(57)【要約】  本発明は，多糖のグルコサミン部分の（６）位にアルデヒド基を有するヒアルロナン誘導体の新規の調製方法に関する。ヒアルロン酸は，無機塩類の有無にかかわらず，プロトン環境下でＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯ又はＴＥＭＰＯ／ＴＣＣ系を使用して酸化させることが可能である。調製したアルデヒドは，例えば水，又は水‐有機溶媒系中でのＮａＢＨ３ＣＮによる還元アミノ化を利用してアミン，ジアミン，アミノ酸，ペプチド及びアミノ基を含む他の化合物を結合させるために使用可能である。ジアミン又は３つ以上のアミノ基を含む化合物を使用する場合，架橋ヒアルロナン誘導体が調製可能である。架橋誘導体は，アミノ‐アルキル基であるＨＡ‐アルキル‐ＮＨ２で置換したヒアルロナンとアルデヒドとを反応させて調製することも可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸がプロトン性溶媒中で４‐Ｒ‐ＴＥＭＰＯ及び共酸化剤と反応し，式中，Ｒは１〜５０個の原子を有する直鎖又は分岐鎖であり，任意で芳香族基又はヘテロ芳香族基を含む，ヒアルロン酸の酸化誘導体の調製方法。
【請求項２】
前記共酸化剤が次亜塩素酸ナトリウム又はＴＣＣ（トリクロロシアヌル酸）を含む請求項１記載の調製方法。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸が，遊離酸又は塩の形態である請求項１又は２記載の調製方法。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸の分子量が，１．１０４〜５．１０６ｇ．ｍｏｌ−１の範囲内にある請求項１〜３いずれか１項記載の調製方法。
【請求項５】
前記プロトン性溶媒が水，及び一般式ＭＸの塩類の水溶液を含み，式中，Ｍはアルカリ金属であり，ＸはＨＣＯ３−，ＣＯ３２−，ＰＯ４３−，ＨＰＯ４２−，Ｈ２ＰＯ４−及びハロゲンを含む群から選択される請求項１〜４いずれか１項記載の調製方法。
【請求項６】
前記塩水溶液の濃度が０〜１５重量％である請求項５記載の調製方法。
【請求項７】
前記ヒアルロン酸，４‐Ｒ‐ＴＥＭＰＯ及び共酸化剤の反応を，温度−１０〜２０℃の範囲内，好ましくは０℃で，５分〜２４時間，好ましくは１０時間行う請求項１〜６いずれか１項記載の調製方法。
【請求項８】
前記４‐Ｒ‐ＴＥＭＰＯの量が前記ヒアルロナンの二量体に対して０．００５〜０．５当量の範囲内である請求項１〜７いずれか１項記載の調製方法。
【請求項９】
前記共酸化剤の量が前記ヒアルロナンの二量体に対して０．０５〜１当量の範囲内である請求項１〜８いずれか１項記載の調製方法。
【請求項１０】
前記溶媒が水であるか，或いは水分含有量が少なくとも３０％（ｖ／ｖ）である水とＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒との混合液である請求項１〜９いずれか１項記載の調製方法。
【請求項１１】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体が，一般式Ｈ２Ｎ‐Ｒのアミン又はＲ‐ＮＨ２基で置換したヒアルロナンと反応し，式中，Ｒは，任意で芳香族基又はヘテロ芳香族基を含む直鎖又は分岐鎖Ｃ１‐Ｃ３０のアルキルである請求項１〜１０いずれか１項記載の方法を使用して調製した前記ヒアルロン酸誘導体の修飾方法。
【請求項１２】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体がアミノ酸と反応する請求項１１記載の修飾方法。
【請求項１３】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体がペプチドと反応する請求項１１記載の修飾方法。
【請求項１４】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体が遊離アミノ基を含む多糖と反応する請求項１１記載の修飾方法。
【請求項１５】
前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖の量が，前記ヒアルロナンの二量体に対して０．０５〜１０当量の範囲内である請求項１１〜１４いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項１６】
水又は水‐有機溶媒系中で，前記ヒアルロン酸誘導体が，前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖と温度０〜８０℃の範囲内，好ましくは２０℃で，１分〜２４時間，好ましくは１時間反応する請求項１１〜１５いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項１７】
