(57)【要約】  限定された抗原（例えば、特異的な細胞内局在化を伴う抗原）に対する自己抗体の、異なるＩｇＧサブクラスの相対的免疫反応性に基づいて、卵巣癌を診断するおよび段階付ける方法が記載されている。
2013511728.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌を検出するまたは段階付ける方法であって：
上記対象から抗体を含んでいるサンプルを得ること
上記サンプルと１または２以上の腫瘍関連抗原とを、抗体−抗原複合体の形成に十分な条件下で接触させること；および
上記抗体−抗原複合体の形成を検出すること、を含んでおり、
複合体の存在は上記腫瘍関連抗原に対する自己抗体の存在を示し、かつ当該自己抗体の存在が上記対象における癌の存在または段階を示す、方法。
【請求項２】
上記１または２以上の腫瘍関連抗原はそれぞれ、腫瘍細胞の核または細胞質において発現するものとして分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記核において発現する腫瘍関連抗原は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ＨＮＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１）、非転移性細胞１／非転移性細胞２（ＮＭＥ１／ＮＭＥ２）、zinc finger DHHC-type containing 7 アイソフォーム２、サバイビン、ｐ５３、ｐ７３、ヌクレオホスミン（Ｂ２３）、滑膜肉腫Ｘ切断点タンパク質２および４（ＳＳＸ２、ＳＳＸ４）、ならびにＨｏｘＡ７からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記細胞質において発現する腫瘍関連抗原は、ピリドキサールキナーゼ、ガレクチン−１、熱ショックタンパク質９０、ペルオキシレドキシン、グルコース調節タンパク質７８、およびプロカテプシンＤからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
上記抗体は、ＩｇＧ型抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ピリドキサールキナーゼ、ガレクチン−１、熱ショックタンパク質９０、zinc finger DHHC-type containing 7 アイソフォーム２、サバイビン、ｐ５３、ｐ７３、ペルオキシレドキシン、ヌクレオホスミン（Ｂ２３）、滑膜肉腫Ｘ切断点タンパク質（ＳＳＸ２、ＳＳＸ４）、ＨｏｘＡ７、グルコース調節タンパク質７８、またはプロカテプシンＤのうちの１もしくは２以上と特異的に結合する自己抗体の存在は、上記対象における癌の存在を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
核におけるヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ＨＮＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１）および非転移性細胞１／非転移性細胞２（ＮＭＥ１／ＮＭＥ２）のうちの１もしくは２以上と特異的に結合する自己抗体の存在、ならびに／またはサイトゾルにおけるピリドキサールキナーゼ、ガレクチン−１および熱ショックタンパク質９０のうちの１または両方の存在は、上記対象がステージＩの卵巣癌を有していることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
核におけるzinc finger DHHC-type containing 7 アイソフォーム２、サバイビン、ｐ５３、もしくはｐ７３のうちの１もしくは２以上と特異的に結合する自己抗体の存在、および／またはサイトゾルにおけるペルオキシレドキシンの存在は、上記対象がステージＩＩＩまたはＩＶの卵巣癌を有していることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｍｕｃ１６、ｐ５３、ＰＬＡＰおよびサバイビンのうちの１または２以上と特異的に結合する自己抗体の存在は、上記対象がステージＩＩＩまたはＩＶの卵巣癌を有していることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
核におけるヌクレオホスミン（Ｂ２３）、滑膜肉腫Ｘ切断点タンパク質（ＳＳＸ２、ＳＳＸ４）、もしくはＨｏｘＡ７のうちの１もしくは２以上と特異的に結合する自己抗体の存在、ならびに／または小胞体におけるグルコース調節タンパク質７８の存在、ならびに／またはリソソームにおけるプロカテプシンＤの存在は、上記対象が癌を有していることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記腫瘍関連抗原は、基体と結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
固体の上記基体は、固体表面またはビーズである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記腫瘍関連抗原は、癌細胞であると知られている細胞の細胞質から単離されるか、または癌細胞であると知られている細胞の核から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
上記癌は、膵臓癌、肺癌、乳癌、大腸癌、または卵巣癌である、請求項１〜６および９〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
対象における卵巣癌を段階付ける方法であって：
上記対象からＩｇＧ型抗体を含んでいるサンプルを得ること；
上記サンプルと卵巣腫瘍に由来する抗原とを、抗体−抗原複合体の形成に十分な条件下で接触させること；
上記抗原と結合しているＩｇＧ型抗体のサブクラスを決定すること；および
上記サブクラスの相対的免疫反応性を決定すること、を含んでおり、
上記サブクラスの相対的免疫反応性は、上記対象が早期卵巣癌を有しているか、上記対象が中期卵巣癌を有しているか、または上記対象が進行卵巣癌を有しているかを示す、方法。
【請求項１６】
上記サブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＩｇＧ２＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＝ＩｇＧ４である相対的免疫反応性の存在は早期卵巣癌の診断を示し；ＩｇＧ２＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４の存在は中期卵巣癌の診断を示し、ＩｇＧ２≧ＩｇＧ３＝ＩｇＧ４＞ＩｇＧ１の存在は進行卵巣癌の診断を示す、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、その全体の内容が参照によって本明細書に援用される、米国仮出願第６１／２６３，２３５号（出願日：２００９年１１月２０日）の利益を主張する。
【０００２】
〔技術分野〕
本発明は、限定された抗原（defined antigen）（例えば、特異的な細胞内局在化を伴う抗原）に対する自己抗体の、異なるＩｇＧサブクラスの相対的免疫反応性に基づいた、癌（例えば、膵臓癌、肺癌、乳癌、大腸癌、または卵巣癌）のバイオマーカーに関する。
【０００３】
〔背景〕
卵巣癌は婦人科系の癌のわずか３分の１を占めるだけであるが、婦人科系の悪性腫瘍による死亡の５５％、および女性における全ての癌による死亡の６％を招く（Memarzadeh S, Berek JS., J Reprod Medicine 2001, 46:621-629;Hoskins WJ. J Cell Biochem 1995;23 (suppl):189-1）。長期の生存はこの３０年間で顕著に変化することはなかった。それは、定着した癌のみを検出する不十分な診断手法が大きな原因である。卵巣癌のわずか１９％のみが、ステージＩにおいて診断される（Hoskins WJ., J Cell Biochem 1995, 23 (suppl):189-199）。一方、女性に関連する他の癌はステージＩにおいて初期診断される（子宮体癌の７７％、乳癌の５５％、および子宮頸癌の８３％）。ステージＩの卵巣癌は９０％のケースにおいて治癒し得るが、進行した疾患（ステージＩＩＩおよびＩＶ）についての５年の生存率は２１％未満である。そのため、生存期間の顕著な向上の見込みが疾患の早期診断において残されている。近年の診断手法は、種々の不備を示す（Clark-Pearson DL. , N Engl J Med 2009, 361:170-177）。第一に、大抵のバイオマーカーは癌特異性を欠いている。第二に、大抵のバイオマーカーは早期疾患に対する陽性的中率を欠いている。第三に、大抵のバイオマーカーは末梢循環において不安定である。さらに、癌の早期検出の概念と、早期癌の特異的検出の概念とは、概して区別されない。症状に先立つ後期癌の同定は、結果に影響を与えないようである；しかしながら、早期における癌の検出は生存期間を大いに向上し得る。
【０００４】
血液循環しているＣＡ１２５の評価は、疾患モニター（治療応答、疾患の再発および進行を明らかにすること）として意図されている（Nossov V, Amneus M, Su F, Lang J, Janco JMT, Reddy ST, Farias-Eisner R., Am J Obstet Gynecol 2008, 199: 215-223）一方、卵巣癌を診断するために用いられてきた（Bast RC, Badgwell D, Lu Z, Marquez R, Rosen D, Liu J, Baggerly KA, Atkinson EN, Skates S, Zhang Z, Lokshins A, Menon U, Jacobs I, Lu K.,  Int J Gynecol Cancer 2005, 15 (suppl 3): 274-281）。ＣＡ１２５は、ステージＩの疾患を患っている女性の５０％未満においてしか上昇しないため、新しい卵巣癌の検出に対して感受的でも特異的でもない。ＣＡ１２５は不十分な特異性を有しており、それは、良性および悪性の乳癌および大腸癌、腹膜刺激、ならびに良性の婦人科系疾患などにおける上昇によって示される（Bast RC, Badgwell D, Lu Z, Marquez R, Rosen D, Liu J, Baggerly KA, Atkinson EN, Skates S, Zhang Z, Lokshins A, Menon U, Jacobs I, Lu K.,  Int J Gynecol Cancer 2005, 15 (suppl 3): 274-281）。早期卵巣癌におけるＣＡ１２５の限定的な発現、および非悪性の病変との関連に起因して、ＣＡ１２５はせいぜい５７％の陽性的中率を示す（Nossov V, Amneus M, Su F, Lang J, Janco JMT, Reddy ST, Farias-Eisner R., Am J Obstet Gynecol 2008, 199: 215-223）。
