(57)【要約】  １つの態様において、本開示は、グルコースに対する少なくとも２つの結合部位を有する多価レクチンと、コンジュゲートフレークワークに結合した２以上の別々のアフィニティリガンドを含むコンジュゲートとを含む架橋マテリアル（ｍａｔｅｒｉａｌ）を提供し、ここで、該レクチンは、該結合部位の少なくとも１つへの結合に関してグルコースと競合しうる、該レクチンのシステイン残基に共有結合している少なくとも１つのアフィニティリガンドを含み、前記の２以上のアフィニティリガンドは該結合部位における該レクチンへの結合に関してグルコースと競合し、異なるコンジュゲート上のアフィニティリガンドとレクチンとの間の非共有結合相互作用の結果として、コンジュゲートは該マテリアルにおいて架橋されている。これらのマテリアルは、所望濃度のグルコースに応答して或る量のコンジュゲートを放出するように設計される。最終用途に応じて、種々の実施形態においては、該コンジュゲートは薬物および／または検出可能な標識をも含みうる。【選択図】図２３
2013541500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースに対する少なくとも２つの結合部位を有する多価レクチンと、コンジュゲートフレークワークに結合した２以上の別々のアフィニティリガンドを含むコンジュゲートとを含む架橋マテリアルであって、
該レクチンが、該結合部位の少なくとも１つへの結合に関してグルコースと競合しうる、該レクチンのシステイン残基に共有結合している少なくとも１つのアフィニティリガンドを含み、
前記の２以上のアフィニティリガンドが該結合部位における該レクチンへの結合に関してグルコースと競合し、異なるコンジュゲート上のアフィニティリガンドとレクチンとの間の非共有結合相互作用の結果として、コンジュゲートが該マテリアルにおいて架橋されている、架橋マテリアル。
【請求項２】
該コンジュゲートが、該コンジュゲートフレームワークに結合した薬物を更に含む、請求項１記載のマテリアル。
【請求項３】
該コンジュゲートが、該コンジュゲートフレームワークに結合した検出可能な標識を更に含む、請求項１記載のマテリアル。
【請求項４】
該レクチンが、レクチン当たりただ１つの共有結合したアフィニティリガンドを含む、請求項１記載のマテリアル。
【請求項５】
該レクチンが、グルコース結合部位当たり１つの共有結合したアフィニティリガンドを含む、請求項１記載のマテリアル。
【請求項６】
該レクチンが、部位特異的突然変異誘発により誘導された少なくとも１つのシステイン残基を含有する組換えＣｏｎＡレクチンである、請求項１記載のマテリアル。
【請求項７】
グルコースに対する結合部位の部分を形成する、野生型ＣｏｎＡ配列におけるアミノ酸が、少なくとも１つのシステイン残基により置換されている、請求項６記載のマテリアル。
【請求項８】
少なくとも１つのシステイン残基が、グルコースに対する結合部位の部分を形成するアミノ酸の（一次アミノ酸配列において測定された場合に）１〜５アミノ酸内に存在する野生型ＣｏｎＡ配列内の位置に存在する、請求項６記載のマテリアル。
【請求項９】
少なくとも１つのシステイン残基が、グルコースに対する結合部位の部分を形成するいずれかのアミノ酸から（一次アミノ酸配列において測定された場合に）少なくとも１、２、３、４または５アミノ酸により隔てられた野生型ＣｏｎＡ配列内の位置に存在する、請求項６記載のマテリアル。
【請求項１０】
該野生型ＣｏｎＡ配列が配列番号１のアミノ酸配列である、請求項７〜９のいずれか１項記載のマテリアル。
【請求項１１】
配列番号１の１２、１４、９９、１００、２０８および２２８位のアミノ酸の１以上がグルコースに対する結合部位の部分を形成する、請求項１０記載のマテリアル。
【請求項１２】
配列番号１の１２、１４、９９、１００、２０８および２２８位のアミノ酸のそれぞれがグルコースに対する結合部位の部分を形成する、請求項１０記載のマテリアル。
【請求項１３】
レクチンが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項６記載のマテリアル。
【請求項１４】
該レクチンが配列番号２のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項１５】
該レクチンが配列番号３のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項１６】
該レクチンが配列番号４のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項１７】
該レクチンが配列番号５のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項１８】
該レクチンが配列番号６のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項１９】
該レクチンが配列番号７のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項２０】
該レクチンが配列番号８のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項２１】
該レクチンが配列番号９のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項２２】
該レクチンが配列番号１０のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項２３】
該レクチンが配列番号１１のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項２４】
該レクチンが配列番号１２のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項２５】
該レクチンが配列番号１３のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項２６】
該レクチンが配列番号１４のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項２７】
該レクチンが配列番号１５のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項２８】
該レクチンが配列番号１６のアミノ酸配列を有し、ただし、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項２９】
システインではない各Ｘが配列番号１からの対応アミノ酸である、請求項１４〜２８のいずれか１項記載のマテリアル。
【請求項３０】
該レクチンが単一のシステインを含む、請求項１４〜２８のいずれか１項記載のマテリアル。
【請求項３１】
Ｘ位の１つがシステインであり、全ての他のＸ位が配列番号１からの対応アミノ酸である、請求項１４〜２８のいずれか１項記載のマテリアル。
【請求項３２】
該レクチンが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ただし、これらの配列のそれぞれにおいて、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項３３】
該レクチンが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、該Ｘ位のただ１つがシステインであり、全ての他のＸ位が、コード可能なアミノ酸である、請求項６記載のマテリアル。
【請求項３４】
該レクチンが、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ただし、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項３５】
該レクチンが単一のシステインを含む、請求項３４記載のマテリアル。
【請求項３６】
該レクチンが配列番号１７のアミノ酸配列を有し、ただし、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項３７】
該レクチンが配列番号１７のアミノ酸配列を有し、１００位のＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項３８】
１０１位のＸがリシンである、請求項３７記載のマテリアル。
【請求項３９】
該レクチンが配列番号１７のアミノ酸配列を有し、１０１位のＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項４０】
１００位のＸがチロシンである、請求項３９記載のマテリアル。
【請求項４１】
該レクチンが、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ただし、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項４２】
該レクチンが単一のシステインを含む、請求項４１記載のマテリアル。
【請求項４３】
該レクチンが配列番号１８のアミノ酸配列を有し、ただし、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項４４】
１１７位のＸがシステインである、請求項４３記載のマテリアル。
【請求項４５】
１２０位のＸがヒスチジンである、請求項４４記載のマテリアル。
【請求項４６】
１２０位のＸがシステインである、請求項４３のマテリアル。
【請求項４７】
１１７位のＸがアスパラギンである、請求項４６記載のマテリアル。
【請求項４８】
１１７位のＸがシステインであり、１２０位のＸがシステインである、請求項４３記載のマテリアル。
【請求項４９】
該レクチンが配列番号１９のアミノ酸配列を有する、請求項６記載のマテリアル。
【請求項５０】
該レクチンが配列番号２０のアミノ酸配列を有する、請求項６記載のマテリアル。
【請求項５１】
該レクチンが配列番号２１のアミノ酸配列を有する、請求項６記載のマテリアル。
【請求項５２】
該レクチンが、野生型ＣｏｎＡと実質的に同じアフィニティでグルコースに結合する、請求項６〜５１のいずれか１項記載のマテリアル。
【請求項５３】
該レクチンが生理的条件下で多量体を形成する、請求項６〜５１のいずれか１項記載のマテリアル。
【請求項５４】
該レクチンがグリコーゲンの存在下でゲルを形成する、請求項６〜５１のいずれか１項記載のマテリアル。
【請求項５５】
該レクチンに共有結合しているアフィニティリガンドが糖を含む、請求項１記載のマテリアル。
【請求項５６】
該糖がグルコースである、請求項５５記載のマテリアル。
【請求項５７】
該糖がマンノースである、請求項５５記載のマテリアル。
【請求項５８】
該レクチンに共有結合しているアフィニティリガンドが糖およびリンカーを含み、該糖がアノマー炭素を介して該リンカーに共有結合している、請求項５５記載のマテリアル。
【請求項５９】
該アノマー炭素がアルファアノマーである、請求項５８記載のマテリアル。
【請求項６０】
該システイン残基のスルフヒドリル基と反応する末端マレイミド基を有する反応性リンカーを使用して該アフィニティリガンドが該レクチンに共有結合された、請求項５８記載のマテリアル。
【請求項６１】
式：
【化１】
2013541500.tif 000105
［式中、
ＸＬは、共有結合または２価の直鎖状または分枝状の飽和または不飽和の所望により置換されていてもよいＣ１−１００炭化水素鎖であり、ここで、ＸＬのメチレン単位の１以上は、所望により且つ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ’）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ’）−、炭素環基、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基により交換されていてもよい；
各場合のＲ’は、独立して、水素、適当な保護基またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分またはヘテロ脂肪族部分である］の反応性リンカーを使用して、該アフィニティリガンドが該レクチンに共有結合された、請求項６０記載のマテリアル。
【請求項６２】
ＸＬの、１〜５個のメチレン単位が、所望により且つ独立して交換されていてもよい、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項６３】
ＸＬがＣ１−２０炭化水素鎖から構成される、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項６４】
ＸＬのメチレン単位の１以上が炭素環基により交換されている、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項６５】
ＸＬのメチレン単位の１以上がシクロヘキシル基により交換されている、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項６６】
ＸＬのメチレン単位の１以上がベンゼン環により交換されている、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項６７】
ＸＬのメチレン単位の１以上が−Ｃ（Ｏ）−により交換されている、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項６８】
ＸＬのメチレン単位の１以上が−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−により交換されている、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項６９】
ＸＬのメチレン単位の１以上が−Ｏ−により交換されている、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項７０】
ＸＬがＰＥＧ部分を含有する、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項７１】
ＸＬが
【化２】
2013541500.tif 000106
である、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項７２】
ＸＬが
【化３】
2013541500.tif 000107
である、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項７３】
ＸＬが
【化４】
2013541500.tif 000108
（ここで、ｎは２、４、６、８、１２または２４である）である、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項７４】
ＸＬが
【化５】
2013541500.tif 000109
である、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項７５】
ＸＬが
【化６】
2013541500.tif 000110
である、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項７６】
ＸＬが
【化７】
2013541500.tif 000111
である、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項７７】
ＸＬが
【化８】
2013541500.tif 000112
である、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項７８】
ＸＬが
【化９】
2013541500.tif 000113
である、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項７９】
ＸＬが
【化１０】
2013541500.tif 000114
である、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項８０】
ＸＬが
【化１１】
2013541500.tif 000115
である、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項８１】
ＸＬが
【化１２】
2013541500.tif 000116
である、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項８２】
ＸＬが
【化１３】
2013541500.tif 000117
である、請求項６１記載のマテリアル。
【請求項８３】
ＸＬが
【化１４】
2013541500.tif 000118
である、請求項６４記載のマテリアル。
【請求項８４】
該コンジュゲートのアフィニティリガンドが糖を含む、請求項１記載のマテリアル。
【請求項８５】
該コンジュゲートのアフィニティリガンドが、グルコース、マンノース、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコースおよびエチルマンノースから選択される糖を含む、請求項８４記載のマテリアル。
【請求項８６】
該コンジュゲートのアフィニティリガンドがビマンノースまたはトリマンノースを含む、請求項８４記載のマテリアル。
【請求項８７】
該コンジュゲートのアフィニティリガンドがアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）またはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を含む、請求項８４記載のマテリアル。
【請求項８８】
該コンジュゲートのアフィニティリガンドが糖およびリンカーを含み、該糖がアノマー炭素を介して該リンカーに共有結合している、請求項８４記載のマテリアル。
【請求項８９】
該アノマー炭素がアルファアノマーである、請求項８８記載のマテリアル。
【請求項９０】
該薬物が抗糖尿病薬である、請求項２記載のマテリアル。
【請求項９１】
該薬物がインスリン分子である、請求項２記載のマテリアル。
【請求項９２】
該薬物がインスリン増感物質である、請求項２記載のマテリアル。
【請求項９３】
該薬物がインスリン分泌促進物質である、請求項２記載のマテリアル。
【請求項９４】
該コンジュゲートフレームワークが重合体である、請求項１記載のマテリアル。
【請求項９５】
該コンジュゲートフレームワークが非重合体である、請求項１記載のマテリアル。
【請求項９６】
該コンジュゲートフレームワークが分枝状または超分枝状である、請求項１記載のマテリアル。
【請求項９７】
該コンジュゲートフレームワークが多糖を含む、請求項１記載のマテリアル。
【請求項９８】
該コンジュゲートが一般式：
【化１５】
2013541500.tif 000119
［式中、
Ｒｘは水素または所望により置換されていてもよいＣ１−６アルキルである；
Ｚ１は、所望により置換されていてもよい２価Ｃ１−１０炭化水素鎖であり、ここで、Ｚ１の、１、２、３、４または５個のメチレン単位は、所望により且つ独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＲａ−、−（Ｃ＝ＮＲａ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｓ＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−（ＣＲｂ＝ＣＲｂ）−、−（Ｎ＝Ｎ）−、所望により置換されていてもよいアリーレン部分または所望により置換されていてもよいヘテロアリーレン部分から選択される１以上の基で交換されていてもよく、ここで、Ｒａは水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたは適当なアミノ保護基であり、Ｒｂは水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリールまたは所望により置換されていてもよいヘテロアリールである；
Ｘ１の各存在は、独立して、−ＯＲｃまたは−Ｎ（Ｒｄ）２であり、ここで、Ｒｃは水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリール、適当なヒドロキシル保護基、カチオン基またはアフィニティリガンドであり、各Ｒｄは、独立して、水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリール、適当なアミノ保護基またはアフィニティリガンドであり、ただし、Ｘ１の、少なくとも２つの存在は、アフィニティリガンドを含む；
Ｙ１は水素、ハロゲン、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリール、−ＯＲｅまたは−ＳＲｅであり、ここで、Ｒｅは水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリールまたは所望により置換されていてもよいヘテロアリールである；
ｒは５〜２５（５および２５を含む）の整数である；
Ｗ１は薬物または検出可能な標識である；ならびに
- - -は、単または二重共有結合に対応する］を有する、請求項１記載のマテリアル。
【請求項９９】
該コンジュゲートが一般式：
【化１６】
2013541500.tif 000120
［式中、
［（［Ａ］−Ｔ）］の各存在は該コンジュゲート内の可能な分枝を表す；
（［Ａ］−Ｔ）の各存在は該コンジュゲートの分枝内の可能な反復を表す；
［Ａ］の各存在は、独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子であるか、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される所望により置換されていてもよい基である；
Ｔの各存在は、独立して、共有結合、または２価の直鎖状もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の所望により置換されていてもよいＣ１−３０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの、１以上のメチレン単位は、所望により且つ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基により交換されていてもよい；
Ｒの各存在は、独立して、水素、適当な保護基またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分またはヘテロ脂肪族部分である；
−Ｂは−Ｔ−ＬＢ−Ｘである；
Ｘの各存在は、独立して、アフィニティリガンドである；
ＬＢの各存在は、独立して、共有結合、またはＸへのＴの共有結合から誘導される基である；
−Ｄは−Ｔ−ＬＤ−Ｗである；
Ｗの各存在は、独立して、薬物または検出可能な標識である；
ＬＤの各存在は、独立して、共有結合、またはＷへのＴの共有結合から誘導される基である；
ｋは２〜１１（２および１１を含む）の整数であり、該コンジュゲート内の少なくとも２つのｋ分枝を定める；
ｑは１〜４（１および４を含む）の整数である；
ｋ＋ｑは３〜１２（３および１２を含む）の整数である；
ｐの各存在は、独立して、１〜５（１および５を含む）の整数である；
ｎの各存在は、独立して、０〜５（０および５を含む）の整数である；
ｍの各存在は、独立して、１〜５（１および５を含む）の整数である；
ｖの各存在は、独立して、０〜５（０および５を含む）の整数である；ただし、各ｋ分枝内で、ｎの、少なくとも１つの存在は、＞１であり、ｖの、少なくとも１つの存在は、＞１である。］を有する、請求項１記載のマテリアル。
【請求項１００】
各ＸおよびＷの非存在下の該コンジュゲートの分子量が１０，０００Ｄａ未満である、請求項９８または９９記載のマテリアル。
【請求項１０１】
各ＸおよびＷの非存在下の該コンジュゲートの分子量が約３００〜約５，０００Ｄａの範囲である、請求項１００記載のマテリアル。
【請求項１０２】
各ＸおよびＷの非存在下の該コンジュゲートの分子量が約３００〜約８００Ｄａの範囲である、請求項１００記載のマテリアル。
【請求項１０３】
Ｘの、少なくとも２つの存在が、糖を含むアフィニティリガンドを含む、請求項１００記載のマテリアル。
【請求項１０４】
Ｘの、少なくとも２つの存在が、グルコース、マンノース、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコースおよびエチルマンノースからなる群から選択される糖を含むアフィニティリガンドを含む、請求項１００記載のマテリアル。
【請求項１０５】
Ｘの、少なくとも２つの存在が、ビマンノースまたはトリマンノースを含むアフィニティリガンドを含む、請求項１００記載のマテリアル。
【請求項１０６】
Ｘの、少なくとも２つの存在が、アミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）またはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）から選択されるアフィニティリガンドを含む、請求項１００記載のマテリアル。
【請求項１０７】
Ｘの、少なくとも２つの存在が、糖およびリンカーを含むアフィニティリガンドを含む、該糖がアノマー炭素を介して該リンカーに共有結合している、請求項１００記載のマテリアル。
【請求項１０８】
該アノマー炭素がアルファアノマーである、請求項１０７記載のマテリアル。
【請求項１０９】
該マテリアルが、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有しグルコースを含有しないｐＨ７の２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー中で３７℃で配置された場合に不溶性である、請求項１記載のマテリアル。
【請求項１１０】
グルコースの濃度に依存した速度または度合で該マテリアルからコンジュゲートが放出される、請求項１０９記載のマテリアル。
【請求項１１１】
該マテリアルが、ＵＳＰ溶解試験法ＩＩを５０ｒｐｍで用いて、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１００ｍｇ／ｄＬ  グルコースを含有するｐＨ７の２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー中で３７℃で６時間配置された場合に、実質的に不溶性のままである、請求項１１０記載のマテリアル。
【請求項１１２】
ＵＳＰ溶解試験法ＩＩを５０ｒｐｍで用いて、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１００ｍｇ／ｄＬ  グルコースを含有するｐＨ７の２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー中で３７℃で６時間配置された場合に、該マテリアルの１０％未満が溶解する、請求項１１０記載のマテリアル。
【請求項１１３】
ＵＳＰ溶解試験法ＩＩを５０ｒｐｍで用いて、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび４００ｍｇ／ｄＬ  グルコースを含有するｐＨ７の２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー中で３７℃で６時間配置された場合に、該マテリアルの少なくとも５０％が溶解する、請求項１１０記載のマテリアル。
【請求項１１４】
ＵＳＰ溶解試験法ＩＩを５０ｒｐｍで用いて、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび４００ｍｇ／ｄＬ  グルコースを含有するｐＨ７の２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー中で３７℃で６時間配置された場合に、該マテリアルの１００％が溶解する、請求項１１０記載のマテリアル。
【請求項１１５】
請求項１〜１１４のいずれか１項記載のマテリアルを患者に投与することを含む方法。
【請求項１１６】
該マテリアルを皮下注射により投与する、請求項１１５記載の方法。
【請求項１１７】
該コンジュゲートが、該フレームワークに結合したインスリン分子を含む、請求項１１５記載の方法。
【請求項１１８】
該患者が糖尿病患者である、請求項１１７記載の方法。
【請求項１１９】
該インスリン分子の平均１日量が１０〜２００Ｕの範囲となるように該マテリアルを投与する、請求項１１７記載の方法。
【請求項１２０】
該マテリアルを毎日投与する、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２１】
該マテリアルを毎週投与する、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２２】
該マテリアルを毎月投与する、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２３】
該患者がインスリン増感物質の投与も受けている、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２４】
該患者がインスリン分泌促進物質の投与も受けている、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２５】
（Ｉ）（ａ）グルコースに対する少なくとも２つの結合部位を有する多価レクチン（ここで、該レクチンは、該結合部位の少なくとも１つへの結合に関してグルコースと競合しうる、該レクチンのシステイン残基に共有結合している少なくとも１つのアフィニティリガンドを含み、該レクチンは、第２標識に接近すると測定可能な応答を生成する第１標識を含む）、および
（ｂ）アフィニティリガンドと第２標識とを含むコンジュゲートを混合し、
（ＩＩ）多価レクチンとコンジュゲートとの混合物にサンプルをさらし［ここで、
（ａ）グルコースが該サンプルに存在しない場合には、該コンジュゲートは該多価レクチンへのアフィニティ結合により該レクチンと架橋マテリアルを形成して、測定可能な応答を生成し、
（ｂ）グルコースが該サンプル中に存在する場合には、該サンプルからのグルコースが該多価レクチン上の結合部位に関して該コンジュゲートと競合する結果として、架橋マテリアルの形成が抑制されるため、該応答は低下する］、
（ＩＩＩ）該サンプル中のグルコースの存在および所望により量を決定するために、センサーで該応答を検出し、所望によりそれを測定する工程を含む方法。
【請求項１２６】
（Ｉ）（ａ）グルコースに対する少なくとも２つの結合部位を有する多価レクチン（ここで、該レクチンは、該結合部位の少なくとも１つへの結合に関してグルコースと競合しうる、該レクチンのシステイン残基に共有結合している少なくとも１つのアフィニティリガンドを含む）、
（ｂ）第２標識に接近すると測定可能な応答を生成する第１標識とアフィニティリガンドとを含む分子の第１グループ、ならびに
（ｃ）アフィニティリガンドと第２標識とを含む分子の第２グループを混合し、
（ＩＩ）多価レクチンならびに分子の第１および第２グループの混合物にサンプルをさらし［ここで、
（ａ）グルコースが該サンプルに存在しない場合には、分子の第１および第２グループのメンバーが該多価レクチンへのアフィニティ結合により接近して、結合性複合体および測定可能な応答を生成し、
（ｂ）グルコースが該サンプル中に存在する場合には、該サンプルからのグルコースが該多価レクチン上の結合部位に関して第１および第２分子と競合する結果として、該結合性複合体の形成が低下するため、該応答は低下する］、
（ＩＩＩ）該サンプル中のグルコースの存在および所望により量を決定するために、センサーで該応答を検出し、所望によりそれを測定する工程を含む方法。
【請求項１２７】
（Ｉ）（ａ）複数のアフィニティリガンドを含むコンジュゲート、および
（ｂ）グルコースに対する少なくとも２つの結合部位を有する多価レクチン（ここで、該レクチンは、該結合部位の少なくとも１つへの結合に関してグルコースと競合しうる、該レクチンのシステイン残基に共有結合している少なくとも１つのアフィニティリガンドを含む）を準備し、
（ＩＩ）該コンジュゲートおよび多価レクチンを混合し（ここで、生じる混合物の粘度は該コンジュゲートとレクチンとの結合によるものである）、
（ＩＩＩ）該レクチンからコンジュゲートを脱離させ粘度の濃度依存的減少を引き起こすグルコースを含有するサンプルと該混合物を接触させ、
（ＩＶ）該サンプル中のグルコースの存在および所望により量を決定するために、粘度における生じた変化を検出し、所望により測定する工程を含む方法。
【請求項１２８】
グルコースに対する結合部位の部分を形成する野生型ＣｏｎＡ配列におけるアミノ酸の代わりにシステインを含む組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１２９】
グルコースに対する結合部位の部分を形成するアミノ酸の（一次アミノ酸配列において測定された場合に）１〜５アミノ酸内に存在する野生型ＣｏｎＡ配列内の位置にシステインを含む組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１３０】
該野生型ＣｏｎＡ配列が配列番号１のアミノ酸配列である、請求項１２８または１２９記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１３１】
配列番号１の１２、１４、９９、１００、２０８および２２８位のアミノ酸の１以上がグルコースに対する結合部位の部分を形成する、請求項１３０記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１３２】
配列番号１の１２、１４、９９、１００、２０８および２２８位のアミノ酸のそれぞれがグルコースに対する結合部位の部分を形成する、請求項１３０記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１３３】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号２のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１３４】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号３のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１３５】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号４のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１３６】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号５のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１３７】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１３８】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号７のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１３９】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号８のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１４０】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号９のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１４１】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号１０のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１４２】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号１１のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１４３】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号１２のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１４４】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号１３のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１４５】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号１４のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１４６】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号１５のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１４７】
各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号１６のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１４８】
システインではない各Ｘが配列番号１からの対応アミノ酸である、請求項１３３〜１４７のいずれか１項記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１４９】
該レクチンが単一のシステインを含む、請求項１３３〜１４７のいずれか１項記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１５０】
Ｘ位の１つがシステインであり、全ての他のＸ位が配列番号１からの対応アミノ酸である、請求項１３３〜１４７のいずれか１項記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１５１】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチドであって、これらの配列のそれぞれにおいて、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１５２】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチドであって、該Ｘ位のただ１つがシステインであり、全ての他のＸ位が、コード可能なアミノ酸である、組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１５３】
少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１５４】
該組換えＣｏｎＡポリペプチドが単一のシステインを含む、請求項１５３記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１５５】
少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号１７のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１５６】
該組換えＣｏｎＡポリペプチドが配列番号１７のアミノ酸配列を有し、１００位のＸがシステインである、請求項１５５記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１５７】
１０１位のＸがリシンである、請求項１５６記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１５８】
該組換えＣｏｎＡポリペプチドが配列番号１７のアミノ酸配列を有し、１０１位のＸがシステインである、請求項１５５記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１５９】
１００位のＸがチロシンである、請求項１５８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１６０】
少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１６１】
該組換えＣｏｎＡポリペプチドが単一のシステインを含む、請求項１６０記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１６２】
少なくとも１つのＸがシステインである、配列番号１８のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１６３】
１１７位のＸがシステインである、請求項１６２記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１６４】
１２０位のＸがヒスチジンである、請求項１６３記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１６５】
１２０位のＸがシステインである、請求項１６２記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１６６】
１１７位のＸがアスパラギンである、請求項１６５記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１６７】
１１７位のＸがシステインであり、１２０位のＸがシステインである、請求項１６２記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１６８】
配列番号１９のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１６９】
配列番号２０のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１７０】
配列番号２１のアミノ酸配列を有する組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１７１】
ＣｏｎＡのグルコース結合部位への結合に関してグルコースと競合しうる少なくとも１つのアフィニティリガンドが該システインに共有結合している、請求項１２８〜１７０のいずれか１項記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１７２】
該アフィニティリガンドが糖を含む、請求項１７１記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１７３】
該糖がグルコースである、請求項１７２記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１７４】
該糖がマンノースである、請求項１７２記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１７５】
該アフィニティリガンドが糖およびリンカーを含み、該糖がアノマー炭素を介して該リンカーに共有結合している、請求項１７２記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１７６】
該アノマー炭素がアルファアノマーである、請求項１７５記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１７７】
該システイン残基のスルフヒドリル基と反応する末端マレイミド基を有する反応性リンカーを使用して該アフィニティリガンドが該組換えＣｏｎＡポリペプチドに共有結合された、請求項１７５記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１７８】
式：
【化１７】
2013541500.tif 000121
［式中、
ＸＬは、共有結合または２価の直鎖状または分枝状の飽和または不飽和の所望により置換されていてもよいＣ１−１００炭化水素鎖であり、ここで、ＸＬのメチレン単位の１以上は、所望により且つ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ’）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ’）−、炭素環基、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基により交換されていてもよい；
各場合のＲ’は、独立して、水素、適当な保護基またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分またはヘテロ脂肪族部分である］の反応性リンカーを使用して、該アフィニティリガンドが該組換えＣｏｎＡポリペプチドに共有結合された、請求項１７７記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１７９】
ＸＬの、１〜５個のメチレン単位が、所望により且つ独立して交換されていてもよい、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１８０】
ＸＬがＣ１−２０炭化水素鎖から構成される、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１８１】
ＸＬのメチレン単位の１以上が炭素環基により交換されている、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１８２】
ＸＬのメチレン単位の１以上がシクロヘキシル基により交換されている、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１８３】
ＸＬのメチレン単位の１以上がベンゼン環により交換されている、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１８４】
ＸＬのメチレン単位の１以上が−Ｃ（Ｏ）−により交換されている、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１８５】
ＸＬのメチレン単位の１以上が−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−により交換されている、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１８６】
ＸＬのメチレン単位の１以上が−Ｏ−により交換.
されている、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１８７】
ＸＬがＰＥＧ部分を含有する、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１８８】
ＸＬが
【化１８】
2013541500.tif 000122
である、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１８９】
ＸＬが
【化１９】
2013541500.tif 000123
である、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１９０】
ＸＬが
【化２０】
2013541500.tif 000124
（ここで、ｎは２、４、６、８、１２または２４である）である、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１９１】
ＸＬが
【化２１】
2013541500.tif 000125
である、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１９２】
ＸＬが
【化２２】
2013541500.tif 000126
である、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１９３】
ＸＬが
【化２３】
2013541500.tif 000127
である、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１９４】
ＸＬが
【化２４】
2013541500.tif 000128
である、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１９５】
ＸＬが
【化２５】
2013541500.tif 000129
である、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１９６】
ＸＬが
【化２６】
2013541500.tif 000130
である、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１９７】
ＸＬが
【化２７】
2013541500.tif 000131
である、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１９８】
ＸＬが
【化２８】
2013541500.tif 000132
である、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項１９９】
ＸＬが
【化２９】
2013541500.tif 000133
である、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【請求項２００】
ＸＬが
【化３０】
2013541500.tif 000134
である、請求項１７８記載の組換えＣｏｎＡポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換えレクチン、結合部位修飾レクチンおよびそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術（例えば、酵素的に不安定なカプセルからの薬物放出を記載しているＳｅａｒｓ，米国特許第４，１４５，４１０号）において公知の「放出制御（コントロールリリース）」による薬物運搬系の大多数は、人体に存在する分子指標（例えば、代謝産物）の量に正比例する間隔および濃度で薬物を放出することができない。したがって、これらの先行技術の系における薬物の運搬または放出は厳密な意味では「制御」されておらず、外的または内的要因に無関係な単なる遅延放出である。
【０００３】
注射可能なインスリンでの糖尿病の治療は、インスリンの放出が無制御で、遅延で望ましくない、良く知られており研究されている一例である。実際、該ホルモンの単なる補充は、この疾患に関連した病的続発症を予防するのに十分でないことが明らかである。これらの続発症の発生は、患者に生じる血液グルコース（血糖）濃度変化に比例した外因性インスリンを供給できていないことを反映していると考えられる。この問題を解決するために、より生理的なインスリン運搬系を開発するための幾つかの生物学的および生物工学的アプローチが示唆されている（例えば、Ｂｒｏｗｎｌｅｅら，米国特許第４，３４８，３８７号；Ｔａｙｌｏｒら，米国特許第５，８３０，５０６号、第５，９０２，６０３号および第６，４１０，０５３号ならびにＺｉｏｎら，米国特許出願公開第２００４−０２０２７１９号を参照されたい）。
【０００４】
Ｚｉｏｎ系のある実施形態においては、多価グルコース結合性分子がグリコシル化重合体−インスリンコンジュゲートと組合されている。該グリコシル化重合体は複数の糖結合性基を含有し、グルコース結合性分子の存在下で不溶性ヒドロゲルまたは粒子を形成する。該ゲルはグルコース濃度の増加に応答してグリコシル化重合体−インスリンコンジュゲートを放出する。該Ｚｉｏｎ系は、典型的な多価グルコース結合性分子としてレクチンコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を使用して実証されている。残念ながら、ＣｏｎＡおよび多数のその他の容易に利用可能なレクチンは、リンパ球増殖を刺激する可能性を有する。これらのいわゆる「分裂促進性」レクチンは、あるタイプのリンパ球の表面上の炭水化物受容体に結合することにより、リンパ球の有糸分裂を潜在的に誘導し、それによりそれらを増殖させうる。ＣｏｎＡを含むほとんどの分裂促進性レクチンは選択的Ｔ細胞分裂促進因子である。少数のレクチンはそれほど選択的ではなく、Ｔ細胞およびＢ細胞の両方を刺激する。分裂促進性レクチンに対する局所的または全身的インビボ曝露は、炎症、細胞傷害性、マクロファージ消化、およびアナフィラキシーを含むアレルギー反応を引き起こしうる。また、植物レクチンは特に免疫原性であり、高力価の抗レクチン特異的抗体を産生することが公知である。したがって、分裂促進性レクチンは、それらの放出を防ぐために多大な注意が払われない限り、それらの天然形態では、インビボ方法および装置に使用できないと理解されるであろう。例えば、Ｔａｙｌｏｒ，米国特許第５，８３０，５０６号は、ＣｏｎＡの使用に関わる毒性リスクを強調しており、グルコースおよびインスリン分子が薬物運搬装置の内外に自由に拡散することをも要する該薬物運搬装置内にＣｏｎＡを含有させる重要性および難しさを強調している。
【０００５】
有用な濃度のグルコースに応答するＺｉｏｎ系における架橋剤として機能するレクチンの能力を妨げることなくレクチンの分裂促進性を軽減するための方法が存在すれば、レクチンのこれらの及び他のインビボ使用に関連したリスクおよび困難が回避されうるであろう。
【発明の概要】
【０００６】
概要
１つの態様において、本開示は、グルコースに対する少なくとも２つの結合部位を有する多価レクチンと、コンジュゲートフレークワークに結合した２以上の別々のアフィニティリガンドを含むコンジュゲートとを含む架橋マテリアル（ｍａｔｅｒｉａｌ）を提供し、ここで、該レクチンは、該結合部位の少なくとも１つへの結合に関してグルコースと競合しうる、該レクチンのシステイン残基に共有結合している少なくとも１つのアフィニティリガンドを含み、前記の２以上のアフィニティリガンドは該結合部位における該レクチンへの結合に関してグルコースと競合し、異なるコンジュゲート上のアフィニティリガンドとレクチンとの間の非共有結合相互作用の結果として、コンジュゲートは該マテリアルにおいて架橋されている。これらのマテリアルは、所望濃度のグルコースに応答して或る量のコンジュゲートを放出するように設計される。最終用途に応じて、種々の実施形態においては、該コンジュゲートは薬物および／または検出可能な標識をも含みうる。該薬物、検出可能標識およびアフィニティリガンドは該コンジュゲートフレームワークに共有または非共有結合されうる。本開示は、これらのマテリアルの使用方法およびこれらのマテリアルの製造方法をも提供する。もう１つの態様においては、本開示は、ＣｏｎＡのような天然レクチンに代わるグルコース応答性マテリアルにおいて使用するための、典型的な組換えレクチン（未修飾体またはアフィニティリガンドで修飾されたもの）を提供する。
【０００７】
定義
本明細書の全体にわたって用いる具体的な官能基、化学用語および一般用語の定義を以下で更に詳しく説明する。本発明の目的においては、化学元素は元素の周期表（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＣＡＳ版，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，第７５版、裏表紙）に従い特定されており、具体的な官能基は、概ね、それに記載されているとおりに定義される。また、有機化学の一般則ならびに具体的な官能基部分および反応性はＯｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，１９９９；ＳｍｉｔｈおよびＭａｒｃｈ  Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１；Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８７に記載されている。
【０００８】
アシル−本明細書中で用いる「アシル」なる語は、一般式−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲＸ１、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＸ１）２、−Ｃ（＝Ｓ）ＲＸ１、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（ＲＸ１）２、および−Ｃ（＝Ｓ）Ｓ（ＲＸ１）、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＲＸ１、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＯＲＸ１、−Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＳＲＸ１、および−Ｃ（＝ＮＲＸ１）Ｎ（ＲＸ１）２を有する基を意味し、ここで、ＲＸ１は水素；ハロゲン；置換または非置換ヒドロキシル；置換または非置換チオール；置換または非置換アミノ；置換または非置換アシル；環状または非環状、置換または非置換、分枝または非分枝脂肪族；環状または非環状、置換または非置換、分枝または非分枝ヘテロ脂肪族；環状または非環状、置換または非置換、分枝または非分枝アルキル；環状または非環状、置換または非置換、分枝または非分枝アルケニル；置換または非置換アルキニル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、モノ−またはジ−脂肪族アミノ、モノ−またはジ−ヘテロ脂肪族アミノ、モノ−またはジ−アルキルアミノ、モノ−またはジ−ヘテロアルキルアミノ、モノ−またはジ−アリールアミノあるいはモノ−またはジ−ヘテロアリールアミノであり、あるいは２つのＲＸ１基が一緒になって５〜６員複素環を形成している。典型的なアシル基には、アルデヒド（−ＣＨＯ）、カルボン酸（−ＣＯ２Ｈ）、ケトン、ハロゲン化アシル、エステル、アミド、イミン、カルボナート、カルバマートおよび尿素が含まれる。アシル置換基には、安定な部分の形成をもたらす本明細書に記載の任意の置換基（例えば、それぞれが更に置換されていてもよい脂肪族基、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロ脂肪族基、複素環基、アリール、ヘテロアリール、アシル、オキソ、イミノ、チオオキソ、シアノ、イソシアノ、アミノ、アジド、ニトロ、ヒドロキシル、チオール、ハロ、脂肪族アミノ、ヘテロ脂肪族アミノ、アルキルアミノ、ヘテロアルキルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アルキルアリール、アリールアルキル、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、アシルオキシなど）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０００９】
脂肪族  −  本明細書中で用いる「脂肪族」または「脂肪族基」なる語は、所望により置換されていてもよい炭化水素部分を意味し、これは直鎖状（すなわち、非分枝状）、分枝状または環状（「炭素環式」）であることが可能であり、完全に飽和していてもよく、あるいは１以上の単位の不飽和を含有していてもよいが、芳香族ではない。特に示されていない限り、脂肪族基は１〜１２個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態においては、脂肪族基は１〜６個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態においては、脂肪族基は１〜４個の炭素原子を含有し、更に他の実施形態においては、脂肪族基は１〜３個の炭素原子を含有する。適当な脂肪族基には、直鎖状または分枝状アルキル、アルケニルおよびアルキニル基、ならびにそれらの混合体、例えば（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキルまたは（シクロアルキル）アルケニルが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
アルケニル  −  本明細書中で用いる「アルケニル」なる語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖脂肪族部分から単一水素原子の除去により誘導される所望により置換されていてもよい１価基を意味する。ある実施形態においては、本発明において使用されるアルケニル基は２〜６個の炭素原子を含有する。ある実施形態においては、本発明において使用されるアルケニル基は２〜５個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態においては、本発明において使用されるアルケニル基は２〜４個の炭素原子を含有する。もう１つの実施形態においては、使用されるアルケニル基は２〜３個の炭素原子を含有する。アルケニル基には、例えばエテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イルなどが含まれる。
【００１１】
アルキル  −  本明細書中で用いる「アルキル」なる語は、１〜６個の炭素原子を含有する脂肪族部分から単一水素原子の除去により誘導される所望により置換されていてもよい飽和直鎖状または分枝状炭化水素基を意味する。いくつかの実施形態においては、本発明において使用されるアルキル基は１〜５個の炭素原子を含有する。もう１つの実施形態においては、使用されるアルキル基は１〜４個の炭素原子を含有する。更に他の実施形態においては、該アルキル基は１〜３個の炭素原子を含有する。更にもう１つの実施形態においては、該アルキル基は１〜２個の炭素を含有する。アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ドデシルなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
アルキニル  −  本明細書中で用いる「アルキニル」なる語は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖脂肪族部分から単一水素原子の除去により誘導される所望により置換されていてもよい１価基を意味する。ある実施形態においては、本発明において使用されるアルキニル基は２〜６個の炭素原子を含有する。ある実施形態においては、本発明において使用されるアルキニル基は２〜５個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態においては、本発明において使用されるアルキニル基は２〜４個の炭素原子を含有する。もう１つの実施形態においては、使用されるアルキニル基は２〜３個の炭素原子を含有する。代表的なアルキニル基には、エチニル、２−プロピニル（プロパルギル）、１−プロピニルなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
アリール  −  本明細書中で単独で又は「アルアルキル」、「アルアルコキシ」もしくは「アリールオキシアルキル」におけるようにより大きな部分の一部として用いられるアリールなる語は、合計５〜１０個の環構成要素を有する所望により置換されていてもよい単環式および二環式環系を意味し、ここで、該系における少なくとも１つの環は芳香族であり、該系における各環は３〜７個の環構成要素を含有する。「アリール」なる語は「アリール環」なる語と互換的に用いられるる。本発明の或る実施形態においては、「アリール」は、１以上の置換基を含有しうるフェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラシルなど（これらに限定されるものではない）を含む芳香環系を意味する。
【００１４】
アリールアルキル  −  本明細書中で用いる「アリールアルキル」なる語は、アリール基（例えば、芳香族またはヘテロ芳香族）で置換されたアルキル基を意味する。
【００１５】
２価炭化水素鎖  −  本明細書中で用いる「２価炭化水素鎖」（「２価アルキレン基とも称される」）なる語は、ポリメチレン基、すなわち、−（ＣＨ２）ｚ−であり、ここで、ｚは１〜３０、１〜２０、１〜１２、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３、１〜２、２〜３０、２〜２０、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、または２〜３の正の整数である。置換された２価炭化水素鎖は、１以上のメチレン水素原子が置換基で置換されたポリメチレン基である。適当な置換基には、置換された脂肪族基に関して後記に記載されているものが含まれる。
【００１６】
カルボニル  −  本明細書中で用いる「カルボニル」なる語は、炭素−酸素二重結合を含有する１価または２価部分を意味する。カルボニル基の非限定的な例には、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノール、ハロゲン化アシル、無水物、尿素、カルバマート、カルボナート、チオエステル、ラクトン、ラクタム、ヒドロキサマート、イソシアナートおよびクロロホルマートが含まれる。
【００１７】
シクロ脂肪族  −  本明細書中で単独で又はより大きな部分の一部として用いられる「シクロ脂肪族」、「炭素環」または「炭素環式」なる語は、３〜１０員環である、本明細書に記載されているとおりの所望により置換されていてもよい飽和または部分不飽和環状脂肪族単環式または二環式環系を意味する。環状芳香族基には、限定的なものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、シクロオクチル、シクロオクテニルおよびシクロオクタジエニルが含まれる。いくつかの実施形態においては、該シクロアルキルは３〜６個の炭素を有する。
【００１８】
ハロゲン  −  本明細書中で用いる「ハロ」および「ハロゲン」なる語は、フッ素（フルオロ、−Ｆ）、塩素（クロロ、−Ｃｌ）、臭素（ブロモ、−Ｂｒ）およびヨウ素（ヨード、−Ｉ）から選択される原子を意味する。
【００１９】
ヘテロ脂肪族  −  本明細書中で用いる「ヘテロ脂肪族」または「ヘテロ脂肪族基」なる語は、炭素原子に加えて１〜５個のヘテロ原子を有する所望により置換されていてもよい炭化水素部分を意味し、これは直鎖状（すなわち、非分枝状）、分枝状または環状（「複素環式」）であることが可能であり、完全に飽和していてもよく、あるいは１以上の単位の不飽和を含有していてもよいが、芳香族ではない。特に示されていない限り、ヘテロ脂肪族基は１〜６個の炭素原子を含有し、ここで、１〜３個の炭素原子は、所望により、独立して、酸素、窒素および硫黄から選択されるヘテロ原子で置換されていてもよい。いくつかの実施形態においては、ヘテロ脂肪族基は１〜４個の炭素原子を含有し、ここで、１〜２個の炭素原子は、所望により、独立して、酸素、窒素および硫黄から選択されるヘテロ原子で置換されていてもよい。更に他の実施形態においては、ヘテロ脂肪族基は１〜４個の炭素原子を含有し、ここで、１〜２個の炭素原子は、所望により、独立して、酸素、窒素および硫黄から選択されるヘテロ原子で置換されていてもよい。更に他の実施形態においては、ヘテロ脂肪族基は１〜３個の炭素原子を含有し、ここで、１個の炭素原子は、所望により、独立して、酸素、窒素および硫黄から選択されるヘテロ原子で置換されていてもよい。適当なヘテロ脂肪族基には、直鎖状または分枝状ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよびヘテロアルキニル基が含まれる。
【００２０】
ヘテロアルアルキル  −  本明細書中で用いる「ヘテロアルアルキル」は、ヘテロアリールにより置換されたアルキル基を意味し、ここで、該アルキルおよびヘテロアリール部分は、独立して、所望により置換されていてもよい。
【００２１】
ヘテロアリール  −  本明細書中で単独で又はより大きな部分、例えば「ヘテロアルアルキル」もしくは「ヘテロアルアルコキシ」の一部として用いられる「ヘテロアリール」なる語は、５〜１０個の環原子、好ましくは５、６または９個の環原子を有する、および連続的環配置において共有されている６、１０または１４個のπ電子を有する、および炭素原子に加えて１〜５個のヘテロ原子を有する所望により置換されていてもよい基を意味する。ヘテロアリール基には、限定的なものではないが、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニルおよびプテリジニルが含まれる。本明細書中で用いる「ヘテロアリール」および「ヘテロアル−」はまた、ヘテロ芳香環が１以上のアリール、炭素環式または複素環式環と縮合している基を含み、ここで、該基または結合点は該ヘテロ芳香環上に存在する。非限定的な例には、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ−キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニルおよびテトラヒドロイソキノリニルが含まれる。ヘテロアリール基は単環式または二環式でありうる。「ヘテロアリール」なる語は、「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」または「ヘテロ芳香族」なる語は互換的に用いられうる。これらの語はいずれも、所望により置換されていてもよい環を含む。
【００２２】
ヘテロ原子  −  本明細書中で用いる「ヘテロ原子」なる語は、窒素、酸素または硫黄を意味し、窒素または硫黄の任意の酸化形態、および塩基性窒素の認知の第四級化形態を含む。「窒素」なる語は、置換された窒素をも含む。
【００２３】
複素環式  −  本明細書中で用いる「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式基」および「複素環式環」は互換的に用いられ、所望により置換されていてもよい安定な５〜７員単環式または７〜１０員二環式部分を意味し、これは飽和または部分不飽和しており、炭素原子に加えて前記の１以上のヘテロ原子を有する。複素環式環は、安定な構造をもたらすいずれかのヘテロ原子または炭素原子において、その付随基に結合されることが可能であり、あるいは該環原子はいずれも、所望により置換されていてもよい。そのような飽和または部分不飽和複素環基の例には、限定的なものではないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニルおよびキヌクリジニルが含まれる。「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」および「複素環基」は本明細書中では互換的に用いられ、ヘテロシクリル環が１以上のアリール、ヘテロアリールまたは炭素環式環と縮合している基、例えば、インドリニル、３Ｈ−インドリル、クロマニル、フェナントリジニルまたはテトラヒドロキノリニルをも含み、ここで、該基または結合点は該ヘテロシクリル環上に位置する。ヘテロシクリル基は単環式または二環式でありうる。「ヘテロシクリルアルキル」なる語は、ヘテロシクリルにより置換されたアルキル基を意味し、ここで、該アルキルおよびヘテロシクリル部分は、独立して、所望により置換されていてもよい。
【００２４】
不飽和  −  本明細書中で用いる「不飽和」なる語は、ある部分が１以上の二重または三重結合を有することを意味する。
【００２５】
部分不飽和  −  本明細書中で用いる「部分不飽和」なる語は、少なくとも１つの二重または三重結合を含む環部分を意味する。「部分不飽和」なる語は、複数の不飽和部位を有する環を含むと意図されるが、本明細書に記載のアリールまたはヘテロアリール部分を含むことは意図されない。
【００２６】
所望により置換されていてもよい  −  本明細書中に記載されている本発明の化合物は、「所望により置換されていてもよい」部分を含有しうる。一般に、「置換」なる語は、その前に「所望により」が付いているかどうかに無関係に、示されている部分の水素の１以上が適当な置換基に交換されることを意味する。特に示されていない限り、「所望により置換されていてもよい」基は、該基の各置換可能位置に適当な置換基を有していてもよく、いずれかの与えられた構造における２以上の位置が、示されている群から選択される２以上の置換基で置換されうる場合、該置換基は、各位置において同じ又は異なりうる。本発明により想定される置換基の組合せは、好ましくは、安定な又は化学的に可能な化合物の形成をもたらすものである。本明細書中で用いる「安定」なる語は、製造、検出および或る実施形態においては回収、精製を可能にする条件または本明細書に開示されている目的のための１以上の用途に付された場合に実質的に変化しない化合物に関するものである。
