(57)【要約】  本発明は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１つの天然デオキシヌクレオシドとを含むキット、そして、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、鋳型ＤＮＡ分子、ＤＮＡプライマー分子、および前記ＤＮＡ依存性ポリメラーゼによって合成されるｄｓＤＮＡから置換されるかあるいは前記ｄｓＤＮＡに結合されることが可能である蛍光部分を含む検出システムとを含むキットに関する。さらに、（ｉ）容器中のサンプルを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのデオキシヌクレオシド、および検出システム（鋳型ＤＮＡ分子と、ＤＮＡプライマー分子と、前記ＤＮＡ依存性ポリメラーゼによって合成されるｄｓＤＮＡに取り込まれるか前記ｄｓＤＮＡから置換されるかあるいは前記ｄｓＤＮＡに結合されることが可能である蛍光部分とを含む）を含む反応混合物と接触させることと、（ｉｉ）前記容器をインキュベートすることと、（ｉｉｉ）蛍光部分からのシグナルを測定することと、蛍光部分からのシグナルを、サンプル中のデオキシヌクレオシドキナーゼ活性と関連付けることとを特徴とする、サンプル中のデオキシヌクレオシドキナーゼ活性の測定方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１つの天然デオキシヌクレオシドとを含むことを特徴とするキット。
【請求項２】
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、鋳型ＤＮＡ分子、ＤＮＡプライマー分子、および前記ＤＮＡ依存性ポリメラーゼによって合成されるｄｓＤＮＡから置換されるかあるいは前記ｄｓＤＮＡに結合されることが可能である蛍光部分を含む検出システムとを含むことを特徴とするキット。
【請求項３】
請求項１または２に記載のキットにおいて、少なくとも、ホスホトランスフェラーゼをさらに含むことを特徴とするキット。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のキットにおいて、少なくとも１つの天然または修飾デオキシヌクレオシドをさらに含むことを特徴とするキット。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のキットにおいて、前記少なくとも１つの天然デオキシヌクレオシドが、デオキシチミジンおよび／またはデオキシシチジンまたはこれらの混合物から選択されることを特徴とするキット。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のキットにおいて、前記少なくとも１つの修飾デオキシヌクレオシドが、ＢｒｄＵおよび／またはＩｄＵ、またはこれらの混合物などの修飾チミジンおよび修飾シチジンから選択されることを特徴とするキット。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のキットにおいて、前記蛍光部分が一本鎖ＤＮＡプローブに結合されることを特徴とするキット。
【請求項８】
請求項７に記載のキットにおいて、前記蛍光部分および消光部分が、一本鎖ＤＮＡプローブに結合されることを特徴とするキット。
【請求項９】
請求項２〜６のいずれか一項に記載のキットにおいて、前記蛍光部分が、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、Ｅｖａ  ｄｙｅまたはＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩなどの二本鎖ＤＮＡ表面結合または挿入分子であることを特徴とするキット。
【請求項１０】
請求項７または８に記載のキットにおいて、前記一本鎖ＤＮＡプローブがその無傷の形態である場合に、前記プローブに結合された前記蛍光部分が消光されることを特徴とするキット。
【請求項１１】
請求項９に記載のキットにおいて、前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはＴｔｈポリメラーゼなどの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とするキット。
【請求項１２】
請求項７または８に記載のキットにおいて、前記一本鎖ＤＮＡプローブに結合された前記蛍光部分が、その無傷の形態でその標的鋳型とハイブリッド形成した場合に最大蛍光を達成することを特徴とするキット。
【請求項１３】
サンプル中のデオキシヌクレオシドキナーゼ活性を測定するための方法において、
ａ．  容器中のサンプルを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１つのデオキシヌクレオシドと、鋳型ＤＮＡ分子、ＤＮＡプライマー分子、および前記ＤＮＡ依存性ポリメラーゼによって合成されるｄｓＤＮＡに取り込まれるか前記ｄｓＤＮＡから置換されるかあるいは前記ｄｓＤＮＡに結合されることが可能である蛍光部分を含む検出システムとを含む反応混合物と接触させるステップと、
ｂ．  前記容器をインキュベートするステップと、
ｃ．  前記蛍光部分からのシグナルを測定するステップと、
ｄ．  前記蛍光部分からのシグナルを、前記サンプル中のデオキシヌクレオシドキナーゼ活性と関連付けるステップと
を特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記少なくとも１つのデオキシヌクレオシドが、天然もしくは修飾デオキシヌクレオシドまたはこれらの混合物であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の方法において、前記少なくとも１つの天然デオキシヌクレオシドが、デオキシチミジンおよび／またはデオキシシチジンまたはこれらの混合物から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１３または１４に記載の方法において、前記少なくとも１つの修飾デオキシヌクレオシドが、ＢｒｄＵおよび／またはＩｄＵ、またはこれらの混合物などの修飾チミジンおよび修飾シチジンから選択されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法において、前記蛍光部分が一本鎖ＤＮＡプローブに結合されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法において、前記蛍光部分および消光部分が、一本鎖ＤＮＡプローブに結合されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法において、前記蛍光部分が、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、Ｅｖａ  ｄｙｅまたはＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩなどの二本鎖ＤＮＡ表面結合または挿入分子であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法において、前記一本鎖ＤＮＡプローブがその無傷の形態である場合に、前記プローブに結合された前記蛍光部分が消光されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはＴｔｈポリメラーゼなどの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１７または１８に記載の方法において、前記一本鎖ＤＮＡプローブに結合された前記蛍光部分が、その無傷の形態でその標的鋳型とハイブリッド形成した場合に最大蛍光を達成することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患、障害、感染（ウィルスおよび細菌の両方）または癌の診断ために、サンプル中の１つまたはいくつかのデオキシリボヌクレオシドキナーゼをリアルタイムで均一（すなわち、非固相）決定するためのキットおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デオキシリボヌクレオシドキナーゼ
真核細胞中には、少なくとも３つのデオキシリボヌクレオシドキナーゼ、チミジンキナーゼ１および２（ＴＫおよびＴＫ２）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）およびデオキシグアノシンキナーゼ（ｄＧＫ）が存在している。
【０００３】
２つの異なるチミジンキナーゼをコードする２つのヒト遺伝子座が存在する。チミジンキナーゼは、細胞のサイトゾル中に見出すことができる。チミジンキナーゼ２はミトコンドリアに局在し、ミトコンドリアのＤＮＡ合成に関与する。ＴＫ２は、チミジンキナーゼ１とは異なるアミノ酸配列、基質特異性および発現プロファイルを有する。
【０００４】
チミジンキナーゼ１活性は、細胞周期のＧ１期の最後からＳ期を通して最も顕著である。ＴＫおよびｄＣＫは、サルベージ経路を介して、細胞中のＴＴＰおよびｄＣＴＰの貯蔵所の制御に関与する。ＴＫ酵素は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下でチミジンからチミジン一リン酸（ＴＭＰ）への変換を触媒する酵素である。
【０００５】
デオキシシチジンキナーゼ活性は細胞周期全体にわたって見出され、主としてリンパ由来の細胞中で確認される。ＴＫ２はミトコンドリア中に位置し、ｄＣＫとほぼ等しいｄＣへの親和性を有する。
【０００６】
疾患の診断
１９８０年代前半に、チミジンキナーゼ活性は種々の腫瘍疾患を患っている患者からの血清中で検出されるだけでなく、通常非常に低いＴＫ活性を示す健康なヒト個体とは大幅に異なり得ることが示された。
【０００７】
血液癌疾患の診断および予後のための単一腫瘍マーカーとしてのＴＫの使用は現在広く受け入れられている。特定の場合には、ＴＫは直接的な診断能力を示している。
【０００８】
ＴＫおよび他のデオキシリボヌクレオシドキナーゼの活性は初期に疾患と関連付けられたが、これは、Ｅｒｉｋｓｓｏｎら（２００２年）ならびにＴｏｐｏｌｃａｎおよびＨｏｌｕｂｅｃ（２００８年）による概説において要約される。
【０００９】
ＴＫ２は、ミトコンドリア病と関連された。
【００１０】
デオキシリボヌクレオシドキナーゼの決定のためのアッセイ
３Ｈ−チミジンなどの放射性基質は、フィルター結合アッセイにおいてＴＫおよびｄＣＫ活性の決定のために広く使用されている。ルーチン臨床診断のためには、放射性ベースのアッセイは魅力的な選択肢ではない。
【００１１】