【０００５】
疾患の管理において、または最終的にはスクリーニング方法において、ＣＡ１２５を代替または補完し得る潜在的なマーカーを同定するために、多大な試みが展開されてきた（Jacobs IJ, Menon U., Mol Cell Proteomics, 3:355-366, 2004）。表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）は、生物試料中のタンパク質の分析における使用に関して、大きな注目を受けてきた。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳプロファイリングは、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、および肝臓癌を、健康な対照から区別するために首尾よく用いられてきた（Zhang H, Kong B, Qu X, Jia L, Deng B, Yang Q., Gynecol Oncol, 102:61-66, 2006）。卵巣癌を患っている患者を、良性卵巣疾患を患っている患者および健康な対照から区別することにおいて、血清のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳプロファイリングは、近年の標準的血清バイオマーカーＣＡ１２５よりも顕著に優れていた（Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM., Lancet, 359:572-577, 2002）。これらのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳプロファイリングにおける初期研究は前途有望であるが、この手法を慣例の診断試験に移行することは困難なままである。ＭＳ技術の欠点は、分光出力の解析におけるのと同様に、ＭＳにおいて、重要ないくつかのタンパク質がより豊富なタンパク質によって隠され得ることである。近年のＭＳ手法における最大の試みは、感度よりもむしろ動作範囲（dynamic range）である。優勢な（prevalent）タンパク質またはペプチドの排除は、特定のサンプルから得られる情報内容を非常に増大させ得るが、アルブミンなどの優勢なタンパク質は診断的意義のあるタンパク質のサブセットのキャリアとして機能し得る（Petricoin EF, Belluco C, Arauio RP, Liotta LA., Nature Rev Cancer 2006, 6:961-967）。
【０００６】
近年の診断方法における特異性の欠如を複雑にしているものは、末梢循環内における大抵のバイオマーカーの乏しい安定性である。抗原に基づいた分析（ＣＡ１２５のＥＬＩＳＡ、さらにはＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなど）に関して、一度、標的抗原が腫瘍から放出されると、それらは免疫学的な抗原処理能力を飽和させ、血管内侵入し、血液循環において検出可能な定常状態濃度に達しなければならない。その結果、血液循環しているバイオマーカーの濃度は、多様な変数（血液における、マーカーの血管内侵入、クリアランス速度およびタンパク質の半減期など）による影響を受ける。全てのバイオマーカーの安定性が調査されてきたわけではないが、循環しているｐ５３の研究は半減期が数時間であることを示し（Angelopoulou K, Yu H, Bharaj B, Giai M, Diamandis EP., Clin Biochem 2000, 33: 53-62）、循環しているＳ１００Ｂタンパク質（黒色腫における）の半減期はわずか３０分であると見積もられている（Harpio R, Einarsson R., Clin Biochem 2004, 37: 512-518）。前立腺癌において、全ＰＳＡおよび遊離ＰＳＡは、それぞれ４．２７時間および２．１４時間の半減期を伴う急速な指数関数的分解相（rapid exponential degradation phase）を示す（Gregorakis AK, Stefanakis S, Malovrouvas D, Petraki K, Gourgiotis D, Scorilas A., Prostate 2008, 68:759-765）。胸部腫瘍を患っている患者において、ＣＥＡ、ＳＣＣ、ＴＰＡおよびＣＹＦＲＡの平均半減期は、それぞれ、３６時間、２．２時間、２．５時間および１．５時間であった（Yoshimasu T, Maebeya S, SuzumaT, Bessho T, Tanino H, Arimoto J, Sakurai T, Naito Y., Int J Biol Markers 1999, 14:99-105）。短い半減期に加え、卵巣癌のためのいくつかの血清バイオマーカーも、交絡因子（心理的ストレス、採血（blood draw）時間、およびサンプル操作における非管理の相違が挙げられる）に非常に敏感であることが実証されてきた（Thorpe JD, Duan X, Forrest R., PLoS ONE 2007, 2: e1281）。バイオマーカーの検出限界と実際の腫瘍量とを関連付ける数学的モデルに基づくと、陽性の試験結果を導く、算出された最小の腫瘍サイズは、ＣＡ１２５および卵巣癌を用いて１１６．７ｍｍ３であった（Lutz AM, Willmann JK, Cochran FV, Ray P, Gambhir SS., PLoS Medicine 2008, 5:1287-1297）。このモデルは、全ての腫瘍細胞によって均一に抗原産生され、分泌されたバイオマーカーの１０％（インビトロ研究に基づく）が血液循環に到達し、かつＣＡ１２５は血液から浄化されないかまたは分解されないと想定したため、この算出された最小サイズは実際より非常に小さく見積もられ得る。
【０００７】
それに対して、抗体は長い半減期を有し、簡単に測定され、かつ末梢循環において安定的であるため、抗体応答は臨床的なバイオマーカーになる見込みがある。癌関連タンパク質の異常発現は、自己抗体の誘発を招き得る（Draghici S, Chatterjee M, Tainsky MA., Expert Rev Mol Diagn 2005, 5: 735-743; Gagnon A, Kim JH, Schorge JO, Ye B, Liu B, Hasselblatt K, Welch WR, Bandera CA, Mok SC., Clin Cancer Res 2008, 14: 764-771; Gercel-Taylor C, Bazzett LB, Taylor DD., Gynecol Oncol 2001, 81:71-76）。実験動物モデルにおいて、最初の腫瘍発達の直後であって、かつ、触診可能な腫瘍または血液循環している腫瘍抗原に十分に先立って、血液循環している腫瘍反応性ＩｇＧが実証され得る（Taylor DD, Gercel-Taylor C., Oncol Rep 1998 Nov-Dec, 5(6):1519-24; Nesterova M, Johnson N, Cheadle C, Cho-Chung YS., Biochim Biophys Acta 2006, 1762: 398-403）。結腸癌において、結腸ポリープを患っている患者と様々な段階および程度の結腸癌を患っている患者とを比較した場合、ｐ５３に対する自己抗体は、多段階の結腸癌発生における腫瘍進行に伴って生じるようである（Tang R, Ko MC, Wang JY, Changchien CR, Chen HH, Chen JS, Hsu KC, Chiang JM, Hsieh LL., Int J Cancer 2001, 94:859-863）。腫瘍反応性抗体は、血液循環している検出可能な腫瘍抗原よりも前に生成されるだけでなく、抗体は他の血清バイオマーカーと比べて、安定的であり、かつ交絡因子に影響されにくい（Nesterova M, Johnson N, Cheadle C, Cho-Chung YS., Biochim Biophys Acta 2006, 1762: 398-403）。
【０００８】
〔要約〕
本明細書に記載されるように、４つのＩｇＧサブクラスについての反応性のパターンは、卵巣癌において異なっている。さらに、異なる細胞区画（膜、核またはサイトゾル）に由来する抗原成分も同様に異なっている。早期および後期の癌（例えば、卵巣癌）の認識パターンを明らかにするために、共通する認識または段階に関連する認識を示す種々の腫瘍由来抗原を、ＭＳによって同定した。
【０００９】
したがって、本明細書で提供されるものは、対象における癌（例えば、膵臓癌、肺癌、乳癌、大腸癌、または卵巣癌）を検出するまたは段階付ける（例えば、検出または段階付けにおける助けのために）方法（例えば、インビトロにおける方法）である。当該方法は、対象から抗体（例えば、ＩｇＧ型抗体）を含んでいるサンプルを得ること；当該サンプルと１または２以上の腫瘍関連抗原とを、抗体−抗原複合体の形成に十分な条件下で接触させること；および当該抗体−抗原複合体の形成を検出することを含んでおり、複合体の存在は腫瘍関連抗原に対する自己抗体の存在を示し、かつ当該自己抗体の存在は当該対象における癌（例えば、膵臓癌、肺癌、乳癌、大腸癌、または卵巣癌）の存在または段階を示すものである。いくつかの実施形態において、当該癌は卵巣癌である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、上記１または２以上の腫瘍関連抗原はそれぞれ、腫瘍細胞（例えば、膵臓、肺、乳房、大腸、または卵巣腫瘍細胞）の核または細胞質において発現するものとして分類される。