【００２７】
「所望により置換されていてもよい」基の置換可能炭素原子上の適当な１価置換基は、独立して、ハロゲン；−（ＣＨ２）０−４Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４ＯＲ°；−Ｏ−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＲ°；−（ＣＨ２）０−４ＣＨ（ＯＲ°）２；−（ＣＨ２）０−４ＳＲ°；−（ＣＨ２）０−４Ｐｈ（これはＲ°で置換されていてもよい）；−（ＣＨ２）０−４Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ（これはＲ°で置換されていてもよい）；−ＣＨ＝ＣＨＰｈ（これはＲ°で置換されていてもよい）；−ＮＯ２；−ＣＮ；−Ｎ３；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ°）２；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｓ）Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｓ）ＮＲ°２；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＯＲ°；−Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｎ（Ｒ°）Ｎ（Ｒ°）Ｃ（Ｏ）ＯＲ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｃ（Ｓ）Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＲ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＳＲ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＳｉＲ°３；−（ＣＨ２）０−４ＯＣ（Ｏ）Ｒ°；−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）０−４ＳＲ−；ＳＣ（Ｓ）ＳＲ°；−（ＣＨ２）０−４ＳＣ（Ｏ）Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｃ（Ｓ）ＮＲ°２；−Ｃ（Ｓ）ＳＲ°；−ＳＣ（Ｓ）ＳＲ°；−（ＣＨ２）０−４ＯＣ（Ｏ）ＮＲ°２；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ°）Ｒ°；−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ°；−Ｃ（ＮＯＲ°）Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４ＳＳＲ°；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）２Ｒ°；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）２ＯＲ°；−（ＣＨ２）０−４ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ°；−（ＣＨ２）０−４ＯＳ（Ｏ）２Ｒ°；−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ°２；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）Ｒ°；−Ｎ（Ｒ°）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ°２；−Ｎ（Ｒ°）Ｓ（Ｏ）２Ｒ°；−Ｎ（ＯＲ°）Ｒ°；−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ°２；−Ｐ（Ｏ）２Ｒ°；−Ｐ（Ｏ）Ｒ°２；−ＯＰ（Ｏ）Ｒ°２；−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ°）２；ＳｉＲ°３；−（Ｃ１−４直鎖状または分枝状アルキレン）Ｏ−Ｎ（Ｒ°）２；または−（Ｃ１−４直鎖状または分枝状アルキレン）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｎ（Ｒ°）２であり、ここで、各Ｒ°は後記のとおりに置換されていてもよく、独立して、水素、Ｃ１−６脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または５〜６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環（これは、独立して窒素、酸素もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する）であり、あるいは前記定義にかかわらず、Ｒ°の、２つの独立した存在が、それらの介在原子と一緒になって、３〜１２員飽和、部分不飽和もしくはアリール単環式もしくは二環式環を形成しており、該環は、独立して窒素、酸素もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有し、後記のとおりに置換されていてもよい。
【００２８】
Ｒ°（またはＲ°の、２つの独立した存在が、それらの介在原子と一緒になることにより形成された環）上の適当な１価置換基は、独立して、ハロゲン、−（ＣＨ２）０−４Ｒ●、−（ハロＲ●）、−（ＣＨ２）０−２ＯＨ、−（ＣＨ２）０−２ＯＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＣＨ（ＯＲ●）２、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｎ３、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）Ｒ●、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＳＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＳＨ、−（ＣＨ２）０−２ＮＨ２、−（ＣＨ２）０−２ＮＨＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＮＲ●２、−ＮＯ２、−ＳｉＲ●３、−ＯＳｉＲ●３、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ●、−（Ｃ１−４直鎖状または分枝状アルキレン）Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、または−ＳＳＲ●であり、ここで、各Ｒ●は置換されていないか、またはそれが「ハロ」の後に続いている場合には、１以上のハロゲンのみで置換されており、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または５〜６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環（これは、独立して窒素、酸素もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する）から選択される。Ｒ°の飽和炭素原子上の適当な２価置換基には＝Ｏおよび＝Ｓが含まれる。
【００２９】
「所望により置換されていてもよい」基の飽和炭素原子上の適当な２価置換基には以下のものが含まれる：＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＲ＊２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ＊、＝ＮＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ＊、＝ＮＲ＊、＝ＮＯＲ＊、−Ｏ（Ｃ（Ｒ＊２））２−３Ｏ−、または−Ｓ（Ｃ（Ｒ＊２））２−３Ｓ−（ここで、Ｒ＊の、それぞれの独立した存在は、水素、後記のとおりに置換されていてもよいＣ１−６脂肪族、または独立して窒素、酸素もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する置換されていない５〜６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される）。「所望により置換されていてもよい」基の、隣接する置換可能な炭素に結合している適当な２価置換基には、−Ｏ（ＣＲ＊２）２−３Ｏ−（ここで、Ｒ＊の、それぞれの独立した存在は、水素、後記のとおりに置換されていてもよいＣ１−６脂肪族、または独立して窒素、酸素もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する置換されていない５〜６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される）が含まれる。
【００３０】
Ｒ＊の脂肪族基上の適当な置換基には、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２、または−ＮＯ２が含まれ、ここで、各Ｒ●は置換されていないか、またはそれが「ハロ」の後に続いている場合には、１以上のハロゲンのみで置換されており、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または５〜６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環（これは、独立して窒素、酸素もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する）である。
【００３１】
「所望により置換されていてもよい」基の置換可能な窒素上の適当な置換基には、−Ｒ†、−ＮＲ†２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ†、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ†２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ†２、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ†２、または−Ｎ（Ｒ†）Ｓ（Ｏ）２Ｒ†が含まれ、ここで、各Ｒ†は、独立して、水素、後記のとおりに置換されていてもよいＣ１−６脂肪族、置換されていないＯＰｈ、または置換されていない５〜６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環（これは、独立して窒素、酸素もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する）であり、あるいは前記定義にかかわらず、Ｒ†の、２つの独立した存在が、それらの介在原子と一緒になって、置換されていない３〜１２員飽和、部分不飽和もしくはアリール単環式もしくは二環式環を形成しており、該環は、独立して窒素、酸素もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する。
【００３２】
Ｒ†の脂肪族基上の適当な置換基は、独立して、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２、または−ＮＯ２であり、ここで、各Ｒ●は置換されていないか、またはそれが「ハロ」の後に続いている場合には、１以上のハロゲンのみで置換されており、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または５〜６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環（これは、独立して窒素、酸素もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する）である。
【００３３】
適当な保護基−本明細書中で用いる「適当な保護基」なる語は、化合物中のその位置に応じてアミノ保護基またはヒドロキシル保護基を意味し、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に記載されているものを包含する。
【００３４】
適当なアミノ保護基には以下のものが含まれる：メチルカルバマート、エチルカルバマート、９−フルオレニルメチルカルバマート（Ｆｍｏｃ）、９−（２−スルホ）フルオレニルメチルカルバマート、９−（２，７−ジブロモ）フルオレニルメチルカルバマート、２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバマート（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、４−メトキシフェナシルカルバマート（Ｐｈｅｎｏｃ）、、２，２，２−トリクロロエチルカルバマート（Ｔｒｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバマート（Ｔｅｏｃ）、２−フェニルエチルカルバマート（ｈＺ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルカルバマート（Ａｄｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−ハロエチルカルバマート、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルカルバマート（ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカルバマート（ＴＣＢＯＣ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エチルカルバマート（Ｂｐｏｃ）、１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルカルバマート（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、２−（２’−および４’−ピリジル）エチルカルバマート（Ｐｙｏｃ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチルカルバマート、ｔ−ブチルカルバマート（ＢＯＣ）、１−アダマンチルカルバマート（Ａｄｏｃ）、ビニルカルバマート（Ｖｏｃ）、アリルカルバマート（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルカルバマート（Ｉｐａｏｃ）、シンナミルカルバマート（ＣＯＣ）、４−ニトロシンナミルカルバマート（Ｎｏｃ）、８−キノリルカルバマート、Ｎ−ヒドロキシピペリジニルカルバマート、アルキルジチオカルバマート、ベンジルカルバマート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバマート（Ｍｏｚ）、ｐ−ニトロベンジルカルバマート、ｐ−ブロモベンジルカルバマート、ｐ−クロロベンジルカルバマート、２，４−ジクロロベンジルカルバマート、４−メチルスルフィニルベンジルカルバマート（Ｍｓｚ）、９−アントリルメチルカルバマート、ジフェニルメチルカルバマート、２−メチルチオエチルカルバマート、２−メチルスルホニルエチルカルバマート、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチルカルバマート、［２−（１，３−ジチアニル）］メチルカルバマート（Ｄｍｏｃ）、４−メチルチオフェニルカルバマート（Ｍｔｐｃ）、２，４−ジメチルチオフェニルカルバマート（Ｂｍｐｃ）、２−ホスホニオエチルカルバマート（Ｐｅｏｃ）、２−トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバマート（Ｐｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−シアノエチルカルバマート、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルカルバマート、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバマート、５−ベンゾイソオキサゾリルメチルカルバマート、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチルカルバマート（Ｔｃｒｏｃ）、ｍ−ニトロフェニルカルバマート、３，５−ジメトキシベンジルカルバマート、ｏ−ニトロベンジルカルバマート、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルカルバマート、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチルカルバマート、フェノチアニジル−（１０）−カルボニル誘導体、Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニルアミノカルボニル誘導体、Ｎ’−フェニルアミノチオカルボニル誘導体、ｔ−アミルカルバマート、Ｓ−ベンジルチオカルバマート、ｐ−シアノベンジルカルバマート、シクロブチルカルバマート、シクロヘキシルカルバマート、シクロペンチルカルバマート、シクロプロピルメチルカルバマート、ｐ−デシルオキシベンジルカルバマート、２，２−ジメトキシカルボニルビニルカルバマート、ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）ベンジルカルバマート、１，１−ジメチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）プロピルカルバマート、１，１−ジメチルプロピニルカルバマート、ジ（２−ピリジル）メチルカルバマート、２−フラニルメチルメチルカルバマート、２−ヨードエチルカルバマート、イソボリルカルバマート、イソブチルカルバマート、イソニコチニルカルバマート、ｐ−（ｐ’−メトキシフェニルアゾ）ベンジルカルバマート、１−メチルシクロブチルカルバマート、１−メチルシクロヘキシルカルバマート、１−メチル−１−シクロプロピルメチルカルバマート、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチルカルバマート、１−メチル−１−（ｐ−フェニルアゾフェニル）エチルカルバマート、１−メチル−１−フェニルエチルカルバマート、１−メチル−１−（４−ピリジル）エチルカルバマート、フェニルカルバマート、ｐ−（フェニルアゾ）ベンジルカルバマート、２，４，６−トリ−ｔ−ブチルフェニルカルバマート、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバマート、２，４，６−トリメチルベンジルカルバマート、ホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、フェニルアセトアミド、３−フェニルプロパンアミド、ピコリンアミド、３−ピリジルカルボキサミド、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、ｐ−フェニルベンズアミド、ｏ−ニトロフェニルアセトアミド、ｏ−ニトロフェノキシアセトアミド、アセトアセトアミド、（Ｎ’−ジチオベンジルオキシカルボニルアミノ）アセトアミド、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド、３−（ｏ−ニトロフェニル）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロパン、４−クロロブタンアミド、３−メチル−ニトロブタンアミド、ｏ−ニトロシンナミド、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、ｏ−ニトロベンズアミド、ｏ−（ベンゾイルオキシメチル）ベンズアミド、４，５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ジチアスクシンイミド（Ｄｔｓ）、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加体（ＳＴＡＢＡＳＥ）、５−置換１，３−ジメチル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、５−置換１，３−ジベンジル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、１−置換３，５−ジニトロ−４−ピリドン、Ｎ−メチルアミン、Ｎ−アリルアミン、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン（ＳＥＭ）、Ｎ−３−アセトキシプロピルアミン、Ｎ−（１−イソプロピル−４−ニトロ−２−オキソ−３−ピロオリン−３−イル）アミン、第四級アンモニウム塩、Ｎ−ベンジルアミン、Ｎ−ジ（４−メトキシフェニル）メチルアミン、Ｎ−５−ジベンゾスベリルアミン、Ｎ−トリフェニルメチルアミン（Ｔｒ）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミン（ＭＭＴｒ）、Ｎ−９−フェニルフルオレニルアミン（ＰｈＦ）、Ｎ−２，７−ジクロロ−９−フルオレニルメチレンアミン、Ｎ−フェロセニルメチルアミノ（Ｆｃｍ）、Ｎ−２−ピコリルアミノ  Ｎ’−オキシド、Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデンアミン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデンアミン、Ｎ−ジフェニルメチレンアミン、Ｎ−［（２−ピリジル）メシチル］メチレンアミン、Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミン、Ν，Ν’−イソプロピリデンジアミン、Ｎ−ｐ−ニトロベンジリデンアミン、Ｎ−サリシリデンアミン、Ｎ−５−クロロサリシリデンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）フェニルメチレンアミン、Ｎ−シクロヘキシリデンアミン、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン、Ｎ−ボラン誘導体、Ｎ−ジフェニルボリン酸誘導体、Ｎ−［フェニル（ペンタカルボニルクロミウム−またはタングステン）カルボニル］アミン、Ｎ−同キレート、Ｎ−亜鉛キレート、Ｎ−ニトロアミン、Ｎ−ニトロソアミン、アミンＮ−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド（Ｄｐｐ）、ジメチルチオホスフィンアミド（Ｍｐｔ）、ジフェニルチオホスフィンアミド（Ｐｐｔ）、ジアルキルホスホルアミダート、ジベンジルホスホルアミダート、ジフェニルホスホルアミダート、ベンゼンスルフェンアミド、Ｏ−ニトロベンゼンスルフェンアミド（Ｎｐｓ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロ−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、３−ニトロピリジンスルフェンアミド（Ｎｐｙｓ）、ｐ−トルエンスルホンアミド（Ｔｓ）、ベンゼンスルホンアミド、２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｒ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｂ）、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｐｍｅ）、２，３，５，６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｅ）、４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｂｓ）、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｓ）、２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルホンアミド（ｉＭｄｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホンアミド（Ｐｍｃ）、メタンスルホンアミド（Ｍｓ）、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミド（ＳＥＳ）、９−アントラセンスルホンアミド、４−（４’，８’−ジメトキシナフチルメチル）ベンゼンスルホンアミド（ＤＮＭＢＳ）、ベンゼンスルホンアミド、、トリフルオロメチルスルホンアミドおよびフェナシルスルホンアミド。
【００３５】
適当なヒドロキシル保護基には以下のものが含まれる：メチル、メトキシメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ−ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４−メトキシフェノキシ）メチル（ｐ−ＡＯＭ）、グアイアコルメチル（ＧＵＭ）、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＣＴＭＰ）、１，４−ジオキサン−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、アリル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｐ−フェニルベンジル、２−ピコリル、４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）エニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４’−ブロモフェナシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、４，４’，４’’−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４’’−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４’’−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾール−１−イル）−ビス（４’，４’’−ジメトキシフェニル）メチル、１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジチオラン−２−イル、ベンゾイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルテキシ���シリル、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルマート、ベンゾイルホルマート、アセタート、クロロアセタート、ジクロロアセタート、トリクロロアセタート、トリフルオロアセタート、メトキシアセタート、トリフェニルメトキシアセタート、フェノキシアセタート、ｐ−クロロフェノキシアセタート、３−フェニルプロピオナート、４−オキソペンタノアート（レブリナート）、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバロアート、アダマントアート、クロトナート、４−メトキシクロトナート、ベンゾアート、ｐ−フェニルベンゾアート、２，４，６−トリメチルベンゾアート（メシトアート）、アルキルメチルカルボナート、９−フルオレニルメチルカルボナート（Ｆｍｏｃ）、アルキルエチルカルボナート、アルキル２，２，２−トリクロロエチルカルボナート（Ｔｒｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エチルカルボナート（ＴＭＳＥＣ）、２−（フェニルスルホニル）エチルカルボナート（Ｐｓｅｃ）、２−（トリフェニルホスホニオ）エチルカルボナート（Ｐｅｏｃ）、アルキルイソブチルカルボナート、アルキルビニルカルボナートアルキルアリルカルボナート、アルキルｐ−ニトロフェニルカルボナート、アルキルベンジルカルボナート、アルキルｐ−メトキシベンジルカルボナート、アルキル３，４−ジメトキシベンジルカルボナート、アルキルｏ−ニトロベンジルカルボナート、アルキルｐ−ニトロベンジルカルボナート、アルキルＳ−ベンジルチオカルボナート、４−エトキシ−１−ナフチルカルボナート、メチルジチオカルボナート、２−ヨードベンゾアート、４−アジドブチラート、４−ニトロ−４−メチルペンタノアート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾアート、２−ホルミルベンゼンスルホナート、２−（メチルチオメトキシ）エチル、４−（メチルチオメトキシ）ブチラート、２−（メチルチオメトキシメチル）ベンゾアート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセタート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセタート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセタート、クロロジフェニルアセタート、イソブチラート、モノスクシノアート、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノアート、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾアート、α−ナフトアート、ニトラート、アルキルΝ，Ν，Ν’，Ν’−テトラメチルホスホロジアミダート、アルキルＮ−フェニルカルバマート、ボラート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４−ジニトロフェニルスルフェナート、スルファート、メタンスルホナート（メシラート）、ベンジルスルホナートおよびトシラート（Ｔｓ）。１，２−または１，３−ジオールを保護する場合、該保護基には以下のものが含まれる：メチレンアセタール、エチリデンアセタール、１−ｔ−ブチルエチリデンケタール、１−フェニルエチリデンケタール、（４−メトキシフェニル）エチリデンアセタール、２，２，２−トリクロロエチリデンアセタール、アセトニド、シクロペンチリデンケタール、シクロヘキシリデンケタール、シクロヘプチリデンケタール、ベンジリデンアセタール、ｐ−メトキシベンジリデンアセタール、２，４−ジメトキシベンジリデンケタール、３，４−ジメトキシベンジリデンアセタール、２−ニトロベンジリデンアセタール、メトキシメチレンアセタール、エトキシメチレンアセタール、ジメトキシメチレンオルトエステル、１−メトキシエチリデンオルトエステル、１−エトキシエチリデンオルトエステル、１，２−ジメトキシエチリデンオルトエステル、α−メトキシベンジリデンオルトエステル、１−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチリデン誘導体、α−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）ベンジリデン誘導体、２−オキサシクロペンチリデンオルトエステル、ジ−ｔ−ブチルシリレン基（ＤＴＢＳ）、１，３−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサニリデン）誘導体（ＴＩＰＤＳ）、テトラ−ｔ−ブトキシジシロキサン−１，３−ジイリデン誘導体（ＴＢＤＳ）、環状カルボナート、環状ボロナート、エチルボロナートおよびフェニルボロナート。
【００３６】
凝集  −  ２以上の細胞が本明細書に記載の架橋剤により「凝集」される場合、それらはそれぞれ、架橋剤により、細胞−架橋剤−細胞複合体として物理的に会合する。典型的に、凝集は、架橋剤濃度が閾値濃度に達して初めて生じる。この濃度は最小凝集濃度（ＭＡＣ）と称される。与えられた架橋剤のＭＡＣは、一般に、溶液吸光度の変化を定量しうる分光測光プレートリーダーを使用して測定される。
【００３７】
会合  −  本明細書において、２つの物体が物理的に互いに「会合」していると称されるのは、それらが、直接的な非共有結合相互作用により結合している場合である。望ましい非共有結合相互作用には、免疫グロブリン分子と、該免疫グロブリンが特異的である抗原との間で生じるタイプのもの、例えばイオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用などが含まれる。物理的会合の強度またはアフィニティは該相互作用の解離定数（Ｋｄ）により表されることが可能であり、この場合、Ｋｄが小さければ小さいほど、大きなアフィニティを表す。例えば、選択された架橋剤と標的分子との会合特性は、当技術分野で良く知られた方法を用いて定量されうる。
【００３８】
生分解性  −  本明細書中で用いる「生分解性」なる語は、生理的またはエンドソーム条件下で分解する（すなわち、その共有結合構造の少なくとも一部を喪失する）分子に関するものである。生分解性分子は必ずしも加水分解的に分解可能というわけではなく、分解には酵素作用を要しうる。
【００３９】
生体分子  −  本明細書中で用いる「生体分子」なる語は、天然に存在するか、（例えば、合成または組換え方法により）人工的に製造されるかには無関係に、細胞および組織において一般に見出される分子（例えば、ポリペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、多糖、糖、脂質、核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ステロイド、代謝産物など）を意味する。生体分子の具体的なクラスには、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、細胞応答修飾因子、例えば増殖因子および走化性因子、抗体、ワクチン、ハプテン、毒素、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス物質、プラスミド、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
薬物  −  本明細書中で用いる「薬物」（「薬」）は、生物学的事象を改変し、抑制し、活性化し、またはそれに影響を及ぼす小分子または生体分子を意味する。例えば、薬物には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：抗エイズ物質、抗癌物質、抗生物質、抗糖尿病物質、免疫抑制物質、抗ウイルス物質、酵素インヒビター、神経毒素、オピオイド、催眠薬、抗ヒスタミン薬、潤滑剤、トランキライザ、抗痙攣薬、筋肉弛緩薬および抗パーキンソン物質、抗痙攣物質および筋肉収縮薬、例えばチャネルブロッカー、縮瞳薬および抗コリン作動薬、抗緑内障化合物、抗寄生生物および／または抗原生動物化合物、細胞−細胞外マトリックス相互作用のモジュレーター、例えば細胞増殖インヒビターおよび抗接着分子、血管拡張物質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質合成のインヒビター、抗高血圧薬、鎮痛薬、解熱薬、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症物質、抗血管新生因子、抗分泌因子、抗凝血および／または抗血栓物質、局所麻酔薬、眼用薬、プロスタグランジン、抗うつ薬、抗精神病物質、制吐薬およびイメージング物質。本発明における使用に適した典型的な薬物の、より完全な一覧は、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｐａｔｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（Ａｘｅｌ  ＫｌｅｅｍａｎｎおよびＪｕｒｇｅｎ  Ｅｎｇｅｌ，Ｔｈｉｅｍｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９９）、“Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ：Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ”（Ｓｕｓａｎ  Ｂｕｄａｖａｒｉら編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）およびＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ−２５／Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｒｙ−２０（発行：Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ，２００１）に見出されうる。
【００４１】
超分枝  −  本明細書中で用いる「超分枝」構造は、少なくとも１つの枝分かれ分枝（例えば、樹状構造）を含む共有結合構造である。超分枝構造は重合および／または非重合亜構造を含みうる。
【００４２】
レクチン  −  本明細書中で用いる「レクチン」は、糖および多糖に特異的に結合するタンパク質である。レクチンは任意の起源（例えば、植物、動物など）に由来しうる。ある実施形態においては、レクチンは天然源から単離されうる。他の実施形態においては、レクチンは合成的または組換え的に製造されうる。レクチンは生理的条件下で１以上のサブユニットから構成されうる。好ましい実施形態においては、レクチンは生理的条件下で２以上のサブユニット（例えば、４個のサブユニット）から構成される。それらのサブユニットは同じ又は異なることが可能である。
【００４３】
分裂促進性レクチン  −  「分裂促進性レクチン」は、１以上の健常患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用するチミジン取り込みアッセイにより測定された場合にＴ細胞の増殖を刺激するレクチンである。一般に、分裂刺激性レクチンは、１μｇ／ｍｌの濃度で、検出可能なレベルのチミジン取り込みをもたらす。典型的な分裂促進性レクチンには以下のものが含まれるが、アルトカルプス・インテグリフォリア（ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｉｉａ）凝集素、バウヒニア・プルプレア（ｂａｕｈｉｎｉａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）凝集素（ＢＰＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、スクシニル−コンカナバリンＡ（ｓ−ＣｏｎＡ）、エリスリナ・コラルロデンドロン（ｅｒｙｔｈｒｉｎａ  ｃｏｒａｌｉｏｄｅｎｄｒｏｎ）凝集素（ＥＣｏｒＡ）、ユーオニムス・ユーロパエウス（ｅｕｏｎｙｍｕｓ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）凝集素（ＥＥＡ）、ダイズ（ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）凝集素（ＳＢＡ）、レンズ・クリナリス（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）凝集素（ＬｃＨ）、マーキア・アムレンシス（ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）凝集素（ＭＡＡ）、ファセオルス・ブルガリス（ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）凝集素（ＰＨＡ）、ヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）分裂促進因子（ＰＷＭ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）およびビシア・ファバ（ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）凝集素（ＶＦＡ）。これらは全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。「分裂促進性レクチン」なる語は、Ｔ細胞の増殖を刺激する能力を保有する天然レクチンの誘導体（例えば、アミノ酸の置換、欠失または付加を含む誘導体）を含むと理解されるべきである。典型的な誘導体は、（例えば、化学修飾のための追加的な反応性基を供与するために）部位特異的突然変異誘発によりアミノ酸残基が導入されているものである。一般に、適当な誘導体は、（例えば、Ｂｌａｓｔをデフォルト設定で使用する）当技術分野で公知の標準的な方法を用いて決定された場合に天然レクチンに対して少なくとも９０％の配列相同性を有する。好ましくは、該誘導体は天然レクチンに対して少なくとも９５％の配列相同性、より好ましくは９９％の配列相同性を有する。限定的なものではないが、典型的な誘導体は、その天然対応物の場合の少なくとも９０％であるＴ細胞増殖のレベルを含みうる。より好ましくは、該レベルは少なくとも９５％、より一層好ましくは少なくとも９９％である。
【００４４】
天然レクチン  −  本明細書中で用いる「天然レクチン」は、天然で見出されるレクチンの化学的組成を有するタンパク質である。
【００４５】
相同性（％）  −  本明細書中で用いる「相同性（％）」なる語は、本開示に定められている最適アライメントの後の２つの配列の間の配列同一性の百分率を意味する。例えば、２つのヌクレオチド配列が「同一」であると言われるのは、それらの２つの配列におけるヌクレオチドの配列が、後記のとおりに最大一致となるようにアライメント（整列）された場合に同一である場合である。２つのヌクレオチド配列の間の配列比較は、典型的に、配列類似性の領域を特定し比較するために、ある領域または「比較ウィンドウ」にわたって、２つの最適にアライメントされた配列を比較することにより行われる。比較のための配列の最適アライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実行、または目視検査により行われうる。
【００４６】
配列同一性の百分率  −  「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたって、２つの最適にアライメントされた配列を比較することにより決定され、この場合、該比較ウィンドウ内のヌクレオチド配列の部分は、それらの２つの配列の最適アライメントのために（付加も欠失も含まない）参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。該百分率は、両方の配列において同一ヌクレオチド残基が存在する位置の数を決定してマッチ（一致）位置の数を得、比較ウィンドウ内の位置の総数でマッチ位置の数を割り算し、得られた数値に１００を掛け算して配列同一性の百分率を得ることにより計算される。前記の配列同一性のこの定義は、当業者により用いられる定義である。この決定自体はいずれのアルゴリズムの助けも必要としない。該アルゴリズムは、配列同一性を決定することではなく配列の最適アライメントを促進することに役立つのに過ぎない。この定義からすると、２つの比較配列の間の配列同一性に関する、十分に定められた唯一の値が存在することになり、該値は、該最適アライメントに関して得られた値に対応する。
【００４７】
生理的条件  −  本明細書中で用いる「生理的条件」は、典型的な患者の動脈血において見出される条件である。一般に、患者は、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、マウスなどである。ヒト患者においては、生理的条件下のｐＨは典型的には約７．３５〜約７．４５（好ましくは約７．４０）である。ヒトの生理的温度は約３６．４〜約３７．４の範囲（好ましくは約３６．９℃）である。
【００４８】
重合体  −  本明細書中で用いる「重合体」または「重合構造」は、一連の共有結合単量体を含む構造である。重合体は１つのタイプの単量体または２以上のタイプの単量体から構成されうる。したがって、「重合体」なる語は共重合体を含み、例えば、異なるタイプの単量体が重合体全体において別々に塊化しているブロック共重合体を含む。重合体は直鎖状または分枝状でありうる。
【００４９】
ポリヌクレオチド  −  本明細書中で用いる「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体である。「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」なる語は互換的に用いられうる。該重合体は天然ヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ポリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、ジヒドロウリジン、メチルプソイドウリジン、１−メチルアデノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシンおよび２−チオシチジン）、化学的修飾塩基、生物学的修飾塩基（例えば、メチル化塩基）、インターカレート化塩基、修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−メチルシチジン、アラビノースおよびヘキソース）または修飾ホスファート基（例えば、ホスホロチオアートおよび５’−ホスホルアミジット結合）を含みうる。
【００５０】
ポリペプチド  −  本明細書中で用いる「ポリペプチド」はアミノ酸の重合体である。「ポリペプチド」、「タンパク質」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は互換的に用いられうる。ポリペプチドは、当技術分野で公知のとおりの天然アミノ酸、非天然アミノ酸（すなわち、天然に存在しないが、ポリペプチド鎖内に組込まれうる化合物）および／またはアミノ酸類似体を含有しうる。また、ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の１以上は、例えば、炭水化物基、ホスファート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲート化、官能基化または他の修飾のためのリンカーなどのような化学的実体の付加により修飾されうる。これらの修飾は該ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸の組込みなどを含みうる。
【００５１】
多糖  −  本明細書中で用いる「多糖」は糖の重合体である。「多糖」、「炭水化物」および「オリゴ糖」なる語は互換的に用いられうる。該重合体は天然糖（例えば、アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノース、タロース、フルクトース、プシコース、ソルボース、タガトース、マンノヘプツロース、セドヘプツロース、オクトロースおよびシアロース）および／または修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボースおよびヘキソース）を含みうる。典型的な二糖には、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ゲンチオビオース、イソマルトース、コジビオース、ラミナリビオース、マンノビオース、メリビオース、ニゲロース、ルチノースおよびキシロビオースが含まれる。
【００５２】
小分子  −  本明細書中で用いる「小分子」なる語は、天然に生じるか又は（例えば、化学合成により）人工的に作製されるかには無関係に、比較的低い分子量を有する分子を意味する。典型的には、小分子は単量体であり、約１，５００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。好ましい小分子は、それが動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおいて局所性または全身性効果をもたらす点で、生物学的に活性である。ある好ましい実施形態においては、該小分子は薬物である。好ましくは、必ずしも必要というわけではないが、該薬物は、使用に関して安全かつ有効であると適当な政府機関または団体により既にみなされているものである。例えば、ＦＤＡにより２１  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§３３０．５、３３１〜３６１および４４０〜４６０に挙げられているヒト用薬、ＦＤＡにより２１  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§５００〜５８９に挙げられている獣医用薬は全て、本発明による使用に許容されるとみなされる。
【００５３】
治療  −  本明細書中で用いる「治療する」（または「治療している」、「治療される」、「治療」など）なる語は、状態（例えば、糖尿病）、状態の症状（例えば、高血糖）または状態に対する素因を軽減し、緩和し、改変し、改善し、改良し、またはそれらに影響を及ぼす目的で、それを要する対象に本開示のマテリアルを投与することを意味する。
【００５４】
種々の実施形態の詳細な説明
本出願は、特許および非特許文書を含む多数の文書に言及している。これらの文書のそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【００５５】
１つの態様においては、図２３および２４に示されているとおり、本開示は、グルコースに対する少なくとも２つの結合部位３０を有する多価レクチン２０とコンジュゲートフレームワーク７０に結合した２以上の別々のアフィニティリガンド６０を含むコンジュゲート５０とを含む架橋マテリアル１０を提供し、ここで、レクチン２０は、結合部位３０の少なくとも１つへの結合に関してグルコースと競合しうる、レクチン２０のシステイン残基に共有結合している少なくとも１つのアフィニティリガンド４０を含み、２以上のアフィニティリガンド６０は、結合部位３０におけるレクチン２０への結合に関してグルコースと競合し、コンジュゲート５０は、異なるコンジュゲート５０上のアフィニティリガンド６０とレクチン２０との間の非共有結合的相互作用の結果としてマテリアル１０において架橋される。これらのマテリアルは、所望濃度のグルコースに応答して或る量のコンジュゲートを放出するように設計される。最終用途に応じて、種々の実施形態においては、該コンジュゲートは薬物および／または検出可能な標識をも含みうる。該薬物、検出可能標識およびアフィニティリガンドは該コンジュゲートフレームワークに共有または非共有結合されうる。本開示は、これらのマテリアルの使用方法およびこれらのマテリアルの製造方法をも提供する。もう１つの態様においては、本開示は、ＣｏｎＡのような天然レクチンに代わるグルコース応答性マテリアルにおいて使用するための、典型的な組換えレクチン（未修飾体またはアフィニティリガンドで修飾されたもの）を提供する。
【００５６】
本開示のレクチンはグルコースに結合し、多価である。該コンジュゲートは、該レクチンへの結合に関してグルコースと競合する２以上の別々のアフィニティリガンドを有するコンジュゲートフレームワークを含む。レクチンおよびコンジュゲートがグルコースの非存在下で一緒になると、非共有結合により架橋されたマテリアルが形成される。該マテリアルが遊離グルコースの存在下に配置されると、これらは該レクチンと該コンジュゲートとの間の相互作用に関して競合する。ある遊離グルコース濃度を超えると、コンジュゲートを放出することにより該マテリアルが分解し始めるような競合レベルになる。その結果、グルコースの局所濃度に直接的に関連した様態で該マテリアルからコンジュゲートが放出される。
【００５７】
多価レクチン
本開示の架橋マテリアルにおけるレクチンはグルコースに対する少なくとも２つの結合部位を含む（すなわち、それらは多価である）。また、該レクチンは、これらの結合部位の１つと会合しうる少なくとも１つの共有結合したアフィニティーリガンドを含む。そのような少なくとも１つのアフィニティリガンドは該レクチンのシステイン残基に共有結合している。種々の実施形態においては、該レクチンは、唯一の共有結合したアフィニティーリガンドを含みうる。種々の実施形態においては、該レクチンは、結合部位当たり１つの共有結合したアフィニティーリガンドを含みうる。典型的には、多価レクチンは２個または４個の結合部位（例えば、１価レクチンの二量体または四量体）を含むが、本開示は、３、５個またはそれ以上の結合部位を有するレクチンをも含む。本開示はまた、結合部位当たり２以上の共有結合したアフィニティーリガンドを有するレクチンを含む。本開示は更に、種々の数の共有結合したアフィニティーリガンドを含む及び／又は未修飾レクチンを含むレクチンの混合物を含むマテリアルを含む。
【００５８】
レクチン
本開示の方法は、システイン残基（天然に存在するか、部位特異的突然変異誘発により組換え的に導入されたかには無関係である）を含む任意のレクチンに適用されうる。レクチンは、種子、根、樹皮、真菌、細菌、海草、海綿動物、軟体動物、魚卵、無脊椎動物および下等脊椎動物の体液ならびに哺乳類細胞膜を含む種々の天然源から単離されている（例えば、Ｔｈｅ  Ｌｅｃｔｉｎｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｅｎｅｒら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６を参照されたい）。いくつかのレクチンは組換え法によっても製造されている（例えば、ＳｔｒｅｉｃｈｅｒおよびＳｈａｒｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３６３：４７−７７，２００３ならびに米国特許公開第２００６０２４７１５４号を参照されたい）。前記のとおり、レクチンは高い特異性で糖および多糖に結合する。例えば、マンノースまたはグルコース残基のみに結合するレクチンもあれば、ガラクトース残基のみを認識するレクチンもある。特定の残基が末端位置に存在することを要するレクチンもあれば、多糖鎖内の残基に結合するレクチンもある。特異的アノマー構造を要するレクチンもあれば、特異的糖配列を認識するレクチンもある。レクチンの構造および特性は文献に詳細に記載されている。最近の総説およびレクチンの一覧としては、Ｌｅｃｔｉｎｓ，ＳｈａｒｏｎおよびＬｉｓ編，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００３；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｌｅｃｔｉｎｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ編，Ｗｉｌｅｙ，２０００；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｌｅｃｔｉｎｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅら編，Ｗｉｌｅｙ，１９９８を参照されたい。
【００５９】
典型的なグルコース結合性レクチンには、カルネキシン、カルレチクリン、Ｎ−アセチルグルコサミン受容体、セレクチン、アシアロ糖タンパク質受容体、コレクチン（マンノース結合性レクチン）、マンノース受容体、アグレカン、ベルシカン、ピスム・サチブム（ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）凝集素（ＰＳＡ）、ビシア・ファバ（ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）レクチン、レンズ・クリナリス（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）レクチン、ダイズレクチン、ラッカセイレクチン、ラスイルス・オクルス（ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｏｃｈｒｕｓ）レクチン、イガマメ（ｓａｉｎｆｏｉｎ）レクチン、ソフォラ・ジャポニカ（ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）レクチン、ボウリンジア・ミルブラエディイ（ｂｏｗｒｉｎｇｉａ  ｍｉｌｂｒａｅｄｉｉ）レクチン、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）およびヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）分裂促進因子が含まれる。種々の実施形態においては、植物レクチンのヒト類似体が使用されうる。これらには、ヒトマンナン結合性タンパク質（ＭＢＰ；マンナン結合性レクチンとも称される；Ｓｈｅｒｉｆｆら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１：７８９−７９４（１９９４）；Ｄｕｍｅｓｔｒｅ−Ｐｅｒａｒｄら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３９：４６５−４７３（２００２））、ヒト肺胞界面活性物質プロテインＡ（ＳＰ−Ａ，Ａｌｌｅｎら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６７：４５６３−４５６９（１９９９））、ヒト肺胞界面活性物質プロテインＤ（ＳＰ−Ｄ，Ｐｅｒｓｓｏｎら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６５：５７５５−５７６０（１９９０））、ＣＬ−４３（ヒト血清タンパク質）およびコングルチニンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
本開示のレクチンは任意の利用可能な手段により製造されうる。レクチンは、組換え技術を用いて、例えば、発現ベクターの使用により（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、細胞内で発現されうる。組換えレクチンは、例えば、発現ベクターによりコードされる組換えレクチンを発現するように操作された宿主細胞系（例えば、細菌、酵母、植物細胞、哺乳類細胞など）を使用することにより製造されうる。いくつかの実施形態においては、発現ベクターは細菌発現ベクターである。ある実施形態においては、レクチンは、遺伝子の高効率タンパク質発現を可能にする細菌細胞（例えば、大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)ＢＬ２１細胞）において発現される。いくつかの実施形態においては、組換え技術を用いて発現されたレクチンは次いで単離および／または精製される。
【００６１】
一般に、本開示のレクチンは少なくとも１つのシステイン残基を含む。ある実施形態においては、本開示のレクチンは単一のシステイン残基を含む。ある実施形態においては、本開示のレクチンは２つのシステイン残基を含む。ある実施形態においては、そのような少なくとも１つのシステイン残基は該レクチンの野生型配列で存在する。ある実施形態においては、該レクチンの野生型配列は、突然変異または欠失した１以上のシステイン残基を含み、該配列内のどこか（例えば、グルコース結合部位に、より近い位置）に１以上のシステイン残基が導入されている。ある実施形態においては、そのような少なくとも１つのシステイン残基は部位特異的突然変異誘発により該レクチン配列内に導入される。いくつかの実施形態においては、野生型レクチン配列において別の残基を置換すること（例えば、アミノ酸置換）により、システイン残基が導入される。いくつかの実施形態においては、野生型レクチン配列にシステイン残基を付加すること（すなわち、アミノ酸付加）により、システイン残基が導入される。
【００６２】
ある実施形態においては、そのような少なくとも１つシステイン残基は、該レクチンが生理的条件下で折り畳まれた場合に該レクチンの表面上に露出する位置に導入される。いくつかの実施形態においては、そのような少なくとも１つのシステイン残基は、該レクチンが生理的条件下で折り畳まれた場合のグルコース結合部位内またはその近傍の位置に導入される。該システインがグルコース結合部位にどのように接近しているかには、システイン残基を介して最終的に共有結合するアフィニティリガンドの性質に応じて或る程度の変動がありうる、と理解されるべきである。例えば、本明細書中に詳細に記載されているとおり、より長い及び／又はより柔軟な反応性リンカーを有するアフィニティリガンドが、より短い及び／又はより非柔軟性の反応性リンカーを有するアフィニティリガンドよりもグルコース結合部位から遠くに位置するシステイン残基を介して共有結合されうる。
【００６３】
ある実施形態においては、グルコースに対する結合部位の部分を形成する野生型配列におけるアミノ酸を置換することにより、そのような少なくとも１つのシステイン残基が導入される。
【００６４】
ある実施形態においては、グルコースに対する結合部位の部分を形成するアミノ酸から１〜５アミノ酸以内（一次アミノ酸配列において測定された場合）の野生型配列内の位置に、そのような少なくとも１つのシステイン残基が導入される。ある実施形態においては、そのような少なくとも１つのシステイン残基とグルコースに対する結合部位の部分を形成するアミノ酸との間の間隔（一次アミノ酸配列におけるもの）は、１〜２、１〜３、１〜４アミノ酸の範囲、例えば１、２、３、４または５アミノ酸である。
【００６５】
ある実施形態においては、そのような少なくとも１つシステイン残基は、それがグルコースに対する結合部位の部分を形成するいずれかのアミノ酸から少なくとも１、２、３、４または５アミノ酸（一次アミノ酸配列において測定された場合）により隔てられるように、野生型配列内の位置に導入される。
【００６６】
これらの実施形態の幾つかにおいては、本開示のレクチンは、前記のとおりに野生型ＣｏｎＡを突然変異させることにより製造され、ここで、野生型ＣｏｎＡは以下のアミノ酸配列（配列番号１）：
【００６７】
【化１】
2013541500.tif 000003
を有し、１２、１４、９９、１００、２０８および２２８位のアミノ酸の１以上はグルコースに対する結合部位の部分を形成する。ある実施形態においては、本開示のレクチンは、前記のとおりに野生型ＣｏｎＡを突然変異させることにより製造され、ここで、配列番号１の１２、１４、９９、１００、２０８および２２８位のアミノ酸のそれぞれはグルコースに対する結合部位の部分を形成する。
【００６８】
ある実施形態においては、本開示のレクチンは少なくとも１つのシステインを含み、野生型レクチン配列（例えば、配列番号１に記載されているＣｏｎＡの野生型配列）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。ある実施形態においては、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいて、レクチン配列内にシステインを導入する置換以外のアミノ酸置換が施されうる。ある実施形態においては、置換は保存的でありうる。すなわち、アミノ酸は、類似した形状および電荷のアミノ酸で置換される。保存的置換は当技術分野でよく知られており、典型的には、以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびチロシン、フェニルアラニン。ある実施形態においては、適当な突然変異の選択の際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮されうる。ポリペプチドに相互作用性生物学的機能を付与する際の疎水性アミノ酸指数の重要性は当技術分野において一般に理解されている。あるいは、親水性に基づいて、同様のアミノ酸の置換が有効に施されうる。ポリペプチドの相互作用性生物学的機能を付与する際の親水性の重要性は当技術分野において一般に理解されている。ポリペプチドを設計する際の疎水性指数または親水性の利用は米国特許第５，６９１，１９８号に更に詳細に記載されている。
【００６９】
ある実施形態においては、本開示のレクチンは配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸配列を有する。
【００７０】
【表１】
2013541500.tif 000004
2013541500.tif 000005
2013541500.tif 000006
2013541500.tif 000007
ただし、これらの配列のそれぞれにおいて、各Ｘはコード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸはシステインである。本明細書中で用いる「コード可能なアミノ酸」は、ポリペプチド合成のために標準的な遺伝暗号により直接的にコードされる２０アミノ酸のいずれかである。
【００７１】
ある実施形態においては、システインではないこれらの配列における各Ｘは配列番号１（すなわち、野生型ＣｏｎＡにおけるその位置のアミノ酸配列）からの対応アミノ酸である。したがって、本開示は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸配列を有するレクチンを含む、と理解されるべきであり、ここで、Ｘ位のいずれか１つはシステインであり、全ての他のＸ位は配列番号１（すなわち、野生型ＣｏｎＡにおけるその位置のアミノ酸配列）からの対応アミノ酸である。
【００７２】
ある実施形態においては、本開示のレクチンは配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸配列であり、ここで、該レクチンは単一システインを含む。ある実施形態においては、本開示のレクチンは配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸配列を有し、ここで、Ｘ位のただ１つはシステインであり、全ての他のＸ位は配列番号１（すなわち、野生型ＣｏｎＡにおけるその位置のアミノ酸配列）からの対応アミノ酸である。簡潔のために、これらの典型的なアミノ酸のそれぞれはここでは再現されないが、それは本開示に含まれると理解されるべきである。
【００７３】
ある実施形態においては、本開示のレクチンは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。ただし、これらの配列のそれぞれにおいては、各Ｘはコード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸはシステインである。
【００７４】
ある実施形態においては、本開示のレクチンは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有し、ここで、Ｘ位の１つだけがシステインであり、全ての他のＸ位はコード可能なアミノ酸である。
【００７５】
ある実施形態においては、本開示のレクチンは、配列番号１７：
【００７６】
【化２】
2013541500.tif 000008
（ただし、少なくとも１つのＸはシステインである）のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。これらの実施形態の幾つかにおいては、該レクチンは単一システインを含む。いくつかの実施形態においては、本開示のレクチンは、少なくとも１つのＸがシステインである配列番号１７のアミノ酸配列を有する。ある実施形態においては、本開示のレクチンは、１００位のＸがシステインである配列番号１７のアミノ酸配列を有する。これらの実施形態の幾つかにおいては、１０１位のＸはリシンである。ある実施形態においては、本開示のレクチンは、１０１位のＸがシステインである配列番号１７のアミノ酸配列を有する。これらの実施形態の幾つかにおいては、１００位のＸはチロシンである。
【００７７】
ある実施形態においては、本開示のレクチンは、配列番号１８：
【００７８】
【化３】
2013541500.tif 000009
（ただし、少なくとも１つのＸはシステインである）のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。これらの実施形態の幾つかにおいては、該レクチンは単一システインを含む。いくつかの実施形態においては、本開示のレクチンは、少なくとも１つのＸがシステインである配列番号１８のアミノ酸配列を有する。ある実施形態においては、本開示のレクチンは、１１７位のＸがシステインである配列番号１８のアミノ酸配列を有する。これらの実施形態の幾つかにおいては、１２０位のＸはヒスチジンである。ある実施形態においては、本開示のレクチンは、１２０位のＸがシステインである配列番号１８のアミノ酸配列を有する。これらの実施形態の幾つかにおいては、１１７位のＸはアスパラギンである。ある実施形態においては、本開示のレクチンは、１１７位のＸがシステインであり、１２０位のＸがシステインである、配列番号１８のアミノ酸配列を有する。
【００７９】
ある実施形態においては、本開示のレクチンは、以下の表に記載されているアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００８０】
【表２】
2013541500.tif 000010
ある実施形態においては、本開示のレクチンは、それが由来する野生型レクチンと実質的に同じアフィニティでグルコースに結合する。ある実施形態においては、本開示のレクチンは、グルコースに対する野生型レクチンのアフィニティの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上に等しいアフィニティでグルコースに結合する。
【００８１】
ある実施形態においては、本開示のレクチンは生理的条件下で多量体を形成する。
【００８２】
ある実施形態においては、本開示のレクチンはグリコーゲンの存在下でゲルを形成する。これらの実施形態の幾つかにおいては、ゲル形成は、以下のアッセイを用いて評価されうる。簡潔に説明すると、未修飾オイスター（Ｏｙｓｔｅｒ）グリコーゲンＩＩ型（Ｓｉｇｍａ  Ａｉｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１０ｍｇ／ｍｌでｐＨ７の２００ｍＭ  ＢＥＳバッファー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に溶解する。ついで５０μＬの該グリコーゲン溶液を９６ウェルマイクロプレート（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ，ＮＪ）のウェル中にピペッティングした。レクチンを凍結乾燥粉末から１０ｍｇ／ｍｌで、１ｍＭ  塩化マンガンおよび１ｍＭ  塩化カルシウムを含有するｐＨ７の１００ｍＭ  ＢＥＳに溶解する。ついで５０μＬの該レクチン溶液を該マイクロタイタープレートウェル内の該５０μＬ  グリコーゲン溶液に加え、それらの２つの液体の適度な混合が保証されるように、該プレートを穏やかに振とうさせる。同様に、１００μＬの該１０ｍｇ／ｍｌ  グリコーゲンを該マイクロタイタープレート上の１つの別のウェルに加えることにより、陰性対照ウェルを調製し、、１０００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  塩化マンガンおよび１ｍＭ  塩化カルシウムを含有するｐＨ７の１００ｍＭ  ＢＥＳバッファー中の５０μＬの１０ｍｇ／ｍｌ  野生型（例えば、天然）レクチン溶液と５０μＬの該グリコーゲン溶液を混合することにより、１つの陽性対照ウェルを調製する。該プレートを室温で１０分間進行させ、その時間の後、商業的に入手可能なマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を４９０ｎｍ（ＯＤ４９０）の波長で使用して、各プレートウェルの混濁度をアッセイする。ついで該ＯＤ４９０値を該陽性（野生型レクチン＋グリコーゲン）対照および陰性対照（グリコーゲンのみ）と比較して、与えられたレクチンに関するグリコーゲン沈殿の相対量を決定する。ある実施形態においては、本開示のレクチンおよび野生型レクチンの両方が同一条件下でこのアッセイにおいて試験された場合に野生型レクチンが示すグリコーゲン沈殿の相対量の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上であるグリコーゲン沈殿の相対量を、本開示のレクチンは示す。
【００８３】
多価架橋剤の作製
