(57)【要約】  変異型Ｆｃ領域を含むモノマーポリペプチド及びその使用方法が提供される。いくつかの実施形態では、モノマーポリペプチドは融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、モノマーポリペプチドは抗体である。【選択図】  図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンＦｃ領域を含むポリペプチドであって、該Ｆｃ領域が、Ｆｃ領域の二量体形成を阻害する１つ以上のアミノ酸置換を含む、前記ポリペプチド。
【請求項２】
標識特異的結合部分をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記標的特異的結合部分が、以下：
（ｉ）結合して、標的特異的結合部分を形成する免疫グロブリン軽鎖可変領域と免疫グロブリン重鎖可変領域；
（ｉｉ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）；及び
（ｉｉｉ）タンパク質スカフォールド
からなる群から選択される、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、治療用ポリペプチドに融合した免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、モノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸置換が、Ｆｃ領域のＣＨ３界面内又はその近傍にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ＣＨ３界面内又はその近傍にある前記アミノ酸置換が、Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付け体系に従う以下のアミノ酸：３４７、３４９、３５０、３５１、３５２、３５４、３５６、３５７、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３９０、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１１及び４３９の１つ以上での置換である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
１つ以上のアミノ酸が、以下：
（ｉ）陽荷電側鎖を有するアミノ酸；
（ｉｉ）陰荷電側鎖を有するアミノ酸；
（ｉｉｉ）親水性側鎖を有するアミノ酸；
（ｉｖ）大きな側鎖を有するアミノ酸
からなる群から選択されるアミノ酸で置換される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ免疫グロブリンに由来する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ免疫グロブリンに由来する、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記Ｆｃ領域が、マウスＩｇＧ免疫グロブリンに由来する、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４免疫グロブリンに由来する、請求項９又は１０に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記アミノ酸置換が、Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付け体系に従う以下のアミノ酸位置：３４９、３５１、３５４、３５６、３５７、３６４、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９９、４０５、４０７、４０９及び４３９の１つ以上での置換である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
以下のアミノ酸位置：３５１、３５６、３５７、３６４、３６６、３６８、３９４、３９９、４０５及び４０７の１つ以上が、陽荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
以下のアミノ酸位置：３４９、３５１、３９４、４０７及び４３９の１つ以上が、陰荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
以下のアミノ酸位置：３５７、３６４、３６６、３６８、及び４０９の１つ以上が、大きな側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
以下のアミノ酸位置：３６６、４０５及び４０７の１つ以上が、親水性側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
アミノ酸位置４０５が、陽荷電側鎖又は親水性側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸位置３５１が、陽荷電側鎖又は陰荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
アミノ酸位置３５７が、陽荷電側鎖又は大きな側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸位置３６４が、陽荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
アミノ酸位置３６６が、陽荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
アミノ酸位置３６８が、陽荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
アミノ酸位置３９４が、陽荷電側鎖又は陰荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
アミノ酸位置３９９が、陽荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
アミノ酸位置４０７が、陽荷電側鎖又は陰荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
アミノ酸位置４０９が、大きな側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
（ｉ）陽荷電側鎖を有する前記アミノ酸が、アルギニン、ヒスチジン及びリシンから選択され；
（ｉｉ）陰荷電側鎖を有する前記アミノ酸が、アスパラギン酸及びグルタミン酸から選択され；
（ｉｉｉ）親水性側鎖を有する前記アミノ酸が、グルタミン、アスパラギン、セリン及びトレオニンから選択され；及び
（ｉｖ）大きな側鎖を有する前記アミノ酸が、トリプトファン、フェニルアラニン及びチロシンから選択される、
請求項１３〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記Ｆｃ領域が、以下のアミノ酸置換：Ｌ３５１Ｒ、Ｌ３５１Ｄ、Ｅ３５７Ｒ、Ｅ３５７Ｗ、Ｓ３６４Ｒ、Ｔ３６６Ｒ、Ｌ３６８Ｒ、Ｔ３９４Ｒ、Ｔ３９４Ｄ、Ｄ３９９Ｒ、Ｆ４０５Ｒ、Ｆ４０５Ｑ、Ｙ４０７Ｒ、Ｙ４０７Ｄ、Ｋ４０９Ｗ及びＲ４０９Ｗの１つ以上を含む、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記Ｆｃ領域が、二量体形成を阻害する少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記Ｆｃ領域が、二量体形成を阻害する少なくとも３つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記アミノ酸置換が、以下：Ｙ３４９Ｄ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｒ、Ｓ３５４Ｄ、Ｅ３５６Ｒ、Ｄ３５６Ｒ、Ｓ３６４Ｒ、Ｓ３６４Ｗ、Ｔ３６６Ｑ、Ｔ３６６Ｒ、Ｔ３６６Ｗ、Ｌ３６８Ｒ、Ｌ３６８Ｗ、Ｔ３９４Ｄ、Ｔ３９４Ｒ、Ｄ３９９Ｒ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｑ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｑ、Ｙ４０７Ｒ、Ｋ４０９Ｒ、及びＫ４３９Ｄからなる群から選択される、請求項３０又は３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記Ｆｃ領域が、以下のアミノ酸置換のセット：Ｙ３４９Ｄ／Ｓ３５４Ｄ、Ｌ３５１Ｄ／Ｔ３９４Ｄ、Ｌ３５１Ｄ／Ｋ４０９Ｒ、Ｌ３５１Ｒ／Ｔ３９４Ｒ、Ｅ３５６Ｒ／Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３５６Ｒ／Ｄ３９９Ｒ、Ｓ３６４Ｒ／Ｌ３６８Ｒ、Ｓ３６４Ｗ／Ｌ３６８Ｗ、Ｓ３６４Ｗ／Ｋ４０９Ｒ、Ｔ３６６Ｒ／Ｙ４０７Ｒ、Ｔ３６６Ｗ／Ｌ３６８Ｗ、Ｌ３６８Ｒ／Ｋ４０９Ｒ、Ｔ３９４Ｄ／Ｋ４０９Ｒ、Ｄ３９９Ｒ／Ｋ４０９Ｒ、Ｄ３９９Ｒ／Ｋ４３９Ｄ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ｑ／Ｙ４０７Ｑ、及びＴ３６６Ｑ／Ｆ４０５Ｑ／Ｙ４０７Ｑの１つ以上を含む、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、欠失したか又は突然変異したヒンジ領域を有する免疫グロブリン重鎖を含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
少なくとも１２個のアミノ酸が、ヒンジ領域から欠失している、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記突然変異が、少なくとも１つのシステイン残基での欠失又は置換である、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが、非改変ヒンジ領域を有する免疫グロブリン重鎖を含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記免疫グロブリン鎖が、完全にヒトである、請求項５〜３７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記免疫グロブリン鎖が、ヒト化されている、請求項５〜３７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記Ｆｃ領域が、ヒト免疫グロブリン重鎖に由来する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
溶液中に存在する前記ポリペプチドの少なくとも７０％が、モノマーである、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドの少なくとも７０％が、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でモノマーである、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記モノマーポリペプチドの割合（％）が、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ又はＡＵＣによって決定される、請求項４１又は４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項４５】
請求項４４に記載の核酸分子で形質転換した宿主細胞。
【請求項４６】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産する方法であって、前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項４４に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、前記方法。
【請求項４７】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４８】
前記組成物中の少なくとも７０％のポリペプチドがモノマーである、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記モノマーポリペプチドの割合（％）が、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ又はＡＵＣによって決定される、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
医薬剤としての使用を目的とする、請求項４８又は４９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年８月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／３７３，４２１号に対する優先権を請求する。尚、上記文献は、参照としてその全文を本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
２．配列表の参照
本出願は、２０１１年８月３日に作成され、２８，６７２バイトのサイズを有するテキストファイルＭＥＤ０５８５＿ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔとして本出願と一緒に提出された配列表を参照として組み込むものとする。
【０００３】
３．発明の分野
本発明は、変異型Ｆｃ領域を含むモノマーポリペプチド及びそれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
４．発明の背景
ネイティブ抗体及び免疫グロブリンは、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽鎖（Ｌ）と２つの同一の重鎖（Ｈ）とから構成されている。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されており、また重鎖は互いに連結されているが、ジスルフィド結合の数は、様々な免疫グロブリンイソタイプの重鎖間で変動する。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）と軽鎖定常領域（本明細書ではＣＬと略記する）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と、重鎖の３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる重鎖定常領域（ＣＨ）とを含み、これらは、いわゆるヒンジ領域で互いに隔てられている。ヒンジ領域は、通常、１つ以上のシステイン残基を含み、これらの残基は、抗体分子内の他の重鎖のヒンジ領域のシステイン残基とジスルフィド架橋を形成しうる。抗体は、抗体特異的結合部位を含む可変ドメインと、エフェクター機能に関与する定常領域とを有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
５．発明の概要
本発明は、Ｆｃ領域の二量体形成を阻害する１つ以上のアミノ酸置換を有する変異型Ｆｃ領域を含むモノマーポリペプチドに関する。モノマーポリペプチドは、変異型Ｆｃ領域に融合した第２ポリペプチド、例えば、治療用タンパク質又は抗体の抗原結合領域をさらに含んでもよい。例示の実施形態において、モノマーポリペプチドは、変異型Ｆｃ領域を有する重鎖と軽鎖とを含むモノマー抗体である。
【０００６】
本発明は、さらに、本発明のモノマーポリペプチドと担体とを含む製剤を提供する。一実施形態では、上記製剤は、薬学的に許容可能な担体を含む治療製剤である。本発明の製剤は、哺乳動物における疾患／病態を治療する、並びに／又は疾患／病態の１つ以上の症状を予防及び／若しくは軽減する上で有用となりうる。製剤は、こうした治療が必要な患者に投与することができ、ここで、製剤は、本発明の１つ以上のモノマーポリペプチドを含んでもよい。別の実施形態では、製剤は、他の治療薬と組み合わせて、モノマーポリペプチドを含んでもよい。
【０００７】
本発明はまた、本発明のモノマーポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。本発明はさらに、本発明の核酸分子を含む発現ベクターと、本発明の核酸分子で形質転換された宿主細胞も提供する。本発明はさらに、本発明のモノマーポリペプチドを製造する方法であって、前記モノマーポリペプチドの発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含む、方法も提供する。
６．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】野生型ＩｇＧ４  Ｆｃドメイン（パネルＡ）、３６６位（パネルＢ）及び４０７位（パネルＣ）でのＩｇＧ４単一アルギニン突然変異体、並びに３６６／４０７二重アルギニン突然変異体（パネルＤ）について得られたＳＥＣ−ＭＡＬＬＳプロフィールを示す。野生型構築物は、二量体と一致する分子量を有するが、３つの突然変異体は、有意に低い分子量を有する。時間は、ｘ軸に沿って分で示し、モル質量はｙ軸に沿ってモル当たりグラムで示す。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図１Ｃ】図１Ｂの続きである。
【図１Ｄ】図１Ｃの続きである。
【図２Ａ】分析した突然変異型ＩｇＧ４  Ｆｃドメインの選択及び既知野生型二量体（ＷＴ）について得られたものとのプロフィールの比較のためのサイズ排除クロマトグラムを示す。パネルＡは、野生型二量体（矢印で示す）と類似していると思われるサンプルについて得られた多数の波形を示し、パネルＢはモノマー種とさらに共通する特徴を示す突然変異体の収集物を示す。パネルＣは、サンプル、すなわち、５２ｋＤａを超える見掛け分子量の突然変異体から、モノマーと一致する分子量（約２８ｋＤａ）の突然変異体までについて得られた広範な範囲の保持時間を示す。
【図２Ｂ】図２Ａの続きである。
【図２Ｃ】図２Ｂの続きである。
【図３Ａ】野生型と、３つのＩｇＧサブクラスのＴ３６６／Ｙ４０７単一及び二重アルギニン突然変異体Ｆｃドメインについての分析ＳＥＣクロマトグラムを示す。各トレースには名称を付け、カッコ内の数字は、主ピークの中心についての保持時間を分で表す。パネルＡ及びＢは、ＩｇＧ１及び２  Ｆｃドメインをそれぞれ示し、Ｙ４０７Ｒは、いずれのサブクラスについても優勢にモノマーのようであるが、他の突然変異体は、モノマーと二量体の混合集団の兆候を示している。パネルＣは、野生型と比較したＩｇＧ４突然変異体を示し、すべてのサンプルが、右側に有意に移動して、モノマーサンプルを示す単分散分布を呈している。
【図３Ｂ】図３Ａの続きである。
【図３Ｃ】図３Ｂの続きである。
【図４Ａ】野生型（パネルＡ）、Ｙ３４９Ｄ（パネルＢ）及びＴ３９４Ｄ（パネルＣ）ヒンジなしＩｇＧ４  Ｆｃドメインについての沈降速度分析超遠心分離（ＳＶ−ＡＵＣ）クロマトグラムを示す。野生型構築物の主ピークは、ホモ二量体の予想質量と一致する見掛け分子量を有し、Ｙ３４９Ｄ突然変異体の主ピークの見掛け分子量は、これより低く、モノマー−二量体平衡と一致しており、Ｔ３９４Ｄ突然変異体の見掛け分子量は、モノマーと一致している。
【図４Ｂ】図４Ａの続きである。
【図４Ｃ】図４Ｂの続きである。
【図５】１６日の期間にわたる野生型ＩｇＧ４、アグリコシル化一価ＩｇＧ４及びグリコシル化ＩｇＧ４の血漿濃度を示す。水平方向の点線は、定量の下限を示している。
【図６Ａ】ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４並びにマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂのＦｃのＣＨ２（パネルＡ）及びＣＨ３（パネルＢ）領域のアラインメントを示す。ルーラーの番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。図に示したイソタイプ間の違いの他に、ここに示していないが、当該技術分野では周知のアロタイプの違いもある。
【図６Ｂ】図６Ａの続きである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
７．詳細な説明
７．１  概論
本発明は、変異型Ｆｃ領域を含むモノマーポリペプチド及びそれらを使用する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の変異型Ｆｃ領域を含むモノマーポリペプチドは、モノマー抗体、モノマー抗体フラグメント又はモノマー融合タンパク質であってよい。本発明の変異型Ｆｃ領域を含むモノマーポリペプチドは、本明細書において、本発明のポリペプチドとも称される。
【００１０】
抗体は、安定な二量体タンパク質である。免疫グロブリン重鎖同士は、ヒンジでは鎖間ジスルフィド結合によって、また、ＣＨ３ドメインでは非共有結合的相互作用によって連結されている。これは、ほとんどの条件下でほとんどのＩｇＧサブタイプが安定な二量体抗体を形成するのに十分である。しかし、ＩｇＧ４抗体は、鎖内及び鎖間ジスルフィド結合を形成して、アーム交換をもたらすことができる（すなわち、重鎖は分離することができ、２つの異なる抗体からの重鎖が対合して、ヘテロ二量体分子を形成することができる）。
【００１１】
抗体は、治療用途についての主要な注目分野となっており、多数の抗体薬剤が承認されているか、あるいは、治療薬としての使用について承認を得る過程にある。治療用抗体に望まれる特徴は、治療しようとする具体的病態によって変わりうる。ある用途では、二価の完全長抗体又は二価の抗体フラグメントが最も有利であるが、別の用途では、モノマー抗体フラグメントが有利である。抗体は、抗原特異的結合部位を含む可変ドメインと、エフェクター機能に関与する定常ドメインとを有する。いくつかの適応では、抗原結合だけが求められるが、その場合、例えば、抗体の治療効果は、抗原と、ブロックしないと抗原と結合することができる１つ以上の特定の特異的分子との間の相互作用をブロックすることである。他の適応では、さらに別の効果、例えば、補体活性化を誘導する、Ｆｃ受容体に結合する、異化作用から保護する、免疫細胞をリクルートする能力などが求められることがある。こうした用途の場合、抗体分子の他の部分、例えば、定常Ｆｃ領域が有利になりうる。
【００１２】
いくつかの適応では、二量体抗体は、抗体が、Ｆａｂフラグメントとして用いられるときアンタゴニストとして作用するにも関わらず、標的抗原に結合すると、望ましくないアゴニスト効果を呈示する可能性がある。場合によっては、この効果は、二価抗体の「架橋結合」に起因すると考えられるが、架橋結合によって標的二量体化が促進され、これによって、次には、特に標的が受容体である場合、活性化が起こりうる。可溶性抗原の場合には、二量体化は、望ましくない免疫複合体を形成しうる。いくつかの適応では、完全長抗体は大きすぎて、要求される標的身体区画を貫通することができないことがあるため、より小さな抗体フラグメント、例えば、モノマー抗体が必要となりうる。場合によっては、抗原との一価結合（例えば、ＦｃαＲＩの場合）がアポトーシスシグナルを誘導しうる。
【００１３】
候補タンパク質治療薬は、最適な薬物動力学的特性がなかったり、及び／又はエフェクター機能から利益を得ていたりする可能性がある。これらの問題に対処するために、抗体フラグメントのＦｃ領域をタンパク質治療薬に融合してもよい。Ｆｃ領域の付加によって、ポリペプチドのエフェクター機能が増強されると共に、ポリペプチドの薬物動力学的特性（例えば、半減期）が改変される可能性がある。さらに、Ｆｃ領域への融合により、タンパク質治療薬の二量体の形成されるであろう。Ｆｃ領域の二量体化を回避することには、抗体について述べたように、タンパク質融合物の場合と同じ利点がある。
【００１４】
治療薬としての用途のモノマーポリペプチドの作製を促進する、実質的に又は完全にモノマーである変異型Ｆｃドメインを作製すれば、有利であろう。こうした変異型モノマーＦｃドメインは、モノマーＦｃ融合タンパク質を製造する目的で、治療用タンパク質に融合させることができる。あるいは、こうした変異型モノマーＦｃドメインは、一価抗体の作製を可能にし、これによって、前述したように、二量体抗体に関連する望ましくない副作用を回避することができよう。本発明は、これらのユニークかつ有利な特徴を有するモノマー抗体の同定及び特性決定に基づくものである。これらのモノマーポリペプチドについては本明細書で詳しく説明する。
【００１５】
７．２  用語
本発明について詳しく説明する前に、本発明は、特定の組成物又は製造ステップに限定されないことを理解すべきである。というのも、これらは変わりうるからである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられているように、単数形「１つ（ａ、ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文面が明らかに他の意味を示すのでない限り、複数の指示物を含むことは留意すべきである。
【００１６】
別途記載のない限り、本明細書で用いられるすべての技術及び科学用語は、本発明が関連する分野の当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、当業者に、本発明で用いられる用語の多くの一般的辞書を提供する。
【００１７】
アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている３文字略号、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字略号のいずれかによって表記する。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられている１文字符号によって表記する。