いくつかの実施形態において、上記核において発現する腫瘍関連抗原は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ＨＮＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１）、非転移性細胞１／非転移性細胞２（ＮＭＥ１／ＮＭＥ２）、zinc finger DHHC-type containing 7 アイソフォーム２、サバイビン、ｐ５３、ｐ７３、ヌクレオホスミン（Ｂ２３）、滑膜肉腫Ｘ共通抗原または切断点タンパク質２および４（ＳＳＸ２、ＳＳＸ４）、ならびにホメオボックスＡ７（ＨｏｘＡ７）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記細胞質において発現する腫瘍関連抗原は、ピリドキサールキナーゼ、ガレクチン−１、熱ショックタンパク質９０、ペルオキシレドキシン、グルコース調節タンパク質７８、およびプロカテプシンＤからなる群より選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ピリドキサールキナーゼ、ガレクチン−１、熱ショックタンパク質９０、zinc finger DHHC-type containing 7 アイソフォーム２、サバイビン、ｐ５３、ｐ７３、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）ペルオキシレドキシン、ヌクレオホスミン（Ｂ２３）、滑膜肉腫Ｘ切断点タンパク質（ＳＳＸ２、ＳＳＸ４）、ＨｏｘＡ７、ムチン１６、細胞表面関連（cell surface associated）（Ｍｕｃ１６）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（癌／精巣抗原１Ｂとしても知られている）、胎盤型アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ＳＳＸ共通抗原、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）、またはカテプシンＤもしくはプロカテプシンＤのうちの１もしくは２以上と特異的に結合する自己抗体の存在は、上記対象における癌（例えば、膵臓癌、肺癌、乳癌、大腸癌、または卵巣癌）の存在を示す。いくつかの実施形態において、ＰＬＡＰと特異的に結合する自己抗体の存在は、上記対象における卵巣癌の存在を示す。いくつかの実施形態において、Ｍｕｃ１６、ｐ５３、ＰＬＡＰおよびサバイビンのうちの１または２以上と特異的に結合する自己抗体の存在は、上記対象がステージＩＩＩまたはＩＶの卵巣癌を有していることを示す。いくつかの実施形態において、サバイビンに対する自己抗体の存在は、上記対象における肺癌または大腸癌の存在を示す。
【００１２】
いくつかの実施形態において、核におけるヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ＨＮＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１）および非転移性細胞１／非転移性細胞２（ＮＭＥ１／ＮＭＥ２）のうちの１もしくは２以上と特異的に結合する自己抗体の存在、ならびに／またはサイトゾルにおけるピリドキサールキナーゼ、ガレクチン−１および熱ショックタンパク質９０のうちの１または両方の存在は、上記対象がステージＩの卵巣癌を有していることを示す。
【００１３】
いくつかの実施形態において、核におけるzinc finger DHHC-type containing 7 アイソフォーム２、サバイビン、ｐ５３、もしくはｐ７３のうちの１もしくは２以上と特異的に結合する自己抗体の存在、および／またはサイトゾルにおけるペルオキシレドキシンの存在は、上記対象がステージＩＩＩの卵巣癌を有していることを示す。
【００１４】
いくつかの実施形態において、核におけるヌクレオホスミン（Ｂ２３）、滑膜肉腫Ｘ切断点タンパク質（ＳＳＸ２、ＳＳＸ４）、もしくはＨｏｘＡ７のうちの１もしくは２以上と特異的に結合する自己抗体の存在、ならびに／または小胞体におけるグルコース調節タンパク質７８の存在、ならびに／またはリソソームにおけるプロカテプシンＤの存在は、上記対象が癌（例えば、卵巣癌）を有していることを示す。
【００１５】
いくつかの実施形態において、上記腫瘍関連抗原は、基体（例えば、固体表面またはビーズ）と結合している。
【００１６】
いくつかの実施形態において、上記腫瘍関連抗原は、癌細胞であると知られている細胞（例えば、卵巣癌細胞）の細胞質から単離されるか、または癌細胞であると知られている細胞の核から単離される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記自己抗体の存在に関する情報を、医療供給者または上記対象へ伝えることをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記対象に対する上記癌のための治療（当該技術分野において公知であるような）を施すことをさらに含む。
【００１８】
別の局面において、本発明は、対象における卵巣癌を段階付ける（例えば、段階付けにおける助けのために）方法（例えば、インビトロにおける方法）を提供する。当該方法は、患者からＩｇＧ型抗体を含んでいるサンプルを得ること；当該サンプルと卵巣腫瘍に由来する抗原とを、抗体−抗原複合体の形成に十分な条件下で接触させること；当該抗原と結合しているＩｇＧ抗体のサブクラスを決定すること；および上記サブクラスの相対的免疫反応性を決定することを含んでおり、当該サブクラスの相対的免疫反応性は、当該対象が早期卵巣癌、中期卵巣癌、または進行卵巣癌を有しているか否かを示す。
【００１９】
いくつかの実施形態において、上記サブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ２＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＝ＩｇＧ４である相対的免疫反応性の存在は早期卵巣癌の診断を示し；ＩｇＧ２＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４の存在は中期卵巣癌の診断を示し、ＩｇＧ２３ＩｇＧ３＝ＩｇＧ４＞ＩｇＧ１の存在は進行卵巣癌を示す。
【００２０】
本明細書に記載されている方法のいくつかの実施形態において、上記対象はヒト（例えば、卵巣癌を有していることがわかっているヒトまたは卵巣癌を有している疑いがあるヒト）である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、上記サンプルは、上記対象からの血清を含んでいる。
【００２２】
別段の定めがない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解される場合と同じ意味を有している。方法および材料が、本発明の利用のために、本明細書において記載されている；当該技術分野において公知の他の適当な方法および材料が同様に用いられ得る。材料、方法、および実施例は例証的なだけであり、限定される意図ではない。全ての公開、特許出願、特許、配列、データベース登録、および本明細書において言及されている他の参照は、その全体が参照によって援用される。矛盾する場合において、本明細書（定義を含む）が優先され得る。本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明白になるであろう。
【００２３】
〔図面の説明〕
図１のＡ〜Ｂは、卵巣腫瘍細胞の特定の細胞区画から単離されたタンパク質に対する、患者の免疫反応性の代表的なウエスタン免疫ブロットである：サイトゾル（Ｃと称する）、膜（Ｍと称する）および核（Ｎと称する）。タンパク質の認識は１：１００に希釈した患者の血清を用いた。代表的な血清は（１Ａ）正常な、同年齢の女性の対照、および（１Ｂ）良性卵巣腫瘤（漿液性腺腫）を患っている患者から得た。
【００２４】
図２のＡ〜Ｃは、卵巣腫瘍細胞の特定の細胞区画から単離されたタンパク質に対する、患者の免疫反応性の代表的なウエスタン免疫ブロットを示している：サイトゾル（Ｃと称する）、膜（Ｍと称する）および核（Ｎと称する）。タンパク質の認識は１：１００に希釈した患者の血清を用いた。代表的な血清は（２Ａ）ステージＩの卵巣癌を患っている患者、（２Ｂ）ステージＩＩの卵巣癌を患っている患者、および（２Ｃ）ステージＩＩＩの卵巣癌を患っている患者から得た。各ステージについてのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を表す代表的な免疫ブロットは、同一の患者の血清を利用したものである。
【００２５】
図３は、特定の細胞区画（サイトゾル（Ｃ）、膜（Ｍ）および核（Ｎ））に由来する抗原に対する、正常な対照（ｎ＝２０）、良性疾患を患っている女性（ｎ＝１５）および様々なステージの卵巣癌を患っている患者（ステージＩ，ｎ＝１５；ステージＩＩ，ｎ＝１５；ステージＩＩＩ，ｎ＝１５）に由来する血清の免疫反応性を表しているウエスタン免疫ブロットの定量化の結果を示す棒グラフである。棒は各群の患者についての全免疫反応性の平均を表す。黒棒は４０ｋＤより大きい抗原に対する平均の反応性を表し、白棒は４０ｋＤより小さい抗原に対する平均の反応性を表す。
【００２６】
図４のＡ〜Ｃは、ステージＩおよびステージＩＩＩの卵巣癌患者によって認識されたタンパク質の２−ＤＩＧＥの結果を示している。ステージＩの癌患者由来のＩｇＧを用いたアフィニティカラムを用いて免疫精製された細胞タンパク質をＣｙ２（４Ａ）と称し、ステージＩＩＩの癌患者由来のＩｇＧを用いたアフィニティカラムを用いて免疫精製された細胞タンパク質をＣｙ３（４Ｂ）と称した。Typhoonイメージスキャナを用いてゲルをスキャンした。各スキャンはCyDyeシグナルのうちの１つを呈した。単独の画像および重ね合わせの画像（４Ｃ）を含む画像表示データを生成するために、ImageQuantソフトウェアを用いた。重ね合わせの画像において、ステージＩの疾患と関連する抗原の例を中間の灰色（オリジナルにおいて緑色）で囲み、ステージＩＩＩと関連する成分の例を濃い灰色（オリジナルにおいて赤色）で囲み、共通する成分の例を薄い灰色（オリジナルにおいて黄色）で囲んだ。
【００２７】
図５は、模範的な卵巣癌の臨床的判断ツリーであり、バイオマーカーとしての腫瘍反応性ＩｇＧの利用に関してカギとなる箇所を示している。
【００２８】
図６は、卵巣癌を患っている患者によって認識された腫瘍由来抗原の２−ＤＩＧＥイメージの画像である。スポット１、１７〜２１、２８〜３２、およびＡ〜Ｃ（オリジナルにおいて緑色）は、ステージＩ疾患の卵巣癌患者に由来するＩｇＧによって認識された抗原タンパク質である。スポット２〜１６および２２〜２７（オリジナルにおいて赤色）は、ステージＩＩＩ疾患の卵巣癌患者に由来するＩｇＧによって認識された抗原タンパク質である。最も明るいスポット（画像の上部、中央の真左；オリジナルにおいて黄色）は、両方によって認識された抗原である。
【００２９】
図７は、ステージＩ疾患またはステージＩＩＩ疾患の卵巣癌患者に由来する血清を用いた免疫反応性スポットの代表的な比較を示している。上側のパネルは示された特定のスポットについての２−Ｄゲルの結果を表す。下側のパネルはそれらスポットの定量化を表す。
【００３０】