前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖を添加した０〜１００時間後に請求項１６記載の反応混合液に添加される還元剤としてのＮａＢＨ３ＣＮの存在下で，前記酸化されたヒアルロン酸誘導体が前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖と反応する修飾方法。
【請求項１８】
前記還元剤としてのＮａＢＨ３ＣＮの量が，前記アルデヒド又はジェミナルジオールの分子量に対して０〜２０モル当量の範囲内である請求項１７記載の修飾方法。
【請求項１９】
前記有機溶媒が水混和性アルコール，特にイソプロパノール又はエタノール，及び水混和性極性非プロトン性溶媒，特にジメチルスルホキシドから成る群より選択される請求項１６〜１８いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項２０】
水の量が溶媒全体の体積に対して少なくとも５０％（ｖ／ｖ）である請求項１６〜１９いずれか１項記載の修飾方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，第一ヒドロキシル基‐ＣＨ２‐ＯＨの代わりにアルデヒド基‐ＣＨ＝Ｏを含むヒアルロン酸誘導体の新規な調製方法に関する。酸化はプロトン性溶媒中で，４位置換ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６‐テトラメチル‐ピペリジニルオキシル）／共酸化剤系を使用して実行可能であり，：
【化１】
2013513672.tif 000002
式中，Ｒは水素又は任意の置換基であり，共酸化剤は次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）又はトリクロロイソシアヌル酸（ＴＣＣ）である。
【背景技術】
【０００２】
２つの反復単位β‐（１，３）‐Ｄ‐グルクロン酸及びβ‐（１，４）‐Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミンから成るヒアルロン酸は重要な多糖である。分子量は，単離方法及び原料物質に依存するが，５．１０４〜５．１０６ｇ．ｍｏｌ−１である。ヒアルロン酸又はそのヒアルロナンナトリウム塩は結合組織，関節の滑液の必須成分であり，また水和，プロテオグリカン組織化，細胞分化，増殖及び血管形成などの生物学的プロセスに重要な役割を担う。ヒアルロン酸は親水性の高い多糖であり，塩の形態でｐＨの全範囲内において水溶性である。
【化２】
2013513672.tif 000003
【０００３】
ヒアルロン酸の酸化
多糖類の酸化は多糖の官能基の酸化度が変化するプロセスである。多糖類の特性を劇的に変化させることができるカルボン酸又はアルデヒドが最も頻繁に形成される。大抵，酸化度が高めの原子を含有する試薬を使用して反応が行われる。
【０００４】
アンジェリーノ（Angelino）の欧州有機化学ジャーナル（European Journal of
Organic Chemistry） 2006年, 19, 4323-4326に記載された，第一ヒドロキシル基で糖類を選択的に酸化する方法では，温度０℃，ＤＭＦ中で２，２，６，６‐テトラメチル‐１‐ピペリジニルオキシルラジカルであるＴＥＭＰＯ／ＴＣＣ系を使用し，相当分のアルデヒドが主生成物として得られた。
【０００５】
ＴＥＭＰＯは，反応中に３種の酸化還元形態をとることが可能な比較的安定なラジカルである。
【化３】
2013513672.tif 000004
【０００６】
触媒量のＴＥＭＰＯを反応に付加することから，ＴＥＭＰＯの酸化形態を現状に戻す共酸化剤を使用することが必要となる。
【０００７】
２，２，６，６‐テトラメチル‐１‐ピペリジニルオキシルラジカル（ＴＥＭＰＯ）及びＮａＯＣｌを介して，温度０℃，ｐＨ１０．２でヒアルロナンの第一ヒドロキシル基をカルボン酸へと酸化した（反応式２）（カーボハイドレイトリサーチ（Carbohydr Res）2000年, 327 (4), 455-61）。
【化４】
2013513672.tif 000005
他の多糖類と同様に，前記ポリマーは位置選択性が高く，分解が少ないことが観察された。前記溶液中の塩（ＮａＢｒ，ＮａＣｌ，Ｎａ２ＳＯ４）の濃度が増加すると，酸化率が減少した。
【０００８】
ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯ系を使用したヒアルロナンの酸化は国際公開第０２／１８４４８  Ａ２号の特許出願に記載されている。発明者らは生物学的錯体を形成する一方で，過カルボキシ化した多糖類の相互作用も扱っている。