【００１８】
抗体の可変ドメイン、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）におけるアミノ酸の番号付けは、別途記載のない限り、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載されているＫａｂａｔ定義に従う。この番号付け体系を用いて、実際の直線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの縮小、又はこれらへの挿入に応じて、より少ない、又は追加のアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従い、残基５２ａ）と、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔに従い、残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含みうる。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体について、「基準」Ｋａｂａｔ番号付け配列を有する抗体の配列の相同性領域でのアラインメントによって決定することができる。フレームワーク残基の最大アラインメントは、往々にして、Ｆｖ領域に用いるために、番号付け体系に「スペーサー」残基の挿入を必要とする。さらに、所与のＫａｂａｔ部位番号でのいくつかの個々の残基の同一性は、種間又は対立遺伝子多様性のために、抗体鎖同士の間で変動しうる。
【００１９】
本明細書で用いるように、「Ｆｃ領域」という用語は、第１定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を指す。従って、Ｆｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの定常領域と、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにこれらドメインに対する可変性ヒンジＮ−末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、Ｆｃ領域は、Ｊ鎖を含みうる。ＩｇＧについては、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣガンマ２及びＣガンマ３（Ｃγ２及びＣγ３）、並びにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動しうるが、ヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、一般に残基Ｅ２１６からそのカルボキシル末端までを含むことが定義されている（ここで、番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う）。本明細書で用いられるように、「ヒンジ領域」とは、ＩｇＧ１のＥ２１６からＰ２３０にわたるＦｃ領域の部分を指す（ここで、番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う）。他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域は、以下の表１に示すのと同じ位置に、重鎖間ジスルフィド結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによって、ＩｇＧ１配列とアラインメントすることができる。
【００２０】
【表１】
2013537416.tif 000003
【００２１】
本発明で用いるように、「抗体」（また、免疫グロブリンとしても知られる）と言う用語は、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体など）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、所望の生物活性を呈示する抗体フラグメント（例えば、抗原結合部分）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）、細胞内抗体、及びこれらのうちいずれかのエピトープ結合フラグメントを包含する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のフラグメント、すなわち少なくとも１つの抗原結合部位を含む分子を包含する。免疫グロブリン分子は、どのイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、サブイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びｇＡ２）又はアロタイプ（例えば、Ｇｍ、例えば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ若しくはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、若しくはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、及びＫｍ（１、２若しくは３））のものであってもよい。抗体は、任意の哺乳動物、例えば、限定するものではないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなど、又はその他の動物、例えば、鳥類（例：ニワトリ）に由来するものでよい。
【００２２】
本発明で用いるように、「モノマータンパク質」又は「モノマーポリペプチド」という用語は、完全に、又は実質的にモノマーである、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％モノマーである変異型Ｆｃ領域を含むタンパク質又はポリペプチドを指す。
【００２３】
本明細書で用いられるように、「モノマー抗体」又は「モノクローナル抗体フラグメント」という用語は、完全に、又は実質的にモノマーである、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％モノマーである変異型Ｆｃ領域を含む抗体を指す。
【００２４】
７．３  モノマーポリペプチド
いくつかの態様では、本発明は、Ｆｃ領域の二量体形成を阻害する１つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失又は挿入）を有する変異型Ｆｃ領域を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域を含む本発明のポリペプチドは、実質的にモノマーであり、例えば、本発明のポリペプチドの少なくとも７０％は、溶液中でモノマーである。例示の実施形態では、変異型Ｆｃ領域を含む本発明のポリペプチドは、実質的にモノマーであり、例えば、本発明のポリペプチドの少なくとも７０％は、濃度０．５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌの溶液中でモノマーである。別の例示の実施形態では、変異型Ｆｃ領域を含む本発明のポリペプチドは、実質的にモノマーであり、例えば、本発明のポリペプチドの少なくとも７０％は、濃度０．５ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌの溶液中でモノマーである。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドの少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％が、溶液中でモノマーである。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドの少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％が、濃度０．５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌの溶液中でモノマーである。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドの少なくとも７０％が、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でモノマーである。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドの少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％が、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でモノマーである。モノマーポリペプチドのパーセントは、当業者には公知の任意の好適な手段、例えば、多角度光散乱検出器（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）及び分析用超遠心機（ＡＵＣ）と組み合わせたサイズ交換クロマトグラフィーによって決定することができる。
【００２５】
変異型Ｆｃ領域は、任意の好適な二量体親Ｆｃ領域に由来するものでよく、例えば、天然に存在するＦｃ領域、多形性Ｆｃ領域配列、改変Ｆｃ領域（例えば、１つ以上の配列改変の導入を有する）、又はキメラＦｃ領域、任意の種由来のＦｃ領域、及び任意の抗体イソタイプのＦｃ領域を含む。様々な実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サル、ネコ、又はイヌ由来の親Ｆｃ領域から誘導したものでよい。例示の実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、ヒト由来の親Ｆｃ領域から誘導したものである。様々な実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＹ抗体由来の親Ｆｃ領域から誘導したものでよい。例としての変異型Ｆｃ領域配列は、ＩｇＧ免疫グロブリンの親Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４免疫グロブリンのＦｃ領域の配列から誘導したものである。具体的実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１の変異型である。別の具体的実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ２の変異型である。別の具体的実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ３の変異型である。さらに別の具体的実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４の変異型である。実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、マウスＩｇＧの変異型である。具体的実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、マウスＩｇＧ１の変異型である。別の実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、マウスＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂの変異型である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、Ｆｃホモ二量体との間の界面を形成する残基に１つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失又は挿入）を含む。例示の実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、Ｆｃホモ二量体の他方の鎖内でそれ自身と相互作用するアミノ酸（自己相互作用残基）の１つ以上の改変を含む。例えば、表６に示す自己相互作用残基を参照されたい。様々な実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、ＣＨ３界面内、ＣＨ３界面付近に１つ以上のアミノ酸改変を含む。様々な実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、ヒンジ領域内に１つ以上のアミノ酸改変を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、ＣＨ３界面を含むが、これは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体由来のＣＨ３界面のアミノ酸配列、又はマウスＩｇＧ２ａ若しくはＩｇＧ２ｂ抗体由来のＣＨ３界面のアミノ酸配列の全部又は一部から誘導されたＣＨ３界面を含む。こうしたマウス及びヒト抗体由来のＣＨ３界面の配列を以下の表２に示す。いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域のＣＨ３界面は、以下の表２に記載したＩｇＧのいずれか１つの少なくとも１６、１７、１８、１９、２０又は全２１アミノ酸を含む配列から誘導したものである。アロタイプ変異がｈＩｇＧ１の３５６位と、ｈＩｇＧ３の３９７位及び４０９位に示されている。各免疫グロブリンクラスのアミノ酸をアラインメントし、図６に示すようにＫａｂａｔ  ＥＵ番号付けに従って番号付けした。この番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１に記載されているヒトＩｇＧ１  Ｋａｂａｔ抗体のＥＵインデックス番号付けを指す。
【００２８】
【表２】
2013537416.tif 000004
【００２９】
いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域のＣＨ３界面内又はその近傍に１つ以上のアミノ酸置換を含む。ＣＨ３界面内又はその近傍における１つ以上のアミノ酸置換は、例えば、Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付け体系に従う以下のアミノ酸：３４７、３４９、３５０、３５１、３５２、３５４、３５６、３５７、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３９０、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１１及び４３９の１つ以上での置換であってよい。例示の実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付け体系に従う以下のアミノ酸位置：３４９、３５１、３５４、３５６、３５７、３６４、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９９、４０５、４０７、４０９、及び４３９の１つ以上でのアミノ酸置換を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、２つのＦｃポリペプチドの間のホモ二量体形成を低減又は排除する親Ｆｃ領域配列に関する１つ以上のアミノ酸置換（例えば、忌避置換（ｒｅｐｅｌｌｉｎｇ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ））を含む。例示の実施形態では、こうした忌避置換は、自己相互作用アミノ酸残基で実施してよい。好適な忌避置換の例として、例えば、荷電側鎖、大きな側鎖又はバルキーな（ｂｕｌｋｙ）側鎖、又は親水性側鎖を有するアミノ酸への置換がある。例えば、親Ｆｃ配列に陽荷電側鎖を有していないアミノ酸残基を、陽荷電側鎖を有するアミノ酸で置換して、変異型Ｆｃ領域を形成することもできる。陽荷電側鎖を有するアミノ酸の例は、アルギニン、ヒスチジン及びリシンから選択することができる。例示の実施形態では、親Ｆｃ領域における以下のアミノ酸位置：３５１、３５６、３５７、３６４、３６６、３６８、３９４、３９９、４０５及び４０７の１つ以上を、陽荷電側鎖を有するアミノ酸で置換することにより、変異型Ｆｃ領域を形成する。あるいは、親Ｆｃ配列に陰荷電側鎖を有していないアミノ酸残基を、陰荷電側鎖を有するアミノ酸で置換して、変異型Ｆｃ領域を形成することもできる。陰荷電側鎖を有するアミノ酸の例は、アスパラギン酸及びグルタミン酸から選択することができる。例示の実施形態では、親Ｆｃ領域における以下のアミノ酸位置：３４９、３５１、３９４、４０７、及び４３９の１つ以上を、陰荷電側鎖を有するアミノ酸で置換することにより、変異型Ｆｃ領域を形成している。これ以外にも、親Ｆｃ配列に親水性側鎖を有していないアミノ酸残基を、親水性側鎖を有するアミノ酸で置換して、変異型Ｆｃ領域を形成してもよい。親水性側鎖を有するアミノ酸の例は、グルタミン、アスパラギン、セリン及びトレオニンから選択することができる。例示の実施形態では、親Ｆｃ領域における３６６位、４０５位及び４０７位のアミノ酸を、親水性側鎖を有するアミノ酸で置換することにより、変異型Ｆｃ領域を形成している。あるいはまた、親Ｆｃ配列に大きな側鎖又はバルキーな側鎖を有していないアミノ酸残基を、大きな側鎖又はバルキーな側鎖を有するアミノ酸で置換して、変異型Ｆｃ領域を形成してもよい。大きな側鎖を有するアミノ酸の例は、トリプトファン、フェニルアラニン及びチロシンから選択することができる。例示の実施形態では、親Ｆｃ領域における以下のアミノ酸位置：３５７、３６４、３６６、３６８、及び４０９の１つ以上を、大きな側鎖を有するアミノ酸で置換することにより、変異型Ｆｃ領域を形成する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、親Ｆｃ領域に関して以下のアミノ酸置換の１つ以上を含む：（ｉ）４０５位のアミノ酸が、陽荷電側鎖又は親水性側鎖を有するアミノ酸で置換されている、（ｉｉ）３５１位のアミノ酸が、陽荷電側鎖又は陰荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、（ｉｉｉ）３５７位のアミノ酸が、陽荷電側鎖又は大きな側鎖を有するアミノ酸で置換されている、（ｉｖ）３６４位のアミノ酸が、陽荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、（ｖ）３６６位のアミノ酸が、陽荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、（ｖｉ）３６８位のアミノ酸が、陽荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、（ｖｉｉ）３９４位のアミノ酸が、陽荷電側鎖又は陰荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、（ｖｉｉｉ）３９９位のアミノ酸が、陽荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、（ｉｘ）４０７位のアミノ酸が、陽荷電側鎖又は陰荷電側鎖を有するアミノ酸で置換されている、（ｘ）４０９位のアミノ酸が、大きな側鎖を有するアミノ酸で置換されている。
【００３２】
いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、親Ｆｃ領域に対する以下のアミノ酸置換の１つ以上を含む：Ｌ３５１Ｒ、Ｌ３５１Ｄ、Ｅ３５７Ｒ、Ｅ３５７Ｗ、Ｓ３６４Ｒ、Ｔ３６６Ｒ、Ｌ３６８Ｒ、Ｔ３９４Ｒ、Ｔ３９４Ｄ、Ｄ３９９Ｒ、Ｆ４０５Ｒ、Ｆ４０５Ｑ、Ｙ４０７Ｒ、Ｙ４０７Ｄ、Ｋ４０９Ｗ及びＲ４０９Ｗ。いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸置換の１つ以上を含む：Ｙ３４９Ｄ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｒ、Ｓ３５４Ｄ、Ｅ３５６Ｒ、Ｄ３５６Ｒ、Ｓ３６４Ｒ、Ｓ３６４Ｗ、Ｔ３６６Ｑ、Ｔ３６６Ｒ、Ｔ３６６Ｗ、Ｌ３６８Ｒ、Ｌ３６８Ｗ、Ｔ３９４Ｄ、Ｔ３９４Ｒ、Ｄ３９９Ｒ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｑ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｑ、Ｙ４０７Ｒ、Ｋ４０９Ｒ、及びＫ４３９Ｄ。
【００３３】
いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、二量体形成を阻害する少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、二量体形成を阻害する少なくとも３つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、二量体形成を阻害する少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、変異型Ｆｃ領域は、親Ｆｃ領域に対する１〜２１、１〜１５、１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２、２〜２１、２〜１５、２〜１０、２〜５、２〜３、３〜２１、３〜１５、３〜１０、３〜５、３〜４、５〜１５、５〜１０、５〜８、５〜６、１０〜２１、１０〜２１、１０〜１５、１０〜１２、１２〜１５、又は１５〜２０のアミノ酸置換を含み、こうして得られる変異型Ｆｃ領域は、親Ｆｃ領域配列と比較して二量体形成が低減又は排除されている。いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、以下のアミノ酸置換のセットの１つ以上を含む：Ｙ３４９Ｄ／Ｓ３５４Ｄ、Ｌ３５１Ｄ／Ｔ３９４Ｄ、Ｌ３５１Ｄ／Ｋ４０９Ｒ、Ｌ３５１Ｒ／Ｔ３９４Ｒ、Ｅ３５６Ｒ／Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３５６Ｒ／Ｄ３９９Ｒ、Ｓ３６４Ｒ／Ｌ３６８Ｒ、Ｓ３６４Ｗ／Ｌ３６８Ｗ、Ｓ３６４Ｗ／Ｋ４０９Ｒ、Ｔ３６６Ｒ／Ｙ４０７Ｒ、Ｔ３６６Ｗ／Ｌ３６８Ｗ、Ｌ３６８Ｒ／Ｋ４０９Ｒ、Ｔ３９４Ｄ／Ｋ４０９Ｒ、Ｄ３９９Ｒ／Ｋ４０９Ｒ、Ｄ３９９Ｒ／Ｋ４３９Ｄ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ｑ／Ｙ４０７Ｑ、Ｌ３５１Ｒ／Ｓ３６４Ｒ／Ｔ３９４Ｒ、及びＴ３６６Ｑ／Ｆ４０５Ｑ／Ｙ４０７Ｑ。いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、アミノ酸置換の任意の組合せを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、ヒンジ領域を含まないか、又は１つ以上の突然変異（アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入など）を有するヒンジ領域を含む。例えば、ヒンジ領域の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、又はそれ以上のアミノ酸が置換されているか、若しくは欠失していてもよいし、又はヒンジ領域の１〜１５、１〜１２、１〜１０、１〜５、１〜３、２〜１５、２〜１２、２〜１０、２〜５、５〜１２、５〜１０、又は５〜８アミノ酸が置換されているか、若しくは欠失していてもよい。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域における少なくとも１つのシステイン残基が、欠失しているか、又は別のアミノ酸、例えば、アラニン、セリン若しくはグルタミンで置換されている。実施形態の一例では、ヒンジ領域のアミノ酸の全部が欠失している。別の実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、非改変ヒンジ領域を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する変異型Ｆｃ領域は、二量体化が低減又は排除された変異型Ｆｃ領域に、別の望ましい機能又は特性を付与する追加的改変を含んでもよい。例えば、本明細書に記載する変異型Ｆｃ領域は、他の公知のＦｃ変異体、例えば、以下の文献に開示されているものと組み合わせてもよい：Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：６３７−４０；Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３−５６４；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：２６５７−２６６２；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：５３−５９；Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７：１５３７−１５４３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９２：１１９８０−１１９８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．４４：１１１−１１７；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ９：１１５−１１９；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ５４：１０１−１０４；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：４９６３−４９６９；Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：２６１３−２６２４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４１７８−４１８４；Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：１９２５−１９３３；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００：１６−２６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：２５７１−２５７５；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１−６６０４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３０：４８７−４９０）；米国特許第５，６２４，８２１号明細書；同第５，８８５，５７３号明細書；同第５，６７７，４２５号明細書；同第６，１６５，７４５号明細書；同第６，２７７，３７５号明細書；同第５，８６９，０４６号明細書；同第６，１２１，０２２号明細書；同第５，６２４，８２１号明細書；同第５，６４８，２６０号明細書；同第６，５２８，６２４号明細書；同第６，１９４，５５１号明細書；同第６，７３７，０５６号明細書；同第７，０８３，７８４号明細書；同第７，１２２，６３７号明細書；同第７，１８３，３８７号明細書；同第７，２１７，７９７号明細書；同第７，２７６，５８５号明細書；同第７，３３２，５８１号明細書；同第７，３５５，００８号明細書；同第７，３３５，７４２号明細書；同第７，３７１，８２６号明細書；同第６，８２１，５０５号明細書；同第６，１８０，３７７号明細書；同第７，３１７，０９１号明細書；同第７，３５５，００８号明細書；米国特許出願公開第２００２／０１４７３１１号明細書；同第２００４／０００２５８７号明細書；同第２００５／０２１５７６８号明細書��同第２００６／０１７３１７０号明細書；同第２００６／０２４２９８号明細書；同第２００６／２３５２０８号明細書；同第２００７／０１３５６２０号明細書；同第２００７／０２２４１８８号明細書；同第２００８／００８９８９２号明細書；並びにＰＣＴ公開番号：国際公開第９４／２９３５１号パンフレット；及び国際公開第９９／５８５７２号パンフレット。
