(57)【要約】本発明は、詳細な記載に記載された式（Ｉ）で示されるグリセロ脂質化合物の特定のファミリーの使用、又は癌転移を予防するための若しくは治療するための医薬の製造に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化２７】
2013519706.tif 000036
｛式中、
−Ｒ１は、１６〜１８個の炭素原子を有するアルキル又はアルケニル基であり、
−Ｒ２は、
（ａ）式（ＩＩ）：
【化２８】
2013519706.tif 000037
［式中、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３は、互いに独立に、水素原子及び１又は２個の炭素原子を有するアルキル基からなる群より選択される］で示される基、及び
（ｂ）ヒドロキシル
からなる群より選択される基であり、
そして
−Ｒ３は、
−モノサッカライド基、もしくは２〜４個のサッカライド単位を有するポリサッカライド基、又は
−式（ＩＩＩ）：
【化２９】
2013519706.tif 000038
［式中、Ｒ４は、モノサッカライド基、もしくは２〜４個のサッカライド単位を有するポリサッカライド基からなる群より選択される］で示される基
からなる群より選択される｝で示される、癌転移を予防するための医薬の製造のためのグリセロ脂質の使用。
【請求項２】
Ｒ１が、１６又は１７個の炭素原子を有するアルキル又はアルケニル基である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
Ｒ１が、−（ＣＨ２）１５−ＣＨ３である、請求項１記載の使用。
【請求項４】
Ｒ２が、式（ＩＩ）の基であり、そしてＲ２１、Ｒ２２及びＲ２３が、各々、水素原子である、請求項１記載の使用。
【請求項５】
Ｒ３又はＲ４が、ペントシル及びヘキソシルからなる群より選択されるモノサッカライドである、請求項１記載の使用。
【請求項６】
Ｒ３又はＲ４が、Ｄ−グルコシル、Ｄ−マンノシル及びＤ−ガラクトシルからなる群より選択されるヘキソシルである、請求項１記載の使用。
【請求項７】
式（Ｉ）の化合物が、下記化合物（Ａ）〜（Ｐ）：
−化合物（Ａ）：
【化３０】
2013519706.tif 000039
−化合物（Ｂ）：
【化３１】
2013519706.tif 000040
−化合物（Ｃ）：
【化３２】
2013519706.tif 000041
−化合物（Ｄ）：
【化３３】
2013519706.tif 000042
［式中、Ｒ３は、ラクトースとも称される、Ｇａｌ−β−（１−４）−Ｇｌｕ基を意味する］、
−化合物（Ｅ）：
【化３４】
2013519706.tif 000043
［式中、Ｒ３は、Ｇａｌ−α−（１−４）−Ｇｌｕ基を意味する］、
−化合物（Ｆ）：
【化３５】
2013519706.tif 000044
［式中、Ｒ３は、Ｇｌｕ−β−（１−４）−Ｇｌｕ基を意味する］、
−化合物（Ｇ）：
【化３６】
2013519706.tif 000045
［式中、Ｒ３は、マルトースとも称される、Ｇｌｕ−α−（１−４）−Ｇｌｕ基を意味する］、
−化合物（Ｈ）：
【化３７】
2013519706.tif 000046
［式中、Ｒ７１及びＲ７２は、水素原子及びヒドロキシル基又はアセチル基からなる群より独立に選択され、これは、（ｉ）Ｒ７１がＨであり、そしてＲ７２がＯＨ又はＯＡｃである場合、Ｇａｌ−β−（１−６）−Ｇｌｕを、ならびに（ii）Ｒ７１がＯＨ又はＯＡｃであり、そしてＲ７２がＨである場合、Ｇｌｕ−β−（１−６）−Ｇｌｕを包含する］、
−化合物（Ｉ）：
【化３８】
2013519706.tif 000047
［式中、Ｒ７１及びＲ７２は、水素原子及びヒドロキシル基又はアセチル基からなる群より独立に選択され、これは、（ｉ）Ｒ７１がＨであり、そしてＲ７２がＯＨ又はＯＡｃである場合、メリビオース又はアセチルメリビオースとも称される、Ｇａｌ−α−（１−６）−Ｇｌｕを、ならびに（ii）Ｒ７１がＯＨ又はＯＡｃであり、そしてＲ７２がＨである場合、Ｇｌｕ−α−（１−６）−Ｇｌｕを包含する］、
−化合物（Ｊ）：
【化３９】
2013519706.tif 000048
［式中、Ｒ７１及びＲ７２は、水素原子及びヒドロキシル基又はアセチル基からなる群より独立に選択され、これは、（ｉ）Ｒ７１がＨであり、そしてＲ７２がＯＨ又はＯＡｃである場合、Ｇａｌ−β−（１−６）−Ｇａｌを、ならびに（ii）Ｒ７１がＯＨ又はＯＡｃであり、そしてＲ７２がＨである場合、Ｇｌｕ−β−（１−６）−Ｇａｌを包含する］、
−化合物（Ｋ）：
【化４０】
2013519706.tif 000049
［式中、Ｒ７１及びＲ７２は、水素原子及びヒドロキシル基又はアセチル基からなる群より独立に選択され、これは、（ｉ）Ｒ７１がＨであり、そしてＲ７２がＯＨ又はＯＡｃである場合、Ｇａｌ−α−（１−６）−Ｇａｌを、ならびに（ii）Ｒ７１がＯＨ又はＯＡｃであり、そしてＲ７２がＨである場合、Ｇｌｕ−α−（１−６）−Ｇａｌを包含する］、
−化合物（Ｌ）：
【化４１】
2013519706.tif 000050
−化合物（Ｍ）：
【化４２】
2013519706.tif 000051
［式中、Ｒ４は、ラクトース又はアセチルラクトースとも称される、Ｇａｌ−β−（１−４）−Ｇｌｕ基を意味する］、
−化合物（Ｎ）：
【化４３】
2013519706.tif 000052
［式中、Ｒ４は、マルトース又はアセチルマルトースとも称される、Ｇｌｕ−α−（１−４）−Ｇｌｕ基を意味する］、
−化合物（Ｏ）：
【化４４】
2013519706.tif 000053
［式中、Ｒ７１及びＲ７２は、水素原子及びヒドロキシル基又はアセチルからなる群より独立に選択され、これは、（ｉ）Ｒ７１がＨであり、そしてＲ７２がＯＨ又はＯＡｃである場合、メリビオース又はアセチルメリビオースとも称される、Ｇａｌ−α−（１−６）−Ｇｌｕを、ならびに（ii）Ｒ７１がＯＨ又はＯＡｃであり、そしてＲ７２がＨである場合、Ｇｌｕ−α−（１−６）−Ｇｌｕを包含する］、
−化合物（Ｐ）：
【化４５】
2013519706.tif 000054
［式中、Ｒ８１及びＲ８２は、水素原子及びヒドロキシル基又はアセチル基からなる群より独立に選択され、これは、（ｉ）Ｒ８１がＨであり、そしてＲ８２がＯＨ又はＯＡｃである場合、ラクトース−β−又はアセチルラクトース−β−（１−６）−Ｇｌｕを、ならびに（ii）Ｒ８１がＯＨ又はＯＡｃであり、そしてＲ８２がＨである場合、ラクトース−β−又はアセチルラクトース−β−（１−６）−Ｇａｌを包含する］
からなる群より選択される、請求項１記載の使用。
【請求項８】
Ｒ３が、式（ＩＩＩ）：
【化４６】
2013519706.tif 000055
［式中、Ｒ４は、モノサッカライド基、又は２〜４個のサッカライド単位を有するポリサッカライド基からなる群より選択される］で示される基からなる、
医薬としての使用のための、請求項１に定義のとおりの式（Ｉ）のグリセロ脂質。
【請求項９】
下記化合物（Ｍ）〜（Ｐ）：
−化合物（Ｍ）：
【化４７】
2013519706.tif 000056
［式中、Ｒ４は、ラクトース又はアセチルラクトースとも称される、Ｇａｌ−β−（１−４）−Ｇｌｕ基を意味する］、
−化合物（Ｎ）：
【化４８】
2013519706.tif 000057
［式中、Ｒ４は、マルトース又はアセチルマルトースとも称される、Ｇｌｕ−α−（１−４）−Ｇｌｕ基を意味する］、
−化合物（Ｏ）：
【化４９】
2013519706.tif 000058
［式中、Ｒ７１及びＲ７２は、水素原子及びヒドロキシル基又はアセチルからなる群より独立に選択され、これは、（ｉ）Ｒ７１がＨであり、そしてＲ７２がＯＨ又はＯＡｃである場合、メリビオース又はアセチルメリビオースとも称される、Ｇａｌ−α−（１−６）−Ｇｌｕを、ならびに（ii）Ｒ７１がＯＨ又はＯＡｃであり、そしてＲ７２がＨである場合、Ｇｌｕ−α−（１−６）−Ｇｌｕを包含する］、
−化合物（Ｐ）：
【化５０】
2013519706.tif 000059
［式中、Ｒ８１及びＲ８２は、水素原子及びヒドロキシル基又はアセチル基からなる群より独立に選択され、これは、（ｉ）Ｒ８１がＨであり、そしてＲ８２がＯＨ又はＯＡｃである場合、ラクトース−β−又はアセチルラクトース−β−（１−６）−Ｇｌｕを、ならびに（ii）Ｒ８１がＯＨ又はＯＡｃであり、そしてＲ８２がＨである場合、ラクトース−β−又はアセチルラクトース−β−（１−６）−Ｇａｌを包含する］
からなる群より選択される、医薬としての使用のための、請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
請求項８又は９のいずれか一項に定義の式（Ｉ）のグリセロ脂質。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に定義の式（Ｉ）の化合物を１つ以上の薬学的な賦形剤と組み合わせて含む、癌転移を予防するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、医療分野に、そしてより特別には、癌転移の予防及び治療に関する。
【０００２】
発明の背景
既知又は市販の抗癌化合物は、癌細胞に対する直接的な作用をはじめとして様々な方法で抗癌特性を発揮する。癌細胞に対して直接作用する多数の抗癌剤は、癌細胞増殖を抑制するか、又は癌細胞に対して細胞障害性である。
【０００３】
しかし、原発癌の完全な除去又は処置の後でさえ、悪性腫瘍が、多くの場合、転移する。転移性悪性腫瘍は、原発腫瘍の転移の結果として、原発病変から離れた部位に形成される。これは癌治療において最も重大な懸念の一つである。具体的に言えば、原発病変が処置されたとしても、別の器官に転移した腫瘍の成長のせいで、患者が死亡する場合もある。多くの種類の臨床的に診断された固形癌（癌の局所的成長から生じる原発病変である、ある種の腫瘍）の場合、外科的除去が第一の処置方法だと考えられている。しかし、原発癌細胞転移は、多くの場合、外科手術の後で観察される。転位部位における癌浸潤は全身に拡散するので、患者は転移性癌の成長が原因で死亡する。切除可能な腫瘍を有する個々の身体にとって、原発腫瘍成長又は局所再発が、多くの場合、死亡の原因であると報告されてきた。したがって、手術可能な腫瘍を有する癌患者のほぼ４０％が外科的手術後の転移性疾患が原因で最終的に死に至ると近年考えられている。
【０００４】
それゆえ、悪性腫瘍転移は、失敗した癌治療の最も一般的な理由である（Bertino et al., (編集1996年), Encyclopedia of Cancer, Academic Press; Devita et al., (編集1997年), Cancer: Principles & Practice of Oncology, Lippincott, Williams and Wilkins; Cavalli et al., (1996), Textbook of Medical Oncology, Dunitz Martin Ltd; Peckham et al., (編集1995年), Oxford Textbook of Oncology, Oxford Univ. Press; and Mendelsohn et al., (1995), The Molecular Basis of Cancer, Saunders, Philadelphiaを参照のこと）。
【０００５】
悪性黒色腫、乳癌、肺癌、大腸癌、及び前立腺癌は、転移する傾向がある癌の種類であると考えられている。転移の範囲は癌の種類に依存して異なる。肺及び肝臓は、癌の標的器官として周知であり、ならびに脳又は骨髄もまた高頻度で標的器官である。骨への転移は、他の器官への転移と異なり、それが直接生命を脅かすことはめったにない。しかし、骨への転移は、耐えがたい骨の痛み、身体的活動の制限などによって複雑であり、その結果、著しく患者の生活の質（ＱＯＬ）を下げ、そして間接的に患者の早期な死を引き起こす。
【０００６】
転移は、様々な遺伝的又は後成的突然変異の結果として生じる非常に複雑なプロセスであり、そして転移の各段階は、特異的な細胞内シグナル伝達経路によって調節されていると思われる。浸潤機構は、転移プロセスを開始し、そして細胞及び細胞外基質への腫瘍細胞の接着の変化、周囲組織のタンパク質分解、ならびに組織を通り身体的に適切な腫瘍細胞への運動からなり、全てのそれらのステップは、シグナル伝達経路によって特異的に調節される。
【０００７】
転移の多段階プロセスには、（ｉ）原発腫瘍からの悪性細胞の放出、（ii）癌細胞の血流への移動、（iii）遠位部位での接着、及び（iv）溢血後の血管内又は組織内での播種性癌細胞の成長が挙げられる。このプロセスにおける各段階では、癌細胞と宿主微小環境との間に異なる種類の相互作用を必要とする。
【０００８】
転移が起こる機構、ひいては阻害され得る機構の詳細については、まだ完全に解明されていないが、しかし、非癌細胞の癌細胞への形質転換に関与する生物学的機構は、癌細胞転移の発生に関与する機構とは明らかに異なることが明白である（Steeg P S, Nat. Medicine 2006, vol.12, (8), 895-904）。例えば、最近の研究は、癌細胞増殖へと導く幾つかの細胞経路と転移性浸潤機構との間の明確な違いを立証している（McLean, G. et al., Nat. Rev. Cancer 5, 505-514 (2005); Playford, M. & Schaller, M., Oncogene 23, 7928-7946 (2004); Birchmeier, C et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 915-925 (2003）。
【０００９】
更に、異なる状況で異なる遺伝子によって実行されるであろう幾つかの相補的機能が必要なため、特異な転移遺伝子の同定は難しいが、２０を超える転移抑制因子が最近同定された。転移抑制因子は、腫瘍抑制因子とは異なる機構で作用し、原発腫瘍に影響を及ぼさない。これらの遺伝子は、腫瘍形成を抑制することなく、腫瘍転移を阻害する（Rinker- Schaeffer CW et al., Clin Cancer Res 2006;12:3882-89; Berger JC et al., Cancer Biol Ther 2005; 4:805-12; Nash KT et al., Front Biosci 2006;11:647-59; Shevde LA et al., Cancer Lett 2003;198:1-20; Steeg PS et al., Clin Breast Cancer 2003; 4:51-62）。
【００１０】
したがって原発腫瘍を除去するために、増殖及び／又はアポトーシス機構のターゲティングが必要な場合には、完全寛解を達成するために、転移性プロセスに対して異なる取り組みをすることが必要であることが、明らかになった。
【００１１】
実際、癌細胞に対して抗増殖作用を有する抗癌剤を含む抗癌剤は、原発腫瘍に対して治療効果を実証したが、これらの抗癌剤のうち殆どどれも同時に抗転移作用を有していない。
【００１２】
前臨床研究は、実際、原発性疾患及び転移性疾患に対する薬剤の差次的効果を報告している。これらのデータは、原発腫瘍のサイズの減少に関して検証された化合物が、転移性疾患に効き目はないかもしれないと説明している。それどころか、抗転移性効果は、原発腫瘍サイズの減少に基づく試験では、検証できないであろう（Steeg P S, Nature Medicine, 12 (8), 895-905 (2006); Lang, J.Y. et al. Clin. Cancer Res. 11, 3455-3464 (2005); Shannon, K.E. et al. Clin. Exp. Metastasis 21, 129-138 (2004); Manni, A. et al. Clin. Exp. Metastasis 20, 321-325 (2003); Cairns, R.A. & Hill, R.P. Cancer Res. 64, 2054-2061 (2004); Lovey, J. et al., Strahlenther. Onkol. 179, 812-818 (2003); Nasulewicz, A. et al. Biochim. Biophys. Acta 1739, 26-32 (2004)）。
【００１３】
より更に、他の研究は、原発腫瘍をターゲティングにする化学療法剤が転移特性を変更し得ることを示した。例えば、メルファラン（melphalan）を用いた鼻腔癌細胞株のインビトロ処置は、その侵襲性を増強させたことを示した(Liang, Y. et al. Eur. J. Cancer 37, 1041-1052 (2001))。転移に作用する原因機構は未知であり、且つ多因子性であり得る。少なくとも以下の２つの可能性がある：（ａ）処置が、突然変異を加速しており、且つより侵襲的な細胞変異体の成長を助長する選択圧を発揮しているか、又は（ｂ）処置に関連するストレスが、生存可能な転移を形成する細胞の能力を増強する、遺伝子発現における変化のようなエピジェネティック変化を誘発している（Cairns R. A. & Hill R. P. Cancer Res., 64, 2054-61 (2004)）。