【０００９】
過ヨウ素酸ナトリウムの使用によるＨＡ及び他の多糖類の酸化率は，スコットら（Scott et al）により研究されている（反応式３）（ヒストケミ（Histochemie） 1969年, 19 (2), 155-61）。
【化５】
2013513672.tif 000006
鎖長，置換反応，ポリマーの立体配置及び温度などの因子を検討し，定量化した。ヒアルロナンを酸化するためにＮａＩＯ４を使用することも米国特許第６６８３０６４号及び第６９５３７８４号に開示された。
【００１０】
生理学的緩衝液中の低分子量ＨＡ類似体のモデル反応が研究された（カーボハイドレイトリサーチ 1999年, 321, (3-4), 228-34)。グルクロン部分及びグルコサミン部分の酸化生成物がＧＣ‐ＭＳ分析で同定された。この結果から，酸化がグルクロン部分で初めに生じ，メソ酒石酸が主生成物であり，ヒアルロナン酸化のバイオマーカーとして使用し得ることが示唆されている。
【００１１】
架橋反応における酸化されたＨＡの使用
架橋ヒドロゲルを調製するための酸化されたＨＡの使用が，ウェンら（Weng et al）により，ジャーナルオブバイオメディカルマテリアルズリサーチＡ（J 
Biomed Mater Res A）2008年, 85 (2), 352-65に記載されている（反応式４）。この場合には，部分的に酸化されたヒアルロナン及びゼラチンの２つの先駆物質が使用された。
【化６】
2013513672.tif 000007
得られたヒドロゲルの物理化学的特性は，機器分析ＦＴ‐ＩＲ，ＳＥＭ（走査電子顕微鏡法）及び流動度測定により解明されている。ヒアルロナンの酸化度が高まると，それに応じてヒドロゲルの相溶性が高まり，水分吸収能が低下する。細胞‐ヒドロゲル相互作用を研究するために，皮膚線維芽細胞を使用した。ヒドロゲル及びその分解生成物の双方が生体適合性を有することが，長期細胞生存率アッセイにより証明されている。細胞と共に培養されると，ヒドロゲルは４週間以内に分解し，接着性は明らかに失われる。良好な生体適合性及び生分解性が，マウス皮下移植で更に証明された。最終的に，ヒドロゲル中の細胞間マトリックスのin vitro及びin vivoでの沈積はＳＥＭ分析で証明された。
【００１２】
外部架橋剤が全く無い状態で３次元ヒドロゲルを形成する，油中水型エマルジョン法により，酸化されたヒアルロナン及びゼラチンから架橋ＨＡを調製する方法が，ウェンらの出版物，バイオマテリアルズ（Biomaterials），2008年, 29, (31), 4149-56に記載されている。この研究において，ヒドロゲル構造へのモデル薬物の取り込み（カプセル封入），及びマクロファージを介するそれらの放出をＨＰＬＣにより検証した。
【００１３】
過ヨウ素酸ナトリウムによりＨＡ‐アルデヒドに酸化したＨＡ，及びアジピン酸ジヒドラジドで修飾したＨＡをカップリングすることによる弾性ヒドロゲルの調製が，サヒナーら（Sahiner et al）により，バイオマテリアル学会会誌ポリマー編（J. Biomater. Sci. Polym. Ed）2008年, 19 (2), 223-43に記載されている（反応式５)。
【化７】
2013513672.tif 000008
得られた誘導体は培養した線維芽細胞の増殖に対して際立った影響を何ら与えていなかったことがＭＴＴアッセイにより示された。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は，多糖のグルコサミン部分の６位にあるヒアルロン酸の第一ヒドロキシル基をアルデヒドへと選択的に酸化させる方法の改良に関する。この新規な反応は，２，２，６，６‐テトラメチル‐１‐ピペリジニルオキシルラジカルであるＴＥＭＰＯ／共酸化剤系を使用して行う。近年発表されているアプローチは，糖リングを開環しながらヒアルロナンのグルクロン部分の２位及び３位にアルデヒド基を導入するか（反応式６，構造２），或いはヒアルロナンのグルコサミン部分の６位にカルボキシル基を導入するか（反応式６，構造１）のいずれかである。
【化８】
2013513672.tif 000009
【００１５】
それぞれの酸化生成物（構造３，反応式６）が共役した糖リングの構造を維持しているという点で，本発明の方法は更に有利である。ジアルデヒドへと酸化した生成物において環が開くと（構造２，反応式６），鎖の直線性が「切断」され，したがって，非修飾ヒアルロナンと比較して，多糖３次元構造は大幅に変化する。カルボン酸へ酸化した生成物（構造１，反応式６）内では，鎖の直線性は「切断」されないとはいえ，カルボキシル基はアルデヒド基のように，このような多様な修飾（結合）能を可能にすることはない。カルボキシル基は既に非修飾多糖の構成要素であることから，構造１（反応式６）への酸化は多糖極性を高めるだけで，新規な置換体の結合に利用可能な新規な性質を発展させることはない。
