(57)【要約】  本発明は、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルス、そのような構築物の調製、ならびに免疫原性組成物およびワクチンにおけるそれらの使用に関する。更に、診断のための組換えパラポックスウイルスの使用に関する。
2013537409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラポックスウイルスおよびイヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルス。
【請求項２】
前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルス・オビスウイルス（ＯＲＦＶ）である、請求項１に記載の組換えパラポックスウイルス。
【請求項３】
前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１である、請求項２に記載の組換えパラポックスウイルス。
【請求項４】
前記組換えパラポックスウイルスが、パラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈおよびパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆからなる群から選択される、請求項３に記載の組換えパラポックスウイルス。
【請求項５】
前記異種ＤＮＡが、前記イヌジステンパーウイルスのＨタンパク質をコードする遺伝子、前記Ｈタンパク質をコードする前記遺伝子の断片、前記イヌジステンパーウイルスのＦタンパク質をコードする遺伝子、および前記Ｆタンパク質をコードする前記遺伝子の断片からなる群から選択される、請求項１に記載の組換えパラポックスウイルス。
【請求項６】
前記異種ＤＮＡが、前記イヌジステンパーウイルスの前記Ｈタンパク質をコードする前記遺伝子またはその断片である、請求項５に記載の組換えパラポックスウイルス。
【請求項７】
前記異種ＤＮＡが、前記イヌジステンパーウイルスの前記Ｆタンパク質をコードする前記遺伝子またはその断片である、請求項５に記載の組換えパラポックスウイルス。
【請求項８】
前記異種ＤＮＡが、配列番号１、配列番号１と少なくとも約９８％の同一性を有する配列、配列番号２、および配列番号２と少なくとも約９８％の同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項１に記載の組換えパラポックスウイルス。
【請求項９】
前記異種ＤＮＡがパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１のＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｈ／Ｈの中に挿入される、請求項１に記載の組換えパラポックスウイルス。
【請求項１０】
前記異種ＤＮＡが、パラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１のＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｈ／Ｈの中のＶＥＧＦコード配列または隣接する非コード配列の中に挿入される、請求項９に記載の組換えパラポックスウイルス。
【請求項１１】
請求項１に記載の組換えパラポックスウイルスの調製方法であって、前記パラポックスウイルスのゲノム内に異種ＤＮＡを挿入することを含む方法。
【請求項１２】
前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルス・オビスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換えパラポックスウイルスが、パラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈおよびパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記異種ＤＮＡが、前記イヌジステンパーウイルスのＨタンパク質をコードする遺伝子、前記Ｈタンパク質をコードする前記遺伝子の断片、前記イヌジステンパーウイルスのＦタンパク質、および前記Ｆタンパク質をコードする前記遺伝子の断片からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記異種ＤＮＡが、前記イヌジステンパーウイルスの前記Ｈタンパク質をコードする前記遺伝子またはその断片である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記異種ＤＮＡが、前記イヌジステンパーウイルスの前記Ｆタンパク質をコードする前記遺伝子またはその断片である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記異種ＤＮＡが、配列番号１、配列番号１と少なくとも約９８％の同一性を有する配列、配列番号２、および配列番号２と少なくとも約９８％の同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の組換えパラポックスウイルスおよび担体を含む免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルス・オビスである、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１である、請求項２０に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記組換えパラポックスウイルスが、パラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈおよびパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆからなる群から選択される、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記異種ＤＮＡが、前記イヌジステンパーウイルスのＨタンパク質をコードする遺伝子、前記Ｈタンパク質をコードする前記遺伝子の断片、前記イヌジステンパーウイルスのＦタンパク質、および前記Ｆタンパク質をコードする前記遺伝子の断片からなる群から選択される、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記異種ＤＮＡが、前記イヌジステンパーウイルスの前記Ｈタンパク質をコードする前記遺伝子またはその断片である、請求項２３に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
前記異種ＤＮＡが、前記イヌジステンパーウイルスの前記Ｆタンパク質をコードする前記遺伝子またはその断片である、請求項２３に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
前記異種ＤＮＡが、配列番号１、配列番号１と少なくとも約９８％の同一性を有する配列、配列番号２、および配列番号２と少なくとも約９８％の同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
請求項１９に記載の免疫原性組成物の調製方法であって、請求項１に記載の組換えパラポックスウイルスを担体と組み合わせることを含む方法。
【請求項２８】
前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルス・オビスである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記パラポックスウイルスがパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組換えパラポックスウイルスが、パラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈおよびパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記異種ＤＮＡが、前記イヌジステンパーウイルスのＨタンパク質をコードする遺伝子、前記Ｈタンパク質をコードする前記遺伝子の断片、前記イヌジステンパーウイルスのＦタンパク質、および前記Ｆタンパク質をコードする前記遺伝子の断片からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記異種ＤＮＡが、配列番号１、配列番号１と少なくとも約９８％の同一性を有する配列、配列番号２、および配列番号２と少なくとも約９８％の同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
動物対象においてイヌジステンパーウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項１９から２６のいずれか一項に記載の治療上有効量の免疫原性組成物を前記動物に投与することを含む方法。
【請求項３４】
抗Ｈまたは抗Ｆタンパク質特異的防御免疫応答が誘導される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
イヌジステンパー疾患に対して動物対象を治療する方法であって、請求項１９から２６のいずれか一項に記載の治療上有効量の免疫原性組成物を前記動物に投与することを含む方法。
【請求項３６】
イヌジステンパー疾患に対して動物を治療するための薬物の調製における、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換えパラポックスウイルスの使用。
【請求項３７】
ワクチン接種動物からの感染動物の区別のためのアッセイにおける、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換えパラポックスウイルスの使用。
【請求項３８】
前記組換えパラポックスウイルスが、パラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈおよびパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆからなる群から選択される、請求項３７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）に由来する異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルス、及び、それらの免疫原性組成物およびワクチンへの使用に関する。また、本発明は、ＣＤＶによって生じる疾患に対してワクチン接種を行うか、またはその疾患を治療もしくは予防するための方法にも関する。更に、本発明は診断のための組換えパラポックスウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポックスウイルス科のウイルスは、楕円形の、非常に大きな、二本鎖ＤＮＡウイルスである。パラポックスウイルス属（ＰＰＶ）は、これらのウイルスの中に含まれる。それらの大きさは、長さ約２２０〜３００ｎｍ×幅１４０〜１７０ｎｍである。それらは、それらと他のポックスウイルスと区別する独特の螺旋状の外殻を有する。
【０００３】
ＰＰＶは、異なる３つの種に分類される。しかし、これらのウイルスがパラポックスウイルス属の中で自律的な種であるかどうかについて、またはそれらが同じ種であるかどうかについては、まだ明らかにされていない。第１の種（パラポックスウイルス・オビス（Parapoxvirus ovis））（ＯＲＦウイルス、ＯＲＦＶ）は、その属の原型とみなされる。それは、伝染性膿疱ウイルス（ecthyma contagiosum virus）、伝染性膿疱性皮膚炎ウイルスまたはオルフウイルスとも呼ばれる。第２の種（パラポックスウイルス・ボビス（Parapoxvirus bovis）１）は、ウシ丘疹性口内炎ウイルスまたは口内炎丘疹ウイルス（stomatitis papulosa virus）とも呼ばれている。第３の種（パラポックスウイルス・ボビス２）は、乳腺ポックスウイルス（udderpoxvirus）、パラワクシニアウイルス、偽牛痘ウイルスまたは搾乳者結節ウイルス（milker's nodule virus）とも呼ばれる。
【０００４】
パラポックスウイルス種は反芻動物に固有である。ＰＰＶは、アカシカ、トナカイ、アカリスおよびゴマフアザラシで見つかった。ＰＰＶによる感染症は、動物および人間の両方に局所疾患を生じる可能性がある。ＰＰＶ種の人畜共通感染症宿主は、ヒツジ、ヤギおよびウシである。それらは、感染動物との直接接触によってヒトに感染症を生じさせ、それは局所的表皮性病変と反応し、それは瘢痕を残すことなく治癒する。それらの疾患を制御するためにワクチン等の予防的対策を用いることができる。
【０００５】
アビポックス（avipox）、ラクーンポックス（racoonpox）、カプリポックス（capripox）、豚痘またはワクシニアウイルスに基づいた外来遺伝情報を発現するためのベクターは、すでに記載されている（ＵＳ５，９４２，２３５およびＵＳ７，０９４，４１２参照）。パラポックスウイルス類は、ベクターワクチンで用いることができる異なる候補を示す。しかし、ポックスウイルス類の個々の属の間の形態的、構造的および遺伝子的差異のため、これらのポックスウイルスに用いる方法は、パラポックスウイルスに用いることができない。そのような差異の一例は、  …  赤血球を凝集させることであり、それは表面タンパク質（赤血球凝集素）により媒介されるが、パラポックスウイルスは凝集させない。
【０００６】
ＰＰＶは、脊椎動物における全身性（非特異的）免疫反応を刺激するので、免疫調節効果を有することができる。動物における全身の抵抗力を増大させるための動物用医薬品にそれらを用いることに成功した。それらを同種および／または異種抗原と組み合わせて、数ヶ月から数年持続する病原体特異的効果、および急速な非病原体特異的効果を有するワクチンを提供することができる。
【０００７】
米国特許第６，３６５，３９３号、Rziha et al., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145、ＷＯ２００４／０５４６１４、およびFischer et al., 2003, J. Virol. 77, 9312-9323に記載されているように、パラポックスウイルス・オビスはベクターとしてすでに用いられてきた。それは、ベクターとして用いる場合、著しい利点、すなわち、非常に狭い寄生範囲、全身感染がないこと、（免疫化の繰り返しが可能な）短期ベクター特異的免疫、早期のワクチン接種（移行抗体の存在下で免疫の誘導を開始することができる）、それに有益な免疫調節特性をもたらす。本発明は、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡのためのベクターとしてのパラポックスウイルスの使用に関する。
