(57)【要約】  分子内ジスルフィド結合を持たず、それ自体が細胞内で機能するＲＮＦ８−ＦＨＡドメインを使用する試験管内選択法だけで得られる抗原結合タンパク質を提供する。ＦＨＡドメインから伸びる１〜４本のループをランダム化し、ターゲット分子への認識部位をＦＨＡドメイン表面に人工的に作り出し、ＲＮＦ８−ＦＨＡドメインライブラリーを構築する。該ライブラリーを使用して、インビトロで効率良く抗原結合タンパク質を選択する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ３ユビキチンライゲースＲＮＦ８−ＦＨＡドメインのループをランダム化したランダムループ化ポリペプチドを得る工程と、
前記ランダムループ化ポリペプチドから抗原結合タンパク質を選択する工程と、を含む、人工抗体を製造する方法。
【請求項２】
前記Ｅ３ユビキチンライゲースＲＮＦ８−ＦＨＡドメインのループは、下記の（ａ’）から（ｄ’）に記載のループのうち、いずれか１つ又は２つ以上のループである、請求項１に記載の方法。
（ａ’）配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の４１−４６番目のアミノ酸残基からなるループ
（ｂ’）配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の４９−６２番目のアミノ酸残基からなるループ
（ｃ’）配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の７８−８３番目のアミノ酸残基からなるループ
（ｄ’）配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の１０８−１１８番目のアミノ酸残基からなるループ
【請求項３】
前記Ｅ３ユビキチンライゲースＲＮＦ８−ＦＨＡドメインのループは、下記の（ａ）から（ｄ）に記載のループのうち、いずれか１つ又は２つ以上のループである、請求項１に記載の方法。
（ａ）配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の４１−４３番目のアミノ酸残基からなるループ
（ｂ）配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の５３−６０番目のアミノ酸残基からなるループ
（ｃ）配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の８０−８２番目のアミノ酸残基からなるループ
（ｄ）配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の１０９−１１４番目のアミノ酸残基からなるループ
【請求項４】
前記ランダムループ化ポリペプチドは、前記Ｅ３ユビキチンライゲースＲＮＦ８−ＦＨＡドメインのループにランダム配列が導入されたポリペプチドであり、前記ランダム配列のアミノ酸残基数は３−１２残基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ランダムループ化ポリペプチドから抗原結合タンパク質を選択する工程が、試験管内選択法である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法により得られる人工抗体。
【請求項７】
イントラボディである、請求項１に記載の方法により得られる人工抗体。
【請求項８】
請求項１に記載の方法により得られる人工抗体と、当該人工抗体の抗原タンパク質との複合体。
【請求項９】
請求項１に記載の方法により得られる人工抗体と、当該人工抗体の抗原タンパク質との複合体であって、前記抗原タンパク質が、Ｅｒｋ２またはＴｒｘである複合体。
【請求項１０】
請求項６に記載の人工抗体であって、配列番号２１から４２のうちいずれかで示されるアミノ酸配列、或いは、配列番号２１から４２のうちいずれかで示されるアミノ酸配列のうち、（ａ）４１−４３番目のアミノ酸残基、（ｂ）５３−６０番目のアミノ酸残基、（ｃ）８０−８２番目のアミノ酸残基、及び（ｄ）１０９−１１４番目のアミノ酸残基以外の部分に１又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列からなる人工抗体。
【請求項１１】
配列番号２１から４２のうちいずれかで示されるアミノ酸配列からなる人工抗体、或いは、配列番号２１から４２のうちいずれかで示されるアミノ酸配列のうち、（ａ）４１−４３番目のアミノ酸残基、（ｂ）５３−６０番目のアミノ酸残基、（ｃ）８０−８２番目のアミノ酸残基、及び（ｄ）１０９−１１４番目のアミノ酸残基以外の部分に１又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列からなる人工抗体。
【請求項１２】
イントラボディである、請求項１１に記載の人工抗体。
【請求項１３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、（ａ）４１−４３番目のアミノ酸残基、（ｂ）５３−６０番目のアミノ酸残基、（ｃ）８０−８２番目のアミノ酸残基、及び（ｄ）１０９−１１４番目のアミノ酸残基のいずれか１つ又は２つ以上の部位にランダム配列が導入されたポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、（ａ）４１−４６番目のアミノ酸残基、（ｂ）４９−６２番目のアミノ酸残基、（ｃ）７８−８３番目のアミノ酸残基、及び（ｄ）１０８−１１８番目のアミノ酸残基のいずれか１つ又は２つ以上の部位にランダム配列が導入されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｅ３ユビキチンライゲースＲＮＦ８のＦＨＡドメインの改変タンパク質であって、ＦＨＡドメインを改変した結果、予め定められた抗原に対して、以前は存在しなかった結合親和性を示す改変タンパク質、およびその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体の親和性と特異性は医療、診断、試薬などの幅広い分野で応用されている。また、近年の抗体工学の発展により、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）やｄｉａｂｏｄｙなど、様々な形態をした小型化された抗体が報告された[Bird et al., Science (1988), vol.242, pp.423-426; Holliger et al., Proc. Natl. Sci. USA(1993), vol.90, pp.6444-6448]。さらに、抗体よりもより小さく安定な人工抗体分子が開発されている[Skerra, Curr. Opin. Biotechnol. (2007), vol.18, pp.295-304]。
【０００３】
例えば、特表２００１−５００５３１号公報には、抗体のＣＤＲ(相補性決定領域)を模したファイブロネクチンIII型ドメインの人工抗体が開示されている。この人工抗体は、タンパク質表面の可動性のループをランダム化することで、抗原認識部位をタンパク質表面に人工的に作り出したものである。
【０００４】
ＲＮＦ８は、ＲＩＮＧ−ＦｉｎｇｅｒドメインとＦＨＡドメインを持つＥ３ユビキチンライゲースであり、ＤＮＡ損傷への応答に関与する事が知られている。立体構造解析により、ＲＮＦ８のＦＨＡドメイン（ＰＤＢ ｃｏｄｅ：２ＰＩＥ、２ＣＳＷ）が、タンパク質表面上に５本のループ（２本が長いループ、３本が短いループ）を有するイムノグロブリン（Ｉｇ）様構造（βサンドイッチ構造）を持つことが示された（図１）。また、結合パートナーであるＭＣＤ１への結合はＦＨＡドメインの２本の長いループを介して成されることが確認されている。この結合様式は抗体の抗原認識様式と似通っており、ＲＮＦ８のＦＨＡドメインは人工抗体分子の開発に適した構造を有することが期待される。
【０００５】
また、ＲＮＦ８は細胞内のタンパク質であるため、ＲＮＦ８由来の人工抗体は、イントラボディ（細胞内発現抗体）としての機能性が高いと考えられる。イントラボディとは、細胞内タンパク質をターゲットとして結合する、細胞内で機能する抗体（主にｓｃＦｖ）である。イントラボディは、様々な疾患,例えばＡＩＤＳ、癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びハンチントン病に対する治療用として開発が進められてきた。
【０００６】
さらに、イントラボディは細胞内ターゲットのノックアウトに効果を発揮する。一般的に細胞内ターゲットのノックアウトはＲＮＡｉが知られている。しかし、ＲＮＡｉは、遺伝子そのもののノックアウトであり、また細胞内ＲＮＡの半減期が短いため、翻訳後修飾されたターゲットの解析には適応できない。イントラボディはＲＮＡよりも細胞内での半減期が長く、またタンパク質レベルでのノックアウトが可能である。このため、イントラボディはＲＮＡｉの上記問題を解消できる[Zhou et al., Mol. Cell. (2000), vol.6, pp.751-756; Jendreyko et al., J. Biol. Chem. (2003), vol.278, pp.47812-47819; Melchionna et al., J. Mol. Biol. (2007), vol.374, pp.641-654]。
【０００７】
しかしながら、抗体を還元的な環境下にある細胞内でイントラボディとして発現させた場合、その分子構造内のジスルフィド結合の破壊により、多くの場合で結合活性の減少もしくは完全なる消失がおこる。
【０００８】
この問題を解決するために、まずジスルフィド結合の関わる分子内のシステインを取り除いた抗体[Proba et al., J. Mol. Biol. (1997), vol.265, pp.161-172]や、より安定性を高めた抗体[Ohage et al., J. Mol. Biol. (1999), vol.291, pp.1129-1134]が開発された。さらにより効果的に細胞内で機能する抗体を得る方法として、細胞内でｓｃＦｖを直接選択する方法が開発された[Visintin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), vol.96, pp.11723-11728]。しかし、細胞を使用する選択系は、抗体ライブラリーのベクターへのライゲーション効率及び細胞への形質転換効率に限界がある。このため、細胞を使用する選択系は、より大きな多様性を持ったライブラリーへの適応が困難である。このため、ファージディスプレイやリボソームディスプレイといった他法との組み合わせ、または選択済みｓｃＦｖのバリデーション法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００１−５００５３１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Bird et al, Science (1988), vol.242, p423-426
