(57)【要約】本発明は、インビトロ培養し、低継代および大規模に継代した自己複製コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）を用いた、多種多様な疾患および傷害の予防、多種多様な疾患および傷害の治療、ならびに組織および臓器の修復、組織および臓器の再生のための方法ならびに細胞の使用に関する。例えば、成人骨髄由来体細胞（ＡＢＭ−ＳＣ）、またはかかる細胞によって生成される組成物は、単独で、または他の成分と組み合わせて、例えば、心血管、神経、外皮、皮膚、歯周、ならびに免疫介在性の疾患、障害、病状、および傷害を治療するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄由来の自己複製コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団または前記細胞由来の馴化細胞培養物を含む生体適合性もしくは生分解性のマトリックスであって、前記ＣＦ−ＳＣが多能性分化能をもたず、前記ＣＦ−ＳＣが正常核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣが、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス−１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、前記ＣＦ−ＳＣが、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない、マトリックス。
【請求項２】
請求項１に記載のマトリックスを含む組織またはネオ組織。
【請求項３】
さらに、薬学的に許容される化合物を含む、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項４】
前記化合物が、脂質、タンパク質、核酸、抗炎症薬、抗生物質、ビタミン、およびミネラルからなる群から選択される、請求項３に記載のマトリックス。
【請求項５】
天然のまたは組換え型のヒト血漿タンパク質、ウシ血漿タンパク質、および／またはブタ血漿タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項６】
前記タンパク質がトロンビンまたはフィブリノゲンである、請求項５に記載のマトリックス。
【請求項７】
前記マトリックスが、コラーゲンまたはポリグリコール酸を含む、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項８】
前記マトリックスが、４ｍｇ／ｍｌ〜６ｍｇ／ｍｌの濃度でコラーゲンを含む、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項９】
病状の治療を必要としている患者において病状を治療する方法であって、請求項１に記載のマトリックスと前記患者とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１０】
前記病状が皮膚科的（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記創傷が、糖尿病患者の足の創傷、静脈性の足の潰瘍の創傷、または手術後の創傷である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記病状が整形外科的（ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＦ−ＳＣが非ヒト供給源に由来する、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項１４】
前記非ヒト供給源が、ウマ供給源、ブタ供給源、イヌ供給源、ネコ供給源、ウシ供給源、ヒツジ供給源、ヤギ供給源、ラクダ供給源、マウス供給源からなる群から選択される、請求項１３に記載のマトリックス。
【請求項１５】
前記患者が非ヒト動物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
医薬組成物を調製する方法であって、前記方法は：
（ａ）可溶性コラーゲンを含む溶液を調製する工程；
（ｂ）骨髄由来の自己複製コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団を懸濁する工程であって、ここで、前記ＣＦ−ＳＣは多能性分化能をもたず、前記ＣＦ−ＳＣは正常核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣは不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣは、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス−１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、前記ＣＦ−ＳＣは、（ａ）の溶液中で、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない、工程；ならびに
（ｃ）（ｂ）の細胞懸濁液を組織の型に移す工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のマトリックスを含む粉末。
【請求項１８】
前記マトリックスが、コラーゲンまたはポリグリコール酸を含む、請求項１７に記載の粉末。
【請求項１９】
病状の治療を必要としている患者において病状を治療する方法であって、請求項１７に記載の粉末と前記患者とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２０】
前記病状が、開放創、皮膚の変形、声帯瘢痕、第３度熱傷および歯周傷害からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、様々な疾患および障害の治療のための、インビトロ培養した自己複製コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）、およびかかる細胞によって生成される組成物の生成ならびに使用に関する。かかるＣＦ−ＳＣの一例として、ヒト成人骨髄由来体細胞（ｈＡＢＭ−ＳＣ）が挙げられる。
【０００２】
本発明は、インビトロで培養し、増殖させた自己複製コロニー形成細胞によって生成される様々な可溶性組成物もしくは分泌組成物の生成を調節する（すなわち、上方制御するかまたは下方制御する）ための、培養中のＣＦ−ＳＣ細胞集団の操作にも関する。
【０００３】
本発明の分野は、細胞ベースの療法および組織工学的療法、特に、（薬学的に許容される溶液、または一時的、永久的もしくは生分解性のマトリックスなどの）薬学的に許容される担体への組み込み、もしくはそれらとの混合を介した投与を含む、ＣＦ−ＳＣ、もしくはかかる細胞によって生成される組成物の使用法ならびに／または投与法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
細胞ベースの療法
一般に、全体的な目的が、損傷組織の機能的および／または美容的な回復である、慢性および急性の組織損傷を管理し、治療するための細胞ベースの療法を用いる際に、２つの主要な選択肢がある。これらの細胞ベースの療法の選択肢には、以下のものが含まれる：１）細胞置換−長期移植を確立することによって損傷組織を置換するための細胞の使用；および２）栄養因子の供給−長期移植を行うことなく、細胞によって送達されるかまたは生成される因子の放出を介した内在性修復機構を刺激するための、細胞および細胞によって生成される組成物（例えば、増殖因子）の使用。
【０００５】
組織損傷の管理および治療における細胞ベースの療法選択肢は、自己細胞または同種細胞の使用の可能性も提示する。これらの各々は、特定の利点および欠点を有する。自己細胞の使用には、以下の因子またはパラメータが含まれる：
患者がドナーであること；
患者一人一人に基づく細胞生成物の製造を必要とすること；
細胞生成物の同一性、純度および効力の可変性；ならびに
治療をするという臨床判断と移植用細胞の有効性との間のタイムラグ。
【０００６】
対照的に、同種細胞の使用には、以下の因子またはパラメータが含まれる：
ドナーが第２者である（すなわち、ドナーは患者ではない）こと；
ドナーの差異に付随するリスク；
細胞生成物の製造バッチにつき複数の患者を治療できること；
細胞生成物の同一性、純度および効力の一貫性の向上；ならびに
治療をするという臨床判断と細胞生成物の有効性との間のタイムラグの低減。
【０００７】
臓器および組織の修復
哺乳類の体の特定の組織の再生能は、何世紀もの間知られており、例えば、皮膚および骨のような組織は、損傷後にそれら自体を修復することが知られている。しかし、中枢神経系（すなわち、脳および脊髄）、末梢神経系および心臓の多数の病状（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）および疾患は、影響を受けた組織における再生能の欠陥のために、ヒトに有害な影響を及ぼす。これらの病状および疾患には、例えば、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、脳卒中、ハンチントン病、外傷性脳損傷、脳腫瘍、ファブリー病、（例えば、うっ血性心不全および心筋梗塞などの）心臓病が含まれる。臨床管理戦略は、例えば、損傷組織（例えば、ニューロン、グリア細胞、心筋）の置換または修復よりも、高頻度で、さらなる障害または損傷の予防に集中し、外来性のステロイドおよび合成の非細胞性医薬を用いた治療を含み、ステロイドまたは合成薬物の連続投与によって決まり得る様々な成功度を有する。
【０００８】
例えば、脊髄損傷の大部分は圧迫損傷であり、残りの症例は脊髄の完全切断を含む。脊髄損傷のための現在の治療処置には、外科的および非外科的な手順を介して脊椎を物理的に安定化させること、かつステロイド療法に伴う炎症反応を抑制することによってさらなる脊髄損傷を予防することが含まれる。
【０００９】
さらに、加齢は、哺乳類に影響を及ぼすほとんど全ての一般的な疾患に対する主要な負の要素であり、皮膚、骨、眼、脳、肝臓、腎臓、心臓、脈管構造、筋肉などの組織を含む多くの組織の変性における加齢の主要な特徴の一つである。さらに、特定の体組織の既に限られている再生能は、人生の過程でほとんど全ての組織が衰退するなかで、年齢、組織の維持および修復機構と共に衰退することが知られている。
【００１０】
したがって、疾患および病状、特に、ヒトにおける神経学的疾患および心疾患ならびに加齢変性状態のための、新しい、改良されかつ有効な治療法を開発する必要がある。
【００１１】
赤血球生成
健常なヒトまたは他の哺乳類の造血細胞は、通常、限られた長期的な自己複製能力をもたない。しかし、ドナーの血液の限られた供給と相まって、血液の壊滅的な損失（またはそうでなければ、血液の追加供給の必要性）の可能性があるため、インビトロで赤血球供給を高めるか、維持するか、またはもたらす方法が非常に望ましい。
【００１２】
血液は、血漿として知られる液体媒体中に懸濁された、いくつかの細胞型からなる高度に特殊化した循環組織である。細胞成分は以下のとおりである：呼吸ガスを運び、ヘモグロビン（肺で酸素と結合し、酸素を体内の組織に輸送する鉄含有タンパク質）を含むので赤色を呈する赤血球（ｒｅｄｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））、疾患と闘う白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））、血液凝固で重要な役割を果たす細胞フラグメントの血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）（血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ））。血液に関連する医学用語は、「血液」を意味するギリシャ語の「ｈａｉｍａ」に由来するｈｅｍｏ−またはｈｅｍａｔｏ−（ＢＥ：ｈａｅｍｏ−およびｈａｅｍａｔｏ−）で始まる場合が多い。血液細胞は、骨髄において、造血と呼ばれる過程で生成される。血液細胞は、脾臓および肝臓によって分解される。正常な赤血球は、１２０日の血漿半減期を有し、その後、造血の過程によって作り出された新しい赤血球によって体系的に置換される。輸血は、血液の最も一般的な治療的使用である。これは、通常、ヒトのドナーから得られる。異なる血液型があるので、誤った血液の輸血は、重篤な合併症を引き起こす可能性があり、正しい型が輸血されることを確かめるために、交差適合試験が行われる。
【００１３】
輸血のための血液ドナーの不足および赤血球の不十分な供給は、患者の治療における、世界共通の問題である。したがって、赤血球供給のグローバルな不足の少なくとも一部を軽減するための手段を提供するような、赤血球の有効性を向上させる新しい、改良されかつ効果的な方法が必要である。
【００１４】
皮膚
表皮置換製品、真皮置換製品、人工皮膚製品、および創傷包帯などの皮膚創傷のための多数の異なる治療が現在利用できる。これらのいくつかの例を以下に簡単に記載する。
【００１５】
表皮置換製品
製造業者によると、ＥＰＩＣＥＬ（商標）（ＧｅｎｚｙｍｅＣｏｒｐ.、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）は、熱傷の治療のために、患者自身の皮膚の生検から増殖させた皮膚の自己表皮細胞で構成されている。細胞を、マウス支持細胞株と共に共培養し、自己表皮のシートにする。
【００１６】
製造業者によると、ＭＹＳＫＩＮ（商標）（ＣｅｌｌＴｒａｎＬＴＤ、シェフィールド、ＳＩ ４ＤＰ  イギリス）は、熱傷、潰瘍および他の非治癒創傷の治療のための、培養した自己表皮代用品である。ＭＹＳＫＩＮ（商標）は、個々の患者の組織から増殖させた生存細胞を含んでいる。ＭＹＳＫＩＮ（商標）は、傷口への細胞の移動を促進させる高度な重合体様コーティング上にケラチノサイト（表皮細胞）の層を含み、そこでケラチノサイトは治癒を開始することができる。ＭＹＳＫＩＮ（商標）は、細胞送達、創傷被覆を支持し、滲出液の管理を可能にするための医療グレードのシリコーン基材層を用いる。
【００１７】
製造業者によると、ＥＰＩＤＥＸ（商標）（ＭｏｄｅｘＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ、ローザンヌ、スイス）は、非外科的方法で患者から直接採取した毛髪由来の幹細胞および前駆細胞から直接増殖させた自己表皮皮膚同等物である。
【００１８】
製造業者によると、ＣＥＬＬＳＰＲＡＹ（商標）（ＣｌｉｎｉｃａｌＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ、ケンブリッジＣＢ２ １ＮＬ、イギリス）は、迅速に表皮カバーを提供し、治癒を促進し、傷跡の質を最適化するために、損傷皮膚上に噴霧される培養上皮自家移植懸濁液である。
【００１９】
真皮置換製品
製造業者によると、ＩＮＴＥＧＲＡ（商標）真皮再生テンプレート（ＩｎｔｅｇｒａＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、プレインズボロ、ニュージャージー州）は、皮膚置換用の二分子膜システムである。この真皮置換層は、制御された空隙率および定められた分解速度で製造される、架橋結合したウシ腱コラーゲン線維およびグリコサミノグリカン（コンドロイチン−６−硫酸）の多孔性マトリックスで作られている。一時的な表皮置換層は、合成ポリシロキサン重合体（シリコーン）で作られており、創傷からの水分損失を制御するように機能する。コラーゲン真皮置換層は、線維芽細胞、マクロファージ、リンパ球の浸潤、および創傷床由来の毛細管のためのマトリックスとして機能する。
【００２０】
製造業者によると、ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴ（商標）（ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏｈｅａｌｉｎｇ Ｉｎｃ.,ラホーヤ、カリフォルニア州）は、生分解性メッシュの足場上で増殖させた同種新生児線維芽細胞であり、全層糖尿病性潰瘍の治療に適応される。
【００２１】
製造業者によると、ＰＥＲＭＡＣＯＬ（商標）（ＴｉｓｓｕｅＳｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ,Ｉｎｃ.、アンドーバー、マサチューセッツ州０１８１０）Ｐｅｒｍａｃｏｌ（商標）外科手術用インプラントは、人体に移植した時に、非アレルギー性で、長持ちするブタ真皮由来のコラーゲンである。
【００２２】
製造業者によると、ＴＲＡＮＳＣＹＴＥ（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢｉｏｈｅａｌｉｎｇＩｎｃ.,ラホーヤ、カリフォルニア州９２０３７）ＴＲＡＮＳＣＹＴＥ（商標）は、ヒト包皮由来の線維芽細胞の一時的な皮膚代用品（同種）である。この製品は、高分子膜、および無菌条件下、ナイロンメッシュ上でインビトロ培養した新生児ヒト線維芽細胞からなる。細胞増殖の前に、このナイロンメッシュを、ブタ真皮コラーゲンでコーティングし、高分子膜（シリコーン）に結合させる。この製品を熱傷に適用した時に、この膜は透明な合成表皮をもたらす。ヒト線維芽細胞由来の一時的な皮膚代用品は、一時的な防護障壁を提供する。ＴＲＡＮＳＣＹＴＥ（商標）は透明であり、創傷床の目視による直接的な監視を可能にする。
【００２３】
製造業者によると、ＲＥＮＧＲＡＮＥＸ（商標）ゲル（Ｏｒｔｈｏ−ＭｃＮｅｉｌＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ,Ｉｎｃ.（Ｃ）ＥＴＨＩＣＯＮ,ＩＮＣ.）は、ゲル中の組換えＰＤＧＦで作られた局所用創傷ケア製品である。
【００２４】
人工皮膚製品（表皮および真皮の組み合わせ製品）
製造業者によると、ＰＥＲＭＡＤＥＲＭ（商標）（ＣａｍｂｒｅｘＢｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ,Ｉｎｃ.,ウォーカーズビル、メリーランド州）ＰＥＲＭＡＤＥＲＭ（商標）は、皮膚の自己表皮層および自己真皮層から構成され、重度の熱傷の治療に適用される。この製品は、柔軟性があり、患者とともに成長することが報告されている。
【００２５】
製造業者によると、ＯＲＣＥＬ（商標）（ＯｒｔｅｃＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ニューヨーク、ニューヨーク州）は、ウシコラーゲンで培養した同種の表皮細胞および線維芽細胞から作られた二分子膜構築物であり、中間層熱傷（ｓｐｌｉｔ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｂｕｒｎ）の治療に適用される。この製造業者は、この製品で治療した２人のヒト患者において、２週間または３週間のそれぞれ時点で、検出可能な製品由来のＤＮＡの証拠は無いと報告している。
【００２６】
製造業者によると、ＡＰＬＩＧＲＡＦ（商標）（Ｓｍｉｔｈ＆Ｎｅｐｈｅｗ社、ロンドン、ＷＣ２Ｎ６ＬＡ、イギリス）は、ウシコラーゲンで培養した同種の表皮細胞および線維芽細胞であり、静脈性下肢潰瘍の治療に適用される。
【００２７】
創傷包帯
製造業者によると、３Ｍ（商標）ＴＥＧＡＤＥＲＭ（商標）透明フィルム包帯（３Ｍ社、セントポール、ミネソタ州）は、外部の汚染物質に対して細菌障壁およびウイルス障壁を提供する通気性フィルムである。
【００２８】
製造業者によると、ＴＩＳＳＥＥＬ（商標）ＶＨフィブリンシーラント（Ｂａｘｔｅｒ社、ディアフィールド、イリノイ州）は、止血の補助として使用するために適用される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、安定な細胞集団およびそれによって生成される組成物の生成および使用に関する。本発明は、主に、同種細胞の使用を含む治療に関する。しかし、自己細胞を用いて、これらの同じ治療を行うことも同様に可能であろう。本発明は、部分的に、皮膚創傷および免疫障害ならびに皮膚に関わる疾患などの皮膚科の病状の治療にも関する。
【００３０】
本明細書で使用する「安定な細胞集団」という用語は、（マウス、ラット、ヒト、イヌ、ウシなどの）生存している哺乳類生物に導入した時に、（軟骨細胞、脂肪細胞、骨細胞などの）特殊化した１つまたは複数の細胞型に分化した細胞の検出可能な生成をもたらさない、単離され、インビトロ培養された細胞集団を意味し、この細胞集団の細胞は、（膜結合型もしくは可溶性のＴＮＦ−α受容体、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト、ＩＬ−１８アンタゴニスト、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃなどに示される組成物などの）検出可能なレベルの少なくとも１つの治療上有用な組成物を発現するか、または発現する能力もしくは発現するように誘導される能力を維持する。
【００３１】
本発明の安定な細胞集団の別の特徴は、これらの細胞が異所性分化を示さないということである。「異所性」という用語は、「間違った場所」または「場違い」という意味である。「異所性」という用語は、ギリシャ語の「置換」を意味する「ｅｋｔｏｐｉｓ」に由来する（「ｅｋ」は外（ｏｕｔｏｆ）＋「ｔｏｐｏｓ」は場所（ｐｌａｃｅ）＝場違い（ｏｕｔ ｏｆ ｐｌａｃｅ））。例えば、異所性腎臓は、通常の場所にないものであり、または、子宮外妊娠は、「異所性妊娠」である。この文脈において、異所性分化の例は、心臓組織に導入された時に、骨組織に似た石灰化および／または骨化をもたらす細胞であろう。この現象は、例えば、間葉系幹細胞が心臓組織に注入された時に生じることが証明されている。Ｂｒｅｉｔｂａｃｈｅｔ ａｌ.,“Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｒｉｓｋｓ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ＩｎｔｏＩｎｆａｒｃｔｅｄ Ｈｅａｒｔｓ,”Ｂｌｏｏｄ,Ｖｏｌ.１１０,Ｎｏ.４（Ａｕｇ.２００７）を参照されたい。
【００３２】
本発明は、様々な疾患および障害の治療のために、インビトロ培養し、増殖させた自己複製コロニー形成体細胞（以下、「ＣＦ−ＳＣ」と称す）、ならびにかかる細胞によって産生される生成物の生成および使用に関する。さらに、本発明は、様々な疾患および障害の治療のために、インビトロ培養し、大規模に増殖させた自己複製コロニー形成体細胞（以下、「ｅｘＣＦ−ＳＣ」と称す）、ならびにかかる細胞によって産生される生成物の生成および使用にも関する。ｅｘＣＦ−ＳＣは、インビトロ培養中に、少なくとも約３０回、少なくとも約４０回、または少なくとも約５０回の細胞集団倍加を経た自己複製コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）である。したがって、インビトロで増殖させた自己複製コロニー形成体細胞は、以下、「ＣＦ−ＳＣ」と称す（その結果、特に明記しない限り、この用語は、インビトロで約３０回未満の集団倍加（例えば、約５回未満、約１０回未満、約１５回未満、約２０回未満、約２５回未満の集団倍加））を経た細胞集団および約３０回を超える、約４０回を超える、または約５０回を超える集団倍加を経た細胞集団の両方を包含する。）ＣＦ−ＳＣの一特定例は、ヒト成人骨髄由来体細胞（以下、「ＡＢＭ−ＳＣ」と称す）である。さらに、ｅｘＣＦ−ＳＣの一特定例は、インビトロ培養中に、少なくとも約３０回、少なくとも約４０回、または少なくとも約５０回の細胞集団倍加を経たヒト成人骨髄由来体細胞（以下、「ｅｘＡＢＭ−ＳＣ」と称す）である。したがって、「ＡＢＭ−ＳＣ」という用語は、特に明記しない限り、インビトロで約３０回未満の集団倍加（例えば、約５回未満、約１０回未満、約１５回未満、約２０回未満、約２５回未満の集団倍加））を経たＡＢＭ−ＳＣ細胞集団および約３０回を超える、約４０回を超える、または約５０回を超える集団倍加を経たＡＢＭ−ＳＣ細胞集団の両方を包含する。
【００３３】
本明細書で使用する「大規模増殖」という用語は、少なくとも約３０回以上の細胞集団倍加を経た細胞集団を指し、これらの細胞は、老化せず、不死化せず、かつ起源の細胞種で見出される正常核型を維持し続ける。
【００３４】
本明細書で使用する「実質的な自己複製能」という用語は、複数世代の細胞子孫の生成をもたらす多数のサイクルの細胞分裂を経る能力を有することを意味する（したがって、各細胞分裂で、１つの細胞が２つの「娘細胞」を生み出し、その際、少なくとも１つの娘細胞はさらに細胞分裂できる）。「実質的な自己複製能」の１つの尺度は、少なくとも約１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回またはそれより多くの細胞倍加を受ける細胞集団の能力によって示される。「実質的な自己複製能」の別の尺度は、（同じかまたは同様の培養条件が維持される時に）細胞培養継代後の組織培養容器中で、再増殖するか、またはコンフルエンスに近づく細胞集団の能力の維持によって示される。したがって、「実質的な自己複製能」の例は、（細胞集団が約１０回を超える集団倍加を受ける前などの）初期の細胞培養倍加中に、このような再増殖のために必要とされる時間の少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の期間で、細胞集団が組織培養容器内で再増殖し続ける時に示される。「実質的な自己複製能」の別の尺度は、集団倍加時間の一貫した速度、または集団倍加の一貫したかつ比較的速い速度の維持である。
【００３５】
本明細書で使用する「多能性分化能が実質的にない」という用語は、インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞の複数の異なる型に分化することができない細胞集団を意味する。実質的な多能性分化能を有する細胞の例として造血幹細胞が挙げられ、これは、インビトロまたはインビボのいずれかで、赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血小板などに分化することができる。実質的な多能性分化能を有する細胞の別の例として間葉系幹細胞が挙げられ、これは、例えば、骨細胞（骨）、脂肪細胞（脂肪）、または軟骨細胞（軟骨）に分化することができる。逆に、「多能性分化能が実質的にない」細胞集団の細胞は、インビトロまたは生物もしくは標的組織（複数可）にインビボ導入された時に、複数の細胞型に分化することができない。本発明の好ましい実施形態において、「多能性分化能が実質的にない」細胞集団は、この細胞集団中の細胞の少なくとも約８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％が、インビトロまたはインビボで検出可能な程度に、２種類以上の細胞型に分化するように誘導され得ない細胞集団である。「単能性」細胞または「単能性前駆細胞」は、多能性分化能が実質的にない細胞の一例である。
【００３６】
本明細書で使用する「幹細胞」とは、以下の２つの性質を保有する１つまたは複数の細胞を意味する：１）未分化状態を維持しながら、多数の細胞分裂周期を経る能力である自己複製能；および２）１種類または複数の種類の成熟細胞型に変化し、そのような変化の際には、もはや細胞分裂周期を経ない能力（例えば、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞などに変化する能力）である分化能。本明細書で使用する分化能は、これらの細胞が、全能性、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、多分化能、または単能性の前駆細胞のいずれかであることを意味する。「間葉系幹細胞」は、この同じ定義の幹細胞であるが、前記細胞は、（例えば、骨髄、脂肪または軟骨などの）間葉組織に由来するかまたはそれから得られた。Ｈｏｒｗｉｔｚｅｔ ａｌ.,“Ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ＭＳＣ：Ｔｈｅ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ”,Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ,ｖｏｌ.７,ｎｏ.５,ｐｐ.３９３−３９５（２００５）およびその中に引用されている参考文献を参照されたい。
【００３７】
本明細書で使用する「全能性」とは、細胞が由来する生物において任意の発生段階中に見出され得るような、任意の細胞型になることができる細胞を意味する。全能性細胞は、一般的に、受精卵（すなわち、卵細胞および精細胞の融合後）の最初の数回の分割によって生成される。したがって、全能性細胞は、胚の細胞型および胚外の細胞型に分化することができる。
【００３８】
本明細書で使用する「多能性」とは、細胞が由来する生物において見られる３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）のいずれかに由来する細胞に分化することができる細胞を意味する。
【００３９】
本明細書で使用する「多分化能」とは、複数の型（すなわち、２種類以上の型）の分化細胞を生成することができる細胞を意味する。間葉系幹細胞は、多分化能細胞の一例である。
【００４０】
本明細書で使用する「単能性」とは、１つの細胞型のみを生産することができる細胞を意味する。単能性細胞は自己複製の性質を有するが、１種類のみの成熟細胞型に変化することができる。
【００４１】
本明細書で使用する「正常核型」とは、一般的に細胞が由来する種で見出され、正常とみなされる数および構造の染色体を含む遺伝子組成物を有することを意味する。
【００４２】
本明細書で使用する「結合組織」は、従来の分類で通常参照される４種類の組織のうちの１つである（他は、上皮組織、筋肉組織、および神経組織である）。結合組織は、生物および臓器構造ならびに支持体に含まれ、通常、中胚葉に由来する。本明細書で使用する「結合組織」には、「固有結合組織」、「特殊化した結合組織」、および「胚性結合組織」とも呼ばれることがある組織が含まれる。
【００４３】
「固有結合組織」は、輪の（または緩い）結合組織を含み、所定の位置に臓器および上皮を保持し、コラーゲンおよびエラスチンを含む様々なタンパク質性線維を有する。固有結合組織には、靭帯および腱を形成する緻密な結合組織（または線維性結合組織）も含まれる。
【００４４】
「特殊化した結合組織」には、血液、骨、軟骨、脂肪および細網結合組織が含まれる。細網結合組織は、リンパ器官（リンパ節、骨髄、および脾臓）を支持する軟骨格を形成する細網線維（微細コラーゲン、ＩＩＩ型）のネットワークである。
【００４５】
「胚性結合組織」には、間葉系結合組織および膠様結合組織が含まれる。（胚性結合組織とも知られる）間葉は、主に胚の中胚葉（三層構造の胚盤の中間層）から発達する組織の塊である。一貫性のある粘性の間葉は、コラーゲン束および線維芽細胞を含む。間葉は、後に、血管、血液に関連する臓器、および結合組織に分化する。膠様結合組織（または粘液組織）は、胎児の発育中に見られる結合組織の一種であり、これは、ウォートンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓｊｅｌｌｙ）（臍帯中で細胞を保護し、隔離する役目を果たす臍帯内のゼラチン状物質）の成分として最も容易に見出される。
【００４６】
本明細書で使用する「不死化」とは、インビトロで不定数の細胞倍加を受けることができる細胞または細胞株を指す。不死化細胞は、絶えず分裂する細胞の能力の自然の制限を排除するか、または回避する遺伝子変化を介して、かかる能力を獲得する。対照的に、「非不死化」細胞は、生物から直接採取し、（「初代細胞培養物」を生じさせるために）インビトロ培養した時に、老化して（分裂する能力を失い）、死ぬ前に、限られた数の細胞倍加を受けることができる真核細胞である。例えば、哺乳類のほとんどの種類の非不死化細胞の初代培養物は、一般に、分化、老化、または死滅する前に、（初代細胞型に応じて）比較的明確であるが再現性よく限られた範囲の細胞倍加を受けることができる。
【００４７】
本明細書で使用する「長期移植」とは、ドナー細胞が投与時から約４週間を超えた後に、それに向けて（もしくはその中に）送達される標的組織内に（またはその一部として）存在するドナー細胞の検出可能な存在を意味する。「約４週間を超える」には、約５週間、６週間、７週間、８週間、１０週間、１２週間、１４週間、１６週間、１８週間、２０週間および２４週間を超える期間が含まれる。「約４週間を超える」には、約６カ月、８カ月、１０カ月、１２カ月、１８カ月、２４カ月、３０カ月、３６カ月、４２カ月および４８カ月を超える期間も含まれる。
【００４８】
本発明は、インビトロで培養し、増殖させた自己複製コロニー形成細胞によって生成される様々な可溶性組成物もしくは分泌組成物の生成を調節する（すなわち、上方制御するかまたは下方制御する）ための、培養中のＣＦ−ＳＣ細胞集団およびｅｘＣＦ−ＳＣ細胞集団の操作にも関する。
【００４９】
本発明は、骨細胞（ｂｏｎｅ ｃｅｌｌ）（骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅｓ））に分化する能力の喪失によって特徴付けられる大規模に増殖させた細胞集団にも関する。例えば、本発明は、補助的骨モルフォゲンであるノギンの存在下での培養の有無に関わらず、骨誘導条件下で培養した時に、カルシウム沈着を生じさせる能力の喪失によって特徴付けられる、大規模に増殖させた細胞集団に関する（実施例１６参照）。（マウスおよびヒトのノギン：例えば、米国国立バイオテクノロジーセンターＰｕｂＭｅｄタンパク質データベース受託番号ＮＰ＿０３２７３７およびＮＰ＿００５４４１（それぞれ）参照。例えば、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ,ｅｔ ａｌ.,“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｎｏｇｇｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅａｄｕｌｔ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ”,Ｊ.Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.１５（９）,６０７７−６０８４（１９９５）も参照されたい）。
【００５０】
本発明は、（上記に記載のとおり）骨細胞に分化する能力の喪失および／またはカルシウム沈着を生じさせる能力の喪失によって特徴付けられる、大規模に増殖させた細胞集団にも関するが、前記細胞集団は、少なくとも１つの治療上有用な組成物を分泌し続けるか、または分泌する能力を維持するか、分泌するように誘発される能力を維持する。
【００５１】
本発明は、細胞ベースの療法および組織工学的療法にも関し、特に、（薬学的に許容される溶液または一時的な、永久的もしくは生分解性のマトリックスなどの）薬学的に許容される担体へ組み込むか、またはそれとの混合を介した投与を含む、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ、もしくはかかる細胞によって生成される組成物の使用法および／もしくは投与法にも関する。
【００５２】
本発明は、増殖させた（すなわち、インビトロで培養し、継代した）細胞集団および大規模に増殖させた細胞集団にも関し、これらは、好ましくは、ＳＴＲＯ−１細胞表面マーカーの発現に関して陰性である。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔｅｔ ａｌ.,“ＳＴＲＯ−１,ＨＯＰ−２６（ＣＤ６３）,ＣＤ４９ａ ａｎｄ ＳＢ−１０（ＣＤ１６６）ａｓ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｍｏｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｐｒｏｇｅｎｙ：ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ”Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ.２００３ Ｓｅｐ：３１３（３）：２８１−９０；およびＤｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ.,“ＴｈｅＳＴＲＯ−１＋ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｓ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ”Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ.２００２：１７０（２−３）：７３−８２；ならびにＯｙａｊｏｂｉｅｔ ａｌ.,“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓｉｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｅｔａｌ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａ ｕｓｉｎｇ ＳＴＲＯ−１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ”,ＪＢｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ.１９９９ Ｍａｒ；１４（３）：３５１−６１を参照されたい。
【００５３】
本発明は、追加の構造成分および／または治療成分と共に、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）を含む、薬学的に許容される組成物の製造ならびに使用にも関する。一例として、例えば、皮膚障害（例えば、熱傷、擦り傷、裂傷、潰瘍、感染症などの皮膚創傷）の治療、修復、および再生において使用するために、ＣＦ−ＳＣまたはｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣまたはｅｘＡＢＭ−ＳＣ）およびコラーゲンを薬学的に許容される溶液中で組み合わせ、液体、半固体、もしくは固体様形態（マトリックス）の組成物を生成してもよい。
【００５４】
本発明は、概して、大規模に継代したコロニー形成体細胞（ｅｘＣＦ−ＳＣ）を含む、コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）と本明細書で呼ぶ自己複製細胞の使用に関する。かかる細胞の例として、様々な疾患および障害、特に、（例えば、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）による心不全および脳卒中などの）虚血、外傷、および／または炎症を含む疾患および障害の治療において使用するための、大規模に継代したヒト成人骨髄由来体細胞（ｅｘＡＢＭ−ＳＣ）を含むヒト成人骨髄由来体細胞（ＡＢＭ−ＳＣ）が挙げられる。
【００５５】
本発明で使用するヒト成人骨髄由来体細胞（ＡＢＭ−ＳＣ）などの自己複製コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）を、米国特許公開第２００３００５９４１４号（２００１年９月２１日に出願された米国特許出願第０９／９６０，２４４号）および米国特許公開第２００４００５８４１２号（２００２年９月２０日に出願された米国特許出願第１０／２５１，６８５号）に記載されるとおりに調製する。これらの特許出願のそれぞれは、これにより、その全体が参照により組み込まれる。特に、（例えば、骨髄、脂肪、皮膚、胎盤、筋肉、臍帯血、または結合組織などに由来する）細胞集団の供給源から単離されたＣＦ−ＳＣを、このＣＦ−ＳＣが、多数の集団倍加を通して基本的に一定の集団倍加速度を維持するように低酸素（例えば、大気に満たない）条件下で培養し、低細胞密度で継代する。このＣＦ−ＳＣを適切な細胞数に増殖させた後、このＣＦ−ＳＣを用いて、本発明の組成物を生成してもよい。例えば、少なくとも約３０回、少なくとも約４０回、または少なくとも約５０回の細胞集団倍加のために、このＣＦ−ＳＣをインビトロで増殖させた後に、ｅｘＣＦ−ＳＣを用いて、本発明の組成物を生成してもよい。一実施形態において、本発明で使用するＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣは骨髄に由来する（それぞれ本明細書でＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣと称す）。
【００５６】
本発明で使用する（例えば、それぞれ、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの一実施形態は、単離細胞集団であり、この細胞集団の細胞は、ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現し、この細胞集団は、少なくとも約３０回、少なくとも約４０回、または少なくとも約５０回の細胞集団倍加後に、約３０時間未満の倍加速度を維持する。
【００５７】
本発明で使用する（例えば、それぞれ、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの別の実施形態は、単離細胞集団であり、この細胞集団の細胞は、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ならびにＣＤ４４、ＨＬＡクラス１抗原、およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンからなる群から選択される１つまたは複数の細胞表面タンパク質を共発現し、この細胞集団は、少なくとも約３０回、少なくとも約４０回、または少なくとも約５０回の細胞集団倍加後に、約３０時間未満の倍加速度を維持する。
【００５８】
本発明で使用する（例えば、それぞれ、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの別の実施形態は、単離細胞集団であり、この細胞集団の細胞は、ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現するが、細胞表面タンパク質ＣＤ１０の発現に関しては陰性であり、この細胞集団は、少なくとも約３０回、少なくとも約４０回、または少なくとも約５０回の細胞集団倍加後に、約３０時間未満の倍加速度を維持する。
【００５９】
本発明で使用する（例えば、それぞれ、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの別の実施形態は、単離細胞集団であり、この細胞集団の細胞は、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ならびにＣＤ４４、ＨＬＡクラス１抗原、およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンからなる群から選択される１つまたは複数の細胞表面タンパク質を共発現するが、細胞表面タンパク質ＣＤ１０の発現に関しては陰性であり、この細胞集団は、少なくとも約３０回、少なくとも約４０回、または少なくとも約５０回の細胞集団倍加後に、約３０時間未満の倍加速度を維持する。
【００６０】
本発明で使用する（例えば、それぞれ、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの別の実施形態は、単離細胞集団であり、この細胞集団の細胞は、表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃに示す可溶性タンパク質からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質を発現し、この細胞集団は、少なくとも約３０回、少なくとも約４０回、または少なくとも約５０回の細胞集団倍加後に、約３０時間未満の倍加速度を維持する。
【００６１】
損傷を受けた組織や臓器は、例えば、疾患（例えば、遺伝性（遺伝的）疾患または（細菌感染症、ウイルス感染症、および真菌感染症などの）感染症）、（熱傷、裂傷、擦り傷、圧迫または侵襲的組織および臓器損傷などの）身体的外傷、虚血、加齢、有害化学物質への曝露、電離放射線、ならびに免疫系の調節不全（例えば、自己免疫疾患）に起因し得る。
【００６２】
本発明は、（例えば、それぞれ、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの精製タンパク質画分、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの馴化培地の上清、ならびにＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの馴化培地に由来する細胞上清画分の使用を包含する。本発明の一実施形態において、上記の成分は、コラーゲンおよび／もしくはフィブリン（例えば、精製した天然または組換えのヒト、ウシ、またはブタのコラーゲンもしくはフィブリン）、および／もしくはポリグリコール酸（ＰＧＡ）などの追加の成分、ならびに／または追加の構造化合物もしくは治療用化合物を含む生理的に適合性のある生分解性マトリックスと組み合わせるか、またはそれらに導入してもよい。このような組み合わせのマトリックスを組織または臓器の損傷の部位に投与し、損傷を受けた組織または臓器の修復および／または再生を促進し、それらを高めるか／または誘起してもよい。
【００６３】
本発明の実施形態には、液体、半固体、または固体様の状態で投与することができる薬学的に許容される組成物に組み込まれた（例えば、それぞれ、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの使用が含まれる。本発明の実施形態は、関連技術の技術者によって日常的に使用されている方法によって、例えば、スプレー式の組成物またはエアロゾル化した組成物として局所適用によって、注射および移入などによって投与してもよい。
【００６４】
組織再生療法のための本発明に記載の（例えば、それぞれ、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ、細胞およびこれらの細胞によって生成される組成物の使用は、前述した組織再生療法および製品と比較して多くの利点を提供することができる。例えば、（例えば、それぞれ、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ、ｅｘＡＢＭ−ＳＣ細胞、ならびにこれらによって生成される組成物の使用は、（炎症およびＴ細胞活性化の低下などの）有害な免疫反応の低下を示すことができる組織再生療法の手段を提供する。例えば、実施例３Ａ、実施例３Ｂ、実施例５、実施例１８、および実施例１９を参照されたい。さらに、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣは、免疫学的に無症状であるので、対象に対して、治療前に、ＨＬＡを一致させることも、事前調整することも必要ではない。実施例１０、パートＩＩを参照されたい。図１７も参照されたい。
【００６５】
本発明は、造血を誘導し、増強し、かつ／または維持するために（特に、赤血球生成と呼ばれる過程において造血前駆細胞から赤血球（ｒｅｄｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））のインビトロでの生成（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）および生成（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）のために）、（増殖させ、大規模増殖させたヒト成人骨髄由来体細胞（それぞれ、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）などの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ、ならびにこれらの細胞によって生成される細胞生成物を使用することにも関する。したがって、本発明の別の実施形態は、赤血球（ｒｅｄｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）の生成（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）および生成（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を誘導し、増強し、かつ／または維持するための、かかる細胞および／もしくはかかる細胞によって生成される組成物の使用を包含する。
