(57)【要約】  本発明はナイセリア属細菌（Neisserial）の免疫原性組成物およびワクチン、それらの製造およびかかる組成物の医薬における使用に関する。特に本発明はH因子結合タンパク質（fHbp）抗原に関わる組成物および方法に関する。本発明者らは、fHbpはST269クローン複合体（これに起因する疾患に関する複数の報告において増殖すると考えられる菌株のサブセット）における発現が乏しいこと、そして、これらの菌株に対して保護を誘発し得るさらなる抗原と共にワクチンを製剤することにより、fHbpを含むワクチンを、前記菌株に対してより有効にすることができるのを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1)第1のfHbp、ポリペプチド抗原；および(2)髄膜炎菌ST269に対して抗体応答を作製することができる第2の抗原を含むものである、ナイセリア菌感染または疾患を予防するための免疫原性組成物。
【請求項２】
ナイセリア菌感染または疾患を予防する方法であって、それを必要とする個体に(1)第1のfHbp、ポリペプチド抗原；および(2)髄膜炎菌ST269に対して抗体応答を作製することができる第2の抗原を含む免疫原性組成物を投与するステップを含むものである前記方法。
【請求項３】
第2の抗原は髄膜炎菌ST269が病因である感染または疾患の予防用である、請求項１または２に記載の免疫原性組成物または方法。
【請求項４】
(1)第1のfHbp、ポリペプチド抗原；および(2)髄膜炎菌ST269に対して抗体応答を作製することができる第2の抗原を含むものである免疫原性組成物。
【請求項５】
第2の抗原は髄膜炎菌ST269が病因である感染または疾患の予防における使用に好適である、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ナイセリア菌感染または疾患が病因である感染または疾患の予防用である医薬の調製における、(1)第1のfHbp、ポリペプチド抗原；および(2)髄膜炎菌ST269に対して抗体応答を作製することができる第2の抗原の使用。
【請求項７】
組成物または方法は髄膜炎菌が病因である感染または疾患の予防用である、請求項１〜６のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、方法または使用。
【請求項８】
組成物は髄膜炎菌L2免疫型が病因である感染または疾患の予防用である、請求項１〜７のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、方法または使用。
【請求項９】
組成物は少なくとも70％は侵害性MenBクローン複合体が病因である髄膜炎菌感染または疾患を予防することができる、請求項１〜８のいずれか1項に記載の免疫原性組成物または方法。
【請求項１０】
第2の抗原はTdfI、Hap、HsfおよびTdfHから選択されるか、または前記抗原の2以上の組み合わせ、例えば、TdfIとHap、TdfIとHsf、HapとHsf、およびTdfIとHapとHsfからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか1項に記載の免疫原性組成物または方法。
【請求項１１】
組成物がさらにナイセリア菌株由来のNadAを含む、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用または方法。
【請求項１２】
１以上の抗原が外膜小胞において発現される、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用または方法。
【請求項１３】
第1と第2の抗原が同じ外膜小胞において発現される、請求項１２に記載の免疫原性組成物、使用または方法。
【請求項１４】
第1と第2の抗原が異なる外膜小胞において発現される、請求項１２に記載の免疫原性組成物、使用または方法。
【請求項１５】
第1と第2の抗原が同時送達用である、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用または方法。
【請求項１６】
組成物が、任意に精製されたサブユニット産物としてまたはブレブ調製物内に、第1の抗原の0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10μg（またはそれ以上）のヒト用量を含むものである、請求項１〜１５のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用または方法。
【請求項１７】
組成物が、任意に精製されたサブユニット産物としてまたはブレブ調製物内に、各第2の抗原の0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10μg（またはそれ以上）のヒト用量を含むものである、請求項１〜１６のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用または方法。
【請求項１８】
(1)第1のfHbp、ポリペプチド抗原および(2)髄膜炎菌ST269に対して抗体応答を作製することができる第2の抗原を含むものであるキット。
【請求項１９】
組成物は、好適には髄膜炎菌由来のさらなる抗原を含むものである、請求項１〜１８のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用、方法またはキット。
【請求項２０】
fHbp抗原は；
(i)  fhBP A、
(ii)  fhBP B、
(iii)  アミノ酸配列F1およびF2を含むキメラタンパク質であって、F1は第1のfHbpアミノ酸配列のN末端断片であり；F2は第2のfHbpアミノ酸配列のC末端断片であり；前記第1と第2のfHbpアミノ酸配列は異なるfHbpファミリー由来であり；断片F1とF2は両方とも長さが少なくとも10個のアミノ酸であり；そしてその融合タンパク質は両方のfHbpファミリーに対して抗体を誘発することができる前記キメラタンパク質、ならびに
(iv)  (i)、(ii)または(iii)に対して80％以上の同一性を有する免疫原性ポリペプチド、
から選択される、請求項１〜１９のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用、方法またはキット。
【請求項２１】
fHbpが脂質化されている、請求項１〜２０のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用、キットまたは方法。
【請求項２２】
fHbpはH因子結合を低下させるかまたは阻止する少なくとも１つの突然変異を有する、請求項１〜２１のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用、キットまたは方法。
【請求項２３】
第1および／または第2の抗原を外膜小胞に発現するステップを含み、前記組成物がナイセリア菌感染または疾患の予防に使用される、先行する請求項のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を製造する方法。
【請求項２４】
外膜小胞を0〜0.5％界面活性剤で抽出する、請求項２３に記載の製造方法。
【請求項２５】
a.  第1のfHbpポリペプチドは好適には単離されかつ少なくとも50％純度に精製されたサブユニットポリペプチドであり、そして第2の抗原は外膜小胞に存在するものである、または
b.  第2の抗原は好適には単離されかつ少なくとも50％純度に精製されたサブユニット抗原であり、そして第1のfHbpポリペプチドは外膜小胞に存在するものである、
先行する請求項のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用、方法またはキット。
【請求項２６】
１以上の抗原が外膜小胞内に含まれ、前記１以上の抗原はアップレギュレーションされていて、無改変の髄膜炎菌、好適には菌株H44/76由来の外膜小胞に存在するタンパク質のレベルより高い抗原のレベルが外膜小胞に存在するものである、先行する請求項のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用、方法またはキット。
【請求項２７】
第2の抗原がST269菌株でないナイセリア菌株由来である、先行する請求項のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用、方法またはキット。
【請求項２８】
第2の抗原が髄膜炎菌のfHbpA株によって引き起こされる感染又は疾患を予防するためのものである、請求項１〜２７のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用、方法またはキット。
【請求項２９】
第1の抗原を、髄膜炎菌L2免疫型に対して抗体を誘発することができる抗原、任意に、L2 LOS、TdfI、Hap、HsfおよびTdfHから選択されるか、または前記抗原の2以上の組み合わせ、例えば、L2 LOSとTdfI、L2 LOSとHap、L2 LOSとHsf、TdfIとHap、TdfIとHsf、HapとHsf、TdfIとHapとHsf、L2 LOSとTdfIとHap、L2 LOSとTdfIとHsf、ならびにL2 LOSとHapとHsfからなる群より選択される抗原と組み合わせるものである、請求項１〜２７のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用、方法またはキット。
【請求項３０】
免疫原性組成物またはキットは髄膜炎菌感染または疾患の治療または予防用、例えば、髄膜炎菌L2免疫型感染または疾患の治療または予防用である、請求項２９に記載の免疫原性組成物、使用、方法またはキット。
【請求項３１】
髄膜炎菌ST11クローン複合体菌株に対する抗体を誘発することができる抗原が髄膜炎菌L2免疫型でない菌株由来である、請求項２９または３０に記載の免疫原性組成物、使用、方法またはキット。
【請求項３２】
第1の抗原を、髄膜炎菌ST11クローン複合体菌株に対して抗体を誘発することができる抗原、任意に、L2 LOS、TdfI、Hap、HsfおよびTdfHから選択されるか、または前記抗原の2以上の組み合わせ、例えば、L2 LOSとTdfI、L2 LOSとHap、L2 LOSとHsf、TdfIとHap、TdfIとHsf、HapとHsf、TdfIとHapとHsf、L2LOSとTdfIとHap、L2 LOSとTdfIとHsf、およびL2 LOSとHapとHsfからなる群より選択される抗原と組み合わせる（または製剤する）ことを特徴とする、請求項１〜３１のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用、方法またはキット。
【請求項３３】
免疫原性組成物またはキットは髄膜炎菌感染または疾患の治療または予防用、例えば、髄膜炎菌ST11クローン複合体感染または疾患の治療または予防用である、請求項３２に記載の免疫原性組成物、使用、方法またはキット。
【請求項３４】
髄膜炎菌ST11クローン複合体菌株に対する抗体を誘発することができる抗原が髄膜炎菌ST11でない菌株由来である、請求項３２または３３に記載の免疫原性組成物、使用、方法またはキット。
【請求項３５】
第1の抗原をNadAと組み合わせるまたは製剤する、請求項１〜３４のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用、方法またはキット。
【請求項３６】
第1の抗原をLipo28と組み合わせるまたは製剤する、請求項１〜３5のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、使用、方法またはキット。
【請求項３７】
請求項１〜３６に記載の免疫原性組成物の第1の抗原を含むワクチンを、髄膜炎菌クローン複合体ST269、または免疫型L2とクローン複合体ST269、またはクローン複合体ST11とクローン複合体ST269、または免疫型L2とクローン複合体ST11とクローン複合体ST269が病因である疾患または感染の予防における使用にとってより好適であるように改善する方法であって、請求項１〜３６のいずれか1項に記載の免疫原性の第1の抗原を第2の抗原と共に製剤して請求項１〜３６のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を生産するステップを含むものである前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はナイセリア属細菌（Neisserial）の免疫原性組成物およびワクチン、これらの製造、ならびにかかる組成物の医薬における使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナイセリア菌株（Neisserial strains）は多数のヒト病理の病原体であり、これに対して有効なワクチンを開発する必要性が存在する。特に淋菌（Neisseria gonorrhoeae）および髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）は、ワクチン接種によって治療しうる病理を引き起こす。
【０００３】
髄膜炎菌は、特に小児および若年成人において重要な病原体である。敗血症および髄膜炎は侵襲性髄膜炎菌性疾患(IMD)の最も生命を脅かす形態である。この疾患は、その高い罹患率および死亡率の故に、世界的な健康問題になっている。
【０００４】
13種の髄膜炎菌血清群が、莢膜多糖類の抗原差異に基づいて特定されており、最も一般的なものは、A、BおよびCであり、これらは世界中の疾患の90％を占める。血清群Bは欧州、米国および中南米のいくつかの国において髄膜炎菌性疾患の最も一般的な原因である。
【０００５】
血清群A、C、WおよびYの莢膜多糖類に基づくワクチンが開発され、髄膜炎菌性疾患のアウトブレイクを抑制することが示されている（Peltola et al 1985 Pediatrics 76; 91-96）。しかし血清群Bは免疫原性が不十分であり、ただ主にIgMアイソタイプの一時的な抗体応答だけを誘発する（Ala'Aldeen D and Cartwright K 1996, J. Infect. 33; 153-157）。従って、ほとんどの温帯の国々の大多数の疾患に関わる血清群B髄膜炎菌に対して現在利用可能な広く有効なワクチンは存在しない。欧州、豪州および米国において主に5歳未満の子供における血清型B疾患の発生率は増加しているので、これは特に問題である。血清群B髄膜炎菌に対するワクチンの開発が特に困難な理由は、この多糖莢膜がヒト神経細胞接着分子と免疫学的に類似する故に免疫原性が乏しいからである。
【０００６】
ワクチン生産の戦略はそれ故に髄膜炎菌の外膜の表面露出構造に重点がおかれてきた、しかし、これは菌株間のこれらの抗原の著しい変動により妨げられている。
【０００７】
髄膜炎菌に対するワクチンにおける使用を意図した1つの抗原はfHbpである。Lewisらは、ワクチン候補としてのfHbpの地位を開示している（Expert Reviews Vaccines 8(6)p729, (2009)）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Peltola et al 1985 Pediatrics 76; 91-96
【非特許文献２】Ala'Aldeen D and Cartwright K 1996, J. Infect. 33; 153-157
【非特許文献３】Expert Reviews Vaccines 8(6)p729, (2009)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はナイセリア菌感染または疾患を予防するために、(1)第1のfHbp、ポリペプチド抗原；および(2)第2の髄膜炎菌ST269に対して抗体応答を作製することができる抗原を含むものである免疫原性組成物に関する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明はナイセリア菌感染または疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする個体に(1)第1のfHbp、ポリペプチド抗原および(2)第2の髄膜炎菌ST269に対して抗体応答を作製することができる抗原を含む免疫原性組成物の保護用量を投与するものである前記方法に関する。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は(1)第1のfHbp、ポリペプチド抗原；および(2)第2の髄膜炎菌ST269に対して抗体応答を作製することができる抗原を含むものである免疫原性組成物に関する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は髄膜炎菌感染または疾患が病因である感染または疾患を予防するための医薬の調製における、(1)第1のfHbp、ポリペプチド抗原；および(2)第2の髄膜炎菌L2免疫型に対して抗体応答を作製することができる抗原の使用に関する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は(1)第1のfHbp、ポリペプチド抗原；および(2)第2の髄膜炎菌ST269に対して抗体応答を作製することができる抗原を含むものであるキットに関する。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は免疫原性組成物を調製する方法であって、fHbp抗原を、髄膜炎菌ST269に対して抗体応答を作製することができる第2の抗原と組み合わせるステップを含むものである前記方法に関する。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、第2の抗原がTdfIまたはHsfまたはHapまたはTdfHである、本明細書に記載の免疫原性組成物または方法に関する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも70％は侵害性MenBクローン複合体が病因である髄膜炎菌感染または疾患を予防することができる、本明細書に記載の免疫原性組成物または方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】英国保健局（the Health Protection Agency UK 1999-2006）に寄託した血清群B髄膜炎菌ケース単離体である。ST269ケースにおける増加を見ることができる。
【図２】TdfI構造を示す。
【図３】異なるレベル：高（ライン1）、中間（ライン7）、低（ライン5）および不検出（ライン2、3、4、6）のfHBPを発現する全細胞のウェスタンブロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
配列識別子:
次の配列識別子が配列表に含まれ、本明細書全体で記載される：
配列番号1-ファミリーB fHbpタンパク質の成熟配列のアミノ酸残基1〜137。
【００１９】
配列番号2-ファミリーA fHbpタンパク質の成熟配列のアミノ酸残基136〜254。
【００２０】
配列番号3-領域113〜135にわたるファミリーA由来のコンセンサス配列
配列番号4-領域113〜135にわたるファミリーB由来のコンセンサス配列
配列番号5-菌株MC58由来の成熟ファミリーB fHbp配列
配列番号6-菌株MC58由来の成熟ファミリーB fHbp配列に対する核酸配列
配列番号7-菌株8047由来の成熟ファミリーA fHbp配列
配列番号8-菌株8047由来の成熟ファミリーA fHbp配列に対する核酸配列
配列番号9-ヒスチジンタグをもつ菌株8047由来の全長fHbp配列のアミノ酸27〜273（LVL489）
配列番号10-LVL489に対する核酸配列
配列番号11-ヒスチジンタグをもつ菌株MC58由来の全長fHbp配列のアミノ酸73〜320（LVL490）
配列番号12-LVL490に対する核酸配列
配列番号13-全長ファミリーB fHbp配列のアミノ酸66〜72
配列番号14-ヒスチジンアフィニティタグの配列
配列番号15-ファミリーAとBにおいて同一であるペプチドGEHT（ファミリーAの8047およびファミリーBのMC58成熟配列におけるaa残基136〜139）
配列番号16-融合タンパク質LVL491のアミノ酸配列
配列番号17-LVL491に対する核酸配列
配列番号18-融合タンパク質Aのアミノ酸配列
配列番号19-融合タンパク質Aに対する核酸配列
配列番号20-融合タンパク質Bのアミノ酸配列
配列番号21-融合タンパク質Bに対する核酸配列
配列番号22-融合タンパク質Cのアミノ酸配列
配列番号23-融合タンパク質Cに対する核酸配列
配列番号24-融合タンパク質Eのアミノ酸配列
配列番号25-融合タンパク質Eに対する核酸配列
配列番号26-ファミリーAを示す位置242〜246内のアミノ酸
配列番号27-ファミリーBを示す位置242〜246内のアミノ酸
詳細な説明
本発明は、随所に記載のように、髄膜炎菌fHbpタンパク質単独を用いて配列型ST269に対して有効な保護を達成することは困難であることを示す。ST269は例えば、英国集団において流行型である（Journal of clinical microbiology 2009, page 3577 - 3585を参照）。本発明はST269に対して有効な、すなわち、ST269が病因である感染または疾患に対して保護を与えることができる抗原を含むfHbpワクチン組成物を提供する。
【００２１】
配列型は、7つのハウスキーピング遺伝子の内部断片の配列を用いて細菌種の単離物を特徴付ける多座配列型決定（MLST：Multilocus sequence typing）により同定される。各ハウスキーピング遺伝子について、細菌種内に存在する異なる配列を明確な対立遺伝子として割り当て、そして各単離物について、7つの遺伝子座のそれぞれにおける対立遺伝子が対立遺伝子プロファイルまたは配列型（ST）を規定する。配列型を、中央対立遺伝子プロファイル（遺伝形質）とそれらの類似性によりクローン複合体に分類する。ナイセリア菌については、一般にいったん中央遺伝形質が同定されると、クローン複合体は、それが他の中央遺伝形質とより密接に整合することがなければ、4または5つの遺伝子座における中央遺伝形質が整合するいずれかのSTを含むとして規定される。本明細書における髄膜炎菌ST269またはST11への言及は、それぞれ髄膜炎菌ST269またはST11クローン複合体への言及を含む。
【００２２】
いくつかの態様において、好適な本発明の免疫原性組成物は、髄膜炎菌B株が＞50％、好適には＞60％、好適には＞70％、好適には＞80％、好適には＞90％病因である感染または疾患に対して保護することができる。
【００２３】
いくつかの態様において、好適な本発明の免疫原性組成物は、髄膜炎菌Bクローン複合体の次のグループ：ST41/44、ST269、ST213が＞50％、好適には＞60％、好適には＞70％、好適には＞80％、好適には＞90％病因である感染または疾患に対して保護することができる。
【００２４】
一態様において、これはfHbpに対する抗体を誘発することができる全長fHBPポリペプチドまたはその断片を提供する。かかるfHbpは、例えば、WO/2009/114485に開示された融合ポリペプチドであってもよい。fHbpはいずれかのfHbpファミリー由来であってもよい。一態様において、fHbpポリペプチドは、fHbpに対する抗体を誘発することができるエピトープを含むいずれかのポリペプチドであってもよい。fHbpはまた、GNA1870およびリポタンパク質2086とも呼ばれる。
【００２５】
fHbpはリピド化されていてもよい。
【００２６】
一態様において、fHbpは、異なるfHbpタンパク質由来のアミノ酸の融合タンパク質を含むキメラfHbpタンパク質であってもよい。
【００２７】
用語キメラfHbpタンパク質とfHbp融合タンパク質は本明細書において互換的に用いられる。
【００２８】
本発明はfHbpタンパク質AおよびBの2つのファミリーを特定し、髄膜炎菌感染または疾患に対して保護を与える2つのファミリー由来の配列をもつキメラfHbp融合タンパク質の構築を可能にする。
【００２９】
第1の態様において、本発明は、アミノ酸配列F1およびF2を含む融合タンパク質であって、F1は第1のfHbpアミノ酸配列のN末端断片でありかつF2は第2のfHbpアミノ酸配列のC末端断片である前記融合タンパク質に関する。
【００３０】
一態様においてはこの融合タンパク質はfHbpファミリーB由来のF1 N末端断片およびfHbpファミリーA由来のF2 C末端断片を含むものである。
【００３１】
一態様において、F1とF2は長さが少なくとも10アミノ酸であるが、好適には20アミノ酸、好適には30アミノ酸、好適には40アミノ酸、好適には50アミノ酸、好適には60アミノ酸、好適には70アミノ酸、好適には80アミノ酸、好適には90アミノ酸、好適には100アミノ酸、または好適には110アミノ酸を含むものであり、好適にはfHbpタンパク質のアミノ酸配列から、連続して取ったものである。
【００３２】
一態様において、第1と第2のfHbpファミリー配列の間のアラインメントを考えた場合、F1とF2断片は重複する配列を含まない。
【００３３】
一態様において、融合タンパク質F1+F2は少なくとも200アミノ酸、好適には少なくとも210、少なくとも220、少なくとも230、少なくとも240、少なくとも250アミノ酸の組み合わせた長さを有し、一態様においては、254アミノ酸の全長FHBPタンパク質である。
【００３４】
本発明のいずれかの融合タンパク質の2つの部分、F1とF2は直接連結されている必要はなく、F1とF2の間にリンカーを含んでもよい。しかし、一態様において、F1とF2は直接連結されている。
【００３５】
場合によっては、融合タンパク質は付加、置換または欠失を有してもよい。
【００３６】
一態様において、配列のF1とF2部分は両方とも免疫原性のエピトープを含む。
【００３７】
一態様において、配列のF1またはF2部分はファミリーAとファミリーB fHbpタンパク質に対する抗体を作製するのに好適なエピトープを含有する。
【００３８】
一態様において、N末端断片はfHbpファミリーBタンパク質の成熟配列の140個のN末端アミノ酸、好適にはfHbpタンパク質の成熟配列のN末端の135、136、137、138または139個のアミノ酸の全てまたは部分と同一、また部分であってもよい。
【００３９】
ファミリーB fHbpタンパク質の成熟配列のアミノ酸残基1〜137は全長ファミリーB fHbp配列のアミノ酸残基66〜202を表す。
【００４０】
好適な断片はファミリーB fHbpタンパク質の成熟配列のアミノ酸残基、1〜135、1〜136、1〜137、1〜138および1〜139、8〜135、8〜137または8〜139である。成熟配列の残基1〜137は次の配列番号1に示したファミリーBの菌株MC58またはファミリーBの他の菌株の同等領域により表される。
【００４１】
配列番号1:
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGE
一態様においては、F1 N末端断片の成熟配列の第1の7個のアミノ酸の1個以上をヒスチジンタグ、または他のアフィニティタグにより置き換えて精製を促進する。さらなる態様においては、ヒスチジンタグ、または他のアフィニティタグを成熟タンパク質のN末端に加えて精製を促進する。
【００４２】
一態様においては、C末端断片はファミリーA fHbpタンパク質の成熟fHbp配列のアミノ酸130〜254、好適には、成熟配列のアミノ酸136〜254、137〜254、138〜254、139〜254または140〜254と同等、またはその部分である。
【００４３】
ファミリーA fHbpタンパク質の成熟配列のアミノ酸残基136〜254は全長ファミリーA fHbp配列のアミノ酸残基155〜273を表す。
【００４４】
いくつかの好適な断片はファミリーA fHbpタンパク質の成熟配列のアミノ酸残基136〜254、137-254、138〜254、139〜254または140〜254である。成熟配列の残基136〜254は、次の配列番号2に示したファミリーAの菌株8047またはファミリーAの他の菌株の同等領域により表される。
【００４５】
配列番号2:
GEHTA FNQLPDGKAE YHGKAFSSDD AGGKLTYTID FAAKQGHGKI EHLKTPEQNV ELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVK IGEKVHEIGIAGKQ
アミノ酸残基GEHTはファミリーAとB（ファミリーAの8047とファミリーBのMC58におけるaa残基136〜139）の間で保存されていて、それ故に両方のファミリーからのアミノ酸配列に含まれうる。
【００４６】
本明細書ではfHbpタンパク質を2つのファミリー、AおよびBに規定する。
【００４７】
一態様において、ファミリー分類は"Sequence Diversity of the Factor H Binding Protein Vaccine Candidate in Epidemiologically Relevant Strains of Serogroup B Neisseria meningitides（血清群B髄膜炎菌の疫学的関連菌株におけるH因子結合タンパク質ワクチン候補の配列多様性）", the Journal of infectious diseases   2009, vol. 200, no3, pp. 379-389に開示されている。
【００４８】
一態様においては、ファミリー同一性を領域136〜254にわたって評価する。
【００４９】
一態様において、同じファミリーのタンパク質は、成熟タンパク質のアミノ酸136から始まりC末端に至るfHbpの配列に基づいて＞80％同一性を有する。
【００５０】
一態様において、異なるファミリーのタンパク質は、成熟タンパク質のアミノ酸136から始まりC末端に至るfHbpの配列に基づいて50〜75％同一性を有する。
【００５１】
一態様において、ファミリー同一性は領域113〜135にわたって評価される。
【００５２】
一態様において、同じファミリーのタンパク質はfHbpの成熟アミノ酸配列の領域113〜135に基づいて＞69％同一性を有する。
【００５３】
一態様において、異なるファミリーのタンパク質は、fHbpの成熟アミノ酸配列の領域113〜135に基づいて＜20％同一性を有する。
【００５４】
一態様において、ファミリーAとBは１以上の次のアミノ酸の存在により識別することができる。
【表１】
2013521327.tif 000002
【００５５】
一態様において、ファミリーAとBは領域113〜135からの次のコンセンサス配列を含む：
A：KINNPDK(I/T)DSLIN(Q/R)RSFLVSGLG （配列番号3）
B：Q(V/I/E)QD(S/P)E(D/H)S(G/R)(K/S)MVAKR(Q/R)F(R/K)IGDI(A/V)（配列番号4）
ファミリーB配列の一例（配列番号5）は菌株MC58である：
2013521327.tif 000003
【００５６】
この配列内で潜在的に重要な配列として特定したアミノ酸には次が含まれる：
・Gly121およびLys122： MAb JAR3と5の結合にとって必須である残基、
・ペプチドGlu146→Arg149およびArg204：MAb502の結合にとって必須である残基、
・残基Pro145、Phe227、Gly228、Lys230およびGlu233： MAb502認識に潜在的に小さい役割を果たしうる残基、
・Glu218およびGlu239（*）：H因子結合に関わる残基。
【００５７】
対応する核酸配列（配列番号6）:
2013521327.tif 000004
【００５８】
ファミリーBの他の種の例には、菌株H44/76、M982、M060240006、03s-0408が含まれ、そしてその他の例も当業者に周知であろう。
【００５９】
ファミリーA配列（配列番号7）の一例は菌株8047である：
2013521327.tif 000005
【００６０】
この配列内で潜在的重要である配列として特定されたアミノ酸には次が含まれる：
Ala173：MAb JAR11の結合にとって必須である残基
Lys179およびGlu191：MAb JAR10の結合にとって必須である残基
Ser215：MAb JAR13の結合にとって必須である残基
