(57)【要約】  本発明は、再生、再構築、増強、または置き換えの対象である対応する器官または組織の構造に由来する、自系または自系でない細胞集団が播種された足場を使用する、必要がある対象における管腔器官または組織の構造の再生、再構築、増強、または置き換えに関する。
2013525077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要がある対象を治療するための移植可能な細胞−足場構築物であって、
ａ）第１の表面を有するマトリックスを備える足場であって、ここで、前記マトリックスが対象における自然の管腔器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように形作られている、足場；および
ｂ）対象に対して自系でなく、かつ第１の表面上にまたはその中に沈着された自然の器官または組織構造ではない供給源から得られた第１の細胞集団
を備え、
前記足場および前記第１の細胞集団が移植可能な構築物を形成する、構築物。
【請求項２】
必要がある対象を治療するための移植可能な細胞−足場構築物であって、
ａ）第１の表面を有するマトリックスを備える足場であって、ここで、必要がある対象における自然の管からの尿の通過を可能にするようにマトリックスが形作られている足場；および
ｂ）対象に対して自系でなく、かつ第１の表面上にまたはその中に沈着された自然の器官または組織構造でない供給源から得られた第１の細胞集団
を備え、
前記マトリックスおよび前記第１の細胞集団が移植可能な構築物を形成する、構築物。
る、構築物。
【請求項３】
必要がある対象において呼吸障害を治療するための移植可能な細胞−足場構築物であって、
（ａ）第１の表面を有するマトリックスを備えた足場であって、ここで、前記マトリックスが、対象において自然の呼吸器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように形作られる、足場；
（ｂ）第１の表面上にまたはその中に沈着された呼吸組織から得られたものではない第１の細胞集団であって、前記マトリックスおよび前記第１の細胞集団は移植可能な構築物を形成する、第１の細胞集団
を備える、構築物。
【請求項４】
必要がある対象において胃腸障害を治療するための移植可能な細胞−足場構築物であって、
（ａ）第１の表面を有するマトリックスを備えた足場であって、ここで、前記マトリックスが、対象において自然の胃腸器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように形作られる、足場；
（ｂ）第１の表面上にまたはその中に沈着された胃腸供給源から得られたものではない第１の細胞集団であって、前記マトリックスおよび前記第１の細胞集団は移植可能な構築物を形成する、第１の細胞集団
を備える、構築物。
【請求項５】
第１の細胞集団が平滑筋細胞（ＳＭＣ）集団である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項６】
第１の細胞集団が対象に対して同種異系である供給源から得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項７】
第１の細胞集団が対象に対して自系である供給源から得られる、請求項３または４に記載の構築物。
【請求項８】
ＳＭＣ集団が脂肪から得られる、請求項５に記載の構築物。
【請求項９】
ＳＭＣ集団が末梢血から得られる、請求項５に記載の構築物。
【請求項１０】
マトリックスが管状マトリックスである、請求項１、２、および５〜９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１１】
管状マトリックスが第１の末端を備える、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
第１の末端が接触対象の腹壁に接触するように構成されている、請求項１１に記載の構築物。
【請求項１３】
第１の末端が対象の腹壁における開口への吻合のために構成されている、請求項１２に記載の構築物。
【請求項１４】
第１の末端が皮膚に対して外部とされるように構成されている、請求項１２または１３に記載の構築物。
【請求項１５】
管状マトリックスが、第１の尿管への接続のための第１の側面開口をさらに備える、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１６】
管状マトリックスが、第２の尿管への接続のための第２の側面開口をさらに備える、請求項１５に記載の構築物。
【請求項１７】
管状マトリックスが、第２の尿管への接続のための第２の尿管をさらに備える、請求項１５に記載の構築物。
【請求項１８】
移植されると、第１の尿管から管状マトリックスの内部までの尿の通過を可能にする、請求項１５に記載の構築物。
【請求項１９】
移植されると、第２の尿管から管状マトリックスの内部までの尿の通過を可能にする、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項２０】
移植されると、対象の外への尿の通過を可能にする、請求項１８に記載の構築物。
【請求項２１】
移植されると、対象の外への尿の通過を可能にする、請求項１９に記載の構築物。
【請求項２２】
移植されると、管状足場の第１の末端が、対象に対して外部である瘻孔を形成する、請求項１４に記載の構築物。
【請求項２３】
第１の末端が、対象の腹壁を通して伸びる瘻孔の末端を備える、請求項２２に記載の構築物。
【請求項２４】
瘻孔の末端が対象の皮膚に接続されている、請求項２３に記載の構築物。
【請求項２５】
移植されると、瘻孔の末端における上皮化された粘膜を形成する、請求項２３または２４に記載の構築物。
【請求項２６】
上皮化された粘膜が、瘻孔の末端において皮膚粘膜領域を備える、請求項２５に記載の構築物。
【請求項２７】
上皮化された粘膜が、皮膚粘膜領域に隣接する前庭領域を備える、請求項２６に記載の構築物。
【請求項２８】
上皮化された粘膜が、最初に前庭領域の中に現れ、皮膚粘膜領域を通して瘻孔の末端に向かって次第に増加する上皮によって特徴付けられる、請求項２７に記載の構築物。
【請求項２９】
上皮が上皮細胞マーカーの発現によって特徴付けられる、請求項２８に記載の構築物。
【請求項３０】
上皮化された粘膜が天然に存在する皮膚粘膜領域と等価である、請求項２５に記載の構築物。
【請求項３１】
他の細胞集団を含まない、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項３２】
尿路上皮細胞を含まない、請求項１、２、および５〜３０に記載の構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、再構築、増強、または置き換えの対象である、対応する器官または組織の構造に由来しない供給源から得られた細胞を播種した足場を使用して、必要がある対象における管腔器官または組織の構造の再構築、増強、または置き換えに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
最近の研究は、ヒトにおける管腔または管状器官のデノボ再生の見込みを実証している。１つの研究において、小児患者の膀胱が、自系の尿路上皮および膀胱の平滑筋細胞を播種した管腔の生物分解性足場を移植することによって拡張された。これらの移植物は、薄層状に組織化された構成および付随する泌尿器機能を伴う完全な厚みの膀胱壁の再生を開始した（Ａｔａｌａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｌａｎｃｅｔ  ３６７，１２４１−１２４６）。別の研究において、自系骨髄細胞の方向付けられた分化によって生成された、自系呼吸上皮細胞および軟骨細胞を播種した、脱細胞化された死体の気管セグメントの足場を使用して、機能的なヒトの気管が操作された（Ａｓｎａｇｈｉ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３０，５２６０−５２６９；Ｍａｃｃｈｉａｒｉｎｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｌａｎｃｅｔ  ３７２，２０２３−２０３０）。
【０００３】
細胞を播種した足場の使用は、様々な型の管腔または管状器官の状況における欠陥に取り組むための潜在能力を有する。いくつかの奇形が、膀胱を異常に発達させ、外科的な増強を要求する可能性がある。尿路変更術は、損傷を受けたかまたは機能的でない泌尿器系に起因して、個人が排尿できないときに身体から尿が通る通路を付け、かつ尿を排出するための方法である。一般的に、尿の流れを遮断し、尿管および／または腎臓中の圧力を増加させる任意の状態が、尿路変更術を必要とし得る。変更術のためのいくつかの共通の適応症には、膀胱切除を必要とする膀胱の癌、腎機能に影響を与える神経因性膀胱、膀胱に対する放射線傷害、女性において起こる難治性失禁、および慢性骨盤痛症候群が挙げられる。一般的に、尿路変更術のための２つの主要な戦略が存在する：人工膀胱造設術および尿禁制型尿路変更術である。小腸粘膜下層（ＳＩ）が尿路変更術のために使用されてもよいが、粘膜および粘膜下層の除去が腸セグメントの退縮をもたらす可能性があることが報告されている（例えば、Ａｔａｌａ，Ａ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５６：３３８（１９９６）を参照のこと）。それゆえに、必要がある患者に尿路変更術の系を提供する他の方法および装置のための必要性が存在している。
【０００４】
尿失禁は、共同体全体と医療設定の両方において、すべての年代およびすべてのレベルの身体の健康の人々に影響を与える、蔓延している問題である。急迫性尿失禁の１つの現在の治療は、ボツリヌス毒素、例えば、Ｂｏｔｏｘ（登録商標）などの神経毒素の注射である。ボツリヌス毒素は、膀胱壁の排尿筋を麻痺させること、またはおそらく、膀胱の求心路に影響を与えること、および尿道下神経における感覚受容体を減少させることによって、膀胱過活動に対してその影響を発揮すると考えられている。ボツリヌス毒素分子の大きなサイズは、その拡散する能力を制限し得、従って、ボツリヌス毒素が求心性と遠心性の両方の神経線維に到達することを妨げる。しかし、Ｂｏｔｏｘ（登録商標）を用いる治療は、膀胱の筋肉壁へのボツリヌス毒素の多数回注射（典型的には、２０〜５０回）を必要とするかもしれない。尿失禁を治療するための代替方法の必要性が残っている。
【０００５】
肺は、脂肪由来の平滑筋細胞および生物分解性の足場を利用すると再生に対して感受性である、高度に組織化された管状器官と見なされ得る。脂肪由来の「間質細胞」を播種したポリグリコール酸（ＰＧＡ）フェルトシートは、ラット肺の肺葉切除モデルの中での肺再生を実証したことが報告されている（Ｓｈｉｇｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  Ｖｏｌ  １７４．ｐｐ  １１９９−１２０５，２００６）。細胞を播種したＰＧＡシートが、残りの肺葉上にシールされた。肺胞および血管の再生が移植の１週間以内に観察され、同時に肺の機能性の回復を伴った。別の研究において、胎仔ラット肺細胞が、ゲルフォームスポンジベースの足場に播種され、成体ラット肺に移植された。移植後４ヶ月までに、視覚的に確認できる血管ネットワークを有する肺胞様構造が、分解している足場の中で再生されることが観察された（Ａｎｄｒａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９２：５１０−５１８，２００７）。胎仔肺細胞が播種されたポリ乳酸−コ−グリコール酸／ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＧＡ／ＰＬＬＡ）足場を使用するインビボ研究の結果（Ｍｏｎｄｒｉｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １２（４）：７１７−７２８，２００６；Ｍｏｎｄｒｉｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏ  ２３９：Ｌ６３９−Ｌ６５０，２００７）は、特定の受容体アイソフォームを標的とするために選ばれた外因性線維芽細胞増殖因子の適切な組み合わせが、組織再生に誘導的な、適切な肺上皮細胞または間葉細胞の挙動を容易にすることを示唆する。Ｍｏｎｄｒｉｎｏｓら（２００６）もまた、三次元ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）構築物が肺胞形成単位（ＡＦＵ）を含有したという観察を報告した（要約、図３）。肺のための再生医薬ベースの治療を提供するために適切なさらなる細胞集団のための必要性が残っている。
【０００６】
胃腸管の欠陥は、治療の代替方法の必要性が存在しているもう１つの領域である。機能的なヒトの気管が、自系骨髄細胞の方向付けられた分化によって生成された自系呼吸上皮細胞および軟骨細胞を播種した、脱細胞化された、死体の気管セグメントの足場を使用して作製された（Ｍａｃｃｈｉａｒｉｎｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）、前出）。分化したＭＳＣから得られた軟骨細胞、ならびに上皮細胞の両方が宿主の生存のために必要とされた、組織操作された気管のためにブタモデルが使用された（Ｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １３９，４３７−４４３）。自系気管外植片から直接得られた軟骨細胞は、気管のデノボ再生に向けて適用可能であるかもしれない（Ｋｏｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｓｕｒｇ  ４３，２１４１−２１４６；Ｋｏｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｓｕｒｇ  Ｉｎｔ  ２４，１１１７−１１２１）。
【０００７】
加えて、現在、小腸（ＳＩ）は、小腸移植が、小児小腸症候群のために、満足のゆくものではない現在の標準的な介護の標準であり、差し迫った臨床的な必要性を表している。上皮細胞および間葉細胞の不完全に解離したクラスターから構成される自系器官様単位が、腸上皮（おそらく、常在性の腸幹細胞を含有する）の部分消化によって得られ、ＰＬＬＡ足場管を播種するために使用され、これは、ブタの腹腔内で引き続き成熟された。移植後７週間の時点で、回収された移植物は、自然のＳＩの総計的な全体の薄層状組織化を再現する組織セグメントを含有することが観察された（Ｓａｌａ，Ｆ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  １５６，２０５−２１２２５）。重要なことに、腹膜に同様に移植された無細胞足場は、胃腸組織セグメントを産生しなかった。しかし、このように組織操作されたＳＩセグメントを大型の動物における宿主ＳＩに移植することの効果は、実証されていないままである。さらに、このアプローチは、移植のために組織様を得るために１０ｃｍまでの自系ＳＩを収穫することを必要とした。加えて、必要とされる自系ＳＩの量をエキソビボ拡大が減少できるか、足場構造を播種することが可能な組織様単位が疾患を有するヒトの腸から単離できるか、または臨床的に適切な移植物を生成するために、どれくらい多くの自系組織が必要とされるかは確かではない。別の報告において、胃由来のＳＭＣを有するかまたは有さないコラーゲンスポンジ足場が、外科的に単離されたイヌの回腸ループの中で、１×１ｃｍの欠陥に移植された。ＳＭＣ＋移植部位における組織の肉眼的分析は、自然様の新生粘膜の再生を実証した。しかし、ＳＭＣ−移植部位の組織は潰瘍があるままであった。血管新生、上皮形成、および環状筋組織化の有意な増強が、ＳＭＣ−移植部位と比較してＳＭＣ＋移植部位においてもまた観察された（Ｎａｋａｓｅ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  １２，４０３−４１２）。足場に播種されたＳＭＣの数の増加により、より広い面積の再生ＳＩ組織を生じたが、平滑筋層の厚さの同時進行の増加は観察されなかった（Ｎａｋａｓｅ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  １３７，６１−６８）。
【０００８】
管腔または管状器官の再生アプローチはまた、食道再生にも適用可能であるかもしれない。２７例の雌性ラットの腹部食道において作製されたパッチ欠陥が、胃無細胞マトリックスから生成した細胞を含まない足場でパッチされた。移植後１８ヶ月の時点においてさえ、２４例の生存個体のうち、どれも薄層筋層粘膜再生の証拠を示さなかった（Ｕｒｉｔａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｓｕｒｇ  Ｉｎｔ  ２３，２１−２６）。対照的に、食道の切除および置き換えのイヌモデルにおいて、ケラチノサイトまたは線維芽細胞の混合物が播種されたＰＧＡ管は、移植後３週間以内に、自然の食道と類似した平滑筋薄層組織化の再生の引き金を引いたのに対して、無細胞ＰＧＡ管は食道の狭窄を形成し、２〜３週間以内に、ほぼ完全な閉塞に導いた（Ｎａｋａｓｅ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １３６，８５０−８５９）。子ブタの頸部食道への無細胞ＳＩＳ管構築物を導入する試みもまた成功せず、乱切および最小限の再生応答を示した（Ｄｏｅｄｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｒｔｉｆ  Ｏｒｇａｎｓ  ３３，３２８−３３３）。
【０００９】
胃由来の器官様単位は、バイオポリマー足場に播種されたとき、ブタの腹腔の中で作製された胃組織中の胃および筋層の粘膜の再構築の引き金を引いた（Ｓａｌａ，Ｆ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  １５６，２０５−２１２）。イヌモデルを使用して、環状の欠陥が７例の動物の胃において作製され、自系に由来する末梢血または骨髄吸引液のいずれかに浸漬された複合生物分解性足場（「Ｎｅｗ−ｓｈｅｅｔ」）がその欠陥の上に縫合された。移植後１６週間までに、欠陥部位は、粘膜下層の中で、再上皮化、絨毛の形成、血管化、および線維症の証拠を有する再生された胃を形成した。しかし、平滑筋層の最小限の再生がｒ、平滑筋α−アクチンの発現によって示されるように観察されたが、成熟平滑筋細胞の表現型と一貫するマーカーであるカルポニンではそうならなかった（Ａｒａｋｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｒｔｉｆ  Ｏｒｇａｎｓ  ３３，８１８−８２６）。
【００１０】
厳密には管状器官ではないが、肛門括約筋は胃腸管の構成要素であり、大腸の開通性を調節する際に決定的に重要である。肛門括約筋を作製するための最近の試みは、膀胱再生を触媒するために使用される同じ一般的プラットフォームを活用する。この目的のために、ヒトの内部肛門括約筋から単離された平滑筋細胞が、中心の型の周囲に注がれたフィブリンゲルに播種された。型の周囲のゲルの細胞媒介性収縮は、括約筋の平滑筋組織の３Ｄ円筒状管の形成を生じた。インビボの吻合は実証されていないままであるが、この生物操作された肛門括約筋は、自然の肛門括約筋の機能性と一貫している、収縮特性および規定された神経伝達物質に対する応答を実証した（Ｈａｓｈｉｓｈ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｓｕｒｇ  ４５，５２−５８；Ｓｏｍａｒａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３７，５３−６１）。代替の供給源の平滑筋細胞の使用は、操作された括約筋の市販品の製造に向けた移行を容易にするかもしれない。
【００１１】
血管組織作製における主要な問題は、自然の血管と釣り合った、適切な、長時間続く生体力学的特性を保有する血管移植片の構築である。動脈の置き換えは、すべての血管に共通な環状負荷であるが、さらにこれらの血管の必要とされるより高い操作圧力の両方に起因して特別なチャレンジを課す。研究者は、種々の合成および有機材料、様々な構築様式（例えば、電子スピンおよびキャスティング）および多数の複合設計を通して、この問題にアプローチしている。例えば、ドナー移植片、天然成分、および合成成分の様々な組み合わせを使用して血管移植片を作製するための試みが行われている（例えば、Ｚｉｌｌａらの米国公開特許出願第２００５／０１３１５２０号；Ｆｌｕｇｅｌｍａｎ，米国公開特許出願第２００７／０１９００３７号；Ｓｈｉｍｉｚｕ，米国特許第６，１３６，０２４号；Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７１８，７２３号；およびＲｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２９２，８０２号を参照のこと）。ポリ（エステルウレタン）ウレア（ＰＥＵＵ）（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２７：３６３１−３６３８）、およびＰＥＵＵ／コラーゲン（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｖｏｌ．１５．Ｓｕｐｐ．１；Ｓ１７−Ｓ２７）から構成された他の足場は、組織様機能特性を示すものとして報告されている。
【００１２】
Ｌｕｄｌｏｗら、米国公開出願第２０１００１３１０７５（その全体が参照により組み入れられる）は、対象から得られる自系細胞を播種した足場を使用して、必要がある対象における薄層が組織化された管腔の器官または組織の構造の再生、再構築、増強、または置き換えに関する。自系でない供給源などの細胞のさらなる供給源のための必要性が残っている。自系幹細胞が、膀胱再構築および膀胱癌のための治療の代替を提供できることが論じられている（Ｙｉｎａｎ  ａｎｄ  Ｇｕｏｍｉｎ（２００８）Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．７０，２９４−２９７を参照のこと）。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、本明細書に記載される再生、再構築、増強、または置き換えの対象である、器官または組織の構造とは異なる供給源から得られる細胞が播種された足場を使用して、必要がある対象における管腔または環状の器官または組織の構造の再生、再構築、増強、または置き換え、そのような細胞を単離する方法、このような細胞を播種した新たな器官／組織構造足場またはマトリックス（構築物）を単離する方法に関する。管腔器官は積層されて組織化されてもよい。このような新たな組織／組織構造構築物を作製する方法、およびこれらの構築物を使用して、必要がある患者を治療する方法もまた提供される。細胞は、自系供給源または自系でない供給源から得られてもよい。自系でない供給源が使用されるならば、治療の方法は、免疫抑制治療の必要性なしで実施されてもよい。
【００１４】
１つの態様において、本発明は、必要がある対象を治療するための移植可能な細胞足場構築物に関わる。１つの実施形態において、この構築物は、ａ）第１の表面を有するマトリックスを備える足場であって、ここで、このマトリックスは、対象における自然の管腔の器官または組織の構造の少なくとも一部に適合するように形作られる、足場；およびｂ）対象に対して自系でなく、そして第１の表面上またはその中に沈着された自然の器官または組織の構造ではない供給源から得られた第１の細胞集団から作られ、上記足場および上記第１の細胞集団は移植可能な構築物を形成する。別の実施形態において、この足場は、対象における自然の血管または器官からの液体の通過を可能にするように形作られる。
【００１５】
別の実施形態において、この構築物は、ａ）第１の表面を有するマトリックスを備える足場であって、ここで、このマトリックスは、必要がある対象における自然の血管からの尿の通過を可能にするように形作られる、足場；およびｂ）対象に対して自系でなく、かつ第１の表面上またはその中に沈着された自然の器官または組織の構造ではない供給源から得られた第１の細胞集団から作られ、上記マトリックスおよび上記第１の細胞集団は移植可能な構築物を形成する。別の実施形態において、このマトリックスは管状マトリックスである。この管状マトリックスは第１の末端を有してもよい。第１の末端は、対象の腹壁と接触するように構成されてもよい。第１の末端は、対象の腹壁における開口部に対して吻合のために構成されてもよい。第１の末端は、皮膚に対して外面化されるように構成されてもよい。別の実施形態において、管状マトリックスは、第１の尿管への接続のための第１の横開口部をさらに含んでもよい。管状マトリックスは、第２の尿管への接続のための第２の横開口部をさらに含んでもよい。管状マトリックスは、第２の尿管への接続のための第２の末端をさらに含む。１つの実施形態において、この構築物は、移植されると、第１の尿管から管状マトリックスの内部までの尿の通過を可能にする。尿の通過は、移植されると、第２の尿管から管状マトリックスの内部まで可能にされてもよい。この構築物は、移植されると、対象からの尿の通過を可能にしてもよい。別の実施形態において、管状足場の第１の末端は、移植されると、対象に対して外部である瘻孔を形成する。第１の末端は、対象の腹壁を通して伸びる瘻孔末端を含んでもよい。瘻孔末端は、対象の皮膚に接続されてもよい。１つの実施形態において、この構築物は、移植されると、瘻孔の末端において上皮化された粘膜を形成してもよい。上皮化された粘膜は、瘻孔の末端において皮膚粘膜領域を有してもよい。上皮化された粘膜は、皮膚粘膜領域に隣接する前庭領域を有してもよい。上皮化された粘膜は、最初に前庭領域に現れ、皮膚粘膜領域を通して瘻孔末端に向かって次第に増加する上皮によって特徴付けられてもよい。上皮は、上皮細胞マーカーの発現によって特徴付けられてもよい。上皮化された粘膜は、天然に存在する皮膚粘膜領域と同等であってもよい。１つの実施形態において、この構築物は任意の他の細胞集団を含まない。この構築物は尿路上皮細胞を含まなくてもよい。この構築物は尿路導管として使用されてもよい。
【００１６】
１つの態様において、本発明は、必要がある対象における呼吸器障害を治療するための移植可能な細胞足場構築物に関わる。１つの他の実施形態において、この構築物は、（ａ）第１の表面を有するマトリックスを備える足場であって、ここで、このマトリックスは、対象における自然の呼吸器官または組織の構造の少なくとも一部に適合するように形作られる、足場；および（ｂ）第１の表面上またはその中に沈着された呼吸組織から得られたものではない第１の細胞集団から作られ、ここで、上記マトリックスおよび上記第１の細胞集団は移植可能な構築物を形成する。１つの他の実施形態において、この構築物は、対象における自然の管からのまたはその中の空気の通過を可能にするように適応される。別の実施形態において、この構築物はまた、呼吸組織から得られた第２の細胞集団も有してもよく、ここで、上記マトリックス、上記第１の細胞集団、および上記第２の細胞集団は移植可能な構築物を形成する。これらの細胞集団は、自系または自系でない供給源から得られてもよい。
【００１７】
１つの態様において、本発明は、必要がある対象における胃腸（ＧＩ）障害を治療するための移植可能な細胞−足場構築物に関わる。１つの他の実施形態において、この構築物は、ａ）第１の表面を有するマトリックスを備える足場であって、ここで、このマトリックスは、対象における自然の胃腸器官または組織の構造の少なくとも一部に適合するように形作られる、足場；およびｂ）第１の表面上またはその中に沈着された胃腸供給源から得られたものではない第１の細胞集団から作られ、上記足場および上記第１の細胞集団は移植可能な構築物を形成する。別の実施形態において、この構築物は、ＧＩ組織から得られた第２の細胞集団をさらに備えてもよく、ここで、上記マトリックス、上記第１の細胞集団、および上記第２の細胞集団は移植可能な構築物を形成する。これらの細胞集団は、自系または自系でない供給源から得られてもよい。
【００１８】
すべての実施形態において、第１の細胞集団は平滑筋細胞（ＳＭＣ）集団である。ある実施形態において、第１の細胞集団は、対象に対して自系ではない供給源から得られる。自系でない供給源は、同種異系供給源であってもよい。ある実施形態において、第１の細胞集団は、対象に対して自系である供給源から得られる。ある実施形態において、ＳＭＣ集団は脂肪から得られる。ある実施形態において、ＳＭＣ集団は末梢血から得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】膀胱増強足場の例を示す。
【図１Ｂ】膀胱増強足場の例を示す。
【図１Ｃ】膀胱増強足場の例を示す。
【図１Ｄ】膀胱増強足場の例を示す。
【図２Ａ】膀胱置き換え足場の例を示す。
【図２Ｂ】膀胱置き換え足場の例を示す。
【図２Ｃ】膀胱置き換え足場の例を示す。
【図２Ｄ】膀胱置き換え足場の例を示す。
【図３Ａ】尿路変更術または導管足場の例を描写する。
【図３Ｂ−Ｃ】図３Ｂ〜Ｃは、様々な型の断面領域を有する尿路変更術構築物の例、ならびに尿管に接続するように構成され得る開口部についての可能性のある位置を示す。図３Ｃは、尿路変更術構築物の変形を図示する（Ａ：オープンクレーム卵形；Ｂ：オープンクレーム卵形容器；Ｃ：クローズド卵形容器および３本の管）。
【図４】Ａ〜Ｄは、尿路変更術または導管構築物の様々な応用を図示する。
【図５】Ａ〜Ｂは、筋肉等価足場の例を示す。
【図６】パッチまたはストリップの型である種々の筋肉等価足場の画像を描写する。
【図７】様々な筋肉等価足場および移植の代表的な方法を描写する。Ａは、足場の平らなシートの形成を描写する。Ｂは、移植の時点で巻かれることができ、腹腔鏡管を通ることができ、かつ腹腔において展開することができる、腹腔鏡に適した足場を描写する。Ｃは、腹腔鏡管を通した挿入を容易にし、その後腹腔中で展開されるための巻き構成における、腹腔鏡に適した足場シートの形成を描写する。Ｄは、管を通した挿入を容易にし、その後腹腔中で展開されるための折り畳み構成またはアコーディオンスタイルでの、腹腔鏡に適した足場シートの形成を描写する。
【図７Ｅ】筋肉等価足場の移植のための可能な外科的方法を描写する。
【図７Ｆ】空の膀胱および充満した膀胱上の移植部位を描写する。
【図７Ｇ】表面のセクション化の際に作製された楕円型を示す外科的スリットを有する尿膀胱モデルを描写する。
【図８】腹腔鏡ポートを通して挿入を容易にするためのあらかじめ折り目を付けられたアコーディオンスタイルの足場シートを描写する。
【図９Ａ】ストリップにプレカットされ、次いで、積み重ねおよび腹腔鏡ポートへの挿入を可能にするために一緒に縫合され、腹腔中の適所に確保された足場を描写する。
【図９Ｂ−Ｅ】Ｂは、長さ１８．７ｃｍ×幅２．０ｃｍで２つの折り畳みを有する１つの足場を描写する。Ｃは、長さ１３．３ｃｍ×幅２．８ｃｍで３つの折り畳みを有する１つの足場を描写する。Ｄは、長さ９．７ｃｍ×幅４．０ｃｍで４つの折り畳みを有する１つの足場を描写する。Ｅは、各々が長さ９．７ｃｍおよび幅２．０ｃｍの２つの折り畳みを有する２枚から構成される１つの足場を描写する。
【図１０】Ａ〜ＣはＧＩ組織足場を描写する。
【図１１Ａ】移植された導管構築物についての構成の例を示す。
【図１１Ｂ】移植された導管構築物についての構成の例を示す。
【図１２】移植されたＮｅｏ〜Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｃｏｎｄｕｉｔ（新生尿導管）足場のための２つの代替的な構成（ＡおよびＢ）を描写する。
【図１３】永続的な尿迂回路構築物の移植された構成要素の例を示す。
【図１４】尿迂回路構築物の他の応用を描写する。
【図１５】尿導管構築物を用いる移植後の試験動物の固定後組織（縦軸方向に二等分した）を示す。
【図１６】Ａ〜Ｄは、肺胞形成単位からのＣｌａｒａ細胞分泌タンパク質（Ａ）およびプロ界面活性剤タンパク質Ｃ（Ｂ〜Ｄ）の発現を示す。
【図１７】肺胞形成単位からのＣｌａｒａ細胞タンパク質の発現を描写する。
【図１８】肺胞形成単位からのＫＲＴ１８、ＳＣＧＢ１Ａ１、およびＳＦＴＰＡ１の発現を描写する。
【図１９】コネキシン４３で染色されたラット肺ＡＦＵの共焦点画像を示す。
【図２０】Ａｄ−ＳＭＣをあらかじめ播種したものと、播種していないものの、ゲルフォームおよびＰＬＧＡ足場上の肺ＡＦＵを描写する（左上のパネル−Ａｄ−ＳＭＣをあらかじめ播種し、次いで単離された肺細胞を播種したゲルフォーム；右上のパネル−Ａｄ−ＳＭＣをあらかじめ播種せず、次いで単離された肺細胞を播種したゲルフォーム；左下のパネル−Ａｄ−ＳＭＣをあらかじめ播種し、次いで単離された肺細胞を播種したゲルフォーム；右下のパネル−Ａｄ−ＳＭＣをあらかじめ播種せず、次いで単離された肺細胞を播種したゲルフォーム；矢印はＡｄ−ＳＭＣをあらかじめ播種した足場上での目に見えるＡＦＵ形成を描写する）。
【図２１】左上のパネルにおいてＣｌａｒａ細胞タンパク質に対する抗体で染色されたゲルフォーム（−）Ａｄ−ＳＭＣを示す；右上のパネルはゲルフォーム（−）Ａｄ−ＳＭＣ位相画像を示す；左下のパネルはＣｌａｒａ細胞タンパク質に対する抗体で染色されたゲルフォーム（＋）Ａｄ−ＳＭＣを示す；右下のパネルはゲルフォーム（＋）Ａｄ−ＳＭＣ位相画像を示す。
【図２２】左上のパネルにおいて界面活性剤タンパク質Ｃに対する抗体で染色されたゲルフォーム（−）Ａｄ−ＳＭＣを示す；右上のパネルはゲルフォーム（−）Ａｄ−ＳＭＣ位相画像を示す；左下のパネルは界面活性剤タンパク質Ｃに対する抗体で染色されたゲルフォーム（＋）Ａｄ−ＳＭＣを示す；そして右下のパネルはゲルフォーム（＋）Ａｄ−ＳＭＣ位相画像を示す（下のパネルにおける矢印は目に見えるＡＦＵ形成を描写する）。
【図２３】左上のパネルにおいて、Ｃｌａｒａ細胞タンパク質に対する抗体で染色されたＰＬＧＡ足場（＋）Ａｄ−ＳＭＣを描写し；右上のパネル−ＰＬＧＡ足場（＋）Ａｄ−ＳＭＣ位相画像；ならびに左下のパネルは免疫蛍光画像および位相画像の統合を示す（上のパネルの矢印は目に見えるＡＦＵ形成を描写する）。
【図２４】界面活性剤タンパク質Ｃに対する抗体で染色されたゲルフォーム足場（＋）Ａｄ−ＳＭＣを示し；右上のパネルはゲルフォーム足場（＋）Ａｄ−ＳＭＣ位相画像を示し；左下のパネルは免疫蛍光画像および位相画像の統合を示す（パネルの中の矢印はゲルフォーム中の空洞スペースを描写する）。
【図２５Ａ】種々の生体材料上での平滑筋細胞の接着／増殖を示す。
【図２５Ｂ】種々の生体材料上での平滑筋細胞の接着／増殖を示す。
【図２５Ｃ】種々の生体材料上での平滑筋細胞の接着／増殖を示す。
【図２６】種々の生体材料上に沈着された平滑筋細胞のための生／死アッセイの結果を示す
【図２７】Ａ〜Ｂは、培養培地中でのインキュベーション後の脂肪由来平滑筋細胞（Ａｄ−ＳＭＣ）を播種した足場を示す。Ｃ〜Ｅは、食道組織から、Ａｄ−ＳＭＣをあらかじめあらかじめ播種しなかった（Ｃ）足場およびＡｄ−ＳＭＣをあらかじめ播種した足場（Ｄ）までの上皮細胞の移動の程度を示す。Ｅは、食道組織を伴わない足場を示す。
【図２８】食道から得られた細胞の培養を示す。
【図２９】Ａは、食道組織および培養食道細胞における上皮細胞マーカーについての遺伝子発現を示す。Ｂは、培養食道細胞のサイトケラチン８、１８、１９免疫染色を示す。
【図３０】細胞移動を評価するための実験設計を示す。
【図３１】食道細胞の移動を示す。
【図３２】食道細胞の移動を示す。
【図３３Ａ】外科的に作製された食道欠陥および引き続く構築物移植を示す。
【図３３Ｂ】移植後１日目における移植された構築物の組織学を示す。
【図３４】移植の部位における血管新生（血管形成）を示す。
【図３５】移植後８日目における移植された構築物の組織学を示す。
【図３６】移植後８日目における移植された構築物の組織学を示す。
【図３７Ａ】移植後１０週目における食道構築物の取り込みを示す。
【図３７Ｂ】セクション１（横断）をより詳細に示す。
【図３７Ｃ】セクション２（横断）をより詳細に示す。
【図３７Ｄ】セクション３（横断）をより詳細に示す。
【図３８】編まれたメッシュに播種されたＡｄ−ＳＭＣを示す。
【図３９】Ａ〜Ｃは小腸（ＳＩ）構築物の移植を示す。
【図４０Ａ】図４０Ａ〜Ｃは、移植後８週目（Ａ）および１６週目（Ｂ〜Ｃ）におけるＳＩパッチ構築物を示す。
【図４０Ｂ】図４０Ａ〜Ｃは、移植後８週目（Ａ）および１６週目（Ｂ〜Ｃ）におけるＳＩパッチ構築物を示す。
【図４１】移植後１０週目におけるＳＩ管状構築物を示す。
【図４２】移植後５ヶ月目におけるＳＩ管状構築物を示す。
【図４３】足場上のラット脂肪由来のＳＭＣの生／死染色を示す。
【図４４】末梢血細胞の細胞形態学を示す。
【図４５】末梢血細胞に対する内皮マーカーについてのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図４６】脂肪由来細胞の細胞形態学を示す。
【図４７】脂肪由来細胞に対する内皮マーカーについてのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図４８】１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で培養された脂肪由来細胞の内皮細胞遺伝子発現分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、本明細書に記載される再構築、増強、または置き換えの対象である、器官または組織の構造とは異なる供給源から得られた細胞集団、そのような細胞を播種した新たな器官／組織構造足場またはマトリックス（構築物）およびそれらの構築物を作製する方法、ならびにそのような新たな器官／組織構造構築物を使用して、必要がある患者を治療する方法に関わる。
【００２１】
１．定義
別様に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒ  Ｌａｎｚａ，Ｒ  Ｌａｎｇｅｒ，＆  Ｊ  Ｖａｃａｎｔｉ），２００７は、本願において使用される用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供する。
【００２２】
当業者は、本発明の実務において使用できる、本明細書に記載されるものと同様のまたは等価な多くの方法および材料を認識している。実際に、本発明は、いかなる場合においても、記載されている方法および材料に限定されない。本発明の目的のために、次の用語が以下に定義される。
【００２３】
本明細書で使用されるような「平滑筋細胞」または「ＳＭＣ」という用語は、本明細書に記載される構築物および方法を使用して、再構築、増強、または置き換えの対象である自然の器官または組織と異なるかまたはそれと同じである供給源から得られる収縮性細胞をいう。本発明によって提供される平滑筋細胞は、一旦、本明細書に記載される足場またはマトリックス上に播種されかつその上で培養されると、中空器官（例えば、膀胱、腹腔、胃腸管など）の壁において見い出され、かつ収縮および弛緩する能力によって特徴付けられる無紋筋を形成することができる。当業者は、平滑筋細胞の他の属性を正しく理解するであろう。
【００２４】
本明細書で使用されるような「細胞集団」という用語は、適切な組織供給源、通常は哺乳動物から直接的に単離によって得られた多数の細胞をいう。単離された細胞集団は、引き続き、インビトロで培養されてもよい。当業者は、本発明における使用のために適切であり得る細胞集団を単離および培養するための様々な方法、ならびに細胞集団中の細胞の様々な数を十分理理解するであろう。細胞集団は、自系供給源または自系でない供給源から得ることができる。ＳＭＣ集団は、脂肪、血液、または膀胱から得ることができ、そして平滑筋細胞に付随するマーカーの発現によって特徴付けられてもよい。ＳＭＣ集団はまた、精製された細胞集団であってもよい。
【００２５】
本明細書で使用されるような「脂肪由来平滑筋細胞集団」または「Ａｄ−ＳＭＣ集団」という用語は、含脂肪細胞または非接着性脂肪細胞を実質的に含まない脂肪由来平滑筋細胞集団（ＳＭＣ）をいう。Ａｄ−ＳＭＣ集団は、平滑筋細胞に付随するマーカーの発現によって特徴付けられてもよい。Ａｄ−ＳＭＣ集団はまた、精製された細胞集団であってもよい。Ａｄ−ＳＭＣ集団は、自系供給源から得ることができる。Ａｄ−ＳＭＣは、血管組織を含有するＳＶＦから得ることができる。従って、Ａｄ−ＳＭＣは、脂肪由来の血管床の毛細血管、動脈、および小静脈から得ることができ、またはＳＭＣは、周皮細胞を含有する血管周囲の隙間から得ることができる。
【００２６】
「胃腸細胞集団」または「ＧＩ細胞集団」という用語は、非限定的に、食道、小腸、大腸、胃、結腸、または肛門括約筋組織が挙げられる胃腸組織から得られる細胞集団をいう。例えば、ＧＩ細胞集団は、食道組織から得られた異種細胞集団であってもよい。
【００２７】
「食道細胞集団」または「食道の細胞集団」という用語は、食道組織から得られる細胞集団をいう。これは、上皮細胞、平滑筋細胞、およびこれらの任意の組み合わせを含む異種細胞集団であってもよい。食道細胞集団は、食道生検からまたは全体の食道組織から得ることができる。あるいは、食道細胞集団は、食道組織生検または全体の食道組織から確立された細胞集団のインビトロ培養から得ることができる。食道細胞集団は、上皮細胞、平滑筋細胞、およびこれらの任意の組み合わせに付随するマーカーの発現によって特徴付けられる。食道細胞集団はまた、精製された細胞集団であってもよい。
【００２８】
「呼吸細胞集団」という用語は、呼吸組織（例えば、肺）から得られた異種細胞集団である細胞集団をいう。呼吸細胞集団は、細気管支細胞、上皮細胞、肺胞細胞、およびこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。呼吸細胞集団は、肺生検からまたは全体の肺組織から得ることができる。あるいは、呼吸細胞集団は、肺組織生検からまたは全体の肺組織から樹立された細胞集団のインビトロ培養から得ることができる。呼吸細胞集団は、細気管支細胞、上皮細胞、肺胞細胞、およびこれらの任意の組み合わせに付随するマーカーの発現によって特徴付けられてもよい。呼吸細胞集団はまた、精製された細胞集団であってもよい。
【００２９】
「自系」という用語は、同じ個体の身体から得られるかまたは移されることをいう。本明細書に記載される自系細胞集団は、自然の器官または組織構造の再生、再構築、増強または置き換えの必要がある対象から得られる。自系細胞集団は、本明細書に記載されるような構築物のレシピエントになるであろう対象から得られる。
【００３０】
「自系でない」という用語は、本明細書に記載されるような移植可能な構築物のレシピエントにならないであろうドナーから得られるかまたはそこから移されることをいう。このような自系でない供給源には、同種異系、同系（自己遺伝子系または同質遺伝子系）、およびこれらの任意の組み合わせである供給源が挙げられる。本明細書で使用されるように、非自系細胞集団は、本明細書に記載されるように、対象に対して自系でない供給源から得られた細胞集団である。
【００３１】
一般的に、「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、または糖脂質ベースの分子マーカーをいい、培養細胞集団中でのその発現または存在が、標準的な方法（または本明細書に開示される方法）によって検出でき、培養細胞集団中の１種以上の細胞が特定の細胞の型であることと一貫している。一般的に、細胞「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、典型的には自然の細胞によって発現される、本明細書に記載される細胞集団の中で発現される分子をいう。このマーカーは、細胞、または、遺伝子、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、もしくは自然の細胞によって発現されるポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）などの染色体上の同定可能な物理的位置によって発現されるポリペプチドであってもよい。このマーカーは、「遺伝子発現マーカー」と呼ばれる遺伝子、または既知のコーディング機能を有さないＤＮＡのあるセグメントの発現領域であってもよい。
【００３２】
一般的に、「平滑筋細胞マーカー」という用語は、培養細胞集団中でのその発現または存在が、標準的な方法（または本明細書に開示される方法）によって検出でき、かつ培養細胞集団中の１種以上の細胞が平滑筋細胞であることと一貫しているマーカーをいう。一般的に、平滑筋細胞（ＳＭＣ）「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、典型的には、自然の平滑筋細胞によって発現される分子をいう。本発明によって意図されるそのようなマーカーには、以下の１種以上が挙げられるがこれらに限定されない：ミオカルディン、アルファ−平滑筋アクチン、カルポニン、ミオシン重鎖、ＢＡＡＬＣ、デスミン、筋線維芽細胞抗原、ＳＭ２２、およびそれらの任意の組み合わせ。
【００３３】
一般的に、「呼吸細胞マーカー」という用語は、培養細胞集団中でのそのマーカーの発現または存在が、標準的な方法（または本明細書に開示される方法）によって検出でき、かつ培養細胞集団中の１種以上の細胞が呼吸細胞であることと一貫している、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、またはリン酸ベースの分子マーカーをいう。一般的に、呼吸細胞「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、典型的には、自然の呼吸細胞によって発現される分子をいう。このマーカーは、細胞、または、遺伝子、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、もしくは、ＳＭＣによって発現されるポリペプチドをコードする核酸などの染色体上の同定可能な物理的位置によって発現されるポリペプチドであってもよい。このマーカーは、「遺伝子発現マーカー」と呼ばれる遺伝子、または既知のコーディング機能を有さないＤＮＡのあるセグメントの発現領域であってもよい。本発明によって意図されるそのようなマーカーには、以下の１種以上が挙げられるがこれらに限定されない：Ｃｌａｒａ細胞分泌タンパク質（ＣＣＳＰ）；プロ界面活性剤タンパク質Ｃ（ＰＰＣ）；ＫＲＴ１８；セクレトグロビン、ファミリー１Ａ、メンバー１（ウテログロビンまたはＳＣＧＢ１Ａ１）；界面活性剤タンパク質Ａ１（ＳＦＴＰＡ１）；およびこれらの任意の組み合わせ。
【００３４】
一般的に、「胃腸細胞マーカー」という用語は、培養細胞集団中でのそのマーカーの発現または存在が、標準的な方法（または本明細書に開示される方法）によって検出でき、かつ培養細胞集団中の１種以上の細胞が胃腸細胞であることと一貫している、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、またはリン酸ベースの分子マーカーをいう。一般的に、胃腸細胞「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、典型的には、自然の胃腸細胞によって発現される分子をいう。このマーカーは、細胞、または、遺伝子、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、もしくは胃腸細胞によって発現されるポリペプチドをコードする核酸などの染色体上の同定可能な物理的位置によって発現されるポリペプチドであってもよい。このマーカーは、「遺伝子発現マーカー」と呼ばれる遺伝子、または既知のコーディング機能を有さないＤＮＡのあるセグメントの発現領域であってもよい。当業者は適切な胃腸細胞マーカーを正しく理解するであろう。
【００３５】
一般的に、「食道細胞マーカー」という用語は、培養細胞集団中でのそのマーカーの発現または存在が、標準的な方法（または本明細書に開示される方法）によって検出でき、かつ培養細胞集団中の１種以上の細胞が食道細胞であることと一貫している、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、またはリン酸ベースの分子マーカーをいう。一般的に、食道細胞「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、典型的には、自然の食道細胞によって発現される分子をいう。このマーカーは、細胞、または、遺伝子、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、もしくは食道細胞によって発現されるポリペプチドをコードする核酸などの染色体上の同定可能な物理的位置によって発現されるポリペプチドであってもよい。このマーカーは、「遺伝子発現マーカー」と呼ばれる遺伝子、または既知のコーディング機能を有さないＤＮＡのあるセグメントの発現領域であってもよい。そのようなマーカーは、非限定的に以下の１種以上が挙げられる食道平滑筋細胞マーカーであってもよい：ミオカルディン、アルファ−平滑筋アクチン、カルポニン、ミオシン重鎖、ＢＡＡＬＣ、デスミン、筋線維芽細胞抗原、ＳＭ２２、およびこれらの任意の組み合わせ。このようなマーカーは、非限定的に以下の１種以上が挙げられる食道上皮細胞マーカーであってもよい：ＫＲＴ８（ケラチン８）、ｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）、サイトケラチン８、１８、１９、およびこれらの任意の組み合わせ。
【００３６】
「脂肪由来平滑筋細胞マーカー」または「Ａｄ−ＳＭＣマーカー」という用語は、本明細書に記載される細胞集団の中で、遺伝子および／またはタンパク質レベルで発現されるマーカーをいう。観察されたタンパク質発現に基づいて、細胞集団は、細胞表面上のタンパク質発現について、マーカーが陽性（＋）または陰性（−）に割り当てられる、特定の細胞表面マーカープロフィールを有してもよい陽性陽性マーカーについては、タンパク質発現は、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％観察され得る。陰性マーカーについては、タンパク質発現は、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または約０％観察され得る。
【００３７】
交換可能に使用される「差次的に発現された遺伝子」、「差次遺伝子発現」という用語、およびこれらの同義語は、第１の細胞または細胞集団中での遺伝子の発現が、第２の細胞または細胞集団中での遺伝子の発現と比較して、より高いかまたはより低いレベルまで活性化される遺伝子をいう。これらの用語はまた、培養中の第１の細胞または第２の細胞の継代の間、遺伝子の発現が経時的に異なる段階でより高いかまたはより低いレベルまで活性化される遺伝子も含む。差次的に発現された遺伝子は、核酸レベルもしくはタンパク質レベルで活性化されるかもしくは阻害されるかのいずれかであってもよく、または選択的スプライシングに供されて異なるポリペプチド産物を生じてもよいこともまた理解される。このような違いは、例えば、ｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌、または他のポリペプチドの分配の変化によって証明され得る。差次的な遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物の間の発現の比較、または２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物の間の発現の比率の比較、またはさらに同じ遺伝子の２つの異なってプロセシングされた産物の比較を含んでもよく、これらは、第１の細胞と第２の細胞の間で異なる。差次的発現には、例えば、第１の細胞と第２の細胞の間で、遺伝子またはその発現産物における、定性的ならびに定量的の両方の、時間的なまたは細胞の発現パターンの違いが挙げられる。第１の細胞と第２の細胞において、または培養中の細胞の継代の間に時間に対して異なる段階で、所定の遺伝子の発現の間に、少なくとも約１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１４．５倍、または少なくとも約１５倍の違いが存在するときに、本発明の目的のために、「差次的遺伝子発現」が存在すると見なされる。マーカーの差次的発現は、間葉系幹細胞またはＭＳＣ（第２の細胞）における発現と比較した、脂肪由来の細胞（第１の細胞）におけるものであってもよい。
【００３８】
「阻害」、「下方調節」、「過小発現」、および「減少」という用語は交換可能に使用され、１つの遺伝子の発現、または１種以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは等価なＲＮＡ分子のレベル、または１種以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、例えば、１種以上の陽性対照および／または陰性対照などの１種以上の対照と比較して減少していることを意味する。発現不足は、ＭＳＣの発現と比較した脂肪由来細胞におけるものであってもよい。
【００３９】
「上方調節」または「過剰発現」という用語は、１つの遺伝子の発現、または１種以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは等価なＲＮＡ分子のレベル、または１種以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、例えば、１種以上の陽性対照および／または陰性対照などの１種以上の対照と比較して上昇していることを意味するために使用される。過剰発現は、ＭＳＣの発現と比較した脂肪由来細胞におけるものであってもよい。
【００４０】
「収縮機能」という用語は、スライドしているアクチンおよびミオシンフィラメントの相互作用を包含する平滑筋の収縮機能をいい、これはカルシウムによって活性化されるミオシンのリン酸化によって開始され、従って、収縮を細胞内カルシウムレベルに対して依存性にする。
【００４１】
「協調リズム収縮機能」または「ＣＲＣＦ」という用語は、周期的な収縮と弛緩のパターンによって特徴付けられる、細胞または細胞集団の収縮機能をいう。この協調リズム収縮は、例えば、本明細書に記載される培養条件下での構築物の維持後に、本明細書に記載される呼吸組織構築物中で観察され得る。
【００４２】
「接触依存性阻害」という用語は、２つ以上の細胞を互いに接触させるときの細胞増殖の停止をいう。この特性の非存在は、細胞の増殖が接触によって阻害されない細胞が互いの上端に積み重なって観察できる細胞培養中で観察でき、これは、形質転換細胞培養におけるフォーカス形成と類似している。間葉系幹細胞はこの特性を示さない。対照的に、接触依存性阻害特性を有する細胞は、培養中に互いの上端に積み重なって観察されることはない。
【００４３】
一般的に、「末梢血」という用語は、身体の全体を循環している血液を意味するものとする。
【００４４】
一般的に、「脂肪組織」または「脂肪」という用語は、主として脂肪細胞から成る疎性結合組織を意味するべきである。脂肪組織は、皮膚の下（皮下脂肪）および内臓の周り（内臓脂肪）が挙げられるがこれらに限定されない、身体の様々な場所から得ることができる。
【００４５】
一般的に、「管腔器官」または「組織構造」という用語は、外側、外部側および内側、管腔側によって特徴付けられる、器官またはその一部を指すものとする。器官または組織構造は、積層して組織化されてもよい。例えば、膀胱の壁は、重層して組織化された多数の層を含む。これは、移行上皮の粘膜から成る内層、弾性線維を有する結合組織から成る、粘膜を支持する粘膜下層と呼ばれる第２の層、および平滑筋から成る筋層と呼ばれる第３の層を有する。別の例において、自然の血管は多層または積層構造を有する。動脈は３つの層、すなわち管腔内表面を覆う血管内皮細胞を備える内膜と呼ばれる最も内側の層、平滑筋細胞の複数シートを備えた中膜と呼ばれる中間層、および疎性結合組織、小血管、および神経を含有する外膜と呼ばれる外側の層を有する。内膜および中膜は基底膜によって分けられている。当業者は、様々な管腔器官および組織構造を正しく理解するであろう。
【００４６】
「構築物」という用語は、１種以上の合成のまたは天然に存在する生体適合性材料から成る足場またはマトリックスの表面上にまたはその中に沈着された少なくとも１種の細胞集団をいう。この細胞集団は、インビトロまたはインビボで、足場またはマトリックスと合わせられてもよい。
【００４７】
「管腔器官構築物」または「管腔器官組織構造構築物」という用語は、１種以上の合成のまたは天然に存在する生体適合性材料から成る足場またはマトリックスの表面上にまたはその中に沈着された少なくとも１種の細胞集団をいう。１つの実施形態において、足場またはマトリックスは、対象の自然の管腔器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように形作られる。対象は、自然の管腔器官または組織構造の再構築、再生、増強、または置き換えを必要とし得る。この細胞集団は平滑筋細胞集団（例えば、脂肪由来のＳＭＣ集団または末梢血由来のＳＭＣ集団）であってもよい。この細胞集団は、インビトロまたはインビボでマトリックスまたは足場と合わせられてもよい。
【００４８】
「呼吸組織構築物」という用語は、足場および１種以上の細胞集団（例えば、脂肪由来のＳＭＣ集団および／または呼吸細胞集団）から成る構築物をいう。この構築物は、少なくとも１種の細胞集団の沈着後に培養されてもよく、第２の細胞集団の沈着後にさらに培養されてもよい。第２の細胞集団は、足場および／または沈着された第１の細胞集団と接触してもよい。
【００４９】
一般的に、「試料」または「患者試料」または「生物学的試料」という用語は、個体、体液、身体組織、細胞系統、組織培養、または他の供給源から得られた任意の生物学的試料を意味するものとする。この用語は、例えば、末梢血もしくは静脈血などの血液、尿および脂肪吸引物などの生物学的起源の他の液体試料などの体液、ならびに生検試料などの固形組織生検（例えば、脂肪組織生検）、またはそこから得られた組織培養もしくは細胞、およびその子孫を含む。この定義はまた、これらが供給源から得られた後で、任意の方法において、例えば、試薬を用いる処理、可溶化、またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドなどの特定の構成要素についての富化などによって操作された試料も含む。この定義はまた、臨床的試料も包含し、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的液体、および組織試料も含む。試料の供給源は、新鮮な、凍結した、および／または保存された器官もしくは組織試料または生検または吸引物などからの固形組織；血液または任意の血液構成成分；脳脊髄液、羊水、腹水、または間質液などの体液；対象の成長の任意の時点からの細胞であってもよい。生物学的試料は、天然には組織とともにまたは組織中では存在しない、保存剤、抗凝血剤、緩衝剤、固定剤、栄養剤、抗生物質などの化合物を含有してもよい。試料は、診断またはモニタリングアッセイのために使用できる。哺乳動物から試料を得るための方法は当該分野において周知である。「試料」という用語が単独で使用される場合、これは「試料」が「生物学的試料」または「患者試料」のことをなお意味するものとし、すなわち、これらの用語は、交換可能に使用される。試料はまた試験試料であってもよい。
【００５０】
「試験試料」という用語は、本明細書に記載される構築物の移植後の対象からの試料をいう。試験試料は、非限定的に、血液、血清、尿、精液、骨髄、粘膜、組織などを含む、哺乳動物対象における様々な供給源から生じてもよい。
【００５１】
「対照」または「対照試料」という用語は、試験試料中で陽性の結果と相関することを補助するために、陰性の結果が予測されている陰性対照をいう。あるいは、対照は、試験試料中で陰性の結果と相関することを補助するために、陽性の結果が予測されている陽性対照であり得る。本発明のために適切である対照には、非限定的に、正常レベルのサイトカインを有することが知られている試料、本明細書に記載される構築物を移植していないことが知られている哺乳動物対象から得られた試料、および正常であることが知られている哺乳動物対象から得られた試料が挙げられる。対照はまた、本明細書に記載される構築物の移植の前に対象から得られた試料であってもよい。加えて、対照は、試験試料中に含有される細胞と同じ起源を有する正常細胞を含有する試料であってもよい。当業者は、本発明における使用のために適切な他の対照を正しく理解するであろう。
【００５２】
