(57)【要約】  本発明は、女性生殖器病原体微生物検出用プライマーセット、並びに前記プライマーセットを用いて女性生殖器病原体微生物を検出する方法及びキットに関する。本発明によれば、非淋菌性尿道炎、軟性下疳、急性性病、化膿性局所リンパ節症、子宮頸管炎及び子宮内膜炎、卵管炎及び骨盤炎、外陰膣カンジダ症、淋病、尿路感染症、骨盤炎症、梅毒、子宮頸部異形成症をはじめとする様々な女性生殖器疾患を引き起こす原因病原体１４種の検体を一度に迅速、正確かつ簡便に分析することができる。また、本発明による技術及び製品は、１次検索又は確診及び治療方針の決定のために広く用いられ、従来の培養又は染色及び単一又は多重のＰＣＲ法などのＤＮＡ検査キットに代わってＳＴＤ又は泌尿生殖系疾患誘発性病原体の診断に直接活用することができる。さらに、本発明による技術は、感染症、糖尿病、癌などの他の疾病の遺伝子診断にも応用することができる。
2013521799.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列のプライマー及び配列番号２の塩基配列のプライマーを含む、女性生殖器病原体微生物検出用プライマーセット。
【請求項２】
前記プライマーセットは、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）及びエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）からなる群から選択される少なくとも１つの病原体微生物を検出する、請求項１に記載の女性生殖器病原体微生物検出用プライマーセット。
【請求項３】
前記プライマーセットは、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）及びエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）を同時に検出する、請求項１に記載の女性生殖器病原体微生物検出用プライマーセット。
【請求項４】
配列番号３の塩基配列のプライマー及び配列番号４の塩基配列のプライマーを含む、女性生殖器病原体微生物検出用プライマーセット。
【請求項５】
前記プライマーセットは、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びトリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）からなる群から選択される少なくとも１つの病原体微生物を検出する、請求項４に記載の女性生殖器病原体微生物検出用プライマーセット。
【請求項６】
前記プライマーセットは、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びトリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）を同時に検出する、請求項４に記載の女性生殖器病原体微生物検出用プライマーセット。
【請求項７】
１）分析する試料から配列番号１の塩基配列のプライマー及び配列番号２の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットを用いて女性生殖器病原体微生物遺伝子を１次ＰＣＲ増幅する段階と、
２）前記１次ＰＣＲ増幅した産物を、前記プライマーセットのいずれか１つのプライマーを用いてマーカーで標識された一本鎖の核酸に２次ＰＣＲ増幅する段階と、
３）前記２次ＰＣＲ増幅した産物を少なくとも１種の女性生殖器病原体微生物検出用プローブと交雑反応させる段階と、
４）前記交雑反応物を蛍光物質が付着した前記マーカーの特異的結合剤と反応させる段階と、
５）蛍光値を測定して飼料内の女性生殖器病原体微生物を検出する段階とを含む、女性生殖器病原体微生物検出方法。
【請求項８】
前記１）段階において、配列番号３の塩基配列のプライマー及び配列番号４の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットをさらに用い、前記２）段階において、配列番号３の塩基配列のプライマー及び配列番号４の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットのいずれか１つのプライマーをさらに用いる、請求項７に記載の女性生殖器病原体微生物検出方法。
【請求項９】
前記２）段階の一本鎖の核酸のマーカー標識のために、マーカーで標識されたｄＮＴＰ存在下でＰＣＲを行う、請求項７に記載の女性生殖器病原体微生物検出方法。
【請求項１０】
前記マーカーはビオチンであり、前記マーカーの特異的結合剤はストレプトアビジンであることを特徴とする、請求項７に記載の女性生殖器病原体微生物検出方法。
【請求項１１】
前記女性生殖器病原体微生物は、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）及びエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）からなる群から選択される少なくとも１つの病原体微生物である、請求項７に記載の女性生殖器病原体微生物検出方法。
【請求項１２】