【００１６】
アルキル基が結合したアルデヒド基は，所謂ジェミナルジオール形態ＨＡ‐ＣＨ（ＯＨ）２で，水中に存在し，アルデヒドと同様に求核試薬と反応することが知られている。水溶液中では，グルコサミン部分の６位（生成物３，反応式６）で酸化したヒアルロナンの９５％以上がジェミナルジオールの形態で存在することが，ＮＭＲ分光法により証明されている。
【００１７】
本発明の方法では，ヒアルロン酸を水中に溶解し，その後，酸化剤を添加し，該混合液を温度−１０〜２０℃，好ましくは０℃で１〜１５０時間，好ましくは２４時間攪拌する。
【００１８】
調製した酸化されたヒアルロナンは，例えばアミノ基を含む化合物の結合に使用可能である。前記結合はイミン形態か，或いは還元後にアミン形態（還元的アミノ化）（反応式７）で実施することが可能である。
【化９】
2013513672.tif 000010
【００１９】
この修飾の両段階は水溶液中で行い，還元はＮａＢＨ３ＣＮを使用して行う。反応式７に記載の反応の両段階は１工程で行うことが可能である。
【００２０】
ヒアルロン酸誘導体の修飾は，酸化誘導体と，一般式Ｈ２Ｎ‐Ｒのアミン又はＲ‐ＮＨ２基で置換したヒアルロナンとを反応させることで行うことが可能であり，式中，Ｒは，任意で芳香族基又はヘテロ芳香族基を含む，直鎖又は分岐鎖Ｃ１‐Ｃ３０のアルキルである。このアミンはアルキルアミン，例えばブチルアミン又はヘキサンジアミン，アミノ酸，ペプチド又は遊離アミノ基を含む多糖とすることが可能である。ジアミン，又は３つ以上のアミノ基を含む化合物を使用する場合，架橋ヒアルロナン誘導体を調製することが可能である。架橋誘導体は，アルデヒドと，アミノアルキル基ＨＡ‐アルキル‐ＮＨ２で置換したヒアルロナンとを反応させることでも調製可能である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ＤＳ＝置換度＝１００％×結合した置換体の分子量／全多糖二量体の分子量。
本明細書で使用している用語「当量（ｅｑ）」は，特に指定がなければヒアルロン酸二量体を指す。本明細書で使用している百分率は，特に指定がなければ重量パーセントを意味する。
出発ヒアルロナン（starting 
hyaluronan）（ソース：シーピーエヌ  エスピーオーエル．エス．アール．オー．（CPN spol. s r. o.), ドルニ  ドブロチ, チェコ）の分子量はＳＥＣ‐ＭＡＬＬＳアッセイで測定した。
【００２２】
実施例１  ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯ系によるヒアルロン酸の酸化
ＮａＣｌＯ（０．５ｅｑ）の水溶液を，ヒアルロナン（１％）（０．１ｇ，２０ｋＤａ）（１０重量％のＮａＣｌを含む），ＴＥＭＰＯ（０．０１ｅｑ）及びＮａＨＣＯ３（３０ｅｑ）の水溶液に徐々に添加した。該混合液を温度−５℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を蒸留水で０．２％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１０％（ＮＭＲにより測定）
2013513672.tif 000011
【００２３】
実施例２  ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯ系によるヒアルロン酸の酸化
ＮａＣｌＯ（０．５ｅｑ）の水溶液を，ヒアルロナン（０．５％）（０．１ｇ，２０００ｋＤａ）（１０重量％のＮａＣｌを含む），ＴＥＭＰＯ（０．０１ｅｑ）及びＮａＨＣＯ３（３０ｅｑ）の水溶液に徐々に添加した。該混合液を温度−５℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を蒸留水で０．２％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１０％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００２４】
実施例３  ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯ系によるヒアルロン酸の酸化
