(57)【要約】  本発明は、試料中の分析物の存在、量および／または活性を検出するための組成物、アッセイ装置、キット、および方法に関する。特に、本発明は、酵素の検出に関する。本発明はまた、酵素の調節異常に関連した疾患を診断する方法、酵素活性の調節剤、抗微生物ペプチドの候補、および毒素をスクリーニングする方法にも関する。
2013521788.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも１つの結合部位で機能化された複数のシグナル粒子と、
ｂ）複数のキャリア粒子と、
ｃ）前記キャリア粒子内に含まれる複数のリンカー分子と、
を含む組成物であって、
この際、前記リンカー分子は、前記シグナル粒子上の少なくとも１つの結合部位と会合して前記シグナル粒子の凝集を引き起こすことができるものである、組成物。
【請求項２】
前記シグナル粒子は、凝集によって測定可能な変化を生じる粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記測定可能な変化は、光学的吸収における変化を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記シグナル粒子は、マイクロ粒子およびナノ粒子からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ナノ粒子は、球状ナノ粒子、ナノチューブおよびナノロッドからなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、コアシェルナノ粒子、およびポリマーナノ粒子からなる群から選択される、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ナノ粒子は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、鉄もしくはコバルト系金属を含むナノ粒子、量子ドット、ポリマーマイクロカプセル、およびポリマーナノカプセルからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの結合部位は、炭化水素またはポリマーを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリマーはポリペプチドである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、ヘリックス−ループ−ヘリックスポリペプチドである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ヘリックス−ループ−ヘリックスポリペプチドは、配列番号１：
【化１】
2013521788.tif 000009
に少なくとも９０％相同な配列を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記キャリア粒子は、表面層により包囲された液状コアを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記表面層は、両親媒性分子を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記両親媒性分子は、脂質および人工両親媒性分子からなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記キャリア粒子は、リポソーム、ミセル、ナノカプセル、マイクロカプセル、およびポリマー粒子からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記キャリア粒子の前記表面層は、酵素または抗微生物ペプチドにより特異的に分解可能なものである、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記酵素がリパーゼである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記リパーゼがホスホリパーゼである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ホスホリパーゼは、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＢ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ１、およびホスホリパーゼＤ２からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
それぞれのリンカー分子は、第１のシグナル粒子上の少なくとも１つの結合部位、および、第２のシグナル粒子上の少なくとも１つの結合部位と会合することができるものである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記リンカー分子は、それぞれのシグナル粒子上の２以上の結合部位と会合することができるものである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記リンカー分子がポリマーである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ポリマーがポリペプチドである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ポリペプチドは、配列番号２：
【化２】
2013521788.tif 000010
に少なくとも９０％相同な配列を有する２つのポリペプチドを含むダイマーである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
酵素活性の速度または程度を調節する化合物をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
保存料をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
表面層により包囲された液状コアを含むキャリア粒子であって、
配列番号２：
【化３】
2013521788.tif 000011
に少なくとも９０％相同な配列を有する２つのポリペプチドを含むダイマーを含有する、キャリア粒子。
【請求項２８】
前記キャリア粒子がリポソームを含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物または請求項２７もしくは２８に記載のキャリア粒子の使用。
【請求項３０】
試料中の分析物を検出するためのアッセイ装置であって、
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物を含み、
前記分析物は、前記キャリア粒子を分解して前記キャリア粒子から前記リンカー分子を放出させることができるものである、アッセイ装置。
【請求項３１】
試料中の分析物を検出するためのキットであって、
ａ）少なくとも１つの結合部位で機能化された複数のシグナル粒子と、
ｂ）複数のキャリア粒子と、
ｃ）前記キャリア粒子内に含まれる複数のリンカー分子と、
を含み、
この際、前記リンカー分子は、前記シグナル粒子上の少なくとも１つの結合部位と会合して前記シグナル粒子の凝集を引き起こすことができるものである、キット。
【請求項３２】
酵素活性の速度または程度を調節する化合物をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記化合物がアルブミンを含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
試料中の分析物を検出する方法であって、以下の工程：
ｉ）前記試料を、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物と接触させる工程（この際、前記分析物は前記キャリア粒子を分解して前記キャリア粒子から前記リンカー分子を放出させる）；および
ｉｉ）前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、
を含む、方法。
【請求項３５】
前記分析物が酵素である、請求項３０に記載のアッセイ装置、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のキット、または請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記酵素がリパーゼである、請求項３５に記載のアッセイ装置、キット、または方法。
【請求項３７】
前記リパーゼがホスホリパーゼである、請求項３６に記載のアッセイ装置、キット、または方法。
【請求項３８】
前記ホスホリパーゼは、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＢ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ１、およびホスホリパーゼＤ２からなる群から選択される、請求項３７に記載のアッセイ装置、キット、または方法。
【請求項３９】
被験者における酵素の調節異常に関連する疾患または症状を診断する方法であって、以下の工程：
ｉ）前記被験者由来の試料を、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物と接触させる工程（この際、前記酵素は前記キャリア粒子を分解して前記キャリア粒子から前記リンカー分子を放出させる）；および
ｉｉ）前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、
を含む、方法。
【請求項４０】
前記酵素がＰＬＡ２である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患または症状が、アテローム性動脈硬化症、膵炎、急性敗血症、および癌からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
酵素活性の調節剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
ｉ）前記酵素を、被検物質または被検混合物、および、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物と接触させる工程；並びに
ｉｉ）前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、
を含む、方法。
【請求項４３】
前記調節剤が阻害剤である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記工程ｉ）が、酵素活性の速度または程度を調節する化合物を添加することをさらに含む、請求項３９〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記工程ｉ）が、前記試料または前記酵素を請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物と接触させた後に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記工程ｉｉ）が、光学的吸収、光学散乱、蛍光、発光、光減衰、磁気特性、電気化学ポテンシャル、粘度、拡散速度論、または偏光における測定可能な変化を検出することを含む、請求項３９〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
抗微生物ペプチドの候補をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
ｉ）被検物質または被検混合物を、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物と接触させる工程；および
ｉｉ）前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、
を含む、方法。
【請求項４８】
毒素を検出する方法であって、以下の工程：
ｉ）被検物質または被検混合物を、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物と接触させる工程；および
ｉｉ）前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の分析物の存在、量または活性を検出するための組成物、装置、キットおよび方法に関する。特に、本発明は、酵素の検出に関する。本発明はまた、酵素の調節異常に関連した疾患を診断する方法、ならびに酵素活性の調節剤、抗微生物ペプチドの候補および毒素をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子の相互作用を迅速に高い感受性でモニターできるアッセイ方法は、ポイント・オブ・ケア診断(point-of-care diagnostics)、薬剤の開発および病原体の検出にとって非常に重要である。複合体または混合サンプル中で酵素を検出できるアッセイ法は特に興味がある。