図８のＡ〜Ｂは、正常な対照（ｎ＝４０）、良性疾患を患っている女性（ｎ＝４０）および様々なステージの卵巣癌を患っている患者（ステージＩ，ｎ＝３５；ステージＩＩ，ｎ＝２５；ステージＩＩＩ，ｎ＝４０；ステージＩＶ，ｎ＝２５）に由来する血清の、ヌクレオホスミン、カテプシンＤ、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）、ホメオボックスＡ７（ＨｏｘＡ７）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａ（ＨＳＰ９０）、ムチン１６、細胞表面関連（Ｍｕｃ１６）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（癌／精巣抗原１Ｂとしても知られている）、ｐ５３、アルカリホスファターゼ、胎盤性１（ＰＬＡＰ）、ＳＳＸ共通抗原、サバイビン、および腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）に対する免疫反応性を表すドット免疫スポットの定量化の結果を示す各６つの箱ひげ図である。＊は対照または良性の何れかより有意に差がある（ｐ＜０．０５）ことを示す。
【００３１】
図９は、正常な対照、ならびに膵臓癌（ｎ＝１５）、肺癌（ｎ＝１５）、乳癌（ｎ＝１５）、大腸癌（ｎ＝１５）、および卵巣癌（ｎ＝４０）を患っている女性に由来する血清の免疫反応性を表すドット免疫スポットの定量化の結果を示す６つの箱ひげ図のセットである。＊は対照より有意に差がある（ｐ＜０．０５）ことを示す。
【００３２】
〔詳細な説明〕
本明細書において記載されているように、卵巣癌患者由来の血清は、対照または良性疾患を患っている女性と比べて、顕著に大きい免疫反応性を示した。後期の患者はより強い強度において、より多いタンパク質を認識したが、段階特異的な異なる認識パターンがＩｇＧサブクラスにおいてみられた（最大の認識がＩｇＧ２サブクラスにおいてみられた）。ステージＩおよびＩＩの患者由来のＩｇＧ２およびＩｇＧ３における免疫反応性は、＞４０ｋＤの核の抗原について最も強いようであるが、一方、ステージＩＩＩの患者において、さらなる免疫反応性が＜４０ｋＤの成分において存在した。また、ステージＩＩＩの患者は、＜４０ｋＤの膜の抗原との類似の反応を示した。段階に関連する３２個の抗原の相違（早期卵巣癌における１１個および後期卵巣癌における２１個）を２Ｄ電気泳動が明らかにした。このように、体液性応答のタイミングおよび安定性によって、特定の腫瘍抗原を認識するＩｇＧサブクラスの定量化が、早期の癌の同定に対して優れたバイオマーカーを提供し、良性卵巣腫瘤と、悪性卵巣腫瘤ならびに早期癌および後期癌とを区別することができる。
【００３３】
免疫監視の概念は、免疫細胞が突然変異に関して宿主細胞をスキャンし、検出された場合には、変異細胞は根絶されることを提案する。重要な文献は、免疫抑制状態に関連する癌に言及しているが、癌の発達に関連する、Ｔｈ１からＴｈ２へのシフトが存在することはより確実であり得る。Ｔｈ２細胞はＴ細胞受容体によって、抗原に対する極度の感受性を有している。そのため、Ｔｈ２細胞の活性化は、免疫抑制の抗原特異的メカニズムである。一般に、腫瘍成分を認識するＴｈ２主導の抗体応答は、非防御的であり、Ｔｈ１細胞介在免疫応答を示すことによって腫瘍進行に寄与し得る（Clerici M, Clerici E, Shearer GM, J Natl Cancer Inst 1996, 88(7):461-2）。移植可能な腫瘍によって生成される「強力な」Ｔｈ１免疫応答と比較して、自然発生腫瘍は量的に軽いＴｈ２免疫応答を誘発する。このように、自然発生腫瘍は適切な免疫応答を刺激しないものであり得るが、腫瘍を根絶するために十分ではない非防御的な体液性免疫応答をむしろ誘発する。特に、「弱い」免疫応答は腫瘍の免疫的認識が起こる状態であるが、根絶は達成されない。
【００３４】
卵巣癌における非防御的な体液性応答の誘発は、腫瘍を根絶することができないが、これら腫瘍反応性免疫グロブリンの出現（このＴｈ２シフトに関連する）は、癌の特性であるようであり、それゆえ卵巣癌の発達に関連する事象のバイオマーカーとしての有用性を有し得る。血液循環における特定のタンパク質の出現は癌を示すものであり得るが、それらと、癌ではない病状とのさらなる関連は、それらの特異性を減少させ、癌のスクリーニングにおけるそれらの使用を妨げる。腫瘍由来抗原の広範なアレイを用いて、評価された全ての癌患者において、特異的な免疫反応性が検出されている（Taylor DD, Homesley HD, Doellgast GJ., Am J Reprod Immunol 1984, 6:179-184; Marx D, Frey M, Zentgraf H, Adelssen G, Schauer A, Kuhn W, Meden H., Cancer Detect & Prevent 2001, 25:117-22）；しかしながら、癌を有していないボランティアからの抗体によるこれらタンパク質の認識は、稀な（＜１％）事象である（Pfreundschuh M., Cancer Chemother Pharmacol 2000, 46 (suppl):S3-S7）。このように、腫瘍由来タンパク質に対する体液性応答の誘発は、癌特異性を向上させるようである。我々のアッセイ系において、癌を有していない対照または良性卵巣疾患を患っている女性において、わずかなレベルの腫瘍反応性抗体が検出されただけである（図１）。我々の以前の発表において、我々は、正常な卵巣から単離した抗原に対する患者由来の免疫グロブリンの反応性を述べた（Gercel-Taylor C, Bazzett LB, Taylor DD., Gynecol Oncol 2001, 81:71-76; Taylor DD, Gercel-Taylor C., Oncol Rep 1998 Nov-Dec, 5(6):1519-24; Taylor DD, Homesley HD, Doellgast GJ., Am J Reprod Immunol 1984, 6:179-184; Taylor DD, Gercel-Taylor C, Parker LP., Gynecol Oncol 2009, 115:112-120）。これらの研究は、正常な卵巣の抗原集団の範囲内における１から２本のバンドの認識を実証した。正常な対照においてみられるバックグランドの反応性が、抗体のＦｃまたはＦａｂ部分を介する結合を表しているか否かを明らかにすることは、解析の設計に起因して不可能である。それとは関係なく、ほんのわずかな（２〜４つ）成分が膜および核の抗原において弱く認識され、ＩｇＧサブクラス間において有意な差はみられなかった（図１のＡおよび図３）。さらなる膜および核の抗原が、良性卵巣疾患を患っている患者由来のＩｇＧによって、ＩｇＧ３サブクラスのうちで顕著に大きい反応性を伴って、弱く認識された（図１のＢおよび図３）。
【００３５】
我々のオリジナルの報告書において、卵巣癌患者における腫瘍反応性免疫グロブリンの存在を実証し、癌抗原の自己血清学的分類の基礎を確立したところ（Taylor DD, Doellgast GJ., Analytical Biochem 1979, 98:53-59）、優勢な抗体がＩｇＧクラスに属することがわかった。ＩｇＧは体液性免疫応答の主要なエフェクター分子であり、血液循環中の全免疫グロブリンの約７５％を占め、二次抗体応答の間にそれらの反応性を発現する。ヒトＩｇＧ区分は、４つの異なるサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４と称される）からなり、それらの平均血清濃度は、ＩｇＧ１が６．８９ｍｇ／ｍｌであり、ＩｇＧ２が３．８０ｍｇ／ｍｌであり、ＩｇＧ３が０．５１ｍｇ／ｍｌであり、ＩｇＧ４が０．５６ｍｇ／ｍｌである。ＩｇＧの主な生物学的活性は、それらのエフェクター機能に関連しており、例えば、補体の活性化、および抗体依存性の細胞障害活性を介在するためにＦｃ受容体に結合することが挙げられる。それらの重鎖は＞９５％の配列相同性を示すが、ＩｇＧサブクラスは特有のエフェクター活性プロファイルを発現する（Ravetch JV, Bolland S. IgG Fc receptors. Annual Rev Immunol 2001; 19:275-290）。一般的に、タンパク質抗原は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３の応答を特徴的に誘発し、これらアイソタイプは全てのＦｃ受容体および補体のＣ１成分を活性化することが可能である。ＩｇＧ４サブクラスの誘発は、慢性抗原刺激に特有であるようである（自己免疫疾患においてみられるなど）；ＩｇＧ４は限定的なＦｃ受容体の活性化を示し、Ｃ１ｑを活性化しない。ＩｇＧ２サブクラスはしばしば、炭水化物の抗原に対する応答において優勢であり、同様に、限定的なＦｃ受容体およびＣ１ｑの活性化を示す（Ravetch JV, Bolland S. IgG Fc receptors. Annual Rev Immunol 2001; 19:275-290）。例えば、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）において、９−Ｏ−アセチル化シアル酸（ＡｃＳＡ）特異的ＩｇＧ２のレベルの上昇が誘発されたが、それはＦｃ受容体、補体カスケードおよび細胞媒介性細胞障害の活性化を誘発できなかった（そのグリコトープ結合能力は影響を受けていなかったにもかかわらず）（Bandyopadhyay S, Bhattacharyya A, Mallick A, Sen AK, Tripathi G, Das T, Sa G, Bhattacharya DK, Mandal C., Intl Immunol 2005, 17:177-191）。抗９−ＯＡｃＳＡの、ＩｇＧ２へのサブクラスの切り替えは、腫瘍細胞のグリコシル化プロファイルにおける変化に関連していた。毎日の低用量のＩＬ−２に対して応答している、非血液性の腫瘍を患っている患者において、平均ＩｇＧ２レベルにおける顕著な増加がみられた；しかしながら、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３，またはＩｇＧ４レベルにおいて、顕著な変化はみられなかった（Soiffer RJ, Murray C, Ritz J, Phillips N, Jacobsohn D, Chartier S, Ambrosino DM., Blood 1995, 85:925-928）。
【００３６】
我々の研究において、評価した全ての卵巣癌患者が、ＩｇＧ２サブクラスにおいて、腫瘍由来抗原との最大の反応性を示している（図２および図３）。ステージＩおよびＩＩ疾患の患者において、このＩｇＧ２応答が、４０ｋＤより大きい核の抗原において最初に誘発された。ステージＩ疾患において、これら核の抗原は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４によって弱く認識されただけであった。我々の以前の研究は、他の研究と同様に、卵巣癌患者の「免疫抑制」状態が二相性であることを示した；早期癌において、抑制は抗原特異的であるようであり、一方、後期の疾患において、それは非特異的である（Taylor DD, Homesley HD, Doellgast GJ., Cancer Res 1980;40: 4064-4069）。我々の最近の結果はこの見解を支持した。ステージＩＩＩ疾患の患者が全てのＩｇＧサブクラスにおいて、広範囲の、類似する認識パターンを示す（それでもＩｇＧ２が顕著に高いレベルの腫瘍反応性を示すが）からである。
