(57)【要約】  本発明は、本明細書においてｐＤＡＢ４４６８−０４１６と称される、ダイズ植物における除草剤耐性についての新規のａａｄ−１２形質転換イベントを包含する。本発明は、ダイズの細胞のゲノム内の特定の部位に挿入された異種ポリヌクレオチドを包含する。一部の実施形態では、前記イベント／ポリヌクレオチドに、例えば、他の除草剤耐性遺伝子（複数可）および／または昆虫抑制タンパク質を含めた他の形質を「積み重ねる」ことができる。さらに、本発明は、試料（例えばダイズ）中の本主題のイベントの存在を検出するためのアッセイを提供する。アッセイは、ダイズゲノムに挿入された組換え構築物のＤＮＡ配列、および挿入部位に隣接しているゲノム配列に基づくことができる。アッセイの実施において有用なキットおよび条件も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１を含むゲノムを含むトランスジェニックダイズ植物。
【請求項２】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０４４２の下で寄託されている代表的な種子に存在するＡＡＤ−１２イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６を含むゲノムを含むダイズ種子。
【請求項３】
配列番号１を含むゲノムを含むダイズ種子。
【請求項４】
配列番号１を含む、請求項２に記載の種子を生長させることによって作出されるダイズ植物。
【請求項５】
ＡＡＤ−１２イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６を含む、請求項４に記載のダイズ植物の後代植物。
【請求項６】
配列番号１を含む、請求項１に記載のダイズ植物の除草剤耐性後代植物。
【請求項７】
配列番号２９および配列番号３０のＳＮＰマーカー間の第４染色体に位置するダイズ染色体標的部位に導入遺伝子挿入断片を含むトランスジェニックダイズ植物であって、前記標的部位が異種核酸を含む、トランスジェニックダイズ植物。
【請求項８】
配列番号２９および配列番号３０のＳＮＰマーカー間の第４染色体上の位置において異種核酸を挿入するステップを含むトランスジェニックダイズ植物を作製する方法であって、前記標的部位が異種核酸を含む方法。
【請求項９】
花粉、胚珠、花、莢、リント、苗条、根、および葉からなる群から選択され、配列番号１を含む、請求項４に記載の植物の一部。
【請求項１０】
配列番号１の残基１〜２７３０および配列番号１の残基９１２２〜１０，２１２からなる群から選択されるゲノム配列中に、またはそれに隣接して導入遺伝子挿入断片を含むトランスジェニックダイズ植物。
【請求項１１】
少なくとも１５ヌクレオチドを含み、ストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１の残基１〜２７３０および配列番号１の残基９１２２〜１０，２１２からなる群から選択される核酸配列とのハイブリダイゼーションを維持する、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１２】
配列番号２〜２８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１の残基２７２０〜２７４０、配列番号１の残基９１１２〜９１３２、およびその相補物からなる群から選択されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ポリメラーゼ連鎖反応によって生成するアンプリコンである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号１を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドを作出する方法。
【請求項１７】
導入遺伝子をダイズゲノムのＤＮＡセグメントに挿入する方法であって、前記ＤＮＡセグメントが、配列番号１の残基１〜２７３０を含む５’末端および配列番号１の残基９１２２〜１０，２１２を含む３’末端を含む方法。
【請求項１８】
ダイズ植物を育種する方法であって、配列番号１を含む第１のダイズ植物を第２のダイズ植物と交雑してゲノムを含む第３のダイズ植物を作出するステップと、前記第３のダイズ植物を、前記ゲノム内に配列番号１が存在することについてアッセイするステップとを含む方法。
【請求項１９】
除草剤耐性形質をダイズ植物に遺伝子移入する方法であって、配列番号１を含む第１のダイズ植物を第２のダイズ植物と交雑してゲノムを含む第３のダイズ植物を作出するステップと、前記第３のダイズ植物を、前記ゲノム内に配列番号１が存在することについてアッセイするステップとを含む方法。
【請求項２０】
雑草を制御する方法であって、請求項１の植物を含む圃場にアリールオキシアルカノエート除草剤を施用するステップを含む方法。
【請求項２１】
前記除草剤が、２，４−Ｄ；２，４−ＤＢ；ＭＣＰＡ；およびＭＣＰＢからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記圃場に第２の除草剤を施用するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の除草剤が、グリホサートおよびジカンバからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
雑草を制御する方法であって、圃場にアリールオキシアルカノエート除草剤を施用するステップと、前記除草剤を施用してから１４日間以内に前記圃場に請求項３の種子を植え付けるステップとを含む方法。
【請求項２５】
ダイズＤＮＡを含む試料中のダイズイベントを検出する方法であって、前記試料を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０４４２の下で寄託されている代表的な種子に存在するＡＡＤ−１２イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６に特徴的な少なくとも１つのポリヌクレオチドと接触させるステップを含む方法。
【請求項２６】
前記試料を、
ａ．配列番号１の残基１〜２７３０、配列番号１の残基９１２２〜１０，２１２、およびその相補物からなる群から選択される隣接配列に結合する第１のプライマー、および
ｂ．配列番号１の残基２７３１〜９１２１またはその相補物を含む挿入断片配列に結合する第２のプライマー
と接触させるステップと、
前記試料をポリメラーゼ連鎖反応に供するステップと、前記プライマーの間で生成されたアンプリコンについてアッセイするステップとを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プライマーが、配列番号２〜７からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも３０ヌクレオチドを含み、かつストリンジェントな条件下で配列番号１の残基２７２０〜２７４０、配列番号１の残基９１１２〜９１３２、およびその相補物からなる群から選択される配列とハイブリダイズし、前記方法が、前記試料および前記ポリヌクレオチドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するステップと、前記試料を、前記ポリヌクレオチドの前記ＤＮＡへのハイブリダイゼーションについてアッセイするステップとをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むＤＮＡ検出キット。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法を実施するためのＤＮＡ検出キット。
【請求項３１】
少なくとも３０ヌクレオチドを含み、かつストリンジェントな条件下で配列番号１の残基２７２０〜２７４０、配列番号１の残基９１１２〜９１３２、およびその相補物からなる群から選択される配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ検出キット。
【請求項３２】
除草剤抵抗性の雑草を処理する、または防ぐために使用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記除草剤が、前記植物を植え付ける前に施用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
グリホサート耐性形質をさらに含む少なくとも１つの請求項１に記載の植物を含む地域においてグリホサート抵抗性の雑草を制御する方法であって、アリールオキシアルカノエート除草剤を前記地域の少なくとも一部に施用するステップを含む方法。
【請求項３５】
前記除草剤がフェノキシオーキシンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記除草剤がグリホサートとのタンク混合物から施用される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記雑草の少なくとも１種が、前記植物と異なる種のグリホサート抵抗性の自生植物である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＡＤ−１２ダイズイベントおよびそれに由来する後代に関する。
【背景技術】
【０００２】
ａａｄ−１２遺伝子（元々はデルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）由来）は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１２）タンパク質をコードする。この形質により、例えば２，４−ジクロロフェノキシ酢酸に対する耐性、およびピリジルオキシ酢酸除草剤に対する耐性が付与される。ａａｄ−１２遺伝子自体は、植物における除草剤耐性について、ＷＯ２００７／０５３４８２に最初に開示された。
【０００３】
植物における異種遺伝子または外来遺伝子の発現は、その外来遺伝子が染色体のどこに挿入されたかに影響される。これは、例えば、クロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）のため、または組み込み部位に近い転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の近傍にあるためである可能性がある（Weisingら、Ann. Rev. Genet 22巻:421〜477頁、1988年）。同じ種類のトランスジェニック植物（または他の生物体）における同じ遺伝子が、異なるイベント間で発現レベルの広範な変動を示すことがある。発現の空間パターンまたは時間パターンにも差があることがある。例えば、種々の植物組織における導入遺伝子の相対的な発現量の差は、導入される遺伝子構築物中に存在する転写調節エレメントから予測されるパターンに対応しない可能性がある。
【０００４】
したがって、多くの場合、所与の目的ために申し分のないレベルまで対象の導入された遺伝子を発現するイベントを特定するために、多数のイベントを創出し、スクリーニングする。商業目的のために、何百から何千もの異なるイベントを作出し、それらのイベントを、導入遺伝子の所望の発現レベルおよび発現パターンを有する単一のイベントについてスクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子の発現の所望のレベルおよび／またはパターンを有するイベントは、従来の育種方法を使用して、有性異系交雑によって導入遺伝子を他の遺伝的背景に遺伝子移入するために有用である。そのような交雑の後代は、元の形質転換体の導入遺伝子の発現特性を維持する。この戦略を使用して、その土地の生長条件によく適合する多数の品種における信頼性の高い遺伝子発現を確実にする。
【０００５】
米国特許出願公開第２００９０１３００７１号は、ダイズイベントＭＯＮ８７７０１および検出方法に関する。米国特許出願公開第２００９００３６３０８号および同第２００８００５１２８８号は、ダイズイベント３５６０．４．３．５および検出方法に関する。米国特許出願第２００８０３１２０８２号は、ダイズイベントＤＰ−３０５４２３−１および検出方法に関する。米国特許出願第２００６０２８２９１５号は、ダイズイベントＭＯＮ８９７８８および検出方法に関する。
【０００６】
本明細書に開示されている特定のイベントを有するＡＡＤ−１２ダイズは、これまでに開示されていない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、アメリカの微生物系統保存機関）に受託番号ＰＴＡ−１０４４２で寄託されている種子を有する、ＤＡＳ−６８４１６−４と称されるＡＡＤ−１２ダイズ（ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ））イベント、およびそれに由来する後代に関する。本発明の他の態様は、後代植物、ダイズ、種子、および／またはダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の植物および種子および後代の再生可能な部位、ならびにそのいずれかから製造された食品または飼料製品を含む。本発明は、花粉、胚珠、花、苗条、根、および葉、ならびに栄養細胞、花粉細胞、および卵細胞の核を含むが、これらに限定されない、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の植物の部位も包含する。本発明は、さらに、フェノキシオーキシン除草剤および／またはアリールオキシアルカノエート除草剤に対する耐性を有する（これらの除草剤を、ダイズ植物の上から施用するか、近接するまたは近くの土壌に施用するか、または近接するまたは近くの雑草に施用するかにかかわらず）ダイズ植物、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の新規の遺伝組成、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を含むダイズ植物の農業生産力の側面に関する。
【０００８】
本発明は、一部において、植物の育種および除草剤耐性植物に関する。本発明は、本明細書に記載の通り、ダイズの細胞のゲノム内の特定の部位に挿入されたポリヌクレオチド配列を含むダイズ植物における新規のａａｄ−１２形質転換イベントを包含する。
【０００９】
一部の実施形態では、前記イベント／ポリヌクレオチド配列に、例えば、他の除草剤耐性遺伝子（複数可）および／または昆虫抑制タンパク質を含めた他の形質を「積み重ねる」ことができる。しかし、本発明は、本明細書に記載の通り、単一のイベントを有する植物を包含する。本発明の特定の実施形態では、種々の除草剤抵抗性の雑草（例えば、グリホサート抵抗性の雑草）を制御するために、１つまたは複数の除草剤耐性形質をダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４に積み重ねる。
【００１０】
さらに、本発明は、試料（例えば、ダイズの）中の本主題のイベントの存在を検出するためのアッセイを提供する。アッセイは、ダイズゲノムに挿入された組換え構築物のＤＮＡ配列、および挿入部位に隣接しているゲノム配列に基づくことができる。アッセイの実施において有用なキットおよび条件も提供される。
【００１１】
したがって、本発明は、一部において、（トランスジェニックダイズ系統における）全ａａｄ−１２挿入断片、およびその境界領域のＤＮＡ配列のクローニングおよび分析に関する。これらの配列は独特である。これらの挿入断片および境界の配列に基づいて、イベント特異的なプライマーを生成した。ＰＣＲ分析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用いて生成したＰＣＲアンプリコンを分析することによってこれらのイベントを同定することができることが実証された。したがって、これらおよび他の関連する手順を用いて、本発明のイベントを含むダイズ系統を一意的に同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ｐＤＡＢ４４６８のプラスミドマップを示す図である。
【図２】ダイズイベントのゲノムＤＮＡを示す図であり、ＤＡＳ−６８４１６−４をＥｃｏＲＶまたはＰｖｕＩＩを用いて消化し、それを使用して対応するＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーを作製し、これを、標的ＤＮＡ配列を増幅するために鋳型として使用した。
【図３】ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の全長配列を５’端から３’端まで確認するためのプライマーの位置を示す図である。
【図４】ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の全長配列を５’端から３’端まで確認するためのプライマーの位置を示す図である。
【図５】ＡＡＤ−１２ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の挿入部位の配列を確認するためのプライマーの位置を示す図である。
【図６】植物の生活環を通した発現レベルを示す図である。
【００１３】
［表の簡単な説明］
表１は、イベントＤＡＳ−６８４１６−４についての挿入断片および隣接配列の配列番号１に関する残基の番号付けを示す。
表２は、サザン分析において使用したプローブの位置および長さを示す。
表３は、サザンブロット分析において予測されたハイブリダイズ断片および観察されたハイブリダイズ断片を示す。
表４は、隣接境界領域を増幅するためのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のゲノムウォーキングの条件を示す。
表５は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４における境界領域およびイベント特異的な配列の標準のＰＣＲ増幅のための条件を示す。
表６は、Ｔ鎖挿入断片についてのアンプリコン１〜４に対するプライマーの説明を示す。
表７は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４における境界領域およびイベント特異的な配列の標準のＰＣＲ増幅のためのＰＣＲ混合物を示す。
表８は、２００８年中に米国およびカナダにおいて生産されたダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４から収集した組織中のＡＡＤ−１２タンパク質レベルの概要を示す。
表９は、サザン分析において使用したプローブの位置および長さを示す。
表１０は、サザンブロット分析において予測されたハイブリダイズ断片および観察されたハイブリダイズ断片を示す。
表１１は、実験１において評価した農業形質パラメータを示す。
表１２は、実験１からの農業特性の分析を示す。
表１３は、２００９年の農業試験および収量試験において収集されたデータを示す。
表１４は、２００９年の全ての地域にわたる農業特性の結果の概要を示す。
表１５は、実験１からの病害発生率および虫害についての分析を示す。
表１６は、ＤＡＳ−６８４１６−４および従来のダイズの試験において観察された病害ストレス要因および昆虫ストレス要因を示す。
表１７は、温暖な条件下および寒冷な条件下でのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４種子の発芽を示す。
表１８は、ダイズの茎葉の一般成分（proximate）分析、繊維分析およびミネラル分析の概要を示す。
表１９は、ダイズの粒一般成分分析および繊維分析の概要を示す。
表２０は、ダイズの粒のミネラル分析の概要を示す。
表２１は、ダイズの粒のアミノ酸分析の概要を示す。
表２２は、ダイズの粒の脂肪酸分析の概要を示す。
表２３は、ダイズの粒のビタミン分析の概要を示す。
表２４は、ダイズの粒のイソフラボン分析の概要を示す。
表２５は、ダイズの粒の抗栄養因子分析の概要を示す。
表２６は、２，４−Ｄ出芽前耐性試験についての現場および処理の情報を示す。
表２７は、２，４−Ｄの出芽前施用に対するＤＡＳ−６８４１６−４ダイズの耐性を例示している。
【００１４】
［配列の簡単な説明］
配列番号１は、本主題のダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４についての挿入断片配列および隣接配列を示す。
配列番号２〜２８は、本明細書に記載のプライマーである。
配列番号２９および３０は、本明細書に記載の隣接ＳＮＰマーカーであるＢＡＲＣ−０１９０９３−０３２９９およびＢＡＲＣ−０４４６０７−０８７３６である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、一部において、植物の育種および除草剤耐性植物に関する。本発明は、本明細書に記載の通り、ダイズの細胞のゲノム内の特定の部位に挿入された、本主題のａａｄ−１２ポリヌクレオチド配列を含むダイズ植物（ダイズ）の新規の形質転換イベントを包含する。一部の実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列に、他の形質を「積み重ねる」ことができる（例えば、他の除草剤耐性遺伝子（複数可）および／または昆虫抑制タンパク質をコードする遺伝子（複数可）など）。しかし、本発明は、本明細書に記載の単一のイベントを有する植物を包含する。
【００１６】
さらに、本発明は、試料中の本主題のイベントの存在を検出するためのアッセイを提供する。本発明の態様は、本明細書において例証または提案される任意の診断用核酸分子、特に、完全にまたは部分的に本主題の隣接配列に基づく診断用核酸分子を設計および／または作出する方法を包含する。
【００１７】
より詳細には、本発明は、一部において、トランスジェニックダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、これらのイベントを含む植物系統、ならびにこの挿入断片、および／またはその境界領域のＤＮＡ配列のクローニングおよび分析に関する。本発明の植物系統は、本明細書において開示され、提案されている配列を使用して検出することができる。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明は、除草剤耐性ダイズ系統、およびその同定に関する。本発明は、一部において、有性交雑の後代が対象のイベントを含有するかどうかを決定するために本主題のイベントの存在を検出することに関する。さらに、イベントを検出するための方法が包含され、それは、例えば、組換え作物に由来する食物の市販前承認および表示を必要とする規制に合致するために役立つ。任意の周知の核酸検出方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸プローブを使用したＤＮＡのハイブリダイゼーションなどによって本主題のイベントの存在を検出することが可能である。イベント特異的なＰＣＲアッセイは、例えば、Windelsら（Med. Fac. Landbouww、Univ. Gent 64/5b:459462、1999年）によって考察されている。これは、グリホサート耐性のダイズイベント４０−３−２を、挿入断片と隣接ＤＮＡとの間の接合部にわたるプライマーセットを使用したＰＣＲによって同定することに関する。より詳細には、１つのプライマーは挿入断片由来の配列を含み、第２のプライマーは隣接ＤＮＡ由来の配列を含んだ。
【００１９】
デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）に由来する、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１２）タンパク質をコードするａａｄ−１２遺伝子を挿入することによってダイズを改変した。この形質は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸除草剤およびピリジルオキシ酢酸除草剤に対する耐性を付与し、植物を形質転換する間、および育種苗床において選抜マーカーとして使用することができる。
【００２０】
より詳細には、本明細書には、ＡＡＤ１２イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６、ならびに、それを、代々、植物全体および分子レベルで安定性および発現について選抜し、特徴付けすることが記載されている。
【００２１】
本発明に従って使用される対象の合成遺伝子（ａａｄ−１２）は、デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）に由来し、フェノキシオーキシン（例えば、２，４−Ｄ、ＭＣＰＡ）、ならびにピリジルオキシオーキシン（例えば、フルロキシピル、トリクロピル）を含めたアリールオキシアルカノエート部分を持ついくつかの除草剤を不活性化することができる酵素をコードする。ａｔＵｂｉ１０プロモーターに駆動されるａａｄ−１２遺伝子を、ダイズ系統であるＭａｖｅｒｉｃｋに、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）法によって導入した。トランスジェニックＴ０植物を４〜６世代にわたって自家受粉させた。平行して、優良なダイズ品種にａａｄ−１２遺伝子の遺伝子移入も行った。全てのトランスジェニックイベントを、封じ込められ、規制された圃場苗床および研究室の環境において４〜５世代にわたって特徴付けた。
【００２２】
イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６挿入物の両末端について配列決定し、特徴付けた。イベント特異的なアッセイを開発した。これは、ダイズゲノム（ダイズの第４染色体）上にマッピングされた；隣接ＳＮＰマーカーは、本明細書に配列番号２９および３０として記載されている。イベントを別の優良な系統に遺伝子移入する。イベントにより、２，４−Ｄおよびグルホシネートに対する耐性がもたらされる。
【００２３】
ａｔＵｂｉ１０プロモーターによって駆動し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）法によって１００を超えるＡＡＤ１２Ｔ１Ｍａｖｅｒｉｃｋダイズイベントを生成した。イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６を、５つの自家受粉させた世代およびいくらかの戻し交雑した世代の単一系列選抜によって選抜した。これは形態学的に正常であり、全ての自家受粉した世代を通じて、Ｖ３における２２４０ｇ  ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ噴霧に対して耐性であった。イベントは、単一の優性遺伝子として遺伝性であり、その上、自家受粉した世代および戻し交雑した世代において正常なメンデル分離を有した。
【００２４】
イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６は、全長の植物転写単位（ＰＴＵ）を伴う単一の組み込みを有することが見いだされた。ベクターの骨格からは抗生物質抵抗性遺伝子配列は見いだされず、また、ａａｄ−１２遺伝子のホモ接合状態および半接合性状態において、数世代を通して遺伝子サイレンシングは検出されなかった。ａａｄ−１２遺伝子は、２，４−Ｄ耐性のレベルをもたらす予測レベルで発現された。イベントは、ａａｄ−１２遺伝子を安定に、複数の世代にわたって、および所与の世代において同胞系列の間で発現した。
【００２５】
上の背景技術のセクションにおいて言及されている通り、導入遺伝子の植物ゲノムへの導入および組み込みは、いくつかのランダムなイベントを伴う（したがって発現される所与の挿入物について「イベント」と称する）。すなわち、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換、「遺伝子銃」、およびＷＨＩＳＫＥＲなどの多くの形質転換技法を用いると、導入遺伝子がゲノム内のどこに挿入されるかは予測不可能である。したがって、挿入断片の両側の隣接植物ゲノムＤＮＡを同定することは、所与の挿入イベントを有する植物を同定するために重要であり得る。例えば、挿入断片と宿主ゲノムとの接合領域にわたってＰＣＲアンプリコンを生成するＰＣＲプライマーを設計することができる。このＰＣＲアンプリコンを使用して、独特のまたは別個の種類の挿入イベントを同定することができる。
【００２６】