「対象」という用語は、欠損した，損傷した、または非機能的な器官を含む、欠損した器官機能または不全の１つ以上の兆候、徴候、または他の指標を経験しているか、または経験した、治療が適格である患者を含む、任意の単独のヒト対象を意味するものとする。このような対象には、非限定的に、新たに診断され、または以前に診断され、今は再発もしくは逆戻りを経験している対象、または、原因に関わらず、欠損した器官機能もしくは不全のリスクがある対象が挙げられる。対象は、欠損した器官機能もしくは不全に付随する状態について以前に治療されていてもよく、またはそのように治療されていなくてもよい。
【００５３】
「患者」という用語は、治療が所望される任意の単独の動物、より好ましくは、哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、および非ヒト霊長類などの非ヒト動物が挙げられる）をいう。最も好ましくは、本発明における患者はヒトである。
【００５４】
「尿迂回路」または「導管」という用語は、長時間にわたる、移植された尿迂回路構築物、吻合された尿管、および任意に隣接するアトリウムとの対象の相互作用から生じる、得られた器官または組織構造をいう。アトリウムは、腹壁を通した尿の通過を可能にし、構築物（腹腔内に位置している）の尾部の末端を皮膚に接続する腹膜覆いの最も前方の管様部分によって作られてもよい、前方の接続室である。
【００５５】
「尾部の」および「頭部の」という用語は、尿の産生および流れに関連した説明的な用語である。「尾部の」という用語は、移植されると瘻孔に最も近い尿迂回路構築物の末端をいうのに対して、「頭部の」という用語は、移植されると腎臓および尿管に最も近い尿迂回路構築物の末端をいう。尾部末端はまた、移植された構築物の「瘻孔」または「流出」末端といわれてもよい。
【００５６】
「残骸」という用語は、尿迂回路構築物の移植後に起こる治癒および再生プロセスの間に形成される細片をいう。残骸は、剥離した組織細胞、炎症性滲出液、および足場生物分解から成り得る。このような細片によって導管が塞がれた場合（不適切な流出）、停滞した細片が導管の管腔内で残骸または半固体ボーラスを形成する。
【００５７】
「創面切除」という用語は、感染を予防するため、閉塞を予防するため、および治癒プロセスを促進するために、外来物質、または引き裂かれた、失活した、夾雑した、もしくは死滅した組織の、導管からの外科的または非外科的な除去をいう。創面切除は残骸の除去を包含してもよい。
【００５８】
「瘻孔」という用語は、尿迂回路構築物の排水用流出末端から身体の外側まで尿を通すために使用される、外科的に作製された開口をいう。尿は、典型的には、身体の外側のリザーバー中に収集される。
【００５９】
「瘻孔ポート」または「瘻孔ボタン」という用語は、瘻孔開口の完全性を維持するために使用されるデバイスなどの手段をいう。１つの実施形態において、瘻孔ポートは、尿迂回路構築物の排水用流出末端から対象の外側までの尿の通過を容易にする。別の実施形態において、瘻孔ポートの管腔は、ステントの移動を回避するため、および後でステントが取り外されることを可能にするために、片方または両方の尿管に配置されたステント（ステントラニヤード）に接続されている縫合糸を取り付けるために使用されてもよい。
【００６０】
本明細書で使用されるような「拡大する」または「拡張する」という用語は、既存の積層して組織化された管腔器官または組織構造のサイズを増加させることをいう。例えば、本発明の１つの態様において、既存の積層して組織化された管腔器官または組織構造は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９％拡大され得る。本発明の別の態様において、既存の積層して組織化された管腔器官または組織構造は、例えば、既存の積層して組織化された管腔器官または組織構造の既存の容積を増加させるために拡大されてもよい。
【００６１】
本明細書で使用されるような「容積」という用語は、規定された領域内に含有されることが可能な液体の量をいう。
【００６２】
一般的に、「再生予後」または「再生の予後」とは、本明細書に記載される構築物の移植の推定経過または結果の予想または予測をいう。本明細書で使用されるように、再生予後には、本明細書に記載される構築物の移植後の機能的な器官または組織構造の開発または改善の予想または予測が挙げられる。本明細書で使用されるように、「再生について予後的」は、新たな器官または組織構造の移植の推定経過または結果の予想または予測を提供することを意味する。
【００６３】
「再生された組織」とは、本明細書に記載されるような構築物の移植後に発達する新たな器官の組織または組織構造をいう。
【００６４】
２．細胞集団
本発明は、以下の１種以上の再構築、再生、増強、または置き換えにおける使用のための平滑筋細胞の集団を提供する：再構築、再生、増強、または置き換えの対象である器官または組織構造から平滑筋細胞が得られていない、積層して組織化された管腔器官または組織構造；呼吸組織から平滑筋細胞が得られていない呼吸組織；ＧＩ組織から平滑筋細胞が得られていない胃腸組織；自然の血管から平滑筋細胞が得られていない血管。ＳＭＣ集団は、収縮機能によって特徴付けられ、１種以上の平滑筋細胞マーカーについて陽性である。
【００６５】
本明細書に論じられるように、組織操作の原理が、典型的には、尿路上皮および平滑筋層から構成される、膀胱または膀胱の構成要素などの、積層して組織化された管腔器官および組織構造の再構築、増強、または置き換えにおける使用のための移植可能な細胞が播種されたマトリックスを提供するように首尾よく適用されている（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．５１，１２１７−１２２８（２００７）；Ｆｒｉｍｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．１，４２５−４３５（２００６）；Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｕｒｏｌ．Ｒｅｐ．１０，１１９−１２５（２００９）；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｕｒｏｌ．１８，５６４−５６９）。平滑筋細胞は、患者自身の組織または適切なドナーの組織から得ることができる。しかし、例えば、癌性膀胱組織の治療の間に、新しくかつ健常な操作された組織を発生させるための基本単位としての、主要な器官部位からの細胞培養系の発生および維持に対する依存性と関連する困難が存在している。明らかに、患者からの癌性細胞は、移植可能な新生膀胱足場またはマトリックスを集団化するためには不適切である。加えて、ドナーからの細胞の供給および生検をとることの容易さが限定要因であり得る。
【００６６】
本発明は、再構築、増強、または置き換えの対象である器官または組織構造とは異なる供給源から得られる細胞集団を提供する。１つの実施形態において、供給源は自系でない供給源である。自系でない供給源は、同種異系、同系（自己遺伝子系または同質遺伝子系）、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。別の実施形態において、供給源は自系供給源である。
【００６７】
別の態様において、細胞集団は、平滑筋細胞集団と一致するか、またはそれに典型的であるマーカーを発現する。
【００６８】
１つの態様において、供給源は末梢血である。１つの実施形態において、末梢血由来の平滑筋細胞集団は適切なドナーから得られる。ドナー試料は静脈血であってもよい。
【００６９】
１つの態様において、供給源は脂肪組織である。１つの実施形態において、脂肪組織由来の平滑筋細胞集団は適切なドナー試料から得られる。ドナー試料は、腹部形成手順または脂肪吸引の間に取り出された脂肪組織であってもよい。
【００７０】
さらに１つの他の実施形態において、本発明の単離された細胞集団は、培養されると、ヒルアンドバレー形態、１種以上の平滑筋細胞マーカーの発現、収縮機能、フィラメント形成、およびサイトカイン合成が挙げられるがこれらに限定されない様々な平滑筋細胞の特徴を発達させることができる。
【００７１】
１つの態様において、培養細胞集団は、そのヒルアンドバレー形態によって特徴付けられる。ヒルアンドバレー形態を有する細胞は、紡錘形状、継代の際の扁平状かつ線維芽細胞様、平行な横列中での伸長および配置、「回転」外観の増殖、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない様々な特徴を有し得る。１つの実施形態において、適切な培地中での培養の際の細胞集団は、培養平滑筋細胞に典型的である「ヒルアンドバレー形態」を発達させる。
【００７２】
別の態様において、培養細胞集団は、１種以上の平滑筋細胞マーカーの存在によって特徴付けられる。１つの実施形態において、適切な培地中で培養されると、以下の１種以上：ミオカルディン、アルファ−平滑筋アクチン、カルポニン、ミオシン重鎖、ＢＡＡＬＣ、デスミン、筋線維芽細胞抗原、ＳＭ２２、およびこれらの任意の組み合わせが非限定的に挙げられる検出可能な平滑筋細胞マーカーを発現させる。
【００７３】
別の態様において、培養細胞集団は、１種以上の細胞表面マーカーを発現する１種以上の細胞の存在によって特徴付けられる。１つの実施形態において、細胞集団は、適切な培地中で培養されると、以下の１種以上、およびこれらの任意の組み合わせが非限定的に挙げられる細胞表面マーカーについて陽性である１種以上の細胞を含有する：ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ３１、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ１１７。細胞表面マーカーについて陽性である細胞集団は、遺伝子発現のレベルおよび／またはタンパク質発現のレベルにおいて陽性であってもよい（実施例３を参照のこと）。例えば、細胞集団は、タンパク質レベルではないが遺伝子レベルでＣＤ７３発現を示し得るが、ＣＤ４５発現は、遺伝子およびタンパク質のレベルで示し得る。別の実施形態において、細胞集団は、適切な培地中で培養のすると、ＣＤ４５＋、ＣＤ３１＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ９０＋、およびＣＤ１０５＋である１種以上の細胞を含有する。別の実施形態において、細胞集団は、ＣＤ３１＋、ＣＤ７３−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１１７＋、ＣＤ１３３−である細胞表面マーカープロフィールを有する。細胞表面マーカープロフィールは、ＣＤ４５＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ５４＋、および／またはＣＤ５６＋の１種以上をさらに含んでもよい。
【００７４】
１つの他の態様において、培養細胞集団は、収縮機能を有する１種以上の細胞の存在によって特徴付けられる。１つの実施形態において、細胞集団は、適切な培地中で培養されると、収縮機能を発現する。別の実施形態において、収縮機能はカルシウム依存性である。１つの他の実施形態において、カルシウム依存性収縮機能は、カルシウムキレート剤を用いる収縮の阻害によって実証される。別の実施形態において、カルシウムキレート剤はＥＤＴＡである。当業者は、当該分野において公知である他のキレート剤が適切であり得ることを正しく理解するであろう。
【００７５】
なお別の態様において、培養細胞集団はフィラメント形成によって特徴付けられる。１つの実施形態において、細胞集団は、適切な培地中で培養されると、フィラメント形成を受ける。
【００７６】
１つの態様において、細胞集団は１種以上のサイトカインを発現する少なくとも１種の細胞を含む。１つの実施形態において、サイトカインは、ＭＣＰ−１、オンコスタチンＭ、ＩＬ−８、およびＧＲＯからなる群より選択される。
【００７７】
１つの態様において、本発明の細胞集団は、単離後に培養における有限の寿命を有する。他の実施形態において、細胞集団は、約１継代、約２継代、約３継代、約４継代、約５継代、約６継代、約７継代、約８継代、約９継代、約１０継代、約１１継代、約１２継代、約１３継代、約１４継代、約１５継代、約１６継代、約１７継代、または約１８継代の寿命を有する。好ましい実施形態において、細胞集団は５継代を超えない培養における寿命を有する。一般的に、脂肪由来のＳＭＣは継代の間に３〜５日間培養でき、一般的に、血液由来のＳＭＣは第１回目の継代後１４日間培養でき、次いで、さらなる継代のために３〜５日間培養できる（より詳細には実施例１を参照のこと）。
【００７８】
１つの態様において、本発明は、本明細書に記載されるような足場またはマトリックスに沈着され、必要がある対象に移植されたときに、少なくとも１種の再生細胞を含有する再生細胞集団を提供し、本発明で意図される再構築、増強、または置き換えの対象である器官または組織構造のために再生効果を提供する。再生細胞集団は、必要がある患者へ移植されると、積層して組織化された管腔器官または組織構造の再生を刺激または開始する能力を有する。一般的に、器官または組織構造の再生は、細胞の構成要素の回復、組織の組織化および構築、機能、および調節性発生によって特徴付けられる。加えて、再生細胞集団は、細胞が播種された管腔器官または組織構造構築物の移植部位において起こる傾向がある不完全性または障害を最小化する。移植の部位における組織崩壊は、コラーゲン沈着の増加および／または瘢痕組織形成として現れ得、その各々が再生細胞集団の使用を通して最小化できる。加えて、特定の細胞事象は再生プロセスを示している。本明細書に記載される細胞集団および足場を使用する再生した膀胱または膀胱の一部の場合において、再生している器官または組織構造は、管腔表面に向かって伸びる多数の微小血管の周りに放射状となっている線維性血管性組織を伴う平滑筋実質、ならびに粘膜表面に整列された十分に発達した血管を有する間質成分から構成される（Ｊａｙｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ３，６７１−６８２を参照のこと）。再生している膀胱または膀胱の一部はまた、紡錘様／間葉細胞およびαＳＭＡ陽性筋肉前駆細胞の存在によって特徴付けられる。１つの実施形態において、αＳＭＡ陽性紡錘様細胞が、新たな間質組織中および複数の新たな血管（細動脈）の周囲で観察される。
【００７９】
再生細胞集団は、非限定的に、胃腸器官または組織構造、例えば、食道、小腸、大腸、胃、結腸、または肛門括約筋；呼吸器官または組織構造、例えば、肺、肺胞および細気管支組織を含む肺組織；および血管が挙げられる、様々な器官または組織構造の再生を刺激または開始する能力を有する。１つの実施形態において、再生細胞は脂肪由来の平滑筋細胞であり、これは、細胞の構成要素、組織の組織化および構造、ならびに／または器官もしくは組織構造の機能の回復を促進する。別の実施形態において、再生細胞は幹細胞ではない。
【００８０】
別の態様において、再生細胞集団は、回復された積層して組織化された管腔器官または組織構造のサイズの適応的調節によって特徴付けられる再生効果を提供する。１つの実施形態において、再生細胞集団の再生効果は、再生細胞集団が播種された足場またはマトリックスを受容する対象に特異的な適応的調節の確立である。１つの実施形態において、適応的調節は、新たな膀胱が成長し、対象の身体サイズと釣り合っているサイズまで発達するような、本明細書に記載される構築物を使用する、対象における膀胱の置き換えまたは増強である。
【００８１】
１つの実施形態において、再生刺激が可能である細胞集団はＭＣＰ−１産生細胞集団であり、これは、ケモカイン産物ＭＣＰ−１を発現する少なくとも１種の細胞を含有する。サイトカインＭＣＰ−１は膀胱排尿筋細胞の正常産物である。大動脈平滑筋細胞において、これは再生において役割を果たし、単核細胞を動員するその能力が周知である。しかし、これはケモカイン以上のものであり；これはまた、血管平滑筋細胞増殖のための強力なマイトジェンでもあり、血管損傷の領域に対して循環している単球を動員する。単球は、典型的には、サイトカインおよび成長因子のためのリザーバーとして働くことができるマクロファージに転換される。マクロファージと筋肉前駆細胞は、両方とも、ＭＣＰ−１シグナル伝達のための標的である。このサイトカインは、身体内での幹細胞および前駆細胞の動員に関連付けられており、再生プロセスに強力に寄与する可能性がある。１つの実施形態において、再生刺激が可能である細胞集団はＭＣＰ−１を産生する細胞集団であり、これは、ケモカイン産物ＭＣＰ−１を発現する少なくとも１個の細胞を含有する。ＭＣＰ−１再生刺激は、移植の部位への特定の細胞型の動員によって特徴付けられる。１つの実施形態において、ＭＣＰ−１は、新たな膀胱の中で増殖するために、移植の部位に筋肉前駆細胞を動員する。別の実施形態において、ＭＣＰ−１は移植の部位に単球を動員し、これは、次々に、様々なサイトカインおよび／またはケモカインを産生して、再生プロセスを容易にする。１つの他の実施形態において、ＭＣＰ−１は大網細胞を誘導して、筋肉細胞に発達させる。
【００８２】
１つの態様において、本発明は、組織再生のための代理マーカーとして、ＭＣＰ−１などの特定のサイトカインの使用を提供する。このようなマーカーは、機能が再構築されたか否かに基づいて、再生の評価と併せて使用できる。再生の時間経過にわたって代理マーカーをモニターすることもまた、再生の予後指標としても役立ち得る。
【００８３】
別の実施形態において、細胞集団は精製された細胞集団である。本明細書に記載されるような精製された細胞集団は、１つ以上の形態に基づく表現型、マーカーの発現、および機能によって特徴付けられる。この表現型には、ヒルアンドバレー形態、１種以上の平滑筋細胞マーカーの発現、サイトカインの発現、培養における有限の増殖寿命、収縮機能、およびフィラメント形成を誘導する能力の１つ以上が非限定的に挙げられる。この表現型は、本明細書に記載されるかまたは当業者に公知である他の特徴を含んでもよい。別の実施形態において、精製された集団は、本明細書に記載されるような平滑筋細胞集団について実質的に均質である。典型的には、実質的に均質である精製された集団は、形態、マーカーの発現、および機能の１つ以上によって判断されるように、少なくとも９０％均質である。他の実施形態において、精製された集団は、少なくとも約９５％均質、少なくとも約９８％均質、または少なくとも約９９．５％均質である。
【００８４】
別の実施形態において、平滑筋細胞集団はヒト脂肪組織から直接得られ、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）におけるその発現のレベルと比較して、以下の１つ以上の差次的発現によって特徴付けられる：オステオポンチン、Ｏｃｔ４Ｂ、成長分化因子５（ＧＤＦ５）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、メラノーマ細胞接着分子（ＭＣＡＭ）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）、ＰＥＣＡＭ、ｖＷＦ、Ｆｌｋ−１、ｒｕｎｔ関連転写因子２（ＲＵＮＸ２）、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）、ＣＤ４４、およびＩＬ−１Ｂ。１つの他の実施形態において、ＳＭＣ集団は、ヒト骨髄由来のＭＳＣにおけるその発現レベルと比較して、（ａ）ＧＤＦ５、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＭＣＡＭ、ＲＵＮＸ２、ＶＣＡＭ１、ＰＥＣＡＭ、ｖＷＦ、およびＦｌｋ−１の１種以上を過小発現し、ならびに／または（ｂ）Ｏｃｔ４Ｂ、オステオポンチン、ＢＭＰ６、ＣＤ４４、およびＩＬ−１Ｂの１種以上を過剰発現する。１つの他の実施形態において、ＳＭＣ集団は、ヒト骨髄由来のＭＳＣにおけるその発現レベルと比較して、（ａ）ＧＤＦ５、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＭＣＡＭ、ＲＵＮＸ２、ＶＣＡＭ１、ＰＥＣＡＭ、ｖＷＦ、およびＦｌｋ−１のすべてを過小発現し、ならびに／または（ｂ）Ｏｃｔ４Ｂ、オステオポンチン、ＢＭＰ６、ＣＤ４４、およびＩＬ−１Ｂのすべてを過剰発現する。
【００８５】
別の実施形態において、脂肪組織から直接得られる平滑筋細胞集団は、ＣＤ４５＋である１種以上の細胞および／またはＣＤ１１７＋である１種以上の細胞を備える。
【００８６】
他の実施形態において、本発明は、ヒト骨髄由来のＭＳＣよりも短い増殖寿命を有するヒト脂肪組織から直接得られた平滑筋細胞集団を提供する。別の実施形態において、ＳＭＣ集団は培養中での接触依存性の増殖阻害を示す。１つの他の実施形態において、脂肪組織から直接得られたＳＭＣ集団は、トロンボキサンＡ２模倣物に応答した少なくとも１種の平滑筋細胞（ＳＭＣ）マーカーの下方調節によって特徴付けられる。他の実施形態において、ＳＭＣマーカーは、ミオカルディンおよびミオシン重鎖−平滑筋アイソフォーム（ＳＭＭＨＣ）からなる群より選択される。別の実施形態において、ミオカルディンおよびＳＭＭＨＣは、トロンボキサンＡ２模倣物に対して応答して下方調節される。
【００８７】
すべての実施形態において、ＳＭＣ集団は、自系供給源または自系でない供給源から得られる。
【００８８】
別の実施形態において、本発明の細胞集団は、移植によるなどの足場の使用なしで、障害を有する対象に投与されてもよい。当業者は、移植の適切な方法を正しく理解するであろう。
【００８９】
本発明は、再生、再構築，増強、または置き換えの対象である管腔器官または組織構造とは異なる供給源から単離された平滑筋細胞集団を提供する。管腔器官または組織構造は、膀胱または膀胱の一部；呼吸器官または組織構造、胃腸器官または組織構造、血管器官または組織構造、例えば、血管または眼の組織構造であってもよい。従って、平滑筋細胞集団は、膀胱でない、呼吸器官でない、胃腸でない、血管でない、または眼でない供給源から得ることができる。
【００９０】
本発明はまた、食道から得られた食道細胞集団などのＧＩ組織細胞集団も提供する。食道供給源は自系供給源であってもよい。１つの実施形態において、細胞集団は異種細胞集団である。別の実施形態において、異種細胞集団には、上皮細胞および／または平滑筋細胞が挙げられる。別の実施形態において、食道細胞集団は、１種以上のバイオマーカーの存在によって特徴付けられる。別の実施形態において、細胞集団は、非限定的に、以下の１種以上、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる検出可能な上皮細胞マーカーを有する：ＫＲＴ８（ケラチン８）、ｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）、サイトケラチン８、１８、１９。１つの実施形態において、細胞集団は、非限定的に、以下の１種以上、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる検出可能な平滑筋細胞マーカーを有する：ミオカルディン、アルファ−平滑筋アクチン、カルポニン、ミオシン重鎖、ＢＡＡＬＣ、デスミン、筋線維芽細胞抗原、ＳＭ２２。
【００９１】
本発明はまた、肺（例えば、全体の肺または肺生検）から得られた細胞集団などの呼吸組織細胞集団も提供する。供給源は、自系供給源であってもよく、または自系でない供給源であってもよい。１つの実施形態において、細胞集団は異種細胞集団である。別の実施形態において、異種細胞集団には、細気管支細胞、上皮細胞、肺胞細胞、Ｃｌａｒａ細胞、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられてもよい。呼吸細胞集団は、細気管支細胞、上皮細胞、肺胞細胞、およびこれらの任意の組み合わせに付随するマーカーの発現によって特徴付けられてもよい。これらのマーカーには以下の１種以上が挙げられる：Ｃｌａｒａ細胞分泌タンパク質（ＣＣＳＰ）、Ｐｒｏ界面活性剤タンパク質Ｃ（ｐｒｏＳＰＣ）、界面活性剤タンパク質Ｃ（ＳＰＣ）、ＫＲＴ１８、セクレトグロブリン、ファミリー１Ａ、メンバー１（ユーテログロブリン）（ＳＣＧＢ１Ａ１）、および界面活性剤タンパク質Ａ１（ＳＦＴＰＡ１）（実施例６〜９を参照のこと）。ＣＣＳＰは細気管支上皮細胞についてのマーカーであり、ｐｒｏＳＰＣは肺胞上皮細胞についてのマーカーである。ＫＲＴ１８は肺特異的サイトケラチンでありかつ上皮マーカーである。ＳＣＧＢ１Ａ１（セクレトグロビン、ファミリー１Ａ、メンバー１（ウテログロビン））はＣｌａｒａ細胞マーカーである。ＳＦＴＰＡ１肺胞上皮マーカーである。呼吸細胞集団はまた、精製された細胞集団であってもよい。
【００９２】
本発明はまた、内皮細胞（ＥＣ）集団も提供する。このようなＥＣ集団は、血管の再構築、増強、または置き換えにおいて使用されてもよい。現在のところ、細胞集団は、血管移植片を構築するために静脈または動脈から直接的に得られている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ：Ｍａｒｃｈ  ２００９−Ｖｏｌｕｍｅ  ６２−Ｉｓｓｕｅ  ３−ｐｐ  ２９７−３０３）。内皮細胞は大動脈から得られてもよい（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｉｓ，Ｃ−００６）。しかし、細胞集団を単離するための適切な血管セグメントの利用可能性、血管から細胞を得る際の困難さ、および生検あたりに得られる細胞の数は限定要因である。細胞がより豊富であり、より多くの数で得ることがより容易である身体の他の領域から細胞集団を得ることが有利であろう。本発明は、血管でない供給源から得られる細胞集団を提供する。供給源は自系であってもよいし、または自系でなくてもよい。細胞集団は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）集団または内皮細胞（ＥＣ）集団であってもよい。血管でない供給源は脂肪組織または末梢血であってもよい。ＳＭＣ集団は患者試料から得ることができる。患者試料は脂肪組織または静脈血であってもよい。１つの実施形態において、血管でない供給源は、腹部形成手順または脂肪吸引の間に取り出された脂肪組織であってもよい。本発明は、血管でない供給源から得られた内皮細胞（ＥＣ）集団の使用を意図し、この供給源は、ＥＣ集団と一貫しているかまたはそれに典型的である遺伝子の発現によって特徴付けられる。ＥＣ集団は、以下の１種以上：ＣＤＨ５／ＶＥＣＡＤ、ｖＷＦ、ＰＥＣＡＭ１、ＦＬＴ１／ＶＥＧＦＲ、ＫＤＲ／ＦＬＫ１、ＴＥＫ、およびこれらの任意の組み合わせの差次的な発現によって特徴付けられてもよい。差次的に発現された遺伝子はＥＣマーカーであってもよい。別の実施形態において、細胞集団は、適切な培地中で培養されると、以下の１種以上、およびこれらの任意の組み合わせが非限定的に挙げられる検出可能なＥＣマーカーを発現する：ＣＤＨ５／ＶＥＣＡＤ、ｖＷＦ、ＰＥＣＡＭ１、ＦＬＴ１／ＶＥＧＦＲ、ＫＤＲ／ＦＬＫ１、ＴＥＫ。１つの態様において、培養ＥＣ集団は、内皮形態によって特徴付けられる。細胞は、短縮形状、円形形状、および立方形状を呈する。実施例１７はＥＣ集団をより詳細に説明している。
【００９３】
１つの他の態様において、本発明は、平滑筋細胞が自系でない供給源から得られた、積層して組織化された管腔器官または組織構造の再構築、再生、増強、または置き換えにおける使用のための膀胱組織から得られた平滑筋細胞集団に関わる。自系でない供給源は同種異系または同系であってもよい。
【００９４】
３．細胞集団を単離する方法
自系細胞集団は、治療の必要がある対象から直接得られる。自系でない細胞集団は、適切なドナーから得ることができる。一般的には、供給源組織は、治療の必要がある器官または組織構造と同じではない。細胞の集団は、例えば、脂肪または末梢血からなどの患者自身の組織またはドナー組織から得ることができる。細胞は生検において単離されてもよい。加えて、細胞は、使用前に凍結または拡大されてもよい。
【００９５】
細胞が播種された足場の構築を準備するために、平滑筋細胞を含有する適切なドナーから得られた試料が、適切な細胞懸濁液中に解離される。細胞の単離および培養のための方法は、発行された米国特許第５，５６７，６１２号（その全体が参照により組み込まれる）において論じられた。単一の細胞懸濁液は、インビトロ培養の一定の期間後、例えば、１週間後に到達され得るので、単一細胞段階への細胞の解離は最初の一次培養のためには必須ではない。組織解離は、細胞外マトリックスおよび細胞を一緒に保持している細胞間結合の機械的および酵素的撹乱によって実施されてもよい。自系でない細胞は、所望される場合、足場上に播種するために利用可能である細胞の数を増加するために、インビトロで培養できる。
【００９６】
細胞は遺伝物質を播種する前にトランスフェクトされてもよい。平滑筋細胞は、ポリマー播種の前に特定の遺伝子でトランスフェクトでき得る。細胞−ポリマー構築物は、宿主または組織操作された新たな器官の長期生存のために要求される遺伝情報を運ぶことができる。
【００９７】
細胞培養は、細胞分画ステップを伴って、または伴わずに調製されてもよい。細胞分画は、当業者に公知である技術を使用して実施することができる。細胞分画は、細胞のサイズ、ＤＮＡ含量、細胞表面抗原、および生存度に基づいて実施することができる。例えば、平滑筋細胞は脂肪組織から富化され得、内皮細胞および脂肪細胞は平滑筋細胞の収集のために減少され得る。細胞分画が使用されてもよいが、本明細書の実施のために必要ではない。
【００９８】
本明細書に記載される方法における別の任意の手順は極低温保存である。極低温の保存は、例えば、複数の侵襲性外科手順のための必要性を減少させるために有用であり得る。生検から採られた細胞または対象からの試料は増幅され得、増幅された細胞の一部が使用されてもよく、別の一部が極低温で保存されてもよい。細胞を増幅および保存する能力は、要求される外科的手順の数を最小化し得る。凍結的保存の有用性の別の例は組織バンクにおいてである。自系でない細胞は、例えば、ドナー組織バンクの中で保存されてもよい。細胞は新たな器官または組織構造のために必要とされるので、極低温の細胞の供給は必要に応じて使用されてもよい。適切なドナーが最初に特定され得、１つ以上の生検が極低温で保存されてもよい。後で、レシピエントの器官または組織構造が何らかの処理様式後に失敗する場合、極低温で保存された自系でない細胞が、処理のために融解されかつ使用されてもよい。例えば、処置後に対象における新たな器官または組織構造中で癌が再出現した場合、極低温で保存された細胞が、ドナーからのさらなる生検の必要性を伴うことなく、器官または組織構造の再構築のために使用され得る。
【００９９】
平滑筋細胞は、一般的なプロトコールに従うことに基づいて、脂肪または末梢血から単離されてもよい。適切な重量（例えば、グラムで）および／または面積（例えば、ｃｍ２）の脂肪生検試料を入手することができる。適切な量の末梢血（例えば、ｍＬ）を、新たな器官または組織構造構築物の計画された移植の前に入手することができる。
【０１００】
以下は、内皮細胞および平滑筋細胞、ならびにＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（ＩＳＣＴ）判断基準（Ｄｏｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ８：４，３１５−３１７）によって定義されるようなＭＳＣ様である細胞を含む複数の細胞型から構成される異種細胞集団を表す、脂肪の間質性血管画分（ＳＶＦ）からの平滑筋細胞の単離のために適切なプロトコールの代表例である。適切なグラム重量の脂肪組織（例えば、７〜２５ｇ）が生検によって得られ、ＰＢＳで洗浄され（例えば、３回）、外科用メスおよびはさみで刻まれ、５０ｍＬの円錐管に移され、そしてＤＭＥＭ−ＨＧ中のコラゲナーゼ（例えば、０．１〜０．３％）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）および１％ＢＳＡの溶液の中にて３７℃で６０分間インキュベートされることができる。これらの管は、消化を容易にするために、継続的に振動されるか、または周期的に振盪されるかのいずれかであってもよい。ＳＶＦは、６００ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化でき、ＤＭＥＭ−ＨＧ＋１０％ＦＢＳ中に再懸濁できる。次いで、間質−血管画分が継代ゼロを播種するために使用されてもよい。
【０１０１】
以下は、末梢血からの平滑筋細胞の単離のために適切なプロトコールの代表例である。適切な量の末梢血（例えば、２５ｍＬ）が、ＰＢＳ中で１：１希釈され、５０ｍＬ円錐管中の２５ｍＬ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ）で重層されてもよい。遠心分離後（例えば、８００ｇ、３０分間）、単核画分が収集でき、ＰＢＳで１回洗浄され、そして継代ゼロを播種するためにα−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁できる。
【０１０２】
別の態様において、本発明は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）が自系でない供給源から得られる、積層して組織化された管腔器官または組織構造の再構築、再生、増強、または置き換えにおける使用のために膀胱組織から平滑筋細胞集団を単離するための方法に関わる。自系でない供給源は同種異系または同系であってもよい。当業者は、膀胱組織からＳＭＣを単離するためのプロトコールを正しく理解するであろう。例えば、例示的なプロトコールは、Ｂｅｒｔｒａｍらの米国特許第７，９１８，８９７号；Ａｔａｌａ  米国特許第６，５７６，０１９号；Ｋｉｍ  ＢＳ  ａｎｄ  Ａｔａｌａ  Ａ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａ  Ａｔａｌａ  ａｎｄ  ＲＰ  Ｌａｎｚａ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００２；ｐｐ  ２８７−２９２；およびＬａｉ  ＪＹ  ａｎｄ  Ａｔａｌａ  Ａ：Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：ｕｒｏｔｈｅｌｉｕｍ．Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａ  Ａｔａｌａ  ａｎｄ  ＲＰ  Ｌａｎｚａ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００２；ｐｐ  ２４３−２４６において見い出すことができ、これらの各々はその全体が参照により組み込まれる。
【０１０３】
当業者は、平滑筋細胞の単離のためのさらなる方法を正しく理解するであろう。
【０１０４】
別の態様において、本発明は、食道細胞集団を単離する方法を提供する。以下は、食道組織からの食道細胞の単離のために適切なプロトコールの代表例である。食道組織が得られ、ＤＭＥＭ＋５ｕｇ／ｍＬゲンタマイシン（洗浄溶液）中に配置され、そして５分間、頻繁に旋回される。その後、組織は新鮮な洗浄溶液に配置される。このプロセスは１〜５回反復され、その後、均一なサイズまで組織は刻まれる。次いで、刻まれた組織は、消化溶液（ＤＭＥＭ中３００Ｕ／ｍＬ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＴｙｐｅＩＶ−Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ／Ｄｉｓｐａｓｅ−Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ；２０ｍＬ／１ｇ組織）を含有する５０ｍＬ遠心管に配置される。消化は３７℃で３０分間続行する。酵素中和は、ＫＳＦＭ培地中の２０％ＦＢＳを使用して達成される。次いで、消化された組織が混合され、大きな組織フラグメントが持ち越されていないことを保証するために、１００μＭ  Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルターを通してろ過される。次いで、この材料は３００ｇで５分間遠心分離され、細胞をペレット化する。次いで、この細胞ペレットはＫＳＦＭで洗浄される。次いで、細胞は計数され、増殖培地（ＫＳＦＭ＋２％ＦＢＳまたはＫＧＭ（５０：５０の補充物を伴うＫＳＦＭ＋１Ｘ  Ａｎｔｉ／Ａｎｔｉ、１Ｘ  ＩＴＳを含有するＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ）中に配置される（実施例１２を参照のこと）。
【０１０５】
別の態様において、本発明は、呼吸細胞集団を単離する方法を提供する。実施例６は、肺組織からの呼吸細胞の単離のために適切なプロトコールの代表例を提供する。当業者は、平滑筋、食道、呼吸、および胃腸の細胞集団の単離のためのさらなる方法を正しく理解するであろう。
【０１０６】
１つの態様において、本発明は、平滑筋細胞への分化を誘導する条件の必要なしで、ＳＶＦから単離された平滑筋細胞集団を単離するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ａ）脂肪組織を入手すること、ｂ）脂肪組織を消化すること、ｃ）消化された脂肪組織を遠心分離して間質性血管画分（ＳＶＦ）を提供すること、ｄ）平滑筋細胞への分化を誘導する条件の必要なしでＳＶＦを培養すること、およびｅ）脂肪組織由来のＳＶＦから平滑筋細胞集団を単離することを備える。１つの実施形態において、培養ステップは、ＳＶＦを洗浄すること、細胞培養培地中でＳＶＦを再懸濁すること、および再懸濁されたＳＶＦをプレーティングすることを備える。別の実施形態において、培養ステップは、プレートまたは容器などの細胞培養支持体に対して接着性である細胞集団を提供することを備える。別の実施形態において、この方法はさらに、培養された細胞集団を拡大することを備える。他の実施形態において、この方法はさらに、平滑筋細胞の特徴について、平滑筋細胞集団を分析することを備える。１つの実施形態において、脂肪組織は自系でない供給源から得られる。
【０１０７】
１つの実施形態において、培養条件は、脂肪組織ＳＶＦ由来の細胞集団から平滑筋細胞への分化を誘導するために細胞培養成分の使用を必要としない。Ｊａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３０（２００９）３５２９−３２７０は、ＳＶＦから得られた分化していない脂肪幹細胞が、幹細胞を平滑筋細胞に分化させるために、６週間の間、ヘパリンを含有する誘導培地中でインキュベートされたことを報告している（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ．米国特許第７，５３１，３５５号もまた参照のこと）。Ｊａｃｋらによって報告されている幹細胞は、このインキュベーション期間の間では、分割することを必要としなかった。別の実施形態において、培養条件は、ヘパリンを含有する誘導培地を含む誘導性培地の使用を必要としない。１つの他の実施形態において、本明細書の方法は、細胞集団を平滑筋細胞に分化させるためまたは細胞集団を培養および拡大するために、外因性成長因子の使用を必要としない培養条件の使用を備える。
【０１０８】
他の報告されている方法を超えた、本発明の方法の利点には、脂肪由来の幹細胞を平滑筋細胞に分化させるステップの除外が含まれ、このことは、脂肪生検を入手することと、そこから平滑筋細胞集団を単離することの間の時間を減少する。加えて、外因性成長因子などの、分化を誘導するための他の細胞培養培地成分の必要性の除外は、コストの点から有利である。
【０１０９】
１つの他の態様において、本発明は、収縮機能を有しかつ１種以上の平滑筋細胞マーカーについて陽性である少なくとも１種の細胞を含有する平滑筋細胞の集団を単離する方法および培養する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、適切なドナーから試料を入手するステップを含み、ここで、この試料は、再構築、増強、または置き換えの必要がある対象において、再構築、増強、または置き換えの標的である管腔器官または組織構造からは得られない。別の実施形態において、この方法は、ドナー試料から平滑筋細胞を得るステップを含む。１つの他の実施形態において、管腔器官または組織構造は膀胱または膀胱の一部である。１つの実施形態において、試料は自系でない試料である。別の実施形態において、試料は末梢血試料である。なお別の実施形態において、試料は脂肪組織試料である。この脂肪組織は、腹部形成手順の結果として対象から取り出された組織であってもよい。
【０１１０】
別の実施形態において、入手するステップに分離ステップが続く。末梢血試料の場合において、分離ステップは、試料を密度勾配物質と接触させること、試料を遠心分離して単核画分を有する密度勾配の境界を定めること、および密度勾配から単核画分を抽出することを含む。抽出された画分からの細胞が培養される培養ステップが分離ステップに続いてもよい。
【０１１１】
脂肪組織試料の場合において、精製ステップは、コラゲナーゼを用いる試料の消化、消化された試料を遠心分離すること、遠心分離された試料を混合して、一次脂肪細胞から間質性細胞を分離すること、混合された試料を遠心分離して、引き続く培養のために再懸濁できる間質性−血管画分を入手することを含む。
【０１１２】
１つの態様において、本発明は、分化誘導性細胞培養培地の使用なしで単離された平滑筋細胞（ＳＭＣ）集団を提供する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ａ）脂肪組織生検を入手するステップ、ｂ）脂肪組織を酵素的に消化するステップ、ｃ）消化された脂肪組織を遠心分離して、異種集団の細胞を含有する間質性血管画分（ＳＶＦ）を提供するステップ、ｄ）異種集団の細胞を洗浄およびプレーティングするステップ、ｅ）平滑筋細胞分化誘導性培地の使用なしで細胞の集団を培養するステップ、ｆ）培養細胞から完全に分化されたＳＭＣ集団を単離するステップを含む。
【０１１３】
１つの他の実施形態において、培養ステップｅ）は、細胞培養支持体に接着性である細胞について選択することを含む。別の実施形態において、培養ステップｅ）は、外因性成長因子を含有する細胞培養培地の使用を含まない。１つの実施形態において、培養方法は、当業者に公知である標準的な条件によって、最少必須培地（例えば、ＤＭＥＭまたは−ＭＥＭ）およびウシ胎仔血清（例えば、１０％ＦＢＳ）を含有する細胞培養培地の使用を含む。別の実施形態において、平滑筋細胞集団は脂肪由来の幹細胞集団ではない。１つの他の実施形態において、平滑筋細胞集団は間葉系幹細胞集団ではない。
【０１１４】
１つの他の態様において、本発明は、内皮細胞の集団を単離する方法および培養する方法を提供する。ＥＣ集団は、短縮形状、円形形状、または立方形状の内皮様形態を呈する細胞の存在によって特徴付けられる。ＥＣ集団は、１種以上の内皮細胞マーカーについて陽性である細胞を含有する。１つの実施形態において、この方法は、血管の再構築、増強、または置き換えの必要がある患者から試料を入手するステップを含み、ここで、試料は血管でない供給源から入手される。別の実施形態において、内皮細胞は患者から入手される試料から得られる。１つの実施形態において、試料は患者に対して自系または自系でない。別の実施形態において、試料は末梢血試料である。なお別の実施形態において、試料は脂肪組織試料である。脂肪組織は、腹部形成手順の結果として対象から取り出された組織であってもよい。
【０１１５】
別の実施形態において、分離ステップが入手するステップに続く。末梢血試料の場合において、分離ステップは、試料を密度勾配物質と接触させること、試料を遠心分離して単一の単離されたバンドの細胞を産生する密度勾配の境界を定めること、ならびに密度勾配から単離された細胞のバンドを抽出および洗浄することを含む。抽出された画分からの細胞が培養される培養ステップが分離ステップに続いてもよい。脂肪組織試料の場合において、精製ステップは、コラゲナーゼを用いる試料の消化、消化された試料を遠心分離すること、一次脂肪細胞から間質性細胞を分離するための遠心分離された試料の混合、引き続く培養のために再懸濁できる間質性−血管画分を入手するために、混合された試料を遠心分離することを含む。
【０１１６】
１つの態様において、本発明は、単離された内皮細胞（ＥＣ）集団を提供する方法を提供する。内皮細胞は、末梢血および脂肪供給源から首尾よく単離されている（Ｄａｉｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１１：９２６−９３１；Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０：Ｅ１１２４−Ｅ１１３２；ｍｅｌｅｒｏ−Ｍａｒｔｉｎ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｂｌｏｏｄ  １０９（１１）：４７６１−４７６８；Ｋｅｒｎ  ｅｔ．ａｌ．，１９８３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：１８２２−１８２９；Ｐｌａｎａｔ−ｂｅｎａｒｄ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０９：６５６−６６３）。
【０１１７】
１つの実施形態において、本発明は、血管でない供給源からＥＣを単離する方法を提供する。血管供給源は末梢血であってもよく、実施例１７はＥＣを入手するための例示的なプロトコールを提供する。血管でない供給源は脂肪組織であってもよく、この場合、この方法は、以下のステップの１つ以上を含む：ａ）脂肪組織生検を入手するステップ、ｂ）脂肪組織を酵素的に消化するステップ、ｃ）消化された脂肪組織を遠心分離して、異種集団の細胞を含有する間質性血管画分（ＳＶＦ）を提供するステップ、ｄ）異種集団の細胞を洗浄およびプレーティングするステップ、ｅ）細胞培養培地中でＶＥＧＦとともに細胞の集団を培養するステップ、ｆ）培養細胞からＥＣ集団を単離するステップ。１つの他の実施形態において、培養ステップｅ）は、細胞培養支持体に接着性である細胞について選択することを含む。以下の実施例１７は、脂肪組織からＥＣを単離する例示的な方法についての付加情報を提供する。
【０１１８】
１つの実施形態において、培養方法は、当業者に公知である標準的な条件によって、最少必須培地（例えば、ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ、またはＥＧＭ−２（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））およびウシ胎仔血清（例えば、１０％ＦＢＳ）を含有する細胞培養培地の使用を含む。別の実施形態において、内皮細胞集団は脂肪由来の幹細胞集団ではない。１つの他の実施形態において、内皮細胞集団は間葉系幹細胞集団ではない。実施例１７は、ＥＣ集団を入手する例示的なプロトコールを説明する。
【０１１９】
４．足場
Ａｔａｌａ米国特許第６，５７６，０１９号（その全体が参照により組み込まれる）において記載されているように、足場またはポリマーマトリックスは、様々な異なる材料から構成されてもよい。一般的には、生体適合性材料、およびとりわけ、生物分解性材料が、本明細書に記載される足場の構築のための好ましい材料である。足場は、少なくとも２つの別々の表面を有する、移植可能であり、生体適合性であり、合成または天然のポリマーマトリックスである。足場は、治療の必要がある管腔器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように形作られる。生体適合性材料は生物分解性である。
【０１２０】
生体適合性とは、生物学的機能に対して毒性または傷害性の効果を有さない材料をいう。生物分解性とは、患者の身体において吸収または分解できる材料をいう。生物分解性材料の例には、例えば、吸収可能な縫合糸が挙げられる。足場を形成するための代表的な材料には、制御された速度で加水分解によって分解され、再吸収される、天然または合成のポリマー、例えば、コラーゲン、ポリ（アルファヒドロキシエステル）、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリオルトエステル、およびポリ無水物、ならびにこれらのコポリマーなどが挙げられる。これらの材料は、分解可能性、管理可能性、サイズ、および構成の最大制御を提供する。好ましい生物分解性ポリマー材料には、吸収可能な合成縫合材料として開発された、ポリグリコール酸およびポリグラクチンが挙げられる。ポリグリコール酸およびポリグラクチン繊維は、製造業者によって供給されたままで使用されてもよい。他の足場材料には、セルロースエーテル、セルロース、セルロース誘導体エステル、フッ素化ポリエチレン、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンズオキサゾール、ポリカーボネート、ポリシアノアリールエーテル、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレンスルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、ポリビニリデンフルオリド、再生セルロース、シリコーン、尿素−ホルムアルデヒド、またはこれらの材料のコポリマーまたは物理的ブレンドが挙げられる。この材料は、適切な抗微生物剤で含浸されてもよく、可視性を改善するため、および外科的手順において補助するために着色添加剤によって着色されてもよい。
【０１２１】
生物分解性である他の足場材料には、ＭＯＮＯＣＲＹＬ（商標）（グリコリドおよびイプシロン−カプロラクトンのコポリマー）、ＶＩＣＲＹＬ（商標）またはＰｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ  ９１０（Ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ３７０およびステアリン酸カルシウムでコートされたラクチドおよびグリコリドのコポリマー）、およびＰＡＮＡＣＲＹＬ（商標）（カプロラクトンおよびグリコリドのポリマーでコートされたラクチドおよびグリコリドのコポリマー）（Ｃｒａｉｇ  Ｐ．Ｈ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｊ．Ａ．，Ｄａｖｉｓ  Ｋ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．：Ａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ  ９１０  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｓｕｔｕｒｅｓ．Ｓｕｒｇ．１４１；１０１０，（１９７５））などのＥｔｈｉｃｏｎ  Ｃｏ．（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｃｏ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ．）によって製造された合成縫合材料、ならびにポリグリコール酸が挙げられる。これらの材料は、製造業者によって供給されたままで使用できる。
【０１２２】
なお別の実施形態において、マトリックスまたは足場は、天然の細胞除去された器官の一部を使用して作製できる。生体構造、または器官の一部は、器官から全体の細胞および組織の内容物を取り除くことによって細胞除去できる。細胞除去プロセスは、一連の連続する抽出を備える。この抽出プロセスの１つの鍵となる特色は、生体構造の複雑なインフラストラクチャーを妨害または破壊する可能性がある過酷な抽出が回避されることである。第１のステップは、細胞細片の除去および細胞膜の可溶化を包含する。これに、核細胞質成分および核成分の可溶化が続く。
【０１２３】
好ましくは、生体構造，例えば、器官の一部は、穏やかな機械的破壊方法を使用して、細胞膜、および器官の一部を取り囲む細胞細片を取り除くことによって細胞除去される。穏やかな機械的破壊方法は、細胞膜を破壊するために十分でなければならない。しかし、細胞除去のプロセスは、生体構造の複雑なインフラストラクチャーの損害または妨害を回避するべきである。穏やかな機械的破壊方法は、適切な量の液体、例えば、蒸留水の中で、器官部分の表面をこすり取ること、器官部分をかき混ぜること、または器官を攪拌することが挙げられる。１つの好ましい実施形態において、穏やかな機械的破壊方法には、細胞膜が破壊され、細胞細片が器官から取り除かれるまで、適切な量の蒸留水中で器官部分を攪拌することが挙げられる。
【０１２４】
細胞膜が取り除かれた後、生体構造の核および細胞質の成分が取り除かれる。これは、インフラストラクチャーを撹乱することなく、細胞および核の成分を可溶化することによって実施できる。核の成分を可溶化するために、非イオン性洗剤または界面活性剤が使用されてもよい。非イオン性洗剤または界面活性剤の例には、Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．から入手可能であり、多くの販売業者から市販されているＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−７０５、およびＴｒｉｔｏｎ  ＤＦ−１６が挙げられるＴｒｉｔｏｎシリーズ；モノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、モノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ４０）、モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）などのＴｗｅｅｎシリーズ、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ．３５）、ポリオキシエチレンエーテルＷ−１（Ｐｏｌｙｏｘ）など、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸、ＣＨＡＰＳ、サポニン、ｎ−デシル−Ｄ−グルコプラノシド、ｎ−ヘプチル−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−Ｄ−グルコピラノシド、およびＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２５】
当業者は、前述の分類に属する化合物および販売業者の説明が商業的に得られてもよく、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ」，ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ，Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，１９８６，Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＭＣ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．ａｎｄ  Ｊｕｄｉｔｈ  Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒ．，Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｃｅｌａｎｅｓｅ  Ｃｏｒｐ．，１９８７において見い出されてもよいことを正しく理解している。１つの好ましい実施形態において、非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎシリーズ、好ましくは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１２６】
非イオン性洗剤の濃度は、細胞除去される生体構造の型に依存して変更されてもよい。例えば、繊細な組織、例えば、血管については、洗剤の濃度は減少されるべきである。非イオン性洗剤の好ましい濃度範囲は、約０．００１〜約２．０％（ｗ／ｖ）であり得る。より好ましくは、約０．０５〜約１．０％（ｗ／ｖ）である。さらにより好ましくは、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約０．８％（ｗ／ｖ）である。これらの好ましい濃度範囲のうち、約０．００１〜約０．２％（ｗ／ｖ）が好ましく、約０．０５〜約０．１％（ｗ／ｖ）が特に好ましい。
【０１２７】
高密度の細胞質フィラメントネットワーク、細胞間複合体、および先端微小細胞構造を含む細胞骨格成分は、水酸化アンモニウムなどのアルカリ溶液を使用して可溶化されてもよい。アンモニウム塩またはそれらの誘導体からなる他のアルカリ溶液もまた、細胞骨格成分を可溶化するために使用されてもよい。他の適切なアンモニウム溶液の例には、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、および水酸化アンモニウムが挙げられる。好ましい実施形態において、水酸化アンモニウムが使用される。
【０１２８】
アルカリ溶液、例えば、水酸化アンモニウムの濃度は、細胞除去される生体構造の型に依存して変更されてもよい。例えば、繊細な組織、例えば、血管については、洗剤の濃度は減少されるべきである。好ましい濃度範囲は、約０．００１〜約２．０％（ｗ／ｖ）であり得る。より好ましくは、約０．００５〜約０．１％（ｗ／ｖ）である。さらにより好ましくは、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．０８％（ｗ／ｖ）である。
【０１２９】
細胞除去された、凍結乾燥された構造は、使用のために必要とされるまで適切な温度で保存されてもよい。使用の前に、細胞除去された構造は、適切な等張緩衝液または細胞培養培地中で平衡化できる。適切な緩衝液には、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋバランス塩溶液などが挙げられるがこれらに限定されない。適切な細胞培養培地には、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ培地、ＭｃＣｏｙ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３０】
使用されてもよいなお他の生体適合性材料には、ステンレス鋼、チタン、シリコーン、金、およびシラスティックが挙げられる。
【０１３１】
ポリマーマトリックスまたは足場は強化できる。例えば、強化材料が、合成のマトリックスもしくは足場の形成の間に加えられてもよく、または移植の前に天然または合成のマトリックスに結合されてもよい。強化を形成するための代表的な材料には、例えば、コラーゲン、ポリ（アルファヒドロキシエステル）、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリオルトエステルおよびポリ無水物、ならびにこれらのコポリマーなどの天然または合成のポリマーが挙げられ、これらは、制御された速度で加水分解によって分解され、再吸収される。これらの材料は、最大制御の分解可能性、管理可能性、サイズ、および配置を提供する。
【０１３２】
生物分解性ポリマーは、Ｉｎｓｔｒｏｎテスターを使用する引っ張り強度、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるポリマー分子量について、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によるガラス転移温度、および赤外（ＩＲ）スペクトル測定による結合構造などの機械的特性に関して特徴付けることができ；毒物学に関しては、Ａｍｅｓアッセイおよびインビトロ催奇形性アッセイを包含する初期スクリーニング試験、ならびに免疫原性、炎症、放出、および分解研究のための動物における移植研究によって特徴付けることができる。インビトロ細胞接着および生存度は、走査型電子顕微鏡、組織学、および放射性同位元素を用いる定量的試験を使用して評価できる。
【０１３３】
