化が0.1 IU/mLより低くなるまで（約40〜48時間、及び一般に200のOD600）、22〜26℃の低減された温度で、当該培養物を増殖させるステップ；及び、(6)連続遠心分離で細菌を回収するステップ。1つの実施態様においては、細胞培養培地は、酵母エキスタンパク質、ペプトン−トリプトン、グルコース、グリセロール、カザミノ酸、トレース塩類及びリン酸緩衝塩類を含む。
【００４４】
特定の実施態様においては、組換え原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体は、AvPAL変異体であり、AvPAL変異体を製造する方法は、(1)バイオリアクター/発酵槽のための種培養物を、AvPAL変異体を発現する細菌のグリセロールストックから振盪フラスコにて37℃で、2から4 OD600の細胞密度に達するまで増殖させること;(2)種培養物を第1の制御バイオリアクター(例えば4L発酵槽)に移すこと;(3)10から20 OD600の細胞密度に達するまで培養物を37℃で培養すること;(4)第1のバイオリアクター(例えば4L発酵槽)の培養物を第2の制御バイオリアクター(例えば100L発酵槽)中に移すこと;(5)少なくとも200 OD600の細胞密度に達するまで37℃で培養物を増殖させること;(6)培養物を約15℃まで冷却すること;及び(7)細菌細胞を遠心分離によって培地から分離することを含む。ある実施態様においては、該方法は、第2のバイオリアクター(例えば100L発酵槽)の培養物を第3の制御バイオリアクター(例えば500L以上の発酵槽)中に移し、冷却する前に少なくとも200 OD600の細胞密度に達するまで培養物を37℃で増殖させ、細菌細胞を培地から分離することを含む。1つの実施態様においては、AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている(配列番号11)。
【００４５】
第6の態様においては、原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体を精製する方法を本明細書中で提供する。第1の実施態様によれば、形質転換細胞群を増殖させ、破裂させて粗組換え酵素を残す。外来物質を粗バルクから分離して、カラムの汚染を防止することができる。1つ又はいくつかのクロマトグラフィー樹脂を使用してクロマトグラフィー精製を行うことができる。続いて、精製されたタンパク質を、長時間にわたって安定な活性を提供するように設計された緩衝液に配合することができる。別の実施態様においては、原核生物PALを精製する方法は、(a)組換え原核生物PALを含む細菌を溶解すること;(b)溶解物を熱で処理して、大腸菌タンパク質を析出させること;(c)第2の連続遠心分離ステップ及び/又は深層ろ過を使用して、この溶解物を浄化すること;(d)浄化した溶解物に炭ろ過ステップを施すこと;(e)(d)の濾液に(１以上の深層フィルター、例えば、Pall EKSP、Pall KS50P及び/又はPall EKMPフィルターを用いた)中間深層ろ過ステップを施した後、(Sartorious Sartopore又はPall EDF 0.2μmフィルターを用いた)最終ろ過ステップを施すこと;(f)最終的な濾液をブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に通すこと;(g)(f)の溶出液をQイオン交換カラムなどの陰イオンクロマトグラフィー樹脂に通すこと;(h)場合によりタンジェンシャルフローろ過を用いた緩衝液交換によって最終生産物を回収すること;及び(i)最終生産物を滅菌することを含む。当業者は、１以上のクロマトグラフィーステップを省略若しくは置き換えることができること、又はクロマトグラフィーステップの順序を変更できることを容易に理解する。最後に、要望に応じて適切な滅菌ステップを実施することができる。また、(例えば、本明細書中で提供される精製方法によって製造された)精製原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体、並びにその医薬組成物及び配合物、並びにその使用方法を本明細書中で提供する。
【００４６】
特定の実施態様においては、組換え原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体は、凝集が最小限のペグ化AvPAL変異体であり、ペグ化AvPAL変異体を精製する方法は、(a)AvPAL変異体を含む細菌細胞を均質化によって溶解して、細胞溶解物を生成すること;(b)細胞溶解物を30から120分間にわたって65℃に加熱すること;(c)加熱された細胞溶解物を遠心分離することであって、AvPAL変異体を含む上澄みを保持すること;(d)上澄みをろ過して、沈殿を除去すること;(e)Toyopearl Giga Cap Q 650Mカラムなどの陰イオン交換(anion exchange)(AIEX)カラム、続いてToyopearl Butyl 650Mカラムなどの疎水性相互作用(hydrophobic interaction)(HIC)カラムによる連続クロマトグラフィーによって、AvPAL変異体を汚染タンパク質から分離することであって、HICカラムからの溶出液がAvPAL変異体を含むこと;(f)AvPAL変異体を含むHICカラムからの溶出液を限外ろ過又は限外ろ過/透析ろ過すること;(g)ポリエチレングリコールとAvPAL変異体とを混合することによってAvPAL変異体をペグ化すること;(h)限外ろ過/透析ろ過によって遊離ポリエチレングリコールをペグ化AvPAL変異体から除去すること;及び(h)ペグ化AvPAL変異体を配合することを含む。実施態様においては、前記AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基(配列番号11)によって置換されている。実施態様においては、ペグ化AvPAL変異体は、ポリエチレングリコールを含む。実施態様においては、ペグ化AvPAL変異体は、ポリエチレングリコールを含み、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比は約1:3である。実施態様においては、AIEXカラムは、Toyopearl Giga Cap Q 650Mカラムである。実施態様においては、HICカラムは、Toyopearl Butyl 650Mカラムである。
【００４７】
実施態様においては、ペグ化AvPAL変異体を精製する方法は、AvPAL変異体を含むHICカラムからの溶出液を凍結及び解凍することであって、約2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%又は15%グリセロール、スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール又はソルビトール等の１以上のポリオール又は糖を凍結の前にHICカラム溶出液に添加することを更に含む。実施態様においては、ポリオールはグリセロールである。実施態様においては、グリセロールの濃度は10%(v/v)である。実施態様においては、糖はスクロースである。実施態様においては、スクロースの濃度は10%(v/v)である。実施態様においては、ペグ化AvPAL変異体を精製する方法は、凍結前に、AvPAL変異体を含むHICカラムからの溶出液を、約16回以上(例えば、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、12回、14回、16回、18回、20回又は25回)までの限外ろ過によって濃縮することを更に含む。実施態様においては、AvPAL変異体を含むHICカラムからの溶出液は、個別の温度のステップを使用して凍結される。実施態様においては、AvPAL変異体を含むHICカラムからの溶出液は、個別の温度のステップを使用して解凍される。実施態様においては、AvPAL変異体を含むHICカラムからの溶出液は、個別の温度のステップを使用して凍結及び解凍される。実施態様においては、AvPAL変異体を含むHICカラムからの溶出液は、リン酸カリウム(KPi)、並びに凝集を低減させ、及び/又はペグ化に際して酵素活性を維持する１以上の薬剤、例えばtrans-桂皮酸(t-CA)及びグリセロールを含む透析ろ過緩衝液で透析ろ過される。実施態様においては、透析ろ過緩衝液は、50mMのKpi、10mMのt-CA、5%グリセロール(pH8.5)を含む。実施態様においては、ポリソルベート80(PS80)などの非イオン性洗剤が、AvPAL変異体を含むHICカラムからの限外ろ過/透析ろ過された溶出液に添加される。実施態様においては、非イオン性洗剤はPS80である。実施態様においては、PS80の濃度は0.02%(v/v)である。また、(例えば、本明細書中で提供される精製方法によって製造された)凝集が最小限のペグ化AvPAL変異体、並びにその医薬組成物及び配合物、並びにその使用方法を本明細書中で提供する。
【００４８】
特定の実施態様においては、組換え原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体は、凝集が最小限のAvPAL変異体であり、AvPAL変異体を精製する方法は、(a)AvPAL変異体を含む細菌細胞を均質化によって溶解して、細胞溶解物を生成すること;(b)細胞溶解物を30から120分間にわたって65℃に加熱すること;(c)加熱された細胞溶解物を遠心分離することであって、AvPAL変異体を含む上澄みを保持すること;(d)上澄みをろ過して、沈殿を除去すること;(e)Toyopearl Giga Cap Q 650MカラムなどのAIEXカラム、続いてToyopearl Butyl 650Mなどの疎水性相互作用HICカラムによる連続クロマトグラフィーによって、AvPAL変異体を汚染タンパク質から分離することであって、HICカラムからの溶出液がAvPAL変異体を含むことを含む。実施態様においては、前記AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基(配列番号11)によって置換されている。実施態様においては、AIEXカラムは、Toyopearl Giga Cap Q 650Mカラムである。実施態様においては、HICカラムは、Toyopearl Butyl 650Mカラムである。また、(例えば、本明細書中で提供される精製方法によって製造された)凝集が最小限のAvPAL変異体、並びにその医薬組成物及び配合物、並びにその使用方法を本明細書中で提供する。
【００４９】
第7の態様においては、高レベルのフェニルアラニンを含む細胞と細菌PALとを接触させ、細菌PALがそのような高レベルのフェニルアラニンを低減するかどうかを判断することによって、フェニルアラニンのレベル上昇を予防、改善又は治療することができる原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体を特定するためのスクリーニングアッセイ及びその方法を本明細書中で提供する。また、そのようなスクリーニングアッセイは、インビトロでの変異体のフェニルアラニン変換活性を試験する前に、活性部位［例えば、ロドスポリディウム トルロイデス(RtPAL)由来のPALにおけるSer 210、Ala−Ser−Gly三成分系(211-213)、Asp214、Leu215、Asn270、Val269、Leu266、Leu134、His137、Lys468、Glu496、Gln500残基と等価である、ストレプトマイセス マリチムス由来のEncPにおけるGlyl42、Thr−Ser−Gly三成分系(143-145)、Asp146、Leu147、Asn196、Ile195、Leu192、Leu76、Asn79、Met400、Thr428、Gln432、又は、ノストック パンクチフォルメ又はアナベナ バリアビリス等の他の原核生物PALにおけるそれらの等価物］、該活性部位に隣接する領域、又は該ポリペプチド配列全体において、保存的又は非保存的置換を含んだ変異体を作製するステップを含むことができる。特定の実施態様においては、該方法は、高スループット分析である。1つの実施態様においては、細菌種の完全なゲノムは、バイオインフォマティクスによるアプローチを用いて、原核生物PAL相同体の存在についてシーケンス及びスクリーニングされる。別の実施態様においては、そのような相同性のタンパク質生産物のPAL触媒活性が、インビトロでのフェニルアラニンからtrans−桂皮酸への変換能の試験等によって確認される。
【００５０】
第8の態様において、PAH活性の欠乏によって全体的又は部分的に引き起こされる障害を含むが、これに限定されない、疾病の診断のための原核生物PALの組成物の使用方法を本明細書中で提供する。ある実施態様においては、原核生物PALを用いて血液、血漿又は血清試料のPheレベルを測定する。また、被験者の血液、血漿又は血清試料のPheレベルの監視に使用するための原核生物PALを含む診断キットを本明細書中で提供する。
【００５１】
本明細書中で提供する組成物及び方法の他の特徴及び利点は、次の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、詳細な説明及び特定例は、本発明の特定の実施態様を示しながらも、説明のためだけに示されるものであることは理解されるべきである。なぜならば、本発明の精神及び範囲内の種々の変更及び改良は、この詳細な説明から当業者に明らかとなるからである。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
（図面の詳細な説明）
【図１Ａ】図1Aは、ノストック パンクチフォルメPALの遺伝子配列である（配列番号1）。
【図１Ｂ】図1Bは、ノストック パンクチフォルメPALのタンパク質配列である（配列番号2）。
【００５３】
【図２Ａ】図2Aは、アナベナ バリアビリス PALの遺伝子配列である（配列番号3）。
【図２Ｂ】図2Bは、アナベナ バリアビリス PALのタンパク質配列である（配列番号4）。
【００５４】
【図３】図3は、原核生物及び真核生物からの芳香族アミノ酸アンモニアリアーゼの相関図である。配列は、GenBankから検索され（アクセッション番号は括弧内に記載）、近隣結合法を用いて、ClustalX(1.83)で整列した。
【００５５】
【図４】図4は、ノストック パンクチフォルメPAL（配列番号2）及びアナベナ バリアビリスPAL（配列番号4）と、EncP PAL（配列番号5）及びシュードモナス プチダHAL（配列番号6）とのシアノバクテリアタンパク質配列の整列である。PAL又はHAL活性に対応する活性部位残基を強調している。
【００５６】
【図５Ａ】図5Aは、位置64でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリスのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)のタンパク質配列である（AvPAL_C64S、配列番号7）。
【図５Ｂ】図5Bは、位置318でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリス PALのタンパク質配列である（AvPAL_C318S、配列番号8）。
【図５Ｃ】図5Cは、位置503でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリス PALのタンパク質配列である（AvPAL_C503S、配列番号9）。
【図５Ｄ】図5Dは、位置565でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリス PALのタンパク質配列である（AvPAL_C565S、配列番号10）。
【図５Ｅ】図5Eは、位置503及び565でシステインからセリンへの置換を有する、アナベナ バリアビリスPALのタンパク質配列であり（AvPAL_C565SC503S、配列番号11）、システインからセリンへの置換は、太字で強調されて下線が引かれている。
【００５７】
【図６Ａ】図6Aは、37℃での様々な時間の長さでのインキュベーション後のインビトロでのPAL比酵素活性に対する、ペグ化されていないAvPALの位置565での又は位置565及び503でのシステインからセリンへの置換の影響を示す。
【図６Ｂ】図6Bは、37℃での様々な時間の長さでのインキュベーション後のインビトロでのPAL比酵素活性に対する、ペグ化されたAvPALの位置565での又は位置565及び503でのシステインからセリンへの置換の影響を示す。
【００５８】
【図７Ａ】図7Aは、変性条件下（左側パネル）又は非変性条件下（右側パネル）でのゲル電気泳動で分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成におけるシステインからセリンへの置換の影響を示す。
【図７Ｂ】図7Bは、SEC−HPLCで分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成に対するAvPALにおけるシステインからセリンへの置換の影響を示す。
【００５９】
【図８】図8は、様々なPEG濃度での部位特異的ペグ化に対するAvPALの位置565及び503（dbl突然変異体）のシステインからセリンへの置換の影響を示す。
【００６０】
【図９】図9は、SEC−HPLCで分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成に対する、0.05％ Tween 80又は10mM EDTAでのAvPALの処理の影響を示す。
【００６１】
【図１０Ａ】図10Aは、SEC−HPLCで分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成に対する、ジチオトレイトール(DTT)でのAvPALの処理の影響を示す。
【図１０Ｂ】図10Bは、SEC−HPLCで分析された、溶液におけるタンパク質凝集体の形成に対する、DTT及びN−エチルマレイミド(NEM)によるAvPALの処理の影響を示す。
【００６２】
【図１１】図11は、４℃（上段のパネル）、25℃（中段のパネル）及び37℃（下段のパネル）で様々な時間（日）で保存された位置565及び503でシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S) (rAV−PAL−PEG)の酵素活性に対する、Phe及びtrans−桂皮酸(t−CA)の影響を示す。
【００６３】
【図１２】図12は、４℃（上段のパネル）、25℃（中段のパネル）及び37℃（下段のパネル）で様々な時間（日）で保存された位置565及び503でシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S) (rAV−PAL−PEG)の酵素活性に対する、１及び５mMでのチロシン(Tyr)の影響を示す。
【００６４】
【図１３Ａ】図13Aは、4℃（上段のパネル）及び37℃（下段のパネル）で様々な時間（週）で保存された位置565及び503でシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S) (rAV−PAL−PEG)の酵素活性に対する、Phe、安息香酸及びピリドキサミンの単独又は組み合わせの影響を示す。
【図１３Ｂ】図13Bは、安息香酸（左）、フェニルアラニン（中央）、及びtrans−桂皮酸（右）の化学構造を図示する。
【００６５】
【図１４】図14は、4℃(上段のパネル)、25℃(中段のパネル)及び40℃(下段のパネル)で様々な時間(週)にわたって保存された位置565及び503におけるシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S)（rAv-PAL-PEG）の比活性(U/mg)に対する、示されている防腐剤のベンジルアルコール(Benz’OH、1.5%)若しくはm-クレゾール(mCresol、0.3%)、及び/又は安定化剤のL-フェニルアラニン(Phe、1mM)、及び/又はグリシン(Gly、1mM)の影響を示す。
【００６６】
【図１５Ａ】図15Aは、25℃(上段のパネル)及び40℃(下段のパネル)で様々な時間(示されている週又は月)にわたって保存された位置565及び503におけるシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S)の正規化活性(%)に対する、示されている1から20mMのグリシン(glycine)(Gly)の影響を示す。
【図１５Ｂ】図15Bは、40℃で様々な時間(示されている週)にわたって保存された位置565及び503におけるシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S)の酵素活性(U/mL)に対する、示されている20、50又は100mMのグリシン(glycine)(Gly)の影響を示す。
【００６７】
【図１６】図16は、ビヒクル又は4.0IU野生型ペグ化AvPALが投与されたENU2マウスと比較した、0.25IU(上段のパネル)、1.0IU(中段のパネル)又は4.0IU(下段のパネル)の酵素が投与されたENU2マウスにおけるインビボのPheレベルに対する、ペグ化AvPALにおける位置565及び503(AvPAL_C565SC503S)でのシステインからセリンへの置換の影響を示す。
【００６８】
【図１７】図17は、ビヒクル又は4.0IU野生型ペグ化AvPALが投与されたENU2マウスと比較した、0.25IU、1.0IU又は4.0IUの酵素が投与されたENU2マウスの体重に対する、ペグ化AvPALにおける位置565及び503(AvPAL_C565SC503S)でのシステインからセリンへの置換の影響を示す。
【００６９】
【図１８】図18は、ビヒクル、又は1:3のAvPAL:PEG比の4.0IU野生型ペグ化AvPALが投与されたENU2マウスと比較した、それぞれのAvPAL:PEG比:1:1.6(上段のパネル)、1:2.4(中断のパネル)又は1:3(下段のパネル)における、4IU酵素が投与されたENU2マウスにおけるインビボのPheレベルに対する、ペグ化AvPALにおける位置565及び503(AvPAL C503S/565S)でのシステインからセリンへの置換の影響を示す。
【００７０】
【図１９】図19は、ビヒクル、又は1:3のAvPAL:PEG比の4.0IU野生型ペグ化AvPALが投与されたENU2マウスと比較した、それぞれのAvPAL:PEG比:1:1.6、1:2.4又は1:3における、4IU酵素が投与されたENU2マウスの体重に対する、ペグ化AvPALにおける位置565及び503(AvPAL_C565SC503S)でのシステインからセリンへの置換の影響を示す。
【００７１】
【図２０Ａ】図20Aは、経時(時間)的な血漿AvPAL_C565SC503Sレベルに対する、位置565及び503におけるシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S)のカニクイザルへの4mg/kg(菱形)及び12mg/kg(正方形)の1回の皮下注射の影響を示す。
【図２０Ｂ】図20Bは、経時(時間)的な血漿AvPAL_C565SC503S(菱形)及びフェニルアラニン(正方形)レベルに対する4mg/kgのAvPAL_C565SC503Sのカニクイザルへの1回の皮下注射の影響を示す。
【００７２】
【図２１Ａ】図21Aは、経時(時間)的な血漿AvPAL_C565SC503Sレベルに対する、位置565及び503におけるシステインからセリンへの置換を有するペグ化AvPAL(AvPAL_C565SC503S)のラットへの1mg/kg(菱形)、5mg/kg(正方形)及び25mg/kg(三角形)の1回の静脈内注射の影響を示す。
【図２１Ｂ】図21Bは、経時(時間)的な血漿AvPAL_C565SC503Sレベルに対する、10mg/kg(菱形)、25mg/kg(正方形)及び250mg/kg(三角形)のAvPAL_C565SC503Sのラットへの1回の皮下注射の影響を示す。
【００７３】
【図２２】図22は、凝集が最小限のペグ化AvPAL変異体ポリペプチドの大規模製造のための製造過程の流れ図である。左向きの矢印は、凝集を低減するための標的であるプロセスステップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
（詳細な説明）
原核生物PAL、及び生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体又はその類似体の組成物、並びに、フェニルケトン尿症を含む高フェニルアラニン血症及び癌を含む他の障害の治療を含む治療目的のためのそれらの使用を本明細書中で提供する。
【００７５】
[Ａ.定義]
特に断りのない限り、本明細書及び特許請求の範囲を含めた本出願で用いる次の用語は、以下に示す定義を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる、単数形「ある(a)」、「ある(an)」及び「該(the)」は、文脈が明らかに他のことを示さなければ、複数の対象を含むことに注意する必要がある。標準的な化学用語の定義は、CareyとSundbergの文献, 上級有機化学(Advanced Organic Chemistry)第3版, A及びB巻(Plenum Press, New York 1992)を含む参考書籍で見出すことができる。本発明の実施には、特に示さなければ、当業者での、合成有機化学、質量分析、クロマトグラフィーの分取及び分析方法、タンパク質化学、生化学、組換えDNA技術、及び薬理学についての従来の方法を用いる。例えば、T.E. Creightonの文献, タンパク質：構造と分子特性(Proteins: Structures and Molecular Properties)(W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehningerの文献, 生化学(Biochemistry)(Worth Publishers, Inc., 第4版, 2004)；Sambrookらの文献, 分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)(第2版, 1989)；酵素学における方法(Methods In Enzymology)(S. ColowickとN. Kaplan編集, Academic Press, Inc.)；Remingtonの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences), 第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)を参照されたい。
【００７６】
本明細書で以前に又は以下に引用されたすべての出版物、特許及び特許出願は、前後にかかわらず、それらの全体において本明細書中に引用により組み込まれる。
【００７７】
次のアミノ酸の略語は、本明細書の全体にわたって用いられる。
【表１】
2013518893.tif 000002
【００７８】
“ポリヌクレオチド”とは、ヌクレオチド単位からなるポリマーをいう。ポリヌクレオチドは、核酸類似体の他に、デオキシリボ核酸("DNA")及びリボ核酸("RNA")等の自然発生の核酸を含む。核酸類似体は、非自然発生の塩基、自然発生のリン酸ジエステル結合以外の他のヌクレオチドと結合するヌクレオチド、又は、リン酸ジエステル結合以外の結合に接続された塩基を含んだものを含む。したがって、核酸類似体に含まれるのは、例えば、ホスホロチオエート(phosphorothioate)、ホスホロジチオエート(phosphorodithioate)、ホスホロトリエステル(phosphorotriester)、ホスホロアミダート(phosphoramidate)、ボラノホスフェート(boranophosphate)、メチルホスホナート(methylphosphonate)、キラルなメチルホスホナート(chiral-methyl phosphonate)、2−O−メチルリボヌクレオチド(2-O-methyl ribonucleotides)、ペプチド核酸(PNA)等であるが、これらに限定されない。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成装置を利用して合成することができる。用語“核酸”とは、一般に、大きいポリヌクレオチドをいう。用語“オリゴヌクレオチド”とは、一般に、約50以下のヌクレオチドである、短いポリヌクレオチドをいう。ヌクレオチド配列は、DNA配列（すなわちA, T, G, C）により表される場合、"T"が"U"で置換されたRNA配列（すなわちA, U, G, C）もこれに含まれることが理解される。
【００７９】
"cDNA"とは、一本鎖又は二本鎖の形態での、mRNAに相補的か同一であるDNAをいう。
【００８０】
従来の表記法は、ポリヌクレオチド配列について説明するために本明細書中で用いられる。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、5'−端末であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左端方向は、5'−方向と呼ばれる。初期RNA転写物への5'から3'のヌクレオチドの追加の方向は、転写方向と呼ばれる。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は、"コード鎖"と呼ばれる。RNA転写物の5'−端末へ位置する5'である、そのDNAから転写されたmRNAと同じ配列を有するDNA鎖における配列は、“上流の配列”をいう。コードするRNA転写物の3'−端末へ位置する3'である、RNAと同じ配列を有するDNA鎖における配列は、“下流の配列”をいう。
【００８１】