「イベント」は、元々ランダムなイベントであるので、本開示の一部として、イベントを含む少なくとも２５００種子のダイズ系統がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａ、ＶＡ、２０１１０に寄託され、制限なく一般に公開されている（しかし、特許権に支配される）。この寄託物は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０４４２と称される。２５個のダイズ（Glycine max）種子（ＡＡＤ−１２イベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６）のバイアルが、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ  ｏｎ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２２、２００９を代表して寄託された。この寄託物は２００９年１１月２日に試験され、同日に種子は生育可能（viable）であった。この寄託物は、特許手続のための種子寄託物に関するブタペスト条約の条項に従い、かつその下で作製されたものであり、また、それに従い、かつその下で維持される。寄託物は、公共の受託所であるＡＴＣＣ受託所において、３０年間、または最新の要求後５年間、または特許の有効期間のいずれかのより長い期間にわたって制限なく維持され、その期間中に生育不能になった場合は交換される。
【００２７】
寄託された種子は本発明の一部である。明らかに、ダイズ植物をこれらの種子から生長させることができ、そのような植物は本発明の一部である。本発明は、これらのダイズ植物に含有される、これらの植物およびその後代を検出するために有用なＤＮＡ配列にも関する。本発明の検出方法およびキットは、試験の最終目的に応じて、これらのイベントの任意の１つ、２つ、またはさらには３つ全てを同定することを対象とすることができる。
【００２８】
本発明の説明に役立つように、また当業者が本発明を実施する指針となるために、本明細書において定義および例が提供される。特に断りのない限り、用語は、当業者による従来の使用法に従って理解される。米国特許法施行規則第１．８２２条に明記されているＤＮＡ塩基の命名法を使用する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「後代」は、ＡＡＤ−１２ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を含む親植物の任意の世代の子孫を意味する。
【００３０】
トランスジェニック「イベント」は、植物細胞を異種ＤＮＡ、すなわち、対象の導入遺伝子を含む核酸構築物で形質転換すること、植物のゲノムに導入遺伝子を挿入することによって生じる植物の集団を再生させること、および特定のゲノム上の位置への挿入を特徴とする特定の植物を選択することによって作出される。用語「イベント」は、元の形質転換体および異種ＤＮＡを含むその形質転換体の後代を指す。用語「イベント」は、ゲノムＤＮＡ／導入遺伝子ＤＮＡを含む、形質転換体と別の品種との間の有性異系交雑によって作出される後代も指す。反復親との戻し交雑を繰り返した後であっても、形質転換された親由来の挿入された導入遺伝子ＤＮＡおよび隣接ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ／導入遺伝子ＤＮＡ）は、交雑の後代において同じ染色体上の位置に存在する。用語「イベント」は、元の形質転換体由来のＤＮＡ、および挿入ＤＮＡを含む一方の親系統（例えば、元の形質転換体および自殖によって生じる後代）と挿入ＤＮＡを含有しない親系統との有性交雑の結果として、対象の導入遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受け取る後代に伝達されることが予測され得る挿入ＤＮＡおよび挿入ＤＮＡのすぐ近接の隣接ゲノム配列を含むその後代も指す。
【００３１】
「接合部配列」は、ゲノムに挿入されたＤＮＡが、挿入点に隣接するダイズのネイティブなゲノム由来のＤＮＡに連結している点にわたり、植物の遺伝物質中の一方または他方の接合部配列の特定または検出は、十分にイベントに特徴的である。本明細書に記載のダイズイベントにおける挿入物にわたるＤＮＡ配列および同様の長さの隣接ＤＮＡが包含される。そのような特徴的な配列の特定の例が本明細書において提供されるが、挿入物の接合部、または挿入物とゲノム配列との接合部とオーバーラップする他の配列も特徴的であり、本発明に従って使用することができる。
【００３２】
本発明は、そのような隣接配列、接合部配列、および挿入断片配列を特定することに関する。関連するＰＣＲプライマーおよびアンプリコンは、本発明に包含される。本発明に従って、挿入ＤＮＡおよびその端までわたるアンプリコンを使用するＰＣＲ分析方法を使用して、対象の登録商標を持つトランスジェニックダイズ系統に由来する商業化されたトランスジェニックダイズの品種または系統を検出または特定することができる。
【００３３】
挿入断片を植物細胞のゲノムに導入するプロセスの間、挿入断片および／またはゲノム隣接配列のいくらかの欠失または他の変化が起こることは珍しくない。したがって、本明細書において提供される関連性のあるプラスミド配列のセグメントは、いくらかの軽微な変動を含む可能性がある。同じことが、本明細書において提供される隣接配列にも当てはまる。したがって、本主題の隣接配列および／または挿入断片配列といくらかの範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む植物は、本発明の範囲内である。本発明の配列に対する同一性は、本明細書で例示または記載されている配列に対して少なくとも６５％配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％配列同一性、より好ましくは少なくとも７５％配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％同一性、およびより好ましくは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であってよい。本明細書において提供されるハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション条件は、そのような植物および本発明のポリヌクレオチド配列を定義するためにも使用することができる。隣接配列プラス挿入断片配列の配列は、寄託されている種子を照会して確認することができる。
【００３４】
これらの挿入断片のそれぞれの全配列は、それぞれの隣接配列の部分と一緒に、本明細書において配列番号１として提供される。配列番号１（全部で１０，２１２塩基対）に関してこのイベントについての挿入断片および隣接配列の位置が下の表１に示されている。これは、例えば、実施例３においてより詳細に考察されている。
【００３５】
【表１】
2013511985.tif 000002
【００３６】
これらの配列（特に隣接配列）は独特である。これらの挿入断片および境界の配列に基づいて、イベント特異的なプライマーを生成した。ＰＣＲ分析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用いて生成したＰＣＲアンプリコンを分析することによって、異なるダイズ遺伝子型においてこれらのダイズ系統を同定することができることが実証された。したがって、これらおよび他の関連する手順を用いて、これらのダイズ系統を一意的に同定することができる。本明細書において同定される配列は独特である。
【００３７】
本発明の検出技法は、植物育種と併せて、１つまたは複数の追加的な対象の形質を後代に与える取り組みにおいて、対象のイベントを含む親植物を別の植物系統と交雑した後に、どの後代植物が所与のイベントを含むかを決定するために特に有用である。これらのＰＣＲ分析方法は、ダイズの育種計画ならびに品質管理、特に商業化されたトランスジェニックダイズ種子に有益である。これらのトランスジェニックダイズ系統のＰＣＲ検出キットも、現在製造され、使用することができる。これは、製品登録および製品管理にも有益である。
【００３８】
さらに、隣接ダイズ／ゲノム配列を使用して、それぞれの挿入断片の遺伝子位置を特異的に同定することができる。この情報を使用して、それぞれのイベントに特異的な分子マーカー系を作製することができる。これらは、育種戦略を加速させるために、および連鎖データを確立するために使用することができる。
【００３９】
さらに、隣接配列の情報を使用して、導入遺伝子の組み込みプロセス、ゲノムの組み込み部位の特性、イベントの選別、導入遺伝子およびそれらの隣接配列の安定性、ならびに遺伝子発現（特に遺伝子サイレンシング、導入遺伝子のメチル化パターン、位置の影響、およびＭＡＲＳ［マトリックス付着領域］などの潜在的な発現関連エレメントなどに関連する）を試験し、特徴付けることができる。
【００４０】
本開示全てに照らして、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０４４２の下で入手可能な種子を包含することが明白でなければならない。本発明は、受託番号ＰＴＡ−１０４４２の下でＡＴＣＣに寄託されている種子から生長させた除草剤耐性ダイズ植物も包含する。本発明は、さらに、前記植物の部位、例えば、葉、組織試料、前記植物によって生産される種子、花粉などを包含する。
【００４１】
さらに、本発明は、寄託されている種子から生長させた植物の後裔植物および／または後代植物、好ましくは除草剤耐性ダイズ植物であって、本明細書に記載の検出可能な野生型ゲノムＤＮＡ／挿入ＤＮＡ接合部配列を含むゲノムを有する植物を包含する。本明細書で使用される場合、用語「ダイズ」は、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘを意味し、ダイズ植物を用いて育種することができるその全品種を包含する。
【００４２】
本発明は、本発明の植物を少なくとも一方の親として使用して交雑を行うプロセスをさらに包含する。例えば、本発明は、本明細書において例示されている植物のいずれかを一方の親または両親として有するＦ１ハイブリッド植物を包含する。また、本発明のそのようなＦ１ハイブリッドによって生産される種子も本発明の範囲内である。本発明は、例示した植物と、異なる（例えば、純系の親）植物を交雑し、得られたハイブリッド種子を収穫することによってＦ１ハイブリッド種子を作出するための方法を包含する。本発明は、雌親または雄親のいずれかである、例示した植物を包含する。得られる植物の特性は、親植物を慎重に考察することによって改良することができる。
【００４３】
除草剤耐性ダイズ植物は、本明細書で言及されている系統の任意の１つの種子から生長させたダイズ植物からなる第１の親ダイズ植物と、第２の親ダイズ植物との有性交雑を最初に行い、それによって複数の第１の後代植物を作出すること；次いで、除草剤に対して抵抗性である（または、本発明のイベントの少なくとも１つを保有する）第１の後代植物を選択すること；第１の後代植物を自殖させ、それによって、複数の第２の後代植物を作出すること；次いで、第２の後代植物から、除草剤に対して抵抗性である（または、本発明のイベントの少なくとも１つを保有する）植物を選択することによって育種することができる。これらのステップは、第１の後代植物または第２の後代植物を第２の親ダイズ植物または第３の親ダイズ植物と戻し交雑することをさらに含んでよい。次いで本発明のダイズ種子を含むダイズ作物、またはその後代を植え付けることができる。
【００４４】
２つの異なるトランスジェニック植物を交配して、それぞれ独立に分離して付加された２つの外因性遺伝子を含有する子孫を作出することもできることがまた理解される。適切な後代を自殖させることにより、付加された外因性遺伝子のどちらについてもホモ接合性である植物を作出することができる。栄養繁殖のように、親植物との戻し交雑および非トランスジェニック植物との異系交雑も意図されている。種々の形質および作物のために一般に使用される他の育種方法は当技術分野で公知である。反復親である望ましいホモ接合性の栽培品種または純系統に、単純に遺伝した、高度に遺伝性の形質の遺伝子を伝達するために戻し交雑育種が使用されてきた。伝達される形質の供給源は、供与親と称されている。生じた植物は、反復親（例えば、栽培品種）の属性および供与親から伝達された望ましい形質を有することが予測される。最初の交雑の後、供与親の表現型を保有する個体を選択し、反復親と繰り返し交雑（戻し交雑）する。生じた親は、反復親（例えば、栽培品種）の属性および供与親から伝達された望ましい形質を有することが予測される。
【００４５】
本発明のＤＮＡ分子は、マーカー利用育種（ＭＡＢ）法において分子マーカーとして使用することができる。本発明のＤＮＡ分子は、当技術分野で公知の通り、遺伝的に連鎖している作物学的に有用な形質を特定する方法（例えば、ＡＦＬＰマーカー、ＲＦＬＰマーカー、ＲＡＰＤマーカー、ＳＮＰおよびＳＳＲなど）において使用することができる。ＭＡＢ法を使用して、本発明のダイズ植物（またはその後代および任意の他のダイズの栽培品種または品種）との交雑の後代において除草剤抵抗性形質を追跡することができる。ＤＮＡ分子はこの形質についてのマーカーであり、当技術分野で周知のＭＡＢ法を使用して、本発明の少なくとも１つのダイズ系統、またはその後代が親または祖先であったダイズ植物における除草剤抵抗性形質（複数可）を追跡することができる。本発明の方法を使用して、対象イベントを有する任意のダイズ品種を特定することができる。
【００４６】
本発明の方法は、本発明の植物を用いて育種するステップを含む、除草剤耐性ダイズ植物を作出する方法を包含する。より詳細には、前記方法は、本発明の２つの植物、または本発明の１つの植物と任意の他の植物とを交雑するステップを含んでよい。好ましい方法は、前記交雑の後代を、本発明に従って検出可能なイベントについて前記後代を分析することによって選択するステップをさらに含む。例えば、本発明を使用して、他の望ましい形質、例えば、作物学的形質など、例えば、本明細書において、種々の実施例において試験されるものなどを含む植物を用いた育種サイクルを通して対象イベントを追跡することができる。対象イベントおよび所望の形質を含む植物を検出し、特定し、選択し、例えば育種のさらなるラウンドに直ちに使用することができる。対象イベント／形質は、昆虫抵抗性形質（複数可）および／または別の除草剤耐性形質と育種を通じて組み合わせ、本発明に従って追跡することもできる。後者の好ましい一実施形態は、対象イベントを除草剤であるジカンバに対する抵抗性をコードする遺伝子と組み合わせて含む植物である。
【００４７】
したがって、本発明は、例えば、グリホサート抵抗性（例えば、抵抗性植物または細菌のＥＰＳＰＳ、ＧＯＸ、ＧＡＴ）、グルホシネート抵抗性（例えば、Ｐａｔ、ｂａｒ）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害性除草剤への抵抗性（例えば、イミダゾリノン［イマゼタピルなど］、スルホニル尿素系、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド、ピリミジニルチオベンゾエート系、および他の化学物質［Ｃｓｒ１、ＳｕｒＡなど］）、ブロモキシニル抵抗性（例えば、Ｂｘｎ）、ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシルフェニル−ピルビン酸−ジオキシゲナーゼ）酵素の阻害剤に対する抵抗性、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）の阻害剤に対する抵抗性、光化学系ＩＩ阻害性除草剤に対する抵抗性（例えば、ｐｓｂＡ）、光化学系Ｉ阻害性除草剤に対する抵抗性、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＩＸ（ＰＰＯ）阻害性除草剤に対する抵抗性（例えば、ＰＰＯ−１）、フェニル尿素除草剤に対する抵抗性（例えば、ＣＹＰ７６Ｂ１）、ジカンバ分解酵素（例えば、ＵＳ２００３０１３５８７９を参照されたい）をコードする形質と組み合わせることができ、その他のものを、単独で、または多数の組合せで積み重ねて、雑草のシフト（weed shift）および／または上述のクラスの任意の除草剤に対する抵抗性を有効に制御する、または妨げる能力をもたらすことができる。
【００４８】
追加的な除草剤に関して、いくつかの追加的な好ましいＡＬＳ（ＡＨＡＳとしても公知である）阻害剤としては、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド系（例えば、クロランスラム−メチル、ジクロスラム、フロラスラム、フルメトスラム、メトスラム、およびペノキススラムなど）、ピリミジニルチオベンゾエート系（例えば、ビスピリバックおよびピリチオバックなど）、ならびにフルカルバゾンが挙げられる。いくつかの好ましいＨＰＰＤ阻害剤としては、メソトリオン、イソキサフルトール、およびスルコトリオンが挙げられる。いくつかの好ましいＰＰＯ阻害剤としては、フルミクロラック、フルミオキサジン、フルフェンピル、ピラフルフェン、フルチアセット、ブタフェナシル、カルフェントラゾン、スルフェントラゾン、およびジフェニルエーテル系（例えば、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、およびオキシフルオルフェンなど）が挙げられる。
【００４９】
さらに、ＡＡＤ−１２単独に、または１つもしくは複数の追加的なＨＴＣ形質を積み重ねたＡＡＤ−１２に、１つまたは複数の追加的なインプット形質（例えば、昆虫抵抗性、真菌抵抗性、もしくはストレス耐性など）またはアウトプット形質（例えば、生産量の増加、油プロファイルの改良、繊維品質の改良など）を積み重ねることができる。したがって、本発明を使用して、任意の数の作物害虫を柔軟かつ費用効果的に制御する能力を伴う改良された作物の品質の完全な作物パッケージをもたらすことができる。
【００５０】
対象のＡＡＤ−１２酵素は、トランスジェニック発現を可能にして、ほぼ全ての広葉雑草およびイネ科雑草を制御し得る除草剤の組合せに対する耐性をもたらす。ＡＡＤ−１２は、例えば、他のＨＴＣ形質（例えば、グリホサート抵抗性、グルホシネート抵抗性、イミダゾリノン抵抗性、ブロモキシニル抵抗性など）、および昆虫抵抗性形質（Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ  ３４／４５など）を積み重ねるための優れた除草剤耐性作物（ＨＴＣ）形質としての機能を果たし得る。さらに、ＡＡＤ−１２は、第２の遺伝子または遺伝子群を用いて遺伝子操作した植物の一次形質転換体を選択するために役立つ選択マーカーとしての機能を果たし得る。
【００５１】
本発明のＡＡＤ−１２遺伝子は、フェノキシ酢酸オーキシン除草剤（例えば２，４−ＤＢ、ＭＣＰＢなど）に変換される化合物に対する抵抗性ももたらす。２，４−ＤＢ除草剤に存在する酪酸部分は、β酸化によって植物毒性２，４−ジクロロフェノキシ酢酸に変換される。同様に、ＭＣＰＢは、β酸化によって植物毒性ＭＣＰＡに変換される。ブタン酸除草剤は、それ自体は非除草性である。ブタン酸除草剤は、感受性植物においてβ酸化によってそれらのそれぞれの酸に変換され、それは植物毒性である除草剤の酢酸の形態である。急速なβ酸化ができない植物は、ブタン酸除草剤による害を受けない。しかし、急速なβ酸化ができる植物およびブタン酸除草剤を酢酸形態に変換することができる植物は、その後にＡＡＤ−１２によって保護される。
【００５２】
除草剤を施用する方法は当技術分野で公知である。そのような施用は、２種以上の除草剤のタンク混合物を含んでよい。本発明に従って使用するためのいくつかの好ましい除草剤としては、２，４−Ｄ；２，４−ＤＢ；ＭＣＰＡ；ＭＣＰＢなどのフェノキシオーキシン除草剤が挙げられる。これらに、１種または複数種の追加的な除草剤耐性遺伝子（複数可）および対応する除草剤（例えばグリホサートおよび／またはグルホシネート）を積み重ねることができる。１種、２種、３種、またはそれ以上の除草剤を、本開示の利益を有する当業者に明白になる有利な組合せで使用することができる。本主題の除草剤の１種または複数種を圃場／地域に、本発明の種子を植え付ける前に施用することができる。そのような施用は、例えば、植え付けの１４日間以内であってよい。本主題の除草剤の１種または複数種は、植え付け時および／または植え付け後であるが出芽前に施用することもできる。本主題の除草剤の１種または複数種は、土に（雑草を制御するために）、または雑草および／または本発明のトランスジェニック植物の上から施用することもできる。本主題の除草剤は、例えば、ある除草剤には耐性であるが、別の除草剤には耐性でない可能性がある雑草を制御する、または防ぐために、交替させること、または組み合わせて使用することができる。本主題の３種類の除草剤について、種々の施用時間を当技術分野で公知の種々の方法で用いることができる。本発明は、ＡＡＤ−１２自生植物を制御するための方法ももたらす。発明の名称が「CONTROL OF AAD DICOT VOLUNTEERS IN MONOCOT CROPS」である同時に出願されたＰＣＴ出願を参照されたい。
【００５３】
本発明のＨＴＣ形質は、他のＨＴＣ形質（これらに限定されないが、グリホサート耐性を含む）との新規の組合せにおいて使用することができる。これらの形質の組合せにより、除草剤（例えば、グリホサート）に対する新しく獲得した抵抗性または固有の耐性によって雑草（および同様のもの）種を制御する新規の方法が生じる。したがって、ＨＴＣ形質に加えて、トランスジェニック作物において、前記酵素によって除草剤耐性を創出する、除草剤を使用して雑草を制御するための新規の方法は、本発明の範囲内である。
【００５４】
さらに、世界中で栽培されているグリホサート耐性作物が一般的である。他のグリホサート耐性作物との輪作において多くの場合、グリホサート抵抗性自生植物を制御することは、輪作作物においては難しい。したがって、作物に個々に積み重ねた、または作物を個々に形質転換した対象のトランスジェニック形質の使用は、他のＨＴＣ自生作物を制御するためのツールを提供する。
【００５５】
本発明の好ましい植物または種子は、そのゲノム内に、本明細書において同定される挿入断片配列と、本明細書において同定される、挿入断片の両側の少なくとも２０〜５００以上の連続した隣接ヌクレオチドを一緒に含む。別段の指定のない限り、隣接配列に言及する場合、それは配列番号１について特定されたものを指す（上の表１を参照されたい）。さらに、配列番号１は、元の形質転換体に挿入された異種ＤＮＡおよび挿入ＤＮＡのすぐ近接する例示的な隣接ゲノム配列を含む。これらの隣接配列の全部または一部は、イベントを含む親系統の有性交雑の結果として挿入ＤＮＡを受け取る後代に伝達されることが予測され得る。
【００５６】
本発明は、本発明の植物の再生可能な細胞の組織培養物を包含する。また、そのような組織培養物から再生された植物も、特に前記植物が例示されている品種の形態学的性質および生理的性質の全てを発現することができる場合、包含される。本発明の好ましい植物は、寄託されている種子から生長させた植物の生理的特性および形態学的特性の全てを有する。本発明は、そのような種子および対象の品質形質を保有する種子の後代をさらに含む。
【００５７】
植物または種子、またはその部位を操作（例えば、突然変異、さらなるトランスフェクション、およびさらに育種）することにより、「従属（本質的に由来する）」品種と称することができるものが創出され得る。植物新品種保護国際同盟（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ）（ＵＰＯＶ）は、ある品種が、保護された品種に由来しているかどうかを決定するための以下のガイドラインを提供した：
［Ａ］以下の場合、品種は別の品種（「原品種」）に本質的に由来するとみなされるべきである
（ｉ）原品種に主として由来する、または、それ自体が原品種に主として由来する品種に由来し、同時に原品種の遺伝子型または遺伝子型の組合せから生じる本質的な特性の発現を保持する；
（ｉｉ）原品種と明確に区別可能である；および
（ｉｉｉ）引き出す行為に由来する差異以外は、原品種の遺伝子型または遺伝子型の組合せから生じる本質的な特性の発現において原品種と一致する。
ＵＰＯＶの国際機関の第６回会議、ジュネーブ、１９９２年１０月３０日；当該連合の事務局により作成された文書。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「系統」は、少なくとも１つの形質について、個体間で遺伝的変異をほとんど示さない、または示さない植物の群である。そのような系統は、何世代か自家受粉させ、選択すること、または組織または細胞の培養技法を使用して、単一の親から栄養繁殖させることによって創出することができる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「栽培品種」および「品種」は同義であり、商業生産のために使用される系統を指す。
【００６０】
「安定性」または「安定な」は、所与の構成要素に関しては、構成要素が代々、好ましくは、少なくとも３世代、実質的に同じレベルで、例えば、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、最も好ましくは±５％で維持されることを意味する。安定性は、温度、位置、ストレスおよび植え付け時間に影響を受ける可能性がある。その後の世代を圃場条件下で比較することにより、構成要素が同様にもたらされるべきである。
【００６１】
「商業的有用性」は、従来の農業設備を使用して農業者が作物を生産することができるように、および従来の圧搾および抽出用設備を使用して記載の構成要素を有する油を種子から抽出することができるように良好な植物生長力および高い稔性を有することと定義される。商業的に有用であるために、種子の重量、油の含有量、および１エーカー当たりの生産された油の総計によって測定した生産量は、同じ地域で栽培される高価値の形質を有さない、別の匹敵する市販のキャノーラ品種の平均生産量の１５％以内である。
【００６２】
「作物学的に優良」は、系統が対象イベント（複数可）に起因する昆虫抵抗性に加えて、例えば生産量、成熟度、病害抵抗性などの望ましい作物学的特性を有することを意味する。以下の実施例に記載の、本発明のイベントを含む植物に個々に、または任意の組合せで獲得される作物学的形質は、本発明の範囲内である。これらの作物学的特性およびデータポイントの全てを使用して、そのような植物を、そのような植物を定義するために使用する特性の範囲内の一点として、または一端もしくは両端で特定することができる。
【００６３】
本開示に照らして当業者に理解されるように、検出キットの好ましい実施形態は、例えば、「接合部配列」または「移行部配列」（ダイズゲノムの隣接配列と挿入断片配列が接する場所）を対象とし、かつ／またはそれを含むプローブおよび／またはプライマーを含んでよい。これは、例えば、上記の表１に示されている一方のまたは両方の接合部配列（挿入断片と隣接配列が接する場所）を同定するために設計されたポリヌクレオチドプローブ、プライマー、および／またはアンプリコンを含む。１つの一般的な設計は、隣接領域内でハイブリダイズする１つのプライマー、および挿入断片内でハイブリダイズする１つのプライマーを有する。そのようなプライマーは、多くの場合、およそ、それぞれの長さが少なくとも約１５残基である。この配置を用いて、プライマーを使用して、本発明のイベントの存在を示す検出可能なアンプリコンを生成／増幅することができる。これらのプライマーを使用して、上に示されている接合部配列にわたる（およびそれを含む）アンプリコンを生成することができる。
【００６４】
隣接配列に「接している」プライマー（複数可）は、一般には、約２００塩基を越えて、または接合部を越えてハイブリダイズするようには設計されない。したがって、典型的な隣接プライマーは、挿入断片の最初から隣接配列に入って２００塩基の範囲内のどちらかの鎖の少なくとも１５残基を含むように設計され得る。すなわち、配列番号１の残基約２５３０〜２７３０および／または約９１２２〜９３２２由来の（またはそれとハイブリダイズする）適切なサイズの配列を含むプライマーは、本発明の範囲内である。挿入プライマーは、挿入断片のどこにでも同様に設計することができるが、残基約２７３１〜２９３１および約８９２１〜９１２１を、例えば、そのようなプライマーの設計のために非排他的に使用することができる。
【００６５】