生物分解性材料はまた、患者の中に移植されたときに、その材料が分解するために必要な時間の長さに関して特徴付けられてもよい。例えば、厚みおよびメッシュサイズなどで構築物を変化させることによって、生物分解性材料は、約２年間から約２ヶ月の間、好ましくは、約１８ヶ月から約４ヶ月の間、最も好ましくは、約１５ヶ月から約８ヶ月の間、そして最も好ましくは約１２ヶ月から約１０ヶ月の間、実質的に生物分解可能であり得る。１つの他の実施形態において、足場は、約１ヶ月以内、約２ヶ月以内、約３ヶ月以内、約４ヶ月以内、約５ヶ月以内、約６ヶ月以内、約７ヶ月以内、約８ヶ月以内、約９ヶ月以内、約１０ヶ月以内、約１１ヶ月以内、または約１２ヶ月以内が非限定的に挙げられる、より短い時間フレームの中で分解するように構築されてもよい。必要な場合、生物分解性材料は、約３年以内、または約４年以内、または約５年間以上以内では実質的に分解されないように構築されてもよい。本明細書に記載されるコーティングの使用もまた、分解の速度を調節するために使用されてもよい。例えば、コーティングを有するマトリックスまたは足場は、例えば、ポリ−ラクチド−コ−グリコリドコポリマーが、コーティングを有さないマトリックスまたは足場よりもゆっくりと分解し得る。
【０１３４】
ポリマーマトリックスまたは足場は、上記に記載されるように制御された細孔構造で製造されてもよい。細孔のサイズは、細胞分布を決定するために使用されてもよい。例えば、ポリマーマトリックスまたは足場上の細孔は、１つの表面から反対の表面まで細胞が移動することを可能にするために大きくてもよい。あるいは、ポリマーマトリックスまたは足場の２つの側面の間の液体の連通が存在するが、細胞は通過することができないように、細孔は小さくてもよい。この目的を達成するための適切な細孔径は、直径約０．０４ミクロン〜約１０ミクロン、好ましくは、直径約０．４ミクロン〜約４ミクロンの間であってもよい。ある実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場の表面は、細孔への細胞集団の接着および移動を可能にするために十分に大きい細孔を備えてもよい。細孔径は、ポリマーマトリックスまたは足場の一方の側から反対側まで細胞が移動することを防ぐために、ポリマーマトリックスまたは足場の内部において減少されてもよい。細孔径が減少しているポリマーマトリックスまたは足場の１つの実施形態は、２つの大きな細孔材料の間にサンドイッチされた小さな細孔材料の積層構造である。ポリカーボネートメンブレンは、これらが、例えば、約０．０１ミクロン、約０．０５ミクロン、約０．１ミクロン、約０．２ミクロン、約０．４５ミクロン、約０．６ミクロン、約１．０ミクロン、約２．０ミクロン、および約４．０ミクロンなどの非常に制御された細孔径で製造できるので、とりわけ適切である。ミクロン以下のレベルにおいて、ポリマーマトリックスまたは足場は、細菌、ウイルス、および他の微生物に対して不浸透性であってもよい。
【０１３５】
数ある中でも、以下の特徴または判断基準が、各々別個のマトリックスまたはその一部の設計において考慮に入れられる：（ｉ）形状、（ｉｉ）強度、（ｉｉｉ）剛性および硬直性、ならびに（ｉｖ）縫合性（マトリックスまたはその一部が、容易に縫合されるかまたはさもなくば隣接する組織に結合される程度）。本明細書において使用されるように、所定のマトリックスまたは足場の剛性は、足場を変形させるように働く単位面積あたりの応力と、それから生じる変形の量の間の比率を表現する計数である、弾性率によって定義される（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａｎｄｒｅａｓ  Ｆ．ｖｏｎ  Ｒｅｃｕｍ，（１９９９）；Ｒａｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと）。足場の硬直性は、所定の足場によって呈される柔軟さ（またはその欠如）の程度をいう。
【０１３６】
これらの判断基準の各々は、それが意図される医学的徴候および生理学的機能に取り組むために、マトリックスまたはその一部が最も良好に配置されかつ変更されることを可能にするように、（数ある中でも、材料の選択および製造プロセスを通して）変化できる変数である。例えば、膀胱の置き換え、再構築、および／または増強のためのマトリックスまたは足場を備える材料は、尿の量の変動に適合するために十分に対応しながら、破れることなく縫合部を支持するために十分に強くなければならない。
【０１３７】
任意に、マトリックスまたは足場は、その生物分解後に、尿路カテーテルが漏出点を残すことなく新たな器官または組織構造から取り外された間に、得られる再構築された膀胱が、空のときに天然の膀胱と同様の様式で折り畳み可能であり、かつ尿管が妨害されないように形作られるべきである。生物操作された膀胱構築物は、１つの要素として製造でき、または各部分が個別に製造でき、またはセクションの組み合わせが特定の部品として製造できる。各特定のマトリックスまたは足場部品は、特定の機能を有するように製造されてもよい。さもなくば、特定の部品が、製造の容易さのために製造されてもよい。特定の部品は特定の材料から構築されてもよく、特定の特性を送達するように設計されてもよい。特定の部品特性には、自然の組織（例えば、尿管）の０．５〜１．５ＭＰａ２と同様の引張強度、および３０〜１００％の最終伸長が挙げられてもよく、または引張強度は０．５〜２８ＭＰａ２の範囲であってもよく、最終伸長は１０〜２００％の範囲であってもよく、そして圧縮強度は＜１２であってもよい。
【０１３８】
ポリマーマトリックスまたは足場は、三次元（３Ｄ）形状を有していてもよい。３Ｄ形状は、管状、半管状、または半円筒状形状であってもよい。３Ｄ形状は凹形形状であってもよい。ポリマーマトリックスまたは足場は平面形状を有していてもよい。平面形状のポリマーマトリックスまたは足場は、より高い柔軟性を可能にするために前処理された領域を有していてもよい。特定の実施形態において、前処理された領域は、折り目が付けられるようにその領域中でコートされる。１つの実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は、腹腔鏡管および／またはポートを通して、巻かれ、折り畳まれ、またはさもなくば移植のための形状となるように、十分に可鍛性である。このような実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は、巻かれず、折り畳まれず、またはさもなくば腹腔鏡管および／またはポートを通しての挿入後の形状に戻るように、十分に可鍛性である。当業者は、他の形状の足場が本発明における使用のために適切であり得ることを正しく理解するであろう。
【０１３９】
円形、ホタテ貝形、平板状、星形状、単独のまたは他の繊維と絡み合ったものであってもよい繊維から形成されたメッシュ様構造が好ましい。分岐状繊維の使用は、その性質が、体積の増加に比例して表面積が増加する問題を解決するために使用されてきたのと同じ原理に基づいている。すべての多細胞生物は、この反復する分岐構造を利用している。分岐系は、器官間の連絡ネットワーク、ならびに個々の器官の機能的単位を表す。この構成を細胞に播種および移植することは、大量の細胞の移植を可能にし、その各々は、宿主の環境に曝露されており、新血管形成が達成されながら、栄養素および廃棄物の自由な交換を提供する。ポリマーマトリックスまたは足場は、所望の最終的な型、構造、および機能に依存して、柔軟または強固に作られてもよい。
【０１４０】
１つの好ましい実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は、平均繊維直径１５μｍのポリグリコール酸で形成され、かつ４−０ポリグラクチン９１０縫合糸を使用して膀胱形状の型に構成される。得られる構造は、非限定的に、コートされたマトリックスまたは足場の分解を遅延させること、適正な機械的特性を達成すること、およびその形状を設定することが挙げられる特定の利点を提供するために、例えば、ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド５０：５０、８０ｍｇ／ｍＬ塩化メチレンなどの液化コポリマーでコートされる。１つの実施形態において、足場は、足場の繊維間の結合部に定着または蓄積するように提供されるコーティングを備える。
【０１４１】
さらなる実施形態において、本発明の足場は、生体適合性かつ生物分解性の形状設定材料でコートされる。１つの実施形態において、形状設定材料は、ポリ−ラクチド−コ−グリコリドコポリマーを含有する。別の実施形態において、形状設定材料は液化されている。他の実施形態において、ポリ−ラクチド−コ−グリコリドは、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、ＤＬ−ラクチド、およびＤ−ラクチドとＬ−ラクチドの両方からなる群より得られたラクチド部分を備える。別の実施形態において、ポリ−ラクチド−コ−グリコリドは、Ｌ−ラクチド（ポリ−Ｌ−ラクチド−コ−グリコリドを形成するため）、Ｄ−ラクチド（ポリ−Ｄ−ラクチド−コ−グリコリドを形成するため）、またはＤＬ−ラクチドもしくはＤ−ラクチドとＬ−ラクチドの両方（ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリドを形成するため）からなる群より得られたラクチド部分を備える。コーティングは、塩化メチレンｍＬあたり、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、または約８０ｍｇのポリ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）５０：５０であり得る。１つの好ましい実施形態において、ＰＬＧＡ５０：５０は、約４２．５ｍｇ／ｍＬ塩化メチレンであってもよい。１つの例示的なプロトコールにおいて、ＰＬＧＡは、溶媒、例えば、塩化メチレン中で溶解され、液体溶液としてコーティングを形成し、これは足場に適用される。
【０１４２】
別の実施形態において、コーティングは、マトリックスまたは足場の約４０％ｗ／ｗ〜約６０％ｗ／ｗ、約４１％ｗ／ｗ〜約５９％ｗ／ｗ、約４２％ｗ／ｗ〜約５８％ｗ／ｗ、約４３％ｗ／ｗ〜約５７％ｗ／ｗ、約４４％ｗ／ｗ〜約５６％ｗ／ｗ、約４５％ｗ／ｗ〜約５５％ｗ／ｗ、約４６％ｗ／ｗ〜約５４％ｗ／ｗ、約４７％ｗ／ｗ〜約５３％ｗ／ｗ、約４８％ｗ／ｗ〜約５２％ｗ／ｗ、または約４９％ｗ／ｗ〜約５１％ｗ／ｗで提供される。他の実施形態において、コーティングは、マトリックスまたは足場の約４０％ｗ／ｗ、約４１％ｗ／ｗ、約４２％ｗ／ｗ、約４３％ｗ／ｗ、約４４％ｗ／ｗ、約４５％ｗ／ｗ、約４６％ｗ／ｗ、約４７％ｗ／ｗ、約４８％ｗ／ｗ、約４９％ｗ／ｗ、約５０％ｗ／ｗ、約５１％ｗ／ｗ、約５２％ｗ／ｗ、約５３％ｗ／ｗ、約５４％ｗ／ｗ、約５５％ｗ／ｗ、約５６％ｗ／ｗ、約５７％ｗ／ｗ、約５８％ｗ／ｗ、約５９％ｗ／ｗ、または約６０％ｗ／ｗで提供される。
【０１４３】
１つの他の態様において、本発明の足場は、例えば、移植後に新たな組織の再生を提供するために、移植の前に（ポリマーマトリックスまたは足場が細胞で播種される前および後に）添加物または薬物で処理されてもよい。従って、例えば、成長因子、サイトカイン、細胞外マトリックスまたは足場成分、および他の生体活性材料は、移植片治療および新たな組織の再生を促進するために、ポリマーマトリックスまたは足場に加えることができる。一般的には、このような付加物は、適切な新たな組織が移植された器官または組織の中で形成されることを確実にするために、再構築され、置き換えられ、または増強される組織または器官に従って選択される（例えば、骨治癒を促進する際の使用のためのこのような付加物の例としては、例えば、Ｋｉｒｋｅｒ−Ｈｅａｄ，Ｃ．Ａ．Ｖｅｔ．Ｓｕｒｇ．２４（５）：４０８−１９（１９９５））を参照のこと）。例えば、（任意に、内皮細胞が播種された）ポリマーマトリックスが血管組織を増強するために使用されるとき、新たな血管組織の再生を促進するために、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（例えば、米国特許第５，６５４，２７３号を参照のこと）が利用できる。成長因子および他の付加物（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮様成長因子（ＨＢＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、サイトカイン、遺伝子、タンパク質など）は、加えられた細胞が利用されるならば、ポリマーマトリックス上に播種された細胞によって産生される可能性がある任意の量のこのような成長因子（もしあれば）を、過剰量で加えることができる。このような付加物は、（例えば、移植片への宿主細胞の浸潤を引き起こしまたは加速することによって）再構築され、置き換えられ、または増強されるべき組織または器官に適切な型の新たな組織の再生を促進するために十分な量で好ましく提供される。他の有用な付加物には、抗生物質などの抗微生物剤が挙げられる。
【０１４４】
１つの好ましい支持マトリックスまたは足場は、一旦細胞支持体が移植されると短い距離を横断した栄養素の拡散によって細胞生存を可能にできる交差フィラメントから構成される。細胞支持マトリックスまたは足場は、移植後の細胞塊の拡大と協調して血管新生化するようになる。
【０１４５】
移植前のインビトロでの三次元構造構築物の構築はインビボでの移植後の再生事象を容易にし得、マトリックスに向けた炎症性応答のリスクを最小化し得、従って、移植片の拘縮および収縮を回避する。
【０１４６】
ポリマーマトリックスまたは足場は、使用前に任意の公知の方法を使用して滅菌されてもよい。使用される方法は、ポリマーマトリックスにおいて使用される材料に依存する。滅菌方法の例には、蒸気、乾熱、放射線、エチレンオキサイドなどのガス、ガスおよび沸騰が挙げられる。
【０１４７】
足場を作る合成材料は、例えば、溶媒キャスティング、圧縮成形、フィラメントドローイング、メッシング、浸出、製織、およびコーティングなどの方法を使用して形作られてもよい。溶媒キャスティングにおいて、塩化メチレンなどの適切な溶媒中の１種以上のポリマーの溶液が、分岐パターンリリーフ構造として成形される。溶媒蒸発後、薄層が得られる。圧縮成形において、ポリマーは、平方インチあたり３０，０００ポンドまでの圧力を適切なパターンに加圧される。フィラメントドローイングは溶解したポリマーからのドローイングを包含し、メッシングは、繊維を加圧することによりメッシュをフェルト様材料に形成することを包含する。浸出において、２種の材料を含有する溶液が、構築物の最終形態に近い形状まで広げられる。次に、溶媒が、成分の１つを溶解して除くために使用され、細孔形成を生じる（参照により組み込まれるＭｉｋｏｓ，米国特許第５，５１４，３７８号を参照のこと）。核形成において、足場の形状である薄膜が、放射状に傷ついた材料のトラックを作製する放射性核分裂生成物に曝露される。次に、ポリカーボネートシートが酸または塩基でエッチング処理され、放射線で損傷された材料のトラックを細孔に変える。最後に、均一な細孔径を有する構造を形成するために、レーザーが使用されて、多くの材料を通して個々の穴を形作りかつ入手してもよい。コーティングとは、例えば、液化コポリマー（ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド５０：５０  ８０ｍｇ／ｍＬ塩化メチレン）などの材料でポリマー構造をコーティングまたは浸透させ、その機械的特性を変化させることをいう。コーティングは、所望の機械的特性が達成されるまで、１層または複数層で実施されてもよい。これらの形状技術は組み合わせて利用されてもよく、例えば、ポリマーマトリックスまたは足場は、一緒に織られ、圧縮成形され、そして接着されてもよい。さらに、異なるプロセスによって形作られた異なるポリマー材料が一緒につなげられ、複合形状を形成してもよい。複合形状は積層構造であってもよい。例えば、ポリマーマトリックスまたは足場は、１種以上のポリマーマトリックスに結合されて、多層ポリマーマトリックスまたは足場構造を形成してもよい。この結合は、液体ポリマーを用いて接着することによって、または縫合によって実施されてもよい。加えて、ポリマーマトリックスまたは足場は、固体ブロックとして形成されてもよく、レーザーまたは他の標準的な機械加工技術によってその所望の最終形に形作られてよい。レーザー成形とは、レーザーを使用して材料を除去するプロセスをいう。
【０１４８】
好ましい実施形態において、足場は、不織布ポリグリコール酸（ＰＧＡ）フェルトおよびポリ（乳酸−コ−グリコール酸）ポリマー（ＰＬＧＡ）から形作られる。
【０１４９】
Ｂｅｒｔｒａｍらの米国公開出願２００７０２７６５０７（その全体が参照により組み込まれる）に記載されているように、本発明のポリマーマトリックスまたは足場は、任意の数の全体の系、形状、または空間の制約を満足するように、任意の数の所望の配置に形作られてもよい。マトリックスは、積層して組織化された管腔器官または組織構造の寸法および形状に適合するように形作られた三次元マトリックスであってもよい。例えば、膀胱再構築のためのポリマーマトリックスの使用において、膀胱の全体または一部の寸法および形状に適合するように形作られた三次元マトリックスが使用されてもよい。生来、ポリマーマトリックスは、様々なサイズの患者の膀胱に適合するように、様々なサイズおよび形状で形作られてもよい。任意に、ポリマーマトリックスは、その生物分解後に、得られる再構築された膀胱は、空のときには天然の膀胱と同様の様式で折り畳み可能であり得るように、形作られるべきである。ポリマーマトリックスはまた、患者の特別な必要性に順応するように他の様式で形作られてもよい。例えば、以前に傷害を有したか、または障害がある患者は、異なる腹腔を有する可能性があり、膀胱置き換え足場、膀胱増強足場、膀胱導管足場、および排尿筋と等価な足場を適応させることを要求する可能性がある。１つの態様において、本発明は、本明細書に記載される平滑筋細胞集団を用いる使用のために適切なさらなる足場を意図する。例えば、眼への移植のために適切な足場が提供されてもよい。
【０１５０】
Ａ．増強足場または置き換え足場
１つの他の態様において、ポリマーマトリックスまたは足場は、膀胱の一部に適合するように形作られる。１つの実施形態において、形作られたマトリックスは、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の既存のレシピエントの膀胱を置き換えるように適合される。１つの他の態様において、ポリマーマトリックスまたは足場は、１００％、すなわち全膀胱に適合するように形作られる。
【０１５１】
１つの実施形態において、ポリマーマトリックスは、少なくとも２つの別々の表面を有する、第１の移植可能な、生体適合性の、合成のまたは天然のポリマーマトリックスまたは足場、および少なくとも２つの別々の表面を有する、第２の移植可能な、生体適合性の、合成のまたは天然のポリマーマトリックスまたは足場を備え、これらは、互いに対して結合するように適応され、結合されたときに、治療の必要がある管腔器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように形作られる。第１のおよび第２のポリマーマトリックスは、２つ以上の区別できる部品に細分された１つの統合ユニットから、または結合するように適応された２つ以上の区別できる部品から形成されてもよい。ある実施形態において、一旦結合された第１および第２のポリマーマトリックスは、管腔器官または組織構造の再構築、増強、または置き換えのために使用されてもよい。
【０１５２】
ある実施形態において、第１および第２のポリマーマトリックスは対称的であるが、他の実施形態においては、第１および第２のポリマーマトリックスは非対称的である。１つの実施形態において、第１のポリマーマトリックスまたは足場は、密閉され、ドーム状の末端、および開いた赤道面境界を伴う半球状または準半球状の形状を有し、第２のポリマーマトリックスまたは足場は、第１のポリマーマトリックスの赤道面境界と結合するように適応されたカラーである。別の実施形態において、第１および第２のポリマーマトリックスは、各々、密閉され、ドーム状の末端、および開いた赤道面境界を伴う半球状または準半球状の形状である。なお別の実施形態において、第１および第２のポリマーマトリックスは、各々、環状または半環状の基部、および各基部から放射状に伸びる少なくとも２つのペタルを備える。この実施形態において、第１および第２のポリマーマトリックスの基部およびペタル形状部分は、フランジを有する長軸方向の、楕円形の開口が結合したマトリックスの１つの側で作製され、環状の開口が長軸方向の開口の反対側で作製されるように結合されて、中空の球状または準球状のマトリックスまたは足場を作製する。別の実施形態において、第１および第２のポリマーマトリックスは、結合するように適応された、上端、前部、および側面のピースを備える３つのパーツから作られる。この実施形態において、３つの区別できるパーツは、少なくとも３つの、好ましくは４つの縦の縫い目を使用して結合され、それによって、王冠形状の新たな膀胱構築物を形成する。王冠形状の構築物は、管腔器官の再構築、増強、または置き換えのためのデバイスとして単独で好ましく使用される。１つの実施形態において、構築物は膀胱増強足場である。膀胱増強足場の１つの例は図１Ａ〜Ｄに描写されている。別の実施形態において、構築物は膀胱置き換え足場である。膀胱置き換え足場の１つの例は図２Ａ〜Ｄに描写されている。
【０１５３】
加えて、第１のポリマーマトリックス、第２のポリマーマトリックス、またはその両方は、管状の管または挿入物を受容するように適応された少なくとも１つのレセプタクルまたはポートを含有してもよく、ここで、自然の管またはチューブへの構築物の接続が必要である。管または挿入物は、それ自体、例えば、円筒状または管状に形作られたポリマーマトリックスであり、各々が、円筒状ポリマーの第１の末端に位置する少なくとも１つのフランジを有する。好ましくは、管または挿入物は、上記の第１または第２のポリマーマトリックスと同じ生体適合性材料から構成される。ある実施形態において、管または挿入物はまた、円筒状または管状の管または挿入物のポリマーマトリックスの周囲に適するように適応されたウォッシャーを含有する。例えば、ウォッシャーはハイドロゲルである。円筒状または管状の管または挿入物は、任意にウォッシャーを含有してもよい。このウォッシャーはハイドロゲルであってもよい。加えて、円筒状または管状挿入物は自己安定性であってもよい。
【０１５４】
別の実施形態において、（一旦細胞が播種された）足場またはマトリックスの自然の管またはチューブへの接続が必要である、管状の管または挿入物を受容するように適応されたレセプタクルまたはポートもまた、以下に考察される他のマトリックスに適用する。
【０１５５】
１つの態様において、足場は、少なくとも２つのマトリックスを含む器官または組織構造の置き換え足場である。１つの実施形態において、足場は、第１の表面を有する第１のマトリックス、および第１の表面を有する第２のマトリックスを備える。第１のマトリックスおよび第２のマトリックスは、結合するように構成または適応されてもよい。別の実施形態において、第１のマトリックスおよび第２のマトリックスは、結合するときに、管腔器官の少なくとも一部に適合するように形作られてもよい。第１および第２のマトリックスは生体適合性材料を備えてもよい。生体適合性材料は生物分解性材料を備えてもよい。
【０１５６】
１つの実施形態において、第１のマトリックスは、閉じた末端および開いた赤道面境界を伴う半球形状を有してもよく、第２のマトリックスは、第１のマトリックスの赤道面境界と結合するように構成または適応されたカラーを有してもよい。閉鎖末端はドーム状であってもよい。別の実施形態において、第１のマトリックスおよび第２のマトリックスは、各々、閉じた末端および開いた赤道面境界を有する半球形状を有してもよい。閉鎖末端はドーム状であってもよい。なお別の実施形態において、第１のマトリックスは、第１のマトリックスの少なくとも１つの境界に沿ってフランジを有する領域をさらに備えてもよい。第２のマトリックスは、第２のマトリックスの少なくとも１つの境界に沿ってフランジを有する領域をさらに備えてもよく、ここで、第２のマトリックスのフランジを有する領域は、第１のマトリックスのフランジを有する領域と結合するように適応される。
【０１５７】
１つの実施形態において、足場は、第１の生体適合性マトリックスおよび第２の生体適合性マトリックスを備え、ここで、第１および第２のマトリックスは、各々が基部を備えてもよく、結合するように構成または適応されてもよい。１つの実施形態において、第１および第２のマトリックスは、結合したときに管腔器官の少なくとも一部に適合するように形作られてもよい。別の実施形態において、第１および第２のマトリックスは、各基部から放射状に伸びる少なくとも２つのペタルをさらに備えてもよい。
【０１５８】
１つの他の実施形態において、第１および第２のマトリックスの各々は、基部および少なくとも４つのペタルを備えた鋳型からもともと得ることができる。１つの構成において、対向するペタルの１つの対は他のペタルよりも長さが短くてもよい。別の実施形態において、第１および第２のマトリックスは結合するように適応された２つの区別できる単位であってもよい。
【０１５９】
１つの実施形態において、第１および第２のマトリックスの基部は結合するように適合される。ある実施形態において、第１および第２のマトリックスは、第１および第２のマトリックスのペタル形状部分を介して結合する。
【０１６０】
他の実施形態において、第１および第２のマトリックスは、第１のマトリックスと第２のマトリックスの間の第１の結合する点において長軸方向の開口を有し、長軸方向の開口の反対側である第１のマトリックスと第２のマトリックスの間の第２の結合する点において環状の開口を有する、中空球状または準球状形状を形成するように構成または適応されてもよい。足場は、第１のまたは第２のマトリックスの基部に組み込まれた少なくとも１つのフラップをさらに含んでもよい。別の実施形態において、長軸方向の開口はへりを有し、少なくとも１つのフラップが長軸方向の開口のへりに配置されている。
【０１６１】
別の態様において、マトリックスまたはマトリックス群は、自然の管に接続可能であってもよい。１つの実施形態において、第１のマトリックス、第２のマトリックス、または両方は、各々が自然の管を受容するように構成または適応される。別の実施形態において、第１のマトリックス、第２のマトリックス、または両方は、少なくとも１つのレセプタクルをさらに備える。少なくとも１つのレセプタクルは、管状挿入物を受容するように構成または適応されてもよい。管状挿入物はレセプタクル中に配置されてもよい。ある実施形態において、管状挿入物は末端を有する。この挿入物は、この末端に位置する少なくとも１つのフランジを有してもよい。別の実施形態において、管状挿入物は、自然の管に接続されるように構成または適応されてもよい。さらなる実施形態において、足場は、表面、および管状挿入物の周りに配置されたウォッシャーを有する。ウォッシャーは、フランジと構築物の表面の間に防水シールを形成するように構成または適応されてもよい。ある実施形態において、ウォッシャーはハイドロゲルを備える。
【０１６２】
図１および２は、少なくとも２つのマトリックスを含む足場構成の代表的な描写を提供する。
【０１６３】
１つの態様において、足場は、１つ以上のマトリックスを含む、器官または組織構造増強足場である。１つの実施形態において、足場は、基部、および複数のノッチを有する第１のマトリックスを含み、ここで、第１のマトリックスは、組み立てられたときに、管腔器官の少なくとも一部に適合される半球形状を形成するように適応される。別の実施形態において、足場は第２および第３のマトリックスを含み、ここで、第１の、第２の、および第３のマトリックスは、結合するように構成または適応されてもよく、結合したときに、管腔器官の少なくとも一部に適合するように形作られる。第１の、第２の、および第３のポリマーマトリックスは、３つの細分されたパーツを備える鋳型から得られてもよい。別の実施形態において、第１の、第２の、および第３のマトリックスは、３つの区別できる鋳型から得られ、結合するように構成または適応されてもよい。１つの他の実施形態において、第１の、第２の、および／または第３のマトリックスは生体適合性材料を備える。生体適合性材料は生物分解性材料を備えてもよい。
【０１６４】
１つの他の態様において、足場は、様々な形状または構成を有するパーツから作られる。１つの実施形態において、足場は、結合したときに第１の王冠形状を一緒に形成する、上端ピース、前部ピース、および側面ピースにそれぞれ対応する第１の、第２の、および第３のポリマーマトリックスを含んでもよい。別の実施形態において、前部ピースおよび側面ピースは、各々が第１の端および第２の端を備えてもよい。前部ピースの第１の端は、側面ピースの第１の端につながれてもよい。前部ピースの第２の端は、側面ピースの第２の端につながれてもよい。１つの他の実施形態において、第１の端は縫い目によってつながれてもよく、および／または第２の端は縫い目によってつながれてもよい。他の実施形態において、前部ピースは、第１の端および第２の端を有するノッチを含んでもよい。第１および第２の端は、例えば、縫い目によってなどでつながれてもよい。別の実施形態において、上端ピースは第１の端を有してもよく、側面ピースは第３の端を有し、そして前部ピースは第３の端を有する。上端ピースの第１の端は側面ピースの第３の端につながれてもよく、および／または上端ピースの第１の端は前部ピースの第３の端につながれてもよい。第１のおよび第３の端は縫い目によってつながれてもよい。別の実施形態において、各ノッチは第１の端および第２の端を有してもよい。これらの端は、例えば、縫い目によってなどでつながれてもよい。他の実施形態において、側面ピースは少なくとも１つのフラップを含んでもよい。
【０１６５】
すべての実施形態において、足場中の各個々のマトリックスまたはすべてのマトリックスは、生物分解性材料を備えてもよい。この材料は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、およびグリコール酸と乳酸のコポリマーからなる群より選択されてもよい。他の実施形態において、マトリックスまたはマトリックス群は、ポリグリコール酸、およびグリコール酸と乳酸のコポリマーを備える。
【０１６６】
１つの実施形態において、管腔器官は管状または中空器官である。この器官は尿生殖器であってもよい。別の実施形態において、尿生殖器は、膀胱、尿管、および尿道からなる群より選択される。１つの他の実施形態において、尿生殖器は膀胱または膀胱セグメントである。ある実施形態において、使用される足場は、天然の膀胱組織のコンプライアンスを呈する、インビボで再生された膀胱組織を形成するように構成または適応される。
【０１６７】
１つの実施形態において、沈着した細胞と結合したマトリックスは移植可能な構築物を形成する。別の実施形態において、少なくとも第１の細胞集団は、本明細書に記載されるような筋肉細胞集団を備える。筋肉集団は平滑筋細胞集団であってもよい。
【０１６８】
別の実施形態において、足場は、第１のマトリックスの第１の表面、第２のマトリックスの第１の表面、または両方の上にまたはその中に沈着された少なくとも第１の細胞集団を有してもよい。１つの他の実施形態において、足場は、第１のマトリックスの第２の表面、第２のマトリックスの第２の表面、または両方の上にまたはその中に沈着された第２の細胞の集団をさらに含んでもよい。第２の細胞の集団は尿路上皮細胞を含む。
【０１６９】
本明細書に記載される増強足場および置き換え足場、ならびにこれらを作製する方法および使用する方法は、Ｂｅｒｔｒａｍらの米国公開特許出願第２００７０２７６５０７号（その全体が参照により組み込まれる）においてさらに記載されている。
【０１７０】
Ｂ．尿路導管足場
本発明は、細胞を播種でき、かつ対象の尿迂回路の構築における胃腸組織での置き換えとして使用できる新たな尿迂回路または導管足場を提供する。例えば、本明細書に記載される新たな尿迂回路は、さもなくば回腸ループ迂回を受ける患者の治療のための放射状膀胱切除後の適用を有してもよい。１つの態様において、本発明は、本明細書に記載される方法から形成される、必要がある対象における尿迂回路としての使用のために適切な導管足場またはマトリックスを意図する。導管足場の１つの末端は１つ以上の尿管に接続されてもよく、他方の末端は、対象の身体に対して外部である尿リザーバーに接続されてもよい。１つの実施形態において、導管は、瘻孔を介して対象の身体を出てもよい。別の実施形態において、ポリマーマトリックスは、管状型で提供される、第１の移植可能な、生体適合性の、合成ポリマーマトリックスまたは足場を備える。ある実施形態において、管状足場は、対象の尿管に接続するように構成された第１の末端を備える。別の実施形態において、第１の足場は、対象における瘻孔または括約筋を形成するように構成された第２の末端をさらに含む。別の実施形態において、第１の足場は、少なくとも１つの尿管に接続するように構成された少なくとも１つの側面開口をさらに含む。ある実施形態において、第１の足場は、第１の尿管に結合するように構成された第１の側面開口、および第２の尿管に結合するように構成された第２の側面開口を含む。
【０１７１】
１つの態様において、足場は、対象における一方または両方の尿管の結合に関して柔軟であるように設計される。１つの実施形態において、足場は、管状構造の側面上での尿管の結合のために１つ以上の開口を有してもよい。別の実施形態において、足場は、尿管の結合のための管状構造の一方の末端に開口を有してもよい。結合される尿管の末端と足場の末端との間の距離が、その尿管の末端と足場の側面の間の距離よりも小さいならば、側面ではなく構造の一方の末端への尿管の結合は、尿管上でより少ない緊張を表すかもしれない。一般的には、足場またはその部分は、対象の一部、例えば、尿管、腹壁、皮膚などに結合されるように構成され、このような構成には、非限定的に、対象の尿管、腹壁、皮膚などに縫合されるか、またはさもなくば接続されるように構成されている、管状マトリックスの開いているかもしくは閉じている末端、末端開口、または側面開口が挙げられる。当業者は、様々な構成がレシピエントの腹腔の特定の寸法に依存することを正しく理解するであろう。
【０１７２】
１つの態様において、管状導管足場は、一方または両方の尿管から、管状足場を通して、そして最終的にはレシピエントの外に通る尿のための流出末端として働く管の一方の末端を備える。１つの実施形態において、足場の流出末端は、レシピエントの腹腔の壁において終結するように構成される。図１２（パネルＡ）は、足場のための例示的構成を図示する。
【０１７３】
別の実施形態において、足場の流出末端は、腹壁を通して、すなわち、経腹壁的に伸び、かつ皮膚瘻孔の皮下層に直接的に、すなわち、経皮的に接続するように構成される。図１２（パネルＢ）は、足場のための例示的な構成を図示する。
【０１７４】
１つの他の実施形態において、管状構造は、平坦な端を備える第１の末端、および不均一なまたは平坦でない端を備える第２の末端を備える。不均一な端は、基部から放射状に伸びる多数のペタルを伴う環状基部を含んでもよい。ペタルの数は、１個、２個、３個、４個、５個、または６個であってもよい。平坦でない端は、例えば、図３Ａに示されるものなどの一連のペタルを含んでもよい。１つの実施形態において、管状構造は、必要がある患者における尿迂回路系または導管としての使用のために適切な型を有する。別の実施形態において、この系は、例えば、尿管瘻術の場合などにおいて、１つ以上の尿管から腹壁セクションまで、尿を迂回させる。他の実施形態において、この系は、例えば、膀胱瘻造設術の場合などにおいて、膀胱から腹壁セクションまで、尿を迂回させる。１つの他の実施形態において、この系は膀胱を尿道に接続する。なお別の実施形態において、第１の系は１つ以上の尿管から腹壁セクションまで尿を迂回させてもよく、第２の系は膀胱から腹壁セクションまで尿を迂回させてもよい。すべての実施形態において、この系は、例えば、瘻孔の形成においてなどで、１つ以上の尿管から腹壁セクションまで尿を迂回させてもよい。
【０１７５】
別の実施形態において、管状マトリックスまたは足場は尿迂回路または導管足場である。１つの実施形態において、尿迂回路系の管状構造は、長方形、円形、または三角形の断面のものである。図３Ｂは、本発明で意図される異なる断面構成のいくつかを図示する。
【０１７６】
別の実施形態において、管状構造は、移植後に開いたままであるように、十分な硬直性を保持している。１つの他の実施形態において、管状構造の硬直性は、カテーテルのその管腔中での使用を伴うかまたは伴わずに保持される。カテーテルが使用される場合、これは、さらなる開いた状態を提供するために、管状構造の管腔空間に配置できる。
【０１７７】
１つの他の実施形態において、導管足場は、尿管の第１の足場の第１の末端を接続するように構成された丸いかまたは卵形のコネクターの型である第２の足場をさらに含んでもよい。なお別の実施形態において、導管足場は、対象において瘻孔を作製するために第１の管状足場の第２の末端を有する、瘻孔または括約筋を形成するように構成されたウォッシャー−リングの型である第３の足場をさらに含んでもよい。図３Ｃは、尿迂回路構築物の変形を図示する（Ａ−開いたクレーム卵形；Ｂ−開いたクレーム卵形容器；Ｃ−閉じた卵形容器および３つの管）。
【０１７８】
ある実施形態において、管状構造は、自制できる瘻孔または括約筋の作製のための吻合を達成するために、組織、器官、または身体の部分への接続のためのウォッシャー構造を含んでもよい。別の実施形態において、ウォッシャーは、約１ｍｍ未満、約１．５ｍｍ未満、約２ｍｍ未満、約２．５ｍｍ未満、約３ｍｍ未満、約３．５ｍｍ未満、約４ｍｍ未満、約４．５ｍｍ未満、または約５ｍｍ未満の厚さで提供される。
【０１７９】
１つの実施形態において、尿迂回路または導管足場は、図３Ａに示される構成に形作られる。１つの他の実施形態において、管状構造は、平坦な端を備える第１の末端および不均一なまたは平坦でない端を備える第２の末端を備える。不均一な端は、対象に対して外部である瘻孔の形成におけるなどで、対象の外部領域への結合のために構成された１つ以上のファスナーを含んでもよい。１つの実施形態において、管状構造の第１および第２の末端は、図３Ａに図示される型であってもよい。ファスナーの数は１個、２個、３個、４個、５個、または６個であってもよい。
【０１８０】
図４Ａは、ヒト泌尿器系についての通常の解剖学の一部を描写する。
【０１８１】
１つの実施形態において、管状構造は、必要がある患者における尿迂回路または導管としての使用のために適切な型を有する。別の実施形態において、導管は、例えば、尿管瘻術の場合においてなどで、１つ以上の尿管から腹壁セクションまで尿を迂回させる（図４Ｂ、４Ｄ）。他の実施形態において、導管は、例えば、膀胱瘻造設術の場合においてなどで、膀胱から腹壁セクションまで尿を迂回させる（図４Ｃ）。１つの他の実施形態において、導管は膀胱を尿道に連結する（図４Ｄ）。なお別の実施形態において、第１の導管は１つ以上の尿管から腹壁セクションまで尿を迂回させてもよく、第２の導管は膀胱から腹壁セクションまで尿を迂回させてもよい。すべての実施形態において、導管は、１つ以上の尿管から腹壁セクションまで尿を迂回させてもよい（図４Ｂ）。すべての実施形態において、導管は瘻孔を形成するように構成されてもよい。
【０１８２】
１つの実施形態において、尿迂回路または導管足場の管状構造は、長方形、円形、または三角形の断面のものである。別の実施形態において、管状構造は、移植後に開いたままであるように、十分な硬直性を保持している。１つの他の実施形態において、管状構造の硬直性は、カテーテルのその管腔中での使用を伴うかまたは伴わずに保持される。ある実施形態において、尿迂回路足場は、移植されると管状構造の管腔空間に配置されるように構成されたカテーテルをさらに含む。１つの実施形態において、カテーテルはＦｏｌｅｙ様バルーンカテーテルである。カテーテルが使用される場合、これは、さらなる開いた状態を提供するために、管状構造の管腔空間に配置できる。当業者は、当該分野で公知である他のカテーテルが本発明を用いる使用のために適切であり得ることを正しく理解する。
【０１８３】
別の実施形態において、足場の管状壁の厚さは、約２ｍｍ未満、約２．５ｍｍ未満、約３．５ｍｍ未満、約４ｍｍ未満、約４．５ｍｍ未満、約５ｍｍ未満、約５．５ｍｍ未満、または約６ｍｍ未満である。
【０１８４】
ある実施形態において、足場は、可変の外径および内径を有してもよい。１つの実施形態において、足場の末端は、口広げ加工してもよく、口広げ加工しなくてもよく、シールされてもよく、または丸くされてもよい。
【０１８５】
他の実施形態において、足場は尿に浸透性である。１つの実施形態において、足場の細孔径は、約０ミクロン〜約５００ミクロンよりも大きい。別の実施形態において、細孔径は約１００ミクロン〜約２００ミクロンである。別の実施形態において、細孔径は約１５０ミクロン〜約２００ミクロンである。他の実施形態において、細孔径は約１００ミクロン、約１１０ミクロン、約１２０ミクロン、約１３０ミクロン、約１４０ミクロン、約１５０ミクロン、約１６０ミクロン、約１７０ミクロン、約１８０ミクロン、約１９０ミクロン、または約２００ミクロンである。ある実施形態において、細孔径は約１００ミクロン、約２００ミクロン、約３００ミクロン、約４００ミクロン、約５００ミクロン、または約６００ミクロンである。他の実施形態において、足場は、単一の細孔径分布、複数の細孔径分布、または細孔勾配分布である、細孔構造を含む。
【０１８６】
別の実施形態において、足場材料は縫合可能であり、漏出に対して抵抗性である組織との接続からであってもよい。
【０１８７】
他の実施形態において、管状足場材料は、移植用途の期間全体にわたる開いた状態、支持細胞結合、および宿主組織の内殖を維持するため、ならびに柔軟性を保持するために選択される。別の実施形態において、材料は、通常のインビボ液体循環の間に曝露される圧力を超える破裂強度を有する。他の実施形態において、材料は、宿主組織の内殖と釣り合った分解時間を有する。
【０１８８】
Ｃ．筋肉等価足場
１つの態様において、本発明のポリマーマトリックスまたは足場は、筋肉等価足場である。１つの実施形態において、筋肉等価足場は排尿筋筋肉等価足場である。別の実施形態において、足場は腹腔鏡移植のために適切である。
【０１８９】
１つの態様において、ポリマーマトリックスは、上記治療の必要がある器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように形作られ、かつ腹腔鏡移植されるために十分なサイズのポリマーマトリックスまたは足場を備える。特定の実施形態において、本発明のポリマーマトリックスまたは足場は約３〜約２０ｃｍ長の間である。１つの実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は最大約２０ｃｍ長である。別の実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は最大約１５ｃｍ長である。別の実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は最大約１０ｃｍ長である。別の実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は最大約８ｃｍ長である。別の実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は最大約４ｃｍ長である。なお別の実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は最大約３ｃｍ長である。特定の実施形態において、本発明のポリマーマトリックスまたは足場は約１から約８ｃｍの間の幅である。ある実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は最大約４ｃｍ幅である。他の実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は最大約３ｃｍ幅である。なお他の実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は最大約５ｃｍ幅である。
【０１９０】
１つの実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は三次元（３Ｄ）形状を有する。別の実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は平面形状を有する。１つの実施形態において、平面形状のポリマーマトリックスまたは足場は、より高い柔軟性を可能にするために前処理された領域を備える。特定の実施形態において、前処理された領域は、折り目が付けられるようにその領域中でコートされる。１つの実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は、腹腔鏡管および／またはポートを通して、巻かれ、折り畳まれ、またはさもなくば移植のための形状となるように、十分に可鍛性である。このような実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は、巻かれず、折り畳まれず、またはさもなくば腹腔鏡管および／またはポートを通しての挿入後の形状に戻るように、十分に可鍛性である。１つの実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は、腹腔鏡管および／またはポートを通しての移植の前に、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のストリップに切断される。特定の実施形態において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のストリップは、腹腔鏡管および／またはポートを通しての移植の前に、結合される。２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のストリップは、接着剤、ステープル、縫合糸、または当業者に公知である他の技術を使用して結合されてもよい。このような実施形態において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の結合されたストリップは、腹腔鏡管および／またはポートを通過するように、折り畳まれ、および／または積み重ねられる。このような実施形態において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のストリップは、腹腔鏡チューブおよび／またはポートを通した挿入後に、折り畳まれず、および／または積み重ねられない。ある実施形態において、以前に配置された結合手段は、腹腔鏡管および／またはポートを通した挿入後に、適切に締め付けされる。
【０１９１】
１つの実施形態において、ポリマーマトリックスは、パッチの型またはストリップの型で提供される、第１の移植可能な、生体適合性の、合成または天然のポリマーマトリックスまたは足場を備える。１つの実施形態において、パッチは、必要がある患者の膀胱における排尿筋等価物としての使用のために適切な型を有する。１つの他の実施形態において、パッチは、必要がある患者の既存の膀胱の容積容量を増加させるために適切な型を有する。特定の実施形態において、パッチは、約５０ｍＬから約５００ｍＬの間で膀胱サイズを増加させる。ある実施形態において、パッチは、５０ｍＬの増加量で膀胱サイズを増加させる。ある実施形態において、パッチは膀胱サイズを約４５０ｍＬ増加させる。１つの実施形態において、３０ｃｍ２の表面積の増加は２００ｍＬの膀胱の容積を２５０ｍＬに増加させる。別の実施形態において、２５ｃｍ２の増加は３５０ｍＬの膀胱の容積を４００ｍＬに増加させる。１つの実施形態において、足場は約３０ｃｍ２の二次元表面積を有する。別の実施形態において、足場は約２５ｃｍ２の二次元表面積を有する。１つの実施形態において、パッチは、ストリップ、ディスク、正方形、楕円、または任意の他の適する構成の型である。他の実施形態において、パッチは、あらかじめ折り目を付けられた型、例えば、アコーディオン様で提供される。
【０１９２】
図５Ａ〜Ｂは、筋肉等価足場またはポリマーマトリックスの例を示す。１つの実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は、二重ウェッジの形状、例えば、図５Ａに示される形状である。別の実施形態において、ポリマーマトリックスは、図６〜９に示される構成の１つに形作られる。
【０１９３】
すべての実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は、膀胱とマトリックスまたは足場の両方に対して緊張を最小化するように形作られる。
【０１９４】
別の実施形態において、ポリマーマトリックスは、パッチの型またはストリップの型で提供される、第１の移植可能な、生体適合性の、合成または天然のポリマーマトリックスまたは足場を備える。１つの実施形態において、パッチは、必要がある患者の膀胱における排尿筋等価物としての使用のために適切な型を有する。１つの他の実施形態において、パッチは、必要がある患者の既存の膀胱の容積容量を増加させるために適切な型を有する。ある実施形態において、パッチは、５０ｍＬの増加量で膀胱サイズを増加させる。１つの実施形態において、パッチは、ストリップ、ディスク、正方形、楕円、または任意の他の適する構成の型である。他の実施形態において、パッチは、あらかじめ折り目を付けられた型、例えば、アコーディオン様で提供される。
【０１９５】
１つの実施形態において、ポリマーマトリックスは、例えば、図１〜９に示される構成の１つにおけるように、泌尿器系の管腔器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように形作られる。すべての実施形態において、これらのマトリックスまたは足場のために使用される生体適合性材料は、例えば、生物分解性である。すべての実施形態において、生体適合性材料はポリグリコール酸であってもよい。
【０１９６】
すべての実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は、生体適合性でありかつ生物分解性の形状設定材料でコートされる。１つの実施形態において、形状設定材料は液体コ−ポリマーを含んでもよい。別の実施形態において、液体コ−ポリマーは、液化ラクチド／グリコリド−コポリマーを備えてもよい。１つの実施形態において、液体コ−ポリマーは、ポリ−ラクチド−コ−グリコリドを備えてもよい。液体コ−ポリマーは、ポリ−Ｄ−ラクチド−コ−グリコリド、ポリ−Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド、またはポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリドを備えてもよい。
【０１９７】
Ｄ．胃腸組織足場
本発明は、胃腸組織構築物、例えば、食道組織または腸足場の形成のために適切な足場を提供する。１つの態様において、本発明のポリマーマトリックスまたは足場は、胃腸管の一部において、その上で、またはその中への移植のために適切である。１つの態様において、ポリマーマトリックスは、治療の必要がある胃腸（ＧＩ）管の少なくとも一部に適合するように形作られるポリマーマトリックスまたは足場を備える。ＧＩ管の適切な部分には、非限定的に、食道、小腸、大腸、胃、結腸、または肛門括約筋組織が挙げられる。
【０１９８】
好ましい実施形態において、ＧＩ足場は、不織ポリグリコール酸（ＰＧＡ）／ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＶＩＣＲＹＬ（商標）織りメッシュ、および織りＰＧＡから形成される。１つの好ましい実施形態において、ＰＬＧＡ／ＰＧＡポリマー足場は、標準型（例えば、３ｍｍ厚）または薄型（例えば、０．５ｍｍ厚）である。
【０１９９】
１つの実施形態において、ＧＩポリマーマトリックスは、パッチの型またはストリップの型で提供される、第１の移植可能な、生体適合性の、合成または天然のポリマーマトリックスまたは足場を備える。１つの実施形態において、パッチは、必要がある患者のＧＩ組織におけるＧＩ組織足場としての使用のために適切な型を有する。１つの他の実施形態において、パッチは、必要がある患者の既存のＧＩ組織の再生、置き換え、増強、または再構築のために適切な型を有する。１つの実施形態において、パッチは、ストリップ、ディスク、正方形、楕円、または任意の他の適する構成の型である。他の実施形態において、パッチは、あらかじめ折り目を付けられた型、例えば、アコーディオン様で提供される。
【０２００】
すべての実施形態において、これらのＧＩマトリックスまたは足場のために使用される生体適合性材料は、例えば、生物分解性である。すべての実施形態において、生体適合性材料はポリグリコール酸であってもよい。ある実施形態において、ポリマー性ＧＩマトリックスまたは足場は、本明細書に記載されるような生体適合性かつ生物分解性形状設定材料でコートされる。
【０２０１】
本発明は、ＧＩ組織または器官の再生、再構築、増強、または置き換えのための表面コルゲート／ラッフルを伴う電子スピン管状複合物の適用を意図する。これらの複合物は、これらがＧＩ組織のトポグラフィーを模倣するように電子スピンされてもよい。ＧＩ組織が天然で管状である場合、トポグラフィーは模倣の管腔表面または外部、非管腔表面であってもよい。管状複合物は、外部表面上のコルゲートで最初に電子スピンされ、これはＧＩ組織足場としての使用のために適切であるかもしれない。複合物が裏返しにされる場合、これは、内部または管腔側面上のコルゲートの配置を提供する。この方向付けは、小腸の管腔の絨毛特徴の組織化を模倣する。そのトポロジー的特徴がＧＩ組織、例えば、食道または小腸を再現する、単独の管状複合物を提供することは、本明細書に記載されるＧＩ構築物の、ＧＩ関連障害への適用を容易にするためのストラテジーを提供する。ＧＩは組織学的下部構造を有する同心円状に組織化された管状複合物を表し、トポロジー的特徴は空間的位置によって変化する。ＧＩの構成要素の再生のための組織操作アプローチは、一般的に、ＳＭＣ、上皮、または他の細胞型が典型的には播種されていない、ＳＩＳ、シリコーン、またはＰＶＤＦなどの材料を使用する置き換えまたは増強に対して焦点を当ててきた。このようなアプローチは、同心円状に組織化された筋肉組織および上皮層の再生によって測定されるように、成功は限定的または変動的であった（Ｊｗｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｓｕｒｇｅｒｙ  ９５：６５７−６６３；Ｊａｎｓｅｎ  ＰＬ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｅｕｒ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  ３６：１０４−１１１；Ｕｅｎｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｓｕｒｇ  １１：９１８−９２２；Ｈｏｅｐｐｎｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｓｕｒｇ  １３：１１３−１１９；Ｋａｉｈａｒａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，，２０００，６９（９）：１９２７−１９３２；Ｎａｋａｓｅ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８前出；Ｔａｋｉｍｏｔｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＡＳＡＩＯ  Ｊ  ３９：Ｍ７３６−７３９；Ｌｏｐｅｓ  ＭＦ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｄｉｓ  Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  １９：２５４−２５９；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｓａｅｚ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｅｕｒ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  ３５：３７２−３７６；Ａｎｓａｌｏｎｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｔｒａｎｓ．Ｐｒｏｃ  ３８：１８４４−１８４８；
Ｐｅｋｍｅｚｃｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｔｕｒｋ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  １５；Ｓａｘｅｎａ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｐｅｄ  Ｓｕｒｇ  ４４：８９６−９０１；Ｇｒｅｉｋｓｃｈｅｉｔ  ＴＣ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２４０）。対照的に、本発明は、平滑筋細胞が播種された生体材料の基礎的プラットフォームを活用する、胃腸管の再生のためのアプローチを意図し、これは、膀胱および膀胱誘導物の再生において成功を実証した（Ｊａｙｏ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．，２００８：Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ３：６７１−６８２）。電子スピンは、ポリマー溶液の電気的に荷電したジェットを使用する生体材料の作製のためのプロセスである（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００５：Ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ．Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）。多数の生物分解性ポリマーおよび生物分解性でないポリマーが、ＧＩ管、例えば、食道、腸、結腸、または肛門括約筋の構成要素を含む管状器官系の再生における適用のために適切な管状複合物に電子スピンされて得る。このようなポリマーの例には、ＰＧＡ、ＰＬＣＬ、およびポリウレタンが挙げられるがこれらに限定されない。このような材料は、細胞の移動および増殖を支持するために十分に確立されている（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００５前出）。
【０２０２】
反復性電子スピンプロトコールに基づく特定の器官系に特徴的であるトポロジー的特色の再構築のためのストラテジーが開発されてきた（その全体が参照により組み込まれる、Ｒａｐｏｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．米国公開特許出願第２００９０２２７０２６号を参照のこと）。手短に述べると、バイナリ電子スピン法が使用されてもよく、ここでは、第１ラウンドの電子スピンは、規定された直径のマンドレルの周りの管を作製するために使用される。次いで、この管状構築物は、複数のさらなるマンドレルの挿入により、その動作直径を数倍増加させるように、強制的に拡大される。次いで、拡大された管状構築物は、第２ラウンドの電子スピンのための鋳型として使用される。次いで、管状複合物の管腔からのすべてのマンドレルの除去は、管状構築物の、そのもともとの直径への逆戻りを生じる。結果的に、第２の層からの過度の電子スピンされた材料は、管状複合物の外部の非管腔表面から突き出た一連のラッフルまたはコルゲートに折り畳まれる。このような管状構築物は、例えば、図１０Ａ〜Ｃに示されるように、食道または小腸の再生における適用のために適切であり得る。
【０２０３】
管状構築物の反転は、小腸の管腔表面に特徴的である絨毛を再現する管腔トポグラフィーを作製するために、内部の管腔表面に向かって表面コルゲートを再方向付けする。このようなやり方で、単独電子スピンされた管状複合物は、そのトポロジー的特徴が管腔に向けて方向付けられているか、または外部表面に向けて方向付けられているかに基づいて、食道または小腸のいずれかの再生のための二重適用を有してもよい。外部コルゲートを有する管は、小腸の絨毛に類似する管腔表面ラッフルを作製するために、裏返しにされてもよい。このようにして、表面コルゲートを用いる単独管状複合物は、少なくとも、食道（図１０Ｃに図示される外部表面上のコルゲート）または小腸（図１０Ｂに図示されるような内部管腔表面上のコルゲート）のいずれかの再生に向けて適用されてもよい。
【０２０４】
Ｅ．呼吸組織足場