【０００３】
酵素は、広範な生理的過程にかかわりがあり、その調節異常は多様な疾患や症状にかかわっている。例えば、ホスホリパーゼは、消化、炎症反応、膜の再構築及び細胞内シグナル伝達等の多くの生理的過程にかかわりがある。本明細書中で精力的に研究されたホスホリパーゼの一つとして、グリセロリン脂質のｓｎ−２アシルエステル結合を切断することによってリン脂質を分解して、遊離脂肪酸及びリゾ脂質(lysolipid)を生成する酵素のスーパーファミリーである、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）がある。ＰＬＡ２の調節異常は、アテローム性動脈硬化症１、膵炎２、急性敗血症３及びある形態の癌４等の多くの病的状態の特徴である。ゆえに、ホスホリパーゼ活性の信頼性の高いアッセイの開発は、長年望まれている。
【０００４】
多くのアッセイは、ＰＬＡ２濃度及び活性を特異的に測定するように開発されてきた。従来、ＰＬＡ２活性は、放射性物質を使用する方法を用いて測定されてきたが、この方法は、危険で、不便で、時間がかかる。他の従来の技術としては、ｐＨ滴定を使用するものがあるが、この技術は、大容積の反応溶液、基質及び酵素を必要とする。他のアプローチとしては、加水分解時に蛍光８，９がまたは吸光度１０が変化する人工的な脂質類似体から作製されるミクロ粒子またはナノ粒子の作製があった。例えば、米国特許第５，４６４，７５４号(Dennis et al)には、ＰＬＡ２によって加水分解されて遊離チオールを生成する合成基質（天然のリン脂質の類似体）を有するＰＬＡ２のアッセイが記載される。次に、この遊離チオールが試薬と反応して発色団を生成した後、これを検出できる。しかしながら、ホスホリパーゼによるリン脂質の分解が、表面接触反応(surface-catalyzed reaction)において基質提示(substrate presentation)に対して特に感受性を示す。ホスホリパーゼは、細胞膜等の脂質２重層に組織化される凝集リン脂質に主として作用するため、化学的性質に加えて、基質のナノスケールでの空間的配置に感受性がある。遊離脂質モノマーへのホスホリパーゼ活性は、２重層、単層及びミセルへの活性に比べて非常に低い５。研究により、ホスホリパーゼ活性が２重層内での相状態６や充填密度(packing density)７に感受性があることさえ示された。人工的な脂質類似体を使用する既知のアッセイは、酵素基質が天然の脂質２重層と同じにはなりえないという欠点がある。
【０００５】
酵素の別のアッセイ技術としては、リポソームを用いるものがある。広範な化学的組成、大きさ及び物性を有するリポソームを容易に合成できる。天然の細胞膜と同様、リポソームは、化学勾配を維持でき、この際、小胞内部の溶液は外とは異なる組成を有する。ゆえに、リポソームに、標的酵素の存在を示すのに使用できるマーカーを充填できる。米国特許第４，８８８，２８８号(Wagner et al)には、検出可能なマーカーを含むリポソームを有する酵素免疫アッセイが記載される。これらのリポソームは、標的ホスホリパーゼによって加水分解されないリン脂質類似体から形成される。この標的ホスホリパーゼはリポソームに結合し、その後非結合のリポソームは除去される。残りの結合リポソームは、さらに破裂させて、温度やｐＨ等の条件を変化させてまたは界面活性剤を添加してマーカーを放出させる。
【０００６】
または、標的酵素の酵素活性の結果リポソーム内部内からマーカーを分散させることによる酵素アッセイもある。ＷＯ  ０３／０６９３０５(Tsao et al)には、非蛍光性ホスファチジルコリン、非蛍光性の負に帯電した分子及び蛍光標識された分子を含むリポソームを有するホスホリパーゼ活性に関するアッセイが記載される。この標的ホスホリパーゼは、リポソームの表面層を加水分解して、蛍光強度を変化させる。リポソームはまた、脂質分解後に小胞内部からの蛍光色素であるカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）の漏出を介してＰＬＡ２を検出するのに利用されていた１１，１２。ＣＦは、ミリモル濃度で自己消失し(self-quench)、色素の放出（及びゆえに希釈）によって、結果的に、蛍光強度が大きく増大する。残念なことに、このアプローチは、非常に粗く(robust)、ヒト血清アルブミンが使用される色素と相互作用する１３ためヒトの診断用途には不適切である。このような制限により、電気活性のある１４または超消失性(superquench)１５分子等の他の物質の放出によるリポソームホスホリパーゼアッセイが開発された。しかしながら、体液が多くの光学活性またはレドックス活性のある化合物を含むので、これらの方法は干渉を受けやすい。
【０００７】
別のアッセイ技術としては、ナノ粒子（ＮＰ）の特有の光学的及び化学的特性を用いるものがある。例えば、米国特許第７，２５９，２５２号(Mirkin et al)には、相補的オリゴヌクレオチドで機能化されたナノ粒子を含み、ナノ粒子が標的核酸に結合すると検出可能な変化が生じる、核酸検出用アッセイが記載される。ナノ粒子はまた、酵素の検出にも利用されてきた。このようなアプローチの一つとして、酵素活性の結果ナノ粒子の凝集または再分散を誘導する基質を用いるものがある。ＷＯ  ２００７／０６３３００(Stevens et al)には、リンカー分子を介して連結したペプチド機能化ナノ粒子(peptide-functionalised nanoparticle)を含む凝集体の使用が記載され、この際、ペプチドは標的酵素によって切断されることが可能であり、この切断により凝集体が分散して検出可能な変化が生じる。ナノ粒子への酵素基質の固定化が多くの系で有効であることは知られているが、酵素との相互作用が低下するまたは粒子の安定性が限定されるという問題がある。さらに、この機能化はしばしば使用される特定の粒子／分子対に特有である。分子密度、活性及び安定性が変化する可能性があるため、ナノ粒子を用いたセンサーは再評価される必要があり、さらに各新規な用途に応じて再設計される必要がある場合が多い。ゆえに、酵素基質とナノ粒子トランスデューサーとの従来の密接なカップリングは、このような系の多用途性及びロバスト性(robustness)を限定してしまう。これらの変動は、特にかかわりのある生体分子の物理的さらには化学的状態によって影響を受けるプロセスを研究する場合には、問題である。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、これらの多くのかつ様々な限定を解消する別のアッセイ法を開発する必要がある。本発明は、シグナル粒子が制御可能に凝集するキャリア粒子からのリンカー分子の放出を特有に組み込んだアッセイを提供して、感受性が高く、ロバストで(robust)、特異的で、柔軟で、かつ生物学的に関連のあるアッセイを提供する。
【０００９】
本発明を添付の図面を参照しながらさらに説明する。ただし、本発明は図面によって限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、シグナル粒子（１）、キャリア粒子（２）及びリンカー分子（３）を含む本発明の一実施態様の絵文字による図面である。上記シグナル粒子（１）は、結合部分（５）が固定化されるコア（４）を有する。キャリア粒子（２）は、内容積（７）を取り囲む両親媒性分子（６）の表面層を有する。
【図２】図２は、キャリア粒子の破裂前（---）およびキャリア粒子の破裂後（−）双方での、シグナル粒子凝集の結果としての本発明の組成物の吸収スペクトルの具体的な変化を示す。
【図３】図３は、室温での多数の異なる溶液条件下での経時的なピークシフト（５７０ｎｍ及び５２０ｎｍでの本発明の組成物の吸収比率として算出）のプロットを示す：（Ａ）（ｉ）ＰＬＡ２の存在下（−）；（ｉｉ）ＰＬＡ２及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の存在下（……）；および（ｉｉｉ）ペプチドリンカー分子の不存在下（---）；ならびに（Ｂ）（ｉ）ＨＳＡの不存在下（−）；（ｉｉ）ＨＳＡを添加した後ＰＬＡ２を添加した際（……）；および（ｉｉｉ）ＰＬＡ２を添加した後ＨＳＡを添加した際（---）。
【図４】図４は、ＨＳＡ添加後の室温での様々なＰＬＡ２濃度でのナノ粒子のスペクトルシフト値を示す検量線である。最大シフト度(maximum shift intensity)を各ポイントで±ＳＥＭでプロットする。
【図５】図５は、波長の関数としての、従来のカルボキシフルオセイン（ＣＦ）を用いたアッセイ組成物の蛍光放射のプロットである；（ｉ）０．７５μＭのＣＦ溶液について（……）；（ｉｉ）３０μＭのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）添加後の０．７５μＭのＣＦ溶液について（---）；（ｉｉｉ）３０μＭのＨＳＡ及び０．１７ｍＭのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００添加後の０．７５μＭのＣＦ溶液について（−）。
【図６】図６は、ＨＳＡ添加後の室温での、（ｉ）５００ｎｇ／ｍｌ；（ｉｉ）２５０ｎｇ／ｍｌ；（ｉｉｉ）１００ｎｇ／ｍｌ；及び（ｉｖ）２５ｎｇ／ｍｌの濃度でのＰＬＡ２処理後の、経時的な（ａ）５２０ｎｍ及び５７０ｎｍでの吸収の正規化ピーク比（線）および（ｂ）吸収ピークの絶対最大値の波長（ポイント）として表される、時間の関数としての、本発明の組成物の吸収のプロットである。
【図７】図７は、所定のＰＬＡ２濃度で３０分間インキュベートした後に破裂したカルボキシフルオセインが充填されたリポソームの画分のプロットである。示されたデータは、平均値±ＳＥＭである。
【図８】図８は、室温での、（ｉ）７０ｐＭのＰＬＡ２で（−）及び（ｉｉ）ＰＬＡ２なしで（---）１２時間インキュベートした後の、波長の関数としての、本発明に係る組成物の光減衰のプロットである。
【図９】図９は、室温での、（ｉ）ＰＬＡ２添加前の（−）及び（ｉｉ）０．７ｎＭ  ＰＬＡ２を添加してから８分後の（---）、波長の関数としての、１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質を含むリポソームの溶液の光減衰のプロットである。
【図１０】図１０ａ）は、３７℃での、ＰＬＡ２添加後のＪＲ２ＫＣ２を充填したリポソーム(JR2KC2-loaded liposome)及びＪＲ２ＥＣで修飾した金ナノ粒子(JR2EC-modified gold nanoparticle)の溶液の、波長の関数としての、正規化光減衰のプロットである。図１０ｂ）は、下記条件下での、ＰＬＡ２添加後のＪＲ２ＫＣ２を充填したリポソーム(JR2KC2-loaded liposome)及びＪＲ２ＥＣで修飾した金ナノ粒子(JR2EC-modified gold nanoparticle)の溶液の経時的なピークシフト（Δλｍａｘ）のプロットである：ｉ）Ｃａ２＋の存在下（---）；ｉｉ）Ｃａ２＋の不存在下（−）；ｉｉｉ）Ｌ−アラニンをＤ−アラニンに置換してペプチドを折りたたんでヘテロ三量体コンプレックスを形成できなくした修飾形態のＪＲ２ＥＣを用いて機能化したナノ粒子を使用（＋）。
【図１１】図１１ａ）は、下記条件下での、１５週間貯蔵後のＪＲ２ＫＣ２を充填したリポソーム(JR2KC2-loaded liposome)及びＪＲ２ＥＣで修飾した金ナノ粒子(JR2EC-modified gold nanoparticle)の溶液の経時的なピークシフト（Δλｍａｘ）のプロットである：ｉ）７ｎＭ  ＰＬＡ２の添加後（●）およびｉｉ）ＰＬＡ２の不存在下（○）。図１１ｂ）は、下記条件下での、室温でのＪＲ２ＫＣ２を充填したリポソーム(JR2KC2-loaded liposome)及びＪＲ２ＥＣで修飾した金ナノ粒子(JR2EC-modified gold nanoparticle)の溶液の経時的なピークシフト（Δλｍａｘ）のプロットである：ｉ）７ｎＭ  ＰＬＡ２の添加後（●）およびｉｉ）ＰＬＡ２の不存在下（○）。
【図１２】図１２ａ）は、ｉ）７ｎＭ  ＰＬＡ２（ｉ）と標識された線）；ｉｉ）３．５ｎＭ  ＰＬＡ２（ｉｉ）と標識された線）；ｉｉｉ）１．４ｎＭ  ＰＬＡ２（ｉｉｉ）と標識された線）；またはｉｖ）７００ｐＭ  ＰＬＡ２（ｉｖ）と標識された線）を、Ｔ＝５分の時点で添加した後の、０．５ｍＭ  Ｃａ２＋の存在下で３７℃でのＪＲ２ＫＣ２を充填したリポソーム(JR2KC2-loaded liposome)及びＪＲ２ＥＣで修飾した金ナノ粒子(JR2EC-modified gold nanoparticle)の溶液の経時的なピークシフト（Δλｍａｘ）のプロットである。線は、便宜上（as a guide for the eye）ひかれている。図１２ｂ）は、ＰＬＡ２濃度の関数としての遅延時間(lag time)（τ）の長さを示す（Ｒ２＝０．９７）。エラーバーは、平均値の標準誤差である、ｎ≧３。
