(57)【要約】  本発明は、オクラトキシンを分解可能なアミダーゼ酵素と、このアミダーゼ酵素を含む飼料添加物または食品添加物と、に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オクラトキシンを分解可能な単離されたアミダーゼ酵素。
【請求項２】
オクラトキシンがオクラトキシンＡである、請求項１に記載のアミダーゼ。
【請求項３】
アミダーゼが、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、より好ましくは９個のアミノ酸配列モチーフ、すなわち、
１）ｘ−Ｐ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｈ−ｘ−Ｈ−ｘ−ｘＧ、
２）Ｇ−ｘ−Ｔ、
３）Ｇ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｇ−Ｐ、
４）Ｇ−Ｈ−ｘ−Ｄ、
５）Ｄ−Ｇ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｃ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−ｘ−ｘ−Ａ−ｘ−ｘ−Ｉ−Ｋ、
６）Ｇ−Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｓ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｐ、
７）Ｖ−ｘ−Ａ−Ｈ−ｘ−ｘ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｇ、
８）Ｈ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｄ、
９）Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｉ−ｘ−ｘ−Ｇ−Ｔ−Ｄ
を含む、請求項１または２に記載のアミダーゼ。
【請求項４】
アミダーゼが、６個のヒスチジン残基と１個のリシン残基と１個のアスパラギン酸残基とを含む活性部位を含むＴｉｍバレル構造を有し、活性部位のアミノ酸残基が、アミダーゼの三次構造と配列番号１とを比較した場合、配列番号１の位置Ｈ１１１、Ｈ１１３、Ｈ１９１、Ｋ２４６、Ｈ２８７、Ｈ２８９、Ｈ３０７、およびＤ３７８に対応する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアミダーゼ。
【請求項５】
アミダーゼが、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の純度である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアミダーゼ。
【請求項６】
アミダーゼが、ｐＨ３〜９および２１〜４０℃でインキュベートされたときにオクラトキシンを分解するものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアミダーゼ。
【請求項７】
アミダーゼ酵素が、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つの配列を有するポリペプチド配列、または配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、または配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つと、１個もしくは数個のアミノ酸付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリペプチド、を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアミダーゼ。
【請求項８】
アミダーゼ酵素が、配列番号１もしくは配列番号３で示される配列を有するポリペプチド配列、または配列番号１もしくは配列番号３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、または配列番号１もしくは配列番号３と１個もしくは数個のアミノ酸付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリペプチド、または配列番号２で示される配列もしくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド、もしくは遺伝暗号の縮重に起因して配列番号２と異なるポリヌクレオチド、もしくは配列番号２と１個もしくは数個のヌクレオチド付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリヌクレオチド、もしくは配列番号２の相補体にストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列、もしくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、の発現により産生されるポリペプチド、を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアミダーゼ。
【請求項９】
アミダーゼが、ｐＨ７．０および４０℃でタンパク質１ｍｇあたり毎分およそ少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００〜約９００ナノモルのオクラトキシンＡを加水分解する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアミダーゼ。
【請求項１０】
オクラトキシンを分解可能なアミダーゼ酵素を含む飼料添加物または食品添加物。
【請求項１１】
オクラトキシンがオクラトキシンＡである、請求項１０に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項１２】
アミダーゼが単離されたものである、請求項１０または１１に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項１３】
アミダーゼが、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、より好ましくは９個のアミノ酸配列モチーフ、すなわち、
１）ｘ−Ｐ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｈ−ｘ−Ｈ−ｘ−ｘＧ、
２）Ｇ−ｘ−Ｔ、
３）Ｇ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｇ−Ｐ、
４）Ｇ−Ｈ−ｘ−Ｄ、
５）Ｄ−Ｇ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｃ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−ｘ−ｘ−Ａ−ｘ−ｘ−Ｉ−Ｋ、
６）Ｇ−Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｓ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｐ、
７）Ｖ−ｘ−Ａ−Ｈ−ｘ−ｘ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｇ、
８）Ｈ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｄ、
９）Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｉ−ｘ−ｘ−Ｇ−Ｔ−Ｄ
を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項１４】
アミダーゼが、６個のヒスチジン残基と１個のリシン残基と１個のアスパラギン酸残基とを含む活性部位を含むＴｉｍバレル構造を有し、活性部位のアミノ酸残基が、アミダーゼの三次構造と配列番号１とを比較した場合、配列番号１の位置Ｈ１１１、Ｈ１１３、Ｈ１９１、Ｋ２４６、Ｈ２８７、Ｈ２８９、Ｈ３０７、およびＤ３７８に対応する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項１５】
アミダーゼが、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の純度である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項１６】
アミダーゼが、ｐＨ３〜９および２１〜４０℃でインキュベートされたときにオクラトキシンを分解するものである、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項１７】
アミダーゼ酵素が、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つの配列を有するポリペプチド配列、または配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、または配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つと、１個もしくは数個のアミノ酸付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリペプチドを含む、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項１８】
アミダーゼ酵素が、配列番号１もしくは配列番号３で示される配列を有するポリペプチド配列、または配列番号１もしくは配列番号３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、または配列番号１もしくは配列番号３と１個もしくは数個のアミノ酸付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリペプチド、または配列番号２で示される配列もしくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド、もしくは遺伝暗号の縮重に起因する配列番号２と異なるポリヌクレオチド、もしくは配列番号２と１個もしくは数個のヌクレオチド付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリヌクレオチド、もしくは配列番号２の相補体にストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列、もしくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、の発現により産生されるポリペプチド、を含む、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項１９】
アミダーゼが、ｐＨ７．０および４０℃でタンパク質１ｍｇあたり毎分およそ少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００〜約９００ナノモルのオクラトキシンＡを加水分解する、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項２０】
アミダーゼが組換え体である、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項２１】
アミダーゼを発現可能な組換え細胞または組換え胞子を含む、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項２２】
細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（特にＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（特にＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、植物細胞、および／またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、もしくはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の胞子から選択される、請求項２１に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項２３】
少なくとも１つの生理学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１０〜２２のいずれか一項に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項２４】
生理学的に許容可能な担体が、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ、コムギフスマもしくはコムギ成分、コメもしくはコメヌカ、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、およびＰＶＡ、ならびにそれらの混合物の少なくとも１つから選択される、請求項２３に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項２５】
飼料添加物が１つ以上のさらなる酵素を含む、請求項１０〜２４のいずれか一項に記載の飼料添加物または食品添加物。
【請求項２６】
１つ以上のさらなる飼料酵素が、カルボキシペプチダーゼ、好ましくはカルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＹ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスパラギン酸プロテアーゼのＰＥＰＡａ、ＰＥＰＡｂ、ＰＥＰＡｃ、およびＰＥＰＡｄ、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ、ペプシンまたはペプシン様プロテアーゼ、トリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼ、およびスブチリシンやその変異体をはじめとする細菌プロテアーゼを含めて、タンパク質分解に関与するもの、ならびにデンプン代謝、繊維分解、脂質代謝に関与するもの、グリコーゲン代謝に関与するタンパク質または酵素、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、−ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルカンリサーゼ、エンドグルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、βグルコシダーゼをはじめとする−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、脂肪分解酵素、ラッカーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ２−オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．３．５））、酸性ホスファターゼ、ならびに／または他のもの、またはそれらの組合せよりなる群から選択される、請求項２５に記載の飼料添加物または食品添加物
【請求項２７】
請求項１０〜２６のいずれか一項に記載の飼料添加物を含む飼料材料または食品材料。
【請求項２８】
請求項２７に記載の食品材料または飼料材料を含む飼料または食料。
【請求項２９】
ａ）穀物、たとえば小穀物（たとえば、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、およびそれらの組合せ）および／またはメイズやソルガムなどの大穀物、ｂ）穀物からの副産物、たとえばトウモロコシグルテンミール、乾燥蒸留穀物かす（ＤＤＧＳ）、コムギフスマ、コムギミドリングス、コムギショーツ、コメヌカ、モミガラ、オートムギガラ、パーム核、およびシトラスパルプ、ｃ）サイレージ、ｄ）ダイズ、ヒマワリ、ラッカセイ、ルピナス、エンドウマメ、ソラマメ、ワタ、カノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉、ジャガイモタンパク質、ホエー、コプラ、ゴマなどの供給源から得られるタンパク質、ｅ）植物源および動物源から得られる油脂、ｆ）ミネラルおよびビタミンを含む群から選択される１つ以上の飼料材料を含む、請求項２８に記載の飼料。
【請求項３０】
前記食料が、穀物、たとえばトウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、穀物製品、たとえばポリッジ、ヌードル、パンまたはケーキ、コーヒー、ココア、ワイン、ビール、豆、香辛料、乾燥果実、グレープジュース、ミルク、乳製品、たとえばチーズ、肉または肉製品を含む、請求項２８に記載の食料。
【請求項３１】
１ｋｇの飼料／食料あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｇのレベルでアミダーゼを含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の飼料または食料。
【請求項３２】
好ましくは、家禽、ブタ、家庭用愛玩動物、魚、貝、および甲殻類よりなる群から選択される、単胃動物による摂取のための、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の飼料。
【請求項３３】
請求項１０〜２７のいずれか一項に記載の食品添加物または飼料添加物を食品材料または飼料材料に添加する工程を含む、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の食料または飼料の製造方法。
【請求項３４】
アミダーゼを少なくとも１つの生理学的に許容可能な担体と混合する工程を含む、請求項１０〜２７のいずれか一項に記載の食品添加物または飼料添加物の製造方法。
【請求項３５】
少なくとも１つの生理学的に許容可能な担体が、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ、コムギフスマもしくはコムギ成分、コメもしくはコメヌカ、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、およびそれらの混合物の少なくとも１つから選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
食品添加物または飼料添加物をホモジナイズする追加の工程を含む、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
食品添加物または飼料添加物をペレット成形する追加の工程を含む、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
オクラトキシン汚染材料とオクラトキシン分解アミダーゼ酵素とを含む組成物。
【請求項３９】
酵素がオクラトキシンＡ分解アミダーゼ酵素である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
材料がオクラトキシンＡおよび／またはオクラトキシンＢで汚染されている、請求項３８または３９に記載の組成物。
【請求項４１】
アミダーゼが単離されたものである、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
アミダーゼが、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、より好ましくは９個のアミノ酸配列モチーフ、すなわち、
１）ｘ−Ｐ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｈ−ｘ−Ｈ−ｘ−ｘＧ、
２）Ｇ−ｘ−Ｔ、
３）Ｇ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｇ−Ｐ、
４）Ｇ−Ｈ−ｘ−Ｄ、
５）Ｄ−Ｇ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｃ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−ｘ−ｘ−Ａ−ｘ−ｘ−Ｉ−Ｋ、
６）Ｇ−Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｓ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｐ、
７）Ｖ−ｘ−Ａ−Ｈ−ｘ−ｘ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｇ、
８）Ｈ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｄ、
９）Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｉ−ｘ−ｘ−Ｇ−Ｔ−Ｄ
を含む、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
アミダーゼが、６個のヒスチジン残基と１個のリシン残基と１個のアスパラギン酸残基とを含む活性部位を含むＴｉｍバレル構造を有し、活性部位のアミノ酸残基が、アミダーゼの三次構造と配列番号１とを比較した場合、配列番号１の位置Ｈ１１１、Ｈ１１３、Ｈ１９１、Ｋ２４６、Ｈ２８７、Ｈ２８９、Ｈ３０７、およびＤ３７８に対応する、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
アミダーゼが、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の純度である、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
アミダーゼ酵素が、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つの配列を有するポリペプチド配列、または配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、または配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つと、１個もしくは数個のアミノ酸付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリペプチドを含む、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
アミダーゼ酵素が、配列番号１もしくは配列番号３で示される配列を有するポリペプチド配列、または配列番号１もしくは配列番号３に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、または配列番号１もしくは配列番号３と１個もしくは数個のアミノ酸付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリペプチド、または配列番号２で示される配列もしくはそれに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド、もしくは遺伝暗号の縮重に起因して配列番号２と異なるポリヌクレオチド、もしくは配列番号２と１個もしくは数個のヌクレオチド付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリヌクレオチド、もしくは配列番号２の相補体にストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、もしくはそれに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、の発現により産生されるポリペプチド、を含む、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
アミダーゼが、ｐＨ７．０および４０℃でインキューベートされたときにタンパク質１ｍｇあたり毎分およそ少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００〜約９００ナノモルのオクラトキシンＡを加水分解する、請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
アミダーゼが組換え体である、請求項３８〜４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
アミダーゼを発現可能な組換え細胞を含む、請求項３８〜４８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５０】
細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（特にＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（特にＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、植物細胞、および／またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、もしくはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の胞子から選択される、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
１つ以上のさらなる酵素を含む、請求項３８〜５０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５２】
１つ以上のさらなる酵素が、カルボキシペプチダーゼ、好ましくはカルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＹ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスパラギン酸プロテアーゼのＰＥＰＡａ、ＰＥＰＡｂ、ＰＥＰＡｃ、およびＰＥＰＡｄ、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ、ペプシンまたはペプシン様プロテアーゼ、トリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼ、およびスブチリシンやその変異体をはじめとする細菌プロテアーゼを含めて、タンパク質分解に関与するもの、ならびにデンプン代謝、繊維分解、脂質代謝に関与するもの、グリコーゲン代謝に関与するタンパク質または酵素、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、−ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルカンリサーゼ、エンドグルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、βグルコシダーゼをはじめとする−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、脂肪分解酵素、ラッカーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ２−オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．３．５））、酸性ホスファターゼ、ならびに／または他のもの、またはそれらの組合せよりなる群から選択される飼料酵素または食品用酵素である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
マイコトキシン分解酵素、たとえばアフラトキシンデトキシザイム、ゼアラレノンエステラーゼ、ゼアラレノンラクトナーゼ、フモニシンカルボキシルエステラーゼ、フモニシンアミノトランスフェラーゼ、アミノポリオールアミンオキシダーゼ、デオキシニバレノールエポキシドヒドロラーゼよりなる群から選択される解毒酵素、マイコトキシン分解微生物、たとえばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、または少なくとも１つのポリマーたとえば微生物細胞壁もしくはベントナイトなどの無機材料を含む吸収剤（すなわち、マイコトキシン結合剤）、の少なくとも１つをさらに含む、請求項５１または５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記組成物が、飼料組成物、発酵ブロス、または廃水である、請求項３８〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｇ／ｋｇのレベルでアミダーゼを含む、請求項３８〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５６】
材料にオクラトキシン分解アミダーゼ酵素を添加する工程を含む、該材料のオクラトキシン汚染の低減方法。
【請求項５７】
酵素がオクラトキシンＡ分解酵素である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
材料がオクラトキシンＡおよび／またはオクラトキシンＢで汚染されている、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
アミダーゼが単離されたものである、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
アミダーゼが、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、より好ましくは９個のアミノ酸配列モチーフ、すなわち、
１）ｘ−Ｐ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｈ−ｘ−Ｈ−ｘ−ｘＧ、
２）Ｇ−ｘ−Ｔ、
３）Ｇ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｇ−Ｐ、
４）Ｇ−Ｈ−ｘ−Ｄ、
５）Ｄ−Ｇ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｃ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−ｘ−ｘ−Ａ−ｘ
−ｘ−Ｉ−Ｋ、
６）Ｇ−Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｓ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｐ、
７）Ｖ−ｘ−Ａ−Ｈ−ｘ−ｘ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｇ、
８）Ｈ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｄ、
９）Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｉ−ｘ−ｘ−Ｇ−Ｔ−Ｄ
を含む、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
アミダーゼが、６個のヒスチジン残基と１個のリシン残基と１個のアスパラギン酸残基とを含む活性部位を含むＴｉｍバレル構造を有し、活性部位のアミノ酸残基が、アミダーゼの三次構造と配列番号１とを比較した場合、配列番号１の位置Ｈ１１１、Ｈ１１３、Ｈ１９１、Ｋ２４６、Ｈ２８７、Ｈ２８９、Ｈ３０７、およびＤ３７８に対応する、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
アミダーゼが、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の純度である、請求項５６〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
アミダーゼ酵素が、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つの配列を有するポリペプチド配列、または配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、または配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つと、１個もしくは数個のアミノ酸付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリペプチドを含む、請求項５６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