本発明は、呼吸組織構築物、例えば、肺組織足場の形成のために適切な足場を提供する。１つの態様において、本発明のポリマーマトリックスまたは足場は、肺の一部において、その上で、またはその中への移植のために適切である。１つの態様において、ポリマーマトリックスは、治療の必要がある自然の呼吸組織の少なくとも一部に適合するように形作られたポリマーマトリックスまたは足場を備える。適切な自然の呼吸組織には、非限定的に、肺、肺胞組織、および細気管支組織が挙げられる。
【０２０５】
すべての実施形態において、呼吸組織足場は、例えば、肺に移植可能である。すべての実施形態において、足場は生物分解性である。すべての実施形態において、足場は生体適合性である。足場は、第１の細胞集団および／または第２の細胞集団の播種のために適切である。すべての実施形態において、第１の細胞集団は脂肪由来の平滑筋細胞集団である。すべての実施形態において、第２の細胞集団は呼吸細胞集団である。すべての実施形態において、第２の細胞集団は肺から得られる。すべての実施形態において、構築物は呼吸組織構築物である。すべての実施形態において、構築物は少なくとも１種の平滑筋細胞マーカーについて陽性である。すべての実施形態において、構築物は少なくとも１種の呼吸組織マーカーについて陽性である。すべての実施形態において、呼吸組織マーカーは以下の１種以上：細気管支マーカー、肺胞マーカー、および上皮マーカーである。すべての実施形態において、構築物は１種以上の肺胞形成単位（ＡＦＵ）を含む。すべての実施形態において、構築物は、協調リズム収縮機能を有する細胞を含む。すべての実施形態において、構築物は移植後に呼吸組織を形成するように適応される。すべての実施形態において、呼吸組織は肺組織である。すべての実施形態において、肺組織は肺胞組織および／または細気管支組織を含む。
【０２０６】
Ｆ．血管足場
Ｒａｐｏｐｏｒｔらの米国公開出願第２００９０２２７０２６号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されているように、自然の血管は多層の積層構造を有し、特殊化した構造的特徴（起伏、コルゲート、ねじれ）は、コラーゲンおよびエラスチン薄層が異なる緊張において異なる程度まで機械的にかみ合わされる平行配置を容易にする。自然の動脈における典型的な観察は、弾性の薄層におけるコルゲートであるが、周囲のコラーゲン層においてはコルゲートがない。これに対する１つの例外は、ナガスクジラにおいて記録されている異例の構造であり、ここでは、たまたま伸長性のある要素であるコラーゲン性成分が高度にコルゲートとなっている、新たな結合組織設計が存在している（Ｇｏｓｌｉｎｅ  ＆  Ｓｈａｄｗｉｃｋ（１９９８）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ．８６：５３５−５４１））。Ｒａｐｏｐｏｒｔらにおいて記載されているように、組織操作足場およびそれを作る方法は、典型的には自然の動脈において見られるものに対して逆のアプローチをとることができ、すなわち、足場の張力層はコルゲートを有するが、弾性層は有さない。張力層の中にコルゲートを付与することは、弾性層の中にコルゲートを付与することよりも容易であるので、このアプローチは有利である。
【０２０７】
本発明における使用のために適切な血管足場は、多層または積層構造を有してもよい。１つの実施形態において、足場は、（ａ）弾性体要素、外部表面、および内部管腔表面を含有する第１の管状要素；ならびに（ｂ）第１の管状要素の外部表面と接触している、張力要素、外部表面、および内部管腔表面を含有する第２の管状要素を含む。
【０２０８】
別の実施形態において、第２の管状要素はコルゲートを有する。本明細書に記載される組織操作足場に存在するコルゲートは、Ｒａｐｏｐｏｒｔらの米国公開出願第２００９０２２７０２６号において例示され、足場の外側の表面上にそれらの外見を示す。
【０２０９】
他の実施形態において、コルゲートを有する第２の管状要素は、繊維の方向が円周方向に方向付けられている繊維ネットワークを有する。
【０２１０】
さらなる管状要素が、第１の管状要素および第２の管状要素を超えて加えられてもよい。
【０２１１】
第１の管状要素の内部管腔表面と、第２の管状要素の外部表面は、両方とも、例えば、組織操作された血管（ＴＥＢＶ）の形成においてなどの、さらなる取り扱いのためにアクセス可能である。本明細書に記載されるように、本発明の血管足場は、１種以上の細胞集団を足場に取り込むことによって、ＴＥＢＶを作るために使用されてもよい。足場の積層構築物は、平滑筋細胞、内皮細胞、および線維芽細胞などの細胞集団の予測された分配を容易にし得る、より多くの天然血管の形態を提供する。
【０２１２】
本明細書に記載される足場のエラストマー要素は、完全に回復可能かつ反復可能である大スケール変形を伴ってストレスに応答する能力を足場に付与する。エラストマー要素は、天然の構成要素、合成の構成要素、１種より多くの天然の構成要素の混合物、１種より多くの合成の構成要素の混合物、天然および合成の構成要素の混合物、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい、エラストマーの構成要素を有する。一般的には、有機または天然の構成要素は、自然の組織構造において通常存在するタンパク質であり、または自然の組織構造から得ることができ、またはタンパク質および／もしくはそのアミノ酸配列をコードする既知の核酸配列に基づいて組換え的もしくは合成的に産生できる。例えば、エラスチンは動脈中で天然に存在し、本発明の血管足場における天然の構成要素として利用されてもよい。天然の構成要素は、本明細書に記載されるように、血管足場および／またはＴＥＢＶの一部であってもよく、これはまた、合成の構成要素を含むかまたは含まない。
【０２１３】
ある実施形態において、第１の管状要素のエラストマー要素は、非限定的に、エラスチン、グルテン、グリアジン、アブダクチン、クモの糸、およびレシリンまたはプロレシリンが挙げられる、弾性タンパク質などの有機または天然の構成要素を含む（Ｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ．Ｏｃｔ  １２：４３７（７０６１）：９９９−１００２）。当業者は、本発明の足場における使用のために適切であり得る他の天然の弾性タンパク質を正しく理解するであろう。
【０２１４】
天然材料の使用は、インタクトな血管足場が、組織操作された血管を構築する目的のためのさらなる取り扱いに供されるときに、利点を提供する。例えば、特定の細胞集団が足場の上で培養または播種されるときに、足場中に存在する天然のエラスチンタンパク質は、足場との適した細胞相互作用を促す。
【０２１５】
他の実施形態において、エラストマー要素は合成の構成要素を含む。合成のエラストマー性構成要素の例には、非限定的に、ラテックス、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ−Ｌ−ラクチド酸（ＰＬＬＡ）、ポリジアキサノン（ＰＤＯ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）、およびポリ（エーテルウレタンウレア）（ＰＥＵＵ）が挙げられる。
【０２１６】
１つの実施形態において、本発明は、エラストマー要素が天然の弾性構成要素および合成の弾性構成要素を含む第１の管状要素を意図する。
【０２１７】
本明細書に記載される足場の張力要素は、足場がストレスに応答して伸長に抵抗することを可能にする、硬直性または張力を足場に付与する。張力要素は、天然の構成要素、合成の構成要素、１種より多くの天然の構成要素の混合物、１種より多くの合成の構成要素の混合物、天然および合成の構成要素の混合物、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい、張力の構成要素を有する。
【０２１８】
別の実施形態において、第２の管状要素の張力要素は、非限定的に、コラーゲン、セルロース、シルク、およびケラチンが挙げられる、線維性タンパク質などの有機または天然の構成要素を備える。当業者は、本発明の足場における使用のために適切であり得る他の天然線維性タンパク質を正しく理解している。他の実施形態において、張力要素は合成の構成要素である。合成の張力構成要素の例には、非限定的に、ナイロン、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））Ｇｏｒｅｔｅｘ（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）、ポリエステル、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、およびポリ（エーテルウレタンウレア）（ＰＥＵＵ）が挙げられる。１つの実施形態において、本発明は、張力要素が天然の張力構成要素および合成の張力構成要素を含む、第２の管状要素を意図する。
【０２１９】
足場のエラストマー要素および張力要素は、天然および合成の構成要素の様々な組み合わせを含有してもよい。例えば、足場は、天然の弾性構成要素および／または天然の張力構成要素、ならびに合成の弾性構成要素および／または合成の張力構成要素を含有してもよい。
【０２２０】
本発明の１つの態様において、ＴＥ足場は、上記のように、第１の管状要素の上に第２の管状要素を有する２層構造に限定されない。ある実施形態において、足場は、第２の管状要素の上の第３の管状要素、第３の管状要素の上の第４の管状要素、第４の管状要素の上の第５の管状要素などのようなさらなる管状要素を含む。加えて、本明細書に記載されるように、さらなる管状要素は、エラストマー要素（例えば、天然および／または合成）または張力要素（例えば、天然および／または合成）を含有してもよい。さらなる管状要素は、本明細書に記載される技術によって接着されてもよい。
【０２２１】
１つの態様において、エラストマー要素に含有されるエラストマー性構成要素、および張力要素に含有される張力構成要素は、各々が異なる弾性率を有する。１つの実施形態において、エラストマー要素のエラストマー性構成要素の弾性率は第１の弾性率を有し、張力要素の張力構成要素は第２の弾性率を有する。好ましい実施形態において、第２の弾性率は第１の弾性率より少なくとも約１桁の規模大きい。１つの実施形態において、第２の弾性率は、第１の弾性率よりも約１桁の規模、約２桁の規模、約３桁の規模、約４桁の規模、またはさらなる桁の規模大きい。例えば、Ｒａｐｏｐｏｒｔらの米国公開出願第２００９０２２７０２６号の実施例１は、張力構成要素ＰＤＯおよびＶｉｃｒｙｌが、エラストマー性構成要素ラテックスの０．３ＭＰａ〜０．５ＭＰａの弾性率と比較した場合に、それぞれ、３ＧＰａおよび９〜１８ＧＰａの弾性率を有することを示す。
【０２２２】
別の態様において、本発明のＴＥ足場は、自然の血管において見い出されるものと実質的に同様の構造的および機能的特性を呈する。当業者は、非限定的に、ストレスおよび緊張に対する応答、コンプライアンス、ヤング率、空隙率、強度などが挙げられる、本明細書の足場が自然の血管を模倣するかまたは密接に類似することを実証するために使用できる多くのパラメーターを正しく理解するであろう。１つの実施形態において、本発明の足場は、異方性様式でストレスおよび緊張に機械的に応答する能力を有することによって特徴付けられる。当業者は、組織操作足場の挙動を特徴付けるために有用である当該分野において十分に認識されている多くのパラメーターが存在していることを正しく理解するであろう（Ｒａｐｏｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．米国公開出願第２００９０２２７０２６号）。このようなパラメーターは、本発明の組織操作足場の機械的挙動を特徴付けする際に、および特に、足場が自然の血管の特性と実質的に同様な特性を呈するか否かを決定する際に、有用である。
【０２２３】
表１は、自然の血管と実質的に同様である足場またはＴＥＢＶに機械的特性を提供することを計画している文献に基づく特徴付けの詳細を提供する。本発明は、表１の値によって特徴付けられ、かつ自然の血管の特性と実質的に同様である機械的特性、好ましくは、（ｉ）Ｊ形状ストレス／緊張曲線によって特徴付けられるストレスおよび緊張に対する機械的応答；（ｉｉ）破砕に対する抵抗性；（ｉｉｉ）粘弾性；または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを呈する組織操作足場に向けられている。加えて、足場は、細胞を播種してＴＥＢＶを形成する目的のために、種々の細胞系統に対する接触性によって特徴付けられる。
【０２２４】
2013525077.tif 000003
【０２２５】
１つの実施形態において、本発明の組織操作足場によって呈されるＪ形状ストレス／緊張曲線の特徴は、（ｉ）約０．１ＭＰａ〜約０．５ＭＰａの外周管弾性率１、（ｉｉ）約３．０ＭＰａ〜約６．０ＭＰａの外周管弾性率２；および（ｉｉｉ）約０．５７〜約１．１２の外周率遷移、ならびにこれらの任意の組み合わせに起因する。別の実施形態において、外周管弾性率１は、約０．１ＭＰａ、０．１３ＭＰａ、約０．１５ＭＰａ、約０．１７ＭＰａ、約０．２ＭＰａ、約０．２２ＭＰａ、約０．２５ＭＰａ、約０．２７ＭＰａ、約０．３ＭＰａ、約０．３２ＭＰａ、約０．３５ＭＰａ、約０．３７ＭＰａ、約０．４ＭＰａ、約０．４２ＭＰａ、約０．４５ＭＰａ、約０．４７ＭＰａ、または約０．５ＭＰａである。別の実施形態において、外周管弾性率２は、約３．０ＭＰａ、約３．２ＭＰａ、約３．５ＭＰａ、約３．７ＭＰａ、約４．０ＭＰａ、約４．２ＭＰａ、約４．５ＭＰａ、約４．７ＭＰａ、約５．０ＭＰａ、約５．２ＭＰａ、約５．５ＭＰａ、約５．７ＭＰａ、または約６．０ＭＰａである。別の実施形態において、外周率遷移は、約０．５７、約０．５９、約０．６１、約０．６３、約０．６５、約０．６７、約０．６９、約０．７１、約０．７３、約０．７５、約０．７７、約０．７９、約０．８１、約０．８３、約０．８５、約０．８７、約０．８９、約０．９１、約０．９３、約０．９５、約０．９７、約０．９９、約１．０１、約１．０３、約１．０５、約１．０７、約１．０９、約１．１１、または約１．１２である。
【０２２６】
別の実施形態において、破砕に対する抵抗性に好都合な特性は、（ｉ）約０．４５ＭＪ／ｍ３〜約１．０ＭＪ／ｍ３の外周管強靱性；（ｉｉ）約０．１ＭＪ／ｍ３〜約０．５ＭＪ／ｍ３の軸方向の管強靱性；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせである。生体材料の強靱性は、破砕に対するその抵抗性を決定することを補助する１つのパラメーターである。明らかに、破砕または引き裂きに対する抵抗性は、これが任意のＴＥＢＶまたはそこから得られる血管移植片の開いた状態を保証することを補助するので、ＴＥ足場における所望の特色である。自然の血管は、液体の環状負荷のストレスおよび緊張に応答した変形に供される。したがって、これらは、長軸方向または軸方向様式で、および／または外周様式で、分裂または破砕のリスクがある。自然の血管と同様に、本発明のＴＥ足場およびＴＥＢＶから得られる血管移植片もまた、破砕のリスクがある。本発明は、特定の軸方向の強靱性および／または特定の外周強靱性が、破砕または引き裂きに抵抗性であるＴＥ足場に寄与するという発見に関わる。１つの実施形態において、外周管強靱性は、約０．４５ＭＪ／ｍ３、約０．５０ＭＪ／ｍ３、約０．５５ＭＪ／ｍ３、約０．６０ＭＪ／ｍ３、約０．６５ＭＪ／ｍ３、約０．７０ＭＪ／ｍ３、約０．７５ＭＪ／ｍ３、約０．８０ＭＪ／ｍ３、約０．８５ＭＪ／ｍ３、約０．９０ＭＪ／ｍ３、約０．９５ＭＪ／ｍ３、約１．０ＭＪ／ｍ３である。別の実施形態において、軸方向の管強靱性は、約０．１ＭＪ／ｍ３、約０．１５ＭＪ／ｍ３、約０．２０ＭＪ／ｍ３、約０．２５ＭＪ／ｍ３、約０．３０ＭＪ／ｍ３、約０．３５ＭＪ／ｍ３、約０．４０ＭＪ／ｍ３、約０．４５ＭＪ／ｍ３、または約０．５０ＭＪ／ｍ３である。別の実施形態において、本発明のＴＥ足場は以下の１つ以上によって特徴付けられる：ｉ）Ｊ形状ストレス／緊張曲線によって特徴付けられるストレスおよび緊張に対する機械的応答を有する足場；ｉｉ）破砕抵抗性足場；ならびにｉｉｉ）粘弾性足場。
【０２２７】
別の実施形態において、ＴＥ足場の粘弾性特性は、（ｉ）約０．０５〜約０．３のタンジェントデルタ；（ｉｉ）約４００ＭＰａ〜約０．１２ＭＰａの保存係数；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせによって特徴付けられる。粘弾性材料は、変形に対する応答において、粘性特性と弾性特性の両方を呈する。粘性材料は、ストレスが適用されるときに、時間とともに直線的に緊張に対して抵抗するが、弾性材料は、ストレスに対して応答して即座に緊張し、一旦、ストレスが除去されると、迅速にそれらの元の状態に戻る。粘弾性材料は、ストレスに対して応答して時間依存性の緊張を呈し、これは、典型的には、非晶質材料の中での原子または分子の拡散を包含する。自然の血管は、液体の環状負荷に対処する粘弾性を示すので、この形質は、ＴＥＢＶまたは血管移植片を作製するために使用される本発明のＴＥ足場のために所望される。本発明は、本発明のＴＥ足場の粘弾性が特定のタンジェントデルタ値および／または特定の保存係数値によって特徴付けられるという発見に関わる。１つの実施形態において、タンジェントデルタは、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、約０．１５、約０．１６、約０．１７、約０．１８、約０．１９、約０．２０、約０．２１、約０．２２、約０．２３、約０．２４、約０．２５、約０．２６、約０．２７、約０．２８、約０．２９、または約０．３０である。他の実施形態において、保存係数は、約４００ＭＰａ、約３５０ＭＰａ、約３００ＭＰａ、約２５０ＭＰａ、約２００ＭＰａ、約１５０ＭＰａ、約１００ＭＰａ、約９０ＭＰａ、約８０ＭＰａ、約７０ＭＰａ、約６０ＭＰａ、約５０ＭＰａ、約４０ＭＰａ、約３０ＭＰａ、約２０ＭＰａ、約１０ＭＰａ、約９ＭＰａ、約８ＭＰａ、約７ＭＰａ、約６ＭＰａ、約５ＭＰａ、約４ＭＰａ、約３ＭＰａ、約２ＭＰａ、約１ＭＰａ、約０．９ＭＰａ、約０．８ＭＰａ、約０．７ＭＰａ、約０．６ＭＰａ、約０．５ＭＰａ、約０．４ＭＰａ、約０．３ＭＰａ、約０．２ＭＰａ、約０．１９ＭＰａ、約０．１８ＭＰａ、約０．１７ＭＰａ、約０．１６ＭＰａ、約０．１５ＭＰａ、約０．１４ＭＰａ、約０．１３ＭＰａ、または約０．１２ＭＰａである。
【０２２８】
本発明の足場のために所望される特性を特定および特徴付けするために適切である、当業者に周知であるいくつかの技術が存在する。これらの技術には、非限定的に、破裂圧力試験；外周方向における準静的機械的試験（引張試験としても知られる）（ストレス／緊張ダイアグラムにおいて提供される結果）；空隙率および細孔径を決定すること（例えば、水銀侵入空隙率測定による）；細胞接着アッセイ；および分解率；移植片コンプライアンスの測定のための圧力／体積曲線が含まれる。
【０２２９】
５．構築物
１つの態様において、本発明は、少なくとも１種の細胞集団が播種されている１種以上のポリマー足場またはマトリックスを提供する。細胞集団が播種されたこのような足場は、本明細書では「構築物」と呼ばれてもよい。１つの実施形態において、細胞−播種されたポリマーマトリックスまたはマトリックス群は、このような構築物の必要がある対象における自然の管腔器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように形作られるかまたは適応される構築物を形成する。
【０２３０】
細胞−播種されたポリマーマトリックスまたはマトリックス群は、膀胱置き換え構築物、膀胱増強構築物、膀胱導管構築物、および排尿筋肉価構築物からなる群より選択される新たな膀胱構築物を形成できる。加えて、呼吸組織構築物、胃腸組織構築物、新たな血管構築物、および眼組織構築物からなる群より選択される構築物を形成する、他の細胞−播種されたポリマーマトリックスが提供される。
【０２３１】
当業者は、本明細書に記載される１種以上の細胞集団の播種または沈着が当該分野にいて公知である種々の方法によって達成できることを正しく理解するであろう。例えば、バイオリアクターインキュベーションおよび培養（Ｂｅｒｔｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．米国公開出願２００７０２７６５０７；ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第７，１１２，２１８号；Ａｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，６１８，７１８号；Ｎｉｋｌａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第６，５３７，５６７号）；圧力で得られる播種（Ｔｏｒｉｇｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１６（７）：７２９−３９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｍａｙ；２７（１３）：２７３８−４６）；および静電播種（Ｂｏｗｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，７２３，３２４号、これらの各々はその全体が参照により組み込まれる）が使用されてもよい。加えて、細胞のエアロゾルを用いる電子スピンされた繊維を同時にコートする最近の技術が、播種または沈着のために適切であり得る（Ｓｔａｎｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２８：２７３８−２７４６）。
【０２３２】
１つの他の態様において、本発明は、本明細書に記載される構築物のいずれかのために、特定の細胞密度で細胞を播種した足場を提供する。１つの実施形態において、足場は約２０×１０６〜約３０×１０６細胞の密度で平滑筋細胞集団が播種される。別の実施形態において、細胞密度は約１×１０６〜約４０×１０６、約１×１０６〜約３０×１０６、約１×１０６〜約２０×１０６、約１×１０６〜約１０×１０６、または約１×１０６〜約５×１０６である。さらなる実施形態において、この密度は約２０×１０６〜約９８×１０６細胞である。なおさらなる実施形態において、この密度は約２１×１０６〜約９７×１０６、約２２×１０６〜約９５×１０６、約２３×１０６〜約９３×１０６、約２４×１０６〜約９１×１０６、約２５×１０６〜約８９×１０６、約２６×１０６〜約８７×１０６、約２８×１０６〜約８５×１０６、約２９×１０６〜約８３×１０６、約３０×１０６〜約８０×１０６、約３５×１０６〜約７５×１０６、約４０×１０６〜約７０×１０６、約４５×１０６〜約６５×１０６、または約５０×１０６〜約６０×１０６である。好ましい実施形態において、この密度は約２４×１０６〜約９１×１０６細胞である。別の実施形態において、この密度は約２．５×１０６〜約４０×１０６、約５×１０６〜約４０×１０６、約７．５×１０６〜約３５×１０６、約１０×１０６〜約３０×１０６、約１５×１０６〜約２５×１０６、および約１７．５×１０６〜約２２．５×１０６である。別の実施形態において、細胞密度は約１×１０６、約２×１０６、約３×１０６、約４×１０６、約５×１０６、約６×１０６、約７×１０６、約８×１０６、約９×１０６、約１０×１０６、約１１×１０６、約１２×１０６、約１３×１０６、約１４×１０６、約１５×１０６、約１６×１０６、約１７×１０６、約１８×１０６、約１９×１０６、約２０×１０６、約２１×１０６、約２２×１０６、約２３×１０６、約２４×１０６、約２５×１０６、約２６×１０６、約２７×１０６、約２８×１０６、約２９×１０６、約３０×１０６、約３１×１０６、約３２×１０６、約３３×１０６、約３４×１０６、約３５×１０６、約３６×１０６、約３７×１０６、約３８×１０６、約３９×１０６、約４０×１０６、約４１×１０６、約４２×１０６、約４３×１０６、約４４×１０６、約４５×１０６、約４６×１０６、約４７×１０６、約４８×１０６、約４９×１０６、約５０×１０６、約５１×１０６、約５２×１０６、約５３×１０６、約５４×１０６、約５５×１０６、約５６×１０６、約５７×１０６、約５８×１０６、約５９×１０６、約６０×１０６、約６１×１０６、約６２×１０６、約６３×１０６、約６４×１０６、約６５×１０６、約６６×１０６、約６７×１０６、約６８×１０６、約６９×１０６、約７０×１０６、約７１×１０６、約７２×１０６、約７３×１０６、約７４×１０６、約７５×１０６、約７６×１０６、約７７×１０６、約７８×１０６、約７９×１０６、約８０×１０６、約８１×１０６、約８２×１０６、約８３×１０６、約８４×１０６、約８５×１０６、約８６×１０６、約８７×１０６、約８８×１０６、約８９×１０６、約９０×１０６、約９１×１０６、約９２×１０６、約９３×１０６、約９４×１０６、約９５×１０６、約９６×１０６、約９７×１０６、約９８×１０６、または約９９×１０６である。
【０２３３】
さらなる態様において、本発明は、足場のｃｍ２あたり特定の細胞密度で細胞が播種された足場を提供する。１つの実施形態において、密度は、約３，０００細胞／ｃｍ２〜約１５，０００細胞／ｃｍ２、約３，５００細胞／ｃｍ２〜約１４，５００細胞／ｃｍ２、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１４，０００細胞／ｃｍ２、約４，５００細胞／ｃｍ２〜約１３，５００細胞／ｃｍ２、約５，０００細胞／ｃｍ２〜約１３，０００細胞／ｃｍ２、約４，５００細胞／ｃｍ２〜約１３，５００細胞／ｃｍ２、約５，０００細胞／ｃｍ２〜約１３，０００細胞／ｃｍ２、約５，５００細胞／ｃｍ２〜約１２，５００細胞／ｃｍ２、約６，０００細胞／ｃｍ２〜約１２，０００細胞／ｃｍ２、約６，５００細胞／ｃｍ２〜約１１，５００細胞／ｃｍ２、約７，０００細胞／ｃｍ２〜約１１，０００細胞／ｃｍ２、約７，５００細胞／ｃｍ２〜約１０，５００細胞／ｃｍ２、約８，０００細胞／ｃｍ２〜約１０，０００細胞／ｃｍ２、約７，５００細胞／ｃｍ２〜約９，５００細胞／ｃｍ２、または約８，０００細胞／ｃｍ２〜約９，０００細胞／ｃｍ２である。好ましい実施形態において、この密度は、約３，０００細胞／ｃｍ２〜約７，０００細胞／ｃｍ２、または約９，０００細胞／ｃｍ２〜約１５，０００細胞／ｃｍ２である。好ましい実施形態において、この密度は、約９．５×１０４細胞／ｃｍ２、約１０×１０４細胞／ｃｍ２、約１０．５×１０４細胞／ｃｍ２、約１１×１０４細胞／ｃｍ２、約１１．５×１０４細胞／ｃｍ２、約１２×１０４細胞／ｃｍ２、約１２．５×１０４細胞／ｃｍ２、約１３×１０４細胞／ｃｍ２、約１３．５×１０４細胞／ｃｍ２、約１４×１０４細胞／ｃｍ２、約１４．５×１０４細胞／ｃｍ２、または約１５×１０４細胞／ｃｍ２である。
【０２３４】
１つの実施形態において、細胞の沈着は、足場を細胞接着増強タンパク質と接触させるステップを含む。別の実施形態において、増強タンパク質は以下の１種以上である：フィブロネクチン、コラーゲン、およびＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）。１つの他の実施形態において、足場は、細胞接着増強タンパク質を含まない。別の実施形態において、細胞の沈着は、足場を細胞集団と接触させることの後で培養するステップを含む。なお別の実施形態において、培養することは、バイオリアクター中でパルス流および／または定常流によって馴化することを含んでもよい。
【０２３５】
次いで、本明細書に記載されるような脂肪または末梢血から単離された平滑筋細胞集団が、本明細書に記載される足場上に播種されて構築物を形成してもよい。
【０２３６】
以下は、足場上に細胞を播種するためのプロトコールの代表例である。脂肪または末梢血由来の平滑筋細胞は、７週間までの間拡大され、足場を播種するために要求される細胞の量を生成してもよい。足場を播種するために適切な細胞の密度は以下に記載される。脂肪由来の平滑筋細胞は、足場を播種して構築物を作り出すための細胞の収穫の前に、２継代の間拡大されてもよい。末梢血由来の平滑筋細胞培養は、足場播種のための収穫の前に、Ｐ３〜４まで拡大されてもよい。細胞播種のための足場を調製するために、適切な材料（例えば、ＰＧＡフェルト）は、サイズを合わせるために切断され、適した形状に縫合され、そして材料（例えば、ＰＬＧＡ）でコートされてもよい。次いで、足場は、適切な方法（例えば、エチレンオキサイド）を使用して滅菌されてもよい。細胞播種の前日に、滅菌された足場は、６０％エタノール／４０％Ｄ−ＰＢＳ、１００％Ｄ−ＰＢＳ、Ｄ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳまたはα−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳを用いて飽和により連続的にあらかじめ濡らされてもよく、続いて、Ｄ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳまたはα−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中、室温で一晩のインキュベーションを行ってもよい。次いで、足場は、脂肪−または末梢血由来の平滑筋細胞を播種でき、対象における移植まで（例えば、７日目まで）、播種された構築物は５％ＣＯ２で加湿３７℃インキュベーター中で成熟させることができる。当業者は、細胞の播種のための足場を調製するためのさらなる方法、および細胞を足場に播種するためのさらなる方法を正しく理解するであろう。
【０２３７】
１つの態様において、本発明は、減少された時間フレームで構築物を調製する方法を提供し、これは、構築物の移植を待っている対象に対して有利である。ＳＶＦから得られた未分化脂肪幹細胞は、平滑筋細胞への分化の前６週間の間、誘導性培地中でインキュベートされなければならないことが報告されている（Ｊａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００９、前出）。１つの実施形態において、この方法は、ａ）ヒト脂肪組織試料を入手するステップ；ｂ）試料から完全に分化した平滑筋細胞集団を単離するステップ；ｃ）この細胞集団を培養するステップ；およびｄ）この細胞集団を、形作られたポリマーマトリックス細胞構築物と接触させるステップを含み、ここで、ステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、約４５日間未満で実施される。別の実施形態において、単離するステップは細胞選択なしで実施される。別の実施形態において、単離するステップｂ）は、入手するステップａ）後約７２時間未満で実施される。なお別の実施形態において、培養するステップｃ）は、約４週間未満で実施される。他の実施形態において、接触させるステップｄ）は、約１０日間未満で実施される。別の実施形態において、ステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、約２８日間未満で実施される。１つの他の実施形態において、単離するステップｂ）は、入手するステップａ）後約４８時間未満で実施される。１つの実施形態において、培養するステップｃ）は、約２週間未満で実施される。別の実施形態において、接触するステップｄ）は、約５日間未満で実施される。すべての実施形態において、ヒト脂肪組織試料は、自系でない供給源から入手される。１つの他の実施形態において、この方法は、平滑筋細胞マーカーの発現を検出するステップをさらに含む。別の実施形態において、発現はｍＲＮＡ発現である。さらなる実施形態において、発現はポリペプチド発現である。１つの実施形態において、ポリペプチド発現は細胞内免疫蛍光によって検出される。
【０２３８】
１つの実施形態において、足場は、本明細書に記載されるような細胞集団を備える。別の実施形態において、足場は、本明細書に記載されるような細胞集団から本質的になる。１つの他の実施形態において、足場は、本明細書に記載されるような細胞集団からなる。
【０２３９】
Ａ．泌尿器系構築物
本発明は、泌尿器系の自然の管腔器官または組織構造の再構築、置き換え、増強、または再生における使用のための構築物を提供する。泌尿器系の器官または組織構造はまた、尿生殖器または泌尿生殖器の器官または組織構造と呼ばれてもよい。自然の器官または組織構造は、積層されて組織化されてもよい。
【０２４０】
別の実施形態において、マトリックスおよび細胞を含有する構築物は、いかなる他の細胞集団も含まない。好ましい実施形態において、構築物は尿路上皮細胞を含まない。
【０２４１】
これらの構築物は、例えば、泌尿器膀胱、尿管、および尿道が挙げられる、尿生殖器などの管腔器官または組織構造を必要がある対象に提供するために使用される。この対象は、このような器官または組織の再構築、増強、または置き換えを必要とし得る。１つの実施形態において、管腔器官または組織構造は膀胱またはその一部であり、ポリマーマトリックスまたは足場は、マトリックスの表面上に沈着した平滑筋細胞を有する。これらの構築物はまた、尿迂回路もしくは導管、または排尿筋等価物を提供するために使用されてもよい。
【０２４２】
１つの態様において、本発明は、本明細書に記載される細胞集団が播種されている足場またはマトリックスを提供する。
【０２４３】
本明細書に記載されるように、本明細書に記載される膀胱の増強または置き換え足場は、少なくとも１種、または少なくとも２種のマトリックスを含んでもよい。これらのマトリックスは、ポリマー性および／または生体適合性であってもよい。第１のポリマーマトリックスまたは第２のポリマーマトリックス、または、もしあれば、両方は、第１のポリマーマトリックスの第１の表面上もしくはその中、第２のポリマーマトリックスの第１の表面上もしくはその中、または両方に沈着された少なくとも１種の細胞集団を有してマトリックスまたは足場プラス細胞の構築物を形成し、ここで、少なくとも１種の細胞集団は、実質的に筋肉細胞集団を備える。この筋肉細胞集団は、例えば、平滑筋細胞集団である。別の実施形態において、第１の表面および第２の表面は、各々、第１および第２のポリマーマトリックスの外部表面である。
【０２４４】
膀胱導管、尿迂回路、または尿路導管構築物を形成するための足場またはマトリックスは、本明細書に記載される細胞集団が播種される。このような足場は細胞集団が播種されており、本明細書では「構築物」と呼ばれてもよい。１つの実施形態において、尿迂回路または膀胱導管構築物は、本明細書に記載されるような１種以上の足場、および本明細書に記載されるような１種以上の足場の１つ以上の表面に沈着された細胞集団から作られる。
【０２４５】
筋肉等価構築物を形成するための足場またはマトリックスは、例えば、泌尿器膀胱を含む尿生殖器などの既存の管腔器官または組織構造を増強するために、必要がある対象に使用されてもよい。この対象は、このような器官または組織の拡大または治療を必要とする可能性がある。１つの実施形態において、管腔器官または組織構造は、膀胱またはその一部であり、ポリマーマトリックスまたは足場は、マトリックスの表面上に沈着した平滑筋細胞を有する。１つの実施形態において、構築物は、排尿筋等価物を提供するために使用される。
【０２４６】
当業者は、細胞集団をマトリックスまたは足場上に沈着させるためのいくつかの適切な方法が存在することを正しく理解している。
【０２４７】
１つの態様において、構築物は、新たな器官または組織構造の必要がある対象への移植のために適切である。１つの実施形態において、構築物は、サイトカインＭＣＰ−１を産生する細胞の集団を備える。別の実施形態において、ＭＣＰ−１は、移植の部位への対象またはレシピエントの自然の間葉系幹細胞の移動を誘発する。１つの実施形態において、レシピエントの自然の間葉系幹細胞を移動することは、新たな器官または組織構造の再生を補助する。
【０２４８】
１つの態様において、本発明の構築物は、移植後の対象に特定の特性を提供するように適応される。１つの実施形態において、構築物は、移植後の対象に再生を提供するように適応される。別の実施形態において、構築物は、移植の部位で対象における再生を促進するように適応される。例えば、移植後、再生された組織は、移植の部位において、構築物それ自体から形成されてもよい。別の実施形態において、構築物は、移植後に対象に機能的特質を付与してもよい。例えば、尿迂回路構築物は、第１の尿管から管状足場の内部までの対象の尿の通過を可能にするように適応されてもよく（例えば、第１の側面開口）、ならびに／または対象の外への尿の一時的貯蔵および通過を提供するように適応されてもよい（例えば、管状足場）。１つの実施形態において、尿迂回路構築物は、移植されると、上皮化された粘膜を提供するように適応されてもよい。別の実施形態において、構築物は、対象における新たな器官または組織構造の恒常性調節的な発生を提供するように適応されてもよい。
【０２４９】
１つの態様において、本発明は、本明細書に記載されるように、尿迂回路構築物の管状足場の第１の末端と、腹壁セクションの間の接続の部位に移植されるように適応されたメッシュ構造を提供する。１つの実施形態において、メッシュ構造は、本明細書に記載される尿迂回路構築物の移植後に新尿路導管の形成を容易にするように適応される。別の実施形態において、メッシュ構造は、皮下脂肪と骨格筋の間に移植されるように適応される。１つの他の実施形態において、メッシュ構造は、瘻孔が開いた状態を提供するように適応される。別の実施形態において、メッシュ構造は、腹壁における開口に付属する位置に配置されている（例えば、瘻孔の位置）。好ましい実施形態において、メッシュ構造は、ヘルニアパッチ、より好ましくは、皮下ヘルニアパッチである。
【０２５０】
泌尿器系の器官または組織構造を用いる使用のための構築物は、本明細書に記載される平滑筋細胞集団が播種されてもよい。ＳＭＣ集団は、再構築、置き換え、増強、または再生の対象である器官または組織構造ではない供給源、例えば、脂肪または末梢血から得られてもよく、ここで、この供給源は、構築物の必要がある対象に対して、自系または自系でなく、例えば、同種異系または同系である。
【０２５１】
１つの他の態様において、本発明は、自系でない供給源である膀胱供給源から得られる平滑筋細胞（ＳＭＣ）を含有する泌尿器系の自然の管腔器官または組織構造の再構築、置き換え、増強、または再生における使用のための構築物に関わる。自系でない供給源は、同種異系供給源または同系供給源であってもよい。自系でない膀胱由来のＳＭＣは、本明細書に記載されるプロトコールに従って、適切な足場上に播種されてもよい。１つの好ましい実施形態において、構築物は、足場、および膀胱由来のＳＭＣから形成されるが、尿路上皮細胞は含まない。膀胱由来のＳＭＣは、構築物を形成するために、膀胱増強、膀胱置き換え、尿路導管、または筋肉等価足場に播種されてもよい。
【０２５２】
Ｂ．胃腸組織構築物
１つの態様において、本発明は、細胞集団が播種されている１種以上の胃腸（ＧＩ）関連ポリマー足場またはマトリックスを提供する。このようなＧＩ足場は少なくとも１種の細胞集団が播種されており、本明細書では「構築物」と呼ばれてもよい。１つの実施形態において、足場は、胃腸（ＧＩ）組織供給源から得られるものではない細胞集団が播種されている。非ＧＩ供給源は、脂肪または末梢血であってもよい。別の実施形態において、細胞集団はＳＭＣ集団である。足場は、例えば、胃腸細胞集団が挙げられる他の細胞集団を実質的に含まなくてもよい。足場は、１種の細胞集団、例えば、ＧＩ組織から得るものではないＳＭＣ集団を備えてもよく、これからなってもよく、またはこれから本質的になってもよい。別の実施形態において、足場は、例えば、食道組織または腸足場などのＧＩ組織足場であってもよい。
【０２５３】
１つの実施形態において、自系ＳＭＣ細胞集団は、必要がある対象の脂肪組織または末梢血から単離できる。この細胞集団は、対象のＧＩ系の中の部位における移植のために適切な足場に播種できる。本発明の細胞集団の利点は、対象が欠陥のあるＧＩ系、例えば、ＧＩ系の癌を有するならば、適切なＳＭＣは、対象のＧＩ系から供給するために利用可能でないかもしれないことである。例えば、食道癌の場合において、対象のＧＩ系の一部またはすべてが除去される場合において、細胞集団が使用されてもよい。対象における食道または食道の一部の除去に際して、自系ＳＭＣ集団は、脂肪生検から単離でき、培養でき、適切な足場上で播種でき、そして対象に移植できて、新たな食道または新たな食道組織構造を提供する。
【０２５４】
１つの他の態様において、本発明は、ＳＭＣ集団およびＧＩ細胞集団が播種されている１種以上のポリマー足場またはマトリックスを提供する。１つの実施形態において、細胞−播種されたポリマーマトリックスまたはマトリックス群は、胃腸（ＧＩ）組織構築物または新ＧＩ構築物を形成する。１つの他の態様において、本発明は、ＳＭＣ集団の使用を通して、ＧＩ細胞集団の沈着または播種を容易にするために適応されている構築物に関わる。ＧＩ組織足場上へのまたはその中への脂肪由来のＳＭＣ集団の沈着または播種が、ＧＩ細胞集団の引き続く播種または沈着を増強する可能性があることが発見された。１つの実施形態において、以前に沈着したＳＭＣ集団を有する構築物は、足場の表面上またはその中のＧＩ細胞集団の移動または播種を容易にする。別の実施形態において、以前に沈着したＳＭＣ集団を有する構築物は、足場および／または沈着したＳＭＣ集団と接触するために、ＧＩ細胞集団の移動を容易にする。ＧＩ細胞集団の移動は、インビトロまたはインビボであってもよい。１つの他の実施形態において、ＧＩ細胞集団は、食道、小腸、大腸、胃、結腸、または肛門括約筋の１つから得られる。
【０２５５】
細胞は、本明細書に記載されるプロトコールに従ってＧＩ足場上に播種されてもよい。実施例１１および１３は、ＧＩ足場上に細胞集団を播種する例示的な方法を提供する。当業者は、細胞の播種および足場への細胞の播種のために足場を調製するためのさらなる方法を正しく理解するであろう。
【０２５６】
１つの実施形態において、ＧＩ足場は、本明細書に記載されるような細胞集団を備える。別の実施形態において、ＧＩ足場は、脂肪由来のＳＭＣ集団およびＧＩ細胞集団を備える。ＧＩ細胞集団は、食道細胞集団または小腸細胞集団であってもよい。別の実施形態において、足場は、本明細書に記載されるように、脂肪由来のＳＭＣ集団およびＧＩ細胞集団から本質的になる。１つの他の実施形態において、足場は、本明細書に記載されるように、脂肪由来のＳＭＣ集団およびＧＩ細胞集団からなる。
【０２５７】
別の態様において、本発明は、平滑筋細胞集団のみが播種されている構築物を提供する。１つの実施形態において、構築物は、脂肪−または血液由来のＳＭＣ集団のみが播種されている。このような構築物は、非限定的に、食道細胞集団（例えば、食道上皮細胞集団）、小腸細胞集団、大腸細胞集団、胃細胞集団、結腸細胞集団、または肛門括約筋細胞集団が挙げられる、いかなる他の胃腸細胞集団も含まない。別の実施形態において、構築物は、線維芽細胞細胞集団，例えば、真皮線維芽細胞細胞集団を含まない。
【０２５８】
別の実施形態において、ＳＭＣ−のみの構築物は、食道、小腸、大腸、胃、結腸、または肛門括約筋の構築物から選択される。１つの他の実施形態において、この構築物は、足場および平滑筋細胞集団、例えば、脂肪−または血液由来のＳＭＣ集団を備えるか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２５９】
１つの他の態様において、本発明の構築物は、本明細書に記載される治療の使用および治療の方法のためにこれらの構築物を特に有利にする、特定の構造的かつ機能的な特色を提供されてもよい。１つの実施形態において、この構築物は、第１の表面、および第１の表面上またはその中に直接播種された細胞集団を有するマトリックスとして提供される足場から作られる。この構築物は、１つの細胞集団のみを有してもよい。１つの実施形態において、１つの細胞集団は平滑筋細胞集団である。足場は、上記のように、外部表面または管腔表面上のコルゲートを提供されてもよい。別の実施形態において、構築物は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）集団が播種された足場から作られてもよく、ここで、構築物は、ＳＭＣ−播種された構築物への別の細胞集団の移動を誘引するからまたは容易にする機能的能力を有する。実施例１３は、この機能的能力の実証を提供する。移動性細胞集団は、食道細胞集団、小腸細胞集団、大腸細胞集団、胃細胞集団、結腸細胞集団、または肛門括約筋細胞集団であってもよい。
【０２６０】
１つの他の実施形態において、移動性細胞集団は食道上皮細胞集団であってもよい。インタクトで自然の食道は、上皮細胞の内部管腔層からなる。対象への移植の前に、自然の食道組織から構築物までまたはその中への上皮細胞の移動を誘引するかまたは容易にする機能的能力を有することが、上皮細胞が播種されていないＳＭＣ−播種された構築物にとって有利である。
【０２６１】
別の実施形態において、マトリックスまたは足場プラス細胞の構築物を形成するために、第１の足場またはポリマーマトリックス（もしあれば、および／または第２の足場またはポリマーマトリックス、または両方）は、第１のポリマーマトリックスの第１の表面（および／または第２のポリマーマトリックスの第１の表面、または両方）上にまたはその中に沈着された少なくとも１種のＳＭＣ集団を備え、ここで、少なくとも１種の細胞集団はＳＭＣ集団を備える。ＳＭＣは、脂肪−または血液由来の平滑筋細胞集団である。
【０２６２】
１つの態様において、本明細書に記載される構築物は、構築物の移植後に、対象への再生されたＧＩ器官またはＧＩ組織を提供するように適応されるか、またはそれが可能である。ＧＩ器官またはＧＩ組織を再生すること／再生されたＧＩ器官またはＧＩ組織の態様は、実施例８（食道）および９（小腸）において記載されている。
【０２６３】
１つの態様において、本発明は、必要がある対象における胃腸（ＧＩ）障害を治療するための構築物、およびこれを使用する治療の方法を提供する。１つの実施形態において、この構築物は、（ａ）足場；（ｂ）足場の第１の表面の上にまたはその中に沈着された胃腸組織から得られたものではない第１の細胞集団および（ｃ）胃腸組織から得られた第２の細胞集団を含む。第１の細胞集団は、脂肪から得ることができる。第１の細胞集団は平滑筋細胞集団であってもよい。別の実施形態において、ＳＭＣ集団は、少なくとも１種の平滑筋細胞マーカーについて陽性であってもよい。１つの他の実施形態において、第２の細胞集団は、食道、小腸、大腸、胃、結腸、または肛門括約筋から得られる。
【０２６４】
なお別の実施形態において、構築物は、少なくとも１種のＧＩマーカーについて陽性である。ＧＩマーカーは上皮細胞マーカーであってもよい。
【０２６５】
１つの実施形態において、第２の細胞集団は、足場の第２の表面上にまたはその中に沈着されている。別の実施形態において、第２の細胞集団は、沈着された第１の細胞集団と接触されている。
【０２６６】
１つの他の実施形態において、構築物は、協調リズム収縮機能を有する細胞を含む。別の実施形態において、構築物は、移植後に胃腸組織を形成するように適応される。ＧＩ組織は、食道、小腸、大腸、胃、結腸、または肛門括約筋であってもよい。
【０２６７】
別の実施形態において、構築物は、移植されると、再生されたＧＩ組織を形成する。１つの他の実施形態において、再生されたＧＩ組織は、食道、小腸、大腸、胃、結腸、または肛門括約筋組織である。別の実施形態において、再生された組織は食道組織である。再生された食道組織は、管腔粘膜表面および／または固有層および筋層粘膜を有してもよい。好ましい実施形態において、再生されたＧＩ組織は食道組織である。別の実施形態において、構築物は、移植されると、上皮化された管腔粘膜表面を形成するように適応される。
【０２６８】
すべての実施形態において、足場はＧＩ組織足場である。すべての実施形態において、ＧＩ組織足場は、食道組織足場、小腸組織足場、大腸組織足場、胃組織足場、結腸組織足場、または肛門括約筋組織足場である。
【０２６９】
すべての実施形態において、構築物はＧＩ組織構築物である。すべての実施形態において、ＧＩ組織構築物は、食道組織構築物、小腸組織構築物、大腸組織構築物、胃組織構築物、結腸組織構築物、または肛門括約筋組織構築物である。
【０２７０】
Ｃ．呼吸組織構築物
１つの態様において、本発明は、本明細書に記載される細胞集団が播種されている呼吸組織構築物を提供する。細胞集団が播種されているこのような足場は、本明細書では「構築物」と呼ばれる。１つの実施形態において、呼吸組織構築物は、本明細書に記載されるような１種以上の足場、および本明細書に記載されるような１種以上の足場の１つ以上の表面に沈着された細胞集団から作られる。足場は、自系または自系でない供給源から得られた平滑筋細胞（ＳＭＣ）集団が播種されている。１つの実施形態において、自系ＳＭＣ細胞集団は、必要がある対象の脂肪組織または末梢血から単離できる。この細胞集団は、対象の肺の中の部位における移植のために適切な足場に播種できる。本発明の細胞集団の利点は、対象が欠陥のある呼吸系、例えば、肺癌を有する場合に、適切なＳＭＣが対象の肺からの供給源のために利用できないかもしれないことである。この細胞集団は、肺癌の場合などに、対象の肺の一部またはすべてが取り除かれる場合において、使用されてもよい。対象における肺または肺の一部の除去の際に、自系ＳＭＣ集団は、新たな肺または新たな肺組織構造を提供するために、生検から単離でき、培養でき、適切な足場上に播種でき、そして対象に移植できる。
【０２７１】
本発明はまた、足場、足場の第１の表面上にまたはその中に沈着された呼吸組織から得たものではない第１の細胞集団；および呼吸組織から得られた第２の細胞集団を含む呼吸組織構築物を提供する。１つの実施形態において、第１の細胞集団は脂肪から得られる。別の実施形態において、第１の細胞集団は平滑筋細胞集団（ＳＭＣ）である。ＳＭＣ集団は、本明細書に記載されるプロトコールに従って、最初に足場上に播種されてもよく、その後、呼吸細胞集団が、ＳＭＣをあらかじめ播種された足場上に播種できる。当業者は、異なる方法が細胞集団の播種のために適切であり得ることを正しく理解するであろう。
【０２７２】
１つの他の実施形態において、構築物は少なくとも１種の平滑筋細胞マーカーについて陽性である。なお別の実施形態において、構築物は以下の１種以上のＳＭＣマーカーについて陽性である：ミオカルディン、アルファ−平滑筋アクチン、カルポニン、ミオシン重鎖、ＢＡＡＬＣ、デスミン、筋線維芽細胞抗原、ＳＭ２２、およびこれらの任意の組み合わせ。１つの実施形態において、第２の細胞集団は肺から得られる。別の実施形態において、構築物は、少なくとも１種の呼吸組織マーカーについて陽性である。なお別の実施形態において、呼吸マーカーは以下の１種以上である：細気管支マーカー、肺胞マーカー、および上皮マーカー。１つの他の実施形態において、構築物は、以下の呼吸組織マーカーの１種以上について陽性である：Ｃｌａｒａ細胞分泌タンパク質（ＣＣＳＰ）；プロ界面活性剤タンパク質Ｃ（ＰｒｏＳＰ−Ｃ）；ＫＲＴ１８；セクレトグロビン、ファミリー１Ａ、メンバー１（ウテログロビンまたはＳＣＧＢ１Ａ１）；界面活性剤タンパク質Ａ１（ＳＦＴＰＡ１）；およびこれらの任意の組み合わせ。１つの実施形態において、細気管支マーカーはＣＣＳＰおよび／またはＳＣＧＢ１Ａ１であり、肺胞マーカーはプロＳＰ−Ｃおよび／またはＳＦＴＰＡ１であり、ならびに上皮マーカーはＫＲＴ１８である。別の実施形態において、第２の細胞集団は、足場の第２の表面上にまたはその中に沈着されている。１つの他の実施形態において、第２の細胞集団は沈着された第１の細胞集団と接触している。なお別の実施形態において、構築物は１以上の肺胞形成単位（ＡＦＵ）を含む。１つの実施形態において、構築物は、協調リズム収縮機能を有する細胞を含む。別の実施形態において、構築物は、移植後に呼吸組織を形成するように適応される。他の実施形態において、呼吸組織は肺組織である。肺組織には肺胞組織および／または細気管支組織が含まれてもよい。
【０２７３】
これらの構築物は、必要がある対象に、肺組織構造などの組織構造を提供するために使用される。この対象は、呼吸組織の再構築、増強、または置き換えを必要とし得る。１つの実施形態において、呼吸組織は肺またはその一部であり、ポリマーマトリックスまたは足場は、マトリックスの表面上に沈着した平滑筋細胞を有する。
【０２７４】
１つの態様において、本発明の呼吸組織構築物は、移植後に対象に特定の特色を提供するように適応される。１つの実施形態において、構築物は、移植後に対象に再生を提供するように適応される。別の実施形態において、構築物は、移植の部位で対象における再生を促進するように適応される。例えば、移植後に、再生された組織は、移植の部位で、構築物それ自体から形成されてもよい。別の実施形態において、構築物は、移植後に、対象に機能的属性を付与してもよい。１つの実施形態において、構築物は、移植の部位で、肺胞形成単位（ＡＦＵ）を形成するように適応されてもよい。
【０２７５】
１つの態様において、本発明は、脂肪由来の平滑筋細胞が播種されていなかった足場に関連して比較して、肺胞形成単位（ＡＦＵ）の数の増加を提供するための、肺細胞懸濁液を播種するための基質としての脂肪由来の平滑筋細胞が播種された足場の使用に関わる。このことは、肺組織再生に関して、本明細書に記載される、当該分野の現在の状態を超えた潜在的に深い改善を有する。完全に特徴付けられた自系の分化細胞型を使用する再生医療ベースのアプローチは、自系でない細胞型、例えば、同種異系胎児由来（Ａｎｄｒａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７前出）または未分化の多能性幹細胞／前駆細胞（Ｓｈｉｇｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００６前出）を超えて有利である。脂肪由来の平滑筋細胞は、文献に記載されてきた他の細胞を超えた特定の利点を有する（Ｂａｓｕ  ａｎｄ  Ｌｕｄｌｏｗ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０  Ｏｃｔ；２８（１０）：５２６−３３．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ａｕｇ  ２５）。本発明は、ＳＭＣ集団の使用を通して、呼吸細胞集団の沈着または播種を容易にするために適応される呼吸組織構築物に関わる。呼吸組織足場上またはその中に脂肪由来のＳＭＣ集団を沈着または播種させることが、引き続く呼吸細胞集団の播種または沈着を増強する可能性のあることが発見された。１つの実施形態において、以前に沈着されたＳＭＣ集団を有する構築物は、足場の表面上またはその中への呼吸細胞集団の移動または播種を容易にする。別の実施形態において、以前に沈着されたＳＭＣ集団を有する構築物は、足場および／または沈着したＳＭＣ集団と接触するために呼吸細胞集団の移動を容易にする。呼吸細胞集団の移動は、インビトロであってもよいし、またはインビボであってもよい。
【０２７６】
１つの他の態様において、本発明は、ＳＭＣ集団および呼吸細胞集団が播種されている１種以上のポリマー足場またはマトリックスを提供する。１つの実施形態において、細胞−播種されたポリマーマトリックスまたはマトリックス群は呼吸組織構築物を形成する。
【０２７７】
１つの態様において、本発明は、必要がある対象に、肺などの既存の呼吸器官または組織構造を増強するために使用されてもよい筋肉等価構築物を提供する。対象は、このような器官または組織の拡大または治療を必要とし得る。１つの実施形態において、呼吸組織は肺またはその一部であり、そしてポリマーマトリックスまたは足場は、マトリックスの表面上に沈着された平滑筋細胞を有する。
【０２７８】
Ｄ．血管構築物
本発明は、血管足場およびそれを作る方法に関する。足場は、血管構築物を形成するように操作される。１つの態様において、本発明は血管構築物に関わる。１つの実施形態において、構築物は、ａ）第１および第２の表面を有する生体適合性管状足場；ならびにｂ）足場の第１の表面上またはその中に沈着された血管でない供給源から得られた第１の細胞集団を含む。別の実施形態において、第１の細胞集団は平滑筋細胞集団である。１つの他の実施形態において、第２の細胞集団は血管でない供給源から得ることができる。第２の細胞集団は、足場の第２の表面上またはその中に沈着されてもよい。別の実施形態において、第２の細胞集団は内皮細胞集団である。すべての実施形態において、血管でない供給源は脂肪組織である。すべての実施形態において、血管でない供給源は末梢血である。別の実施形態において、管状足場の第１の表面は外部表面である。好ましい実施形態において、外部表面はコルゲート化されている。１つの他の実施形態において、管状足場の第２の表面は内部管腔表面である。すべての実施形態において、足場は合成材料を含んでもよい。すべての実施形態において、足場は天然材料を含んでもよい。
【０２７９】
別の実施形態において、第１の細胞集団は平滑筋細胞集団である。１つの他の実施形態において、第２の細胞集団は、血管でない供給源から得ることができる。第２の細胞集団は、足場の第２の表面上またはその中に沈着されてもよい。別の実施形態において、第２の細胞集団は内皮細胞集団である。すべての実施形態において、血管でない供給源は脂肪組織である。すべての実施形態において、血管でない供給源は末梢血である。別の実施形態において、管状足場の第１の表面は外部表面である。好ましい実施形態において、外部表面はコルゲート化されている。１つの他の実施形態において、管状足場の第２の表面は内部管腔表面である。すべての実施形態において、足場は合成の材料を含んでもよい。すべての実施形態において、足場は天然の材料を含んでもよい。１つの実施形態において、第１のまたは第２の細胞集団を得るために使用される血管でない供給源は対象に対して自系である。別の実施形態において、第１のまたは第２の細胞集団を得るために使用される血管でない供給源は対象に対して自系でない。
【０２８０】
別の態様において、本発明は、本発明の足場から得られる血管構築物を提供する。自然の血管とのそれらの実質的な類似性を考慮すると、足場は、次には心臓血管疾患の治療のために血管バイパス移植片として使用できる構築物を作製するための改変に対して特に適している。血管バイパス移植片には動静脈（ＡＶ）シャントが挙げられる。好ましい実施形態において、本発明の足場は、心臓血管疾患を治療する際の使用のために、小さな直径、典型的には６ｍｍ未満を有する血管構築物を作製するために使用できる。
【０２８１】
本明細書で論じられているように、足場のある特定の実施形態は、弾性率および弾性率遷移の範囲、およびこれらの任意の組み合わせに起因するＪ形状ストレス／緊張曲線によって特徴付けられるストレスおよび緊張に対して機械的応答を呈することが示された。弾性率パラメーターに加えて、血管移植片を作る際の使用のために足場を魅力的にする、足場によって呈される他の特性が存在する。１つの態様において、本発明の足場は、まず血管移植片としての使用のために血管構築物を作るために、および血管移植片が、一旦移植されると開いた状態を保持することを確実にするために、足場を特に適切にする特定の特性を呈する。このような特性には、非限定的に、足場上への細胞の播種を可能にする特性、足場の破砕に対する抵抗性を提供する特性、および足場に対する粘弾性を提供する特性が挙げられる。
【０２８２】
１つの実施形態において、足場上の細胞の播種に有利な特性は、細孔径が、管状要素の外膜または外部側面における約１００ミクロンから、管腔または内部側面における約５〜約１５ミクロンまで徐々に減少する、細孔勾配に起因する。細孔径が、足場上またはその中での首尾よい細胞の播種のための重要な要因であることは当該分野においてよく知られている。例えば、細孔径は、様々な細胞型が、インビボで観察されるものと同様の様式で、他の移動している細胞と相互作用できるように、様々な細胞型が足場の表面におよび足場を通して移動するために十分に大きくなければならない。本発明は、特定の細孔勾配が首尾よい細胞の播種に寄与するという発見に関わる。１つの実施形態において、細孔勾配は、足場を細胞に接近可能にし、それによって、細胞播種のためのその能力を増強する。別の実施形態において、細孔勾配は約１００ミクロン（外部側面）〜約５ミクロン（内部側面）、約１００ミクロン（外部側面）〜約６ミクロン（内部側面）、約１００ミクロン（外部側面）〜約７ミクロン（内部側面）、約１００ミクロン（外部側面）〜約８ミクロン（内部側面）、約１００ミクロン（外部側面）〜約９ミクロン（内部側面）、または約１００ミクロン（外部側面）〜約１０ミクロン（内部側面）である。
【０２８３】