いくつかのレクチンは、例えば、生理的条件下で多量体を形成する結果として、多価である。多価架橋剤はまた、２以上の１価レクチンを単一構築物へと共有結合または非共有結合により連結することにより作製されうる。典型的には、２以上のレクチン（それらは同じ又は異なる配列を有しうる）が互いに直接的に（例えば、カップリング剤により）、またはフレームワークを介して間接的に連結されうる。種々の実施形態においては、２、３、４またはそれ以上のタンパク質が単一の構築物へと合体されうる。種々の実施形態においては、そのような２、３、４またはそれ以上の１価レクチンは同一配列を有しうる。これらのアプローチのいずれかは、該レクチンが、カップリング前に（例えば、付属反応性基を含むように）化学修飾されることを要しうると理解されるであろう。また、本開示の多価架橋剤は特定のカップリング反応またはフレームワークに限定されないと理解されるであろう（例えば、それらは、重合体および／または非重合体構造を含むフレームワークを使用して製造されうる）。さらに、該フレームワークは直鎖状、分枝状、樹枝状および／またはこれらの組合せでありうると理解されるであろう。典型的なフレームワークおよびカップリング化学は該コンジュゲートに関して後記に記載されている。
【００８４】
種々の実施形態においては、該１価レクチンは互いに又はフレームワークに共有結合される。そのような実施形態においては、該レクチンは直接的に（すなわち、介在化学基を伴わずに）連結されることが可能であり、あるいはスペーサー（例えば、該レクチンの間または該レクチンとフレームワークとの間の何らかの物理的分離をもたらす共有結合鎖またはカップリング剤）を介して間接的に連結されることが可能である。該コンジュゲートに関して後記に記載されているとおり、レクチンは、アミド、エステル、エーテル、イソ尿素およびイミン結合（これらに限定されるものではない）を含む多数の化学結合により、互いに又はフレームワークに共有結合されうると理解されるべきである。
【００８５】
種々の実施形態においては、２以上の１価結合性タンパク質が互いに又はフレームワークに非共有結合されうる。ある実施形態においては、ヒト血清中の該非共有結合の解離定数（Ｋｄ）は１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である。例えば、当技術分野でよく知られているとおり、非共有結合性リガンド−受容体ペア（限定的なものではないが例えば、ビオチン−アビジンに基づくペア）により、レクチンは互いに又はフレームワークに非共有結合されうる。そのような実施形態においては、該リガンド受容体ペアの一方のメンバーは一方のレクチンに共有結合され、該ペアの他方のメンバーは他方のレクチンまたはフレームワークに共有結合される。該レクチン（またはレクチンおよびフレームワーク）が一緒にされると、該リガンドとその受容体との間の強力な非共有結合性相互作用が該リガンドを互いに（または該フレームワークに）非共有結合させる。典型的なリガンド／受容体ペアには、タンパク質／補因子および酵素／基質ペアが含まれる。一般に使用されるビオチン／アビジンペアのほかに、これらには、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ＦＫ５０６／ＦＫ５０６−結合性タンパク質（ＦＫＢＰ）、ラパマイシン／ＦＫＢＰ、シクロフィリン／シクロスポリンおよびグルタチオン／グルタチオントランスフェラーゼペアが含まれるが、これらに限定されるものではない。他の適当なリガンド／受容体ペア、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（登録商標）ならびに更に“Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”，Ｋｅｓｓｌｅｒ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９０のＫｅｓｓｌｅｒ，ｐｐ．１０５−１５２；“Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）”，Ｐａｓｃａｌ  Ｂａｉｌｌｏｎ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２０００；および“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２に記載されているもの（これらに限定されるものではない）のようなエピトープタグとペアにされたモノクローナル抗体も、当業者に認識されるであろう。
【００８６】
アフィニティリガンド
任意のアフィニティーリガンドが、それが、レクチンに共有結合するとレクチンの結合部位と会合しうる限り、使用可能である。典型的には、アフィニティーリガンドは、レクチン結合部位と相互作用する認識要素、および該認識要素が該結合部位内に結合したら該アフィニティーリガンドが該レクチン内のシステイン残基に共有結合するのを可能にする反応性リンカーを含むであろう。
【００８７】
認識要素
レクチンの対応リガンド（例えば、ＣｏｎＡの場合にはグルコースまたはマンノース）と結合に関して競合しうる任意の認識要素が、本開示のアフィニティーリガンドにおいて使用可能であろう。種々の実施形態においては、該認識要素は糖を含む。ある実施形態においては、該糖は天然糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、リボース、キシロースなど）である。ある実施形態においては、該糖は修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、ヘキソースなど）である。ある実施形態においては、該認識要素はグルコース、スクロース、マルトース、マンノース、これらの誘導体（例えば、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、エチルマンノースなど）および／またはこれらの、より高次の組合せ（例えば、ビマンノース、直鎖状および／または分枝状トリマンノースなど）である。他の典型的な糖は当業者により認識されるであろう。特に、用途に応じて、該コンジュゲートアフィニティーリガンドに関して後記に記載されている糖のいずれも（例えば、コンジュゲートに関して後記に記載されている式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）の糖のいずれも）が使用可能であると理解されるべきである。ある実施形態においては、該認識要素は単糖を含む。ある実施形態においては、該認識要素は二糖を含む。ある実施形態においては、該認識要素は三糖を含む。いくつかの実施形態においては、該認識要素は糖および１以上のアミン基を含む。いくつかの実施形態においては、該認識要素はアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）である。いくつかの実施形態においては、該認識要素はアミノエチルマンノース（ＡＥＭ）である。いくつかの実施形態においては、該認識要素はアミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）である。いくつかの実施形態においては、該認識要素はアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）である。いくつかの実施形態においては、該認識要素はβ−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）である。いくつかの実施形態においては、該認識要素はアミノエチルフコース（ＡＥＦ）である。他の実施形態においては、該認識要素はＤ−グルコサミン（ＧＡ）である。
【００８８】
種々の実施形態においては、該認識要素は多糖、糖ペプチドまたは糖脂質を含む。ある実施形態においては、該認識要素は２〜１０個の糖部分、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の部分を含む。該多糖、糖ペプチドまたは糖脂質の末端および／または内部残基は、問題のレクチンの糖特異性に基づいて選択されうる（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３１７：５００−５０４，１９７３およびＬｉｓら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：３５−６７，１９８６を参照されたい）。
【００８９】
当技術分野においてよく知られているとおり、ある多糖は合成的に製造されうる（例えば、Ｌｅｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１９９−２０２，１９８３を参照されたい）。多糖は天然源（例えば、他の多糖、糖タンパク質、糖脂質など）からも製造されうる。例えば、ある実施形態においては、多糖は、エンドグリコシダーゼ、例えばエンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＨおよび／またはＮ−エンドグリコシダーゼＦ（Ｎ−グリカナーゼとも称される）を使用する糖タンパク質の酵素的切断により製造されうる（例えば、Ｈｉｒａｎｉら，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：４８５−４９２，１９８７を参照されたい）。エンドグリコシダーゼは、商業的入手源（例えば、ＱＡ−Ｂｉｏ，ＰｒｏＺｙｍｅ，Ｒｏｃｈｅ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｇｌｙｋｏなど）を含む任意の起源から得られうる。その代わりに又はそれに加えて、エンドグリコシダーゼは細胞源（例えば、細菌、酵母、植物など）から単離および／または精製されうる。アルカリ性ボロヒドリドに不安定な結合（Ｏ−グリコシド結合）により糖タンパク質に連結された多糖は、Ｓｐｉｒｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２４９：５７０４−５７１７，１９７４の方法に従い０．８Ｍ  ＮａＢＨ４を含有する０．１Ｎ  ＮａＯＨで３７℃で６８時間処理することにより、該糖タンパク質から切断されうる。多糖は、Ｔａｋａｓａｋｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ８３：２６３−２６８，１９８２に記載されている標準的な化学法を用いる加ヒドラジン分解により遊離されうる。
【００９０】
また、糖タンパク質からの切断の前または後、これらの多糖のいずれかは、１以上のエキソグリコシダーゼ（例えば、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼおよびマンノシダーゼ）を使用して更に切断されると理解されるであろう。当業者は、種々のレクチンに適した望ましい末端糖部分を露出させるために、望ましくない末端糖部分の除去のための方法を容易に決定することが可能である。あるいは、ある実施形態においては、所望の末端糖部分を酵素的に付加することが有利かもしれない。例えば、限定的なものではないが、酵素ＵＤＰ−ガラクトース：Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ガラクトースからＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンへと、または末端Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを有する多糖へと、ガラクトースを転移させうる。また、多糖へのガラクトースまたは他の糖残基の付加は、例えばＬｅｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：４２４−４２９，１９８７に記載されているとおりに合成的に達成されうる。
【００９１】
種々の実施形態においては、個々のレクチンに対する認識要素は実験的に選択されうる。そのような実施形態においては、１以上の認識要素が、グルコースと比較された場合のレクチンに対するそれらの相対的結合アフィニティに基づいてスクリーニングされうる。ある実施形態においては、糖および／または多糖のライブラリーが同様にスクリーニングされる。適当な認識要素はグルコースとの検出可能なレベルの競合を示すが、レクチンとグルコースとの間の全ての結合をそれが妨げるほど強力には競合しないであろう。ある実施形態においては、関連レクチン特性に対する種々のアフィニティリガンドの効果を（例えば、後記および実施例に更に詳細に記載されているとおり、凝集を抑制するそれらの能力および／またはそれらのマテリアル凝固点に基づいて）試験することにより、種々の認識要素がスクリーニングされうる。ある実施形態においては、該認識要素は、（例えば、コンジュゲートが該認識要素を結合部位から追い出して、架橋マテリアルを形成するように）該修飾レクチンが組合されることになるコンジュゲートを考慮して選択される。
【００９２】
反応性リンカー
アフィニティーリガンドは反応性リンカーを介してレクチンのシステイン残基に共有結合されうる。典型的には、これは、該リガンドの認識要素をレクチン結合部位を会合させること、ついで該反応性リンカーをシステインレクチンと反応させることを含むであろう。ある実施形態においては、該反応性リンカーは、該認識要素の結合特性を実質的に妨げない位置において該認識要素に結合されうる。例えば、該認識要素が糖または多糖である場合、該リンカーは末端糖のＣ１、Ｃ２またはＣ６位に結合されうる。ある実施形態においては、該リンカーはＣ１位に結合されうる。該Ｃ１位はアノマー炭素とも称され、アルファまたはベータコンホメーションで該リンカーに連結されうる。ある実施形態においては、該リンカーはアルファアノマーとしてＣ１位に結合される。
【００９３】
ある実施形態においては、該反応性リンカーは末端マレイミド基を含む。該マレイミド基はシステイン残基上の遊離チオールと反応して共有結合を形成する。末端マレイミド基を有する反応性リンカーを製造するために使用されうる典型的な前駆体を以下の表に示す。ある実施形態においては、以下に示されている前駆体のＮＨＳ基をアミン含有認識要素（例えば、アミノ末端糖、例えば、ＡＥＭ）と反応させて反応性リンカーを形成させる。
【００９４】
【表３】
2013541500.tif 000011
2013541500.tif 000012
2013541500.tif 000013
例えば、種々の実施形態においては、該アフィニティーリガンドは、一般式（Ｉ）：Ｒｅ−Ｌ１（式中、Ｒｅは認識要素であり、−Ｌ１は反応性リンカーである）を有しうる。ある実施形態においては、Ｒｅは糖部分である。ある実施形態においては、Ｒｅは、該リンカーにＣ１位において共有結合したグルコースまたはマンノース部分である。
【００９５】
ある実施形態においては、−Ｌ１は、一般式（ＩＩ）：
【００９６】
【化４】
2013541500.tif 000014
［式中、
ＸＬは、共有結合または２価の直鎖状または分枝状の飽和または不飽和の所望により置換されていてもよいＣ１−１００炭化水素鎖であり、ここで、ＸＬのメチレン単位の１以上は、所望により且つ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ’）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ’）−、炭素環基、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基により交換されていてもよい；
各場合のＲ’は、独立して、水素、適当な保護基またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分またはヘテロ脂肪族部分である］を有しうる。
【００９７】
ある実施形態においては、ＸＬの、１、２、３、４または５個のメチレン単位は、所望により且つ独立して交換されていてもよい。ある実施形態においては、ＸＬはＣ１−１０、Ｃ１−８、Ｃ１−６、Ｃ１−４、Ｃ２−１２、Ｃ４−１２、Ｃ６−１２、Ｃ８−１２またはＣ１０−１２炭化水素鎖から構築され、ここで、ＸＬのメチレン単位の１以上は、所望により且つ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ’）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ’）−、炭素環基、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基により交換されていてもよい。いくつかの実施形態においては、ＸＬのメチレン単位の１以上は炭素環基により交換されている。いくつかの実施形態においては、ＸＬのメチレン単位の１以上はシクロヘキシル基により交換されている。いくつかの実施形態においては、ＸＬのメチレン単位の１以上はベンゼン環により交換されている。ある実施形態においては、ＸＬのメチレン単位の１以上は−Ｃ（Ｏ）−により交換されている。ある実施形態においては、ＸＬのメチレン単位の１以上は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−により交換されている。ある実施形態においては、ＸＬのメチレン単位の１以上は−Ｏ−により交換されている。ある実施形態においては、ＸＬはＰＥＧ部分を含有する。
【００９８】
いくつかの実施形態においては、ＸＬは
【００９９】
【化５】
2013541500.tif 000015
である。
【０１００】
いくつかの実施形態においては、ＸＬは
【０１０１】
【化６】
2013541500.tif 000016
である。
【０１０２】
いくつかの実施形態においては、ＸＬは
【０１０３】
【化７】
2013541500.tif 000017
（ここで、ｎは２、４、６、８、１２または２４である）である。
【０１０４】
いくつかの実施形態においては、ＸＬは
【０１０５】
【化８】
2013541500.tif 000018
である。
【０１０６】
いくつかの実施形態においては、ＸＬは
【０１０７】
【化９】
2013541500.tif 000019
である。
【０１０８】
いくつかの実施形態においては、ＸＬは
【０１０９】
【化１０】
2013541500.tif 000020
である。
【０１１０】
いくつかの実施形態においては、ＸＬは
【０１１１】
【化１１】
2013541500.tif 000021
である。
【０１１２】
いくつかの実施形態においては、ＸＬは
【０１１３】
【化１２】
2013541500.tif 000022
である。
【０１１４】
いくつかの実施形態においては、ＸＬは
【０１１５】
【化１３】
2013541500.tif 000023
である。
【０１１６】
いくつかの実施形態においては、ＸＬは
【０１１７】
【化１４】
2013541500.tif 000024
である。
【０１１８】
いくつかの実施形態においては、ＸＬは
【０１１９】
【化１５】
2013541500.tif 000025
である。
【０１２０】
いくつかの実施形態においては、ＸＬは
【０１２１】
【化１６】
2013541500.tif 000026
である。
【０１２２】
いくつかの実施形態においては、ＸＬは
【０１２３】
【化１７】
2013541500.tif 000027
である。
【０１２４】
種々の実施形態においては、個々のレクチン／標的分子の組合せのための反応性リンカーは実験的に選択されうる。そのような実施形態においては、同じ認識要素と異なるリンカー（例えば、異なる長さのリンカー、異なる反応性基を有するリンカー、異なる疎水性を有するリンカーなど）とを有する幾つかのアフィニティリガンドが、関連レクチン特性（例えば、ＭＡＣ値および／またはグリコーゲンを沈殿させる能力など）に対するそれらの効果に基づいてスクリーニングされる。
【０１２５】
修飾レクチンの精製
種々の実施形態においては、修飾レクチン（すなわち、アフィニティリガンドに共有結合している組換えレクチン）は、その特性を改善するために更に加工されうる。したがって、ある実施形態においては、多価レクチンを含む組成物は、タンパク質断片、未修飾成分などを除去するために精製されうる。一般に、これらの分離は物理的特性（例えば、電荷、分子量および／またはサイズ）および／または化学的特性（例えば、グルコースまたはマンノースに対する結合アフィニティー）に基づいて達成されうる。ある実施形態においては、これらの示差特性に基づく２以上の方法を組合せることにより最適除去が達成されうる。１つの実施形態においては、これらの分離は変性条件下で行われる。例えば、未修飾または部分修飾レクチンは、イオン交換クロマトグラフィーにより、それらの実効電荷に基づいて除去されうる。ゲル濾過クロマトグラフィーは、サイズに基づいて、異なる修飾のレクチンを互いに識別するために用いられうる。アフィニティークロマトグラフィーは、未修飾または部分修飾レクチンを除去するために用いられうるもう１つの方法である。このアプローチは、修飾、部分修飾および未修飾レクチンの、特異的標的分子（例えば、グルコースまたはマンノース）に対する結合アフィニティーの相違を利用する。
【０１２６】
修飾レクチンの特徴づけ
種々の実施形態においては、修飾レクチンは、その特性を確認または特徴づけするためにスクリーニングまたは更に試験されうる。代表的アッセイには、アフィニティーアッセイ、凝集アッセイ、Ｔ細胞分裂促進性アッセイ、Ｔ細胞生存性アッセイ、抗原性アッセイなどが含まれる。
【０１２７】
アフィニティーアッセイは、該修飾レクチンをアフィニティーカラム（例えば、標的分子を伴う樹脂）に通過させ、該カラムからの該レクチンの除去に必要な溶出条件を決定することを含みうる。当技術分野で公知のとおり、平衡透析も用いられうる。該修飾レクチンを本開示の１以上のコンジュゲートと一緒にし、ついで種々の濃度のグルコースと接触させるセットポイント（ｓｅｔ  ｐｏｉｎｔ）アッセイも用いられうる。好ましくは、該修飾レクチンの結合アフィニティーは未修飾レクチンの結合アフィニティーの少なくとも７５％である。より好ましくは、該結合アフィニティーは未修飾レクチンの少なくとも８５％であり、さらに好ましくは少なくとも９５％である。
【０１２８】
ある実施形態においては、修飾レクチンの最小凝集濃度（ＭＡＣ）を決定するために凝集アッセイが用いられうる。例えば、ある実施形態においては、ＭＡＣは、米国特許出願公開第２００７−０１１０８１１号に記載されているとおりにウサギ赤血球を使用して決定されうる。ある実施形態においては、修飾レクチンは、未修飾レクチンより高いＭＡＣを有しうる。好ましくは、該ＭＡＣは未修飾レクチンのＭＡＣの２５倍である。より好ましくは、該ＭＡＣは未修飾レクチンのＭＡＣの５０倍、さに好ましくは１００倍である。ある実施形態においては、未修飾レクチンは、ホルムアルデヒド安定化ウサギ赤血球の２％  ｖ／ｖ  懸濁液で、４μｇ／ｍｌを超えるＭＡＣを示す。好ましくは、該ＭＡＣは６μｇ／ｍｌを超える、より好ましくは１０μｇ／ｍｌを超える、より一層好ましくは２５μｇ／ｍｌを超える。
【０１２９】
分裂促進性アッセイは、典型的には、関心のある組成物をＴ細胞培養（例えば、ＰＢＭＣ細胞）と或る期間にわたって接触させ、ついでＴ細胞増殖のレベルを測定することを含むであろう。細胞増殖を測定するための種々の方法が公知である。１つの実施形態においては、４５０ｎｍにおいて分光光度的に細胞密度が測定されうる。もう１つの実施形態においては、５７０ｎｍにおけるＭＴＴの減少を検出することにより間接的尺度が得られうる（例えば、Ｏｈｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５：１９９−２０３，１９９１を参照されたい）。好ましい実施形態においては、細胞増殖のレベルは、トリチウム化チミジン取り込みアッセイを用いて決定される。他の適当な方法が使用可能であり、本発明は特定の増殖アッセイに何ら限定されない、と当業者は認識するであろう。ある実施形態においては、修飾レクチンのＴ細胞分裂促進性は未修飾レクチンのＴ細胞分裂促進性の５０％未満である。Ｔ細胞分裂促進性の低下は、ある範囲の架橋剤濃度（例えば、０．０１、０．１、１、１０、１００および１０００μｇ／ｍｌ）にわたって比較チミジン取り込みアッセイを行うことにより評価されうる。好ましい実施形態においては、該チミジン取り込みアッセイは、約５００，０００  ＰＢＭＣを含むサンプルを使用して行われる。ついで該試験組成物（例えば、修飾組成物）の分裂促進性は％最大未修飾分裂促進性として表される。％最大未修飾分裂促進性は、全ての測定濃度にわたる該試験組成物に関する最大ＣＰＭ（カウント毎分）値を、全ての測定濃度にわたる該未修飾組成物の最大ＣＰＭ値で割り算することにより得られる。好ましくは、分裂促進性の低下を伴う試験組成物は、該未修飾組成物より少なくとも５０％低いレベルのＴ細胞増殖を誘導する。より好ましくは、該レベルは少なくとも７５％低く、より一層好ましくは少なくとも９０％、９５％または９９％低い。
【０１３０】
Ｔ細胞生存性は、該Ｔ細胞培養にトリパンブルーを加え、該細胞の代表的サンプルを計数することにより同様の実験を用いて測定されうる（該トリパンを取り込むもの又は該トリパンを尚も排除するもの、すなわち、青くなるものと青くならないものとに注目する）。ついで、該トリパンを排除する細胞（「青くない」生細胞）の数を、計数した細胞（「青い」死細胞＋「青くない」生細胞）の総数で割り算することにより、生存率（％）を計算する。他の適当な方法が使用可能であり、本発明は特定の生存性アッセイに何ら限定されない、と当業者は認識するであろう。ある実施形態においては、ＰＢＭＣを５００，０００細胞／ｍｌの濃度で使用してアッセイした場合、修飾レクチンは、１００μｇ／ｍｌにおいて、１０％を超える細胞生存率を示す。好ましくは、該生存率は２５％を超える、より好ましくは５０％を超える、より一層好ましくは９０％を超える。
【０１３１】
コンジュゲート
該コンジュゲートは、コンジュゲートフレームワークに結合した２以上の別々のアフィニティリガンドを含む。それらの２以上のアフィニティリガンドは、修飾レクチンへの結合に関して標的分子と競合する。最終用途に応じて、該コンジュゲートは薬物および／または検出可能な標識をも含みうる。該アフィニティリガンド、薬物および／または検出可能標識は該コンジュゲートフレームワークに共有または非共有結合されうる。
【０１３２】
アフィニティリガンド
前記の２以上の別々のアフィニティリガンドは、同じ又は異なる化学構造を有しうる。それらの２以上の別々のアフィニティリガンドは標的分子自体と同じ化学構造を有することが可能であり、あるいは該標的分子の化学的関連種であることが可能である。唯一の要件は、それらが修飾レクチンへの結合に関して標的分子と競合することである。ある実施形態においては、該修飾レクチンに対する該コンジュゲートおよび標的分子の相対アフィニティーは１：１〜１００：１の範囲である［ここで、１００：１の相対アフィニティーは、コンジュゲート、標的分子および修飾レクチンの平衡混合物（３７℃でｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中）において、標的分子の濃度が１００×コンジュゲート濃度である場合、該修飾レクチンが、ほぼ等しいモル量のコンジュゲートおよび標的分子に結合することを意味する］。ある実施形態においては、該相対アフィニティーは１：１〜５０：１、１：１〜１０：１、１：１〜５：１、または１：１〜２：１の範囲である。種々の実施形態においては、例えば、該コンジュゲートおよび該標的分子に対する該修飾レクチンの相対アフィニティを微調整するために、該アフィニティリガンドが標的分子とは異なる化学構造を有することが有利でありうる。例えば、該標的分子がグルコースである場合、アフィニティーリガンドの１以上として、糖または多糖を使用することが可能である。例えば、該標的分子がグルコースである場合、該アフィニティリガンドは糖を含みうる。したがって、ある実施形態においては、該アフィニティーリガンドは多価グルコース結合性分子（限定的なものではないが例えば、ＣｏｎＡ、マンナン結合性レクチンまたはＭＢＬなど）への結合に関してグルコースと競合しうる。
【０１３３】
ある実施形態においては、該アフィニティーリガンドは以下の式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）を有する。
【０１３４】
【化１８】
2013541500.tif 000028
［式中、
各Ｒ１は、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、−Ｏ−Ｙ、−Ｇ−Ｚまたは−ＣＨ２Ｒｘである；
各Ｒｘは、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙまたは−Ｏ−Ｙである；
各Ｒｙは、独立して、−Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２である；
各Ｙは、独立して、単糖、二糖または三糖である；
各Ｇは、独立して、共有結合または所望により置換されていてもよいＣ１−９アルキレンであり、ここで、Ｇのメチレン単位の１以上は、所望により、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２−または−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−により置換されていてもよい；
各Ｚは、独立して、ハロゲン、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−Ｎ３、−Ｃ≡ＣＲ２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２または−ＯＳＯ２Ｒ２である；そして
各Ｒ２は、独立して、水素であるか、あるいはＣ１−６脂肪族、フェニル、窒素、酸素もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜７員複素環または窒素、酸素もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロアリール環から選択される所望により置換されていてもよい基である］。
【０１３５】
ある実施形態においては、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）のアフィニティーリガンドは単糖である。ある実施形態においては、該アフィニティーリガンドは二糖である。ある実施形態においては、該アフィニティーリガンドは三糖である。ある実施形態においては、該アフィニティーリガンドは四糖である。ある実施形態においては、該アフィニティーリガンドは４個以下の糖部分を含む。
【０１３６】
前記で一般的に定義されたとおり、各Ｒ１は、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙ、−Ｏ−Ｙ、−Ｇ−Ｚまたは−ＣＨ２Ｒｘである。ある実施形態においては、Ｒ１は水素である。ある実施形態においては、Ｒ１は−ＯＨである。他の実施形態においては、Ｒ１は−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある実施形態においては、Ｒ１は−Ｏ−Ｙである。ある他の実施形態においては、Ｒ１は−Ｇ−Ｚである。いくつかの実施形態においては、Ｒ１は−ＣＨ２ＯＨである。他の実施形態においては、Ｒ１は−ＣＨ２−Ｏ−Ｙである。さらに他の実施形態においては、Ｒ３は−ＮＨ２である。式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）における各Ｒ１置換基は（Ｒ）または（Ｓ）立体化学を有しうると当業者は認識するであろう。
【０１３７】
前記で一般的に定義されたとおり、各Ｒｘは、独立して、水素、−ＯＲｙ、−Ｎ（Ｒｙ）２、−ＳＲｙまたは−Ｏ−Ｙである。いくつかの実施形態においては、Ｒｘは水素である。ある実施形態においては、Ｒｘは−ＯＨである。他の実施形態においては、Ｒｘは−Ｏ−Ｙである。
【０１３８】
前記で一般的に定義されたとおり、各Ｒｙは、独立して、−Ｒ２、−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２である。いくつかの実施形態においては、Ｒｙは水素である。他の実施形態においては、Ｒｙは−Ｒ２である。いくつかの実施形態においては、Ｒｙは−Ｃ（Ｏ）Ｒ２である。ある実施形態においては、Ｒｙはアセチルである。他の実施形態においては、Ｒｙは−ＳＯ２Ｒ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）２、−ＣＯ２Ｒ２または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）２である。
【０１３９】
前記で一般的に定義されたとおり、Ｙは単糖、二糖または三糖である。ある実施形態においては、Ｙは単糖である。いくつかの実施形態においては、Ｙは二糖である。他の実施形態においては、Ｙは三糖である。いくつかの実施形態においては、Ｙはマンノース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラムノースまたはキシロピラノースである。いくつかの実施形態においては、Ｙはスクロース、マルトース、ツラノース、トレハロース、セロビオースまたはラクトースである。ある実施形態においては、Ｙはマンノースである。ある実施形態においては、ＹはＤ−マンノースである。糖Ｙはアノマー炭素を介して−Ｏ−Ｙの酸素基に結合してグリコシド結合を形成すると当業者は認識するであろう。該グリコシド結合はアルファまたはベータ立体配置を有しうる。
【０１４０】
前記で一般的に定義されたとおり、各Ｇは、独立して、共有結合または所望により置換されていてもよいＣ１−９アルキレンであり、ここで、Ｇのメチレン単位の１以上は、所望により、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−、−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２−または−Ｎ（Ｒ２）ＳＯ２Ｎ（Ｒ２）−により置換されていてもよい。いくつかの実施形態においては、Ｇは共有結合である。ある実施形態においては、Ｇは−Ｏ−Ｃ１−８アルキレンである。ある実施形態においては、Ｇは−ＯＣＨ２ＣＨ２−である。
【０１４１】
前記で一般的に定義されたとおり、各Ｚは、独立して、ハロゲン、−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−Ｎ３、−Ｃ≡ＣＲ２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２または−ＯＳＯ２Ｒ２である。いくつかの実施形態においては、Ｚはハロゲンまたは−ＯＳＯ２Ｒ２である。他の実施形態においては、Ｚは−Ｎ３または−Ｃ≡ＣＲ２である。ある実施形態においては、Ｚは−Ｎ（Ｒ２）２、−ＯＲ２または−ＳＲ２である。ある実施形態においては、Ｚは−ＳＨである。ある実施形態においては、Ｚは−ＮＨ２である。ある実施形態においては、−Ｇ−Ｚは−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である。
【０１４２】
いくつかの実施形態においては、式（ＩＩＩａ）のＣ１炭素上のＲ１置換基は−Ｇ−Ｚであり、式（ＩＩＩａ−ｉ）：
【０１４３】
【化１９】
2013541500.tif 000029
（式中、Ｒ１、ＧおよびＺＬは、本明細書中に定義され記載されているとおりである）の化合物を与える。
【０１４４】
いくつかの実施形態においては、該リガンドは式（ＩＩＩａ−ｉｉ）：
【０１４５】
【化２０】
2013541500.tif 000030
（式中、Ｒ１、Ｒｘ、ＧおよびＺは、本明細書中に定義され記載されているとおりである）を有する。
【０１４６】
標的分子がグルコースである或る実施形態においては、例えば、グルコース応答性マテリアルの応答を微調整するために、該アフィニティリガンドがグルコースとは異なる化学構造を有することが有利でありうる。例えば、ある実施形態においては、以下の１以上を含むアフィニティーリガンドを使用することが可能であろう：グルコース、スクロース、マルトース、マンノース、これらの誘導体（例えば、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、エチルマンノースなど）および／またはより高次の、これらの組合せ（例えば、ビマンノース、直鎖状および／または分枝状トリマンノースなど）。ある実施形態においては、アフィニティーリガンドは単糖を含む。ある実施形態においては、該アフィニティーリガンドは二糖を含む。ある実施形態においては、該アフィニティーリガンドは三糖を含む。ある実施形態においては、該アフィニティーリガンドは多糖を含む。いくつかの実施形態においては、該アフィニティーリガンドは糖および１以上のアミン基を含む。いくつかの実施形態においては、該アフィニティーリガンドはアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）である。いくつかの実施形態においては、該アフィニティリガンドはアミノエチルマンノース（ＡＥＭ）である。いくつかの実施形態においては、該アフィニティーリガンドはアミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）である。いくつかの実施形態においては、該アフィニティーリガンドはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）である。いくつかの実施形態においては、該アフィニティーリガンドはβ−アミノエチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＥＧＡ）である。いくつかの実施形態においては、該アフィニティーリガンドはアミノエチルフコース（ＡＥＦ）である。他の実施形態においては、該アフィニティーリガンドはＤ−グルコサミン（ＧＡ）である。ある実施形態においては、糖リガンドは「Ｄ」立体配置を有する。他の実施形態においては、糖リガンドは「Ｌ」立体配置を有する。以下に、これらの典型的なアフィニティーリガンドの構造を示す。他の典型的なアフィニティーリガンドは当業者により認識されるであろう。
【０１４７】
【化２１】
2013541500.tif 000031
種々の実施形態においては、該アフィニティリガンドは多糖、糖ペプチドまたは糖脂質である。ある実施形態においては、該アフィニティリガンドは２〜１０個の糖部分、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の部分を含む。該多糖、糖ペプチドまたは糖脂質の末端および／または内部残基は、問題のレクチンの糖特異性に基づいて選択されうる（例えば、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３１７：５００−５０４，１９７３およびＬｉｓら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：３５−６７，１９８６を参照されたい）。
【０１４８】
種々の実施形態においては、個々のコンジュゲート／修飾レクチンの組合せに関するアフィニティリガンドは実験的に選択されうる。そのような実施形態においては、グルコースと比較された場合の該修飾レクチンに対するそれらの相対結合アフィニティーに基づいて、１以上のアフィニティリガンドがスクリーニングされる。ある実施形態においては、このようにして糖および／または多糖のライブラリーがスクリーニングされる。適当なアフィニティリガンドはグルコースとの検出可能なレベルの競合を示すが、該修飾レクチンとグルコースとの間の全ての結合をそれが妨げるほど強くは競合しないであろう。
【０１４９】
他の典型的な標的分子／アフィニティリガンドの組合せが当業者により認識されるであろう。一般に、アフィニティリガンドは、標的分子自体を使用して、および／または標的分子の誘導体を作製することにより（例えば、標的分子に対して化学的および／または立体化学的修飾を施し、ついで、生じた誘導体を、問題の修飾レクチンに対するその相対アフィニティに関してスクリーニングすることにより）、任意の標的分子に対して作製されうる。
【０１５０】
後記に更に詳細に記載されているとおり、該アフィニティリガンドは該コンジュゲートのフレームワーク内に（例えば、重合体バックボーンの一部として、または単量体の側鎖基として）天然で存在しうる。代替的（または付加的に）、アフィニティリガンドは（例えば、コンジュゲートフレームワークに合成的に付加された化学基の形態で）コンジュゲートフレームワーク内に人工的に取り込まれうる。ある実施形態においては、コンジュゲートは、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上または１００以上のアフィニティーリガンドを含むフレームワークを含むうる。ある実施形態においては、コンジュゲートは、２〜５、２〜１０、２〜２０、２〜２５、２〜５０または２〜１００のアフィニティーリガンドを含むフレームワークを含みうる。ある実施形態においては、コンジュゲートは、わずか２、３または４個の別々のアフィニティーリガンドを含むフレームワークを含みうる。
【０１５１】
アフィニティリガンドをコンジュゲートフレームワークにコンジュゲート化するための方法は後記で更に詳細に記載されている。ある実施形態においては、該アフィニティリガンドが糖を含む場合、コンジュゲート化（直接的であるか間接的であるかに無関係に）該糖のＣ１、Ｃ２またはＣ６位を含む。ある実施形態においては、該コンジュゲート化はＣ１位を含む。該Ｃ１位はアノマー炭素とも称され、アルファまたはベータコンホメーションで該コンジュゲートフレームワークに連結されうる。ある実施形態においては、該Ｃ１位はアルファアノマーとして構成される。他の実施形態においては、該Ｃ１位はベータアノマーとして構成される。
【０１５２】
薬物
前記のとおり、種々の実施形態においては、コンジュゲートは薬物を含みうる。例えば、該マテリアルが、例えば制御可能な様態で患者において薬物を運搬するために、治療目的で使用される場合、薬物が含まれうる。コンジュゲートは任意の薬物を含みうると理解されるべきである。コンジュゲートは同一薬物の２コピー以上を含むことが可能であり、および／または２以上のタイプの薬物を含むことが可能である。該コンジュゲートはいずれかの特定の薬物に限定されるものではなく、小分子薬物または生体分子薬物を含みうる。一般に、使用される薬物は、治療すべき疾患または障害に左右されるであろう。
【０１５３】
例えば、限定的なものではないが、種々の実施形態においては、コンジュゲートは以下の薬物のいずれかを含みうる：ジクロフェナック（ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ）、ニフェジピン（ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）、リバスチグミン（ｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎｅ）、メチルフェニデート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｉｄａｔｅ）、フルオロキセチン（ｆｌｕｏｒｏｘｅｔｉｎｅ）、ロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、コデイン（ｃｏｄｅｉｎｅ）、エチルモルヒネ（ｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｉｎｅ）、デキストロメトルファン（ｄｅｘｔｒｏｍｅｔｈｏｒｐｈａｎ）、ノスカピン（ｎｏｓｃａｐｉｎｅ）、ペントキシベリン（ｐｅｎｔｏｘｉｖｅｒｉｎｅ）、アセチルシステイン（ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ブロムヘキシン（ｂｒｏｍｈｅｘｉｎｅ）、エピネフリン（ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、イソプレナリン（ｉｓｏｐｒｅｎａｌｉｎｅ）、オルシプレナリン（ｏｒｃｉｐｒｅｎａｌｉｎｅ）、エフェドリン（ｅｐｈｅｄｒｉｎｅ）、フェノテロール（ｆｅｎｏｔｅｒｏｌ）、リミテロール（ｒｉｍｉｔｅｒｏｌ）、イプラトロピウム（ｉｐｒａｔｒｏｐｉｕｍ）、コリネテオフィリナート（ｃｈｏｌｉｎｅｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎａｔｅ）、プロキシフィリン（ｐｒｏｘｉｐｈｙｌｌｉｎｅ）、ベクロメタゾン（ｂｅｃｈｌｏｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）、デスラノシド（ｄｅｓｌａｎｏｓｉｄｅ）、ジゴキシン（ｄｉｇｏｘｉｎｅ）、ジギトキシン（ｄｉｇｉｔｏｘｉｎ）、ジソピラミド（ｄｉｓｏｐｙｒａｍｉｄｅ）、プロスシラリジン（ｐｒｏｓｃｉｌｌａｒｉｄｉｎ）、チニジン（ｃｈｉｎｉｄｉｎｅ）、プロカインアミド（ｐｒｏｃａｉｎａｍｉｄｅ）、メキシレチン（ｍｅｘｉｌｅｔｉｎ）、フレカイニド（ｆｌｅｃａｉｎｉｄｅ）、アルプレノロール（ａｌｐｒｅｎｏｌｏｌ）、プロプロアノロール（ｐｒｏｐｒｏａｎｏｌｏｌ）、ナドロール（ｎａｄｏｌｏｌ）、ピンドロール（ｐｉｎｄｏｌｏｌ）、オクスプレノロール（ｏｘｐｒｅｎｏｌｏｌ）、ラベタロール（ｌａｂｅｔａｌｏｌ）、チルノロール（ｔｉｒｎｏｌｏｌ）、アテノロール（ａｔｅｎｏｌｏｌ）、ペンタエリトリチルテトラニトラート（ｐｅｎｔａｅｒｉｔｒｉｔｙｌｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）、イソソルビドジニトラート（ｉｓｏｓｏｒｂｉｄｄｉｎｉｔｒａｔｅ）、イソソルビドモノニトラート（ｉｓｏｓｏｒｂｉｄｍｏｎｏｎｉｔｒａｔｅ）、ニフェジピン（ｎｉｐｈｅｄｉｐｉｎ）、フェニルアミン、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、ジルチアゼム（ｄｉｌｔｉａｚｅｍ）、シクランデラル（ｃｙｃｌａｎｄｅｌａｒ）、ニコチニルアルコールホール（ｎｉｃｏｔｉｎｙｌａｌｃｈｏｌｈｏｌ）、イノシトールニコチナート（ｉｎｏｓｉｔｏｌｎｉｃｏｔｉｎａｔｅ）、アルプロスタトジル（ａｌｐｒｏｓｔａｔｄｉｌ）、エチレフリン（ｅｔｉｌｅｐｈｒｉｎｅ）、プレナルテロール（ｐｒｅｎａｌｔｅｒｏｌ）、ドブタミン（ｄｏｂｕｔａｍｉｎｅ）、ドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ）、ジヒドロエルゴタミン（ｄｉｈｙｄｒｏｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ）、グアネチジン（ｇｕａｎｅｔｉｄｉｎｅ）、ベタニジン（ｂｅｔａｎｉｄｉｎｅ）、メチルドーパ（ｍｅｔｈｙｌｄｏｐａ）、レセルピン（ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ）、グアンファシン（ｇｕａｎｆａｃｉｎｅ）、トリメタファン（ｔｒｉｍｅｔｈａｐｈａｎ）、ヒドララジン（ｈｙｄｒａｌａｚｉｎｅ）、ジヒドララジン（ｄｉｈｙｄｒａｌａｚｉｎｅ）、プラゾシン（ｐｒａｚｏｓｉｎｅ）、ジアゾキシド（ｄｉａｚｏｘｉｄ）、カプトプリル（ｃａｐｔｏｐｒｉｌ）、ニフェジピン（ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）、エナラプリル（ｅｎａｌａｐｒｉｌ）、ニトロプルシド（ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ）、ベンドロフルメチアジド（ｂｅｎｄｒｏｆｌｕｍｅｔｈｉａｚｉｄｅ）、ヒドロクロルチアジド（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｔｈｉａｚｉｄｅ）、メチクロチアジド（ｍｅｔｙｃｈｌｏｔｈｉａｚｉｄｅ）、ポリチアジド（ｐｏｌｙｔｈｉａｚｉｄｅ）、クロルサリドン（ｃｈｌｏｒｔｈａｌｉｄｏｎ）、シネタゾン（ｃｉｎｅｔａｚｏｎ）、クロパミド（ｃｌｏｐａｍｉｄｅ）、メフルシド（ｍｅｆｒｕｓｉｄｅ）、メトラゾン（ｍｅｔｈｏｌａｚｏｎｅ）、ブメタニド（ｂｕｍｅｔａｎｉｄｅ）、エタクリナシド（ｅｔｈａｃｒｙｎａｃｉｄｅ）、スピロノラクトン（ｓｐｉｒｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミロリド（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ）、クロフィブレート（ｃｈｌｏｆｉｂｒａｔｅ）、ニコチン酸、ニケリトロール（ｎｉｃｈｅｒｉｔｒｏｌ）、ブロムフェニラミン（ｂｒｏｍｐｈｅｎｉｒａｍｉｎｅ）、シンナリジン（ｃｉｎｎａｒｉｚｉｎｅ）、デキスクロルフェニラミン（ｄｅｘｃｈｌｏｒｐｈｅｎｉｒａｍｉｎｅ）、クレマスチン（ｃｌｅｍａｓｔｉｎｅ）、アンタゾリン（ａｎｔａｚｏｌｉｎｅ）、シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）、プロエタジン（ｐｒｏｅｔｈａｚｉｎｅ）、シメチジン（ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ）、ラニチジン（ｒａｎｉｔｉｄｉｎｅ）、スクラルファット（ｓｕｃｒａｌｆａｔ）、パパベリン（ｐａｐａｖｅｒｉｎｅ）、モキサベリン（ｍｏｘａｖｅｒｉｎｅ）、アトロピン（ａｔｒｏｐｉｎ）、ブチルスコポラミン（ｂｕｔｙｌｓｃｏｐｏｌａｍｉｎ）、エメプロン（ｅｍｅｐｒｏｎ）、グルコピロン（ｇｌｕｃｏｐｙｒｒｏｎ）、ヒオスシアミン（ｈｙｏｓｃｙａｍｉｎｅ）、メペンソラル（ｍｅｐｅｎｓｏｌａｒ）、メチルスコポラミン（ｍｅｔｈｙｌｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ）、オキシフェンシクリミン（ｏｘｉｐｈｅｎｃｙｃｌｉｍｉｎｅ）、プロバンテリン（ｐｒｏｂａｎｔｅｌｉｎｅ）、テロジリン（ｔｅｒｏｄｉｌｉｎ）、センナグリコシド（ｓｅｎｎａｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、サグラダエクストラクト（ｓａｇｒａｄａｅｘｔｒａｃｔ）、ダントロン（ｄａｎｔｒｏｎ）、ビサコジル（ｂｉｓａｃｈｏｄｙｌ）、ナトリウムピコスルフェート（ｓｏｄｉｕｍｐｉｃｏｓｕｌｆａｔ）、エツロス（ｅｔｕｌｏｓ）、ジフェノールキシレート（ｄｉｐｈｅｎｏｌｘｙｌａｔｅ）、ロペルアミド（ｌｏｐｅｒａｍｉｄｅ）、サラゾスルファピリジン（ｓａｌａｚｏｓｕｌｆａｐｙｒｉｄｉｎｅ）、ピルビン（ｐｙｒｖｉｎ）、メベンダゾール（ｍｅｂｅｎｄａｚｏｌ）、ジメチコン（ｄｉｍｅｔｉｃｏｎ）、フェロフマラート（ｆｅｒｒｏｆｕｍａｒａｔｅ）、フェロスクシナート（ｆｅｒｒｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、フェリテトラセミナトリウム（ｆｅｒｒｉｔｅｔｒａｓｅｍｉｓｏｄｉｕｍ）、シアノコバラミン（ｃｙａｎｏｃｈｏｂａｌａｍｉｎｅ）、葉酸（ｆｏｌｉｄ  ａｃｉｄ）ヘパリン、ヘパリン補因子、ジクルマロール（ｄｉｃｕｌｍａｒｏｌｅ）、ワルファリン（ｗａｒｆａｒｉｎ）、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ビタミンＫ、チオペタ（ｔｈｉｏｐｅｔａ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄ）、メルファラン（ｍｅｌｆａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎ）、メルカトプリン（ｍｅｒｃａｔｏｐｕｒｉｎ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎ）、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｈｒｉｓｔｉｎ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、デカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、アムサクリン（ａｍｓａｃｈｒｉｎ）、アミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｈｅｔｉｍｉｄ）、ホスフェストロール（ｐｈｏｓｐｈｅｓｔｒｏｌ）、メドロキシプログレステロン（ｍｅｄｒｏｘｉｐｒｏｇｒｅｓｔｅｒｏｎｅ）、ヒドロキシプロゲステロン（ｈｙｄｒｏｘｉｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、メゲステロール（ｍｅｇｅｓｔｅｒｏｌ）、ノルエチステロン（ｎｏｒｅｔｉｓｔｅｒｏｎ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｐｈｅｎ）、シクロスポリン（ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）、スルホソミジン（ｓｕｌｆｏｓｏｍｉｄｉｎｅ）、ベンシルペニシリン（ｂｅｎｓｙｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、フェノキシメチルペニシリン（ｐｈｅｎｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、ジクロキサシリン（ｄｉｃｌｏｘａｃｉｌｌｉｎ）、クロキサシリン（ｃｌｏｘａｃｉｌｌｉｎ）、フルコキサシリン（ｆｌｕｃｏｘａｃｉｌｌｉｎ）、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、アモキシシリン（ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ）、ピバンピシリン（ｐｉｖａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、バカンピシリン（ｂａｃａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、ピペラシリン（ｐｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ）、メジオシリン（ｍｅｚｉｏｃｉｌｌｉｎ）、メシリナム（ｍｅｃｉｌｌｉｎａｍ）、ピブメシリナム（ｐｉｖｍｅｃｉｌｌｉｎａｍ）、セファロチン（ｃｅｐｈａｌｏｔｉｎ）、セファレキシン（ｃｅｐｈａｌｅｘｉｎ）、セフラジン（ｃｅｐｈｒａｄｉｎ）、セファドロキシル（ｃｅｐｈａｄｒｏｘｉｌ）、セファクロル（ｃｅｐｈａｃｌｏｒ）、セフロキシム（ｃｅｆｕｒｏｘｉｍ）、セフォタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｍ）、セフタジジム（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍ）、セフォキシチン（ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ）、アズトレオナム（ａｚｔｒｅｏｎａｍ）、イミペナム（ｉｍｉｐｅｎｅｍ）、シラスタチン（ｃｉｌａｓｔａｔｉｎ）、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、リメサイクリン（���ｙｍｅｃｙｃｌｉｎｅ）、デメクロサイクリン（ｄｅｍｅｃｌｏｃｙｃｌｉｎｅ）、メタサイクリン（ｍｅｔａｃｙｃｌｉｎｅ）、オキシテトラサイクリン（ｏｘｉｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、スピラマイシン（ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ）、フシジン酸、リンコマイシン（ｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎ）、クリンダマイシン（ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）、スペクチノマイシン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、リファンピシン（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）、アンホテリシン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）Ｂ、グリセオフルビン（ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）、ナイスタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ）、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、メトロニダゾール（ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、チニダゾール（ｔｉｎｉｄａｚｏｌｅ）、トリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）、ノルフロキサシン（ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ）、サラゾスルファピリジン（ｓａｌａｚｏｓｕｌｆａｐｙｒｉｄｉｎ）、アミノサリル（ａｍｉｎｏｓａｌｙｌ）、イソニアジド（ｉｓｏｎｉａｚｉｄ）、エタンブトール（ｅｔａｍｂｕｔｏｌ）、ニトロフラントイン（ｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）、ナリジクス酸、メタナミン（ｍｅｔａｎａｍｉｎｅ）、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎ）、ヒドロキシクロロキン（ｈｙｄｒｏｘｉｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎ）、チニダゾール（ｔｉｎｉｄａｚｏｌ）、ケトコナゾール（ｋｅｔｏｋｏｎａｚｏｌ）、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、インターフェロン  イドクスウリジン（ｉｄｏｘｕｒｉｄｉｎ）、レチナール（ｒｅｔｉｎａｌ）、チアミン（ｔｉａｍｉｎ）、デクスパンテノール（ｄｅｘｐａｎｔｅｎｏｌ）、ピリドキシン（ｐｙｒｉｄｏｘｉｎ）、葉酸、アスコルビン酸、トコフェロール、フィトミナジオン（ｐｈｙｔｏｍｉｎａｄｉｏｎ）、フェンフルラミン（ｐｈｅｎｆｌｕｒａｍｉｎ）、コルチコトロピン（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ）、テトラコサクチド（ｔｅｔｒａｃｏｓａｃｔｉｄ）、チロトロピン（ｔｙｒｏｔｒｏｐｉｎ）、ソマトトプリン（ｓｏｍａｔｏｔｏｐｒｉｎ）、ソマトレム（ｓｏｍａｔｒｅｍ）、バソプレッシン（ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）、リプレッシン（ｌｙｐｒｅｓｓｉｎ）、デスモプレッシン（ｄｅｓｍｏｐｒｅｓｓｉｎ）、オキシトシン（ｏｘｙｔｏｃｉｎ）、クロリオンゴナドトロ
ピン（ｃｈｌｏｒｉｏｎｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）、コルチゾン（ｃｏｒｔｉｓｏｎ）、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、フルオドロコルチゾン（ｆｌｕｏｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎ）、フルオキシメステロン（ｆｌｕｏｘｉｍｅｓｔｅｒｏｎ）、メステロロン（ｍｅｓｔｅｒｏｌｏｎ）、ナンドロロン（ｎａｎｄｒｏｌｏｎ）、スタノゾロール（ｓｔａｎｏｚｏｌｏｌ）、オキシメトロン（ｏｘｉｍｅｔｏｌｏｎ）、シプロテロン（ｃｙｐｒｏｔｅｒｏｎ）、レボチロキシン（ｌｅｖｏｔｙｒｏｘｉｎ）、リオチロニン（ｌｉｏｔｙｒｏｎｉｎ）、プロピルチオウラシル（ｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏｕｒａｃｉｌ）、カルビマゾール（ｃａｒｂｉｍａｚｏｌ）、チアマゾール（ｔｉａｍａｚｏｌ）、ジヒドロタキステロール（ｄｉｈｙｄｒｏｔａｃｈｙｓｔｅｒｏｌ）、アルファカルシドール（ａｌｆａｃａｌｃｉｄｏｌ）、カルシチロール（ｃａｌｃｉｔｉｒｏｌ）、インスリン、トルブタミド（ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄ）、クロルプロパミド（ｃｈｌｏｒｐｒｏｐａｍｉｄ）、トラザミド（ｔｏｌａｚａｍｉｄ）、グリピジド（ｇｌｉｐｉｚｉｄ）、グリベンクラミド（ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄ）、フェノバルビタール（ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ）、メチピロン（ｍｅｔｈｙｐｒｙｌｏｎ）、ピリチジオン（ｐｙｒｉｔｙｉｄｉｏｎ）、メプロバマート（ｍｅｐｒｏｂａｍａｔ）、クロルジアゼポキシド（ｃｈｌｏｒｄｉａｚｅｐｏｘｉｄ）、ジアゼパム（ｄｉａｚｅｐａｍ）、ニトラゼパム（ｎｉｔｒａｚｅｐａｍ）、バクロフェン（ｂａｃｌｏｆｅｎ）、オキサゼパム（ｏｘａｚｅｐａｍ）、クロラゼパート二カリウム（ｄｉｋａｌｉｕｍｃｌｏｒａｚｅｐａｔ）、ロラゼパム（ｌｏｒａｚｅｐａｍ）、フルニトラゼパム（ｆｌｕｎｉｔｒａｚｅｐａｍ）、アルプラゾラム（ａｌｐｒａｚｏｌａｍ）、ミダゾラム（ｍｉｄａｚｏｌａｍ）、ヒドロキシジン（ｈｙｄｒｏｘｉｚｉｎ）、ダントロレン（ｄａｎｔｒｏｌｅｎｅ）、クロメチアゾール（ｃｈｌｏｍｅｔｉａｚｏｌ）、プロピオンマジン（ｐｒｏｐｉｏｎｍａｚｉｎｅ）、アリメマジン（ａｌｉｍｅｍａｚｉｎｅ）、クロルプロマジン（ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ）、レボメプロマジン（ｌｅｖｏｍｅｐｒｏｍａｚｉｎｅ）、アセトフェナジン（ａｃｅｔｏｐｈｅｎａｚｉｎｅ）、フルフェナジン（ｆｌｕｐｈｅｎａｚｉｎｅ）、ペルフェナジン（ｐｅｒｐｈｅｎａｚｉｎｅ）、プロクロルペラジン（ｐｒｏｃｈｌｏｒｐｅｒａｚｉｎｅ）、トリフルオペラジン（ｔｒｉｆｌｕｏｐｅｒａｚｉｎｅ）、ジキシラジン（ｄｉｘｙｒａｚｉｎｅ）、チオジラジン（ｔｈｉｏｄｉｒａｚｉｎｅ）、ペリシアジン（ｐｅｒｉｃｉａｚｉｎ）、クロプロチキセン（ｃｈｌｏｐｒｏｔｈｉｘｅｎｅ）、チザニジン（ｔｉｚａｎｉｄｉｎｅ）、ザレプロン（ｚａｌｅｐｌｏｎ）、ズクロペンチゾール（ｚｕｃｌｏｐｅｎｔｉｚｏｌ）、フルペンチゾール（ｆｌｕｐｅｎｔｉｚｏｌ）、チチキセン（ｔｈｉｔｈｉｘｅｎ）、ハロペリドール（ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ）、トリミプラミン（ｔｒｉｍｉｐｒａｍｉｎ）、オピプラモール（ｏｐｉｐｒａｍｏｌ）、クロミプラミン（ｃｈｌｏｍｉｐｒａｍｉｎ）、デシプラミン（ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎ）、ロフェプラミン（ｌｏｆｅｐｒａｍｉｎ）、アミトリプチリン（ａｍｉｔｒｉｐｔｙｌｉｎ）、ノルトリプチリン（ｎｏｒｔｒｉｐｔｙｌｉｎ）、プロトリプチリン（ｐｒｏｔｒｉｐｔｙｌｉｎ）、マプトロチリン（ｍａｐｔｒｏｔｉｌｉｎ）、カフェイン、シンナリジン（ｃｉｎｎａｒｉｚｉｎｅ）、シクリジン（ｃｙｃｌｉｚｉｎｅ）、ジメンヒジナート（ｄｉｍｅｎｈｙｄｉｎａｔｅ）、メクロジン（ｍｅｃｌｏｚｉｎｅ）、プロメタジン（ｐｒｏｍｅｔａｚｉｎｅ）、チエチルペラジン（ｔｈｉｅｔｈｙｌｐｅｒａｚｉｎｅ）、メトクロプラミド（ｍｅｔｏｃｌｏｐｒａｍｉｄｅ）、スコポラミン（ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ）、フェノバルビタール（ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ）、フェニトイン（ｐｈｅｎｙｔｏｉｎｅ）、エトスクシミド（ｅｔｈｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）、プリミドン（ｐｒｉｍｉｄｏｎｅ）、カルバマゼピン（ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎｅ）、クロナゼパム（ｃｈｌｏｎａｚｅｐａｍ）、オルフェナドリン（ｏｒｐｈｅｎａｄｒｉｎｅ）、アトロピン（ａｔｒｏｐｉｎｅ）、ベンサトロピン（ｂｅｎｓａｔｒｏｐｉｎｅ）、ビペリデン（ｂｉｐｅｒｉｄｅｎ）、メチキセン（ｍｅｔｉｘｅｎｅ）、プロシリジン（ｐｒｏｃｙｌｉｄｉｎｅ）、レボドパ（ｌｅｖｏｄｏｐａ）、ブロモクリプチン（ｂｒｏｍｏｃｒｉｐｔｉ）、アマンタジン（ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）、アンベノン（ａｍｂｅｎｏｎ）、ピリドスチグミン（ｐｙｒｉｄｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、シンスチグミン（ｓｙｎｓｔｉｇｍｉｎｅ）、ジスルフィラム（ｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ）、モルヒネ（ｍｏｒｐｈｉｎｅ）、コデイン（ｃｏｄｅｉｎｅ）、ペンタゾシン（ｐｅｎｔａｚｏｃｉｎｅ）、ブプレノルフィン（ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ）、ペチジン（ｐｅｔｈｉｄｉｎｅ）、フェノペリジン（ｐｈｅｎｏｐｅｒｉｄｉｎｅ）、フェンタニル（ｐｈｅｎｔａｎｙｌ）、メサドン（ｍｅｔｈａｄｏｎｅ）、ピリトラミド（ｐｉｒｉｔｒａｍｉｄｅ）、デキストロプロポキシフェン（ｄｅｘｔｒｏｐｒｏｐｏｘｙｐｈｅｎｅ）、ケトベミドン（ｋｅｔｏｂｅｍｉｄｏｎｅ）、アセチルサリチル酸、セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、フェナゾン（ｐｈｅｎａｚｏｎｅ）、フェニルブタゾン（ｐｈｅｎｙｌｂｕｔａｚｏｎｅ）、アザプロパゾン（ａｚａｐｒｏｐａｚｏｎｅ）、ピロキシカム（ｐｉｒｏｘｉｃａｍ）、エルゴタミン（ｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ）、ジヒドロエルゴタミン（ｄｉｈｙｄｒｏｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ）、シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）、ピジチフェン（ｐｉｚｉｔｉｆｅｎ）、フルメドロキソン（ｆｌｕｍｅｄｒｏｘｏｎ）、アロプリノール（ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ）、プロベネシド（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ）、マルロチオマラートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｍａｕｒｏｔｈｉｏｍａｌａｔｅ）  オーロノフィン（ａｕｒｏｎｏｆｉｎ）、ペニシラミン（ｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ）、エストラジオール（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、エストラジオールバレリアナート（ｅｓｔｒａｄｉｏｌｖａｌｅｒｉａｎａｔｅ）、エストリオール（ｅｓｔｒｉｏｌ）、エチニルエストラジオール（ｅｔｈｉｎｙｌｅｓｔｒａｄｉ���ｌ）、ジヒドロゲステロン（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎ）、リネストレノール（ｌｙｎｅｓｔｒｅｎｏｌ）、メドロキシプログレステロン（ｍｅｄｒｏｘｉｐｒｏｇｒｅｓｔｅｒｏｎｅ）、ノルエチステロン（ｎｏｒｅｔｉｓｔｅｒｏｎｅ）、シクロフェニレ（ｃｙｃｌｏｐｈｅｎｉｌｅ）、クロミフェン（ｃｌｏｍｉｐｈｅｎｅ）、レボノルゲストレル（ｌｅｖｏｎｏｒｇｅｓｔｒｅｌ）、メストラノール（ｍｅｓｔｒａｎｏｌ）、オルニダゾール（ｏｒｎｉｄａｚｏｌ）、チニダゾール（ｔｉｎｉｄａｚｏｌ）、エコナゾール（ｅｋｏｎａｚｏｌ）、クロトリマゾール（ｃｈｌｏｔｒｉｍａｚｏｌ）、ナタマイシン（ｎａｔａｍｙｃｉｎｅ）、ミコナゾール（ｍｉｃｏｎａｚｏｌｅ）、スルベンチン（ｓｕｌｂｅｎｔｉｎ）、メチルエルゴタミン（ｍｅｔｈｙｌｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ）、ジノプロスト（ｄｉｎｏｐｒｏｓｔ）、ジノプロストン（ｄｉｎｏｐｒｏｓｔｏｎ）、ゲメプロスト（ｇｅｍｅｐｒｏｓｔ）、ブロモクリプチン（ｂｒｏｍｏｃｒｉｐｔｉｎｅ）、フェニルプロパノールアミン、ナトリウムクロモグリカート（ｓｏｄｉｕｍｃｈｒｏｍｏｇｌｉｃａｔｅ）、アゼタソラミド（ａｚｅｔａｓｏｌａｍｉｄｅ）、ジクロフェンアミド（ｄｉｃｈｌｏｐｈｅｎａｍｉｄｅ）、ベータカロテン、ナロキソン（ｎａｌｏｘｏｎｅ）、葉酸カルシウム、特にクロニジン（ｃｌｏｎｉｄｉｎｅ）、テフィリン（ｔｈｅｐｈｙｌｌｉｎｅ）、ジピラダモール（ｄｉｐｙｒａｄａｍｏｌ）、ヒドロクロチアザード（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｔｈｉａｚａｄｅ）、スコポラミン（ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ）、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎｅ）、フロセミド（ｆｕｒｏｓｅｍｉｄｅ）、塩化カリウム、モルヒネ（ｍｏｒｐｈｉｎｅ）、イブプロフェン（ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）、サルブタモール（ｓａｌｂｕｔａｍｏｌ）、テルブタリン（ｔｅｒｂｕｔａｌｉｎ）、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）など。この一覧は典型例であると意図され、本開示のコンジュゲートにおいては、任意の薬物が、それが公知であるか後に発見されるかにかかわらず使用可能であると理解されるべきである。
【０１５４】
種々の実施形態においては、コンジュゲートは、ペプチド性または非ペプチド性でありうる例えば以下のようなホルモン薬を含みうる：アドレナリン、ノルアドレナリン、アンジオテンシン、アトリオペプチン、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、カルシトニン、カルシトリオール、カルシジオール、コルチコトロピン、コルチゾール、ドーパミン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、エリスロポエチン、濾胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ヒスタミン、ヒト胎盤性ラクトゲン、インスリン、インスリン様増殖因子、インヒビン、レプチン、ロイコトリエン、リポトロピン、メラトニン、オレキシン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、プロスタグランジン、レニン、セロトニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（または甲状腺刺激ホルモン）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、チロキシン、トリヨードチロニン、バソプレッシンなど。ある実施形態においては、該ホルモンは、グルカゴン、インスリン、インスリン様増殖因子、レプチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（または甲状腺刺激ホルモン）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、チロキシンおよびトリヨードチロニンから選択されうる。この一覧は典型例であると意図され、本開示のコンジュゲートにおいては、任意のホルモン薬が、それが公知であるか後に発見されるかにかかわらず使用可能であると理解されるべきである。
【０１５５】
種々の実施形態においては、コンジュゲートは甲状腺ホルモンを含みうる。
【０１５６】
種々の実施形態においては、コンジュゲートは抗糖尿病薬（すなわち、糖尿病に罹患している患者に有益な効果を与える薬物）を含みうる。
【０１５７】