Glu217（*）およびGlu238：H因子-結合に関わる。註：いくつかの菌株において、第2のグルタミン酸はThr238（*）により置き換えることができる（菌株8047の例）。これらの菌株はまたH因子と結合することができる。
【００６１】
対応する核酸配列（配列番号8）：
2013521327.tif 000006
【００６２】
ファミリーAの他の種の例には、菌株M1239、M981、M08_240117、M97252153が含まれ、その他の例は当業者に周知でありうる。
【００６３】
融合タンパク質は好適には、本明細書に記載の両方のファミリーメンバーに対する抗体を誘発することができる。一態様において、融合タンパク質は、好適には、ファミリーAまたはファミリーB fHbp分子を発現する髄膜炎菌による感染に応答して、中和化抗体を誘発することができる。
【００６４】
好適にはこのキメラタンパク質は、有効用量を投与すると、ナイセリア菌感染に対する保護免疫応答、より好適には、髄膜炎菌血清群B感染に対する保護を誘発する。
【００６５】
一態様において、この融合タンパク質はナイセリア菌全長fHbpタンパク質に対して作製される抗体、または哺乳動物宿主のナイセリア菌による感染により作製される抗体について免疫学的に反応性がある。
【００６６】
一態様において、キメラタンパク質はfHbp AまたはfHbp Bのいずれかを発現する菌株の補体死滅に介在する細菌抗体の生産を誘発することができる。
【００６７】
一態様において、本発明の融合タンパク質はH因子結合を阻止するかまたは低下させる突然変異を少なくとも１つ有する。
【００６８】
一態様において、その突然変異は欠失、挿入または置換である。H因子結合は、例えば、ELISAまたは表面プラズモン共鳴により試験したヒトH因子結合であってもよい（M.C. Schneider et al., 2009 “Neisseria meningitidis recruits factor H using protein mimicry of host carbohydrates（髄膜炎菌は宿主糖類のタンパク質模倣を利用してH因子を補充する）” Nature Lettersに開示されている）。
【００６９】
一態様において、H因子結合を阻止する突然変異はC末端のF2断片（fHbpのアミノ酸136〜254から）内に含有される。
【００７０】
一態様において、H因子結合を阻止する突然変異はfHbpにおける少なくとも１つのGluのAlaへの置換を含む。さらなる態様において、H因子結合を阻止する突然変異は、F2断片内に含有される次の残基の１以上の置換（fHbp結合を阻止するため）を含む：fHbpファミリーAのGlu 217、Glu/Thr 238；およびfHbpファミリーBのGlu 218、Glu 239。一態様において、１以上の残基をアラニンに突然変異させる。
【００７１】
H因子結合はELISAにより試験することができる。例えば、fHbpポリペプチド（キメラまたは非キメラ）をマイクロプレートにコーティングしてもよい。飽和と洗浄の後に、精製ヒトfHまたは組換えヒトfHをマイクロウエル中でインキュベートすると、ヒトfHに対するウサギ抗体の付加および引き続いてのペルオキシダーゼと結合した抗ウサギIgGとのインキュベーションを介してfHbpとの結合が現れる（洗浄後）。
【００７２】
F1断片がファミリーB由来である一態様において、F1断片は位置121にGlyおよび位置122にLysを含む（番号は参照ファミリーB菌株としてMC58菌株に基づく）。
【００７３】
一態様において、融合タンパク質は抗体JAR3またはJAR5と結合することができる。
【００７４】
F2断片がファミリーA由来である一態様において、F2断片は次のアミノ酸：Ala 173；Ser 215；Lys 179およびGlu 191の１以上または全てを含み（番号は参照ファミリーA菌株として8047菌株に基づく）、そして一態様においてはLys 179とGlu 191の両方を含む。一態様において、融合タンパク質は抗体JAR10、JAR11、JAR13の１以上と結合することができる。
【００７５】
F2断片がファミリーA由来である一態様において、融合タンパク質は、天然アミノ酸を置換える次のアミノ酸：Ala217、任意にAla（位置238）、Glu146、位置146に挿入されたGly、このグルタミンの後に（その後の番号は野生型8047配列に対して+1だけシフトされる）、Gly148、Arg149およびArg204の１以上または全てを含むように構築される（番号は参照ファミリーA菌株として8047菌株に基づく）。一態様において、融合タンパク質はMAb502と結合することができる。
【００７６】
F2断片がファミリーA由来である一態様において、断片はPro 145、Phe 227、Gly 228、Lys 230およびGlu 233の１以上のまたは全てを含んでもよい。一態様において、融合タンパク質はMAb502と結合することができる。
【００７７】
以上に述べた抗体は次の文献に言及されており、本明細書にその全てが参照により組み込まれる：P.T. Beernink and D.M. Granoff, 2008 “Bactericidal antibody induced by meningococcals recombinant chimeric factor H-binding protein vaccines（髄膜炎菌組換えキメラH因子結合タンパク質ワクチンにより誘発される殺菌性抗体）” Inf. & Imm. vol. 76, p. 2568-2575；P.T. Beernink et al., 2008 “Fine antigenic specificity and cooperative bactericidal activity of monoclonal antibodies directed at the meningococcal vaccine candidate Factor H-binding protein” Inf. & Imm. vol. 76, p. 4232-4240；M. Scarselli et al., 2009 “Epitope mapping of a bactericidal monoclonal antibody against the factor H binding protein of Neisseria meningitidis（髄膜炎菌のH因子結合タンパク質に対する殺菌性モノクローナル抗体のエピトープマッピング）” J. Mol. Biol. vol. 386, p. 97-108)。一態様において、fHbpにはかかる文献のいずれかにおいて免疫原性に関係があると開示されたアミノ酸が含まれる。
【００７８】
一態様において、1以上の上に規定したアミノ酸改変を含む開示のキメラタンパク質は、これらの改変のないキメラタンパク質と比較して、fHbpを発現する菌株に対する殺菌力価の増加を示す。
【００７９】
一態様において、本発明の融合タンパク質は成熟ファミリーB fHbpタンパク質由来の残基1〜135、1〜136、1〜137、1〜138または1〜139および成熟ファミリーA fHbpタンパク質の残基136〜254、137〜254、138〜254、139〜254または140〜254を含み、そしてH因子と結合することはできない。
【００８０】
一態様において、本発明の融合タンパク質は成熟ファミリーB fHbpタンパク質由来の残基8〜135、8〜136、8〜137、8〜138または8〜139、任意にヒスチジンタグ、および成熟ファミリーA fHbpタンパク質の残基136〜254、137〜254、138〜254、139〜254または140〜254を含み、そしてH因子と結合することはできない。
【００８１】
一態様において、成熟ファミリーB fHbpタンパク質由来の最初の7個のアミノ酸の1個以上が存在せず、そして精製を促進するためにヒスチジンタグまたは他のアフィニティタグにより置換えることができる。かかる場合には、融合タンパク質のファミリーB fHbp部分は成熟配列の残基2、3、4、5、6または7から出発する。
【００８２】
一態様において、融合ポリペプチドは、例えば、MC58配列を有するファミリーB fHbpタンパク質由来の残基1〜135、1〜136、1〜137、1〜138；または1〜139、および、例えば、菌株8047の配列を有するファミリーA fHbpタンパク質の残基136〜254、137〜254；138〜254；139〜254；または140〜254を含み、融合タンパク質は、天然アミノ酸を置換える次のアミノ酸：Ala217、任意にAla（位置238）、Glu146、位置146に挿入されたGly、このグルタミンの後に（その後の番号は野生型8047配列に対して+1だけシフトされる）、菌株MC58由来のファミリーB成熟タンパク質配列のGly148、Arg149およびArg204を含むように構築される。これらのアミノ酸は後に例示した構築物Cに見いだされる。一態様において、融合ポリペプチドはさらにPro 145、Phe 227、Gly 228、Lys 230およびGlu 233の１以上または全てを含む。これらのアミノ酸は後に例示した構築物Eに見いだされる。
【００８３】
一態様において、融合ポリペプチドは、本明細書で開示した融合タンパク質LVL491（配列番号16）、A（配列番号18）、B（配列番号20）、C（配列番号22）、D、E（配列番号24）またはF、特に融合タンパク質A、B、C、およびEから選択される。
【００８４】
組成物はまた、ST269クローナル複合体内に髄膜炎菌によって引き起こされる感染又は疾患に対して有効な抗原を含む。
【００８５】
本明細書における両方の抗原を含む免疫原性組成物に対する言及は、組み合わせ送達に対する異なる抗原の真の組み合わせ、例えば、単独ワクチン用量の剤形で、ならびに同時送達または実質的に同時送達（例えば医師への同じ訪問時の各成分の注射による）用の両方の抗原を含む免疫原性組成物として、ならびに、1つの抗原に続いて、ある時間間隔後の、第2抗原の経時的送達を包含することを意図している。従って、本発明の免疫原性組成物は、一元であってもまたは、適宜、組み合わせもしくは経時的送達用の別々の成分を含むものであってもよい。
【００８６】
髄膜炎菌ST269に対する抗体を作製することができる抗原はいずれかの好適な抗原、好適には、ST269の感染が病因である感染または疾患を保護または改善する免疫応答を作製することができる抗原であってもよい。
【００８７】
一態様において、ST269に対して有効である抗原は髄膜炎菌ST269が＞50%、＞60%、＞70%、＞80%、＞90%、さらに好適には髄膜炎菌ST269クローン型の実質的に全て、病因である感染または疾患に対して保護することができる抗原である。
【００８８】
一態様において、前記抗原はTdfI、HsfおよびHapからまたはそれらの組み合わせ、例えば、前記抗原の2つ以上の組み合わせ、例えばTdfIとHap、TdfIとHsf、HapとHsf、およびTdfIとHapとHsfからなる群より選択される。これらの抗原を以下にさらに詳しく考察する。
【００８９】
組成物はまた、髄膜炎菌L2免疫型に対する抗体応答を作製することができる抗原を含んでもよい。本発明者らは、試験したL2菌株の大部分はfHbpを低レベルで発現することを見出した。
【００９０】
髄膜炎菌L2免疫型に対して抗体応答を作製できる抗原は、L2免疫型の＞50％、＞60％、＞70％、＞80％または＞90％による感染が病因である感染または疾患を保護または改善する免疫応答を作製できるいずれかの好適な抗原、好適には、L2免疫型による感染が病因である感染または疾患を保護または改善する免疫応答を作製できる抗原であってもよい。
【００９１】
一態様において、前記抗原は髄膜炎菌L2の50％、＞60％、＞70％、＞80％または＞90％、さらに好適には、髄膜炎菌L2の実質的に全てがコードするまたは発現する抗原であって、さらに好適には、前記％発現は所与の国または地域で循環する菌株について確認されたものである。
【００９２】
一態様において、前記抗原はL2 LOS、Tdfl、HsfまたはHapから選択されるかまたは前記抗原の2以上の組み合わせ、例えば、L2 LOSとTdfI、L2 LOSとHap、L2 LOSとHsf、TdfIとHap、TdfIとHsf、HapとHsf、TdfIとHapとHsf、L2 LOSとTdfIとHap、L2 LOSとTdfIとHsf、およびL2 LOSとHapとHsfからなる群より選択される。これらの抗原をさらに詳しく以下で考察する。
【００９３】
組成物はまた、髄膜炎菌ST11クローン複合体菌株に対する抗体応答を作製することができる抗原を含んでもよい。本発明者らは、多くのL2免疫型菌株はST11クローン複合体由来であることを見出した。
【００９４】
本発明の一態様において、本発明の組み合わせは、ST11（ST11への言及はST11クローン複合体を含む）に対しても有効である抗原を含む。一態様において、ST11クローン複合体に対して有効な抗原は、L2 LOS、Hap、TdfIおよびHsf（以下にさらに詳しく考察される）から選択されるか、または前記抗原の2つ以上の組み合わせ、例えば、L2 LOSとTdfI、L2 LOSとHap、L2 LOSとHsf、TdfIとHap、TdfIとHsf、HapとHsf、TdfIとHapとHsf、L2 LOSとTdfIとHap、L2 LOSとTdfIとHsf、およびL2 LOSとHapとHsfからなる群より選択される。
【００９５】
髄膜炎菌ST11に対する抗体応答を作製することができる抗原は、いずれかの好適な抗原、好適には、ST11による感染が病因である感染または疾患を保護または改善する免疫応答を作製することができる抗原でありうる。
【００９６】
一態様において、ST11に対して有効である抗原は髄膜炎菌ST11が＞50%、＞60%、＞70%、＞80%、＞90%、さらに好適には髄膜炎菌ST11クローン型の実質的に全て、病因である感染または疾患に対して保護することができる抗原である。
【００９７】
本明細書におけるいずれか特定の抗原に対する言及または請求は、前記抗原の全ての欠失、挿入および置換突然変異体、または本明細書に記載の前記抗原の他の特定の変異体、または（前記抗原がポリペプチドである場合）好適には免疫原性であるそのポリペプチドと80％以上、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％同一性を有するポリペプチドを含むものである。
【００９８】
Hsf：Hsfは自己輸送体タンパク質に共通の構造を有する。例えば、髄膜炎菌株H44/76由来のHsfは、アミノ酸1〜51からなるシグナル配列、表面に曝されかつ可変領域（アミノ酸52〜106、121〜124、191〜210および230〜234）を含有する成熟タンパク質のアミノ末端の頭部領域（アミノ酸52〜479）、頸部領域（アミノ酸480-509）、疎水性α-へリックス領域（アミノ酸518〜529）ならびに4つの膜貫通鎖が外膜に架かるアンカードメイン（アミノ酸539〜591）から構成される。
【００９９】
全長Hsfを本発明の免疫原性組成物に用いることはできるが、ワクチンのタイプに応じて様々なHsf末端切断体および欠失体を有効に用いることもできる。
【０１００】
Hsfをサブユニットワクチンに用いる場合、一態様において可溶性パッセンジャードメインの部分；例えば、アミノ酸52〜479の完全ドメイン、最も好適にはその保存部分、例えば、アミノ酸134〜479の特に有効な配列を用いる。一態様においてHsfの形態を末端切断してWO01/55182に開示されるタンパク質の可変域を欠失させてもよい。
【０１０１】
一態様において変異体はWO01/55182に規定された1、2、3、4、または5つの可変域の欠失を含むであろう。前記配列および下記配列は1、3、5、7、10または15個以下のアミノ酸だけ、NまたはC末端のいずれかまたは両方において伸長または末端切断してもよい。
【０１０２】
一態様においてHsfの断片は、従って、好適にはアミノ酸52〜473を含有するHsfの全頭部領域を含む。Hsfのさらなる断片にはアミノ酸配列：52〜62、76〜93、116〜134、147〜157、157〜175、199〜211、230〜252、252〜270、284〜306、328〜338、362〜391、408〜418、430〜440および469〜479の１以上を含む表面が曝された頭部領域が含まれ得る。
【０１０３】
Hsfは外膜小胞調製物中に存在する場合、これを全長タンパク質としてまたは好適にはアミノ酸1〜51と134〜591の融合体から構成される有効な変異体（アミノ酸配列134〜C末端の成熟外膜タンパク質を生じる）として発現させることができる。一態様においてHsfの形態を末端切断してWO01/55182に開示したタンパク質の可変域を欠失させてもよい。一態様において変異体はWO01/55182に規定した1、2、3、4、または5つの可変域の欠失を含みうる。一態様においては、第1および第2可変域を欠失させる。
【０１０４】
一態様において変異体はアミノ酸配列52〜237または54〜237由来の残基を欠失しうるし、さらに好適にはアミノ酸52〜133または55〜133由来の残基を欠失しうる。成熟タンパク質はシグナルペプチドを欠くであろう。
【０１０５】
Hap：髄膜炎菌由来のHap様タンパク質のコンピューター分析は少なくとも3つの構造ドメインを示す。菌株H44/76由来のHap様配列を参照して考えると、アミノ酸1〜42を含むドメイン1は自己輸送体ファミリーの特徴であるsec依存性シグナルペプチドをコードし、アミノ酸43〜950を含むドメイン2は表面に曝されて免疫系に接近可能なパッセンジャードメインをコードし、残基951〜C末端（1457）を含むドメイン3は集合してバレル様構造に組み立てられ外膜内に繋ぎ止められると思われるβ鎖をコードすると予想される。ドメイン2は表面に曝され、よく保存され（試験した全菌株で80％超）、かつ大腸菌のサブユニット抗原として生産されうるので、興味深いワクチン候補を代表する。ドメイン2および3は表面に曝され、よく保存されていると思われるので（Pizza et al. (2000), Science 287: 1816-1820）、これらは興味深いワクチン候補を代表する。ドメイン2はパッセンジャードメインとして公知である。
【０１０６】
本発明の免疫原性組成物は、好適には、OMV調製物中に結合された全長Hapタンパク質を含んでもよい。本発明の免疫原性組成物はまた、菌株H44/76においてアミノ酸残基43〜950、または残基43〜1178由来のN末端断片から構成されるHapのパッセンジャードメインを含んでもよい。Hapのこれらの断片は、特に本発明の組成物のサブユニットで有利に使用しうる。Hapのパッセンジャードメイン（またはN末端断片）に対する前記配列はNまたはC末端のいずれかまたは両方で1、3、5、7、10、15、20、25、または30個以下のアミノ酸だけ伸長または末端切断することができる。
【０１０７】
TdfI：ナイセリア菌抗原NMB0964（NMB番号はwww.neisseria.orgから利用しうる髄膜炎菌B群ゲノム配列を意味する）［菌株Z2491の髄膜炎菌グループAゲノムにおけるNMA1161として、およびWO00/55327におけるBASB082として、およびZnuDとして公知］はナイセリア菌全体に保存される抗原であって或る範囲のナイセリア菌株に対する細菌抗体を誘発することができる。本発明者らは、この抗原は細菌においてZn2+受容体として機能し、そしてその発現は培地中のZn2+のレベルにより調節されることを見出した。
【０１０８】
本明細書における用語NMB0964ポリペプチドは、一般に、ナイセリア菌株由来の（TdfI遺伝子によりコードされた）ナイセリア菌TdfIポリペプチドを含む（このタンパク質はナイセリア菌株の間でよく保存されているので、当業者は特定のナイセリア菌株の同一性を容易に識別することができる）。この用語はそれ故に、NMA1161配列、およびWO00/55327のBASB082ポリペプチド配列（およびBASB082ポリペプチドに関する本発明の全てのポリペプチド）を含む。例えば、本発明のNMB0964ポリペプチドは、WO00/55327の配列番号2、または前記配列番号2と70、80、90または95％超の配列同一性をもつポリペプチド、または前記配列番号2からの7、10、12、15または20個（またはそれを超える）の隣接アミノ酸の免疫原性断片（特に、（必要であれば、タンパク質担体とカップリングした時に）前記配列番号2を認識できる免疫応答を誘発することができる前記免疫原性断片）を含むポリペプチドを包含する。NMB0964免疫原性断片の実施形態は、いずれか所与のNMB0964配列に適用した図２の位相幾何学図に示した細胞外ループ配列を含む。前記NMB0964免疫原性の断片ポリペプチド配列は、WO 00/55327の配列番号2からの前記細胞外ループ配列（図２に定義した）と70、80、90または95％を超える配列同一性を有しうるか、またはWO 00/55327の配列番号2からの前記細胞外ループ配列（図２に定義した）からの7、10、12、15または20個（またはそれを超える）の隣接アミノ酸の免疫原性断片（特に、（必要であればタンパク質担体とカップリングした場合）前記配列番号2を認識できる免疫応答を誘発することができる前記免疫原性断片）を含むポリペプチドであってもよく、そして本発明のNMB0964ポリペプチドとして提供される。前記NMB0964免疫原性の断片ポリペプチド配列は、図２に与えた第3の細胞外ループ配列（ここで、任意に、2つのCys残基は保存されるべきであり、かつジスルフィド結合していてもいなくてもよい）からの配列と70、80、90または95、99または100％を超える配列同一性を有しうるか、または前記細胞外ループ配列からの7、10、12、15または20個（またはそれを超える）の隣接アミノ酸
の免疫原性断片（特に、（必要に応じてタンパク質担体とカップリングした場合）前記配列番号2を認識できる免疫応答を誘発することができる前記免疫原性断片）を含むポリペプチドであってもよく、そして本発明のNMB0964ポリペプチドとして提供される。一実施形態において、このNMB0964免疫原性の断片ポリペプチドは全長NMB0964（成熟配列またはシグナルを伴う配列）ポリペプチドではない。
【０１０９】
一態様においては、NMB0964をサブユニットワクチン手法の単離抗原として用いることができる。
【０１１０】
他の態様においては、NMB0964抗原を、被験者に投与すると抗NMB0964抗体を誘発する小胞の生産を提供するのに十分なレベルのNMB0964ポリペプチドを生産するナイセリア種細菌（Neisseria species bacterium）から調製した単離された外膜小胞；および製薬上許容される賦形剤の形態で用いることができる。
【０１１１】
これはNMB0964ポリペプチド生産を遺伝的に改変したナイセリア種細菌によって達成することができるのであって、その遺伝的改変は、例えば：Zurリプレッサー（NMB1266）（培地中のZn2+の存在でNMB0964の発現をスイッチオフするタンパク質）の機能性発現を破壊すること；NMB0964プロモーターをZurと結合しないもの、特に内因性NMB0964プロモーターより強いプロモーター、例えばlacプロモーターと置換えることにより；または、Zn2+濃度の低い（すなわち5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05または0.01μM未満のフリーZn2+）培地、例えば、ICP-MSによりおよそ1.69μM Zn2+を有するRoswell Park Memorial Institute 培地1640（RPMI）の使用、または、例えば、公知の亜鉛キレート剤、例えばTPEN（N,N,N',N'-テトラキス(2-ピリジルメチル)エチレンジアミン）を用いる培地のZn2+の除去（NMB0964の発現を最大化するように培地に十分加えるべきである）を介して行われる。
【０１１２】
ナイセリア種細菌を、例えば、siaD遺伝子の機能性発現の破壊を通して莢膜多糖を枯渇させてもよい。msbBおよび／またはhtrB遺伝子の機能性発現を破壊して外膜小胞中のLOSを解毒してもよい。１以上の次の遺伝子：PorA、PorB、OpA、OpC、PilC、またはFrpBの発現を破壊してもよい。lgtB遺伝子の機能性発現を破壊してもよい。かかる破壊はWO01/09350およびWO2004/014417に記載されている。ナイセリア種細菌は免疫型L2またはL3であってもよい。
【０１１３】
ナイセリア菌株から外膜小胞（ミクロ小胞またはブレブとしても知られる）を調製または単離する方法は当技術分野で周知であり、WO01/09350およびWO2004/014417に、そして以下にも記載されている。典型的には、外膜小胞を、界面活性剤なしで、または0〜0.5、0.02〜0.4、0.04〜0.3、0.06〜0.2、または0.08〜0.15％界面活性剤を用いてのいずれか、例えばデオキシコール酸、例えば、およそまたは正確に0.1％デオキシコール酸を用いて抽出することにより単離する。
【０１１４】
Zn2+の低い特定の培養条件において調製した、または、NMB0964を過剰発現するようにもしくはZurを介して亜鉛抑制機構を除去するように遺伝子操作して作った突然変異体髄膜炎菌株から調製したOMVワクチンはNMB0964が濃厚であり、従って、かかるOMVはこれらの方法で調製しなかったOMVと比較して優れた細菌抗体応答を誘発することができる。
【０１１５】
一態様において、本発明は、被験者に投与すると抗NMB0964抗体を誘発する小胞の生産を提供するのに十分なNMB0964ポリペプチドのレベルを生産するナイセリア種細菌から調製した単離された外膜小胞を含む免疫原性組成物；および製薬上許容される賦形剤を含むものである免疫原性組成物に関する。NMB0964ポリペプチドはナイセリア種細菌にとって内因性であってもよい。ナイセリア種細菌は、外因性NMB0964ポリペプチドをコードする核酸を含有するように遺伝的に改変してもよい。NMB0964ポリペプチドは内因性プロモーターをもつNMB0964遺伝子から発現することができる。ナイセリア種細菌はNMB0964ポリペプチド生産を遺伝的に改変することができる。ナイセリア種細菌はZurリプレッサー（NMB1266）の機能性発現の破壊を通して遺伝的に改変することができる。
【０１１６】
ナイセリア種細菌を遺伝的に改変して異種プロモーターからNMB0964ポリペプチドを発現させることができる。一態様において、この異種プロモーターはZurリプレッサーと結合しない。一態様において、この異種プロモーターはナイセリア種細菌において、NMB0964遺伝子の非抑制型内因性プロモーターより強力なプロモーターである。一態様において、この異種プロモーターはIPTG-誘導性lacプロモーターである。
【０１１７】
一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルはトリプシン・ソイ・ブロス（TSB）で増殖した髄膜炎菌株H44/76により作られたものより高い。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルはRoswell Park Memorial Institute 培地 1640 （RPMI）で作られるものと同じかまたはそれより高い。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルは、Roswell Park Memorial Institute 培地 1640 （RPMI）で1μM TPEN（N,N,N',N'-テトラキス(2-ピリジルメチル)エチレンジアミン）を用いて増殖した髄膜炎菌株H44/76により作られるものと同じかまたはそれより高い。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルは、髄膜炎菌株H44/76により、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05または0.01μMより低いフリーZn2+を有する培地において作られるものと同じかまたはそれより高い。
【０１１８】
一態様において、ナイセリア種細菌は髄膜炎菌、または髄膜炎菌血清群Bである。一態様において、ナイセリア種細菌は莢膜多糖を欠く。一態様において、ナイセリア種細菌はsiaD遺伝子の機能性発現の破壊を通して莢膜多糖を欠く。一態様において、ナイセリア種細菌はmsbBおよび／またはhtrB遺伝子の機能性発現が破壊されている。一態様において、ナイセリア種細菌は次の遺伝子：PorA、PorB、OpA、OpC、PilC、またはFrpBの１以上の発現が破壊されている。一態様において、ナイセリア種細菌はlgtB遺伝子の機能性発現が破壊されている。一態様において、ナイセリア種細菌は免疫型L2またはL3である。
【０１１９】
一態様においては、外膜小胞を0〜0.5、0.02〜0.4、0.04〜0.3、0.06〜0.2、または0.08〜0.15％界面活性剤、例えばデオキシコール酸、例えば、およそまたは正確に0.1％デオキシコール酸を用いて抽出することにより単離する。
【０１２０】
一態様において、本発明は、免疫原性組成物を生産する方法であって、被験者に投与すると抗NMB0964抗体を誘発する外膜小胞の生産を提供するのに十分なレベルのNMB0964ポリペプチドを生産するナイセリア種細菌を培養するステップ；培養した細菌から外膜小胞を調製するステップ；および外膜小胞を製薬上許容される賦形剤と組み合わせてfHbpポリペプチドとの組み合わせで被験者に投与するのに好適な免疫原性組成物を生産するステップを含むものである前記方法に関する。一態様において、NMB0964ポリペプチドはナイセリア種細菌に内因性である。一態様においては、ナイセリア種細菌は遺伝的に改変されていて外因性NMB0964ポリペプチドをコードする核酸を含有する。一態様においては、NMB0964ポリペプチドは内因性プロモーターをもつNMB0964遺伝子から発現される。一態様において、ナイセリア種細菌はNMB0964ポリペプチド生産において遺伝的に改変されている。一態様において、ナイセリア種細菌はZurリプレッサーの機能性発現の破壊を通して遺伝的に改変されている（NMB1266）。一態様においては、ナイセリア種細菌を遺伝的に改変して異種プロモーターからのNMB0964ポリペプチドの発現を提供する。一態様において、異種プロモーターはZurリプレッサーと結合しない。一態様において、異種プロモーターはナイセリア種細菌において、NMB0964遺伝子の非抑制型内因性プロモーターより強力なプロモーターである。一態様において、異種プロモーターはIPTG-誘導性lacプロモーターである。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルは、トリプシン・ソイ・ブロス（TSB）中で増殖した髄膜炎菌株H44/76により作られるレベルより高い。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルは、Roswell Park Memorial Institute 培地1640（RPMI）で増殖した髄膜炎菌株H44/76により作られるレベルと同じかまたはそれより高い。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルは、1μM TPEN（N,N,N',N'-テトラキス（2-ピリジルメチル）エチレンジアミン）を伴うRoswell 
Park Memorial Institute 培地1640（RPMI）で増殖した髄膜炎菌株H44/76により作られるレベルと同じかまたはそれより高い。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルは、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05または0.01μM未満のフリーZn2+を有する培地中の髄膜炎菌株H44/76により作られるレベルと同じかまたはそれより高い。一態様において、ナイセリア種細菌の培養は、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05または0.01μM未満のフリーZn2+を有する培地で行われる。
【０１２１】
一態様においては、ナイセリア種細菌の培養をZn2+キレート剤を含む培地にて行う。一態様において、Zn2+キレート剤は培地に0.01〜100、0.1〜10、0.3〜5、または0.5〜1μMの濃度で存在する。一態様において、培地に存在するZn2+キレート剤はTPENである。一態様において、TPENの濃度は1〜50μM、例えば、1〜30μMである。