【０００８】
パラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１は、野生型ウイルスと同等の力価を有する細胞培養物中で増殖させることができる非常に弱毒化された株である。それは、感染性ベクターウイルスの複製を支援する宿主（例えばヒツジおよびヤギ）およびそれを行わない宿主（例えば犬、ブタ、ウマ、マウスおよびラット）の両方において顕著な免疫刺激特性を有する。株Ｄ１７０１に由来する化学的に不活性化されたパラポックスウイルス・オビスの製剤である（以前は、Ｂａｙｐａｍｕｎｅ（登録商標）として公知の）Ｚｙｌｅｘｉｓ（登録商標）は、感染性疾患の予防、感染後防御（metaphylaxis）および治療的処置のために、ならびに動物におけるストレス誘導性疾患を予防するために用いられる。
【０００９】
イヌジステンパーは、犬および他の肉食動物の、感染性が高い、急性または亜急性の発熱性ウイルス疾患であり、世界的に発生するものである。一部の犬は主に呼吸器の徴候を示し、その他は腸の徴候を示し、それらの動物の少なくとも３０％が神経症状を発症する。実験的に感染させた全ての犬は、中枢神経系内に組織病理学的病変を有する。死亡率は３０％から８０％の間の範囲である。少数の症例では、回復した犬がそのウイルスを脳細胞内に宿し続け、その中でそれがゆっくりと自己複製して、最終的に老齢犬脳炎を発生させる。ジステンパーを発症して助かった犬は、生涯にわたって再感染に対する免疫を有する。犬におけるジステンパーの制御のために免疫化が推奨され、年一回のワクチン再接種が推奨される。
【００１０】
イヌジステンパーは、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）（パラミクソウイルス科モルビリウイルス属のメンバー）によって生じる。ＣＤＶは、麻疹および牛疫を生じるウイルスに密接な関連がある。イヌジステンパーウイルス粒子は覆われており、１５，６１６のヌクレオチドのマイナス鎖ＲＮＡゲノムを含む。細胞培養適応Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ（ＯＰ−ＣＤＶ）株について全ゲノムが配列決定された（Sidhu et al., 1993, Virology 193, 50-65）。ウイルスゲノムは、６種のタンパク質：ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、リンタンパク質（Ｐ）、基質（Ｍ）タンパク質、融合（Ｆ）タンパク質、血球凝集素（Ｈ）タンパク質および巨大（Ｌ）タンパク質をコードする。遺伝子は、（３’−５’）：Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｈ、Ｌの順序でゲノムＲＮＡ内に配置される。各タンパク質は、マイナス鎖ＲＮＡ鋳型から転写された特異なｍＲＮＡから翻訳される。ＨおよびＦタンパク質は共に糖タンパク質であり、ウイルスエンベロープ内に局在する。Ｆタンパク質前駆体（Ｆ０）が翻訳後切断を受け、それによってＦ１サブユニットタンパク質を産生する（Cherpillod et al, 2004, Arch. Virol. 149, 1971-1983）。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、一般に、イヌジステンパーウイルスに対する迅速な先天性免疫応答および持続性異種遺伝子特異的免疫を媒介するための組換えパラポックスウイルスの使用に関し、特にパラポックスウイルス・オビス（ＰＰＶＯ）の使用に関する。
【００１２】
一態様において、組換えパラポックスウイルスは、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１を含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１−Ｖを含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈである。更に他の一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆである。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスは、前記イヌジステンパーウイルスのＨタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスは、前記イヌジステンパーウイルスのＦタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスは、配列番号１、または配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスは、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、パラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１のＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｈ／Ｈの中に挿入される。別の態様において、前記異種ＤＮＡは、パラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１のＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｈ／Ｈの中のＶＥＧＦコード配列または隣接する非コード配列の中に挿入される。
【００１３】
本発明は、組換えパラポックスウイルスの調製方法であって、前記パラポックスウイルスのゲノム内に異種ＤＮＡを挿入することを含む方法を包含する。一態様において、前記方法はパラポックスウイルス・オビスの使用を含む。一態様において、前記方法はパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１の使用を含む。一態様において、前記方法はパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１−Ｖの使用を含む。一態様において、前記方法はパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈの調製を含む。一態様において、前記方法はパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆの調製を含む。一態様において、前記方法で使用する異種ＤＮＡは、イヌジステンパーウイルスのＨタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記方法で使用する異種ＤＮＡは、配列番号１、または配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。
【００１４】
本発明は、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスおよび担体を含むワクチンまたは免疫原性組成物を包含する。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスを含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１を含む。別の態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１−Ｖを含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈである。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆである。一態様において、前記異種ＤＮＡは、前記イヌジステンパーウイルスのＨタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、前記イヌジステンパーウイルスのＦタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、配列番号１、または配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。
【００１５】
本発明は、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスおよび担体を組み合わせることを含む、ワクチンまたは免疫原性組成物の調製方法を包含する。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスを含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスは、パラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１を含む。別の態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１−Ｖを含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈである。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆである。一態様において、前記異種ＤＮＡは、前記イヌジステンパーウイルスのＨタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、前記イヌジステンパーウイルスのＦタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、配列番号１、または配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。
【００１６】
本発明は、動物対象においてイヌジステンパーウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む前記組換えパラポックスウイルスおよび担体を含む治療上有効量のワクチンまたは免疫原性組成物を前記動物に投与することを含む方法を包含する。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスを含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１を含む。別の態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１−Ｖである。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈである。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆである。一態様において、前記異種ＤＮＡは、前記イヌジステンパーウイルスのＨタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、前記イヌジステンパーウイルスのＦタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、配列番号１、または配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。一態様において、前記免疫応答は、ＣＤＶ特異的抗体の誘導である。一態様においては、抗Ｈタンパク質特異的防御免疫応答が誘導される。一態様においては、抗Ｆタンパク質特異的防御免疫応答が誘導される。別の態様において、前記免疫応答は、抗Ｈタンパク質血清抗体の誘導である。別の態様において、前記免疫応答は、抗Ｆタンパク質血清抗体の誘導である。
【００１７】
本発明は、イヌジステンパー疾患に対して動物対象にワクチン接種を行う方法であって、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスおよび担体を含む治療上有効量のワクチンまたは免疫原性組成物を前記動物に投与することを含む方法を包含する。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスを含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１を含む。別の態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１−Ｖを含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈである。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆである。一態様において、前記異種ＤＮＡは、前記イヌジステンパーウイルスのＨタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、前記イヌジステンパーウイルスのＦタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、配列番号１、または配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。
【００１８】
本発明は、イヌジステンパー疾患に対して動物対象を治療する方法であって、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む治療上有効量の組換えパラポックスウイルスおよび担体を前記動物に投与することを含む方法を包含する。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスを含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１を含む。別の態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１−Ｖを含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈである。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆである。一態様において、前記異種ＤＮＡは、前記イヌジステンパーウイルスのＨタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、前記イヌジステンパーウイルスのＦタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、配列番号１、または配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。
【００１９】