当業者は、さまざまな標準のハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲの条件の下で、配列番号１（または相補物）のセグメント、およびその相補物とハイブリダイズするようにプライマーおよびプローブを設計することができ、ここでプライマーまたはプローブが例示された配列と完全に相補的ではないことも認識されよう。すなわち、ある程度のミスマッチが容認され得る。およそ２０ヌクレオチドのプライマーについて、例えば、一般には、ミスマッチ塩基がアンプリコンと逆のプライマーの内部または末端にある場合、１または２ヌクレオチド程度は逆の鎖と結合しなくてよい。種々の適切なハイブリダイゼーション条件が以下に提供される。イノシンなどの合成ヌクレオチド類似体は、プローブにも使用することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ならびにＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブも使用することができる。重要なのは、そのようなプローブおよびプライマーが、本発明のイベントの存在に対して特徴的である（独自に特定し、区別することができる）ことである。
【００６６】
ＰＣＲ増幅において、例えば、軽微な配列決定のエラーを生じる可能性があるエラーが起こり得ることに留意するべきである。すなわち、別段の指定のない限り、本明細書において列挙されている配列は、ダイズのゲノムＤＮＡから長いアンプリコンを生成し、次いでそのアンプリコンをクローニングし、配列決定することによって決定した。ゲノムＤＮＡから配列決定するために十分なアンプリコンを生成するために必要な多数回の増幅を考慮すると、このように生成し、決定した配列においてわずかな差異および軽微な不一致が見いだされることは珍しいことではない。当業者は、これらの型の一般的な配列決定のエラーまたは不一致に起因して必要になる調整はいずれも本発明の範囲内であることを認識し、留意するべきである。
【００６７】
例えば、イベントを創出する間に配列を挿入する場合、いくらかのゲノム配列が欠失することは珍しくないことにも留意すべきである。したがって、本主題の隣接配列と、例えばＧＥＮＢＡＮＫに列挙されているゲノム配列との間にもいくらかの差異が出現する可能性がある。
【００６８】
「挿入断片」の構成成分が図面に例示されており、以下の実施例においてより詳細に考察されている。これらの構成要素のＤＮＡポリヌクレオチド配列、またはその断片を、本発明の方法においてＤＮＡプライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００６９】
本発明の一部の実施形態では、ダイズ植物由来の植物および種子などにおける導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供される。本明細書において提供される本主題の導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の接合部配列（配列番号１の残基２７３０〜２７３１と残基９１２１〜９１２２の間）、そのセグメント、および例示された配列の相補物およびその任意のセグメントを含むＤＮＡ配列が提供される。挿入領域の接合部配列は、ゲノムに挿入された異種ＤＮＡと、挿入部位に隣接しているダイズの細胞由来のＤＮＡの接合部にわたる。そのような配列は、所与のイベントに対して特徴的であり得る。
【００７０】
これらの挿入断片および境界の配列に基づいて、イベント特異的なプライマーを生成することができる。ＰＣＲ分析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用いて生成したＰＣＲアンプリコンを分析することによって、異なるダイズ遺伝子型において本発明のダイズ系統を同定することができることが実証された。これらおよび他の関連する手順を用いて、これらのダイズ系統を一意的に同定することができる。したがって、そのようなプライマー対に由来するＰＣＲアンプリコンは独特であり、これらのダイズ系統を同定するために使用することができる。
【００７１】
一部の実施形態では、新規の導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の連続した断片を含むＤＮＡ配列は本発明の態様である。導入遺伝子挿入断片配列の十分な長さのポリヌクレオチドおよび３つの上述のダイズ植物の１つまたは複数由来のダイズのゲノム配列の十分な長さのポリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列および／またはこれらのダイズ植物の１つまたは複数に対して特徴的なアンプリコン産物を生成するためのプライマー配列として有用である配列が包含される。
【００７２】
関連する実施形態は、本明細書において特定されるＤＮＡ配列（例えば、配列番号１およびそのセグメントなど）の導入遺伝子部分の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列、またはその相補物、およびこれらの配列由来の同様の長さのダイズの隣接ＤＮＡ配列、またはその相補物に関する。そのような配列は、ＤＮＡ増幅方法において、ＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマーを使用して生成されるアンプリコンは、本明細書で言及されるダイズイベントのいずれかに対して特徴的である。したがって、本発明は、そのようなＤＮＡプライマーおよび相同プライマーによって生成されるアンプリコンも包含する。
【００７３】
本発明は、試料中の、本明細書で言及されるダイズイベントに対応するＤＮＡの存在を検出する方法も包含する。そのような方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、これらのダイズイベントの少なくとも１つ由来のＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において使用したとき、前記イベント（複数可）に対して特徴的であるアンプリコンを生成するプライマーセットと接触させるステップと；（ｂ）核酸の増幅反応を実施し、それによって、アンプリコンを生成するステップと；（ｃ）アンプリコンを検出するステップとを含んでよい。
【００７４】
本発明の別の検出方法は、試料中の、前記イベントの少なくとも１つに対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記ダイズイベントの少なくとも１つ由来のＤＮＡとハイブリダイズさせ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で対照のダイズ植物（対象のイベントがないＤＮＡ）とハイブリダイズしないプローブと接触させるステップと；（ｂ）試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するステップと；（ｃ）プローブのＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出するステップとを含む方法を包含する。
【００７５】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のａａｄ−１２イベントを含むダイズ植物を作出する方法であって、（ａ）第１の親ダイズ系統（前記系統の植物に前記除草剤抵抗性形質を付与する本発明の発現カセットを含む）と第２の親ダイズ系統（この除草剤耐性形質を欠く）を有性交雑し、それによって、複数の後代植物を作出するステップと；（ｂ）分子マーカーを使用することによって後代植物を選択するステップとを含む方法を包含する。そのような方法は、場合によって、後代植物を第２の親ダイズ系統と戻し交雑して、前記昆虫耐性形質を含む真の育種（true-breeding）ダイズ植物を作出するさらなるステップを含んでよい。
【００７６】
本発明の別の態様によると、前記３種のイベントの任意の１つ（または複数）を用いて交雑の後代の接合性を決定する方法が提供される。前記方法は、ダイズＤＮＡを含む試料を本発明のプライマーセットと接触させるステップを含んでよい。前記プライマーは、前記ダイズイベントの少なくとも１つ由来のゲノムＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において使用したとき、前記ダイズイベントの少なくとも１つに対して特徴的である第１のアンプリコンを生成する。そのような方法は、核酸の増幅反応を実施し、それによって、第１のアンプリコンを生成するステップと；第１のアンプリコンを検出するステップと；ダイズＤＮＡを含む試料を、ダイズ植物由来のゲノムＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において使用したとき、ダイズのゲノム領域と相同なネイティブなダイズのゲノムＤＮＡを含む第２のアンプリコンを生成する前記プライマーセットと接触させるステップと；核酸の増幅反応を実施し、それによって、第２のアンプリコンを生成するステップとをさらに含む。この方法は、第２のアンプリコンを検出するステップと、試料中の第１のアンプリコンと第２のアンプリコンとを比較するステップであって、両方のアンプリコンが存在することにより、試料が、導入遺伝子挿入物についてヘテロ接合性であることが示されるステップとをさらに含む。
【００７７】
ＤＮＡ検出キットは、本明細書に開示されている組成物およびＤＮＡの検出の技術分野で周知の方法を使用して開発することができる。このキットは、試料中の対象のダイズイベントＤＮＡを特定するために有用であり、このＤＮＡを含有するダイズ植物を育種するための方法に適用することができる。キットは、例えば、本明細書に開示されているアンプリコンと相同または相補的であるＤＮＡ配列、または対象イベントの導入遺伝子の遺伝エレメントに含有されるＤＮＡと相同または相補的であるＤＮＡ配列を含有する。これらのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ増幅反応において、またはＤＮＡのハイブリダイゼーション方法においてプローブとして、使用することができる。キットは、検出方法を実行するために必要な試薬および材料も含有することができる。
【００７８】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子（例えば、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、または酵素など）を付着させた単離された核酸分子である。そのようなプローブは、標的核酸の鎖、本発明の場合では、ダイズ植物由来であるかイベント由来のＤＮＡを含む試料由来であるかにかかわらず、前記ダイズイベントの１つ由来のゲノムＤＮＡの鎖と相補的である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために使用することができるポリアミドおよび他のプローブ材料も含む。
【００７９】
「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖とアニーリングしてプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間のハイブリッドを形成し、次いでポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される、単離された／合成された核酸である。本発明のプライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸の増幅方法によって標的核酸配列を増幅するためのそれらの使用を指す。
【００８０】
プローブおよびプライマーは、一般に、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ポリヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。そのようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列と特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な配列類似性を有するが、標的配列とは異なり、標的配列とハイブリダイズする能力を保持するプローブを従来の方法によって設計することができる。
【００８１】
プローブおよびプライマーを調製し、使用するための方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、1〜3巻Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989年に記載されている。ＰＣＲのプライマー対は、公知の配列から、例えば、その目的のためのコンピュータプログラムを使用することによって得ることができる。
【００８２】
本明細書に開示されている隣接ＤＮＡおよび挿入断片の配列に基づくプライマーおよびプローブを使用して、従来の方法によって、例えば、そのような配列を再クローニングし、配列決定することによって、開示されている配列を確認すること（および、必要であれば、補正すること）ができる。
【００８３】
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅の方法を使用して、試料中のトランスジェニックイベント由来のＤＮＡの存在を特定することができる。核酸分子またはその断片は、ある特定の状況下で他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書で使用される場合、２つの核酸分子は、２つの分子が、逆平行の、二本鎖核酸構造を形成することができる場合、互いと特異的にハイブリダイズすることができると言える。核酸分子は、別の核酸分子と完全な相補性を示す場合、その「相補物」であると言える。本明細書で使用される場合、分子は、分子の一方のあらゆるヌクレオチドが、他方のヌクレオチドと相補的である場合、「完全な相補性」を示すと言える。２つの分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、互いとアニーリングしたままであることを可能にするために十分な安定性で互いとハイブリダイズすることができる場合、「最小限相補的」であると言える。同様に、分子は、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で、互いとアニーリングしたままであることを可能にするために十分な安定性で互いとハイブリダイズすることができる場合、「相補的」であると言える。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrookら、1989年に記載されている。したがって、完全な相補性から逸脱することは、そのような逸脱により、二本鎖構造を形成する分子の能力が完全に妨げられない限りは許容できる。核酸分子がプライマーまたはプローブとしての機能を果たすためには、用いる特定の溶媒および塩濃度の下で安定な二本鎖構造を形成できるために十分に配列内で相補的であることのみが必要である。
【００８４】
本明細書で使用される場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件下で比較されている核酸配列の相補物と特異的にハイブリダイズし得る核酸配列である。用語「ストリンジェントな条件」は、Sambrookら、1989年、9.52〜9.55において考察されている特定のハイブリダイゼーション手順による、核酸プローブの標的核酸（すなわち、対象とする特定の核酸配列）とのハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。Sambrookら、1989年、9.47〜9.52および9.56〜9.58も参照されたい。したがって、本発明のヌクレオチド配列は、相補的なＤＮＡ断片のひと続きと２重鎖分子を選択的に形成するそれらの能力に関して使用することができる。
【００８５】
構想される適用に応じて、プローブの標的配列に対する選択性のさまざまな程度を実現するためにハイブリダイゼーションのさまざまな条件を使用することができる。高い選択性を必要とする適用のために、一般には、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件を用いることがある、例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌによってもたらされるような比較的低塩かつ／または高温の条件を選択することがある。ストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーション濾過器を高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃）で少なくとも２回洗浄することを伴ってよい。ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することは、当業者に公知である。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、低ストリンジェンシーである５０℃で約２．０×ＳＳＣから高ストリンジェンシーである５０℃で約０．２×ＳＳＣまでから選択することができる。さらに、洗浄ステップにおける温度は、低ストリンジェンシー条件である室温、約２２℃から高ストリンジェンシー条件である約６５℃まで増加させることができる。温度と塩との両方が変動してよい、または、温度もしくは塩濃度のいずれかは、他方の変数が変化する一方で一定に保たれてよい。そのような選択的な条件は、もしあれば、プローブと鋳型または標的鎖との間のミスマッチを少し容認する。ハイブリダイゼーションによってＤＮＡ配列を検出することは当業者に周知であり、米国特許第４，９６５，１８８号および同第５，１７６，９９５号の教示は、ハイブリダイゼーション分析の方法の例である。
【００８６】
特に好ましい実施形態では、本発明の核酸は、高ストリンジェンシー条件下で、本明細書において例証または提案される、その相補物および断片を含めたプライマー（またはアンプリコンもしくは他の配列）の１つまたは複数と特異的にハイブリダイズする。本発明の一態様では、本発明のマーカー核酸分子は、本明細書において例示された配列の１つに記載されている核酸配列、またはその相補物および／もしくは断片を有する。
【００８７】
本発明の別の態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような核酸配列と、８０％から１００％の間または９０％から１００％の間の配列同一性を共有する。本発明の別の態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような配列と９５％から１００％の間の配列同一性を共有する。そのような配列は、遺伝的交雑の後代を特定するための植物育種方法において、マーカーとして使用することができる。プローブの標的ＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションは、当業者に公知の任意の数の方法によって検出することができ、それらとしては、これらに限定されないが、蛍光タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグおよび化学発光タグを挙げることができる。
【００８８】
特定の増幅プライマー対を使用する標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）に関して、「ストリンジェントな条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（またはその相補物）を有するプライマーが結合し得る標的核酸配列のみとハイブリダイズすること、および好ましくは特有の増幅産物、アンプリコンを生成することを可能にする条件である。
【００８９】
用語「（標的配列）に特異的な」は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含む試料中の標的配列のみとハイブリダイズすることを示す。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」は、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅産物を指す。例えば、有性交雑によって生じたダイズ植物が、本発明のダイズ植物由来のトランスジェニックイベントゲノムＤＮＡを含有するかどうかを決定するために、ダイズ植物の組織試料から抽出したＤＮＡを、挿入された異種ＤＮＡの挿入部位の近接する植物のゲノム内の隣接配列に由来するプライマー、および挿入された異種ＤＮＡに由来する第２のプライマーを含むプライマー対を使用して、イベントＤＮＡの存在に対して特徴的であるアンプリコンを生成する核酸の増幅方法に供することができる。アンプリコンは、ある長さであり、同じくイベントに対して特徴的である配列を有する。アンプリコンの長さは、プライマー対の全て合わせた長さ足す１ヌクレオチド塩基対、および／またはプライマー対の全て合わせた長さ足す約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、またはそれ以上のヌクレオチド塩基対（上に列挙されている増大のいずれかを足すまたは引く）にわたってよい。あるいは、プライマー対は、挿入断片のヌクレオチド配列全体を含むアンプリコンが生成されるように、挿入ＤＮＡの両側の隣接配列に由来してもよい。植物のゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入ＤＮＡ配列からある距離に位置してよい。この距離は、１ヌクレオチド塩基対から最大約２万ヌクレオチド塩基対までにわたることができる。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡの熱増幅反応において形成される可能性があるプライマー二量体を特に除外する。
【００９１】
核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含めた当技術分野で公知の種々の核酸の増幅方法のいずれかによって実現することができる。種々の増幅方法が当技術分野で公知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている。２２ｋｂに至るまでのゲノムＤＮＡを増幅するためにＰＣＲ増幅方法が開発されてきた。これらの方法ならびにＤＮＡ増幅の技術分野で公知の他の方法を、本発明の実施において使用することができる。本明細書において提供される配列に由来するプライマーを使用してイベントからそのような配列を増幅し、その後ＰＣＲアンプリコンまたはクローニングされたＤＮＡの標準のＤＮＡ配列決定を行うことにより、本主題のダイズイベント由来の異種導入遺伝子ＤＮＡ挿入断片の配列または隣接ゲノム配列を検証すること（および必要であれば、補正すること）ができる。
【００９２】
これらの方法によって生成されるアンプリコンは、複数の技法によって検出することができる。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムを用いた染色は、ＤＮＡアンプリコンを検出する周知の一般的な方法である。別のそのような方法は、近接する隣接ゲノムＤＮＡ配列および挿入ＤＮＡ配列の両方とオーバーラップするＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計する遺伝子ビット分析（Genetic Bit Analysis）である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェル内に固定化されている。対象の領域のＰＣＲ後（挿入配列内の１つのプライマーおよび近接する隣接ゲノム配列内の１つのプライマーを使用する）、一本鎖のＰＣＲ産物は、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼおよび予測される次の塩基に特異的な標識したｄｄＮＴＰを使用する一塩基伸長反応の鋳型としての機能を果たし得る。読み取りは、蛍光またはＥＬＩＳＡに基づいてよい。信号により、上首尾の増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長に起因して、挿入断片／隣接配列が存在することが示される。
【００９３】
別の方法は、Winge（Innov. Pharma. Tech. 00巻:18〜24頁、2000年）に記載されているようなパイロシークエンス技法である。この方法では近接するゲノムＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするオリゴヌクレオチドを設計する。このオリゴヌクレオチドを、対象の領域（挿入配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプライマー）由来の一本鎖のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’−ホスホ硫酸およびルシフェリンの存在下でインキュベートする。ｄＮＴＰを個々に加え、それが取り込まれた結果、測定される光信号がもたらされる。光信号により、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基または多塩基の伸長が上首尾であり、したがって導入遺伝子挿入断片／隣接配列が存在することが示される。
【００９４】
蛍光偏光は、本発明のアンプリコンを検出するために使用することができる別の方法である。この方法に従って、オリゴヌクレオチドを、ゲノムの隣接ＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするように設計する。このオリゴヌクレオチドを、対象の領域（挿入ＤＮＡ内の１つのプライマーおよび隣接ゲノムＤＮＡ配列内の１つのプライマー）由来の一本鎖のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識したｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。一塩基伸長により、ｄｄＮＴＰが取り込まれる。取り込みは、蛍光光度計を使用して偏光の変化として測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長の成功によって、導入遺伝子挿入断片／隣接配列が存在することを示す。
【００９５】
ＴＡＱＭＡＮ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）は、ＤＮＡ配列の存在を検出し、定量する方法である。簡単に述べると、ゲノムの隣接と挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプライマー）を、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルにかける。特異的な増幅の間に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにより、ＦＲＥＴプローブ上のクエンチング部分から蛍光部分が離れて除かれ、放出される。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によって、隣接配列／導入遺伝子挿入断片配列が存在することを示す。
【００９６】
配列の検出において使用するための分子ビーコンが記載されている。簡単に述べると、隣接ゲノムＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブの独特の構造により、蛍光部分およびクエンチング部分が極めて近傍に保たれる二次構造が含有される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプライマー）を、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルにかける。ＰＣＲ増幅が上手くいった後、ＦＲＥＴプローブが標的配列にハイブリダイズすることにより、プローブの二次構造が除去され、蛍光部分およびクエンチング部分が空間的に分離される。蛍光シグナルが結果として生じる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によって、隣接ゲノム配列／導入遺伝子挿入断片配列が存在することを示す。