【０１２２】
一態様において、外膜小胞を調製するステップは、0〜0.5、0.02〜0.4、0.04〜0.3、0.06〜0.2、または0.08〜0.15％の界面活性剤、例えばデオキシコール酸、例えば、およそまたは正確に0.1〜0.5％デオキシコール酸を用いて抽出することにより行う。一態様において、外膜小胞を調製するステップは、界面活性剤を用いることなく行う。
【０１２３】
一態様においては、fHbpポリペプチドを、次の配列：
RDQYGLPAHSHEYDDCHADIIWQKSLINKRYLQLYPHLLTEEDIDYDNPGLSCGFHDDDNAHAHTHS
と50、60、70、80、90、95、99以上、または100％配列同一性を共有するペプチド配列、または前記配列からの7、10、12、15または20個（またはそれ以上）の隣接アミノ酸の免疫原性断片を含む（場合によっては、ここで、前記ペプチド配列もしくは前記免疫原性の断片は、もし必要であればタンパク質担体とカップリングして、WO00/55327の配列番号2を認識できる免疫応答を誘発することができる）ポリペプチド、ならびに、製薬上許容される担体と組み合わせる。一態様においては、2つのCys残基がポリペプチドに存在し、そしてジスルフィド連結されていてもよい。一態様において、ポリペプチドは全長成熟NMB0964ポリペプチドでないか、または無傷のシグナル配列をもつ全長成熟NMB0964ポリペプチドでない。
【０１２４】
一態様において、免疫原性組成物は髄膜炎菌L2免疫型に対する抗体応答を生じることができる抗原を含む。このような抗原はL2 LOSであり得る。
【０１２５】
LPS（リポ多糖、LOSまたはリポオリゴ糖としても知られる）はナイセリア菌の外膜上の内毒素である。LPSの多糖部分が細菌抗体を誘発することは公知である。LOSの構造および機能は、Verheul, Microbiological reviews, March 1993, Vol 57, no 1, p34-49に記載されている。
【０１２６】
LPSのオリゴ糖部分内の不均一性は色々なナイセリア菌株間の構造および抗原的多様性を生じる（Griffiss et al. Inf. Immun. 1987 ; 55: 1792-1800）。これが髄膜炎菌株をL2免疫型に区分するのに使われている（Scholtan et al. J Med Microbiol 1994,41 : 236-243）。免疫型L3、L7、およびL9は免疫学的にまた構造的に類似しており（あるいは同じですらある）それ故にL3、7、9（または本明細書の目的に対しては同族的に「L3」）と呼んでいる。髄膜炎菌のLPS L3、7、9（L3）、L2およびL5はシアル酸付加により、またはシチジン5'-一リン酸-N-アセチルノイラミン酸の付加により改変することができる。LPS構造および不均一性のさらなる説明については、M. P. Jennings et al, Microbiology 1999, 145, 3013-3021およびMol Microbiol 2002, 43: 931-43を参照されたい。
【０１２７】
L2 LOSはL2免疫型を規定し、従って、fHbpに基づくワクチンを補充する潜在的抗原である。
【０１２８】
L2 LOSは、好適には、ナイセリア菌L2免疫型を死滅することができる抗体を作製する。一態様において、本明細書におけるL2 LOSへの言及はL3V菌株を含む。
【０１２９】
L2 LOSは外膜小胞において提示することができる（OMV-用語「ブレブ」と「外膜小胞」は本明細書において互換的に使われる）、その場合、好適には、前記小胞を低パーセントの界面活性剤、より好適には0〜0.5％、0.02〜0.4％、0.04〜0.3％、0.06〜0.2％、0.08〜0.15％または0.1％、最も好適にはデオキシコール酸（DOC）を用いて抽出する、しかし、L2 LOSはサブユニットワクチンの部分であってもよい。
【０１３０】
さらに一般に、本発明のOMVは低パーセントの界面活性剤、より好適には0〜0.5％、0.02〜0.4％、0.04〜0.3％、0.06〜0.2％、0.08〜0.15％または0.1％、最も好適にはデオキシコール酸［DOC］を用いて抽出することができる。
【０１３１】
LOSは単味で、またはT細胞エピトープの供給源、例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM-197またはOMV外膜タンパク質と結合して用いることができる。
【０１３２】
L2 LOSは解毒されていてもよい。
【０１３３】
かかる態様の全ての詳細を、以下にさらに詳しく、LOSの選択と調製に関連して記載する。
【０１３４】
LPS、好適には髄膜炎菌のLPSが本発明のワクチンに含まれる場合、好適および有利には、免疫型L2およびL3のいずれかまたは両方が存在する。
【０１３５】
一態様において、第2の抗原は内部コアのHep II上の位置6に少なくともPEAを有する髄膜炎菌LPSであって、このHep II上に第2のPEAまたはグルコースを伴うかまたは伴わない。
【０１３６】
本発明の免疫原性組成物に含まれ得る好適な他の抗原は、アドヘシン、自己輸送体タンパク質、毒素、内在性外膜タンパク質およびFe獲得タンパク質を含むタンパク質のカテゴリーから選択することができる。
【０１３７】
一態様において、本発明は少なくともまたは正確に2、3、4、5、6、7、8、9または10種の異なるナイセリア菌抗原を含む免疫原性組成物を提供する。もっとも好適には、これらの抗原は次から選択されるタンパク質の少なくとも2、3、4または5つのグループから選択される：
FhaB、NspA PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB 0315、NMB 0995、NMB 1119およびNadAからなる群より必要に応じて選択されるナイセリア菌アドヘシン；
IgAプロテアーゼ、AspA、およびNadAからなる群より必要に応じて選択されるナイセリア菌自己輸送体；
FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRTおよびLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のいずれかまたは両方からなる群より必要に応じて選択されるナイセリア菌毒素；
TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、Lipo28（GNA2132）、Sibp、NMB0293、FbpA、Bcp、BfrA、BfrBおよびP2086（XthA）からなる群より選択されるナイセリア菌Feもしくは亜鉛獲得タンパク質または他の金属獲得タンパク質；および
ナイセリア菌の膜関連タンパク質、好適には、PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA、LbpA、TspA、TspB、TdfH、PorB、MItA、HpuB、HimD、HisD、OstA、HlpA（GNA1946）、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、およびPldA（OmplA）からなる群より必要に応じて選択される外膜タンパク質、特に内在性外膜タンパク質。
【０１３８】
本発明の抗原は好適に単離されたものであり、これらが人手により改変されていることを意味する。一態様において、これらはある程度、最も好適には（他成分と組み合わせる前の本発明の免疫原性組成物は）40、50、60、70、80、90、95または99％以上の純度である。
【０１３９】
タンパク質を本明細書で具体的に述べる場合、それは生来の全長タンパク質へおよびその自然変異体（すなわち、ナイセリア菌、好適には、髄膜炎菌株から得られる生来のタンパク質）への言及であるが、また、これらの抗原性断片（特にサブユニットワクチンの文脈における）も包含しうる。これらは、タンパク質のアミノ酸配列から、隣接して採取した少なくとも15個のアミノ酸、好適には少なくとも20個のアミノ酸、少なくとも30個のアミノ酸、少なくとも40個のアミノ酸または少なくとも50個のアミノ酸を含有するもしくは含む（しばしば具体的に本明細書で記載した）断片である。抗原性断片はまた、免疫原性断片であってもよい。さらに想定していることとして、タンパク質およびタンパク質配列への言及は本明細書において、前記タンパク質配列由来の、または前記タンパク質のアミノ酸配列由来の7、10、12、15、20、30、40または50個（またはそれ以上）の隣接アミノ酸を含む免疫原性断片を包含するポリペプチドを含むものである（場合によっては、前記免疫原性断片は、もし必要であれば、タンパク質担体とカップリングしている場合、前記タンパク質もしくは前記タンパク質配列を認識しうる免疫応答を誘発することができる）。さらに抗原性断片は、ナイセリア菌全長タンパク質に対して作製される抗体にまたは哺乳動物の宿主のナイセリア菌の感染により作製される抗体と免疫学的反応性のある断片を表す。抗原性断片はまた、有効用量を投与するとナイセリア菌感染に対する保護免疫応答を誘発する断片も含み、さらに好適には、前記断片は髄膜炎菌および／または淋菌感染に対して保護作用があり、最も好適には髄膜炎菌血清群Bの感染に対して保護作用がある。
【０１４０】
前記抗原性断片にはまた、ナイセリア菌タンパク質の組換え融合タンパク質、またはその断片が含まれる。これらは色々なナイセリア菌タンパク質またはそれらの断片を同じポリペプチドに組み合わせることができる。あるいは、本発明はまた、ナイセリア菌タンパク質またはそれらの断片の個々の融合タンパク質を、異種配列、例えば、T細胞エピトープまたは精製タグの提供体、例えば：p-ガラクトシダーゼ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、エピトープタグ、例えばFLAG、mycタグ、ポリヒスチジン、またはウイルス表面タンパク質、例えばインフルエンザウイルス赤血球凝集素、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197との融合タンパク質として含むものである。
【０１４１】
NMB参照（またはGNA参照）に関連した本発明の抗原は、公知の配列に対応する公知の参照番号（当業者に周知の）を言及し、これは（例えば）www.neisseria.orgから入手することができる。
【０１４２】
以上に述べた5つのクラスのタンパク質はWO/2004/014418（本明細書にその全てが参照により組み込まれる）に含まれる。
【０１４３】
1.アドヘシン：
アドヘシンには、FhaB（W098/02547）、NadA（J. Exp. Med (2002) 195: 1445；NMB 1994）、上記のとおりNhhAとしても知られるHsf（NMB 0992）（W099/31132）、上記Hap（NMB 1985）（WO99/55873）、NspA（W096/29412）、MafA（NMB 0652）およびMafB（NMB 0643）(Annu Rev Cell Dev Biol. 16; 423-457 (2000)；Nature Biotech 20; 914-921 (2002))、Omp26（NMB 0181）、NMB 0315、NMB 0995、NMB 1119およびPilC（Mol. Microbiol. 1997,23 ; 879-892）が含まれる。これらはナイセリア菌の宿主細胞表面との結合に関わるタンパク質である。Hsfは自己輸送体タンパク質でもあるアドヘシンの一例である。本発明の免疫原性組成物は、それ故に、Hsfと他の自己輸送体タンパク質との組み合わせを含んでもよく、その場合、Hsfはアドヘシンとしての能力に寄与する。これらのアドヘシンは髄膜炎菌または淋菌または他のナイセリア菌株由来であってもよい。本発明はまた、ナイセリア菌由来の他のアドヘシンも含む。
【０１４４】
FhaB：この抗原はW098/02547に配列番号38（ヌクレオチド3083〜9025）と記載されており、NMB0497も参照されたい。本発明者らは、FhaBが単独で、および特に本発明の他の抗原とともに、抗付着性抗体を誘導するのに有効であることを見出した。全長FhaBを用いてもよいが、本発明者らは特にC末端切断体が、驚くべきことに、少なくとも有効である、好適には、交差菌株効果の点でより有効であることを見出した。かかる末端切断体はまた、有利なことに、クローニングがはるかに容易であることが示されている。本発明のFhaB末端切断体は、典型的にはFhaB分子のN末端の3分の2に対応し、好適にはその新しいC末端は位置1200〜1600に、より好適には位置1300〜1500に、そして最も好適には位置1430〜1440に位置する。具体的な実施形態は1433または1436にC末端を有する。従って、本発明のかかるFhaB末端切断体およびかかる末端切断体を含むワクチンは本発明の独立した態様であり、ならびに本発明の組み合わせ免疫原性組成物の成分である。このN末端も10、20、30、40または50個までのアミノ酸が末端切断されうる。
【０１４５】
2.自己輸送体タンパク質：
自己輸送体タンパク質は典型的には、シグナル配列、パッセンジャードメイン、および外膜との付着のためのアンカードメインから構成される。自己輸送体タンパク質の例には、上記Hsf（W099/31132）（NMB 0992）、HMW、Hia（van Ulsen et al Immnol. Med. Microbiol. 2001 32 ； 53-64）、上記Hap（NMB 1985）（W099/55873 ； van Ulsen et al Immnol. Med. Microbiol. 2001 32 ; 53-64）、UspA、UspA2、NadA（NMB1994）（Comanducci et al J. Exp. Med. 2002 195 ； 1445-1454）、AspA（Infection and Immunity 2002, 70 (8) ; 4447-4461; NMB 1029）、Aida-1様タンパク質、SSh-2およびTshが含まれる。NadA（J. Exp. Med （2002） 195： 1445）は自己輸送体タンパク質の他の例であるとともにアドヘシンである。本発明の免疫原性組成物はそれ故に、NadAとアドヘシンの組み合わせを含んでもよく、その場合、NadAは自己輸送体タンパク質としての能力に寄与する。これらのタンパク質は、髄膜炎菌または淋菌または他のナイセリア菌株由来であってもよい。本発明はまた、ナイセリア菌由来の他の自己輸送体タンパク質を含む。
【０１４６】
3．鉄、亜鉛および他の金属獲得タンパク質
これらのタンパク質には、TdfI（上記、Dove J et al Microbiology 2003 and Turner PC et al Microbiology 2001 - 全てを参照に加える）；TbpA（NMB 0461）（W092/03467、US5912336、W093/06861およびEP586266）、TbpB（NMB 0460）（W093/06861およびEP586266）、LbpA（NMB 1540）（Med Microbiol (1999) 32: 1117）、LbpB（NMB 1541）（WO/99/09176）、HpuA（U73112.2）（Mol Microbiol. 1997,23 ; 737-749）、HpuB（NC_003116. 1）（Mol Microbiol. 1997,23 ; 737-749）, P2086（XthA（NMB 0399）としても公知）（13"'International Pathogenic Neisseria Conference 2002）、FbpA（NMB 0634）、FbpB、BfrA（NMB 1207）、BfrB （NMB 1206）、Lipo28（GNA2132（NMB 2132）としても公知）、Sibp （NMB 1882）、HmbR、HemH、Bcp （NMB 0750）、鉄(III)ABC輸送体-ペルメアーゼタンパク質 （Tettelin et al Science 287; 1809-1815 2000）、鉄(III)ABC輸送体-周辺質（Tettelin et al Science 287; 1809-1815 2000）、TonB-依存性受容体（NMB 0964およびNMB 0293）（Tettelin et al Science 287 ; 1809-1815 2000）およびトランスフェリン結合タンパク質関係タンパク質（Tettelin et al Science 287 ; 1809-1815 2000）が含まれる。これらのタンパク質は髄膜炎菌、淋菌または他のナイセリア菌株から誘導することができる。本発明はまた、ナイセリア菌由来の他の鉄獲得タンパク質も含むものである。
【０１４７】
TbpAはTbpBと相互作用してナイセリア菌の外膜上にタンパク質複合体を形成し、これがトランスフェリンと結合する。構造的に、TbpAは、短い細胞内ループおよびより長い細胞外ループにより連結された複数の膜貫通βストランド、TonBボックスおよびプラグドメインと共に、細胞内N末端ドメインを含有する。
【０１４８】
それぞれ高分子量と低分子量を有するTbpBの2つのファミリーが識別されている。高分子量と低分子量型のTbpBは、相同性に基づいて識別可能であるTbpAの色々なファミリーと結合する。類似分子量であるにも関わらず、これらは、高分子量または低分子量の型のTbpBと結合するので、高分子量および低分子量ファミリーとして知られている（Rokbi et al FEMS Microbiol. Lett. 100； 51,1993）。用語TbpA（高）およびTbpA（低）を用いてこれらの2つの型のTbpAを表し、またTbpBについても同様に表される。本発明の免疫原性組成物は、髄膜炎菌の血清群A、B、C、YおよびW-135由来のTbpAおよびTbpB、ならびに淋菌を含む他の細菌由来の鉄獲得タンパク質を含みうる。トランスフェリン結合タンパク質TbpAおよびTbpBはまた、それぞれTbp1およびTbp2とも呼ばれる（Cornelissen et al Infection and Immunity 65 ; 822, 1997）。
【０１４９】
TbpAはいくつかの異なる領域を含有する。例えば、髄膜炎菌株H44/76由来のTbpAの場合、アミノ末端の186個のアミノ酸は内部球状ドメインを形成し、22個のβストランドは膜に架かってβバレル構造を形成する。
【０１５０】
これらは短い細胞内ループと大きい細胞外ループにより連結されている。
【０１５１】
細胞外ループ2、3および5は最高の配列可変度を有し、ループ5は表面に曝される。ループ5と4はリガンド結合に関わる。
【０１５２】
一態様において、TbpAの断片は、TbpAの細胞外ループを含む。髄膜炎菌株H44/76由来のTbpAの配列を用いると、これらのループはアミノ酸200〜202がループlに、アミノ酸226〜303がループ2に、アミノ酸348〜395がループ3に、アミノ酸438〜471がループ4に、アミノ酸512〜576がループ5に、アミノ酸609〜625がループ6に、アミノ酸661〜671がループ7に、アミノ酸707〜723がループ8に、アミノ酸769〜790がループ9に、アミノ酸814〜844がループ10に、そしてアミノ酸872〜903がループ11に対応する。配列アライメント後の他のTbpタンパク質における対応配列も好適な断片を構成しうる。他の好適な断片にはTbpのループ2、ループ3、ループ4またはループ5を構成するアミノ酸配列が含まれるであろう。
【０１５３】
本発明の免疫原性組成物がTbpAを含む場合、TbpA（高）とTbpA（低）の両方を含むのが好ましい。
【０１５４】
TbpAは好適には外膜小胞（OMV）ワクチンで提供されるが、サブユニットワクチンの一部分であってもよい。例えば、本発明の免疫原性組成物中に導入しうる単離された鉄獲得タンパク質は当技術分野で周知である（WO00/25811）。これらを細菌宿主において発現させ、界面活性剤（例えば、2％Elugent）を用いて抽出し、アフィニティクロマトグラフィによりまたは当技術分野で周知の標準クロマトグラフィ技法を用いて精製することができる（Oakhill et al Biochem J. 2002 364； 613-6）。
【０１５５】
TbpAをOMVワクチンで提供する場合、その発現を本明細書で考察した遺伝的技法によりアップレギュレーションしてもよいし、または好適には以下に記載の鉄制限条件下の親菌株の増殖によりアップレギュレーションすることもできる。このプロセスはまた、様々な鉄調節タンパク質、特に免疫優性になりうるFrpBのアップレギュレーションももたらしうる、それ故に、下記のように、かかるタンパク質（特にFrpB）の発現をダウンレギュレーション（および、好適にはコードする遺伝子を除去）して、本発明の免疫原性組成物が広範囲のナイセリア菌株中に存在する抗原に対する免疫応答を誘発することを確実にすることが有利である。TbpA（高）とTbpA（低）の両方が免疫原性組成物中に存在することが適切であり、これはTbpAの交互の型を発現する2つの菌株由来のOMVを組み合わせることにより好適に達成される。
【０１５６】
4.毒素：
毒素にはFrpA（NMB 0585；NMB 1405）、FrpA/C（以下の定義を参照）、FrpC（NMB 1415；NMB 1405）（W092/01460）、NM-ADPRT（NMB 1343）（13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani et al pl35）、VapD（NMB 1753）、リポ多糖（LPS；リポオリゴ糖またはLOSとも呼ばれる）免疫型L2およびLPS免疫型L3が含まれる。FrpAとFrpCはこれら2種のタンパク質の間で保存される領域を含有し、このタンパク質の好適な断片はこの保存された、好適にはFrpA/Cの配列のアミノ酸227〜1004を含む断片を含有するポリペプチドであろう。これらの抗原は髄膜炎菌または淋菌または他のナイセリア菌株由来であってもよい。本発明はまたナイセリア菌由来の他の毒素も含む。
【０１５７】
代わりの実施形態において、毒素は毒性の調節に関わる抗原、例えば、リポ多糖の合成に機能するOstAを含みうる。
【０１５８】
FrpAおよびFrpC：髄膜炎菌は鉄制限時に分泌されるFrpAおよびFrpCと呼ばれる2種のRTXタンパク質をコードする（Thompson et al., (1993) J. Bacteriol. 175: 811-818; Thompson et al., (1993) Infect. Immun.. 61: 2906-2911）。RTX（反復配列毒素）タンパク質ファミリーは一般に、そのC末端近くにコンセンサス：Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly（Asn/Asp）Asp Xaa（LXGGXGN/DDX）による一連の9個のアミノ酸の反復配列を有する。大腸菌HlyAにおける反復配列はCa2+結合の部位であると考えられる。菌株FAM20で特徴付けられた髄膜炎菌のFrpAおよびFrpCタンパク質は、その中央部およびC末端において広範なアミノ酸類似性を共有するが、N末端においては（もし有っても）非常に限られた類似性しかない。
【０１５９】
さらに、FrpAとFrpC間に保存された領域は、9個のアミノ酸モチーフの反復（FrpAでは13回そしてFrpCでは43回）に因るいくらかの多形性を示す。
【０１６０】
本発明の免疫原性組成物は全長FrpAおよび／またはFrpCまたは、好適には、FrpAとFrpC間に保存された配列を含む断片を含みうる。保存された配列は9個のアミノ酸の反復配列単位から形成される。
【０１６１】
本発明の免疫原性組成物は好適には、3回を超える反復、10回を超える反復、13回を超える、20回を超える反復または23回を超える反復を含みうる。
【０１６２】
かかる末端切断体は、かかる抗原を含む全長分子およびワクチンを超える有利な特性を有し、本発明の独立した態様を形成するとともに、本発明の免疫原性組成物に組み込まれる。
【０１６３】
FrpAとFrpC間で保存された配列はFrpA/Cと記され、FrpAまたはFrpCが本発明の免疫原性組成物の構成要素を形成する場合、FrpA/Cを有利に用いることができる。FrpA配列のアミノ酸277〜1004は好ましい保存領域である。前記配列はNまたはC末端のいずれかまたは両方において1、3、5、7、10、15、20、25、または30個以下のアミノ酸だけ伸長または末端切断することができる。
【０１６４】
LPS:
本発明の一態様においては、L2 LOSをfHbpと組み合わせる。
【０１６５】
LPSは好適には外膜小胞（OMV）に提示される（好適にはその場合、小胞は低パーセント、より好適には0〜0.5％、0.02〜0.4％、0.04〜0.3％、0.06〜0.2％、0.08〜0.15％または0.1％の界面活性剤、最も好適にはオキシコール酸[DOC]で抽出される）、しかしまた、サブユニットワクチンの一部であってもよい。LPSは当技術分野で周知の手順を用いて単離することができ、それには、熱水-フェノール操作（Wesphal and Jann Meth. Carbo. Chem. 5; 83-91 1965）が含まれる。また、Galanos et al. 1969, Eur J Biochem 9: 245-249、およびWu et al. 1987, Anal Bio Chem 160: 281-289も参照されたい。LPSはそのままでまたはT細胞エピトープの供給源、例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM-197またはOMV外膜タンパク質と結合して用いてもよい。単離されたLOSを結合する技法も公知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれるEP 941738を参照されたい）。
【０１６６】
LOS（特に本発明のLOS）がブレブ製剤中に存在する場合、LOSを、好適には、in situで、LOSの結合を可能にする方法により、ブレブ調製物上に同様に存在する１以上の外膜タンパク質（例えば、髄膜炎菌のPorAまたはPorB）と結合する。
【０１６７】
このプロセスは、ブレブ製剤内においてLOS抗原の安定性および／または免疫原性（T細胞ヘルプを提供する）および／または抗原性を有利に増進し、従って（髄膜炎菌外膜の表面上の自然環境におけるLOSのように）その最も保護的なコンフォーメーションにおいてT-依存性オリゴ糖免疫源に対するT細胞ヘルプを与えうる。さらに、ブレブ内のLOSの結合はLOSの解毒をもたらすことができる（リピドA部分が外膜中に安定して埋められ、利用されて毒性を生じることをより少なくする）。従って、本明細書で記載した解毒方法、すなわちブレブをhtrB'またはmsbB'突然変異体から単離するか、またはポリミキシンB［脂質に高アフィニティである分子］と機能的に同等な無毒ペプチドを組成物に加えることによる解毒方法（ポリミキシンBと機能的に同等な無毒ペプチド、特に、ペプチドSAEP 2（2つのシステインがジスルフィド架橋を形成する配列KTKCKFLKKC）の使用についてのさらなる詳細はWO 93/14115、WO 95/03327、 Velucchi et al (1997) J Endotoxin Res 4: 1-12、およびEP 976402を参照されたい）は必要としないであろう（しかし、さらなる安全のためにこれを組み合わせて加えてもよい）。従って、本発明者らが見出したのは、ブレブ中に存在するLOSがブレブ内方式で、同じくブレブ中に存在する外膜タンパク質と結合しているブレブを含む組成物は、ブレブが由来する生物により引き起された疾患の治療または予防のためのワクチンを形成することができ、その場合、かかるワクチンは実質的に無毒でありかつその生来の環境においてLOSに対するT依存性細菌応答を誘導することができるということである。
【０１６８】
本発明は、それ故に、さらに、ブレブ内LOSが結合した髄膜炎菌ブレブ調製物を提供する。
【０１６９】
かかるブレブ調製物を、問題の細菌から単離し（WO 01/09350を参照）、次いで公知の結合化学で処理してLOSのオリゴ糖部分の基（例えば、NH2またはCOOH）をブレブ外膜タンパク質の基（例えば、NH2またはCOOH）と連結することができる。グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、またはグルタルアルデヒド／ホルムアルデヒド混合物を用いる架橋技法を用いることができる、しかしもっと選択的な化学、例えば、EDACまたはEDAC／NHS（J. V. Staros, R. W. Wright and D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions（N-ヒドロキシスクシンイミドによる水溶性カルボジイミド介在カップリング反応の促進）. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986)；およびBioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) ppl73-176）を用いることが好ましい。LOSとタンパク質分子の間を共有結合で連結する他の結合化学または処理で使用しうるものはEP 941738に記載されている。
【０１７０】
一態様においては、ブレブ調製物を莢膜多糖の非存在のもとで結合する。ブレブを（天然にまたは下記の突然変異を介して）莢膜多糖を生産しない菌株から単離してもよく、またはほとんど、好適には全ての、夾雑する莢膜多糖を除去して精製してもよい。この方法では、ブレブ内のLOS結合反応がはるかに効率的である。
【０１７１】
一態様においては、ブレブ中に存在するLOSの10、20、30、40、50、60、70、80、90、または 95％超は架橋／結合している。
【０１７２】
ブレブ内の結合は、好適には、次のプロセスステップの1、2または全3ステップを組み込むべきである：結合pHはpH 7.0を超えるべきであり、好適にはpH 7.5以上（最も好適にはpH 9未満で）；反応中、1〜5％、好適には2〜4％、最も好適にはおよそ3％スクロースの条件を維持すべきであり；結合反応においてNaClは最小化し、好適には0.1M、0.05M、0.01M、0.005M、0.001M、そして最も好適には全く非存在にすべきである。全てのこれらのプロセス特性は、結合プロセスを通して、溶液中でブレブが安定に維持されることを確実にする。
【０１７３】
EDAC/NHS結合プロセスはブレブ内の結合用に好適なプロセスである。
【０１７４】
EDAC／NHSは、過度に高く架橋して濾過性に悪影響を与えがちなホルムアルデヒドにとって好ましい。EDACはカルボン酸（例えば、LOSにおけるKDO）と反応して活性のあるエステル中間体を作る。アミン求核試薬（外膜タンパク質、例えば、PorB中のリシンなど）の存在のもとで、アミド結合が形成されてイソ尿素副産物を放出する。しかし、EDACが介在する反応の効率はスルホ-NHSエステル中間体の形成を通して促進することができる。スルホ-NElSエステルは水溶液中で、EDAC単独のカルボン酸との反応から形成される活性エステルより長く残存する。従って、この2段プロセスを用いて、より高い収率のアミド結合形成が実現される。
【０１７５】
EDAC／NHS結合は、J. V. Staros, R. W. Wright and D. M. Swingle, "Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions（N-ヒドロキシスクシンイミドによる水溶性カルボジイミド介在カップリング反応の促進）" Analytical chemistry 156: 220-222 (1986)；およびBioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) ppl73-176において考察されている。一態様においては、0.01〜5mg EDAC/mgブレブ、さらに好適には0.05〜1mg EDAC/mgブレブを用いる。用いるEDACは、サンプル中に存在するLOSの量に依存し、その量は、順に、ブレブを抽出するために用いるデオキシコール酸（DOC）％に依存する。低い％DOC（例えば、0.1％）では高い量のEDAC（lmg/mg以上）を用いるが、より高い％DOC（例えば、0.5％）では過度のブレブ間の架橋を避けるために、より低い量のEDAC（0.025〜0.lmg/mg）を用いる。
【０１７６】