本発明は、イヌジステンパー疾患に対して動物を治療するための薬物の調製における、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスの使用を包含する。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１を含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１−Ｖを含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈである。更に他の一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆである。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスは、前記イヌジステンパーウイルスのＨタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスは、前記イヌジステンパーウイルスのＦタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスは、配列番号１、または配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスは、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、パラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１のＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｈ／Ｈの中に挿入される。別の態様において、前記異種ＤＮＡは、パラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１のＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｈ／Ｈの中のＶＥＧＦコード配列または隣接する非コード配列の中に挿入される。
【００２０】
本発明は、イヌジステンパー疾患に対して動物にワクチン接種を行うための薬物の調製におけるパラポックスウイルスの使用を包含する。一態様において、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスが提供される。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１を含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１−Ｖを含む。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈである。一態様において、前記組換えパラポックスウイルスはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆである。別の態様において、前記異種ＤＮＡは、ＣＤＶのＨタンパク質をコードする遺伝子を含む。別の態様において、前記異種ＤＮＡは、ＣＤＶのＦタンパク質をコードする遺伝子を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、配列番号１、または配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。一態様において、前記異種ＤＮＡは、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。
【００２１】
本発明は、動物対象内に存在するパラポックスウイルスの起源を決定する方法を提供する。本明細書に記載されるパラポックスウイルスは、それらのゲノム組成および発現するタンパク質の両方とも野生型株から区別することができる。そのような区別により、ワクチン接種動物と感染動物の間の識別が可能になる。組換えパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈは、ＤＩＶＡアッセイで用いることができる。組換えパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆは、ＤＩＶＡアッセイで用いることができる。
【００２２】
これらのおよび他の態様は、以下の発明を実施するための形態によって開示され、包含される。
【００２３】
本発明は、添付の図面を参照することによってより深く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】プラスミドｐｄＶ−ＣＤＶ−ＨおよびｐｄＶ−ＣＤＶ−Ｆの構築。転移プラスミドｐｄＶ−Ｒｅｃ１内にＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片としてＣＤＶ−ＨならびにＣＤＶ−Ｆ遺伝子をクローニングし、プラスミドｐｄＶ−ＣＤＶ−Ｈ（１Ａ）またはｐｄＶ−ＣＤＶ−Ｆ（１Ｂ）を得た。
【図２】Ｄ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−ＦまたはＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈを感染させた細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色（ＩＰＭＡ）。Ｖｅｒｏ細胞に組換えＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆ（２Ａ）またはＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈ（２Ｂ）を感染させた。２Ｃに対照（非感染）Ｖｅｒｏ細胞を示す。暗色に染色された細胞は特異的タンパク質発現を示す。
【図３】組換え体によって発現させたＣＤＶ−Ｆタンパク質またはＣＤＶ−Ｈタンパク質の免疫蛍光染色。Ｖｅｒｏ細胞に組換えＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈを８時間（３Ａ）および１２時間（３Ｂ）感染させたか、または組換えＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈを２４時間（３Ｃ）感染させた。ウサギ抗−ＣＤＶ−Ｈ抗体（１：２０００で希釈）またはウサギ抗−ＣＤＶ−Ｆ抗体（１：２００で希釈）、および１：２０００で希釈した抗−ウサギ−Ａｌｅｘａ−５５５で特異的染色を達成した。陰性対照については、非感染細胞を用いた（Ｄ）。具体的には、染色細胞は矢印で示される。
【図４】ＯＲＦＶ組換え感染細胞内で発現させたＣＤＶのＦ−遺伝子のウエスタンブロット分析。非感染Ｖｅｒｏ細胞（ｎｉ）、組換えＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆ（ＭＯＩ＝３．０）を４〜７２時間感染させた細胞（感染後４、８、２４、４８および７２）、およびＣＤＶ  Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｒｔ（参考株）感染細胞（ＣＤＶ対照）からタンパク質溶解物を調製した。
【図５】Ｄ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈの一段増殖曲線（ＳＳＧＣ）。親ウイルスＤ１７０１−Ｖ（白丸）または組換えＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈ（黒丸）をＶｅｒｏ細胞に感染させた（ＭＯＩ＝３．０）。
【図６】免疫蛍光法によるＣＤＶ−Ｈ特異的抗体の検出。組換えＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈ（１０７ｐｆｕ）を筋肉内に免疫したマウスの血清（１：１０００で希釈）（図６Ａ〜Ｃは、ＣＤＶ  Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ株を感染させたＶｅｒｏ細胞を示す）。矢印は、マウス抗血清との特異的な反応を示す。図６Ｄは非感染Ｖｅｒｏ細胞を示す。
【図７】クローニングされたＨ遺伝子断片の配列。制限酵素クローニングおよび分析（ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ）のためのリンカー配列として５’末端の２０ｎｔおよび３’末端の２１ｎｔを加えたイヌジステンパーウイルスＨタンパク質のコード領域（配列番号１、１８２４ｎｔ）。ＡＴＧ開始コドンには下線が引かれている。
【図８】クローニングされたＦ遺伝子断片の配列。制限酵素クローニングおよび分析（ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ）のためのリンカー配列として５’末端の１９ｎｔおよび３’末端の１６ｎｔを加えたイヌジステンパーウイルスＦタンパク質のコード領域（配列番号２、１９８９ｎｔ）。ＡＴＧ開始コドンには下線が引かれている。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書で特に定義されない限り、本発明に関連して用いる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。
【００２６】
本発明の態様の記載に用いられる用語に、以下の定義を適用することができる。それらは、参照により本明細書に組み込まれる各個別の参照に含まれるあらゆる矛盾した定義に優先する。
【００２７】
「約」または「およそ」は、測定可能な数値変数に関連して用いられる場合、示された変数値、および、示された値の実験誤差内（例えば、平均の９５％の信頼区間内）にある全ての変数値または示された値の１０％内にある全ての変数値のどちらか大きい方を指すが、これは、約が週単位の時間間隔について用いられる場合を除くものであり、その場合においては、「約３週間」は１７から２５日間であり、約２から約４週間は１０から４０日間である。
【００２８】
本明細書で用いられる「動物」および「対象」という用語は、飼いならされたおよび野生の両方の哺乳動物を含むイヌジステンパー感染症にかかりやすい任意の動物を含む。
【００２９】
本明細書で用いられる「抗体」は、供与源、製造方法または他の特性にかかわらず抗原結合部位を含む任意のポリペプチドである。それは、抗原に対して、その抗原に対する免疫応答の結果として特異的に結合する免疫グロブリン分子またはその断片を指す。免疫クロブリンは、「定常」領域および「可変」領域を有する「軽」ポリペプチド鎖および「重」ポリペプチド鎖から構成される血清タンパク質であり、定常領域の組成に基づいてクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）に分けられる。所定の抗原に対して「特異的な」抗体は、抗体の可変領域が排他的に特異的抗原を認識し、結合することを示す。その用語としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、ヒト化抗体、四量体抗体、四価抗体、多重特異性抗体、一本鎖抗体、ドメイン特異性抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン削除抗体、融合タンパク質、ＳｃＦｃ融合タンパク質、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体およびＣＤＲグラフト抗体が挙げられるが、それらに限定されるものではない。抗体は、天然の供与源もしくは組換え型の供与源に由来する無傷免疫グロブリンであることができるか、または無傷免疫クロブリンの免疫活性部分であることができる。「抗体」は、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）断片、Ｆｄ断片、ｄＡｂ断片、二重抗体（diabody）、ＣＤＲ３ペプチド、束縛ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチド、ナノボディ（nanobody）、二価ナノボディ、小モジュラー免疫薬（small modular immunopharmaceutical）（ＳＭＩＰ）およびミニボディ（minibody）、上述した断片のいずれか、それらの化学的または遺伝子的に操作された対応物、ならびに抗原結合機能を保持する他の抗体断片を含む、限定されるものではないが抗体断片を含む抗原結合性タンパク質に転化することができる。典型的には、そのような断片は抗原結合性ドメインを含む。当業者によって認識されるように、そのような分子のいずれかは、その免疫原性を低下させるため、その親和性を増加させるため、その特異性を変化させるため、または他の目的のために、操作（例えば「生殖細胞系化（germlined）」）することができる。
【００３０】
本明細書で用いられる「抗原」または「免疫原」は、対象に曝露した際にその抗原に対して特異的な免疫応答を誘導する１種以上のエピトープ（直線状、立体構造または両方）を含む分子を指す。抗原という用語は、サブユニット抗原（抗原は、抗原が事実上関連づけられる全生物体から分離・区分されている）、ならびに死滅、弱毒化、または不活化された細菌、ウイルス、菌、寄生虫または他の微生物を指す。抗原という用語はまた、抗イディオタイプ抗体またはその断片等の抗体、および抗原または抗原決定基（エピトープ）を模倣し得る合成ペプチドミモトープをも指す。抗原という用語はまた、インビボで、例えばＤＮＡ免疫化適用で抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをも指す。
【００３１】
本明細書で用いられる「抗原性」は、タンパク質またはポリペプチドに対して高められた抗体によって免疫特異的に結合するタンパク質またはポリペプチドの能力を指す。
【００３２】
「緩衝液」は、別の化学物質の濃度の変化を防ぐ化学系を意味する。プロトン供与体および受容体系は、水素イオン濃度（ｐＨ）の著しい変化を防ぐ緩衝液の役割をする。緩衝液の更なる例は、弱酸およびその塩（共役塩基）の混合物または弱塩基およびその塩（共役酸）の混合物を含有する溶液である。
【００３３】
本明細書で用いられる「イヌ」は、一般に犬と呼ばれるものを含むが、イヌ科の他のメンバーを含む。
【００３４】
「イヌジステンパーウイルス」という用語は、モノネガウイルス目におけるパラミクソウイルス科におけるモルビリウイルス属のメンバーを指す。
【００３５】
本明細書で用いられる「細胞系」または「宿主細胞」という用語は、ウイルスが複製し得るまたは維持され得る原核細胞または真核細胞を意味する。
【００３６】
「細胞性免疫応答」または「細胞媒介免疫応答」は、Ｔリンパ球または他の白血球またはその両方が媒介するものであり、サイトカイン、ケモカイン、および活性化されたＴ細胞、白血球またはその両方から産生される同様の分子の産生を含む。
【００３７】
「保存的置換」は、本技術分野で定義されており、当業者に公知であり、それらの関連した物理学的特性に従って残基を分類すると認められる。
【００３８】
本明細書で用いられる「培養物（culture）」という用語は、他の種または型がない場合に成長する細胞または微生物の集団を意味する。