種々の実施形態においては、コンジュゲートはインスリン分子を含みうる。本明細書中で用いる「インスリン」または「インスリン分子」なる語はインスリン分子の全ての塩および非塩形態を含む。該塩形態は、インスリン分子に応じて、アニオン性またはカチオン性でありうる、と理解されるであろう。「インスリン」または「インスリン分子」は、それが生物活性である（すなわち、インビボで投与された場合に、グルコースにおける検出可能な減少を引き起こしうる）限り、野生型および修飾形態の両方のインスリンを含むと意図される。野生型インスリンは、精製形態、合成形態または組換え形態のいずれであるかには無関係に、任意の種に由来するインスリンを含む（例えば、ヒトインスリン、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど）。これらのうちの幾つかは例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から商業的に入手可能である。
【０１５８】
ヒトインスリンの野生型配列を以下に及び図２５に示す。
【０１５９】
【化２２】
2013541500.tif 000032
本開示はヒトインスリン分子（すなわち、ヒトプロインスリンまたは生物活性ヒトインスリン分子）に限定されない。一般に、本開示は、インスリン様生物活性を保有する（すなわち、インビボで適当な用量で適当な種に投与された場合にグルコースにおける検出可能な減少を引き起こしうる）任意のヒトまたは非ヒトインスリンを含む。例えば、後記のとおり、本開示はまた、修飾ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなどを含む。
【０１６０】
本開示のインスリン分子は、野生型インスリンに存在しない化学修飾および／または突然変異を含みうる、と理解されるべきである。種々の修飾インスリンが当技術分野で公知である（例えば、ＣｒｏｔｔｙおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｅｍｅｒｇ．Ｃａｒｅ．２３：９０３−９０５，２００７ならびにＧｅｒｉｃｈ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１１３：３０８−１６，２００２ならびにそれらにおいて引用されている参考文献を参照されたい）。インスリンの修飾形態は（例えば、化学的部分、例えば後記のＰＥＧ基または脂肪アシル鎖の付加により）化学修飾されることが可能であり、および／または突然変異（すなわち、アミノ酸の付加、欠失または置換により突然変異）されることが可能である。
【０１６１】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、１〜１０個（例えば、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜９、６〜８、６〜７、７〜９、７〜８、８〜９、９、８、７、６、５、４、３、２または１個）のアミノ酸置換、付加および／または欠失において野生型インスリンとは異なる。ある実施形態においては、本開示のインスリン分子はアミノ酸置換のみにおいて野生型インスリンとは異なる。ある実施形態においては、本開示のインスリン分子はアミノ酸付加のみにおいて野生型インスリンとは異なる。ある実施形態においては、本開示のインスリン分子はアミノ酸置換および欠失の両方において野生型インスリンとは異なる。
【０１６２】
ある実施形態においては、アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいて施されうる。ある実施形態においては、置換は保存的でありうる。すなわち、アミノ酸は、類似した形状および電荷のアミノ酸で置換される。保存的置換は当技術分野でよく知られており、典型的には、以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびチロシン、フェニルアラニン。ある実施形態においては、適当な突然変異の選択の際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮されうる。ポリペプチドに相互作用性生物学的機能を付与する際の疎水性アミノ酸指数の重要性は当技術分野において一般に理解されている。あるいは、親水性に基づいて、同様のアミノ酸の置換が有効に施されうる。ポリペプチドの相互作用性生物学的機能を付与する際の親水性の重要性は当技術分野において一般に理解されている。ポリペプチドを設計する際の疎水性指数または親水性の利用は米国特許第５，６９１，１９８号に更に詳細に記載されている。
【０１６３】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下の式（Ｘ１）に示されているとおり、配列番号２４（Ａ−ペプチド）のアミノ酸配列および配列番号２５（Ｂ−ペプチド）のアミノ酸配列および３つのジスルフィド架橋を含む。
【０１６４】
【化２３】
2013541500.tif 000033
式（Ｘ１）において、Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１位のそれぞれにおけるＸａａは、独立して、コード可能なアミノ酸、コード可能なアミノ酸（例えば、１〜２個、１〜３個、１〜４個などのコード可能なアミノ酸）の配列であるか、または欠落しており、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１８およびＡ２１位のそれぞれにおけるＸａａは、独立して、コード可能なアミノ酸であり、Ｂ３、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０位のそれぞれにおけるＸａａは、独立して、コード可能なアミノ酸であるか、または欠落している。
【０１６５】
いくつかの実施形態においては、Ａ０，Ａ２２，Ｂ０およびＢ３１位のそれぞれにおけるＸａａは欠落している。
【０１６６】
ある実施形態においては、式（Ｘ１）におけるＡ−およびＢ−ペプチドの位置の１以上におけるＸａａは、以下の表１および表２に記載されている選択肢から選択される。
【０１６７】
【表４】
2013541500.tif 000034
いくつかの実施形態においては、式（Ｘ１）のインスリン分子は、以下の表３に示されているものから選択されるＡ８、Ａ９、Ａ１０およびＢ３０位におけるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態においては、式（Ｘ１）のインスリン分子は、単一種に関して以下の表３に示されているもの（例えば、ヒト配列からのもの、すなわち、Ａ８におけるＴｈｒ、Ａ９におけるＳｅｒ、Ａ１０におけるＩｌｅおよびＢ３０におけるＴｈｒ）から選択されるＡ８、Ａ９、Ａ１０およびＢ３０位におけるアミノ酸を含む。
【０１６８】
【表５】
2013541500.tif 000035
種々の実施形態においては、本開示のインスリン分子はＢペプチド配列のＢ２８および／またはＢ２９位において突然変異している。例えば、インスリン  リスプロ（ｌｉｓｐｒｏ）（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））は、ＢペプチドのＣ末端の最後から２番目のリシンおよびプロリン残基が逆転している速効型インスリン突然変異体（ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン）である。この修飾はインスリン多量体の形成を阻止する。インスリンａｓｐａｒｔ（アスパルト）（ＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標））は、Ｂ２８位のプロリンがアスパラギン酸で置換された、もう１つの速効型インスリン突然変異体（ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン）である。この突然変異体も多量体の形成を妨げる。いくつかの実施形態においては、Ｂ２８および／またはＢ２９における突然変異は該インスリン分子内の他の位置における１以上の突然変異を伴う。例えば、インスリンｇｌｕｌｉｓｉｎｅ（グルリシン）（ＡＰＩＤＲＡ（登録商標））は、Ｂ３位におけるアスパラギン酸がリシン残基により置換されており、Ｂ２９位におけるリシンがグルタミン酸残基により置換されている、さらにもう１つの速効型インスリン突然変異体（ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン）である。
【０１６９】
種々の実施形態においては、本開示のインスリン分子は、ヒトインスリンと比較して変化している等電点を有する。いくつかの実施形態においては、等電点の変化は、インスリンＡペプチドのＮ末端および／またはインスリンＢペプチドのＣ末端に１以上のアルギニン残基を付加することにより達成される。そのようなインスリンポリペプチドの具体例には、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンおよびＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンが含まれる。もう１つの例として、インスリンｇｌａｒｇｉｎｅ（グラルジン）（ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））は、ＡｓｐＡ２１がグリシンにより置換されており、２つのアルギニン残基がＢペプチドのＣ末端に付加されている、典型的な持続型インスリン突然変異体である。これらの変化の効果は、等電点を変化させて、ｐＨ４において完全に可溶性である溶液を与えることである。したがって、いくつかの実施形態においては、本開示のインスリン分子は、Ａ２１がＧｌｙであるＡペプチド配列と、Ｂ３１がＡｒｇ−ＡｒｇであるＢペプチド配列とを含む。本開示は、これらの突然変異および本明細書に記載されている任意の他の突然変異（例えば、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン）の全ての単一および複数の組合せを含むと理解されるべきである。
【０１７０】
種々の実施形態においては、本開示のインスリン分子はトランケート化（末端切断）されている。例えば、Ｂペプチド配列は残基Ｂ（１−２）、Ｂ（１−３）、Ｂ３０、Ｂ（２９−３０）またはＢ（２８−３０）を欠いていることが可能である。いくつかの実施形態においては、これらの欠失および／またはトランケート化は前記インスリン分子のいずれにも当てはまる［限定的なものではないが例えば、これにより、デス（Ｂ３０）−インスリンｌｉｓｐｒｏ（リスプロ）、デス（Ｂ３０）−インスリンａｓｐａｒｔ（アスパルト）、デス（Ｂ３０）−インスリンｇｌｕｌｉｓｉｎｅ（グルリシン）、デス（Ｂ３０）−インスリンｇｌａｒｇｉｎｅ（グラルジン）が得られる］。
【０１７１】
いくつかの実施形態においては、インスリン分子はＡまたはＢペプチド配列のＮまたはＣ末端上に追加的なアミノ酸残基を含有する。いくつかの実施形態においては、Ａ０、Ａ２２、Ｂ０および／またはＢ３１位に１以上のアミノ酸残基が位置する。いくつかの実施形態においては、Ａ０位に１以上のアミノ酸残基が位置する。いくつかの実施形態においては、Ａ２２位に１以上のアミノ酸残基が位置する。いくつかの実施形態においては、Ｂ０位に１以上のアミノ酸残基が位置する。いくつかの実施形態においては、Ｂ３１位に１以上のアミノ酸残基が位置する。いくつかの実施形態においては、インスリン分子はＡ０、Ａ２２、Ｂ０またはＢ３１位にいずれの追加的アミノ酸残基をも含まない。
【０１７２】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、１以上のアミド化アミノ酸が酸性形態により置換された突然変異を有しうる。例えば、アスパラギンはアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換されうる。同様に、グルタミンはアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換されうる。特に、ＡｓｎＡ１８、ＡｓｎＡ２１もしくはＡｓｎＢ３またはそれらの残基の任意の組合せはアスパラギン酸またはグルタミン酸により置換されうる。ＧｌｎＡ１５もしくはＧｌｎＢ４またはそれらの両方はアスパラギン酸またはグルタミン酸により置換されうる。ある実施形態においては、インスリン分子はＡ２１位のアスパラギン酸またはＢ３位のアスパラギン酸またはそれらの両方を有する。
【０１７３】
生物活性を維持させたままインスリン分子内の更に他のアミノ酸を突然変異させることが可能である、と当業者は認識するであろう。例えば、限定的なものではないが、以下の修飾も当技術分野で広く受け入れられている：アスパラギン酸でのＢ１０位のヒスチジン残基の置換（ＨｉｓＢ１０→ＡｓｐＢ１０）；アスパラギン酸でのＢ１位のフェニルアラニン残基の置換（ＰｈｅＢ１→ＡｓｐＢ１）；アラニンでのＢ３０位のトレオニン残基の置換（ＴｈｒＢ３０→ＡｌａＢ３０）；アラニンでのＢ２６位のチロシン残基の置換（ＴｙｒＢ２６→ＡｌａＢ２６）；およびアスパラギン酸でのＢ９位のセリン残基の置換（ＳｅｒＢ９→ＡｓｐＢ９）。
【０１７４】
種々の実施形態においては、本開示のインスリン分子は、延長した作用プロファイルを有する。例えば、ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は脂肪酸でアシル化されうる。すなわち、該インスリン分子上のアミノ基と該脂肪酸のカルボン酸基との間でアミド結合が形成される。該アミノ基は該インスリン分子のＮ末端アミノ酸のアルファ−アミノ基であることが可能であり、あるいは該インスリン分子のリシン残基のイプシロン−アミノ基であることが可能である。本開示のインスリン分子は、野生型インスリンに存在する３つのアミノ基の１以上においてアシル化されることが可能であり、あるいは野生型配列内に導入されたリシン残基上でアシル化されることが可能である。ある実施形態においては、インスリン分子はＢ１位においてアシル化されうる。ある実施形態においては、インスリン分子はＢ２９位においてアシル化されうる。ある実施形態においては、該脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデシル酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデシル酸（Ｃ１７）およびステアリン酸（Ｃ１８）から選択される。例えば、インスリンｄｅｔｅｍｉｒ（デテミル）（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））は、ＴｈｒＢ３０が欠失しておりＣ１４脂肪酸鎖（ミリスチン酸）がＬｙｓＢ２９に結合している持続型インスリン突然変異体である。
【０１７５】
いくつかの実施形態においては、ＡペプチドのＮ末端、ＢペプチドのＮ末端、Ｂ２９位のＬｙｓのイプシロン−アミノ基または本開示のインスリン分子内の任意の他の利用可能なアミノ基は、一般式：
【０１７６】
【化２４】
2013541500.tif 000036
（式中、ＲＦは水素またはＣ１−３０アルキル基である）の脂肪酸部分に共有結合している。いくつかの実施形態においては、ＲＦはＣ１−２０アルキル基、Ｃ３−１９アルキル基、Ｃ５−１８アルキル基、Ｃ６−１７アルキル基、Ｃ８−１６アルキル基、Ｃ１０−１５アルキル基またはＣ１２−１４アルキル基である。ある実施形態においては、該インスリンポリペプチドはＡ１位の部分にコンジュゲート化される。ある実施形態においては、該インスリンポリペプチドはＢ１位の部分にコンジュゲート化される。ある実施形態においては、該インスリンポリペプチドはＢ２９位のイプシロン−アミノ基の部分にコンジュゲート化される。ある実施形態においては、該インスリン分子のＢ２８位はＬｙｓであり、ＬｙｓＢ２８のイプシロン−アミノ基が該脂肪酸部分にコンジュゲート化される。ある実施形態においては、該インスリン分子のＢ３位はＬｙｓであり、ＬｙｓＢ３のイプシロン−アミノ基が該脂肪酸部分にコンジュゲート化される。いくつかの実施形態においては、該脂肪酸鎖は８〜２０炭素長である。いくつかの実施形態においては、該脂肪酸はオクタン酸（Ｃ８）、ノナン酸（Ｃ９）、デカン酸（Ｃ１０）、ウンデカン酸（Ｃ１１）、ドデカン酸（Ｃ１２）またはトリデカン酸（Ｃ１３）である。ある実施形態においては、該脂肪酸はミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデカン酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデカン酸（Ｃ１７）、ステアリン酸（Ｃ１８）、ノナデカン酸（Ｃ１９）またはアラキジン酸（Ｃ２０）である。
【０１７７】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン（インスリンｌｉｓｐｒｏ（リスプロ））、ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン（インスリンａｓｐａｒｔ（アスパルト））、ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン（インスリンｇｌｕｌｉｓｉｎｅ（グルリシン））、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン（インスリンｇｌａｒｇｉｎｅ（グラルジン））、ＮεＢ２９−ミリストイル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン（インスリンｄｅｔｅｍｉｒ（デテミル））、ＡｌａＢ２６−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１ＧｌｕＢ１３−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、デス（Ｂ２７）−ヒトインスリン、デス（Ｂ２８−Ｂ３０）−ヒトインスリン、デス（Ｂ１）−ヒトインスリン、デス（Ｂ１−Ｂ３）−ヒトインスリン。
【０１７８】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−パルミトイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−パルミトイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０１７９】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−パルミトイル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−ミリストイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−パルミトイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−パルミトイル−γ−グルタミル）−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−リトコリル−γ−グルタミル）−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ヒトインスリン。
【０１８０】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。
【０１８１】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ３０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ａｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。
【０１８２】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。
【０１８３】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン。
【０１８４】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン。
【０１８５】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン。
【０１８６】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン。
【０１８７】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
【０１８８】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
【０１８９】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
【０１９０】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
【０１９１】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン。
【０１９２】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン。
【０１９３】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン。
【０１９４】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン。
【０１９５】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン。
【０１９６】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン。
【０１９７】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン。
【０１９８】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン。
【０１９９】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン。
【０２００】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン。
【０２０１】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０２０２】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０２０３】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０２０４】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０２０５】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０２０６】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０２０７】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０２０８】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０２０９】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０２１０】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
【０２１１】
ある実施形態においては、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−デス（Ｂ２６）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＡｓｐＢ１ＡｓｐＢ３ＡｓｐＢ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン。
【０２１２】
本開示は、前記突然変異および／または化学修飾のいずれかを含む、非ヒトインスリン（例えば、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど）の修飾形態をも含む。
【０２１３】
これらの及び他の修飾インスリン分子は米国特許第６，９０６，０２８号、第６，５５１，９９２号、第６，４６５，４２６号、第６，４４４，６４１号、第６，３３５，３１６号、第６，２６８，３３５号、第６，０５１，５５１号、第６，０３４，０５４号、第５，９５２，２９７号、第５，９２２，６７５号、第５，７４７，６４２号、第５，６９３，６０９号、第５，６５０，４８６号、第５，５４７，９２９号、第５，５０４，１８８号、第５，４７４，９７８号、第５，４６１，０３１号および第４，４２１，６８５号、ならびに米国特許第７，３８７，９９６号、第６，８６９，９３０号、第６，１７４，８５６号、第６，０１１，００７号、第５，８６６，５３８号および第５，７５０，４９７号に詳細に記載されている。
【０２１４】
インスリン分子を含む薬物をコンジュゲート化するための方法を以下に説明する。ある実施形態においては、インスリン分子はＡ１アミノ酸残基を介してコンジュゲートフレームワークにコンジュゲート化される。ある実施形態においては、Ａ１アミノ酸残基はグリシンである。しかし、本開示はＮ末端コンジュゲート化に限定されず、ある実施形態においては、インスリン分子は非末端Ａ−ペプチドアミノ酸残基を介してコンジュゲート化されうると理解されるべきである。特に、本開示は、（野生型の又は部位特異的突然変異誘発により導入された）Ａ−ペプチド内の任意の位置に存在するリシン残基のイプシロン−アミン基を介したコンジュゲート化を含む。Ａ−ペプチド上のコンジュゲート化位置が異なれば、インスリン活性の低下も異なりうると理解されるであろう。ある実施形態においては、インスリン分子はＢ１アミノ酸残基を介してコンジュゲートフレームワークにコンジュゲート化される。ある実施形態においては、Ｂ１アミノ酸残基はフェニルアラニンである。しかし、本開示はＮ末端コンジュゲート化に限定されず、ある実施形態においては、インスリン分子は非末端Ｂ−ペプチドアミノ酸残基を介してコンジュゲート化されうると理解されるべきである。特に、本開示は、（野生型の又は部位特異的突然変異誘発により導入された）Ｂ−ペプチド内の任意の位置に存在するリシン残基のイプシロン−アミン基を介したコンジュゲート化を含む。例えば、ある実施形態においては、インスリン分子はＢ２９リシン残基を介してコンジュゲート化されうる。インスリンｇｌｕｌｉｓｉｎｅ（グルリシン）の場合、Ｂ３リシン残基を介したコンジュゲートフレームワークへのコンジュゲート化が用いられうる。Ｂ−ペプチド上のコンジュゲート化位置が異なれば、インスリン活性の低下も異なりうると理解されるであろう。
【０２１５】
ある実施形態においては、該リガンドは、インスリン分子のような薬物上の２以上のコンジュゲート化点にコンジュゲート化される。例えば、インスリン分子はＡ１  Ｎ末端およびＢ２９リシンの両方においてコンジュゲート化されうる。いくつかの実施形態においては、Ｂ１位ではなくＢ２９およびＡ１位においてコンジュゲート化するために、炭酸塩バッファー中でアミドコンジュゲート化を行う。他の実施形態においては、インスリン分子はＡ１  Ｎ末端、Ｂ１  Ｎ末端およびＢ２９リシンにおいてコンジュゲート化されうる。更に他の実施形態においては、Ｂ１およびＢ２９またはＢ１およびＡ１位においてコンジュゲート化が生じるように、保護基が使用される。インスリン分子上のコンジュゲート化位置の任意の組合せが用いられうると理解されるであろう。いくつかの実施形態においては、該コンジュゲート化点の少なくとも１つは、突然変異したリシン残基、例えばＬｙｓＡ３である。
【０２１６】
種々の実施形態においては、コンジュゲート化は、インスリン増感物質（すなわち、インスリンの作用を増強する薬物）を含みうる。インスリンの効果を増強する薬物には、ビグアニド（例えば、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ））およびグリタゾン（ｇｌｉｔａｚｏｎｅ）が含まれる。最初のグリタゾン薬はトログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）であったが、これは重篤な副作用を有することが判明した。第２世代のグリタゾンには、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）およびロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）が含まれ、ロシグリタゾンは、ある治験において、有害な心血管事象に関連づけられているものの、これらはより高い耐容性を示す。
【０２１７】
種々の実施形態においては、コンジュゲートはインスリン分泌促進物質（すなわち、膵臓のベータ細胞によるインスリンの分泌を刺激する薬物）を含みうる。例えば、種々の実施形態においては、コンジュゲートはスルホニル尿素を含みうる。スルホニル尿素は、膵臓のベータ細胞によるインスリン分泌を、グルコースの作用に対してそれを増感させることにより刺激する。スルホニル尿素は更に、グルカゴン分泌を抑制し、インスリンの作用に対して標的組織を増感させうる。第１世代のスルホニル尿素には、トルブタミド（ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）、クロルプロパミド（ｃｈｌｏｒｐｒｏｐａｍｉｄｅ）およびカルブタミド（ｃａｒｂｕｔａｍｉｄｅ）が含まれる。より低い用量で活性である第２世代のスルホニル尿素には、グリピジド（ｇｌｉｐｉｚｉｄｅ）、グリベンクラミド（ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ）、グリクラジド（ｇｌｉｃｌａｚｉｄｅ）、グリボルヌリド（ｇｌｉｂｏｒｎｕｒｉｄｅ）およびグリメプリド（ｇｌｉｍｅｐｉｒｉｄｅ）が含まれる。種々の実施形態においては、コンジュゲートはメグリチニド（ｍｅｇｌｉｔｉｎｉｄｅ）を含みうる。適当なメグリチニドには、ナテグリニド（ｎａｔｅｇｌｉｎｉｄｅ）、ミチグリニド（ｍｉｔｉｇｌｉｎｉｄｅ）およびレパグリニド（ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ）が含まれる。それらの血糖低下作用はスルホニル尿素の場合より速く且つ短い。他のインスリン分泌促進物質には、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）およびＧＬＰ−１類似体（すなわち、１〜１０アミノ酸の置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾の点でＧＬＰ−１とは異なる、ＧＬＰ−１様生物活性を有するペプチド）が含まれる。ＧＬＰ−１は、空腹を抑制することにより、および中枢作用により満腹感を増強することにより、およびグルカゴン放出を抑制することにより、食物摂取を減少させる。ＧＬＰ−１は、膵島細胞の増殖を増加させることにより血漿グルコースレベルを低下させ、食物消費後のインスリン産生を増加させる。ＧＬＰ−１は、例えば、リラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）の場合のように、そのインビボ半減期を延長させるために脂質コンジュゲート化により化学修飾されうる。さらに他のインスリン分泌促進物質には、エキセンジン（ｅｘｅｎｄｉｎ）−４およびエキセンジン−４類似体（すなわち、１〜１０アミノ酸の置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾の点でエキセンジン−４とは異なる、エキセンジン−４様生物活性を有するペプチド）が含まれる。エキセジン−４はアメリカドクトカゲの毒において見出され、ＧＬＰ−１様生物活性を示す。それはＧＬＰ−１より遥かに長い半減期を有し、ＧＬＰ−１とは異なり、生物活性を喪失することなくそのＮ末端の８アミノ酸残基によりトランケート化されうる。ＧＬＰ−１およびエキセンジン−４のＮ末端領域はほぼ同一であり、有意な相違は、第２アミノ酸残基がＧＬＰ−１ではアラニンであるがエキセンジン−４ではグリシンであることであり、このことはエキセンジン−４にインビボ消化に対するその抵抗性をもたらす。エキセンジン−４はまた、そのＣ末端に、ＧＬＰ−１と比較した場合に追加的な９アミノ酸残基を有する。Ｍａｎｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：７１３−７１６，２００７およびＲｕｎｇｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：５８３０−５８４０，２００７は、本開示のコンジュゲートにおいて使用されうる種々のＧＬＰ−１およびエキセンジン−４類似体を記載している。ＧＬＰ−１の短い半減期はジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による酵素消化によるものである。ある実施形態においては、内因性ＧＬＰ−１の効果はＤＰＰ−ＩＶインヒビター（例えば、ビルダグリプチン（ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ）、シタグリプチン（ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）、サクサグリプチン（ｓａｘａｇｌｉｐｔｉｎ）、リナグリプチン（ｌｉｎａｇｌｉｐｔｉｎ）またはアログリプチン（ａｌｏｇｌｉｐｔｉｎ））の投与により増強されうる。
【０２１８】
種々の実施形態においては、コンジュゲートはアミリン（ａｍｙｌｉｎ）またはアミリン類似体（すなわち、１〜１０アミノ酸の置換、付加もしくは欠失および／または化学修飾の点でアミリンとは異なる、アミリン様生物活性を有するペプチド）を含みうる。アミリンはグルコースの調節において重要な役割を果たしている（例えば、ＥｄｅｌｍａｎおよびＷｅｙｅｒ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１７５−１８９，２００２を参照されたい）。アミリンは、食物摂取に応答して膵臓のベータ細胞によりインスリンと共に分泌される神経内分泌ホルモンである。インスリンは、血流からのグルコースの消失を調節するように働くが、アミリンは、胃および肝臓からの血流中のグルコースの出現を調節するのを助けるように働く。酢酸プラムリンチド（ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ  ａｃｅｔａｔｅ）（ＳＹＭＬＩＮ（登録商標））は典型的なアミリン類似体である。天然ヒトアミリンはアミロイド生成性であるため、プラムリンチドを設計するための戦略は、アミロイド生成性ではないラットアミリンからの残基で或る残基を置換することを含むものであった。特に、プロリン残基は構造破壊性残基であることが公知であり、したがって、これは該ラット配列からヒト配列内へ直接的に移植された。Ｇｌｕ−１０もアスパラギンで置換された。
【０２１９】
種々の実施形態においては、コンジュゲート化前の薬物は１以上の反応性部分（例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの部分）を含有しうる。後記のとおり、これらの反応性部分は、ある実施形態においては、コンジュゲート化過程を促進しうる。具体例には、アルファ末端アミンおよび／またはイプシロン−アミンリシン基を含有するペプチド薬が含まれる。これらの反応性部分のいずれもが、それを有さない公知薬物に人工的に付加されうると理解されるであろう。例えば、ペプチド薬の場合、適当なアミノ酸（例えば、リシン）が該アミノ酸配列内に付加または置換されうる。また、後記で更に詳しく説明するとおり、該コンジュゲート化過程は、コンジュゲート化の前に或る反応性部分を選択的に保護することにより制御されうると理解されるであろう。
【０２２０】
前記のとおり、本開示は薬物と標的分子とのいずれかの特定の組合せには限定されない。
【０２２１】
種々の実施形態においては、本開示のマテリアルは、天然フィードバックメカニズムを操作するために利用されうる。例えば、２つの内因性物質のレベルが相互関連している（例えば、グルコースとインスリンとの場合が挙げられ、この場合、インスリンのレベルは、グルコースのレベルが増加するにつれて増加し、グルコースのレベルは、インスリンのレベルが増加するにつれて減少する）、多数の天然フィードバックメカニズム（ほとんどのホルモン制御メカニズムを含む）が存在する。そのような実施形態においては、内因性物質の一方が標的分子（例えば、グルコース）となり、他方が薬物（例えば、インスリン）となる。あるいは、種々の実施形態においては、該薬物は、（ａ）他方の内因性物質と同じ機能（例えば、グルコースレベルを低下させる）を有する、（ｂ）他方の内因性物質の産生を刺激する、および／または（ｃ）他方の内因性物質の効果を増強する分子でありうる。例えば、グルコースが標的分子である場合、薬物としてはインスリンの代わりにインスリン分泌促進物質またはインスリン増感物質を使用しうるであろう。
【０２２２】
人工的フィードバック系の、他の非限定的な具体例には、高レベルのインスリンに応答してグルカゴンコンジュゲートを放出するマテリアル、血栓症指標物質に応答して抗凝血性コンジュゲート［例えば、クマリン、例えば、ワルファリン（ｗａｒｆａｒｉｎ）、アセノクマロール（ａｃｅｎｏｃｏｕｍａｒｏｌ）、フェンプロクモン（ｐｈｅｎｐｒｏｃｏｕｍｏｎ）およびフェニンジオン（ｐｈｅｎｉｎｄｉｏｎｅ）、ヘパリン、直接的トロンビンインヒビター、例えば、アルガトロバン（ａｒｇａｔｒｏｂａｎ）、レピルジン（ｌｅｐｉｒｕｄｉｎ）、ビバリルジン（ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）およびダビガトラン（ｄａｂｉｇａｔｒａｎ）など］を放出するマテリアル、乳酸レベルの増加に応答して乳酸低下薬コンジュゲート（例えば、ジクロロアセタート）を放出するマテリアルなどが含まれる。
【０２２３】
種々の実施形態においては、マテリアルは、標的分子に直接は関連していない機能を有する薬物を含むコンジュゲートを放出するように設計されうる。限定的なものではないが、食事後に濃度が増加する標的分子（例えば、グルコース）に応答するマテリアルは、長期にわたる食事時薬物投与を行うために使用されうる。定期的におよび／または食事と共に投与される必要のあるいずれの薬物も、そのような運搬系から利益を受けるであろう。当技術分野でよく知られているとおり、多数の伝統的薬物は食事と共に又は食事時に投与される必要がある。例えば、脂肪の吸収を抑制する薬物（例えば、オルリスタット（ｏｒｌｉｓｔａｔ））は食事時間中に有利に使用される。同様に、脂質レベルを低下させる薬物、例えばロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、アトルバスタチン（ａｔｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）もしくはシンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）、またはトリグリセリドレベルを低下させる薬物、例えばジェムフィブロジル（ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ）も食事時に有利に放出されうる。
【０２２４】
検出可能標識
前記のとおり、種々の実施形態においては、コンジュゲートは検出可能標識を含みうる。例えば、該コンジュゲートがセンサーなどにおいて使用される場合、生物、組織または細胞内のコンジュゲートの位置を検出するために、検出可能標識を含有させることが可能である。コンジュゲートは、当技術分野で公知のいずれかの検出可能標識を含みうると理解されるべきである。コンジュゲートは同一標識のコピーの２以上を含むことが可能であり、および／または２以上のタイプの標識を含むことが可能である。一般に、使用される標識は、最終用途、および検出のために用いられる方法に左右されるであろう。
【０２２５】
検出可能標識は、直接的に検出可能または間接的に検出可能（例えば、シグナル生成系の１以上の追加的なメンバーとの協同作用によるもの）でありうる。直接的に検出可能な標識の具体例には、放射能、常磁性、蛍光、光散乱、吸収および比色標識が含まれる。蛍光イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、γ−フタルアルデヒド、フルオレスカミンなどは全て、典型的な蛍光標識である。化学発光標識、すなわち、二次基質を色素原産物に変換しうる標識は、間接的に検出可能な標識の例である。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンなどは全て、典型的なタンパク質系化学発光標識である。ルミノール、イソルミノール、テロマチック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルなどは、典型的な非タンパク質系化学発光標識である。間接的に標識可能な標識の、もう１つの非限定的な一般に用いられる具体例は、アフィニティリガンド、すなわち、それ自体が直接的または間接的に検出可能でありうる二次結合相手（例えば、抗体またはアプタマー）に対する強力なアフィニティを有する標識である。
【０２２６】
一般に、検出可能標識は種々の方法で可視化または検出されることが可能であり、個々の検出方法は、個々の検出可能標識に基づいて選択され、ここで、代表的な検出手段には、例えば、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、常磁性の測定、蛍光測定、光吸収測定、光散乱の測定などが含まれる。
【０２２７】
種々の実施形態においては、コンジュゲート前の標識は１以上の反応性部分（例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの部分）を含有しうる。後記のとおり、これらの反応性部分は、ある実施形態においては、コンジュゲート化過程を促進しうる。具体例には、アルファ末端アミンおよび／またはイプシロン−アミンリシン基を含有するペプチド標識が含まれる。これらの反応性部分のいずれもが、それを有さない公知標識に人工的に付加されうると理解されるであろう。例えば、ペプチド標識の場合、適当なアミノ酸（例えば、リシン）が該アミノ酸配列内に付加または置換されうる。また、後記で更に詳しく説明するとおり、該コンジュゲート化過程は、コンジュゲート化の前に或る反応性部分を選択的に保護することにより制御されうると理解されるであろう。
【０２２８】
コンジュゲートフレームワーク
コンジュゲートは、アフィニティリガンドを天然で含むフレームワーク（例えば、グリコーゲンおよびデキストランのような多糖はグルコースアフィニティリガンドを天然で含む）から、および／または天然もしくは合成フレームワーク内にアフィニティリガンドを人工的に組込むことにより製造されうる。本開示のコンジュゲートは特定のフレームワークに限定されないと理解されるべきである。例えば、コンジュゲートは、重合体および／または非重合体構造を含むフレームワークを使用して製造されうる。また、該コンジュゲートフレームワークは直鎖状、分枝状、超分枝状および／またはこれらの組合せでありうると理解されるべきである。以下の節では、いくつかの典型的なコンジュゲートフレームワークを説明する。
【０２２９】
種々の実施形態においては、コンジュゲートは、重合体構造を含むフレームワークから製造されうる。例えば、付随的反応性基（例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなど）を含有する重合体も使用されうる。単一のフレームワークにおいては、（例えば、重合体フレームワークを得るために、適当な単量体を所望の比で共重合させることにより）種々の付随基が混合されうると理解されるであろう。後記のとおり、これらの反応性基は、アフィニティリガンド、薬物および／または検出可能標識を該フレームワークに結合させるために使用されうる。共重合体、混合物、および種々のフレームワークの付加体も使用されうる。そのような組合せは、マテリアルの力学的および化学的特性を最適化するのに有用でありうる。
【０２３０】
種々の実施形態においては、カルボキシル（または反応性エステル）付随基を有するフレームワーク（−ＣＯＯＨ含有フレームワーク、すなわち、ＣＢＦ）が使用されうる。そのようなフレームワークはカルボキシル基を天然で含むことが可能であり、あるいはそれらを含むように修飾されうる。典型的な重合体ＣＢＦには、カルボキシル化多糖（ＣＰＳ）、例えばアルギナート（Ａｇ）、カルボキシメチル化Ｄ−マンノ−Ｄ−グルカン（ＣＭＭＧ；Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手可能）、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤｅｘ）、カルボキシメチルキチン（ＣＭＣｈ；Ｋａｔａｋｕｒａ  Ｃｈｉｋｋａｌｉｎ  Ｃｏ．から入手可能）、Ｎ−脱硫酸化Ｎ−アセチル化ヘパリン（ＤＳＨ）およびヒアルロン酸（ＨＡ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＤＳＨおよびＣＭＤｅｘはＳｕｇａｈａｒａら，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２４，５３５−５４３（２００１）に従い合成されうる。一般に、ヒドロキシル化フレームワークは、塩基性条件下のクロロ酢酸との反応によりカルボキシル化されうる。重合体フレームワークの場合、単量体に関するカルボキシル置換度は１〜１００ｍｏｌ％で変動しうる。天然に存在するカルボキシル化重合体には、カルボキシル化ポリ（アミノ酸）（ＣＰＡＡ）、例えばポリ−Ｌ−グルタミン酸およびポリ−Ｌ−アスパラギン酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。カルボキシル化アミノ酸（例えば、重合体バックボーンの一部となるカルボキシル基のほかにカルボキシル基を有するアミノ酸）を非カルボキシル化アミノ酸（例えば、カルボキシル基のみが重合体バックボーンの一部となる、該カルボキシル基を有するアミノ酸）と共重合させることにより、カルボキシラート含量は１〜１００％ｍｏｌ  ＣＯＯＨ／ｍｏｌ  ＡＡ残基で変動しうる。
【０２３１】
種々の実施形態においては、アミン付随基を有するフレームワーク（−ＮＨ２含有フレームワーク、すなわち、ＮＢＦ）が使用されうる。そのようなフレームワークは、天然に存在するものであることが可能であり、あるいは第一級アミンを含むように化学修飾されうる。後者は、重合体フレームワーク、例えばアミン付随多糖（ＮＰＳ）、例えばデアセチル化キトサン（Ｃｈ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）およびジエチルアミノエチルエーテルデキストラン（ＤＥＡＥＤｅｘ），ＭＷ５００，０００ｇ／ｍｏｌ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｐａ．）を含むが、これらに限定されるものではない。そのような重合体フレームワークの場合、単量体に関するアミン置換度は１〜１００ｍｏｌ％で変動しうる。他の適当なＮＢＦには、プリン塩基の１以上が２’位においてアミン基で誘導体化されているポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。天然に存在するアミノ化重合体には、ポリ（アミノ酸）、例えばポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）およびそのエナンチオマーが含まれるが、これらに限定されるものではない。アミノ化アミノ酸（例えば、最終的に重合体バックボーンの一部となるアミン基のほかにアミンを有するアミノ酸）を非アミノ化アミノ酸（例えば、アミンのみが最終的に重合体バックボーンの一部となるものである、該アミンを有するアミノ酸）と共重合させることにより、アミン含量は１〜１００％ｍｏｌ  ＮＨ２／ｍｏｌアミノ酸残基で変動しうる。
【０２３２】
種々の実施形態においては、ヒドロキシル付随基を有する重合体（−ＯＨ含有フレームワーク、すなわち、ＯＢＦ）が使用されうる。そのようなフレームワークは天然でヒドロキシル化されていることが可能であり、あるいはヒドロキシル基を含むように化学修飾されうる。デキストランに加えて、天然に存在する重合体ＯＢＦには、多糖、例えば酵母マンナン（Ｍｎ）、プルラン（Ｐｌ）、アミロース（Ａｍ）、アミロペクチン（ＡｍＰ）、グリコーゲン（Ｇｌ）、セルロース（Ｃｌ）、ヒアルロナート（Ｈｙ）、コンドロイチン（ＣｈＤ）およびデキストリン（Ｄｘ）（これらの全てはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能である）が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、ポリ（アミノ酸）、例えばポリ（セリン）、ポリ（トレオニン）、ポリ（チロシン）およびポリ（４−ヒドロキシプロリン）もヒドロキシル化重合体として使用されうる。ヒドロキシル化アミノ酸を非ヒドロキシル化アミノ酸で共重合させることにより、該ポリ（アミノ酸）のヒドロキシル含量は１〜１００％ｍｏｌ−ＯＨ／ｍｏｌアミノ酸残基で変動しうる。もちろん、カルボキシル（または反応性エステル）、アミノおよびヒドロキシル付随基は、適当なアミノ酸を所望の比で共重合させることにより、単一重合体において混合されうる。
【０２３３】
種々の実施形態においては、スルフヒドリル付随基を有するフレームワーク（−ＳＨ含有フレームワーク、すなわち、ＳＢＦ）が使用されうる。ＳＢＦは天然でスルフヒドリル化されることが可能であり、あるいは標準的な有機化学技術を用いて、スルフヒドリル基を含むように化学修飾されうる。他の実施形態においては、アルデヒド、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの付随基を有するフレームワークが使用されうる。
【０２３４】
使用されうる幾つかの典型的な重合体には、前記クラスのフレームワークに加えて、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡ−ＰＧＡ共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルフメラート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、ポリアセタール、生分解性ポリシアノアクリラートおよび生分解性ポリウレタンが含まれる。
【０２３５】
種々の実施形態においては、以下の一般式（ＩＶ）のコンジュゲートが使用されうる。
【０２３６】
【化２５】
2013541500.tif 000037
式（ＩＶ）のコンジュゲートの種々の実施形態は実施例５７に更に詳細に記載されているが、一般には、以下のとおりに理解されるべきである：
Ｒｘは水素または所望により置換されていてもよいＣ１−６アルキルである；
Ｚ１は、所望により置換されていてもよい２価Ｃ１−１０炭化水素鎖であり、ここで、Ｚ１の、１、２、３、４または５個のメチレン単位は、所望により且つ独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＲａ−、−（Ｃ＝ＮＲａ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｓ＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−（ＣＲｂ＝ＣＲｂ）−、−（Ｎ＝Ｎ）−、所望により置換されていてもよいアリーレン部分または所望により置換されていてもよいヘテロアリーレン部分から選択される１以上の基で交換されていてもよく、ここで、Ｒａは水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたは適当なアミノ保護基であり、Ｒｂは水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリールまたは所望により置換されていてもよいヘテロアリールである；
Ｘ１の各存在は、独立して、−ＯＲｃまたは−Ｎ（Ｒｄ）２であり、ここで、Ｒｃは水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリール、適当なヒドロキシル保護基、カチオン基またはアフィニティリガンドであり、各Ｒｄは、独立して、水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリール、適当なアミノ保護基またはアフィニティリガンドであり、ただし、Ｘ１の、少なくとも２つの存在は、アフィニティリガンドを含む；
Ｙ１は水素、ハロゲン、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリール、−ＯＲｅまたは−ＳＲｅであり、ここで、Ｒｅは水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリールまたは所望により置換されていてもよいヘテロアリールである；
ｒは５〜２５（５および２５を含む）の整数である；
Ｗ１は薬物または検出可能な標識である；ならびに
- - -は、単または二重共有結合に対応する。
【０２３７】
種々の実施形態においては、以下の一般式（Ｖ）のコンジュゲートが使用されうる。
【０２３８】
【化２６】
2013541500.tif 000038
該式中、
［（［Ａ］−Ｔ）］の各存在は該コンジュゲート内の可能な分枝を表す；
（［Ａ］−Ｔ）の各存在は該コンジュゲートの分枝内の可能な反復を表す；
［Ａ］の各存在は、独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子であるか、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される所望により置換されていてもよい基である；
Ｔの各存在は、独立して、共有結合、または２価の直鎖状もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の所望により置換されていてもよいＣ１−３０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの、１以上のメチレン単位は、所望により且つ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基により交換されていてもよい；
Ｒの各存在は、独立して、水素、適当な保護基またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分またはヘテロ脂肪族部分である；
−Ｂは−Ｔ−ＬＢ−Ｘである；
Ｘの各存在は、独立して、アフィニティリガンドである；
ＬＢの各存在は、独立して、共有結合、またはＸへのＴの共有結合から誘導される基である；
−Ｄは−Ｔ−ＬＤ−Ｗである；
Ｗの各存在は、独立して、薬物または検出可能な標識である；
ＬＤの各存在は、独立して、共有結合、またはＷへのＴの共有結合から誘導される基である；
ｋは２〜１１（２および１１を含む）の整数であり、該コンジュゲート内の少なくとも２つのｋ分枝を定める；
ｑは１〜４（１および４を含む）の整数である；
ｋ＋ｑは３〜１２（３および１２を含む）の整数である；
ｐの各存在は、独立して、１〜５（１および５を含む）の整数である；
ｎの各存在は、独立して、０〜５（０および５を含む）の整数である；
ｍの各存在は、独立して、１〜５（１および５を含む）の整数である；
ｖの各存在は、独立して、０〜５（０および５を含む）の整数である；ただし、各ｋ分枝内で、ｎの、少なくとも１つの存在は、＞１であり、ｖの、少なくとも１つの存在は、＞１である。
【０２３９】
一般式（Ｖ）（および本明細書中の他の式）は各水素を明示的には挙げていないと理解されるべきである。例えば、中央の［Ａ］がＣ６アリール基であり、ｋ＋ｑ＜６である場合、Ｃ６アリール環上の開いた位置は水素を含むと理解される。
【０２４０】
一般に、［Ａ］の各存在は可能な分枝集合点を表し、各集合点における分枝の数は、中央の［Ａ］に関してはｋの値により、そして［Ａ］の非中心部の存在に関してはｎの値により決定される、と理解される。ｋ＞２であるため、該コンジュゲートは常に少なくとも２つのｋ分枝を含む。ｎの各存在は０〜５の整数でありうるため、本開示はこれらのコンジュゲートの分枝および超分枝（例えば、樹枝状）実施形態の両方を想定している、と当業者に理解される。各ｋ分枝内でｎの少なくとも１つの存在が＞１であること、およびｖの少なくとも１つの存在が＞１であることを要する前提は、各コンジュゲートがＢ（すなわち、アフィニティリガンド）の存在において少なくとも２つの別々のｋ分枝を含むことを保証する。
【０２４１】
ある実施形態においては、ｐ括弧部分における［Ａ］の各存在は、ｎ＞１の値に対応する幾つかのｎ括弧部分により置換される。例えば、両方のｋ分枝においてｋ＝２およびｐ＝２である場合、該コンジュゲートは式（Ｖａ）を有しうる。
【０２４２】
【化２７】
2013541500.tif 000039
他の実施形態においては、ｐ括弧部分における［Ａ］の末端の存在のみが、ｎ＞１の値に対応する幾つかのｎ括弧部分により置換される。例えば、両方のｋ分枝においてｋ＝２およびｐ＝２（および、両方のｋ分枝における最初のｐ括弧部分に関してはｎ＝０）である場合、該コンジュゲートは式（Ｖｂ）を有しうる。
【０２４３】
【化２８】
2013541500.tif 000040
ある実施形態においては、ｍ括弧部分における［Ａ］の各存在は、ｖ＞１の値に対応する幾つかのＢ部分により置換される。例えば、ｋ＝２、ｐの各存在＝１およびｍの各存在＝２である場合、該コンジュゲートは式（Ｖｃ）を有しうる。
【０２４４】
【化２９】
2013541500.tif 000041
他の実施形態においては、ｍ括弧部分における［Ａ］の末端の存在のみが、ｖ＞１の値に対応する幾つかのＢ部分により置換される。例えば、ｋ＝２、ｐの各存在＝１およびｍの各存在＝２（および、各ｎ分枝における最初のｍ括弧部分に関してはｖ＝０）である場合、該コンジュゲートは式（Ｖｄ）を有しうる。
【０２４５】
【化３０】
2013541500.tif 000042
別の一例としては、前記式の両方のｋ分枝においてｑ＝１およびｎ＝１である場合、該コンジュゲートは式（Ｖｅ）を有しうる。
【０２４６】
【化３１】
2013541500.tif 000043
あるいは、前記式の両方のｋ分枝においてｑ＝１およびｎ＝２である場合、該コンジュゲートは式（Ｖｆ）を有しうる。
【０２４７】
【化３２】
2013541500.tif 000044
種々の実施形態においては、本開示は、アフィニティリガンドおよび／または薬物または検出可能な標識（これらはコンジュゲートフレームワークに非共有結合している）を含むコンジュゲートをも提供する。
【０２４８】
例えば、いくつかの実施形態においては、本開示は、
［Ａ］、Ｔ、Ｄ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖのそれぞれが、前記および本明細書中に記載されているとおりに定義され、
Ｘの各存在が、独立して、アフィニティリガンドであり、
ＬＲＰＢの各存在が、独立して、ヒト血清における１ｐｍｏｌ／Ｌの解離定数でＴとＸとの間で非共有結合を形成するリガンド−受容体ペアである、前記式のいずれかのコンジュゲートを提供する。
【０２４９】
更に他の実施形態においては、本開示は、
［Ａ］、Ｔ、Ｂ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖのそれぞれが、前記および本明細書中に記載されているとおりに定義され、
−Ｄが−Ｔ−ＬＲＰＤ−Ｗであり、
Ｗの各存在が、独立して、薬物または検出可能な標識であり、
ＬＲＰＤの各存在が、独立して、ヒト血清における１ｐｍｏｌ／Ｌの解離定数でＴとＷとの間で非共有結合を形成するリガンド−受容体ペアである、前記式のいずれかのコンジュゲートを提供する。
【０２５０】
他の実施形態においては、本開示は、
［Ａ］、Ｔ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖのそれぞれが、前記および本明細書中に記載されているとおりに定義され、
−Ｂが−Ｔ−ＬＲＰＢ−Ｘであり、
Ｘの各存在が、独立して、アフィニティリガンドであり、
ＬＲＰＢの各存在が、独立して、ヒト血清における１ｐｍｏｌ／Ｌの解離定数でＴとＸとの間で非共有結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、
−Ｄが−Ｔ−ＬＲＰＤ−Ｗであり、
Ｗの各存在が、独立して、薬物または検出可能な標識であり、
ＬＲＰＤの各存在が、独立して、ヒト血清における１ｐｍｏｌ／Ｌの解離定数でＴとＷとの間で非共有結合を形成するリガンド−受容体ペアである、前記式のいずれかのコンジュゲートを提供する。
【０２５１】
種々の実施形態においては、本開示のコンジュゲートは一般式（ＶＩ）を有しうる。
【０２５２】
【化３３】
2013541500.tif 000045
該式中、［Ａ］、Ｂ、Ｔ、Ｄ、ｖ、ｍ、ｎおよびｐは本明細書中に定義され記載されているとおりであり、ｋは１〜１１（１および１１を含む）の整数であり、ｊは１〜４である。式（ＶＩ）のコンジュゲートは薬物へのリガンドのコンジュゲート化の複数の部位を有しうる。ｑが１である場合、前記の下位概念（式Ｖａ〜Ｖｆ）は、ｊが１である式（ＶＩ）のコンジュゲートに適合する、と理解される。同様に、ｊが２、３または４であるコンジュゲートに関する類似下位概念が当業者により想定されうる。
【０２５３】
例示目的で、また、誤解を避けるために、式（ＶＩ）のコンジュゲートにおける−［Ａ］−Ｄ−［Ａ］−の存在（すなわち、ｊが２である場合）は、−［Ａ］−Ｔ−ＬＤ−Ｗ−ＬＤ−Ｔ−［Ａ］−（薬物がコンジュゲートフレームワークに共有結合している場合）または−［Ａ］−Ｔ−ＬＲＰＤ−Ｗ−ＬＲＰＤ−Ｔ−［Ａ］−（薬物がコンジュゲートフレームワークに非共有結合している場合）と表されうる、と理解されるべきである。
【０２５４】
典型的な基の説明
［Ａ］（集合点）
ある実施形態においては、［Ａ］の各存在は、独立して、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される所望により置換されていてもよい基である。いくつかの実施形態においては、［Ａ］の各存在は同一である。いくつかの実施形態においては、中央の［Ａ］は［Ａ］の全ての他の存在とは異なる。ある実施形態においては、［Ａ］の全ての存在は、中央の［Ａ］以外は同一である。いくつかの実施形態においては、［Ａ］は、所望により置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリール基である。いくつかの実施形態においては、［Ａ］は６員アリールである。ある実施形態においては、［Ａ］はフェニルである。ある実施形態においては、［Ａ］は、Ｎ、ＯまたはＳから選択されるヘテロ原子である。いくつかの実施形態においては、［Ａ］は窒素原子である。いくつかの実施形態においては、［Ａ］は酸素原子である。いくつかの実施形態においては、［Ａ］は硫黄原子である。いくつかの実施形態においては、［Ａ］は炭素原子である。
【０２５５】
Ｔ（スペーサー）
ある実施形態においては、Ｔの各存在は、独立して、２価の直鎖状もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の所望により置換されていてもよいＣ１−２０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの、１以上のメチレン単位は、所望により且つ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基により交換されていてもよい。ある実施形態においては、Ｔの、１、２、３、４または５個のメチレン単位が、所望により且つ独立して、交換されていてもよい。ある実施形態においては、Ｔは、Ｃ１−１０、Ｃ１−８、Ｃ１−６、Ｃ１−４、Ｃ２−１２、Ｃ４−１２、Ｃ６−１２、Ｃ８−１２またはＣ１０−１２炭化水素鎖から構成され、ここで、Ｔの、1以上のメチレン単位は、所望により且つ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基により交換されていてもよい。いくつかの実施形態においては、Ｔの、１以上のメチレン単位が、複素環基により交換されている。いくつかの実施形態においては、Ｔの、１以上のメチレン単位が、トリアゾール部分により交換されている。ある実施形態においては、Ｔの、１以上のメチレン単位が、−Ｃ（Ｏ）−により交換されている。ある実施形態においては、Ｔの、１以上のメチレン単位が、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−により置換されている。ある実施形態においては、Ｔの、１以上のメチレン単位が、−Ｏ−により交換されている。
【０２５６】
いくつかの実施形態においては、Ｔは、
【０２５７】
【化３４】
2013541500.tif 000046
である。
【０２５８】
いくつかの実施形態においては、Ｔは、
【０２５９】
【化３５】
2013541500.tif 000047
である。
【０２６０】
いくつかの実施形態においては、Ｔは、
【０２６１】
【化３６】
2013541500.tif 000048
である。
【０２６２】
いくつかの実施形態においては、Ｔは、
【０２６３】
【化３７】
2013541500.tif 000049
である。
【０２６４】
いくつかの実施形態においては、Ｔは、
【０２６５】
【化３８】
2013541500.tif 000050
である。
【０２６６】
いくつかの実施形態においては、Ｔは、
【０２６７】
【化３９】
2013541500.tif 000051
である。
【０２６８】
ある実施形態においては、Ｔの各存在は同一である。
【０２６９】
ある実施形態においては、Ｔの各存在（基ＢおよびＤ以外）は共有結合であり、該コンジュゲートは一般式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）： 
【０２７０】
【化４０】
2013541500.tif 000052
［式中、［Ａ］、Ｂ、Ｄ、ｖ、ｍ、ｎ、ｐ、ｋおよびｊは、それぞれ式（Ｖ）または（ＶＩ）に関して定義され記載されているとおりである］を有する。
【０２７１】
一般式（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）の或る実施形態においては、中央の［Ａ］以外の［Ａ］の各存在は共有結合、ｖ＝１の各存在であり、該コンジュゲートは式（ＩＸ）または（Ｘ）：
【０２７２】
【化４１】
2013541500.tif 000053
［式中、［Ａ］、Ｂ、Ｄ、ｑ、ｋおよびｊは、それぞれ式（Ｖ）または（ＶＩ）に関して定義され記載されているとおりである］を有する。
【０２７３】
式（ＩＸ）に関する或るそのような実施形態においては、ｋ＝２かつｑ＝１である。
【０２７４】
他の実施形態においては、ｋ＝３かつｑ＝１である。
【０２７５】
他の実施形態においては、ｋ＝２かつｑ＝２である。
【０２７６】
式（Ｘ）に関する或るそのような実施形態においては、ｋ＝１かつｊ＝２である。
【０２７７】
他の実施形態においては、ｋ＝２かつｊ＝２である。
【０２７８】
他の実施形態においては、ｋ＝３かつｊ＝２である。
【０２７９】
他の実施形態においては、ｋ＝１かつｊ＝３である。
【０２８０】
他の実施形態においては、ｋ＝２かつｊ＝３である。
【０２８１】
他の実施形態においては、ｋ＝３かつｊ＝３である。
【０２８２】
いくつかの実施形態においては、本開示は、一般式（ＩＸａ）：
【０２８３】
【化４２】
2013541500.tif 000054
（式中、ＢおよびＤは、本明細書中に定義され記載されているとおりである）のコンジュゲートを提供する。
【０２８４】
例えば、いくつかの実施形態においては、本開示は式：
【０２８５】
【化４３】
2013541500.tif 000055
（式中、ＷおよびＸは、本明細書中に定義され記載されているとおりである）のコンジュゲートを提供する。
【０２８６】
いくつかの実施形態においては、本開示は、一般式（ＩＸｂ）：
【０２８７】
【化４４】
2013541500.tif 000056
（式中、ＢおよびＤは、本明細書中に定義され記載されているとおりである）のコンジュゲートを提供する。
【０２８８】
例えば、いくつかの実施形態においては、本開示は式：
【０２８９】
【化４５】
2013541500.tif 000057
2013541500.tif 000058
（式中、ＷおよびＸは、本明細書中に定義され記載されているとおりである）のコンジュゲートを提供する。
【０２９０】
いくつかの実施形態においては、本開示は、一般式（ＩＸｃ）：
【０２９１】
【化４６】
2013541500.tif 000059
（式中、ＢおよびＤは、本明細書中に定義され記載されているとおりである）のコンジュゲートを提供する。
【０２９２】
例えば、いくつかの実施形態においては、本開示は式：
【０２９３】
【化４７】
2013541500.tif 000060
（式中、ＷおよびＸは、本明細書中に定義され記載されているとおりである）のコンジュゲートを提供する。
【０２９４】
ｊが２、３または４である式（ＶＩＩＩ）のコンジュゲートに関して、式（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩｂ）および（ＶＩＩｃ）に類似した下位概念ならびにそれらの種が当業者により想定されうる、と理解される。例えば、ｊが２である場合、ある実施形態においては、本開示は式：
【０２９５】
【化４８】
2013541500.tif 000061
（式中、ＢおよびＤは、本明細書中に定義され記載されているとおりである）のコンジュゲートを提供する。
【０２９６】
ある実施形態においては、本開示は式：
【０２９７】
【化４９】
2013541500.tif 000062
（式中、Ｗ、Ｘおよびｊは、本明細書中に定義され記載されているとおりである）のコンジュゲートを提供する。
【０２９８】
Ｂ（リガンド）
種々の実施形態においては、−Ｂは−Ｔ−ＬＢ−Ｘであり、ここで、Ｘはリガンドであり、ＬＢは、共有結合、またはＴへのＸの共有結合から誘導される基である。典型的なリガンドは前記に記載されている。
【０２９９】
Ｄ（薬物）
種々の実施形態においては、−Ｄは−Ｔ−ＬＤ−Ｗであり、ここで、Ｗは薬物であり、ＬＤは、共有結合、またはＴへのＷの共有結合から誘導される基である。典型的な薬物は前記に記載されている。
【０３００】
Ｄ（検出可能な標識）
前記のとおり、種々の実施形態においては、ＤにおけるＷは検出可能標識（検出可能な標識）である。例えば、該コンジュゲートがセンサーなどにおいて使用される場合、生物、組織または細胞内のコンジュゲートの位置を検出するために、検出可能標識を含有させることが可能である。コンジュゲートは、当技術分野で公知のいずれかの検出可能標識を含みうると理解されるべきである。コンジュゲートは同一標識のコピーの２以上を含むことが可能であり、および／または２以上のタイプの標識を含むことが可能である。一般に、使用される標識は、最終用途、および検出のために用いられる方法に左右されるであろう。検出可能標識は、直接的に検出可能または間接的に検出可能（例えば、シグナル生成系の１以上の追加的なメンバーとの協同作用によるもの）でありうる。直接的に検出可能な標識の具体例には、放射能、常磁性、蛍光、光散乱、吸収および比色標識が含まれる。蛍光イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、γ−フタルアルデヒド、フルオレスカミンなどは全て、典型的な蛍光標識である。化学発光標識、すなわち、二次基質を色素原産物に変換しうる標識は、間接的に検出可能な標識の例である。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンなどは全て、典型的なタンパク質系化学発光標識である。ルミノール、イソルミノール、テロマチック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルなどは、典型的な非タンパク質系化学発光標識である。間接的に標識可能な標識の、もう１つの非限定的な一般に用いられる具体例は、アフィニティリガンド、すなわち、それ自体が直接的または間接的に検出可能でありうる二次結合相手（例えば、抗体またはアプタマー）に対する強力なアフィニティを有する標識である。
【０３０１】
一般に、検出可能標識は種々の方法で可視化または検出されることが可能であり、個々の検出方法は、個々の検出可能標識に基づいて選択され、ここで、代表的な検出手段には、例えば、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、常磁性の測定、蛍光測定、光吸収測定、光散乱の測定などが含まれる。
【０３０２】