アミダーゼ酵素が、配列番号１もしくは配列番号３で示される配列を有するポリペプチド配列、または配列番号１もしくは配列番号３に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、または配列番号１もしくは配列番号３と１個もしくは数個のアミノ酸付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリペプチド、または配列番号２で示される配列もしくはそれに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド、もしくは遺伝暗号の縮重に起因して配列番号２と異なるポリヌクレオチド、もしくは配列番号２と１個もしくは数個のヌクレオチド付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリヌクレオチド、もしくは配列番号２の相補体にストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、もしくはそれに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、の発現により産生されるポリペプチド、を含む、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
アミダーゼが、ｐＨ７．０および４０℃でインキュベートされたときタンパク質１ｍｇあたり毎分およそ少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００〜約９００ナノモルのオクラトキシンＡを加水分解する、請求項５６〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
アミダーゼが組換え体である、請求項５６〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
アミダーゼを発現可能な組換え細胞を含む、請求項５６〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（特にＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（特にＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、植物細胞、および／またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、もしくはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の胞子から選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
１つ以上のさらなる酵素を添加する工程を含む、請求項５６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
１種以上のさらなる酵素が、カルボキシペプチダーゼ、好ましくはカルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＹ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスパラギン酸プロテアーゼのＰＥＰＡａ、ＰＥＰＡｂ、ＰＥＰＡｃ、およびＰＥＰＡｄ、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ、ペプシンまたはペプシン様プロテアーゼ、トリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼ、およびスブチリシンやその変異体をはじめとする細菌プロテアーゼを含めて、タンパク質分解に関与するもの、ならびにデンプン代謝、繊維分解、脂質代謝に関与するもの、グリコーゲン代謝に関与するタンパク質または酵素、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、−ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルカンリサーゼ、エンドグルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、βグルコシダーゼをはじめとする−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、脂肪分解酵素、ラッカーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ２−オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．３．５））、酸性ホスファターゼ、ならびに／または他のもの、またはそれらの組合せよりなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
マイコトキシン分解酵素、たとえばアフラトキシンデトキシザイム、ゼアラレノンエステラーゼ、ゼアラレノンラクトナーゼ、フモニシンカルボキシルエステラーゼ、フモニシンアミノトランスフェラーゼ、アミノポリオールアミンオキシダーゼ、デオキシニバレノールエポキシドヒドロラーゼよりなる群から選択される解毒酵素、マイコトキシン分解微生物、たとえばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、または少なくとも１つのポリマーたとえば微生物細胞壁もしくはベントナイトなどの無機材料を含む吸収剤（すなわち、マイコトキシン結合剤）、の少なくとも１つを添加する工程をさらに含む、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記組成物が、飼料組成物、発酵ブロス、または廃水である、請求項５６〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｇ／ｋｇのレベルでアミダーゼを含む、請求項５６〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
請求項５６〜７３のいずれか一項に記載の方法により取得可能な飼料材料。
【請求項７５】
請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の有効量の飼料を動物に給餌する工程を含む、動物の成長速度増加および／または健康増進の方法。
【請求項７６】
オクラトキシンを分解するアミダーゼ酵素をコードする組換え細胞または組換え胞子。
【請求項７７】
アミダーゼ酵素がオクラトキシンＡを分解する、請求項７６に記載の細胞または胞子。
【請求項７８】
アミダーゼが組換え体である、請求項７６または７７に記載の細胞または胞子。
【請求項７９】
アミダーゼが単離されたものである、請求項７６〜７８のいずれか一項に記載の細胞または胞子。
【請求項８０】
アミダーゼが、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、より好ましくは９個のアミノ酸配列モチーフ、すなわち、
１）ｘ−Ｐ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｈ−ｘ−Ｈ−ｘ−ｘＧ、
２）Ｇ−ｘ−Ｔ、
３）Ｇ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｇ−Ｐ、
４）Ｇ−Ｈ−ｘ−Ｄ、
５）Ｄ−Ｇ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｃ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−ｘ−ｘ−Ａ−ｘ−ｘ−Ｉ−Ｋ、
６）Ｇ−Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｓ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｐ、
７）Ｖ−ｘ−Ａ−Ｈ−ｘ−ｘ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｇ、
８）Ｈ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｄ、
９）Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｉ−ｘ−ｘ−Ｇ−Ｔ−Ｄ
を含む、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載の細胞または胞子。
【請求項８１】
アミダーゼが、６個のヒスチジン残基と１個のリシン残基と１個のアスパラギン酸残基とを含む活性部位を含むＴｉｍバレル構造を有し、活性部位のアミノ酸残基が、アミダーゼの三次構造と配列番号１とを比較した場合、配列番号１の位置Ｈ１１１、Ｈ１１３、Ｈ１９１、Ｋ２４６、Ｈ２８７、Ｈ２８９、Ｈ３０７、およびＤ３７８に対応する、請求項７６〜８０のいずれか一項に記載の細胞または胞子。
【請求項８２】
アミダーゼが、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の純度である、請求項７６〜８１のいずれか一項に記載の細胞または胞子。
【請求項８３】
アミダーゼ酵素が、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つの配列を有するポリペプチド配列、または配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、または配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５〜１１、１３、１４もしくは１５のいずれか１つと、１個もしくは数個のアミノ酸付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリペプチドを含む、請求項７６〜８２のいずれか一項に記載の細胞または胞子。
【請求項８４】
アミダーゼ酵素が、配列番号１もしくは配列番号３で示される配列を有するポリペプチド配列、または配列番号１もしくは配列番号３に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、または配列番号１もしくは配列番号３と１個もしくは数個のアミノ酸付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリペプチド、または配列番号２で示される配列もしくはそれに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド、もしくは遺伝暗号の縮重に起因して配列番号２と異なるポリヌクレオチド、もしくは配列番号２と１個もしくは数個のヌクレオチド付加、欠失および／もしくは置換だけ異なるポリヌクレオチド、もしくは配列番号２の相補体にストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、もしくはそれに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、の発現により産生されるポリペプチド、を含む、請求項７６〜８３のいずれか一項に記載の細胞または胞子。
【請求項８５】
細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（特にＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（特にＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、植物細胞、および／またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、もしくはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の胞子から選択される、請求項７６〜８４のいずれか一項に記載の細胞または胞子。
【請求項８６】
モチーフが、
１）ｘ１−Ｐ−Ｇ−ｘ２−ｘ３−Ｄ−ｘ４−Ｈ−ｘ５−Ｈ−ｘ６−ｘ７−Ｇ、
２）Ｇ−ｘ８−Ｔ、
３）Ｇ−ｘ９−ｘ１０−ｘ１１−Ｇ−Ｐ、
４）Ｇ−Ｈ−ｘ１２−Ｄ、
５）Ｄ−Ｇ−ｘ１３−ｘ１４−ｘ１５−Ｃ−ｘ１６−ｘ１７−ｘ１８−ｘ１９−Ｒ−ｘ２０−ｘ２１−ｘ２２−Ｒ−ｘ２３−ｘ２４−Ａ−ｘ２５−ｘ２６−Ｉ−Ｋ、
６）Ｇ−Ｇ−Ｖ−ｘ２７−Ｓ−ｘ２８−ｘ２９−Ｄ−ｘ３０−Ｐ、
７）Ｖ−ｘ３１−Ａ−Ｈ−ｘ３２−ｘ３３−Ｇ−ｘ３４−ｘ３５−Ｇ、
８）Ｈ−ｘ３６−ｘ３７−ｘ３８−ｘ３９−Ｄ、
９）Ｇ−Ｖ−ｘ４０−Ｉ−ｘ４１−ｘ４２−Ｇ−Ｔ−Ｄ、
を含み、式中、
ｘ１＝ｌ／ｍ、ｘ２＝ｌ／ｍ、ｘ３＝ｗ／ｉ、ｘ４＝ｃ／ｖ／ｓ／ａ、ｘ５＝任意のアミノ酸、ｘ６＝ｆ／ｙ／ｌ、ｘ７＝任意のアミノ酸、ｘ８＝ｙ／ｆ、ｘ９＝ｔ／ａ／ｓ／ｖ／ｒ、ｘ１０＝ｉ／ｆ／ａ、ｘ１１＝−任意のアミノ酸、ｘ１２＝ｇ／ｓ、ｘ１３＝ｖ／ｅ、ｘ１４＝任意のアミノ酸、ｘ１５＝ｅ／ｄ／ｇ、ｘ１６＝任意のアミノ酸、ｘ１７＝任意のアミノ酸、ｘ１８＝ａ／ｇ／ｔ、ｘ１９＝ｖ／ａ、ｘ２０＝任意のアミノ酸、ｘ２１＝ｑ／ｍ／ａ、ｘ２２＝ｌ／ｉ／ｖ、ｘ２３＝ｒ／ｈ／ｃ、ｘ２４＝ｇ／ｎ、ｘ２５＝ｋ／ｒ／ｔ／ｅ／ｄ、ｘ２６＝任意のアミノ酸、ｘ２７＝ｌ／ｍ／ｖ／ｇ、ｘ２８＝任意のアミノ酸、ｘ２９＝任意のアミノ酸、ｘ３０＝任意のアミノ酸、ｘ３１＝ａ／ｓ／ｈ、ｘ３２＝ｃ／ｖ／ａ、ｘ３３＝ｈ／ｑ、ｘ３４＝ｋ／ｒ、ｘ３５＝任意のアミノ酸、ｘ３６＝ｇ／ｖ／ａ、ｘ３７＝ｓ／ｔ／ｉ、ｘ３８＝ｙ／ｆ／ｅ、ｘ３９＝ｌ／ａ／ｉ、ｘ４０＝任意のアミノ酸、ｘ４１＝ａ／ｖ、ｘ４２＝−ｌ／ａ
である、請求項３に記載の酵素、請求項１３に記載の飼料添加物もしくは食品添加物、請求項４２に記載の組成物、請求項６０に記載の方法、または請求項８０に記載の細胞もしくは胞子。
【請求項８７】
モチーフが、
１）ｌ／ｍ−Ｐ−Ｇ−ｌ／ｍ−ｗ−Ｄ−ｃ−Ｈ−ｘ−Ｈ−ｆ−ｘ−Ｇ、
２）Ｇ−ｙ／ｆ−Ｔ、
３）Ｇ−ｔ−ｉ−ｘ−Ｇ−Ｐ、
４）Ｇ−Ｈ−ｇ−Ｄ、
５）Ｄ−Ｇ−ｖ−ｘ−ｅ−Ｃ−ｘ−ｘ−ａ−ｖ−Ｒ−ｘ−ｑ−ｌ−Ｒ−ｒ−ｇ−Ａ−ｋ−ｘ−Ｉ−Ｋ、
６）Ｇ−Ｇ−Ｖ−ｌ／−Ｓ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｐ、
７）Ｖ−ａ−Ａ−Ｈ−ｃ−ｈ−Ｇ−ｋ−ｘ−Ｇ、
８）Ｈ−ｇ−ｓ−ｙ−ｌ−Ｄ、
９）Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｉ−ａ−ｌ−Ｇ−Ｔ−Ｄ
を含む、請求項８６に記載の酵素、飼料添加物もしくは食品添加物、組成物、方法、または細胞もしくは胞子。
【請求項８８】
実質的に本明細書で説明される通りのアミダーゼを含む飼料添加物または食品添加物。
【請求項８９】
実質的に本明細書で説明される通りの飼料添加物を含む飼料または食料。
【請求項９０】
実質的に本明細書で説明される通りの飼料または食料を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコトキシンの解毒方法に関する。より特定的には、本発明は、オクラトキシンとくにオクラトキシンＡを解毒するためのアミダーゼ酵素ならびに少なくとも１種のアミダーゼを含む飼料添加物およびまたは食品添加物に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコトキシンは、本質的にはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、およびフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する菌類の毒性二次代謝産物である。それは、広範にわたる農産物上で、ならびに多岐にわたる作物学的条件下、生態学的条件下、および収穫後条件下で、世界的に産生されうる。
【０００３】
マイコトキシンは、圃場で、飼料材料もしくは食品材料の貯蔵時に、または食物連鎖のより後の時点で、食物連鎖に入りうる。マイコトキシンに汚染された食物を摂取すると催奇形作用、発癌作用、およびエストロゲン様作用または免疫抑制作用を生じるおそれがあるので、食品中および飼料中へのその蓄積は、ヒトおよび動物の健康に大きな脅威となる。
【０００４】
１９８５年、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎは、世界の子実の約２５％がマイコトキシンにより汚染されていると推定した（Ｊｅｌｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。子実および穀物の全世界の輸入および輸出が増加し、かつ環境および気象のパターンが変化しているので、この数値は、それ以来、おそらく増加してきているであろう。
【０００５】
現在、確認されているマイコトキシンは４００種を超えるが、最も関心が払われている、したがって、最も研究されているマイコトキシンとしては、アフラトキシン、デオキシニバレノール、ゼアラレノン、フモニシン、およびオクラトキシンが挙げられる。
【０００６】
毒素産生カビには多くの種が存在するが、ごく少数のマイコトキシンがヒトに対して重要であると考えられる。
【０００７】
菌類の３つの属、すなわち、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、およびフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属は、マイコトキシン汚染の事例に関与することが最も多い。菌類のコロニー形成、増殖、およびマイコトキシン産生は、一般的には、さまざまな因子により影響される。そのうち最も重要なのは、温度および水分活性である。
【０００８】
一般的には、温暖な地域では、アフラトキシンに大きな関心が払われる。なぜなら、この毒素を産生するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の種に最適な条件が熱帯地域に存在するからである。これとは対照的に、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の種は、より低い最適温度を有しているので、結果として、より穏やかな気候に適している。したがって、オクラトキシン、フモニシン、およびゼアラレノンは、こうした条件を提供する地域で産生される。
【０００９】
オクラトキシンは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）類またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）類の数種の菌類により二次代謝産物として産生される一群のマイコトキシンであり、イソクマリンの誘導体よりなる弱有機酸である。Ａ、Ｂ、およびＣで表される３つの一般に認識されているオクラトキシンが存在する。オクラトキシンＡは、オクラトキシン類の中で最も多く存在する一員であり、したがって、最も一般的に検出されるが、それに加えて、最も毒性が強い。オクラトキシンＡ（オクラトキシンＡ）は、穀物中および他の高デンプン食物中に存在する腎毒性、催奇形性、肝毒性、および発癌性のマイコトキシンである。穀物および穀物製品以外に、オクラトキシンＡはまた、コーヒー、ココア、ワイン、ビール、豆、香辛料、乾燥果実、グレープジュース、ブタ腎臓、ならびにこのマイコトキシンで汚染された飼料に暴露された非反芻動物の他の肉および肉製品をはじめとする一連の他の食料品中にも見いだされる。多くの国々は、食品中のオクラトキシンＡレベルに対して、典型的には、食料のタイプおよび品質に依存して１〜１０ｐｐｂ（十億分率）の制限を課してきた。
【００１０】
【化１】
2013540430.tif 000002
【００１１】
オクラトキシンＡの産生は、生長時の圃場で、収穫時に、好ましい環境条件下の貯蔵時および輸送時に（特定的には、適正に乾燥されていない場合）、菌類が作物に感染することが原因である。
【００１２】
オクラトキシンＡは、６Ｍ塩酸中還流下で４８時間加熱することにより（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９６５）またはカルボキシペプチダーゼＡにより（Ｐｉｔｏｕｔ，１９６９）、オクラトキシンα（ＯＴα）およびＬ−フェニルアラニンに加水分解されうる安定な化合物である。ＯＴαは、一般に、ＯＴＡよりもかなり毒性が低いと報告されているので、ＯＴＡからオクラトキシンαへの変換は、その毒性を低減する方法であると考えられる。さらに、体内でのオクラトキシンαの排出半減期（９．６ｈ）は、ＯＴＡの排出半減期（１０３ｈ）よりも短い（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００１３】
【化２】
2013540430.tif 000003
【００１４】
食品安全性を確保するために、食品生産チェーンに沿っていくつかの段階でマイコトキシンの取込みを防止するさまざまな手法が開発されている。
【００１５】
カルボキシペプチダーゼＡと呼ばれる哺乳動物の消化酵素はＯＴＡを分解のケーブルであるが、この酵素の効率は低いことが、１９７０年代以降、知られるようになった。実際上、ブタなどのカルボキシペプチダーゼＡを有する動物では、ＯＴＡの毒性は、それが飼料中に存在するので問題である。さらに、ＯＴＡは、カルボキシペプチダーゼＡの活性をいくらか抑制しうることが判明している。
【００１６】
本発明以前には、オクラトキシンＡ（ＯＴＡ）を含めてオクラトキシンを分解する効率的な酵素溶液の開示は存在しない。ＯＴＡ分解に関してカルボキシペプチダーゼ以外の酵素活性が報告されているが、今まで、ＯＴＡ分解活性を示すタンパク質を同定できていない。
【００１７】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）から生産された粗リパーゼである「Ａｍａｎｏ（商標）リパーゼ」と呼ばれる市販のリパーゼ製品（Ａｍａｎｏ（商標）  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｊａｐａｎ）は、オクラトキシン分解活性を有することが知られている。
【００１８】
このリパーゼ製品のＯＴＡ分解活性は、これまで、リパーゼ活性またはプロテアーゼ活性に帰属されてきた。たとえば、非特許文献１は、Ａｍａｎｏ（商標）リパーゼのＯＴＡ分解活性がリパーゼから生じると結論付けた。
【００１９】
非特許文献２は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）から単離されたＯＴＡ分解活性を有する酵素製剤を記述している。しかしながら、この酵素製剤は、活性成分の配列がアミノ酸レベルまたはＤＮＡレベルで決定しうる程度まで精製されていなかった。類似の問題が他の事例で報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｍａｒｉａ  Ａ．Ｓｔａｎｄｅｒ（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２０００，４８，５７３６−５７３９）
【非特許文献２】Ａｂｒｕｎｈｏｓａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔ．，２００７，２９，１９０９−１９１４）
【非特許文献３】Ａｂｒｕｎｈｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＯＸＩＮＳ，［２０１０］，２，１０７８−１０９９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、オクラトキシン、より特定的にはオクラトキシンＡ（ＯＴＡ）を効率的に分解可能な酵素の同定および単離を行うべく本発明者らにより行われた研究に依拠する。
【００２２】
本発明者らは、当初の仮説に反して、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）に由来するホルムアミダーゼ、さらにはＡｍａｎｏ（商標）リパーゼ製品中に存在するホルムアミダーゼが、ＯＴＡに対しては活性を有していないが、予想どおり、ホルムアミドに対しては活性を有していることを見いだした。
【００２３】
本発明者らは、驚くべきことに、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）オープンリーディングフレームによりコードされる４８０アミノ酸の仮説タンパク質（これ以降ではアミダーゼ２として参照される）が、オクラトキシン分解活性、特定的にはオクラトキシンＡ分解活性を有することを見いだした。
【００２４】
さらに、本発明者らはまた、驚くべきことに、Ｎ末端配列またはシグナル配列を含むかつ約５１ｋＤａのＭＷを有する全長４８０アミノ酸のアミダーゼ２（アミダーゼ２ｓｉｇとして参照される）が、オクラトキシンＡ分解活性を有するうえに、約４７ｋＤａのＭＷを有する分泌される成熟した４３８アミノ酸のアミダーゼ２（アミダーゼ２ｍａｔとして参照される）も同様の活性を有することを見いだした。
【００２５】
アミダーゼ２ｍａｔの場合、Ｎ末端の４２個のアミノ酸が切断されることを見いだした。すなわち、アミダーゼ２が培養培地中に分泌されるとき、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ペプチダーゼにより、そのＮ末端の４２ａａが切断されて、成熟アミダーゼ２（すなわち、アミダーゼ２ｍａｔ）が形成される。
【００２６】
本発明者らは、オクラトキシンＡの分解に関与するアミダーゼ酵素をコードするＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）遺伝子の単離およびクローニングを行い、その結晶構造を同定した。この遺伝子は、配列番号１で示される配列を有するポリペプチド（アミダーゼ２ｓｉｇ）をコードすることが確認された。さらに、この酵素は、Ｎ末端の４２アミノ酸の配列の切断により、翻訳後修飾されることが確認され、この成熟アミダーゼ２は、配列番号３として示される。
【００２７】
本発明の第１の態様によれば、オクラトキシンを分解可能な単離されたアミダーゼ酵素が提供される。より特定的にはオクラトキシンＡ
【００２８】
本発明の第２の態様によれば、オクラトキシンを分解可能なアミダーゼ酵素を含む食品添加物または飼料添加物が提供される。より特定的にはオクラトキシンＡ
【００２９】
本発明の第３の態様によれば、本発明に係る飼料添加物を含む食品材料または飼料材料が提供される。
【００３０】
本発明の第４の態様によれば、本発明に係る飼料材料を含む食料または飼料が提供される。
【００３１】
本発明の第５の態様によれば、オクラトキシンを分解可能なアミダーゼ酵素を、少なくとも１種の生理学的に許容可能な担体と、混合することを含む、食品添加物または飼料添加物の製造方法が提供される。
【００３２】
本発明の第６の態様によれば、オクラトキシンを分解可能なアミダーゼ酵素を材料に添加することを含む、材料中のオクラトキシン汚染を低減する方法が提供される。
【００３３】
本発明の第７の態様によれば、オクラトキシン汚染材料とオクラトキシンを分解可能なアミダーゼ酵素とを含む組成物が提供される。
【００３４】
本発明の第８の態様によれば、本発明に係る食品添加物または飼料添加物を食品材料または飼料材料に添加することを含む、食料または飼料の製造方法が提供される。
【００３５】
本発明の第９の態様によれば、本発明に係る有効量の飼料を動物に給餌することを含む、動物の成長速度増加および／または健康増進の方法が提供される。
【００３６】
本発明の第１０の態様によれば、食料または飼料の製造時におけるオクラトキシンを分解するアミダーゼの使用が提供される。
【００３７】
本発明の第１１の態様によれば、本発明に係る方法により取得可能な食料または飼料が提供される。
【００３８】
本発明の第１２の態様によれば、オクラトキシンを分解可能なアミダーゼ酵素を含む組換え細胞が提供される。
【００３９】
本発明の第１３の態様では、配列番号１もしくは配列番号３に対して少なくとも３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチド配列、または配列番号１もしくは配列番号３と１つもしくは複数のアミノ酸付加、欠失、および／もしくは置換だけ異なるポリペプチド配列、あるいは配列番号２に対して少なくとも３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有するポリヌクレオチドまたは配列番号２と１つもしくは複数のヌクレオチド付加、欠失、および／もしくは置換だけ異なるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列、を含むアミダーゼ酵素が提供されるが、ただし、前記ポリペプチドは配列番号１ではない。
【００４０】
本発明の第１４の態様によれば、オクラトキシンＡを分解可能なペプチダーゼ酵素ＰＥＰＡｄ（配列番号１２）を含む食品添加物または飼料添加物が提供される。
【００４１】
本発明の第１５の態様によれば、第１３の態様に係る飼料添加物を含む食品材料または飼料材料が提供される。
【００４２】
本発明の第１６の態様によれば、第１４の態様に係る飼料材料を含む食料または飼料が提供される。
【００４３】
以下の説明では、とくに明記されていないかぎり、説明された好ましい特徴のいずれもが、本発明のいずれの態様にもあてはまることは、理解されよう。さらに、好ましい特徴のいずれもが、適宜、組み合わせて使用されると想定されることは、理解されよう。
【００４４】
さらに、オクラトキシンまたはオクラトキシンを分解可能なアミダーゼ酵素という用語は、好ましい実施形態では、オクラトキシンＡまたはオクラトキシンＡを分解可能なアミダーゼ酵素を意味することは、理解されよう。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、アミダーゼ（アミドヒドロラーゼ）という用語は、アミドを加水分解することが可能なアミドヒドロラーゼスーパーファミリーの酵素を意味する。
【００４６】
本発明者らは、オクラトキシン分解に関与するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のアミダーゼ２酵素の単離およびクローニングを行った。この酵素は、オクラトキシンＡを分解するうえでとくに効果的である。この酵素は、とくに基質特異性に関して生化学的に特性解析されていない特定の細菌アミダーゼに対して約４０％の同一性を示す仮説４８０アミノ酸Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）タンパク質（Ａｎ１４ｇ０２０８０、受託番号ＸＰ＿００１４００８３４）をコードするＯＲＦにより発現されることが示された。
【００４７】
データベース検索によれば、この推定アミドヒドロラーゼ（アミダーゼ２）は、Ｓａｒｇａｓｓｏ海から単離された環境ＤＮＡ配列によりコードされるカルボキシペプチダーゼＳｇｘ９３５５ｅ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８（２００９）：４５６７−４５７６）などの特定のジペプチダーゼに対して３６％のアミノ酸配列同一性を有することが示唆される。Ｓｇｘ９３５５ｅの３Ｄ構造は公知であり、それはアミドヒドロラーゼスーパーファミリー（ＡＨＳ）のメンバーである。アミダーゼ２とＳｇｘ９３５５ｅとの配列アライメントから、アミダーゼ２は、ＡＨＳのメンバーであることが示唆される。
【００４８】
これは、（β／α）８バレル（Ｔｉｍバレル）構造フォールドを含む顕著な基質多様性を有する一群の酵素である。このスーパーファミリー内の酵素のほとんどは、Ｃ−Ｏ、Ｃ−Ｎ、またはＰ−Ｏ結合の加水分解を触媒する。このスーパーファミリーのメンバーは、ＯＴＡの加水分解に関連付けされていない。
【００４９】
アミダーゼ（すなわちアミドヒドロラーゼ）およびオクラトキシンを分解可能なアミダーゼという用語が、とくに明記されていないかぎり、本明細書では同義的に用いられること、または異なる酵素が論じられていることが文脈から明らかであることは、理解されよう。
【００５０】
アミダーゼおよびオクラトキシンＡを分解可能なアミダーゼという用語は、サンプル中に存在するオクラトキシンＡの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％をオクラトキシンαに分解可能な酵素を意味する。
【００５１】
オクラトキシンを分解可能ないずれのアミダーゼも本発明で使用するのに好適であることは、当業者には明らかであろう。好ましくは、本発明のいずれの態様で使用されるアミダーゼも、少なくともオクラトキシンＡを分解するアミダーゼである。