【００３６】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、概して、完全長抗体においてＦｃ領域の両方のコピーに結合することから、本明細書に記載する変異型Ｆｃ領域は、一般に、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）の機能を保持しないようである。このＦｃＲ結合の欠如は、Ｆｃ受容体刺激が望ましくない場合には、抗体又はＦｃ融合タンパク質には有用となりうる。しかし、ＩｇＡ抗体由来の変異型Ｆｃ領域は、受容体がＦｃ単鎖（例えば、Ｆｃモノマー）内のＣα２／Ｃα３界面に結合するため、やはりそのＦｃαＲに結合する可能性がある。さらに、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は１つのＦｃモノマーにのみ結合するが、これは、本発明の変異型Ｆｃ領域が、ＦｃＲｎ結合を十分に保持しうることを示している。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する変異型Ｆｃ領域は、１つ以上のＦｃＲに結合せず、従って、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、及び／又は抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）活性を有していない。別の実施形態では、本明細書に記載する変異型Ｆｃ領域は、ＦｃαＲ結合、ＦｃＲｎ結合、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、又は抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）の低減又は増大をもたらす追加的修飾を有する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する変異型Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎの変異型Ｆｃ領域の結合親和性を増大する追加的修飾を含み、これによって、変異型Ｆｃ領域を含むポリペプチドの血清半減期が増加する。例えば、半減期が増加した本発明のモノマーポリペプチドは、ＦｃとＦｃＲｎ受容体同士の相互作用に関与するものとして識別されるアミノ酸残基を修飾することにより、作製することができる（例えば、米国特許第６，８２１，５０５号明細書及び同第７，０８３，７８４号明細書；並びに国際公開第０９／０５８４９２号パンフレットを参照されたい）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する変異型Ｆｃ領域は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｎ、Ｐ２５７Ｌ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む。別の実施形態では、本明細書に記載する変異型Ｆｃ領域は、以下のアミノ酸置換のセット：Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｌ／Ｍ４３４Ｙ、Ｐ２５７Ｎ／Ｍ４３４Ｙ、及びＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの１つ以上をさらに含む。具体的実施形態では、本明細書に記載する変異型Ｆｃ領域は、アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅをさらに含む。本明細書で用いる「ポリペプチド半減期」という用語は、ポリペプチドの薬物動力学的特性を意味し、投与からのポリペプチド分子の平均存続時間の測度である。ポリペプチド半減期は、患者の身体（若しくは他の哺乳動物）又は特定のその区画からのタンパク質の既知量の５０％を排除するのに必要な時間として表すことができ、例えば、血清（すなわち循環半減期）、又は他の組織において測定されている。半減期は、１つのポリペプチド又はポリペプチドのクラスによって変動しうる。一般に、ポリペプチドの半減期が増加すると、投与したポリペプチドの、循環における平均滞留時間（ＭＲＴ）が増加する。半減期の増加は、患者に投与される薬物量の減少、さらには、投与頻度の減少も可能にする。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する変異型Ｆｃ領域は、ＦｃαＲ及び／又はＦｃＲｎに対する親和性の増大又は低減を呈示し、これは、親Ｆｃ領域と比較して、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍、又は少なくとも２００倍、又は２倍〜１０倍、又は５倍〜５０倍、又は２５倍〜１００倍、又は７５倍〜２００倍、又は１００倍〜２００倍多いか、又は少ない。別の実施形態では、本明細書に記載する変異型Ｆｃ領域は、親Ｆｃ領域と比較して、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、又は少なくとも５％多いか、又は少ない、ＦｃαＲ及び／又はＦｃＲｎに対する親和性を呈示する。いくつかの実施形態では、本発明の変異型Ｆｃ領域は、ＦｃαＲ及び／又はＦｃＲｎに対する親和性が増大している。別の実施形態では、本発明の変異型Ｆｃ領域は、ＦｃαＲ及び／又はＦｃＲｎに対する親和性が低減している。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明の変異型Ｆｃ領域の配列は、親Ｆｃ領域との実質的なアミノ酸置換配列同一性を有する。例えば、本発明の変異型Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、親Ｆｃ領域のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有しうる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本発明のモノマーポリペプチドは、タンパク質化学の分野で公知であり、本明細書でさらに詳しく説明するタンパク質の単離／精製方法によって精製することができる。精製モノマーポリペプチドは、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９５％、また最も好ましくは少なくとも９８％の純度を有する。純度の正確な数値とは無関係に、ポリペプチドは、医薬品としての使用目的で十分純粋である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する変異型Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、グリコシル化されていてもよいし、アグリコシルであってもよい。いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域を含むポリペプチドの部分がグリコシル化されているか、又はアグリコシルである。変異型Ｆｃ領域は、ネイティブグリコシル化パターン又は改変グリコシル化パターンを含んでもよい。改変グリコシル化パターンは、例えば、Ｆｃ領域配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を改変することにより、達成することができる。例えば、１つ以上のグリコシル化部位の排除をもたらす１つ以上のアミノ酸置換を実施することによって、その部位（例えば、ＩｇＧのアスパラギン２９７）でのグリコシル化を排除することができる。変異型Ｆｃ領域を含むこうしたアグリコシル化ポリペプチドは、必要なグリコシル化装置が欠失した細菌細胞において生産することができる。
【００４３】
Ｆｃ領域のオリゴ糖にシアル酸を添加することにより、抗炎症活性を増大すると共に、こうした分子の細胞傷害作用を改変することができる（Ｋｅｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１３：６７０−６７３；Ｓｃａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ．２００７  Ｍａｒ；４４（７）：１５２４−３４）。従って、変異型Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、特定の治療用途のための適切なシアリル化プロフィールで修飾することができる（米国特許出願公開第２００９／０００４１７９号明細書及び国際公開第２００７／００５７８６号パンフレット）。一実施形態では、本明細書に記載の変異型Ｆｃ領域は、ネイティブＦｃ領域と比較して改変されたシアリル化プロフィールを含む。一実施形態では、本明細書に記載の変異型Ｆｃ領域は、ネイティブＦｃ領域と比較して増加したシアリル化プロフィールを含む。別の実施形態では、本明細書に記載の変異型Ｆｃ領域は、ネイティブＦｃ領域と比較して減少したシアリル化プロフィールを含む。
【００４４】
７．３．１  Ｆｃ融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本発明のモノマーポリペプチドは、Ｆｃ融合タンパク質、例えば、１つ以上の異種タンパク質部分に結合した、本明細書に記載の変異型Ｆｃ領域を含むポリペプチドである。Ｆｃ融合タンパク質を形成するために、任意の所望する異種ポリペプチドを変異型Ｆｃ領域に融合して、Ｆｃ融合タンパク質を形成することができ、このような異種ポリペプチドとして、例えば、治療用タンパク質、Ｆｃ領域が欠失した抗体フラグメント及びタンパク質スカフォールドなどが含まれる。例示の実施形態では、ポリペプチドのサイズ、可溶性、発現率、及び／又は血清半減期を増加させる上で望ましい異種ポリペプチドにＦｃ領域を融合させる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、異種ポリペプチドの精製及び／又は検出のためのタグとして異種ポリペプチドに融合させる。例示の実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は実質的にモノマーであり、例えば、Ｆｃ融合タンパク質の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、溶液中でモノマーである。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変異型Ｆｃ領域は、１つ以上の異種ポリペプチドに融合させてもよいし、あるいはＮ及び／又はＣ末端でこれらポリペプチドと連結させてもよい。変異型Ｆｃ領域は、当該技術分野で公知の任意の好適な手段、例えば、化学結合、化学架橋、又は遺伝子融合によって、直接、又は化学又はアミノ酸リンカーを介して、異種ポリペプチドに連結してもよい。好ましくは、変異型Ｆｃ領域は、Ｆｃドメイン及び異種ポリペプチド部分が適正にフォールドされ、異種ポリペプチド部分が、生物活性を保持するように、異種ポリペプチド配列に連結する。
【００４６】
本発明のＦｃ融合物は、治療効果を得るために一価性が所望される場合に用いることができる。例えば、本発明のＦｃ融合物は、Ｆｃ融合物の二価性が受容体の二量体形成を誘導し、それによってシグナル伝達経路に不要なモジュレーションが起こることが懸念される場合に、用いることができる。本発明のＦｃ融合物はまた、治療用Ｆｃ融合物が、免疫系媒介による活性、例えば、エフェクター機能、ＡＤＣＣ、食作用及びＣＤＣを誘導することなく、治療作用を発揮することが好ましい場合にも望ましい。
【００４７】
本発明のＦｃ融合物は、疾患の診断及び治療に関わる多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ診断及び治療有用性を有する。本発明によれば、本明細書に記載の一価ポリペプチドは、どんな異種タンパク質部分でも組み込むことができるため、本発明は、特定の異種タンパク質部分を組み込むＦｃ融合タンパク質に関するものではない。本発明のＦｃ融合タンパク質の具体的有用性は、具体的異種タンパク質部分に応じて異なる。異種タンパク質の選択は、異種タンパク質の一価形態を投与する治療価値及び／又は利点に基づいて行ってよい。このような考慮は、当業者の技能で十分可能である。本発明のＦｃ融合タンパク質は、ある分子の活性を部分的又は完全にブロックするためのアンタゴニスト及び／又はインヒビターとして用いることもできる。具体的実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は、受容体に結合して、ネイティブリガンドと受容体との結合をブロック又は妨害することにより、対応するシグナル伝達経路を阻害しうるリガンドの受容体結合部分を含む。別の実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は、ネイティブリガンドに結合して、リガンドがネイティブ受容体と結合するのを阻止し、これによって、対応するシグナル伝達経路を阻害しうる受容体のリガンド結合ドメインを含む。また別の実施形態では、本発明の一価ポリペプチドは、より長い半減期が所望される、治療効果を有する異種分子を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、１つ以上の異種ポリペプチドの精製を促進するためのタグとして用いてもよい。本発明のＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃドメインを含むポリペプチドを単離するための当該技術分野で公知の任意の好適な方法、例えば、クロマトグラフ技法（例えば、イオン交換、サイズ排除、疎水性相互作用クロマトグラフィー）、並びにプロテインＡ及び／又はプロテインＧ、及び／又は抗Ｆｃ抗体、又はこれらの組合せの使用を用いて、精製することができる。一般に、培地又は細胞溶解物からのＦｃタグ付きタンパク質の精製は、樹脂（例えば、アガロース又はセファロースビーズ）に結合させたプロテインＡ又はプロテインＧを用いることを含む。精製は、例えば、Ｆｃタグ付きタンパク質を含む溶液中でプロテインＡ又はプロテインＧ樹脂をインキュベートした後、遠心分離ステップによって可溶性画分から樹脂を分離することにより、又はＦｃタグ付きタンパク質の溶液を、プロテインＡ又はプロテインＧ樹脂を含むカラムに通過させることにより、バッチ形態で実施することができる。プロテインＡ又はプロテインＧからのＦｃタグ付きタンパク質の溶離は、任意の好適な方法、例えば、様々な等張性及び／又はｐＨのバッファー中でｆｃ結合樹脂をインキュベートすることによって実施してよい。Ｆｃタグ付きポリペプチドは、様々な技法、例えば、イオン交換、サイズ排除、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はこれらの組合せなどを用いて、さらに精製してもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、１つ以上の異種ポリペプチドの検出を容易にするためのタグとして用いてもよい。本発明のＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃドメインを含むポリペプチドを識別するために当該技術分野で知られる任意の好適な方法、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、及び／又は抗Ｆｃ抗体のような標識Ｆｃ結合タンパク質の使用によって、検出することができる。こうしたＦｃ結合タンパク質は、任意の好適な検出試薬に結合させてもよく、このような試薬として、例えば、発色団、発蛍光団、蛍光部分、りん光色素、タンデム色素、ハプテン、ビオチン、酵素コンジュゲート、及び／又は放射性同位元素が含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００９／０１２４５１１号明細書を参照、尚、その教示内容は、参照として本明細書に組み込むものとする）。１つ以上の標識Ｆｃ結合タンパク質と一緒にインキュベートした後、本発明の変異型Ｆｃ領域でタグ付けしたタンパク質を、当該技術分野で公知の１つ以上の免疫検出技法を用いて、識別することができ、このような技法として、例えば、免疫蛍光顕微鏡検査法、フローサイトメトリー、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、及び／又はオートラジオグラムがある。いくつかの態様では、本発明のＦｃタグ付きタンパク質の精製を容易にするために、上記の標識Ｆｃ結合タンパク質を用いてもよい。例えば、Ｆｃタグ付きタンパク質を１つ以上の蛍光標識抗Ｆｃ抗体に結合させた後、当該技術分野では公知の様々な蛍光活性化細胞自動分離法を用いて分離することができる。
【００５０】
異種タンパク質のカテゴリー例として、限定するものではないが、酵素、増殖因子（例えば、トランスフォーミング増殖因子、例：ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、治療用タンパク質（例えば、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ）、又は腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α））、サイトカイン、膜貫通受容体の細胞外ドメイン、受容体リガンド、完全Ｆｃ領域を欠失した抗体フラグメント（例えば、抗体の抗原結合フラグメント）、又は非免疫グロブリン標的結合スカフォールドがある。
【００５１】
いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、抗体の抗原結合部分である。抗体の抗原結合部分は、ある抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを含む。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって実施することができることが分かっている。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合フラグメントの例としては、以下のものがある：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉ）合成リンカーによって連結されたＦｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬ及びＶＨ）からなる単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であって、上記リンカーにより、両ドメインを単鎖タンパク質として形成することができ、この単鎖において、ＶＬ及びＶＨ領域が対合することによって一価分子を形成する（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）；（ｖｉｉｉ）ワクシボディ（米国特許出願公開第２００４／０２５３２３８号明細書を参照）；及び（ｉｘ）一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）からなる二重特異性又は単一特異性直線状抗体であって、これらのセグメントは、一対の抗原結合領域を形成する（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）及び米国特許第５，６４１，８７０号明細書参照）。
【００５２】
抗体フラグメントは、当業者には公知の従来の技法を用いて取得することができ、また、これらのフラグメントは、インタクトな抗体と同様に、有用性のためにスクリーニングしてもよい。伝統的には、抗体フラグメントは、当該技術分野で公知の方法を用いて、インタクトな抗体のタンパク質分解消化によって得られてきた。しかし、今日では、抗体フラグメントを組換え宿主細胞により直接生産することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖ抗体フラグメントはすべて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させ、これから分泌させることができ、このようにして、多量のフラグメントを容易に生産することが可能になった。一実施形態では、抗体フラグメントは、以下に記載する抗体ファージライブラリーから単離することができる。これ以外に、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収して、化学的に結合させることにより、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３−１６７（１９９２））。別の手法によれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。また、当該技術分野で公知の方法、例えば、ＰＣＴ国際公開第９２／２２３２４号パンフレット；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；及びＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）に開示されているものなどを用いて、組換えによってＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを生産する技術を使用することもできる。単鎖Ｆｖ及び抗体を生産するのに用いることができる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号明細書及び同第５，２５８，４９８号明細書に記載されているものがある。ドメイン抗体の例としては、限定するものではないが、Ｄｏｍａｎｔｉｓから入手可能なものがあり、これらは、治療標的に特異的である（例えば、国際公開第０４／０５８８２１号パンフレット；国際公開第０４／０８１０２６号パンフレット；国際公開第０４／００３０１９号パンフレット；国際公開第０３／００２６０９号パンフレット；米国特許第６，２９１，１５８号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第６，６９６，２４５号明細書；及び同第６，５９３，０８１号明細書を参照）。市販されているドメイン抗体のライブラリーを用いて、モノクローナルドメイン抗体を識別定することができる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は、非免疫グロブリン標的結合スカフォールドである異種ポリペプチドに結合した変異型Ｆｃ領域を含む。非免疫グロブリン標的結合スカフォールドは、概して突然変異アミノ酸配列を含有させることにより、標準タンパク質から得られる。非免疫グロブリン標的結合スカフォールドは、例えば、以下のものに由来するものでよい：抗体サブストラクチャー、ミニボディ、アドネクチン、アンチカリン、アフィボディ、ノッティン、グルボディ、Ｃ型レクチン様ドメインタンパク質、テトラネクチン、クニッツドメインタンパク質、チオレドキシン、サイトクロームｂ５６２、ジンクフィンガースカフォールド、ブドウ球菌ヌクレアーゼスカフォールド、フィブロネクチン又はフィブロネクチン二量体、テネイシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ−受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼインヒビター、抗体色素タンパク質、ミエリン膜付着分子Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２及びＶＣＡＭ−１のＩ−セットドメイン、ミオシン結合プロテインＣの１−セット免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合プロテインＨの１−セット免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−セット免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、ツイッチン（ｔｗｉｔｃｈｉｎ）、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリトロポエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロンγ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルコロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ細胞抗原受容体、スーパーオキシドジムスターゼ、組織因子ドメイン、シトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬ、又はタウマチン。その他の好適なタンパク質スカフォールドは、Ｗｕｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：５０２（本明細書に参照として組み込む）に記載されている。