【００６６】
本発明の分野の別の実施例は、かかる細胞、細胞集団、それらによって生成される組成物の使用によって、免疫、自己免疫、および炎症性疾患を予防し、治療することに関する。
【００６７】
別の実施例において、本発明は、皮膚（すなわち、表皮、真皮、皮下組織）の創傷の修復および再生のための組成物および方法を提供し、それには、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ヒトＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）、またはかかる細胞によって生成される生成物、ならびに追加の構造化合物もしくは治療用化合物が組み込まれた液体、半固体、および固体様マトリックスの製造および使用が含まれる。
【００６８】
前臨床研究の代表的な結果
インビボの前臨床薬理学的研究は、心筋梗塞および脳卒中の治療におけるＡＢＭ−ＳＣの有益な効果を示した。例えば、心筋梗塞のラットモデルにおけるｈＡＢＭ−ＳＣの心臓内注射の効果を調べる（特に、ＡＭＩ（急性心筋梗塞）後の心機能回復におけるｈＡＢＭ−ＳＣの有効性を判定し、ｈＡＢＭ−ＳＣの分布および配置を評価する）ための研究において、ｈＡＢＭ−ＳＣが心機能を著しく改善し、線維症を著しく低下させることを示した。さらに、このｈＡＢＭ−ＳＣは、心臓注射から４週間後の心臓内にも、注射から８週間後の調べた末梢臓器のいずれにも残らないことが観察された。さらに、ブタのＡＭＩモデルにおけるブタおよびヒトのＡＢＭ−ＳＣの安全性ならびに有効性を調べるための（特に、ＭＹＯＳＴＡＲ（商標）カテーテルを介した、細胞の経皮的なＮＯＧＡ（商標）誘導性心内膜心筋投与の実行可能性、安全性および有効性を評価する）研究において、この特定の送達法は十分に許容され、心臓パラメータに著しい改善をもたらすことが証明された。同様に、（特に、虚血性脳卒中からの神経運動回復の促進におけるｈＡＢＭ−ＳＣの有効性を判定するために）ｈＡＢＭ−ＳＣの送達法および脳卒中の回復の比較において、Ｉ．Ｖ．治療または大脳内治療が神経運動活性に著しい改善をもたらすことが観察された。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ヒト成人骨髄由来体細胞（約２７回の集団倍加時のＡＢＭ−ＳＣ）によって分泌されるタンパク質の２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離（ｐＨ３．５〜１０；１２％ポリアクリルアミド）を示す。ゲル上の各スポットは、約５〜２００キロダルトン（ｋＤａ）のサイズ範囲にある、別々の、異なるタンパク質を示す。Ｘ軸は、等電点（ｐＨ３．５〜１０）にしたがって分離されたタンパク質を示す。Ｙ軸は、（１２％ポリアクリルアミドを通過することによって）分子量にしたがって分離されたタンパク質を示す。
【図２】（約４３回の集団倍加時の）ヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣに由来する神経成長因子（ＮＧＦ）および馴化培地を用いたＰＣ−１２のニューロンへの分化を示す顕微鏡写真である。Ａ）ＲＰＭＩ−ＩＴＳ培地のみ。Ｂ）ＮＧＦを補充したＲＰＭＩ−ＩＴＳ。Ｃ）濃縮対照培地の１：５０希釈液およびＮＧＦを補充したＲＰＭＩ−ＩＴＳ。Ｄ）ヒトＡＢＭ−ＳＣ由来の濃縮馴化培地の１：５０希釈液およびＮＧＦを補充したＲＰＭＩ−ＩＴＳ。矢印は、神経突起伸長を示す。パネルＤの神経突起伸長の程度は、パネルＢおよびＣのそれらよりも著しくロバストである。
【図３】ヒトＡＢＭ−ＳＣを用いるマイトジェン誘発性Ｔ細胞増殖の阻害を示すグラフである。ロット番号ＲＥＣＢ８０１は、約１９回の集団倍加まで継代培養したＡＢＭ−ＳＣを示し、ロット番号ＲＥＣＢ９０６は、約４３回の集団倍加まで継代培養したｅｘＡＢＭ−ＳＣを示す。Ｔ細胞の増殖を刺激するために、培養物に２．５μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（「ＰＨＡ」）を接種した。次に、細胞を７２時間後に収集し、ＣＤ３−ＰＣ７抗体で染色した。ヒト間葉系幹細胞を、陽性対照として用いた（Ｃａｍｂｒｅｘ）（ヒト間葉系幹細胞は、現在、ＬｏｎｚａＧｒｏｕｐ Ｌｔｄ.、バーゼル、スイスが所有しているＣａｍｂｒｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社から入手した）。
【図４】外科的に誘発した切開創傷後７日目のブタの皮膚の顕微鏡写真である。Ａ）（約２８回の集団倍加時の）ブタの同種ＡＢＭ−ＳＣで治療した３番目の創傷は、実質的には瘢痕のない完全な創傷閉鎖を示す。Ｂ）相対的に、ビヒクルのみで治療した４番目の創傷は、目に見える瘢痕を示す。Ｃ）このグラフは、両方の治療群の組織切片の組織形態学的スコア化を示し、ブタＡＢＭ−ＳＣで治療した創傷における組織球数の統計的に有意な減少（ｐ＝０．０３）を示す（統計的有意性は、対応のない両側Ｔ検定を用いて決定した）。「組織球」のバーを、ＰＢＳＧ治療対ｐＡＢＭ−ＳＣ治療で比較されたい。
【図５】治療後７日目の切開創傷の再上皮形成の程度を示すグラフ（上のパネル）である。（約２８回の集団倍加時の）ブタＡＢＭ−ＳＣで治療した創傷は、ビヒクルのみで治療した創傷よりも厚い表皮を有していた。左下のパネルの顕微鏡写真（Ｂ）は、ブタＡＢＭ−ＳＣで治療した創傷の表皮の（組織学的に）完全かつ解剖学的に正確な修復を示す。右下のパネルの顕微鏡写真（Ｃ）は、７日の時点の皮下組織における、（組織学的に）少なくとも一過的に生着（ｅｎｇｒａｆｔ）しているように見えるブタＡＢＭ−ＳＣ（矢じり）を示す。
【図６】細胞再構成後２４時間目に播種した含水コラーゲンゲル格子のＡＢＭ−ＳＣに媒介された収縮を示すグラフである。（約２７回の集団倍加時の）ヒトＡＢＭ−ＳＣを、生分解コラーゲンベースの液体培地中に（１．８×１０６細胞／ｍＬで）再構成し、次に、約４〜８℃で２４時間保存した。次の日、この液体細胞懸濁液を培養皿に入れ、半固体コラーゲン格子を形成させた。この半固体コラーゲン格子を、３日間にわたって細胞培養インキュベーター内で維持し、収縮を促進した。細胞を含めずに調製したコラーゲン格子は収縮せず、このことは、収縮が細胞の存在に依存することを示す。
【図７】約４３回の集団倍加時のｅｘＡＢＭ−ＳＣを利用して、異なる細胞濃度で播種した含水コラーゲンゲル格子のＡＢＭ−ＳＣに媒介された収縮を示すグラフである。このデータは、収縮の速度および絶対的な大きさが細胞数に関係することを示す。熱不活性化細胞がゲルを収縮させないことは、この活性が生物物理学的事象であることを示す。
【図８】約４３回の集団倍加時のｅｘＡＢＭ−ＳＣを利用して、含水コラーゲンゲル格子中で３日間培養した時の、数種のサイトカインおよびマトリックスプロテアーゼ（すなわち、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、アクチビン−Ａ、ＭＭＰ−１、およびＭＭＰ−２）のＡＢＭ−ＳＣに媒介された分泌を示すグラフである。
【図９】（約４３回の集団倍加時のｅｘＡＢＭ−ＳＣを利用した）液体（左のパネル、Ａ）または半固体（右のパネル、Ｂ）として生分解性コラーゲンベースの培地中で再構成したヒトＡＢＭ−ＳＣの顕微鏡写真である。この製剤を用いて再構成した時に、細胞懸濁液は、４℃で２４時間を超えても液体として存在することができる。培養皿に入れ、３７℃でインキュベートした時に、この細胞懸濁液は、１〜２時間以内に凝固し、物理的に操作することができる半固体構造を生じさせる。
【図１０】生分解性コラーゲンベースの培地中で再構成した（約４３回の集団倍加時の）ヒトＡＢＭ−ＳＣを、３日間培養することによって形成した固体様のネオ組織（ｎｅｏｔｉｓｓｕｅ）の顕微鏡写真である。上の左のパネル（Ａ）は、伸ばした時の組織の柔軟性を示す写真である。上の右のパネル（Ｂ）は、固体様のネオ組織の全体的なテクスチャを示す写真である。下のパネル（Ｃ）は、マッソン・トリクロームによって染色した組織の組織切片を示し、ＡＢＭ−ＳＣによって合成した豊富な細胞外マトリックスを示す。細胞を含めないで同じ方法によって構成した対照ゲルが、この方法によって青く染まらないことは、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンに富むマトリックスがこれらの細胞によって生成されることを示す。
【図１１】ＴＮＦ−α刺激がある時と無い時のヒトＡＢＭ−ＳＣによって分泌される多数の再生促進サイトカイン（ｐｒｏ−ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｃｙｔｏｋｉｎｅ）量の一例を示す。継代培養した時に、ＡＢＭ−ＳＣは、血管新生を増大させ、炎症を調節し、創傷治癒を促進することが知られる潜在的治療濃度のいくつかの増殖因子およびサイトカインを分泌する。ＡＢＭ−ＳＣは、血管新生促進因子（例えば、ＳＤＦ−１α、ＶＥＧＦ、ＥＮＡ−７８およびアンジオゲニン）、免疫調製物質（例えば、ＩＬ−６およびＩＬ−８）ならびに瘢痕阻害剤／創傷治癒モジュレーター（例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３およびアクチビン−Ａ）を含むいくつかのサイトカインおよび増殖因子をインビトロで一貫して分泌することが示されている。さらに、これらの因子のいくつかの放出は、急性組織損傷の過程で放出される既知の炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）によっても調節される。
【図１２】傷害応答カスケード（傷害から瘢痕までの間の炎症、再生および線維症）のモデルならびに炎症、再生および線維症において役割を果たし得る分子の例を示す。
【図１３】ヒトＡＢＭ−ＳＣ治療ラットでの改善された心機能の結果の一例を示すグラフである。治療後４週間目に、ＡＢＭ−ＳＣを投与したラットは、著しく高い＋ｄｐ／ｄｔ（圧力の正の最大変化率）値を示した（Ａ）。４週間目の＋ｄｐ／ｄｔ値から０週の＋ｄｐ／ｄｔ値を引くことによって（「デルタ＋ｄｐ／ｄｔ」）、この研究の間の心機能の変化を表すと、ビヒクル治療ラットはこの研究の間に心機能を低下させるが（負のデルタ）、いずれかの細胞集団で治療した動物は心機能の有意な改善を示すことが証明された（Ｂ）。ビヒクル治療ラットと比較して、ＡＢＭ−ＳＣを投与したラットが著しく低いタウ値を示した（Ｃ）ことは、左室コンプライアンスの増大を示唆する。タウは、等容性左心室圧の減衰の時定数である。圧力の負の最大変化率（−ｄｐ／ｄｔ）について、４週間目の−ｄｐ／ｄｔ値から０週の−ｄｐ／ｄｔ値を引くことによって（「デルタ−ｄｐ／ｄｔ」）、この研究の間の心機能の変化を表すと、ビヒクル治療ラットはこの研究の間に心機能を低下させるが（負のデルタ）、細胞調製物で治療した動物は心機能の有意な改善を示すことが証明された（Ｄ）（ＡＮＯＶＡによって＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１４】ヒトＡＭＢ−ＳＣ（ｈＡＢＭ−ＳＣ）で治療した心筋梗塞のラットモデルにおける線維症の低下および血管新生の増強を示す。半定量的スコア化を用いて、心筋梗塞７日後にビヒクルまたはＡＢＭ−ＳＣを投与したラットの心臓における梗塞サイズの変化を評価した。ＡＢＭ−ＳＣの投与後約３０日目に行った組織病理学的解析は、ビヒクルと比較してｈＡＢＭ−ＳＣを投与したラットの梗塞サイズにおいて著しい低下を示した。あらかじめ設定したスケールによると、ｈＡＢＭ−ＳＣを投与したラットの組織学的スコアは、ビヒクル対照よりも約２ポイント低かった。この図は、代表的な梗塞サイズの縮小の例を示す。
【図１５】心筋梗塞後７日目にビヒクルまたはＡＢＭ−ＳＣを投与したラットの心臓構造における、ＡＢＭ−ＳＣの投与後約３０日目に行った変化の組織学的測定から得られた結果を示す。
【図１６】同種ヒトＡＢＭ−ＳＣ（ＲＥＣＢ８０１）およびｅｘＡＢＭ−ＳＣ（ＲＥＣＢ９０６）は、一方向ＭＬＲ（混合リンパ球反応）アッセイにおけるマイトジェン誘発性Ｔ細胞増殖を抑制することを示す。
【図１７】同種ブタＡＢＭ−ＳＣが、２方向ＭＬＲ負荷実験において、Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘発することができないことを示す。分裂指数は、ベースライン時、治療後３日目または３０日目に収集し、次に、培地、ビヒクル、ｐＡＢＭ−ＳＣまたはＣｏｎＡを用いてインビトロで負荷した試料について計算した。３日目または３０日目における全ての動物からの、ＣｏｎＡで刺激したＰＢＭＣ細胞についての平均分裂指数は、治療前および剖検時の両方において、ビヒクルおよびｐＡＢＭ−ＳＣで治療した動物のＰＢＭＣ細胞の分裂指数よりも有意に高かった（＊ｐ＜０．０５）。
【図１８】ベースライン（ＢＬ）測定値とｈＡＢＭ−ＳＣによる治療後９０日目に得られた測定値を比較することによって、３人の患者における心臓の修復された灌流欠損サイズの変化を示す。
【図１９】ベースライン（ＢＬ）測定値とｈＡＢＭ−ＳＣによる治療後９０日目に得られた測定値を比較することによって、３人の患者で測定した心臓駆出率の変化を示す。
【図２０】インビトロで、ｈＡＢＭ−ＳＣによって分泌された赤血球生成サイトカイン（すなわち、ＩＬ−６、アクチビン−Ａ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＳＤＦ−１およびＳＣＦ）の量の例を示す。ＡＢＭ−ＳＣロットを、ＲＡＹＢＩＯ（商標）ヒトサイトカイン抗体アレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を用いてサイトカイン分泌について試験した。最初に、馴化培地（ＣＭ）を生成するために、細胞を無血清のＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ（商標））で３日間培養した。次に、このＣＭを、分析前にＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（商標）ＰＬＵＳ−２０遠心分離機フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮した。
【図２１】ｅｘＡＢＭ−ＳＣが、用量依存的にインビトロでＴＮＦ−αレベルを低下させることを示す。（約４３回の集団倍加時の）ヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣが、様々な播種密度（例えば、１０，０００細胞／ｃｍ２、２０，０００細胞／ｃｍ２、および４０，０００細胞／ｃｍ２）で培養した時に、それらのＴＮＦ−αレベルを低下させる能力について試験した。細胞を、無血清のＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ（商標））のみで、またはその培地に１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを補充して３日間培養した。熱不活性化細胞も陰性の対照として含めた。ＴＮＦの濃度をＹ軸に示す（Ｙ軸は、１００倍に濃縮した培地中の物質の濃度を示す）。
【図２２】図２２Ａおよび図２２Ｂは、ＴＮＦ−αの減少が、（約４３回の集団倍加時の）ｅｘＡＢＭ−ＳＣによるｓＴＮＦ−ＲＩおよびｓＴＮＦ−ＲＩＩの分泌によって媒介されるように思われることを示す。ｓＴＮＦ−ＲＩの基礎レベルの発現は、炎症促進性因子が存在しない場合に生じる（Ａ）が、ｓＴＮＦ−ＲＩＩは、最初にＴＮＦ−αで刺激した時にのみ、かなりのレベルで検出される（Ｂ）。これらのデータは、播種した細胞数と検出されたｓＴＮＦ−ＲＩおよびｓＴＮＦ−ＲＩＩの両方のレベルの間の反比例関係を明らかにし、分泌された受容体自体がＴＮＦ−αに結合すると、ＴＮＦ−αをマスキングする可能性を示唆する（Ｙ軸は、１００倍に濃縮した培地中の物質の濃度を示す）。
【図２３】（約４３回の集団倍加時のｅｘＡＢＭ−ＳＣによる）ＩＬ−ＩＲＡの分泌レベルが用量依存的であることを示す。ＩＬ−ＩＲＡの基礎レベルの発現は、炎症促進性因子が存在しない場合に生じるが、ＴＮＦ−αで刺激した時に、可溶性レベルは約１０倍増加する（Ｙ軸は、１００倍に濃縮した培地中の物質の濃度を示す）。
【図２４】ｅｘＡＢＭ−ＳＣによる、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）およびＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の発現を示す。ヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣは、ＴＮＦ−αなどの炎症性シグナルがない時でさえ、基礎レベルのＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ；図２４Ａ）およびＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ；図２４Ｂ）を発現する。
【図２５Ａ】混合ＰＢＭＣ反応アッセイにおいて、ヒトＡＢＭ−ＳＣは、ＴＮＦ−α（図２５Ａ）およびＩＬ−１３（図２５Ｂ）のレベルを低下させるが、同時に、ＩＬ−２（図２５Ｃ）の発現の増加を誘導することを示す（Ｒ＝レスポンダーＰＢＭＣ、ＳＥＬＦ＝レスポンダーと同じドナーから単離し、マイトマイシンＣで処理したＰＢＭＣ、ＳＴＩＭ＝異なるドナーから単離し、マイトマイシンＣで処理したＰＢＭＣ）。
【図２５Ｂ】混合ＰＢＭＣ反応アッセイにおいて、ヒトＡＢＭ−ＳＣは、ＴＮＦ−α（図２５Ａ）およびＩＬ−１３（図２５Ｂ）のレベルを低下させるが、同時に、ＩＬ−２（図２５Ｃ）の発現の増加を誘導することを示す（Ｒ＝レスポンダーＰＢＭＣ、ＳＥＬＦ＝レスポンダーと同じドナーから単離し、マイトマイシンＣで処理したＰＢＭＣ、ＳＴＩＭ＝異なるドナーから単離し、マイトマイシンＣで処理したＰＢＭＣ）。
【図２５Ｃ】混合ＰＢＭＣ反応アッセイにおいて、ヒトＡＢＭ−ＳＣは、ＴＮＦ−α（図２５Ａ）およびＩＬ−１３（図２５Ｂ）のレベルを低下させるが、同時に、ＩＬ−２（図２５Ｃ）の発現の増加を誘導することを示す（Ｒ＝レスポンダーＰＢＭＣ、ＳＥＬＦ＝レスポンダーと同じドナーから単離し、マイトマイシンＣで処理したＰＢＭＣ、ＳＴＩＭ＝異なるドナーから単離し、マイトマイシンＣで処理したＰＢＭＣ）。
【図２６】ヒトＡＢＭ−ＳＣを用いた、マイトジェン誘発性ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）増殖の阻害を示すグラフである。ＲＥＣＢ８０１は、約１９回の集団倍加まで継代培養したＡＢＭ−ＳＣの特定ロットを示し、ＲＥＣＢ９０６は、約４３回の集団倍加まで継代培養したＡＢＭ−ＳＣの特定ロットを示す。ＰＢＭＣ増殖を刺激するために、培養物に２．５μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニンを接種した。培養５６時間後、細胞をチミジン−［メチル−３Ｈ]でパルスし、７２時間目に同位体の取り込みを定量化した（ＣＰＭ）。ヒト間葉系幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社）を陽性対照として含めた。
【図２７】医療グレードのブタコラーゲンゲル収縮アッセイの結果を示すグラフであり、ヒトｅｘＣＦ−ＳＣの密度の増加およびコラーゲンゲル濃度の増加の関数としてコラーゲンゲル収縮の有効用量反応曲線を示す。
【図２８】ブタコラーゲンゲルのネオ組織内に被包し、培養したヒトｅｘＣＦ−ＳＣ内で生成されるＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）の量を示し、細胞密度の増加の関数としてゲル内のＶＥＧＦ濃度が増加することを示す。
【図２９】ヒトｅｘＣＦ−ＳＣによって生成される因子を含む馴化培地を、非馴化培地を用いて得られた結果と比較した時の、インビトロ創傷閉鎖アッセイで得られた結果を示し、馴化培地は、非馴化培地と比較して創傷閉鎖の速度および大きさを著しく増加させることを示す。
【図３０】２４時間、ヒトｅｘＣＦ−ＳＣをＩＬ−１α（ＩＬ−１ａ）（１０ｎｇ／ｍＬ）に暴露した後に馴化培地内に存在する分泌因子の定量的測定を示し、ＩＬ−１ａがいくつかの因子の発現を誘導し、他の因子の発現を上方制御することを示す。
【図３１】２４時間、ヒトｅｘＣＦ−ＳＣを腫瘍壊死因子α（ＴＮＦａ）（１０ｎｇ／ｍＬ）に暴露した後に馴化培地内に存在する分泌因子の定量的測定を示し、ＴＮＦａがいくつかの因子の発現を誘導し、他の因子の発現を上方制御することを示す。
【図３２】２４時間、ヒトｅｘＣＦ−ＳＣをインターフェロンγ（ＩＦＮｇ）（１０ｎｇ／ｍＬ）に暴露した後に馴化培地内に存在する分泌因子の定量的測定を示し、ＩＦＮｇがいくつかの因子の発現を誘導し、他の因子の発現を上方制御することを示す。
【図３３】ヒトｅｘＣＦ−ＳＣの分泌プロファイルに対する炎症性因子の効果をまとめる。数値コードを用いて、これらの効果の程度および性質を示し、効果の大きさと方向に基づいて５つのカテゴリーに分けた。コード：−２＝２を超える低下；−１＝０〜−２の低下；０＝変化なし；＋１＝１０未満の誘導；＋１０＝１０〜１０００の誘導；＋１０００＝１０００を超える誘導。これらの結果は、ヒトｅｘＣＦ−ＳＣが、異なる炎症マーカーに反応してそれらの分泌プロファイルを変更し、それによって、ヒトＡＢＭＳＣがインビボ環境に応じて異なる効果を有することを期待してもよいことを示す。
【図３４】色が同一のボックスは、示した因子の誘導が、治療効果（例えば、血管、免疫、再生、炎症、創傷修復のシステムおよびメカニズム）を与えるのに有用であり得る様々な生物システム（例として、ただしこれらに限定されない）を示す。
【図３５】３０細胞／ｃｍ２で播種し、４％酸素で増殖させた新生児のヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）において、３０００細胞／ｃｍ２で播種し、２０％酸素で増殖させたＮＨＤＦと比べて、ほぼ２００の転写物が、少なくとも２倍（ｐ≦０．０１）異なって発現することを示す。表２も参照されたい。
【図３６】低酸素（４％酸素）および低細胞播種密度（６０細胞／ｃｍ２）の条件下で、インビトロで培養し、継代した時に、ウマ（馬）供給源の成体骨髄由来細胞が急速増殖および多回数の細胞倍加を可能にすることを示すグラフである。
【図３７】コラーゲンマトリックス中で培養した時に、ウマ（馬、ＥＱ１０４）成体骨髄由来細胞集団が、生理活性（ゲル収縮）を示す。
【図３８】ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）の足場に播種し、培養したヒトｅｘＣＦ−ＳＣ内のＶＥＧＦレベルを示し、細胞密度の増加の関数としてＰＬＧＡ構築物内に含まれるＶＥＧＦの増加を示す。
【図３９】本発明の生物工学によって作られた様々な形態の構築物を示す写真である。ＡおよびＢ）培養し、架橋結合して生存していない機械的に安定な生理活性構築物を生成した後のヒトｅｘＣＦ−ＳＣ播種ブタコラーゲンゲル。Ｃ）培養し、脱水して生存していない薄膜生理活性構築物を生成した後のヒトｅｘＣＦ−ＳＣ播種ブタコラーゲンゲル。Ｄ）不織のＰＬＧＡ足場（左下隅）およびヒトｅｘＣＦ−ＳＣを播種し、不織ＰＬＧＡ足場で培養した構築物（右下隅）。米国の２５セント硬貨をサイズ比較のために示した（中央、上部）。
【図４０】コラーゲンベースの生理活性デバイスを作製するための本発明のプロセスを示すフローチャートである。実施形態において、このプロセスは、概説するとおり４つの主要なステップを含む。
【図４１】ｈＡＢＭ−ＳＣを播種したコラーゲン構築物を染色した生／死の生存率を示す蛍光顕微鏡画像である。
【図４２】ｈＡＢＭ−ＳＣを播種したブタコラーゲン構築物の経時的なコラーゲンゲル収縮測定値。
【図４３】ｈＡＢＭ−ＳＣを播種したブタコラーゲンゲル構築物に由来し、収集した馴化培地および構築物の溶解物中に存在するＶＥＧＦのＥＬＩＳＡによる定量化。
【図４４】培地に２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加しない場合および添加した場合における、ｈＡＢＭ−ＳＣを播種したコラーゲン構築物内の細胞生存率。
【図４５】培養したｈＡＢＭ−ＳＣ播種ブタコラーゲンゲル構築物の溶解物中のＶＥＧＦのＥＬＩＳＡによる定量化。
【図４６】培養し、グルタルアルデヒドで架橋結合したｈＡＢＭ−ＳＣコラーゲン構築物の消化物のコラゲナーゼ消化時間および細胞生存率。
【図４７】加工したｈＡＢＭ−ＳＣコラーゲン構築物内のＶＥＧＦのＥＬＩＳＡによる定量化。
【図４８】加工によりバラバラになったコラーゲン構築物のプレーティング後のｈＡＢＭ−ＳＣ生存率。
【図４９】様々なデバイス反復物（ｄｅｖｉｃｅ ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）の溶解物中のＶＥＧＦのＥＬＩＳＡによる定量化。
【図５０】様々なデバイス反復物の溶解物中のＶＥＧＦのＥＬＩＳＡによる定量化。
【図５１】様々なデバイス反復物の溶解物中のＶＥＧＦのＥＬＩＳＡによる定量化。
【図５２】培養し、グルタルアルデヒドで架橋結合した細胞播種コラーゲン構築物の脱水前の写真である。
【図５３】脱水ステップ中のデバイスの実施形態の写真である。
【図５４】細胞を播種した６６０１デバイスの写真である。
【図５５】本発明の例示的なデバイスの写真である。
【図５６】縫合保持試験中の６６０１デバイス反復物の写真である。
【図５７】様々なデバイス反復物の溶解物中のＶＥＧＦのＥＬＩＳＡによる定量化。
【図５８】デバイス反復物の溶解物中のＶＥＧＦのＥＬＩＳＡによる定量化。
【図５９】ＧＢＴコラーゲンベースの生理活性デバイスの原型。Ａ．４６０００、架橋結合なし。Ｂ．０．００１％のグルタルアルデヒドで架橋結合した４６００１、４６０００−００１の画像は利用できない。
【図６０】外科的に誘導した屈筋腱損傷のＫｅｓｓｌｅｒ−Ｋａｊｉｍａ縫合（矢頭）およびＧＢＴデバイス４６００１を用いた修復。
【図６１】幅約０．７〜０．９ｃｍ×直径２．８ｃｍの条片にカットし、指の屈筋腱の周りを包んだ４６００１。
【図６２】ＳＣＡＦＴＥＸ ＰＬＧＡ ９０／１０足場のみ（左下、ガーネット（Ｇａｒｎｅｔ）細胞治療用製品を播種したＳＣＡＦＴＥＸ）、ＧＢＴ００９（右下））。２５セント硬貨をスケールとして含めた。
【図６３】ＣＭＣ関節形成後に親指に移植したＧＢＴ  ＰＬＧＡベースのデバイス。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
本発明は、長期的な細胞移植に頼ることのない細胞ベースの療法の使用に関する。特に、本発明は、様々な疾患および障害、特に、（例えば、神経の組織および臓器ならびに心臓の組織および臓器などの）限定された自己複製能を有する組織および臓器を含む疾患および障害の治療における、細胞ならびに細胞によって生成される組成物の使用に関する。本発明の実施形態において、本発明の細胞を、治療を必要とする患者と接触させる。「患者」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物の両方を包含する。
【００７１】
一般的に、幹細胞またはその他の初期段階の前駆細胞は、これらの細胞が特定の分化経路に関係づけられているので、可塑性を失う。生体分子レベルでは、このプロセスが起こり始めると、別の方法で、この細胞が、分裂するように、または別の細胞型になるように促す特定のシグナル伝達分子（例えば、マイトジェンおよびモルフォゲン）に応答する能力を失う。したがって、細胞が分化し始めると、細胞は細胞周期を離れ（すなわち、もはや有糸分裂を経ることができず）、Ｇ０と呼ばれる不可逆的な状態に移行し、この細胞はもはや分裂することができない。Ｇ０への移行は、複製老化とも関連する（その特徴は、分子内タンパク質ｐ２１およびｐ５３の発現増加を含む）。したがって、可塑性の喪失（種々な細胞型に分化する能力）は、一般的に、細胞分化または細胞老化への前兆とみなされる。さらに、可塑性の損失は、一般的に細胞の連続的自己複製能の喪失とも関連づけられている。対照的に、一般的で、従来から受け入れられているこのシナリオに対して、予想外の、驚くべき本発明の結果は、本発明のｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ｅｘＡＢＭ−ＳＣ）が、可塑性の損失にもかかわらず（比較的一定の速度での自己複製を含む）自己複製を継続することである。したがって、本発明の一実施形態は、連続的自己複製能を有する治療上有用な「末期の細胞」（例えば、連続的自己複製および栄養支持因子（または「栄養支持細胞」）を生成することができる細胞）である。別の実施形態において、本発明のｅｘＣＦ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣは、有意量のｐ２１および／またはｐ５３を発現せず、前記分子の「有意量」は、細胞の老化を示す量である（老化は、ｐ２１、ｐ５３、および／または他の細胞周期調節因子の十分な発現レベルを必要とし得る）。
【００７２】
さらに、本発明の分野の多くの専門家は、臓器および組織を生成するか、または臓器および組織の再生を促進する、限られた有用性または能力を有するために可塑性を失った非造血性間質型細胞を予想する。したがって、本発明の別の驚くべき、予想外の結果は、可塑性は失ったが、インビトロで新しい組織を生成し、インビボで組織の再生を促進する能力を保持している、大規模に継代したＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣ）を生成する能力である。
【００７３】
本発明は、とりわけ、コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）（そのうちの一例として、ヒト成人骨髄由来体細胞（ＡＢＭ−ＳＣ）が挙げられる）と本明細書で呼ぶ自己複製細胞を用いた組織の修復、再生、および／または若返りの方法に関する。本発明で使用するヒト成人骨髄由来体細胞（ＡＢＭ−ＳＣ）などの自己複製コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）を、米国特許公開第２００３００５９４１４号（２００１年９月２１日に出願された米国出願第０９／２６０，２４４号）および米国特許公開第２００４００５８４１２号（２００２年９月２０日に出願された米国出願第１０／２５１，６８５号）に記載されるとおりに調製する。これにより、これらの特許出願のそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる。（それぞれ、２００７年６月１５日に出願された）米国仮特許出願第６０／９２９，１５１号および同第６０／９２９，１５２号、（２００７年８月１０日に出願された）米国仮特許出願第６０／９５５，２０４号および、（２００７年１１月１日に出願された）米国仮特許出願第６０／９９６，０９３号も、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
本発明は、ＣＦ−ＳＣ細胞由来の馴化細胞培養物を含む組成物およびマトリックスにも関する。本発明は、さらに、ＣＦ−ＳＣ細胞由来の馴化細胞培養物を用いて、患者の病状を治療する方法を提供する。「ＣＦ−ＳＣ細胞由来の馴化細胞培養物」という用語は、ＣＦ−ＳＣ細胞を増殖させ、その後、これらの細胞をこの培地から取り除いた培地を指す。実施形態において、ＣＦ−ＳＣ細胞に由来するかかる馴化細胞培養物は、実質的にＣＦ−ＳＣ細胞を含まない。「実質的に含まない」とは、これらの細胞の全てを取り除くか、またはこれらの細胞の大部分を取り除くことを意味する。必要に応じて、ＣＦ−ＳＣ細胞由来の馴化細胞培養物を、医薬品、例えば、いくつか例を挙げると、インターロイキン−１β（ＩＬ−ｌｂ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−Ｌａ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ｇ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−ｂ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ−Ａ）、および／または植物性血球凝集素（ＰＨＡ）などの刺激因子で処理し、馴化細胞培地の生成を誘導する。
【００７５】
特に、（例えば、骨髄（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）、脂肪、皮膚、胎盤、筋肉、臍帯血、または結合組織などに由来する）細胞の供給集団から単離されたＣＦ−ＳＣを、これらのＣＦ−ＳＣが、（例えば、限定されないが、１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、４５回および／または５０回の集団倍加を経験するなどの）多数の集団倍加を通して（例えば、限定されないが、約３０時間未満の倍加速度などの）基本的に一定の集団倍加速度を維持するように、（例えば、限定されないが、４ｍＭグルタミンおよび１０％ウシ胎仔血清が補充された最小必須培地−アルファ（例えば、ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）から入手可能）などの）適切な培地の存在下で培養細胞表面に接着させ、（例えば、限定されないが、窒素で平衡化した約２〜５％のＯ２、約５％のＣＯ２などの）低酸素条件下で培養し、続いて、（約３０〜１０００細胞／ｃｍ２などの）低細胞密度で継代する。
【００７６】
本発明の実施形態は、低酸素条件下で培養したＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）で生成してもよく、その際、前記Ｏ２濃度は、約１〜２０％の範囲であり（例えば、前記Ｏ２濃度が、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、または約２０％であり）、それにＣＯ２を加え、窒素で平衡化する。例えば、ＡＢＭ−ＳＣを低酸素条件下で培養してもよく、その際、前記Ｏ２濃度は、約２０％、約２０％未満、約１５％、約１５％未満、約１０％、約１０％未満、約７％、約７％未満、約６％、約６％未満、約５％、約５％未満、約４％、約４％未満、約３％、約３％未満、約２％、約２％未満、約１％であるか、または前記低酸素条件は、約１％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％、約１％〜約５％、約５％〜約２０％、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％、約１０％〜約１５％、約１０％〜約２０％、約２％〜約８％、約２％〜約７％、約２％〜約６％、約２％〜約５％、約２％〜約４％、約２％〜約３％、約３％〜約８％、約３％〜約７％、約３％〜約６％、約３％〜約５％、約３％〜約４％、約４％〜約８％、約４％〜約７％、約４％〜約６％、約４％〜約５％、約５％〜約８％、約５％〜約７％、約５％〜約６％の範囲、もしくは約５％である。
【００７７】
本発明の実施形態は、低酸素条件下で培養したＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）で生成してもよく、その際、ＣＯ２濃度は、約１〜１５％の範囲であり（例えば、前記ＣＯ２濃度が、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、または約１５％であり）、それに低濃度のＯ２を加え、窒素で平衡化する。本発明の実施形態を、低細胞密度で細胞を播種することによって継代したＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）で生成してもよく、前記細胞密度は、約１〜２５００細胞／ｃｍ２の範囲である（例えば、細胞密度が、約１、約２、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１５００、約２０００または約２５００細胞／ｃｍ２である）。例えば、ＡＢＭ−ＳＣは、約２５００細胞／ｃｍ２未満、約１０００細胞／ｃｍ２未満、約５００細胞／ｃｍ２未満、約１００細胞／ｃｍ２未満、約５０細胞／ｃｍ２未満、約３０細胞／ｃｍ２未満、または約１０細胞／ｃｍ２未満の播種密度で継代してもよい。本発明の実施形態は、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）で生成してもよく、その際、細胞集団倍加速度は、約２４〜９６時間未満の範囲で維持される（例えば、細胞集団倍加速度は、約２４、約３０、約３６、約４２、約４８、約５４、約６０、約６６、約７２、約７８、約８４、約９０、または約９６時間未満で維持される）。本発明の実施形態は、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）で生成してもよく、その際、細胞集団は、約５〜５０回の集団倍加の範囲などの様々な範囲の集団倍加を通して、基本的に一定の倍加速度を維持する（例えば、集団倍加速度は、約５〜１０、約５〜１５、約５〜２０、約５〜２５、約５〜３０、約５〜３５、約５〜４０、約５〜４５、または約５〜５０回の集団倍加の間維持される）。
【００７８】
本発明の実施形態は、液体、半固体、または固体様状態にあってもよい薬学的に許容される組成物に組み込まれたＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）の使用を含む。「液体、半固体、または固体様状態」という用語の使用は、これらの細胞が含まれる薬学的に許容される組成物が、１）（通常の生理食塩水中などの）一般的な液体状態から；２）ゼリー状、ゼラチン状、または粘弾性状態を含む広範囲の低粘性〜高粘性状態まで（その際、この医薬組成物は、例えば、この組成物が、油もしくは蜂蜜のようにゆっくり「漏出する」状態から、ゼリー状、柔軟性、半弾性、および／または展性があり得るゼラチン質もしくは粘弾性が増した状態の粘性の範囲にあるように非常に高レベル〜非常に低レベルの細胞外液を含む）；３）マトリックス内の生存細胞が、（例えば、哺乳類の皮膚と同じくらい柔軟な半弾性特性のいくつかを有する）耐久性があり、非ゼラチン質であるが、なお柔軟な、半弾力性の、展性のあるマトリックスに当初懸濁された環境を再構築した（非常に低レベルの細胞外液を有する）固体様状態までの、様々な範囲の物理的状態に及び得ることを示すことを目的としている。図１０Ａおよび図１０Ｂを参照されたい。
【００７９】
非弾性としても知られている粘弾性は、塑性変形を受ける時に粘性および弾力性の両方の特徴を示す物質を説明する。蜂蜜のような粘性物質は、ストレスが加えられると、時間と共に直線的に剪断流および歪みに抵抗する。弾性物質は、引き伸ばされると即座に歪み、ストレスが取り除かれると、それらの元の状態に素早く戻る。粘弾性物質は、これらの性質の両方の要素を有し、それ自体、時間依存的な歪みを示す。
【００８０】
液体、半固体、および固体様のビヒクル中の細胞の臨床投与は、創傷中に不要な滲出液を閉じ込めることなく、創傷床の輪郭を成形する治療の適用を可能にする。
【００８１】
コラーゲンまたはフィブリンなどの可溶性マトリックス成分を、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）と組み合わせることは、サイトカインおよびマトリックスメタロプロテアーゼなどの重要な分泌タンパク質の発現を上方制御するようにこの細胞集団を誘導する。さらに、外科的に誘発した創傷へのＡＢＭ−ＳＣの適用は、創傷閉鎖を促進し、瘢痕化を防ぎ、それによって最低限の瘢痕化をもたらすと思われる（例えば、実施例７参照）。本発明の実施形態において、ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣ細胞を含むマトリックスを、治療を必要としている患者、例えば、創傷を有する患者と接触させる。
【００８２】
さらに、（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの見かけの免疫調節特性（例えば、実施例５参照）は、これらの細胞が組み込まれる組成物および治療法を、例えば、限定されないが、慢性炎症性皮膚疾患、乾癬、扁平苔癬、エリテマトーデス（ＬＥ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、および薬疹（すなわち、皮膚の有害な薬物反応）などの皮膚に関係する（皮膚科学的な）免疫障害および免疫疾患の治療に対して魅力的にする。
【００８３】
（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの馴化培地の分泌タンパク質および細胞上清画分は、インビボ使用に適するようにする方法で、無血清状態から製造し、濃縮し、調製することができる。この方法で調製した時に、ＡＢＭ−ＳＣの無血清馴化培地は、治療有効濃度の多数の再生促進サイトカイン、成長因子、およびマトリックスプロテアーゼを含むことが示された（例えば、表１Ａ、表１Ｂおよび１Ｃ参照）。ＡＢＭ−ＳＣによって生成される何百もの可溶性因子の複合混合物は、２次元ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって区別することができる（図１参照）。個々のタンパク質および他の巨大分子を、これらのゲルから切り出し、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析）などの当技術分野で日常的に行われている技術を用いて同定することができる。
【００８４】
開示する方法（ならびにクロマトグラフィーまたは中空糸細胞培養系などの他の分離技術）を利用して、所望のタンパク質または細胞上清画分を単離し、透析し、凍結乾燥し、固体として保存するか、または治療的投与のために適切なビヒクルで再構成することができる。一実施形態において、タンパク質または細胞上清画分を、半固体コラーゲンまたはフィブリンベースのビヒクルで再構成し、創傷床へ局所的に適用する。
【００８５】
（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣによって生成される生成物に加えて、（脂質、タンパク質、および核酸などの生物製剤を含む）小分子化合物から大きな高分子化合物などの、任意の数および種類の薬学的に許容される化合物を、（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ、またはかかる細胞によって生成される生成物を含む生分解性マトリックスなどの薬学的に許容される担体と共に投与するために組み込んでもよい。非常に少しの標本として、かかる追加分子は、ほんの少しのカテゴリーの例をあげると、抗炎症薬、抗生物質、ビタミン、および（カルシウムなどの）ミネラルなどの小分子医薬品を含んでもよい。同様に、生物製剤の非常に少しの標本は、治療上有益な変異体、ならびに様々なアイソフォーム、断片、サブユニット、ならびに置換、挿入、および欠失変異体などのかかる分子の誘導体を含む細胞外マトリックスタンパク質、血漿凝固タンパク質、抗体、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、（カルジオリピンおよびスフィンゴミエリンなどの）脂質、ならびに（リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡ発現コンストラクトなどの）核酸を含んでもよい。本明細書に提供する教示と組み合わせて、任意の数の追加の構造的または治療上有益な化合物が、（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ、またはかかる細胞によって生成される生成物を含む生分解性マトリックスなどの薬学的に許容される担体と共に投与するために含まれ得ることを当業者なら理解できるので、これらは単なる一例として言及される。
【００８６】
本発明の一実施形態は、糖尿病足もしくは静脈性下肢潰瘍などの糖尿病患者、または手術後の創傷における創傷閉鎖を刺激する方法を包含する。創傷閉鎖の刺激は、（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ、またはかかる細胞によって生成される生成物を、天然に存在する細胞外マトリックスならびに／または、例えば、精製した天然もしくは組換え型のヒト、ウシ、ブタ、または組換え型のコラーゲン、ラミニン、フィブリノゲン、および／もしくはトロンビンなどの血漿タンパク質成分と組み合わせた医薬組成物で治療することによって促進することができる。この医薬組成物は、組織の損傷部位で、ヒトを含む哺乳類に投与することができる。別の実施形態では、局所的に投与される生分解性マトリックスを、精製した天然または組換え型のコラーゲン、フィブリノゲン、および／またはトロンビンなどの成分を同種の（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣと組み合わせた混合物から形成する。
【００８７】
本発明の別の実施形態において、同種細胞およびマトリックスの医薬組成物を、（例えば、限定されないが、１日〜１カ月以上などの）長期間、インビトロで培養し、結合組織の新たな形成をもたらす。本発明の別の実施形態において、この生分解性マトリックスは、ウシコラーゲンまたはポリグリコール酸（ＰＧＡ）である。別の実施形態において、この医薬組成物は、酸素圧を低下させた条件下、例えば、限定されないが、約４〜５％Ｏ２に相当する酸素圧、５％ＣＯ２、および窒素で平衡化した条件下で、無血清細胞培地で培養する。
【００８８】
一実施形態において、本発明は、以下のステップを含む医薬組成物を調製する方法を包含する：
（ａ）可溶性コラーゲンと、グルタミン、炭酸水素ナトリウム、およびＨＥＰＥＳを補充した（必要に応じて、インスリン、トランスフェリン、および／またはセレンの補充を含む）無血清細胞培地とを含む溶液を調製するステップ；
（ｂ）この溶液にＣＦ−ＳＣまたはｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣまたはｅｘＡＢＭ−ＳＣ）を再懸濁するステップ；ならびに
（ｃ）この細胞懸濁液を組織の型またはその同等物に移し、３７℃、例えば、細胞培養インキュベーター内に入れた時に凝固させるステップ。
【００８９】
医薬組成物を調製する上記の方法は、さらに、（例えば、限定されないが、１〜３日以上などの）長期間、約４〜５％Ｏ２、５％ＣＯ２に等しく、窒素で平衡化した低酸素圧条件下で、この培養物をインキュベートするステップを含んでもよい。
【００９０】
別の実施形態において、本発明は、以下のステップを含む医薬組成物を調製する方法を包含する：
ａ）フィブリノゲンおよびトロンビンを含む溶液を調製するステップ；
ｂ）この溶液にＣＦ−ＳＣまたはｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣまたはｅｘＡＢＭ−ＳＣ）を再懸濁するステップ；ならびに
ｃ）この再懸濁液を開放創へ投与するステップ。
【００９１】
別の実施形態において、本発明は、以下のステップを含む医薬組成物を調製する方法を包含する：
ａ）可溶性コラーゲンと、グルタミン、炭酸水素ナトリウム、およびＨＥＰＥＳを補充した（必要に応じて、インスリン、トランスフェリン、および／またはセレンの補充を含む）無血清細胞培地を含む溶液とを調製するステップ；
ｂ）ＣＦ−ＳＣまたはｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣまたはｅｘＡＢＭ−ＳＣ）に由来する細胞上清の１つまたは複数の画分を、この溶液に混合するステップ；ならびに、
ｃ）この溶液を組織の型またはその同等物に移し、３７℃、例えば、細胞培養インキュベーター内に入れた時に凝固させるステップ。
【００９２】
医薬組成物を調製する上記の方法は、さらに、約１８〜２１％Ｏ２および５％ＣＯ２に等しい大気の酸素圧条件下で、組織の型またはその同等物をインキュベートするステップを含んでもよい。
【００９３】
別の実施形態において、本発明は、以下のステップを含む医薬組成物を調製する方法を包含する：
ａ）フィブリノゲンおよびトロンビンを含む溶液を調製するステップ；
ｂ）ＣＦ−ＳＣまたはｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣまたはｅｘＡＢＭ−ＳＣ）に由来する細胞上清の１つまたは複数の画分を、この溶液に混合するステップ；ならびに、
ｃ）この溶液を開放創へ投与するステップ。
【００９４】