【００５２】
好ましくは、本発明に係るアミダーゼ酵素は、以下のアミノ酸配列モチーフ、すなわち、
１）ｘ−Ｐ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｈ−ｘ−Ｈ−ｘ−ｘＧ〔式中、２個のＨｉｓ残基は、活性部位に存在する〕、
２）Ｇ−ｘ−Ｔ、
３）Ｇ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｇ−Ｐ、
４）Ｇ−Ｈ−ｘ−Ｄ〔式中、Ｈｉｓ残基は、活性部位に存在する〕、
５）Ｄ−Ｇ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｃ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−ｘ−ｘ−Ａ−ｘ−ｘ−Ｉ−Ｋ〔式中、Ｌｙｓ残基は、活性部位に存在する〕、
６）Ｇ−Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｓ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｐ〔式中、Ｖａｌ残基は、活性部位に存在する〕、
７）Ｖ−ｘ−Ａ−Ｈ−ｘ−ｘ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｇ〔式中、２個のＨｉｓ残基は、活性部位に存在する〕、
８）Ｈ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｄ〔式中、Ｈｉｓ残基は、活性部位に存在する〕、
９）Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｉ−ｘ−ｘ−Ｇ−Ｔ−Ｄ〔式中、Ａｓｐ残基は、活性部位に存在する〕、
の少なくとも１つ、好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、より好ましくは、９つを含む。
【００５３】
好ましくは、モチーフは、以下のとおり、すなわち、
１）ｘ１−Ｐ−Ｇ−ｘ２−ｘ３−Ｄ−ｘ４−Ｈ−ｘ５−Ｈ−ｘ６−ｘ７−Ｇ〔式中、２個のＨｉｓ残基は、活性部位に存在する〕、
２）Ｇ−ｘ８−Ｔ、
３）Ｇ−ｘ９−ｘ１０−ｘ１１−Ｇ−Ｐ、
４）Ｇ−Ｈ−ｘ１２−Ｄ〔式中、Ｈｉｓ残基は、活性部位に存在する〕、
５）Ｄ−Ｇ−ｘ１３−ｘ１４−ｘ１５−Ｃ−ｘ１６−ｘ１７−ｘ１８−ｘ１９−Ｒ−ｘ２０−ｘ２１−ｘ２２−Ｒ−ｘ２３−ｘ２４−Ａ−ｘ２５−ｘ２６−Ｉ−Ｋ〔式中、Ｌｙｓ残基は、活性部位に存在する〕、
６）Ｇ−Ｇ−Ｖ−ｘ２７−Ｓ−ｘ２８−ｘ２９−Ｄ−ｘ３０−Ｐ〔式中、Ｖａｌ残基は、活性部位に存在する〕、
７）Ｖ−ｘ３１−Ａ−Ｈ−ｘ３２−ｘ３３−Ｇ−ｘ３４−ｘ３５−Ｇ〔式中、２個のＨｉｓ残基は、活性部位に存在する〕、
８）Ｈ−ｘ３６−ｘ３７−ｘ３８−ｘ３９−Ｄ〔式中、Ｈｉｓ残基は、活性部位に存在する〕、
９）Ｇ−Ｖ−ｘ４０−Ｉ−ｘ４１−ｘ４２−Ｇ−Ｔ−Ｄ〔式中、Ａｓｐ残基は、活性部位に存在する〕、
である。ただし、
ｘ１＝ｌ／ｍ、ｘ２＝ｌ／ｍ、ｘ３＝ｗ／ｉ、ｘ４＝ｃ／ｖ／ｓ／ａ、ｘ５＝任意のア
ミノ酸、ｘ６＝ｆ／ｙ／ｌ、ｘ７＝任意のアミノ酸、ｘ８＝ｙ／ｆ、ｘ９＝ｔ／ａ／ｓ／ｖ／ｒ、ｘ１０＝ｉ／ｆ／ａ、ｘ１１＝−任意のアミノ酸、ｘ１２＝ｇ／ｓ、ｘ１３＝ｖ／ｅ、ｘ１４＝任意のアミノ酸、ｘ１５＝ｅ／ｄ／ｇ、ｘ１６＝任意のアミノ酸、ｘ１７＝任意のアミノ酸、ｘ１８＝ａ／ｇ／ｔ、ｘ１９＝ｖ／ａ、ｘ２０＝任意のアミノ酸、ｘ２１＝ｑ／ｍ／ａ、ｘ２２＝ｌ／ｉ／ｖ、ｘ２３＝ｒ／ｈ／ｃ、ｘ２４＝ｇ／ｎ、ｘ２５＝ｋ／ｒ／ｔ／ｅ／ｄ、ｘ２６＝任意のアミノ酸、ｘ２７＝ｌ／ｍ／ｖ／ｇ、ｘ２８＝任意のアミノ酸、ｘ２９＝任意のアミノ酸、ｘ３０＝任意のアミノ酸、ｘ３１＝ａ／ｓ／ｈ、ｘ３２＝ｃ／ｖ／ａ、ｘ３３＝ｈ／ｑ、ｘ３４＝ｋ／ｒ、ｘ３５＝任意のアミノ酸、ｘ３６＝ｇ／ｖ／ａ、ｘ３７＝ｓ／ｔ／ｉ、ｘ３８＝ｙ／ｆ／ｅ、ｘ３９＝ｌ／ａ／ｉ、ｘ４０＝任意のアミノ酸、ｘ４１＝ａ／ｖ、ｘ４２＝−ｌ／ａ。
【００５４】
任意のアミノ酸という用語が、アミノ酸Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、もしくは非天然アミノ酸、またはアミノ酸誘導体のいずれか１つを意味することは、理解されよう。
【００５５】
より好ましい実施形態では、モチーフは、以下のとおり、すなわち、
１）ｌ／ｍ−Ｐ−Ｇ−ｌ／ｍ−ｗ−Ｄ−ｃ−Ｈ−ｘ−Ｈ−ｆ−ｘ−Ｇ〔式中、２個のＨｉｓ残基は、活性部位に存在する〕、
２）Ｇ−ｙ／ｆ−Ｔ、
３）Ｇ−ｔ−ｉ−ｘ−Ｇ−Ｐ、
４）Ｇ−Ｈ−ｇ−Ｄ〔式中、Ｈｉｓ残基は、活性部位に存在する〕、
５）Ｄ−Ｇ−ｖ−ｘ−ｅ−Ｃ−ｘ−ｘ−ａ−ｖ−Ｒ−ｘ−ｑ−ｌ−Ｒ−ｒ−ｇ−Ａ−ｋ−ｘ−Ｉ−Ｋ〔式中、Ｌｙｓ残基は、活性部位に存在する〕、
６）Ｇ−Ｇ−Ｖ−ｌ／−Ｓ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｐ〔式中、Ｖａｌ残基は、活性部位に存在する〕、
７）Ｖ−ａ−Ａ−Ｈ−ｃ−ｈ−Ｇ−ｋ−ｘ−Ｇ〔式中、２個のＨｉｓ残基は、活性部位に存在する〕、
８）Ｈ−ｇ−ｓ−ｙ−ｌ−Ｄ〔式中、Ｈｉｓ残基は、活性部位に存在する〕、
９）Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｉ−ａ−ｌ−Ｇ−Ｔ−Ｄ〔式中、Ａｓｐ残基は、活性部位に存在する〕
である。
【００５６】
オクラトキシンを分解可能な先行技術のカルボキシペプチダーゼ酵素が、列挙したモチーフのいずれをも含まず、本発明に係るアミダーゼに対して配列相同性を示さないことは、当業者であれば容易にわかるであろう。
【００５７】
好ましい一実施形態では、アミダーゼは、その産生に用いられた培養培地中の他の成分を実質的に含まない単離されたアミダーゼである。
【００５８】
さらなる好ましい実施形態では、アミダーゼは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の純度である。
【００５９】
さらなる好ましい実施形態では、アミダーゼは、６個のヒスチジン残基と１個のリシン残基と１個のアスパラギン酸残基とを含む活性部位を含む歪んだＴｉｍ様バレル構造を含むアミダーゼであり、活性部位のアミノ酸残基は、アミダーゼの三次構造と配列番号１とを比較した場合、配列番号１の位置Ｈ１１１、Ｈ１１３、Ｈ１９１、Ｋ２４６、Ｈ２８７、Ｈ２８９、Ｈ３０７、およびＤ３７８に対応する。
【００６０】
当業者であれば、Ｔｉｍバレルが、ペプチド骨格に沿って交互に現れる８個のαヘリックスと８個の平行βストランドとで構成された保存タンパク質フォールドであることは、理解されよう。Ｔｉｍバレルは、単一ドメイン中に交互に現れるαヘリックスとβストランドとのパターンを含んでいるので、α／βタンパク質フォールドと考えられる。Ｔｉｍバレルでは、ヘリックスおよびストランド（通常はそれぞれ８個）は、トポロジー的にトロイドとして知られるドーナツ形状でそれ自体を閉じるように湾曲したソレノイドを形成する。平行βストランドは、ドーナツの内壁を形成し、一方、αヘリックスは、ドーナツの外壁を形成する。各βストランドは、ヘリックスの１つを含む長い右巻きループを介してバレル中の次の隣接するストランドに結合する。
【００６１】
アミダーゼ２の構造は、２つのドメイン、すなわち、コア触媒ドメインと、より小さいβサンドイッチドメインと、に分けることが可能である。触媒ドメインは、αヘリックスにより外面上でフランキングされた８個の平行βストランド（β５〜７、９〜１３）のやや歪んだＴＩＭ様バレルを形成する残基１０７〜４２５を含む。残基１８２に存在するストランドβ７の中央のキンクにより、２つの個別のストランドβ７ａおよびβ７ｂに分けられる。このキンクは、バレル歪みを引き起こす特徴を示す。β７ａは、ただ１つの隣接バレルストランドβ６を有するが、ストランドβ７ｂは、それに水素結合された２つの隣接部β８およびβ９を有する。前者は、バレルコアに結合された二次構造エレメントを示すが、形式上その一部ではない。バレル歪みの第２の原因は、β１３のすぐ下流の残基３７５〜３７８と、環を閉じると思われる第１のバレルストランドβ５と、のカノニカル水素結合相互作用の不在である。したがって、ドメインコアの全体的外観は、平行βシートのサンドイッチにやや類似しており、一方は、３個のストランドで構成され、他方は、７個のストランドで構成される。それらのうち、触媒ドメインの合計１３個のヘリックス（１２個のαおよび１個のｇ）、すなわち、バレルストランドおよびβ８のすぐ後のヘリックスは、バレルヘリックスとして帰属可能であり、一方、残り４個のヘリックスは、バレルの頂部および底部をライニングする追加の二次構造エレメントを示す。
【００６２】
βサンドイッチドメインは、Ｎ末端およびＣ末端の両方の残基（４３〜１０６、４２６〜４８０）を含む。Ｃ末端残基により形成される３個のストランド（β１４〜１６）は、２つのシートの大きい方の一部である。Ｎ末端残基により形成される４個のストランドのうち、β３は、より小さいシートに属し、一方、長い鋭く曲がったストランドβ１、β２、およびβ４は、両方シートの形成に寄与する。β１とβ４だけは、互いと平行である。ヘリカルターンγ１６およびγ１７は、β１４とβ１５の間に挿入されて、触媒ドメインを押し込める。β３とβ４の間に挿入されたヘリックスγ１およびα２は、反対方向を向いて、溶媒暴露される。
【００６３】
標準的ソフトウェアパッケージ、たとえば、ＰｙＭＯＬ（ｗｗｗ．Ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）をそのデフォルトパラメーターで用いて、所与のアミダーゼの三次構造を、図２５に示される座標を有する配列番号１の三次構造と、容易に比較可能であることは、当業者であれば理解されよう。
【００６４】
さらに、オクラトキシンを分解可能な先行技術のカルボキシペプチダーゼ酵素が、活性部位に指定の残基を含むＴｉｍバレル様構造を含まないことは、当業者であれば容易にわかるであろう。
【００６５】
一実施形態では、アミダーゼは、Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＵＢＭＢ）に準拠したＥＣ３．５．１．Ｘの酵素である。ただし、Ｘは、この委員会による提供される指定番号である。
【００６６】
先行技術のカルボキシペプチダーゼＡおよびカルボキシペプチダーゼＹが、それぞれ、ＥＣ３．４．１７．１および３．４．１６．５で表されることは、当業者であれば理解されよう。
【００６７】
好ましい一実施形態では、アミダーゼは、ｐＨ３〜９かつ２１〜４０℃でインキュベートしたときにオクラトキシンＡを分解するものである。
【００６８】
以下の方法の節に記載のＯＴＡ分解アッセイを用いて、オクラトキシンＡを分解するアミダーゼ酵素の能力を決定可能であることは、あきらかであろう。
【００６９】
好適なアミダーゼは、それぞれ、配列番号１、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、および１５として示される、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、タラロマイセス・スティピタタス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、たとえば、Ｓ．ロゼオスポラス（Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）、サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）、サリニスポラ・アレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ）、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、メタリジウム・アニソプリアエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）、およびアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に由来するもの、または配列番号１、３、５〜１１、１３、１４、もしくは１５のいずれか１つに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含む。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に係る添加物、食品、飼料、使用、および方法で使用されるアミダーゼ酵素は、配列番号１もしくは配列番号３で示される配列または配列番号１もしくは配列番号３に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列を有するポリペプチド、または配列番号１もしくは配列番号３と１つもしくは複数のアミノ酸付加、欠失、および／もしくは置換だけ異なるポリペプチド、あるいは配列番号２を含むポリヌクレオチド、または配列番号２に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有するポリヌクレオチド、または配列番号２と１つもしくは複数のヌクレオチド付加、欠失、および／もしくは置換だけ異なるポリヌクレオチド、または配列番号２の相補体にストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列、またはそれに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列、の発現により産生されるポリペプチド、を含む。
【００７１】
さらなる好ましい実施形態では、本発明に係る酵素は、Ｃ−Ｎ、Ｃ−Ｏ、またはＰ−Ｏ、より好ましくはＣ−Ｎの化学結合切断を触媒する。
【００７２】
当技術分野の任意の周知技術を用いて全長アミダーゼ２変異体を作製可能であることは、当業者には明らかであろう。Ｎ末端配列またはシグナル配列の切断に対して耐性のある安定な変異体は、ペプチド配列中のプロテアーゼ感受性ペプチド結合を突然変異させることにより産生可能である。
【００７３】
たとえば、突然変異は、配列番号１に示される４８０ａａのアミダーゼ２配列の以下の７１個の部位の１つ以上で行うことが可能であり、これは、宿主生物によりその培地中に分泌されるペプチダーゼであるシグナルペプチダーゼおよびペプシンによる加水分解に対する感受性を改変可能であり：
１８  ３１  ３２  ３３  ３４  ４２  ５５  ５６  ５６  ６４  ６９  ７０  ７８  ７９  １０７  １１４  １２７  １２８  １３９  １４６  １４７  １５６  １８４  １８５  １９４  １９５  １９７  ２０２  ２０３  ２２０  ２３６  ２６２  ２６４  ２６９  ２７０  ３０４  ３１７  ３１８  ３２５  ３３５  ３３６  ３３６  ３３７  ３４３  ３４４  ３５１  ３５２  ３５４  ３５５  ３５９  ３６０  ３７４  ３７５  ３８６  ３８７  ３８８  ３８９  ３９０  ３９１  ４００  ４１２  ４２０  ４２４  ４２５  ４３５  ４３６  ４４０  ４４６  ４６１  ４６２  ４６２  ４８０、
以下の４４個の部位での突然変異は、トリプシン耐性を改変可能であり：
３  ４  ３６  ４８  ６６  ７５  ８８  ８９  ９２  ９９  １３８  １４１  １５５
１６６  ２３１  ２３２  ２３５  ２３９  ２４０  ２４３  ２４６  ２５６  ２７１
２７９  ２８２  ２９１  ２９９  ３０３  ３２０  ３２２  ３３０  ３４６  ３５１
３６１  ３６８  ３９５  ４０５  ４２６  ４４５  ４５１  ４５８  ４６１  ４６４
４７６、
以下の９０個の部位での突然変異は、キモトリプシン耐性を改変可能である：
１  １１  １６  １９  ２３  ３２  ３４  ３９  ５３  ５６  ５７  ６５  ７０  ７９  ９０  ９１  ９８  １０３  １０７  １０８  １１２  １１３  １１４  １２０  １２１  １２４  １２８  １３９  １４４  １４７  １５１  １５４  １５７  １６０  １７９  １８５  １９１  １９５  ２０３  ２０６  ２０９  ２１５  ２１６  ２２１  ２３６  ２４８  ２５４  ２６２  ２６５  ２７０  ２８７  ２８９  ２９５  ３０５  ３０７  ３１０  ３１６  ３１８  ３１９  ３２５  ３２６  ３３６  ３３７  ３４４  ３４９  ３５２  ３５５  ３５９  ３６０  ３６３  ３７５  ３８７  ３８９  ３９１  ３９８  ４０１  ４１３  ４２１  ４２５  ４２９  ４３６  ４４１  ４４７  ４５５  ４５７  ４６２  ４６３  ４７１  ４７９  ４８０。
【００７４】
さらに、溶解性および熱安定性を改善するために、４８０ａａのアミダーゼ２ポリペプチドまたはその変異体を、そのアスパラギン（Ａｓｎ）残基、セリン（Ｓｅｒ）残基、およびトレオニン（Ｔｈｒ）残基のいずれかで、Ｎおよび／またはＯ−グリコシル化しうることは、理解されよう。
【００７５】
本明細書に定義されるように、ストリンジェント条件という用語が、５０℃および０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  Ｎａ３シトレート  ｐＨ７．０｝での洗浄を意味することは、理解されよう。
【００７６】
また、この条件が、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  Ｎａ３シトレート  ｐＨ７．０｝での洗浄として本明細書に定義される高ストリンジェント条件でありうることは、理解されよう。
【００７７】
他の好ましい実施形態では、アミダーゼ酵素は、配列番号１、３、５〜１１、１３、１４、もしくは１５を含むアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を有するポリペプチド、または配列番号１、３、５〜１１、１３、１４、もしくは１５と１つもしくは複数のアミノ酸付加、欠失、および／もしくは置換だけ異なるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドの発現により、産生される。
【００７８】
より好ましくは、アミダーゼは、
ａ）配列番号２またはそれに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド、または配列番号２と１つもしくは複数のヌクレオチド付加、欠失、および、／もしくは置換だけ異なるポリヌクレオチド、
ｂ）遺伝暗号の縮重に起因して配列番号２と異なるポリヌクレオチド、
ｃ）配列番号２の相補体、またはそれに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列、または配列番号２の相補体と１つもしくは複数のヌクレオチド付加、欠失、および／もしくは置換だけ異なるポリヌクレオチド、にストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
から選択されるポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７９】
他の好ましい実施形態では、本発明で使用されるオクラトキシンＡを分解するアミダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００８０】
ベクターが、任意の好適な発現ベクターでありうること、およびベクターの選択が、ベクターが挿入される細胞のタイプに依存して異なりうることは、当業者には明らかであろう。好適なベクターとしては、ｐＧＡＰＴ−ＰＧ、ｐＲＡＸ１、ｐＧＡＭＤ、およびｐＧＰＴ−ｐｙｒＧ１が挙げられる。
【００８１】
さらなる好ましい実施形態では、ベクターは細胞内に含まれる。さらなる実施形態では、細胞は胞子である。
【００８２】
本明細書で用いられる場合、胞子という用語が、菌類または細菌の胞子（内生胞子または外生胞子）を意味することは、理解されよう。
【００８３】
本発明に係る細胞は、任意の好適な細胞でありうる。より好ましくは、任意の好適な細菌細胞、菌類細胞、または植物細胞。さらにより好ましくは、細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（特定的にはＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（特定的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、植物細胞、および／またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、もしくはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の胞子から選択される。
【００８４】
より好ましい実施形態では、本発明で使用されるオクラトキシン（好ましくはオクラトキシンＡ）を分解するアミダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む組換え細胞または組換え胞子が提供される。
【００８５】
さらなる好ましい実施形態では、本発明で使用されるアミダーゼ酵素は組換え型である。
【００８６】
本発明の好ましい態様では、オクラトキシンを分解可能なアミダーゼ酵素を含む食品添加物または飼料添加物が提供される。
【００８７】
好ましくは、アミダーゼ酵素は、少なくともオクラトキシンＡを分解するであろう。
【００８８】
より好ましくは、アミダーゼ酵素はまた、少なくとも１種の他のオクラトキシン、より好ましくは、少なくともオクラトキシンＢを分解するであろう。
【００８９】
さらなる実施形態では、酵素はまた、オクラトキシンＢおよびオクラトキシンＣを除く少なくとも１種のオクラトキシン誘導体ならびに／または少なくとも１種の麦角アルカロイドを分解するであろう。
【００９０】
麦角アルカロイドが、アミド結合を含有する化合物であり、たとえば、エルゴコルニン、エルゴコルニニン、エルゴクリスチン、エルゴクリスチニン、エルゴクリプチン、エルゴクリプチニン、エルゴメトリン、エルゴシン、エルゴタミン、およびエルゴタミニンが挙げられることは、理解されよう。これらの化合物は、ヒトおよび家畜を含めて生物に対して毒性がある。
【００９１】
動物により摂取される食料中または飼料中に存在する毒素のレベルを低減すべく、この食品添加物または飼料添加物をオクラトキシンで汚染された食品材料または飼料材料に添加することができることは、当業者には明らかであろう。オクラトキシンＡは、穀物および他の高デンプン食品、さらには、たとえば、コーヒー、ココア、ワイン、ビール、豆、香辛料、乾燥果実、グレープジュース、非反芻動物の乳製品および肉製品の重要な汚染物質であることが知られている。オクラトキシンＡは、たとえ低レベルでも存在すれば有害でありうる腎毒性、催奇形性、肝毒性、および発癌性の化合物である。
【００９２】
より好ましい実施形態では、添加物は飼料添加物である。
【００９３】
好ましい実施形態では、食品添加物または飼料添加物は、少なくとも０．００１ｇ／ｋｇ、少なくとも０．０１ｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｇ／ｋｇ、少なくとも１ｇ／ｋｇ、少なくとも５ｇ／ｋｇ、少なくとも７．５ｇ／ｋｇ、少なくとも１０．０ｇ／ｋｇ、少なくとも１５．０ｇ／ｋｇ、少なくとも２０．０ｇ／ｋｇ、少なくとも２５．０ｇ／ｋｇのレベルでアミダーゼを含む。好ましくは、食品添加物または飼料添加物は、食品材料または飼料材料に添加したときに飼料材料が１〜５００ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは２〜５０ｍｇ／ｋｇまたは２〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内のアミダーゼを含むようなレベルでアミダーゼを含む。
【００９４】
本発明の好ましい実施形態では、アミダーゼは、ＯＴＡが１μｇ／ｍｌの濃度で存在する場合、ｐＨ７．０および４０℃で、タンパク質１ｍｇあたり毎分少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、３００、５００、７００、９００、１０００ナノモルのＯＴＡを加水分解することが可能である。
【００９５】
より好ましくは、本発明に係る食品添加物または飼料添加物は、オクラトキシンを分解可能なアミダーゼ酵素を発現可能な組換え細胞を含む。より好ましくは、アミダーゼ酵素は、少なくともオクラトキシンＡを分解可能である。
【００９６】
さらにより好ましくは、アミダーゼ酵素はまた、少なくとも１種のさらなるオクラトキシンもしくはオクラトキシン誘導体および／または少なくとも１種の麦角アルカロイド、より好ましくはオクラトキシンＢを分解可能である。
【００９７】
最も好ましくは、アミダーゼは、配列番号１、配列番号３、または配列番号５〜１１、１３、１４、もしくは１５のいずれか１つ、または配列番号１、３、５〜１１、１３、１４、もしくは１５のいずれか１つに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含む。
【００９８】
他の好ましい実施形態では、細胞は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の細胞または胞子である。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の細胞が、生細胞、死細胞、または破壊細胞でありうることは、当業者には明らかであろう。
【００９９】
好ましい実施形態では、組換え細胞は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）細胞である。より好ましくは、細胞は、同一種の非組換え細胞と比較した場合、増大されたＯＴＡ分解活性を有する。
【０１００】
本発明で使用されるオクラトキシンＡを分解可能なアミダーゼ酵素が、独立して、液状または固形／顆粒状のいずれかの組成物として提供することができることは、当業者であれば理解されよう。
【０１０１】
好ましくは、前記酵素が液体形態である場合、前記酵素は、前記酵素を含む細胞の培養後に培地中に分泌される。好ましくは、前記培地は無細胞である（すなわち、細胞は培地から分離されている）。好ましくは、前記培地は濃縮される。培地を顆粒化して固形酵素組成物を提供することができることは、理解されよう。
【０１０２】
さらに、使用および／または適用形態および／または投与形態に依存して、溶液または固体の形態で本発明に係る食品添加物または飼料添加物を提供することができることは、理解されよう。
【０１０３】
さらなる実施形態では、添加物は、食品または飼料として使用される材料の前処理に使用することができる。
【０１０４】
たとえば、アミダーゼは、エタノールプラントから副産物として生産されるような液体の処理に使用することができる。この場合、添加物は、エタノール生産用の酵母または微生物の増殖に使用される培地中に見いだされるオクラトキシンＡ汚染物質を分解すべく、液体発酵ブロスに添加することができる。
【０１０５】
続いてブロスを乾燥させて動物に給餌しうることは、理解されよう。
【０１０６】
他の選択肢の実施形態では、添加物は、ＯＴＡで汚染されたミルクたとえば牛乳に添加することができる。
【０１０７】
一実施形態では、本発明に係る食品添加物または飼料添加物は、摂取に好適な液状製剤であり、好ましくは、そのような液状組成物はさらに、緩衝剤、塩、ソルビトール、および／またはグリセロールの少なくとも１つを含む。
【０１０８】
好ましくは、食品添加物または飼料添加物はさらに、少なくとも１種の生理学的に許容可能な担体を含む。
【０１０９】
生理学的に許容可能な担体は、好ましくは、少なくともの１つマルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギまたはコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、およびそれらの混合物から選択される。
【０１１０】
さらなる実施形態では、食品添加物または飼料添加物はさらに、金属イオンキレート化剤を含みうる。金属イオンキレート化剤は、ＥＤＴＡまたはクエン酸から選択可能である。
【０１１１】
一実施形態では、アミダーゼ酵素は、生理学的に許容可能な担体上で乾燥される。
【０１１２】
一実施形態では、食品添加物または飼料添加物は、顆粒化または他の酵素と共顆粒化される。
【０１１３】
好ましい実施形態では、本発明で使用されるアミダーゼは、１種以上のさらなる酵素と組み合わせて使用することができる。好ましい実施形態では、１種以上のさらなる酵素は、カルボキシペプチダーゼ、好ましくは、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＹ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスパラギン酸プロテアーゼのＰＥＰＡａ、ＰＥＰＡｂ、ＰＥＰＡｃ、およびＰＥＰＡｄ、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ、ペプシンまたはペプシン様プロテアーゼ、トリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼ、およびスブチリシンやその変異体をはじめとする細菌プロテアーゼを含めて、タンパク質分解に関与するもの、ならびにデンプン代謝、繊維分解、脂質代謝に関与するもの、グリコーゲン代謝に関与するタンパク質または酵素、他の汚染物質を分解する酵素、アセチルエステラーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、エキソおよびエンドペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、ホルムアミダーゼ、−ガラクトシダーゼ、たとえば、αまたはβガラクトシダーゼ、エキソグルカナーゼ、グルカンリサーゼ（ｇｌｕｃａｎ  ｌｙｓａｓｅｓ）、エンドグルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、−グルコシダーゼ、たとえば、αまたはβグルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペプチダーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ２−オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．３．５））、酸性ホスファターゼ、ならびに／あるいは他のものまたはそれらの組合せよりなる群から選択される。これらは、たとえば、組成物または飼料の粘度を調整する酵素を含む。
【０１１４】
とくに好ましい実施形態では、酵素は、カルボキシペプチダーゼＡと組み合わせて使用される。
【０１１５】
さらなる好ましい実施形態では、酵素は、ＰＥＰＡｄプロテアーゼと組み合わせて使用される。
【０１１６】
さらなる実施形態では、アミダーゼは、マイコトキシン分解酵素、たとえば、アフラトキシンデトキシザイム（ａｆｌａｔｏｘｉｎ  ｄｅｔｏｘｉｚｙｍｅ）、ゼアラレノンエステラーゼ、ゼアラレノンラクトナーゼ、フモニシンカルボキシルエステラーゼ、フモニシンアミノトランスフェラーゼ、アミノポリオールアミンオキシダーゼ、デオキシニバレノールエクスポキシド（ｅｘｐｏｘｉｄｅ）ヒドロラーゼよりなる群から選択される解毒酵素、マイコトキシン分解微生物、たとえば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、または少なくとも１種のポリマーたとえば微生物細胞壁もしくはベントナイトなどの無機材料を含む吸収剤（すなわち、マイクトキシン（ｍｙｃｔｏｘｉｎ）結合剤）、の少なくとも１つと組み合わせて使用することができる。
【０１１７】
飼料添加物を任意の好適な動物に供しうることは、理解されよう。好ましい一実施形態では、動物は、単胃動物、たとえば、家禽、ブタ、魚、貝、および甲殻動物、たとえば、エビ、愛玩動物、たとえば、ネコやイヌなどである。他の選択肢の好ましい例では、動物は、たとえば、雌ウシもしくは他のウシ科動物、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、シカ、ラマ、アンテロープ、アルパカ、またはウィルドビーストから選択される反芻動物である。
【０１１８】
また、本発明に係る食品添加物または飼料添加物が、安定化剤および／またはバルキング剤および／または他の酵素などの他の成分をも含みうることは、当業者には自明であろう。