“相補的”とは、トポロジー適合性、又は2つのポリヌクレオチドの相互作用する表面が共に一致することをいう。したがって、2つの分子は、相補的と説明することができ、更に、接触表面特性は、互いに相補的である。第一のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、第二のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と同一の場合は、第一のポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチドに相補的である。したがって、配列が5'−TATAC−3'のポリヌクレオチドは、配列が5'−GTATA−3'のポリヌクレオチドに相補的である。
【００８２】
対象のヌクレオチド配列に相補的な配列が、基準ヌクレオチド配列に実質的に同一である場合は、ヌクレオチド配列は、基準ヌクレオチド配列に“実質的に相補的”である。
【００８３】
“コードする”とは、明確なヌクレオチド配列（すなわち、rRNA、tRNA及びmRNA）又は、明確なアミノ酸配列を有する生物学的プロセスでの他のポリマー及び巨大分子の合成のテンプレートとして提供される、遺伝子、cDNA又はmRNA等のポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定配列の固有特性、並びに、そこから生じる生物特性をいう。したがって、遺伝子により生じるmRNAの転写及び翻訳が、細胞又は他の生物系でタンパク質を生成する場合は、その遺伝子は、タンパク質をコードする。mRNA配列に同一で、配列表に通常提供されるヌクレオチド配列である、コード鎖、及び、遺伝子又はcDNAの転写のテンプレートとして用いられる、非コード鎖は、共に、その遺伝子若しくはcDNAのタンパク質、又は他の生産物をコードしていると言うことができる。特段の定めがない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いの退化したもので、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及びRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。
【００８４】
“組換えポリヌクレオチド”とは、共に自然に連結されない配列を有するポリヌクレオチドをいう。増幅された又は組み立てられた組換えポリヌクレオチドは、適切なベクターに含まれ得る。また、ベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するのに用いることができる。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞とは、“組換え宿主細胞”と呼ばれる。この場合遺伝子は、宿主細胞で発現され、例えば“組換えポリペプチド”が産生される。また、組換えポリヌクレオチドは、コードしない機能（例えば、プロモーター、複製開始点、リボソーム結合部位等）を提供することができる。
【００８５】
“発現制御配列”とは、動作可能に結合されたヌクレオチド配列の発現（転写及び／又は翻訳）を制御するポリヌクレオチドのヌクレオチド配列をいう。“動作可能に結合された”とは、ある部分の活性（例えば、転写を制御する能力）が、他の部分に対する作用（例えば、配列の転写）で生じる、2つの部分の間の機能的な関係をいう。発現制御配列は、例えば、プロモーターの配列（例えば、誘導性又は構成性）、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（すなわちATG）、イントロンのためのスプライシングシグナル、及び終止コドンを含むが、これらに限定されない。
【００８６】
“発現ベクター”とは、発現するヌクレオチド配列に動作可能に結合された発現制御配列を含んだ組換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現のためのシス作用エレメントを十分に含み、他の発現のためのエレメントは、宿主細胞によって、又はインビトロ発現系において供給することができる。発現ベクターは、コスミド、プラスミド（例えば、裸の又はリポソームに含まれた）、及び、組換えポリヌクレオチドを組み込むウイルス等の当技術分野で公知のものをすべて含む。
【００８７】
“増幅”とは、ポリヌクレオチド配列が複製され、多くのポリヌクレオチド分子に拡散される（例えば、逆転写、複製連鎖反応及びリガーゼ連鎖反応による）手段をいう。
【００８８】
“プライマー”とは、設計されたポリヌクレオチドテンプレートに特異的にハイブリダイズすることができ、相補的なポリヌクレオチドの合成の開始点を提供することができるポリヌクレオチドをいう。そのような合成は、ポリヌクレオチドプライマーが、合成が行われる条件下（すなわち、ヌクレオチド、相補的なポリヌクレオチドテンプレート、及びDNAポリメラーゼ等の重合のための薬剤の存在下で）で供される場合に生じる。プライマーは、一般に、一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは、一般に、デオキシリボ核酸であるが、広範囲の合成の及び自然発生のプライマーは多くの適用で有用である。プライマーは、ハイブリダイズされ、合成開始のための部位として提供されるように設計されている、テンプレートに相補的であるが、そのテンプレートの完全な配列を反映する必要はない。そのような場合においては、テンプレートへのプライマーの特異的なハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に依存する。プライマーは、例えば、色素部位、放射性部位又は蛍光性部位で標識化され、検出可能な部位として使用されることができる。
【００８９】
“ポリペプチド”とは、自然発生の構造変異体、及び、ペプチド結合により結合される合成的非自然発生のその類似体に関連する、並びに、自然発生の構造変異体、及び合成で非自然発生のその類似体に関連する、アミノ酸残基を含むポリマーをいう。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を利用して合成することができる。用語“タンパク質”とは、一般に、大きいポリペプチドをいう。用語“ペプチド”とは、一般に、短いポリペプチドをいう。
【００９０】
従来の表記法は、ポリペプチド配列を図示するために本明細書中で用いられ、ポリペプチド配列の左端は、アミノ末端であり、ポリペプチド配列の右端は、カルボキシル末端である。
【００９１】
“保存的置換”とは、アミノ酸のポリペプチドにおける機能的に類似するアミノ酸への置換をいう。次の６つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。
1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)；
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；
4)アルギニン(R)、リジン(K)；
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；及び、
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)
また、アミノ酸は、次のように分類することができる。
(1)疎水性:Met, Ala, Val, Leu, Ile；
(2)中性親水性：Cys, Ser, Thr；
(3)酸性：Asp, Glu；
(4)塩基性：Asn, Gln, His, Lys, Arg；
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基：Gly, Pro；及び、
(6)芳香族：Trp, Tyr, Phe
【００９２】
2つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の文脈での用語“同一の”又はパーセント“同一性”とは、先の同時係属中の米国特許出願第11/230,374号（2005年9月19日出願；その全体において本明細書中に引用により組み込まれる）に記載された配列比較アルゴリズムを用いて、又は、目視検査によって測定され、最大の一致において比較及び整列される場合、同一であるか、若しくは特定の割合同一である、ヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する2以上の配列又は部分配列をいう。
【００９３】
2つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈での語句“実質的に相同性がある”又は“実質的に同一の”とは、一般的に、次の配列比較アルゴリズムを用いて、又は目視検査で測定され、最大の一致において比較及び整列される場合、少なくとも40％、60％、80％、90％、95％、98％核酸又はアミノ酸残基と同一である２以上の配列又は部分配列をいう。実質的な同一性は、長さにおいて少なくとも約50残基である配列の領域にわたって、例えば、少なくとも約100残基である配列の領域にわたって、又は、少なくとも約150残基の領域にわたって存在することができる。一部の実施態様においては、配列は、比較生体高分子の一方又は両方のすべての長さにわたって実質的に同一である。
【００９４】
“実質的に純粋”又は“単離された”とは、対象種が優勢種で存在すること（すなわち、モル基準で、組成物での他の個々の巨大分子種よりも豊富である）、及び、実質的に精製された画分が、対象種がすべての存在する巨大分子種の少なくとも約50％（モル基準で）含む組成物であることを意味する。一般的に、実質的に純粋な組成物とは、組成物に存在する巨大分子種の約80％〜90％又はそれより多くが関心対象の精製された種であることを意味する。対象種は、組成物が単一の巨大分子種から実質的に構成される場合は、実質的に均質に精製される（従来の検出方法では、組成物で汚染種が検出されない）。溶媒種、小分子（＜500ダルトン）、安定化剤（例えばBSA）、及び成分のイオン種は、本定義の目的においては、巨大分子種に考慮されない。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の組成物は、実質的に純粋であり、或いは単離される。ある実施態様においては、原核生物PAL変異体の組成物は、それらの合成に用いる巨大分子の出発物質に関して、実質的に純粋であり、或いは単離される。ある実施態様においては、医薬組成物は、１以上の医薬として許容し得る賦形剤と混合された、実質的に精製又は単離された原核生物PAL変異体を含む。
【００９５】
対象に適用される“自然発生の”とは、対象を自然界で発見することができる事実をいう。例えば、天然資源から分離され得る生物体（ウイルスを含む）に存在し、研究室で、人間によって故意に改変されていない、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列が、自然発生するというものである。
【００９６】
“野生型”(wt)は、生物体の自然な遺伝型を指す用語である。野生型は、突然変異型（遺伝子突然変異を有する生物体）と区別される。
【００９７】
用語“ポリペプチド”及び“タンパク質”とは、アミノ酸残基のポリマーであり、生産物の最小長に限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体等がその定義に含まれる。完全長タンパク質及びそのフラグメントが共にその定義に包含される。また、その用語は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等のポリペプチドの発現後修飾を含む。更に、本明細書で用いる“ポリペプチド”とは、タンパク質が所望の活性を維持する限りにおいて、天然の配列に対する欠失、付加及び置換等の修飾（一般的に、本質的に保存的）を含むタンパク質をいう。そのようなポリペプチドは、本明細書中では“突然変異体”と呼ばれる。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発でのように、意図的であってもよいし、又は、タンパク質を産生する宿主で若しくはPCR増幅によるエラーで生じる突然変異のように、偶発的であってもよい。
【００９８】
本明細書中で用いられる、“変異体”、“類似体”、又は“誘導体”は、例えば、ペプチドなどの所定化合物と約70％より高く100％未満の配列相同性を有する化合物、例えばペプチドである。そのような変異体、類似体、又は誘導体は、自然発生のアミノ酸残基の他に、例えば、ホモアルギニン、オルニチン、ペニシラミン及びノルバリンに限定はされないが例として含有する非自然発生のアミノ酸残基からなっていてもよい。また、そのような変異体、類似体、又は誘導体は、1以上のD−アミノ酸残基からなっていてもよく、2以上のアミノ酸残基間の非ペプチドインターリンケージ(non-peptide interlinkage)を含んでもよい。
【００９９】
本明細書中で用いられる、PALポリペプチド（例えばAvPAL）と、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール又はPEG）との“比”は、PALポリペプチドと水溶性ポリマーとの間の反応条件のモル比をいう。例えば、AvPALとポリエチレングリコールとの約1:3の比（1:3 AvPAL:PEG）は、化学的に修飾されたPALが、AvPAL上のポリエチレングリコール３モル当たり約１モルのリジン残基での反応条件において生成されることを意味する。AvPALモノマーは、18個のリジン残基を有するため、約1:3のAvPAL:PEGの比は、ペグ化反応におけるPEG54モル当たりAvPAL1モルに対応する。以下の実施例6に記載する反応条件下で、約１：３の比AvPAL:PEGは、AvPALモノマーのモル当たり約10〜12モルのPEGを生じる。
【０１００】
本明細書中で用いられる“治療”又は“治療する”とは、予防的処置、治療的処置、又は診断処置をいう。
【０１０１】
“予防的”処置は、疾病又は病状（すなわち癌）の兆候を示さない、又は、初期兆候のみを示す被験者に、病状の進行の危険性を低減させる目的で施される処置である。本明細書で提供する配合物を含む原核生物PALの組成物は、病状（すなわち癌）の進行の可能性を低減させるために、又は、病状が進行した場合に、病状の重症度を最小限にするために、予防的処置として提供することが可能である。
【０１０２】
“治療的”処置は、疾病（すなわち癌）の兆候又は症状を低減させる又は除去する目的で、疾病の兆候又は症状を示す被験者に施される処置である。当該兆候又は症状は、生化学的、細胞的、組織学的、機能的、主観的、又は客観的であり得る。原核生物PALの組成物は、治療的処置又は診断のために提供することが可能である。
【０１０３】
“診断”とは、病状（すなわち癌）の存在又は性質を識別することを意味する。診断方法は、病状の特異性及び選択性で異なる。特定の診断方法は、病状の確定診断を提供し得ないが、当該方法が診断の一助となる陽性の指示を提供する場合は、当該方法で事足りる。
【０１０４】
“医薬組成物”とは、ヒト及び哺乳動物を含む被験体動物での医薬的用途に適切な組成物である。医薬組成物は、薬理学的に有効量の原核生物PALポリペプチドを含み、また、医薬として許容し得る担体も含む。医薬組成物は、2以上の成分の組み合わせ、複合若しくは凝集から、又は、1以上の成分の分離から、又は、他の型の1以上の成分の反応若しくは相互作用から、直接的若しくは間接的に生じる生成物の他に、活性成分及び担体からなる不活性成分を含んだ組成物を包含する。したがって、医薬組成物は、本明細書中で提供する原核生物PALポリペプチドと医薬として許容し得る担体とを混合して製造される組成物を包含する。
【０１０５】
“医薬として許容し得る担体”とは、標準的な医薬賦形剤、ビヒクル、希釈剤、安定化剤、保存剤、溶解剤、乳化剤、佐剤、及び／又は、例えば、リン酸塩緩衝食塩水溶液、デキストロースの5％水溶液等のこれらに限定されない担体、油／水又は水／油エマルジョン等のエマルジョン、並びに、様々な湿潤剤及び／又は佐剤をいう。適切な医薬担体及び配合物は、Remingtonの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences)第19版(Mack Publishing Co., Easton, 1995)に記載されている。使用する医薬担体は、活性剤の意図される投与形式に依存し得る。一般的な投与形式は、腸内投与（例えば経口）、非経口投与（例えば、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、又は腹腔内注射；局所的投与、経皮的投与、又は口腔粘膜投与）を含む。“医薬として許容し得る塩”は、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）、及びアンモニア又は有機アミンの塩類を含む、医薬用途の原核生物PAL変異体の組成物に配合することができる塩である。
【０１０６】
“医薬として許容し得る”又は“薬理学的に許容し得る”とは、生物学的又は有害でない物質を意味する。すなわち、当該物質は、有害な生物学的作用を生じること、又は、それが含まれる組成物の成分と有害な様式において相互作用することなしに、個体に投与することができる。
【０１０７】
本明細書中で用いられる用語“単位剤形”とは、ヒト及び動物の被験者（被験体）の単一用量として適切な物理的に分離したユニットをいい、それぞれのユニットは、医薬として許容し得る希釈剤、担体又はビヒクルと関連する所望の効果を奏するのに十分な量で計算された所定量の原核生物PAL変異体を含む。新規の単位剤形の仕様は、用いられる特定の原核生物PAL変異体、その達成される効果、及び、宿主のそれぞれの原核生物PAL変異体と関連する薬力学に依存し得る。
【０１０８】
“生理学的なpH”、又は“生理学的な範囲のpH”とは、約7.2〜8.0の包括的な範囲、より一般には、約7.2〜7.6の包括的な範囲のpHを意味する。
【０１０９】
本明細書中で用いられる用語“被験者（被験体）”は、哺乳動物及び非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例は、限定されず、哺乳類の種類の任意のメンバーを含む：ヒト、チンパンジー等のヒト以外の霊長動物、並びに、他の類人猿及び猿類；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の家畜；ウサギ、イヌ及びネコ等の家庭動物；ラット、マウス及びモルモット等のげっ歯動物などを含む実験動物。非哺乳動物の例は、鳥類、魚類等を含むが、これらに限定されない。当該用語は、特別の年齢や性別を示すものではない。
【０１１０】
［Ｂ．原核生物PAL変異体］
特定の巨大分子の信頼できる三次元構造又は構造モデルの解明は、合理的設計が、特異的構造、及び／又は当該巨大分子の機能の最適化のための生産的な方法になることを可能にする。PAL酵素の最適化の三次元構造又は構造モデルを用いる方法は、先の同時係属中の米国特許出願第11/230,374号（2005年９月19日出願；その全体において本明細書中に引用により組み込まれる）に記載される。原核生物PALの高分解能三次元タンパク質結晶構造が、原核生物PALの生化学特性及び生物物理学特性を改善する、及び、原核生物PALのインビボでの治療有効性を増加させるタンパク質工学を含む技術に関係する方法で使用することができる。野生型原核生物PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び／又は低減された免疫原性を有する原核生物PAL変異体を本明細書中で提供する。また、野生型原核生物PALと比較して、高い生化学的安定性、及び／又は生化学的半減期を有する原核生物PAL変異体を本明細書中で提供する。
【０１１１】
これまでの実験では、PAL突然変異体(Schusterらの文献、FEBS Lett. 349(2):252〜254(1994);Schusterらの文献、Proc Natl Acad Sci USA 92(18):8433〜8437(1995); Langerらの文献、Biochemistry 36:10867〜10871(1997);El-Batalらの文献、Acta Microbiol Pol. 49(1):51〜61(2000);Rotherらの文献、Eur. J. Biochem. 269:3065〜3075(2002))、及びHAL突然変異体(Taylorらの文献、J. Biol. Chem. 269(44):27473〜27477(1994);Baedekerらの文献、Eur. J. Biochem. 269(6):1790〜1797 (2002))などの改質された形態のPALが示された。
【０１１２】
（増大された触媒活性を有する原核生物PAL変異体）
本明細書中で提供する野生型PALの生物学的に活性のある部位は、PALの動力学的特性を最適化するように改質することができる。最大半量活性を提供する基質の濃度であるKmは、許容範囲内（120μM〜240μMの範囲）でのPheレベルを維持するPALの治療有効性と密接に関連している。Kmは、基質における酵素の親和性である。親和性を制御することにより、様々な濃度で基質に対する酵素の有効性を制限又は制御することができる。例えば、Kmが1000μM（例えば、ロドスポリディウム トルロイデス由来のPAL）である場合、酵素活性は、240μMの血液Pheレベルで約12.5％、及び60μMの血液Pheレベルで約3％に低減される。Kmが240μMであれば、酵素活性は、240μMの血液Pheレベルで約50％、及び60μMの血液Pheレベルで約12％に低減される。Kmが120μMである場合は、酵素の活性は、240μMの血液Pheレベルにおいて約70%に低減され、60μMの血液Pheレベルにおいて約35%に低減されることになる。最適には、治療目的は、Pheを低減させるばかりでなく、約120μMから約240μMの最適範囲内に維持するのに十分な活性を有する酵素を有することである。高いKm(すなわち1000μM)を有する酵素は、Pheレベルが正常な範囲内まで低下すると急速に活性を失うとともに、高濃度又は大容量の投与物の非実用的な投与を必要とすることになる。一方、非常に低いKmを有する酵素は、Pheレベルを急速に減少させ、それは、高フェニルアラニン血症にとっては致命的であり得るが、癌の管理には有用であり得る。
【０１１３】
ある実施態様においては、生物学的に活性のある改質されたPALは、少なくとも約0.1s-1、又は約0.5s-1より高いkcatである。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質PALは、少なくとも約0.2s-1、又は約1.0s-1のkcatである。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質PALは、約10μMから約1000μMのKmである」。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質PALは、約100μMから約1000μMのKmである。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質PALは、野生型のそれの約2倍から約1000倍の酵素活性を示す。他の実施態様においては、生物学的に活性のある改質PALは、野生型PALのそれより約10%から約100%高い酵素活性を示す。そのような生物学的に活性のある改質PALタンパク質を、部位特異的突然変異誘発などによる当該技術分野で既知の方法を使用して形成することができる。
【０１１４】
HALにおけるすべての活性部位の残基は、それぞれバリン及びグルタミン残基で置換されたH83及びE414を除いてEncPに存在することが証明された(Xiang, L.らの文献、J. Biol. Chem. 277:32505〜32509(2002))。活性部位においてL-ヒスチジンのイミダゾール部分を結合及び配向させ、酵素結合陽イオン中間体を安定化させる上でのHALにおけるH83の役割が調査された(Xiangらの文献、J. Bacteriology 187(12):4286〜4289(2005);Xiangらの文献、J. Bacteriology 188(14):533(2006))。E414のカルボキシレート基は、触媒におけるベースとして作用し得ることが提案された。調査では、EncP突然変異体を部位特異的突然変異誘発によって生成して、EncPによる桂皮酸形成へのV83の寄与を評価した。バリンをヒスチジンで置換すると、PAL活性の低下によって特徴付けられる突然変異体V83Hが生成された。バリンをアラニンで置換すると、野生型EncP V83Aより高活性であり、L-フェニルアラニンに対してわずかに低い親和性を有し、Kmが野生型酵素の23μMに対して120μMである突然変異体V83Aが得られた。しかし、V83Aは、野生型EncPと比較すると、高いkcatを有し、野生型酵素より高活性であった。
【０１１５】
（低減された免疫原性を有する原核生物PAL変異体）
多くの戦略は、一般にタンパク質免疫原性を低減させるために利用される。一部の実施態様においては、免疫反応を最小限にするために導入される改良は、巨大分子の構造、機能又は安定性を損なわない。用いられる有効な戦略は、ヒト配列含量を増やすこと（キメラ及び／又は他の‘ヒト化’アプローチ）、溶液物性を改良すること、抗体エピトープを除去すること、化学誘導体化（ペグ化など）を導入すること、及び／又は、MHCアグリトープを識別及び除去することを含む。注入による治療においては、インビボでの免疫反応性は、改良される合理的な突然変異生成が生じる及び／又は免疫原性のこれらの部位を突然変異させる前に、単独で、及び部位特異的ペグ化［Hershfieldらの文献, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7185-7189 (1991); Leongらの文献, Cytokine 16(3): 106-119 (2001); Leeらの文献, Pharm. Res. 20(5):818-825 (2003)］、又は、タンパク質免疫原性を許容されるレベルに低減させる他の化学誘導体化方法を組み合わせ、エピトープマッピングをすることで解消することができる。抗原表面タンパク質領域の改良は、免疫原性を低減させる［Chirinoらの文献, Drug Discov. Today 9(2):82-90 (2004)］。ある改良方法は、触媒活性（例えば、吸光度分析が活性測定に用いられる）を保持する、非常に小さなサイズのタンパク質の構築を含む。また、ELISAスクリーニングに結び付くタンパク質工学を用いて、低減された免疫反応性を有する突然変異体の同定をすることができる。他の方法は、ペグ化誘導体化のための追加的な表面リジン部位における点突然変異を導入するもので、この方法は、試験酵素プリンヌクレオシドホスホリラーゼで免疫原性を低減させることが明らかにされている［Hershfieldらの文献(1991), 前述の箇所］。別の経路は、タンパク質エピトープ領域に位置する残基の突然変異を用いて、免疫原部位を除去する［Yeungらの文献, J. Immunol. 172(11):6658-6665 (2004)］。抗体のヒト化(antibody humanization)と類似しているアプローチでは、相同ループ領域、及び／又はヒト抗体からの残基は、相同タンパク質の対応するループ領域に置換される。
【０１１６】
タンパク質の溶液物性の改良は、特異的酵素活性を増加させ、及び／又は、免疫原性を低減させることができる。細菌で発現された組換えタンパク質の一般的な溶液物性は、例えば、鎖間ジスルフィド結合の形成、疎水性相互作用、及び／又は、２価カチオンによるタンパク質凝集体の形成である［Chiらの文献, Pharm.Res.20(9):1325-1336 (2003)］。組換え発現タンパク質の凝集は、免疫反応を高める［Hermelingらの文献, Pharm. Res. 21(6):897-903 (2994); Schellekensの文献, Nephrol. Dial. Transplant. 20(suppl 6):vi3-9 (2005)］。ある改良方法は、他のアミノ酸（例えばセリン）残基により表面システイン残基を置換して、鎖間ジスルフィド結合の形成の可能性を最小限にすることを含む。例えば、セリン残基による2つの表面システイン残基の置換は、酵素活性に対して若干の影響があるコリスミン酸リアーゼの凝集を低減させた［Holdenらの文献, Biochim. Biophys. Acta 1594(l):160-167 (2002)］。
【０１１７】
他のアミノ酸残基（例えばセリン残基）で置換された１以上のシステイン残基を有する原核生物PAL変異体を本明細書中で提供する。ある実施態様においては、原核生物PALの１以上のシステイン残基は、他のアミノ酸残基で置換されている。一部の実施態様においては、原核生物PALはAvPALである。特定の実施態様においては、AvPALの１以上のシステイン残基は、システイン残基で置換されている。
【０１１８】
［Ｃ．化学的に修飾された原核生物PAL変異体］
巨大分子の化学修飾は、非特異的な方法（誘導体化された種を混合させる)、部位特異的な方法（野生型巨大分子の反応指向性誘導体化、及び／又は、部位特異的突然変異誘発と化学修飾を組み合わせて用いる部位選択性修飾）、又は、発現タンパク質ライゲーション法［Hofmannらの文献, Curr. Opin.Biotechnol. 13(4):297-303 (2002)］で行うことが可能である。一部の実施態様においては、化学修飾は、免疫原性を低減させるために用いられる。ペグ化は、タンパク質の免疫原性を低減させる実証された方法である［Bhadraらの文献, Pharmazie 57(l):5-29 (2002)］が、リン酸化、アミド化、カルボキシル化、アセチル化、メチル化、酸付加塩類、アミド、エステル、及び、N−アシル誘導体の形成を用いた修飾により、グリコシル化及び他の化学誘導体化方法も可能である［Davisの文献, Science 303:480-482 (2004)］。