本発明の一プロセスは、それ故に、ブレブ内に結合したLOS（好適には髄膜炎菌の）を生産するプロセスであって、pH 7.0〜pH 9.0（好適にはおよそpH 7.5）のpHにおいて、1〜5％（好適にはおよそ3％）スクロース中でEDAC/NHSの存在のもとで、場合によっては、実質的にNaClを欠く条件において（前記の通り）ブレブを結合するステップ、および結合したブレブを反応混合物から単離するステップを含む前記プロセスである。
【０１７７】
反応混合物のウェスタン分離ゲル上で抗LOS（例えば、抗L2または抗L3）mAbを用いて反応を追跡し、反応時間が経るにつれて、ブレブ中の大部分のLOSについてLOS分子量が増加するのを示すことができる。
【０１７８】
99％ブレブの収率をかかる技法を用いて回収することができる。
【０１７９】
EDACが優れたブレブ内の架橋剤であるとわかったのは、これがLOSをOMPとT依存性免疫原性の改良に十分な程度に架橋するが、濾過性、凝集およびブレブ間架橋が問題になるほど高い程度まで架橋しない点にあった。作製されたブレブの形態は結合していないブレブのそれに類似する（電子顕微鏡による）。さらに、前記プロトコルは過度に高い架橋が起こる（これはブレブの表面上に自然に存在する保護性OMP、例えば、TbpAまたはHsfの免疫原性を低下しうる）ことを回避した。
【０１８０】
ブレブが由来する髄膜炎菌株は、莢膜多糖を生産できない突然変異菌株（例えば、以下に記載の突然変異菌株、特にsiaD'）であることが好適である。また髄膜炎菌性疾患に対して有効な免疫原性組成物は、L2とL3 LOSが両方ともブレブ外膜タンパク質と結合しているL2およびL3ブレブを含むことも好適である。さらに、ブレブ内結合したブレブ内のLOS構造がlgtB-髄膜炎菌株由来のものと一致していることが好ましい（下記の通り）。最も好適には、免疫原性組成物は莢膜多糖を生産できない突然変異体髄膜炎菌株由来でありかつlgtB-であるブレブ内結合したブレブであって：莢膜多糖を生産できない突然変異体髄膜炎菌株由来のL2およびL3ブレブを含むか；lgtB-である突然変異体髄膜炎菌株由来であるL2およびL3ブレブを含むか；または、最も好適には、莢膜多糖を生産できない突然変異体髄膜炎菌株由来のL2およびL3ブレブを含みかつlgtB-である前記ブレブを含むものである。
【０１８１】
本発明に用いることができる典型的なL3髄膜炎菌株はH44/76 menB菌株である。
【０１８２】
典型的なL2菌株はB16B6 menB菌株または39E C型髄膜炎菌株である。
【０１８３】
先に説明したように、本発明のブレブは結合の作用によりある程度解毒されていてさらに解毒する必要はないが、さらなる安全のために、例えば、htrB'またはmsbBである髄膜炎菌株由来のブレブを用いるか、またはポリミキシンB［リピドAに高アフィニティをもつ分子］と機能的に等価の無毒ペプチド（好適にはSEAP 2）をブレブ組成物に加えるさらなる解毒方法（先に記載の通り）を用いてもよい。
【０１８４】
以上の方法で、髄膜炎菌性ブレブおよびブレブを含む免疫原性組成物であって、重要な抗原として、実質的に無毒であり、自己免疫問題が無く、T依存性特性を有し、その自然環境に存在し、そして（L2+L3組成物の場合に）髄膜炎菌株の90％超に対する細菌抗体応答を誘発できるLOSを有する前記免疫原性組成物が提供される。
【０１８５】
一態様において、ブレブ内のLOS結合プロセスは次のステップの1、2または3つ全てを組み込むべきである：結合pHはpH 7.0超、好適にはpH 7.5以上（最も好適にはpH 9で）であり；反応中、1〜5％、好適には2〜4％、最も好適にはおよそ3％スクロースの条件を維持すべきであり；結合反応においてNaClは最小化され、好適には0.1M、0.05M、0.01M、0.005M、0.001M、そして最も好適には全く非存在にすべきである。全てのこれらのプロセス特性は、結合プロセスを通して、溶液中でブレブが安定に維持されることを確実にする。
【０１８６】
LOSを様々な技法および化学によりブレブ内で外膜タンパク質に結合させることはできるが、EDAC/NHS結合プロセスがブレブ内結合用の好ましいプロセスである。EDAC／NHSは、過度に高く架橋して濾過性に悪影響を与えがちなホルムアルデヒドにとって好ましい。EDACはカルボン酸と反応して活性のあるエステル中間体を作る。
【０１８７】
アミン求核試薬の存在のもとで、アミド結合が形成されてイソ尿素副産物を放出する。しかし、EDACが介在する反応の効率はスルホ-NHSエステル中間体の形成を通して促進することができる。スルホ-NElSエステルは水溶液中で、EDAC単独のカルボン酸との反応から形成される活性エステルより長く残存する。従って、この2段プロセスを用いて、より高い収率のアミド結合形成が実現されるEDAC／NHS結合は、J. V. Staros, R. W. Wright and D. M. Swingle, "Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions（N-ヒドロキシスクシンイミドによる水溶性カルボジイミド介在カップリング反応の促進）" Analytical chemistry 156: 220-222 (1986)；およびBioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) ppl73-176において考察されている。
【０１８８】
5．内在性外膜タンパク質
他のカテゴリーのナイセリア菌タンパク質もまた、本発明のナイセリア菌ワクチンに封入するための候補でありうるのであって、驚くほど有効なやり方で他の抗原と組み合わせることができる。膜結合タンパク質、特に内在性膜タンパク質、そして最も有利には、外膜タンパク質、とりわけ内在性外膜タンパク質を本発明の組成物に用いることができる。かかるタンパク質の一例はナイセリア菌ホスホリパーゼ外膜タンパク質である、Omp IA（NMB 0464）（WOOO/15801）として公知のPIDAである。さらなる例はTspA（NMB 0341）（Infect. Immun. 1999,67 ； 3533-3541）およびTspB（T細胞刺激性タンパク質）（WO 00/03003 ； NMB 1548, NMB 1628 または NMB 1747）である。
【０１８９】
さらなる例には、Tdfh、Tdfl（上記）、PilQ（NMB 1812）（W099/61620）、OMP85（D15としても知られる）（NMB 0182）（WO00/23593）、NspA（U52066）（W096/29412）、FhaC（NMB 0496またはNMB 1780）、PorB（NMB 2039）（Mol. Biol. Evol. 12； 363-370,1995）、HpuB（NC_003116.1）、TdfH（NMB 1497）（Microbiology 2001,147 ; 1277-1290）、OstA（NMB 0280）、MItA（GNA33およびLipo30としても知られる）（NMB0033）、HtrA（NMB 0532；WO99/55872）、HimD（NMB 1302）、HisD（NMB 1581）、HlpA（NMB 1946）、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、TbpA（NMB 0461）（W092/03467）（先の鉄および亜鉛獲得タンパク質の項も参照）およびLbpA（NMB 1541）が含まれる。
【０１９０】
OMP85：本発明の免疫原性組成物は全長OMP85を、好適にはOMV調製物の一部分として、含んでもよい。OMP85の断片も本発明の免疫原性組成物に用いることができ、特に、アミノ酸残基1〜475または50〜475から成るOMP85の表面が曝されたドメインを本発明の免疫原性組成物のサブユニット成分中に組み込むのが好適である。OMP85の表面が曝されたドメインに対する前記配列は、NまたはC末端のいずれかまたは両方で1、3、5、7、10、15、20、25、または30個以下のアミノ酸だけ伸長または末端切断することができる。シグナル配列をOMP85断片から省かれていることが好ましい。
【０１９１】
OstA：
OstAはリポt多糖の合成に機能し、そして毒性の調節因子であると考えることができる。あるいは、毒素のカテゴリーが毒性ならびに毒素の調節因子を含むと拡大された場合、OstAは毒素のカテゴリーに含まれうる。
【０１９２】
他の態様において、本発明は請求項に記載の組成物中に存在するタンパク質またはタンパク質の組み合わせをコードするポリヌクレオチドに関する。例えば、fHbpを第2の抗原との組み合わせで、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしてまたは同じ核酸構築物（例えば、ベクター構築物）上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして提供することができる。
【０１９３】
「ポリヌクレオチド」は一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、これらは未改変のRNAまたはDNAまたは改変されたRNAまたはDNAであってもよい。「ポリヌクレオチド」には、限定されるものでないが、1本鎖および2本鎖のDNA、1本鎖および2本鎖の領域の混合物であるDNA、1本鎖および2本鎖のRNA、1本鎖および2本鎖の領域の混合物であるRNA、1本鎖または、より典型的には、2本鎖であってもよいDNAおよびRNAまたは1本鎖および2本鎖の領域の混合物を含むハイブリッド分子が含まれる。
【０１９４】
さらに、「ポリヌクレオチド」はRNAまたはDNAまたはRNAとDNAの両方を含む3本鎖領域を意味する。用語ポリヌクレオチドにはまた、安定性または他の理由のために、１以上の改変された塩基および改変された主鎖をもつDNAまたはRNAが含まれる。「改変された」塩基には、例えば、トリチル化塩基および異常な塩基、例えばイノシンが含まれる。DNAおよびRNAには色々な改変がなされている：従って、「ポリヌクレオチド」は、典型的には自然に見出される化学的、酵素的、または代謝的に改変されたポリヌクレオチドの形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なDNAおよびRNAの形態を包含する。
【０１９５】
「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドと呼ぶことが多い比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【０１９６】
本発明の他の態様は1以上のポリヌクレオチドを含む免疫学的／ワクチン製剤に関する。かかる技法は当技術分野で公知であり、例えば、Wolff et al., Science, (1990) 247 : 1465-8を参照されたい。
【０１９７】
かかるワクチンは、先に記載した本発明のタンパク質組み合わせに対応する複数のタンパク質をコードする1以上のポリヌクレオチドを含む。
【０１９８】
かかるポリヌクレオチドからのタンパク質の発現は、哺乳動物細胞内の発現を駆動することができる真核生物プロモーターの制御下にありうる。ポリヌクレオチドはさらに他の抗原をコードする配列を含んでもよい。
【０１９９】
発現を駆動しうる真核生物プロモーターの例には、アデノウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーターを含むウイルス由来のウイルスプロモーターが含まれる。
【０２００】
あるいは、哺乳動物プロモーターを用いて発現を駆動することができる。さらなる態様において、本発明は、髄膜炎菌感染または疾患を予防または改善するための、改良されたfHbpに基づく組成物またはワクチンを製造する方法であって、fHbpを、髄膜炎菌ST269に対して抗体応答を作製することができる第2の抗原と組み合わせるステップを含むものである前記方法に関する。
【０２０１】
本発明の組成物は、サブユニット組成物、外膜小胞（ブレブ）の環境の抗原を含む組成物であってもよく、またはサブユニットと外膜小胞の組み合わせを含みうる。
【０２０２】
一態様において、本発明は、被験者に投与すると抗NMB0964抗体を誘発する外膜小胞の生産を提供するのに十分なレベルのNMB0964ポリペプチドを生産するナイセリア種細菌を培養するステップ；培養した細菌から外膜小胞を調製するステップ；および外膜小胞を製薬上許容される賦形剤と組み合わせて本明細書に規定したfHbpポリペプチドと組み合わせて被験者に投与するのに好適な免疫原性組成物を生産するステップに関する。
【０２０３】
ある特定の態様を以下に記載する。
【０２０４】
本発明の免疫原性組成物またはワクチンはサブユニット組成物であってもよい。
【０２０５】
サブユニット組成物は、その成分が少なくとも50％、好適には少なくとも60％、70％、80％、90％純度まで単離され精製されている組成物である。
【０２０６】
サブユニット組成物は水溶液であってもよい。この組成物は、抗原の疎水性部分を可溶化するために、界面活性剤、好適には非イオン、双性イオンまたはイオン界面活性剤を含んでもよい。この組成物はリポソーム構造を形成しうる脂質を含んで、脂質膜に架かる構造によって抗原の提示を可能にすることができる。
【０２０７】
髄膜炎菌血清群B（menB）は、工業規模での製造を可能にするのに十分な量の外膜ブレブを排泄する。外膜小胞はまた、細菌細胞の界面活性剤抽出プロセスを介して調製することもできる（例えば、EP11243を参照）。
【０２０８】
本発明の免疫原性組成物はまた、好適には、遺伝子組換えまたは他の方法（金属枯渇条件下（例えば、亜鉛枯渇条件下又は鉄枯渇条件下）での増殖を含む）のいずれかによりアップレギュレーションされている抗原を有する外膜小胞調製物を含んでもよい。かかる外膜小胞調製物でアップレギュレーションされうる抗原の例には、TdfI、TdfH、NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA（高）、TbpA（低）、LbpA、TbpB、LbpB、PilQ、AspA、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM- ADPRT、MafA、MafBおよびPIdAが含まれる。かかる調製物はまた、任意に、LPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のいずれかまたは両方を含みうる。
【０２０９】
一態様において、OMVはダウンレギュレーションされている抗原を含む。
【０２１０】
ブレブ調製物のナイセリア菌株からの製造は当業者に周知のいずれかの方法により達成することができる。一態様においては、EP 301992、US 5,597,572、EP 11243またはUS 4,271,147、Frederiksonら（NIPH Annals [1991]、14： 67-80）、Zollinger ら（J. Clin. Invest. [1979]、63： 836-848）、Saundersら（Infect. Immun. [1999]、67： 113-119）、Drabickら（Vaccine [2000]、18： 160-172）またはWO 01/09350（実施例8）に開示された方法を用いる。一般に、OMVを界面活性剤、好適にはデオキシコール酸によって抽出し、そして核酸を任意に酵素を使って除去する。精製は超遠心分離により、任意に次いで、サイズ排除クロマトグラフィにより達成する。もし2種以上の異なる本発明のブレブが含まれれば、それらを1つの容器内で組み合わせて本発明の多価調製物を作製する（もし異なる本発明のブレブが別の容器内の別の組成物であっても、同時に［同じ通院時に］投与されれば、調製物は多価とみなされる）。
【０２１１】
OMV調製物は通常、0.2μmフィルターを介する濾過により滅菌し、好適には、ブレブ調製物を安定化することが公知であるスクロース溶液（例えば、3％）中で貯蔵する。
【０２１２】
外膜小胞調製物内のタンパク質のアップレギュレーションは、遺伝子の余分なコピーを、OMV調製物が由来するナイセリア菌中に挿入することにより達成することができる。あるいは、OMV調製物が由来するナイセリア菌株において、遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに交換してもよい。かかる技法はWO01/09350に記載されている。タンパク質のアップレギュレーションはOMV中に存在するタンパク質レベルを、未改変の髄膜炎菌（例えば菌株H44/76）に由来するOMV中に存在するタンパク質レベルより高くする。一態様において、そのレベルは1.5、2、3、4、5、7、10または20倍高くなろう。
【０２１３】
LPSをOMVにおける追加の抗原にしようとする場合、好適には、高レベルの結合LPSを保存する一方、特に有毒で結合の乏しいLPSを除去するために、低濃度の抽出界面活性剤（例えば、デオキシコール酸またはDOC）を用いるプロトコルをOMV調製法で使用することができる。用いるDOCの濃度は、好適には0〜0.5％DOC、0.02〜0.4％DOC、0.04〜0.3％DOC、さらに好適には0.06％〜0.2％DOCまたは0.08〜0.15％DOC、最も好適にはおよそまたは正確に0.1％DOCである。
【０２１４】
一態様において、OMVは界面活性剤抽出を使わずに、好適には、fHbpなどの抗原を過剰発現して得た生来のOMVを含む。
【０２１５】
「より強力なプロモーター配列」は、目的の抗原をコードする遺伝子に対する転写を増加する調節制御エレメントを意味する。
【０２１６】
「発現のアップレギュレーション」とは、非改変（すなわち、天然の）ブレブの発現と比較して、目的の抗原の発現を増進するいずれかの手段を意味する。
【０２１７】
アップレギュレーションの量は目的の特定の抗原に応じて変わりうるが、そのブレブの完全性を破壊しうる量を超えないものと理解される。抗原のアップレギュレーションは非改変ブレブの発現より少なくとも10％高い発現を意味する。一態様において、発現は50％高い。さらに好適には、発現は少なくとも100％高い（2倍）。最も好適には、発現は3、4、5,7、10、20倍高い。あるいはまたはさらに、特にTbpA、TbpB、LbpAおよびLbpBの場合、発現のアップレギュレーションは発現が代謝性または栄養性変化に条件付けられないことを意味しうる。一態様においては、鉄制限条件（例えば、鉄キレート剤の存在で）で増殖した細菌から誘導されたブレブの発現レベルを評価する。
【０２１８】
ふたたび、意味を明確にするために言えば、用語「前記抗原をより少なく生産するように細菌株を遺伝子操作する」または「ダウンレギュレーション」は、非改変（すなわち、天然ブレブ）と比較して、好適には、欠失により、発現が非改変ブレブのそれより少なくとも10％低くなるように、目的の抗原の発現（または機能的遺伝子産物の発現）を低下するいずれかの手段を意味する。
【０２１９】
一態様において、発現は50％低く、最も好適には、完全に存在しない。もしダウンレギュレーションしたタンパク質が酵素または機能性タンパク質であれば、ダウンレギュレーションは１以上の突然変異を導入することにより達成され、酵素または機能的活性の10％、20％、50％、80％ または好適には100％低下をもたらしうる。
【０２２０】
ナイセリア菌タンパク質の発現をモジュレートするのに必要な遺伝子操作ステップは当業者に公知の様々な方法で行うことができる。例えば、配列（例えば、プロモーターまたはオープンリードフレーム）を挿入することができるしまたプロモーター／遺伝子をトランスポゾン挿入の技法により破壊することができる。例えば、遺伝子の発現をアップレギュレーションするために、強力なプロモーターをトランスポゾンを介して遺伝子の開始子ドンの2kb上流までに（さらに好適には200〜600bp上流に、最も好適にはおよそ400bp上流に）挿入することができる。点突然変異または欠失も利用することができる（特に遺伝子の発現のダウンレギュレーションに）。
【０２２１】
しかし、かかる方法はまったく不安定または不確実であり、それ故に、遺伝子操作ステップは好適には相同組換え事象を介して行うことが好ましい。一態様において、この事象は細菌染色体上の少なくとも30個のヌクレオチドの配列（1つの組換え遺伝子領域）と菌株内の形質転換されたベクター上の少なくとも30ヌクレオチドの配列（第2の組換え遺伝子領域）との間で起こる。一態様において、これらの領域は40〜1000ヌクレオチド、さらに好適には100〜800ヌクレオチド、最も好適には500ヌクレオチド）である。これらの組換え遺伝子領域は、高度にストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズしうるのに十分な程度に類似していなければならない。
【０２２２】
本明細書で記載した遺伝子改変事象を行うために用いる方法（例えば、組換え事象による遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションおよびさらなる遺伝子発現のナイセリア菌ゲノムへの導入）はWO01/09350に記載されている。ナイセリア菌に組込むことができる典型的で強力なプロモーターはporA、porB、IgtF、Opa、p110、lst、およびhpuABである。PorAおよびPorBは構成的で強力なプロモーターとして好ましい。PorBプロモーター活性がporBの開始コドンの1〜250上流のヌクレオチドに対応する断片に含まれることは確立されている。
【０２２３】
鉄制限培地における増殖による抗原の発現のアップレギュレーション
本発明の外膜小胞調製物中のいくつかの抗原のアップレギュレーションは、好適には、鉄制限条件下で増殖したナイセリア菌の親菌株由来の外膜小胞を単離することにより達成される。培地の鉄濃度が低いと、TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuBおよびP2086を含む鉄獲得に関わるタンパク質の発現の増加をもたらしうる。それによりこれらのタンパク質の発現はアップレギュレーションされるので、例えば、強力プロモーターの挿入またはその遺伝子の追加コピーの挿入によって関わる遺伝子を組換え改変する必要はない。本発明はまた、前記遺伝子も組換え改変された場合の、鉄制限培地における増殖による鉄獲得タンパク質のアップレギュレーションも包含する。
【０２２４】
鉄制限は鉄キレート剤の培地への付加により実施する。
【０２２５】
好適な鉄キレート剤には、2,2-ジピリジル、EDDHA（エチレンジアミン-ジ （o- ヒドロキシルフェニル酢酸）およびデスフェラル（Desferal）（デフェリオキサミンメシレート、Sigma）が含まれる。デスフェラルは好ましい鉄キレート剤であり、培地に10〜100pM、好適には25〜75μM、より好適には50〜70μM、最も好適には60μMの濃度で加えられる。培地の鉄含量は、主として、酵母エキスおよびダイズペプトン成分に由来し、存在量はバッチによって異なりうる。従って、鉄獲得タンパク質のアップレギュレーションを達成するために最適なデスフェラルの濃度は、培地のバッチによって異なりうる。当業者は最適濃度を容易に決定しうるであろう。基本的には、所望の鉄調節タンパク質の発現をアップレギュレーションするのに十分であるが、該細菌の増殖に悪影響を及ぼさない程度の量の鉄キレート剤を培地に加えるべきである。
【０２２６】
一態様においては、亜鉛制限を用いて、例えば、TdfIの発現を増加することができる。これは、例えば、Zn2+濃度が低い、すなわち5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05または0.01μMフリーZn2+のもとでの培地（例えば、ICP-MSによって約1.69μM Zn2+を有するRoswell Park Memorial Institute培地1640（RPMI））を用いるか、または例えば、公知の亜鉛キレート剤、例えば、TPEN（N,N,N',N'-テトラキス(2-ピリジルメチル)エチレンジアミン）を用いて培地中のZn2+を除去する（NMB0964の発現が最大になるように十分に培地に加えるべきである）ことによって、達成することができる。合成培地、例えば、CatlinまたはCatlin適合化培地を使うこともできる（"Nutritional profiles of Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, and Neisseria lactamica in chemically defined media and the use of growth requirements for gonococcal typing（化学的に規定した培地における淋菌、髄膜炎菌、およびナイセリア・ラクタミカ菌の栄養プロファイルならびに淋菌分類のための増殖要件の使用）". Catlin BW J Infect Dis. 1973 Aug;128(2):178-94.）。
【０２２７】
Zn2+の低い特定の培養条件で、またはNMB0964を過剰発現するかもしくはZurが介在する亜鉛抑制機構を除去するように遺伝子操作した突然変異体髄膜炎菌株から調製したOMVワクチンはNMB0964に富むものであって、かかるOMVはこれらの方法で調製しなかったOMVと比較して良好な殺菌抗体応答を誘発する。
【０２２８】
一態様において、鉄または他の金属獲得タンパク質の鉄または他の適当な金属制限条件下における増殖によるアップレギュレーションは、他の抗原の組換えアップレギュレーションと組み合わせられ、それによって本発明の外膜ベシクルが得られる。
【０２２９】
可変性かつ非保護性の免疫優性抗原のダウンレギュレーション／除去:
多くの表面抗原は細菌株間で可変性であって、その結果、密接に関係する菌株の限られたセットに対してのみ保護性がある。本発明の一態様は、他のタンパク質が低下したまたは、好適には、可変性表面タンパク質をコードする遺伝子が欠失した本発明の外膜小胞を包含する。かかる欠失のある細菌株が生産するブレブは、ワクチンで投与されると、ワクチン被接種者の免疫系に対する保存タンパク質（外膜に保持された）の作用による影響がより高いので、様々な菌株に対する交差反応性の潜在能力がより強力である。本発明のブレブ免疫原性組成物においてダウンレギュレーションしうるナイセリア菌のかかる可変性抗原の例にはPorA、PorB、Opaが含まれる。
【０２３０】
ダウンレギュレーションまたはスイッチオフしてもよい他のタイプの遺伝子はin vivoでその細菌により容易にスイッチオン（発現）またはオフできる遺伝子である。かかる遺伝子によりコードされる外膜タンパク質は常に細菌上に存在するのでなく、ブレブ調製物中のかかるタンパク質の存在はまた、前記の理由によりワクチンの有効性にとって有害でもありうる。ダウンレギュレーションまたは欠失の好ましい例はナイセリア菌のOpcタンパク質である。感染生物は容易にOpcになりうるので、Opcを含有するブレブワクチンにより誘導される抗Opc免疫は、限られた保護能力しか有しないであろう。
【０２３１】
例えば、これらの可変性または非保護性遺伝子の発現をダウンレギュレーションするかまたは一定期間スイッチオフしてもよい。これはブレブの外表面上に少量存在する、より良好な抗原に免疫系を集中させる利点を有する。ダウンレギュレーションはまた、前記外膜タンパク質の表面に曝された可変性免疫優性ループが改変または欠失されて、生じる外膜タンパク質の免疫優性をより低下させうることを意味する。
【０２３２】
発現のダウンレギュレーションに関する方法はWO01/09350に開示されている。
【０２３３】
本発明のブレブ免疫原性組成物でダウンレギュレーションされるタンパク質の好ましい組合わせには、PorAおよびOpA；PorAおよびOpC；OpAおよびOpC；PorAおよびOpAおよびOpCが含まれる。
【０２３４】
4つの異なるOpa遺伝子が髄膜炎菌のゲノム中に存在することは公知であり（Aho et al. 1991 Mol. Microbiol. 5: 1429-37）、それ故にOpaの発現がダウンレギュレーションされると言った場合、好適には髄膜炎菌中に存在する1、2、3または（好適には）4つ全ての遺伝子がダウンレギュレーションされることを意味する。かかるダウンレギュレーションはWO 01/09350に記載されたように遺伝子操作で行うか、またはOpa遺伝子座からの発現が無いかまたは低い、容易に見出せる天然の安定した髄膜炎菌株を捜すことにより行うことができる。かかる菌株は、Poolman et al（1985 J. Med. Micro. 19: 203-209）に記載の技法を用いて見出すことができ、この場合、OpA-である細胞はOpaを発現する細胞と異なる表現型を有し、これはプレート上または顕微鏡下で外観を観察して判断することができる。いったん見付かると、Opaの欠如を確立する発酵実験後の細胞内容物のウェスタンブロットを実施することによりその菌株が安定してOpa-であることを示すことができる。
【０２３５】
外膜小胞におけるいくつかの抗原のアップレギュレーションを鉄制限条件下の増殖により達成する場合、可変性タンパク質FrpB（Microbiology 142; 3269-3274, (1996); J. Bacteriol. 181 ; 2895-2901 (1999) ）もアップレギュレーションされうる。本発明者らは、これらの環境のもとでは、W001/09350に記載したように全タンパク質の発現をダウンレギュレーションすることにより、またはFrpBの可変域を欠失させることによりFrpBの発現をダウンレギュレーションするのが有利であることを見出した。
【０２３６】
これは、免疫原性組成物により誘発される免疫応答が広範囲の菌株に存在する抗原を指向することを確実にする。FrpBのダウンレギュレーションは好適には、本発明のブレブ免疫原性組成物中のPorAおよびOpA；PorAおよびOpC；OpAおよびOpC；PorAおよびOpAおよびOpCのダウンレギュレーションと組み合わせる。
【０２３７】
本発明の代わりの実施形態においては、鉄制限条件下で増殖させたものでないナイセリア菌株から調製した外膜小胞においてFrpBをダウンレギュレーションする。
【０２３８】
本発明の免疫原性組成物中のブレブは、WO01/09350に開示されたLPSを解毒する方法を介して解毒することができる。特に、本発明のLPSを解毒する方法は、WO01/09350に開示されたhtrBおよび／またはmsbB酵素のダウンレギュレーション／欠失に関わる。ナイセリア菌のmsbBおよびhtrB遺伝子はそれぞれlpxL1およびlpxL2とも呼ばれ（WO00/26384）、これらの遺伝子の欠失突然変異は、表現型において、1つの二級アシル基を欠くmsbB-突然変異体LOS、および両方の二級アシル基を欠くhtrB-突然変異体LOSにより特徴付けられる。W093/14155およびWO95/03327は、本発明の組成物で用いることができるポリマイシンBの機能的等価体である無毒性ペプチドを記載している。
【０２３９】
かかる方法は、好適には、低レベルのDOC、好適には0〜0.3％DOC、さらに好適には0.05％〜0.2％DOC、最も好適には、およそまたは正確に0.1％DOCに関わるブレブ抽出の方法と組み合わせる。
【０２４０】
LPSを解毒するさらなる方法には、ブレブ調製物に、先に記載したポリミキシンBの機能的等価体である無毒性ペプチド（好適にはSAEP2）を加える方法が含まれる。
【０２４１】
交差反応性多糖：
被包性グラム陰性細菌からの細菌外膜ブレブの単離は、しばしば、莢膜多糖の同時精製をもたらす。いくつかの例では、多糖は他のブレブ成分により与えられる免疫応答を増進しうるので、この「夾雑」材料は有用であることを示しうる。しかし他の例では、細菌のブレブ調製物中に夾雑する多糖材料の存在は、ワクチン中のブレブの使用に有害であることを示しうる。例えば、少なくとも髄膜炎菌の場合、血清群B莢膜多糖は保護免疫を与えずかつヒトにおいて有害な自己免疫応答誘発に感受性であることが示されている。従って、遺伝子操作で作ったブレブ生産用の細菌株から本発明の外膜小胞を単離して、莢膜多糖を含まぬようにしてもよい。そうするとブレブはヒトにおける使用に好適になりうる。かかるブレブ調製物の特に好ましい例は莢膜多糖を欠く髄膜炎菌血清群B由来のものである。
【０２４２】
これは、莢膜生合成および／または搬出に必要な遺伝子が損なわれている改変ブレブ生産菌株を用いることにより達成することができる。
【０２４３】
