(57)【要約】  本発明は、治療用リポソーム、並びにこれらを製造及び使用する方法を提供する。特に、本発明の治療用リポソームは、Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸エステル部分を含むリン脂質を含む。幾つかの実施の形態では、これらの治療用リポソームは、被験体への活性化合物、例えば薬剤及び／又は栄養補助食品の送達を支援するのに使用される。幾つかの実施の形態では、本発明の組成物は、相乗的な治療効果を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用リポソーム組成物であって、その各々が独立してＣ１６〜Ｃ２２脂肪酸エステルである脂肪酸エステル部分を少なくとも２つ有するリン脂質を含む治療用リン脂質リポソーム、及び前記治療用リン脂質リポソームによって被包される活性化合物を含む、治療用リポソーム組成物。
【請求項２】
前記リン脂質が、式：
【化１】
2013526533.tif 000005
（式中、
Ｒ１及びＲ２の各々は、該Ｒ１及びＲ２の各々が結合するカルボキシレート基とともに、独立してＣ１６〜Ｃ２２脂肪酸部分であり、
Ｒ３は、該Ｒ３が結合する酸素原子とともに、コリン部分、セリン部分、イノシトール部分又はエタノールアミン部分を形成する）
のリン脂質である、請求項１に記載の治療用リポソーム組成物。
【請求項３】
前記Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸がω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸又はω−９脂肪酸である、請求項１に記載の治療用リポソーム組成物。
【請求項４】
前記Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸が、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、カレンジン酸（ＣＬＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、又はそれらの組合せを含む、請求項３に記載の治療用リポソーム組成物。
【請求項５】
前記Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸が、ＧＬＡ、ＳＤＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＥＴＡ−３、又はそれらの組合せを含む、請求項１に記載の治療用リポソーム組成物。
【請求項６】
前記活性化合物が、薬剤又は栄養補助化合物を含む、請求項１に記載の治療用リポソーム組成物。
【請求項７】
前記薬剤が、抗生物質、スタチン、カルシウムチャネル遮断剤、ＡＣＥ阻害剤、α−アゴニスト、α−遮断剤、レンニン遮断剤、デクスメチルフェニデート、グアンファシン、メチルフェニデート、抗炎症性化合物、又はそれらの組合せを含む、請求項６に記載の治療用リポソーム組成物。
【請求項８】
前記栄養補助化合物が、リスベラトロール、キノン、ジフェルロイルメタン、ステロール、β−グルカン、グルコサミン、カロテノイド、テルペン、キサントフィル、ω−３脂肪酸、プロバイオティクス、プレバイオティクス、又はそれらの組合せを含む、請求項６に記載の治療用リポソーム組成物。
【請求項９】
その各々が独立してＣ１６〜Ｃ２２脂肪酸エステルである脂肪酸エステル部分を少なくとも２つ有するリン脂質を含む治療用リン脂質リポソーム、及び前記治療用リン脂質リポソームによって被包される活性化合物を含む治療用リポソーム組成物を作製する方法であって、前記方法が、
活性化合物を含む緩衝剤溶液と、可溶化されるリン脂質混合物を組み合わせることであって、該可溶化されるリン脂質混合物が、溶媒中に可溶化されるリン脂質を含む、可溶化されるリン脂質混合物を組み合わせることと、
被包される活性化合物を有する治療用リン脂質リポソームを含む治療用リポソーム組成物を形成することと、
を含む、治療用リポソーム組成物を作製する方法。
【請求項１０】
治療用リポソーム組成物を形成する前記工程が、超音波処理、均質化処理、微細流動化処理、レーザー処理、高剪断混合、又はそれらの組合せを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
治療用リポソーム組成物から該溶媒の少なくとも一部分を除去する工程を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
溶媒が、ヘキサン、イソヘキサン、クロロホルム、ポリソルベート、アルコール、糖アルコール化合物、ビタミン−Ｅ  ＴＰＧＳ、ポリエチレングリコール、石油化学品、又はそれらの組合せを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
リン脂質が、式：
【化２】
2013526533.tif 000006
（式中、
Ｒ１及びＲ２の各々は、該Ｒ１及びＲ２の各々が結合するカルボキシレート基とともに、独立してＣ１６〜Ｃ２２脂肪酸部分であり、
Ｒ３は、該Ｒ３が結合する酸素原子とともに、コリン部分、セリン部分、イノシトール部分又はエタノールアミン部分を形成する）
のリン脂質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸がω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸又はω−９脂肪酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸が、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、カレンジン酸（ＣＬＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、又はそれらの組合せを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸が、ＧＬＡ、ＳＤＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＥＴＡ−３、又はそれらの組合せを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
活性化合物が、薬剤又は栄養補助化合物を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
薬剤が、抗生物質、スタチン、カルシウムチャネル遮断剤、ＡＣＥ阻害剤、α−アゴニスト、α−遮断剤、レンニン遮断剤、デクスメチルフェニデート、グアンファシン、メチルフェニデート、抗炎症性化合物、又はそれらの組合せを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記栄養補助化合物が、リスベラトロール、キノン、ジフェルロイルメタン、ステロール、β−グルカン、グルコサミン、カロテノイド、テルペン、キサントフィル、ω−３脂肪酸、プロバイオティクス、プレバイオティクス、又はそれらの組合せを含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用リポソーム、並びにこれらを製造及び使用する方法に関する。特に、本発明の治療用リポソームは、Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸エステル部分を含むリン脂質を含む。幾つかの実施の形態では、これらの治療用リポソームは、被験体への活性化合物、例えば薬剤及び／又は栄養補助食品の送達を支援するのに使用される。幾つかの実施の形態では、かかる組成物は、相乗的な治療効果を有する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は２０１０年５月１０日に出願された米国仮出願第６１／３３３，１７３号に関連する２０１０年１２月２１日に出願された米国仮出願第６１／４２５，３６６号（これらの全てについて、その全体が参照によって本明細書中に援用される）の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
リポソームは、１つ又は複数の脂質二重層から構成される人工的に調製される小胞である。リポソームの典型的な脂質二重層はリン脂質から構成される。多くの場合、リポソームは、その特有の特性のために、標的を絞った薬剤又は栄養素の送達に使用される。リポソームは、疎水膜の内側の水性溶液上の領域を被包する。溶解した親水性の溶質は、脂質を容易に通過することはできない。しかしながら、疎水性の化学物質は、膜中に溶解させることができる。このため、リポソームは、疎水性の分子及び親水性の分子の両方を保有することができる。
【０００４】
