(57)【要約】天然ヒト白血球抗原および変性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を含む組成物、および当該組成物を作製するための方法が、本明細書中で提供される。天然ＨＬＡに対する抗体を検出するための方法およびキットも、本明細書中で提供される。天然ＨＬＡは、その組成物の大部分を占める主成分であり、それは選択的酵素反応によって、混合組成物中の天然ＨＬＡを濃縮することによって作製される。一局面において、本発明の組成物は、少なくとも９０％の天然ヒト白血球抗原および多くても１０％の変性ヒト白血球抗原を含む。
2013519902.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも９０％の天然ヒト白血球抗原および多くても１０％の変性ヒト白血球抗原を含む、組成物。
【請求項２】
前記ヒト白血球抗原が、クラスＩヒト白血球抗原、クラスＩＩヒト白血球抗原およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ヒト白血球抗原がクラスＩヒト白血球抗原である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒト白血球抗原のうちの少なくとも９０％が、同じ対立遺伝子のものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ヒト白血球抗原が固体担体に結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記固体担体が、複数のビーズ、複数のマイクロビーズ、複数の微粒子、複数のマイクロスフィア、ウェル、膜、ポリマー、フィルターおよびマイクロアレイならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記固体担体が複数のマイクロビーズである、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記固体担体が、シリカ、金、ラテックス、ポリスチレン、ポリスルホン、ヒドロゲル、ポリ塩化ビニル、ガラスおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される材料を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記固体担体が検出可能な標識を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記検出可能な標識が、蛍光色素、放射性標識、磁気標識、バーコードまたはそれらの組み合わせである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ヒト白血球抗原が、前記固体担体に共有結合される、請求項５に記載の組成物。
【請求項１２】
複数の前記固体担体を含む、請求項５に記載の組成物であって、ここで、該複数の固体担体のうちのある特定の固体担体に結合した前記ヒト白血球抗原のうちの少なくとも９０％が、同じ対立遺伝子のものであり、該複数の固体担体のうちの各々の固体担体が、該複数の固体担体のうちのその他の固体担体に関して、異なるヒト白血球抗原対立遺伝子を結合する、組成物。
【請求項１３】
前記天然ヒト白血球抗原および前記変性ヒト白血球抗原がクラスＩヒト白血球抗原である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記複数の固体担体が、４またはそれより多い固体担体を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記複数の固体担体が、８またはそれより多い固体担体を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記複数の固体担体が、１６またはそれより多い固体担体を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記複数の固体担体が、３２またはそれより多い固体担体を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
少なくとも９０％の天然ヒト白血球抗原および多くても１０％の変性白血球抗原を含む組成物を作製する方法であって、該方法は：
ａ．天然ヒト白血球抗原および変性ヒト白血球抗原を含む第１の組成物と、セリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、またはアミダーゼとを、該セリンプロテアーゼ、該リパーゼ、該エステラーゼ、または該アミダーゼが、該変性ヒト白血球抗原を消化する条件下で接触させる工程；ならびに
ｂ．該セリンプロテアーゼ、該リパーゼ、該エステラーゼ、または該アミダーゼを中和して、少なくとも９０％の天然ヒト白血球抗原および多くても１０％の変性白血球抗原を含む結果として生じる組成物を得る工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記ヒト白血球抗原が、天然クラスＩヒト白血球抗原および変性クラスＩヒト白血球抗原を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒト白血球抗原が、１またはそれより多い固体担体に結合される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒト白血球抗原が、複数のマイクロビーズまたは微粒子に結合される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の組成物を、セリンプロテアーゼと接触させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記セリンプロテアーゼが、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サブチリシンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の組成物をリパーゼと接触させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記リパーゼがホスホリパーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の組成物を、エステラーゼと接触させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記エステラーゼが、アセチルコリンエステラーゼである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記エステラーゼが、チオエステラーゼである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の組成物を、アミダーゼと接触させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
天然ヒト白血球抗原に結合する抗体をスクリーニングする方法であって、該方法は：
ａ．サンプルと請求項５に記載の組成物とを接触させる工程；
ｂ．該組成物への抗体の結合を検出する工程であって、該組成物への抗体の結合は、該天然ヒト白血球抗原に特異的な抗体を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３１】
抗体の結合を検出する前記工程を、フローサイトメトリーを使用して実行する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体の結合を検出する前記工程を、二次抗体を使用して実行する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記二次抗体が、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、アビジン標識、ビオチン標識およびそれらの組み合わせからなる群より選択される標識を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物が、複数のマイクロビーズまたは微粒子を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が複数のマイクロビーズを含み、該複数のマイクロビーズのうちの各々のマイクロビーズが検出可能な標識を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記検出可能な標識が、蛍光色素、放射性標識、磁気標識またはバーコードである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項５に記載の組成物および該組成物への抗体の結合を検出するための試薬を含む、キット。
【請求項３８】
前記試薬が二次抗体を含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記二次抗体が、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、アビジン標識およびビオチン標識からなる群より選択される標識を含む、請求項３８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願への相互参照
この出願は、米国仮出願第６１／３３８，２５８号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
２．本発明の分野
本明細書中で提供される組成物および方法は一般的に、例えば天然ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に対する抗体の検出において有用である組成物、およびその調製方法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
３．背景
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、ヒト細胞の表面の抗原に結合し、そしてエフェクターＴ細胞に対してそれを提示し得る。２つの主なＨＬＡのクラス、クラスＩ  ＨＬＡおよびクラスＩＩ  ＨＬＡが、外来性抗原および天然抗原の両方を提示する。クラスＩ  ＨＬＡは、ウイルスおよび腫瘍特異的タンパク質を含む、細胞内で産生されたペプチド抗原に結合し、そしてＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ））に提示し得る。クラスＩ  ＨＬＡを有する細胞によって提示された外来性抗原に反応して、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞は、その外来性抗原を提示している細胞を破壊し得る。クラスＩＩ  ＨＬＡは、細胞外由来のペプチド抗原に結合し、そしてＣＤ４＋Ｔ細胞（例えばヘルパーＴ細胞）に提示し得る。クラスＩＩ  ＨＬＡを有する細胞によって提示された外来性抗原に反応して、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞は、体液性免疫反応を確立（ｍｏｕｎｔ）し得る。ＨＬＡは、ある癌および自己免疫疾患、および移植片拒絶において役割を果たすと考えられる。
【０００４】
ＨＬＡに対する抗体は、通常輸血、妊娠または移植から起こる同種免疫化によって産生される。それらはまた、非同種免疫化個体においても見出された。非特許文献１。移植レシピエントにおいて見出されたＨＬＡに対する抗体は、急性および慢性移植片拒絶反応の原因であることが示された。従って、レシピエントがドナーのＨＬＡに対する抗体を有しているかどうかを決定することが、レシピエントにおける移植片拒絶反応のリスクの決定において重要であり得る。
【０００５】
現在まで、ＨＬＡに結合した担体が、ＨＬＡに対する抗体の検出において有用であった。レシピエント由来のサンプルを担体と接触させ、そしてその担体に結合する抗体を、続いて従来の技術を用いて検出し得る。しかし、従来の担体は、典型的には天然ＨＬＡおよび変性ＨＬＡの両方に結合する。従って、これらの担体は、天然ＨＬＡに対する抗体および変性ＨＬＡに対する抗体を区別する能力が限られる。