別の実施形態において、本発明は、特に、（自己免疫障害などの）免疫に関連する障害、（急性および慢性両方の炎症性障害を含む）炎症、（心筋梗塞などの）虚血、（熱傷、裂傷、および擦り傷などの）外傷、（細菌、ウイルス、真菌による感染症などの）感染症、ならびに慢性皮膚創傷によって引き起こされる組織損傷の治療における組織再生を包含する。本発明は、損傷および障害、例えば、限定されないが、（例えば、神経外傷および神経変性疾患などによって引き起こされ得る）中枢神経系（脳）および末梢神経系（例えば、脊髄）の多様な神経損傷および神経障害の治療を包含する。本発明の別の実施形態では、骨、結合組織、および軟骨の再生を必要とする疾患および障害、慢性および急性の炎症性肝疾患、血管不全、ならびに角膜変性および黄斑変性の治療を包含する。本発明の別の実施形態は、（例えば、心筋虚血ならびに血管の修復および再生などの）心血管および肺の損傷および障害の治療を包含する。本発明の別の実施形態は、膵臓および肝臓の組織ならびに他の内分泌腺および外分泌腺の損傷および障害の治療を包含する。本発明の別の実施形態は、胸腺ならびに他の免疫細胞を生成し、収容する器官の損傷および障害の治療を包含する。本発明の別の実施形態は、（例えば、尿管および膀胱などの）泌尿生殖器系の損傷および障害の治療を包含する。本発明の別の実施形態は、ヘルニアおよびヘルニア組織の治療を包含する。本発明の別の実施形態は、心臓弁の治療、修復、再生、および再構築を包含する。
【００９５】
（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣまたは（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣに由来するタンパク質および細胞上清画分も、固体様コラーゲンベースのデバイスで再構成され得る。これらの細胞をこのような方法で再構成する時、この固体様コラーゲンマトリックスを数日かけて再造形し、それ自体特有なマトリックスを作るネオ組織を生じさせる。（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）かかるＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣに由来するネオ組織は、柔軟で、縫合可能であり、生理活性がある（例えば、図３８参照）。これらの構造物は、滅菌し、化学的に架橋し、凍結乾燥するか、またはさらに処理することで、これらの細胞を生き残れないように、かつさらに増殖できないようにさせることもできる。
【００９６】
かかるデバイスは、全層熱傷創傷を含む熱傷の治療に特に有益であり得る。血管新生化された創傷床を再構築するために、重度の熱傷患者は、死んだ組織の外科的切除後の人工皮膚代替物で治療される場合が多い。創傷床が癒された後に、これらの患者は、その後、宿主表皮を再成長させる目的で、上皮細胞の人工皮膚の製品またはアプリケーションで治療される。
【００９７】
本明細書に記載されるものなどの組成物は、従来の人工皮膚製品（例えば、ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴ（商標））の代わりに使用される時に、望ましくないＴ細胞媒介性免疫反応を阻害するか、または低下させることによって、その後に移植された同種の皮膚の寿命を延ばすことができる（例えば、実施例５参照）。Ｔ細胞媒介性免疫反応を調節することによって、本発明の組成物は、患者自身の皮膚の再成長を刺激するのに十分な期間、人工皮膚のその後の再適用を可能にすることができる。
【００９８】
上記のＡＢＭ−ＳＣは、以下の特性を示すことが明らかになっている：
インビトロ
・血管新生および組織修復に重要なサイトカインの分泌。
・瘢痕化およびマトリックス代謝回転の阻止および阻害のための因子の放出。
・血管新生促進活性を示す内皮細胞の遊走の促進。
インビボ
・急性心筋梗塞（ＡＭＩ）および脳卒中の複数の動物モデルにおける予後の大幅な改善。
・効果的で、良好な耐容性を示す細胞の心臓内送達または大脳内送達。
・注射後８週間、組織において細胞が検出できないこと。
・細胞に対する測定可能な免疫反応がないこと。
【００９９】
本発明の一実施形態において、（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣによって分泌される多数の再生促進性細胞因子は、（例えば、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）または脳卒中による心不全によって損傷した心臓および神経の臓器および組織などの）損傷した組織および臓器の治療、修復、再生、および／または若返りに用いることができる。これらには、図１１に示すＡＢＭ−ＳＣなどのＣＦ−ＳＣによって分泌され得る因子が含まれる。例えば、これらの因子には、ＳＤＦ−１α、ＶＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、アンギオゲニン、ＢＤＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＡＬＣＡＭ、ＭＭＰ−２、アクチビン、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１３、ＭＣＰ−１が含まれるが、これらに限定されない。図１１を参照されたい。表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃにまとめたものなどの追加の因子も、（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣによって分泌され得る。
【０１００】
（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣによる再生促進因子の分泌は、馴化細胞培地の生成を誘導するか、または患者への細胞投与の前にこれらの細胞をプライミングするための（例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）などの）刺激因子で前処理することによって、増強または誘導することができる。
【０１０１】
急性虚血、外傷または炎症は、影響を受けた臓器および組織において、様々な細胞および化学的な事象をもたらす。例えば、図１２を参照されたい。炎症段階では、損傷部位への因子の放出および細胞の流入が起こる。再生段階では、機能的な組織の適切な修復のために循環細胞の動員が起こる。線維症の段階では、臓器の機能を損なう可能性のある線維性の瘢痕の沈着が起こる。さらに、様々なサイトカインおよび他の生体分子は、これらのプロセスのそれぞれにおいて様々な役割を担っている。例えば、図１２を参照されたい。
【０１０２】
本発明における（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣの使用には、炎症を治療および予防する方法、線維症（すなわち、組織の瘢痕化）を低下させる一方で、臓器または組織の再生を刺激する方法、ならびに（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）刺激されるかまたは刺激されないＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣによって生成される組成物（例えば、サイトカイン、プロテアーゼ、細胞外マトリックスタンパク質など）により血管新生を刺激する方法が含まれる。
【０１０３】
別の実施形態において、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣは、線維症の生物学的プロセスを阻害することができる。線維症は、多くのヒト組織における創傷治癒、瘢痕化、および炎症の天然副生成物である。瘢痕組織が、最適な臓器の機能に必要である細胞を置換するので、線維性の瘢痕としても知られる線維症は、特に、心臓および中枢神経系（ＣＮＳ）における最適な機能を有する組織の再生に対して重大な障害である。本明細書に開示する細胞を用いた治療は、線維症を予防または軽減するのに役立ち、それによって、損傷を受けた組織の治癒を促進する。線維症は、膜結合細胞表面分子を含む２種類以上の分泌タンパク質または細胞生成組成物の追加的効果または相乗効果によって予防することができる。さらに、（ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）投与されたＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣによって誘導されるかまたは生成されるマトリックスプロテアーゼは、線維症を防ぐのに重要な役割を果たすことができる。
【０１０４】
本発明の別の代表的な使用において、新血管新生としても知られる血管新生が、所望の組織で増大する。新たに形成された組織は、血液供給が行われなければならないので、血管新生、すなわち新しい血管の形成は再生医療の重要な要素であり、内皮細胞が、本発明によって治療される変性過程、疾患の進行、または急性傷害の間に失われた場合には、血管新生が重要である。したがって、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）またはかかる細胞によって生成される組成物の使用は、標的組織および臓器（特に、例えば、損傷を受けた心臓組織）における血管新生を刺激するのに有用である。血管新生は、組織修復の重要な要素であり、損傷した組織の治癒を最適化するために、線維症抑制と合わせて機能することができる。
【０１０５】
本発明の別の代表的な使用は、投与細胞が生着しないで、再生または若返りのプロセスを刺激することを伴う。インビボ試験で、ヒトＡＢＭ−ＳＣまたはｅｘＡＢＭ−ＳＣの長期的細胞生着または組織特異的分化が一般的に見られないことが示され、これらの細胞が組織再生を刺激するメカニズムは、細胞置換を介するのではなく、代わりに、これらの細胞自体および／またはそれらの細胞が生成する因子に対する宿主反応を介することを示唆する。しかし、これは、骨髄におけるＡＢＭ−ＳＣの役割が、構造的および栄養的な支持を提供することであることを考えれば驚くべきことではない。したがって、本発明には、損傷した組織および臓器の治療が含まれ、その際、投与されるＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）は、永久的そして長期的な組織もしくは臓器の生着を示さない。その代わり、治療用のＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ）は、顕著なレベルまたは現在検出可能なレベルで修復組織の一部になることなく、栄養支持因子を提供し、細胞死を抑制し、線維症を阻害し、炎症（例えば、免疫細胞の炎症反応）を阻害し、細胞外マトリックスの再構築を促進し、かつ／または血管新生を刺激する。
【０１０６】
本発明の更なる例は、一定の期間後に、これらの投与細胞が実験動物のどこにも検出されないことを教示し、このことは、投与細胞が完全に身体から取り除かれることを示唆する。これは、分泌因子が、損傷組織の修復に重要な役割を果たしていることを示唆する。
【０１０７】
その有用性を示す本発明のさらに別の例において、本明細書で開示するｈＡＢＭ−ＳＣは、一人のドナーソースに由来する。このように、これらの細胞は患者における同種細胞移植物であり、これらの移植された細胞が、有害な免疫反応を刺激する可能性を示唆しているのかもしれない。しかし、驚くべきことに、本明細書で開示する移植された同種細胞は、実際に、インビトロでマイトジェン誘発性Ｔ細胞増殖を抑制し、インビボでＴ細胞依存性免疫反応の誘導を避けることができる。Ｔ細胞媒介性免疫反応は、治癒、再生、および若返りのプロセスに害を及ぼす免疫プロセスの重要な要素である。
【０１０８】
本明細書で使用する「有効量」は、組織、臓器、または生物システム（例えば、免疫系）の性能、機能、完全性、構造または組成において検出可能な改善をもたらすのに十分な量であり、前記改善は、損傷した組織、臓器または生物システムの完全なもしくは部分的な寛解、修復、補修、再生、または治癒を示す。
【０１０９】
表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃは、無血清細胞培地で継代培養した時に、ヒトＡＢＭ−ＳＣによって分泌されるサイトカイン、成長因子、可溶性受容体、およびマトリックスプロテアーゼの多数のリストを示す。培地上清濃縮物＃１＝４ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（商標））。培地上清濃縮物＃２＝インスリン−トランスフェリン−セレン−Ａ（Ｇｉｂｃｏ（商標））を補充した、４ｍＭのＬ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社）を含むＲＰＭＩ−１６４０。
【０１１０】
これらの結果は、これらの条件下で培養した時に、組織再生および免疫系の調節に重要な多数の栄養因子および可溶性受容体が、治療的に適するレベルでＡＢＭ−ＳＣによって生成されることを証明する。特に、以前の実験は、表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃに示されるものなどの分泌タンパク質レベルを達成するために、インスリン、トランスフェリン、セレンを含む基本培地の補充が必要であることを証明した。
【０１１１】
生存しているおよび生存していない生理活性デバイス
本発明の実施形態には、創傷治癒を高めるための構築物内に可溶性因子およびマトリックス沈着をもたらすことができる組織様構築物を作るＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを播種した足場の生成が含まれる。足場の特性、細胞播種、および培養条件を評価し、皮膚、骨、神経、および筋肉などの組織の修復ならびに再生を支援するのに有用な組織工学構築物を生成するように最適化する。これらの組織工学構築物は、インビボで負傷した／損傷した組織へ、治療に適する因子を送達するための製品として使用することができる。
【０１１２】
具体的には、ヒトまたは非ヒトのＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを、組織工学構築物の作製のために、コラーゲンハイドロゲルの足場内に埋め込むことができる。細胞を播種したコラーゲンゲル構築物を、インビトロ培養で維持し、細胞を調節するかまたは刺激して、これらの構築物内に関連因子を分泌し、生成することができる。培養条件／パラメータは、場合により、化学的、機械的、または電気的な刺激（例えば、低酸素圧、成長因子の添加、または培養容器の攪拌）で変化させることができる。ヒト、ブタ、またはウシ由来のコラーゲンは、例えば、限定されないが、これらの生成物を生成するのに有用であり得る。これらの構築物は、フィブリン、ヒアルロン酸、ヘパリン、アルギン酸塩、ゼラチン、キトサン、ラミニン、もしくはフィブロネクチンを含む他の天然由来のマトリックスとコラーゲンを組み合わせるか、またはコラーゲンをそれらと置換することにより、さらに発展させることができる。
【０１１３】
組織工学構築物は、ヒトまたは非ヒトのＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを播種した合成高分子の足場から生成することもできる。具体的には、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸共重合体などのＦＤＡに承認された物質は、それらの優れた生体適合性および生分解性により使用されるだろう。これらの共重合体は、特定の性質を有する複数の足場構造中で生成され得る。分解速度は、グリコール酸に対する乳酸の共重合体比を変えることによって調整することができる。組織工学構築物として有用なこれらの重合体の特定の配置には、多孔質不織メッシュが含まれるが、これに限定されない。ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを播種した重合体の足場を、これらのコラーゲン構築物と同様に培養で維持し、上記と同様の操作を使用して最適化することができる。また、これらの構築物は、重合体の足場に天然由来のマトリックスを添加するかまたは組み込むことで生成することができる。ヒトまたは非ヒトのＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを含む組織工学構築物の足場として有用な他の合成重合体には、非分解性のシリコーン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリジメチルシロキサン、ポリスルホン、ならびに分解性のポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、および他のポリエステルもしくはポリウレタンが含まれる。
【０１１４】
ヒトまたは非ヒトのＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを播種した足場を培養し、インビトロでネオ組織を形成することができる。これらの構築物を直接適用するか、または凍結保存し、後で、ヒトもしくは非ヒトの対象へ送達するために、生存している構築物として用いることができるか、または、さらに、貯蔵および患者への後の適用のために操作し、生存していない構築物に変換することができる。生存している構築物には、注射用の液体中の細胞懸濁液または注射用の半固体マトリックス、細胞を播種した注射用のマトリックス微粒子、および細胞を播種した移植用の固体構築物が含まれ得る。これらの構築物は、生存細胞および無傷のタンパク質を有する構築物を維持するために、製造時から対象に適用されるまで凍結保存することができる。これらの同じ製剤をさらに処理して、生存していない細胞を含む生存していない構築物にするが、なおその構築物内の細胞によって生成された、治療に適する因子およびマトリックスを維持している構築物を生成することもできる。構築物を生存していないようにさせる方法には、照射、タンパク質架橋結合、タンパク質安定化のための添加剤、脱細胞化などの化学修飾、または、凍結、脱水熱乾燥（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｄｒｙｉｎｇ）、および凍結乾燥などの温度操作が含まれる。特定の化学的架橋結合処理には、グルタルアルデヒド、カルボジイミド（ＥＤＣ）、ポリエポキシド化合物、ジイソシアネート、ジビニルスルホン、および天然由来のゲニピンまたはリボースが含まれる。滅菌法は、生存していないようにさせるかまたは最終滅菌用の組織工学構築物に使用されるさらなる操作であってもよく、方法には、照射、電子ビーム、またはガスプラズマ処理が含まれる。生存していない構築物を、室温で維持し、保存してもよい。
【０１１５】
本発明の実施形態には、生理活性デバイス（すなわち、組成物、物品、物体、製品、アンサンブル、コレクション、生成物など）が含まれ、これらのデバイスは、生存しているＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ、生存していないＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ、または任意の組み合わせの生存しているＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣと生存していないＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣとの両方の混合物で構成されている「生存している（ｌｉｖｉｎｇ）」（「生存している（ｌｉｖｅ）」）製品、「生存していない」製品、または生存している製品および生存していない製品の両方の組み合わせである。本発明の実施形態には、さらに、このような生存しているデバイスおよび生存していないデバイスが含まれ、これらのデバイスは、（追加の精製、単離、および／または分離のステップの有無にかかわらず）生存しているＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣならびに／または生存していないＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣに由来する成分で部分的にまたは完全に構成される。本明細書で定義される「生存していない」デバイスは、（ａ）生存していないＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを含むデバイス；（ｂ）ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを含み、これらの細胞を死滅させることを目的とした処理条件（例えば、照射、凍結、凍結融解、空気乾燥／乾燥、化学的架橋結合、加熱、凍結乾燥）にさらされているデバイスであって、前記処理が、１００％効果的であっても、そうでなくてもよい（すなわち、ある程度、生存しているＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣの画分が残っていてもよい）デバイス；ならびに（ｃ）生存しているＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣまたは生存していないＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣに由来する（例えば、分離されるか、単離されるか、または精製される）１つもしくは複数の成分を含むデバイスである。本明細書で定義する「生存している」デバイスは、生存しているＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを含むデバイスであり、その際、前記デバイスは、その中でＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣの生存率を維持することを目的とした処理条件にさらされている。本明細書で定義する「生存している」デバイスは、ある程度、一部の生存していないＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣ（すなわち、死んだＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣ）を含んでいてもよい。
【０１１６】
本発明の一実施形態において、生存しているデバイスは、ほぼ１００％生存しているＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを含む。本発明の他の実施形態において、生存しているデバイスは、約２５％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９８％以上、および約９９％以上生存しているＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを含む。
【０１１７】
本発明の一実施形態において、生存していないデバイスは、１００％またはほぼ１００％生存していない（すなわち、死んだ）ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを含んでいてもよい。本発明の他の実施形態において、生存していないデバイスは、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満、および約１％未満の生存していないＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを含んでいてもよい。
【０１１８】
本発明の実施形態は、さらに、必要な構成成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｐａｒｔｓ）の取得時に、費用効率が高く、（当業者が）組み立てるのが容易である生理活性デバイスを含む。
【０１１９】
本発明の実施形態には、（１）生分解性の足場（例えば、足場は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）で構成される）、ならびに（２）生存しているＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ、生存していないＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ、または、生存しているＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣと生存していないＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣとの混合物で構成される、あるいは（生存しているまたは生存していない）ＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣに由来する１つもしくは複数の成分で構成される皮膚様組織構築物の生理活性デバイスの生成および使用が含まれる。
【０１２０】
本発明の実施形態には、所望の生分解率を達成するために選択されるか、工学処理されるか、または改変された生理活性デバイスが含まれる。本発明の実施形態には、これらの足場または生物工学処理構築物の元の体積もしくは元の質量の約１００％、９８％、９５％、９０％、８５％、８０％または５０％が、６ヶ月以内、３ヶ月以内、１ヶ月以内、３週間以内、２週間以内、１週間以内、５日以内、３日以内、４８時間以内、２４時間以内、１２時間以内に除去されるか、吸収されるか、劣化するか、またはそうでなければ、破壊された足場または生物工学処理構築物の生分解が含まれる。
【０１２１】
本発明のさらなる実施形態には、ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを、ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣに由来する成分と併用する時に、生体適合性および生理活性について異なる物質を試験し、評価する方法が含まれる。生体適合性の試験法には、例えば、細胞生存率、細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、代謝、生存、ならびにアポトーシス活性の試験が含まれるが、これらに限定されない。かかる評価に用いられ得る方法および技術の例として、カルセイン／ＥｔｈＤ−１アッセイ、ＣＥＬＬ ＴＩＴＥＲ ＧＬＯ（商標）アッセイ、グルコース／ラクテートアッセイ、組織学的評価が挙げられるが、これらに限定されない。生理活性の試験法には、例えば、栄養因子の分泌およびマトリックス代謝回転の試験が含まれるが、これらに限定されない。かかる評価に用いられ得る方法および技術の例として、ＥＬＩＳＡ、マトリックス含有量の測定、免疫染色、および組織学的評価が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
本発明の実施形態は、所望の治療レベルの分泌因子および内在性因子を含むデバイスを生成するための細胞播種密度ならびに細胞培養条件の変化を包含する。かかるデバイスを評価するために用いられるアッセイには、例えば、目視による検査／操作、細胞の数および生存率、組織学的評価、（例えば、ＥＬＩＳＡまたはマトリックスキットを用いる）栄養因子およびマトリックス生成の測定、ならびに機能的挙動（例えば、ゲル収縮、細胞共培養アッセイ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
本発明は、さらに、コラーゲンベースの生理活性デバイスの作製法を提供する。図４０は、コラーゲンベースの生理活性デバイスを作製するためのプロセスの実施形態を示すフローチャートである。ステップ１で、細胞を、本発明の方法によって調製する。ステップ２で、本明細書に開示するとおりに、これらの細胞をコラーゲンと混合する。ステップ３で、本明細書に記載するとおりに、これらの細胞をコラーゲンと培養する。ステップ４で、これらの構築物を処理する。例えば、実施形態において、本発明の細胞を、バイオマトリックス、例えば、コラーゲン、ゲル溶液に被包する。ゲル溶液を固化した後に、実施形態において、この構築物を低酸素条件下で培養する。培養期間の終わりに、実施形態において、これらの構築物を、例えば、グルタルアルデヒドで架橋結合し、続いて、例えば、グリシンで洗浄することによって処理する。実施形態において、これらの構築物を脱水し、これらの細胞が分泌する生理活性因子を保存したままこれらの細胞を不活性にさせる。これらの構築物を、脱水状態中または再水分補給（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）後のいずれかでネオ組織および／または手術用移植片として用いることができる。脱水は完全脱水を包含する、すなわち、周囲条件下で、全ての液体がこれらの構築物から蒸発するが、必ずしも周囲湿度を下回る特定の湿度レベルまでの脱水を包含するわけではない。
【０１２４】
本発明の実施形態の一例には、約２×１０６細胞／ｍＬ、約５×１０６細胞／ｍＬまたは約６×１０６細胞／ｍＬの最終濃度で、ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬのコラーゲン（例えば、ラットまたはブタのコラーゲン）と組み合わせることが含まれるが、これに限定されない。図２７を参照されたい。図２７は、３ｍｇ／ｍＬまたは４ｍｇ／ｍＬのいずれかの濃度で、医療グレードのブタコラーゲンゲル（例えば、ＴＨＥＲＡＣＯＬ（商標）；ＳＥＷＯＮＣＥＬＬＯＮＴＥＣＨ、ソウル、韓国）内にヒトｅｘＣＦ−ＳＣを様々な密度で播種し、培地中で懸濁培養した結果を示す（各時点での各条件についてｎ＝３）。ゲル構築物の直径を、２４、４８および７２時間の時点で測定した。ｘ方向およびｙ方向の初期の直径を各時点の収縮した直径と比較することにより、表面積の収縮の割合を算出した。熱不活性化した細胞を含む対照ゲルは、ほとんど収縮しなかった。対照的に、細胞密度の増加に伴う、またコラーゲンゲル濃度の増加に伴うコラーゲンゲル収縮の用量反応があった。
【０１２５】
本発明の実施形態は、さらに、約１×１０３細胞／ｍＬ〜約１×１０７細胞／ｍＬの範囲の最終濃度で、ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣをコラーゲン（または別の生体適合性マトリックス）と組み合わせることを含む。例えば、本発明の実施形態は、約１×１０３細胞／ｍＬ以上、約１×１０４細胞／ｍＬ以上、約１×１０５細胞／ｍＬ以上、約１×１０６細胞／ｍＬ以上、約１×１０７細胞／ｍＬ以上、約２×１０３細胞／ｍＬ以上、約２×１０４細胞／ｍＬ以上、約２×１０５細胞／ｍＬ以上、約２×１０６細胞／ｍＬ以上、約３×１０３細胞／ｍＬ以上、約３×１０４細胞／ｍＬ以上、約３×１０５細胞／ｍＬ以上、約３×１０６細胞／ｍＬ以上、約４×１０３細胞／ｍＬ以上、約４×１０４細胞／ｍＬ以上、約４×１０５細胞／ｍＬ以上、約４×１０６細胞／ｍＬ以上、約５×１０３細胞／ｍＬ以上、約５×１０４細胞／ｍＬ以上、約５×１０５細胞／ｍＬ以上、約５×１０６細胞／ｍＬ以上、約６×１０３細胞／ｍＬ以上、約６×１０４細胞／ｍＬ以上、約６×１０５細胞／ｍＬ以上、約６×１０６細胞／ｍＬ以上、約７×１０３細胞／ｍＬ以上、約７×１０４細胞／ｍＬ以上、約７×１０５細胞／ｍＬ以上、約７×１０６細胞／ｍＬ以上、約８×１０３細胞／ｍＬ以上、約８×１０４細胞／ｍＬ以上、約８×１０５細胞／ｍＬ以上、約８×１０６細胞／ｍＬ以上、約９×１０３細胞／ｍＬ以上、約９×１０４細胞／ｍＬ以上、約９×１０５細胞／ｍＬ以上、約９×１０６細胞／ｍＬ以上、の最終濃度で細胞を有するコラーゲン（または別の生体適合性マトリックス）を含んでもよい。
【０１２６】
本発明の実施形態は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコラーゲン（または別の生体適合性マトリックス）と組み合わせて、任意の最終濃度でＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはそれに由来する成分）を含んでもよい。例えば、本発明の実施形態は、約０．１ｍｇ／ｍＬ以上、０．５ｍｇ／ｍＬ以上、１ｍｇ／ｍＬ以上、２ｍｇ／ｍＬ以上、３ｍｇ／ｍＬ以上、４ｍｇ／ｍＬ以上、５ｍｇ／ｍＬ以上、６ｍｇ／ｍＬ以上、７ｍｇ／ｍＬ以上、８ｍｇ／ｍＬ以上、９ｍｇ／ｍＬ以上、１０ｍｇ／ｍＬ以上、１２ｍｇ／ｍＬ以上、１５ｍｇ／ｍＬ以上、２０ｍｇ／ｍＬ以上、２５ｍｇ／ｍＬ以上、３０ｍｇ／ｍＬ以上、４０ｍｇ／ｍＬ以上、５０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度でコラーゲン（または別の生体適合性マトリックス）を有するＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはそれに由来する成分）を含んでもよい。
【０１２７】
本発明の実施形態は、所望のレベルの栄養因子（例えば、限定されないが、ＶＥＧＦ）の生成／濃度を提供するように最適化した、組み合わせる最終コラーゲン濃度、細胞濃度、および期間で、生体適合性マトリックス（例えば、限定されないが、コラーゲン）とＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣとを組みあわせることを含む。図２８を参照されたい。
【０１２８】
図２８は、４ｍｇ／ｍｌの医療グレードのブタコラーゲンゲルネオ組織の中に、２ｅ６、５ｅ６、または６ｅ６細胞／ｍＬの様々な密度でヒトｅｘＣＦ−ＳＣを播種し、１日、３日、または６日のいずれかの間、培地中で懸濁培養して得られた結果を示す（各時点での各条件についてｎ＝３）。構築物に、一日おきに新鮮な培地を補充するか、または示したところには、６日の培養期間中、補充しなかった。各時点で、ゲルを、平衡塩類溶液で３回洗浄し、急速凍結した。タンパク質抽出緩衝液中で機械的に解離させることにより、溶解物を各ゲルで作製した。ゲル溶解物にＥＬＩＳＡを用いて、ｈＡＢＭ−ＳＣコラーゲンゲル構築物内に含まれるＶＥＧＦの量（ｎｇ）を定量化した（エラーバーは、３つの別々のゲルの標準偏差を表す）。対照には、培養しないゲルのみ、２ｅ６細胞／ｍｌを播種して培養しないゲル、および熱不活性化した５ｅ６細胞／ｍｌを播種して６日間培養したゲルが含まれる。結果は、細胞密度が増加するにつれ、ゲル内に含まれるＶＥＧＦが増加することを示す。３日の培養時間が、ｈＡＢＭ−ＳＣを播種したコラーゲンゲル内に最高量のＶＥＧＦを有することを示す。
【０１２９】
本発明の代表的な実施形態として、限定されないが、ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを、約１〜約３０日の範囲の期間中、本明細書に記載の任意の細胞濃度で、本明細書に記載の任意濃度のコラーゲンと組み合わせてもよい。例えば、上記の期間は、限定されないが、約：１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２０日、２５日、および３０日であってもよい。
【０１３０】
本発明の実施形態において、ゲルネオ組織、またはゲル構築物は、１ｍｌ〜２０ｍｌ、２ｍｌ〜1０ｍｌ、３ｍｌ〜８ｍｌまたは５ｍｌ〜約７ｍｌのゲルの総容積を含む。実施形態において、このゲルの総容積は、少なくとも１ｍｌ、少なくとも２ｍｌ、少なくとも３ｍｌ、少なくとも４ｍｌ、少なくとも５ｍｌ、少なくとも６ｍｌ、少なくとも７ｍｌ、少なくとも８ｍｌ、少なくとも９ｍｌ、少なくとも１０ｍｌ、少なくとも１１ｍｌ、少なくとも１２ｍｌ、少なくとも１３ｍｌ、少なくとも１４ｍｌ、少なくとも１５ｍｌ、少なくとも１６ｍｌ、少なくとも１７ｍｌ、少なくとも１８ｍｌ、少なくとも１９ｍｌ、および少なくとも２０ｍｌである。
【０１３１】
本発明の実施形態には、ＳＣＡＦＴＥＸ（商標）ＰＬＧＡ足場（ＢＭＳ、ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ、ＬＬＣ、ロードアイランド州、米国）などの生体適合性のマトリックスおよび足場が含まれるが、これに限定されない。
【０１３２】
本発明の実施形態には、血清を含む培地、追加の成長因子および／もしくは生存因子を含む培地、タンパク質を含まない培地（すなわち、化学的に定義された培地）、または血清を含まない培地（例えば、タンパク質は補充するが、血清を補充しない培地）を用いて、生体適合性のマトリックスおよび足場の中で培養したＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
市販の足場製品の限定されない数例として、以下のものが挙げられる：
・ＢＩＯＢＲＡＮＥ（商標）（Ｂｅｒｔｅｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ.）、
・ＰＥＲＭＡＣＯＬ（商標）（ＴｉｓｓｕｅＳｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ,Ｉｎｃ.）、
・ＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標）（ＬｉｆｅＣｅｌｌＣｏｒｐ.）、
・Ｅ−Ｚ−ＤＥＲＭ（商標）（ＢｒｅｎｎｅｎＭｅｄｉｃａｌ,Ｉｎｃ.）、
・ＭＡＴＲＩＳＴＥＭ（商標）（ＭｅｄｌｉｎｅＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ,Ｉｎｃ.）、
・ＩＮＴＥＧＲＡ（商標）およびＩＮＴＥＧＲＡ（商標）Ｆｌｏｗａｂｌｅ Ｗｏｕｎｄ Ｍａｔｒｉｘ（ＩｎｔｅｇｒａＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ.）、
・ＰＲＩＭＡＴＲＩＸ（商標）（ＴＥＩＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、
・ＴＩＳＳＵＥＭＥＮＤ（商標）（ＴＥＩＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、
・ＡＬＬＯＤＥＲＭ（商標）（ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐ.）、
・ＣＹＭＥＴＲＡ（商標）（ＬｉｆｅＣｅｌｌＣｏｒｐ.）、
・ＮＥＯＦＯＲＭ（商標）（ＭｅｎｔｏｒＣｏｒｐ.）、
・ＤｅｒｍａＭａｔｒｉｘ（Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（商標）（ＭＴＦ（商標）））、
・ＧＲＡＦＴＪＡＣＫＥＴ（商標）およびＧＲＡＦＴＪＡＣＫＥＴＸＰＲＥＳＳ（商標）（ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ ＭｅｄｉｃａｌＧｒｏｕｐ）、
・ＧＡＭＭＡＧＲＡＦＴ（商標）（ＰｒｏｍｅｔｈｅａｎＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ,Ｉｎｃ.）、
・ＯＲＴＨＡＤＡＰＴ（商標）Ｂｉｏｉｍｐｌａｎｔ（ＰｅｇａｓｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃｓ,Ｉｎｃ.）。
【０１３４】
生存しているまたは生存していない細胞を含む市販の足場製品の限定されない数例として、以下のものが挙げられる：
・ＣＥＬＡＤＥＲＭ（商標）（ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏＨｅａｌｉｎｇ,Ｉｎｃ.）、
・ＬＡＳＥＲＳＫＩＮ（商標）（ＦｉｄｉａＡｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｓ.Ｒ.Ｌ.,イタリア）、
・ＰＥＲＭＡＤＥＲＭ（商標）（ＣａｍｂｒｅｘＣｏｒｐ.）、
・ＡＰＬＩＧＲＡＦ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ,Ｉｎｃ.）、
・ＯＲＣＥＬ（商標）（ＯｒｔｅｃＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ.,イスラエル）、
・ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴ（商標）（ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏｈｅａｌｉｎｇ Ｉｎｃ.）、および
・ＴＲＡＮＳＣＹＴＥ（商標）（ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏｈｅａｌｉｎｇ Ｉｎｃ.）。
【０１３５】
生存していない生理活性デバイスを生成するのに使用してもよい方法の限定されない数例として、（例えば、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、ポリエポキシド化合物、およびジビニルスルホンなどの薬剤を用いる）架橋結合処理、（室温でのデバイスの保存を可能にし、タンパク質含有量を維持する働きもする）凍結乾燥などの処理を細胞またはデバイスに施すこと；（例えば、ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴ（商標）に対して現在使用されている）１回または複数回の凍結／融解サイクルを細胞および／またはデバイスに施すこと；ならびに（細胞および／またはデバイスが凍結にさらされた時に生成される免疫原性ペプチドによって引き起こされ得る免疫原性の可能性を減少させるのを助けることもできる）脱細胞化が挙げられる。本発明の実施形態において、グルタルアルデヒドなどの少なくとも１種類の架橋剤が、０．０００９％〜０．０９％、０．００１％〜０．０８％、０．００５％〜０．０５％および０．００８％〜０．０８％の濃度でこの架橋結合反応に存在する。実施形態において、この架橋剤が、０．０１％、０．０５％または０．００５％でこの架橋結合反応に存在する。
【０１３６】
本発明は、所望のレベルの栄養因子（例えば、限定されないが、ＶＥＧＦ）の生成／濃度を提供するように最適化した、組み合わせる最終コラーゲン濃度、細胞濃度、および期間で、ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣならびに生体適合性マトリックスおよび／または生分解性マトリックス（例えば、限定されないが、コラーゲン）を含む、動物に移植するためのデバイスを提供する。かかるデバイスを、例えば、手術時に移植することができる。実施形態において、このデバイスは、脱水状態および再び水分が補給された（ｒｅｈｙｄｒａｔｅｄ）状態の両方において可撓性があり、耐久性があるなどの適切な物理的性質を有する。代表的な実施形態において、これらのデバイスは、円形またはほぼ円形であり、少なくとも２３ｍｍ、少なくとも２４ｍｍ、少なくとも２６ｍｍ、少なくとも２７ｍｍ、少なくとも２８ｍｍ、少なくとも２９ｍｍ、少なくとも３０ｍｍおよび少なくとも３５ｍｍの直径を有する。実施形態において、これらのデバイスは、少なくとも６０ｍｇ、少なくとも６５ｍｇ、少なくとも７０ｍｇ、少なくとも８０ｍｇ、少なくとも９０ｍｇ、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも１１０ｍｇ、少なくとも１１５ｍｇ、少なくとも１２０ｍｇおよび少なくとも１３０ｍｇの重さがある。
【０１３７】
実施形態において、本発明のデバイスを、ヒトを含む動物の整形外科的な傷害を予防するかまたは修復するのに用いる。実施形態において、整形外科的な傷害には、首、腕、背中、肘、手、足、膝、手首、腰、および足首への傷害が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ヒトを含む動物の腱傷害は、修復を必要とする領域にこのデバイスを接着することによって支援することができる。実施形態において、本発明のデバイスは、ほぼ長方形である。例えば、円形の断片を、身体の一部に接着させるために条片に切断することができる。実施形態において、修復の対象となる腱は、ヒトの手の中にある。実施形態において、このデバイスを、負傷した動物、例えば、ヒトの体に外科的に移植する。例えば、本発明のデバイスは、腱の周りを効果的に包み、滑らかな滑走面を提供することは明らかであるという点で、腱上（ｅｐｉ−ｔｅｎｄｉｎｏｕｓ）の修復の代替物として用いることができる。腱上の修復は、歴史的に、その修復に２０％強度を加えるので、本発明の生理活性デバイスが、これの縫合（ｔｈｉｓ  ｓｔｉｔｃｈ）の使用を排除することができる。追加の因子がこのデバイス内に埋め込まれると、屈筋腱の強度の改善および癒着形成の減少の両方が実現できる。実施形態において、例えば、軟骨細胞が埋め込まれた本発明のデバイスを、親指の関節炎の手術（ＣＭＣ関節形成）におけるスペーサーとして用いる。ＦＤＡに承認され、軟骨形成細胞からなる生理活性成分を含まない２つの主要な移植片が、現在、ＣＭＣ関節手術に用いられている。
【０１３８】
バイオアッセイの例
さらに生理活性を最適化し、本発明の細胞、細胞成分、および生理活性デバイスが実行する作用機序を検討し、さらに特定するために用いることができる様々なバイオアッセイが利用できる。限定されないが、かかるアッセイの数例として、スクラッチアッセイ、（Ａｍ.Ｊ.Ｐａｔｈｏｌ.,１５６（１）：１９３−２００（２０００）およびその中で引用されている参考文献に記載されるものなどの）インビトロモデル系として３次元皮膚構築物を用いる生理活性の評価、マクロファージ活性化の評価、および本発明の細胞および生理活性デバイスによって生成される因子の定性的および定量的な分泌プロファイルに対する追加因子の効果の評価が挙げられ得る。
【０１３９】
このスクラッチアッセイは、インビトロでの細胞移動を測定するための、簡単で低コストの、よく知られている方法である。このアッセイは、細胞培養単層を掻いて、接着細胞のないを空隙を作製することによって行われる。空隙（すなわち、擦り傷）は、この空隙を超えて移動する、かつ／または成長する細胞によって閉鎖されるので、細胞移動の開始時、ならびに細胞移動の間に、一定間隔で、空隙の画像を取得してもよい。次に、画像の比較を行い、対照治療と比較して、少なくとも１つの実験的な治療法を用いて、これらの細胞の移動速度を定量化する。図２９を参照されたい。
【０１４０】
図２９は、ｈＡＢＭ−ＳＣが、インビトロの創傷閉鎖アッセイにおいて閉鎖の割合および大きさを高める因子を生成することを証明する結果を示す。特に、単層を横切って擦り傷を作るためにピペットチップで傷をつける前に、正常なヒトケラチノサイト（ＮＨＥＫ）をコンフルエントな単層になるまで増殖させた。４時間および６時間の間隔で、擦り傷を作ったすぐ後に写真を撮り、対照培地または馴化培地でインキュベートした。創傷閉鎖の程度を、画像解析ソフトウェア（ＣＭＡ、ＭｕｓｃａｌｅＬＬＣ）を用いて、初期の写真と４時間および６時間の写真を比較し、擦り傷の領域を計算することにより決定した。閉鎖の程度を、この図で最初の傷の割合として示す。ヒトｅｘＣＦ−ＳＣ細胞が分泌する因子を有する馴化培地（完全馴化培地）は、ｈＡＢＭ−ＳＣ細胞に曝露されていない対照培地（完全培地）と比較して、閉鎖の割合が増加した。４時間および６時間の時点の両方で、ｈＡＢＭ−ＳＣ細胞のヒトｅｘＣＦ−ＳＣによって馴化された培地で処理したウェルに残っている擦り傷の領域は、対照培地で処理したものと比較して有意に減少し（それぞれ、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１）、このことは、閉鎖率および閉鎖の大きさの両方が増加したことを示す。
【０１４１】
（Ａｍ.Ｊ.Ｐａｔｈｏｌ.,１５６（１）：１９３−２００（２０００）およびその中で引用されている参考文献に記載されるものなどの）３次元皮膚構築物を用いて、例えば、皮膚の成長、発達、モデリング、リモデリング、および創傷修復に対する本発明の生理活性デバイスの効果を分析し、最適化することができる。
【０１４２】
本発明の細胞および生理活性デバイスによって生成されるタンパク質および他の化合物の定性的および定量的な分泌プロファイルに対する追加因子の効果の評価を、様々な追加因子を用いて行ってもよい。限定されないが、かかる評価の３例として、図３０、図３１、および図３２は、ＩＬ−1α（ＩＬ−１ａ）、ＴＮＦ−α（ＴＮＦａ）、およびインターフェロン−γ（ＩＦＮｇ）の分子による外因的な処理にさらされた場合、またはさらされない場合の、骨髄由来細胞によって生成される因子の分泌プロファイルに対するこれらの分子の効果を示す。
【０１４３】
図３０は、ヒトｅｘＣＦ−ＳＣを、２４時間、ＩＬ−１α（ＩＬ−１ａ）（１０ｎｇ／ｍＬ）に暴露した後に、Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ノークロス、ジョージア州、米国）のＱＵＡＮＴＩＢＯＤＹ（商標）グラス抗体アレイを用いて、馴化培地中の分泌因子を定量的に測定した結果を示す。各抗体によって検出されたタンパク質量の計算を、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社のＱアナライザーソフトウェアを用いた５点の標準曲線を用いて行った。各抗体を、陽性の対照および陰性の対照と共に、４つ組でアレイを行った。異常値を、Ｑアナライザーソフトウェアを用いて生データから自動的に排除し、平均値を決定して、タンパク質量を計算した。各バーは、３回の生物学的反復の平均値±標準偏差を表す。８つの因子（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＮＦ、ＣＸＣＬ−１６、ＭＭＰ−３、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−３ａ）は、ＩＬ−１ａ刺激時にのみ検出されたが、追加因子（例えば、ＧＤＦ−１５、ＩＬ−８、ＧＲＯ、ＭＣＰ−１）は、ＩＬ−１ａ処理により、基礎レベルを越えて少なくとも２倍誘導された。ＩＬ−１αは炎症状態で存在しているので、ヒトｅｘＣＦ−ＳＣによるこれらの因子の上方制御は、炎症の抑制、血管新生、組織再生および免疫エフェクターの動員に重要である。