前記女性生殖器病原体微生物は、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）、エロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びトリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）からなる群から選択される少なくとも１つの病原体微生物である、請求項８に記載の女性生殖器病原体微生物検出方法。
【請求項１３】
前記ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）及びエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）検出用プローブは、それぞれ配列番号７〜２０の塩基配列を有するものである、請求項１２に記載の女性生殖器病原体微生物検出方法。
【請求項１４】
前記プローブがビーズに結合された形態である、請求項７に記載の女性生殖器病原体微生物検出方法。
【請求項１５】
前記１）段階において、配列番号５の塩基配列のプライマー及び配列番号６の塩基配列のプライマーを含むＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プライマーセットをさらに用い、前記２）段階において、ＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プライマーセットのいずれか１つのプライマーをさらに用い、前記３）段階において、ＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プローブをさらに用いる、請求項７又は８に記載の女性生殖器病原体微生物検出方法。
【請求項１６】
前記ＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プローブは、配列番号２１の塩基配列を有するものである、請求項１５に記載の女性生殖器病原体微生物検出方法。
【請求項１７】
配列番号１の塩基配列のプライマー及び配列番号２の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットと、
配列番号３の塩基配列のプライマー及び配列番号４の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットと、
それぞれ配列番号７〜２０の塩基配列を有するウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）及びエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）検出用プローブからなる群から選択される少なくとも１つのプローブとを含む女性生殖器病原体微生物検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、女性生殖器病原体微生物検出用プライマーセット、並びに前記プライマーセットを用いて女性生殖器病原体微生物を検出する方法及びキットに関する。
【０００２】
〔背景技術〕
女性の泌尿生殖系炎症は最も一般的な疾患であり、前記炎症の原因は細菌から寄生虫、ウイルスに至るまで非常に多様であるが、掻痒感、強度の炎症や悪臭を伴い、ひどい場合は不妊を引き起こし、妊娠中におけるこれらの感染は流産及び新生児の遺伝的異常を招くなど深刻な疾病を引き起こすので、適切な予防及び診断はもとより、治療に致命的な合併症を防止することが非常に重要である。代表的な女性生殖器（外陰部、膣、子宮頸部など）の感染としては、細菌性膣炎（bacterial vaginosis）、トリコモナス膣炎、外陰膣カンジダ症、慢性外陰カンジダ症、炎症性膣炎、萎縮性膣炎、子宮頸部炎などがある。前記泌尿生殖系炎症は、性行為により感染（Sexually transmitted disease; STD）することが多く、成人の約５０％以上が少なくとも１回感染するほど一般的な疾病であるので、ＳＴＤ病原体検査製品の需要がさらに増えるものと予想される。
【０００３】
しかし、現在米国ＦＤＡ承認の市販されているＳＴＤ病原体検査製品は、ＰＣＲ方法やＨｙｂｒｉｄ ｃａｐｔｕｒｅ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙの方法であり、２種のＳＴＤ病原体（C. trachomatis, N. gonorrhoeae）に関してのみ単一又は多重に検査する程度のものである。ところが、この２種以外の他のＳＴＤや泌尿生殖系炎症誘発性病原体も不妊症や新生児の遺伝的異常を招くなど深刻な疾病を引き起こすことがあり、相当数の性病は無症状で感染者の３０％が感染していることを知らないまま生活しているので、病原体の拡散防止と適切な治療のために、できるだけ多くの病原体を同時に検査する方法が切実に求められている現状である。
【０００４】
疾患の治療や診断において症状別にアプローチするのが便利ではあるが、効果的な治療のためには病原体を正確に同定する必要がある。臨床所見で病原体を診断することもあるが、正確な同定のために塗抹、培養などの伝統的な方法、糖利用法、免疫蛍光法、共凝集法（co-agglutination）、モノクローナル抗体検査法などが行われている。最近は、病原体のＲＮＡやＤＮＡなどを検出する方法が開発されている。