【０１１９】
好ましくは、本発明に係る食品添加物または飼料添加物は、約７０℃まで、約８０℃まで、または約９５℃までの熱処理に対して熱安定性であろう。熱処理は、約０．５分間まで、約５分間まで、約１０分間まで、約３０分間まで、約６０分間まで実施可能である。熱安定性という用語は、指定温度に加熱する前に添加物中に存在した／活性であった酵素成分の少なくとも約７５％が、室温に冷却した後、依然として存在する／活性であることを意味する。好ましくは、指定温度に加熱する前に添加物中に存在しかつ活性であった酵素成分の少なくとも約８０％は、室温に冷却した後、依然として存在しかつ活性である。
【０１２０】
本発明に係る食品添加物または飼料添加物は、約３０週間超、約４０週間超、約５０週間超、約１年間超、約１．５年間超の貯蔵寿命を有しうる。貯蔵寿命とは、調製されたときに添加物中に存在しかつ活性であった酵素成分の少なくとも約８０％が、依然として存在しかつ活性であることを意味する。
【０１２１】
好ましくは、本発明に係る食品添加物または飼料添加物の調製方法は、オクラトキシン、好ましくはオクラトキシンＡを分解するアミダーゼ酵素を、任意選択的に、少なくとも１種の生理学的に許容可能な担体と、混合することを含む混合工程を含む。
【０１２２】
より好ましくは、アミダーゼ酵素はまた、少なくとも１種のさらなるオクラトキシンもしくはオクラトキシン誘導体および／または少なくとも１種の麦角アルカロイド、より好ましくはオクラトキシンＢをも分解可能である。
【０１２３】
とくに好ましい実施形態では、食品添加物または飼料添加物は、粉末を生成すべくホモジナイズされる。
【０１２４】
他の選択肢の好ましい実施形態では、食品添加物または飼料添加物は、国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレット（参照により本明細書に組み入れられるものとする）に記載されるように、顆粒剤（ＴＰＴ顆粒剤として参照される）の形に製剤化される。
【０１２５】
他の好ましい実施形態では、食品添加物または飼料添加物が顆粒剤の形に製剤化される場合、顆粒剤は、タンパク質コアを覆うように被覆された水和したバリヤー塩を含む。そのような塩被覆の利点は、熱耐性の改良、貯蔵安定性の改良、およびそのままでは酵素に悪影響を及ぼす他の食品添加物または飼料添加物からの保護である。
【０１２６】
好ましくは、塩被覆に使用される塩は、２０℃で０．２５未満の水分活性または６０％超の一定の湿度を有する。
【０１２７】
好ましくは、塩被覆はＮａ２ＳＯ４を含む。
【０１２８】
食品添加物または飼料添加物の調製方法はまた、粉末をペレット化するさらなる工程をも含みうる。粉末は、当技術分野で公知の他の成分と混合してもよい。粉末または粉末を含む混合物は、ダイに通して押し出してもよく、得られたストランドは、さまざまな長さの好適なペレット剤の形にカットされる。
【０１２９】
任意選択的に、ペレット化工程は、ペレット剤の形成前にスチーム処理またはコンディショニング段階を含んでもよい。粉末を含む混合物は、コンディショナー中、たとえば、スチーム注入機能を備えたミキサー中に配置してもよい。混合物は、６０〜１００℃などの指定温度までコンディショナー中で加熱されるが、典型的な温度は、７０℃、８５℃、９０℃、または９５℃であろう。滞留時間は、数秒間から数分間まで、さらには数時間まで、さまざまでありうる。たとえば、５秒間、１０秒間、１５秒間、３０秒間、１分間、２分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、および１時間。
【０１３０】
さらなる態様では、本発明に係る食品添加物または飼料添加物を含む食品材料または飼料材料が提供される。本発明に係る食品添加物または飼料添加物が、任意の適切な食品材料または飼料材料への添加に好適であることは、理解されよう。
【０１３１】
予防工程として任意の食品材料または飼料材料に食品添加物または飼料添加物を添加することができることは、当業者には自明であろう。他の選択肢として、食品添加物または飼料添加物は、オクラトキシン汚染、好ましくはオクラトキシンＡ汚染を受けやすいことが知られている食品材料もしくは飼料材料に、またはオクラトキシン、好ましくはオクラトキシンＡで汚染されていることが示された食品材料もしくは飼料材料に、添加することができる。さらに、任意の好適な手段、たとえば、ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡにより、または市販のオクラトキシン検出ストリップ（Ｈｅｌｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ  ＣＡ）を用いて、オクラトキシン、好ましくはオクラトキシンＡの存在を確認可能であることは、当業者には明らかであろう。
【０１３２】
本明細書で用いられる場合、飼料材料という用語は、動物により摂取される基礎飼料材料を意味する。さらに、これが、たとえば、少なくとも１種の加工されていない子実、ならびに／または大豆粉や骨粉などの加工された植物性および／もしくは動物性の材料を含みうることは、理解されよう。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、飼料材料は、次の成分、すなわち、ａ）穀物、たとえば、小子実（たとえば、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、およびそれらの組合せ）および／またはメイズやソルガムなどの大子実、ｂ）穀物からの副産物、たとえば、トウモロコシグルテン粉、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧＳ）、コムギフスマ、コムギミドリング、コムギショート、コメヌカ、モミガラ、オートムギガラ、パーム核、およびシトラスパルプ、ｃ）サイレージ、たとえば、メイズサイレージ、ｄ）ダイズ、ヒマワリ、ラッカセイ、ルピナス、エンドウマメ、ソラマメ、ワタ、カノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉粉および骨粉、ジャガイモタンパク質、ホエー、コプラ、ゴマなどの供給源から得られるタンパク質、ｅ）植物源および動物源から得られる油および脂肪、ｆ）ミネラルおよびビタミンの１つ以上を含むであろう。
【０１３４】
本明細書で用いられる場合、飼料という用語は、１種以上の飼料添加物が添加された飼料材料を意味する。他の態様によれば、本発明に係る飼料材料を含む飼料が提供される。
【０１３５】
さまざまな動物がさまざまな飼料を必要とし、たとえ同一の動物であっても、動物を飼育する目的に依存して、異なる飼料を必要とすることもあることは、当業者であれば理解されよう。
【０１３６】
好ましくは、飼料は、メイズもしくはトウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライコムギ、ライムギ、コメ、タピオカ、ソルガム、および／またはそれらの副産物のいずれか、さらにはダイズミーン（ｍｅａｎ）、アブラナ種子粉、カノーラ粉、綿実粉、ヒマワリ種子ミーン、動物副産物粉、およびそれらの混合物のような高タンパク質成分を含む飼料材料を含みうる。より好ましくは、飼料は、動物脂肪および／または植物油を含みうる。
【０１３７】
任意選択的に、飼料はまた、たとえばカルシウムなどの追加のミネラルおよび／または追加のビタミンをも含有してもよい。
【０１３８】
本明細書で用いられる場合、食品材料という用語は、ヒトにより摂取される基礎食品を意味する。これが子実、植物性または動物性の材料を含んでもよいことは、理解されよう。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、食品材料は、穀物または穀物製品、コーヒー、ココア、ワイン、ビール、豆、香辛料、乾燥果実、グレープジュース、ミルク、肉または肉製品の１つ以上を含みうる。
【０１４０】
本明細書で用いられる場合、食料という用語は、１種以上の食品添加物が添加された食品材料を意味する。他の態様によれば、本発明に係る食品材料を含む食料が提供される。
【０１４１】
好ましい実施形態では、食料または飼料は、約０．００１ｍｇ〜１０ｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ〜１０ｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ〜１０ｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ〜５ｇ／ｋｇ、１ｍｇ〜５ｇ／ｋｇ、０．５ｇ〜１ｇ／ｋｇ食料／飼料のレベルでアミダーゼを含む。
【０１４２】
要求された利点を本発明に係る食品添加物または飼料添加物に提供すべく、食料／飼料が、オクラトキシン、好ましくはオクラトキシンＡで汚染された食料／飼料でなければならないことは、当業者であれば容易にわかるであろう。
【０１４３】
他の態様では、飼料の生産方法が提供される。飼料は、典型的には、飼料ミルを用いて生産され、その際、原料は、最初に、好適な粒子サイズに粉砕され、次いで、適切な添加物と混合される。次いで、飼料は、マッシュまたはペレットとして生産可能であり、後者は、典型的には、温度を目標レベルに上昇させてから飼料をダイに通して特定のサイズのペレットを生産する方法を含む。ペレットを冷却させる。続いて、脂肪や酵素などの液状添加物を添加することが可能である。飼料の生産はまた、特定的には少なくともスチームの使用を含みうる好適な技術によりペレット化する前に、押出しまたは膨化を含む追加の工程をも含みうる。
【０１４４】
飼料は、任意の好適な動物用の飼料であってもよい。好ましくは、飼料は、飼養動物用または家畜用である。
【０１４５】
一実施形態では、動物は、単胃動物、たとえば、家禽（たとえば、ブロイラー、産卵鶏、ブロイラー種鶏、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、水鳥）、ブタ（すべての年齢区分）、魚、エビなどの甲殻動物を含めて貝・甲殻類、愛玩動物（たとえば、イヌ、ネコ）である。
【０１４６】
さらなる実施形態では、動物は、反芻動物、たとえば、ウシ科動物（たとえば、雌ウシ、スイギュウ、バイソン、ヤク）、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、シカ、ラマ、アンテロープ、アルパカ、またはウィルドビーストである。
【０１４７】
飼料は、少なくとも０．０００１重量％の飼料添加物を含みうる。好適には、飼料は、少なくとも０．０００５％、少なくとも０．００１０％、少なくとも０．００２０％、少なくとも０．００２５％、少なくとも０．００５０％、少なくとも０．０１００％、少なくとも０．０２０％、少なくとも０．１００％、少なくとも０．２００％、少なくとも０．２５０％、少なくとも０．５００重量％の飼料添加物を含みうる。
【０１４８】
さらなる態様では、食料または飼料のマイコトキシン汚染レベルを低減ための、食料または飼料の製造におけるオクラトキシン、好ましくはオクラトキシンＡを分解可能な少なくとも１種のアミダーゼ酵素の使用が提供される。
【０１４９】
好ましくは、アミダーゼ酵素はまた、少なくとも１種のさらなるオクラトキシンもしくはオクラトキシン誘導体および／または少なくとも１種の麦角アルカロイド、より好ましくはオクラトキシンＢをも分解可能である。
【０１５０】
好ましくは、少なくとも１種のアミダーゼ酵素は、食品添加物または飼料添加物として製剤化される。より好ましくは、食品添加物または飼料添加物は、本発明に係る食品添加物または飼料添加物である。
【０１５１】
本発明のさらなる態様では、本明細書で説明されるように、オクラトキシン、好ましくはオクラトキシンＡで汚染された材料と、オクラトキシン、好ましくはオクラトキシンＡを分解するアミダーゼと、を含む組成物が提供される。
【０１５２】
本発明の好ましい実施形態では、組成物は、オクラトキシンＡ分解アミダーゼを発現可能な組換え細胞を含む。
【０１５３】
前記組成物が任意の好適なオクラトキシンＡ汚染材料を含みうることは、理解されよう。好ましい実施形態では、組成物は、食品材料もしくは飼料材料、発酵ブロスもしくは発酵プロセスの廃産物たとえばＤＤＧＳ、廃水、または汚染土壌を含む。
【０１５４】
当業者であれば、食品材料や飼料材料以外の組成物のオクラトキシンＡ汚染が問題となりうることは、理解されよう。たとえば、工業プロセスに由来するオクラトキシンＡを含有する廃水は、水路の汚染を引き起こしうる。
【０１５５】
また、オクラトキシン、好ましくはオクラトキシンＡを分解可能なアミダーゼ酵素を汚染された材料に添加することを含む、材料中のオクラトキシン汚染を低減する方法も本発明により提供される。
【０１５６】
また、本発明に係る方法により取得可能な食品材料または飼料材料も本発明により提供される。
【０１５７】
本発明のさらなる態様では、本発明に係る有効量の飼料を動物に給餌することを含む、動物の成長速度増加および／または健康増進の方法が提供される。
【０１５８】
本文中で用いられる場合、健康という用語は、飼料中に存在するレベルのオクラトキシンから生じるオクラトキシン毒性に起因する動物への有害作用を低減することを意味する。
【０１５９】
実施例および図面を参照しながら本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】同一のタンパク質濃度におけるＰＥＰＡｄ（Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）からクローニングされたＤａｎｉｓｃｏアスパラギン酸プロテアーゼ）、Ａｍａｎｏ（商標）リパーゼ、およびウシカルボキシペプチダーゼＡのＯＴＡ分解能力を示している。活性は、ＯＴα（ＯＴＡの産物）の面積％で、すなわち、産物に対応する面積を全面積（ＯＴＡ＋ＯＴαのピーク面積）で割り算して、表した。
【図２】（Ａ）：フェニルセファロース充填カラム（２．６ｃｍ×１０ｃｍ）および１Ｍ〜０Ｍの硫酸アンモニウムグラジエントを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）／アフィニティークロマトグラフィー、（Ｂ）：ＨＩＣ後の０Ｍ〜１ＭのＮａＣｌグラジエントを用いたＱ３０カラムの陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）からの画分のＯＴα面積パーセントおよび相対リパーゼ活性（％）を示している。
【図３】最大ＯＴＡ分解活性を有する濃縮ＡＥＸ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。示されたバンドＡおよびＢをトリプシンでゲル内消化し、ペプチド同定のために消化ペプチドを逆相ＨＰＬＣで分離してＭＳで解析した。
【図４】硫酸アンモニウム分画後のＨＩＣ／アフィニティークロマトグラフィーによるＯＴＡ活性画分の分離をグラフで示している。図４Ａは、フェニルセファロースカラムを用いたＨＩＣまたはアフィニティークロマトグラフィーを示しており、図４Ｂは、ブチルセファロースカラムを用いたＨＩＣを示している。図４Ｃは、ブチルセファロースカラムからの捕集画分２〜２８中のリパーゼおよびＯＴＡ活性の分布を示している。
【図５】アンモニウム分画、フェニルセファロースを用いたＨＩＣ／アフィニティー、ブチルセファロースを用いたＨＩＣ、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ３０を用いたＡＥＸ、およびＡｍｉｃｏｎ  ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０コンセントレーター（分画分子量１０ｋＤａ）を用いた膜分離／濃縮の精製工程後の濃縮ＯＴＡ活性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。
【図６】ホルムアミド（図６Ａ）およびＯＴＡ（図６Ｂ）、２８０ｎｍでアッセイされたタンパク質ピークに関して、図５に示される膜分離・濃縮ＡＥＸ画分中に存在する活性を示している。
【図７】アミダーゼ２発現カセットの構築を示している。
【図８】アミダーゼ２遺伝子を保有するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）形質転換体の細胞内タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。アミダーゼ２のタンパク質バンドは、矢印により示される。
【図９】アミダーゼ２遺伝子を保有するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）形質転換体の細胞外タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。アミダーゼ２のタンパク質バンドは、矢印により示される。
【図１０】ＯＴＡ分解能力に関するアミダーゼ２遺伝子を保有するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）形質転換体の細胞内および細胞外（発酵ブロス）の画分（１〜１５）のスクリーニングを示している。１０μｌの細胞内画分またはブロスを２５μｌの１μｇ／ｍｌ  ＯＴＡ、１００μｌのリン酸ナトリウム（６７ｍＭ、ｐＨ７．０）と混合し、４０℃で３５分間インキュベートした。反応終了時、０．２％の酢酸を含有する１３０μｌのアセトニトリルを添加して反応を停止させた。反応混合物を濾過し、５μｌを残存ＯＴＡのＲＰ−ＨＰＬＣ解析により解析した。ｗｔは、形質転換に使用した親株を意味し、ｃｔｒｌは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）形質転換体の不在下での反応を意味する。
【図１１】ＯＴＡの分解に関するトランスジェニックＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）細胞内調製物由来のアミダーゼ２のｐＨ最適条件を示している。反応混合物は、５μｌのアミダーゼ２混合物（１５５μｇタンパク質／ｍｌのタンパク質濃度を有する）形質転換体の細胞内画分３、４、７〜８、１０〜１１、および１３〜１５の混合物）、０．１ｍｌの６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３、４、５、６、７、８、および９）、２５μｌのＯＴＡ（１μｇ／ｍｌ）を含有していた。反応を３０℃で６０分間行い、０．２％のＨＡＣを含有する０．１３ｍｌのアセトニトリルの添加により停止させた。濾過後の残存ＯＴＡのＲＰ−ＨＰＬＣ解析法のために、１０μｌの注入量を使用した。
【図１２】トランスジェニックＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）細胞内調製物由来のアミダーゼ２の熱安定性を示している。１．５ｍｌエペンドルフ（ｅｐｅｎｄｏｒｐｆ）チューブ内のプレインキュベーション混合物は、５μｌのアミダーゼ２混合物（１５５μｇタンパク質／ｍｌ）および４５μｌの６７ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を含有していた。サンプルを８０℃で０、５、１０、１５、２０、２５、および３０分間プレインキュベートした。１５℃に冷却した後、５０μｌの６７ｍＭリン酸緩衝液および２５μｌのＯＴＡ（１μｇ／ｍｌ）を添加して反応を開始し、これを３０℃で６０分間インキュベートし、０．２％のＨＡＣを含有する１３０μｌのアセトニトリルの添加により反応を停止させた。濾過後の残存ＯＴＡのＲＰ−ＨＰＬＣ解析法のために、１０μｌの注入量を使用した。
【図１３】６７ｍＭリン酸ナトリウム中、ｐＨ３〜９、７０℃でインキュベートされたトランスジェニックＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）細胞内調製物由来のアミダーゼ２のｐＨ安定性および温度安定性を示している。反応混合物は、５μｌのアミダーゼ２混合物（１５５μｇタンパク質／ｍｌ）、ｐＨ３、４、５、６、７、８、または９のいずれかの４５μｌの６７ｍＭリン酸緩衝液を含有していた。反応混合物を７０℃で３０分間インキュベートし、その後、２μｌのエタノール中０．５ｍｇ／ｍｌ  ＯＴＡおよび８０μｌの０．２Ｍ  Ｍｏｐｓ  ｐＨ７．０を添加し、サンプルを３０℃で６０分間インキュベートした。０．２％のＨＡＣを含有する１３０μｌのアセトニトリルを添加することにより反応を停止させ、濾過し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより解析した。
【図１４】ＡＥＸ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）によるおよびＡＥＸ後の画分１３の質量分析（Ｂ）による、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）形質転換体のブロス１３から精製された組換えアミダーゼ２の解析を示している。
【図１５】アミダーゼタンパク質濃度の関数としてＯＴＡ分解を示している。使用されたアミダーゼは、形質転換体のブロス１３から精製された（アミダーゼ２ｍａｔとして参照される４３８ａａのタンパク質）。
【図１６】トランスジェニックＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＡｍａｎｏ（商標）リパーゼ製品から精製されたアミダーゼ２ｍａｔの活性に及ぼすカルシウムイオン濃度の影響を示している。
【図１７】Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の細胞内画分から抽出されたアミダーゼ２（アミダーゼ２ｓｉｇ）によるＯＴＡの分解である。アミダーゼ２ｓｉｇに対するＣａＣｌ２やＥＤＴＡによる阻害は、見られない。
【図１８Ａ】アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のアミダーゼ２アミノ酸配列（４８０ａａ）（配列番号１）を一文字形式で示している。一重下線が付された配列は、図５から得られたものであり、二重下線が付されているのは、図８から得られたものである。
【図１８Ｂ】アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のアミダーゼ２アミノ酸配列（４８０ａａ）＋そのＣ末端の６個のヒスチジン残基を一文字形式で示している（配列番号４）。
【図１９】アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のアミダーゼ２アミノ酸配列（４８０ａａ）を三文字形式で示している。ＯＴＡ分解アミダーゼに特有な特徴は、太字および下線付きのアミノ酸残基、すなわち、保存残基（太字）および９個の配列モチーフ（下線付き）として示されている。
【図２０】ａは、歪んだＴＩＭ様バレル構造を形成するアミダーゼ２（配列番号１）タンパク質四量体の構造を示しており、ｂは、８つのサブユニットの１つの構造を示している。
【図２１】アミダーゼ２活性部位環境の構造を示している。
【図２２−１】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−２】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−３】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−４】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−５】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−６】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−７】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−８】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−９】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−１０】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−１１】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−１２】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−１３】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−１４】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−１５】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−１６】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−１７】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−１８】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−１９】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−２０】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−２１】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−２２】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−２３】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−２４】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−２５】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−２６】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−２７】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−２８】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−２９】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−３０】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−３１】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−３２】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−３３】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−３４】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−３５】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−３６】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−３７】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−３８】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−３９】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−４０】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−４１】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−４２】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２２−４３】アミダーゼ２の単量体の結晶座標を示している。
【図２３】発現プラスミドｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−アミダーゼＧ．グラミニコラ（Ｇ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）の概略図を示している。
【図２４】発現プラスミドｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−アミダーゼＭ．アニソプリアエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）の概略図を示している。
【図２５】発現プラスミドｐＲＡＸ−アミダーゼＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のマップを示している。
【図２６】オクラトキシンを分解するアミダーゼ活性に不可欠な９個の配列モチーフを示す１１種のアミダーゼ配列のアライメントを示している。
【図２７】配列番号１ならびに低オクラトキシン分解活性を有することが知られているカルボキシペプチダーゼＡおよびＹのアライメントを示している。
【発明を実施するための形態】
【０１６１】
とくに定義されていないかぎり、本明細書で用いられる科学技術用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２０ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本開示で用いられる用語の多くを含む一般的辞書を当業者に提供する。
【０１６２】
本開示は、本明細書に開示された例示的な方法および材料により限定されるものではなく、本明細書で説明されたものと類似のまたは均等Ｆな方法および材料はいずれも、本開示の実施形態の実施または試験に使用することができる。数値の範囲は、範囲を規定する数を包含する。とくに指定がないかぎり、それぞれ、核酸配列は、５’から３’方向に左から右に書かれており、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右に書かれている。
【０１６３】
本明細書に提供される見出し語は、明細書全体を参照することにより得られる本開示の種々の態様または実施形態を限定するものではない。したがって、すぐ下に定義される用語は、明細書全体を参照すれば、より十分に定義される。
【０１６４】
アミノ酸は、本明細書では、アミノ酸の名称、三文字略号、または一文字略号を用いて参照される。
【０１６５】
本明細書で用いられる場合、「同一性」という用語は、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列との特定の相同性を有する要素を意味する。これに関連して、「同一性」という用語は、以下でより詳細に説明されるアライメントアルゴリズムを用いて配列をアライメントした後の２種の酵素間の配列同一性パーセントを意味する。
【０１６６】
本発明に関連して、相同アミノ酸配列とは、配列に対して少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、または９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性がありうるアミノ酸配列を含むものとみなされる。典型的には、相同体は、たとえば、対象アミノ酸配列と同一の活性部位を含むであろう。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能Ａを有するアミノ酸残基）に基づいて検討ことも可能であるが、本発明との関連では、配列同一性に基づいて相同性を表すことが好ましい。
【０１６７】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列に対して、相同性比較は、目測でまたはより一般的には容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて実施可能である。こうした市販のコンピュータープログラムを用いて、２つ以上の配列間の相同性％を計算することが可能である。
【０１６８】