【００３９】
本明細書で用いられる「ＤＩＶＡ」という用語は、ワクチン接種動物から感染動物を区別することが可能なワクチンまたは免疫原性組成物を意味する。
【００４０】
「用量」は、対象に与えられるワクチンまたは免疫原性組成物を指す。「初回用量」または「初回抗原刺激用量」は、Ｄａｙ０で与えられるそのような組成物の用量を指す。
「二次用量」または「三次用量」または「年間用量」は、初回用量と同じワクチンまたは免疫原性組成物であってもなくてもよい、初回用量に続いて与えられるそのような組成物の量を指す。
【００４１】
「エピトープ」は、Ｔ細胞受容体または特異的抗体に結合する抗原の特異的部位であり、典型的には約３個のアミノ酸残基から約２０個のアミノ酸残基を含む。
【００４２】
本明細書で用いられる「賦形剤」は、抗原ではないワクチンまたは免疫原性組成物の任意の成分を指す。
【００４３】
「断片」は、タンパク質または遺伝子の切断部分を指す。「機能的断片」および「生物学的活性断片」は、完全長タンパク質または遺伝子の生物学的性質を保持する断片を指す。「免疫学的活性断片（immunogenically active fragment）」は、免疫応答を誘発する断片を指す。
【００４４】
本明細書で用いられる「Ｆタンパク質」という用語は、イヌジステンパーウイルスの融合タンパク質を指す。
【００４５】
本明細書で用いられる「Ｈ」タンパク質という用語は、イヌジステンパーウイルスの血球凝集素糖タンパク質を指す。
【００４６】
本明細書で用いられる「異種」という用語は、異なる種または株に由来することを意味する。
【００４７】
本明細書で用いられる「同種」という用語は、同じ種または株に由来することを意味する。
【００４８】
「相同性」または「パーセント相同性」は、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列相同性を達成した後の、更に配列相同性の一部としてあらゆる保存的置換を考慮した比較配列内の残基と同一である候補配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合を指す。
【００４９】
「相同体」または「種相同体」は、実質的なポリヌクレオチド配列相同性を有し、かつ同一または同様の生物学的機能および／または特性を有する、２種以上の異なる種で見出される遺伝子を含む。好ましくは、種相同体を表すポリヌクレオチド配列は、例によって本明細書に記載されているように、中程度にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズし、同一または同様の生物学的活性および、または特性を有する。別の態様において、種相同体を表すポリヌクレオチドは、約６０％超の配列相同性、約７０％超の配列相同性、約８０％超の配列相同性、約９０％超の配列相同性、約９５％超の配列相同性、約９６％超の配列相同性、約９７％超の配列相同性、約９８％超の配列相同性、または約９９％超の配列相同性を共有する。
【００５０】
「液性免疫応答」は、抗体によって少なくとも部分的に媒介されるものを指す。
【００５１】
「同一性」または「パーセント同一性」は、両配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後の、配列同一性の一部としてあらゆる保存的置換を考慮しない比較配列内の残基と同一である候補配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸の割合を指す。
【００５２】
対象における「免疫応答」は、抗原に対する液性免疫応答、細胞性免疫応答、または液性および細胞性免疫応答の発生を指す。免疫応答は、診断目的もしくは他の試験のために十分であってよいか、または病原体の感染によって引き起こされる有害な健康効果もしくはその合併症を含む疾患の徴候もしくは症状を予防するために適切であってよい。免疫応答は、通常、本技術分野において公知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを用いて決定することができる。
【００５３】
本明細書で用いられる「免疫原性の」または「免疫原性」は、抗原に対して特異的に向けられた免疫応答を誘発する能力を指す。
【００５４】
本明細書で用いられる「免疫原性組成物」または「免疫学的に有効な量」または「免疫応答を生じさせるために有効な量」という用語は、単独でまたは医薬的に許容し得る担体と共に動物に投与する場合に特異的な免疫応答を生じさせる（すなわち、免疫原性活性を有する）、免疫系が認識することが可能な組成物または抗原を指す。
【００５５】
本明細書で用いられる「鼻腔内」投与は、対象の鼻を通した、あるいは経由した身体へのワクチンまたは免疫原性組成物等の物質の導入を指し、主に鼻粘膜を通した物質の輸送を含む。
【００５６】
本明細書で用いられる「単離された」は、それが天然に存在する環境から、単独で、あるいは異種宿主細胞または染色体もしくはベクター（例えば、プラスミド、ファージ等）中で取り出されていることを意味する。単離された微生物は、それが天然に存在する環境から分離されたた場合等、例えば培養物内に生物体が他の微生物を実質的に有さない組成物を指す。「単離された」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド等の特に定義された任意の物質を記載するために用いる場合、通常はその物質、例えばポリペプチドまたは核酸、が見出される元の細胞性環境とは別の物質を指す。ゆえに本明細書において、一例として挙げるに過ぎないが、本発明のポリヌクレオチドで構築される組換え細胞系は、「単離された」核酸を利用する。別の場合、ワクチンまたは免疫原性組成物として特定のタンパク質または特異的免疫原性断片を主張または用いる場合、それが自然の中に存在することができる在り方と比較して、それが同定され、分離され、ある程度精製されたので、それが単離されたと考えられる。抗原を産生する組換え細菌または真核細胞発現ベクター内でタンパク質またはその特異的免疫原性断片を産生する場合、それは、単離されたタンパク質または核酸として存在すると考えられる。例えば、ポリヌクレオチドで構築された組換え細胞系は、「単離された」核酸を利用する。
【００５７】
「医薬剤」は、疾患の予防、治癒もしくは改善、または何らかの生理学的な状態もしくは発生の予防に有用な任意の剤を指す。
【００５８】
「感染多重度」（ＭＯＩ）という用語は、細胞１個当たりの生物体の数の比率を指し、それは、所定の感染症にどれくらいの接種材料を用いる予定であるかを詳細に示す。
【００５９】
本明細書に用いられる「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ細胞の単一系が産生する抗体を指し、全ては特定の抗原上の１つのエピトープに対して特異的である。モノクローナル抗体を作製するために用いる抗原は、病原体の単離タンパク質または病原体全体として提供することができる。「ハイブリドーマ」は、骨髄腫細胞および特異的抗体産生細胞の融合によって形成される雑種細胞からなるクローン細胞系である。一般に、モノクローナル抗体はマウス起源である。しかし、モノクローナル抗体はまた、ファージディスプレイ技術もしくはファージディスプレイと同等の方法によって、または非マウス起源の雑種細胞によって産生された抗原の特定のエピトープに対して作製された抗体のクローン集団をも指す。
【００６０】
本明細書で用いられる「経口」または「経口的」投与は、口を通して、または、それを経由して、対象の身体にワクチンまたは免疫原性組成物等の物質を導入することを指し、嚥下または口腔粘膜を通した輸送（例えば舌下または口腔内粘膜吸収）またはその両方を含む。気管内も経口または経口的投与の手段である。
【００６１】
本明細書で用いられる「経口鼻」投与は、鼻および口を通して、または、それを経由して、対象の身体に免疫原性組成物またはワクチン等の物質を導入することを指し、これは、例えば鼻内に１つ以上の液滴を入れることによって起こる。経口鼻投与は、経口および鼻腔内投与に関連した輸送プロセスを含む。
【００６２】
本明細書で用いられる「パラポックスウイルス」、「パラポックスウイルス株」という用語は、ポックスウイルス科およびパラポックスウイルス属に属するウイルスを指す。
【００６３】
本明細書で用いられる「パラポックスウイルス・オビス」および「ＯＲＦＶ」という用語は、ポックスウイルス科、パラポックスウイルス属およびパラポックスウイルス・オビス種に属するウイルスを指す。これらのウイルスは、伝染性膿疱ウイルス、伝染性膿疱性皮膚炎ウイルスまたはオルフウイルスとも呼ばれる。それらは、それらを他のポックスウイルスから区別する独特の螺旋状の外殻を有する。
【００６４】
「パラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１」という用語は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３６５，３９３号に記載されているウイルスを指す。「パラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１−Ｖ」は、サル細胞系Ｖｅｒｏに適合させたパラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１を指す。
【００６５】
「非経口投与」は、消化管を含まない経路を通して、または、それを経由して、対象の身体にワクチンまたは免疫原性組成物等の物質を導入することを指す。
非経口投与としては、皮下、筋肉内、経皮、皮内、腹腔内、眼内および静脈内投与が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００６６】
本明細書で用いられる「病原体」または「病原微生物」という用語は、その宿主動物内で疾患、疾病または異常状態を誘導するかまたは引き起こす可能性がある微生物、例えばイヌジステンパーウイルス、を意味する。
【００６７】
「医薬的に許容し得る」は、適切な医学的判断の範囲内にある物質であって、過度の毒性、刺激、アレルギー応答等なしで対象の組織に接触する使用に適しており、妥当な効果対危険比に相応し、それらの用途に有効である物質を指す。
【００６８】
本明細書で用いられる「ポリクローナル抗体」は、特定の病原体または抗原に対して作製された抗体の混合集団を指す。一般に、前記集団は様々な抗体群を含み、各群は、病原体または抗原の特定のエピトープに対して特異的である。ポリクローナル抗体を作製するためには、病原体または抗原に対する抗体を宿主が産生するよう誘導する接種または感染によって病原体全体または単離抗原を宿主に導入する。
【００６９】
本明細書で用いられる「ポックスウイルス」という用語は、ポックスウイルス科に属するウイルスを指す。これらのウイルスは、楕円形の、非常に大きな二本鎖ＤＮＡウイルスである。
【００７０】
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、鎖中で共有結合したヌクレオチドモノマーで構成された有機ポリマー分子を意味する。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。
【００７１】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」という用語は、鎖中で結合した２個以上のアミノ酸で構成された有機ポリマー分子を意味する。
【００７２】
本明細書で用いられる「予防する」、「予防すること」または「予防」等の用語は、微生物の複製を阻害すること、微生物の伝染を阻害すること、または微生物がその宿主内でそれ自体を確立することを阻害することを意味する。本明細書で用いられるこれらの用語等は、感染症の１つ以上の徴候または症状を阻害すること、または妨げること、または緩和することを意味することもできる。
【００７３】
ワクチンまたは免疫原性組成物に関して本明細書で用いられる「防御」、「防御すること」、「防御免疫」等は、ワクチンまたは免疫原性組成物で使用された抗原が由来する生物体によって引き起こされる疾患の症状をワクチンまたは組成物が予防または軽減することを意味する。「防御」および「防御すること」等の用語はまた、対象中にすでに存在する疾患または疾患の１つ以上の症状を治療的に処置するためにワクチンまたは免疫原性組成物を用いることができることも意味する。
【００７４】
「組換え的に調製されたＰＰＶ」または「組換えＰＰＶ」は、それらのゲノム内に挿入および／または欠失を有するＰＰＶである。挿入および欠失は、分子生物学的方法を用いて作成される。
【００７５】
「特異的結合」、「特異的に結合する」等の用語は、生理学的またはアッセイ条件下で測定可能であり、選択的である複合体を形成する２個以上の分子として定義される。適切に選択された条件下で、非特異的結合が阻害されると同時にそのような結合が実質的に阻害されない場合、抗体または他の阻害剤はタンパク質に「特異的に結合する」と言われる。特異的結合は、高親和性を特徴とし、化合物またはタンパク質に対して選択的である。非特異的結合は、通常は低親和性を有する。例えば、ＩｇＧ抗体における結合は、一般に、少なくとも約１０−７Ｍ以上、例えば、少なくとも約１０−８Ｍ以上、または少なくとも約１０−９Ｍ以上、または少なくとも約１０−１０以上、または少なくとも約１０−１１Ｍ以上、または少なくとも約１０−１２Ｍ以上の親和性を特徴とする。その用語は、例えば多くの抗原によって担持されない特定のエピトープに対して抗原結合性ドメインが特異的であって、その場合、抗原結合性ドメインを担持する抗体が一般に他の抗原に結合しない場合に適用可能である。
【００７６】
本明細書で用いられる「特異的免疫原性断片」は、その配列に対して特異的な抗体またはＴ細胞が認識可能な配列の一部を指す。
【００７７】
本明細書で用いられる「実質的に同一」は、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性の程度を指す。
【００７８】
本明細書で用いられる「治療上有効量」という用語は、微生物またはサブユニット抗原またはポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたはそれらの組み合わせの量であって、それが投与された対象における免疫応答を誘発するのに十分な量を意味する。
【００７９】
本明細書で用いられる「治療剤」は、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症もしくは真菌感染症、それらによって引き起こされる疾患または状態の処置（治療）を助ける任意の分子、化合物、ウイルスまたは治療薬、好ましくは弱毒化されたもしくは死滅させたウイルス、あるいはサブユニットまたは化合物を指す。
【００８０】