【０００５】
近年、韓国のバイオベンチャーがマルチプレックスＰＣＲ法を用いて４〜９種のＳＴＤ病原体に関する検査キットを開発、販売しているが、これらはマルチプレックスＰＣＲを行い、その後電気泳動により増幅されたバンドの大きさから感染の有無を判別しなければならないので、マルチプレックスＰＣＲを行う病原体の数が制限されざるをえず、同じ大きさに増幅された非特異的産物と特異的産物の区別が難しく、分析時に同程度の大きさに増幅されると判読にエラーが生じる恐れがあるという問題がある。
【０００６】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
よって、本発明者らは１４種の女性生殖器病原体に感染しているか否かとその程度を分析できるプライマーセット、並びに前記プライマーセットを用いて女性生殖器病原体微生物を検出する方法及びキットを開発することにより、ＳＴＤ病原体を含む泌尿生殖系炎症を引き起こす主要原因病原体及び陽性対照群であるＧＡＰＤＨを高感度及び高精度で同時に迅速かつ簡便に検出できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、配列番号１の塩基配列のプライマー及び配列番号２の塩基配列のプライマーを含む女性生殖器病原体微生物検出用プライマーセットを提供することを目的とする。また、本発明は、配列番号３の塩基配列のプライマー及び配列番号４の塩基配列のプライマーを含む女性生殖器病原体微生物検出用プライマーセットを提供することを目的とする。
【０００８】
さらに、本発明は、１）分析する試料から配列番号１の塩基配列のプライマー及び配列番号２の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットを用いて女性生殖器病原体微生物遺伝子を１次ＰＣＲ増幅する段階と、２）前記１次ＰＣＲ増幅した産物を、前記プライマーセットのいずれか１つのプライマーを用いてマーカーで標識された一本鎖の核酸に２次ＰＣＲ増幅する段階と、３）前記２次ＰＣＲ増幅した産物を少なくとも１種の女性生殖器病原体微生物検出用プローブと交雑反応させる段階と、４）前記交雑反応物を蛍光物質が付着した前記マーカーの特異的結合剤と反応させる段階と、５）蛍光値を測定して飼料内の女性生殖器病原体微生物を検出する段階とを含む女性生殖器病原体微生物検出方法を提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本発明は、配列番号１の塩基配列のプライマー及び配列番号２の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットと、配列番号３の塩基配列のプライマー及び配列番号４の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットと、それぞれ配列番号７〜２０の塩基配列を有するウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）及びエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）検出用プローブからなる群から選択される少なくとも１つのプローブとを含む女性生殖器病原体微生物検出用キットを提供することを目的とする。
【００１０】
〔発明の効果〕
本発明によれば、非淋菌性尿道炎、軟性下疳、急性性病、化膿性局所リンパ節症、子宮頸管炎及び子宮内膜炎、卵管炎及び骨盤炎、外陰膣カンジダ症、淋病、尿路感染症、骨盤炎症、梅毒、子宮頸部異形成症をはじめとする様々な女性生殖器疾患を引き起こす原因病原体１４種の検体を一度に迅速、正確かつ簡便に分析することができる。
【００１１】
また、本発明による技術及び製品は、１次検索又は確診及び治療方針の決定のために広く用いられ、従来の培養又は染色及び単一又は多重のＰＣＲ法などのＤＮＡ検査キットに代わってＳＴＤ又は泌尿生殖系疾患誘発性病原体の診断に直接活用することができる。さらに、本発明による技術は、感染症、糖尿病、癌などの他の疾病の遺伝子診断にも応用することができる。
【００１２】
〔図面の簡単な説明〕
＜図１＞マルチプレックスビーズアレイの基本原理を示す模式図である。
【００１３】
＜図２＞核酸ビーズ結合の原理を示す模式図である。
【００１４】
＜図３＞ＰＣＲ基礎実験結果であり、１．５％アガロースゲルに標準試料（微生物１４種のゲノムＤＮＡ）のＰＣＲ産物を電気泳動してＰＣＲ条件を確認したものである。
【００１５】
＜図４＞ビーズアレイにおける基礎実験結果であり、各ビーズアレイが反応する条件を確認したものである。
【００１６】
〔発明を実施するための形態〕
一態様として、本発明は、配列番号１の塩基配列のプライマー及び配列番号２の塩基配列のプライマーを含む女性生殖器病原体微生物検出用プライマーセットを提供する。前記プライマーセットは、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）及びエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）からなる群から選択される少なくとも１つの病原体微生物を検出することができ、また、前記微生物を同時に検出することができる。