【０１１９】
ある範囲のPEG化学試薬とPALタンパク質の比を用いたPAL上の一連の異なるペグ化反応は、各改質方法に対するPEG-PAL誘導体を提供することになる。最適なペグ化度を、吸収アッセイとPAGE及び原生ゲル分析とを併用して誘導体化PAL種毎に得られた残留活性に基づいて、又は多角光散乱(multiple light scattering)(MALS)によるSE-HPLCを使用してPEG誘導体化の程度を測定するよって測定することができる。最適な改質の初期範囲を測定した後に、比較の動態学的分析(Vmax及びKm測定、基質の結合定数、タンパク質分解安定性、活性のpH依存性、活性の温度依存性を含む)及び最適なPEG-PAL種の免疫反応性をELISA、免疫沈降及びウェスタンブロットによって測定することができる。最適な誘導体化条件を使用してペグ化のための最も好適なPAL突然変異体を生成するために、タンパク質工学を用いることもできる。PALタンパク質のサイズを最小限に抑え、PAL表面の最も抗原性の強い領域を単に改質することによって、PEG改質のコストが低減されると同時に、最大量の酵素活性及び最小量の免疫原性が維持されることになる。同様に、部位特異的ペグ化を用いて、酵素誘導体を得ることができる。
【０１２０】
リン酸化などの他の化学的改質、又はLys、Arg及びCys残基の他の化学的改質を用いて、免疫原性領域及び/又はタンパク質分解感受性領域を遮蔽することができる。そのような化学的改質としては、Bednarsakiのポリマー添加法が挙げられ、PAL安定性を向上させ、免疫原性を低減させ、プロテアーゼ抵抗性を向上させるためのAltus Corporationの架橋法が代表例である。Bednarsakiは、ポリマー添加がタンパク質の温度安定性を向上させることを証明し(Wangらの文献、J. Am. Chem. Soc. 114(1):378〜380(1992))、Altus Corporationは、グルタルアルデヒド架橋が酵素安定性を向上させることを見出した。
【０１２１】
PALなどのタンパク質のインビボの治療半減期がペグ化の恩恵を受けるかどうかを見出すために、様々な異なるPEG:PAL結合体が合成され、インビトロで特徴付けられ、L-Pheの低減についてインビボで試験される。ペグ化の潜在的な効果を最適化するとともに、１以上のPEG結合部位を特定するために、ポリマー長、配座及びPEG結合度を変化させる設計手法が採用される。ある実施態様においては、ペグ化PALを調製するための方法は、(a)PALとポリエチレングリコールとを、PALを１以上のPEG基に結合させる条件下で反応させること;及び(b)反応生成物を得ることを含む。PAL改質の特異的部位は、結合体の固有の活性を有意に変化させ得るため、異なる種類及び量のPEGが調査された。PALのペグ化に用いられた化学作用は、メトキシ-PEG(O-[(N-スクシンイミジルオキシカルボニル)-メチル]-O’-メチルポリエチレングリコール)のNHS-エステルを使用するPALの第一級アミンのアシル化であった。メトキシ-PEG-NHS又はメトキシ-PEG-SPAによるアシル化は、本来の第一級アミンからの変化をなくするアミド結合をもたらす。
【０１２２】
これらの方法は、ポリマー:タンパク質結合体の実質的に均質な混合物を提供する。本明細書中で用いられる「実質的に均質」は、ポリマー:タンパク質結合体分子のみが観察されることを意味する。ポリマー:タンパク質結合体は、生物学的活性を有し、本明細書中で提供されるこれらの「実質的に均質な」ペグ化PAL調製物は、均質な調製物の利点、例えば、ロット毎の薬物動態の予測性の点で臨床用途において容易であることを示すのに十分なものである。
【０１２３】
本明細書中に記載されるペグ化手法での使用に意図されるポリマー分子を、水溶性ポリマー又はそれらの混合物の中から選択することができる。水溶性ポリマーを、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ-(N-ビニルピロリドン)、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、HPMA、Fleximer.TM及びポリビニルアルコール、モノ-(C1〜C10)アルコキシ-PEG、アリールオキシ-PEG、トレシルモノメトキシPEG、PEGプロピオンアルデヒド、ビス-スクシンイミジルカーボネートPEG、セルロース、又は他の炭水化物系ポリマーからなる群から選択することができる。選択されるポリマーは、それが結合するタンパク質が生理的環境などの水性環境で沈殿しないように、水溶性である必要がある。ポリマーは分枝状又は非分枝状であり得る。ある実施態様においては、最終製品調製物の治療的使用のために、そのポリマーは、医薬として許容し得ることになる。
【０１２４】
ある実施態様においては、本明細書での使用のための水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール、略してPEGである。本明細書中で用いられているように、ポリエチレングリコールは、モノ-(C1〜C10)アルコキシ又はアリールオキシ-ポリエチレングリコールなどの他のタンパク質を誘導体化するのに使用されてきたPEGの形態のいずれかを包含することを意味する。
【０１２５】
タンパク質分子に対するポリエチレングリコール分子の割合は、反応混合物におけるそれらの濃度とともに変化することになる。概して、(過剰な未反応タンパク質又はポリマーが存在しない点での反応の効率性の観点から)最適な比は、選択されるポリエチレングリコールの分子量及び存在する利用可能な反応性基(典型的にはεアミノ基の数)によって決定づけられる。概して、使用されるポリマーの分子量が大きいほど、タンパク質に結合できるポリマー分子の数が少なくなる。同様に、これらのパラメーターを最適化するときにポリマーの分枝を考慮することができる。一般に、分子量が大きいほど(分枝が多いほど)、ポリマー:タンパク質比が大きくなる。5kDa及び20kDaを含むが、それらに限定されないいくつかの異なる直鎖状PEGポリマー長、10kDa及び40kDaを含むが、それらに限定されない二腕分枝状PEGポリマーの結合体を意図するものである。ある実施態様においては、本明細書で意図されるペグ化反応について、平均分子量は、約2kDaから約100kDa(「約」という用語は+/-1kDaを示す)である。他の実施態様においては、平均分子量は、約5kDaから約40kDaである。PALに対する水溶性のポリマーの比は、一般に、モノPEGでは1:1、ジPEGでは2:1等である。
【０１２６】
（ペグ化原核生物PAL変異体）
共同出願された米国特許第7,531,341号の実施例7〜9には、ENU2又はBTBRenu2マウスにおけるPheレベルに対する、ロドスポリディウム トルロイデス由来のリジン突然変異体R91K PAL(RtPAL)、NpPAL、及び、AvPALのペグ化された及びペグ化されていない形態の影響が記載されている。この動物モデルは、動物で重度の高フェニルアラニン血症によって生じる、PAHの遺伝子座のホモ接合突然変異体である。高い血漿Pheレベルは、この動物を血漿Pheを低減させるPALの能力を評価するための適切なモデルにする。NpPAL及びAvPALのペグ化形態の投与により、ペグ化されていないNpPAL及びAvPALと比較して、ENU2マウスのPheがそれぞれ大きく低減される。そのような効果は、10週間にわたる毎週の注射でのNpPALにおいて維持される。これらの結果は、シアノバクテリア種である、ノストック パンクチフォルメ及びアナベナ バリアビリス由来のPALのペグ化が、PKUの影響を受けたマウスのPheレベルを低減させるのに不可欠であることを示すものである。
【０１２７】
本明細書の実施例14には、ENU2マウスのPheレベルに対する、AvPALポリペプチドにおけるシステイン残基（例えば位置503及び565）のセリンによる置換の影響が記載されている。ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの投与により、ペグ化野生型AvPALで達成されたものと同等に、血漿Pheが低減された。また、抗PAL抗体の抗体力価は、ペグ化野生型AvPALと比較して、ペグ化AvPAL変異体で注入された動物では低かった。これらの結果は、ペグ化AvPAL変異体が、(1)ペグ化野生型AvPALと同等のインビボでのPAL酵素活性を有し、かつ、(2)ペグ化野生型AvPALと比較して、免疫原性を低減させることを示すものである。
【０１２８】
低減された免疫原性を有するペグ化PAL変異体を本明細書中で提供する。1つの実施態様は、低減された免疫原性を有するNpPAL変異体のペグ化形態である。別の実施態様は、低減された免疫原性を有するAvPAL変異体のペグ化形態である。特定の実施態様は、NpPAL又はAvPAL変異体と、水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)とを反応させることによってペグ化が達成されるNpPAL又はAvPAL変異体を意図するものである。ある実施態様においては、ペグ化は、NpPAL又はAvPAL変異体とPEGとを、少なくとも1:1、少なくとも1:1.5、少なくとも1:2、少なくとも1:3又は少なくとも1:4のPAL:PEGの比で1回反応させることによって達成される。1つの実施態様において、PAL変異体は、AvPAL変異体であり、ペグ化は、1:3のPAL:PEG比を用いて達成される。ペグ化ＰＡＬ変異体を調製するための方法も本明細書中で提供される。
【０１２９】
一部の実施態様においては、一部に酵素の活性部位及び/又はその付近における他のアミノ酸残基(例えばチロシン)の潜在的ペグ化を阻止することによって、又は酵素活性にとって重要なリジン残基の潜在的ペグ化を阻止することによって、触媒活性を強化し、免疫原性を低減させ、及び/又は生化学的安定性を向上させるために、原核生物PAL変異体の活性部位及び/又はその付近に１以上のリジン残基が導入される。特定の理論に結び付くことなしに、原核生物PALの活性部位(すなわちAvPALの位置78又は314)及び/又はその付近のチロシン残基は、酵素活性を低下させるペグ化のための部位であり得ると仮定するものである。ある実施態様においては、酵素活性に必要とされない原核生物PALの活性部位及び/又はその付近の１以上のアミノ酸がリジン残基によって置換されている。一部の実施態様においては、原核生物PALは、AvPALである。1つの実施態様においては、位置78又は314のAvPALチロシン残基は、ペグ化に利用可能でない。ここでも特定の理論に結び付くことなしに、近隣のリジン残基PAL(すなわち、AvPALにおける位置413)のペグ化により通常はペグ化が阻止される原核生物PALのリジン残基(すなわち、AvPALにおける位置419)は、基質結合及び/又は触媒活性を低下させるペグ化のための部位であり得ると仮定するものである。一部の実施態様においては、原核生物PALの１以上のアミノ酸残基がリジン残基によって置換されるため、酵素の基質結合及び/又は触媒活性にとって重要なリジン残基がペグ化に利用可能でない。特定の実施態様においては、原核生物PALは、AvPALである。1つの実施態様においては、位置419のAvPALリジン残基は、ペグ化に利用可能でない。
［Ｄ．原核生物PAL変異体の治療用途及び投与］
【０１３０】
[1.様々な形態の高フェニルアラニン血症(HPA)]
様々なHPA患者集団を治療する方法であって、HPA及び/又はPKUを管理するために原核生物PAL変異体組成物を単独で、又は他の治療法と組み合わせて使用することを含む方法を本明細書中で提供する。特に、通常は食事介入を用いないほど十分に低いフェニルアラニン濃度を有する患者集団(すなわち軽度HPAの患者)、中度PKU患者、古典的又は重度PKU患者、及びそれらの任意の部分集団を治療するために原核生物PAL変異体組成物を使用できることを意図するものである。軽度HPAの影響を改善するための原核生物PAL変異体組成物による治療の対象となる患者は、血清濃度が200μM未満の妊婦及び幼児を含む。様々な患者集団、及びそれらの異なる治療ニーズを本セクションで更に説明する。
【０１３１】
一部の実施態様は、タンパク質制限食を、原核生物PAL変異体、又はその生物学的に活性のある変異体、突然変異体若しくはフラグメントを含む組成物と組み合わせて被験者に投与することによって古典的な重度PKUを治療することを意図するものであり、タンパク質制限食と原核生物PAL変異体との併用投与は、前記被験者の血漿におけるフェニルアラニン濃度を、前記併用投与がない場合の前記濃度と比較して低下させるのに有効である。加えて、HPAを有する妊婦を治療する方法であって、タンパク質制限食と原核生物PAL変異体との併用投与が、前記併用投与がない場合の濃度と比較して妊婦の血漿におけるフェニルアラニン濃度を低下させるのに有効であるように、タンパク質制限食を原核生物PAL変異体、又はその生物学的に活性のある誘導体と組み合わせて該女性に投与することを含む方法を提供する。特定の実施態様においては、治療は、420μMを超えるPheレベルを示す患者に対して意図される。
【０１３２】
他の実施態様は、180μMを超える血漿Phe濃度によって特徴付けられるHPAを有する任意の個人に対して、原核生物PAL変異体の投与の前に、原核生物PAL変異体組成物を、患者のそのような血漿Phe濃度の低下をもたらすのに有効な量で投与することを含む。本明細書中で提供する方法は、300μMを超えるPhe濃度によって特徴付けられる高いPKUを有する幼児を本明細書中に記載の原核生物PAL変異体組成物で治療するのにも有用であり得る。「幼児」とは、0から約36ヵ月の年齢の患者を意味する。
【０１３３】
（重度の古典的PKUの特徴及びその治療方法）
重度PKUは、1200μMを超える血漿Phe濃度で顕在化し、4800μM程度になり得る。この障害を有する患者は、その血漿Phe濃度を臨床的に許容し得るレベル(典型的には、600μM未満又は300μM未満)まで低下させるために、Pheフリー食で治療される必要がある。これらの患者は、最大で１日当たり250〜350mgの食事性Pheのみを許容することが可能である(Spaapenらの文献、Mol. Genet Metab. 78:93〜99(2003))。そのように、これらの患者は、生後7〜10日でPhe制限処方食を開始し、残りの寿命に対してこの食事制限を負うことになる。これらの個人が負う厳格な食事制限の緩和が有益となる。
【０１３４】
古典的なPheを有する個人の診断に使用される試験を、以下に更に詳細に説明する。これらの試験により、古典的な重度PKUを有する患者には低フェニルアラニン食が必要であることが明らかになっている(Luckeらの文献、Pediatr. Neurol. 28:228〜230(2003))。したがって、本明細書中で提供する特定の方法は、個人の血漿Phe濃度を監視することによって患者が古典的PKUに罹っていることを判断することを含むことになる。次いで、原核生物PAL変異体単独、又は低タンパク質食とPAL変異体との併用療法を、患者の血漿Phe濃度の少なくとも25%の低下がもたらされるように投与することによって患者を治療することができる。ある実施態様においては、該方法は、血漿Phe濃度の30%の低下をもたらすことになる。他の実施態様においては、該方法は、個人の血漿Phe濃度の40%、50%、60%、70%、80%又は90%以上の減少をもたらすことになる(例えば、重度の古典的PKUを有する患者が4800μMのPhe濃度を有する場合は、Phe濃度の90%の低下は、食事制限をほとんど必要としないほど十分に低い濃度である480μMの血漿Phe濃度をもたらすことになる)。勿論、本明細書中で提供する治療方法は、重度の古典的PKUの治療であっても本明細書中に記載の任意の他のHPAの治療であっても、患者の血漿Phe濃度を約120μMから約360μM±15μMの範囲にできるだけ近いレベルまで、又は約120μMから約240μMの最適範囲に下げることを企てるものであることが理解されるべきである。
【０１３５】
ある実施態様においては、治療される古典的PKU患者のの血漿Phe濃度は、1000μMを超える無制限の血漿Phe濃度の任意の量から、600μM未満の任意の血漿Pheレベルまで低減される。勿論、原核生物PAL変異体及びタンパク質制限食を用いた併用療法が、血漿Phe濃度のより小さな減少、例えば、800μMから約1200μMのレベルまでの減少をもたらす場合でも、これは、この範囲の血漿Phe濃度を有する患者が、Phe制限処方物を食するのと異なって食事のタンパク質の量を単に制限することによって疾患を管理できることで、個人の生活の質が顕著に向上するとともに、食事制限に対する患者コンプライアンスが高められるため、臨床的に有用な治療成果であると見なされることになる。
【０１３６】
該治療の結果として患者によって許容され得る食事性Pheレベルの量の増加は、治療的に有効な成果であると見なされることになる。例えば、原核生物PAL変異体治療薬を投与した結果として、患者は、その食事性Pheの摂取量を250〜350mg/日から350〜400mg/日に増加させることが可能である(すなわち、患者のPhe許容表現型が、古典的PKU患者から中度PKU患者の表現型に変化する)ことを意図するものである。勿論、本明細書に教示する治療的介入は、患者がその食事性Pheの摂取量を250〜350mg/日から400〜600mg/日に増加させることを可能にする(すなわち、患者のPhe許容表現型が、古典的PKU患者から軽度PKU患者の表現型に変化する)、又は場合によっては、患者が、１日当たり600mgを超えるPheの摂取量(すなわち正常な食事摂取)を有することを可能にすることが望ましい。
【０１３７】
(BH4-非応答性PKU患者の特徴及びその治療方法)
本明細書中で提供する組成物及び方法で治療することができる患者の第2のグループは、高い血漿Phe濃度、すなわち200μMを超える任意の濃度を有すると判断されたが、(以下に記載するBH4装薬試験によって判断されるように)BH4治療に対して非応答性であると診断された個人である。そのような患者としては、軽度PKU(すなわち、600μMまでの血漿Phe濃度)を有する個人、中度PKU(すなわち、600μMから約1200μMの血漿Phe濃度)を有する個人、並びに古典的な重度PKU(すなわち、1200μMを超える血漿Phe濃度)を有する患者を挙げることができる。
【０１３８】
ある実施態様においては、BH4治療に対して非応答性である患者は、患者の血漿Phe濃度を減少させるために、PAL変異体が、患者の食事における低減された量のタンパク質と組み合わせて与えられる。原核生物PAL変異体の投与は、原核生物PAL変異体薬を投与せずに同じ食事プロトコルを投与してもたらされる減少と比較して、患者の血漿Phe濃度のより大きな減少をもたらすことができる。食事制限は、減少した量のPheを有する合成医薬タンパク質処方物を与えることによってPhe摂取を制限する食事であり得るか、或いは食事制限は、患者が、その全体的なタンパク質摂取量を制限することを要求するが、患者が制限された量で通常の食物を食することを許可するものであり得る。
【０１３９】
古典的PKU患者について記載された治療成果が、参照により本セクションに組み込まれる。例えば、中度PKUを有する患者(すなわち、600μMから1200μMの無制限の血漿Phe濃度を有する患者)についての治療成果は、患者の血漿Phe濃度の少なくとも25%の減少を含み得る。ある実施態様においては、該方法は、血漿Phe濃度の30%の減少をもたらすことになる。他の実施態様においては、該方法は、個人の血漿Phe濃度の40%、50%、60%、70%、80%又は90%以上の減少をもたらすことになる(例えば、中度古典的PKUを有する患者が1000μMのPhe濃度を有する場合は、Phe濃度の90%の低下は、食事制限をほとんど又は全く必要としないほど十分に低い濃度である100μMの血漿Phe濃度をもたらすことになる)。
【０１４０】
ある実施態様においては、治療される中度PKU患者の血漿Phe濃度は、600μMから1200μMである任意の量の無制限の血漿Phe濃度から300μM未満の任意の血漿Phe濃度まで低減される。1つの実施態様においては、(単独、又は食事制限と組み合わせた)原核生物PAL変異体による治療は、例えば200μMから約400μMのレベルまでの血漿Phe濃度の低下をもたらし、それは、この範囲の血漿Phe濃度を有する患者が、Phe制限処方物を食するのと異なって食事のタンパク質の量を単に制限することによって疾患を管理できるため、臨床的に有用な治療成果であると見なされることになる。実際、多くの調査において、そのような患者は通常の食事を食することさえできることが教示されている。
【０１４１】
治療の結果として患者によって許容され得る食事性Pheレベルの量の増加は、治療的に有効な成果であると見なされることになる。例えば、原核生物PAL変異体治療薬を(単独、又は他の治療的介入と組み合わせて)投与した結果として、患者は、その食事性Pheの摂取量を350〜400mg/日から400〜600mg/日に増加させることが可能である(すなわち、患者のPhe許容表現型が、中度PKU患者から軽度PKU患者の表現型に変化する)ことを意図するものである。勿論、本明細書に教示する治療的介入は、患者がその食事性Pheの摂取量を350〜400mg/日から増加させて、毎日600mgを超えるPheの摂取量(すなわち、通常の食事摂取量)を有することを可能にすることが望ましい。
【０１４２】
単に軽度のPKUを示す患者、すなわち、毎日400〜600mgのPhe摂取の許容量を有する患者は、本明細書中で提供する組成物及び方法を使用して治療され、360μM±15μMにできるだけ近い正規化血漿Phe濃度をもたらすことが望ましいため、原核生物PAL変異体系治療薬の恩恵を受けることができる。そのような患者については、有利な治療成果は、患者の血漿Phe濃度の少なくとも25%の減少を含むことになる。1つの実施態様においては、該方法は、血漿Phe濃度の30%の減少をもたらすことになる。別の実施態様においては、該方法は、個人の血漿Phe濃度の40%、50%又は60%以上の減少をもたらすことになる(例えば、軽度PKUを有する患者が600μMのPhe濃度を有する場合は、Phe濃度の60%の低下は、360μMの血漿Phe濃度、すなわち血漿Pheの許容し得る正常な濃度をもたらすことになる)。
【０１４３】
ある実施態様においては、治療される軽度PKU患者の血漿Phe濃度は、400μMから600μMである任意の量の無制限の血漿Phe濃度から100μM未満の任意の血漿Pheレベルまで低減される。勿論、(単独、又は食事制限と組み合わせた)原核生物PAL変異体による治療が血漿Phe濃度のより小さな減少、例えば200μMから約400μMのレベルまでの減少をもたらす場合でも、これは、臨床的に有用な治療成果であると見なされることになる。
【０１４４】
治療の結果として患者により許容され得る食事性Pheレベルの量の増加は、治療的に有効な成果であると見なされることになる。例えば、(単独、又は他の治療的介入と組み合わせて)原核生物PAL変異体治療薬を投与した結果として、患者は、その食事性Pheの摂取量を400〜600mg/日から増加させて(すなわち、患者のPhe許容表現型が軽度PKU患者から軽度HPA患者の表現型に変化する)、１日当たり600mgより多いPheの摂取量(すなわち、通常の食事性摂取量)を有することが可能になることを意図するものである。
【０１４５】
また、患者が、単に非PKU HPAの症候を示す患者、すなわち最大で600μMまでの高い血漿Phe濃度を有する患者であるが、そうでなければ通常のタンパク質食を食することが許される場合であっても、高いPhe濃度は、そのような個人のIQに有意な影響を及ぼすことが証明されているため、原核生物PAL変異体治療の恩恵を受けることになる。更に、以下に記載するように、特殊なニーズを有する被験者、例えば妊婦及び幼児の原核生物PAL変異体治療的介入は、患者の血漿Pheレベルが200μM未満の認定「安全」レベル内である場合でも、特に重要である。
【０１４６】
(母性PKU及びその治療方法)
受胎が予定されているPKU女性及び妊娠しているPKU女性における血漿Pheレベルの代謝的制御は、胎児のPAH状態にかかわらず、子宮内の中程度に高いPheレベルであっても、それに暴露される胎児に深刻な結果がもたらされるため重要である。血漿Phe濃度の治療的制御は、十分な制御を達成することができなければ、小頭症、精神薄弱及び先天性心臓疾患を含む障害がもたらされるため、妊娠の最初の三半期において特に重要である。
【０１４７】
例えば、フェニルケトン尿症に関するNIHコンセンサスステートメント(Consensus Statement)(第17巻#3、2000年10月)には、3〜10mg/dLの母性Pheレベルへの胎児の暴露が24%の小頭症の発生率をもたらすのに対して、20mg/dLを超える(すなわち、1200μMを超える)レベルに暴露された胎児が73%の小頭症の発生率を有することが報告された。同様に、20mg/dLを超える母性Pheレベルに暴露された子供の10%に先天性心臓疾患が見出された。重要なことは、6mg/dLを超えるPheのレベルが、子供のIQを有意に低下させることが注目されている。したがって、母性PKU症候群のリスクを回避するためには、最も軽いHPAを示す女性であっても、あらゆる形態のフェニルケトン尿症を有する女性の血漿Phe濃度を厳密に制御することが肝要である。しかし、米国の診療所で使用されてきたPKU女性の血漿Phe濃度の許容し得る目標レベルは、10mg/dL〜15mg/dLの範囲であり、これは、妊婦に対して推奨される2〜6mg/dLのレベル、又は母性PKU症候群を発生させるリスクを小さくするために英国及びドイツで使用されている1〜4mg/dLよりはるかに高い。
【０１４８】
妊婦に対する別の重要な事項は、その全タンパク質摂取量である。妊娠中の低タンパク質食は、遅延腎臓発達、及びそれに続くネフロン数の減少をもたらし、潜在的に成人における高血圧症に至ることが示唆されているため(D’Agostinoの文献, N. Engl. J. Med. 348(17)1723〜1724、(2003))、妊娠中は、女性が十分なタンパク質を食することが重要である。以下の表は、様々な個人に対して推奨される全食事性タンパク質摂取量についての例示的なガイドラインを示す。
【表２】
2013518893.tif 000003
【０１４９】
上記例示的なガイドラインからわかるように、米国においては、出産可能年齢(例えば51歳未満)の女性に対する推奨タンパク質摂取量は、44から50g/日であるのに対して、妊婦は、約60g/日の摂取量が必要である。カナダ及び英国においては、妊婦に対する推奨タンパク質摂取量は、約70g/日から52g/日である。したがって、妊婦の血漿Phe濃度レベルを厳密に制御することを確実にする必要性は、このグループのPKU患者が、同年齢の妊娠していないPKU女性より多くのタンパク質を必要とするという事実によって更に複雑化される。
【０１５０】
上記に鑑みて、本明細書中で提供するPAL変異体治療薬は、妊婦に特に有用であることを意図するものである。妊娠しているか、又は妊娠を予定している、任意の形態のHPAに罹っている女性に原核生物PAL変異体治療のコースを施すことで、その血漿Phe濃度レベルを180μMから約360μMのできるだけ近くに維持させることができる。そのような治療のコースは、そのような女性が、その正常なタンパク質摂取量を増加させることを可能にする。
【０１５１】
本明細書中に記載されている、血漿Phe濃度のレベル、及びそのようなPhe濃度を減少させるべき程度の説明が、妊婦についての本セクションに組み込まれる。
【０１５２】
（幼児におけるPKUの管理及びその治療方法）
本明細書全体を通じて記載するように、幼児(0歳から3歳)における血漿Phe濃度の上昇は、小児のIQの有意な低下をもたらすことが測定されてきた。しかし、本明細書の他の箇所に記載したように、400μM程度までの高い血漿Phe濃度を有する患者は、通常は、食事介入を受けない。したがって、0歳から3歳の年齢の幼児は、現在の治療から有意な悪影響を被る。本出願は、360μM±15μMを超える無制限の血漿Phe濃度を有する任意の幼児を、その被験者の血漿Phe濃度の有益な減少をもたらすために、原核生物PAL変異体を含む治療組成物で治療することを意図するものである。
【０１５３】
ある実施態様においては、幼児は、0歳から3歳の年齢であり、原核生物PAL変異体の投与の前に約1200μMの無制限の血漿Phe濃度を有し、前記投与は、血漿Phe濃度を減少させる。1つの実施態様においては、投与により、血漿Phe濃度は、1800μMを超える濃度から約1500μM、約1200μM、約1100μM、約1000μM、約900μM、約800μM、約700μM、約600μM、約550μM、約500μM、約450μM、約400μM、約350μM、約300μM、約275μM、約250μMまで減少される。他の実施態様においては、幼児は、0歳から3歳の年齢であり、約1200μMを超える無制限の血漿Phe濃度を有し、この血漿Phe濃度は、原核生物PAL変異体を単独、又は食事と組み合わせて投与することにより、約800μM、約500μM又は約360μMまで減少される。360μMを超える無制限の血漿Phe濃度を有する幼児を原核生物PAL変異体で治療して、そのような血漿Phe濃度の減少をもたらすことを意図するものであることを当業者なら理解するであろう。上記血漿Phe濃度の治療的低減の説明は、参照により本明細書中に組み込まれている。更に、初期の無制限の血漿Phe濃度に対する10%以上の減少は、幼児に対する治療法の治療成果と見なされることになる。原核生物PAL変異体治療薬と食事制限とを組み合わせて、そのような幼児における血漿Phe濃度の治療的減少をもたらすことができることが理解されるべきである。