本明細書で用いられる「治療上有効量」は、病原体、例えばウイルス、細菌、寄生虫または真菌による感染によって引き起こされる、有害な健康効果またはその合併症を含む疾患の徴候または症状を予防または寛解させるために適当な抗原またはワクチンまたは免疫原性組成物の投与を受けた対象（例えば犬）における免疫応答を誘導する抗原またはワクチンまたは免疫原性組成物の量を指す。液性免疫もしくは細胞媒介免疫、または液性および細胞媒介免疫の両方を誘導することができる。抗原、ワクチンまたは免疫原性組成物に対する動物の免疫原性応答は、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイを通して間接的に、または野生型株による誘発後の徴候および症状のモニタリングを通して直接的に評価することができる。ワクチンまたは免疫原性組成物によって付与された防御免疫は、排出される誘発生物体の減少、および／または、対象の死亡率、罹患率、体温、ならびに全体的な身体的状態、健康および動作等の臨床徴候の減少を測定することによって評価することができる。治療上有効なワクチンまたは免疫原性組成物の量は、使用する特定の免疫原または対象の状態に応じて変化することができ、当業者によって決定することができる。
【００８１】
本明細書で用いられる「治療する（treat）」、「治療すること（処置すること、treating）」または「処置（treatment）」等の用語は、微生物による感染症を予防するか、軽減するか、または排除することを意味する。また、これらの用語等は、微生物の複製を減少させること、微生物の伝染を減少させること、微生物がその宿主内でそれ自体を確立する能力を減少させること、または微生物がその宿主内でそれ自体を確立することを防ぐことを意味することもできる。また、本明細書で用いられるこれらの用語等は、微生物による感染症の１つ以上の徴候もしくは症状を軽減させること、寛解させること、または排除すること、あるいは微生物による感染症からの回復を早めることを意味することもできる。
【００８２】
本明細書で用いられる「ワクチン接種する」および「ワクチン接種すること」等の用語は、動物にワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを意味する。
【００８３】
本明細書で用いられる「ワクチン」および「ワクチン組成物」という用語は、感染症を予防もしくは軽減するか、または感染症の１つ以上の徴候もしくは症状を予防もしくは軽減する、改変されて生きているか、弱毒化されたか、もしくは死滅されたウイルスもしくは細菌を含む組成物、またはサブユニットワクチン、または上述のものの任意の組み合わせを意味する。病原体に対するワクチンの防御効果は、通常、対象内で免疫応答を誘導することによって達成される。一般的に言って、感染症の発現率の消滅もしくは減少、徴候もしくは症状の寛解、または感染した対象からの微生物の排除の促進は、ワクチン組成物の防御効果を示す。本明細書に記載されるワクチンは、イヌジステンパーウイルスによって引き起こされる感染症に対する防御効果を提供する。
【００８４】
本明細書で用いられる「変異体」という用語は、変異的差異を除けば誘導された配列が所定の配列と本質的に同一である、所定のタンパク質および／または遺伝子配列の誘導体を指す。前記差異は、天然に存在してもよいし、合成もしくは遺伝子操作で作製してもよい。
【００８５】
「ベクター」または「ベクターウイルス」は、異種ＤＮＡの挿入に適切であり、細胞または生物体内に挿入ＤＮＡを輸送することが可能であり、適切な場合、異種ＤＮＡを発現させることを可能にするＰＰＶである。
【００８６】
本明細書で用いられる「獣医学的に許容し得る」という用語は、適切な医学的判断の範囲内にある物質であって、過度の毒性、刺激、アレルギー応答等を伴うことなく動物の組織に接触する使用に適しており、妥当な効果対危険比に相応し、それらの用途に有効である物質を指す。
【００８７】
本明細書で用いられる「獣医学的に許容し得る担体」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、かつそれが投与される獣医学対象にとって有毒でない担体媒体を指す。
【００８８】
ウイルス、免疫原性組成物およびワクチン
本発明は、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスの調製のためのパラポックスウイルスの使用を包含する。
【００８９】
一態様においては、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスの調製のためのパラポックスウイルス・オビス（ＰＰＶＯ）が用いられる。別の態様においては、パラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１が用いられる。この株は、米国特許第６，３６５，３９３号、Rziha et al., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145、およびCottone, et al., 1998, Virus Research, 56, 53-67に記載されている。更なる態様においては、パラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖが用いられる。
【００９０】
パラポックスウイルスに挿入される遺伝子配列は、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む。一態様において、異種ＤＮＡは、イヌジステンパーウイルスのＨタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、異種ＤＮＡは、配列番号１、または配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。イヌジステンパーウイルスのＨ遺伝子を含むクローン化断片の完全な配列（配列番号１）を図７に示す。それは、制限酵素クローニングおよび分析（ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ）のための５’（２０ｎｔ）および３’（２１ｎｔ）末端上のリンカー配列を有する完全長コード領域（１８２４ｎｔ）を含む。一態様において、異種ＤＮＡは、イヌジステンパーウイルスのＦタンパク質をコードする遺伝子またはその断片を含む。一態様において、異種ＤＮＡは、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。イヌジステンパーウイルスのＦ遺伝子を含むクローン化断片の完全な配列（配列番号２）を図８に示す。それは、制限酵素クローニングおよび分析（ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ）のための５’（１９ｎｔ）および３’（１６ｎｔ）末端上のリンカー配列を有する完全長コード領域（１９８９ｎｔ）を含む。
【００９１】
ポリヌクレオチドの配列についての知識によって、そのポリヌクレオチドのあらゆる可能な断片が容易に利用可能になる。ゆえに、本発明は、Ｈタンパク質の断片を提供する。ゆえに、本発明はまた、Ｆタンパク質の断片をも提供する。一態様においては、機能的断片が提供される。別の態様においては、生物学的活性断片が提供される。断片は、例えば濾過またはクロマトグラフィ等の従来の方法によって精製することができる。断片は、当業者に公知の方法による組換えによって作製することができる。
【００９２】
組換えパラポックスウイルスの調製においては、パラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１のＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｈ／Ｈの中に異種ＤＮＡを挿入する。別の態様においては、パラポックスウイルス・オビス株Ｄ１７０１のＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｈ／Ｈの中のＶＥＧＦコード配列または隣接する非コード配列の中に異種ＤＮＡを挿入する。異種ＤＮＡをパラポックスウイルスに挿入するために用いる方法は標準的であり、当業者に公知である。それらは、米国特許第６，３６５，３９３号に記載されている。
【００９３】
一態様において、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスは、パラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈまたはパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆである。これらのウイルスは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約を遵守して、健康保護局カルチャーコレクション（Health Protection Agency Culture Collections）（ＨＰＡカルチャーコレクション）の一部である欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）（英国、ウィルトシアＳＰ４  ０ＪＧ、サリスバリー、ポートンダウン）に寄託されている。
【００９４】
プラスミドｐｄＶ−ＣＤＶ−Ｈの配列（７，９７５ｎｔ）は配列番号３であり、それは配列表に示される。
【００９５】
プラスミドｐｄＶ−ＣＤＶ−Ｆの配列（８，１３４ｎｔ）は配列番号４であり、それは配列表に示される。
【００９６】
本発明はまた、本明細書に記載される配列と少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９３％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、および少なくとも約５０％の同一性および／または相同性を有するポリヌクレオチド配列をも包含する。
【００９７】
本発明はまた、本明細書に記載される配列番号のいずれか１つの非コード鎖または補体に厳密性が中〜高程度の条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列およびその種相同体をも包含する。例示的な厳密性の高い条件としては、６５℃〜７５℃における０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含む緩衝液中での最終的洗浄が挙げられるのに対して、例示的な厳密性が中程度の条件としては、３５℃〜４５℃における２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含む緩衝液中での最終的洗浄が挙げられる。同等の厳密性の条件は、Ausubel, et al. (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pp. 6.0.3 to 6.4.10に記載されているように温度および緩衝液または塩濃度の変化を通して達成することができることが本技術分野で分かっている。
【００９８】
組換えＰＰＶは、細胞、細胞系および宿主細胞内で増殖させることができる。前記細胞、細胞系または宿主細胞としては、例えば、哺乳動物細胞および非哺乳動物細胞であってよいが、それらに限定されるものではない。ＰＰＶを増殖させ得る細胞、細胞系および宿主細胞は、容易に知られており、当業者が利用可能である。一態様においては、Ｖｅｒｏ細胞が用いられる。他の態様においては、ウシ腎臓またはヒツジ精巣細胞が用いられる。
【００９９】
組換えＰＰＶは、免疫原性組成物またはワクチンにおける使用前に更に弱毒化または不活性化させることができる。弱毒化および不活性化の方法は、当業者に周知である。弱毒化のための方法としては、適切な細胞系上における細胞培養物内での連続継代、紫外線照射および化学的突然変異生成が挙げられるが、それらに限定されるものではない。不活性化のための方法としては、ホルマリン、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）もしくはバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）による処置、または当業者に公知の他の方法が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０１００】
ホルマリンによる不活性化は、ウイルス懸濁液を３７％のホルムアルデヒドと混合してホルムアルデヒド終濃度を０．０５％とすることによって行うことができる。室温でおよそ２４時間一定に撹拌することによってウイルス−ホルムアルデヒド混合物を混合する。次いで、適切な細胞系上の成長についてアッセイして、不活性化ウイルス混合物を生き残ったウイルスについて試験する。
【０１０１】
ＢＥＩによる不活性化は、本発明のウイルス懸濁液を０．１ＭのＢＥＩ（０．１７５Ｎ  ＮａＯＨ中における２−ブロモ−エチルアミン）と混合してＢＥＩ終濃度を１ｍＭとすることによって行うことができる。室温でおよそ４８時間一定に撹拌することによってウイルス−ＢＥＩ混合物を混合した後、１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウムを添加して終濃度を０．１ｍＭとする。混合を更に２時間続ける。適切な細胞系に関する成長についてアッセイして、不活性化ウイルス混合物を生き残ったウイルスについて試験する。
【０１０２】
組換えＰＰＶは、免疫原性組成物およびワクチンで用いることができる。
【０１０３】
免疫原性組成物およびワクチンは、製剤用ビヒクル、賦形剤または媒体の役割をする液体、半固体または固体希釈剤を含む１種以上の獣医学的に許容し得る担体を場合によって含んでいてもよい。本明細書で用いる場合、「獣医学的に許容し得る担体」としては、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗細菌および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤等が挙げられる。希釈剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を挙げることができる。等張剤としては、当業者に周知の塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。安定剤としては、当業者に周知のアルブミンが挙げられる。保存剤としては、当業者に周知のメルチオレート（merthiolate）が挙げられる。
【０１０４】