【００１７】
また、本発明は、配列番号３の塩基配列のプライマー及び配列番号４の塩基配列のプライマーを含む女性生殖器病原体微生物検出用プライマーセットを提供する。前記プライマーセットは、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びトリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）からなる群から選択される少なくとも１つの病原体微生物を検出することができ、また、前記微生物を同時に検出することができる。
【００１８】
他の態様として、本発明は、１）分析する試料から配列番号１の塩基配列のプライマー及び配列番号２の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットを用いて女性生殖器病原体微生物遺伝子を１次ＰＣＲ増幅する段階と、２）前記１次ＰＣＲ増幅した産物を、前記プライマーセットのいずれか１つのプライマーを用いてマーカーで標識された一本鎖の核酸に２次ＰＣＲ増幅する段階と、３）前記２次ＰＣＲ増幅した産物を少なくとも１種の女性生殖器病原体微生物検出用プローブと交雑反応させる段階と、４）前記交雑反応物を蛍光物質が付着した前記マーカーの特異的結合剤と反応させる段階と、５）蛍光値を測定して飼料内の女性生殖器病原体微生物を検出する段階とを含む女性生殖器病原体微生物検出方法を提供する。
【００１９】
前記１）段階において、配列番号３の塩基配列のプライマー及び配列番号４の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットをさらに用いることができ、前記２）段階において、配列番号３の塩基配列のプライマー及び配列番号４の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットのいずれか１つのプライマーをさらに用いることができる。
【００２０】
前記方法は、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）及びエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）からなる群から選択される少なくとも１つの女性生殖器病原体微生物を検出することができ、配列番号３の塩基配列のプライマー及び配列番号４の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットをさらに用いると、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）、エロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びトリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）からなる群から選択される少なくとも１つの病原体微生物を検出することができる。
【００２１】
前記ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）及びエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）検出用プローブは、それぞれ配列番号７〜２０の塩基配列を有するものでもよい。
【００２２】
また、前記１）段階において、配列番号５の塩基配列のプライマー及び配列番号６の塩基配列のプライマーを含むＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プライマーセットをさらに用いることができ、前記２）段階において、ＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プライマーセットのいずれか１つのプライマーをさらに用いることができ、前記３）段階において、ＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プローブをさらに用いることができる。前記ＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プローブは、配列番号２１の塩基配列を有するものでもよい。
【００２３】
本発明による女性生殖器病原体微生物検出方法は、段階１）〜５）で行われる一連の過程を行うことを特徴とする。本発明によれば、病原体１４種の検体を一度に迅速、正確かつ簡便に分析することができる。
【００２４】
段階１）は、配列番号１の塩基配列のプライマー及び配列番号２の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットを用いて試料内のＤＮＡを１次ＰＣＲ増幅する段階であり、この段階において、試料内のＤＮＡの中にある女性生殖器病原体微生物の遺伝子は指数関数的に（exponential）増幅される。
【００２５】