【図１３】図１３ａ）は、下記条件下での、７ｎＭ  ＰＬＡ２の添加後のＪＲ２ＫＣ２を充填したリポソーム(JR2KC2-loaded liposome)及びＪＲ２ＥＣで修飾した金ナノ粒子(JR2EC-modified gold nanoparticle)の溶液の経時的なピークシフト（Δλｍａｘ）のプロットである：ｉ）室温（−）またはｉｉ）３７℃（---）。図１３ｂ）は、下記条件下での、室温で７ｎＭ  ＰＬＡ２の添加後のＪＲ２ＫＣ２を充填したリポソーム(JR2KC2-loaded liposome)及びＪＲ２ＥＣで修飾した金ナノ粒子(JR2EC-modified gold nanoparticle)の溶液の経時的なピークシフト（Δλｍａｘ）のプロットである：ｉ）４ｍｇ／ｍｌ  ＨＳＡ添加後（---）またはｉｉ）ＨＳＡ不存在下（−）。図１３ｃ）は、下記条件下での、室温でのＪＲ２ＫＣ２を充填したリポソーム(JR2KC2-loaded liposome)及びＪＲ２ＥＣで修飾した金ナノ粒子(JR2EC-modified gold nanoparticle)の溶液の経時的なピークシフト（Δλｍａｘ）のプロットである：ｉ）４ｍｇ／ｍｌ  ＨＳＡ、７０ｎＭ  ＰＬＡ２及びＣａ２＋の存在下（---）；ｉｉ）４ｍｇ／ｍｌ  ＨＳＡ及び７０ｎＭ  ＰＬＡ２の存在下ではあるがＣａ２＋の不存在下（……）；またはｉｉｉ）４ｍｇ／ｍｌ  ＨＳＡ及び７０ｎＭ  ＰＬＡ２の存在下ではあるがＪＲ２ＫＣ２の不存在下（−）。図１３ｄ）は、室温で４ｍｇ／ｍｌ  ＨＳＡ添加してから１０分後の、ＪＲ２ＫＣ２を充填したリポソーム(JR2KC2-loaded liposome)及びＪＲ２ＥＣで修飾した金ナノ粒子(JR2EC-modified gold nanoparticle)の溶液のＰＬＡ２濃度の関数としてのピークシフト（Δλｍａｘ）のプロットである。エラーバーは、平均値の標準誤差である、ｎ≧３。線は、目で案内して(as a guide for the eye)ひく。
【図１４】図１４は、ＪＲ２ＫＣ２を充填したリポソーム(JR2KC2-loaded liposome)及びＪＲ２ＥＣで修飾した金ナノ粒子(JR2EC-modified gold nanoparticle)の溶液を含むナノ粒子−ペプチドアッセイ（●）及び従来のカルボキシフルオセイン（ＣＦ）を用いた蛍光アッセイ（○）を用いて測定した際の、３７℃でのクロルプロマジン濃度の関数としてのＰＬＡ２の阻害率（％）のプロットである。
【図１５】図１５は、下記条件下での、７ｎＭ  ＰＬＡ２添加後のＪＲ２ＫＣ２を充填したリポソーム(JR2KC2-loaded liposome)及びＪＲ２ＥＣで修飾した金ナノ粒子(JR2EC-modified gold nanoparticle)の溶液の時間の関数としてのピークシフト（Δλｍａｘ）のプロットである：ｉ）クロルプロマジンの不存在下（●）またはｉｉ）１０μＭ  クロルプロマジンの存在下（○）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第一の態様は、
ａ）少なくとも１つの結合部位で機能化された複数のシグナル粒子と、
ｂ）複数のキャリア粒子と、
ｃ）前記キャリア粒子内に含まれる複数のリンカー分子と、
を含む組成物であって、
この際、前記リンカー分子は、前記シグナル粒子上の少なくとも１つの結合部位と会合して前記シグナル粒子の凝集を引き起こすことができるものである、組成物を提供する。
【００１２】
トランスデューサー粒子としても知られている、シグナル粒子は、リンカー分子と接触しておかれると凝集できる適当な粒子を含みうる。シグナル粒子の重要な特性は、凝集によって検出可能なまたは測定可能な変化を引き起こすことである。
【００１３】
適当なシグナル粒子としては、マイクロ粒子及びナノ粒子がある。好ましくは、粒子は、有意な大きさに依存する光学特性を発揮するのには十分大きいが、溶液中で分散し続けるには十分小さい。好ましくは、粒子は、２ｎｍ〜１００ｎｍの範囲の直径を有するナノ粒子を含む。ナノ粒子は、例えば、球状のナノ粒子、ナノチューブまたはナノロッドを有してもよい。適当なナノ粒子としては、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、コアシェルナノ粒子及びポリマーナノ粒子がある。好ましい金属ナノ粒子としては、金、銀、鉄金属またはコバルト系金属を含むものがある。適当な半導体ナノ粒子としては、量子ドットがある。適当なコアシェルナノ粒子としては、金属シェル及び誘電性若しくは半導体コア、または誘電性若しくは半導体シェル及び金属コア、または誘電性若しくは半導体シェル及び誘電性若しくは半導体コアを有するものがある。適当なポリマー粒子としては、コア及びシェルが明確に分かれている(delineated)粒子を有するポリマーマイクロカプセル及びナノカプセルがある２３，２４。好ましくは、シグナル粒子は金ナノ粒子である。
【００１４】
使用されるシグナル粒子は、問題となる特定のアッセイによって(tailored to)もよい。例えば、金及び銀ナノ粒子は、所望の測定可能な変化が光吸収の変化を有するような用途に特に適切である。金及びコバルト系金属を有するナノ粒子は、所望の測定可能な変化が磁性の変化を有するような用途に特に適切である。場合によっては、シグナル粒子の大きさによって、凝集前後の組成物の吸収スペクトルを測定できる。これは、金ナノ粒子及び量子ドットに特にいえる。シグナル粒子の大きさは、電磁スペクトルの特定の領域内のスペクトルシフトを形成するのに最適化されうる。例えば、サンプルによって吸収されない可視スペクトルの領域内に吸収スペクトルを形成する大きさのシグナル粒子を提供することが望ましい。場合によっては、赤外線に相当するものに近い磁性スペクトルの領域内に吸収スペクトルを形成する大きさのシグナル粒子を提供することが望ましい。生体組織はこれらの波長に対して容易に透明であるため、このようなシグナル粒子はインビボ用途に特に有用であろう。
【００１５】
シグナル粒子は、少なくとも１つの結合部位で機能化される。好ましくは、各シグナル粒子は、１、２、３、４またはそれ以上の結合部位で機能化される。当該結合部位は、適当な手段によってシグナル粒子の表面に一時的にまたは永久的に結合してもよい。例えば、結合部位は、シグナル粒子に共有結合しても、またはシグナル粒子の表面に吸着若しくは固定化しても、またはこれに共役してもよい。結合部位は、好ましくはリンカー分子に相補的であり、シグナル粒子の凝集を促進するようにリンカー分子と会合できる。この会合は、ホモ会合(homo-association)（結合部位及びリンカー分子が同じタイプの分子である場合）であっても、またはより好ましくは、ヘテロ会合(hetero-association)（結合部位及びリンカー分子が異なるタイプの分子である場合）であってもよい。
【００１６】
結合部位は、シグナル粒子の表面に付着でき、リンカー分子と会合できる。適当な結合部位としては、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ペプトイド、ペプチド核酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの合成誘導体等の炭水化物及びポリマーがある。適当なタンパク質としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、キャプトアビジン(captavidin)、及び抗体がある。適当なポリペプチドとしては、超分子集合したものがあり、コイルドコイルポリペプチド及びヘリックス−ループ−ヘリックスポリペプチド、特に２量化等の２次元またはそれ以上の次元の相互作用を有するものがある。特に好ましいポリペプチドは、ＪＲ２ＥＣと称する、配列番号１のポリペプチドである。
【００１７】
【化１】
2013521788.tif 000003
【００１８】
結合部位はまた、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％一致したポリペプチドを有してもよい。他の適当な結合部位としてはビオチン、およびリンカー分子が抗体である場合には、これに結合する抗原がある。好ましくは、結合部位はオリゴヌクレオチドではない。
【００１９】
一実施形態においては、２、３、４またはそれ以上の異なるタイプの結合部位がシグナル粒子の表面で一緒に固定化されてもよい。
【００２０】
シグナル粒子はまた、さらなる有用な部位を用いて一緒に機能化されてもよい。例えば、シグナル粒子は、非特異的な吸着を低減するためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のタンパク質排斥(protein-repellant)分子またはスペーサー分子を用いて一緒に機能化されてもよい。
【００２１】
キャリア粒子は、リンカー分子を含み、その後放出物質と接触するとリンカー分子を放出することが可能である適当な粒子を有していてもよい。本明細書中で使用される、「放出物質」というフレーズは、キャリア粒子を分解または透過(permeabilise)してリンカー分子を溶液中に流出させ、シグナル粒子と接触させることができる物質を意味する。例としては、抗微生物ペプチド、毒及び酵素がある。好ましくは、酵素は、ＰＬＡ２等のホスホリパーゼを含む、リパーゼである。本明細書中で使用される、キャリア粒子のまたはこの表面層の「分解」ということばは、リンカー分子の放出を促進するキャリア粒子の構造変化を意味する。
【００２２】
キャリア粒子は、固体粒子または表面層により包囲された液状コアを有してもよい。
【００２３】
表面層は、好ましくはポリマー薄膜または両親媒性分子の層である。適当な両親媒性分子としては、操作された(engineered)ブロック共重合体等の人工的に生じた(artificially generated)両親媒性分子、およびリン脂質等の脂質がある。キャリア粒子の表面層は、好ましくは脂質混合物を含む。一実施形態においては、この脂質混合物は、細胞または組織から抽出された不明確な混合物であってもよい。または、脂質混合物は、十分規定されていてもよい。脂質は、合成物であってもよいが、好ましくは天然の脂質に化学的及び分子的に同じであるまたはほとんど同じである。一実施形態においては、表面層は、０〜３５％コレステロールを含む。コレステロールの量が増えると、リパーゼ分解速度が減少することが知られており、ゆえに感受性の低いことが例えばより高い酵素レベルを検出するのに望ましい場合には系の応答を調整するのに使用されてもよい。他の実施形態においては、表面層は、０〜２５％の、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマーでグラフト化された脂質を含む。実施例９に記載されるように、ＰＥＧによるグラフト化により、ＨＳＡを必要とせずにプラズモンピーク(Plasmon peak)のレッドシフト(redshift)がより大きくなる。加えて、実施例１５に記載されるように、ＰＥＧによるグラフト化により、ペプチドの放出がより早くなるため、誘導期(lag phase)が減少し、全体の応答が若干高くなる。
【００２４】
好ましくは、キャリア粒子の表面層は、酵素（「放出物質」）によって特異的に分解可能である。好ましくは、酵素は、リパーゼであり、より好ましくはＰＬＡ２等のホスホリパーゼである。キャリア粒子の表面層は、分子のタイプ、分子の相状態及び分子の充填密度がそれに対する表面層が酵素基質であろう特定の酵素を測定するであろうから、問題となる特定のアッセイによって(tailored to)もよい。ゆえに、標的酵素がリパーゼである場合には、分子は、主に脂質を含んでもよい。標的酵素がホスホリパーゼである場合には、脂質は、主にリン脂質を含んでもよい。
【００２５】
キャリア粒子の液状コアは、好ましくは油状のまたは水性の溶液を含む。
【００２６】
キャリア粒子が表面層により包囲された液状コアを有する実施形態では、リンカー分子は、液状コア内に、または表面層内に含まれてもよい。
【００２７】
他の適当なキャリア粒子が当業者には既知であろうが、キャリア粒子は、リポソーム、ミセル、ナノカプセル、マイクロカプセル及びポリマー粒子からなる群より選択されることが好ましい。好ましくは、キャリア粒子はリポソームである。
【００２８】
リンカー分子は、シグナル粒子の凝集を促進できる適当な分子を含んでもよい。したがって、リンカー分子は、シグナル粒子上の一以上の結合部位と会合できる必要がある。本明細書中で使用される、「会合できる(capable of associating)」というフレーズは、リンカー分子が、適当な条件下で、即ち、キャリア粒子から放出後結合部位と接触させる際に、シグナル粒子の結合部位と会合するであろうことを意味する。好ましくは、各リンカー分子は、第１のシグナル粒子上の１以上の結合部位、及び第２のシグナル粒子上の１以上の結合部位と会合できる。第１のシグナル粒子上の１以上の結合部位、及び第２のシグナル粒子上の１以上の結合部位とのリンカー分子の会合は、第１及び第２のシグナル粒子と連結するであろう。ゆえに、複数のシグナル粒子上の結合部位との複数のリンカー分子の会合により、シグナル粒子の凝集が形成するであろう。好ましくは各リンカー分子は、各シグナル粒子の２、３、４またはそれ以上の結合部位と会合できる。