【非特許文献２】Holliger et al, Proc. Natl. Sci. USA (1993), vol.90, p6444-6448
【非特許文献３】Skerra, Curr Opin Biotechnol (2007), vol.18, p295-304
【非特許文献４】Zhou et al, Mol. Cell (2000), vol.6, p751-756,
【非特許文献５】Jendreyko et al, J. Biol. Chem (2003), vol.278, p47812-47819
【非特許文献６】Melchionna et al, J. Mol. Biol (2007), vol.374, p641-654
【非特許文献７】Proba et al, J. Mol. Biol (1997), vol.265, p161-172
【非特許文献８】Ohage et al, J. Mol. Biol (1999), vol.291, p1129-1134
【非特許文献９】Visintin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), vol.96, p11723-11728
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
人工抗体としての機能を有し、また、細胞内でイントラボディとして発現させても結合活性を失わないＲＮＦ８−ＦＨＡドメイン改変タンパク質を、インビトロで効率良く製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ＲＮＦ８−ＦＨＡドメインは分子内ジスルフィド結合を持たない、またそれ自体が細胞内で機能するタンパク質であるため、上述のような最適化を行う必要はなく、一般的なインビトロでの選択だけで効率良く機能性抗体を得ることが可能となる。
【００１３】
本発明の第１の側面は、人工抗体を製造する方法に関する。この方法は、Ｅ３ユビキチンライゲースＲＮＦ８−ＦＨＡドメインのループをランダム化したランダムループ化ポリペプチドを得る工程と、ランダムループ化ポリペプチドから抗原結合タンパク質を選択する工程とを含む。
【００１４】
Ｅ３ユビキチンライゲースＲＮＦ８−ＦＨＡドメインは、分子内ジスルフィド結合を持たず、それ自体が細胞内で機能するポリペプチドである。本発明のランダムループ化ポリペプチドは、ＲＮＦ８−ＦＨＡドメインを利用して、一般的なインビトロでの選択だけで抗原結合タンパク質を得ることができる。
【００１５】
具体的に説明すると、ＦＨＡドメインから伸びる１〜４本のループをランダム化し、対象となるターゲット分子への認識部位をＦＨＡドメイン表面に人工的に作り出す。このランダムループ化ポリペプチドを含む、ＲＮＦ８−ＦＨＡドメインライブラリーを構築する。その上で、インビトロで効率良く抗原結合タンパク質を選択する。
【００１６】
ＲＮＦ８−ＦＨＡドメインライブラリーの構築方法を、以下、より詳細に説明する。配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の４１−４３番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ１）、配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の５３−６０番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ２）、配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の８０−８２番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ３）、及び配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の１０９−１１４番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ４）から選択されるいずれか１つ又は２つ以上のループに、各ループの残基数と同じ残基数を有するランダム配列を導入することにより、人工抗体ライブラリーを作製する。このライブラリーから、タンパク質、ペプチド、低分子、及び糖鎖などの様々な抗原に対する結合分子の取得が可能である。もっとも、ランダム配列が導入される配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、又は付加したものであってもよい。すなわち、上記の説明において配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに替えて、配列番号１の（ａ）４１−４３番目のアミノ酸残基、（ｂ）５３−６０番目のアミノ酸残基、（ｃ）８０−８２番目のアミノ酸残基、及び（ｄ）１０９−１１４番目のアミノ酸残基以外の部分に、１又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列からなるランダムループ化ポリペプチドを得てもよい。
【００１７】
本発明の更なる態様において、配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の４１−４６番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ１’）、配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の４９−６２番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ２’）、配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の７８−８３番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ３’）、及び配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の１０８−１１８番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ４’）から選択されるいずれか１つ又は２つ以上のループに、各ループの残基数と同じ残基数を有するランダム配列を導入することによっても、人工抗体ライブラリーを作製する。このライブラリーから、タンパク質、ペプチド、低分子、及び糖鎖などの様々な抗原に対する結合分子の取得が可能である。もっとも、ランダム配列が導入される配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、又は付加したものであってもよい。すなわち、上記の説明において配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに替えて、配列番号１の（ａ）４１−４６番目のアミノ酸残基、（ｂ）４９−６２番目のアミノ酸残基、（ｃ）７８−８３番目のアミノ酸残基、及び（ｄ）１０８−１１８番目のアミノ酸残基以外の部分に、１又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列からなるランダムループ化ポリペプチドを得てもよい。
【００１８】
上記のランダムループ化ポリペプチドの例は、Ｅ３ユビキチンライゲースＲＮＦ８−ＦＨＡドメインのループにランダム配列が導入されたポリペプチドである。導入されたランダム配列のアミノ酸残基数の例は、３−１２残基である。本発明においては、この程度の長さのランダム配列を導入することが好ましい。
【００１９】
そして、人工抗体ライブラリーから、抗原結合タンパク質を選択する。抗原結合タンパク質を選択するための方法の例は、試験管内選択法である。試験管内選択法の例としては、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、バクテリアディスプレイが挙げられる。これらの方法は、一般的に試験管内選択系として知られている。
【００２０】
リボソームディスプレイは、インビトロ翻訳系において、リボソーム−ペプチド−ｍＲＮＡ複合体を形成させ、特定の機能を有するペプチドをコードするタンパク質を選択する方法である。この方法において、一般的な大腸菌抽出液を用いるリボソームディスプレイよりも選択性が高いことが報告されている再構築タンパク質合成系である、いわゆるＰＵＲＥシステム[Shimizu et al. (2005), Methods, vol.36, pp.299-304]を利用したリボソームディスプレイが好ましい。
【００２１】
本発明の第２の側面は、上記に説明した方法により製造又は選択された人工抗体又は人工抗体と抗原との複合体に関する。この人工抗体は、好ましくは、イントラボディである。人工抗体の抗原タンパク質との複合体における抗原タンパク質の例は、Ｅｒｋ２（extracellular signal-regulated kinase 2）及びＴｒｘ（Thioredoxin）である。
【００２２】
具体的な人工抗体の例は、配列番号２１から４２のうちいずれかで示されるアミノ酸配列からなる人工抗体である。本発明の人工抗体は、配列番号２１から４２のうちいずれかで示されるアミノ酸配列のうち、（ａ）４１−４３番目のアミノ酸残基、（ｂ）５３−６０番目のアミノ酸残基、（ｃ）８０−８２番目のアミノ酸残基、及び（ｄ）１０９−１１４番目のアミノ酸残基以外の部分に１又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列からなる人工抗体であってもよい。これらの人工抗体は、好ましくは、イントラボディである。
【００２３】