ＮａＣｌＯ（０．５ｅｑ）の水溶液を，ヒアルロナン（１％）（０．１ｇ，２０ｋＤａ）（１０重量％のＮａＣｌを含む），４‐アセトアミド‐ＴＥＭＰＯ（０．０１ｅｑ）及びＮａＨＣＯ３（３０ｅｑ）の水溶液に徐々に添加した。該混合液を温度−５℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を蒸留水で０．２％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１０％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００２５】
実施例４  ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯ系によるヒアルロン酸の酸化
ＮａＣｌＯ（０．５ｅｑ）の水溶液を，ヒアルロナン（１％）（０．１ｇ，２０ｋＤａ）（１０重量％のＮａＣｌを含む），４‐アセトアミド‐ＴＥＭＰＯ（０．０５ｅｑ）及びＮａＨＣＯ３（３０ｅｑ）の水溶液に徐々に添加した。該混合液を温度−１０℃で１０時間攪拌した。その後，該溶液を蒸留水で０．２％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１０％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００２６】
実施例５  ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯ系によるヒアルロン酸の酸化
ＮａＣｌＯ（０．３ｅｑ）の水溶液を，ヒアルロナン（１％）（０．１ｇ，２０ｋＤａ），４‐アセトアミド‐ＴＥＭＰＯ（０．１ｅｑ）及びＮａＨＣＯ３（３０ｅｑ）の水溶液に徐々に添加した。該混合液を温度２０℃で１時間攪拌した。その後，該溶液を蒸留水で０．２％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ５％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００２７】
実施例６  ＴＥＭＰＯ／ＴＣＣ系によるヒアルロン酸の酸化
４‐アセトアミド‐ＴＥＭＰＯ（０．０１ｅｑ）及びＴＣＣ（０．２ｅｑ）を，Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド／水：７０／３０の混合液中のヒアルロン酸溶液（１％）（０．１ｇ，２０ｋＤａ）に添加した。該混合液を温度−５℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ５％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００２８】
実施例７  ＴＥＭＰＯ／ＴＣＣ系によるヒアルロン酸の酸化
４‐アセトアミド‐ＴＥＭＰＯ（０．０１ｅｑ）及びＴＣＣ（０．２ｅｑ）を，Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド／水：９０／１０の混合液中のヒアルロン酸溶液（１％）（０．１ｇ，２０ｋＤａ）に添加した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１０％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００２９】
実施例８  ＴＥＭＰＯ／ＴＣＣ系によるヒアルロン酸の酸化
４‐アセトアミド‐ＴＥＭＰＯ（０．０１ｅｑ）及びＴＣＣ（１ｅｑ）を，Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド／水：４０／６０の混合液中のヒアルロン酸溶液（１％）（０．１ｇ，２０ｋＤａ）に添加した。該混合液を温度−５℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１５％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００３０】
実施例９  ＴＥＭＰＯ／ＴＣＣ系によるヒアルロン酸の酸化
４‐アセトアミド‐ＴＥＭＰＯ（０．０１ｅｑ）及びＴＣＣ（１ｅｑ）を，Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド／水：４０／６０の混合液中のヒアルロン酸溶液（０．５％）（０．１ｇ，２０００ｋＤａ）に添加した。該混合液を温度−５℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１５％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００３１】
実施例１０  ＴＥＭＰＯ／ＴＣＣ系によるヒアルロン酸の酸化