過去数年間、非放射性ベースのアッセイを開発するためにいくつかの試みが成されており、これらは全ていろいろな点でより優れている。異なるデオキシリボヌクレオシドキナーゼの検出において使用される一連の方法、アッセイおよび試薬組成物は以下に続く。
【００１２】
欧州特許第１３８５００５号明細書には、アジドチミジン（ＡＺＴ）の競合的な一リン酸化に基づいた非放射性ＴＫ活性ベースのアッセイが提示されている。この技術はさらに、Ｄｉａｓｏｒｉｎ  Ｓ．ｒ．ｌ．によって自動２段階ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）発光診断アッセイへ開発されている。この２段階アッセイでは、まずサンプル中に存在するＴＫによってＡＺＴがモノリン酸化ＡＺＴＭＰにリン酸化される。そして、固体表面基質結合抗ＡＺＴＭＰ抗体に対してＴＫリン酸化ＡＺＴＭＰと競合するイソルミノールに結合したＡＺＴＭＰ（ＡＺＴＭＰ−ＡＢＥＩ）からの発光が次に検出される。この２段階アッセイの大きな欠点は、動的な読取りが制限されることである。別の欠点は、天然チミジンの代わりに修飾ヌクレオシド基質を使用することである。
【００１３】
国際公開第２００９／０６３２５４号パンフレットには、ＨＰＬＣにより分離されてＵＶにより検出される一リン酸化Ｂｒ−ｄＵの使用によって、サンプル中のＴＫ活性を決定するための半均一的な（ｓｅｍｉ−ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）方法が開示されている。この方法の不利な点は、反応が修飾基質を用いて行われ、検出が別の工程で行われることである。
【００１４】
米国特許出願公開第２００８／２４８４７２号明細書には、天然ＴＴＰの誘導体であるＢｒ−ｄＵＴＰの生成のための試薬混合物中のデオキシリボヌクレオシドキナーゼによってサンプル中のＴＫ活性の相補性を利用する固相アッセイが開示される。Ｂｒ−ｄＵＴＰは、次に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いるプライマー伸長によって取り込まれる。固相結合ＲＮＡ鋳型はモノマーｒＡから作られ、２００〜４００のモノマー長であり、固相に取り付けられる。取り込まれた［Ｂｒ］Ｕは、ＴＫ活性の最終決定のためのＥＬＩＳＡにおいて、抗［Ｂｒ］ｄＵアルカリホスファターゼ結合抗体を用いて第２の工程で検出される。この２段階アッセイは多くの手作業の相互作用工程により実施するのが煩わしく、実行するのに非常に長い時間がかかる。
【００１５】
サンプル中のｄＣＫ活性を測定するための信頼性のあるアッセイはまだ提示されていない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＴＴＰおよびｄＣＴＰを生成するためのサルベージ経路を示す。
【図２】本発明に従う方法の検出システム２の原理を示す。
【図３】本発明に従う方法の検出システム３の原理を示す。
【図４】本発明に従う方法の検出システム１の原理を示す。
【図５】ｈｒＴＫ１標準点に対する実施例３からの閾値レベルＣｔに到達する、リアルタイム蛍光捕獲によって得られる蛍光曲線。
【図６】ｈｒＴＫ１標準点に対する実施例３からの平均Ｃｔ値における対数スケールの線形回帰。
【図７】ｈｒｄＣＫ標準点に対する実施例４からの平均Ｃｔ値における対数スケールの線形回帰。
【図８】ｈｒＴＫ１をｈｒｄＣＫと共に多重化する実施例７からの対数スケールの線形回帰。
【図９】実施例８で使用されるイヌ血清サンプルおよびｈｒＴＫ１標準点中のＴＫ１の測定からの対数スケールの線形回帰。
【図１０】実施例９からの閾値レベルＣｔに到達する、リアルタイム蛍光捕獲によって得られる線形規格化蛍光曲線。
【図１１】病原性イヌ血清およびｈｒＴＫ１標準点からの実施例９からの平均Ｃｔ値における対数スケールの線形回帰。
【図１２】実施例１０からの閾値レベルＣｔに到達する、リアルタイム蛍光捕獲によって得られる線形およびダイナミックチューブ規格化蛍光。
【図１３】ｈｒＴＫ１標準点に対する実施例１０からの平均Ｃｔ値における対数スケールの線形回帰。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義：
本明細書中の全ての用語および単語は、関連技術分野におけるその通常の意味および使用に従って解釈されるべきである。明白にするためにいくつかの用語は以下により具体的に議論される。
【００１８】
チミジンおよびデオキシチミジンは、他に記載されない限り、本発明全体にわたって交換可能に使用される。
【００１９】
均一アッセイは、プライマー−鋳型システムが伸長されている間にシグナルを発生する非固相アッセイであり、最小限のプライマー伸長後の処理を必要とする。これらのアッセイは分離工程を必要としない。反応は、低親和性相互作用を妨害するためにビーズまたは固相を取り付けることなく完全に溶液中で生じる。均一アッセイ方法は、創薬において必要とされるスループットのためおよびアッセイの小型化のために必須である。あらゆる均一アッセイにおいて、アッセイの成分は全て測定中ずっと存在している。分離工程の排除はこれらのアッセイの大きな利点であるが、これは、アッセイ成分の非特異的測定のために困難を呈する（ソース：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｉｃｇｌｏｓｓａｒｉｅｓ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／Ａｓｓａｙｓ．ａｓｐ、２０１０年４月２８日に検索）。
【００２０】
デオキシヌクレオシドは、五炭糖デオキシリボースに取り付けられた窒素含有塩基から構成される分子である。デオキシヌクレオシドは、デオキシリボース糖に結合された単純な塩基と呼ばれることが多い。天然デオキシヌクレオシドは、非修飾デオキシヌクレオシドと定義される。これらの例としては、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびイノシンが挙げられる。
【００２１】
天然デオキシヌクレオシドは、ヒトなどの野生型生物において存在する形態のデオキシヌクレオシドである。
【００２２】
ヌクレオシド類似体とも呼ばれる修飾デオキシヌクレオシドは、グリコシルアミンまたは核酸塩基において任意のタイプの修飾を有するデオキシヌクレオシドである。医学において、いくつかのヌクレオシド類似体は、抗ウィルス薬または抗癌薬として使用される。修飾デオキシヌクレオシドの例は、アジドチミジン（ＡＺＴ）、ブロモ−デオキシウリジン（Ｂｒ−ｄＵ）、ヨード−デオキシウリジン、ビニル−デオキシチミジンおよびフルオロ−デオキシウリジンである。
【００２３】
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型としての役割を果たす一本鎖ＤＮＡによる、デオキシリボヌクレオシド三リン酸のデオキシリボ核酸への構築を触媒する酵素である。いくつかの文献では、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれ得る。
【００２４】
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、３つの別個の酵素活性：（ａ）デオキシヌクレオシド５’−三リン酸から生成されるモノヌクレオチド単位の、プライマー鎖の３’−ヒドロキシル末端への付加を鋳型ＤＮＡの指示下で触媒する５’→３’ポリメラーゼ活性と、（ｂ）二重鎖ＤＮＡにおいてのみ活性な５’→３’エキソヌクレアーゼと、（ｃ）不適正な末端ヌクレオチドを選択的に除去することができる、主として一本鎖ＤＮＡにおいて活性な３’→５’エキソヌクレアーゼとを有することができる。ＤＮＡポリメラーゼＩに加えて、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびＴｔｈポリメラーゼ（サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｓ）に由来）だけがこれまでに確認された５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ポリメラーゼであることに留意されたい。
【００２５】
鋳型ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのための鋳型としての役割を果たすｓｓＤＮＡ分子である。
【００２６】
ＤＮＡプライマー分子は、一続きの鋳型ＤＮＡ分子に相補的な短いＤＮＡ分子であり、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ重合のためのプライマーとしての役割を果たす。
【００２７】
無傷の形態（ｉｎｔａｃｔ  ｆｏｒｍ）：本発明で使用されるＤＮＡプローブは、本発明に従うあらゆるポリメラーゼ反応が実施される前の形態である場合に、その無傷の形態であるといわれる。
【００２８】
サルベージ合成経路は図１に示されており、ＴＴＰおよびｄＣＴＰの合成のための経路の１つである。
【００２９】
ＴＴＰおよびｄＣＴＰは、チミジンおよびデオキシシチジンの対応するデオキシヌクレオシドの三リン酸塩である。これらはまず、デオキシリボヌクレオシドキナーゼの助けを借りて、例えばＡＴＰからのリン酸基を移動して、対応する一リン酸塩のＴＭＰまたはｄＣＭＰを生じることによって生成される。
【００３０】
ｄＴＭＰキナーゼおよびシチジル酸（ｃｙｔｉｄｙｌａｔｅ）キナーゼは、対応する二リン酸ヌクレオシドのＴＤＰおよびｄＣＤＰの形成を触媒する。
【００３１】
ヌクレオシド二リン酸キナーゼは、二リン酸塩を最終の三リン酸ヌクレオチドに変換する。
【００３２】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、第１の鎖の合成中に鋳型としての役割を果たす一本鎖ＲＮＡによる、デオキシリボヌクレオシド三リン酸のデオキシリボ核酸への構築を触媒する酵素である。
【００３３】
使用される略語
ＡＴＰ            アデノシン５’−三リン酸
ＡＺＴＭＰ        アジド−チミジン一リン酸
ＢｒｄＵ          ブロモデオキシウリジン
ｄＣＤＰ          デオキシシチジン二リン酸
ｄＣＫ            デオキシシチジンキナーゼＥＣ２．７．１．２１；ＡＴＰ：シチジン−５’−ホスホトランスフェラーゼ
ｄＣＭＰ          デオキシシチジン一リン酸
ｄＣＭＰＫ        シチジル酸キナーゼ：ＥＣ２．７．４．１４；ＡＴＰ：ｄＣＭＰホスホトランスフェラーゼ
ｄｓＤＮＡ        二本鎖ＤＮＡ
ｈｒｄＣＫ        ヒト組換えデオキシヌクレオシドキナーゼ
ｈｒＴＫ１        ヒト組換えチミジンキナーゼ１
ＭＭＸ            ＭａｓｔｅｒＭｉｘ［サンプルなしの試薬混合物］