【００５４】
Ｆｃ融合タンパク質は、任意の好適な立体配置で構築することができる。いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域のＣ末端を異種タンパク質のＮ末端に連結することができる。あるいは、異種タンパク質のＣ末端を変異型Ｆｃ領域のＮ末端に連結してもよい。いくつかの実施形態では、異種タンパク質を変異型Ｆｃ領域の露出した内部（非末端）残基に連結するか、又は変異型Ｆｃ領域を異種タンパク質の露出した内部（非末端）残基に連結することができる。別の実施形態では、任意の組合せの変異型Ｆｃ−異種タンパク質立体配置を用いることによって、変異型Ｆｃ：異種タンパク質の比が１：１より大きくなる（例えば、１異種タンパク質に対し２変異型Ｆｃ分子）ようにすることもできる。
【００５５】
変異型Ｆｃ領域と異種タンパク質は、互いに直接結合してもよいし、リンカー配列を用いて、間接的に結合してもよい。例示の実施形態では、リンカー配列は、それぞれの部分がその適正な二次及び三次構造に適正にフォールドすることを確実にするのに十分な距離だけ変異型Ｆｃ領域と異種タンパク質を隔てる。好適なリンカー配列は、以下に挙げる特性の１つ以上を有しうる：（１）可変の延長コンホメーションを採用することができる、（２）変異型Ｆｃポリペプチド又は異種タンパク質の機能性ドメインと相互作用しうる定序二次構造を形成する傾向を呈示しない、及び／又は（３）機能性タンパク質ドメインとの相互作用を促進しうる、最小限の疎水性又は荷電性を有する。可変タンパク質領域における典型的表面アミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒがある。Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含むアミノ酸配列の順列は、リンカー配列の上記基準を満たすことが求められる。その他のほぼ中性のアミノ酸、例えば、Ｔｈｒ及びＡｌａもリンカー配列に用いることができる。具体的実施形態では、長さが約１５アミノ酸のリンカー配列を用いて、機能性タンパク質ドメイン同士を好適に隔てることができるが、これより長い、又は短いリンカー配列を用いてもよい。変異型Ｆｃ領域と異種タンパク質を隔てるリンカー配列の長さは、長さ５〜５００アミノ酸でよく、より好ましくは長さ５〜１００アミノ酸である。好ましくは、リンカー配列は、長さ約５〜３０アミノ酸である。好ましい実施形態では、リンカー配列は、約５〜約２０アミノ酸、又は約１０〜約２０アミノ酸である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、開裂性リンカーを介して、変異型Ｆｃ領域を１つ以上の異種ポリペプチドと融合してもよい。様々な開裂性リンカーが当業者には周知である（例えば、米国特許第４，６１８，４９２号明細書；同第４，５４２，２２５号明細書；同第４，６２５，０１４号明細書；同第５，１４１，６４８号明細書；及び同第４，６７１，９５８号明細書を参照；尚、これら文献の教示内容は参照として本明細書に組み込むものとする）。これらのリンカー基からの物質の遊離のため作用機構としては、例えば、感光性結合の照射、酸触媒加水分解、及びタンパク質分解酵素による切断などがある。例示の実施形態では、異種ポリペプチドの精製及び／又は検出を容易にするためのタグとして用いられる本発明の変異型Ｆｃ領域を異種ポリペプチドから除去した後、開裂性リンカーの化学的又は酵素的切断により精製及び／又は検出を実施する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域と異種ポリペプチドとを含む本発明のＦｃ融合タンパク質は、公知の架橋試薬及びプロトコルを用いて、作製することができる。例えば、変異型Ｆｃ領域と異種タンパク質を架橋するのに、当業者には公知で、しかも有用な多数の化学架橋試薬がある。例えば、好適な架橋剤は、ヘテロ二機能性クロスリンカーであり、これを用いて、段階的に分子同士を連結することができる。ヘテロ二機能性クロスリンカーは、タンパク質を結合するためのより特異的結合方法を設計する能力を提供し、これによって、ホモタンパク質ポリマーのような不要な副反応物の発生を抑制する。当該技術分野では、非常に多様なヘテロ二機能性クロスリンカーが知られており、例えば、以下のものがある：スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分を有する架橋剤は、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として得ることができ、これは、一般に、より高い水溶性を有する。さらに、結合鎖内にジスルフィド架橋を有する架橋剤は、アルキル誘導体として合成して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのリンカー切断の量を減らすようにすることもできる。その他の好適な架橋剤として、ホモ二機能性及び光反応性クロスリンカーがある。ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）及びジメチルピメルイミデート．２ＨＣｌ（ＤＭＰ）は、有用なホモ二機能性架橋剤の例であり、ビス−［Ｂ−（４−アジドサリシルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）及びＮ−スクシンイミジル−６（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は、有用な光反応性クロスリンカーの例である。近年のタンパク質結合技術の概観については、Ｍｅａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１：２−１２（参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は、標準的タンパク質化学技術、例えば、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）及びＧｒａｎｔ  Ｇ．Ａ．（ｅｄ．），Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及びＣｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載されているものを用いて、製造することができる。本明細書に記載のＦｃ融合タンパク質の製造に好適な自動ペプチド合成装置は市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００）。
【００５９】
変異型Ｆｃ領域と異種ポリペプチドの化学的結合のための前述した架橋方法のいずれにおいても、開裂性ドメイン又は開裂性リンカーを用いることができる。切断によって、異種ポリペプチドと変異型Ｆｃ領域を分離することが可能になる。例えば、Ｆｃ融合タンパク質が細胞を貫通した後、開裂性リンカーの切断によって、変異型Ｆｃ領域を異種ポリペプチドから分離することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は、１つの連続したポリペプチド鎖として発現される、変異型Ｆｃ領域と異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質として作製することができる。このような融合タンパク質は、本明細書において、組換えにより結合されたものと呼ぶ。こうした融合タンパク質を調製する際には、変異型Ｆｃ領域及び異種ポリペプチドをコードする核酸と、任意で、変異型Ｆｃ領域と異種ポリペプチドを連結するためのペプチドリンカー配列とを含む融合遺伝子を構築する。融合遺伝子（翻訳産物が所望の融合タンパク質である）を作製するための組換えＤＮＡ技術の使用は、当該技術分野では公知である。融合タンパク質を作製するための方法の例が、ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／米国特許第８７／０２９６８号明細書、ＰＣＴ／米国特許第８９／０３５８７号明細書及びＰＣＴ／米国特許第９０／０７３３５号明細書、並びにＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８に記載されており、参照として本明細書に組み込まれる。主として、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、従来の技術に従い、連結のための平滑末端又はスタッガー末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた付着末端の充填、不要な連結を防ぐためのアルカリ性ホスファターゼ処理、及び酵素的連結を用いて実施する。あるいは、自動ＤＮＡ合成装置などの従来の技術により融合遺伝子を合成することもできる。別の方法では、２つの連続した遺伝子断片の間に相補的突出部を発生させるアンカープライマーを用いて、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を実施することも可能であり、これらを後にアニーリングして、キメラ遺伝子配列を作製することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照）。融合遺伝子によってコードされるＦｃ融合タンパク質は、当該技術分野では公知の様々な発現系を用いて、組換えにより作製してもよい（以下も参照のこと）。
【００６１】
７．３．２  モノマー抗体
いくつかの実施形態では、本発明のモノマーポリペプチドは、モノマー抗体、例えば変異型Ｆｃ領域を含む抗体又は抗体フラグメントであり、ここで抗体又は抗体フラグメントは、実質的にモノマーであり、免疫特異的に標的に結合する。一例示の実施形態では、モノマー抗体は、本明細書に記載の変異型Ｆｃ領域を有する重鎖と、軽鎖とを含み、抗体は実質的にモノマーである。モノマー抗体は、任意のタイプの抗体のモノマー形態であってもよく、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、又は完全なヒト抗体、又は変異型Ｆｃ領域を含む上記いずれかのフラグメントのモノマー形態を含む。変異型Ｆｃ領域を含むモノマー抗体又はそのフラグメントは、任意の供給源、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ニワトリなどに由来するものであってもよく、任意のイソタイプのものでもよい。
【００６２】
本明細書に記載の変異型Ｆｃ領域を含むモノマー抗体は、任意の好適な手段によって作製することができる。例えば、抗体又は抗体フラグメントのＦｃ領域の配列は、本明細書に記載のＦｃ領域配列変異型を導入するように修飾してもよく、これによって、Ｆｃ領域のモノマー形態を増加させる。あるいは、抗体又はフラグメントの親Ｆｃ領域の全部又は実質的部分を本明細書に記載の変異型Ｆｃ領域の配列で置換してもよい。抗体の親Ｆｃ領域を置換して、変異型Ｆｃ領域を導入する場合には、置換Ｆｃ領域は、同じ種及び／若しくはイソタイプの抗体、又は異なる種及び／若しくはイソタイプの抗体に由来するものでよく、これによってキメラ抗体を形成する。例えば、ヒトＩｇＧ４抗体の親Ｆｃ領域を変異型ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域で置換することにより、モノマーヒト抗体を形成することができる。あるいは、マウスＩｇＧ抗体の親Ｆｃ領域をヒトＩｇＧ抗体由来の変異型Ｆｃ領域で置換することにより、モノマーキメラ抗体を形成することもできる。こうしたＦｃ修飾は、当該技術分野では公知であり、また以下にさらに詳しく説明する標準組換えＤＮＡ技術を用いて実施してよい。
【００６３】
治療効果を得るために一価性が望ましい場合、本発明のモノマー抗体を用いてよい。例えば、抗体の二価性によって、標的細胞が誘導されて抗原のモジュレーションを受ける懸念がある場合に、モノマー抗体を用いることができる。また、治療用抗体が、免疫系媒介の活性、例えば、エフェクター機能、ＡＤＣＣ、食作用及びＣＤＣを伴わずに、治療作用を発揮することが好ましい場合に、本発明のモノマー抗体が望ましい。従って、本発明のモノマー抗体は、疾患の診断及び治療に関わる多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ診断及び治療有用性を有する。
【００６４】
本発明によれば、本明細書に記載のモノマー抗体は、どの抗原にでも結合しうるため、本発明は、特定の抗原に向けられるモノマー抗体に関するものではないことは理解されよう。本発明のモノマー抗体の具体的有用性は、具体的標的抗原に応じて異なる。標的抗原の選択は、標的抗原に特異的な抗体の一価形態を投与する治療価値及び／又は利点に基づいて行ってよい。このような考慮は、当業者の技能で十分に可能である。本発明のモノマー抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで特定の抗原の活性を部分的又は完全にブロックするためのアンタゴニスト及び／又はインヒビターとして用いることもできる。具体的実施形態では、本発明のモノマー抗体は、リガンド抗原に特異的であり、リガンド抗原に関わるリガンド−受容体の相互作用をブロック又は妨害することにより抗原活性を阻害することによって、対応するシグナル伝達経路及びその他の分子又は細胞事象を阻害する。別の実施形態では、本発明のモノマー抗体は、リガンドとの接触により活性化されうる受容体抗原に特異的であり、リガンド−受容体の相互作用をブロック又は妨害することにより抗原活性を阻害し、これによって、対応するシグナル伝達経路及びその他の分子又は細胞事象を阻害する。
【００６５】
本明細書に記載のモノマー抗体は、モノマー抗体の意図する用途に応じて、任意の所望する標的と免疫特異的に相互作用することができる。例えば、モノマー抗体は、標的、例えば、細胞表面受容体、癌抗原、サイトカイン、酵素などに結合しうる。モノマー抗体は、既存の抗体、例えば、市販されている形態の抗体、又は新たに単離した抗体に由来するものでよい。市販の抗体の例として、限定するものではないが、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）などがある。様々なタイプの抗体を作製する方法は、当該技術分野では公知であり、また、以下に詳しく説明する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域を含むモノマー抗体又は抗体フラグメントは、２５０ナノモルより小さいＫＤで標的に免疫特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＫＤは、１００ナノモルより小さい、５０ナノモルより小さい、２５ナノモルより小さい、又は１ナノモルより小さい。いくつかの実施形態では、上記条件下でのＫＤは、９００ピコモルより小さい、８００ピコモルより小さい、７００ピコモルより小さい、６００ピコモルより小さい、５００ピコモルより小さい、４００ピコモルより小さい、３００ピコモルより小さい、２００ピコモルより小さい、又は１００ピコモルより小さい。いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域を含むモノマー抗体又は抗体フラグメントは、２５０ナノモルより小さいＩＣ５０で、標的を阻害する。いくつかの実施形態では、ＩＣ５０は、１００ナノコモルより小さい、５０ナノモルより小さい、２５ナノモルより小さい、又は１ナノモルより小さい。いくつかの実施形態では、上記条件下でのＩＣ５０は、９００ピコモルより小さい、８００ピコモルより小さい、７００ピコモルより小さい、６００ピコモルより小さい、５００ピコモルより小さい、４００ピコモルより小さい、３００ピコモルより小さい、２００ピコモルより小さい、又は１００ピコモルより小さい。いくつかの実施形態では、モノマー抗体のＫＤ及び／又はＩＣ５０は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）親和性データ、細胞結合、標準ＥＬＩＳＡ又は標準フローサイトメトリーアッセイを用いて、測定することができる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、モノマー抗体の結合親和性は、親抗体の結合親和性と実質的に同じである。例えば、本明細書に記載の変異型Ｆｃ領域を作製するためにＦｃ領域に１つ以上の配列変異を導入しても、抗体の結合親和性にほぼ又は全く影響をもたらさない。例えば、モノマー抗体を作製するために抗体のＦｃ領域に配列変異を導入すると、標的に対する抗体の結合親和性に、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％より小さい変化が起こる。あるいは、モノマー抗体を作製するために抗体のＦｃ領域に配列変異を導入すると、標的に対する抗体の結合親和性に、１０倍、８倍、５倍、４倍、３倍、又は２倍より小さい変化が起こる。いくつかの実施形態では、モノマー抗体は、標的に対する親抗体の結合親和性の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を維持する。いくつかの実施形態では、標的に対するモノマー抗体の結合親和性は、同じ標的の親抗体の結合親和性の１０倍、８倍、５倍、４倍、３倍、又は２倍以内である。
【００６８】
一実施形態では、本発明のモノマー抗体は、本明細書に記載の変異型Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体又はそのフラグメントである。モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の様々な技法を用いて調製することができるが、こうした技法としては、以下のものがある：ハイブリドーマの使用（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）、組換え及びファージディスプレイ技術、又はこれらの組合せ。本明細書で用いる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の、又は単離された抗体の集団から得られた抗体を指す。例えば、上記の集団を含む個々の抗体は、わずかな量で存在しうる自然に起こりうる突然変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位、又は多重特異的改変抗体の場合には多重抗原部位に対して向けられている。さらに、様々な決定基（エピトープ）に対して向けられる様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の同じ決定基に対して向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体による混入なしに合成することができる点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、いずれか特定の方法による抗体の生産を必要とするものと解釈すべきではない。
【００６９】
ハイブリドーマ技術を用いたモノクローナル抗体の生産又はスクリーニング方法は、当該技術分野において一般的であり、公知である。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；及びＢｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照されたい。さらに、抗体ファージライブラリーを用いて、モノクローナル抗体を生産する方法は、当該技術分野において一般的であり、公知である。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）；及びＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：６２４−６２８  （１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）を参照されたい。ファージディスプレイライブラリーを作製するための市販のキット（例えば、ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．２７−９４００−０１；及びｔｈｅ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳＵＲＦＺＡＰ（商標）  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｋｉｔ，ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．２４０６１２）の他に、抗体ディスプレイライブラリーを作製及びスクリーニングするのに使用するための方法及び試薬の例は、例えば、米国特許第６，２４８，５１６号明細書；同第６，５４５，１４２号明細書；同第６，２９１，１５８号明細書；同第６，２９１，１５９１号明細書；同第６，２９１，１６０号明細書；同第６，２９１，１６１号明細書；同第６，６８０，１９２号明細書；同第５，９６９，１０８号明細書；同第６，１７２，１９７号明細書；同第６，８０６，０７９号明細書；同第５，８８５，７９３号明細書；同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５９３，０８１号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第７，１９５，８６６号明細書に記載されている。
【００７０】
一実施形態では、本発明のモノマー抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はそれらのフラグメントであり、これらは、本明細書に記載の変異型Ｆｃ領域を含む。ヒト化抗体は、所望の抗原に結合する、非ヒト種抗体（本明細書ではまた、ドナー抗体とも称する）に由来する抗体分子である。ヒト化抗体は、ドナー抗体からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子からの１つ以上のフレームワーク領域（本明細書では、アクセプター抗体とも呼ぶ）とを有する。往々にして、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基を、ドナー抗体からの対応する残基で置換することにより、抗原結合を改変、好ましくは改善し、及び／又は免疫原性を低減する。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野で公知の方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を識別するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデル化、及び特定の位置の特異フレームワーク残基を識別するための配列比較によって、識別する。（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと）。実際には、また、いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、概してヒト抗体であり、このヒト抗体では、いくつかの超可変領域残基と、恐らくいくつかのＦＲ残基は、ドナー抗体における類似部位からの残基で置換されている。別の実施形態では、ＦＲ残基は完全にヒト残基である。
【００７１】
ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，前掲：Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６  （１９８８））の方法に従い、超可変領域配列を、ヒト抗体の対応する配列で置換することによって実施する。具体的には、ヒト化抗体は、当該技術分野で公知の方法によって調製することができ、こうした方法としては以下のものがある：ＣＤＲグラフティング手法（例えば、米国特許第６，５４８，６４０号明細書を参照）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）又は表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（米国特許第５，６３９，６４１号明細書及び同第６，７９７，４９２号明細書；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））、鎖シャッフリング戦略（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）９５：８９１０−８９１５を参照）、分子モデル化戦略（米国特許第５，６３９，６４１号明細書）など。これらの一般的手法を標準突然変異及び組換え合成技術と組み合わせて、所望の特性を備えるモノマーヒト化抗体を作製することもできる。