【０１５４】
[2.他の治療用途]
(様々な形態の癌及びその治療方法)
また、様々な形態の癌を治療する方法であって、原核生物PAL変異体を含む医薬組成物の治療有効量を被験者に投与することを含む方法を本明細書中で提供する。広い実施態様においては、癌は、癌に由来する細胞の増殖及び/又は生存がフェニルアラニンの制限又は欠失に感受性のある癌である。ある実施態様においては、癌は、肺癌、脳若しくは中枢神経系の癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌又は転移性黒色腫である。他の実施態様においては、癌は、頭及び首の癌、卵巣癌、子宮癌、白血病(例えば、急性骨髄性白血病若しくは急性リンパ芽球性白血病)又は骨髄腫である。更に他の実施態様においては、癌は、小児癌又は抵抗性癌(すなわち、癌治療薬若しくは標的化癌治療薬に対して抵抗性を有することが証明された癌)である。
【０１５５】
一部の実施態様においては、癌を治療するための方法であって、そのような治療を必要とする被験者に対して、原核生物PAL変異体及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物の治療有効量を被験者に投与することを含み、原核生物PAL変異体は、野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性及び/又は低減した免疫原性を有し、被験者の血液、血清又は血漿におけるフェニルアラニン濃度を検出レベル未満から約20μMから60μM、例えば、約20μM未満、又は約10μM未満の範囲まで低減するのに有効であり、タンパク質制限(すなわちフェニルアラニンフリー)食を被験者に投与することを場合により更に含む方法を提供する。
【０１５６】
(パーキンソン病及びその治療方法)
PKUのモデルであるPahemu2マウスの脳の詳細な神経病理的評価により、活性化された小グリア又はマクロファージ(CD11b+細胞)の数の増加、並びに脳の2つのドーパミン作動性領域、すなわち黒質(substantia nigra)(SN)及び視床下部における誘発性窒素酸化物合成酵素(inducible nitric oxide synthase)(iNOS)の免疫活性の増大が明らかになった(Emburyらの文献、Pediatr. Res. 58:283〜287、2005参照)。SNにおけるこの浸透CD11+細胞及びiNOS上方制御の存在は、パーキンソン病(Parkinson’s Disease)(PD)にも観察される。PD及びHPA/PKUの別の共通の特徴は、脳におけるドーパミンの低下であり、後者は、Pheが、ドーパミンの前駆体であるL-Dopaの前駆体であるチロシン(tyrosine)(Tyr)に変換されない結果として生じる。加えて、PD及びPKUの両方が、ドーパミン作動性ニューロンの損失又は損傷に関連し、PD及び少なくともPahemu2マウスの両方が、臨床的には運動機能の障害を示す。
【０１５７】
PDを治療する方法であって、原核生物PAL変異体を含む医薬組成物の治療有効量を被験者に投与することを含む方法を本明細書中で提供する。原核生物PAL変異体治療は、例えば、血液-脳バリヤーを横断することが可能であることが知られるドーパミン前駆体L-Dopaのような神経伝達物質を含む、PDを治療するための他の治療薬と組み合わせられ得る。
【０１５８】
治療有効量の原核生物PAL変異体の投与が有益である疾患の徴候としては、HPA、PKU、チロシン血症、癌及びPDが挙げられる。非経口投与、経口投与、又は他の標準的な投与経路及び投与量を、標準的な方法を使用して決定することができる。
【０１５９】
[2.治療での使用のための組成物]
また、PKU/HPAの治療的介入を本明細書中で提供する。そのような介入は、最初は、単独又は食事制限と組み合わせて使用することができる原核生物PAL変異体の使用に基づく。更に、原核生物PAL変異体及び/又は食事制限と、例えば、脳におけるPhe蓄積を防止するための例えば大きな中性アミノ酸(Kochらの文献、Mol. Genet. Metabol. 79:110〜113(2003)参照)などの、PKUの他の症状を抑えるように設計された他の治療組成物とを更に組み合わせることができる。本セクションでは、本明細書で意図される治療に使用することができる組成物の説明を提供する。
【０１６０】
(原核生物PAL変異体組成物、医薬組成物及び配合物)
治療有効量の原核生物PAL変異体を、１以上の医薬として許容し得る賦形剤、ビヒクル希釈剤、安定化剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤及び/又は担体とともに含む医薬組成物を本明細書中で提供する。そのような医薬組成物は、様々な緩衝液分(例えば、Tris-HCl、ホスフェート)、pH及びイオン強度の希釈剤;洗浄剤及び可溶化剤(例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート80)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、防腐剤(例えば、チメロゾール、ベンジルアルコール)及び増量物質(例えば、ラクトース、マンニトール)などの添加剤を含む(例えば、参照により本明細書中に組み込まれているRemington’s Pharmaceutical Sciences、第18版(1990、Mack Publishing Co.(ペンシルバニア州Easton)) 1435:1712頁参照)。治療有効量の活性成分は、体重、年齢及び治療目標などの因子を考慮に入れることによって当業者が容易に決定することができる治療、予防又は診断有効量である。
【０１６１】
ある実施態様において、原核生物PAL変異体医薬組成物は、溶液のpHを所望の範囲内に維持するための緩衝剤を含む。そのような緩衝剤としては、Tris-HCl、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムが挙げられる。これらの緩衝剤の混合物を使用することもできる。組成物に有用な緩衝剤の量は、使用される特定の緩衝剤及び溶液のpHに大きく依存する。例えば、酢酸塩は、pH6よりpH5の方がより効率的な緩衝剤であるため、pH6よりpH5の溶液でより少ない酢酸塩を使用することができる。ある実施態様においては、緩衝剤は、Tris-HClである。一部の実施態様においては、医薬組成物のpH範囲は、約6.0〜8.0、例えば、約6.5〜7.5又は約7.0〜7.6である。
【０１６２】
本明細書中で提供する医薬組成物は、溶液を等張性とし、注射に対する適合性を高めるための等張性調整剤を更に含み得る。ある実施態様においては、等張性調整剤は、100〜200mM、例えば、120〜170mM又は120〜150mMの濃度範囲内の塩化ナトリウムである。
【０１６３】
医薬として許容し得る担体又は賦形剤は、本明細書中で提供する原核生物PAL変異体組成物を安定化させる分子である安定化剤を含み得る。本明細書に用いられている「安定化させる」という用語は、例えば、限定を目的とせずに、原核生物PAL酵素の保存寿命を増大させること、原核生物PAL酵素をタンパク質分解消化から保護すること、原核生物PAL酵素を活性配座に維持すること、及び/又は原核生物PAL酵素活性を高温での保存に際して維持することを含むように意図される。例えば、安定化剤は、(例えば、安定化剤が存在しない場合のペグ化原核生物PAL変異体と比較して)ペグ化原核生物PAL変異体の保存寿命(T90)、すなわち、実施例3に記載のアッセイを使用して測定される特定のインビトロ酵素活性が所与の温度、例えば、4℃、25℃、37℃、40℃又は42℃で10%以上低下した時間を少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%又は1000%以上(例えば、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍若しくは10倍以上、又はその任意の範囲内で)増大させることができる。一部の実施態様においては、T90は、4℃で6倍から7倍長く、25℃で4倍から5倍長く、37℃で2倍から3倍長く、42℃で2倍から3倍長く、又はその組合せになる。ある実施態様においては、ペグ化原核生物PAL変異体は、ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sであり、安定化剤はPheである。或いは、安定化剤は、高温での保存に際してペグ化原核生物PAL変異体の酵素活性を維持することができる。すなわち、該変異体は、(例えば、安定化剤が存在しない場合のペグ化原核生物PAL変異体と比較して)25℃、37℃又は40℃で所与の時間、例えば、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、3ヵ月、4ヵ月、6ヵ月、9ヵ月、1年、2年若しくは5年以上、又はその任意の範囲の時間にわたる保存に際して、実施例3に記載のアッセイを使用して測定される特定のインビトロ酵素活性の少なくとも約40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%若しくは99%以上、又はその範囲内の割合を維持する。
【０１６４】
安定化剤としては、L-フェニルアラニン(Phenylalanine)(Phe)、及びtrans-桂皮酸(trans-cinnamic acid)(t-CA)、安息香酸及びチロシン(tyrosine)(Tyr)等のその構造類似体が挙げられる。インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)由来の植物PAL(PvPAL)の活性の損失は、アフィニティー精製後のその基質であるL-フェニルアラニンの除去において示され  (Da Cunha、Eur. J. Biochem. 178:243〜248(1988))、ロドスポリディウム  トルロイデス(Rhodosporidium toruloides)由来の酵母PAL(RtPAL)は、チロシンによりプロテアーゼ不活化から保護されることが示された(Wangらの文献, Mol. Genet. Metab. 86:134-140 (2005); Pilbakらの文献, FEBS J. 273:1004-1019 (2006))。以下に示すように、Phe及び特定のその構造類似体は、AvPALから原核生物PALのPEG:PAL複合体を安定化させる能力がある(実施例11参照)。特定の理論に結び付くことなしに、原核生物PAL酵素は、酵素-基質結合体としてより安定しており、結合基質Pheは、生産物t-CA、又はt-CAの遷移状態類似体に変換されると仮定するものである。t-CAは、そうでなければ高反応性活性部位中心(MIO群)への結合を維持することによって、原核生物PAL酵素を安定化させる。したがって、当該原核生物PAL酵素の基質であるPhe、生産物、t-CA又はその構造類似体を安定化剤として使用することができる。
【０１６５】
また、原核生物PAL変異体及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物であって、医薬として許容し得る担体は、安定化剤を含む医薬組成物を本明細書中で提供する。安定化剤は、Phe又はその構造類似体であり得る。安定化剤をL-フェニルアラニン、trans-桂皮酸及び安息香酸からなる群から選択することができる。安定化剤の例示的な範囲は、原核生物PALの活性部位1モル当たり約0.1から20モルの安定化剤、例えば、原核生物PALの活性部位1モル当たり約0.5から10モルの安定化剤、又は原核生物PALの活性部位1モル当たり約1から10モルの安定化剤である。
【０１６６】
ある実施態様においては、医薬組成物は、原核生物PAL変異体及び医薬として許容し得る担体を含み、原核生物PAL変異体は、野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性及び/又は低減された免疫原性を有し、医薬として許容し得る担体は、安定化剤を含む。ある実施態様においては、安定化剤は、Phe又はその構造類似体である。ある実施態様においては、安定化剤は、L-フェニルアラニン、trans-桂皮酸及び安息香酸からなる群から選択される。
【０１６７】
一部の実施態様においては、医薬組成物は、原核生物PAL変異体及び医薬として許容し得る担体を含み、原核生物PAL変異体はAvPAL変異体であり、AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されており、AvPAL変異体は、ポリエチレングリコールの水溶性ポリマーを更に含み、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比は、1:3であり、医薬として許容し得る担体は、安定化剤を含む。ある実施態様においては、安定化剤は、Phe又はその構造類似体である。ある実施態様においては、安定化剤は、L-フェニルアラニン、trans-桂皮酸及び安息香酸からなる群から選択される。
【０１６８】
医薬として許容し得る担体又は賦形剤は、防腐剤、例えば、細菌、真菌又は原虫などの微生物の増殖を停止又は防止するとともに、ウイルスを破壊する抗菌剤を含み得る。抗菌剤は、細菌を殺す(殺菌)か、又はそれらの増殖を防止する(静菌)することができる。例えば、限定することを目的とせずに、原核生物PAL酵素を細菌汚染から保護し、原核生物PAL酵素の保存寿命を増大させ、原核生物PAL酵素を活性配座に維持し、原核生物PAL酵素活性を高温での保存に際して維持する防腐剤が有用である。
【０１６９】
本明細書中で提供する防腐剤としては、フェノール、及びm-クレゾール等のその構造類似体を挙げることができる。防腐剤、例えばm-クレゾールの例示的な濃度範囲は、約0.1%から1%(w/v)である。一部の実施態様においては、m-クレゾールの範囲は、約0.1%から0.5%(w/v)である。他の実施態様においては、m-クレゾールの範囲は、約0.3%から0.5%(w/v)である。
【０１７０】
本明細書中で提供する安定化剤としては、単独、又は防腐剤と組み合わせて使用される場合は、Phe及びその構造類似体、並びにGly及びその構造類似体が挙げられる。安定化剤、例えばPheの濃度の例示的な範囲は、約0.1から10mMである。ある実施態様においては、Pheの範囲は、約0.5から5mMである。他の実施態様においては、Pheの範囲は、約0.5から1.5mMである。安定化剤、例えばGlyの濃度の例示的な範囲は、約0.1から100mMである。ある実施態様においては、Glyの範囲は、約1から100mMである。他の実施態様においては、Glyの範囲は、約1から20mMである。他の実施態様においては、Glyの範囲は、約20から100mMである。
【０１７１】
ある実施態様においては、医薬組成物は、原核生物PAL変異体及び医薬として許容し得る担体を含み、原核生物PAL変異体は、野生型PALと比較して、高いフェニルアラニン変換活性、及び/又は低減された免疫原性を有し、医薬として許容し得る担体は、少なくとも2つの安定化剤、及び場合により防腐剤(すなわち抗菌剤)を含む。ある実施態様においては、少なくとも2つの安定化剤は、Phe若しくはその構造類似体、及びGly若しくはその構造類似体、又はそれらの任意の組合せである。ある実施態様においては、安定化剤は、Phe及びGlyである。ある実施態様においては、防腐剤は、m-クレゾール又はその構造類似体である。特定の実施態様においては、安定化剤は、Phe及びGlyであり、防腐剤は、m-クレゾールである。
【０１７２】
一部の実施態様においては、医薬組成物又は配合物は、ペグ化AvPAL変異体及び医薬として許容し得る担体を含み、AvPAL変異体とポリエチレングリコールの比は、約1:3(AvPAL:PEG=1:3)であり、AvPAL変異体の位置503及び565のシステイン残基が、セリン残基によって置換されており、医薬として許容し得る担体は、少なくとも2つの安定化剤、及び場合により防腐剤(すなわち抗菌剤)を含む。ある実施態様においては、少なくとも2つの安定化剤は、Phe若しくはその構造類似体、及びGly若しくはその構造類似体、又はそれらの任意の組合せである。ある実施態様においては、安定化剤は、Phe及びGlyである。ある実施態様においては、防腐剤は、m-クレゾール又はその構造類似体である。特定の実施態様においては、安定化剤は、Phe及びGlyであり、防腐剤は、m-クレゾールである。
【０１７３】
本明細書中で用いられているように、原核生物PAL変異体を意図する場合は、「治療有効量」という用語は、患者に利益をもたらす血液、血漿又は血清L-フェニルアラニンの減少を与える量を指す。その量は、個人によって異なり、患者の全体的な身体的状態、食事及び疾患状態を含むいくつかの因子に依存することになる。治療に使用される原核生物PAL変異体の量は、血液、血漿又は血清フェニルアラニンレベルの許容し得る減少を与え、原核生物PAL変異体治療中にこの値を有益なレベル(通常は少なくとも約30%、典型的には10%から50%の範囲)に維持するものである。当該組成物の治療有効量は、公的に入手可能な材料及び手順を使用して、当業者により容易に確認され得る。
【０１７４】
一部の実施態様においては、原核生物PAL変異体、又はその医薬組成物は、野生型PALより低い頻度で投与される。投与頻度は、治療される状態に応じて異なるが、概して毎週約1回である。実際に用いられる投与頻度は、原核生物PAL変異体に対する異なる個人による応答の差異により、本明細書に開示されている頻度と幾分異なり得ることが理解される。「約」という用語は、そのような差異を反映することを意図する。原核生物PAL変異体は、毎週約2回、毎週約1回、2週間に約1回、毎月約1回、又は毎月約1回より長い頻度で投与されることを意図するものである。
【０１７５】
本明細書中で提供する組成物及び方法を使用して、血液、血漿又は血清L-フェニルアラニンレベルを低減することができる。以上に説明したように、最も一般的な血清L-フェニルアラニンレベルは、HPAにより上昇する。本明細書中で提供する組成物及び方法によって治療可能な状態としては、PKUに関連するHPAが挙げられる。チロシン血症に見出されるような血清L-チロシンレベルの上昇をもたらし得る状態も治療可能である。血液、血漿又は血清L-フェニルアラニンレベルの低下が有益である多くの癌関連状態を、本明細書中で提供する原核生物PAL変異体医薬組成物及び方法で治療することができる。
【０１７６】
本明細書中で提供する原核生物PAL変異体医薬組成物は、一部の実施態様においては、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、動脈内又は鞘内の非経口注射によって投与される。しかし、他の送達経路を有効に利用することも可能であることは、当業者に自明である。
【０１７７】
本明細書中に記載の方法は、上記分子を、１以上の医薬として許容し得る賦形剤、ビヒクル、希釈剤、安定化剤、防腐剤(例えば抗菌剤)、可溶化剤、乳化剤、補助剤及び/又は担体、並びに任意で他の治療的及び/又は予防的成分とともに含む原核生物PAL変異体組成物を使用する。そのような賦形剤としては、水、食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノール、シクロデキストリン、改質シクロデキストリン(すなわちスルホブチルエーテルシクロデキストリン)等の液体が挙げられる。非液体配合物に対する好適な賦形剤も当業者に既知である。
【０１７８】
組成物に使用することができる医薬として許容し得る塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩等無機酸塩;並びに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩等の有機酸の塩が挙げられる。医薬として許容し得る賦形剤及び塩についての十分な説明は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第18版(1990、ペンシルバニア州Easton: Mack Publishing Company、1990)から入手可能である。
【０１７９】
また、湿潤剤又は乳化剤などの補助物質、生物学的緩衝物質及び界面活性剤等が、そのようなビヒクルに存在し得る。生物学的緩衝液は、薬理学的に許容し得るとともに、所望のpH、すなわち生理的に許容し得る範囲のpHを有する配合物を与える実質的に任意の溶液であり得る。緩衝液の例としては、食塩水、リン酸緩衝食塩水、Tris緩衝食塩水及びハンク緩衝食塩水等が挙げられる。
【０１８０】
意図する投与方式に応じて、医薬組成物は、正確な投与量の1回の投与に好適な単位剤形などの、例えば、錠剤、坐薬、丸剤、カプセル剤、粉剤、液剤、懸濁液、クリーム剤、軟膏剤又はローション剤などの固体、半固体又は液体の剤形の形態であり得る。組成物は、治療有効量の原核生物PAL変異体を、医薬として許容し得る担体と組み合わせて含み得るのに加えて、他の医薬剤、補助剤、希釈剤、緩衝剤等を場合により含み得る。
【０１８１】
概して、本明細書中で提供する原核生物PAL変異体医薬組成物は、(頬及び舌下を含む)経口投与、直腸投与、鼻投与、局所投与、肺投与、膣投与若しくは(筋肉内、動脈内、鞘内、皮下及び静脈内を含む)非経口投与に好適なものを含む医薬配合物として投与されるか、又は吸飲若しくは吸入による投与に好適な形態で投与されることになる。一部の実施態様においては、組成物は、例えば、苦痛の程度に応じて調整することができる便利な毎日投与治療法を用いて静脈内投与される。
【０１８２】
固体組成物については、従来の無毒性固体担体としては、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース及び炭酸マグネシウムが挙げられる。液体の医薬として投与し得る組成物を、例えば、本明細書中に記載の原核生物PAL変異体組成物及び任意の医薬補助剤を、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール及びエタノール等の賦形剤に溶解や分散させ、これにより溶液または懸濁液を作成することによって調製することができる。望まれる場合は、投与すべき医薬組成物は、湿潤剤若しくは乳化剤、pH緩衝剤及び等張化剤等、例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビトール、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン等の少量の無毒性補助物質をも含み得る。当該剤形を調製する実際的な方法は、既知であるか、又は当業者に明らかになる(例えば、前掲のRemington’s Pharmaceutical Sciences参照)。
【０１８３】
経口投与については、該組成物は、一般に、錠剤、カプセル剤若しくは軟質ゲルカプセル剤の形態をとることになるか、又は水性若しくは非水性溶液剤、懸濁液又はシロップ剤であり得る。錠剤及びカプセル剤を、経口投与形態として使用することができる。経口用途の錠剤及びカプセル剤は、一般に、ラクトース及びトウモロコシデンプンなどの１以上の広く使用される担体を含むことになる。典型的には、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も添加される。懸濁液が使用される場合は、活性剤と乳化剤及び懸濁剤とを組み合わせることができる。望まれる場合は、香料、着色剤及び/又は甘味料を添加することもできる。本明細書中の経口配合物に組み込まれる他の任意の成分としては、防腐剤、懸濁剤及び増粘剤等が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１８４】
非経口配合物を、溶液若しくは懸濁液、注射前の液体での再構成、可溶化若しくは懸濁に好適な固体若しくは凍結乾燥形態、又はエマルジョンとしての従来の形態で調製することができる。一部の実施態様においては、無菌注射懸濁液は、好適な担体、分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、当該技術分野で既知の技術に従って配合される。無菌注射可能配合物は、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒での無菌の注射可能溶液又は懸濁液でもあり得る。採用できる許容し得るビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル液及び等張性塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌の不揮発性油、脂肪エステル又はポリオールが溶媒又は懸濁媒体として従来の方法で採用される。加えて、非経口投与は、一定レベルの投与量を維持するように徐放又は持続放出システムの使用を含み得る。
【０１８５】
本明細書中に記載の原核生物PAL変異体組成物を、フェニルケトン尿症を含む高フェニルアラニン血症、及び癌を含む他の障害を含む様々な疾患を治療するのに治療有効量で患者に投与することができる。そのような原核生物PAL変異体組成物の毒性及び治療有効性を、例えば、LD50(母集団の50%までの致死投与量)及びED50(母集団の50%の治療有効用量)を測定することなどの細胞培養物、又は実験動物における標準的な薬学的方法によって測定することができる。毒性と治療効果の間の投与量の比は、治療指数であり、それを比LD50/ED50として表すことができる。高い治療指数を示す原核生物PAL変異体組成物を使用することができる。
【０１８６】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用のための一連の投与量を公式化するのに使用することができる。投与量は、毒性がほとんどないか、又は最小限のED50を含む一連の血中濃度以内であり得る。該投与量は、採用される剤形、及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。治療有効投与量又は治療有効量を、細胞培養アッセイ及び動物モデルから測定することができる。
【０１８７】
(食事性タンパク質)
HPA/PKU患者への原核生物PAL変異体組成物の投与に加えて、一部の実施態様においては、患者の食事性タンパク質を制限又は変更できることも意図される。当業者は、PKUの治療に使用される様々な市販のタンパク質配合物を認識している。そのような配合物としては、MAXIMAID、PHENEX 1、PHENEX 2(Ross Laboratories社(英国Liverpool)及びLOFENALAC、PHENYL-FREE(Mead-Johnson社)等が挙げられる。
【０１８８】
当業者は、一般に、Phe濃度が存在しない参照されたタンパク質配合物を使用することができる。該タンパク質配合物は、PKU患者が不足しているアミノ酸がしばしば補給されている。そのようなアミノ酸としては、例えば、L-チロシン及びL-グルタミンが挙げられる。PKU患者の食事にバリン、イソロイシン及びロイシンを補給することが望ましいことが示唆されている(米国特許第4,252,822号)。特定の臨床的症状において、PKUの毒性効果は、チロシン及びトリプトファンなどの他のアミノ酸の脳摂取を阻止するPheによって引き起こされる。PKU患者の食事に過剰のそのような大きな中性アミノ酸を補給すると、脳へのPhe摂取が阻止され、脳のPheレベルが低下することが見出された。したがって、本明細書中で提供する方法では、食事療法に、これらのアミノ酸の1種以上を含む組成物を更に補給できることを意図するものである(Kochらの文献、Mol.Genet. Metabol.79:110-113(2003))。
【０１８９】
更に、通常、ヒトの乳及び動物起源の他の食物に見出されるL-カルニチン及びタウリンも、タンパク質制限に加えて、補給されるべきであることが知られる。一部の実施態様においては、通常ヒトの乳及び動物起源の食品に見出されるこれらの因子の量の供給を助けるために、L-カルニチンを、タンパク質補給100g当たり20mgで補給することができ、タウリンを、タンパク質補給100g当たり40mgで補給することができる。
【０１９０】
加えて、当業者は、食事性タンパク質制限にかかわらず、他の補給物が提供されるように患者に補給されるべきである必須ビタミン及びミネラルなどの他の成分について、2000年全米科学アカデミー全米研究評議会の食事摂取基準(2000 National Academy of Sciences-National Research Council Dietary Reference Intakes)を参照する。
【０１９１】
全タンパク質量及び所望の血漿Phe濃度に関する上記説明については、当業者は、必要とされる食事性タンパク質制限の量を決定し、それに応じて患者の食事を調整することができる。例えば、約11〜14歳の男性を例にとると、個人は、毎日45gのタンパク質を摂取する必要がある。その個人が、重度の古典的PKUを有する個人である場合は、その無制限の血漿Phe濃度は、1200μMを超える可能性が高く、その個人の食事性タンパク質源のすべてでなくとも大半が、その血漿Phe濃度を600μMまで低下させることができる粉末状タンパク質補給物によるものである可能性が高い。原核生物PAL変異体をその被験者に投与することによって、治療成果は、患者の血漿Phe濃度のより大きな減少をもたらすものになるか、或いは、治療成果は、個人の血漿Phe濃度が同様の程度まで低下するが、その個人が、食事性配合物でなく通常の食事からのタンパク質を許容することが可能になるものである。
【０１９２】