【０００６】
いくつかの例において、天然ＨＬＡに対する抗体は、移植の失敗を予測するが、変性ＨＬＡに対する抗体は移植の失敗を予測しない。非特許文献２。従って、変性ＨＬＡに対する抗体の干渉無しに、天然ＨＬＡに対する抗体を検出し得る組成物および方法への必要性が存在する。そのような組成物および方法を、偽陽性のシグナルに起因して、例えばドナーＨＬＡに対する抗体に関してレシピエントをスクリーニングするアッセイが、代わりに変性ＨＬＡを検出する場合に、見込みのあるドナーが除外されることを防止するために使用し得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００８）８６：１１１１〜１５
【非特許文献２】Ｃａｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００９）８８（２）：２２６〜３１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
４．要旨
例えば、天然ＨＬＡに対する抗体を検出し得る組成物および方法が、本明細書中で提供される。最初の局面において、天然ＨＬＡおよび変性ＨＬＡを含む組成物が本明細書中で提供され、ここでその天然ＨＬＡは、相当量存在する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９０％が天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても１０％が変性している。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９５％が天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても５％が変性している。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９９％が天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても１％が変性している。
【０００９】
いくつかの実施形態において、天然ＨＬＡおよび変性ＨＬＡを、クラスＩ  ＨＬＡ、クラスＩＩ  ＨＬＡ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択する。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡはクラスＩ  ＨＬＡである。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡは、クラスＩＩ  ＨＬＡである。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡは、クラスＩ  ＨＬＡおよびクラスＩＩ  ＨＬＡの組み合わせである。
【００１０】
天然ＨＬＡおよび変性ＨＬＡは、同じ対立遺伝子、または２つ以上の異なる対立遺伝子のものであり得る。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９０％が同じ対立遺伝子のものである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９５％が同じ対立遺伝子のものである。他の実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９９％が同じ対立遺伝子のものである。
【００１１】
いくつかの実施形態において、天然ＨＬＡおよび変性ＨＬＡは、固体担体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に結合する。そのＨＬＡを、当業者に公知のあらゆる技術によって、その固体担体に結合し得る。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡをその固体担体に直接結合する。他の実施形態において、そのＨＬＡをその固体担体に間接的に結合する。
【００１２】
その固体担体は、当業者に公知のあらゆる適当な材料から作製され得る。いくつかの実施形態において、その固体担体は、シリカ、金、ラテックス、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリスルホン、ヒドロゲル、ポリ塩化ビニル、ガラス、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される材料を含む。
【００１３】
さらに、その固体担体の形態は、当業者によって適当とみなされる任意の形態であり得る。いくつかの実施形態において、その固体担体は、複数のビーズ、複数のマイクロビーズ、複数の微粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、複数のマイクロスフィア、ウェル、膜、ポリマー、フィルター、マイクロアレイおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、その固体担体は、複数のマイクロビーズである。
【００１４】
いくつかの実施形態において、その固体担体は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態において、その検出可能な標識は、蛍光色素、放射性標識、磁気標識、またはバーコードを含む。ある実施形態において、その検出可能な標識は、蛍光色素である。
【００１５】
別の局面において、複数の固体担体を含むパネルが本明細書中で提供され、ここでその複数の固体担体のうちの各固体担体が、ＨＬＡに結合している、ここでＨＬＡのうちの少なくとも９０％が天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても１０％が変性している、ここで複数の固体担体のうち特定の固体担体に結合したＨＬＡの少なくとも９０％が同じ対立遺伝子のものであり、そしてここで複数の固体担体のうちの各固体担体が、複数の固体担体のうちの他の固体担体に関して、異なるＨＬＡに結合している。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡは、クラスＩ  ＨＬＡ、クラスＩＩ  ＨＬＡ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、その複数の固体担体は、４個の固体担体、８個の固体担体、１６個の固体担体、または３２個の固体担体を含む。
【００１６】
別の局面において、少なくとも９０％の天然ＨＬＡおよび多くても１０％の変性ＨＬＡを含む組成物を作製するための方法が本明細書中で提供される。その方法は、ａ）天然ＨＬＡおよび変性ＨＬＡを含む第１の組成物を、セリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、またはアミダーゼと、そのセリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、またはアミダーゼが変性ＨＬＡを切断する条件下で接触させる工程；ならびにｂ）そのセリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、またはアミダーゼを中和して、結果としてできる、少なくとも９０％の天然ＨＬＡおよび多くても１０％の変性ＨＬＡを含む組成物を生じる工程を包含する。ある実施形態において、そのＨＬＡは、溶液中に懸濁している。ある実施形態において、そのＨＬＡは１つ以上の固体担体に結合している。特定の実施形態において、そのＨＬＡは、複数のマイクロビーズまたは微粒子に結合している。
【００１７】
その方法のいくつかの実施形態において、そのＨＬＡを、セリンプロテアーゼと接触させる。特定の実施形態において、そのセリンプロテアーゼはトリプシンである。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡを、リパーゼと接触させる。特定の実施形態において、そのリパーゼはホスホリパーゼである。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡを、エステラーゼと接触させる。特定の実施形態において、そのエステラーゼは、アセチルコリンエステラーゼである。他の実施形態において、そのエステラーゼは、チオエステラーゼである。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡをアミダーゼと接触させる。
【００１８】
別の局面において、天然ＨＬＡに対する抗体をスクリーニングする方法が、本明細書中で提供される。この方法は、ａ）サンプルを、固体担体に結合したＨＬＡを含む組成物と接触させる工程であって、ここでＨＬＡのうちの少なくとも９０％が天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても１０％が変性している、工程；ならびにｂ）抗体の組成物に対する結合を検出する工程を含み、ここで抗体の組成物への結合は、天然ＨＬＡに対する抗体を示す。
【００１９】
いくつかの実施形態において、そのサンプルは生物学的サンプルである。いくつかの実施形態において、そのサンプルを、ヒト被験体から採取する。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、ヒト被験体から採取した血液サンプルである。
【００２０】
その組成物に対する抗体の結合の検出を、当業者に公知のあらゆる技術によって行い得る。いくつかの実施形態において、抗体の結合の検出を、フローサイトメトリーを用いて行う。いくつかの実施形態において、抗体の結合の検出を、二次抗体を用いて行う。特定の実施形態において、その二次抗体は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、アビジン標識、ビオチン標識、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される標識を含む。
【００２１】
別の局面において、天然ＨＬＡに対する抗体を検出するためのキットが、本明細書中で提供される。これらのキットは、ａ）固体担体に結合したＨＬＡを含む組成物であって、ここでＨＬＡのうちの少なくとも９０％が天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても１０％が変性している、組成物、ならびにｂ）その組成物に対する抗体の結合を検出するための試薬を含む。いくつかの実施形態において、その試薬は、二次抗体を含む。ある実施形態において、その二次抗体は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、アビジン標識、ビオチン標識、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、検出可能な標識を含む。
【００２２】