リポソームは典型的には、水性溶液中でリン脂質と所望の活性化合物（例えば、薬剤、栄養素、栄養補助食品等）とを組み合わせることによって形成される。典型的には、エネルギーを水性溶液に供給して、活性化合物を被包する脂質二重層を形成する。幾つかの例では、供給されるエネルギーの量及び種類がリポソームの形成及び大きさに影響を及ぼし、例えば多くの場合、より高いエネルギーを供給すると、より小さいリポソームが形成される。
【０００５】
作用部位へと活性化合物を送達するために、リポソーム由来の脂質二重層が、細胞膜二重層と融合又は結合する。これによって、活性化合物を、細胞膜の脂質二重層を通り越させる形で無差別的に（indiscriminately）送達することが可能となる。別の送達方法は、直接的な細胞との融合ではなく拡散によるものである。ここで、活性化合物は、リポソーム内のｐＨ不均衡のために中和された状態となり、それによって活性化合物が細胞膜を自由に通過することが可能となる。
【０００６】
Zerougaet al.は、共有結合したドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）エステル及びメトトレキサート（ＭＴＸ）を有するリン脂質を開示している（非特許文献１）。このリン脂質は、リポソーム二重層を形成しやすい。しかしながら、活性化合物ＭＴＸはリポソームによって被包されておらず、むしろリン脂質それ自体の一部であり、それによって、活性化合物ＭＴＸが身体の免疫系に曝されたままとなる。
【０００７】
標的を絞った治療法、生物学、遺伝子療法、及び個別化医療がより普及しつつあるため、リポソームの有益性はますます増大している。現在のリポソームに伴う問題は、リン脂質が、送達される活性化合物との適合性を有さず、非活性化を引き起こす場合があることである。また、リン脂質が標的細胞との適合性を有しない場合がある。リポソームに伴う別の不都合な点は、免疫系が外来の物質を容易に脅威と認識することである。このため、免疫系によって容易に異物（すなわち、抗原）と認識されるリン脂質から作り出されるリポソームは、破壊され、目的の標的細胞に決して到達しない可能性がある。さらに、様々なリン脂質から作製される従来のリポソームは、それ自体単独では非活性である。すなわち、そのような従来のリポソームは、リポソーム内に被包される活性化合物を除くと、特段の治療活性を示していない。リポソームそれ自体が治療的であれば、又はリポソームそれ自体が活性化合物と組み合わせて相乗的な治療活性をもたらすことができれば、必要とされる活性化合物の量を低減することができ、それによって、活性化合物によって引き起こされる任意の副作用の発生及び／又は重症度が顕著に低減されると考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Anticancer Drug,2002, 13(3), 301-311
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、治療用リポソーム、又は活性化合物の活性を増強するリポソーム、例えば活性化合物と組み合わせた場合に相乗効果を示すリポソームに対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の幾つかの態様は、活性化合物を送達する特定の治療に対して調整する（tailored）ことができるリン脂質を含む治療用リポソーム及び治療用リポソーム組成物を提供する。他の態様では、治療用リポソーム組成物を形成するために活性化合物を被包する方法が提供される。かかる治療用リポソーム組成物を使用して、被験体の免疫系による免疫応答をたとえあったとしても最小限のものとしながら、活性化合物を標的細胞又は標的器官へと到達させ、これを送達することができる。本発明の更に他の態様は、悪性腫瘍及び／又は良性腫瘍に位置する或る特定のタンパク質に対する比較的高い結合親和性を含む治療用リポソーム及び治療用リポソーム組成物を提供する。幾つかの特定の実施の形態では、本発明の組成物及び方法は、薬剤送達系として有用である。多くの場合、かかる組成物及び方法によって、単一用量で標的細胞へと送達される活性化合物をより多くすること、及び／又は健康な細胞及び器官、すなわち望ましくない部位へと送達される活性化合物をより少なくすることが可能となる。これは、活性化合物が健康な細胞及び／又は器官を含む全ての細胞及び／又は器官に対して毒性を有することが通常であるがん療法において特に有用である。さらに、幾つかの実施の形態では、かかる組成物が、治療用リポソームと活性化合物との間の相乗効果を示す。
【００１１】
本発明の１つの特定の態様は、治療用リポソーム、治療用リポソーム組成物、並びにこれらを使用及び製造する方法を提供する。典型的には、かかる治療用リポソームは、その各々が独立してＣ１６〜Ｃ２２脂肪酸に由来する脂肪酸エステル部分を少なくとも２つ含むリン脂質を含む。幾つかの実施の形態では、Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸の各々が独立して、ω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸又はω−９脂肪酸である。例示的なω−３脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、全ｃｉｓ（all-cis）８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ又はＥＴＡ−３。これは本明細書中では交換可能な用語として使用される）及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含むがこれらに限定されない。例示的なω−６脂肪酸は、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、カレンジン酸（calendic acid）（ＣＬＡ）及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含むがこれらに限定されない。
【００１２】
さらに、他の実施の形態では、リン脂質は、コリン、セリン、イノシトール、エタノールアミン、又は別の極性基を更に含む。リン脂質は、酵母、海洋動物（例えばオキアミ）、植物及び／又は海洋植物（例えば微細藻類）から得ることができる。微細藻類の場合には、リン脂質を含有するバイオマスを、そのリン脂質の構造を変更するように設計した特定の条件下で成長させ、それによって、異なる形で構造化された（すなわち、その天然形態で成長させた場合と異なる脂肪酸を含む）と規定される、構造化された（すなわち、非天然の）リン脂質を含むリン脂質を製造することができる。リン脂質を、例えばエステル化（esterification）／エステル交換（transesterification）／アシル化を介して、合成的に改変（例えば、触媒的に「再ランダム化（re-randomized）」）することもできる。かかる合成的改変（例えば、再ランダム化）を使用して、多種多様な異なる脂肪酸エステル、及び／又は脂肪酸エステルの多種多様な組合せを含むリン脂質を調製することができる。さらに、かかる合成的改変によって、リン脂質のホスフェート部分と結合した多種多様な極性基ももたらされる。かかる合成的改変は、酵素、化学的触媒、超音波、電磁エネルギー、又はそれらの組合せを使用して達成することができる。幾つかの実施の形態では、合成的改変は、脂肪酸とリン脂質を反応させることであって、リン脂質と会合する（associated）末端位置のうちの１つ又は複数を改変（例えば、再配置）する、反応させることと、少なくとも１つの脂肪酸エステル基を除去又は加水分解することであって、ヒドロキシル基を生成する、除去又は加水分解することと、Ｃ１６又はそれより炭素原子数が大きい（例えばＣ１６、Ｃ１８、Ｃ２０又はＣ２２の）少なくとも１つの特定の脂肪酸を共有結合させる（すなわち、この脂肪酸とエステル基を形成する）ことであって、脂肪酸エステル基を生成する、共有結合させることとを含む。
【００１３】
本発明の更に他の態様は、Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸のエステル部分を少なくとも２つ含むリン脂質を含む治療用リポソームを提供する。リン脂質から作製される従来のリポソームとは異なり、本発明のリポソームはそれ自体単独で治療的である（例えば、治療活性を示す）ことを理解すべきである。多くの例では、本発明のリポソームはまた、活性化合物と組み合わせた場合に相乗効果を示す。脂肪酸部分は、飽和又は不飽和のω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸及び／又はω−９脂肪酸であり得る。幾つかの実施の形態では、リン脂質のホスフェート部分は、その末端位置に極性の官能基を含むホスホエステル部分を含む。例示的なホスホエステル部分は、コリン、セリン、イノシトール及びエタノールアミンのホスホエステルを含むがこれらに限定されない。他の実施の形態では、リン脂質は、活性化合物を実質的に被包することが可能である。更に他の実施の形態では、脂肪酸は、実質的に非免疫原性であるか、又は生体、例えばヒトの身体による検出を最小化するように適合される。