上記したランダムループ化ポリペプチドの例は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、（ａ）４１−４３番目のアミノ酸残基、（ｂ）５３−６０番目のアミノ酸残基、（ｃ）８０−８２番目のアミノ酸残基、及び（ｄ）１０９−１１４番目のアミノ酸残基のいずれか１つ又は２つ以上の部位にランダム配列が導入されたポリペプチドである。ランダム配列が導入される例は、上記のループ部位がランダム配列で置き換わったものである。
【００２４】
上記したランダムループ化ポリペプチドの例は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、（ａ）４１−４６番目のアミノ酸残基、（ｂ）４９−６２番目のアミノ酸残基、（ｃ）７８−８３番目のアミノ酸残基、及び（ｄ）１０８−１１８番目のアミノ酸残基のいずれか１つ又は２つ以上の部位にランダム配列が導入されたポリペプチドである。ランダム配列が導入される例は、上記のループ部位がランダム配列で置き換わったものである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、様々な抗原に対する結合タンパク質を取得できる人工抗体として改変タンパク質を利用できる。
【００２６】
また、細胞内タンパク質を抗原とした場合、それらを認識する結合タンパク質はイントラボディとして細胞内で機能させることが可能である。例えば、該結合タンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用の阻害や生細胞内のターゲットのイメージング、ターゲット分子の局在の制御などの生化学的な基礎実験から、タンパク質−タンパク質相互作用解析（プロテオミクス解析）、試薬、診断、治療薬への応用などのまったく新しい様々な用途への利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ＲＮＦ８−ＦＨＡドメインの構造の模式図を示す。
【図２】図２は、ＲＮＦ８−ＦＨＡドメインのアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、ＲＮＦ８−ＦＨＡ遺伝子を導入した、大腸菌タンパク質発現ベクターを示す。
【図４】図４は、ＲＮＦ８−ＦＨＡ遺伝子を導入した、哺乳動物細胞内タンパク質発現ベクターを示す。
【図５】図５は、ＲＮＦ８−ＦＨＡ遺伝子及びＥＧＦＰ遺伝子を導入した、哺乳動物細胞内タンパク質ベクターを示す。
【図６】図６は、ＳＰＲによるＥｒｋ２結合分子の親和性測定結果を示す。
【図７】図７は、精製したＥｒｋ２結合クローンによる組換えＥｒｋ２の免疫沈降実験結果を示す。
【図８】図８は、哺乳動物細胞内で発現したＥｒｋ２結合クローンによる内在性Ｅｒｋ２のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図９】図９は、Ｅｒｋ１／２の細胞内での機能を示す。
【図１０】図１０は、Ｅｒｋ２結合クローンによる内在性Ｅｒｋシグナルの阻害を示す。
【図１１】図１１は、Ｅｒｋ２結合クローン−ＮＬＳ（核移行シグナル）による内在性Ｅｒｋ２の局在の制御を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明のＲＮＦ８−ＦＨＡドメインライブラリーの構築方法について説明する。この方法は、まず、ＦＨＡドメインから伸びる１〜４本のループをランダム化し、対象となるターゲットへの認識部位をＦＨＡドメイン表面に人工的に作り出すものである。
【００２９】
この方法は、配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の４１−４３番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ１）、配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の５３−６０番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ２）、配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の８０−８２番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ３）、及び配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の１０９−１１４番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ４）から選択されるいずれか又は２つ以上のループ部位に、ランダム配列を導入することで、人工抗体ライブラリーを作製する。もっとも、ランダム配列が導入される配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、又は付加したものであってもよい。すなわち、上記の説明において配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに替えて、配列番号１の（ａ）４１−４３番目のアミノ酸残基、（ｂ）５３−６０番目のアミノ酸残基、（ｃ）８０−８２番目のアミノ酸残基、及び（ｄ）１０９−１１４番目のアミノ酸残基以外の部分に、１又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列を含む（又は、からなる）ランダムループ化ポリペプチドを得てもよい。
【００３０】
本発明の更なる態様において、この方法は、配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の４１−４６番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ１’）、配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の４９−６２番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ２’）、配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の７８−８３番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ３’）、及び配列番号１で示されるＲＮＦ８タンパク質の１０８−１１８番目のアミノ酸残基からなるループ（Ｌｏｏｐ４’）から選択されるいずれか又は２つ以上のループ部位に、ランダム配列を導入することによっても、人工抗体ライブラリーを作製する。もっとも、ランダム配列が導入される配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、又は付加したものであってもよい。すなわち、上記の説明において配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに替えて、配列番号１の（ａ）４１−４６番目のアミノ酸残基、（ｂ）４９−６２番目のアミノ酸残基、（ｃ）７８−８３番目のアミノ酸残基、及び（ｄ）１０８−１１８番目のアミノ酸残基以外の部分に、１又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列を含む（又は、からなる）ランダムループ化ポリペプチドを得てもよい。
【００３１】
ランダム配列を導入する例は、ループ部位（図２の実線の四角で囲まれた部位）又はループ１’〜４’から選択されるループ部位（図２の破線の四角で囲まれた部位）をランダム配列に置き換えるものである。ランダム配列の例は、３−１２残基を有するランダム配列である。ランダム配列を導入する好ましい例は、ランダム配列を導入する部位の残基数と同じ残基数を有するランダム配列に置き換えるものである。このようなランダムループ化ポリペプチドを得るためには、配列番号１で示されるポリペプチドのＤＮＡのうち、ループ部位に相当する部分にランダムオリゴヌクレオチドを導入すればよい。ランダムオリゴヌクレオチドの例は、ＮＮＫ配列、ＮＮＳ配列及びＮＮＹ配列であり、ここで、Ｎ はアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、又はチミン（Ｔ）を意味する；Ｋはグアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）を意味する；Ｓはシトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）を意味する；Ｙはシトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）を意味する。ランダムヌクレオチドは公知の方法に従って生成すればよい。ＤＮＡ又はＲＮＡにランダムオリゴヌクレオチドを導入する方法も公知である。
【００３２】
次に、ランダムオリゴヌクレオチドを導入した上記ループ（ランダムループ）に対応するＲＮＡを転写させ、転写物を得る。転写工程は、バイオテクノロジーの分野において公知である。よって、公知の方法に基づいて転写工程を行うことができる。
【００３３】
そして、得られた転写物をインビトロで翻訳する。このようにして、ＲＮＦ８−ＦＨＡドメインライブラリーを得ることができる。
【００３４】
次に、ＲＮＦ８−ＦＨＡドメインライブラリーについて、抗原結合タンパク質を選択する。抗原結合タンパク質を選択するための方法としては、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、バクテリアディスプレイなどの一般的に試験管内選択系（インビトロセレクション）として知られる方法を使用する。一般的な大腸菌抽出液を用いるリボソームディスプレイよりも選択性が高い再構築タンパク質合成系である、ＰＵＲＥシステムに基づくリボソームディスプレイが好ましい。ＰＵＲＥシステムは、翻訳に必要な因子を個々で調製し、それらを再構成した無細胞翻訳系である。ＰＵＲＥシステムは、リボソームディスプレイの効率を低下させ得るヌクレアーゼやプロテアーゼの混入がほとんど認められないため、高い選択効率を持つ事が報告されている[Villemagne et al., (2006) J. Immunol. Methods, vol.313, pp.140-148]。
【００３５】