【００３７】
血清学的に定義されたバイオマーカーの解析は、一般に、患者の両極端（進行癌と完全に正常なボランティア）に焦点が当てられてきた。多くのバイオマーカーは、これら両極端に基づいて、スクリーニングおよび診断における利用のために必要な特異性および感受性を示す。しかしながら、良性疾患、前癌性疾患、早期癌および炎症性病状が含まれる場合、大抵のバイオマーカーは、臨床的利用に十分な感受性および特異性を達成できない。JacobsおよびMenonは、効果的なスクリーニングテストであるためには、アッセイは最低でも９９．６％の特異性を達成する必要があると算出した（Jacobs IJ, Menon U., Mol Cell Proteomics, 3:355-366, 2004）。近年、分析物として血清抗体を用いた包括的なエピトープ／抗原プロファイリングが、診断マーカー（特に、リスクの高い集団における）として大規模に調べられた（Chatterjee M, Wojciechowski J, Tainsky MA., Mol Biol 2009,  520:21-38; Chatterjee M, Mohapatra S, Ionan A, Bawa G, Ali-Fehmi R, Wang X, Nowak J, Ye B, Nahhas FA, Lu K, Witkin SS, Fishman D, Munkarah A, Morris R, Levin NK, Shirley NN, Tromp G, Abrams J, Draghici S, Tainsky MA., Cancer Res 2006, 66:1181-1190）。ファージディスプレイシステムを用いた組み換え抗原の、ハイスループットのセレクションと、アレイに基づいた血清学的検出との、この組み合わせは、機能の観点を除いて無作為な方法において、エピトープまたは腫瘍抗原の大きなパネルを定義した（Chatterjee M, Wojciechowski J, Tainsky MA., Mol Biol 2009, 520:21-38）。Chatterjeeら（Chatterjee M, Mohapatra S, Ionan A, Bawa G, Ali-Fehmi R, Wang X, Nowak J, Ye B, Nahhas FA, Lu K, Witkin SS, Fishman D, Munkarah A, Morris R, Levin NK, Shirley NN, Tromp G, Abrams J, Draghici S, Tainsky MA., Cancer Res 2006, 66:1181-1190）は、６５個の異なる抗原を同定し、３２人の卵巣癌患者からの血清において反応性があること、ならびに健康な女性の対照、および良性疾患または他の悪性の婦人科系疾患の何れかを患っている１４人の患者からの血清において反応性がないことを実証した。この技術のハイスループット能力にもかかわらず、種々の限定（バクテリアまたはファージ成分との高い交差反応性、元の腫瘍の中に存在する正常組織（リンパ系細胞が挙げられる）由来のｃＤＮＡの共発現、および癌に関連する翻訳後修飾およびプロセシングの非存在が挙げられる）を有しているが、それはこれら「人工の」タンパク質の標的の免疫反応性の喪失を招き得る（Nishikawa H, Tanida K, Ikeda H, Sakakura M, Miyahara Y, Aota T, Mukai K, Watanabe M, Kuribayashi K, Old LJ, Shiku H., Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98:14571-14576）。それら６５個の抗原のアレイを用いて、Chatterjeeら（Chatterjee M, Mohapatra S, Ionan A, Bawa G, Ali-Fehmi R, Wang X, Nowak J, Ye B, Nahhas FA, Lu K, Witkin SS, Fishman D, Munkarah A, Morris R, Levin NK, Shirley NN, Tromp G, Abrams J, Draghici S, Tainsky MA., Cancer Res 2006, 66:1181-1190）は、感受性および特異性がそれぞれ、わずか５５％および９８％であることを見出した。
【００３８】
近年の多くのバイオマーカー研究の決まった目的は、癌（段階に関係ない）の早期検出であった（Singh AP, Senapati S, Ponnusamy MP, Jain M, Lele SM, Davis JS, Remmenga S, Batra SK., Lancet Oncol 2008, 9: 1076-1085）。卵巣癌のための「新しい」バイオマーカーの多くは、癌特異性を欠いているか、または進行疾患に関連しているかの何れかである（Kim K, Visintin I, Alvero AB, Mor G., Clin Lab Med 2009, 29:47-55）。癌の生存を向上させるカギは、早期癌の検出である。なぜなら、癌がステージＩにおいて診断されれば、５年の生存率が９３％まで顕著に向上するからである。不幸なことに、卵巣癌のケースの１９％のみが、このステージで診断される。外科手術および化学療法における進歩にもかかわらず、進行卵巣癌を患っている患者の大多数が、最前線の治療を終えた後、１２〜１８ヶ月の間に再発し得る。再発のリスクは種々の因子（例えば、診断時の段階が挙げられ、ステージＩＶの患者の約９０〜９５％が再発する）に基づいて変化する。さらに、次善に（suboptimally）減量術を施されたステージＩＩＩの患者の８０〜８５％が再発し得、同様に、最適に減量術を施されたステージＩＩＩの患者の７０〜８０％が再発し得、ステージＩＩの患者の３０％が再発し得る。それに対して、ステージＩの患者の１０％未満が再発し得る。再発性卵巣癌は相変わらず致命的であり、再発性疾患の治療は一時的に軽くするものであり、一般に、疾患関連症状をコントロールすること、治療関連毒性を制限すること、生活の質を維持すること、および生存期間を延ばすことを目的として開始される（Herzog TJ., Clin Cancer Res 2004, 10:7439-7449）。それゆえ、臨床的有用性を有するために、バイオマーカーは９９．６％より高い特異性を伴って早期疾患を同定可能であることが不可欠である。卵巣癌の全てのステージについての、核および膜の抗原に対するＩｇＧ２およびＩｇＧ３の免疫反応性は、対照および良性疾患を患っている患者にみられるものよりも大きかった（図２および図３）。進行癌の患者においてみられる、より大きい反応性に加えて、認識された細胞性抗原の評価は、両方に共通する抗原および段階特異的な抗原を同定した（図４および表１）。このように、患者由来のＩｇＧ２による段階特異的タンパク質の認識は、卵巣癌の存在および段階の両方を明確にし得る。ＩｇＧ２サブクラスの範囲におけるエフェクター機能の非存在は、進行癌に関連する免疫抑制環境に対する重要な要因であり得る。ＩｇＧ２は特定の抗原の細胞認識を妨害し得、同様に、目標を定められる（targetable）抗原を、細胞表面から除去し得る。婦人科系腫瘍専門医にとってカギとなる別の論点は、超音波診断によって同定された良性卵巣腫瘤と悪性卵巣腫瘤とを区別することである。図１および図２に示されるように、腫瘍由来の核の抗原に対するＩｇＧ２の反応性の存在は、良性腺腫とステージＩの卵巣癌とを区別し得る。
【００３９】
これらの発見は、本明細書に記載されている診断方法の一実施形態を強調するが、それは二段階のアッセイからなり得る。以前に実証されたように、患者の体液性応答によって定義される抗原性タンパク質の多くは、癌の存在を明らかにするようであり、良性卵巣疾患由来のものと正常なものとを区別し得る（Taylor DD, Gercel-Taylor C, Parker LP., Gynecol Oncol 2009, 115:112-120）が、それはスクリーニングアッセイまたは卵巣腫瘤の性質を区別するためのアッセイの一段階目を構成し得る。二段階目として、サイトゾル、核および膜区画に由来する特定の抗原タンパク質が、段階特異性を示す（図４および表１参照）。認識が比較された最初の１２個の抗原のうち、ＰＬＡＰのみが、卵巣癌特異性を示した；しかしながら、我々の分析は他の卵巣特異的抗原の存在を示しており、最近これらは同定されている（Taylor DD, Gercel-Taylor C, Parker LP., Gynecol Oncol 2009, 115:112-120）。患者由来のＩｇＧ２およびＩｇＧ３によるこれらタンパク質の認識パターンは、卵巣癌の段階を明らかにし得る。
【００４０】
さらに、腫瘍発達の間のそれらの早期出現および末梢循環におけるＩｇＧの安定性によって、特定の腫瘍抗原を認識するＩｇＧサブクラスの定量化は、早期癌の同定のための優れたバイオマーカーを提供し、良性卵巣腫瘤と悪性卵巣腫瘤との区別を可能にする。
【００４１】
（使用方法）
本明細書に包含されるものは、本明細書に記載されている腫瘍関連抗原に特異的な自己抗体の存在を検出することに基づいて、癌（例えば、膵臓癌、肺癌、乳癌、大腸癌、または卵巣癌）を診断するおよび段階付ける方法である。タンパク質の存在および／またはレベルは、当該技術分野において公知の方法を用いて（例えば、定量的な免疫アッセイ法を用いて）評価され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質の存在および／またはレベルを検出するために、ハイスループットの方法（例えば、当該技術分野において公知であるようなタンパク質または遺伝子チップ（例えば、Ch. 12, Genomics, in Griffiths et al., Eds. Modern genetic Analysis, 1999; W. H. Freeman and Company, Ekins and Chu, Trends in Biotechnology, 1999, 17:217-218; MacBeath and Schreiber, Science 2000, 289(5485):1760-1763; Simpson, Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002; Hardiman, Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts, DNA Press, 2003を参照））が用いられ得る。
【００４２】