【００７２】
定義により、ヒト化抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する配列、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体において対応する配列と同一であるか、又は相同的であり、この鎖の別の部分は、別の種に由来する配列、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体において対応する配列と同一であるか、又は相同的である抗体、並びに、このような抗体のフラグメント（これらが所望の生物活性を呈示する限り）である（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書において興味深いキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルのような旧世界ザル（Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ  Ｍｏｎｋｅｙ））由来の可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長類化」抗体及びヒト定常領域配列（米国特許第５，６９３，７８０号明細書）がある。
【００７３】
一実施形態では、本発明のモノマー抗体は、本明細書に記載の変異型Ｆｃ領域を含むヒト抗体又はそのフラグメントである。ヒト抗体は、マウス又はラット可変及び／又は定常領域配列を有する抗体に関連する問題のいくつかを回避する。こうしたマウス又はラット由来の配列が存在すると、抗体の急速なクリアランスを起こす可能性、又は患者による抗体に対する免疫応答の発生を招く恐れがある。マウス又はラット由来の抗体の使用を避けるために、げっ歯類、その他の哺乳動物又は動物が、完全なヒト抗体を産生するように、機能性ヒト抗体遺伝子座をげっ歯類、その他の哺乳動物又は動物に導入することによって、完全なヒト抗体を作製することができる。
【００７４】
ヒト抗体は、当該技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。例えば、今日、免疫すると、内因性免疫グロブリン生産の非存在下で、ヒト抗体の全レパトアを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能である。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，５９１，６６９号明細書（すべてＧｅｎＰｈａｒｍ）；米国特許第５，５４５，８０７号明細書；及び国際公開第９７／１７８５２号パンフレットを参照。ヒト抗体作製のためのマウスのＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）株の使用が記載されている。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）及びＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）を参照されたい。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）株は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。マウスのＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）株の作製及びこれらのマウスで生産された抗体については、以下の文献でさらに詳しく説明されている：米国特許第６，６７３，９８６号明細書；同第７，０４９，４２６号明細書；同第６，８３３，２６８号明細書；同第６，１６２，９６３号明細書、同第６，１５０，５８４号明細書、同第６，１１４，５９８号明細書、同第６，０７５，１８１号明細書、同第６，６５７，１０３号明細書；同第６，７１３，６１０号明細書及び同第５，９３９，５９８号明細書；米国特許出願公開第２００４／００１０８１０号明細書；同第２００３／０２２９９０５号明細書；同第２００４／００９３６２２号明細書；同第２００５／００５４０５５号明細書；同第２００５／００７６３９５号明細書；及び同第２００６／００４０３６３号明細書。別の手法では、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，を含む他者は、「ミニ遺伝子座」手法を用いている。この手法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，６２５，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，７７０，４２９号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５，８１４，３１８号明細書；同第５，８７７，３９７号明細書；同第５，８７４，２９９号明細書；同第６，２５５，４５８号明細書；同第５，５９１，６６９号明細書；同第６，０２３，０１０号明細書；同第５，６１２，２０５号明細書；同第５，７２１，３６７号明細書；同第５，７８９，２１５号明細書；同第５，６４３，７６３号明細書；及び同第５，９８１，１７５号明細書に記載されている。また、Ｋｉｒｉｎも、大きな染色体片又は全染色体を微小核融合によって導入したマウスからのヒト抗体の作製を示している。米国特���第６，６３２，９７６号明細書を参照されたい。さらに、Ｍｅｄａｒｅｘのミニ遺伝子座（Ｈａｍａｂ）を含むＫｉｒｉｎのＴｃマウスの交雑育種によって得られたＫＭ（商標）マウスも作製されている。これらのマウスは、ＫｉｒｉｎマウスのヒトＩｇＨトランスクロモソームと、Ｇｅｎｐｈａｒｍマウスのκ鎖トランスジーンとを有する（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，（２００２）４：９１−１０２）。ヒト抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法によって得ることもできる。好適な例として、限定するものではないが、ファージディスプレイ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（旧称ＣＡＴ），Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ，Ｄｙａｘ，Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｘｏｍａ，Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ，Ａｌｅｘｉｏｎ（旧称Ｐｒｏｌｉｆｅｒｏｎ），Ａｆｆｉｍｅｄ）リボソームディスプレイ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（旧称ＣＡＴ））、酵母ディスプレイなどがある。ファージディスプレイ技術（例えば、米国特許第５，９６９，１０８号明細書を参照）を用いて、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパトアからヒト抗体及び抗体フラグメントをｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産することができる。ファージディスプレイは、様々なフォーマットで実施することができ、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．及びＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）に概要が記載されている。Ｖ−遺伝子セグメントの複数の供給源をファージディスプレイに用いることができる。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）；及び米国特許第５，５６５，３３２号明細書及び同第５，５７３，９０５号明細書を参照されたい。前述したように、ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化したＢ細胞によって作製してもよい（米国特許第５，５６７，６１０号明細書及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照）。
【００７５】
７．３．３  異種タンパク質及び抗原
一般に、本発明のモノマーポリペプチドが抗原結合部分を含む場合には、本発明のモノマーポリペプチドは目的の抗原に特異的に結合する。一実施形態では、本発明のモノマーポリペプチドは、ポリペプチド抗原に特異的に結合する。別の実施形態では、本発明のモノマーポリペプチドは、非ポリペプチド抗原に特異的に結合する。また別の実施形態では、本発明の一価ポリペプチドを疾患又は障害に罹患した哺乳動物に投与することによって、その哺乳動物に治療利益をもたらすことができる。
【００７６】
変異型Ｆｃ変異体部分を含む本発明の一価ポリペプチド（例えば、一価抗体、Ｆｃ融合タンパク質）により、ほぼあらゆる分子をターゲティングすることができ、及び／又は一価ポリペプチドに組み込むことができるが、このようなポリペプチドとして、限定するものではないが、以下に挙げるタンパク質、並びに以下に挙げるタンパク質に属するサブユニット、ドメイン、モチーフ及びエピトープがある：レニン；成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩＣ因子、ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、及びフォンビルブラント因子；抗凝固因子、例えば、プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；プラスミノーゲンアクチベーター、例えば、ウロキナーゼ若しくはヒト尿又は組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子α及びβ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（血小板やＴ細胞由来の好酸球走化性物質：ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、βラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；ホルモン又は増殖因子の受容体、例えば、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＨＧＦＲ（ｃＭＥＴとしても知られる）；インターフェロン、例えば、αインターフェロン（α−ＩＦＮ）、βインターフェロン（β−ＩＦＮ）及びγインターフェロン（γ−ＩＦＮ）；プロテインＡ又はＤ：リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、若しくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、若しくはＮＴ−６）、又は神経成長因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、例えば、αＦＧＦ及びβＦＧＦ；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−４、又はＴＧＦ−５など；インスリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ８０及びＣＤ１４７；ＴＮＦ−関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、例えば、細���死受容体ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ５並びにデコイ受容体ＴＲＡＩＬ−Ｒ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ５；エリトロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成因子（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−β、及び−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３；ＴＮＦα、スーパーオキシドジムスターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳ包膜の一部、例えば、ｇｐ１２０；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；細胞接着分子、例えば、ＬＥＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３及びＶＣＡＭ、ａ４／ｐ７インテグリン、及び（Ｘｖ／ｐ３インテグリン（その１以上のサブユニットを含む）、インテグリンαサブユニット、例えば、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、α７、α８、α９、αＤ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４１、αＩＩｂ、αＩＥＬｂ；インテグリンβサブユニット、例えば、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、β５、β６、β７及びβ８；インテグリンサブユニット組合せ、例えば、限定するものではないが、αＶβ３、αＶβ５、及びα４β７；アミロイドβ（Ａβ又はＡベータ）；アポトーシス経路のメンバー；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣ；Ｅｐｈ受容体、例えば、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＢ２など；ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）例えば、ＨＬＡ−ＤＲ；補体タンパク質、例えば補体受容体ＣＲ１、Ｃ１Ｒｑ及びその他の補体因子、例えば、Ｃ３及びＣ５；糖タンパク質受容体、例えば、ＧｐＩｂα、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ及びＣＤ２００；並びに以上挙げたいずれかのポリペプチドのフラグメント。
【００７７】
癌抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含む本発明の一価ポリペプチドも考慮され、限定するものではないが、以下のものを含む：ＡＬＫ受容体（プレイオトロフィン受容体）、プレイオトロフィン、ＫＳ１／４全癌抗原；卵巣がん抗原（ＣＡ１２５）；前立腺酸性フォスフェート；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；黒色腫関連抗原ｐ９７；黒色腫抗原ｇｐ７５；高分子量黒色腫抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）；前立腺特異的膜抗原；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；多形上皮ムチン抗原；ヒト乳脂肪球抗原；結腸直腸腫瘍関連抗原、例えば、ＣＥＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＯ１７−１Ａ、ＧＩＧＡ１９−９、ＣＴＡ−１及びＬＥＡ；バーキットリンパ腫抗原−３８．１３；ＣＤ１９；ヒトＢリンパ腫抗原−ＣＤ２０；ＣＤ３３；黒色腫特異的抗原、例えば、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２及びガングリオシドＧＭ３；腫瘍特異的移植型細胞表面抗原（ＴＳＴＡ）；ウイルス誘導腫瘍抗原、例えば、Ｔ抗原、ＤＮＡ腫瘍ウイルス及びＲＮＡ腫瘍ウイルスの外膜抗原；癌胎児性抗原−α−フェトプロテイン、例えば、結腸のＣＥＡ、５Ｔ４癌胎児性栄養芽層糖タンパク質及び膀胱腫瘍癌胎児性抗原；分化抗原、例えば、ヒト肺癌抗原Ｌ６及びＬ２０；線維肉腫の抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原−Ｇｐ３７；ネオ糖タンパク質；スフィンゴ脂質；乳癌抗原、例えば、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）；ＮＹ−ＢＲ−１６；ＨＥＲ２抗原（ｐ１８５ＨＥＲ２）；多形上皮ムチン（ＰＥＭ）；悪性ヒトリンパ球抗原−ＡＰＯ−１；分化抗原、例えば、胎児赤血球に存在するＩ抗原；成人赤血球に存在する一次内胚葉Ｉ抗原；着床前胚；胃腺癌に存在するＩ（Ｍａ）；乳房上皮に存在するＭ１８、Ｍ３９；骨髄性細胞に存在するＳＳＥＡ−１；ＶＥＰ８；ＶＥＰ９；Ｍｙｌ；ＶＩＭ−Ｄ５；結腸直腸癌に存在するＤ１５６−２２；ＴＲＡ−１−８５（血液型Ｈ）；精巣及び卵巣癌に存在するＳＣＰ−１；結腸腺癌に存在するＣ１４；肺腺癌に存在するＦ３；胃癌に存在するＡＨ６；Ｙハプテン；胚性癌細胞に存在するＬｅｙ；ＴＬ５（血液型Ａ）；Ａ４３１細胞に存在するＥＧＦ受容体；膵臓癌に存在するＥ１シリーズ（血液型Ｂ）；胚性癌細胞に存在するＦＣ１０．２；胃腺癌抗原；腺癌に存在するＣＯ−５１４（血液型Ｌｅａ）；腺癌に存在するＮＳ−１０；ＣＯ−４３（血液型Ｌｅｂ）；Ａ４３１細胞のＥＧＦ受容体に存在するＧ４９；結腸腺癌に存在するＭＨ２（血液型ＡＬｅｂ／Ｌｅｙ）；結腸癌に存在する１９．９；胃癌ムチン；骨髄性細胞に存在するＴ５Ａ７；黒色腫に存在するＲ２４；胚性癌細胞に存在する４．２、ＧＤ３、Ｄ１．１、ＯＦＡ−１、ＧＭ２、ＯＦＡ−２、ＧＤ２、及びＭ１：２２：２５：８並びに４〜８期胚に存在するＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４；皮膚Ｔ細胞リンパ腫抗原；ＭＡＲＴ−１抗原；Ｓｉａｌｙ  Ｔｎ（ＳＴｎ）抗原；結腸癌抗原ＮＹ−ＣＯ−４５；肺癌抗原ＮＹ−ＬＵ−１２変異体Ａ；腺癌抗原ＡＲＴ１；腫瘍随伴性脳−精巣−癌抗原（腫瘍と神経細胞の共通抗原ＭＡ２；傍腫瘍性神経抗原）；神経腫瘍腹側抗原２（Ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｖｅｎｔｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２）（ＮＯＶＡ２）；肝細胞癌抗原遺伝子５２０；腫瘍関連抗原ＣＯ−０２９；腫��関連抗原ＭＡＧＥ−Ｃ１（癌／精巣抗原ＣＴ７）、ＭＡＧＥ−Ｂ１（ＭＡＧＥ−ＸＰ抗原）、ＭＡＧＥ−Ｂ２（ＤＡＭ６）、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−４ａ、ＭＡＧＥ−４ｂ及びＭＡＧＥ−Ｘ２；及び癌−精巣抗原（ＮＹ−ＥＯＳ−１）；並びに上に挙げたポリペプチドのいずれかのフラグメント。
【００７８】
いくつかの具体的実施形態では、変異型Ｆｃ領域を含む本発明の一価ポリペプチド（例えば、一価抗体、Ｆｃ融合タンパク質）は、ｃＭＥＴ若しくはＴＲＡＩＬ−Ｒ２若しくはＶＥＧＦを含むか、又はこれらに結合する。
【００７９】
７．４  モノマーポリペプチドコンジュゲート
いくつかの実施形態では、本発明のモノマーポリペプチドは、当該技術分野で公知の方法を用いて、ある物質に結合しているか、又は共有結合している。一実施形態では、結合させる物質は、治療薬、検出可能な標識（本明細書では、リポーター分子とも呼ばれる）又は固体支持体である。モノマーポリペプチドとの結合に好適な物質としては、限定するものではないが、以下のものがある：アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成ポリマー、ポリマー微粒子、生物細胞、ウイルス、発蛍光団、発色団、色素、毒素、酵素、放射性同位元素、固体マトリクス、半固体マトリクス及びこれらの組合せ。別の物質をモノマーポリペプチドに結合又は共有結合させる方法は、当該技術分野では公知である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本発明のモノマーポリペプチドを固体支持体に結合する。モノマーポリペプチドは、スクリーニング及び／又は精製及び／又は製造工程の一環として固体支持体に結合させてもよい。あるいは、本発明のモノマーポリペプチドは、診断法又は組成物の一部分として固体支持体に結合させてもよい。本発明での使用に好適な固体支持体は、概して、液相中に実質的に不溶性である。多数の支持体が利用可能であり、当業者には周知である。従って、固体支持体としては、固体及び半固体マトリクス、例えば、エーロゲル及びヒドロゲル、樹脂、ビーズ、バイオチップ（薄膜被覆バイオチップなど）、マイクロ流体チップ、シリコンチップ、マルチウェルプレート（マイクロタイタープレート又はマイクロプレート）、膜、導電性及び非導電性金属、ガラス（顕微鏡スライドを含む）及び磁気支持体などがある。固体支持体のさらに具体的な例としては、以下のものがある：シリカゲル、ポリマー膜、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、ブラスチックビーズ、アルミナゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのような多糖、ポリ（アクリレート）、ポリスチレン、ポリ（アクリルアミド）、ポリオール、アガロース、アガー、セルロース、デキストラン、デンプン、ＦＩＣＯＬＬ、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ（エチレングリコール）など）、ナイロン、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、デンプンなど。
【００８１】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、本発明のモノマーポリペプチドを結合するために、反応性官能基を含んでいてもよく、こうした基として、限定するものではないが、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミノ、尿素、炭酸塩、カルバミド酸塩、イソシアン酸塩、スルホン、スルホン酸塩、スルホンアミド、スルホキシドなどがある。
【００８２】
好適な固相支持体を所望の最終用途及び様々な合成プロトコルについての好適性に基づいて選択することができる。例えば、本発明のモノマーポリペプチドと固体支持体とを結合するのに、アミド結合形成が望ましい場合には、ペプチド合成に一般に用いられる樹脂を用いることができ、こうした樹脂として、例えば、以下のものがある：ポリスチレン（例：Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓなどから得られるＰＡＭ−樹脂）、ＰＯＬＹＨＩＰＥ（商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ，Ｃａｎａｄａから得られる）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られる）、ポリエチレングリコールでグラフティングしたポリスチレン樹脂（ＴＥＮＴＡＧＥＬ（商標）、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ポリジメチル−アクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、又はＰＥＧＡビーズ（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られる）。
【００８３】
いくつかの実施形態では、モノマーポリペプチド及び／又はその関連リガンドを検出する診断及びその他のアッセイの目的で、本発明のモノマーポリペプチドを標識に結合する。モノマーポリペプチドに結合して、本明細書に記載する本方法及び組成物で用いる標識は、２８０ｎｍより大きい波長で最大の吸光を呈示すると共に、モノマーポリペプチドに共有結合したとき、その分光特性を保持する、有機又は無機の任意の化学部分である。標識としては、限定するものではないが、発色団、発蛍光団、蛍光タンパク質、りん光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素及び放射性同位元素がある。
【００８４】
いくつかの実施形態では、モノマーポリペプチドを酵素標識に結合させる。酵素は、検出可能なシグナルの増幅が得られ、これによりアッセイ感度が高くなるため、望ましい標識である。いくつかのアッセイでは、化学発光を発生する酵素及びその適切な脂質が好ましい。これらには、限定するものではないが、ルシフェラーゼ及びエクオリンの天然及び組換え形態が含まれる。
【００８５】