ＮｄＰＫ          ヌクレオシド二リン酸キナーゼ：ＥＣ２．７．４．６；ＡＴＰ：ヌクレオシド二リン酸ホスホトランスフェラーゼ
ｈｒＴＫ１        ヒト組換えチミジンキナーゼ１
ｓｓＤＮＡ        一本鎖ＤＮＡ
ＴＤＰ            デオキシチミジン二リン酸
ＴＫ              チミジンキナーゼ：ＥＣ２．７．１．２１；ＡＴＰ：チミジン−５’−ホスホトランスフェラーゼ
ＴＭＰＫ          ｄＴＭＰキナーゼ：ＥＣ２．７．４．９；ＡＴＰ：ＴＭＰホスホトランスフェラーゼ
ＴＭＰ            デオキシチミジン一リン酸
【発明の概要】
【００３４】
本発明の目的は、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ活性を検出するための一般的で改善された方法およびキットを提供することである。本発明者らは、サンプル中のＴＫを検出できるだけでなく、例えば、癌治療中の薬物耐性発現のモニタリングのためにｄＣＫを試験することもでき、性能が確実であり、迅速、簡単であり、ユーザーが使いやすく、臨床的な使用に安全である、活性ベースのデオキシリボヌクレオシドキナーゼ活性アッセイのキットおよび方法が依然として必要とされていることを見出した。
【００３５】
癌疾患管理のための診断ツールとしてのｄＣＫの使用は、まだその臨床用途を見出していない。しかしながら、癌治療において使用されるシタラビンおよびより新しいゲムシタビンなどのいくつかのヌクレオシド類似体はｄＣＫによって活性化され、従って、耐性はｄＣＫの欠乏と関連しているので、耐性発現を簡単に決定するために効率的な解決を見出すことが最も重要である。
【００３６】
本発明は、特許請求の範囲において要約される。
【００３７】
発明の詳細な説明
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。Ｔａｑポリメラーゼまたは単にＴａｑは、６５〜７５℃の間の最適温度間隔を有する。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性も組み込む。
【００３８】
予想外に、プライマー伸長および５’→３’ヌクレアーゼ活性の両方に関して、３７℃におけるＴａｑＤＮＡポリメラーゼの静止活性（ｒｅｓｔ−ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、蛍光で二重標識化されたプローブ（一方がそのエネルギーを他方に移動させ（消光）、他方はエネルギーを光の代わりに熱へ放出する）から５’結合蛍光マーカーを放出するのに十分であることが分かった。
【００３９】
従って、これまで提示されたデオキシリボヌクレオシドキナーゼの検出方法と比較して、終点の酵素活性を決定する代わりに、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ活性をリアルタイムで測定することが可能であり得る。
【００４０】
核酸増幅アッセイ系におけるリアルタイムの決定は、改善された感受性に加えて、迅速性、改善された分解能、およびより良い精度という利点を有する。
【００４１】
また、均一なデオキシリボヌクレオシドキナーゼ活性アッセイが現在市場にあるアッセイと競合するために、健常者からのこれらの活性（例えば、０．５Ｕ／ｌ〜７Ｕ／ｌ）をアッセイ開始から５時間以内に測定することができなければならないことも主張された。
【００４２】
これまでの試みでは、残念ながら、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いる３７℃におけるプライマー伸長および５’−ヌクレアーゼ反応では結果は得られなかった。そのため、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長反応および５’ヌクレアーゼ反応は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼＩからの同じ活性によって置換され、従って、均一アッセイのリアルタイム側面が保たれ得ることが主張および仮定された。残念なことに、ＤＮＡポリメラーゼＩは５’結合フルオロフォアを非特異的に放出するので、この酵素は使用できないことが判明した。
【００４３】
そのため、両方の反応のためにただ１つのインキュベーション温度を用いる真のリアルタイムアプローチは放棄され、２段階の温度シフト手順で置き換えられなければならず、すなわち、（１）ＴＴＰまたはｄＣＴＰの生成は３７℃で生じなければならず、（２）プライマー伸長結合５’−ヌクレアーゼフルオロフォアの放出は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの活性を支援するためにより高い温度（例えば、５１℃）でインキュベートされなければならないことが再度主張された。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは５１℃においてその最高活性の約４０％を保持するはずなので、これはうまくいくことが期待された。さらに、温度シフト２段階アッセイは、温度シフトを実行するためのリアルタイムＰＣＲ機器をプログラミングすることによって試験提供者およびオペレータには見えなくすることができるので、産業上の適用性は保持されるはずであることが主張された。
【００４４】
そのためにまず第１に、５１℃におけるハイブリダイゼーションに最適な熱力学的特性に調和させるようにプライマー−鋳型−プローブシステムが構築された。ＭｇＣｌ２濃度を考慮に入れて、プローブのＴｍは６９℃に達すると計算された。ＴＫ活性のみを測定する最初の試みでは、意外にも、３７℃のインキュベーション工程では、含有された２つの標準点から放出および規格化された蛍光、すなわちそれぞれ２０００ｐｇ、２００ｐｇ、２０および２ｐｇのｈｒＴＫ１からの活性の微細な線形グラフが生じることが判明した。０．９６６９のＲ２値が得られた。５１℃の反応から放出および規格化された蛍光の線形グラフは解釈するのにさらに悪くなるが、まだ読むことができる。従って、サンプル中のＴＫを検出するために可能性のあるリアルタイムアッセイアプローチはすぐ近くにあると結論付けられた。さらにより意外なことは、第１の実験が、正常な健常者からの血清サンプル中に見出されるレベルまで下がったＴＫ活性を１時間以内に測定する可能性を示すという事実であった。これは、最初の予備的な仕様から４時間の改善を示す。ｈｒＴＫ１の比活性は、２．１μｍｏｌ／分／ｍｇであると推定される。アッセイは、リアルタイムＰＣＲを説明する線形および定常（飽和）期を保持するだけである。３７℃におけるＴＫ活性のリアルタイム検出の驚くべき効果は、２段階温度シフト手順と関連がある２つの他の問題を直ちに解決した。第１に、ＴＫは特徴的なＴＴＰ阻害を示す。これにより、２段階アッセイは、高ＴＫ活性含有サンプルに対して実施するのが困難になる、すなわち、希釈工程が必要とされ得る。生成されるＴＴＰまたはｄＣＴＰは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＴＴＰまたはｄＣＴＰのプライマー−鋳型システムへの取込みによって絶えず除去されるので、今この問題は省略することができる。第２に、より高いＴＫ活性値（１０Ｕ／ｌという低い値からでさえ）はアッセイの開始から数分以内に発生し、従って分解能を激しく妨害するので、５１℃などのより高い温度におけるＴａｑＤＮＡポリメラーゼの非常に高い重合速度（７２℃で３５〜１００ｎｔ／秒）は、リアルタイムでアッセイ結果を解釈する上でいくつかの深刻な問題を引き起こし得る。同時に、１回の反応につき限られた量のＴａｑＤＮＡポリメラーゼＵだけが使用され得ることがシグナルの分解能によって必要とされるという事実のために、健常者からの活性はシグナルが検出できるまでに数時間を必要とし得る。要約すると、明らかでない知見が開示され、これは、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ活性の検出のための産業上の適用可能なアッセイおよび方法（図５）に今変わり得る。アッセイの感受性は、この後の実験、実施例３において検証される。
【００４５】
要約すると、天然基質チミジン（Ｔ）および／またはデオキシシチジン（ｄＣ）、またはこれらの混合物と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとは、ＴＫまたはｄＣＫなどのデオキシリボヌクレオシドキナーゼの触媒濃度を測定するために必要とされる必須の試薬であることが今分かった。これは、ＴＫまたはｄＣＫ活性アッセイのための他の既知の成分を有する均一混合物中で行うことができる。サンプル中のＴＫまたはｄＣＫ触媒活性と、反応混合物中に存在するｄＴＭＰキナーゼ、またシチジル酸キナーゼなどの他のヌクレオシドキナーゼおよびヌクレオシド二リン酸キナーゼからの活性との結合相補性によって、アッセイは性能が確実であり、実施が迅速および簡単であり、臨床的に安全であるとされる。これらの試薬は、都合よく、プライマー−鋳型−検出器システムを用いるプライマー伸長によりＴＴＰまたはｄＣＴＰを生成する（それぞれ固定された濃度を有する）ためのキットおよび緩衝液中に含有させることができる。サンプルを含まない反応混合物中の試薬は、本明細書の他の部分では、マスターミックス（略語ＭＭＸ）と呼ばれるであろう。またＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＭＭＸ中に含まれていてもよい。表１は、デオキシリボヌクレオシドキナーゼの決定のための方法を組み込んだキット成分に関連して従来技術の現状を要約する。要約すると、これまでのデオキシリボヌクレオシドキナーゼキットクレームはどれも、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび天然Ｔおよび／またはｄＣ基質、またはこれらの混合物、またはそれを使用する方法を組み込んでいない。
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【００４６】
細菌およびウィルスなどからのサンプル中の核酸標的の検出および測定のための均一ＰＣＲアッセイは、臨床診断において極めて重要なアッセイ方法になってきている。
【００４７】
異なる検出技術が均一ＰＣＲアッセイに適用されている。これらには、分子検出器の挿入を用いる消光技術と、二重標識化ＦＲＥＴ核酸プローブなどの消光プローブ技術と、接触消光核酸プローブを利用するいわゆる分子ビーコン法とが含まれる。
【００４８】