【０１４４】
図３１は、ヒトｅｘＣＦ−ＳＣを、２４時間、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦａ）（１０ｎｇ／ｍＬ）に暴露した後に、Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ノークロス、ジョージア州、米国）のＱＵＡＮＴＩＢＯＤＹ（商標）グラス抗体アレイを用いて馴化培地中の分泌因子を定量的に測定した結果を示す。各抗体によって検出されたタンパク質量の計算を、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社のＱアナライザーソフトウェアによる５点の標準曲線を用いて行った。各抗体を、陽性の対照および陰性の対照と共に、４つ組でアレイを行った。異常値を、Ｑアナライザーソフトウェアを用いて生データから自動的に排除し、平均値を決定して、タンパク質量を計算した。各バーは、３回の生物学的反復の平均値±標準偏差を表す。５つの因子（すなわち、ＣＸＣＬ−１６、ＥＮＡ−７８、ＩＣＡＭ−１、ＭＩＰ−３ａ、ＲＡＮＴＥＳ）は、ＴＮＦａ刺激時にのみ検出されたが、追加の５つの因子（すなわち、ＧＤＦ−１５、ＰＩＧＦ、ＩＬ−８、ＧＲＯ、ＭＣＰ−１）は、ＴＮＦａ処理により、基礎レベルを越えて少なくとも２倍誘導された。ＴＮＦａは炎症状態で存在しているので、ｈＡＢＭＳＣによるこれらの因子の上方制御は、炎症の抑制、血管新生、組織再生および免疫エフェクターの動員に重要である。
【０１４５】
図３２は、ヒトｅｘＣＦ−ＳＣを、２４時間、インターフェロンγ（ＩＦＮｇ）（１０ｎｇ／ｍＬ）に暴露した後に、Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ノークロス、ジョージア州、米国）のＱＵＡＮＴＩＢＯＤＹ（商標）グラス抗体アレイを用いて、馴化培地中の分泌因子を定量的に測定した結果を示す。各抗体によって検出されたタンパク質量の計算を、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社のＱアナライザーソフトウェアによる５点の標準曲線を用いて行った。各抗体を、陽性の対照および陰性の対照と共に、４つ組でアレイを行った。異常値を、Ｑアナライザーソフトウェアを用いて生データから自動的に排除し、平均値を決定して、タンパク質量を計算した。各バーは、３回の生物学的反復の平均値±標準偏差を表す。２つの因子（すなわち、ＧＤＮＦおよびＣＸＣＬ１６）は、ＩＦＮｇ刺激時にのみ検出されるが、追加の２つの因子（すなわち、ＰＩＧＦおよびＭＣＰ−１）は、ＩＦＮｇ処理により、基礎レベルを越えて少なくとも２倍誘導される。ＩＦＮｇは炎症状態で存在しているので、ｈＡＢＭＳＣによるこれらの因子の上方制御は、炎症の抑制、血管新生、組織再生および免疫エフェクターの動員に重要である。
【０１４６】
図３３は、お互いに比較したｈＡＢＭ−ＳＣに対する腫瘍壊死因子α（ＴＮＦａ）、インターフェロンγ（ＩＦＮｇ）、およびインターロイキン−１α（ＩＬ−１a）の相対効果のサイドバイサイド比較を提供する。完全培地（ＡＭＥＭ＋１０％血清＋グルタミン）中で２日間、その後、培地＋ビヒクル（基礎）または培地＋１０ｎｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦａ）、インターフェロンγ（ＩＦＮｇ）もしくはインターロイキン−１α（ＩＬ−１ａ）中で、１日維持したヒトｅｘＣＥ−ＳＣの培養液から上清（ｓｐｎｔｓ）を収集した。この上清に存在する１５０以上の因子の定量分析を、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社のＱｕａｎｔｉｂｏｄｙアレイを用いて完了した。この表は、基礎および処理上清を比較したときの変化の大きさと方向を示す。数値コードを用いて、効果の大きさおよび方向に基づいて、これらの効果を５つのカテゴリーに分けた：−２＝２を越える減少、−１＝０〜−２の減少、０＝変化なし、＋１＝１０未満の誘導、＋１０＝１０〜１０００の誘導、＋１０００＝１０００を越える誘導。これらの結果は、ヒトＡＢＭ−ＳＣが異なる炎症マーカーに反応してそれらの分泌プロファイルを変更し、その結果、ヒトＡＢＭＳＣが、インビボ環境に応じて異なる効果を持つと期待できる可能性を示す。
【０１４７】
図３４は、限定されないが、示される因子の誘導が、治療効果を与えるのに有用であり得る様々な生物システムの例（例えば、血管、免疫、再生、炎症、および創傷修復のシステムならびに血管、免疫、再生、炎症、および創傷修復のメカニズム）を示す。
【０１４８】
転写物発現のゲノムプロファイルの評価を用いて、本発明の細胞および生理活性デバイスに対する細胞培養条件の効果を最適化し、分析することができる。例えば、図３５は、４％酸素で増殖させ、３０細胞／ｃｍ２で播種した線維芽細胞対２０％酸素で増殖させ、３０００細胞／ｃｍ２で播種した線維芽細胞において、約２００の転写物が、少なくとも２倍異なって発現する（ｐ≦０．０１）という事実を示すグラフである。これらの結果を、さらに、以下の表２に記載する。
【０１４９】
具体的には、異なって発現した遺伝子を、４％酸素条件下で培養し、３０細胞／ｃｍ２の細胞播種密度で継代した新生児のヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を用いて、２０％酸素条件下で培養し、３０００細胞／ｃｍ２の細胞播種密度で継代したＮＨＤＦにおける遺伝子発現と比較して同定した。約３７回の集団倍加後、低酸素（４％）で低細胞播種密度（３０細胞／ｃｍ２）または高酸素（２０％）で高細胞播種密度（３０００細胞／ｃｍ２）のいずれかの条件下で、それぞれ３つのフラスコ中で増殖させたＮＨＤＦ細胞からＲＮＡを単離した。このＲＮＡをＣｙ５で標識し、３０，９６８個のヒトプローブを含むＰｈａｌａｎｘＢｉｏｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ社（パロアルト、カリフォルニア州、米国）のヒト全ゲノムＯＮＥＡＲＲＡＹ（商標）とハイブリダイズさせた。各増殖条件下での遺伝子発現の倍数変化を、全部で３種類の３つ組の試料について決定した。少なくとも２倍異なって発現した１９６個のプローブを同定した（Ｐ≦０．０１）。このデータは、低酸素で低細胞播種密度の条件下で増殖させたｎｈＤＦが、標準的な組織培養条件と比較して、著しく異なる遺伝子発現プロファイルをもたらすことを示す。
【０１５０】
【表１】
2013528175.tif 000002
【０１５１】
再生および治療用の粉末
本発明の実施形態には、（ヒトまたは非ヒト供給源に由来する）ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣと生分解性マトリックス（例えば、コラーゲン、ＰＧＡなど）の組み合わせを用いた、インビトロでの組織（例えば、骨格筋、平滑筋、皮膚、軟骨など）の再生が含まれる。
【０１５２】
本発明の実施形態には、ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣから生成される乾燥もしくは凍結乾燥した再生用ならびに治療用の粉末の生成が含まれる。本発明の実施形態には、ＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣの成分）が組み込まれた人工組織および生物学的に適合したマトリックス（例えば、コラーゲンマトリックス）から生成される再生用ならびに治療用の粉末も含まれる。例えば、ＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ、生物学的に適合したマトリックスに組み込まれたＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣ、ならびに人工組織に組み込まれたＣＦ−ＳＣおよびｅｘＣＦ−ＳＣは、米国特許第７，３５８，２８４号（Ｇｒｉｆｆｅｙ,ｅｔ ａｌ.；これにより、参照により本明細書に組み込まれる）に記載され、さらに引用される方法にしたがって処理され、利用され得る。本発明の実施形態は、無細胞の組織マトリックスの一部として基底膜を含まないし構成もしないＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはそれに由来する成分）を含む乾燥もしくは凍結乾燥した再生用ならびに治療用の粉末を包含する。
【０１５３】
本発明の実施形態は、本発明の粉末を患者と接触させることによって、治療を必要としている患者の病状を治療することを含む。実施形態において、真皮の変形（例えば、挫瘡瘢痕、法令線）の治療のために、声帯瘢痕、（例えば、死んだ皮膚の壊死組織切除後ではあるが、皮膚弁移植前に適用される）第３度熱傷の治療のために、および／または所望の予後が、瘢痕化が殆どない、より早い治癒である全ての臨床的シナリオにおいて、本発明の再生用ならびに治療用の粉末を用いて、開放創を治療し、歯周の修復を助けるかまたは歯周の修復をもたらす。本発明の実施形態は、本明細書に記載の新しい組織を作製すること、その後、これらの組織を、治療薬として用いることができる、生存していない微粒子粉末に覆うことを含む。
【０１５４】
本発明の実施形態は、他の所望の組織を構築するために、ＥＣＭ（細胞外マトリックス）の供給源として粉末を使用することも含む。
【０１５５】
本発明の実施形態には、さらに、ヒト、または非ヒト動物において、注射、噴霧、層にすること、充填、およびケーシングによる（ｉｎ−ｃａｓｉｎｇ）インビボ適用のために、液体形態、半液体形態、または乾燥形態で粉末を調製すること、ならびに使用することが含まれる。
【０１５６】
獣医学への適用
本発明の実施形態には、（少なくとも一部が）非ヒト細胞に由来する細胞、細胞組成物、および生理活性デバイス、ならびに獣医学（すなわち、非ヒト）への適用に有用な方法も含まれる。例えば、組成物および生理活性デバイスは、限定されないが、ウマ科の動物（例えば、ウマ／ロバ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）（例えば、ブタ（ｐｉｇ））、イヌ科の動物（例えば、イヌ）、ネコ科の動物（例えば、ネコ）、ウシ科の動物（例えば、雌ウシ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）（例えば、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ））、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）（例えば、ヤギ（ｇｏａｔ））、ラクダ科の動物（例えば、ラクダ／ラマ）、およびネズミ科の動物（例えば、ラット／マウス）のカテゴリーの動物に由来するか、またはそれらの動物を治療するために用いられ得る。
【０１５７】
例として、限定されないが、ウマ科の動物（ウマ）供給源からの成体骨髄由来細胞は、低酸素（４％）および低細胞播種（６０細胞／ｃｍ２）下でインビトロ培養した時に、急速増殖ならびに高回数の細胞倍加を可能にすることが証明されている。図３６を参照されたい。
【０１５８】
特に、図３６は、ウマ科の動物（ウマ）骨髄由来体細胞の増殖の動態プロットを示す。１ヶ月齢の子ウマの上腕骨および大腿骨からの骨髄由来細胞を６０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、４％酸素で増殖させ、マスターセルバンク（ＭＣＢ）を作製した。ＭＣＢおよびその後に続く全てのワーキングセルバンク（ＷＣＢ１−ＷＣＢ３）を６０細胞／ｃｍ２で播種し、４％酸素および低細胞播種密度でウマのＡＢＭＳＣの増殖動態を決定した。ＭＣＢの合計３９回の細胞集団倍加を、増殖あたり平均８回の細胞集団倍加で４回を越える増殖を達成した。これらの結果は、ヒトＡＢＭＳＣが低酸素および低細胞播種密度の条件下で増殖するのと同様の倍加ならびに増殖動態で、ウマＡＢＭＳＣは増殖することができることを示す。
【０１５９】
さらに、上記の条件下で培養したウマ科の動物（ウマ）の成体骨髄由来の細胞集団は、表３に示す特有のタンパク質発現プロファイルを示すことが明らかになった。特に、ウマＡＢＭ−ＳＣを、マスターセルバンクおよびワーキングセルバンク中の表面マーカーの発現についてフローサイトメトリーによって特徴づけた。ウマの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ウマＡＢＭＳＣにおいて陰性であるいくつかのマーカーに対する陽性対照として用いた。これらの結果は、ウマＡＢＭＳＣが、表面マーカーのＣＤ４４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ９０、およびＣＤ１４７によって同定され得ることを示す。これらのマーカーは、全ての増殖にわたって一貫した発現を示す。さらに、ウマＡＢＭＳＣは、全ての増殖にわたってＧＭ−ＣＳＦおよびビメンチンを発現する。より低い割合で発現する他の表面マーカーは、ＣＤ１３およびＭＨＣＩである。ＰＢＭＣ上では発現するが、ウマのＡＢＭＳＣ上では発現せず、混入物の可能性を検出するのに用いることができるマーカーは、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４およびＣＤ１１ｂである。
【０１６０】
【表２】
2013528175.tif 000003
【０１６１】
ウマ科の動物（ウマ）の成体骨髄由来の細胞集団が、コラーゲンマトリックスで培養した時に、ヒトおよびブタの成体骨髄由来細胞について以前に証明されたのと同じタイプの生理活性（ゲル収縮）を示すことも証明された。例えば、図３７を参照されたい。例えば、図３７は、ウマＡＢＭ−ＳＣを１．６ｍｇ／ｍｌのラットの尾のコラーゲンゲル内に５ｅ６細胞／ｍｌで播種し、３日間、培地中で懸濁培養した時に得られた結果を示す。ゲル構築物の直径を、２４時間、４８時間、および７２時間の時点で測定した。ｘ方向およびｙ方向の最初の直径を各時点の収縮した直径と比較することによって、表面積収縮の割合を計算した。熱不活化細胞を含む対照ゲルは収縮をほとんど示さなかったが、培養３日後に、活性細胞が、これらのゲルを最初のサイズから５．８％まで著しく収縮させた。
【０１６２】
本発明の別の実施形態において、ｈＡＢＭ−ＳＣは、生体適合性の細胞マトリックス中にかなりの量のＶＥＧＦを生成することもできる。例えば、図３８は、ｅｘＣＦ−ＳＣを播種し、培養したポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）の足場内のＶＥＧＦ量を示す。細胞を、直径２ｃｍの不織ＰＬＧＡ重合体の足場上に、３ｅ６細胞または７ｅ６細胞の様々な密度で播種し、１日間、３日間、または６日間培養した。培養２日目および４日目に、構築物に新鮮な培地を補充した。各時点で、構築物を、平衡塩類溶液で３回洗浄し、急速凍結させた。タンパク質抽出緩衝液中で機械的に解離させることによって、溶解物を各構築物から作製した。構築物の溶解物にＥＬＩＳＡを用いて、ｈＡＢＭ−ＳＣ播種したＰＬＧＡ構築物内に含まれるＶＥＧＦの量（ｎｇ）を定量化した。結果は、細胞密度の増加につれて、ＰＬＧＡ構築物内に含まれるＶＥＧＦが増加することを示す。
【０１６３】
本発明の実施形態は、（ＰＬＧＡ足場などの）生体適合性マトリックス内に、約１００細胞／ｍｍ３〜約１０００００細胞／ｍｍ３の範囲の密度で播種したＡＢＭ−ＳＣ（例えば、ヒトまたは非ヒトＣＦ−ＳＣまたはｅｘＣＦ−ＳＣ）を含む。例えば、本発明の実施形態は、約１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００および１０００００細胞／ｍｍ３以上で、生体適合性マトリックス内に播種した細胞を含む。
【０１６４】
追加の再生用および治療用の組成物ならびに適用
本発明の実施形態は、（例えば、戦争中の兵士に起こるか、または熱傷もしくは高速発射体によって受けた熱傷もしくは傷害を患う他の個人において起こるものなどの）急性および慢性の外傷に関連する傷害の治療および管理のために、本発明の生理活性組成物を使用することを含む。したがって、本発明の実施形態は、熱傷の傷害、皮膚創傷、外傷性脳損傷の治療および修復に有用な方法および組成物を含む。本発明の実施形態は、（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経病理学的病状の治療を含むが、これらに限定されない）神経細胞および神経シグナル伝達の治療ならびにそれらの機能の維持のために、本発明の組成物を使用することを含む。
【０１６５】
本発明の実施形態は、例えば、乳腺切除／乳房再建術を行う患者において、切開部位の瘢痕の治癒および縮小を促進するために、外科的に誘導した傷害の治療および修復のために本発明の組成物を使用することも含む。
【０１６６】
本発明の追加の実施形態は、直接か、または（乾燥粉末、液体、半液体、ペースト、固体、もしくは半固体などの任意の最終形態で適用することができる）生体適合性マトリックスに組み込むか、生理活性組成物およびデバイスに組み込むか、再生用および治療用の粉末に組み込むかのいずれかにより、ＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはそれら由来の成分）を使用することを含み、前記使用は、特に、（限定されないが）以下のものを包含してもよい：
・生体適合性シート（すなわち、シート様マトリックス；これは、「現場での」熱傷または他の創傷に対して可動性があり、かつ迅速に適用するためにパケットに詰めることができる）に組み込まれたＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはそれら由来の成分）の使用；
・懸濁液中の（例えば、開放創にスプレーするか、注入するか、または塗ることによる適用のための）ＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはそれら由来の成分）の使用
・外傷性脳損傷などの傷害の軽減のためのＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはそれら由来の成分）の使用；
・敗血症を防ぐか、または軽減するためのＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはそれら由来の成分）の使用；
・亜急性の傷害（例えば、手足救済の改善および切断防止のために）の治癒を促進するかまたは治癒をもたらすためのＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはそれら由来の成分）の使用；
・自己の皮膚移植の予後を改善する（例えば、拒絶リスクまたは「取得の失敗」を低下させる）ためのＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはそれら由来の成分）の使用；
・外観を損なった瘢痕の縮小または修正のためのＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはそれら由来の成分）の使用；
・パーキンソン病、アルツハイマー病または他の神経学的病変の過程を遅くするためのＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはそれら由来の成分）の使用；
・慢性のおよび不十分な治癒の創傷の治癒を助けるためのＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはそれら由来の成分）の使用；
・限定的な瘢痕を縮小、改善、または除去する（例えば、可動性および生活の質を向上させる）ためのＣＦ−ＳＣおよび／もしくはｅｘＣＦ−ＳＣ（またはそれら由来の成分）の使用。
【０１６７】
・本発明の特定の実施形態において、ＡＢＭ−ＳＣは、様々な形および形態の組織工学処理構築物において有用である。例えば、図３９は、以下の写真を示す：ＡおよびＢ）生存していない機械的に安定な生理活性構築物を生成するために培養し、架橋結合した後のｈＡＢＭ−ＳＣを播種したブタコラーゲンゲル；Ｃ）生存していない薄膜生理活性構築物を生成するために培養し、脱水した後のｈＡＢＭ−ＳＣを播種したブタコラーゲンゲル；ならびにＤ）不織のＰＬＧＡ足場（左）およびｈＡＢＭ−ＳＣを播種した不織のＰＬＧＡ足場の培養構築物。
【０１６８】
本発明の追加の実施形態には、以下のものも含まれる：
・ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを播種した足場を、他の細胞型と共培養し、（例えば、神経、血管、骨、軟骨、心臓の疾患（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の治療上有用な因子の生成のために）ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣに由来する組織特異的因子の刺激を可能にする生理活性組成物およびデバイス；
・ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを播種した足場を、様々なＯ２、Ｎ２およびＣＯ２のガス比で培養し、さらに所望の生理活性に最適化する組成物およびデバイス（これは、低酸素状態、大気状態、または過酸素状態をもたらすために、培養構築物と接触する空気中に存在する様々な割合の酸素を含み得る）；
・ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを播種した足場を、様々な培地条件下で培養し、さらに所望の生理活性に最適化する組成物およびデバイス（これは、増殖因子タンパク質、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、糖、脂肪酸、および緩衝剤などの化学因子の追加の変動を含み得る）；
・特定の形態の天然マトリックスまたは合成高分子にＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを播種するか、または患者への細胞（またはそれらに由来する成分）のマイクロキャリア送達ビヒクル用に、ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを特定の形態に被包する組成物およびデバイス。さらに、ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣを用いて、インビトロで生成した特定の形態の組織工学処理構築物および足場を、患者への担体送達ビヒクル用に、生存可能なＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣと組み合わせて使用する；
・ＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣから生成した組織工学処理構築物および足場を用いて、生理活性フィルム、包帯、パッチ、縫合糸、メッシュ、またはラップを生産することができる。これらの構築物の多数の形状、サイズ、および厚さを、特定の適用のために設計することができる。包帯またはパッチは、損傷した皮膚組織を覆うために適用することができる。可撓性のある構築物を、生理活性ラップとして使用し、骨、靭帯、腱、神経、および筋肉などのより不規則な形状の組織を囲むことができる；
・培養中のＣＦ−ＳＣおよび／またはｅｘＣＦ−ＳＣならびにマトリックス足場の配置を、細胞のカプセル化、足場の外側の周囲に播種する細胞、細胞から足場に因子を分泌するための細胞−足場の並置を含む異なる構築物の調製のために特異的に設計することができる。
【０１６９】
免疫障害
本発明の細胞および組成物を用いて、とりわけ、免疫疾患、自己免疫疾患、および炎症性疾患ならびに免疫障害、自己免疫障害、および炎症性障害を予防し、治療し、かつ／または改善することができる。かかる障害の数例を以下に示す：これらのリストは、単なる例示であり、全ての免疫疾患、自己免疫疾患、および炎症性疾患ならびに免疫障害、自己免疫障害、および炎症性障害に関して包括的であることを意図せず、以下のものは、本発明の細胞および組成物で治療することができる病状に関して制限するものとして解釈されるべきではない。
【０１７０】
完全なまたは部分的な自己免疫原因を有するいくつかの疾患の例：急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、セリアック病、クローン病、１型真性糖尿病、妊娠性類天疱瘡（Ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、川崎病、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、視神経炎、オード甲状腺炎（Ｏｒｄ’ｓｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、天疱瘡、悪性貧血、多発性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、ライター症候群、シェーグレン症候群、高安動脈炎、（「巨細胞性動脈炎」としても知られる）側頭動脈炎、温式自己免疫性溶血性貧血、およびヴェーゲナー肉芽腫症。
【０１７１】
自己免疫に関連すると疑われているいくつかの疾患の例：全身性脱毛症、ベーチェット病、シャーガス病、慢性疲労症候群、自立神経障害、子宮内膜症、化膿性汗腺炎、間質性膀胱炎、ライム病、モルフェア、神経性筋強直症、ナルコレプシー、乾癬、サルコイドーシス、強皮症、潰瘍性大腸炎、白斑、および外陰部痛。
【０１７２】
いくつかの免疫過敏性の疾患および障害の例：アレルギー性喘息、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎（「枯草熱」）、アナフィラキシー、重症筋無力症、血管浮腫、アルサス反応、アトピー性皮膚炎（湿疹）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性悪性貧血、セリアック病、接触性皮膚炎（例えば、ツタウルシ毒発疹（ｐｏｉｓｏｎｉｖｙ ｒａｓｈ）、好酸球増加症、胎児赤芽球症、農夫肺（アルサス型反応））、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、新生児溶血性疾患、免疫複合体糸球体腎炎、免疫性血小板減少症、重症筋無力症、天疱瘡、リウマチ熱、関節リウマチ、血清病、亜急性細菌性心内膜炎、ハンセン病の諸症状、マラリアの諸症状、結核の諸症状、全身性エリテマトーデス、側頭動脈炎、輸血反応、移植片拒絶、および蕁麻疹（Ｕｒｔｉｃａｒｉａ）（蕁麻疹（ｈｉｖｅｓ））。
【０１７３】
いくつかの炎症性障害の例：アレルギー、強直性脊椎炎、関節炎、ぜんそく、自閉症腸炎、自己免疫疾患、ベーチェット病、慢性炎症、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、乾癬、乾癬性関節炎、再灌流傷害、関節リウマチ、移植片拒絶反応、および血管炎。
【０１７４】
いくつかの免疫不全障害の例：（Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症および選択的免疫グロブリン欠損症などの）Ｂ細胞欠損症、（ディジョージ症候群（胸腺形成不全）、慢性粘膜皮膚カンジダ症、高ＩｇＭ症候群、インターロイキン１２受容体欠損症などの）Ｔ細胞欠損症、（重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群、および毛細血管拡張性運動失調などの）Ｔ細胞とＢ細胞の複合異常、（遺伝性血管浮腫または遺伝性血管神経性浮腫および発作性夜間ヘモグロビン尿症などの）補体欠損症、（白血球接着不全症、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、チェディアック東症候群、ヨブ症候群（高ＩｇＥ症候群）、周期性好中球減少症、ミエロペルオキシダーゼ欠損症、ブドウ糖−６−リン酸脱水素酵素欠損症、およびインターフェロンγ欠損症などの）食細胞欠乏症（Ｐｈａｇｏｃｙｔｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）、ならびに一般変異型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、Ｖｉｃｉ症候群、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）。
【０１７５】
本発明の実施形態
本発明の特定の実施形態には、以下のものが含まれる。
【０１７６】
Ａ１．治療有効量の１つまたは複数の生物学的組成物を対象へ投与する方法であって、自己複製コロニー形成細胞の単離集団を前記対象へ投与することを含み、前記細胞集団中の細胞は、実質的に多分化能をもたず、前記細胞が正常核型を有し、前記細胞が不死化されない方法。
【０１７７】
Ａ２．治療有効量の１つまたは複数の生物学的組成物を対象へ投与する方法であって、
（ｉ）自己複製コロニー形成細胞の単離集団によって生成される１つまたは複数の生物学的組成物を単離すること；および
（ｉｉ）前記１つまたは複数の生物学的組成物を前記対象へ投与すること
を含み、前記細胞集団の細胞は、実質的に多分化能をもたず、前記細胞が正常核型を有し、前記細胞が不死化されない方法。
【０１７８】
Ａ３．対象の損傷組織を修復するか、治療するか、または損傷組織の再生を促進する方法であって、有効量の自己複製コロニー形成細胞の単離集団を前記対象に投与することを含み、前記細胞集団の細胞は、実質的に多分化能をもたず、前記細胞が正常核型を有し、前記細胞が不死化されない方法。
【０１７９】
Ａ４．対象の損傷組織を修復するか、治療するか、または損傷組織の再生を促進する方法であって、
（ｉ）自己複製コロニー形成細胞の単離集団によって生成される１つまたは複数の生物学的組成物を単離すること；および
（ｉｉ）前記１つまたは複数の生物学的組成物を前記対象へ投与すること
を含み、前記細胞集団の細胞は、実質的に多分化能をもたず、前記細胞が正常核型を有し、前記細胞が不死化されない方法。
【０１８０】
Ａ５．対象の炎症性活性、免疫活性、または自己免疫活性を治療するかまたは低下させる方法であって、有効量の自己複製コロニー形成細胞の単離集団を前記対象に投与することを含み、前記細胞集団の細胞は、実質的に多分化能をもたず、前記細胞が正常核型を有し、前記細胞が不死化されない方法。
【０１８１】
Ａ６．対象の炎症性活性、免疫活性、または自己免疫活性を治療するかまたは低下させる方法であって、
（ｉ）自己複製コロニー形成細胞の単離集団によって生成される１つまたは複数の生物学的組成物を単離すること；および
（ｉｉ）前記１つまたは複数の生物学的組成物を前記対象へ投与すること
を含み、前記細胞集団の細胞は、実質的に多分化能をもたず、前記細胞が正常核型を有し、前記細胞が不死化されない方法。
【０１８２】
Ａ７．投与前に、前記細胞集団の細胞に多分化能を失わせるのに十分な多数の集団倍加の間、前記細胞集団をインビトロで継代する、実施形態Ａ１〜Ａ６のいずれかに記載の方法。
【０１８３】
Ａ８．前記細胞集団が単能性の分化能（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ）を有する、実施形態Ａ１〜Ａ７のいずれか１つに記載の方法。
【０１８４】
Ａ９．前記細胞が実質的な自己複製能を有する、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれかに記載の方法。
【０１８５】
Ａ１０．投与前に、多数の集団倍加の間、実質的な自己複製能を保持しながら、前記細胞集団をインビトロで継代する、実施形態Ａ１〜Ａ９のいずれかに記載の方法。
【０１８６】
Ａ１１．前記単離細胞集団の細胞が胚性幹細胞ではない、実施形態Ａ１〜Ａ１０のいずれか１つに記載の方法。
【０１８７】
Ａ１２．前記単離細胞集団の細胞が、幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）、や線維芽細胞ではない、実施形態Ａ１〜Ａ１１のいずれか１つに記載の方法。
【０１８８】
Ａ１３．前記細胞が、ａ）骨細胞；ｂ）脂肪細胞；およびｃ）軟骨細胞からなる群から選択される１つまたは複数の細胞型に分化しない、実施形態Ａ１〜Ａ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０１８９】
Ａ１４．前記細胞が、骨誘導性条件下での治療後に、検出可能なレベルのカルシウムを沈着させない、実施形態Ａ１〜Ａ１３のいずれか１つに記載の方法。
【０１９０】
Ａ１５．前記骨誘導性条件が、外から供給されるノギンへの暴露を含む、実施形態Ａ１４に記載の方法。
【０１９１】
Ａ１６．前記単離細胞集団の細胞が結合組織に由来する、実施形態Ａ１〜Ａ１５のいずれか１つに記載の方法。
【０１９２】
Ａ１７．前記単離細胞集団の細胞が間質細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
【０１９３】
Ａ１８．前記単離細胞集団の細胞がＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現する、実施形態Ａ１〜Ａ１７のいずれか１つに記載の方法。
【０１９４】
Ａ１９．前記細胞集団が、複数のインビトロ細胞倍加を通して、ほぼ一定の倍加速度を維持する、実施形態Ａ１〜Ａ１８のいずれか１つに記載の方法。
【０１９５】
Ａ２０．前記細胞が、ａ）ＣＤ１０；ｂ）ＳＴＲＯ−１；およびｃ）ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ−１からなる群から選択される１つまたは複数の抗原の検出可能な発現に関して陰性である、実施形態Ａ１〜Ａ１９のいずれか１つに記載の方法。
【０１９６】
Ａ２１．前記細胞が、ａ）ＣＤ４４；ｂ）ＨＬＡクラス−１抗原;およびｃ）β（ベータ）２−ミクログロブリンからなる群から選択される１つまたは複数の抗原の検出可能な発現に関して陽性である、実施形態Ａ１〜Ａ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０１９７】
Ａ２２．前記細胞が、ａ）ＴＮＦ−ＲＩ；ｂ）可溶性ＴＮＦ−ＲＩ；ｃ）ＴＮＦ−ＲＩＩ；d）可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ；ｅ）ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト；およびｆ）ＩＬ−１８結合タンパク質からなる群から選択される検出可能な量の組成物を発現するかまたは分泌する、実施形態Ａ１〜Ａ２１のいずれか１つに記載の方法。
【０１９８】
Ａ２３．前記細胞が、表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃに示す組成物からなる群から選択される検出可能な量の組成物を発現するかまたは分泌する、実施形態Ａ１〜Ａ２１のいずれか１つに記載の方法。
【０１９９】
Ａ２４．前記単離細胞集団の細胞が、最初に、ａ）骨髄；ｂ）脂肪組織／脂肪；ｃ）皮膚；ｄ）胎盤；ｅ）臍帯；ｆ）腱；ｇ）靭帯；ｈ）筋膜；およびｉ）他の結合組織からなる群から選択される組織源から単離される、実施形態Ａ１〜Ａ２３のいずれか１つに記載の方法。
【０２００】
Ａ２５．前記組織源がヒトである、実施形態２４に記載の方法。
【０２０１】
Ａ２６．前記細胞集団が、以下のものからなる群から選択される多数のインビトロ細胞倍加を通して、ほぼ一定の倍加速度を維持する、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれか１つに記載の方法：
ａ）１〜５回の細胞倍加；ｂ）５〜１０回の細胞倍加；ｃ）１０〜２０回の細胞倍加；ｄ）２０〜３０回の細胞倍加；ｅ）３０〜４０回の細胞倍加；ｆ）４０〜５０回の細胞倍加；ｇ）１〜５０回の細胞倍加；ｈ）５〜５０回の細胞倍加；ｉ）１０〜５０回の細胞倍加；ｊ）２０〜５０回の細胞倍加；ｋ）３０〜５０回の細胞倍加；ｌ）１〜１０回の細胞倍加；ｍ）１〜２０回の細胞倍加；ｎ）１〜３０回の細胞倍加；ｏ）１〜４０回の細胞倍加；ｐ）５〜２０回の細胞倍加；ｑ）５〜３０回の細胞倍加；ｒ）５〜４０回の細胞倍加；ｓ）１０〜３０回の細胞倍加；ｔ）１０〜４０回の細胞倍加；およびｕ）２０〜４０回の細胞倍加。
【０２０２】
Ａ２７．前記細胞集団が、以下ものからなる群から選択される多数の集団倍加を受ける、実施形態Ａ１〜Ａ２６のいずれか１つに記載の方法：
ａ）少なくとも約１０回の集団倍加；ｂ）少なくとも約１５回の集団倍加；ｃ）少なくとも約２０回の集団倍加；ｄ）少なくとも約２５回の集団倍加；ｅ）少なくとも約３０回の集団倍加；ｆ）少なくとも約３５回の集団倍加；ｇ）少なくとも約４０回の集団倍加；ｈ）少なくとも約４５回の集団倍加；ｉ）少なくとも約５０回の集団倍加。
【０２０３】
Ａ２８．前記１つまたは複数の生物学的組成物が、前記細胞集団の細胞表面において、またはその細胞表面に結合している、実施形態Ａ１〜Ａ２７のいずれか１つに記載の方法。
【０２０４】
Ａ２９．前記１つまたは複数の生物学的組成物が、前記細胞集団の細胞外環境へ分泌される、実施形態Ａ１〜Ａ２８のいずれか１つに記載の方法。
【０２０５】
Ａ３０．前記１つまたは複数の生物学的組成物が、ａ）タンパク質；ｂ）炭水化物；ｃ）脂質；ｄ）脂肪酸；ｅ）脂肪酸誘導体；ｄ）気体、およびｅ）核酸からなる群から選択される１つまたは複数の分子である、実施形態Ａ１〜Ａ２９のいずれか１つに記載の方法。
【０２０６】
Ａ３１．前記タンパク質が、ａ）糖化タンパク質；ｂ）サイトカイン；ｃ）ケモカイン；ｄ）リンホカイン；ｅ）増殖因子；ｆ）栄養因子；ｇ）形態形成タンパク質；およびｈ）ホルモンからなる群から選択される、実施形態Ａ３０に記載の方法。
【０２０７】
Ａ３２．前記１つまたは複数の生物学的組成物が、以下のものからなる群から選択される分子に結合し、かつそれらの分子の生理活性を不活性化するかまたは低下させる、実施形態Ａ３１に記載の方法：
ａ）脂肪酸；ｂ）脂肪酸誘導体；ｃ）受容体分子；ｄ）サイトカイン；ｅ）ケモカイン；ｆ）リンホカイン；ｇ）増殖因子；ｈ）栄養因子；ｉ）形態形成タンパク質；およびｊ）ホルモン。
【０２０８】
Ａ３３．前記１つまたは複数の生物学的組成物が、以下のものからなる群から選択される同族リガンドに結合する可溶性受容体である、実施形態Ａ３２に記載の方法：
ａ）脂肪酸；ｂ）脂肪酸誘導体；ｃ）受容体分子；ｄ）サイトカイン；ｅ）ケモカイン；ｆ）リンホカイン；ｇ）増殖因子；ｈ）栄養因子；ｉ）形態形成タンパク質；およびｊ）ホルモン。
【０２０９】
Ａ３４．前記細胞が、１つまたは複数の生物学的組成物の発現を増加させるように誘導される、実施形態Ａ１〜Ａ３３のいずれか１つに記載の方法。
【０２１０】
Ａ３５．前記細胞が、１つまたは複数の生物学的組成物を発現するように誘導される、実施形態Ａ１〜Ａ３３のいずれか１つに記載の方法。
【０２１１】
Ａ３６．前記１つまたは複数の生物学的組成物が、表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃから選択される、実施形態Ａ１〜Ａ２９のいずれか１つに記載の方法。
【０２１２】
Ａ３７．前記１つまたは複数の生物学的組成物が以下のものからなる群から選択される、実施形態Ａ１〜Ａ２９のいずれか１つに記載の方法：
ａ）ＴＮＦ−ＲＩ；ｂ）可溶性ＴＮＦ−ＲＩ；ｃ）ＴＮＦ−ＲＩＩ；Ｄ）可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ；ｅ）ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト；およびｆ）ＩＬ−１８結合タンパク質。
【０２１３】
Ａ３８．前記細胞集団の細胞が、生存している哺乳類生物に投与される時、組織もしくは臓器において、または組織もしくは臓器と長期の生着を示さない、実施形態Ａ１〜Ａ３７のいずれか１つに記載の方法。
【０２１４】
Ａ３９．前記細胞集団の細胞が、１つまたは複数の治療上有用な組成物のほぼ一定のレベルのインビボ生産を維持する、実施形態Ａ１〜Ａ３８のいずれか１つに記載の方法。
【０２１５】
Ａ４０．前記生産レベルが、以下のものからなる群から選択される一定時間中維持される、実施形態Ａ３９に記載の方法：
ａ）少なくとも約２４時間；ｂ）少なくとも約４８時間；ｃ）少なくとも約７２時間；ｄ）少なくとも約４日間；ｅ）少なくとも約５日間；ｆ）少なくとも約６日間；ｇ）少なくとも約７日間；ｈ）少なくとも約２週間；ｉ）少なくとも約３週間；ｊ）少なくとも約４週間；ｋ）少なくとも約１カ月；ｌ）少なくとも約２カ月；ｍ）少なくとも約３カ月：ｎ）少なくとも約６カ月；およびｏ）少なくとも約１年。
【０２１６】
Ａ４１．前記患者がヒトである、実施形態Ａ１〜Ａ４０のいずれか１つに記載の方法。
【０２１７】
Ａ４２．前記方法が、以下のものからなる群から選択される疾患または障害を治療するために用いられる、実施形態Ａ１〜Ａ４１のいずれか１つに記載の方法。
ａ）神経の疾患または障害；ｂ）心臓の疾患または障害；ｃ）皮膚の疾患または障害；ｄ）骨格筋の疾患または障害；ｅ）呼吸器の疾患または障害；ｆ）肝臓の疾患または障害；ｇ）腎臓の疾患または障害；ｈ）尿生殖器系の疾患または障害；ｉ）膀胱の疾患または障害；ｊ）内分泌の疾患または障害；ｋ）造血の疾患または障害；ｌ）膵臓の疾患または障害；ｍ）糖尿病：ｎ）眼の疾患または障害；ｏ）網膜の疾患または障害；ｐ）胃腸の疾患または障害；ｑ）脾臓の疾患または障害；ｒ）免疫疾患または免疫障害；ｓ）自己免疫疾患または自己免疫障害；ｔ）炎症性疾患または炎症性障害；ｕ）過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害、およびｖ）癌。
【０２１８】
Ａ４３．前期細胞が、遺伝子改変された、実施形態Ａ１〜Ａ４２のいずれか１つに記載の方法。
【０２１９】
Ａ４４．前期細胞が、組換え核酸分子の導入によって遺伝子改変された、実施形態Ａ４３に記載の方法。
【０２２０】
Ａ４５．実施形態Ａ１〜Ａ４７のいずれか１つに記載の単離細胞集団を作製するプロセスであって、
ｉ）生物から細胞供給源集団を得ること；および
ｉｉ）前記細胞供給源集団をインビトロで培養すること
を含むプロセス。
【０２２１】
Ｂ１．自己複製コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）、かかる細胞由来の馴化細胞培地、および精製された天然の細胞外マトリックスもしくは血漿タンパク質、または単離された組換え型の細胞外マトリックスもしくは血漿タンパク質の薬学的に許容される混合物を含む組成物。
【０２２２】
Ｂ２．前記ＣＦ−ＳＣが骨髄由来である、実施形態Ｂ１に記載の組成物。
【０２２３】
Ｂ３．前記ＣＦ−ＳＣがヒト由来である、実施形態Ｂ１またはＢ２に記載の組成物。
【０２２４】
Ｂ４．前記ＣＦ−ＳＣがヒトを含む成体哺乳類に由来する、実施形態Ｂ１〜Ｂ３のいずれか１つに記載の組成物。
【０２２５】
Ｂ５．前記ＣＦ−ＳＣが、表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃに示す１つまたは複数の分泌タンパク質を発現する、実施形態Ｂ１〜Ｂ４のいずれか１つに記載の組成物。
【０２２６】
Ｂ６．前記細胞外マトリックスまたは血漿タンパク質が、以下のものからなる群から選択される分子の１つまたは複数の全長もしくはオールターナティブプロセシングされたアイソフォーム、タンパク質分解断片、またはサブユニットを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ５のいずれか１つに記載の組成物：
ａ）コラーゲン；ｂ）エラスチン；ｃ）フィブロネクチン；ｄ）ラミニン；ｅ）エンタクチン（ニドジェン）；ｆ）ヒアルロン酸；ｇ）ポリグリコール酸（ＰＧＡ）；ｈ）フィブリノゲン（第Ｉ因子）；ｉ）フィブリン；ｊ）プロトロンビン（第ＩＩ因子）；ｋ）トロンビン；ｌ）抗トロンビン；ｍ）組織因子  ＶＩＩａのコファクター（第ＩＩＩ因子）：ｎ）プロテインＣ；ｏ）プロテインＳ；ｐ）プロテインＺ；ｑ）プロテインＺ関連プロテアーゼインヒビター；ｒ）ヘパリンコファクターＩＩ；ｓ）第Ｖ因子（プロアクセレリン、不安定因子）；ｔ）第ＶＩＩ因子；ｕ）第ＶＩＩＩ因子；ｖ）第ＩＸ因子；ｗ）第Ｘ因子；ｘ）第ＸＩ因子；ｙ）第ＸＩＩ因子；ｚ）第ＸＩＩＩ因子；ａａ）フォン・ヴィルブランド因子；ａｂ）プレカリクレイン；ａｃ）高分子量キニノーゲン；ａｄ）プラスミノーゲン；ａｅ）プラスミン；ａｆ）組織プラスミノーゲン活性化因子；ａｇ）ウロキナーゼ；ａｈ）プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１；およびａｉ）プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−２。
【０２２７】
Ｂ７．さらに、精製した天然のサイトカインもしくはケモカインまたは単離した組換え型のサイトカインもしくはケモカインを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ６のいずれか１つに記載の組成物。
【０２２８】
Ｂ８．前記細胞外マトリックス、血漿タンパク質、サイトカイン、および／またはケモカインがヒトに由来する、実施形態Ｂ１〜Ｂ７のいずれか１つに記載の組成物。
【０２２９】
Ｂ９．前記薬学的に許容される混合物が、半固体マトリックスまたは固体マトリックスを形成する、実施形態Ｂ１〜Ｂ８のいずれか１つに記載の組成物。
【０２３０】
Ｂ１０．損傷組織を、実施形態Ｂ１〜Ｂ８のいずれか１つに記載の組成物で治療する方法であって、前記組成物が液体である方法。
【０２３１】
Ｂ１１．前記液体が注射によって適用される、実施形態Ｂ１０に記載の方法。
【０２３２】
Ｂ１２．損傷組織を、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の組成物で治療する方法であって、前記組成物が液体として適用されるが、その後、半固体マトリックスまたは固体マトリックスを形成する方法。
【０２３３】
Ｂ１３．前記組織が、以下のものからなる群から選択される病状の結果として損傷を受ける、実施形態Ｂ１０〜Ｂ１２に記載の方法：
ａ）疾患；ｂ）物理的外傷；ｃ）虚血；ｄ）加齢；ｅ）熱傷；ｆ）細菌感染；ｇ）ウイルス感染；ｈ）真菌感染；およびｉ）免疫系の調節不全。
【０２３４】
Ｂ１４．前記損傷組織が皮膚である、実施形態Ｂ１３に記載の方法。
【０２３５】
Ｂ１５．顔面皮膚の若返りのための、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の組成物の使用法。
【０２３６】
Ｂ１６．前記組成物が急性炎症を阻害する、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の組成物の使用法。
【０２３７】
Ｃ１．損傷を受けた臓器または組織を治療するか、修復するか、再生するか、または治癒する方法であって、前記損傷を受けた臓器または組織の前記治療、修復、再生、または治癒を達成するために、前記損傷を受けた臓器または組織を、有効量の自己複製コロニー形成体細胞またはかかる細胞から生成される組成物と接触させることを含む方法。
【０２３８】
Ｃ２．前記損傷を受けた臓器または組織を、以下のものからなる群から選択される手段によって、有効量の自己複製コロニー形成体細胞またはかかる細胞から生成される組成物と接触させる、実施形態Ｃ１に記載の方法：
ａ）損傷を受けた臓器または組織への注射；ｂ）損傷を受けた臓器または組織上への適用；ｃ）損傷を受けた臓器または組織の近位の部位への注射；ｄ）損傷を受けた臓器または組織の近位の部位への適用；ｅ）静脈内投与。
【０２３９】
Ｃ３．前記細胞が骨髄に由来する、実施形態Ｃ１またはＣ２に記載の方法。
【０２４０】
Ｃ４．前記細胞がヒトである、実施形態Ｃ１〜Ｃ３のいずれか１つに記載の方法。
【０２４１】
Ｃ５．前記細胞または前記細胞によって生成される組成物が、（細胞性自己免疫などの）有害な免疫反応、線維症（瘢痕化）および／または有害な組織リモデリング（例えば、心室リモデリング）を阻害するかまたは低下させる、実施形態Ｃ１〜Ｃ４のいずれか１つに記載の方法。
【０２４２】
Ｃ６．前記細胞または前記細胞によって生成される組成物が、炎症を制御し、かつ／または急性炎症を阻害する、実施形態Ｃ１〜Ｃ５のいずれか１つに記載の方法。
【０２４３】
Ｃ７．前記細胞または前記細胞によって生成される組成物が、血管新生を刺激するかまたは増強する、実施形態Ｃ１〜Ｃ５のいずれか１つに記載の方法。
【０２４４】
Ｃ８．前記細胞が、前記損傷を受けた臓器または組織内へと、顕著なレベルまたは検出可能なレベルの永久的な生着や長期の生着を示さない、実施形態Ｃ１〜Ｃ５のいずれか１つに記載の方法。