莢膜多糖生合成または搬出をコードする遺伝子の不活化は、制御領域、コード領域のいずれかまたは両方を突然変異（点突然変異、欠失または挿入）する（好適には前記の相同組換え技法を用いて）ことによるか、またはかかる遺伝子の酵素機能を低下するいずれか他の方法により達成することができる。さらに、莢膜の生合成遺伝子の不活化はまた、アンチセンス過剰発現またはトランスポゾン突然変異誘発により達成することもできる。好ましい方法は多糖生合成および搬出のために必要な髄膜炎菌cps遺伝子のいくつかまたは全ての欠失である。この目的については、置換プラスミドpMF121（Frosh et al. 1990, Mol. Microbiol. 4: 1215-1218に記載）を用いてcpsCAD（+galE）遺伝子クラスターを除去する突然変異を送達することができる。
【０２４４】
WO 01/09350においては、プラスミドpMF121（Frosch et al., 1990）を用いて莢膜多糖を欠く髄膜炎菌B株が構築されている。このプラスミドは、グループB多糖（B PS）の生合成経路およびエリスロマイシン耐性遺伝子をコードする遺伝子座の隣接領域を含有する。B PSの欠失はグループB莢膜多糖の発現の喪失ならびにガラクトース欠乏LPSの合成に導くgalEの活性コピーの欠失をもたらした。
【０２４５】
L3またはL2LPSに対する抗体の安全性は、ヒトスフィンゴ糖脂質に存在するラクト-N-ネオテトラオース オリゴ糖基（Galβl-4GlcNAcβl-3Galβl-4Glcβl-）に類似した構造の存在によって疑問視されている。多数の人がL3 LPSの残量を含有するデオキシコール酸抽出小胞ワクチンを用いて安全にワクチン接種を受けているとしても（G. Bjune et al, Lancet (1991), 338,1093-1096；GVG. Sierra et al, NIPH ann (1991), 14,195-210）、LOS糖類の末端部分の欠失は、ヒト組織の表面に存在する構造とのいずれかの交差反応を阻止するのに有利である。好ましい実施形態において、lgtB遺伝子の不活化は末端ガラクトース残基およびシアル酸が存在しない中間体LPS構造（この突然変異はL2およびL3LOSに4GlcNAcpl-3Galpl-4Glcpl-構造を残す）をもたらす。かかる中間体はL3およびL2LPS菌株において得ることができよう。
【０２４６】
代わりの、それより好ましくないLPSの（短い）バージョンはIgtE遺伝子を遮断することによって得ることができる。galE突然変異も利用し得る。
【０２４７】
さらなる代わりのバージョンは、galE 突然変異（Cloning and molecular analysis of the galE gene of Neisseria meningitidis and its role in lipopolysaccharide biosynthesis（髄膜炎菌のgalE遺伝子のクローニングと分子分析およびリポ多糖生合成におけるその役割）. Jennings MP, van der Ley P, Wilks KE, Maskell DJ, Poolman JT, Moxon ER. Mol Microbiol. 1993 Oct;10(2):361-9）を用いて莢膜不在菌株と短α鎖をもつLOS（lgtE突然変異として）を得ることである。
【０２４８】
さらなる代わりのそれより好ましくないLPSのバージョンはIgtA遺伝子を遮断することによって得ることができる。もしかかるlgtA-突然変異を選択するのであれば、lgtC発現も遮断して非免疫原性のLI免疫型が形成されるのを阻止するのが好ましい。
【０２４９】
LgtB-突然変異体は最も好ましい、というのは、本発明者らはこれが安全問題を解決するために最適な末端切断である一方、細菌抗体応答をなお誘発しうるLPS保護オリゴ糖エピトープを保持することを見出したからである。
【０２５０】
それ故に、（精製されたまたは単離されたブレブ中に）L2またはL3調製物または髄膜炎菌ブレブ調製物をさらに含む本発明の免疫原性組成物は一般に、好適には遺伝子のスイッチオフにより、最も好適にはプロモーターおよび／または遺伝子のオープンリードフレームの全てもしくは一部分を除去することにより、遺伝子操作によってlgtB、lgtAまたはlgtE遺伝子からの機能性遺伝子産物の発現を永久にダウンレギュレーションしたナイセリア菌株（好適には髄膜炎菌株）から有利に誘導される。
【０２５１】
前記の本発明の免疫原性組成物を髄膜炎菌B菌株から誘導する場合、さらに莢膜多糖（ヒト様の糖構造も含有する）も除去することが好適である。多くの遺伝子をスイッチオフしてこれを達成することはできるが、本発明者らは有利には、ブレブ生産菌株を、好適には遺伝子のスイッチオフにより、最も好適にはプロモーターおよび／または遺伝子のオープンリードフレームの全てもしくは一部分を除去することにより、遺伝子操作によってsiaD遺伝子からの機能性遺伝子産物の発現を永久にダウンレギュレーションする（すなわち、α-2-8ポリシアリルトランスフェラーゼ活性をダウンレギュレーションする）ことが好適であることを示した。かかる不活化はWO 01/09350に記載されている。このsiaD（synDとしても知られる）突然変異は、莢膜多糖からヒト類似エピトープの除去をもたらすことができる多くの突然変異の中でも最も有利なものである、何故なら、これはLOSの保護エピトープの生合成に影響を与えない単独の突然変異の1つであって、従って、究極的にLOSを保護抗原として用いることを目的とし、細菌の増殖に最小限の影響しか与えないプロセスにおいて有利であるからである。本発明の好ましい態様は、それ故に、IgtE-siaD-、lgtA-siaD-または、好適には、lgtB-siaD-髄膜炎菌B突然変異体菌株から誘導される前記ブレブ免疫原性調製物である。この菌株自体が本発明のさらなる態様である。
【０２５２】
siaD-突然変異は以上の理由で好ましいが、髄膜炎菌B莢膜多糖合成をスイッチオフする他の突然変異を用いることもできる。
【０２５３】
従ってブレブ生産菌株を、好適には遺伝子のスイッチオフにより、最も好適にはプロモーターおよび／または遺伝子のオープンリードフレームの全てもしくは一部分を除去することにより、遺伝子操作によって次の遺伝子：galE、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA（synXおよびsiaAと等価）、synB（siaBと等価）またはsynC（siaCと等価）遺伝子の１以上からの機能性遺伝子産物の発現を永久にダウンレギュレーションすることができる。lgtE-突然変異をこれらの突然変異の１以上と組み合わせてもよい。一態様においては、lgtB-突然変異をこれらの突然変異の１以上と組み合わせてもよい。本発明のさらなる態様は、それ故に、髄膜炎菌Bのかかる組み合わせた突然変異体菌株から誘導される前記のブレブ免疫原性調製物である。この菌株自体が本発明のさらなる態様である。
【０２５４】
lgtBおよびlgtEを含む様々なlgt遺伝子を含有するナイセリア菌の遺伝子座およびその配列は当技術分野で公知である（M. P. Jennings et al, Microbiology 1999,145, 3013-3021およびその引用文献、ならびにJ. Exp. Med. 180: 2181-2190 [1994]を参照）。
【０２５５】
全長（非末端切断型）LOSを最終産物に用いる場合、LOSをシアル酸付加しないことが所望される（かかるLOSは、同じくシアル酸付加されてない最も危険な侵襲性髄膜炎菌B菌株に対する免疫応答を生じるので）。かかる場合、synA（synXおよびsiaAと等価）、synB（siaBと等価）またはsynC（siaCと等価）遺伝子を除去した莢膜不在菌株を用いると、かかる突然変異はmenB LOSのシアル酸付加を不能にするので有利である。
【０２５６】
ブレブ調製物、特に、低DOC濃度で抽出した調製物においては、LPSを本発明の免疫原性組成物中の抗原として用いることができる。しかし、ヒト様ラクト-N-ネオテトラオース構造を除去するために、galE、lgtE、lgtA（特にlgtCとの組み合わせて）、または、好適には、lgtB遺伝子／遺伝子産物の酵素機能をダウンレギュレーション／欠失／不活化することが有利である。LPSオリゴ糖構造を生合成するためのlgt遺伝子を含むナイセリア菌遺伝子座（およびその配列）は当技術分野で公知である（Jennings et al Microbiology 1999 145 ; 3013-3021およびその引用文献、およびJ. Exp. Med. 180 : 2181-2190 [1994]）。lgtB（または機能性の遺伝子産物）のダウンレギュレーション／欠失は、これがLPS保護エピトープを無傷のまま残すので好ましい。
【０２５７】
本発明の髄膜炎菌血清群Bブレブ調製物において、siaDおよびlgtBの両方のダウンレギュレーション／欠失は好適であり（髄膜炎菌Bブレブ生産菌株におけるlgtB-と、ctrA-、ctrB-、ctrC-、ctrD-、synA-（synX-およびsiaA-と等価）、synB-（siaB-と等価）またはsynC-（siaC-と等価）のいずれかとの組み合わせも用いることができる）、最適な安全性を持ち、LPS保護エピトープを保持するブレブ調製物をもたらす。
【０２５８】
本発明のさらなる態様は、それ故に、かかる髄膜炎菌Bの突然変異菌株の組み合わせから誘導される前記ブレブ免疫原性調製物である。前記菌株自体も本発明のさらなる態様である。
【０２５９】
本発明の免疫原性組成物は少なくとも、1、2、3、4または5つの異なる外膜小胞調製物を含む。2つ以上のOMV調製物が含まれる場合、本発明の少なくとも１つの抗原は各OMVにおいてアップレギュレーションされている。かかるOMV調製物は同じ種および血清群のナイセリア菌株から、または好適には、異なるクラス、血清群、血清型、サブ血清型または免疫型のナイセリア菌株から誘導することができる。例えば、免疫原性組成物は、免疫型L2のLPSを含有する１以上の外膜小胞調製物および免疫型L3のLPSを含有する１以上の外膜小胞調製物を含んでもよい。L2またはL3 OMV調製物は好適にはLPSオリゴ糖合成遺伝子座において最小限の相可変性を有する安定な菌株から誘導する。
【０２６０】
本発明の免疫原性組成物はまた、サブユニット組成物と外膜小胞の両方を含んでもよい。その溶解度の故にサブユニット組成物に封入するのに特に好適であるいくつかの抗原がある。
【０２６１】
かかるタンパク質の例には、TdfI、FhaB、NspA、Hsfのパッセンジャードメイン、Hapのパッセンジャードメイン、AspAのパッセンジャードメイン、AspA、OMP85、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PilQが含まれる。外膜小胞調製物は、組換えにより外膜小胞においてアップレギュレーションされている次のリスト：NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA（高）、TbpA（低）、LbpA、TbpB、LbpB、NadA、TspA、TspB、PilC、PilQ、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、MafA、MafBおよびPldAから選択される少なくとも１つの異なる抗原を有し；そして任意に、LPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のいずれかまたは両方を含みうる。
【０２６２】
本発明の他の態様は、それから本発明の外膜小胞（任意に、前記のように、遺伝子組換えでアップレギュレーションされた少なくとも2種の本発明のタンパク質を有する外膜小胞）を誘導することができる、遺伝子操作されたナイセリア菌株である。かるナイセリア菌株は髄膜炎菌または淋菌であってもよい。
【０２６３】
この菌株はまた、galE、LgtB、LgtE、SiaD、OpC、OpA、PorA、FrpB、msbBおよびHtrBの1、2、3、4、5、6、7または8種の発現を含む他のナイセリア菌タンパク質の発現をダウンレギュレーションするように、遺伝子操作（先に記載した）されていてもよい。ダウンレギュレーションのための好ましい組み合わせには、少なくともLgtBとSiaDのダウンレギュレーション（好適には欠失）、少なくともPorAとOpCのダウンレギュレーション、少なくともPorAとOpAのダウンレギュレーションならびに少なくともPorA、OpAおよびOpCのダウンレギュレーションが含まれる。
【０２６４】
ブレブ生産に関する前記の本発明によって、本発明のさらなる態様は本発明の免疫原性組成物またはワクチンを作る方法を含む。これらには、本発明のキメラタンパク質を、（本発明のナイセリア菌由来のブレブの形態で存在しうる）ナイセリア菌から単離した抗原またはタンパク質と一緒に混合して本発明の免疫原性組成物を作るステップ、ならびに、この本発明の免疫原性組成物を製薬上許容される担体と組み合わせるステップを含むものである本発明のワクチンを作る方法が含まれる。
【０２６５】
また本発明には、ナイセリア菌培養物からキメラタンパク質を含む外膜小胞を単離するステップを含むものである本発明の免疫原性組成物を作る方法が含まれる。かかる方法は少なくとも2つの外膜小胞調製物を混合するさらなるステップを含みうるのであって、一態様においては、少なくとも１つの外膜小胞調製物は免疫型L2のLPSを含有しそして少なくとも１つの外膜小胞調製物は免疫型L3のLPSを含有する。本発明にはまた、外膜小胞を0〜0.5％DOCの濃度で抽出することにより単離するかかる方法が含まれる。LPS含量を最小限にするためには0.3〜0.5％DOCの濃度を用いる。LPSを抗原として保存するOMV調製物においては、0〜0.3％、好適には0.05％〜0.2％、最も好適には約0.1％のDOC濃度を抽出に用いる。
【０２６６】
本発明の免疫原性組成物はさらに細菌の莢膜多糖またはオリゴ糖を含んでもよい。莢膜多糖またはオリゴ糖は、髄膜炎菌血清群A、C、Y、および／またはW-135、インフルエンザb型菌、肺炎球菌、連鎖球菌群A、連鎖球菌群B、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌の１以上から誘導しうる。
【０２６７】
本発明のさらなる態様は、本発明の抗原組成物と、ウイルスまたはグラム陽性菌に関連する病状を含むある特定の病状に対して有利に用いられる他の抗原とを含むワクチンの組み合わせである。
【０２６８】
1つの好ましい組み合わせでは、本発明の抗原性組成物を、単味のまたはタンパク質担体と結合していてもよい次の髄膜炎菌莢膜多糖またはオリゴ糖：A、C、YまたはW-135の1、2、3または、好適には、4つ全てと共に製剤する。一態様においては、本発明の免疫原性組成物をAおよびC；またはC；またはCおよびYと共に製剤する。髄膜炎菌、好適には血清群B由来のタンパク質を含有するかかるワクチンは包括的な髄膜炎菌ワクチンとして有利に用いることができる。
【０２６９】
さらなる好ましい実施形態において、単味のまたは結合した髄膜炎菌の莢膜多糖またはオリゴ糖A、C、YまたはW-135の1、2、3もしくは4つ全て（前記の通り）と共に製剤した本発明の抗原性組成物を、結合したインフルエンザb型菌莢膜多糖またはオリゴ糖および／または1種以上の単味のまたは結合した肺炎球菌性の莢膜多糖またはオリゴ糖と共に製剤する。任意に、ワクチンはまた、肺炎球菌感染に対して宿主を保護できる1種以上のタンパク質抗原を含んでもよい。かかるワクチンは包括的な髄膜炎ワクチンとして有利に用いることができる。
【０２７０】
なおさらなる好ましい実施形態においては、本発明の免疫原性組成物を、髄膜炎菌、インフルエンザb型菌、肺炎球菌、連鎖球菌群A、連鎖球菌群B、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌の1つ以上から誘導された莢膜多糖またはオリゴ糖と共に製剤する。肺炎球菌の莢膜多糖抗原は、好適には、血清型 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33Fから（最も好適には血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23Fから）選択される。さらなる好ましい実施形態はインフルエンザ菌のPRP莢膜多糖を含有しうる。さらなる好ましい実施形態は黄色ブドウ球菌の5型、8型または336型莢膜多糖を含有しうる。さらなる好ましい実施形態は表皮ブドウ球菌のI型、II型またはIII型莢膜多糖を含有しうる。さらなる好ましい実施形態は連鎖球菌B群のla型、Ic型、II型、III型莢膜多糖を含有しうる。さらなる好ましい実施形態は連鎖球菌A群の莢膜多糖を含有し、好適にはさらに少なくとも１つのMタンパク質、そしてさらに好適には複数の型のMタンパク質を含みうる。
【０２７１】
かかる本発明の莢膜多糖は、担体タンパク質、例えば、破傷風トキソイド断片C、ジフテリアトキソイド、CRM197、ニューモリシン、タンパク質D（US6342224）と結合していてもまたはしていなくてもよい。多糖結合は公知のカップリング技法により調製することができる。例えば、多糖をチオエーテル結合を介してカップリングしてもよい。この結合法は、多糖を1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（CDAP）により活性化してシアネートエステルを形成することに依る。こうして活性化多糖を直接またはスペーサー基を介して担体タンパク質上のアミノ基とカップリングさせることができる。一態様においては、シアネートエステルをヘキサンジアミンとカップリングして、このアミノ誘導体化した多糖を、チオエーテル結合の形成に関わるヘテロ連結化学を用いて、担体タンパク質と結合する。かかる結合体はPCT公開出願W093/15760（Uniformed Services University）に記載されている。
【０２７２】
結合体はまた、US4365170（Jennings）およびUS4673574（Anderson）に記載の直接還元アミノ化法により調製することができる。他の方法は、EP-0-161-188、EP-208375およびEP-0-477508に記載されている。さらなる方法は、アジピン酸ヒドラジド（ADH）で誘導体化した臭化シアン活性化多糖のカルボジイミド縮合によるタンパク質担体とのカップリングに関わる（Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256）。オリゴ糖が含まれる場合、これらが結合しているのが好ましい。
【０２７３】
好ましい肺炎球菌のタンパク質抗原は、肺炎球菌の外側表面に曝された（肺炎球菌の生活環の少なくとも一部において宿主の免疫系により認識されうる）肺炎球菌のタンパク質であるか、または肺炎球菌により分泌または放出されたタンパク質である。
【０２７４】
最も好適には、前記タンパク質は肺炎球菌の毒素、アドヘシン、2成分シグナルトランスデューサー、またはリポタンパク質、またはそれらの断片である。特に好ましいタンパク質には、限定されるものでないが、ニューモリシン（好適には化学処理または突然変異により解毒されたもの）［Mitchell et al. Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18 (13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.（肺炎球菌1型と2型由来のニューモリシン遺伝子とタンパク質の比較）"、Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007 (1) : 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli : rapid purification and biological properties.（大腸菌におけるニューモリシン遺伝子の発現：迅速な精製と生物学的特性）"、WO 96/05859 (A. Cyanamid)、WO 90/06951 (Paton et al)、WO 99/03884 (NAVA)］；PspAおよびその膜貫通欠失変異体（US 5804193-Briles ら）；PspCおよびその膜貫通欠失変異体（WO 97/09994-Briles et al）；PsaAおよびその膜貫通欠失変異体（Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64 (12): 5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus praeumoniae"）；肺炎球菌のコリン結合タンパク質およびその膜貫通欠失変異体；CbpAおよびその膜貫通欠失変異体（WO 97/41151； WO 99/51266）； グリセルアルデヒド-3-ホスフェート-デヒドロゲナーゼ（Infect. Immun. 1996 64： 3544）； HSP70 （WO 96/40928）； PcpA （Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164: 207-14）；M様タンパク質、（EP 0837130）およびアドヘシン18627、（EP 0834568）が含まれる。さらなる肺炎球菌のタンパク質抗原は、WO 98/18931に開示されたもの、特にWO 98/18930およびPCT/US99/30390に選択されたものである。
【０２７５】
本発明の免疫原性組成物／ワクチンはまた、任意に、他のグラム陰性菌、例えば、カタル球菌（Moraxella catarrhalis）またはインフルエンザ菌から作られた外膜小胞調製物を含んでもよい。
【０２７６】
本発明の免疫原性組成物はさらに、カタル球菌由来のOMV調製物を含んでもよい。遺伝子操作したOMV調製物は、WO01/09350に記載の通りカタル球菌から誘導することができる。アップレギュレーションには次の（保護抗原をコードする）遺伝子の1つ以上が好ましい：OMP106（WO 97/41731およびWO 96/34960）、HasR（PCT/EP99/03824）、PilQ（PCT/EP99/03823）、OMP85（PCT/EP00/01468）、lipo06（GB 9917977.2）、lipolO（GB 9918208.1）、lipoll（GB 9918302.2）、lipol8（GB 9918038.2）、P6（PCT/EP99/03038）、ompCD、CopB（Helminen ME, et al (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010）、D15（PCT/EP99/03822）、OmplAl（PCT/EP99/06781）、Hly3（PCT/EP99/03257）、LbpAおよびLbpB（WO 98/55606）、TbpAおよびTbpB（WO 97/13785およびWO 97/32980）、OmpE、UspAlおよびUspA2（WO 93/03761）、ならびにOmp21。これらはまた、他のグラム陰性菌中に非相同的に導入することができる。
【０２７７】
次の遺伝子の１以上はダウンレギュレーションが好ましい：CopB、OMP106、OmpBl、TbpA、TbpB、LbpA、およびLbpB。
【０２７８】
次の遺伝子の１以上はダウンレギュレーションが好ましい：htrB、msbBおよびlpxK。
【０２７９】
次の遺伝子の１以上はアップレギュレーションが好ましい：pmrA、pmrB、pmrE、およびpmrF。
【０２８０】
本発明の免疫原性組成物はさらにインフルエンザ菌由来のOMV調製物を含んでもよい。遺伝子操作したOMV調製物はWO01/09350に記載の通りインフルエンザ菌から誘導することができる。次の遺伝子（保護抗原をコードする）の１以上のアップレギュレーションが好ましい：D15（WO94/12641）、P6（EP 281673）、TbpA（W096/40929；W095/13370）、TbpB（W096/40929；W095/13370）、P2、P5（WO94/26304）、OMP26（WO97/01638）、HMW1、HMW2、HMW3、HMW4、Hia、Hsf、Hap、Hin47、およびHif（ピリンをアップレギュレーションするには、このオペロン内の全ての遺伝子をアップレギュレーションすべきである）。これらはまた、非相同的に他のグラム陰性菌中に導入しうる遺伝子としても好ましい。
【０２８１】
次の遺伝子の１以上はダウンレギュレーションが好ましい：P2、P5、Hif、IgAl-プロテアーゼ、HgpA、HgpB、HMW1、HMW2、Hxu、htrB、msbBおよびlpxK。
【０２８２】
次の遺伝子の１以上はアップレギュレーションが好ましい：pmrA、pmrB、pmrE、およびpmrF。
【０２８３】
本発明の免疫原性組成物／ワクチンはまた、任意に、ジフテリア、破傷風および百日咳菌感染の１以上に対する保護を与える抗原を含むことができる。百日咳成分は、PT、FHAおよび69kDaのペルタクチンからの少なくとも１つの抗原（好適には2または3つ全て）を含有する死滅全細胞細胞百日咳菌（Pw）または無細胞百日咳菌（Pa）であってもよい。典型的には、ジフテリアおよび破傷風に対する保護を与える抗原はジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドでありうる。トキソイドは化学的に不活化した毒素または点突然変異の導入により不活化した毒素であってもよい。
【０２８４】
免疫原性組成物／ワクチンはまた、任意に、型決定できないインフルエンザ菌、RSVに対して宿主を保護しうる１以上の抗原および／またはインフルエンザウイルスに対して宿主を保護しうる１以上の抗原を含む。かかるワクチンは包括的中耳炎ワクチンとして有利に用いることができる。
【０２８５】
好ましい型決定できないインフルエンザ菌タンパク質抗原には、フィンブリンタンパク質（米国特許第5766608号）およびそれからのペプチドを含む融合体（例えば、LB1融合体）（米国特許第5843464号-Ohio State Research Foundation）、OMP26、P6、タンパク質D、TbpA、TbpB、Hia、Hmwl、Hmw2、Hap、およびD15が含まれる。
【０２８６】
好ましいインフルエンザウイルス抗原には、卵またはMDCK細胞、またはVero細胞または全fluビロソーム内で増殖した全ウイルス、生ウイルスまたは不活化ウイルス、スプリットインフルエンザウイルス（R. Gluck, Vaccine, 1992,10, 915-920に記載）またはそれらの精製または組換えタンパク質、例えば、HA、NP、NA、またはMタンパク質、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【０２８７】
好ましいRSV（呼吸器合胞体ウイルス）抗原には、F糖タンパク質、G糖タンパク質、HNタンパク質、Mタンパク質またはそれらの誘導体が含まれる。
【０２８８】
本発明の免疫原性組成物は、カタル球菌のタンパク質、例えば、TbpA（W097/13785；W099/52947）、TbpB（W097/13785；W099/52947；Mathers et al FEMS Immunol Med Microbiol 1997 19; 231-236；Myers et al Infect Immun 1998 66; 4183-4192）、LbpA、LbpB （Du et al Infect Immun 1998 66； 3656-3665）、UspAl、UspA2 （Aebi et al Infect Immun. 1997 65； 4367-4377）、OMP106 （US6214981）、Ton-B依存性受容体（WO00/78968）、CopB（Sethi et al Infect. Immun. 1997 65; 3666-3671）、およびHasR受容体（WO00/78968）；インフルエンザ菌のタンパク質、例えば、HMW（St Geme et al Infect Immun 1998 66； 364-368）、Hia（St Geme et al J. Bacteriol. 2000 182； 6005- 6013）、Tbpl（W096/40929；W095/13370）、Tbp2（W096/40929；W095/13370；Gray-Owen et al Infect Immun 1995 63； 1201-1210）、LbpA、LbpB （Schryvers et al 1989,29 ： 121-130）、HasR、TonB依存性受容体（Fleishmann et al Science 1995 269； 496-512）が含まれる］、ヘモグロビン-結合タンパク質［HhuA（Cope et al Infect Immun 2000 68； 4092-4101）、HgpA（Maciver et al Infect Immun 1996 64； 3703-3712）、HgbA、HgbBおよびHgbC（Jin et al Infect Immun 1996 64； 3134-3141）、HxuA（Cope et al Mol Microbiol 1994 13 ； 863-873）、HxuC（Cope et al Infe
ct Immun 2001 69 ; 2353-2363）；髄膜炎菌由来のタンパク質、例えば、Tbpl、Tbp2、FbpA、FbpB、BfrA、BfrB（Tettelin et al Science 2000 287； 1809-1815）、LbpA、LbpBおよびHmbRを含みうる。
【０２８９】
一態様において、本発明はまた、本発明の抗原および免疫原性組成物を製薬上許容される賦形剤との組み合わせで含む医薬組成物に関する。好適な賦形剤は当技術分野で周知である。好適な賦形剤は当該分野において周知である。好適な賦形剤は、典型的には、大きい、徐々に代謝される高分子、例えば、タンパク質、糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、スクロース（Paoletti et al., 2001, Vaccine, 19:2118）、トレハロース（WO 00/56365）、ラクトースおよび脂質凝集物（例えば、油滴またはリポソーム）である。当業者はかかる担体を周知している。ワクチンはまた希釈剤、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、などを含有する。さらに、助剤、例えば、湿潤または乳濁化剤、pH緩衝剤などが存在してもよい。無菌で発熱物質を含まないリン酸緩衝化生理食塩水が典型的な担体である。製薬上許容される賦形剤の徹底した考察は、Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20.sup.th edition, ISBN:0683306472に記載されている。
【０２９０】
組成物の成分は同時、実質的に同時、又は連続的に送達することができる。
【０２９１】
本発明の一実施形態は、本発明の抗原および免疫原性組成物のワクチンにおける製薬上許容される賦形剤との製剤である。
【０２９２】
ワクチン調製物は、一般に、「Vaccine Design（"The subunit and adjuvant approach（サブユニットとアジュバント手法）" (eds Powell M. F. & Newman M. J. ) (1995) Plenum Press New York）」に記載されている。
【０２９３】
有効なワクチンの開発は、有効な免疫応答がワクチン接種した個人に誘発されたかどうかを確立する信頼できる試験を必要とする。髄膜炎については、血清殺菌活性（SBA）試験法を用いて、ワクチンに封入するのに好適な抗原を決定することができ、好適には、SBAの4倍増加を保護の代理指標として受け入れることができる。従って、SBAの4倍増加を誘発しうる用量を保護用量または有効量として受け入れることができる。特に、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、その組成物中に、記載した（単離および／または精製）抗原のそれぞれの0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9 または10μg（またはそれ以上）のヒト用量を含みうる。
【０２９４】
本発明の医薬組成物またはワクチンはまた、アジュバントを含んでもよい。
【０２９５】