１つの態様において、細孔勾配は、ＴＥ足場の管腔内部側面上の細胞の播種のため、およびＴＥ足場の外部外膜側面上の細胞の播種のために有利であるアーキテクチャーを提供する。１つの実施形態において、管腔内部表面上のより小さな細孔径は、内部表面上およびその中の内皮細胞の播種のために適合しており、外部外膜側面上のより大きな細孔径は、外部表面上およびその中の平滑筋細胞の播種のために適合している。別の実施形態において、内皮細胞は、ＴＥ足場の内部管腔表面上およびその中の単層または平らなシート様構造を形成するように播種され、ならびに／または平滑筋細胞は、ＴＥ足場の外部外膜表面上および／もしくはその中に播種される。
【０２８４】
ある実施形態において、ＴＥ足場の内部管腔表面上におよびそれを通して播種された内皮細胞は、特定の細孔径を超えた外部外膜表面に向かって移動することができない。好ましい実施形態において、細孔径は約１５〜約２０ミクロンである。別の好ましい実施形態において、細孔径は約１５ミクロン、約１６ミクロン、約１７ミクロン、約１８ミクロン、約１９ミクロン、または約２０ミクロンである。
【０２８５】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される血管足場から得られる血管構築物を提供する。結果として、これらの構築物は、自然の血管において見い出されるものと実質的に同様の構造的特性および機能的特性を呈する。１つの実施形態において、本発明のＴＥＢＶは、異方性様式でストレスおよび緊張に機械的に応答する能力を有することによって特徴付けられる。別の実施形態において、ＴＥＢＶは、（ｉ）足場の破砕に対する抵抗性に有利に働く特性；および／または（ｉｉ）足場の粘弾性に有利に働く特性を有する。
【０２８６】
別の態様において、本発明の組織操作された血管（ＴＥＢＶ）は、移植後に観察される血管移植片に付随するある特定の合併症を調節できる。１つの実施形態において、ＴＥＢＶは、移植後にコンプライアンスのミスマッチを調節する。別の実施形態において、調節には以下の１つ以上が挙げられる：動脈瘤形成への抵抗性、拡張に対する抵抗性、破砕に対する抵抗性、血栓症に対する抵抗性、吻合過形成に対する抵抗性、および内膜過形成に対する抵抗性。当業者は、ＴＥＢＶによる調節に供されるさらなる要因を正しく理解するであろう。
【０２８７】
１つの態様において、本発明は、本明細書に記載されるように、足場および細胞集団を含有する血管構築物を提供する。１つの実施形態において、足場は、必要がある哺乳動物への移植のための適切である血管構築物を形成するように操作されてもよい。例えば、足場は、本明細書に記載される方法によって１種以上の細胞集団を加えることによって操作されてもよい。当業者は、本発明の血管構築物が、非限定的に、頸動脈、鎖骨下動脈、腹腔動脈、腸間膜動脈、腎動脈、腸骨動脈、細動脈、毛細血管、細静脈、鎖骨下静脈、頸静脈、腎静脈、腸骨静脈、大静脈が挙げられる多くの型の血管に適用可能であり得ることを正しく理解するであろう。
【０２８８】
血管構築物は、第２の管状要素の中に、および／または構築物の第２の管状要素の外部表面上に第１の細胞集団を有してもよい。好ましい実施形態において、第１の細胞集団は平滑筋細胞集団である。当業者は、非限定的に、ヒト大動脈平滑筋細胞、ヒト臍動脈平滑筋細胞、ヒト肺動脈平滑筋細胞、ヒト冠状動脈平滑筋細胞、ヒト気管支平滑筋細胞、ヒト橈骨動脈平滑筋細胞、およびヒト伏在または頸静脈平滑筋細胞が挙げられる、様々な型の平滑筋細胞（ＳＭＣ）が本発明における使用のために適切であり得ることを正しく理解している（Ｂｅｒｔｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．米国公開出願２００７０１９００３７号およびＬｕｄｌｏｗらの米国公開出願第２０１００１３１０７５号を参照のこと、これらの両方は、それらの全体が参照により組み込まれる）。Ｂｅｒｔｒａｍら（前出）によって記載されるように、ＳＭＣは、例えば、生きている対象からの生検および死体からの全体の器官の回収が挙げられる様々な供給源から単離されてもよい。Ｌｕｄｌｏｗら（前出）において記載されるように、ＳＭＣは、脂肪組織または末梢血から得られてもよい。ＳＭＣは、構築物を用いる治療の必要がある対象に対して自系細胞であってもよく、構築物のレシピエントであることが意図されている対象から単離された生検から単離されてもよい。ＳＭＣは、治療の必要がある対象に対して自系でなくてもよく、適切なドナーから得られた生検から単離されてもよい。
【０２８９】
１つの実施形態において、足場上に播種された平滑筋細胞集団は、血管でない供給源から得られる。１つの他の実施形態において、本発明の構築物は、血管供給源から得られた細胞を含まない。本発明の血管構築物は、血管でない供給源から得られる平滑筋細胞集団を備え、これらから本質的になり、またはこれらからなる。ＳＭＣ集団は、脂肪組織または末梢血から得ることができる。
【０２９０】
別の実施形態において、構築物は、構築物の内部または管腔表面上に第２の細胞集団を備える。好ましい実施形態において、第２の細胞集団は内皮細胞集団である。当業者は、非限定的に、ヒト冠状動脈内皮細胞、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト肺動脈内皮細胞、皮膚微小血管内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、ヒト臍帯動脈内皮細胞、ヒト伏在静脈内皮細胞、ヒト頸静脈内皮細胞、ヒト橈骨動脈内皮細胞、および内胸動脈内皮細胞などの動脈および静脈内皮細胞（ＥＣ）が挙げられる、様々な型の内皮細胞（ＥＣ）が本発明における使用のために適切であり得ることを正しく理解するであろう（米国公開出願第２００７０１９００３７号を参照のこと、その全体が参照により組み込まれる）。ＥＣは、非限定的に、脂肪組織、末梢血、血管実質、循環している内皮細胞および内皮細胞前駆体、例えば、骨髄前駆細胞、末梢血幹細胞および胚性幹細胞が挙げられる、様々な供給源から単離されてもよい（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．米国公開出願第２００４００４４４０３号およびＲａｆｆｉ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第６，８５２，５３３号を参照のこと、これらの各々は、それらの全体が参照により組み込まれる）。
【０２９１】
当業者は、本明細書に記載される１種以上の細胞集団の播種または沈着が当該分野において知られている様々な方法によって達成されてもよいことを正しく理解するであろう。例えば、バイオリアクターのインキュベーションおよび培養（Ｂｅｒｔｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．米国公開出願第２００７０２７６５０７号；ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第７，１１２，２１８号；Ａｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，６１８，７１８号；Ｎｉｋｌａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第６，５３７，５６７号）；圧力で誘導される播種（Ｔｏｒｉｇｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１６（７）：７２９−３９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｍａｙ；２７（１３）：２７３８−４６）；および静電播種（Ｂｏｗｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，７２３，３２４号）が使用されてもよい。加えて、細胞のエアロゾルを用いて電子スピン繊維を同時にコートする最近の技術は、播種または沈着のために適切である可能性がある（Ｓｔａｎｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２８：２７３８−２７４６）。
【０２９２】
１つの実施形態において、細胞の沈着は、細胞接着増強タンパク質と管状足場を接触させるステップを包含する。別の実施形態において、増強タンパク質は、以下の１種以上である：フィブロネクチン、コラーゲン、およびＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）。１つの他の実施形態において、管状足場は、細胞接着増強タンパク質を含まない。別の実施形態において、細胞の沈着は、１種以上の細胞集団と管状足場を接触させた後で培養するステップを含む。なお別の実施形態において、培養は、バイオリアクター中での脈動流および／または定常流によるコンディショニングを含んでもよい。
【０２９３】
Ｅ．眼組織構築物
別の態様において、本発明は、眼の障害を治療するために本明細書に記載されるＳＭＣ集団の適用を意図する。眼の障害は、対象が、眼の筋肉の不適当な機能に起因して欠陥のある眼を有するものである。平滑筋は眼の中の毛様体筋として存在し、様々な距離の物体を見るために眼の適応を制御し、そしてシュレム管を通して房水の流れを調節する。次いで、平滑筋は、眼の虹彩にもまた存在する。老眼および遠視などの眼の障害を有する個人は、これらのＳＭＣ集団から利益を得ることができる。１つの実施形態において、自系でないＳＭＣ細胞集団は、必要がある対象の脂肪組織または末梢血から単離できる。細胞集団は、対象の眼の中の部位における移植のために適切な足場に播種できる。本発明の細胞集団の利点は、対象が眼組織の限られた利用能に起因して、または生検を採取する困難さに起因して欠陥のある眼を有するならば、適切なＳＭＣが対象の眼からの供給源として利用可能でないかもしれないことである。自系でないＳＭＣ集団は、新たな眼組織を提供するために、生検から単離され、培養され、適切な足場上で播種され、そして対象に移植されることができる。別の実施形態において、本発明の平滑筋細胞集団は、眼でない供給源から得られ、移植によるなどの足場の使用なしで、眼の障害を有する対象に投与されてもよい。当業者は移植の適切な方法を正しく理解している。眼でない供給源は、自系であってもよいし、または自系でなくてもよい。
【０２９４】
６．使用の方法
Ａ．管腔器官および組織構造構築物の使用
１つの態様において、本発明は、積層して組織化された管腔器官または組織構造を提供することを、そのような治療の必要がある対象に対して行う方法を意図する。１つの実施形態において、対象は、器官または組織の再構築、再生、増強、または置き換えの必要があり得る。１つの実施形態において、この方法は、器官または組織構造の必要がある器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように形作られた生体適合性の合成のまたは天然のポリマーマトリックスを提供するステップを含む。この提供するステップの後には、対象に対して自系でなく、かつ再構築、再生、増強、または置き換えの対象である対応する器官または組織構造から得られたものではない、少なくとも１種の細胞集団を沈着させることが続いてもよい。沈着するステップは、ポリマーマトリックス上で細胞集団を培養することを含んでもよい。構築物を提供するためにマトリックス上に細胞集団を沈着した後で、これは、所望の積層して組織化された管腔器官または組織構造の形成のために、治療の部位において、患者に移植することができる。
【０２９５】
１つの他の態様において、本発明は、必要がある対象に、積層して組織化された管腔器官または組織構造を提供するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ａ）上記治療の必要がある器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように形作られた生体適合性の合成または天然のポリマーマトリックスを提供するステップ；ｂ）対象に対して自系でなく、かつ新たな器官または組織構造に対応する器官または組織から得られたものではないポリマーマトリックスの第１の領域上にまたはその中に細胞集団を沈着させるステップ；およびｃ）積層して組織化された管腔器官または組織構造の形成のために、形作られたポリマーマトリックス細胞構築物を上記対象に移植するステップを含む。
【０２９６】
本発明はまた、自然の管腔器官または組織構造を、自然ではない器官または人工器官で置き換えるための方法も提供する。この置き換え器官は、これが自然の器官のもともとの型ではないが、それにも関わらず、同じかまたは実質的に同様のやり方で機能することが可能であるという意味で、自然ではないかまたは人工である。対象の自然の器官または組織構造は、自然ではない器官または人工器官を形成するために、本明細書に記載される構築物を移植することによって、自然ではない器官または人工器官で置き換えられてもよい。自然ではない器官または人工器官は、構築物を受容する対象に対して自系であるかまたは自系でない細胞を備える。移植の最初の段階において、およびその後の有限の期間の間、構築物は、細胞が播種された生物分解性足場から構成されるが、足場の分解後、自然ではない器官または人工器官は、足場などの合成の構成要素を含有しない。１つの他の実施形態において、自然ではない器官または人工器官は、非限定的に、膀胱増強構築物、膀胱置き換え構築物、尿路導管構築物、筋肉等価構築物、呼吸組織構築物、胃腸組織構築物、または血管構築物が挙げられる移植された構築物から形成される。
【０２９７】
すべての実施形態において、本発明の方法は、血管新生を可能にするために、対象の網、腸間膜、筋肉筋膜、および／または腹膜で、移植された管腔器官または組織構造構築物を包むステップをさらに含む。
【０２９８】
１つの実施形態において、本明細書に記載される足場、細胞集団、および方法は、本明細書に記載される障害の治療において有用である医薬の調製のためにさらに使用されてもよい。これらの障害には、積層して組織化された管腔器官または組織構造の再生、再構築、増強、または置き換えを必要とする対象の任意の状態が挙げられる。
【０２９９】
別の実施形態において、移植された構築物上に沈着された細胞はＭＣＰ−１を産生し、移植の部位においてこれを放出し、これが自然の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が移植の部位に移動することを刺激する。１つの他の実施形態において、自然のＭＳＣは、移植の部位において、移植された構築物の再生を容易にしかつ／またはこれを増強する。
【０３００】
上記のように、本発明の構築物は、治療の必要がある対象に対して自系でない細胞集団を含有してもよい。加えて、本発明の細胞集団は、移植によるなどの足場の使用なしで、障害を有する対象に投与されてもよい。当業者は、移植の適切な方法を正しく理解するであろう。自系でない細胞集団は同種異系または同系であってもよい。
【０３０１】
１つの実施形態において、自系でない細胞および／または細胞それら自体を含有する構築物のいずれをも、免疫抑制剤の必要なしで、その必要がある対象に投与されてもよい。必要とされない免疫抑制剤には、非限定的に、アザチオプリン、シクロホスファミド、ミゾリビン、シクロスポリン、タクロリムス、水和物、クロラムブシル、ロベンザリット二ナトリウム、オーラノフィン、アルプロスタジル、グスペリムス塩酸塩、バイオシンソルブ、ムロモナブ、アレファセプト、ペントスタチン、ダクリズマブ、シロリムス、ミコフェノレートモフェチル、レフロノミド、バシリキシマブ、ドルナーゼα、ビンダリット、クラドリビン、ピメクロリムス、イロデカキン、セデリズマブ、エファリズマブ、エベロリムス、アニスペリムス、ガビリモマブ、ファラリモマブ、クロファラビン、ラパマイシン、シプリツマブ、サイレイトウ、ＬＤＰ−０３、ＣＤ４、ＳＲ−４３５５１、ＳＫ＆Ｆ−１０６６１５、ＩＤＥＣ−１１４、ＩＤＥＣ−１３１、ＦＴＹ−７２０、ＴＳＫ−２０４、ＬＦ−０８０２９９、Ａ−８６２８１、Ａ−８０２７１５、ＧＶＨ−３１３、ＨＭＲ−１２７９、ＺＤ−７３４９、ＩＰＬ−４２３３２３、ＣＢＰ−１０１１、ＭＴ−１３４５、ＣＮＩ−１４９３、ＣＢＰ−２０１１、Ｊ−６９５、ＬＪＰ−９２０、Ｌ−７３２５３１、ＡＢＸ−ＲＢ２、ＡＰ−１９０３、ＩＤＰＳ、ＢＭＳ−２０５８２０、ＢＭＳ−２２４８１８、ＣＴＬＡ４−１ｇ、ＥＲ−４９８９０、ＥＲ−３８９２５、ＩＳＡｔｘ−２４７、ＲＤＰ−５８、ＰＮＵ−１５６８０４、ＬＪＰ−１０８２、ＴＭＣ−９５Ａ、ＴＶ−４７１０、ＰＴＲ−２６２−ＭＧ、およびＡＧＩ−１０９６が挙げられる（米国特許第７，５６３，８２２号を参照のこと）。当業者は、要求されない他の免疫抑制剤を正しく理解している。
【０３０２】
別の態様において、本発明は、新たな器官または組織構造の移植後の患者の予後評価のための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、（ａ）上記対象から得られた試験試料中のＭＣＰ−１発現のレベルを検出するステップ；（ｂ）対照試料（または対照参照値）と比較した、ＭＣＰ−１発現のレベルに対する、試験試料中の発現レベルを決定するステップ；および（ｃ）ＭＣＰ−１発現レベルの決定に基づいて患者の再生予後を予測するステップを含み、ここで、対照試料（または対照参照値）と比較した場合に、試験試料中でより高いレベルでのＭＣＰ−１の発現が患者における再生についての予後である。
【０３０３】
別の態様において、本発明は、患者における新たな器官または組織構造の移植後の患者の予後評価のための方法を提供し、この方法は、（ａ）患者の生物学的試料を得ること；および（ｂ）生物学的試料中のＭＣＰ−１発現を検出することを含み、ここで、ＭＣＰ−１発現は、患者における再生について予後的である。ある実施形態において、対照試料（または対照参照値）と比較して患者の生物学的試料において増加したＭＣＰ−１発現は、対象における再生について予後的である。ある実施形態において、対照試料（または対照参照値）と比較して患者試料において減少したＭＣＰ−１発現は、対象における再生について予後的でない。患者試料は、血液または尿などの体液を備える試験試料であってもよい。
【０３０４】
ある実施形態において、決定するステップは、（ｉ）試験試料および対照におけるＭＣＰ−１発現の差次的なレベルを測定すること；ならびに／または（ｉｉ）試験試料および対照におけるＭＣＰ−１発現の差次的なレベルを測定することから得られたデータを分析することを備える。適切なソフトウェアおよびプロセッサは当該分野において周知であり、市販されている。プログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピーディスク、ハードドライブ、ＤＶＤなどの有形的媒体、またはプロセッサに付随するメモリ上に保存されたソフトウェアの中で具現化されてもよいが、しかし、当業者は、全体のプログラムもしくはその一部がプロセッサ以外のデバイスによって代替的に実行でき、および／または周知の様式でファームウェアおよび／または専用のハードウェアの中で具現化でき得ることを容易に正しく理解するであろう。
【０３０５】
決定するステップの後で、典型的には、測定結果、知見、診断、予測、および／または治療の推奨が記録され、かつ、例えば、技術者、医師、および／または患者に連絡される。ある特定の実施形態において、コンピューターは、患者および／または担当医などの関心を有する関係者にこのような情報を連絡するために使用される。ある実施形態において、アッセイが実施され、またはアッセイ結果は、診断の結果が連絡される国家もしくは管轄区域とは異なる国家または管轄区域において分析される。
【０３０６】
好ましい実施形態において、差次的なレベルのＭＣＰ−１発現を有する試験対象において測定されたＭＣＰ−１発現のレベルに基づく、予後、予測、および／または治療の推奨は、アッセイが完了し、予後および／または予測が生じた後で可能な限り速やかに対象に連絡される。結果および／または関連情報は、対象を治療する医師によって対象に連絡されてもよい。あるいは、結果は、文章、ｅメールなどの電子形態の連絡、または電話が挙げられる任意の連絡手段によって試験対象に直接連絡されてもよい。連絡は、ｅメール連絡の場合などで、コンピューターの使用によって容易にされてもよい。特定の実施形態において、予後試験および／または試験から引き出された結論および／または試験に基づく治療の推奨は、電気通信における当業者によく知られているコンピューターハードウェアおよびソフトウェアの組み合わせを使用して、自動的に生成されかつ対象に送達される。医療を指向する連絡システムの１つの例は、米国特許第６，２８３，７６１号に記載されている；しかし、本発明は、この特定の連絡システムを利用する方法に限定されない。本発明の方法の特定の実施形態において、試料のアッセイ、再生の予後および／または予測、ならびにアッセイの結果または予後の連絡を含む、方法のステップのすべてまたはいくつかは、多様な（例えば、外国の）管轄区域において実行されてもよい。
【０３０７】
別の態様において、本明細書に記載される予後方法は、移植の成功、および再生のためのリハビリテーション／治療プロトコールに関わる関心を有する関係者に情報を提供する。１つの実施形態において、これらの方法は、（ａ）上記対象から得られた試験試料中のＭＣＰ−１発現のレベルを検出するステップ；（ｂ）対照試料（または対照参照値）に関連するＭＣＰ−１発現のレベルに対する試験試料中の発現レベルを決定するステップ；および（ｃ）ＭＣＰ−１発現レベルの決定に基づいて、患者の再生予後を予測するステップを含み、ここで、対照試料と比較した場合の試験試料中のＭＣＰ−１のより高い発現のレベルは、新たな呼吸組織の再生の状態を示している。
【０３０８】
本明細書に記載されるように、「再生予後」または「再生的予後」とは、一般的に、本明細書に記載される構築物の移植のありそうな経過または結果の予想または予測をいう。１つの実施形態において、再生予後は、以下の任意の１つ以上を包含する：本明細書に記載される構築物の移植を通しての膀胱の置き換えまたは増強後の機能的膀胱の発達または改善、本明細書に記載される構築物の移植後の機能的尿迂回路の発達、本明細書に記載される構築物の移植後の膀胱の能力または膀胱の能力の改善の発達、または本明細書に記載される構築物の移植後の膀胱コンプライアンスまたは膀胱コンプライアンスの改善の発達、本明細書に記載される構築物の移植後の胃腸組織の再構築、増強、または置き換え後の胃腸（ＧＩ）機能またはＧＩ能力の発達または改善、本明細書に記載される構築物の移植を通した呼吸組織の置き換えまたは増強後の機能的肺の発達または改善、あるいは本明細書に記載される構築物の移植後の肺能力の発達または肺能力の改善。
【０３０９】
本明細書に記載されるような、「再生された組織」とは、本明細書に記載されるような構築物の移植後に発達する新たな組織構造の組織をいう。再生された構造は、膀胱または膀胱の一部、尿路導管、胃腸組織、または肺または肺の一部であってもよい。再生された組織は、根底にある平滑筋を伴う、連続する尿路上皮を含んでもよい。
【０３１０】
すべての実施形態において、本発明は、特定の移植後モニタリングステップを含む、必要がある対象に新たな器官または組織構造を提供するための方法に関する。１つの実施形態において、本明細書に記載されるような治療の必要がある対象に器官または組織構造を提供する方法は、上記のような再生の予後評価の移植後ステップを含んでもよい。別の実施形態において、移植された構築物の効果および性能が、超音波画像診断、腎盂像、ならびに尿および血液の分析などを通して、移植後の様々な時点においてモニタリングされる。
【０３１１】
１つの実施形態において、本明細書に記載される足場、細胞集団、構築物、および方法は、本明細書に記載される障害の治療において有用な医薬の調製のためにさらに使用されてもよい。これらの障害には、自然の管腔器官または組織構造の再生、再構築、増強、または置き換えを要求する、対象における任意の状態が挙げられる。器官または組織構造は積層されて組織化されてもよい。
【０３１２】
Ｂ．泌尿器系器官および組織構造構築物の使用
本発明は、泌尿器系の自然の管腔器官または組織構造の再構築、置き換え、増強、または再生における使用のための構築物の使用のための方法を提供する。泌尿器系の器官または組織構造はまた、尿生殖器または泌尿生殖器の器官または組織構造といわれる場合がある。自然の器官または組織構造は積層されて組織化されてもよい。
【０３１３】
１つの他の態様において、本発明は、必要がある対象に新たな膀胱またはその一部を提供するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ａ）膀胱またはその一部に適合するように形作られた生体適合性の合成または天然のポリマーマトリックスを提供すること；ｂ）自系でなくかつ対象の膀胱から得られたものではない細胞集団を、ポリマーマトリックスの第１の領域上またはその中に沈着させること；およびｃ）形作られたポリマーマトリックス細胞構築物を、新たな膀胱またはその一部の形成のために対象に移植することを含む。別の実施形態において、本明細書に記載される方法のステップｂ）の細胞集団は、平滑筋細胞マーカーについて陽性である、収縮機能を有する、１種以上の末梢血由来の平滑筋細胞を含有し、またはステップｂ）の細胞集団は、平滑筋細胞マーカーについて陽性である、収縮機能を有する１種以上の脂肪組織由来の平滑筋細胞を含有する。１つの他の実施形態において、細胞集団の収縮機能はカルシウム依存性である。
【０３１４】
すべての実施形態において、本発明の方法は、本明細書に記載されるように細胞集団が播種された、膀胱置き換え足場、膀胱増強足場、膀胱導管足場、または排尿筋筋肉等価足場に基づく、移植のための構築物を利用する。
【０３１５】
すべての実施形態において、本発明の方法は、血管新生を可能にするために、対象の網、腸間膜、筋肉、筋膜、および／または腹膜を用いて、移植された構築物を包むステップをさらに含む。包むステップは、本明細書に記載される泌尿器系構築物のいずれを移植するときにも使用されてもよい。
【０３１６】
器官または組織構造は膀胱または膀胱の一部である。１つの他の実施形態において、インビボで形成された、積層して組織化された管腔器官または組織構造は、天然の膀胱組織のコンプライアンスを呈する。
【０３１７】
１つの他の態様において、本発明は、必要がある対象における欠損がある膀胱のための尿迂回路または導管を提供するための方法を提供する。１つの実施形態において、必要がある対象に尿迂回路を提供するための方法は、（ａ）生体適合性導管足場を提供するステップ；（ｂ）上記足場の第１の領域上またはその中に、対象に対して自系でない第１の細胞集団を沈着するステップ；および（ｃ）尿が対象から出ることを可能にする導管を形成するために、ステップ（ｂ）の足場を上記対象に移植するステップを含む。別の実施形態において、生体適合性材料は生物分解性である。他の実施形態において、生体適合性材料はポリグリコール酸である。なお別の実施形態において、第１の細胞集団は実質的に平滑筋細胞集団である。
【０３１８】
１つの実施形態において、この方法は、本明細書に記載されるような尿迂回路または導管足場を提供するステップを含む。他のさらなる実施形態において、尿迂回路または導管足場は、本明細書に記載される第１の、第２の、および第３の足場などの複数の部品で提供される。別の実施形態において、この方法は、尿迂回路または導管構築物を形成するために、欠陥のある膀胱から得られた細胞集団を沈着するステップをさらに含む。１つの他の実施形態において、沈着ステップは、足場上で細胞集団を培養することを含んでもよい。ある実施形態において、この方法は、必要がある患者に尿迂回路構築物を移植するステップをさらに含む。別の実施形態において、移植は、欠陥のある膀胱の部位においてである。
【０３１９】
１つの実施形態において、構築物の開いた末端（例えば、腹壁に接続するように構成された第１の末端）が、腹壁または恥骨上壁を通して皮膚に吻合され（造孔術）、瘻孔または括約筋を形成する。別の実施形態において、カテーテルが、瘻孔開口を通して、構築物の管腔に挿入され、尿流出を提供する。
【０３２０】
図１１Ａ〜Ｂは、移植された導管構築物の構成を図示する。
【０３２１】
別の実施形態において、本発明の方法は、尿迂回路構築物の移植後に、障害物の存在について導管をモニタリングするステップをさらに含む。この障害物は、残骸の積み重ねによって引き起こされ得る。この方法は、障害物が検出されるならば、導管の管腔から残骸を取り除くステップをさらに含んでもよい（例えば、創面切除）。
【０３２２】
１つの態様において、本発明は、一時的ベースで、必要がある対象に尿迂回路を提供する。１つの実施形態において、一時的尿迂回路または導管構築物は、瘻孔開口を形成するために対象に移植され、カテーテルまたは他のデバイスが、瘻孔を通して、導管構築物の管腔まで一時的に挿入される。一時的な導管は、欠陥のある膀胱に対する永続的な解決法が試みられながら、尿が対象を出ることを可能にするという利点を提供する。例えば、導管構築物の移植は、細胞集団が播種された新たな膀胱構築物の移植の前、その後、またはそれと同時に実施することができる（例えば、Ｂｅｒｔｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．前出を参照のこと）。図１１Ｂは、一時的尿迂回路構築物の移植された構成要素の例を示す。
【０３２３】
１つの実施形態において、本発明の方法は、血管新生を可能にするために対象の網、腸間膜、筋膜、および／または腹膜を用いて、移植された尿迂回路または導管構築物を包むステップをさらに含んでもよい。
【０３２４】
１つの態様において、本発明は、永続的ベースで、必要がある対象に尿迂回路を提供する。図１３は、永続的尿迂回路構築物の移植された構成要素の例を示す。
【０３２５】
１つの実施形態において、本明細書に記載される構築物は、尿道前立腺部の置き換えおよび尿迂回路のために使用されてもよい。このような手順は、尿道前立腺部を取り除くために前立腺全摘出術を必要とする対象にとって必要である。他の実施形態において、構築物は、経皮的迂回管のために使用されてもよく、バルブ様ねじれを伴う自制できる管を形成する。さらなる実施形態において、構築物は、膀胱頸部外科手術において使用される膀胱頸部スリングおよび包み材料、ならびに自制できるチャネルまたはカテーテル装着可能な開口を伴う尿の出口であってもよい。このような実施形態の例は図１４に描写されている。
【０３２６】
局所的なおよび／または上行性の感染に対して開口を防御する特性を取り込み、ならびに女性における膣前庭および男性における舟状窩において空になる、区別できる構造である尿道を介して、尿は身体から出る。具体的には、この領域における粘膜皮膚は、保護性内因性乳酸微生物フローラのための基質を提供する、グリコーゲンが豊富な細胞から構成される、角質化していない層状化された扁平上皮である。また、皮膚の近くの上皮として、これは、酸ホスファターゼ活性、および殺菌性化合物を分泌するマクロファージの存在を示すリソソーム用免疫反応性と関連する（Ｈｏｌｓｔｅｉｎ  ＡＦ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  ２６４：２３）。
【０３２７】
１つの態様において、本明細書に記載される尿迂回路または新たな尿路導管（ＮＵＣ）構築物は、泌尿器粘膜と皮膚上皮の間の自然様遷移の形成に導く可能性があり、これは、自然の尿道において観察される粘膜皮膚領域の構造的特色を有する。遷移領域は、上皮化された粘膜といわれてもよい。１つの実施形態において、構築物は、移植されると、上皮化された粘膜を形成するように適応されている。１つの実施形態において、上皮化された粘膜は、前庭領域および粘膜皮膚領域を備える。別の実施形態において、前庭領域は粘膜皮膚領域に隣接している。別の実施形態において、粘膜皮膚領域は、対象の腹壁および皮膚に接続された構築物の間質性末端に位置している。一般的に、天然に存在する粘膜皮膚領域は、粘膜および皮膚の存在によって特徴付けられ、外部の皮膚が終了し、身体の内部を覆う粘膜が開始する、身体の開口部の近くに典型的には存在する。本明細書の構築物および方法によって提供される上皮化された粘膜は、対象への移植後に尿迂回路構築物の第１の末端において発達する。さらなる実施形態において、上皮化された粘膜は、前庭領域において最初に出現し、粘膜皮膚領域を通して、構築物の瘻孔末端に向かって次第に拡大または増加する、上皮の存在によって特徴付けられる。別の実施形態において、上皮は、上皮細胞マーカーの発現によって特徴付けられる。さらなる実施形態において、上皮細胞マーカーはサイトケラチンである。サイトケラチンは、当該分野において公知である１種以上のサイトケラチンであってもよく、これには、非限定的に、サイトケラチン１〜１９が挙げられる。１つの他の実施形態において、サイトケラチンは、抗パンサイトケラチン（ＡＥ−１／ＡＥ３）抗体および／またはサイトケラチン７（ＣＫ−７）抗体を用いて検出可能である。
【０３２８】
表５．４および図１５は、例示的な移植された尿迂回路または導管の様々な領域を指し示す。セクション５および６は、（ｉ）頭部末端：瘻孔部分、頭部部分、および中間部分の導管、ならびに（ｉｉ）尾部末端：導管の残りの中間部分および左／右尿管−導管連結にそれぞれ対応する。なお別の実施形態において、導管の尾部セクションの管腔表面を覆う上皮は、抗ＣＫ−７抗体によって検出可能であるように、ＣＫ−７について陽性である（例えば、セクション６）。１つの他の実施形態において、頭部および中間部の導管の局面の管腔表面を覆う上皮は、抗ＣＫ−７抗体によって検出可能であるように、ＣＫ−７について陰性である（例えば、セクション５）。１つの実施形態において、導管の尾部セクションの管腔表面を覆う上皮は、ＡＥ１／ＡＥ３について陽性である（例えば、セクション６）。別の実施形態において、導管の頭部および中間部分の局面の管腔表面を覆う上皮は、抗ＡＥ１／ＡＥ３抗体によって検出可能であるように、ＡＥ１／ＡＥ３について陰性である（例えば、セクション５）。別の態様において、尿迂回路は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）マーカーの発現によって特徴付けられる。１つの実施形態において、ＳＭＣマーカーはα−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）および／またはカルポニンである。別の実施形態において、ＳＭＣマーカーは、抗α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）抗体および／または抗カルポニン抗体を用いて検出可能である。１つの他の実施形態において、導管の尾部の領域における導管壁または外部表面構成要素は、抗ＳＭＡ抗体によって検出可能であるように、ＳＭＡについて陽性である（例えば、セクション６）。別の実施形態において、頭部および中間部分の導管セクションにおける導管壁または外部表面構成要素は、抗ＳＭＡ抗体によって検出可能であるように、ＳＭＡについて陰性である（例えば、セクション５）。１つの他の実施形態において、導管の尾部領域における導管壁または外側表面構成要素は、抗カルポニン抗体によって検出可能であるように、カルポニンについて陽性である（例えば、セクション６）。１つの他の実施形態において、頭部および中間部分−導管セクションにおける導管壁または外部表面構成要素は、抗カルポニン抗体によって検出可能であるように、カルポニンについて陰性である（例えば、セクション５）。
【０３２９】
本明細書に記載される構築物の、上皮化された粘膜を形成する能力は、腹部瘻孔を経由した尿迂回路を達成する主要な課題に対する解決を提供する。経皮デバイスの有効寿命は、出口部位感染によってしばしば妨げられることが受け入れられている（Ｋｎａｂｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０：５０３）。カテーテル、カニューレ、補綴アタッチメント、およびグルコースセンサーなどの経皮デバイスは、それらの意図される医学的目的に関わらず、皮膚を突き抜き、その保護障壁を破壊し、および細菌の侵入のための洞管を作製する（Ｉｓｅｎｈａｔｈ  ＳＮ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  ８３：９１５）。不適切な上皮治癒、生体適合性の欠如、または機械的ストレスに起因する、製品−皮膚界面の分解は、さらなる失敗のリスクを引き起こし得る（ｖｏｎ  Ｒｅｃｕｍ  ＡＦ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ  ＪＢ．（１９８１）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｅｎｇ  ５：３７）。
【０３３０】
別の態様において、尿迂回路構築物は、レシピエントの組織との相互作用を通して、管状類器官を再生する。１つの実施形態において、レシピエント組織との構築物の相互作用は、経腹−経皮配置によってである。１つの他の実施形態において、管状類器官は、尿管からレシピエントの外部までの尿の流れを可能にする。尿は、膀胱、尿道、および瘻孔（すなわち、道または開口）において見い出されるネイティブ様機能的特性を維持しながら、レシピエントの外に流れる。粘膜−皮膚連結部は、それぞれ、ヒトの男性および女性の、前部尿道の開口部；膣前庭および舟状窩において見い出される連結部に類似している。これらの天然の連結部は、上行性感染に対する防御を提供し得る湿−乾表面に対して決定的である粘膜ゾーンによって覆われている。これらの粘膜ゾーンの扁平上皮は、１）グリコーゲンが豊富であり、２）分泌性であり（酵素および殺菌剤を放出可能であり）、かつ３）食作用性であり；そして損傷した表面に迅速に移動できる。
【０３３１】
１つの態様において、本発明は、必要がある対象に粘膜皮膚連結部（ＭＣＪ）を提供する方法を提供する。ＭＣＪは、粘膜および皮膚の存在によって特徴付けられる、天然に存在する粘膜皮膚領域に類似し、これは、典型的には、外部皮膚が終了し、身体の内部を覆う粘膜が開始する身体の開口部の近くに存在する。１つの実施形態において、この方法は、本明細書に記載される足場および本明細書に記載される細胞集団から作られた構築物を提供するステップを含む。別の実施形態において、この方法は、構築物の移植後にＭＣＪが形成するように、空気に曝露されるように適用されている第１の部分（例えば、管状形状構築物の第１の末端）および空気に曝露されていない第２の部分（例えば、管状形状構築物の第２の末端）を有する構築物を、必要がある対象に投与するステップをさらに含む。
【０３３２】
拡大されるための器官または組織への足場の移植は、実施例において記載されている方法に従って、または当該分野において認識されている方法に従って実施できる。マトリックスまたは足場は、標的器官に移植片材料を縫合することによって、対象の器官または組織に移植できる。
【０３３３】
すべての実施形態において、尿迂回路または導管構築物を提供する方法は、メッシュ構造を投与することをさらに備える。別の実施形態において、投与するステップは、皮下脂肪と骨格筋の間にメッシュ構造を挿入することを備える。１つの実施形態において、メッシュ構造は皮下移植される。別の実施形態において、メッシュ構造は、第１の末端と腹壁セクションの間の接続部位に移植される。別の実施形態において、メッシュ構造は、本明細書に記載される尿迂回路構築物の移植後の新たな尿路導管の形成を容易にする。１つの他の実施形態において、メッシュ構造は瘻孔が開いた状態を提供する。好ましい実施形態において、メッシュ構造はヘルニアパッチであり、好ましくは、皮下ヘルニアパッチである。１つの他の実施形態において、メッシュ構造は、腸ヘルニア形成のリスクがある対象への投与のために適応される。例えば、腸の一部が選択された腹壁開口の上に位置しているならば、腸は、腸を通した食物の通過に関連したぜん動に起因する、開口に向かってまたは開口を通して突出してもよい。当業者は、選択された腹壁開口の位置と対象の腸の試験に基づいて、対象に腸の突出のリスクがあるか否かを評価できる。のような評価後、当業者は、対象が本明細書に記載される尿迂回路構築物およびメッシュ構造を投与されるべきか否かを決定できる。
【０３３４】
１つの態様において、本発明は、泌尿器系における何らかの欠陥の治療の必要がある対象を治療するための方法を提供する。適切な対象には、欠損があり、損傷し、または機能的でない泌尿器系が挙げられる、欠損がある組織機能または機能不全の１つ以上の表れ、徴候、または他の指標を経験しているか、または経験したことのある、治療のために適格である患者などの任意の単独の対象が挙げられる。一般的には、対象は、積層して組織化された管腔器官または組織構造の再生、再構築、増強、または置き換えの必要がある対象である。このような対象には、非限定的に、新しく診断されたかもしくは以前に診断され、かつ今、再発または再発生を経験している対象、または原因に関わらず、欠損がある器官機能もしくは不全のリスクがある対象が挙げられる。対象は、欠損がある器官機能もしくは不全に関連する状態のために以前に治療されていてもよいし、またはそのように治療されていなくてもよい。対象は、尿迂回路のための候補であってもよく、これには、非限定的に、膀胱切除が要求される膀胱の癌を有する対象、腎機能に影響を与える神経因性膀胱を有する対象、膀胱に放射線傷害を有する対象、および難治性失禁を有する対象が挙げられる。対象は、尿迂回路が要求されると新しく診断されてもよく、または尿迂回路が要求されると以前に診断され、今、合併症を経験しているか、または原因に関わらず、欠損があるか、損傷しているか、もしくは機能的でない泌尿器系のリスクがある。対象は、欠損しているか、損傷しているか、もしくは機能的でない泌尿器系と関連する状態について以前に治療されていてもよく、またはそのように治療されていなくてもよい。本明細書に記載される細胞集団は、対象に対して自系でない。
【０３３５】
記載される技術は、既存の積層して組織化された管腔器官または組織構造を拡大することを、そのような治療の必要がある患者において行うために使用されてもよい。例えば、既存の積層して組織化された管腔器官または組織構造は、上記治療の必要がある器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように、かつ腹腔鏡移植されるために十分なサイズで形作られたポリマーマトリックスまたは足場を提供すること、対象に対して自系でなく、かつこの器官または組織構造から得られたものではない細胞集団を、上記ポリマーマトリックスの第１の領域上またはその中に沈着させるステップ；および既存の積層して組織化された管腔器官または組織構造が拡大するように、形作られたポリマーマトリックスを上記治療の上記患者に腹腔鏡移植することによって拡大されてもよい。
【０３３６】
図７ｅは、本明細書に記載される筋肉等価足場の移植のための可能な外科的方法を描写する。図７ｆは、空の膀胱および充満した膀胱上の移植部位を描写する。図７ｇは、表面の切片化に際して作製された、楕円形を示す外科スリットを有する膀胱モデルを描写する。折り畳まれたかまたは巻かれた本発明のポリマーマトリックスまたは足場を通過させるために、利用できる空間が限られているモデルとして、プラスチック管が使用されてもよい。
【０３３７】
記載される技術はまた、このような治療の必要がある患者において、膀胱容積を増加させるために使用されてもよい。例えば、膀胱容積は、上記治療の必要がある器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように、かつ腹腔鏡移植されるために十分なサイズで形作られた生体適合性ポリマーマトリックスまたは足場を提供すること；対象に対して自系でなく、かつ容積の増加の対象である対応する器官または組織構造から得られたものではない細胞集団を、上記ポリマーマトリックスの第１の領域上またはその中に沈着させること；および膀胱の体積が増加するように、上記ポリマーマトリックス構築物を、上記治療の部位で上記患者に腹腔鏡移植することによって増加されてもよい。１つの実施形態において、本発明のマトリックスまたは足場は、膀胱体積を約５０ｍＬ増加させるために適切である。他の実施形態において、本発明のマトリックスまたは足場は、膀胱体積を約１００ｍＬ増加させるために適切である。他の実施形態において、マトリックスまたは足場は、膀胱体積を約６０、約７０、約８０、または約９０ｍＬ増加させるために適切である。
【０３３８】
記載される技術は、このような治療の必要がある患者における膀胱切断部位を拡大するためにさらに使用されてもよい。例えば、膀胱切断は、ａ）上記治療の必要がある器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように、かつ腹腔鏡移植されるために十分なサイズで形作られた生体適合性の合成または天然のポリマーマトリックスを提供すること；ｂ）対象に対して自系でなく、かつ容積の増加の対象である対応する器官または組織構造から得られたものではない細胞集団を、上記ポリマーマトリックスの第１の領域上またはその中に沈着させること；およびｃ）膀胱切断が拡大されるように、形作られたポリマーマトリックス構築物を、上記治療の部位で、上記患者に腹腔鏡移植することによって拡大されてもよい。
【０３３９】
別の非限定的な本発明の用途には、このような治療の必要がある患者における尿失禁の治療のための方法を含む。例えば、尿失禁は、上記治療の必要がある器官または組織構造の少なくとも一部に適合するように、かつ腹腔鏡移植されるために十分なサイズで形作られた生体適合性の合成または天然のポリマーマトリックスを提供すること；対象に対して自系でなく、かつ治療の対象である対応する器官または組織構造から得られたものではない細胞集団を、上記ポリマーマトリックスの第１の領域上またはその中に沈着させること；および膀胱体積が増加されるように、形作られたポリマーマトリックス構築物を、上記治療の部位で、上記患者に腹腔鏡移植することによって治療されてもよい。
【０３４０】
１つの他の態様において、本発明は、自系でない供給源である膀胱供給源から得られた平滑筋細胞（ＳＭＣ）を含有する泌尿器系の自然の管腔器官または組織構造の再構築、置き換え、増強、または再生のための構築物の使用のための方法に関わる。自然の器官または組織構造は積層されて組織化されてもよい。自系でない供給源は、同種異系供給源または同系供給源であってもよい。１つの好ましい実施形態において、治療の方法には、足場および膀胱由来のＳＭＣから形成されるが尿路上皮細胞は含まない、構築物の使用が挙げられる。膀胱由来のＳＭＣは、構築物を形成するために、膀胱増強、膀胱置き換え、尿路導管、または筋肉等価足場に播種されてもよい。自系でない膀胱由来のＳＭＣを含有する構築物は、本明細書に記載される治療の方法において使用されてもよい。
【０３４１】
１つの他の態様において、本発明は、生体力学的刺激または循環に基づく、必要がある対象への移植後の新たな膀胱の再生のための方法を提供する。１つの態様において、これらの方法は、膀胱または膀胱の一部の増強または置き換えのために移植された、移植された新たな膀胱構築物の再生を促進する際の使用のために適切である。１つの実施形態において、新たな膀胱構築物は、新たな膀胱マトリックスまたは足場上に細胞を播種することから形成される。別の実施形態において、新たな膀胱足場は、膀胱置き換え足場、膀胱増強足場、膀胱導管足場、または排尿筋筋肉等価足場である。
【０３４２】
１つの態様において、本発明の方法は、新たな膀胱足場に少なくとも１種の細胞集団を播種することから形成された移植された新たな膀胱構築物に適用される。１つの実施形態において、細胞−播種されたポリマーマトリックス（またはマトリックス群）は、膀胱置き換え足場、膀胱増強足場、膀胱導管足場、または排尿筋筋肉等価足場である。１つの実施形態において、少なくとも１種の細胞集団は、実質的に筋肉細胞集団を備える。別の実施形態において、筋肉細胞集団は平滑筋細胞集団であってもよい。本明細書に記載されるように、播種のために異なる密度の細胞が適している。
【０３４３】
１つの態様において、本発明の方法は、新たな膀胱の移植後の様々な時点でおよび様々な期間の間、実施される。１つの実施形態において、循環は、時間の期間にわたって日ベースで、時間の期間にわたって週ベースで、または１週間おきに実施される。別の実施形態において、日々の循環レジメンの期間は、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、または１４週間以上である。循環のための例示的なプロトコールは実施例１８に記載されている。
【０３４４】
１つの実施形態において、対象にとっての日々の循環プロトコールは、約１時間の間、新たな膀胱を充満させるステップ、約１時間の間、充満した新たな膀胱から排液するステップ、および新たな膀胱から自由に、典型的には、一晩、排液するステップを含んでもよい。このプロトコールは、対象における循環レジメンの１日目に実施できる。この日々の並びは、最初の日以後の多数の連続する日の間、実施できる。１つの実施形態において、循環プロトコールは、充満ステップの期間が、約２時間、約３時間、約４時間、または約４時間より長い時間まで増加される、１日目の後の日に実施されてもよい。別の実施形態において、充満ステップおよび排液ステップは、新たな膀胱が自由に排液を許される前に、１日１回より多く反復されてもよい。
【０３４５】
別の実施形態において、対象は移植後カテーテル装着され、そして循環時間は、対象のカテーテルにクランプを付けることおよびクランプを外すことによって制御される。
【０３４６】
当業者は、さらなる循環レジメンが本明細書で意図されることを正しく理解するであろう。
【０３４７】
循環プロトコールの例は以下の通りである。本明細書に記載されるように、新たな膀胱マトリックスまたは足場に細胞を播種することによって形成された新たな膀胱構築物の移植後、移植後およそ１ヶ月で開始し、およそ９０日目まで継続して、循環が２週間毎に実施される（１４±２日間隔）。循環は、移植された新たな膀胱のコンプライアンス測定などの特定の型の評価後に完了されるが、これは蛍光透視画像などの他の型の評価前である。循環は、１０〜２５ｍＬ／分の速度でのコンプライアンス測定の完了後、（インキュベーターによってあたためられた）滅菌生理食塩水で膀胱を再膨張させることによって実施される。循環は少なくとも５〜１０回反復される。０〜１０ｍｍＨｇの開始圧力が達成され、開始時間とともに記録される。時間、送達される等張溶液の量、および得られる圧力が、各サイクルについて、カテーテルの周辺で漏出が観察された時点で（漏出点としても知られる）、または送達された量がちょうど実施されたコンプライアンス測定のそれと等しいとき、いずれかが最初に来た時点で記録される。
【０３４８】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）移植された新たな膀胱を液体で満たすステップ；（ｂ）ステップ（ａ）の満たされた新たな膀胱を空にするステップを含む、対象において移植された新たな膀胱の再生を促進する方法を提供する。別の実施形態において、この方法は、（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）を反復するステップを含む。１つの他の実施形態において、この方法は、移植後最初の２週間以内に始められる。１つの実施形態において、ステップ（ａ）および（ｂ）は、１日に１回、週に１回、または２週間に１回実施される。ある他の実施形態において、満たすステップ（ａ）は約１時間の間実施され、空にするステップ（ｂ）は約１時間の間実施される。なお別の実施形態において、ステップ（ａ）および（ｂ）は移植後少なくとも約６週間まで実施される。１つの他の実施形態において、ステップ（ａ）および（ｂ）は移植後約１０週間を超えて実施されない。別の実施形態において、ステップ（ａ）および（ｂ）は移植後約１０週間を超えて実施される。他の実施形態において、満たすことは新たな膀胱を拡大することを含む。別の実施形態において、再生は、循環を受けていない対象における新たな膀胱と比較して、新たな膀胱の収容能力の増加を備える。１つの他の実施形態において、再生は、循環を受けていない対象における新たな膀胱と比較して、新たな膀胱のコンプライアンスの増加を備える。他の実施形態において、再生は、循環を受けていない対象における新たな膀胱と比較して、新たな膀胱における細胞外マトリックスの発達の増加を備える。１つの実施形態において、細胞外マトリックスの発達の増加はエラスチン線維の発達を備える。
【０３４９】
１つの他の態様において、本発明は、移植された新たな膀胱がレシピエントの必要性に応答性であるように、哺乳動物における新たな膀胱の、恒常性によって調節的である発達を提供するための方法に関わる。１つの実施形態において、移植された新たな膀胱は、レシピエントに比例したサイズまで成長する。別の実施形態において、対象における新たな膀胱の、恒常性によって調節的である発達を提供するための方法は、（ａ）生体適合性ポリマー足場を提供するステップ；（ｂ）上記足場の第１の領域上またはその中に第１の細胞集団を沈着させるステップであって、上記第１の細胞集団が実質的に筋肉細胞集団である、ステップ；および（ｃ）ステップ（ｂ）の足場を上記対象に移植して、恒常性によって調節的である発達を確立するステップを含む。１つの他の実施形態において、恒常性によって調節的である発達は、器官のサイズおよび構造の回復を備える。別の実施形態において、恒常性によって調節的である発達は、体重に比例した新たな膀胱の収容能力を備える。１つの実施形態において、比例した新たな膀胱の収容能力は、移植後約４ヶ月で達成される。別の実施形態において、対象における新たな膀胱の、恒常性によって調節的である発達を提供するための方法には、移植された新たな膀胱の、恒常性によって調節的である発達または進行の状態をモニタリングするステップが挙げられる。モニタリングすることは、移植された新たな膀胱の位置および形状、ならびに／または尿流動態コンプライアンスおよび収容能力の測定を示すための膀胱Ｘ線造影手順を含んでもよい。
【０３５０】
本発明の方法は、泌尿器系に関連する障害を有する対象の治療のための適用を有する。このような対象には、欠損があるか、損傷しているか、または機能的でない泌尿器系が挙げられる、欠損がある器官機能または不全の表れ、徴候、または他の指標を経験しているかまたは経験したことがある、治療に対して適格である患者が挙げられる、任意の単独のヒト対象が挙げられる。そのような対象には、非限定的に、新しく診断されたかもしくは以前に診断され、かつ今、再発または再発生を経験している対象、または原因に関わらず、欠損がある器官機能もしくは不全のリスクがある対象が挙げられる。対象は、欠損がある器官機能もしくは不全に関連する状態のために以前に治療されていてもよいし、またはそのように治療されていなくてもよい。対象は、尿迂回路のための候補であってもよく、これには、非限定的に、膀胱切除が要求される膀胱の癌を有する対象、腎機能に影響を与える神経因性膀胱を有する対象、膀胱に放射線傷害を有する対象、および難治性失禁を有する対象が挙げられる。対象は、尿迂回路が必要とされると新しく診断されてもよく、または尿迂回路が必要とされると以前に診断され、今、合併症を経験しているか、または原因に関わらず、欠損があるか、損傷しているか、もしくは機能的でない泌尿器系のリスクがあってもよい。対象は、欠損しているか、損傷しているか、もしくは機能的でない泌尿器系と関連する状態について以前に治療されていてもよく、またはそのように治療されていなくてもよい。
【０３５１】
Ｃ．胃腸組織構築物の使用
１つの態様において、本発明は、ＧＩ器官またはＧＩ組織構造を提供することを、そのような治療の必要がある対象に対して行うための方法を意図する。１つの実施形態において、ＧＩ器官または組織構造は、積層して組織化された管腔器官または組織構造であってもよい。別の実施形態において、対象は、器官または組織の再構築、増強、または置き換えの必要があり得る。１つの実施形態において、この方法は、器官または組織構造の必要があるＧＩ器官またはＧＩ組織構造の少なくとも一部に適合するように形作られた、生体適合性である合成または天然のポリマーマトリックスを提供するステップを含む。この提供するステップに続いて、対象に対して自系であるかまたは自系でなく、かつ再構築、増強、または置き換えの対象である対応するＧＩ器官またはＧＩ組織構造から得られたものではない、少なくとも１種の細胞集団を沈着させることが行われ得る。この沈着させるステップは、ポリマーマトリックス上で細胞集団を培養することを含んでもよい。マトリックス上で細胞集団を沈着して構築物を提供した後で、これは、所望の積層して組織化された管腔ＧＩ器官またはＧＩ組織構造の形成のために、治療のための部位において患者に移植できる。１つの実施形態において、積層して組織化された管腔ＧＩ器官またはＧＩ組織構造は、食道もしくは食道の一部；または小腸もしくは小腸の一部である。
【０３５２】
１つの他の態様において、本発明は、必要がある対象にＧＩ器官またはＧＩ組織構造を提供するための方法に関する。１つの実施形態において、この方法は、ａ）上記治療の必要があるＧＩ器官またはＧＩ組織構造の少なくとも一部に適合するように形作られた生体適合性である合成または天然のポリマーマトリックスを提供するステップ；ｂ）ＧＩ器官またはＧＩ組織から得られたものではない細胞集団を、ポリマーマトリックスの第１の領域上またはその中に沈着させるステップ；およびｃ）ＧＩ器官または組織構造の形成のために、形作られたポリマーマトリックスを対象に移植するステップを含む。１つの他の態様において、本発明は、必要がある対象に、ＧＩ器官またはＧＩ組織構造を提供するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ａ）ＧＩ器官またはＧＩ組織構造に適合するように形作られた、生体適合性である合成または天然のポリマーマトリックスを提供するステップ；ｂ）ポリマーマトリックスの第１の領域上またはその中に、ＧＩ器官またはＧＩ組織から得られたものではない細胞集団を沈着させるステップ；およびｃ）ＧＩ器官または組織構造の形成のために、形作られたポリマーマトリックス細胞構築物を対象に移植するステップを含む。別の実施形態において、本明細書に記載される方法のステップｂ）の細胞集団は、平滑筋細胞マーカーについて陽性である、収縮機能を有する１種以上の末梢血由来の平滑筋細胞を含有するか、またはステップｂ）の細胞集団は、平滑筋細胞マーカーについて陽性である、収縮機能を有する１種以上の脂肪組織由来の平滑筋細胞を含有する。１つの他の実施形態において、細胞集団の収縮機能はカルシウム依存性である。
【０３５３】
１つの他の態様において、本発明は、必要がある対象における欠損があるＧＩ系のためのＧＩ構築物を提供するための方法を提供する。１つの実施形態において、必要がある対象にＧＩ構築物を提供するための方法は、（ａ）生体適合性ＧＩ組織足場を提供するステップ；（ｂ）上記足場の第１の領域上にまたはその中に第１の細胞集団を沈着させるステップであって、上記第１の細胞集団が実質的に筋肉細胞集団である、ステップ；（ｃ）対象においてＧＩ組織を形成するために、上記対象にステップ（ｂ）の足場を移植するステップを含む。この方法は、上記足場の第１の領域上またはその中に第２の細胞集団を沈着させるステップ、および／またはステップ（ｂ）の後で、沈着した第１の細胞集団と、第２の細胞集団を接触させるステップをさらに含んでもよい。別の実施形態において、生体適合性材料は生物分解性である。他の実施形態において、生体適合性材料はポリグリコール酸である。なお別の実施形態において、第１の細胞集団は、実質的に平滑筋細胞集団である。別の実施形態において、第２の細胞集団は、ＧＩ細胞集団，例えば、食道細胞集団、小腸細胞集団などである。
【０３５４】
１つの実施形態において、本発明の方法は、血管新生を可能にするために、移植されたＧＩ組織構築物を、対象の網、腸間膜、筋肉筋膜、および／または腹膜で包むステップをさらに含む。
【０３５５】
１つの態様において、本発明は、ＧＩ関連障害のために、本明細書に記載される平滑筋細胞集団の適用を意図する。食道関連障害を治療するための方法もまた本発明で意図される。食道は平滑筋を含有し、そして食道関連障害は、対象が、不適切な機能、例えば、機能不全の食道筋肉に起因する欠損のある食道を有するものである。ある特定の細胞集団は、投与されたときに、食道に有益な効果を提供し得ることが報告されている（例えば、Ｎａｋａｓｅ（２００８）前出）。
【０３５６】