【００２９】
一実施形態においては、リンカー分子はまた、他のリンカー分子とホモ会合(homo-associate)または架橋できる。例えば、特定の条件下で、ＪＲ２ＫＣ２等のリンカー分子は繊維を形成してもよい。キャリア粒子内での繊維の形成は、放出物質の不存在下でキャリア粒子からのリンカー分子の漏出を低減することによって系の安定性を促進する可能性がある。
【００３０】
リンカー分子は、ポリマーを含んでもよい。好ましくは、ポリマーは、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドである。適当なタンパク質としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、キャプトアビジン(captavidin)、及び抗体がある。適当なポリペプチドとしては、コイルドコイルポリペプチド及びヘリックス−ループ−ヘリックスポリペプチド、特に２量化等の２次元またはそれ以上の次元の相互作用を有するものがある。特に好ましいポリペプチドは、配列番号２の配列を含むまたは有する、ＪＲ２ＫＣポリペプチドの共有結合した対（２量体）を有する、ＪＲ２ＫＣ２２６である。
【００３１】
【化２】
2013521788.tif 000004
【００３２】
ＪＲ２ＫＣ２は、２つの別のシグナル粒子上の２つの結合部位と会合して、２つのジスルフィド結合した４つのヘリックスバンドル(disulphide-linked four-helix bundles)に折りたたまれてもよい。リンカー分子はまた、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％一致した配列を含むまたは有するポリペプチドの２量体を有してもよい。他の適当なリンカー分子としてはビオチン、および結合部位が抗体である場合には、これに結合する抗原がある。
【００３３】
リンカー分子及び結合部位は、以下に記載するように、例えば、ビオチン−アビジン共役対、抗体−抗原共役対またはＪＲ２ＥＣ−ＪＲ２ＫＣ２−ＪＲ２ＥＣ共役対を形成してもよい。
【００３４】
本発明の特に好ましい実施形態においては、シグナル粒子は、ＪＲ２ＥＣで機能化され、リンカー分子はＪＲ２ＫＣ２を有する。本実施形態では、結合部位及びリンカー分子の架橋反応の分子基盤は、合成ｄｅ  ｎｏｖｏ設計ポリペプチド(synthetic de novo designed polypeptide)間の折りたたみに依存したヘテロ会合(folding-dependent hetero-association)である。ＪＲ２ＥＣ及びＪＲ２ＫＣは、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフに折りたたまれ、溶液中で４つのヘリックスバンドル(four-helix bundles)にヘテロ２量化(heterodimerize)するように設計される。双方のペプチドは、金ナノ粒子にＪＲ２ＥＣを固定化するために及びジスルフィド架橋を介して２つのＪＲ２ＫＣモノマーを共有結合するために利用されるループ領域に位置するシステイン残基を有する。溶液中では、酸化形態のＪＲ２ＫＣ（ＪＲ２ＫＣ２と称する）は、２つの相補ペプチド（ＪＲ２ＥＣ）と会合して、２つのジスルフィド結合した４つのヘリックスバンドル(four-helix bundles)におりたたまれるヘテロ３量コンプレックス(hetero-trimeric complex)を形成する。双方のペプチドが酸化されると、ヘテロ会合がジスルフィド結合した４つのヘリックスバンドル(four-helix bundles)のペプチド繊維の集合体を誘導する１６。ＪＲ２ＥＣで機能化された金ナノ粒子は、ナノモル濃度のＪＲ２ＫＣ２の存在下で素早くかつ多量に凝集する。プラズモンピーク(Plasmon peak)の得られたレッドシフト(redshift)は、リンカー分子の濃度によって変化する２６。
【００３５】
本組成物は、さらにキャリア粒子の表面層の酵素による分解速度を促進するように設計された分子、またはキャリア粒子の漏出速度を促進するように設計された分子を含んでもよい。例えば、本組成物は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のアルブミンをさらに含んでもよい。実施例４及び実施例１３に記載されるように、ＨＳＡを使用することにより、キャリア分子の分解(disassembly)をより良好により早くすることができる。
【００３６】
本組成物はまた、成分の保存を助ける１以上の保存料を含んでもよい。特に、本組成物は、乾燥または凍結乾燥の際にリポソーム等の成分を保護する保存料を含んでもよい。適当な保存料としては、脱水及び再水和中に脂質２重層及びタンパク質を安定化する、トレハロース等の糖がある。
【００３７】
本組成物は、上記成分の分散溶液を含んでもよい。好ましくは、分散溶液は、水性溶液を含む。
【００３８】
本組成物、またはこの溶液は、好ましくは６〜８のｐＨを有する。より好ましくは、ｐＨは、７〜８の範囲である。最も好ましくは、ｐＨは、７．２〜７．６の範囲であり、約７．４が好ましい。
【００３９】
好ましい実施形態においては、本組成物は、複数のナノ粒子、複数のリポソーム及び前記リポソーム内に封入された複数のリンカー分子を含む。特に好ましい実施形態においては、本組成物は、複数のＪＲ２ＥＣポリペプチドで機能化された金ナノ粒子、複数のリポソーム及び前記リポソーム内に封入された複数のＪＲ２ＫＣ２ポリペプチドを含む。
【００４０】
本発明の第一の態様に係る組成物は、保存の際に非常に安定である。実施例３および実施例１０に記載されているように、ＪＲ２ＫＣ２をカプセル化したリポソームを含む組成物は、ＣＦに配置したリポソームと対比して、保存の際に顕著な安定性を示している。４℃で１５週間保存した後であっても、バックグラウンド漏出は検出されず、ＰＬＡ２へのすべての反応性を維持した。
【００４１】
本発明の第一の態様に係る組成物はまた、使用する原料が相対的に安価であり、かつ、分析物の試料をテストするための十分な組成物の提供に必要な各成分がごく少量であることから、相対的に安価である。
【００４２】
本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様と関連して記載されるキャリア粒子を提供する。好ましくは、前記キャリア粒子は、表面層により包囲された液状コアを含み、ＪＲ２ＫＣ２または配列番号２：
【００４３】
【化３】
2013521788.tif 000005
【００４４】
に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％相同な配列を有するポリペプチドのダイマーを含む。
【００４５】
好ましくは、前記表面層は、両親媒性分子を含む。好ましくは、前記キャリア粒子はリポソームである。
【００４６】
本発明の第三の態様は、本発明の第一の態様に係る組成物、または本発明の第二の態様に係るキャリア粒子の使用を提供する。上述したように、本発明に係る組成物が、酵素、抗微生物ペプチド、または毒素等の基質の放出状態にある場合、前記キャリア粒子からの前記リンカー分子の放出によって、シグナル粒子の凝集が検出できる。本発明の第一の態様に係る組成物は、したがって、酵素等の分析物の検出、酵素活性調節剤のスクリーニング、候補抗微生物ペプチドおよび毒素のスクリーニングを含む、多くの用途を有する。これらの用途は、下記により詳細に詳述される。
【００４７】
本発明に係る第四の態様は、試料中の分析物を検出するためのアッセイ装置を提供する。前記アッセイ装置は、本発明の第一の態様に係る組成物を含む。
【００４８】
本明細書において、「試料中の分析物の検出のため」の段階は、試料中の分析物の有無の検出、試料中の分析物の量または濃度の測定、試料中の分析物の活性の検出、および試料中の分析物の活性の量の測定を含む。好ましくは、前記分析物は酵素である。前記酵素は、好ましくはリパーゼであり、より好ましくはホスホリパーゼであり、最も好ましくはＰＬＡ２である。
【００４９】
本発明の第一の態様に係る組成物またはその成分の１以上は、水溶液として提供されうる。あるいは、前記組成物またはその成分の１以上は、保存のために凍結乾燥され、次いで使用前に再溶解されうる。
【００５０】
一実施形態において、前記アッセイ装置は、本発明の第一の態様に係る組成物でコートされたディップスティックを含みうる。他の実施形態において、前記アッセイ装置は、本発明の第一の態様に係る組成物を含む側方流装置を含む。好ましくは、前記組成物は、ディップスティックまたは側方流装置の表面上で乾燥または凍結乾燥される。前記スティックまたは前記側方流装置の液体試料への暴露により、前記成分が溶解されて液体に戻る。
【００５１】
本発明の第５の態様は、本発明の第一の態様に係る組成物またはその個別の成分を含む試料中の分析物を検出するためのキットを提供する。
【００５２】
好ましくは、前記分析物は酵素である。好ましくは、前記酵素はリパーゼであり、好ましくはＰＬＡ２等のホスホリパーゼである。
【００５３】
前記キットは、本発明の第一の態様に係る組成物またはその個別の成分を含む、さらに１以上の区画を含みうる。好ましくは、前記各成分は別個の区画内に含有される。各区画は、溶媒として、または凍結乾燥形態で保存されうる。第一の態様に係る組成物を提供するため、使用直前で前記いくつかの成分の溶液が好適な量で混合されうる。
【００５４】
本発明の第六の態様は、
ｉ）前記試料を、本発明の第一の態様に係る組成物と接触させる工程（この際、前記分析物は前記キャリア粒子を分解して前記キャリア粒子から前記リンカー分子を放出させる）；および
ｉｉ）前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、
を含む、試料中の分析物を検出する方法を提供する。
【００５５】
好ましくは、前記分析物は酵素である。前記酵素は、不安定な前記表面層により、前記キャリア粒子を分解しうる。好ましくは、前記酵素の酵素活性は、前記リンカー分子の放出を介して、前記キャリア粒子の前記表面層に穴または多孔を形成する。前記酵素は、好ましくはリパーゼであり、より好ましくはＰＬＡ２等のホスホリパーゼである。
【００５６】
図１には本発明の一実施形態を示す。この際、前記組成物は、シグナル粒子（１）と、キャリア粒子（２）と、リンカー分子（３）と、を含む。前記シグナル粒子（１）は、１以上の結合部位（５）で固定化されるコア（４）を含む。前記キャリア粒子（２）は、内容積（７）を包囲する両親媒性分子（６）の表面層を含む。ＰＬＡ２に加えて、任意のＨＳＡの存在により、キャリア粒子（２）の破裂、およびリンカー分子（３）の放出が生じる。前記リンカー（３）は、次いで前記シグナル粒子（１）における結合部位（５）とヘテロ結合し、前記シグナル粒子の凝集を引き起こす。次いで試料中の酵素活性の指標とするため、前記シグナル粒子の凝集が検出および／または測定されうる。
【００５７】
好ましくは、前記試料は液体試料である。前記液体試料は、工業資源、環境資源、農業資源、または生物資源等の任意の資源から供給されうる。前記試料は、合成または製造試料を含みうる。あるいは、前記試料は体液を含みうる。前記試料は、血液、血清、血漿、間質液、唾液、痰、眼球レンズ液（ocular lens liquid）、汗、尿、母乳、アスコット液（ascots liquid）、粘液、髄液、腹膜液、皮膚滲出液、咽頭滲出液、気管支肺胞洗浄液、気管吸引物（tracheal aspirations）、脳脊髄液、精液、頸管粘液、膣または尿道分泌物、および羊水を含む生体資源から供給または構成されてもよい。前記液体試料は、水溶液による希釈、処理、または抽出により、半固形または固形資源から供給されてもよい。
【００５８】
一実施形態において、前記方法は、前記キャリア粒子の表面層の酵素分解の速度を高めるように設計された分子、またはキャリア粒子の漏出の速度を高めるように設計された分子の存在下で行われる。例えば、前記溶液は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のアルブミンをさらに含みうる。上述したように、ＨＳＡが存在すると、キャリア分子からのリンカー分子の放出の速度が向上することが見出されている。よって、第六の態様に係る前記方法は、好ましくは、前記試料を、本発明の第一の態様に係る組成物と接触させた後、アルブミンを添加する工程をさらに含む。
【００５９】
好ましくは、前記シグナル粒子の凝集は、系内における測定可能な変化を介して検出される。前記系内における測定可能な変化は、光学的吸収、光学散乱、蛍光強度もしくは放出ピーク、蛍光、光減退、磁気特性、電気化学ポテンシャル、表面電荷、粘度、拡散動力学、または可視偏光における変化を含みうる。
【００６０】