【００１４】
本発明の更に他の態様は、治療用リポソーム、及び治療用リポソーム内に被包される活性化合物を含む治療用リポソーム組成物を提供する。幾つかの実施の形態では、リン脂質における脂肪酸部分の各々は独立して、ＥＰＡ、ＳＤＡ、ＤＰＡ、ＥＴＡ（すなわち、ＥＴＡ−３）又はＤＨＡである。
【００１５】
更に他の実施の形態では、治療用リポソーム組成物は、異なるリン脂質の混合物を含む。１つの特定の実施の形態では、リポソームは、コリンのホスフェートエステル及び２つのＤＨＡエステルを含むリン脂質、コリンのホスフェートエステル並びにＤＨＡエステル及びＥＰＡエステルを含む第２のリン脂質、コリンのホスフェートエステル並びにＤＨＡエステル及びＥＴＡエステルを含む第３のリン脂質、並びにコリンのホスフェートエステル及び２つのＥＴＡエステルを含む第４のリン脂質の混合物を含む。これらの実施の形態内において、第１のリン脂質〜第４のリン脂質は、リン脂質の総量が１００％を超えない限りにおいて、各々約５重量％〜９５重量％の範囲の量で存在し得る。複数のリン脂質が等重量で存在することもある。
【００１６】
本発明の更に他の態様は、本明細書中で開示される治療用リポソーム、及び治療用リポソーム内に実質的に被包される活性化合物を含む治療用リポソーム組成物を提供する。活性化合物は実際上、任意の分子、例えば薬剤、栄養補助食品、栄養素等であり得る。活性化合物の幾つかの例は、有機酸、脂質、カロテノイド、アミノ酸、ヌクレオチド、ステロイド、微量元素、ビタミン、ホルモン、ペプチド、アミノ酸、タンパク質、ポリフェノール、キノン、分子の組合せ、薬剤、高分子化合物（例えばグリコーゲン由来の分子、若しくはグリコサミノグリカン、又は組織、例えば骨及び軟骨を形成する他の高分子単位）、及びそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【００１７】
幾つかの実施の形態では、活性化合物は、抗生物質、スタチン、カルシウムチャネル遮断剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、α−アゴニスト、α−遮断剤、レンニン遮断剤、デクスメチルフェニデート、グアンファシン、メチルフェニデート、及び抗炎症性化合物からなる群から選択される薬剤を含み得る。
【００１８】
本発明の他の態様は、本明細書中で開示される治療用リポソーム組成物を作製する方法を提供する。幾つかの実施の形態では、かかる方法は、活性化合物を含む緩衝剤溶液と、可溶化されるリン脂質混合物を混和する又はこれらを組み合わせることと、リポソームによって被包される活性化合物の組成物を形成することとを含む。可溶化されるリン脂質混合物は、溶媒中に可溶化されるリン脂質を含む。活性化合物は、治療用リン脂質リポソーム内に実質的に被包される。幾つかの実施の形態では、本発明の方法は、治療用リポソーム組成物から溶媒の少なくとも一部分を除去することを含み得る。
【００１９】
本発明の１つの特定の態様は、治療用リポソーム組成物であって、その各々が独立してＣ１６〜Ｃ２２脂肪酸である脂肪酸エステル部分を少なくとも２つ含むリン脂質、及び活性化合物を含む、治療用リポソーム組成物を提供する。
【００２０】
本発明のこの態様内において、幾つかの実施の形態では、リン脂質は、式：
【化１】
2013526533.tif 000002
（式中、
Ｒ１及びＲ２の各々は、Ｒ１及びＲ２の各々が結合するカルボキシレート基とともに、独立してＣ１６〜Ｃ２２脂肪酸部分であり、
Ｒ３は、Ｒ３が結合する酸素原子とともに、コリン部分、セリン部分、イノシトール部分又はエタノールアミン部分を形成する）
のリン脂質である。
【００２１】
別の実施の形態では、Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸はω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸又はω−９脂肪酸である。
【００２２】
さらに、別の実施の形態では、Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸は、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ又はＥＴＡ−３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、カレンジン酸（ＣＬＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、又はそれらの組合せを含む。
【００２３】
更に他の実施の形態では、Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸の各々が独立して、ＳＤＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ、ＥＰＡ、又はＥＴＡである。
【００２４】
他の実施の形態では、活性化合物は、薬剤又は栄養補助化合物を含む。これらの実施の形態内において、幾つかの例では、薬剤は、抗生物質、スタチン、カルシウムチャネル遮断剤、ＡＣＥ阻害剤、α−アゴニスト、α−遮断剤、レンニン遮断剤、デクスメチルフェニデート、グアンファシン、メチルフェニデート、抗炎症性化合物、又はそれらの組合せを含む。他の例では栄養補助化合物は、リスベラトロール、キノン、ジフェルロイルメタン、ステロール、β−グルカン、グルコサミン、カロテノイド、テルペン、キサントフィル（xanthophyll）、ω−３脂肪酸、プロバイオティクス、プレバイオティクス、又はそれらの組合せを含む。
【００２５】
本発明の別の特定の態様は、治療用リポソーム、及び治療用リポソーム内に被包される活性化合物を含む治療用リポソーム組成物を作製する方法を提供する。典型的には、治療用リポソームは、その各々が独立してＣ１６〜Ｃ２２脂肪酸である脂肪酸エステル部分を少なくとも２つ含むリン脂質を含み、上記方法は、
活性化合物を含む緩衝剤溶液と、可溶化されるリン脂質混合物を組み合わせることであって、可溶化されるリン脂質混合物が、溶媒中に可溶化されるリン脂質を含む、可溶化されるリン脂質混合物を組み合わせることと、
治療用リポソーム内に被包される活性化合物を含む治療用リポソーム組成物を形成することと、
を含む。
【００２６】
幾つかの実施の形態では、治療用リポソーム組成物を形成する工程は、超音波処理、均質化処理、微細流動化処理、レーザー処理、高剪断混合、又はそれらの組合せを含む。
【００２７】
他の実施の形態では、かかる方法は、治療用リポソーム組成物から溶媒の少なくとも一部分を除去する工程を更に含む。
【００２８】
さらに、他の実施の形態では、溶媒は、ヘキサン、イソヘキサン、クロロホルム、ポリソルベート、糖アルコール化合物、ビタミン−Ｅ  ＴＰＧＳ、ポリエチレングリコール、石油化学品、又はそれらの組合せを含む。
【００２９】
幾つかの特定の実施の形態では、リン脂質は、式：
【化２】
2013526533.tif 000003
（式中、
Ｒ１及びＲ２の各々は、Ｒ１及びＲ２の各々が結合するカルボキシレート基とともに、独立してＣ１６〜Ｃ２２脂肪酸部分であり、
Ｒ３は、Ｒ３が結合する酸素原子とともに、コリン部分、セリン部分、イノシトール部分又はエタノールアミン部分を形成する）
のリン脂質である。
【００３０】
更に他の実施の形態では、Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸の各々が独立して、ω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸又はω−９脂肪酸である。これらの実施の形態内において、幾つかの例では、Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸の各々が独立して、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ又はＥＴＡ−３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、カレンジン酸（ＣＬＡ）、又はドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）である。
【００３１】
さらに、他の実施の形態では、Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸の各々が、ＳＤＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ、ＥＰＡ、又はＥＴＡである。