好適なアジュバントには、アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムが含まれるが、またカルシウムの塩（特に炭酸カルシウム）、鉄または亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化チロシン、またはアシル化糖類、カチオンまたはアニオンとして誘導体化された多糖類、またはポリホスファゼン類の不溶懸濁液であってもよい。
【０２９６】
利用できる好適なThlアジュバント系には、モノホスホリルリピドA、特に3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドA、およびモノホスホリルリピドA、好適には3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL）のアルミニウム塩（好適にはリン酸アルミニウム）との組み合わせが含まれる。増強系は、モノホスホリルリピドAとサポニン誘導体の組み合わせ、特にWO 94/00153に開示されたQS21と3D-MPLの組み合わせ、または、W096/33739に開示されたQS21をコレステロールによってクエンチした低反応原性組成に関わる。水中油乳濁液中のQS21 3D-MPLおよびトコフェロールに関わる特に強力なアジュバント製剤はW095/17210に記載され、好ましい製剤である。
【０２９７】
ワクチンはサポニン、さらに好適にはQS21を含んでもよい。ワクチンはまた、水中油乳濁液およびトコフェロールを含んでもよい。オリゴヌクレオチドを含有する非メチル化CpG（WO 96/02555）もまた、TH1応答の好ましいインデューサーであり、本発明における使用に好適である。
【０２９８】
本発明の他の態様はナイセリア菌感染の予防または治療に用いるための免疫グロブリンを調製する方法であって、受給者を本発明のワクチンを用いて免疫感作するステップおよび免疫グロブリンを受給者から単離するステップを含むものである前記方法である。この方法により調製される免疫グロブリンは本発明のさらなる態様である。本発明の免疫グロブリンおよび製薬上許容される担体を含む医薬組成物は本発明のさらなる態様であって、この態様はナイセリア菌疾患を治療または予防するための医薬品の製造に用いることができる。患者に有効量の本発明の医薬調製物を投与するステップを含むものである、ナイセリア菌感染を治療または予防する方法は本発明のさらなる態様である。
【０２９９】
ポリクローナル抗体生産のための接種材料は、典型的には、抗原性組成物を生理学的に許容される希釈剤、例えば生理食塩水またはヒト使用に好適な他のアジュバントに希釈して水性組成物を形成することにより調製する。接種材料の免疫刺激量を哺乳動物に投与し、次いで接種した哺乳動物を、保護抗体を誘発するのに十分な時間、維持する。
【０３００】
抗体はアフィニティクロマトグラフィなどの周知の技法により所望の程度まで単離することができる（Harlow and Lane Antibodies; a laboratory manual 1988）。
【０３０１】
抗体は様々な通常用いる動物、例えば、ヤギ、霊長類、ロバ、ブタ、ウマ、モルモット、ラットまたはヒトからの抗血清調製物を含みうる。動物から採血して血清を回収する。
【０３０２】
本発明によって生産される免疫グロブリンには全抗体、抗体フラグメントまたはサブフラグメントが含まれる。抗体はいずれかのクラスの全免疫グロブリン、例えば、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgE、本発明の2種以上の抗原に二重特異性をもつキメラ抗体またはハイブリッド抗体であってもよい。これらはまた、フラグメント、例えば、F(ab')2、Fab'、Fab、Fvなどであってもよく、ハイブリッドフラグメントを含む。免疫グロブリンはまた、特異的抗原と結合して複合体を形成することにより抗体のように作用する天然、合成または遺伝子操作で作られたタンパク質も含む。
【０３０３】
本発明のワクチンを、その具体的なワクチンからのチャレンジに応答して生産される免疫グロブリンの供給源である受給者に投与することができる。このように処置した被験者が提供する血漿から、過免疫グロブリンが通常の血漿分画手法を介して得られる。ナイセリア菌感染に対する耐性を与えるかまたはナイセリア菌感染を治療するために、過免疫グロブリンを他の被験者に投与しうる。幼児、免疫無防備状態の個体におけるナイセリア菌疾患の治療もしくは予防に、または治療が必要であるがその個体にワクチン接種に応答して抗体を生産する時間が無い場合、本発明の過免疫グロブリンは特に有用である。
【０３０４】
本発明のさらなる態様は、本発明の免疫原性組成物の少なくとも2つの構成成分に対して反応性のさらなるモノクローナル抗体（またはそれらのフラグメント；好適にはヒトもしくはヒト化した）の2つ以上を含む医薬組成物であって、グラム陰性菌、好適にはナイセリア菌、より好適には髄膜炎菌または淋菌そして最も好適には髄膜炎菌血清群Bによる感染を治療または予防するために用いることができる前記免疫原性組成物である。
【０３０５】
かかる医薬組成物は、いずれかのクラスの全免疫グロブリン、例えば、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgE、本発明の2種以上の抗原に二重特異性をもつキメラ抗体またはハイブリッド抗体であってもよいモノクローナル抗体を含む。これらはまた、フラグメント、例えば、F(ab')2、Fab'、Fab、Fvなどであってもよく、ハイブリッドフラグメントを含む。
【０３０６】
モノクローナル抗体を作る方法は当技術分野で周知であり、脾細胞の骨髄腫細胞との融合体（Kohler and Milstein 1975 Nature 256; 495; Antibodies-a laboratory manual Harlow and Lane 1988）を含みうる。あるいは、モノクローナルFvフラグメントは好適なファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる（Vaughan TJ et al 1998 Nature Biotechnology 16; 535）。モノクローナル抗体は公知の方法によるヒト化または部分ヒト化したものであってもよい。
【０３０７】
本発明の他の態様は、ナイセリア菌疾患の治療または予防のための方法であって、本発明のワクチンの保護用量（または有効量）をそれを必要とする宿主に投与するステップを含むものである前記方法に関わる。
【０３０８】
本発明はまた、ナイセリア菌感染または疾患を治療または予防するための医薬の調製における本発明の免疫原性組成物の使用、ならびに、髄膜炎菌感染または疾患を治療または予防するための本明細書に記載した免疫原性組成物を含む。
【０３０９】
一態様において、予防はmenB感染および／または疾患に対する予防である。
【０３１０】
宿主は好適にはヒト宿主である。
【０３１１】
本発明のワクチン調製物を用いて、前記ワクチンを全身または粘膜経路を介して投与する手段により感染に感受性の哺乳動物を保護または治療することができる。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路を介する注入；または粘膜を介する経口／食事、呼吸器、尿生殖器路への投与を含みうる。従って、本発明の一態様は、グラム陰性菌の感染により引き起される疾患に対するヒト宿主を免疫感作する方法であって、宿主に本発明の調製物の免疫保護用量を投与するステップを含むものである前記方法である。
【０３１２】
各ワクチン用量中の抗原の量は、典型的なワクチンの有意な、有害な副作用無しに免疫保護応答を誘発する量として選択される。かかる量は、用いる具体的な免疫源および提示する方法に応じて変わりうる。一般に、各用量は1〜100pg、好適には5〜50pg、そして最も典型的には5〜25utのタンパク質抗原またはOMV調製物を含みうると予想される。
【０３１３】
特別なワクチンに対する最適な量は、被験者における適当な免疫応答の観察に関わる標準研究により確かめることができる。
【０３１４】
最初のワクチン接種後、十分な間隔を置いて、被験者は1回または数回の追加免疫を受けることができる。
【０３１５】
本発明のワクチンは、好適な免疫保護を与えかつ無毒であって小児期または青年期に対する使用に好適である。
【０３１６】
小児期の使用は4歳未満の幼児における使用を意味する。
【０３１７】
免疫保護は、先に記載のSBAおよび／または動物保護モデルおよび／または接着阻止試験法に満足に適合することを意味する。
【０３１８】
無毒は、公知のLALおよび発熱性試験法により測定したワクチンの内毒素活性を満足するレベルを超えないことを意味する。
【０３１９】
ワクチンの効力は様々な試験法を通して試験することができる。動物モデルの保護試験法は当技術分野で周知である。さらに、血清殺菌試験法（SBA）は、髄膜炎菌ワクチンの効力を見積るための最も通常認められる免疫学的マーカーである（Perkins et al. J Infect Dis. 1998,177 : 683-691）。
【０３２０】
かかる相乗的応答は、各抗原によって別々に誘発されるSBAより少なくとも50％、2倍、3倍、好適には4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍そして最も好適には10倍高い抗原の組み合わせにより誘発されるSBAによって特徴付けることができる。一態様においては、SBAを、抗原が誘導された同種菌株に対しておよび、好適にはまた、異種菌株のパネルに対して測定する（代表的なパネルについては以下を参照されたい：例えば、NZ124/98 (B:4:P1.7-2,4:L3 ST-44複合体)、760676 (B:2a:P1.5,2:L2 ST-11複合体）、A-4クラスターに属するBZ10 (B: 2b: P1. 2)；ET-37複合体に属するB16B6 (B: 2a: P1. 2)；H44/76 (B: 15 : P1. 7,16)）。SBAは髄膜炎菌ワクチンの効力を見積るために最も通常認められた免疫学的マーカーである（Perkins et al. J Infect Dis. 1998, 177: 683-691）。満足なSBAは任意の公知の方法により確かめることができる。SBAは、動物モデルから、またはヒト被験者から得た血清を用いて行うことができる。
【０３２１】
ヒト血清を使用してSBAを行うための好ましい方法は以下のとおりである。初回ワクチン接種の前、2回目のワクチン接種の2ヵ月後および3回目のワクチン接種の1ヵ月後に血液サンプルを採取する（1年に3回のワクチン接種が典型的なヒト初回ワクチン接種計画であり、例えば、0、2および4ヶ月、または0、1および6ヶ月の時点で投与を行う）。かかるヒト初回ワクチン接種計画は、1歳未満（例えば、Hibワクチン接種と同時に実施する）に実施することができ、あるいは、2〜4歳の小児または青年にもかかる初回ワクチン接種計画でワクチン接種をしてSBAを試験することができる。さらなる血液サンプルを、初回ワクチン接種の6〜12ヶ月後、および追加接種が適用可能な場合には追加接種の1ヵ月後に採取してもよい。
【０３２２】
3回目のワクチン接種（初回ワクチン接種計画の3回目のワクチン接種）（2〜4歳の小児または青年、好ましくは1歳以下の小児におけるもの）の1ヶ月後、本発明の抗原が由来する髄膜炎菌株に対するSBA（抗体希釈）力価において（ワクチン接種前の力価と比較して）4倍の増加を示す被験者のパーセントが該被験者の30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、最も好ましくは60％以上である場合には、SBAは、同種殺菌活性を有する抗原またはブレブ調製物に関して満足しうるものであろう。
【０３２３】
もちろん、異種殺菌活性を有する抗原またはブレブ調製物も、それが由来する髄膜炎菌株に対して十分なSBAを誘発することができれば、同種殺菌活性を有するブレブ調製物を構成することができる。
【０３２４】
3回目のワクチン接種（初回ワクチン接種計画の3回目のワクチン接種）（2〜4歳の小児または青年、好ましくは1歳以下の小児におけるもの）の1ヶ月後、3つの異種髄膜炎菌株に対するSBA（抗体希釈）力価において（ワクチン接種前の力価と比較して）4倍の増加を示す被験者のパーセントが該被験者の20％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは35％以上、最も好ましくは40％以上である場合には、SBAは、異種殺菌活性を有する抗原またはブレブ調製物に関して満足しうるものであろう。かかる試験は、異種殺菌活性を有する抗原またはブレブ調製物が種々の髄膜炎菌株に対する交差殺菌性抗体を誘導しうるかどうかの良好な指標である。かかる3つの異種株は、好適には、互いに異なる、および、好適には、異種殺菌活性を有する抗原またはブレブ調製物の原料となったまたはそれが由来する株とは異なる、電気泳動型（ET）複合体または多座配列型（multilocus sequence typing）（MLST）パターン（Maidenら PNAS USA 1998, 95:3140-5を参照）を有するべきである。当業者は、髄膜炎菌、特に、重要な病難の原因であると認められておりおよび／または認識されているMenB超ビルレント系統に相当する髄膜炎菌B型株において認められる遺伝的多様性を表す異なるET複合体を有する3つの株を容易に決定しうるであろう（Maidenら、前掲を参照されたい）。例えば、使用しうる3つの株としては以下のものが挙げられる：A-4クラスターに属するBZ10 (B:2b:P1.2)、ET-37複合体に属するB16B6 (B:2a:P1.2)、およびET-5複合体に属するH44/76 (B:15:P1.7,16)、または同じET/クラスターに属する他の任意の菌株。例えばET-5複合体に属する髄膜炎菌CU385（B:4:P1.15）から製造されたまたはそれに由来する、異種殺菌活性を有する抗原またはブレブ調製物を試験するために、かかる菌株を使用することが可能である。使用しうるもう1つのサンプル株は系統3流行性クローン（例えば、NZ124 [B:4:P1.7,4]）由来である。もう1つのET-37株はNGP165 (B:2a:P1.2)である。
【０３２５】
SBA活性の測定方法は当技術分野において公知である。例えば、使用しうる方法はWO 99/09176に記載されている。一般には、被験株の培養物を（好ましくは、鉄キレート剤、例えばEDDAの増殖培地への添加による鉄枯渇条件にて）対数増殖期まで、または亜鉛枯渇のために1-30μＭのTPENを添加することによって、増殖させる。TPENは、例えばMH寒天中の10〜30μM、例えば20μMの濃度にて用いることができる。これを、約20000 CFU/mlに調節された試験用細胞懸濁液を得るために、BSAを含有する培地（例えば、0.3％ BSAを含有するハンクス培地）に懸濁させることができる。被験血清の2倍連続希釈液（好ましくは、56℃で30分間熱不活化されたもの）［例えば、50μl/ウェルの容量中］と20000 CFU/ml 被験髄膜炎菌株懸濁液［例えば、25μl/ウェル体積の］とを混合することにより、一連の反応混合物を調製することができる。反応バイアルをインキュベート（例えば、37℃で15分間）し、振とう（例えば、210rpm）しなければならない。最終反応混合物［例えば、100μl容量］は更に、補体源［例えば、25％最終容量の予備試験された子ウサギ血清］を含有し、それを前記のとおりに［例えば、37℃で60分間］インキュベートする。この試験法には無菌ポリスチレンU底96ウェルマイクロタイタープレートを使用することができる。アリコート［例えば、10μl］を、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから採取し、ミュラー・ヒントン（Mueller-Hinton）寒天プレート（好適には、1％ Isovitalexおよび1％ 熱不活化ウマ血清を含有する）上に滴下し、インキュベートする（例えば、5％ CO2中、37℃で18時間）。一態様においては、個々のコロニーをアリコート当たり80 CFUまで数えることができる。次の3つの試験サンプルを対照として用いることができる：バッファー＋細菌＋補体；バッファー＋細菌＋不活化補体；血清＋細菌＋不活化補体。SBA力価は、データを処理して回帰計算により50％の細胞死に対応する希釈の測定値を与えるプログラムを用いて、簡単に計算することができる。
【０３２６】
あるいは、相乗的応答は動物保護試験法における抗原の組み合わせの効力により特徴付けることができる。例えば、実施例12または13に記載の試験法を用いることができる。一態様において、抗原の組み合わせにより保護される動物数は、抗原それ自体だけを用いるのと比較して、特に準最適用量の抗原において、有意に改善される。
【０３２７】
淋菌による感染の予防用に成功するワクチンは、次の要素：淋菌の補体介在性死滅を促進するための、および／または食作用および多形核白血球などの白血球による微生物死滅を促進するための、および／または淋菌の宿主組織への付着を阻止するための血清および／または粘膜抗体の１以上の作製を必要とし：細胞介在性免疫応答の誘導も保護に参加しうる。
【０３２８】
本発明のブレブ淋菌ワクチン調製物の効力の改善は、他に記載されるように、抗付着性、および／またはオプソニン化特性、および／または細菌活性を有する血清および／または粘膜抗体について誘導される免疫応答を分析することにより評価することができる（McChesney D et al, Infect. Immun. 36: 1006, 1982；Boslego J et al: "Efficacy trial of a purified gonococci pilus vaccine（精製した淋菌線毛ワクチンの効力試験）", in Program and Abstracts of the 24th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, American Society for Microbiology, 1984；Siegel M et al, J. Infect. Dis 145: 300, 1982 ；de la Pas, Microbiology, 141 (Pt4): 913-20,1995）。
【０３２９】
淋菌による生殖感染のマウスモデルは最近記載されている（Plante M, J. Infect. Dis. , 182 : 848-55, 2000）。本発明のブレブ淋菌ワクチンの効率の改善はまた、このマウス感染モデルにおける淋菌によるコロニー形成を防止または低下させるその能力により評価してもよい。
【０３３０】
あるいは、相乗的応答は、付着遮断試験法における抗原の組み合わせの効力により特徴付けることができる。例えば、実施例11に記載の試験法を用いることができる。一態様において、抗原の組み合わせに対して生起される抗血清により誘導される遮断の程度は、それら自体による抗原に対して生起される抗血清を用いるのと比較して、特に準最適用量の抗体において、有意に改善される。
【０３３１】
特許出願および許可された特許を含む本出願における全ての参照の教示は、本明細書にその全てが参照により組み込まれる。本出願が優先権を主張する特許出願は、参照により本明細書にその全てが公開および参照のために本明細書に記載した方法で組み込まれるものである。
【０３３２】
疑義を避けるために記すと、本発明者らは本明細書の用語「含む（‘comprising’、‘comprise’および‘comprises’）」を任意に用語「から成る（‘consisting of’、‘consist of’、および ‘consists of’）」と、それぞれ、いずれの場合にも置換えうると意図している。本明細書および請求項において用いる、用語「含む（"comprising"およびそのいずれかの形、例えば、"comprise"および"comprises"）」、「有する（"having"およびそのいずれかの形、例えば、"have"および"has"）」、「含む（"including"およびそのいずれかの形、例えば、"includes"および"include"）」または「含有する（"containing"およびそのいずれかの形、例えば、"contains" および "contain"）」はすべてを包括的または末尾が開放的であって、追加の、挙げてないエレメントまたは方法のステップを排除するものではない。
【０３３３】
本発明の「ワクチン組成物」に関する本明細書の実施形態はまた、本発明の「免疫原性組成物」に関する実施形態に適用可能であり、そして、逆も真である。全ての数値における用語「約（“about”）」または「およそ（“around”）」は5％の変動を容認する、すなわち、約1.25％の値は1.19％〜1.31％の間を意味しうる。
【０３３４】
用語「1つの（"a"または"an"）」の使用は、請求項および／または明細書において用語「含む（"comprising"）」と関連して用いられる場合、「1（"one"）」を意味しうるが、これはまた、「1以上」、「少なくとも1」、および「1または1を超える」の意味と一致する。請求項における用語「または（"or"）」の使用は、代わりのものだけまたは代わりのものがお互いに排他的であることを意味すると明示されなければ、「および／または（"and/or"）」を意味するために使われるが、本発明は代わりのものだけならびに「および／または（"and/or"）」を意味するという定義を支持する。本出願全体を通して、用語「約（"about"）」を用いて、値はその値を測定するために使われた測定誤差の固有の変動または研究対象の間に存在する変動を含むことを示す。
【０３３５】
本明細書で使用する用語「またはその組み合わせ」は、この用語に先行する掲げられたアイテムの全ての順列と組み合わせを意味する。例えば「A、B、C、またはその組み合わせ」は、A、B、C、AB、AC、BC、またはABCの少なくとも1つを含み、そしてもし順序が特別な文脈において重要であれば、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、または CABも含むことを意図する。この例で続けると、明らかに含まれるのは、１以上のアイテムまたは用語の反復を含有する組み合わせ、例えば、BB、AAA、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABBなどである。当業者は、文脈からそうでないことが明らかでなければ、典型的にはいずれの組み合わせにおいてもアイテムまたは用語の数に制限がないことを理解するであろう。
【０３３６】
本明細書でのブレブ、小胞および外膜小胞への言及はまた、当業者に公知の全ての単離膜由来のタンパク質産物、例えば、ブレブ、マイクロ小胞、OMV、OMPC（外膜タンパク質複合体）、またはゴースト膜（membrane ghost）などへの言及であることを意図する。
【０３３７】
本明細書での全ての事例における「保護のため」および「治療のため」への言及はそれぞれ、明白には代わりに「予防における使用のため」または「治療における使用のため」と書くことができる。
【０３３８】
本明細書で開示したおよび請求した組成物および／または方法の全ては、本開示の教示のもとで、無駄な実験なしに作りかつ実施することができる。本発明の組成物と方法は好適な実施形態を用いて記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された方法のステップまたは一連の複数のステップにおける組成物および／または方法に変法を適用できることは当業者に明らかであろう。当業者に明らかな全てのかかる類似した置換および改変は、添付した請求項により規定される本発明の精神、範囲および概念内にあるとみなされる。
【０３３９】
本明細書に記載した特定の実施形態は説明の方法として示されたのであって本発明を限定するものでないことは理解されよう。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態において使うことができる。当業者は、通常の研究を用いて、本明細書に記載の具体的な手順との多数の等価物を確認することができるであろう。かかる等価物は、本発明の範囲内にありかつ本発明の請求の範囲内にあると考えられる。本明細書で記載した全ての出版物と特許出願は、本発明が関わる当業者の技術レベルを示すものである。あたかもそれぞれの個々の出版物と特許出願を具体的にかつ個々に参照により組み入れると示したのと同じ程度に、全ての出版物と特許出願は本明細書に参照により組み入れられる。
【０３４０】
本発明をさらに、次の限定するものでない実施例を参照して記載する。
【実施例１】
【０３４１】
融合タンパク質の製造
1.  fHbp由来の色々な融合タンパク質を大腸菌株に発現させた。
【０３４２】
表１
【表２】
2013521327.tif 000007
【０３４３】
2.  宿主菌株：
T7 Express competent E.col（T7発現用コンピテント大腸菌）（NEBカタログ番号 C2566H）：増強されたBL21派生株；lacオペロン中にT7 RNAポリメラーゼが組み込まれている〜λプロファージ無し；LonおよびOmpTプロテアーゼ欠損株；ファージT1耐性株（fhuA2）；メチル化DNA（McrA-、McrBC-、EcoBr-m-、Mrr-）を制限しない；B菌株；動物産物を含まない。遺伝形質：fhuA2 lacZ::T7 gene 1 [lon] omp T gal sulA11 R(mcr-73::miniTn10--TetS)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10--TetS) endA1 Δ(mcrC-mrr)114::IS10：。
【０３４４】
3.  組換えタンパク質（全長配列について付与した番号付け）：
本明細書に例示した融合体のファミリーB部分は全長MC58配列のアミノ酸位置73から出発し、その全長配列自体はアミノ酸66にて出発する成熟配列を含む。（7個のN末端アミノ酸（CSSGGGG-配列番号11）をMHHHHHH（配列番号12）により置換えて精製を可能にする）。
【０３４５】
もし全長MC58タンパク質配列の番号を、全長配列の残基200が成熟MC58配列の残基135に対応することを考慮すれば、融合体のMC58部分は残基200（…DIA）にて完了する。
【０３４６】
本明細書に例示した融合体の8047部分は全長（273アミノ酸）8047タンパク質配列の残基155（GEH…）にて始まる。ペプチドGEHT（配列番号13）はファミリーAとBにおいて同一であり、2つの部分間の継手はGly残基である。全長配列の残基155は成熟配列の136に対応する。
【０３４７】
表２
【表３】
2013521327.tif 000008
【０３４８】
4.組換えタンパク質の発現：
4.1-形質転換
大腸菌T7 ExpressのプラスミドDNAによる形質転換を標準方法により、CaCl2処理した細胞を用いて行った（Hanahan D. ＜ Plasmid transformation by Simanis.（Simanisによるプラスミド形質転換）＞ In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.）。
【表４】
2013521327.tif 000009
【０３４９】
A：NEB（カタログ番号：C2566H）
B：BBL(登録商標) Select APS(登録商標) LBブロスベース、BD（MD, USA）（カタログ番号：292438）；寒天、Laboratoire MAT（QC, Canada）（カタログ番号：AP-0108）
C： Sigma（ON, Canada）（カタログ番号： K-4000）
4.2-培養
大腸菌T7 Express＋形質転換（5.1節）からのプラスミドを接種したコンフルエント寒天プレートを剥ぎ取り、培地に再懸濁し、そしてこれを用いて800mlのLBブロス（BD）±1％（w/v）グルコース（Laboratoire MAT、カタログ番号：GR-0101）＋抗生物質（5.1節に記載の通り）を接種し、O.D.600nm 0.1〜0.2を得た。
【０３５０】
培養を37℃にて、250RPMでO.D.600nmおよそ0.8までインキュベートした。この時点で、1 mlの各培養を採集し、14 000 RPMにて5分間遠心分離し、そして上清／ペレットを-20℃にて別々に凍結した。
【０３５１】
4.3-誘導
およそ0.8のO.D.600nmにて、培養T7 Expressを冷却（-20℃、20分間）した後、1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG；EMD Chemicals Inc.、カタログ番号：5815）を加えることにより組換えタンパク質の発現を誘導し、そして一晩22℃、250 RPMにてインキュベートした。
【０３５２】
4.4-誘導後のサンプル調製
一晩誘導した後（およそ16時間）、O.D.600nmを誘導後に評価し、培養を14000 RPMにて5分間遠心分離し、そして上清／ペレットを-20℃にて別々に凍結した。
【０３５３】
5.精製：
細菌ペレットを、500mM NaClおよびプロテアーゼインヒビター（Complete, Roche）の混合物を含有する20mMビシンバッファー（pH 8.0）に再懸濁した。細菌をConstant System 1.1 KW 2 X 30 000 PSIを用いて溶菌した。可溶（上清）および不溶（ペレット）成分を遠心分離により20 000gで20分間、4℃にて分離した。
【０３５４】
6-Hisタグ付きタンパク質を生来の条件のもと、IMAC上でProfinia標準プロトコル（流量：2ml/min）を用いて精製した。可溶成分を、細菌再懸濁に用いたのと同じバッファーにより予め平衡化した5ml Hisトラップカラム（BioRad）に加えた。カラムに添加した後、そのカラムを同じバッファーにより洗浄した。本発明者らは2回目の洗浄に500mM NaCl、10mMイミダゾールを含有する20mMビシンバッファー（pH 8.0）を用いた。溶出は、500mM NaClおよび250mMイミダゾールを含有する20mMビシンバッファー（pH 8.0）を用いて実施した。タンパク質はPBS 1X pH 7.4を用いて透析し、そして投与量はBioRadのDC Protein Assayを用いて決定した。
【０３５５】
SDS-Page：
ゲル：NuPAGE 4〜12％ Bis-Trisゲル 1.0mm X 15ウエル（Invitrogen カタログ番号：NP0323BOX）。
【０３５６】
サンプル、バッファーおよび泳動条件の調製はメーカー（Invitrogen）の推奨する条件下で行った。
【０３５７】
ウェスタンブロット:
バッファーの調製および泳動条件はメーカー（Invitrogen）の推奨する条件下で行った。
【０３５８】
膜を30分間、37℃、60RPMにて、3％ミルク/PBS 1X 新鮮溶液を用いてブロックした。ブロックするインキュベーションの後、α-6XHisタグ（AbCam、カタログ番号：ab9108-100）またはα-fHbpA（200802032 pool g2、18/06/08 D42）から成り、それぞれ3％ミルク/PBS 1Xの新鮮溶液に1：1000または1：400にて希釈した一次抗体を1時間37℃、60RPMで加えた。その後、膜を、3回、5分間室温にて0.02％ Tween 20／PBS 1Xを用いて洗浄した。二次抗体は、3％ミルク／PBS 1X 新鮮溶液中のヤギ抗-ウサギアルカリホスファターゼ（Jackson laboratory, カタログ番号：111-055-144）を希釈1：14000で、またはヤギアルカリホスファターゼ抗-IgG＋IgM（H+L）マウス（Jackson laboratory, カタログ番号：115-055-068）を希釈1：6000で用いて、加えた。膜を1時間、37oC、60 RPMでインキュベートした。その後、膜を3回、5分間室温にて0.02％ Tween 20 / PBS 1Xを用いて洗浄した後、膜をメーカーの推奨する条件下でアルカリホスファターゼ基質（Sigma Fast NBT/BCIP, カタログ番号：B5655-25TAB）に曝した。
【実施例２】
【０３５９】
融合タンパク質A
この融合体はファミリーB MC58成熟タンパク質配列（残基1〜残基135）の一部とファミリーA 8047成熟タンパク質配列（残基136〜残基254）の一部を含む。この融合体において、M.C.Schneiderらによってタンパク質のH因子結合に関わると同定された2残基（Glu217およびThr238）をアラニンに突然変異させた。
【０３６０】
核酸配列におけるこれらの突然変異は次の通りである：