【００９７】
ダイズゲノム内の挿入するために優れた位置を開示し、本発明は、この遺伝子位置の概ね近くに少なくとも１つの非ａａｄ１２挿入断片を含むダイズ種子および／またはダイズ植物も含む。１つの選択肢は、本明細書において例示されているａａｄ−１２挿入断片を異なる挿入断片で置換することである。これらの一般的な点については、例えば、本発明に従って、標的化相同組換えを使用することができる。この種類の技術は、例えば、ＷＯ０３／０８０８０９Ａ２および対応する公開された米国特許出願（Ｕ．Ｓ．２００３／０２３２４１０）の主題である。したがって、本発明は、本明細書において同定される隣接配列の全てまたは認識できる部分（例えば、配列番号１の残基１〜２７３０および残基９１２２〜１０，２１２）が隣接する異種挿入断片（多コピーのａａｄ−１２の代わりにまたはそれと一緒に）を含む植物および植物細胞を包含する。ａａｄ−１２遺伝子の１つの追加的なコピー（または複数の追加的なコピー）も、この／これらのように挿入の標的とすることができる。
【００９８】
植物細胞の特定の染色体上の部位内に、相同組換えによってポリヌクレオチド配列を組み込むための方法は、当技術分野の範囲内で記載されている。例えば、米国特許出願公開第２００９／０１１１１８８Ａ１号に記載の部位特異的な組み込みでは、ドナーポリヌクレオチド配列の染色体上の標的への導入を媒介するためのリコンビナーゼまたはインテグラーゼの使用が記載されている。さらに、国際的な特許出願第ＷＯ２００８／０２１２０７号には、１つまたは複数のドナーポリヌクレオチド配列をゲノムの特定の位置内に組み込むためのジンクフィンガー媒介相同組換えが記載されている。米国特許第６，７２０，４７５号に記載のＦＬＰ／ＦＲＴまたは米国特許第５，６５８，７７２号に記載のＣＲＥ／ＬＯＸなどのリコンビナーゼの使用を利用して、ポリヌクレオチド配列を特定の染色体上の部位に組み込むことができる。最終的に、ドナーポリヌクレオチドを特定の染色体上の位置に標的化するためのメガヌクレアーゼの使用が、Puchtaら、PNAS USA 93巻(1996年)5055〜5060頁に記載されている。
【００９９】
植物細胞内に部位特異的に組み込むための他の種々の方法は、一般に、公知であり、適用可能である（Kumarら、Trands in Plant Sci. 6巻(4号)(2001年) 155〜159頁）。さらに、いくつかの原核生物および下等真核生物において同定された部位特異的な組換え系を植物における使用に適用することができる。そのような系の例としては、これらに限定されないが、酵母であるジゴサッカロマイセス・ロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）のｐＳＲ１プラスミド由来のＲ／ＲＳリコンビナーゼ系（Arakiら(1985年)J. Mol. Biol. 182巻：191〜203頁）、およびファージＭｕのＧｉｎ／ｇｉｘ系（MaeserおよびKahlmann(1991年)Mol. Gen. Genet. 230巻：170〜176頁）が挙げられる。
【０１００】
本発明の一部の実施形態では、既存のトランスジェニックイベントに近接して新しい導入遺伝子（複数可）を組み込む、または積み重ねることが望ましい場合がある。トランスジェニックイベントは、単一の挿入部位、正常なメンデル分離および安定発現、ならびに多数の環境区域における、およびそれ全てにわたる除草剤耐性および農業生産力を含めた効力の優れた組合せなどの独特の特性に基づいて選抜された好ましいゲノム遺伝子座と考えることができる。新しく組み込まれた導入遺伝子は、既存の形質転換体の導入遺伝子の発現特性を維持すべきである。さらに、新しく組み込まれたイベントのゲノム隣接配列および染色体上の位置はすでに同定されているので、新しく組み込まれたイベントを検出し、確認するためのアッセイの開発は克服されるであろう。最終的に、既存の導入遺伝子に連結された特定の染色体上の位置に新しい導入遺伝子を組み込むことにより、従来の育種方法を使用した有性異系交雑による導入遺伝子の他の遺伝的背景への遺伝子移入が促進される。
【０１０１】
本発明の一部の実施形態では、トランスジェニックイベントからポリヌクレオチド配列を削除することが望ましい場合がある。例えば、米国特許仮出願第６１／２９７，６２８号に記載の導入遺伝子の削除では、染色体に組み込まれたトランスジェニックイベントから、遺伝子発現カセットからなるポリヌクレオチド配列を除去するためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用が記載されている。除去されるポリヌクレオチド配列は、選抜マーカーであってよい。ポリヌクレオチド配列を削除および除去したら、改変されたトランスジェニックイベントを、ポリヌクレオチド配列を挿入することによって再標的化することができる。ポリヌクレオチド配列を削除し、その後、改変されたトランスジェニックイベントを再標的化することにより、選抜マーカーの再使用、または特定の遺伝子が発現することによって生じる、植物のトランスクリプトームに対する意図されたものではない変化を克服する能力などの利点がもたらされる。
【０１０２】
本発明は、本明細書において、異種核酸を挿入するために優れた、ダイズゲノム内の第４染色体上の特定の部位を開示している。第４染色体上のターゲティング部位の位置を同定することにおいて有用な５’分子マーカー、３’分子マーカー、５’隣接配列、および３’隣接配列も開示されている。したがって、本発明は、対象の異種核酸をこの予め確立した標的部位に、またはこの標的部位の付近に導入するための方法を提供する。本発明は、開示されている標的部位またはそのような部位の概ね近くに挿入された任意の異種ヌクレオチド配列を含むダイズ種子および／またはダイズ植物も包含する。そのような標的化組み込みを実現するための１つの選択肢は、本明細書において例示されているｐａｔ発現カセットの代わりに異なる挿入断片を削除することおよび／または置換することである。この一般的な点について、例えば、またこれらに限定することなく、本発明に従って標的化相同組換えを使用することができる。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、遺伝子、イベントまたは形質を「積み重ねること（stacking）」は、所望の形質を１つのトランスジェニック系統内に組み合わせることである。植物育種家は、それぞれが所望の形質を有する親同士の交雑を行い、次にこれらの所望の形質を両方とも有する子孫を同定することによってトランスジェニック形質を積み重ねる。遺伝子を積み重ねるための別の方法は、形質転換の間に、２種以上の遺伝子を同時に植物の細胞核に伝達することによる。遺伝子を積み重ねるための別の方法は、トランスジェニック植物を、対象とする別の遺伝子を用いて再形質転換することによる。例えば、遺伝子を積み重ねることを用いて、例えば、２種以上の異なる昆虫形質、昆虫抵抗性形質（複数可）と病害抵抗性形質（複数可）、２種以上の除草剤への抵抗性形質、および／または昆虫抵抗性形質（複数可）と除草剤抵抗性の形質（複数可）を含めた２種以上の異なる形質を組み合わせることができる。対象の遺伝子に加えて選抜マーカーを使用することも、遺伝子を積み重ねることと考えることができる。
【０１０４】
「相同組換え」とは、２種のヌクレオチド配列が相互作用して（組み換えられて）新しい組換えＤＮＡ配列を形成し得る類似したヌクレオチド配列を含有する対応する部位を有するヌクレオチド配列の任意の対の間の反応を指す。類似したヌクレオチド配列の部位は、本明細書ではそれぞれが「相同配列」と称される。一般に、相同組換えの頻度は、相同配列の長さが増加するにつれて増加する。したがって、相同組換えは、同一には満たない２つのヌクレオチド配列間で起こり得るが、組換え頻度（または効率）は、２つの配列間の相違が増加するにつれて減退する。組換えは、ドナー分子および標的分子のそれぞれの１つの相同配列を使用して実現することができ、それによって「単一乗換え」組換え産物を生成することができる。あるいは、標的ヌクレオチド配列およびドナーヌクレオチド配列のそれぞれに２つの相同配列を置くことができる。ドナー上の２つの相同配列と標的上の２つの相同配列との間の組換えにより、「２重乗換え」組換え産物が生成する。ドナー分子上の相同配列が、操作される配列（例えば、対象の配列）に隣接する場合、標的分子との２重乗換え組換えにより、対象の配列が元々標的分子上の相同配列の間にあったＤＮＡ配列と交換された組換え産物がもたらされる。２重乗換え組換えイベントによって標的とドナーとの間でＤＮＡ配列を交換することは、「配列交換」と称される。
【０１０５】
本明細書において言及または引用された全ての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、それらが本明細書の明確な教示と相反しない限りは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
以下の実施例は、本発明を実施するための手順を例示するため、および本発明のある特定の好ましい実施形態を実証するために含まれる。これらの実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。当業者には、以下の実施例に開示されている技法は、それを実施するための好ましい方式を例示するために使用される特定の手法を表していることが理解されたい。しかし、当業者には、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、なお同様または類似の結果を得ながら、これらの特定の実施形態において多くの変更を行うことができることが理解されたい。別段の指定のない限り、全ての百分率は重量により、特に断りのない限り、全ての溶媒混合物の割合は体積による。
【０１０７】
別段の指定のない限り、以下の略語が使用されている。
ＡＡＤ−１２  アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−１
ｂｐ  塩基対
℃  摂氏温度
ＤＮＡ  デオキシリボ核酸
ＤＩＧ  ジゴキシゲニン
ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
ｋｂ  キロベース
μｇ  マイクログラム
μＬ  マイクロリットル
ｍＬ  ミリリットル
Ｍ  モル質量
ＯＬＰ  オーバーラッププローブ
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＴＵ  植物転写単位
ＳＤＳ  ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＯＰ  標準操作手順
ＳＳＣ  塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムとの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ７．０
ＴＢＥ  トリス塩基、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ８．３
Ｖ  ボルト
［実施例］
【実施例１】
【０１０８】
ａａｄ−１２ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の形質転換および選抜
トランスジェニックダイズ（Glycine max）イベントＤＡＳ−６８４１６−４を、ダイズ子葉節の外植片をアグロバクテリウム媒介形質転換によって生成した。Ｔ鎖ＤＮＡ領域内に選抜マーカー（ｐａｔ）および対象の遺伝子（ａａｄ−１２）と一緒にバイナリーベクターｐＤＡＢ４４６８（図１）を保有する武装解除したアグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１（Hoodら、2006年）を使用して形質転換を開始した。
【０１０９】
Zengら（Zengら、2004年）の手順を改変して用いてアグロバクテリウム媒介形質転換を行った。簡単に述べると、ダイズ種子（Ｍａｖｅｒｉｃｋ栽培品種）を基本培地上で発芽させ、子葉節を単離し、アグロバクテリウムに感染させた。アグロバクテリウムを除去するために、苗条誘導（shoot initiation）培地、苗条伸長培地、および発根培地にセフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンを補充した。グルホシネートによる選択を使用して、形質転換されていない苗条の生長を阻害した。選択された苗条を、根を発生させるために発根培地に移し、次に、小植物を順化させるために土壌混合物に移した。
【０１１０】
選択された小植物の頂小葉にグルホシネートを塗布して推定形質転換体についてスクリーニングした。スクリーニングされた小植物を温室に移して、気候順化させ、次に葉にグルホシネートを塗布して耐性を再確認し、推定形質転換体であるとみなした。スクリーニングされた植物の試料を採取し、選択マーカー遺伝子および／または対象の遺伝子を確認するための分子解析を行った。Ｔ０植物を温室内で自家受精させてＴ１種子を生じさせた。
【０１１１】
Ｔ１植物を戻し交雑し、優良な生殖質（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）に遺伝子移入した。このイベント、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４は、独立した形質転換分離株から生成した。イベントをその独特の特性、例えば、単一の挿入部位、正常なメンデル分離および安定発現、ならびに広範な遺伝子型背景および多数の環境全ての区域にわたる除草剤耐性および農業生産力を含めた効力の優れた組合せに基づいて選抜した。以下の実施例は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を特徴付けるために使用したデータを含有する。
【実施例２】
【０１１２】
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のサザンブロットによる特徴付け
サザンブロット分析を使用して、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１８−４の組み込みパターンを確立した。これらの実験により、ａａｄ−１２導入遺伝子のダイズゲノム内への組み込みおよびその完全性を実証するデータが生成した。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１８−４は、プラスミドｐＤＡＢ４４６８由来のａａｄ−１２ＰＴＵの単一コピーを含有する全長の、単純な組み込みイベントであると特徴付けられた。
【０１１３】
サザンブロットのデータにより、ｐＤＡＢ４４６８Ｔ鎖断片がダイズイベントＤＡＳ−６８４１８−４のゲノムに挿入されたことが示唆された。詳細なサザンブロット分析を、ｐＤＡＢ４４６８のＴ鎖組み込み領域に含有されるａａｄ−１２遺伝子に特異的なプローブ、およびプラスミド内に位置する切断部位を有し、プラスミドまたはプラスミドとダイズのゲノムＤＮＡの接合部にわたる断片（境界断片）内にハイブリダイズ断片を生じる説明的な制限酵素を使用して行った。サザンハイブリダイゼーションによって示された制限酵素とプローブの組合せについての分子量は、このイベントに独特であり、その同定パターンを確立した。これらの分析により、ａａｄ−１２ＰＴＵの再配置を伴わずにプラスミド断片がダイズのゲノムＤＮＡに挿入されたことも示された。
【０１１４】
実施例２．１
ダイズの葉の試料の収集およびゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を含有する個々のダイズ植物から回収した葉組織からゲノムＤＮＡを抽出した。さらに、ａａｄ−１２遺伝子が存在しない物質系統の代表である遺伝的背景を含有する従来のダイズ植物であるＭａｖｅｒｉｃｋからｇＤＮＡを単離した。
【０１１５】
標準のＣＴＡＢ法の後、凍結乾燥した葉組織から個々のゲノムＤＮＡを抽出した。抽出した後、ＤＮＡを、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して分光蛍光分析によって定量した。次いで、ＤＮＡをアガロースゲル上で可視化してＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ分析からの値を確認し、ＤＮＡの質を決定した。
【０１１６】
実施例２．２
ＤＮＡの消化および分離
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４をサザンブロットによって分子キャラクタリゼーションするために、１０マイクログラム（１０μｇ）のゲノムＤＮＡを消化した。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４および非トランスジェニックダイズ系統であるＭａｖｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡを、各ＤＮＡ試料にＤＮＡ１μｇ当たりおよそ５ユニットの選択された制限酵素および対応する反応緩衝液を加えることによって消化した。各試料を、およそ３７℃で一晩インキュベートした。消化のために、制限酵素ＳｐｅＩ、ＫｐｎＩ、およびＰａｃＩを個々に使用した（Ｎｅｗ  ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。さらに、陽性ハイブリダイゼーション対照試料を、プラスミドＤＮＡであるｐＤＡＢ４４６８を非トランスジェニックダイズ品種であるＭａｖｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡと混ぜ合わせることによって調製した。プラスミドＤＮＡ／ゲノムＤＮＡ反応混液を、試験試料の場合と同じ手順および制限酵素を用いて消化した。消化物を一晩インキュベートした後、ＮａＣｌを、最終濃度が０．１Ｍになるまで加え、消化されたＤＮＡ試料を、イソプロパノールを用いて沈殿させた。沈殿したＤＮＡペレットを、１×ローディング緩衝液（０．１％ブロモフェノールブルー、１００ｍＭのＥＤＴＡ、５０％グリセロール、１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５）２０μｌに再懸濁させた。次いで、ＤＮＡ試料および分子サイズマーカーを、０．４×ＴＡＥ緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を用いた０．８５％アガロースゲルにより、３５ボルトでおよそ１８〜２２時間、電気泳動して断片の分離を実現した。ゲルを臭化エチジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で染色し、ＤＮＡを紫外線（ＵＶ）の下で可視化した
【０１１７】
実施例２．３
サザン転写およびメンブレン処理
サザンブロット分析をSeversonら（1997年）に記載されている通り実施した。ＤＮＡ断片を電気泳動によって分離し、ＵＶ光の下で可視化した後、ゲルを変性溶液（１５０ｍＭのＮａＯＨ、３ｍＭのＥＤＴＡ）中におよそ２０分間浸し、次いで、中和溶液（１５０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．８）に移し少なくとも２０分間置いた。ナイロンメンブレン（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ、ＩＮ）へのサザン転写を、転写緩衝液（２５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、ｐＨ１０）を伴うウィッキング系を用いて一晩実施した。転写後、メンブレンを６５℃で約２時間、加熱乾燥することによってＤＮＡをメンブレンに結合させた。このプロセスにより、ハイブリダイゼーションのためのサザンブロットメンブレンの準備ができた。
【０１１８】
実施例２．４
ＤＮＡプローブの標識化およびハイブリダイゼーション
標識したプローブを使用してナイロンメンブレンに結合したＤＮＡ断片を検出した。この実験のために使用したプローブは、プラスミドｐＤＡＢ４４６８の特定のヌクレオチド領域に対するプライマーを使用したＰＣＲ増幅によって生成した。増幅されたＰＣＲ断片をアガロースゲルから単離し、精製し、ハイブリダイゼーションプローブのための鋳型として使用した。サザンブロットハイブリダイゼーションプローブを、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＲＥＡＤＹ−ＴＯ−ＧＯ（商標）ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を製造者の説明書に従って使用したランダムプライミングによってα３２Ｐに特異的なヌクレオチドで標識し、ＰＲＯＢＥＱＵＡＮＴ（商標）Ｇ−５０マイクロカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）によって精製した。この実験のために使用したプローブが記載された表は、表２に記載されている。プレハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーション緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ、ＭＯ）を使用して６５℃で４時間行った。次いで、プレハイブリダイゼーション溶液をデカントし、水で５分間煮沸することによって予め変性させた所望の量の特異的なプローブを含有するハイブリダイゼーション溶液と交換した。ハイブリダイゼーション／プローブ混合物をナイロンメンブレンと一緒に６５℃で一晩インキュベートした。
【０１１９】
ハイブリダイゼーション後、メンブレンを６５ｏＣ、洗浄緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、２．５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、リン酸を用いて調整ｐＨ７．８に調整した）で２０分間、３回洗浄した。洗浄したフィルターをオートラジオグラフィーのためにＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒスクリーンに曝露させ、画像をスキャンした。検出されたバンドの数およびサイズを、プローブについて実証した。さらに、サザンブロットにおいて分子量マーカーを使用してハイブリダイズ断片サイズを決定した。
【０１２０】
【表２】
2013511985.tif 000003
【０１２１】
実施例２．５
サザンブロットの結果
ａａｄ−１２ＰＴＵの公知の制限酵素部位に基づく、特定の消化物およびプローブに関して予測された断片サイズおよび観察された断片サイズが表３に示されている。予測された断片サイズは、ｐＤＡＢ４４６８のプラスミドマップ（図１）に基づき、観察された断片サイズは、これらの分析から概算したものであり、α３２Ｐで標識されたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ  ＩＩ断片の指示サイズに基づく。
【０１２２】
これらの消化およびハイブリダイゼーションから２種類の断片を同定した：公知の酵素部位がプローブ領域に隣接し、ａａｄ−１２ＰＴＵの挿入領域内に完全に含有されている内部の断片、および公知の酵素部位がプローブ領域の一端に位置し、第２の部位がダイズゲノム内にあると予測される境界断片。ほとんどの場合、ＤＮＡ断片の組み込み部位はそれぞれのイベントに独特であるので、境界断片のサイズはイベントごとに変動する。境界断片により、組み込まれたＤＮＡに対して制限酵素部位を位置づける手段およびＤＮＡ挿入物の数を評価する手段がもたらされる。イベントＤＡＳ−６８４１６−４を含有するダイズの３世代に対して完了したサザンブロット分析により、プラスミドｐＤＡＢ４４６８由来の低コピー、インタクトなａａｄ−１２ＰＴＵが、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のダイズゲノムに挿入されたことを示唆するデータがもたらされた。
【０１２３】
【表３】
2013511985.tif 000004
【０１２４】
制限酵素ＳｐｅＩおよびＫｐｎＩは、プラスミドｐＤＡＢ４４６８に独特の制限部位を含有する。続いて、これらの酵素を、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４におけるａａｄ−１２遺伝子挿入断片を特徴付けるために選択した。５，４３６ｂｐより大きいまたは５，３８３ｂｐより大きい境界断片は、それぞれＳｐｅＩおよびＫｐｎＩで消化した後、ａａｄ−１２遺伝子プローブとハイブリダイズすることが予測された（表３）。それぞれＳｐｅＩおよびＫｐｎＩを使用したとき、約１２，０００ｂｐおよび約１６，０００ｂｐの単一のａａｄ−１２ハイブリダイゼーションバンドが観察された。プローブがこのサイズのバンドにハイブリダイズすることにより、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のダイズゲノム内にａａｄ−１２遺伝子に対する単一の挿入部位が存在することが示唆される。制限酵素ＰａｃＩを、ａａｄ−１２植物転写単位（ＰＴＵ、プロモーター／遺伝子／ターミネーター）を含有する２，９０４ｂｐの断片を放出させるために選択した（表３）。予測された２，９０４ｂｐの断片は、ＰａｃＩ消化した後、ａａｄ−１２遺伝子プローブを用いて観察された。全３種の酵素を用いてＤＡＳ−６８４１６−４試料を消化し、その後ａａｄ−１２遺伝子プローブとハイブリダイズさせることで得られた結果により、プラスミドｐＤＡＢ４４６８由来のインタクトなａａｄ−１２ＰＴＵの単一コピーがダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のダイズゲノムに挿入されたことが示された。
【０１２５】
実施例２．６
骨格配列が存在しないこと
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４にスペクチノマイシン抵抗性遺伝子が存在すること、または存在しないことをモニターするために、多重ＰＣＲアッセイを実施した。実験は、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子コード配列の５つの異なる領域および内部標準として内在性のダイズレクチン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  Ｎｏ：Ｋ００８２１  Ｍ３０８８４）配列内の４０７ｂｐ領域を検出するために設計した。さらに、以下の対照を含めた：（ｉ）スペクチノマイシン抵抗性遺伝子を保有するプラスミドＤＮＡを付加した形質転換されていないダイズのゲノムＤＮＡを用いた陽性対照；（ｉｉ）形質転換されていないダイズ、Ｍａｖｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡを用いた陰性対照；および（ｉｉｉ）ゲノムＤＮＡを有さないブランク。
【０１２６】
ダイズ由来のゲノムＤＮＡを、ＣＴＡＢ法を使用して単離し、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎを使用して定量した。各試料のＤＮＡ濃度を１００ｎｇ／μｌに正規化した。ＰＣＲ反応を、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子コード配列およびレクチン遺伝子配列に特異的なプライマー配列を使用して実施した。この反応物を、試料当たりＰＣＲ産物２０μｌを２％Ｅゲルにローディングすることによって分析した。
【０１２７】
Ｅゲル上に多数のアンプリコンが存在すること（１００ｂｐ、１５０ｂｐ、および４０７ｂｐのバンド）は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４がスペクチノマイシン抵抗性遺伝子コード配列を含有することを示すことになる（スペクチノマイシン抵抗性遺伝子コード配列について、１００ｂｐおよび１５０ｂｐの増幅されたバンドが予測される）。内部標準であるレクチン遺伝子配列に対応する４０７ｂｐのアンプリコンのみが存在する場合、そのことは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４がスペクチノマイシン抵抗性コード配列を含有しないことを示す。
【０１２８】