【００３２】
他の実施の形態では、活性化合物は、薬剤又は栄養補助化合物を含む。これらの実施の形態内において、幾つかの例では、薬剤は、抗生物質、スタチン、カルシウムチャネル遮断剤、ＡＣＥ阻害剤、α−アゴニスト、α−遮断剤、レンニン遮断剤、デクスメチルフェニデート、グアンファシン、メチルフェニデート、抗炎症性化合物、又はそれらの組合せを含む。他の例では、栄養補助化合物は、リスベラトロール、キノン、ジフェルロイルメタン、ステロール、β−グルカン、グルコサミン、カロテノイド、テルペン、キサントフィル、ω−３脂肪酸、プロバイオティクス、プレバイオティクス、又はそれらの組合せを含む。
【００３３】
本発明の治療用リポソーム組成物は、「単一殻のもの」であっても、「二重殻のもの」であっても、又はそれらの組合せであってもよい。単一殻（又は単ラメラ）は、単一の脂質二重層を含むリポソームを表す。二重殻（又は多重ラメラ）は、２つの脂質二重層を含むリポソーム、例えば、１つの脂質二重層リポソームが別の脂質二重層リポソーム内に被包されたものを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の幾つかの態様は、結合した脂肪酸を少なくとも２つ含むリン脂質を含む治療用リポソームを提供する。脂肪酸の各々は独立してＣ１６〜Ｃ２２脂肪酸である。加えて、脂肪酸の各々は飽和又は不飽和のものであり得る。幾つかの実施形態では、脂肪酸は不飽和のものである。これらの実施形態内において、幾つかの例では、脂肪酸は、ω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸又はω−９脂肪酸である。リン脂質は、ホスフェートエステルも含む。典型的には、ホスフェートエステルは、ホスフェート基と結合した（これによって、ホスフェートエステル基を形成する）極性化合物を含む。幾つかの実施形態では、極性化合物は、極性基、例えばアミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアミノ基又はテトラアルキル（tetraalkyl）アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基等を含む。リン脂質のホスフェート基と結合することができる例示的な極性化合物は、コリン、セリン、イノシトール及びエタノールアミンを含むがこれらに限定されない。
【００３５】
本発明のリン脂質の１つの特定の実施形態を、以下に図１として示す。図１において、部分Ａ及び部分Ｂは独立してＣ１６〜Ｃ２２脂肪酸に由来し、部分Ｃは極性化合物に由来する。
【化３】
2013526533.tif 000004
【００３６】
図１に示されるリン脂質が少なくとも１つのキラル中心（例えば、部分Ｂが結合する炭素原子）を有することを理解すべきである。したがって、図１に示されるリン脂質内に少なくとも２つの立体異性体が存在し得る。本発明の範囲は、リン脂質の全ての異性体、及び異性体の混合物を含む。幾つかの実施形態では、本発明のリポソームは、鏡像異性体的に濃縮された、又は鏡像異性体的に純粋なリン脂質を含む。他の実施形態では、本発明のリポソームは、図１のリン脂質のラセミ混合物を含む。
【００３７】
治療用リポソームを形成するリン脂質が全て同じである必要はない。幾つかの実施形態では、治療用リポソームを製造する際に種々のリン脂質の量を変化させることによって、リポソームの治療上の有効性（例えば、標的細胞又は標的器官への送達）を増大させることができる。多くの例では、治療用リポソームとリポソーム内に被包される活性化合物との間の相乗効果が存在する。様々な脂肪酸及び極性化合物の組合せを使用して、治療用リポソームを形成することができる。例えば、幾つかの実施形態では、５重量％、１５重量％、２５重量％、３５重量％、４５重量％、５５重量％、６５重量％、７５重量％、８５重量％及び９５重量％を含む５重量％〜９５重量％の治療用リポソームがＤＨＡ、ＥＴＡ及びコリンを含むリン脂質を含んでいてもよく、残りのリン脂質がＥＰＡ、ＤＨＡ及びセリンを含んでいてもよい。更に他の実施形態では、５重量％、１５重量％、２５重量％、３５重量％、４５重量％、５５重量％、６５重量％、７５重量％、８５重量％及び９５重量％を含む５重量％〜９５重量％の治療用リポソームが同じ脂肪酸（例えば、ＥＴＡ又はＥＴＡ−３を含む）及び極性化合物としてコリンを有するリン脂質を含んでいてもよく、残りのリン脂質がＤＨＡ及びＥＴＡ並びにセリンを含んでいてもよい。さらに、本発明の治療用リポソームは、１又は２の異なるリン脂質に限定されず、むしろ５〜８０、１０〜７０、２０〜６０、３０〜５０及び約４０を含む３〜１００の異なるリン脂質から構成されていてもよい。
【００３８】
装填されていない（すなわち、いずれの活性化合物も被包していない）治療用リポソームにおける任意の１つの脂肪酸の組成は、総リポソームの約５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％及び９５重量％を含む、総リポソームの約５重量％から約９５重量％まで変化し得る。例えば、治療用リポソームは、約３０重量％のＤＨＡ、約３０重量％のＥＰＡ、及び約３０重量％のＥＴＡを含んでいてもよく、残りの重量は典型的にはホスフェートエステル基及びジグリセリド骨格である。代替的には、約５０重量％の治療用リポソームがＤＨＡを含んでいてもよく、約２０重量％の治療用リポソームがＥＴＡを含んでいてもよい。さらに、治療用リポソームは、２又は３の異なる脂肪酸に限定されず、むしろ４、５、６、７、８、９及び１０を含む複数の異なる脂肪酸を含んで（compose）いてもよい。これらの更なる脂肪酸は、ＤＰＡ、ＡＬＡ、ＧＬＡ、ＣＬＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡ、ＳＤＡ、又はそれらの組合せを含み得る。また、治療用リポソームは、脂肪酸の総濃度が約９５重量％を超えない限りにおいて、ω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸及びω−９脂肪酸の様々な組合せを含み得る。
【００３９】
同様に、任意の１種類の極性化合物（すなわち、図１における部分Ｃ）の組成は、装填されていない治療用リポソームの約５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％及び４５重量％を含む、装填されていない治療用リポソームの約５重量％から約４５重量％まで変化し得る。例えば、リポソームは、約１５重量％のコリン、約１５重量％のセリン、及び約１０重量％のイノシトールを含み得る。代替的には、本発明の治療用リポソームは、約２０重量％のコリン及び約１５重量％のセリン、又は３０重量％のコリン及び残りの様々な極性化合物の混合物を含んでいてもよく、さらに、治療用リポソームは、１〜３の極性基のみに限定されず、極性基の総濃度が約４５重量％を超えない限りにおいて、４及び５を含む複数の異なる種類の極性基を含み得る。
【００４０】
脂肪酸及び極性化合物の種類及び量は典型的にはリン脂質供給源に依存する。例えば、植物系（plant based）リン脂質供給源、例えばヤシ、シャゼンムラサキ及びダイズは、コリン部分が豊富であるが或る特定のω−３脂肪酸に乏しい場合がある。逆に、海洋微生物、例えばオキアミ、及び魚は、セリン極性部分、及び或る特定のω−３脂肪酸、例えばＥＰＡの両方が豊富である場合がある。
【００４１】
微生物、例えば海洋植物、プランクトン、真菌類、微細藻類及び大型藻類のリン脂質は、その供給源に応じて、広範なω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸及びω−９脂肪酸並びに極性基を含む。ＤＨＡを含むリン脂質に関しては、微細藻類は、トラウストキトリウム（Thraustochytrium）属、シゾキトリウム（Schizochytrium）属、及びクリプテコジニウム・コーニー（Crypthecodiniumcohnii（C. cohnii））を含むクリプテコジニウム（Crypthecodinium）属由来の種を含み得る。また、ジノフィセエ（Dinophyceae）綱、バシラリオフィセエ（Bacillariophyceae）綱、クロロフィセエ（Chlorophyceae）綱、プリムネシオフィセエ（Prymnesiophyceae）綱及びユーグレノフィセエ（Euglenophyceae）綱の成員は、高濃度のＤＨＡを有する好適なリン脂質を産生することができる。ＥＰＡを含有するリン脂質に関しては、微細藻類は、ファエオダクチルム・トリコムルム（Phaeodactylum tricomulum）、ポルフィリジウム・クルエンタム（Porphyridiumcruentum）及びモノダス・サブテラナス（Monodus subterranous）を含む、トラウストキトリウム属、シゾキトリウム属、ファエオダクチルム（Phaeodactylum）属、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属、ポルフィリジウム（Porphyridium）属及びモノダス（Monodus）属由来の種を含み得る。