【００１４】
したがって、抗転移薬の開発に関して、最も興味深い標的は、原発腫瘍成長に干渉することなく転移拡散を制御する細胞プロセスの分子である。
【００１５】
過去２０年で、幾つかのチームは、「真」（即ち：転移プロセスを特異的にターゲティングすること）の抗転移薬を見出すことに専念した。ラゾキサン（razoxane）のようなそれら抗転移薬の幾つかは、物理的バリアーを精巧に構成することによって転移性細胞の血管内侵入を阻害するが、そのことは原発腫瘍の成長を制限しない（Bergamo et al., Dalton trans., 2007, 13, 1267-1272）。それらの大部分は、コロニー形成の様々な段階を阻害する（Perret & Crepin, Fundamental and Clinical Pharmacology, 2008, 22, 465-92）。
【００１６】
またインビトロで移動する癌細胞の能力と、インビボで転移する癌細胞の能力との間の直接的な関係を示した先行研究により、新たな抗転移標的を同定する可能性が広がった（特に、Giamperi et al., 2009, Nature Cell Biology, Vol. 11(11): 1287-1296; Patent Application No. US 2003/00 54985, Hazan et al., 2000, The Journal of Cell biology, Vol. 148(4): 779-790; Yang et al., 2009, Cancer Cell, Vol. 15: 124-134を参照のこと）。
【００１７】
予備臨床試験段階を含む、有望な実験的試験の主題であった化合物は、エデルフォシン（edelfosine）（ＥＴ−１８−ＯＣＨ３）という名のアルキルグリセロリン脂質化合物である（Vogler et al., Cancer Invest, 1998, 16(8):549-53, Candal et al., Cancer Chemother Pharmacol, 1994, 34(2), 175-8）。
【００１８】
しかし、エデルフォシンは、抗血管新生効果及びおそらく抗侵襲作用を有すると当技術分野において記載されてきた一方で、その分子作用の明確な理解は欠けている。例えば、エデルフォシンは、用量に依存して血管新生に対し二相性効果を発揮することが示されている（Vogler et al., Cancer Invest, 1998, 16(8):549-53, Candal et al., Cancer Chemother Pharmacol, 1994, 34(2), 175-8, Cajate C & Mollinedo F, Current Drug metabolism, 2002, 3, 491-525）。更に、ＰＡＦ（Andrade S P et al., Int. J. Exp. Pathol., 1992, 73, 503-13）又はブチリル−グリセロール（Dobson D E, et al., Cell, 1990, 61, 223-30）のような他の関連グリセロ脂質は、血管新生促進性であると報告されている。
【００１９】
更に、エデルフォシンはまた原発腫瘍成長を標的とし、且つアポトーシス促進性効果を発揮するので、エデルフォシンは、「真」の抗転移薬ではない（Gajate C and Mollinedo F, Curr. Drug Metab. 3, 491-525 ; Nieto-Miguel et al., 2007, Cancer Res, 67 (31); Estella-Hermoso de Mendoza et al., 2009, Clin Cancer Res, 15(3), 858-864）。
【００２０】
最後に、エデルフォシンは、ヒトに投与された場合、毒性が高いことが周知であり、またその臨床的治療用途は、重症で有害な副作用によって著しく阻止された（Gajate C and Mollinedo F, Curr. Drug Metab. 3, 491-525）。
【００２１】
したがって、腫瘍転移を阻害する方法、特に、処置された癌患者に重篤な副作用を引き起こさずに転移を阻害する方法が、当技術分野において依然として必要である。
【００２２】
発明の概要
本発明は、式（Ｉ）：
【化１】
2013519706.tif 000002
｛式中、
−Ｒ１は、１６〜１８個の炭素原子を有するアルキル又はアルケニル基であり、
−Ｒ２は、
（ａ）式（ＩＩ）：
【化２】
2013519706.tif 000003
［式中、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３は、互いに独立に、水素原子及び１又は２個の炭素原子を有するアルキル基からなる群より選択される］で示される基、及び
（ｂ）ヒドロキシル
からなる群より選択される基であり、
そして
−Ｒ３は、
−モノサッカライド基、もしくは２〜４個のサッカライド単位を有するポリサッカライド基、又は
−式（ＩＩＩ）：
【化３】
2013519706.tif 000004
［式中、Ｒ４は、モノサッカライド基、もしくは２〜４個のサッカライド単位を有するポリサッカライド基からなる群より選択される］で示される基
からなる群より選択される｝で示される、癌転移を予防するための医薬の製造のためのグリセロ脂質の使用に関する。
【００２３】
本発明はまた、癌転移を予防するための式（Ｉ）のグリセロ脂質の使用に関する。
【００２４】
本発明はまた、癌転移を予防するための方法であって、上記の式（Ｉ）のグリセロ脂質を、それを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。
【００２５】
式（Ｉ）のグリセロ脂質は、本明細書において本発明の一般的な説明に詳述されている、式（Ａ）〜（Ｐ）の化合物を包含する。
【００２６】
0
本発明はまた、上記と同義の式（Ｉ）の化合物を１つ以上の薬学的に許容しうる賦形剤と組み合わせて含む、癌転移を予防するための医薬組成物に関する。
【００２７】
最後に、本発明は、上記の式（Ｉ）のグリセロ脂質それ自体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】式（Ｉ）の化合物、特に、式（Ｉ）［式中、基Ｒ３は、モノサッカライド又はポリサッカライド基を意味する］の化合物を得るために有用なグリセロール脂質前駆体である、中間体化合物Ａの合成のスキームを示す。このスキームは、本明細書中では「スキーム１」と呼ばれる。
【図２】式（Ｉ）［式中、基Ｒ３は、モノサッカライド又はポリサッカライド基を意味する］の化合物を得るために有用な、６位に遊離ヒドロキシル基を有するグリコピラノシル誘導体である、中間体化合物Ｂの合成のスキームを示す。このスキームは、本明細書中では「スキーム２」と呼ばれる。
【図３】式（Ｉ）［式中、基Ｒ３は、モノサッカライド又はポリサッカライド基を意味する］の化合物を得るために有用な、６−Ｏ−アセチル−２’３’４−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−ガラクトピラノースである、中間体化合物Ｃの合成のスキームを示す。このスキームは、本明細書中では「スキーム３」と呼ばれる。
【図４】化合物Ｃを化合物Ｂと反応せることによる、式（Ｉ）［式中、基Ｒ３は、モノサッカライド又はポリサッカライド基を意味する］の化合物の合成のスキームを示す。このスキームは、本明細書中では「スキーム４」と呼ばれる。
【図５】式（Ｉ）｛式中、基Ｒ３は、式（ＩＩＩ）［式中、Ｒ４は、モノサッカライド又はポリサッカライド基を意味する］の基である｝の化合物の合成のスキームを示す。このスキームは、本明細書中では「スキーム５」と呼ばれる。
【図６Ａ】癌性ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞及び非癌性ＭＣＦ−１０Ａ細胞に対する細胞運動に及ぼすＪＰＨ１７０１（又はOhmline）活性。運動は、トランスウエルアッセイにより試験した。加えて、生存率試験は、ＭＴＴアッセイを用いて実施した。図６Ａ〜Ｂ）：ＪＰＨ１７０１（図６ＡのＪＰＨ１７０１の濃度は、０（対照条件）、１０nM、１００nM、３００nM及び１μMである）は、１０μMを除いて、生存率（図６Ｂ）に影響することなく、１０nMからＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ野生型（ＷＴ）細胞の運動を減少（図６Ａ）させる。
【図６Ｂ】癌性ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞及び非癌性ＭＣＦ−１０Ａ細胞に対する細胞運動に及ぼすＪＰＨ１７０１（又はOhmline）活性。運動は、トランスウエルアッセイにより試験した。加えて、生存率試験は、ＭＴＴアッセイを用いて実施した。図６Ａ〜Ｂ）：ＪＰＨ１７０１（図６ＡのＪＰＨ１７０１の濃度は、０（対照条件）、１０nM、１００nM、３００nM及び１μMである）は、１０μMを除いて、生存率（図６Ｂ）に影響することなく、１０nMからＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ野生型（ＷＴ）細胞の運動を減少（図６Ａ）させる。
【図６Ｃ】癌性ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞及び非癌性ＭＣＦ−１０Ａ細胞に対する細胞運動に及ぼすＪＰＨ１７０１（又はOhmline）活性。運動は、トランスウエルアッセイにより試験した。加えて、生存率試験は、ＭＴＴアッセイを用いて実施した。図６Ｃ〜Ｄ）：ＭＣＦ−１０Ａ運動（図６Ｃ）及び生存率（図６Ｄ）は、ＪＰＨ１７０１（図６ＣのＪＰＨ１７０１の濃度は、０（対照条件）、１０nM、１００nM、３００nM及び１μMである）による影響を受けない。
【図６Ｄ】癌性ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞及び非癌性ＭＣＦ−１０Ａ細胞に対する細胞運動に及ぼすＪＰＨ１７０１（又はOhmline）活性。運動は、トランスウエルアッセイにより試験した。加えて、生存率試験は、ＭＴＴアッセイを用いて実施した。図６Ｃ〜Ｄ）：ＭＣＦ−１０Ａ運動（図６Ｃ）及び生存率（図６Ｄ）は、ＪＰＨ１７０１（図６ＣのＪＰＨ１７０１の濃度は、０（対照条件）、１０nM、１００nM、３００nM及び１μMである）による影響を受けない。
【図６Ｅ】癌性ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞及び非癌性ＭＣＦ−１０Ａ細胞に対する細胞運動に及ぼすＪＰＨ１７０１（又はOhmline）活性。運動は、トランスウエルアッセイにより試験した。加えて、生存率試験は、ＭＴＴアッセイを用いて実施した。図６Ｅ〜Ｆ）：ＳＫ３依存性運動に対する効果。図６Ｅは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ ｓｈＲＤ＝ＳＫ３＋ＳＫ３を発現している細胞の運動が、ＪＰＨ１７０１（ＪＰＨ１７０１の濃度は、０（対照条件）、１０nM、１００nM、３００nM及び１μMである）により影響をうけることを示す。対照的に、図６Ｆに示すように、ＪＰＨ１７０１は、ＪＰＨ１７０１（ＪＰＨ１７０１の濃度は、０（対照条件）、１０nM、１００nM、３００nM及び１μMである）の非特異的な効果が示されている１μMを除いて、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ ｓｈＳＫ３（これは、ＳＫ３を発現しない）の遊走能力に影響しない。
【図６Ｆ】癌性ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞及び非癌性ＭＣＦ−１０Ａ細胞に対する細胞運動に及ぼすＪＰＨ１７０１（又はOhmline）活性。運動は、トランスウエルアッセイにより試験した。加えて、生存率試験は、ＭＴＴアッセイを用いて実施した。図６Ｅ〜Ｆ）：ＳＫ３依存性運動に対する効果。図６Ｅは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ ｓｈＲＤ＝ＳＫ３＋ＳＫ３を発現している細胞の運動が、ＪＰＨ１７０１（ＪＰＨ１７０１の濃度は、０（対照条件）、１０nM、１００nM、３００nM及び１μMである）により影響をうけることを示す。対照的に、図６Ｆに示すように、ＪＰＨ１７０１は、ＪＰＨ１７０１（ＪＰＨ１７０１の濃度は、０（対照条件）、１０nM、１００nM、３００nM及び１μMである）の非特異的な効果が示されている１μMを除いて、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ ｓｈＳＫ３（これは、ＳＫ３を発現しない）の遊走能力に影響しない。
【図７Ａ】ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ野生型（ＷＴ）における全細胞電流に対する、１μMでのＪＰＨ１７０１の２４時間適用の効果。図７Ａ）：ＭＤＡ−ＭＤ−４３５ｓについて記録された電流の図。上に、対照条件下の電流をＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓについて記録した。下に、ＪＰＨ１７０１ １μMで２４時間の間、処置した細胞の電流を表した。
【図７Ｂ】ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ野生型（ＷＴ）における全細胞電流に対する、１μMでのＪＰＨ１７０１の２４時間適用の効果。図７Ｂ）：アパミン−感受性電流に対するＪＰＨ１７０１の効果。細胞を、ＪＨＰ１７０１ １μMで２４時間の間インキュベートし、次に電流を、アパミン（ＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルの特異的な遮断薬である）の非存在下又はアパミン有りで測定した。ヒストグラムは、アパミンにより阻害された電流の振幅を示す。ＪＰＨ１７０１での処置の後、アパミン−感受性電流は、消失した。
【図８Ａ】ＳＫ３チャネル活性に対するＪＰＨ１７０１の効果；図８Ａ）：０mVで記録されたＳＫ３電流に対するＪＰＨ１７０１の３種類の用量（３００nM、上部曲線；１μM、中部曲線；及び１０μM、底部曲線）の用量及び時間応答効果。＊は、ｐ＜０．０５で、対照と有意に異なることを意味する。
【図８Ｂ】ＳＫ３チャネル活性に対するＪＰＨ１７０１の効果；図８Ｂ）：電流の５０％阻害を得るためのＪＰＨ１７０１の用量非依存効果を示すヒストグラム（ＪＰＨ１７０１の濃度は、１０、１及び０．３μMである）。結果は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（平均値の標準誤差）として表す。
【図８Ｃ】ＳＫ３チャネル活性に対するＪＰＨ１７０１の効果；図８Ｃ）：ＳＫ３活性に対する、ラセミ体ヘキサデシルオキシ−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロール−ラクトース（ＪＰＨ１７０１又はOhmline、即ち：実施例中のＪＰＨ１７０１）混合物の効果、及び両方の鏡像異性体（Ｒ−ＪＰＨ１７０１及びＳ−ＪＰＨ１７０１）の効果を示すヒストグラム。阻害のパーセンテージは、比率（ＳＫ３電流振幅及びコードコンダクタンス（１０μM ＪＰＨ１７０１の存在下）／対照実験中のＳＫ３電流振幅）を表す。黒色のバーは、０mVでの電流を示し、そして灰色のバーは、コードコンダクタンスを示す。
【図８Ｄ】ＳＫ３チャネル活性に対するＪＰＨ１７０１の効果；図８Ｄ）：＋ＪＰＨ１７０１形態の（濃度：０（対照）、０．３、１及び１０μM）の用量依存効果。カラム、平均値、バー、ＳＥＭ、（ラセミ混合物については５細胞、そして、＋及び−形態については４細胞）。
【図８Ｅ】ＳＫ３チャネル活性に対するＪＰＨ１７０１の効果；図８Ｅ）：０．３及び２μM ＪＰＨ１７０１による、大脳皮質の膜ホモジネートから得たＳＫＣａチャネルへの１２５Ｉ−アパミン（７pM）の特異的結合の対照に対する％を示すヒストグラム。
【図９Ａ】ＳＫＣａサブタイプ及びＩＫＣａチャネルに対するＪＰＨ１７０１の選択的効果。図９Ａ）：１０μM ＪＰＨ１７０１の適用の前後に、組換え型ＳＫ１、ＳＫ２、ＳＫ３及びＩＫＣａチャネルを発現しているＨＥＫ２９３細胞で記録された全細胞Ｋ＋電流の例（上方グラフ：それぞれＳＫ１及びＳＫ２、下方グラフ：それぞれＳＫ３及びＩＫＣａ）。電流を、ｐＣａ ６で、ランプ・プロトコルにより、０mVの恒常維持から５００msで−１００mV〜＋６０mV発生させた。
【図９Ｂ】ＳＫＣａサブタイプ及びＩＫＣａチャネルに対するＪＰＨ１７０１の選択的効果。図９Ｂ）：０mVで記録されたＳＫＣａ（ＳＫ１、ＳＫ２、ＳＫ３）及びＩＫＣａ電流振幅に対する１０μM ＪＰＨ１７０１の効果を示すヒストグラム。結果は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表わす。＊は、ｐ＜０．０５で、対照と有意に異なることを意味する。各チャネル（ＳＫ１、ＳＫ２、ＳＫ３及びＩＫＣａ）について、左側カラム（淡灰色）は、対照の結果を表し、そして右側カラム（暗灰色）は、ＪＰＨ１７０１適用後の結果を表す。