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４由来のＤＮＡ試料では、１００ｂｐまたは１５０ｂｐの断片は増幅されなかった。４０７ｂｐ断片のみが増幅された。しかし、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子を保有するプラスミドＤＮＡをダイズのゲノムＤＮＡに加えた陽性対照には１００ｂｐ、１５０ｂｐ、および４０７ｂｐの増幅断片が存在した。形質転換されていないダイズ由来のＤＮＡを含有する陰性対照では、単一の４０７ｂｐ断片が増幅された。最終的に、いかなるゲノムＤＮＡも含有しない反応物からは、いかなる増幅断片も産生されなかった。そのように、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４においてスペクチノマイシン抵抗性コード配列は検出されなかった。
【実施例３】
【０１２９】
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の挿入断片および隣接境界領域におけるＤＮＡ配列のクローニングおよび特徴付け
ゲノムの挿入部位を特徴付け、説明するために、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のＴ鎖ＤＮＡ挿入断片および隣接ゲノムＤＮＡ境界領域の配列を決定した。２，７３０ｂｐの５’隣接境界配列、１，０９１ｂｐの３’隣接境界配列、および６，３９１ｂｐのＴ鎖挿入断片を含む、全部で１０，２１２ｂｐのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４ゲノム配列（配列番号１）を確認した。配列解析により、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４が、予測されたＴ鎖挿入断片から配列が変動することなく、ＭＡＲエレメント、ａａｄ−１２発現カセット、およびｐａｔ発現カセットを含有するインタクトな導入遺伝子の単一コピーを含有することが検証された。
【０１３０】
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の挿入断片および境界の配列に基づくＰＣＲ増幅により、境界領域がダイズ起源であること、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４をイベント特異的に同定するために接合領域を使用することができることが検証された。隣接境界配列を含めた接合領域にわたる配列を分析することにより、Ｔ鎖の挿入によって生じるいかなる新規のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ＞＝１５０  コドン）も同定されなかった。さらに、Ｔ鎖の挿入部位を、非トランスジェニックダイズのゲノムから同定された隣接境界配列の領域に対応するゲノムの断片をクローニングすることによって特徴付けた。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を野生型ゲノム配列と比較することにより、元の遺伝子座からの５５ｂｐの欠失およびイベントの３’組み込み接合部における９ｂｐの挿入が明らかになった。全体的に、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の挿入断片および境界配列を特徴付けることにより、Ｔ鎖の単一の、インタクトなコピーがダイズゲノム内に存在することが示された。
【０１３１】
実施例３．１
ゲノムＤＮＡの抽出および定量
凍結乾燥した葉組織または粉砕したての葉組織から、改変したＣＴＡＢ法を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡを抽出した後、ＤＮＡ試料を１×ＴＥ（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）（Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ、ＭＯ）に溶解させ、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ法を製造者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）の説明書に従って使用して定量した。ＰＣＲ分析のために、ＤＮＡ試料を分子生物学グレードの水（５ＰＲＩＭＥ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で希釈して、濃度を１０〜１００ｎｇ／μＬにした。
【０１３２】
実施例３．２
ＰＣＲプライマー
表４には、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のＤＮＡ挿入断片および隣接境界領域をクローニングし、確認するために使用したプライマー配列が、図２で記した位置および説明とともに列挙されている。全てのプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成された。プライマーを、原液については水（５ＰＲＩＭＥ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に溶解させて濃度を１００μＭにし、検量線用溶液については１０μＭの濃度まで水で希釈した。
【０１３３】
【表４】
2013511985.tif 000005
【０１３４】
【表５】
2013511985.tif 000006
【０１３５】
【表６】
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【０１３６】
【表７】
2013511985.tif 000008
【０１３７】
実施例３．３
ゲノムウォーキング
ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ、Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って使用して、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４についてｐＤＡＢ４４６８Ｔ鎖挿入断片の５’隣接境界領域および３’隣接境界領域をクローニングした。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４由来のゲノムＤＮＡおよそ２μｇをＥｃｏＲＶおよびＰｖｕＩＩを用いて一晩消化した（図２）。ＤＮＡ消化物を、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−２５（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を使用して精製し、その後ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）アダプターとライゲーションしてＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーを構築した。ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーのそれぞれを、アダプタープライマーＡＰ１（このキットで提供される）および構築物特異的プライマーであるＥＳ＿ＬＥｎｄ０３またはＥＳ＿ＰＡＴＥｎｄ０３（表４）を用いた一次ＰＣＲ増幅のためのＤＮＡ鋳型として使用した。次に、一次ＰＣＲ反応物１：２５希釈物１マイクロリットル（１μＬ）を、このキットで提供されるネステッドアダプタープライマーＡＰ２およびネステッド構築物特異的プライマーであるＥＳ＿ＬＥｎｄ０４またはＥＳ＿ＰＡＴＥｎｄ０４（表４、７および図２）を用いた二次ＰＣＲ増幅ための鋳型として使用した。
【０１３８】
実施例３．４
従来のＰＣＲ
標準のＰＣＲを使用してダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の挿入断片および境界配列をクローニングし、確認した。従来のＰＣＲ増幅ために、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴＡＱ（商標）（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）、ＨＯＴＳＴＡＲＴＡＱ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、ＨＩＧＨ  ＦＩＤＥＬＩＴＹ（商標）ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｉｎｃ）、またはＥＡＳＹ−Ａ（商標）高忠実度ポリメラーゼキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を製造者の推奨手順に従って使用した。特定のＰＣＲ条件およびアンプリコンの説明が表５、６、および７に列挙されている。
【０１３９】
実施例３．５
ＰＣＲ産物の検出、精製、ＰＣＲ産物のサブクローニング、および配列決定
ＰＣＲ産物を１．２％または２％Ｅ−ＧＥＬ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製品の説明書に従って使用して電気泳動によって検査した。ＤＮＡマーカーと比較することによって断片サイズを推定した。必要であれば、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して１％アガロースゲルから断片を切り取って１×ＴＢＥ（８９ｍＭのトリス−ホウ酸、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）に入れ、臭化エチジウムで染色することによってＰＣＲ断片を精製した。
【０１４０】
ＰＣＲ断片を、配列決定するためにＴＯＰＯ  ＴＡ  ＣＬＯＮＩＮＧ（登録商標）ＫＩＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製品の説明書に従って使用してＰＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにサブクローニングした。詳細には、製造者の説明書に従って、ＴＯＰＯ（登録商標）クローニング反応物２〜５マイクロリットルをＯｎｅ  Ｓｈｏｔ化学的コンピテントなＴＯＰ１０細胞に導入し、形質転換した。クローニングされた断片を、プラスミドＤＮＡをミニプレップした後に（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、ＥｃｏＲＩで制限消化することによって、またはＴ３プライマーおよびＴ７プライマーを使用したダイレクトコロニーＰＣＲによって検証した。次に、選択されたコロニーのプラスミドＤＮＡまたはグリセロールストックを配列決定するために外部委託した。
【０１４１】
サブクローニングした後、予測されたＤＮＡ断片がクローニングされたことを確認するために、推定標的ＰＣＲ産物について最初に配列決定した。予測されたＤＮＡ断片を含有するコロニーを選択して、プライマーウォーキングによる二本鎖の全長についての配列決定を完了した。配列決定は全て、Ｃｏｇｅｎｉｃｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）によって行われた。
【０１４２】
挿入断片および境界配列の最終的な組立てを、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して完了した。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の挿入断片およびその隣接境界配列のアノテーションを、ベクターＮＴＩ（バージョン１０および１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して実施した。
【０１４３】
ＧｅｎＢａｎｋの非冗長ヌクレオチドデータベースに対してＢＬＡＳＴプログラムを使用して相同性検索を実施した。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（バージョン１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）解析を実施して、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の完全な挿入断片および隣接境界配列、ならびに野生型Ｍａｖｅｒｉｃｋダイズ系統の元の遺伝子座におけるＯＲＦ（≧１５０コドン）を同定した。
【０１４４】
実施例３．６
５’末端境界配列
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーのそれぞれから、導入遺伝子の５’末端に対して特異的なネステッドプライマーセットを使用してＤＮＡ断片を増幅した。ＥｃｏＲＶ  ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーから約１．８ｋｂの断片、およびＰｖｕＩＩ  ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーから約３ｋｂの断片が観察された。これらの断片を、ＰＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングした。ヌクレオチド配列のデータを生成するために、末端配列決定用にそれぞれのライブラリーについて５つのコロニーを無作為に選定した。プライマーウォーキングによって完全な配列を得るために、両方のＰＣＲプライマーの配列を含有するコロニーを選択した。配列解析により、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のＥｃｏＲＶ  ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーから増幅されたクローンが１，７４４ｂｐのＤＮＡ断片を含有すること、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のＰｖｕＩＩ  ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーから増幅されたクローンが３，０４７ｂｐのＤＮＡ断片を含有することが明らかになった。配列解析により、ＥｃｏＲＶ  ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーから得られたＤＮＡ断片とＰｖｕＩＩ  ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリークローンから得られたＤＮＡ断片が、プライマーＥＳ＿ＬＥｎｄ０４とＥｃｏＲＶ部位との間の領域においてオーバーラップしていることが明らかになった。これらのＤＮＡ断片は全て、導入遺伝子内にＴ鎖境界Ｂの５’末端接合部を含有し、これは、それらが、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の５’末端の導入遺伝子挿入断片およびその隣接境界の同じ領域から増幅されたことを示している。得られた２，７３０ｂｐのダイズのゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋにある配列との有意な相同性を有さないことが見いだされた。
【０１４５】
実施例３．７
３’末端境界配列
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のＥｃｏＲＶ  ＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーから、導入遺伝子の３’末端に対して特異的なネステッドプライマーセットを使用して、サイズが約１．３ｋｂであるＤＮＡ断片を増幅した。次に、このＤＮＡ断片をＰＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングした。末端配列決定のために５つのコロニーを無作為に選定した。５つのクローンは全て、プライマーＡＰ２およびプライマーＥＳ＿ＰＡＴＥｎｄ０４の両方の配列を含有した。これらのクローンについて完全に配列決定することにより、１，３５９ｂｐのコンセンサスＤＮＡ断片が得られた。配列解析することにより、１，３５９ｂｐの断片が、Ｔ鎖境界Ａの３’末端領域由来の２６８ｂｐの断片およびダイズのゲノムＤＮＡ由来の１，０９１ｂｐの断片で構成されることが開示された。ＢＬＡＳＴ検索により、この１，０９１ｂｐのダイズＤＮＡ配列とＧｅｎＢａｎｋにある配列との間に有意な相同性は同定されなかった。
【０１４６】
実施例３．８
ＤＮＡ挿入断片および接合部配列
以前に記載されているようなＰＣＲに基づく方法を使用して、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４からＤＮＡ挿入断片および隣接境界領域をクローニングした。５’隣接境界および３’隣接境界配列および予測された導入遺伝子配列を使用して、表６に列挙されているＰＣＲプライマーを設計した。全部で、４つのオーバーラップＤＮＡ断片（９７８ｂｐのアンプリコン１、２，４１４ｂｐのアンプリコン２、１，８３４ｂｐのアンプリコン３、および１，７０５ｂｐのアンプリコン４）をクローニングし、配列決定した（図３）。挿入断片および隣接境界配列の全体を、４つの断片の間のオーバーラップ配列に基づいてアセンブリした。最終的にアセンブリした配列を解析することにより、ｐＤＡＢ４４６８の導入遺伝子に由来する６，３９１ｂｐの断片が存在することが確認され、また、プラスミドｐＤＡＢ４４６８から予測された配列と比較して、挿入ＤＮＡ配列の塩基の変化は見られなかった。
【０１４７】
実施例３．９
ダイズのゲノム配列の確認
ダイズゲノム内のダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４導入遺伝子の挿入部位を確認するために、異なるプライマー対を用いてＰＣＲを行った（図４および表５）。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４由来のゲノムＤＮＡおよび他のトランスジェニックダイズ系統または非トランスジェニックダイズ系統由来のゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。したがって、得られた５’末端境界配列が正確であるかどうかを確認するために、ａａｄ−１２遺伝子から５’末端境界配列にわたるＤＮＡセグメントを増幅するためにａａｄ−１２特異的な２種のプライマー、例えば、ＡＩＩＬＥｎｄ０５およびＡＩＩＬＥｎｄ０６、ならびに、１６ＬＥｎｄＧ０１および１６ＬＥｎｄＧ０２と称される５’末端境界配列に従って設計した２種のプライマーを使用した。同様に、クローニングされた３’末端境界配列を確認するために、ｐａｔ特異的なプライマー、例えばＰＡＴ−Ｅｎｄ０６、および１６ＰＡＴＧ０１および１６ＰＡＴＧ０２と称される、３’末端境界配列に従って設計した２種のプライマーを使用して、ｐａｔ遺伝子から３’末端境界配列にわたるＤＮＡセグメントを増幅した。予測されたサイズを有するＤＮＡ断片は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の隣接境界に位置した１つのプライマー、導入遺伝子特異的な１つのプライマーの各プライマー対を用いたダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のゲノムＤＮＡからのみ増幅されたが、他のトランスジェニックダイズ系統または非トランスジェニック対照由来のＤＮＡ試料からは増幅されなかった。結果は、クローニングされた５’境界配列および３’境界配列が、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４におけるＴ鎖挿入断片の隣接境界配列であることを示している。
【０１４８】
ダイズゲノム内のＤＮＡ挿入物をさらに確認するために、２つのダイズ配列にわたるＰＣＲ増幅を完了した。５’末端境界配列に従って設計した２種のプライマー、１６ＬＥｎｄＧ０３および１６ＬＥｎｄＧ０４、ならびに３’末端境界配列に対する２種のプライマー、１６ＰＡＴＧ０３および１６ＰＡＴＧ０４を使用して、導入遺伝子、５’末端境界配列、および３’境界配列の全体を含有するＤＮＡセグメントを増幅した。予測通り、１６ＬＥｎｄＧ０３および１６ＰＡＴＧ０３のプライマー対を用いたＰＣＲ増幅により、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のゲノムＤＮＡからおよそ９ｋｂのＤＮＡ断片、および非トランスジェニックダイズ対照および他のダイズトランスジェニック系統から２．７ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。同様に、１６ＬＥｎｄＧ０４および１６ＰＡＴＧ０４のプライマー対を用いて完了したＰＣＲ反応により、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の試料からおよそ９ｋｂのＤＮＡ断片、および他のダイズ対照系統全てから、同様に、２．８ｋｂのＤＮＡ断片がもたらされた。両方のプライマー対をＰＣＲに使用した場合、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４以外の全てのダイズ試料において約６ｋｂのサイズのかすかなバンドが目に見えたことが認められ、これは、このかすかなバンドが、このプライマー対でのダイズゲノムの非特異的な増幅に起因することを示唆している。
【０１４９】
実施例３．１０
ダイズのゲノム配列の確認
１６ＬＥｎｄＧ０３と１６ＰＡＴＧ０３のプライマー対と１６ＬＥｎｄＧ０４および１６ＰＡＴＧ０４のプライマー対を使用して非トランスジェニックダイズ系統であるＭａｖｅｒｉｃｋから増幅された２．７ｋｂのＤＮＡ断片および２．８ｋｂのＤＮＡ断片をクローニングし、配列決定した。それらの配列を互いに突き合せ、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４からクローニングされた５’境界配列および３’境界配列とアラインメントした。これにより、クローニングされたＤＮＡ配列が、ｐＤＡＢ４４６８のＴ鎖がダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４に組み込まれた遺伝子座を含有したことが実証された。アラインメント解析により、元の遺伝子座からの５５ｂｐの欠失および３’組み込み接合部における９ｂｐの挿入物も明らかになった（図５）。クローニングされた元の遺伝子座のダイズのゲノム領域においてオープンリーディングフレーム（＞／＝４５０ｂｐ、１５０アミノ酸）は同定されなかった。
【実施例４】
【０１５０】
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の隣接ＳＮＰマーカーによるゲノムの特徴付け
ゲノムの挿入部位を特徴付け、説明するために、挿入断片の近傍に位置するマーカー配列を決定した。多型的な一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーのパネルを使用して導入遺伝子の位置を同定し、マッピングした。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４２は、第４染色体上の１１９．６ｃＭに位置する。この位置は、２つの隣接ＳＮＰマーカー、ＢＡＲＣ−０４４６０７−０８７３６とＢＡＲＣ−０１９０９３−０３２９９の間である。より詳細には、導入遺伝子の位置は、ＳＮＰマーカーＢＡＲＣ−０１９０９３−０３２９９から１．３ｃＭ（４８０ｋｂ）離れてマッピングされた。
【０１５１】
実施例４．１
隣接境界領域の配列を用いたＢＬＡＳＴ
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の隣接境界領域の配列（配列番号１）を、ダイズの全ゲノム配列のＢＬＡＳＴに使用した。ＢＬＡＳＴの結果により、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の境界配列の両方が、連鎖群Ｃ１である第４染色体（Ｇｍ０４）上に位置したことが示された。
【０１５２】
実施例４．２
ＳＮＰマッピングおよびＢＬＡＳＴの結果
境界配列を用いたＢＬＡＳＴおよびマッピングからの結果に基づいて、イベントは、第４染色体に割り当てられた。そのように、１０種のＳＮＰマーカーをダイズ遺伝連鎖マップから選択した。ＳＮＰ配列を、Ｄｒ．Ｃｒｅｇａｎ、Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、およびＵＳＤＡによって開発されたＳＮＰマーカーから選択した。これらのＳＮＰマーカーは、第４染色体に対応する連鎖群Ｃ１に関連づけられる。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４についてＴ鎖挿入断片の物理的な位置を決定するために、ダイズの全ゲノム配列のＢＬＡＳＴにＳＮＰ配列を使用した。
【０１５３】
実施例４．３
ＳＮＰマーカーの結果
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４は、第４染色体上の１１９．６ｃＭにマッピングされる。２つの隣接ＳＮＰマーカーは、ＢＡＲＣ−０４４６０７−０８７３６およびＢＡＲＣ−０１９０９３−０３２９９である。導入遺伝子は、ＳＮＰマーカーＢＡＲＣ−０１９０９３−０３２９９から１．３ｃＭ（４８０ｋｂ）離れており、ＳＮＰマーカーＢＡＲＣ−０４４６０７−０８７３６とＢＡＲＣ−０１９０９３−０３２９９の間のおよそ１１９．６ｃＭである。
【実施例５】
【０１５４】
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４におけるＡＡＤ−１２タンパク質の特徴付け
組換えトランスジェニックダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４に由来するＡＡＤ−１２タンパク質の生化学的性質を特徴付けた。定量的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー（Coomassie blue）を用いて染色し、糖タンパク質を検出する方法）、およびウェスタンブロット法を使用してタンパク質の生化学的性質を特徴付け、ＡＡＤ−１２タンパク質の発現を確認した。
【０１５５】
実施例５．１
植物組織におけるＡＡＤ−１２タンパク質の発現
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４におけるＡＡＤ−１２タンパク質のレベルを決定した。可溶性の抽出可能なＡＡＤ−１２タンパク質を、ダイズの葉における定量的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）方法を使用して測定した。
【０１５６】
ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現を解析するために調製した。０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いてダイズ植物の組織からＡＡＤ−１２タンパク質を抽出した。植物組織を遠心分離し；水性上清を収集し、必要に応じて適切な緩衝液で希釈し、ＡＡＤ−１２ＥＬＩＳＡキットをサンドイッチ形式で使用して解析した。キットは製造者の推奨プロトコールに従って使用した。
【０１５７】
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４において、検出解析を実施して、発現の安定性および遺伝性を垂直方向（世代間）および水平方向（系列間）の両方で調査した。Ｔ５世代ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４において、発現は安定であり（分離性でない）、系列全てにわたって一貫した（図６）。
【０１５８】