蛍光における変化は、蛍光光度計を用いて測定されうる。しかしながら、多くの生物学的に関連のある溶液は、それ自体が発光する分子、または低分子量の有機色素の蛍光収率を変化させる分子を含む。実施例６に記載されるように、試料中の血清タンパク質は、蛍光色素であるカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）に基づくアッセイにより得られた蛍光シグナルを著しく低下させる。そのため、蛍光における変化の測定は、使用に制限を有しうる。
【００６１】
より好ましい測定可能な変化は、光学的吸収における変化を含む。前記吸収における変化は、吸収ピークのシフト等の組成物の吸収プロファイルの形状の変化を含む。好ましくは、前記吸収における変化は、電磁スペクトルの可視領域内で生じる。かような変化は、さまざまな方法を用いて定量されうる。例えば、レシオメトリック分析法は、２つの特定波長（例えば、５２０ｎｍおよび５７０ｎｍ）における吸収の比率を算出することを含む。あるいは、ピーク位置解析方においては、吸収ピークが最大の波長が、凝集の程度の指標として採用されうる。ピークシフト（Δλｍａｘ）は、紫外可視スペクトルの最大励起波長における変化の測定値であり、この時点において記録したスペクトルにおける最大励起波長から、Ｔ＝０の時点において記録したスペクトルにおける最大励起波長を差し引くことにより算出される。実施例２に記載されるように、レシオメトリック分析法は、ノイズの結果が少なく、低レベルのシグナルで細かく分離できることから好ましい。
【００６２】
かような光学的変化は、測色技術を用いることにより検出および測定されうる。例えば、定量的測定は分光計を用いて行うことができ、また、一定の基準に対し、溶液の色を目視で比較することにより行うこともできる。あるいは、測定は試料および本発明の第一の態様に係る組成物の混合物を、紙、プラスチック、ニトロセルロース膜、または薄層クロマトグラフィー板等の固体基板上に適用することにより行うことができる。
【００６３】
図２には、本発明に係る組成物の吸収スペクトルにおける、シグナル粒子の凝集によって生じる典型的な変化を示す。典型的なナノ粒子の分散溶液において、リポソームの破裂の前は、前記リンカー分子およびナノ粒子は完全に分離されており、プラズモン吸収ピークは５２０ｎｍである。ＰＬＡ２（７ｎＭ）等の酵素の添加により、トラップされたリンカー分子が放出され、ナノ粒子の広範な凝集が引き起こされる。数分以内にこの凝集が吸収ピークの最大吸収波長が５７０ｎｍとなる劇的なレッドシフトを誘導する。
【００６４】
前記系内における変化の範囲は、試料における分析物の濃度または試料における分析物の活性の測定に用いられうる。分析物が存在しない場合、前記キャリア粒子の表面層は原形を保ち、前記リンカー分子は放出されず、前記シグナル粒子の凝集も生じない。前記分析物が存在する場合には、前記キャリア粒子は分解され、リンカー分子が放出され、結果として前記シグナル粒子の凝集が生じる。前記凝集物の存在する割合がより大きいと、前記キャリア粒子もより分解され、前記リンカー分子もより放出されて、シグナル粒子のより広範な凝集が起こり、そして系内においてより大きな変化が生じる。公知の方法を用いることにより、分析物の濃度または分析物の活性を決定することが可能となる、系内の変化に対する標準的な曲線が得られうる。実施例５に記載されるように、図４は、ＰＬＡ２とともに３０分間インキュベーションした後の酵素濃度に係る関数として、ナノ粒子スペクトルのシフトの大きさに係る検量線を示す。実施例１４に記載されるように、図１３ｄは、ＰＬＡ２およびＨＳＡとともに１０分間インキュベーションした後の酵素濃度の関数として、前記アッセイのシグモイド反応を示す。
【００６５】
試料を、本発明の第一の態様に係る組成物と接触すると、シグナル粒子の凝集が検出される前に、通常、遅延が観測される（実施例１１を参照）。この遅延は、「遅滞期」または「遅延時間」として知られている。前記遅滞期は、二重層における加水分解生成物、特に脂肪酸の蓄積によるものであると推測されている。脂肪酸分子は、脂質二重層において、ＰＬＡ２が高親和性で結合するために、分離したドメインを形成する傾向がある。前記遅滞期の終わりにおける突然の破裂は、前記加水分解生成物の集積が表面結合酵素に近接することによって生じる局所的な生成物の阻害の除去と関連しうる。膜結合ＰＬＡ２の量の増加はまた、遅滞期の終わりにおける高速な加水分解の開始と一致することが観測されている。実施例１２（第１節）に記載されるように、前記遅滞期の長さは、試料中のＰＬＡ２の濃度と相関がある。特に、対数線形の依存性が、前記遅滞期および前記ＰＬＡ２の濃度の間で実証されている。よって、前記遅滞期の長さの測定は、試料におけるＰＬＡ２等の分析物の濃度または活性を測定する代わりの方法を提供する。前記遅滞期の長さの測定はまた、実施例１６に記載されるように、遅滞期の長さの増加の効果を有する阻害剤のスクリーニングに用いられうる。
【００６６】
前記遅滞期の長さに影響する数多くのパラメータは、例えば、アッセイ成分の相対濃度を変化させることによって、アッセイのダイナミックレンジの調節をするための多くの可能性をさらに提示する。
【００６７】
前記遅滞期の長さの測定は、相対的に短いタイムスケールで再現性の高い結果を与えるため、当該方法は多くのルーチンアプリケーションに適している。しかしながら、最高感度が要求される場合には、長いインキュベーション期間を考慮して、例えば、最大比色分析応答等の系内における１０または３０分後の変化の程度を測定することが好ましい。
【００６８】
上記本発明の第六の態様に係る方法は、多くの理由から特に有利である。リポソーム等のキャリア粒子の使用は、生物学的に関連のある基質と作用する酵素を研究することができる。当該方法は、ＰＬＡ２等のホスホリパーゼの検出に特に好適である。わずかな基質の構造および化学的性質の変化に対するＰＬＡ２の感度のため、リポソームの脂質二重層等の未修飾リン脂質との相互作用の基づくアッセイの使用は有利である。
【００６９】
キャリア粒子からのリンカー分子の放出の要因に関するアッセイの使用もまた、極めて適応性がある。前記方法は、酵素基質（キャリア粒子の表面層）が、基本原理を修正することなく変更できるため、広範囲の酵素に適用されうる。
【００７０】
実施例５において実証されているように、前記アッセイは非常に鋭敏であり、リポソームの酵素反応からたった５分後に、１０ｎＭ未満のＰＬＡ２の検出を可能にする。単一のキャリア粒子の分解が数多くのリンカー分子を放出し、結果として数多くのシグナル粒子の凝集が生じるため、この感度は、少なくとも一部において、前記シグナルの増幅に起因する。より高感度な測定をするため、反応時間を長くすることができる。例えば、実施例８で実証されているように、前記アッセイは、長時間のインキュベーションでわずか７０ｐＭの酵素濃度の検出に用いられうる。前記アッセイは室温（１６〜２５℃）で行われうるが、高い温度（例えば、３７℃）におけるアッセイは、反応時間を短縮し、アッセイの感度を向上させうる。
【００７１】
前記酵素基質はシグナル粒子−リンカー分子共役体と化学的に結合しないため、前記酵素およびシグナル成分のデカップリングは、基質の化学的性質、温度、溶液条件、またはインキュベーションの時間を変化させることなく、所望の濃度範囲となるようにアッセイを調整するために利用されうる。アッセイの感度は、アッセイ組成物におけるキャリア粒子の濃度、キャリア粒子により生じたリンカー分子の濃度、またはリポソームのナノ粒子の比率を変更することによって、ピコモル〜マイクロモルのレベルに調整されうる。前記放出速度は、例えば、リポソーム中のペプチドのローディング率を変化させることによって変化しうる。
【００７２】
シグナル粒子を凝集するためのリンカー分子の使用は、高度に特異的、かつ、しっかりとした変換メカニズムを提供する。前記アッセイは、溶液条件の広い範囲において機能することができ、所定の培地、１０％ヒト血清、または細胞溶解物全体において機能しうる。これは、血清タンパク質等の分子の存在により前記シグナルの産生が顕著に低下する多くの公知のアッセイ方法とは対照的である。
【００７３】
また、特許請求されたアッセイの方法は、必要とする工程数が少なく、直線的な混合手順であることから、当該方法は簡便で容易に自動化される。
【００７４】
上述したように、酵素の異常調節は、多様な疾患および症状に関係する。問題となる疾患または症状に応じて、前記病態は、異常に高いもしくは異常に低い酵素の濃度、または異常に高いもしくは異常に低い酵素活性に起因または関連しうる。前記酵素の異常は、疾患の原因となり、または限局性炎症等の病変の簡易な指標でありうる。試料中の酵素濃度または酵素活性の測定は、したがって、かような疾患の診断に用いられうる。本発明の第七の態様は、
ｉ）前記被験者由来の試料を、本発明の第一の態様に係る組成物と接触させる工程（この際、前記酵素は前記キャリア粒子を分解して前記キャリア粒子から前記リンカー分子を放出させる）；および
ｉｉ）前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、
を含む、被験者の酵素の調節異常に関連する疾患または症状を診断する方法を提供する。
【００７５】
前記シグナル粒子の凝集は、第六の態様において前述したように検出および測定されうる。
【００７６】
前記シグナル粒子の凝集の程度は、試料中の酵素濃度または酵素活性と直接関連する。前記凝集の程度（測定可能な変化を通して評価される）は、酵素濃度または酵素活性が異常に高いか異常に低いかを決定するために、「正常」の酵素濃度（例えば、健常者における平均酵素濃度）によって得られた凝集の程度と対比されうる。
【００７７】
正常酵素濃度または活性からの偏差は、酵素の調節異常に関連した疾患または症状を診断するために、当業者に用いられうる。
【００７８】
問題となる酵素は、例えば、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはトリアシルグリセロールリパーゼでありうる。ホスホリパーゼは、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＢ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ１、およびホスホリパーゼＤ２を含む。トリアシルグリセロールリパーゼは、膵リパーゼ、胃リパーゼ、および舌リパーゼを含む。目的とする他の酵素は、ジアシルグリセロールリパーゼ、コレステラーゼ、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ、肝性リパーゼ、内皮リパーゼ、リポタンパク質リパーゼ、胆汁酸塩依存性リパーゼ、およびホルモン感受性リパーゼを含む。
【００７９】
上述したように、特定の目的とする酵素はＰＬＡ２である。ＰＬＡ２の濃度は、アテローム性動脈硬化症、膵炎、急性敗血症、および癌を含む数多くの疾患および症状の指標である。したがって、本発明の第七の態様は、好ましくはアテローム性動脈硬化症、膵炎、急性敗血症、または癌を診断する方法を提供する。
【００８０】
診断目的における酵素レベルの研究に加えて、酵素アッセイの他の重要な適用は、酵素の活性を調節する剤の高スループットスクリーニングである。したがって、本発明の第八の態様は、
ｉ）前記酵素を、被検物質または被検混合物、および、本発明の第一の態様に係る組成物と接触させる工程；並びに
ｉｉ）前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、
を含む、酵素活性の調節剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００８１】
前記シグナル粒子の凝集は、第六の態様において前述したように検出および測定されうる。
【００８２】
前記凝集の程度（測定可能な変化を通して評価される）は、前記被検物質または前記被検混合物が酵素活性を向上させるか低下させるかを決定するために、被検物質または被検混合物の非存在下で得られた凝集の程度と対比されうる。
【００８３】
被検混合物は、合成化合物の既知の混合物、または潜在的に未知もしくは同定されていない組成物の天然由来試料でありうる。
【００８４】
前記酵素を、被検物質／被検混合物、および、本発明の第一の態様に係る組成物と接触させる工程は、組成物の同時混合または逐次混合を含む。一実施形態において、前記被検物質／被検混合物、および、本発明の第一の態様に係る組成物は、はじめに混合され、次いで酵素が添加されうる。好ましい逐次混合は、問題となる成分に依存する。
【００８５】
特に興味深いことは、酵素の潜在的な阻害剤である。阻害剤存在下、シグナル粒子の凝集の程度は、被検物質／被検混合物の非存在下における凝集の程度と対比すると、減少する。実施例１６に記載されるように、阻害剤はまた、シグナル粒子が検出される前に、遅滞期の長さが長くなることが見出されている。前記方法は、溶液に基づく阻害剤および基質に基づく阻害剤の両者のスクリーニングに用いられうる。両親媒性の競合阻害剤ＭＪ３３等の基質に基づく阻害剤のスクリーニングの場合には、前記被験物質は好ましくは１以上のキャリア粒子の表面層内に含有される。これらのキャリア粒子はまた、リンカー分子を含み、または酵素活性と競合するキャリア粒子の分離集団となりうる。