【図１０Ａ】実験的転移モデルに対するＪＰＨ１７０１の抗転移性効果。ＪＰＨ１７０１（１μM）又はビヒクルで２４時間、前処置された２００万個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ−ｌｕｃ細胞を、ＮＭＲＩ／ヌードマウスのＭＦＰに移植した。マウスを１週間に３回、全ての実験の間（１４〜１５週間）、１５mg/kgの静注にて、ＪＰＨ１７０１で又はビヒクルで処置した。原発腫瘍は、その容量が５００mm３に達した時（移植後６〜７週間）、外科的に除去した。原発腫瘍の外科的除去の７〜８週間後、マウスを安楽死させた。図１０Ａ〜Ｂ）：安楽死前の、ビヒクルで処置したマウス（図１０Ａ）又はＪＰＨ１７０１で処置したマウス（図１０Ｂ）からの転移のインビボＢＬＩ。
【図１０Ｂ】実験的転移モデルに対するＪＰＨ１７０１の抗転移性効果。ＪＰＨ１７０１（１μM）又はビヒクルで２４時間、前処置された２００万個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ−ｌｕｃ細胞を、ＮＭＲＩ／ヌードマウスのＭＦＰに移植した。マウスを１週間に３回、全ての実験の間（１４〜１５週間）、１５mg/kgの静注にて、ＪＰＨ１７０１で又はビヒクルで処置した。原発腫瘍は、その容量が５００mm３に達した時（移植後６〜７週間）、外科的に除去した。原発腫瘍の外科的除去の７〜８週間後、マウスを安楽死させた。図１０Ａ〜Ｂ）：安楽死前の、ビヒクルで処置したマウス（図１０Ａ）又はＪＰＨ１７０１で処置したマウス（図１０Ｂ）からの転移のインビボＢＬＩ。
【図１０Ｃ】実験的転移モデルに対するＪＰＨ１７０１の抗転移性効果。ＪＰＨ１７０１（１μM）又はビヒクルで２４時間、前処置された２００万個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ−ｌｕｃ細胞を、ＮＭＲＩ／ヌードマウスのＭＦＰに移植した。マウスを１週間に３回、全ての実験の間（１４〜１５週間）、１５mg/kgの静注にて、ＪＰＨ１７０１で又はビヒクルで処置した。原発腫瘍は、その容量が５００mm３に達した時（移植後６〜７週間）、外科的に除去した。原発腫瘍の外科的除去の７〜８週間後、マウスを安楽死させた。図１０Ｃ）：安楽死後の、生物発光によりエクスビボで検出された転移を有する組織の数（リンパ節、肺、脊柱、及び下肢骨を含む）。
【図１０Ｄ】実験的転移モデルに対するＪＰＨ１７０１の抗転移性効果。ＪＰＨ１７０１（１μM）又はビヒクルで２４時間、前処置された２００万個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ−ｌｕｃ細胞を、ＮＭＲＩ／ヌードマウスのＭＦＰに移植した。マウスを１週間に３回、全ての実験の間（１４〜１５週間）、１５mg/kgの静注にて、ＪＰＨ１７０１で又はビヒクルで処置した。原発腫瘍は、その容量が５００mm３に達した時（移植後６〜７週間）、外科的に除去した。原発腫瘍の外科的除去の７〜８週間後、マウスを安楽死させた。図１０Ｄ）：ビヒクルで又はＪＰＨ１７０１で処置したマウスの転移スコア。２つのパラメータを使用して、各マウスの転移スコアを評価した：（ｉ）ＢＬＩによりエクスビボで検出された転移を有する組織又は器官の数、及び（ii）各転移のＢＬＩ強度（フォトン／分）。箱ひげ図は、第１四分位、中央値及び第３四分位を示し、正方形は平均値を示した。SigmaStatソフトウエアで実施した統計分析は、順位和検定（Rank Sum Test）を使用して作成した。マウスの両方のコホート間の差異は、有意に異なる。
【図１０Ｅ】実験的転移モデルに対するＪＰＨ１７０１の抗転移性効果。ＪＰＨ１７０１（１μM）又はビヒクルで２４時間、前処置された２００万個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ−ｌｕｃ細胞を、ＮＭＲＩ／ヌードマウスのＭＦＰに移植した。マウスを１週間に３回、全ての実験の間（１４〜１５週間）、１５mg/kgの静注にて、ＪＰＨ１７０１で又はビヒクルで処置した。原発腫瘍は、その容量が５００mm３に達した時（移植後６〜７週間）、外科的に除去した。原発腫瘍の外科的除去の７〜８週間後、マウスを安楽死させた。図１０Ｅ）：時間の関数として、インビボで転移を示しているマウスパーセンテージ。１２週目（終点）の転移を有するマウスの数を１００％として設計することにより、データを正規化した。図の上半分は、プラセボ成分（ビヒクル）を摂取した対照マウスサブグループで得た結果を表している。図の下半分は、ＪＰＨ１７０１を摂取したマウスで得た結果を表している。図の上半分と下半分に表した結果間の比較は、ＪＨＰ１７０１処置マウスにおいて転移発生が遅れた又は欠如していることを示す。
【図１０Ｆ】実験的転移モデルに対するＪＰＨ１７０１の抗転移性効果。ＪＰＨ１７０１（１μM）又はビヒクルで２４時間、前処置された２００万個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ−ｌｕｃ細胞を、ＮＭＲＩ／ヌードマウスのＭＦＰに移植した。マウスを１週間に３回、全ての実験の間（１４〜１５週間）、１５mg/kgの静注にて、ＪＰＨ１７０１で又はビヒクルで処置した。原発腫瘍は、その容量が５００mm３に達した時（移植後６〜７週間）、外科的に除去した。原発腫瘍の外科的除去の７〜８週間後、マウスを安楽死させた。図１０Ｆ）：両方のコホートにおける転移発生を表しているグラフ：黒丸付きの上側曲線：プラセボ成分（ビヒクル）を摂取した対照マウスサブグループ；白丸付きの下側曲線：ＪＰＨ１７０１を摂取したマウス。各コホートのスコア（個々のスコアの合計）は、ＢＬＩによりインビボで評価された転移発生の程度を表す。
【図１１Ａ】ＰＡＦ受容体、ＰＬＣ及びＰＫＣ活性に対するＪＰＨ１７０１の効果。図１１Ａ）：０．３及び２μM エデルフォシンによる、ならびに０．３及び２μM ＪＰＨ１７０１による、ＣＨＯ細胞の膜ホモジネートから得た組換え型ＰＡＦ受容体への３Ｈ−Ｃ１６−ＰＡＦの特異的結合の対照に対するパーセンテージを示すヒストグラム。
【図１１Ｂ】ＰＡＦ受容体、ＰＬＣ及びＰＫＣ活性に対するＪＰＨ１７０１の効果。図１１Ｂ）：１００nM Ｃ１６−ＰＡＦにより誘発された応答に対して正規化された、ＰＡＦ受容体に対する０．３及び２μMのエデルフォシン及びＪＰＨ１７０１のアゴニスト応答の対照に対するパーセンテージ（％効果、即ち：細胞内カルシウム濃度の増大）を示すヒストグラム。ＩＣ５０を、エデルフォシン及びＪＰＨ１７０１について決定した。＊は、ｐ＜０．０５で、対照と有意に異なることを意味する。
【図１１Ｃ】ＰＡＦ受容体、ＰＬＣ及びＰＫＣ活性に対するＪＰＨ１７０１の効果。図１１Ｃ〜Ｄ）：ＰＫＣ（図１１Ｃ、ＰＫＣは：α、β１、β２、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ιである）：及びホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）活性（図１１Ｄ）に対するＪＰＨ１７０１の効果を示す用量応答曲線。
【図１１Ｄ】ＰＡＦ受容体、ＰＬＣ及びＰＫＣ活性に対するＪＰＨ１７０１の効果。図１１Ｃ〜Ｄ）：ＰＫＣ（図１１Ｃ、ＰＫＣは：α、β１、β２、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ιである）：及びホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）活性（図１１Ｄ）に対するＪＰＨ１７０１の効果を示す用量応答曲線。
【図１２Ａ】ＪＰＨ１７０１処置は、乳房脂肪体（ＭＦＰ）−モデル腫瘍の原発腫瘍成長に影響しなかった。ＪＰＨ１７０１（１μM）で又はビヒクルで２４時間、前処置したＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ−ｌｕｃ細胞の２００万個を、ＮＭＲＩ／ヌードマウスのＭＦＰに移植した。マウスを、一週間に３回、１５mg/kgの静注にて、ＪＰＨ１７０１で又はビヒクルで処置した。図１２Ａ）：腫瘍容量の経時変化。移植２週間後、原発腫瘍を、端度器（caliper）を用いて三次元で週１回、６週間の間、測定し、腫瘍容量を計算した（黒丸：ビヒクル、白丸：ＪＰＨ１７０１）。
【図１２Ｂ】ＪＰＨ１７０１処置は、乳房脂肪体（ＭＦＰ）−モデル腫瘍の原発腫瘍成長に影響しなかった。ＪＰＨ１７０１（１μM）で又はビヒクルで２４時間、前処置したＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ−ｌｕｃ細胞の２００万個を、ＮＭＲＩ／ヌードマウスのＭＦＰに移植した。マウスを、一週間に３回、１５mg/kgの静注にて、ＪＰＨ１７０１で又はビヒクルで処置した。図１２Ｂ）：腫瘍ＢＬＩの経時変化。移植２週間後、原発腫瘍中の癌細胞の数を、ＢＬＩイメージングにより週１回、６週間の間、評価した（黒丸：ビヒクル、白丸：ＪＰＨ１７０１）。対照コホートとＪＰＨ１７０１で処置したマウスのコホートとの間に、差異は観察されなかった。
【００２９】
発明の詳細な説明
驚くべきことに、本明細書の以下に記載の式（Ｉ）を有する、グリセロ脂質化合物の特定のファミリーが、少なくともＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルを発現している腫瘍細胞に対して特異的な抗転移特性を有しているということを、本発明にしたがって見出した。
【００３０】
したがって、本発明は、式（Ｉ）：
【化４】
2013519706.tif 000005
｛式中、
−Ｒ１は、１６〜１８個の炭素原子を有するアルキル又はアルケニル基であり、
−Ｒ２は、
（ａ）式（ＩＩ）：
【化５】
2013519706.tif 000006
［式中、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３は、互いに独立に、水素原子及び１又は２個の炭素原子を有するアルキル基からなる群より選択される］で示される基、及び
（ｂ）ヒドロキシル
からなる群より選択される基であり、
そして
−Ｒ３は、
−モノサッカライド基、もしくは２〜４個のサッカライド単位を有するポリサッカライド基、又は
−式（ＩＩＩ）：
【化６】
2013519706.tif 000007
［式中、Ｒ４は、モノサッカライド基、もしくは２〜４個のサッカライド単位を有するポリサッカライド基からなる群より選択される］で示される基
からなる群より選択される｝で示される、癌転移を予防するための医薬の製造のためのグリセロ脂質の使用に関する。
【００３１】
また、本発明は、癌転移を予防するための上記の式（Ｉ）のグリセロ脂質の使用に関する。
【００３２】
本発明はまた、それを必要する癌患者において転移を予防するための方法であって、上記の式（Ｉ）のグリセロ脂質又は上記の式（Ｉ）の該グリセロ脂質を含む医薬組成物を該患者に投与する工程を含む方法を包含する。本発明によれば、転移を予防することは、原発腫瘍から遠位部位への細胞の拡散を妨害することを包含する。
【００３３】
本発明によれば、式（Ｉ）の化合物がＳＫ３／ＫＣａ２．３カリウムチャネルの活性を阻害し、そしてＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルに対する該阻害活性がその抗転移特性に寄与する、又はこれを十分に説明するということが見出された。
【００３４】
より正確には、ｓｎ−１（Ｒ１）に少なくとも１６個の炭素の脂肪酸長及びｓｎ−３（Ｒ３）に１個のジサッカライドを有する、式（Ｉ）の化合物が、非常に効果的であることが見出された。ヘキサデシルオキシ−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロール（ＨＭＧ）類似体｛ｓｎ−１（Ｒ１）に少なくとも１６個の炭素の脂肪酸長を有し、そしてＲ３（ｓｎ−３）は、下記：
【化７】
2013519706.tif 000008
［式中、Ｒ４は、モノサッカライド基、又は２〜４個のサッカライド単位を有するポリサッカライド基（例えば、化合物 Ｍ、Ｎ、Ｏ及びＰ）からなる群より選択される］からなる｝は、またＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルの強力な阻害剤として実証された。
【００３５】
INSERM(Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale)の名で、２００８年２月６日公開のヨーロッパ特許出願第EP 1 884 774号に既に開示された方法に従って、ＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルが、式（Ｉ）の化合物の癌細胞遊走阻害効果において必須であるか否かを決定するために、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞株中で、２セットのＳＫ３／ＫＣａ２．３遺伝子のｓｉＲＮＡを用いて、又は陰性コントロールとしてスクランブルｓｉＲＮＡを用いて細胞をトランスフェクトすることにより、ＳＫ３／ＫＣａ２．３ ｍＲＮＡをノックダウンした。
【００３６】
ＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルが、式（Ｉ）の化合物の癌細胞遊走阻害効果において必須であるという同じ確証が、ＳＫ３／ＫＣａ２．３ ｍＲＮＡに対するｓｈＲＮＡを含有しているレンチウイルス（lentivirus）を用いたＳＫ３／ＫＣａ２．３−発現癌細胞の感染を受けて、得られた。
【００３７】
第一に、ノックダウンＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルが、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ遊走細胞の数を減少させることを見出した。更に重要なことにはノックダウンＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルが、本発明の式（Ｉ）の化合物の細胞遊走に対する阻害効果を完全に抑制することが見出された。
【００３８】
より更に、その後、ヒトＳＫ３／ＫＣａ２．３ｃＤＮＡでトランスフェクトされたＳＫ３／ＫＣａ２．３−陰性ヒト細胞は、本発明の式（Ｉ）の化合物の阻害効果に感受性になったことが見出された。とりわけ、式（Ｉ）の化合物が、ＳＫ３／ＫＣａ２．３ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞の遊走を阻害することが見出されたが、一方、ＳＫ３／ＫＣａ２．３ｃＤＮＡでのトランスフェクション前の同じＳＫ３／ＫＣａ２．３−陰性細胞の遊走は、式（Ｉ）の化合物で阻害されなかった。
【００３９】
上記の式（Ｉ）の化合物が、原発腫瘍部位から遊走しようとしているそれら転移性癌性細胞を選択的に標的化できることも見出した。
【００４０】
式（Ｉ）のグリセロ脂質が、インビボで抗転移効果を有することを更に見出した。
【００４１】
本明細書の実施例で示されるこれらのインビボ実験の結果は、癌細胞のインビトロ遊走を阻害する物質の能力と、抗転移薬としてインビボで作用する同じ物質の能力との間には直接的関係が存在するという先の研究を完全に裏付ける。
【００４２】
本明細書の実施例において示されるように、式（Ｉ）のグリセロ脂質は、癌患者において転移を予防するための一般的に高い治療関心事である。
【００４３】
式（Ｉ）のグリセロ脂質の更なる重要な特性は、その低細胞傷害性からなり、このことは、癌患者へのこれらのグリセロ脂質の投与が、該患者に対して望まない毒性をもたらさないことを意味する。実際、インビボで癌転移を阻害するために効果的な式（Ｉ）のグリセロ脂質の量では、該式（Ｉ）のグリセロ脂質は、インビボで副作用を起こさないということが示されている。
【００４４】
式（Ｉ）のグリセロ脂質は、原発腫瘍成長には影響を及ぼさないので、「真」の抗転移薬であることが更に実証された。式（Ｉ）のグリセロ脂質を、癌転移の動物モデルにおいてインビボで投与した場合、（ｉ）非毒性であり、（ii）抗転移性であり及び（iii）原発腫瘍成長に影響がないことを、本明細書の実施例の結果が明確に示す。この特異性が、非特異的化合物と比べて、おそらくより良い耐性へと導く。転移拡散を制御する細胞プロセスのターゲティングはまた、特に、原発腫瘍組織量が手術によって除去することができる場合、有望な寛解総合戦略であり得る。当技術分野において公知のように、癌患者は、既に疾患及び原発腫瘍に対する全身抗癌治療の両方で衰弱しており、かつこれらの患者は、転移の発生を予防又は治療することを目的とした任意の追加の処置を含む、任意の追加の予防的又は治療的処置によって引き起こされ得る副作用に非常に敏感なので、特異性及び非毒性は、式（Ｉ）のグリセロ脂質の非常に貴重な特性である。
【００４５】
とりわけ、抗アポトーシス効果及び抗転移性効果の両方を有するエデルフォシンのような構造的に近い公知の癌治療薬をはじめとして、構造的に関連する公知の癌治療薬と比べて、式（Ｉ）の化合物が、癌性及び非癌性細胞の両方に対してかなり低い細胞障害活性を保持していることが本明細書の実施例で示された。