【００４２】
ＤＨＡ及びＥＰＡを産生する他の微細藻類は、オドンテラ・アウリタ（Odontella aurita）、パブロバ・ルテリ（Pavlova lutheri）、イソクリシス・ガルバナ（Isochrysis galbana）、ナンノクロロプシス及びポルフィリジウム・クルエンタムを含むがこれらに限定されない。更に他の有用な微細藻類は、チャエトセロス・カルシトランス（Chaetoceros calcitrans）、チャエトセロス・グラシリス（Chaetoceros gracilis）、ニトズシア・クロステリウム（Nitzschiaclosterium）、スケルトネマ・コスタツム（Skeletonema costatum）、タラッシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）、ヅナリエラ・テルチオレクタ（Dunaliellatertiolecta）、ナンノクロリス・アトムス（Nannochloris atomus）、クロオモナス・サリナ（Chroomonas salina）、ナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsisoculata）、テトラセルミス・チュイ（Tetraselmis chui）、テトラセルミス・スエシカ（Tetraselmis suecica）及びパブロバ・サリナ（Pavlovasalina）を含む。
【００４３】
上の微細藻類の培養技法は既知である。例えば、トラウストキトリウム及びシゾキトリウムの培養は米国特許第５，３４０，５９４号に開示されており、クリプテコジニウム・コーニーの培養は米国特許第５，３９７，５９１号及び同５，４９２，５３８号並びに特開平１−１９９５８８号（１９８９）に開示されている。
【００４４】
幾つかの実施形態では、リン脂質は、上の海洋性バイオマスから単離及び精製される。不純物、例えば細菌、微粒子及び抽出化学物質は、リン脂質を抽出する際には、ほとんど常に存在する。リン脂質の抽出は、極性溶媒抽出及び非極性溶媒抽出、噴霧乾燥、超臨界抽出、遠心分離、酵素抽出、機械プレス、押出し、超音波処理、デカンタ抽出、並びにそれらの組合せを含む既知の方法を使用して行うことができる。
【００４５】
リン脂質を抽出する一方法は、典型的には細胞を溶解する、海洋性バイオマスを噴霧乾燥することである。引き続き、溶解した細胞を、典型的には非極性溶媒、例えばヘキサンを使用して抽出して、脂肪酸リン脂質部分を除去する。かかるプロセス及び他の好適なプロセスが、米国特許第６，３７２，４６０号に詳細に記載されている。別の方法は、バイオマスを前処理して、存在する場合があり、前処理しなければリン脂質を分解する可能性がある任意のホスホリパーゼを非活性化することである。引き続き、脂質及びリン脂質を、極性溶媒抽出及び非極性溶媒抽出、噴霧乾燥、超臨界抽出、遠心分離、酵素抽出、機械プレス、押出し並びにデカンタ抽出を含む既知の技法を使用して、バイオマスから抽出する。抽出したリン脂質は多くの場合、水洗浄、アセトン、又は極性物質及び糖脂質からの疎水性若しくは中性の物質の分離をもたらす他の溶媒を用いて、総脂質画分から単離及び精製する。引き続きリン脂質を、既知の方法、例えばワイプトフィルム蒸発を使用して乾燥させる。
【００４６】
微細バイオマス又はリン脂質に存在する任意の細菌は、抗細菌剤を使用して不活性化することができる。微粒子は、例えば、当業者に既知の様々な濾過方法、例えば遠心分離、フィルタープレス、サイクロン濾過、重力デカンタ（gravity decanter）又は濾過媒体（filter media）のいずれかを使用する濾過によって、除去することができる。抽出溶媒（solvents）は、フラッシュ蒸留、蒸発及び重力デカンタ処理（gravity decanting）を使用して除去することができる。
【００４７】
クリプテコジニウム・コーニーは、多量のＤＨＡ（例えば、２５％〜４５％）を有する高濃度のリン脂質（例えば、２０％〜３０％）を含有する。リン脂質は、およそ９０％の濃度まで更に精製及び単離することができる。ファエオダクチルム属、ナンノクロロプシス属、ポルフィリジウム属及びモノダス属由来の種も、多量のＥＰＡを有する高濃度のリン脂質を含有する。クリプテコジニウム・コーニーと同様に、これらの微生物由来のリン脂質を、およそ９０％の濃度まで更に精製及び単離することができる。
【００４８】
リン脂質の更なる精製によって、所望の量の脂肪酸濃度を有する治療用リポソームの製造が可能となる。例えば、治療用リポソームは、上で開示されるように約４０％のＤＨＡ及び約４０％のＥＰＡ（９０重量％のリン脂質として存在する）、又は７０％のＥＰＡ及び１０％のＤＨＡ、又は１０％のＥＰＡ及び７０％のＤＨＡを含有し得る。さらに、ＤＰＡ、ＳＤＡ、ＧＬＡ、ＡＬＡ、ＥＴＡ、ＣＬＡ、又はそれらの組合せの脂肪酸のリン脂質を、これらの脂肪酸を含むリン脂質を単離及び精製することによって、治療用リポソーム中に組み込むことができる。
【００４９】
本発明の幾つかの態様は、リン脂質の混合物を含む治療用リポソームを提供する。幾つかの実施形態では、治療用リポソームは、リン脂質の混合物を含む。１つの特定の実施形態では、リン脂質の混合物は、様々な量のＥＰＡ、ＥＴＡ及びＤＨＡを含むリン脂質を含む。例えば、１つのリン脂質がＥＰＡ脂肪酸エステル部分及びＤＨＡ脂肪酸エステル部分を有していてもよく、第２のリン脂質がＥＴＡ脂肪酸エステル部分及びＤＨＡ脂肪酸エステル部分を有していてもよい。治療用リポソームが、２つ以上、３つ以上、４つ以上又は５つ以上の異なるリン脂質を有していてもよいことを理解すべきである。加えて、治療用リポソームの脂肪酸は、ＳＤＡ、ＤＰＡ、ＥＰＡ、ＥＴＡ−３、ＤＨＡ、及びそれらの組合せを含んでいてもよい。
【００５０】
幾つかの実施形態では、治療用リポソームにおけるＤＨＡ、ＥＴＡ及びＥＰＡの各々の濃度は、約５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％及び９５重量％を含む、総脂肪酸の約１０重量％未満から約９５重量％まで変化し得る。他の脂肪酸、例えばＤＰＡ、ＡＬＡ、ＧＬＡ、ＣＬＡ、ＳＤＡ及びＳＤＡが治療用リポソームに存在することもある。これらの他の脂肪酸の濃度は典型的には、ＤＨＡ、ＥＴＡ及びＥＰＡの濃度未満である。治療用リポソームにおけるω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸及び／又はω−９脂肪酸の総含有量は典型的には、約１５重量％超〜約７０重量％であり、約１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％及び７０重量％を含む。
【００５１】
典型的な脂質供給源の幾つかは、コリン又はセリンを含有する植物又は海洋生物を含む。例示的な植物の脂質供給源は、ダイズレシチン、ルリジサ油、サクラソウ油、ヒマワリ油、ヤシ油、シャゼンムラサキ、及びそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。例示的な海洋生物の脂質供給源は、オキアミ及び魚を含むがこれらに限定されない。酵母も脂質供給源であり得る。このため、脂質は、微生物のリン脂質、魚油、オキアミ油、植物油、酵母、及びそれらの組合せから得ることができる。脂質は、遊離脂肪酸、脂肪酸塩化物、脂肪酸アルキルエステル、脂肪酸ビニルエステル、脂肪酸無水物、モノグリセリド、ジグリセリド若しくはトリグリセリドの形態、又は脂肪酸の任意の他の活性化された形態の飽和又は不飽和の脂肪酸であり得る。微生物のリン脂質を使用する場合、リン脂質を、プランクトン、真菌類、大型藻類及び／又は微細藻類に由来する海洋性バイオマスから単離及び精製することができる。好適な微細藻類は、トラウストキトリウム属、シゾキトリウム属、及びクリプテコジニウム・コーニーを含むクリプテコジニウム属、ジノフィセエ綱、バシラリオフィセエ綱、クロロフィセエ綱、プリムネシオフィセエ綱、ユーグレノフィセエ綱、ファエオダクチルム・トリコムルム、ポルフィリジウム・クルエンタム及びモノダス・サブテラナスを含む、ファエオダクチルム属、ナンノクロロプシス属、ポルフィリジウム属及びモノダス属由来の種を含み得る。
【００５２】
治療用リポソームにおけるリン脂質の総濃度は、治療用リポソームの約５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％及び９５重量％を含む、リポソームの約５重量％から約９５重量％まで変化し得る。