【０２４５】
Ｃ９．前記損傷を受けた臓器が、心臓、脳、および脊髄からなる群から選択される、実施形態Ｃ１〜Ｃ８のいずれか１つに記載の方法。
【０２４６】
Ｃ１０．前記損傷を受けた組織が、心臓組織、（中枢神経系組織および末梢神経系組織を含む）神経組織、（主要な動脈、静脈、および毛細血管ならびにマイナーな動脈、静脈、および毛細血管を含む）血管組織からなる群から選択される、実施形態Ｃ１〜Ｃ８のいずれか１つに記載の方法。
【０２４７】
Ｄ１．インビトロで新しい赤血球の生成を誘発する、増強する、かつ／または維持する方法。
【０２４８】
Ｄ２．前記誘発、増強、または維持が、自己複製コロニー形成細胞と造血前駆細胞との共培養によって達成される、実施形態Ｄ１に記載の方法。
【０２４９】
Ｄ３．前記自己複製コロニー形成細胞がヒト骨髄由来体細胞（ｈＡＢＭ−ＳＣ）である、実施形態Ｄ２に記載の方法。
【０２５０】
Ｄ４．前記ｈＡＢＭ−ＳＣが成人由来である、実施形態Ｄ３に記載の方法。
【０２５１】
Ｄ５．前記共培養が、前記自己複製コロニー形成細胞からの造血前駆細胞の分離を維持するために半透過性のバリアーを利用する一方で、前記バリアーを越えて前記自己複製コロニー形成細胞によって生成される組成物の交換を可能する、実施形態Ｄ１〜Ｄ３のいずれか１つに記載の方法。
【０２５２】
Ｄ６．前記誘発、増強、または維持が、自己複製コロニー形成細胞によって生成される単離した組成物と造血前駆細胞との共培養によって達成される、実施形態Ｄ１に記載の方法。
【０２５３】
Ｄ７．前記自己複製コロニー形成細胞がヒト骨髄由来体細胞（ｈＡＢＭ−ＳＣ）である、実施形態Ｄ５に記載の方法。
【０２５４】
Ｄ８．前記ｈＡＢＭ−ＳＣが成人由来である、実施形態Ｄ６に記載の方法。
【０２５５】
Ｄ９．前記単離した組成物が凍結乾燥される、実施形態Ｄ５〜Ｄ７のいずれか１つに記載の方法。
【０２５６】
Ｄ１０．前記単離した組成物が凍結保存される、実施形態Ｄ５〜Ｄ７のいずれか１つに記載の方法。
【０２５７】
Ｄ１１．前記単離した組成物が、１つまたは複数の薬学的に許容される担体と混合される、実施形態Ｄ５〜Ｄ７のいずれか１つに記載の方法。
【０２５８】
Ｄ１２．細胞由来の組成物および／または栄養因子を生成し、単離し、精製し、かつ／または包装をする方法。
【０２５９】
Ｄ１３．馴化培地を生成する方法であって、前記培地が血清を含むか、または無血清培地である方法。
【０２６０】
Ｄ１４．馴化培地から画分および／または細胞由来の組成物を単離し、精製する方法であって、前記培地が血清を含むか、または無血清培地である方法。
【０２６１】
Ｄ１５．ＣＤ３４＋臍帯血細胞（ＣＢＣ）を単離し、凍結保存し、かつ／または増殖させる方法。
【０２６２】
Ｄ１６．前記ＣＢＣを懸濁培養で増殖させる、実施形態Ｄ１５に記載の方法。
【０２６３】
Ｄ１７．前記ＣＢＣを、自己複製コロニー形成細胞の支持細胞層と共培養することによって増殖させる、実施形態Ｄ１５に記載の方法。
【０２６４】
Ｄ１８．前記自己複製コロニー形成細胞がヒト骨髄由来体細胞（ｈＡＢＭ−ＳＣ）である、実施形態Ｄ１７に記載の方法。
【０２６５】
Ｄ１９．デキストロースを含む平衡塩類溶液（ＢＳＳＤ）を含む洗浄液。
【０２６６】
Ｄ２０．前記デキストロースが約４．５％デキストロースの濃度である、実施形態Ｄ１９に記載の洗浄液。
【０２６７】
Ｄ２１．さらに、ヒト血清アルブミンを含む、実施形態Ｄ１９またはＤ２０に記載の洗浄液。
【０２６８】
Ｄ２２．前記ヒト血清アルブミンが約５％ヒト血清アルブミンの濃度である、実施形態Ｄ２１に記載の洗浄液。
【０２６９】
Ｄ２３．平衡塩類溶液中にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびヒト血清アルブミンを含む凍結保存培地。
【０２７０】
Ｄ２４．前記ＤＭＳＯ濃度が約５％であり、前記ＨＳＡ濃度が約５％である、実施形態Ｄ２３に記載の凍結保存培地。
【０２７１】
Ｅ１．骨髄由来の単離細胞集団であって、前記細胞集団の細胞の約９１％超がＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現し、約３０時間未満の倍加速度を有する細胞集団。
【０２７２】
Ｅ２．前記細胞集団がヒト骨髄由来である、実施形態Ｅ１に記載の単離細胞集団。
【０２７３】
Ｅ３．ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現する前記細胞集団の細胞が、ＣＤ３４および／またはＣＤ４５を発現しない、実施形態Ｅ１またはＥ２に記載の単離細胞集団。
【０２７４】
Ｅ４．ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現する前記細胞集団の細胞が、ＧＡＴＡ−４、Ｉｒｘ４、およびＮｋｘ２．５からなる群から選択される少なくとも１つの心臓関連転写因子をさらに発現する、実施形態Ｅ１、Ｅ２、またはＥ３のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
【０２７５】
Ｅ５．ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現する前記細胞集団の細胞が、以下のものからなる群から選択される少なくとも１つの栄養因子をさらに発現する、実施形態Ｅ１、Ｅ２、またはＥ３のいずれか１つに記載の単離細胞集団：
ａ）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；
ｂ）シスタチン−Ｃ；
ｃ）インターロイキン−６（ＩＬ−６）；
ｄ）インターロイキン−７（ＩＬ−７）；
ｅ）インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）；
ｆ）神経成長因子（ＮＧＦ）；
ｇ）ニュートロフィン−３（ＮＴー３）；
ｈ）マクロファージ化学誘因物質タンパク質−１（ＭＣＰ−１）；
ｉ）マトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）；
ｊ）幹細胞因子（ＳＣＦ）；および
ｋ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）。
【０２７６】
Ｅ６．ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現する前記細胞集団の細胞が、ｐ２１またはｐ５３をさらに発現し、その際、ｐ５３の発現が、１８ｓｒＲＮＡの１０６個の転写物あたりｐ５３の最高で約３０００個の転写物の相対的発現であり、ｐ２１の発現が、１８ｓ ｒＲＮＡの１０６個の転写物あたりｐ２１の最高で約２０，０００個の転写物の相対的発現である、実施形態Ｅ１、Ｅ２、またはＥ３のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
【０２７７】
Ｅ７．前記単離細胞集団を、以下のものからなる群から選択される多数の集団倍加を通してインビトロ培養する、実施形態Ｅ１、Ｅ２、またはＥ３のいずれか１つに記載の単離細胞集団：
ａ）少なくとも約１５回の集団倍加；
ｂ）少なくとも約２０回の集団倍加；
ｃ）少なくとも約２５回の集団倍加；
ｄ）少なくとも約３０回の集団倍加；
ｅ）少なくとも約３５回の集団倍加；および
ｆ）少なくとも約４０回の集団倍加。
【０２７８】
Ｅ８．骨髄由来の単離細胞集団を作製する方法であって、前記細胞集団の細胞の約９１％超がＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現し、前記細胞集団が約３０時間未満の倍加速度を有し、以下のステップを含む方法：
ａ）低酸素条件または低酸化ストレス条件下で前記細胞集団の供給源を培養し、接着細胞集団を生成するステップ；および
ｂ）約２５００細胞／ｃｍ２未満の播種密度で前記接着細胞集団を培養するステップ。
【０２７９】
Ｅ９．前記細胞集団がヒト骨髄に由来する、実施形態Ｅ８に記載の方法。
【０２８０】
Ｅ１０．実施形態８のパートａ）に記載の細胞集団の供給源を、以下のものからなる群から選択される初期播種密度で培養する、実施形態Ｅ８またはＥ９に記載の方法：
ａ）約７５０００細胞／ｃｍ２未満；および
ｂ）約５００００細胞／ｃｍ２未満。
【０２８１】
Ｅ１１．実施形態８のパートｂ）に記載の接着細胞集団を、以下のものからなる群から選択される播種密度で培養する、実施形態Ｅ８〜Ｅ１０のいずれか１つに記載の方法：
ａ）約２５００細胞／ｃｍ２未満；
ｂ）約１０００細胞／ｃｍ２未満；
ｃ）約１００細胞／ｃｍ２未満；
ｄ）約５０細胞／ｃｍ２未満；および
ｅ）約３０細胞／ｃｍ２未満。
【０２８２】
Ｅ１２．前記低酸素条件が以下のものからなる群から選択される、実施形態Ｅ８〜Ｅ１１のいずれか１つに記載の方法：
ａ）約１〜１０％の酸素；
ｂ）約２〜７％の酸素；
ｄ）約２０％未満の酸素；
ｃ）約１５％未満の酸素；
ｄ）約１０％未満の酸素；
ｅ）約５％未満の酸素；および
ｆ）約５％の酸素。
【０２８３】
Ｅ１３．前記細胞集団の供給源を培養する前に、前記細胞集団の供給源中の赤血球を溶解することをさらに含む、実施形態Ｅ８〜Ｅ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０２８４】
Ｅ１４．前記細胞集団の供給源を培養する前に、密度勾配を通過させることによって分画した供給源の前記細胞集団を、選択することをさらに含む、実施形態Ｅ８〜Ｅ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０２８５】
Ｅ１５．ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現する前記細胞集団の細胞が、ＣＤ３４および／またはＣＤ４５を発現しない、実施形態Ｅ８〜Ｅ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０２８６】
Ｅ１６．ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現する前記細胞集団の細胞が、ＧＡＴＡ−４、Ｉｒｘ４、およびＮｋｘ２．５からなる群から選択される少なくとも１つの心臓関連転写因子をさらに発現する、実施形態Ｅ８〜Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
【０２８７】
Ｅ１７．ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現する前記細胞集団の細胞が、以下のものからなる群から選択される少なくとも１つの栄養因子をさらに発現する、実施形態Ｅ８〜Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法：
ａ）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；
ｂ）シスタチン−Ｃ；
ｃ）インターロイキン−６（ＩＬ−６）；
ｄ）インターロイキン−７（ＩＬ−７）；
ｅ）インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）；
ｆ）神経成長因子（ＮＧＦ）；
ｇ）ニュートロフィン−３（ＮＴ−３）；
ｈ）マクロファージ化学誘因物質タンパク質−１（ＭＣＰ−１）；
ｉ）マトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）；
ｊ）幹細胞因子（ＳＣＦ）；および
ｋ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）。
【０２８８】
Ｅ１８．ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現する前記細胞集団の細胞が、ｐ２１またはｐ５３をさらに発現し、その際、ｐ５３の発現が、１８ｓｒＲＮＡの１０６個の転写物あたりｐ５３の最高で約３０００個の転写物の相対的発現であり、ｐ２１の発現が、１８ｓ ｒＲＮＡの１０６個の転写物あたりｐ２１の最高で約２０，０００個の転写物の相対的発現である、実施形態Ｅ８〜Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
【０２８９】
Ｅ１９．前記単離細胞集団を、以下のものからなる群から選択される多数の集団倍加を通してインビトロ培養する、実施形態Ｅ８〜Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法：
ａ）少なくとも約１５回の集団倍加；
ｂ）少なくとも約２０回の集団倍加；
ｃ）少なくとも約２５回の集団倍加；
ｄ）少なくとも約３０回の集団倍加；
ｅ）少なくとも約３５回の集団倍加；
ｆ）少なくとも約４０回の集団倍加。
【０２９０】
Ｅ２０．以下のものからなる群から選択される疾患を患うヒトを治療するための薬剤の製造における、実施形態Ｅ１〜Ｅ７のいずれか１つに記載の単離細胞集団の使用：
ａ）変性疾患；
ｂ）急性損傷疾患；
ｃ）神経学的疾患；
ｄ）心臓疾患。
【０２９１】
Ｅ２１．変性疾患または急性損傷疾患を患うヒトを治療するための薬剤の製造における、実施形態Ｅ１〜Ｅ７のいずれか１つに記載の単離細胞集団の使用。
【０２９２】
Ｅ２２．骨髄由来の単離細胞集団であって、前記細胞集団の細胞の約９１％超がＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現する、低酸素条件下で約３０時間未満の倍加速度を有する細胞集団。
【０２９３】
Ｅ２３．前記細胞集団がヒト骨髄由来である、実施形態Ｅ２２に記載の単離細胞集団。
【０２９４】
Ｅ２４．前記低酸素条件が約１〜１０％の酸素である、実施形態Ｅ２２またはＥ２３に記載の単離細胞集団。
【０２９５】
Ｅ２５．前記低酸素条件が約５％の酸素である、実施形態Ｅ２４に記載の単離細胞集団。
【０２９６】
Ｅ２６．前記細胞集団を、約２５００細胞／ｃｍ２未満の播種密度で接着細胞集団として培養する、実施形態Ｅ２２〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
【０２９７】
Ｅ２７．前記播種密度が約１０００細胞／ｃｍ２未満である、実施形態Ｅ２２〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
【０２９８】
Ｅ２８．前記播種密度が約１００細胞／ｃｍ２未満である、実施形態Ｅ２２〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
【０２９９】
Ｅ２９．前記播種密度が約５０細胞／ｃｍ２未満である、実施形態Ｅ２２〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
【０３００】
Ｅ３０．前記播種密度が約３０細胞／ｃｍ２未満である、実施形態Ｅ２２〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の単離細胞集団。
【０３０１】
Ｅ３１．単離細胞集団を作製する方法であって、前記細胞集団の細胞の約９１％超がＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現する、約３０時間未満の倍加速度を有し、以下のステップを含む方法：
ａ）ヒトから骨髄細胞を吸引するステップ；
ｂ）骨髄吸引物の赤血球成分を溶解するステップ；
ｃ）組織培養デバイス中に非溶解性骨髄細胞を播種するステップ；
ｄ）非溶解性骨髄細胞を表面に接着させるステップ；
ｅ）５％酸素条件下で接着細胞を培養するステップ；
ｆ）３０細胞／ｃｍ２の播種密度で前記接着細胞を継代するステップ。
【０３０２】
Ｅ３２．実施形態Ｅ３１に記載の方法によって取得できる単離細胞集団。
【０３０３】
Ｅ３３．実施形態Ｅ３１に記載の方法によって取得した単離細胞集団。
【０３０４】
Ｅ３４．単離細胞集団を作製する方法であって、前記細胞集団の細胞の約９１％超がＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０を共発現し、前記細胞集団が３０回の細胞倍加後に約３０時間未満の倍加速度を有し、以下のステップを含む方法：
ａ）ヒトから骨髄細胞を吸引するステップ；
ｂ）密度勾配を通過させることによって分画した供給源の前記細胞集団を、選択するステップ；
ｃ）組織培養デバイス中に分画細胞を播種するステップ；
ｄ）前記分画細胞を表面に接着させるステップ；
ｅ）５％酸素条件下で接着細胞を培養するステップ；
ｆ）３０細胞／ｃｍ２の播種密度で前記接着細胞を継代するステップ。
【０３０５】
Ｅ３５．実施形態Ｅ３４に記載の方法によって取得できる単離細胞集団。
【０３０６】
Ｅ３６．実施形態Ｅ３４に記載の方法によって取得した単離細胞集団。
【０３０７】
実施例
実施例１
成人骨髄由来体細胞の生理活性：
無血清の馴化培地の生成
無血清の馴化培地を、（以下に記載の）分泌タンパク質の固相抗体捕捉などのアッセイにおいて使用するために、以下に記載のとおりに生成した。ヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号ＲＥＣＢ−８１９；約４３回の集団倍加の時点の）を解凍し、４ｍＭのＬ−グルタミン（カタログ番号ＳＨ３００３４．０１、ロット番号１３４−７９４４（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ.、ローガン、ユタ州、米国））を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ（商標）カタログ番号１２４９１−０１５、ロット番号１２１６０３２（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ.、カールスバッド、カリフォルニア州、米国））、または４ｍＭのＬ−グルタミンを含み、インスリン−トランスフェリン−セレン−Ａ（ＩＴＳ）（ＧＩＢＣＯ（商標）カタログ番号５１３００−０４４、ロット番号１３４９２６４）を補充したＨｙＱ（登録商標）ＲＰＭＩ−１６４０（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）カタログ番号ＳＨ３０２５５．０１、ロット番号ＡＲＣ２５８６８）のいずれかに再懸濁した。次に、細胞懸濁液を、Ｔ−２２５ｃｍ２ＣＥＬＬＢＩＮＤ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ.、ニューヨーク州、米国）培養フラスコ（培養表面を、特許権を有するマイクロ波プラズマプロセスで処理した；米国特許第６，６１７，１５２号参照）(ｎ＝３）に、培地３６ｍＬ中２０，０００細胞／ｃｍ２で播種した（条件あたりｎ＝３）。培養物を、３７℃の加湿した、３種類のガスを有するインキュベーター（窒素で平衡化した４％Ｏ２、５％ＣＯ２）内に約２４時間置いた。次に、接着していないデブリを除去するのと同じ日に、培養物に新鮮な培地を再供給し、インキュベーターに戻した。３日目に、細胞培地を、製造業者の取扱説明書に従って、２０ｍＬＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（商標）ＰＬＵＳ−２０遠心濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ.、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）を用いて濃縮した。簡単に説明すると、濃縮器を、４５分間、１１４０×Ｇで遠心分離した。濃縮上清を、きれいな２ｍＬのクライオバイアルに移し、−８０℃で保存した。新鮮な培地も、陰性の対照として使用するために、記載のとおりに濃縮した。次に、これらの細胞を、０．２５％ブタトリプシンＥＤＴＡ（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標）；カタログ番号３０−００４−Ｃ１（ＭｅｄｉａｔｅｃｈＩｎｃ.、ハーダン、バージニア州、米国））を用いて、これらのフラスコから取り除いた。次に、トリプシンを、等容積の１０％ウシ胎仔血清を含む細胞培地を加えることによって中和した。細胞の数および生存率の分析を、それぞれ、ＣＯＵＬＴＥＲ（商標）ＡｃＴ１０シリーズアナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、フラートン、カリフォルニア州）およびトリパンブルー排除アッセイを用いて行った。
【０３０８】
２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うために、（ロット番号ＰＣＨ６２７；約２７回の集団倍加時の）ヒトＡＢＭ−ＳＣを解凍し、４ｍＭのＬ−グルタミン（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）；カタログ番号ＳＨ３００３４．０１、ロット番号１３４−７９４４）を補充したＨｙＱ（登録番号）最小必須培地（ＭＥＭ）、アルファ改良（ＡｌｐｈａＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）；カタログ番号ＳＨ３０２６５．０１、ロット番号ＡＳＡ２８１１０）、または４ｍＭのＬ−グルタミン（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）；カタログ番号ＳＨ３００３４．０１、ロット番号１３４−７９４４）を補充したＲＰＭＩ１６４０（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）；カタログ番号ＳＨ３０２５５．０１）のいずれかに再懸濁した。次に、細胞懸濁液を、Ｔ−２２５ｃｍ２ＣＥＬＬＢＩＮＤ（商標）培養フラスコ（ｎ＝３）中、培地３６ｍＬに２４，０００〜４０，０００細胞／ｃｍ２で播種した（条件あたりｎ＝３）。培養物を、３７℃の加湿した、３種類のガスを有するインキュベーター（窒素で平衡化した４％Ｏ２、５％ＣＯ２）内に約２４時間置いた。接着していないデブリを除去するのと同じ日に、培養物に新鮮な培地を再供給し、次に、インキュベーターに戻した。次の日に、馴化培地を収集し、プールし、１５分間、１１４０×Ｇで遠心分離し、細胞デブリを除去し、次に、−８０℃での短期保存のために無菌の遠心管に移した。
【０３０９】
実施例２
分泌因子の２次元（２−Ｄ）ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分離（図１）
馴化培地および対照培地の凍結した一定分量（試料）を、分析のためにＫｅｎｄｒｉｃｋ Ｌａｂｓ社（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ Ｌａｂｓ,Ｉｎｃ.）（マジソン、ウィスコンシン州）に送った。使用前に、試料を解凍し、室温まで温めた。各試料約５０ｍＬを凍結乾燥し、次に、ＳＤＳ煮沸緩衝液（５％ドデシル硫酸ナトリウム、５％β−メルカプトエタノール、１０％グリセロールおよび６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８）２００μＬおよび超純水２ｍＬに再溶解した。次に、これらの試料を、６，０００〜８，０００ＭＷＣＯ膜を用いて、２日間、４℃で、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０に対して透析した。最後の透析は、水のみを用いて行った。これらの試料を再び凍結乾燥し、ＳＤＳ煮沸緩衝液２００μＬに再溶解し、ゲルにロードする前に、５分間、煮沸水浴中で加熱した。
【０３１０】
２次元ゲル電気泳動を、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ,Ｐ.Ｈ.,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２５０：４００７−４０２１,１９７５）の方法に従って、以下のとおりに行った。等電点電気泳動を、最初、２．０％アンフォライン、ｐＨ３．５〜１０（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社,Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ,ＮＪ）を用いて、２０，０００ボルト−時間で、内径２．０ｍｍのガラス管の中で行った。次に、ＩＥＦ内部標準（トロポミオシン）５０ｎｇを各試料に加えた。このトロポミオシン標準をゲル上の基準点として用い、これは、ＭＷ３３，０００およびｐＩ５．２のより低いポリペプチドスポットを有する二重線として移動する。アンフォラインのこのセットのためのチューブゲルのｐＨ勾配を、表面ｐＨ電極を用いて決定した。
【０３１１】
緩衝液０（１０％グリセロール、５０ｍｍジチオスレイトール、２．３％ＳＤＳ、０．０６２５Ｍ  ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８）の中で１０分間平衡化した後、各チューブゲルを、１２％アクリルアミドスラブゲル（厚さ１．０ｍｍ）の上部に置かれた濃縮用ゲルの上部に封着した。ＳＤＳスラブゲル電気泳動を、２５ｍＡで約５時間行った。以下のタンパク質（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.）を、分子量標準物質として、このゲルのアガロース部分（このアガロースは、チューブゲルとスラブゲルの間に位置付けられる）の単一ウェルに加えた：ミオシン（２２０，０００ダルトン）、ホスホリラーゼＡ（９４，０００ダルトン）、カタラーゼ（６０，０００ダルトン）、アクチン（４３，０００ダルトン）、炭酸脱水酵素（２９，０００ダルトン）、およびリゾチーム（１４，０００ダルトン）。銀染色後に、これらの標準物質は、アクリルアミドスラブゲルの塩基性縁部上のバンドとして現れる（Ｏａｋｌｅｙｅｔ ａｌ.Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１０５：３６１−３６３,１９８０）。次に、このゲルを、２枚のセロファン紙の間で、酸性末端を左側にして乾燥させた（図１）。ゲルを質量分析で使用する場合、ゲルを、Ｏ’ＣｏｎｎｅｌｌおよびＳｔｕｌｔｓ（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌａｎｄ Ｓｔｕｌｔｓ.Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ.１８：３４９−３５９,１９９７）の銀染色法を用いて染色する。
【０３１２】
これらの結果は、提供した方法を用いて、ヒトＡＢＭ−ＳＣを動物血清が無い状態で培養すると、分泌タンパク質に富む馴化培地を生成することができ、かかるタンパク質を、それぞれ同定し、単離することができることを示す。もう１つの方法として、このように生成された馴化培地を、様々な分子量に基づいて発現タンパク質を分画することによって処理することもできる。タンパク質濃縮および分画の技術は、当業者に周知であり、日常的に用いられている。これらの技術には、親和性クロマトグラフィー、中空糸濾過、２Ｄ  ＰＡＧＥ、および低吸収限外濾過（ｌｏｗ−ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）などの技術が含まれる。
【０３１３】
実施例３Ａ
ヒトＡＢＭ−ＳＣによる再生促進性サイトカインの分泌
ヒトＡＢＭ−ＳＣを、ＡＦＧ１０４培地を含む細胞培養「Ｔ」フラスコに、６，０００生存細胞／ｃｍ２で、３つ組で播種した。２４時間、細胞を接着させ、平衡化した後に、培地を完全に交換し、フラスコを７２時間インキュベートした。培地を収集し、遠心分離し、市販の比色分析ＥＬＩＳＡアッセイキットを用いてサイトカインについて分析するまで、−８０℃で保存した。分泌サイトカイン放出の分析については、７２時間のインキュベーションの最後の２４時間に、１０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを加えることによって、姉妹フラスコを処理した。それぞれのロットについて、基本条件および刺激条件に対して、３ロットのフラスコの細胞および上清を、独立して調製し、処理し、貯蔵し、それぞれ、基本フラスコＡ、基本フラスコＢおよび基本フラスコＣまたは刺激フラスコＡ、刺激フラスコＢおよび刺激フラスコＣと名付けた。
【０３１４】
結果は、継代培養した時に、血管新生、炎症および創傷治癒を増強することが知られている、潜在的に治療濃度のいくつかの増殖因子およびサイトカインを、ＡＢＭ−ＳＣが分泌することを示す。図１１を参照されたい。したがって、ＡＢＭ−ＳＣは、血管新生促進因子（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒ）（例えば、ＳＤＦ−１α、ＶＥＧＦ、ＥＮＡ−７８およびアンジオゲニン）、免疫調節物質（例えば、ＩＬ−６およびＩＬ−８）ならびに瘢痕阻害因子／創傷治癒調節因子（例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３およびアクチビン−Ａ）を含むいくつかのサイトカインおよび増殖因子をインビトロで一貫して分泌することが示された。さらに、これらの因子のいくつかの放出は、急性組織傷害の過程中に放出される既知の炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）によって調節される。
【０３１５】
実施例３Ｂ
分泌因子の固相捕捉および同定（表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃ）
馴化培地を、サイトカイン、プロテアーゼ、および可溶性受容体などの様々なタンパク質の存在について、ＲＡＹＢＩＯ（商標）ヒトサイトカイン抗体アレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ,Ｉｎｃ.、ノークロス、ジョージア州、米国）を用いる固相抗体捕捉タンパク質アレイによってスクリーニングした。簡単に説明すると、馴化培地の凍結した一定分量を、使用前に解凍し、室温まで温めた。アレイ膜を、８ウェルトレイ（Ｃシリーズ１０００）のウェルに入れた。各ウェルに、１×ブロッキング緩衝液（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ,Ｉｎｃ.）２ｍＬを加え、次に、室温で３０分間インキュベートし、これらの膜をブロッキングした。次に、ブロッキング緩衝液を各容器から静かに取り除き、次に、これらの膜を、室温で１時間、（ブロッキング緩衝液で１：１０に希釈した）馴化培地と共にインキュベートした。新しい細胞培地を、ＰＢＳの代わりに陰性の対照として用いた。次に、試料を各容器から静かに取り除き、１×洗浄緩衝液Ｉ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ,Ｉｎｃ.）２ｍＬを用いて、５分間振盪しながら、室温で３回洗浄した。次に、アレイ膜を、１×ブロッキング緩衝液で調製したビオチン結合２次抗体１ｍＬと共に１ウェルに入れ、室温で１時間インキュベートした。次に、アレイを洗浄緩衝液で数回洗浄した。１×ブロッキング緩衝液で１：１０００に希釈したＨＲＰ結合ストレプトアビジン２ｍＬを各膜に加え、次に、室温で２時間インキュベートした。次に、膜を１×洗浄緩衝液で数回洗浄した。化学発光用検出試薬を、製造業者（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ,Ｉｎｃ.）の取扱説明書に従って調製し、各膜に適用し、室温で２分間インキュベートした。次に、膜をプラスチックシート上に、タンパク質側を上にして置いた。次に、膜の反対側を、別の１枚のプラスチックシートで覆った。プラスチックのしわを伸ばすことによって、空気の泡をこれらの膜から除いた。次に、これらの膜をｘ線フィルム（ＫｏｄａｋＸ−ＯＭＡＴ ＡＲ（商標）フィルム）に暴露し、次に、フィルム現像液を用いて処理した。
【０３１６】
表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃは、無血清細胞培地中で継代培養した時に、ヒトＡＢＭ−ＳＣによって分泌されるサイトカイン、増殖因子、可溶性受容体、およびマトリックスプロテアーゼの広範囲に及ぶリストである。培地上清濃縮物＃１＝４ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ（商標））。培地上清濃縮物＃２＝４ｍＭのＬ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社）を含み、インスリン−トランスフェリン−セレン−Ａ（Ｇｉｂｃｏ（商標））を補充したＲＰＭＩ−１６４０。
【０３１７】
これらの結果は、これらの条件下で培養した時に、組織再生および免疫系の調節に重要な多数の栄養因子および可溶性受容体が、ＡＢＭ−ＳＣによって生成されることを示す。特に、前の実験は、基本培地にインスリン、トランスフェリンおよびセレンを補充することが、表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃに示したものなどの分泌タンパク質レベルを達成するのに必要であることを示した。表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃに示したタンパク質レベルを、ＲＡＹＢＩＯ（商標）ヒトサイトカイン抗体アレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を用いて評価した。値を、平均光学密度（Ｏ.Ｄ.）として表す。（試験試料についてＮ＝２、対照についてＮ＝４）。（＋）と報告される値は、それぞれの陰性の対照の平均Ｏ．Ｄ.値を超える２標準偏差より大きい特定の検体の平均Ｏ．Ｄ.値を示す。（−）と報告される値は、それぞれの陰性の対照の平均Ｏ．Ｄ.値を超える２標準偏差以下の特定の検体の平均Ｏ．Ｄ.値を表す。
【０３１８】
【表３−１】
2013528175.tif 000004
【表３−２】
2013528175.tif 000005
【表３−３】
2013528175.tif 000006
【表３−４】
2013528175.tif 000007
【表３−５】
2013528175.tif 000008
【表３−６】
2013528175.tif 000009
【表３−７】
2013528175.tif 000010
【０３１９】
実施例４
成人骨髄由来体細胞の生理活性
分泌因子によって増強したインビトロでの神経発生
最初に、最終濃度３．０ｍｇ／ｍＬで、０．１Ｎの酢酸にラット尾部コラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を再懸濁することによって、コラーゲンのストック溶液を調製した。次に、このコラーゲンベースの培地を、本明細書に記載したとおり、Ｂｅｌｌｅｔ ａｌ.,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ,ｖｏｌ.７６,ｎｏ.３,ｐｐ.１２７４−１２７８（Ｍａｒｃｈ １９７９）に記載されるものに少し変更を加えて、調製した。簡単に説明すると、このラット尾部コラーゲン溶液と、５ｍＭのＬ−グルタミン（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））、抗生剤−抗真菌剤溶液（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））を補充した５×ＤＭＥＭ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と、緩衝液（０．０５Ｎ ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、２．２％ ＮａＨＣＯ３（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社）、および６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社））とを４．７:２．０:３．３の比で混合することによってコラーゲン培地を調製した。このコラーゲン細胞懸濁液約５００μＬを、２４ウェル培養プレートの各ウェルに加えた。次に、この２４ウェルプレートを、３７℃の加湿した、３種類のガスを有するインキュベーター（窒素で平衡化した４％Ｏ２、５％ＣＯ２）内に１時間入れ、このコラーゲン溶液を凝結させた。凍結したラットＰＣ−１２を解凍し、４ｍＭのＬ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標））を補充し、インスリン−トランスフェリン−セレン−Ａ（Ｇｉｂｃｏ（商標）を補充したＲＰＭＩ−１６４０の中で洗浄し、２５℃で５分間、３５０×ｇで遠心分離した。１３６ｎｇ／ｍＬのラットβ−ＮＧＦ（β−ＮＧＦ）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社）、（陰性の対照として用いる）馴化していない濃縮ＲＰＭＩ−１６４０／ＩＴＳ培地の１：５０希釈液、および馴化した濃縮ＲＰＭＩ−１６４０／インスリン−トランスフェリン−セレン−Ａ（ＩＴＳ）培地の１：５０希釈液を含む場合と含まない場合で、細胞ペレットを７５，０００生存細胞／ｍＬの濃度で同じ溶液に再懸濁した（培地を、実施例１に記載のとおりに馴化した；馴化した陰性の対照培地および馴化していない陰性の対照培地を、実施例１に記載のとおりに濃縮した）。次に、細胞懸濁液１ｍＬを、各コホートに対して２つのゲル（１ｍＬゲル）のそれぞれの表面の全域に均一に分注し、次に、位相差顕微鏡法によって確認した。次に、これらのプレートを、３７℃の加湿した、３種類のガスを有するインキュベーター（窒素で平衡化した４％Ｏ２、５％ＣＯ２）内に入れた。使用済みの培地を、３日ごとに新鮮な培地と交換した。画像を１０日目に撮った。図２を参照されたい。
【０３２０】
これらの結果は、ヒトＡＢＭ−ＳＣによって生成される馴化培地を補充した時に、ＰＣ１２の、ＮＧＦによる神経細胞への分化が著しく増強されることを示す。興味深いことに、培養物中の軸索および神経突起の数によって評価した場合、神経分化の程度は、馴化培地を単独で加えた時には、顕著ではなかった。多少の神経突起伸長が、ＮＧＦ単独の存在下で観察されたが、馴化培地を培養物に補充すると、神経突起の数および長さの両方が著しく増大した。発明者らの研究所の以前の研究から、試験した全ての標準的な、公開された実験条件下で、インスリン、トランスフェリン、およびセレンをＲＰＭI培地に補充することが、ＰＣ１２の神経分化に重大な意味をもつことが示された。これらのデータは、ヒトＡＢＭ−ＳＣによって馴化した培地が、ＲＰＭＩ／ＩＴＳ培地を単独で用いて、またはＮＧＦを含むＲＰＭＩ／ＩＴＳ培地を用いて得られるレベルを超えて、神経突起伸長を補うかまたは誘導する成分を含むことを示す。図２を参照されたい。
【０３２１】
実施例５
成人骨髄由来体細胞の生理活性
インビトロでのマイトジェン誘発性Ｔ細胞増殖の阻害
ヒトＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号ＲＥＣＢ８０１、約１８回の集団倍加時）およびｅｘＡＢＭ−ＳＣ（ＲＥＣＢ９０６、約４３回の集団倍加時）を、４ｍＭのグルタミンおよび血清ロット選択し、γ線照射した１０％ウシ胎仔血清（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標））を補充した完全培地（最小必須培地−α（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標））中６０００生存細胞／ｃｍ２の濃度で７５ｃｍ２フラスコに入れ、３７℃の加湿した、３種類のガスを有するインキュベーター（窒素で平衡化した４％Ｏ２、５％ＣＯ２）内でインキュベートした。２４時間後、使用済み培地を吸引し、新鮮な培地１５ｍＬと交換した。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、カタログ番号ＰＴ２５０１、ロット番号６Ｆ３８３７、現在、ＬｏｎｚａＧｒｏｕｐ Ｌｔｄ．、バーゼル、スイスが所有しているＣａｍｂｒｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社から入手）を、間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ（商標）；ＬｏｎｚａＧｒｏｕｐ Ｌｔｄ．、バーゼル、スイス）１５ｍＬ中６０００生存細胞／ｃｍ２の濃度で７５ｃｍ２フラスコに入れ、大気Ｏ２および５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で、３７℃でインキュベートした。２４時間後、使用済み培地を吸引し、新しいＭＳＣＧＭ（商標）１５ｍＬと交換した。培養９６時間後に、ヒトＡＢＭ−ＳＣ（ｈＡＢＭ−ＳＣ）およびｈＭＳＣの両方を収集した。収集したｈＡＢＭ−ＳＣおよびｈＭＳＣを、９６ウェル丸底プレートに、ＲＰＭＩ完全培地（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標））中２５，０００生存細胞／ｍＬの濃度でプレーティングした。ヒト末梢血単核球（ＰＭＢＣ）を、１．２５μＭのカルボキシフルオレセインサクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）中で標識し、ｈＭＳＣ（ロット番号ＲＥＣＢ８０１）、（ロット番号ＲＥＣＢ９０６の）ｈＡＢＭ−ＳＣと共に、または単独で、ＲＰＭＩ完全培地中２５０，０００細胞／ウェルで培養した。Ｔ細胞増殖を刺激するために、培養物に２．５μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社）を接種した。次に、７２時間後に細胞を収集し、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＣＤ３−ＰＣ７抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で染色し、ＦｌｏｗＪｏ８．０ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ,Ｉｎｃ.、アシュランド、オレゴン州）を用いて、Ｂｅｃｋｍａｎ ＦＣ ５００血球計算器で解析した。ＣＤ３＋細胞のみを、分裂指数について分析した。図３を参照されたい。
【０３２２】
これらの研究結果は、ｅｘＡＢＭ−ＳＣが、Ｔ細胞活性化およびＴ細胞増殖を阻害する能力を有し、それによって、Ｔ細胞によって媒介される移植片拒絶、Ｔ細胞の調節不全が関与する自己免疫障害を抑制するか、または他の免疫原性の皮膚製品に対して免疫寛容の状態を誘導するための治療薬として有用であり得ることを示す。したがって、同種皮膚製品の手術の適用を待っている熱傷患者を治療するために、同種ヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣまたはかかる細胞によって生成される組成物を使用することを想定することができる。このような実施形態において、最初に、ｅｘＡＢＭ−ＳＣまたはかかる細胞によって生成される組成物で開放創を治療することは、宿主細胞を傷害部位に移動させるように刺激することによって、創傷床を再構築するのに役立つように作用するだけでなく、同種皮膚または皮膚置換物の長期の生着を可能にする環境を提供するように作用し得る。
【０３２３】
実施例６
インビボ投与用の水性ビヒクル中におけるブタＡＢＭ−ＳＣの再構成
ブタＡＢＭ−ＳＣを、６０細胞／ｃｍ２で播種し、４日目に再供給し、全部で６日間増殖させた。細胞を収集し、次の使用まで凍結させた。ブタＡＢＭ−ＳＣの凍結した一定分量を解凍し、ＤＰＢＳＧ（４．５％グルコースを補充したダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））で洗浄し、２５℃で５分間、３５０×ｇで遠心分離した。細胞ペレットを、約５０，０００／μＬの濃度でＤＰＢＳＧに再懸濁した。細胞数および細胞生存率のアッセイを、それぞれ、ＣＯＵＬＴＥＲ（商標）ＡｃＴ１０シリーズアナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、フラートン、カリフォルニア州）およびトリパンブルー排除によって行った。次に、この細胞懸濁液を、１ｃｃのツベルクリン注射器に充填した。
【０３２４】
実施例７
成人骨髄由来体細胞の生理活性
同種ブタＡＢＭ−ＳＣを用いた切開創傷の治療
体重５７ｋｇ〜７８ｋｇの２匹のユカタンブタに麻酔をし、無菌手術の準備をした。約５０ｍｍの長さの４つの切開創傷を、２匹の動物（番号３および番号４）の両側に、脊椎傍および胸部領域の皮膚に沿って、１匹の動物につき全部で８つの傷を手術用メスで作った。エピネフリンを染み込ませた無菌ガーゼを損傷部位に挿入することによって出血を止めた。次に、約１０〜２０分後にガーゼを取り除き、１２回の別々の注射剤に分けたブタＡＢＭ−ＳＣを、この切開部の周りに均等間隔で単回投与し、さらに１０〜３００μＬを創傷床自体に適用して、それぞれの創傷を治療した。同様に、対照の創傷にビヒクル（ＤＰＢＳＧ）のみを注射した。次に、創傷を、Ｓｔｅｒｉ−Ｓｔｒｉｐｓ（商標）（３Ｍ）で閉鎖し、これらの動物を、保護用アルミニウム製ジャケットで覆った。これらのジャケットを毎日数回チェックし、安定で、適切な位置を確実に保った。創傷包帯を毎日監視し、０日目、１日目、３日目、５日目、および７日目に変化を写真に撮った。組織病理（検査）のために、動物を７日目に安楽死させた。ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を調製し、Ｈ＆Ｅで染色した。専門の獣医病理学者が、治療群に関して盲検で、組織形態学的スコア化を行った。
【０３２５】
創傷の治療後７日目に、同種ブタＡＢＭ−ＳＣで治療した病変は、ほとんど目に見える瘢痕化の徴候を示さなかったが（図４）、ビヒクルで治療した病変は、目に見える瘢痕化の徴候を示した。これらの創傷の組織形態計測分析は、ＡＢＭ−ＳＣで治療した創傷において、組織マクロファージ（組織球）の著しい低下を示したが、評価した他の組織学的スコアのいずれにおいても顕著な差は見られなかった。
【０３２６】
類似の組織切片を、再上皮形成の程度（創傷治癒率のおおよその指標）についてスコア化すると、ＡＢＭ−ＳＣで治療した組織切片は、切開部で再増殖する上皮細胞の量の著しい増加を示した（図５）。
【０３２７】
実施例８
液体、半固体、または固体様の治療薬としてインビボ投与するための、コラーゲンビヒクル中のヒトＡＢＭ−ＳＣの生理活性（図６〜９）
コラーゲンベースの生分解性ビヒクルで再構成し、４℃で保存した時、ヒトＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号ＰＣＨ６１０；約２７回の集団倍加）は、少なくとも２４時間、（ゲル収縮アッセイにおける細胞の生理活性によって示されるとおり）高い細胞生存率を保持する。このように保存すると、このコラーゲン溶液は液体のままであり、著しく生存率が低下することなく、懸濁状態でこれらの細胞を保存する（図６）。次に、これらの細胞の生理活性を、創傷修復のインビボアッセイを用いて評価することができる。このアッセイを行うために、最初に、３．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、０．１Ｎの酢酸にラット尾部コラーゲン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社）を再懸濁することによって、コラーゲンのストック溶液を調製した。このコラーゲン培地を、本明細書に記載されるように少し変更を加えたＢｅｌｌら（Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ,ｖｏｌ.７６,ｎｏ.３,ｐｐ.１２７４−１２７８（１９７９年３月））に記載のとおりに調製した。簡単に説明すると、このラット尾部コラーゲン溶液と、５ｍＭのＬ−グルタミン（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））、抗生剤−抗真菌剤溶液（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標）；カタログ番号３０−００４−Ｃ１）を補充した５×ＤＭＥＭ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と、緩衝液（０．０５Ｎ ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、２．２％ ＮａＨＣＯ３（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社）、および６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社））とを４．７:２．０:３．３の比で混合することによってコラーゲン培地を調製した。凍結したヒト成体骨髄由来体細胞（ｈＡＢＭ−ＳＣ）を解凍し、１×ＤＭＥＭで洗浄し、２５℃で５分間、３５０×ｇで遠心した。これらの細胞ペレットを、約７２，０００の全細胞／μＬの濃度で１×ＤＭＥＭに再懸濁した。次に、細胞懸濁液５０μＬをコラーゲン培地２ｍＬに加え、穏やかに粉砕し（すなわち、穏やかにピペッティングして、コラーゲン培地中均質な細胞懸濁液を得）、約１，８００細胞／μＬの最終細胞濃度を得た。次に、この細胞懸濁液を約４〜８℃で一晩保存した。次の日、液体の細胞懸濁液を１５ｍＬのコニカルチューブから移し、２４ウェル細胞培養プレートに約５００μＬ／ウェルで分注した。次に、これらのプレートを、３７℃の加湿した、３種類のガスを有するインキュベーター（窒素で平衡化した４％Ｏ２、５％ＣＯ２）内に１時間置き、コラーゲンを半固体ゲルに凝固させた。次に、これらのゲルを、使い捨ての、滅菌した薬さじ（ＶＷＲ）を用いて２４ウェルプレートから取り除き、１２ウェルの培養プレートに移した。次に、これらのゲルを、１ウェルあたり１×ＤＭＥＭ１．０ｍＬに浮かべた。陰性対照については、記載されたとおりではあるが、細胞を含めないでゲルを調製した。各条件について、３つのウェルに播種した（ｎ＝３）。