ＴＥＭＰＯ（０．０１ｅｑ）及びＴＣＣ（０．２ｅｑ）を，Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド／水：７０／３０の混合液中のヒアルロン酸溶液（１％）（０．１ｇ，２０ｋＤａ）に添加した。該混合液を温度２０℃で１時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ５％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００３２】
実施例１１  ＴＥＭＰＯ／ＴＣＣ系によるヒアルロン酸の酸化
ＴＥＭＰＯ（０．０１ｅｑ）及びＴＣＣ（０．２ｅｑ）を，ＤＭＦ／水：７０／３０の混合液中のヒアルロン酸溶液（１％）（０．１ｇ，２０ｋＤａ）に添加した。該混合液を温度−５℃で１００時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ５％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００３３】
実施例１２  ＴＥＭＰＯ／ＮａＢｒＯ系によるヒアルロン酸の酸化
ＮａＣｌＯ（０．５ｅｑ）の水溶液を，ヒアルロナン（１％）（０．１ｇ，２０ｋＤａ）（５重量％のＮａＢｒを含む），４‐アセトアミド‐ＴＥＭＰＯ（０．５ｅｑ）及びＮａＨＣＯ３（３０ｅｑ）の水溶液に徐々に添加した。該混合液を温度０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を蒸留水で０．２％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１４％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００３４】
実施例１３  ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯ系によるヒアルロン酸の酸化
ＮａＣｌＯ（０．５ｅｑ）の水溶液を，ヒアルロナン（１％）（０．１ｇ，２００ｋＤａ）（１０重量％のＮａＢｒを含む），ＴＥＭＰＯ（０．５ｅｑ）及びＮａＨＣＯ３（５ｅｑ）の水溶液に徐々に添加した。該混合液を温度０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を蒸留水で０．２％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１８％（ＮＭＲにより測定，詳細は実施例１参照）
【００３５】
実施例１４  酸化されたヒアルロナンとアミンとの反応
ブチルアミン（０．４ｅｑ）を，酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度  ＤＳ＝１８％，実施例１３）に添加した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を２倍量のアセトン及び０．１ｍｌのＮａＣｌ飽和水溶液で沈殿させ，ろ過し，真空乾燥させた。その後，得られた黄色の材料を分析した。
ＵＶ‐ＶＩＳ  ３２８ｎｍ，ｎ→π＊遷移  ‐ＣＨ＝Ｎ‐
【００３６】
実施例１５  酸化されたヒアルロナンとブチルアミンとの反応，及びそれに続く還元
ブチルアミン（０．４ｅｑ）を，酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度  ＤＳ＝１８％，実施例１３）に添加した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１５％（ＮＭＲにより測定）
2013513672.tif 000012
【００３７】
実施例１６  酸化されたヒアルロナンとジアミンとの反応，及びそれに続く還元
ヘキサンジアミン（０．４ｅｑ）を，酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度  ＤＳ＝１８％，実施例１３）に添加した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１６％（ＮＭＲにより測定）
2013513672.tif 000013
【００３８】
実施例１７  酸化されたヒアルロナンとアミノ‐ヒアルロナンとの反応
ヘキサンジアミン（１ｅｑ，ＤＳ＝１６％，実施例１６）で置換したヒアルロナン誘導体の１％水溶液を，酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度  ＤＳ＝１８％，実施例１３）に，温度２０℃で添加した。数分後に得られた不溶性の凝縮したゴム状沈殿物を機械的に粉砕して小片にし，ろ過し，減圧下で乾燥させた。
ＦＴ‐ＩＲ（ＫＢｒ）  １７００ｃｍ−１
【００３９】
実施例１８  リジンによる酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