卵巣癌の模範的な臨床的判断ツリー（図５）において、バイオマーカー（腫瘍反応性抗体など）を適用するための３つの潜在的な時点がある。第一に、可能性のあるバイオマーカーは、リスクの高い集団において、または全集団において、無症候の個人における癌の検出のためにそれらを適用することによるスクリーニングのために用いられ得る。第二に、可能性のあるバイオマーカーは、疑わしいもしくは明白な腫瘤、超音波診断によって同定された腫瘤または骨盤もしくは腹部の痛みの症状を有している個人の明確な診断のために用いられ得る。第三に、可能性のあるバイオマーカーは、残存の疾患および転移性の疾患の治療応答を評価するために、および再発の早期同定のために、卵巣癌に関して治療された（手術および最前線の化学療法によって）個人における、疾患のモニタリングまたはフォローアップのために用いられ得る。本明細書に記載されているバイオマーカーは、上記のうちの１もしくは２つ以上の時点において、または上記の３つ全ての時点において、または他の時点（例えば、医療供給者または保険業者によって決定される場合）において、用いられ得る。
【００４３】
本明細書において卵巣癌は一例として用いられているが、本明細書に記載されている方法は同様に、他の癌（例えば、上皮起源の他の癌（例えば、癌腫（例えば、膵臓癌、肺癌、乳癌、または大腸癌）））のために用いられ得る。
【００４４】
〔実施例〕
本発明を以下の実施例においてさらに詳細に説明するが、特許請求の範囲に記載されている発明の範囲を限定するものではない。
【００４５】
（実施例１．腫瘍反応性ＩｇＧによる特定の抗原標的の認識）
卵巣腫瘍細胞の特定の区画に由来する標的タンパク質を用いて、正常な女性の対照および良性卵巣疾患を患っている女性において、体液性応答の存在を評価した。
【００４６】
Gynecologic Oncology Group Serum Bank（オハイオ州コロンバス）から入手した保存血清において実験を行った。血清は、ステージＩ（ｎ＝１５）、ステージＩＩ（ｎ＝１５）およびステージＩＩＩ（ｎ＝２０）において診断された漿液性乳頭状腺癌を患っている患者、または良性卵巣疾患（漿液性腺腫、ｎ＝１５）を患っている患者、および同年齢の女性のボランティア（ｎ＝２０）からの試料を含んでいた。卵巣の患者および良性卵巣疾患の患者からの血清を外科手術前に入手した。対照群は、普通の婦人科系の検査を受けている、同年齢の健康な女性（何かの癌の診断を受けていない、卵巣癌または乳癌に遺伝的にかかりやすくない、かつ、サンプル収集後少なくとも６ヶ月間疾患にかかっていない）からなっていた。全ての血清は−７０℃において保存されている。サンプル入手時における年齢、病理学的診断、および組織学的分析を、全ての群について入手した。腫瘍を有していない対照の平均年齢は５７．０±４．１才であり、対して卵巣癌を患っている患者は５８．１±５．２才、良性疾患を患っている患者は５６．９±５．３才であり、年齢の相違は有意ではなかった。ＣＡ１２５は診断マーカーとして十分には働かないと報告されてきたが、外科手術前のＣＡ１２５レベルを、患者記録から入手した。癌の徴候がない２０人の対照の対象のうち、５人（２５％）がＣＡ１２５レベル＞３５ｕｎｉｔｓ／ｍｌを示し、一方、良性卵巣腫瘤を有する１５人の女性のうち７人（４７％）が上昇したＣＡ１２５（＞３５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を示した。ステージＩの疾患を患っている１５人の患者のうち、９人がＣＡ１２５レベル＜３５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ（平均は２６．７４±１６．２２である）を示した。ステージＩＩＩの卵巣癌を患っている２０人の患者のうち、１８人の女性が１４２．１２±８２．３３ｕｎｉｔｓ／ｍＬである、上昇したＣＡ１２５の平均レベル（４２〜９３７に分布している）を示した。
【００４７】
体液性応答をウエスタン免疫ブロットによって評価した。ウエスタンブロット分析のために、腫瘍に由来する細胞タンパク質を以下のように調製した。全細胞タンパク質（細胞区画からのものが挙げられる）を、ステージＩＩＩｃの卵巣嚢胞腺癌を患っている女性から我々の研究所において確立した、ヒト卵巣腫瘍細胞系統から単離した（ＵＬ−ＢおよびＵＬ−Ｏと称する）。ＵＬ−Ｏ細胞は、乳癌／卵巣癌の家族歴がある４８才の白人女性に由来した（医療記録は患者がＢＲＣＡ１＋であることを示していた）。一方、ＵＬ−Ｂは、癌の家族歴がない７２才の白人女性に由来した（Taylor DD, Gercel-Taylor C., Gynecol Oncol 2008, 110:13-21）。これらの卵巣腫瘍細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％の胎仔ウシ血清、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２００ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンによって補完した）中で、加湿された５％ＣＯ２雰囲気において生育させる。細胞の生存率をトリパンブルー排除によって評価したところ、本研究に利用した全ての培養物は＞９５％生存していた。
【００４８】
タンパク質の細胞成分の分画を製造者の手順（BioVision, Mountain View, カリフォルニア州）に従って行った。２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて、腫瘍細胞の単層を徹底的に洗浄し、次いで、擦り取ることによって単層から取り除き、サイトゾル、膜、および核に由来する画分へ分離した。各細胞画分のタンパク質濃度を、Bradfordマイクロアッセイ（Bio-Rad Laboratories, Hercules, カリフォルニア州）を用いて決定した。適切な分画を評価するために、膜画分のタンパク質マーカー（胎盤型アルカリホスファターゼおよびＥｐＣＡＭ）、核画分のタンパク質マーカー（ヒストンＨ３）および細胞質画分のタンパク質マーカー（ＧＡＰＤＨ）を、ウエスタン免疫ブロット法によって評価する。抗体をSanta Cruz Biotechnologyから入手した。抗体は、抗ＰＬＡＰ（sc-47691）、抗ＥｐＣＡＭ（sc-73491）、抗ヒストンＨ３（sc-10809）および抗ＧＡＰＤＨ（sc-47724）であった。各細胞成分の画分は、それらの特異的マーカーに関してのみ、免疫ブロット上に検出可能なバンドを示した。
【００４９】
患者の自己抗体反応パターンを可視化するために、可溶化させたタンパク質（４０μｇ／レーン）を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、電気泳動によって分離させ（Laemmli UK., Nature 1970, 227, 680-685）、ウエスタン免疫ブロット法によって解析した（Brown R, Clugston C, Burns P, Edlin  A, Vasey P, Vojtesek B, Kaye SB., Int J Cancer 1993, 55, 678-684）。ニトロセルロース膜をSuperBlock（Pierce Chemical）を用いて３時間ブロッキングし、患者の血清（５％の脱脂粉乳をＴｗｅｅｎ２０と共に含んでいるＴＢＳ中に１：１００希釈した）を用いて４℃において一晩プローブさせ、続いてペルオキシダーゼと共役させた抗ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４（AbD Serotec, Raleigh, ノースカロライナ州）をプローブさせた。我々は、血清反応陽性の患者と血清反応陰性の対照とを区別するのに最適な希釈度を同定するための、患者および対照の血清の段階希釈を用いて、この試験のために当該１：１００希釈を予め決定した（Taylor DD, Homesley HD, Doellgast GJ., Am J Reprod Immunol 1984, 6:179-184）。結合した免疫複合体を増強した化学発光（ECL, Amersham Life Sciences, Arlington Heights, イリノイ州）によって可視化した。得られたＸ線フィルムをスキャンし、デジタル化して、Un-scan-itソフトウェア（Silk Scientific Corp., Orem, ユタ州）を用いて画素密度へ変換した。各細胞区画に由来する抗原（４０ｋＤより大きいか、または小さい）に対する免疫反応性を、各ゲル上に含まれる対照の基準（ＨＲＰ−抗マウスＩｇ）の画素値を用いて統一させた。免疫反応性のないレーンが１の値を示すように、統一させた画素値を、各ゲル上の陰性対照のレーンで割った。各患者について全く同じ（duplicate）ゲルを用い、これらのゲルから得られた比を平均した。各段階にある全ての患者の平均から、平均値および標準偏差を算出した。
【００５０】
２Ｄ  ＤＩＧＥ（２次元ディファレンスゲル電気泳動）タンパク質発現プロファイリングを以下のように行った。ステージＩの患者から溶出された、免疫アフィニティ単離した細胞タンパク質（３００μｇ）をＣｙ２と称する。ステージＩＩＩの患者由来のＩｇＧによってカラムから溶出されたタンパク質（３００μｇ）をＣｙ３と称した。第一の次元において等電点電気泳動（ＩＥＦ）を用い、第二の次元においてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、２つのサンプルを単一の２Ｄゲル上で同時に分離させた。電気泳動の後、Typhoonイメージスキャナを用いてゲルをスキャンした。各スキャンはCyDyeシグナル（Ｃｙ２およびＣｙ３）のうち１つを呈した。単独の画像および重ね合わせの画像を含む画像表示データを生成するために、ImageQuantソフトウェアを用いた。次いで、画像をDeCyderソフトウェア解析（多重のサンプルを自動的に探し出し、解析する）にかけた。２Ｄゲルスポットを移動させ、染色液および阻害化学物質を取り除くために洗浄し、最大量の消化バッファを吸収させるために乾燥した。乾燥した２Ｄゲルスポットをシークエンシンググレードの改質トリプシンを含んでいる消化バッファ（質量で１：３０）中で再水和させ、タンパク質をゲル中で３７℃において消化させた。トリフルオロ酢酸抽出バッファを用いて、消化されたペプチドをゲルから抽出し、消化されたトリプシンペプチドをC-18 Zip-tips（Millipore）を用いて脱塩した。脱塩したペプチドをＣＨＣＡマトリックス（α−シアノ−ヒドロキシケイ皮酸）と混合し、ＭＡＬＤＩプレートのウェル中へスポットした。各サンプル中のペプチドの質量スペクトル（ＭＳ）を、Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzerを用いて得た。各サンプルについて最も豊富なペプチドのうち少なくとも１０個をさらに、断片化およびタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）に供した。タンパク質の同定は、ペプチドフィンガープリント質量マッピングおよびペプチド断片化マッピング（ＭＳ／ＭＳスペクトルを用いた）に基づいた。組み合わせたＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルを、一次配列データベースからタンパク質を同定するために、MASCOT検索エンジンに装備されたGPS Explorerソフトウェアを用いて、データベース検索にかけた。