同様に、中度PKUを有する約11〜14歳の男性については、本明細書中で提供する方法を使用して、制限配合物でなく通常のタンパク質摂取を通じて、割り当てられた毎日45gのタンパク質を与えることが可能であり得る。本明細書中で提供する方法が有効であるかどうかを判断することは、患者の血漿Phe濃度を定期的に測定して、血漿Phe濃度が少なくとも400μM未満に維持されていることを確認することを含む。そのような濃度を測定するための試験を以下に記載する。ある実施態様においては、360μM未満又は約360μMの濃度が達成される。
【０１９３】
[3.患者集団の特定及び監視]
本明細書中に記載されているように、所与の患者が、原核生物PAL変異体治療に応答性があるかどうかを判断すること、並びに治療されるPKU患者のクラスを特定するために最初に患者のフェニルアラニン濃度を測定するとともに、療法の有効性を監視するために治療法の進行を通じて患者のフェニルアラニン濃度を測定する必要があり得る。そのような例示的方法を以下に記載する。
【０１９４】
(BH4装薬試験)
BH4装薬試験は、BH4の不足又はPAHの欠乏によりHPAを有する患者間の識別を可能にする。
【０１９５】
最も単純なBH4装薬試験は、外来性のBH4を投与し、血漿Phe濃度の低下に対する投与の影響を確認するものである。最初に、Danksらの文献、Lancet 1:1236(1976)によって2mg/kgのBH4の静脈装薬が提案された。より純度の高いBH4が入手できるようになったため、体重1kg当たり約2.5mgの量のBH4の経口投与を使用して試験を実施することが可能になった。究極的には、7.5mg/kgの1回経口投与量のBH4を投与する標準化された手法がNiederwiserらによって提案されたが(Niederwieserらの文献、Eur. J. Pediatr. 138:441(1982))、いくつかの研究所は、さらにより多い体重1kg当たり20mgのBH4を使用している。
【０１９６】
単純なBH4装薬試験が、信頼性のある結果をもたらすためには、患者の血液Pheレベルは、400μMを上回る必要がある。したがって、その装薬試験を実施する前の2日間にわたって患者をPKU食から外すことが慣例になっていることが多い。BH4試験キットは、Dr. Schircks Laboratories社(スイスJona)から入手可能であり、販売されている。このキットは、通常の食事の摂取の約30分後における体重1kg当たり20mgのBH4の投与量を推奨している。
【０１９７】
(Phe濃度の測定)
血液中のPheの存在を確認するための多くの方法がある(例えば、Shawらの論文、「フェニルケトン尿症-臨床生化学における分析方法(Analytical Methods in Phenylketonuria-Clinical Biochemistry)」、In Bickettら編、「フェニルケトン尿症及びアミノ酸代謝のいくつかの他の先天性異常(Phenylketonuria and Some Other Inborn Errors of Amino Acid Metabolism)」、Stuttgart、Georg Thiem Verlag、47〜56(1971)参照)。典型的には、フェニルアラニン及びチロシン濃度は、蛍光アッセイを使用して患者の血清から測定される。このアッセイは、フェニルアラニンがロイシルアラニンの存在下でニンヒドリンとともに加熱されたときの蛍光物質の形成に依存する(McCamanらの文献、J. Lab. Clin. Med. 59:885〜890(1962))。
【０１９８】
Phe濃度を測定するための最も一般的な方法は、患者からの血液試料で飽和されたフィルター紙から円板をくり抜くガスリー試験である。枯草菌(Bacillus subtilis)が接種され、枯草菌の増殖の特異的インヒビターを含む寒天のトレーにて均一な円板をインキュベートする。フェニルアラニンが均一な円板から寒天上に移ると、Pheが、細菌の増殖の阻害を逆転させることにより、細菌の増殖した領域が生じる。これを、既知の量のPheを含む円板を使用して実施された同様のアッセイとの比較によってフェニルアラニン濃度と関連づけることができる。
【０１９９】
Phe濃度を定量する他の方法としては、HPLC、質量分析及び薄層クロマトグラフィー等が挙げられる。そのような方法を使用して、治療前の患者の血漿Phe濃度を測定するとともに、投薬治療中のPhe濃度を監視して、その有効性を判断することができる。
【０２００】
患者の血漿Pheレベルは、投薬治療の時間経過全体を通じて便利な間隔で(例えば、毎日、一日おき又は毎週)監視されることを意図するものである。そのような規則性で血漿Pheレベルを監視することによって、臨床家は、治療の有効性を評価し、それに応じて原核生物PAL変異体及び/又は食事性タンパク質必要量を調整することが可能となる。
【０２０１】
[4.併用療法]
本明細書中で提供する方法の一部の実施態様においては、様々な形態のHPAを有する患者において治療成果をもたらすために、原核生物PAL変異体と食事性タンパク質制限とが併用される。本明細書中で意図される併用療法において適切な治療成果を達成するために、一般には、所望の治療成果(すなわち、血漿Phe濃度の低下、及び/又は血漿Phe濃度の同時発生的な増加をもたらすことなくより多量のPhe/タンパク質摂取を許容する能力)をもたらすのに有効な組合せ量で原核生物PAL変異体組成物と食事制限を患者に投与することになる。この方法は、原核生物PAL変異体組成物と食事性タンパク質治療組成物を同時に投与することを含み得る。これを、食事性タンパク質必要量のすべてを含むとともに、薬理的タンパク質配合物中に原核生物PAL変異体を含む単一の組成物又は薬理的タンパク質配合物を投与することによって達成することができる。或いは、食事性タンパク質(補給物又は通常のタンパク質食)を原核生物PAL変異体の薬理的配合物(錠剤、注射又は飲料)とほぼ同時に摂取する。原核生物PAL変異体をプロテインバー、又は消化に好適なブラウニー、パンケーキ、ケーキなどの他の食物に配合することもできる。
【０２０２】
他の代替においては、原核生物PAL変異体治療は、数分から数時間の範囲の間隔で、食事性タンパク質治療に先行又は後続し得る。タンパク質及び原核生物PAL変異体組成物を別々に投与する実施態様においては、一般に、原核生物PAL変異体が依然として患者に有利な影響を及ぼすことが可能になるように、有意な時間が各送達間で終了しないようにする。そのような場合において、ある実施態様においては約1時間程度のみの遅延時間で、食事性タンパク質摂取の約2〜6時間前又は後以内に原核生物PAL変異体を投与することを意図するものである。一部の実施態様においては、原核生物PAL変異体治療は、日投与量の原核生物PAL変異体を無期限に患者に投与する連続治療であることが意図される。他の状況、例えば、単により軽度のPKU及びHPAの形態を有する妊婦においては、女性が妊娠及び/又は授乳する期間だけ原核生物PAL変異体治療が継続されることもある。
【０２０３】
更に、原核生物PAL変異体及び食事性タンパク調節の送達のみに基づく治療に加えて、本明細書中で提供される方法は、HPAの１以上の症候を特に標的とする第3の組成物を用いた併用療法をも意図するものである。例えば、HPAによって引き起こされるチロシンの不足は、神経伝達物質ドーパミン及びセロトロンの欠乏をもたらすことが公知である。したがって、原核生物PAL変異体及び食事性タンパク質を使用した方法を、L-ドーパ、カルビドーパ及び5-ヒドロキシトリプトファン神経伝達物質の投与と更に組み合わせて、食事におけるチロシンの量の減少に起因する欠点を補正することが可能であることを意図するものである。
【０２０４】
原核生物PAL変異体の投与が(PAHの投与とは異なり)チロシンを生成しないため、そのような治療では、チロシンは、そのような患者にとって必須アミノ酸のままである。したがって、チロシンの食事性補給は、BH4治療と組み合わせて原核生物PAL変異体が与えられる患者にとって望ましいことがある。
【０２０５】
[E.原核生物PAL変異体の製造]
また、原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体を製造する方法を本明細書中で提供する。1つの例示的な実施態様においては、N末端標識(例えばオクタヒスチジル標識)を有する又は有しないで、IPTG(イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)等の誘導プロモーターを用いて、ベクター、例えばpIBX1(Suらの文献, Appl. Environ. Microbiol. 62:2723-2734 (1996))、又はpET28a(Invitrogen社)において、大腸菌BLR(DE3)/pLysS(Novagen社)、又は大腸菌BL21(DE3)/pLysS(Invitrogen社製)細胞において、組換え原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体が過剰発現される。バイオリアクター/発酵槽のための種培養物を、グリセロールストックから振盪フラスコにて増殖させる。その後、そのような種培養物を、供給バッチモードに制御されたバイオリアクターへ導入する。グルコースを補充し、pHを塩基(NH4OH)で調整し、1200rpm以下で攪拌する。O2供給は、20%より高くなるように溶存酸素を維持する。当該細胞を、37℃の温度で、70〜100のOD600になるまで(約22〜25時間)増殖させ、その後、0.4mM IPTGで誘導する。温度を30℃まで低下させ、0.1 IU/mLより低くなるまで(約40〜48時間、及び一般に200のOD600)増殖させる。細胞培養培地は、一般に、酵母エキスタンパク質、ペプトン-トリプトン、グルコース、グリセロール、カザミノ酸、トレース塩類及びリン酸緩衝塩類と定義され、これらから構成される。組換え原核生物PAL生産物、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体は、細胞内で生産され、分泌されない。細菌は、連続遠心分離(αLaval, Carr, Ceba、又はこれらの等価物)により回収される。この例示的なプロトコルの他の変型が、当業者に明らかになるであろう。
【０２０６】
[F.原核生物PAL変異体の精製]
また、原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体を精製する方法を本明細書中で提供する。例示的な第1の実施態様によれば、形質転換された細胞群を増殖させ、残りの粗組換え酵素は破壊される。異物は、カラムの汚損を防止するために、通常粗バルクから分離される。クロマトグラフィー精製は、1又はいくつかのクロマトグラフィー樹脂を用いて行われる。次いで、精製されたタンパク質は、長期間にわたって安定した活性を提供するよう設計された緩衝液で調製される。他の実施態様においては、原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体の精製方法は、(a)圧力ホモジナイザー(但し、ガラスビーズ溶解などの他の物理的手段も可)を用いて、組換え原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体を含む細菌を溶解させること;(b)熱処理を行うこと;(c)第二の連続遠心分離ステップ及び/又は(Cuono Zeta Plus、Maximizer、Pall Filtron、Millipore Millistak、又はOpticao filtersを用いた)深層ろ過を使用してこの溶解物を浄化すること;(d)(Millipore Millistak 40ACを用いた)炭ろ過ステップを施すこと;(e)(１以上の深層フィルター、例えば、Pall EKSP、Pall KS50P及び/又はPall EKMPフィルターを用いた)中間深層ろ過ステップを施した後、(Sartorious Sartopore又はPall EDF0.2μmフィルターを用いた)最終ろ過ステップを施すこと;(f)(Tosoh Biosciences社のToyopearl Butyl 650Mなどの)ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーに通すこと;(g)Qイオン交換カラムに通すこと(Bio Rad社のMacroprep High Qなどの）;及び(h)場合により(Sartorious Hydrosart又はPES 30 kDa膜などによる)タンジェンシャルフローろ過を用いた緩衝液交換によって最終生産物を回収することを含む。当業者は、クロマトグラフィーステップ若しくはろ過ステップの１以上を省略若しくは置き換えることができること、又はクロマトグラフィーステップの順序を変更できることを容易に理解する。最後に、要望に応じて適切な滅菌ステップを実施することができる。
【０２０７】
さて、本発明について概説してきたが、それは次の実施例を参照して、より容易に理解することができる。実施例は、説明目的のためだけに提示されるものであり、決して、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。用いた数値(例えば、量、温度等)に関しては、正確性を担保するように努力をしたが、いくらかの実験誤差又は偏差は、当然のことながら許容されるべきである。
【実施例】
【０２０８】
［実施例１  ノストック パンクチフォルメ及びアナベナ バリアビリスPALのクローニング］
（DNA操作）
ノストック パンクチフォルメのゲノムDNAをATCC(29133D)から入手した。また、PAL遺伝子(ZP_00105927)を、プライマー
【化１】
2013518893.tif 000004
からPCR増幅した。得られたPCR産物をNdeI及びNotIで消化した。また、1.7kbのフラグメントを、N−His標識化及び非標識のためのpET−28a(+)及びpET−30a(+)（Novagen社製）にそれぞれライゲーションした。
【０２０９】
アナベナ バリアビリスの細胞をATCC(29413)から入手した。ゲノムDNAを抽出し(Qiagen社製)、PAL遺伝子(YP_324488)を、NheI部位を除去するために、SOE−PCRで増幅した。プライマー１
【化２】
2013518893.tif 000005
及びプライマー２
【化３】
2013518893.tif 000006
を用いて、ヌクレオチド1−1190を増幅した。また、プライマー３
【化４】
2013518893.tif 000007
及びプライマー４
【化５】
2013518893.tif 000008
を用いて、ヌクレオチド1142−1771を増幅した。これらの2つのPCR産物を組み合わせて、プライマー１及び４を有する完全長遺伝子を増幅した。得られたPCR産物をNheIで消化し、Klenow(NEB)で鈍化した後、NotIで消化した。1.7kbのフラグメントをpET−28a(+)及びpET−30a(+)（Novagen社製）にライゲーションした。このプラスミドを3p86−23と命名した。
【０２１０】
また、AvPAL遺伝子を、pIBX1［Suらの文献, Appl. Environ. Microbiol. 62:2723-2734 (1996)］から誘導されたベクターpIBX7［Tkalecらの文献, Appl. Environ. Microbiol. 66:29-35 (2000)］でクローン化した（実施例7参照）。
【０２１１】
（細菌株及び培養条件）
ノストック パンクチフォルメPAL(NpPAL)、大腸菌BL21(DE3)細胞（Stratagene社製）をpGro7（Takara社製）で形質転換した。また、適切なBL21(DE3)pGro7細胞をInoue法［Sambrook及びRussellの文献, 「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」, 第３版 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001)］により調製した。これらの細胞を、pET−28−NpPALで形質転換し、50mg/Lカナマイシン及び20mg/Lクロラムフェニコール添加25mL LB培地において、37℃で一晩培養した。20mLのこの培養物を、カナマイシン、クロラムフェニコール、及び500mg/L L−アラビノース添加１L LB培地に播き、37℃で増殖させた。0.6のOD600で、当該培養物を氷で冷却した。５分後、当該培養物を0.3mM IPTGで誘導し、20℃で16時間増殖させた。細胞を遠心分離により回収した。
【０２１２】
BL21(DE3)pLysS細胞（Stratagene社製）をAvPALで形質転換し、アラビノース誘導をすることなしに、NpPALと同様に培養した。
【０２１３】
pIBX7ベクターでクローン化されたAvPAL（実施例7参照）を、BLR(DE3)/pLysS（Novagen社製）細胞に形質転換することで導入し、50mg/L カナマイシン添加25mL LBにおいて、一晩37℃で培養した。20mLのこの培養物を、カナマイシン添加１L LB培地に播き、37℃で増殖させた。0.6のOD600で、当該培養物を氷で冷却した。５分後、当該培養物を0.3mM IPTGで誘導し、30℃で16時間増殖させた。細胞を遠心分離により回収した。
【０２１４】
［実施例２  NpPAL及びAvPALの精製］
培養物を卓上型遠心分離機(bench-top centrifuge)において、5,000gで20分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞のペレットを、更なる処理に先駆けて、概して、-70℃で凍結した。解凍において、当該細胞のペレットを、TBS(25mM Tris, 150mM NaCl, pH7.8)中で約80光学濃度ユニット(600nm)に懸濁した。細胞を、APV圧力ホモジナイザーに12〜14,000psiで２回通過させて溶解した。次いで、粗溶解物を55℃で2時間加熱処理した。当該溶解物を10,000gで30分間遠心分離し、上清を保存し、0.2μm真空フィルター（コーニング社製）でろ過した。
【０２１５】
PALを、butyl 650Mカラム（Tosoh BioSciences社製）及びMacroPrep High Qカラム（BioRad社製）に連続的に通して、浄化された溶解物から精製した。溶出生産物は、SDS−PAGE及び逆相HPLCにより高純度を示した。
【０２１６】
［実施例３  ペグ化PAL変異体の生成］
ロドスポリディウム トルロイデス由来のPAL(RtPAL)のペグ化の方法を以下に説明する。原核生物PAL［例えば、NpPAL又は、AvPAL］のペグ化に用いられる同様の方法が、実施例6に記載されている。
【０２１７】
（タンパク質のペグ化）
ペグ化は、文献の方法［Hershfieldらの文献, (1991), 前述の箇所; U.S. Patent No. 6,057,292; Luらの文献, Biochemistry 40(44):13288-13301 (2001); Nektar Therapeutics, 2003 catalog］の改良を用いる。活性化PEGは、線状PEGスクシンイミジルスクシナート（mPEG-SPA、分子量５kDa又は分子量20kDa）及び分岐PEGヒドロスクシンイミド（mPEG2−NHSエステル、分子量10kDa又は分子量40kDa）を含む。両者は、メトキシ基で一端が覆われており、Nektar Therapeutics社から市販されている。また、最適ペグ化タンパク質の試験的測定が一般に求められている［Veroneseらの文献, J. Bioactive Compatible Polymers 12:196-207 (1997)］。最適ペグ化条件は、様々なPAL:PEG比（タンパク質単量体当たりのリジンの数に沿ったタンパク質のモル比を考慮する）、様々なpH、様々な緩衝液、様々な温度、及びインキュベーション時間を用いて決定される。野生型PALは、リジンの数が多く［それぞれ、ロドスポリディウム トルロイデス(Rt)及びアナベナ バリアビリス単量体当たり29及び18］、非変性PALは、マウスでの反復注射に対し免疫反応性を示し、裸の野生型PALは、プロテアーゼへの暴露で急速に不活性化されるので、高いPALタンパク質：PEG誘導体化の比が必要である。ペグ化反応は、-20℃で凍結することで停止され、試料は、SDS−PAGE、MALDI−TOF質量分析、活性評価、タンパク質分解感受性、及び免疫反応性により分析される。
【０２１８】
活性、タンパク質分解、及び免疫評価に先駆けて、過剰な未反応PEGを除去するために、反応を、0.05Mリン酸カリウム緩衝液(pH8.5)に対して、Tube−O−Dialyzer（GenoTechnology社製）を用いて攪拌して４℃で一晩透析する。NIタンパク質分析キット（GenoTechnology社製）を用いてタンパク質濃度を測定した後、前述したとおり、標準反応条件で未誘導体化及びPEG誘導体化PAL試料のPAL活性測定を行う。インビトロの特性評価に続いて、PKUマウスモデルを用いて、最も有望なペグ化治療候補物でインビボ試験を行う。
【０２１９】
（特性評価）
非変性タンパク質試料及びペグ化タンパク質試料において、280nmのPAL吸光係数（RtPAL及びAvPALにおいてそれぞれ、0.5及び0.75mg mL-1cm-1）を用いて、タンパク質濃度を測定した。また、当該濃度は、正確なタンパク質濃度の測定を妨害し得る非タンパク質汚染物質を除去する試料処理を含む、NIタンパク質分析キット（GenoTechnology社製）を用いて算出される。
【０２２０】
PEG-PAL生産物をMALDI-TOF MSで特性評価して、各PALモノマーに結合されたPEG分子の数を測定するとともに、活性評価及びSDS-PAGE及び原生ゲル分析を用いて特性評価して、それぞれ活性が保持されていること、完全に誘導体化されていること、及び四量体PAL形成の欠損がないことを確認する。PAL及びPEG-PAL試料については、MALDI-TOF質量測定分析は、サブユニット解離及び種の検出の再現性を向上させるために、0.5Mの尿素又は0.025Mのグアニジン-HClを必要とする。
【０２２１】
部位特異的ペグ化(LC/ESI−MSD)、及びペグ化の前後に遊離アミン滴定を決定するトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を決定するために、ペプチドマッピング法によってPEG−PAL生産物の特性評価をする。ペプチドマッピング法は、リジンで終端となる多数のトリプシンペプチドで、ペグ化の相対的な占有率を測定するが、サイズ及び多数の隣接したリジントリプシンペプチドにより、この方法を用いて、すべての部位を視覚化することはできない。TNBS分析は、より正確に酵素のモル当たりのPEG分子の平均数を決定するが、どの部位がペグ化されるかに関する情報を提供するものではない。このような理由で、両分析を用いて相互に補完した。PEGによるPAL生産物の誘導体化の割合の大体の見積もりは、SDS−PAGE及び天然ゲル解析によって推定することが可能である。ペグ化前後の比活性を評価し、四量体のPAL構造の損失がないことを証明するために、酵素分析を用いる。
【０２２２】
（PAL活性分析）
動力学的モードのCary UV分光光度計(Cary 50)を用いて、PALの活性分析を行う。290nmでの吸光度の増加によってモニターされたtrans−桂皮酸の生成を測定することにより［Hodginsの文献, (1968), 前述の箇所］、L−フェニルアラニン基質でのPALの活性を室温(25℃)で評価した。290nmのtrans−桂皮酸のモル吸光係数は、10,238リットルM-1cm-1である。反応混合物は、100mM Tris−HCl緩衝液(pH8.5)中22.5mMのフェニルアラニンを含んでいた。標準測定においては、最終酵素濃度が0.0035mg/mLであるが、動力学的試験においては、分析での酵素濃度は、分当たりの290nmでの勾配が0.005〜0.02の範囲にあるように、調節される。活性データは比活性(μmol×min-1mg-1)で表される。１ユニットのPALは、室温で分当たり１μモルのtrans−桂皮酸を生成する酵素量と定義される。
【０２２３】
[実施例４  インビトロ半減期及び免疫原性の試験]
生化学的特性評価の後、最も有望なPEG−PAL候補物を、３つの異なる補足的方法（ウェスタンブロット、ELISA及び免疫沈降(IP)）を用いて、野生型PAL（ペグ化されていない）を注入したPKUマウスにより産生された抗体に対する免疫反応性のスクリーニングを行った。
【０２２４】
ウェスタンブロット分析においては、PAL抗血清（野生型PALを注入したマウスからの)を１:10,000の希釈で用いる。また、陰性対照として、緩衝液で処置されたマウスからの血清も同様の希釈で用いる。二次抗体である、アルカリホスファターゼを結合したヤギ抗マウスIgG（Promega社製）を１:5,000に希釈し、AP基質ウェスタンブルー（Promega社製）を用いて着色した。Nunc/Immuno Maxisorpプレート（Nalge Nunc International社製）を用いて、次いで、リン酸緩衝液中１mg/mLのPALを用い、リン酸緩衝液、0.05％ Tween 20、2％ BSAでブロキングをする標準操作により、ELISA試験を行った。マウス抗血清（野生型PAL暴露マウス）をEBブロック溶液（リン酸緩衝液、0.05％ Tween 20、2％ BSA）で１:10,000に希釈し、HRPヤギ抗マウスIgGを、450nmで検出するのに用いられるTMBと共に、二次抗体として用いる。
【０２２５】
免疫沈降をPAL抗体結合試験に用いる。タンパク質試料（PAL又はペグ化PAL）をTTBS緩衝液（0.1％ Tween添加Tris緩衝食塩水）中でインキュベートし、抗体試料添加前のPAL活性を測定する。免疫性がないマウス血清を用いて、それぞれの試料を、陽性対照の抗PAL血清の8倍超で、及び、複製陰性対照反応でインキュベートした。インキュベーション後、ビーズのマウスIgG結合能を考慮して、プロテインGセファロース４(50%, v/v)を過剰に添加し、再度試料を４℃で一晩、回転しながらインキュベートする。遠心分離により上清を回収し、それぞれの試料のPAL活性を当該上清で分析する。ウェスタンブロットによる更なる解析を行えるよう、ビーズペレットは廃棄しない。抗体−ビーズ結合が生じるか確認するために、ウェスタンブロットを用いてビーズのPAL抗原を検出する。PAL結合ステップの後に遠心分離により回収されたビーズを、TTBS及びTBS緩衝液で数回洗浄した。これらの洗浄に続き、SDS−PAGEローディングバッファーをビーズに添加し、試料を95℃で５分間加熱する。その後、PAL抗血清を用いてウェスタンブロットにより試料を分析する。弱い抗体結合を示す酵素変異体は、ウェスタンブロットで検出されたペレット化ビーズ画分で対応する小さなPALを有しており、高い抗体結合を示す野生型の非変性PALと比較して、上清に高い活性が残存することを示した。
【０２２６】
［実施例５  プロテアーゼ感受性試験］
ロドスポリディウム トルロイデス由来の野生型PALに関するプロテアーゼマッピング試験では、タンパク質分解感受性の主要部位が示された。そのような部位の除去は、タンパク質分解感受性を低減させ又は除去させ、有用なPKU酵素基質の開発に寄与することができる。しかしながら、タンパク質分解感受性のそのような部位の除去により、酵素活性が低減又は失活し得る。
【０２２７】
タンパク質工学により、活性を保持する改良されたPAL（及びPEG−PAL）突然変異体を作製した後、トリプシン／キモトリプシンプロテアーゼ反応混液でのインキュベーションを用いるプロテアーゼ耐性のクリーニング、およびそれに続く活性の保持（OD290測定による）及び低減されたタンパク質分解（PAGEゲル分析による）のモニタリングにより、インビボ試験で用いるための、適切なインビトロ特性を有する突然変異体の同定が可能となる。
【０２２８】
腸内環境に近く、2.3mMトリプシン、3.5mMキモトリプシン、3.05mMカルボキシペプチダーゼA、及び3.65mM カルボキシペプチダーゼBを含むプロテアーゼ反応混液でのインキュベーションによりタンパク質分解の安定性を評価する。タンパク質分解試験は、酵素によるインキュベーション、つまり、試験される様々なタンパク質変異体（ペグ化された又はペグ化されていない、若しくは他の化学修飾による原生又は突然変異タンパク質）の、プロテアーゼ暴露後の活性保持及び安定性保持の時間的経過を含む、タンパク質分解感受性の程度を測定するためのPAL溶液へのプロテアーゼの添加を含む。SDS−PAGE及びMALDI−TOF質量分析マッピング試験を用いて、プロテアーゼ感受性部位の位置を決定した［Kriwacki, R.W.らの文献, J. Biomol. Tech. 9(3):5-15 (1980)］。これらのマッピング結果は、プロテアーゼ感受性の主要部位（既に同定されている2つの主要部位等）を決定するのに重要であり、すべての主要な感受性部位は、ペグ化の保護、及び／又は、PALアーキテクチャーから感受性領域を除去及び／又は保護する突然変異体を用いて除去することができた。
【０２２９】
［実施例６  ペグ化NpPAL及びAvPALの生成］
一般に、NpPAL及びAvPALのペグ化は、タンパク質とSUNBRIGHT ME−200HS 20kDa NHS活性化PEG(NOF)を混合することを含むものである。
【０２３０】
ペグ化のプロトコールである、NHS活性化20kDa線状PEGを用いる標準"HC"方法は、次のとおりである。
【０２３１】
1)タンパク質をエンドトキシンの存在に関して評価した。
タンパク質溶液(0.1mL)を0.9mLの新鮮なMQ水で希釈し、0.5EU/mLの感受性レベルでエンドトキシンに関して携帯型のCharles River社の装置(EndoPTS)で試験した。エンドトキシンが0.5EU/mLより高い場合、エンドトキシンをMustang Eろ過で最初に、次いで、Sterogene Etox樹脂で、又は更にクロマトグラフィー精製により低減させた。低減は制限されるが、pH7.8でDEAE FF（Amersham社製）に通すことで十分に有用であった。