リジン（０．３ｅｑ）を，酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度  ＤＳ＝１８％，実施例１３）に添加した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１４％（ＮＭＲにより測定）
2013513672.tif 000014
【００４０】
実施例１９  リジンによる酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
リジン（２０ｅｑ）を，酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度  ＤＳ＝１８％，実施例１３）に添加した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（１０ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。その後，得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１７％（ＮＭＲにより測定，実施例１０）
【００４１】
実施例２０  セリンによる酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
セリン（０．３ｅｑ）を，酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度  ＤＳ＝１８％，実施例１３）に添加した。該混合液を温度２０℃で１分間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１４％（ＮＭＲにより測定）
2013513672.tif 000015
【００４２】
実施例２１  アルギニンによる酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
アルギニン（０．３ｅｑ）を，酸化されたヒアルロン酸の水溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度  ＤＳ＝１８％，実施例１３）に添加した。該混合液を温度２０℃で１００時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣl，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１１％（ＮＭＲにより測定）
2013513672.tif 000016
【００４３】
実施例２２  ペンタペプチドＰＡＬ‐ＫＴＴＫＳ（パルミトイル‐Ｌｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｓｅｒ）による酸化されたヒアルロナンの還元的アミノ化
イソプロピルアルコール中の置換ペンタペプチドＰＡＬ‐ＫＴＴＫＳ（０．０５ｅｑ）１％溶液を，水／イソプロパノール系２／１中の酸化されたヒアルロン酸の溶液（１％）（０．１ｇ，酸化度  ＤＳ＝１８％，実施例１３）に添加した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。その後，該溶液を，ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｅｑ）を含む水０．５ｍｌと混合した。該混合液を温度２０℃で２４時間攪拌した。該溶液を０．１％に希釈し，混合液（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ３）３×５リットルに対して透析し（１日１回），蒸留水７×５リットルに対して透析した（１日２回）。得られた溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ９％（ＮＭＲにより測定）
2013513672.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成24年10月17日(2012.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸がプロトン性溶媒中で４‐Ｒ‐ＴＥＭＰＯ及び共酸化剤と反応し，式中，Ｒは１〜５０個の原子を有する直鎖又は分岐鎖である，ヒアルロン酸の酸化誘導体の調製方法。
【請求項２】
前記Ｒが芳香族基又はヘテロ芳香族基を含む請求項１記載の調製方法。
【請求項３】
前記共酸化剤が次亜塩素酸ナトリウム又はＴＣＣ（トリクロロシアヌル酸）を含む請求項１又は２記載の調製方法。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸が，遊離酸又は塩の形態である請求項１〜３いずれか１項記載の調製方法。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸の分子量が，１．１０４〜５．１０６ｇ．ｍｏｌ−１の範囲内にある請求項１〜４いずれか１項記載の調製方法。