【００８６】
前記第八の態様に係る方法は、前記酵素基質（キャリア粒子の表面層）がシグナル粒子−リンカー分子共役体と化学的に結合しないため、極めて適応性がある。スクリーニングが溶液に基づく阻害剤に対するものであっても、基質に基づく阻害剤に対するものであっても、前記シグナル粒子に基づく変換はほとんど同じであり、シグナル粒子、結合部位、またはキャリア粒子のカプセル化のいずれについても再構築は不要である。この適応性により、溶液および基質の両者に組み込まれた酵素阻害剤の定量的な研究が可能となる。
【００８７】
また、電気活性または蛍光分析の系とは異なり、荷電または高度に共役した酵素を使用した場合であっても、酵素よりも読み出し機構に作用するため、誤った結果が得られることはほとんどない。
【００８８】
上述したように、前記放出物質はまた、膜の浸透、漏出、および破裂を誘導するペプチド等の誘導性抗微生物部分を含みうる。本発明の第九の態様は、
ｉ）被検物質または被検混合物を、本発明の第一の態様に係る組成物と接触させる工程；および
ｉｉ）前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、
を含む、抗微生物ペプチドの候補をスクリーニングする方法を提供する。
【００８９】
前記シグナル粒子の凝集は、第六の態様において前述したように検出および測定されうる。
【００９０】
前記シグナル粒子の有意な凝集は、被検物質／被検混合物が、リンカー分子を放出するためのキャリア粒子の表面層の浸透、漏出、または破裂を十分に誘導し、その結果、被検物質／被検混合物が抗微生物ペプチドの候補である、または含む指標となる。
【００９１】
毒素の多くは、細胞膜の破壊を介して損傷効果を与える。例えば、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）アルファ毒素は、膜に細孔を形成することによって、溶血および組織損傷を生じさせる膜破壊毒素である。Staphylococcus aureusアルファ毒素は、ホスホリパーゼＣ活性を有する膜破壊毒素であり、ガス壊疽および筋壊死の直接的な原因となる。本発明の第一の態様に係る組成物は、したがって、キャリア粒子の表面層における毒素の作用を介して、当該毒素の検出またはスクリーニングに用いられうる。よって、本発明の第十の態様は、
ｉ）被検物質または被検混合物を、本発明の第一の態様に係る組成物と接触させる工程；および
ｉｉ）前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、
を含む、毒素を検出する方法を提供する。
【００９２】
前記シグナル粒子の凝集は、第六の態様において前述したように検出および測定されうる。
【００９３】
リンカー分子を放出するためのシグナル粒子の有意な凝集は、被検物質または被検混合物が、キャリア粒子の表面層を破壊または分解した指標となり、結果として、前記被検物質／被検混合物は、毒素である、または含む。この方法は、よって、潜在的な毒素のスクリーニングにも使用されうる。
【００９４】
好ましくは、前記キャリア粒子の表面層は、脂質またはリン脂質を含み、動物細胞における毒素の作用と似た症状を示すように、組成物において、十分に通常の細胞膜と類似する。
【００９５】
本発明の詳細は、発明の詳細な説明および下記実施例によって説明され、本発明に係るすべての実施形態は、適宜変更して適用される。
【００９６】
本発明に係る態様を以下の非限定的な実施例により説明する。
【実施例】
【００９７】
実施例１：材料の準備
ポリペプチド：ポリペプチドであるＪＲ２ＥＣ（配列番号１）およびＪＲ２ＫＣ（配列番号２）は、標準フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学プロトコルおよびＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ポリ（エチレン）グリコール−ポリスチレン樹脂を用いてパイオニア自動化ペプチド合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成した。粗生成物は予備ＨＩＣＨＲＯＭ  Ｃ−８カラムを用いて逆相ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって同定した。ＪＲ２ＫＣ２を得るために、凍結乾燥されたペプチドモノマー（１ｍＭ）をｐＨ８の０．１Ｍ重炭酸アンモニウムバッファー中に溶解し、９０分間通気し、使用前に少なくとも２４時間４℃でインキュベートした。合成は先行文献１６中に詳細に記述されている。
【００９８】
他の化学物質：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）、ムフェジコブラ由来のホスホリパーゼＡ２、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）はシグマアルドリッチ社（Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）から購入し、精製することなく用いた。ＰＬＡ２阻害剤クロルプロマジンおよびＭＪ３３もシグマアルドリッチ社から購入した。脂質はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。
【００９９】
ナノ粒子：ブリティッシュバイオセルインターナショナル社（ＢＢＩ）から購入した金ナノ粒子（２０ｎｍ)を１０μＭ  ＪＲ２ＥＣとともに１６時間インキュベートした。未結合のＪＲ２ＥＣの濃度を＜０．１ｎＭまで減らすために、粒子を１５，０００Ｇで繰り返し遠心し、３０ｍＭビス−トリスｐＨ７中で再懸濁した。
【０１００】
リポソーム：ポリペプチドが充填された（ｌｏａｄｅｄ）大きな単層リポソームを先行文献２０中で述べられているように、押出しによって準備した。各バッチは、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）５ｍｇからクロロホルム１０ｍｇ／ｍｌ中で準備した。脂質はアルゴン流下で初めに乾燥し、残余の溶剤を除去するために少なくとも２時間真空下に静置した。乾燥した脂質フィルムを次いでＰＢＳ（１０ｍＭリン酸塩，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）中の０．２５ｍＭ  ＪＲ２ＫＣ２  １ｍＬで再水和し、ボルテックスした。得られた多重膜小胞溶液を１００ｎｍ細孔を有するＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅポリカーボネート膜を用いて１９回押出した。溶離液としてＰＢＳを用いてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００カラムによりゲルろ過することによって捕捉されなかったペプチドをリポソーム懸濁液から除去した。
【０１０１】
再水和溶液がＮａＯＨでｐＨ７に調整した５０ｍＭ  ＣＦ，２０ｍＭリン酸塩であること以外は、カルボキシフルオレセイン充填リポソームを同様に準備した。溶離液としてＰＢＳを用いてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムによりろ過することによって捕捉されなかった色素を除去した。全ての試料中の全脂質濃度はＳｔｅｗａｒｔ  ａｓｓａｙを用いて決定した。２１
これらの材料を下記実施例で適宜用いた。
【０１０２】
実施例２：レシオメトリックおよびピーク位置データ分析法の比較
方法論：実施例１にしたがって準備された、ＪＲ２ＥＣ−機能化ナノ粒子（０．１ｎＭ）およびＪＲ２ＫＣ２−充填リポソーム（５ｍｇ／ｍｌリン脂質）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中に０．５ｍＭ  Ｃａ２＋とともに懸濁した。ナノ粒子−リポソーム混合物をＰＬＡ２およびＨＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）で処理した。各試料に対して、ＰＬＡ２の下記濃度を用いた：
（ｉ）５００ｎｇ／ｍｌ；
（ｉｉ）２５０ｎｇ／ｍｌ；
（ｉｉｉ）１００ｎｇ／ｍｌ；
（ｉＶ）２５ｎｇ／ｍｌ。
【０１０３】
ＵＶ−可視スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ２５  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計で記録した。時間をかけて集めて得られた吸収スペクトルは２つの異なる方法を用いて分析した：
（ａ）レシオメトリック分析方法
この方法において、５２０ｎｍおよび５７０ｎｍでの吸収の比（プラズモンシフト（ｐｌａｓｍｏｎ  ｓｈｉｆｔ））は式１を用いて計算した：
【０１０４】
【数１】
2013521788.tif 000006
【０１０５】
この際、Ａａｇｇは（５７０ｎｍで測定された）凝集粒子による吸収、Ａｄｉｓｐは（５２０ｎｍで測定された）分散粒子による吸収、およびＡｓｃａｔは（８００ｎｍで正規化した）散乱による吸収である。
【０１０６】
（ｂ）ピーク位置分析方法
この方法では、吸収ピークの絶対最大値の波長が凝集の度合いを示すと考えられる。
【０１０７】
結果：各方法を用いて得られたデータを図６に示す。線は、レシオメトリック法（ａ）を用いて得られたデータを示し、一方、点はピーク位置分析法（ｂ）を用いて得られたデータを示す。レシオメトリック法はノイズの結果をあまり拾わなかっただけでなく、低−レベルシグナルの分離がよりよくなった。
【０１０８】
実施例３：ペプチド−充填リポソームの安定性
方法論：１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）をＰＢＳバッファー（１０ｍＭリン酸塩、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で１００ｎｍ細孔を有するポリカーボネート膜を用いて５ｍｇ／ｍｌ  ＰＯＰＣの押出によって準備した。得られたリポソームは、動的光散乱によって測定された平均流体力学半径（ＲＨ）が４９±２ｎｍの狭いサイズ分布を有しており、ゼータ電位（ζ）が−６．６±０．４ｍＶであった。これらの両性イオンＰＯＰＣリポソームの負のゼータ電位は従前の報告２７とよく一致している。
【０１０９】
ペプチド−充填リポソームの準備において、実施例１で述べたように脂質を再水和し、０．２５ｍＭのＪＲ２ＫＣ２を含むＰＢＳ中で押し出した。捕捉されないペプチドはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１００ゲルろ過カラムを用いて除去した。ペプチド−充填リポソームの流体力学半径およびゼータ電位はそれぞれ５１±６ｎｍおよび−７．６±１．２ｍＶであった。これらの値は、バファーのみを含むリポソームと顕著に変わるものではなく、これは、ペプチドが脂質膜の外葉（ｏｕｔｅｒ  ｌｅａｆｌｅｔ）に結合していないことを示す。
【０１１０】
ＣＦ−充填リポソームを実施例１の方法にしたがって準備した。
【０１１１】
結果：リポソームおよびこれらのペプチド充填物は貯蔵において顕著な安定性を示した。４℃４週間後でさえ、リポソーム溶液はＰＬＡ２なしでナノ粒子の凝集を引き起こさず、これはペプチドがリポソーム内から漏れていないことを示す。しかしながら、界面活性剤のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００の０．１体積％をナノ粒子−リポソーム混合物に添加すると、ナノ粒子はプラズモンバンドの劇的な４０ｎｍレッドシフトを示し、これは、ペプチド−リポソームシステムが損傷を受けておらず、活性であることを示す。
【０１１２】
貯蔵の間に顕著なバックグラウンドリークが起こったので、この安定性はより慣用的なＣＦ放出アッセイによっては見出せなかった。わずか４℃２４時間でＣＦ−充填リポソームは１５％の内容物を放出し、これは、ペプチド−リポソームシステムが顕著によい安定性を示すことを表す。ＪＲ２ＫＣ２（配列番号２）のより緩やかな放出は、ポリペプチドがＣＦよりも顕著に大きいという事実によるかもしれない。ペプチドもまたＣＦよりも多くの極性および極性基を有し、これにより、疎水性二重層コアを横断するエネルギー障壁を増大させる。実際、リポソームシステムは、ポリペプチドを保持する際に効果的であるので、この特定例において、ＰＬＡ２の添加だけが、顕著なナノ粒子架橋を誘発するのには不十分なごく少量のペプチドを放出した。
【０１１３】
実施例４：アッセイ性能における溶液条件の影響
方法論：実施例１にしたがって、２０ｎｍ  ＪＲ２ＥＣ−機能化金ナノ粒子および１００ｎｍ  ＪＲ２ＫＣ２−充填リポソームの混合溶液を準備した。吸収スペクトルは下記に述べるように種々の溶液条件下の溶液に対して測定した。