【０２３２】
2)タンパク質の濃縮及び緩衝液交換
タンパク質を25mg/mLより高く75mg/mL以下に濃縮し、50mM KPO4(pH8.5)に緩衝液交換した。スピンフィルターを用いてこの濃縮物を調製する場合、最初に、当該フィルターを、緩衝液単独で、低減された速度と時間で（3000rpm、３分）回転することでエンドトキシンに関して試験をし、次いで、ステップ1)のタンパク質と同様の方法で、エンドトキシンに関して保持された緩衝液を試験した。50mM KPO4(pH8.5)の緩衝液バッチの履歴／配合は、水（1/4〜１L）、リン酸ニカリウム（48.75mM、8.4913g/l）、及びリン酸一カリウム(1.25mM、0.17011g/L)であった。溶液を0.2μmフィルターでろ過し、室温で保存した。濃縮生産物をMustang Eフィルターアクロディスクでゆっくりろ過した（１〜２mL／分）。滅菌TBS(pH7.5)で希釈及びブランクとされた試料のタンパク質濃度をA280で測定した。吸光係数は、NpPALで0.83、AvPALで0.75であった。
【０２３３】
3)NpPAL及びAvPALのペグ化
通常-80℃で保存されるPEGを室温になるまで加温した。KPO4緩衝液をPEGに加え、大きな塊がすべて懸濁されるために、最大速度で攪拌すること、及び、試験管を手で激しく振盪することで再懸濁した。代替として、PEGをpH〜5の水中に再懸濁した。最初に湿らせたPEGのあるよく懸濁されたPEG溶液に、タンパク質を１分以内に加え、非常に穏やかな転移によって混合した。アルミニウムホイルで包まれた試験管を選鉱機の軸に載置し、室温で3時間、非常に穏やかに振動させた。当該試験管をTBS(pH7.5)で充填し、ろ過滅菌した。懸濁液をすぐに配合し、或いは、配合されるまで４℃で保存した。
【０２３４】
4)配合
配合緩衝液の配合／バッチの履歴は、水（1/4〜１L）、Tris系(3.2mM)、Tris−HCl(16.8mM)及び塩化ナトリウムからなり；緩衝溶液を0.2μmフィルターでろ過し、室温で保存した。当該緩衝溶液を、100MWCO再生化セルロース膜で、Vivaflow 50（小さなロット）又はVivafiow 200（大きなロット）を用いてタンジェンシャルフローろ過にかけた。当該溶液を、MQ水、0.1N NaOH及び200mLの水で再度フラッシングした。当該溶液を50mL／分の直交流でTBS(pH7.5)により平衡化した。透過液のpHを7.5となるようにした。
【０２３５】
当該溶液を最初にTBSで約３倍に希釈して緩衝液交換し、少なくとも4時間で元の容積に戻した。直交流は、概して、Vivaflow 50及び200で180〜200mL／分であった。
【０２３６】
最終生産物をMustang Eでろ過した。エンドトキシンの存在は、1.9mLの無菌新鮮水で0.1mLに希釈した後に評価した。エンドトキシンが１EU/mLより高い場合、Sterogene Etoxゲルで低減した。配合された無菌ペグ化NpPAL又はAvPALをバイアルで密封し、-70℃でインビボ試験に供するまで保存した。
【０２３７】
［実施例７  AvPAL変異体（システイン変異体）の生成］
細菌で発現され組換えタンパク質に生じる凝集を低減させるために、AvPALポリペプチドにおいてアミノ酸置換を行った。タンパク質凝集は、酵素活性を低減させ、及び／又は、インビボでの免疫原性を増加させ得る。凝集のそのような形成の１つは、鎖間ジスルフィド結合の形成の結果として生じる。このような可能性を最小限にするために、様々なAvPALのシステイン残基を単独で、或いは組み合わせて、セリン残基と置換した。
【０２３８】
AvPALポリペプチドは、位置64、235、318、424、503及び565の、６個のシステイン残基を有していた（配列番号４）。次のAvPAL単一システイン突然変異体を生成した：AvPAL_C64S（配列番号７）、AvPAL_C318S（配列番号８）、AvPAL_C503S（配列番号９）、及びAvPAL_C565S（配列番号10）。また、AvPAL二重システイン突然変異体である、AvPAL_S565SC503S（配列番号11）も生成した。図5A〜5Eは、これらのAvPALシステイン突然変異体のアミノ酸配列を示す。
【０２３９】
（クローニング）
フォワードプライマーAvarPALfor
【化６】
2013518893.tif 000009
及び、リバースプライマーAvarPALrev
【化７】
2013518893.tif 000010
を有する、アナベナ バリアビリスゲノムDNA（ATCC 29413-U、Qiagen DNeasyキット）からAvPAL遺伝子を増幅した。得られたPCR産物をTaqで処理した後、pCR2.1 TOPO TA（Invitrogen社製）にライゲーションした。得られたプラスミドを1p40と命名した。
【０２４０】
5'NheIサイトを加え、内部NheIサイトをSOE−PCRで除去した。上流AvPALフラグメントをフォワードプライマーN−Nhe−AvPAL
【化８】
2013518893.tif 000011
及び、リバースプライマーNhe−AvPALrev
【化９】
2013518893.tif 000012
を有する1p40から増幅した。また、下流AvPALフラグメントをフォワードプライマーNhe−AvPALfor
【化１０】
2013518893.tif 000013
及び、リバースプライマーAvPALrev−r
【化１１】
2013518893.tif 000014
を有する1p40から増幅した。１回のPCR反応において、2つのPCR産物をDNAポリメラーゼでアニール化し増長して、完全長のAvPAL遺伝子を生産した後、プライマーN−Nhe−AvPAL及びAvPALrev−rで増幅した。得られたPCR産物をNheIで消化し、Klenowで鈍化し、NotIで消化し、pET28a(+)ベクター（NdeIでの消化、Klenowでの鈍化、及びNotIでの消化により調製した）にライゲーションした。得られたプラスミドを3p86−23と命名した。
【０２４１】
新規の制限サイトをPCRにより加えた。AvPALを、フォワードプライマーAvEcoRIfor
【化１２】
2013518893.tif 000015
及び、リバースプライマーAvSmalrev
【化１３】
2013518893.tif 000016
を有するプラスミド3p86−23で増幅した。得られたPCR産物をEcoRI及びSmaIで消化し、EcoRI及びSmaI消化pIBX7ベクターにライゲーションした。得られたプラスミドを7p56 Av3と命名した。
【０２４２】
（システイン突然変異体）
AvPALポリペプチド位置503及び565に対応する、AvPAL遺伝子の2つのシステインコドンを部位特異的突然変異誘発(QuickChange XL II、Stratagene社製)によってセリンコドンと置換した。位置503のシステインコドンを、フォワードプライマーAv_C503S
【化１４】
2013518893.tif 000017
及び、リバースプライマーAv_C503Srev
【化１５】
2013518893.tif 000018
を有するPCRによってプラスミド7p56 Av3のセリンコドンに変換した。セリンコドンに下線を付した。また、コード鎖のGからCの突然変異（非コード鎖のCからGの突然変異）を太字で示した。得られたプラスミドをj282と命名した。位置565のシステインコドンを、フォワードプライマーAv_C565S
【化１６】
2013518893.tif 000019
及び、リバースプライマーAv_C565Srev
【化１７】
2013518893.tif 000020
を有するプラスミドj282のセリンコドンに変換した。セリンコドンに下線を付した。また、コード鎖のGからCの突然変異（非コード鎖のCからGの突然変異）を太字で示した。得られたプラスミドをj298aと命名した。
【０２４３】
AvPALポリペプチドの位置64、318及び565のAvPAL遺伝子のシステインコドンを、次のプリマーのペアを用いて同様にセリンコドンと置換した：C64S、フォワードプライマーAv_C64S
【化１８】
2013518893.tif 000021
及び、リバースプライマーAv_C64Srev
【化１９】
2013518893.tif 000022
；C318S、フォワードプライマーAv_C318S
【化２０】
2013518893.tif 000023
及び、リバースプライマーAv_C318Srev
【化２１】
2013518893.tif 000024
;並びに、C565S、フォワードプライマーAv_C565S（配列番号28）、及び、リバースプライマーAv_C565Srev（配列番号29）。セリンコドンに下線を付し、コード鎖のGからCの突然変異、及び非コード鎖のCからGの突然変異を太字で示した。
【０２４４】
［実施例８  AvPAL変異体（システイン突然変異体）のインビトロでの酵素活性］
本研究の目的は、インビトロでのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)酵素活性に対するAvPALポリペプチドの様々なシステイン残基のセリンによる置換の影響を判断することであった。
【０２４５】
AvPAL変異体（すなわち、システイン変異体）を、実施例7に記載したとおりにクローニングした。AvPALシステイン突然変異体の発現プラスミドを細菌に形質転換した。また、AvPALシステイン突然変異体ポリペプチドを、実施例1に記載したとおりに発現し、実施例2に記載したとおりに精製した。
【０２４６】
実施例3に記載したとおりに、野生型(WT)AvPAL及びAvPALシステイン突然変異体をインビトロでのPAL酵素活性に関して試験した。表1は、ペグ化されていないWT AvPALと比較して、インビトロでのペグ化されていない精製AvPALシステイン突然変異体タンパク質のPAL比活性が、位置64(AvPAL_C64S)のシステイン残基のセリンによる置換によって低減されたが、位置503若しくは565のいずれか、又は、位置503及び565の両方（それぞれ、AvPAL_C503S、AvPAL_C565S、及びAvPAL_C565SC503S）のシステイン残基のセリンによる置換によって悪影響を受けなかったことを示す。
【表３】
2013518893.tif 000025
【０２４７】
セリン残基の導入が、ペグ化AvPALタンパク質の酵素活性に影響を及ぼすか否かを判断するために、WT AvPAL及び二重システイン突然変異体であるAvPAL_C565SC503Sを実施例6に記載したとおりにペグ化した。表1は、ペグ化AvPALタンパク質のインビトロでのPALの比活性が、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換によって悪影響を受けなかったことを示す。
【０２４８】
［実施例９  AvPAL変異体（システイン突然変異体）のインビトロでの生化学特性評価］
本研究の目的は、(1)促進された安定性、(2)凝集体の形成、及び(3)部位特異的ペグ化に対する、AvPALポリペプチドでの様々なシステイン残基のセリンによる置換の影響を判断することであった。
【０２４９】
（促進された安定性）
インビトロでの安定性に対する、AvPALのシステイン残基のセリンによる置換の影響を、精製AvPALシステイン突然変異体（ペグ化されている又はペグ化されていない）を37℃で様々な期間保存した後、実施例3に記載したとおりに、これらのタンパク質のインビトロでのPAL比活性を測定することにより判断した。
【０２５０】
野生型AvPAL及びAvPALシステイン突然変異体（ペグ化されている又はペグ化されていない）を実施例8に記載したとおりに調製した。
【０２５１】
図6Aに示すとおり、ペグ化されていないAvPALタンパク質の比活性は、37℃で少なくとも5日間安定しており、また、位置565、又は位置503及び565の両方のシステイン残基のセリンによる置換によって悪影響を受けなかった。同様に、図6Bに示すとおり、ペグ化AvPALタンパク質の比活性は、37℃で少なくとも6日間安定していた。単一のシステインAvPAL突然変異体であるAvPAL_C565Sは、37℃で6日後に、野生型AvPAL及び二重システインAvPAL突然変異体であるAvPAL_C565SC503Sと比較して、多少低減された安定性を示した。
【０２５２】
（凝集体の形成）
溶液中のタンパク質凝集体の形成に対する、システイン残基のセリンによる置換の影響を、ペグ化されていない精製野生型AvPAL及びAvPALシステイン突然変異体を、変性及び天然ゲル電気泳動又はSEC−HPLCのいずれかによって分離することにより判断した。
【０２５３】
精製AvPAL調製物を、変性条件（4〜12％ NuPAGE Bis−Tris）又は本来の条件［8％ Tris−Gly(pH8.3)］下でゲル電気泳動によって分離した。分離されたAvPALタンパク質をクマシーブルーで染色した。
【０２５４】
精製AvPAL調製物をSEC−HPLCによって分離した。AvPALタンパク質を、20mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl(pH6.9)においてTSKゲルカラム［G3000SW×l, 7.8mm×30 cm, 5μm (Tosoh Bioscience社製, LLC)］にロードし、0.5mL／分の流速で溶出した。分離されたAvPALタンパク質をAgilent series 1100分光器で分析した。
【０２５５】
凝集体は、ゲル電気泳動（図7A）又はSEC−HPLC（図7B）で判断されたように、野生型AvPAL調製物、並びにAvPAL_C503S及びAvPAL_C64S調製物に含まれていたが、AvPAL_C565S及びAvPAL_C565SC503S調製物には含まれていなかった。
【０２５６】
（部位特異的ペグ化）
部位特異的ペグ化に対する、AvPALでのシステイン残基のセリンによる置換の影響を、実施例6に記載したとおりに、野生型AvPAL、及び二重システイン突然変異体AvPAL_C503SC565Sをペグ化し、AvPALリジン残基：K2、KlO、K32、Kl15、K145、K195、K301、K335、K413、K419、K493、K494及びK522での相対的ペグ化を比較することにより判断した。
【０２５７】
ペグ化されていない又はペグ化されたAvPALタンパク質の約100μg（10μg/μLで10μL）を8M尿素で変性した。その後、変性タンパク質を、37℃でpH8.2の0.8M 尿素中のトリプシンとの100μLの反応体積で、一晩（〜20時間）消化した。トリプシンに消化されたタンパク質を、1μLの１M DTTと37℃で1時間処理することにより還元し、3μLの15% TFAでクエンチさせた。消化されたタンパク質をCl8逆相カラムで分離した。それぞれのペグ化AvPALペプチドのペグ化の割合を対応するペグ化されていないペプチドのペプチドマッピングを減じることによって算出した。
【０２５８】
図8にAvPALタンパク質：PEGの1:3の比で示すとおり、可能性のあるK419を除いて、いずれのリジン(K)残基のペグ化の割合において有意な相違はなかった。また、二重システイン突然変異体C565SC503Sのペグ化の割合は、野生型AvPALと比較して、低かった。しかしながら、AvPALタンパク質：PEGの比を増加することでの二重システイン突然変異体を用いて得られた結果においては、用量反応相関は見られず、比較的小さなペグ化割合と共に考慮すると、これは、K1419の観察された相違が重要でないようであることを示す。したがって、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換は、AvPALの部位特異的ペグ化に影響していないと思われた。
【０２５９】
［実施例１０  AvPALタンパク質の凝集メカニズム］
本研究は、細菌で発現されたAvPALタンパク質の凝集メカニズムを調査するために行われた。
【０２６０】
精製AvPAL生産物を濃縮し、37℃で2時間、濃縮タンパク質溶液をインキュベートし、溶液中で精製AvPALタンパク質の凝集を促進させた。凝集を、SEC−HPLCでAvPALタンパク質を分離することにより検出した。ジスルフィド架橋が凝集の原因であるか否かを判断するために、50mMジチオトレイトール(DTT)を濃縮タンパク溶液に添加し、37℃で2時間、インキュベートした。
【０２６１】
実施例2に記載したとおりに、細菌で発現されたAvPALタンパク質を精製し、スピンフィルター(Millipore Biomax−10K NMWL)を用いて濃縮した。タンパク質を、エッペンドルフ遠心分離機5415Cで、約15,000gで数分間回転させた。凝集する傾向があるシステイン突然変異体（例えば、AvPAL_C503S及びAvPAL_C64S）においては、タンパク質を約20mg/mLまで濃縮し、37℃で2時間、インキュベートした。凝集に抵抗性のあるシステイン突然変異体（例えば、AvPAL_C565S及びAvPAL_C565SC503S）においては、タンパク質を約40mg/mLまで濃縮し、37℃で2時間、インキュベートした。
【０２６２】
表2に示すとおり、精製AvPALシステイン突然変異体AvPAL_C64S及びAvPAL_C503Sの調製物は、37℃で2時間のインキュベーションで凝集体を形成した。予想どおり、この凝集は、AvPALタンパク質を37℃で2時間のインキュベーションの前に濃縮した場合、悪化した。凝集は、DTTへの濃縮タンパクの暴露によって阻害され、これは、凝集がジスルフィド架橋によるものであることを示すものである。これに対して、精製AvPALシステイン突然変異体AvPAL_C565S及びAvPAL_C565SC503Sの調製物は、37℃で2時間のインキュベーションで凝集体を形成せず、これは、位置565のシステイン残基が、ジスルフィド架橋によってAvPALの凝集に関係することを示すものであった。
【表４】
2013518893.tif 000026
【０２６３】
どのシステイン残基が遊離スルフヒドリル基として存在するかを判断するために、精製AvPAL調製物を8M 尿素の存在下で変性し、ヨードアセトアミドによってアルキル化し、トリプシンで消化し、そして、LC/MSで分析した。AvPALシステイン残基はすべて、ヨードアセトアミドで標識化され、これは、細菌で発現されたAvPALのシステイン残基のすべてが、遊離スルフヒドリル基として存在することを示すものであった（データは示さない）。
【０２６４】
どのシステイン残基が天然タンパク質の表面で存在するかを判断するために、精製AvPAL調製物を最初にN−エチルマレイミド(NEM)で処理し、次いで、8M 尿素の存在下で変性し、ヨードアセトアミドによってアルキル化し、トリプシンで消化し、そして、LC/MSで分析した。位置235及び424のシステイン残基は、NEMによってアルキル化されなかった。また、位置318のシステイン残基は、NEMによって単に部分的にアルキル化されただけであった。これらは、位置64、503及び565のシステイン残基が、天然AvPALの表面にあり、位置318のシステイン残基が、天然AvPALの表面で部分的に暴露されたことを示すものであった（データは示さない）。
【０２６５】
どのシステイン残基が鎖間ジスルフィド架橋に関係するかを判断するために、精製したペグ化されていない野生型AvPAL調製物の0.7mg/mL溶液の67μLを変性し、20mMヨードアセトアミドを含む8M尿素において、37℃で1時間アルキル化し、次いで、トリプシンで、25℃で一晩（〜17.5時間）、100μLの反応体積において消化した。トリプシンに消化されたタンパク質を分離し、質量分析で分析した。また、推定されたジスルフィドペアに対応するペプチドを、同定し、全イオン数(TIC)として定量した。
【０２６６】
表3は、C503−C503、C503−C565、C565−C318及びC565−C565においてジスルフィドペアが検出されたことを示す。位置565の、及び、位置503の少ない程度までの、システイン残基は、精製AvPAL調製物において、ジスルフィドペアで見られた。
【表５】
2013518893.tif 000027
【０２６７】
ジスルフィド架橋に加え、付加的メカニズムがAvPALタンパク質の凝集に関係し得るか否かを判断するための試験を実施した。
【０２６８】
精製AvPAL調製物を0.05% Tween又は10mM EDTAでインキュベートし、次いで、実施例9に記載したとおりに、SEC−HPLCで分離した。Tweenは、疎水的相互作用によりタンパク質凝集を低減させる。また、EDTAは、2価カチオンの存在によりタンパク質凝集を低減させる。図9に示すように、0.05% Tween又は10mM EDTAへの暴露は、AvPALタンパク質凝集に影響を与えなかった。10mM EDTA処理AvPALにおける10分での追加的なピークは、210nmのEDTAの吸光度によるものであった。
【０２６９】
更にAvPALタンパク質凝集におけるジスルフィド架橋の役割を調査するために、精製AvPALをDTTによる処理で還元した後、SEC−HPLCによる分離の前に脱塩した。図10Aに示すとおり、AvPALタンパク質凝集は、DTTでの処理により最小限となり、凝集体は、37℃で18時間のインキュベーションの後に再形成された。これに対して、図10Bに示すとおり、AvPAL表面のシステインが、DTT暴露後に（但し、脱塩、及び37℃で18時間のインキュベーション前に）N−メチルマレイミド(NEM)での処理により変性される（すなわち、アルキル化される）と、凝集体は、再形成しなかった。
【０２７０】
上述に基づくと、細菌で発現されたAvPALの凝集は、疎水性効果、又は２価カチオンの存在によるものではなく、鎖間ジスルフィド結合の形成単独によるものであると思われる。位置565及び503のシステイン残基は、AvPAL調製物における鎖間ジスルフィド結合の形成に関係している。
【０２７１】
［実施例１１  AvPAL変異体（システイン突然変異体）ペグ化形態の液体配合物］
本発明で提供する配合物におけるAvPALポリペプチド変異体（例えば、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換）のペグ化形態の促進された安定性に対する、様々な添加剤（例えば安定化剤）の影響を調査するための試験を実施した。
【０２７２】
実施例7に記載したとおりに、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを調製した。
【０２７３】
ペグ化AvPAL_C565SC503Sの様々な配合物の促進された安定性を、インビトロ活性分析、キュベット分析、又はプレート分析で測定した。キュベット分析においては、精製ペグ化AvPAL_C565SC503SをTBS希釈緩衝液で希釈した後、22.5mM Phe、100mM Tris−HCl(pH8.5)を含む分析緩衝液に加えた。30℃で２分間のインキュベーションの後、放出されたtrans−桂皮酸(t-CA)量を290nmの吸光度で測定した。プレート分析においては、精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、BSA/Phe/Brij添加TBS希釈緩衝液で希釈した後、22.5mM Phe、100mM Tris−HCl(pH8.5)を含む分析緩衝液に加えた。30℃で10〜20分間のインキュベーションの後、放出されたtrans−桂皮酸(t-CA)量を290nmの吸光度で測定した。PAL活性の１IUは、１μモルのTCA／分と等しい。
【０２７４】
第一の促進された安定性についての試験においては、ペグ化二重システイン突然変異体AvPALであるAvPAL_C565SC503Sの安定性に対するpHの影響を評価した。精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、pH４〜９の様々なpHで、10mM緩衝液及び140mM NaClにおいてプレフォーミュレーションした。試験された緩衝液は、クエン酸塩(pH4)、酢酸塩(pH5)、ヒスチジン(pH6)、リン酸塩(pH7)、Tris（pH7.5及びpH8）、及びアルギニン(pH9)であった。４℃、25℃又は37℃で30日以内の酵素配合物の保存後、インビトロ活性を測定した。PAL酵素活性のすべての損失をpH４で観察した。pH７〜８の範囲のpHを更なる評価に選択した。
【０２７５】
第二の促進された安定性についての試験においては、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安定性に対する、pH及び様々な賦形剤の影響を評価した。精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、0.5% EDTA、0.5% アスコルビン酸添加0.5% EDTA、又は５mMメチオニン(Met)添加0.5% EDTAの非存在下又は存在下で、10mM Tris及び140mM NaCl（pH７、7.5又は8.0）においてプレフォーミュレーションした。４℃、25℃又は37℃で60日以内の酵素配合物の保存後、インビトロ活性を測定した。pH7.0及び7.5では、酵素活性の維持において等しく、EDTAは、酵素活性に効果がほとんど又は全くなかった。また、抗酸化剤のアスコルビン酸及びメチオニンは、酵素活性に悪影響を及ぼした。
【０２７６】
同様の促進された安定化についての試験においては、AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sのペグ化の影響を評価した。酵素活性の損失の速度は、ペグ化されていないAvPAL_C565SC503Sとペグ化されたAvPAL_C565SC503Sとの間で類似していた。
【０２７７】
第三の促進された安定性についての試験においては、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安定性に対する、賦形剤としての酵素基質及び生産物の影響を評価した。約12mg/mL(0.2mM)の精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、１mM Phe（活性部位モル当たり５モルの基質）、２mM TCA（活性部位モル当たり10モルの生産物）、又は0.05% Tween80（界面活性剤）の非存在下又は存在下で、10mM Tris及び140mM NaCl(pH7.5)においてプレフォーミュレーションした。４℃、25℃又は37℃で様々な時間での酵素配合物の保存後、インビトロ活性を毎週測定した。Phe及びt−CAは、有意に酵素安定性を増加させたが、Tweenは、酵素安定性に効果がなかった。
【０２７８】
促進された安定性についての第一、第二及び第三の試験の概要を図11に示す。
【０２７９】
第四の促進された安定性についての試験においては、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安定性に対する、賦形剤としての低濃度のPhe及びt−CAの影響を評価した。約12mg/mL(0.2mM)の精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、0.4mM Phe（活性部位モル当たり２モルの基質）、又は0.4mM TCA（活性部位モル当たり２モルの生産物）の非存在下又は存在下で、10mM Tris及び140mM NaCl(pH7.5)においてプレフォーミュレーションした。４℃、25℃又は37℃で様々な時間での酵素配合物の保存後、インビトロ活性を毎週測定した。低濃度のPhe及びt−CAは、酵素活性の安定化に有効であった。
【０２８０】
第五の促進された安定性についての試験においては、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安定性に対する、賦形剤としての弱い酵素基質、チロシン(Tyr)の影響を評価した。約12mg/mL(0.2mM)の精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、１mM又は５mM Tyr（活性部位モル当たりそれぞれ５モル又は25モルの基質）の非存在下又は存在下で、10mM Tris及び140mM NaCl(pH7.5)においてプレフォーミュレーションした。４℃、25℃又は37℃で様々な時間での酵素配合物の保存後、インビトロ活性を毎週測定した。チロシンは、酵素活性に対し、最小限で、非用量依存的な安定効果を有していた（図12）。
【０２８１】
第六の促進された安定性についての試験においては、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安定性に対する、賦形剤としての求核捕捉剤の影響を評価した。約20mg/mL(0.33mM)の精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、１mM Phe（活性部位モル当たり３モルの基質）、２mM求核捕捉剤（活性部位モル当たり６モルの安息香酸又はピリドキサミン）、又は１mM Pheと２mM求核捕捉剤との両方の非存在下又は存在下で、10mM Tris及び140mM NaCl(pH7.5)においてプレフォーミュレーションした。４℃、又は37℃で様々な時間での酵素配合物の保存後、インビトロ活性を毎週測定した。安息香酸は、酵素活性の安定化に有効であったが、ピリドキサミンはそうではなかった（図13A）。Phe及び安息香酸の相加効果はなく、これは、同様の安定化メカニズムであることを示唆するものであった。
【０２８２】
安息香酸及びt−CAの安定化効果は、それらがPheの構造類似体として機能することを示唆する（図13B参照）。
【０２８３】