【００４６】
説明として、エデルフォシンは、本明細書において、転移性癌性細胞株でインビトロでの２４時間−インキュベーション時間の後、５μM未満のＩＣ５０を示したが、式（Ｉ）の化合物はすべて、同じ転移性癌性細胞に対して１０μMを超えるＩＣ５０を有する。インビトロの細胞傷害性に関してアッセイした式（Ｉ）の化合物の多くは、５０μMを超えるＩＣ５０を示し、そのうちの多くが１００μMを超えるＩＣ５０を示す。
【００４７】
本明細書で使用する、表現「低い細胞傷害性」とは、インビトロ生存アッセイにおいて測定する場合、標的細胞と試験化合物の２４時間のインキュベーションの後、対象の化合物が１０μMを超えるＩＣ５０を示すことを意味する。用いることができる慣用的インビトロ細胞生存アッセイには、（ｉ）トリパンブルーアッセイ及び（ii）ＭＴＴアッセイが挙げられる。本発明の目的のために、化合物の「細胞傷害性」値を評価することに関して、ＭＴＴアッセイが、基準アッセイとして好ましく使用される。
【００４８】
それゆえ、式（Ｉ）のグリセロ脂質は、低細胞傷害性の抗転移薬からなる。本明細書において意図されるように、低細胞傷害性化合物として、式（Ｉ）のグリセロ脂質は、１０μMを超えるＩＣ５０値を有する。１０μMを超えるＩＣ５０値は、１１μM、１２μM、１３μM、１４μM、１５μM、１６μM、１７μM、１８μM、１９μM、２０μM、２１μM、２２μM、２３μM、２４μM、２５μM、２６μM、２７μM、２８μM、２９μM、３０μM、３１μM、３２μM、３３μM、３４μM、３５μM、３６μM、３７μM、３８μM、３９μM、４０μM、４１μM、４２μM、４３μM、４４μM、４５μM、４６μM、４７μM、４８μM、４９μM、５０μM、５１μM、５２μM、５３μM、５４μM、５５μM、５６μM、５７μM、５８μM、５９μM、６０μM、６１μM、６２μM、６３μM、６４μM、６５μM、６６μM、６７μM、６８μM、６９μM、７０μM、７１μM、７２μM、７３μM、７４μM、７５μM、７６μM、７７μM、７８μM、７９μM、８０μM、８１μM、８２μM、８３μM、８４μM、８５Ｖ、８６μM、８７Ｖ、８８μM、８９μM、９０μM、９１μM、９２μM、９３μM、９４μM、９５μM、９６μM、９７μM、９８μM、９９μM及び１００μMを超えるか、又は１００μM以上のＩＣ５０値を包含する。
【００４９】
説明として、所与の化合物の細胞傷害性を評価するために、ＭＴＴアッセイは、主な試薬として、（１）ＭＴＴ溶液（最終濃度０．５mg/mLで、５％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地に、ＭＴＴを溶解する）を使用して実施し得る。細胞中で、ＭＴＴはホルマザン結晶に変換され、これは純粋なジメチルスルホキシドで溶解する。簡潔に述べれば、ＭＴＴアッセイは、以下の工程を含み得る：
（ａ）２４ウエルプレートに標的細胞を適切な細胞数で、例えば１ウエルに付き規定の細胞数（１ウエルにつき４００００細胞）を播種し、そして対照ウエルには細胞を入れないままにしておく工程（最小吸光度用の対照として使用する）、
（ｂ）プレートを、加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートする工程、
（ｃ）試験化合物をプレートに加え、そして範囲濃度に応じて反復を行う工程、
陰性対照（ビヒクル対照を含む）及び陽性対照（例えば、蒸流水）を含める、
（ｄ）加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２、３７℃で所望の時間の間、プレートをインキュベートする工程、
（ｅ）ＭＴＴ試薬、例えば２４ウエルプレートの１ウエルに付き８００μLを加える工程、
（ｆ）細胞株に従って、所望の時間の間、例えばＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓについて４５分間３７℃でインキュベートする工程、
（ｇ）１容量（例えば８００μL）のジメチルスルホキシドを加える工程、
（ｈ）１時間のインキュベーションの後、ホルマザン沈殿物を溶解させるために各ウエルでピペッティングを行う工程、
（ｉ）９６ウエルプレートの各ウエルごとの吸光度の値を、試験波長として４９０nm及び基準波長として６３０nmを使用して測定する工程、そして
（ｊ）以下の式を用いて各ウエル中の細胞生存率を決定する工程：
【数１】
2013519706.tif 000009
【００５０】
ＭＴＴアッセイはまた、Rogerらによって開示（2004, Biochim Biophys Acta, Vol. 1667: 190-199）されたように、当業者によって実施され得る。
【００５１】
細胞傷害アッセイの終わりに、試験物質の最大半数（５０％）阻害濃度（ＩＣ）として、ＩＣ５０値を決定する。
【００５２】
好ましくは、上記工程（ａ）は、１ウエルに付き４×１０５標的細胞を使用して実施する。
【００５３】
好ましくは、工程（ａ）は、初代培養細胞又は細胞株のいずれかのヒト転移性癌性細胞を用いて実施する。より好ましくは、標的細胞は転移性ヒト乳癌細胞からなる。最も好ましくは、信頼できる基準として、標的細胞はＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞株（ATCC No. HTB-129）由来の細胞からなる。
【００５４】
本明細書において先で既に詳細に記載したように、式（Ｉ）の化合物がインビトロ細胞遊走アッセイにおいて転移性癌性細胞遊走を阻害することが本明細書において見出されたので、これらの化合物は、癌患者における転移の発生を予防するための活性成分として有用である。
【００５５】
興味深いことに、本明細書の実施例において、式（Ｉ）のグリセロ脂質は、卵巣、子宮、腎臓、肝臓、肺、体の一部（例えば、脚、腕）、脊柱、脾臓及びリンパ節を含む多種多様な組織及び器官における転移形成を阻害する能力を有するということが示されている。これら後述の結果は、これから発生するか又は既に発生している転移増殖巣の体内局在位置に関係なく、全身用抗転移薬としての式（Ｉ）のグリセロ脂質の有効性を裏付けている。これら後述の結果はまた、転移の発生を予防しようとしている癌の種類に関係なく、式（Ｉ）のグリセロ脂質の有効性を裏付けている。
【００５６】
アッセイする式（Ｉ）の化合物に依存して、式（Ｉ）の化合物が、細胞培養において１０nM〜３００nMの最終濃度で、細胞遊走を５０％以上阻害するということが本明細書において見出された。
【００５７】
式（Ｉ）の化合物の阻害活性をアッセイするために、当業者はRogerらによって開示されたアッセイ（2004, Biochim Biophys Acta, Vol. 1667 : 190-199）を参照してもよく、それは、下記工程を含む方法として簡潔に説明され得る：
（ａ）非遊走細胞が膜を通過するのを阻止する一方、遊走細胞が膜を通過するのを可能にするための、適切な直径を有する細孔を保持する膜に転移性癌性細胞を接触をさせる工程、そして
（ｂ）膜を通過する細胞を定量化する工程。
【００５８】
式（Ｉ）の化合物の阻害活性を決定するために、上記の細胞遊走アッセイの工程（ａ）を、培地中、事前にインキュベートした細胞で、規定の最終濃度で該化合物を用いて、実施する。化合物（Ｉ）で誘発された細胞遊走の阻害パーセンテージを計算するために、アッセイの終わりに、化合物（Ｉ）と共にインキュベートした細胞のうち膜を通過してきた細胞の数を測定し、そして、対照培地でインキュベートした細胞のうち膜を通過してきた細胞の数と比較する。
【００５９】
代替的には、式（Ｉ）の化合物の細胞遊走阻害活性を、本明細書において実施例で開示される創傷治癒アッセイを実施することにより評価することができ、これに関して当業者はまた、Rodriguezらの論文（2005, Methods Biol Mol, Vol. 294 : 23-29）を参照してもよい。創傷治癒アッセイは、インビトロにおける方向性細胞遊走を研究するための、簡単で、安価で、且つ最古に開発された方法の一つである。この方法は、インビボでの創傷治癒の間に、細胞遊走を模倣する。基本的な工程は、細胞単層中に「傷」を創製する工程、細胞遊走の間の最初及び傷が縫合されるまでの一定間隔に画像を撮る工程、そして画像を比較して細胞の遊走速度を定量化する工程を含む。細胞遊走に対する細胞マトリックス及び細胞間相互作用の効果について研究するためには、それは特に適切である。細胞を培養皿に播種し、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ中でコンフルエンスになるまで、増殖させる。次に単層を無菌の黄色のピペットチップではがす。次に、取り除かれた部域への細胞の遊走を顕微鏡下で検査する。遊走する試験細胞の能力を決定するために、はがした時直ちに及び２４時間後の画像を撮る。創傷治癒アッセイは、転移性癌細胞の遊走を阻害する式（Ｉ）の化合物の能力を決定するための、本明細書の実施例において使用された遊走アッセイである。したがって創傷治癒アッセイは、本発明による参照の最も好ましい細胞遊走アッセイからなる。
【００６０】
本明細書の実施例において、前記インビトロ細胞遊走アッセイは、ヒト転移性癌性細胞株、すなわちＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞株（ATCC No. HTB-129）を用いて実施した。
【００６１】
本明細書で使用するように、「ａ」又は「ａｎ」は、一つ以上を意味することができる。本明細書で使用するように、用語「含んでいる」と併せて使用する場合、用語「ａ」又は「ａｎ」は、一つ又は二つ以上を意味することができる。本明細書で使用するように、「別の」は、少なくとも二つ目以上を意味することができる。
【００６２】
本明細書で使用するように、「アルキル」は、アルカン分子から１個の水素原子を除去することにより得られる炭素及び水素原子の基を指し、直鎖状又は分岐鎖状部分を含む。
【００６３】
本明細書で使用するように、「アルケニル」は、アルケン分子から１個の水素原子を除去することにより得られる炭素及び水素原子の基を指し、直鎖状又は分岐鎖状分子を含む。アルケニルは、１個以上の炭素−炭素の二重結合を含む。
【００６４】
本明細書で使用するように、用語「サッカライド基」は、式（Ｉ）の化合物の基Ｒ３として、サッカライド部分の任意の原子を介して、例えばアグリコン炭素原子を介して、共有結合している、酸化、還元又は置換されているサッカライドモノラジカルを指す。該用語は、アミノ含有サッカライド基を含む。
【００６５】
本明細書で使用するように、用語「ヘキソース」は、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、バンコサミン、３−デスメチル−バンコサミン、３−エピ−バンコサミン、４−エピ−バンコサミン、アコサミン、アクチノサミン、ダウノサミン、３−エピ−ダウノサミン、リストサミン、Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、Ｄ−グルクロン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、シアル酸（sialyic acid）、イズロン酸、Ｌ−フコースなどを包含する。
【００６６】
本明細書で使用するように、用語「ペントース」は、Ｄ−リボース又はＤ−アラビノース；ケトース、例えば、Ｄ−リブロース又はＤ−フルクトース；ジサッカライド、例えば、２−Ｏ−（α−Ｌ−バンコサミニル）−β−Ｄ−グルコピラノース、２−Ｏ−（３−デスメチル−α−Ｌ−バンコサミニル）−β−Ｄ−グルコピラノース、スクロース、ラクトース又はマルトース；誘導体、例えば、アセタール、アミン、アシル化糖、硫酸化糖及びリン酸化糖を包含する。
【００６７】
本明細書で使用するように、用語「ポリサッカライド」は、（ｉ）複数の同一サッカライド単位からなるホモ−ポリサッカライド、ならびに（ii）複数のサッカライド単位及び少なくとも２個の異なるサッカライド単位からなるヘテロ−ポリサッカライドを包含する。
【００６８】
本明細書で使用するように、用語「ポリサッカライド」は、２〜４個のサッカライド単位を含むか、又は或いは２〜４個のサッカライド単位からなる、サッカライドポリマーを意味し、用語「オリゴサッカライド」と互換的に使用することができる。
【００６９】
用語「アミノ含有サッカライド基」は、アミノ置換基を有するサッカライド基を指す。代表的なアミノ含有サッカライドとしては、Ｌ−バンコサミン、３−デスメチル−バンコサミン、３−エピ−ダウノサミン、エピ−バンコサミン、アコサミン、アクチノサミン、ダウノサミン、３−エピ−ダウノサミン、リストサミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンなどが挙げられる。
【００７０】
幾つかの好ましい実施態様において、式（Ｉ）のグリセロ脂質では、Ｒ１は、１６、１７及び１８個の炭素原子を有するアルキル又はアルケニル基である。
【００７１】
本明細書において実施例の結果は、１６〜１８個の炭素原子を有するＲ１基の存在が、式（１）のグリセロ脂質の抗転移性効果に有意に寄与することを例証する。
【００７２】
任意の特定の理論に縛られつもりではないが、本発明者らは、炭素原子１５個以下を有するアルキル又はアルケニル基による基Ｒ１の置換が、細胞遊走を阻害する能力の低下、ひいては低下した抗転移効果を有するグリセロ脂質化合物をもたらすと、考えている。式（Ｉ）の化合物の幾つかの実施態様において、Ｒ１は、以下のアルキル基：−（ＣＨ２）１５−ＣＨ３、−（ＣＨ２）１６−ＣＨ３及び−（ＣＨ２）１７−ＣＨ３より選択されるアルキル基である。
【００７３】
式（Ｉ）の化合物の幾つかの実施態様において、Ｒ２は、ヒドロキシ基である。
【００７４】
式（Ｉ）の化合物の幾つかの実施態様において、Ｒ２は、式（ＩＩ）の基であり、そしてＲ２１、Ｒ２２及びＲ２３は、各々、水素原子である。
【００７５】
式（Ｉ）の化合物の幾つかの実施態様において、Ｒ２は、式（ＩＩ）の基であり、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３のうちの一つは、１又は２個の炭素原子を有するアルキル基であり、一方、その他の二つは、各々、水素原子である。
【００７６】
式（Ｉ）の化合物の幾つかの実施態様において、Ｒ３又はＲ４は、ペントシル基及びヘキソシル基からなる群より選択されるモノサッカライドである。
【００７７】
一般的に、本発明によると、ペントース基は、下記式（ＩＶ）：
【化８】
2013519706.tif 000010
［式中、
−Ｒ５１、Ｒ５２及びＲ５３は、互いに独立に、ヒドロキシ、メトキシ、アセチルオキシ、アミノ及びアセチルアミノ基からなる群より選択される］を有する。
【００７８】
基Ｒ５１、Ｒ５２及びＲ５３に関する好ましい意味は、ヒドロキシ及びアセチルオキシより選択される。
【００７９】
特定の実施態様において、式（ＩＶ）のＲ３又はＲ４は、すべてヒドロキシ基を意味する、基Ｒ５１、Ｒ５２及びＲ５３を有する。
【００８０】
他の実施態様において、式（ＩＶ）のＲ３又はＲ４は、すべてアセチル基を意味する、基Ｒ５１、Ｒ５２及びＲ５３を有する。
【００８１】
幾つかの実施態様において、Ｒ３又はＲ４は、Ｄ−リボシル、Ｄ−アラビノシル、Ｄ−キシロシル、Ｄ−リブロシル及びＤ−キシルロシルからなる群より選択されるペントシルである。
【００８２】
一般的に、本発明によると、ヘキソシル基は、下記式（Ｖ）：
【化９】
2013519706.tif 000011
［式中、
−Ｒ６１、Ｒ６２、Ｒ６３及びＲ６４は、互いに独立に、ヒドロキシ、メトキシ、アセチルオキシ、アミノ及びアセチルアミノ基からなる群より選択される］を有する。
【００８３】
基Ｒ６１、Ｒ６２、Ｒ６３及びＲ６４の好ましい意味は、ヒドロキシ及びアセチルオキシより選択される。
【００８４】
特定の実施態様において、式（Ｖ）のＲ３又はＲ４は、すべてヒドロキシ基を意味する、基Ｒ６１、Ｒ６２、Ｒ６３及びＲ６４を有する。
【００８５】
他の実施態様において、式（Ｖ）のＲ３又はＲ４は、すべてアセチルオキシ基を意味する、基Ｒ６１、Ｒ６２、Ｒ６３及びＲ６４を有する。
【００８６】
幾つかの実施態様において、Ｒ３又はＲ４は、Ｄ−グルコシル、Ｄ−マンノシル及びＤ−ガラクトシルからなる群より選択されるヘキソシルである。
【００８７】
他の実施態様において、Ｒ３又はＲ４は、Ｄ−フルクトシル及びＤ−ソルボシルからなる群より選択されるケトヘキソシルである。
【００８８】
幾つかの実施態様において、Ｒ３又はＲ４は、βガラクトシル及びテトラ−アセチル−βガラクトシル基からなる群より選択される。
【００８９】
幾つかの他の実施態様において、Ｒ３は、βグルコシル及びテトラ−アセチル−βグルコシル基からなる群より選択される。
【００９０】
より更なる実施態様において、Ｒ３又はＲ４は、イノシトール及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選択される。
【００９１】