アジュバントとしては、当業者に公知の多くの他のものの中で、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、例えばフロイント完全および不完全アジュバント、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、ジョージア州アトランタ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア州エメリービル）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、アラバマ州バーミンガム）もしくは他のサポニン分画物、モノホスホリルリピドＡ、アブリジンリピド−アミンアジュバント（Avridine lipid-amine adjuvant）、大腸菌（組換え体等）由来の易熱性毒素、コレラ毒素またはムラミルジペプチドが挙げられるが、それらに限定されるものではない。本発明の文脈において有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は、当業者によって容易に決定することができる。一態様において、本発明は、約５０μｇ〜約２０００μｇのアジュバントを含む免疫原性組成物およびワクチンについて検討する。別の態様において、アジュバントは、約１００μｇ〜約１５００μｇ、または約２５０μｇ〜約１０００μｇ、または約３５０μｇ〜約７５０μｇの量で含まれる。別の態様において、アジュバントは、免疫原性組成物またはワクチンの約５００μｇ／２ｍｌ用量の量で含まれる。
【０１０５】
免疫原性組成物およびワクチンは抗生物質を含んでいてもよい。そのような抗生物質としては、アミノグリコシド、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、マクロライド、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミドおよびテトラサイクリン
のクラスからのものが挙げられるが、それらに限定されるものではない。一態様において、本発明は、約１μｇ／ｍｌ〜約６０μｇ／ｍｌの抗生物質を含む免疫原性組成物およびワクチンについて検討する。別の態様において、免疫原性組成物およびワクチンは、約５μｇ／ｍｌ〜約５５μｇ／ｍｌの抗生物質、または約１０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの抗生物質、または約１５μｇ／ｍｌ〜約４５μｇ／ｍｌの抗生物質、または約２０μｇ／ｍｌ〜約４０μｇ／ｍｌの抗生物質、または約２５μｇ／ｍｌ〜約３５μｇ／ｍｌの抗生物質を含む。更に別の態様において、免疫原性組成物およびワクチンは、約３０μｇ／ｍｌ未満の抗生物質を含む。
【０１０６】
組換えＰＰＶに加えて、免疫原性組成物およびワクチンは、他の抗原を含んでいてもよい。抗原は、微生物の不活性化された全体的もしくは部分的調製物の形態であってもよく、または遺伝子工学技術もしくは化学合成によって得られた抗原分子の形態であってもよい。本発明による使用に適切な他の抗原としては、病原性細菌または病原性ウイルスに由来するものが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０１０７】
組換えイヌジステンパーウイルス免疫原性組成物およびワクチンは、例えばエールリヒア・カニス（Ehrlichia canis）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩ）、イヌアデノウイルスＩＩ型（ＣＡＶ−２）、イヌアデノウイルス（ＣＡＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、レプトスピラ・イクテロヘモリジア（Leptospira icterohemorrhagiae）（ＬＩ）、レプトスピラ・カニコーラ（Leptospira canicola）（ＬＣ）、レプトスピラ・グリポティフォーサ（Leptospira grippotyphosa）（ＬＧ）、レプトスピラ・ポモナ（Leptospira pomona）（ＬＰ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）等の１種以上の更なるイヌ抗原との混合物を場合によって含んでいてもよい。抗原の１つの組み合わせは、コロナウイルスおよびレプトスピラ（新興血清型レプトスピラ・グリポティフォーサおよびレプトスピラ・ポモナを含む）を有するまたは有さない、イヌパルボウイルス、イヌアデノウイルスおよびイヌパラインフルエンザの分離株を包含する。
【０１０８】
本明細書に記載される免疫原性組成物およびワクチンは、ＣＤＶに対する有効な免疫応答を誘導するために動物に投与することができる。従って、ＣＤＶに対する有効な免疫応答を刺激する方法であって、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスを含む治療上有効量の免疫原性組成物またはワクチンを動物に投与することを含む方法が本明細書において記載される。一態様において、前記方法は、抗Ｈタンパク質血清抗体の誘導をもたらす。別の態様において、前記方法は、抗Ｆタンパク質血清抗体の誘導をもたらす。
【０１０９】
本明細書に記載される免疫原性組成物およびワクチンは、イヌジステンパー疾患に対して動物対象にワクチン接種を行うために動物に投与することができる。免疫原性組成物およびワクチンは、動物におけるイヌジステンパー疾患を予防または治療するために動物に投与することができる。従って、イヌジステンパー疾患に対して動物にワクチン接種を行い、イヌジステンパー疾患を予防または治療する方法であって、イヌジステンパーウイルスに由来する異種ＤＮＡを含む組換えパラポックスウイルスを含む治療上有効量の免疫原性組成物またはワクチンを動物に投与することを含む方法が本明細書において記載される。
【０１１０】
形態、投与量、投与経路
免疫原性組成物およびワクチンは、投与経路に応じて様々な形態で作製することができる。例えば、免疫原性組成物およびワクチンは、注射用に適した滅菌水溶液もしくは分散液の形態で作製することができるか、または凍結乾燥技術を用いて凍結乾燥形態で作製することができる。凍結乾燥された免疫原性組成物およびワクチンは、典型的には約４℃で維持され、安定化溶液（例えば生理食塩水およびＨＥＰＥＳ）で戻すことができる。別の場合、凍結乾燥によって免疫原性組成物およびワクチンを保存することができる。免疫原性組成物およびワクチンは、懸濁液またはエマルジョンの形態で作製することもできる。
【０１１１】
免疫原性組成物およびワクチンは、治療上有効量の上記組換えＰＰＶを含む。精製ウイルスを免疫原性組成物もしくはワクチン中に直接用いることができるか、または更に弱毒化もしくは不活性化することができる。典型的には、免疫原性組成物またはワクチンは、約１×１０２〜約１×１０１２ＰＦＵ、または約１×１０３〜約１×１０１１ＰＦＵ、または約１×１０４〜約１×１０１０ＰＦＵ、または約１×１０５〜約１×１０９ＰＦＵ、または約１×１０６〜約１×１０８ＰＦＵを含む。防御効果を提供するために有効な免疫原性組成物またはワクチン中のウイルスの正確な量は、当業者が決定することができる。
【０１１２】
免疫原性組成物およびワクチンは、一般に、約０．５ｍｌから約５ｍｌの間の体積の獣医学的に許容し得る担体を含む。別の態様において、担体の体積は、約１ｍｌから約４ｍｌの間、または約２ｍｌから約３ｍｌの間である。別の態様において、担体の体積は、約１ｍｌ、または約２ｍｌ、または約３ｍｌ、または約５ｍｌである。免疫原性組成物およびワクチンにおける使用に適切な獣医学的に許容し得る担体は、本明細書に記載されるもののいずれかであることができる。
【０１１３】
当業者は、投与前にウイルスを弱毒化または不活性化する必要があるのかどうかについて容易に決定することができる。別の態様において、組換えＰＰＶは、更に弱毒化することなく動物に直接投与することができる。治療上有効なウイルスの量は、動物の状態および感染の程度を含む幾つかの因子のいずれかに応じて変化する可能性があり、当業者が決定することができる。
【０１１４】
本発明の方法によれば、単一用量を動物に投与することが可能であり、または、それに代えて２回以上の接種を約２〜約１０週間の間隔で行うことができる。追加抗原刺激計画を必要とする可能性があり、最適な免疫化を提供するために投与量計画を調整することができる。当業者は、最適な投与計画を容易に決定することができる。
【０１１５】
免疫原性組成物およびワクチンは、血流内に、筋肉内に、または内部臓器内に直接投与することができる。それらは、経口的にまたは鼻腔内に投与することができる。非経口投与のための適切な手段としては、静脈内、動脈内、腹腔内、鞘内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内および皮下が挙げられるが、それらに限定されるものではない。非経口投与のための適切な装置としては、針（顕微針を含む）、注射器、無針注射器および注入技術が挙げられる。
【０１１６】
非経口製剤は、典型的には、賦形剤、例えば塩、炭水化物および緩衝剤（好ましくは、約３〜約９、または約４〜約８、または約５〜約７．５、または約６〜約７．５、または約７〜約７．５のｐＨに）を含有し得る水溶液であるが、幾つかの適用のために、それらは、滅菌非水溶液として、または滅菌した、発熱性物質を含まない水等の適切なビヒクルと共に用いられる乾燥形態として、より適切に製剤化することができる。
【０１１７】
例えば凍結乾燥による、滅菌条件下における非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的医薬技術を用いて容易に達成することができる。
【０１１８】
イヌジステンパー疾患に対して動物にワクチン接種を行うための薬物の調製に、本明細書に記載される組換えパラポックスウイルスおよび免疫原性組成物およびワクチンを用いることができる。
【０１１９】
本発明は、動物対象内に存在するパラポックスウイルスの起源を決定する方法を提供する。
【０１２０】
ＤＩＶＡワクチン（ワクチン接種動物から感染動物を区別することが可能なもの）を利用するワクチン接種は、動物対象内に存在するパラポックスウイルスの起源を決定するための手段を提供する。この区別は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法およびＰＣＲを含むがそれらに限定されるものではない各種の診断方法のいずれかによって達成することができる。これらの方法および他の方法は当業者に容易に認識されかつ知られている。
【０１２１】
本明細書に記載されるパラポックスウイルスは、それらのゲノム組成および発現するタンパク質の両方とも野生型株と区別することができる。そのような区別により、ワクチン接種と感染動物の間の識別が可能になる。例えば、特定の実験室試験においてパラポックスウイルスに対して試験が陽性である動物が、野生型パラポックスウイルス株を有するかどうかを、またはすでにワクチン接種を通して得られた組換えパラポックスウイルスを有するかどうかを決定することができる。
【０１２２】
その決定を行うために様々なアッセイを用いることができる。例えば、パラポックスウイルスに対する試験が陽性である動物からウイルスを分離することでき、以前のワクチン接種を示すパラポックスウイルスゲノムの存在を決定するために核酸ベースのアッセイを用いることができる。核酸ベースのアッセイとしては、サザンまたはノーザンブロット分析、ＰＣＲおよび配列決定が挙げられる。別の場合、タンパク質ベースのアッセイを用いることができる。タンパク質ベースのアッセイでは、感染が疑われる細胞または組織をパラポックスウイルスに対する試験が陽性である動物から単離することができる。細胞抽出物は、そのような細胞または組織から作製でき、例えば、すでに接種した組換えパラポックスウイルスまたは野生型パラポックスウイルスのどちらかの存在を区別して同定することができるウイルスタンパク質に対する適切な抗体を用いたウエスタンブロット法に付すことができる。
【０１２３】
動物において誘導される免疫応答の程度および性質は、様々な技術を用いて評価することができる。例えば、接種動物から血清を回収し、例えば従来のＥＬＩＳＡでパラポックスウイルスに対して特異的な抗体の有無について試験することができる。リンパ組織内の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答の検出は、細胞性免疫応答の誘導を示すＴ細胞分裂増殖等のアッセイによって達成することができる。関連技術は、本技術分野において、例えばColigan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994)に十分に記載されている。
【０１２４】
組換えパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈは、ＤＩＶＡアッセイで用いることができる。一態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーＮ−遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。別の態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーＰ−遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。更に別の態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーＬ−遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。更に別の態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーＭ−遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。
【０１２５】
組換えパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆは、ＤＩＶＡアッセイで用いることができる。一態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーＮ−遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。別の態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーＰ−遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。更に別の態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーＬ−遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。更に別の態様において、それは、ワクチン接種動物から感染動物を区別するためにイヌジステンパーＭ−遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイで用いることができる。
【０１２６】
以下の例証となる非限定的な実施例によって本発明を更に記載する。
【実施例】
【０１２７】