【０１１４】
図３Ａ中で示すように、吸収スペクトルを測定した：
（ｉ）ＰＬＡ２存在下；
（ｉｉ）ＰＬＡ２およびＥＤＴＡ存在下；および
（ｉｉｉ）ペプチドリンカー分子非存在下。
【０１１５】
結果（Ａ）：酵素ＰＬＡ２によってリポソーム切断が起こり、捕捉されたペプチドは放出され、ナノ粒子吸収スペクトルをレッドシフトさせた。５７０および５２０ｎｍでの吸収比のプロットはこのシフトを表す。本研究で用いられたホスホリパーゼはカルシウム依存性である。予期されるように、溶媒中にＥＤＴＡが含まれることで、おそらく酵素的なリポソーム分解を阻害することによって凝集を抑制した。ＰＬＡ２の添加はまたリポソーム中にペプチドリンカー分子が含まれなかった時には何ら凝集を引き起さず、これは、酵素自体が観察されたスペクトルシフトに直接的に関与しているものではないことを示す。
【０１１６】
図３Ｂに示されるように、吸収スペクトルもまた測定された：
（ｉ）ＨＳＡ非存在下；
（ｉｉ）ＨＳＡ添加に続いてＰＬＡ２を添加したとき；および
（ｉｉｉ）ＰＬＡ２添加に続いてＨＳＡを添加したとき。
【０１１７】
ＨＳＡは血清中の普遍的なタンパク質であり、他の役割の中で、肝臓に脂肪酸を輸送する。
【０１１８】
結果（Ｂ）：ＰＬＡ２とともにリポソームをインキュベーションした後、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加すると、キャリア粒子からリンカー分子を放出する速度が大きく増加することが見出された。ペプチド−充填リポソームにＰＬＡ２の添加後すぐに（３０秒）ＨＳＡを４ｍｇ／ｍｌ添加すると、ペプチドが急速に放出され、大きな粒子凝集につながった。ＨＳＡだけでは何ら粒子凝集を引き起こさなかった。興味深いことに、ＰＬＡ２前にＨＳＡを添加してもペプチドの放出は抑制され、これは、リポソームへのＨＳＡの結合がリポソームへのＰＬＡ２の結合を妨げる可能性があることを示す。上述したように、（ペプチドリンカー分子なしの）ブランクリポソームを用いた図３Ａに示されるコントロール実験は、ナノ粒子架橋を何ら起こさなかった。用いたＰＬＡ２はＣａ２＋−依存的であるので、Ｃａ２＋非存在下で行った実験は同様に何ら架橋を起こさなかった。したがって、我々は、ＨＡＳの存在によって支持されて、ＪＲ２ＥＣ−改変ナノ粒子の凝集の原因は、ＰＬＡ２−依存性ＪＲ２ＫＣ２放出であると考えることができる。
【０１１９】
実施例５：アッセイの定量性能
システムの挙動を最適化し、検証した後、アッセイの定量性能を決定した。
【０１２０】
方法論：ＪＲ２ＥＣ−機能化ナノ粒子（０．１ｎＭ）およびＪＲ２ＫＣ２−充填リポソーム（５ｍｇ／ｍｌリン脂質）を含む組成物を実施例１にしたがって準備した。組成物は種々の濃度のＰＬＡ２溶液を用いて３０分間インキュベートした。ナノ粒子吸収スペクトルは式１を用いて分析した：
【０１２１】
【数２】
2013521788.tif 000007
【０１２２】
この際、Ａａｇｇは（５７０ｎｍで測定された）凝集粒子による吸収、Ａｄｉｓｐは（５２０ｎｍで測定された）分散粒子による吸収、およびＡｓｃａｔは（８００ｎｍで正規化した）散乱による吸収である。
【０１２３】
結果：得られた反応は添加されたＰＬＡ２の量およびこの酵素がリポソームとともにインキュベートされる時間に主として依存していることが見出された。ＨＳＡの添加後の反応はほとんどすぐなので、ＨＳＡとともにインキュベートする時間は重要な因子ではなかった。アッセイはリポソーム上の酵素作用のわずか５分後に１０ｎＭ未満のＰＬＡ２を検出することができた。酵素濃度の範囲に対する結果を図４に示す。最大シフト強度は各点に対する±ＳＥＭでプロットした。結果は濃度ともにＳ字状の反応を示す。これらの条件（ナノ粒子濃度０．３ｎＭ、ペプチド充填濃度０．５ｍＭおよびリポソーム濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）では、検出のより低い限界が約１ｎＭであった。高いＰＬＡ２レベルではペプチドリンカー分子がナノ粒子を飽和させるのに十分に濃縮され、よって凝集量を減少させるという事実により、定量の上限は約５０ｎＭであった。しかしながら、用いられるリポソームの濃度、またはリポソームに充填されるリンカー分子の濃度を変えると反応カーブが移動するので、この範囲は可変である。したがって、基質化学、温度、溶液条件またはインキュベーション時間を変えることなく、所望の濃度範囲にアッセイを調整することが可能となる。
【０１２４】
実施例６：従来のカルボキシフルオレセイン−系アッセイにおける血清タンパク質の影響
方法論：ＰＢＳ中のカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）０．７５μＭ溶液を準備した。蛍光放射をこの溶液の波長の機能として初めに測定した（・・・・・・）。次いで引き続いての３０μＭ  ＨＡＳの添加後（−−−）、および０．１７ｍＭ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加後（−）にスペクトルを集めた。
【０１２５】
結果：図５に示すように、ＣＦ溶液に対するＨＳＡ添加により、色素の放出プロファイルが変わった。最大ピーク位置は変わらなかったが、ピーク強度は顕著に変わった。ＨＳＡはＣＦ放出をほぼ１／３に減少させたが、ＨＡＳおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は協同して作用し、放出をほぼ２／３に減少させた。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００だけの添加は放出強度に何ら影響を与えなかった（データは示さない）。
【０１２６】
したがって、血清タンパク質の存在により、従来のＣＦ−系アッセイを用いて得られる蛍光シグナルが顕著に減少した。さらに、状況を複雑にしていることは、小胞を溶解し、システムを修正するために添加される界面活性剤がタンパク質と協同して作用し、さらに蛍光量を減ずるという事実である。これらの影響は所定のタンパク質レベルで補うことが可能であるけれども、臨床アッセイにおいてかようなことを行うと各試料中のタンパク質レベルを測定する追加的な段階を必要とする。影響が生体試料中で共通して見出される多数のタンパク質で同様な所定の異なる比であることも明らかではない。したがって、従来のＣＦ−系アッセイの安定性および適応性は限定的である。
【０１２７】
実施例７：酵素濃度の作用としてカルボキシフルオレセインアッセイからの反応
酵素濃度の作用として先行技術のカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）放出アッセイからの反応を調べた。
【０１２８】
方法論：５０ｍＭカルボキシフルオレセイン含有リポソームを実施例１で述べたように準備した。試料中の最終脂質濃度は３０μｇ／ｍｌであった。脂質は種々の濃度で３０分間、ＰＬＡ２溶液とともにインキュベートした。実験はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ蛍光光度計で励起波長４９０ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍで行った。スリット幅１０ｎｍを双方のケースで用いた。全ての実験は２２℃で行い、恒温バスによって維持された。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いてリポソームが破断するコントロール実験によって最大反応が示された。
【０１２９】
結果：結果を図７に示す。放出は線形にＰＬＡ２濃度に依存し、１ｎＭの低レベルでの検出を可能にした。調べた条件下で、２００ｎＭ  ＰＬＡ２は、３０分間でほぼ全てのリポソームを破裂させるのに十分であった。
【０１３０】
実施例８：アッセイの感受性
本発明のアッセイの感受性をインキュベーション時間を延長して試験した。
【０１３１】
方法論：ＪＲ２ＥＣ−機能化ナノ粒子（０．１ｎＭ）およびＪＲ２ＫＣ２−充填リポソーム（５ｍｇ／ｍｌリン脂質）を含む組成物を実施例１にしたがって準備した。この溶液を室温で１２時間７０ｐＭ  ＰＬＡ２溶液とともにインキュベートした。ＰＬＡ２なしで同一の溶液をインキュベートした。次いで、双方の溶液にＨＳＡを添加し、２０分後、光吸収を測定した。
【０１３２】
結果：得られたデータを図８に示す。実線（−）はＰＬＡ２とともにインキュベートした溶液の光減衰を示し、点線（−−−）は、ＰＬＡ２非存在下でインキュベートした溶液の光減衰を示す。本アッセイがインキュベーションを延長することで、７０ｐＭの低い酵素濃度を検出するために用いることができることを結果は示す。反応条件を最適下することによって、この検出限界をより低くすることが可能となる。
【０１３３】
実施例９：ＰＥＧ−グラフト脂質の影響
ＰＥＧ−グラフト脂質を含む表面層を有するリポソームが与える影響を調べた。
【０１３４】
方法論：１．５ｍｏｌ％  ＰＥＧ−脂質を含むリポソームを準備した。光吸収は、ＰＬＡ２添加前および（ｉｉ）０．７ｎＭ  ＰＬＡ２の添加後８分で測定した。ＨＳＡは添加しなかった。
【０１３５】
結果：図９に得られたデータを示す。実線（−）はＰＬＡ２添加前の溶液の光減衰を示し、点線（−−−）は、ＰＬＡ２添加後の溶液の光減衰を示す。ＰＥＧ−脂質の１．５モル％含有リポソームはＨＳＡを必要とすることなくプラズモンピークの顕著に大きなレッドシフトを起こした。
【０１３６】
実施例１０：ペプチド−充填リポソームＩＩの安定性
実施例１にしたがって準備された、ＪＲ２ＥＣ−機能化ナノ粒子およびＪＲ２ＫＣ２−充填リポソームをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中に０．５ｍＭ  Ｃａ２＋とともに懸濁した。ＪＲ２ＫＣ２−充填リポソームを全脂質濃度０．１ｍｇ／ｍｌにまで希釈した。リポソーム中に充填されたＪＲ２ＫＣ２の濃度は０．２５ｍＭであり、１００％放出の際にはＪＲ２ＫＣ２の約０．１μＭの濃度となる。リポソームはエッペンドルフチューブでＰＢＳバッファー中に分散され４℃で１５週間貯蔵した。リポソームは暗中で貯蔵したが、機械的振動または偶発的光曝露からは保護しなかった。１．４ｎＭ  ＰＬＡ２を添加し、アッセイ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ２５  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて２分間隔で３０分間、４００〜８００ｎｍの範囲で全スペクトルを記録することによって、分光学的に（ＵＶ−可視範囲で）測定した。ピークシフト（Δλｍａｘ；ＵＶ−可視スペクトル中で最大吸光波長における変化）は、ＰＬＡ２添加後のλｍａｘからＰＬＡ２添加前の最大吸光波長（λｍａｘ）を引くことによって得た。特に述べられていない限り、全ての測定は室温（約２５℃）で行った。
【０１３７】
コントロールは：ｉ）Ｃａ２＋なしおよび：ｉｉ）ペプチドが折り重ならず、ヘテロ三量体複合体を形成できない状態にする、Ｌ−アラニンがＤ−アラニンに置換された改変されたＪＲ２ＥＣ型で機能化したナノ粒子を用いて行った。
【０１３８】
結果：ＪＲ２ＫＣ２のこの濃度で、ＪＲ２ＥＣ改変シグナル粒子の広範囲の凝集が誘発された。図１０ａに示すように、ＰＬＡ２に暴露するとリポソームの分解により、金ナノ粒子の局在化した表面プラズモン反応（ＬＳＰＲ）バンドの顕著なレッドシフトを誘発する捕捉されたＪＲ２ＫＣ２ペプチドの放出が起こった。この速い変換および大きな光学シフトにより、酵素活性のリアルタイムモニタリングが可能となった。ペプチド充填リポソームは驚くべき安定性を示した。貯蔵の１５週間後にも何らＪＲ２ＫＣ２のバックグランドリークが検出されなかった一方、７ｎＭ  ＰＬＡ２の添加後は大きな反応が得られた（図１１ａ参照）。データはＰＬＡ２なしでは何らＪＲ２ＫＣ２の自然発生的な放出はなく、リポソームがＰＬＡ２に対する完全な反応を維持することを示す。
【０１３９】
ここで用いられた（ムフェジコブラ）ＰＬＡ２触媒活性はＣａ２＋のミリモル濃度の存在に大きく依存するため、Ｃａ２＋なしで実験を繰り返すことは有用なネガティブコントロールである。期待されるように、ＰＬＡ２の添加の際にＣａ２＋なしでは粒子凝集が何ら見られなかった（図１０ｂ参照）。この観察により、粒子凝集が単に酵素の存在よりもむしろＰＬＡ２が介する脂質の加水分解に依存することが確認される。さらに、改変された、折りたたまれていないＪＲ２ＥＣペプチドで被覆された粒子はＰＬＡ２が介するＪＲ２ＫＣ２の放出の際に凝集しなかった（図１０ｂ参照）。
【０１４０】
実施例１１：遅滞期（Ｌａｇ  Ｐｈａｓｅ）