本明細書において既に詳述したように、Ｒ３又はＲ４は、２〜４個のサッカライド単位を有するポリサッカリジル（polysaccharidyl）基を意味してもよい。幾つかの実施態様において、該ポリサッカリジル基に含まれるすべてのサッカライド単位は、同一であり、該ポリサッカラリジル（polysacchararidyl）基は、ホモポリサッカリジル基からなる。他の実施態様において、該ポリサッカリジル基に含まれるサッカライド単位は、すべてが同一ではなく、該ポリサッカリジル基は、ヘテロポリサッカリジル基からなる。
【００９２】
一般的に、本発明の式（Ｉ）の化合物のＲ３又はＲ４ポリサッカリジル基において、サッカライド単位のいずれか一つは、モノサッカリジル（monosaccharidyl）単位の意味について上で詳述されたサッカライド単位の群より選択されてもよい。
【００９３】
Ｒ３又はＲ４が、２個以上のヘキソース単位を含むポリサッカリジル基からなる幾つかの実施態様において、２個のヘキソース単位は、１−４結合又は１−６結合により共有結合している。２個のヘキソース単位は、α１−４、α１−６、β１−４及びβ１−６結合からなる群より選択される共有結合を介して、互いに結合していてもよい。
【００９４】
幾つかの実施態様において、Ｒ３又はＲ４は、スクロシル、ラクトシル、マルトシル、メリビオシル、トレハロシル及びセロビオシルからなる群より選択されるジサッカライドである。好ましい実施態様は、Ｒ３又はＲ４が、ラクトシル、マルトシル及びメリビオシルからなる群より選択されるジサッカライドであるそれらを包含する。
【００９５】
幾つかの他の実施態様において、Ｒ３又はＲ４は、ラフィノシル及びメレジトシルからなる群より選択されるトリサッカライドである。
【００９６】
より更なる実施態様において、Ｒ３又はＲ４は、テトラサッカライド・アカルボシル（acarbosyl）である。
【００９７】
したがって、式（Ｉ）の化合物の特定の実施態様によると、Ｒ３は、モノサッカライド基又は２〜４個のサッカライド単位を有するポリサッカライド基からなる群より選択される。
【００９８】
また、式（Ｉ）の化合物の他の実施態様によると、Ｒ３は、本明細書において先に定義された式（ＩＩＩ）の基であり、ここで、Ｒ４は、モノサッカライド基又は２〜４個のサッカライド単位を有するポリサッカライド基からなる群より選択される。
【００９９】
本発明の式（Ｉ）の好ましい化合物は、下記化合物（Ａ）〜（Ｐ）からなる群より選択され得る：
−化合物（Ａ）：
【化１０】
2013519706.tif 000012
−化合物（Ｂ）：
【化１１】
2013519706.tif 000013
−化合物（Ｃ）：
【化１２】
2013519706.tif 000014
−化合物（Ｄ）：
【化１３】
2013519706.tif 000015
［式中、Ｒ３は、ラクトースとも称される、Ｇａｌ−β−（１−４）−Ｇｌｕ基を意味する］、
−化合物（Ｅ）：
【化１４】
2013519706.tif 000016
［式中、Ｒ３は、Ｇａｌ−α−（１−４）−Ｇｌｕ基を意味する］、
−化合物（Ｆ）：
【化１５】
2013519706.tif 000017
［式中、Ｒ３は、Ｇｌｕ−β−（１−４）−Ｇｌｕ基を意味する］、
−化合物（Ｇ）：
【化１６】
2013519706.tif 000018
［式中、Ｒ３は、マルトースとも称される、Ｇｌｕ−α−（１−４）−Ｇｌｕ基を意味する］、
−化合物（Ｈ）：
【化１７】
2013519706.tif 000019
［式中、Ｒ７１及びＲ７２は、水素原子及びヒドロキシル基又はアセチル基からなる群より独立に選択され、これは、（ｉ）Ｒ７１がＨであり、そしてＲ７２がＯＨ又はＯＡｃである場合、Ｇａｌ−β−（１−６）−Ｇｌｕを、ならびに（ii）Ｒ７１がＯＨ又はＯＡｃであり、そしてＲ７２がＨである場合、Ｇｌｕ−β−（１−６）−Ｇｌｕを包含する］、
−化合物（Ｉ）：
【化１８】
2013519706.tif 000020
［式中、Ｒ７１及びＲ７２は、水素原子及びヒドロキシル基又はアセチル基からなる群より独立に選択され、これは、（ｉ）Ｒ７１がＨであり、そしてＲ７２がＯＨ又はＯＡｃである場合、メリビオース又はアセチルメリビオースとも称される、Ｇａｌ−α−（１−６）−Ｇｌｕを、ならびに（ii）Ｒ７１がＯＨ又はＯＡｃであり、そしてＲ７２がＨである場合、Ｇｌｕ−α−（１−６）−Ｇｌｕを包含する］、
−化合物（Ｊ）：
【化１９】
2013519706.tif 000021
［式中、Ｒ７１及びＲ７２は、水素原子及びヒドロキシル基又はアセチル基からなる群より独立に選択され、これは、（ｉ）Ｒ７１がＨであり、そしてＲ７２がＯＨ又はＯＡｃである場合、Ｇａｌ−β−（１−６）−Ｇａｌを、ならびに（ii）Ｒ７１がＯＨ又はＯＡｃであり、そしてＲ７２がＨである場合、Ｇｌｕ−β−（１−６）−Ｇａｌを包含する］、
−化合物（Ｋ）：
【化２０】
2013519706.tif 000022
［式中、Ｒ７１及びＲ７２は、水素原子及びヒドロキシル基又はアセチル基からなる群より独立に選択され、これは、（ｉ）Ｒ７１がＨであり、そしてＲ７２がＯＨ又はＯＡｃである場合、Ｇａｌ−α−（１−６）−Ｇａｌを、ならびに（ii）Ｒ７１がＯＨ又はＯＡｃであり、そしてＲ７２がＨである場合、Ｇｌｕ−α−（１−６）−Ｇａｌを包含する］、
−化合物（Ｌ）：
【化２１】
2013519706.tif 000023
−化合物（Ｍ）：
【化２２】
2013519706.tif 000024
［式中、Ｒ４は、ラクトース又はアセチルラクトースとも称される、Ｇａｌ−β−（１−４）−Ｇｌｕ基を意味する］、
−化合物（Ｎ）：
【化２３】
2013519706.tif 000025
［式中、Ｒ４は、マルトース又はアセチルマルトースとも称される、Ｇｌｕ−α−（１−４）−Ｇｌｕ基を意味する］、
−化合物（Ｏ）：
【化２４】
2013519706.tif 000026
［式中、Ｒ７１及びＲ７２は、水素原子及びヒドロキシル基又はアセチル基からなる群より独立に選択され、これは、（ｉ）Ｒ７１がＨであり、そしてＲ７２がＯＨ又はＯＡｃである場合、メリビオース又はアセチルメリビオースとも称される、Ｇａｌ−α−（１−６）−Ｇｌｕを、ならびに（ii）Ｒ７１がＯＨ又はＯＡｃであり、そしてＲ７２がＨである場合、Ｇｌｕ−α−（１−６）−Ｇｌｕを包含する］、
−化合物（Ｐ）：
【化２５】
2013519706.tif 000027
［式中、Ｒ８１及びＲ８２は、水素原子及びヒドロキシル基又はアセチルからなる群より独立に選択され、これは、（ｉ）Ｒ８１がＨであり、そしてＲ８２がＯＨ又はＯＡｃである場合、ラクトース−β−又はアセチルラクトース−β−（１−６）−Ｇｌｕを、ならびに（ii）Ｒ８１がＯＨ又はＯＡｃであり、そしてＲ８２がＨである場合、ラクトース−β−又はアセチルラクトース−β−（１−６）−Ｇａｌを包含する］。
【０１００】
説明として：
−  化合物Ａは、表１及び表２に開示している化合物ＪＰＨ１５１８及びＪＰＨ１５２３によって特に例証されており、
−  化合物Ｂは、表２に開示されている化合物ＪＰＨ１５１９及びＪＰＨ１５２４によって特に例証されており、
−  化合物Ｃは、表１及び表２に開示されている化合物ＪＰＨ１５２８によって特に例証されており、
−  化合物Ｄは、表１、２及び３に開示されている化合物ＪＰＨ１７０１、ならびに表３に開示されている化合物ＪＰＨ１７００によって特に例証されており、
−  化合物Ｇは、表３に開示されている化合物ＪＰＨ１８００によって特に例証されており、
−  化合物Ｉは、表３に開示されている化合物ＪＰＨ１７８４及びＪＰＨ１８８２によって特に例証されており、そして
−  化合物Ｍは、表３に開示されている化合物ＣＨＳ３１によって特に例証されている。
【０１０１】
式（Ｉ）の化合物の合成の実施に関して、当業者は、下記参考文献を参照してもよい：
- J.J. Godfroid, C. Broquet, S. Jouquey, M. Lobbar, F. Heymanns, C. Redeuith, E. Steiner, E. Michel, E. Coeffier, J. Fichelle and M. Worcel. J. Med. Chem. 1987, 30, 792-797,
- R. R. Schmidt Angew. Chem. 1986, 98, 213-236,
- R. R. Schmidt Pure and Appl. Chem. 1989, 61, 1257-1270,
- N. S. Chandrakumar and J. Hajdu J. Org. Chem. 1983, 48, 1197-1202,
- R. K. Erukulla, X. Zhou, P. Samadder, G. Arthur, and R. Bittman J. Med. Chem. 1996, 39, 1545-1548、及び
- J. R. Marino-Albernas, R. Bittman, A. Peters, and E. Mayhew J. Med. Chem. 1996, 39, 3241-3247
- M. Hunsen, D. A. Long, C. R. D'Ardenne, and A. L. Smith Carbohydr. Res. 2005, 340, 2670-2674
- S. Chittaboina, B. Hodges, and Q. Wang Lett. Org. Chem. 2006, 3, 35-38
- P. J. Garegg, T. Regberg, J. Stawinsky, and R. Stromberg. Chem. Scr. 1986, 25, 59-62
- B. C. Froehler and M. D. Mattenci Tetrahedron Lett. 1986, 27, 469-472
- A. V. Nikolaev, I. A. Ivanova, V. N. Shibaev, and N. K. Kochetkov. Carbohydrate Research 1990, 204, 65-78
- I. A. Ivanova, A. J. Ross, M. A. J. Ferguson, and A. V. Nikolaev J. Chem. Soc., Perkin Trans 1 1999, 1743-1753
- A. J. Ross, I. A. Ivanova, M. A. J. Ferguson and A. V. NIkolaev J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2001, 72-81。
【０１０２】
説明として、置換グリセロ脂質の合成に関する方法は、米国特許第US 6,030,628号に特に開示されており、当業者は、本発明の式（Ｉ）の化合物の合成の実施に関してそれを参照することができる。
【０１０３】
置換グリセロ脂質の合成に関する他の方法はまた、米国特許出願又は米国特許第US 2004/0067893、US 2004/0213836、US 4,275,588、US5,932,242、US 5,762,958、US 6,583,127号にも開示されている。
【０１０４】
基Ｒ３が、モノサッカライド基又はポリサッカライド基を意味する、式（Ｉ）の化合物の実施態様はまた、本明細書に後述されているように合成することができる。本明細書の下記の方法は、式（Ｉ）を有する化合物のファミリーに包含されるサッカライド誘導体のいずれか一つを合成するために使用することができる：
【０１０５】
ａ）  グリセロール−ジエーテル誘導体の合成
化合物Ａは、サッカライド単位の結合のために使用するグリセロール脂質前駆体である（M. Kates et al. Lipids., 1991, 26, 1095-1101; J. J. Godfroid et al. J. Med. Chem. 1987, 30, 792-797を参照のこと）。その合成は、図１に示したスキーム１に描写されている。
図１のスキーム１：  （ｉ）Ｃ１６Ｈ３３Ｂｒ、ＮａＨ、トルエン 還流 ６時間；（ii）ＨＣｌ １２M、ＭｅＯＨ 還流 ３時間；（iii）Ｐｈ３Ｃｌ、Ｅｔ３Ｎ、トルエン 還流 ５時間；（iv）（ａ）ＣＨ３Ｉ、ＮａＨ、ＴＨＦ 還流 ３時間；（ｂ）ＨＣｌ １２M、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３ 室温。
【０１０６】
ｂ）  αアノマー結合を有するジサッカライドの合成経路
まず、６位の遊離ヒドロキシル基（化合物Ｂ）を有するグリコピラノシル誘導体の合成を、図２に図式化したように合成する。
−図２のスキーム２：  （ｉ）グリコシル−テトラアセタート−トリクロロアセトアミダート、ＢＦ３、Ｅｔ２Ｏ（ii）Ｐｈ３Ｃｌ、Ｅｔ３Ｎ、トルエン 還流 ５時間；（iii）ＢｎＢｒ、ＮａＨ、ＤＭＦ １２時間；（vi）ＨＣｌ １２M、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３ 室温（R. R. Schmidt Angew. Chem. 1986, 98, 213-236; R. R. Schmidt Pure and Appl. Chem. 1989, 61, 1257-1270を参照のこと）。
【０１０７】
次に、第２サッカライド単位（Ｃ）  正しい保護基を保持している６−Ｏ−アセチル−２’３’４−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−ガラクトピラノースを、図３に報告しているように合成する。
−図３のスキーム３：  （ｉ）ＢｎＢｒ、ＮａＨ、ＤＭＦ １２時間；（ii）Ｈ２ＳＯ４、Ａｃ２Ｏ／ＡｃＯＨ ３時間 室温；（iii）ＢｎＮＨ２、ＴＨＦ 室温 １５時間。
【０１０８】
αグリコシル化を、ＢのＣとの反応により達成する（スキーム４及びShingu et al. Carbohyd. Res. 2005, 340, 2236-2244を参照のこと）。図４に描写されているように、脱保護工程の後、目的化合物が生成される。
−図４のスキーム４：  （ｉ）Ｐｈ３Ｐ、ＣＢｒ４、ＤＭＦ；（ii）ＭｅＯＮａ 触媒、ＭｅＯＨ；（iii）Ｈ２、Ｐｄ／Ｃ、ＭｅＯＨ
図４に表される中間体Ｉの６位の酢酸基の選択的脱保護は、第３サッカライド単位、そして同様にそれに続く第４サッカライド単位のどちらの導入の可能性も容易に与える。
−図５のスキーム５：  （ｉ）無水酢酸／ＨＣｌＯ４、酢酸、１５時間、（（ii）酢酸アンモニウム、ＤＭＦ、４８時間、（iii）イミダゾール／ＰＣｌ３／Ｅｔ３Ｎ、ＣＨ３ＣＮ、（IVi）Ａ、塩化ピバロイル、Ｉ２、ピリジン、（Vi）（ａ）ＮａＯＣＨ３ 触媒、ＣＨ３ＯＨ、（ｂ）アンバーライト（Amberlite）IR 120。
【０１０９】
先で既に詳細に説明してきたように、本発明の式（Ｉ）の化合物は、その低い細胞傷害性に加えて、主にＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネル活性の阻害又はさらには遮断を誘発する。
【０１１０】
また、本発明の式（Ｉ）の化合物は、主に癌性細胞遊走の高い阻害活性を示し、そしてひいては癌転移を阻害するために有用であることが見出された。更にまた、式（Ｉ）のグリセロ脂質のインビボ抗転移特性も示された。
【０１１１】
本明細書に記載されている式（Ｉ）の化合物は、癌細胞がＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルを発現する癌における転移の発生を予防するために有用である。
【０１１２】
特に、本明細書に記載されている式（Ｉ）の化合物は、アプドーマ（ＡＰＵＤ腫瘍）、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌腫（例えば、ウォーカー癌腫、基底細胞癌、基底扁平細胞癌、ブラウン・ピアース癌、腺管癌、エールリッヒ癌、上皮内癌、クレブス２癌、メルケル細胞癌、粘液性癌、非小細胞肺癌、コート細胞癌、乳頭癌、硬腺癌、細気管支癌、気管支原性肺癌、扁平上皮癌、及び移行上皮癌）、組織球性障害、白血病（例えば、Ｂ細胞白血病、混合細胞型白血病、ヌル細胞白血病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞慢性白血病、ＨＴＬＶ−ＩＩ関連白血病、リンパ性急性白血病、リンパ性慢性白血病、マスト細胞白血病、及び骨髄性白血病）、悪性組織球増殖症、ホジキン病、免疫増殖性小腸疾患（immunoproliferative small）、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、細網内皮症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫瘍、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング（Ewing）肉腫、滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、軟骨腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、絨毛性腫瘍、腺癌、細胞腫、腺腫、胆管腫、真珠腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、卵巣男性胚細胞腫、肝細胞腫、汗腺腫、膵島細胞腫瘍、ライディッヒ（Leydig）細胞腫、乳頭腫、セルトリ（Sertoli）細胞腫、莢膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、脳室上衣細胞腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性、角化血管腫、好酸球増多を伴う血管リンパ組織過形成、硬化性血管腫、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管外皮細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、実験肉腫、カポジ肉腫、及びマスト細胞肉腫）、腫瘍（例えば、骨腫瘍、乳房腫瘍、消化管腫瘍、肝腫瘍、膵腫瘍、下垂体腫瘍、精巣腫瘍、眼窩腫瘍、頭頸部腫瘍、中枢神経系腫瘍、聴神経腫瘍、骨盤腫瘍、気道腫瘍、及び泌尿生殖器腫瘍）、神経線維腫症、及び子宮頸部異形成を含むが、これらに限定されない様々な癌の転移の発生を予防するために、ならびに細胞が不死化した又は形質転換した他の状態の治療のために有用である。これら後者の結果はまた、転移の発生を予防又は治療すべき癌の種類に関係なく、式（Ｉ）のグリセロ脂質の効果を裏付けている。