本発明において、「病原体」という用語は、病気を引き起こす微生物などをいうものであり、細菌、ウイルス、リケッチア、原虫、スピロヘータ、カビなどを含み、好ましくは病原性細菌又はカビ、より好ましくはウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）及びエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）を含む１４種の病原性細菌又はカビの少なくとも１つを示す。
【００２６】
本発明において、「プライマー」という用語は、短い遊離３’末端ヒドロキシル基（free 3'hydroxyl group）を有する核酸配列であり、相補的な鋳型（template）と塩基対（base pair）を形成することができ、鋳型のコピーのための開始地点として機能する短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度において、重合反応のための試薬及び異なる４種のヌクレオシド・トリホスフェートの存在下でＤＮＡ合成を開始することができる。本発明の具体的な実施例において、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）及びエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）を検出するための順方向プライマーは配列番号１、逆方向プライマーは配列番号２のプライマーを用い、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）を検出するための順方向プライマーは配列番号３、逆方向プライマーは配列番号４のプライマーを用いた。特に、陽性対照群であるＧＡＰＤＨに対する順方向プライマーは配列番号５、逆方向プライマーは配列番号６のプライマーを用いた（表１）。
【００２７】
本発明のプライマーは、ホスホルアミダイト固体支持体方法又はその他の公知の方法を用いて化学的に合成することができる。また、このような核酸配列は、当該分野に公知の多くの手段を用いて変形させることができる。このような変形の非限定的な例としては、メチル化、キャップ化、天然ヌクレオチドの少なくとも１種の同族体への置換、及びヌクレオチド間の変性、例えば、荷電していないリンカー（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カーバメートなど）又は荷電したリンカー（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）への変性がある。
【００２８】
本発明において、「ＰＣＲ（polymer chain reaction）」という用語は、生きた有機体を用いることなく、簡単な合成酵素反応を用いて鋳型となる核酸から特定ＤＮＡを大量に増幅させる分子技術と定義される。ＰＣＲは、鋳型となる核酸、プライマー、ＤＮＡポリメラ−ゼ（DNA polymerase）及びｄＮＴＰ（Deoxynucleotide triphosphate）を用い、核酸の変性（denaturation）、プライマーの結合（annealing）及びＤＮＡの伸長（extension）の３段階を経て行われる。各段階に適用される温度、時間及び繰り返し回数は、ＰＣＲの種類、鋳型ＤＮＡ、プライマー、ＰＣＲ装置などにより異なり、特に限定されるものではない。
【００２９】
段階２）は、段階１）で種特異的に増幅した遺伝子産物をプローブに相補的な鎖に増幅させるプライマーで２次ＰＣＲ増幅する段階であり、プローブに相補的な鎖にのみ選択的に増幅されるので、プローブと遺伝子産物の交雑効率が向上する。
【００３０】
本発明において、「マーカー」という用語は、プライマーを標識することができる標識物質であり、マーカーで標識されたｄＮＴＰの存在下でＰＣＲを行って遺伝子をマーカーで標識するためのものである。プローブと遺伝子産物の交雑を妨害せず、遺伝子標識のために用いることができるものであれば限定されるものではなく、当業界に公知の様々な物質を用いることができる。本発明の具体的な実施例においては、マーカーとしてビオチンを用い、マーカーの特異的結合剤としてストレプトアビジンを用いたが、これに限定されるものではなく、様々な吸収波長を有する様々な蛍光マーカーを用いてもよく、様々な放射性半減期を有する放射性マーカーを用いてもよい。マーカーで標識された鎖への増幅のために、順方向又は逆方向のマーカーで標識されたプライマーを用いる。交雑反応するプローブがアンチセンス鎖である場合は順方向プライマーにマーカーで標識してセンス鎖を増幅させ、交雑反応するプローブがセンス鎖である場合は逆方向プライマーにマーカーで標識してアンチセンス鎖を増幅させる。本発明の具体的な実施例においては逆方向プライマーを用いた。
【００３１】
特に、本発明の具体的な実施例においては、シグナルが非常に低いという問題を解決するために、２次一本鎖ＰＣＲ標識化（labeling）方法を導入することにより、従来得られていた最大ＭＦＩ（mean fluorescence intensity，シグナルの程度）値が約１００程度であったのに対し、ＭＦＩ値が約１，０００程度の強いシグナルを得ることができた。２次一本鎖ＰＣＲ標識化の利点は、蛍光で標識された対象物が非対称ＰＣＲ（asymmetrical PCR）で得られるものより多いというところにある。２つのＰＣＲ方法のどちらも線形増幅（linear amplification）により標識されるが、非対称増幅の場合は標識された対象物が再び二重螺旋を形成することがあるので、実際にビーズアレイに結合する確率が急激に減少する。