別の態様において、本発明は、ＧＩ関連障害の治療のための方法を提供する。「胃腸障害」、「ＧＩ障害」、「胃腸関連障害」または「ＧＩ関連障害」という用語は、食道、胃、小腸および大腸、肛門括約筋、および肛門から作られている、ＧＩ管の中の任意の欠損を指すものとする。欠損は、胃腸管に沿った任意の点において起こっている構造的欠損であってもよく、嘔吐ならびに嚥下の問題および便通の問題に導き得る、障害または閉塞を引き起こす可能性がある。欠損はまた、ＧＩ管に沿った中断または間隙も含んでもよい。当業者は、種々のＧＩ障害が、本明細書に記載される構築物および方法を用いる治療のために適切であり得ることを正しく理解するであろう。１つの実施形態において、治療のために適切なＧＩ関連障害は、非限定的に、Ｂａｒｒｅｔｔ食道、食道閉鎖症、ロングギャップ食道閉鎖症、気管食道瘻、気管食道遠位瘻を伴う閉鎖症、気管食道近位瘻を伴う閉鎖症、および気管食道二重瘻を伴う閉鎖症が挙げられる食道関連障害である。別の実施形態において、ＧＩ関連障害は、ある特定の兆候を表す患者のために必須であるとき、実施される小腸切除から生じる小腸関連障害である。例えば、広範囲の切除が、炎症性腸疾患、外傷、腸間膜血管疾患、腸軸捻、先天性閉鎖症、および新生児壊死性腸炎を有する個人のために実施され得る。このような切除の共通の結果は短腸症候群（ＳＢＳ）であり、これは、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、Ｂ１２、および脂溶性ビタミンの欠乏が挙げられる正常な栄養および液体吸収の撹乱から生じ、そして下痢、脱水、栄養の吸収不良、および付随して起こる進行性栄養失調によって特徴付けられる。
【０３５７】
別の実施形態において、ＧＩ関連障害は癌性であり、これには、非限定的に、食道癌、胃癌、腸癌、括約筋の癌、または結腸癌が挙げられる。
【０３５８】
１つの態様において、本発明は、必要がある対象における胃腸組織の再生、再構築、増強、または置き換えのための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、（ａ）足場；（ｂ）足場の第１の表面上またはその中に沈着された胃腸組織から得られたものではない第１の細胞集団；および（ｃ）胃腸組織から得られた第２の細胞集団を含む胃腸組織構築物を投与するステップを含む。１つの他の実施形態において、第１の細胞集団は脂肪から得られる。別の実施形態において、第１の細胞集団は平滑筋細胞（ＳＭＣ）集団である。ＳＭＣ集団は、少なくとも１種の平滑筋細胞マーカーについて陽性であり得る。なお別の実施形態において、第２の細胞集団は、食道、小腸、大腸、胃、結腸、または肛門括約筋から得られる。１つの実施形態において、構築物は、少なくとも１種の胃腸（ＧＩ）組織マーカーについて陽性である。ＧＩ組織マーカーは、上皮細胞マーカーであってもよい。別の実施形態において、構築物は、協調リズム収縮機能を有する細胞を含む。１つの他の実施形態において、構築物は、移植後に胃腸組織を形成するように適応される。なお別の実施形態において、ＧＩ組織は、食道、小腸、大腸、胃、結腸、または肛門括約筋組織である。
【０３５９】
別の実施形態において、この方法は、投与するステップの前に、対象から１種以上の試料を入手するステップを含む。１つの他の実施形態において、この方法は、本明細書に記載されるように、試料から１種以上の細胞集団を単離するステップ、およびそれらを培養するステップを含む。なお別の実施形態において、この方法は、ＧＩ組織構築物を形成するために、本明細書に記載されるＧＩ組織足場と、１種以上の細胞集団を接触させるステップを含む。
【０３６０】
１つの態様において、本発明は、必要がある対象におけるＧＩ関連障害の治療において有用である医薬の調製のための本明細書に記載される構築物の使用を提供する。１つの実施形態において、構築物は、平滑筋細胞集団および食道細胞集団が播種された食道組織足場を含む食道組織構築物である。別の実施形態において、ＧＩ関連障害は食道関連障害である。１つの実施形態において、構築物は、平滑筋細胞集団および腸細胞集団が播種された腸組織足場を含む腸組織構築物である。腸細胞集団は小腸から得ることができる。別の実施形態において、ＧＩ関連障害は腸関連障害である。
【０３６１】
本発明の方法は、胃腸障害を有する対象の治療のための適用を有する。そのような対象には、欠損があるか、損傷しているか、または機能的でない胃腸系が挙げられる、欠損がある胃腸（ＧＩ）機能または不全の１つ以上の表れ、徴候、または他の指標を経験しているかまたは経験したことがある、治療に対して適格である患者が挙げられる、任意の単独のヒト対象が挙げられる。このような対象には、非限定的に、新しく診断されたかもしくは以前に診断され、かつ今、再発または再発生を経験している対象、または原因に関わらず、欠損があるＧＩ機能もしくは不全のリスクがある対象が挙げられる。対象は、欠損があるＧＩ機能もしくは不全に関連する状態のために以前に治療されていてもよいし、またはそのように治療されていなくてもよい。対象は、非限定的に、食道関連疾患、胃関連疾患、腸関連疾患、または肛門括約筋に関連する疾患が挙げられる、ＧＩ関連疾患を有する候補であってもよい。対象は、このような疾患のための治療が要求されると新しく診断されてもよく、またはこのような疾患のための治療が要求されると以前に診断され、今、合併症を経験しているか、または原因に関わらず、欠損があるか、損傷しているか、もしくは機能的でない食道、胃、腸、または肛門括約筋のリスクがあってもよい。対象は、欠損しているか、損傷しているか、もしくは機能的でない食道、胃、腸、または肛門括約筋と関連する状態について以前に治療されていてもよく、またはそのように治療されていなくてもよい。
【０３６２】
Ｄ．呼吸組織構築物の使用
１つの態様において、本発明は、このような治療の必要がある対象に呼吸組織構造を提供するための方法を意図する。１つの実施形態において、対象は、肺、肺組織、肺胞組織、および細気管支組織などの呼吸組織再構築、再生、増強、または置き換えの必要があり得る。１つの実施形態において、この方法は、器官または組織構造の必要がある呼吸組織の少なくとも一部に適合するように形作られた生体適合性である合成または天然のポリマーマトリックスを提供するステップを含む。提供するステップに続いて、呼吸組織から得られたものではない第１の細胞集団を、マトリックス上またはその中に沈着させるステップが行われてもよい。第１の細胞集団はＳＭＣ集団であってもよい。沈着させるステップは、ポリマーマトリックス上で第１の細胞集団を培養することを含んでもよい。第１の細胞集団をマトリックス上に沈着させた後で、第２の細胞集団は、これが、構築物を形成するために、マトリックスおよび／または沈着された第１の細胞集団と接触するように、マトリックス上に沈着されてもよい。第２の細胞集団は呼吸細胞集団であってもよい。構築物は、所望の呼吸組織構造の形成のために治療の部位において患者に移植できる、呼吸組織構築物であってもよい。１つの実施形態において、呼吸組織構造は肺の一部である。１つの実施形態において、第１のおよび／または第２の細胞集団は、治療の必要がある対象に対して自系である。別の実施形態において、第１のおよび／または第２の細胞集団は、治療の必要がある対象に対して自系でない。
【０３６３】
別の態様において、本発明は、必要がある対象における呼吸組織の再生、再構築、増強、または置き換えのための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、（ａ）足場；（ｂ）足場の第１の表面上またはその中に沈着された呼吸組織から得られたものではない第１の細胞集団；および（ｃ）呼吸組織から得られた第２の細胞集団を含む呼吸組織構築物を投与するステップを含む。本発明は、呼吸組織構築物、例えば、細胞が播種された呼吸組織足場の形成のために適切な足場を提供する。１つの実施形態において、足場は、本明細書に記載される細胞集団を備える。別の実施形態において、足場は、脂肪由来のＳＭＣ集団および呼吸細胞集団を備える。別の実施形態において、足場は、本明細書に記載されるように、脂肪由来のＳＭＣ集団および呼吸細胞集団から本質的になる。１つの他の実施形態において、足場は、本明細書に記載されるように、脂肪由来のＳＭＣ集団および呼吸細胞集団からなる。この細胞集団は、対象に対して、自系であってもよいし、または自系でなくてもよい。
【０３６４】
別の実施形態において、移植された構築物上に沈着した細胞はＭＣＰ−１を産生し、移植の部位においてこれを放出する。ＭＣＰ−１は、自然の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が移植の部位に移動するように刺激してもよい。１つの他の実施形態において、自然のＭＳＣは、移植の部位における移植された構築物の再生を容易にし、および／または増強してもよい。
【０３６５】
１つの実施形態において、沈着した細胞集団は、本明細書に記載されるように、脂肪組織から得られた平滑筋細胞（ＳＭＣ）集団である。別の実施形態において、ＳＭＣ集団は、収縮機能を有し、かつ、ミオカルディン、アルファ−平滑筋アクチン、カルポニン、ミオシン重鎖、ＢＡＡＬＣ、デスミン、筋線維芽細胞抗原、ＳＭ２２、およびこれらの任意の組み合わせなどの平滑筋細胞マーカーについて陽性である少なくとも１種の細胞を含む。他の実施形態において、ＳＭＣ集団は、ミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）発現を実証する少なくとも１種の細胞を含む。ＭＹＯＣＤ発現は、ＭＹＣＯＤポリペプチドまたはＭＹＯＣＤポリペプチドをコードする核酸の発現であってもよい。別の実施形態において、ＳＭＣの収縮機能はカルシウム依存性である。別の実施形態において、ポリマーマトリックスは、脂肪由来のＳＭＣ集団および呼吸細胞集団が播種されている。
【０３６６】
すべての実施形態において、本発明の方法は、本明細書に記載されるような細胞集団が播種された呼吸組織足場に基づいている、移植のための構築物を利用する。
【０３６７】
別の実施形態において、本明細書に記載される呼吸組織の再生、再構築、増強、または置き換えのための方法は、ａ）治療の必要がある対象において呼吸組織の少なくとも一部に適合するように形作られた生体適合性である合成または天然のポリマーマトリックスを提供するステップ；ｂ）本明細書に記載される細胞密度で上記ポリマーマトリックスの第１の領域上またはその中に第１の細胞集団を沈着させるステップであって、上記第１の細胞集団は実質的にＳＭＣ集団である、ステップ；ｃ）本明細書に記載される細胞密度で、ポリマーマトリックスの第２の領域上またはその中に（および／または沈着した第１の細胞集団と接触させるために）第２の細胞集団を沈着させるステップ；ならびにｄ）呼吸組織構造の形成のために上記治療の部位において、形作られたポリマーマトリックス細胞構築物を対象に移植するステップを含む。１つの他の実施形態において、インビボで形成された呼吸組織構造は、天然の呼吸組織の挙動を呈する。１つの実施形態において、呼吸組織構造は協調リズム収縮機能を呈する。
【０３６８】
１つの態様において、本発明の方法は、第１および第２の細胞集団を呼吸組織足場に播種することから形成された、移植された呼吸組織構築物に適用する。１つの実施形態において、第１の細胞集団は、脂肪由来の平滑筋細胞集団であり、かつ第２の細胞集団は呼吸細胞集団である。播種するために様々な密度の細胞が本明細書に記載されるように適し得る。
【０３６９】
別の実施形態において、本発明の平滑筋細胞集団は、移植などによって、足場の使用なしで、呼吸障害を有する対象に投与されてもよい。当業者は、移植の適切な方法を正しく理解するであろう。
【０３７０】
本発明の方法は、呼吸障害を有する対象の治療のための適用を有する。気道平滑筋は、多くの脊椎動物の気管支樹に存在する。呼吸障害は、肺の筋肉の不適切な機能に起因して、対象が欠損のある呼吸系を有するものである。肺に投与されたときに、ある特定の細胞集団は有益な効果を提供する可能性があることが報告されている（例えば、Ｏｈｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｈｒｏｎ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔ  Ｐｕｌｍｏｎ  Ｄｉｓ．２００８  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；３（４）：５０９−５１４）。肺癌を有する個人もまた利点を得ることができる。本明細書に記載される方法による治療から利点を得る可能性がある対象には、欠損があり、損傷し、または機能的でない呼吸系が挙げられる、欠損がある呼吸機能または機能不全の１つ以上の表れ、徴候、または他の指標を経験しているか、または経験したことのある、治療のために適格である患者が挙げられる、任意の単独の対象が挙げられる。このような対象には、非限定的に、新しく診断されたかもしくは以前に診断され、かつ今、再発または再発生を経験している対象、または原因に関わらず、欠損がある呼吸機能もしくは不全のリスクがある対象が挙げられる。対象は、欠損がある呼吸機能もしくは不全に関連する状態のために以前に治療されていてもよいし、またはそのように治療されていなくてもよい。対象は、非限定的に、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（すなわち、慢性気管支炎、肺気腫）、肺癌、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、喘息、閉塞性および拘束性気道疾患、肺形成不全（例えば、早産から）を有する対象が挙げられる、肺関連疾患を有する候補であってもよい。対象は、肺関連疾患のための治療が要求されると新しく診断されてもよく、または肺関連疾患のための治療が要求されると以前に診断され、今、合併症を経験しているか、または原因に関わらず、欠損があるか、損傷しているか、もしくは機能的でない肺のリスクがある。対象は、欠損しているか、損傷しているか、もしくは機能的でない肺と関連する状態について以前に治療されていてもよく、またはそのように治療されていなくてもよい。
【０３７１】
Ｅ．血管構築物の使用
血管足場および構築物は、必要がある対象において、心臓血管障害を治療するための方法において使用されてもよい。１つの実施形態において、この方法は血管構築物を移植するステップを含む。別の実施形態において、血管構築物は、ａ）第１および第２の表面を有する生体適合性管状足場；およびｂ）足場の第１の表面上またはその中に沈着された、血管でない供給源から得られた第１の細胞集団を含んでもよい。１つの実施形態において、第１の細胞集団は平滑筋細胞集団である。
【０３７２】
心臓血管障害を治療する方法は、必要がある対象を特定するステップを含む。１つ以上の生検または試料が対象から得られてもよい。１つの他の実施形態において、この方法は、試料から１種以上の細胞集団を単離するステップ、および足場上で１種以上の細胞集団を培養して、構築物またはＴＥＢＶを提供するステップを含む。別の実施形態において、培養することは、バイオリアクター中での細胞が播種された足場のコンディショニングを含む。１つの実施形態において、コンディショニングは、バイオリアクター中での定常流および／または脈動流を備える。別の実施形態において、この方法は、心臓血管疾患または障害を治療するための、必要がある対象への、細胞−播種され、コンディショニングされたＴＥＢＶの移植を含む。
【０３７３】
当業者は、本発明の方法による治療のために適切である様々な心臓血管障害を正しく理解するであろう。一般的に、心臓血管障害は、２つの自然の管の間の通路または吻合の形成から利益を得るであろう障害であり、ここで、血液は、第１の自然の血管から第２の自然の血管まで迂回される。例えば、動静脈（ＡＶ）シャントの場合におけるように、第１の自然の管は動脈であってもよく、第２の自然の管は静脈であってもよい。本発明の方法および構築物はまた、非限定的に、Ｂｌａｌｏｃｋ−Ｔａｕｓｓｉｇシャント、心臓血管シャント、左−右シャント、右−左シャント、ＬａＶｅｅｎ腹腔静脈シャント、門脈大静脈シャント、および脾腎シャントが挙げられる様々な他のシャントのために適切であってもよい。
【０３７４】
別の実施形態において、本発明は、必要がある対象における心臓血管障害の治療において有用である医薬の調製のための、本明細書に記載されるＴＥ足場および／またはＴＥＢＶの使用を提供する。これらの足場はまた、血管構築物を作製する際の使用のためにもまた提供される。血管構築物は、心臓血管障害を治療する際の使用のために提供される。
【０３７５】
本発明の方法は、心臓血管障害を有する対象の治療のための適用を有する。このような対象には、欠損がある心臓血管機能または機能不全の１つ以上の表れ、徴候、または他の指標を経験しているか、または経験したことのある、治療のために適格である患者が挙げられる、任意の単独の対象が挙げられる。このような対象には、非限定的に、新しく診断されたかもしくは以前に診断され、かつ今、再発または再発生を経験している対象、または原因に関わらず、欠損がある器官機能もしくは不全のリスクがある対象が挙げられる。対象は、欠損がある心臓血管機能もしくは不全に関連する状態のために以前に治療されていてもよいし、またはそのように治療されていなくてもよい。
【０３７６】
以下の実施例は、提示目的のみのために提供され、いかなる場合においても、本発明の範囲を限定することは意図されない。
【０３７７】
すべての特許、特許出願、および本願において引用された文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【実施例】
【０３７８】
実施例１−ＳＭＣの供給源としての末梢血および脂肪組織
血液由来の細胞
Ｌｕｄｌｏｗらの米国公開特許出願第２０１００１３１０７５号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されているように、平滑筋細胞は、イヌ、ブタ、およびヒトの末梢血から首尾よく単離されて。実施例１に記載されているすべての結果もまた、Ｌｕｄｌｏｗらにおいて見い出すことができる。手短に述べると、５０ｍＬの末梢血のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）との１：１希釈（最終量１００ｍＬ）が調製され、密度勾配材料であるＨｉｓｔｏｐａｑｕｅに重層され、そして１，３５４×ｇで室温にて２０分間遠心分離された。遠心分離後、４つの層が密度勾配（上端から下端まで）の中で明確に規定される：血清、バフィーコート、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ、赤血球である。単核細胞はバフィーコート中に位置し、これは、不透明な白色／灰色バンドとして現れる。バフィーコートは引き出され、別個の５０ｍＬ円錐管に移された。ＰＢＳで５０ｍＬまで希釈される。試料は室温で１０分間、７１１×ｇで遠心分離し、細胞をペレット化する。ペレットを再懸濁し、細胞を培養する。引き続く細胞継代によって適した細胞数に到達するとき、アリコートが固定され、発現された平滑筋細胞タンパク質の免疫検出、平滑筋細胞ｍＲＮＡ転写物、細胞収縮物の核酸検出、サイトカイン、および酵素合成が挙げられる、終点分析のために処理される。
【０３７９】
結果
培地選択。単一の４０〜５０ｍＬイヌ末梢血試料の単核画分は、６つの異なる培地処方で再懸濁され、６ウェルＰｒｉｍａｒｉａまたはコラーゲンコートされたプレートに播種された。１週間の培養後、小さな接着コロニーおよび小さな細胞集合体がすべての条件で観察されたが（ＤＭＥＭ培地単離物は示されない）、細胞型の同一性は識別できなかった。付随する補充物のすべてを有するアルファ−ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、ＥＧＭ−２培地中で、ならびに選択された付随する補充物（マイナスＶＥＧＦおよびＦＧＦ２）および同じ培地中で増殖された組織培養プレート上にコートされたＩ型コラーゲンを有するＥＧＭ−２中で増殖させたとき、小さなクラスターおよび細胞集合体がＰｒｉｍａｒｉａ培養ディッシュ上で観察された。同様の結果は、ＤＭＥＭ処方中で増殖させた末梢血培養においても見られた。
【０３８０】
培養の２週間後、増生コロニーおよび小さな単層が、Ｐｒｉｍａｒｉａおよびコラーゲンコートされたプレート上のα−ＭＥＭ中で観察された。形態学的には、これらのコロニーは平滑筋または内皮に見えた。平滑筋または内皮形態の増生コロニーはまた、他の培地／基材条件において形成された。いくらかのマクロファージは、アルファ−ＭＥＭ中で最初は維持されたが、しかし、引き続く形態に持ち越さなかった。Ｐｒｉｍａｒｉａプレート上で１０％ＦＢＳを有するαＭＥＭ中で単離された細胞は、平滑筋またはマクロファージの形態であった。これらの条件下では内皮細胞は単離されなかった。コラーゲンＩプレート上でαＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で単離された細胞は、平滑筋、内皮、およびマクロファージの形態であった。２０％ＦＢＳを有するＥＧＭ−２およびＤＭＥＭなどの他の培地／基材処方もまた、間葉様細胞および内皮様細胞の増生を許容した。
【０３８１】
１２通りの培地／基質条件のうち、アルファ−ＭＥＭ１０％ＦＢＳを有するＰｒｉｍａｒｉａプレートが、内皮細胞の増生コロニーを伴わない、最も均質な平滑筋細胞の単離を含有した。Ｐｒｉｍａｒｉａプレート上で単離され、Ｎｕｎｃｌｏｎ表面上で（アルファ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で）拡大された細胞は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）に典型的であり、他の研究（Ｋａｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）；Ｋｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）；Ｓｉｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、前出）における記載と一貫している、古典的な「ヒルアンドバレー」形態を呈した。
【０３８２】
これらの細胞はまた、数回の継代の間、この形態を維持した。Ｌｕｄｌｏｗらの米国特許出願番号第２０１００１３１０７５号の図１６において示されるように、ブタ頸動脈ＳＭＣ（Ｈ）およびイヌ膀胱ＳＭＣ（Ｉ）の画像が比較のために示される。より後の継代における平滑筋細胞（Ｆ、Ｇ）は、より大きくかつより広がるようになり、より成熟ＳＭＣのように見えた。初期の継代（Ａ〜Ｅ）は、ブタ頸動脈（Ｈ）およびイヌ膀胱（Ｉ）から単離された平滑筋細胞（ＳＭＣ）に類似している。後期の平滑筋細胞の継代（Ｆ、Ｇ）は、より大きくかつより広がっており、このことは、平滑筋表現型を示唆する。
【０３８３】
脂肪由来の細胞
平滑筋細胞は、以下の手順に従ってブタ脂肪組織から単離された。すべての手順はバイオセーフティーフードの中で実施される。
【０３８４】
脂肪試料を入手する。バイオセーフティー容器中で、使用前２４時間を超えない間、室温または４℃で保存する。１００ｍＬのＰＢＳあたり、１ｇのＢＳＡおよび０．１ｇのコラゲナーゼを加えることによってコラゲナーゼ溶液を調製する。０．２μｍフィルターユニットを通してこの溶液をろ過する。３７℃にあたためる。各遠心分離ボトルに、脂肪体積あたり等価量のコラゲナーゼ溶液を加える。１組織量のコラゲナーゼ溶液が必要とされる（すなわち、１０ｍＬ脂肪組織あたり、１０ｍＬのコラゲナーゼ溶液）。消毒剤で管をぬぐい、キャップをし、パラフィルムで包み、そして振盪機上の３７℃インキュベーター中に６０分間配置する。３００×ｇにて、室温で５分間遠心分離する。管を遠心分離機の外に出し、これらを１０分間激しく振盪して、細胞を完全に混合する。これは、一次脂肪細胞からの間質性細胞の完全な分離を完了するためである。再び３００×ｇにて、室温で５分間遠心分離する。上端の油、一次脂肪細胞（浮遊細胞の黄色層）、およびコラゲナーゼ溶液を注意深く吸引して除く。間質性−血管画分（下端の暗赤色細胞）がかき回されないように、ペレット上に約１０ｍＬの茶色のコラゲナーゼ溶液を残す。１％ＢＳＡを有するＰＢＳ中に細胞のペレットを再懸濁し、Ｓｔｅｒｉ−Ｆｌｉｐを使用してろ過する。３００×ｇで５分間、細胞を遠心分離し、残りのコラゲナーゼ溶液を吸引する。吸引するとき、オイルが可能な限り徹底的に取り除かれるように、ピペットの先端が上端から吸引するべきである。細胞ペレットは、下端において固く充填されているべきである。各遠心分離管に、１０ｍＬの組織培養培地を加え、細胞を再懸濁する。細胞を１つの管にプールし、再度遠心分離する。上清を吸引する。１０ｍＬの培地に細胞を懸濁する。細胞を等しく、従って、適切な数のフラスコに分ける。プレーティングの２４〜７２時間後、フラスコから培地を吸引する。ＰＢＳで洗浄し、吸引する。フラスコあたり、もともとの量の新鮮な培地を加える。細胞は、８０〜９０％コンフルエンスまで増殖させ、次いで、継代するか、Ｐ１（継代１）細胞として凍結するか、または分化させるかのいずれかを行う。引き続く細胞継代によって適した細胞数に達したとき、アリコートが固定され、発現された平滑筋細胞タンパク質の免疫検出のために処理される。
【０３８５】
培養物の形態は、培養中で３〜５日後に評価された。脂肪組織から得られたヒトおよびブタの細胞は、平滑筋細胞の形態学的特徴を呈する（Ｌｕｄｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．米国特許出願第２０１００１３１０７５号の図１７）。細胞はヒルアンドバレー形態を示し、継代時に紡錘形状、平板状、および線維芽細胞様、長くかつ平行列で配置され、ならびに増殖の「回転」外観などのさらなる特徴を呈し、これらのすべてが培養平滑筋細胞に典型的である。
【０３８６】
平滑筋マーカー。収縮遺伝子（およびそれらがコードしているタンパク質）の発現の増加は、ＳＭＣ成熟と関連がある。本発明者らは、総ＲＮＡを単離すること、および半定量ＲＴ−ＰＣＲによって、血液または脂肪組織単離された平滑筋細胞が、平滑筋細胞マーカーであるミオカルディン、平滑筋アルファ−アクチン、ＳＭ２２、ミオシン重鎖、およびカルポニンを発現したか否かを決定した。結果は、これらの細胞が、膀胱平滑筋細胞において見い出された平滑筋細胞マーカーと一貫して、遺伝子レベルでこれらのすべての平滑筋細胞マーカーを発現したことを示す。これらのデータは、末梢血または脂肪組織から単離されたこれらの平滑筋細胞マーカーが、平滑筋細胞の特性を有するという考えを支持する。
【０３８７】
表現型特徴付け。本発明者らは、これらの末梢血単離された平滑筋細胞が、平滑筋遺伝子発現の転写レギュレーターならびに特定の平滑筋収縮タンパク質を発現することをすでに示している。ＲＴ−ＰＣＲ分析が、ＳＭＣマーカーであるミオカルディン、平滑筋アルファ−アクチン、ＳＭ２２、平滑筋ミオシン重鎖、およびカルポニンの遺伝子発現のために実施された（Ｌｕｄｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．米国特許出願第２０１００１３１０７５号の図１９を参照のこと）。試料は、ブタの脂肪、末梢血、および膀胱（継代４）から単離された平滑筋細胞であった。脂肪組織から単離されたＳＭＣは、各継代の間、３〜５日間培養できたのに対して、血液から単離されたＳＭＣは、最初の継代前１４日間培養でき、次いで、さらなる継代について３〜５日間培養できる。ベータ−アクチンのための遺伝子発現は、ゲルの内部負荷対照として使用された。脂肪および末梢血細胞単離物についての発現プロフィールは膀胱ＳＭＣのそれと同等である。
【０３８８】
免疫蛍光染色が、平滑筋細胞発現タンパク質マーカーに指向された様々な抗体を利用して実施された。マーカーであるアルファ−アクチン、ＳＭ２２、カルポニン、および平滑筋ミオシン重鎖が、ブタの脂肪、末梢血、および膀胱から単離された平滑筋細胞において試験された。これらのタンパク質は、すべてが、平滑筋細胞の収縮機能に関与している。複数の継代における平滑筋細胞が、平滑筋アルファ−アクチン、ＳＭ２２、カルポニン、および平滑筋ミオシン重鎖について陽性に染色された。これらのタンパク質の細胞下局在は、膀胱ＳＭＣと比較して、平滑筋細胞において実質的に同一であった。細胞のストレスファイバー中のこれらのタンパク質の詳細な染色が注目された。この染色のパターンは、平滑筋細胞に典型的であり、かつ予測されるものである。
【０３８９】
ヒト末梢血から単離された平滑筋細胞の免疫染色は、継代５において観察された（Ｌｕｄｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．米国特許出願第２０１００１３１０７５号の図２０を参照のこと）。平滑筋アルファ−アクチン、ＳＭ２２、およびカルポニンについてのプローブが使用された。平滑筋アルファ−アクチンおよびカルポニンの二重染色（上端右のパネル）は、同じ細胞中でのこれらの２つのタンパク質の共発現を明らかにする。単一の細胞中での１種より多くの平滑筋細胞マーカーの同時発現は、これらが平滑筋細胞であるという考えをさらに支持する。
【０３９０】
収縮性。末梢血由来の平滑筋細胞は平滑筋収縮タンパク質を発現するので、本発明者らは、これらがＳＭＣのように機能する能力を評価するために、三次元ゲル収縮アッセイを実施した。ＳＭＣは、三次元ゲル中に包埋したときに、コラーゲンマトリックスの収縮を自発的に誘導することが示されている（Ｔｒａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ８８：７７−８３）。脂肪組織由来の平滑筋細胞もまた、収縮性のために試験された。
【０３９１】
Ｌｕｄｌｏｗらの米国特許出願第２０１００１３１０７５号の図２１に示されているように、ブタ血液由来の（Ａ）およびブタ脂肪組織由来の（Ｂ）細胞は、膀胱平滑筋細胞（Ｃ）と同程度まで収縮する。混合物へのＥＤＴＡの添加は収縮を阻害し、従って、収縮がカルシウム依存性であるという考えを支持し、これは、平滑筋細胞の別の特徴である。これらのデータは、直径の減少が収縮細胞に依存すること、および細胞がこの収容能力で機能することを示す。細胞は５００，０００細胞／ｍＬで播種され、２日後のコラーゲンゲル直径の減少によって実証されるように、収縮が可能であることが見い出された。ブタ膀胱平滑筋細胞は陽性対照として使用された。この収縮のカルシウム依存性を実証するために、カルシウムキレート剤ＥＤＴＡが別々の試料に加えられて、収縮を阻害した。これらの結果は、これらの細胞の、膀胱由来の平滑筋細胞と同様の、カルシウム依存性様式で収縮する能力を確認する。
【０３９２】
増殖動態。細胞治療適用において平滑筋細胞を利用するために、必要とされる細胞数が、受容可能な時間枠の中で達成できるか否かを決定することが重要である。イヌおよびブタの研究からの結果は、平滑筋コロニー（末梢血の４０ｍＬ試料から）が播種後７日までの初期に観察でき、そして１４日以内に容易に継代できることを示す。１つの研究において、１２０万個の細胞が培養の１８日後（継代２の最後）に得られ、その時点で、これらは凍結保存された。これらの特定の細胞は、約５０日後に融解され、増殖速度論を決定するために約８０％コンフルエントのときに、慣用的に継代された。融解の６日後、細胞集団は１６７０万個の細胞まで拡大された（継代３の最後）。培養の次の７日後、細胞集団は３１７０万個の細胞に到達した（継代４の最後）である。この初期の研究は、大雑把に３０００万個の細胞を培養の３０日間で達成できることを示す。
【０３９３】
細胞は、限られた増殖能力を有することが見い出された。Ｌｕｄｌｏｗらの米国特許出願第２０１００１３１０７５号の図２２は、単位面積あたりの回収された細胞の数の関数として、ヒト脂肪組織から単離された平滑筋細胞の増殖を示す。これらのデータは、継代４と５の間で、回収された細胞の数は下落し始め、このことは、これらの細胞が限定されかつ有限の増殖能力を有しており、これは、前駆細胞に特徴的であるが、真の幹細胞に特徴的ではないことを示す。
【０３９４】
Ｌｕｄｌｏｗらの米国特許出願第２０１００１３１０７５号の図２３は、継代あたりに回収された細胞の数の関数として、ブタ脂肪、末梢血、および膀胱平滑筋から単離された平滑筋細胞の増殖を示す。図示されるように、細胞数の劇的な増加が、２〜４週間の時間枠に対して、継代２と３の間で達成されており、数千万細胞の回収を可能にしている。このことは、脂肪由来の細胞の限定されかつ有限の増殖能力を実証している。
【０３９５】
増殖の接触阻害。末梢血および脂肪組織から単離された平滑筋細胞は、増殖の接触阻害を呈する。例えば、これらの細胞の形態学評価は、数回の継代に対する増殖の接触阻害の存在を実証する。細胞は、互いとの接触の際に増殖を継続しない。対照的に、ＭＳＣは、増殖の接触阻害を呈さず、これらは、形質転換した細胞培養中での増殖巣形成と同様に、互いの上端に積み重なって観察できる。例えば、Ｚｈｏｕらは、マウス骨髄の単核細胞画分からのＭＳＣの単離および培養を報告しており、３回の継代後に、培養されたＭＳＣが接触阻害の喪失を実証したことを観察している（１０８５０頁および図１Ａを参照のこと）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６；６６（２２）：１０８４９−１０８５４）。
【０３９６】
サイトカインＭＣＰ−１産生。ＭＣＰ−１は膀胱排尿筋細胞の正常な産物である。大動脈平滑筋細胞において、ＭＣＰ−１は再生において役割を果たす。ヒト末梢血平滑筋細胞において産生されたＭＣＰ−１を定量するために、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＥＬＩＳＡベースのアッセイ系が使用された。培地試料は二連でアッセイされ、標準曲線と比較されて、推定ＭＣＰ−１レベルを提供し、μｇ／２４時間／１００万個細胞として報告された。ヒト膀胱平滑筋、脂肪、末梢血、および膀胱尿路上皮（陰性対照）から単離された細胞についてサイトカインＭＣＰ−１の発現が決定された。Ｌｕｄｌｏｗらの米国特許出願第２０１００１３１０７５号の図２４は、この分析からの結果が、ヒト末梢血由来の平滑筋細胞およびヒト脂肪組織由来の平滑筋細胞が、ＭＣＰ−１をヒト膀胱平滑筋細胞のレベルと同等のレベルで産生することを示す。これらのデータは、ちょうど膀胱ＳＭＣと同様に、ＭＣＰ−１が、脂肪および末梢血から単離された平滑筋細胞によって発現されるという結論を支持する。加えて、これらのデータは、筋肉前駆細胞が動員され／移動すること、または構築物中で増殖することを直接的または間接的に引き起こすことによって、ＭＣＰ−１の産生が、再生において決定的な役割を果たし得ることを示唆する。
【０３９７】
脂肪から単離された平滑筋細胞は、いくつかの平滑筋細胞の特徴を示す。本発明者らの研究は、標準的な酵素消化および低速遠心分離プロトコールを使用して、細胞が脂肪から容易に単離できることを示した。細胞は非常に迅速に拡大でき、おそらく、１ヶ月の時間内で、約３０００万個細胞まで到達する。平滑筋マーカーが継代３まで早い時期に存在しているので、本発明者らの研究は、これらの細胞が、実際は、真の幹細胞集団ではなく平滑筋細胞集団を表す可能性があることをさらに示した。さらに、単離された平滑筋細胞は、標準コラーゲンゲル収縮アッセイによって実証されるように、収縮機能が可能である。平滑筋細胞の特徴付け。本発明者らは、引き続く継代の間、平滑筋細胞の細胞形態が保持されることをすでに示している。遺伝子レベルとタンパク質レベルの両方で平滑筋マーカーの良好な相関もまた存在する。サイトカイン誘導。脂肪平滑筋細胞によるＭＣＰ−１の発現は、本発明者らに、自然の間葉系幹細胞が補充され／移動すること、または構築物中で増殖することを直接的または間接的に引き起こすことによって、ＭＣＰ−１の産生が、再生において決定的な役割を果たし得ると仮定することを導いた。
【０３９８】
実施例２−ＭＣＰ−１産生および細胞密度
膀胱平滑筋細胞の培養からの馴化培地が、ＭＣＰ−１の検出および定量のための市販のキットを使用して分析された。９種の構築物からの馴化培地試料（３つの播種レベルの各々からの３つずつ）および構築物に播種するために使用された対のＳＭＣ細胞がＭＣＰ−１レベルについて試験された。結果を表２．１に示す。
【０３９９】
2013525077.tif 000004
【０４００】
構築物培地中に存在するＭＣＰ−１を定量するために、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのイヌＭＣＰ−１に特異的なＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用した。試料は二連でアッセイされ、標準曲線と比較されて、構築物培地中の推定ＭＣＰ−１レベルを提供した。Ｌｕｄｌｏｗらの米国特許出願第２０１００１３１０７５号の図２５に示されるように、この分析からの結果は、ＭＣＰ−１産生と、播種された細胞の密度との間の正の相関を示す。表２．２は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＥＬＩＳＡによって決定された構築物培地のＭＣＰ−１定量を示す。表２．３は、得られる比率が播種密度の違いに匹敵することが見ることができる、各群からの平均ＭＣＰ−１レベルの比較を示す。
【０４０１】
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【０４０２】
結果は、培地中で検出された細胞数とＭＣＰ−１レベルの間に正の相関が存在したことを示した。ＳＭＣ外植のために処理された再生イヌ膀胱（およそ９００万個の細胞が播種された）からのある組織は、自然のイヌ組織および再生されたイヌ組織において典型的に観察されるものよりも多くの脂肪を含有したことが以前に注目されている。組織は、外植されたときに非常に柔らかく、そして外植片は、見られたときに、自然の組織で観察されたものに対して、より高い比率で脂肪組織を含有した。
【０４０３】
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【０４０４】
これらの外植プレート上の培地は、脂肪組織が存在するときに典型的に観察される表面上の「光沢」もまた呈した。これらの観察は、再生された膀胱組織の脂肪沈着／脂肪生成におけるＭＣＰ−１／ＣＣＲ−２相互作用のための役割を示唆する。
【０４０５】
実施例３−脂肪由来の平滑筋細胞対間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
脂肪組織は、内皮細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、および限られた間葉分化潜在能力を有する前駆細胞から構成される異種細胞集団を表す。Ｌｕｄｌｏｗらの米国公開特許出願２０１００１３１０７５号（その全体が参照により組み込まれる）およびＢａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１  Ａｐｒ  ２．［印刷前電子公開］において記載されるように、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、抗原発現、タンパク質フィンガープリンティング、増殖速度論、および機能的分析は、ヒト脂肪から得られた、接着性の間質性血管画分（ＳＶＦ）の細胞組成を定量的に評価するためである。培地処方が脂肪ＳＶＦ平滑筋細胞区画についての富化に影響を与えることが見い出された。これらのヒト脂肪由来の平滑筋細胞（Ａｄ−ＳＭＣ）は、表現型的かつ機能的に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または他の脂肪由来の前駆細胞集団から区別できる。
【０４０６】
最初の「継代ゼロ」接着ヒトＳＶＦ由来の細胞集団の細胞組成を、定量的リアルタイムＰＣＲ法（ＴＡＱＭＡＮ（商標））を使用して調べた。開始の接着性ＳＶＦ由来の細胞集団（内皮マーカー、平滑筋マーカー、および脂肪細胞関連マーカーを発現する細胞から構成される）から、ＭＳＣの増殖に対して選択する規定された培地条件下でのＳＶＦ由来の細胞の拡大を通して、顕著に区別できる生物学的特性を有する細胞集団を同定および培養することが可能であることが見い出された（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐａｒｔ  Ａ  １５：１−１１；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １１，１８９−１９７（２００９））。ＭＳＣと歴史的に関連するマーカーの発現における部分的な重複に関わらず、この細胞集団は、鍵となる核および細胞表面マーカーの発現のＦＡＣｓおよびＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）分析に基づいて、ＭＳＣと比較して、明確に、著明な平滑筋細胞表現型を有する。この集団はまた、ＭＳＣと比較したときに、際立って内皮性が少ない。平滑筋細胞表現型の現れは、継代数、脂肪ドナー供給源、または組換えサイトカインおよび増殖因子を用いる指向された分化についての要求性とは独立している。加えて、この平滑筋細胞が富化された集団は、明瞭にそれをＭＳＣから区別する、特有のプロテオミックシグネチャーを有する。最後に、本発明者らは、２つの細胞型の間で明確な機能的二分法を立証するために、トロンボキサンＡ２模倣物Ｕ４６６１９に向けた、この平滑筋細胞様集団およびＭＳＣの正反対に対立する応答を活用した。まとめると、これらのデータは、この集団が、脂肪由来の平滑筋細胞（Ａｄ−ＳＭＣ）集団としてより正確に説明され、そして内皮細胞およびＭＳＣを含む他のクラスの脂肪由来の細胞と比較して、別々のかつ区別できる細胞種を表すという結論を支持する。
【０４０７】
方法および材料
脂肪組織の調製。ヒト脂肪試料は、皮下にまたは脂肪吸引を通してのいずれかで得られ（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）、そして等量のＰＢＳ／ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）（５μｇ／ｍＬ）で３〜５回洗浄した。脂肪は、３７℃で１時間、ろ過滅菌したコラゲナーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）（０．１％、１％ＢＳＡ  ＤＭＥＭ−ＨＧ（Ｇｉｂｃｏ）中）で消化し、次いで、５０ｍＬ円錐管中３００ｇで５分間、遠心分離された。間質性血管画分は、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中に再懸濁され、１００  ５μｍ  Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ真空フィルターを通してろ過された。細胞集団は３００ｇで５分間、再度ペレット化され、そしてＤＭＥＭ−ＨＧ＋１０％ＦＢＳ＋ゲンタマイシン５μｇ／ｍＬ中に再懸濁された。継代２の最後における骨髄由来のＭＳＣは、商業的な供給業者（Ｌｏｎｚａ）から入手された。平滑筋細胞マーカーの発現に対する培地型の効果の研究については、ＳＶＦ由来の細胞は、代替的に、α−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ、ＳＭＣＭ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）またはＬ１５（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁された。
【０４０８】
Ｔａｑ−Ｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲ。ＲＮＡは、製造業者の説明書に従って、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＭＳＣまたはＡｄ−ＳＭＣから精製された。ｃＤＮＡは、製造業者の説明書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２μｇのＲＮＡから生成された。ｃＤＮＡ合成後、各試料は１：１０に希釈された。ｑＲＴ−ＰＣＲは、以下に列挙するＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブを使用して、次のように設定された：１０μＬマスターミックス（２×）、１μＬプライマー／プローブ、９μＬ  ｃＤＮＡ（１：１０希釈）。
【０４０９】
次のＴａｑＭａｎプライマーが、平滑筋、内皮、および脂肪生成遺伝子発現の評価のために使用された：ＳｍαＡ（平滑筋アルファ−アクチン）：Ｈｓ００９０９４４９＿ｍ１、ＳＭ２２：Ｈｓ００１６２５５８＿ｍ１、ミオカルディン：Ｈｓ００５３８０７６＿ｍ１、ＳＭＭＨＣ（平滑筋ミオシン重鎖）：Ｈｓ００２２４６１０＿ｍ１、カルポニン：Ｈｓ００１５４５４３＿ｍ１、アディポネクチン：Ｈｓ００６０５９１７＿ｍ１、ＦＡＢＰ−４（脂肪酸結合タンパク質＃４）：Ｈｓ１０８６１７７＿ｍ１、ＣＤＨ５／ＶＥＣＡＤ（血管内皮カドヘリン）：Ｈｓ００１７４３４４＿ｍ１、ｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）：Ｈｓ００１６９７９５＿ｍ１、ＰＥＣＡＭ１（血小板内皮細胞接着分子＃１）：Ｈｓ００１６９７７７＿ｍ１、ＦＬＴ１／ＶＥＧＦＲ（ＶＥＧＦ受容体）：Ｈｓ０１０５２９３６＿ｍ１、ＫＤＲ／ＦＬＫ１（胎児肝臓キナーゼ＃１）：Ｈｓ００１７６６７６＿ｍ１、ＴＥＫ（チロシンキナーゼ、内皮）：Ｈｓ００９４５１５５＿ｍ１。１８ｓ  ｒＲＮＡが内因性対照として使用され、すべての試料は膀胱平滑筋細胞ｃＤＮＡに対して較正された。すべてのプライマー／プローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから確保された。すべての反応は、ＡＢＩ７３００リアルタイムサーマルサイクラーにおいて、デフォルトサイクリングパラメーターを使用して実行された。ＰＣＲデータの分析は、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ＣｔによるＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ（ＲＱ）の方法を使用して実施された。
【０４１０】
アレイ−ＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイムアレイベースのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＭＳＣ（ＰＡＨＳ−０８２Ａ）および細胞表面マーカーＰＣＲアレイプラットフォーム（ＰＡＨＳ−０５５Ａ）を、製造業者の説明書に従って使用して、３５サイクル実施した。
【０４１１】
ＦＡＣｓ分析
データ点あたり０．５×１０６〜１×１０６細胞が２％パラホルムアルデヒド中で固定され、そしてＦｃ受容体が、非特異的結合を妨害するためにブロックされた。次いで、細胞が、製造業者によって推奨されるように、細胞表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、またはＣＤ１３３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のための直接結合体化された抗体とともにインキュベートされた。最終洗浄（ＰＢＳ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に続いて、抗原検出は、適切な蛍光チャネルを使用して、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  １またはＧｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｍｉｎｉ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｓｓａｙシステムを利用して実施された。最小限５０００〜１０，０００イベントが、各試料から獲得された。
【０４１２】
２Ｄプロテオミック分析
継代制御された（Ｐ２の最後）骨髄由来ＭＳＣおよびＡｄ−ＳＭＣは、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．５％ＮＰ４０およびプロテアーゼインヒビター、Ｒｏｃｈｅ）中で溶解され、各細胞型からの４０μｇのタンパク質溶解物は、製造業者の説明書に従って、ｐＨ４．０〜７．０  Ｚｏｏｍ  ＩＥＦストリップ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で泳動された。次いで、各ストリップは、４〜１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓアクリルアミド上に負荷し、二次元泳動を行った。ゲルは、製造業者の説明書に従って、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色された。
【０４１３】
継代制御（Ｐ２の終わり）骨髄由来のＭＳＣおよびＡｄ−ＳＭＣは、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．５％ＮＰ４０およびプロテアーゼインヒビター、Ｒｏｃｈｅ）中で溶解され、各細胞型からの４０μｇのタンパク質溶解物は、製造業者の説明書に従って、ｐＨ４．０〜７．０  Ｚｏｏｍ  ＩＥＦストリップ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で泳動された。次いで、各ストリップは、４〜１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓアクリルアミド上に負荷し、二次元泳動を行った。ゲルは、製造業者の説明書に従って、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色された。
【０４１４】
結果
Ａｄ−ＳＶＦ中の発現マーカー（Ｌｕｄｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．米国公開特許出願第２０１００１３１０７５号の図９１）。本発明者らは、規定された内皮、脂肪生成、および平滑筋細胞特異的ＴａｑＭａｎプライマーのパネルを使用して、プレーティングに続いて最初の２４〜４８時間以内に、組織培養フラスコ上で脂肪組織の間質性−血管画分から得られた細胞集団の定量的ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。これは、最初の接着細胞集団における発現マーカーを分析するために役立ち、ならびに平滑筋細胞特異的遺伝子の発現の際に、継代、時間、および培地処方の効果の引き続く分析のためのベースラインを確立する。低いがしかし検出可能なレベルのＦＡＢＰ−４およびアディポネクチンが、残りの脂肪細胞の存在と一貫して、最初の２４時間以内に接着細胞集団中で観察された。同様に、ＶＥＣＡＤ、ｖＷＦ、ＰＥＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＦＬＫ、およびＴＥＫの発現によって規定される内皮細胞集団がこの時点において存在した。ＳＭ＿Ａ、ＳＭ２２、ミオカルディン、ＳＭＭＨＣ、およびカルポニンの発現によって規定される平滑筋細胞集団もまた、最初期接着細胞集団の中で観察された。本発明者らは、プレーティングの２４〜４８時間以内に、３つすべての細胞集団を検出することが可能であった。以下に論じられるように、平滑筋細胞は、細胞集団のこの混合物から単離された。
【０４１５】
平滑筋マーカーの発現は培地型に依存する。脂肪は複数の細胞型から構成される不均一組織であるので、内皮細胞またはＭＳＣを超えた、平滑筋細胞についての富化は、培地処方によって影響を受ける可能性があると予想することは合理的である。骨髄および脂肪からの未分化ＭＳＣの単離は、培地組成に密接に依存している（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９前出）。特に、培地中のグルコースレベルの上昇または高密度での増殖の存在は、ＭＳＣの拡大に逆らって選択するように見える（Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．２００９前出；Ｓｔｏｌｚｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｊｕｖ  Ｒｅｓ  ２００６；９：３１−３５）。本発明者らは、培地処方の調節が、ＭＳＣおよび他の細胞集団を減らした、平滑筋細胞についての富化において有用であり得ると推論した。Ｌｕｄｌｏｗらの米国公開特許出願第２０１００１３１０７５号の図９２（培地型によるＳＭＣマーカー発現のＴａｑｍａｎ分析）に示されるように、脂肪−ＳＶＦからの平滑筋細胞富化集団の拡大は、ＤＭＥＭ−ＨＧ培地中での増殖に緊密に依存する。α−ＭＥＭ、ＳＭＣＭ、またはＬ１５の拡大は、ＳＭαＡ、ＳＭ２２、ミオカルディン、ＳＭＭＨＣ、およびカルポニンの発現の減少によって示されるように、平滑筋細胞表現型の顕著な減少と関連付けられる。
【０４１６】
Ａｄ−ＳＭＣは、ＭＳＣよりも平滑筋細胞により密接に類似している。本発明者らは、Ａｄ−ＳＭＣおよびＭＳＣの平滑筋細胞に関連する遺伝子発現シグネチャーを評価するために、半定量ＲＴ−ＰＣＲを使用した。Ｌｕｄｌｏｗらの米国公開特許出願第２０１００１３１０７５号の図９３において示されるように、鍵となる平滑筋マーカーであるカルポニン、ミオカルディン、およびＳＭＭＨＣの発現は、ＭＳＣと比較したときに、Ａｄ−ＳＭＣにおいて著しく顕著であり、この細胞集団がＭＳＣよりも平滑筋細胞により類似しているという本発明者らの仮説を支持する。次いで、本発明者らは、複数の独立した脂肪調製物（ｎ＝４）にわたって、および培養中の５継代に対して、ＳＭＣ特異的マーカーの発現の安定性を評価した。Ｌｕｄｌｏｗらの米国公開特許出願第２０１００１３１０７５号（継代を横切ったＡｄのＲＴ−ＰＣＲ）の図９４において示されるように、ＳＭαＡ、ＳＭ２２、ＳＭＭＨＣ、ミオカルディン、およびカルポニンの発現は、継代を横切って顕著に一定であり、かつドナーとは独立しており、このことは、平滑筋細胞表現型の発現が経時的に安定であることを実証する。これらの観察は、Ａｄ−ＳＭＣが、より完全に分化されており、表現型的に安定な細胞集団であることと一貫している。
【０４１７】
アレイベースのＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ａｄ−ＳＭＣとＭＳＣの間で、鍵となるマーカーの遺伝子発現の顕著な違いを示す。本発明者らは、継代制御された（Ｐ２）Ａｄ−ＳＭＣとＭＳＣの間での遺伝子発現の違いを体系的に特定するために、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＭＳＣ  Ｍａｒｋｅｒ  Ａｒｒａｙパネルを使用した。このパネルは、ＭＳＣの多能性および自己再生に関与する８４個の遺伝子の発現状態をプロファイリングする。Ａｄ−ＳＭＣとＭＳＣの間で区別できるとして同定された鍵となるマーカーの要約は表３．１に示される。ＭＳＣと比較して、有意な（少なくとも１０倍の）Ａｄ−ＳＭＣにおける下方調節が、ＧＤＦ５、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＭＣＡＭ、ＲＵＮＸ２、およびＶＣＡＭ１について観察された。ＭＳＣと比較して、有意な（少なくとも１０倍の）Ａｄ−ＳＭＣにおける上方調節が、ＢＭＰ６、ＣＤ４４、およびＩＬ１βについて観察された。遺伝子発現におけるこれらの鍵となる違いは、継代または細胞試料とは独立して一貫したままであることが観察された（ｎ＝６、データ示さず）。遺伝子発現分析は、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ａｒｒａｙを使用して継続された。
【０４１８】
2013525077.tif 000007
【０４１９】
鍵となる結果の要約は表３．２に提示され、ここでは、本発明者らはＰ０およびＰ４においてＡｄ−ＳＭＣを試験した。
【０４２０】
2013525077.tif 000008
【０４２１】
線維芽細胞性／間質性マーカーＡＬＣＡＭ、ＣＯＬ１Ａ１、およびＣＯＬ１Ａ２の発現は、平滑筋細胞特異的マーカーＭＹＨ１０、ＭＹＨ９、およびＭＹＯＣＤと同様に、継代にわたって維持される。この集団は、脂肪細胞マーカーＲＥＴＮについて陰性であり、このことは、接着性脂肪細胞の夾雑が最小限であることを示す。重要なことに、Ａｄ−ＳＭＣは４継代以内にＨＬＡ  ＭＨＣ  ＩＩ陰性状態を獲得するが、これらは最初はＨＬＡ  ＭＨＣ  ＩＩ陽性であり、このことは、ＭＨＣ  ＩＩ陰性であるＭＳＣとの鍵となる区別である。別の興味深い観察は、内皮マーカーＥＮＧ、ＩＣＡＭ２、ＮＯＳ３、ＰＥＣＡＭ１、ＳＥＬＰ、ＴＥＫ、ＶＥＣＡＭ、およびＶＷＦの下方調節の一般的な流れによって判断されるように、Ａｄ−ＳＭＣは、継代とともに進行的に内皮が少なくなることである。このデータは、Ｌｕｄｌｏｗらの米国公開特許出願第２０１００１３１０７５号の図９５におけるＲＴＰＣＲ分析によって、独立して確認されている。
【０４２２】
脂肪由来の平滑筋細胞（Ａｄ−ＳＭＣ）と間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の間の遺伝子発現プロフィールをさらに比較するために、ＰＣＲベースの遺伝子アレイ分析を、ヒト間葉系幹細胞マーカー（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ＰＡＨＳ−０８２Ａ）について実施した（データ示さず）。結果は、Ａｄ−ＳＭＣ、ＭＳＣ、および十分に特徴付けられている非ＭＳＣ細胞型、ヒト大動脈内皮細胞（ＨｕＡＥＣ）の間の相同遺伝子発現の程度を示す。分析された８４個のヒトＭＳＣ遺伝子のうち、ヒトＡｄ−ＳＭＣは、最初の単離において、ヒトＭＳＣと２７％のみ相同性を共有する（８４個の遺伝子中２３個）（データ示さず）。対照的に、十分に特徴付けられている、非ＭＳＣ、ＨｕＡＥＣは、ＭＳＣと４９％の相同性を共有する（８４個の遺伝子のうち４１個）（データ示さず）。このことは、Ａｄ−ＳＭＣが、よく知られている非ＭＳＣ細胞型であるＨｕＡＥＣよりも、ＭＳＣとの顕著により少ない相同性を共有するという結論を支持する。従って、Ａｄ−ＳＭＣは、ＨｕＡＥＣよりもさらによりＭＳＣに似ておらず、脂肪組織から単離されたＡｄ−ＳＭＣ細胞はＡｄ−ＳＭＣであって、ＭＳＣではないという結論をさらに支持する。
【０４２３】
Ａｄ−ＳＭＣの細胞表面プロフィールは、ＭＳＣについて定義されたものとは有意に異なる。
本発明者らは、ＭＳＣとＡｄ−ＳＭＣの両方が、伝統的にＭＳＣと関連付けられている発現表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の発現を共有していることを観察した（表３．１）。しかし、以下に論じられるように、これらのマーカーは、ＭＳＣとの歴史的な関連性を超えた固有の生物学的意義を有していない。細胞表面マーカーＲＴ−ＰＣＲ分析からの遺伝子発現の結果は、一般的には、Ｌｕｄｌｏｗらの米国公開特許出願第２０１００１３１０７５号（図９６Ａ〜Ｃ（Ａｄ−ＳＭＣ）および図９７Ａ〜Ｂ（ＭＳＣ））に示される比較ＦＡＣｓ分析の結果において反映されており、これは、Ａｄ−ＳＭＣが、ＣＤ３１＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋であることを示す。重要なことに、Ａｄ−ＳＭＣはＣＤ４５＋およびＣＤ１１７＋であり、ＣＤ４５−およびＣＤ１１７−であるＭＳＣとの明白な区別である。ＣＤ７３の発現は、脂肪間質性血管画分について以前に報告されたものと一貫しているが（ｄａ  Ｓｉｌｖａ  Ｍｅｉｒｅｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１９：２２０４（２００６））、しかし、骨髄由来のＭＳＣについて報告されたものとは異なっている。
【０４２４】
継代制御されたＭＳＣおよびＡｄ−ＳＭＣは独特なプロテオミックシグネチャーを有する。