【０１１３】
本発明は、化学療法、寒冷療法、温熱療法、放射線療法などのような他の処置法と組み合わせて用いることもできる。
【０１１４】
式（Ｉ）のグリセロ脂質は、任意の生体組織又は任意の生体器官中の転移の発生を予防するために使用することができる。式（Ｉ）のグリセロ脂質の有用性は、卵巣、子宮、腎臓、肝臓、肺、骨組織（例えば、大腿骨を含む脚骨、腕骨、背部と腰部の脊椎骨を含む脊柱、骨盤）、脾臓、リンパ節、結腸、胸、脳、前立腺、膵臓及び皮膚を含む、多種多様な組織及び器官中の転移の発生に対する、予防的処置又は治療的処置を包含する。
【０１１５】
幾つかの実施態様において，本明細書に記載されている式（Ｉ）の化合物は、黒色腫又は乳癌、肺癌、甲状腺癌、骨肉腫又は腎臓癌に冒されている癌患者における転移の発生を予防するために有用である。
【０１１６】
本発明の別の目的は、本明細書に亘って記載されている式（Ｉ）の化合物それ自体からなる。
【０１１７】
本発明の更なる目的は、本明細書に亘って定義されている式（Ｉ）の化合物を一つ以上の薬学的賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物からなる。
【０１１８】
本発明のより更なる目的は、本明細書に亘って定義されている式（Ｉ）の化合物を一つ以上の薬学的賦形剤と組み合わせて含む、癌転移を予防するための医薬組成物からなる。
【０１１９】
本発明のまた更なる目的は、癌患者における転移の発生を予防するための医薬の製造のための、本明細書に記載されている式（Ｉ）の化合物の使用からなる。
【０１２０】
本発明の別の目的は、癌患者における転移の発生を予防するための、本明細書に記載されている式（Ｉ）の化合物の使用からなる。
【０１２１】
式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物、及び式（Ｉ）の化合物の治療的投与方法は、本明細書に後述されている。
【０１２２】
本発明の医薬組成物
本発明は、有効量の、本明細書に記載されている式（Ｉ）の化合物、及び薬学的に許容しうる担体を含む、医薬組成物を提供する。
【０１２３】
適切な担体及びそれらの製剤は、Osloらにより編集されたRemington's Pharmaceutical Science, 16th ed.; 1980, Mack publishing Co.に記載されている。
【０１２４】
「生理学的に許容しうる担体」とは、全身投与又は局所投与において安全に使用し得る、固体もしくは液体充填剤、希釈剤又は物質を意味する。特定の投与経路に依存して、当技術分野において周知の様々な薬学的に許容しうる担体には、固体又は液体充填剤、希釈剤、ハイドロトロープ（hydrotope）、界面活性剤、及びカプセル化物質が挙げられる。
【０１２５】
患者にとって有効な投与のために適切な薬学的に許容しうる組成物を調製するために、これらの組成物は、典型的には、有効量の式（Ｉ）の化合物を適切な量の担体と一緒に含有する。
【０１２６】
本発明の医薬組成物は、非経口的に、又は血流まで確実に送達する効果的な形態での他の方法により投与され得る。かかる医薬組成物の用量及び所望の薬物濃度は、想定される特定の使用に依存して変化し得る。
【０１２７】
無菌は、膜（０．２ミクロン）を通す除菌により、容易に達成される。
【０１２８】
医薬組成物は、良好な医療行為と整合するやり方で、処方され、投薬され、及び投与される。この文脈において考慮される要因としては、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、及び医療従事者に公知の他の要因が挙げられる。
【０１２９】
投与される式（Ｉ）の化合物の量は、かかる考慮により左右され、そして患者又は哺乳動物における癌転移の発生を減少させる又は遮断するための必要最小量である。
【０１３０】
各投与時に非経口的に投与される式（Ｉ）の化合物の量は、典型的には、０．０１mg/kg〜１００mg/kg、好ましくは０．０１mg/kg〜５０mg/kg、及び最も好ましくは０．０５mg/kg〜２５mg/kg、そして例えば１０mg/kgと、さまざまである。
【０１３１】
一般的に、本発明の医薬組成物は、該医薬組成物の総重量に基づいて、０．０１重量％〜９９．９９重量％、又は０．１重量％〜９９．９重量％、更に又は１重量％〜９９重量％、より又は１０％〜９０％の式（Ｉ）の化合物を含み、該組成物の残りは、その中に含まれる一つ以上の賦形剤からなる。
【０１３２】
かかる量は、好ましくは哺乳動物にとって毒性である量より少ない。
【０１３３】
本発明による処置の方法
本発明は、癌転移の予防のための方法を提供する。
【０１３４】
本発明は、先に開示したような、細胞を式（Ｉ）の化合物の有効量と接触させることを含む、患者における癌転移の発生の予防のための方法を提供する。
【０１３５】
したがって「有効量」とは、インビボで転移の数を減少させる式（Ｉ）の化合物の量を包含する。インビボでの転移の数の減少は、本明細書の実施例に開示している実験的モデルアッセイに従って評価し得る。
【０１３６】
説明として、式（Ｉ）の化合物の有効量は、下記工程を含む方法により評価し得る：
ａ）複数の動物を準備する工程、
ｂ）工程ａ）で準備された動物に、所望の数の非転移性癌細胞（該癌細胞は、転移を起こす能力がある）を投与する工程、
ｃ）工程ｂ）の終わりで得た動物に、式（Ｉ）の化合物の公知の量を投与する工程、
ｄ）工程ｃ）の終わりで得た動物の一種類の組織中の、又は二種類以上の組織中の転移性癌細胞数を測定する工程、
ｅ）試験した組織の各種に関して、転移性癌細胞の数と、工程ｂ）に付したが、該式（Ｉ）の化合物を投与されていない対照動物で見つけた転移性癌細胞の数とを比較する工程、そして
ｆ）式（Ｉ）の化合物の該公知の量を受けた動物からの少なくとも一つの組織中で見つけた転移性癌細胞の数が、該式（Ｉ）の化合物を投与されなかった対照動物で見つけた転移性癌細胞の数よりも少ない場合、式（Ｉ）の化合物の該公知の量を、該化合物の有効量と指定する工程。
【０１３７】
上記方法の幾つかの好ましい実施態様によれば、工程ａ）で使用する動物は、ヌードマウス、例えば、ＮＭＲＩ系のヌードマウスを含むマウスからなる。
【０１３８】
上記方法の幾つかの好ましい実施態様によれば、工程ｂ）で投与する非転移性癌細胞は、工程ａ）で準備する動物以外の同じ種の動物から生じる癌細胞、例えば、マウス癌細胞からなる。
【０１３９】
好ましくは、これらの細胞が動物体の一つ以上の組織又は器官に迅速にコロニー形成をすることができるように、該非転移性癌細胞は、静脈内に投与される。
【０１４０】
幾つかの好ましい実施態様によれば、工程ｂ）で投与する該非転移性癌細胞は、非転移性乳癌細胞からなる。説明として、非転移性乳癌細胞の静脈注射は、乳房組織における該非転移性癌細胞のホーミングをもたらし、そこで次に該癌細胞は増殖し、これは、動物の乳房組織内での非転移性癌腫瘍の移植と等しい。
【０１４１】
上記方法の幾つかの好ましい実施態様によれば、工程ａ）では、式（Ｉ）の化合物の公知の量の一連の同時試験ができる数の試験動物が準備される。すなわち、工程ａ）が準備する動物を、動物のサブグループに分けてもよく、ここで、動物の各サブグループは、工程ｃ）で式（Ｉ）の化合物の所与の公知量を投与され、したがって、インビボアッセイの終わりに転移を阻害する該式（Ｉ）の化合物の最小有効量を確定できるように、様々な量の式（Ｉ）の化合物を同時にアッセイできる。好ましくは、動物のサブグループの一つは、工程ｂ）で非転移性癌細胞を投与されるが、工程ｃ）では式（Ｉ）の化合物を投与されない、対照群からなる。該動物の対照サブグループで測定された非転移性癌細胞の数は、次に比較工程ｅ）を実施するために使用する。
【０１４２】
上記方法の工程ｆ）において、転移性細胞の数における差が統計的に有意である場合、試験動物は、対照サブグループの動物よりも少ない数の転移性細胞を有していると考えられ、このことは、従来のＴ−検定において、Ｐ値が、０．０５よりも低いことを意味し、これは０．０１よりも低いＰ値を包含する。
【０１４３】
本明細書で使用する、工程ｄ）で測定する「転移性癌細胞の数」は、動物中で見つける転移増殖巣の数を包含する。幾つかの実施態様において、「転移性細胞の数」は、動物中で見つける、試験された各種の組織又は試験された身体局在化についての転移増殖巣の数を包含する。すなわち、幾つかの実施態様において、工程ｄ）で測定する「転移性癌細胞の数」は、各種の組織、例えば、卵巣、子宮、腎臓、肝臓、肺、脚、脊柱、脾臓及びリンパ節についての転移性細胞増殖巣の数を包含する。
【０１４４】
本明細書で使用する、工程ｄ）で測定する「転移性癌細胞の数」は、該転移性癌細胞により発光される検出可能なシグナルを計数すること、そして次に工程ｅ）で対応するシグナル数量化シグナル値を比較することにより実施することができる。該検出可能なシグナルは、該転移性癌細胞により発光される生物発光シグナルを包含する。説明として、本明細書の実施例において示されるように、該生物発光シグナルは、生物発光物質のカリウム塩、例えば、Ｄ−ルシフェリンのカリウム塩をマウスに投与すること、そして次に、例えば、全身生物発光撮像装置を使用することによって、動物全身から発光される生物発光シグナルの局在確認及び計数により得ることができる。
【０１４５】
最後に、上記の方法により、ひとたび式（Ｉ）の化合物の有効量が決まれば、この有効量は、動物体の重量単位、例えば体重の１kg当たりの量による有効量として表現することができ、当業者は、治療計画の大部分の場合を含める、ヒト癌患者において転移の発生を予防するための該式（Ｉ）の化合物の有効量を容易に決定する。
【０１４６】
本明細書の先に既に記載しているように、各用量で投与する式（Ｉ）の化合物の量は、典型的には０．０１mg/kg〜１００mg/kg、好ましくは０．０１mg/kg〜５０mg/kg、そして最も好ましくは０．０５mg/kg〜２５mg/kg、そして例えば１０mg/kgと、さまざまである。
【０１４７】
投与療法サイクルは、式（Ｉ）の化合物の毎日、隔週、毎週、隔月及び毎月の投与を包含する。
【０１４８】
本発明はまた、式（Ｉ）の化合物を対象に投与することを含む、原発癌からの転移を予防するための方法を提供する。好ましい態様において、化合物は、実質的に精製されている。対象は、好ましくは動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【０１４９】
例えば、リポソーム内封入、微小粒子、マイクロカプセル、化合物を発現可能な組換え細胞、受容体仲介エンドサイトーシス（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照のこと）のように様々な送達システムが公知であり、式（Ｉ）の化合物を投与するために使用することができる。導入の方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物は、任意の都合のよい経路により、例えば、注入又はボーラス注射により、上皮もしくは皮膚粘膜ライニング（例えば、口腔内粘膜、直腸粘膜及び腸管粘膜、等）を介する吸収により投与することができ、他の生理活性剤と一緒に投与することができる。投与は、全身又は局所的であることができる。経肺投与も、例えば、吸入器や噴霧器の使用により、及びエアロゾル化剤を含む剤形により用いることもできる。
【０１５０】
特定の実施態様において、本発明の組成物を体の特定の部位に局所的に投与することが望ましい場合がある;これは、例えば、非限定的に、手術中の局所注入、局所適用、例えば、手術後の創傷被覆材と併せて、注射により、カテーテルを用いることにより、坐剤を用いることにより、又は移植片（該移植片は、シアラスト（sialastic）膜もしくは繊維のような膜を含む、多孔性、非多孔性、もしくはゼラチン質材料である）を用いることにより達成されうる。幾つかの他の実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、例えば、ポリエチレングリコールでコーティングされた、又は転移性癌細胞により発現された表面分子(例えば、表面抗原、表面グリコシド残基、表面受容体、等)と結合するリガンド分子をその表面に有するリポソーム内封入化で、一つ以上の組織を特異的に標的にすることができる。
【０１５１】
本発明を、非限定的に、下記実施例により更に説明する。
【０１５２】
実施例
実施例１：  グリセロ脂質のインビトロ抗転移活性
Ａ．  材料及び方法
Ａ．１．  細胞培養
既に記載（Roger S, Potier M, Vandier C, Le Guennec JY, Besson P. Description and role in proliferation of iberiotoxin-sensitive currents in different human mammary epithelial normal and cancerous cells.  Biochim Biophys Acta 2004; 1667: 190-9.）されているように、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓを、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。不死化正常乳腺上皮細胞株ＭＣＦ−１０Ａ及び１８４Ａ１を、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２の１：１の混合物（５％ウマ血清（Invitrogen Life Technologies, France）、インスリン（１０μg/mL）、上皮成長因子（２０ng/mL）、ヒドロコルチゾン（０．５μg/mL）含有、ならびにＭＣＦ−１０Ａには１００ng/mLコレラトキシン、及び１８４Ａ１には１ng/mLコレラトキシン＋５μg/mLトランスフェリンをそれぞれ含有）中で培養した。
【０１５３】
高Ｋ＋培地を、Ｋ＋−、Ｎａ＋−及びＣａ２＋−を含まないＤＭＥＭ−基礎培地（Cambrex Bio Science, France）から特別に作製し、そして使用時に６０mM ＫＣｌ、８４mM ＮａＣｌ、２mM ＣａＣｌ２を補充した。
【０１５４】
すべての細胞株は、American Type Culture Collection（ATCC, LGC Promochem, Molsheim, France）から得た。
【０１５５】
Ａ．２．  インビトロでの細胞増殖及び細胞遊走
細胞増殖を、記載（Roger S, Potier M, Vandier C, Le Guennec JY, Besson P. Description and role in proliferation of iberiotoxin-sensitive currents in different human mammary epithelial normal and cancerous cells.  Biochim Biophys Acta 2004;1667:190-9.）されているように、テトラゾリウム塩還元法を使用して測定した。細胞を２４−ウエルプレートに播種し、４８時間成長させた。次に薬剤を、細胞増殖に影響を及ぼさない濃度で２４時間加えた。記載（Roger S, Potier M, Vandier C, Le Guennec JY, Besson P. Description and role in proliferation of iberiotoxin-sensitive currents in different human mammary epithelial normal and cancerous cells.  Biochim Biophys Acta 2004; 1667: 190-9.）されているように、細胞遊走を、８μm孔径ポリエチレンテレフタラート・メンブラン細胞培養インサート（Becton Dickinson, France）付き２４−ウエルプレート中で分析した。
【０１５６】