本明細書中で提供される組成物および方法は、変性ＨＬＡに対する抗体の望ましくない検出無しに、天然ＨＬＡに対する抗体の検出を有利に可能にする。天然ＨＬＡに特異的な抗体の検出は、ある例において、例えば変性ではなく天然ＨＬＡに対する抗体の存在が、移植の失敗を予測する場合、有用である。これらの状況下で、本明細書中で提供される組成物および方法は、見込みのあるドナーが、レシピエントにおける変性ＨＬＡに対する抗体の検出によって引き起こされる、偽陽性のシグナルに起因して除外されることを防止することを助け得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｃは、Ａ−遺伝子座（図１Ａ）、Ｂ−遺伝子座（図１Ｂ）、およびＣ−遺伝子座（図１Ｃ）クラスＩ  ＨＬＡに関する、ＬＡＢＳｃｒｅｅｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｅａｄｓ（ＬＳＡＢ）との、天然クラスＩ  ＨＬＡ（Ｗ６／３２）および変性クラスＩ  ＨＬＡ（ＨＣ１０）に特異的な抗体の反応性を示すグラフを提供する。それらは、Ｗ６／３２およびＨＣ１０両方のＬＳＡＢとの反応性を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｃは、Ａ−遺伝子座（図１Ａ）、Ｂ−遺伝子座（図１Ｂ）、およびＣ−遺伝子座（図１Ｃ）クラスＩ  ＨＬＡに関する、ＬＡＢＳｃｒｅｅｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｅａｄｓ（ＬＳＡＢ）との、天然クラスＩ  ＨＬＡ（Ｗ６／３２）および変性クラスＩ  ＨＬＡ（ＨＣ１０）に特異的な抗体の反応性を示すグラフを提供する。それらは、Ｗ６／３２およびＨＣ１０両方のＬＳＡＢとの反応性を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｃは、Ａ−遺伝子座（図１Ａ）、Ｂ−遺伝子座（図１Ｂ）、およびＣ−遺伝子座（図１Ｃ）クラスＩ  ＨＬＡに関する、ＬＡＢＳｃｒｅｅｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｅａｄｓ（ＬＳＡＢ）との、天然クラスＩ  ＨＬＡ（Ｗ６／３２）および変性クラスＩ  ＨＬＡ（ＨＣ１０）に特異的な抗体の反応性を示すグラフを提供する。それらは、Ｗ６／３２およびＨＣ１０両方のＬＳＡＢとの反応性を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｃは、Ｗ６／３２およびＦＣ１０の、Ａ−遺伝子座（図２Ａ）、Ｂ−遺伝子座（図２Ｂ）およびＣ−遺伝子座（図２Ｃ）クラスＩ  ＨＬＡに関する、組成物（「天然ビーズ」）との反応性を示すグラフを提供する。これらの研究において使用した担体は、マイクロビーズである。これらのグラフは、ＬＳＡＢと比較して、組成物とのＨＣ１０の低い反応性を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｃは、Ｗ６／３２およびＦＣ１０の、Ａ−遺伝子座（図２Ａ）、Ｂ−遺伝子座（図２Ｂ）およびＣ−遺伝子座（図２Ｃ）クラスＩ  ＨＬＡに関する、組成物（「天然ビーズ」）との反応性を示すグラフを提供する。これらの研究において使用した担体は、マイクロビーズである。これらのグラフは、ＬＳＡＢと比較して、組成物とのＨＣ１０の低い反応性を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜図２Ｃは、Ｗ６／３２およびＦＣ１０の、Ａ−遺伝子座（図２Ａ）、Ｂ−遺伝子座（図２Ｂ）およびＣ−遺伝子座（図２Ｃ）クラスＩ  ＨＬＡに関する、組成物（「天然ビーズ」）との反応性を示すグラフを提供する。これらの研究において使用した担体は、マイクロビーズである。これらのグラフは、ＬＳＡＢと比較して、組成物とのＨＣ１０の低い反応性を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｃは、Ａ−遺伝子座（図３Ａ）、Ｂ−遺伝子座（図３Ｂ）、およびＣ−遺伝子座（図３Ｃ）ＨＬＡ対立遺伝子に関する、３人の非同種免疫化男性血清のＬＳＡＢおよび組成物（「天然ビーズ」）との反応性を示すグラフを提供する。これらの研究において使用した担体は、マイクロビーズである。これらのグラフは、ＬＳＡＢと比較して、組成物の改善された精度を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｃは、Ａ−遺伝子座（図３Ａ）、Ｂ−遺伝子座（図３Ｂ）、およびＣ−遺伝子座（図３Ｃ）ＨＬＡ対立遺伝子に関する、３人の非同種免疫化男性血清のＬＳＡＢおよび組成物（「天然ビーズ」）との反応性を示すグラフを提供する。これらの研究において使用した担体は、マイクロビーズである。これらのグラフは、ＬＳＡＢと比較して、組成物の改善された精度を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｃは、Ａ−遺伝子座（図３Ａ）、Ｂ−遺伝子座（図３Ｂ）、およびＣ−遺伝子座（図３Ｃ）ＨＬＡ対立遺伝子に関する、３人の非同種免疫化男性血清のＬＳＡＢおよび組成物（「天然ビーズ」）との反応性を示すグラフを提供する。これらの研究において使用した担体は、マイクロビーズである。これらのグラフは、ＬＳＡＢと比較して、組成物の改善された精度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
６．実施形態の詳細な説明
６．１  定義
本明細書中で使用される場合、「天然」、「天然ヒト白血球抗原」および「天然ＨＬＡ」という用語は、その天然の状態で、ＨＬＡの細胞外部分の構造的および抗原的特性を維持する、ＨＬＡまたはその断片を指す。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「天然クラスＩヒト白血球抗原」および「天然クラスＩ  ＨＬＡ」という用語は、重鎖またはその断片に非共有結合したβ２ミクログロブリンドメインを含む、その天然の状態でクラスＩ  ＨＬＡの細胞外部分の構造的および抗原的完全性を維持する、クラスＩヒト白血球抗原またはその断片を指す。いくつかの実施形態において、天然クラスＩ  ＨＬＡは、Ｗ６／３２およびＢＩＨ抗体（Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ｉｎｃ．）に結合し得る。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「天然クラスＩＩヒト白血球抗原」および「天然クラスＩＩ  ＨＬＡ」という用語は、お互いに非共有結合した２つのグリコシル化ポリペプチド鎖を含むヘテロダイマーを含む、その天然の状態でクラスＩＩ  ＨＬＡの細胞外部分の構造的および抗原的完全性を維持する、クラスＩＩヒト白血球抗原またはその断片を指す。いくつかの実施形態において、天然クラスＩＩ  ＨＬＡは、ＨＢ−１４５抗体（ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲに対する）、およびＨＢ−１８０抗体（ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ  ＤＲに対する）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））に結合し得る。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「変性」、「変性ヒト白血球抗原」、および「変性ＨＬＡ」という用語は、天然のコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）ではない細胞外ドメインを含むＨＬＡを指す。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「変性クラスＩヒト白血球抗原」および「変性クラスＩ  ＨＬＡ」という用語は、β２ミクログロブリンドメインを欠くクラスＩヒト白血球抗原またはその断片を指す。いくつかの実施形態において、変性クラスＩ  ＨＬＡは、ＨＣ１０抗体（Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ｉｎｃ．）およびＨＢ２９６抗体（ＡＴＣＣ）に結合し得る。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「変性クラスＩＩヒト白血球抗原」および「変性クラスＩＩ  ＨＬＡ」という用語は、モノマーコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）のクラスＩＩヒト白血球抗原またはその断片を指す。いくつかの実施形態において、変性クラスＩＩ  ＨＬＡは、ＨＢ−２９８（ＨＬＡ−ＤＲα鎖に対する）抗体（ＡＴＣＣ）に結合し得る。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「固体担体」という用語は、ＨＬＡを結合し得、そして本明細書中で提供される方法と適合性である、あらゆる固体担体を指す。固体担体の例は、複数のビーズ、複数のマイクロビーズ、複数の微粒子、複数のマイクロスフィア、ウェル、膜、ポリマー、フィルター、マイクロアレイおよびそれらの組み合わせを含む。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「同じＨＬＡ対立遺伝子」という用語は、同様の構造および抗原的特性を共有し、そして同じＨＬＡ遺伝子座および対立遺伝子由来である、２つ以上のＨＬＡ分子またはその断片を指す。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「異なるＨＬＡ対立遺伝子」という用語は、異なる構造および抗原的特性を有し、そして異なるＨＬＡ遺伝子座および対立遺伝子由来である、ＨＬＡ分子またはその断片を指す。
【００３３】
６．２  天然ＨＬＡに対する抗体を検出するための組成物
少なくとも９０％の天然ＨＬＡおよび多くても１０％の変性ＨＬＡを含む組成物が、本明細書中で提供される。ある実施形態において、その組成物を、天然ＨＬＡに対する抗体を検出するために使用し得る。天然ＨＬＡに対する抗体の検出は、例えば移植片拒絶反応の可能性の決定において有用であり得る。ある実施形態において、その組成物はまた、ＨＬＡワクチンの開発、およびエフェクターＴ細胞結合アッセイにおいて有用であり得る。
【００３４】
その組成物を、本明細書中で記載される方法を含む、当業者に明らかであるあらゆる技術によって作製し得る。その組成物の各要素を、下記でさらに詳細に議論する。
【００３５】
６．２．１．天然ＨＬＡ
いくつかの実施形態において、本明細書中で提供される組成物は、少なくとも９０％の天然ＨＬＡおよび多くても１０％の変性ＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡは固体支持体に結合している。他の実施形態において、そのＨＬＡは溶液中である。
【００３６】
天然クラスＩ  ＨＬＡは、ほとんどの有核ヒト細胞に存在する、５７ｋＤａの糖タンパク質である。天然クラスＩ  ＨＬＡは、典型的には１２ｋＤａのβ２ミクログロブリンドメインを含む軽鎖に結合した、４５ｋＤａのポリペプチド重鎖を含む。ある実施形態において、その重鎖は、軽鎖に非共有結合している。その重鎖は、典型的には３つのαサブユニット、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部を含む。α１およびα２サブユニットが、ペプチドリガンド結合のための結合溝を形成する。対照的に、変性クラスＩ  ＨＬＡは、β２ミクログロブリンドメインを欠く。
【００３７】
クラスＩ  ＨＬＡ重鎖は、３つの主要な遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ）のうちの１つ、または３つのマイナーな遺伝子（ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、およびＨＬＡ−Ｇ）のうちの１つによってコードされる。これらの遺伝子座のそれぞれにおける対立遺伝子バリエーションが、クラスＩ  ＨＬＡによって示される多型に寄与することを助ける。特定のクラスＩ  ＨＬＡを、遺伝子座、およびそのクラスＩ  ＨＬＡが発現する特定の対立遺伝子によって分類し得る。例示的なクラスＩ  ＨＬＡ対立遺伝子を、表１（ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子）、表２（ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子）、および表３（ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子）に列挙する。
【００３８】
天然クラスＩＩ  ＨＬＡは、専門化抗原提示細胞（例えばＢリンパ球、樹状細胞、およびマクロファージ）の表面に存在する、多型性の６１ｋＤａヘテロダイマータンパク質である。クラスＩＩ  ＨＬＡは、３つのサブクラス：ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲに分けられる。天然クラスＩＩ  ＨＬＡは、典型的にはお互いに結合したα鎖およびβ鎖を含む。ある実施形態において、そのα鎖およびβ鎖は、お互いに非共有結合している。対照的に、変性クラスＩＩ  ＨＬＡは、モノマータンパク質である。
【００３９】