別の実施形態では、モノマーポリペプチドをハプテン、例えば、ビオチンに結合させる。ビオチンは、酵素系において、検出可能なシグナルをさらに増幅するように作用することができ、また、単離の目的で、アフィニティークロマトグラフィーに用いられるタグとして作用することができるため、有用である。検出を目的として、ビオチンに対し親和性を有する酵素コンジュゲート、例えば、アビジン−ＨＲＰを用いる。次に、ペルオキシダーゼ基質を添加して、検出可能なシグナルを生成する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、モノマーポリペプチドを蛍光タンパク質標識に結合させる。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びフィコビリンタンパク質及びその誘導体がある。蛍光タンパク質、特にフィコビリンタンパク質は、タンデム色素標識ラベル化剤を作製するのにとくに有用である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、モノマーポリペプチドを放射性同位元素に結合させる。好適な放射性材料としては、限定するものではないが、以下のものがある：ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３５Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３ＳＭ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ及び９７Ｒｕ。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明のモノマーポリペプチドは、ポリペプチドの薬物動力学的特性を高める部分、例えば、非タンパク質性ポリマー又は血清アルブミンと結合してもよい。一実施形態では、モノマーポリペプチドをポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＣ」）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンに、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書又は同第４，１７９，３３７号明細書に記載の方法で結合する。「ＰＥＧ」という用語は、ＰＥＧのサイズ又はその末端での修飾とは無関係に、広範に用いられて、あらゆるポリエチレングリコール分子を包含し、式：Ｘ−Ｏ（ＣＨＯ２ＣＨＯ２Ｏ）ｎ−１ＣＨＯ２ＣＨＯ２ＯＨ（１）（式中、ｎは、２０〜２３００であり、Ｘは、Ｈ又は末端修飾、例えば、Ｃ１−４アルキルである）により表すことができる。一実施形態では、ＰＥＧは、一端においてヒドロキシ又はメトキシで終了してもよく、すなわち、ＸはＨ又はＣＨ３である（「メトキシＰＥＧ」）。ＰＥＧは、さらに別の化学基：反応に結合するのに必要な化学基；分子の化学合成から生じる化学基；又は分子部分の最適距離のためのスペーサーである化学基を含んでもよい。さらに、ＰＥＧは、互いに連結された１つ以上のＰＥＧ側鎖からなるものであってもよい。２つ以上のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、マルチアーム又は分枝ＰＥＧと呼ばれる。分枝ＰＥＧは、例えば、様々なポリオール（例えば、グリセロール、ペンタエリトリオール、及びソルビトールなど）にポリエチレンオキシドを添加することによって調製することができる。例えば、４アーム分子ＰＥＧは、ペンタエリトリオールとエチレンオキシドから調製することができる。当業者であれば、どのようにベギル化結合ポリペプチドを治療に用いるのか、所望の投薬量、循環時間、タンパク質分解耐性、免疫原性、及びその他の考慮事項に基づいて、ＰＥＧの好適な分子量を選択することができる。タンパク質の特性を高めるためのＰＥＧ及びその使用についての論考は、Ｎ．Ｖ．Ｋａｔｒｅ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０：９１−１１４（１９９３）を参照されたい。
【００８９】
当該技術分野で公知の技術を用いて、本発明のモノマーポリペプチドにＰＥＧを結合させることができる。例えば、ペプチド又はタンパク質とＰＥＧの結合は、一般に、ＰＥＧの活性化後、活性化ＰＥＧを標的タンパク質／ペプチド又はリンカーに直接連結させることを含み、リンカーは、後に活性化させて標的タンパク質／ペプチドに連結させる（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，３５７１（１９７７）及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，３５８２（１９７７），Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，及びＨａｒｒｉｓ  ｅｔ．ａｌ．，ｉｎ：Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ  ｅｄ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２；Ｃｈａｐ．２１及び２２を参照のこと）。
【００９０】
７．５  核酸
前述したアミノ酸配列に加えて、本発明はさらに、変異型Ｆｃ領域を含む本発明のモノマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。従って、本発明はまた、本明細書に記載するモノマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、さらには、細胞（例えば、哺乳動物細胞）におけるその効率的発現のためのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。本発明はまた、こうしたポリヌクレオチド及び発現ベクターを含有する宿主細胞、並びに本明細書に記載のポリヌクレオチドを用いて、モノマーポリペプチドを作製する方法も提供する。上記のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の構造的及び／又は機能的特徴を有するモノマーポリペプチドをコードする。
【００９１】
本発明はまた、例えば、本明細書で定義するように、ストリンジェントな、又はより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、本発明のモノマーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。本明細書で用いる「ストリンジェンシー」という用語は、ハイブリダイゼーション実験の実験条件（例えば、温度及び塩濃度）を指し、プローブとフィルター結合核酸との間の相同性の程度を示すものであり；ストリンジェンシーが高いほど、プローブとフィルター結合核酸との間の相同性は高い。
【００９２】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、限定するものではないが、約４５℃で６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のフィルター結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの後、約５０〜６５℃で０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１回以上の洗浄；高度にストリンジェントな条件、例えば、約４５℃で６Ｘ  ＳＳＣ中のフィルター結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの後、約６５℃で０．１Ｘ  ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で１回以上の洗浄；又は当業者には公知のその他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件がある（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．及びＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ、ページ６．３．１〜６．３．６及び２．１０．３を参照のこと）。
【００９３】
当該技術分野では公知の任意の方法によって本発明のポリヌクレオチドを取得し、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。例えば、モノマーポリペプチドの全部又は一部のヌクレオチド配列が既知である場合には、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、化学的に合成したオリゴヌクレオチドから組織化してもよい（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２  （１９９４）に記載のように）。手短には、これは、ポリペプチドをコードする配列の一部を含む重複オリゴヌクレオチドを合成し、これらオリゴヌクレオチドをアニーリングして、連結した後、連結したオリゴヌクレオチドをＰＣＲにより増幅することを含む。
【００９４】
モノマーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、好適な供給源由来の核酸から作製することもできる。特定のポリペプチドをコードする核酸を含むクローンは入手できないが、ポリペプチド分子の配列がわかっている場合には、ポリペプチドをコードする核酸を化学的に合成してもよいし、好適な供給源から取得してもよい（例えば、ｃＤＮＡライブラリー、又は上記配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅により、若しくは、例えば、ｃＤＮＡライブラリーから、ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを識別するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングによって、ポリペプチドを発現する任意の組織又は細胞から作製したｃＤＮＡライブラリー、又はそれらから単離した核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ。次に、ＰＣＲにより生産した増幅核酸は、当該技術分野では公知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローン化することができる。
【００９５】
ポリペプチドのヌクレオチド配列、及び対応するアミノ酸配列を決定したら、当該技術分野では公知のヌクレオチド配列の操作方法、例えば、組換えＤＮＡ技法、部位指定突然変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、以下の文献に記載の技法を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ）を用いて、ヌクレオチド配列を操作することにより、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを作製する、例えば、Ｆｃ領域におけるアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を形成することができる。
【００９６】
７．６  ベクター、宿主細胞、及びポリペプチド生産
本明細書では、本発明のモノマーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターも提供される。一例示の実施形態では、本明細書に記載のモノマーポリペプチドをコードする核酸を発現ベクターに組み込むことによって、好適な宿主細胞において上記モノマーポリペプチドを発現させることができる。様々な発現ベクターをモノマーポリペプチドの発現に使用してよい。発現ベクターとしては、自己複製の染色体外ベクター又は宿主ゲノムに組み込まれるベクターが挙げられる。発現ベクターは、宿主細胞型と適合するように構築する。従って、本発明で有用となる発現ベクターとしては、限定するものではないが、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、酵母、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ系においてモノマーポリペプチド発現を可能にするものがある。当該技術分野では周知のように、本発明のモノマーポリペプチドを発現するのに有用となりうる様々な発現ベクターが市場又はその他で入手可能である。
【００９７】
発現ベクターは、概して、モノマーポリペプチドのコード配列を含むが、この配列は、制御若しくは調節配列、選択マーカー、及び／又は別のエレメントに機能的に連結している。本明細書において、「機能的に連結している」とは、モノマーポリペプチドの核酸配列が、別の核酸配列と機能的関係にあるように配置されていることを意味する。一般に、これらの発現ベクターは、モノマーポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されており、概して、タンパク質を発現するのに用いられる宿主細胞に適している。一般に、転写及び翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列を含んでもよい。当該技術分野では周知のように、発現ベクターは、一般に、選択遺伝子又はマーカーを含んでおり、これによって、発現ベクターを含有する形質転換宿主細胞の選択が可能になる。選択遺伝子は、当該技術分野で公知であり、用いる宿主細胞によって異なる。
【００９８】
本出願はまた、モノマーポリペプチドをコードする核酸、ベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞、及びモノマーポリペプチドの発現のための宿主細胞の使用も提供する。ベクター中のポリヌクレオチドを発現するのに適した宿主細胞としては、原核細胞、酵母、又はより高等な真核細胞がある。この目的に適した原核生物としては、真正細菌、例えば、グラム陰性又はグラム陽性細菌、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のような腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）がある。真核微生物、例えば、糸状菌又は酵母も好適な宿主細胞であり、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、米国特許第７３２６６８１号明細書などがある。グリコシル化ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物、例えば、植物細胞（例：米国特許出願公開第２００８００６６２００号明細書）、無脊椎動物細胞、及び脊椎動物細胞に由来する。グリコシル化モノマーポリペプチドの発現のための無脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ２１／Ｓｆ９、イラクサギンウワバＢｔｉ−Ｔｎ５ｂ１−４がある。有用な脊椎動物細胞の例としては、ニワトリ細胞（例：国際公開第２００８１４２１２４号パンフレット）及び哺乳動物細胞、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、又はげっ歯類、例えば、ウサギ、ラット、ミンク若しくはマウス細胞がある。
【００９９】
組換えポリペプチドの発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当該技術分野では周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞系があり、限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例：Ｈｅｐ  Ｇ２）、ヒト上皮腎２９３細胞、及びいくつかの他の細胞系が含まれる。様々な宿主細胞が、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾に固有の、かつ特異的な機構を有している。モノマーポリペプチドの適正な修飾及びプロセシングを確実にするために、適切な細胞系又は宿主系を選択することができる。このため、遺伝子産物の一次転写物、グリコシル化、及びリン酸化の適正なプロセシングのための細胞機構を有する真核宿主細胞を用いることができる。こうした哺乳動物細胞として、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（機能性免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞系）、ＳＰ２０、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞がある。一実施形態では、ヒトリンパ球を不死化させることによって作製したヒト細胞系を用いて、モノマーポリペプチドを組換えにより生産することができる。一実施形態では、ヒト細胞系ＰＥＲ．Ｃ６．（Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、モノマーポリペプチドを組換えにより生産することができる。
【０１００】
また、本発明の核酸及び宿主細胞を用いて、モノマーポリペプチドを生産する方法も提供される。モノマーポリペプチドの組換え発現には、一般に、モノマーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築が必要である。次に、従来の方法で発現ベクターを宿主細胞に転移させた後、トランスフェクトした細胞を従来の方法で培養することにより、モノマーポリペプチドを生産する。モノマー抗体を発現させる場合には、全重鎖及び軽鎖配列（変異型Ｆｃ領域を含む）を、同じ、又は異なる発現カセットから発現させてもよいし、これらの配列を１つ以上のベクターに含有させてもよい。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本発明のモノマーポリペプチドは、モノマーポリペプチドの安定発現を含む細胞系において発現させる。安定発現は、組換えタンパク質の長期の高収率生産のために用いることができる。例えば、モノマーポリペプチド分子を安定して発現する細胞系を作製してもよい。発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択マーカー遺伝子を含む、適切に作製されたベクターで、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、濃縮培地において１〜２日にわたり細胞を増殖させてから、選択培地に移す。組換えプラスミド内の選択マーカーは、選択に対する耐性を賦与することから、染色体にプラスミドを安定に組み込んだ細胞を増殖させて、フォーカスを形成し、次に、これらのフォーカスをクローン化し、細胞系へと増殖させることができる。高収率の安定な細胞系を生産する方法は、当該技術分野では公知であり、試薬は一般に市販のものが入手可能である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明のモノマーポリペプチドは、モノマーポリペプチドの一過性発現を含む細胞系において発現させる。一過性トランスフェクションは、細胞に導入した核酸が、その細胞のゲノム又は染色体ＤＮＡに組み込まれないプロセスである。これは、実際、細胞内で、染色体外エレメント、例えば、エピソームとして維持される。エピソームの核酸の転写プロセスは影響を受けないため、エピソームの核酸によってコードされたタンパク質が生産される。
【０１０３】
細胞系は、安定な細胞系又は一過性トランスフェクト細胞系のいずれも、当該技術分野では公知の細胞培地及び条件で維持することにより、モノマーポリペプチドの発現及び生産が達成される。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞培地は、市販の培地調製物、例えば、ＤＭＥＭ又はＨａｍ’ｓ  Ｆ１２を基材とする。別の実施形態では、細胞培地は、細胞増殖及び生物学的タンパク質発現の両方の増加を支持するように修飾する。本明細書で用いるように、「細胞培地」、「培養基」、及び「培地組成物」と言う用語は、多細胞生物又は組織外部の人工的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境における細胞の維持、成長、増殖、又は拡大のための栄養溶液を指す。細胞培地は、具体的な細胞培養の用途に合わせて最適化することができ、このような用途として、例えば、細胞の増殖を促進するように調製された細胞培養物増殖培地、又は組換えタンパク質生産を促進するように調製された細胞培養物生産培地などがある。栄養素、構成材料、及び成分という用語は、本明細書では置換え可能に用いられ、いずれも、細胞培地を組成する成分を指す。
【０１０４】
組換え発現によってモノマーポリペプチド分子を生産したら、ポリペプチドを精製するための当該技術分野では公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例：イオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、又はタンパク質の精製のための他の標準的技法によって精製してよい。さらに、本発明のモノマーポリペプチドを異種ポリペプチド配列（例えば、「タグ」）に融合させて、精製を促進することも可能である。こうしたタグの例として、例えば、ポリヒスチジンタグ、ＨＡタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、又はＦＬＡＧタグがある。アフィニティー精製法で用いることができるこのようなタグに結合する抗体は市販されている。
【０１０５】
組換え技術を用いる場合には、モノマーポリペプチドを細胞内で、すなわち細胞周辺腔内に生産することもできるし、又は培地に直接分泌させることもできる。モノマーポリペプチドを細胞内で生産する場合には、第１ステップとして、粒子状破片（宿主細胞又は溶解フラグメントのいずれでも）を、例えば、遠心分離又は限外ろ過により除去する。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３−１６７（１９９２）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞周辺腔内に分泌されるポリペプチドを単離する方法を記載している。モノマーポリペプチドを培地に分泌させる場合には、一般に、こうした発現系からの上清をまず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを用いて濃縮させる。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦのようなプロテアーゼインヒビターを前述のステップのいずれかで含有させてもよいし、また、外来の混入物の増殖を防止するために、抗生物質を含有させてもよい。
【０１０６】
７．７  医薬製剤
いくつかの態様では、本発明は、本発明のモノマーポリペプチドと薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物中、変異型Ｆｃドメインを含むポリペプチドの少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％がモノマーである。いくつかの実施形態では、モノマーポリペプチドのパーセントは、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって決定される。いくつかの実施形態では、モノマーポリペプチドのパーセントは、ＡＵＣによって決定される。特定の実施形態では、モノマーポリペプチドのパーセントは、以下に記載する実施例で説明するようなＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ及び／又はＡＵＣによって決定される。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、薬剤として用いられる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明のモノマーポリペプチドは、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と一緒に、医薬（治療用）組成物として製剤化することができ、当該技術分野では公知の様々な方法によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路及び／又は方式は、所望する結果に応じて異なる。本明細書で用いられるように、モノマーポリペプチドを含む医薬製剤は、本発明の製剤と呼ぶ。「薬学的に許容可能な担体」という用語は、活性成分の生物活性の効果を妨害しない１種以上の無毒性材料を意味する。こうした製剤は、一般的に、塩類、緩衝剤、保存料、適合性担体、及び任意でその他の治療薬を含みうる。このような薬学的に許容可能な製剤は、また、一般的に、ヒトへの投与に好適な適合性固体又は液体充填剤、希釈剤又はカプセル化物質も含みうる。本発明の製剤に用いることができる他に考慮される担体、賦形剤、及び／又は添加剤としては、例えば、芳香剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、脂質、タンパク質賦形剤、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン、塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウムなどがある。本発明の製剤での使用に好適な上記及びその他の公知の医薬用担体、賦形剤及び／又は添加剤は当該技術分野では公知であり、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００５），及び“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，６０ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．（２００５）に記載されているものがある。薬学的に許容可能な担体は、当業者には周知のように、また、本明細書でも記載するように、モノマーポリペプチドの投与方式、溶解性及び／又は安定性について好適なものを選択することができる。