【０３２８】
ゲル収縮が用量依存的である程度を評価するために、同様のアッセイを行い、その際、ヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号ＲＥＣＢ８１９；約４３回の集団倍加時）を、冷凍貯蔵庫から取り出した直後に、異なる細胞濃度で、コラーゲン溶液中で再構成した（図７）。最初に、３．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、０．１Ｎの酢酸にラット尾部コラーゲン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社）を再懸濁することによって、コラーゲンのストック溶液を調製した。次に、このコラーゲン培地を、本明細書に記載されるように少し変更を加えたＢｅｌｌら（１９７９）に記載のとおりに調製した。簡単に説明すると、このラット尾部コラーゲン溶液と、５ｍＭのＬ−グルタミン（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））、抗生剤−抗真菌剤溶液（Ｃｅｌｌｅｇｒｏ（商標））を補充した５×ＤＭＥＭ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と、緩衝液（０．０５Ｎ ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、２．２％ ＮａＨＣＯ３（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社）、および６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社））とを４．７:２．０:３．３の比で混合することによってコラーゲン培地を調製した。凍結したヒト成人骨髄由来体細胞（ｈＡＢＭ−ＳＣ）を解凍し、１×ＤＭＥＭで洗浄し、２５℃で５分間、３５０×ｇで遠心した。これらの細胞ペレットを、約４０，０００個、約８０，０００個および２００，０００個の生存細胞／μＬの濃度で１×ＤＭＥＭに再懸濁した。各細胞懸濁液５０μＬをコラーゲン培地２ｍＬに加え、穏やかに粉砕した。このコラーゲン細胞懸濁液約５００μＬを、２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに加えた。次に、これらのプレートを、３７℃の加湿した、３種類のガスを有するインキュベーター（窒素で平衡化した４％Ｏ２、５％ＣＯ２）内に１時間置き、コラーゲン溶液を凝固させた。次に、これらのゲルを、使い捨ての、滅菌した薬さじ（ＶＷＲ）を用いてこれらのプレートから取り除き、１２ウェルの培養プレートに移した。これらのゲルを、１ウェルあたり１×ＤＭＥＭ１．０ｍＬに浮かべた。
【０３２９】
陰性対照として、これらの細胞を、（生理活性を除去するために）熱不活性化したことを除いて、最高濃度のｈＡＢＭ−ＳＣ（５×１０６／ｍＬ）を用いて、上記のとおりにゲルを調製した。最初に、１×ＤＭＥＭ培地中最初の細胞懸濁液を、水を含むヒートブロックで、４０分間７０℃まで加熱すること（熱伝達）によって、熱不活性化細胞を調製した。各条件について、３つのウェルに播種した（ｎ＝３）。
【０３３０】
これらのゲルが時間とともに収縮する程度を決定するために、最初または出発時の表面積の割合を、平台のスキャナーを用いて、０時間、２４時間、４８時間および７２時間の時点で取得したデジタル画像から計算した。各画像から、水平方向および垂直方向の両方でゲルの直径を測定し、平均値を求めた。結果は、ゲル収縮の速度および程度の両方が用量依存的に影響を受けたことを証明する（図７）。
【０３３１】
これらの半固体ゲル中のヒトＡＢＭ−ＳＣから生成される特定の分泌タンパク質のレベルを決定するために、これらのゲルの周囲の液体培地から収集した馴化細胞培養上清で酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を（培養３日目に）行った（図８）。上清を無菌の１５ｍＬコニカルチューブに移し、１５分間、１１４０×ｇで遠心し、細胞デブリを除去した。次に、上清を２ｍＬのクライオバイアルに移し、短期貯蔵のために−８０℃に移した。アッセイの日に、上清を解凍し、使用前に室温まで平衡化させた。ＥＬＩＳＡ分析を行い、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、アクチビン−Ａ、ｐｒｏ−ＭＭＰ−１、およびＭＭＰ−２を検出した（ＥＬＩＳＡは、製造業者の取扱説明書に従って行った。；全てのキットをＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ,Ｉｎｃ.（ミネアポリス、ミネソタ州、米国）から購入した）。結果は、治療関連レベルの栄養因子をこれらの半固体ネオ組織によって生成させることができること、かつこれらのレベルは、細胞濃度を調整することによって調節することができることを示す。熱不活性化細胞のみを含む培養物中では、測定した栄養因子の検出できるレベルは認められなかった。アッセイ条件間の統計比較を、一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【０３３２】
ヒトＡＢＭ−ＳＣをコラーゲン溶液で再構成し、局所治療薬として用いることができる大型のフォーマットの半固体構造を構築することもできる（図９）。かかる構造を構築するために、最初に、３．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で０．１Ｎの酢酸にラット尾部コラーゲン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社）を再懸濁することによって、コラーゲンのストック溶液を調製した。このラット尾部コラーゲン溶液と、５ｍＭのＬ−グルタミン（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））、抗生剤−抗真菌剤溶液（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））を補充した５×ＤＭＥＭ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と、緩衝液（０．２８６Ｎ ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、１．１％ ＮａＨＣＯ３（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社）、および１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社））とを６:２:２の比で混合することによって、水性コラーゲン培地を調製した。凍結したｈＡＢＭ−ＳＣを解凍し、１×ＤＭＥＭで洗浄し、次に、２５℃で５分間、３５０×ｇで遠心した。これらの細胞ペレットを、約９０，０００細胞／μＬの濃度で１×ＤＭＥＭに再懸濁した。次に、およそ１．１ｍＬの細胞懸濁液をコラーゲン培地２０ｍＬに加え、穏やかに粉砕して、５×１０６細胞／ｍＬの最終細胞濃度を得た。最終コラーゲン濃度は、１．８ｍｇ／ｍＬであった。次に、この細胞懸濁液を、１０ｃｍのペトリ皿（形成皿）に分注した。分注したコラーゲン溶液中の有効量の細胞は、約１００×１０６生存細胞であった。次に、この細胞懸濁液を含む１０ｃｍの形成皿を、３７℃の、加湿した（５％ＣＯ２）インキュベーター内に１時間置き、このコラーゲン溶液を凝固させた。次に、この半固体ゲルを、１０ｃｍの形成皿から注意深く取り出し、１５ｃｍペトリ皿（培養皿）に移し、写真を撮った。
【０３３３】
ヒトＡＢＭ−ＳＣおよびコラーゲンに由来する固体様ネオ組織を構築するために、上記の半固体構造を、さらに２日間、３７℃の、加湿した（５％ＣＯ２）細胞培養インキュベーター内に戻すことができる（図１０）。固体様ネオ組織を形成するために、最終コラーゲン溶液が（１．８ｍｇ／ｍＬのかわりに）１．４ｍｇ／ｍＬであることを除いて、上記のとおりに調製した半固体ゲルを、１０ｃｍの形成皿の端から注意深く取り除き、１５ｃｍ培養皿の中の、抗生剤−抗真菌剤溶液（ＣＥＬＬＧＲＯ（商標））を含む１×ＤＭＥＭ約８２ｍＬに浮かべた。次に、この半固体ゲルを、さらに４８時間、３７℃の、加湿した（５％ＣＯ２）インキュベーターに移し、出発コラーゲン基質を含まない固体様組織構造へのマトリックスのリモデリングを促進した。次に、この固体様ネオ組織を１５ｃｍ培養皿から取り出して、写真を撮った（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。マッソン・トリクローム染色によるこのネオ組織の組織学的分析は、このマトリックスが、新たに合成されたヒトのコラーゲンおよびプロテオグリカンに富むことを証明する（図１０Ｃ）。対照コラーゲンゲルは、この方法で染色されない。コラーゲンおよびプロテオグリカンは青色に染色される。
【０３３４】
これらの研究の結果は、ＡＢＭ−ＳＣの凍結ストックを、解凍時に分注し、コラーゲンベースの液体培地で再構成することができ、液体懸濁液、半固体構築物、または固体様ネオ組織として治療に使用できることを示す。このような方法で調製し、約４〜１０℃で保存すると、この細胞懸濁液は、２４時間を超えて、十分な細胞生存率を維持しながら液体として留まる。次に、このような方法を用いて、臨床適用のためのＡＢＭ−ＳＣを製剤化すると、これらの細胞を投与する臨床医に十分な自由度を提供する。この懸濁液を、液体注射剤として投与するか、またはもう１つの方法として、創傷床に局所的に適用することができる。後者の場合、この液体細胞懸濁液を、創傷の輪郭に成形し、次に、（例えば、約３７℃まで温めた時に、）半固体構造に凝結させることが想定される。あるいは、この懸濁液をこのような方法で用いて、半固体構築物または固体様ネオ組織を製造することができる。
【０３３５】
これらのデータは、これらの方法によって調製した時に、生じた組成物もそれぞれ、様々な種類の創傷、特に、皮膚に関わる創傷の修復を媒介するのに重要な生理活性を有することも示す。
【０３３６】
したがって、液体コラーゲンベースの培地で調製したｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ｅｘＡＢＭ−ＳＣ）、もしくはかかる細胞によって生成される組成物を、開放創を治療するために局所的に用いるか、または顔の若返りのための皮膚充填剤に代わる注射剤として用いることができる。
【０３３７】
半固体形態では、ｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ｅｘＡＢＭ−ＳＣ）またはかかる細胞によって生成される組成物は、損傷した全層皮膚を外科的に除去した重度の熱傷患者を治療するために局所的に用いられ、それによって、皮膚代替物として作用することができる。
【０３３８】
ｅｘＣＦ−ＳＣ（例えば、ｅｘＡＢＭ−ＳＣ）によって生成された固体のネオ組織を、ヒトの死体の皮膚（ＡＬＬＯＤＥＲＭ（商標））、ブタの皮膚（ＰＥＲＭＡＣＯＬ（商標））および他の動物由来の構築物（ＩＮＴＥＧＲＡ（商標））の代替物として外科的に用いることができるであろう。さらに、これらのデータは、これらの様々な構築物のそれぞれの効力を、細胞またはこれらの細胞によって生成された組成物の用量を変えることによって調節することができることも示す。
【０３３９】
実施例９
ｈＡＢＭ−ＳＣで治療したラットの心臓機能の改善
心筋梗塞後のヒトＡＢＭ−ＳＣの動物への投与は、（ＡＢＭ−ＳＣなどの）ＣＦ−ＳＣが、血管新生を刺激し、線維症を低下させることによって、心臓機能を改善し、心臓組織損傷の修復を増強することを証明する。図１５を参照されたい。冠動脈を閉鎖し、それによって、心臓病変（すなわち、心臓の損傷領域）を作ることによって、急性心筋梗塞のラットモデルを利用した。損傷を受けたラットに、ｈＡＢＭ−ＳＣまたはビヒクルのいずれかを心臓内注射した。
【０３４０】
心機能についての方法：両方の性のスプラーグドーリーラット（約３カ月齢）に、正中線胸骨切開による左前下行枝（ＬＡＤ）の周りの絹結紮糸の永久的な留置により、心筋梗塞を実験的に誘発した。この手順後５日目に、これらのラットに、シクロスポリンＡ治療の標準的な投与計画を開始し、この研究期間中続けた。梗塞後７〜８日目に、ラットに麻酔し、挿管し、心臓の尖部をさらすために、肋間切開を行った。次に、超音波ミラーカテーテルを、心室壁を貫いて挿入し、約３０〜６０秒の期間で、経時的に圧力測定を記録した。この梗塞生成および心機能の圧力／時間測定のモデルは、標準的で、十分に特徴づけられたモデルであり、それによって、心機能に対する細胞療法の効果を評価することができる（例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｅｈｍｓｅｎ,ｅｔ ａｌ.,Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ.,１０５（１４）：１７２０−６（２００２）参照）。
【０３４１】
３０ゲージの低デッドスペース針を取り付けた１００μＬハミルトンシリンジを用いて、試験組成物を送達した。５回の別々の２０μＬの注射を、２〜３分の間に行った。４回の注射を、可視化した梗塞の周りに等距離で行い、５回目を、変色域によって決定した梗塞領域の中央に直接入れた。注射後、この切開部を縫合し、気胸を低下させ、これらの動物から人工呼吸器を取り外し、抜管した。注射後４週間目（梗塞後５週間目）に、動物に再び麻酔し、正中線胸骨切開により心臓を露出させ、ミラーカテーテルを挿入した。上記のとおりにｄｐ／ｄｔ測定を行った後、これらのラットを、大量失血によって安楽死させた。
【０３４２】
心機能についての結果（図１３）：治療後４週間目に、ＡＢＭ−ＳＣを受け取ったラットは、著しく高い＋ｄｐ／ｄｔ（圧力の正の最大変化率）値を示した（Ａ）。４週目の値＋ｄｐ／ｄｔ値から０週目の＋ｄｐ／ｄｔ値を引くことによって（「Δ＋ｄｐ／ｄｔ」）、試験期間中の心機能の変化を示すと、ビヒクル治療ラットでは、試験期間中、心機能は低下し（負のΔ）、いずれかの細胞調製物で治療した動物では、心機能に著しい改善が示される（Ｂ）ことが証明された。ビヒクル治療ラットと比較して、ＡＢＭ−ＳＣを受け取ったラットは、著しく低いタウ値を示し（Ｃ）、左室コンプライアンスの増加が示唆された。タウは、等容性左室圧減衰の時定数である。圧力の負の最大変化率（−ｄｐ／ｄｔ）については、４週目の値−ｄｐ／ｄｔ値から０週目の−ｄｐ／ｄｔ値を引くことによって（「Δ−ｄｐ／ｄｔ」）、試験期間中の心機能の変化を示すと、ビヒクル治療ラットでは、試験期間中、心機能は低下し（負のΔ）、細胞調製物で治療した動物では、心機能に著しい改善が示される（Ｄ）ことが証明された（ＡＮＯＶＡによると、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【０３４３】
心臓構造についての方法：左前下行枝（ＬＡＤ）の周りの絹結紮糸の永久的な留置により、スプラーグドーリーラットに心筋梗塞を実験的に誘発した。動物に、シクロスポリンＡ治療（１０ｍｇ/ｋｇ、皮下、毎日）の標準的な投与計画を開始し、この研究期間中続けた。
【０３４４】
梗塞後７〜８日目に、ラットに麻酔し、挿管し、心臓の尖部をさらすために、肋間切開を行った。心機能を評価し、その後、３０ゲージの低デッドスペース針を取り付けた１００μＬハミルトンシリンジを用いて、試験物質を送達した。５回の別々の２０μＬの注射を、２〜３分の間に行った。４回の注射を、可視化した梗塞の周りに等距離で行い、５回目を、変色域によって決定した梗塞領域の中央に直接入れた。注射後、この切開部を縫合し、気胸を低下させ、これらの動物から人工呼吸器を取り外し、抜管した。注射後４週間目（梗塞後５週間目）に、動物に再び麻酔し、正中線胸骨切開により心臓を露出させ、心機能を評価した。機能測定を完了した後、ラットを大量失血によって安楽死させた。最初に、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）およびメデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）の混合物を用いて、ラットに深く麻酔した。次に、胸腔を外科的に露出させ、心臓を解剖し、１０％中性緩衝化ホルマリン中で浸漬固定した。次に、心臓を大まかに３片に区分し、包埋用の型に正しい位置で置き、パラフィン包埋処理した。次に、心臓組織を６μｍの薄片にし、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）またはマッソン・トリクロームで染色した。全ての心臓からの少なくとも６つの切片も、それぞれ、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）およびトリクロームで染色した。特に、トリクローム染色は、コラーゲン（青）対筋肉組織（赤）の可視化を可能にさせる。コラーゲンが（再生のない）瘢痕組織の存在を示すので、正常な心筋に対するコラーゲンの比を決定した。検出不能のコラーゲンを０とし、最高／重篤を５とすることで、半定量的スコア化のスケールを考案した。次に、組織形態学的なスコア化のために、有資格の病理学者に染色切片を送った。
【０３４５】
各スライドは、心臓の３つの横断面を含み、（１）は中央の心室領域から両方の心室の断面図を示し、（２）は心室の遠位の１／３を示し、（３）は心室の尖部を示す。組織形態計測分析については、以下の段階付けスキームを用いた。
【０３４６】
組織損傷の位置：左の心室（ＬＶ）、右の心室（ＬＶ）、両方の心室（ＢＶ）。
【０３４７】
影響を受けた心室の損傷の割合（傷害のサイズ）：パーセンテージ（％）（０〜１００％）で示す。
【０３４８】
心室の実験的に損傷を与えた領域の厚さのスコア：推定の厚さ（ｍｍ）に基づき１〜４の段階で示す。組織切片中の既知の目印と比較する（例えば、赤血球の直径の平均は７ミクロンである；心筋の筋束の直径の平均は３０ミクロンである）。段階１（．５ｍｍ未満）；段階２（．５ｍｍ〜１ｍｍ）、段階３（１ｍｍ〜１．５ｍｍ）；段階４（１．５ｍｍ以上）。
【０３４９】
組織傷害の領域の新血管新生：（０〜４の段階、正常（０）〜初期の組織損傷の全域にわたる新血管新生（４））。
【０３５０】
初期の血管損傷：前から存在する血管の変性／壊死を含み、残りの血管デブリの除去に起因する血栓症および／または炎症を０〜４の段階で表し、０は血管損傷が存在せず、４は影響を受けた領域全体の血管損傷を表す。
【０３５１】
組織損傷領域内の線維症の程度：梗塞手順によって引き起こされた初期損傷領域の線維症および瘢痕化のレベルを０〜４の段階で表し、２０％ずつ変化させ、線維症なし（０）〜（４）で表す。例えば、心室の２０％の線維症には（１）の段階を、心室の４０％の線維症には（２）の段階を、心室の６０％の線維症には（３）の段階を、心室の６０％超の線維症には（４）の段階を割当てる。
【０３５２】
心臓構造についての結果：その後、ラットを屠殺し、心臓組織を切片にして、染色した。有資格の獣医病理学者が半定量的スコア化を行い（図１５）、ビヒクルまたはＡＢＭＳＣを受けとった、心筋梗塞後７日後のラットの心臓の梗塞サイズの変化を評価した。組織病理学的分析から、ビヒクルと比較して、ｈＡＢＭ−ＳＣを受け取ったラットの梗塞サイズの著しい減少が示された。あらかじめ設定したスケールによると、ｈＡＢＭ−ＳＣを受け取ったラットの組織学的スコアは、ビヒクル対照よりも約２ポイント低かった。図１４は、代表的な梗塞サイズの減少の例を示す。組織病理学的分析から、ｈＡＢＭ−ＳＣが、梗塞域において、線維症を低下させ、血管新生を増強させることが決定され（図１５）、再生促進性活性と一致した。したがって、ｈＡＢＭ−ＳＣで治療したラットは、心臓組織構造の劇的な改善を示すことが観察された。図１４および図１５を参照されたい。
【０３５３】
実施例１０
成人骨髄由来体細胞は免疫介在性反応を抑制する
パートＩ：１方向ＭＬＲ（混合リンパ球反応）アッセイにおけるマイトジェン誘導性Ｔ細胞増殖の抑制
方法：ヒトＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣ（それぞれ、ロット番号ＲＥＣＢ８０１およびＲＥＣＢ９０６）を、４ｍＭＬ−グルタミン（カタログ番号ＳＨ３００３４．０１、ロット番号１３４−７９４４、（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ.、ローガン、ユタ州、米国））を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ（商標）；カタログ番号１２４９１−０１５、ロット番号１２１６０３２（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ.、カールスバッド、カリフォルニア州、米国））、または４ｍＭのＬ−グルタミンを含み、インスリン−トランスフェリン−セレン−Ａ（ＩＴＳ）（ＧＩＢＣＯ（商標）カタログ番号５１３００−０４４、ロット番号１３４９２６４）を補充したＨｙＱ（登録商標）ＲＰＭＩ−１６４０（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）カタログ番号ＳＨ３０２５５．０１、ロット番号ＡＲＣ２５８６８）などの完全培地１５ｍＬ中６０００生存細胞／ｃｍ２の濃度で７５ｃｍ２のフラスコに入れ、３７℃の加湿した、３種類のガスを有するインキュベーター（窒素で平衡化した４％Ｏ２、５％ＣＯ２）内で培養した。２４時間後、使用済み培地を吸引し、新鮮な培地１５ｍＬと交換した。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）（ＬｏｎｚａＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、以前はＣａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号ＰＴ２５０１、ロット番号６Ｆ３８３７）を、ＭＳＣＧＭ（商標）（Ｌｏｎｚａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社）１５ｍＬ中６０００生存細胞／ｃｍ２の濃度で７５ｃｍ２のフラスコに入れ、３７℃の、加湿したインキュベーター内で、大気Ｏ２、５％ＣＯ２で培養した。２４時間後、使用済み培地を吸引し、新しいＭＳＣＧＭ（商標）１５ｍＬと交換した。培養９６時間後に、ｈＡＢＭ−ＳＣおよびｈＭＳＣの両方を収集した。収集したｈＡＢＭ−ＳＣおよびｈＭＳＣを、９６ウェル丸底プレートに、ＲＰＭＩ完全培地（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標））中２５，０００生存細胞／ｍＬの濃度でプレーティングした。ヒト末梢血単核球（ＰＭＢＣ）を、カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）１．２５μＭで標識し、ｈＭＳＣ、ＲＥＣＢ８０１、ＲＥＣＢ９０６と共に、または単独で、ＲＰＭＩ完全培地中２５０，０００細胞／ウェルで培養した。Ｔ細胞増殖を刺激するために、培養物に２．５μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社）を接種した。次に、７２時間後に細胞を収集し、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＣＤ３−ＰＣ７抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で染色し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、ＢｅｃｋｍａｎＦＣ ５００血球計算器で分析した。ＣＤ３＋細胞のみをゲーティングして、分裂指数について解析した。
【０３５４】
結果：同種ヒトＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣは、１方向ＭＬＲアッセイにおいてマイトジェン誘導性Ｔ細胞増殖を抑制する。図１６を参照されたい。
【０３５５】
パートＩＩ：同種ブタＡＢＭ−ＳＣは、２方向ＭＬＲ負荷アッセイにおけるＴ細胞媒介性免疫反応を誘発しない。
方法：免疫測定については０日目（治療前）に、および細胞性免疫反応の分析については倍検時（治療後３日目または３０日目）に、ブタ全血を収集した。各動物のＰＢＭＣを、ｐＡＢＭ−ＳＣ、マイトジェンＣｏｎＡと共に、または培地単独で培養した。試料をフローサイトメトリーにより分析し、増殖量を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて計算した。
【０３５６】
全血試料をＤＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ）−２％ブタ血清で１：１に希釈した。希釈した血液をフィコール（希釈した血液：フィコールの比は２：１）で覆い、３０分間、３５０×Ｇで遠心し、遠心分離サイクルを制動０で終了した。得られた上層を吸引した。所望の単核球を含む中間層を各試料についてプールし、ＤＰＢＳ−２％ブタ血清で３回洗浄した。洗浄後、ペレットをＡＣＫ溶解緩衝液２０ｍＬに再懸濁し、３分間インキュベートし、残留赤血球を除去し、次に、５分間、２５０×Ｇで遠心した。ペレットをＤＰＢＳ−２％ブタ血清２０ｍＬで洗浄し、ＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ブタ血清、２ｍＭＬ−ｇｌｕｔ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ、１×Ｐｅｎｎ−Ｓｔｒｅｐ）５ｍＬに再懸濁した。遠心分離により、２０×１０６細胞／ｍＬの濃度で細胞を凍結させ、氷冷凍結培地（ブタ血清中１０％ＤＭＳＯ）に再懸濁し、すぐに２ｍＬのクライオバイアルに加え、クライオレートフリーザー（ｃｒｙｏｒａｔｅｆｒｅｅｚｅｒ）に入れた（凍結速度＝−４０℃まで−２５℃／分、−１２．０℃まで＋１５℃／分、−４０℃まで−１℃／分、−１２０℃まで−１０℃／分）。細胞を１バイアルにつき２ｍＬの一定分量で、使用するまで液体窒素の気相中で保存した。
【０３５７】
０日目に、各試験条件について研究テンプレートに従って、ｐＡＢＭ−ＳＣを、ＡＦＧ−１０４培地中１０，０００細胞／ウェルの濃度で、９６ウェル培養皿にプレーティングした。プレートを、３７℃の、窒素で平衡化した低Ｏ２（４〜５％）、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で一晩インキュベートした。
【０３５８】
次の日、ＰＢＭＣをＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテート、サクシニミジルエステル）で標識した。簡単に説明すると、ＰＢＭＣのバイアルを３７℃の水浴中で解凍し、ＲＰＭＩ完全培地１０ｍＬで洗浄し、３００×Ｇで細胞を遠心し、ＤＰＢＳに再懸濁した。細胞濃度を１０×１０６細胞／ｍＬに調節し、０．６２５ｍＭの最終濃度で、５分間、ＣＦＳＥとインキュベートした。すぐに、細胞を氷冷ＤＰＢＳ／５％ブタ血清４０ｍＬで洗浄し、３００×Ｇで１０分間遠心した。細胞を再びＤＰＢＳ／５％ブタ血清２５ｍＬで洗浄し、前回と同様に遠心した。３回目でかつ最終回として、細胞をＲＰＭＩ完全培地１０ｍＬで洗浄した。細胞濃度を調節し、５×１０６細胞／ｍＬの最終濃度にした。以下の研究テンプレートに従って、標識ＰＢＭＣをアッセイプレートに加えた。ＡＦＧ−１０４培地を吸引し、ＲＰＭＩ完全培地１００μＬと交換した。ＲＰＭＩ完全培地１００μＬを非刺激ウェルに添加し、ＲＰＭＩ完全培地中に２０μｇ／ｍＬのＣｏｎＡを含む培地１００μＬを刺激ウェルに添加し、４．５％グルコース−ＲＰＭＩ完全培地を、ビヒクル細胞に添加した。研究テンプレートに従って、９６ウェルプレートに、１ウェル当たり５００，０００標識ＰＢＭＣをプレーティングした。プレートを、３７℃の、大気Ｏ２（高いＯ２）、加湿有り、５％ＣＯ２、窒素なしで、５日間インキュベートした。与えられた各血液試料について、全ての条件を、３つ組みで完了した。サブセットの血液試料について、ビヒクル刺激を完了したが、培地単独と有意に異なることはなかった。共培養５日後に、フローサイトメトリーのために、細胞を９６ウェルプレートからフローチューブへ移すことによって細胞を採集した。標準的なプロトコールに従って、間接染色を行った。使用した一次抗体は、ビオチン結合マウス抗−ブタＣＤ３モノクローナル抗体であり；その後、ストレプトアビジン−ＰＥ−Ｃｙ７二次試薬に暴露した。細胞を、フロー洗浄（ｆｌｏｗｗａｓｈ）緩衝液２００μＬに再懸濁し、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００デバイス上で分析した。
【０３５９】
結果：ベースライン時、および治療後３日目または３０日目に収集した試料について分裂指数を計算し、次に、培地、ビヒクル、ｐＡＢＭ−ＳＣまたはＣｏｎＡを用いてインビトロで誘発した。ＣｏｎＡを用いて刺激したＣＤ３＋細胞については、３日目または３０日目における全ての動物の平均分裂指数は、治療前および剖検時において、ビヒクル処理動物およびｐＡＢＭ−ＳＣ治療動物のＣＤ３＋細胞の分裂指数よりも有意に高かった（＊ｐ＜０．０５）。図１７を参照されたい。
【０３６０】
実施例１１
臨床開発
最初の急性心筋梗塞後３０〜６０日目の成人コホートに、心内膜心筋注射により投与した、単回漸増用量のｈＡＢＭ−ＳＣの安全性を評価するために、第１相、非盲検、用量漸増試験を行った。この研究の第１の目的は、ＮＯＧＡ（商標）またはＮＯＧＡＸＰ（商標）電気機械的心臓マッピングシステム（ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｃａｒｄｉａｃ ｍａｐｐｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）によって導かれるＭＹＯＳＴＡＲ（商標）カテーテルを用いて、複数の心内膜心筋注射によって送達された単回漸増用量のｈＡＢＭ−ＳＣの安全性および可能性を調査することであった。第２の目的は、左心容積、寸法、心筋梗塞のサイズおよび電圧によって測定される、単回漸増用量のｈＡＢＭ−ＳＣの予備的な有効性を調査することであった。
【０３６１】
研究プロトコールにより、試験対象を、安全性について頻繁に監視して１２カ月間追跡する。９０日目および６ヵ月目の追跡調査来院時に、有効性の評価を行う。目的の研究集団は、（登録）前３０日以内に急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を発症し、経皮的血管再生による治療が成功し、ＴＩＭＩＩＩまたはより高い血流を回復し、心筋灌流イメージング（ＳＰＥＣＴ）によって測定した場合に、３０％以上の左室駆出率を示す、３０〜７５歳齢の同意した成人である。
【０３６２】
試験対象患者基準および排除基準
この研究の試験対象患者基準には、以下のものが含まれる：（１）３０〜７５歳齢であること（包括的）；（２）（心筋灌流イメージング［ＳＰＥＣＴ］によって確認されたＭＩと一致するＥＣＧ変化に加えて、正常レベルと比較して、心特異的トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）酵素濃度の倍加を引き起こした、つい最近のＭＩとして定義される）ＡＭＩから３０〜６０日目であること；（３）経皮的血管再生が成功し、梗塞領域へのＴＩＭＩＩＩまたはより高い血流を回復したこと；（４）出産可能な女性の場合において（投与前２４時間以内に）妊娠検査（血清＿ｈＣＧ）が陰性であること；（５）心筋灌流イメージング（ＳＰＥＣＴ）によって測定した時に、左室駆出率（ＬＶＥＦ）が、３０％を超えること；（６）ベースラインにおいて、心臓酵素試験（ＣＰＫ、ＣＰＫＭＢ、ｃＴｎＩ）が正常範囲内であること；（７）歩行可能でなければならないこと。
【０３６３】
この研究の除外基準には、以下のものが含まれる：（１）登録６カ月以内に、経皮的または外科的な血管再生を必要とする場合がある顕著な冠状動脈の狭窄；（２）左心室（ＬＶ）の血栓（移動性または壁在性）；（３）高いグレードの房室ブロック（ＡＶＢ）；（４）ＡＭＩ後４８時間を超えて、頻繁な、再発性、（３０秒を超える）持続性または非持続性の心室頻拍；（５）心臓内のマッピングおよび注射の手順の間に対象の安全を妨げる恐れがある臨床的に有意な心電図上の異常；（６）制御されていない心拍数を伴う心房細動；（７）重度の弁膜疾患（例えば、大動脈弁狭窄症、僧帽弁狭窄症、弁の交換を必要とする重度の弁膜機能不全）；（８）心臓弁交換の病歴；（９）突発性心筋症；（１０）重度の末梢血管疾患；（１１）正常上限（ＵＬＮ）の３倍を超える肝酵素（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ［ＡＳＴ］／アラニンアミノトランスフェラーゼ［ＡＬＴ］）；（１２）２．０ｍｇ／ｄＬを超える血清クレアチニン；（１３）（登録）前３年以内の活性な癌の病歴（基底細胞癌を除く）；（１４）以前に骨髄移植を行ったことがあること；（１５）既知のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染；（１６）胸部Ｘ線（ＣＸＲ）または血液培養による、同時感染または敗血症の証拠があること；（１７）登録前３０日以内の実験的臨床治験への参加；（１８）登録前６カ月以内のアルコールまたは娯楽的薬物乱用；（１９）登録前１４日以内の大規模な外科手術または大外傷；（２０）既知の自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス［ＳＬＥ］、多発性硬化症）；（２１）プロトロンビン（ＰＴ）または部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）の、検査正常値と比較した臨床的に有意な上昇；（２２）血小板減少（血小板数５０，０００／ｍｍ３未満）；（２３）（登録）前３カ月以内の、抗糖尿病薬投与計画の変更、または７．０％を超えるＨｂＡｌｃとして定義される、不適切に制御されているＩ型またはＩＩ型糖尿病；（２４）１８０ｍｍＨｇを超える収縮期血圧（ＳＢＰ）および／または１００ｍｍＨｇを超える拡張期血圧（ＤＢＰ）として定義される、制御されていない高血圧；（２５）ＡＭＩ後２４時間を越える向イオン性薬物の使用；（２６）治験責任者の意見で、対象を過度の危険に曝すまたはこの研究の目的を妨げる恐れがある血行動態不安定、不安定な不整脈および挿管などの他の併発状態；（２７）治験責任者の意見で、対象の、プロトコールに従う能力を妨げる、対象の安全を損なうまたは研究結果の解釈を妨げる恐れがある全ての他の主要な病気；ならびに（２８）適切なＣＴスキャン評価のための造影剤注射に対する（アレルギーまたは正常に機能しない腎機能のいずれかの）禁忌症。
【０３６４】
研究薬物の投与量および投与：同一コホートの対象には、３日より短い間隔では投与せず、以前のコホートの全ての対象における少なくとも３週間の安全性データの審査を受けて、次のコホートの投与は、約４週間の間隔をあける。
【化１】
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【０３６５】
投与当日には、ベースライン評価が完了した後、およびＮＯＧＡ（商標）またはＮＯＧＡＸＰ（商標）電気機械的マッピングシステム（Ｂｉｏｓｅｎｓｅ Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｄｉａｍｏｎｄ Ｂａｒ、ＣＡ）を用いた経皮的心室マッピングの直後に、ｈＡＢＭ−ＳＣの複数回の逐次的注射を、ＭＹＯＳＴＡＲ（商標）カテーテルを用いて、経皮的にＬＶから接近して心筋層中に直接送達する。
【０３６６】
研究手順：計画されたｈＡＢＭ−ＳＣ投与前２１日以内に、見込みがある対象から同意を得、スクリーニングを行い、その投与は、ＡＭＩ後３０〜６０日以内に行わなければならない。適格性を決定するためのスクリーニング手順も、病院のＳＯＰが追加の試験を（すなわち、カテーテル法の直前に）必要としない限り、ベースライン値として用いる。治療の有効性についてのベースライン試験は、６分間歩行試験、ＮＹＨＡ分類、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）濃度についての血液分析、心エコー検査、左右の心臓カテーテル法、心筋灌流イメージング（ＳＰＥＣＴ）、およびＮＯＧＡ（商標）またはＮＯＧＡＸＰ（商標）電気機械的マッピングからなる。入院当日には、（出産可能な女性対象の場合には、妊娠検査［血清＿ｈＣＧ］を含む）追加のベースライン血液試験を行い、適格性を確認する。投与の当日（研究０日目）には、対象に、ＮＯＧＡ（商標）またはＮＯＧＡＸＰ（商標）電気機械的心臓マッピングを行い、ＭＹＯＳＴＡＲ（商標）カテーテルを左心室中に留置する。ｈＡＢＭ−ＳＣの用量を、心内膜心筋への複数回の逐次的注射により、（ＮＯＧＡ（商標）またはＮＯＧＡＸＰ（商標）によって画定された）損傷した心筋組織中に投与する。ｈＡＢＭ−ＳＣの投与後、起こり得る貫壁性穿孔を検出するために心エコーを行い、連続心臓遠隔測定モニタリングを用いて最低２４時間観察するために、対象を集中治療室（ＩＣＵ）に直接入れる。合併症のない安定な対象は、ＩＣＵからレベルを下げた病室に移し（心臓モニターを行い）、次いで、投与手順から７２時間以降、退院帰宅させる。合併症を有する対象は、レベルを下げた病室に移すのに安定し、適するまで、最適な医療管理下でＩＣＵに留める。安全性評価を、ｈＡＢＭ−ＳＣの投与後７日目、１４日目、２１日目、６０日目および９０日目、ならびに６カ月目および１２カ月目に行う。有効性評価を、手順後９０日目および６カ月目に行い、これには、それぞれ、コントラストを高めた心エコー検査、心筋の再灌流および生存率の解析（ＳＰＥＣＴ）、左右の心臓カテーテル法（９０日目のみ）、６分間歩行試験、ＮＹＨＡ分類、ならびにＮＯＧＡ（商標）またはＮＯＧＡＸＰ（商標）電気機械的マッピング（９０日目のみ）によって測定される、左心容積、寸法、心筋梗塞のサイズおよび電圧が含まれる。
【０３６７】
この研究の安全性エンドポイントには、以下のものが含まれる：（１）研究プロトコール中に詳述する有害事象；（２）ＣＢＣ、ＣＭＰ、ＣＰＫ／ＣＰＫＭＢ、ｃＴｎｌ、ＰＴ／ＰＴＴおよびＨＬＡ抗体解析を含む血液または血液成分の、ベースラインからの臨床的に有意な変化；（３）心電図（ＥＣＧ）または心臓の遠隔測定によって評価される心臓の電気的な活動の、ベースラインからの臨床的に有意な変化；（４）２４時間ホルター監視によって評価される心臓の電気的な活動の、ベースラインからの臨床的に有意な変化；（５）（手順後の）心エコー図によって評価される周術期心筋穿孔；ならびに（６）集中的な神経学的検査を含む身体検査によって評価される身体的および精神的な状態の、ベースラインからの臨床的に有意な変化。脳血管障害（脳卒中）と一致する徴候および症状が観察される場合には、さらなる評価についての神経学上の助言を得る。
【０３６８】
有効性のエンドポイント：監視すべき有効性のエンドポイントには、以下のものが含まれる：（１）心筋灌流イメージング（ＳＰＥＣＴ）によって測定される、ベースラインと比較した収縮末期容量および／または拡張末期容量；（２）心筋灌流イメージング（ＳＰＥＣＴ）によって測定される、ベースラインと比較した心筋梗塞のサイズ；（３）コントラスト増強２−Ｄ心エコー検査によって測定される、ベースラインと比較した収縮末期寸法および／または拡張末期寸法；（４）ＮＯＧＡ（商標）またはＮＯＧＡＸＰ（商標）電気機械的マッピングによって測定される、ベースラインおよび（コア実験室から提供された）ヒストリカルコントロールと比較した、ｈＡＢＭ−ＳＣを注射した心筋層領域における活動電位電圧の振幅；（５）左右の心臓カテーテル法によって決定される、ベースラインと比較した心拍出量および圧力勾配；（６）６分間歩行試験によって評価される、ベースラインと比較した生活の質；ならびに（７）定期身体検査を実施する医師が評価する、ベースラインと比較した機能性心血管疾患クラス（ＮＹＨＡ機能分類スキーム）。
【０３６９】
ｈＡＢＭ−ＳＣの心内膜心筋への送達：ｈＡＢＭ−ＳＣは、心室チャンバー内から、カテーテルに案内される直接注射によって心筋層へ送達される。ｈＡＢＭ−ＳＣの心内膜心筋への送達は、ＮＯＧＡ（商標）ＣａｒｄｉａｃＮａｖｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｓｅｎｓｅ−Ｗｅｂｓｔｅｒ社（ダイヤモンドバー、カリフォルニア州）のインタクトな心筋層の物理的、機械的および電気的な特性のインビボでの三次元視覚化のための最先端のシステムの１つ）の援助によって達成される。実際の注射は、ＣｏｒｄｉｓＭＹＯＳＴＡＲ（商標）／カテーテルを用いて行う。ＮＯＧＡ（商標）システムによって、左心室の心機能のリアルタイムの観測、心臓組織損傷の検出、カテーテル先端の観察および留置が可能になる。ＡＭＩ後の患者の衰弱した心臓の状態を考慮して、（開心（ｏｐｅｎ  ｈｅａｒｔ）による送達または直接的な心臓内への送達と比較して）比較的非侵襲性の送達システム、すなわち、ＮＯＧＡ（商標）マッピングシステムと併用するＭＹＯＳＴＡＲ（商標）注射用カテーテルを、ｈＡＢＭ−ＳＣの投与のために選択した。
【０３７０】
予備的な結果：５人の患者についての予備的な結果が得られている。最初の３人の患者は、初期用量群（３０×１０６細胞）に含まれ、残りの２人の患者に、第２の漸増用量（１００×１０６細胞）を投与した。全体的に、ｈＡＢＭ−ＳＣは、全ての患者において良好に耐容され、心機能が改善する傾向が数人の患者において認められた。より詳細な結果を以下で考察する。
【０３７１】
安全性に関する知見：いずれの患者においても、（治療前後の抗体プロファイリングによって測定した場合）同種免疫応答の証拠は見出されなかった。
【０３７２】
心機能の評価：ＮＯＧＡ電気機械的マッピング：機能のマッピングを、治療時および細胞治療後９０日目に行った。代表的な単極性電圧マップを、第１用量コホートの第２患者から得た。明確な電圧の不足を、梗塞領域において認めることができた（データ示さず）。１５回の細胞注射を、梗塞の辺縁部において、参考のために単極性電圧を用いて行った。追跡調査９０日目に、単極性電圧の明確な改善を認めることができ、正常に近い電圧が梗塞域に広がっていた。同様の程度の電圧の改善が、患者１、患者３および患者４において認められた（データ示さず）。
【０３７３】
心筋灌流イメージング（ＳＰＥＣＴ）：灌流イメージングを、以前に公開された方法に従って、ベースライン時、細胞治療後９０日目および６カ月目に行った。
【０３７４】
全ての画像を、デジタルで取得し、解析した。この解析から、２４時間の洗い流し再スキャンと併せて、基礎条件およびアデノシンストレス条件下における駆出率、灌流欠損サイズおよび心室容積を導いた。各時点における各患者についての結果を以下で考察する。
【０３７５】
灌流欠損：一般に、全体的な梗塞サイズを示すと考えられている灌流欠損サイズは、治療患者では、追跡調査の６カ月間にわたって減少するか、または不変のままであった。欠損が、全心室壁の４〜５％未満まで回復したことを意味する「臨床的に有意である」とみなされる欠損の減少を、２人の患者が示した。これらの症例の両方において、改善領域は、ＮＯＧＡマッピングによって測定した場合、電圧改善領域と一致した。ＮＯＧＡマッピングは研究用とみなされているが、このデータは、単極性電圧が、梗塞サイズの測定に代わることができるという仮説の妥当性を支持する。
【０３７６】
駆出率（ＥＦ）：一般に、研究患者の駆出率は、改善するか、または比較的不変のままであった。１人の患者は、全体的なＥＦの（６カ月間にわたって６３％から５０％への）顕著な減少を経験したが、この患者は、細胞治療の過程の間に、完全用量の細胞が実際に心内膜心筋に投与されたか否かが疑われる重大な有害事象を経験した。２人の患者は、この患者群について予想された増加をはるかに上回るＥＦの増加を示した。プラセボ対照を欠くことにより、この改善の機構についてのいかなる結論も排除することができない。
【０３７７】
拡張末期容量（ＥＤＶ）：ＥＤＶを、ベースライン時ならびに治療後９０日目および６ヶ月目に測定した。一般に、ＥＤＶは、すべての患者において、６カ月の追跡期間にわたり不変のままであり、これらの患者において、顕著なリモデリングは生じなかったことが示唆された。
【０３７８】
図１８は、３人の患者において、ベースライン（ＢＬ）測定値を、ｈＡＢＭ−ＳＣによる治療後９０日目に得た測定値と比較することによる、心臓の修復された灌流欠損サイズの変化を示す。図１９は、ベースライン（ＢＬ）測定値を、ｈＡＢＭ−ＳＣによる治療後９０日目に得た測定値と比較することによる、３人の患者において測定した心臓の駆出率の変化を示す。
【０３７９】
実施例１２
インビトロで赤血球を生成するためのヒトＡＢＭ−ＳＣおよびそれに由来する組成物
骨髄の微小環境が、造血を支持し、調節するのに必要なマトリックス分子、増殖因子およびサイトカインの必須の組合せをもたらすことはよく知られている（Ｄｅｘｔｅｒａｔ ａｌ.１９８１）。造血細胞の自己複製および系列によって制限される分化を推進することが知られている、栄養因子の全部ではないにしても大部分が、間葉系支持細胞に由来する（Ｑｕｅｓｅｎｂｅｒｒｙｅｔ ａｌ.１９８５）。ＲｏｅｃｋｌｅｉｎとＴｏｒｏｋ−Ｓｔｏｒｂ（１９９５）は、これらの細胞の比較的純粋な集団の中でさえ、造血を示差的に支持する亜集団を単離することができることを示した。これらの以前の刊行物に記載されている不死化クローンとは異なり、本明細書に記載のとおりに利用されるｈＡＢＭ−ＳＣは、ＩＬ−６（Ｕｌｌｒｉｃｈｅｔ ａｌ.１９８９）、ＬＩＦ（Ｃｏｒｙ ｅｔ ａｌ.１９９１）、ＳＤＦ−１（Ｈｏｄｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ.２０００）、ＳＣＦ（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ.１９９１）、アクチビン−Ａ（Ｓｈａｏｅｔ ａｌ.１９９２）、ＶＥＧＦおよびＩＧＦ−ＩＩ（Ｍｉｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ.２００６）を含むが、これらに限定されない赤血球生成を誘導し、維持するのに重要な多くの因子を分泌する、ＣＤ４５陰性で、ＣＤ９０／ＣＤ４９ｃ同時陽性の非造血性支持細胞の純粋な集団である（図２０）。
【０３８０】
造血前駆体（例えば、胚性幹細胞（ＥＳ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、臍帯血細胞（ＣＢＣ）または方向付けされた赤芽球前駆体（ＢＦＵ−Ｅ））の出発集団から赤血球細胞を生成するために、ヒトＡＢＭ−ＳＣおよび／またはかかる細胞によって生成される組成物を利用して、造血前駆体の赤芽球への増殖および分化のために必要な、またはその増殖および分化を補うために必要な赤血球生成因子の「カクテル」を送達することによって、赤血球生成を誘導し、増強し、かつ／または維持することができる。図２０を参照されたい。
【０３８１】
実施例１３
細胞由来組成物および栄養因子の生成、単離、精製および包装
二段階の下流のバイオプロセスが、ヒトＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣによって生成される分泌増殖因子、サイトカイン、可溶性受容体および他の巨大分子などの組成物を製造し、収集し、かつ精製するために開発されている。細胞によって作られた化学量論比などで生成された、分泌細胞組成物のこのカクテルは、再生促進性の治療用細胞培養試薬ならびに／またはインビトロでの細胞および組織の再生を研究するための研究ツールとして途方もない可能性を有する。かかる組成物は、懸濁培養での出発赤血球前駆細胞集団の増殖および系列に適した分化を支持するための、細胞自体の代替物として使用することもできる。
【０３８２】
無血清馴化培地の生成