創傷治癒アッセイ：  細胞を培養皿に播種し、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ中でコンフルエンスになるまで成長させた。単層を、無菌の黄色ピペッティングではがした。取り除かれた領域までの細胞の遊走を顕微鏡下で検査した。写真を、はがした時直ちに及び２４時間後に、撮った。
【０１５７】
Ａ．３．  細胞傷害性アッセイ
細胞増殖抑制効果と細胞傷害効果とを区別するために、２つの細胞傷害性アッセイを用いた。第１のアッセイにおいて、処置の２４時間後の細胞生存率をトリパンブルー排除法により評価した。第２の方法において、細胞を、１、３、１０及び３０μMのエデルフォシンで８時間インキュベートし、次に新鮮な培養液で３回洗浄した。残りの生存細胞を６日間成長させた後、先に記載のようにＭＴＴアッセイを用いて数量化した。
【０１５８】
Ａ．４．  溶液及び薬剤
生理食塩水液（ＰＳＳ）は、以下の組成であった（単位mM）：  ＮａＣｌ １４０、ＭｇＣｌ２ １、ＫＣｌ ４、ＣａＣｌ２ ２、Ｄ−グルコース １１．１、及びＨＥＰＥＳ １０、１M ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した。ピペット溶液、ｐＣａ＝７（Ｃａ２＋を含まない濃度）は、以下の濃度であった（単位mM）：  Ｋ−グルタメート １２５、ＫＣｌ ２０、ＣａＣｌ２ ０．３７、ＭｇＣｌ２１、Ｍｇ−ＡＴＰ １、ＥＧＴＡ １、ＨＥＰＥＳ １０、１M ＫＯＨでｐＨ７．２に調整した。より高いｐＣａ（６．４及び６）を有するピペット溶液も用いた。テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、４−アミノピリジン（４−ＡＰ）、ＮＳ １６１９（１−（２’−ヒドロキシ−５’−トリフルオロメチルフェニル）−５−トリフルオロメチル−２（３Ｈ）ベンゾイミダゾロン））、アパミン、ＢＭＳ ２０４−３５２及びエデルフォシンを、図の凡例に示された濃度で、ＰＳＳ又は培地に加えた。Dominique Cahard（UMR 6014 CNRS de l'IRCOF University of Rouen）よりＢＭＳ ２０４−３５２を好意により頂いた以外は、全ての薬剤及び化学製品は、Sigma-Aldrich（St Quentin, France）より購入した。
【０１５９】
Ａ．５．統計
特に断りのない限り、データは、平均値±平均値の標準誤差として表わした（ｎ＝細胞の数）。StatView 4.57ソフトウエア（Abacus Concepts, Berkeley, USA）を用いて実施した統計解析は、スチューデントｔ検定又は一要因分散分析法（one-way factor ANOVA）、続いて事後Bonferroni-Dunn検定を使用して行った。差異は、ｐ＜０．０５の場合、有意であるとみなした。
【０１６０】
Ｂ．  結果
（ｉ）低・細胞傷害性及び（ii）転移性癌性細胞に対する式（Ｉ）の様々なグリセロ脂質化合物の高・細胞遊走阻害活性を示す結果を、後述の表１に示す。
【０１６１】
実施例２：  グリセロ脂質のインビトロ及びインビボ抗転移活性
Ａ．  材料及び方法
Ａ．１．  細胞培養
この研究のために、ＡＴＣＣから購入した２種類の細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ及びＨＥＫ２９３を使用した。これらの細胞株をダルベッコ変法イーグル培地中に維持した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ及びＨＥＫ２９３それぞれに対して、培地を５％（v/v）及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で補充した。細胞を加湿雰囲気中、３７℃（９５％空気、５％ＣＯ２）で成長させた。マイコプラズマ汚染の非存在は、定期的にMycoalert（登録商標）マイコプラズマ検出キット（Lonza）を使用して検証した。
【０１６２】
Ａ．２．  構築物、トランスフェクション及び形質導入
全ての構築物は、先に記載（Chantome et al., Exp Cell Res. 2009 Dec 10;315(20):3620-30）のとおりであった。
【０１６３】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ及びＨＥＫ２９３細胞に、ポリブレン（４μg/mL、Sigma）の存在下、感染多重度（ＭＯＩ）１：３でレンチウイルスベクターを形質導入した。ＧＦＰ細胞を計数することにより測定したＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓの形質導入割合は、９０％近くであった。ＨＥＫ２９３−ＳＫ３／ＫＣａ２．３の１つのクローンを選別するために、限界希釈法を実行し、そしてＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルの発現を制御するために、各クローンを、アパミン及びエデルフォシンを用いてパッチクランプで、ならびにウエスタンブロット法により試験した。
【０１６４】
Ａ．３．  細胞増殖アッセイ
細胞増殖を、他書に記載（S.Roger et al., 2004）されているように、テトラゾリウム塩還元法（ＭＴＴ）を使用して測定した。細胞を１ウエルあたり４０，０００細胞の密度で２４−ウエルプレート上に播種し、着床の２４時間後、測定を三連で実施した。
【０１６５】
Ａ．４．  二次元（２Ｄ）運動アッセイ
細胞運動を、先に記載（S.Roger et al., 2004）のように、８μm孔径ポリエチレンテレフタラート・メンブラン細胞培養インサート（Becton Dickinson, France）付き２４−ウエルプレート中で分析した。簡潔に述べれば、４×１０４ ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞を、５％ＦＢＳ（±微量）で補充された培地を含む上部コンパートメント中に播種した。下部コンパートメントを、化学誘引物質として１０％ＦＢＳ（±微量）で補充された培地で満たした。コーティングなしで二次元（２Ｄ）運動アッセイを実施した。２４時間後、メンブランの上側からの定常細胞を除去し、一方、インサートの底部側の移動細胞を、５つの別々の領域で固定し、染色し、そして計数した（拡大率、×２００）。少なくとも３つの独立実験を、各々三連で実施した。
【０１６６】
Ａ．５．  電気生理学
実験を、３５mmペトリ皿に１cm2あたり３０００細胞を播種した、細胞で実施した。全ての実験は、先に記載［８］したように、パッチ−クランプ技術の従来の全細胞記録構成を用いて実施した。ＰＣａ溶液は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ及びＨＥＫ２９３−ＳＫ３／ＫＣａ２．３細胞について、それぞれ７及び６．４であった。
【０１６７】
簡潔に述べれば、実験は、Axopatch 200B パッチ−クランプ増幅器（Axon Instrument）を使用して実行し、1322-A Digidataコンバーター（Axon Instrument）でデジタル化したデータを、Clampex of pClamp 9.2ソフトウエア（Axon Instrument）を使用してコンピューターに保存した。パッチ−クランプデータを、Clampfit 9.2及びOrigin 7.0 ソフトウエア（Microcal Inc., Northampton, MA, USA）の両方を使用して分析した。
【０１６８】
Ａ．６．  溶液及び薬剤
生理食塩水溶液（ＰＳＳ）は、以下の組成を有した（単位mM）：  ＮａＣｌ １４０、ＭｇＣｌ２ １、ＫＣｌ ４、ＣａＣｌ２ ２、Ｄ−グルコース １１．１及びＨＥＰＥＳ １０、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した。
【０１６９】
全細胞記録のためのピペット溶液は、以下を含有した（単位mM）：  Ｋ−グルタメート １２５、ＫＣｌ ２０、ＭｇＣｌ２ １、Ｍｇ−ＡＴＰ １、ＨＥＰＥＳ １０、そしてＫＯＨでｐＨを７．２に調整し、様々な濃度のＣａＣｌ２及びＥＧＴＡを加えて、計算されたｐＣａ＝７（０．３７mM ＣａＣｌ２及び１０mM ＥＧＴＡ）又はｐＣａ＝６．４（０．７mM ＣａＣｌ２及び１mM ＥＧＴＡ）を得た。
【０１７０】
アルキル−脂質分子を、エタノール／ＤＭＳＯの混合物に溶解した。最終濃度は、エタノール及びＤＭＳＯのそれぞれ、２％及び３％未満であった。
【０１７１】
Ａ．７．  実験的転移アッセイ及びＪＰＨ１７０１での処置
雌ＮＭＲＩヌードマウス、６週齢を、Janvier laboratoriesから購入した。アニマル・ケア・ライセンス No.44565下、INSERM、U892、University of Nantesでマウスを繁殖させ、そして収容した。
【０１７２】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓを、２４時間の間、１μM ＪＰＨ１７０１で、又は２％ＤＭＳＯ／３％エタノール（ビヒクル）でインキュベートし、側尾静脈に静脈注射（０．７５  １０６）をした。次に、マウスを、一週間に３回、１２週間、１５mg/kgの静注にて、ＪＰＨ１７０１又はビヒクルで処置した。ＪＰＨ１７０１又はビヒクルで処置したマウスに副作用は観察されなかった。
【０１７３】
Ａ．８．  乳房脂肪体モデル腫瘍：
雌ＮＭＲＩヌードマウス、３〜４週齢をJanvier laboratoriesから購入した。アニマル・ケア・ライセンスNo.44565下、INSERM、U892、University of Nantesでマウスを繁殖させ、そして収容した。
【０１７４】
ルシフェラーゼ発現細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ−を、１μM ＪＰＨ １７０１（Ohmline）で、又は２％ＤＭＳＯ／３％エタノール（ビヒクル）で２４時間処置し、２．１０６細胞を、右側の除去した脂肪体に注入した。細胞に、血清を含まない５０μL容量のＤＭＥＭを２５−ゲージ針を通して注入した。マウスを、１週間に３回、１４〜１５週間、１５mg/kgの静注にて、ＪＰＨ １７０１（Ohmline）又はビヒクルで処置した。
【０１７５】
原発腫瘍の成長を、端度器（caliper）測定により及び生物発光イメージング（ＢＬＩ）により、週１回評価した。腫瘍容量を、長さ×幅×深さとして計算し、原発腫瘍は、その容量が５００mm3に達した時（移植後６〜７週間）、外科的に除去した。腫瘍切除の８週間後にマウスを安楽死させ、そして転移をリンパ節、肺、脊柱、及び下肢骨中で、生物発光イメージングによりエクスビボで検出した。
【０１７６】
Ａ．９．  生物発光イメージング（ＢＬＩ）
全てのマウスを、全身生物発光イメージングを使用し転移量の相対量を数量化して、毎週評価した（FimageurTM; BIOSPACE Lab, France）。各マウスに、Ｄ−ルシフェリン（Interchim）のカリウム塩を１５０mg/kg体重の用量にて腹腔内注射で与え、ケタミン（Ketamin）／キシラジン（xylasin）の腹腔内注射で麻酔をかけた。飽和プレートが側体、腹側及び背側位置中に到達するまで、生物発光イメージをリアルタイムで回収した。生物発光腫瘍細胞から発光される光のレベルは、フォトン・イメージャー・システム（photon imager system）により検出され、統合され、デジタル化され、そして表示された。対象の領域は、実験的転移の周りに、注意が向けられた。各対象の領域内の転移量は、乳癌細胞中のルシフェラーゼ活性から生成される光の相対量として数量化され、Photovision＋ソフトウエア（version 1.3; Biospace Lab）を使用してcpm（カウント毎分）で表現された。剖検時に、回収した各組織についてエクスビボＢＬＩ測定を実施した。
【０１７７】
Ｂ．  結果
Ｂ．１．  ＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルの新規な遮断薬そしてそれによる細胞運動の阻害薬としてのアルキル脂質の同定
本発明者らは、小コンダクタンスＣａ２＋−活性化Ｋ＋チャネルファミリー、ＳＫ３又はＫＣａ２．３チャネルが、上皮癌及び黒色腫細胞運動のメディエータであることを立証した（Potier et al., Mol Cancer Ther. 2006 Nov;5(11):2946-53 ; Chantome et al., Exp Cell Res. 2009 Dec 10;315(20):3620-30）。近年、転移に対するこのチャネルの役割が立証され、そして本発明者らは、このチャネルが転移発生を促進することを見出した（WO2008015267, ≪A method for the in vitro screening of anti-cancer compounds that inhibits SK3/KCa2.3, and said anti-cancer compounds≫）。この特許（WO2008015267）を使用して、本発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞のＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルにより媒介される遊走を減少させる化合物のその能力について検査した。本発明者らは、エデルフォシンが、ＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルにより媒介される遊走を減少させることを見出した（Potier et al., Br J Pharmacol. 2011 162(2), 464-79）。したがって、本発明者らは、アルキル−脂質分子について、とりわけエデルフォシンに近い構造を有するアルキル−脂質分子のスクリーニングに着目することに決めた。エデルフォシンは、エーテル脂質であり、また抗腫瘍剤としても知られている。しかし、この化合物は、ヒトに投与された場合、毒性が強い。エーテル脂質の化学療法的活性は、少なくとも一つには、加水分解に必要なアルキル開裂酵素が癌細胞に欠けているせいで、癌細胞に蓄積するエーテル脂質の能力と、そしてそれ故にこれらの脂質の除去により生じると、当技術分野において考えられている。癌細胞膜に集められたエーテル脂質による界面活性剤様活性の働きが、膜の構造を乱し、したがって細胞を破壊することができると、当技術分野において考えられている。この文脈において、エデルフォシンの抗癌効果は、ホスホコリン部分の存在によって媒介されると考えられている（Mollinedo et al., 1997, Cancer Research, Vol. 57(7: 1320-1328); Mollinedo et al., 2004, Curr Med Chem, Vol.11 (24: 3163-3184）。
【０１７８】
本発明者らの目的は、転移性細胞の遊走に関連する細胞内経路を特異的に標的化するであろう「真」の抗転移性薬剤を設計することであった。実際、非特異的処置は、多くの場合、重篤な副作用（例えば、免疫抑制、汎血球減少症（貧血、血小板減少症、及び白血球減少を伴う骨髄細胞成長阻害）、下痢、嘔吐、及び脱毛（毛髪減少））を引き起こす。
【０１７９】
したがって本発明者らは、化合物のどの部分が細胞遊走に対するその阻害活性にとって不可欠なのかを確認することを期待して、それらの構造に基づいて異なるアルキル脂質の類似体を試験することを選んだ。次に本発明者らは、グリセロール骨格が除去された分子、或いはｓｎ−１、ｓｎ−２もしくはｓｎ−３が除去された又は置換された分子を試験した。試験した異なる化合物の活性を、表２にまとめた。本発明者らは、グリセロール骨格の不存在下では、類似体は、より毒性が強く且つ細胞遊走に対して無効であるので、グリセロール骨格が不可欠であることを見出した（類似体２、３、表２を参照のこと）。より短い鎖の類似体はまた、細胞遊走において無効であるので、ｓｎ−１位における脂肪鎖の長さは、重要である（類似体６、表２を参照のこと）。ｓｎ−１におけるエーテル結合の存在（類似体８、表２を参照のこと）で同じ結論である。次に本発明者らは、ｓｎ−２部分が修飾された化合物を試験し、そしてＰＡＦ様類似体（化合物４）は、細胞遊走に対して効果がないことを見出した。最後に、本発明者らは、ｓｎ−３上の部分が不可欠であることを見出した（類似体９〜１７）。実際、ｓｎ−３上のホスホコリンの除去により、細胞遊走に対するその阻害効果が減少した（化合物１０）。興味深いことに、本発明者らがｓｎ−３上にモノサッカライドを更に加えた場合（類似体１１〜１５）、阻害活性が再出現した。類似体は、ジサッカライドを加えた場合、より効果的であった（類似体１７及び表２を参照のこと）。
【０１８０】
結論として、本発明者らは、ｓｎ−１中のエーテル結合、ｓｎ−１中の少なくとも１６炭素の脂肪鎖長、ｓｎ３中のＯ−ＣＨ３部分、及びホスホコリン又はモノ−ジサッカライドのような成分が、細胞遊走に対する阻害活性にとって不可欠であることを確証する。このスクリーニングから、本発明者らは、エーテル結合を含むｓｎ−１上のＣ１６鎖、ｓｎ−２上のＯ−ＣＨ３、及びｓｎ−３上のβ−ラクトースを有するＪＰＨ１７０１についての研究に焦点を合わせた。