種々の植物の段階における圃場発現レベル試験を、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４において、Ｖ３前、Ｖ３後、Ｒ２前、およびＲ２後で実施した。噴霧処理全てについて、ならびに２，４−Ｄ除草剤を噴霧した小区画および噴霧していない小区画について、発現値は同様であった。２×噴霧率（２，２４０ｇｍ  ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ）を施用し、試験のどのポイントにおいても植物に対する害は確認されなかった。植物のｖ３前の段階における、系列全てにわたった平均の発現は３００μｇ／ｃｍ２であった。２，４−Ｄを噴霧した後、発現は安定なままであり、系列にわたって平均４００μｇ／ｃｍ２であった。ダイズがＲ２前に到達した時には、平均の発現は、平均２００μｇ／ｃｍ２にわずかに降下した。２，４−Ｄを噴霧した後、Ｒ２後の発現は以前の平均４００μｇ／ｃｍ２に戻った。図６を参照されたい。
【０１５９】
実施例５．２
植物組織におけるＡＡＤ−１２タンパク質の発現
２００８年中に米国およびカナダの６つの区域で追加的な圃場発現試験を行った。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の４つの処理（噴霧なし、２，４−Ｄを噴霧、グルホシネートを噴霧、または２，４−Ｄおよびグルホシネートの両方を噴霧）を試験した。試料採取した植物組織は、葉、粒、根、および茎葉を含んだ。発生のＶ５段階およびＶ１０段階において葉組織を収集し、Ｒ３段階において根および茎葉を収集した。発生のＲ８段階において粒を収集した（Gaska、2006年）。可溶性の抽出可能なＡＡＤ−１２タンパク質を、実施例５．１において前記されている通り、検証された酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）方法を使用して測定した。全ての種類の組織について、ＡＡＤ−１２タンパク質レベルをｎｇ／乾燥重量（ｍｇ）に基づいて算出した。
【０１６０】
種々のダイズマトリックスにおけるＡＡＤ−１２タンパク質の濃度（部位にわたって平均した）の概要が表８に示されている。平均の発現値は、Ｒ３段階の根における１５．５ｎｇ／乾燥重量（ｍｇ）から、Ｖ５段階の葉組織における６６．１ｎｇ／ｍｇにわたった。発現値は、噴霧処理全てについて、ならびに２，４−Ｄ除草剤およびグルホシネート除草剤を噴霧した小区画および噴霧していない小区画について、同様であった。６つの区域全てにわたって、対照組織においてＡＡＤ−１２タンパク質は検出されなかった。
【０１６１】
【表８】
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【０１６２】
実施例５．３
ＡＡＤ−１２タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
安定剤を加えたＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４を伴うリン酸緩衝生理食塩水）ベースの緩衝液中のダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の凍結乾燥した葉組織からＡＡＤ−１２タンパク質を抽出し、可溶性タンパク質を遠心分離によって収集した。上清を濾過し、可溶性タンパク質をフェニルセファロース（ＰＳ）ビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に結合させた。１時間インキュベートした後、ＰＳビーズをＰＢＳＴで洗浄し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて結合したタンパク質を溶出した。伝導率を増加させるために、塩化ナトリウムを加え、ＰＳ精製されたタンパク質を、ＡＡＤ−１２特異的なポリクローナル抗体とコンジュゲートした抗ＡＡＤ−１２免疫親和性カラムにローディングした。結合していないタンパク質をカラムから収集し、カラムを予め冷却したＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）を用いて広範囲にわたって洗浄した。結合したタンパク質を、３．５ＭのＮａＳＣＮ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０である緩衝液を用いてカラムから溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって検査した。同じプロトコールを使用して、対照ダイズ系統であるＭａｖｅｒｉｃｋの葉組織からタンパク質を単離した。Ｍａｖｅｒｉｃｋは、ａａｄ−１２遺伝子を含有しないが、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４植物を表す遺伝的背景を有する。
【０１６３】
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４およびＭａｖｅｒｉｃｋ由来の凍結乾燥した葉組織を、約２．０％のプロテアーゼ阻害剤反応混液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ、ＭＯ）を含有するＰＢＳＴ緩衝液と混合し、Ｇｅｎｏ−Ｇｒｉｎｄｅｒのボールベアリングを用いて粉砕することによってタンパク質を抽出した。試料を遠心分離し、上清を、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液と混合し、加熱し、短時間遠心分離した。試料をＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに直接ローディングした。陽性参照標準物質、微生物由来のＡＡＤ−１２タンパク質も、試料緩衝液と混合し、ゲルにローディングした。トリス／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅ、ＣＡ）を用いて電気泳動を行った。電気泳動した後、ゲルを半分に切り、一方の半分はＰｉｅｒｃｅ  ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅタンパク質染料で染料し、他方のゲルの半分は、ニトロセルロースメンブレンに電気ブロッティングした。次に、ＡＡＤ−１２特異的なポリクローナルウサギ抗体を用いてニトロセルロースメンブレンを探索した。化学発光基質を使用して、免疫反応性のバンドを可視化した。微生物由来のＡＡＤ−１２では、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて可視化された主要なタンパク質バンドは、およそ３２ｋＤａであった。予測通り、対応する植物由来のＡＡＤ−１２タンパク質は、微生物由来のタンパク質とサイズが同一であった。予想通りに、植物の精製された画分は、ＡＡＤ−１２タンパク質に加えて、少量の非免疫反応性不純物を含有した。共精製されたタンパク質は、カラムマトリックスとの弱い相互作用によってカラム上に保持されたと思われる（Williamら、2006年、KennedyおよびBarne、1983年およびHolroydeら、1976年）。
【０１６４】
微生物由来のＡＡＤ−１２およびＤＡＳ−６８４１６−４植物組織抽出物は、抗ＡＡＤ−１２ポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロットにおいて予測されるサイズの陽性シグナルを示した。ＡＡＤ−１２ウェスタンブロット分析では、対照であるＭａｖｅｒｉｃｋの抽出物において免疫反応性タンパク質は観察されず、また、トランスジェニック植物由来の試料において代替のサイズのタンパク質（凝集体または分解生成物）は見られなかった。モノクローナル抗体により、微生物由来のタンパク質において少量のＡＡＤ−１２二量体が検出された。これらの結果により、ＡＡＤ−１２タンパク質がダイズにおいて発現されているという証拠が追加される。
【実施例６】
【０１６５】
サザンブロットによるダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のメチル化検出解析
導入された導入遺伝子は、植物ゲノムに組み込まれた後にサイレンシングを受ける可能性がある。導入遺伝子の発現は、転写レベルおよび／または転写後レベルで阻害される可能性がある。転写レベルでの遺伝子サイレンシングは、導入遺伝子、そのプロモーターおよび他の関連性のある配列のメチル化に関連することが報告されている（Stemら、1997年）。特定の配列におけるメチル化を検出するために、ある方法では、メチル化感受性制限酵素を利用してＤＮＡを消化し、その後ＤＮＡ産物をサザンブロット分析する。特定の制限酵素部位がメチル化されていると、酵素はＤＮＡを切断しない。制限部位がメチル化されていると、サザンブロットで検出可能な、分子量がより高いＤＮＡ断片がもたらされる。サザンブロットに基づくメチル化解析を実施して、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４についてＴ鎖挿入断片のメチル化の状態を決定した。このアッセイは、ａａｄ−１２遺伝子に特異的なプローブおよびそのプロモーターおよび２つのメチル化感受性制限酵素を使用して行った。ａａｄ−１２発現カセットのメチル化は検出されなかった。
【０１６６】
６．１．ダイズの葉の試料収集およびゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離
ゲノムＤＮＡを、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４および非トランスジェニックダイズ系統であるＭａｖｅｒｉｃｋのそれぞれの植物の葉から調製した。伝統的なＣＴＡＢ法を使用して、凍結乾燥した葉の試料からゲノムＤＮＡを単離した。抽出後、ＤＮＡを、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して定量した。
【０１６７】
６．２．ＤＮＡの消化および分離
ＤＮＡの分子キャラクタリゼーションのために、１０マイクログラム（１０μｇ）のダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４由来のゲノムＤＮＡおよび非トランスジェニックダイズ系統であるＭａｖｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ１μｇ当たりおよそ５ユニットの選択された制限酵素および対応する反応緩衝液を各ＤＮＡ試料に加えることによって消化した。各試料を、およそ３７℃で一晩インキュベートした。制限酵素ＡｃｉＩおよびＨｙｐ１８８ＩＩＩを使用して消化した（Ｎｅｗ  ＥｎｇｌおよびＢｉｏＬａｂ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。非トランスジェニックダイズであるＭａｖｅｒｉｃｋ由来のＤＮＡを、試験試料と同じ手順および制限酵素を用いて消化して陰性対照として機能させた。消化されたＤＮＡ試料を、ＮａＣｌを０．１Ｍの最終濃度まで加えた後、イソプロパノールを用いて沈殿させ、１×ローディング緩衝液（０．１％ブロモフェノールブルー、１００ｍＭのＥＤＴＡ、５０％グリセロール、１０ｍＭのトリス  ｐＨ７．５）２０μｌに再懸濁させた。次いで、ＤＮＡ試料および分子サイズマーカーを、０．４×ＴＡＥ緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を３５ボルトでおよそ１８〜２２時間用いて０．８５％アガロースゲルによって電気泳動して断片の分離を実現した。ゲルを臭化エチジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で染色し、ＤＮＡを紫外線（ＵＶ）の下で可視化した。
【０１６８】
６．３．サザン転写およびメンブレン処理
Seversonら、（1997年）に記載されている通りサザンブロット分析を実施した。簡単に述べると、ＤＮＡ断片を電気泳動によって分離し、ＵＶ光の下で可視化した後、ゲルを変性溶液（１５０ｍＭのＮａＯＨ、３ｍＭのＥＤＴＡ）におよそ２０分間曝露させ、その後、中和溶液（１５０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．８）に少なくとも２０分間曝露させた。転写緩衝液（２５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、ｐＨ１０）を用いたウィッキング系を使用して、一晩、ナイロンメンブレン（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ、ＩＮ）にサザン転写を実施した。転写した後、メンブレンを６５℃で約２時間加熱乾燥した。このプロセスにより、ハイブリダイゼーションのためのサザンブロットメンブレンの準備ができた。
【０１６９】
６．４．ＤＮＡプローブの標識化およびハイブリダイゼーション
ナイロンメンブレンに結合したＤＮＡ断片を、標識したプローブを使用して検出した。プローブは、プラスミドｐＤＡＢ４４６８由来の特異的なプライマーを伴う増幅されたＰＣＲ断片として生成した。これらのＰＣＲ増幅された断片をアガロースゲルから切り取り、精製した。精製されたＤＮＡ断片を、ハイブリダイゼーションプローブを作製するための鋳型として使用した。ハイブリダイゼーションプローブを、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＲＥＡＤＹ−ＴＯ−ＧＯ（商標）ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を製造者の説明書に従って使用したランダムプライミングによってα３２Ｐに特異的なヌクレオチドで標識し、ＰＲＯＢＥＱＵＡＮＴ（商標）Ｇ−５０マイクロカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）によって精製した。この試験のために使用したプローブの一覧は、表９に記載されている。
【０１７０】
プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、それぞれ、６５℃で４時間および一晩、ハイブリダイゼーション緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ、ＭＯ）を使用して行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを６５℃、洗浄緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、２．５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＳＤ、リン酸を用いてｐＨ７．８に調整した）で２０分間、３回洗浄した。洗浄したフィルターを、オートラジオグラフィーのためにＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒスクリーンに曝露させ、画像をスキャンした。
【０１７１】
【表９】
2013511985.tif 000010
【０１７２】
６．５  プローブの除去
サザンハイブリダイゼーションのデータを得た後、メンブレンブロットからＤＮＡプローブを除去し、メンブレンブロットは、異なるＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションに再利用することができた。簡単に述べると、曝露後、メンブレンブロットを室温で１０分間、再生溶液１（３０ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ）で洗浄し、６５℃で３０分間、再生溶液２（５ｍＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）で洗浄した。次いで、メンブレンブロットを２×ＳＳＣで簡単に洗浄し、それで別のＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションの準備ができた。メンブレンブロットをオートラジオグラフィーのためにＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒスクリーンに曝露させて、次のハイブリダイゼーションに進む前にＤＮＡプローブの全てを確実に除去した。
【０１７３】
６．６．サザンブロットの結果
この試験では、ａａｄ−１２遺伝子およびそのプロモーターであるＡｔＵｂｉ１０のメチル化の状態を決定するために、メチル化感受性制限酵素ＡｃｉＩおよびＨｙｐ１８８ＩＩＩを使用した。ｐＤＡＢ４４６８のＴ鎖ＤＮＡの公知の制限酵素部位に基づいて予測された特定の消化物およびプローブの断片サイズが表１０で示されている。サザンブロットにおいて分子量がより高い断片が検出されることは、ＡｃｉＩ制限酵素部位およびＨｙｐ１８８ＩＩＩ制限酵素部位の認識配列内のシトシンがメチル化されていることを示すと思われる。そのように、メチル化により、制限酵素がゲノムＤＮＡを消化することができなくなる。
【０１７４】
制限酵素ＡｃｉＩおよびＨｙｐ１８８ＩＩＩを使用してａａｄ−１２遺伝子のメチル化の状態を検査した。ａａｄ−１２プローブを使用すると、予測されたサイズを有するハイブリダイゼーションバンドが観察された。このデータは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４において、ＡｃｉＩおよびＨｙｐ１８８ＩＩＩの認識部位におけるメチル化が起こっていないことを示唆している。同様に、Ｈｙｐ１８８ＩＩＩで消化されたダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４ＤＮＡ試料において、ＡｔＵｂｉ１０プローブを使用すると、予測された分子量のバンドが検出された。このデータは、ａａｄ−１２プロモーター配列における認識部位がメチル化されていなかったことを示している。
【０１７５】
【表１０】
2013511985.tif 000011
【実施例７】
【０１７６】
農業形質データ
２００８年の米国およびカナダの６区域における組成研究の一部として、および２００９年に米国およびカナダの８区域において行われた別々の試験においても、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を用いた農業試験を行った。これらの試験では、イベントＤＡＳ−６８４１６−４ダイズ（２，４−Ｄ除草剤および／またはグルホシネート除草剤の施用を伴う、または伴わない）と、その非トランスジェニック近同質遺伝子対照（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）を比較した。両方の試験の全てにわたる結果により、農業形質パラメータは、従来のダイズ系統について得られる範囲内であることが示された。
【０１７７】
実施例７．１．
２００８年の農業形質データの生成
２００８年に、アイオワ、イリノイ、インディアナ、ネブラスカおよびカナダのオンタリオ（２つの現場）に位置する６つの現場において、イベントＤＡＳ−６８４１６−４ダイズおよび非トランスジェニック対照（Ｍａｖｅｒｉｃｋ品種）を用いた農業研究を行った。対照系統であるＭａｖｅｒｉｃｋと比較して、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４（除草剤処理を伴う、および除草剤処理を伴わない）の同等性を調査するために、群生／集団数、実生／植物生長力、植物の高さ、倒伏、病害発生率、虫害、および開花までの日数を含めた農業形質決定因子を評価した。この試験は、実験１と称される。
【０１７８】
試験ダイズ種子および対照ダイズ種子を、作条の間隔をおよそ３０インチ（７５ｃｍ）として、２５ｆｔの作条当たりおよそ１１２種子の播種密度で植えた。それぞれの現場において、それぞれの処理について３回反復の小区画を確立し、それぞれの小区画は２〜２５ｆｔの作条からなった。小区画を完全乱塊（randomized complete block）（ＲＣＢ）計画に配置し、それぞれの現場において独特に無作為化した。それぞれのダイズの小区画には、同様の成熟度の非トランスジェニックダイズの２つの作条が隣接していた。試験現場全体を最低１０ｆｔの同様の相対的な成熟度の非トランスジェニックダイズで囲んだ。
【０１７９】
除草剤処理については、１エーカー当たりおよそ２０ガロン（１８７Ｌ／ｈａ）の噴霧体積を施用した。これらの施用は、商慣習の最大表示量を再現するように設計した。２，４−Ｄを、季節の合計３ｌｂ  ａｅ／Ａで、上からの施用で３回散布して施用した。出芽前および生長段階のおよそＶ４およびＲ２において、それぞれ１．０ｌｂ  ａｅ  Ａ（１，１２０ｇ／ｈａ）の施用を行った。グルホシネートを、季節の合計０．７４ｌｂ  ａｉ／Ａ（８２８ｇ  ａｉ／ｈａ）、上からの施用で２回散布して施用した。生長段階のおよそＶ６およびＲ１において、それぞれ０．３３ｌｂ  ａｉ／Ａおよび０．４１ｌｂ  ａｉ／Ａ（３７４ｇ  ａｉ／ｈａおよび４５４ｇ  ａｉ／ｈａ）の施用を行った。
【０１８０】
圃場現場の全てにわたって、混合モデル（ＳＡＳ  バージョン８；ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １９９９）を使用して農業形質データについて分散分析を行った。エントリーを固定効果とみなし、区域、区域内のブロック、区域×エントリー、およびエントリー×区域内のブロックを、変量効果として指定した。全体的な処理の効果の有意性を、Ｆ検定を用いて推定した。対照と、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４（噴霧なし）トランスジェニックエントリー、グルホシネートを噴霧したダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４（ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート）トランスジェニックエントリー、２，４−Ｄを噴霧したダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４（ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ）トランスジェニックエントリーならびにグルホシネートおよび２，４−Ｄの両方を噴霧したダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４（ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方）トランスジェニックエントリーの間で、ｔ検定を用いて対応のある対比を行った。多重性を制御するために、偽発見率（False Discovery Rate）（ＦＤＲ）を使用して調整Ｐ値も算出した（BenjaminiおよびHochberg、1995年）。
【０１８１】
【表１１】
2013511985.tif 000012
【０１８２】
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤から収集した農業形質データの分析を行った。群生数、初期集団、実生生長力、施用後の害、倒伏、最終的な群生数または開花までの日数について、統計的有意差は観察されなかった（表１２）。高さについては、対照とダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ噴霧との間に有意な対応のあるｔ検定が観察された。しかし、有意な全体的な処理の効果は観察されず、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４処理と対照との間の差異は非常に小さく、また、差異は、異なるダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４処理間で共有されなかった。これらの結果に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４は、近同質遺伝子非トランスジェニック対照と農業的に同等であった。
【０１８３】
【表１２】
2013511985.tif 000013
【０１８４】
実施例７．２．
２００９年の農業形質データの生成
２００９年に、アーカンソー、アイオワ、イリノイ、インディアナ、ミズーリ、およびネブラスカに位置する８か所の現場においてダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４および非トランスジェニック対照（Ｍａｖｅｒｉｃｋ品種）を用いた農業研究行った。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４ダイズ（除草剤処理を伴う、および除草剤処理を伴わない）の対照との同等性を調査するために、群生／集団数、実生／植物生長力、植物の高さ、病害発生率、虫害、および開花までの日数を含めた農業形質決定因子を評価した（表１３）。
【０１８５】
【表１３】
2013511985.tif 000014
【０１８６】
試験には完全乱塊（randomized-complete-block）計画を用いた。エントリーは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照系統、および市販されている非トランスジェニックダイズ系統であった。試験ダイズ種子、対照ダイズ種子および参照ダイズ種子を、作条の間隔をおよそ３０インチ（７５ｃｍ）として、作条当たりおよそ１１２種子の播種密度で植えた。それぞれの現場において、それぞれの処理について４回反復の小区画を確立し、各小区画は２〜２５ｆｔの作条からなった。それぞれのダイズの小区画には、非トランスジェニックダイズ（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）の２つの作条が隣接していた。試験現場全体を、最低４つの作条（または１０ｆｔ）の非トランスジェニックダイズ（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）で囲んだ。適切な昆虫、雑草、および病害の制御慣習を施用して農業的に許容できる作物を生産した。
【０１８７】
商慣習の最大表示量（maximum label rate）を再現するように除草剤処理を適用した。処理は、噴霧しない対照および特定の生長段階において２，４−Ｄ、グルホシネート、２，４−Ｄ／グルホシネートを施用した除草剤施用からなった。２，４−Ｄ施用については、Ｖ４生長段階およびＲ２生長段階において除草剤を１．０ｌｂ  ａｅ／Ａ（１，１２０ｇ  ａｅ／ｈａ）の比率で施用した。グルホシネート処理については、Ｖ４生長段階およびＶ６〜Ｒ２生長段階にある植物に施用を行った。両方の施用については、Ｖ４施用およびＶ６〜Ｒ２施用について、それぞれグルホシネートを０．３３ｌｂ  ａｉ／Ａ（３７４ｇ  ａｉ／ｈａ）および０．４１ｌｂ  ａｉ／Ａ（４５４  ｇ  ａｉ／ｈａ）の比率で施用した。両方の除草剤を施用するエントリーは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４および非トランスジェニックＭａｖｅｒｉｃｋを含めた対照であった。Ｍａｖｅｒｉｃｋ小区画は、除草剤を施用した後に枯死することが予測された。
【０１８８】
圃場現場全てにわたって、混合モデル（ＳＡＳバージョン８；ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １９９９年）を用いて農業形質データについて分散分析を行った。エントリーを固定効果とみなし、区域、区域内のブロック、区域×エントリー、およびエントリー×区域内のブロックを、変量効果として指定した。個々の区域において、類似の様式で、エントリーを固定効果とし、ブロックおよびエントリー×ブロックを変量効果として分析を行った。データは統計分析には回さなかった。９５％信頼水準において有意差が宣言され、Ｆ検定を用いて全体的な処理の効果の有意性を推定した。噴霧していないＡＡＤ−１２（噴霧なし）トランスジェニックエントリー、グルホシネートを噴霧したＡＡＤ−１２（ＡＡＤ−１２＋グルホシネート）トランスジェニックエントリー、２，４−Ｄを噴霧したＡＡＤ−１２（ＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄ）トランスジェニックエントリーならびにグルホシネートおよび２，４−Ｄの両方を噴霧したＡＡＤ−１２（ＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄ＋グルホシネート）トランスジェニックエントリーと対照エントリーとの間で、ｔ検定を用いて対応のある対比を行った。
【０１８９】