実施例１．ＣＤＶ−ＨおよびＣＤＶ−Ｆタンパク質を発現する組換えウイルスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−ＨおよびＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆの作製
ＣＤＶのＨタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えパラポックスウイルス・オビス、およびＣＤＶのＦタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えパラポックスウイルス・オビスを作製した。ＨおよびＦタンパク質の発現を評価した。
【０１２８】
組換えパラポックスウイルス・オビスＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−ＨおよびＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆの作製のために、パラポックスウイルス・オビス（ＰＰＶＯ）ベクター系（米国特許第６，３６５，３９３号；Rziha et al., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145；Fischer et al., 2003, J. Virol. 77, 9312-9323；Henkel et al., 2005, J. Virol. 79, 314-325）を用いた。ＰＣＲによってウイルス株ＲｏｃｋｂｏｒｎからＣＤＶ−Ｈ遺伝子およびＦ遺伝子を得て、ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ制限消化、アガロースゲル（０.８％ｗ／ｖ）電気泳動、およびＱｉａｅｘ  ＩＩゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎ；ドイツ）による精製に続いて、大きさが１８６５ｂｐ（Ｈ）または２０２４ｂｐ（Ｆ）のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ  ＤＮＡ断片としてクローニングした。プラスミドｐｄＶ−Ｒｅｃ１（Fischer et al., 2003）をＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで二重消化し、ライゲーション（Ｆａｓｔライゲーションキット、Ｐｒｏｍｅｇａ；ドイツ）に用いた。大腸菌ＤＨ５αＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）の形質転換後、プラスミドＤＮＡのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ制限消化によって挿入陽性コロニーを選択した。これによって、転移プラスミドｐｄＶ−ＣＤＶ−Ｈ（図１Ａ）または転移プラスミドｐｄＶ−ＣＤＶ−Ｆ（図１Ｂ）が得られた。前記プラスミド内の関連の制限部位およびそれらのヌクレオチド（nulceotide）位置を前記図に示す。アンピシリン抵抗性遺伝子（ＡｍｐｉＲ）ならびにＴ７およびＳＰ６プロモーターも示される。Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；ドイツ）によって両転移プラスミドを調製し、ＤＮＡ塩基配列決定のために用いた。この目的のために、ｐｄＶ−Ｒｅｃ１内の挿入部位の上流に位置するプライマーＯＲＦ３２Ｎ（配列番号５；５’−ＧＣＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＴＧＣＧＣＴＡＣＣＡＡＴＴＣＧＣＧＣ−３’）および挿入部位の下流に位置するプライマーＯＲＦ３１Ｎ（配列番号６；５’−ＧＣＡＴＣＣＣＧＴＴＡＣＣＡＣＣＧＧＡＧＡＣＣＧＡＣＧＣＴＣＣＣ−３’）、ならびに内部Ｈ遺伝子特異的プライマーＣＤＨ−Ｆ（配列番号７；５’−ＣＡＧＡＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＴＣ−３’）およびＣＤＨ−Ｒ（配列番号８；５’−ＧＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＡＴＧＴＣＡＡＣＣＧＣ−３’）をそれぞれ用いた。これによって、挿入Ｈ遺伝子の完全な配列（配列番号１）の決定が可能になった。内部Ｆ遺伝子特異的プライマーＣＤＦ−Ｆ（配列番号９、５’−ＣＣＣＴＧＣＴＡＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＧＴＣＧＴＧＴＧ−３’）およびＣＤＦ−Ｒ（配列番号１０、５’−ＣＧＴＴＡＴＡＣＣＡＴＡＴＣＡＧＧＧＴＡＴＴＧＣＣＴＣＣ−３’）によって、完全なＦ遺伝子配列（配列番号２）の決定が可能になった。
【０１２９】
Ｂｌｕｏ−Ｇａｌ染色による組換え体の選択
Ｖｅｒｏ細胞（１０６個の細胞）を０．１ＭＯＩ（感染多重度）のｌａｃＺ発現ウイルスＤ１７０１−ＶｒＶで感染させ、２時間後に製造業者の推奨（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ；Ｌｏｎｚａ、ドイツ）に従ってヌクレオフェクションによって２μｇのｐｄＶ−ＣＤＶ−ＨまたはｐｄＶ−ＣＤＶ−ＦプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。３〜４日後にウイルス溶解物を採取し、６ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）内でＶｅｒｏ細胞に関する滴定のために用いた。プラークが見えるようになった際、記載されているように（Fischer et al., 2003）、アガロース含有Ｂｌｕｏ−Ｇａｌを被せた。外観が白色のウイルスプラークを採集し、４８ウェルプレートの単一ウェル内でＶｅｒｏ細胞（１×１０５個の細胞）の同時感染のために単一プラーク溶出液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に４℃で終夜）を用いた。
【０１３０】
プラーク−ＰＣＲによる組換え体の選択
Pasamontes et al.（J. Virol. Methods 35:137-141; 1991）の方法を改良して、各ウイルスプラーク分離株からのＤＮＡの単離を行った。ウイルス溶解物（０．２ｍｌ）を３回凍結（−７０℃）および融解（３７℃）し、氷上で３回、２０〜３０秒間超音波破砕した（超音波水浴）。フェノールおよびクロロホルム抽出の後、１０μｇの酵母ｔＲＮＡまたは３μｌのＧｌｙｃｏＢｌｕｅ（Ａｍｂｉｏｎ；ドイツ）を加えた後、エタノール沈殿を行った。ＤＮＡペレットを７０％（ｖ／ｖ）のエタノールで２回洗浄し、乾燥後に１４μｌの２回蒸留水（aqua bidest）に溶解した。
【０１３１】
ＣＤＶ−Ｈ特異的ＰＣＲのために、４．０ｐｍｏｌのＣＤＨ−Ｆ（配列番号７）および４．０ｐｍｏｌのＣＤＨ−Ｒ（配列番号８）のプライマーからなる１μｌのプライマー混合物ならびに５μｌのＲｅｄｄｙＭｉｘ  ２×ＰＣＲ（Ａｂｇｅｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）と４μｌのＤＮＡを氷上で混合した。ＰＣＲは、Ｔｒｉｏ  Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ；ドイツ）内で、９８℃で２分間インキュベートした後、９６℃で１分間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、および７２℃で２分間の最終拡張工程を４０サイクル行うことによって実施した。ＣＤＶ−Ｆ特異的ＰＣＲについては、プライマーＣＤＦ−ＦおよびＣＤＦ−Ｒをそれぞれ用いて、（６５℃の代わりに）６８℃で３０秒間を除いて同一の条件を用いた。水平の１％（ｗ／ｖ）アガロース−臭化エチジウム（１ｍｌ当たり０．３マイクログラム）ゲルでＰＣＲ産物を分離した。大きさが６８６ｂｐのＨ遺伝子特異的ＰＣＲ断片を示すプラーク分離株からのウイルス溶解物を希釈し、上記のようにＢｌｕｏ−Ｇａｌアガロースオーバレイを用いて更に少なくとも３回プラーク精製した。また、大きさが７６６ｂｐのＦ遺伝子特異的ＰＣＲ断片を示すプラスミドｐｄＶ−ＣＤＶ−Ｆによるトランスフェクションからのプラーク分離株も、Ｈ遺伝子含有ウイルスプラークについて記載したように更にプラーク精製した。最後に、４μｌのＤＮＡ、３．９５ｐｍｏｌのプライマーｌａｃＺ−Ｆ（配列番号１１；５’−ｃｇａｔａｃｔｇｔｃｇｔｃｇｔｃｃｃｃｔｃａａ−３’）および４．１３ｐｍｏｌのプライマーｌａｃＺ−Ｒ（配列番号１２；５’−ｃａａｃｔｃｇｃｃｇｃａｃａｔｃｔｇａａｃｔ−３’）を用いたＬａｃＺ遺伝子特異的ＰＣＲで、ＨまたはＦ遺伝子に対して陽性の組換えウイルスプラーク分離株のＤＮＡを試験した。５μｌのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）を加えた後、９８℃で２分間加熱し、その後９６℃で１分間、６２℃で３０秒間および６８℃で９０秒間、そして６８℃で２分間の最終拡張工程を４０サイクル行うことによってＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の分離は、上記のように行った。大きさが５０８ｂｐのＬａｃＺ遺伝子特異的断片がなかったので、対応する組換えウイルスプラーク分離株が、３回のプラーク精製後にＬａｃＺ発現親ウイルスＤ１７０１−ＶｒＶを含まないことが分かった。Ｄ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−ＨおよびＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆの高力価ウイルス保存液の調製後、後述するようにウイルスＤＮＡを調製し、ＣＤＶ−ＰＣＲおよびＬａｃＺ−ＰＣＲにおける試験に用いた。
【０１３２】
組換えウイルスプラークの免疫組織化学的染色（ＩＰＭＡ）
挿入された外来遺伝子の発現の成功が、２４ウェルプレート内でＶｅｒｏ細胞に関して滴定した組換えウイルスプラークの免疫組織化学的染色を含むＩＰＭＡによって最初に試みられた。ウイルスプラークの外観試験の後、各ウェルから培地を吸引し、ラミナーフローフード内でプレートをおよそ１０分間開いたままで細胞を乾燥させた。その後、−２０℃で１５〜２０分間氷冷無水メタノールで細胞を固定した。氷冷１％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＰＢＳで２回洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含有するＰＢＳで細胞を室温（ＲＴ）で９０分間ブロックした。外来遺伝子発現の検出は、１：２．０００で希釈したＦタンパク質に対する多クローン性ウサギ（Ｒ）抗血清（Ｐ．Ｐｌａｔｔｅｔ  ＆  Ａ．Ｚｕｒｂｒｉｇｇｅｎ（ベルン大学、スイス）により提供）（図２Ａ）または１％のＦＣＳを含むＰＢＳ中で１：１．０００で希釈した多クローン性Ｈタンパク質特異的ウサギ抗血清ＭＣ７１１（Ｖ．ｖｏｎ  Ｍｅｓｓｌｉｎｇ（ケベック大学、カナダ）により提供）（図２Ｂ）による室温で６０分間のインキュベーションによって達成された。ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した後、１：２０００で希釈したペルオキシダーゼ結合抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ−ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ．、ＤＩＡＮＯＶＡ；ドイツ）を加え、室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴおよびＰＢＳによる完全な洗浄の後、基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｎｏｖａ  Ｒｅｄ、Ａｘｘｏｒａ；ドイツ）を、赤褐色の陽性の染色が現れるまで、製造業者の指示書の推奨にしたがって加えた。陰性対照として、１：１００で希釈した、Ｆタンパク質に対する多クローン性ウサギ抗血清で非感染細胞をインキュベートした（図２Ｃ）。Ｄ−１７０１−ＶｒＶまたはＤ−１７０１−Ｖを感染させた細胞も陰性対照として用いた。ウイルスプラークおよび感染細胞は、ＣＤＶのＦタンパク質（図２Ａ）およびＨタンパク質（図２Ｂ）に対して陽性が強いことが分かった。
【０１３３】
実施例２．Ｄ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−ＨおよびＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆの特性決定
ウイルス保存液の調製
Ｄ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−ＨおよびＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆの高力価組換えウイルス保存液を得るため、１０〜２０個のＴ１５０培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ；ドイツ）を同時に０．５のＭＯＩで感染させた。３日後、およそ８０％の細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められ、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、４℃で２時間）のために全フラスコの細胞および上清を採取し、回収した。慎重に上清を除去し、ウイルスペレットを１〜２ｍｌのＰＢＳに４℃で終夜溶解させた。１０秒間の３パルス（１００Ｗ）（各パルス間に１０秒間の破壊）を用いて氷上での音波処理（音波細胞破壊器（Sonic cell disruptor）、Ｂｒａｎｓｏｎ；ドイツ）によってウイルス懸濁液を完全に分散させた後、遠心分離（５００〜７００×ｇ、１０分間、４℃）を行い、細胞破壊片を除去した。上清を氷上で保管して、１．０ｍｌのＰＢＳ中に細胞ペレットを再懸濁させ、氷上で超音波破砕した（その間に１０秒間の休止を伴う２０秒間で２回、次いで３０秒間で１回）。低速遠心分離の後、その上清を最初の上清と組み合わせ、一定分量に分け、滴定し、−７０℃で保管した。
【０１３４】
ウイルスＤＮＡの特性決定
Ｖｅｒｏ細胞をＭＯＩ０．５で感染させ、２〜３日後（およそ８０％のＣＰＥ）にトリプシン処理および４℃の短時間の低速遠心分離によって採取した。Ｍａｓｔｅｒ  Ｐｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏｚｙｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）を用いて、製造業者の手順に従ってＤＮＡを単離した。
【０１３５】