無細胞翻訳系は、エネルギー再生系と少なくとも一種のアミノ酸とを有する。エネルギー再生系は、タンパク質の合成に必要なＡＴＰやＧＴＰ等のエネルギー源の再生に関わる要素を意味する。エネルギー再生系物質の例は、ＡＴＰ再生に関わる酵素（クレアチンキナーゼやピルビン酸キナーゼ）、その基質（クレアチンリン酸やホスホエノールピルビン酸等）である。無細胞翻訳系は、アミノ酸を少なくとも一種、好ましくは天然に存在する２０種のアミノ酸を含む。無細胞翻訳系は、さらに非天然のアミノ酸を含んでいても良い。無細胞翻訳系は、例えば、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳカリウムやトリス酢酸等）、各種の塩類、界面活性剤、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ等）、シャペロンタンパク質（ＤｎａJ、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、及びＨＳＰ７０等）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ等）、プロテアーゼ阻害剤、又は（リボ）ヌクレアーゼ阻害剤を含んでもよい。
【００３６】
これらの方法を使用して、上記ランダムオリゴヌクレオチド転写物をインビトロで翻訳する。この翻訳工程の例は、無細胞翻訳系を用いて転写物をインビトロで翻訳するものである。この工程により、リボソーム−ペプチド−ｍＲＮＡ複合体が構築される。
【００３７】
上記リボソーム−ペプチド−ｍＲＮＡ複合体と、予め定められた抗原とが結合することにより、抗原に結合するペプチドのｍＲＮＡをインビトロで選択することができる（インビトロセレクション）。抗原はタンパク質、ペプチド、低分子、糖鎖などのいずれでもよい。ここで、予め抗原をビオチンで標識しておくことで、後述のＥＬＩＳＡによる抗原結合ペプチドのスクリーニングが可能となる。この標識化の工程はバイオテクノロジーの分野において公知である。よって、公知の方法に基づいて標識工程を行うことができる。
【００３８】
上記の方法において選択されたｍＲＮＡを回収し、回収したｍＲＮＡを逆転写させてｃＤＮＡとした後、このｃＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅させることでセカンドラウンド以降のリボソームディスプレイ用遺伝子を再構築することができる。リボソームディスプレイは４ラウンド以上行うことが好ましい。
【００３９】
数ラウンドのリボソームディスプレイ及びインビトロセレクションによって回収された遺伝子を発現ベクターにサブクローニングし、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることで、抗原に対して結合親和性の高い、ＲＮＦ８−ＦＨＡドメイン改変タンパク質（抗原結合タンパク質）を発現、精製することができる。これらの工程はバイオテクノロジーの分野において公知であり、よって、公知の方法に基づいて行うことができる。
【００４０】
上記に説明した通り、本発明の好ましい利用は、ＲＨＦ８−ＦＨＡドメイン改変タンパク質のライブラリーを作製し、リボソームディスプレイを用いて、抗原に対して結合親和性の高いＲＨＦ８−ＦＨＡドメイン改変タンパク質（抗原結合タンパク質）をインビトロで選択する方法である。
【００４１】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。本発明は、以下説明する実施例に限定されるものではなく、当業者に自明な範囲で修正を加えたものも含む。
【実施例】
【００４２】
ＲＮＦ８−ＦＨＡドメインライブラリーの構築
ＲＮＦ８のＦＨＡドメインの立体構造（図１、ＰＤＢ ｃｏｄｅ：２ＰＩＥ）を基にして、ＲＮＦ８のＦＨＡドメイン（図２、配列番号１）の４つのループをランダム化（ＮＮＳ）したループを含むＲＮＦ８ライブラリーを設計し、１４０塩基以下の断片として化学合成した（ＦＡＳＭＡＣ）。ランダム化する部分は、図２において四角で囲った、ＲＮＦ８タンパク質の４１−４３番目のアミノ酸残基、５３−６０番目のアミノ酸残基、８０−８２番目のアミノ酸残基及び１０９−１１４番目のアミノ酸残基部分である。また、ライブラリー遺伝子は高タンパク質発現を目的としていわゆる最適コドン（図２大文字表記）を採用した。さらに、リボソームディスプレイを実施する上で必要となる、３’末端にＦＬＡＧ配列を付加したＴ７プロモーターおよびＳＤ配列を含む５’ＵＴＲ配列も化学合成した（ＦＡＳＭＡＣ）。下線部位はそれぞれのオリゴＤＮＡが相補する（オーバーラップする）領域を示す。
N-Term (配列番号２: GACTATAAAGATGACGATGACAAAggcgagcctggcttcttcgtcaccggagaccgcgccggtggccgctcatggtgcctgcgccgcgtgggcatgagcgccggctggctgcttctcgaggatggtTGCgaagttac)
C-Term (配列番号３: cCgaagaagactgggaAacCatTtatccttgtcttAGcccTaagaatgaTcaaatgatTgaaaaGaatGAATTCggtggcagcggaggtgaatatcaaggccaatcgtctgac)
LOOPs 1&2 (配列番号４: ctTctCgaGgatggTTGCgaAgtTacCgtTggTNNSNNSNNSggtgtcacCtaccaGctggtatcaaaannsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsaaccactgCgttCtTaagcaAaatcctgag)
LOOP 3 (配列番号５: ccactgCgttCtTaagcaAaatcctgagggccaatggacCattatggacaacaagNNSNNSNNSggtgtttggctgaacCgAgcgcgCctggaacctttGCgCgtctatAGcattcatcagggTgac)
LOOP 4 (配列番号６: GCgCgtctatAGcattcatcagggTgactacatccaacttggTNNSNNSNNSNNSNNSNNSgagaatgcCgagtatgaatatgaagttacCgaagaagactgggaAaccatttatcc)
5’ UTR (配列番号７: gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatggactataaagatgacgatgacaaa)
【００４３】
Ｍ１３ファージのｇｅｎｅ ＩＩＩ（ｇ３ｐ）の部分配列（２２０−３２６番目のアミノ酸残基）はＭ１３ＫＯ７由来ファージゲノムを鋳型としてプライマーｇ３ｐ（配列番号８：GAATATCAAGGCCAATCGTCTGAC）、及び、プライマーｇ３ｐ−ＳｅｃＭｓｔｏｐ（配列番号９: CTCGAGTTATTCATTAGGTGAGGCGTTGAGGGCCAGCACGGATGCCTTGCGCCTGGCTTATCCAGACGGGCGTGCTGAATTTTGCGCCGGAAACGTCACCAATGAAAC）を用いてＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）によってＰＣＲ増幅（変性：９４℃,１０秒、アニーリング：５８℃, ３０秒、伸長：６８℃,６０秒、サイクル：２５回）後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）によって精製した。
化学合成したそれぞれの遺伝子断片（５‘ＵＴＲ, Ｎ−Ｔｅｒｍ, Ｌｏｏｐ１＆２, Ｌｏｏｐ３, Ｌｏｏｐ４,Ｃ−ｔｅｒｍ）とｇ３ｐの遺伝子をそれぞれ１ｐｍｏｌ、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴＯＹＯＢＯ） を含むＰＣＲ反応液(トータル５００μＬ)を調製し、１５サイクルのＰＣＲ反応（変性：９４℃,１０秒、アニーリング：５８℃, ３０秒、伸長：６８℃,６０秒）を実行した後、５’プライマー（配列番号１０: gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctag）１０ｐｍｏｌ、プライマーＳｅｃＭｓｔｏｐ（配列番号１１: ggattagttattcattaggtgaggcgttgagg）１０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １μＬを反応液（５０μＬ×１０本）に追加で加え、更に１０サイクルのＰＣＲ反応（変性：９４℃,１０秒、アニーリング：５８℃, ３０秒、伸長：６８℃,６０秒）を実行した。１％アガロースを用いた電気泳動によって、すべての遺伝子がつながったバンドを確認後、そのバンドを切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製して最終的なランダム配列を含む遺伝子ライブラリーとした。
【００４４】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写
精製した遺伝子ライブラリーＤＮＡ１μｇを２０μＬのｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＲｉｂｏｍａｘＴＭ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７, Ｐｒｏｍｅｇａ)によってｍＲＮＡとし、カラム精製した（ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ カラム、ＱＩＡＧＥＮ）。
【００４５】
無細胞翻訳系を用いたＩｎ ｖｉｔｒｏ翻訳（リボソーム−ペプチド−ｍＲＮＡ複合体の構築）