【００３２】
段階３）は、前記２次ＰＣＲ増幅したマーカーで標識された一本鎖の遺伝子産物を前記１４種の女性生殖器病原体検出用プローブが固定されたミクロスフェアビーズと交雑反応させる段階であり、プローブが固定されるビーズの種類は特に限定されるものではなく、ビーズアレイの製造は当該分野に公知の一般的な方法に従う。
【００３３】
本発明において、「プローブ」という用語は、相補的塩基配列を有する核酸と特異的に結合し、結合するか否かにより該当核酸が存在するか否かを認識できる核酸を意味する。プローブは、オリゴヌクレオチドプローブ、一本鎖ＤＮＡ（single stranded DNA）プローブ、二本鎖ＤＮＡ（double stranded DNA）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形態に製作されてもよい。本発明のプローブは、当業界に公知の様々な方法で製作することができ、本発明の具体的な実施例においては、各病原体の１６Ｓ遺伝子領域に対して多重配列アラインメント方法を適用した結果を基に製作した。本発明のプローブは、前記プローブを用いて試料と交雑反応することにより１４種の女性生殖器病原体を特異的に検出できるものであればいかなる配列のプローブでもよく、好ましくはウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）及びエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）検出用プローブであり、それぞれ配列番号７〜２０の塩基配列を用いたものである（表２）。
【００３４】
本発明の具体的な実施例において、プローブは、２次ＰＣＲを用いてビオチン−ｄＣＴＰで標識された試料遺伝子と特異的に反応するように、ミクロスフェアビーズに化学的に固定された形態で提供されている。図２は核酸ビーズ結合の原理を示す模式図である。
【００３５】
交雑反応の際に用いられるバッファ、時間及び温度条件は調節することができ、本発明の具体的な実施例において、バッファはＨｙｂｒｉｓｏｌバッファを用い、反応温度は９５℃で５分間、４０℃で３０分間交雑反応させた。
【００３６】
段階４）及び段階５）は、前記プローブと前記方法で準備した試料との反応の程度を蛍光値で確認する段階である。本段階に用いられる蛍光物質は、好ましくはフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド又はフルオレスカミンである。本発明の具体的な実施例においてはフィコエリスリンを用いた。
【００３７】
本発明において、「マルチプレックスリキッドアレイシステム（multiplex liquid array system）」という用語は、本発明の方法を実行するための蛍光値検出方法であり、図１にマルチプレックスビーズアレイの基本原理を模式図で示す。このようなサスペンションアレイの特徴は、１つのチューブ（Tube）の中で交雑反応が起こる３次元的方法であり、反応後、例えばＬｕｍｉｎｅｘ１００（登録商標）（Luminex社，米国）システムにおいて同時に５３２ｎｍと６３３ｎｍの波長を測定することにより蛍光値が得られることにある。６３３ｎｍの波長で測定された蛍光値はミクロスフェアビーズ（microsphere bead）を識別し、５３２ｎｍの波長で測定された蛍光値は各プローブと反応したＰＣＲ産物がストレプトアビジン−Ｃｙ３又はストレプトアビジン−フィコエリスリン結合により現れた値である（Keji et al., Cytometry 33:31 8-323, 1998）。本発明の具体的な実施例において、サスペンションアレイはフルオロメトリー（Fluorometry）法を用いたＬｕｍｉｎｅｘ１００システムを用いて高速測定でき、１回の測定で１００〜３００個のミクロスフェアビーズの蛍光値の最大頻度を確認できるので正確な分析が可能であり、蛍光反応の結果が数値で現れるので定量分析及び自動化システムへの適用が容易である（Armstrong et al., Cytometry 40:102-108, 2000）。すなわち、蛍光液相多重分析機器であるＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いると、ＰＣＲ技法とハイブリッド化技法を用いた従来のキットに比べて精度及び感度が高く、ミクロスフェアビーズの最大１００種に、各病原体に特異的な塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを結合させて検出する方式であり、病原体数を最大１００種類まで同時に検出可能なのでキット内に含める病原体数にそれほど制限されず、またソフトウェアプログラムにより指定されたミクロスフェアビーズの種類に応じて蛍光値が数値で標識されるので電気泳動画像解析によるエラーを排除でき、感染の有無だけでなく、感染量の多少までも分かるので定性及び定量分析も可能である。
【００３８】