種々の実施形態においては、コンジュゲート前の標識は１以上の反応性部分（例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの部分）を含有しうる。後記のとおり、これらの反応性部分は、ある実施形態においては、コンジュゲート化過程を促進しうる。具体例には、アルファ末端アミンおよび／またはイプシロン−アミンリシン基を含有するペプチド標識が含まれる。これらの反応性部分のいずれもが、それを有さない公知標識に人工的に付加されうると理解されるであろう。例えば、ペプチド標識の場合、適当なアミノ酸（例えば、リシン）が該アミノ酸配列内に付加または置換されうる。また、後記で更に詳しく説明するとおり、該コンジュゲート化過程は、コンジュゲート化の前に或る反応性部分を選択的に保護することにより制御されうると理解されるであろう。
【０３０３】
ＬＢおよびＬＤ（共有結合）
ＸをＴに、および／またはＷをＴ（「成分」と総称される）に共有結合させるために、種々のコンジュゲート化化学が用いられうる、と当業者は理解するであろう。そのような技術は当技術分野において広く知られており、典型的な技術を以下に説明する。成分は、直接的に（すなわち、介在化学基を伴うことなく）またはスペーサー（例えば、コンジュゲート化要素と該コンジュゲートフレームワークの残部との間の何らかの物理的分離をもたらす共有鎖またはカップリング剤）を介して間接的に結合されうる。成分は、アミド、アミン、エステル、エーテル、チオエーテル、イソ尿素、イミンなどの結合（これらに限定されるものではない）を含む幾つかの化学結合によりコンジュゲートフレームワークに共有結合されうる、と理解されるべきである。ある実施形態においては、ＬＢおよび／またはＬＤ（この節の目的においては「Ｌ」と総称される）は共有結合である。いくつかの実施形態においては、Ｌは、Ｔの所望により置換されていてもよいカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性またはヒドロキシル反応性部分をＸまたはＷのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基に結合させることから誘導される所望により置換されていてもよい部分である。いくつかの実施形態においては、Ｌは、ＸまたはＷの所望により置換されていてもよいカルボキシル反応性、チオール反応性、アミン反応性またはヒドロキシル反応性部分をＴのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基に結合させることから誘導される所望により置換されていてもよい部分である。いくつかの実施形態においては、Ｌは
【０３０４】
【化５０】
2013541500.tif 000063
である。いくつかの実施形態においては、Ｌはスクシンイミド部分である。
【０３０５】
種々の実施形態においては、成分は、当技術分野で公知の「クリック（ｃｌｉｃｋ）化学」反応を用いてコンジュゲートフレームワークに共有結合されうる。これらは、例えば、環状付加反応、求核開環反応、および炭素−炭素多重結合への付加を含む（例えば、ＫｏｌｂおよびＳｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ８：１１２８−１１３７，２００３およびそれらにおいて引用されている参考文献ならびにＤｏｎｄｏｎｉ，Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ  Ｊ．２：７００−７０８，２００７およびそれらにおいて引用されている参考文献を参照されたい）。前記のとおり、種々の実施形態においては、該成分は、天然の又は化学的に付加された付随基を介してコンジュゲートフレームワークに結合されうる。一般に、該成分およびフレームワークのいずれか一方に、反応性基のペアの第１および第２メンバー（例えば、反応してアミド結合を生成するカルボキシル基およびアミン基）が存在しうる（すなわち、それらの２つのメンバーの相対位置は、それらが反応してコンジュゲートを生成する限り、無関係である）、と理解されるであろう。典型的な結合は後記で更に詳細に記載されている。種々の実施形態においては、カルボキシル（または反応性エステル）含有成分は、Ｋｉｍら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２４：４８４３−４８５１（２００３）により概説されている方法を用いて、−ＯＨ含有フレームワーク（ＯＢＦ）にコンジュゲート化（結合）されうる。簡潔に説明すると、該ＯＢＦを該カルボキシル含有成分と共にＤＭＳＯに溶解し、乾燥雰囲気下、Ｎ’，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒として使用して反応させる。カルボキシル含有成分は、カルボジイミド（ＥＤＡＣ）カップリング法を用いて−ＮＨ２含有フレームワーク（ＮＢＦ）にコンジュゲート化されうる。この方法を用いて、該カルボキシル含有成分を、ｐＨ５のバッファー中、ＥＤＡＣとの反応により官能基化し、ついでＮＢＦを加える。これらの場合のいずれにおいても（そして以下の場合のいずれにおいても）、得られる生成物は、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過および選択的沈殿を含む、当業者に利用可能な多数の手段により精製されうる。
【０３０６】
種々の実施形態においては、アミン含有成分を−ＣＯＯＨ含有フレームワーク（ＣＢＦ）に結合させることが可能である。活性化エステル部分を使用するＣＢＦ（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００８およびそれにおいて引用されている参考文献を参照されたい）。簡潔に説明すると、例えば−ＮＨＳ、−ＳＳＣ、−ＮＰＣなどのような末端活性化カルボン酸エステルを含有するＣＢＦを、無水有機溶媒、例えばＤＭＳＯまたはＤＭＦに溶解する。ついで所望の当量数のアミン含有成分を加え、室温で数時間混合する。また、Ｂａｕｄｙｓら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．９：１７６−１８３，１９９８に記載されているとおり、安定なアミン結合を得るために、アミン含有成分をＣＢＦにコンジュゲート化することも可能である。この反応は、無水条件下、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の該ＣＢＦとアミン含有成分との溶液にトリブチルアミン（ＴＢＡ）およびイソブチルクロロホルマートを加えることにより達成されうる。あるいは、アミン含有成分を、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、Ｎ−シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロボラート（ＣＴＥＡ）、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボラート（ＣＤＡＰ）およびｐ−ニトロフェニルシアナート（ｐＮＰＣ）など（これらに限定されるものではない）の試薬を使用して、シアン化によりＯＢＦに結合させることが可能である。ＣＮＢｒ反応は、水溶液中、弱塩基性ｐＨで行われうる。ＣＤＡＰ反応は、トリエチルアミン（ＴＥＡ）を触媒として使用して、弱塩基性ｐＨで、ＤＭＳＯと水との混合物中で行われる。ある実施形態においては、アミン含有成分を、例えば、ピリジンを含有する緩衝化水溶液中のグルタルアルデヒドカップリングおよびそれに続くグリシンでのクエンチによりＮＢＦにコンジュゲート化させることが可能である。ある実施形態においては、アミン含有成分を、シッフ塩基カップリング法の利用およびそれに続く還元により、アルデヒド含有フレームワークにコンジュゲート化することが可能である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００８およびそれにおいて引用されている参考文献ならびにＭｅｉら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１６：１６８０−１６８６を参照されたい）。簡潔に説明すると、末端活性化アルデヒド（例えば、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドなど）を有するフレームワークを、望ましくないアルデヒド加水分解を避けるために中性またはそれ未満のｐＨの水性バッファーに溶解する。ついで所望の当量数のアミン含有成分を加え、室温で混合し、ついで過剰の適当な還元剤（例えば、ナトリウムボロヒドリド、ナトリウムシアノボロヒドリド、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド、ピリジンボラン、トリエチルアミンボランなど）を加える。
【０３０７】
種々の実施形態においては、ヒドロキシル含有成分を、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）法に従いＯＢＦにコンジュゲート化することが可能である。この方法を用いて、該ＯＢＦをｐＨ１１．４の炭酸水素塩バッファーに加え、ＤＶＳで活性化させ、ついでヒドロキシル含有成分を加え、ついでグリシンを加えて該反応を中和しクエンチする。また、ヒドロキシル含有成分を、前記のとおりに活性化エステル部分を使用してＯＢＦに結合させて、エステル結合を生成させることも可能である。
【０３０８】
種々の実施形態においては、スルフヒドリル含有成分を、比較的穏やかな方法を用いて、マレイミド含有フレームワーク（ＭＢＦ）に結合させて、チオエーテル結合を生成させることが可能である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００８およびそれにおいて引用されている参考文献を参照されたい）。該マレイミド基は活性化エステルより遥かに加水分解を受けにくいため、該反応は、水性条件下で行われうる。簡潔に説明すると、ＭＢＦをｐＨ６．５〜７．５の緩衝化水溶液に溶解し、ついで所望の当量数のスルフヒドリル含有成分を溶解する。室温で数時間混合した後、該チオエーテル結合コンジュゲートを精製することが可能である。また、スルフヒドリル含有成分を、Ｔｈｏｍａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５９１９−５９２９，１９９９に記載されている方法により、ＮＢＦにコンジュゲート化することが可能である。この反応は、該ＮＢＦを無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁させ、ついで２，６−ルチジンおよび酸無水物を加え、ついで反応中間体を精製することを含む。ついでスルフヒドリル含有成分をトリエチルアミンと共にＤＭＦ中の該中間体の溶液に加える。
【０３０９】
種々の実施形態においては、アジド含有成分を、ホイスゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）型アジド−アルキン環状付加の銅（Ｉ）触媒現代版を用いて、アルキン含有フレームワーク（ＡＢＦ）に結合させて、１，４−ジ−置換１，２，３−トリアゾールを得ることが可能である（例えば、Ｄｏｎｄｏｎｉ，Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ  Ｊ．２：７００−７０８，２００７およびそれにおいて引用されている参考文献ならびにＤｅｄｏｌａら，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．５：１００６−１０１７，２００７を参照されたい）。この反応は、一般に「クリック（ｃｌｉｃｋ）」反応と称され、例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびＣｕ（ＰＰｈ３）３Ｂｒを触媒系として使用して、ＴＨＦ原液中で行われうる（例えば、Ｗｕら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５７７５−５７７７，２００５を参照されたい）。該反応は、アスコルビン酸ナトリウムおよびＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを触媒系として使用して、３：１（ＴＨＦ：水）混合物中でも行われうる（例えば、Ｗｕら，前掲を参照されたい）。いずれの場合も、該アジド含有成分を所望の当量数で該ＡＢＦに加え、ついで室温で１２〜４８時間混合する。あるいは、前記と全く同じ条件を用いて、アルキン含有成分をアジド含有フレームワークにコンジュゲート化することが可能である。
【０３１０】
ある成分は２以上の同じ化学的反応性部分を天然で有する。いくつかの例においては、それらの部位の１つだけにおいて該成分を選択的に反応させるための化学反応型および条件を選択することが可能である。例えば、インスリンを反応性アミンを介してコンジュゲート化する場合、ある実施形態においては、インスリン生物活性を維持するためには、Ｎ末端α−Ｐｈｅ−Ｂ１はＮ末端α−Ｇｌｙ−Ａ１およびε−Ｌｙｓ−Ｂ２９より好ましい結合部位である（例えば、Ｍｅｉら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１６８０−１６８６，１９９９およびそれにおいて引用されている参考文献ならびにＴｓａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８，１９９７を参照されたい）。インスリンとヘキサデセナール（アルデヒドを末端とする分子）との間の典型的な反応において、５４％  イソプロパノールを含有するｐＨ６．８の１．５Ｍ  サリチル酸ナトリウム水溶液中、ナトリウムシアノボロヒドリドの存在下、それらの２つの成分を１：６（インスリン：アルデヒド  ｍｏｌ／ｍｏｌ）の比で一晩混合すると、単一置換Ｐｈｅ−Ｂ１第二級アミンコンジュゲート化生成物への８０％を超える変換が生じることを、研究者は見出した（Ｍｅｉら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１６８０−１６８６，１９９９）。彼らの研究は、溶媒、ｐＨおよびインスリン：アルデヒド比の全ての選択が該反応の選択性および収率に影響を及ぼすことを示した。しかし、ほとんどの場合、化学反応条件の選択による選択性の達成は困難である。したがって、ある実施形態においては、反応が望まれる部位以外の全ての部位において該成分（例えば、インスリン）を選択的に保護し、ついで、該マテリアルが反応生成し精製された後、脱保護工程を行うことが有利でありうる。例えば、インスリンアミン基の選択的保護の多数の例が文献に記載されており、例えば、酸性（ＢＯＣ）、弱酸性（シトラコン酸無水物）および塩基性（ＭＳＣ）下で脱保護されうるものが含まれる（例えば、Ｔｓａｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８，１９９７；Ｄｉｘｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０９：３１２−３１４，１９６８；およびＳｃｈｕｅｔｔｌｅｒら，Ｄ．Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６０：１７２１，１９７９を参照されたい）。一例においては、Ｇｌｙ−Ａ１およびＬｙｓ−Ｂ２９アミンをｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）基で選択的に保護し、ついで、９０％  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／１０％  アニソール溶液中、４℃で１時間のインキュベーションにより、コンジュゲート化した後、それを除去することが可能である。１つの実施形態においては、インスリンの乾燥粉末を無水ＤＭＳＯに溶解し、ついで過剰のトリエチルアミンを溶解する。この溶液に、ＴＨＦ中の約２当量のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート溶液ををゆっくり加え、該溶液を３０〜６０分間混合させる。反応後、該粗溶液を過剰のアセトンに注ぎ、ついで希ＨＣｌを滴下して、反応したインスリンを沈殿させる。該沈殿物を遠心分離し、アセトンで洗浄し、真空下で完全に乾燥させる。所望のジ−ＢＯＣ保護生成物は、分取逆相ＨＰＬＣまたはイオン交換クロマ��グラフィーを用いて、未反応インスリン、望ましくないジ−ＢＯＣ異性体およびモノ−ＢＯＣおよびトリ−ＢＯＣ副生成物から分離されうる（例えば、Ｔｓａｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６：１２６４−１２６８，１９９７を参照されたい）。逆相ＨＰＬＣの場合、０．１％  ＴＦＡを含有する７０％  水／３０％  アセトニトリル中の該粗生成物の溶液をＣ８カラム上にローディングし、次第に増加するアセトニトリル勾配で溶出する。所望のジ−ＢＯＣピークを集め、ロトバップに付して（ｒｏｔｏｖａｐｐｅｄ）アセトニトリルを除去し、それを凍結乾燥して純粋な生成物を得る。
【０３１１】
ＬＲＰＢおよびＬＲＰＤ（非共有結合）
ＸをＴに、および／またはＷをＴ（「成分」と総称される）に非共有結合させるために種々のコンジュゲート化化学法が用いられうる、と当業者は理解するであろう。そのような技術は当技術分野において広く知られており、典型的な技術を以下に記載する。ある実施形態においては、ヒト血清における非共有結合の解離定数（Ｋｄ）は１ｐｍｏｌ／Ｌ未満である。例えば、成分は、当技術分野でよく知られている非共有的リガンド−受容体ペア（限定的なものではないが例えば、ビオチン−アビジンに基づくペア）を介してコンジュゲートフレームワークに非共有結合されうる。そのような実施形態においては、該リガンド受容体ペアの一方のメンバーは該成分に共有結合され、該ペアのもう一方のメンバーはコンジュゲートフレームワークに共有結合される。該成分およびコンジュゲートフレームワークが一緒になると、該リガンドとその受容体との間の強力な非共有的相互作用が該成分を該コンジュゲートフレームワークに非共有結合させる。典型的なリガンド／受容体ペアには、タンパク質／補因子および酵素／基質ペアが含まれる。一般に使用されるビオチン／アビジンペアの他に、これらには、限定的なものではないが、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ＦＫ５０６／ＦＫ５０６結合性タンパク質（ＦＫＢＰ）、ラパマイシン／ＦＫＢＰ、シクロフィリン／シクロスポリン、およびグルタチオン／グルタチオントランスフェラーゼペアが含まれる。他の適当なリガンド／受容体ペア、例えば、限定的なものではないがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（登録商標）ならびに更にはＫｅｓｓｌｅｒ，“Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”，Ｋｅｓｓｌｅｒ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９０のｐ．１０５−１５２、“Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）”，Ｐａｓｃａｌ  Ｂａｉｌｌｏｎ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２０００、および“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２に記載されているもののようなエピトープタグとペアになったモノクローナル抗体が、当業者により認識されるであろう。
【０３１２】
ｋおよびｑ
一般式（Ｖ）のコンジュゲートの場合、ｋは２〜１１（２および１１を含む）の整数であり、該コンジュゲート内の少なくとも２つのｋ分枝を定める。ある実施形態においては、ｋ＝２または３である。ｑは１〜４（１および４を含む）の整数であり、中央の［Ａ］基に結合したＤ基の数を定める。ある実施形態においては、ｑ＝１である。いくつかの実施形態においては、ｑ＝２である。ｋ＋ｑは３〜６（３および６を含む）の整数である。ある実施形態においては、ｋ＋ｑ＝３または４である。
【０３１３】
ｊが２、３または４である一般式（ＶＩ）のコンジュゲートの場合、ｋは１〜１１（１および１１を含む）の整数である。ある実施形態においては、ｋは１、２または３である。ｑは１〜４（１および４を含む）の整数であり、中央の［Ａ］基に結合したＤ基の数を定める。ある実施形態においては、ｑ＝１である。いくつかの実施形態においては、ｑ＝２である。ｋ＋ｑは３〜６（３および６を含む）の整数である。ある実施形態においては、ｋ＋ｑ＝３または４である。
【０３１４】
ｐおよびｍ
ｐの各存在は、独立して、１〜５（１および５を含む）の整数である。ある実施形態においては、ｐの各存在は同一である。ある実施形態においては、ｐ＝１、２または３である。ある実施形態においては、ｐ＝１である。
【０３１５】
ｍの各存在は、独立して、１〜５（１および５を含む）の整数である。ある実施形態においては、ｍの各存在は同一である。ある実施形態においては、ｍ＝１，２または３である。ある実施形態においては、ｍ＝１である。
【０３１６】
ｎおよびｖ
ｎの各存在は、独立して、０〜５（０および５を含む）の整数である。ただし、各ｋ分枝においては、少なくとも１つのｎの存在は＞１である。与えられたｋ分枝内の分子は本明細書においてはｎ分枝と称される。
【０３１７】
ある実施形態においては、ｐ括弧部分内の［Ａ］の各存在は、ｎ＞１の値に対応する幾つかのｎ括弧部分により置換される（例えば、前記式（Ｖａ）を参照されたい）。いくつかのそのような実施形態においては、該コンジュゲートにおけるｎの各存在は同一である。これらの実施形態のいくつかにおいては、ｎ＝１または２である。
【０３１８】
他の実施形態においては、ｐ括弧部分内の［Ａ］の末端存在のみが、ｎ＞１の値に対応する幾つかのｎ括弧部分により置換される（例えば、前記式（Ｖｂ）を参照されたい）。ある実施形態においては、各ｋ分枝は、ｎ＞１のただ１つの存在を含む（すなわち、ｎの全ての他の存在＝０）。いくつかのそのような実施形態においては、該コンジュゲートにおけるｎの各存在は同一である。これらの実施形態のいくつかにおいては、ｎ＝１または２である。
【０３１９】
ｖの各存在は、独立して、０〜５（０および５を含む）の整数である。ただし、各ｋ分枝においては、少なくとも１つのｖの存在は＞１である。
【０３２０】
ある実施形態においては、ｍ括弧部分内の［Ａ］の各存在は、ｖ＞１の値に対応する幾つかのＢ部分により置換される（例えば、前記式（Ｖｃ）を参照されたい）。いくつかのそのような実施形態においては、該コンジュゲートにおけるｖの各存在は同一である。これらの実施形態のいくつかにおいては、ｖ＝１または２である。
【０３２１】
他の実施形態においては、ｍ括弧部分内の［Ａ］の末端存在のみが、ｖ＞１の値に対応する幾つかのＢ部分により置換される（例えば、前記式（Ｖｄ）を参照されたい）。ある実施形態においては、各ｋ分枝は、ｖ＞１のただ１つの存在を含む（すなわち、ｖの全ての他の存在＝０）。いくつかのそのような実施形態においては、該コンジュゲートにおけるｖの各存在は同一である。これらの実施形態のいくつかにおいては、ｖ＝１または２である。ある実施形態においては、各ｎ分枝は、ｖ＞１の少なくとも１つの存在を含む。ある実施形態においては、各ｎ分枝は、ｖ＞１のただ１つの存在を含む（すなわち、ｖの全ての他の存在＝０）。いくつかのそのような実施形態においては、該コンジュゲートにおけるｖの各存在は同一である。これらの実施形態のいくつかにおいては、ｖ＝１または２である。
【０３２２】
式（ＶＩ）のｊは１〜４（１および４を含む）の整数であり、Ｄ基へのコンジュゲート化の数を定める。ある実施形態においては、ｊ＝１である。ある実施形態においては、ｊ＝２である。いくつかの実施形態においては、ｊ＝３である。他の実施形態においては、ｊ＝４である。
【０３２３】
ローディングレベル
一般に、コンジュゲート上にローディングされる薬物（または検出可能標識）の量は該薬物の分子量に左右され、コンジュゲートフレームワークの分子量および／または化学的活性化のレベル（すなわち、該フレームワークに付随基が付加される場合）を調節することにより制御されうる。種々の実施形態においては、該薬物および／または検出可能標識のローディングレベルは、コンジュゲート（例えば、薬物を含むもの）に対して、薬物および／または検出可能標識５〜９９％  ｗ／ｗの範囲でありうる。種々の実施形態においては、５０〜９０％の狭い範囲内、例えば８０〜９９％の範囲内のローディングレベルが用いられうる。
【０３２４】
その他
種々の実施形態においては、生分解性フレームワークが使用されうる。種々の実施形態においては、例えば、生分解性が用途に重要でない場合、および／または得られるフレームワークもしくはコンジュゲートが、生分解性が必要でないほどに十分に良く排泄される場合には、非生分解性フレームワークが使用されうる。種々の実施形態においては、コンジュゲートフレームワーク（または存在する場合には、例えば薬物とフレームワークとの間のスペーサー）は酵素による消化を受けやすい。種々の実施形態においては、該酵素は投与部位に存在する。コンジュゲートフレームワークを切断しうる幾つかの酵素が患者に存在する、と当業者は認識するであろう。限定的なものではないが、これらには、サッカリダーゼ、ペプチダーゼおよびヌクレアーゼが含まれる。典型的なサッカリダーゼには、マルターゼ、スクラーゼ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、グルコアミラーゼおよびデキストラナーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。典型的なペプチダーゼには、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ、プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼおよびグリシルグリシンジペプチダーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。典型的なヌクレアーゼには、デオキシリボヌクレアーゼＩ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１およびヌクレアーゼＳ１が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０３２５】
また、酵素の選択に応じて、酵素切断を受けうる幾つかのコンジュゲートフレームワークが存在する、と当業者は認識するであろう。例えば、サッカリダーゼ分解が望まれる場合には、多糖を含むフレームワークが使用されうる（例えば、限定的なものではないが、１，４−結合アルファ−Ｄ−グルコース残基の反復鎖を含む多糖を含むコンジュゲートはアルファ−アミラーゼにより分解されるであろう）。限定的なものではないが、適当な多糖には、スイートコーン、カキ、肝臓（ヒト、ウシ、ウサギ、ラット、ウマ）、筋肉（ウサギの脚、ウサギの腹部、魚、ラット）、ウサギの毛、スリッパー・リンペット（ｓｌｉｐｐｅｒ  ｌｉｍｐｅｔ）、パン酵母および真菌（これらに限定されるものではない）を含む多数の起源に由来するグリコーゲンおよび部分消化グリコーゲンが含まれる。使用されうる他の多糖重合体およびスペーサーには、カルボキシル化多糖、−ＮＨ２付随多糖、ヒドロキシル化多糖、アルギナート、コラーゲン−グリコサミノグリカン、コラーゲン、マンナン、アミロース、アミロペクチン、セルロース、ヒアルロナート、コンドロイチン、デキストリン、キトサンなどが含まれる。ペプチダーゼ切断が望まれる場合には、切断性酵素により認識されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが使用されうる（例えば、限定的なものではないが、［−グリシン−プロリン−］配列を含むコンジュゲートはプロリダーゼにより分解されるであろう）。ある実施形態においては、アミノ化および非アミノ化アミノ酸の共重合体、ヒドロキシル化および非ヒドロキシル化アミノ酸の共重合体、カルボキシル化および非カルボキシル化アミノ酸の共重合体、前記または前記付加体の共重合体を使用しうるであろう。ヌクレアーゼ消化が望まれる場合には、ポリヌクレオチドが使用されうる（例えば、限定的なものではないが、連続的アデノシン残基のオリゴマーを含有するポリヌクレオチドを含むコンジュゲートはリボヌクレアーゼＡにより分解されるであろう）。
【０３２６】
種々の実施形態においては、コンジュゲート（すなわち、コンジュゲート化薬および／または化学的もしくは酵素的分解によりコンジュゲートから放出された薬物）の薬物動態学的および／または薬力学的挙動は、対応する非コンジュゲート化薬と（例えば、両方が皮下投与された場合）実質的に同一でありうる。例えば、薬物動態（ＰＫ）の観点からは、血清濃度曲線は、同等量の非コンジュゲート化薬が投与された場合と実質的に同一でありうる。追加的または代替的に、血清Ｔｍａｘ、血清Ｃｍａｘ、平均血清滞留時間（ＭＲＴ）、平均血清吸収時間（ＭＡＴ）および／または血清半減期は、非コンジュゲート化薬が投与された場合と実質的に同一でありうる。薬力学（ＰＤ）の観点からは、該コンジュゲートは、非コンジュゲート化薬と実質的に同じ様態で体内の物質に作用しうる。例えば、インスリンコンジュゲートの場合、該コンジュゲートは、非コンジュゲート化インスリンと実質的に同じ様態で血液グルコースレベルに影響を及ぼしうる。この場合、最小血液グルコース濃度に到達するまでの時間（Ｔｎａｄｉｒ）、初期値に対する或る比率（例えば、初期値の７０％、またはＴ７０％ＢＧＬ）未満に血液グルコースレベルが維持される持続時間などを比較することにより、実質的に類似した薬力学的挙動が観察されうる。これらのＰＫおよびＰＤ特性は、種々の公開されている薬物動態学的または薬力学的方法（例えば、皮下運搬に適した方法に関しては、Ｂａｕｄｙｓら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．９：１７６−１８３，１９９８を参照されたい）のいずれかに従い決定されうる、と理解されるであろう。
【０３２７】
１つの実施形態においては、コンジュゲート（すなわち、修飾レクチンを伴わない単離形態）は、例えば、非コンジュゲート化薬に関して決定された値の４０％以内である、最大血清薬物濃度に到達するまでの時間（Ｔｍａｘ）、平均薬物滞留時間（ＭＲＴ）、血清半減期および平均薬物吸収時間（ＭＡＴ）のような薬物動態学的（ＰＫ）パラメータを示す。種々の実施形態においては、コンジュゲートは、非コンジュゲート化薬により示されるＰＫパラメータの３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または更には１０％以内であるＰＫパラメータを示す。いくつかの実施形態においては、コンジュゲートは、非コンジュゲート化薬により示されるＰＫパラメータの２０％以内であるＰＫパラメータを示す。例えば、皮下運搬のためのインスリンコンジュゲートを含む実施形態においては、該コンジュゲートは、１５〜３０分のインスリンＴｍａｘ、５０分未満の平均インスリン滞留時間（ＭＲＴ）、または４０分未満の平均インスリン吸収時間（ＭＡＴ）（これらの全ては、ヒト組換えインスリン治療群から決定された値の２０％以内である）を示しうる。ある実施形態においては、該コンジュゲートは２０〜２５分のインスリンＴｍａｘ、４５分未満の平均インスリン滞留時間（ＭＲＴ）、および３５分未満の平均インスリン吸収時間（ＭＡＴ）を示しうる。ある実施形態においては、該コンジュゲートは、１２０分未満、例えば１００分未満の血清半減期を示しうる。
【０３２８】
１つの実施形態においては、本発明のコンジュゲートは、例えば、物質の最小／最大血液濃度に到達するまでの時間（Ｔｎａｄｉｒ／Ｔｍａｘ）、または該物質の血液レベルが初期値の７０％／１３０％未満／超に維持される持続時間（Ｔ７０％ＢＬ／Ｔ１３０％ＡＬ）のような薬力学（ＰＤ）パラメータを示す。例えば、皮下運搬のためのインスリンコンジュゲートを含む実施形態においては、該コンジュゲートは、４５〜６０分のグルコースＴｎａｄｉｒ、および１８０分未満のグルコースＴ７０％ＢＧＬ（これらは共に、ヒト組換えインスリン治療群から決定された値の２０％以内である）を示しうる。ある実施形態においては、５０〜５５分のグルコースＴｎａｄｉｒ、および１６０分未満のグルコースＴ７０％ＢＧＬを示しうる。種々の実施形態においては、コンジュゲートは、非コンジュゲート化薬により示されるＰＤパラメータの４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または更には１０％以内であるＰＤパラメータを示す。いくつかの実施形態においては、コンジュゲートは、非コンジュゲート化薬により示されるＰＤパラメータの２０％以内であるＰＤパラメータを示す。
【０３２９】
コンジュゲートを製造するための中間体
１つの態様においては、本発明は、本開示のコンジュゲートを製造するための試薬を提供する。したがって、種々の実施形態においては、
［Ａ］、Ｔ、Ｄ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖのそれぞれが、前記および本明細書中に記載されているとおりに定義され、
Ｂが−Ｔ−ＬＢであり、
ＬＢの各存在が、独立して、水素、アルキン含有部分、アジド含有部分、または所望により置換されていてもよいカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性もしくはヒドロキシル反応性部分である、一般式（Ｖ）の化合物を提供する。他の実施形態においては、
［Ａ］、Ｔ、Ｂ、ｋ、ｑ、ｋ＋ｑ、ｐ、ｎ、ｍおよびｖのそれぞれが、前記および本明細書中に記載されているとおりに定義され、
Ｄが−Ｔ−ＬＤであり、
ＬＤの各存在が、独立して、水素、アルキン含有部分、アジド含有部分、または所望により置換されていてもよいカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性もしくはヒドロキシル反応性部分である、一般式（Ｖ）の化合物を提供する。
【０３３０】
コンジュゲートの製造方法
本発明者らは、典型的な薬物としてインスリンを、そして典型的なアフィニティリガンドとしてアミノエチルグルコース（ＡＥＧ）、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）、アミノエチルビマンノース（ＡＥＢＭ）および／またはアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）を使用して、前記コンジュゲートの製造方法を例示している。限定的なものではないが、２つのアフィニティリガンドと１つの薬物分子とを含有し、全てのフレームワーク成分の間に短い距離を有するコンジュゲートは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ−スクシンイミジルアミノトリアセタート（ＴＳＡＴ）、ｔｒｉｓ−スクシンイミジル−１，３，５−ベンゼントリカルボキシラート（ＴＳＢ）およびベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−４−酪酸−ＮＨＳ−エステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ４）をコンジュゲートフレームワークとして使用して製造されうる。フレームワーク成分間に、より大きな空間が望まれる場合には、スクシンイミジル（６−アミノカプロイル）アミノトリアセタート（ＴＳＡＴ−Ｃ６）、スクシンイミジル（６−アミノ（ＰＥＯ−６））アミノトリアセタート（ＴＳＡＴ−ＰＥＯ−６）、ベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−６−アミノカプロン酸−ＮＨＳエステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ６）およびベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−１０−アミノデカン酸−ＮＨＳエステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ１０）が使用されうる。ＴＳＡＴ−Ｃ６スペーサーアーム化学は、ＴＳＡＴ−ＰＥＯ−６の場合より疎水性の特性を該コンジュゲートに付与する。例えば、例示目的としてであるが、１つの実施形態においては、アフィニティリガンド（例えば、ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＭＢおよびＡＥＴＭ）およびインスリンの両方を、末端活性化エステルを介してＴＳＡＴ−Ｃ６フレームワークと反応させて、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＧ−２、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２、インスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭＢ−２およびインスリン−ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２コンジュゲートを得ることが可能である。これらの種々のアフィニティリガンドは、実施例に記載されているとおり、前もって合成される。また、各インスリンがＰｈｅ−Ｂ１  α−アミノ基においてのみ反応しうるように、実施例に記載されているとおり、インスリンのＡ１およびＢ２９アミノ基はＢＯＣ保護される。ＤＭＳＯ中の４０〜５０ｍｇ／ｍｌ  溶液としての約１当量のＢＯＣ−インスリンを、過剰のトリエチルアミンを含有するＤＭＳＯ中のＴＳＡＴ−Ｃ６の５０ｍｇ／ｍｌ  溶液に室温で加え、約１時間反応させる。つぎに、ＤＭＳＯ中の１００ｍｇ／ｍｌ  溶液としての過剰のＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭおよび／またはＡＥＴＭ（２〜１０当量）を加え、更に１２時間反応させる。反応後、該ＤＭＳＯ溶液をｐＨ５の食塩バッファー中に１０倍で超希釈し、ついでｐＨを８．０に調節し、該溶液をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通過させて、低分子量反応物および塩を除去する。ボイド画分において溶出する物質を、３Ｋ限外濾過装置を使用して濃縮し、ついでそれを予備規模の逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ８，０．１％  ＴＦＡを含有するアセトニトリル／水移動相）上に注入して、���反応ＢＯＣ２−インスリンから所望の生成物を精製する。所望の溶出ピークを集め、プールし、ロトバップに付して（ｒｏｔｏｖａｐｐｅｄ）、アセトニトリルを除去し、それを凍結乾燥して純粋な生成物を得る。最後に、該凍結乾燥粉末を９０％  ＴＦＡ／１０％  アニソールに４℃で１時間溶解し、ついで、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有するＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）バッファー中で１０倍で超希釈することにより、ＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を使用して、ｐＨを７．０〜８．０に調節し、ついで該物質をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通過させて、アニソール、ＢＯＣおよびいずれかの他の混入塩を除去する。ついで、脱保護され精製されたコンジュゲート水溶液を所望のレベルまで濃縮し、必要になるまで４℃で保存する。
【０３３１】
この典型的な方法は、ＴＳＡＴ−Ｃ６フレームワークを後記の異なるフレームワークで置換することにより、異なるアフィニティリガンドおよび薬物、異なるコンジュゲート化化学、フレームワーク成分間の異なる分離ならびに／または異なる価数を伴う他のコンジュゲートを製造するために用いられうる、と理解されるであろう。
【０３３２】
例えば、フレームワーク成分間に更に大きな距離が要求され、および／または維持された電荷がコンジュゲート化部位において要求される場合には、適当なサイズのアミン含有ジエチルアセタール（例えば、アミノプロピオンアルデヒドジエチルアセタール（ＡＰＤＡ）またはアミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（ＡＢＤＡ））を、ここに挙げられているフレームワーク上の反応性基の１つにコンジュゲート化し、ついで残りの反応性基を、関心のあるアフィニティリガンド（例えば、ＡＥＭ、ＡＥＢＭまたはＡＥＴＭ）と完全に反応させることが可能である。ついで酸性条件下で反応性アルデヒド基を該ジエチルアセタールから露出させ、ついでインスリンで還元的アミノ化を行って、薬物コンジュゲート化工程を完了させ、ついでＡＢＤＡ−ＴＳＡＴ、ＡＢＤＡ−ＬＣＴＳＡＴなどを使用することが可能である。更にもう１つの例においては、多価性を増加させるために、テトラキス−（Ｎ−スクシンイミジルカルボキシプロピル）ペンタエリトリトール（ＴＳＰＥ）を使用して、３つのアフィニティリガンドおよび１つの薬物分子を結合させることが可能である。また、前記教示のいずれかを用いて、より一層高次の価数を有する超分枝（例えば、樹枝状）コンジュゲートを製造することが可能である、と当業者に理解されるであろう。例えば、ＲｏｃｋｅｎｄｏｒｆおよびＬｉｎｄｈｏｒｓｔは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２１７：２０２−２３８，２００１において、超分枝構造体を製造するための本アプローチの包括的総説を記載している。
【０３３３】
更に、所定の度合の多価性を既に含有するリガンドを前記方法により再び反応させて、より一層高次のリガンド多価性を得ることが可能である。例えば、各アフィニティリガンドの２つを、反応性アミンもコンジュゲート化されている適当なフレームワークにコンジュゲート化することにより、末端反応性アミンを含有する２価ＡＥＭ−２、ＡＥＢＭ−２またはＡＥＴＭ−２分子を製造することが可能である。各アフィニティリガンドの３つを、反応性アミンもコンジュゲート化されている適当なフレームワークにコンジュゲート化することにより、末端反応性アミンを含有する３価ＡＥＭ−３、ＡＥＢＭ−３またはＡＥＴＭ−３分子を製造することが可能である。該ＮＨ２−２価糖を前記の同じフレームワークと反応させて、薬物分子１個当たり４および６個のリガンドを含有する薬物コンジュゲートを得ることが可能である。該ＮＨ２−３価糖を前記の同じフレームワークと反応させて、薬物分子１個当たり６および９個のリガンドを含有する薬物コンジュゲートを得ることが可能である。
【０３３４】
全ての場合において、フレームワーク化学、価数およびリガンド：フレームワーク化学量論を調節することにより、異なるリガンドの混合物を多価フレームワークを介して同一薬物にコンジュゲート化することが可能である、と認識されるべきである。例えば、インスリン−ＡＥＭ−１−ＡＥＢＭ−１、インスリン−ＡＥＢＭ−１−ＡＥＴＭ−１、インスリンＡＥＭ−２−ＡＥＴＭ−２およびインスリンＡＥＭ−１ＡＥＴＭ−２は全て、この混合リガンド法により合成されうる。
【０３３５】
最後に、いくつかの場合には、該薬物とは異なる手段によりアフィニティリガンドを該フレームワークにコンジュゲート化することが望ましいかもしれない。例えば、２価マレイミド／１価活性エステル官能基化フレームワーク（例えば、スクシンイミジル−３，５−ジマレイミドフェニルベンゾアート（ＳＤＭＢ））を使用して、別々の工程で２つのスルフヒドリル官能基化アフィニティリガンドおよび１つのアミン官能基化薬をコンジュゲート化することが可能である。例えば、本明細書に記載されている方法を用いて、インスリンまたは別のアミン含有薬を該フレームワークの活性化エステル部分にコンジュゲート化することが可能である。別の工程において、４−イミノチオランとの反応により、アミノエチル糖（ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭ）を末端スルフヒドリル含有リガンドに変換することが可能である。最後に、該フレームワーク−ジ−マレイミド−インスリンコンジュゲートを過剰のスルフヒドリル官能基化糖と混合して、生じる２価−糖−インスリンコンジュゲートを得ることが可能である。
【０３３６】
架橋マテリアル
コンジュゲートおよび架橋剤を標的分子の非存在下で一緒にすると、非共有的に架橋されたマテリアルが形成される。種々の実施形態においては、架橋剤とコンジュゲートとの溶液を混合することにより、自己集合により、該マテリアルは水溶液中で製造されうる。種々の実施形態においては、逆エマルションにより該マテリアルの粒子が製造されうる。米国特許出願公開第２００４−０２０２７１９号に更に詳細に記載されているとおり、これは、疎水性液体と界面活性剤との混合物に前記水溶液を加え、該混合物を撹拌することにより達成されうる。
【０３３７】
該架橋マテリアルが形成されたら、それは種々の用途に使用されうる。マテリアルが遊離標的分子の存在下に配置されると、これらは架橋剤とコンジュゲートとの相互作用に関して競合する。遊離標的分子が或る濃度を超えると、競合のレベルは、コンジュゲートを表面から放出することによりマテリアルが分解し始めるようなものとなる。種々の実施形態においては、放出の度合および／または速度は、標的分子の濃度が増加するにつれて増加する。その結果、標的分子の局所濃度に直接的に関連づけられる様態で、コンジュゲートはマテリアルから放出される。
【０３３８】
一般に、マテリアルの放出特性は、架橋剤、コンジュゲート、標的分子および条件（例えば、ｐＨ、温度など）の性質に左右されるであろう。コンジュゲートに対する架橋剤のアフィニティが標的分子に対するアフィニティより遥かに大きい場合には、マテリアルは、標的分子の濃度が高い場合にコンジュゲートを放出するに過ぎない。コンジュゲートに対する架橋剤の相対アフィニティが減少すると、マテリアルからのコンジュゲートの放出はより低い標的分子濃度で生じるであろう。マテリアルの放出特性は、コンジュゲートに対する架橋剤の相対量を変化させることによっても調節されうる。コンジュゲートに対する架橋剤の比が高いほど、より高い標的分子濃度でコンジュゲートを放出するマテリアルが得られるであろう。コンジュゲートに対する架橋剤の比が低いほど、より低い標的分子濃度でコンジュゲートを放出するマテリアルが得られるであろう。用途に応じて、これらの変数は、多種多様な標的分子濃度に応答するマテリアルを与えることを可能にすると、理解されるであろう。
【０３３９】
種々の実施形態においては、該架橋マテリアルは、３７℃でｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中に配置された場合、不溶性である。種々の実施形態においては、設定点と称される閾値濃度まで標的分子が該バッファーに加えられた場合、該架橋マテリアルは実質的に不溶性のままである。設定点を超えると、該架橋マテリアルはコンジュゲートの放出の度合および速度の増加を示す。この変化は急激に生じうる、あるいは設定点の周囲の濃度の範囲にわたって徐々に生じうる、と理解されるであろう。一般に、所望の設定点および変化は標的分子の性質および該マテリアルの意図される用途に左右されるであろう。特に、該マテリアルが、特定の標的分子のレベルの増加に応答するように設計された場合、該標的分子の濃度の正常な生理的範囲に基づいて所望の設定点が決定されうる。患者に存在する標的分子の量は内部および／または外部因子に基づいて変動しうる、と理解されるべきである。例えば、ある実施形態においては、標的分子の量は、例えば、ホルモン周期または代謝経路における変化に応答して、経時的に自然変動しうる（耐久的事象中に増加する乳酸など）。ある実施形態においては、該変動は外部事象（例えば、食後のグルコースの増加）から生じうる。種々の実施形態においては、外部因子は、本開示のマテリアルからのコンジュゲートの放出を人工的に誘発させるために用いられうる。例えば、コンジュゲートの放出がグルコースの増加に感受性である場合、高グルコース飲料を摂取することにより、短時間にわたりコンジュゲートを人工的に放出させることが可能であろう。
【０３４０】
種々の実施形態においては、標的分子はグルコースである。ヒトにおけるグルコース濃度の正常な生理的範囲は６０〜２００ｍｇ／ｄＬである。６０ｍｇ／ｄＬ未満のグルコース濃度は低血糖とみなされる。２００ｍｇ／ｄＬを超えるグルコース濃度は高血糖とみなされる。種々の実施形態においては、本開示のマテリアルは、５０ｒｐｍでのＵＳＰ溶解試験法ＩＩを用いて、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含有するｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中に３７℃で６時間配置された場合、実質的に不溶性のままでありうる。種々の実施形態においては、５０ｒｐｍでのＵＳＰ溶解試験法ＩＩを用いて、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含有するｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中に３７℃で６時間配置された場合、該マテリアルの１、２、４、６、８または１０％未満が溶解する。種々の実施形態においては、５０ｒｐｍでのＵＳＰ溶解試験法ＩＩを用いて、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含有するｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中に３７℃で６時間それが配置された場合、本開示のマテリアルの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％未満が溶解する。
【０３４１】
以下の表は他の典型的な標的分子に関する正常な生理的範囲を示す。
【０３４２】
【表６】
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これらの及び他の標的分子に関する所望の設定点は多種多様な用途に関して容易に決定されうる、と理解されるであろう。該設定点は、ある患者（例えば、患者の性別、異常に低い又は高いレベルの標的分子を有する患者などに基づく）または用途（例えば、より高い頻度で放出するように設計された薬物運搬系は、より低い頻度で放出するように設計された系より低い閾値濃度を要しうる）に関して調節される必要がありうる、と理解されるであろう。
【０３４３】
所望の設定点を有するマテリアルは、本明細書に記載されている材料および方法を用いて通常の実験により製造されうる、と理解されるであろう。例えば、同じ架橋剤およびコンジュゲートを組合せて、コンジュゲートに対する架橋剤の次第に増加する比（ｗ／ｗ）を有する一連のマテリアルを製造することが可能である。これらのマテリアルは或る範囲の設定点をカバーするであろう。適当な設定点を有するリードマテリアルが特定されたら、より精密な精度で該方法を繰返して、最適化マテリアルを得ることが可能である。あるいは（または追加的に）、同じコンジュゲートを、該コンジュゲートに対する次第に増加するアフィニティを有する複数の異なる架橋剤と組合せることが可能である。これは、（例えば、コンジュゲートに対する架橋剤のｗ／ｗ比を変化させることにより）更に精密化されうる設定点の範囲を有する複数のマテリアルを与えるであろう。あるいは、同じ架橋剤を複数の異なるコンジュゲートと組合せることにより、該方法を開始させることが可能であろう。種々の実施形態においては、該コンジュゲートは、（例えば、種々のアフィニティリガンドを含ませることの結果として）架橋剤に対する種々のアフィニティを有しうる。種々の実施形態においては、該コンジュゲートは同じアフィニティリガンドを含みうるが、（例えば、異なるコンジュゲートフレームワークの結果として）異なる分子量を有しうる。
【０３４４】
用途
もう１つの態様においては、本開示は、該マテリアルの使用方法を提供する。一般に、該マテリアルは、標的分子に応答して、制御可能な様態でコンジュゲートを放出するために使用されうる。後記のとおり、該マテリアルはインビトロまたはインビボで標的分子と接触されうる。
【０３４５】
種々の実施形態においては、マテリアルはインビトロまたはインビボ化学センサーの成分として使用されうる。この態様はグルコースセンサーに関して後記で説明されるが、異なる標的分子を単に使用することにより他の化学センサーが調製されうると前記から理解されるであろう。
【０３４６】
例えば、種々の実施形態においては、本開示のマテリアルは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づくグルコースセンサーにおいて使用されうる。ＦＲＥＴは、２つの異なる発蛍光団が互いに接近すると、これがそれらの２つの発蛍光団の間のエネルギー転移を可能にして該発蛍光団の一方または両方の蛍光の減少（これは蛍光消光と称される）をもたらすことに基づく（Ｂａｌｌｅｒｓｔａｄｔら，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ３４５：２０３−２１２，１９９７）。例えば、ある実施形態においては、グルコースの非存在下では、蛍光標識架橋剤と蛍光標識コンジュゲートとの混合物は不溶性架橋マテリアルを形成し、隣接発蛍光団はＦＲＥＴを受けるであろう。グルコースの存在下では、該蛍光標識架橋剤と該蛍光標識コンジュゲートとの平均距離が増加して、ＦＲＥＴのレベルが減少し、それにより個々の蛍光シグナルが増加するであろう。それにより、蛍光のレベルはグルコースのレベルと直接的に相関されうる。蛍光標識のペアの代わりに、互いに接近すると測定可能な応答を生成する標識の代替的ペアが使用されうる、と理解されるべきである。したがって、ある実施形態においては、本発明は、（Ｉ）（ａ）グルコースに対する少なくとも２つの結合部位を有する多価レクチン（ここで、該レクチンは、該結合部位の少なくとも１つへの結合に関してグルコースと競合しうる、該レクチンのシステイン残基に共有結合している少なくとも１つのアフィニティリガンドを含み、該レクチンは、第２標識に接近すると測定可能な応答を生成する第１標識を含む）、（ｂ）アフィニティリガンドと第２標識とを含むコンジュゲートを混合し、（ＩＩ）多価レクチンとコンジュゲートとの混合物にサンプルをさらし［ここで、（ａ）グルコースが該サンプルに存在しない場合には、該コンジュゲートは該多価レクチンへのアフィニティ結合により該レクチンと架橋マテリアルを形成して、測定可能な応答を生成し、（ｂ）グルコースが該サンプル中に存在する場合には、該サンプルからのグルコースが該多価レクチン上の結合部位に関して該コンジュゲートと競合する結果として、架橋マテリアルの形成が抑制されるため、該応答は低下する］、（ＩＩＩ）該サンプル中のグルコースの存在および所望により量を決定するために、センサーで該応答を検出し、所望によりそれを測定する工程を含む方法を提供する。ある実施形態においては、第１および第２標識は蛍光標識であり、該応答は蛍光シグナルである。
【０３４７】
ある実施形態においては、それらの２つの標識（例えば、蛍光標識）は、同じ多価レクチンに結合することにより接近する異なる分子上に位置しうる。したがって、ある実施形態においては、本発明は、（Ｉ）（ａ）グルコースに対する少なくとも２つの結合部位を有する多価レクチン（ここで、該レクチンは、該結合部位の少なくとも１つへの結合に関してグルコースと競合しうる、該レクチンのシステイン残基に共有結合している少なくとも１つのアフィニティリガンドを含む）、（ｂ）第２標識に接近すると測定可能な応答を生成する第１標識とアフィニティリガンドとを含む分子の第１グループ、ならびに（ｃ）アフィニティリガンドと第２標識とを含む分子の第２グループを混合し、（ＩＩ）多価レクチンならびに分子の第１および第２グループの混合物にサンプルをさらし［ここで、（ａ）グルコースが該サンプルに存在しない場合には、分子の第１および第２グループのメンバーが該多価レクチンへのアフィニティ結合により接近して、結合性複合体および測定可能な応答を生成し、（ｂ）グルコースが該サンプル中に存在する場合には、該サンプルからのグルコースが該多価レクチン上の結合部位に関して第１および第２分子と競合する結果として、該結合性複合体の形成が低下するため、該応答は低下する］、（ＩＩＩ）該サンプル中のグルコースの存在および所望により量を決定するために、センサーで該応答を検出し、所望によりそれを測定する工程を含む方法を提供する。ある実施形態においては、第１および第２標識は蛍光標識であり、該応答は蛍光シグナルである。
【０３４８】
他の典型的な実施形態においては、本開示のマテリアルは、粘度に基づくグルコースセンサーにおいて使用されうる（例えば、米国特許第６，２６７，００２号、第６，４７７，８９１号および第６，９３８，４６３号を参照されたい）。コンジュゲートと架橋剤とを再び一緒にして架橋マテリアルを形成させる。該マテリアルへのグルコースの添加は今度は粘度の濃度依存的減少を引き起こし、これは（例えば、円錐および平面構造で配置されたマイクロビスコメーターを使用して、せん断速度の関数として）測定可能である。それにより該サンプルの粘度はグルコースのレベルと直接的に相関されうる。これらの２つの典型的なグルコースセンサーは、該コンジュゲート内に薬物が存在することを要しない、と理解されるであろう。また、粘度に基づくセンサーは、該コンジュゲート内に検出可能標識が存在することを要しない、と理解されるであろう。
【０３４９】
ある実施形態においては、本発明は、（Ｉ）（ａ）複数のアフィニティリガンドを含むコンジュゲート、（ｂ）グルコースに対する少なくとも２つの結合部位を有する多価レクチン（ここで、該レクチンは、該結合部位の少なくとも１つへの結合に関してグルコースと競合しうる、該レクチンのシステイン残基に共有結合している少なくとも１つのアフィニティリガンドを含む）を準備し、（ＩＩ）該コンジュゲートおよびレクチンを混合し（ここで、生じる混合物の粘度は該コンジュゲートとレクチンとの結合によるものである）、（ＩＩＩ）該レクチンからコンジュゲートを脱離させ粘度の濃度依存的減少を引き起こすグルコースを含有するサンプルと該混合物を接触させ、（ＩＶ）該サンプル中のグルコースの存在および所望により量を決定するために、粘度における生じた変化を検出し、所望により測定する工程を含む方法を提供する。
【０３５０】
種々の実施形態においては、マテリアルは、制御可能な様態で薬物を患者に運搬するために使用されうる。本発明は、本開示のマテリアルを投与することにより疾患または状態を治療することを含む。該マテリアルは、任意の患者（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、マウスなど）を治療するために使用されうるが、それらは、最も好ましくは、ヒトの治療において使用される。マテリアルは任意の経路により患者に投与されうる。一般に、最も適当な投与経路は、治療される疾患または状態の性質、薬物の性質、標的分子の性質、患者の状態などを含む種々の要因に左右されるであろう。一般に、本開示は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、心室内、経皮、直腸、膣内、腹腔内、局所（例えば散剤、軟膏剤または滴剤によるもの）、頬側への、または経口もしくは鼻腔内噴霧剤もしくはエアロゾール剤としての投与を含む。これらの種々の経路のための医薬組成物の製剤化（処方）および製造における一般的考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に見出されうる。
【０３５１】
種々の実施形態においては、該マテリアルは、例えば注射により皮下投与されうる。該マテリアルは、運搬を容易にするために担体に溶解されうる。例えば、該担体は、無菌水、食塩水（塩類液）または緩衝食塩水（緩衝塩類液）（これらに限定されるものではない）を含む水溶液でありうる。一般に、コンジュゲートの形態の薬物の治療的有効量が投与されるであろう。薬物の「治療的有効量」は、該薬物の効力と毒性との比較評価を伴う合理的な利益／リスク比で疾患または状態を治療するのに（例えば、該疾患または状態の症状を改善する、進行を遅らせる、再発を予防する、開始を遅らせるなどに）十分な該薬物の量を意味する。一般に、治療効力および毒性は、細胞培養における又は実験動物での標準的な薬理学的方法により決定されることが可能であり、例えばＥＤ５０（治療被験者の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（治療被験者の５０％に致死性である用量）を計算することにより決定されうる。ＥＤ５０／ＬＤ５０は該薬物の治療係数を表す。当技術分野でよく知られているとおり、一般に、大きな治療係数を有する薬物が好ましいが、重篤な疾患または状態の場合、特に、代替的治療選択肢が存在しない場合には、より小さな治療係数が許容されうる。ヒトへの投与のための適当な用量範囲の最終的な選択は臨床治験の経過中に決定される。
【０３５２】
種々の実施形態においては、該薬物はインスリンであり、インスリンの平均１日量は１０〜２００Ｕ、例えば２５〜１００Ｕの範囲である（ここで、１Ｕ（単位）のインスリンは〜０．０４ｍｇである）。ある実施形態においては、これらのインスリン用量を伴うマテリアルの量が毎日投与される。ある実施形態においては、これらのインスリン用量の５〜１０倍を伴うマテリアルが毎週投与される。ある実施形態においては、これらのインスリン用量の１０〜２０倍を伴うマテリアルの量が隔週で投与される。ある実施形態においては、これらのインスリンの用量の２０〜４０倍を伴うマテリアルの量が毎月投与される。これと同じアプローチが、公知用量範囲を有する他の承認薬、例えば、任意の承認されているインスリン増感物質およびインスリン分泌促進物質（本明細書に記載されているもの）に類推適用されうる、と当業者は認識するであろう。
【０３５３】
いずれかの或る患者に対する薬物の合計１日使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医師により決定されると理解されるであろう。いずれかの或る患者に対する具体的な治療的有効量は、治療される疾患または状態；使用される具体的な薬物の活性；使用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食事；使用される具体的な薬物の投与時機、投与経路および排泄速度；治療の持続期間；使用される具体的な薬物と組合せて又は同時に使用される薬物；ならびに医学分野でよく知られた同様の要因を含む種々の要因に左右されるであろう。種々の実施形態においては、本開示のマテリアルは２回以上投与されうる。例えば、本開示は特に、連続的スケジュール（例えば、１日１回、２日ごとに１回、週１回、２週ごとに１回、月１回など）で皮下注射により患者にマテリアルが投与される方法を含む。
【０３５４】
ある実施形態においては、本開示のマテリアルは、患者（例えば、哺乳動物患者）における高血糖を治療するために使用されうる。ある実施形態においては、該患者は糖尿病患者である。しかし、本方法は糖尿病患者の治療に限定されない。例えば、ある実施形態においては、マテリアルは、血糖調節異常に関連した感染を伴う患者における高血糖を治療するために使用されうる。ある実施形態においては、マテリアルは、糖尿病を治療するために使用されうる。
【０３５５】
種々の実施形態においては、本開示のマテリアルは、少なくとも１つの追加的療法を受けている患者に投与されうる。種々の実施形態においては、そのような少なくとも１つの追加的療法は、投与されるマテリアルの場合と同じ疾患または障害を治療することを意図したものである。種々の実施形態においては、そのような少なくとも１つの追加的療法は、主要薬物の副作用を治療することを意図したものである。そのような２以上の療法は、両方の療法から該患者が利益を受ける期間が存在する限り、同じ重複している又は重複していない時間枠内で行われうる。そのような２以上の療法は、両方の療法から該患者が利益を受ける期間が存在する限り、同じ又は異なるスケジュールで行われうる。そのような２以上の療法は、両方の療法から該患者が利益を受ける期間が存在する限り、同じ又は異なる製剤で行われうる。ある実施形態においては、本開示の単一のマテリアルは、同じ疾患または障害を治療するための２以上の薬物を含みうる。ある実施形態においては、同じ疾患または障害を治療するための異なる薬物を含む、本開示の２以上の別々のマテリアルが（混合物として又は別々に）投与されうる。ある実施形態においては、コンジュゲート化されていない二次薬物（すなわち、該マテリアルの成分と単に混合されただけであり、該架橋マテリアルに共有結合していない薬物）が本開示のマテリアル中に含まれうる。例えば、ある実施形態においては、これらのアプローチはいずれも、２以上の抗糖尿病薬を対象に投与するために用いられうる。このアプローチの或る典型的な実施形態はインスリン関連療法に関して後記で更に詳細に説明されるが、他の療法もそのような組合せアプローチにより有益であると前記から理解されるであろう。
【０３５６】
インスリン増感物質（例えば、ビグアニド、例えばメトホルミン、グリタゾン）は、与えられた量のインスリンに対する患者の応答を増強することにより作用する。したがって、インスリン増感物質の投与を受けている患者は、その他の点では同じ患者の場合より低い用量の本開示のインスリン系マテリアルで十分であろう。したがって、ある実施形態においては、インスリンコンジュゲートを含むマテリアルは、インスリン増感物質でも治療されている患者に投与されうる。種々の実施形態においては、本開示のマテリアルは、インスリン増感物質の非存在下で要求される通常用量の７５％までで投与されうる。種々の実施形態においては、通常用量の５０、４０、３０または２０％までが投与されうる。
【０３５７】
インスリン抵抗性は、正常なインスリン応答を得るのにインスリンの通常量では不適当である障害である。例えば、インスリン抵抗性患者は、その抵抗性を克服し十分なグルコース低下効果を得るためには高い用量のインスリンを要しうる。これらの場合、それほど抵抗性でない患者において通常は低血糖を誘発するインスリン用量でさえも、高抵抗性患者においてはグルコース低下効果をもたらさない。同様に、本開示のマテリアルは、それが高レベルのインスリンコンジュゲートを適当な時間枠で放出する場合にのみ、このサブクラスの患者に有効である。ある実施形態においては、このサブクラスの患者の治療は、それらの２つのアプローチを組合せることにより促進されうる。したがって、ある実施形態においては、インスリンのベースラインレベルを得るために、インスリンに基づく伝統的な療法が用いられ、患者に必要な場合には、制御されたインスリン補充をもたらすために、本発明のマテリアルが投与される。したがって、ある実施形態においては、インスリンコンジュゲートを含むマテリアルは、インスリンでも治療されている患者に投与されうる。種々の実施形態においては、該インスリンは、本開示のマテリアルの非存在下で要求される通常用量の７５％までで投与されうる。種々の実施形態においては、該通常用量の５０、４０、３０または２０％までが投与されうる。この組合せアプローチは、インスリン分泌促進物質（例えば、スルホニル尿素、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４など）および／またはインスリン増感物質（例えば、ビグアニド、例えば、メトホルミン、グリタゾン）の投与を受けているインスリン抵抗性患者においても使用されうると理解されるであろう。
【０３５８】
キット
もう１つの態様においては、本開示は、マテリアルを製造するための、修飾レクチンおよびコンジュゲートおよび他の試薬を含むキットを提供する。例えば、キットは、複数のコンジュゲートおよび複数の修飾レクチンを含む別々の容器を含みうる。該キットのコンジュゲートおよび修飾レクチンが混合されると、架橋マテリアルが形成される。種々の実施形態においては、該マテリアルは皮下運搬を意図したものであり、該キットはシリンジまたはペンを含む。種々の実施形態においては、キットは、架橋マテリアルが予め充填されたシリンジまたはペンを含みうる。該キットは、該コンジュゲートと修飾レクチンとを混合して該架橋マテリアルを製造するための説明をも含みうる。
【０３５９】
更にもう１つの態様においては、本開示はコンジュゲートおよび／または修飾レクチンのライブラリーを提供する。これらのライブラリーは、所望の設定点を有するマテリアルを得るのに特に有用でありうる。種々の実施形態においては、ライブラリーは、同じコンジュゲートで種々の設定点を与える複数の修飾レクチンを含みうる。種々の実施形態においては、ライブラリーは更に、該ライブラリー内のコンジュゲートで架橋マテリアルを形成する１以上のコンジュゲートを含みうる。該ライブラリーが２以上のそのようなコンジュゲートを含む場合、コンジュゲートが異なれば、分子量、コンジュゲート分子当たりのアフィニティーリガンドの数および／またはアフィニティーリガンドも異なりうる。種々の実施形態においては、ライブラリーは、２以上のタイプのアフィニティーリガンドを含むコンジュゲートの１以上を含みうる。種々の実施形態においては、ライブラリーは、同じ修飾レクチンで種々の設定点を与える複数のコンジュゲートを含みうる。種々の実施形態においては、ライブラリーは更に、該ライブラリー内のコンジュゲートで架橋マテリアルを形成する１以上の修飾レクチンを含みうる。
【０３６０】
更にもう１つの態様においては、本開示は、（ａ）第２標識に接近すると測定可能な応答を生成する第１標識を含む修飾レクチンを含む第１容器、および（ｂ）第２標識を含むコンジュゲートを含む第２容器とを含むキットを提供する。
【０３６１】
更にもう１つの態様においては、本開示は、（ａ）修飾レクチンを含む第１容器、（ｂ）第２標識に接近すると測定可能な応答を生成する第１標識およびアフィニティリガンドを含む分子の第１グループを含む第２容器、ならびに（ｃ）第２標識およびアフィニティリガンドを含む分子の第２グループを含む第３容器を含むキットを提供する。ある実施形態においては、第１および第２分子は同一容器内に存在する。
【図面の簡単な説明】
【０３６２】
【図１】（ａ）骨格（スカフォールド）としてのＴＳＡＴ−Ｃ６、アフィニティリガンドとしてのＡＥＭおよび薬物としてのＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを使用して合成された典型的なコンジュゲートと、（ｂ）実施例３２に従い合成されたインスリン−グリコーゲンコンジュゲートとに関して得られたＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較。
【図２】ＰＢＳバッファー中のコンジュゲート１（□）、コンジュゲート２（△）およびＲＨＩ（◆）に関する促進安定性試験（ＡＳＴ）凝集アッセイ。該コンジュゲートは、医薬等級ＲＨＩと比較して著しく増強された安定性を示している。
【図３Ａ】図３（ａ）：促進安定性試験（ＡＳＴ）化学的安定性の結果（ａ）ＲＰ−ＨＰＬＣ  ＡＳＴコンジュゲート安定性。図３（ｂ）：促進安定性試験（ＡＳＴ）化学的安定性の結果（ａ）ＡＳＴコンジュゲートに関するＬＣ／ＭＳデータ。
【図３Ｂ】図３（ａ）：促進安定性試験（ＡＳＴ）化学的安定性の結果（ａ）ＲＰ−ＨＰＬＣ  ＡＳＴコンジュゲート安定性。図３（ｂ）：促進安定性試験（ＡＳＴ）化学的安定性の結果（ａ）ＡＳＴコンジュゲートに関するＬＣ／ＭＳデータ。
【図４】新鮮コンジュゲート（▲）および７２時間ＡＳＴコンジュゲート（○）に関する非糖尿病雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（ｎ＝４）におけるインビボ生物活性。該７２時間ＡＳＴコンジュゲートの生物活性は該新鮮コンジュゲートの場合と区別できなかった（全時点に関してｐ＞０．２１）。
【図５】〜２０Ｕ  インスリン当量／ｋｇの用量の皮下注射（▲）インスリン−デキストラン（７０Ｋ）に関する非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）における血液グルコース低下プロファイル。
【図６】〜２．５Ｕ  インスリン当量／ｋｇの用量の皮下注射（■）インスリン−グリコーゲン（ＩＩ型）デキストラン（７０Ｋ）に関する非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）における血液グルコース低下プロファイル。
【図７】雄非糖尿病ＳＤラットにおいて３．５Ｕ当量インスリン／ｋｇの皮下用量の（◆）ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２インスリンコンジュゲートおよび（□）可溶性組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）から得られた血液グルコースレベル。各データセットはｎ＝６のラットに関する平均および標準偏差を表す。