クラスＩＩ  ＨＬＡの各鎖は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部を含む。６個の主なクラスＩＩ  ＨＬＡ遺伝子（ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１）が存在し、それぞれの遺伝子はα鎖またはβ鎖のいずれかをコードする。クラスＩ  ＨＬＡ遺伝子と同様、各クラスＩＩ  ＨＬＡ遺伝子は、多くの対立遺伝子を含む。クラスＩ  ＨＬＡおよびクラスＩＩ  ＨＬＡを、Ｐｅｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７５（１）：４３−４９（２００３）において記載されたような組換えＤＮＡ技術を含む、当業者に公知のあらゆる技術を用いて作製し得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、その組成物は、相当量の天然ＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９０％が天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても１０％が変性している。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９５％が天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても５％が変性している。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９９％が天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても１％が変性している。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９９．５％が天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても０．５％のＨＬＡが変性している。これらの組成物を作製するための技術を、下記で記載する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、その組成物は、クラスＩ  ＨＬＡ、クラスＩＩ  ＨＬＡ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、その組成物はクラスＩ  ＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、その組成物はクラスＩＩ  ＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、その組成物は、クラスＩ  ＨＬＡおよびクラスＩＩ  ＨＬＡの組み合わせを含む。
【００４２】
その組成物は、全長天然ＨＬＡ、またはその断片を含み得る。いくつかの実施形態において、その組成物は、全長天然クラスＩ  ＨＬＡを含み、各クラスＩ  ＨＬＡは、β２ミクログロブリン鎖に非共有結合した重鎖を含む。いくつかの実施形態において、その組成物は、全長クラスＩＩ  ＨＬＡを含み、各クラスＩＩ  ＨＬＡは、β鎖に非共有結合したα鎖を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、各ＨＬＡは、天然ＨＬＡ細胞外ドメインの構造上のおよび抗原的完全性を破壊しない、欠失、付加、またはアミノ酸置換のような修飾を含む。いくつかの実施形態において、各ＨＬＡは、天然クラスＩ  ＨＬＡの細胞外ドメインを含むクラスＩ  ＨＬＡである。いくつかの実施形態において、各ＨＬＡは、天然クラスＩ  ＨＬＡの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの断片を含むクラスＩ  ＨＬＡである。いくつかの実施形態において、各ＨＬＡは、天然クラスＩ  ＨＬＡの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むクラスＩ  ＨＬＡである。いくつかの実施形態において、各ＨＬＡは、天然クラスＩ  ＨＬＡの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部の断片を含むクラスＩ  ＨＬＡである。
【００４４】
いくつかの実施形態において、各ＨＬＡは、天然クラスＩＩ  ＨＬＡの細胞外ドメインを含むクラスＩＩ  ＨＬＡである。いくつかの実施形態において、各ＨＬＡは、天然クラスＩＩ  ＨＬＡの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの断片を含むクラスＩＩ  ＨＬＡである。いくつかの実施形態において、各ＨＬＡは、天然クラスＩＩ  ＨＬＡの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むクラスＩＩ  ＨＬＡである。いくつかの実施形態において、各ＨＬＡは、天然クラスＩＩ  ＨＬＡの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部の断片を含むクラスＩＩ  ＨＬＡである。
【００４５】
本明細書中で提供される組成物は、同じ対立遺伝子または２つ以上の異なる対立遺伝子のＨＬＡを含み得る。同じ対立遺伝子のＨＬＡは、同じ構造および抗原的特性を共有し、そして同じＨＬＡ遺伝子座および対立遺伝子由来である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９０％が同じ対立遺伝子のものである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９５％が同じ対立遺伝子のものである。他の実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９９％が同じ対立遺伝子のものである。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９０％が、同じ対立遺伝子のものであり、そしてＨＬＡ−ＡクラスＩ  ＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９０％が、同じ対立遺伝子のものであり、そして表１に列挙したＨＬＡ−ＡクラスＩ  ＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９０％が、同じ対立遺伝子のものであり、そしてＨＬＡ−ＢクラスＩ  ＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９０％が、同じ対立遺伝子のものであり、そして表２に列挙したＨＬＡ−ＢクラスＩ  ＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９０％が、同じ対立遺伝子のものであり、そしてＨＬＡ−ＣクラスＩ  ＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９０％が、同じ対立遺伝子のものであり、そして表３に列挙したＨＬＡ−ＣクラスＩ  ＨＬＡを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９０％が、同じ対立遺伝子のものであり、そしてＨＬＡ−ＤＰクラスＩＩ  ＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９０％が、同じ対立遺伝子のものであり、そしてＨＬＡ−ＤＱクラスＩＩ  ＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９０％が、同じ対立遺伝子のものであり、そしてＨＬＡ−ＤＲクラスＩＩ  ＨＬＡを含む。
【００４９】
６．２．２．固体担体
ある実施形態において、本明細書中で提供されるＨＬＡは、固体担体に結合している。固体担体に結合した天然ＨＬＡは、組成物が天然ＨＬＡに対する抗体に結合することを可能にする。結合した天然ＨＬＡに対する抗体を、当業者に公知のあらゆる技術を用いて検出し得る。
【００５０】
ある実施形態において、固体担体に結合した相当量のＨＬＡが天然のものである。本明細書中で使用される場合、「相当量」は、変性ＨＬＡに特異的な抗体の有意な結合無しに、天然ＨＬＡに対する抗体の結合および検出を可能にするあらゆる量であり得る。この量を、固体担体に結合したＨＬＡの総数に対する天然ＨＬＡの総数のパーセンテージとして表し得る。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも７５％が天然のものである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも８０％が天然のものである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも８５％が天然のものである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９０％が天然のものである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９５％が天然のものである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９９％が天然のものである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡのうちの少なくとも９９．５％が天然のものである。
【００５１】
ＨＬＡを、当業者に公知のあらゆる技術によって、固体担体に結合し得る。さらに、ＨＬＡを固体担体に直接、または間接的に結合し得る。いくつかの実施形態において、ＨＬＡを固体担体に直接結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡを、吸収、化学的なカップリングによって、またはＨＬＡに付加した尾部エレメントを介した化学的な連結によって、固体担体に直接結合する。ある実施形態において、ＨＬＡを受動的吸収によって、担体に直接結合する。Ｃａｎｔａｒｅｒｏら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０５：３７３−３８２（１９８０）。いくつかの実施形態において、ＨＬＡを、連結部分によって固体担体に間接的に結合する。いくつかの実施形態において、その連結部分は、抗体、レクチン、ＣＤ８分子、ＣＤ４分子、Ｔ細胞受容体およびその断片からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、その連結部分は、二機能性架橋剤である。有用な二機能性架橋剤は、当業者に公知である。
【００５２】
その固体担体は、ＨＬＡに結合し得る、当業者に公知のあらゆる材料から作製され得る。固体担体のための周知の材料は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスルホン、ヒドロゲル、ポリビニルおよび磁鉄鉱を含む。いくつかの実施形態において、その固体担体は、シリカ、金、ラテックス、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリスルホン、ヒドロゲル、ポリ塩化ビニル、ガラス、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される材料を含む。
【００５３】
さらに、その固体担体は、当業者によって適当であるとみなされるあらゆる構造上の構成を有し得る。固体担体は、複数のビーズ、複数のマイクロビーズ、複数の微粒子、複数のマイクロスフィア、ウェル、膜、ポリマー、フィルター、マイクロアレイおよびそれらの組み合わせを含み得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、その固体担体は、複数のマイクロビーズである。有用なマイクロビーズは、Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．およびＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．等のような供給源から商業的に入手可能である。ある実施形態において、そのマイクロビーズは、直径２μｍから８μｍである。ある実施形態において、そのマイクロビーズは、直径４μｍから６μｍである。
【００５５】