本発明の具体的な実施例においては、従来技術より特異度と感度の高いマルチプレックスリキッドアレイシステムを用い、３次元的な交雑反応後にＬｕｍｉｎｅｘ１００で２種類の波長を同時に測定して蛍光値を得た。それぞれミクロスフェアビーズを識別する蛍光値（６３３ｎｍ）及び試料と特異的結合剤との結合の程度を測定する蛍光値（５３２ｎｍ）を高速で測定して定性及び定量分析を行った。このようにして、前記１４種の女性生殖器病原体感染の有無が判定された。
【００３９】
本発明の方法は、前記１）段階で配列番号５の塩基配列のプライマー及び配列番号６の塩基配列のプライマーを含むＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プライマーセットをさらに用いることができ、前記２）段階でＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プライマーセットのいずれか１つのプライマーをさらに用いることができ、前記３）段階でＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プローブをさらに用いることができる。前記ＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プローブは配列番号２１の塩基配列を有するものでもよい。本発明は、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内部対照群（internal control）として上記本発明の方法に用いる。
【００４０】
ＧＡＰＤＨ（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）は、ヒト染色体１２番に位置する遺伝子であり、細胞に必須の代謝過程である解糖に関与する酵素であると共に、細胞内で常に発現するのでその発現量がほとんど変化しない遺伝子である。
【００４１】
ＧＡＰＤＨプライマーは、試料内の内在遺伝子として常に発現するＧＡＰＤＨ遺伝子を特異的に増幅できるように考案されたものであり、ＧＡＰＤＨ遺伝子を検出するためのＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プローブは、前記病原体検出用プローブと同時に交雑させる。この過程によりＰＣＲ反応が正常に起きているか否かをビーズアレイ分析器内で直ちに確認することができるので、ＰＣＲ増幅の失敗に伴う不検出の場合の数を大幅に低減することができる。本発明の具体的な実施例において、陽性対照群であるＧＡＰＤＨに対する順方向プライマーは配列番号５、逆方向プライマーは配列番号６のプライマーを用い、ＧＡＰＤＨに対する順方向プローブは配列番号２０、逆方向プローブは配列番号２１のプローブを用いた。
【００４２】
他の態様として、本発明は、配列番号１の塩基配列のプライマー及び配列番号２の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットと、配列番号３の塩基配列のプライマー及び配列番号４の塩基配列のプライマーを含むプライマーセットと、それぞれ配列番号７〜２０の塩基配列を有するウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocum）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus Saprophyticus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Staphylococcus pyogenes）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）及びエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）検出用プローブからなる群から選択される少なくとも１つのプローブとを含む女性生殖器病原体微生物検出用キットを提供する。
【００４３】
本発明によれば、分析感度、測定範囲、特異度、交差反応性及び再現性において顕著な効果を示す病原体検出用キットは、病原体１４種の検体を一度に迅速、正確かつ簡便に分析することができる。上記と同じ内容は繰り返しを避けるために省略する。
【００４４】
上記方法を様々に変形及び応用することができるが、これらも本発明の範囲に含まれる。
【００４５】
〔実施例〕
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであるので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４６】
＜実施例１＞
プライマー及びプローブの製作
選定された病原体の特異的なプライマー及びプローブを下記表１及び表２に示す。
【００４７】
【表１】
2013521799.tif 000003
【００４８】
【表２】
2013521799.tif 000004
【００４９】
＜実施例２＞
ＳＴＤ病原体からのゲノムＤＮＡの抽出
Ｉｎｔｒｏｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＧ−ｓｐｉｎＴＭ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Cat. No. 17121）を用いてＳＴＤ病原体からゲノムＤＮＡを抽出した。