【０１０８】
本発明の製剤は、所望の用量について適切なｗ／ｖをもたらす濃度のモノマーポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、モノマーポリペプチドは、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、又は１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌの濃度で本発明の製剤中に存在する。いくつかの実施形態では、製剤中のモノマーポリペプチドの濃度は、約０．１〜約１００重量％まで変動しうる。いくつかの実施形態では、本発明のモノマーポリペプチドの濃度は、０．００３〜１．０モルの範囲である。
【０１０９】
一実施形態では、本発明の製剤は、発熱物質除去製剤であり、内毒素及び／又は関連発熱物質を実質的に含まない。内毒素は、微生物内部に閉じ込められた毒素を含み、この毒素は、微生物が分解されるか、死滅したときにのみ放出される。発熱物質はまた、細菌及びその他の微生物の外膜に由来する熱誘発性の熱安定性物質（糖タンパク質）も含む。これらの物質のいずれも、ヒトに投与すると、熱、高血圧及びショックを引き起こす。潜在的な有害作用があるため、たとえ少量の内毒素であっても、静脈内投与用医薬剤溶液からは除去しなければならない。Ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ＆  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（「ＦＤＡ」）は、静脈内の薬剤適用の場合、１時間に体重１ｋｇ当たりの用量につき５内毒素単位（ＥＵ）の上限を設定している（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６  （１）：２２３（２０００））。いくつかの具体的実施形態では、組成物中の内毒素及び発熱物質レベルは、１０ＥＵ／ｍｇより低い、又は５ＥＵ／ｍｇより低い、又は１ＥＵ／ｍｇより低い、又は０．１ＥＵ／ｍｇより低い、又は０．０１ＥＵ／ｍｇより低い、又は０．００１ＥＵ／ｍｇより低い。
【０１１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に用いる場合には、本発明の製剤は滅菌してなければならない。本発明の製剤は、様々な滅菌方法で滅菌してよく、滅菌方法として、滅菌ろ過、照射などがある。一実施形態では、モノマーポリペプチド製剤は、予め滅菌した０．２２ミクロンフィルターでフィルター滅菌する。注射用の滅菌組成物は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００５）に記載の通常の薬務に従って製剤化することができる。
【０１１１】
本発明の治療用組成物は、特定の投与経路、例えば、経口、鼻、肺、局所（口腔及び舌下など）、直腸、膣及び／又は非経口投与のために製剤化することができる。本明細書で用いる「非経口投与」及び「非経口的に投与される」というフレーズは、腸及び局所投与以外の投与様式を指し、通常、注射によるものであり、こうした投与様式として、限定するものではないが、静脈内、筋内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内注射及び注入がある。局所又は経皮投与に好適な本発明の製剤としては、粉末、噴霧、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤がある。活性化合物を滅菌条件下で、薬学的に許容可能な担体、及び必要に応じて任意の防腐剤、バッファー、又は噴射剤と混合してもよい（米国特許第７，３７８，１１０号明細書；同第７，２５８，８７３号明細書；同第７，１３５，１８０号明細書；米国特許出願公開第２００４−００４２９７２号明細書；及び同第２００４−００４２９７１号明細書）。
【０１１２】
製剤は、単位投薬形態をしているのが便利であり、薬学の分野で公知の任意の方法で調製することができる。本発明の医薬組成物で活性の成分の実際の投薬レベルは、患者に対して毒性にならずに、具体的な患者、組成物、及び投与様式についての所望する治療応答を達成するのに有効な活性成分の量（例えば、「治療有効量」）が得られるように、変動しうる。選択される投薬レベルは、様々な薬物動力学的要因、例えば、使用する本発明の具体的組成物の活性、投与経路、投与時間、使用する具体的化合物の排出速度、治療期間、使用する具体的組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物及び／又は材料、治療する患者の年齢、性別、体重、病態、健康状態、及び病歴、並びに医学分野で周知の類似要因がある。好適な投薬量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）以上、例えば、０．１、１、１０、又は５０ｍｇ／ｋｇ（体重）以上、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）が好ましい。
【０１１３】
７．８  用途例
本明細書に記載のモノマーポリペプチドは、診断及び／又は治療目的に用いることができる。いくつかの実施形態では、本発明のモノマーポリペプチド及びその組成物は、細胞及び組織において標的発現を検出する目的で、又は標的発現細胞及び組織をイメージングする目的でｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いることができる。例えば、いくつかの実施形態では、モノマーポリペプチドは、生きているヒトの患者における標的発現をイメージングするのに用いることができる、変異型Ｆｃ領域を含むモノマー抗体である。
【０１１４】
例として、診断のための使用は、例えば、試験しようとするサンプルを、任意で対照サンプルと一緒に、モノマー抗体と標的同士の複合体の形成を可能にする条件下で、モノマー抗体と接触させることによって達成することができる。次いで、複合体形成を検出する（例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、又はモノマー抗体と結合した部分を検出するためのイメージングにより）。試験サンプルと一緒に対照サンプルを用いる場合には、両サンプルにおいて複合体を検出し、サンプル同士の複合体の形成に統計的に有意な差があれば、試験サンプル中の標的の存在を示している。
【０１１５】
一実施形態では、本発明は、標的を含有することが疑われるサンプル中の標的の存在を決定する方法を提供し、前記方法は、本発明のモノマー抗体にサンプルを暴露するステップと、モノマー抗体とサンプル中の標的との結合を決定するステップを含み、モノマー抗体とサンプル中の標的との結合は、サンプル中の標的の存在を示すものである。一実施形態では、サンプルは生体サンプルである。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイを用いて、標的の過剰発現又は増幅を検出するのに、モノマー抗体を用いることができる。一実施形態では、モノマー抗体をサンプルに添加し、モノマー抗体を、検出しようとする標的に結合させて、検出可能な標識（例えば、放射性同位元素又は蛍光標識）でタグ付けし、標識の定位のために患者を外部からスキャニングする。
【０１１７】
これに代わり、又はこれに加えて、ＦＩＳＨアッセイ、例えば、ＩＮＦＯＲＭ（商標）（Ｖｅｎｔａｎａ，Ａｒｉｚ．により販売）又はＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（商標）（Ｖｙｓｉｓ，Ｉ１１．）を、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織上で実施して、サンプルにおける標的発現又は過剰発現の程度（もしあれば）を決定する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明のモノマーポリペプチド及びその組成物は、必要とする被検者に、疾患／障害／病態の予防及び／又は治療を目的として投与することができる。本発明は、標的関連の、又は追発した疾患／障害／病態を予防、治療、維持、軽減、若しくは阻害する、並びに／又は哺乳動物における疾患の１つ以上の症状を予防及び／若しくは軽減する方法であって、哺乳動物に治療有効量のモノマーポリペプチドを投与することを含む、上記方法を含む。モノマーポリペプチド組成物は、医師の指示に従い、短期（急性）若しくは長期、又は断続的に投与することができる。
【実施例】
【０１１９】
８．例証
以下の実施例により本発明の実施を説明する。これらの実施例は、本発明の全範囲を制限又は限定することを意図するものではない。
【０１２０】
８．１  実施例１：ヒンジ欠失ＩｇＧ４ベクターの作製
野生型ヒトＩｇＧ４定常ドメインの１２アミノ酸ヒンジ領域を以下のようにして除去した：ＩｇＧ発現ベクターｐＥＵ８．２は、初め参照文献［１］に記載される重鎖発現ベクターから得たものであり、哺乳動物細胞において全ＩｇＧ重鎖を発現するためのヒト重鎖定常領域及び調節エレメントを含む。このベクターは、単純にＯｒｉＰエレメントを導入することによって改変した。ヒンジ領域上流の５’イントロンと、ヒンジ領域のすぐ下流の３’イントロン配列とにフランキングするオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。次に、参考文献［２］に記載の標準的突然変異誘発技法を用いて、上流のイントロンと１２アミノ酸ヒンジ領域を除去した。配列において予想される４２０ｂｐ欠失をＤＮＡ配列決定によって確認した。新規のベクターをｐＥＵ８．２Δヒンジと称する。
【０１２１】
８．２  実施例２：ヒンジ欠失ＩｇＧ４分子の作製
８．２．１  実施例２ａ：抗細胞表面受容体抗体６のｐＥＵ８．２Δヒンジへのサブクローニング
抗細胞表面受容体抗体（「抗体６」と称する）のＶＨ及びＶＬドメインをベクターｐＥＵ８．２Δヒンジ及びｐＥＵ４．４ベクターにそれぞれサブクローン化した。ＶＨドメインを、ヒト重鎖γ４定常ドメイン（但し、１２アミノ酸ヒンジ領域は除去した）と、調節エレメントとを含むベクター（ｐＥＵ８．２Δヒンジ）にクローン化して、哺乳動物細胞に全ＩｇＧ重鎖を発現させた。同様に、ヒト軽鎖（λ）定常ドメイン及び調節エレメントの発現用のベクター（ｐＥＵ４．４）にＶＬドメインをクローン化して、哺乳動物細胞に全ＩｇＧ軽鎖を発現させた。ＩｇＧを得るために、ベクターを発現する重鎖及び軽鎖ＩｇＧをＥＢＮＡ−ＨＥＫ２９３哺乳動物細胞にトランスフェクトした。ＩｇＧを発現させて、培地に分泌させた。回収物をプールし、ろ過してから精製した後、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、ＩｇＧを精製した。培養上清をＣｅｒａｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＢｉｏＳｅｐｒａ）の適切なサイズのカラムにロードし、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した。０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を用いて、結合ＩｇＧをカラムから溶離した後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）の添加により中和した。溶離した物質を、Ｎａｐ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，＃１７−０８５４−０２）を用いて、ＰＢＳにバッファー交換した後、ＩｇＧのアミノ酸配列に基づく吸光係数を用いて、ＩｇＧの濃度を分光測光法により決定した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製ＩｇＧを凝集及び分解について分析した。
【０１２２】
８．２．２  実施例２ｂ：Ｍｕｌｔｉ  Ａｎｇｌｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）と組み合わせたサイズ置換クロマトグラフィーによる抗体６ＩｇＧ４Δヒンジ分子の特性決定
Ｍｕｌｔｉ  Ａｎｇｌｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィーは、バイオポリマーの正確な分子サイズを決定するための非常に高感度の技術である。このシステムを用いて、抗体６ＩｇＧ４野生型と比較した抗体６ＩｇＧ４Δヒンジ分子の分子量を決定した。１００μｌサンプルをまず、ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ４０００カラム（３００×７．８ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ部品番号００Ｈ−２１４７−Ｋ０、通し番号３８９５２４−１１）を用いて分析したが、上記カラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１１００ＨＰＬＣにより毎分１．０ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳで平衡した。Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＤＡＤ）からの２２０及び２８０ｎｍシグナルを用いて、ピークを検出した。ＨＰ１１００ＤＡＤ検出器からの溶出液をＷｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＤＡＷＮ  ＥＯＳ及びＯｐｔｉｌａｂ  ｒＥＸ検出器（それぞれ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｇｌｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ及びＲｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ検出器）に通過させた。これら検出器からの出力をＡＳＴＲＡ  Ｖ（５．１．９．１．）ソフトウエアを用いて処理した。０．１８４の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）値を用いた（グリコシル化ＩｇＧが、約２．５質量％のグリカンを有すると想定して計算した）。Ｄ−ＰＢＳ平衡カラムからの検出器１１（９０°）バックグラウンド光散乱値は、＜０．３５ボルトであった。
【０１２３】
国際公開第２００７／０５９７８２  Ａ１号パンフレットによれば、ＩｇＧ４Δヒンジ変異体は、野生型ＩｇＧ４分子のサイズのほぼ半分（約７５ｋＤａ）であるはずである。しかし、野生型ＩｇＧ４及びＩｇＧ４Δヒンジの両者について算出されたサイズは、いずれも、二価分子について予想されるサイズと大体同じであった（表３）。これは、１２アミノ酸ヒンジ領域のみの欠失が、予想（約７５ｋＤａ）サイズの一価モノマーを生成するには十分でないことを示している。
【０１２４】
【表３】
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【０１２５】
８．３  実施例３：ＣＨ３定常ドメイン突然変異の生成
一価抗体の生産をさらに安定化するために、さらなる突然変異をＣＨ３定常ドメイン領域におけるＩｇＧ４Δヒンジ分子に導入して、ＩｇＧ４分子の２つのアーム間のＣＨ３−ＣＨ３界面を破壊した。
【０１２６】
８．３．１  実施例３ａ：ＣＨ３−ＣＨ３界面の破壊のためのアミノ酸の選択
ＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインは、２つのＦｃ鎖の二量体化を促進して、機能性免疫グロブリン分子を形成する表面を含む。二量体化は、２つの会合するＣＨ３ドメイン各々の片面内での相互作用によって媒介されるが、一方のＣＨ３ドメインの面は、他方のＣＨ３ドメインの面のものと同一のアミノ酸残基から構成されており、ＣＨ３ドメインの一方は、他方に対し、その縦軸に沿って１８０°回転することによって、二量体化のために適正な配向を達している。界面は、回転対称によるそれらの関係のために、各ＣＨ３ドメインからの約１６アミノ酸から構成されており、界面の中心は、各々のタンパク質鎖において同じ位置に位置するアミノ酸から構成されている。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの結晶構造［３］の分析によって、向き合うＣＨ３ドメインのそれぞれの対応物と相互作用する各アミノ酸との界面の中心にあるものとして、両ＣＨ３ドメインからの３６６位のトレオニン及び４０７位のチロシンを同定することができた。ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列とヒトＩｇＧ４の配列とのアラインメントにより、ＩｇＧ４の配列に同じアミノ酸が存在することが明らかになったが、実際に、すべてのヒトＩｇＧイソタイプのＣＨ３ドメインにおけるそれらの位置に同じアミノ酸が存在する。ＣＨ３−ＣＨ３界面におけるアミノ酸のいずれを置換しても、界面の不安定化がおこり、二量体の形成を防止することができたが、特にアミノ酸の置換を、天然に存在するアミノ酸より大きい側鎖で実施すると、そうであった。これは、こうした置換により、強力な相互作用に必要な密接な接触が破壊されるためであろう。最大限の破壊は、一方の鎖の１つのアミノ酸と、他方の鎖でそれと接触しているアミノ酸を置換することによって達成されると推定される。導入したアミノ酸がその側鎖に同じ実効電荷を帯びている場合には、これによって、電荷に基づく反発作用が生じ、また、パッキングの改変により相互作用表面の破壊が起こる。改変残基の数を最小限にするために、界面中心の２つのアミノ酸、すなわちｔｈｒ３６６及びｔｙｒ４０７を選択し、アルギニン（いずれも、大きな側鎖を有し、実効陽電荷を帯びている）で置換した。
【０１２７】
８．３．２  実施例３ｂ：抗体６ＩｇＧ４ΔヒンジＣＨ３ドメインの突然変異誘発
標準的な部位指定突然変異誘発方法を用いて、ｐＥＵ８．２Δヒンジの３６６位のトレオニンをアルギニンに、４０７位のチロシンをアルギニンに突然変異させた。ＤＮＡ配列決定を用いて、突然変異誘発を確認した。新規の変異体は、ｐＥＵ８．２ΔヒンジＴ３６６ＲＹ４０７Ｒと称する。抗体６のＶＨ及びＶＬドメインを、ｐＥＵ８．２ΔヒンジＴ３６６ＲＹ４０７Ｒ及びｐＥＵ４．４にそれぞれサブクローン化した。ヒト重鎖γ４定常ドメイン（但し、１２アミノ酸ヒンジ領域を除去し、３６６位のトレオニンと４０７位のチロシンをアルギニンに突然変異させた）と、調節エレメントを含むベクター（ｐＥＵ８．２ΔヒンジＴ３６６ＲＹ４０７Ｒ）に、ＶＨドメインをクローン化して、哺乳動物細胞に全ＩｇＧ重鎖を発現させた。同様に、ヒト軽鎖（λ）定常ドメイン及び調節エレメントの発現用のベクター（ｐＥＵ４．４）にＶＬドメインをクローン化して、哺乳動物細胞に全ＩｇＧ軽鎖を発現させた。ＩｇＧを得るために、ベクターを発現する重鎖及び軽鎖ＩｇＧをＥＢＮＡ−ＨＥＫ２９３哺乳動物細胞にトランスフェクトした。ＩｇＧを発現させて、培地に分泌させた。回収物をプールし、ろ過してから精製した後、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、ＩｇＧを精製した。培養上清をＣｅｒａｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＢｉｏＳｅｐｒａ）の適切なサイズのカラムにロードし、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した。０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を用いて、結合ＩｇＧをカラムから溶離した後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）の添加により中和した。溶離した物質を、Ｎａｐ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，＃１７−０８５４−０２）を用いて、ＰＢＳにバッファー交換した後、ＩｇＧのアミノ酸配列に基づく吸光係数を用いて、ＩｇＧの濃度を分光測光法により決定した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、またＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製ＩｇＧを凝集及び分解について分析した。
【０１２８】
８．３．３  実施例３ｃ：多角度レーザー光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）と組み合わせたサイズ置換クロマトグラフィーによる抗体６ＩｇＧ４ΔヒンジＴ３６６ＲＹ４０７Ｒ分子の特性決定
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳを用いて、抗体６ＩｇＧ４野生型及び抗体６ＩｇＧ４Δヒンジと比較した抗体６ＩｇＧ４ΔヒンジＴ３６６ＲＹ４０７Ｒ分子の分子量を決定した。１００μｌサンプルをまず、ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ４０００カラム（３００×７．８ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ部品番号００Ｈ−２１４７−Ｋ０、通し番号３８９５２４−１１）を用いて分析したが、上記カラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１１００ＨＰＬＣにより毎分１．０ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳで平衡した。Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＤＡＤ）からの２２０及び２８０ｎｍシグナルを用いて、ピークを検出した。ＨＰ１１００ＤＡＤ検出器からの溶出液をＷｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＤＡＷＮ  ＥＯＳ及びＯｐｔｉｌａｂ  ｒＥＸ検出器（それぞれ、多角度レーザー光散乱及び屈折率検出器）に通過させた。これら検出器からの出力をＡＳＴＲＡ  Ｖ（５．１．９．１．）ソフトウエア（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＵＳＡ）を用いて処理した。０．１８４の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）値を用いた（グリコシル化ＩｇＧが約２．５質量％のグリカンを有すると想定して計算した）。Ｄ−ＰＢＳ平衡カラムからの検出器１１（９０°）バックグラウンド光散乱値は＜０．３５ボルトであった。
【０１２９】
抗体６ＩｇＧ４ΔヒンジＴ３６６ＲＹ４０７Ｒ変異体について算出されたサイズは約６８ｋＤａであり、一価分子と一致していたが、野生型ＩｇＧ４及びＩｇＧ４Δヒンジの両者は、いずれも、二価分子について予想されるサイズと同様であった（表４）。
【０１３０】
【表４】
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【０１３１】
８．３．４  実施例３ｄ：ＨｅＬａ細胞からのリガンド誘導サイトカイン放出の阻害
二価抗体６ＩｇＧ４野生型及び抗体６ＩｇＧ４Δヒンジと比較した一価抗体６ＩｇＧ４ΔヒンジＴ３６６ＲＹ４０７Ｒの生物活性を決定するために、これらの活性をＨｅＬａヒト細胞アッセイにおいて、リガンド誘導サイトカイン放出の用量依存的阻害を測定することにより、評価した。手短には、１０％ウシ胎仔血清及び１％非必須アミノ酸を添加したＭＥＭ中に維持するＨｅＬａ細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ＥＣＡＣＣカタログ番号９３０２１０１３）を、１．５×１０４細胞／ウェルで９６ウェル組織培養アッセイプレートに接種して、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で一晩（１６〜１８時間）培養した。培地中で連続的に希釈した精製ＩｇＧ変異体を、上記のＨｅＬａ細胞に、一晩培養した培地を除去せずに添加し、ＨｅＬａ細胞と一緒に３７℃で３０〜６０分プレインキュベートした。続いて、濃度ＥＣ５０のリガンド（アッセイにおいて最大応答の半分を達成するリガンドの濃度として定義される）を添加した後、３７℃及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で４〜５時間インキュベートした。上清（条件培地）を回収し、上清中のサイトカインレベルを、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて決定した。試験した各構築物のＩＣ５０を表５に示す。これらのデータは、一価抗体Ａｂ６ＩｇＧ４ΔヒンジＴ３６６ＲＹ４０７Ｒ構築物が生物活性を保持していることを示している。
【０１３２】
【表５】
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【０１３３】
８．４  実施例４：ＣＨ３−ＣＨ３界面の分子モデル化