相同性％は、コンティグ配列にわたり計算可能である。すなわち、一方の配列を他方の配列にアライメントし、一方の配列中のそれぞれのアミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と１回に１残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップ無し」アライメントと呼ばれる。典型的には、そのようなギャップ無しアライメントは、比較的短い残基数にわたり行われるにすぎない。
【０１６９】
これは非常に単純かつ一貫性のある方法であるが、たとえば、１つの挿入または欠失があると、それ以外は同一である配列対であっても、それ以降のアミノ酸残基がアライメントできなくなるという点が考慮されていないので、グローバルアライメントを行った場合、相同性％が大幅に減少する可能性がある。したがって、ほとんどの配列比較法は、全相同性スコアに過度のペナルティーを課すことなく可能性のある挿入および欠失を考慮した最適アライメントを生成するようにデザインされる。これは、局所相同性を最大化するように試行して配列アライメント中に「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【０１７０】
しかしながら、これらのより複合的な方法では、同一アミノ酸の個数が同数の場合、できるかぎり少ないギャップを有する配列アライメントが、２つの比較配列間のより高い関連性を反映して、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するように、アライメント中に生じるそれぞれのギャップに「ギャップペナルティー」が割り当てられる。典型的には、ギャップの存在に比較的高いコストを課しかつギャップ中のそれぞれの後続残基により小さいペナルティーを課する「アファインギャップコスト」が使用される。これは、最もよく使用されるギャップスコアリングシステムである。当然ながら、ギャップペナルティーが高ければ、より少ないギャップを有する最適化アライメントが生成されるであろう。ほとんどのアライメントプログラムでは、ギャップペナルティーを変更できるようになっている。しかしながら、配列比較用のそのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。たとえば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列に対するデフォルトギャップペナルティーは、ギャップ１つにつき−１２、各伸長ごとに−４である。
【０１７１】
したがって、最大相同性％の計算では、最初に、ギャップペナルティーを考慮して最適アライメントを生成することが必要である。そのようなアライメントを行うのに好適なコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ  １９８４  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２  ｐ３８７）である。配列比較を行いうる他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）、およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツール一式が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡはいずれも、オフライン検索およびオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ  ７−５８  ｔｏ  ７−６０を参照されたい）。
【０１７２】
しかしながら、いくつかの用途では、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールもまた、タンパク質およびヌクレオチドの配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７７（１）：１８７−８およびｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。
【０１７３】
同一性に基づいて最終相同性％を求めることが可能であるが、アライメント法自体は、典型的には、オールオアナッシング対比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性または進化距離に基づいてそれぞれのペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケール化類似性スコアマトリックスが広く使用される。一般に使用されるそのようなマトリックスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（一連のＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトマトリックス）である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムでは、一般的には、パブリックデフォルト値または供給されるのであればカスタムシンボル比較表のいずれかが使用される（さらに詳しくはユーザーマニュアルを参照されたい）。いくつかの用途に対して、ＧＣＧパッケージではパブリックデフォルト値を、またはＢＬＯＳＵＭ６２などの他のソフトウェアの場合にはデフォルトマトリックスを、使用することが好ましい。
【０１７４】
他の選択肢として、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ  ７３（１），２３７−２４４）に類似したアルゴリズムに基づくＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の多重アライメント機能を用いて、相同性パーセントを計算することが可能である。
【０１７５】
ソフトウェアを用いて最適アライメントを生成させた後、相同性％、好ましくは配列同一性％を計算することが可能である。典型的には、ソフトウェアにより配列比較の一部分としてこれを行い、数値結果を生成させる。
【０１７６】
本発明の好ましい態様では、配列相同性／同一性パーセントを計算するために、次のソフトウェアおよび設定値が使用される。アミノ酸配列では、可能性のあるそれぞれのアミノ酸配列ペアに対してＡｌｉｇｎＸ  ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ．）製のＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  ９．１）により、ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ（相同性）または「ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ」のパーセントを計算する。設定値は、デフォルトパラメーター（ギャップ生成ペナルティー−１０、ギャップ伸長ペナルティー０．１）である。
【０１７７】
核酸配列では、ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ（相同性）または「ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ」のパーセントは、可能性のあるそれぞれの核酸配列ペアに対してＩｎｆｏｒｍａｘ  Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）製のＡｌｉｇｎＸ  ＶｅｃｔｏｒＮＴＩプログラムにより計算する。設定値は、ＤＮＡ用のデフォルト設定値である、すなわち、ギャップ生成ペナルティー：１５およびギャップ伸長ペナルティー：６．６６（多重アライメントに対して同一の設定値）。
【０１７８】
好ましくは、アミノ酸同一性（相同性）は、全長アミノ酸配列にわたり、または核酸ではそれぞれの全長アミノ酸配列をコードする対応するポリヌクレオチドに対して計算される。
【０１７９】
配列はまた、サイレント変化を起こして機能的に等価な物質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を有しうる。アミノ酸の性質（たとえば、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または親媒性）の類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行ってもよく、したがって、アミノ酸を官能基でグループにまとめることが有用である。アミノ酸は、その側鎖の性質だけに基づいて、グループにまとめることが可能である。しかしながら、そのうえさらに突然変異データを含めるほうがより有用である。こうして誘導されるアミノ酸のセットは、おそらく構造的理由で保存されるであろう。これらのセットは、Ｖｅｎｎ図（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｃ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｏｎ  Ｇ．Ｊ．（１９９３）”Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５−７５６）（Ｔａｙｌｏｒ  Ｗ．Ｒ．（１９８６）”Ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５−２１８）の形態で記述可能である。保存的置換は、たとえば、一般に認められているアミノ酸のＶｅｎｎ図グループ分けを記述する以下の表に従って、行いうる。
【０１８０】
【表１】
2013540430.tif 000004
【０１８１】
本発明はまた、行いうる相同的置換（置換および置換えは、両方とも、本明細書では、既存のアミノ酸残基と他の選択肢の残基との交換を意味すべく用いられる）、すなわち、類似のもの同士、たとえば、塩基性のもの同士、酸性のもの同士、極性のもの同士などの置換を包含する。また、非相同的置換、すなわち、一方のクラスの残基から他方のクラスの残基への置換、または他の選択肢として、オルニチン（これ以降ではＺとして参照される）、ジアミノ酪酸オルニチン（これ以降ではＢとして参照される）、ノルロイシンオルニチン（これ以降ではＯとして参照される）、ピリイルアラニン（ｐｙｒｉｙｌａｌａｎｉｎｅ）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の組込みを含む置換も行いうる。
【０１８２】
置換えはまた、非天然アミノ酸によっても行いうる。
【０１８３】
「タンパク質」という用語は、本明細書で用いられる場合、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを含む。
【０１８４】
「〜と等価なアミノ酸残基」、「〜に対応するアミノ酸」という用語、およびそれらの文法的等価表現は、本明細書では、特定のタンパク質の特定のアミノ酸配列中に示されるものと類似の位置および作用を有するタンパク質のアミノ酸残基を意味すべく用いられる。当業者であれば、比較可能なタンパク質中の指定の残基の等価性についてわかるであろう。
【０１８５】
「性質」という用語またはその文法的等価表現は、ポリペプチドとの関連では、本明細書で用いられる場合、選択可能または検出可能なポリペプチドの任意の特性または属性を意味する。これらの性質としては、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、温度活性および／またはｐＨ活性プロファイル、飼料加工安定性、ならびに分泌能力が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８６】
本明細書で用いられる場合、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語および／または「タンパク質」という用語と同義である。いくつかの場合、「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である。いくつかの場合、「アミノ酸配列」という用語は、「酵素」という用語と同義である。
【０１８７】
アミノ酸配列は、好適な供給源から調製／単離可能であるか、または合成的に作製可能であるか、または組換えＤＮＡ技術を用いて調製してもよい。
【０１８８】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では同義的に用いられる。本開示および特許請求の範囲では、アミノ酸残基に対して従来の一文字コードおよび三文字コードが使用される。アミノ酸の三文字コードは、ＩＵＰＡＣＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に準拠して定義される。また、ポリペプチドは、遺伝暗号の縮重に基づいて２種以上のヌクレオチド配列によりコード可能であると理解される。
【０１８９】
「シグナル配列」または「シグナルペプチド」という用語は、タンパク質の成熟形態または前駆体形態の分泌に関与するヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の任意の配列を意味する。シグナル配列のこの定義は、機能的定義であり、タンパク質の分泌の遂行に関与する、タンパク質遺伝子のＮ末端部によりコードされるすべてのアミノ酸配列を含むものとする。それは、多くの場合、普遍的ではないが、タンパク質のＮ末端部または前駆体タンパク質のＮ末端部に結合される。
【０１９０】
「機能性断片」とは、そのポリペプチドのその特性を保持するポリペプチドの断片を意味する。本発明との関連では、アミダーゼ酵素の機能性断片は、全タンパク質のアミダーゼ酵素切断能力を保持する断片である。
【０１９１】
「単離された」、「回収された」、または「精製された」という用語は、その元の環境から取り出された材料を意味する。「実質的に精製された」という用語、材料が少なくとも実質的な程度まで精製されたことを意味する。
【０１９２】
一態様では、好ましくは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、単離された形態である。「単離された」という用語は、天然で配列に自然に会合するかつ天然で見いだされる少なくとも１つの他の成分が、配列に少なくとも実質的に含まれないことを意味する。
【０１９３】
用語の他の定義が、本明細書全体にわたり現れることもある。例示的実施形態をより詳細に説明する前に、本開示が記載の特定の実施形態に限定されるものではないことを理解すべきである。なぜなら、当然ながら、それらは変更してもよいからである。また、本開示の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で用いられる用語が、特定の実施形態を説明することだけを目的としたものにすぎず、限定を意図したものではないことも理解すべきである。
【０１９４】
値の範囲が提供される場合、文脈上明らかに異なる場合を除いて下限の単位の１／１０まで、その範囲の上限と下限の間の各介在値もまた、特定的に開示されたものと理解される。指定範囲内の任意の指定値または介在値と、その指定範囲内の任意の他の指定値または介在値と、の間のより小さい範囲は各々、本開示に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、その範囲内に包含しても除外してもよく、一方、皆無、または両方の限界値がより小さい範囲内に包含された各範囲もまた、指定範囲内の任意の特定的に除外された限界値に従って、本開示に包含される。指定範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値の一方または両方を除外した範囲もまた、本開示の範囲内に含まれる。
【０１９５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、文脈上明らかに異なる場合を除いて、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、複数形の参照語が包含されることに留意しなければならない。したがって、たとえば、「ａ  ｇｅｎｅ（遺伝子）」の参照対象は、複数のそのような候補物を包含し、「ｔｈｅ  ｃｅｌｌ（細胞）」の参照対象は、１つ以上の細胞および当業者に公知のその均等Ｆ物の参照対象を包含し、他の場合も同様である。
【０１９６】
本明細書で検討される出版物は、単に本出願の出願日前に開示されたものとして提供されているにすぎない。本明細書の記載内容は、そのような出版物が、本明細書に添付されている特許請求の範囲に対して先行技術を構成することを容認するとみなされるべきものではない。
【０１９７】
本発明で使用される酵素は、バッチプロセス、フェドバッチプロセス、および連続フロープロセスを含めて、固体培養または液内培養のいずれかにより産生可能である。培養は、水性ミネラル塩培地、有機成長因子、炭素源材料およびエネルギー源材料、分子状酸素、ならびに当然ながら、１種以上の利用される特定の微生物種の出発接種物、を含む増殖培地中で達成される。
【０１９８】
炭素源およびエネルギー源、酸素、同化可能な窒素、および微生物の接種物に加えて、適正な微生物増殖を確保するために、微生物変換プロセスで細胞による炭素源およびエネルギー源の同化を最大化するために、ならびに発酵培地中で最大細胞密度で最大細胞収率を達成するために、適正割合で好適量のミネラル栄養素を供給することが必要である。
【０１９９】
水性ミネラル培地の組成は、当技術分野で公知のように、部分的には利用される微生物および基質に依存して、広範にわたりうる。ミネラル培地は、いずれも当技術分野で公知のように、窒素に加えて、好適量のリン、マグネシウム、カルシウム、カリウム、硫黄、およびナトリウムを、好適な可溶性の同化可能なイオン形および結合形で、含まなければならず、また、好ましくは、銅、マンガン、モリブデン、亜鉛、鉄、ホウ素、ヨウ素などの特定の微量元素が、同様に、好適な可溶性の同化可能な形態で、存在しなければならない。
【０２００】
醗酵反応は、好気的プロセスであり、このプロセスでは、微生物種が盛んに増殖するのを支援するのに有効である好適な酸素分圧に発酵槽の内容物を維持すべく提供される、空気、酸素富化空気、さらには実質的に純粋な分子状酸素などの分子状酸素含有ガスにより、所要の分子状酸素が供給される。実際には、酸素化炭化水素基質を用いて、微生物の増殖に必要な酸素要求量を低減させる。それにもかかわらず、基質の同化および微生物の対応する増殖が部分的には燃焼プロセスであるので、増殖のために分子状酸素を供給しなければならない。
【０２０１】
通気速度はかなりの範囲にわたりうるが、通気は、一般的には、発酵槽内の液体体積あたり毎分約０．５〜１０、好ましくは約０．５〜７体積（利用圧力および２５℃で）の範囲内の酸素含有ガスの速度で行われる。この量は、反応器に供給される通常の酸素含有率の空気に基づいており、純酸素に関しては、それぞれの範囲は、発酵槽内の液体体積あたり毎分約０．１〜１．７、好ましくは約０．１〜１．３体積（利用圧力および２５℃で）の酸素であろう。
【０２０２】
微生物変換プロセスに利用される圧力は、広範にわたりうる。圧力は、一般的には、装置および運転のコストと酸素溶解性とのバランスが達成されるように、約０〜５０ｐｓｉｇ、現時点で好ましくは約０〜３０ｐｓｉｇ、より好ましくは大気圧を少なくともわずかに超える範囲内である。大気圧よりも大きい圧力は、そのような圧力が水性発酵体中の溶存酸素濃度を増加させる傾向があり、結果的に、細胞増殖速度を増加させるのを支援しうるという点で、有利である。同時に、これは、高大気圧が装置および運転のコストを間違いなく増加させるという事実により、バランスがとられる。
【０２０３】
発酵温度はいくらか異なりうるが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ）やトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）などの糸状菌では、温度は、一般的には、選択される微生物の株に依存して、約２０℃〜４０℃の範囲内、一般に好ましくは約２５℃〜３４℃の範囲内であろう。
【０２０４】
微生物はまた、同化可能な窒素源を必要とする。同化可能な窒素源は、微生物による代謝利用に好適な形態で窒素を放出可能な１種もしくは複数種の任意の窒素含有化合物でありうる。タンパク質加水分解物などのさまざまな有機窒素源化合物を利用することが可能であるが、通常は、安価な窒素含有化合物、たとえば、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素、および種々のアンモニウム塩、たとえば、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、または種々の他のアンモニウム化合物を利用することが可能である。アンモニアガス自体は、大規模運転に便利であり、好適量で水性発酵体（発酵培地）に通してバブリングすることにより、利用することが可能である。同時に、そのようなアンモニアはまた、ｐＨ調整を支援するためにも利用可能である。
【０２０５】
水性微生物発酵体（発酵混合物）のｐＨ範囲は、約２．０〜８．０の例示的範囲内になければならない。糸状菌では、ｐＨは、通常、約２．５〜８．０の範囲内であり、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）では、ｐＨは、通常、約３．０〜７．０の範囲以内である。特定の微生物に対するｐＨ範囲の選好性は、ある程度、利用される培地、さらには特定の微生物に依存するので、当業者であれば容易に決定可能である培地の変化により、いくらか変化する。
【０２０６】
発酵槽内の発酵混合物の平均保持時間は、部分的には利用された発酵温度および培養物に依存して、かなり異なりうるが、一般的には約２４〜５００時間、現時点で好ましくは２４〜４００時間の範囲内であろう。好ましくは、発酵は、炭素含有基質を制限因子として制御することにより、炭素含有基質の良好な変換を細胞に提供し、実質的量の未変換基質による細胞の汚染を回避できるように、行われる。後者は、水溶性基質では、残留痕跡量が容易に洗浄除去されるので、問題ではない。しかしながら、非水溶性基質の場合、問題になって、好適な洗浄工程などの追加の産物処理工程が必要になることがある。以上で説明したように、このレベルに達する時間は、重要ではなく、特定の微生物および行われる発酵プロセスに応じて変化しうる。しかしながら、発酵培地中の炭素源濃度、および炭素源の所望のレベルが達成されたか否か、をいかに決定するかは、当技術分野で周知である。
【０２０７】
発酵をバッチ運転または連続運転として行うことが可能であるが、フェドバッチ運転は、制御のしやすさ、均一量の産物の産生、およびすべての装置の最も経済的な使用の点で、かなり好適である。所望により、水性ミネラル培地を発酵槽に供給する前に、炭素源材料およびエネルギー源材料の一部もしくは全部および／またはアンモニアなどの同化可能な窒素源の一部を水性ミネラル培地に添加することが可能である。反応器に導入される各ストリームは、好ましくは、所定の速度で、またはモニターにより決定可能な必要項目、たとえば、炭素基質およびエネルギー基質の濃度、ｐＨ、溶存酸素、発酵槽からのオフガス中の酸素または二酸化炭素、光透過率により測定可能な細胞密度などに応じて、制御される。種々の材料の供給速度は、炭素源およびエネルギー源の効率的な利用に合致したできるかぎり迅速な細胞増殖速度が得られるように、基質仕込み量に対してできるかぎり高い微生物細胞収率が得られるように、変更可能である。
【０２０８】
バッチ運転または好ましいフェドバッチ運転のいずれかで、装置、反応器、または発酵の手段、槽、もしくは容器、パイプ、付随する循環装置もしくは冷却装置などはすべて、通常、たとえば、少なくとも約１５分間にわたり約１２１℃でスチームを利用することにより、最初に滅菌される。次いで、滅菌された反応器に、酸素および炭素含有基質を含むすべての所要の栄養素の存在下で、選択された微生物の培養物を接種する。利用される発酵槽のタイプは重要ではないが、現時点で好ましいのは、１５Ｌ  Ｂｉｏｌａｆｉｔｔｅ（Ｓａｉｎｔ−Ｇｅｒｍａｉｎ−ｅｎ−Ｌａｙｅ，Ｆｒａｎｃｅ）下の運転である。
【０２０９】
また、発酵ブロスからの本発明に係る酵素の捕集および精製は、当技術分野でそれ自体公知である手順によって行うことが可能である。発酵ブロスは、一般的には、細胞を含めて細胞デブリ、種々の懸濁物質、および他のバイオマス汚染物質、さらには好ましくは当技術分野で公知の手段により発酵ブロスから取り出される本発明に係る所望の酵素産物を含有するであろう。そのような取出しに好適なプロセスとしては、従来の固液分離技術、たとえば、遠心分離、濾過、透析、精密濾過、回転真空濾過、または無細胞濾液を生成するための他の公知のプロセスなどが挙げられる。限外濾過、蒸発、沈殿などの技術を用いて、発酵ブロスまたは無細胞濾液をさらに濃縮することが好ましいこともある。上清または濾液のタンパク質の成分の沈殿は、塩たとえば硫酸アンモニウムを利用して、達成可能である。任意選択的に、結晶化により、またはさまざまなクロマトグラフィー手順、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、または当技術分野で認められた類似の手順により、さらなる精製を達成することが可能である。
【０２１０】
変異体／誘導体
本発明はまた、酵素の任意のアミノ酸配列またはそのような酵素をコードする任意のヌクレオチド配列の、変異体、相同体、および誘導体の使用を包含する。
【０２１１】
変異アミノ酸配列は、グリシン残基やβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル基、エチル基、プロピル基などのアルキル基を含めて、配列の任意の２つのアミノ酸残基間に挿入可能である好適なスペーサー基を含みうる。変異のさらなる形態は、ペプトイド形の１種以上のアミノ酸残基の存在を含み、当業者であれば十分に理解されよう。疑問を生じないように述べておくが、「ペプトイド形」とは、α炭素置換基がα炭素上ではなく残基の窒素原子上に存在する変異アミノ酸残基を意味すべく用いられるものである。ペプトイド形のペプチドの調製プロセスは、当技術分野で、たとえば、Ｓｉｍｏｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１およびＨｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４）で公知である。
【０２１２】
他の成分
本発明に係る飼料添加物または組成物は、他の成分または担体と組み合わせて使用することができる。
【０２１３】
飼料酵素に好適な担体としては、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ、コムギフスマまたはコムギ成分、コメまたはコメヌカ、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、ならびにそれらの混合物が挙げられる。それに加えて、脂肪／ワックス被覆、植物ガム添加などに基づくものを含めて、いくつかのカプセル化技術が存在する。
【０２１４】
他の成分の例としては、増粘剤、ゲル化剤、乳化剤、結合剤、結晶調整剤、甘味剤（人工甘味剤を含む）、レオロジー調整剤、安定化剤、抗酸化剤、染料、酵素、担体、媒体、賦形剤、希釈剤、滑沢剤、風味剤、着色剤、懸濁化剤、崩壊剤、顆粒化結合剤などのうちの１つ以上が挙げられる。これらの他の成分は、天然物でありうる。これらの他の成分は、化学技術および／または酵素技術を用いて調製可能である。
【０２１５】
本明細書で用いられる場合、本明細書で用いられる「増粘剤またはゲル化剤」という用語は、不混和性液体、空気、または不溶性固体のいずれかのドロップレットである粒子の移動を減速または防止することにより分離を防止する製品を意味する。
【０２１６】
本明細書で用いられる「安定化剤」という用語は、製品（たとえば食品）の経時変化を防ぐ成分または成分の組合せとして定義される。
【０２１７】
本明細書で用いられる「乳化剤」という用語は、乳濁液の分離を防止する成分（たとえば食品成分）を意味する。
【０２１８】
本明細書で用いられる場合、「結合剤」という用語は、物理的または化学的な反応を介して製品を結合一体化する成分（たとえば食品成分）を意味する。
【０２１９】
本明細書で用いられる「結晶調整剤」という用語は、脂肪または水のいずれかの結晶化に影響を及ぼす成分（たとえば食品成分）を意味する。
【０２２０】
「担体」または「媒体」とは、化合物投与に好適な材料を意味し、当技術分野で公知の任意のそのような材料、たとえば、非毒性であるかつ組成物のいずれの成分とも有害な形で相互作用しない、任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤などが挙げられる。
【０２２１】
栄養学的に許容可能な担体の例としては、たとえば、子実、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、石油ゼリー、植物油などが挙げられる。
【０２２２】
賦形剤の例としては、次のもの、すなわち、微結晶セルロースおよび他のセルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、グリシン、デンプン、乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールの１つ以上が挙げられる。
【０２２３】
崩壊剤の例としては、次のもの、すなわち、デンプン（好ましくは、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、またはタピオカデンプン）、ナトリウムデンプングリコレート、クロスカルメロースナトリウム、および特定の複合ケイ酸塩の１つ以上が挙げられる。
【０２２４】
顆粒化結合剤の例としては、次のもの、すなわち、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、マルトース、ゼラチン、およびアカシアの１つ以上が挙げられる。
【０２２５】
滑沢剤の例としては、次のもの、すなわち、マグネシウムステアレート、ステアリン酸、グリセリルベヘネート、およびタルクの１つ以上が挙げられる。
【０２２６】
希釈剤の例としては、次のもの、すなわち、水、エタノール、プロピレングリコール、およびグリセリン、ならびにそれらの組合せの１つ以上が挙げられる。
【０２２７】
他の成分は、同時に（たとえば、それらが混合一体化された状態の場合、さらにはそれらが異なる経路により送達される場合）または逐次的に（たとえば、それらは異なる経路により送達可能である）使用してもよい。
【０２２８】
本明細書で用いられる場合、「動物またはヒトが摂取するのに好適な成分」という用語は、栄養学的利点がありうるか、繊維代替品でありうるか、または一般に消費者に有益な効果がありうる添加物として、本発明に係る組成物に添加されるまたは添加されうる化合物を意味する。
【０２２９】
例として、成分は、アルギネート、キサンタン、ペクチン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、イヌリン、グアーガム、ガラクトオリゴサッカリド（ＧＯＳ）、フラクトオリゴサッカリド（ＦＯＳ）、ラクトスクロース、ダイズオリゴサッカリド、パラチノース、イソマルトオリゴサッカリド、グルコオリゴサッカリド、キシロオリゴサッカリドなどのプレバイオティクスでありうる。
【０２３０】
単離された
一態様では、好ましくは、本発明で使用されるアミダーゼ酵素は、単離された形態である。「単離された」という用語は、天然でアミダーゼ酵素に自然に会合するかつ天然で見いだされる少なくとも１つの他の成分が、アミダーゼ酵素に少なくとも実質的に含まれないことを意味する。「単離された」という用語は、産生に用いられる培養培地中の少なくとも１つの他の成分が、アミダーゼ酵素に少なくとも実質的に含まれないことを意味する。本発明に係るアミダーゼ酵素は、その物質にそのままでは会合されうるまたは酵素の産生に使用されうる１種以上の汚染物質が実質的に含まれない形態で提供することができる。
【０２３１】
したがって、たとえば、それは、細胞または汚染を引き起こす可能性のある１種以上のポリペプチドおよび／または核酸分子を実質的に含みえない。アミダーゼ酵素は、アミダーゼ酵素がブロス中に残存するように、発酵時または発酵後、細胞をブロスから分離することにより単離することができる。アミダーゼ酵素は、発酵ブロスを真空濾過による細胞分離に付すことにより単離することができる。
【０２３２】
一実施形態では、単離されたという用語は、産生に用いられる培養培地の他の成分が実質的に含まないように、アミダーゼがブロスから単離されることを意味する。
【０２３３】
精製された