本発明の実施は、当該技術の技能の範囲内である分子生物学および酵素学において周知の技術を用いる。本発明によると、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、基質としての天然ＴまたはｄＣとを含むキットは、サンプル中の触媒濃度のＴＫまたはｄＣＫを測定するためにいくつかの検出部分と組み合わせて使用することができる。
【００４９】
またキットは、ＴＭＰＫまたはｄＣＭＰＫなどのホスホトランスフェラーゼおよびＮｄＰＫによって完成されてもよい。これらの成分は、都合よく非組換え天然宿主に由来することもできるし、あるいは相補酵素の活性遺伝子を保有する真核生物または細菌ベクター系から発現される組換え酵素に由来することもできる。
【００５０】
プライマー−鋳型−プローブ検出器システムの設計
本発明の全ての好ましい態様において、プライマー−鋳型−プローブシステムを設計することが重要である。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの選択は、プライマー−鋳型−検出器の選択と整合しなければならない。
【００５１】
本発明は、リアルタイムＰＣＲの場合と同様に温度サイクリングシフトを必要としない。しかしながら、検出器として二重標識化一本鎖およびＦＲＥＴ消光ＤＮＡプローブを用いて（図２）、検出はリアルタイムで容易に行われる。プライマー−鋳型−プローブシステムは、ここでは、プライマーよりも３〜１５℃高いＴｍを達成するようにプローブ配列を構築することによって、プローブがプライマーよりも前に鋳型とハイブリッド形成することを指示するように設計され、従って、プライマーよりも速く鋳型に優先的に結合する。さらにより好ましいのは、５〜１０℃高いＴｍである。最も好ましいのは、７〜９℃高いＴｍである。次に、プライマー伸長を開始するためのＴＴＰまたはｄＣＴＰの必要条件は、プローブがプライマーよりも前に鋳型に優先的に結合するために短い遅延を課してもよい。この検出器システム（図２）については、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、本発明の最も好ましいＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの濃度は、１回の反応につき０．０１〜４Ｕの範囲でよい。より好ましいのは、１回の反応につき０．１〜２Ｕである。さらにより好ましいのは、１回の反応につき０．３〜１ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼである。最も好ましいのは、１回の反応につき０．５ＵのＴａｑポリメラーゼである。プライマーの設計は、考慮中の５’ヌクレアーゼアッセイを用いて、消光剤と５’−フルオロフォアとの間のフォルスタ半径を取らなければならない。
【００５２】
分子ビーコンプローブなどの蛍光二重標識化一本鎖ＤＮＡプローブ（その無傷でハイブリッド形成されていない形態では消光される）を検出器として用いる（図３）ことは、ハイブリッド形成工程に対して同じ温度戦略を課する。プライマー−鋳型−プローブシステムは、プライマーよりも３〜１５℃高いＴｍを達成するようにプローブ配列を構築することによって、プローブがプライマーよりも前に鋳型とハイブリッド形成することを指示するように設計され、従って、プライマーよりも速く鋳型に優先的に結合する。さらにより好ましいのは、５〜１０℃高いＴｍである。最も好ましいのは、７〜９℃高いＴｍである。次に、プライマー伸長を開始するためのＴＴＰまたはｄＣＴＰの必要条件は、プローブがプライマーよりも前に鋳型に優先的に結合するために短い遅延を課してもよい。図３に記載されるように本発明に従う検出を実行するために、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ鎖置換活性を保有しなければならない。本発明のこの検出器システムについては、置換ＤＮＡポリメラーゼの濃度は、使用されるＤＮＡポリメラーゼに対して１回の反応につき０．０１〜５Ｕの範囲でよい。より好ましいのは、１回の反応につき０．１〜３Ｕである。
【００５３】
最後の検出器システム（図４）では、プライマー伸長によって生じる二本鎖ＤＮＡは、表面結合または挿入蛍光分子の結合が結合時に検出されることを可能にする（図４）。この検出システムのために使用されるＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼで例示される３’→５’ｅｘｏ−ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり得る。ＤＮＡポリメラーゼの濃度は、好ましい酵素に応じて１回の反応につき０．０１〜４Ｕの範囲でよい。より好ましいのは、１回の反応につき０．１〜２Ｕである。
【００５４】
異なる検出器システムからのシグナルの検出
シグナル検出のための機器は、優先的に、リアルタイムＰＣＲ機器であり得る。機器の加熱−冷却原理または励起および発光検出原理に関してどんな優先も本発明に従う方法には適用されない。
【００５５】
本発明に従う方法はＣｔ値を使用することができ、これは次に、１リットル当たりの単位酵素活性（Ｕ／ｌ）などの触媒濃度定義に変換される。本発明に従う方法が、シグナルのサンプリング中、Ｃｔ値および時間単位のどちらかを選択可能であることは理解されるべきである。方法は、触媒濃度に対して承認された定義を用いる。
【００５６】
サンプル中のＴＫまたはｄＣＫの量は、好ましくは、使用される検出システムに応じて蛍光の増大または減少の合計が閾値検出可能レベルに到達するサイクル数を関連付けることによって、検出方法のいずれかにより決定される。
【００５７】
キット設計
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび天然ＴまたはｄＣ基質は１つまたは複数の反応容器に分配されてもよい。蛍光検出機器において本発明に従う方法を実行するのに適した反応容器は、好ましくは、２０μｌ〜２００μｌの全容積を保持することができる。さらにより好ましくは、反応容器は、２５μｌまたは５０μｌの容積を保持することができる。本発明に従う方法の反応容積は、好ましくは、５μｌ〜１００μｌの範囲であり得る。さらにより好ましい反応容積は２５μｌ〜５０μｌである。
【００５８】
キットを用いるサンプル処理
ＭＭＸを反応容器に加えた後、サンプルが容器に添加される。容器は閉められ、測定機器に入れられ、インキュベートされる。蛍光サンプリングが始まり、選択されたサイクル数だけ継続される。ＴＫ／ｄＣＫサンプルは、好ましくは、血清または血漿を構成することができる。さらにより好ましいのは、血清およびクエン酸血漿である。反応容積のサンプルの割合は、好ましくは、１〜２０％であるものとする。
【００５９】
本発明に従う方法は、サンプル中の触媒濃度のＴＫまたはｄＣＫの検出および決定のために、ＴＴＰまたはｄＣＴＰの生成を、プライマー伸長および蛍光シグナル発生と結び付ける。簡単に言うと、ＴＴＰまたはｄＣＴＰは、キットを構成するＴＭＰＫまたはｄＣＭＰＫおよびＮｄＰＫの相補活性と共に、サンプルからのＴＫまたはｄＣＫによって生成される。ＴＭＰＫまたはｄＣＭＰＫ、およびＮｄＰＫは、好ましくは、サンプル中のＴＫまたはｄＣＫの最高推測濃度を超えて（例えば、３０００Ｕ／ｌよりも多く）反応中に存在する。ＮｄＰＫに関しては、２０００ｐｇのｈｒＴＫ１で表される触媒濃度（約１００００Ｕ／ｌ）の１×〜１０００×である。さらにより好ましいのは、２０００ｐｇのｈｒＴＫ１で表される触媒濃度の５０×〜１０００×の間のであるＮｄＰＫ濃度である。ＴＭＰＫまたはｄＣＭＰＫに関しては、２０００ｐｇのＴＫで表される触媒濃度の１×〜１０００×が好ましい。さらにより好ましいのは、２０００ｐｇのｈｒＴＫ１で表される触媒濃度の５×〜１００×の間の濃度である。
【００６０】
ＴＴＰまたはｄＣＴＰ基質は、都合よくキットを構成するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって継続的に利用され、３つの検出システムのいずれかに従ってプライマー伸長反応を実行して蛍光シグナルを発生し、これは次に、サンプル中のＴＫまたはｄＣＫ触媒濃度と関連付けることができる。３つの検出システムは全てについて、鋳型は、測定すべきデオキシリボヌクレオシドキナーゼがどれであるかに応じて、プライマー結合相補配列の下流（すなわち鋳型配列の５’−方向）の鋳型ヌクレオチド配列中に１つまたは複数の「Ａ」または「Ｇ」を有することが好ましい。デオキシグアノシンキナーゼ（ｄＧｋ）を検出する場合、鋳型は、プライマーの下流に１つまたは複数の「Ｃ」を必要とする。明確にするために、本明細書では、各プライマー−プローブ−検出器セットは、使用される検出システムに関係なく、少なくとも鋳型と、検出が意図されるデオキシリボヌクレオシドキナーゼとに関して特異的であることに注意されたい。５’ヌクレアーゼ検出システムを用いる多重検出、すなわち同一反応容器中の複数のデオキシリボヌクレオシドキナーゼの検出も、特異的なプローブ配列および標識を必要とする。
【００６１】
検出システム１とも呼ばれる検出システムの１つ（図２）では、５’−共有結合フルオロフォアと、同じプローブに３’−方向に共有結合された消光剤フルオロフォアとを有する一本鎖オリゴヌクレオチドプローブからの蛍光は、動的消光またはＦＲＥＴの作用によって消光される。所定量のプライマー、鋳型およびプローブを用いるプライマー伸長反応の過程において、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって、５’−共有結合フルオロフォアが放出される、すなわちプローブから加水分解される。
【００６２】
検出システム２とも呼ばれる別の検出システム（図４）では、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｉ（登録商標）、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（登録商標）およびＥｖａ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｙｅ（登録商標）で例示されるがこれらに限定されない挿入または表面結合蛍光発生分子からの蛍光は、その遊離または非結合状態で消光される。所定量の鋳型および１つのプライマーを使用するプライマー伸長反応の過程において、蛍光発生分子は、生成される二本鎖ＤＮＡに挿入または表面結合され、その際に蛍光を発生し始める。
【００６３】
検出システム３とも呼ばれる第３の検出システム（図３）では、５’−共有結合フルオロフォアと、５’−結合フルオロフォアに対して３’−末端で同じプローブに共有結合された消光剤フルオロフォアとを有する、いわゆる分子ビーコンを含む一本鎖オリゴヌクレオチドプローブからの蛍光は、接触消光または静的消光の作用によって消光される。