いくつかの実施形態において、その固体担体は、複数の微粒子である。いくつかの実施形態において、その微粒子は、ナノ結晶（ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ）または量子ドットである。
【００５６】
その固体担体はまた、ＨＬＡに結合した抗体の同定、分離および分類を可能にし得る、検出可能な標識、またはあらゆる他の同定する特徴を含み得る。例えば、その担体は、マイクロビーズを、フローサイトメトリーを用いて分類することを可能にするフルオロフォアでそれぞれ標識された複数のマイクロビーズであり得る。検出可能な標識は、蛍光色素、放射性標識、磁気標識、バーコードおよびそれらの組み合わせを含み得る。ある実施形態において、その検出可能な標識は、蛍光色素である。ある実施形態において、その検出可能な標識は、放射性標識である。ある実施形態において、その検出可能な標識は、バーコードである。ある実施形態において、その担体は、蛍光色素、放射性標識、磁気標識、バーコード、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、検出可能な標識を含む。
【００５７】
６．３  パネル
別の局面において、複数の固体担体を含むパネルが本明細書中で提供され、ここでその複数の固体担体のうちの各固体担体は、ＨＬＡに結合し、ここで結合したＨＬＡのうちの少なくとも９０％は天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても１０％が変性している、ここでその複数の固体担体のうち特定の固体担体に結合したＨＬＡのうちの少なくとも９０％は、同じ対立遺伝子のものであり、そしてここでその複数の固体担体のうちの各固体担体は、複数の固体担体のうちの他の固体担体に関して異なるＨＬＡに結合している。そのパネルは、本明細書中で提供されるＨＬＡのいずれにも結合し得る。パネルは有利に、一度に１つ以上の天然クラスＩ  ＨＬＡに対する複数の抗体を検出することを可能にする。
【００５８】
いくつかの実施形態において、上記複数の固体担体は、少なくとも２つ以上の固体担体を含む。いくつかの実施形態において、複数の固体担体は、少なくとも４つ以上の固体担体を含む。いくつかの実施形態において、複数の固体担体は、少なくとも８個以上の固体担体を含む。いくつかの実施形態において、複数の固体担体は、少なくとも１６個以上の固体担体を含む。いくつかの実施形態において、複数の固体担体は、少なくとも３２個以上の固体担体を含む。いくつかの実施形態において、複数の固体担体は、少なくとも６４個以上の固体担体を含む。いくつかの実施形態において、複数の固体担体は、少なくとも１２８個以上の固体担体を含む。いくつかの実施形態において、複数の固体担体は、少なくとも２５６個以上の固体担体を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、複数の固体担体のうちの各固体担体は、ＨＬＡ−ＡクラスＩ  ＨＬＡに結合する。いくつかの実施形態において、複数の固体担体のうちの各固体担体は、ＨＬＡ−ＢクラスＩ  ＨＬＡに結合する。いくつかの実施形態において、複数の固体担体のうちの各固体担体は、ＨＬＡ−ＣクラスＩ  ＨＬＡに結合する。いくつかの実施形態において、複数の固体担体のうちの各固体担体は、表１、２、および３において見出されるクラスＩ  ＨＬＡおよびそれらの組み合わせから選択される、任意のクラスＩ  ＨＬＡに結合する。
【００６０】
いくつかの実施形態において、複数の固体担体のうちの各固体担体は、ＨＬＡ−ＤＰクラスＩＩ  ＨＬＡに結合する。いくつかの実施形態において、複数の固体担体のうちの各固体担体は、ＨＬＡ−ＤＱクラスＩＩ  ＨＬＡに結合する。いくつかの実施形態において、複数の固体担体のうちの各固体担体は、ＨＬＡ−ＤＲクラスＩＩ  ＨＬＡに結合する。
【００６１】
いくつかの実施形態において、そのパネルは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲおよびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＨＬＡに結合した、複数の担体を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、特定の固体担体に結合したＨＬＡの少なくとも９０％が、同じ対立遺伝子のものである。いくつかの実施形態において、特定の固体担体に結合したＨＬＡの少なくとも９５％が、同じ対立遺伝子のものである。いくつかの実施形態において、特定の固体担体に結合したＨＬＡの少なくとも９９％が、同じ対立遺伝子のものである。いくつかの実施形態において、特定の固体担体に結合したＨＬＡの少なくとも９９．５％が、同じ対立遺伝子のものである。
【００６３】
６．４  天然ＨＬＡに対する抗体を検出するために有用な組成物を作製するための方法
本発明の別の局面において、少なくとも９０％の天然ヒト白血球抗原および多くても１０％の変性ヒト白血球抗原を含む組成物を作製するための方法が、本明細書中で提供される。いくつかの実施形態において、その方法は：ａ）天然ＨＬＡおよび変性ＨＬＡを含む第１の組成物を、セリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、またはアミダーゼと、そのセリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、またはアミダーゼが変性ＨＬＡを切断する条件下で接触させる工程；ならびにｂ）そのセリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、またはアミダーゼを中和して、結果としてできる、少なくとも９０％の天然ヒト白血球抗原および多くても１０％の変性ヒト白血球抗原を含む組成物を産生する工程を包含する。その方法を使用して、本明細書中で提供される、少なくとも９０％の天然ＨＬＡおよび多くても１０％の変性ＨＬＡを含むいずれの組成物も作製し得る。
【００６４】
６．４．１．天然ＨＬＡおよび変性ＨＬＡの組成物
第１の組成物のＨＬＡは、ＨＬＡのうちの１つ以上のクラスを含み得る。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡは、クラスＩ  ＨＬＡ、クラスＩＩ  ＨＬＡ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡはクラスＩ  ＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡはクラスＩＩ  ＨＬＡを含む。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡはクラスＩ  ＨＬＡおよびクラスＩＩ  ＨＬＡの組み合わせを含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、第１の組成物のＨＬＡは、溶液中であり得る。他の実施形態において、そのＨＬＡは固体担体に結合し得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、第１の組成物のＨＬＡを、溶液中に懸濁し得る。そのＨＬＡを、当業者に適当とみなされるあらゆる溶液中に懸濁または可溶化し得る。ある実施形態において、その溶液は、緩衝溶液である。ある実施形態において、その溶液は、ＨＬＡの非特異的分解を防止するのを助け得るが、変性ＨＬＡの特異的切断は可能にする添加物を含む。そのような添加物の例は、プロテアーゼ阻害剤、抗菌薬、金属キレート剤（ｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｏｒ）および還元剤を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態において、そのＨＬＡは、リン酸緩衝化溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＰＢＳ）を含む溶液中にある。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡは、金属キレート剤を含む溶液中にある。ある実施形態において、その金属キレート剤は、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）である。いくつかの実施形態において、そのＨＬＡは抗菌薬を含む溶液中にある。ある実施形態において、その抗菌薬はアジ化ナトリウムである。ある実施形態において、その抗菌薬はチメロサールである。ある実施形態において、そのＨＬＡは還元剤を含む溶液中にある。ある実施形態において、その還元剤はジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。ある実施形態において、その還元剤は２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）である。
【００６８】
さらに、いくつかの実施形態において、その溶液は、天然ＨＬＡおよび変性ＨＬＡの非特異的分解の防止を助けるが、変性ＨＬＡの切断は可能にする、プロテアーゼ阻害剤を含み得る。いくつかの実施形態において、その溶液は、酸性プロテアーゼ阻害剤、チオールプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、プロテアーゼ阻害剤を含む。そのような阻害剤の例は、ペプスタチンＡ（酸性プロテアーゼ阻害剤）、ロイペプチン（チオールプロテアーゼ阻害剤）、アンチパイン（チオールプロテアーゼ阻害剤）、ＥＤＴＡ（メタロプロテアーゼ阻害剤）、およびＥＧＴＡ（メタロプロテアーゼ阻害剤）を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態において、第１の組成物のＨＬＡは、固体担体に結合している。天然ＨＬＡおよび変性ＨＬＡに結合する固体担体を、当業者に公知のあらゆる技術を用いて得ることができる。天然ＨＬＡおよび変性ＨＬＡに結合する固体担体を、例えば、クラスＩ  ＨＬＡ、クラスＩＩ  ＨＬＡ、またはそれらの組み合わせのいずれかに結合した商業的に入手可能なマイクロビーズ（例えばＦｌｏｗＰＲＡクラスＩおよびクラスＩＩビーズ、ＬＡＢＳｃｒｅｅｎクラスＩおよびクラスＩＩＰＲＡビーズ、ＬＡＢＳｃｒｅｅｎ  Ｍｉｘｅｄビーズ、およびＬａｂＳｃｒｅｅｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  ＡｎｔｉｇｅｎクラスＩおよびクラスＩＩビーズ（Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ｉｎｃ．））を含む、商業的な供給源から得ることができる。他の実施形態において、天然ＨＬＡおよび変性ＨＬＡに結合した固体担体を、組換え天然ＨＬＡおよび組換え変性ＨＬＡを固体担体に結合することによって作製し得る。組換え天然ＨＬＡおよび組換え変性ＨＬＡを、例えばＰｅｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７５（１）：４３−４９（２００３）において記載された技術を含む、当業者に公知のあらゆる技術を用いて、作製し、それを固体担体に結合し得る。
【００７０】
６．４．２．セリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼまたはアミダーゼによる変性ＨＬＡの切断
いくつかの実施形態において、その方法は、天然ＨＬＡおよび変性ＨＬＡの第１の組成物を、セリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼまたはアミダーゼに、そのセリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼまたはアミダーゼが変性ＨＬＡを切断する条件下で接触させる工程を含む。
【００７１】