一態様では、好ましくは、本発明で使用されるアミダーゼ酵素は、精製された形態である。「精製された」という用語は、所与の成分が高レベルで存在することを意味する。成分は、望ましくは、組成物中に存在する主成分である。好ましくは、それは、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％のレベルで存在する。ただし、前記レベルは、検討対象の全組成物を基準にして乾燥重量／乾燥重量に基づいて決定される。いくつかの実施形態では、量は、少なくとも約８５％である。ただし、前記レベルは、検討対象の全組成物を基準にして乾燥重量／乾燥重量に基づいて決定される。
【０２３４】
濃縮物
一態様では、好ましくは、本発明で使用されるアミダーゼ酵素は、濃縮物として使用される。濃縮物は、酵素が排出された培地の濃縮形態であってもよい。好ましくは、濃縮物は、酵素が分泌されたかつ細胞が除去された培地の濃縮形態であってもよい。
【実施例】
【０２３５】
材料および方法
オクラトキシンＡは、Ｆｌｕｋａ（ｃａｔ．ｎｏ．３２９３７−５ＭＧ）製であった。カルボキシペプチダーゼＡは、ウシ科動物膵臓由来であった（Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ９２６８）。市販のアミダーゼおよび試薬を含めて他の酵素はすべて、Ｓｉｇｍａ製、Ｒｏｃｈｅ製、Ｍｅｒｃｋ製、およびＤａｎｉｓｃｏ製であった。Ａｍａｎｏ（商標）リパーゼは、天野エンザイム株式会社（日本国名古屋）製であった。フェニルセファロース、オクチルセファロース、ブチルセファロースを含むすべてのクロマトグラフィー媒体、陰イオン交換用、ゲル濾過（ＰＤ１０カラム）用、およびタンパク質精製用の装置Ａｅｋｔａ  ｅｘｐｌｏｒｅｒは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製であった。マイクロプレートは、Ｎｕｎｃ  Ａ／Ｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）製およびＣｏｒｎｉｎｇ（ＵＳＡ）製であった。マイクロプレートリーダーは、Ｂｉｏｔｅｋ（ＵＳＡ）製であった。トウモロコシ粉は、地方市場から入手したが、ダイズ−トウモロコシを原料とする飼料は、Ｔｈｅ  Ｄａｎｉｓｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ａｔ  Ｋｏｌｄｉｎｇ（Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手した。
【０２３６】
マイコトキシン分解アッセイ：
ホルムアミダーゼ活性の測定方法
使用した溶液：  Ｍｅｇａｚｙｍｅギ酸アッセイキット（Ｋ−ｆｏｒｍ  ０５／０６）ボトル１、４ｍｌのミリＱ水を添加してリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．６を生成する。５℃に保つ。ボトル２、５．２ｍｌの水を添加して適正ＮＡＤ濃度を得る（−２０℃に維持する）。ボトル３、使用前のＦＤＨ振盪液である（それを５℃で維持する）。ホルムアミドは、Ｓｉｇｍａ製の９９．８０％の液状製品（Ｆ９０３７）（５℃に維持する）であり、さらなる希釈を行わずに使用した。
【０２３７】
アッセイ手順：９６ウェル半領域ｕｖ透明性マイクロプレートに以下のものを添加する：
１０μｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）（キットの溶液１）、
１０μｌのＮＡＤ（キットの溶液２）、
２．５μｌのギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）（キットの溶液３）、
１．６μｌの１００％（ｖ／ｖ）ホルムアミド溶液（Ｓｉｇｍａ製、Ｆ９０３７）、
１００μｌのミリＱ水。
３７℃でマイクロプレートリーダーにより３４０ｎｍのＯＤ増加を１分ごとに読み取り、毎回読み取る前に１５〜６０分間振盪する。読取り間隔：１分間。５分間の読取り後、５μｌ〜２０μｌのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）調製物を添加する（活性に依存する）。
反応速度（最大直線傾き）を取得する。
【０２３８】
対照：ホルムアミダーゼを添加せずに、その代わりに、緩衝液または水またはホルムアミダーゼ活性を有していない細胞抽出物を添加する。
【０２３９】
ＯＴＡの酵素分解の定量。アッセイで利用した緩衝液は、次のとおりであった。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４、４．５、５、および５．５）、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６、６．５、および７）、０．２Ｍ  Ｍｏｐｓ−ＮａＯＨ）ｐＨ７．０）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５、８、および８．５）。エタノール／水（６０／４０）に溶解された５ｍｇのオクラトキシンＡ（Ｓｉｇｍａ，ｒｅｆ．３２９３７）でオクラトキシンＡ（ＯＴＡ）溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を作製し、−２０℃で貯蔵した。３００μＬの最終体積で１５μＬのＯＴＡ溶液およびさまざまな酵素濃度（たとえば、０．１〜５ｍｇ／ｍｌ）を用いて、スクリーニングアッセイを行った。一定した攪拌下で２０時間±１時間にわたり３７℃で酵素反応を行った。ＨＰＬＣ分析用シリンジフィルター０．２０μｍを用いてサンプルを濾過した。ＨＰＬＣ装置は、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｐ５８０ポンプ、ならびにＤｉｏｎｅｘ  ＲＦ−２０００蛍光検出器（λｅｘ＝３３３ｎｍ、λｅｍ＝４６０ｎｍ）および２５７ｎｍのＤｉｏｎｅｘ  ＵＶＤ３４０Ｕ  ＵＶ検出器に接続されたＤｉｏｎｅｘ  ＡＳＩ−１００オートサンプラーで構成された。溶出は、０．６ｍＬ／分の流量で水／アセトニトリル／酢酸（１００：１００：１、ｖ／ｖ／ｖ）をｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １００−５Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ、粒子サイズ５μｍ、Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ）を通して行った。カラムを３０℃に維持し、ガードカラム（Ｃ１８、１ｍｍ、Ｏｐｔｉｍｉｚｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続した。ＯＴＡおよびその分解産物を２３５ｎｍ  ｕｖおよび蛍光（２７８ｎｍ励起、４４０ｎｍ発光）の両方でモニターした。
【０２４０】
ＯＴＡ活性に関するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）調製物のアッセイ。反応混合物は、５０ｍＭ  Ｍｅｓ−ＮａＯＨの緩衝液ｐＨ７．０中に希釈された２４５μＬのＯＴＡ（１μｇ／ｍＬ）、および５μＬのサンプル（Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ブロス、無細胞抽出物、アンモニウム分画およびクロマトグラフィーの後の画分またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の産物）で構成された。反応を４０℃で３０分間〜２時間行った。９５℃で５分間加熱を用いて反応を停止させた。シリンジフィルター０．２０μｍを用いてサンプルを濾過し、５μＬをＨＰＬＣ装置に注入した。
【０２４１】
リパーゼアッセイおよびエステラーゼアッセイ。Ｓｉｇｍａから基質として購入したｐ−ニトロフェニルブチレート（ｐＮＰＢ）を用いて、リパーゼ活性およびエステラーゼ活性をアッセイした。アセトニトリル中に４０ｍＭで溶解された５マイクロリットルのｐＮＰＢを１６５μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５および５μＬの酵素溶液に添加し、これを用いてＯＴＡ分解を試験した。４１０ｎｍで６０分間にわたり光学濃度を追跡した。
【０２４２】
プロテアーゼ活性アッセイ（ペトリ皿法）。１００ｍＭリン酸水素二ナトリウム緩衝液ｐＨ６中に１％カゼイン、１％アガロースを含有するプレートを用いて、プロテアーゼ活性を確認した。プレートを３７℃で一晩培養し、酵素を含有するウェルの周りの帯白色リングの発生により、プロテアーゼ活性を明らかにした。
【０２４３】
タンパク質濃度アッセイ。製造業者により提供された手順に従ってＢｒａｄｆｏｒｄの方法に基づいてＢｉｏ−ｒａｄタンパク質アッセイ試薬により、タンパク質濃度を定量した。標準としてＢＳＡを使用し、各サンプルを二重反復方式で添加して、マイクロプレートで５９５ｎｍのＯＤを測定した。
【０２４４】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のＯＴＡ分解活性の精製
硫酸アンモニウム分画。５グラムのＡｍａｎｏリパーゼ酵素を１００ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５に溶解させた。４０％飽和に対応する硫酸アンモニウムの量を添加して、結晶を溶解させた。３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を捕集し、６０％飽和に達するように硫酸アンモニウムを添加した。撹拌により結晶を溶解させ、再び溶液を遠心分離した。４０％〜６０％硫酸アンモニウム飽和での沈殿物に対応するペレットを、４×４０ｍＬの５０ｍＭトリシン、１Ｍ硫酸アンモニウムｐＨ７に溶解させ、０．２２μｍフィルターで濾過した。
【０２４５】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。１Ｍ硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭトリシンｐＨ７（緩衝液Ａ）と平衡化されたフェニルセファロースＦＦカラム、ブチルセファロースカラム、またはオクチルセファロースＣＬ４Ｂカラムに、硫酸アンモニウム分画からのサンプルを注入適用した。Ａｅｋｔａ精製システムに接続されたカラムを緩衝液Ａ（１０ｍＬ／分）で洗浄し、結合されたタンパク質を５０ｍＭトリシン（緩衝液Ｂ）のリニアグラジエントで溶出させた。１０ｍＬの画分を捕集し、ＯＴＡ活性アッセイまたはホルムアミダーゼアッセイに使用した。
【０２４６】
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）。ＯＴＡの高変換率を有する画分をプールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（緩衝液Ａ）で平衡化されたＰＤ１０カラムで脱塩した。脱塩されたサンプルを緩衝液Ａ（１０ｍｌ／分）で平衡化されたＳｏｕｒｃｅ  Ｑ３０カラムに適用した。カラムを緩衝液Ａで洗浄し、結合されたタンパク質を緩衝液Ａ中の０〜１Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出させた（緩衝液Ｂは、１Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液Ａと同一である）。グラジエント時、５ｍｌの画分を捕集した。
【０２４７】
タンパク質の濃縮。陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られたＯＴＡ分解活性を有する画分を、再生セルロース膜（分画分子量１０ｋＤａ）を備えたＡｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（商標）コンセントレーターを用いて濃縮した。
【０２４８】
最適ｐＨの決定。５マイクロリットルの酵素溶液を、次のさまざまな緩衝液中に１μｇ／ｍＬで希釈された２４５μＬのＯＴＡと組み合わせた。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４、４．５、５、および５．５）、５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６、６．５、および７）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５、８、および８．５）。反応を３７℃で３０分間行い、９５℃で５分間加熱することにより停止させた。
【０２４９】
最適温度。５マイクロリットルの酵素溶液を最適ｐＨで２４５μＬのＯＴＡ  １μｇ／ｍＬと混合し、２０、３０、４０、６０、７０℃で３０分間インキュベートした。９５℃で５分間加熱することにより、反応を停止させた。
【０２５０】
温度安定性。酵素溶液をさまざまな温度（３０、４０、６０、７０、８０、および９０℃）で１時間インキュベートし、５μＬを最適条件下でオクラトキシン分解反応のために２４５μＬのＯＴＡ  １μｇ／ｍＬと混合した。９５℃で５分間加熱することにより、反応を停止させた。対照はインキュベートしなかった。
【０２５１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。タンパク質の分離および解析を行うために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用された。４０マイクロリットルのサンプルを１０μＬの５×充填緩衝液（ＤＤＴおよびＳＤＳを含有する）と混合し、５分間煮沸した。２０μＬをＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）上に充填した。製造業者の手順に従って電気泳動を行った。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅブリリアントブルーで染色した。
【０２５２】
質量分析。メスを用いて対象のタンパク質をゲル（上記）からカットし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。タンパク質を酵素（主にトリプシン）で消化した。消化後、ペプチドを抽出し、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを同一性および特性解析の目的でタンパク質データベースに対して自動探索した。
【０２５３】
ホルムアミダーゼおよびアミダーゼ２の阻害アッセイ。１つのプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩＣ）錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１．５ｍＬのミリＱ水に溶解させて、７×ストック溶液を得た。ホルムアミダーゼ阻害アッセイでは、通常利用される１００μＬのミリＱ水の代わりに、２０μＬの７×ＰＩＣストック溶液および８０μＬのミリＱ水を、ホルムアミダーゼ活性アッセイの節に列挙された他の成分と混合した。ＯＴＡ分解活性では、３５μＬの７×ＰＩＣ溶液を、２１０μＬのＯＴＡ  １μｇ／ｍＬおよび５μＬの酵素溶液と混合した。１２５ｍＭ  ＥＤＴＡストック溶液を調製し、１０ｍＭおよび５０ｍＭの最終濃度を得るのに適切な体積を、ＯＴＡ  １μｇ／ｍＬおよび５μＬの酵素と混合した。対照の場合、ホルムアミダーゼ活性アッセイでは、阻害剤溶液をミリＱ水で置き換え、ＯＴＡ分解活性では、ＭＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７緩衝液で置き換えた。
【０２５４】
結果
実施例１  ＯＴＡ活性に関するスクリーニング
種々のリパーゼ、プロテアーゼ、およびアミダーゼを含む３０種の酵素を、オクラトキシンＡを分解するそれらの能力に関して調べた（表１）。カルボキシペプチダーゼＡおよびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のリパーゼ（Ａｍａｎｏ（商標）  Ａ）だけが、既報のとおりＯＴＡを分解可能であった（Ｐｉｔｏｕｔ，１９６９、Ｓｔａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。さらに、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のアスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐＡｄ２（Ｄａｎｉｓｃｏ）は、ＯＴＡ変換活性を呈したが、これはそれほど効率的ではなかった。これらの３種の酵素の比較を容易にするために、ＰＥＰＡｄのタンパク質濃度を決定し、同一濃度（１ｍｇ／ｍｌ）でカルボキシペプチダーゼＡおよびＡｍａｎｏ（商標）リパーゼＡの酵素溶液を調製した。分解の速度を調べた（図１）。図１は、Ａｍａｎｏ（商標）リパーゼＡおよびカルボキシペプチダーゼＡのＯＴＡ分解速度が類似していることを示している。３７℃で７時間反応させた後、ＯＴＡピークが見られなかったことは、ＯＴＡの完全変換が達成されたことを意味する。ＰＥＰＡｄでは、１日間反応させた後でさえも、完全変換は達成されなかった。Ａｍａｎｏ（商標）リパーゼＡ製品は、主要な活性がリパーゼであるさまざまな酵素の混合物であった。ＰＥＰＡｄ以外に、他のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスパラギン酸プロテアーゼのＰＥＰＡａ、ＰＥＰＡｂ、およびＰＥＰＡｃ（Ｗａｎｇ、２０１０年）、ブタエラスターゼ、ならびに酵母カルボキシペプチアーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉａｓｅ）Ｙはすべて、ＯＴＡに対して特定の活性を呈した。メタロプロテアーゼ（すなわち、カルボキシペプチダーゼＡ、Ｚｎ２＋依存性プロテアーゼ）以外のアスパラギン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼエラスターゼ、およびカルボキシペプチダーゼＹが、ＯＴＡを分解可能であることを示したのは、これが初めてである。表１に列挙された他のプロテアーゼ、リパーゼ、およびアミダーゼは、ＯＴＡを分解可能でなかった（データは示されていない）。
【０２５５】
【表２】
2013540430.tif 000005
【０２５６】
【表３】
2013540430.tif 000006
【０２５７】
実施例２  Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発酵液または濾過ブロス（無細胞）に由来するオクラトキシンＡ分解活性の精製。
最初に、硫安沈殿を利用した。いくつかの硫酸アンモニウム濃度をＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）粗タンパク質抽出物に適用した。上清およびペレットの両方でＯＴＡ分解活性を定量した。硫酸アンモニウム濃度を増大させることにより、ＯＴＡ分解活性を上清からペレットに移動させた。６０％硫酸アンモニウムでは、分解活性はすべて、ペレット中に見いだされた。このことから、４０％〜６０％硫酸アンモニウムでの沈殿の酵素がマイコトキシンを加水分解可能であることが実証された。同一の塩濃度（６０％）で、わずかなリパーゼ活性がペレット中に残存した（データは示されていない）。
【０２５８】
４０％〜６０％での硫酸アンモニウム画分をさらなるオクラトキシン分解酵素精製の出発原料として利用した。以上で説明した疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）およびそれに続く陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を用いて、ＯＴＡ分解活性からリパーゼ活性を分離した。１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する５０ｍＭトリシン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）（緩衝液Ａ）中に活性画分を懸濁させた。
【０２５９】
図２Ａは、フェニルセファロースから得られた画分とＯＴＡとを１時間反応させた後で得られたＯＴα面積パーセントを示している。この図は、画分番号５１から６４までＯＴＡ分解活性が増加し、一方、最大リパーゼ／エステラーゼ活性が画分番号６５〜６８に見いだされることを示している。この観測から、オクラトキシン分解活性がＡｍａｎｏ（商標）リパーゼ製品中のリパーゼ／エステラーゼ活性とは明らかに無関係であることが示唆される（これまでは、Ｓｔａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００で、ＯＴＡ分解活性がリパーゼ活性に起因することが示唆されていた）。ＯＴＡを分解するタンパク質が９０％〜１００％緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリシン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で溶出されたことから、フェニルセファロースクロマトグラフィー媒体が明らかにアフィニティー媒体として機能したことが示唆される。ＯＴＡはまた、フェニル基をも含有ので、ＯＴＡ分解酵素は、ＯＴＡまたはここで使用した分離媒体のいずれかのフェニル基に結合可能であるにちがいない。この工程から得られたすべての画分に存在していたリパーゼ／エステラーゼ活性に関して、それは１００％緩衝液Ｂで溶出された。これは予想外ではない。なぜなら、リパーゼ／エステラーゼは、非常に疎水性の基質である脂質およびトリグリセリドの加水分解を行い、したがって、フェニルセファロースのような疎水性マトリックスと密に結合するからである。
【０２６０】
図２Ｂは、ＡＥＸ画分とＯＴＡとを３０分間反応させた後で得られたＯＴα面積パーセントを示している。最大ＯＴＡ活性は、画分番号２６中に見いだされた。しかしながら、それはまた、これらの画分の中で相対リパーゼ活性が最大であった。このことから、ＡＥＸ工程はＯＴＡ分解活性からリパーゼ／エステラーゼ活性を分離できなかったことが示唆されるが、これは、ＯＴＡ分解活性を精製しようとした試みの中の唯一のクロマトグラフィー工程として以前の研究者により使用されたものである（Ａｂｒｕｎｈｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０２６１】
要約すると、図２Ａおよび２Ｂから、リパーゼ／エステラーゼは、既報（Ｓｔａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）で仮定されたようにＯＴＡの分解に関与する酵素でないこと（図２Ａ）、およびＯＴＡ分解活性からのリパーゼ／エステラーゼ活性の分離は、Ａｍａｎｏ（商標）リパーゼからＯＴＡを分解する酵素を精製しようとした試みの中で以前の研究者により実施されたＡＥＸ（Ａｂｒｕｎｈｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）により達成されなかったこと、が示唆される。以前の研究者は、疎水性の差に基づいてタンパク質を分離する疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体と通常みなされるフェニルセファロースクロマトグラフィー媒体が、ＯＴＡ分解活性に関するアフィニティー分離媒体としてここで使用することができることを示さなかった。
【０２６２】
硫酸アンモニウム分画およびそれに続くフェニルセハロース（Ｓｅｈａｒｏｓｅ）を用いたＨＩＣ／アフィニティークロマトグラフィーおよびＡＥＸによる精製の後、ＯＴＡ分解活性を含有した画分は、依然として、いくらかのリパーゼ／エステラーゼ活性を有していた。図４は、図２ＢのＡＥＸ精製手順で得られたＯＴＡ活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果を示している。２つの主バンドＡおよびＢがゲル上に存在することがわかる。質量分析によるそれらのバンドの部分的配列決定およびそれに続くはタンパク質データベースでの相同性探索から、バンドＡは、それぞれ、
１：アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来の予測アセトアミダーゼ／ホルムアミダーゼ４５，０１２Ｄａ（包括度  ２７％）
２：アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）由来のホルムアミダーゼ４５，２７７Ｄａ（包括度  ２４％）
３：アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のホルムアミダーゼ４４，９０７Ｄａ（包括度  ２０％）
に対応する少なくとも３種のタンパク質を含み、かつバンドＢは、
１：アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のグリオキシル酸／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ３９，６０３Ｄａ（包括度  ３４％）
２：アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）由来のアセチルエステラーゼ３２，６４０Ｄａ（包括度  ９％）
３：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のエンド−１，４−β−キシラナーゼＡ前駆体３５，４８６Ｄａ（包括度  １７％）
に対応する少なくとも３種のタンパク質を含むことが示唆される。
【０２６３】
図４に示される結果から、ＯＴＡを分解する酵素は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ホルムアミダーゼであると考えられた。他の同定された酵素は、理論上、ＯＴＡ分解に無関係である。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ホルムアミダーゼのさらなる精製を行った。
【０２６４】
実施例３はオクラトキシンＡ分解酵素の精製を改良した。
さまざまな緩衝液およびさまざまなグラジェントプログラムを用いても、ＨＩＣおよびＡＥＸによる精製のさらなる改良は、達成されなかった。フェニルセファロースを用いた精製は、ＯＴＡ分子がフェニル基を有するので、アフィニティー工程と見なすことが可能であるが、しかしながら、不純物は、高い疎水性を有し、フェニルセファロース媒体に密に結合するので、非常に遅く溶出する（図４Ａ）。オクチルセファロースおよびブチルセファロースを利用した場合、ＯＴＡ分解活性画分は、未吸着フロースルー画分中に見いだされた。このことから、それは、低い疎水性を有し、かつフェニルセパロース（Ｓｅｐａｈｒｏｓｅ）へのその密な結合は、本質的に親和性によるものであり（図４Ａ）、一方、高い疎水性を有する不純物は、フェニルセファロースの場合のように、密に結合して、遅く溶出したことが示唆される（図４Ｂ）。
【０２６５】
硫酸アンモニウム分画（ＡＳ）、フェニルセファロースによるＨＩＣ／アフィニティー（ＨＩＣ１）、ブチルセファロースによるＨＩＣ（ＨＩＣ２）、およびＡＥＸを用いて、手順をさらに改良し、活性画分を濃縮して１０ｋＤａのカットオフのモレキュラーシーブで脱塩した。図４に示された濃縮脱塩された画分５および６をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した（図５）。タンパク質バンドをゲルから単離し、トリプシンで消化した。消化物をＲＰ−ＨＰＬＣで分離し、ＭＳにより解析してタンパク質バンドの同一性を同定した。
【０２６６】
ＭＳの結果から、４工程の精製の後、ＯＴＡ分解活性は、単一バンドに限局されなかったことが示唆され、その代わりに次の酵素が同定された（強度の順）。ホルムアミダーゼ（配列包括度  ５１％）、ホルムアミダーゼ分解産物（プロテアーゼによりもたらされた）（３０％）、細菌アミダーゼとの類似性（２５％）を有する注釈がないＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）タンパク質配列（Ａｎ１４ｇ０２０８０、ＸＰ＿００１４００８３４）、グルタミルトランスペプチダーゼ（１７％）、およびアルドース１−エピメラーゼ（１４％）。これらの結果から、ＯＴＡを分解する可能性が最も高い同定された酵素は、図３および５の結果により示されるように、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ）ホルムアミダーゼであると考えられ、その次に、細菌アミダーゼとの類似点を有する注釈がないＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）タンパク質配列、およびグルタミルトランスペプチダーゼであり、３つのすべてが、ＯＴＡ分子に存在するＣ−Ｎ結合に対して活性を有する。
【０２６７】
実施例４  ＯＴＡを分解する能力を有しうる同定された酵素の特性解析。
図３、４、５、および６の結果に基づいて、２つの推定アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）酵素ホルムアミダーゼおよびグルタミルトランスペプチダーゼならびに仮説タンパク質Ａｎ１４ｇ０２０８０（ＸＰ＿００１４００８３４）に関するさらなる研究を行った。
【０２６８】
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）起源の推定ホルムアミダーゼは、基質特異性を含めてその生化学的性質に関してこれまで特性解析されていないが、それは、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）からクローニングされ、β−ガラクトシダーゼ活性により間接に示唆されるように発現された（Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ホルムアミダーゼは、グリオキシル酸代謝およびジカルボン酸代謝、さらには窒素代謝に関与することが知られている。それは、水の存在下でホルムアミドをギ酸（ホルメート）およびアンモニウムに変換する（ホルムアミド＋Ｈ２Ｏ→ギ酸塩＋ＮＨ３）。ホルムアミダーゼ活性の存在は、以上の材料および方法の節に示されるように、Ｍｅｇａｚｙｍｅギ酸キットを用いてアッセイされた。
【０２６９】
ＡＥＸ工程で得られる画分でこのアッセイを行ったとき、ホルムアミダーゼは、２５〜３０の画分中に観測された（図６Ａ）。これは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）から調製されたＡｍａｎｏ（商標）リパーゼ製品を含めて菌類および菌類調製物が、ホルムアミドをギ酸およびアンモニウムに分解する活性ホルムアミダーゼを有することを示す第１の指標であった。同様に重要なこととして、ホルムアミダーゼ活性は、ＯＴＡ活性を精製するようにデザインされた精製工程を用いて精製されたことから、菌類ホルムアミダーゼはＯＴＡを分解することが示唆される。ホルムアミダーゼ活性に関して試験した同一の画分をＯＴＡの分解に関してアッセイしたとき、変換は、画分２６〜３２で増加した（図６Ｂ）。図６Ａおよび図６Ｂからわかるように、２つの活性は、同一の画分中に存在した。データから、さらに、これまで特性解析されてこなかったＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ホルムアミダーゼまたはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ホルムアミダーゼは、ＯＴＡ分解活性を有するという仮説を立てられた。
【０２７０】
実施例５  Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ホルムアミダーゼ遺伝子を保有するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）形質転換体でのホルムアミダーゼおよびＯＴＡ分解活性の解析
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ホルムアミダーゼ形質転換体をホルムアミダーゼ活性およびＯＴＡ分解活性に関して解析した。表２からわかるように、ホルムアミダーゼ活性は、１５種の形質転換体のうち１２種の形質転換体で検出された。驚くべきことに、明らかに、高いホルムアミダーゼ活性を有するがＯＴＡ分解活性が低いかまたはまったくない形質転換体に見られるように、ホルムアミダーゼＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）は、ＯＴＡを分解可能でなかった。このことから、菌類ホルムアミダーゼは、ＯＴＡ分解活性を有していなくてもよいが、４つの精製工程を介してＯＴＡ活性と一緒に共精製されたことが示唆される。