Ｌｕｄｌｏｗらの米国公開特許出願第２０１００１３１０７５号の図３８は、ＭＳＣ、膀胱由来のＳＭＣ、Ａｄ−ＳＭＣ、およびヒト大動脈平滑筋細胞の全体のプロテオミックシグネチャーの比較分析を示す。上の２つのパネルは、Ａｄ−ＳＭＣがＭＳＣから区別でき、また脂肪組織から単離されたＭＳＣならびに他のクラスの幹細胞および前駆細胞とは異なることを実証する（Ｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ；Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００９；９：２２３−２３２；Ｎｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００８；３１４：１５７５−１５８４）。両方のゲル上の矢印は、ＭＳＣとＡｄＳＭＣの間の１つの違い；ｐＨ勾配および分子量範囲の中での異なりかつ区別できる位置におけるタンパク質の濃度を強調する。ＭＳＣは、ｐＨ７．０、および６０，０００以上の分子量に対してより近くで、このタンパク質濃度を有する。対照的に、ＡｄＳＭＣは、ｐＨ４．０、および６０，０００未満の分子量に対してより近くで、このタンパク質濃度を有する。ｐＨ７．０におけるゲルの端から右外側に沿ったスメアによって示されるように、ＡｄＳＭＣはまた、７より上のｐＨを有する存在するタンパク質を、ＭＳＣよりも多く有する。膀胱平滑筋細胞を対照として分析した。ボックスはすべての試料の中での類似性の領域を示す。ＡｄＳＭＣタンパク質プロフィールは膀胱由来のＳＭＣのプロフィール（左下のパネル）に最も類似しており、これは、ＭＳＣについて観察されたパターンから区別されることが明白である。大動脈平滑筋細胞もまた、さらなる平滑筋細胞対照（右下のパネル）として分析された。大動脈平滑筋細胞および膀胱平滑筋細胞のプロテオミックシグネチャーは、最も同一性がある。まとめると、ＭＳＣのプロフィールと区別できるように異なっている、ＡｄＳＭＣ、膀胱、および大動脈平滑筋細胞のプロフィール間の高度の類似性は、ＭＳＣではなくＳＭＣが脂肪組織から単離されているという結論を支持する。すべてのゲルはＳＰＲＹＯ  Ｒｕｂｙ染色を用いて染色されて、タンパク質パターンを可視化した。
【０４２５】
Ａｄ−ＳＭＣの増殖動態はＭＳＣとは顕著に異なる。
Ａｄ−ＳＭＣの増殖性潜在能力は、４０継代まで首尾よく拡大されてきたＭＳＣとは顕著に異なる（Ｂｒｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４：２７８−２９４（１９９７））。Ｌｕｄｌｏｗらの米国公開特許出願第２０１００１３１０７５号の図９９において示されるように、Ａｄ−ＳＭＣは、培養において４日目〜５日目後に増殖性能力の顕著な下落を示す。本発明者らはまた、ＭＳＣとは異なり、Ａｄ−ＳＭＣが、接触依存性である増殖性の阻害を呈することも観察してきた。これらの観察は、Ａｄ−ＳＭＣが自己再生の能力を有さないこと、それゆえに、定義により、幹細胞または前駆細胞ではないことを実証する。ＭＳＣは増殖性の接触阻害を呈さず、そしてこれらは、形質転換された細胞培養におけるフォーカス形成と同様に、互いに上端に積み重なって観察できる。このことは、以前の観察と一貫している（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２００６前出）。
【０４２６】
Ａｄ−ＳＭＣおよびＭＳＣは、Ｕ４６６１９を用いる処理に対して、明確に反対の応答を有する。
平滑筋細胞関連発生経路の活性化に関与するシグナル伝達カスケードを標的とする小分子の効果を評価するための本発明者らの取り組みの一部として、本発明者らは、その効果には細胞内Ｃａ２＋レベルの増加ならびにＲｈｏＡ、ＣａＭおよびＭＬＣキナーゼシグナル伝達カスケードの活性化が含まれる、トロンボキサンＡ２模倣物であるＵ４６６１９に焦点を当てた。以前に報告されたように（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２７（１）：１９１−１９９）、本発明者らは、Ｕ４６６１９（１μＭ）を用いる処理が、ＭＳＣにおいて、鍵となる平滑筋細胞マーカーであるミオカルディンおよびＳＭＭＨＣの上方調節に導いたことを確認した。しかし、Ａｄ−ＳＭＣは、同じ処理に対して、Ｌｕｄｌｏｗらの米国公開特許出願第２０１００１３１０７５号の図１００において示されるように、ミオカルディンおよびＳＭＭＨＣ発現のあいまいでない下方調節によって応答した（レーン：１−ＭＳＣ対照；２−ＭＳＣ＋Ｕ４６６１９；３−Ａｄ−ＳＭＣ対照；４−Ａｄ−ＳＭＣ＋Ｕ４６６１９；５−Ｈ２０；および６−ＳＭＣ）。これらの結果はＡｄ−ＳＭＣとＭＳＣの間の機能的二分性の証拠を提供する。
【０４２７】
機能的マーカーの発現
Ｌｕｄｌｏｗらの米国公開特許出願第２０１００１３１０７５号の図１０１は、中胚葉分化マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を提供する。レーンの内容物：１：ＭＳＣ対照；２：ＭＳＣ実験；３：ＡｄＳＭＣ対照；４：ＡｄＳＭＣ実験；５：末梢血対照；６：末梢血実験；および７：Ｈ２Ｏ。ＭＳＣおよびＡｄＳＭＣにおける中胚葉分化のマーカーの発現は、脂肪生成分化を受けている。ＡｄＳＭＣは、標準条件下での増殖の間に、ＭＳＣと比較して、有意により高いオステオポンチンの発現を示す（ｎ＝１）。Ｏｃｔ４Ａのスプライシング変異体であり、確立された多能性のマーカーであるＯｃｔ４Ｂ（Ｋｏｔｏｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６（１）：２９０−１）の発現は、ＭＳＣと比較して、脂肪由来の細胞中で有意に上方調節される。ＭＳＣも脂肪由来の細胞も、Ｏｃｔ４Ａの発現を示さなかった。
【０４２８】
Ｌｕｄｌｏｗらの米国公開特許出願第２０１００１３１０７５号の図１０２は、ＭＳＣ／ＡｄＳＭＣにおけるＯｃｔ４Ａ／Ｏｃｔ４Ｂ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。レーンの内容物：１：膀胱ＳＭＣ；２：ＨＦＦ−１（ヒト線維芽細胞）；３：ＭＳＣ；４：ＡｄＳＭＣ；５：末梢血；６：Ｈ２Ｏ。密接に関連がある転写アイソフォームＯｃｔ４ＡおよびＯｃｔ４Ｂの発現が、ＭＳＣ、ＡｄＳＭＣ、線維芽細胞、およびＳＭＣ系統において評価された。評価されたすべての細胞系統がＯｃｔ４Ｂを発現したが、多能性マーカーＯｃｔ４Ａ（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９前出）の発現は観察されなかった（ｎ＝１）。
【０４２９】
本研究は、脂肪のＰ０接着性間質性血管画分からの直接的なＡｄ−ＳＭＣの単離が培地処方に依存することを実証する。平滑筋細胞マーカーの発現は強固かつ一貫しており、ドナー供給源および継代にわたって独立している。本発明者らは、遺伝子発現、プロテオミックおよび表面マーカー分析によって実証されるように、Ａｄ−ＳＭＣがＭＳＣから表現型的に区別でき、かつ、平滑筋細胞関連のシグナル伝達経路を標的とする薬理学的因子に対するそれらの応答によって評価されるように、ＭＳＣから機能的に区別できることを示した。他の公開されている報告とは対照的に、これらの平滑筋細胞の単離は、ＴＧＦ−βまたは関連する小分子を用いる方向付けられた分化を要求しない。Ａｄ−ＳＭＣは、４〜５継代以内に１０７細胞まで拡大され得、十分な範囲の平滑筋細胞関連マーカーを発現し、およびインビトロ（Ｃａ２＋−依存性収縮性）とインビボ（ブタ切除モデルにおける新たな尿路導管の再生）の両方で、膀胱由来のＳＭＣと機能的に同等である（Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｊｕｌｙ  ８−１１，２００９）。これらのデータは、この集団が脂肪由来の平滑筋細胞（Ａｄ−ＳＭＣ）集団としてより正確に記載され、そして内皮細胞およびＭＳＣを含む、他のクラスの脂肪由来の細胞と比較して、別々のかつ区別できる集団を表すという結論を支持する。
【０４３０】
実施例４−膀胱でない細胞供給源からの新たな尿路導管の構築
Ｌｕｄｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．米国公開特許出願第２０１００１３１０７５号およびＬｕｄｌｏｗらの米国仮出願第６１／３３０，７７４号（この内容はその全体が参照により組み込まれる）は、ブタ末梢血および脂肪からの平滑筋細胞の単離および特徴付けを記載している。末梢血および脂肪由来の平滑筋細胞は、合成の、生物分解性管状足場構造を播種するために使用され得、ブタ膀胱切除モデルへのこれらの播種された足場の移植は、新たな尿路導管の首尾よい再生に導く。平滑筋細胞は、実施例１に記載されるプロトコールに従って、ブタ膀胱、脂肪、および末梢血から得られた（Ｌｕｄｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．米国仮出願第６１／３３０，７７４号の実施例３も参照のこと）。
【０４３１】
ブタからの末梢血由来の単核画分の直接プレーティングは、典型的な平滑筋細胞形態を有するコロニーの成長を生じる。スクリーニングされたすべて（１００％）の動物が（ｎ＝２４）平滑筋細胞結腸を生成し、２．４４×１０３〜２．３７×１０６平滑筋細胞が、５０ｍＬの末梢血から、継代ゼロで回収された。平滑筋細胞の回収は、培地処方、細胞密度、または表面コーティングの変化によって影響されなかった（データ示さず）。同様のアプローチを、平滑筋細胞の供給源として、皮下または脂肪吸引物由来の脂肪の潜在的な適用を調べるために使用した。本発明者らは、ブタ脂肪からの平滑筋細胞のコロニー（単層に拡大可能）を１００％効率で生成することができ（ｎ＝２４）、細胞回収率は１．３７×１０５〜４．３６×１０５細胞／ｇ脂肪組織であった。比較として、平滑筋細胞は、１．２９×１０６〜９．３×１０６細胞／ｇ膀胱組織の回収率で膀胱組織から単離できた。末梢血または脂肪からの滑筋細胞コロニーの拡大は、培養された膀胱由来の平滑筋細胞に特徴的な典型的な旋回状の「ヒルアンドバレー」組織化を伴う細胞単層の形成を生じた。
【０４３２】
平滑筋収縮性と関連するタンパク質（ミオカルディン、ＳＭ２２、α−平滑筋アクチン（ＳＭαＡ）、平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭＭＨＣ）、およびカルポニン（ＣＮＮ））の発現の増加は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫蛍光分析によって確認された。ブタ膀胱−、脂肪−、および末梢血−由来の平滑筋細胞の各々の収縮性は、コラーゲンゲルマトリックス中でのＣａ２＋依存性収縮性アッセイおよび三次元Ｃａ２＋−依存性収縮性アッセイによって確認された。収縮性は、公知のＣａ２＋キレート剤であるＥＤＴＡによって阻害された。ブタの（Ａ）膀胱−、（Ｂ）脂肪−、および（Ｃ）末梢血−由来の平滑筋細胞の増殖動態もまた評価された。平滑筋細胞コロニー（ブタ末梢血の５０ｍＬ試料または７〜２５ｇブタ脂肪から）は播種後７日以内に同定可能であり、１４日以内に継代されてもよいことが観察された。１００万から数１０００万個の平滑筋細胞が、２〜４週間以内に、膀胱、末梢血、または脂肪から回収された（ｎ＝２４）。膀胱および脂肪由来の平滑筋細胞は、合成の新たな尿路導管足場に播種するための細胞を収穫する前に、２継代の間拡大された。末梢血由来の平滑筋細胞は３〜４継代の間拡大され、等価な細胞数を生成した。平均して、３０〜４０×１０６平滑筋細胞が、新たな尿路導管足場に播種するために使用された。
【０４３３】
材料および方法
ブタの膀胱、脂肪、および末梢血からの平滑筋細胞の生成。平滑筋細胞は膀胱および脂肪生検から単離され、ならびに末梢血は新たな尿路導管構築物の生成における使用のために引き出される。１ｃｍ２膀胱生検試料、２ｃｍ２脂肪生検試料、および５０ｍＬの末梢血が、最終の新たな尿路導管の計画された移植のおよそ８週間前に、２４匹のＧｏｔｔｉｎｇｅｎブタの各々から得られた。膀胱由来の平滑筋細胞の単離のために、尿路上皮細胞層が膀胱生検から解剖されて除かれ、残りの平滑筋層は１ｍｍ２ピースに切断され、組織培養プレートの表面に配列された。生検ピースは、バイオセーフティーキャビネットの中で、１０〜３０分間乾燥された。ＤＭＥＭ−ＨＧ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳが生検試料に加えられ、加湿３７℃インキュベーター中で、５％ＣＯ２にてインキュベートされた。
【０４３４】
脂肪組織（７〜２５ｇ）はＰＢＳで３回洗浄され、メスおよびはさみを用いて刻まれ、５０ｍＬ円錐管に移され、そしてＤＭＥＭ−ＨＧ中０．３％コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）および１％ＢＳＡの溶液中で、３７℃にて６０分間インキュベートされた。これらの管は、消化を容易にするために、継続的に振動されるか、または周期的に振盪されるかのいずれかであった。間質性血管画分は、６００ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化され、ＤＭＥＭ−ＨＧ＋１０％ＦＢＳ中に再懸濁された。次いで、間質性血管画分は継代ゼロに播種するために使用された。２５ｍＬのブタ末梢血は、ＰＢＳ中で１：１希釈され、５０ｍＬ円錐管中で２５ｍＬ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ）を重層された。遠心分離後（例えば、８００ｇ、３０分間）、単核画分が収集され、ＰＢＳで１回洗浄され、そして継代ゼロに播種するためにα−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁された。
【０４３５】
新尿路導管細胞／足場複合物の組み立て
膀胱、脂肪、および末梢血由来の平滑筋細胞は、ＮＵＣ足場に播種するために要求される１０７細胞を生成するために７週間までの間別々に拡大された。膀胱および脂肪由来の平滑筋細胞は、最終構築物を産生するための足場の播種のために細胞を収穫する前に、２継代の間拡大された。末梢血由来の平滑筋細胞培養は、足場播種のための収穫の前にＰ３〜４まで拡大された。ＮＵＣ足場を作製するために、ＰＧＡフェルトは、サイズを合わせるために切断され、ＮＵＣの形状に縫合され、そしてＰＬＧＡでコートされた。次いで、この構築物は、エチレンオキサイドを使用して滅菌された。細胞播種の前日に、ＮＵＣ足場は、６０％エタノール／４０％Ｄ−ＰＢＳ、１００％Ｄ−ＰＢＳ、Ｄ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳまたはα−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳを用いて連続的にあらかじめ濡らされ、続いて、Ｄ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳまたはα−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中、室温で一晩のインキュベーションを行ってもよい。次いで、ＮＵＣ足場は、膀胱−、脂肪−または末梢血由来の平滑筋細胞を播種され、移植の準備ができるまで、７日目までに、播種された構築物は５％ＣＯ２で加湿３７℃インキュベーター中で成熟された。
【０４３６】
ＲＮＡの単離および半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ブタの膀胱、脂肪、および末梢血由来の平滑筋細胞から単離された。各試料からの１μｇのＲＮＡが、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写された。以下の平滑筋細胞特異的プライマーがＲＴ−ＰＣＲ反応を設定するために使用された（５’−３’）：β−アクチン（Ｆ：  ＴＴＣ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、Ｒ：  ＣＧＴ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  Ｔ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２），ＳＭ２２（トランスゲリン）（Ｆ：  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＡＣＴ  ＧＧＴ  ＴＴＡ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  Ｃ，（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）Ｒ：  ＴＣＴ  ＡＡＣ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）），ＳＭαＡ（Ｆ：  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＣＡＧ  ＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５），Ｒ：  ＡＡＧ  ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＣＧＧ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）），ＳＭＭＨＣ（Ｆ：  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＴＧＣ  ＣＡＣ  ＣＴＣ，（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）Ｒ：  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）），ＣＮＮ（カルポニン）（Ｆ：  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＣＡＡ  Ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９），Ｒ：  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）），ＭＹＯＣＤ（Ｆ：  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１），Ｒ：  ＡＣＴ  ＣＣＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２））。サイクリング条件：変性９５℃（２分間）、変性９５℃（４５秒間）、アニーリング（４５秒間）、伸長７２℃（４５秒間）、最終伸長７２℃（５分間）。３５サイクル（ミオカルディン  ４０サイクル）。アニーリング温度：β−アクチン＝５８℃、ＳＭ２２＝５６℃、ＳＭαＡ＝５５℃、ＳＭＭＨＣ＝６０℃、ＣＮＮ＝５１℃、ＭＹＯＣＤ＝５２℃。ＰＣＲ反応は、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して実行され、ｉＱｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上でサイクリングされた。免疫蛍光分析。以下の抗体が免疫蛍光分析のために使用された：ＳＭαＡ（Ｄａｋｏ  ＃Ｍ０８５１）、ＣＮＮ（Ｄａｋｏ  ＃Ｍ３５５６）、ＳＭ−ＭＨＣ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｍ７７８６）、ミオカルディン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＃ＳＣ３４２８）、ＳＭ２２（Ａｂｃａｍ  ＃ａｂ２８８１１−１００）、抗ｍｓＩｇＧ１／Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ａ２１１２１）、抗ｍｓＩｇＧ２ａ／Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ａ２１１３１）、抗ｇｔＩｇＧ／Ａｌｅｘａｆｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ａ１１０５５）。１０μｇ／ｍＬで使用されたＳＭＭＨＣを例外として、すべての一次抗体は５μｇ／ｍＬの濃度で使用された。収縮性アッセイ。収縮性アッセイは以前に記載されたように実施された（Ｔｒａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１前出）。増殖反応論。新たな尿路導管足場の播種のための組織単離物からの平滑筋細胞の���大は、７０％以上のコンフルエンスでの連続継代によった。
【０４３７】
実施例５−新たな尿路導管移植を評価するためのＹｏｒｋｓｈｉｒｅブタにおける研究
この研究は、８週間の期間にわたって雌性Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅブタモデルにおける新たな尿路導管移植を評価する。本研究の目的は、膀胱の外科的除去（根治的膀胱切除）後の組織再生および新たな膀胱導管構築物移植系の流入末端への尿管の迂回について、同種異系平滑筋細胞を播種された新たな膀胱導管構築物の使用における皮膚瘻孔作製の安全性および機能性を決定することである。腹膜は全構築物を包むために使用される。構築物の排水用流出末端は、尿を通過させるために、外科的に作製された瘻孔に向かって方向付けおよび付属される。回復時間の完了に際して（５６＋／−５日目）、動物は安楽死させるものとし、腎臓、導管、ならびに組織学的調製および病理学的試験のための関連する器官および組織を収集するために剖検が実施されるものとする。３匹の動物が１つの主要な手順に供される。同種異系ＳＭＣが播種された新たな膀胱導管構築物が移植される。デバイス移植には、排尿のための皮膚瘻孔作製が含まれる。本研究において、新たな膀胱導管構築物と組み合わせたヒト腹部瘻孔の要求性に取り組む、瘻孔が作製される。
【０４３８】
研究設計
６匹のＹｏｒｋＳｈｉｒｅブタは、膀胱の外科的除去を受けた（膀胱全摘出術）。腹側腹部瘻孔を有する四足動物における潜在的な腸ヘルニア／摘出術を回避するために、ヘルニアパッチが評価された。瘻孔形成方法は、２つのフェーズ、ＡおよびＢにおいて評価された（表５．１）。手短に述べると、めくれ上がった瘻孔形成の方法はフェーズＡにおいて評価され、平らな瘻孔を形成する方法はフェーズＢにおいて評価された。表５．２は本研究の４つの相を説明し、表５．３は研究計画を要約する。
【０４３９】
試験物品
試験物品は、同種異系脂肪由来のＳＭＣを有するＰＧＡ／ＰＬＧＡ新尿路導管構築物であった。足場は、同種異系脂肪由来のＳＭＣが播種されている合成のラクチド／コ−グリコリド酸ポリマーから構成されている。試験物品は２２℃±５で保存された。試験物品は、以下に記載される外科手順を経由して動物に移植された。
【０４４０】
平滑筋細胞は同種異系脂肪供給源から得られたが、しかし、免疫抑制治療が外科手順の間またはその後に使用された。
【０４４１】
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【０４４２】
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【０４４３】
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【０４４４】
各動物は鎮静させられ、手術準備前に麻酔された。次いで、各動物は挿管されて、麻酔の誘導および維持のために吸入剤を受容した。次いで、手術の領域が清浄化され、無菌手術のためにドレープを掛けられた。準備は手術前に実施された。バイタルサインは移植手術の間モニターされた。
【０４４５】
膀胱切除に伴う導管全体を通しての尿管転位
尿管転位手順は開腹術を介して実施された。正中切開は尾側におよそ１５ｃｍ伸びる臍に対して５ｃｍ頭側から開始する腹部において行われた。腹膜が同定され、組織が新たな尿路導管構築物を覆い、かつ身体壁を通して外に出ることができる導管を形成するために十分に長くなるまで、腹膜は腹部空間から注意深く分けられた。腹膜は測定され、そして構築物を包みかつ身体壁の外側に伸びる導管を形成するために切断された。腹膜は３−０  Ｖｉｃｒｙｌを用いて構築物の周りで縫合された。組織がインタクトでありかつ血管新生したままであることを確実にするために注意が払われた。次いで、尿が腹腔に入っていくことを回避するために注意を払いながら、膀胱が曝露され、かつ尿を空っぽにされた。膀胱に供給している動脈および静脈が同定され、結紮された。尿管が同定され、２つの７Ｆｒ  １４ｃｍ非吸収性尿管ステントが上行性様式で挿入され、そして尿管は膀胱から注意深く横切開された。尿道はそれが横切開されたままでかがり縫いされた。次いで、膀胱が取り出された。左の尿管は、右側に到達するための十分な移動性が存在するまでの間、頭部に伸びる周囲の腹膜後筋膜から注意深く解放された。右の尿管は、構築物の末端に到達するために自由に解剖された。尿管は、単純連続パターンで３−０  Ｖｉｃｒｙｌを用いて構築物に縫合された。瘻孔は、乳腺に対して側方である腹側腹壁上で作製された。様々な皮膚瘻孔作製方法論は、外科手術の間に開発されてもよい。腹膜導管は外面化され、かつ皮膚に縫合されてもよい。手術用接着剤が縫合線に沿って、かつ腹膜が身体壁を出る場所に配置された。ステントに接続されている縫合ストランドは、将来の取り出しのために瘻孔を通して外面化され、そして、適した長さの瘻孔ボタン／カテーテルが瘻孔に挿入され、７〜２１日間の期間の間、適正な排液を可能にした（およそ１週間の完了後、意識がある状態で、または必要な場合、麻酔下でステントが取り外される）。一旦確保されると、腹部切開は、吸収可能でないＰｒｏｌｅｎｅ縫合糸で閉じられた。皮膚は慣用的な様式で閉じられた。動物は回復させられた。腹膜は、血管構造全体を通して血流を止めることを妨害するために多大な注意を払って取り扱いおよび操作された。尿管非分解性ステントは、診断評価が、これらを未成熟で取り除く必要（例えば、腎臓閉塞）を明らかにしない限り、およそ７日間の間、所定の場所に放置される。手術は０日目に各動物に対して１回実施された。
【０４４６】
瘻孔ボタンの注意および維持ならびに切開部位の評価
瘻孔ボタン：確定的な手術後、瘻孔カテーテル（ＤａＶＩＮＣＩ作製瘻孔ボタンまたは等価物：様々な時点での必要性に基づき３〜１０ｃｍ）が再挿入され、縫合糸で動物に固定される。瘻孔ボタンは、場合あたりの必要性に基づいて、および潜在的には本研究の存続期間の間、所定の場所に維持される。瘻孔ボタンは、開いている状態を保証するために点滴されないときには、滅菌生理食塩水でフラッシュされる。７日目と２１日目の間に、足場材料は分解を受け、微粒子（タンパク質関連）が尿中に流れ始める。これは、瘻孔ボタンの閉塞、および構築物の収容能力よりも上のまたはそれを超えた量の尿の保持を引き起こし得る。従って、瘻孔の創面切除およびまたは新たな導管が必要に応じて行われる。
【０４４７】
頻度／持続時間：日々の観察、続いて、カテーテルが流れていないと観察されるときに、必要に応じた維持。時間はおよそ１５分間が必要とされる。
【０４４８】
切開部位の評価：切開部位は、最初の１４日間の間、または治癒するまで毎日評価される。瘻孔領域および周辺の組織は、必要に応じて清浄化される。瘻孔は尿排液について観察され、切開部位は、裂開、異常な排出、におい、炎症、または任意の異常について評価される。頻度／期間：最初の１４日間の間、または治癒するまで、および／または施設の獣医の裁量において、毎日評価される。時間はおよそ１５分間必要とされる。
【０４４９】
うっ血性瘻孔組織の創面切除手順：瘻孔／導管中にうっ血性組織を有するうっ血性動物は、創面切除手順を受ける。動物は、プロトコールに従って鎮痛剤を与えられる。創面切除のための鉗子の挿入を容易にするために、小さな切開が瘻孔上で作られる。うっ血性組織は、視覚的に／触覚的に同定され、ピンセットでつかまれ、そして穏やかに引っ張られる。一旦、すべてのうっ血性組織が取り除かれると、瘻孔／導管は、生理食塩水溶液でフラッシュされてもよい。創面切除手順において切開が要求されるならば、これは縫合で閉じられる。瘻孔ボタンが再挿入され、縫合で動物に固定される。動物は個々のケージの中で回復される。頻度／持続時間：時間はおよそ４５分間必要とされる。
【０４５０】
回復：各手術の完了直後に、動物は麻酔から回復され、ホームケージに移される。この時間は、手術手順の最後におよそ１時間発生する。
【０４５１】
研究の期間の間の移植後手術後の臨床的観察：移植後、個々の動物の食物摂取および糞便／尿アウトプットの評価が移植後８週間の間毎日行われる。観察は、移植／最移植手術後５日間行われる：臨床的観察は８週間の間毎日行われる。
【０４５２】
生存：移植／最移植手術後の回復動物は５６＋／−５日間の期間の間生存する。この期間の間、健康評価が動物に対して行われる。
【０４５３】
動物の屠殺および剖検
身体検査−すべての動物が安楽死の前に評価される。検査は、動物の一般的状態：直腸体温、呼吸数、心拍数、および毛細血管再充満時間を記録することを含む。
【０４５４】
剖検−すべての動物は剖検に供される。腎臓、導管、尿管、および瘻孔に対して特定の焦点が当てられる。総体的な評価は、腎臓、尿管、導管、瘻孔、胸部、腹部、および骨盤腔、ならびにこれらの器官および組織に対して実施される。何らかの総体的な損傷、接着、および／または器官の変化（生殖を含む）が観察されるならば、これらは評価され、写真撮影され、そして組織病理学的評価のために収集される。完全な新膀胱導管領域は、その場所で可視化および写真撮影される。さらなる写真および／または総体的な損傷は、検視解剖医の裁量で取り上げられてもよい。導管の固定は、瘻孔へのホルマリンの注入、ならびに導管および尿管を膨張させることによって、ホルマリンを用いて行われる。これは、Ｆｏｌｅｙ（または等価物）カテーテルを用いて行われるのに対し、瘻孔は圧力を保持するために結紮される。剖検は、５６日目（±５日目）に、動物あたりおよそ１／２時間で実施される。
【０４５５】
結果
尿路変更術は、腹部における尿管から瘻孔までの新尿路導管（ＮＵＣ）の外科的移植によって首尾よく樹立された。ＮＵＣ移植の成功を示す瘻孔を介して尿を収集することが可能であった。ヘルニアパッチを、腹側腹部瘻孔を有する四足動物における潜在的な腸ヘルニア／摘出を回避するために評価した。
【０４５６】
固定された泌尿器は、収集され、トリミングされ、調べられ、パラフィンに包埋され、そして切片化された。スライドは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）ならびにＭａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（エラスチン）で染色された。腹腔が開かれ、移植された試験物品および外科手術的方法論の結果が、その場所で可視化されかつデジタル写真撮影された。導管は、腎臓および尿管とひとまとめにして取り出された。尿管が測定され、次いで吻合部位から３〜４ｃｍ離れた横断面によって導管から引き離された。腎臓、尿管、リンパ節、および総体的に観察された任意の他の損傷の代表的な切片が得られた。すべての組織試料は、組織学的処理の前２４〜４８時間の間、１０％Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｆｏｒｍａｌｉｎ（ＮＢＦ）中に配置された。
【０４５７】
固定後、再生された移植物のサイズおよび形状に依存して、導管は、縦方向（流れに対して平行）または横方向（流れに対して垂直）のいずれかで開かれた。図１５は、トリミングのスキームを示す。固定後の導管組織（縦方向に二分されている）は、組織学的評価のための様々な関心対象の領域（波線／強調表示された円）を示す。組織学的処理のために提出される組織サンプリング（カセットの数）は、導管のサイズに依存して変動した（４〜７カセット）。尿の流れの方向は矢印によって表示される。組織サンプリングは表５．４に概説されている。いくつかの導管はトリミングスキームに適合するには長さが短すぎるので、利用可能な導管はより少ないセクションに分割された。
【０４５８】
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【０４５９】
組織のトリミングの間、デジタル写真が、図解目的のために撮られた。固定後、組織は、マクロスライドまたはマイクロスライドまで慣用的に処理され、そしてヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）ならびにＭａｓｓｏｎ三重染色で染色された。加えて、４種の免疫組織化学染色が動物番号３に対して実施された；平滑筋用の抗アルファ−平滑筋アクチンおよびカルポニン、上皮／尿路上皮用の抗パンサイトケラチン（ＡＥ−１／ＡＥ３）および抗サイトケラチン７（ＣＫ−７）。すべてのスライドは顕微鏡的に評価された。適している場合、個々の動物データのための顕微鏡的観察は、テキストの表５．５において列挙されているような判断基準に基づいて、「０」から「４」のスコアを与えられた。
【０４６０】
肉眼的知見および顕微鏡的知見
すべての動物についての肉眼的知見および顕微鏡的関連性の比較リストが生成された。新尿路導管についての個々の動物の顕微鏡的データもまた収集された。各動物の上部尿路は、間欠性部分的閉塞の発生に対する瘻孔狭窄の影響を見極めるために評価された。知見（例えば、水尿管症、水腎症、腎盂腎炎）は、以下に概略されるような瘻孔狭窄の観察と一貫している。
【０４６１】
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【０４６２】
フェーズＡ動物（番号１、２、および３）
自系脂肪瘻孔（動物１）：この外科手術的アプローチはフラッシュ瘻孔の構築を生じ、これは、スケジュールの剖検時点（６３日）まで開いたままの状態であった。瘻孔の開いた状態は、最初の手術の時点における瘻孔（チュービング）ポートの配置によって主に達成され、これは、引き続く再構築手術まで、その場所に残っていた。再構築手術は粘膜反転からなり、これは、狭窄および引き続く閉塞に導く瘻孔−皮膚狭窄症を予防する際に有効でないことが見い出された。
【０４６３】
シリコーンリング瘻孔（動物２）：この外科手術的アプローチは惹起された瘻孔の構築を生じ、これは最初の３０日間の間開いたままの状態であった。瘻孔（チュービング）ポートおよび皮膚パッチを用いる引き続く瘻孔修復／再構築は、移植後の６０日目のスケジュールされた剖検まで、移植後３０日目から瘻孔が狭くなることを妨害するために行われた。初期のシリコーン瘻孔構築および皮膚パッチ再構築の方法論は、瘻孔狭窄を予防しなかった。
【０４６４】
シャッター皮膚外転瘻孔（動物３）：この外科手術的アプローチは、フラッシュ瘻孔の構築を生じ、これは、スケジュール剖検時点まで（３２日間）、開いたままの状態であった。尿管ステントラニヤードの外部曝露を妨害するために、および手術後人工膀胱造設術部位の環境細片夾雑を最小化するために、瘻孔ポートが使用され、瘻孔管腔の中に尿管ステントラニヤードを固定した。
【０４６５】
フェーズＢ動物（番号４、５、および６）
ヘルニアパッチ：より大きな腹壁欠陥およびヘルニアパッチの利用は、剖検まで開いたままの状態であったフラッシュ瘻孔を生じた。腹部内ヘルニアパッチは、ＮＵＣの腹側壁と統合するように見え、適切でない可能性がある。皮下ヘルニアパッチは、ヘルニア形成を予防するためには十分であり、使用のために受容可能であった。
【０４６６】
免疫組織化学
免疫組織化学（ＩＨＣ）分析が、特に瘻孔における導管新組織を特徴付けるために、移植後３２日目に動物番号３のみを用いて実施された。同じ時点は、Ｎｅｏ−Ｂｌａｄｄｅｒ  Ａｕｇｍｅｎｔ（商標）移植後の新膀胱組織の組成を評価するイヌ研究において、以前に分析され（Ｊａｙｏ  ＩＩ  ２００８前出）、これは２種の細胞型：膀胱由来の尿路上皮細胞およびＳＭＣが播種されたのに対し；本研究における新尿路導管試験物品は脂肪由来のＳＭＣのみが播種された。
【０４６７】
サイトケラチン７（ＣＫ−７）−導管の頭部面および中間面の管腔表面を覆っている上皮（セクション５−表５．４）は、ＣＫ−７について染色が陰性であった。しかし、管腔上皮セクション６（導管の尾部面）はＣＫ−７について染色は陽性であった。
【０４６８】
パンサイトケラチン（ＡＥ１／ＡＥ３）−管腔上皮はセクション５（表５．４）に存在し、皮膚−瘻孔界面の上皮を除いて、導管の頭部面および中間面はＡＥ１／ＡＥ３についての染色が陰性であった。セクション６における管腔表面を覆う上皮（尿管吻合の近傍の尾部面から）は、ＡＥ１／ＡＥ３についての染色が陽性であった。
【０４６９】
抗α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）−頭部および中間部導管におけるセクション５（表５．４）からの導管壁構成要素はＳＭＡについての染色が陰性であった。導管の尾部領域におけるセクション６（表５．４）の壁の構成要素は、ＳＭＡについて染色が弱い陽性であった。カルポニン（ＣＬＰ）−導管の尾部領域におけるセクション６（表５．４）の頭部および中間部の導管におけるセクション５からの導管壁の構成要素は、ＣＬＰについて染色が弱い陽性であった。これらの知見は以前に報告されたものと一貫している（Ｊａｙｏ  ＩＩ（２００８）前出）。加えて、上皮が、皮膚−瘻孔界面の新組織、ならびに導管の頭部面および中間面の管腔表面を覆っていた。
【０４７０】
結論
最初の３匹の動物（１、２、および３）についての瘻孔の構築／再構築において使用される脂肪、シリコーン、およびシャッター方法論は、狭窄に導く皮下瘻孔狭窄症を表示した。フラッシュ瘻孔形成における腹部内ヘルニアパッチ（筋肉と内臓の間）の使用は、閉塞および引き続く瘻管形成に導く過度の炎症性宿主応答を表示した。フラッシュ瘻孔形成における皮下ヘルニアパッチ（皮下脂肪と骨格筋の間）の使用は、軽度から中程度の炎症を誘導し、および瘻孔−皮膚狭窄症を有意に減少させ、瘻孔が開いた状態の延長を生じた。瘻孔における尿の流れの閉塞の有病率は、瘻孔狭窄、または瘻管形成を導いた内部（筋肉と内臓の間）パッチの使用によって主として引き起こされた。上部尿路の知見の出現は、観察された瘻孔狭窄と一貫していた。
【０４７１】
移植後３２日間で、導管の頭部および中間部において観察されたサイトケラチン−７およびパンサイトケラチンに陽性な上皮によって証明されるように、自然の様粘膜皮膚結合部が、皮膚−瘻孔界面および管腔粘膜表面において形成されていた。
【０４７２】
移植後３２日目でのブタにおける導管組織の新組織組成は、移植後の等価な時間でのイヌにおける新膀胱組織と一貫しており（Ｊａｙｏ  ＩＩ（２００８）前出）、このことは、イヌにおける新膀胱増強およびブタにおける新尿路導管によって誘発された泌尿組織再生の等価性を示唆する。
【０４７３】
イヌにおいて新膀胱増強によって（Ｊａｙｏ  ＩＩ（２００８）前出）、およびブタにおいて新尿路導管によって誘発された等価な新泌尿組織形成は、２種の細胞型（膀胱由来の尿路上皮細胞および平滑筋細胞）または１種の細胞型（脂肪由来の平滑筋細胞）を播種した試験物品の再生能力が同様であることをさらに示唆する。
【０４７４】
実施例６−成体ラットからの肺組織細胞単離
手短に述べると、肺はＰＢＳですすがれた。組織は氷上で刻まれ、胸膜を徹底的に破壊された。刻まれた組織は、室温（ＲＴ）で２０分間、揺すりながらコラゲナーゼＩＶで消化され、次いで、粉砕され、重力によってペレット化され、上清が吸引された。消化ステップおよび粉砕ステップは、２回反復された。最終消化後、試料は粉砕され、１００μＭ  Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐでろ過された。次いで、試料はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで中和され、細胞は３００×ｇで５分間、ペレット化された。細胞ペレットは、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで３回洗浄され、最終洗浄後、細胞は５００×ｇで５分間、ペレット化された。細胞は５０／５０培地［５０％ＤＭＥＭ高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）、Ｈｕ  ｒＥＧＦ１−５３、ＢＰＥ、５％ＦＢＳ、１×Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ、および１×インスリントランスフェリンセリニウム（ＩＴＳ）を含有する５０％ＫＳＦＭ］中に再懸濁された。
【０４７５】
実施例７−３Ｄ培養において単離された肺細胞中の細気管支および肺胞特異的マーカーの遺伝子およびタンパク質発現
実施例６において単離された細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｇｅｌフォーム、およびポリ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）フォームにプレートし、これらの細胞が単離でき、それらの肺起源と一貫したマーカーを発現できるという仮説を試験するために５０／５０中に維持された。
【０４７６】
結果：試験されたマーカー：細気管支上皮細胞のためのＣＣＳＰ（Ｃｌａｒａ細胞分泌タンパク質）；肺胞上皮細胞のためのプロＳＰ−Ｃ（プロ界面活性剤タンパク質）。
【０４７７】
図１６Ａは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で＞１４日間増殖され、１／２０００のＣｌａｒａ  Ｃ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で免疫染色されたラット肺消化物中の肺胞形成単位からのＣｌａｒａ細胞分泌タンパク質の発現を示す（緑色）。ＤＡＰＩを核染色のために使用した（青色）。
【０４７８】
図１６Ｂは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で＞１４日間増殖され、１／２０００のＰｒｏＳＰ−Ｃ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で免疫染色されたラット肺消化物中の肺胞形成単位からのプロ界面活性剤タンパク質Ｃの発現を示す（緑色）。ＤＡＰＩを核染色のために使用した（青色）。
【０４７９】
図１６Ｃは、ゲルフォーム上で１０〜１１日目であり、ＰｒｏＳＰ−Ｃ  １／２０００で染色された肺胞細胞中の肺胞形成単位からのプロ界面活性剤タンパク質Ｃの発現を示す（緑色）。ＤＡＰＩを核染色のために使用した（青色）。
【０４８０】
図１６Ｄは、ゲルフォーム上で増殖され（１０〜１１日間）、１／２０００のＰｒｏＳＰ−Ｃ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色された肺胞細胞中の肺胞形成単位からのプロ界面活性剤タンパク質Ｃの発現の拡大図を示す（緑色）。ＤＡＰＩを核染色のために使用した（青色）。
【０４８１】
図１７は、ＰＬＧＡフォーム上で１０〜１１日目であり、Ｃｌａｒａ  Ｃｅｌｌ  ＳＰ  １／２０００で染色された肺胞細胞中の肺胞形成単位からのＣｌａｒａ細胞タンパク質の発現の拡大図を示す（緑色）。
【０４８２】
図１８は、肺胞形成単位からのＫＲＴ１８の発現を描写する。ＫＲＴ１８は肺特異的サイトケラチンでありかつ上皮マーカーである。ＩＥＣ１５９２が陰性であったので、肺Ｄ１１がキャリブレーターとして使用され、従って、これは１．０のデフォルトＲＱ値を受けた。図１８はまた、肺胞形成単位からのＳＣＧＢ１Ａ１の発現も描写する。ＳＣＧＢ１Ａ１（セクレトグロビン、ファミリー１Ａ、メンバー１（ウテログロビン））はＣｌａｒａ細胞マーカーである。ＳＣＧＢ１Ａ１の強固な発現は、Ｃｌａｒａ細胞についてのＩＦ染色を確認する。図１８はまた、肺胞形成単位からのＳＦＴＰＡ１の発現も示す。ＳＦＴＰＡ１（界面活性剤タンパク質Ａ１）は肺胞上皮マーカーである。ＩＥＣ１５９２が陰性であったので、肺Ｄ１１が較正手段として使用され、従って、これは１．０のデフォルトＲＱ値を受けた。
【０４８３】
細気管支および肺胞特異的マーカーの遺伝子およびタンパク質発現は、これらの細胞が、２つの異なる支持物質を使用して、三次元で首尾よく単離および培養されたという結論を支持する。自発的に形成される拍動性細胞ボディーは肺組織細胞単離物から観察された。これらは、Ｍａｔｒｉｇｅｌの使用が挙げられるがこれに限定されないいくつかの細胞培養条件下では、サテライト流動細胞を伴う三次元細胞クラスターである。これらのクラスターにおいて特徴付けられる細胞は、それぞれ、ｖＷＦ、カルポニン、およびコネキシン４３に対する抗体との免疫反応性によって評価されるような、上皮、平滑筋および骨格筋、ならびに神経起源のものである。これらのクラスターは、リズムの割合が拍動性であることが示されており、インビトロで収縮性を示す。
【０４８４】
実施例８−Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で増殖された肺ＡＦＵ由来のボディー
コネキシン４３は細胞から細胞へのチャネルを検出する。これらのチャネルのクラスターは、ギャップジャンクションを作るために集合する。ギャップジャンクションの連絡は、細胞増殖の発達および調節において重要である。
【０４８５】
図１９は、コネキシン４３で染色されたラット肺ＡＦＵの共焦点画像を示す。図１９の左のパネルは、ＡＦＵに典型的な「ブドウの房」の外見を描写する。右のパネルは、ＡＦＵの中の見かけの中空腔を描写する。拍動性ボディー形成が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上の肺ＡＦＵから観察された。ボディーは自発的収縮性を実証した。
【０４８６】
結論として、単離されたラット肺細胞は、三次元での培養の間にＡＦＵ構造を形成することが可能であるようである。
【０４８７】
実施例９−Ａｄ−ＳＭＣを用いるプレ播種を伴う、および伴わない、ゲルフォームおよびＰＬＧＡ足場上での肺ＡＦＵ
図２０は、Ａｄ−ＳＭＣを用いるプレ播種を伴う、および伴わない、ゲルフォームおよびＰＬＧＡ足場上での肺ＡＦＵを描写する（左上のパネル−Ａｄ−ＳＭＣがプレ播種され、次いで単離された肺細胞が播種されたゲルフォーム；右上のパネル−Ａｄ−ＳＭＣがプレ播種されておらず、次いで、単離された肺細胞が播種されたゲルフォーム；左下のパネル−Ａｄ−ＳＭＣがプレ播種され、次いで、単離された肺細胞が播種されたゲルフォーム；右下のパネル−Ａｄ−ＳＭＣがプレ播種されておらず、次いで、単離された肺細胞が播種されたゲルフォーム；矢印は、Ａｄ−ＳＭＣがプレ播種された足場上での見かけのＡＦＵ形成を描写する）；単離された肺細胞のみ播種され、Ａｄ−ＳＭＣがプレ播種されていない足場上では見られない。
【０４８８】
図２１は、左上のパネルにおいて、Ｃｌａｒａ細胞タンパク質に対する抗体で染色されたゲルフォーム（−）Ａｄ−ＳＭＣを示す；右上のパネルはゲルフォーム（−）Ａｄ−ＳＭＣ位相画像を示す；左下のパネルはＣｌａｒａ細胞タンパク質に対する抗体で染色されたゲルフォーム（＋）Ａｄ−ＳＭＣを示す；そして右下のパネルはゲルフォーム（＋）Ａｄ−ＳＭＣ位相画像を示す。左上のパネルと比較して、左下のパネルにおける染色の強度の増加は、Ａｄ−ＳＭＣの存在がラット肺細胞増殖を支持することを示唆する。
【０４８９】
図２２は、左上のパネルにおいて、界面活性剤タンパク質Ｃに対する抗体で染色されたゲルフォーム（−）Ａｄ−ＳＭＣを示す；右上のパネルはゲルフォーム（−）Ａｄ−ＳＭＣ位相画像を示す；左下のパネルは界面活性剤タンパク質Ｃに対する抗体で染色されたゲルフォーム（＋）Ａｄ−ＳＭＣを示す；そして右下のパネルはゲルフォーム（＋）Ａｄ−ＳＭＣ位相画像を示す（下のパネルにおける矢印は見かけのＡＦＵ形成を描写する）。左上のパネルと比較して、左下のパネルにおける染色の強度の増加は、Ａｄ−ＳＭＣの存在がラット肺細胞増殖を支持することを示唆する。
【０４９０】
図２３は、左上のパネルにおいて、Ｃｌａｒａ細胞タンパク質に対する抗体で染色されたＰＬＧＡ足場（＋）Ａｄ−ＳＭＣを描写する；右上のパネル−ＰＬＧＡ足場（＋）Ａｄ−ＳＭＣ位相画像；そして左下のパネルは免疫蛍光画像および位相画像の併合を示す（上のパネルの矢印は見かけのＡＦＵ形成を描写する）。
【０４９１】
図２４は、界面活性剤タンパク質Ｃに対する抗体で染色されたゲルフォーム足場（＋）Ａｄ−ＳＭＣを示す；右上のパネルはゲルフォーム足場（＋）Ａｄ−ＳＭＣ位相画像を示す；左下のパネルは免疫蛍光画像および位相画像の併合を示す（パネルにおける矢印がゲルフォーム中の中空スペースを描写する）。
【０４９２】
結論として、Ａｄ−ＳＭＣは、ラット肺細胞増殖の増加を容易にする。ラット肺細胞を播種する前に、ゲルフォームおよびＰＬＧＡ足場材料をＡｄ−ＳＭＣとともにプレ培養することは、Ａｄ−ＳＭＣとプレ培養しなかった足場と比較して、見かけのラット肺細胞ＡＦＵ形成を増加する。ゲルフォーム中の中空スペースの端の周辺で増殖するラット肺細胞は、インタクトな肺の中の肺胞構造の外見を模倣する。
【０４９３】
実施例１０−ＧＩ足場上の播種のための脂肪からの平滑筋細胞の単離
１４匹の雄性Ｌｅｗｉｓラットからの腹部脂肪試料は皮下で得られ、等量のＤＭＥＭ−ＨＧ／抗生物質／抗真菌剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）（５μｇ／ｍＬ）で３回洗浄された。脂肪は、フィルター滅菌されたコラゲナーゼＩ（ＤＭＥＭ−ＨＧ中０．３％、１％ＢＳＡ）で、３７℃にて１時間消化され、次いで、５０ｍＬ円錐管中で、５分間、３００ｇで遠心分離された。間質性血管画分（ＳＶＦ）は、１００μｍ  Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ真空フィルターを通してろ過され、脂肪および残余組織を除去し、次いで、ＤＭＥＭ−ＨＧ＋１０％ＦＢＳで中和された。細胞集団はペレット化され、３００ｇで５分間、再度洗浄され、ＤＭＥＭ−ＨＧ＋１０％ＦＢＳ＋抗生物質／抗真菌剤５μｇ／ｍＬに再懸濁された。
【０４９４】
一次脂肪組織由来の平滑筋細胞（Ａｄ−ＳＭＣ）は、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）を補充したＳＭＣ増殖培地（ＤＭＥＭ−ＨＧ／抗生物質／抗真菌剤（５μｇ／ｍＬ）上でプレーティングおよび維持された。培養は、加湿された５％ＣＯ２を含有する空気中で、３７℃でインキュベートされた。継代は、７０〜９０％コンフルエンスにおいて、トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）を用いる酵素消化による組織培養プラスチックから細胞を取り出すこと、および新鮮な培養容器に再プレーティングすることによって実施された。ラット脂肪由来の細胞の形態が観察され（継代１、２０Ｘ）、そしてイヌ、ブタ、およびヒトを含む他の種から以前に培養された脂肪由来の細胞の形態と同一であると見られた。
【０４９５】
免疫蛍光
培養培地はディッシュから取り出され、接着細胞はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回すすがれた。細胞は２％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで一晩、４℃にて固定され、次いで、ＰＢＳで３回すすがれた。細胞は、透過緩衝液（０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および２％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ）で希釈されたカルポニンおよび平滑筋アルファ−アクチン一次抗体（最終濃度３μｇ／ｍＬ）とともに一晩インキュベートされた。ＰＢＳを用いる３回のすすぎ後、１μｇ／ｍＬの濃度で二次抗体が加えられ、３０分間インキュベートされた。細胞核（青色）がＨｏｅｃｈｓｔ色素で染色され、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ  ４０００Ｂ）で見る前にＰＢＳで３回すすがれた。免疫染色を、これらの細胞が平滑筋細胞マーカーのサブセットを発現したことをタンパク質レベルで確認するために実施した。カルポニンおよび平滑筋アルファ−アクチンが、これらのタンパク質は他のタンパク質と比較して静的に培養された細胞中で最も信頼性が高く検出されるという本発明者らの経験（未発表データ）に基づいて選択された。脂肪から単離されたラット細胞中で観察されたフィラメント状染色は、他の組織から単離された平滑筋細胞を染色するために観察されたものと同一であった。カルポニンおよび平滑筋アルファ−アクチン免疫染色が観察され、これは、単離されかつ培養された細胞がラット脂肪由来の平滑筋細胞（Ａｄ−ＳＭＣ）であったことのサポートを提供する。カルポニンおよび平滑筋アルファ−アクチンタンパク質発現は、イヌ、ブタ、およびヒトを含む他の種から以前に培養されたＡｄ−ＳＭＣの発現と同一であるようである。
【０４９６】
ＴａｑＭａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ラットＡｄ−ＳＭＣから精製した。ｃＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２μｇのＲＮＡから生成した。ｃＤＮＡ合成後、各試料は１：６希釈された。ｑＲＴ−ＰＣＲを、１０μＬマスターミックス（２×）、１μＬプライマー／プローブ、９μＬ  ｃＤＮＡ（１：６希釈）を使用して設定した。平滑筋、内皮、および脂肪生成遺伝子発現の評価のために、以下のＴａｑＭａｎプライマー／プローブが使用された：ＳｍαＡ（平滑筋アルファ−アクチン）、ＳＭ２２、ＭＹＯＣＤ（ミオカルディン）、ＳＭＭＨＣ（平滑筋ミオシン重鎖）、ＣＮＮ１（カルポニン）、ＡＤＩＰＯＱ（アディポネクチン）、ＦＡＢＰ−４（脂肪酸結合タンパク質＃４）、ＣＤＨ５／ＶＥＣＡＤ（血管内皮カドヘリン）、ｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）、ＰＥＣＡＭ１（血小板内皮細胞接着分子＃１）、およびＫＤＲ／ＦＬＫ１（胎児肝臓キナーゼ＃１）。ＰＰＩＢ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＢ）は内因性対照として使用され、すべての試料はラット脂肪組織ｃＤＮＡに対して較正された。
【０４９７】
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【０４９８】
すべてのプライマー／プローブはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手された。すべての反応は、ＡＢＩ７３００リアルタイムサーマルサイクラーで、デフォルトサイクリングパラメーターを使用して実行された。ＰＣＲデータの分析は、比較Ｃｔによる相対定量（ＲＱ）の方法を使用して実施された。
【０４９９】
関わっている平滑筋マーカー遺伝子、ミオカルディン、平滑筋アルファ−アクチン、トランスゲリン、ミオシン重鎖、およびカルポニンの発現を、複数の継代にわたって評価するために、総ＲＮＡが単離され、定量的ＲＴ−ＰＣＲが実施された。これらのタンパク質は、すべてが平滑筋細胞の収縮機能に関与している。本発明者らの結果は、ラット脂肪組織から単離された細胞が、これらの関わっている平滑筋細胞マーカーのすべてを転写レベルで発現することを指し示す。マーカー発現は、単離直後に培養された細胞（Ｐ０）および引き続く３回の継代（Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３）において観察され、その後、培養は終了した。全体として、ＳＭＣマーカーの発現は、もともとのラット培養（Ｐ０）において存在し、引き続く継代（Ｐ１〜Ｐ３）まで増加する。この発現のパターンは、イヌ、ブタ、およびヒトを含む他の種から以前に培養されたＡｄ−ＳＭＣのパターンと同一であるようである。
【０５００】
脂肪細胞マーカーであるアディポネクチンおよび脂肪酸結合タンパク質−４、ならびに上皮マーカーカドヘリン−５、血小板／上皮細胞接着分子、キナーゼ挿入ドメイン受容体、およびｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の発現が、単離直後の培養（Ｐ０）において観察された。これらの細胞型は脂肪組織にもまた存在しているので、このことは予測されていた。これらのマーカーの発現は、１回目の継代（Ｐ１）の際に顕著に減少し、引き続く継代（Ｐ２，Ｐ３）ではわずかに検出可能になる。この脂肪細胞および内皮マーカー発現の喪失のパターンは、イヌ、ブタ、およびヒトを含む他の種から以前に培養されたＡｄ−ＳＭＣのパターンを反映している。
【０５０１】
分子およびタンパク質分析を使用して、本発明者らは、本発明者らがラット皮下脂肪から脂肪由来の平滑筋細胞（Ａｄ−ＳＭＣ）を単離できることを確認した。ラットＡｄ−ＳＭＣは、イヌ、ブタ、およびヒトの脂肪組織から単離されたＡｄ−ＳＭＣと同一の特徴を有する。
【０５０２】
実施例１１−平滑筋細胞が播種されたＧＩ足場
生体材料に対する平滑筋細胞の適合性が試験された。以下を含むいくつかの足場材料が試験された：ＰＣＬフォーム：ａ）２３〜５３μｍ；ｂ）１０６〜１５０μｍ；ｃ）１５０〜２５０μｍ；ｄ）２５０〜３００μｍ；ＰＬＣＬフォーム（１５０〜２５０μｍ）；標準型ＰＬＧＡ／ＰＧＡフェルト（３ｍｍ厚）；薄いＰＬＧＡ／ＰＧＡフェルト（０．５ｍｍ厚）；Ｇｅｌａｔｉｎ  ＰＬＧＡ／ＰＧＡフェルト；Ｖｉｃｒｙｌ織りＰＧＡメッシュ；織りＰＧＡ管。
【０５０３】
足場材料の調製−フォームが調製され、他のさらなる材料は商業的な販売業者から購入された。ＰＧＡフェルトのコーティングは自家で実施された。材料の調製後、５ｍｍパンチが各材料（ｎ＝３）から得られ、使用のために準備ができるまで、デシケーターの中に維持された。
【０５０４】
播種された足場の培養−足場は、およそ２０分間の間、６０％エタノールで手短に滅菌され、５分間、１×ＰＢＳですすがれた。平滑筋細胞（ＳＭＣ）培養培地が、１５分間の間、足場をあらかじめ濡らすために使用された。その後、１５μＬのＳＭＣ中の３×１０５ラットＡｄ−ＳＭＣが、超低細胞接着２４ウェルプレートを使用して、各足場上に播種された。細胞は、３７℃加湿インキュベーター中で、３時間の間、足場に接着させられた。
【０５０５】
ＭＴＳアッセイ−２時間の間、細胞が接着された後、プレート中の各ウェルはＰＢＳで満たされ、振盪機上に５分間配置し、ＰＢＳは吸引され、次いで、新鮮なＰＢＳで置き換えられた；これは３回反復された。この手順は、足場からあらゆる未結合の細胞を除去するために実施された。ＰＢＳ中での最後の洗浄後、ＭＴＳアッセイ（非破壊細胞増殖アッセイ；キットはＰｒｏｍｅｇａから入手された）が、材料上の急速な細胞接着を決定するために足場上で実施された。手短に述べると、ＭＴＳ溶液は、２０μＬ  ＭＴＳ対１００μＬ  ＳＭＣ培地の比率で各足場に適用された。ＭＴＳ溶液の添加後、足場は、振盪機上で１時間インキュベートされた。各足場からの溶液は９６ウェルプレートに配置され、吸収レベルは、Ｅｌｉｓａプレートリーダー上で４９０ｎｍで読み取られた。次いで、足場は、すべてのＭＴＳ溶液が除去されるまで、１×ＰＢＳですすがれた。新鮮なＳＭＣ培地が足場に加えられ、３７℃での培養がさらに７日間継続された。この時点で、細胞接着を評価するために、別のＭＴＳアッセイが実施された。
【０５０６】
図２５Ａ〜Ｃは、様々な生体材料に対する平滑筋細胞の接着／増殖を示す。（ＭＴＳアッセイ吸収読み取りで理解されるように）ＰＣＬおよびＰＬＣＬ足場が播種後２時間により低い細胞接着値を有するにも関わらず、生／死画像は、ＰＧＡ足場と比較して、これらの材料上でより良好な細胞被覆を示すようである。２３〜５３および１０６〜１５０μｍ細孔径を有するＰＣＬ足場は、他の足場との比較において、最も生存可能でない細胞を有するようである。７日目までに、ＭＴＳアッセイの吸収の読み取りは、編まれたメッシュおよび標準型ＰＬＧＡ／ＰＧＡ足場は、最高の吸収読み取りを有し、それによって、最高の細胞増殖速度を有することを示した。この一般的傾向は、７日目までに増殖の減少が存在した薄いＰＬＧＡ／ＰＧＡフェルトは別として、播種後２時間、同様に見られた。これはフェルトの「薄さ」、および存在する繊維の量、および細胞にとって増殖しかつ成長するためにもはや余地がないかもしれないという事実に起因し得る。
【０５０７】
図２６は、様々な生体材料上に沈着された平滑筋細胞についての生／死アッセイの結果を示す。生／死生存度／細胞傷害性キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手された。培養の２日後、生／死アッセイが、生存度を評価するために、足場の細胞上で実施された。
【０５０８】
ラットＡｄ−ＳＭＣおよび様々な生体材料を使用する細胞接着および生存度研究は、標準型ＰＬＧＡ／ＰＧＡを進めることを支持する。薄いＰＬＧＡ／ＰＧＡ、Ｖｉｃｒｙｌ織りメッシュ、および織りＰＧＡ管は、概念研究のインビボ証拠のための試験物品としてである。ラットＡｄ−ＳＭＣは、生体材料への細胞接着に関して、イヌ、ブタ、およびヒトの脂肪組織から単離されたＡｄ−ＳＭＣと同様に挙動する。膀胱の再生のために以前に首尾よく適用されたＰＧＡ／ＰＬＧＡ足場は（Ｂａｓｕ  ａｎｄ  Ｌｕｄｌｏｗ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８：５２８−５３３，２０１０；Ｊａｙｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ３，６７１−６８２）、Ａｄ−ＳＭＣが播種され、７日間の間、培養培地中でインキュベートされた。この時点で、播種された足場は、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（緑色）およびＥｔｈｉｄｉｕｍ  Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ  １（赤色）中でインキュベートされて、それぞれ、生細胞および死滅細胞を強調表示した。図２７Ａに示されるように、緑色蛍光によって指し示されるように、足場は生細胞で覆われ、使用された生体材料がラットＡｄ−ＳＭＣの接着および生存性を支持することを指し示す。より高い規模（図２７Ｂ）は、足場繊維に沿った接着の詳細を明らかにする。