変性ＨＬＡを切断する、当業者に公知のあらゆるセリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼまたはアミダーゼを、その基質と接触し得る。理想的には、そのセリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼまたはアミダーゼは、変性ＨＬＡを選択的に切断するが、天然ＨＬＡはそのままにしておく。さらに、特定のセリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼまたはアミダーゼの、選択的に変性ＨＬＡを切断する能力は、そのＨＬＡがその特定のセリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼまたはアミダーゼと接触した温度および時間によって変動し得る。当業者は、特定のプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼまたはアミダーゼが特定のクラスの変性ＨＬＡを切断するために適当な条件が何であり得るかを決定し得る。
【００７２】
本方法のいくつかの実施形態において、ＨＬＡを、変性ＨＬＡを選択的に切断し得るが、天然ＨＬＡはそのままにしておくセリンプロテアーゼと接触させる。特定の実施形態において、そのＨＬＡを、トリプシン、キモトリプシン、およびエラスターゼを含む、トリプシン様族（ｃｌａｎ）由来のセリンプロテアーゼと接触させる。特定の実施形態において、そのセリンプロテアーゼはトリプシンである。特定の実施形態において、そのセリンプロテアーゼはキモトリプシンである。特定の実施形態において、そのセリンプロテアーゼはエラスターゼである。他の実施形態において、そのセリンプロテアーゼはサブチリシンである。
【００７３】
いくつかの実施形態において、そのＨＬＡを、第１の組成物中の変性ＨＬＡを選択的に切断し得るが、天然ＨＬＡはそのままにしておくリパーゼと接触させる。特定の実施形態において、そのリパーゼは、ホスホリパーゼである。特定の実施形態において、そのホスホリパーゼは、ホスホリパーゼＡ、ホスホリパーゼＢ、ホスホリパーゼＣおよびホスホリパーゼＤからなる群より選択される。
【００７４】
いくつかの実施形態において、そのＨＬＡを、第１の組成物中の変性ＨＬＡを選択的に切断し得るが、天然ＨＬＡはそのままにしておくエステラーゼと接触させる。特定の実施形態において、そのエステラーゼは、アセチルコリンエステラーゼである。他の実施形態において、そのエステラーゼはチオエステラーゼである。特定の実施形態において、そのチオエステラーゼは、アセチル−ｃｏＡヒドロラーゼ、パルミトイル−ｃｏＡヒドロラーゼ、スクシニル−ｃｏＡヒドロラーゼ、およびアシル−ｃｏＡヒドロラーゼからなる群より選択される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、そのＨＬＡを、変性ＨＬＡを選択的に切断し得るが、天然ＨＬＡはそのままにしておくアミダーゼと接触させる。いくつかの実施形態において、そのアミダーゼはペプチドアミダーゼである。
【００７６】
６．４．３．セリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、またはアミダーゼの中和
プロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼまたはアミダーゼによる変性ＨＬＡの切断後、そのプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼまたはアミダーゼの酵素活性を中和する。特定のプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼまたはアミダーゼの中和を、当業者に公知のあらゆる技術を用いて行い得る。例えば、特定のプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼまたはアミダーゼを、当該プロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼまたはアミダーゼの阻害剤を含む試薬と接触させることによって、中和を達成し得る。
【００７７】
いくつかの実施形態において、プロテアーゼを、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤を含む試薬と接触させることによって、中和を達成する。いくつかの実施形態において、そのプロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼ阻害剤である。特定の実施形態において、そのセリンプロテアーゼ阻害剤は、トリプシン阻害剤である。特定の実施形態において、そのトリプシン阻害剤は、アプロチニンである。特定の実施形態において、そのトリプシン阻害剤は、ベンズアミジンである。特定の実施形態において、そのトリプシン阻害剤は、フッ化フェニルメチルスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｆｏｎｙｌ）（ＰＭＳＦ）である。特定の実施形態において、そのトリプシン阻害剤は、トリプシン中和溶液（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−５００２）である。特定の実施形態において、そのセリンプロテアーゼ阻害剤は、キモトリプシン阻害剤である。特定の実施形態において、そのキモトリプシン阻害剤は、キモトリプシン阻害剤２である。特定の実施形態において、そのセリンプロテアーゼ阻害剤は、エラスターゼ阻害剤である。いくつかの実施形態において、そのエラスターゼ阻害剤は、アルファ１−アンチトリプシンである。ある実施形態において、そのセリンプロテアーゼ阻害剤は、サブチリシン阻害剤である。ある実施形態において、そのサブチリシン阻害剤は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓサブチリシン阻害剤である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、リパーゼを、１つ以上のリパーゼ阻害剤と接触させることによって中和を達成する。ある実施形態において、そのリパーゼ阻害剤は、リプスタチン（ｌｉｐｉｓｔａｔｉｎ）である。いくつかの実施形態において、エステラーゼを、１つ以上のエステラーゼ阻害剤と接触させることによって中和を達成する。いくつかの実施形態において、そのエステラーゼ阻害剤は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態において、そのアセチルコリンエステラーゼ阻害剤は、有機リン酸塩またはカルバミン酸塩である。いくつかの実施形態において、そのエステラーゼ阻害剤は、チオエステラーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態において、そのチオエステラーゼ阻害剤は、５−（フラン−２−イルメチレン）ピリミジン−２，４，６−トリオンである。いくつかの実施形態において、アミダーゼを、１つ以上のアミダーゼ阻害剤と接触させることによって、中和を達成する。いくつかの実施形態において、そのアミダーゼ阻害剤は、ニトリルである。いくつかの実施形態において、そのニトリルは、ビス−ｐ−ニトロフェニルリン酸塩である。
【００７９】
６．５  天然ＨＬＡに対する抗体を検出するための方法
別の局面において、天然ＨＬＡに対する抗体を検出するための方法が、本明細書中で提供される。天然ＨＬＡに対する抗体の検出は、例えば、組織移植または臓器移植の状況において有用であり得、ここでドナーの天然ＨＬＡに対する抗体の検出が、移植片拒絶反応のリスクを決定することにおいて有益であり得る。
【００８０】
ある実施形態において、これらの方法は：ａ）サンプルを、固体担体に結合したＨＬＡを含む組成物と接触させる工程であって、ここでＨＬＡのうちの少なくとも９０％が天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても１０％が変性している、工程；およびｂ）抗体の組成物への結合を検出する工程を含み、ここで抗体の固体担体への結合は、サンプル中の天然ＨＬＡに特異的な抗体の存在を示す。本明細書で提供される組成物は、固体担体に結合したＨＬＡを含む、あらゆる組成物を含み得、ここでＨＬＡのうちの少なくとも９０％は天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても１０％は、変性している。
【００８１】
ある実施形態において、固体担体に結合したＨＬＡのうちの少なくとも９０％が同じ対立遺伝子のものである。ある実施形態において、固体担体に結合したＨＬＡのうちの少なくとも９５％が同じ対立遺伝子のものである。ある実施形態において、固体担体に結合したＨＬＡのうちの少なくとも９９％が同じ対立遺伝子のものである。ある実施形態において、固体担体に結合したＨＬＡのうちの少なくとも９９．５％が同じ対立遺伝子のものである。
【００８２】
ある実施形態において、そのＨＬＡは、クラスＩ  ＨＬＡ、クラスＩＩ  ＨＬＡ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。ある実施形態において、そのＨＬＡはクラスＩ  ＨＬＡである。ある実施形態において、そのＨＬＡはクラスＩＩ  ＨＬＡである。ある実施形態において、そのＨＬＡはクラスＩ  ＨＬＡおよびクラスＩＩ  ＨＬＡの組み合わせである。
【００８３】
ある実施形態において、その組成物は複数の固体担体のうちの当該固体担体を含み、ここで複数の固体担体のうちの特定の固体担体に結合したＨＬＡの少なくとも９０％は同じ対立遺伝子のものであり、そして複数の固体担体のうちの各固体担体は、複数の固体担体のうちの他の固体担体に関して異なるＨＬＡ対立遺伝子に結合している。ある実施形態において、その複数の固体担体は、４つ以上の固体担体を含む。ある実施形態において、その複数の固体担体は、８つ以上の固体担体を含む。ある実施形態において、その複数の固体担体は、１６個またはそれ以上の固体担体を含む。ある実施形態において、その複数の固体担体は、３２個またはそれ以上の固体担体を含む。
【００８４】
生物学的サンプルを含む、当業者に公知のあらゆる有用なサンプルを使用し得る。例示的な有用な生物学的サンプルは、全血、血液誘導体、赤血球濃縮物、血漿、血清、新鮮凍結血漿、全血由来血小板濃縮物、グロブリン、寒冷沈降物（ｃｒｙｏｐｒｅｃｐｉｔａｔｅ）、脳脊髄液、口腔から採取されたもののような上皮細胞、幹細胞、白血球、好中球および顆粒球のような、組織および細胞を含む。
【００８５】
サンプルを、組織、細胞、または臓器移植のヒトドナーまたは当該組織、細胞、または臓器移植の意図されたレシピエントから得ることができる。いくつかの実施形態において、そのサンプルを、腎臓、肝臓、または心臓移植のヒトドナーから得る。いくつかの実施形態において、そのサンプルを、ヒトレシピエントにおける移植のために意図された組織、細胞、または臓器から得る。特定の実施形態において、そのサンプルを、ヒトレシピエントにおける移植のために意図された腎臓、肝臓、または心臓から得る。他の実施形態において、そのサンプルを、輸血のヒトドナーまたはレシピエントから得る。他の実施形態において、そのサンプルを、レシピエントにおける輸血のために意図された血液または血液誘導体から得る。ある実施形態において、そのサンプルを、骨髄移植のヒトドナーまたはレシピエントから得る。
【００８６】
当業者に公知の、抗体の担体への結合を検出し得るあらゆるシステムを、抗体の結合を検出するために使用し得る。例えば、天然ＨＬＡに対する抗体の結合の検出を、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、アビジン標識、ビオチン標識、またはそれらの組み合わせのような、検出可能な標識に結合体化した二次抗体を用いて行い得る。さらに、本明細書中で記載したもののような検出可能な標識を含む担体は、結合した天然ＨＬＡに対する抗体の多重化した検出および分類を可能にする。
【００８７】
特定の実施形態において、抗体の結合の検出を、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイのような、免疫吸着サンドイッチアッセイを用いて行う。免疫吸着サンドイッチアッセイは、使用する固体担体が、マイクロタイタープレートウェルである場合に特に有用であり得る。膜またはフィルターの固体担体に関して、抗体の結合の検出を、イムノブロッティング技術を用いて行い得る。他の実施形態において、抗体の結合の検出を、フローサイトメトリーを用いて行う。
【００８８】
６．６  キット