【００６４】
インキュベーションおよびリアルタイムサイクリングの開始の前に、分子ビーコンプローブは変性され、標的鋳型とのハイブリッド形成が可能になる。鋳型とハイブリッド形成すると、接触消光が解放され、ゼロ時間で最大蛍光が到達される。所定量のプライマー、鋳型およびプローブを用いるプライマー伸長の過程において、プローブは、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｍ大型断片ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｔ大型断片ＤＮＡポリメラーゼの作用によって置換される。後者の２つのＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が欠けている。分子ビーコンは置換されるとそのステムループ構造形態を保持し、単位時間当たりのＴＴＰまたはｄＣＴＰの生成に関係して、接触消光が蛍光を消す。Ｄａｂｃｙｌの使用により５’フルオロフォアからの蛍光が吸収される。３つ検出システム全てにおいて検出はリアルタイムで行われる。
【００６５】
検出システム１に関連するキットは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、天然ＴもしくはｄＣ基質、またはＢｒ−ｄＵもしくはｄＣ、最も好ましくは天然ＴまたはｄＣ基質とを含むことができる。好ましくは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼを持っていない。
【００６６】
好ましくは、キットは、０．００１〜１００ｎｇ／反応、さらにより好ましくは、０．０１〜１０ｎｇ／反応の濃度へのＴＭＰＫまたはｄＣＭＰＫと、０．０２〜０．００２Ｕ／ＬのＮｄＰＫ／反応と、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰまたはＧＴＰ（０．５〜１５ｍＭ、より好ましくは３〜６ｍＭ、最も好ましくは４〜５ｍＭの間のＡＴＰ）などのγ−リン酸供与体とを含む。
【００６７】
プライマーは１０〜２０のヌクレオチド長、より好ましくは１０〜１５のヌクレオチド長である。プライマーは、副溝結合修飾プライマーであってもよい。プライマーの例は配列番号９である。鋳型（５０〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは７５〜２５０ヌクレオチド）は、プライマー配列に相補的な３’−近位配列を有する。好ましくは、鋳型配列は、ＴＫまたはｄＣＫの検出のために、プライマー結合部位の１〜１０ヌクレオチド下流側（すなわち、鋳型の５’−方向）、さらにより好ましくは、プライマー配列に対する補体の３’−端部のすぐ下流側の位置に１つまたは複数の「Ａ」または「Ｇ」を有する。最も好ましくは、１つのＡまたは１つのＧが、プライマー配列に対する補体の３’−端部のすぐ下流側の位置に位置する。鋳型配列の残りの部分を形成するヌクレオチド組成物は、好ましくは、ＴＫ活性の検出のためにはＴ、ＣおよびＧの混合物であり、あるいはｄＣＫ活性の検出のためにはＧの代わりにＡであり、好ましい比率は６０〜４０％のＧＣである。鋳型の例は配列番号７である。
【００６８】
挿入または表面結合蛍光発生分子は、例えば、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（登録商標）、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（登録商標）、またはＥｖａ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｙｅ（登録商標）によって例示される。
【００６９】
さらに、キットはデオキシヌクレオチド三リン酸、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰおよびｄＣＴＰを含んでいてもよい。
【００７０】
キットは、２〜８ｍＭの間の最終濃度へのＤＴＴまたはＤＴＥなどの酵素安定化試薬と、０．２〜１％（Ｗ／Ｖ）の間の最終濃度へのＢＳＡと、５ｍＭ〜１２ｍＭ、最も好ましくは５〜１０ｍＭの濃度へのＭｇＣｌ２としてのＭｇ２＋とを含んでいてもよい。
【００７１】
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、０．０１〜５Ｕ／反応の間の濃度である。天然ＴまたはｄＣ基質は、好ましくは、０．０１ｍＭ〜１ｍＭの間であり、さらにより好ましくは０．１ｍＭである。
【００７２】
挿入分子を利用する検出システムに関係する方法では、ＭＭＸおよびサンプルの混合物は、好ましくは、３６〜４２℃、またはさらにより好ましくは３７℃で３０〜２２０分間インキュベートされ、規格化された蛍光が選択された蛍光の閾値レベルを交差するために必要とされる蛍光捕獲サイクルの回数（Ｃｔ）を関連付けることによって、サンプル中のＴＫまたはｄＣＫの量がリアルタイムで決定される。次に、それぞれのデオキシリボヌクレオシドキナーゼについて、閾値Ｃｔ交差点を、標準曲線（図７）を構成する既知の数の異なるＴＫＵ／ｌまたはｄＣＫＵ／ｌの予め選択されたサンプルのＣｔに適合させる。値は、２〜８の異なる触媒濃度（好ましくは、１〜３Ｕ／ｌ、１０〜２０Ｕ／ｌおよび５０〜１００Ｕ／ｌ、１００〜５００Ｕ／ｌおよび５００〜１５００Ｕ／ｌの間の濃度）のＴＫまたはｄＣＫのいずれかからなる標準曲線に外挿される。標準曲線は、別々に割り当てられたＴＫまたはｄＣＫを含む。
【００７３】
検出システム２を用いてＴＫまたはｄＣＫを検出するためのキットは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、天然ＴもしくはｄＣ基質、またはＢｒｄＵもしくはｄＣとを含んでいてもよい。最も好ましいのは、天然ＴまたはｄＣ基質である。好ましくは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼを持たないが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはＴｔｈＤＮＡポリメラーゼなど）。
【００７４】
好ましくは、キットは、０．００１〜１００ｎｇ／反応、さらにより好ましくは０．０１〜１０ｎｇの濃度へのＴＭＰＫまたはｄＣＭＰＫと、０．０２〜０．００２Ｕ／ＬのＮｄＰＫとを含む。０．５〜１５ｍＭの間、より好ましくは４〜６ｍＭの間の濃度のＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰまたはＧＴＰなどのγ−リン酸供与体が必要とされる。最も好ましいのは、５ｍＭのＡＴＰである。１０〜２０のヌクレオチド長のプライマーがキット中に含まれていてもよい。プライマーは、配列番号２および配列番号５で例示される。最も好ましいプライマーは１０〜１５のヌクレオチド長である。プライマーは、副溝結合修飾プライマーであってもよい。
【００７５】
検出システム２において使用するための鋳型は、２５〜２００ヌクレオチドの長さでキット中に含まれ得る。鋳型の例は、配列番号１および配列番号４において示される。鋳型は、プライマーに相補的な３’−配列と、下流側（すなわち、鋳型５’端部の方向）の二重標識化核酸プローブに相補的な配列とを含む。鋳型配列は、プライマーの３’−端部から１〜１０ヌクレオチド下流側、さらにより好ましくはプライマーの３’−端部のすぐ下流側に位置する１つまたは複数の「Ａ」または「Ｇ」を含むことができる。鋳型配列の残りの部分を形成するヌクレオチド組成物は、好ましくは、Ｔ、Ｃ、ＧおよびＡの混合物であり、好ましい比率は６０〜４０％のＧＣである。１０〜３０のヌクレオチド長のプローブは配列番号３または配列番号６によって例示され、これは、機能的に適合することが当該技術分野におい知られているフルオロフォアおよび消光剤対により共有結合で標識化される。例えば、ＴＫ特異的な鋳型のために、プローブの５’結合フルオロフォアは６−ＦＡＭフルオロフォア標識を含むことができ、３’−末端ヌクレオチドはＢＨＱ１消光フルオロフォア標識（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を保有することができる。ｄＣＫ特異的な鋳型のために、プローブは、３’−末端ヌクレオチドに結合されたＢＨＱ１と共に、６−ＦＡＭの代わりにＴＥＴフルオロフォア標識を保有することができる。６−ＦＡＭとＴＥＴの間のスペクトル差は非常に大きく（１１ｎｍ）、多重形式で実行される場合でも、２つのフルオロフォアから放出される光を区別することが可能になる。ヌクレオチドＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰはキット中に含まれ得る。キットは、２〜１０ｍＭの間の最終濃度へのＤＴＴまたはＤＴＥなどの酵素安定化試薬と、０．２〜１％（Ｗ／Ｖ）の間の最終濃度へのＢＳＡと、４０〜１００ｍＭの間、最も好ましくは５０ｍＭの濃度への塩としての一価のカチオン（例えば、ＫＣｌとしてのＫ−）と、５ｍＭ〜１４ｍＭ、最も好ましくは７〜１２ｍＭの濃度への二価のカチオン（例えば、ＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４としてのＭｇ２＋）とを含んでいてもよい。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、１回の反応につき０．０１〜２Ｕの間の濃度で存在する。ＴもしくはＢｒｄＵもしくはｄＣ基質または天然ＴもしくはｄＣ基質は、好ましくは、０．０１ｍＭ〜１ｍＭの間、さらにより好ましくは０．１ｍＭの濃度で存在する。
【００７６】
これらのキット成分を用いる図２に示される方法は、サンプルおよびＭＭＸを好ましくは３３℃〜４２℃、さらにより好ましくは３７℃で３０〜２００分間インキュベートし、リアルタイムで継続的に検出器からのシグナルの増大を捕獲および測定することを含む。好ましくは、規格化された蛍光（すなわち、蛍光捕獲の開始後少なくとも最初の５回の捕獲サイクルにわたる全蛍光からバックグラウンド蛍光が差し引かれた後に残るサンプルからの蛍光）が選択された閾値レベルを交差するために必要とされる蛍光捕獲サイクルの回数（Ｃｔ）を関連付けることによって、あるいは、同じ閾値に到達するのに必要とされる時間に関連付けることによって、サンプル中のＴＫまたはｄＣＫの量を決定する。サンプルの閾値Ｃｔを、Ｕ／ｌで表される既知の触媒濃度のＴＫまたはｄＣＫを有する予め選択された標準から作成される標準曲線に適合させる。閾値レベルの決定は実行前に固定閾値を設定することによって行われてもよいし、あるいは実行の完了後に、最低のデオキシリボヌクレオシドキナーゼ活性が含まれる対照、例えば０Ｕ／ｌを含有する負の対照（実行の最後に交差する）に対して閾値レベルを設定することによって行われてもよい。