ＣＨ３−ＣＨ３界面の分析をヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインの高分解能結晶構造（ＰＤＢアクセッションナンバー１Ｈ３Ｕ［３］）及び唯一入手可能なＩｇＧ４Ｆｃドメイン結晶構造（ＰＤＢアクセッションナンバー１ＡＤＱ［４］）で、ＰｙＭｏｌソフトウエア（ワールドワイドウェブｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ［５］）を用いて実施した。ＰＤＢアクセッションナンバーとは、ワールドワイドウェブｐｄｂ．ｏｒｇでアクセス可能なＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに関する。分子間接触に関与する残基は、ファンデルワールス半径＋０．５Åの和［６］より接近した原子団の任意の対を含む残基として定義されている。部位指定突然変異体の崩壊の可能性を、ＰｙＭｏｌ突然変異誘発ウィザードを用いて分析することにより、様々なアミノ酸鎖で置換した際の理論的衝突を確認した。
【０１３４】
ＣＨ３−ＣＨ３界面での分子間相互作用に関与する残基を表６に示す。界面での最も顕著な非ファンデルワールス相互作用は、Ｔ３６６とＹ４０７同士の２つの水素結合（これは、分析した全ての結晶構造に存在する）、及び構造に応じて起こりうる３つ又は４つの塩架橋（Ｅ３５６−Ｋ４３９、Ｄ３９９−Ｒ４０９、Ｋ３９２−Ｄ３９９、及びＲ４０９−Ｄ３９９）であった。
【０１３５】
Ｔ３６６及びＹ４０７は、ＣＨ３界面のコアで重要な残基であり、これら残基の両方がアルギニンへと突然変異することによって、Ｆｃドメインの二量体化が阻止される（実施例３参照）。別の２つの残基（Ｌ３６８及びＦ４０５）は、この領域における有意な相互作用に関与するものとして識別されており、これらの位置での合理的突然変異もまたＣＨ３ドメインの二量体化を阻止しうることを示している。既述したように、構造分析によって、二量体化界面に４つ以下の塩架橋が存在しうることが明らかになり、これらの位置での突然変異は、電荷反発を引き起こすか、又は単純に、Ｆｃ二量体形成に影響をもたらすことが推定される静電気相互作用を除去する。４つのコア界面残基（Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｆ４０５及びＹ４０７）並びに５つの塩架橋残基（Ｅ３５６、Ｄ３９９、Ｋ３９２、Ｒ４０９及びＫ４３９）に加えて、５つの残基（Ｅ３５１、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４）からなる第３のセットが、ホモ二量体の向き合うＣＨ３ドメイン上の同一残基、又は崩壊性突然変異の挿入（例えば、互いに反対の同電荷の挿入）を可能にする傾向が高いと思われる特定の残基のいずれかと相対するものとして識別された。また、ＣＨ３−ＣＨ３界面周辺における残基（Ｙ３４９、Ｓ３５４、Ｅ３５７）からなる第４のセットも、二量体形成に影響を与える可能性があるものとして決定された。
【０１３６】
【表６】
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【０１３７】
上記の位置での単一又は複数の部位指定突然変異の影響を分析するために、５アミノ酸からなる１セットを側鎖の各タイプを代表するものとして選択した：陽荷電（アルギニン）；陰荷電（アスパラギン酸）；大きな芳香族（トリプトファン）；小さな中性（アラニン）；及び親水性（グルタミン）。疎水基の挿入は、タンパク質−タンパク質界面を破壊するようではないと推論したことから、脂肪族側鎖は排除した。表７に記載の、合計６５のＩｇＧ４ＣＨ３ドメイン単一、二重及び三重突然変異体を合理的に設計して、構築物を発現させ、ヒンジなしＩｇＧ４Ｆｃドメインと同様に分析した。これら突然変異体のうちの２１を、野生型ヒンジを含むＩｇＧ４Ｆｃドメインと同様に設計、発現及び分析した。また、３７のＩｇＧ１及び３つのＩｇＧ２ヒンジなしＦｃドメイン突然変異体も調べた。
【０１３８】
８．５  実施例５：ＣＨ３−ＣＨ３界面領域におけるアミノ酸の突然変異誘発及びＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ及びＨＰＬＣによる分析
８．５．１  実施例５ａ：突然変異誘発、タンパク質発現及び精製
ＩｇＧ１、２及び４のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを既存の抗体構築物からのＰＣＲによって増幅し、ｐＥＵベクターにクローン化して、目的とする３つのＩｇＧサブクラスについてヒンジなしＦｃドメインの発現構築物を作製した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用い、製造者の指示に従って、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を実施した。
【０１３９】
組換えＦｃドメインの一過性発現を、ＥＢＮＡ−１遺伝子でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で実施した。１００μｇ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシンを含有する細胞を、細胞１ｍｌ当たり１μｇのＤＮＡと一緒に、直線状ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を１２：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比で用いて、１±０．１×１０６生存細胞／ｍｌの細胞数でトランスフェクトした。細胞にＣＨＯ  ＣＤ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を２日目及び５日目に供給し、７日後に遠心分離により回収した。上清を０．２２μＭフィルターでろ過してから、Ｆｃドメインを、Ｖｉｖａｐｕｒｅ  ｍａｘｉｐｒｅｐＧスピンカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｅｐｓｏｍ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）を用いて、プロテインＧアフィニティカラムクロマトグラフィーにより精製した。溶離したサンプルを濃縮し、Ｎａｐ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてＰＢＳにバッファー交換し、タンパク質純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。典型的な収率は、初めの培養物１リットル当たり＞９５％純度のタンパク質約５０〜１００ｍｇであった。
【０１４０】
８．５．２  実施例５ｂ：多角度レーザー光散乱
光散乱を分別に即して実施した（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）が、これは、実施例３ｂに記載したのと同じ方法で実施した。ＤＡＷＮ−ＨＥＬＥＯＳ及びＯｐｔｉｌａｂ  ｒＥＸ計器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）をそれぞれ用いて、光散乱及び示差屈折率を検出した。突然変異体のデータは、取得可能な場合、それらを表７に示す。
【０１４１】
以前、全抗体として分析された野生型ＩｇＧ４及びＴ３６６Ｒ／Ｙ４０７Ｒ二重変異体のＦｃドメインを光散乱によって分析して、タンパク質の分子量の正確な測定値（±３％）を決定し、このようにしてＦｃドメインのモノマー又は二量体性を決定する。３６６位及び４０７位での単一アルギニン突然変異体も、さらに別の７つの突然変異体と共に分析した。図１は、野生型と比較したＴ３６６Ｒ／Ｙ４０７Ｒサンプルの光散乱データを示す。
【０１４２】
モノマーＦｃドメインについてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって決定した分子量は、約２５．９ｋＤａ（２つの等しく集合した糖型からなる）であったため、二量体は５１．８ｋＤａの質量を有すると推定された。従って、野生型ＩｇＧ４Ｆｃドメインの光散乱から得られた５２ｋＤａの分子量は、推定分子量と十分に一致し、野生型が、上記の条件下では排他的に二量体であることを示している。しかし、Ｔ３６６Ｒ、Ｙ４０７Ｒ及びＴ３６６Ｒ／Ｙ４０７Ｒ突然変異体は、より低い見掛け分子量（３２〜３５ｋＤａ）を有し、モノマー種について予想されるものに近づくものの、完全には一致しない。
【０１４３】
８．５．３  実施例５ｃ：サイズ排除クロマトグラフィー
Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣで、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製タンパク質サンプルを分析した。濃度０．８ｍｇ／ｍｌの各サンプル５０μｌを、オートサンプラーでカラムにインジェクトして、リン酸緩衝食塩水泳動バッファーにおいて流量０．５ｍｌ／分で泳動を実施した。野生型Ｆｃドメインのサンプルを各バッチと一緒にロードし、直接比較した。また、すべてのサンプルは２回繰り返して泳動させた。
【０１４４】
光散乱データと一致して、図２に示すように、６５のＩｇＧ４突然変異体のＨＰＬＣ分析によって、サンプルを、二量体のものと、モノマーのものとにおおまかに分離することはできないことが明らかにされた。表７は、サイズ排除ＨＰＬＣを用いた６５のＩｇＧ４突然変異体についてのデータを示す。分析から、ＩｇＧ４突然変異体には、二量体と一致する分子量で溶離したものもあれば、モノマーの分子量で溶離したものもあったことがわかった。さらに、中間の保持時間で溶離したＩｇＧ４突然変異体もあった。これらのサンプルには、２つの種の間の平衡によって、モノマー及び二量体保持時間の間に急速な交換があると考えられる。ＳＥＣ保持時間と、クロマトグラムの外観（例えば、明らかに単分散性のサンプル、又はピークの広がり又は二重ピークから種の明瞭な混合物）に基づいて３つの任意の群にさらに分類した結果、１９の二量体（野生型を除く）、１８のモノマー−二量体平衡状態のもの、及び優勢にモノマー種を示す有意に小さい分子量を有する２８の突然変異体が得られた。疑いのないように言えば、単独で組み込まれると二量体を生成する突然変異体は、モノマー又は平衡状態の種をもたらす他の突然変異と組み合わせると、モノマーを生成しうることは当業者にはあきらかであろう。表に「モノマー」という表記が用いられている場合、当業者であれば、これらの種の構造をさらに調べるのに利用可能な別の実験方法を認識されるであろう。
【０１４５】
【表７】
2013537416.tif 000009
2013537416.tif 000010
【０１４６】
Ｆｃドメイン相互作用におけるヒンジ領域の役割をさらに詳しく調べるために、１７のモノマーヒンジなしＩｇＧ４突然変異体及び少数の他の突然変異体を、野生型ヒンジを含むＩｇＧ４Ｆｃドメインに転換し、精製したタンパク質をＨＰＬＣにより分析した。すべてのサンプルは、Ｒ４０９Ｗ突然変異体を除いてヒンジなしドメインについて観察されたものと類似の挙動を示した。Ｒ４０９Ｗ突然変異体は、ヒンジなしＩｇＧ４Ｆｃドメインのような優勢にモノマー種としての挙動と比較して、モノマー及び二量体のほぼ等分の集団を含んでいた。残る１６の「モノマー」突然変異体はすべて、ピーク積分により測定すると、３０％を下回る二量体を含んでいた（表８）。これは、３７℃で２週間のインキュベーションの結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣによるはっきりとした変化の兆候を全く示さなかったことから、非還元条件下で静的集団であることがわかった。表９に、表示位置でのモノマーＦｃ（ＩｇＧ４Ｆｃのみ）を形成する突然変異のタイプをまとめた。
【０１４７】
【表８】
2013537416.tif 000011
【０１４８】
【表９】
2013537416.tif 000012
【０１４９】
８．６  実施例６：ＩｇＧ１及び２のＨＰＬＣ分析
図３のクロマトグラムは、ＩｇＧ４のサブクラスと比較した、ＩｇＧサブクラス１及び２の単一及び二重Ｔ３６６Ｒ／Ｙ４０７Ｒ突然変異体についての分析ＳＥＣデータを示す。３つのサブクラスの突然変異体は、配列アラインメントによるほぼ同じ界面残基を有するにもかかわらず、それぞれ挙動が異なる。ＩｇＧ１及び２の両方について、Ｙ４０７Ｒ突然変異体は、性質が最もモノマー的に見えるのに対し、Ｔ３６６Ｒ及びＴ３６６Ｒ／Ｙ４０７Ｒ突然変異体は、混合集団の明らかな兆候を示している。これを２９のヒンジなしＩｇＧ１Ｆｃドメイン突然変異体の作製によってさらに分析した。ＩｇＧ４サブタイプとしてモノマーであった２１の突然変異体を調べると、そのうち１１の突然変異体のみがＩｇＧ１としてモノマーであった（表１０）。
【０１５０】
ＩｇＧサブクラス、Ｒ３５５Ｑ、Ｑ４１９Ｅ及びＰ４４５Ｌの間で異なる残基のうち３つは、分子間相互作用に関与しておらず、従って、ＣＨ３二量体の安定性に大きな影響をもたらさないはずである。しかし、Ｒ４０９Ｋは、２つのＣＨ３ドメイン間の界面にあり、また、Ｋ４０９は、Ｆｃ二量体の安定性に大きく寄与することが以前明らかにされている［７］。ＩｇＧ４様界面（すなわち、Ｋ４０９Ｒ）を生成するためのＩｇＧ１突然変異体の部位指定突然変異誘発によって、表１０から明らかなように、ＩｇＧ４について観察された状態に逆転した突然変異体のいくつかが得られた。
【０１５１】
本発明は、安定な半抗体の初めての作製及び特性決定を示すものであり、Ｆｃドメインの有利な特性、例えば、長い半減期は維持しながら、二価抗体による抗原の架橋がもたらしうる、時に不要なアゴニスト作用に解決策を提供する。これは、増大したサイズ及び／又はＦｃＲｎ再生により半減期を延長するペプチド、タンパク質又はポリマーとの融合なしに、他の非活性化抗体フォーマット又は新規のスカフォールドが有していない独特の特性であり、従って、一価抗体を魅力的な選択肢にする。
【０１５２】
【表１０】
2013537416.tif 000013
【０１５３】
８．７  実施例７：Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ＵｌｔｒａＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ（沈降速度分析超遠心分離）（ＳＶ−ＡＵＣ）
Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ＵｌｔｒａＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ（ＳＶ−ＡＵＣ）を複数のヒンジなし構築物に実施して、沈降係数及び見掛け溶解分子量を決定した。実験及び分析をＭ−Ｓｃａｎ  Ｌｔｄ．（Ｗｏｒｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）で実施した。ＳＶ−ＡＵＣは、２０℃でＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＸＬ−Ａ  ＡＵＣ計器で実施した。濃度２８〜４２μＭのサンプルをＸＬ−Ａ  ＡＵＣ細胞のサンプルセクターにロードし、ＰＢＳバッファーを細胞の対照セクターにロードした。波長（γ）スキャンを実施して、配列スキャンに用いることができる好適なγを取得した（得られたデータが、Ｂｅｅｒ  Ｌａｍｂｅｒｔの法則が依然として有効である、すなわち吸光度≦１．０であるスペクトル領域であるとき）。これに基づき、３００ｎｍのλを選択した。初期ＳＶスキャンを３，０００ｒｐｍで開始して、重い凝集体の存在を確認した。界面移動は観察されなかったが、これはサンプル中に大きな沈殿物が存在しないことを意味する。最終ローター速度４０，０００ｒｐｍを、６分間隔での２００スキャンと共に選択した。得られたデータを、ＳＥＤＦＩＴプログラムを用いて評価して、スベドベリ単位（Ｓ）で記録される沈降係数（ｓ）値のｃ（ｓ）プロフィールを取得した。平均部分比体積０．７３ｍｌ／ｇ（２０℃で）をＳＥＤＦＩＴ分析に用いた。コンピュータープログラムＳＥＤＮＴＥＲＰを用いて、バッファー密度及びＰＢＳのバッファー粘度を計算した。バッファー密度の値１．００５３４とＰＢＳの粘度（ポアズ）０．０１００２を算出した。３つのヒンジなしＦｃサンプルについて得られた沈降係数をまとめたものを表１１に示す。このデータの分布グラフを図４に示す。
【０１５４】
野生型ヒンジなしＩｇＧ４Ｆｃドメインの主要種は、３．７Ｓのｓ値を示した。ｃ（Ｍ）への変換によって、３．７Ｓ成分の見掛け溶解分子量は、５１．２ｋＤａとなったが、これは、ホモ二量体の予想分子量と一致する。２．４Ｓのｓ値と１．２％の相対ＵＶ吸収率を有する、より小さい成分は、見掛け溶解分子量が２７．４ｋＤａであったが、これは、モノマーの予想分子量と近似で一致する（図４Ａ）。ヒンジなしＩｇＧ４Ｙ３４９ＤＦｃドメインの主要種は、３．５Ｓのｓ値を示した。ｃ（Ｍ）への変換によって、３．５Ｓ成分の見掛け溶解分子量は、４３．３ｋＤａとなったが、これは、ホモ二量体成分の予想分子量より低い。この結果は、ＨＰＬＣデータと一致しており、これは、上記の特定の突然変異体が、急速モノマー−二量体平衡にあることを示している（図４Ｂ）。ヒンジなしＩｇＧ４Ｔ３９４ＤＦｃドメインの主要種は、２．４Ｓのｓ値を示した。ｃ（Ｍ）への変換によって、２．４Ｓ成分の見掛け分子量は、２６．８ｋＤａとなったが、これは、モノマーＦｃドメインの予想分子量と一致する。ホモ二量体の存在は、この突然変異体については検出されなかった（図４Ｃ）。
【０１５５】
【表１１】
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【０１５６】
実施例で使用した試薬は市販のものであってもよいし、又は当該技術分野で公知の市販の計器類、方法、又は試薬を用いて調製してもよい。前述の実施例は、本発明の様々な形態、及び本発明の方法の実施を示すものである。これらの実施例は、本発明の多くの異なる実施形態の網羅的な説明の提供を意図するものではない。従って、前述の発明は、理解を明瞭にするために説明及び例として幾分詳細に記載されているが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲を逸脱することなく、多くの変更及び改変をこれらに加えうることは容易に理解されよう。
【０１５７】
８．８  実施例８：マウスにおける薬物動力学的試験
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１グループ当たり５匹）に、１０ｍｇ／ｋｇ（体重）ＩＶボラス用量の野生型ＩｇＧ４、グリコシル化一価ＩｇＧ４（Ｃ２２６Ｑ／Ｃ２２９Ｑ／Ｔ３９４Ｄ突然変異からなる）又はアグリコシル化一価ＩｇＧ４（Ｃ２２６Ｑ／Ｃ２２９Ｑ／Ｎ２９７Ｑ／Ｔ３９４Ｄ突然変異からなる）を投与した。野生型ＩｇＧ４及びアグリコシル化一価ＩｇＧ４については、５分、１、２、４、７、１０、１３及び１６日おきに、またグリコシル化一価ＩｇＧ４については５分、２、４及び７日置きに血漿サンプルを回収した。抗ヒトＩｇＧ４Ｆｃポリクローナル抗体を用いた抗体の捕捉と、抗ヒトλ軽鎖モノクローナル抗体を用いた検出とを含むＭＳＤ免疫アッセイにより、タンパク質濃縮物をアッセイした（図５）。各グループについて、ＷｉｎＮｏＬｉｎソフトウエアを用いて、時間０から最終測定可能時間までの濃度時間曲線下面積（ＡＵＣＩＮＦ）、クリアランス、β半減期、及び最大濃度（Ｃｍａｘ）の薬物動力学的パラメーターを計算したが、その際、非コンパートメント分析又は２コンパートメントモデル化のいずれかを用いた。得られた結果を表１２に示す。一価ＩｇＧ４の半減期は、１３日の半減期を有する野生型ＩｇＧ４と比較すると、約２０時間である。血漿半減期は、インタクトなＩｇＧ４について観測されたものより短かったが、一価抗体の２０時間という血漿半減期は、げっ歯類におけるＦａｂ分子の一般的半減期（概して、０．５〜３．５時間）に対して有意な改善を示している（例えば、［８］、［９］、［１０］、及び［１１］参照）。血漿半減期が短いのは、より小さい一価抗体の糸球体ろ過の増加及び／又はＦｃＲｎの結合活性の減少によると考えられる。
【０１５８】
【表１２】
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【０１５９】
８．９：実施例９：マウスＩｇＧ１  ＣＨ３−ＣＨ３界面領域におけるアミノ酸の突然変異誘発並びにＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ及びＨＰＬＣによる分析
タンパク質を基材とする治療薬の効果を評価するのに、マウスモデルなどいくつかの動物モデル系が一般に用いられている。これらの試験は、代用分子、例えば、マウス抗体、又はマウスＦｃ領域を組み込んだ融合タンパク質を使用して十分に実施することができる。さらに突然変異誘発スクリーンを実施して、モノマーマウス抗体の作製に有用なＦｃ突然変異を識別した。いくつかの部位指定突然変異を含むヒンジなしマウスＩｇＧ１Ｆｃドメインを実施例５のヒト構築物と同様に作製した。突然変異の選択は、主としてヒトモノマーＦｃ操作から得たデータによって決定した。ＨＰＬＣ及びＳＥＣ−ＭＡＬＬＳを実施して、突然変異型マウスＩｇＧ１Ｆｃの特性を決定したが、表１３にデータをまとめる。表１３に概要を示すように、モノマーヒトＦｃドメインの形成をもたらす突然変異の大部分は、モノマーマウスＦｃドメインの形成をもたらさない。しかし、突然変異Ｆ４０５Ｒは、主にモノマーであるマウスＩｇＧ１Ｆｃドメインを生成し、いくつかの突然変異は、モノマー−二量体平衡状態にあるマウスＩｇＧ１Ｆｃドメインを生成する。
【０１６０】
【表１３】
2013537416.tif 000016
【０１６１】
本明細書に記載するすべての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許又は特許出願が、参照として本明細書に組み込まれると明示的かつ個別に表示されているのと同じ程度まで、本明細書に参照として組み込むものとする。
【０１６２】
参考文献
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［６］  Ｔｓａｉ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｌｉｎ，  Ｓ．Ｌ．，  Ｗｏｌｆｓｏｎ，  Ｈ．Ｊ．  ＆  Ｎｕｓｓｉｎｏｖ，  Ｒ．  Ａ  ｄａｔａｓｅｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｏｒｄｅｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２６０，  ６０４−６２０  （１９９６）
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［９］．  Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）．  Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｆａｂ  （ＡＢ．Ｆａｂ）  ｃａｎ  ｂｅ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ａｌｂｕｍｉｎ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  １９，  ２９１−２９７．
［１０］  Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  Ｆａｂ’  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ＬＩＮＧＯ−１  Ｌｉ３３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２２，  ２００−２１０．
［１１］  Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）．  Ａｎｔｉ−ｐｈｅｎｃｙｃｌｉｄｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ａｌｔｅｒ  ｐｈｅｎｃｙｃｌｉｄｉｎｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ２６９，  １０７９−１０８５．
【図１Ａ】
2013537416.tif 000017
【図１Ｂ】
2013537416.tif 000018
【図１Ｃ】
2013537416.tif 000019
【図１Ｄ】
2013537416.tif 000020
【図２Ａ】
2013537416.tif 000021
【図２Ｂ】
2013537416.tif 000022
【図２Ｃ】
2013537416.tif 000023
【図３Ａ】
2013537416.tif 000024
【図３Ｂ】
2013537416.tif 000025
【図３Ｃ】
2013537416.tif 000026
【図４Ａ】
2013537416.tif 000027
【図４Ｂ】
2013537416.tif 000028
【図４Ｃ】
2013537416.tif 000029
【図５】
2013537416.tif 000030
【図６Ａ】
2013537416.tif 000031
【図６Ｂ】
2013537416.tif 000032
【配列表】
2013537416000001.app
【国際調査報告】
2013537416.tif 000033
2013537416.tif 000034
2013537416.tif 000035
2013537416.tif 000036
2013537416.tif 000037