タンパク質合成反応試薬である無細胞翻訳系（ＰＵＲＥシステム）は既報[Shimizu et al. (2005), Methods, vol.36, pp.299-304]に従い調製した。調製した反応液（１００μｌ）に１０ｐｍｏｌのｍＲＮＡライブラリーを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。氷冷したＷａｓｈ緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ, ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１μｇ／ｍＬ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ （Ｓｉｇｍａ）］を５００μＬ加え、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ, ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１００μｇ／ｍＬ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ ｔｏｔａｌＲＮＡ （Ｓｉｇｍａ）、５％ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ （ＰＩＥＲＣＥ）］５００μＬを加えた。予め５％ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで４℃で一晩ブロッキングしておいたＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１磁性体ビーズ（１００μＬスラリー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、５００μＬ Ｗａｓｈ緩衝液でＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて２回洗浄後、全量の翻訳後反応液（リボソームディスプレイライブラリー溶液）を加え、磁性体ビーズ及びストレプトアビジンへの前吸着操作を４℃、６０分行った。その後、ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて上清を回収した。
【００４６】
抗原タンパク質のビオチン化
Ｓｉｇｍａより購入した抗原タンパク質（ヒトＥｒｋ２および大腸菌チオレドキシン:Ｔｒｘ）は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＰＥＯ４−Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ）の標準プロトコールに従ってビオチン化した。ビオチン化したそれぞれの抗原タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによるバンドの移動度のシフトよりビオチン化が確認され、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて濃度を決定した。
【００４７】
インビトロセレクション
予め５％ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで４℃で一晩ブロッキングしておいたＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１磁性体ビーズ（１００μＬスラリー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、５００μＬ Ｗａｓｈ緩衝液でＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて２回洗浄後、１００ｎｍｏｌのビオチン化抗原タンパク質を加え、４℃で磁性体ビーズに固定化した。３０分後、５００μＬ Ｗａｓｈ緩衝液でＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３回洗浄後、回収した磁性体ビーズに前吸着処理後の翻訳反応液を加え４℃で１時間ローテーションによって攪拌した。ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって上清を廃棄し、回収した磁性体ビーズに１ｍＬ のＷａｓｈ緩衝液を加え、４℃で５分ローテーションによって攪拌した。この操作を３０回繰り返した後、１００μＬ Ｅｌｕｔｉｏｎ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ, ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ）を回収した磁性体ビーズに加え、４℃で１０分静置する事によって、複合体を磁性体ビーズから遊離させた。ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって上清を回収し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ（ＱＩＡＧＥＮ）によってｍＲＮＡを回収、精製した。
【００４８】
ＲＴ−ＰＣＲ
回収したｍＲＮＡはＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）によってｃＤＮＡとした後、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＲＴ−ＰＣＲ(トータル２５０μＬ、変性：９４℃、１０秒、アニーリング：５８℃, ３０秒、伸長：６８℃、６０秒、３５サイクル)を行った。なお、使用したプライマーを以下に示す。
逆転写リバースプライマー：Ｃ−ｔｅｒｍ Ｒ（配列番号１２: GTCAGACGATTGGCCTTGATATTC）、
PCRプライマー：5’プライマー（配列番号１０: gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctag）及びＣ−ｔｅｒｍ Ｒ（配列番号１２: GTCAGACGATTGGCCTTGATATTC）
ＲＴ−ＰＣＲ後の反応液は１％アガロースを使用して電気泳動し、対応するサイズのバンドを切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【００４９】
リボソームディスプレイ用遺伝子の再構築
セカンドラウンド以降のリボソームディスプレイ用遺伝子の再構築は以下のように行った。ＲＴ−ＰＣＲ後の精製遺伝子、５’ＵＴＲ、ｇ３ｐ遺伝子のそれぞれを１ｐｍｏｌ、５’プライマー（配列番号１０: gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctag）１０ｐｍｏｌ、プライマーＳｅｃＭｓｔｏｐ（配列番号１１: ggattagttattcattaggtgaggcgttgagg）１０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を含むＰＣＲ反応液（トータル２５０μＬ）を調製し、１５サイクルのＰＣＲ反応(変性：９４℃,１０秒、アニーリング：５８℃, ３０秒、伸長：６８℃,６０秒)を実行した後、１％アガロースを用いた電気泳動によって、すべての遺伝子がつながったバンドを確認後、そのバンドを切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。
【００５０】
サブクローニング
４ラウンド後、回収した遺伝子を大腸菌発現ベクターｐＥＴ−ＭａｌＳｔｒｅｐ（図３）にクローニングした。すなわち、４ラウンドのＲＴ−ＰＣＲの後、５’側にＥｃｏＲＩを導入したプライマーＥｃｏ１−（−Ｍ）−ＦＬＡＧ＿Ｆ（配列番号１３: CCgaattcGACTATAAAGATGACGATGACAAAggC）、３’側にＨｉｎｄＩＩＩを導入したプライマーＲＮＦ８−Ｈｉｎｄ３＿Ｒ（配列番号１４: ggAAGCTTattCttttcAatcatttgAtcattc）、及びＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴＯＹＯＢＯ）を含む反応液（トータル１００μＬ）を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液を２０サイクルの増幅(変性：９４℃,１０秒、アニーリング：５８℃, ３０秒、伸長：６８℃,６０秒)に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。精製した遺伝子１μｇおよび発現ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、１時間処理し、１％アガロースを使用した電気泳動によって対応するバンドを確認後、そのバンドを切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。インサート遺伝子とベクター遺伝子を３:１（モル比）で混合し、ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、室温で３０分反応後、予め調製（Ｚ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ.Ｃｏｌｉ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ：ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ）しておいた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン（終濃度 ５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天プレート上で３７℃、一晩培養した。
【００５１】
ＥＬＩＳＡによる抗原結合タンパク質の１次スクリーニング
一晩培養した後、ＬＢ寒天プレートから９５個のシングルコロニーをアンピシリン（終濃度 ５０μｇ／ｍＬ）を含む１００μＬの２×ＹＴ培地に植菌し、３７℃で３−５時間培養（ＯＤ６００＝０．５−０．８）後、ＩＰＴＧ(終濃度０．１ｍＭ)を添加し、２５℃、一晩培養した。培養した大腸菌溶液１０μＬに、９０μＬのＰＢＳおよび４０μＬの溶菌試薬（２０μＬ ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ：Ｎｏｖａｇｅｎ、２０μＬ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ溶液 ２．５ｍｇ／ｍＬ）を加え、室温で１時間溶菌した。溶菌した溶液に１２．５％スキムミルク溶液（ＰＢＳ）を４０μＬ加え、室温で１時間ブロッキングした。平行して、１ｗｅｌｌ当たり１００ｎｇ／２０μＬで抗原タンパク質を４℃で一晩固定しておいた３８４穴プレートを１００μＬ ＰＢＳで２回洗浄し、５％ スキムミルク溶液（ＰＢＳ）を１００μＬ加え、室温で１時間ブロッキングした後、１００μＬ ＰＢＳで２回洗浄して抗原固定プレートとした。このプレートにブロッキング済みの大腸菌抽出液を２０μＬ加え、室温でプレートミキサーを使用して緩やかに攪拌した。１時間後、１００μＬ ＰＢＳで５回プレートを洗浄し、２０μＬ（１：２０００希釈）のａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２−ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）を加えて室温で１時間プレートミキサー上で緩やかに攪拌した。さらにプレートを１００μＬ ＰＢＳで５回洗浄し、２０μＬの発色基質（０．４ｍｇ／ｍＬ  ３,３’,５,５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ, ０．０１％過酸化水素）によって検出した。室温で１５分間反応させた後、２０μＬの２Ｎ ＨＣｌを加えて反応を停止させ、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５２】