【０２７１】
興味深いことに、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ホルムアミダーゼ遺伝子をＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ゲノム中に導入する場合のように外来ＤＮＡを組み込むことにより、本発明者らは、形質転換に使用した親株Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）と比較して、未知の機序により、より高いＯＴＡ分解活性を有する形質転換体の作製に成功した。たとえば、形質転換体７＃、２＃、８＃、１１＃、１５＃を参照されたい。１６＃が野生型であったことに留意されたい（親株）。対照は、ブロスを添加しない反応であった。すべてのこれらアッセイに発酵ブロスを使用した。反応混合物は、１０μｌのブロス、５０μｌのＯＴＡ（１μｇ／ｍｌ）、１００μｌのリン酸ナトリウム（６７ｍＭ、ｐＨ７またはｐＨ９）を含有していた。対照では、振盪フラスコ発酵で５日間経過した培養物の１０μｌのブロスを１０μｌの水で置き換えた。反応終了時、１６０μｌのアセトニトリルを添加して反応を停止させ、濾過し、１０μｌをＨＰＬＣ分析のために注入した。
【０２７２】
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）菌のホルムアミダーゼがＯＴＡを分解できなかったという驚くべき発見に基づいて、本発明者らは、ＯＴＡ分解のための第２の候補、すなわち、本明細書でアミダーゼ２と記された仮説Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）タンパク質（Ａｎ１４ｇ０２０８０、ＸＰ＿００１４００８３４）がＯＴＡ分解活性を有するかを確認するさらなる研究を行った。
【０２７３】
実施例６  推定アミダーゼ２遺伝子発現プラスミドの構築
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の推定アミダーゼ２遺伝子は、４８０アミノ酸のアミダーゼタンパク質（配列番号１）をコードする。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アミダーゼ２遺伝子に対する組換え発現プラスミドを作製するために、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＵＶＫ１４３株から得られたゲノムＤＮＡ鋳型を用いたＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  ＰＣＲ反応で、２つのプライマーＧＧＡＧＡＴＣＴＡＴＣＡＴＧＧＴＣＣＧＣＣＧＡＡＴＴＧおよびＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＴＴＡＣＧＴＧを使用された（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９：７３８−７４３，１９９３）。２つのプライマーを用いて、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、および７２℃で１分間を３０サイクルで、ＰＣＲ反応を行った。７２℃で最終の伸長を５分間行い、反応系を４℃に冷却した。得られたＰＣＲアンプリコンのコード領域のヌクレオチド配列を、Ｈｉｓタグを含めずに、配列番号２として列挙する。ＱｉａｇｅｎスピンカラムでＰＣＲ断片を精製した。それを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで消化し、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで消化されたｐＧＡＰＴプラスミドベクター（たとえば、米国特許第６，４２６，４１０号明細書を参照されたい）中にクローニングした。得られたプラスミドｐＧＡＰＴ−アミダーゼ２（図７に示される）が、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモーターとＡ．ツビンゲンシス（Ａ．ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）グルコアミラーゼターミネーターとの間に挿入されたＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アミダーゼ２を含む組換え遺伝子を有することを、ＤＮＡ配列決定により確認した。対応するコードタンパク質配列は、配列番号４に示される。これは、タンパク質精製を支援するめにタンパク質のｃ末端に６個のヒスチジン残基が追加されたことを除いて、配列番号１と同等である。
【０２７４】
実施例７  組換えアミダーゼ２産生株の構築
ＰＥＧ媒介プロトプラスト融合形質転換プロトコルを用いて、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のＡＰ４株（Ｂｅｒｋａ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ８６：１５３−１６２，１９９０）をｐＧＡＰＴ−アミダーゼ２プラスミドで形質転換した。形質転換プロトコルは、トリコデルマ・ハージアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）由来の溶解酵素（Ｓｉｇｍａ，Ｌ１４１２）を用いて、Ｃａｍｐｂｅｌｌ法（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｔ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６（１９８９を参照されたい））の変法を利用した。１００種超の形質転換体を取得し、３０種の形質転換体をＭＭプレートで選択した。最初に、対照ＡＰ４親株および１５種の形質転換体を選択してＣＭＡプレートで増殖させ、そして、ＣＭＡプレートの菌糸および胞子の両方を含有する菌糸寒天プラグを、３０ｍｌの培養培地を含有する振盪フラスコに移した。形質転換体を２８℃で６日間増殖させた。対照ＡＰ４株および１５種すべての形質転換体からの菌糸ペレットを水で少なくとも２回洗浄した。菌糸ペレットをＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｙ細胞溶解試薬（Ｓｉｇｍａ，Ｃ４４８２）中に懸濁させた。細胞内タンパク質を室温で２時間抽出した。懸濁液を遠心沈降し、抽出された細胞内タンパク質を含有する１５μｌの上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて解析した（図８）。培養ブロスをマイクロ遠心分離機で１０分間遠心沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて１５μｌの上清（細胞外タンパク質）を解析した（図８）。
【０２７５】
【表４】
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【０２７６】
表３は、３０ｍｌの媒体の入った２５０ｍｌシリコナイズフラスコ中でアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）およびその形質転換体を増殖させるために使用した媒体（１リットルあたり）を示している。最初に、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株をＣＭＡプレートで３〜５日間増殖させ、そして２ｃｍ２＋をフラスコに移して３０℃で５日間増殖させた。野生型（対照株または親株６２０）では、０．５ｍｇ／ｍｌのウリジンを追加した。
【０２７７】
【表５】
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【０２７８】
【表６】
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【０２７９】
図８．アミダーゼ２遺伝子を保有するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の細胞内タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。アミダーゼ２のタンパク質バンドを矢印により示した。Ｍ．分子マーカー、ＡＰ４、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の親株。形質転換体には１〜１５の番号を付した。
【０２８０】
図９は、アミダーゼ２遺伝子を保有するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の細胞外タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。アミダーゼ２のタンパク質バンドは、矢印により示される。アミダーゼ２バンドの上方の他の主要バンドは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）により分泌されたα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼであった。ゲルに充填したサンプルは、さまざまな形質転換体の発酵ブロスであった。
【０２８１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された推測アミダーゼ２バンドが実際にアミダーゼ遺伝子の産物であることを確認するために、バンドを切り取り、ゲル内消化によりトリプシンで消化した。消化物をＲＰ−ＨＰＬＣにより分離し、質量分析により解析した。これにより、推定アミダーゼ２配列（配列番号１）（図１８Ａ）中に見いだされる４つのアミノ酸配列が明らかにされた。同定された４つの配列は、以下のとおりである。
１．ＥＡＬＱＮＧＹ、
２．ＡＬＰＡＧＥＶＬＧＳＹ、
３．ＧＡＧＰＬ、
４．ＳＶＧＰＱＡＰＬ。
【０２８２】
実施例８  ＯＴＡ分解および生化学的触媒パラメーターに関する組換えアミダーゼ２の特性解析
図１０に示されるように、推定タンパク質コード遺伝子（アミダーゼ２）を保有するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の１５種の形質転換体＋親株（ｗｔ）の細胞内画分および細胞外画分（ブロス）の両方を、ＯＴＡを分解するそれらの能力に関してアッセイした。図１０は、驚くべきことに、Ｇｅｎｂａｎｋ（Ａｎ１４ｇ０２０８０、受託番号ＸＰ＿００１４００８３４）から得られた仮説タンパク質コードＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）遺伝子が、ＯＴＡ分解活性を有する活性酵素をコードし、この活性酵素が、細胞内および細胞外の両方に見いだされることを示している。細胞内画分または細胞外画分（ブロス）と共にインキュベートした後に検出可能なＯＴＡが残存しないので（すなわち、２ｐｂｂの検出可能レベル未満）、最良の形質転換体が、形質転換体３、４、７、１１、１３、および１４であることがわかる。親株（ｗｔ）Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）と比較して、形質転換体８、１０、および１５はまた、かなり高いＯＴＡ分解活性を有していた。
【０２８３】
組換えアミダーゼ２は、少なくともｐＨ３〜９でＯＴＡ分解活性であった。図１１は、ｐＨ７．０で酵素活性が最も高く、続いて、ｐＨ６および８、ｐＨ５および９であることを示している。
【０２８４】
酵素が追加されていない対照と比較して、８０℃で５〜３０分間プレインキュベートし後に８０％超の活性が残存していたので、組換えアミダーゼ２は、図１２からわかるように明らかに熱安定性であった。５μｌの酵素と４５μｌの６７ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）との反応混合物を８０℃で０〜３０分間インキュベートし、その後、さらなる５０μｌのリン酸緩衝液および２５μｌの１μｇ／ｍｌ  ＯＴＡを添加し、３０℃で６０分間インキュベートした。０．２％酢酸（ｖ／ｖ）を含有する１３０μｌのアセトニトリルを添加することにより、反応を停止させた。反応混合物を濾過し、ＨＰＬＣ分析のために注入した（１０μｌ）。Ｃｔｒｌは、アミダーゼが追加されていない対照であった。
【０２８５】
さらにまた、組換えアミダーゼ２は、ｐＨ６〜９、７０℃でかなり安定であった。安定性は、ｐＨの減少に伴って減少した（図１３）。ｐＨ７．０および３０℃で活性をアッセイした。プレインキュベーション混合物は、５μｌのアミダーゼ２混合物（１５５μｇタンパク質／ｍｌ）、４５μｌの６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３、４、５、６、７、８、および９）を含有していた。サンプルを７０℃で３０分間プレインキュベートした。３０℃に冷却した後、エタノール中２μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ  ＯＴＡおよび８０μｌの０．２Ｍ  Ｍｏｐｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）を添加し、反応系を３０℃で６０分間インキュベートした。０．２％ＨＡＣを含有する１３０μｌのアセトニトリルを添加することにより、反応を停止させ、濾過し、そして残存ＯＴＡをモニターするために５μｌの注入を用いてＲＰ−ＨＰＬＣに注入した。
【０２８６】
実施例９  アミダーゼ２遺伝子を保有するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の発酵ブロスからの組換えアミダーゼ２ｍａｔの精製
高ＯＴＡ活性を有する形質転換体１３のブロスを用いて（図１０）、硫酸アンモニウム分画、フェニルセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、ブチルセファロースを用いたＨＩＣ、および以下で説明されるＡＥＸにより、組換えアミダーゼ２ｍａｔを精製した。
【０２８７】
１）（ＮＨ４）２ＳＯ４分画。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アミダーゼ２遺伝子を保有する４０ｍｌのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ブロスに、（ＮＨ４）２ＳＯ４を、撹拌により、４０％飽和になるように添加した。３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を捕集し、（ＮＨ４）２ＳＯ４を、撹拌により、６０％飽和になるように添加し、溶液を再び遠心分離した。４０〜６０％（ＮＨ４）２ＳＯ４飽和での沈殿物に対応するペレットを、１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する４０ｍｌの５０ｍＭトリシン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に溶解させ、０．２２μｍフィルターで濾過した。
【０２８８】
２）疎水性相互作用／アフィニティークロマトグラフィー。以上の工程から得られた濾過サンプルを、フェニルセファロースＦＦカラム（２．６×１０ｃｍ）に充填した。１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有するトリシン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を用いて洗浄を行った後、１Ｍ〜０Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４の５０ｍＭトリシン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）のリニアグラジエントを用いて、１０ｍｌ／分の流量で、チューブ１つあたり１０ｍｌで、活性画分を溶出させた。Ａｅｋｔａ精製システムを用いて精製を達成した。
【０２８９】
３）陰イオン交換クロマトグラフィー。活性画分をプールし、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５（緩衝液Ａ）で平衡化されたＰＤ１０カラムで脱塩した。脱塩されたサンプルを緩衝液Ａ（１０ｍｌ／分）で平衡化されたＳｏｕｒｃｅ  Ｑ１５カラムに適用した。カラムを緩衝液Ａで洗浄し、結合されたタンパク質を、緩衝液Ａ中の０〜１Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出させた。グラジエント溶出時、５ｍｌの画分を捕集した。活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ（図１４Ａ）、アミダーゼ２ｍａｔが基本的には均一になるまで精製されたことが示唆される。活性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで４９ｋＤａよりもわずかに低い分子質量を有するタンパク質バンドに関連付けられた（図１４）。Ｍａｌｄｉ−ｔｏｆ測定による質量分析では、このタンパク質バンドは、４７２１４Ｄａ（±２％）の質量を有しうることが示唆される（図１４Ｂ）。画分１２のＮ末端配列決定では、アミダーゼ２ｍａｔのＮ末端がＳＴＤＥＡＫＶＴＩ（配列番号３３）で開始されたことが示唆される。６個のヒスチジン残基を含めて４８０ａａのアミダーゼ２の全長は、５１，９８３Ｄａの分子質量を有すると推定され、一方、そのＣ末端に６個のヒスチジン残基を含むＮ末端４２ａａトランケートアミダーゼ２は、４７，３３８Ｄａの質量を有すると推測される。これらのことから、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ブロス中に分泌されたアミダーゼ２、すなわち、アミダーゼ２ｍａｔは、アミダーゼ２ｓｉｇ中のＡｌａ−Ｓｅｒのペプチド結合間で切断する培養ブロス中のシグナルペプチダーゼまたは他のペプチダーゼによりプロセシングされたアミダーゼ２であることが示唆される。
【０２９０】
実施例１０  アミダーゼ２の基質特異性
ｋｍ／Ｖｍの決定：
アミダーゼ２ｍａｔのＡＥＸ工程で得られた画分を用いた場合、ＯＴＡ分解酵素のＫｍおよびＶｍの速度定数は、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ計算法を用いて、それぞれ、０．２９μＭ／分および１３μＭであった。
【０２９１】
オクラトキシンＢの分解：
ＡＥＸ後に得られたアミダーゼ２ｍａｔの酵素溶液を、オクラトキシンＢに対して、１時間にわたり、最適条件下、同一濃度で、試験した。オクラトキシンＢでの分解速度は、ＯＴＡと比較して８％であった。
【０２９２】
実施例１１  純粋アミダーゼ２ｍａｔのＯＴＡ分解活性
アミダーゼ２遺伝子を保有するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の発酵ブロスから精製されたアミダーゼ２ｍａｔのオクラトキシンＡ（ＯＴＡ）分解活性を、その濃度の関数として、図１５に示す。ＯＴＡの分解はアミダーゼ２ｍａｔ濃度依存性であることが、図１５からわかる。また、１６０ｎｇ／ｍｌのアミダーゼ２ｍａｔ濃度では、３０分後、ＯＴＡは８３％低減したことがわかる。図１５の直線領域から計算されたアミダーゼ２ｍａｔの比活性は、１μｇ／ｍｌ反応混合物のＯＴＡ濃度、ｐＨ７．０および４０℃では、タンパク質１ｍｇあたり１分間に加水分解されるＯＴＡ換算で９００ナノモルであった。材料および方法の節で説明したように、図１５に対する反応を０．１Ｍｏｐｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）および４０℃で３０分間行い、その後、０．２％の酢酸を含有する等体積のアセトニトリルを添加することにより停止させ、そしてＣ１８カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣで解析した。
【０２９３】
実施例１２  Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）で見いだされる細胞内アミダーゼ２と細胞外アミダーゼ２との間のＣａ２＋に対する感受性の差。
Ａｍａｎｏ（商標）リパーゼ製品から、またはアミダーゼ２遺伝子を保有するトランスジェニックＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のブロスから、精製されたアミダーゼ２（すなわち、アミダーゼ２ｍａｔ）は、両方とも、そのＯＴＡ加水分解活性が８ｍＭ  ＣａＣｌ２により約４０％阻害されるが（図１６）、トランスジェニックＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のアミダーゼ２の細胞内画分（アミダーゼ２ｓｉｇ）は、８ｍＭ  ＣａＣｌ２ではＣａＣｌ２によりそれほど阻害されないことが観測された（図１７）。これらの結果から、アミダーゼ２のＮ末端の喪失は、Ｃａ２＋阻害への感受性を引き起こすことが示唆される。Ｃａ２＋による阻害は、等モル量のＥＤＴＡを含む二価キレート化剤の添加により克服された。また、Ａｍａｎｏ（商標）リパーゼ製品のＯＴＡ分解活性は、ＥＤＴＡ感受性であることが知られている。この実施例からは、二価イオンを含有する系でのアミダーゼ２ｍａｔの使用を、ＥＤＴＡなどのキレート化剤の添加により支援しうることが示唆される。クエン酸および他の有機酸たとえばプロピオン酸は、飼料添加物として広く使用されおり、二価イオンまたは三価イオンをキレート化して、それらによるアミダーゼ２ｍａｔ阻害を軽減することが可能である。一方、余分のＥＤＴＡはまた、組換えアミダーゼ２ｍａｔを阻害した（データは示されていない）。これらの結果から、アミダーゼ２ｍａｔは、ＯＴＡの解毒に使用することができるが、二価イオンまたは三価金属イオンに対しておよびＥＤＴＡのようなキレート化剤に対して感受性があるので、ある程度の制約を受けることが示唆され、一方、アミダーゼ２ｓｉｇは、二価イオンまたは三価金属イオンに対しておよびＥＤＴＡのようなキレート化剤に対してそれほど感受性がないことが見いだされたことから、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ブロスで見いだされる分泌された、プロセシングされた、または成熟したアミダーゼ２（すなわち、アミダーゼ２ｍａｔ）ではなく全長のアミダーゼ２の重要性が示唆される（以下を参照されたい）。
【０２９４】
実施例１３  Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の細胞内画分（アミダーゼ２ｓｉｇ）から抽出されたアミダーゼ２によるＯＴＡの分解。
この実施例では、感受性の低い形態のアミダーゼ２すなわちアミダーゼ２ｓｉｇを使用することの利点が示される。図１７からわかるように、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２または２０ｍＭ  ＥＤＴＡは、アミダーゼ２ｍａｔと比較してアミダーゼ２ｓｉｇに対して阻害を示すさなかった（図１６）。これは、ＯＴＡを解毒するうえで、キレート化剤を含む添加物でアミダーゼ２ｓｉｇを使用する明確な利点を提供する。反応には、６０μｌのｍｏｐｓ−ＮａＯＨ（０．２Ｍ、ｐＨ７．０）、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、アミダーゼ遺伝子を保有するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）細胞から抽出されたアミダーゼ２ｓｉｇ（０．４６μｇのタンパク質）、２μｌの２５μｇ／ｍｌ  ＯＴＡ、および１２０μｌの最終体積とするのに必要な水が含まれていた。反応を３７℃で３０分間行い、０．２％の酢酸を含有する１５０μｌのアセトニトリルを添加することにより停止させた。５μｌの注入でＣ１８カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより、ＯＴＡおよびその産物ＯＴα（＝ＯＴα）を分析した。陽性対照（ＰＣ）は、緩衝液、アミダーゼ、およびＯＴＡ以外の添加物を含有していなかった。ブランクは、緩衝液およびＯＴＡだけを含有していた。
【０２９５】
実施例１４  Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の細胞内画分（アミダーゼ２ｓｉｇ）から抽出されたアミダーゼ２ｓｉｇによるトウモロコシ粉中およびＤＤＧＳ（可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣）中のＯＴＡの分解。
トウモロコシは、ＯＴＡの主要な担体であり、さらに、バイオエタノール生産では、それは、ＤＤＧＳ中に担持され濃縮されうる。トウモロコシおよびＤＤＧＳは、飼料成分として広く使用される。ＤＤＧＳ中のマイコトキシンレベルは、飼料に添加することができるＤＤＧＳの量を制限する通常の因子である。ここでの実施例は、トウモロコシ粉中およびＤＤＧＳ中のＯＴＡを分解するアミダーゼ２ｓｉｇの能力を示す。
【０２９６】
トウモロコシ粉の場合、５０ｍｇのトウモロコシ粉を、２１０μｌの水、８μｌのＯＴＡ（２５μｇ／ｍｌ）、および２０μｌのアミダーゼ２ｓｉｇ（３．１μｇのタンパク質）に添加し、混合し、そして３７℃で２２時間インキュベートした。ＯＴＡ濃度は、開始時の８００ｐｐｂから終了時の１４ｐｐｂに減少した。ＨＰＬＣによるＯＴＡ分析は、以上の材料および方法の節に説明されている。
【０２９７】
ＤＤＧＳの場合、ＮａＯＨで６．７にｐＨ調整された１０ｍｌの水中に１ｇを懸濁させた。２１０μｌのこのスラリーに８μｌのＯＴＡ（２５μｇ／ｍｌ）および２０μｌのアミダーゼ２ｓｉｇ（３．１μｇのタンパク質）を添加し、混合し、そして３７℃で２２時間インキュベートした。ＯＴＡ濃度は、開始時の８００ｐｐｂから終了時の５ｐｐｂまで減少した。ＨＰＬＣによるＯＴＡ分析は、以上の材料および方法の節で説明した。
【０２９８】
実施例１５  アミダーゼ２ｍａｔによるミルク中のＯＴＡの分解。
ミルクやチーズをはじめとする多くの食品は、ＯＴＡで汚染される可能性があることが知られている。この実施例では、アミダーゼ２ｍａｔを用いてミルク中のＯＴＡの分解を試験する。
【０２９９】
０．２２μｇのタンパク質を含有する、Ａｒｌａ  Ｆｏｏｄｓ  Ａｍｂａ（Ａａｒｈｕｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）製の０．１５ｍｌのライトミルク（１．５％脂肪、タンパク質３．４ｇ、炭水化物４．７ｇ、カルシウム１２０ｍｇ、リン９５ｍｇ、１００ｍｌ中）、３μｌのＯＴＡ（２．５μｇ／ｍｌ）、７．５μｌの精製アミダーゼ２ｍａｔ（アミダーゼ２遺伝子を保有するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のブロスに由来する）を混合し、４０℃で２．５時間反応させた。ＯＴＡは、開始時の４７ｐｐｂから２．５時間インキュベーション後の検出不能レベル（＜２ｐｐｂ）に減少した。ＨＰＬＣによるＯＴＡ分析は、以上の材料および方法の節で説明した。
【０３００】
実施例１６  トウモロコシ粉中のＯＴＡの解毒におけるアミダーゼ２ｍａｔ
１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中の反応混合物（Ｃ１〜３）には、６０ｍｇのトウモロコシフラワー（ｆｌｏｗｅｒ）、２００μｌのＭｏｐｓ−ＮａＯＨ（０．２Ｍ  ｐＨ７．０）、４０μｌのアミダーゼ２混合物（これは、アミダーゼ２遺伝子を有するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）形質転換体のブロス３、４、７、８、１０、１１、１３、１４、および１５の同体積の混合物であった）、２０μｌのＯＴＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ）が含まれていた。３つの成分の全体積は、２６０μｌであり、最終ＯＴＡは、３８μｇ／ｍｌまたは３８ｐｐｍ（ｐｐｍ、百万分率）であった。対照：対照（Ｃ−４〜６）のチューブは、アミダーゼ調製物（ブロス）が水で置き換えられたこと以外はＣ１〜３と同一であった。
【０３０１】
２０時間にわたりスケーキング（ｓｋａｋｉｎｇ）しながら３０℃で反応を行い、その後、０．２％酢酸を含有する等体積のアセトニトリル２６０μｌの添加により反応を停止させ、ＯＴＡを抽出した。遠心分離および濾過を行った後、濾液をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣの結果から、残留ＯＴＡが検出できなかったことが示唆されることから（２ｐｐｂ未満）、アミダーゼ２ｍａｔは、トウモロコシ粉中のＯＴＡを３８ｐｐｍから２ｐｐｂ未満に低減させうることが示唆される。
【０３０２】
実施例１７  トウモロコシ−ダイズ系飼料中のＯＴＡの解毒におけるアミダーゼ２ｍａｔ。
ＯＴＡで汚染されたダイズ−トウモロコシ系飼料（その組成は表３に挙げられている）を用いたアミダーゼ２ｍａｔの試験は、トウモロコシ粉を用いた試験とまったく同じであった。すなわち、チューブＳ１〜３（実験）にはブロスが入っており、一方、チューブＳ５〜６（対照）ではブロスを水で置き換えた。２０時間インキュベーション後、ＯＴＡレベルは、３８ｐｐｍから６．６ｐｐｍに減少、すなわち、１／６に減少または８２％減少した。
【０３０３】
【表７】
2013540430.tif 000010
【０３０４】
実施例１８  アミダーゼ２の結晶構造の解析
表４に示されるようにアミダーゼ２の１５種の結晶を得た。
【０３０５】
結晶ＡＭ７およびＡＭ１５のＸ線回折を行い、アミダーゼ２（ａａ４５〜４８０）のこれらの２種の結晶の構造を２．５Åの分解能で解析した。
【０３０６】
アミダーゼ２は、図２０に示されるＴｉｍバレル構造に類似した構造および図２１に示される活性部位を有することが示された。ＡＭ７結晶セットで解析された結晶構造のデータのまとめを以下に示す。
【０３０７】
【表８】
2013540430.tif 000011
【０３０８】
Ｐｈａｓｅｒを用いて５つの最も類似した構造のアンサンブルを解析することにより、構造解析を行った。
【０３０９】
アミダーゼ２（配列番号１）の活性部位は、少なくとも次の残基、すなわち、Ｈｉｓ１１１、Ｈｉｓ１１３、Ｈｉｓ１９１、Ｌｙｓ２４６、Ｈｉｓ２８７、Ｈｉｓ２８９、Ｈｉｓ３０７、Ａｓｐ３７８、およびＶａｌ２５３を含むことが判明した。それは、触媒用および／構造用として少なくとも２つの金属イオンに収容することができ、いわゆる二核金属中心を形成する。
【０３１０】
四量体の形態で存在する酵素の１つの単量体の座標を図２２に示す。
【０３１１】
【表９】
2013540430.tif 000012
【０３１２】
【表１０】
2013540430.tif 000013
【０３１３】
実施例１９。トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）中での菌類種グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）Ｍ１．００１由来およびメタリジウム・アニソプリアエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）ＡＲＳＥＦ２３由来のアミダーゼの発現。
グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）Ｍ１．００１由来およびメタリジウム・アニソプリアエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）ＡＲＳＥＦ２３由来のアミダーゼを発現するために、両方の遺伝子をＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中で発現させるべくコドン最適化された配列として合成し、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によりｐＤｏｎｏｒ２２１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中にクローニングした。精製目的で６×Ｈｉｓコドンを各遺伝子の３’コード領域に追加した。トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）中で両方アミダーゼの発現を可能にするために、それらのコード配列を、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ組換え反応を介して、Ｇａｔｅｗａｙ適合対象ベクターｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３（国際公開第２０１０／１４１７７９Ａ１号パンフレットおよび国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／５７５３１号明細書に説明されている）中にクローニングした。このベクターは、対象の遺伝子の強い誘導発現を可能にするＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来のプロモーター領域およびターミネーター領域と、アセトアミドを唯一の窒素源としてまたはウリジンの不在下でまたはその両方のいずれでも形質転換体の増殖を引き起こすアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳおよびｐｙｒＧ選択マーカーと、菌類細胞内で非染色体プラスミドの維持を可能にするＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）テロメア領域と、を含有する。ｃｂｈＩプロモーター領域およびｃｂｈＩターミネーター領域は、バクテリオファージλ系特異的組換え部位ａｔｔＲ１、ａｔｔＲ２によりフランキングされた、クロラムフェニコール耐性遺伝子ＣｍＲおよび致死性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子（ｃｃｄＢ）により分離される。そのような構成は、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ組換え反応を介して正しい向きでｃｂｈＩ調節エレメントの制御下に対象の遺伝子を含有する組換え体の直接選択を可能にする。
【０３１４】
各アミダーゼ遺伝子のｐＥｎｔｒｙクローンと対象ベクターｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３との間のＬＲ組換え反応は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのプロトコルに従って、ＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ（商標）  ＩＩ酵素を用いて行った。供給業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の説明どおり、産生された組換え産物をＥ．ｃｏｌｉ  Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５αに導入して形質転換させ、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２×ＹＴ寒天プレート（１６ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）、１０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１６ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ寒天（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ））上で、発現構築物ｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−アミダーゼＧ．グラミニコラ（Ｇ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）およびｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−アミダーゼＭ．アニソプリア（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａ）を含有するクローンを選択した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２×ＹＴ培地で細菌培養物の増殖を行った後、単離されたプラスミドを制限分析に付し、適正な制限パターンのクローンを、４つの主要なセルラーゼｃｂｈＩ、ｃｂｈＩＩ、ｅｇｌＩ、ｅｇｌＩＩが欠失したトリコデルマ・リーエイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｅｉ）２８３０ｐｙｒＧ陰性株（国際公開第２０１０／１４１７７９Ａ１号パンフレット）の形質転換に使用した。最終発現プラスミドｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−アミダーゼＧ．グラミニコラ（Ｇ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）およびｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−アミダーゼＭ．アニソプリアエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）を図２３〜２５に示す。
【０３１５】
記載のごとく、わずかな変更を行ってＰＥＧプロトプラスト法を用いて、０．５〜２μｇの各発現プラスミドをＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中に導入して形質転換を行った。プロトプラスト調製のために、１５０ｒｐｍで振盪しながら、トリコデルマ最少培地ＭＭ（２０ｇ／Ｌグルコース、１５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．５、５ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．６ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．６ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｍｌ  １０００ＸＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素溶液｛５ｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、３．７ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ｝）中、２４℃で、胞子を１６〜２４時間増殖させた。発芽胞子を遠心分離により収集し、菌類細胞壁の溶解のために５０ｍｇ／ｍｌのＧｌｕｃａｎｅｘ  Ｇ２００（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）溶液で処理した。Ｐｅｎｔｔｉｌａｅら［Ｇｅｎｅ  ６１（１９８７）１５５−１６４］の説明どおり、標準的方法によりプロトプラストのさらなる調製を行った。
【０３１６】
一般的には、２００μｌの全体積中に約１μｇのＤＮＡと１〜５×１０７個のプロトプラストとを含有する形質転換混合物を２ｍｌの２５％ＰＥＧ溶液で処理し、２体積の１．２Ｍソルビトール／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５／１０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液で希釈し、１Ｍソルビトールと２０ｍＭアセトアミドとを含有する３％選択トップアガロースＭＭ（（ＮＨ４）２ＳＯ４をアセトアミドで置き換えた以外に以上に挙げたのと同一の最少培地）と混合し、そしてアセトアミドを含む２％選択アガロース上に注加した。プレートを２８℃で５〜７日間インキュベートし、その後、形質転換体を増殖させて胞子形成を開始した。
【０３１７】
形質転換プレートから収集された胞子混合物（１０６個の胞子／ｍｌ）を用いて、産生培地（１Ｌあたり）、すなわち、グリシン産生培地（４．７ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、３３ｇ／Ｌ  １，４−ピペラジンビス（プロパンスルホン酸）、ｐＨ５．５、６．０ｇ／Ｌグリシン、５．０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｍｌ／Ｌ  ４００×Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素、２０ｇ／Ｌグルコース、６．５ｇ／Ｌソホロース）の入った振盪フラスコに接種した。対照として、１０ｍＭウリジンの存在下であること以外は同一条件下で、Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）レシピエント２８３０株を増殖させた。３０℃および２００ｒｐｍで５日発酵させた後、培養物を収集し、細胞外抽出物および細胞内抽出物の両方を酵素分析に付した。
【０３１８】
実施例２０。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＩＣＣ＃２４４５株中でのアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アミダーゼの発現
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中でＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来の推定アミダーゼ遺伝子を発現させるために、後続のＧａｔｅｗａｙ法によるクローニングのためのａｔｔＢ１およびこａｔｔＢ２部位を５’末端および３’末端に含む遺伝子特異的プライマーを用いて、アミダーゼコード配列をアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ４０ゲノムＤＮＡ（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＦＧＳＣ，ＵＳＡから入手した）から増幅した。それに加えて、リバースプライマーは、発現タンパク質の精製を容易にするために、６ｘＨｉｓをコードするトリプレットを含有する。
【０３１９】
以下のプライマーセット、すなわち、
フォワード
５’  ＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＣＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＣ３’
リバース
５’  ＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＡＴＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＧＣ  ３’
を使用した。供給業者により推奨された標準的条件下で高忠実度Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  ＯＹ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）により、すべてのＰＣＲ反応を増幅させた。０．８％のアガロースゲル上で増幅ＤＮＡ断片を分離した後、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔ  ＰＣＲ精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ  ＆  ｃｏ．ＫＧ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製し、供給業者の推奨に従ってｐＤｏｎｏｒ２２１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で１５０ｎｇを組み換えた。５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２ｘＹＴ寒天プレート上で、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アミダーゼを含有するｐＥｎｔｒｙクローンを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αコロニーを選択した。細菌細胞から単離されたプラスミドをその制限消化パターンによりインサートの存在に関して解析し、ＡＢＩ３１００配列アナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列解析により検査した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のプロトコルに従って、後続のＧａｔｅｗａｙ  ＬＲ反応を介して、米国特許第０７４５９２９９号明細書に記載の対象ベクターｐＲＡＸｄｅｓｔ２中にクローニングすべく、得られたｐＥｎｔｒｙ−アミダーゼＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）プラスミドを使用した。供給業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の説明どおり、形成された組換え産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５αに導入して形質転換させ、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ｘＹＴ寒天プレート（１６ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）、１０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１６ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ寒天（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ））上で、発現構築物ｐＲＡＸ−アミダーゼＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）（図２５）を含有するクローンを選択した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ｘＹＴ培地中で細菌培養物の増殖を行った後、単離されたプラスミドを制限分析に付し、続いて、ＡＢＩ３１００配列アナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定を行った。細菌配列以外に、最終発現プラスミドｐＲＡＸ２−アミダーゼＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモーターおよびターミネーターの制御下のＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アミダーゼコード領域と、選択マーカーとしてアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｐｙｒＧ遺伝子と、菌類細胞内での自律複製のためのＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＡＭＡ１配列と、を含有する。
【０３２０】
０．５〜２μｇのこのプラスミドを、当技術分野で公知のまたは米国特許第０７４５９２９号明細書に記載の通常の形質転換手順を用いて、Ｇｅｎｅｎｃｏｒにより開発されたＡ．ニガー・バル・アワモリ（Ａ．ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ  ａｗａｍｏｒｉ）ＧＩＣＣ＃２４４５株に導入して形質転換させた。この株は、内因性グルコアミラーゼｇｌａＡ遺伝子が欠失しており、ウリジン原栄養性に関する形質転換体の選択を可能にする突然変異をｐｙｒＧ遺伝子中に有する。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）形質転換体を３７℃で４〜５日間にわたりＭＭ培地（窒素源としてアセトアミドの代わりに１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌを使用した以外は、Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）形質転換に使用したのと同一の最少培地）上で増殖させ、さまざまな形質転換プレートの胞子の全集団（１０６個の胞子／ｍｌ）を用いて、産生培地（１Ｌあたり）、すなわち、１２ｇトリプトン、８ｇソイトン、１５ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１２．１ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、２．１９ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍｌ  Ｔｗｅｅｎ８０、１５０ｇマルトース、ｐＨ５．８の入った振盪フラスコに接種した。３０℃および２００ｒｐｍで５日発酵させた後、培養物を収集し、細胞外抽出物および細胞内抽出物の両方を酵素分析に付した。
【０３２１】
実施例２１。オクラトキシン分解用の３種の追加の菌類由来のアミダーゼ
グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）（ＧＭＧＭ）、メタリジウム・アニソプリアエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）、およびアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に由来する推定アミダーゼ配列はすべて、オクラトキシンＡを分解した。
【０３２２】
表６は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）で細胞内発現された、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、メタリジウム・アニソプリアエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）、およびアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に由来する３つの菌類アミダーゼの活性を示している。基質としてＯＴＡを用いた反応混合物は、７５μｌのリン酸液（６７ｍＭ、ｐＨ７）と、５μｌのＯＴＡ（２．４μｇ／ｍｌ）と、２０μｌの細胞内無細胞画分と、で構成した。反応を２３℃で１７時間行い、０．１５ｍｌのアセトニトリルを添加することにより停止させ、そして５μｌの注入量でＨＰＬＣにより解析した。
【０３２３】
【表１１】
2013540430.tif 000014
【０３２４】
表中のデータから、Ｇ．グラミコラ（Ｇ．ｇｒａｍｉｃｏｌａ）由来のアミダーゼは、オクラトキシンに対して最も高い活性を有し、一方、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来のアミダーゼは、この基質に対してより低い活性を有することが示唆される。
【０３２５】
実施例２２  推定アミダーゼ配列の配列比較
配列比較は、デフォルトパラメーター（ギャップ生成ペナルティー−１０、ギャップ伸長ペナルティー０．１）を用いてＡｌｉｇｎＸ  ＶｅｃｔｏｒＮＴＩプログラム（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によりポリペプチド配列の全長にわたり行った。表７に見られるように、推定アミダーゼは、低い全相同性を有すると思われる。しかしながら、図２６からわかるように、配列番号５〜１１、１３、１４、および１５で示されるポリペプチドはすべて、アミダーゼ２（配列番号１および３）と同一のモチーフを有する。
【０３２６】
Ｍｕｌｔａｌｉｎバージョン５．４．１（Ｆ．ＣＯＲＰＥＴ，１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：１０８８１−１０８９０）を用いて、配列のアライメントを行った。使用したパラメーター：ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップ加重：１２、ギャップ長加重：２、コンセンサスレベル：高＝９０％  低＝５０％、コンセンサス記号：！はＩＶのいずれかであり、＄はＬＭのいずれかであり、％はＦＹのいずれかであり、＃はＮＤＱＥＢＺのいずれかである。
【０３２７】
配列の説明およびそれらのウェブ受託番号（括弧内）：
さらに、実施例２１（表６）に示されるように、配列番号１３〜１５は、オクラトキシン分解活性を有する。
【０３２８】
【表１２】
2013540430.tif 000015
【０３２９】
１１個の配列の共通配列モチーフは、以下のコンセンサスを有する。
１）ｌ／ｍ−Ｐ−Ｇ−ｌ／ｍ−ｗ／ｉ−Ｄ−ｃ／ｖ／ｓ／ａ−Ｈ−ｘ−Ｈ−ｆ／ｙ／ｌ−ｘＧ〔式中、２個のＨｉｓ残基は、活性部位上に存在する〕、
２）Ｇ−ｙ／ｆ−Ｔ、
３）Ｇ−ｔ／ａ／ｓ／ｖ／ｒ−ｉ／ｆ／ａ−ｘ−Ｇ−Ｐ、
４）Ｇ−Ｈ−ｇ／ｓ−Ｄ〔式中、Ｈｉｓ残基、活性部位上に存在する〕、
５）Ｄ−Ｇ−ｖ／ｅ−ｘ−ｅ／ｄ／ｇ−Ｃ−ｘ−ｘ−ａ／ｇ／ｔ−ｖ／ａ−Ｒ−ｘ−ｑ／ｍ／ａ−ｌ／ｉ／ｖ−Ｒ−ｒ／ｈ／ｃ−ｇ／ｎ−Ａ−ｋ／ｒ／ｔ／ｅ／ｄ−ｘ−Ｉ−Ｋ〔式中、Ｌｙｓ残基は、活性部位上に存在する〕、
６）Ｇ−Ｇ−Ｖ−ｌ／ｍ／ｖ／ｇ−Ｓ−ｘ−ｘ−Ｄ−ｘ−Ｐ〔式中、Ｖａｌ残基は、活性部位上に存在する〕、
７）Ｖ−ａ／ｓ／ｈ−Ａ−Ｈ−ｃ／ｖ／ａ−ｈ／ｑ−Ｇ−ｋ／ｒ−ｘ−Ｇ〔式中、２個のＨｉｓ残基は、活性部位上に存在する〕、
８）Ｈ−ｇ／ｖ／ａ−ｓ／ｔ／ｉ−ｙ／ｆ／ｅ−ｌ／ａ／ｉ−Ｄ〔式中、Ｈｉｓ残基は、活性部位上に存在する〕、
９）Ｇ−Ｖ−ｘ−Ｉ−ａ／ｖ−ｌ／ａ−Ｇ−Ｔ−Ｄ、〔式中、Ａｓｐ残基は、活性部位上に存在する〕。
【０３３０】
配列番号１は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のアミダーゼ２であり、配列５は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の仮説タンパク質（ＸＰ＿００１４００９８１）であり、配列番号６は、Ａ．フラバス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）由来の仮説タンパク質（ＸＰ＿００２３８５３１３）であり、配列番号７は、タラロマイセス・スティピタタス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ）由来の仮説タンパク質（ＸＰ＿００２４７７９７２）であり、配列番号８は、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）由来の仮説タンパク質（ＸＰ＿９６２２３８）であり、配列番号９は、ストレプトマイセス・ロゼオスポラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）由来の推定アミドヒドロラーゼ（ＺＰ＿０４７１２１５６）であり、配列番号１０は、サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）由来の推定アミドヒドロラーゼ（ＹＰ＿００１４７０３７１）であり、配列番号１１は、サリニスポラ・アレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ）由来の推定アミドヒドロラーゼ（ＹＰ＿００１５３６９９５）であり、配列番号１３は、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）由来の推定アミドヒドロラーゼ（ＥＦＱ２５７９２）であり、配列番号１４は、メタリジウム・アニソプリアエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）由来の推定アミドヒドロラーゼ（ＥＦＺ０００５８）であり、配列番号１５は、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来の仮説タンパク質（ＸＰ＿００１８２６７５８）である。
【０３３１】
実施例２３  配列番号１とオクラトキシン分解活性を有するカルボキシペプチダーゼとの配列比較
低いオクラトキシン分解活性を有する２種のカルボキシペプチダーゼ、すなわち、ウシカルボキシペプチダーゼＡおよび酵母カルボキシペプチダーゼＹは、公知である（Ｌｕｉｓ  Ａｂｒｕｎｈｏｓａ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｒ．Ｍ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｒｍａｎｄｏ  Ｖｅｎａｎｃｉｏ，  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ  Ａ  ｆｏｒ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｆｅｅｄ  Ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｔｏｘｉｎｓ  ２０１０，２，１０７８−１０９９）。これらの酵素のオクラトキシン分解活性は、確認されている。しかしながら、図２７からわかるように、これらの酵素は、配列番号１に対して相同性を示さず、オクラトキシン分解能力に関連する９個のモチーフのはいずれをも含有しない。さらに、これらの酵素は、アミダーゼ型Ｔｉｍバレル構造を有していない。
【０３３２】
配列リスト
配列番号１
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のアミダーゼ２ｓｉｇ
【化３】
2013540430.tif 000016
【０３３３】
配列番号２
配列タイプ：ＤＮＡ、ＤＮＡ名：アミダーゼ２を含有するＤＮＡ遺伝子、長さ：１４４３、生物：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）
【化４】
2013540430.tif 000017
【０３３４】
配列番号３
配列タイプ：タンパク質、タンパク質名：アミダーゼ２ｍａｔ、長さ：４３８、生物：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）
【化５】
2013540430.tif 000018
【０３３５】
配列番号４
アミダーゼ２Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）＋ｃ末端６Ｈ
【化６】
2013540430.tif 000019
【０３３６】
配列番号５
配列タイプ：タンパク質、タンパク質名：推定アミダーゼ２相同体、長さ：４２０、生物：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）
【化７】
2013540430.tif 000020
【０３３７】
配列番号６
配列タイプ：タンパク質、タンパク質名：推定アミダーゼ２相同体、長さ：４１９、生物：アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）
【化８】
2013540430.tif 000021
【０３３８】
配列番号７
配列タイプ：タンパク質、タンパク質名：推定アミダーゼ２相同体、長さ：４０５、生物：タラロマイセス・スティピタタス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ）
【化９】
2013540430.tif 000022
【０３３９】
配列番号８
配列タイプ：タンパク質、タンパク質名：推定アミダーゼ２相同体、長さ：４４０、生物：ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）
【化１０】
2013540430.tif 000023
【０３４０】
配列番号９
配列タイプ：タンパク質、タンパク質名：推定アミダーゼ２相同体、長さ：４１３、生物：ストレプトマイセス・ロゼオスポラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）
【化１１】
2013540430.tif 000024
【０３４１】
配列番号１０
配列タイプ：タンパク質、タンパク質名称：推定アミダーゼ２相同体、長さ：４０７、生物：サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）
【化１２】
2013540430.tif 000025
【０３４２】
配列番号１１
配列タイプ：タンパク質、タンパク質名称：推定アミダーゼ２相同体、長さ：４０８、生物：サリニスポラ・アレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ）
【化１３】
2013540430.tif 000026
【０３４３】
配列番号１２
配列タイプ：タンパク質、タンパク質名：ｐｅｐＡｄ２（プロテアーゼ）、長さ：４８０、生物：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）
【化１４】
2013540430.tif 000027
【０３４４】
配列番号１３
生物  グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）Ｍ１．００１（菌類）、４７２ａａ
【化１５】
2013540430.tif 000028
【０３４５】
配列番号１４
生物  メタリジウム・アニソプリアエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）ＡＲＳＥＦ２３．４８５ａａ、
【化１６】
2013540430.tif 000029
【０３４６】
配列番号１５
Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アミドヒドロラーゼ
【化１７】
2013540430.tif 000030
【０３４７】
配列番号１６
ウシカルボキシペプチダーゼＡ（４１９ａａ）。受託番号：ＮＰ＿７７７１７５。Ｓｉｇｍａ製品番号Ｃ０２６１。
【化１８】
2013540430.tif 000031
【０３４８】
配列番号１７
パン酵母（サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来のカルボキシペプチダーゼＹ、５３２ａａ、受託番号：ＥＤＶ１１７８８。Ｓｉｇｍａ製品番号Ｃ３８８８。
【化１９】
2013540430.tif 000032
【０３４９】
文献リスト
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８  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅ，  Ｋ．  Ｊ．，  Ｓｔｅｙｎ，  Ｐ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｆｏｕｒｉｅ，  Ｌ．  （１９６５）．  Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ．  ＩＩ．  Ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎｓ  Ａ，  Ｂ，  ａｎｄ  Ｃ，  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ  Ｗｉｌｈ．  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｐｅｒｋｉｎ  １］  ７０８３−７０８８
９  ＷＨＯ／ＦＡＯ  （１９９８）．  Ｆｏｏｄ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．  Ａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，  Ｇｅｎｅｖａ
１０  Ｗａｎｇ，  Ｈ  （２０１０）．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇａｌ  ｃｅｌｌｓ．  ＷＯ  ２０１００１４５７４  （Ａ２）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−４３】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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