【００５３】
リン脂質上の脂肪酸は、純粋にランダムな様式で存在し得る。すなわち、幾つかのリン脂質が全て、所望の種類の脂肪酸の濃度に応じて、Ｃ２０脂肪酸若しくはＣ２２脂肪酸、両方の混合物、又はＣ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸及びＣ１８脂肪酸の混合物を有していてもよい。このため、リン脂質上において脂肪酸部分の配置が事前に決定されることはない。
【００５４】
リン脂質の更なる精製を使用して、所望の又は調整された量の脂肪酸を有するリン脂質を製造することができる。例えば、リン脂質は、約４０％のＤＨＡ及び約４０％のＥＰＡ（９０重量％のリン脂質として存在する）、又は７０％のＥＰＡ及び１０％のＤＨＡ、又は１０％のＥＰＡ及び７０％のＤＨＡ、又は４０％のＥＴＡ、２０％のＤＨＡ及び２０％のＥＰＡを含有するものとすることができる。さらに、ＤＰＡ、ＳＤＡ、ＧＬＡ、ＡＬＡ、ＣＬＡ、又はそれらの組合せを含むリン脂質を、これらの脂肪酸を含有するリン脂質を単離及び精製（又は合成）することによって、リン脂質中に組み込むことができる。このため、正確に調整された脂肪酸濃度のリン脂質を得ることができる。
【００５５】
本発明の他の態様は、リン脂質組成物を作製する方法を提供する。かかる方法は典型的には、所望のリン脂質組成物を製造するのに十分な条件下で第１のリン脂質又はその供給源、第２の脂質又はその供給源、及び第３の脂質又はその供給源の混合物を準備することを含む。幾つかの実施形態では、リパーゼを使用して、混合物からリン脂質組成物を製造する。幾つかの例では、第１のリン脂質は、Ｃ２０、Ｃ１８又はより少数の炭素原子を有する脂肪酸を含む。さらに、他の例では、第２の脂質はＣ２０脂肪酸を少なくとも１つ含み、第３の脂質はＣ２２脂肪酸を少なくとも１つ含む。幾つかの実施形態では、リン脂質組成物を作製する方法は、リン脂質組成物を製造するのに十分な条件下で第１のリン脂質又はその供給源、及び第２の脂質又はその供給源の混合物を準備することを含む。これらの実施形態内において、幾つかの例では、第１のリン脂質は、Ｃ２０、Ｃ１８又はより少数の炭素原子を有する脂肪酸を含む。さらに、他の例では、第２の脂質は、Ｃ２０脂肪酸又はＣ２２脂肪酸を含む。
【００５６】
リン脂質の合成的改変は典型的には、脂肪酸とリン脂質を反応させることであって、リン脂質と結合する脂肪酸のうちの１つ若しくは複数を再配置する／置き換える、反応させること、又はリン脂質と結合した若しくは共有結合した少なくとも１つの脂肪酸を除去するとともに、別のＣ１６若しくはそれより炭素数が大きい脂肪酸、例えばＣ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸又はＣ２２脂肪酸を結合させることを含む。リパーゼ系酵素とのリン脂質又はそれらの供給源の反応によって、リン脂質の脂肪酸が改変される。例えば、第１のリン脂質の少なくとも１つのＣ２０、Ｃ１８又はそれより炭素原子数が小さい脂肪酸を、第２の脂質若しくはそれらの供給源及び／又は第３の脂質若しくはそれらの供給源由来の少なくとも１つのＣ２０脂肪酸及び／又はＣ２２脂肪酸によって置き換えることができる。このため、混合物に存在するＥＰＡ、ＥＴＡ及びＤＨＡの濃度に応じて、所望の量のこれらの脂肪酸を含むリン脂質を製造することができる。例えば、ＥＰＡ又はＥＴＡのリン脂質が望ましい場合、Ｃ２０脂肪酸を含有する脂質供給源を使用して、触媒又はリパーゼの存在下でリン脂質供給源由来のＣ１８又はそれより炭素原子数が小さい脂肪酸を置き換えて、所望のリン脂質を製造することができる。ＤＨＡ、ＥＰＡ及び／又はＥＴＡを含むリン脂質混合物が望ましい場合、Ｃ２０脂肪酸を含むリン脂質又はその供給源、及びＣ２２脂肪酸を含む脂質又はその供給源を使用して、最初のリン脂質由来のＣ２０、Ｃ１８又はそれより炭素原子数が小さい脂肪酸部分を置き換えることができる。このため、元の脂肪酸部分を、触媒又は酵素（例えばリパーゼ）を使用して、異なる脂肪酸部分（例えば、より炭素原子数の大きい炭素鎖の脂肪酸）によって置き換える又は置換することができる。ＤＰＡ、ＡＬＡ、ＧＬＡ、ＣＬＡ、ＳＤＡ、又はそれらの混合物を含む脂質を含む、異なる脂肪酸エステル部分を含む更なるリン脂質又は対応する供給源を添加して、最初のリン脂質由来のＣ２０、Ｃ１８又はそれより炭素原子数が小さい炭素鎖の脂肪酸部分を置き換える又は置換することができることを理解すべきである。
【００５７】
置換反応に使用される脂質は、微細藻類由来のリン脂質、及び／又は魚若しくはオキアミ由来の海洋系リン脂質、及び／又は植物系リン脂質であり得る。代替的には、合成脂肪酸又はその誘導体を置換反応に使用することもできる。所望のリン脂質組成物を調製する際に有用である例示的な合成脂肪酸又は誘導体は、脂肪酸塩化物、脂肪酸アルキルエステル、脂肪酸ビニルエステル、脂肪酸無水物、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリド、又はエステル交換反応に使用することができる任意の他の形態の脂肪酸を含むがこれらに限定されない。
【００５８】
エステル交換反応に有用である酵素は、リパーゼ、及びリパーゼ様酵素、例えばホスホリパーゼ酵素を含む。好適なホスホリパーゼは、Sankyoによって提供されるホスホリパーゼＡ（Ｌｅｃｉｔａｓｅ）及びＮｏｖｏｚｙｍｅ（４３５及び５２５）を含むがこれらに限定されない。ホスホリパーゼは、不溶性マトリクス上に、及び／又はこのマトリクスを界面活性剤物質でコーティングすることによって固定化することができる。例えば、ホスファチジルコリンを含有するダイズレシチンリン脂質を、高純度のリン脂質画分を含む反応器内において、５０：５０の重量比、３５：６５の重量比、６５：３５の重量比、４０：６０の重量比及び６０：４０の重量比を含む、約２５：７５から７５：２５までのダイズレシチンリン脂質対海洋性リン脂質の重量比で組み合わせる。リパーゼ及び／又はリパーゼ活性を有する酵素を、総リン脂質の約２重量％〜５重量％の濃度範囲で混合物に添加する。
【００５９】
加えて、図１における極性部分Ｃを、別の極性化合物によって置き換える又は置換することもできる。例えば、コリン極性基を含有するダイズレシチン（lecithin）リン脂質を、ホスホリパーゼＤ酵素及びセリンの存在下で反応させて、セリンによってコリンの全て又は一部分を置き換えることができる。これによって、出発物質として、より高価なセリン基を有する海洋生物リン脂質ではなく、より安価なコリン極性基を有する植物系リン脂質を使用することが可能となる。ホスフェート基上の置換は、脂肪酸置換と同時に達成してもよく、又はかかる置換を段階的に行なってもよい。
【００６０】
開示されるプロセスによって、必要に応じて、調整された濃度のＥＴＡ、ＥＰＡ及び／又はＤＨＡ、並びにＡＬＡ、ＧＬＡ、ＳＤＡ、ＤＰＡ、ＣＬＡの１つ又は複数を含むリン脂質を調製することが可能となる。本発明のリン脂質混合物の利点は、低い費用（第１のリン脂質供給源が植物系であり得るため）、調整された脂肪酸濃度、及び高い純度である。脂肪酸の調整によって、特定の配合（すなわち、ホスファチジルコリン（ＰＣ）とともに高ＥＰＡ、又はホスファチジルセリン（ＰＳ）とともに高ＤＨＡ）を容易に生産することが可能となる。リン脂質の調整によって、活性化合物を標的細胞へとより効果的に送達し、幾つかの例では相乗効果をもたらすことができる特有の治療用リポソームを形成することが可能となる。
【００６１】
置換反応を複数回繰り返して、リン脂質混合物において所望の脂肪酸の濃度を増大させることができる。置換がグリセリドとリン脂質との間の炭素鎖の分配の平衡に到達すると、グリセリドからのリン脂質の単離が可能である。単離したリン脂質を、その標的炭素鎖（複数も可）の利用可能性が先のグリセリド媒体の利用可能性より高い新たなグリセリド（又はエステル）画分中に配置して、これによって、最終的なリン脂質混合物における標的炭素鎖（複数も可）をより高い割合へと連続的に到達させることができる。
【００６２】
触媒を使用して置換速度を増大させることもできる。触媒は、任意のアルカリ触媒、例えば金属アルコキシド（例えば、金属エトキシド及び金属メトキシド。ここで金属は、例えばこれらに限定されないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム等の当業者に既知の任意の好適な金属イオンであり得る）であり得る。有機アミン、及び他の弱塩基性化合物、例えばこれらに限定されないが、酢酸ナトリウム又は酢酸カリウムを使用して、反応を促進することもできる。幾つかの例では、超音波処理を、単独で又は酵素若しくは触媒と組み合わせて使用することもできる。
【００６３】