ＤＮＡ配列解析
ＥＬＩＳＡ解析でポジティブであったクローンについてＤＮＡ配列を解析した。各ＥＬＩＳＡポジティブクローンを培養し、プラスミドを回収（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ＭｉｎｉＰｒｅｐ ｋｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ）してＤＮＡ配列解析に供した。その際に使用したシーケンス用プライマーはｐＥＴ−ＭＡＬｓｅｑＦ:（配列番号１５: CCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATC）であった。
【００５３】
抗原結合クローンの発現と精製
結合活性が確認された各クローンを、アンピシリン（終濃度 ５０μｇ／ｍＬ）を含む２００ ｍＬの２×ＹＴ培地に植菌し、３７℃で３−５時間培養（ＯＤ６００＝０．５−０．８）後、ＩＰＴＧ(終濃度０．１ ｍＭ)を添加し、２５℃で一晩培養した。培養した大腸菌を遠心分離機によって回収し、６０ｍＬのＬｙｓｉｓバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ ７．５, ５００ ｍＭ ＮａＣｌ, １０ ｍＭ β−メルカプトエタノール, ５ｍＭ ＭｇＳＯ４, １０Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ）で再懸濁し、超音波破砕機（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＵＳＤ−２５０）によって破砕した。遠心分離によって上清を回収し、０．２２μｍのフィルターを通した後、ＭＢＰＴｒａｐ（５ｍＬ×２本、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるアフィニティー精製（ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ, ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を行った。精製後、タンパク質溶液を透析膜を用いてＰＢＳにバッファー交換した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単一バンドであることを確認し、ＢＣＡプロテインアッセイキット（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて濃度を決定した。
【００５４】
抗原結合クローンの比活性比較（ＥＬＩＳＡ）
ＰＢＳで希釈した精製した各結合クローン（５００ｎｇ／ｗｅｌｌ）を予め抗原を固定した３８４穴プレートに加え、上述したＥＬＩＳＡ(１次スクリーニングＥＬＩＳＡ)と同様の方法によって、結合クローンの結合比活性を比較した。
【００５５】
抗原結合クローンの親和性測定
精製した各クローンの親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００システムを使用して測定し、すべての操作はＢｉａｃｏｒｅの取扱説明書に従った。なお、ビオチン化した抗原タンパク質（Ｅｒｋ２及びチオレドキシン）のセンサーチップへの固定は、ストレプトアビジンを介したＳＡ センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して行った。
【００５６】
精製したＥｒｋ２結合クローンタンパク質による組換えＥｒｋ２タンパク質の免疫沈降実験
６ｗｅｌｌプレートで予め培養しておいたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含むＰＢＳ  ５００μＬを加えて４℃、１０分間インキュベートして細胞を溶解させた。これをｘ１００００ｇで１０分間の遠心分離し、得られた上清を細胞溶解液として使用した。５０μＬの細胞溶解液に５μｇのＥｒｋ２タンパク質と１０μｇのＥｒｋ２結合クローン（Ｅｒｋ２ ｃｌｏｎｅ Ｎ）又はコントロールクローン（Ｔｒｘ ｃｌｏｎｅ Ａ）を加えた。得られた溶液に４０μｌ の洗浄（５００μＬ ＰＢＳ×３回）済みＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｇａｒｏｓｅ Ｒｅｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を加えて室温でローテーションにより緩やかに攪拌した。１時間後、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＲｅｓｉｎを回収し、５００μＬ ＰＢＳで３回洗浄した後、５０μＬのＦＬＡＧ Ｐｅｐｔｉｄｅ溶液（５００μｇ／ｍＬ）を加えて、結合複合体を室温で５分間溶出した。最後にＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して上清を回収し、それらのうち１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、１μＬをウエスタンブロットで解析した。ウエスタンブロットは、１次抗体に１：１０００希釈した抗ＥＲＫ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２次抗体に１：１００００希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と１：１００００希釈したａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２−ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。検出は、ＥＣＬ ａｄｖａｎｃｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて標準の方法で行った。
【００５７】
哺乳動物細胞内発現Ｅｒｋ２結合クローンによる内在性Ｅｒｋ１／２の免疫沈降実験
ｐｃＤＮＡ３．１−ＲＮＦ８−Ｖ５／Ｈｉｓ哺乳動物細胞発現プラスミドの調製：図４
発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ ／ ＸｈｏＩサイトにＲＮＦ８の各クローン（Ｔｒｘ ｃｌｏｎｅ Ａ, Ｅｒｋ２ ｃｌｏｎｅ Ａ, Ｅｒｋ２ ｃｌｏｎｅ Ｃ, Ｅｒｋ２ ｃｌｏｎe Ｎ）のＤＮＡ断片を挿入することによりｐｃＤＮＡ３．１−ＲＮＦ８−Ｖ５／Ｈｉｓを作製した（各ＲＮＦ８断片の３’末端にＳａｌＩを付加し、ベクターのＸｈｏＩの連結させた）。制限酵素サイトを付加した各ＲＮＦ８クローンのＤＮＡ断片はＥｃｏＲＩ−ＲＮＦ８−ｆｏｒ（配列番号１６: ５’− gccgaattcaccatgggcgagcctggcttcttcgtc −３’）及びＳａｌＩ−ＲＮＦ８−ｒｅｖ（配列番号１７: ５’− gccgtcgacattcttttcaatcatttgatc −３’）のプライマーセットを使用するＰＣＲ反応（ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ＴＯＹＯＢＯ、変性：９４℃,１０秒、アニーリング：５８℃, ３０秒、伸長：６８℃,６０秒、サイクル：３０回)により作製した。各ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した後、制限酵素処理を行った。制限酵素処理済みのＤＮＡ断片は１％アガロースゲル電気泳動を行い、対応するバンドを切り出した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製を行った。精製済みのベクターおよびインサートのＤＮＡ断片はＴａＫａＲａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ （ＴａＫａＲａ）を用いて標準の方法でライゲーションを行った。ライゲーション産物は大腸菌ＴＧ１ Ｆ−にトランスフォームし、得られたコロニーを培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ＭｉｎｉＰｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドの回収を行った。
【００５８】
発現したＥｒｋ２結合クローンによる内在性ＥＲＫ１／２のプルダウン
６ｗｅｌｌプレートでＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐｃＤＮＡ３．１−ＲＮＦ８−Ｖ５／Ｈｉｓをトランスフェクトし、２４時間後に培地を廃棄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ イミダゾール及びプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含むＰＢＳ  ５００μＬを加えて４℃、１０分間インキュベートして細胞を溶解させた。これをｘ１００００ｇで１０分間の遠心分離し、得られた上清を細胞溶解液として使用した。ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ （ＴａＫａＲａ） １０μＬを細胞溶解液に加えた。４℃で２時間インキュベートした後、レジンを５００μＬ ＰＢＳで５回洗浄した。洗浄済みのレジンに２０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８, ２％ＳＤＳ, ５％ β−メルカプトエタノール, １０％グリセロール, 少量のＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ)を加えた。この混合物を煮沸した後、１０μＬをウエスタンブロットの解析サンプルとして用いた。ウエスタンブロットは、１次抗体に１：１０００希釈した抗ＥＲＫ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２次抗体に１：１００００希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。検出は、ＥＣＬ ａｄｖａｎｃｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて標準の方法で行った。