この試験では多数の対比を行ったので、多重性が問題であった。予想外の効果を探すために単一の試験において多数の比較を行う場合、多重性が問題である。これらの条件下で、比較に関するｐ値に基づいて誤って差異が宣言される確率は非常に高い（１−０．９５比較の数）。この試験では分析物当たり４つの比較があり（１６種の農業形質についての分析所見）、農業形質について６４の比較が生じる。したがって、調整していないｐ値に基づいて１つまたは複数の誤った差異が宣言される確率は、農業形質について９９％であった（１−０．９５６４）。
【０１９０】
対照エントリー、ＡＡＤ−１２噴霧なしエントリー、ＡＡＤ−１２＋グルホシネートエントリー、ＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄエントリー、およびＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄ＋グルホシネートエントリーから収集した農業形質データの分析を行った。現場全てにわたる分析について（表１４）、実生生長力、最終集団、植物生長力／害（Ｖ４、Ｒ１）、倒伏、病害発生率、虫害、開花までの日数、成熟までの日数、莢の数、種子の数、生産量、および植物の高さについて統計的有意差は観察されなかった。群生数および初期集団については、対照とＡＡＤ−１２＋グルホシネートエントリーとの間に有意な対応のあるｔ検定が観察されが、有意な全体的な処理の効果またはＦＤＲ調整Ｐ値を伴わなかった。植物生長力／害（Ｒ２）については、対照とＡＡＤ−１２＋グルホシネートエントリーおよびＡＡＤ−１２＋２，４−Ｄ＋グルホシネートエントリーのどちらとの間にも有意な対応のあるｔ検定および有意な全体的な処理の効果が観察されたが、有意なＦＤＲ調整Ｐ値を伴わなかった。これらの変数全てについて平均した結果も、この試験において試験された参照系統について見いだされた範囲内であった。
【０１９１】
【表１４】
2013511985.tif 000015
2013511985.tif 000016
【０１９２】
実施例７．３．
生態学的評価
ダイズ栽培の実践に詳しい人（育種家、圃場の管理者、圃場の農学者、圃場の従業員）がダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の圃場試験をモニターし、観察した。圃場試験を行った人員は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４植物に対する植物病害および害虫の発生率を、同じ試験において従来のダイズ品種と比較して視覚的にモニターした。実施例７．１に記載の実験１の一部として、病害および虫害を、０％が病害発生率または昆虫抵抗性に起因する害を表す０〜１００％の数値的な尺度で評価した。表１５に、実験１に記載の６か所の現場全てにわたる結果が示されている。
【０１９３】
【表１５】
2013511985.tif 000017
【０１９４】
病害発生率については、統計的有意差は観察されなかった。虫害については、対照とダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤との間に有意な対応のあるｔ検定が観察された。しかし有意な全体的な処理の効果は観察されず、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４処理と対照との間の差異は小さく、また、差異は、異なるダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４処理間で共有されなかった。
【０１９５】
２００６年〜２００８年に行われた全てのＵＳＤＡ  ＡＰＨＩＳに届け出た圃場試験からの生態学的な観察も行った。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４植物の試験における病害の発生率および昆虫の存在を記録し、従来の対照と比較したダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４植物の発生率または反応の差異を検査した。全ての場合において、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４植物のいずれの試験でも従来の対照と比較して差異は見られなかった。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４および従来のダイズの試験において観察された病害ストレス要因および昆虫ストレス要因は、表１６に記載されている。これらの観察は、生態学的なストレス要因に対するダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の反応は、従来のダイズの反応と異ならないという結論を裏付ける。
【０１９６】
【表１６】
2013511985.tif 000018
【０１９７】
実施例７．４．
発芽（Ｇｅｒｍａｎｃｙ）および休眠の評価
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４種子の発芽について、温暖な条件下および寒冷な条件下で近同質遺伝子型の比較器と比較して調べることによって種子の休眠特性の変化を評価した。
【０１９８】
温暖発芽試験については、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４および対照ダイズの種子を、水を染み込ませた発芽用パッドを含有するペトリ皿に、プレート当たり２５個置き、過剰な水を流し出した。プレートを２５℃に置き、これらの条件下で５日間保持した。系統当たり１６プレート（４００種子）を調製した。５日後、発芽しなかった種子の数を記録した。
【０１９９】
寒冷発芽試験については、鉢植え用土を満たした平箱半分当たり種子１００個の種子を植えた。平箱に多少水をまき、１０℃で７日間保持し、その後２５℃に５日間曝露し、その後、発芽しなかった種子の数を記録した。
【０２００】
それぞれの試験からのデータを、反復当たり種子１００個の４回の反復を伴う完全無作為計画を使用した分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した。統計分析のために、発芽した種子の数を１００で割った値の平方根のアークサインを使用してデータを変換した。発芽率（パーセント）が、表１７に要約されている。
【０２０１】
【表１７】
2013511985.tif 000019
【０２０２】
温暖発芽実験または寒冷発芽実験のいずれにおいても、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の種子の発芽と対照ダイズの種子の発芽との間に有意差はなかった（それぞれＰｒ＞Ｆ＝１．０および０．１３）。これらの結果は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４において種子の休眠特性が変化してないことを示している。
【０２０３】
実施例７．５．
農業特性、病害特性、害虫特性、および発芽特性の概要
生育期全体を通して植物の生長特性を評価する農業形質データにより、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の従来の非トランスジェニックダイズとの同等性が実証されている。植物の生長および表現型の特性、病害および昆虫の圧力に対する感受性によって示される生態学的ストレス要因に対する反応、ならびに発芽および休眠の特性は、多様な環境にわたって、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４植物と従来のダイズとの間で変化しなかった。したがって、これらのデータにより、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の農業特性、病害特性、および害虫特性は、従来のダイズの農業特性、病害特性、および害虫特性と有意に異ならず、また、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４ダイズが植物害虫リスクの増加を示す徴候はないという結論が裏付けられる。Benjamini、Y.、Hochberg、Y.（1995年）Controling the false discovery rate：A practical and powerful approach to multiple testing. J. Royal Statistical Soc. B、57巻:289〜300頁。
【実施例８】
【０２０４】
粒および茎葉の組成
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４（２，４−Ｄを噴霧、グルホシネートを噴霧、２，４−Ｄ＋グルホシネートを噴霧、または２，４−Ｄまたはグルホシネートを噴霧していない）と従来のダイズとの間の同等性を調査するために、ダイズの茎葉および粒について組成分析を実施した。米国およびカナダの主要なダイズ生産地域内に位置する６か所の試験場において、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を伴う種子系統およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を伴わない種子系統を使用して試験を行った。試験場は、多様な農業習慣および環境条件の地域を代表し、タンパク質の発現解析および実施例７．１に記載の農業実験１のために使用したのと同じ現場であった。試験はアイオワ、イリノイ、インディアナ、ネブラスカ、およびカナダのオンタリオ（２現場）に位置した。
【０２０５】
ダイズの茎葉および粒の試料を、種々の試験を用いて栄養素量について分析した。茎葉について行った分析は、タンパク質、脂肪、灰分、水分、炭水化物、酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）、中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、カルシウムおよびリンを含んだ。粒について行った分析は、一般成分（灰分、全脂肪、水分、タンパク質、コレステロール、炭水化物）、繊維、ミネラル、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン、抗栄養因子を含んだ。
【０２０６】
ダイズの茎葉および粒についての栄養分析の結果を文献において報告されている値と比較した。圃場現場の全てにわたって、混合モデルを使用して分散分析も行った。エントリーを固定効果とみなし、区域、区域内のブロック、および区域×エントリーを、変量効果として指定した。全体的な処理の効果の有意性を、Ｆ検定を用いて推定した。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４トランスジェニックエントリー（噴霧していないＡＡＤ−１２；２，４−Ｄまたはグルホシネートを噴霧していない）、グルホシネートを噴霧したダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４トランスジェニックエントリー（ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート）、２，４−Ｄを噴霧したダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４トランスジェニックエントリー（ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ）、ならびにグルホシネートおよび２，４−Ｄの両方を噴霧したダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４トランスジェニックエントリー（ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方）と、対照エントリーとの間でｔ検定を用いて対応のある対比を行った。
【０２０７】
この試験では多数の対比を行ったので、多重性が問題であった。予想外の効果を探すために単一の試験において多数の比較を行う場合、多重性が問題である。これらの条件下で、比較に関するｐ値に基づいて誤って差異が宣言される確率は非常に高い（１−０．９５比較の数）。この試験では分析物当たり４つの比較があり（７５の定量化された分析物）、現場の組成分析全てにわたって３００の比較が行われた。したがって、調整していないｐ値に基づいて１つまたは複数の誤った差異が宣言される確率は９９．９９％より高かった。
【０２０８】
多重性を説明するための１つの方法は、ｐ値を調整して実験に関する誤差率（宣言された差異が全て有意である確率）を制御することであるが、試験において多くの比較を行う場合、特異的な効果を検出するための検定力は有意に低下する可能性がある。検定力がはるかに大きい代替法は、ｐ値を調整してそれぞれの宣言された差異が有意である確率を制御することである。これは、偽発見率（ＦＤＲ）手順（BenjaminiおよびHochberg、1995年）を用いて実現することができる。したがって、変量効果の処理間の真の差異の識別（偽陽性）を改善するために、ＦＤＲを用いてｐ値を調整した。
【０２０９】
実施例８．１．
ダイズの茎葉の組成分析
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの茎葉試料中のタンパク質、脂肪、灰分、水分、炭水化物、酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）、中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、カルシウムおよびリンの分析を実施した。全ての区域にわたる結果の概要が表１８に示されている。
【０２１０】
タンパク質、脂肪、灰分、水分、炭水化物、ＡＤＦ、ＮＤＦ、カルシウムまたはリンについて、現場全てにわたる分析において、対照エントリーとトランスジェニックエントリーとの間に統計学的差異は観察されなかった。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネートおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤についての現場全てにわたる平均灰分値は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネートおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−ＤについてのＮＤＦ値と同様に、文献範囲の外側であった。非トランスジェニック対照を含めた全ての処理についてのＡＤＦ値も、文献値の外側であった。茎葉におけるいかなる一般成分、繊維の種類、またはミネラルについても、平均値は、非トランスジェニック対照とトランスジェニックエントリーのいずれとの間でも有意に異ならなかった。これらの組成成分に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４ダイズ由来の茎葉は、近同質遺伝子非トランスジェニック対照の茎葉と実質的に同等であった。
【０２１１】
【表１８】
2013511985.tif 000020
【０２１２】
実施例８．２．
ダイズの粒の組成分析
実施例８．２．１
一般成分および繊維
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの粒試料中のタンパク質、脂肪、灰分、水分、コレステロール、炭水化物、ＡＤＦ、ＮＤＦおよび総食物繊維の分析を実施した。全ての区域にわたる結果の概要が表１９に示されている。
【０２１３】
脂肪、ＡＤＦまたは総食物繊維に関しては、現場全てにわたる分析において、対照エントリーとトランスジェニックエントリーとの間に統計学的差異は観察されなかった。しかし、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄエントリーについては、ＡＤＦが文献範囲よりもわずかに高かった。
【０２１４】
タンパク質レベルは、現場全てにわたる分析において、噴霧なし、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤について、調整していないＰ値に基づいて対照と比較して有意に異なった。しかし、ＦＤＲを調整した後、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄについてのｐ値のみが有意であり、また、全ての処理についての全体の平均のタンパク質の値は報告された文献値の範囲内であり、これは、差異が生物学的には意味がないことを示している。
【０２１５】
灰分の現場全てにわたる分析において、対照と２，４−Ｄを噴霧したダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４処理との間に有意な調整していないＰ値が観察されたが、全体的な処理の効果または調整したＰ値は観察されなかった。灰分値も、報告された文献値の範囲内であり、これは、差異が生物学的には意味がないことを示している。
【０２１６】
水分レベルは、現場全てにわたる分析において、噴霧なし、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤について、調整していないＰ値に基づいて対照と比較して有意に異なった。しかし、水分についての全体的な処理の効果は有意でなく、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ処理のみが有意なＦＤＲ調整したＰ値を有し、また、全ての処理について平均水分レベルは文献範囲内であった。このことにより、差異は生物学的には意味がないことが示された。
【０２１７】
コレステロール値は、全て定量限界未満（＜ＬＯＱ）であり、また、報告された文献値はない。
【０２１８】
炭水化物レベルは、現場全てにわたる分析において、噴霧なし、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄについて、調整していないＰ値に基づいて対照と比較して有意に異なった。しかし、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ処理のみが、ＦＤＲ調整したＰ値に基づいて対照と有意に異なり、全ての処理の平均は報告された文献値の範囲内であり、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
【０２１９】
ＮＤＦレベルは、現場全てにわたる分析において、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネートについて、調整していないＰ値に基づいて対照と比較して有意に異なっが、これは、有意な調整したＰ値または全体的な処理の効果を伴わなかった。現場全てにわたるＮＤＦの値は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネートおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄエントリーについて報告された文献値よりもわずかに高かったが、差異は、非トランスジェニック近同質遺伝子対照と比較して９％未満であった。
【０２２０】
これらの組成成分に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４由来の粒は、非トランスジェニックダイズの粒と実質的に同等であった。
【０２２１】
【表１９】
2013511985.tif 000021
【０２２２】
実施例８．２．２
ミネラル
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの粒試料中のカルシウム、クロム、銅、ヨウ素、鉄、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、セレン、ナトリウムおよび亜鉛の分析を実施した。全ての区域にわたる結果の概要が表２０に示されている。
【０２２３】
クロム、銅、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、リン、セレンおよびナトリウム（検出されなかった）については、現場全てにわたる分析において、調整していないＰ値に基づいて、対照エントリーとトランスジェニックエントリーとの間に統計学的差異は観察されなかった。
【０２２４】
カルシウムは、現場全てにわたる分析におい  て、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄについて、調整していないＰ値に基づいて有意差を有したが、これは、有意なＦＤＲ調整したＰ値または全体的な処理の効果を伴わず、全ての処理の平均は文献範囲内に入り、これは、差異が生物学的には意味がないことを示している。
【０２２５】
マグネシウムレベルは、現場全てにわたる分析において、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネートについて、それぞれ、調整していないｐ値および調製したｐ値に基づいて対照と比較して有意に異なったが、全体的な処理の効果は有意でなかった。マグネシウムの現場全てにわたる平均値は、報告された文献値よりもわずかに低かったが、対照と比較して差異は小さく（＜３％）、全てのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーが、対照と比較して、より文献値に近かった。
【０２２６】
全てのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーが、現場全てにわたる分析において、対照と比較して有意に高いカリウムの値を有した。しかし、対照と比較して差異は小さく（＜５％）、全てのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーが、対照と比較して、より文献範囲に近かった。
【０２２７】
亜鉛レベルの差異は、現場全てにわたる分析において、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤について、調整していないＰ値に基づいて有意であったが、これは、有意なＦＤＲ調整したＰ値または全体的な処理の効果を伴わず、また、差異は小さかった（＜４％）。
【０２２８】
これらの組成成分に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４由来の粒は、非トランスジェニックダイズの粒と実質的に同等であった。
【０２２９】
【表２０】
2013511985.tif 000022
【０２３０】
実施例８．２．３
アミノ酸
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの粒試料中の以下のアミノ酸の分析を実施した：アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、シスチン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン。全ての区域にわたる結果の概要が表２１に示されている。
【０２３１】
システイン、メチオニン、プロリン、チロシンまたはトリプトファンについては、対照エントリーとトランスジェニックエントリーとの間に統計学的差異は観察されなかった。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄについてのイソロイシンレベルは、調整していないＰ値に基づいて対照と有意に異なったが、これは、有意なＦＤＲ調整したＰ値または有意な全体的な処理の効果を伴わなかった。残りの１２種のアミノ酸のレベルは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーのうちの２つ以上について、対照と比較してわずかに低かったが（＜７％）、全てが非トランスジェニックダイズについての文献範囲内に入った。全てのエントリーについて、全てのアミノ酸が文献範囲内であり、これは、差異が生物学的には意味がないことを示している。これらの組成成分に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４由来の粒は、非トランスジェニックダイズの粒と実質的に同等であった。
【０２３２】
【表２１】
2013511985.tif 000023
【０２３３】
実施例８．２．４
脂肪酸
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの粒試料中の２２種の脂肪酸の分析を実施した。全ての区域にわたる結果の概要が表２２に示されている。
【０２３４】
脂肪酸の１０：０カプリン酸、１５：０ペンタデカン酸、１５：１ペンタデセン酸、２０：３エイコサトリエン酸、２０：４アラキドン酸、８：０カプリル酸、１２：０ラウリン酸、１４：０ミリスチン酸、１４：１ミリストレイン酸、１７：１ヘプタデセン酸、１８：３ガンマリノレン酸、および２０：２エイコサジエン酸を分析し、結果はＬＯＱ未満であった。脂肪酸の１６：０パルミチン酸、１７：０ヘプタデカン酸、および２０：１エイコセン酸は、対照とＡＡＤ−１２エントリーとの間で有意に異ならなかったが、２０：１エイコセン酸値は、ＡＡＤ−１２＋グルホシネートおよびＡＡＤ−１２＋両方の除草剤について、報告された文献値よりも低かった。しかし、対照と比較して差異は小さかった（＜５％）。
【０２３５】
１６：１パルミトレイン酸のレベルは、対照と、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤との間で、調整していないｐ値に基づいて有意に異なった。しかし、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーのみが、１６：１パルミトレイン酸について有意なＦＤＲ調整したＰ値を有した。この処理についての１６：１パルミトレイン酸の現場全てにわたる値は報告された文献値と比較して低かったが、近同質遺伝子対照と比較して差異は小さかった（＜１３％）。
【０２３６】
１８：０ステアリン酸のレベルは、対照と、噴霧なしおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネートとの間で、調整していないＰ値に基づいて有意に異なった。しかし、調整したｐ値または全体的な処理の効果に基づいて有意差は確認されず、また、全てのエントリーは報告された文献値の範囲内であり、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
【０２３７】
１８：１オレイン酸のレベルは、対照と、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤との間で有意に異なった。しかし、１８：１オレイン酸レベルは、全ての処理について報告された文献値の範囲内であり、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
【０２３８】
１８：２リノール酸のレベルは、対照と、噴霧なしおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄとの間で、調整していないＰ値に基づいて有意に異なった。しかし、調整したｐ値または全体的な処理の効果に有意差は確認されず、また、１８：２リノール酸レベルは全ての処理について報告された文献値の範囲内であり、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
【０２３９】
１８：３リノレン酸のレベルは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーのそれぞれと、対照との間で、調整していないｐ値に基づいて有意に異なり、また、調整したｐ値も、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤処理の間で対照と比較して有意であった。１８：３リノレン酸について入手可能な文献値はないが、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４と対照処理との間の差異は小さかった（＜６％）。
【０２４０】
２０：０アラキジン酸のレベルは、対照と、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤との間で、調整していないｐ値に基づいて有意に異なり、まら、２０：０アラキジン酸は、現場全てにわたる分析において、噴霧なし、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート処理について、調整したＰ値にも有意差を有した。しかし、２０：０アラキジン酸レベルは全ての処理について報告された文献値の範囲内であり、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