凍結保存したヒトＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号Ｐ２５−Ｔ２Ｓ１Ｆ１−５）を解凍し、４ｍＭＬ−グルタミン（ＨＹＣＬＯＮＥ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、ローガン、ユタ州、米国、カタログ番号ＳＨ３０２５５．０１）を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１２４９１−０１５、ロット番号２８４１７４（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．、カールスバッド、カリフォルニア州、米国））１Ｌに再懸濁する。
【０３８３】
細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢｉｎｄ（登録商標）ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１０チャンバー（カタログ番号３３１２、（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州、米国））中に、１ｃｍ２当たり２０，０００〜２５，０００細胞の密度で播種する。ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１０チャンバーユニットの一方のポートに、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）培養チャンバー充填アクセサリー（Ｃｕｌｔｕｒｅｃｈａｍｂｅｒ ｆｉｌｌｉｎｇ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）カタログ番号３３３３、（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州、米国））を付け、他方のポートには、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）培養チャンバー充填アクセサリー３７ｍｍ、０．１μＭフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）カタログ番号：３２８４、（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州、米国））を付ける。
【０３８４】
培養物を、３７℃±１℃のインキュベーター内に入れ、血液ガス混合物（５±０．２５％ＣＯ２、４±０．２５％Ｏ２、残りは窒素（ＧＴＳ、アレンタウン、ペンシルベニア州））を用いて、５±０．５時間通気する。播種後２４±２時間後に、培地を除去し、新鮮な培地１Ｌと交換し、前記のとおりに通気する。約７２±２時間後に、無血清馴化培地を、生物学的安全キャビネット内のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１０チャンバーユニットから無菌的に取り出し、１ＬのＰＥＴＧ瓶に移す。その後、この無血清馴化培地を、接線フローろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって処理する。
【０３８５】
無血清馴化培地の単離および精製
接線フローろ過（ＴＦＦ）を、上記のとおりにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１０チャンバーユニットから回収した無血清馴化培地のリザーバで行った。１００キロダルトン（ｋＤ）の分子量カットオフを有するポリスルホン中空糸（カタログ番号Ｍ１ＡＢＳ−３６０−０１Ｐ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ランチョドミンゲス、カリフォルニア州、米国））を利用した。馴化した無血清リザーバ（貯留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を、中空糸の管腔を通過して管腔の面に対して接線方向に再循環させる。１００ｋＤ以下の分子量を有する分子は、管腔を通過して、２ＬのＰＥＴＧ瓶中に入る。この画分は、透過物またはろ液と呼ばれる。この貯留物を、容積が約５０ｍＬ未満に減少するまで連続して再循環させる。その後、この貯留物を廃棄し、さらなる処理のために、透過物を保持する。得られた透過物（約１Ｌ）は、細胞デブリおよび大型の巨大分子は含まない、低分子量の分子を含む清澄な無血清溶液であり、本明細書で、画分＃１と呼ぶ。
【０３８６】
その後、画分＃１に対して、１０キロダルトン（ｋＤ）の分子量カットオフを有するポリスルホン中空糸（カタログ番号Ｍ１１Ｓ−３６０−０１Ｐ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ランチョドミンゲス、カリフォルニア州、米国））を用いて、追加のＴＦＦを行う。その後、画分＃１を貯留物として用い、中空糸の管腔を通過して管腔の面に対して接線方向に再循環させる。１０ｋＤ以下のより小さい分子（すなわち、アンモニア、乳酸など）は、この管腔を通過することが可能である。貯留物の容積が１００ｍＬまで減少した後に、溶液のダイアフィルトレーションを開始する。フェノールレッドを含まないアルファ−ＭＥＭ（ＨＹＣＬＯＮＥ、カタログ番号ＲＲｌ１２３６．０１（ＨＹＣＬＯＮＥＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、ローガン、ユタ州、米国））１Ｌを、透過物がポンプで汲みだされるのと同じ速度で貯留物のリザーバに添加し、それにより、リザーバの容積を一定に維持する。得られた貯留物は、分子量が１０ｋＤから１００ｋＤまでの範囲の小型分子のみを含み、本明細書で、画分＃２と呼ぶ。
【０３８７】
５０キロダルトン（ｋＤ）の分子量カットオフを有するポリスルホン中空糸（カタログ番号Ｍ１５Ｓ−３６０−０１Ｐ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ランチョドミンゲス、カリフォルニア州、米国））を用いて、画分＃２に追加のＴＦＦを行うことによって、画分＃２をさらに処理することができる。したがって、画分＃２を、中空糸の管腔を通過して管腔の面に対して接線方向に再循環させる。５０ｋＤ以下のより小さい分子は、この管腔を通過する。両方の処理ストリームを、生成物として保持する。得られた透過物／ろ液は、主として、１０ｋＤ〜５０ｋＤの分子で構成されるが（画分＃３）、貯留物は、５０ｋＤ〜１００ｋＤの範囲の巨大分子を含む（画分＃４）。
【０３８８】
それぞれの得られた画分を、６０ｍＬのＰＥＴＧ瓶（カタログ番号２０１９−００６０、ＮａｌｇｅｎｅＮｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）の中で凍結させる。
【０３８９】
その後、そのような単離タンパク質画分に対して、さらなる無菌的な下流の処理および包装を行うことができ、その際、かかる組成物を、透析し、凍結乾燥し、（ＢＩＯＬＹＰＨ（商標）、ホプキンス、ミネソタ州、米国によって製造される）ＬＹＯＳＰＨＥＲＥＳ（商標）などの乾燥した生体適合性マトリックス中で再構成することができる。
【０３９０】
実施例１４
ＣＤ３４＋臍帯血細胞（ＣＢＣ）の単離、凍結保存および増殖
系列が方向付けされた赤血球系細胞（ＣＦＵ−Ｅまたは網状赤血球）の大規模生産を、以下に記載する方法を利用して、幹細胞または赤芽球前駆体（例えば、臍帯血細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞およびＢＦＵ−Ｅ）の出発集団から行うことができる。
【０３９１】
健常な臨月の新生児の臍帯血を、ヘパリン処置血液収集袋に収集する。塩化アンモニウム溶解溶液を臍帯血に添加し、次いで、この混合物を、室温で１５分間、３００×ｇで遠心することによって、清浄な有核細胞調製物を作製する。上清を細胞ペレットから吸引し、この細胞ペレットを、５％ヒト血清アルブミンを有するＢＳＳＤ（洗浄溶液）で洗浄する。これらの細胞を、室温で１５分間、３００×ｇで再び遠心し、洗浄液を、細胞ペレットから吸引によって除去する。ＣＤ３４＋細胞を、ＭＡＳＣＬＳカラム（ＭＡＣＳ（登録商標）；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、グラッドバッハ、ドイツ）を用いる磁気細胞分離によって、確立されたプロトコールを使用して分離する。その後、ＣＤ３４＋ＣＢＣを、約２×１０６細胞／ｍＬで、ＣＳＭ−５５に再懸濁し、速度制御フリーザーを用いて凍結保存する。
【０３９２】
ＢＳＳＤ（４．５％デキストロースを有する平衡塩類溶液）を、以下のように調製する。平衡塩類溶液である無菌の洗浄液（ＳｔｅｒｉｌｅＩｒｒｉｇａｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＢＳＳ；Ｂａｘｔｅｒ社、ディアフィールド、イリノイ州、米国）に、４５０±０．５ｇのデキストロース（ＥＭＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ギブスタウン、ニュージャージー州、米国）を添加し、ＢＳＳを用いて最終容積を１０．０Ｌにする。
【０３９３】
ＣＳＭ−５５（凍結保存用培地５％ＤＭＳＯ、５％ＨＳＡ）を、以下のように調製する:２Ｌの瓶の中で、ＢＳＳＤ１．４Ｌを、２５％ＨＳＡ（２５％ヒト血清アルブミン溶液、ＺＬＢ Ｂｅｈｒｉｎｇ社、イリノイ州、米国）４００ｍＬおよび５０％ＤＭＳＯ（５０％ジメチルスルホキシド、ＥｄｗａｒｄｓＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社、アーバイン、カリフォルニア州、米国）２００ｍＬと組み合わせる。
【０３９４】
洗浄溶液を、ＢＳＳＤ４００ｍＬおよび２５％ＨＳＡ１００ｍＬを用いて調製する。
【０３９５】
懸濁培養におけるＣＤ３４＋ＣＢＣの増殖
その後、これらの細胞を、１．０Ｕ／ｍＬの組換えヒトＥＰＯ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号２８７−ＴＣ）、１０  ＬＹＯＳＰＨＥＲＥＳ（商標）／Ｌを補充したＳｔｅｍＳｐａｎ（登録商標）Ｈ３００（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に再懸濁し、１．０×１０６／ｍＬの細胞濃度で、使い捨てのＨＹＣＬＯＮＥ（商標）、灌流ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳＣＯＮＴＡＩＮＥＲ（商標）（バイオリアクター）または等価物の中に接種する。培養物を、新鮮培地の連続的な流れを用いて、３７℃、窒素で平衡化した５％ＣＯ２、４％Ｏ２で、３週間維持する。１４日目に、Ｍｉｈａｒａｄａら、２００６に記載のとおりに、培養物に、糖質コルチコイドアンタゴニストのミフェプリストンを補充し、除核を加速させる。新鮮培地の連続的な流れを、２１日目の採集まで、これらの条件下で、一定速度で維持する。
【０３９６】
ヒトＡＢＭ−ＳＣ支持細胞層上でのＣＢＣの増殖
凍結保存したヒトＡＢＭ−ＳＣを解凍し、１．０Ｕ／ｍＬの組換えヒトＥＰＯ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号２８７−ＴＣ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、およびロット選択し、ガンマ線照射した１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を補充したＡｄｖａｎｃｅｄＲＰＭＩ培地１６４０（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））に再懸濁し、４０層の細胞培養ファクトリー（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆａｃｔｏｒｙ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の中に、１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃で、窒素で平衡化した５％ＣＯ２、４％Ｏ２下で維持する。５日目に、２分の１の容積の使用済み培地をこの培養物から除去し、１．０×１０６ＣＢＣ／ｍＬと共に、２分の１の容積の新鮮培地を添加することによって補充する。その後、新鮮培地の不連続な流れ（オン−オフ−オン）を与えて、培地条件が、新鮮（オン）から馴化（オフ）へ、再び新鮮培地（オン）に戻るように循環するのを可能にする。１４日目に、上記の記載のとおりに、培養物に、糖質コルチコイドアンタゴニストのミフェプリストンを補充し、除核を加速させる。共培養を、２１日目の採集まで、これらの条件下で維持する。
【０３９７】
実施例１５
ＡＢＭ−ＳＣは、スカベンジャー受容体およびアンタゴニストを分泌し、腫瘍壊死因子−αのレベルを用量依存的に減少させる
背景：本発明の実施形態は、治療有効量のｅｘＡＢＭ−ＳＣまたはｅｘＡＢＭ−ＳＣによって生成される組成物を送達することによって、対象の（炎症または自己免疫活性などの）有害な免疫活性を治療するか、低下させるか、または予防するための方法および組成物を含む。本発明の実施形態は、インビトロでの天然に存在する分泌組成物または基礎レベルの分泌組成物の生成による、ｅｘＡＢＭ−ＳＣまたはそれによって生成された組成物の利用を含む。あるいは、本発明の実施形態は、ｅｘＡＢＭ−ＳＣを操作して、（例えば、ＴＮＦ−αなどの炎症促進性因子の投与によって）生成される組成物の量および種類を調節（上方制御または下方制御）することによる、ｅｘＡＢＭ−ＳＣまたはそれによって生成される組成物の利用も含む。
【０３９８】
例えば、現在までに、ｅｘＡＢＭ−ＳＣが、サイトカインの腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の少なくとも１つのスカベンジャー受容体、およびインターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）の少なくとも１つのアンタゴニスト、およびサイトカインのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）の少なくとも１つの結合タンパク質（アンタゴニスト）を生成することが見出されている。したがって、本発明の実施形態は、治療上有用なタンパク質を未変性の形態で一貫して分泌する（ｅｘＡＢＭ−ＳＣなどの）安定な細胞集団の使用および投与のための方法および組成物を含む。
【０３９９】
本明細書で使用する場合、「安定な細胞集団」という用語は、単離し、インビトロ培養した細胞集団を意味し、この細胞集団は、（マウス、ラット、ヒト、イヌ、ウシなどの）生存哺乳類生物に導入した時に、（ニューロン（複数可）、心筋細胞（複数可）、骨細胞（複数可）、肝細胞（複数可）などの）１つまたは複数の新しい細胞型に分化した細胞の検出可能な生成を生じることはなく、この細胞集団中の細胞は、（可溶性ＴＮＦ−α受容体、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト、ＩＬ−１８アンタゴニスト、表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃなどに示す組成物などの）検出可能なレベルの少なくとも１つの治療上有用な組成物を分泌し続けるか、またはそのような組成物を分泌する能力もしくはそのような組成物の分泌を誘導する能力を維持し続ける。
【０４００】
本発明の目的では、「スカベンジャー受容体」は、（膜結合型であろうと、または細胞外環境中に遊離していようと、）その同族リガンドに結合し、中和することができる任意の可溶性受容体または分泌された受容体を意味すると意図される。
【０４０１】
上記に列挙した炎症促進性因子に加えて、本開示を考慮すると、本発明の細胞集団によって生成される組成物の濃度および種類を操作するために、本発明の細胞集団を、現在知られているまたは今後発見もしくは同定される因子の任意の数、種類、組合せおよび／または異なる濃度で、処理することができることも理解される。例えば、本発明の細胞集団は、好ましくは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびレプチンなどの因子で処理することができる。しかし、好ましい因子のこの簡潔なリストは、本発明の細胞集団を処理するために用いることができる異なる組成物の数に関して制限するものとして意図されず、また制限するものとして解釈されるべきではなく、（簡潔な例として、核酸、脂質、炭水化物などの他の生物学的巨大分子、ならびにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および亜酸化窒素（ＮＯ）などの小分子および化学物質などを含む）多くの他の種類の化合物も、本発明の細胞集団を操作するために用いることができると理解されるので、これらの組成物がタンパク質に制限されることもない。
【０４０２】
方法：酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（これについても以下に記載する）で使用するために、無血清馴化培地を、以下に記載するとおりに生成した。凍結保存したヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号ＭＦＧ−０５−１５；約４３回の集団倍加時）を解凍し、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを含む場合と含まない場合とで、４ｍＭＬ−グルタミン（カタログ番号ＳＨ３００３４．０１．ロット番号１３４−７９４４、（ＨＹＣＬＯＮＥ（Ｃ）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、ローガン、ユタ州、米国））を補充したＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ（商標）；カタログ番号１２４９１−０１５、ロット番号１２１６０３２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カールスバッド、カリフォルニア州、米国））に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、Ｔ−２２５ｃｍ２ＣＥＬＬＢＩＮＤ（商標）（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．、ニューヨーク州、米国）培養フラスコ（培養表面が、特許権を有するマイクロ波プラズマ加工で処理されている；米国特許第６，６１７，１５２号参照）（ｎ＝３）に、培地３６ｍＬ中１０，０００、２０，０００、４０，０００細胞／ｃｍ２で播種した（条件につきｎ＝３）。４０，０００細胞／ｃｍ２で播種した熱不活性化細胞を、陰性対照として用いた。一定分量を無菌チューブへ移し、それを、（効率的な熱伝達のために）水を含む７０℃の加熱ブロック中で、約４０分間インキュベートすることによって、細胞を熱不活性化した。培養物を、３７℃の加湿した、３種類のガスを有するインキュベーター（窒素で平衡化した４％Ｏ２、５％ＣＯ２）内に約２４時間置いた。次いで、接着していないデブリを除去するのと同じ日に、培養物に新鮮培地を再供給して、インキュベーターに戻した。３日目に、細胞培地を、２０ｍＬのＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（商標）ＰＬＵＳ−２０遠心濾過ユニット（ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って濃縮した。簡単に説明すると、濃縮器を、１１４０×Ｇで４５分間遠心した。濃縮した上清（１００×最終濃度）を、清浄な２ｍＬのクライオバイアルに移し、後の使用まで、−８０℃で保存した。
【０４０３】
これらの接着培養物中の、ヒトＡＢＭ−ＳＣから生成された特定の分泌タンパク質のレベルを測定するために、３日目に、上記のとおりに収集し、１００×濃縮し、馴化した細胞培養上清で、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を行った。アッセイ当日、使用前に、上清を解凍し、室温まで平衡化させた。ＥＬＩＳＡ解析を行い、ＴＮＦ−α、可溶性ＴＮＦ−ＲＩ（ｓＴＮＦ−ＲＩ）、可溶性ＴＮＦ−ＲＩＩ（ｓＴＮＦ−ＲＩＩ）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−ＩＲＡ）およびＩＬ−２受容体αを検出した（製造業者の取扱説明書に従って行った；全てのキットは、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ミネアポリス、ミネソタ州、米国）から購入した）。
【０４０４】
これらの結果は、治療的に適するレベルの分泌スカベンジャー受容体（例えば、ｓＴＮＦ−ＲＩ）および受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−ＩＲＡ）が、これらの接着培養物によって生成され、これらのレベルを、細胞の濃度または用量を調節することによって制御することができることを証明する（図２１〜２３）。重要なことには、これらのデータは、これらの細胞が、それらが置かれた炎症性環境に応答することも証明する。例えば、強力な炎症性サイトカインのＴＮＦ−αで処理した後に、これらの細胞は、ｓＴＮＦ−ＲＩＩ（図２２Ｂ）およびＩＬ−ＩＲＡ（図２３）の分泌を上方制御する。興味深いことに、これらの試料培養物において、ＴＮＦ−αのレベルが、細胞播種密度を増加させる毎に著しく減少し（図２１）、このことは、ＴＮＦ−α自体が、ＡＢＭ−ＳＣまたはＡＢＭ−ＳＣが分泌する因子のいずれかによって、何らかの方法で捕捉されたことを示唆する。
【０４０５】
ｓＴＮＦ−ＲＩおよびｓＴＮＦ−ＲＩＩの両方が、ＴＮＦ−αに結合し、ＴＮＦ−αの生理活性を中和することができることは確立されている。測定可能なレベルのＴＮＦ受容体の両方の形態およびＴＮＦ−α自体が、細胞播種密度が増加する毎にそれぞれ著しく減少するので、このアッセイ系では、ＡＢＭ−ＳＣ由来のｓＴＮＦ−ＲＩおよびｓＴＮＦ−ＲＩＩが、ＴＮＦ−αに結合し、ＴＮＦ−αをマスキングしている可能性がある。
【０４０６】
熱不活性化細胞のみを含む培養物中では、測定した可溶性受容体および受容体アンタゴニストの検出可能なレベルは認められなかった。アッセイ条件間の統計学的比較を、一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。
【０４０７】
実施例１６
骨形成誘導アッセイ：ヒトＡＢＭ−ＳＣ細胞は、約２５回の集団倍加を超えて増殖させた細胞集団を標準的な骨誘導条件に曝した時、または約３０回の集団倍加を超えて増殖させた細胞集団を増強した骨誘導条件に曝した時に、インビトロで骨分化の特徴を示さない
方法：以降、間葉系幹細胞増殖培地（ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＳＣＧＭ（商標））と呼ぶ、ＭＳＣＧＭ（商標）ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、カタログ番号ＰＴ−４１０５）を補充した間葉系幹細胞基礎培地（ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＳＣＢＭ（商標）；Ｌｏｎｚａ社、カタログ番号ＰＴ−３２３８）を１ウェル当たり２．４ｍＬ含む６ウェル培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５１６）に、ヒトＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣを３１００細胞／ｃｍ２で播種した。約４時間後、ＭＳＣＧＭ（商標）を、適切な試験条件に変えた。陰性対照ウェルは、ＭＳＣＧＭ（商標）単独、または５ｎｇ／ｍＬの組換えマウスノギン／ＦｃＣｈｉｍｅｒ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号７１９−ＮＧ）を補充したＭＳＣＧＭ（商標）のいずれかを再供給したウェルであった。試験ウェルは、骨形成誘導培地（ＯｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓＩｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＯＩＭ；Ｌｏｎｚａ社、カタログ番号ＰＴ−３９２４およびＰＴ−４１２０）単独（標準的な骨誘導条件）、または５ｎｇ／ｍＬの組換えマウスノギン／ＦｃＣｈｉｍｅｒを補充したＯＩＭ（増強した骨誘導条件）のいずれかで処理したウェルであった。次いで、培養物を、３７℃の加湿したＣＯ２インキュベーター内で維持し、新鮮培地を、３〜４日毎に２週間再供給した。１４日後、製造業者の取扱説明書に従って、ＣａｌｃｉｕｍＬｉｑｕｉｃｏｌｏｒキット（Ｓｔａｎｂｉｏ社、カタログ番号０１５０−２５０）を用いるカルシウム測定のために培養物を処理した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４マイクロプレートリーダーを用いて、５５０ｎｍで、プレートを読み取った。
【０４０８】
結果：研究ロット番号ＭＣＢ１０９由来のヒトＡＢＭ−ＳＣおよびｅｘＡＢＭ−ＳＣを、標準的な骨誘導条件下（ＯＩＭのみ）または増強した骨誘導条件下（ＯＩＭおよびモルフォゲンであるノギン；ＯＩＭ＋ノギン）で培養した。陰性対照の培養物を、増殖培地単独（ＭＳＣＧＭ（商標））またはノギンを補充したＭＳＣＧＭ（商標）（ＭＳＣＧＭ（商標）＋ノギン）のいずれかの中で維持した。
【０４０９】
約１６回の集団倍加時のＡＢＭ−ＳＣは、ＯＩＭ培地にノギンを補充した時に、カルシウム沈着の約６倍の増加を示した（すなわち、約１６回の集団倍加時のＡＢＭ−ＳＣは、ＯＩＭ条件下では、カルシウムを約５μｇ／ウェル沈着し、ＯＩＭ＋ノギンの条件下では、約３０μｇ／ウェルを沈着した）。ＡＢＭ−ＳＣは、標準的なＯＩＭ条件下では、約１６回の集団倍加を超えると、検出可能なレベルのカルシウムを沈着する能力を喪失したが、これは、ノギンを補うことによって逆転させることができた（すなわち、約２５回の集団倍加時のｅｘＡＢＭ−ＳＣは、ＯＩＭ条件下では、検出可能なカルシウムを沈着しなかったが、これらの同じ細胞は、ＯＩＭ＋ノギンの条件下では、カルシウムを約５μｇ／ウェル沈着した）。対照的に、約３０回を超える集団倍加時では（例えば、約３５および４３回の集団倍加時では）、ｅｘＡＢＭ−ＳＣは、試験した条件（標準的なＯＩＭまたは増強したＯＩＭ）のいずれにおいても、検出可能なレベルのカルシウムを沈着しなかった。
【０４１０】
実施例１７
ＡＢＭ−ＳＣによる、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）およびＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の発現
方法：約４３回の細胞集団倍加を経たヒトＡＢＭ−ＳＣ（ロット番号：Ｐ１７−Ｔ２Ｓ１Ｆ１−５）を解凍し、ブレフェルジンＡを３μｇ／ｍＬ（１×）で補充したＡＦＧ増殖培地中に播種し、加湿した、５％ＣＯ２インキュベーター内に、３７℃で２４時間置いた。次いで、ブタトリプシンを使用して、培養細胞を培養フラスコから除去し、洗浄し、フローサイトメトリーのために、ＣＡＬＴＡＧＦＩＸ＆ＰＥＲＭ（登録商標）染色プロトコール（ＣＡＬＴＡＧ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社；現在、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（カールスバッド、カリフォルニア州、米国）の一部である）に従って調製した。細胞を、１：１０に希釈したニートのＦＩＴＣ結合マウス抗−ヒトＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号１１−７０１５、クローンＣＲＭ１７）抗体または非標識ウサギ抗−ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ；Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ社、カタログ番号１８９３−１、クローンＥＰ１０８８Ｙ）のいずれかを用いて、ともに室温で４５分間染色した。次いで、ＦＩＴＣ−ウサギＦＩＴＣ−標識ヤギ抗−ウサギ抗体を用いて、ＩＬ−１８ＢＰを検出した。アイソタイプ対応対照を、陰性対照として含めた（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社）。
【０４１１】
結果：ヒトｅｘＡＢＭ−ＳＣは、ＴＮＦ−αなどの炎症性シグナルの非存在下であっても、基礎レベルのＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ；図２４Ａ）およびＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ；図２４Ｂ）を発現させる。
【０４１２】
実施例１８
ヒトＡＢＭ−ＳＣは、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１３の発現を減少させるが、同時に、ＩＬ−２の発現を増加させる
方法：ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、１）同一ドナー（レスポンダー＋自己）由来のマイトマイシンＣ処理したＰＢＭＣ、または２）異なるドナー（レスポンダー＋刺激因子）由来のマイトマイシンＣ処理したＰＢＭＣのいずれかを含む２４ウェルプレート中、５％ヒト血清アルブミン、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  グルタミン、０．０５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０中で共培養した。各供給源からのＰＢＭＣを、それぞれ、４×１０５細胞／ウェルで播種した。各条件について、培養物に、ヒトＡＢＭ−ＳＣを４０，０００細胞／ウェルの播種密度で補う場合と、補わない場合とを設けた。培養物を、加湿した、５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で７日間維持し、培地を馴化した。馴化した細胞培養上清を収集し、種々のサイトカインの存在について、ＳＥＡＲＣＨＬＩＧＨＴ（商標）９−Ｐｌｅｘアッセイ（ＰｉｅｒｃｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ロックフォード、イリノイ州）を用いて分析した。統計解析を、一元配置ＡＮＯＶＡ（分散の解析）によって行った。
【０４１３】
結果：混合ＰＢＭＣ反応について予想されるとおり、同種ＰＢＭＣ（レスポンダー＋刺激因子）の共培養により、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１３のレベルの著しい増加がもたらされた。しかし、ヒトＡＢＭ−ＳＣを用いて誘発した場合、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−αの両方が有意に減少した（Ｐ＜０．００１）ことから、ＡＢＭ−ＳＣを治療に活用して、炎症性メディエーターの病巣レベルまたは血清レベルを低下させることによって、慢性炎症障害または移植片拒絶を治療できることが示唆された。図２５Ａ、図２５Ｂおよび図２５Ｃを参照されたい。
【０４１４】
特に、ＡＢＭ−ＳＣは、自己（レスポンダー＋自己）および同種（レスポンダー＋刺激因子）の両方の混合ＰＢＭＣ培養物において、ＩＬ−２の発現上昇を誘導するが（Ｐ＜０．００１）、同時にＰＢＭＣ増殖を抑制する。この結果は、Ｔ細胞増殖の促進におけるＩＬ−２の重要性を考慮すると、幾分か矛盾するように思えるが、最近、マウスにおいて、ＩＬ−２経路を破壊すると、免疫不全よりむしろ、リンパ過形成および自己免疫が生じることが示され、これは、ＩＬ−２の主要な生理学的役割が、Ｔ細胞応答を増強するのではなく、制限するかまたは調整することができることを示唆する（Ｎｅｌｓｏｎ,“ＩＬ−２,Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ−Ｃｅｌｌｓ,ａｎｄ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ,”Ｊｏｕｒ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１７２：３９８３−３９８８（２００４））。さらに、現在、ＩＬ−２も、インビボにおいてＴ細胞反応を抑制することにより自己寛容を促進するのに重大な意味をもち、これが生じる機構は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の増殖および成熟を介することが知られている。したがって、ＡＢＭ−ＳＣを治療に利用して、調節性Ｔ細胞の成熟を、ＩＬ−２の上方制御の誘導を介して間接的に支持することによって、Ｔ細胞寛容を誘導できることが企図される。
【０４１５】
実施例１９
ヒトＡＢＭ−ＳＣは、マイトジェン誘導性末梢血単核球の増殖を阻害する
方法：ヒト成人骨髄由来体細胞（ＡＢＭ−ＳＣ）を、５％ＣＯ２下、加湿インキュベーター内で９６時間インビトロ培養し、次いで、９６ウェル丸底プレートにて、ＲＰＭＩ完全培地（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標））中２５，０００生存細胞／ｍＬの濃度で継代した。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、別々に、ＲＰＭＩ完全培地中２５０，０００細胞／ｍＬで、またはＡＢＭ−ＳＣの（約１９回の集団倍加まで継代培養した）ロット番号ＲＥＣＢ８０１もしくは（約４３回の集団倍加まで継代培養した）ＲＥＣＢ９０６と共に培養した。ＰＢＭＣ増殖を刺激するために、培養物に、２．５μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を接種した。培養５６時間後に、チミジン−［メチル−３Ｈ］（Ｐｅｒｋｉｎｇ Ｅｌｍｅｒ社、１μＣｉ／ウェル）で細胞をパルスした。細胞を、７２時間目に、フィルターマスターハーベスター（Ｆｉｌｔｅｒｍａｓｔｅｒ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）を用いて、ガラスフィルター上に収集した。フィルターを、Ｏｍｎｉｆｉｌｔｅｒｐｌａｔｅｒ中で、ＮＸＴ ＴｏｐＣｏｕｎｔシンチレーションカウンターを用いて読み取った。ヒト間葉系幹細胞を、陽性対照として含めた（ヒト間葉系幹細胞は、現在、ＬｏｎｚａＧｒｏｕｐ Ｌｔｄ.、バーゼル、スイスが所有しているＣａｍｂｒｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社から入手した）。統計学的解析を、一元配置ＡＮＯＶＡ（分散の解析）によって行った。
【０４１６】
結果：ＰＢＭＣ誘導性増殖は、ＡＢＭ−ＳＣのいずれかのロットを用いて誘発した時に、有意に減少した（Ｐ＜０．００１）。図２６を参照されたい。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、陽性対照として含めた。これらのデータは、ＡＢＭ−ＳＣが、全ＰＢＭＣ調製物のマイトジェン誘導性増殖を阻害するだけでなく、このアッセイ系にＡＢＭ−ＳＣが存在すると、調製物中の様々な細胞亜集団（例えば、単核球、顆粒球、リンパ球）の増殖を誘導しないことを示唆する。
【０４１７】
実施例２０
コラーゲンベースの生理活性デバイス
この実施例において、以下の略語を用いる：
ＡＤＧ；Ｌ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭに基づく培地製剤
ＢＳＣ；バイオセーフティーキャビネット（層流フード）
ＢＳＳ；平衡塩類溶液
ＣＦＭ−Ｇ；ＭＥＭ、グリセロール、ウシ血清およびＦＢＳを含む凍結保存培地
ＤＭＥＭ；ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＰＢＳ；ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
ＥＬＩＳＡ；酵素結合免疫吸着測定法
ＥｔｈＤ−１；エチジウムブロマイド（死細胞を赤色に染める）
Ｇｌｕｔ；グルタルアルデヒド
ｈＡＢＭＳＣ（ｓ）；ヒト成人骨髄由来間質細胞（複数可）
ＨＥＰＥＳ；
ＰＢＳ；リン酸緩衝生理食塩水
ＲＰＭ；１分間あたりの回転数
ＶＥＧＦ；血管内皮増殖因子
【０４１８】
序論
ヒト成人骨髄由来間質細胞（ｈＡＢＭ−ＳＣ）は、組織の修復および再生に関与する多種多様な因子を分泌する。ラット尾部コラーゲンと組み合わせると、これらの細胞は数日間生存し、用量依存的に構築物を収縮させ、培地に因子を放出する（研究ＲＮＤ−０４−０３２−３を参照する）。ｈＡＢＭ−ＳＣおよびラット尾部コラーゲンを組み合わせ、培養することから生成される構築物は、医療デバイスとして販売される可能性を有する治療因子を含む柔軟な実体である。この実施例は、臨床グレードの、ＧＭＰコラーゲンベースの生理活性医療デバイスを調製する方法を提供する。
【０４１９】
以下の４つの主要なステップが、コラーゲンベースの生理活性デバイスの生成に関与した：１）細胞の調製、２）コラーゲンゲルの形成、３）コラーゲン＋細胞構築物の培養、および４）コラーゲン構築物の加工。各ステップは、調整のための一連の変数および機会を含んでいた。様々な程度の生理活性、耐久性、柔軟性、およびサイズを有する２００を超える異なるデバイスを作製した。
【０４２０】
細胞密度、コラーゲン濃度、および／またはコラーゲンゲル容積を増加させると、より高い生理活性がもたらされた。実施形態において、４ｍｇ／ｍｌまたは６ｍｇ／ｍｌいずれかのコラーゲン濃度が、この研究において最適な生理活性をもたらした。最高で９ｍｌのコラーゲンゲル容積から生成されたデバイスが適しており、より高レベルのＶＥＧＦをもたらした。しかし、より高容積のゲルは、他のデバイス反復物と比較して、耐久性が低下した。これらの構築物を加工するために用いたグルタルアルデヒド架橋結合濃度は、０．００５％〜０．０５％の間が最適であった。層流フード内でのポリエチレンプラスチックの脱水により、薄く、可撓性であり、室温にて保存することができるデバイスが得られた。
【０４２１】
ｈＡＢＭ−ＳＣおよび臨床グレードのブタコラーゲンを用いて、コラーゲンベースの生理活性デバイスの製作に成功した。以下のプロトコールは、比較的低いＣＯＧ、耐久性、および安定性を有する、生存していない生理活性医療デバイスの生成法を提供する。本発明の実施形態において、最適と認められたパラメータには、以下のものが含まれる：
６ｅ６ ｈＡＢＭ−ＳＣ
３日間または４日間の培養
４ｍｇ／ｍｌまたは６ｍｇ／ｍｌのコラーゲン
６〜９ｍｌのゲル容積
０．００５％、０．０１％および０．００５％のグルタルアルデヒド。
【０４２２】
目的
この研究の目的は、１）生存細胞を欠くが、生理活性因子を保持する、２）長期保存が可能で、かつ輸送が容易である、３）ＧＭＰ製造に拡大することができる医療デバイスを開発することであった。
【０４２３】
研究設計
この実施例において、ｈＡＢＭ−ＳＣを用いるコラーゲンベースの生理活性デバイスの生成には、図４０で概要を述べた４つの主要なステップが含まれる。各ステップは、異なる特徴を有するデバイスを生成するために変更することができる複数の要素を必要とする。この実施例は、生存しておらず、生理活性を有し、拡張可能な医療デバイスの生成のための最良の組み合わせを特定するために、成分を段階的な方法で変更した多数のより小さい実験のまとめである。変更したパラメータのまとめを表４に示す。
【０４２４】
【表４】
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【０４２５】
２００を超える異なる組み合わせ／デバイスを作製した。これらのデバイスを、最初に、サイズ、テクスチャ、色、表面プロフィールについて物理的な観測および測定により評価した。それらの物理的特徴により容認できると思われるデバイスを、ＥＬＩＳＡによる因子の定量化、機械的検査、コラゲナーゼ消化について、さらに試験を続けた。
【０４２６】
材料および方法
細胞
細胞型：製品レベルのｈＡＢＭＳＣ（この研究を通して、複数のロットを用いた）
培養容器：なし、凍結バイアルから解凍し、再懸濁した直後に用いられる細胞
播種密度：これらの研究を通して、コラーゲンゲル構築物内の播種密度を変更したが、６ｅ６、７ｅ６、８ｅ６、１０ｅ６、１５ｅ６個の生存細胞の全細胞数を各デバイスに含めた。
【０４２７】
材料および機器
デバイス材料および機器
Ｌ−グルタミンを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（ＡＤＧ）：ＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ、４ｍＭ グルタミン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
コラーゲン：ブタ皮膚由来の、１０ｍｇ／ｍｌのＴｈｅｒａＣｏｌコラーゲン（１％；ＳｅｗｏｎＣｅｌｌｏｎｔｅｃｈ、韓国）
（４ｍｇ／ｍｌコラーゲンゲルに対する）コラーゲン緩衝液：７．５％炭酸水素ナトリウム１６ｍｌ、１ＭＨＥＰＥＳ４ｍｌ、１Ｎ水酸化ナトリウム２ｍｌ、滅菌水７８ｍｌ
（６ｍｇ／ｍｌコラーゲンゲルに対する）コラーゲン緩衝液：７．５％炭酸水素ナトリウム２０ｍｌ、１ＭＨＥＰＥＳ  ６．６６ｍｌ、１Ｎ水酸化ナトリウム５．３ｍｌ、滅菌水６８ｍｌ
Ｌ−グルタミンを含む１０×ＤＭＥＭ：１０×ＤＭＥＭ、１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン
グルタルアルデヒドのワーキング溶液：最終濃度まで１×ＤＰＢＳで希釈した８％グルタルアルデヒドストック溶液
５Ｍグリシン溶液：グリシン粉末（Ｓｉｇｍａ社）、１×ＤＰＢＳ
１×ＤＰＢＳ
懸濁培養用６ウェルプレート（直径３５ｍｍのウェル、ＧｒｅｎｉｅｒＢｉｏＯｎｅ社）
平型薬さじ
Ｖ.Ｍｕｅｌｌｅｒ滅菌パウチ１２”×１５”（ポリエチレンプラスチック）
トリパンブルー  Ｇｉｂｃｏ社カタログ番号１５２５０−０６１
バイオセーフティーキャビネット（ＢＳＣ）
インキュベーター：Ｆｏｒｍａ ３１５０
遠心分離機：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ６Ｒ
血球計数器：Ｂｒｉｇｈｔｌｉｎｅ
倒立顕微鏡：Ｎｉｋｏｎ Ｍｏｄｅｌ ＴＳ１００
【０４２８】
デバイス試験の材料および機器
カルセインＡＭおよびＥｔｈＤ−１染色（生存細胞／死細胞の生存率／細胞毒性キット、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社）
コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ.）
平衡塩類溶液（ＢＳＳ）
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ（ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット、ＲｎＤＳｙｓｔｅｍｓ社）
はさみ
３７℃の水浴
ボルテックス
【０４２９】
実験手順
デバイスの生成
以下の４つの主要なステップにより、コラーゲンベースの生理活性デバイスの生成を完了した：上記の図４０で概説した１）細胞の調製、２）コラーゲンゲルの形成、３）コラーゲン＋細胞構築物の培養、および４）コラーゲン構築物の加工。
【０４３０】
簡単に説明すると、コラーゲンゲル溶液にｈＡＢＭ−ＳＣを封入することによって構築物を形成した。ウェルの直径が３５ｍｍの６ウェル懸濁プレートを、細胞含有ゲル溶液で満たし、ゲル化のために３７℃でインキュベートした。このゲル溶液を固化させた時点で、これをウェルからはがし、培地を用いて懸濁培養した。このコラーゲンゲル構築物を低Ｏ２条件下で培養し、その間、細胞はコラーゲンゲルを積極的に収縮させた。培養期間の終わりに、これらの構築物を、グルタルアルデヒド架橋結合により加工し、その後、グリシン洗浄した。最終的に、この構築物を脱水すると、これらの細胞は不活性化するが、これら細胞によって分泌された生理活性因子は保存された。
【０４３１】
各ステップにおいて、変更する機会はあった。その際、プロセスが変更されたか、または複数回の反復が行われ、詳細を以下に提供する。
【０４３２】
細胞の調製
ほとんどのデバイスは、液体窒素下で保存したバイアルから直接解凍したｈＡＢＭ−ＳＣを用いて作製した。これらの構築物のために、以下のステップを行って、これらの細胞を調製した：
１．凍結バイアルを液体窒素タンクから取り出し、６〜１０分間、３７℃の水浴中で解凍した。
２．細胞を、５０ｍｌのコニカルチューブ中のＡＤＧ培地で再懸濁した。
３．コニカルチューブ内の細胞を５分間、１，２４０ｒｐｍで遠心し、細胞をペレットにした。
４．上清を除去し、細胞数を数えるために、細胞をＡＤＧ培地に再懸濁した。
５．細胞懸濁液試料１００μｌを取り、ＡＤＧ培地に１：１０で希釈した。トリパンブルーで１：１希釈したこの試料を用いて、細胞の数および生存率を、血球計数器で評価した。トリパンブルーを排除した生存細胞を数え、色素を保持し、青色に染まった死細胞を数えた。
６．最終細胞濃度を用いて、単一の５０ｍｌコニカルチューブに、適切な数の生存細胞を一定分量入れた。
７．細胞懸濁液を含むコニカルチューブを、５分間、１，２４０ｒｐｍで再び遠心し、細胞をペレットにした。
８．全上清を細胞ペレットから除去した。これらのペレットは、構築物形成のために、コラーゲンゲル溶液と混合する準備ができた。
【０４３３】
コラーゲンゲル形成
コラーゲンゲル構築物を、これらの細胞ペレットと共に、ゲル成分を混合することによって形成した。これらの成分は、常に、以下の順番で混合した：Ｌ−グルタミンを含む１０×ＤＭＥＭ、コラーゲン緩衝液、ＴｈｅｒａＣｏｌストックコラーゲン、次いで、混合物を加えて、細胞ペレットを再懸濁する。
【０４３４】
表４に、これらのデバイスを生成するのに用いた異なるパラメータをまとめる。３つの異なるコラーゲン緩衝液を、４ｍｇ／ｍｌゲル、６ｍｇ／ｍｌゲル、または８ｍｇ／ｍｌゲルのために用いた。全てのゲル溶液成分を、細胞と組み合わせて、ゲル形成を開始するまで４℃で保った。
１．Ｌ−グルタミンを含む１０×ＤＭＥＭを、５０ｍｌコニカルチューブ（６個のゲルを作製する場合）または２５０ｍｌ瓶（１２個のゲルを作製する場合）のいずれかに加えた。各構築物の１０×ＤＭＥＭの容積は、最終ゲル構築物容積の１／１０であり、この構築物内でＤＭＥＭを１×溶液にした。
２．コラーゲンゲルの最終濃度を適切な４ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、または８ｍｇ／ｍｌにするために、コラーゲン緩衝液を、１０×ＤＭＥＭに加え、回転混合した。
３．１０ｍｇ／ｍｌのＴｈｅｒａＣｏｌストック溶液を、片方の手で回転させながら、瓶の中にコラーゲンをピペッティングによって加え、溶液中にコラーゲンを均等に分散させた。
４．これらの成分を、同じピペットを用いて、素早くピペットで溶液を吸引および排出することによって、均質溶液になるまで迅速に混合した（コラーゲンは、ピペットの内側をコーティングするが、混合中にピペットでの吸引および排出により流出し続けるだろう）。同様にピペッティング中、この溶液を含む瓶を回転させて、混合を助ける。
５．この溶液を完全に混合すると、さらに粘性の一貫性と相まって、ピンク色の外観を呈した。
６．このゲル溶液を細胞ペレットにピペットで入れ、素早くピペッティング操作して、これらの細胞をゲル溶液に完全に再懸濁させた。再懸濁した細胞で、この溶液が均一に濁り、細胞凝集体が見えなくなるまで、ピペッティング操作を続けた。
７．次いで、この細胞懸濁液を、ピペッティング操作を繰り返して、残りのコラーゲンゲル溶液に均一に分注し、このゲル溶液中にこれらの細胞を均一に分布させた。
８．規定量の細胞＋コラーゲン溶液を、懸濁培養６ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れた。異なるデバイスを作製し、試験したので、この最終容積は３ｍｌ〜９ｍｌの範囲であった。
９．ゲル溶液を含む培養プレートを、すぐに、５％ＣＯ２および１８％Ｏ２を含む３７℃の加湿インキュベーターに入れた。これらのプレートを１時間そのままにしておき、コラーゲンのゲル化を完了させた。
【０４３５】
コラーゲンおよび細胞構築物の培養
１．１時間インキュベーションした後、これらのプレートをインキュベーターから取り出し、ＢＳＣ内に置いた。
２．完全なゲル化後のコラーゲンゲル構築物を、滅菌した平型薬さじを用いて、これらのプレートのウェルから取り除いた。この薬さじをゲルの端とウェルの壁の間に挿入し、周囲を切り取り、ウェルの壁からこのゲルを完全に引き離した。
３．薬さじを用いて、これらのゲルを、周囲に沿って中心に向かって端を穏やかに押すことによって、ウェルの底から持ち上げた。