【００５９】
ｐＣＳ２−ＲＮＦ８−ＥＧＦＰ哺乳動物細胞発現プラスミドの調製：図５
はじめにＥＧＦＰのＤＮＡ断片を発現ベクターｐＣＳ２＋のＸｈｏＩ／ＸｂａＩサイトに挿入したプラスミドを構築した。さらに、このプラスミドのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトに各クローン（Ｔｒｘ ｃｌｏｎｅ Ａ, Ｅｒｋ２ ｃｌｏｎｅ Ｃ, Ｅｒｋ２ ｃｌｏｎｅ Ｎ）のＤＮＡ断片を挿入することによりｐＣＳ２−ＲＮＦ８−ＥＧＦＰを作製した（ＲＮＦ８断片の３’末端にＳａｌＩを付加し、ベクターのＸｈｏＩの連結させた）。制限酵素サイトを付加したＥＧＦＰのＤＮＡ断片はＸｈｏＩ−ＥＧＦＰ−ｆｏｒ（配列番号１８: ５’−gccctcgaggtgagcaagggcgaggagctg−３’）及びＸｂａＩ−ＥＧＦＰ−ｒｅｖ（配列番号１９: ５’ −gcctctagattacttgtacagctcgtccat−３’）のプライマーセット、制限酵素サイトを付加した各ＲＮＦ８クローンのＤＮＡ断片はＥｃｏＲＩ−ＲＮＦ８−ｆｏｒ（配列番号１６: ５’−gccgaattcaccatgggcgagcctggcttcttcgtc−３’）及びＳａｌＩ−ＲＮＦ８−ｒｅｖ（配列番号１７: ５’−gccgtcgacattcttttcaatcatttgatc−３’）のプライマーセットを使用するＰＣＲ反応（ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ＴＯＹＯＢＯ、変性：９４℃,１０秒、アニーリング：５８℃, ３０秒、伸長：６８℃,６０秒、サイクル：３０回)により作製した。各ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、制限酵素処理した。制限酵素処理済みのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動に供し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。精製済みのベクターおよびインサートのＤＮＡ断片はＴａＫａＲａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ）を用いて標準の方法でライゲーションした。ライゲーション産物は大腸菌ＴＧ１ Ｆ−にトランスフォームし、得られたコロニーを培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ＭｉｎｉＰｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドの回収を行った。
【００６０】
次にＥＧＦＰのＣ末端にＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原由来の核移行シグナル（ＮＬＳ）を付加したＤＮＡ断片を発現ベクターｐＣＳ２＋のＸｈｏＩ／ＸｂａＩサイトに挿入したプラスミドを構築した。さらに、このプラスミドのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトにＲＮＦ８の各クローン（Ｔｒｘ ｃｌｏｎｅＡ,Ｅｒｋ２ ｃｌｏｎｅ Ａ, Ｅｒｋ２ ｃｌｏｎｅ Ｃ, Ｅｒｋ２ ｃｌｏｎe Ｎ）のＤＮＡ断片を挿入することによりｐＣＳ２−ＲＮＦ８−ＥＧＦＰ−ＮＬＳを作製した（ＲＮＦ８断片の３’末端にＳａｌＩを付加し、ベクターのＸｈｏＩの連結させた）。制限酵素サイトを付加したＥＧＦＰ−ＮＬＳのＤＮＡ断片はＸｈｏＩ−ＥＧＦＰ−ｆｏｒ（配列番号１８: ５’− gccctcgaggtgagcaagggcgaggagctg −３’）及びＸｂａＩ−ＥＧＦＰ−ＮＬＳ−ｒｅｖ（配列番号２０: ５’−gcctctagatcataccttgcgcttcttctttggcggcttgtacagctcgtccatgcc −３’）のプライマーセット、制限酵素サイトを付加した各ＲＮＦ８クローンのＤＮＡ断片はＥｃｏＲＩ−ＲＮＦ８−ｆｏｒ（配列番号１６: ５’− gccgaattcaccatgggcgagcctggcttcttcgtc −３’）及びＳａｌＩ−ＲＮＦ８−ｒｅｖ（配列番号１７: ５’− gccgtcgacattcttttcaatcatttgatc −３’）のプライマーセットを使用するＰＣＲ反応（ＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ＴＯＹＯＢＯ、変性：９４℃,１０秒、アニーリング：５８℃, ３０秒、伸長：６８℃,６０秒、サイクル：３０回）により作製した。制限酵素処理を行ったＤＮＡ断片をアガロース電気泳動に供し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。精製済みのベクターおよびインサートのＤＮＡ断片はＴａＫａＲａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ）を用いて標準の方法でライゲーションした。ライゲーション産物は大腸菌ＴＧ１ Ｆ−にトランスフォームし、得られたコロニーを培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ＭｉｎｉＰｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドの回収を行った。
【００６１】
ＲＮＦ８人工抗体の哺乳類細胞内での発現
哺乳類培養細胞であるＨＥＫ２９３Ｔを１０％ ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で３７℃、５％ＣＯ２供給下で培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて標準の方法により、ｐＣＳ２−ＲＮＦ８−ＥＧＦＰ又はｐＣＳ２−ＲＮＦ８−ＥＧＦＰ−ＮＬＳで細胞をトランスフェクトした。
【００６２】
Ｅｒｋ２抗原結合クローンによる細胞内Ｅｒｋ２リン酸化活性の阻害実験
２４ｗｅｌｌプレートを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｐＣＳ２−ＲＮＦ８−ＥＧＦＰでトランスフェクトし、２４時間後に終濃度１００ｎＭ ＰＭＡを加えて３７℃で３０分間インキュベートした。細胞のＰＭＡ処理後、直ちに培地を廃棄し、１００μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８, ２％ ＳＤＳ, ５％ β−メルカプトエタノール, １０％グリセロール, 少量のＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ）を加えて細胞を溶解した。この細胞溶解液を煮沸した後、１５μＬをウエスタンブロットの解析サンプルとして用いた。１次抗体に抗ｐ９０ＲＳＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗リン酸化Ｓｅｒ３８０ ｐ９０ＲＳＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗リン酸化Ｔｒｅ３５９／Ｓｅｒ３６３ ｐ９０ＲＳＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び抗リン酸化Ｔｒｅ５７３ ｐ９０ＲＳＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用い、いずれの抗体も希釈倍率は１：１０００で使用した。また、２次抗体には１：１００００希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。検出は、ＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて標準の方法で行った。
【００６３】
ＲＮＦ８人工抗体およびＥｒｋ１およびＥｒｋ２（Ｅｒｋ１／２）の細胞内局在の観察
ｐＣＳ２−ＲＮＦ８−ＥＧＦＰ−ＮＬＳでトランスフェクションした２４時間後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４％ＰＦＡで室温、１５分間のインキュベートにより固定した後、５００μＬ ＰＢＳで３回洗浄した。これに５００μＬ ０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳを加えた後、室温で５分間インキュベートすることで膜透過処理を行い、５００μＬ ＰＢＳで３回洗浄を行った。次に５００μＬ １０％ＦＣＳ／ＰＢＳを加え、室温で３０分間ブロッキングを行った。Ｅｒｋ１／２を染色するために、１次抗体として抗ＥＲＫ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を１０％ＦＣＳ／ＰＢＳで１：５０希釈した溶液を用いて室温で１時間、第一の反応を行い、５００μＬ ＰＢＳで３回洗浄した。２次抗体としてＡｌｅｘａ５５５標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０％ＦＣＳ／ＰＢＳで１：５００希釈した溶液を用いて室温で１時間、第二の反応を行い、ＰＢＳで３回洗浄した。最後にＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を添加したＰＢＳを加えて蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ ＩＸ７０）にてＥＧＦＰ（ＲＮＦ８）、ＥＲＫおよび核の三重染色像を観察した。
【００６４】
結果及び考察
選択された抗原結合タンパク質の配列解析
リボソームディスプレイによるインビトロセレクション後の１ｓｔスクリーニングＥＬＩＳＡの結果を表１に示す。
【００６５】
【表１】
2013532951.tif 000003
【００６６】