【図８】雄非糖尿病ＳＤラットにおいて３．５Ｕ当量インスリン／ｋｇの皮下用量の（◆）ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２インスリンコンジュゲートおよび（□）可溶性組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）から得られた血清グルコース濃度。各データセットはｎ＝６のラットに関する平均および標準偏差を表す。
【図９】ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２（Ｂ２９−置換）インスリンコンジュゲート（５Ｕ／ｋｇ）での時間０における非糖尿病雄ＳＤラットにおける皮下注射の後の（◆）血清インスリンおよび（○）血液グルコースレベルのプロット。データはｎ＝３のラットに関する平均および標準偏差を表す。
【図１０】ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭおよびＡＥＴＭの化学構造。糖に基づくアフィニティリガンドの、ＣｏｎＡに対するアフィニティは、示されているとおりに増加する。
【図１１】いくつかの典型的な非樹枝状コンジュゲートの化学構造。
【図１２】ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２インスリンコンジュゲート（◆）、可溶性組換えヒトインスリン（○）およびインスリンリスプロ（△）（全て３．５Ｕ／ｋｇ）での時間０における非糖尿病雄ＳＤラットにおける皮下注射の後の血清インスリン（左）および血液グルコース（右）レベルのプロット。データはｎ＝６のラットに関する平均および標準偏差を表す。
【図１３】示されているとおりの種々のアフィニティリガンドを有するＴＳＡＴ−Ｃ６に基づくインスリンコンジュゲートでの時間０における非糖尿病雄ＳＤラット（各製剤に関してｎ＝３）における皮下注射の後の血液グルコースレベルのプロット。該グルコース低下応答は、該アフィニティリガンドのアフィニティが増加するにつれて減少する。
【図１４】ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２コンジュゲート（３．５Ｕ／ｋｇ）での時間０における非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）における皮下注射の後の血清インスリン（左）および血液グルコース（右）レベルのプロット。
【図１５】ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＢＭ−２コンジュゲート（５Ｕ／ｋｇ）での時間０における非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）における皮下注射の後の血清インスリン（左）および血液グルコース（右）レベルのプロット。
【図１６】ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＢＭ−１  ＡＥＴＭ−１コンジュゲート（５Ｕ／ｋｇ）での時間０における非糖尿病雄ＳＤラット（ｎ＝３）における皮下注射の後の血清インスリン（左）および血液グルコース（右）レベルのプロット。
【図１７】可溶性タンパク質を試験するための部分精製ＳＣＩ−３のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。レーン１＝ラダー；レーン２＝１０μｌの天然ＣｏｎＡ対照；レーン３＝洗浄＃１からの１０μｌの上清；レーン４＝洗浄＃１からの２０μｌの上清；レーン５＝洗浄＃２からの１０μｌの上清；レーン６＝洗浄＃２からの２０μｌの上清；レーン７＝洗浄＃３からの１０μｌの上清；レーン８＝洗浄＃３からの２０μｌの上清；レーン９＝ブロースルー（Ｂｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）ＳＣＩ−３（１０倍濃縮物）；およびレーン１０＝ブロースルーＳＣＩ−３（４０倍濃縮物）。
【図１８】可溶性タンパク質を試験するための部分精製ＳＣＩ−４のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。レーン１＝ラダー；レーン２＝１０μｌの天然ＣｏｎＡ対照；レーン３＝洗浄＃１からの１０μｌの上清；レーン４＝洗浄＃１からの２０μｌの上清；レーン５＝洗浄＃２からの１０μｌの上清；レーン６＝洗浄＃２からの２０μｌの上清；レーン７＝洗浄＃３からの１０μｌの上清；およびレーン８＝洗浄＃３からの２０μｌの上清。可溶性ＳＣＩ−４の量は７５〜１２５ｍｇタンパク質（実際の可溶性タンパク質は６２ｍｇ）であると推定された。
【図１９】チオールアッセイ測定においてＭｅａｓｕｒｅ−ｉＴ（商標）チオール定量標準物から得た標準曲線。
【図２０】本開示の典型的な糖アフィニティリガンドと典型的な組換えＣｏｎＡ（ｒＣｏｎＡ）との間の反応の度合を測定するために用いたＭｅａｓｕｒｅ−ｉＴ（商標）チオール定量アッセイからの結果。ｒＣｏｎＡに対する糖アフィニティリガンドの比の増加は、無関係なジスルフィド結合の減少と相関することが判明した。
【図２１】典型的なＣｏｎＡサンプルに関する最小凝集濃度（ＭＡＣ）の比較。（Ａ）天然ＣｏｎＡ、（Ｂ）アセチルＣｏｎＡ、（Ｃ）ＡＥＭ−ＬＣ−ＳＭＰＨと反応したｒＣｏｎＡ  ＳＣＩ−３、（Ｄ）脱気溶媒の存在下でＡＥＭ−ＬＣ−ＳＭＰＨと反応したｒＣｏｎＡ  ＳＣＩ−３、（Ｅ）脱気溶媒の存在下でＡＥＭ−ＬＣ−ＳＭＰＨと反応したｒＣｏｎＡ  ＳＣＩ−３および（Ｆ）脱気溶媒の存在下でＡＥＭ−ＬＣ−ＳＭＰＨと反応したｒＣｏｎＡ  ＳＣＩ−４。カラム１〜１２は１，０００から０．５μｇ／ｍＬまで（左から右へ）の様々な溶液中のＣｏｎＡまたはｒＣｏｎＡタンパク質濃度に対応する。
【図２２】典型的なＣｏｎＡサンプルに関する最小凝集濃度（ＭＡＣ）の比較の証明。（Ａ）天然ＣｏｎＡ、（Ｂ）アセチルＣｏｎＡ、（Ｃ）ＡＥＭ−ＬＣ−ＳＭＰＨと反応したｒＣｏｎＡ  ＳＣＩ−３、（Ｄ）ＡＥＭ−ＬＣ−ＳＭＰＨと反応したｒＣｏｎＡ  ＳＣＩ−４、（Ｅ）脱気溶媒の存在下でＡＥＭ−ＬＣ−ＳＭＰＨと反応したｒＣｏｎＡ  ＳＣＩ−３、および（Ｆ）脱気溶媒の存在下でＡＥＭ−ＬＣ−ＳＭＰＨと反応したｒＣｏｎＡ  ＳＣＩ−４。カラム１〜１２は１，０００から０．５μｇ／ｍＬまで（左から右へ）の様々な溶液中のＣｏｎＡまたはｒＣｏｎＡタンパク質濃度に対応する。
【図２３】グルコースに対する少なくとも２つの結合部位３０を有する多価レクチン２０の概要図。ここで、レクチン２０は、該結合部位３０の少なくとも１つへの結合に関してグルコースと競合しうる、レクチン２０のシステイン残基に共有結合している少なくとも１つのアフィニティリガンド４０を含む。
【図２４】図２３の多価レクチン２０（簡単のために、結合部位３０の少なくとも１つへの結合に関してグルコースと競合しうる少なくとも１つの共有結合アフィニティリガンド４０は、図２４の主概要図に示されていない）と、コンジュゲートフレームワーク７０に結合した２以上の別々のアフィニティリガンド６０を含むコンジュゲート５０とを含む架橋マテリアル１０の概要図。ここで、２以上のアフィニティリガンド６０は結合部位３０におけるレクチン２０への結合に関してグルコースと競合し、コンジュゲート５０は、異なるコンジュゲート５０上のアフィニティリガンド６０とレクチン２０との間の非共有結合的相互作用の結果としてマテリアル１０において架橋される。
【図２５】３つのジスルフィド架橋により連結されたＡ−ペプチド（配列番号２２）およびＢ−ペプチド（配列番号２３）を有する野生型ヒトインスリンの構造。  実施例  Ｉ．典型的コンジュゲートの製造方法  この一連の第１の実施例は、典型的コンジュゲートの種々の製造方法を記載する。該実施例は、出発成分および最終生成物を精製しアッセイするためのアッセイをも含む。これらの方法は、本発明の範囲内の他のコンジュゲートを与えるように修飾されうると理解されるべきである。
【０３６３】
実施例１−アジドエチルグルコース（ＡｚＥＧ）の合成
ａ．ブロモエチルグルコースの合成
ＤＯＷＥＸ  ５０Ｗｘ４樹脂（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）を脱イオン水で洗浄して脱色させた。２２５ｇｍのＤ−グルコース（１．２５ｍｏｌ；１当量，Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）と１４０ｇｍのＤＯＷＥＸ  ５０Ｗｘ４との混合物を２．２Ｌの２−ブロモエタノール（３０．５ｍｏｌ，２５当量；１２４．９７ｇｍ／ｍｏｌ；１．７６２ｇｍ／ｍＬ；ＢＰ＝１５０Ｃ；Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）で処理し、該撹拌混合物を８０℃に４時間加熱した。該反応をＴＬＣ（２０％  メタノール／ジクロロメタン（ＤＣＭ））によりモニターした。反応は約２時間後に完了し、それを室温に冷却した。該溶液を濾過して該樹脂を取り出し、該樹脂を酢酸エチルおよびＤＣＭで洗浄した。得られた濾液をロータリーエバポレーター内で放散させて琥珀色油を得た。放散後合計４００ｇｍ。
【０３６４】
該琥珀色油を以下のとおりにシリカゲル（ＤＣＭ中に充填された４ｋｇのシリカ）上で精製した。該粗製物をＤＣＭに溶解し、該カラム上にローディングし、ついで２×４Ｌの１０％メタノール／ＤＣＭ；２×４Ｌの１５％メタノール／ＤＣＭ；および３×４Ｌの２０％メタノール／ＤＣＭで溶出した。生成物含有画分（ＴＬＣに基づく）をプールし、放散乾固させて１５２ｇｍの１−α−ブロモエチル−グルコース（４２％）を得た。
【０３６５】
ｂ．ブロモエチルグルコースからアジドエチルグルコース（ＡｚＥＭ）への変換
加熱マントル、オーバーヘッドスターラー（頭上撹拌装置）および温度計を備えた５Ｌ丸底三頚フラスコに１５０ｇｍのブロモエチルグルコース（５２５ｍｏｌ）を仕込んだ。該油を２Ｌの水に溶解し、６８．３ｇｍのアジ化ナトリウム（１．０５ｍｏｌ，２当量；６５ｇｍ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）、ついで７．９ｇｍのヨウ化ナトリウム（５２．５ｍｍｏｌ，０．０８当量；１４９．８９ｇｍ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）で処理し、該溶液を５０℃に加温し、一晩撹拌した。該溶液を室温に冷却し、ロトバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）上で濃縮乾固させた。固体残渣を３×５００ｍＬの５：１  ｖｏｌ．ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨで４０℃で消化した。合わせた有機部分を濾過し、蒸発乾固させてアジドエチルグルコース（８６ｇｍ）を薄灰色（オフホワイト）固体として得た。ＴＬＣ（２０％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ；Ｈ２ＳＯ４でチャー）；単一スポット；出発物質と識別不能。
【０３６６】
ｃ．アジドエチルグルコースの再精製
３２ｍｇのアジドエチルグルコースを１００ｍＬの水中に加えた。該混濁溶液をガラス微細繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｂ）で濾過した。金色の濾液をロトベイパー（ｒｏｔｏｖａｐｏｒ）上で蒸発させて固体を得た。該固体をメタノール（１００ｍＬ）中に加え、該混濁溶液をガラス微細繊維フィルターで再び濾過した。得られた淡黄色濾液を真空下で放散させて固体を得た。
【０３６７】
該固体を最少のメタノール（５０ｍＬ）中に加え、撹拌しながら酢酸エチル（１５０ｍＬ）をゆっくりと加えた。該濃厚スラリーを冷却し、濾過した。該固体を風乾（吸湿）させ、６０℃のオーブンに一晩入れた。ＴＬＣは元の物質をほとんど示していない。収量１５．４ｇｍ。母液を真空下で蒸発させて黄色ガムを得た。今回はこの物質を更に精製することはしなかった。
【０３６８】
実施例２−アジドエチルマンノース（ＡｚＥＭ）の合成
ａ．ブロモエチルマンノースの合成
ＤＯＷＥＸ  ５０Ｗｘ４樹脂（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）を脱イオン水で洗浄して脱色させる。２２５ｇｍのＤ−マンノース（１．２５ｍｏｌ；１当量，Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）と１４０ｇｍのＤＯＷＥＸ  ５０Ｗｘ４との混合物を２．２Ｌの２−ブロモエタノール（３０．５ｍｏｌ，２５当量；１２４．９７ｇｍ／ｍｏｌ；１．７６２ｇｍ／ｍＬ；ＢＰ＝１５０Ｃ；Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）で処理し、該撹拌混合物を８０℃に４時間加熱する。該反応をＴＬＣ（２０％  メタノール／ジクロロメタン（ＤＣＭ））によりモニターする。反応は約２時間後に完了し、ついでそれを室温に冷却する。該溶液を濾過して該樹脂を取り出し、該樹脂を酢酸エチルおよびＤＣＭで洗浄する。得られた濾液をロータリーエバポレーター内で放散させて琥珀色油を得る。
【０３６９】
該琥珀色油を以下のとおりにシリカゲル（ＤＣＭ中に充填された４ｋｇのシリカ）上で精製する。該粗製物をＤＣＭに溶解し、該カラム上にローディングし、ついで２×４Ｌの１０％メタノール／ＤＣＭ；２×４Ｌの１５％メタノール／ＤＣＭ；および３×４Ｌの２０％メタノール／ＤＣＭで溶出する。生成物含有画分（ＴＬＣに基づく）をプールし、放散乾固させて１５２ｇｍの１−α−ブロモエチル−マンノース（４２％）を得る。
【０３７０】
ｂ．ブロモエチルマンノースからアジドエチルマンノース（ＡｚＥＭ）への変換
加熱マントル、オーバーヘッドスターラー（頭上撹拌装置）および温度計を備えた５Ｌ丸底三頚フラスコに１５０ｇｍのブロモエチルマンノース（５２５ｍｏｌ）を仕込む。該油を２Ｌの水に溶解し、６８．３ｇｍのアジ化ナトリウム（１．０５ｍｏｌ，２当量；６５ｇｍ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）、ついで７．９ｇｍのヨウ化ナトリウム（５２．５ｍｍｏｌ，０．０８当量；１４９．８９ｇｍ／ｍｏｌ；Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ）で処理し、該溶液を５０℃に加温し、一晩撹拌する。該溶液を室温に冷却し、ロトバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）上で濃縮乾固させる。固体残渣を３×５００ｍＬの５：１  ｖｏｌ．ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨで４０℃で消化する。合わせた有機部分を濾過し、蒸発乾固させてアジドエチルマンノースを薄灰色（オフホワイト）固体として得る。
【０３７１】
ｃ．アジドエチルマンノースの再精製
３２ｍｇのアジドエチルマンノースを１００ｍＬの水中に加える。該混濁溶液をガラス微細繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｂ）で濾過する。該濾液をロトベイパー（ｒｏｔｏｖａｐｏｒ）上で蒸発させて固体を得る。該固体をメタノール（１００ｍＬ）中に加え、該混濁溶液をガラス微細繊維フィルターで再び濾過する。得られた淡黄色濾液を真空下で放散させて固体を得る。
【０３７２】
該固体を最少のメタノール（５０ｍＬ）中に加え、撹拌しながら酢酸エチル（１５０ｍＬ）をゆっくりと加える。該濃厚スラリーを冷却し、濾過する。該固体を風乾（吸湿）させ、６０℃のオーブンに一晩入れる。母液を真空下で蒸発させて黄色ガムを得る。
【０３７３】
実施例３−アジドエチルマンノビオース（ＡｚＥＢＭ）の合成
実施例２からのＡｚＥＭ化合物を、ベンゼンジメチルエーテルを使用して選択的に保護し、カラムクロマトグラフィーにより精製し、ついで臭化ベンジルと反応させて１−α−（２−アジドエチル）−４，６−ベンズアルデヒド  ジアセタール−３−ベンジル−マンノピラノシドを得る。ついで、厳密に無水の条件下、銀トリフラート化学法を用いて、該生成物を１−α−ブロモ−２，３，４，６−テトラベンゾイルマンノピラノシドでグリコシル化して、保護されたアジドエチルマンノビオース生成物を得る。ついで該中間生成物を脱保護してベンジル基を除去して、ＡｚＥＢＭを得る。
【０３７４】
実施例４−アジドエチルマンノトリオース（ＡｚＥＴＭ）の合成
ａ．１−α−ブロモ−２，３，４，６−テトラベンゾイル−マンノース
撹拌棒および窒素入口を含有する５００ｍＬ  三頚フラスコに４０ｇｍ（６０．９ｍｍｏｌ）のペンタベンゾイルマンノースおよび８０ｍＬの塩化メチレンを加えた。得られた溶液を氷浴内で５℃未満に冷却し、反応温度が１０℃未満に維持されるような速度で添加漏斗で８０ｍＬの３３％  ＨＢｒ−酢酸溶液を加えた。完全な添加（〜３０分間）の直後に、該氷浴を除去し、撹拌を３時間継続した。
【０３７５】
該反応溶液を等体積（１６０ｍＬ）のＤＣＭで希釈し、水（２×５００ｍＬ）、飽和炭酸水素塩（２×５０ｍＬ）およびブライン（１×５０ｍｌ）で連続的に抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させて４１ｇｍの固体泡を得（理論収量４０．１ｇｍ）、Ｎ２下、冷凍庫内で保存した。この物質を、更に精製することなく使用した。該反応は、ＴＬＣによりモニターした：シリカゲル（ヘキサン／酢酸エチル，７／３）；出発物質Ｒｆ  ０．６５，生成物Ｒｆ  ０．８；ＵＶ可視化。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  ８．１１（ｄ，２Ｈ），８．０１（ｍ，４Ｈ），７．８４（ｄ，２Ｈ），７．５８（ｍ，４Ｈ），７．４１（ｍ，６Ｈ），７．２８（ｔ，２Ｈ），６．５８（ｓ，１Ｈ），６．２８（ｍ，２Ｈ），５．８（ｍ，１Ｈ），４．７５（ｄｄ，１Ｈ），４．６８（ｄｄ，１Ｈ），４．５（ｄｄ，１Ｈ）。
【０３７６】
ｂ．１−アジドエチル−２，４−ジベンゾイルマンノース
撹拌棒、窒素入口および３００ｍＬの無水アセトニトリルを含有する１．０Ｌ  三頚フラスコに２５ｇｍの１−アジドエチルマンノース（１００．４ｍｍｏｌ）および５０ｍＬのトリエチルオルトベンゾアート（２２０ｍｍｏｌ，２．２当量）を加えた。得られたスラリーを室温で撹拌し、０．８ｍＬ（１０ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を原液で加えた。該溶液は１０分以内に清澄化した。撹拌を更に２時間継続し、ついで２５ｍＬの１０％  ＴＦＡを加え、撹拌を更に２時間継続して、該中間体をエステル異性体へと加水分解した。溶媒を真空下で蒸発させて粘性油を得、これを５０ｍＬのＤＣＭでトリチュレーションし、再び蒸発させて粘性油を得た。
【０３７７】
トルエン（７０ｍＬ）を該残渣に加え、該粘性溶液に２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノースを結晶種として加えた。微細沈殿物が１５分以内に形成し、撹拌を室温で一晩継続した。得られた濃厚懸濁液を冷凍庫内で２〜４時間静置し、ついで濾過し、該固体を氷冷トルエン（２×１０ｍＬ）で洗浄した。該固体を一定重量まで風乾させて〜９５％の異性体純度の２１ｇｍ（５０％異性体純度でＴＹ  ２２．８５ｇｍ）を得た。該生成物を４０ｍＬのトルエン中に加え、１時間撹拌し、ついで該冷凍庫内に更に２時間配置した。該固体を濾過し、氷冷トルエンで洗浄（２×１０ｍＬ）し、一定重量まで風乾させて、１８．５ｇｍの単一異性体生成物２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノースを８３％の収率で得た。母液は、望ましくない（非所望）異性体および少量の所望の異性体を含有していた。該反応は、ＴＬＣによりモニターした：ＳＧ（ヘキサン／酢酸エチル，７／３）；出発物質Ｒｆ  ０．０，オルトエステル中間体Ｒｆ  ０．９。（ヘキサン／酢酸エチル，８／２）；ＳＭ  Ｒｆ  ０．８，所望異性体Ｒｆ  ０．４，非所望異性体Ｒｆ  ０．２．１Ｈ  ＮＭＲ  ３００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ３）δ  ８．１２（ｔ，４Ｈ），７．６６（ｔ，２Ｈ），７．５（ｍ，４Ｈ），５．５６（ｔ，１Ｈ），５．４８（ｍ，１Ｈ），５．１４（ｍ，１Ｈ），４．５（ｄｄ，１Ｈ），４．０（ｍ，２Ｈ），３．８（ｍ，３Ｈ），３．５６（ｍ，１Ｈ），３．４４（ｍ，１Ｈ）。
【０３７８】
ｃ．ペルベンゾイル化−マン（α−１，３）−マン（α−１，６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシド
撹拌棒、窒素入口を備えた１．０Ｌ  三頚フラスコに、１８５ｍＬのＤＣＭ中の４１ｇｍの粗１−ブロモ−テトラベンゾイルマンノース（６０．９ｍｍｏｌ，〜２．５当量）を加えた。これに１１．２ｇｍの２，４−ジベンゾイルアジドエチルマンノース（２４．５ｍｍｏｌ）を加え、ついで１１．２ｇｍの４Ａシーブを加えた。該スラリーを室温で１０分間撹拌し、メタノール／氷浴内で−１５℃に冷却した。別の暗色容器内に１９０ｍＬのトルエンを加え、ついで１５．１ｇｍの銀−トリフルオロメタンスルホナート（ＡｇＯＴｆ）（５８．８ｍｍｏｌ，２．４当量）を加え、暗所で撹拌して溶液を得た。この溶液を大きな添加漏斗に移し、該反応を遮光して該撹拌懸濁液に滴下した。ＡｇＯＴｆの添加速度を調節することにより、反応温度を−１０℃未満に維持した。添加が完了したら（〜３０分間）、該冷却浴を除去し、単一生成物がＴＬＣ（ＳＧ，ヘキサン／酢酸エチル；７／３，ブロモＲｆ  ０．９，アジドＲｆ  ０．４，トリオス生成物Ｒｆ  ０．５，ＵＶ可視化）により残留するようになるまで、該反応を更に２時間撹拌した。
【０３７９】
トリエチルアミン（７ｍＬ，５．０当量）を加え、ついで２００ｍＬのＤＣＭを加えた。生じたスラリーをシリカゲルおよびセライトのパッドで濾過し、２×７５ｍＬのＤＣＭで洗浄した。溶媒を真空下で蒸発させ、残渣を酢酸エチル中に加え、水（２）×１００ｍＬ）、炭酸水素塩（２×５０ｍＬ）、ブライン（１×７５ｍＬ）で連続的に洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させて３９ｇｍの固体泡（ＴＹ  ３９．５ｇｍ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  ３００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ３）  δ  ８．３（ｄ，２Ｈ），８．２（ｍ，８Ｈ），７．８５（ｄ，４Ｈ），７．７５（ｄｄ，４Ｈ），７．３−７．６５（ｍ，３０Ｈ），７．２（ｔ，２Ｈ），６．０５（ｍ，４Ｈ），５．９（ｔ，２Ｈ），５．６３（ｍ，２Ｈ），５．３８（ｓ，２Ｈ），５．１８（ｄ，１Ｈ），４．６５（ｍ，４Ｈ），４．５（ｍ，２Ｈ），４．３５（ｍ，４Ｈ），３．８（ｍ，２Ｈ），３．５４（ｍ，２Ｈ）。
【０３８０】
ｄ．マン（α−１，３）−マン（α−１，６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシド
４０ｍＬのメタノール中の３．０ｇｍのペルベンゾイル化−マン（α−１，３）−マン（α−１，６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシド（１．８６ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液にメタノール中の０．２ｍＬの４．２８Ｍ  ナトリウムメトキシドを加えた。生じた懸濁液を室温で２０時間撹拌して透明溶液を得た。該反応の完了をＴＬＣ（ＳＧ，ヘキサン／酢酸エチル：８／２  ＳＭ  Ｒｆ  ０．４，生成物Ｒｆ  ０．０）によりモニターした。
【０３８１】
該メタノールを真空下で蒸発させて油性半固体を得た。残渣を酢酸エチル（５０ｍＬ）中に加え、３時間撹拌した。該固体を濾過し、新鮮な酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、一定重量まで風乾させて１．０９ｇｍ（ＴＹ  １．０７ｇｍ）の生成物を得た。母液は、脱保護副生成物である残留メチルベンゾアートを含有していた。
【０３８２】
実施例５−アジドエチル−糖（ＡｚＥＧ、ＡｚＥＭ、ＡｚＥＢＭ、ＡｚＥＴＭ）からのアミノエチル−糖（ＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭ）の合成
パラジウム／炭素触媒、少量の酢酸および溶媒としてのエタノールを使用することにより、実施例１〜４からのアジド末端化合物は室温で容易に水素化されて、対応するアミン末端化合物を与える。図１０はＡＥＧ、ＡＥＭ、ＡＥＢＭ、ＡＥＴＭの化学構造を示す。該方法は、ＡＥＴＭに関して以下に記載するものと同じである。ただし、試薬、溶媒などの量は、水素化されるべき糖−リガンドのモル数に応じて一定比率で増減されるべきである、と当業者は理解するであろう。
【０３８３】
ａ．マン（α−１，３）−マン（α−１，６）−α−１−アミノエチルマンノピラノシド（「アミノエチルトリマンノース」、ＡＥＴＭ）
１００ｍＬの水および５０ｍＬのエタノール中の５．３ｇｍ（９．２５ｍｍｏｌ）のマン（α−１，３）−マン（α−１，６）−α−１−アジドエチルマンノピラノシドの溶液に０．８ｇｍの５％Ｐｄ／Ｃを加えた。激しく撹拌されているその懸濁液を３０〜４０ｐｓｉで４８時間、または出発物質がＴＬＣ（ＳＧ，メタノール，ＳＭ  Ｒｆ  ０．７５，Ｐｄｔ  Ｒｆ  ０．０，ＰＭＡ  ｖｉｓ．）により明らかでなくなるまで水素化した。該懸濁液をセライトで濾過し、該セライトをエタノール（２×５０ｍＬ）で濯ぎ、濾液を真空下で濃縮した。
【０３８４】
この物質のＨＰＬＣ（Ｃ１８，３％  アセトニトリル／９７％  ０．１％Ｈ３ＰＯ４，２２０ｎｍ，２ｍｌ／分）は、安息香酸エステルを示すＲｔ  ２．５分での注入カラムボイド物質のＵＶ吸収を示した。
【０３８５】
該濾液を７０ｍＬの水および１２ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨで希釈し、該溶液を室温で一晩撹拌した（ＨＰＬＣ：カラムボイドＲｔ２．５分においてＵＶ物質無し；安息香酸と同時溶出するＲｔ１０．５分におけるＵＶ物質）。２ｇｍの脱色木炭を加え、該撹拌懸濁液を８０℃に加熱し、室温に冷却し、セライトで濾過した。濾液ｐＨを２Ｎ  ＨＣｌで８．０に調節し、無色溶液を真空下で約５０％の体積まで濃縮した。
【０３８６】
該溶液を樹脂カラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ，５０ｇｍ）上にローディングし、溶出画分が中性ｐＨになるまで水で洗浄して（６×７５ｍＬ）、残留酸副生成物を除去した。該アミン生成物を０．２５Ｎ  水酸化アンモニウム（６×７５ｍＬ）で該カラムから洗い流し、該アミン生成物−ニンヒドリン検出を示す画分を合わせ、真空下で２５〜３０ｍＬまで濃縮した。この濃縮溶液を３００ｍＬの撹拌エタノールに滴下し、撹拌を更に２時間継続した。該生成物を濾過し、新鮮エタノール（２×５０ｍＬ）で洗浄し、一定重量まで風乾させた。得られた白色無定形固体を更に真空オーブン内で８０℃で５時間乾燥させて４．１ｇｍの白色顆粒固体（ＴＹ  ５．１ｇｍ）を得た。該ＮＭＲは芳香族部分を含んでいなかった。１ＮＭＲ  ３００ＭＨｚ（Ｄ２Ｏ）  δ  ５．０８（ｓ，１Ｈ），４．８７（ｓ，１Ｈ），４．８１（ｓ，１Ｈ），４．８−３．６（ｍ，１８Ｈ），２．９（ｍ，２Ｈ）。
【０３８７】
実施例６−ジプロパルジル糖の合成およびＡＥ−リガンドの製造
ａ．ジエチルジプロパルマロナートの合成
ジエチルマロナート（１２２．５ｇ，０．７６４８ｍｏｌ）を、ナトリウムエトキシド（ナトリウム金属，３８．５ｇ，１．６７ｍｏｌから調製したもの）を含有する無水エタノール（８００ｍｌ）に加えた。３０分後、プロパルジルブロミド（２００ｇ，１．６８ｍｏｌ）を、温度を６０℃未満に維持しながら該撹拌懸濁液にゆっくり加えた。該混合物を一晩（１５時間）還流した。沈殿した塩を濾過により除去し、エタノールで洗浄した。溶媒を真空中で除去し、残渣を水で希釈し、エタノール（２×２００ｍｌ）で抽出した。合わせた抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、該溶媒を真空中で除去して金色の油を得た。該油を高真空（４０℃）で３時間配置し、放置した。固体が結晶し始めて油性固体を形成した。それを一晩（１６時間）放置した。シクロヘキサンをフラスコに仕込み、固体を破壊し、濾過し、シクロヘキサンで洗浄して白色結晶生成物（８１ｇｍ，収率４４．８％）を得た。反応はＧＣにより追跡した。
【０３８８】
ｂ．ジプロパルジルマロン酸の合成
ジエチルジプロパルジルマロナート（８０ｇｍ，０．３３９ｍｏｌ）を６００ｍｌの１０％  アルコール性水酸化カリウム中で一晩（１５時間）還流した。溶媒を真空中で除去し、残渣を３Ｎ  ＨＣｌで酸性化した。残渣をＥｔ２Ｏ（２×３００ｍｌ）で抽出した。合わせた抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、真空中で濃縮して油を得た。それを高真空（４０℃）で２時間配置し、放置してジプロパルジルマロン酸を油として得た（４６ｇｍ，収率７５．４％）。反応はＧＣにより追跡した。
【０３８９】
ｃ．ジプロパルジル乳酸の合成
ＣＯ２の発生が停止するまで、ジプロパルジルマロン酸（２６ｇｍ，０．４４３ｍｏｌ）を原液で１３５℃で加熱した。ついでそれを冷却して油を得た。該油を０．５ｐｓｉで蒸留した。蒸留フラスコ内の残留油性残渣および固体を合わせ（１５．７ｇｍ，収率７９．９％）、そのまま次工程において使用した。
【０３９０】
ｄ．［２−（３−プロパ−２−イニル−ヘキサ−５−イノイルアミノ）−エチル］−カルバミン酸ｔ−ブチルエステルの合成
３００ｍｌのＣＨ３ＣＮ中のジプロパルジル酢酸（１５．５６ｇｍ，０．１１４３ｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（３６．７４ｇｍ，０．１１４ｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２９．６ｇｍ，０．２２９ｍｏｌ）を含有する０℃の撹拌溶液に５０ｍｌのＣＨ３ＣＮ中のＮ−ｂｏｃ−エチレンジアミン（１８．３ｇｍ，０．１１４３ｍｏｌ）を添加漏斗によりゆっくり加えた。沈殿が生じた。氷浴を除去し、生成物を室温で一晩（１６時間）撹拌した。該反応は今や完全に均一である。該溶液を真空中で濃縮し、残渣を８００ｍｌの水で希釈した。生じた固体を大量の水で濾過し、真空乾燥させて１４．３ｇｍの粗生成物を得た。ＤＣＭからの再結晶化（２×）、濾過およびヘキサンでの洗浄は該生成物を与える（９．８５ｇｍ，収率３１％，ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）により純度９８％）。
【０３９１】
ｅ．［２−（３−プロパ−２−イニル−ヘキサ−５−イノイルアミノ）−エチル］−カルバミン酸ｔ−ブチルエステルへのアジド糖のクリック反応
ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の１，１  ジプロパルジル−アセチル−（−１Ｎ，２Ｎ−ＢＯＣ−１，２−ジアミノエチル）アミド（ＤＰ，４１８ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）にＴＦＡ（４ｍＬ）を０℃で５分間にわたって滴下した。該暗色化溶液を室温で一晩撹拌した。揮発物を減圧下で蒸発させた。トルエン（２０ｍＬ）を残渣に加え、減圧下で２回放散させた。得られた暗色油を、更なる精製を行うことなく使用した。
【０３９２】
この残渣に１５分間撹拌しながらＴＨＦ（２０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）を加えた。硫酸銅（２２５ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ）を加え、ついでアスコルビン酸ナトリウム（１８０ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を５５〜６０℃に６時間加熱し、ついで室温で１８時間撹拌した。該溶液を減圧下で約半分の体積まで蒸発させ、微細繊維ガラスファイバーで濾過した。得られた透明溶液を樹脂カラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｘ−２）上に配置し、それを中性ｐＨまで水（６×７５ｍＬ）で洗浄し、ついで１０％  ＮＨ４ＯＨ（８×７５ｍＬ）で洗浄した。ニンヒドリンで陽性に染色した画分を合わせ、減圧下で蒸発させてガラス状固体を得た。該ガラス残渣を水（２５０ｍＬ）中に加え、０．５ｇｍの木炭で処理し、加熱して還流させた。該冷却スラリーをセライトおよび微細繊維フィルターで濾過した。生じた淡黄色溶液を減圧下で蒸発させてガラス状固体を得、メタノールを加え、蒸発（２×）させて薄白色（オフホワイト）泡（０．９ｇｍ，ＴＹ  １．０ｇｍ）を得た。
【０３９３】
実施例７−トリプロパルジル糖の合成およびＡＥ−リガンドの製造
ａ．２−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）チオアセトアミド−トリス［（プロパルジルオキシ）メチル］アミノメタン
エタノール（５ｍＬ）中のｔ−ブチル  Ｎ−（２−メルカプロエチル）カルバマート（Ｆｒｏｎｔｒｕｎ  Ｏｒｇａｎｉｘ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ；１７７．２６ｍｇ，１ｍｍｏｌ）の溶液に、撹拌しながらＮａＯＨ（１．１ｍｍｏｌ）を室温で加えた。この溶液に２−ブロモアセトアミド−トリス［（プロパルジルオキシ）メチル］アミノメタン（３５６ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７３，５６０２を参照されたい）を加え、撹拌を２０時間継続した（ＴＬＣ  ＳＧ  ８／２  ヘキサン／酢酸エチル，ｐｄｔ  Ｒｆ  ０．４）。該溶媒を真空下で蒸発させ、残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）中に加え、水（２５ｍＬ）、０．５Ｎ  ＮａＯＨ（２５ｍＬ）およびブライン（２５ｍＬ）で連続的に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して油を得た（３６０ｍｇ，ＴＹ  ４５２．３ｍｇ）。ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３（ｐｐｍ）：７．０５（ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）；５．２５（（ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）；４．８５（ｓ，６Ｈ）；３．８５（ｓ，６Ｈ）；３．３（ｍ，２Ｈ）；３．１５（ｓ，２Ｈ）；２．７（ｍ，２Ｈ）；２．４２（ｓ，３Ｈ）；１．２２（ｓ，９Ｈ）。
【０３９４】
ｂ．２−（２−アミノエチル）チオアセトアミド−トリス［（トリアゾロ−１−（２−エチルマンノース）４−メトキシ）メチル］アミノメタン
室温のＤＣＭ（４０ｍＬ）中の２−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）チオアセトアミド−トリス［（プロパルジルオキシ）メチル］アミノメタン（１ｇｍ，２．２１ｍｍｏｌ）撹拌溶液にＴＦＡ（４ｍＬ）を滴下した。得られた溶液を一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をトルエン（１５ｍＬ）中に加え、蒸発乾固させた。
【０３９５】
残渣をＴＨＦ（４０ｍＬ）、水（４０ｍＬ）中に加え、撹拌して溶液を得た。アジドエチルマンノース（３．７５当量，２．０ｇｍ，８．３ｍｍｏｌ）を加え、ついで硫酸銅（５００ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（４００ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を５５〜６０℃（油浴）で６時間撹拌し、室温に冷却し、一晩撹拌した。得られた混合物を真空下で半分の体積まで濃縮し、ミクロガラスフィルターで濾過した。濾液を樹脂カラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０ｗ  ５０ｘ４−１００）上にローディングし、中性になるまで水（６×７５ｍＬ）で洗浄した。ついでカラムを１５％  水酸化アンモニウム（１０×７５ｍＬ）で溶出し、ニンヒドリンに陽性の画分をプールし、濃縮してガラス状泡（１．２９ｇｍ，ＴＹ（ＭＷ  １０９９ｇ／ｍｏｌ），２工程で５３％）を得た。
【０３９６】
実施例８−ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンの合成
典型的な合成においては、４ｇの粉末インスリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１００ｍｌの無水ＤＭＳＯに室温で溶解し、ついで４ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加える。該溶液を室温で３０分間撹拌する。つぎに１．７９ｍｌ（２．６当量）のジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカルボナート／ＴＨＦ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を該インスリン−ＴＥＡ溶液にゆっくり加え、約１時間混合する。５ｍｌのＤＭＳＯ中に２５０μｌのエタノールアミンを含有する４ｍｌのストック溶液の添加およびそれに続く５分間の混合により、該反応をクエンチする。クエンチ後、全溶液を１６００ｍｌのアセトン中に注ぎ、スパーテルで手短に混合する。つぎに１８．９％  ＨＣｌ：水の溶液の８×４００μｌ  アリコートを該混合物の表面上に滴下して、反応したインスリンを沈殿させる。ついで該沈殿物を遠心分離し、上清を別のビーカー内にデカントし、一方、沈殿ケークを取っておく。該上清溶液に、１８．９％  ＨＣｌ：水の溶液の別の８×４００μｌ  アリコートを該混合物の表面上に滴下して、反応したインスリンの第２の沈殿物を得る。この第２沈殿物を遠心分離し、上清を捨てる。それらの２つの沈殿工程からの合わせた遠心分離ケークをアセトンで１回洗浄し、真空下、室温で乾燥させて粗粉末を得る。該粗粉末は、典型的には、所望のＢＯＣ２生成物６０％およびＢＯＣ３物質４０％を含有する。
【０３９７】
分取用逆相ＨＰＬＣ法を用いて、該粗粉末から純粋なＢＯＣ２−インスリンを単離する。バッファーＡは、０．１％  ＴＦＡを含有する脱イオン水であり、バッファーＢは、０．１％  ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。該粗粉末を２５ｍｇ／ｍｌで７０％Ａ／３０％Ｂ混合物に溶解し、該カラム上への注入の前にシリンジ濾過する。精製前に、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを使用して該カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８，７μｍ，１９×１５０ｍｍ）を１５ｍｌ／分で７０％Ａ／３０％Ｂ  移動相で平衡化する。約５ｍｌの該粗粉末溶液を１５ｍｌ／分の流速で５分間にわたって該カラム上に注入し、ついで７０％Ａ／３０％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂまでの直線勾配を次の３．５分間にわたって用い、更に２．５分間、それで維持する。この方法を用いた場合、所望のＢＯＣ２ピークは約１０．６分の時点で溶出し、その直後にＢＯＣ３ピークが続く。該溶液を集めたら、それをロトバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）に付してアセトニトリルを除去し、それを凍結乾燥して、純粋なＢＯＣ２−インスリン粉末を得る。ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により同一性を確認し、Ｎ末端配列決定（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によりコンジュゲート化の部位を決定する。
【０３９８】
実施例９−ベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−ω−アミノ酸−ＮＨＳエステル）アミドフレームワークの合成
ジクロロメタン（ＤＣＭ）（５ｍＬ）中の１，３，５−ベンゼントリカルボニルクロリド（１ｇｍ，３．８ｍｏｌ）の溶液を氷浴内の１Ｎ  ＮａＯＨ（２５ｍＬ）中のω−アミノ酸（３．１当量）の激しく撹拌されている溶液に滴下する。該氷浴を除去し、撹拌を室温で４時間継続する。２Ｎ  ＨＣｌ（〜１５ｍＬ）をｐＨ約２になるまで滴下し、得られたスラリーを更に２時間撹拌する。沈殿物を濾過し、冷水（２×２０ｍＬ）で洗浄し、真空下で空気中、ついで６０℃のオーブン内で一晩乾燥させる。得られた白色固体を、更に精製することなく使用する。各ω−アミノ酸の収量（４−アミノ酪酸：収量１．６ｇｍ，９１％；６−アミノカプロン酸：収量１．９ｇｍ，９２％）。
【０３９９】
前記物質を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．１ｍｍｏｌ，３．１当量）を含有するＤＭＳＯ（５ｍＬ）中に加え、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣＩ，３．６ｍｍｏｌ，３．６当量）を室温で加える。得られた溶液を２４時間撹拌し、水（１２５ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相を水（２×５０ｍＬ）、ブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させる。溶媒を蒸発させ、半固体残渣をアセトニトリル（１０ｍＬ）でトリチュレーションする。該固体を濾過し、冷溶媒で洗浄し、真空下の空気中、ついで６０℃のオーブン内で一晩乾燥させる。該生成物は尿素副生成物を含有しない。ベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−６−アミノカプロン酸−ＮＨＳエステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ６）：３０４ｍｇ，３６％，ｍｐ  １４０〜１４２℃。ベンゼン−１，３，５−トリカルボキシ−（Ｎ−４−酪酸−ＮＨＳ−エステル）アミド（ＴＳＢ−Ｃ４）：２４５ｍｇ，４５％、ｍｐ  １８２〜１８４℃。
【０４００】
実施例１０−樹枝状フレームワークの合成
ａ．ニトロ基含有アルキン末端官能基化デンドロンの水素化
ｎ＝２、４または８の末端アルキンおよびニトロプロピオン酸コアを含有するデンドロンを（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆａｃｔｏｒｙ，  Ｓｗｅｄｅｎから）得、更に精製することなく使用する。該デンドロンをＤＣＭとエタノールとの１００ｍＬの５０：５０（ｖｏｌ）混合物に溶解し、０．８ｇｍの５％  Ｐｄ／Ｃを加える。激しく撹拌されている懸濁液を３０〜４０ｐｓｉで、４８時間、または出発物質がＴＬＣにより明らかでなくなるまで水素化する。該懸濁液をセライトで濾過し、これをエタノール（２×５０ｍＬ）で濯ぎ、濾液を真空下で濃縮する。
【０４０１】
濾液を７０ｍＬの水および１２ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨで希釈し、該溶液を室温で一晩撹拌する。２ｇｍの脱色性木炭を加え、該撹拌懸濁液を８０℃に加熱し、室温に冷却し、セライトで濾過する。濾液のｐＨを２Ｎ  ＨＣｌで８．０に調節し、該無色溶液を約５０％の体積まで真空下で濃縮する。
【０４０２】
該溶液を樹脂カラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ，５０ｇｍ）上にローディングし、溶出画分が中性ｐＨになるまで水で洗浄して（６×７５ｍＬ）、残留酸副生成物を除去する。該アミン生成物を０．２５Ｎ  水酸化アンモニウム（６×７５ｍＬ）で該カラムから洗い流し、該アミン生成物（ニンヒドリン検出）を示す画分を合わせ、ロータリーエバポレーターを使用して真空下で蒸発させる。
【０４０３】
ｂ．アジドエチルマンノースとのデンドロン（アミン，アルキン−４）の反応
水素化後に得られたアミノコアと４つの末端アルキン基とを含有するデンドロン生成物（８．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）、水（４０ｍＬ）中に加え、撹拌して溶液を得る。アジドエチルマンノース（４．７５当量，２．５３ｇｍ，１０．５１ｍｍｏｌ）を加え、ついで硫酸銅（５００ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（４００ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を５５〜６０℃（油浴）で６時間撹拌し、室温に冷却し、一晩撹拌する。得られた混合物を真空下で半分の体積まで濃縮し、ミクロガラスフィルターで濾過する。濾液を樹脂カラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０ｗ  ５０ｘ４−１００）上にローディングし、中性になるまで水（６×７５ｍＬ）で溶出する。ついで該カラムを１５％  水酸化アンモニウム（１０×７５ｍＬ）で溶出し、ニンヒドリンに陽性の画分をプールし、濃縮してガラス状泡を得る。
【０４０４】
実施例１１−有機溶媒中での多価活性化エステルを使用するアミン官能基化薬コンジュゲート化（薬物を最初に加える）
Ｎ末端活性化エステルを含有するフレームワークを６０ｍＭで１．０ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解し、ついで４００μｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加える。該溶液を室温で１０分間、迅速に撹拌する。ついで、これとは別に、アミン含有薬を７．４ｍＭの濃度で７．９ｍｌのＤＭＳＯに溶解する。溶解したら、該薬物溶液全体を該フレームワーク／ＤＭＳＯ／ＴＥＡ溶液に１０分間にわたって滴下し、ついで室温で２時間混合する。ついで残りの活性化エステルを以下のとおりにアミン官能基化アフィニティリガンドと反応させる。アフィニティリガンドの３７０ｍＭ  溶液を適当な容量の乾燥ＤＭＳＯ中で調製する。溶解したら、十分な溶液を加えて、初期活性化エステル基の数から１を差し引いた数の３倍に等しい幾つかの反応性等価体を得る。例えば、フレームワーク当たりＮ＝３の初期活性化エステル基が存在する場合には、（３×（３−１）×６０ｍＭ／３７０ｍＭ）＝０．９７３ｍｌのアフィニティリガンド溶液を加える。フレームワーク当たりＮ＝４の初期活性化エステル基が存在する場合には、（３×（４−１）×６０ｍＭ／３７０ｍＭ）＝１．４６ｍｌのアフィニティリガンド溶液を加えるなどである。該アフィニテイリガンド溶液を加えた後、完全な反応が保証されるように該溶液を室温で更に１時間撹拌する。
【０４０５】
ついで、得られた溶液を、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ（ｐＨ５．０）ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水溶液中に１０倍で超希釈し、ついで８．０の最終ｐＨになるまで希ＨＣｌでｐＨ調節する。該水溶液を、まず、コンジュゲート化および未コンジュゲート化マテリアルの所望の分離のための適当な固相を使用するサイズ排除により精製する。ついで、カラムボイド体積を通過した溶液を、適当なサイズの限外濾過膜を使用して約１０ｍｌまで濃縮する。Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ８，７μｍ，１９×１５０ｍｍカラム上の分取用逆相ＨＰＬＣを用いて、この溶液を更に精製して、所望の生成物を得る。バッファーＡは、０．１％  ＴＦＡを含有する脱イオン水であり、バッファーＢは、０．１％  ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。精製前に、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを使用して該カラムを１５ｍｌ／分で８０％Ａ／２０％Ｂ  移動相で平衡化する。約５ｍｌの該粗溶液を１５ｍｌ／分の流速で２分間にわたって該カラム上に注入し、ついで８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂまでの直線勾配を次の５分間にわたって用い、ついで、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂまでの、より遅い直線勾配を、次の２２分間にわたって用いる。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、フレームワークおよびアフィニティリガンドに応じて様々なものとなろう。該溶液を集めたら、それをロトバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）に付してアセトニトリルを除去し、それを凍結乾燥して、純粋なコンジュゲートを得る。その同一性はＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により確認されうる。
【０４０６】
実施例１２−均一リガンド−多価糖を含有するＢ１−インスリンコンジュゲート
実施例１１に記載の方法および実施例８のアミン含有薬ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）を使用し、以下のフレームワークおよびアフィニティリガンドを使用して、薬物コンジュゲートを製造した。トリス−スクシンイミジル−１，３，５−ベンゼントリカルボキシラート（ＴＳＢ）、トリス−スクシンイミジルアミノトリアセタート（ＴＳＡＴ）、トリス−スクシンイミジル（６−アミノカプロイル）アミノトリアセタート（ＴＳＡＴ−Ｃ６）およびテトラキス−（Ｎ−スクシンイミジルカルボキシプロピル）ペンタエリトリトールＴＳＰＥ活性化エステルフレームワークをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から購入し、更に精製することなく使用した。ＴＳＢ−Ｃ４およびＴＳＢ−Ｃ６フレームワークを実施例９に従い合成した。ＡＥＭ、ＡＥＢＭおよびＡＥＴＭアフィニティリガンドを実施例１〜４に従い合成した。適当なサイズのサイズ排除媒体はＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）であり、適当なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。
【０４０７】
全ての場合において、実施例１１に従い得た凍結乾燥粉末を９０％  ＴＦＡ／１０％  アニソールに４℃で１時間溶解し、ついで、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）バッファー中の１０倍の超希釈に付すことにより、ＢＯＣ保護基を除去した。ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを７．０〜８．０に調節し、ついで該物質（マテリアル）をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通過させて、アニソール、ＢＯＣおよび他の低分子量の脱保護副生成物ならびにいずれかの他の混入塩を除去する。ついで、脱保護され精製されたコンジュゲート水溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、約５８Ｕ  インスリン／ｍｌ（Ａ２８０測定に基づく）まで濃縮し、必要になるまで４℃で保存した。出発物質ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンマテリアルはＰｈｅ−Ｂ１末端に１個の遊離アミン基を有するに過ぎないため、Ｎ末端配列決定により各脱保護最終生成物において実証されるとおり、該Ｐｈｅ−Ｂ１が該フレームワークへのインスリンコンジュゲート化の唯一の部位である。
【０４０８】
【表７】
2013541500.tif 000065
実施例１３−混合リガンド−多価糖を含有するＢ１−インスリンコンジュゲート
実施例１１に記載の方法および実施例８のアミン含有薬ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）を使用して、フレームワークに連結された糖アフィニティリガンドの混合物を有する薬物コンジュゲートを製造した。ＴＳＡＴ−Ｃ６およびＴＳＰＥ活性化エステルフレームワークをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から購入し、更に精製することなく使用した。ＡＥＭ、ＡＥＢＭおよびＡＥＴＭを実施例１〜４に従い合成した。適当なサイズのサイズ排除媒体はＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）であり、適当なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。
【０４０９】
全ての場合において、実施例１１に従い得た凍結乾燥粉末を９０％  ＴＦＡ／１０％  アニソールに４℃で１時間溶解し、ついで、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）バッファー中の１０倍の超希釈に付すことにより、ＢＯＣ保護基を除去した。ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを７．０〜８．０に調節し、ついで該物質（マテリアル）をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通過させて、アニソール、ＢＯＣおよび他の低分子量の脱保護副生成物ならびにいずれかの他の混入塩を除去した。ついで、脱保護され精製されたコンジュゲート水溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して所望のレベルまで濃縮し、必要になるまで４℃で保存した。出発物質ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンマテリアルはＰｈｅ−Ｂ１末端に１個の遊離アミン基を有するに過ぎないため、Ｎ末端配列決定により各脱保護最終生成物において実証されるとおり、該Ｐｈｅ−Ｂ１が該フレームワークへのインスリンコンジュゲート化の唯一の部位である。
【０４１０】
【表８】
2013541500.tif 000066
実施例１４−予製多価糖を使用する多価糖を含有するＢ１−インスリンコンジュゲート
実施例１１に記載の方法および実施例８のアミン含有薬ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）を使用して、予め合成された多価アミン含有アフィニティリガンドから以下のインスリンコンジュゲートを製造する。ジスクシンイミジルスベラート（ＤＳＳ）およびＴＳＡＴ−Ｃ６活性化エステルフレームワークをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から購入し、更に精製することなく使用する。末端反応性アミンを含有する２価ＡＥＭ−２、ＡＥＢＭ−２およびＡＥＴＭ−２分子を、反応性アミンもコンジュゲート化されている適当なフレームワークに各アフィニティリガンドの２つをコンジュゲート化することにより製造する。末端反応性アミンを含有する３価ＡＥＭ−３、ＡＥＢＭ−３およびＡＥＴＭ−３分子を、反応性アミンもコンジュゲート化されている適当なフレームワークに各アフィニティリガンドの３つをコンジュゲート化することにより製造する。適当なサイズのサイズ排除媒体はＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）であり、適当なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。
【０４１１】
全ての場合において、実施例１１に従い得た凍結乾燥粉末を９０％  ＴＦＡ／１０％  アニソールに４℃で１時間溶解し、ついで、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）バッファー中の１０倍の超希釈に付すことにより、ＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを７．０〜８．０に調節し、ついで該物質（マテリアル）をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通過させて、アニソール、ＢＯＣおよび他の低分子量の脱保護副生成物ならびにいずれかの他の混入塩を除去する。ついで、脱保護され精製されたコンジュゲート水溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して所望のレベルまで濃縮し、必要になるまで４℃で保存する。出発物質ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンマテリアルはＰｈｅ−Ｂ１末端に１個の遊離アミン基を有するに過ぎないため、Ｎ末端配列決定により各脱保護最終生成物において実証されるとおり、該Ｐｈｅ−Ｂ１が該フレームワークへのインスリンコンジュゲート化の唯一の部位である。
【０４１２】
【表９】
2013541500.tif 000067
実施例１５−均一リガンド−樹枝状フレームワークを使用する多価糖を含有するＢ１インスリンコンジュゲート
実施例１０ｂにおいて製造した１つのアミノコアと４つの末端アルキン基とを含有する０．１ｇｍ（０．０９８ｍｍｏｌ）のデンドロンを１００ｍｇ／ｍｌで無水ＤＭＳＯに溶解する。該溶液を、ジスクシンイミジルスベラート（ＤＳＳ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，０．０９８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（４００μＬ）とを含有する溶液に滴下し、室温で１時間反応させる。ついでこの混合物を、実施例８のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）（０．５８８ｇ，０．０９８ｍｍｏｌ）を含有する５０ｍｇ／ｍｌ溶液に滴下し、２時間反応させる。
【０４１３】
得られたコンジュゲートを水中に超希釈し、ｐＨを８．０に調節する。該溶液を、ＢｉｏＧｅｌ  Ｐ２を使用して脱塩し、ついで、Ａｍｉｃｏｎ  ３ｋ限外濾過装置を使用する濃縮に付す。得られた溶液を逆相クロマトグラフィーにより精製し、アセトニトリルを除去するためにロトバップに付し（ｒｏｔｏｖａｐｐｅｄ）、凍結乾燥する。該凍結乾燥粉末を９０％  ＴＦＡ／１０％  アニソールに４℃で１時間溶解し、ついで、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）バッファー中の１０倍の超希釈に付すことにより、ＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを７．０〜８．０に調節し、ついで該物質（マテリアル）をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通過させて、アニソール、ＢＯＣおよび他の低分子量の脱保護副生成物ならびにいずれかの他の混入塩を除去する。ついで、脱保護され精製されたコンジュゲート水溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して所望のレベルまで濃縮し、必要になるまで４℃で保存する。出発物質ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンマテリアルはＰｈｅ−Ｂ１末端に１個の遊離アミン基を有するに過ぎないため、Ｎ末端配列決定により各脱保護最終生成物において実証されるとおり、該Ｐｈｅ−Ｂ１が該フレームワークへのインスリンコンジュゲート化の唯一の部位である。
【０４１４】
実施例１６−ＮＨ２−Ｂ２９−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリンの合成
ａ．Ｆｍｏｃ−１−（Ｂ２９）−インスリン
典型的な合成においては、４ｇｍの粉末インスリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１００ｍｌの無水ＤＭＳＯに室温で溶解し、ついで４ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加える。該溶液を室温で３０分間撹拌する。つぎに１．２当量の９−フルオレニルメチルＮ−スクシンイミジルカルボナート（Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をＴＨＦ中のＦｍｏｃ−ＮＨＳの１．０Ｍ溶液として該インスリン−ＴＥＡ溶液にゆっくり加える。該反応を約１時間混合する。５ｍｌのＤＭＳＯ中に２５０μｌのエタノールアミンを含有する４ｍｌのストック溶液の添加およびそれに続く５分間の混合により、該反応をクエンチする。クエンチ後、全溶液を１６００ｍｌのアセトン中に注ぎ、スパーテルで手短に混合する。つぎに１８．９％  ＨＣｌ：水の溶液の８×４００μｌ  アリコートを該混合物の表面上に滴下して、反応したインスリンを沈殿させる。ついで該沈殿物を遠心分離し、上清を別のビーカー内にデカントし、一方、沈殿ケークを取っておく。該上清溶液に、１８．９％  ＨＣｌ：水の溶液の別の８×４００μｌ  アリコートを該混合物の表面上に滴下して、反応したインスリンの第２の沈殿物を得る。この第２沈殿物を遠心分離し、上清を捨てる。それらの２つの沈殿工程からの合わせた遠心分離ケークをアセトンで１回洗浄し、ついで、真空下、室温で乾燥させて粗粉末を得る。該粗粉末は、典型的には、該Ｆｍｏｃ１生成物２０％、該Ｆｍｏｃ２生成物６５％および未反応インスリン１５％を含有する。
【０４１５】
分取用逆相ＨＰＬＣ法を用いて、該粗粉末から純粋な所望のＦｍｏｃ１−インスリンを単離する。バッファーＡは、０．１％  ＴＦＡを含有する脱イオン水であり、バッファーＢは、０．１％  ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。該粗粉末を２５ｍｇ／ｍｌで７０％Ａ／３０％Ｂ混合物に溶解し、該カラム上への注入の前にシリンジ濾過する。精製前に、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを使用して該カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８，７μｍ，１９×１５０ｍｍ）を１５ｍｌ／分で７０％Ａ／３０％Ｂ  移動相で平衡化する。約５ｍｌの該粗粉末溶液を１５ｍｌ／分の流速で５分間にわたって該カラム上に注入し、ついで７０％Ａ／３０％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂまでの直線勾配を次の３．５分間にわたって用い、更に２．５分間、それで維持する。この方法を用いた場合、所望のＦｍｏｃ１ピークは未反応ＲＨＩピークの約３分後に溶出し、その直後にＦｍｏｃ２−インスリンピークが続く。該溶液を集めたら、それをロトバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）に付してアセトニトリルを除去し、それを凍結乾燥して、純粋なＦｍｏｃ１−インスリン粉末を得る。ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により同一性を確認し、Ｎ末端配列決定（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によりコンジュゲート化の部位を決定する。
【０４１６】
ｂ．ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−Ｆｍｏｃ−（Ｂ２９）−インスリン
典型的な合成においては、１ｇのＦｍｏｃ１−（Ｂ２９）−インスリンを２５ｍｌの無水ＤＭＳＯに室温で溶解し、ついで１ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加える。該溶液を室温で３０分間撹拌する。つぎに０．３７９ｍｌ（２．２当量）のジ−ｔｅｒｔ−ジカルボナート／ＴＨＦ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を該インスリン−ＴＥＡ溶液にゆっくり加え、約１時間混合する。５ｍｌのＤＭＳＯ中に２５０μｌのエタノールアミンを含有する１ｍｌのストック溶液の添加およびそれに続く５分間の混合により、該反応をクエンチする。クエンチ後、全溶液を４００ｍｌのアセトン中に注ぎ、スパーテルで手短に混合する。つぎに１８．９％  ＨＣｌ：水の溶液の８×１００μｌ  アリコートを該混合物の表面上に滴下して、反応したインスリンを沈殿させる。ついで該沈殿物を遠心分離し、上清を別のビーカー内にデカントし、一方、沈殿ケークを取っておく。該上清溶液に、１８．９％  ＨＣｌ：水の溶液の別の８×１００μｌ  アリコートを該混合物の表面上に滴下して、反応したインスリンの第２の沈殿物を得る。この第２沈殿物を遠心分離し、上清を捨てる。それらの２つの沈殿工程からの合わせた遠心分離ケークをアセトンで１回洗浄し、ついで、真空下、室温で乾燥させて粗粉末を得る。該粗粉末は、典型的には、９０％を超える所望のＢＯＣ２−Ｆｍｏｃ−１生成物を含有する。
【０４１７】
分取用逆相ＨＰＬＣ法を用いて、該粗粉末から純粋なＢＯＣ２−Ｆｍｏｃ−１−インスリンを単離する。バッファーＡは、０．１％  ＴＦＡを含有する脱イオン水であり、バッファーＢは、０．１％  ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。該粗粉末を２５ｍｇ／ｍｌで７０％Ａ／３０％Ｂ混合物に溶解し、該カラム上への注入の前にシリンジ濾過する。精製前に、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを使用して該カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８，７μｍ，１９×１５０ｍｍ）を１５ｍｌ／分で７０％Ａ／３０％Ｂ  移動相で平衡化する。約５ｍｌの該粗粉末溶液を１５ｍｌ／分の流速で５分間にわたって該カラム上に注入し、ついで７０％Ａ／３０％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂまでの直線勾配を次の３．５分間にわたって用い、更に２．５分間、それで維持する。この方法を用いた場合、所望のＢＯＣ２−Ｆｍｏｃ１ピークはＦｍｏｃ１−インスリン出発物質の約５分後に溶出する。該溶液を集めたら、それをロトバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）に付してアセトニトリルを除去し、それを凍結乾燥して、純粋なＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−Ｆｍｏｃ（Ｂ２９）−インスリン粉末を得る。ＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により同一性を確認し、Ｎ末端配列決定（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によりコンジュゲート化の部位を決定する。
【０４１８】
ｃ．ＮＨ２−（Ｂ２９）−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリン
前工程で得た凍結乾燥粉末をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％  ピペリジンに４℃で３０分間溶解し、ついで、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）バッファー中の１０倍の超希釈に付すことにより、ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−Ｆｍｏｃ（Ｂ２９）のＦｍｏｃ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを７．０〜８．０に調節し、ついで該物質（マテリアル）をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通過させて、Ｆｍｏｃ、ＤＭＦおよびいずれかの他の混入塩を除去する。該ＮＨ２−（Ｂ２９）−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリンを、必要に応じて、粉末へと凍結乾燥させ、または所望により水溶液中で直接的に使用する。
【０４１９】
実施例１７−ＮＨ２−Ｂ２９−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリンコンジュゲートの合成
実施例８のＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを使用して前記実施例に記載されている多価−アフィニティリガンド−薬物コンジュゲートの全ては、その代わりに実施例１６のＮＨ２−Ｂ２９−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ１）−インスリンを使用して合成されうる。得られるコンジュゲートの全ては同じ分子量および置換度特性を有するが、該インスリン分子のコンジュゲート化の部位はイプシロンＢ２９アミノ基であり、Ｎ末端Ｐｈｅ−Ｂ１ではない。
【０４２０】
実施例１８−有機溶媒中での多価活性化エステルを使用するアミン官能基化薬コンジュゲート化（薬物を最後に加える）
この実施例は、薬物をアフィニティリガンドの前にフレームワークに加える実施例１１に記載の方法の代替法を記載する。この実施例においては、アフィニティリガンドを薬物の前にフレームワークに加える。Ｎ末端活性化エステルを含有するフレームワークを６０ｍＭで１ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解し、ついで４００μｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加える。該溶液を室温で１０分間迅速に撹拌する。並行して、アフィニティリガンドの１２２ｍＭ溶液を適当な容量の無水ＤＭＳＯ中で調製する。溶解したら、十分なアフィニティリガンド溶液を１０分間にわたって滴下して、フレームワーク上の活性化エステル基の数Ｎから１を差し引いた数に厳密に等しい幾つかの反応性等価体を得る。例えば、フレームワーク上にＮ＝３の活性化エステル基が存在する場合には、（１×（３−１）×６０ｍＭ／１２２ｍＭ）＝０．９８ｍｌのアフィニティリガンド溶液を加える。フレームワーク上にＮ＝４の活性化エステル基が存在する場合には、（１×（４−１）×６０ｍＭ／１２２ｍＭ）＝１．５ｍｌのアフィニティリガンド溶液を加えるなどである。該アフィニテイリガンド溶液を加えた後、該溶液を室温で１時間撹拌する。
【０４２１】
ついで、これとは別に、該アミン含有薬を８．１ｍＭの濃度で７．５ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解する。溶解したら、該薬物溶液全体を該フレームワーク／ＤＭＳＯ／アフィニティリガンド／ＴＥＡ溶液に１分間にわたって加え、ついで、完全な反応が保証されるように室温で更に２時間混合する。
【０４２２】