【００７７】
図３に示される検出システム３を用いてＴＫまたはｄＣＫを検出するためのキットは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、天然基質ＴもしくはｄＣまたはＢｒｄＵもしくはｄＣ、最も好ましくはＴまたはｄＣ天然基質とを含むことができる。好ましくは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、またはバチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）からのＢｓｍ  ＤＮＡポリメラーゼの大型断片（Ｋ．Ｋ．ＤＮＡＦＯＲＭ）、またはバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ大型断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）により例示されるような置換活性ポリメラーゼである。
【００７８】
好ましくは、キットは、０．００１〜１００ｎｇ／反応、さらにより好ましくは０．０１〜１０ｎｇの濃度へのＴＭＰＫまたはｄＣＭＰＫと、０．０２〜０．００２Ｕ／ＬのＮｄＰＫとを含む。２〜８ｍＭの間、より好ましくは４〜６ｍＭの間の濃度のＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰまたはＧＴＰなどのγ−リン酸供与体が必要とされる。最も好ましいのは、４ｍＭの濃度のＡＴＰである。
【００７９】
７〜２０のヌクレオチド長のプライマーがキット中に含まれ得る。プライマーの例は配列番号９に示される。プライマー配列は副溝結合プライマーであってもよい。最も好ましくは、プライマーは１０〜１６のヌクレオチド長である。
【００８０】
３０〜１０００のヌクレオチドの長さを有する鋳型がキット中に含まれ得る。鋳型配列の例は配列番号８に示される。鋳型は、プライマーに相補的な３’−配列と、下流側（すなわち、鋳型の５’端部の方向）の二重標識化核酸プローブに相補的な配列とを含む。鋳型配列は、プライマーの３’−端部から１〜１０ヌクレオチド下流側（より好ましくは、ヌクレオチドは２〜４ヌクレオチドの間である）、さらにより好ましくはプライマーの３’−端部のすぐ下流側に位置する１つまたは複数の「Ａ」または「Ｇ」を含むことができる。鋳型配列の残りの部分を形成するヌクレオチド組成物は、好ましくは、Ｔ、Ｃ、ＧおよびＡの混合物であり、好ましい比率は６０〜４０％のＧＣである。キットは分子ビーコンプローブを含んでいてもよい。プローブの構造は図３に例示される。プローブは、５’共有結合フルオロフォアと、３’−端部の方向の消光剤フルオロフォアとを含むことができる。好ましくは、消光剤はＤａｂｃｙｌなどの接触消光剤フルオロフォアであり、接触消光原理に従って機能する。プローブ配列の例は配列番号１０に示される。鋳型配列の残りの部分を形成するヌクレオチド組成物は、好ましくは、Ｔ、ＣおよびＧまたはＡの混合物であり、好ましい比率は６０〜４０％のＧＣである。
【００８１】
キットのその他の成分は、ＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰまたは他の修飾ヌクレオチドと、２〜８ｍＭの間の最終濃度へのＤＴＴまたはＤＴＥなどの酵素安定化試薬と、０．２〜１％（Ｗ／Ｖ）の間の最終濃度へのＢＳＡと、５〜１００ｍＭの間、最も好ましくは１０ｍＭの濃度への塩としての一価のカチオン（例えば、ＫＣｌとしてのＫ−）と、５ｍＭ〜１２ｍＭ、最も好ましくは５〜１０ｍＭの濃度への二価のカチオン（例えば、ＭｇＣｌ２としてのＭｇ２＋）とであり得る。
【００８２】
キットは、Ｂｓｍ  ＤＮＡポリメラーゼＤＮＡポリメラーゼの大型断片によって例示されるＤＮＡ鎖置換特性を有するＤＮＡポリメラーゼを含有してもよい。さらにより好ましいのは、鎖置換特性を有し、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。置換ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、０．０１〜２Ｕ／反応の間の濃度である。ＴもしくはＢｒｄＵもしくはｄＣ基質または天然ＴまたはｄＣ基質は、好ましくは、０．０１ｍＭ〜１ｍＭの間、さらにより好ましくは０．１ｍＭである。
【００８３】
これらのキット成分を用いる図３に示される方法は、サンプルおよびＭＭＸを好ましくは３３℃〜４２℃、さらにより好ましくは３７℃でインキュベートし、リアルタイムで継続的に蛍光の減少を測定することを含む。好ましくは、規格化された蛍光（すなわち、開始後少なくとも最初の５〜１８サイクルにわたる全蛍光からバックグラウンド蛍光が差し引かれた後に残るサンプルからの蛍光）が選択された閾値レベルを交差するために必要とされる蛍光捕獲サイクルの回数（Ｃｔ）を関連付けることによって、あるいは、同じ閾値に到達するのに必要とされる時間に関連付けることによって、サンプル中のＴＫまたはｄＣＫの量を決定する。サンプルの閾値Ｃｔを、Ｕ／ｌで表される既知の触媒濃度のＴＫまたはｄＣＫを有する予め選択された標準から作成される標準曲線に適合させる。
【００８４】
国際公開第１００３６３５９号パンフレットには、ポリメラーゼ活性のアッセイのためのキットが記載されている。国際公開第１００３６３５９号パンフレットの方法およびキットは、血清を有するサンプルにおいてポリメラーゼ活性をどのようにして検出することができるかについて議論していない。血清を有するサンプル中のポリメラーゼ活性を検出することができるキットが必要とされている。
【実施例】
【００８５】
以下は、本明細書のこのセクションに記載される全ての検出システムに適用される。
−  反応チューブおよびＰＣＲ機器は、実施例１に続く全ての実施例について同一である。
−  緩衝混合物は、実施例１に続く全ての実施例について同一である。
−  ＭＭＸは、試験すべきデオキシリボヌクレオシドキナーゼ含有サンプル（デオキシリボヌクレオシドキナーゼサンプルが緩衝液で置き換えられた負の対照を含む）を除く全ての成分を含むと定義される。
−  サンプルは、組換えもしくは精製デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、またはこれらを含む血清もしくは血漿のいずれかであり得る。
−  デオキシリボヌクレオシドキナーゼの希釈は、全ての実施例に対して、表２に記載される緩衝液中で行われる。
−  反応容積は検出システムに関係なく２５μｌである。
−  全てのサンプルは、使用される検出システムに関係なく３通り実行される。
【００８６】
実施例１：
検出システム１に従うｈｒＴＫ１標準曲線
２００ｐｇ、２０ｐｇおよび２ｐｇのｈｒＴＫ１から、ｈｒＴＫ１触媒活性値を示す標準曲線を作成した。ｈｒＴＫ１の負の対照として、そして規格化された蛍光の閾値レベルの決定のために、０ｐｇの標準点を含有させた。ｈｒＴＫ１の比活性は、２．１μｍｏｌ・分−１・ｍｇ−１であった。各標準点を３通り実行した。ｈｒＴＫ１は、ＴＫ希釈緩衝液（表２）中に希釈した。
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【００８７】
簡単に言うと、酵素混合物は、５００×に希釈（１回の反応につき０．０１単位の最終触媒濃度を与える）した酵母からのＮｄＰＫと、５０×に希釈（１回の反応につき３６ｎｇに等しい）したＴＭＰＫと共に、ｈｒＴＫ１の各標準点を含有するように調製した。酵母ＮｄＰＫおよび組換えＴＭＰＫの比活性は、それぞれ５．４および３μｍｏｌ／分／ｍｇであると推定される。緩衝混合物、基質混合物およびオリゴヌクレオチド混合物を表４に従って調製した。各標準点に対する３．２＊２５μｌのＭＭＸは、緩衝混合物、基質混合物、およびオリゴヌクレオチド混合物（表３）を０．８ＵのＫｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼと一緒に混合することによって、１．５ｍｌのポリプロピレン微小遠心管中室温で調製した（０ｐｇのｈｒＴＫ１の負の対照を含む）。
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【００８８】
鋳型を含まない対照ＭＭＸ（Ｎｏ−Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＭＭＸ）中に２００ｐｇの酵素混合物を含有させた。１００μｌのＰＣＲチューブ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）に２５μｌを３通り分配した。チューブを閉め、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ３０００（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）リアルタイムＰＣＲ機器に入れた。実行プロファイルは、（１）４２℃で２分間保持、（２）３５℃で１分間保持、（３）３７℃で１５分間保持、（４）サイクリング：３７℃で３０秒間→３７℃で３０秒間であり、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（登録商標）／ＦＡＭチャネル（４７０ｎｍで励起、５１０ｎｍで検出）に対してシグナルを獲得した。各サイクルを９０回繰り返した。全アッセイ時間は１０８分間である。
【００８９】
結果
蛍光の規格化はサイクル１から行った。９０サイクル（分）の後に交差する０ｐｇのｈｒＴＫ１に対する閾値を選択した。この実施例では、０．０００標準蛍光単位における閾値を得た。Ｘ軸には、それぞれの標準点からの活性（デオキシリボヌクレオシドキナーゼのｐｇで与えられる）が与えられる。各標準点は、ｐｇ（ｘ）；Ｃｔ（ｙ）値を保有する。０．９６５のＲ２値が得られ、標準曲線が、サンプル中のＴＫＵ／ｌの量を決定するための手段としての役割を果たすことができることが示される。
【００９０】
実施例２．
検出システム１に従うｈｒｄＣＫからのｄＣＫ標準曲線
２００００ｐｇ、２０００ｐｇ、２００ｐｇ、２０ｐｇおよび２ｐｇの酵素から、ｈｒｄＣＫ触媒活性値を示す標準曲線を作成した。ｈｒｄＣＫの負の対照として、そして規格化された蛍光の閾値レベルの決定のために、０ｐｇの標準点を含有させた。簡単に言うと、酵素混合物は、ｈｒＴＫ１の各標準点と、実施例１と同様のＮｄＰＫと、５０×に希釈（１回の反応につき４８ｎｇの酵素に等しい）したｄＣＭＰＫとを含有するように調製した（表４）。組換えｄＣＭＰＫの比活性は、３５μｍｏｌ／分／ｍｇであると推定される。３．２＊２５μｌのＭＭＸは、緩衝混合物、基質混合物およびオリゴヌクレオチドを０．８ＵのＫｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−断片ＤＮＡポリメラーゼと一緒に混合することによって、各標準点に対して、１．５ｍｌのポリプロピレン微小遠心機中室温で調製した（０ｐｇのｈｒｄＣＫの負の対照を含む）。ＭＭＸ調製物は、ｄＣＴＰがＭＭＸ中ＴＴＰで置き換えられることを除いて、実施例１の場合と同一であった。オリゴヌクレオチド混合物は表４に従う。