【０１８１】
図６は、この類似体が１０nMから、およそ１μMで見られる最大効果を伴って細胞遊走を阻害することを示す（図６Ａ）。これらの濃度で、ＪＰＨ１７０１が細胞生存率に及ぼす影響はない（図６Ｂ）。ＪＰＨ１７０１は、非癌性細胞ＭＣＦ−１０Ａの細胞遊走又は細胞生存率には影響を及ぼさなかった（図６Ｃ及び６Ｄ）。図６Ｅは、ＳＫ３に対するｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスに感染している細胞を使用して、ＪＰＨ１７０１がＳＫ３−依存性運動に特異的に作用することを立証した。対照条件において、ｓｈＲＮＡランダムを用いて、本発明者らは、野生型細胞でのＪＰＨ１７０１の同じ阻害効果を示した（図６Ｅ）。ＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネル無しの場合、遊走の基本レベルは減少する（６０％ vs 対照条件）。ＳＫ３−細胞に対する１μMでの効果（図５又は６Ｃ）以外に、ＪＰＨ１７０１は、ＭＣＦ−１０Ａを用いて１μMで観察されたようにＪＰＨ１７０１の非特異的な効果を示唆する、任意の追加的な効果を有する。次にＪＰＨ１７０１は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞のＳＫ３−依存性遊走を減少させた。
【０１８２】
次いで、本発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞におけるＳＫ３活性に対するＪＰＨ１７０１の効果を、パッチクランプ法を使用して試験した。パッチクランプアッセイの前に、これらの細胞をＪＰＨ１７０１ １μMで２４時間処理した。未処理細胞と比べて、ＪＰＨ１７０１はＳＫ３電流を大幅に減少させた（図７Ａ）。実際、ＪＰＨ１７０１処理の後、アパミン感受性電流は、全て消失した（図７Ｂ）。
【０１８３】
本発明者らは、次に、パッチクランプ法を使用して測定するＳＫ３活性に対する類似体を直接試験するために、ＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルを発現しているＨＥＫ細胞を発育させた（図８）。本発明者らは、１０μMでの分子の急性適用がＳＫ３電流を減少させ、０mVで記録された電流振幅（ＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルのみによって運ばれた電流）及びＳＫ３コンダクタンスのいずれも、ＪＰＨ１７０１によって減少したことを見出した。ＳＫ３電流のＪＰＨ１７０１−誘発阻害を０mVで分析し、そして実験の全経時変化を図８Ａに示す。ＪＰＨ１７０１の効果は、用量依存性であり、試験したどの濃度（３００nM、１μM、１０μM）でも、全阻害は適用の１２０秒後に観察された。この阻害もまた、時間依存性であった。例えば、１０μM ＪＰＨ１７０１は、１２０秒後に電流振幅の約７０％を減少させた。
【０１８４】
加えて、１０nM アパミンの適用がＳＫ３電流を完全に遮断した（データは示さず）。
【０１８５】
本発明者らは更に、０．３、１及び１０μMのＪＰＨ１７０１が電流の５０％阻害を得るために必要な時間を分析した（図８Ｂ）。試験したどの濃度でも、電流振幅の５０％を減少させるために約４０秒が必要であった。内因性ＨＥＫカリウム電流は、適用濃度範囲のＪＰＨ１７０１によって有意には影響されなかった（データは示さず）。５μM Ａ２３１８７の添加により細胞内カルシウム濃度を増加させると、ＪＰＨ１７０１の効果は完全に逆転した（データは示さず）。
【０１８６】
ＪＰＨ１７０１はラセミ混合物として試験されたので、本発明者らは、ＳＫ３チャネルを減少させるその能力は、その鏡像異性体のうちの一つ（（Ｒ）−ＪＰＨ１７０１及び（Ｓ）−ＪＰＨ１７０１）に特異的に起因するのかどうかを調べた。鏡像異性的に純粋なＲ−及びＳ−ＪＰＨ１７０１の合成は、鏡像異性的に純粋な（２Ｒ）及び（２Ｓ）１−Ｏ−ヘキサデシルオキシ−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロールから達成された。ラセミ混合物と比較して、両方の鏡像異性体は、ＳＫ３チャネル活性の減少において同様の作用を示した（図８Ｃ）。したがって、以下の実験は、両方の鏡像異性体のＪＰＨ１７０１の組み合わせを使用して実施した。
【０１８７】
ＪＰＨ１７０１がアパミン結合部位と相互作用するかどうかを研究するために、１２５Ｉ−アパミン結合研究を実施した。図８Ｅは、ＪＰＨ１７０１が、ＳＫＣａチャネルを発現している膜への１２５Ｉ−アパミン結合を阻害しないことを示し、このことは、ＪＰＨ１７０１及びアパミンが、依然として研究されないままである固有の部位及び機構を介して作用することを示唆している。
【０１８８】
ＳＫＣａ／ＩＫＣａチャネルのその他のメンバーに対するＪＰＨ１７０１の選択性を試験した。図９Ａは、対照条件下及び１０μM ＪＰＨ１７０１の適用後のＨＥＫ細胞中で発現されたＳＫ１、ＳＫ２、ＳＫ３及びＩＫＣａチャネルに対して実施した代表的な全細胞電流を示す。実験プロトコルは、図８で使用したものと同様であった。ＪＰＨ１７０１を、５００msecで＋６０mV〜−１００mVの膜電位に対して試験した。定常状態の阻害に達した時、１０nM アパミン又は１μM クロトリマゾールそれぞれを、残留ＳＫＣａ及びＩＫＣａ電流を完全に阻害するために用いた。図９Ｂは、ＪＰＨ１７０１が、ＩＫＣａ電流に対しては不活性であるが、ＳＫ１及びＳＫ３電流（効力比較、ＳＫ３＞ＳＫ１）を有意に減少させることができることを示す。試験した濃度では、本化合物はＳＫ２チャネルに対して不活性であった。
【０１８９】
これらの結果より、式（Ｉ）の化合物、及び特に化合物の群（Ａ〜Ｐ、発明の詳細な記載を参考のこと）より選択される式（Ｉ）の化合物を使用して、ＳＫ２とＳＫ１／ＳＫ３チャネルとを区別することもできるし、また末梢組織（ＳＫ１チャネルを発現しなかったもの）におけるＳＫ３チャネルの機能的役割を研究するための有用なツールになり得ることが実証される。
【０１９０】
類似体の同定をさらに進めるために、メリビオース又はマルトース・ヘキサデシルオキシ−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロール（ＨＭＧ）類似体をＳＫ３電流について試験し、ならびにラクトースの各炭素上にＯ−アセチルを有するＪＰＨ様分子も試験した（表３）。メリビオース及びマルトースの両方、ならびにＪＰＨ１７００（これは、ラクトースの各炭素上に基Ｏ−アセチルを有するＪＰＨ１７０１の前駆体である）も、ＳＫ３活性を減少させたが、すべてのこれらの類似体の効果は弱い。
【０１９１】
最後に、本発明者らは、Ｒ３が、下記：
【化２６】
2013519706.tif 000028
からなる化合物［式中、Ｒ４は、モノサッカライド基、又は２〜４個のサッカライド単位を有するポリサッカライド基からなる群より選択される］（例えば、化合物Ｍ、Ｎ、Ｏ及びＰ）のＳＫ３活性に対する阻害効果を試験した。
【０１９２】
ＣＨＳ３１（これは、化合物Ｍの例である）は、そのｓｎ３（すなわち：Ｒ３）結合にリン酸を有するヘキサデシルオキシ−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロール類似体の例である（表３を参照のこと）。ＪＰＨ１７００のように、この分子は、ＳＫ３活性を減少させた。たとえこれらの化合物のどれもがＪＰＨ１７０１のように効果的ではなかったとしても、このことは、ヘキサデシルオキシ−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロール（ＨＭＧ）ジサッカライドファミリーがＳＫ３チャネルを阻害する、つまり抗転移性効果を呈する可能性を有していることを示す。
【０１９３】
Ｂ．２．  実験的転移モデルに対するＪＰＨ１７０１の抗転移性効果
最近、本発明者らは、癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓにおけるＳＫ３／ＫＣａ２．３チャネルの活性が転移発生を促進させることを立証した。ＪＰＨ１７０１のようなＳＫ３／ＫＣａ２．３遮断薬が転移発生を予防することができるかどうか決定するために、本発明者らは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現しているＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞を有する実験的転移のモデルを使用した。癌細胞を、尾静脈に入れて体循環に直接注入した。マウスの１つのコホートを、ＪＰＨ１７０１で一週間に３回、１２週間、静脈投与により処置した。別のコホートは、同じ条件下、ビヒクルで処置した。処置の終わりに、対照マウスの７０％（７／１０）で、及びＪＰＨ１７０１処置マウスのわずか４０％（４／１０）で、転移をインビボで生物発光イメージング（ＢＬＩ）により可視化した（表４）。更にすすめて、マウスを屠殺し、様々な組織における転移の検出をエクスビボでＢＬＩにより実施した。各コホートからの陽性組織の数を、表４に示した。転移性病変が、全てのビヒクル−処置マウスで検出された。興味深いことに、ＪＰＨ１７０１で処置したマウスの３０％（３／１０）は、エクスビボで転移発生の徴候は示さなかった。臨床的研究を利用して、本発明者らは、各マウスの転移性プロファイルを決定し、そしてＪＰＨ１７０１処置が転移性プロファイルを、より転移発生が少ないプロファイルへと移行させたことを見出した（図１０Ａ〜Ｂ、１０Ｃ及び１０Ｄ）。
【０１９４】
ＪＰＨ１７０１の抗転移性効果についてより多くの情報を得るために、本発明者らは、ＢＬＩにより両方のコホート間の転移出現の動力学を比較した。１２週目（終点）で、インビボで可視化される転移を有するマウスのみを、この研究に含めた。図１０Ｅに示すように、転移出現は、ＪＰＨ１７０１処置群におけるよりも対照群において、およそ３倍早かった。ビヒクルで処置したマウスの７５％が、４週目に検出可能な転移を呈した。ＪＰＨ１７０１で処置したマウスに関して、本発明者らは、更に３週間待つ必要があった。結論として、ＪＰＨ１７０１は、インビボで転移を示しているマウス（４／１０）において転移形成の遅延を可能にした。他方で、ひとたび転移が検出されると、その成長速度は、両方のコホートとも同じであった（図１０Ｆ）。
【０１９５】
本発明者らは、インビトロで、ＪＰＨ１７０１が、ＳＫ３−依存性運動を阻害するが、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓの増殖には影響を及ぼさないことを立証した。インビボ・データは、インビトロで見つけたこれらと合致していた：  ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓを尾静脈に注入し、そしてＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓは、潜在転位部位上の動脈血に到達する前に、直径１０μM（２Ｄ運動アッセイにおける孔径として）の肺毛細血管に移動しなくてはならない。ＪＰＨ１７０１は、おそらく癌細胞の血管外遊走及び血管内侵入にとって必要なＳＫ３−依存性運動を阻害することによって、転移発生を妨害した。しかし、ひとたび癌細胞がその増殖に有利な環境を有する組織に到達すると、ＪＰＨ１７０１処置は癌細胞の増殖を抑制しなかった。
【０１９６】
Ｂ．３．  ＪＰＨ１７０１処置は原発腫瘍成長に影響せず
また、エデルフォシンは、幾つかの機構を介して、とりわけプロテインキナーゼＣ又はホスホリパーゼＣのような酵素活性の阻害によりその生物学的効果を発揮すると、報告されていた。それらの阻害は、エデルフォシンの細胞増殖抑制効果及び細胞毒性効果の一部を説明できる（Gajate, C., and Mollinedo, F., Curr Drug Metab, 2002, 3, 491-525, Van Blitterswijk, W.J., and Verheij, M., Curr Pharm Des, 2008, 14, 2061-2074）。
【０１９７】
本発明者らは、エデルフォシンと比較して、ＪＰＨ１７０１は、すべてのＰＫＣとは相互作用することはできず、ＰＬＣとのみ僅かに相互作用することを立証した。
【０１９８】
実際、ＪＰＨ１７０１の分子構造は、ＬＰＡ及びＰＡＦに似ている。分子構造間のこの類似性により、ＪＰＨ１７０１の効果の幾つかが、ＰＡＦ受容体又はＬＰＡ（リゾホスファチジン酸）受容体へのその結合により媒介されているのかどうかを分析することを、本発明者らは決心した。図１１に示すように、エデルフォシンは、ＰＡＦ受容体のＣ１６−ＰＡＦ結合部位と相互作用することができ（図１１Ａ）、したがって用量依存的に細胞内カルシウムを増加させることができた（図１１Ｂ）。対照的に、ＪＰＨ１７０１は、ＰＡＦ受容体と相互作用することができなかった。同じ結果をＬＰＡ受容体で得た（０．３及び２μM ＪＰＨ１７０１で、ＬＰＡ結合はそれぞれ１０５．３±８．０％及び８７．２±４．７％）。
【０１９９】
また、エデルフォシンは、その細胞増殖抑制効果及び細胞毒性効果の一部を説明できるプロテインキナーゼＣ又はホスホリパーゼＣのような酵素活性を阻害することが報告されていた。図１１Ｄは、ＪＰＨ１７０１が、７．０μMのＩＣ５０でＰＬＣ活性と相互作用できたことを示し、これは、エデルフォシンについて測定したＩＣ５０値（２．５μMのＩＣ５０）よりも、非常に高い値である。
【０２００】
ＰＫＣ活性に関して、ＪＰＨ１７０１は、１０種のＰＫＣファミリーのいずれの活性にも影響を及ぼさなかった（図１１Ｃ）。
【０２０１】
最後に、本発明者らは、ＪＰＨ１７０１が、エデルフォシンとは違って、原発腫瘍成長を標的にせず、したがって転移性プロセスに対して特異的であることを立証した。ＪＰＨ１７０１（Ohmline）（１μM）で又はビヒクルで、２４時間、前処置された２００万個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ−ｌｕｃ細胞を、ＮＭＲＩ／ヌードマウスの乳房脂肪体に移植した。マウスを、一週間に３回、１５mg/kgの静注にて、ＪＰＨ１７０１で又はビヒクルで処置した。移植後６週間を過ぎて、腫瘍容量の時間経過を見てみると、ビヒクルとＪＰＨ１７０１処置マウスの間には差違はなかった（図１２Ａ）。同様に、６週間の間、原発腫瘍の癌細胞の数の週１回の評価は、ビヒクルとＪＰＨ１７０１処置マウスとの間に任意の有意な差異を明示しなかった（図１２Ｂ）。
【０２０２】
ＳＫ３−細胞遊走に対する低濃度でのその作用に関連して、非癌性上皮細胞の細胞生存率に及ぼす式（Ｉ）のグリセロ脂質の限定的な効果は、エデルフォシンのような非特異的な化合物と比較すると、有望である。なぜならエデルフォシン様化合物の使用に関連する危険は、その有効濃度且つ高濃度が正常な細胞の溶解を引き起こす界面活性剤様特性のせいで一般的に細胞障害性であるということであった。
【０２０３】
【表１】
2013519706.tif 000029
2013519706.tif 000030
【０２０４】
【表２】
2013519706.tif 000031
2013519706.tif 000032
2013519706.tif 000033
【０２０５】
【表３】
2013519706.tif 000034
【０２０６】
表３は、２つのモデルにおけるＳＫ３活性に対する異なる分子の効果を示す。電流活性が、ＨＥＫ２９３ＬｖＳＫ３及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞中で測定された。パーセンテージは、化合物によるＨＥＫ２９３細胞中のＳＫ３チャネルに対する電流及びコンダクタンスの阻害を表わす。アパミン−感受性電流は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ野生型細胞中のアパミンによって消失した残留電流の一部を示す。
【０２０７】
【表４】
2013519706.tif 000035
【図１】
2013519706.tif 000060
【図２】
2013519706.tif 000061
【図３】
2013519706.tif 000062
【図４】
2013519706.tif 000063
【図５】
2013519706.tif 000064
【図９Ｂ】
2013519706.tif 000065
【図１０Ｂ】
2013519706.tif 000066
【図１２Ｂ】
2013519706.tif 000067
【図６Ａ】
2013519706.tif 000068
【図６Ｂ】
2013519706.tif 000069
【図６Ｃ】
2013519706.tif 000070
【図６Ｄ】
2013519706.tif 000071
【図６Ｅ】
2013519706.tif 000072
【図６Ｆ】
2013519706.tif 000073
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【国際調査報告】
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