正確な座位におけるＣＤＶ−ＨまたはＦ遺伝子の挿入を確認するため、２μｇのＤＮＡを制限酵素で消化し、０．８％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル内で分離し、標準的手法に従ってサザンブロットハイブリダイゼーションのためのナイロン膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ドイツ）に転移させた。ＣＤＶ−ＨまたはＦ遺伝子特異的プローブ（ＣＤＶ−ＨまたはＣＤＶ−Ｆ  ＰＣＲの産物）をゲル単離し、ＲｅｄｉＰｒｉｍｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ドイツ）を用いて放射性物質で標識した（３２Ｐ−ｄＣＴＰ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ；ドイツ）。次いでこれをサザンブロットハイブリダイゼーションに用い、０．５％（ｗ／ｖ）の脱脂乳粉末、１．０％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および０．５ｍｇ／ｍｌの変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ（ＫＴ−ＤＮＡ、Ｓｉｇｍａ；ドイツ）を含有する４×ＳＳＰＥ（１×＝０．１８ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＰＰ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中で５０℃の条件下で実施した。Ｘ線（Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ；ドイツ）の曝露の後、０．４ＮのＮａＯＨ中で、４５℃で３０〜６０分間のインキュベーションによってプローブをフィルタから除去し、その後０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で１００℃の短時間インキュベーションを行った。２回目のハイブリダイゼーションのために、文献（Cottone et al., 1998. Virus Res. 56, 53-67）の記載に従ってｖｅｇＦ−Ｅ座位を含むＤ１７０１−ＶのＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｈを用いた。サザンブロットの結果から、Ｄ１７０１−ＶｒＶのゲノム内へのＨまたはＦ遺伝子の正確な挿入が確認された。
【０１３６】
ＣＤＶ−ＨまたはＦ遺伝子特異的ＲＮＡの検出
Ｖｅｒｏ細胞を３〜５のＭＯＩで感染させ、感染後（ｐ．ｉ．）、異なる時点で、ＳｕｒｅＰｒｅｐ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）を用いてトータルＲＮＡを単離した。更に、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ；０．０４ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ；ドイツ）またはシクロヘキシミド（ＣＨＸ、０．１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｅｒｖａ；ドイツ）の存在下で感染させた細胞からＲＮＡを抽出し、挿入されたＨ−またはＦ−遺伝子の初期発現について試験した。対照として、非感染細胞からＲＮＡを単離した。ホルムアルデヒドを含む変性１％アガロースゲルでそれらのＲＮＡを分離し、文献（Kroczek, R.A. & Siebert, E. Anal. Biochem. 184:90-95, 1990）の記載にしたがってナイロン膜に転移させた。放射性物質で標識したＣＤＶ−ＨまたはＣＤＶ−ＦのＰＣＲ断片を４２℃のＵｌｔｒａＨｙｂ溶液（Ａｍｂｉｏｎ；ドイツ）中でハイブリダイゼーションプローブとして用いた。結果は、ＯＲＦＶの初期ｖｅｇＦ−Ｅプロモーターの制御下のその調節によるＣＤＶ−ＨまたはＣＤＶ−Ｆ遺伝子の前初期発現を明確に示した（Rziha et al. 1999, J. Biotechnol., 73, 235-242）。
【０１３７】
免疫蛍光法によるＣＤＶのＨまたはＦタンパク質の検出
免疫蛍光法のために、１．０のＭＯＩで、４チャンバースライド（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ；ドイツ）内でＶｅｒｏ細胞（１×１０５個／ｍｌ）を感染させた。感染後、異なる時点で細胞を培地で洗浄し、３７℃で１５分間、３．７％（ｖ／ｖ）メタノールを含まないホルムアルデヒド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）で固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、３７℃で５分間の０．２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００による処置によって細胞を透過化処理した。ＰＢＳ洗浄後、３７°Ｃで３０〜４０分間、５％のＦＣＳを含むＰＢＳで細胞をブロックした。ＣＤＶ−ＨまたはＣＤＶ−Ｆタンパク質の検出のため、ウサギ抗−ＣＤＶ−Ｈ抗体（１：２０００で希釈）またはウサギ抗−ＣＤＶ−Ｆ抗体（１：２００で希釈）、および抗ウサギ−Ａｌｅｘａ−５５５（１：２０００で希釈）を用いて細胞を３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで５回洗浄した後、ＰＢＳに１：２０００で希釈した二次抗ウサギＡｌｅｘａ−５５５または抗ウサギＡｌｅｘａ−４８８抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；ドイツ）を用いて、３７℃で３０分間、暗所でスライドをインキュベートした。陰性対照として、非感染細胞を用いた。
【０１３８】
ＯＲＦＶによる感染の後の後期の時点での細胞の検出は、Ｒｕｄｉｇｅｒ  Ｒａｕｅ博士（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ、英国）によって提供されたＯＲＦＶ特異的ウサギ抗血清ＰＡＳ２２７４を用いて実施した。１％ＦＣＳを有するＰＢＳに血清を１：１００で希釈し、１：２０００の希釈率で二次抗体（抗ウサギＡｌｅｘａ−４８８）を用いた。
【０１３９】
製造業者（Ｂｉｏｔｉｕｍ；ドイツ）の指示書に従ってＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ−６４７でアクチン細胞骨格の染色を行った後、暗所において室温で２０〜３０分間、０．０４μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２’−フェニルインドールジヒドロクロリド；ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ；ドイツ）で核の染色を行った。ＰＢＳ中での完全な洗浄の後、スライドにＭｏｗｉｏｌ−ＤＡＢＣＯを固定し、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いてＺｅｉｓｓ社のＡｐｏＴｏｍｅで蛍光撮像を行った。ＤＡＰＩで核を染色した。
【０１４０】
図３に示される結果からは、各組換え体で感染させた（ＭＯＩ＝１．０）Ｖｅｒｏ細胞内におけるＣＤＶ−Ｈタンパク質またはＣＤＶ−Ｆタンパク質の強い発現が明らかである。後期に感染させた細胞は、抗血清ＰＡＳ２２７４による特異的染色によって更に同定することができた。非感染細胞またはＤ１７０１−ＶもしくはＤ１７０１−ＶｒＶを感染させた細胞の使用を介して染色の特異性を試験した。
【０１４１】
ウエスタンブロット法によるＣＤＶ−ＨまたはＦタンパク質の検出
Ｖｅｒｏ細胞（３×１０５個の細胞）を３．０のＭＯＩで同時に感染させ、５％ＣＯ２雰囲気において３７℃でインキュベートした。感染後の異なる時点で細胞および上清を採取し、遠心分離し（８，９００×ｇ、１０分間、４℃）、細胞沈降物を１．０ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を含有する０．１５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。氷上で３０分後、溶解物を１５．０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）のために上清を保存した。この目的のために、３部の溶解物を１部の４×ＤｕａｌＣｏｌｏｒタンパク質負荷緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ；ドイツ）と混合し、５分間沸騰させ、超音波破砕し、推奨（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｉｏｚｙｍ；ドイツ）にしたがってトリス−トリシン−ＳＤＳ操作緩衝液と共に８％（ｗ／ｖ）ＰｒｏＳｉｅｖｅ５０ゲルを用いておよそ１０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。分子量マーカーとして着色済みタンパク質ラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ；ドイツ）を用いた。電気泳動の後、製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）の指示書に従って、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転移させた。室温で３時間の３×Ｒｏｔｉｂｌｏｃｋ（Ｒｏｔｈ；ドイツ）中における膜ブロック化の後、多クローン性ウサギ抗Ｈまたは抗Ｆ抗血清（Ｐ．Ｐｌａｔｔｅｔ博士およびＡ．Ｚｕｒｂｒｉｇｇｅｎ博士（ベルン大学、スイス）によって提供）を１×ＲｏｔｉＢｌｏｃｋ中に１：１０，０００で希釈して用いた。４℃での終夜のインキュベーションの後、膜を５回、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０を有するトリス緩衝生理食塩水）中で完全に洗浄し、室温で１時間、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体（１：２０，０００；Ｊａｃｋｓｏｎ−ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ．、Ｄｉａｎｏｖａ；ドイツ）でインキュベートした。ＴＢＳ−Ｔ洗浄の後、文献（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ドイツ）に推奨されるようにＥＣＬ基質を用いた。化学発光Ｘ線フィルム（ＣＬ−ＸＰｏｓｕｒｅ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ドイツ）を用いて反応タンパク質を検出した。
【０１４２】
予想される分子量（Ｈ＝８０ｋＤａ；Ｆ０＝６０ｋＤａ、Ｆ１＝４０ｋＤａ）のＣＤＶ−ＨまたはＦタンパク質の発現を、感染後の異なる時点で確認した。図４は、ＣＤＶのＦタンパク質の検出を代表として示す。上部のパネルは多クローン性Ｆ特異的ウサギ抗血清との反応を示し、切断された（Ｆ１）ＣＤＶ遺伝子産物を検出している。中央のパネルは、アクチン−βタンパク質の検出を示し、それは、相当するタンパク質の量が各ウェルにロードされたことを証明している。下部のパネルは、後期ＯＲＦＶ主要エンベロープタンパク質（Ｆ１３Ｌ）の検出を示す。
【０１４３】
インビトロでのウイルス産生
ＯＲＦＶベクターのゲノム内へのＣＤＶ遺伝子の挿入がウイルス成長に影響を与える可能性があるのかについて試験するため、滴定実験または一段階ウイルス成長曲線（ＳＳＧＣ）によって組換え体のウイルス産生を親Ｄ１７０１−Ｖと比較した。代表として図５にＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈウイルスについて示されるように、全細胞溶解物を感染後（ｐ．ｉ．）の示された時間で採取して、３回滴定した。感染性の後代の産生は、親Ｄ１７０１−Ｖウイルスと区別がつかなかった。この実験は、ＣＤＶ遺伝子を挿入しても親ベクターウイルスと比較してインビトロ成長特性が変わらないという結論を支持している。
実施例３．免疫蛍光法によるＣＤＶ−Ｈ特異的抗体の検出
Ｖｅｒｏ細胞をＣＤＶ  Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ株で感染させた（図６Ａ〜Ｃ）か、または感染させず（図６Ｄ）に組換えＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈ（１０７ＰＦＵ）で筋肉内に免疫化したマウスの血清（１：１０００で希釈）で固定し、インキュベートした。
【０１４４】
ＤＡＰＩによって細胞核を染色した。核外染色は、マウス抗血清との特異的な反応性の結果である。パネルＤは、位相コントラスト照明を示し、細胞融合によって特徴づけられるＣＤＶ感染細胞をより良好に視覚化する。
【０１４５】
このアッセイは、ＣＤＶ−Ｈ抗原を発現するＯＲＦＶ組換え体を有するマウスの免疫化によって特異的血清抗体の産生が生じることを証明した。
実施例４．免疫蛍光法によるＣＤＶ−Ｆ特異的抗体の検出
１０６ＰＦＵまたは１０７ＰＦＵのＤ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆを含有する０．１ｍｌでＢａｌｂ／Ｃマウス（４〜６週齢（一群当たりｎ＝５））を１回、２回または３回、２週間間隔で、筋肉内に免疫化する。最後の免疫化の２週間後までに毎週血清試料をそれぞれ採取する。Ｄ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆの免疫原性を試験するため、上記の手順に従って免疫蛍光法およびウエスタンブロット法によってその血清を分析する。
【０１４６】
全体的に、これらの結果は、ＯＲＦＶ組換え体Ｄ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｈ内におけるＣＤＶ−Ｈの発現の成功を証明する。それらはまた、ＯＲＦＶ組換え体Ｄ１７０１−Ｖ−ＣＤＶ−Ｆ内におけるＦ−遺伝子の発現の成功を証明する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図３（Ｃ）】
2013537409.tif 000007
【図３（Ｄ）】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図６（Ｃ）】
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【図６（Ｄ）】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013537409.tif 000019
2013537409.tif 000020