方法論：実施例１にしたがって準備した、ＪＲ２ＥＣ−機能化ナノ粒子（０．１ｎＭ）およびＪＲ２ＫＣ２充填リポソーム（５ｍｇ／ｍｌリン脂質）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中に０．５ｍＭ  Ｃａ２＋とともに懸濁した。１．４ｎＭ  ＰＬＡ２を添加した。アッセイ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ２５  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて２分間隔で６０分間、４００〜８００ｎｍの範囲で全スペクトルを記録することによって、分光学的に（ＵＶ−可視範囲で）測定した。ＰＬＡ２はＴ＝５分の時点で添加した。ピークシフト（Δλｍａｘ）は、ＰＬＡ２添加後のλｍａｘからＰＬＡ２添加前の最大吸光波長（λｍａｘ）を引くことによって得た。
【０１４１】
結果：１．４ｎＭ  ＰＬＡ２の添加はすぐに粒子凝集を引き起こさなかったが、例えば、遅滞−爆発挙動（ｌａｇ−ｂｕｒｓｔ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ）、すなわち、短い爆発相（ｂｕｒｓｔ  ｐｈａｓｅ）が続く遅滞期を示した（図１０ｂ参照）。これは、ＪＲ２ＫＣ２の放出が濃度依存的遅滞期だけ先行することを示す。
【０１４２】
実施例１２：遅滞期における被分析物濃度および温度の影響
遅滞期の持続は、試料中のホスホリパーゼの濃度および活性に依存する重要な動的パラメーターである。この点を考慮して、適切なアッセイ基準（ａｓｓａｙ  ｍｅｔｒｉｃ）として遅滞期が用いられうるかどうかを決定するために体系的調査を行った。
【０１４３】
材料：実施例１にしたがって準備したＪＲ２ＥＣ−機能化ナノ粒子（０．１ｎＭ）およびＪＲ２ＫＣ２−充填リポソーム（０．１ｍｇ／ｍｌリン脂質）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中に０．５ｍＭ  Ｃａ２＋とともに懸濁した。
【０１４４】
ｉ）被分析物濃度の影響
方法論：ＰＬＡ２を以下の濃度：ｉ）７ｎＭ、ｉｉ）３．５ｎＭ、ｉｉｉ）１．４ｎＭ、またはｉｖ）７００ｐＭで添加した。アッセイ反応は、３７℃でＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ２５  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて２分間隔で６０分間、４００〜８００ｎｍの範囲で全スペクトルを記録することによって、分光学的に（ＵＶ−可視範囲で）測定した。ＰＬＡ２はＴ＝５分の時点で添加した。ピークシフト（Δλｍａｘ）は、ＰＬＡ２添加後のλｍａｘからＰＬＡ２添加前の最大吸光波長（λｍａｘ）を引くことによって得た。
【０１４５】
結果：遅滞期の長さはＰＬＡ２の濃度に明らかに依存していて、３７℃で０．５ｍＭＣａ２＋の存在下で７ｎＭ−７００ｐＭの範囲の濃度で５から４０分にまで拡張したことが見出された（図１２ａ参照）。
【０１４６】
ｉｉ）温度の影響
方法論：ＰＬＡ２７ｎＭを以下の条件：ｉ）室温、およびｉｉ）３７℃で添加した。アッセイ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ２５  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて２分間隔で６０分間、４００〜８００ｎｍの範囲で全スペクトルを記録することによって、分光学的に（ＵＶ−可視範囲で）測定した。ＰＬＡ２はＴ＝５分の時点で添加した。ピークシフト（Δλｍａｘ）は、ＰＬＡ２添加後のλｍａｘからＰＬＡ２添加前の最大吸光波長（λｍａｘ）を引くことによって得た。
【０１４７】
結果：図１３ａで示されるように、温度もまた遅滞期の長さに重要な影響を与えた。７ｎＭのＰＬＡ２濃度で、室温の遅滞期は３７℃の場合よりも約２０分間長くなった。
【０１４８】
実施例１３：アッセイ性能に対するヒト血清アルブミンの影響
方法論：実施例１にしたがって準備した、ＪＲ２ＥＣ−機能化ナノ粒子（０．１ｎＭ）およびＪＲ２ＫＣ２充填リポソーム（０．１ｍｇ／ｍｌリン脂質）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中に０．５ｍＭ  Ｃａ２＋とともに懸濁した。ＰＬＡ２７ｎＭを以下の条件：ｉ）ＰＬＡ２の添加５分後ペプチド充填リポソームに対してヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の４ｍｇ／ｍｌの添加とともに、およびｉｉ）ＨＳＡの添加なしで添加した。アッセイ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ２５  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて２分間隔で３０分間、４００〜８００ｎｍの範囲で全スペクトルを記録することによって、分光学的に（ＵＶ−可視範囲で）測定した。ＰＬＡ２はＴ＝５分の時点で添加した。ピークシフト（Δλｍａｘ）は、ＰＬＡ２添加後のλｍａｘからＰＬＡ２添加前の最大吸光波長（λｍａｘ）を引くことによって得た。
【０１４９】
４ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡおよび７０ｎＭ  ＰＬＡ２を用いて、室温で実験を繰り返し、コントロールはｉ）Ｃａ２＋なし、およびｉｉ）ＪＲ２ＫＣ２なしで行った。
【０１５０】
結果：ペプチド充填リポソームに対してＨＳＡを添加することによってペプチドがほとんどすぐに放出され、大きな粒子凝集が起こった（図１３ｂ参照）。ＨＳＡだけでは何ら粒子凝集が起こらなかった。同様に、図１３ｃに示されるように、ＪＲ２ＫＣ２を充填していないリポソームと同様に、Ｃａ２＋非存在下でＰＬＡ２後にＨＳＡを添加しても凝集は起きなかった。したがって、我々はリン脂質の酵素加水分解、リポソームの不安定化、そしてより速い分解の結果、ＨＳＡがリポソーム表面に結合して膜内で蓄積した脂肪酸を除去すると仮定する。プラズモンピークのシフトはＨＳＡ存在下でもより大きくなり、これは、高濃度の脂肪酸の存在がポリペプチドの結合および折りたたみを妨げることを示す。
【０１５１】
実施例１４：アッセイ性能に対するＰＬＡ２濃度の影響
方法論：実施例１にしたがって準備した、ＪＲ２ＥＣ−機能化ナノ粒子（０．１ｎＭ）およびＪＲ２ＫＣ２充填リポソーム（０．１ｍｇ／ｍｌリン脂質）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中に０．５ｍＭ  Ｃａ２＋とともに懸濁した。アッセイ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ２５  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて４ｍｇ／ｍＬ  ＨＡＳの添加１０分後種々のＰＬＡ２濃度に対して４００〜８００ｎｍの範囲で全スペクトルを記録することによって、分光学的に（ＵＶ−可視範囲で）測定した。ピークシフト（Δλｍａｘ）は、ＰＬＡ２添加後のλｍａｘからＰＬＡ２添加前の最大吸光波長（λｍａｘ）を引くことによって得た。
【０１５２】
結果：酵素レベルの範囲に対する結果は図１３ｄに示し、これは濃度とともにＳ字状反応を示す。アッセイ反応は試料中に存在する活性ＰＬＡ２量およびこの酵素がリポソームとともにインキュベートされる時間量に主として依存した。ＨＳＡを用いると室温で酵素活性わずか５分後で１０ｎＭ未満のＰＬＡ２を検出することができた。
【０１５３】
実施例１５：遅滞期に対するＰＥＧ−グラフト化脂質の影響
方法論：実施例１にしたがって準備した、２％  １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングルコール）］（ＰＥＧ，分子量＝４０００ｇ／ｍｏｌ）を有するＪＲ２ＫＣ２充填リポソームおよびＪＲ２ＥＣ−機能化ナノ粒子（０．１ｎＭ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中に０．５ｍＭ  Ｃａ２＋とともに懸濁した。アッセイ反応は、ＰＬＡ２あり、およびなしで、室温で、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ２５  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて、２分間隔で３０分間、４００〜８００ｎｍの範囲で全スペクトルを記録することによって、分光学的に（ＵＶ−可視範囲で）測定した。ピークシフト（Δλｍａｘ）は、ＰＬＡ２添加後のλｍａｘからＰＬＡ２添加前の最大吸光波長（λｍａｘ）を引くことによって得た。
【０１５４】
結果：ＰＥＧ−グラフト化リポソームにおいて、ペプチドの顕著に速い放出が室温で観察された（図１１ｂ参照）。遅滞期はＰＯＰＣリポソーム中約２５分から２％ＰＥＧ化脂質の添加で１０分にまで減少した。全反応は純ＰＯＰＣリポソームと比較してわずかに高くもなった。
【０１５５】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）で改変された脂質を含めることは、溶液中に存在するリポソームとタンパク質との間の非特異的相互作用を減少させるので、ドラッグデリバリー用途では一般的な改変である。興味深いことに、非特異的相互作用は減少するにもかかわらず、ホスホリパーゼによる脂質の特異的加水分解はＰＥＧ末端脂質を一部含むリポソームにおいて実質的に増加する。この効果は、ＰＥＧ−脂質によって運ばれる負の正味電荷によって介される可能性が高い。
【０１５６】
実施例１６：遅滞期における阻害剤の影響
単にその濃度を測定するよりもむしろ酵素の活性を測定することが重要である一適用は、阻害剤に対するハイスループットスクリーニングである。クロルプロマジンは、ＰＬＡ２の典型的な水溶性小分子阻害剤であり、したがってかようなスクリーニングにおけるこのアッセイの有用性に対して良好なテストケースである。
【０１５７】
方法論：ＪＲ２ＫＣ２充填リポソーム、カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）−充填リポソームおよびＪＲ２ＥＣ−機能化金ナノ粒子は、実施例１で述べたように準備した。ＰＬＡ２およびクロルプロマジンの混合物はリポソームの懸濁に対して添加した。アッセイ反応は、種々の濃度のクロルプロマジンをＰＬＡ２（７ｎＭ）、機能化金ナノ粒子（０．１ｎＭ）およびリポソーム（１．４ｎＭ）とともに３７℃で１０分間インキュベートした後、分光学的に（ＵＶ−可視範囲で）測定した。ＪＲ２ＫＣ２充填リポソームに対して、アッセイ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ２５  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて、２分間隔で、４００〜８００ｎｍの範囲でスペクトルを記録することによって、分光学的に（ＵＶ−可視範囲で）測定し、次いで、Δλｍａｘを引いた。
【０１５８】
結果：これらの実験により、クロルプロマジンに対するＩＣ５０が６．５μＭとなった（図１４）。この値は単相ヒル方程式（ｍｏｎｏｐｈａｓｉｃ  Ｈｉｌｌ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）にデータを適合させることによって得た。
【０１５９】
【数３】
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【０１６０】
この際、ｍｉｎは完全に阻害された値で、ｍａｘは阻害されていない値で、ｘは阻害剤の濃度であり、ｎはヒル係数である。遅滞期は阻害剤なしの約５分から１０μＭクロルプロマジンの存在下約１５分まで増加した（図１５参照）。この遅滞期は活性非阻害ＰＬＡ２の濃度が試料中に存在する実際のＰＬＡ２濃度の約半分であったことを示す（図１２ｂ参照）。
【０１６１】
クロルプロマジンによる阻害はＣＦ−充填リポソームを用いて確認し、１０μＭのＩＣ５０値であった（図１４参照）。わずかに高い濃度がクロルプロマジンに対して以前報告され（ＩＣ５０＝１０−１００μＭ）、用いられたアッセイ方法が得られたＩＣ５０値の大きさに影響を与えることを示す。この相違は、関連する相対的時間スケールに依存しうる。多くの従来のアッセイ（例えば、放射性アッセイ）は非常に時間がかかり、酵素活性の連続的モニタリングができないので、遅滞期が終了し、爆発相が始まった後に評価を行う場合がある。したがって、比較的少量の残余の活性酵素が大きな反応となり、それ故、より速いアッセイ中と同じ見掛け阻害を得るためにより高濃度の阻害剤が必要となる場合がある。この相違が他の阻害剤システムと一致することがわかっている場合、このアッセイによって提供されるリアルタイム測定に加えて天然基質提示の利点が薬剤候補の将来的な開発において重要であることがわかる。さらに、電気活性または蛍光分析システムを用いる場合と異なり、本システムは電荷を帯びた、または高共役系阻害剤によってかき乱される可能性が低い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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