【００５１】
各患者による特定のタンパク質スポットの認識を、特定の抗原それぞれに対する抗体反応の存在または非存在によって階層化した。癌を有していない対照からの特定の抗原の存在と、卵巣癌の各段階における患者からの特定の抗原の存在との比較を、クラスカル・ワリスの検定によって行った。ｐ＜０．０５を有する検定は、統計学的に有意であるとみなされる。
【００５２】
結果を図１のＡ〜Ｂに示している。対照のサンプルは、ＩｇＧのサブクラスに関わらず、サイトゾル由来の抗原に対する反応性を何も示さなかった。対照は、全てのＩｇＧサブクラスにおいて、膜区画に由来する抗原において、５０ｋＤにおける単一バンドを認識した。また、これらの対照は、核画分において５０ｋＤの抗原を認識し、同様に全てのＩｇＧサブクラスにおいて５２および６０ｋＤにおける２本のバンドを認識した。また、ＩｇＧ３サブクラスは、さらなる弱い反応性のバンドを示す。良性疾患を患っている患者において、５０ｋＤのバンドが、全てのＩｇＧサブクラスに関して、膜画分および核画分において認識される。さらなる３４ｋＤのバンドが、全てのＩｇＧサブクラスに関して、全ての画分において認識される。１５〜３０ｋＤのバンド群が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４によって、膜画分において認識され、５５〜１００ｋＤのさらなる群が全てのＩｇＧサブクラスによって核画分において認識された。
【００５３】
次いで、腫瘍細胞系統から単離したタンパク質を用いて、ステージＩ（図２のＡ）、ステージＩＩ（図２のＢ）およびステージＩＩＩ（図２のＣ）の卵巣癌を患っている女性に由来する抗体を用いて、体液性免疫応答の存在を解析した。以前の研究では、癌患者の血清が正常な卵巣上皮において、わずか数本の少数のバンドに対する反応性を示すことを実証した（aylor DD, Gercel-Taylor C, Parker LP., Gynecol Oncol 2009, 115:112-120）。卵巣腫瘍由来抗原に関して、抗原の認識における相違がみられた。５０ｋＤのバンドの認識は全ての患者に共通しているようである。
【００５４】
ステージＩの患者（図２のＡ）に関して、ウエスタン免疫ブロットは、２０〜１４０ｋＤの分子量に分布している複数のバンドを同定した。この免疫反応性は、ＩｇＧ２＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＝ＩｇＧ４であった（図３）。ＩｇＧ２およびＩｇＧ３に関して、反応性は、核の抗原に関してより大きく、次いで膜の抗原が大きく、サイトゾルの抗原の認識が最小であった。対して、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４に関して、膜の抗原は最も大きい反応性を示し、次いでサイトゾルの抗原が大きく、核の抗原は反応性が最も小さかった。主な（primary）免疫反応性は、４０ｋＤより大きい分子量を示す抗原においてみられた。
【００５５】
ステージＩＩの卵巣癌を患っている患者に関して、ウエスタン免疫ブロットは、１０〜１４０ｋＤの分子量に分布している複数のバンドを同定した（図２のＢ）。この免疫反応性は、ＩｇＧ２＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４であった（図３）。全てのＩｇＧサブクラスに関して、反応性は核の抗原に関して、より大きく、次いで膜の抗原が大きく、サイトゾルの抗原の認識が最小であった。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４に関して、サイトゾル由来の抗原による有意な反応性はみられなかった。一方、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３に関して、より低い反応性（それぞれ、２．６８±１．２５および１．８５±０．８１）が、４０ｋＤ未満の抗原において主にみられた。全てのサブクラスにおいて類似する反応性によって、患者由来のＩｇＧは、膜区画に由来する＜４０ｋＤの抗原を主に認識した（ＩｇＧ１＝２．５９±０．６９、ＩｇＧ２＝２．７９±０．６３、ＩｇＧ３＝２．６１±０．７１、およびＩｇＧ４＝２．３８±０．５６）。
【００５６】
ステージＩＩＩの患者に関して、ウエスタン免疫ブロットは、１０〜１４０ｋＤの分子量に分布している複数のバンドを同定した（図２のＣ）。この免疫反応性は、ＩｇＧ２≧ＩｇＧ３＝ＩｇＧ４＞ＩｇＧ１であった（図３）。全てのＩｇＧサブクラスに関して、強度以外、認識パターンは同一のようであった。ＩｇＧ２およびＩｇＧ３に関して、反応性は核の抗原に関してわずかに大きく、次いで膜の抗原が大きく、サイトゾルの抗原の認識が最小であった。核の抗原に関して、反応性のレベルは、＜４０ｋＤの抗原および＞４０ｋＤの抗原について、ＩｇＧ２（それぞれ、４．６８±０．６３対４．７１±０．７２）およびＩｇＧ３（それぞれ、３．４２±０．５８対４．０８±０．６７）に関して類似していた。膜の抗原に関して、主な反応性が４０ｋＤ未満の抗原についてみられた：ＩｇＧ１は＜４０ｋＤの抗原について２．０８倍大きい（＞４０ｋＤの抗原に対する）反応性を示し、ＩｇＧ２は２．２７倍大きい反応性を示し、ＩｇＧ３は１．６４倍大きい反応性を示し、ＩｇＧ４は１．５１倍大きい反応性を示した。サイトゾル区画に由来する抗原は、＜４０ｋＤの抗原について類似するより大きい反応性を示した。
【００５７】
（実施例２．免疫反応性のある成分の同定）
患者のＩｇＧ認識を介在する抗原の正体を、２−ＤＩＧＥを用いて調べた（図４のＡ、Ｂ、Ｃ）。癌患者の反応性を解析する前に、良性卵巣疾患を患っている患者によって認識された抗原を、良性の患者由来のＩｇＧを用いて構成されたアフィニティカラムを用いた免疫吸着法によって除去した。
【００５８】
免疫反応性タンパク質を単離するための、患者の血清による免疫アフィニティカラムを用意するために、０．５ｍｌの結合用バッファ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）を用いて患者の血清（０．５ｍｌ）を希釈し、１ｍｌのHiTrap Protein Gカラム（GE Healthcare BioSciences, Piscataway, ニュージャージー州）にかけた。サンプルを室温において１時間カラムを再循環させ、次いで１０ｍｌの結合用バッファを用いて洗浄したか、またはサンプルを室温において、２８０ｎｍにおいて吸収する物質が流出液中に出なくなるまで再循環させた。次いで、HiTrapカラムに結合している患者由来のＩｇＧを、タンパク質Ｇと架橋させた。架橋するために、０．２Ｍのトリエタノールアミン，ｐＨ８．０を用いてカラムを平衡化し、２５ｍＭのＤＭＰ（ジメチルピメリデートジヒドロクロリド）を含んでいる１ｍｌの架橋バッファを加え、室温において４５分間インキュベートした。次いで、１ｍｌのブロッキングバッファ（０．１ｍＭのエタノールアミン，ｐＨ８．２）をカラムに加え、室温において１時間インキュベートした。免疫アフィニティカラムを結合用バッファを用いて２回洗浄し、続いて１ｍｌの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を加え、ＤＭＰと架橋していない抗体を溶出させた。
【００５９】
段階に関連する免疫反応性タンパク質を分離するために、ＵＬ−Ｂ細胞の単層をＰＢＳを用いて徹底的に洗浄し、次いで擦り取ることによって取り除いた。細胞を氷冷ＰＢＳ中に再懸濁し、４００ｘｇにおいて１０分間遠心した。細胞ペレットを１％のＮＰ−４０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＤＴＴ、ならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の混合溶液（Sigma-Aldrich, St. Louis, ミズーリ州）に溶解させ、この懸濁液を１０，０００ｘｇにおいて１５分間遠心した。上清を抗ヒトＩｇＧ、Ａ、Ｍ−アガロースと共に１時間インキュベートすることによって清澄にした。これらの可溶化した細胞タンパク質を、プールした患者由来のＩｇＧから構成した免疫アフィニティカラムにかけた。まず、卵巣疾患を患っている患者由来のＩｇＧから構成したアフィニティカラムを用いて、細胞タンパク質を予め吸着させた。結合していないタンパク質をステージＩの患者由来のＩｇＧまたはステージＩＩＩの患者由来のＩｇＧから構成したアフィニティカラムにかけた。これらのタンパク質を室温において１時間カラムを再循環させ、次いで１０ｍｌの結合用バッファ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）を用いて洗浄したか、またはこれらのタンパク質を、２８０ｎｍにおいて吸収する物質が流出液中に出なくなるまで再循環させた。次いで、１ｍｌの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を加えることによって、結合した物質をカラムから溶出させ、２８０ｎｍにおける吸光度をモニタリングした。各免疫アフィニティカラムから溶出されたタンパク質のピークを回収し、トリス塩基の添加によってｐＨを中和した。溶出したタンパク質のタンパク質濃度を、Bradfordマイクロアッセイによって決定した。
【００６０】
ステージＩの患者のＩｇＧから溶出したタンパク質をＣｙ２と称し、ステージＩＩＩから溶出したタンパク質をＣｙ３と称した。２−Ｄ分離の後、共通するスポットおよび特有のスポットを明らかにするために、多様なサンプルの解析を行った（図４のＣ）。この解析は、段階に関連する抗原の相違を３２個明らかにした。これらの特有のパターンのうち、１１個のタンパク質が、ステージＩの患者による認識の増大（４倍より大きい）を示し、２１個のタンパク質が、ステージＩＩＩの患者による認識の増大を示した。これらのうち、ペプチドフィンガープリント質量マッピングおよびペプチド断片化マッピング（ＭＳ／ＭＳスペクトルを用いた）を用いて、ステージＩおよびＩＩＩのそれぞれについて、６個の共通するタンパク質および５個の段階特異的なタンパク質の正体を決定した（表１）。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