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【００９１】
最後に、それぞれの標準点からの酵素混合物を添加した。２０００ｐｇのｈｒｄＣＫの酵素混合物をＮＴＣ  ＭＭＸ中に含有させた。次に、３つの別個のＰＣＲチューブに２５μｌを分配した。
【００９２】
チューブを閉め、リアルタイムＰＣＲ機器に入れた。サイクリングプロファイルは、（１）４２℃で２分間保持、（２）３５℃で１分間保持、（３）３７℃で１５分間保持、（４）サイクリング：３７℃で３０秒間→３７℃で３０秒間であり、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（登録商標）／ＦＡＭチャネル（４７０ｎｍで励起、５１０ｎｍで検出）に対してシグナルを獲得した。各サイクルを９０回繰り返した。全アッセイ時間は１０８分間である。
【００９３】
結果
蛍光の規格化はサイクル１からである。９０分後の０ｐｇに対する閾値を選択した。閾値を０．０１７標準蛍光単位に設定した。Ｘ軸には、それぞれの標準点からの活性（デオキシリボヌクレオシドキナーゼのｐｇで与えられる）が与えられる。各標準点は、ｐｇ（ｘ）；Ｃｔ（ｙ）値を保有する（図４）。
【００９４】
実施例３
検出システム２に従うｈｒＴＫ１標準曲線
２００ｐｇ、２０ｐｇおよび２ｐｇのｈｒＴＫ１から、触媒活性値を示す標準曲線を作成した。０ｐｇの標準点を負の対照として含有させた。簡単に言うと、酵素混合物は、ｈｒＴＫ１標準点と、実施例１の場合と同様のＮｄＰＫおよびＴＭＰＫとを含有するように調製した。ＭＭＸは、０．４ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼがＫｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼの代わりに用いられ、オリゴヌクレオチドが表５に従ったことを除いて、実施例１の場合と同様に調製した。最後に、それぞれの標準点の酵素混合物を各専用ＭＭＸに添加した。２００ｐｇの酵素混合物をＮＴＣ中に含有させた。各標準点混合物から２５μｌを３つのＰＣＲチューブに分配した。チューブにフタをし、ＰＣＲ機器に入れた。サイクリングプロファイルは、（１）４２℃で１分間保持、（２）３５℃で１分間保持、（３）サイクリング：３７℃で３０秒間→３７℃で３０秒間であり、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（登録商標）／ＦＡＭチャネル（４７０ｎｍで励起、５１０ｎｍで検出）に対してシグナルを獲得した。各１分間サイクルを６０回繰り返した。全アッセイ時間は６５分間である。
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【００９５】
結果
図１２は、この実験から得られる生の蛍光を示す。生の蛍光を標準規格化した。すなわち、最初の５回のサイクルにわたって単に計算し、サイクル１から開始して直線化した（図５）。それぞれの標準点に対するＣｔの数（Ｘ軸）を決定するために、閾値レベルを約６０分後の２ｐｇに対して選択した。閾値は、標準蛍光単位の０．１２（Ｙ軸）であることが分かった。内臓ソフトウェアＲｏｔｏｒ−ｇｅｎｅ  ｖ．６．０１を用いて、選択された閾値に対してＣｔ値を決定した。各標準点Ｃｔの平均（Ｙ軸）およびｈｒＴＫ１のｐｇ値（Ｘ軸）の対数回帰プロットによって、得られた標準曲線を使用して本当のサンプルの単位活性値を決定することの妥当性を示す０．９８のＲ２値が得られた。アッセイの精度性能（ＣＶ％）結果は、以下の表６に要約される。Ｃｔ値が反応中のｈｒＴＫのピコグラムからの活性に対応することに注意されたい。この特定の構築物の比活性が２．１μｍｏｌ／分／酵素１ｍｇであることが分かれば、実際の触媒濃度を推定することが可能である。しかしながら、国際単位定義（すなわち、１Ｕ＝１μｍｏｌ／分／ｌ）に従うためのＴＫ活性の標準化がまだ存在しないので、単純な理由だけで、この実施例では対応する「ピコグラム」活性が与えられる。
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【００９６】
検出システム２に従うＨｒｄＣＫからのｄＣＫ標準曲線
２００００ｐｇ、２０００ｐｇ、２００ｐｇ、２０ｐｇおよび２ｐｇの酵素から、ＨｒｄＣＫ触媒活性値を示す標準曲線を作成した。負の対照として０ｐｇの標準点を含有させた。簡単に言うと、酵素混合物は、標準点と、実施例１および２で与えられるようなＮｄＰＫおよびｄＣＭＰＫとを含有するように調製した。３．２＊２５μｌのＭＭＸは、緩衝混合物、基質混合物、オリゴヌクレオチド混合物（表７）を０．４ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼと一緒に混合することによって、各標準点に対して、１．５ｍｌのポリプロピレン微小遠心管中室温で調製した（０ｐｇのｄＣＫの負の対照を含む）。オリゴヌクレオチドを以下の表７で与えられるもので置き換えたことに注意されたい。最後に、それぞれの標準点からの酵素混合物をＭＭＸに添加した。２００００ｐｇの酵素混合物をＮＴＣ  ＭＭＸ中に含有させた。２５μｌのＭＭＸおよび標準点混合物を３つのＰＣＲチューブに分配した。チューブにフタをし、リアルタイムＰＣＲ機器に入れた。サイクリングプロファイルは、（１）４２℃で１分間保持、（２）３５℃で１分間保持、（３）サイクリング：３７℃で３０秒間→３７℃で３０秒間であり、ＪＯＥチャネル（５３０ｎｍで励起、５５５ｎｍで検出）に対してシグナルを獲得した。各サイクルを６０回繰り返した。全アッセイ時間は６５分間である。
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【００９７】
結果
ｄＣＫのｐｇ値の各標準点に対するＣｔ値は、実施例３に記載されるように得た。直線的な蛍光の対数回帰によって、この標準曲線を使用して本当の臨床サンプルからのｄＣＫ活性値を決定することの妥当性を示す０．９８のＲ２値が得られた。精度性能結果は、表８に要約される。対数スケールの線形回帰は図７に示される。
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【００９８】
実施例５．
検出システム３に従うｈｒＴＫ１標準曲線
２００ｐｇ、２０ｐｇおよび２ｐｇの酵素から、ｈｒＴＫ１触媒活性値を示す標準曲線を作成した。簡単に言うと、それぞれのヌクレオシドキナーゼのための酵素混合物は、実施例３に記載されるようなＮｄＰＫおよびＴＭＰＫと一緒にヌクレオシド標準点を含有するように調製した。３．２＊２５μｌｍｐＭＭＸは、以下の点：ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドを以下の表９に与えられるもので置き換えた点を除いて、実施例３に従って調製した。
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【００９９】
最後に、それぞれの標準点からの酵素混合物をそれぞれのＭＭＸに添加した。２００ｐｇの酵素混合物をＮＴＣ中に含有させた。チューブを閉め、リアルタイムＰＣＲ機器に入れた。サイクリングプロファイルは、（１）４２℃で１分間保持、（２）３５℃で１分間保持、（３）３７℃で１５分間保持、（４）サイクリング：３７℃で３０秒間→３７℃で３０秒間であり、ＦＡＭチャネルに対してシグナルを獲得し、９０回繰り返した。全アッセイ時間は１０８分間である。閾値は９０分における０ｐｇに対して選択した。
【０１００】
結果
図ｘは、置換されたＦＡＭ／Ｄａｂｃｙｌ分子ビーコンプローブからの生の蛍光の減少をリアルタイムで示す。閾値は０．０１２標準蛍光単位に設定される。図１４は、３つの標準点から得られたＣｔ値の平均の対数回帰を示す。Ｒ２値は０．９６である。直線的な蛍光の対数回帰によって、この標準曲線を使用して本当の臨床サンプルからのｄＣＫ活性値を決定することの妥当性を示す０．９８のＲ２値が得られる。
【０１０１】
実施例６．
検出システム３に従うｈｒｄＣＫ標準曲線
２０００ｐｇ、２００ｐｇ、および２０ｐｇおよび２ｐｇの酵素から、ｈｒｄＣＫ触媒活性値を示す標準曲線を作成した。０ｐｇの標準点を負の対照として、そして規格化された蛍光値の閾値を設定するために含有させた。簡単に言うと、それぞれのヌクレオシドキナーゼのための酵素混合物は、ヌクレオシド標準点と、実施例２および４に従うＮｄＰＫおよびｄＣＭＰＫとを含有するように調製した。３．２＊２５μｌのＭＭＸは、オリゴヌクレオチドが以下の表１０に従うことを除いて、実施例５に従って調製した。
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【０１０２】
最後に、それぞれのヌクレオシドおよびそれぞれの標準点からの酵素混合物をそれぞれのＭＭＸに添加した。２００ｐｇの酵素混合物をＮＴＣ  ＭＭＸ中に含有させた。各標準点から３つの１００μｌのＰＣＲチューブに２５μｌを分配し、フタをし、リアルタイムＰＣＲ機器に入れた。サイクリングプロファイルは、（１）４２℃で１分間保持、（２）３５℃で１分間保持、（３）サイクリング：３７℃で３０秒間→３７℃で３０秒間であり、ＪＯＥチャネルに対してシグナルを獲得した。各サイクルを９０回繰り返した。全アッセイ時間は１０８分間である。
【０１０３】
結果
蛍光シグナルの規格化はサイクル１からである。閾値は、９０分後の０ｐｇに対して選択した。平均Ｃｔ値の対数回帰は４つの標準点からである。Ｒ２値は０．９６である。
【０１０４】
実施例７．
異なる量の各デオキシリボヌクレオシドキナーゼを有する混合物を用いる検出システム２に従うｈｒＴＫ１およびｈｒｄＣＫの多重決定
以下の表１１で与えられる異なるｈｒＴＫ１およびｈｒｄＣＫの触媒活性値を有する混合物から標準曲線を作成した。簡単に言うと、酵素混合物は、実施例１および２に従うＮｄＰＫ、ＴＭＰＫおよびｄＣＭＰＫと一緒に、各標準点ｈｒＴＫ１／ｈｒｄＣＫ点を含むように調製した。ＭＭＸは、以下の点：実施例４からのオリゴヌクレオチドを含有させ、ＮｄＰＫが０．０２Ｕ／反応である点を除いて、実施例３に従って調製した。
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【０１０５】