【００５０】
＜実施例３＞
ＰＣＲによる病原体ゲノムＤＮＡの増幅
実施例２で得られた鋳型ＤＮＡ ５ｕｌ（２ｎｇ）、実施例１で得られたプライマーそれぞれ０．５ｕＭ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、７．５ｍＭ １０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ultratools, Spain） ５ｕｌ、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ultratools, Spain） １Ｕで準備したＰＣＲ反応混合物を９５℃で５分間変性（denature）させ、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を４０回繰り返して伸長（extension）させ、７２℃で７分間最終伸長させた。図３は１．５％アガロースゲルに標準試料（微生物１４種のゲノムＤＮＡ）のＰＣＲ産物を電気泳動してＰＣＲ条件を確認したものである。
【００５１】
＜実施例４＞
ビオチン−ｄＣＴＰを用いた２次一本鎖ＰＣＲによる相補的な一本鎖の形成
実施例３で作成されたＰＣＲ産物を鋳型として５ｕｌ、ビーズアレイプローブに相補的な鎖を形成する逆方向プライマー（０．５ｕＭ）、２．５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ ｍｉｘ、０．４ｍＭ ｂｉｏｔｉｎ−ｄＣＴＰ（Invitrogen） ２ｕｌ、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ultratools, Spain） ５ｕｌ、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ultratools, Spain） １Ｕで準備したＰＣＲ反応混合物を９５℃で５分間変性させ、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間を３５回繰り返して一本鎖を増幅した。
【００５２】
＜実施例５＞
プローブが固定されたミクロスフェアビーズの製作
製作されたプローブ（ＧＡＰＤＨを含めて全１５種）をそれぞれ１００ｕＭずつ準備し、それぞれ反応させるビーズを番号通りによく混合し、その後４０ｕｌ（４〜５×１０５ｂｅａｄｓ／ｕｌ）ずつ取って各ビーズに０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ４．５） ２０ｕｌを混ぜ、その後準備したプローブ２０ｕＭを分けてビーズと混ぜた。次に、新しく作成した１０ｍｇ／ｍｌ ＥＤＣ溶液１ｕｌを入れ、その後暗所で約３０分間振盪して反応させた。これに１０ｍｇ／ｍｌ ＥＤＣ溶液をさらに１ｕｌ追加して入れ、その後暗所で約２０分間振盪して反応させた。次に、各チューブに５００ｕｌの０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液を入れてよく混ぜ、ビーズと上澄液を遠心分離して上澄液を除去した。再度５００ｕｌの０．１％ＳＤＳ溶液によく混合し、ビーズと上澄液を遠心分離して上澄液を除去した。最後に、１５０ｕｌのＴＥ（ｐＨ８．０）バッファを入れてよく混ぜ、その後４℃の暗室で保管した。
【００５３】
＜実施例６＞
ミクロスフェアビーズとの交雑反応
ビオチン−ｄＣＴＰで標識された試料遺伝子をＨｙｂｒｉｓｏｌバッファに溶解し、その後プローブが結合されたミクロスフェアビーズと交雑反応（９５℃で５分間、４０℃で３０分間）させた。
【００５４】
＜実施例７＞
Ｌｕｍｉｎｅｘ１００装置を用いたシグナル検出
Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で全１４種類のミクロスフェアビーズを測定し、ミクロスフェアビーズのＭＦＩ値からそれぞれの微生物が検出されたか否かを決定した。多数のビーズアレイキットで遺伝子型分析が正確に行われていることから、感染の有無を判定できることを確認した。図４は各ビーズアレイが反応する条件を確認したものである。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】マルチプレックスビーズアレイの基本原理を示す模式図である。
【図２】核酸ビーズ結合の原理を示す模式図である。
【図３】ＰＣＲ基礎実験結果であり、１．５％アガロースゲルに標準試料（微生物１４種のゲノムＤＮＡ）のＰＣＲ産物を電気泳動してＰＣＲ条件を確認したものである。
【図４】ビーズアレイにおける基礎実験結果であり、各ビーズアレイが反応する条件を確認したものである。
【図１】
2013521799.tif 000005
【図２】
2013521799.tif 000006
【図３】
2013521799.tif 000007
【図４】
2013521799.tif 000008
【配列表】
2013521799000001.app
【国際調査報告】
2013521799.tif 000009
2013521799.tif 000010
2013521799.tif 000011
2013521799.tif 000012