第六の促進された安定性についての試験からのデータは、様々な配合物におけるペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの有効期間を推定するために組み合わされた。有効期間を次のように決定した：(1)それぞれの配合物の状態において、一次速度式の後、活性減退(kdecay)を決定する；(2)1n(kdecay)υ.１／温度(°K)をプロットする；(3)所定の配合物の状態における活性減退に必要なEa(ΔGdecay)を決定する；(4)算出されたEa、及び所定温度の観察されたkdecayを用いて、４℃のkdecayを推定する；及び、(5)特異的酵素活性が４℃で10％以上低下する時間である、保存寿命(T90)を決定する。
【０２８４】
表4は、Phe及びt−CAが、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの推定された保存寿命を大幅に増大させることを示す。
【表６】
2013518893.tif 000028
【０２８５】
要約すると、上述のプレフォーミュレーションについての試験は、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sにおける最適pHが７〜7.5であることを示した。抗酸化剤の存在により、酵素活性の大幅な損失が生じる。Phe及びtrans−桂皮酸(t−CA)は、促進された条件（25℃及び37℃）下で、rAvPAL−PEGの安定性を50％以上増加させる。rAvPAL−PEG活性部位当たり２倍を超えるPhe又はt−CAは、活性を安定させるのに十分であり、それ以上高い濃度では、付加的な利点はないものと思われる。弱いPAL基質であるチロシン(Tyr)は、酵素活性を安定させないと思われるが、安息香酸は、その構造類似体であるPheと同程度に、rAvPAL−PEG活性を安定させる。Pheと組み合わせた場合、付加的な活性安定化は、安息香酸で見られず、これは、共通の活性安定化メカニズムであることを示唆している。
【０２８６】
［実施例１２  AvPAL変異体（システイン突然変異体）のペグ化形態の凍結乾燥配合物］
AvPALポリペプチド変異体（例えば、位置503及び565のシステイン残基のセリンによる置換での）のペグ化形態の活性に対する、様々な固体（例えば、凍結乾燥）の配合物の影響を調査するための試験を実施した。
【０２８７】
実施例7に記載したとおりに、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを調製した。
【０２８８】
ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを次のように配合した：(Fl)10mg/mLのAvPAL_C565SC5O3S、10mM Tris(pH 7.5)；(F2)10mg/mLのAvPAL_C565SC503S、10mM Tris(pH 7.5)、25mg/mLのマンニトール；又は、(F3)10mg/mLのAvPAL_C565SC503S、10mM Tris(pH7.5)、20mg/mLのマンニトール、5mg/mLのスクロース。配合後、それぞれのPAL酵素活性は、1.7〜1.8U/mgであった。凍結乾燥後、配合物を4℃で26まで保存した後、新鮮なろ過滅菌MilliQ水で再懸濁した。実施例11に記載したとおりに、PAL酵素活性を測定した。表5は、様々なAvPAL_C565SC503S配合物の凍結乾燥、保存、又は再懸濁においては、活性の損失がないものと見られたことを示す。
【表７】
2013518893.tif 000029
【０２８９】
[実施例13  ペグ化AvPAL変異体の配合物]
本明細書中で提供する配合物において、例えば、位置503及び565におけるシステイン残基のセリン置換を有するAvPALポリペプチド変異体(AvPAL_C565C503S)のペグ化形態の加速安定性に対する様々な賦形剤、例えば安定化剤及び防腐剤(すなわち抗菌剤)の影響を調査するための試験を実施した。
【０２９０】
実施例7に記載したとおりに、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを調製した。
【０２９１】
実施例11に記載したようにインビトロ活性アッセイを使用して、ペグ化AvPAL_C565SC503Sの異なる配合物の加速安定性を測定した。
【０２９２】
予備防腐剤適合性試験において、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの活性化及び安定性に対する、防腐剤、すなわち抗菌剤の存在の影響を評価した。精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを10mMのTris緩衝液及び135mMのNaClにてpH7.35で配合した。試験した防腐剤:ベンジルアルコール(0.15%);m-クレゾール(0.3%);クロロ-クレゾール(0.25%);及びフェノール(0.5%)。酵素配合物を防腐剤の不在下で、又はベンジルアルコール、m-クレゾール、クロロ-クレゾール若しくはフェノールの存在下で室温にて1時間にわたってインキュベートした後に、初期活性測定を行った。酵素配合物を4℃で65日間までの時間にわたって保存した後に、インビトロ活性を測定した。初期酵素活性は、防腐剤に影響されず、酵素は、試験した防腐剤の各々と適合していたが、m-クレゾールについては活性の緩慢な低下が観察された。
【０２９３】
第1の防腐剤適合性試験において、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの活性及び安定性に対する、安定剤、すなわちL-フェニルアラニン(Phenylalanine)(Phe)若しくはGlyの存在下又は不在下での防腐剤、すなわち抗菌剤の存在の影響を評価した。精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを10mMのTris緩衝液及び135mMのNaClにてpH7.35で配合した。試験した防腐剤:ベンジルアルコール(0.15%);m-クレゾール(0.3%);及びフェノール(0.5%)。試験した安定剤:Phe(1mM);及びGly(1mM)。酵素配合物を防腐剤若しくは安定剤の不在下、又は1つの防腐剤、1つの安定剤、若しくは1つの防腐剤と1つの安定剤との様々な組合せの存在下で、18週間までの時間にわたって4℃、25℃又は40℃で保存した後に、インビトロ活性を測定した。すべての防腐剤が、この試験において初期酵素活性を低下させ、フェノールとGlyとの組合せが強力な酵素インヒビターであった。いずれの場合も、防腐剤の存在下で配合された酵素は、Phe単独の存在下での酵素より安定性が低かった。追跡試験においても、50mMのTris緩衝液、135mMのNaClにてpH7.3で配合した12mg/mL(0.19mM)の酵素を使用して同様の結果が得られた。
【０２９４】
第2の防腐剤適合性試験において、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安定性に対する、安定剤、すなわちPhe若しくはGlyの存在下又は不在下での異なるTris緩衝液濃度の影響及び防腐剤、すなわち抗菌剤の存在の影響を評価した。精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを10mM、25mM又は50mMのTris緩衝液及び135mMのNaClにてpH7.3で配合した。試験した防腐剤:ベンジルアルコール(1.5%)。試験した安定剤:Phe(1mM);及びGly(1mM)。酵素配合物を単独の異なるTris緩衝液中、又はベンジルアルコール若しくはPhe単独、又はベンジルアルコール、Phe及びGlyの様々な組合せの存在下での50mMのTris緩衝液中で、12週間までの時間にわたって4℃、25℃又は40℃にて保存した後、インビトロ活性を測定した。Tris緩衝液濃度が増加するに従って酵素活性が低下した。試験した濃度において、ベンジルアルコールは、酵素と不適合であった。試験したすべての配合物における酵素は、Phe単独の存在下で配合された酵素より安定性が低かった。
【０２９５】
第3の防腐剤適合試験において、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安定性に対する、防腐剤、すなわち抗菌剤と、１以上の安定剤、すなわちPhe及びGlyとの様々な組合せの存在の影響を評価した。精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを10mMのTris緩衝液及び135mMのNaClにてpH7.35で配合した。試験した防腐剤:ベンジルアルコール(1.5%);及びm-クレゾール(0.3%)。試験した安定剤:Phe(1mM);及びGly(1mM)。酵素配合物を単独のPhe中、又はPhe、Glyとベンジルアルコール若しくはm-クレゾールとの様々な組合せ中で、37週間までの時間にわたって4℃、25℃若しくは40℃にて保存した後に、インビトロ活性を測定した。この試験の結果を図14に示す。既に認められたように、配合物における防腐剤の存在は、初期酵素活性を低下させたが、4℃及び25℃において、m-クレゾール、Phe及びGlyを含む酵素配合物での酵素活性の低下は、過渡的なものにすぎなかった。この酵素配合物は、Phe単独について実施例11で観察された安定化効果に最も近いことが判明した。
【０２９６】
第4の防腐剤適合試験において、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安定性に対する、防腐剤、すなわちm-クレゾール及び安定剤、すなわちPheの存在下での異なるGly濃度の影響を評価した。精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、Glyの不在下、又は1、3、5、10若しくは20mMのGlyの存在下で、10mMのTris緩衝液、135mMのNaCl、1mMのPhe及び3.2mg/mL(0.32%)にてpH7.2で配合した。酵素配合物を12週間にわたって25℃又は40℃で保存した後に、インビトロ活性を測定した。この試験の結果を図15Aに示す。正規化活性(様々な配合物における保存前の酵素活性の%)として報告される、25℃又は40℃での保存による酵素活性の低下は、Glyの添加により投与量に依存して低減された。防腐剤含有配合物におけるGlyによる酵素活性の安定性の向上は、RP-HPLCによって測定されたペグ化AvPAL_C565SC503Sの主要ピークの維持と十分に相関していた。
【０２９７】
第5の防腐剤適合試験において、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安定性に対する、安定剤、すなわちPheの存在下であるが、防腐剤の不在下での異なるGly濃度の影響を評価した。精製ペグ化AvPAL_C565SC503Sを、20から100mMの範囲の様々な濃度のGlyの存在下で、10mMのTris緩衝液、135mMのNaCl及び1mMのPheにてpH7.2で配合した。酵素配合物を8週間にわたって40℃で保存した後に、インビトロ活性を測定した。この試験の結果を図15Bに示す。40℃の保存による酵素活性の低下は、防腐剤を含有しないペグ化AvPAL_C565SC503S配合物において、Glyの添加によって投与量に依存して低減された。
【０２９８】
[実施例14  マウスにおけるAvPAL変異体(システイン突然変異体)及びそれらのペグ化形態の影響]
これらの試験の目的は、マウスにおけるインビボのPheレベルに対する、AvPALポリペプチドにおける位置503及び565でのシステイン残基のセリン置換の影響を測定することであった。
【０２９９】
基本的には、その全体が参照により本明細書中に組み込まれている、2006年6月12日に出願された先の同時係属の米国特許出願第11/451,999号の実施例7から9に記載されているとおりに、ペグ化形態のAvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを、ホモ接合ENU2(BTBRenu2としても知られる)マウスにおけるインビボ活性について試験した。ENU2マウスは、重度HPAを有する動物をもたらすPAH座におけるホモ接合突然変異体である。高い血漿Pheレベルにより、この動物は、血漿Pheを低減させるPALの能力を評価するための適切なモデルとなる。
【０３００】
第1の試験において、AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを様々な投与量で試験した。ENU2マウス(雄及び雌)を5つの投与量グループ:4つの試験グループ(n=4)及び1つのビヒクルグループ(n=2)に分けた。各マウスに、ビヒクル、低投与量ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL(0.25IU)、中投与量ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL(1.0IU)、高投与量ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL(4.0IU)又はペグ化野生型AvPAL(4.0IU)の8週間の皮下投与を与えた。血漿を投与前及び投与の48時間後(57日目まで)に回収し、Pheレベルについて分析した。抗AvPAL抗体レベルの分析のために、投与前及び投与の48時間後(57日目まで)に血清も回収した。また、最初の投与の2日前から(40日目まで)マウスの体重を毎週1回ずつ測定した。
【０３０１】
1匹のビヒクル処理マウス及び1匹の低投与量ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL処理マウスの2匹のマウスが試験中に死んだ。図16に示すように、ペグ化二重システイン突然変異体AvPALの各皮下注射の48時間後の血漿に、Pheレベルの投与量依存的低下が観察された。同等の投与量においては、ペグ化野生型AvPALで処理されたマウスとペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処理されたマウスとの間に血漿Ｐｈｅレベルの差がなかった。図17に示されるように、ビヒクルで処理されたマウス、ペグ化野生型AvPALで処理されたマウス又はペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処理されたマウスの間には体重の有意な差もなかった。雄及び雌の両方のマウスを試験に使用したため、体重の有意な差が観察されなかった可能性が高い。
【０３０２】
これらのマウスにおける抗AvPAL抗体を、間接的ELISAアッセイを用いて分析した。このアッセイにおいて、マイクロタイタプレートをAvPALで被覆し、ブロックし、次いで各マウスの血液からの希釈された血清に適切に暴露した。マイクロタイタプレートの表面に結合されたAvPALが認識され、血清試料に存在するAvPAL特異的抗体によって結合された。検出可能に標識されたヤギの抗マウスIgG抗体により、結合した抗AvPAL抗体が検出された。血清試料を最初に1:50に希釈し、1:50に希釈された貯蔵マウス血清に由来する「切点」と比較して分析した。切点より低いシグナルを有する試料を＜50又は「陰性」と報告した。「陽性」と見なされる残りの試料を、シグナルが切点を下回るまで低下する希釈率まで、1:3の一連の滴定にて更に希釈した。陽性のシグナル(すなわち切点より高いシグナル)を与える最も高い希釈係数をその試料の力価と報告した。この滴定シリーズを通じて、差は、切点レベルにおけるシグナルの最小限の変化の結果であり得るため、力価の3倍の変化は、検出された抗体の有意な差を反映しているとは言えない。
【０３０３】
表6に示されるように、抗AvPAL抗体力価は、ペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処理されたマウスの方が、同等の投与量(4.0IU)のペグ化野生型AvPALで処理されたマウスと比較して低かった。明確な投与量応答は観察されなかったが、高投与量(4.0IU)のペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処理されたマウスは、低投与量(0.25IU)のペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処理されたマウスより高い抗AvPAL抗体力価を有していた。
【表８】
2013518893.tif 000030
【表９】
2013518893.tif 000031
【０３０４】
4.0IUペグ化野生型AvPALと比較して、4.0IUのペグ化二重システイン突然変異体AvPALが投与されたマウスにおける低減された抗AvPAL IgG力価が、試験全体を通じて維持された。
【０３０５】
第2の試験において、AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを異なるペグ化比で試験した。雄のENU2マウスを5つの投与量グループ: 4つの試験グループ(n=4)及び1つのビヒクルグループ(n=2)に分けた。各マウスに、ビヒクル、低投与量ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL(4IU及び1:1.6のAvPAL:PEG比)、中投与量ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL(4IU及び1:2.4のAvPAL:PEG比)、高投与量ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL(4IU及び1:3のAvPAL:PEG比)又はペグ化野生型AvPAL(4IU及び1:3のAvPAL:PEG比)の8週間の皮下投与を与えた。血漿を投与前及び投与の4日後(61日目まで)に回収し、Pheレベルについて分析した。抗AvPAL抗体レベルの分析のために、投与前及び投与の4日後(57日目まで)に血清も回収した。また、最初の投与の2日前から(40日目まで)マウスの体重を毎週1回ずつ測定した。
【０３０６】
1匹のビヒクル処理マウスが試験中に死んだ。図18に示されるように、ペグ化二重システイン突然変異体AvPALの各皮下注射の4日後に、PheレベルのPEG比依存的低下が観察された。同等のPEG比では、ペグ化野生型AvPAL又はペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処理されたマウスの間に血漿Pheレベルの差がなかった。図19に示されるように、ペグ化野生型AvPAL又はペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処理されたマウスの体重は、ビヒクル処理マウスより有意に大きかった。
【０３０７】
これらのマウスにおける抗AvPAL抗体力価を、上記間接的ELISAアッセイを用いて分析した。
【０３０８】
表7に示されるように、抗AvPAL抗体力価は、ペグ化二重システイン突然変異体AvPALで処理されたマウスの方が、同じAvPALとPEGの比(1:3)を有する、同等の投与量のペグ化野生型AvPALで処理されたマウスと比較して低かった。抗AvPAL抗体力価とAvPALとPEGの比との間に逆の投与量応答が観察され、それは、AvPALなどのタンパク質のペグ化がインビボの免疫原性の低減に関連することという予測と一致する。
【表１０】
2013518893.tif 000032
【０３０９】
上記結果は、ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL AvPAL_C565SC503Sが、インビボで、ペグ化野生型AvPALに適合性のあるPAL酵素活性を有することを示している。ペグ化されていない野生型AvPALは、検出可能なインビボPAL酵素活性を有していなかったため(2006年6月12日に出願された米国特許出願第11/451,999号の実施例8参照)、ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL、AvPAL_C565SC503S及びペグ化野生型AvPALを含むAvPAL変異体は、野生型AvPALより高いフェニルアラニン変換活性を有すると結論づけられる。
【０３１０】
上記結果は、また、位置503及び565の両方におけるシステインからセリンへの置換により、インビトロでタンパク質凝集を低減させたペグ化AvPAL変異体が、ペグ化野生型AvPALと比較して、低減された免疫原性を有することを示している。ペグ化自体が、低減された免疫原性と関連するため、AvPAL変異体は、野生型AvPALと比較してインビボで低減された免疫原性を有すると結論づけられる。
【０３１１】
[実施例15  カニクイザル及びラットにおけるペグ化形態のAvPAL変異体(システイン突然変異体)の毒性/薬物動態試験]
毒性/薬物動態試験を実施して、カニクイザル及びラットにおける1回投与量のペグ化形態のAvPALポリペプチド変異体(例えば、位置503及び565にシステイン残基のセリン置換を有する)の投与の影響を測定した。
【０３１２】
ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを実施例7に記載したとおりに調製した。
【０３１３】
カニクイザルの毒性/薬物動態試験
この試験では、それぞれが3匹の雄及び3匹の雌を含む4つのグループのサルを使用した。グループ1には、偽薬(mL/kg)を与え、グループ2、3及び4には、それぞれ4、12及び60mg/kgの溶液中ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの1回の皮下注射を与えた。血漿試料を投与前、及び3から504時間までの投与後の様々な時間に各サルより回収した。60mg/kgの投与量は、サルにとって有毒であることが判明したため、この試験のグループ4の部分を外した。
【０３１４】
図20Aは、4及び12mg/kgの1回の皮下注射の後の様々な時間における血漿中のペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの濃度を示す。データは、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの単相的除去を示している。一次吸収を有する1つの区画モデルは、1回の皮下注射後のペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの血漿プロファイルを示していると思われる。
【０３１５】
図20Bは、4mg/kgの1回の皮下注射後の様々な時間における血漿中のPhe及びペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの濃度を示す。この投与量において、血漿Phe濃度は、24時間以内にGC/MSアッセイの定量の限界を下回る濃度まで低減され、血漿Pheの低下は、10日間にわたって維持された。
【０３１６】
(ラットの毒性/薬物動態試験)
この試験では、偽薬グループでは3匹の雄及び3匹の雌を含み、並びに試験グループでは6匹の雄及び6匹の雌を含む8つのグループのラットを使用した。グループ1及び5には、偽薬の1回の静脈内及び皮下注射を与えた。グループ2、3及び4には、それぞれ1、5及び25mg/kgのペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの1回の静脈内注射を与えた。グループ6、7及び8には、それぞれ10、25及び250mg/kgのペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの1回の皮下注射を与えた。血液試料を投与前、及び1から360時間までの投与後の様々な時間にラットから回収した。各回収時において、血液を各グループの3匹のラットから回収した。この試験では、ラットにおいて毒性が観察されなかった。
【０３１７】
図21Aは、1、5及び25mg/kgの1回の静脈内注射の後の様々な時間における血漿中のペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの濃度を示す。データは、1回の静脈内注射からのペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの単相的除去を示している。
【０３１８】
図21Bは、10、25及び250mg/kgの1回の皮下注射の後の様々な時間における血漿中のペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの濃度を示す。一次吸収を有する1つの区画モデルは、1回の皮下注射後のペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの血漿プロファイルを示していると思われる。
【０３１９】
表8は、1回の静脈内又は皮下注射後のペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの薬物動態パラメーターを示す。
【表１１】
2013518893.tif 000033
【０３２０】
この薬物動態試験では、性別による差が見られなかった。AUCinf及びCmaxは、静脈内及び皮下投与経路の両方について、投与量に概ね比例していた。
【０３２１】
(ラット及びカニクイザルにおける多投与毒性試験)
ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの安全性を、ラット及びカニクイザルにおける繰返し投与毒性試験で評価した。
【０３２２】
25mg/kgまでのペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sが28日間にわたって毎週2回皮下投与されたラットでは、毒性が示されなかった。
【０３２３】
1mg/kgまでのペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sが28日間にわたって毎週2回皮下投与されたカニクイザルでは、有意な毒性が示されなかった。血漿Pheレベルの投与量依存的低下が、最初の投与後に観察されたが、7回目の投与後に、血漿Pheレベルは、すべての投与グループにおいて基線に戻り、投与された酵素に対する抗体応答の可能性が示された。28日目には、大半の1mg/kg処理動物に最小の抗AvPAL_C565SC503S IgG力価が観察された。28日目に、試験におけるいずれの動物にもIgM力価が観察されなかった。
【０３２４】
［実施例１６  例示原核生物PAL配合物］
以下の実施例は、フェニルアラニンのレベルの上昇によって特徴付けられる疾患及び障害、例えば、PKUを含むHPA、及び癌を含む他の障害の治療に有用である原核生物PAL、又はその生物学的に活性のあるフラグメント、突然変異体、変異体若しくは類似体を含む組成物を配合するために用いられるパラメーターに関するガイドラインを提供する。本発明の原核生物PALの組成物に用いられるパラメーターは、pHを維持する緩衝剤、等張性調節剤、安定化剤の非存在又は存在、他の賦形剤、ビヒクル、及び希釈剤等の非存在又は存在を含むが、これらに限定されない。
【０３２５】
実施例11では、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを、約12〜20mg/mL（約0.2〜0.33mM）の濃度で配合した。1つの原核生物PAL変異体を、約１〜50mg/mL（約0.016〜0.8mM）、例えば約５〜20mg/mL（約0.08〜0.33mM）、又は約５〜15mg/mL（約0.08〜0.25mM）の範囲の濃度で配合する。本明細書で提供する1つの例示的な原核生物PAL変異体の配合物は、約10+/-5mg/mL（約0.16+/-0.08mM）のPAL酵素濃度を有する。
【０３２６】
実施例11では、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを、10mM Tris−HCl、140mM NaCl（pH7.0、7.5及び8.0)で配合した。1つの例示的な緩衝剤は、５〜50mM、例えば５〜20mM、又は５〜15mMの範囲の濃度のTris−HCl、又はその等価物である。本明細書で提供する原核生物PALの組成物の例示的な配合は、約10+/-5mMのTris−HCl緩衝液の濃度であった。
【０３２７】
医薬組成物の1つの例示的なpHは、約6.0〜8.5、例えば約7.0〜8.0、又は約7.0〜7.6である。本明細書で提供する原核生物PALの組成物の例示的な配合は、約7.3+/-0.3のpHである。
【０３２８】
例示的な等張性調節剤は、約100〜200mM、例えば約130〜170mM、又は約130〜150mMの範囲の濃度のNaCl、又はその等価物である。本明細書で提供する原核生物PALの組成物の例示的な配合は、約140+/-10mMのNaClの濃度を有する。
【０３２９】
実施例11に示すとおり、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを、Phe、及び、例えば、t−CA及び安息香酸を含むその構造類似体の存在下で安定化させた。また、Tyrは、PAL酵素に対して最小の安定効果があった。1つの例示的な安定化剤は、原核生物PALの活性部位のモル当たり約0.1〜20モル、例えば、原核生物PALの活性部位のモル当たり約0.5〜10モル、又は、原核生物PALの活性部位のモル当たり約１〜10モルの範囲のPhe、又はその構造類似体である。本明細書で提供する原核生物PALの組成物の例示的な配合は、原核生物PALの活性部位のモル当たり約５+/-４モルの安定化剤の濃度であった。
【０３３０】
ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sは、７より低いpH若しくは7.6より高いpHで、又は、EDTA、アミノグアニジン若しくはTween 80の存在下では有意に安定しなかった。また、抗酸化剤アスコルビン酸及びメチオニンは、PAL酵素を不安定にした（実施例11、データは示さない）。しかし、本明細書中で提供する組成物は、これらの成分の1種以上を含み得る。