最後に、それぞれの酵素混合物を各ＭＭＸに添加した。チューブにフタをし、リアルタイムＰＣＲ機器に入れた。サイクリングプロファイルは、（１）４２℃で２分間保持、（２）３５℃で１分間保持、（３）３７℃で１５分間保持、（４）サイクリング：３７℃で３０秒間→３７℃で３０秒間であり、ＦＡＭ／ＳＹＢＲチャネルに対して、そして、ＪＯＥチャネルからシグナルをそれぞれ獲得した。各サイクルを９０回繰り返した。全アッセイ時間は１０８分間である。サイクル１からの規格化を開始した。閾値は９０分後の０ｐｇのＴＫに対して選択した。
【０１０６】
結果
図８は、多重化実験からの対数スケールの線形回帰結果を示す。Ｙ軸は、検出に必要とされるＣｔの数である。Ｘ軸は、それぞれのデオキシリボヌクレオシドキナーゼからの任意の「ｐｇ」活性である。結果は明らかに、いずれのデオキシリボヌクレオシドキナーゼの量も他方のプライマー伸長効率に影響を与えないことを示す。関連する２つのデオキシリボヌクレオシドキナーゼの異なる傾斜は、恐らく、これらの酵素が示し得る異なる比活性によるものである。
【０１０７】
実施例８
検出システム２に従うイヌ血清サンプル中の野生型ＴＫの触媒濃度の決定およびＴＫ−ＲＥＡ法との相関
事前に悪性疾患を有することが診断されたイヌ血清サンプルを、検出システム２に従ってｈｒＴＫ１触媒濃度について試験した。各血清は、ＴＫ−ＲＥＡ法によって予め測定されている。標準曲線には、２００ｐｇ、２０ｐｇおよび２ｐｇのｈｒＴＫ１からの触媒活性を含有させた。実験は、以下の点：１）血清サンプルＴＫ希釈緩衝液がｈｒＴＫ１の代わりに使用され、血清を５％の最終濃度まで添加したこと、すなわち、各反応中に１．２５μｌの血清を含有させた（ＭＭＸ／酵素混合物当たり４μｌの血清）ことと、２）サイクリングプロファイルが実施例１に従ったこととを除いて、実施例２に従って実行した。規格化はサイクル１からであった。閾値は、９０分後の０ｐｇのＴＫに対して選択した。
【０１０８】
結果
Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ｖ．６．１ソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）を用いて、各標準点および血清サンプルに対するＣｔを得た。サンプルおよび標準曲線において対数スケールの線形回帰を実行した（図９）。２つの血清が最初に得られたＴＫ−ＲＥＡＵ／ｌ値に適合できないことがすぐに分かるであろう。「＞８０」値を有する第３の血清は直線に適合し得るはずがないので、これも適合されることはできない。従って、これらの３つの血清は「異常値」であると考えられ、これらの３つの血清を除いた回帰直線を作成した。標準点に対する式と、３つの異常値（「＞８０」、３３．２および９．８のＴＫ−ＲＥＡＵ／ｌ）を除いた血清サンプルに対する式とは、曲線の傾斜に関して２．４Ｃｔだけ異なる。２つの曲線は同じ傾斜を共有することは明らかである。本発明に従う方法を用いてこの実施例の血清から得られるＵ／ｌを評価する際、これは、血清点に対する回帰直線式、すなわち、式
ｙ＝−１０．７９Ｌｎ（ｘ）＋９３．７８４
だけを用いて行われる。血清サンプル回帰直線に対するｈｒＴＫ１のｐｇの相関は、標準点回帰曲線に対して与えられるＴＫの「ｐｇ」活性量に関して、式Ｕ／ｌ＝ｅ＾（（１１．７９ｌｎ（ｐｇ（ｘ））＋２１．０８５）／１０．６７）を用いるだけで解決される。図９において、各標準点は［「ｐｇ」ＴＫ（Ｘ）；Ｃｔ（Ｙ）］で表され、各血清は、［「ＴＫ−ＲＥＡＵ／ｌ」ＴＫ（Ｘ）；Ｃｔ（Ｙ）］で表される。Ｒ２値は、各曲線に対して与えられる。図９中の「ＯＬ」は、異常値の血清を示す。図９からの結果は精度データと共に、表１２および１３において一覧にされる。興味深いことに、「＞８０Ｕ／ｌ」サンプルは、延長された血清回帰直線への外挿による希釈を必要とせずに、本発明に従う方法を用いて評価されて、４５０Ｕ／ｌＴＫ−ＲＥＡの対応する単位を有し得る。
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【０１０９】
実施例９
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ技術の原理、すなわち検出システム１を用いる血清添加ｈｒＴＫ１サンプルの決定
Ｄｉａｓｏｒｉｎ  ｓ．ｒ．ｌ．（Ｓａｌｕｇｇｉａ  Ｉｔａｌｙ）からのＴＫ−ＲＥＡ製品を用いてＴＫ１活性が予め測定されているイヌからの血清を、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ技術の原理を用いて試験した。血液提供者からの１０％ヒト正常血清が添加された、４０ｐｇ、２０ｐｇ、４ｐｇ、２ｐｇおよび０ｐｇのｈｒＴＫ１からの触媒活性を示す標準曲線サンプルを、血清サンプル（最終１０％）と一緒に測定した。０ｐｇの添加標準点サンプルを負の対照および規格化された蛍光の閾値決定因子として含有させた。簡単に言うと、酵素混合物は、０．００２ＵのＮｄＰＫと、１回の反応につき１８ｎｇのｄＴＭＰキナーゼと、各ｈｒＴＫ１標準点サンプルまたは各血清サンプルとを含有するように調製した。緩衝混合物、基質混合物およびオリゴヌクレオチド混合物は表３に従って調製した。各サンプルに対するＭＭＸは、１．５ｍｌのポリプロピレン微量遠心管中室温で、水と、混合物と、０．５ＵのＫｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＡＧ）とを混合することによって調製した。ＭＭＸ２００ｐｇのｈｒＴＫ１の酵素混合物標準点サンプルは、Ｎｏ−Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＴＣ）として使用した。
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【０１１０】
サンプルを分配し、チューブを閉め、リアルタイムＰＣＲ機器に入れた。実行プロファイルは、（１）４０℃で１分間保持、（２）３０℃で１分間保持、（３）３５℃で１０分間保持（４）サイクリング：３５℃で３０秒間→３７℃で３０秒間であり、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（登録商標）チャネル（４７０ｎｍで励起、５１０ｎｍで検出）に対してシグナルを獲得した。各サイクルを６０回繰り返した。
【０１１１】
結果
蛍光の規格化を獲得し、標準規格化を用いてサイクル１から直線にした（図１０）（すなわち、最初の５回のサイクルからの平均蛍光を使用して、ソフトウェア供給者に従って、その後のサイクルから得られる蛍光から推定されるバックグラウンド蛍光を決定した）。ＮＴＣ閾値（カットオフ）は、蛍光の最高の増大を有するサンプルの４％である。内臓ソフトウェアＲｏｔｏｒ−ｇｅｎｅ  ｖ．６．０１（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、選択された閾値対してＣｔ値を決定した。約５６サイクル（Ｃｔ）の後に交差する０ｐｇのｈｒＴＫ１に対して閾値を選択した。この実施例では、０．０３２９５標準蛍光単位における閾値を得た。図１１は、得られたＣｔ値の対数スケールの線形回帰を示す。Ｘ軸には、ｈｒＴＫ１のｐｇとして、あるいはＴＫ−ＲＥＡＵ／ｌとして、それぞれのサンプルからの活性が与えられる。各サンプル点は、ｐｇ／ＴＫ−ＲＥＡＵ／ｌ（Ｘ）；Ｃｔ（ｙ）値を有する。血清添加ｈｒＴＫ１標準点サンプル対して線形回帰および０．９６８８のＲ２スコアが得られ、サンプル中のＴＫＵ／ｌの量を決定するために相関が十分良好であることが示された。傾斜間の関係をさらに決定するために、２つの別々の回帰曲線に対してスチューデントのｔ検定を適用した。データセットが小さいため、ｔ検定は手作業で計算した。分散は等しいがサンプルサイズが等しくない検定を実施した。データセットにおける０．０７のスコアは、傾斜が等しいと考えられる可能性が高いことを示した。
【０１１２】
実施例１０．
鎖置換技術の原理を用いて、すなわち検出システム３に従って得られたｈｒＴＫ１標準曲線
８０ｐｇ、４０ｐｇ、２０ｐｇ、８ｐｇ、４ｐｇ、２ｐｇおよび０ｐｇのｈｒＴＫ１から、触媒活性値を示す標準曲線を作成した。簡単に言うと、ＭＭＸは、各標準点に対して、実施例２および表７に記載されるように調製した。
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【０１１３】
８０ｐｇのｈｒＴＫ１含有酵素混合物をＮＴＣ中に含有させた。ＭＭＸを分配し、チューブを閉じ、リアルタイムＰＣＲ機器に入れた。サイクリングプロファイルは、（１）４２℃で１分間保持、（２）３５℃で１分間保持、（３）３７℃で１５分間保持、（４）サイクリング：３７℃で３０秒間→３７℃で３０秒間であり、ＦＡＭチャネルに対してシグナルを獲得し、９０回繰り返した。全アッセイ時間は１０８分間である。閾値は９０分における０ｐｇに対して選択した。
【０１１４】
結果
図１２は、置換されたＦＡＭ分子ビーコンヘアピンプローブからの規格化された蛍光からの減少をリアルタイムで示す。使用した規格化方法は、ソフトウェア提供者の説明書（Ｃｏｒｂｅｔｔ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従うダイナミックチューブ規格化であった。閾値は、−（マイナス）０．０２１１８標準蛍光単位に設定した。図１３は、６つの標準点から得られる平均Ｃｔ値の対数スケールの線形回帰を示す。Ｒ２値は０．９４２２であり、血清または血漿からの臨床サンプル中のＴＫ活性の決定のために標準曲線が適用され得ることが示される。
【０１１５】
参考文献
・  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  Ｓ，Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｂ，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｋ，Ｅｋｌｕｎｄ  Ｈ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００２  ５９（８）：１３２７−４６．
・  Ｔｏｐｏｌｃａｎ  Ｏ  ａｎｄ  Ｈｏｌｕｂｅｃ  Ｌ．Ｊｒ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｍｅｄ．Ｄｉａｇｎ．２００８  ２（２）：１２９−１４１
・  特許：米国特許出願公開第２００８／０２４８４７２号明細書、欧州特許第１３８５００５号明細書、国際公開第２００９／０６３２５４号パンフレット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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