別の局面において、天然ＨＬＡに対する抗体を検出するためのキットが、本明細書中で提供される。ある実施形態において、そのキットは：ａ）固体担体に結合したＨＬＡを含む組成物であって、ここでＨＬＡのうちの少なくとも９０％が天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても１０％が変性している、組成物、およびｂ）組成物に対する抗体の結合を検出するための試薬を含む。本明細書で提供される組成物は、固体担体に結合したＨＬＡを含む組成物のいずれも含み得、ここでＨＬＡのうちの少なくとも９０％が天然のものであり、そしてＨＬＡのうちの多くても１０％が変性している。
【００８９】
ある実施形態において、その組成物は、複数の固体担体のうちの当該固体担体を含み、ここで複数の固体担体のうちの特定の固体担体に結合したＨＬＡの少なくとも９０％は同じ対立遺伝子のものであり、そして複数の固体担体のうちの各固体担体は、複数の固体担体のうちの他の固体担体に関して、異なるＨＬＡ対立遺伝子に結合する。ある実施形態において、その複数の固体担体は、４個またはそれ以上の固体担体を含む。ある実施形態において、その複数の固体担体は、８個またはそれ以上の固体担体を含む。ある実施形態において、その複数の固体担体は、１６個またはそれ以上の固体担体を含む。ある実施形態において、その複数の固体担体は、３２個またはそれ以上の固体担体を含む。
【００９０】
当業者に公知の、抗体の結合を検出するために有用なあらゆる試薬を使用し得る。例えば、ウェスタンブロット、イムノブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡおよびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のようなアッセイにおいて、二次抗体が、抗体の結合を検出するために有用であり得る。いくつかの実施形態において、その試薬は、二次抗体を含む。ある実施形態において、その二次抗体は、抗ヒトＩｇＧ抗体である。
【００９１】
いくつかの実施形態において、その試薬は、検出可能な標識を含む二次抗体を含む。ある実施形態において、そのキットは、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、アビジン標識、ビオチン標識、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、検出可能な標識を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、そのキットはさらに、洗浄緩衝液、コントロール緩衝液、ゲル、添加緩衝液、分子量マーカー、複数のウェルを含むプレート、およびポジティブコントロールサンプルおよびネガティブコントロールサンプルを含み得る。
【００９３】
以下の制限しない実施例が、上記で記載されたある実施形態を説明する。
【実施例】
【００９４】
以下の実施例が、本発明の局面をさらに説明するために示される。実施例１は、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズの調製を説明する。実施例２は、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズ上のクラスＩ  ＨＬＡの型を同定するために使用するアッセイ方法を説明する。実施例３は、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズの純度を示す分析結果を提供する。実施例４は、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズの抗体反応性の結果を示す。これらの実施例において、Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ｉｎｃ．の商業的に入手可能なＬＡＢＳｃｒｅｅｎ製品を使用し、そしてそれらはそのカタログ番号で同定される。
【００９５】
７．１  実施例１：天然クラスＩ  ＨＬＡに結合したマイクロビーズの調製
本実施例は、天然クラスＩ  ＨＬＡに結合したマイクロビーズ（「天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズ」）の例示的な調製を提供する。ＬＡＢＳｃｒｅｅｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｅａｄｓ（ＬＳＡＢ）、具体的にはＬＡＢＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ＨＬＡ  ＣｌａｓｓＩ−Ｃｏｍｂｉ（カタログＩＤ：ＬＳ１Ａ０４）を、Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ｉｎｃ．から得た。処理無しで、ＬＳＡＢは、ビーズ表面に結合した天然クラスＩ  ＨＬＡおよび変性クラスＩ  ＨＬＡの両方を含む。
【００９６】
図１Ａ〜図１Ｃは、Ｗ６／３２およびＨＣ１０のＬＳＡＢとの反応性を示す。モノクローナル抗体Ｗ６／３２は、天然クラスＩ  ＨＬＡに特異的に結合する。モノクローナル抗体ＨＣ１０は、変性クラスＩ  ＨＬＡに特異的に結合する。図１Ａ〜図１Ｃは、Ａ−遺伝子座（図１Ａ）、Ｂ−遺伝子座（図１Ｂ）、およびＣ−遺伝子座（図１Ｃ）クラスＩ  ＨＬＡ対立遺伝子に対する特異性に関して、メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。検出抗体のＭＦＩのレベルは、天然クラスＩ  ＨＬＡまたは変性クラスＩ  ＨＬＡいずれかに対する抗体の結合のレベルに対応する。これらの図は、ＬＳＡＢは、Ｗ６／３２モノクローナル抗体およびＨＣ１０モノクローナル抗体の両方に反応性であることを示す。
【００９７】
天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズを調製するために、ＬＳＡＢ上の変性クラスＩ  ＨＬＡを、トリプシン（セリンプロテアーゼ）による選択的タンパク質分解消化に供した。トリプシンを、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、Ｎｅｗ  ＪｅｒｓｅｙのＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから凍結乾燥形態で購入した（カタログコードＴＲＬ、カタログ番号ＬＳ００３７２）。
【００９８】
そのトリプシンを、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＩｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で、約０．００００４％から約０．０４％重量／体積の作業濃度に再構築した。天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズを、約３７℃で約３０分間、トリプシン溶液にさらした。
【００９９】
次いでそのトリプシン溶液を、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭａｒｙｌａｎｄのＬｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．から購入した、Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＮＳ）（カタログ番号ＣＣ−５００２）を用いて中和した。トリプシンによる約３０分の消化後に、体積で約２：１のストックＴＮＳを加えた。他の例において、１×ＰＢＳ、約０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む混合物を用いた急速希釈（約１：２）によって、中和を達成した。
【０１００】
次に、そのマイクロビーズを、約１０，０００ｇで約２分間遠心分離し、そして約１ｍＬの１×ＬＡＢＳｃｒｅｅｎ（登録商標）洗浄緩衝液（カタログ番号ＬＳＰＷＡＢＵＦ）で２回洗浄した。続いてそのマイクロビーズを、約２％のＢＳＡ中、約４℃で一晩インキュベートした。次いでそのマイクロビーズを、約１ｍＬのＬＡＢＳｃｒｅｅｎ（登録商標）洗浄緩衝液で３回洗浄した。
【０１０１】
７．２  実施例２：天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズのアッセイ
この実施例は、本明細書中で記載された方法によって調製した、高純度の例示的なマイクロビーズを示す。タンパク質分解消化が、変性クラスＩ  ＨＬＡを除去したことを確認するために、実施例１によって調製したマイクロビーズのパネルを、Ｗ６／３２またはＨＣ１０のいずれかとインキュベートして、それぞれ天然クラスＩ  ＨＬＡまたは変性クラスＩ  ＨＬＡを検出した。
【０１０２】
約１００μｌの約１×ＰＢＳ中で希釈した約１μｌの抗体を、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズと、振とう器上で、室温で約３０分間インキュベートした。次いでそのマイクロビーズを、約１ｍＬのＬＡＢＳｃｒｅｅｎ（登録商標）洗浄液で３回洗浄し、そして次いで約１００μｌのフィコエリトリン結合体化（ＰＥ結合体化）ヤギ抗マウス二次抗体と、振とう器上で、室温で約３０分間インキュベートした。次に、そのマイクロビーズを３回洗浄し、そしてＬｕｍｉｎｅｘフローマシン（Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｆｌｏｗ  ｍａｃｈｉｎｅ）によって分析した。
【０１０３】
図２Ａ〜図２Ｃは、Ｗ６／３２（天然クラスＩ  ＨＬＡに特異的）およびＨＣ１０（変性クラスＩ  ＨＬＡに特異的）のマイクロビーズとの反応性を提供する。Ｙ軸はＭＦＩを示し、そしてＸ軸はＡ−遺伝子座（図２Ａ）、Ｂ−遺伝子座（図２Ｂ）、およびＣ−遺伝子座（図２Ｃ）クラスＩ  ＨＬＡ対立遺伝子に対する特異性を示す。ビーズパネルの全ての特異性のＭＦＩから、サンプルネガティブコントロールビーズのＭＦＩを引くことによって、Ｌｕｍｉｎｅｘフローマシンからの生データを正規化して、非特異的またはバックグラウンドシグナルを除去した。１，０００ＭＦＩを超える全ての正規化した値をポジティブとみなした。これらの図は、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズは、ＨＣ１０と低い反応性を有することを示し、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズに低いパーセンテージの変性クラスＩ  ＨＬＡしか残っていないことを示す。
【０１０４】
７．３  実施例３：天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズの純度
この実施例は、本明細書中で記載された方法によって調製した、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズのいくつかの例示的なサンプルの純度を提供する。下記の表１〜表３は、上記の実施例１で提供された調製手順に従って作製し、そして上記の実施例２で提供された手順に従ってアッセイしたマイクロビーズに残った変性クラスＩ  ＨＬＡのパーセンテージを示す。変性クラスＩ  ＨＬＡのパーセンテージを、以下の式に従って計算した：［ＨＣ１０  ＭＦＩ／（ＨＣ１０  ＭＦＩ＋Ｗ６／３２  ＭＦＩ）］＊１００。データを、マイクロビーズの９８個のサンプル（５バッチ）から取った。
【０１０５】
下記の表１は、Ａ−遺伝子座クラスＩ  ＨＬＡ対立遺伝子の特異性に関する、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズサンプルのデータである。そのデータは、０．９７％の標準偏差を有する、０．８１％の変性クラスＩ  ＨＬＡの平均パーセンテージを示す。
【０１０６】
【表１】
2013519902.tif 000003
下記の表２は、Ｂ−遺伝子座クラスＩ  ＨＬＡ対立遺伝子の特異性に関する、マイクロビーズサンプルのデータである。そのデータは、３．８６％の標準偏差を有する、３．５３％の変性クラスＩ  ＨＬＡの平均パーセンテージを示す。
【０１０７】
【表２】
2013519902.tif 000004