【０３３１】
原核生物PALの組成物は、液体配合物として調製できるが、固体（例えば、凍結乾燥）の配合物として調製してもよい。そのような場合、賦形剤（例えば、充填剤、マンニトール及び／又はスクロース等）を添加することができる。実施例12では、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを、25mg/mLマンニトールの存在下、又は、5mg/mLスクロース添加20mg/mLマンニトールの存在下で、10mM Tris−HCl、140mM NaCl(pH7.5)において配合及び凍結乾燥した。1つの例示的な凍結乾燥配合物は、約1〜5％(w/v)又は10〜50mg/mL、例えば約2〜4％、又は2〜3％の濃度のマンニトールを含む。他の凍結乾燥配合物は、約1〜5％(w/v)(又は10〜50mg/mL)、例えば約1〜3％、又は約1.5〜2.5％のマンニトール濃度、並びに、約0.1〜2％(w/v)(又は0.1〜2mg/mL)、例えば約0.2〜1％、又は約0.3〜0.7％のスクロース濃度である、マンニトール及びスクロースを含む。更に別の原核生物PALの組成物の凍結乾燥配合は、約2.5+/-0.5％マンニトールの濃度、又は、2.0+/-0.5％マンニトール添加0.5+/-0.2％スクロースであった。
【０３３２】
したがって、表9に、本明細書で提供する原核生物PALの組成物の例示的な配合物を示す。
【表１２】
2013518893.tif 000034
【０３３３】
[実施例17  ペグ化AvPAL変異体の例示的な配合物]
以下の実施例は、フェニルアラニンのレベルの上昇によって特徴付けられる疾患及び障害、例えば、PKUを含むHPA、及び癌を含む他の障害の治療に有用であるペグ化AvPAL変異体、すなわち二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを含む組成物の例示的な配合物を提供する。原核生物PAL組成物を配合するのに用いることができるパラメーターとしては、pHを維持するための緩衝剤、等張性調整剤、安定化剤の有無、及び他の賦形剤、ビヒクル及び希釈剤等、例えば防腐剤又は抗菌剤の有無が挙げられるが、それらに限定されない。これらの配合物は、本明細書中に記載の他のAvPALシステイン突然変異体などの他のペグ化AvPAL変異体に適用可能であることが理解される。
【０３３４】
実施例13において、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを約8〜20mg/mL(約0.13〜0.33mM)の濃度で配合した。1つのペグ化AvPAL変異体を、約1から50mg/mL(約0.016から0.8mM)、例えば、約5から20mg/mL(約0.08から0.33mM)、又は約5から15mg/mL(約0.08から0.25mM)の範囲の濃度で配合する。本明細書中で提供するペグ化AvPAL変異体組成物の配合物は、約10+/-5mg/mL(約0.16+/-0.08mM)の酵素濃度を有する。
【０３３５】
実施例13において、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを10mMのTrisHCl、135mMのNaClにてpH7.3で配合した。本明細書中で提供する配合物のための1つの例示的な緩衝剤は、濃度が5から50mM、例えば、5から20mM、又は5から15mMの範囲のTris-HCl又はその同等物である。本明細書中で提供するAvPAL変異体組成物の1つの配合物は、約10+/-5mMのTris-HCl緩衝剤濃度を有する。
【０３３６】
医薬組成物の例示的なpHは、約pH 6.0〜8.0、例えば約pH 6.5〜7.5、又はpH 7.0〜7.6である。本明細書中で提供するAvPAL変異体組成物の1つの配合物は、約7.3+/-0.3のpHを有する。
【０３３７】
例示的な等張性調整剤は、濃度が約100から200mM、例えば、約120から170mM、又は約120から150mMの範囲のNaCl又はその同等物である。本明細書中で提供するAvPAL変異体組成物の1つの配合物は、約135+/-15mMのNaCl濃度を有する。
【０３３８】
実施例13に示されているように、ペグ化AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sを防腐剤又は抗菌剤、すなわちm-クレゾールと2つの安定化剤、すなわちPhe及びGlyとの組合せの存在下で安定化させた。例示的な防腐剤は、m-クレゾール又はその構造類似体であり、防腐剤の範囲は約0.1%から1%(w/v)、例えば、約0.1%から0.5%(w/v)、又は約0.3%から0.5%(w/v)である。AvPAL変異体組成物の1つの配合物は、約0.4%+/-0.1%(w/v)の防腐剤濃度を有する。例示的な安定化剤は、Phe若しくはその構造類似体、及び/又はGly若しくはその構造類似体であり、Phe若しくはその構造類似体の範囲は、約0.1から10mM、例えば、約0.5から5mM、又は約0.5から1.5mMであり、Gly若しくはその構造類似体の範囲は、約0.1から100mM、例えば、約1.0から100mM、約1.0から20mM、又は約20から100mMである。本明細書中で提供するAvPAL変異体組成物の1つの配合物は、Pheの濃度が約1.0+/-0.5mMであり、Glyの濃度が約50.5+/-49.5mMである。本明細書中で提供するAvPAL変異体組成物の別の配合物は、Pheの濃度が約1.0+/-0.5mMであり、Glyの濃度が約10.5+/-9.5mMである。本明細書中で提供するAvPAL変異体組成物の別の配合物は、Pheの濃度が約1.0+/-0.5mMであり、Glyの濃度が約60+/-40mMである。
【０３３９】
したがって、本明細書中で提供するペグ化AvPAL変異体組成物の1つの例示的な配合物を表10に示す。防腐剤、すなわちm-クレゾールの存在は、この例示的な配合物において任意であると理解すべきである。
【表１３】
2013518893.tif 000035
【０３４０】
[実施例18  凝集が低減されたAvPAL変異体の製造]
凝集の制御は、特にタンパク質自体が免疫原性である場合にタンパク質ベースの治療薬の製造及び配合における関心事である。凝集が最小限の(例えば、位置503及び565におけるシステイン残基のセリン置換を有する)ペグ化AvPALポリペプチド変異体の大規模製造を可能にする製造方法が開発された。本明細書中で用いられているように、「最小限の凝集」とは、凝集していない(すなわち、四量体形態の)AvPAL変異体に対する凝集した(すなわち、四量体形態の前のSE-HPLCから溶離する形態)の比が1%未満、例えば、0.5%未満、0.2%未満又は0.1%未満であることを意味する。
【０３４１】
ペグ化AvPALポリペプチド変異体の大規模製造のための製造方法の開発を通じて、酵素が沈殿及び凝集しやすいことが判明した。沈殿をろ過によって除去することができるが、それらは、容易に再形成し得る。フィルターの適切な使用及び特定の非イオン性洗剤により、沈殿の問題を解決することができる。2つのタイプの可溶性凝集物:動的光散乱によって検出され、ろ過によって除去することができる非常に大きな100nmの凝集体;及びSE-HPLCによって検出され、ろ過によって除去することができないより小さな凝集体が特定された。製造方法において沈殿及び凝集体の存在を低減又は最小限にする適切なステップが講じられた。
【０３４２】
AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの大規模製造のための例示的な製造方法を示す流れ図を図22に示す。左方向の矢印は、AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの凝集の低減を達成した製造ステップを示し、上から下に、(a)酵素精製中のクロマトグラフィーステップを順序づけること;(b)精製酵素の冷凍-解凍の前に凍結保護物質を添加すること;(c)様々な賦形剤及びろ過ステップを使用すること;及び(d)緩衝条件を選択し、精製酵素の前ペグ化処理時に賦形剤を使用することを含む。しかし、これらの製造ステップのいずれか１以上を単独で、又は任意の組合せで使用して、それらの１以上の製造ステップを含まない方法によって調整されたAvPAL変異体又はペグ化AvPALと比較して、凝集が低減された(又は凝集が最小限の)AvPAL変異体又はペグ化AvPAL変異体を達成することができるということが理解されるだろう。AvPAL二重システイン突然変異体AvPAL_C565SC503Sの例示的な製造方法におけるステップの各々の概要を以下に記載する。
【０３４３】
発酵。AvPAL変異体ポリペプチドAvPAL_C565SC503Sを発現するBLR(DE3)/pLysS(Novagen)細胞のシードバイアル(実施例7参照)を解凍し、約500mLの培地を含む2.8Lのフラスコに移し、2から4 OD600の細胞密度に達するまで、攪拌しながら37℃でインキュベートした。シードフラスコを第1のバイオリアクター(4L発酵槽)に移し、培養物が10から20 OD600の細胞密度に達するまで発酵を進行させた。第1のバイオリアクター(4L発酵槽)の培養物を第2のバイオリアクター(100L発酵槽)に移し、培養物が少なくとも200 OD600の細胞密度に達するまで発酵を37℃で進行させた。培養液を15℃まで冷却し、CEPA Z61遠心分離機又はWestfalia CSC-6連続式ディスクスタック遠心分離機を使用して遠心分離することによって細胞を培地から分離した。細胞ペーストを-80℃で凍結させた。上記方法を第3のバイオリアクター(例えば500L以上の製造発酵槽)のためにスケールアップすることができる。
【０３４４】
細胞分解。凍結した細胞ペーストを解凍し、室温の20mMのTris-HCl、100mMのNaCl(pH8.0)の緩衝液に再懸濁させて、約120から140 OD600の密度の細胞スラリーを生成した。細胞を、温度が30℃未満に制御された700〜800バールのNiro NS30006ホモジナイザーに2回通すことによる均質化によって溶解させた。溶解物の温度を監視して、均質化処理を通じてそれが50℃未満に維持されていることを確認した。
【０３４５】
加熱ステップ。均質化の後、細胞溶解物の温度を20℃に調整し、1NのNaOHの添加によってpHを約8.0に調整した。細胞溶解物を穏やかに65℃に加熱し、30から120分間にわたって65℃に維持し、次いで15℃まで冷却した。
【０３４６】
遠心分離及びろ過。CEPA Z61遠心分離機又はWestfalia CSC-6連続式ディスクスタック遠心分離機を使用して遠心分離することによって、加熱した細胞溶解物を浄化した。可溶性AvPAL変異体ポリペプチドを含む上澄みを維持し、不溶性溶解物ペレットを破棄した。Westfalia遠心分離機からの浄化熱処理溶解物は、下流のフィルターを汚染する懸濁粒子を有していた。様々なフィルターを試験した後、250L浄化熱処理溶解物を処理するのに好適なろ過スキーム、すなわち、浄化加熱処理溶解物を、(a)1.3m2Cuno R55SP Zetacarbon深層フィルター、0.5〜1.0μm、(b)7.5m2Pall KS50P単層セルロース系深層フィルター、0.4〜0.8μm、(c)7.5m2Pall EKMP単層セルロース系深層フィルター、0.2〜0.5μm、及び(d)6.6m2Pall EDF二層PES/PVDF滅菌グレードフィルター、0.2μmに150LMHの流量で順次通すスキームを特定した。
【０３４７】
AIEXクロマトグラフィー及びHICクロマトグラフィー。AIEXカラム樹脂をMacroPrep High QからToyopearl Giga Cap Q 650M(TPGQ、Tosoh Biosciences社)に変更し、TPGQ AIEXカラムが一番目で、Toyopearl Butyl 650M(TPB、Tosoh Biosciences社)HICカラムが二番目になるように、カラムの順序を逆転したことを除いては、実施例2に記載されているとおりに、AvPAL変異体ポリペプチドAvPAL_C565SC503Sを、疎水性相互作用(hydrophobic interaction)(HIC)カラム及び陽イオン性交換(AIEX)カラムに順次通すことによって浄化加熱処理溶解物から精製した。他のAIEX及びHICカラム樹脂を使用できること、及びHICカラムの代わりにサイズ排除クロマトグラフィーを使用できることが理解されるべきである。
【０３４８】
浄化加熱処理溶解物をpH7.8の25mMのTris-HClで2倍に希釈し、pH7.8の25mMのTris-HClにて平衡化されたTPGQ AIEXカラムに充填した。カラムを25mMのTris-HCl、130mMのNaCl(pH7.8)で洗浄し、AvPAL_C565SC503Sを、25mMのTris-HCl中130から1000mMのNaCl(pH7.8)の勾配を使用して溶出させた。AvPAL_C565SC503Sを含むフラクションを貯蔵し、25 mMのTris-HCl、1.2 Mの(NH4)2SO4(pH 6.5)で2倍に希釈し、25 mMのTris-HCl、0.64Mの(NH4)2SO4(pH 6.5)で平衡化されたTPB HICカラムに充填した。カラムを25 mMのTris-HCl、0.58 Mの(NH4)2SO4(pH 6.5)で洗浄し、AvPAL_C565SC503Sを、25 mMのTris-HCl中0.58から0Mの(NH4)2SO4(pH6.5)の勾配を使用して溶出させた。AvPAL_C565SC503Sを含むフラクションを貯蔵した。
【０３４９】
製造方法のこの段階において、精製AvPAL_C565SC503Sは、抗大腸菌宿主細胞タンパク質(ECP)ELISA、SDS-PAGE、及びそれに続くクーマシー染色、銀染色、抗AvPALウェスタンブロッティング及び抗ECPウェスタンブロッティング、並びにSE-HPLCによって測定した場合に高レベルの純度を示した。HICカラムがAIEXカラムの後に続くようにカラムの順序を逆転させると、SE-HPLCによって測定した精製AvPAL_C565SC503Sの凝集が低減された。3回の処理において、AIEXカラムの後の7.58%+/-1.68%と比較して、HICカラムの後の精製AvPAL_C565SC503Sに0.07%+/-0.03%の凝集体(非凝集(すなわち四量体)酵素に対する凝集酵素の百分率での比)が検出された。
【０３５０】
AvPALバルク(凍結保存) 。HICカラムからの溶出の後に、通常通り、精製AvPAL_C565SC503Sを凍結保存する。大規模製造では、バルク精製AvPAL_C565SC503Sを、不連続温度ステップを使用して液体窒素で凍結し、次いで約-30℃以下の温度、例えば約-70℃又は約-80℃で保存する。制御凍結は、非制御凍結と比較して酵素の凝集の低減をもたらした。5%、10％若しくは15%のグリセロール、10%のスクロース又は10%のソルビトールを含む糖又はポリオールを、凍結の前にバルク精製AvPAL_C565SC503Sに添加すると、解凍した際の凝集が低減された。例えば、限定することなく、グリセロール、スクロース、トレハロース、グリセリン、ソルビトール及びマンニトール等の１以上の糖又はポリオールを、5%から20%(液体についてはv/v及び粉末についてはw/v)の範囲の様々な濃度で凍結の前にバルク精製AvPAL_C565SC503Sに添加すると、解凍した際の凝集が低減されることが理解されるべきである。
【０３５１】
小規模試験を実施して、酵素の保全性若しくは比活性、又は凝集の量に悪影響を与えることなく、凍結前にバルク精製AvPAL_C565SC503Sを濃縮できるかどうかを判断した。
【０３５２】
25mMのTris-HCl、〜0.24 Mの(NH4)2SO4(pH 6.5)中の精製AvPAL_C565SC503Sの調製物を10%(v/v)の最終グリセロール濃度に調整し、ボトルに当量ずつ分配し、ドライアイスで凍結し、-80℃で保存した。凍結したバルクAvPAL_C565SC503Sを30℃の水浴にて解凍し、0.2μmのPES真空フィルターでろ過し、Hydrosart 30kDa分子量カットオフメンブレン(Sartorius)を使用して限外ろ過により濃縮した。AvPAL_C565SC503Sを限外ろ過によって濃縮した。酵素を2倍、4倍、8倍及び16倍に濃縮した際にアリコートを除去することにより、2.5mg/mLから約35mg/mLの酵素濃縮物を得た。分析用に取り出した試料を0.2μmのAcrodisk Suporシリンジフィルターでろ過し、-80℃まで凍結し、3日間保存し、30℃の水浴にて解凍した。凍結-解凍後のタンパク質の回復、比活性の回復、タンパク質の保全性及び凝集のレベルから判断すると、バルクAvPAL_C565SC503Sの濃縮は、酵素に悪影響をもたらしていなかった。
【０３５３】
バルクAvPAL(解凍)。大規模製造では、凍結バルク精製AvPAL_C565SC503Sを不連続制御ステップで解凍する。制御解凍は、非制御解凍と比較して、酵素凝集の低減をもたらす。
【０３５４】
限外ろ過/透析ろ過。ペグ化の前に、凝集を最小限にしてバルク精製AvPAL_C565SC503Sを濃縮するために、一連のろ過ステップを実施した。解凍したバルク精製AvPAL_C565SC503Sをガラス繊維フィルターでろ過した後に、ナイロンフィルターでろ過して、大きな凝集を除去した。ろ過したバルク精製AvPAL_C565SC503Sに限外ろ過/透析ろ過を施して、酵素を約75mg/mLまで濃縮した。原型の透析ろ過緩衝液は、200mMのリン酸カリウム(Kpi)(pH8.5)であったが、50mMのリン酸カリウム(Kpi)、10mMのトランス桂皮酸(t-CA)、5%グリセロール(pH8.5)に変更された。Kpi濃度の低減並びにt-CA及びグリセロールの添加は、SE-HPLCによって検出されるタンパク質凝集の低減をもたらすことが判明した。緩衝剤濃度が後のペグ化処理と適合可能なほど低い濃度に維持されるのであれば、炭酸塩及びホウ酸塩、並びにリン酸ナトリウム(NaPi)などの他のリン酸塩などの他の緩衝剤を使用することができる。限外ろ過/透析ろ過後に、バルク精製AvPAL_C565SC503Sをガラス繊維フィルター、続いてナイロンフィルターで再ろ過した。
【０３５５】
限外ろ過/透析ろ過したAvPAL_C565SC503Sを200mMのKpi、8mMのt-CA、4%グリセロール、0.02%ポリソルベート80(PS80)(pH8)中約60mg/mLに調整し、次いでPVDFフィルターでろ過した。PS80を添加すると、タンパク質沈殿の形成が防止されることが判明した。ポリソルベート20(PS20)及びBrij 35等の他の非イオン性洗剤を使用して、沈殿を防止することができる。
【０３５６】
NHS-PEGの添加。上記酵素濃度を高めた結果として濃度を調整したことを除いては、基本的には実施例6に記載したとおりに精製AvPAL_C565SC503Sをペグ化した。最終的なペグ化反応混合物は、15mg/mLのAvPAL_C565SC503S、13.1mMの20kDa NHS活性化PEG(NOF)、1.5mMのt-CA及び0.005%のPS80であった。周囲温度で3時間後、反応混合物を約2.3mg/mLの酵素濃度まで希釈し、Tris/NaCl緩衝剤の添加によって失活させた。
【０３５７】
遊離PEGの除去及び最終配合物。基本的には実施例6に記載したとおりに限外ろ過/透析ろ過により遊離PEGをペグ化AvPAL_C565SC503Sから除去し、次いで基本的には実施例11及び13に記載したとおりに配合した。
【０３５８】
ペグ化AvPAL_C565SC503S配合バルク薬物質(PEG-PAL FBDS)(凍結保存)。配合したペグ化AvPAL_C565SC503Sを凍結し、-70℃で保存した。最終的な配合薬生産物は、最小限の凝集で10mg/mLの酵素濃度を有する。
【０３５９】
［実施例19  原核生物PAL組成物での臨床的評価］
以下の実施例は、本明細書中で提供する治療方法における、原核生物PAL、又はその生物学的に活性のある変異体、突然変異体及びフラグメント([原核生物PAL])を含む組成物の臨床的評価に用いられるパラメーターに関するガイダンスを提供する。他の箇所で説明したとおり、原核生物PALをHPA、軽度PKU及び古典的PKUの治療に使用することができる。臨床試験が行われ、安全性、薬動力学、並びに、代替エンドポイント及び明確な臨床的エンドポイント両者の初期反応に関する原核生物PALの経口又は皮下用量の評価を提供する。当該臨床試験は、100人の評価可能な患者の十分な安全性情報を収集するために、最低で24週間にわたって実施されるが、必ずしもこれに限定されない。当該臨床試験の初期用量は、約0.001〜約1.0mg/kg/週で変動する。この用量により、患者における過剰な血漿Pheレベルの低減がもたらされない場合、又は血漿Pheレベルを増加させずに毎日の経口Phe摂取量を増加させる能力として測定される有意な直接的臨床的便益がもたらされない場合は、投与を必要に応じて増やし、24週間の(但し、必ずしもそれに限定されない)追加的な最小限の期間にわたって維持して、安全性を確保するとともに、更なる有効性を評価することができる。
【０３６０】
安全性の判断は、相違のある、有害事象、アレルギー反応、完全な臨床化学パネル（腎臓及び肝機能）、尿検査、及びCBCを含む。また、血液Phe量の低減、神経心理及び認識機能検査、並びに包括的評価を含む他のパラメーターがモニターされる。更に、本発明の実施例は、循環における薬剤の薬動力学パラメーター、並びに、原核生物PALの、血液中における一般的な分布及び半減期の判断を意図するものである。これらの判断は、臨床反応に対して用量を関連付けることを支援するものと予想される。
【０３６１】
（方法）
血漿Phe量が上昇した患者は、病歴及び健康診断、神経心理及び認識機能検査、臨床検査（CBC、Panel 20、CH50、UA）の標準セット、尿のプテリン量、ジヒドロプテリジン還元酵素(DHPR)量、並びに、血清アミノ酸の血液（血漿）パネルの絶食という、ベースラインを経験する。患者は、厳密に毎週通院する必要がある。患者は、治療期間の終了１週間後、完全な評価のために病院に戻る。用量増加が必要であれば、患者は、上述に概説された同様のスケジュールに従う。安全性が試験全体にわたってモニターされる。
【０３６２】
（診断、及び包含／除外の基準）
患者は、遺伝子試験及び血液におけるPheレベルの上昇によって確認されたHPA又は軽度PKUの診断書を有する男性又は女性であり得る。試験には、食事制限に厳密に従わないHPA又はPKU患者が含まれることになる。出産の可能性を有する女性患者は、各投与の直前に陰性の妊娠試験(尿中β-hCG)を有さなければならず、試験全体を通じて医学的に承認された避妊法を使用するよう勧告されなければならない。患者は、妊娠又は授乳している場合;試験に参加する前の30日以内に治験薬を与えられた場合;又は特定の医学的状態、重度の併発病、若しくは試験コンプライアンスを有意に低下させ得るその他の酌量状況を有する場合は、この試験から除外されることになる。
【０３６３】
(食事性介入)
最初の無作為化及び2週間の治療期間の後に、すべての試験参加者は、食事カウンセリングを受け、全体で4から6週間にわたって、標準的な食事療法及び/又はPhe特異的医療食で完成された標準的なPhe制限食餌療法に従うことになる。食事療法を家庭で管理し、食事摂取量を日誌に記録することになる。栄養分及び医療食の摂取量の分析、並びに推奨食事摂取量(RDI)を治療グループ間で比較することになる。
【０３６４】
（原核生物PALの安全性）
原核生物PAL治療は、深刻な急性又は慢性の薬物反応が研究時に生じない場合には、安全であると判断される。薬剤の非常に長期的な投与は、深刻な異常が臨床検査、臨床研究所、又は他の適切な研究で見られない場合には、安全であると判断される。
【０３６５】
[実施例20  ペグ化AvPAL変異体の臨床評価]
ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL、AvPAL_C565SC503Sをヒトにおいて臨床評価する。臨床評価の目的は、PKU患者における安全性、許容性、薬物動態(pharmacokinetics)(PK)及び有効性を判断することである。血液Pheレベルは、臨床的エンドポイントとしての役割を果たすことになる。
【０３６６】
(段階1)
段階1は、16から50歳の年齢の35PKU患者における非盲検1回投与増量試験である。一次的な目的は、ペグ化二重システイン突然変異体AvPAL、AvPAL_C565SC503Sの安全性及び許容性を評価することであり、二次的な目的は、ペグ化酵素のPK及びPheの低減を評価することである。5人の被験者の7つのコホートに、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3及び1 mg/kgの上昇投与量のペグ化AvPAL_C565SC503Sを順次投与する。各コホートにおける被験者は、1回投与を受け、全体で6週間にわたって追跡される。参入基準は、スクリーニングでの血液Pheレベル、及び過去3年間の平均血液Pheレベルが600μM以上であることである。
【０３６７】
(段階2)
段階2の試験を、中断のない2つのパートに分ける。
○  パート1-16週間-8週間の投与、次いでその後の投与量最適化
○  パート2-40週間の延長
【０３６８】
段階2は、35人のPKU患者における2つのパートの非盲検投与量最適化試験である。16週間の期間にわたって実施されるパート1は、ペグ化AvPAL_C565SC503Sの投与物を8週間にわたって毎週1回投与した後、一定期間の投与量最適化を行うことを含む。600μMを下回る血液Phe濃度を達成するように各被験者の投与量を調整する。一次的な目的は、ペグ化AvPAL_C565SC503Sの多投与の安全性及び許容性を評価することであり、二次的な目的は、血液Phe濃度、免疫応答、例えば抗AvPAL抗体力価及び定常状態PKに対するペグ化酵素の影響を評価することである。パート2では、個別化された最適化投与量及び投与頻度で、被験者にペグ化AvPAL_C565SC503Sを40週間にわたって投与する。
【０３６９】
(段階3)
段階1及び2の試験が完了すると、追加的な試験は、例えば、限定することなく、非PKU HPA患者、BH4-応答性PKU患者及び非BH4応答性PHU患者などの特殊な集団における更なる試験を含む、より多くの数の被験者における段階3の6ヵ月二重盲検試験を潜在的に含んでいてもよい。
（配列表）
【０３７０】
本明細書は、配列表のコンピュータ読取可能書式(CRF)のコピーとともに出願されている。2010年1月29日に作成され、サイズが53,623バイトである11808-101_SEQLIST.txtという名称のCRFは、配列表のペーパーコピーと同一であり、その全体が参照により本明細書中に組み込まれている。
【０３７１】
当業者であれば、上の実施例で説明したような本発明の多くの改良及び変形を想到するものと考えられる。したがって、添付した特許請求の範囲で開示したような限定のみが本発明に構成されるべきである。
【図１Ａ】
2013518893.tif 000036
【図１Ａ−１】
2013518893.tif 000037
【図１Ｂ】
2013518893.tif 000038
【図２Ａ】
2013518893.tif 000039
【図２Ａ−１】
2013518893.tif 000040
【図２Ｂ】
2013518893.tif 000041
【図３】
2013518893.tif 000042
【図４】
2013518893.tif 000043
【図４−１】
2013518893.tif 000044
【図４−２】
2013518893.tif 000045
【図４−３】
2013518893.tif 000046
【図５Ａ】
2013518893.tif 000047
【図５Ｂ】
2013518893.tif 000048
【図５Ｃ】
2013518893.tif 000049
【図５Ｄ】
2013518893.tif 000050
【図５Ｅ】
2013518893.tif 000051
【図６】
2013518893.tif 000052
【図７Ａ】
2013518893.tif 000053
【図７Ｂ】
2013518893.tif 000054
【図８】
2013518893.tif 000055
【図９】
2013518893.tif 000056
【図１０】
2013518893.tif 000057
【図１１】
2013518893.tif 000058
【図１２】
2013518893.tif 000059
【図１３】
2013518893.tif 000060
【図１４】
2013518893.tif 000061
【図１５Ａ】
2013518893.tif 000062
【図１５Ｂ】
2013518893.tif 000063
【図１６】
2013518893.tif 000064
【図１７】
2013518893.tif 000065
【図１８】
2013518893.tif 000066
【図１９】
2013518893.tif 000067
【図２０】
2013518893.tif 000068
【図２１】
2013518893.tif 000069
【図２２】
2013518893.tif 000070
【配列表】
2013518893000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年10月9日(2012.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013518893000001.app
【国際調査報告】
2013518893.tif 000071
2013518893.tif 000072
2013518893.tif 000073
2013518893.tif 000074