２種類の抗原（Ｅｒｋ２,Ｔｒｘ）ともに良好な結果が得られ、Ｅｒｋ２に対しては９０％に近い確率でポジティブクローンを得る事ができた。これらポジティブクローンについてＤＮＡ配列解析を行い、ポジティブクローンの濃縮効率を調べた。Ｅｒｋ２に関しては、トータルで１４種類の配列の異なるクローンが得られ、約７割がグループＡに属するクローンであった。ここで、グループＡからＭに属するクローンはＬｏｏｐ１からＬｏｏｐ３までがまったく同一のアミノ酸配列を持ち、Ｌｏｏｐ４だけ配列が異なっていた（表２、グループＡ〜Ｎの配列は、それぞれ配列番号２１〜配列番号３４に対応する）。
【００６７】
【表２】
2013532951.tif 000004
【００６８】
この傾向はＴｒｘの場合においても観察された（表３、グループＡ〜Ｈの配列は、それぞれ配列番号３５〜配列番号４２に対応する）。これらの８種類の異なるクローンの内、グループＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦはＬｏｏｐ１からＬｏｏｐ３までが同一配列を持っていた。これらの結果より、本発明の人工抗体は主にＬｏｏｐ１からＬｏｏｐ３を使ってターゲットを認識している事が考えられる。
【００６９】
【表３】
2013532951.tif 000005
【００７０】
また、選択された各種クローンの結合比活性を比較する目的で、Ｅｒｋ２結合クローンから１回以上得られたクローン（グループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＮ）と単独のクローン（グループＪ）、およびＴｒｘ結合クローン（グループＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、及びＨ）を発現させ、精製した。ほとんどのクローンで、最終精製量は約２００−２５０ｍｇ／Ｌ（２×ＹＴ培地）の良好な回収量で得ることができた。
【００７１】
次に、精製したすべての結合クローンを５００ｎｇ／ｗｅｌｌで調製し、ＥＬＩＳＡによる結合活性を比較した（表４）。
【００７２】
【表４】
2013532951.tif 000006
【００７３】
Ｅｒｋ２の場合、グループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＪはＬｏｏｐ１からＬｏｏｐ３までが同じアミノ酸配列であるにもかかわらず、グループＡ、Ｂ、及びＪとグループＣ及びＤとの間に明らかな比活性の差が認められた。Ｔｒｘの場合においても同様の結果が得られ、Ｌｏｏｐ１からＬｏｏｐ３が同一のアミノ酸配列であるグループＡ、Ｃ、及びＤの内、グループＣ及びＤは明らかに比活性が低かった。これらの結果は、本発明の人工抗体のＬｏｏｐ４はターゲットとの親和性に大きく影響を及ぼしている事を示唆している。
【００７４】
Ｅｒｋ２結合クローンの親和性測定
Ｅｒｋ２結合クローン（ｃｌｏｎｅ Ｎ）について、ＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ）によって親和性を解析した結果、Ｋｄ＝３０ｎＭの一般的な抗体と同等の親和性を持つ事が確認された（図６）。
【００７５】
精製したＥｒｋ２結合クローンによる組換えＥｒｋ２の免疫沈降
精製したＥｒｋ２結合クローン（Ｃｌｏｎｅ Ｎ）の抗原特異性を検討する目的で、哺乳動物細胞抽出液に組換えＥｒｋ２タンパク質を加えて、Ｅｒｋ２結合クローンによる免疫沈降実験を行った（図７）。まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、Ｅｒｋ２結合クローンを加えた場合、Ｅｒｋ２タンパク質の分子量に相当する位置で１本のバンドが認められ、その他非特異的なバンドは検出されなかった。また、ウエスタンブロットの結果、検出されたバンドがＥｒｋ２タンパク質である事が確認された。これらの結果より、細胞抽出液中でＥｒｋ２結合クローンは厳密にＥｒｋ２タンパク質を認識している事が確認された。
【００７６】
哺乳動物細胞内で発現したＥｒｋ２結合クローンによる内在性Ｅｒｋの免疫沈降
次に、精製したタンパク質による免疫沈降実験ではなく、Ｅｒｋ２結合クローンの遺伝子を細胞内に導入し、内在性Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２（Ｅｒｋ１／２）の免疫沈降を検討した（図８）。Ｅｒｋ２結合クローン遺伝子を導入した場合、内在性Ｅｒｋ１／２のバンドがはっきりと確認され、コントロールであるＴｒｘ結合クローン遺伝子を導入した細胞においてはバンドは確認されなかった。
【００７７】
この結果より、ＲＮＦ８人工抗体は細胞内で安定に発現し、また、高い機能性を持つことが証明された。一般的に、免疫沈降は界面活性剤等で細胞を破壊し、その細胞抽出液に精製した抗体タンパク質を加える事で実行される。この方法では、対象となるターゲットごとに抗体を精製する必要があり、スループット性が極めて低い。また、細胞抽出液からの免疫沈降であるため、より自然な細胞内環境を反映した結果を得る事はできない。本発明のＲＮＦ８人工抗体は、これらの問題がなく、加えて、様々な細胞の状態（細胞周期、薬剤投与など）に合わせたまったく新しい免疫沈降法を可能にする。
【００７８】
Ｅｒｋ２抗原結合クローンによる細胞内Ｅｒｋ２リン酸化活性の阻害実験
図９に示したようにＥｒｋ１およびＥｒｋ２（Ｅｒｋ１／２）は、ｐ９０ＲＳＫ、Ｃ−Ｍｙｃ、及びＥｌｋ１をリン酸化するシグナル伝達因子である。この点を念頭に置き、Ｅｒｋ２結合クローンがＥｒｋと結合する事で、ｐ９０ＲＳＫとの相互作用を阻害（ｐ９０ＲＳＫのリン酸化阻害）できるかどうかを調べるために実験を行った（図１０）。
【００７９】
その結果、Ｅｒｋ２結合ＲＮＦ８人工ポリペプチドを導入した場合、明らかなｐ９０ＲＳＫのリン酸化抑制が検出され、ＲＮＦ８人工抗体は細胞内でＥｒｋの活性を強く阻害していることが確認され、イントラボディとしての機能性が極めて高いことが証明された。細胞内には一般的な抗体医薬では対応できなかった様々な疾患の要因とされるタンパク質が多く知られており、それゆえに、ＲＮＦ８人工抗体は、基礎研究のみならず、これらのタンパク質をターゲットとした新規医薬の開発にも応用することが可能である。
【００８０】
Ｅｒｋ２結合ポリペプチドによる内在性Ｅｒｋの局在制御
Ｅｒｋ２に結合するクローンに核移行シグナル（ＮＬＳ）を導入し、これらを細胞内で発現させて、内在性Ｅｒｋの局在化を観察した（図１１）。まず、ＥＧＦＰを観察した。すべての結合クローンの核内への局在が認められた。次に、抗Ｅｒｋ抗体によって内在性Ｅｒｋを観察した。Ｅｒｋ２結合クローンを導入したすべての細胞で内在Ｅｒｋの核内への移行が認められ、コントロールであるＴｒｘ結合分子を導入した細胞においては、内在性Ｅｒｋの核内移行は認められなかった。
【００８１】
この結果より、Ｅｒｋ２結合ポリペプチドによる細胞質に存在する内在性Ｅｒｋの核内への共移行性が確認され、ターゲットタンパク質の細胞内局在を自由にコントロールできることが証明された。抗体をベースとしたイントラボディの場合で、ＥＲ残留 ｓｉｇｎａｌ（ＳＥＫＤＥＬ）の付加によって、イントラボディのＥＲへの局在を制御できることが知られており[Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1993), vol.90, pp.7889-7893]、ＲＮＦ８人工抗体にある種の移行シグナルを付加する事によって（核外移行シグナル：ＮＥＳ、核小体移行シグナル：ＮＯＳ、ミトコンドリアマトリックス移行シグナル：ＭＴＳ、ペルオキシソーム移行シグナル：ＰＴＳなど）、様々な部位への局在を制御（場合によってはターゲット複合体として）する事が可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００８２】
配列番号２  オリゴヌクレオチド
配列番号３  オリゴヌクレオチド
配列番号４  オリゴヌクレオチド
ｎは任意の塩基を表す。
ｓはグアニン又はシトシンを表す。
配列番号５  オリゴヌクレオチド
ｎは任意の塩基を表す。
ｓはグアニン又はシトシンを表す。
配列番号６  オリゴヌクレオチド
ｎは任意の塩基を表す。
ｓはグアニン又はシトシンを表す。
配列番号７  オリゴヌクレオチド
配列番号１０  オリゴヌクレオチド
配列番号１１  オリゴヌクレオチド
配列番号１２  オリゴヌクレオチド
配列番号１３  オリゴヌクレオチド
配列番号１４  オリゴヌクレオチド
配列番号１５  オリゴヌクレオチド
配列番号１６  オリゴヌクレオチド
配列番号１７  オリゴヌクレオチド
配列番号１８  オリゴヌクレオチド
配列番号１９  オリゴヌクレオチド
配列番号２０  オリゴヌクレオチド
配列番号２１  タンパク質
配列番号２２  タンパク質
配列番号２３  タンパク質
配列番号２４  タンパク質
配列番号２５  タンパク質
配列番号２６  タンパク質
配列番号２７  タンパク質
配列番号２８  タンパク質
配列番号２９  タンパク質
配列番号３０  タンパク質
配列番号３１  タンパク質
配列番号３２  タンパク質
配列番号３３  タンパク質
配列番号３４  タンパク質
配列番号３５  タンパク質
配列番号３６  タンパク質
配列番号３７  タンパク質
配列番号３８  タンパク質
配列番号３９  タンパク質
配列番号４０  タンパク質
配列番号４１  タンパク質
配列番号４２  タンパク質
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明のＲＮＦ８−ＦＨＡドメイン改変タンパク質の製造方法は、例えば、生化学産業や医薬産業において利用されうる。
【００８４】
本出願は日本で出願された特願２０１０−１５９２２７（出願日：２０１０年７月１４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図２】
2013532951.tif 000007
【図１】
2013532951.tif 000008
【図３】
2013532951.tif 000009
【図４】
2013532951.tif 000010
【図５】
2013532951.tif 000011
【図６】
2013532951.tif 000012
【図７】
2013532951.tif 000013
【図８】
2013532951.tif 000014
【図９】
2013532951.tif 000015
【図１０】
2013532951.tif 000016
【図１１】
2013532951.tif 000017
【配列表】
2013532951000001.app
【国際調査報告】
2013532951.tif 000018
2013532951.tif 000019
2013532951.tif 000020