【０２４１】
２２：０ベヘン酸のレベルは、対照と、噴霧なし、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄ、およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤との間で、調整していないｐ値に基づいて有意に異なり、また、２２：０ベヘン酸のレベルは、現場全てにわたる分析において、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネートについて、調整したＰ値にも有意差を有した。しかし、有意な全体的な処理の効果はなく、また、２２：０ベヘン酸レベルは全ての処理について報告された文献値の範囲内であり、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
【０２４２】
調査した２２種の脂肪酸のうち、２１種の脂肪酸について、４つのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーの全てが、対照と統計学的に区別できなかったか、または、文献値の範囲内であった。１つの場合（噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４；１６：１パルミトレイン酸）で、値は最小の文献値をわずかに下回り、対照と統計学的に異なった（＜１３％低かった）が、３種の噴霧処理の全ては、文献範囲内であった。これらの組成成分に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６由来の粒は、非トランスジェニックダイズの粒と実質的に同等であった。
【０２４３】
【表２２】
2013511985.tif 000024
【０２４４】
実施例８．２．５
ビタミン
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの粒試料中のビタミンの分析を実施した。全ての区域にわたる結果の概要が表２３に示されている。
【０２４５】
ダイズの粒中のベータ−トコフェロール、デルタ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、ビタミンＡ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤおよびナイアシンについての文献値は見つからなかった。ベータトコフェロール、ビタミンＡ、ビタミンＢ１２およびビタミンＤは全てＬＯＱ未満であった。ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＥまたはナイアシンについて、対照、噴霧していないＡＡＤ−１２および処理したＡＡＤ−１２の間に差異は観察されなかった。入手可能な文献範囲を有するこれらのビタミンの中で、近同質遺伝子対照を含めた全ての処理について値がその範囲を超えたビタミンＢ２を例外として、全ての処理がこれらの範囲内に入った。
【０２４６】
デルタ−トコフェロールレベルは、対照と、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネートエントリーおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄエントリーとの間で、調整していないｐ値に基づいて有意に異なった。しかし、これは、有意な調整したＰ値または全体的な処理の効果を伴わなかった。ガンマトコフェロールは、対照と、噴霧なしエントリーおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−Ｄエントリーとの間で、調整していないｐ値および調整したｐ値に基づいて有意に異なった。しかし、ガンマトコフェロールは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４処理について、近同質遺伝子対照と比較して１１％未満高かった。
【０２４７】
ビタミンＢ５レベルは、対照と、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネートエントリーとの間で、調整したＰ値に基づいて有意に異なった。しかし、これは、有意な全体的な処理の効果を伴わなかった。
【０２４８】
葉酸は、対照と、噴霧なし、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤について、調整していないｐ値に基づいて有意に異なった。葉酸については、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーの２種について、対照と比較して調整したｐ値にも有意差があった。しかし、葉酸レベルは全ての処理について報告された文献値の範囲内であり、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーは、近同質遺伝子対照との差異が＜９％であり、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
【０２４９】
これらの組成成分に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４由来の粒は、非トランスジェニックダイズの粒と実質的に同等であった。
【０２５０】
【表２３】
2013511985.tif 000025
【０２５１】
実施例８．２．５
イソフラボン
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの粒試料中のイソフラボンの分析を実施した。全ての区域にわたる結果の概要が表２４に示されている。
【０２５２】
ゲニステインおよびグリシテインの結果は、処理した試料について、ＬＯＱを下回った。ダイジンレベルは、対照とダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤エントリーとの間で、調整していないｐ値および調整したｐ値に基づいて有意に異なった。しかし、全体的な処理の効果は有意でなかった。報告された文献値はないが、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤処理は、近同質遺伝子対照との差異が＜９％であった。ゲニスチンレベルは、対照とダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤エントリーとの間で、調整していないｐ値および調整したｐ値に基づいて有意に異なった。しかし、全体的な処理の効果は有意でなかった。ゲニスチン値は、全ての処理について、報告された文献値よりも高かったが、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４処理は、近同質遺伝子対照と比較して差異が９％未満であった。グリシチンの値は対照とダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤との間で、調整していないｐ値および調整したｐ値に基づいて有意に異なった。グリシチンについて報告された文献値はなかったが、全てのダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４エントリーが、近同質遺伝子エントリーと比較して、差異が１３％未満であった。
【０２５３】
これらの組成成分に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４ダイズ由来の粒は、非トランスジェニックダイズの粒と実質的に同等であった。
【０２５４】
【表２４】
2013511985.tif 000026
【０２５５】
実施例８．２．５
抗栄養因子
対照、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の除草剤由来のダイズの粒試料中の抗栄養因子の分析を実施した。全ての区域にわたる結果の概要が表２５に示されている。
【０２５６】
レクチン、フィチン酸、またはトリプシン阻害物質について、対照エントリーとトランスジェニックエントリーとの間に統計学的差異は観察されなかった。これらの３種の抗栄養因子は全て文献範囲内でもあり、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
【０２５７】
ラフィノースは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート処理について、対照と比較して調整していないｐ値に基づいて有意に低かった（＜１０％）。ラフィノースは、現場全てにわたる分析において、調整したＰ値または全体的な処理の効果に基づいて有意に異ならなかった。ラフィノースレベルは、全ての処理について報告された文献値の範囲内でもあり、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
【０２５８】
スタキオースは、対照およびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネートエントリーとの間で、調整していないＰ値に基づいて有意に異なった。スタキオースレベルは、現場全てにわたる分析において、調整したＰ値または全体的な処理の効果に基づいて有意に異ならなかった。スタキオースレベルは、全ての処理について報告された文献値の範囲内でもあり、これは、非トランスジェニックダイズとの同等性を示している。
【０２５９】
レクチン、フィチン酸、ラフィノース、スタキオースおよびトリプシン阻害物質についての抗栄養因子分析は、全て報告された文献値の範囲内であり、調整していないｐ値に基づく２つの有意差は、抗栄養因子のレベルがダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４処理について対照と比較して低かった。
【０２６０】
これらの組成成分に基づいて、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４ダイズ由来の粒は、非トランスジェニックダイズの粒と実質的に同等であった。
【０２６１】
【表２５】
2013511985.tif 000027
【０２６２】
実施例８．３
粒および茎葉の組成の概要
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の組成物は、近同質遺伝子系統と統計学的に区別できなかったか、または近同質遺伝子系統との差異が１３％未満であったか、または非トランスジェニックダイズについての文献範囲内であった。したがって、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４は、非トランスジェニックダイズと実質的に同等であることが見いだされた。組成の結果のプロットは、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方ダイズと対照ダイズ系統との間に、生物学的に意味のある、処理に関連するいかなる組成上の差異も示していない。結論として、噴霧していないダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋グルホシネート、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋２，４−ＤおよびダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４＋両方の組成の結果により、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４と従来のダイズの同等性が確認される。
【実施例９】
【０２６３】
植え付け前の、一掃するための施用および出芽前試験
この実施例では、本発明によって可能になる、ダイズ作物の植え付けおよび除草剤の使用の新しい方法を記載している。
【０２６４】
植え付け前の、一掃するための除草剤の施用は、所与の作物を植え付ける前に、冬または初春の間に現れた雑草を枯らすことを意図している。一般には、これらの施用は、植え付け前に雑草の物理的な除去が完了していない不耕起または低耕起の管理体制において適用する。したがって、不耕起または低耕起のダイズと併せて使用する除草剤計画によって、植え付け前に存在する非常に広範な広葉雑草およびイネ科雑草を制御しなければならない。
【０２６５】
グリホサート、グラモキソン、およびグルホシネートは、植え付け前の、一掃するための除草剤の施用のために広範に使用される非選択的な残留しない除草剤の例である。しかし、一部の雑草は、以下の因子の１つまたは複数に起因して、そのような除草剤で制御することが難しい：除草剤に対する雑草種または生物型の固有の非感受性、比較的大きなサイズの越冬一年生雑草、および除草剤の取り込みおよび活性を制限する寒冷な気候条件。非選択的な除草剤が不十分である場合に、これらの除草剤とタンク混合して雑草に対するスペクトルおよび活性を増加させるために、いくつかの除草剤の選択肢が利用可能である。１つの例は、ヒメムカシヨモギ（Conyza canadensis）（horseweed）を制御するために役立つ２，４−Ｄ＋グリホサートのタンク混合の施用を用いることである。グリホサートは、存在する雑草の大部分を植え付け前に一掃制御するために４２０〜１６８０ｇ  ａｅ／ｈａ、より一般には、５６０〜８４０ｇ  ａｅ／ｈａで使用することができるが、多くの広葉雑草種（例えば、ヒメムカシヨモギ（horseweed））を制御することに役立つように、２８０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａの２，４−Ｄをに施用することができる。
【０２６６】
２，４−Ｄは、非常に広範囲の広葉雑草（比較的低温においてさえも）に対して有効であり、かつ非常に安価であるので、一般的に好まれる植え付け前の除草剤である。しかし、一掃するための施用の後に植える作物が２，４−Ｄに対して感受性が高い場合（例えば、大部分の双子葉作物）、土壌に２，４−Ｄが残留すること（短期であっても）により、作物が害される恐れがある。ダイズに使用するために、多くの２，４−Ｄエステル除草剤の表示では、１ｌｂ  ａｉ／エーカーの一掃するための施用の少なくとも１５日後までは新しい作物の植え付けが制限されている。２，４−Ｄの低揮発性エステル製剤の場合では、一掃するための最大０．５ｌｂ  ａｉ／エーカーまでの比率では、一般には、施用後７日を過ぎてから植え付けることが必要とされ、１．０ｌｂ  ａｉ／エーカーの比率では、一般には、施用後３０日を過ぎてから植え付けることが必要とされる。水溶性である２，４−Ｄのアミン製品の場合のさらなる懸念は、除草剤が種子の帯域に浸出する恐れがあることである。しかし、ａａｄ−１２遺伝子を含有する作物は、２，４−Ｄに対して耐性であり、土壌中に２，４−Ｄが残留することによって負の影響を受けない。この耐性に起因して、ａａｄ−１２遺伝子を含有する植物は、ａａｄ−１２遺伝子を含有しない植物よりも害を持続することなく、一掃後すぐに植えることができる。さらに、タンク混合（または市販のプレミックス）パートナーと用いる２，４−Ｄ除草剤の柔軟性が増し、費用が縮小することにより、雑草制御の選択肢が改善され、重要な不耕起および低耕の状況における一掃するための施用の頑強性が増す。
【０２６７】
２，４−Ｄアミンの出芽前施用を、植え付けの７日前、１５日前または３０日前に、１１２０ｇ  ａｅ／ｈａ、２２４０ｇ  ａｅ／ｈａ、４４８０ｇ  ａｅ／ｈａの比率で、ａａｄ−１２遺伝子を含有するダイズ（イベントＤＡＳ−６８４１６−４）および対照ダイズに適用する。出芽前施用を、当技術分野において認められている手順で、地理的に異なる地方に位置する圃場の小区画に適用する。出芽および早期生長の正確な評価をもたらすために、除草剤処理した小区画は、処理していない小区画と対になっている。植え付け後、および植え付けの７日前、１５日前または３０日前の２，４−Ｄの施用後；ａａｄ−１２遺伝子を含有するダイズ（イベントＤＡＳ−６８４１６−４）および対照ダイズの害を測定する。圃場試験の結果は、ａａｄ−１２遺伝子を含有するダイズ（イベントＤＡＳ−６８４１６−４）により、植え付けの７日前、１５日前、または３０日前の２，４−Ｄ除草剤の出芽前処理に頑強な耐性がもたらされることを示している。
【０２６８】
これらの実施例は、利用可能な多くの選択肢のうちのいくつかである。雑草制御の当業者は、例として、連邦の除草剤表示（CPR、2003年）に記載の製品およびAgriliance Crop Protection Guide（2003年）に記載の用法を利用することによって、これらに限定されないが、グラモキソン＋２，４−Ｄまたはグルホシネート＋２，４−Ｄを含めた種々の他の施用に注目されよう。上記の例を、安定に形質転換されていれば、ＡＡＤ−１２遺伝子によって保護される、２，４−Ｄ（または他のフェノキシオーキシン除草剤）に対する感受性が高い任意の作物に施用することができることも、当業者には認識されよう。
【０２６９】
ＤＡＳ−６８４１６−４ダイズは、２，４−Ｄに対して耐性である除草剤である。この実施例では、圃場条件下での、ＤＡＳ−６８４１６−４ダイズの除草剤耐性の特徴付けについて報告している。ＤＡＳ−６８４１６−４ダイズを、除草剤である２，４−Ｄに対する耐性について、米国で行った圃場試験において評価した。ＤＡＳ−６８４１６−４ダイズについて、提唱された最大の施用率は、２，４−Ｄについては１１２０ｇ  ａｅ／ｈａである。以下に考察するデータは、ＤＡＳ−６８４１６−４ダイズにより、これらの提唱された最大使用率の少なくとも４倍の比率において、許容できる耐性がもたらされることを示している。
【０２７０】
２，４−Ｄの解毒、およびこの化合物によって後に引き起こされる害からの保護に対するＤＡＳ−６８４１６−４ダイズの効力を、圃場研究において特徴付けた。２，４−Ｄに対する出芽前の耐性を評価するために試験を設計した。出芽前試験を完全乱塊計画として行った。実験単位は、出芽前試験のための、長さおよそ３ｍの、作条が２つある小区画からなり、全ての試験は３回の反復を含有した。除草剤の施用は全て、噴霧体積およそ１４０〜１９０ｌ／ｈａを送達する、ガスで加圧された小さな小区画噴霧装置を用いて行った。使用した２，４−Ｄの製剤は、４５６ｇ  ａｅ／リットルのジメチルアンモニウム塩であった。作物が出芽したおよそ７日後に、視覚的な害の評点を取得した。評点は、小区画内の植物全てにわたって観察された全ての害の症状の視覚的合成を反映する０〜１００の尺度で取得し、０＝処理していない小区画と比較して害なし、１００＝全ての植物が枯死とした。
【０２７１】
出芽前試験は、植え付け後だが、作物が出芽する前の、１１２０ｇ  ａｅ／ｈａ、２２４０ｇ  ａｅ／ｈａ、および４４８０ｇ  ａｅ／ｈａの施用からなった。出芽前試験に関する情報は、表２６に提示されている。
【０２７２】
【表２６】
2013511985.tif 000028
【０２７３】
要約すると、２，４−Ｄ耐性の圃場評価を行った。ミシシッピ、インディアナ、およびミネソタの区域において、ＤＡＳ−６８４１６−４ダイズおよび形質転換されていないＭａｖｅｒｉｃｋダイズの、出芽前の２，４−Ｄアミンの施用に対する反応を検査する試験を行った。この３区域全てにわたって平均すると、２，４−ＤアミンをＤＡＳ−６８４１６−４に出芽前に施用することにより、施用率に関係なく、２％以下の害が生じた（表２７）。形質転換されていないＭａｖｅｒｉｃｋでは、同じ処理によって３４〜６０％の害が引き起こされた。２，４−Ｄを出芽前施用したものの害は、群生の減少および生長の低下からなった。
【０２７４】
【表２７】
2013511985.tif 000029
【実施例１０】
【０２７５】
グリホサート耐性遺伝子＋ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の組合せを使用してグリホサート抵抗性の雑草を制御する方法
グリホサートは、非常に広範な広葉およびイネ科雑草種を制御するので、広範囲にわたって使用されている。しかし、ＧＴＣにおいて、および非作物施用においてグリホサートの使用を繰り返すことにより、雑草のシフトが自然により耐性の種またはグリホサート抵抗性の生物型に選択されてきており、またこれからもそれが続くであろう。大部分の除草剤抵抗性管理戦略では、抵抗性の雑草の出現を遅延させる方法として、同じ種の制御をもたらすが異なる作用様式を有する、効果的な比率で使用されるタンク混合の除草剤パートナーが処方される。４１６ＡＡＤ−１２イベントにグリホサート耐性形質（および／または他の除草剤耐性形質）を積み重ねることにより、グリホサート、フェノキシオーキシン（複数可）（例えば、２，４−Ｄ）およびピリジルオキシ酢酸オーキシン除草剤（例えば、トリクロピル）を同じ作物において選択的に使用することが可能になり、それによってＧＴＣにおいてグリホサート抵抗性の双子葉雑草種を制御することが可能になる機構をもたらすことができた。これらの除草剤は、異なる作用様式の２つ以上の除草剤を含むタンク混合物中で同時に施用することができ；植え付け前、出芽前、または出芽後および分裂時のおよそ２時間からおよそ３カ月までにわたる施用のタイミングで、単一の除草剤の組成をそれぞれ逐次的に施用することができる；あるいは、それぞれの化学的クラスを代表する任意の数の除草剤の任意の組合せを、作物の植え付けの約７カ月以内、作物を収穫するまで（または、個々の除草剤について、いずれか最も短い収穫前の間隔）の任意のタイミングで施用することができる。
【０２７６】
広範なスペクトルのイネ科雑草および広葉雑草を制御することにおいて、施用のタイミング、個々の除草剤の比率、および厄介なまたは抵抗性の雑草を制御する能力の点で柔軟性を有することが重要である。グリホサート抵抗性遺伝子／ＡＡＤ−１２  ４１６イベントの積み重ねを有する作物におけるグリホサートの施用は、約２５０〜２５００ｇ  ａｅ／ｈａにわたってよく；（１種または複数種の）フェノキシオーキシン除草剤は、約２５〜４０００ｇ  ａｅ／ｈａ施用してよく；（１種または複数種の）ピリジルオキシ酢酸オーキシン除草剤は、２５〜２０００ｇ  ａｅ／ｈａ施用してよい。これらの施用（複数可）の最適な組合せ（複数可）およびタイミングは、特定の状況、種、および環境に左右され、雑草制御の当業者および本開示の利益を受ける当業者が決定することが最善である。
【０２７７】
北アメリカにおいて植えられている綿、キャノーラ、トウモロコシ、およびダイズの畑地の大部分は、グリホサート耐性（ＧＴ）形質を含有し、また、ＧＴトウモロコシの採用は増えている。追加的なＧＴ作物（例えば、コムギ、イネ、サトウダイコン、および芝生）が開発中であるが、これまで発売されていない。多くの他のグリホサート抵抗性種は、開発段階への実験中である（例えば、アルファルファ、サトウキビ、サンフラワー、ビート、エンドウ、ニンジン、キュウリ、レタス、タマネギ、イチゴ、トマト、およびタバコ；ポプラおよびモミジバフウのような森林種；ならびにマリーゴールド、ペチュニア、およびベゴニアのような園芸種；World Wide Web、isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm、2005年）。ＧＴＣは、このシステムによって提供される、雑草完全な広がりを制御するための価値があるツールであり、利便性および費用の有効性である。しかし、現在標準の基剤処理としてのグリホサートの有用性は、グリホサート抵抗性の雑草について選択されている。さらに、グリホサートのみの化学的プログラムが実施されている圃場において、グリホサートが本質的にあまり効果的でない雑草が優勢な種にシフトしている。ＡＡＤ−１２イベント４１６にＧＴ形質を積み重ねることにより、従来の育種によってまたは新規の形質転換イベントと共同で、雑草を制御する効力、柔軟性、および雑草のシフトを管理する能力および除草剤抵抗性の発生を改良することができる。作物をＡＡＤ−１２イベント４１６で形質転換することにより、単子葉作物は、フェノキシオーキシンまたはピリジルオキシオーキシンの安全性により高い余地を有することになり、双子葉作物にフェノキシオーキシンを選択的に施用することができる。ＡＡＤ−１２イベント４１６およびＧＴ形質を任意の単子葉作物種または双子葉作物種に積み重ねた場合、改良された雑草制御の選択肢のためのいくつかのシナリオを構想することができる：
ａ）大部分のイネ科植物および広葉雑草種を制御するために、グリホサートを標準の出芽後の施用率（４２０〜２１６０ｇ  ａｅ／ｈａ、５６０〜８４０ｇ  ａｅ／ｈａが好ましい）で施用することができる。ヒメムカシヨモギ（Conyza canadensis）などのグリホサート抵抗性の広葉雑草またはグリホサートを用いて制御することが本質的に厄介な雑草（例えば、ツユクサ（Commelina）種、サツマイモ（Ipomoea）種など）を制御するために、２８０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａ（５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａが好ましい）の２，４−Ｄを、グリホサートと、逐次的に、タンク混合して、またはプレミックスとして施用して有効な制御をもたらすことができる。トリクロピルについては、施用率は一般には７０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａ、より一般には１４０〜４２０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲になる。フルロキシピルについては、施用率は、一般には３５〜５６０ｇ  ａｅ／ｈａ、より一般には７０〜２８０  ａｅ／ｈａの範囲になる。
ｂ）現在、ＧＴＣにおいて施用されるグリホサートの比率は、一般に、施用のタイミング当たり５６０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲である。グリホサートは、広葉雑草種よりもイネ科植物種に対してはるかに効果的である。ＡＡＤ−１２イベント４１６＋ＧＴを積み重ねた形質により、イネ科植物に有効な比率のグリホサート（１０５−８４０ｇ  ａｅ／ｈａ、より好ましくは２１０−４２０ｇ  ａｅ／ｈａ）が可能になる。それから、２，４−Ｄ（２８０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａ、より好ましくは５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａ）を、イネ科植物に有効な比率のグリホサートと、逐次的に、タンク混合して、またはプレミックスとして施用して必要な広葉雑草の制御をもたらすことができる。上記の比率のトリクロピルおよびフルロキシピルは、処理レジメンにおいて許容できる構成成分になる。低率のグリホサートにより、広葉雑草の制御にもいくらかの利益がもたらされる；しかし、主要な制御は、２，４−Ｄ、トリクロピル、またはフルロキシピルによるものである。
【０２７８】
作物をＡＡＤ−１２イベント４１６で形質転換することにより、１つまたは複数の商業的なアリールオキシオーキシン除草剤を単独で、または組み合わせて（逐次的にまたはそれぞれ独立に）使用することが可能になることが、雑草制御の当業者には認識されよう。これらの化学物質を代表する特定の比率の他の除草剤は、ＣＰＲ（Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）書籍または同様の編集物によって編集された除草剤の表示、オンライン（例えば、cdms.net/manuf/manuf.asp）で編集された表示、またはＡｇｒｉｌｉａｎｃｅからのCrop Protection Guide（2005年）などの任意の商業的なまたは学術的な作物保護の手引きによって決定することができる。ＡＡＤ−１２イベント４１６によってＨＴＣにおいて使用することが可能になったそれぞれの代替の除草剤は、単独で使用されようが、タンク混合して使用されようが、または逐次的に使用されようが、本発明の範囲内であるとみなされる。
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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