置換反応を実施する反応器は、ステンレス鋼タンク、ガラス内張タンク及び鋼合金ブレンドタンクを含むがこれらに限定されないリン脂質（phospholipids）又はそれらの供給源を保持するのに好適である任意の容器であり得る。反応温度は典型的には、約５０℃〜約９０℃、約６０℃〜約８０℃及び７０℃を含む、約４０℃〜約１００℃である。反応時間は、６時間〜２０時間及び１０時間〜１５時間を含む、約４時間〜約２４時間の範囲であり得る。また、反応は、常温、約２０℃で約３ヶ月間行うことができる。これによって、リン脂質の貯蔵中に起こる置換が可能となり、更なる熱を供給する必要がなくなる。
【００６４】
リン脂質を、リン脂質中のエステル結合を加水分解するために、触媒によって予め処理したものを含むリパーゼ系化合物と反応させることもできる。その結果として得られるものは、魚の匂い又は化学的な臭いが低減し、果実の匂いが増大した脂質又は油である。一態様では、オキアミ系リン脂質を、それを脱臭するためにリパーゼと反応させる。典型的には、反応を、真空下及び攪拌下で、約４０℃〜約６５℃で約４時間〜約４８時間の期間行う。引き続き、リパーゼを、非活性化するか、又は最終生成物から濾過によって取り除く。
【００６５】
本発明の幾つかの態様は、本明細書中で開示されるリン脂質、及びリン脂質から形成される治療用リポソーム内に被包される活性化合物を含む治療用リポソーム組成物を提供する。活性化合物は実際上、任意の分子、例えば有機酸、脂質、カロテノイド、アミノ酸、ヌクレオチド、ステロイド、微量元素、ビタミン、ホルモン、ペプチド、アミノ酸、タンパク質、ポリフェノール、キノン、分子の組合せ、化合物、例えば薬剤、高分子化合物（例えばグリコーゲン由来の分子、若しくはグリコサミノグリカン、又は組織、例えば骨及び軟骨を形成する他の高分子単位）、又はともに送達されるこれらの種類のうちの１つ若しくは複数であり得る。治療用リポソーム組成物は、経口、局所、鼻腔内、眼又は静脈内の方法を含む様々な方法によってヒト及び動物中に導入することができる。
【００６６】
幾つかの特定の実施形態では、リン脂質は、活性化合物を実質的に被包する、すなわち、この治療用リポソーム内に活性化合物を含む治療用リポソームを形成する。被包は典型的には、標的細胞に到達する前に活性化合物が治療用リポソームを通じて拡散しないように、活性化合物との関係で極性基（例えば、図１における部分Ｃ）の特定の組合せを選択することによって達成される。さらに、極性基は、細胞膜上における結合を増強するように選択することができる。例えば、コリン極性基は、ヒトの身体におけるどの細胞においても容易に見出される。このため、脂質二重層において大多数のコリン極性基を有するリン脂質は、ヒトの細胞と容易に結合して、活性化合物を送達することができる。また、或る特定のタンパク質に対する結合親和性を増強する特定の極性基を有するリン脂質を選択することができる。これらのタンパク質は、特定の悪性腫瘍又は良性腫瘍と会合する場合がある。例えば、アネキシン−Ａ５はセリン極性基に対して強い結合親和性を有する自然に発生するタンパク質であり、リポソームにおけるリン脂質はそれ自体が悪性腫瘍及び良性腫瘍と会合するように改変され得る。
【００６７】
治療用リポソームを形成するリン脂質は、組み合わせた治療的利益を達成する際に、そのリポソームが被包する活性化合物と相乗的であるように選択することもでき、このため、得られる治療用リポソーム組成物は、単なる送達機構ではなく、その性質として治療的である。一例として、所望の利益が心血管系の利益である場合、ＥＰＡ脂肪酸エステルを有するホスファチジルコリンが治療用リポソームを形成して、心血管系の健康に利益を与える栄養素又は薬剤を被包する。同様に、ＤＨＡ脂肪酸エステルを有するホスファチジルセリンを使用して、認知面の健康の観点からプラスに作用する栄養素又は薬剤を有する治療用リポソーム組成物を形成することができる。
【００６８】
開示される治療用リポソーム組成物の１つの特定の態様では、活性化合物は抗生物質である。かかる治療用脂質組成物によって、小腸粘膜における抗生物質の選択的吸収の増大が可能となり、結腸の微生物叢への抗生物質の送達が最小化される。この態様では、リポソームによって被包される抗生物質は、結腸の微生物叢、例えばクロストリジウム・ディフィシル（Clostridiumdifficile）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、プロテウス・ブルガリス（Proteusvulgaris）等に対する抗生物質の悪影響を低減するように設計する。幾つかの例では、治療用リポソームによって被包される抗生物質は、結腸の微生物叢、例えばクロストリジウム・ディフィシル、クレブシエラ・ニューモニエ、プロテウス・ブルガリス等における抗生物質耐性の発生を低減することができる。抗生物質は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に対して効果的であり得る。ω−３リポソームの提供は、腸粘膜の完全性（integrity）及び障壁防御を維持するように作用する。結腸の微生物叢への抗生物質の送達の緩和は、幾つかの例では、門、属及び種のレベルでの腸の微生物叢の変化と関連する肥満症、代謝症候群及び糖尿病並びに炎症性腸疾患の発症を最小化することができると考えられている。したがって、本発明の幾つかの実施形態は、抗生物質治療を受けている被験体における肥満症、代謝症候群及び／又は糖尿病の発症のリスクを低減する方法を提供する。かかる方法は、活性化合物として抗生物質を含む本発明の治療用リポソーム組成物を投与することを含む。
【００６９】
開示される治療用リポソーム組成物の１つの特定の態様では、活性化合物は抗生物質である。この特定の実施形態の幾つかの例では、抗生物質は、病態、例えば急性中耳炎又は慢性中耳炎、顕著な炎症性要素を有する病態を治療する際に活性を有する。治療用リポソームを構成するω−３脂肪酸が豊富なリン脂質は、中耳区画内の微生物を標的とする抗生物質と相乗的に作用する、中耳区画におけるシクロオキシゲナーゼ及びリポキシゲナーゼの代謝産物（例えば、ＰＧＥ２及びＬＴＢ４）を低減する効果を有する。抗生物質は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に対して効果的であり得る。
【００７０】
本発明の治療用リポソーム組成物の１つの特定の実施形態は、ＥＰＡリン脂質及びＤＨＡリン脂質並びに活性化合物としてＮ−アセチルシステインを含む。この特定の実施形態の幾つかの例では、Ｎ−アセチルシステインは、病態、例えば急性中耳炎又は慢性中耳炎、アデノイド咽頭炎、咽頭炎、肺炎、及び細菌のバイオフィルムを形成する顕著な傾向を有する他の病態を治療する際に活性を有する。治療用リポソームを構成するω−３脂肪酸が豊富なリン脂質は、中耳、扁桃腺、咽頭扁桃腺又は他の身体区画内の微生物のバイオフィルムを標的とするＮ−アセチルシステインと相乗的に作用する、中耳、扁桃腺、咽頭扁桃腺又は他の身体区画においてバイオフィルムの足場（scaffolding）を低減する効果を有する。治療用Ｎ−アセチルシステインリポソームは、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に対して効果的であり得る。
【００７１】
治療用リポソーム組成物の更に別の特定の実施形態では、腸粘膜の完全性に対する治療効果を有する化合物（ブチレート、グルタミン、グルタチオン、スルファサラジン、メトロニダゾール等の化合物を含む）が、治療用リポソーム内に被包される。この特定の実施形態の幾つかの例では、ブチレート、グルタミン及びグルタチオン等の化合物は、腸粘膜を横断するエンドトキシンの移行を低減し、それによってエンドトキシン血症を低減する際に活性を有する。治療用リポソームを構成するω−３脂肪酸が豊富なリン脂質は、これらの膜構造の修復に関して使用されるブチレート又はグルタミンと相乗的に作用する、腸粘膜の障壁の完全性を再構築する効果を有する。治療用リポソームを構成するＥＰＡ、ＥＴＡ及びＤＨＡを含有するω−３脂肪酸が豊富なリン脂質は、腸障壁の完全性、エンドトキシン（ＬＰＳ）の通過、及びエンドトキシン血症に対するリポソーム／薬剤複合体の効果を顕著に増大させるような、障壁機能に対する相乗効果を有する。
【００７２】
治療用リポソーム組成物の更に別の特定の実施形態では、スタチン（ロバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン等を含むがこれらに限定されないＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤）が、治療用リポソーム内に被包される。治療用リポソームを構成するＥＰＡを含有するω−３脂肪酸が豊富なリン脂質は、血中脂質及び血中脂質の変化と関連する障害に対するリポソーム／薬剤複合体の効果を顕著に増大させるような、血中の脂質及びリポタンパク質の組成（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ等）に対する相乗効果を有する。