表１に示されるように、ステージＩの患者によって選択的に（preferentially）認識される抗原のうち、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ＨＮＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１）および非転移性細胞１／非転移性細胞２（ＮＭＥ１／ＮＭＥ２）は核に局在化し、ピリドキサールキナーゼ、ガレクチン−１、および熱ショックタンパク質９０は一般的にサイトゾルにおいて発現する。ステージＩＩＩの患者によって選択的に（preferentially）認識される抗原のうち、zinc finger DHHC-type containing 7 アイソフォーム２、サバイビン、ｐ５３およびｐ７３は核に局在化し、ペルオキシレドキシンはサイトゾルに存在する。両方の患者群による認識を示しているタンパク質に関して、ヌクレオホスミン（Ｂ２３）、滑膜肉腫Ｘ切断点タンパク質（ＳＳＸ２、ＳＳＸ４）、およびＨｏｘＡ７は一般的に核に局在化するタンパク質に相当し、グルコース調節タンパク質７８は小胞体に局在化し、プロカテプシンＤはリソソームに存在する。
【００６３】
（実施例３．腫瘍細胞由来の抗原の特異な認識）
腫瘍細胞由来の抗原の特異な認識を明らかにするために、ＵＬ−６由来の可溶化した細胞性抗原を、早期卵巣癌または後期卵巣癌を患っている患者由来のＩｇＧによるそれらの特異的認識に基づいて単離した。これらの患者由来のＩｇＧをタンパク質Ｇ−Sepharoseカラム上で単離し、ＤＭＰを用いて架橋した。また、同様の方法において、良性卵巣疾患を患っている女性由来のＩｇＧを単離し、タンパク質Ｇと結合させた。まず、可溶化したタンパク質を、良性疾患に由来する免疫アフィニティカラムにかけた。これによって、これらの患者由来のＩｇＧと反応するタンパク質を除去した。次いで、結合していないタンパク質を早期または後期に由来するＩｇＧを用いて用意した免疫アフィニティカラムにかけた。カラムを徹底的に洗浄し、次いで溶出させた。溶出したタンパク質を２−ＤＩＧＥによって比較した。早期の患者から単離した反応性のあるスポットを、後期の患者と、デジタル化画像を重ね合わせることによって比較した。次いで、反応性のあるスポットを定量化し、４倍の増加／減少を示しているスポットをＭＳシークエンシングによって明らかにした。
【００６４】
結果を図６および図７に示している。全部で３２個の反応性のあるスポットが同定された。反応性のあるスポットとしては、ヌクレオホスミン、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ、ＮＭＥ１−ＮＭＥ２、核リボタンパク質Ａ２／Ｂ１、Ｚｎ−ＤＨＨＣ−containing７、およびアルドースレダクターゼアイソフォームが挙げられる。
【００６５】
（実施例４．卵巣ではない癌における反応性）
免疫吸着クロマトグラフィによって、培養細胞から特定の免疫反応性タンパク質を単離した。各タンパク質に対する市販の抗体を入手した：抗プロカテプシンＤ（ウサギモノクローナル、Calbiochem）、抗ＧＲＰ７８（ヤギポリクローナル、Santa Cruz Biotechnology [SCBT]）、抗ｐ５３（マウスモノクローナル、Abcam）、抗ヌクレオホスミン（マウスモノクローナル、Abcam）、抗胎盤型アルカリホスファターゼ（マウスモノクローナル、Abcam）、抗ＳＳＸ共通エピトープ（ウサギポリクローナル、SCBT）、抗サバイビン（ウサギポリクローナル、Abcam）、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１（マウスモノクローナル、SCBT）、抗Ｍｕｃ１６（マウスモノクローナル、SCBT）、抗ＨＳＰ９０（ラットモノクローナル、Abcam）、抗ＴＡＧ７２（マウスモノクローナル、Abcam）、および抗Ｈｏｘ７（マウスモノクローナル、SCBT）。卵巣腫瘍細胞系統に由来するタンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（０．３％のＳＤＳ、２ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、２００ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１μｇ／ｍＬのロイペプチン、１μｇ／ｍＬのアプロチニン、１μｇ／ｍＬのペプスタチン、および１ｍＭのＰＭＳＦを含んでいる）に氷上で可溶化させた。可溶化したタンパク質を免疫吸着カラムにかけ、４℃において一晩インキュベートした。特異的に結合したタンパク質を０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．８（１ＭのＴｒｉｓを用いて中和させた）を用いて溶出させた。
【００６６】
腫瘍の抗原と反応性のある免疫グロブリンに対するアレイアッセイを以下のように行った。精製したエキソソームタンパク質（２０ｎｇ／ｍＬタンパク質を含む２５０μＬ）を、バイオドット精密濾過装置（Bio-Rad Laboratories, Hercules, カリフォルニア州）を用いて、ニトロセルロース膜に付けた。対照として、段階希釈したヒトＩｇＧを、ブロットを統一させるための内部陽性対照として各膜上にスポットした。希釈したマウスＩｇおよびウサギＩｇを、陰性対照として各膜上にスポットした。ペルオキシダーゼと共役させたＩｇサンプルを試薬対照として、および配向のために、各膜上にスポットした。５％のＢＳＡを用いて膜をブロッキングし、次いでＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて３回洗浄し、ＴＢＳを用いて２回洗浄した。既知の癌患者および癌を患っていない対象からの血清（１：１００に希釈した）を、４℃において一晩、膜と共にインキュベートし、ペルオキシダーゼと共役させた抗ヒトＩｇＧと共にインキュベートし、ＥＣＬによって可視化した。得られたフィルムを画像化し、Kodak解析ソフトウェアを用いて解析した。全てのスポットについての画素値を取得し、内部陽性対照に基準を合わせた後、膜同士の比較を行った。最初の２０個の対照サンプルの最大基準化画素値として、正の値に対するカットオフをセットした。
【００６７】
その結果は、卵巣癌と同様に、膵臓癌、肺癌、乳癌、および大腸癌を包含する癌について、いくつかの抗原の反応性を示す。反応性（正常な女性の対照に由来する血清、良性卵巣疾患を患っている女性に由来する血清、および卵巣癌患者に由来する血清）を明らかにするためにドットブロットアレイを用いて、各抗原の平均画素を決定し、プロットした（図８のＡ〜Ｂ）。正常な対照および良性疾患の女性の両方についての免疫反応性は、試験した全ての抗原に対して陰性であると判断された。癌の全ての群についての平均は、対照および良性の場合と統計学的に異なっていた。試験した抗原の大部分に関して、平均の反応性（画素値）は、早期の疾患（ステージＩおよびＩＩ）よりも、ステージＩＩＩおよびＩＶの疾患において大きかったが、その差は有意ではなかった。しかしながら、Ｍｕｃ１６、ｐ５３、ＰＬＡＰおよびサバイビンに関して、反応性は早期の疾患よりも、進行した疾患において有意に大きかった。
【００６８】
進行した膵臓癌、肺癌、乳癌、および大腸癌を患っている女性に由来する血清についての研究を繰り返したところ、対照の女性と卵巣癌患者とを比較した場合、試験した全ての癌患者が、ヌクレオホスミン、カテプシンＤ、ｐ５３、およびＳＳＸ抗原を認識する抗体を生成することが示された（図９）。卵巣癌患者だけが、胎盤型アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）を認識するようである。肺癌および大腸癌の患者は、サバイビンをより強く認識するようである。
【００６９】
〔他の実施形態〕
本発明はその詳細な説明と組み合わせて記載されているが、上述の説明は例示することが意図され、かつ本発明の範囲を限定しないことが意図されるものであり、本発明は付随の特許請求の範囲によって規定されることが理解されるであろう。他の局面、利益、および変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】卵巣腫瘍細胞の特定の細胞区画から単離されたタンパク質に対する、患者の免疫反応性の代表的なウエスタン免疫ブロットを示す図である。
【図２】卵巣腫瘍細胞の特定の細胞区画から単離されたタンパク質に対する、患者の免疫反応性の代表的なウエスタン免疫ブロットを示す図である。
【図３】特定の細胞区画（サイトゾル（Ｃ）、膜（Ｍ）および核（Ｎ））に由来する抗原に対する、正常な対照（ｎ＝２０）、良性疾患を患っている女性（ｎ＝１５）および様々なステージの卵巣癌を患っている患者（ステージＩ，ｎ＝１５；ステージＩＩ，ｎ＝１５；ステージＩＩＩ，ｎ＝１５）に由来する血清の免疫反応性を表しているウエスタン免疫ブロットの定量化の結果を示す棒グラフを示す図である。
【図４】ステージＩおよびステージＩＩＩの卵巣癌患者によって認識されたタンパク質の２−ＤＩＧＥの結果を示す図である。
【図５】模範的な卵巣癌の臨床的判断ツリーを示す図である。
【図６】卵巣癌を患っている患者によって認識された腫瘍由来抗原の２−ＤＩＧＥイメージの画像を示す図である。
【図７】ステージＩ疾患またはステージＩＩＩ疾患の卵巣癌患者に由来する血清を用いた免疫反応性スポットの代表的な比較を示す図である。
【図８】正常な対照（ｎ＝４０）、良性疾患を患っている女性（ｎ＝４０）および様々なステージの卵巣癌を患っている患者（ステージＩ，ｎ＝３５；ステージＩＩ，ｎ＝２５；ステージＩＩＩ，ｎ＝４０；ステージＩＶ，ｎ＝２５）に由来する血清の、ヌクレオホスミン、カテプシンＤ、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）、ホメオボックスＡ７（ＨｏｘＡ７）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａ（ＨＳＰ９０）、ムチン１６、細胞表面関連（Ｍｕｃ１６）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（癌／精巣抗原１Ｂとしても知られている）、ｐ５３、アルカリホスファターゼ、胎盤性１（ＰＬＡＰ）、ＳＳＸ共通抗原、サバイビン、および腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）に対する免疫反応性を表すドット免疫スポットの定量化の結果を示す各６つの箱ひげ図を示す図である。
【図９】正常な対照、ならびに膵臓癌（ｎ＝１５）、肺癌（ｎ＝１５）、乳癌（ｎ＝１５）、大腸癌（ｎ＝１５）、および卵巣癌（ｎ＝４０）を患っている女性に由来する血清の免疫反応性を表すドット免疫スポットの定量化の結果を示す６つの箱ひげ図のセットを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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