下記の表３は、Ｃ−遺伝子座クラスＩ  ＨＬＡ対立遺伝子の特異性に関する、マイクロビーズサンプルのデータである。そのデータは、１．２４％の標準偏差を有する、２．６０％の変性クラスＩ  ＨＬＡの平均パーセンテージを示す。
【０１０８】
【表３】
2013519902.tif 000005
表１〜表３の全体的な結果は、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズの５個のバッチに対して、３．１０％の標準偏差を有する、２．５１％の変性クラスＩ  ＨＬＡの平均パーセンテージを示す。これらの結果は、本方法によって、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズを高い純度で作製し得ることを示す。
【０１０９】
実施例４：天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズの反応性
ＬＳＡＢビーズおよび実施例１によって調製したマイクロビーズに対する、非同種免疫化男性血清中の抗体の反応性プロファイルを比較する、さらなる調査を行った。図３Ａ〜図３Ｃは、Ａ−遺伝子座（図３Ａ）、Ｂ−遺伝子座（図３Ｂ）、およびＣ−遺伝子座（図３Ｃ）ＨＬＡ対立遺伝子に関する、３つの非同種免疫男性血清のＬＳＡＢおよび天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズとの反応性を示す。３つの例全てにおいて（Ａ−遺伝子座、Ｂ−遺伝子座、およびＣ−遺伝子座）、その結果は、血清中の抗体の、ＬＳＡＢマイクロビーズとの高い陽性の反応性を示すが、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズとは示さない。試験したＡ−遺伝子座対立遺伝子に対する抗体反応性に関して、ＬＳＡＢビーズと比較して、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズを使用した場合に、平均９８．３％のＭＦＩの減少があった。試験したＢ−遺伝子座対立遺伝子に対する抗体反応性に関して、ＬＳＡＢビーズと比較して、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズを使用した場合に、平均９４．３％のＭＦＩの減少があった。試験したＣ−遺伝子座対立遺伝子に対する抗体反応性に関して、ＬＳＡＢビーズと比較して、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズを使用した場合に、平均８９．９％のＭＦＩの減少があった。これらの結果は、抗体の結合は主に変性クラスＩ  ＨＬＡによるものであり、そして天然クラスＩ  ＨＬＡによるものではないことを示す。上記で記載したように、ＬＳＡＢビーズ上の変性クラスＩ  ＨＬＡは、偽陽性シグナルを提供し、そして潜在的なドナーの不必要な除外を引き起こし得る。従って、これらの結果は、天然クラスＩ  ＨＬＡマイクロビーズは、クラスＩ  ＨＬＡのより正確な検出を提供し得ることを示す。
【０１１０】
本明細書中で引用された全ての参考文献は、個々の出版物または特許または特許出願それぞれが、具体的におよび個々に、全ての目的のためにその全体として参考として援用されると示されたように同じ程度、その全体としておよび全ての目的のために、本明細書中で参考として援用される。本発明は、様々な好ましい実施形態に関して詳細に記載されたが、それに制限することを意図せず、むしろ当業者は、そこに変更および修飾を行い得、それらは本発明の精神および添付の特許請求の範囲内であることを認識する。
【０１１１】
（項目１）
少なくとも９０％の天然ヒト白血球抗原および多くても１０％の変性ヒト白血球抗原を含む、組成物。
（項目２）
上記ヒト白血球抗原が、クラスＩヒト白血球抗原、クラスＩＩヒト白血球抗原およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
（項目３）
上記ヒト白血球抗原がクラスＩヒト白血球抗原である、項目２に記載の組成物。
（項目４）
上記ヒト白血球抗原のうちの少なくとも９０％が、同じ対立遺伝子のものである、項目１に記載の組成物。
（項目５）
上記ヒト白血球抗原が固体担体に結合される、項目１に記載の組成物。
（項目６）
上記固体担体が、複数のビーズ、複数のマイクロビーズ、複数の微粒子、複数のマイクロスフィア、ウェル、膜、ポリマー、フィルターおよびマイクロアレイならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目５に記載の組成物。
（項目７）
上記固体担体が複数のマイクロビーズである、項目５に記載の組成物。
（項目８）
上記固体担体が、シリカ、金、ラテックス、ポリスチレン、ポリスルホン、ヒドロゲル、ポリ塩化ビニル、ガラスおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される材料を含む、項目５に記載の組成物。
（項目９）
上記固体担体が検出可能な標識を含む、項目５に記載の組成物。
（項目１０）
上記検出可能な標識が、蛍光色素、放射性標識、磁気標識、バーコードまたはそれらの組み合わせである、項目９に記載の組成物。
（項目１１）
上記ヒト白血球抗原が、上記固体担体に共有結合される、項目５に記載の組成物。
（項目１２）
複数の上記固体担体を含む、項目５に記載の組成物であって、ここで、該複数の固体担体のうちのある特定の固体担体に結合した上記ヒト白血球抗原のうちの少なくとも９０％が、同じ対立遺伝子のものであり、該複数の固体担体のうちの各々の固体担体が、該複数の固体担体のうちのその他の固体担体に関して、異なるヒト白血球抗原対立遺伝子を結合する、組成物。
（項目１３）
上記天然ヒト白血球抗原および上記変性ヒト白血球抗原がクラスＩヒト白血球抗原である、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
上記複数の固体担体が、４またはそれより多い固体担体を含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１５）
上記複数の固体担体が、８またはそれより多い固体担体を含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１６）
上記複数の固体担体が、１６またはそれより多い固体担体を含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１７）
上記複数の固体担体が、３２またはそれより多い固体担体を含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１８）
少なくとも９０％の天然ヒト白血球抗原および多くても１０％の白血球抗原を含む組成物を作製する方法であって、該方法は：
ａ．天然ヒト白血球抗原および変性ヒト白血球抗原を含む第１の組成物と、セリンプロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、またはアミダーゼとを、該セリンプロテアーゼ、該リパーゼ、該エステラーゼ、または該アミダーゼが、該変性ヒト白血球抗原を消化する条件下で接触させる工程；ならびに
ｂ．該セリンプロテアーゼ、該リパーゼ、該エステラーゼ、または該アミダーゼを中和して、少なくとも９０％の天然ヒト白血球抗原および多くても１０％の白血球抗原を含む結果として生じる組成物を得る工程、
を包含する、方法。
（項目１９）
上記ヒト白血球抗原が、天然クラスＩヒト白血球抗原および変性クラスＩヒト白血球抗原を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記ヒト白血球抗原が、１またはそれより多い固体担体に結合される、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
上記ヒト白血球抗原が、複数のマイクロビーズまたは微粒子に結合される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記第１の組成物を、セリンプロテアーゼと接触させる、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
上記セリンプロテアーゼが、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サブチリシンまたはこれらの組み合わせからなる群より選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記第１の組成物をリパーゼと接触させる、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
上記リパーゼがホスホリパーゼである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
上記第１の組成物を、エステラーゼと接触させる、項目１８に記載の方法。
（項目２７）
上記エステラーゼが、アセチルコリンエステラーゼである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記エステラーゼが、チオエステラーゼである、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
上記第１の組成物を、アミダーゼと接触させる、項目１８に記載の方法。
（項目３０）
天然ヒト白血球抗原に結合する抗体をスクリーニングする方法であって、該方法は：
ａ．サンプルと項目５に記載の組成物とを接触させる工程；
ｂ．該組成物への抗体の結合を検出する工程であって、該組成物への抗体の結合は、該天然ヒト白血球抗原に特異的な抗体を示す、工程、
を包含する、方法。
（項目３１）
抗体の結合を検出する上記工程を、フローサイトメトリーを使用して実行する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
上記抗体の結合を検出する上記工程を、二次抗体を使用して実行する、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
上記二次抗体が、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、アビジン標識、ビオチン標識およびそれらの組み合わせからなる群より選択される標識を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
上記組成物が、複数のマイクロビーズまたは微粒子を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
上記組成物が複数のマイクロビーズを含み、該複数のマイクロビーズのうちの各々のマイクロビーズが検出可能な標識を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
上記検出可能な標識が、蛍光色素、放射性標識、磁気標識またはバーコードである、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
項目５に記載の組成物および該組成物への抗体の結合を検出するための試薬を含む、キット。
（項目３８）
上記試薬が二次抗体を含む、項目３７に記載のキット。
（項目３９）
上記二次抗体が、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、アビジン標識およびビオチン標識からなる群より選択される標識を含む、項目３８に記載のキット。
【図１Ａ】
2013519902.tif 000006
【図１Ｂ】
2013519902.tif 000007
【図１Ｃ】
2013519902.tif 000008
【図２Ａ】
2013519902.tif 000009
【図２Ｂ】
2013519902.tif 000010
【図２Ｃ】
2013519902.tif 000011
【図３Ａ】
2013519902.tif 000012
【図３Ｂ】
2013519902.tif 000013
【図３Ｃ】
2013519902.tif 000014
【国際調査報告】
2013519902.tif 000015
2013519902.tif 000016
2013519902.tif 000017