【請求項６】
前記プロトン性溶媒が水，及び一般式ＭＸの塩類の水溶液を含み，式中，Ｍはアルカリ金属であり，ＸはＨＣＯ３−，ＣＯ３２−，ＰＯ４３−，ＨＰＯ４２−，Ｈ２ＰＯ４−及びハロゲンを含む群から選択される請求項１〜５いずれか１項記載の調製方法。
【請求項７】
前記塩水溶液の濃度が０〜１５重量％である請求項６記載の調製方法。
【請求項８】
前記ヒアルロン酸，４‐Ｒ‐ＴＥＭＰＯ及び共酸化剤の反応が，温度−１０〜２０℃の範囲内で，５分〜２４時間行われる請求項１〜７いずれか１項記載の調製方法。
【請求項９】
前記反応が温度０℃で行われる請求項８記載の調製方法。
【請求項１０】
前記反応が１０時間行われる請求項８記載の調製方法。
【請求項１１】
前記４‐Ｒ‐ＴＥＭＰＯの量が前記ヒアルロナンの二量体に対して０．００５〜０．５当量の範囲内である請求項１〜８いずれか１項記載の調製方法。
【請求項１２】
前記共酸化剤の量が前記ヒアルロナンの二量体に対して０．０５〜１当量の範囲内である請求項１〜１１いずれか１項記載の調製方法。
【請求項１３】
前記溶媒が水であるか，或いは水分含有量が少なくとも３０％（ｖ／ｖ）である水と極性非プロトン性溶媒との混合液である請求項１〜１２いずれか１項記載の調製方法。
【請求項１４】
前記極性非プロトン性溶媒がＤＭＦである請求項１３記載の調製方法。
【請求項１５】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体が，一般式Ｈ２Ｎ‐Ｒのアミン又はＲ‐ＮＨ２基で置換したヒアルロナンと反応し，式中，Ｒは直鎖又は分岐鎖Ｃ１‐Ｃ３０のアルキルである請求項１〜１４いずれか１項記載の方法を使用して調製した前記ヒアルロン酸誘導体の修飾方法。
【請求項１６】
前記Ｒが芳香族基又はヘテロ芳香族基を含む請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体がアミノ酸と反応する請求項１５又は１６記載の修飾方法。
【請求項１８】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体がペプチドと反応する請求項１５又は１６記載の修飾方法。
【請求項１９】
前記酸化されたヒアルロン酸誘導体が遊離アミノ基を含む多糖と反応する請求項１５又は１６記載の修飾方法。
【請求項２０】
前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖の量が，前記ヒアルロナンの二量体に対して０．０５〜１０当量の範囲内である請求項１１〜１９いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項２１】
前記ヒアルロン酸誘導体と，前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖との反応が，水又は水‐有機溶媒系中で，温度０〜８０℃の範囲内で，１分〜２４時間行われる請求項１１〜２０いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項２２】
前記反応が温度２０℃で行われる請求項２１記載の修飾方法。
【請求項２３】
前記反応が１時間行われる請求項２１記載の修飾方法。
【請求項２４】
前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖を添加した０〜１００時間後に請求項２１〜２３いずれか１項記載の反応混合液に添加される還元剤としてのＮａＢＨ３ＣＮの存在下で，前記酸化されたヒアルロン酸誘導体が前記アミン，アミノ酸，ペプチド又は多糖と反応する修飾方法。
【請求項２５】
前記還元剤としてのＮａＢＨ３ＣＮの量が，前記アルデヒド又はジェミナルジオールの分子量に対して０〜２０モル当量の範囲内である請求項２４記載の修飾方法。
【請求項２６】
前記有機溶媒が水混和性アルコール及び水混和性極性非プロトン性溶媒から成る群より選択される請求項２１〜２５いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項２７】
前記水混和性アルコールがイソプロパノール又はエタノールであり，前記水混和性極性非プロトン性溶媒がジメチルスルホキシドである請求項２６記載の修飾方法。
【請求項２８】
水の量が溶媒全体の体積に対して少なくとも５０％（ｖ／ｖ）である請求項２１〜２７いずれか１項記載の修飾方法。
【国際調査報告】
2013513672.tif 000018
2013513672.tif 000019