・コドンGAA（nT 649、Glu217）はコドンGCA（Ala217*）に突然変異した。
【０３６１】
・コドンACC（nT 712、Thr238）はコドンGCC（Ala238*）に突然変異した。
【０３６２】
この融合体の配列−配列番号18（長さ：254aa）は次の通りである：
2013521327.tif 000010
下線を引いた配列は菌株 MC58由来のファミリーB配列である。融合体の他の配列は菌株8047由来のファミリーA配列である。
【０３６３】
対応する核酸配列（配列番号19）：
ATGCATCATCATCACCATCATGTTGCAGCAGATATTGGCGCAGGTCTGGCAGATGCACTGACCGCTCCGCTGGATCATAAAGATAAAGGTCTGCAGAGCCTGACCCTGGATCAGAGCGTTCGCAAAAATGAAAAACTGAAACTGGCAGCACAGGGTGCAGAAAAAACCTATGGTAATGGCGATAGCCTGAATACCGGCAAACTGAAAAATGATAAAGTGAGCCGCTTTGATTTTATTCGCCAGATTGAAGTTGATGGTCAGCTGATTACCCTGGAAAGCGGTGAATTTCAGGTGTATAAACAGAGCCATAGCGCACTGACCGCCTTTCAGACCGAACAAATTCAGGATAGCGAACATAGCGGTAAAATGGTTGCCAAACGCCAGTTTCGTATTGGTGATATTGCCGGTGAACATACCGCATTTAATCAGCTGCCGGATGGTAAAGCAGAATATCATGGCAAAGCCTTTAGCTCTGATGATGCCGGTGGTAAACTGACCTATACCATTGATTTTGCAGCCAAACAGGGTCATGGCAAAATTGAACATCTGAAAACACCGGAACAGAATGTTGAACTGGCAGCAGCAGAACTGAAAGCAGATGAAAAAAGCCATGCCGTTATTCTGGGTGATACCCGTTATGGTAGCGAAGCAAAAGGCACCTATCATCTGGCACTGTTTGGTGATCGTGCACAGGAAATTGCAGGTAGCGCAGCAGTTAAAATTGGCGAAAAAGTGCATGAAATTGGCATTGCCGGTAAACAG
【実施例３】
【０３６４】
融合タンパク質B（配列番号20および21）
Glu238はH因子と結合できる全ての菌株において保存されてないので、この残基はこの結合にとって潜在的に必須でない。そこで、融合タンパク質Bを提案した。
【０３６５】
この融合体は、アミノ酸Glu217（全ての菌株で保存され、H因子結合に関わる確率が非常に高い）だけをAla217に変異させた融合体Aに基づくものである。
【実施例４】
【０３６６】
融合タンパク質C
融合体Aに基づき、さらにいくつかの突然変異を含むこの融合体は、融合体AとBで失われたファミリーB MAb502エピトープを回復するために導入した。
【０３６７】
ファミリーB成熟タンパク質配列の残基Glu146〜Arg149およびArg204はMAb502を認識する重要な残基であると同定した。
【０３６８】
残基Gly147は既にfHbpファミリーA成熟タンパク質配列中に存在する。fHbpファミリーAタンパク質配列のアミノ酸Asp146、Lys148およびSer203を、Glu146、Arg149およびArg204によりそれぞれ置換えた。さらに、グリシンを位置147に導入した。
【０３６９】
核酸配列における突然変異：
Asp146 → Glu146 ： GAC → GAA （nT 436）
Gly147の付加     ： GGC （nT 439）
Lys148 → Arg149 ： AAA → AGG （nT 445）
Ser203 → Arg204 ： TCA → CGT （nT 610）。
【０３７０】
融合体の配列（長さ：255aa）（配列番号22）：
2013521327.tif 000011
対応する核酸配列（配列番号23）：
ATGCATCATCATCACCATCATGTTGCAGCAGATATTGGCGCAGGTCTGGCAGATGCACTGACCGCTCCGCTGGATCATAAAGATAAAGGTCTGCAGAGCCTGACCCTGGATCAGAGCGTTCGCAAAAATGAAAAACTGAAACTGGCAGCACAGGGTGCAGAAAAAACCTATGGTAATGGCGATAGCCTGAATACCGGCAAACTGAAAAATGATAAAGTGAGCCGCTTTGATTTTATTCGCCAGATTGAAGTTGATGGTCAGCTGATTACCCTGGAAAGCGGTGAATTTCAGGTGTATAAACAGAGCCATAGCGCACTGACCGCCTTTCAGACCGAACAAATTCAGGATAGCGAACATAGCGGTAAAATGGTTGCCAAACGCCAGTTTCGTATTGGTGATATTGCCGGTGAACATACCGCATTTAATCAGCTGCCGGAAGGTGGTCGTGCAGAATATCATGGCAAAGCCTTTAGCTCTGATGATGCCGGTGGTAAACTGACCTATACCATTGATTTTGCAGCCAAACAGGGTCATGGCAAAATTGAACATCTGAAAACACCGGAACAGAATGTTGAACTGGCAGCAGCAGAACTGAAAGCAGATGAAAAACGTCATGCCGTTATTCTGGGTGATACCCGTTATGGTAGCGAAGCAAAAGGCACCTATCATCTGGCACTGTTTGGTGATCGCGCACAGGAAATTGCAGGTAGCGCAGCAGTTAAAATTGGCGAAAAAGTGCATGAAATTGGCATTGCCGGTAAACAG
【実施例５】
【０３７１】
提案した融合タンパク質D
融合タンパク質Dは融合体Cに基づくものであり、ここでは、H因子結合に関わるアミノ酸Glu218だけをAla218に突然変異した。
【実施例６】
【０３７２】
融合タンパク質E
この融合体は融合タンパク質Cに基づく。潜在的にMAb502認識に関わるいくつかのさらなる残基を同定した。ファミリーB成熟タンパク質配列には、Pro145、Phe227、Gly228、Lys230およびGlu233が存在する。
【０３７３】
これらの残基の役割を試験するために、融合体Eを提案した。融合体Eはこれらの残基を挿入した融合体Cである。
【０３７４】
これらの興味深い残基を融合体中に回復するためには、単独のコドン突然変異を融合タンパク質C構築物上で行わなければならない：ファミリーA成熟タンパク質配列（菌株8047）におけるArg230をLys230に突然変異しなければならない。
【０３７５】
融合体-配列番号24（長さ：255aa）の配列：
2013521327.tif 000012
核酸配列における突然変異：
・Arg230→Lys230：CGC→AAA（nT688）
対応する核酸配列（配列番号25）：
ATGCATCATCATCACCATCATGTTGCAGCAGATATTGGCGCAGGTCTGGCAGATGCACTGACCGCTCCGCTGGATCATAAAGATAAAGGTCTGCAGAGCCTGACCCTGGATCAGAGCGTTCGCAAAAATGAAAAACTGAAACTGGCAGCACAGGGTGCAGAAAAAACCTATGGTAATGGCGATAGCCTGAATACCGGCAAACTGAAAAATGATAAAGTGAGCCGCTTTGATTTTATTCGCCAGATTGAAGTTGATGGTCAGCTGATTACCCTGGAAAGCGGTGAATTTCAGGTGTATAAACAGAGCCATAGCGCACTGACCGCCTTTCAGACCGAACAAATTCAGGATAGCGAACATAGCGGTAAAATGGTTGCCAAACGCCAGTTTCGTATTGGTGATATTGCCGGTGAACATACCGCATTTAATCAGCTGCCGGAAGGTGGTCGTGCAGAATATCATGGCAAAGCCTTTAGCTCTGATGATGCCGGTGGTAAACTGACCTATACCATTGATTTTGCAGCCAAACAGGGTCATGGCAAAATTGAACATCTGAAAACACCGGAACAGAATGTTGAACTGGCAGCAGCAGAACTGAAAGCAGATGAAAAACGTCATGCCGTTATTCTGGGTGATACCCGTTATGGTAGCGAAGCAAAAGGCACCTATCATCTGGCACTGTTTGGTGATAAAGCACAGGAAATTGCAGGTAGCGCAGCAGTTAAAATTGGCGAAAAAGTGCATGAAATTGGCATTGCCGGTAAACAG
【実施例７】
【０３７６】
提案した融合タンパク質F
これは融合体Eに基づくものであって、H因子結合に関わるアミノ酸Glu218だけがAla218に突然変異している。
【実施例８】
【０３７７】
ST269クローン複合体に与える、fHbpに対する抗体の効果
方法
抗原調製物
組換えfHBP変異体（v）AおよびBをIPTG誘導後のBL21（DE3）大腸菌で生産し、IMACカラムを用いて精製した。fhbp配列は菌株MC58（fHBP B）および2996（fHBP A）から誘導した。遺伝子をリーダー配列に対応するヌクレオチド配列が無くかつC末端にHis-タグをもつpET24bプラスミドにクローニングした。
【０３７８】
動物取扱手続き：
10〜30マウスのグループを3回、筋肉内（1M）経路により第0、21および28日に免疫化した。各注入物はAl(OH)3上に吸着された5μgの一価のfHBPワクチン(fHBP AまたはfHBP B)を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウス血清は実験20080790および20090265由来のものであった。
【０３７９】
10匹のモルモットを3回、筋肉内（1M）経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物は10μgのタンパク質に規準化しかつAlP04と共に製剤したOMV抗原を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。モルモット血清は実験20090266由来のものであった。
【０３８０】
SBA
髄膜炎菌を一晩、ペトリ皿で37℃＋5％CO2にて培養した。これらを4時間、ペトリ皿で20μM TPEN（亜鉛キレート剤）を伴うかまたは伴わずに37℃＋5％CO2で継代培養した。血清サンプル（プールした血清）を40分間56℃にて不活化し、次いでPBS-グルコース0.1％中に1/10または1/50希釈し、次いで平底マイクロプレート中の25μLの体積に2倍希釈した。次いで寒天プレートからまたは細胞接触後の25μLの細菌混合物（PBS-グルコース0.1％に希釈して1ウエル当たりおよそ100〜150 CFUを得た）および子ウサギ補体（マイクロウエル中の最終濃度：12.5％ v/v）を血清希釈物に加えた。37℃にて振とうのもとで75分間のインキュベーションの後、2層の寒天（0.9％）をウエルに加えた。マイクロプレートを一晩35または37℃＋CO2にてインキュベートした。CFUを数え、死滅パーセントを計算した。SBA力価は死滅の50％を与える希釈である。
【０３８１】
クローン複合体ST269からの2種の菌株：M01-240013およびM01-240101を用いた。両菌株は英国で2001年に単離されたものである。
【０３８２】
結果
抗fHbpB血清をSBAでfHbpファミリーBを発現する菌株（M01-240101）について試験する一方、抗fHbpA血清をSBAでファミリーAからのfHbpを発現する菌株（M01-240013）に対して用いた。SBAはTPENの非存在または存在のもとで実施した。
【０３８３】
わずか1つの菌株（菌株M01-240101）が抗fHbp抗体により補体の存在のもとで死滅した。第2の菌株、M01-240013は抗fHbp抗体により死滅しない。観察では、細菌培養条件（TPENの非存在または存在）はSBA力価に影響を与えない。
【０３８４】
表1：子ウサギ補体の存在のもとでの抗fHbp抗体の殺菌力価
【表５】
2013521327.tif 000013
【０３８５】
結論
抗fHbp抗体は、単独ではM01-240013菌株（クローン複合体ST269由来）を有効に死滅させることができない。
【実施例９】
【０３８６】
L2髄膜炎菌株は、L3様の内部コアを含有するLOSを生産する菌株より低いレベルのfHbpを発現する
方法
抗原調製物
組換えfHBP変異体（v）AおよびBをIPTG誘導後のBL21（DE3）大腸菌で生産し、IMACカラムを用いて精製した。fhbp配列は菌株MC58（fHBP B）および2996（fHBP A）から誘導した。遺伝子を、リーダー配列に対応するヌクレオチド配列が無くかつC末端にHis-タグをもつpET24bプラスミドにクローニングした。組換えnadAをBL21大腸菌でも生産し、その配列は菌株2996から誘導した。
【０３８７】
動物取扱手続き：
30 OF1マウスのグループを3回、筋肉内（IM）経路により、第0、21および28日にAl(OH)3上に吸着させた精製組換えタンパク質を用いて免疫感作した。第42日に、血液サンプルを採取して血清を得た。マウス血清は実験20080232から得た。
【０３８８】
全細胞調製物を用いるウェスタンブロット
髄膜炎菌株を一晩MH、寒天プレート上で37℃＋5％CO2にて培養した。これらを4時間、MH寒天プレート上で20μM TPEN（亜鉛キレート剤）と共に37℃＋5％CO2にて継代培養した。不活化は、寒天プレートから収穫した細胞をPBS-PMSF（200μM）-アジド（0.2％）ONで37℃にてインキュベートすることにより実施した。不活化した細胞を次いでPBSで洗浄し、-20℃にて凍結した。
【０３８９】
10μgの細胞調製物をウエル当たりに加え、タンパク質を還元条件下で12％ゲル（Novex）を用いて分離し、次いでそのタンパク質をニトロセルロース膜上に移した。非特異的結合部位をブロックした後、膜を2時間、fHBP A、fHBP BまたはNadAのいずれかで免疫感作したマウスの血清混合物と共にインキュベートした。TdfIを検出するために、膜を抗-TdfIウサギ血清または4種の抗-TdfI Mabの混合物のいずれかとインキュベートした。洗浄後、膜を抗-マウスIgビオチン化抗体（Amersham）とインキュベートした。抗体の結合をストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ結合（Amersham）を用いて検出した。
【０３９０】
各菌株について、fHBP、TdfIおよびNadAの発現レベルをウェスタンブロットにより評価した。発現レベルを次の通り採点した：高い発現レベル、++；中間の発現レベル、+；低い発現レベル、+/-および非検出の発現（図３に例示した通り）。
【０３９１】
fhbp対立遺伝子の同定
ほとんどの菌株について、Beerninckと共同研究者が2006に記載したPCRタイピングにより、fHbp対立遺伝子を測定した。いくつかの菌株については、完全なfhbp遺伝子座を、粗MenB溶菌液からPCRによりプライマーを用いて増幅した。PCR断片を次いで高純度PCR精製キット（Roche）で精製し、Sanger法により配列決定した。Fletcher et al, 2004に記載のLasergene MegAlign-ClustalX ソフトウエアを用いて、ファミリーAおよびB参照配列（それぞれ2996およびMC58）と比較した後に、配列タイプ（ファミリーAまたはB）を推定した。
【０３９２】
LOS内部コア組成物
次の規則を用いてlpt3、lpt6、lot3/oac1およびlgtG遺伝子の存在／機能性を分析した後に、LOS内部コア組成物を推定した：
・もしlot3/oac1が存在しかつイン・フェーズであれば、GlcNAcはO-アセチル化されている、
・もしlgtGが存在しかつイン・フェーズであれば、グルコースはHepIIの位置3に結合している、
・もしlpt6が存在すれば、PEAはHepIIの位置6に連結している、
・もしlpt3が存在しかつlgtGが不在またはアウト・フェーズであれば、PEAはHepIIの位置3に結合している、
・もしlpt3が存在しかつlgtGがイン・フェーズであれば、PEAはHepIIの位置3に結合している、
・もしlpt3が不在であれば、PEAはHepIIの位置3に結合してない。
【０３９３】
次の命名法を用いて、色々な内部コア構造を特徴付けた：
L3＝HepIIの位置3上の1つのPEA、内部コアGlcNAc上のさらなるアセチルを伴うかまたは伴わない。かかる内部コアは次のLOS免疫型：L1、L3、L7、L8と関連する。
【０３９４】
L2＝HepIIの位置6上の1つのPEAおよび位置3上の1つのグルコースならびに内部コアGlcNAc上の1つのさらなるアセチル。
【０３９５】
L3v＝（位置3および6上の）HepII上の2つのPEAならびに一般に内部コアGlcNAc上の1つのさらなるアセチル。
【０３９６】
L5＝HepIIの位置3上の1つのグルコースならびに内部コアGlcNAc上の1つのさらなるアセチル
LX＝HepIIの位置3および6上にPEAまたはグルコースが無く、そして内部コアGlcNAc上の1つのさらなるアセチル。
【０３９７】
結果
155菌株のLOS内部コアを分子的方法によりタイピングした（表1）。これらの菌株は、英国（n=53）、ドイツ（n=40）およびスペイン（n=47）において最近（2004年以後）単離されたかまたは5つの異なる国々の患者（n=15）から2002年前に単離された疾患単離物から無作為に選択した。
【０３９８】
140の細菌の単離物のうち、大部分の菌株はL3内部コアを生産した（66〜94％）。L2内部コアは英国とドイツの菌株の2および2.5％でそれぞれ観察される一方、スペインの菌株の17％超で見出される。
【０３９９】
155臨床単離物のうち、52菌株をfHBPおよびNadA遺伝子出現、対立遺伝子およびfHBP、NadA、TdfI発現について分析した。これらの52菌株は次のように選択した：2002年より前に単離された15菌株、無作為に選択した最近の単離物（英国、ドイツおよびスペイン）および全て最近のL2（表2）。
【０４００】
fhbp遺伝子は52菌株全てに存在し、菌株の62％（32/52）は対立遺伝子Bを所持し、38％（20/52）は対立遺伝子Aを所持した。
【０４０１】
fhbpB対立遺伝子はL3およびL2菌株の68％（21/31）および60％（9/15）にそれぞれ検出されるので、LOS型とfhbp対立遺伝子の間に関連は見られない。
【０４０２】
fHBPはfhbpA対立遺伝子およびfhbpB対立遺伝子を所持する菌株の50％および62％においてそれぞれよく発現される（+または++）ので、fHBP対立遺伝子とfHBP発現の間に関連は見られない。
【０４０３】
しかし、L3菌株のわずか19％（6/31）が低または不検出レベルのfHbpを生産する一方、L2菌株の93％（14/15）は低または不検出のfHbp発現が観察された。
【０４０４】
さらに、L2免疫型の菌株の多くはまた、ST11クローン複合体であることが見出された。
【０４０５】
nadA遺伝子は分析した菌株の44％（23/52）に存在するが、菌株のわずか25％（13/52）がウェスタンブロットにより検出可能量のNadAを発現する。
【０４０６】
fHBP発現とは対照的に、LOS内部コアとNadAの発現の間に関係はない。実に、わずかL3菌株の16％およびL2菌株の27％がNadAの検出可能量を生産する。
【０４０７】
fHBPを発現しないまたは発現レベルの低い52菌株の22菌株のうち、わずか4菌株が検出可能なレベルのNadAを発現する。
【０４０８】
TdfIの発現を、TdfIに対する4種のモノクローナル抗体および／または組換えTdfIで免疫化したウサギからのポリクローナル血清の混合物を用いて分析した。試験した51菌株のうち、94％は検出可能量のTdfI（48/51）を発現する。
【０４０９】
低いまたは不検出レベルのfHBPを発現する22菌株のうち、1つを除く全てがTdfIを生産する。この菌株はnadA遺伝子を所持しない。
【０４１０】
結論
この結果が示唆するのは、L2菌株はL3内部コアLOSを発現する菌株より有意に低いレベルのfHBPを生産する傾向を持つことである。この観察はとりわけ、L2菌株が最近の臨床単離物の17％であるスペインのような国々において、fHBPだけに基づくMenBワクチンに対して議論を起こす。さらに、試験したスペインのL2菌株は全て検出可能な量のNadAを発現しない。
【０４１１】
不検出または低いレベルのfHBPを発現する22菌株のうちわずか4菌株が検出可能なレベルのNadAを発現する一方、1つを除く全てがTdfIを生産する。
【０４１２】
表1：155侵襲性menB菌株の内部コア型決定（最近単離された140菌株を含む）
【表６】
2013521327.tif 000014
【０４１３】
表2：分析した52菌株の特徴：LOS内部コアタイプ、fhpb対立遺伝子（遺伝子）、fHBPの発現レベル、nadA遺伝子の存在、NadAの発現レベル、TdfIの発現（Mabおよび／またはウサギ血清を用いて）
【表７】
2013521327.tif 000015
【実施例１０】
【０４１４】
TdfIの付加による、fHBPに基づくワクチンの効力の改善
方法
抗原調製物
組換えfHBP変異体（v）AおよびBをIPTG誘導後のBL21（DE3）大腸菌で生産し、IMACカラムを用いて精製した。fHbp配列は菌株MC58（fHBP B）および2996（fHBP A）から誘導した。遺伝子を、リーダー配列に対応するヌクレオチド配列が無くかつC末端にHis-タグをもつpET24bプラスミドにクローニングした。
【０４１５】
動物取扱手続き：
10〜30マウスのグループを3回、筋肉内（1M）経路により第0、21および28日に免疫化した。各注入物は5μgのタンパク質に規準化しかつAS04アジュバント系（AIP04＋3-O-デスアシル-4'モノホスホリルリピドA）またはAl(OH)3上に吸着された一価fHBPワクチン（fHBP AまたはfHBP B）または二価fHbpA+Bワクチンのいずれかと共に製剤したOMV抗原を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウス血清は実験20040652、20070371および20080083由来であった。
【０４１６】
全細胞調製物を用いるウェスタンブロット
髄膜炎菌を一晩、MH寒天プレートで37℃＋5％CO2にて培養した。これらを4時間 MH寒天プレート上で20μM TPEN（亜鉛キレート剤）と共に37℃＋5％CO2で継代培養した。不活化は寒天プレートから収穫した細胞をPBS-PM SF（200μM）-アジド（0.2％） ON 37℃にて行った。不活化した細胞を次いでPBS中で洗浄しそして-20℃にて凍結した。
【０４１７】
ウエル当たり10μgの細胞調製物を加え、タンパク質を還元条件下で12％ゲル（Novex）を用いて分離し、次いでタンパク質を10μgの細胞調製物上に移した。非特異的結合部位をブロックした後、膜を2時間、TdfIに対するモノクローナル抗体と共にまたはfHBP AもしくはfHBP B血清で免疫化したマウスから採取した血清の混合物と共にインキュベートした。洗浄後、膜を抗-マウスIgビオチン化抗体（Amersham）とインキュベートした。抗体の結合をストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ結合（Amersham）を用いて検出した。
【０４１８】
各菌株について、fHBPの発現レベルをウェスタンブロットにより評価した。
【０４１９】
発現レベルを次の通り採点した：高い発現レベル、++；中間の発現レベル、+；低い発現レベル、+/-および非検出の発現。
【０４２０】
SBA
髄膜炎菌を一晩、ペトリ皿で37℃＋5％CO2にて培養した。これらを4時間、ペトリ皿で20μM TPEN（亜鉛キレート剤）を伴うかまたは伴わずに37℃＋5％CO2で継代培養した。血清サンプル（プールした血清）を40分間56℃にて不活化し、次いでPBS-グルコース0.1％中に1/10または1/50希釈し、次いで平底マイクロプレート中の25μLの体積に2倍希釈した。次いで25μLの細菌混合物（PBS-グルコース0.1％に希釈して1ウエル当たり100〜150 CFUを得た）および子ウサギ補体（マイクロウエル中の最終濃度：12.5％ v/v）を血清希釈物に加えた。37℃にて振とうのもとで75分間のインキュベーションの後、2層の寒天（0.9％）をウエルに加えた。マイクロプレートを一晩35または37℃＋CO2にてインキュベートした。CFUを数え、死滅パーセントを計算した。SBA力価は死滅の50％を与える希釈である。
【０４２１】
fhbp対立遺伝子の同定：
T  完全なfhbp遺伝子座を粗MenB溶菌液からPCRによりプライマーを用いて増幅した。PCR断片を次いで高純度PCR精製キット（Roche）で精製し、Sanger法により配列決定した。Lasergene MegAlign-ClustalX ソフトウエアを用いて変異体1、2および3参照配列と比較した後に、配列タイプ（変異体1、2または3）を推定した。
【０４２２】
結果
色々な髄膜炎菌株を、SBAにて、一価fHbpワクチン（fHbpAまたはfHbpB）または二価fHbpワクチン（fHbpA＋B）で免疫化したマウスからの血清を用いて試験した。これらの菌株を、ウェスタンブロットによりおよびそのfHbp対立遺伝子により測定したfHbpの発現レベルに基づいて選択した。それらの結果（表3）は、fHbp Bで免疫化したマウスからの血清はfHbp Aタンパク質を生産する菌株に対して殺菌性がない（そしてこの逆も観察された）ので、fHbpが交差保護fHbp応答を誘発できないことを明らかに示す。fHBP AとfHBP Bを用いて免疫化したマウスからの血清は、fHbp AまたはfHbp Bタンパク質を発現する菌株の補体死滅を媒介する能力のある殺菌性抗体の生産を誘発した。さらに、標的化したSBA菌株によるfHbpの発現レベルは殺菌力価にも影響を与えた：fHbp発現レベルが低いほど、殺菌力価は低い。これらの結果は、低いまたは非検出のfHbpレベルしか生産しない菌株に対して保護するために、fHbpに基づくワクチンを他の抗原を加えることにより改善する必要性を明らかにする。
【０４２３】
表3：異なるfHBPタンパク質を異なるレベルで発現する一連の髄膜炎菌に対する抗fHBPマウス血清の血清殺菌力価
【表８】
2013521327.tif 000016
【０４２４】
マウスを、共通のバックグランド（por AKO、galE LOSおよび莢膜不在）を有する組換えH44/76菌株から得た異なるOMV調製物で免疫化した。異なる調製物はTdfIおよびfHbpのレベルにより差別化した。対照OMV（Ctrl OMV）は検出可能量のTdfIおよびfHbpを有しなかった。TdfI OMVをTdfIを過発現する菌株から生産し、そしてTdfI-fHBP OMVをTdfIとfHbpの両方を過発現する菌株から発現した。その血清を、色々なレベルのTdfIを発現する一連のH44/76菌株を用いてSBAで分析した。野生型（WT）菌株は検出可能量のTdfIを発現しない一方、pTacプロモーター下のTdfI遺伝子を含有するpfP10プラスミドにより形質転換した組換えH44/76菌株は、ITPG（IPTG）の存在のもとで高レベルのTdfIを生産した（以下の表4）。
【０４２５】
対照調製物（Ctrl-OMV）により免疫化したマウスからの血清は殺菌性がなかった。高い量のTdfIを発現する菌株（IPTG）だけが補体の存在のもとで抗TdfI抗体により死滅した。対照的に、TdfI-fHbp OMV調製物により免疫化したマウスからの血清は2つのH44/76菌株の補体死滅に抗fHbp抗体の存在を介して媒介し、そして観察されるように、殺菌力価と標的化菌株により生産されたTdfIのレベルの間には相関があった（以下の表4）。
【０４２６】
表4：異なるレベルのTdfIを生産する異なるH44176菌株（WT＝野生型；またはIPTG＝誘導を介してTdfIを過発現する菌株）に対する血清殺菌力価
【表９】
2013521327.tif 000017
【実施例１１】
【０４２７】
TdfIの付加による、fHBPに基づくワクチン効力の改善
方法
抗原調製物
外膜小胞（OMV）を、色々な組換えH44/76菌株（porAKO、莢膜マイナス、galE LOSおよび色々な外膜タンパク質を過発現する）から古典的0.5％DOC抽出物を用いて生産した。
【０４２８】
組換えfHBP変異体（v）AおよびBをIPTG誘導後のBL21（DE3）大腸菌で生産し、IMACカラムを用いて精製した。fhbp配列を菌株MC58（fHBP B）および2996（fHBP A）から誘導した。遺伝子をリーダー配列に対応するヌクレオチド配列が無くかつC末端にHis-タグをもつpET24bプラスミドにクローニングした。
【０４２９】
動物取扱手続き：
10〜30マウスのグループを3回、筋肉内（1M）経路により第0、21および28日に免疫化した。各注入物はAl(OH)3上に吸着された5μgの一価のfHBPワクチン(fHBP AまたはfHBP B)を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウス血清は実験20080790および20090265由来であった。
【０４３０】
10モルモットのグループを3回、筋肉内（1M）経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物は10μgのタンパク質に規準化しかつAlP04と共に製剤したOMV抗原を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。モルモット血清は実験20090266由来であった。
【０４３１】
SBA
髄膜炎菌を一晩、ペトリ皿で37℃＋5％CO2にて培養した。これらを4時間、ペトリ皿で20μM TPEN（亜鉛キレート剤）を伴うかまたは伴わずに37℃＋5％CO2で継代培養した。血清サンプル（プールした血清）を40分間56℃にて不活化し、次いでPBS-グルコース0.1％中に1/10または1/50希釈し、次いで平底マイクロプレート中の25μLの体積に2倍希釈した。次いで寒天プレートからまたは細胞接触後の、25μLの細菌混合物（PBS-グルコース0.1％に希釈して1ウエル当たりおよそ100〜150 CFUを得た）および子ウサギ補体（マイクロウエル中の最終濃度：12.5％ v/v）を血清希釈物に加えた。37℃にて振とうのもとで75分間のインキュベーションの後、2層の寒天（0.9％）をウエルに加えた。マイクロプレートを一晩35または37℃＋CO2にてインキュベートした。CFUを数え、死滅パーセントを計算した。SBA力価は死滅の50％を与える希釈である。
【０４３２】
結果
抗fHbp B血清をSBAでfHbpファミリーBを発現する菌株について試験する一方、抗fHbp A血清をSBAでファミリーAからのfHbpを発現する菌株に対して用いた。TdfIを過発現する菌株から生産されるOMV（ブレブ）で免疫化したモルモットからの血清をfHbp BとfHbp A菌株の両方に対して試験した。
【０４３３】
抗TdfIおよび抗fHbp血清を単独で試験するかまたは混合した後にTPENの存在または非存在におけるSBAを実施した
一連の16菌株をSBAに使用した。これらのうちで、5〜7菌株は抗fHbp抗体により死滅した（SBA培養条件におけるTPENの非存在もしくは存在に応じて）（SBA力価＞128）。TPENの非存在では、わずか3菌株がTdfIブレブで免疫化したモルモット由来の血清により死滅した一方、TPENの存在では12菌株が死滅した。
【０４３４】
抗-fHbpと抗-TdfIブレブ血清を混合すると、SBA力価が改善される一般的傾向があり、少なくとも抗-fHBpと抗-TdfIブレブ血清殺菌活性の相加効果を示している。
【０４３５】
表5
【表１０】
2013521327.tif 000018
【実施例１２】
【０４３６】
子ウサギ血清を補体源として用いる、19種の髄膜炎菌株に対する色々なワクチン組成物のSBAでの保護効果
結果を死滅菌株のパーセントとして表現した（力価≧1/128）。二価15％ LOS OMVワクチン、二価fHBP、ならびにfHbp（GNA1870）、NadA、GNA2132（Lipo28）、GNA1030、GNA2091を含む五価サブユニットワクチンにより誘発される菌株適用範囲の比較。
【０４３７】
表６
【表１１】
2013521327.tif 000019