ついで、得られた溶液を、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ（ｐＨ５．０）ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水溶液中に１０倍で超希釈し、ついで８．０の最終ｐＨになるまで希ＨＣｌでｐＨ調節する。該水溶液を、まず、コンジュゲート化および未コンジュゲート化マテリアルの所望の分離のための適当な固相を使用するサイズ排除により精製する。ついで、カラムボイド体積を通過した溶液を、適当なサイズの限外濾過膜を使用して約１０ｍｌまで濃縮する。Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８，７μｍカラム（１９×１５０ｍｍ）上の分取用逆相ＨＰＬＣを用いて、この溶液を更に精製して、所望の生成物を得る。バッファーＡは、０．１％  ＴＦＡを含有する脱イオン水であり、バッファーＢは、０．１％  ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。精製前に、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを使用して該カラムを１５ｍｌ／分で８０％Ａ／２０％Ｂ  移動相で平衡化する。約５ｍｌの該粗溶液を１５ｍｌ／分の流速で２分間にわたって該カラム上に注入し、ついで８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂまでの直線勾配を次の５分間にわたって用い、ついで、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂまでの、より遅い直線勾配を、次の２２分間にわたって用いる。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、フレームワークおよびアフィニティリガンドに応じて様々なものとなろう。該溶液を集めたら、それをロトバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）に付してアセトニトリルを除去し、それを凍結乾燥して、純粋なコンジュゲートを得る。その同一性はＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により確認されうる。
【０４２３】
実施例１９−未保護インスリンから有機溶媒中で製造される多価糖を含有するＢ２９−インスリンコンジュゲート
この実施例は、未保護インスリンの場合にはＬｙｓ−Ｂ２９イプシロン−アミノ部分が最も反応性のアミンであり、ついでＡ１が反応性であり、ついでＢ１が反応性であることを利用する。したがって、アミン含有薬として未保護インスリンを使用する場合には、生じるコンジュゲートは主としてＬｙｓ−Ｂ２９位において置換されているはずである。実施例１８に記載の方法およびアミン含有薬としての組換えヒトインスリン（ＭＷ＝５８０８Ｄａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から購入したＴＳＡＴ−Ｃ６活性化エステルフレームワークを使用して、以下のインスリンコンジュゲートを製造した。ＡＥＭおよびＡＥＴＭは、既に記載されているとおりに合成した。適当なサイズのサイズ排除媒体はＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）であり、適当なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤａであった。
【０４２４】
【表１０】
2013541500.tif 000068
Ｎ末端配列決定によれば、ＡＥＭ含有フレームワークの約８５％がＬｙｓ−Ｂ２９を介してインスリンにコンジュゲート化され、ＡＥＴＭ含有フレームワークの約８７％がＬｙｓ−Ｂ２９を介してインスリンにコンジュゲート化された。
【０４２５】
実施例２０−水性溶媒中での多価活性化エステルを使用するアミン官能基化薬コンジュゲート化（薬物を最後に加える）
この実施例は、有機溶媒ではなく水性溶媒中で反応を行う、実施例１８に記載の方法の代替法を記載する。Ｎ末端活性化エステルを含有するフレームワークを６０ｍＭで６．２５ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解し、ついで２ｍｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加える。該溶液を室温で１０分間迅速に撹拌する。並行して、アフィニティリガンドの４４８ｍＭ溶液を適当な容量の無水ＤＭＳＯ中で調製する。溶解したら、十分なアフィニティリガンド溶液を１０分間にわたって滴下して、フレームワーク上の活性化エステル基の数Ｎから１を差し引いた数の１．５倍に等しい幾つかの反応性等価体を得る。例えば、フレームワーク上にＮ＝３の活性化エステル基が存在する場合には、（１.５×（３−１）×６０ｍＭ／４４８ｍＭ）×６．２５ｍｌ＝２．５ｍｌのアフィニティリガンド溶液を加える。フレームワーク上にＮ＝４の活性化エステル基が存在する場合には、（１．５×（４−１）×６０ｍＭ／４４８ｍＭ）×６．２５ｍｌ＝３．８ｍｌのアフィニティリガンド溶液を加えるなどである。該アフィニテイリガンド溶液を加えた後、該溶液を室温で１時間撹拌する。
【０４２６】
ついで、これとは別に、該アミン含有薬を１７．２ｍＭの濃度で２．６７ｍｌの０．１Ｍ（ｐＨ１１）炭酸ナトリウムバッファーに溶解し、ついで１．０Ｎ  水酸化ナトリウムでｐＨを１０．８に調節する。溶解したら、該フレームワーク／ＤＭＳＯ／アフィニティリガンド／ＴＥＡ溶液の全体を７５分間にわたって該薬物／炭酸塩バッファー溶液に滴下する。滴下中、必要に応じて、希ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用して、生じた混合物のｐＨを５分毎に１０．８に調節する。該滴下後、完全な反応が保証されるように該溶液を更に１５分間撹拌する。
【０４２７】
ついで、得られた溶液を、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ（ｐＨ５．０）ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水溶液中に１０倍で超希釈し、ついで８．０の最終ｐＨになるまで希ＨＣｌでｐＨ調節する。該水溶液を、まず、コンジュゲート化および未コンジュゲート化マテリアルの所望の分離のための適当な固相を使用するサイズ排除により精製する。ついで、カラムボイド体積を通過した溶液を、適当なサイズの限外濾過膜を使用して約４０ｍｌまで濃縮する。Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８，７μｍカラム（１９×１５０ｍｍ）上の分取用逆相ＨＰＬＣを用いて、この溶液を更に精製して、所望の生成物を得る。バッファーＡは、０．１％  ＴＦＡを含有する脱イオン水であり、バッファーＢは、０．１％  ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。精製前に、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを使用して該カラムを１５ｍｌ／分で８０％Ａ／２０％Ｂ  移動相で平衡化する。約５ｍｌの該粗溶液を１５ｍｌ／分の流速で２分間にわたって該カラム上に注入し、ついで８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂまでの直線勾配を次の５分間にわたって用い、ついで、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂまでの、より遅い直線勾配を、次の２２分間にわたって用いる。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、フレームワークおよびアフィニティリガンドに応じて様々なものとなろう。該溶液を集めたら、それをロトバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）に付してアセトニトリルを除去し、それを凍結乾燥して、純粋なコンジュゲートを得る。その同一性はＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により確認されうる。
【０４２８】
実施例２１−未保護インスリンから水性溶媒中で合成されるＢ２９−ＡＥＭ−２−インスリンコンジュゲート
この実施例は、未保護インスリンの場合にはＬｙｓ−Ｂ２９イプシロン−アミノ部分が最も反応性のアミンであり、ついでＡ１が反応性であり、ついでＢ１が反応性であることを利用する。したがって、アミン含有薬として未保護インスリンを使用する場合には、生じるコンジュゲートは主としてＬｙｓ−Ｂ２９位において置換されているはずである。実施例２０に記載の方法およびアミン含有薬としての組換えヒトインスリン（ＭＷ＝５８０８，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から購入したＴＳＡＴ−Ｃ６活性化エステルフレームワークを使用して、ＡＥＭ−２インスリンコンジュゲートを製造した。インスリン類似体として使用したＡＥＭは、既に記載されているとおりに合成した。適当なサイズのサイズ排除媒体はＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）であり、適当なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤａであった。最終生成物（ＨＰＬＣにより純度９５％）は６７２９ｇ／ｍｏｌの所望の分子量を有することが判明した（ＬＣ−ＭＳ）。このことは、インスリン１個当たり合計２．０個のＡＥＭ分子がコンジュゲート化されたことを表しており、該コンジュゲート分子の８５％以上がＬｙｓ−Ｂ２９部位においてコンジュゲート化された（Ｎ末端配列決定）。
【０４２９】
実施例２２−アルデヒド含有フレームワークを使用する一般化アミン官能基化薬物コンジュゲート化
ａ．２個以上のアフィニティリガンドおよび１個の末端アルデヒドで官能基化されたフレームワーク
まず、Ｎ末端活性化エステルを含有するフレームワークを６０ｍＭで２７．０ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解し、ついで８００μｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加える。該溶液を室温で１０分間迅速に撹拌する。アミン含有ジエチルアセタールのストック溶液を５８０ｍＭの濃度で５ｍｌの無水ＤＭＳＯ中で調製する。溶解したら、２．９ｍｌの該ジエチルアセタール溶液を該フレームワーク／ＤＭＳＯ／ＴＥＡ溶液に５分間にわたって滴下し、ついで室温で更に１５分間混合する。ついで残りの活性化エステルを以下のとおりにアミン官能基化アフィニティリガンドと反応させる。アフィニティリガンドの３７０ｍＭ溶液を適当な容量の乾燥ＤＭＳＯ中で調製する。溶解したら、十分な溶液を加えて、初期活性化エステル基の数Ｎから１を差し引いた数の１．５倍に等しい幾つかの反応性等価体を得る。例えば、フレームワーク当たりＮ＝３の初期活性化エステル基が存在する場合には、（１.５×（３−１）×６０ｍＭ×２７／３７０ｍＭ）＝１３ｍｌのアフィニティリガンド溶液を加える。フレームワーク当たりＮ＝４の初期活性化エステル基が存在する場合には、（１．５×（４−１）×６０ｍＭ×２７／３７０ｍＭ）＝２０ｍｌのアフィニティリガンド溶液を加えるなどである。該アフィニテイリガンド溶液を加えた後、完全な反応が保証されるように該溶液を室温で更に１時間４５分撹拌する。反応後、全溶液をジエチルエーテルで１０倍希釈し、激しく混合し、遠心分離して、所望の物質を含有する濃厚な底相を上清から分離する。上清を捨てた後、同容量のエタノールを加えて固体沈殿塊を得る。遠心分離し上清を捨てた後、該物質をエタノールおよびエーテルでよく洗浄し、ついで真空下で乾燥させて、複数のアフィニティリガンドおよびジエチルアセタール基を含有する粗フレームワークを得る。
【０４３０】
ｂ．末端アルデヒドを使用するアミン官能基化薬のコンジュゲート化
乾燥したら、集めた物質を６０ｍｌのＤＩ水に溶解し、溶液ｐＨを１．０に調節することにより、該ジエチルアセタールからアルデヒド基を形成させる。該溶液を３０分間混合し、ついで、１．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する６ｍｌの２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）バッファーを加え、希ＮａＯＨ溶液を使用して溶液ｐＨを６．５に調節する。４８ｍｍｏｌの該アミン含有薬を該溶液に加え、必要に応じてｐＨを６．５に再調節する。これとは別に、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する１５ｍｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＷＳ（ｐＨ７．０）バッファーに１．５ｇのナトリウムシアノボロヒドリド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を溶解することにより、還元剤のストック溶液を調製し、希ＨＣｌ溶液でｐＨを注意深く６．５に調節する。１３ｍｌの該シアノボロヒドリドストック溶液を該薬物／フレームワーク／アルデヒド溶液に加え、室温で一晩反応させる。
【０４３１】
得られた水溶液を、まず、コンジュゲート化および未コンジュゲート化マテリアルの所望の分離のための適当な固相を使用するサイズ排除により精製する。ついで、カラムボイド体積を通過した溶液を、適当なサイズの限外濾過膜を使用して約１０ｍｌまで濃縮する。Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８，７μｍカラム（１９×１５０ｍｍ）上の分取用逆相ＨＰＬＣを用いて、この溶液を更に精製して、所望の生成物を得る。バッファーＡは、０．１％  ＴＦＡを含有する脱イオン水であり、バッファーＢは、０．１％  ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。精製前に、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを使用して該カラムを１５ｍｌ／分で８０％Ａ／２０％Ｂ  移動相で平衡化する。約５ｍｌの該粗溶液を１５ｍｌ／分の流速で２分間にわたって該カラム上に注入し、ついで８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂまでの直線勾配を次の５分間にわたって用い、ついで、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂまでの、より遅い直線勾配を、次の２２分間にわたって用いる。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、フレームワークおよびアフィニティリガンドに応じて様々なものとなろう。該溶液を集めたら、それをロトバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）に付してアセトニトリルを除去し、それを凍結乾燥して、純粋なコンジュゲートを得る。その同一性はＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により確認されうる。
【０４３２】
実施例２３−末端反応性アルデヒド基を含有するＡＥＭ−２フレームワークおよびＢ１における後続のインスリンコンジュゲート化
ａ．２  ＡＥＭおよび１アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（ＡＢＤＡ）で官能基化されたＴＳＡＴ
このマテリアルは、多価活性化エステルフレームワークとしてのＴＳＡＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）およびアミン含有ジエチルアセタールとしての４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、実施例２２ａに記載の方法に従い合成される。既に記載されているとおりに合成したＡＥＭ（ＭＷ＝２２３ｇ／ｍｏｌ）をアフィニティリガンドとして使用した。
【０４３３】
ｂ．ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンとのＴＳＡＴ−ＡＥＭ−２−ＡＢＤＡのコンジュゲート化
このマテリアルは、実施例２２ｂに記載の方法、前記（ａ）で製造されたＴＳＡＴ−ＡＥＭ−２ＡＢＤＡ、および実施例８に従い合成されたアミン含有薬ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）を用いて合成された。適当なサイズのサイズ排除媒体はＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）であり、適当なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。出発物質ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンマテリアルはＰｈｅ−Ｂ１末端に１個の遊離アミン基を有するに過ぎないため、該Ｐｈｅ−Ｂ１が該フレームワークへのインスリンコンジュゲート化の唯一の部位である。該凍結乾燥粉末を９０％  ＴＦＡ／１０％  アニソールに４℃で１時間溶解し、ついで、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）バッファー中の１０倍の超希釈に付すことにより、ＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを７．０〜８．０に調節し、ついで該物質（マテリアル）をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通過させて、アニソール、ＢＯＣおよび他の低分子量の脱保護副生成物ならびにいずれかの他の混入塩を除去する。ついで、脱保護され精製されたコンジュゲート水溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、所望のレベルまで濃縮し、必要になるまで４℃で保存する。
【０４３４】
最終生成物（ＨＰＬＣにより純度９５％）は、６４６２ｇ／ｍｏｌの所望の分子量を有することが判明した（ＬＣ−ＭＳ）。このことは、インスリン１個当たり合計２．０個のＡＥＭ分子がコンジュゲート化されたことを表しており、そのうちの９９％はＰｈｅ−Ｂ１部位にコンジュゲート化されていた（Ｎ末端配列決定）。
【０４３５】
実施例２４−末端反応性アルデヒド基を含有するＡＥＭ−３フレームワークおよびＢ１における後続のインスリンコンジュゲート化
ａ．３  ＡＥＭおよび１アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（ＡＢＤＡ）で官能基化されたＴＳＰＥ
このマテリアルは、多価活性化エステルフレームワークとしてのＴＳＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）およびアミン含有ジエチルアセタールとしての４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、実施例２２ａに記載の方法に従い合成される。既に記載されているとおりに合成したＡＥＭ（ＭＷ＝２２３ｇ／ｍｏｌ）をアフィニティリガンドとして使用した。
【０４３６】
ｂ．ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンとのＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３−ＡＢＤＡのコンジュゲート化
このマテリアルは、実施例２２ｂに記載の方法、前記（ａ）で製造されたＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３−ＡＢＤＡ、および実施例８に従い合成されたアミン含有薬ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）を用いて合成された。適当なサイズのサイズ排除媒体はＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）であり、適当なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。出発物質ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンマテリアルはＰｈｅ−Ｂ１末端に１個の遊離アミン基を有するに過ぎないため、該Ｐｈｅ−Ｂ１が該フレームワークへのインスリンコンジュゲート化の唯一の部位である。該凍結乾燥粉末を９０％  ＴＦＡ／１０％  アニソールに４℃で１時間溶解し、ついで、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）バッファー中の１０倍の超希釈に付すことにより、ＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを７．０〜８．０に調節し、ついで該物質（マテリアル）をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通過させて、アニソール、ＢＯＣおよび他の低分子量の脱保護副生成物ならびにいずれかの他の混入塩を除去する。ついで、脱保護され精製されたコンジュゲート水溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、所望のレベルまで濃縮し、必要になるまで４℃で保存する。
【０４３７】
最終生成物（ＨＰＬＣにより純度９５％）は、６８９７ｇ／ｍｏｌの所望の分子量を有することが判明した（ＬＣ−ＭＳ）。このことは、インスリン１個当たり合計３．０個のＡＥＭ分子がコンジュゲート化されたことを表しており、そのうちの９９％はＰｈｅ−Ｂ１部位にコンジュゲート化されていた（Ｎ末端配列決定）。
【０４３８】
実施例２５−末端反応性アルデヒド基を含有するＡＥＭ−３−スカフォールドおよび未保護インスリンを使用するＢ１における後続のインスリンコンジュゲート化
ａ．３  ＡＥＭおよび１アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（ＡＢＤＡ）で官能基化されたＴＳＰＥ
このマテリアルは、多価活性化エステルスカフォールドとしてのＴＳＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）およびアミン含有ジエチルアセタールとしての４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、実施例２２ａに記載の方法に従い合成される。既に記載されているとおりに合成したＡＥＭ（ＭＷ＝２２３ｇ／ｍｏｌ）を指標類似体として使用した。
【０４３９】
ｂ．ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンとのＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３−ＡＢＤＡのコンジュゲート化
このマテリアルは、実施例２２ｂに記載の方法、前記（ａ）で製造されたＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３−ＡＢＤＡ、およびアミン含有薬である未修飾インスリン（ＭＷ＝５，８０８ｇ／ｍｏｌ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて合成された。適当なサイズのサイズ排除媒体はＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）であり、適当なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。出発物質である未保護インスリンマテリアルは３個の遊離アミン基を有し、Ｐｈｅ−Ｂ１（ｐＫａ〜６．８）はｐＨ６．５において最も反応性のアミンであるため、該Ｐｈｅ−Ｂ１が該スカフォールドへのインスリンコンジュゲート化の主要部位である。該凍結乾燥粉末を、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）バッファーに溶解する。ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを７．０〜８．０に調節し、ついで該物質（マテリアル）を、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、所望のレベルまで濃縮し、必要になるまで４℃で保存する。
【０４４０】
最終生成物（ＨＰＬＣにより純度９５％）は、６８９７ｇ／ｍｏｌの所望の分子量を有することが判明した（ＬＣ−ＭＳ）。このことは、インスリン１個当たり合計３．０個のＡＥＭ分子がコンジュゲート化されたことを表しており、そのうちの＞８５％がＰｈｅ−Ｂ１部位にコンジュゲート化されていた（Ｎ末端配列決定）。
【０４４１】
実施例２６−混合フレームワーク化学ならびに薬物およびアフィニティリガンドの別々の対応コンジュゲート化
スクシンイミジル−３，５−ジマレイミドフェニルベンゾアート（ＳＤＭＢ）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から購入可能であり、更に精製することなく以下の実施例で使用されうる。ＳＤＭＢを６０ｍＭで１．０ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解し、ついで４００μｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加える。該溶液を室温で１０分間、迅速に撹拌する。ついで、これとは別に、アミン含有薬を８．１ｍＭの濃度で７．５ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解する。溶解したら、該ＳＤＭＢ溶液全体を該ＤＭＳＯ−薬物溶液に１０分間にわたって滴下し、ついで、完全な反応が保証されるように室温で更に２時間混合する。
【０４４２】
ついで、得られた溶液を、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ（ｐＨ５．０）ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水溶液中に１０倍で超希釈し、ついで８．０の最終ｐＨになるまで希ＨＣｌでｐＨ調節する。該水溶液を、まず、コンジュゲート化および未コンジュゲート化マテリアルの所望の分離のための適当な固相を使用するサイズ排除により精製する。ついで、カラムボイド体積を通過した溶液を、適当なサイズの限外濾過膜を使用して約１０ｍｌまで濃縮する。
【０４４３】
これとは別に、６．０ｍｍｏｌのアミン含有アフィニティリガンドを、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ（ｐＨ８．２）ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水溶液に４５０ｍＭの濃度で溶解する。この溶液に、６．６ｍｍｏｌのイミノチオラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、ｐＨ８．２で室温で３０分間反応させて、アミン末端基を末端スルフヒドリル基へ変換する。得られた物質（マテリアル）を、前工程で製造された薬物−フレームワーク−ジ−マレイミドコンジュゲートの１０ｍｌ溶液と混合する。完全な反応が保証されるように、該マレイミド基を指標−類似体スルフヒドリル基とｐＨ８．２で２時間反応させる。ついで、得られた溶液を、コンジュゲート化および未コンジュゲート化マテリアルの所望の分離のための適当な固相を使用するサイズ排除により精製する。ついで、カラムボイド体積を通過した溶液を、適当なサイズの限外濾過膜を使用して約１０ｍｌまで濃縮する。
【０４４４】
最後に、Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８，７μｍカラム（１９×１５０ｍｍ）上の分取用逆相ＨＰＬＣを用いて、この溶液を更に精製して、所望の生成物を得る。バッファーＡは、０．１％  ＴＦＡを含有する脱イオン水であり、バッファーＢは、０．１％  ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。精製前に、Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ  ６００システムを使用して該カラムを１５ｍｌ／分で８０％Ａ／２０％Ｂ  移動相で平衡化する。約５ｍｌの該粗溶液を１５ｍｌ／分の流速で２分間にわたって該カラム上に注入し、ついで８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂまでの直線勾配を次の５分間にわたって用い、ついで、７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂまでの、より遅い直線勾配を、次の２２分間にわたって用いる。所望のピークの保持時間は、使用する薬物、フレームワークおよびアフィニティリガンドに応じて様々なものとなろう。該溶液を集めたら、それをロトバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）に付してアセトニトリルを除去し、それを凍結乾燥して、純粋なコンジュゲートを得る。その同一性はＬＣ−ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により確認されうる。
【０４４５】
実施例２７−混合フレームワーク化学を用いてアミノエチル糖にコンジュゲート化されたインスリン
実施例２６に記載の方法および実施例８に従い合成されたアミン含有薬ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリン（ＭＷ＝６，００８ｇ／ｍｏｌ）を使用して、以下の具体的な薬物コンジュゲートが得られる。ＡＥＭ（ＭＷ＝２２３ｇ／ｍｏｌ）、ＡＥＢＭ（ＭＷ＝３８５ｇ／ｍｏｌ）およびＡＥＴＭ（ＭＷ＝５４７ｇ／ｍｏｌ）を、既に記載されているとおりに合成し、該合成においてアフィニティリガンドとして使用した。適当なサイズのサイズ排除媒体はＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）であり、適当なサイズの限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤである。
【０４４６】
全ての場合において、実施例２６に従い得た凍結乾燥粉末を９０％  ＴＦＡ／１０％  アニソールに４℃で１時間溶解し、ついで、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）バッファー中の１０倍の超希釈に付すことにより、ＢＯＣ保護基を除去する。ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを７．０〜８．０に調節し、ついで該物質（マテリアル）をＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムに通過させて、アニソール、ＢＯＣおよび他の低分子量の脱保護副生成物ならびにいずれかの他の混入塩を除去する。ついで、脱保護され精製されたコンジュゲート水溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、約５８Ｕ  インスリン／ｍｌ（Ａ２８０測定に基づく）まで濃縮し、必要になるまで４℃で保存する。出発物質ＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンマテリアルはＰｈｅ−Ｂ１末端に１個の遊離アミン基を有するに過ぎないため、該Ｐｈｅ−Ｂ１が該フレームワークへのインスリンコンジュゲート化の唯一の部位である。これはＮ末端配列決定により各脱保護最終生成物において実証されうる。
【０４４７】
【表１１】
2013541500.tif 000069
実施例２８−相補的フレームワークを使用する薬物コンジュゲート化のための一般化クリック化学
少なくとも１つのアミノ酸官能性と１以上の末端アルキン基とを含有するフレームワーク（８．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）、水（４０ｍＬ）中に加え、撹拌して溶液を得る。アジドエチル基含有薬物（１０．５１ｍｍｏｌ）を加え、ついで硫酸銅（５００ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（４００ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）を加える。得られた混合物を５５〜６０℃（油浴）で６時間加熱し、室温に冷却し、一晩撹拌し、真空下で半分の体積まで濃縮し、ミクロガラスフィルターで濾過する。濾液を樹脂カラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０ｗ  ５０ｘ４−１００）上にローディングし、中性になるまで水（６×７５ｍＬ）で溶出する。ついで該カラムを１５％  水酸化アンモニウム（１０×７５ｍＬ）で溶出し、ニンヒドリンで陽性の画分をプールし、濃縮してガラス状泡を得る。
【０４４８】
実施例２９−ウシおよびブタのような他の種からの中性インスリンを使用して製造されたコンジュゲート
少なくとも１つの反応性アミン官能性を含有する他の種からのインスリン（例えば、ウシおよびブタインスリン）を、組換えヒトインスリンをコンジュゲート化するために用いられる方法のいずれかを用いて結合させることが可能である。ウシまたはブタインスリンから製造される生じるコンジュゲートの分子量は、以下の表に挙げられている量だけ、組換えヒトインスリンから製造されるものとは異なる、と当業者は理解するであろう。
【０４４９】
【表１２】
2013541500.tif 000070
また、ウシまたはブタインスリンから製造される生じるコンジュゲートは、ヒトインスリンから製造されるコンジュゲートの場合と比べて、それらのインスリンの構造における僅かな相違のため、若干異なるクロマトグラフィーピーク保持時間を有しうる、と当業者は理解するであろう。
【０４５０】
実施例３０−リスプロ（Ｌｉｓｐｒｏ）、アスパルト（Ａｓｐａｒｔ）、グルリシン（Ｇｌｕｌｙｓｉｎｅ）、グラルギン（Ｇｌａｒｇｉｎｅ）およびデテミル（Ｄｅｔｅｍｉｒ）のようなインスリン類似体を使用して製造されたコンジュゲート
少なくとも１つの反応性アミン官能性を含有する全ての公知インスリン類似体［例えば、リスプロ（Ｌｉｓｐｒｏ）、アスパルト（Ａｓｐａｒｔ）、グルリシン（Ｇｌｕｌｙｓｉｎｅ）、グラルギン（Ｇｌａｒｇｉｎｅ）およびデテミル（Ｄｅｔｅｍｉｒ）］を、組換えヒトインスリンをコンジュゲート化するために用いられる方法のいずれかを用いて結合させることが可能である。インスリン類似体から製造される生じるコンジュゲートの分子量は、以下の表に挙げられている量だけ、組換えヒトインスリンから製造されるものとは異なる、と当業者は理解するであろう。
【０４５１】
【表１３】
2013541500.tif 000071
また、インスリン類似体から製造される生じるコンジュゲートは、ヒトインスリンから製造されるコンジュゲートの場合と比べて、それらのインスリンの構造における僅かな相違のため、若干異なるクロマトグラフィーピーク保持時間を有しうる、と当業者は理解するであろう。
【０４５２】
インスリングルリシン（これはＢ２９リシンを含有せず、その代わりにＢ３リシンを含有する）の使用は、未保護インスリングルリシンを使用した場合、主としてＢ３コンジュゲートを与えるであろう。しかし、Ｂ１−インスリングルリシンコンジュゲートが望ましい場合には、ＢＯＣ−（Ａ１，Ｂ３）−インスリングルリシンを、まず、実施例８に記載されているＢＯＣ−（Ａ１，Ｂ２９）−ヒトインスリンと同じ方法を用いて合成する。
【０４５３】
実施例３１−ペプチドインスリン分泌促進性コンジュゲートを使用して製造されたコンジュゲート
Ｎ末端アミン官能性を含有するペプチドインスリン分泌促進物質（例えば、限定的なものではないが、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１類似体エクサニチド（ｅｘａｎｉｔｉｄｅ））を、インスリンをコンジュゲート化するために用いられる方法のいずれかを用いて結合させることが可能である。
【０４５４】
ＩＩ．典型的なコンジュゲートのインビトロアッセイ
この一連の第２の実施例は、いくつかの典型的なコンジュゲートのインビトロ特性を調べる種々の実験を記載する。
【０４５５】
実施例３２−インスリン−グリコーゲンコンジュゲートの合成
この比較例は、米国特許出願公開第２００７００９９８２０号に従うインスリン−グリコーゲンコンジュゲートの合成を記載する。簡潔に説明すると、１ｇｍの商業的に入手可能な未精製カキグリコーゲン（ＩＩ型，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で脱イオン水に溶解する。得られた溶液に固体ＣＮＢｒをグリコーゲンに対するＣＮＢｒの質量比０．６８で加え、３Ｎ  水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液を使用してｐＨを１０．７＋／−０．２に一定に維持する。１５分間攪拌した後、別の同じ質量の同等固体ＣＮＢｒを加え、４５分間攪拌しながらｐＨを１０．７＋／−０．２に一定に維持する。ついでインスリンを、グリコーゲンに対するインスリンの質量比０．６０で該溶液に加え、炭酸水素ナトリウムを使用してｐＨを９．１５に調節する。該溶液を一晩攪拌し、５０ｋＤａ  ＭＷＣＯポリエーテルスルホン円形膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して脱イオン水に対して徹底的に限外濾過し、凍結乾燥する。ついで、得られた粉末を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）３０  ＨｉＬｏａｄ  １６／６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）充填カラム上で１Ｍ  酢酸移動相を使用するゲル濾過ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）により未コンジュゲート化インスリンから精製する。ついで該インスリングリコーゲン画分を凍結乾燥して該コンジュゲートを純粋な白色粉末として得る。得られた精製マテリアルは、アミノ酸分析（ＵＣＬＡ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を用いて測定したところ、インスリン−グリコーゲンコンジュゲート当たり１．０ｗｔ％のインスリンを含有していた。
【０４５６】
実施例３３−液体クロマトグラフィー分析
この実施例は、実施例３２に従い合成されたインスリン−グリコーゲンコンジュゲートおよび本発明に従い合成された典型的なコンジュゲートのＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルを記載する。実施例３２に従い合成されたインスリン−グリコーゲンの５ｍｇ／ｍｌ  溶液１００μｌおよび典型的なコンジュゲートの１ｍｇ／ｍｌ  溶液１００μｌを、８０％  水／２０％  アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）移動相（それぞれは０．１％  ＴＦＡを含有する）で平衡化されたＷａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ８  ５μｍカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）上に注入した。この研究において使用した典型的コンジュゲートは、フレームワークとしてのＴＳＡＴ−Ｃ６、アフィニティリガンドとしてのＡＥＭおよび薬物としてのＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１、Ｂ２９）−インスリンを使用して合成した。
【０４５７】
以下の勾配法を用いて、該サンプルを１．０ｍｌ／分で溶出した：０〜５分−一定  ８０％  水／２０％  ＣＨ３ＣＮ、５〜３５分−５０％  水／５０％  ＣＨ３ＣＮへの直線勾配。図１における溶出プロファイルは該典型的コンジュゲートに関して単一スパイクを示しており、これは単一の化学的に特徴的な種を示している。一方、該インスリン−グリコーゲンコンジュゲートは広範かつ不均一な溶出プロファイルを示しており、これは種々の化学的および／または分子量物質の広範な分布を示している。
【０４５８】
実施例３４−分子量分布分析
この実施例は、実施例３２に従い合成されたインスリン−グリコーゲンおよび同じ典型的コンジュゲートのＭＷおよびＭＷ分布における相違を記載する。該インスリン−グリコーゲンコンジュゲートのＭＷおよびＭＷ分布は、ｐＨ７のＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中の２５ｍｇ／ｍｌ  溶液１ｍｌを、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で平衡化されたウルトラヒドロゲルサイズ排除カラム（Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ）（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上に注入することにより決定した。該カラムを０．５ｍｌ／分で３０分にわたって溶出させ、該溶出プロファイルを２８０ｎｍでの吸光度として測定した。同じプロトコールを用いる別の実験において、１０００、５０００、１２０００、２５０００、５００００、８００００、１５００００、２７００００および４１００００ｇ／ｍｏｌデキストランＭＷ標準物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を注入して、ＭＷ対保持時間の検量線を確定した。該検量線および該インスリン−グリコーゲンコンジュゲートの溶出プロファイルに基づいて、平均ＭＷは５００，０００ｇ／ｍｏｌと決定され、該分布の６７％は２５０，０００〜１，０００，０００Ｄａの広範囲にわたって溶出した（データ非表示）。これとは対照的に、該典型的コンジュゲートは、ＬＣ／ＭＳ（ＨＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）による測定で、ちょうど６，７３０ｇ／ｍｏｌの単一ＭＷのみを有することが判明した。
【０４５９】
実施例３５−コンジュゲートの化学的および物理的安定性
この実施例は、３７℃での１５０往復／分の機械的撹拌を伴う、Ｈｉｎｄｓら（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１１．１９５−２０１，２０００）に記載されている方法による促進（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ）条件下、典型的コンジュゲートの安定性と未コンジュゲート化インスリンの安定性とを比較する。医薬等級の組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）を該促進安定性研究のための対照として選択した。Ｈｏｌｃｏｍｂｅら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２７：１２４１−１２４２，２００４）は、非促進条件下、ＲＨＩ安定性は、室温（ＲＴ）では少なくとも３０日間、そして凍結された場合にはそれより相当に長く維持されると記載している。図２は、５０Ｕ／ｍｌにおけるｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のＲＨＩおよび２つの典型的コンジュゲートに関する凝集安定性アッセイからの結果を示す。全ての場合において、溶液中の残存率（％）は、与えられた時点で該溶液を遠心分離（４５００×ｇ、５分間）し、上清のＡ２８０を測定し、該上清Ａ２８０を元の出発溶液のもので割り算することにより決定した。コンジュゲート１は、フレームワークとしてのＴＳＡＴ−Ｃ６、アフィニティリガンドとしてのＡＥＭおよび薬物としてのＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１、Ｂ２９）−インスリンを使用して合成した。
【０４６０】
３７℃で４８時間の連続的撹拌の後、該ＲＨＩの６％未満は溶液中で安定なままであったが、該ＲＨＩの大部分は不溶性凝集物として析出した。同じ長さの時間の後、該ＩＰＣの９６％〜９９％は該ＰＢＳ溶液中で完全かつ可溶性のままであったため、それらの両方のコンジュゲートは実質的に、より安定なままであった。該データは、該コンジュゲートが、これらの条件下、ＲＨＩより有意に安定であることを決定的に示している。ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、該コンジュゲートの化学的安定性を評価した（図３ａを参照されたい）。４８時間の促進安定性試験の後、水−アセトニトリル溶出勾配を用いるＣ８−逆相カラムを使用して該コンジュゲート溶液を分析した。前−および後−安定性コンジュゲートサンプルの保持時間が、得られたＬＣトレースにおいて見出される未コンジュゲート化（遊離）インスリンおよびデスアミドインスリンの比率と共に示されている。検出可能な量の遊離インスリンもデスアミド体も観察されなかったが、このことは、（ｉ）糖とインスリン分子との間の共有結合が安定であり、（ｉｉ）促進安定性試験（ＡＳＴ）中に該コンジュゲートの有意な化学的分解が生じないことを示している。ＡＳＴの前およびそれと並行して、該コンジュゲートを、４℃〜室温の毎日のサーマルサイクリングを含む９０日間の非促進安定性試験にも付した。該並行研究の終了時に、ＲＰ−ＨＰＬＣは、該コンジュゲートが尚も化学的および物理的に安定であることを示した（データ非表示）。
【０４６１】
該コンジュゲートをＡＳＴに付す前および付した後に得られるＬＣ−ＭＳデータから、ＨＥＰＥＳバッファー中の該コンジュゲート化学的安定性の更なる証明が得られる。興味深いことに、ＰＢＳ中の４８時間ＡＳＴコンジュゲートサンプルは、相当な分解が生じたことを示したが、ＨＥＰＥＳバッファー中の４８時間ＡＳＴコンジュゲートサンプルは完全に無傷かつ安定であった（図３ｂを参照されたい）。ＨＥＰＥＳ中で保存されたコンジュゲートＨＳ−１−６０−１は該ＡＳＴの前および後で６７３０Ｄａの分子量（ＭＷ）を有し、このことは、両方のマンノース残基、該多量体スカフォールドおよびインスリンが全て、化学的に不変であり完全に安定であることを示している。コンジュゲートの安定性を確保するために、保存、インビトロ試験およびインビボ試験に使用する全てのバッファーは緩衝剤としてＨＥＰＥＳを含有する。
【０４６２】
該ＬＣ−ＭＳデータはＦＤＡ製造規制遵守を著しく改善する。なぜなら、該ＬＣ−ＭＳ試験は該コンジュゲートの化学的同一性アッセイとして容易に働きうるからである。該薬物（例えば、インスリン）、多量体スカフォールドおよびコンジュゲートは全て、別個の分子量を有するため、生じるアフィニティリガンド比は、コンジュゲートの分子量からスカフォールドの分子量を引き算して糖基による残存質量を得ることにより、容易に計算されうる。コンジュゲートＨＳ−１−６０−１の場合、マンノース：インスリンのモル比はちょうど２．０と計算される。
【０４６３】
実施例３６−コンジュゲートの機能的安定性
該コンジュゲートが化学的および物理的に安定であることを示した後、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用して、７２時間ＡＳＴコンジュゲートを、５Ｕ／ｋｇで、インビボでのその皮下生物活性に関して、新鮮コンジュゲートと比較して評価した（図４を参照されたい）。
【０４６４】
該７２時間ＨＥＰＥＳ  ＡＳＴコンジュゲートデータの分析は、グルコースの最小に達するまで時間（Ｔｎａｄｉｒ）が６０分であり、空腹時血液グルコース値の７０％に戻るまでの時間（Ｔ７０％ＢＧ）が１２８±１５分未満であることを示した。スチューデントｔ検定（各群に関してｎ＝４）を用いる、各時点における新鮮コンジュゲートと７２時間ＡＳＴコンジュゲートとの生物活性曲線の比較は、有意差を示さなかった（全てのｐ値＞０．２１）。これらの結果は、該製剤に関する特定された目標の範囲内であった。このことはコンジュゲート化学的安定性の維持がインビボ機能的特性の維持につながることを示している。
【０４６５】
ＩＩＩ．典型的コンジュゲーとのインビボアッセイ
この一連の第３の実施例は、いくつかの典型的なコンジュゲートのインビボ特性を調べる種々の実験を記載する。
【０４６６】
実施例３７−ＲＨＩおよびデキストランまたはグリコーゲンコンジュゲートと比較した場合のコンジュゲートの生物活性
ａ．インスリン−デキストラン生物活性
この比較例は皮下投与インスリン−デキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＷ〜７０Ｋ）のインビボ薬動力学プロファイルを評価する。後記に示すとおり、米国特許公開第２００４０２０２７１９号に従い合成されたインスリン−デキストランコンジュゲートは、皮下注射後比較的遅く作用する。なぜなら、該コンジュゲート重合体の高ＭＷは全身循環内への吸収速度を有意に妨げるからである。修飾された臭化シアン（ＣＮＢｒ）カップリング反応を用いてインスリン−デキストランを合成した。簡潔に説明すると、５００ｍｇのデキストラン（ＭＷ＝７０Ｋ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５０ｍｌの脱イオン水に溶解した。得られた溶液に５６ｍｇの固体ＣＮＢｒを加え、５Ｎ  ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを１０．７±０．２に維持した。１５分間攪拌した後、別の５６ｍｇの固体ＣＮＢｒを加え、４５分間攪拌しながらｐＨを１０．７±０．２に維持した。ついで３００ｍｇの組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）を該溶液に加え、固体炭酸水素ナトリウムを使用してｐＨを９．１５に調節した。該溶液を一晩攪拌し、１０Ｋ  ＭＷＣＯポリエーテルスルホン円形膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用してＤＩ水に対して徹底的に限外濾過し、凍結乾燥した。ついで、得られた粉末を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５充填カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上で１Ｍ  酢酸移動相を使用する高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）により未コンジュゲート化インスリンから精製した。ついで該インスリン−デキストラン画分を凍結乾燥して該コンジュゲートを純粋な粉末として得た。インスリンコンジュゲート化の度合は、アミノ酸分析（ＵＣＬＡ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）による測定では１０％（ｗ／ｗ）であった。
【０４６７】
０．２５ｍｌの無菌１×ＰＢＳ溶液を使用して該インスリン−デキストランの皮下注射剤（１ｍｌ当たり２０Ｕ相当のインスリン）を、絶食した正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，２００〜２５０ｇ，ｎ＝４）の頚部の背部に投与した。注射後−１５および０分ならびに１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００および３６０分における尾静脈放血により血液サンプルを集めた。商業的に入手可能な試験ストリップ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用して血液グルコース値を測定した。図５に示すとおり、グルコース最小（Ｔｎａｄｉｒ）濃度に達するまでの時間は注射後約３時間であることが分かり、血清グルコースレベルは注射後少なくとも５時間にわたって低下したままである。
【０４６８】
ｂ．インスリン−グリコーゲン生物活性
この実施例は、皮下投与インスリン−グリコーゲンのインビボ薬動力学プロファイルを評価する。該インスリン−グリコーゲンコンジュゲートは、実施例３２に従い合成した。２．５Ｕ／ｋｇ相当のインスリン用量を、絶食した正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，２００〜２５０ｇ，ｎ＝４）の頚部の背部に注射することにより、該インスリン−グリコーゲンコンジュゲートの生物活性を評価した。注射後−１５および０分ならびに１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００および３６０分における尾静脈放血により血液サンプルを集めた。商業的に入手可能な試験ストリップ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用して血液グルコース値を測定した。前記のインスリン−デキストランコンジュゲートと比較して、該高ＭＷインスリン−グリコーゲンコンジュゲートは、遥かに迅速に且つより大きな度合でグルコースレベルを低下させる（図６を参照されたい）。この迅速な作用および消失プロファイルは皮下注射後の高ＭＷグリコーゲン重合体鎖の迅速な酵素消化によるものである。
【０４６９】
ｃ．コンジュゲートおよびＲＨＩ生物活性の比較
この実施例は、皮下投与された典型的コンジュゲートおよび組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）のインビボ薬動力学プロファイルを評価し比較する。該典型的コンジュゲートは、スカフォールドとしてのＴＳＡＴ−Ｃ６、指標類似体としてのＡＥＭおよび薬物としてのＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１、Ｂ２９）−インスリンを使用して合成した。各場合において、該コンジュゲートまたはＲＨＩを３．５Ｕ／ｋｇで、絶食した正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，４００〜５００ｇ，ｎ＝６）の頚部の背部に注射した。注射後０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分における尾静脈放血により血液サンプルを集めた。商業的に入手可能な試験ストリップ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用して血液グルコース値を測定した。図７に示されているとおり、ＲＨＩおよび該典型的コンジュゲートに関するグルコース低下プロファイルは、該典型的コンジュゲートがインビボで酵素的に消化され得ないにもかかわらず、ほぼ同一である。該コンジュゲートの迅速な作用および消失プロファイルは、十中八九、該コンジュゲートがＲＨＩより僅か１４％大きいに過ぎないため、ＭＷの増加の効果があったとしてもそれは薬動力学的特性の点でほぼ無視可能なものとなることによるものであろう。
【０４７０】
実施例３８−ＲＨＩとのＰＫ比較
この実施例は、皮下投与された典型的コンジュゲートおよび組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）に関して得られた血清インスリンプロファイルを記載し比較する。該典型的コンジュゲートは、フレームワークとしてのＴＳＡＴ−Ｃ６、アフィニティリガンドとしてのＡＥＭおよび薬物としてのＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１、Ｂ２９）−インスリンを使用して合成した。各場合において、該コンジュゲートまたはＲＨＩを３．５Ｕ／ｋｇで、絶食した正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，４００〜５００ｇ，ｎ＝６）の頚部の背部に注射した。注射後０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分における尾静脈放血により血液サンプルを集めた。ついで、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ，Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、血清インスリン濃度を測定した。図８から理解されうるとおり、該コンジュゲートに関する薬動力学的プロファイルはＲＨＩのものから統計的に区別不能であり、このことは、このコンジュゲートが皮下注射後に血清中に迅速に吸収され血清から消失することを示している。
【０４７１】
実施例３９−ＡＥＭ−２−ＴＳＡＴ−Ｃ６−インスリンコンジュゲートのＢ２９置換形態のＰＫおよび生物活性
この実施例は、皮下投与された典型的コンジュゲートに関して得られた血清インスリンおよび血液グルコース低下プロファイルを記載する。該典型的コンジュゲートは、（実施例３７および３８におけるようなＢ１置換コンジュゲートではなくＢ２９置換コンジュゲートを製造するために）フレームワークとしてのＴＳＡＴ−Ｃ６、アフィニティリガンドとしてのＡＥＭおよび薬物としての組換えヒトインスリンを使用して合成した。この場合、該コンジュゲートを５Ｕ／ｋｇで、絶食した正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，４００〜５００ｇ，ｎ＝６）の頚部の背部に注射した。注射後０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分における尾静脈放血により血液サンプルを集めた。商業的に入手可能な試験ストリップ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用して血液グルコース値を測定した。また、各時点からの血液を４℃で遠心分離して血清を集めた。ついで、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ，Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、血清インスリン濃度を測定した。図９から理解されうるとおり、該Ｂ２９置換コンジュゲートに関する薬動力学的プロファイルはＲＨＩおよびＢ１置換コンジュゲート（実施例３８からのもの）のものから統計的に区別不能であり、このことは、このコンジュゲートが皮下注射後に血清中に迅速に吸収され血清から消失することを示している。
【０４７２】
実施例４０−リスプロ（Ｌｉｓｐｒｏ）とのＰＫおよび生物活性の比較
この実施例は、皮下投与された典型的コンジュゲートおよびインスリンリスプロ（ｌｉｓｐｒｏ）に関して得られた血清インスリンおよび血液グルコースプロファイルを比較する。インスリンリプスロ（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））は、速効型インスリン類似体であり、これにおいては、ＢペプチドのＣ末端上の最後から２番目のリシンおよびプロリン残基が逆転している。比較のために、可溶性組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）からのデータも示されている（実施例３８および図８を参照されたい）。
【０４７３】
該典型的コンジュゲートは、フレームワークとしてのＴＳＡＴ−Ｃ６、アフィニティリガンドとしてのＡＥＭおよび薬物としてのＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１、Ｂ２９）−インスリンを使用して合成した。各場合において、該コンジュゲートまたはインスリンリスプロを３．５Ｕ／ｋｇで、絶食した正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，４００〜５００ｇ，ｎ＝６）の頚部の背部に注射した。注射後０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分における尾静脈放血により血液サンプルを集めた。商業的に入手可能な試験ストリップ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用して血液グルコース値を測定した。また、各時点からの血液を４℃で遠心分離して血清を集めた。ついで、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ，Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、血清インスリン濃度を測定した。図１２から理解されうるとおり、該コンジュゲートに関する薬動力学的プロファイルはインスリンリスプロのものから統計的に区別不能である。
【０４７４】
実施例４１−生物活性に対するアフィニティリガンドの効果
この実施例は、一連の皮下投与された典型的コンジュゲートに関して得られた血液グルコースプロファイルを比較する。該典型的コンジュゲートは、フレームワークとしてのＴＳＡＴ−Ｃ６および薬物としてのＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１、Ｂ２９）−インスリンを使用して合成した。アフィニティの範囲をカバーするコンジュゲートによってアフィニティリガンド組成を変動させた：ＡＥＭ−２、ＡＥＢＭ−２、ＡＥＴＭ−１、ＡＥＢＭ−１およびＡＥＴＭ−２（最低アフィニティから最高アフィニティへ）。各場合において、該コンジュゲートを５Ｕ／ｋｇ（ＡＥＭ−２では３．５Ｕ／ｋｇ）で、絶食した正常非糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，４００〜５００ｇ，ｎ＝６）の頚部の背部に注射した。注射後０分ならびに３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分における尾静脈放血により血液サンプルを集めた。商業的に入手可能な試験ストリップ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用して血液グルコース値を測定した。また、各時点からの血液を４℃で遠心分離して血清を集めた。ついで、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ，Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、血清インスリン濃度を測定した。
【０４７５】
図１３から理解されうるとおり、グルコース低下応答は、該リガンドのアフィニティが増加するにつれて減少した。このデータは、該アフィニティリガンドの性質が該コンジュゲートの生物活性に影響を及ぼしうるという最初の提示を示すものであった。図１４〜１６は、試験した４つのコンジュゲートのそれぞれに関する血清インスリンレベルと共に血液グルコースレベルを示す。これらの結果は、より高いアフィニティリガンドを有するコンジュゲートに関するグルコース応答の低下が該コンジュゲートのＰＫプロファイルの低下から生じることを非常に明らかに示している（ＡＥＭ−２に関する図１４をＡＥＴＭ−２に関する図１６と比較されたい）。本発明者らは、この低下したＰＫプロファイル（および付随する生物活性）が生理的グルコース濃度の増加により逆転されうることを示した（すなわち、循環中のコンジュゲートのレベルはグルコース濃度の増加と共に上昇する）。ある実施形態においては、このグルコース依存性は、コンジュゲートのインビボ特性を更に調整するために用いられうることが明らかであろう。
【０４７６】
ＩＶ．結合部位修飾レクチン
この一連の第４の実施例は種々の結合部位修飾レクチンの製造および試験を記載する。
【０４７７】
実施例４２−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えＣｏｎＡ（ｒＣｏｎＡ）製造
ｒＣｏｎＡ発現遺伝子構築物の製造
ｒＣｏｎＡ構築物の遺伝子合成はＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において以下のとおりに行われた。ｒＣｏｎＡ産物の発現をコードする関心のある遺伝子を以下の表に一覧する。該遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔにおいて合成し、ついでＮｃｏＩ（５’部位）およびＢａｍＨＩ（３’部位）酵素で切断し、ついでｐＥＴ２４ｄベクター（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内の同じ部位内に挿入した。ついで、得られたプラスミドを培養フラスコにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において増幅し、ついで抽出し、精製して、ＴＥバッファー中のプラスミドＤＮＡの〜１ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。典型的なｒＣｏｎＡ構築物の核酸配列を以下の表に示す。
【０４７８】
【表１４】
2013541500.tif 000072
2013541500.tif 000073
大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)形質転換のためのＤＮＡ調製
形質転換をＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において行い、得られた形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を穿刺培養として運搬した。該ＤＮＡが大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)株内に形質転換された後、得られた遺伝子構築物は、以下の表に示すアミノ酸配列をコードしていた。
【０４７９】
【表１５】
2013541500.tif 000074
実施例４３−可溶性ｒＣｏｎＡの製造および精製
実施例４２に記載されている穿刺培養を２×１００ｍｍプレート（ＹＴカナマイシンプレート；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にストリーキングし、逆さまにして３７℃のインキュベーター内で一晩インキュベートした。個々のコロニーを、５０μｇ／ｍＬ  カナマイシン（硫酸カナマイシン；Ｆｉｓｈｅｒ  ＃ＢＰ９０６−５）を含有する５ｍＬのＬＢ培地内で成長させ、１２５ｒｐｍ、３７℃で一晩インキュベートした。陰性対照も含めた。次に該５ｍＬ  ストックの５μｌを、５ｇ／ｍＬ  カナマイシン（硫酸カナマイシン；Ｆｉｓｈｅｒ  ＃ＢＰ９０６−５）を含有する５０ｍＬ  ＬＢ培地に加え、３７℃で一晩インキュベートした。１５０μＬの５０％  グリセロールに３５０μｌの増殖培地を加えることにより、サンプルのグリセロールストックを調製した。グリセロールストックサンプルをドライアイス／エタノール中で瞬間凍結し、−８０℃の冷凍庫内で保存した。６ｍＬの該５０ｍＬ培養を、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ（硫酸カナマイシン；Ｆｉｓｈｅｒ  ＃ＢＰ９０６−５）を含有する１ＬのＬＢ培地内に接種することにより、更なる大規模化を行い、それを３７℃または３０℃で０．４００のＯＤ６００ｎｍまで増殖させた。０．２００のＯＤに達したら、サンプルを頻繁（２０分ごと）に検査した。ＯＤ  ０．４００に達したら、サンプルを３０℃に冷却し、５００μｇ／Ｌの１Ｍ  ＩＰＴＧ（ＦＣ  ＩＰＴＧ  ０．５ｍＭ；Ｆｉｓｈｅｒ  ＃ＰＲ−Ｖ３９５１）、１００ｒｐｍ、３０℃で一晩インキュベートした。
【０４８０】
培養を２５０ｍＬ  遠心チューブ内にデカントし、７０００ｒｐｍ（５０００×ｇ）で２０分間遠心（Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ−５Ｂ）して細菌をペレット化させた。１つの小さな上清アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析のために取った後、残りの上清を漂白剤中にデカントした。該細菌ペレットを、封入体の単離および可溶性タンパク質を遊離させるための溶菌／洗浄における更なる使用のために、−８０℃で保存した。
【０４８１】
ペレットを−８０℃から取り出し、氷上で解凍した。２００μＬの１０ｍｇ／ｍＬ  リゾチーム（Ｆｉｓｈｅｒ  ＃ＰＩ８９８３３）および１０μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２を含有する１０ｍＬの１×ＴＢＳを各２５０ｍＬペレットに加え、ピペッティングした（必要に応じて音波処理を用いた）。サンプルを穏やかにピペッティングし、章動ミキサー上、室温で１０分間混合した。サンプルを１５，０００×ｇで２０分間遠心させ（Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ−５Ｂ）、デカントにより上清を取り出した。可溶性タンパク質を含有する上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ７５精製のために取っておいた（洗液１（Ｗａｓｈ＃１））。２００μＬの１０ｍｇ／ｍＬ  リゾチーム（Ｆｉｓｈｅｒ  ＃ＰＩ８９８３３）、１０μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２および５μＬ／１０ｍＬのＤＮアーゼＩ（Ｆｉｓｈｅｒ  ＃ＰＩ−８９８３５）を含有する１０ｍＬの１×ＴＢＳを各ペレットに加え、ピペッティングし、音波処理して（約３０秒間、２回）、均一溶液を得、凝塊を除去した。サンプルを章動ミキサー上、室温で１０分間配置し、ついで１５，０００×ｇで２０分間遠心させた（Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ−５Ｂ）。上清をデカントにより取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ７５精製のために取っておいた（洗液２（Ｗａｓｈ＃２））。ペレットを０．５×ＴＢＳで洗浄し（１５ｍｌ洗浄液／ペレット）、音波処理した（約３０秒間、２回）。総体積を０．５×ＴＢＳで３０ｍＬに増加させた。サンプルを１５，０００×ｇで２０分間遠心させた（Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ−５Ｂ）。上清をデカントにより取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ７５精製のために取っておいた（洗液３（Ｗａｓｈ＃３））。
【０４８２】
実施例４４−ｒＣｏｎＡサンプルのアフィニティカラム精製
実施例４２および４３に従い合成したｒＣｏｎＡサンプルをアフィニティカラムクロマトグラフィーにより精製して、完全反応物質を未反応および／または部分的反応物質から分離した。セファデックス（Ｓｐｈａｄｅｘ）Ｇ７５（１２ｇ）を結合バッファー（ＢＢ；１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；７．４のｐＨへ；１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１ｍＭ  ＭｎＣｌ２（２Ｌ中））で調製し、ＢｉｏＲａｄ  Ｅｃｏｎｏカラム（ｃａｔ＃７３７−５０３１）上にローディングした。該セファデックスＧ７５カラムを１２５ｍＬのＢＢで２回洗浄した。蠕動ポンプを使用して、可溶性タンパク質洗液１〜３をセファデックスＧ７５カラム上にゆっくりローディングした。蠕動ポンプを使用して該カラムを１００ｍＬのＢＢで２回した。ｒＣｏｎＡをＢＢ中の３５ｍＬの２０ｍＭ  アルファメチルマンノースで６回溶出した。典型的には、それらの６個の画分を異なるチューブ内に集めた。ｒＣｏｎＡは一般には画分３〜５において溶出された。各画分の２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）を測定した。バックグラウンド（．０４４）を超えるＡ２８０を有する画分のそれぞれを合わせ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｕｌｔｒａ１５  １０Ｋ（Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心機において４５００×ｇ×８分）を使用して濃縮した。サンプルを、注意深くピペッティングすることにより再懸濁させ、必要に応じて更なるプール化画分を加え、遠心分離した。サンプルを約１ｍｇ／ｍＬ（Ａ２８０＝．３）まで濃縮し、将来の研究に必要になるまで４℃で保存した。
【０４８３】
実施例４５−ｒＣｏｎＡサンプルでのゲル形成