【００７３】
本発明の治療用リポソーム組成物のまた更なる特定の実施形態では、治療用リポソームは、心血管系の機能に対して有益な薬剤、例えばカルシウムチャネル遮断剤、ＡＣＥ阻害剤、α−アゴニスト、α−遮断剤、レニン遮断剤等を被包するＥＰＡリン脂質を含む。治療用リポソームを構成するω−３が豊富なリン脂質は、血圧及び心疾患と関連する特質に対する相乗効果を有する。
【００７４】
本発明の治療用リポソーム組成物の別の特定の実施形態では、治療用リポソームは、中枢神経系の機能に対して有益な薬剤、例えばデクスメチルフェニデート、グアンファシン、又は注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）の治療のためのメチルフェニデートを被包するＤＨＡリン脂質を含む。治療用リポソームを構成するＤＨＡが豊富なリン脂質は、ＡＤＨＤの症状を改善するために利用されるこれらの薬剤との相乗効果を有する。
【００７５】
他の実施形態では、ホスフェート基と結合する化合物を、脂質受容体、例えばグラム陰性細菌のリポ多糖Ａ部分又は細菌のエンドトキシンを典型的に検出するトール様受容体−４（ＴＬＲ−４）と結合するように選択することができる。エンドトキシンによるＴＬＲ−４の活性化は、生物にとって有害であり得る炎症応答を誘発する。脂肪酸、例えばＤＨＡ、ＥＴＡ及びＥＰＡを有するリポソームは、典型的な炎症応答を誘発し、このため過度のＴＬＲ−４活性化と関連する障害を媒介することなく、ＴＬＲ−４と結合することができる。これらは、炎症性腸疾患、過度の腸透過性の障害、及びＴｈ１／Ｔｈ２免疫不均衡の病態を含む。
【００７６】
本発明の治療用リポソームは、複数の異なるリン脂質を含み得る。例えば、各リポソームは、（例えば、４つの異なる）リン脂質の混合物を含み得る。１つの特定の実施形態では、第１のリン脂質がコリン及びＤＨＡ脂肪酸エステルを含み、第２のリン脂質がコリン並びにＤＨＡ脂肪酸エステル及びＥＰＡ脂肪酸エステルを含み、第３のリン脂質がコリン並びにＤＨＡ脂肪酸エステル及びＥＴＡ脂肪酸エステルを含み、第４のリン脂質がコリン及びＥＴＡ脂肪酸エステルを含む。これらのリン脂質の各々の量は、等量（すなわち、各々２５重量％）で存在し得るか、又は総計が１００％を超えない限りにおいて、各々約５重量％〜約９５重量％の範囲で存在し得る。
【００７７】
リン脂質は、不飽和脂肪酸エステル（例えば、ω−３脂肪酸エステル）の分解を防止するための、トコフェロール、ＢＨＴ、ＢＨＡ、ＴＢＱＨ、エトキシキン、β−カロテン、アスタキサンチン、フコキサンチン、カンタキサンチン、ビタミンＥ及びビタミンＣを含む酸化防止剤を含んでいてもよい。リン脂質は、結合剤、モノグリセリド及びトリグリセリド（高純度のω−３脂肪酸エステルを含有する油から又はω−３脂肪酸エステルの濃縮物から得られるものを含む）、エステル及びエステル化合物、並びにソルビトールを含む他の薄化剤（thinning agents）を更に含んでいてもよい。これは、リン脂質を更なる処理のために流動性粉末又は液体とする際に助けとなる。さらに、リン脂質は、既知の被包技法を使用して被包するか、又は圧縮して丸薬とすることができる。
【００７８】
治療用リポソーム組成物は、ＰＥＧ又はＰＥＧ化合物、例えばビタミンＥ  ＴＰＧＳを含んでいてもよい。任意に、治療用リポソーム組成物の経口用配合物が、腸による治療用リポソームの吸収において助けとなる腸溶コーティングを含んでいてもよい。
【００７９】
固体経口用配合物において、ＰＥＧ成分は、３０１５〜４８００、１３０５〜１５９５、３６００〜４４００、４４００〜４８００、７０００〜９０００、６０００〜７５００、及び３１５０〜３６８５を含む１５０〜９０００の平均分子量を含有する。ＰＥＧは、９５：５及び８５：１５を含む９９：１〜５０：５０のリン脂質対ＰＥＧの重量百分率による比率で存在する。ＰＥＧは、以下の商品名の硬質、不透明、顆粒状の固体である：Ｃａｒｂｏｗａｘ（商標）ＰＥＧ  ３３５０、Ｃａｒｂｏｗａｘ（商標）ＰＥＧ  １４５０、Ｃａｒｂｏｗａｘ（商標）ＰＥＧ  ４０００、Ｃａｒｂｏｗａｘ（商標）ＰＥＧ  ４６００、Ｃａｒｂｏｗａｘ（商標）ＰＥＧ  ８０００及びＣａｒｂｏｗａｘ（商標）６０００。ＰＥＧは、食品グレードの使用に好適な任意の他の市販の配合物でもあり得る。
【００８０】
液体経口用配合物において、ＰＥＧ成分は、１９０〜２１０、２８５〜３１５、３８０〜４２０及び５７０〜６３０を含む１９０〜６３０の平均分子量を含有する。ＰＥＧは、以下の市販製品であり得る：Ｃａｒｂｏｗａｘ（商標）ＰＥＧ  ２００、Ｃａｒｂｏｗａｘ（商標）ＰＥＧ  ３００、Ｃａｒｂｏｗａｘ（商標）ＰＥＧ  ４００及びＣａｒｂｏｗａｘ（商標）ＰＥＧ  ６００。
【００８１】
治療用リポソーム組成物の経口用配合物は、リスベラトロール、キノン、ジフェルロイルメタン、ステロール、β−グルカン、グルコサミン、カロテノイド、テルペン、キサントフィル、ω−３脂肪酸、プロバイオティクス、プレバイオティクス、及びそれらの組合せからなる群から選択される更なる化合物を含有していてもよい。これを、ＰＥＧ、ＰＥＧ化合物、リン脂質又は脂質組成物と混合することができる。
【００８２】
また更なる態様では、有効量の治療用リポソーム組成物を例えば経口的に又は静脈内に提供することによって、開示される治療用リポソーム組成物を用いて様々な病気（ailments）及び疾患を治療する方法が開示される。かかる病気及び疾患は、アルツハイマー病、炎症（例えば、関節炎及びクローン病）、心血管系疾患（例えば、高コレステロール、心疾患及び高血圧症）、統合失調症、ストレス、鬱病、がん、ＡＤＤ、ＡＨＤ、ＡＤＨＤ、性欲減退及び月経閉止を含むがこれらに限定されない。開示される治療用リポソーム組成物は、ヒト及び動物におけるリポキシン、レゾルビン及びプロテクチンの内在レベルを変調することもできる。
【００８３】
また更なる態様では、治療用リポソーム組成物を作製する方法が開示される。かかる方法は、ホモジナイザー又はミクロフルイダイザーを使用することによって達成することができる超音波及び／又は高圧を使用することを含み得る。方法は、溶媒、例えばこれらに限定されないが、有機溶媒（例えば、アルコール、ヘキサン、イソヘキサン、クロロホルム、及び食品／医薬品／栄養補助食品の処理に使用される様々なアルコール製品）、食品／医薬品／栄養補助食品の処理に使用される石油化学製品、ポリソルベート、糖アルコール化合物、ビタミン−Ｅ  ＴＰＧＳ、ＰＥＧ、又はそれらの組合せ中でリン脂質を可溶化することも含み得る。典型的には、溶媒中のリン脂質の溶液を、リン脂質が活性化合物を実質的に被包する治療用リポソームを形成するのに十分な条件下で活性化合物を含有する緩衝剤溶液に懸濁する。溶媒は、例えば蒸発によって、任意に除去することができる。かかる方法は、不活性環境において又は真空下で達成することができる（ＵＨＰ技法を除く）。治療用リポソームを形成することは、超音波処理、均質化処理、微細流動化処理、他のＵＨＰ、レーザー処理、又は高剪断混合を使用して行うこともできる。他の好適な方法は、Morrissey, Lab Protocol for Preparing Phospholipid Vesicles (SUV) bySonication（イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校）及びMoore, Destruction ofLiposomes in Water by Neutron Recoil（シカゴ大学、２００９年２月６日）（これらの両方について、その全体が参照によって本明細書中に援用される）に見出すことができる。
【００８４】
本発明の上記の記述は例示及び説明のために提示されている。上記の記載は本明細書において開示されている形態（単数又は複数）に本発明を限定する意図はない。本発明の記載には１つ又は複数の実施形態並びに或る特定の変形形態及び変更形態の記載が含まれているが、例えば本開示を理解した後に当業者の技術及び知識内にあり得るような他の変形形態及び変更形態も本発明の範囲内である。許容される程度まで代替的な実施形態（特許請求されるものに対して代替的な、交換可能な及び／又は均等な構造、機能、範囲又は工程が含まれる）を含む権利を、かかる代替的な、交換可能な及び／又は均等な構造、機能、範囲又は工程が本明細書に開示されているか否かにかかわらず、また任意の特許可能な主題を公衆に捧げる意図なく取得することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明のリン脂質の１つの特定の実施形態を、図１として示す。図１において、部分Ａ及び部分Ｂは独立してＣ１６〜Ｃ２２脂肪酸に由来し、部分Ｃは極性化合物に由来する。
【国際調査報告】
2013526533.tif 000007
2013526533.tif 000008