【０４３８】
a それぞれのLOSタイプを発現する試験菌株の数
b それぞれのLOSタイプについてSBAで試験した菌株により示された血清群
同じ結果であるが、さらに詳しく記載すると：
表７
【表１２】
2013521327.tif 000020
【実施例１３】
【０４３９】
キメラfHBPタンパク質の免疫原性
方法
抗原調製物
fH結合部位の突然変異を伴う／伴わないキメラfHBPタンパク質を前記実施例（実施例1〜7）に記載の通り調製した。
【０４４０】
動物取扱手続き：
20マウスのグループを3回、筋肉内（1M）経路により第0、21および35日に免疫化した。各注入物はAl(OH)3上に吸着された5μgのキメラfHbpタンパク質を含有した。第49日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウス血清は実験20090833由来のものであった。
【０４４１】
rSBA
髄膜炎菌を一晩、ペトリ皿で37℃＋5％CO2にて培養した。これらを4時間、ペトリ皿で37℃＋5％CO2にて継代培養した。血清サンプル（個々の血清）を40分間56℃にて不活化し、次いでPBS-グルコース0.1％中に1/50希釈し、次いで平底マイクロプレート中の25μLの体積に2倍希釈（8x）した。次いで寒天-プレート培養からの、25μLの細菌混合物（PBS-グルコース0.1％に希釈して1ウエル当たりおよそ50〜250 CFUを得た）および子ウサギ補体（マイクロウエル中の最終濃度：12.5％ v/v）を血清希釈物に加えた。37℃にて振とうのもとで75分間のインキュベーション後、2層の寒天（0.9％）をウエルに加えた。マイクロプレートを一晩33℃＋CO2にてインキュベートした。CFUを数え、死滅パーセントを計算した。SBA力価は死滅の50％を与える希釈である。
【０４４２】
個々の血清を分析し、幾何平均力価を計算した。幾何平均計算に当たって、第1希釈に対する死滅が50％未満の死滅である場合、力価を50に設定し、もし死滅が最後の希釈において50％より高ければ、力価を25600に設定した。
【０４４３】
結果
血清をrSBAで、fHbpファミリーB（H44/76）またはfHbpファミリーA（S3446）を発現する菌株について試験した（以下の表を参照）。
【０４４４】
組換えfHbpBによる免疫化は、H44/76菌株（fHbpファミリーB）の補体死滅を媒介することができる殺菌抗体の生産を誘発したが、S3446菌株（fHbpファミリーA）のそれを誘発しなかった（応答した菌株のパーセントはそれぞれ100％および10％）。組換えfHbpAはS3446菌株に対して低い殺菌性抗体応答を、そしてH44/76菌株に対して非常に低い応答しか誘発しなかった。
【０４４５】
キメラfHBP（fH結合部位突然変異有りまたは無し）で免疫化した動物は、H44/76とS3446 菌株の両方に対して殺菌性応答を誘発することができた（H44/76およびS3446それぞれに対して100％および90％までの応答菌株）。最良の応答は構築物LVL-511（2つのアミノ酸突然変異）が達成した。
【０４４６】
表1：子ウサギ補体の存在のもとでの抗キメラfHBP抗体の殺菌力価
【表１３】
2013521327.tif 000021
【０４４７】
結論
抗キメラfHBP抗体は、両方のファミリー（AおよびB）由来の菌株の死滅に有効であった。この能力はfH結合部位の突然変異によって変わらない。
【実施例１４】
【０４４８】
Hap（本明細書ではMapとも呼ぶ）の免疫原性
方法
抗原調製物
Map
生来の切断されたMapを、H44/76 cps-菌株の発酵後に得た上清から精製した。2ロットを生産し、第2ロットはH44/76 cps-を過発現するMapから得た［H44/76由来の全map遺伝子をPCRにより増幅し、Mapの発現を制御するlacIQ遺伝子およびタンデムlac/tacプロモーターを含有するpFP10由来のナイセリア菌複製プラスミド（Pagotto et al, Plasmid 43, 24-34, 2000）にクローニングすることにより実施した］。Mapを濃縮し、クロマトグラフィにより精製した。
【０４４９】
組換えMap N端末（aa43-1178）を大腸菌における細胞質の発現により生産した。
【０４５０】
fHbp
組換えfHBP変異体（v）AおよびBをIPTG誘導後のBL21（DE3）大腸菌で生産し、IMACカラムを用いて精製した。fHbp配列は菌株MC58（fHbp B）および2996（fHbp A）から誘導した。遺伝子をリーダー配列に対応する遺伝子が無くかつC末端にHis-タグをもつpET24bプラスミドにクローニングした。
【０４５１】
動物取扱手続き
Map
10〜25マウスのグループを3回、筋肉内（1M）経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物はスペコール（specol）を用いて製剤した10μgの生来の切断されたHapまたは5μgのrec N-末端Hapを含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウス血清は実験20090608、20100463、20100708由来のものであった。
【０４５２】
6〜10モルモットのグループを3回、筋肉内（1M）経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物はスペコール（specol）と製剤した10μgのタンパク質を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。モルモット血清は実験20090619、20100464、20100711由来のものであった。
【０４５３】
fHbp
10〜30マウスのグループを3回、筋肉内（1M）経路により第0、21および28日に免疫化した。各注入物はAl(OH)3上に吸着された5μgの一価のfHBPワクチン(fHBP AまたはfHBP B)を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウス血清は実験20080790および20090265由来のものであった。
【０４５４】
6〜10モルモットのグループを3回、筋肉内（1M）経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物はAl(OH)3上に吸着された5μgの一価のfHbpワクチン(fHbp AまたはfHbp B)を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。血清は実験20090200g3または20100464g10由来のものであった。
【０４５５】
SBA
髄膜炎菌を一晩、ペトリ皿で37℃＋5％CO2にて培養した。これらを4時間、ペトリ皿で20μM TPEN（亜鉛キレート剤）と共に37℃＋5％CO2で継代培養した。血清サンプル（プールした血清）を40分間56℃にて不活化し、次いでPBS-グルコース0.1％中に1/50希釈し、次いで平底マイクロプレート中の25μLの体積に2倍希釈した。次いで25μLの寒天-プレート培養からまたは細胞接触後の細菌混合物（PBS-グルコース0.1％に希釈して1ウエル当たりおよそ50〜250 CFUを得た）および子ウサギ補体（マイクロウエル中の最終濃度：12.5％ v/v）を血清希釈物に加えた。37℃にて振とうのもとで75分間のインキュベーションの後、2層の寒天（0.9％）をウエルに加えた。マイクロプレートを一晩33℃＋CO2にてインキュベートした。CFUを数え、死滅パーセントを計算した。SBA力価は死滅の50％を与える希釈である。
【０４５６】
Map KO菌株構築
髄膜炎菌増殖および形質転換手続きは先に記載の通り実施した（Weynants et al, 2009）。
【０４５７】
菌株17540はJulio Vasquez （CNM, Madrid, Spain）、菌株M01-240355およびNZ98/254はR.Borrow（HPA, Manchester, UK）からの贈物であった。
【０４５８】
H44/76 hap遺伝子のユニークなPstI部位中に挿入されたカナマイシン耐性カセットを含むmap/hap::kanRプラスミド（van Ulsen et al , 2003）はTommassen教授の好意の贈物であった。カナマイシン耐性コロニーを、煮沸した細菌溶菌液でのPCRによりhap遺伝子の不活化についてスクリーニングした。補体感受性の変化を避けるために、全クローンについてトリシンゲルおよび銀染色によりLOSの完全性を点検した。
【０４５９】
"Genetically modified L3,7 and L2 lipooligosaccharides from Neisseria meningitidis serogroup B confer a broad cross-bactericidal response（遺伝子操作で改変した髄膜炎菌血清群BからのL3、7およびL2リポオリゴ糖は広範な交差殺菌性応答を与える）", Weynants V, Denoeul P, Devos N, Janssens D, Feron C, Goraj K, Momin P, Monnom D, Tans C, Vandercammen A, Wauters F, Poolman JT. Infect Immun. 2009 May；77(5)：2084-93。
【０４６０】
"A Neisserial autotransporter NalP modulating the processing of other autotransporters（他の自己輸送体のプロセシングをモジュレートするナイセリア菌自己輸送体NalP）", van Ulsen P, van Alphen L, 10 Hove J, Fransen F, van der Ley P, Tommassen J. Mol Microbiol. 2003 Nov;50(3)。
【０４６１】
結果
Mapに対する相同性に基づいて選択した色々な髄膜炎菌を、スペコール（specol）を製剤した生来の切断されたMapまたは組換えN末端Mapで免疫化したマウスおよびモルモットからの血清を用いてSBAで試験した。結果（以下の表1）が示すように、H44/76と最低の相同性をもつ菌株M06-240336が死滅するので、Mapは交差保護殺菌応答を誘発する。17/22菌株は、モルモットから得た抗生来の切断されたMap抗体によって死滅した。これらの17菌株のうちの6菌株は抗fHbp抗体によって死滅しない。類似したMap配列を共有する菌株が死滅したり（M06-240336）または死滅しない（M06-240877）という事実により示唆されるように、Mapの発現レベルの相違がいくつかの菌株が死滅しないことの説明でありうる。
【０４６２】
Mapが殺菌抗体の標的であることを確認するために、ΔMap菌株（NZ98/254、M05-240355、SP17540）を殺菌の試験法に用いた（以下の表2）。かかるSBA条件においては、死滅のないことを観察した。これらの結果はMapが交差殺菌性抗体を誘発する主要抗原であることを確認する。
【０４６３】
表1：子ウサギ補体の存在のもとでの抗Map抗体の殺菌力価
【表１４】
2013521327.tif 000022
【０４６４】
表 2：Map KO菌株に対する抗Map抗体の力価
【表１５】
2013521327.tif 000023
【０４６５】
結論
Mapは交差殺菌活性を誘発し、クローン複合体ST269（例えば、M01-240013菌株）からの菌株およびL2免疫型（例えば、SP17540菌株）からの菌株を含む抗fHbpによって死滅しない菌株の効果的な死滅をもたらす。
【０４６６】
この結果は、MapとfHbpに基づくワクチンがfHbpに基づくワクチンより優れた菌株範囲をカバーしうることを示唆する。
【実施例１５】
【０４６７】
Hsf（本明細書ではMsfとも呼ぶ）は野生型菌株に対する殺菌抗体を誘発する
方法
抗原調製物
OMV
外膜小胞（OMV）を、色々な組換えH44/76菌株（porAKO、莢膜マイナス、galE LOSおよびMsfおよび／またはZnuDタンパク質を過発現する）から古典的0.5％DOC抽出物を用いて生産した。
【０４６８】
fHbp
組換えfHBP変異体（v）AおよびBをIPTG誘導後のBL21（DE3）大腸菌で生産し、IMACカラムを用いて精製した。fhbp配列は菌株MC58（fHBP B）および2996（fHBP A）から誘導した。遺伝子をリーダー配列に対応するヌクレオチド配列が無くかつC末端にHis-タグをもつpET24bプラスミドにクローニングした。
【０４６９】
mAb
mAb Hsfcross/5は骨髄腫細胞と免疫化BALB/cマウスから採取したリンパ球Bとの融合体から得たものであって、前記免疫化マウスは、RIMMSと名付けられた反復、多部位免疫化計画を用いて、組換えH44/76菌株（porA KO、莢膜不在、Msf過発現、M01-0240101から）由来のOMV 20μgで免疫化したものである。
【０４７０】
動物取扱手続き：
OMV
10モルモットのグループを3回、筋肉内（1M）経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物は10μgのタンパク質に規準化しかつAlPO4と共に製剤したOMV抗原を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。血清は実験20090266由来のものであった。
【０４７１】
fHbp
6〜10モルモットのグループを3回、筋肉内（1M）経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物はAl(OH)3上に吸着された10μgの一価fHbpワクチン(fHbp AまたはfHbp B)を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。血清は実験20090200g3または20100464g10由来のものであった。
【０４７２】
SBA
髄膜炎菌を一晩、ペトリ皿で37℃＋5％CO2にて培養した。これらを4時間、ペトリ皿でに37℃＋5％CO2で継代培養した。血清サンプル（プールした血清）を40分間56℃にて不活化し、次いでPBS-グルコース0.1％中に1/50希釈し、次いで平底マイクロプレート中の25μLの体積に2倍希釈した。次いで25μLの寒天-プレート培養からの細菌混合物（PBS-グルコース0.1％に希釈して1ウエル当たりおよそ50〜250 CFUを得た）および子ウサギ補体（マイクロウエル中の最終濃度：12.5％ v/v）を血清希釈物に加えた。37℃にて振とうのもとで75分間のインキュベーションの後、2層の寒天（0.9％）をウエルに加えた。マイクロプレートを一晩33℃＋CO2にてインキュベートした。CFUを数え、死滅パーセントを計算した。SBA力価は死滅の50％を与える希釈である。
【０４７３】
Msf/Hsf KO菌株構築
髄膜炎菌B菌株17567（J. Vasquez, CNM, Madrid, Spainより）増殖と形質転換手順は先に記載のように実施した（Weynants et al, 2009）。msf/hsf::CmRプラスミドを次の通り構築した。概略を述べると、1531bp（hsf遺伝子の5’隣接領域）、1775bp（hsfコード配列）および1465bp（3’隣接領域）に対応する4771bpのDNA断片を、H44/76ゲノムDNAから、プライマーHsfセンス（CGCAATAAATGGGGTTGTCAATAATTGT）およびHsfリバース（AGTCAAGGCGCACGCTGTCGGCAT）を用いてPCR増幅し、そしてpGEMT-Easyベクターにクローニングした。プラスミドを次いでプライマーHSF5’ci2（gaagatctgccgtctgaaacccgtaccgatgcggaaggctata）およびHSF3’ci2（gaagatctttcagacggcgataaagtcctgccgcgttgtgtttc）を用いてサークルPCR突然変異誘発で処理し、(i)hsf遺伝子を除去し、(ii)取込み配列を挿入し、そして(iii)抗生物質耐性遺伝子のクローニングを容易にするBglII制限部位を挿入した。CmR遺伝子をpCMCプラスミド（Weynants et al, 2009）からプライマーBAD20（tcccccgggagatctcactagtattaccctgttatccc）およびプライマーCAM3’Bgl2（agatctgccgctaactataacggtcc）を用いて増幅した。この断片をサークルPCR産物中のBglII制限部位の後にクローニングし、プラスミドpRIT15456を得た。クロラムフェニコール耐性コロニーを、煮沸した細菌溶菌液でのPCRによりmsf/hsf遺伝子の不活化についてスクリーニングした。Msf発現の非存在をさらにウェスタンブロットにより確認した。補体感受性の変化を避けるために、全クローンについてトリシンゲルおよび銀染色によりLOSの完全性も点検した。
【０４７４】
"Genetically modified L3,7 and L2 lipooligosaccharides from Neisseria meningitidis serogroup B confer a broad cross-bactericidal response（遺伝的に改変された髄膜炎菌血清群BからのL3、7およびL2リポオリゴ糖は広範な交差殺菌性応答を与える）". Weynants V, Denoeul P, Devos N, Janssens D, Feron C, Goraj K, Momin P, Monnom D, Tans C, Vandercammen A, Wauters F, Poolman JT. Infect Immun. 2009 May；77(5)：2084-93。
【０４７５】
結果
野生型菌株に対して殺菌抗体を誘発するMsfの潜在能力を評価するために、高レベルのMsf発現を有する（ウェスタンブロットの結果）菌株SP17567を選択した。
【０４７６】
Msfに対する血清またはMsf-ZnuD OMVおよび対照ブレブ（抗原過発現が無いかまたはZnuDだけの過発現）を血清殺菌試験法で試験した。Msfに対して特異的なモノクローナル抗体も試験した。
【０４７７】
以下の表1の結果は、対照ブレブと比較して、Msf過発現ブレブについては少なくとも20倍の殺菌活性の増加を示す。高い殺菌力価はMsd特異的mAbについても観察される。ただ組換えfHbpは、試験検出限界付近の低い殺菌応答しか誘発しない。
【０４７８】
Msfが殺菌抗体の主な標的であることを確認するために、ΔMsf SP17567菌株を殺菌試験法に用いた。かかるSBA条件においては、死滅は観察されなかった。これらの結果は、抗原としてのMsfは高レベルのMsfを発現する野生型菌株の死滅を誘発できることを確認する。
【０４７９】
表 1：菌株SP17567野生型およびMsf KOに対する殺菌力価
【表１６】
2013521327.tif 000024
【０４８０】
結論
抗Msf抗体は、抗fHbp抗体による死滅が難しい野生型菌株の死滅に介在しうる。これは、fHbpに基づくワクチンへのMsfの付加がMenBワクチンの保護範囲を増強しうることを示唆する。
【実施例１６】
【０４８１】
TdfI（本明細書ではZnuDとも呼ぶ）を過発現するブレブに対する抗体のL2菌株に与える効果
方法
抗原調製物
外膜小胞（OMV）を、組換えH44/76菌株（porAKO、莢膜マイナス、galE LOSならびにZnuD（およびMsf）タンパク質を過発現する）から古典的0.5％DOC抽出物を用いて生産した。
【０４８２】
動物取扱手続き：
OMV
26〜30マウスのグループを3回、筋肉内（1M）経路により第0、21および28日に免疫化した。
【０４８３】
10モルモットのグループを3回、筋肉内（1M）経路により第0、14および28日に免疫化した。
【０４８４】
各注入物は5（マウス）または10μg（GP）のタンパク質に規準化しかつAlS04と共に製剤したOMV抗原を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウスとモルモット血清はそれぞれ実験20090265、20100463および20090266、20100464由来のものであった。
【０４８５】
fHbp
20マウスのグループを3回、筋肉内（1M）経路により第0、21および35日に免疫化した。各注入物はAl(OH)3上に吸着された5μgの一価fHbpワクチン（fHbpAまたはfHbpB）を含有した。第49日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウス血清は実験20090833由来であった。
【０４８６】
SBA
髄膜炎菌を一晩、ペトリ皿で37℃＋5％CO2にて培養した。これらを4時間、ペトリ皿上で20μM TPEN（亜鉛キレート剤）を伴ってまたは伴わずに37℃＋5％CO2にて継代培養した。血清サンプル（プールした血清）を40分間56℃にて不活化し、次いでPBS-グルコース0.1％中に1/50希釈し、次いで平底マイクロプレート中の25μLの体積に2倍希釈した。次いで25μLの寒天-プレート培養からの細菌混合物（PBS-グルコース0.1％に希釈して1ウエル当たりおよそ50〜250 CFUを得た）および子ウサギ補体（マイクロウエル中の最終濃度：12.5％ v/v）を血清希釈物に加えた。37℃にて振とうのもとで75分間のインキュベーションの後、2層の寒天（0.9％）をウエルに加えた。マイクロプレートを一晩33℃＋CO2にてインキュベートした。CFUを数え、死滅パーセントを計算した。SBA力価は死滅の50％を与える希釈である。
【０４８７】
ZnuD KO SP17540菌株構築
髄膜炎菌増殖および形質転換手続きは先に記載の通り実施した（Weynants et al, 2009）。必要な場合、20mM TPEN(N,N,N',N'-テトラキス(2-ピリジルメチル)エチレンジアミン）を培地に加えることにより、ZnuD発現を誘導した。菌株17540はJulio Vasquez （CNM, Madrid, Spain）よりの贈物であった。
【０４８８】
znuD::kanRプラスミドはTommassen教授の好意の贈物であって、Stork et al, 2010に記載されている。カナマイシン耐性コロニーを、煮沸した細菌溶菌液でのPCRによりznuD遺伝子の部分的欠失についてスクリーニングした。ZnuD不活化を、TPENの存在のもとでの増殖後の全細胞溶菌液についてのウェスタンブロットによりさらに確認した。補体感受性の変化を避けるために、全クローンについてトリシンゲルおよび銀染色によりLOSの完全性を点検した。
【０４８９】
"Genetically modified L3,7 and L2 lipooligosaccharides from Neisseria meningitidis serogroup B confer a broad cross-bactericidal response（遺伝的に改変された髄膜炎菌血清群BからのL3、7およびL2リポオリゴ糖は広範な交差殺菌性応答を与える）". Weynants V, Denoeul P, Devos N, Janssens D, Feron C, Goraj K, Momin P, Monnom D, Tans C, Vandercammen A, Wauters F, Poolman JT. Infect Immun. 2009 May;77(5): 2084-93。"An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential（ワクチン潜在能力をもつ亜鉛獲得に関わる髄膜炎菌の外膜受容体）". Stork M, Bos MP, Jongerius I, de Kok N, Schilders I, Weynants VE, Poolman JT, Tommassen J. PLoS Pathog. 2010 Jul 1；6：e1000969。
【０４９０】
結果
L2免疫型からの3菌株およびクローン複合体STllをrSBAに用いた。これらの菌株は抗-fHbp抗体および補体により死滅されない（表1）。
【０４９１】
ZnuD抗体の殺菌潜在能力の評価は（in vivo条件の様な）亜鉛制限増殖培地を介して実施した。これは、MH寒天プレート中で20μMのTPENを用いて達成した。
【０４９２】
TPEN条件下の殺菌試験法で試験したマウス抗-ZnuD OMV血清は、試験した3つの菌株の死滅を実証した。類似した結果がモルモット由来の血清で観察された。培地にTPENが非存在であると、菌株は抗ZnuD抗体により死滅しなかった。
【０４９３】
ZnuDが殺菌抗体の主な標的であることを確認するために、ΔZnuD SP17540菌株をTPENによる殺菌試験法に用いた。かかるSBA条件のもとで、死滅は観察されなかった。これらの結果は、ZnuDが菌株SP17540に対する殺菌抗体の主な標的であることを実証する。
【０４９４】
表1：L2菌株に対する抗OMVの殺菌力価
【表１７】
2013521327.tif 000025
【０４９５】
考察と結論
先の実験（実施例11を参照）において、2つのL2菌株（760676とM05-0240072）は抗ZnuD抗体によって死滅しなかったことに注目すべきである。繰り返した実験（この実施例で提示した）において、これらの2つの菌株は抗ZnuD抗体によって死滅する。ZnuDの発現は、SBAを行う培養で体系的点検が行われなかったので、ZnuDが前シリーズの実験（実施例11で示した）では菌株760676およびM05-0240072によって発現されなかったと考えられる。発現しなかったことの可能な説明の1つは、使用したTPENプレートが古過ぎて亜鉛の効率的なキレート化が起こらなかったことである。
【０４９６】
WT L2菌株ならびにSP17540 znuD KO菌株を用いて得た新しい結果は、ZnuD（OMVに過発現される）が抗fHbpによって死滅しないL2免疫型由来の菌株の効果的な死滅をもたらすことを確証する。このデータは、fHbpと追加の抗原（ZnuDのような）に基づくワクチンがfHbp単独に基づくワクチンと比較して菌株の有効範囲を改善しうることを支持する。
【図１】
2013521327.tif 000026
【図２】
2013521327.tif 000027
【図３】
2013521327.tif 000028
【配列表】
2013521327000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月8日(2012.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1)第1のfHbp、ポリペプチド抗原；および(2)髄膜炎菌ST269に対して抗体応答を作製することができる第2の抗原を含むものである、ナイセリア菌感染または疾患の予防に使用するための免疫原性組成物。
【請求項２】
(1)第1のfHbp、ポリペプチド抗原；および(2)髄膜炎菌ST269に対して抗体応答を作製することができる第2の抗原を含むものである免疫原性組成物。
【請求項３】
組成物は少なくとも70％は侵害性MenBクローン複合体が病因である髄膜炎菌感染または疾患を予防することができる、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
第2の抗原はTdfI、Hap、HsfおよびTdfHから選択されるか、または前記抗原の2以上の組み合わせ、例えば、TdfIとHap、TdfIとHsf、HapとHsf、およびTdfIとHapとHsfからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
１以上の抗原が外膜小胞において発現される、請求項１〜４のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
組成物は、好適には髄膜炎菌由来のさらなる抗原を含むものである、請求項１〜５のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
fHbp抗原は；
(i)  fhBP A、
(ii)  fhBP B、
(iii)  アミノ酸配列F1およびF2を含むキメラタンパク質であって、F1は第1のfHbpアミノ酸配列のN末端断片であり；F2は第2のfHbpアミノ酸配列のC末端断片であり；前記第1と第2のfHbpアミノ酸配列は異なるfHbpファミリー由来であり；断片F1とF2は両方とも長さが少なくとも10個のアミノ酸であり；そしてその融合タンパク質は両方のfHbpファミリーに対して抗体を誘発することができる前記キメラタンパク質、ならびに
(iv)  (i)、(ii)または(iii)に対して80％以上の同一性を有する免疫原性ポリペプチド、
から選択される、請求項１〜６のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
fHbpはH因子結合を低下させるかまたは阻止する少なくとも１つの突然変異を有する、請求項１〜７のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
第1および／または第2の抗原を外膜小胞に発現するステップを含み、前記組成物がナイセリア菌感染または疾患の予防に使用される、請求項１〜８のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を製造する方法。
【請求項１０】
a.  第1のfHbpポリペプチドは好適には単離されかつ少なくとも50％純度に精製されたサブユニットポリペプチドであり、そして第2の抗原は外膜小胞に存在するものである、または
b.  第2の抗原は好適には単離されかつ少なくとも50％純度に精製されたサブユニット抗原であり、そして第1のfHbpポリペプチドは外膜小胞に存在するものである、
請求項１〜９のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、または方法。
【請求項１１】
１以上の抗原が外膜小胞内に含まれ、前記１以上の抗原はアップレギュレーションされていて、無改変の髄膜炎菌、好適には菌株H44/76由来の外膜小胞に存在するタンパク質のレベルより高い抗原のレベルが外膜小胞に存在するものである、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、または方法。
【請求項１２】
第1の抗原を、髄膜炎菌ST11クローン複合体菌株に対して抗体を誘発することができる抗原、任意に、L2 LOS、TdfI、Hap、HsfおよびTdfHから選択されるか、または前記抗原の2以上の組み合わせ、例えば、L2 LOSとTdfI、L2 LOSとHap、L2 LOSとHsf、TdfIとHap、TdfIとHsf、HapとHsf、TdfIとHapとHsf、L2LOSとTdfIとHap、L2 LOSとTdfIとHsf、およびL2 LOSとHapとHsfからなる群より選択される抗原と組み合わせる（または製剤する）ことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、または方法。
【請求項１３】
第1の抗原をNadAと組み合わせるまたは製剤する、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、または方法。
【請求項１４】
第1の抗原をLipo28と組み合わせるまたは製剤する、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、または方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４に記載の免疫原性組成物の第1の抗原を含むワクチンを、髄膜炎菌クローン複合体ST269、または免疫型L2とクローン複合体ST269、またはクローン複合体ST11とクローン複合体ST269、または免疫型L2とクローン複合体ST11とクローン複合体ST269が病因である疾患または感染の予防における使用にとってより好適であるように改善する方法であって、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の免疫原性の第1の抗原を第2の抗原と共に製剤して請求項１〜１４のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を生産するステップを含むものである前記方法。
【国際調査報告】
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