実施例４２〜４４に従い合成し精製したｒＣｏｎＡを、グリコーゲンの存在下でゲルを形成するそれらの能力に関して試験した。該サンプル中に存在するアルファメチルマンノースを、まず、以下のとおりに除去した。脱イオン水で予め平衡化されたＢｉｏＳｐｉｎ３０カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）にサンプルを加えた。該ＢｉｏＳｐｉｎカラムを４℃、１０００×ｇで遠心分離し、得られた溶出液は、実質的に脱塩されたｒＣｏｎＡサンプルを含有し、アルファメチルマンノースは除去されていた。サンプルを合わせ、Ａ２８０測定値を得た。典型的には、該Ａ２８０測定値は、アルファメチルマンノースの除去の前に得られたＡ２８０測定値と相関していた。
【０４８４】
ついで以下のアッセイを用いて、グリコーゲンの存在下のゲル形成を測定した。未修飾カキグリコーゲンＩＩ型（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１０ｍｇ／ｍｌでｐＨ７の２００ｍＭ  ＢＥＳバッファー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に溶解した。ついで５０μＬの該グリコーゲン溶液を９６ウェルマイクロタイタープレート（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ，ＮＪ）のウェル内にピペッティングした。ｒＣｏｎＡサンプルを凍結乾燥粉末から１０ｍｇ／ｍｌで、１ｍＭ  塩化マンガンおよび１ｍＭ  塩化カルシウムを含有するｐＨ７の１００ｍＭ  ＢＥＳバッファーに溶解した。ついで５０μＬの該ｒＣｏｎＡ溶液を該マイクロタイタープレート内の５０μＬ  グリコーゲン溶液に加え、それらの２つの液体の適度な混合が保証されるように該プレートを穏やかに振とうした。該プレートを室温で１０分間展開させ、ついで、４９０ｎｍの波長（ＯＤ４９０）で、商業的に入手可能なマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して、各プレートウェルの濁度をアッセイした。該ＯＤ４９０値を用いて、与えられたｒＣｏｎＡに関するグリコーゲン沈殿の量を決定した。また、該１０ｍｇ／ｍｌ  グリコーゲン溶液の代わりに初期１ｍｇ／ｍｌ  グリコーゲン溶液を使用して、このアッセイを繰返した。ＳＣＩ−１、ＳＣＩ−３およびＳＣＩ−４サンプルはグリコーゲンの存在下でゲルを形成した。これは、天然（植物由来）ＣｏｎＡ対照により形成されるゲルに匹敵するものであった。
【０４８５】
実施例４６−ｒＣｏｎＡサンプルの化学的特徴づけ
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を使用する変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を該ｒＣｏｎＡサンプルに関して行って、それらが可溶性ｒＣｏｎＡを含有するかどうかを判定した。簡潔に説明すると、１０〜１４％  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ予製ゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）および１×Ｔｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して該ＰＡＧＥ実験を行った。広範囲の分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）および天然コンカナバリンＡレクチン（ＣｏｎＡ，ＶＩ型，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の２ｍｇ／ｍｌ  サンプルも対照として泳動させた。２５μＬの各修飾レクチンまたは対照サンプルを、５μＬのβ−メルカプトエタノール（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する１×Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）５０μＬに溶解し、該サンプルを沸騰水浴中で約５分間加熱した。該サンプルが室温に冷却した後、１０μＬの各サンプルを該予製ＰＡＧＥゲルのウェル内にローディングした。ついで該サンプルを２００ボルトで６０分間泳動させた。該電気泳動後、該ゲルを脱イオン水：メタノール：氷酢酸（体積比６０：３０：１０）の溶液中で３０分間固定し、ついで脱イオン水中で２回洗浄した。最後に該ゲルを１×Ｂｉｏ−Ｓａｆｅクーマシーブルー染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で６０分間染色した。該最終ゲルをライトテーブルおよびデジタルカメラでイメージングして該染色ゲルを記録した。該染色タンパク質バンドを、分子量および天然ＣｏｎＡ対照サンプルと比較することにより、それらの分子量に関してアッセイした（図１７および１８を参照されたい）。
【０４８６】
実施例４７−アフィニティリガンドおよび修飾レクチンに結合した反応性リンカーの合成
まず、１組の反応性リンカーを得るために、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）を、以下の表に示されている前駆体と反応させた（ＡＥＭのアミノ基は各前駆体のＮＨＳ基と反応して、共有結合を形成する）。これらの前駆体のそれぞれは（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯまたはＰｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから）商業的に入手可能である。
【０４８７】
【表１６】
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ＬＣ−ＳＭＰＨを前駆体として使用する該方法を以下に記載する。なぜなら、後続実施例に記載されている修飾ｒＣｏｎＡサンプルの製造において、この前駆体を使用したからである。しかし、前記のその他の前駆体でも同じ方法を用いたと理解されるべきである。また、アミン含有認識要素（例えば、ＡＥＭのようなアミノ末端糖）と反応して反応性リンカーを形成しうる−ＮＨＳ基のような基を含有するいずれの前駆体もこの方法または類似方法に従い使用されうる、と理解されるであろう。
【０４８８】
前記のとおり、まず、アミノエチルマンノース（ＡＥＭ）をＬＣ−ＳＭＰＨ前駆体と反応させて、糖−マレイミド分子（アフィニティリガンド）を形成させた。ＡＥＭ（４５．２８ｍｇ）をシンチレーションバイアルに加えた。無水ＤＭＳＯ（２ｍＬ）および小さな撹拌棒を加え、該ＡＥＭの全てが溶解するまで撹拌した。ＴＥＡ（０．８ｍＬ）を加え、１分間撹拌した。ＬＣ−ＳＭＰＨ（１００ｍｇ）を２ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、該反応混合物にゆっくり加え、室温で１時間撹拌した。
【０４８９】
薄液（Ｔｈｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ）クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行って、該反応の完全性を測定した。毛細管を使用して、５滴のＡＥＭ溶液、５滴の該反応混合物および５滴の該ＬＣ−ＳＭＰＨをＴＬＣ紙の細片の出発線上の別々のスポット上に加えた。ＵＶ光源を使用して、それらのスポットのどれがＵＶ活性であるかが見出された。該ＴＬＣ細片を、７５／２５  エタノール／酢酸エチルを含有する小室内に配置し、妨げられない状態で１０分間展開させ、ついで乾燥させた。該細片を、ＵＶ光源を使用してＵＶ活性スポットに関して調べ、ついでＨ２ＳＯ４中に２秒間浸漬し、該スポットが褐色化するまで乾燥させた。一般に、該反応混合物スポットが該ＬＣ−ＳＭＰＨスポットと同様にＵＶ活性であるが、（最小ストリーキングで）該ＡＥＭスポットのように褐色である場合には、該反応は完了している。
【０４９０】
ついで、１：１０  ＨＣｌを使用してｐＨを６〜９に維持しながら、該反応溶液を４０ｍＬの１×Ｓ２４バッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に滴下した。
【０４９１】
次に、実施例４２〜４４に従い合成され精製されたｒＣｏｎＡのジスルフィド結合をＤＴＴで還元した。簡潔に説明すると、アルファ−メチルマンノースを含有する２００ｍｇのｒＣｏｎＡ（５ｍｇ／ｍＬで４０ｍＬ）を１１．８７ｍｇのＤＴＴと混合した。該混合物を室温で１時間インキュベートし、ついで、１×Ｓ２４で平衡化されたＰ６  Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｋｓを使用してＤＴＴを除去した。
【０４９２】
還元されたｒＣｏｎＡを、前記の糖−マレイミド分子と反応させた。ｒＣｏｎＡとのコンジュゲート化反応が完了まで進行する可能性を増大させるために、該糖−マレイミド溶液を該ｒＣｏｎＡの２０倍のモル濃度で使用した。簡潔に説明すると、還元されたｒＣｏｎＡを、ゆっくり撹拌しながら該糖−マレイミド分子溶液に滴下し、室温で２時間インキュベートした。該反応後、１×Ｓ２４バッファーで平衡化されたＰ６  Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｋｓを使用して、過剰の糖−マレイミド分子を除去した。アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）遠心管を使用して、更なる試験のために該溶液を１８ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
【０４９３】
実施例４８−チオールアッセイ
該ｒＣｏｎＡと該糖マレイミド分子との反応の完全性を試験するために、チオールアッセイを用いた。Ｍｅａｓｕｒｅ−ｉＴ（商標）チオール定量試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該製造業者の説明に従い使用して、チオール測定を行った。簡潔に説明すると、Ｍｅａｓｕｒｅ−ｉＴ（商標）チオール定量標準物（以下の表による）のストックおよび実施溶液ならびに定量試薬を調製した。
【０４９４】
【表１７】
2013541500.tif 000078
チオール定量試薬実施溶液（１００μＬ）をマイクロウェルプレートの各ウェルに加えた。チオール定量標準物または未知チオールサンプルを該ウェルに加え、混合し、マイクロプレートリーダーを使用して蛍光を検出した。未知チオール濃度を決定するために、標準曲線を確定した（図１９）。
【０４９５】
図２０に示されているとおり、ｒＣｏｎＡに対する糖マレイミドの比は、未反応ジスルフィド結合の減少と相関することが判明した。
【０４９６】
実施例４９−ＭＡＣアッセイ
実施例４７に従い調製された修飾ｒＣｏｎＡサンプルを、以下のＭＡＣアッセイにおいて赤血球を凝集させるそれらの能力に関して試験した。Ｃｒｏｗｌｅｙら，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８３：３６８−３７３，１９８２の方法に従い、ホルムアルデヒド安定化ウサギ赤血球の２％  ｖ／ｖ懸濁液を使用して、各修飾ｒＣｏｎＡの最小凝集濃度（ＭＡＣ）をＶ型ウェルマイクロタイタープレートにおいて決定した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｕｎｉｔ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅから入手したウサギ血液から公開方法（Ｎｏｗａｋら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３９３：１１５−１２３，１９７５）により調製したホルムアルデヒド処理ウサギ赤血球は従来の研究から入手可能であった。ＭＡＣは、視認可能な凝集を示す最高希釈度におけるｒＣｏｎＡ濃度と定義した。
【０４９７】
簡潔に説明すると、レクチン濃度が約０．１〜１０００μｇ／ｍｌにわたる希釈液を使用して、各修飾ｒＣｏｎＡの水溶液３０μＬを９６ウェルプレートのウェルに加えた。ついで該ホルムアルデヒド処理ウサギ赤血球の３０μＬアリコートを各ウェル内にピペッティングした。低いレクチン濃度においては、架橋細胞のネットワークを形成するには不十分なレクチンしか存在せず、該細胞は該Ｖ型ウェルの底に沈降して、上から見えると暗色極小環のように見えるものを該プレートの底に形成した。しかし、レクチン濃度が最小凝集濃度（ＭＡＣ）に達したら、レクチン分子は赤血球表面上の糖受容体を架橋し始めて、Ｖ型ウェルの底に沈降し得ないネットワークを形成し、上方から見ると大きな不透明な拡散性の環のように見えるものを形成した。そのような大きな拡散性環を形成する最低濃度が個々のレクチンに関するＭＡＣ値である。
【０４９８】
以下の表に、試験した種々のｒＣｏｎＡサンプルに関するＭＡＣ値を要約する（図２１および２２も参照されたい）。
【０４９９】
【表１８】
2013541500.tif 000079
実施例５０−分裂促進性アッセイ
この実施例は、種々の修飾レクチン組成物のＴ細胞分裂促進性を特徴づけて比較するために用いられうるアッセイを記載する。この典型的なアッセイの修飾および別法は当業者に明らかであろう。このアッセイには高精製Ｔ細胞ではなく末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用する。なぜなら、レクチンによるＴ細胞活性化は、一般に、補助細胞と総称される非Ｔ細胞集団（例えば、単球、樹状細胞）の存在を要するからである。典型的なアッセイにおいては、ＰＢＭＣを３名の健常ヒトドナーの全血から単離し、９６ウェルプレート内で約１００，０００細胞／ウェルで別々にプレーティングする。ついで、１０００（または１００）μｇ／ｍｌの濃度から開始する種々のレクチン組成物（例えば、天然および処理物）の三重系列希釈物を該ウェルに加える。該プレートを３７℃で３日間インキュベートし、その時点で０．８μＣｉの３Ｈ−チミジンを更に１８時間にわたって各ウェルに加える。ついで分裂促進性の度合を、増殖性ＰＢＭＣによる３Ｈ−チミジン取り込みにより測定する。いくつかの場合には、新規レクチン組成物（例えば、修飾ｒＣｏｎＡ組成物）の分裂促進性を％最大天然分裂促進性として表す。％最大天然分裂促進性は、測定した全濃度にわたる修飾レクチン組成物に関する最大ＣＰＭ（計数／分）値を、測定した全組成物にわたる天然レクチン組成物の最大ＣＰＭ値で割り算することにより得られる。
【０５００】
これまでの研究において、ＭＡＣ値と％  ＣｏｎＡ最大分裂促進性との間の強い相関性（すなわち、ＭＡＣ値の有意な増加は分裂促進効果の有意な減少を招く）を本発明者らは見出している。したがって、本開示においては、ＭＡＣ値は、ある与えられた化学修飾に関する分裂促進性の潜在的減少を決定するための代用物として用いられる。
【０５０１】
Ｖ．制御可能な様態でコンジュゲートを放出するための架橋マテリアル
この一連の第５の実施例は、制御可能な様態でコンジュゲートを放出するための典型的な架橋マテリアルの製造を記載する。該実施例はまた、それらのインビトロおよびインビボ特性の幾つかを記載する。
【０５０２】
実施例５１−修飾ＣｏｎＡから製造された架橋マテリアル
Ｓ１４バッファー中の１８ｍｇ／ｍｌ  修飾ｒＣｏｎＡ溶液０．５０ｍｌを遠心管に加え、ついで１．１８ｍｇ／ｍｌ  酢酸亜鉛二水和物脱イオン水溶液０．１１１ｍｌと混合する。ついでＳ１４バッファー中のＣ６−アミン−ＡＥＢＭ−２−インスリンの２．３ｍｇ／ｍｌ  溶液０．５０ｍｌを加え、ついで迅速に混合して不溶性粒子の分散液を得る。該分散液を室温で２０分間静置し、ついで遠心分離により上清から分離する。得られたケークを、０．１５０Ｍ  塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．４の２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（Ｓ２４バッファー）１．０ｍｌで２回洗浄する。この過程中、該初期上清および２回の洗浄溶液を１つの大きな遠心管内に集める。その合わせた上清および洗浄溶液に、０．３３３ｍｌの１．１８ｍｇ／ｍｌ  酢酸亜鉛二水和物脱イオン水溶液を加える。該溶液を２０分間放置し、ついで、沈殿粒子が更に生じた場合にはそれを遠心分離により単離し、最初の２つの洗浄工程からの残存する粒子と合わせる。この合わせた不溶性画分を０．３３３ｍｌのＳ２４バッファーで更に３回洗浄する。残存不溶性物質を０．３３３ｍｌのＳ２４バッファーに分散させ、３７℃で穏やかな撹拌下で一晩インキュベートする。翌日、残存粒子を遠心分離により再び単離し、０．３３３ｍｌのＳ２４中でもう１回洗浄する。生じた不溶性物質を、Ｓ２４を使用して０．３０ｍｌの合計容量中に分散させ、更なる研究のために取っておく。この方法は、任意の量の所望の生成物を得るために直接的に大規模化されうる。前記合成において、異なる刺激応答特性を有する製剤を得るために、Ｃ６−アミン−ＡＥＢＭ−２−インスリンはＣ６−アミン−ＡＥＴＭ−２−インスリン（またはいずれかの他のコンジュゲート）で置換されうる。
【０５０３】
実施例５２−非糖尿病ラットにおけるＩＰＧＴＴ実験
与えられた架橋マテリアル０．３００ｍｌを、体重４００〜５００ｇの３匹の正常雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｌｏｃａｔｉｏｎ）のそれぞれに皮下注射する。製剤の注射の前に、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を使用して、尾静脈放血により血液グルコース値を測定し、約１００μｌの血清を尾静脈放血により得てバックグラウンドインスリンレベルに関してアッセイする。該研究期間中はラットの檻から餌を除去する。注射後３０分、６０分、９０分および１２０分の時点で血清および血液グルコース値を得る。該注射後１２０分の時点で、３８％  ｗ／ｖ  グルコース溶液の腹腔内注射を行って４ｇ／ｋｇ用量を投与し、ついで血清および血液グルコース値を１３５分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分および３００分の時点で得る。ついで、純粋なインスリンコンジュゲート溶液から作成された標準曲線を用いて、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ，Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して血清インスリン濃度を測定する。
【０５０４】
実施例５３−インスリン−グリコーゲン架橋マテリアルのグルコース応答性溶解に対する種々の動物血清の効果およびアミラーゼ活性に対する相関性
この実施例は、インスリン−グリコーゲンに基づくコンジュゲートを使用して合成されたグルコース応答性製剤に関するグルコース濃度の関数としての種々の動物血清におけるインビトロ溶解を記載する。該インスリン−グリコーゲンコンジュゲートは以下の方法により合成した。まず、ｐＨ８．２の２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＡ）中の１０ｍｇ／ｍｌ  組換えヒトインスリン溶液（ＲＨＩ）６２．５ｍｌをｐＨ９．０に調節し、氷上で冷却してＲＨＩストック溶液を得る。それとは別に、０．３１２ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＡ）を３ｍｌのＤＩ水に溶解してＴＥＡストック溶液を得る。それとは別に、０．３００ｇのシアノジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボラート（ＣＤＡＰ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１．２ｍｌのＤＭＳＯに溶解してＣＤＡＰストック溶液を得る。それとは別に、１００ｍｇのマンノサミン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１．５ｍｌの１００ｍＭ  ｐＨ９  ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水に溶解し、ｐＨを９．０に調節してマンノサミンストック溶液を得る。それとは別に、２．０ｇのカキＩＸ型グリコーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を４０ｍｌの１００ｍＭ  ｐＨ９  ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水に溶解し、ついで該溶液を濾過により清澄化し、氷浴上で冷却する。つぎに１ｍｌのＣＤＡＰストック溶液を該グリコーゲン溶液に加え、１分間混合し、ついで１ｍｌの該ＴＥＡ溶液を加え、得られた溶液のｐＨを９．０に調節する。さらに１分間攪拌した後、６２ｍｌの該ＲＨＩ溶液を加え、得られた溶液を５分間攪拌し、ついで１．０６５ｍｌの該マンノサミン溶液を加える。該溶液を室温で一晩攪拌し、５０ｋＤａ  ＭＷＣＯポリエーテルスルホン円形膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して脱イオン水に対して徹底的に限外濾過し、凍結乾燥する。ついで、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）３０  ＨｉＬｏａｄ  １６／６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）充填カラム上で１Ｍ  酢酸移動相を使用するゲル濾過ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）により、得られた粉末を未コンジュゲート化インスリンから３回精製する。ついで該インスリングリコーゲン画分を凍結乾燥して、該コンジュゲートを純粋な白色粉末として得る。
【０５０５】
以下のとおり、多価架橋剤として未修飾または修飾ｒＣｏｎＡを使用して、グルコース応答性製剤を製造する。ｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中の２５ｍｇ／ｍｌ  インスリン−グリコーゲンコンジュゲート溶液２００μｌをｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中の２５ｍｇ／ｍｌ  未修飾または修飾ｒＣｏｎＡ溶液２００μｌと混合し、２０分間放置する。つぎに各製剤を遠心分離し、４００μｌのｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で室温で５回洗浄する。最終洗浄および遠心分離の後、上清を捨て、残存不溶性マテリアルを５０μｌの１×ＰＢＳに分散させる。以下の形態で特定の量のグルコースを含有する個々の動物種からの５０μｌの血清と共に２４×５０μｌの分散液を９６ウェルプレートに加える。
【０５０６】
【表１９】
2013541500.tif 000080
該実験の開始時に各ウェルは白色不透明に見えることがある（光透過の低下または４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）の上昇により測定される）。ついで該９６ウェルプレートを３７℃で６時間インキュベートし、ついで各ウェルのＡ４５０値を再び測定する。残存製剤の％を、Ａ４５０（最終）をＡ４５０（初期）で割り算し１００を掛け算することにより計算する。全てのマテリアルが溶解していたなら、Ａ４５０値はゼロに近く、これはほぼ０％の残存を示すものである。あるいは、マテリアルが全く溶解していなかったなら、Ａ４５０は初期値に近く、これはほぼ１００％の残存を示すものである。
【０５０７】
実施例５４−修飾ｒＣｏｎＡおよびＡＥＭ−２コンジュゲートを使用するグルコース応答性マテリアル
この実施例は、フレームワークとしてのＴＳＡＴ−Ｃ６、アフィニティリガンドとしてのＡＥＭおよび薬物としてのＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを使用して合成されたコンジュゲートを使用するグルコース応答性不溶性マテリアルの形成を記載する。ｐＨ８．２のＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中の５０μｌの２ｍｇ／ｍｌ  コンジュゲート溶液を９６ウェルマイクロプレートの各ウェルにおいてｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中の５０μｌの２５ｍｇ／ｍｌ  修飾ｒＣｏｎＡ溶液と混合する。各ウェルは、０、５０、１００、２００、４００、８００および１６００ｍｇ／ｄｌに等しい最終濃度を与えるように次第に増加する濃度の５．５μｌの濃縮グルコース溶液を含有する。該最終ウェルは、最終濃度が１００ｍＭとなるように５．５μｌの高効力アルファ−メチルマンノース糖インヒビターを含有する。ついで、次第に増加するグルコース濃度の存在下で該ｒＣｏｎＡ／コンジュゲート混合物が沈殿する能力を評価する。該組合せが不溶性ネットワークを形成する場合には、該ウェルは白色かつ不透明に見える（光透過の低下または４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）の上昇により測定される）。グルコース濃度が十分に高い場合には、ウェル全体の内容物は可溶性かつ透明になる（光透過の上昇または４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）の低下により測定される）。
【０５０８】
実施例５５−種々の動物血清における性能の試験
この実施例は、実施例５４のグルコース応答性製剤に関するグルコース濃度の関数としての種々の動物血清におけるインビトロ溶解を記載する。以下の形態で特定の量のグルコースを含有する個々の動物種からの５０μｌの血清と共に２４×５０μｌの分散液を９６ウェルプレートに加える。
【０５０９】
【表２０】
2013541500.tif 000081
該実験の開始時に各ウェルは白色不透明に見えることがある（光透過の低下または４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）の上昇により測定される）。ついで該９６ウェルプレートを３７℃で６時間インキュベートし、ついで各ウェルのＡ４５０値を再び測定する。残存製剤の％を、Ａ４５０（最終）をＡ４５０（初期）で割り算し１００を掛け算することにより計算する。全てのマテリアルが溶解していたなら、Ａ４５０値はゼロに近く、これはほぼ０％の残存を示すものである。あるいは、マテリアルが全く溶解していなかったなら、Ａ４５０は初期値に近く、これはほぼ１００％の残存を示すものである。
【０５１０】
実施例５６−ｒＣｏｎＡおよびＡＥＭ−２コンジュゲートを使用するグルコース応答性マテリアル
この実施例は、フレームワークとしてのＴＳＡＴ−Ｃ６、アフィニティリガンドとしてのＡＥＭおよび薬物としてのＮＨ２−Ｂ１−ＢＯＣ２（Ａ１，Ｂ２９）−インスリンを使用して合成されたコンジュゲートを使用する、グルコース応答性不溶性マテリアルの形成させるための代替法を記載する。０．１５０Ｍ  塩化ナトリウムを含有するｐＨ８．２の２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（Ｓ１４バッファー）中の０．５０ｍｌの２．３ｍｇ／ｍｌ  コンジュゲート溶液を遠心管に加え、ついで、０．１５０Ｍ  塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．４の２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（Ｓ２４バッファー）中の０．５００ｍｌの２５ｍｇ／ｍｌ  ｒＣｏｎＡ溶液と迅速に混合して不溶性粒子の分散液を得る。該分散液を室温で２０分間静置し、ついで遠心分離により上清から分離する。得られたケークを、０．１５０Ｍ  塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．４の２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（Ｓ２４バッファー）１．０ｍｌで５回洗浄する。最終洗浄後、残存不溶性物質を３７℃で一晩インキュベートする。翌日、残存粒子を遠心分離により再び単離し、０．１ｍｌのＳ２４中でもう１回洗浄する。生じた不溶性物質を、Ｓ２４を使用して０．３０ｍｌの合計容量中に分散させ、更なる研究のために取っておく。この方法は、任意の量の所望の生成物を得るために直接的に大規模化されうる。
【０５１１】
実施例５７−非糖尿病ラットにおけるＩＰＧＴＴ実験
実施例５６において製造されたマテリアル０．３００ｍｌを、体重４００〜５００ｇの３匹の正常雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）のそれぞれに皮下注射する。製剤の注射の前に、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を使用して、尾静脈放血により血液グルコース値を測定し、約１００μｌの血清を尾静脈放血により得てバックグラウンドインスリンレベルに関してアッセイする。該研究期間中はラットの檻から餌を除去する。注射後３０分、６０分、９０分および１２０分の時点で血清および血液グルコース値を得る。該注射後１２０分の時点で、３８％  ｗ／ｖ  グルコース溶液の腹腔内注射を行って４ｇ／ｋｇ用量を投与し、ついで血清および血液グルコース値を１３５分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分および３００分の時点で得る。ついで、純粋なインスリンコンジュゲート溶液から作成された標準曲線を用いて、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ，Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して血清インスリン濃度を測定する。内因性ラットインスリンはこのアッセイにおいては交差反応しない。したがって、得られるいずれの結果も専ら外的投与インスリンコンジュゲートによるものであり、該動物からの内因性インスリンに由来するものではないであろう（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡキットの説明，Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎを参照されたい）。
【０５１２】
別の実験において、０．３００ｍｌの食塩水を、体重４００〜５００ｇの３匹の正常雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）のそれぞれに皮下注射する。製剤の注射の前に、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を使用して、尾静脈放血により血液グルコース値を測定し、約１００μｌの血清を尾静脈放血により得てバックグラウンドインスリンレベルに関してアッセイする。該研究期間中はラットの檻から餌を除去する。注射後３０分、６０分、９０分および１２０分の時点で血清および血液グルコース値を得る。該注射後１２０分の時点で、３８％  ｗ／ｖ  グルコース溶液の腹腔内注射を行って４ｇ／ｋｇ用量を投与し、ついで血清および血液グルコース値を１３５分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分および３００分の時点で得る。ついで、ラットインスリンに特異的な商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ，Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して血清インスリン濃度を測定する。この実験からの結果は、正常非糖尿病ラットにおいて膵臓により産生されるグルコース応答性内因性インスリン分泌を確定するであろう。
【０５１３】
別の実験において、５Ｕ／ｋｇの組換えヒトインスリン（ＲＨＩ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、体重４００〜５００ｇの３匹の正常雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）のそれぞれに皮下注射する。製剤の注射の前に、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を使用して、尾静脈放血により血液グルコース値を測定し、約１００μｌの血清を尾静脈放血により得てバックグラウンドインスリンレベルに関してアッセイする。該研究期間中はラットの檻から餌を除去する。注射後３０分、６０分、９０分および１２０分の時点で血清および血液グルコース値を得る。該注射後１２０分の時点で、３８％  ｗ／ｖ  グルコース溶液の腹腔内注射を行って４ｇ／ｋｇ用量を投与し、ついで血清および血液グルコース値を１３５分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分および３００分の時点で得る。ついで、純粋なインスリンコンジュゲート溶液から作成された標準曲線を用いて、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ，Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して血清インスリン濃度を測定する。内因性ラットインスリンはこのアッセイにおいては交差反応しない。したがって、得られるいずれの結果も専ら外的投与インスリンコンジュゲートによるものであり、該動物からの内因性インスリンに由来するものではないであろう（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡキットの説明，Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎを参照されたい）。
【０５１４】
実施例５８−非糖尿病ラットにおける正常／高血糖クランプ実験
この実施例は、グルコース濃度の関数として定常状態血清インスリン濃度を得るためにラットにおけるグルコースレベルを一定に維持するためのグルコースクランプの使用を記載する。実施例５６において製造されたマテリアル０．３００ｍｌ（〜０．６ｍｌ／ｋｇ体重）を、体重３００〜４００ｇの４匹の正常二重頚静脈カテーテル化雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）のそれぞれに皮下注射する。各ラットからの１つのカテーテルを、濃縮グルコース溶液を含有する可変速度シリンジポンプに接続する。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を使用して、５分ごとに尾静脈放血により血液グルコース値を測定し、注射後の最初の２時間は、該ラットを１００ｍｇ／ｄｌで維持するためにシリンジポンプ静脈内注入速度を定期的に調節する。最初の２時間の後は、グルコース注入速度を増加させ、更に２時間、４００ｍｇ／ｄｌに維持する。血清を一定間隔で集めて、インスリン濃度（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ，Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）および血液グルコース値を得る。
【０５１５】
実施例５９−非糖尿病ブタにおける正常／高血糖クランプ実験およびラットで得られた結果との合致
以下の実験は、類似したグルコース応答プロファイルがブタにおいて得られうるかどうかを判定するために行うことが可能である。実施例５６において製造されたマテリアル０．３００ｍｌ（〜０．０１２ｍｌ／ｋｇ体重）を、体重２０〜２５ｋｇの４頭の正常頚静脈カテーテル化雄Ｙｕｃａｔａｎ  Ｍｉｎｉａｔｕｒｅブタ（Ｓｉｎｃｌａｉｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯ）のそれぞれに皮下注射する。各ブタからのカテーテルを、濃縮グルコース溶液を含有する可変速度シリンジポンプに接続する。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ糖測定器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を使用して、５分ごとに静脈内カテーテル採血により血液グルコース値を測定し、注射後の最初の２時間は、該ブタを６５ｍｇ／ｄｌで維持するためにシリンジポンプ静脈内注入速度を定期的に調節する。最初の２時間の後は、グルコース注入速度を増加させ、更に２時間、４００ｍｇ／ｄｌに維持する。血清を一定間隔で集めて、インスリン濃度および血液グルコース値を得る。該インスリンコンジュゲートは内因性ブタインスリンと交差反応しうるため、新規アッセイ方法を開発した。該方法は、ブタにおけるインスリンを検出するために実施されうる。ブタおよび該典型的インスリンコンジュゲートの両方をほぼ同じシグナル対ノイズ比で検出するためのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）が開発されている。内因性ブタインスリンによるこのキットにおけるシグナルは、個々のブランクブタ血清サンプルをｃ−ペプチドＲＩＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）および該インスリンＲＩＡキットにおいて使用することにより決定される。得られた相関性が決定されたら、任意の血清サンプルＲＩＡインスリンシグナルが内因性インスリンおよびコンジュゲート化インスリンから寄与に変換されうる。
【０５１６】
実施例６０−式（ＩＶ）のコンジュゲート
この実施例は式（ＩＶ）：
【０５１７】
【化５１】
2013541500.tif 000082
の幾つかの典型的なコンジュゲートを記載する。
【０５１８】
これらのコンジュゲートならびにこれらのコンジュゲートを製造するための中間体および方法の更に他の実施形態は、２０１０年１月２７日付け出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１０／２２２５１に見出されうる。この関連出願の全内容を参照により本明細書に組み入れることとする。
【０５１９】
ある実施形態においては、式（ＩＶ）のコンジュゲートは以下の典型的な基の１以上を含みうる。
【０５２０】
Ｒｘ
ある実施形態においては、Ｒｘは水素である。ある実施形態においては、Ｒｘは、所望により置換されていてもよいＣ１−６アルキルである。ある実施形態においては、Ｒｘは、所望により置換されていてもよいＣ１−３アルキルである。ある実施形態においては、Ｒｘは、所望により置換されていてもよいメチルである。ある実施形態においては、Ｒｘは−ＣＨ３である。
【０５２１】
Ｚ１
ある実施形態においては、Ｚ１は、所望により置換されていてもよい２価Ｃ１−１０、Ｃ１−８、Ｃ１−６、Ｃ１−４またはＣ１−２炭化水素鎖である。ある実施形態においては、Ｚ１は、−（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−または−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−である。ある実施形態においては、Ｚ１は−（ＣＨ２）−または−（ＣＨ２ＣＨ２）−である。ある実施形態においては、Ｚ１は−（ＣＨ２）−である。ある実施形態においては、Ｚ１は−（ＣＨ２ＣＨ２）−である。ある実施形態においては、Ｚ１は−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−である。ある実施形態においては、Ｚ１は−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−である。
【０５２２】
ある実施形態においては、Ｚ１は、所望により置換されていてもよい２価Ｃ１−１０炭化水素鎖であり、ここで、Ｚ１の１、２または３個のメチレン単位は、所望により且つ独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＲａ−、−（Ｃ＝ＮＲａ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｓ＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−（ＣＲｂ＝ＣＲｂ）−、−（Ｎ＝Ｎ）−、所望により置換されていてもよいアリーレン部分または所望により置換されていてもよいヘテロアリーレン部分から選択される１以上の基で交換されていてもよい。ある実施形態においては、Ｚ１は、所望により置換されていてもよい２価Ｃ１−１０炭化水素鎖であり、ここで、Ｚ１の１、２または３個のメチレン単位は、所望により且つ独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＲａ−、−（Ｃ＝ＮＲａ）−または−（Ｃ＝Ｏ）−から選択される１以上の基で交換されていてもよい。ある実施形態においては、Ｚ１は−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）（ＣＨ２）３Ｓ−、−ＣＨ（Ｒｆ）２、−ＣＨ２ＣＨ（Ｒｆ）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（Ｒｆ）２−、−ＣＨ２Ｓ−または−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−であり、ここで、Ｒｆは、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールである（例えば、ある実施形態においては、Ｒｆは、所望により置換されていてもよいアリールであり、ある実施形態においては、Ｒｆはフェニルである）。ある実施形態においては、Ｚ１は−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）２−または−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）（ＣＨ２）３Ｓ−である。ある実施形態においては、Ｚ１は−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）２−である。ある実施形態においては、Ｚ１は−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）（ＣＨ２）３Ｓ−である。
【０５２３】
Ｙ１
ある実施形態においては、Ｙ１はフリーラジカル開始剤の断片である。そのような断片はＹ１の定義に含まれ、開始剤断片は、ハロゲン、−ＯＲｅ、−ＳＲｅ、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリールおよび所望により置換されていてもよいヘテロアリール部分を含みうる。
【０５２４】
ある実施形態においては、Ｙ１は水素、ハロゲンまたは開始剤断片である。ある実施形態においては、Ｙ１は水素またはハロゲンである。ある実施形態においては、Ｙ１は水素または臭素である。
【０５２５】
Ｘ１
ある実施形態においては、Ｘ１は−ＯＲｃである。ある実施形態においては、Ｘ１は−ＯＲｃおよび−Ｎ（Ｒｄ）２の混合物である。ある実施形態においては、Ｘ１は−Ｎ（Ｒｄ）２である。
【０５２６】
Ｗ１および------
ある実施形態においては、------は共有単結合である。
【０５２７】
ある実施形態においては、Ｗ１はアミノ基を介して重合体に共有結合している。ある実施形態においては、Ｗ１は第一級アミノ基を介して重合体に共有結合している。
【０５２８】
例えば、ある実施形態においては、基
【０５２９】
【化５２】
2013541500.tif 000083
は、基
【０５３０】
【化５３】
2013541500.tif 000084
に相当し、ここで、基［薬物−ＮＨ−］または［薬物−Ｎ＝］は、第一級アミノ基を介して直接的に共有的にコンジュゲート化されている薬物である。他の実施形態においては、該薬物は、付随アミノ基を末端とするスペーサー基（例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、エステル結合、アミド結合など）を含みうる。後者の実施形態は、該薬物の活性部分と該重合体との間の、より大きな分離を可能にする。
【０５３１】
ｒ
ある実施形態においては、ｒは１０〜２５（１０および２５も含む）の整数である。ある実施形態においては、ｒは１５〜２５（１５および２５も含む）の整数である。ある実施形態においては、ｒは２０〜２５（２０および２５も含む）の整数である。ある実施形態においては、ｒは５〜２０（５および２０も含む）の整数である。ある実施形態においては、ｒは１０〜２０（１０および２０も含む）の整数である。ある実施形態においては、ｒは１５〜２０（１５および２０も含む）の整数である。ある実施形態においては、ｒは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５である。ある実施形態においては、ｒは５である。ある実施形態においては、ｒは１０である。ある実施形態においては、ｒは１５である。ある実施形態においては、ｒは２０である。ある実施形態においては、ｒは２５である。
【０５３２】
ある実施形態においては、基：
【０５３３】
【化５４】
2013541500.tif 000085
は、基：
【０５３４】
【化５５】
2013541500.tif 000086
［式中、（ｇ＋ｔ）の和はｒに等しい］の混合物に相当する。ある実施形態においては、ｇおよびｔの各場合は、独立して、１〜２４（１および２４も含む）の整数である。ただし、（ｇ＋ｔ）の和は５以上かつ２５以下である。ある実施形態においては、ｇおよびｔは約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２または１：１（ｇ：ｔ）の比で存在する。ある実施形態においては、ｔおよびｇは約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、または１：２（ｔ：ｇ）の比で存在する。
【０５３５】
典型的なコンジュゲート
ある実施形態においては、式（ＩＶ−ａ１）
【０５３６】
【化５６】
2013541500.tif 000087
のコンジュゲートが使用されうる。
【０５３７】
ある実施形態においては、式（ＩＶ−ａ２）
【０５３８】
【化５７】
2013541500.tif 000088
のコンジュゲートが使用されうる。
【０５３９】
ある実施形態においては、式（ＩＶ−ｂ１）
【０５４０】
【化５８】
2013541500.tif 000089
のコンジュゲートが使用されうる。
【０５４１】
ある実施形態においては、式（ＩＶ−ｂ２）
【０５４２】
【化５９】
2013541500.tif 000090
のコンジュゲートが使用されうる。
【０５４３】
ある実施形態においては、式（ＩＶ−ｃ１）
【０５４４】
【化６０】
2013541500.tif 000091
のコンジュゲートが使用されうる。
【０５４５】
ある実施形態においては、式（ＩＶ−ｃ２）
【０５４６】
【化６１】
2013541500.tif 000092
のコンジュゲートが使用されうる。
【０５４７】
これらの典型的なコンジュゲートのいずれかにおいては、基：
【０５４８】
【化６２】
2013541500.tif 000093
は、基：
【０５４９】
【化６３】
2013541500.tif 000094
［式中、（ｇ＋ｔ）の和はそれぞれｒに等しい］の混合物に相当しうる。ある実施形態においては、ｒは１０である。ある実施形態においては、ｒは２０である。
【０５５０】
コンジュゲートの特徴づけ
該コンジュゲートは、核磁気共鳴（例えば、１Ｈ  ＮＭＲ）、分子量および多分散性に関するゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、ならびに鎖当たりの酸基の数の決定のための酸滴定またはフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）を含むいずれかの分析方法により特徴づけられうる。
【０５５１】
ある実施形態においては、該コンジュゲートフレームワーク（すなわち、アフィニティーリガンド、薬物または検出可能標識のいずれをも含有しないもの）は１０，０００Ｄａ未満、例えば、約１００〜約１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ある実施形態においては、該コンジュゲートフレームワークは約３００〜約５，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ある実施形態においては、該コンジュゲートフレームワークは約５００〜約２，５００Ｄａの範囲の分子量を有する。ある実施形態においては、該コンジュゲートフレームワークは約１，０００〜約２，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ある実施形態においては、該コンジュゲートフレームワークは約２００〜約１，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ある実施形態においては、該コンジュゲートフレームワークは約３００〜約８００Ｄａの範囲の分子量を有する。
【０５５２】
ある実施形態においては、いくつかのコンジュゲートの混合物を得る。この混合物中のそれらのコンジュゲートは同じ又は異なる分子量を有しうる。１つの実施形態においては、該混合物の多分散性は１．５未満である。１つの実施形態においては、該混合物の多分散性は１．２５未満である。
【０５５３】
実施例６１−式（Ｖ）のコンジュゲート
この実施例は式（Ｖ）：
【０５５４】
【化６４】
2013541500.tif 000095
の幾つかの典型的なコンジュゲートを記載する。
【０５５５】
これらのコンジュゲートならびにこれらのコンジュゲートを製造するための中間体および方法の更に他の実施形態は、２０１０年１月２７日付け出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１０／２２２６８に見出されうる。この関連出願の全内容を参照により本明細書に組み入れることとする。
【０５５６】
いくつかの実施形態においては、本開示は、一般式（ＩＸ−ａ）：
【０５５７】
【化６５】
2013541500.tif 000096
のコンジュゲートを提供する。
【０５５８】
例えば、いくつかの実施形態においては、本開示は式：
【０５５９】
【化６６】
2013541500.tif 000097
2013541500.tif 000098
のコンジュゲートを提供する。
【０５６０】
いくつかの実施形態においては、本開示は、一般式（ＩＸ−ａ）：
【０５６１】
【化６７】
2013541500.tif 000099
のコンジュゲートを提供する。
【０５６２】
例えば、いくつかの実施形態においては、本開示は式：
【０５６３】
【化６８】
2013541500.tif 000100
2013541500.tif 000101
のコンジュゲートを提供する。
【０５６４】
いくつかの実施形態においては、本開示は、一般式（ＩＸ−ａ）：
【０５６５】
【化６９】
2013541500.tif 000102
のコンジュゲートを提供する。
【０５６６】
例えば、いくつかの実施形態においては、本開示は式：
【０５６７】
【化７０】
2013541500.tif 000103
2013541500.tif 000104
のコンジュゲートを提供する。
【０５６８】
コンジュゲートの特徴づけ
該コンジュゲートは、核磁気共鳴（例えば、１Ｈ  ＮＭＲ）、分子量および多分散性に関するゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）などを含むいずれかの分析方法により特徴づけられうる。
【０５６９】
ある実施形態においては、該コンジュゲートフレームワーク（すなわち、アフィニティーリガンド、薬物または検出可能標識のいずれをも含有しないもの）は１０，０００Ｄａ未満、例えば、約１００〜約１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ある実施形態においては、該コンジュゲートフレームワークは約３００〜約５，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ある実施形態においては、該コンジュゲートフレームワークは約５００〜約２，５００Ｄａの範囲の分子量を有する。ある実施形態においては、該コンジュゲートフレームワークは約１，０００〜約２，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ある実施形態においては、該コンジュゲートフレームワークは約２００〜約１，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ある実施形態においては、該コンジュゲートフレームワークは約３００〜約８００Ｄａの範囲の分子量を有する。
【０５７０】
実施例６２−蛍光標識多糖の製造
この実施例は、蛍光多糖、特にテトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により誘導体化されたマンナン（これは、ＦＲＥＴに基づくグルコースセンサーにおいて使用されることがある）の製造方法を記載する。該ＴＲＩＴＣ−マンナン化合物は、実施例６３の用途において使用されるものである。
【０５７１】
簡潔に説明すると、窒素下のシュレンク（Ｓｃｈｌｅｎｋ）管内で、１ｇのマンナン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を２０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に、該溶液が透明になるまで９５℃で溶解する。次に２滴のピリジン（無水，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を該混合物に加える。２０ｍｇのＴＲＩＴＣ粉末を該加熱溶液に直接加え、ついで１０μｌのジブチルスズ  ジラウラート（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、該混合物を２時間反応させ、ついで該フラスコを加温浴から取り出し、冷却する。５０：５０  エタノール：ジエチルエーテル混合物を使用して、該ＴＲＩＴＣ−マンナンを数回の沈殿サイクルにより精製し、この場合、該沈殿物を２０００×ｇで１０分間遠心分離し（Ａｌｌｅｇｒａ  ２１Ｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）、各沈殿工程の相互間に、該遠心分離粒子ケークを再溶解するために、最少量の脱イオン水に再溶解する。前記条件下で該溶液を遠心分離した後の上清において視認可能な赤またはオレンジ色が視覚的に認められなくなるまで、これを繰返す。該沈殿物を最後の繰返しで脱イオン水に再溶解し、凍結乾燥して、精製されたＴＲＩＴＣ−マンナン生成物を得る。
【０５７２】
実施例６３−ＦＲＥＴ用途における修飾レクチン組成物の使用
この方法は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づくグルコースセンサーとしての、本発明の修飾ｒＣｏｎＡ組成物の用途を記載する。ＦＲＥＴは、２つの異なる発蛍光団が互いに接近すると、これはそれらの２つの発蛍光団の間のエネルギー転移を可能にして該発蛍光団の一方または両方の蛍光の減少（これは蛍光消光と称される）をもたらすことに基づく（Ｂａｌｌｅｒｓｔａｄｔら，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ３４５：２０３−２１２，１９９７）。
【０５７３】
糖インヒビターの非存在下では、蛍光修飾ｒＣｏｎＡと蛍光多糖との混合物は密集ゲルを形成し、隣接発蛍光団はＦＲＥＴを受けるであろう。グルコースのような糖インヒビターの存在下では、該蛍光修飾ｒＣｏｎＡと該蛍光多糖との平均距離が増加して、ＦＲＥＴのレベルが減少し、それにより個々の蛍光シグナルが増加するであろう。
【０５７４】
本発明の修飾ｒＣｏｎＡ組成物は、その改良された安全性プロファイルにより、未修飾ｒＣｏｎＡを使用する場合より安全なインビボグルコースセンサーを提供しうる。
【０５７５】
以下のインビトロ試験は、本開示の修飾ｒＣｏｎＡを使用して行う。ＦＩＴＣ標識修飾ｒＣｏｎＡは、蛍光イソチオシアナート（ＦＩＴＣ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して製造されうる。ついで、精製されたＦＩＴＣ−修飾ｒＣｏｎＡを、実施例６２により合成されたＴＲＩＴＣ−マンナンと混合する。
【０５７６】
３つのストック溶液を以下のとおりに調製する。
【０５７７】
（ｉ）ＦＩＴＣ−修飾ｒＣｏｎＡ  −  ６０ｍｇのＦＩＴＣ−修飾ｒＣｏｎＡを２ｍｌの１００ｍＭ  ＢＥＳ（ｐＨ７）、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２に溶解する。
【０５７８】
（ｉｉ）ＴＲＩＴＣ−マンナンストック  −  ６０ｍｇのＴＲＩＴＣ−マンナンを２ｍｌの１００ｍＭ  ＢＥＳ（ｐＨ７）、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２に溶解する。
【０５７９】
（ｉｉｉ）グルコースストック  −  １２００ｍｇのグルコースを１００ｍｌの１００ｍＭ  ＢＥＳ（ｐＨ７）、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２に溶解することにより、１２００ｍｇ／ｄｌのグルコース溶液を調製する。
【０５８０】
ついで、該ＦＩＴＣ−修飾ｒＣｏｎＡおよびＴＲＩＴＣ−マンナンストック溶液の１：２系列希釈を１００ｍＭ  ＢＥＳ（ｐＨ７）、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２中で別々に行って、ＦＩＴＣ−修飾ｒＣｏｎＡおよびＴＲＩＴＣ−マンナンの最終濃度が３０、３、０．３、０．０３、０．００３、０．０００３、０．００００３および０．０００００３ｍｇ／ｍｌとなるようにする。該ストック溶液を、例えば９６ウェルマイクロタイタープレート（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ，ＮＪ）上で、互いに混合する。全ての成分の最終濃度が、全ての溶液を互いに混合した後で３倍減少するように、該プレートは設計される。
【０５８１】
該溶液を互いに混合した後、ＦＩＴＣには４８５／５２５ｎｍのフィルターペアを、そしてＴＲＩＴＣ蛍光の測定には５４４／５９０ｎｍのフィルターペアを使用して、蛍光プレートリーダー（ｆｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）により該プレートの蛍光をアッセイする。
【０５８２】
室温で１２００ｍｇ／ｄｌ  グルコースバッファーを使用して両方の組のフィルターペアで測定した後、該プレートリーダーのインキュベーター機能を用いて該プレートを３７℃に加熱する。３０分間の平衡化の後、ＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣ蛍光の両方に関して、もう一度該プレートを読取る。ついで該プレートを室温に再冷却する。
【０５８３】
第２、４、６および８行の全てに５０μｌの９６００ｍｇ／ｄｌ  グルコース溶液を更に加え、一方、第１、３、５および７行の全てに５０μｌのバッファーを更に加える。該プレートを室温でもう一度読取り、該過程を、最後に０．１Ｍ  メチル−α−マンノピラノシドを使用して繰返す。
【０５８４】
該グルコースセンサーの更なる最適化は、該重合体のアフィニティを調節すること、該修飾ｒＣｏｎＡおよびＴＲＩＴＣ−マンナンの蛍光ローディングを最適化すること、ならびに蛍光分光光度計で該実験を再実施して、プレートリーダー／フィルターペア設定と比較して最大ＦＲＥＴまたはＦＲＥＴ消光を可能にすることにより行われうる。
【０５８５】
実施例６４−粘度測定グルコースセンサー
この実施例は、グルコース応答性溶液の粘度の変化に基づいてグルコースを検出しうる系において修飾ｒＣｏｎＡ組成物がどのようにして使用されうるのかを示す。修飾ｒＣｏｎＡ組成物を、１００ｍｇ  ｒＣｏｎＡ当量／ｍｌの濃度で、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２およびＣａＣｌ２を含有する２０ｍＭ  ＢＥＳバッファー（ｐＨ７）に溶解する。これとは別に、酵母マンナン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、２００ｍＭ  ＢＥＳバッファー（ｐＨ７）バッファーの５つの溶液（各溶液は、それぞれ０、１００、８００、１６００および３２００ｍｇ／ｄｌのグルコースを含有する）に溶解する。０．７００ｍｌの該修飾ｒＣｏｎＡストック溶液を、種々の濃度のグルコースを含有するそれらの５つのマンナンストック溶液のそれぞれと混合して、得られる５つの溶液が０、５０、４００、８００および１６００ｍｇ／ｄｌのグルコースを含有するようにする。
【０５８６】
円錐−平板の配置に設定された小型粘度計を使用して、せん断速度の関数として、各溶液の粘度を測定する。該円錐は直径４ｃｍであり、２度の角度を有し、０．５８ｍｌのサンプル容量を要する。サンプルの蒸発を低減するために溶媒トラップを使用する。各サンプルに関して、２２℃および３７℃の両方で、ある範囲のせん断速度にわたって、定常状態流動粘度を測定する。
【０５８７】
この液体が体液と接触した場合、測定粘度は該体液のグルコース濃度と直接相関するであろう。
【０５８８】
他の実施形態
本発明の他の実施形態は、本明細書の考察または本明細書に開示されている本発明の実施から当業者に明らかとなろう。本明細書および実施例は典型例に過ぎないとみなされ、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲により定められると意図される。
【図１】
2013541500.tif 000135
【図２】
2013541500.tif 000136
【図３Ａ】
2013541500.tif 000137
【図３Ｂ】
2013541500.tif 000138
【図４】
2013541500.tif 000139
【図５】
2013541500.tif 000140
【図６】
2013541500.tif 000141
【図７】
2013541500.tif 000142
【図８】
2013541500.tif 000143
【図９】
2013541500.tif 000144
【図１０】
2013541500.tif 000145
【図１１】
2013541500.tif 000146
【図１２】
2013541500.tif 000147
【図１３】
2013541500.tif 000148
【図１４】
2013541500.tif 000149
【図１５】
2013541500.tif 000150
【図１６】
2013541500.tif 000151
【図１７】
2013541500.tif 000152
【図１８】
2013541500.tif 000153
【図１９】
2013541500.tif 000154
【図２０】
2013541500.tif 000155
【図２１】
2013541500.tif 000156
【図２２】
2013541500.tif 000157
【図２３】
2013541500.tif 000158
【図２４】
2013541500.tif 000159
【図２５】
2013541500.tif 000160
【配列表】
2013541500000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月25日(2013.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースに対する少なくとも２つの結合部位を有する多価レクチンと、コンジュゲートフレークワークに結合した２以上の別々のアフィニティリガンドを含むコンジュゲートとを含む架橋マテリアルであって、
該レクチンが、該結合部位の少なくとも１つへの結合に関してグルコースと競合しうる、該レクチンのシステイン残基に共有結合している少なくとも１つのアフィニティリガンドを含み、
前記の２以上のアフィニティリガンドが該結合部位における該レクチンへの結合に関してグルコースと競合し、異なるコンジュゲート上のアフィニティリガンドとレクチンとの間の非共有結合相互作用の結果として、コンジュゲートが該マテリアルにおいて架橋されている、架橋マテリアル。
【請求項２】
該コンジュゲートが、該コンジュゲートフレームワークに結合した薬物を更に含む、請求項１記載のマテリアル。
【請求項３】
該コンジュゲートが、該コンジュゲートフレームワークに結合した検出可能な標識を更に含む、請求項１記載のマテリアル。
【請求項４】
該レクチンが、レクチン当たりただ１つの共有結合したアフィニティリガンドを含む、請求項１記載のマテリアル。
【請求項５】
該レクチンが、グルコース結合部位当たり１つの共有結合したアフィニティリガンドを含む、請求項１記載のマテリアル。
【請求項６】
該レクチンが、部位特異的突然変異誘発により誘導された少なくとも１つのシステイン残基を含有する組換えＣｏｎＡレクチンである、請求項１記載のマテリアル。
【請求項７】
グルコースに対する結合部位の部分を形成する、野生型ＣｏｎＡ配列におけるアミノ酸が、少なくとも１つのシステイン残基により置換されている、請求項６記載のマテリアル。
【請求項８】
少なくとも１つのシステイン残基が、グルコースに対する結合部位の部分を形成するアミノ酸の（一次アミノ酸配列において測定された場合に）１〜５アミノ酸内に存在する野生型ＣｏｎＡ配列内の位置に存在する、請求項６記載のマテリアル。
【請求項９】
少なくとも１つのシステイン残基が、グルコースに対する結合部位の部分を形成するいずれかのアミノ酸から（一次アミノ酸配列において測定された場合に）少なくとも１、２、３、４または５アミノ酸により隔てられた野生型ＣｏｎＡ配列内の位置に存在する、請求項６記載のマテリアル。
【請求項１０】
該レクチンが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ただし、これらの配列のそれぞれにおいて、各Ｘが、コード可能なアミノ酸であり、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項１１】
該レクチンが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、該Ｘ位のただ１つがシステインであり、全ての他のＸ位が、コード可能なアミノ酸である、請求項６記載のマテリアル。
【請求項１２】
該レクチンが、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ただし、少なくとも１つのＸがシステインである、請求項６記載のマテリアル。
【請求項１３】
該レクチンに共有結合しているアフィニティリガンドが糖を含む、請求項１記載のマテリアル。
【請求項１４】
該糖がグルコースである、請求項１３記載のマテリアル。
【請求項１５】
該糖がマンノースである、請求項１３記載のマテリアル。
【請求項１６】
該レクチンに共有結合しているアフィニティリガンドが糖およびリンカーを含み、該糖がアノマー炭素を介して該リンカーに共有結合している、請求項１３記載のマテリアル。
【請求項１７】
該薬物がインスリン分子である、請求項２記載のマテリアル。
【請求項１８】
該コンジュゲートが一般式：
【化１５】
2013541500.tif 000161
［式中、
Ｒｘは水素または所望により置換されていてもよいＣ１−６アルキルである；
Ｚ１は、所望により置換されていてもよい２価Ｃ１−１０炭化水素鎖であり、ここで、Ｚ１の、１、２、３、４または５個のメチレン単位は、所望により且つ独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＲａ−、−（Ｃ＝ＮＲａ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｓ＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−（ＣＲｂ＝ＣＲｂ）−、−（Ｎ＝Ｎ）−、所望により置換されていてもよいアリーレン部分または所望により置換されていてもよいヘテロアリーレン部分から選択される１以上の基で交換されていてもよく、ここで、Ｒａは水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたは適当なアミノ保護基であり、Ｒｂは水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリールまたは所望により置換されていてもよいヘテロアリールである；
Ｘ１の各存在は、独立して、−ＯＲｃまたは−Ｎ（Ｒｄ）２であり、ここで、Ｒｃは水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリール、適当なヒドロキシル保護基、カチオン基またはアフィニティリガンドであり、各Ｒｄは、独立して、水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリール、適当なアミノ保護基またはアフィニティリガンドであり、ただし、Ｘ１の、少なくとも２つの存在は、アフィニティリガンドを含む；
Ｙ１は水素、ハロゲン、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリール、−ＯＲｅまたは−ＳＲｅであり、ここで、Ｒｅは水素、所望により置換されていてもよい脂肪族、所望により置換されていてもよいヘテロ脂肪族、所望により置換されていてもよいアリールまたは所望により置換されていてもよいヘテロアリールである；
ｒは５〜２５（５および２５を含む）の整数である；
Ｗ１は薬物または検出可能な標識である；ならびに
- - -は、単または二重共有結合に対応する］を有する、請求項１記載のマテリアル。
【請求項１９】
該コンジュゲートが一般式：
【化１６】
2013541500.tif 000162
［式中、
［（［Ａ］−Ｔ）］の各存在は該コンジュゲート内の可能な分枝を表す；
（［Ａ］−Ｔ）の各存在は該コンジュゲートの分枝内の可能な反復を表す；
［Ａ］の各存在は、独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子であるか、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される所望により置換されていてもよい基である；
Ｔの各存在は、独立して、共有結合、または２価の直鎖状もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の所望により置換されていてもよいＣ１−３０炭化水素鎖であり、ここで、Ｔの、１以上のメチレン単位は、所望により且つ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基により交換されていてもよい；
Ｒの各存在は、独立して、水素、適当な保護基またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分またはヘテロ脂肪族部分である；
−Ｂは−Ｔ−ＬＢ−Ｘである；
Ｘの各存在は、独立して、アフィニティリガンドである；
ＬＢの各存在は、独立して、共有結合、またはＸへのＴの共有結合から誘導される基である；
−Ｄは−Ｔ−ＬＤ−Ｗである；
Ｗの各存在は、独立して、薬物または検出可能な標識である；
ＬＤの各存在は、独立して、共有結合、またはＷへのＴの共有結合から誘導される基である；
ｋは２〜１１（２および１１を含む）の整数であり、該コンジュゲート内の少なくとも２つのｋ分枝を定める；
ｑは１〜４（１および４を含む）の整数である；
ｋ＋ｑは３〜１２（３および１２を含む）の整数である；
ｐの各存在は、独立して、１〜５（１および５を含む）の整数である；
ｎの各存在は、独立して、０〜５（０および５を含む）の整数である；
ｍの各存在は、独立して、１〜５（１および５を含む）の整数である；
ｖの各存在は、独立して、０〜５（０および５を含む）の整数である；ただし、各ｋ分枝内で、ｎの、少なくとも１つの存在は、＞１であり、ｖの、少なくとも１つの存在は、＞１である。］を有する、請求項１記載のマテリアル。
【国際調査報告】
2013541500.tif 000163
2013541500.tif 000164
2013541500.tif 000165
2013541500.tif 000166
2013541500.tif 000167