【０５０９】
実施例１２−食道細胞の単離
ラット食道組織が、輸送用容器から取り出され、ＤＭＥＭ＋５μｇ／ｍＬゲンタマイシン（洗浄溶液）中に配置され、そして５分間の間、頻繁に旋回された。次いで、組織は新鮮な洗浄溶液に配置された。このプロセスは、均一なサイズまで組織を刻む前に、総計３回反復された。次いで、刻まれた組織は、消化溶液（ＤＭＥＭ中３００Ｕ／ｍＬ  ＩＶ型コラゲナーゼ−Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ／ディスパーゼ−幹細胞；２０ｍＬ／１ｇ組織）を含有する５０ｍＬ遠心分離管に配置された。消化は３７℃で３０分間進行した。酵素中和は、ＫＳＦＭ培地中２０％ＦＢＳを使用して達成された。次いで、消化された組織が混合され、１００μＭ  Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルターを通してろ過されて、大きな組織フラグメントが持ち越されていないことを保証した。次いで、この材料は、３００ｇで５分間遠心分離された。次いで、細胞ペレットはＫＳＦＭで洗浄された。次いで、細胞が計数され、増殖培地（ＫＳＦＭ＋２％ＦＢＳまたはＫＧＭ（５０：５０の補充物を含むＫＳＦＭ＋１×Ａｎｔｉ／Ａｎｔｉ、１×ＩＴＳを含有するＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ）中にプレーティングされた。
【０５１０】
図２８に示されるように、最初の接着の際に（パネル１左上）、円形および細長い細胞型の混合集団であるように見える。引き続く継代は（Ｐ１；残りのパネル２〜４）、円形および細長い細胞型から構成される培養を明らかにする。ＴａｑＭａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲ。ＲＮＡは、製造業者の説明書に従って、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してラットＡｄ−ＳＭＣから精製された。製造業者の説明書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２μｇのＲＮＡからｃＤＮＡが生成された。ｃＤＮＡ合成後、各試料は１：６希釈された。ｑＲＴ−ＰＣＲは１０μＬマスターミックス（２X）、１μＬプライマー／プローブ，９μＬ  ｃＤＮＡ（１：６希釈）を使用して設定された。以下のＴａｑＭａｎプライマーが、上皮遺伝子発現の評価のために使用された：ＫＲＴ８（ケラチン８）、ｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）。ＰＰＩＢ（ペプチジルプロピルイソメラーゼＢ）は内皮対照として使用され、すべての試料はラット全食道組織ｃＤＮＡに対して較正された。すべてのプライマー／プローブはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手された。すべての反応は、ＡＢＩ７３００リアルタイムサーマルサイクラーで、デフォルトサイクリングパラメーターを使用して実行された。ＰＣＲデータの分析は、比較Ｃｔによる相対定量（ＲＱ）の方法を使用して実施された。
【０５１１】
図２９Ａに示されるように、上皮細胞マーカーＫＲＴ８およびｖＷＦ遺伝子の遺伝子発現は、食道組織（Ｅｓｏ  ＃１  ｏｒｇ；ＥＳＯ  ＃２  Ｏｒｇ）および培養食道細胞（Ｅｓｏ  ＩＥＣ）について観察された。
【０５１２】
免疫蛍光
培養培地をディッシュから取り出し、接着細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回すすいだ。細胞を２％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで一晩、４℃にて固定し、次いで、ＰＢＳで３回すすいだ。細胞は、透過緩衝液（０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および２％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ）で希釈された、ＣＮＮ１（カルポニン）、ＳＭα−アクチン（平滑筋アルファ−アクチン）、ＣＫ８、１８、１９（サイトケラチン８、１８、１９）一次抗体（最終濃度３〜５μｇ／ｍＬ）とともに一晩インキュベートされた。ＰＢＳを用いる３回のすすぎ後、１μｇ／ｍＬの最終濃度で二次抗体が加えられ、３０分間インキュベートされた。細胞核がＨｏｅｃｈｓｔ色素で染色され、蛍光顕微鏡で見る前にＰＢＳで３回すすがれた。図２９Ｂに示されるように、サイトケラチン８、１８、１９染色は、これらの培養物が上皮細胞を含有したというｑＲＴ−ＰＣＲをさらに支持した。カルポニンおよび平滑筋アルファ−アクチン染色が、これらの培養物が平滑筋細胞を含んでいたか否かを決定するために実施された。これらの結果は、ラット食道細胞培養が、最小限、上皮および平滑筋細胞の異種集団から構成されるという結論を支持する。
【０５１３】
実施例１３−ＧＩ足場への食道細胞移動
インビトロアッセイが、標準型ＰＬＧＡ／ＰＧＡ足場材料に食道細胞が移動する能力を評価するために開発された。手短に述べると、規定された直径の円形穴が、滅菌生検パンチを使用して、足場にまで切断された（以下の図の左のパネルを参照のこと）。次いで、食道組織はこの穴に挿入され（以下の図の右のパネルを参照のこと）、全体のカセットは、増殖培地ＫＧＭ（５０：５０補充物を伴うＫＳＦＭ＋ＤＭＥＭ−ＨＧ＋５％ＦＢＳ、抗生物質／抗真菌剤；５μｇ／ｍＬ、および１×インスリン／トランスフェリン／セレニウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充）中で、３７℃にて、加湿５％ＣＯ２大気中で８日間インキュベートされた。
【０５１４】
インタクトな、自然の食道は、上皮細胞の内部管腔層からなる。ＳＭＣが播種された足場のみが食道上皮細胞の移動を容易にできるか否かに取り組むために実験が実施され、それによって、以前にＡｄ−ＳＭＣが播種されたかまたは播種されなかった足場カセットに、外科的に取り出された齧歯動物の食道組織外植片が挿入された。
【０５１５】
図３０は、外科的に取り出された齧歯動物の食道組織外植片が、足場カセット単独（中央パネルの下）またはＡｄ−ＳＭＣが播種された足場カセット（右のパネル）に挿入された実験の設計を図示する。８日間のインキュベーション後、カセットは固定され、上皮細胞についてのマーカーとしてのサイトケラチンに対する抗体で染色された。緑色蛍光のより広い分布によって実証されるように、食道上皮細胞は、ラットＡｄ−ＳＭＣをあらかじめ播種しなかった足場カセットまでと比較して（図２７Ｃ）、以前にラットＡｄ−ＳＭＣが播種された足場カセットまで、組織からより長い距離を移動した（図２７Ｄ）。予期されたように、食道組織を挿入することなく、ラットＡｄ−ＳＭＣのみで播種されたカッセットは、検出できる上皮細胞が無かった（図２７Ｅ）。足場に移動する上皮細胞の数の定量は実施されなかったものの、図２７Ｃと比較して、図２７Ｄにおける足場の先端における蛍光の密度の増加は、Ａｄ−ＳＭＣを足場にあらかじめ播種することにより、生体材料への食道細胞の移動の数の増加を生じることを示唆する。
【０５１６】
図３１は、組織から、脂肪−播種されたＰＧＡ／ＰＬＧＡコートされた足場に向かうサイトケラチン＋食道細胞の移動／接着の増加を示す。図３１は、緑色蛍光のより広い分布を示し、このことは、ラットＡｄ−ＳＭＣを含有しない足場カセットよりも（中央のパネル）、最初にラットＡｄ−ＳＭＣが播種された足場カセットに（右のパネル）、組織からより多くの食道上皮細胞が移動したことを指し示す。予想された通り、対照としてのラットＡｄ−ＳＭＣのみを有するカセット（食道組織が挿入されていない）は上皮細胞の存在を示さなかった（左のパネル）。この実験の変形において、ＰＬＧＡコートされたＰＧＡフェルトは、ラット食道に縫合され、１２〜１４日間培養され、そして足場が切断され、ＤＡＰＩで染色された。図３２（両方のパネル）に示されるように、食道細胞は、白色スポットによって指し示されるように（ＤＡＰＩ染色）、足場に移動している。
【０５１７】
実施例１４−食道組織構築物の移植
以下の研究は、食道組織置き換えを開発することに組織操作技術を適用する目的のために、ラット脂肪からの平滑筋細胞（ＳＭＣ）の単離ならびに遺伝子型および表現型特徴付けに関わる。脂肪由来のＳＭＣは、合成の生物分解性足場パッチを播種するために使用されてもよいこと、およびラット食道損傷モデルへのこれらの播種された足場の移植は、積層して組織化された食道壁の首尾よい再生に導くことが見い出された。
【０５１８】
ラット脂肪からの平滑筋細胞単離および培養
ＳＭＣは実施例１および４のプロトコールに従って単離および培養された（Ｌｕｄｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．米国公開特許出願第２０１００１３１０７５号もまた参照のこと）。
【０５１９】
インビトロ食道細胞移動アッセイ
アッセイは実施例１３において記載されるように実施された。
【０５２０】
足場産生
足場は、ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）でコートされたポリグリコール酸（ＰＧＡ）メッシュから構成された。ＰＧＡは７０ｍｇ／ｃｃのバルク密度を有する、２０ｃｍ×３０ｃｍ×０．７５ｍｍシートの型の不織フェルトとして供給されている（Ｃｏｎｃｏｒｄｉａ  Ｍｅｄｉｃａｌ）。ＰＬＧＡ（５０：５０、Ｄｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＩＶ＝０．５５〜０．７５）は、使用前に塩化メチレン中に溶解された。ＰＧＡメッシュは、ＰＬＧＡ溶液（液化コポリマー（ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド５０：５０  ８０ｍｇ／ｍＬ塩化メチレン）を含有するビーカーに浸漬することによってコートされた。このコーティングは、適正な機械的安定性を達成するために加えられた。次いで、コートされたＰＧＡメッシュは、エチレンオキサイドで滅菌され、そして使用まで乾燥チャンバーに保存された。
【０５２１】
構築物移植物製造
滅菌足場（３ｍｍ×５ｍｍ）がＳＭＣ増殖培地中で水和され、移植のための構築物を作るために５０，０００細胞が播種された。構築物は、増殖培地で覆われ、３７℃にて、加湿５％ＣＯ２−含有大気中で移植の前５日間インキュベートされた。
【０５２２】
動物の手術
麻酔下で、雌性Ｌｅｗｉｓラット（およそ２８日齢）が、上部正中腹部開腹術を受けた。腹部食道が動かされ、およそ３ｍｍ幅および５ｍｍ長と測定される欠陥が、噴門の近位に作製され、そして非吸収性７−０シルク（Ｅｔｈｉｃｏｎ）の結節縫合を使用して、移植された構築物によって置き換えられた。次いで、この構築物は網で覆われた。ゲンタマイシン（０．１ｍｇ）が腹腔内に与えられた後で、腹部が閉じられた。手術後、ラットはそれらのケージに戻され、７日間、柔らかい経口食および水摂取が無制限に許された。この時間の後、ラットは固いラット固形飼料および水の摂取を無制限に許された。
【０５２３】
組織学的評価
剖検において、非吸収性縫合糸によって同定されかつ線引きされるような、組織操作された食道を含有する組織が、１０％緩衝化ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）中で固定された。食道壁（欠陥部位）の選択されたセクションが、一連の上昇濃度のエタノール中で脱水され、パラフィンに包埋された。薄片（５μｍ）を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン、ならびにＭａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＬＬＣ，Ｌｏｎｇｍｏｎｔ，ＣＯ．）で染色し、間質性および筋肉構成要素を可視化した。
【０５２４】
図３３Ａは、外科的に作製された食道欠陥および引き続く構築物移植を描写する。食道は実行可能な領域への接近を可能にするように膨張されるので、外科的切除は、いくらか卵形形状である欠陥を生じた（図３３Ａ−左のパネル）。移植されると、構築物を固定するために使用された非吸収性縫合糸は、移植物の端が見えるように意図的に作られたので、これらは、剖検の際に、再生された食道組織の境界を線引きするために使用できた（図３３Ａ−右のパネル）。動物は、移植後３．５、１０、１２、および１６週で屠殺された。表１４．１は、これらの時点で観察された組織学的結果を要約する。
【０５２５】
図３３Ｂは、移植後１日での組織学を示す。欠陥を通した横断面は、欠陥の縁に対する移植された構築物の適正な同格関係を示す。大網の覆い部位において、新しい血管の構築物の空間への貫入（新血管形成）、軽度の炎症性浸潤物（好中球および単核）、遊離のおよび血管内赤血球、および好酸球性フィブリンによって特徴付けられる、初期組織再生治癒応答の組織化が存在する。細菌コロニーの多巣性集合体もまた存在する。足場の管腔表面は上皮化の証拠を示さない。急性出血性膵炎を伴う膵臓組織が存在する。手術部位は、解剖学的に膵臓および網の近くである。医原性または術後炎症が膵臓の頭部または尾部を偶発的に包括し得ることが注目されるべきである。
【０５２６】
2013525077.tif 000015
【０５２７】
図３４は、血管新生（血管形成）を示す。左のパネル：欠陥部位中の構築物の足場材料を示す、４０倍拡大Ｈ＆Ｅ染色（偏光）セクション。右のパネル：構築物の移植足場繊維中での顕著な血管形成（矢印）を示す、より高倍率拡大（６００×）の緑色ボックス領域（左）（Ｆ）。
【０５２８】
図３５は、移植後８日における組織学を示す。セクションは移植物の中心から取られた。セクション２（縦方向）；治療部位の中心はこのセクションにおいて捕捉され、これは、欠陥の縁への足場の適正な同格関係を示す。管腔表面の上皮化の評価できる証拠は存在しない。根底にある壁は、初期の組織化が顆粒化／線維結合組織、縁の近くの平滑筋束の血管新生および局所的再生からなることを示すが、足場材料の多くがあると見られる移植の中心の近くでは何も観察されなかった（組織切断のアーティファクトに起因する）。全体として、中心では主に中程度、末梢部では軽度に活動的な慢性炎症が存在する。大網覆い部位は、線維結合組織および肝臓からなる初期の組織化が、顕著な損傷を伴うことなく、大網に接着して見えることを示す。石灰化、壊死、または細菌コロニー形成の証拠はない。
【０５２９】
図３６は、移植後８日目における組織学を示す。セクションは、移植物からの末梢から取られた。セクション１（縦方向）；治療部位の末梢面はこのセクションで捕捉され、欠陥の縁に対する足場パッチ（構築物）の適正な同格関係、および管腔表面の完全な上皮化を実証する。平滑筋束の存在を伴う組織化している顆粒化／線維結合組織、血管新生、および軽度の炎症性浸潤、主に、縫合材料の周辺のいくつかの巨細胞を伴う、マクロファージおよびリンパ球によって特徴付けられる、食道壁の初期の再生が存在する。偏光フィルターを使用したときに最小限の残渣の繊維が観察されたので、生体材料（足場）の分解はほぼ完全（約９０％）である。石灰化、壊死、または細菌コロニー形成の証拠はない。上に重なる網は、接着性肺組織と関連する顕著な活性慢性炎症を示し、これは、網に含まれた（縫合された）ように見える。同様に、網に接着されている肝臓組織の中に縫合材料の痕跡が存在する。
【０５３０】
移植後８日目に、（末梢における）欠陥部位の管腔表面は上皮によって完全に覆われ、典型的に、治癒／再生プロセスにおいて予想される、根底にある再生している筋束および軽度の炎症性応答を伴って組織化している顆粒組織を伴う。移植後８日目に、欠陥の中心は管腔表面の上皮化の明確な証拠を示さない。縁において再生している筋束および中程度の慢性炎症を伴って、顆粒組織によって取り囲まれている、中程度の量の足場材料が存在する。
【０５３１】
図３７Ａは、移植後１０週目の食道構築物の取り込みを示す。図３７Ｂは、セクション１（横断）をより詳細に示す：噴門洞（Ｆ）への開口（矢印）を有するネイティブ食道セクション。食道構築物で処理した欠陥部位は存在しない。図３７Ｃは、セクション２（横断）をより詳細に示す：欠陥部位の遠位縁の部分を伴う自然の食道セクション。粘膜下層再生を伴う管腔粘膜表面の完全な再上皮化が存在する（固有層および筋層粘膜）。外筋層は、線維血管結合組織および平滑筋細胞からなる不完全な部分的再生が、円形／縦方向の束形成に完全に配列されてはいないことを示す。主として重層する網および外筋層の中に、最小限の足場材料（繊維）が存在する。石灰化、壊死、または細菌コロニー形成の証拠は伴わずに、限局的な最小限の慢性炎症（マクロファージ／リンパ球）が存在する。
【０５３２】
図３７Ｄは、セクション３（横断）をより詳細に示す：新たな食道、自然の食道、および治療部位。移植後１０週の動物が屠殺され、移植部位に対して前方および後方に配置されたインタクトなネイティブ組織を含有する食道の連続セクションが取り出され、組織学的評価のために処理された（図４１Ｄ−第１のパネル）。移植部位および対向する自然のインタクト組織の横断面が、Ｈ＆Ｅ（赤色）およびＭａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（青色）で染色された（図３７Ｄ−第２のパネル）。高倍率の移植部位（図３７Ｄ−第３のパネル）および対向するインタクトなネイティブ食道の壁（図３７Ｄ−第４のパネル）は、移植部位における管腔粘膜表面および粘膜下層の完全な再上皮化を明らかにした。この部位の外筋層は、線維血管結合組織および平滑筋細胞からなる再生の証拠を示す。しかし、平滑筋細胞は、自然の組織中で明らかであるように、円形／縦方向束形成まで完全に配列されていない。最小限の足場材料（繊維）が観察され、これが存在する場合、これは、網および外筋層に制限されて見える。移植部位は、最小限の限局的な慢性炎症を含有するように見え、石灰化、壊死、または細菌コロニー形成の証拠は伴わなかった。１０週間後、食道構築物の移植は、３つすべての壁層：粘膜、筋層、および漿膜の形成によって特徴付けられる新食道再生に導いた。
【０５３３】
実施例１５−小腸組織構築物の移植
組織操作の原理は、積層壁アーキテクチャーを用いて管腔器官を再構築するための移植可能な細胞／生体材料複合物を開発する際に首尾よく使用されており（例えば、膀胱）、ここで、デノボ器官形成は、複合物（構築物としてもまた知られる）の移植後に触媒され、機能的器官の再生を生じる。Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（商標）（Ｔｅｎｇｉｏｎ，Ｉｎｃ．）がこれらの原理に適用されて、胃腸管セグメント（現在のケアの基準）に対する代替として、尿迂回路および他の泌尿器的適用のための自系再生生成物を開発している。小腸（ＳＩ）は、積層壁アーキテクチャーを有する管状器官の特定化された反復バリエーションを表す。本発明に提示された結果は、他の管状器官、具体的には、ＳＩへの尿路を超えた、基礎的な器官再生プラットフォームを拡張する潜在能力を実証する。平滑筋細胞（Ａｄ−ＳＭＣ）はラット内臓脂肪からエキソビボで拡大され、ＳＩ移植のために生体材料に投入するために使用された（Ｂａｓｕ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．７ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  ＩＳＳＣＲ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００９）。（実施例４のプロトコールもまた参照のこと）。
【０５３４】
足場製造
足場は、ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）でコートされたポリグリコール酸（ＰＧＡ）メッシュから構成された。ＰＧＡは、２０ｃｍ×３０ｃｍ×０．７５ｍｍシートの型で、７０ｍｇ／ｃｃのバルク密度を有する不織フェルトとして供給されている（Ｃｏｎｃｏｒｄｉａ  Ｍｅｄｉｃａｌ）。ＰＬＧＡ（５０：５０、Ｄｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＩＶ＝０．５５〜０．７５）は、使用前に塩化メチレンに溶解された。ＰＧＡメッシュは、ＰＬＧＡ溶液（液化コポリマー（ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド５０：５０  ８０ｍｇ／ｍＬ塩化メチレン）を含有するビーカーに浸漬することによってコートされた。このコーティングが、適正な機械的安定性を達成するために加えられた。次いで、コートされたＰＧＡメッシュは、サイズを合わせるようにカットされ、エチレンオキサイドで滅菌され、そして使用まで乾燥チャンバー中で保存された。あるいは、ヘキサフルオロプロパノール（Ｓｉｇｍａ）中の１０％ＰＣＬの溶液を電子スピンすることによって、管状ＳＩ足場が４ｍｍ直径マンドレルに作られた。
【０５３５】
構築物移植片製造
滅菌足場（パッチまたは管）は、ＳＭＣ増殖培地中で水和され、移植のための構築物を作るために５０，０００細胞が播種された。構築物は、増殖培地で覆われ、３７℃にて、加湿５％ＣＯ２−含有大気中で移植の前５日間インキュベートされた。平滑筋細胞（Ａｄ−ＳＭＣ）はラット内臓脂肪からエキソビボで拡大され、ＳＩ移植のために生体材料に投入するために使用された。Ａｄ−ＳＭＣは、ＳＩパッチまたは管構築物を組み立てるために、織りＰＧＡメッシュまたはＰＧＡもしくはＰＣＬ管に播種された（図３８）。ＳＩパッチ構築物は、管腔に完全にさらされるためにＳＩ壁に切り込まれた長方形の欠陥（５ｍｍ×４ｍｍ）の上で非吸収性縫合糸を用いて縫合された。管状ＳＩ足場（４ｍｍＩ．Ｄ．を有する１ｃｍ長）は、自然のＳＩの横方向切開および１ｃｍ部分の除去後に、ＳＩの前部分と遠位部分を接続するために使用された。
【０５３６】
動物手術
麻酔下で、雌性Ｌｅｗｉｓラット（およそ２８日齢）が、正中腹部開腹術を受けた。小腸は動かされて、およそ３ｍｍ幅および５ｍｍ長と測定される欠陥が設定され、そして非吸収性７−０シルク（Ｅｔｈｉｃｏｎ）の結節縫合を使用して、移植された構築物によって置き換えられた。あるいは、小腸の管状セクションが、宿主から完全に切除され、１ｃｍ管状構築物の端から端までの吻合が、非吸収性７−０シルクの連続縫合を使用して達成された（図３９Ａ〜Ｂ）。図３９Ｃは、小腸に移植されたパッチ構築物の一例を示し、暗い色の非吸収性縫合材料は、パッチの末梢周辺に見える。次いで、この構築物は網で覆われた。腹部は、ゲンタマイシン（０．１ｍｇ）が腹腔内に与えられた後で閉じられた。手術後、ラットは、それらのケージに戻され、７日間、柔らかい経口食および水摂取が無制限に許された。この時間の後、ラットは固いラット固形飼料および水の摂取を無制限に許された。ラットは、手術後４日から２０週までの範囲の時点で再生の組織学的評価について収集された。
【０５３７】
組織学的評価
剖検において、非吸収性縫合糸によって同定されかつ線引きされるような、再生された小腸を含有する組織は、１０％緩衝化ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）中で固定された。小腸壁（欠陥部位）の選択されたセクションは、一連の上昇濃度のエタノール中で脱水され、パラフィンに包埋された。セクション（５μｍ）は切断され、ヘマトキシリンおよびエオシン、ならびにＭａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＬＬＣ，Ｌｏｎｇｍｏｎｔ，ＣＯ．）で染色され、間質性および筋肉構成要素を可視化した。欠陥部位に印を付ける非吸収性縫合糸が、自然のＳＩ壁を含む粘膜および筋肉の薄板層の再生を評価するために、自然のＳＩと新たなＳＩ組織の比較を可能にした。
【０５３８】
パッチベースのＳＩ構築物からの腸壁の完全な再生
小腸の再生を実証するために、長方形４×５ｍｍビクリルポリマーから構成されるパッチ型構築物が使用されて、雌性Ｌｅｗｉｓラット（ｎ＝４）のＳＩ壁における外科的に得られた欠陥を矯正した。試験動物は、安楽死の前に８〜２０週間の間回復させられ、再生の領域の回復は、非吸収性縫合によって定義される通りであった。再生の程度は、試験動物における組織学的分析によって評価された（要約示さず）。管腔粘膜表面の再上皮化が、移植後８週までに観察された。ほぼ完全な生体材料の分解が、この時点までに注目された。慢性炎症は明らかではなかった。重要なことに、図４０Ａに示されるように、筋層を含む小腸壁の３つすべての層の完全な再生は、移植後８週までに観察可能であった。図４０Ａ左上のパネル（Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、１０×縦方向、腸）；右上のパネル（Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、４０×移植物／欠陥部位）；左下（腸内容物を伴う管腔が示される；全体以下、小腸（縦方向に開いている）、管腔（腸内容物）および欠陥部位（破線）を露出するため；右下（Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、４０×正常腸）。移植後１６週におけるＳＩパッチ処理部位の縦方向セクション化は（図４０Ｂ〜Ｃ）、腸粘膜および粘膜下層の完全な再生、ならびに筋層の部分的な再生を示し、レムナント足場線維、石灰化、壊死、または細菌コロニー形成の証拠は伴わなかった。図４０Ｂの左上のパネルは、全体以下、小腸、および欠陥部位（破線の楕円領域）を示す。右上のパネルは、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、移植／欠陥部位の×１０を示す。２つの左下のパネルは、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、移植／欠陥部位の×４００を示し、再生された筋束が見える−欠陥の縁（左）および中央（右）。右下のパネルは、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、移植片／欠陥部位の×４０を示す（二重ヘッドの破線）である。図４０Ｃはこのパネルのより大きいバージョンを提供する。
【０５３９】
管状ＳＩ構築物からの腸壁の部分的再生
自然のラットＳＩのおよそ１ｃｍの外科的切除に続いて、管状ＳＩ構築物が、直接的な末端から末端への吻合によって移植された（ｎ＝６）（図４１）。管状構築物は、ＰＧＡまたはＰＣＬから構成されるＡｄ−ＳＭＣ播種されたバイオポリマーから構成された。宿主齧歯動物は、４日から５ヶ月までの範囲の期間の間、移植後に回収させられた（要約示さず）。ＳＩパッチについて観察された繰り返す様式で、管状構築物中でＳＩ壁の再生を媒介する労力は、不完全な吻合、狭窄症、過度の縫合材料、構築物からの生体材料の突出、乏しいまたは不完全な構築物の血管形成、ならびに接着および関連する腸閉塞を含む、外科的手順の開発と関連した困難さによって複雑にされた（要約示さず）。これらの困難にも関わらず、再生結果の予備的な指標は観察可能であった。管腔粘膜表面の部分的な再上皮化は、構築物の移植後１４日目に注目された。筋層の関連する再生は観察されず、最小限の生体材料の分解のみが注目された。腸壁の予備的な再生は、線維血管層の形成と関連した。付随する血管新生を伴う成長中の線維血管組織もまた、移植後１４日までに観察可能であった。
【０５４０】
移植後１０週までに、生体材料（ＰＧＡ）の完全な分解が観察された。構築物の管腔粘膜表面の顕著な再上皮化が注目され、線維血管組織浸潤が付随した。観察される場合、再上皮化の欠如は、おそらく、顕著な細菌コロニー形成に起因した。重要なことに、管壁の再生は、主として吻合縁に位置する筋線維の多巣性集合体の形成に伴って起こった（図４１）。図４１の左上のパネルは、ＰＧＡ管セグメントを示す小腸の二分後の全体以下の画像を示す。右上のパネルは移植部位を示す（Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、×１０、矢印は吻合を指し示す）。左の第１の下のパネルは、細菌コロニーによって覆われた、管腔表面を示すＨＥ、×４００を示す（好塩基性染色）。管壁は高度に血管新生化されている。第２の下のパネルは、管壁の縦方向セクションを示す、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、×１０を示す（中央）。第３の下のパネルは、細菌コロニーによって覆われた、管腔表面を示す管腔（ＨＥ、×４００）を示す（好塩基性染色）。右下の第４のパネルは、吻合部位（近位）およびＰＧＡ管の管腔表面上の再上皮化の程度を示す、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、×４０を示す。
【０５４１】
移植後５ヶ月目において、生体材料（ＰＧＡ）は完全に分解され、管腔粘膜表面の上皮層のほぼ完全な再生が注目された。根底にある線維血管結合組織を伴う粘膜上皮は、主に、欠陥の縁の近くである、筋線維および束の多巣性集合体によって浸潤された（図４２）。図４２の左上のパネルは、二重ヘッド黒色矢印によって指し示されるＰＧＡ管セグメントを示す、小腸の全体以下画像を示す。右上のパネルは、移植部位、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、×１０を示す。下の４つのパネルは、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ×１００，Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ×１０、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ×１００、およびＴｒｉｃｈｒｏｍｅ×４０を示す（左から右の順番）。
【０５４２】
実施例１６−食道または小腸構築物のための生体材料の評価
食道または小腸（ＳＩ）組織置き換えを必要とする患者のための現在の治療ストラテジーは、しばしば、生活の質に負の影響を与える有害な副作用を伴う。この問題に取り組むために、本研究は、これらの器官の再生に対して組織操作原理を適用することを追求した。以前には、これらの原理は、積層壁アーキテクチャーを有する別の管状器官である膀胱を再構築するための移植可能な細胞／生体材料複合物を開発するために首尾よく使用されている。これらの場合において、デノボ組織生成は、複合物（構築物とも呼ばれる）の移植後に触媒され、機能的器官の再生を生じた（Ｂａｓｕ  ａｎｄ  Ｌｕｄｌｏｗ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０；２８（１０）：５２６−３３；Ｂａｓｕ  Ｊ．７ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  ＩＳＳＣＲ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００９；Ｊａｙｏ  ＭＪ．Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ２００８；３：６７１；Ｊｏｓｅｐｈ  Ｄ．Ｊ  Ｕｒｏｌ  ２００９；１８１：５５５）。
【０５４３】
方法：様々な型および組成の生体材料が評価された。細孔径２３〜３００μｍのポリ−カプロラクトン（ＰＣＬ）フォームは、溶媒キャスト−微粒子浸出法、ならびにポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）でコートされた種々の型のポリグリコリド（ＰＧＡ）ファイバーによって作られた。これらには、コートされたＰＧＡ不織メッシュ（ＰＧＡｎｗ）、織りメッシュ（ＰＧＡｗ）、および編み組み管（ＰＧＡｂ）が含まれた。平滑筋細胞はラット内臓脂肪からエキソビボで拡大され（Ａｄ−ＳＭＣ）、インビトロおよびインビボ評価のために生体材料に播種するために使用された（Ｂａｓｕ  ２００９前出）。このインビトロでの細胞−生体材料の評価は、生／死染色、細胞接着／増殖アッセイ（ＭＴＳ）、および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によってであった。インビボでの食道およびＳＩ再生の評価のために、ＰＧＡｗおよびＰＧＡｎｗは、５ｍｍ×４ｍｍ長方形パッチまでトリミングされ、構築物を作製するためにＡｄ−ＳＭＣが播種された。Ａｄ−ＳＭＣを有するＰＧＡｂは、管状ＳＩ構築物を作製するために使用された。食道とＳＩの両方のためのパッチ構築物は、成体ラットにおいて管腔を露出するために組織壁に切断されたおよそ５ｍｍ×４ｍｍの長方形欠陥の上で、非再吸収性縫合糸で縫合された。管状ＳＩ構築物（１０ｍｍ長、４ｍｍ内径）は、横方向切開後に、ＳＩの前側および遠位部分を接続するために使用された。網は、血管新生の供給源を提供するために、構築物の上で縫合された。動物は、移植後の６日から２０週の範囲の時点で安楽死させられた。剖検において、組織は収集され、ホルマリン中に固定され、そして切片化およびＴｒｉｃｈｏｍｅを用いる染色のためにパラフィン包埋された。欠陥部位に印を付ける非吸収性縫合糸は、ネイティブと再生された組織の比較を可能にした。
【０５４４】
結果：インビトロアッセイは、すべての材料が、容認可能な細胞生存度、増殖、および形態を有したことを示した。左：図４３−ＰＣＬフォーム上のラットＡｄ−ＳＭＣの生／死染色、１５０〜２５０μｍ細孔径、１０X。右：ＰＧＡｎｗ上のラットＡｄ−ＳＭＣのＳＥＭ画像、１７０X。より低い細胞生存度および増殖が、より小さな細孔のＰＣＬフォーム上で見られた。
【０５４５】
インビボでもまた、分析が実施された。図３７Ｄは、移植後１０週でのＰＧＡｎｗ食道パッチ構築物の欠陥部位を通したセクション化を示す。図４０は、移植後８週（図４０Ａ）および１６週（図４０Ｂ〜Ｃ）におけるＰＧＡｗ  ＳＩパッチ構築物を示す。図４１は１０週におけるＰＧＡｂ  ＳＩ管状構築物を示す。図４２において、移植後２０週のＰＧＡｂ  ＳＩ管状構築物は、外筋層の部分的な再生を伴う、管腔粘膜表面および粘膜下層の完全な再上皮化を示した。レムナント足場線維、石灰化、壊死、または細菌コロニー形成の証拠は存在しなかった。
【０５４６】
ＰＧＡおよびＰＣＬ生体材料は、インビトロでＡｄ−ＳＭＣとの生体適合性を示した。ＰＧＡ材料は、食道およびＳＩパッチならびにＳＩ管状構築物を産生するために適切であった。ＰＧＡパッチ構築物のインビボ移植は、それぞれ、１０週および１６週以内に食道およびＳＩ組織再生を生じた。ＰＧＡｂ管状構築物のインビボ移植は２０週以内にＳＩ組織再生を生じた。
【０５４７】
実施例１７−末梢血および脂肪組織からの内皮細胞単離および拡大
内皮細胞は、末梢血および脂肪供給源から首尾よく単離されている（Ｄａｉｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１１：９２６−９３１；Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０：Ｅ１１２４−Ｅ１１３２；ｍｅｌｅｒｏ−Ｍａｒｔｉｎ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｂｌｏｏｄ  １０９（１１）：４７６１−４７６８；Ｋｅｒｎ  ａｔ．ａｌ．，１９８３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：１８２２−１８２９；Ｐｌａｎａｔ−ｂｅｎａｒｄ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０９：６５６−６６３）こともまた報告されている。末梢血供給源から内皮細胞を培養することは、培養培地に血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を補充することによって容易にされる。
【０５４８】
血液由来細胞−細胞単離および培養：手短に述べると、末梢血は、無菌条件下での静脈穿刺および収集後に、健常ヒトボランティアから得られた。ヘパリン化血液または白血球プレップ（新鮮から２４時間経過まで）がＤＰＢＳで２倍〜４倍に希釈され、等量のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７に重層される。次いで、勾配が４００〜８００×ｇ、３０〜４５分間遠心分離される。単一の単離されたバンド中の細胞が取り出され、ＤＰＢＳで洗浄される。選択した培地（α−ＭＥＭを補充した１０ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ；１０％ＦＢＳを含有するα−ＭＥＭ、ＶＥＧＦ補充なし）に再懸濁され、次いで、細胞は、コラーゲンＩ、フィブロネクチン、またはコラーゲンＩＶ（またはこれらの組み合わせ）がコートされたプレートにプレーティングされ、その結果、Ｐ１００あたり５〜２０ｍＬのもともとの全血量が加えられる。プレーティングされた細胞は、培地交換の前に２４〜９６時間、３７℃／５％ＣＯ２に配置され、栄養供給は、新鮮な培地を用いて、２〜４日毎に継続される。コロニー成長は７〜２１以内に起こる。細胞はトリプシン処理後に継代され、２継代までの間、４０００〜８０００細胞／ｃｍ２を播種する。ＶＥＧＦを伴うかまたは伴わないＥＧＭ−２培地もまた、細胞を培養するために使用できる。
【０５４９】
培養末梢血細胞の細胞形態：末梢血細胞単離後、上記のように、細胞は、この培地中で２〜３週間培養され、それらの形態が試験された（図４４、パネルＢを参照のこと）。末梢血細胞の対照培養は、ＶＥＧＦ補充なしで１０％ＦＢＳを含有する培地中で維持された（パネルＡ）。これらの２種の培地中で維持された末梢血細胞の形態はＨｕＡＥＣと比較され、これは、陽性対照として働いた（パネルＣ）。ＶＥＧＦ補充なしの１０％血清含有培地中で維持された末梢血細胞は、線維芽細胞様細胞の形態を呈する（パネルＡ）。１０ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦを補充した培地中でのこれらの細胞の培養後に（パネルＢ）、細胞は、対照内皮細胞培養において見られるものと同一である、短縮型、円形、または立方形形状の内皮様形態を呈する（パネルＣ）。従って、末梢血から単離された内皮様に見える細胞は、ＶＥＧＦを補充した培地中で首尾よく培養できる。
【０５５０】
培養末梢血細胞の内皮細胞遺伝子発現分析：ＲＴＰＣＲ分析のための細胞試料が、ＶＥＧＦ補充を伴わない１０％血清含有培地中に維持された培養（図４５、レーン１）、および１０ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦを補充した培地中で維持された培養（レーン２）から取られた。いかなるＰＣＲプライマーも含まない蒸留水が陰性対照として使用されたのに対して（レーン３）、ＨｕＡＥＣは内皮細胞遺伝子マーカー発現のための陽性対照として使用された（レーン４）。表１７．１は、ＲＴ−ＰＣＲ分析において使用される内皮遺伝子マーカーのリストを提供する。Ｂ−アクチンはゲルについてのローディング対照として使用された。これらの内皮細胞マーカーの発現は、ＶＥＧＦを用いる補充を伴うかまたは伴わない培地中での培養の場合に観察される。従って、内皮細胞が末梢血から単離および培養できる。
【０５５１】
2013525077.tif 000016
【０５５２】
脂肪由来の細胞−細胞の単離および培養：ヒト脂肪試料が、皮下的に、または商業的な供給業者からの脂肪吸引を通してのいずれかで得られ、等量のＰＢＳ／ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）（５μｇ／ｍＬ）で３〜５回洗浄された。脂肪は、フィルター滅菌されたコラゲナーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）（０．１％、ＤＭＥＭ−ＨＧ中１％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ））で、３７℃にて１時間消化され、次いで、５０ｍＬ円錐管中で５分間、３００ｇで遠心分離された。間質性血管画分はＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁され、そして１００μｍ  Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ真空フィルターを通してろ過された。細胞集団は、３００ｇで５分間、再度ペレット化され、再懸濁され、そして１０ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦを補充したα−ＭＥＭ、ＶＥＧＦ補充を伴わない１０％ＦＢＳを含有するα−ＭＥＭ、または１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で培養された。ＶＥＧＦを伴うかまたは伴わないＥＧＭ−２培地もまた、細胞を培養するために使用されてもよい。
【０５５３】
培養脂肪由来の細胞の細胞形態：脂肪細胞単離後、上記のように、細胞は、この培地中で２〜３週間培養され、これらの形態が調べられた（図４６、パネルＢを参照のこと）。脂肪由来の細胞の対照培養は、ＶＥＧＦ補充を伴わない１０％ＦＢＳを含有する培地中で維持された（パネルＡ）。これらの２種の培地中で維持された脂肪由来の細胞の形態は、陽性対照として働いたＨｕＡＥＣと比較された（パネルＣ）。ＶＥＧＦ補充を伴わない１０％血清含有培地中に維持された脂肪由来の細胞は、平滑筋細胞様形態が維持され、細長い旋回状細胞から構成された（パネルＡ）。１０ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦを補充した培地中でのこれらの細胞の培養後（パネルＢ）、細胞は、対照内皮細胞培養において見られるものと同一である、短縮され、円形の、または立方形の形状の内皮様形態を呈する（パネルＣ）。従って、脂肪組織から単離された内皮様外見の細胞は、ＶＥＧＦを補充した培地中で首尾よく培養できる。
【０５５４】
脂肪由来の細胞の内皮細胞遺伝子マーカー発現：脂肪由来の細胞が、ＲＴＰＣＲによる内皮遺伝子発現分析の目的のために、分離され、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養された（マーカーのリストについては表１７．１を参照のこと）。細胞試料は、最初のプレーティングの２４時間後および４８時間後、ならびに引き続く継代（Ｐ０からＰ３まで）においてもまた取られた。ヒト大動脈内皮細胞（ＨｕＡＥＣ）はマーカー発現についての陽性対照として使用された。図４８は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で培養された脂肪由来の細胞の内皮細胞遺伝子発現分析のＲＴＰＣＲの結果を示す。最初の単離後、脂肪由来の細胞は、６種の内皮細胞マーカーの遺伝子発現によって証明されるように（最初のプレーティングの２４時間後および４８時間後）、内皮細胞の集団を含有する。これらの遺伝子の発現は、内皮遺伝子発現の喪失によって指し示されるように、ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ中での培養および継代の際に失われている（Ｐ０〜Ｐ３）。従って、内皮細胞の集団は脂肪組織中に存在し、最初の細胞単離後に特定できる。
【０５５５】
ＲＴＰＣＲ分析のための細胞試料もまた、ＶＥＧＦ補充を伴わない１０％血清含有培地中で維持された培養物（図４７、レーン１および３）、および１０ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦを補充した培地中に維持された培養物（レーン２および４）から取られた。いかなるＰＣＲプライマーも含まない蒸留水は陰性対照として使用されたのに対して（レーン５）、ＨｕＡＥＣは内皮細胞遺伝子マーカー発現についての陽性対照として使用された（レーン６）。Ｂ−アクチンはゲルについてのローディング対照として使用された。これらの内皮細胞マーカーの１種以上の発現が、ＶＥＧＦを補充された培地中での培養の場合に観察される。従って、内皮細胞が脂肪組織から単離および培養できる。ＶＥＧＦを伴うかまたは伴わないＥＧＭ−２培地もまた、細胞を培養するために使用されてもよい。
【０５５６】
実施例１８−新膀胱および新尿路導管移植を評価するためのイヌ研究
インビボ研究が、組織再生および置き換えのために新膀胱構築物（ＮＢＲ）または新尿路導管（ＮＵＣ）を移植することの機能的結果を決定するために行われた。１０匹の動物がこの研究に参加させられた。根治的な移植手術の前に、３匹の動物が、足場の播種において使用されるための自系細胞提供のための膀胱生検手順を受けた。これらの動物は、根治手術の前に数日間、回復させられた。すべての動物は、尿道スペアリング膀胱切除を受け、Ｔｅｎｇｉｏｎ’ｓ  Ｎｅｏ−Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔが移植された。１１匹の動物の中の２匹が、自系ＳＭＣが播種された構築物を移植されたのに対し、残りの８匹の動物は、同種異系ＳＭＣが播種された構築物を移植された。動物は４３〜１８７日間生存した。生存期間の間、動物の新器官は、総計０〜１６２時間、循環された。新器官発生は、尿力学評価、指定された時点におけるサイトグラム、および時折の細胞検査を通してモニターされた。腎臓の健康が、超音波、ならびに尿および血液の分析を使用してモニターされた。生存期間の完了の際に、尿生殖器系組織が収集され、組織学的に分析された。１０匹の動物が首尾よく移植され、４３〜１８８日間生存した。研究中の１１匹の動物のうちの４匹が、最終的な医学的状態（すなわち、新膀胱穿孔、腎感染、または水腎症）に起因して、選択時点において安楽死され、１匹は１３週で組織病理学評価の目的のために安楽死された。残りの６匹は生存して、スケジュールされた生存期間を完了した。
【０５５７】
研究設計
総計１０匹のイヌ（７匹が雌性、３匹が雄性−去勢）が、健常動物における完全な膀胱置き換えについて評価された。回復期間の前およびその間、血液および尿試料が、指定された時点で収集され、分析され、および記録された。移植のおよそ１週間後、動物の発達している新器官は、バルーンカテーテルを介して、尿道開口の閉塞を通して循環されて、膀胱に尿を満たすことを可能にし、次いで、動物が随意調節を起こすまで、スケジュールされた時点において閉塞の取り外しを行い、「天然の循環」が始まることを可能にした。蛍光顕微鏡画像、漏出点圧力モニタリング（ＬＰＰ）、超音波、および新器官の膀胱鏡検査評価が、スケジュールされた時点およびスケジュールされていない時点で実施されて、新器官の収容能力を測定し、新器官の壁厚を評価し、ならびに本研究の期間全体を通して新器官、尿管、および腎臓の状態をモニターした。表１８．１は各動物に関する情報を提供する。外科手術。動物は動物の取り扱い、技術的手順の実施、および外科手術の準備の前に鎮静化させられた。
【０５５８】
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【０５５９】
生検
正中切開が、自系構築物が移植されるようにスケジュールされた両方の動物（番号１および４）について、臍に対してすぐ尾側に始まる腹部において行われた。膀胱は露出され、尿が空にされた。膀胱組織の１つの２ｃｍ×２ｃｍ尖端ドームピースが膀胱から切除された。膀胱組織は、直ちに細胞の単離のための組織培養培地中に無菌的に保存された。次いで、膀胱中の欠陥が、吸収可能な縫合材料を使用して、少なくとも２層中で閉じられた。皮膚は、再度、適したサイズの吸収可能な縫合材料を使用して表皮下様式で閉じられた。構築物は、本明細書に記載されるプロトコールに従って調製された。
【０５６０】
構築物移植
滅菌Ｆｏｌｅｙバルーンカテーテルが膀胱に配置され、正中切開が、臍に対してすぐ尾側に始まる腹部において行われた。網が特定され、２つの層として維持され、そして頭側の半分と尾側の半分に分けられた。次いで、膀胱が露出され、膀胱は尿が空にされた。尿管が背側局面上に入り、尿管開口部が三角部では空になっていた場所を含む、三角部領域を同定する際に外科医を補助するために、正中縦方向切開が膀胱の中で行われた。適したサイズのＶｉｃｒｙｌ縫合は、三角部領域の中の尿管の下の骨盤入口において尿道頸部の周囲のおよそ５点で糸を通された。次いで、尿管は膀胱から切除され、膀胱壁の部分および尿管開口においてインタクトである三角部領域を残した。１１匹の動物のうちの６匹（動物番号４〜９）は、尿管開口において、膀胱壁／三角部レムナントを除去した右側および左側に対して、尿管横断面を有した。尿管ステントは、尿管開口から腎臓に向かう上行性様式で、一方または両方の尿管に配置された。次いで、全体の膀胱が、確保された丸い尿道頸部の周囲に固定された縫合に対して近位で切除された。構築物が培地から無菌的に取り出され、滅菌シリンジまたは湿らせたガーゼを使用して、滅菌した生理学的ｐＨの生理食塩水を穏やかに注入することにより、手順の間、湿潤が維持された。構築物の尾側開口は、尿道頸部に以前に固定されたＶｉｃｒｙｌ縫合を介して尿道に結合されていた。吻合後、動物番号１のための尿管開口は、滅菌した８ｍｍ穴パンチを使用して、構築物の腹側側面上のおよそ８時および４時位置の中点に作製された。動物番号４〜１１において、背側側面上の尿管開口の位置は、構築物への尿排出を容易にするために、およそ１０時および２時の位置に調整され、または三角部／天然の位置の近くであった。次いで、各尿管開口部は、構築物上の適した開口に縫合された。プロレン縫合は、手術後の取り出しを容易にするために、各尿管ステントの遠位末端に結合された。次いで、頭側の網の半分と尾側の網の半分が、構築物の上で引っ張られ、およそ２〜４ｍＬのＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）外科手術用接着剤が使用されて、網組織中における止血を確立した。網中に包まれた構築物は、適正な閉鎖および水密性を確実にするために、構築物の完全な覆いについて目視でチェックされた。腹部切開は層の中で閉じられ、皮膚は吸収可能な縫合材料を用いて表皮下様式で閉じられた。動物１および３〜９について、Ｆｏｌｅｙバルーンカテーテルが動物に固定され、手術後の尿の排出、収集、および／または循環を容易にするために、その場所に残された。動物１０および１１については、以下の「尿路カテーテルおよびポート系移植」を参照のこと。尿管非分解性ステントはすべての動物に固定された。表１８．１は、各動物についてステントが取り外されたときの移植後日数を列挙する。
【０５６１】
尿路カテーテルおよびポート系移植：動物番号１、２および４〜９の生存期間の間、動物がカテーテルに接近することを妨害する試みにも関わらず、Ｆｏｌｅｙカテーテル（例えば、動物へのＥｌｉｚａｂｅｔｈａｎカラーおよび縫合カテーテル）は、動物によって時期尚早に動かされていたことが注目された。これらの問題に取り組むために、動物番号１０および１１は、動物番号１、２、および４〜９において使用されたＦｏｌｅｙバルーンカテーテル系を置き換えるために、外科的に移植された、２つの独立した留置尿路ポートおよびカテーテル系を各々移植された。８−９Ｆｒ．バルーンカテーテルは、移植手順の間に、パース−スティング技術を使用して、膀胱頸部において尿道中に移植された。一旦、カテーテルのバルーン末端が尿道に固定されると、カテーテルは動物の横腹に対してトンネルとなり、ここで、ポートが結合され、皮下ポケットの中に移植される。次いで、このシステムは、約３ｍＬの生理食塩水でバルーンを膨潤させること、および尿道が遮断されることを目視的に確認することによって試験され、機能性が保証された。カテーテルの挿入点は、尿管吻合の側面上の構築物の先端における背側側面にあった。一旦構築物に固定されると、カテーテルは、動物の横腹を通してトンネルとなり、ここで、ポートは結合され、バルーンカテーテルポートとは離れている皮下ポケットに移植された。
【０５６２】
循環：動物１、２、および４〜９における留置Ｆｏｌｅｙバルーンカテーテルが、動物自身の尿を用いて新器官を満たすことおよび空にすることを制御するために使用された。循環期間の最初に、カテーテルの遠位端は、尿がカテーテルから漏出することを妨害するように遮断され、カテーテルバルーンは、尿が新器官から排出することを遮断するために、尿道開口において膨潤された。次いで、新器官は、１日におよそ４時間の間、２回、自然に尿で満たされることが許容された。各４時間の循環セッションの最後に、尿は、Ｆｏｌｅｙカテーテルを使用して新器官から吸い上げられ、収集された尿の量が記録された。動物番号１０および１１は、移植されたポートおよびカテーテル系を使用して循環された。皮下ポートを経由して、移植されたバルーンは生理食塩水で満たされて、およそ４時間の間の尿の流れを妨げた。次いで、新器官は、尿ポートおよびカテーテル系を通して空にされた。実施された循環は、動物が循環プロセスに耐える能力、または随意調節の達成に基づいて、動物から動物で変化した（表４）。
【０５６３】
コンプライアンスのモニタリング−尿力学
漏出点圧力（ＬＰＰ）試験は、動物が鎮静されている間、スケジュールされた時点で実施された。留置ポートおよびカテーテルを有さない動物番号１、２、および４〜９については、領域が清浄化され、Ｆｏｌｅｙバルーンカテーテルが挿入され、約３ｍＬの生理食塩水で膨潤されて、尿道開口を遮断した。次いで、残りの尿は、Ｆｏｌｅｙカテーテルおよびシリンジを使用して、新器官から除去された。滅菌生理食塩水溶液を含有する較正された注入ポンプに接続された、生理学的圧力トランスデューサー（ＭＥＭＳｃＡＰ（登録商標）ＳＰ８４４）モニタリング装置が、Ｆｏｌｅｙカテーテルの管腔に結合された。生理食塩水溶液がカテーテルの周囲で漏出し始めるまで（漏出点としても知られる）、生理食塩水溶液は、２０ｍＬ／分の速度で新器官に注入され、圧力が連続的にモニターされ、そして電子的に記録された。一旦漏出が確認されたら、注入は停止され、体積（ＬＰＰ能力）および圧力（漏出点膀胱内圧力）が記録された。新器官中の生理食塩水量の確認は、容器に新器官内容物を吸引すること、および収集した量を記録することによって測定された。留置ポートおよびカテーテルを有する動物番号１０〜１１は、ヨードおよびアルコールで磨き洗浄され、次いで、ポート部位においてポビドンでスプレーされた。留置Ｆｏｌｅｙバルーンカテーテルは、およそ３ｍＬの生理食塩水溶液で膨張されて、尿道開口を遮断した。残りの尿は、留置尿路カテーテルおよびシリンジを使用して、新器官から除去された。滅菌生理食塩水溶液を含有する較正された注入ポンプに接続された生理学的圧力トランスデューサー（ＭＥＭＳｃＡＰ（登録商標）ＳＰ８４４）モニタリング装置が留置尿路カテーテルの管腔に結合され、漏出点体積および圧力が測定され、体積は、動物番号１、２、および４〜９について記載されたのと同様に新器官内容物の吸引によって確認された。
【０５６４】
画像化−サイトグラム：蛍光顕微鏡画像は、動物が鎮静されている間に、スケジュールされた時点で実施された。留置ポートおよびカテーテルを有さない動物番号１、２、および４〜９については、領域が清浄化され、Ｆｏｌｅｙバルーンカテーテルが挿入され、約３ｍＬの生理食塩水で膨潤されて、尿道開口を遮断した。次いで、残りの尿は、Ｆｏｌｅｙカテーテルおよびシリンジを使用して、新器官から除去された。留置ポートおよびカテーテルを有する動物番号１０〜１１は、ヨードおよびアルコールで磨き洗浄され、次いで、ポート部位においてポビドンでスプレーされた。留置Ｆｏｌｅｙバルーンカテーテルは、およそ３ｍＬの生理食塩水溶液で膨張されて、尿道開口を遮断した。残りの尿は、留置尿路カテーテルおよびシリンジを使用して、新器官から除去された。３：１生理食塩水／コントラスト溶液は、カテーテルを介して新器官に注射された。一旦、新器官がＬＰＰに基づいて収容能力まで満たされると、前側／後側（ＡＰ）および側方蛍光顕微鏡画像が、新器官の特徴および状態を評価するために作成された。滴下量が記録された（ＣＹＧ能力）。すべての画像は電子的に保管された。次いで、生理食塩水／コントラスト溶液は、留置カテーテルおよびシリンジを使用して新器官から吸引された。
【０５６５】
超音波：新器官および腎臓の超音波画像は、動物が鎮静されている間に、スケジュールされた時点で実施された。空のおよび充満した新器官の壁厚が測定および記録された。左および右の腎臓の長さおよび幅が測定および記録された。
【０５６６】
構築物は、雑種犬に首尾よく移植された。１１匹のイヌのうちの７匹が、スケジュールされまたは選択的屠殺まで生存し、１１匹のうちの６匹が移植後１７０〜１８７日の間生存した。最初の構築物が調べられた４３日目までに、構築物治癒は定常状態を達成し、得られる新器官は、尿路上皮、粘膜下層、筋肉、および漿膜／網の層から構成された。
【０５６７】
すべての新器官は、優秀な上皮化、平滑筋形成、および神経支配に対して適正であった。このことは、剖検の時点で、臨床的結果または収容能力ベースの分類（新膀胱または新膀胱導管）とは独立していた。構築物からの平滑筋細胞は、これが正常膀胱中に存在する典型的な位置において、筋肉層（筋層）となるように再構築された。筋層は、（イヌにおいて典型的であるように）３つの別々の層として、および（ヒトにおいて典型的であるように）束となった筋原線維の１つまたは２つの層として観察された。すべての提示は機能的であると推測された。
【０５６８】
自系と同種異系の両方の構築物処方を用いる、全体のイヌ膀胱の首尾よい置き換えが実証された。両方の動物が自系構築物を移植され、スケジュールされた２４週の研究期間までまたはそれを超えて生存した。同種異系構築物が移植された３匹の動物もまた、研究期間までまたはそれを超えて生存した。４匹の同種異系構築物レシピエントは、それらのスケジュールされた剖検まで生存しなかったが、４匹すべてが関連する生成物ではないようである。動物体重の付加的な増加、新器官体積収容能力、および研究の期間の全体を通した動物の大部分の尿力学コンプライアンスが挙げられる新器官モニタリングパラメーターのいくつかについて、陽性傾向が観察された。加えて、新器官壁厚は、わずかにより薄いがイヌ膀胱の一般的厚みと比較し得ることが見い出された。循環されなかったが、その自然の膀胱の能力を回復し、研究を完了することが可能であった（２４週生存期間以上）動物１を例外として、循環は、すべての動物について実施された。動物番号５、６、１０、および１１は、３２〜６４時間の範囲の最小限の時間数で循環された。これらの動物の中で、動物の安楽死を必要とする臨床的な合併症の前に、６および１１は最も短い期間生存した。
【０５６９】
１０匹の動物のうちの６匹が、２４週以上の期間生存し、５／６が平均１４６時間循環された。手術後新器官の循環の品質および量は、新器官再生の結果に影響を与え（例えば、新膀胱または新膀胱導管）、生存可能性の増加は、この動物のグループで注目された。細胞密度は、４．０Ｅ＋０６〜１０６Ｅ＋０６ＳＭＣの範囲にわたって変動した。機能性目的のために、全体の膀胱再生は、剖検において、剖検が移植後１２０日以下で行われた場合には自然の膀胱および／または構築物の体積の５０％以上、ならびに剖検が移植後１２０日超で行われた場合には自然の膀胱および／または構築物の体積の６５％以上であった結果として定義された。１０匹の動物のうち、８匹が新膀胱の結果を達成したのに対して、２匹が新膀胱導管の結果を達成した。
【０５７０】
組織再生および置き換えのための自系または同種異系構築物を移植することの機能的結果が実証された。１０匹の動物は首尾よく移植され、４３〜１８８日生存した。本研究は、新膀胱置き換え産物が、全体の膀胱切除および尿管再移植のイヌ動物モデルにおいて試験され得ることを確立した。手術後新器官循環の品質および量は、新器官再生（例えば、新膀胱または新膀胱導管）の結果に影響を与えた。機能性目的のために、剖検が移植後１２０日以下で行われた場合には自然の膀胱および／または構築物の体積の５０％以上の容積、ならびに剖検が移植後１２０日超で行われた場合には自然の膀胱および／または構築物の体積の６５％以上の容積の達成に起因して、膀胱再生が観察された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−Ｅ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【国際調査報告】
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