４．４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、および７ｍｌのゲル容積の構築物については、ＡＤＧ培地６ｍｌを、コラーゲンゲル構築物を含む各ウェルに加えた。８ｍｌおよび９ｍｌのゲル容積の構築物については、ＡＤＧ培地４ｍｌを加えた。
５．各構築物が培地中を自由に浮いている状態を確実にするか、あるいは、薬さじを用いて、構築物を完全にさらに持ち上げた。
６．次いで、これらの培養プレートを、培養のために、３７℃の、低酸素４％Ｏ２、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内に入れた。
７．構築物を１〜９日間培養した。ほとんどの構築物を６４〜７２時間培養した。
【０４３６】
コラーゲン構築物の加工
コラーゲンゲル中の細胞の培養後、これらの構築物を加工して、生存していない最終デバイスにした。この加工には、グルタルアルデヒド架橋結合、グルタルアルデヒド反応停止および脱水が含まれる。
【０４３７】
過剰なアミン基の条件下で、グルタルアルデヒド架橋結合反応を終了した。高濃度のグリシン溶液を加えることにより、未反応のグルタルアルデヒドの遊離端をグリシンと反応させた。この反応停止ステップは、架橋剤としてグルタルアルデヒドを用いる潜在毒性を防ぎ、制限することができる。
１．培養構築物を、グルタルアルデヒド溶液６ｍｌの添加により架橋結合した。このゲル構築物を、グルタルアルデヒド架橋結合および洗浄ステップの間中、元の培養プレート中で保持した。
２．グルタルアルデヒドを用いる架橋結合を、プレート振盪機をわずかに動かしながら、
室温で３０分間または１時間行った。
３．次いで、グルタルアルデヒド溶液をこれらのウェルから取り除き、１×ＤＰＢＳ６ｍｌを加えて、残留グルタルアルデヒドの洗浄を始めた。
４．１×ＤＰＢＳ６ｍｌによる少なくとも全部で４回の洗浄を１０分間行い、各ウェルから取り除いた。この洗浄の少なくとも２回については、これらのプレートをプレート振盪機上に置き、穏やかに撹拌した。
５．各ウェルに０．５Ｍのグリシン溶液６ｍｌを添加することにより、グルタルアルデヒド架橋結合反応を停止した。室温で２時間、３時間または４時間のグリシン反応停止中、プレートをプレート振盪機上に置き、穏やかに撹拌した。
６．グリシン反応停止の終わりに、この溶液を除去し、これらの構築物を、ステップ４で明記したとおり、再び、少なくとも全部で４回の洗浄にＤＰＢＳを用いて完全に、洗浄した。
７．最後の洗浄後、架橋結合した構築物の周りのウェルから可能な限り多くの液体を取り除き、ＢＳＣ内で構築物の脱水を始めた。
８．組織培養プレートの底で、以下の様々な脱水表面を直接試験した；スズ箔、ポリエチレンプラスチック（具体的には、１２”×１５”ポリエチレン滅菌パウチ）。これらの表面をＢＳＣ内においた。
９．平型薬さじを用いて、各単一架橋結合構築物を、ウェルプレートから脱水表面に移した。
１０．これらの構築物に対して、互いに少なくとも１０ｃｍの間隔をあけた。フードの明かりを消し、送風機を付けたまま、適切に機能する高さまでフードのドアを開けた状態で、構築物をＢＳＣ内に一晩放置した。
１１．これらの構築物を、ＢＳＣ内で一晩脱水した後、紙のように非常に薄いディスクにまで脱水することにより、デバイス構造を生成し、これをさらなる試験に用いた。
【０４３８】
デバイス試験
デバイス試験を、本明細書に記載の方法に従って行った。以下の試験を行った：物理的パラメータ、コラゲナーゼ消化およびＶＥＧＦＥＬＩＳＡを用いた生理活性の評価。
【０４３９】
結果
生存している構築物パラメータの変動
これらの実験について、生存しているコラーゲンゲル構築物内のｈＡＢＭ−ＳＣから分泌される因子の量および捕捉が増加するように培養条件を最適化することに焦点を置いた。最初の方法には、密度、コラーゲンゲルの濃度およびコラーゲンゲル内の細胞の培養時間を変動させることを含んだ。
【０４４０】
前の実験に基づき、ＣＯＧを考慮すると、２ｅ６細胞／ｍｌおよび５ｅ６細胞／ｍｌの細胞密度をこれらの研究で探求した。最初の実験のために作製した構築物は、容積が３ｍｌのコラーゲンゲルを利用し、したがって、最終的な全細胞数は、各ゲル中６ｅ６または１５ｅ６細胞のいずれかであった。このコラーゲンゲル濃度は、３ｍｇ／ｍｌまたは４ｍｇ／ｍｌ（各ゲル３ｍｌ容積）のいずれかであった。この最初の研究における第３の変数は、３７℃で、Ｎ２で平衡化した４％Ｏ２、５％ＣＯ２の低酸素圧下、１日間、３日間、６日間、または９日間、ｈＡＢＭ−ＳＣを播種したコラーゲンゲルを培養することであった。図４１および図４２は、細胞生存率、細胞形態、細胞活性および構築物の生理活性の分析を有するこの最初の研究の結果を示す。
【０４４１】
図４１は、完了した第１の研究の生存している構築物を染色する、細胞生存率（緑色のカルセインＡＭ＝生存、赤色のＥｔｈＤ−１＝死）の画像を示す。図４１の画像の上段は、培養３日後の４個のデバイス間の細胞形態における細胞播種密度およびコラーゲン濃度の違いを強調する。より高濃度のコラーゲンを播種した構築物は、より多くの生存している細胞を有するように見える。より多くのＥｔｈＤ−１赤色染色によって観察すると、３ｍｇ／ｍｌの構築物内の細胞死もわずかに上昇していた。これらのコラーゲンゲルは、コラーゲンゲル１ｍｌあたり最高で５百万個のＡＢＭ−ＳＣを許容し、保持することができるようにも見える。より高濃度のコラーゲンを有する構築物は、より収縮し、したがって、より密度が高くなるので（証拠として図４２を参照されたい）、４ｍｇ／ｍｌ、５ｅ６／ｍｌのデバイスにおいて、より多くの生存細胞が現れることは、実際、ゲルサイズの低下および全体的な密度の増加にまさに起因する可能性がある。
【０４４２】
図４１の下段は、同じ数の細胞を播種したが、１〜９日間培養したデバイスについて、培養時間の影響を強調している。細胞を播種したコラーゲン構築物の培養の最初の３日間で、これらの細胞がゲルを操り、ゲルをより少ない容積まで収縮する。３日目の形態（図２ｆ）は、ゲルを収縮させる細胞の一部の整列化を示す。３日目〜６日目の形態は似ているが、培養９日目までに、より多くの死細胞がこれらの構築物内に現れる（赤色染色）。
【０４４３】
より多くの細胞数およびコラーゲン濃度の増加が、より生存能力があり、収縮させる細胞を保持するのに好ましいように思われる。理論的には、より生存能力のある細胞が、より生理活性のある因子をもたらすべきである。
【０４４４】
図４２に示すとおり、細胞密度およびコラーゲン含有量の両方の増加が、構築物をより収縮させた。５ｅ６個のＡＢＭ−ＳＣを有するデバイスは、２ｅ６個のＡＢＭ−ＳＣを有するデバイスよりも速く、高い割合で収縮した。コラーゲン含有量が４ｍｇ／ｍｌまで増加した時、構築物はより速く、大きな程度で収縮した。組み合わせると、効果は相加的であった。
【０４４５】
これらの予備構築物の生理活性を評価するために、これらのデバイス内および培地中に分泌されたＶＥＧＦを、ＥＬＩＳＡを用いて定量化し、それを図４３にまとめる。このデバイスを消化し、この溶液の一部を分析し、次いで、全含有量（緑色のバー）を計算することによって、これらの構築物内に含まれるＶＥＧＦを測定した。これらのデバイスの全タンパク質含量を、ＢＣＡキットを用いて測定した（赤色のバー）。デバイスあたりのＶＥＧＦ量を、全タンパク質含量に対して正規化した（紫色のバー）。分泌因子の分析については、培地を実験の最後に収集し、分析し、培地１ｍｌあたりの因子の量として表した（青色のバー）。いくつかの構築物については、上清を分析しなかったので、青色バーはデータセットから失われている。
【０４４６】
図４３にまとめたＥＬＩＳＡデータは、１）より多くの細胞を加えると（１５ｅ６対６ｅ６）、構築物あたりのＶＥＧＦが多くなる、２）構築物内のコラーゲン含有量を増加させると（３ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ）、構築物あたりのＶＥＧＦが多くなる、３）デバイスを、６日を超えて培養すると、ＶＥＧＦ含有量が減少し、代わりに培地中により多くのＶＥＧＦが分泌されることを示す。
【０４４７】
また、図４３の結果は、毎日、構築物の培地交換を行った時、ＶＥＧＦ含有量が減少したので、３日間培養した構築物の供給プロトコールが最良で、この期間の培地に変化を起こさないことを示した。６日を越えて培養した構築物については、毎日培地交換する供給プロトコールも、または全く培地交換しない供給プロトコールも、結果として得られるＶＥＧＦ含有量は似ていたが、構築物を３日目に一回培地交換した時に、ＶＥＧＦ含有量が減少した。したがって、６日以内の任意の培養時間にわたり、全く培地を交換しないことによって、構築物内の最適なＶＥＧＦ含有量が達成され得る。これは、培地交換に付随する物品のコストならびに製造時間および人件費を著しく低下させる。
【０４４８】
全培養期間中、同じ培地中で培養した構築物は、デバイス内に最大のＶＥＧＦを含んでいた。しかし、供給せずに構築物を６日間培養することは、高いＶＥＧＦ含有量を維持するのに有益であるが、この期間中、培地はわずかに酸性になる。培養条件を改善するために、培地にＨＥＰＥＳを加える試験を行い、結果を図４４に示した。
【０４４９】
図４４に示したとおり、培地に２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加すると、培養期間中、コラーゲンゲル構築物内の細胞の生存が改善された。図４４の右のパネルを左のパネルと比較すると、培地に２０ｍＭＨＥＰＥＳを添加して培養した構築物は、より多くの生存細胞（緑色の細胞）およびより少ない死細胞（赤）を有していた。したがって、全てのその後の実験には、これらの構築物の培養のために、２０ｍＭＨＥＰＥＳをＬ−グルタミンを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地に添加することを含めた。
【０４５０】
これらの最初の研究の間に、以下の観察を行った。
１．播種する細胞が増加すると、ゲル収縮、ＶＥＧＦ分泌およびＶＥＧＦ含有量の増加をもたらした。
２．より高濃度のコラーゲンは、ゲル収縮、ＶＥＧＦ分泌およびこの構築物内のＶＥＧＦ捕捉の増加をもたらした。
３．培養時間が１日および３日の構築物は、より長い培養時間よりも、これらの構築物内に含まれるＶＥＧＦの捕捉を最大化した。
【０４５１】
これらの結果に基づいて、４ｍｇ／ｍｌ以上のコラーゲン濃度を有し、６日間未満培養した構築物を、次の研究に進めた。
【０４５２】
この次の段階中の焦点は、より厳密な分析および比較のために、Ｎ＝３の数個のリードデバイスを準備することであった。細胞密度、培養時間および供給プロトコールに焦点を置いた。全ての構築物を、４ｍｇ／ｍｌのより高濃度のコラーゲンで作製した。１日、３日、または６日の培養時間を考慮し、６日の培養では、３日目に１回供給したかまたは全く供給しなかった。ＶＥＧＦ含有量の定量化の結果を図４５に示す。
【０４５３】
供給した６日間の培養物と、供給しなかった培養物を比較すると、明らかな傾向が現れた。供給せずに６日間培養したデバイスでは、これらの構築物内のＶＥＧＦレベルが増強した。しかし、最大のＶＥＧＦを有する構築物は、３日間培養した構築物であった。以前に見られたとおり、播種する細胞数の増加（６対１５対１８）は、ＶＥＧＦレベルの増加と相関した。
【０４５４】
上記のデータの全てに基づいて、培養時間を４日以下に保ち、コラーゲン含有量を４ｍｇ／ｍｌに固定することを決めた。ＡＢＭ−ＳＣの限られた供給源および費用に対する影響のために、細胞数を、構築物あたり６ｅ６個のＡＢＭ−ＳＣに固定することも決めた。
【０４５５】
ａ）生存していない構築物の加工に伴うパラメータの変動
次の段階の目的は、生存構築物を加工して、室温での貯蔵に耐え、適用中に外科医が取り扱うことができる、耐久性があり、柔軟な、最終生成物である、生存していないデバイスを作製することであった。重要なことには、加工中に用いる技術は、これらの構築物の培養中にｈＡＢＭ−ＳＣによって分泌される生理活性因子を保存しなければいけないか、または著しく減少させてはいけないことである。
【０４５６】
これらの構築物のグルタルアルデヒド架橋結合を、最も容認できる方法として選択し、必要とされる単純な架橋結合プロトコールのおかげでより耐久性のある生成物を、かつこの架橋剤を利用して、ＦＤＡに認可される前の他のコラーゲン生成物（すなわち、ザイダーム（Ｚｙｄｅｒm）およびザイプラスト（Ｚｙｐｌａｓｔ））を生成した。架橋結合後の脱水を方法として選択し、このデバイスを、室温で保存することができる、薄く、可撓性のある乾燥材料に縮小させた。この節の中で示した結果が、最終加工のために試験した変更を要約する。この実施例のここから、デバイスという用語は、グルタルアルデヒド架橋結合および脱水の加工を受け、最終生成物をもたらす、生存していない構築物を指す。構築物という用語は、加工前の、生存細胞を播種したコラーゲンゲル構築物を指す。
【０４５７】
最初の実験で、構築物消化および細胞生存率に対するグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔ）濃度および架橋結合時間の影響を調べた。これらの最初の加工した「生存していない」反復物の結果を図４６に示す。
【０４５８】
図４６に示すとおり、ｇｌｕｔ濃度または架橋結合時間が増加すると、コラゲナーゼによる消化に対する構築物の耐性が増加し、細胞生存率が減少した。ｇｌｕｔ濃度を増加させるが、架橋結合時間を増加させないと、これらの構築物の架橋結合の改善により効果的な方法であることが判明した。架橋結合プロトコールの全ては、取り扱いに対して非常に耐久性のあるコラーゲン構築物をもたらした。最初の取り扱い時に、容易に崩壊し、バラバラに壊れ得る未加工の構築物とは異なり、ｇｌｕｔ固定デバイスはそれらの完全性を維持した。
【０４５９】
固定プロトコールを最適化し続ける一方で、脱水法を組み入れた。真空乾燥機を利用する機会のない場合およびＧＭＰ製造中にそれを利用できないと予想される場合に、バイオセーフティーキャビネット内における空気乾燥を利用した。試験した乾燥表面には、ホイル、薄く可撓性のあるポリエチレンプラスチック（また、プラスチックとも呼ばれる）、およびこれらの構築物を培養するのに用いられる組織培養プレートを含めた。図４７は、異なる表面を試験する最初の研究結果、ならびに架橋結合条件のさらなる変化およびそれらの条件の、デバイスＶＥＧＦレベルに対する効果を示す。
【０４６０】
プラスチック表面での脱水は、他の表面と比較して、脱水期間中に最高のＶＥＧＦを保存するのに役立った。不運にも、組織培養プレート中で直接脱水すると、脱水させたデバイスを取り除くのが困難になり、将来の製造工程に対して実用的でない表面にさせた。セロファンおよびホイルの表面上でのデバイスの脱水は、脱水期間の終わりに、これらのデバイスが容易にはがれる、固着しない表面を可能にした。したがって、これらのデバイスの全ての継続した開発には、ポリエチレンプラスチック表面上での構築物の脱水を含めた。
【０４６１】
図４７の結果は、ｇｌｕｔの増加が、ＶＥＧＦ含有量または回復の低下をもたらすという最初の観察を再確認する（左から右に傾向が観察される）。同様に、より長い固定時間は（３０分と１時間を比較すると）、ＶＥＧＦ含有量または回復の減少をもたらした。０．００１％のｇｌｕｔ濃度で３０分間架橋結合し、プラスチック上で脱水した構築物は、架橋結合していない未加工の構築物よりわずか２ｎｇ下回るＶＥＧＦの減少をもたらした。
【０４６２】
収集した全てのデータを考慮すると、グリシン洗浄を伴うｇｌｕｔおよび脱水のこの加工法が、架橋結合し、脱水しても、十分なＶＥＧＦを保存するデバイスを生成するのに最も適すると決定した。結果として得られたデバイスは、未加工の構築物と比較して、柔軟で、取り扱いに対して顕著により耐久性があり、紙のように非常に薄い材料であった。加工した構築物も、脱水状態でより安定であり、これらのデバイスの室温での長期保存を可能にした。
【０４６３】
ｇｌｕｔ架橋結合および脱水を含む完全な加工後の細胞生存率を評価するために、（６ｅ６細胞、３ｍｌゲル容積、４ｍｇ／ｍｌのコラーゲン、３日間培養、０．００１％ｇｌｕｔで３０分間加工し、脱水した）デバイスを、はさみを用いて１ｍｍ３未満の小片に細かく切り、ＡＦＧ（１０％ＦＢＳを含むｈＡＢＭ−ＳＣ増殖培地）中で６日間平板培養した。この培養物を毎日監視し、加工デバイスからのｈＡＢＭ−ＳＣの全てのプレーティングおよび／または増殖を観察した。この培養物の明視野画像および蛍光画像を図４８に示す。
【０４６４】
デブリおよび細胞レムナントが培養物中に存在していたが、培養期間にわたって、デバイス由来の生存細胞の増殖を示す変化は観察されなかった。培養６日後、生きている生存細胞のみが活発に取り込み、それらの細胞を緑色に染色するカルセインＡＭ色素で、デブリを染色した。図４８の明視野画像は、培養６日後に存在するデバイス／細胞デブリクラスターを強調する。このクラスターは、カルセイン色素で陽性に染まらないので、クラスター内には生存細胞が存在しないことが判明した。全ての生存細胞を示す陽性の緑色染色は、培養物全体および全てのデブリ中で観察されなかった。これらの結果は、生存している構築物を３０分間、０．００１％のグルタルアルデヒドで加工し、脱水すると、このデバイスを非生存状態にさせる、すなわち生存細胞がない状態にさせると思われることを示す。
【０４６５】
脱水した構築物の安定性を評価するために、数日間、室温で維持したいくつかのデバイスのＶＥＧＦ含有量を分析した。この研究には、エタノールを用いて固定したデバイス、異なる緩衝液で洗浄した事前加工した構築物および３ｍｌ超のコラーゲンを用いて生成したデバイスも含まれた。コラーゲン含有量を増加させる２つの方法を試験した；６ｍｇ／ｍｌまでコラーゲン濃度を増加させること、または３ｍｌのコラーゲン溶液から６ｍｌのコラーゲン溶液に構築物の容積を増加させること。
【０４６６】
この実験でコラーゲン濃度を増加させても、デバイス内に含まれるＶＥＧＦは増加しなかったが、ゲル容積を倍加させると、ＶＥＧＦ量が倍加した。このコラーゲンゲル容積の倍加は、デバイス内に含まれるＶＥＧＦ量を最大にする、最も顕著な改善をもたらした。ゲル容積の増加は、６ｅ６から１５ｅ６へ播種する細胞数を増加させることに匹敵する影響をＶＥＧＦ含有量に与えた。これは、これらのデバイスを生成するのに用いたブタコラーゲン量の増加における物品の費用が、各デバイスに必要とされるｈＡＢＭ−ＳＣ数の増加における物品の費用よりも著しく安価であるので、注目すべき発見であった。
【０４６７】
コラーゲンゲル構築物を６ｍｌ容積にすることで、より高レベルのＶＥＧＦを達成することを当てにして実験を続けた。図４９の中の、５２ｎｇの最高レベルのＶＥＧＦを有する反復物は、６ｍｌ容積での４ｍｇ／ｍｌのコラーゲンに６ｅ６細胞を有し、３日間培養し、０．０００１％ｇｌｕｔで３０分間架橋結合して、脱水したデバイスであった。この反復物は、ＶＥＧＦレベルを最高にしたが、このデバイスの耐久性は容認できるものではなかった。０．０００１％のグルタルアルデヒドでのこの非常に低レベルの架橋結合は、その完全性を維持しながら、適度な取り扱いに耐えることができなかった。取り扱い後、このデバイス自体は、容易に崩壊し、変形した。したがって、０．００１％以上のｇｌｕｔ架橋結合濃度が、患者への適用中に必要な取り扱いに耐えられるほど十分に耐久性があるデバイスを生成するのに必要であると結論づけた。しかし、これは、デバイスの生理活性を損なうことになる。
【０４６８】
４ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを用いて２日間培養した構築物は、３日間の培養に匹敵するＶＥＧＦレベルをもたらした。図５０の反復物の中の最も重要な結果は、架橋結合濃度が０．００１％ｇｌｕｔで、６ｍｇ／ｍｌまでコラーゲン濃度を増加させると、他の反復物と比較してＶＥＧＦレベルが最大化したということであった。８ｍｇ／ｍｌまでコラーゲンを増加させても、さらにＶＥＧＦは増加しなかった。６ｍｇ／ｍｌのコラーゲン濃度で生成した最初の構築物の図４８の結果は、コラーゲンゲル溶液製剤が６ｍｇ／ｍｌのコラーゲンに最適化されなかったので、その対応する４ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを用いたデバイスと比較して、ＶＥＧＦの増加をもたらさなかった。図５０は、６ｍｇ／ｍｌのコラーゲンのゲル製剤を、培養期間中にこのゲルを固化し、収縮する能力を最適化するように変更した後に作製したデバイスの結果であった。したがって、正しいゲル製剤の６ｍｇ／ｍｌのコラーゲン構築物が、４ｍｇ／ｍｌおよび８ｍｇ／ｍｌの反復物と比較して、デバイス内のＶＥＧＦ捕捉を増強した。
【０４６９】
０．０５％のｇｌｕｔ濃度は、このデバイスの取り扱いに際し、柔軟性が減少し、堅さが増加したために除外した。今後のデバイスのために選択したｇｌｕｔ濃度には、０．００１％、０．００５％、および０．０１％を含めた。
【０４７０】
４ｍｇ／ｍｌの構築物と比較するために、別のセットのデバイスを調製し、その結果を図５１に示した。このデータは、さらに開発され、この時点までに間に合った競争相手である全ての可能性のある反復物を示す。１０を下回るデバイス反復物まで変更を最終的に絞るために、複数回の反復を実行した。これらの結果に含まれる１つの変更は、（６ｅ６から１５ｅ６個の細胞の前回の急激な上昇のかわりに）わずかに６ｅ６を超える細胞数の増加の効果を観察することであった。
【０４７１】
考察
コラーゲンベースの生理活性デバイスは、ｈＡＢＭ−ＳＣおよび臨床グレードのブタコラーゲンを用いてうまく作ることができる。細胞密度、コラーゲン濃度、コラーゲンゲル容積、培養時間、グルタルアルデヒド架橋結合の濃度および時間、グリシン反応停止時間、洗浄緩衝液、ならびに脱水表面を変えた複数のデバイスを作製し、試験した。
【０４７２】
これらの研究は、細胞密度の増加が、デバイス内に含まれるＶＥＧＦ量を著しく増加させることができることを示した。しかし、より多くの細胞を添加すると、著しく費用が跳ね上がるので、デバイスには、６ｅ６個以下の細胞／デバイスを含め、ＶＥＧＦ含有量を高める他の方法を追求することに決めた。
【０４７３】
これらの研究における最も重要な発見は、濃度または容積のいずれかによる構築物のコラーゲン含有量の上昇が、生理活性を増大させることができることであった。構築物内のコラーゲンの増加は、おそらく、より多くの因子を分泌させる細胞の活性およびこの構築物内のこれらの因子をより良好に保持するゲルの能力の両方を増大するのに寄与した。広範なコラーゲンの濃度および容積を試験した後に、留意すべきことは、６ｍｇ／ｍｌより高めても、ＶＥＧＦ含有量の実質的な増加をもたらさなかったことである。結果として、６ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを、さらなるデバイス開発に用いる最適濃度として選択した。６ｍｌを超えてコラーゲンゲル容積を増加させると、デバイスの強度を低下させるように見えるが、これらの反復物を、より高いＶＥＧＦ含有量などの他の利点を提供するように、さらなる試験および開発について考慮した。
【０４７４】
培養した細胞播種コラーゲン構築物をグルタルアルデヒド架橋結合および脱水によって加工することにより、検出可能な生存細胞または培養によりさらに増殖できる細胞を含まないデバイスが得られた。グルタルアルデヒド濃度の増加は、より耐久性のある構築物をもたらしたが、０．０５％を超える濃度は、結果として得られるデバイスの可撓性を減少させた。０．００５％、０．０１％、および０．０５％のｇｌｕｔ濃度をさらに考慮した。
【０４７５】
より長時間の加工は生理活性に負の影響を及ぼすので、全体的な加工時間をより短く保つために、今後のデバイス反復物については、３０分の架橋結合時間を選択した。ポリエチレンプラスチックの脱水表面は、スズ箔および培養皿を上回って優れていることが判明した。ポリエチレンは滅菌することができ、固着しない表面を可能にし、脱水後に、これらのデバイスは容易に取り外し可能であった。
【０４７６】
できるだけ高いＶＥＧＦ含有量を保つ目的で、最終加工プロトコールには、グルタルアルデヒド架橋結合前の培養構築物の洗浄を含めず、唯一、架橋結合後にＤＰＢＳによる洗浄を含めた。
【０４７７】
実施例２１
コラーゲンベースの生理活性デバイス：手の腱の修復に対するデバイスの評価
実施例２０の略語をこの実施例でも用いる。
【０４７８】
要約
手の腱の修復には、このデバイスは、１）それ自体またはレシピエントの組織への縫合に耐えられるほど十分に強いこと、２）関連する生理活性因子を含むこと、３）外科医の操作に耐えられること、かつ４）薄くて、可撓性があることを必要とした。
【０４７９】
スケールアップしたＧＭＰ製造および製品流通に対する強度、生理活性、外観、実施可能性の予備基準を満たすコラーゲンベースの生理活性デバイスを、本明細書に記載のｈＡＢＭ−ＳＣを用いてうまく、再現性よく生成した。必須の特徴を有すると判定した６個のデバイスのさらなる試験が、手の外科医（ｈａｎｄ  ｓｕｒｇｅｏｎ）によって続けられた。これらのデバイスは、寸法、強度および生理活性の点で異なっているが、製造および治療への適用に対するコアとなる必要条件を維持している。
【０４８０】
デバイスに示される要素は、１）ＧＭＰグレードの材料の使用、２）製造のためにスケールアップすることができる生成法、および３）エンドユーザーである手の外科医を満足させる物理的および機能的な特性である。６個の最終デバイスは、薄くて、可撓性があった。これらは、再水分補給により、容易に操作でき、繰り返し取り扱えた。生理活性の代替マーカーとして用いられるＶＥＧＦを、全てのデバイスにおいてナノグラムレベルで測定した。同様に、全てのデバイスは、荷重破壊に達する前に、数グラムの重さを保持する縫合保持試験（ｓｕｔｕｒｅｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｅｓｔｉｎｇ）に耐えることができる。
【０４８１】
目的
この研究の目的は、１）手の腱の修復に、コラーゲンベースの生理活性デバイスを作製するためのＧＭＰ材料および方法を使用すること、ならびに２）これらのデバイスの物理的および機能的な特性を評価することであった。
【０４８２】
研究計画
この研究において、要素を様々な組み合わせで変えて、製造基準および臨床基準の両方を満たす一連のデバイスを作製した。製造のための必要条件には、以下のものが含まれた；１）ＧＭＰグレードの材料から作られるデバイス、２）スケールアップに適用できるプロセス、および３）室温で保存することができ、長期間安定であり得るデバイス。好ましいデバイスは、以下の特色を有する；１）非常に薄いこと、２）可撓性があること、３）操作が容易であること、４）縫合を保持するのに十分強いこと、および５）所望のサイズおよび形状に切断するのに十分大きいこと。
【０４８３】
デバイスの性質、大規模製造の実施可能性に基づいて、デバイスのサブセットをさらなる試験へと進めた。この報告は、さらに検討するために選択したサブセットの作製法および分析をまとめる。
【０４８４】
材料および方法
細胞
細胞型：ｈＡＢＭＳＣ  ロット番号Ｐ１５−Ｔ２Ｓ１Ｆ１−５、バイアルあたり約５０ｅ６個の細胞
培養容器；なし、凍結バイアルから解凍し、再懸濁した直後に用いられる細胞
播種密度：各コラーゲンゲル構築物に播種した６ｅ６個の生存細胞
【０４８５】
材料および機器
デバイス材料および機器
Ｌ−グルタミンを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（ＡＤＧ）：Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ、４ｍＭ グルタミン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
コラーゲン：ブタの皮膚由来の１０ｍｇ／ｍｌのＴｈｅｒａＣｏｌ１％コラーゲン（Ｓｅｗｏｎ Ｃｅｌｌｏｎｔｅｃｈ、韓国）
（４ｍｇ／ｍｌのコラーゲンゲルに対する）コラーゲン緩衝液：７．５％炭酸水素ナトリウム１６ｍｌ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ  ４ｍｌ、１Ｎ水酸化ナトリウム２ｍｌ、滅菌水７８ｍｌ
（６ｍｇ／ｍｌのコラーゲンゲルに対する）コラーゲン緩衝液：７．５％炭酸水素ナトリウム２０ｍｌ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ  ６．６６ｍｌ、１Ｎ水酸化ナトリウム５．３ｍｌ、滅菌水６８ｍｌ
Ｌ−グルタミンを含む１０×ＤＭＥＭ：１０×ＤＭＥＭ、１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン
０．００５％または０．０１％グルタルアルデヒドのワーキング溶液：８％グルタルアルデヒドストック溶液、１×ＤＰＢＳ
５Ｍグリシン溶液：グリシン粉末（Ｓｉｇｍａ社）、１×ＤＰＢＳ
１×ＤＰＢＳ
懸濁培養用６ウェルプレート（直径３５ｍｍのウェル、Ｇｒｅｎｉｅｒ ＢｉｏＯｎｅ社）
平型薬さじ
Ｖ.Ｍｕｅｌｌｅｒ滅菌パウチ１２”×１５”（ポリエチレンプラスチック）
トリパンブルー  Ｇｉｂｃｏ社カタログ番号１５２５０−０６１
バイオセーフティーキャビネット（ＢＳＣ）
インキュベーター：Ｆｏｒｍａ ３１５０
遠心分離機：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ
血球計数器：Ｂｒｉｇｈｔｌｉｎｅ
倒立位相差顕微鏡：Ｎｉｋｏｎ Ｍｏｄｅｌ ＴＳ１００
【０４８６】
デバイス試験の材料および機器
カルセインＡＭおよびＥｔｈＤ−１染色（生存細胞／死細胞の生存率／細胞毒性キット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）
コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ.）
平衡塩類溶液（ＢＳＳ）
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ（ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）
天秤
機械的試験器具（デバイスを固定するための小さなクランプと、棒を保持するクランプを有する２つの研究室用リングスタンド）
３−０Ｅｔｈｉｂｏｎｄ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）
重りのバスケット（ペーパークリップおよびステップル付きのガーゼ）
重り（５ｇ、１０ｇ、２０ｇ）
はさみ
３７℃の水浴
ボルテックス
【０４８７】
実験手順
デバイスの生成
本発明の実施形態において、以下の４つの主要なステップが、コラーゲンベースの生理活性デバイスの生成に含まれる：１）細胞の調製、２）コラーゲンゲルの形成、３）コラーゲン＋細胞構築物の培養、および４）コラーゲン構築物の加工。
【０４８８】
簡単に説明すると、コラーゲンゲル溶液中でｈＡＢＭ−ＳＣを封入することによって構築物を形成する。ウェルの直径が３５ｍｍの６ウェルプレートを、細胞含有ゲル溶液で満たし、インキュベートする。このゲル溶液が固化した時点で、これをウェルからはがし、培地を用いて懸濁培養する。このコラーゲンゲル構築物を、約３日間、低Ｏ２条件下で培養し、その間、これらの細胞はコラーゲンゲルを積極的に収縮させる。培養期間の終わりに、これらの構築物を、グルタルアルデヒド架橋結合、グルタルアルデヒド反応を止めるためのグリシンによる反応停止、および脱水によって加工し、これらの細胞によって分泌される分子を維持しながらも、これらの細胞を不活性にさせる。
【０４８９】
各ステップにおいて、変更する機会はある。その際、プロセスが変更されたか、または複数の反復物が処理され、詳細を以下に提供する。
【０４９０】
細胞の調製
ほとんどのデバイスは、液体窒素下で保存したバイアルから取ったｈＡＢＭ−ＳＣを用いて作製した。これらの構築物のために、以下のステップを行って、これらの細胞を調製した：
１．５０ｅ６個のｈＡＢＭＳＣ／バイアルの凍結バイアルを液体窒素タンクから取り出し、６〜１０分間、３７℃の水浴中で解凍した。
２．細胞を、５０ｍｌのコニカルチューブ中のＡＤＧ培地で再懸濁した。
３．コニカルチューブ内の細胞を５分間、１，２４０ｒｐｍで遠心分離し、細胞をペレットにした。
４．上清を除去し、細胞数を数えるために、細胞をＡＤＧ培地に再懸濁した。
５．細胞懸濁液試料１００μｌを、ＡＤＧ培地で１：１０希釈した。トリパンブルーで１：１希釈したこの試料を用いて、細胞の数および生存率を、血球計数器で評価した。トリパンブルーを排除した生存細胞を数え、色素を保持して青色に染った死細胞を数えた。
６．最終細胞濃度を用いて、単一の５０ｍｌコニカルチューブに、合計３６ｅ６個または７２ｅ６個のいずれかの生存細胞を一定分量入れた。６個のゲル構築物のバッチを作製する場合には、３６ｅ６個の細胞を用い、１２個のゲルのバッチを作製する場合には７２ｅ６個の細胞を用いた。
７．細胞懸濁液を含むコニカルチューブを、５分間、１，２４０ｒｐｍで再び遠心分離し、細胞をペレットにした。
８．全ての上清の液体を細胞ペレットから除去した。これらのペレットを、さらに再懸濁しなかった。
【０４９１】
培養細胞で作製した１個のデバイスについては、バイアルを解凍し、ｈＡＢＭ−ＳＣを２．２ｅ４個の細胞／ｃｍ２でＴフラスコに入れ、一晩インキュベートした。次の日、細胞を収集し、洗浄して、ＡＤＧ培地に再懸濁した。次いで、これらの収集した細胞を、上記のステップ５から続けて、同じ方法で処理した。
【０４９２】
コラーゲンゲル形成
コラーゲンゲル構築物を、これらの細胞ペレットと共に、ゲル成分を混合することによって作製した。これらの成分は、常に、以下の順番で混合した：Ｌ−ｇｌｕｔを含む１０×ＤＭＥＭ、コラーゲン緩衝液、ＴｈｅｒａＣｏｌストックコラーゲン、次いで、細胞ペレット。
【０４９３】
表５に、この研究で考察する異なる構築物を生成するのに用いた成分および割合をまとめる。２つの異なるコラーゲン緩衝液を、４ｍｇ／ｍｌゲルまたは６ｍｇ／ｍｌのゲルに用いた。全てのゲル溶液成分を、細胞と組み合わせて、ゲル形成を開始するまで４℃で保った。
１．Ｌ−グルタミンを含む１０×ＤＭＥＭを、５０ｍｌコニカルチューブ（６個のゲルを作製する場合）または２５０ｍｌ瓶（１２個のゲルを作製する場合）のいずれかに加えた。
２．適切な４ｍｇ／ｍｌまたは６ｍｇ／ｍｌの最終コラーゲン濃度ゲル用のコラーゲン緩衝液を、１０×ＤＭＥＭに加え、回転混合した。
３．１０ｍｇ／ｍｌのＴｈｅｒａＣｏｌストック溶液を、反対側の手で回転させながら、瓶の中にコラーゲンをピペッティングによって加え、溶液全体にコラーゲンを均等に分散させた。
４．これらの成分を、同じピペットを用いて、溶液を素早くピペッティング操作で上下させることによって、迅速に均質溶液になるまで混合した（コラーゲンは、ピペットの内側をコーティングするが、混合中にピペッティング操作で上下させることにより流出し続けるだろう）。ピペッティング中、この溶液を含む瓶も回転させると、混合を助ける。溶液への泡の導入を防ぐために、全ての溶液を完全に分注しないで、この溶液の少なくとも２ｍｌを、常にピペットチップに保たせた。
５．この溶液を、粘性の均一な一貫性を兼ね備えて、全体が均一なピンク色の外観を呈するまで完全に混合した。
６．このゲル溶液１０ｍｌを細胞ペレットにピペットで入れ、素早くピペッティング操作で上下させて、これらの細胞をゲル溶液に完全に再懸濁させた。再懸濁した細胞で、この溶液が均一に濁り、細胞凝集体が見えなくなるまで、ピペッティング操作を続けた。
７．次いで、この細胞懸濁液を、残りのコラーゲンゲル溶液に均一に、完全に分注し、ピペッティング操作で上下させることを繰り返して、このゲル溶液全体にこれらの細胞を均一に分布させた。泡の導入を避けるために、ピペットチップの中には、少なくとも２ｍｌを、いつも保持した。
８．細胞＋コラーゲン溶液４〜９ｍｌを、懸濁培養６ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れた。
【０４９４】
ゲル溶液を含む培養プレートを、すぐに、５％ＣＯ２および１８％Ｏ２を含む３７℃の加湿インキュベーターに入れた。これらのプレートを１時間そのままにしておき、コラーゲンのゲル化を完了させた。
【０４９５】
【表５】
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【０４９６】
４ｍｇ／ｍｌまたは６ｍｇ／ｍｌのいずれかのゲルのために、２つの別々のコラーゲンゲル緩衝液調製物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）がある。
コラーゲンゲル構築物の最終的なパラメータ
６ｅ６個の細胞／構築物
コラーゲン濃度：４ｍｇ／ｍｌまたは６ｍｇ／ｍｌ
様々なゲル容積：４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、または９ｍｌ
１ｍＭのＬ−グルタミン
１×ＤＭＥＭ
０．４５％の炭酸水素ナトリウム
１５．９ｍＭの水酸化ナトリウム
２０ＭのＨＥＰＥＳ
【０４９７】
コラーゲンおよび細胞構築物の培養
１．１時間インキュベーションした後、これらのプレートをインキュベーターから取り出し、ＢＳＣに入れた。
２．完全なゲル化後のコラーゲンゲル構築物を、滅菌した平型（ｆｌａｔ  ｅｎｄ）薬さじを用いて、これらのプレートのウェルから持ち上げた。この薬さじをゲルの端とウェルの壁の間に挿入し、周囲を切り取り、ウェルの壁からこのゲルを完全に引き離した。
３．この薬さじを用いて、これらのゲルを、周囲に沿って中心に向かって端を穏やかに押すことによって、ウェルの底から持ち上げた。
４．４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、および７ｍｌのゲル容積の構築物については、ＡＤＧ培地６ｍｌを、コラーゲンゲル構築物を含む各ウェルに加えた。８ｍｌおよび９ｍｌのゲル容積の構築物については、ＡＤＧ培地４ｍｌを加えた。
５．各構築物を試験し、各構築物が培地中を自由に浮いている状態を確実にするか、あるいは、薬さじを用いて、構築物を完全にさらに持ち上げた。
６．次いで、これらの培養プレートを、培養のために、３７℃の、低酸素４％Ｏ２、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内に入れた。
７．ほとんどの構築物を３日間（６４〜７２時間）培養した。１つの反復物を２日間（４０〜４８時間）培養した。
【０４９８】
コラーゲン構築物の加工
コラーゲンゲル中の細胞の培養後、これらの構築物を加工して、生存していない最終デバイスを得た。この加工には、グルタルアルデヒド架橋結合、グルタルアルデヒド反応停止および脱水が含まれる。
【０４９９】
過剰なアミン基の条件下で、グルタルアルデヒド架橋結合反応を終了する。高濃度のグリシン溶液を加えることにより、未反応のグルタルアルデヒドの遊離端がグリシンと反応することが可能になる。この反応停止ステップは、架橋剤としてグルタルアルデヒドを用いる潜在毒性を防ぎ、制限することができる。
１．２〜３日間培養した構築物を、０．００５％、０．０１％、または０．０５％のグルタルアルデヒドの適切なワーキング溶液６ｍｌの添加により架橋結合した。このゲル構築物を、グルタルアルデヒド架橋結合および洗浄ステップの間中、元の培養プレート中で保持した。
２．プレート振盪機上でわずかに動かしながら、グルタルアルデヒドを用いる架橋結合を、室温で３０分間行った。
３．３０分後、グルタルアルデヒド溶液をこれらのウェルから取り除き、１×ＤＰＢＳ６ｍｌを加えて、残留グルタルアルデヒドの洗浄除去を始めた。
４．１×ＤＰＢＳ６ｍｌの少なくとも全部で４回の洗浄を１０分間行い、各ウェルから取り除いた。この洗浄の少なくとも２回については、これらのプレートをプレート振盪機上に置き、穏やかに撹拌した。
５．各ウェルに０．５Ｍのグリシン溶液６ｍｌを添加することにより、グルタルアルデヒド架橋結合反応を停止した。室温で２時間、３時間または４時間のグリシン反応停止中、プレートをプレート振盪機上に置き、穏やかに撹拌した。これらのデバイス上で培養した細胞の生存率に対する、２時間および４時間の反応停止時間の効果を試験した（結果を図５２に示す）。
６．グリシン反応停止の終わりに、溶液を除去し、これらの構築物を、ステップ４で明記したとおり、少なくとも全部で４回の洗浄にＤＰＢＳを用いて再び、完全に、洗浄した。
７．最後の洗浄後、架橋結合した構築物の周りのウェルから可能な限り多くの液体を取り除き、ＢＳＣ内で構築物の脱水を始めた。
８．１２”×１５”ポリエチレン滅菌パウチをＢＳＣ内に入れ、ポリエチレンプラスチック側を仰向けにした
９．平型薬さじを用いて、それぞれの単一架橋結合構築物を、ウェルプレートからプラスチック面に移した。
１０．これらの構築物に対して、互いに少なくとも１０ｃｍの間隔をあけた。フードの明かりを消し、送風機を付けたまま、適切に機能する高さまでフードのドアを開けた状態で、構築物をＢＳＣ内に一晩放置した。
１１．これらの構築物を、ＢＳＣ内で一晩脱水した後、紙のように非常に薄いディスクにまで脱水することにより、デバイス構造が作られ、これをさらなる試験に用いた。
【０５００】
デバイスの命名
各デバイスに４〜５ケタの数を与えた。最初のケタは、ゲル内のコラーゲン濃度、４ｍｇ／ｍｌまたは６ｍｇ／ｍｌのいずれかに対応し、その結果、最初のケタは「４」または「６」のいずれかである。第２のケタは、コラーゲンゲル容積が４ｍｌに対しては「４」、５ｍｌに対しては「５」などを表す。最後の２〜３つのケタは、コラーゲン構築物を架橋結合するのに用いたグルタルアルデヒド濃度のパーセンテージを特定する。例えば、０．００５％のグルタルアルデヒド濃度を用いた場合、デバイス名の最後の２〜３つのケタは、「００５」になる。最後の例として、「６６０１」と表示されたデバイスは、６ｍｇ／ｍｌのコラーゲン濃度、容積が６ｍｌで、０．０１％のグルタルアルデヒドで架橋結合して作製した構築物を意味する。
【０５０１】
デバイスの全ての最終反復物には、６ウェル懸濁培養プレート中のＴｈｅｒａＣｏｌコラーゲンハイドロゲルの中で、３日間培養した６ｅ６個のｈＡＢＭＳＣが含まれる（最初の直径３５ｍｍ）。
【０５０２】
デバイス試験
この実施例のコラーゲンベースの生理活性デバイスにて、デバイス試験を行った。以下のデバイス試験を行った：物理的パラメータ、コラゲナーゼ消化およびＶＥＧＦＥＬＩＳＡによる生理活性および縫合保持試験による機械的性質。
【０５０３】
結果
デバイス生成
コラーゲン濃度、コラーゲンゲル容積、およびグルタルアルデヒド架橋剤濃度を変えて、異なる性質を有するデバイスを生成した。これらの変化の多くを、表５および表６にまとめる。
【０５０４】
このデバイスの予備評価は、製造の実施可能性ならびに視覚検査および触覚検査に基づいていた。以下の観察を行い、次世代のデバイスの戦略および方法を変えた；
１．４ｍｇ／ｍｌのコラーゲンゲル構築物は、６ｍｇ／ｍｌのコラーゲンゲル構築物より小さかった。
２．６ウェルプレートに許容される最大ゲル容積は、培養のための培地４ｍｌを含む９ｍｌであった。
３．ゲル容積が３ｍｌ容積を下回ると、完全にゲル化せず、固体構築物も形成しなかった。
４．グルタルアルデヒド架橋結合は、構築物の取り扱いにおける耐久性の増加を可能にした。
５．任意の濃度での架橋結合は、再水分補給のときに、架橋結合していないデバイスよりもはるかに耐久性のあるデバイスを生成した。
【０５０５】
脱水前のグルタルアルデヒド架橋結合構築物の例を図５２に示す。このデバイス反復物の強度の実際の測定を以下で考察する。
【０５０６】
デバイス生成の最終加工ステップは脱水ステップである。架橋結合し、洗浄した構築物を、ＢＳＣ内で層流空気流の下、ポリエチレン表面上で脱水することによって、これを行った。図５３は、脱水中のいくつかのデバイス反復物を示す（６種類の異なる反復物のｎ＝６のデバイス）。
【０５０７】
乾燥工程中にいくつかの観察を行った：
１．ゲル容積がより大きい構築物は、ゲル容積がより小さい構築物よりも厚く、かつ直径が大きい。
２．より大きく、より厚い構築物は、完全脱水までに１２時間を超える時間を要する。（注釈：本明細書で、完全脱水とは、ＢＳＣ内で周囲層流空気流の条件下、構築物から全ての液体を蒸発させることを指す。しかし、これは、これらの構築物が、周囲の空気の湿度を下回る特定の定量化された湿度レベルまで脱水されたことを特定しない。）
３．４ｍｇ／ｍｌのコラーゲン構築物は、１２時間未満で完全に脱水することができた。
４．これらの構築物の脱水は、任意の目に見える液滴を完全に蒸発させ、その後、ゲルの高さを減少させた。
５．完全脱水の際、脱水中に、表面の外観は、澄んだ、つやのある状態から白色の、不透明な状態になった。
【０５０８】
０．５ｍｍ未満の厚さを有する完全脱水した最終デバイス
言及したとおり、未反応の残基が周囲の細胞に対して毒性があると証明できるので、任意の残りのグルタルアルデヒドを反応停止することが重要である。固定したデバイスの潜在毒性を評価する１つの方法は、デバイスの上部で細胞を培養する試みである。ｈＡＢＭ−ＳＣまたはヒト軟骨細胞のいずれかをデバイスの上部に加え、それらの生存率を培養時間の経過と共に観察した。図５４は、デバイス生成の加工ステップ中、２時間または４時間いずれかのグリシンによる反応停止時間を有するデバイスの表面上での培養４日後の軟骨細胞およびｈＡＢＭ−ＳＣの両方の細胞毒性の結果を示す。これらの結果は、より長い４時間のグリシン洗浄ステップが、グルタルアルデヒド架橋結合デバイスの毒性を低下させたことを示す。２時間のグリシン洗浄時間を有するデバイスは、培養後に、このデバイスの表面上における死細胞（赤色染色）の増加を示した。４時間のグリシン洗浄時間を有するデバイスは、この表面の全域に、高密度の接着細胞および生存細胞（緑色の染色）を有していた。
【０５０９】
脱水した最終デバイスの物理的性質
多くのデバイスが、効能、外科医またはスケールアップの実施可能性に必要な基準に満たなかったので、最終試験に進まなかった。表６に記載の６個のデバイスは、受け入れられ、追加分析をする価値があると判断した。コラーゲンベースの生理活性デバイスの６個の最終反復物のうちの５個の写真を図５５に示す。
【０５１０】
これらの全反復物の構築物内の出発コラーゲン濃度は、６ｍｇ／ｍｌであった。６ｍｇ／ｍｌのコラーゲン濃度の構築物のコラーゲンゲル容積およびグルタルアルデヒド濃度などのパラメータを変化させると、このデバイス構造の物理的性質を著しく変化させることができた。
【０５１１】
コラーゲン構築物を生成するのに用いる初期容積を増加させると、デバイス構造の直径および重量の両方を増加させる。これらの違いの視覚的な図、ならびに定量的な証拠を、それぞれ図５５および表６に提供する。
【０５１２】
【表６】
2013528175.tif 000014
【０５１３】
【表７】
2013528175.tif 000015
【０５１４】
この節で考察するコラーゲンベースの生理活性デバイスの全６個のバージョンは、脱水状態で同様に薄く、可撓性があった。これらのデバイスの再水分補給により、耐久性の違いが明らかになり、特に、異なるグルタルアルデヒド架橋結合濃度によって異なった。０．０５％で架橋結合したデバイスは、実質的により強固であったが、なお、可撓性があった。０．００５％のグルタルアルデヒドで架橋結合した６６００５デバイスは、操作後にバラバラになることなく、非常に可撓性があり、柔軟であった。概して、これらの６個のデバイスは、柔軟性に変動があったが、扱いやすさおよび取り扱いは容認できるものであった。７ｍｌのコラーゲンゲル容積から生成したデバイスは、５ｍｌおよび６ｍｌのバージョンと比較して、再水分補給後に、顕著により厚かった。
【０５１５】
デバイスの機能的性質
これらのデバイスの生理活性および強度を評価し、比較した。血管内皮増殖因子であるＶＥＧＦは、組織の治癒および再生に治療上有用であり得る関連タンパク質であり、培養物中のｈＡＢＭ−ＳＣによって高量発現する。コラーゲンゲルに含まれるＶＥＧＦの量を、これらのデバイスの生理活性の代替マーカーとして用いた。
【０５１６】
このデイバス構造の強度は、有望な製品としてのこれらのデバイスの処理の実施可能性、耐久性、および使用において重要である。組織の治癒または再生に役立つ製品としてのこのデバイスの適用は、組織へこのデバイスを縫合することを含み、したがって、このデバイス反復物を比較するために、縫合保持試験によって強度を評価した。
【０５１７】
これらのデバイスに含まれるＶＥＧＦ量を、コラゲナーゼ消化したこれらのコラゲナーゼ消化物にてＥＬＩＳＡ測定を行うことによって測定した。縫合保持試験を、標準的な実験装置を用いて行った。このデバイスの上端をクランプで固定し、さし縫い縫合により下端を貫いて縫い合わせた。縫合糸を、重りのバスケットに結合させた。これらのデバイスの強度を、このデバイスが破損して、縫合糸が抜けるまで重りを増加させることによって評価した。２０ｇの重りを保持している縫合保持試験中の強度試験装置内に含まれる６６０１デバイスの写真を図５６に示す。
【０５１８】
図５７および図５８は、デバイス内に含まれるＶＥＧＦ量（ｎｇ）および縫合保持試験中の、これらのデバイスが破損する前に耐えることができた最大重量負荷（ｇ）の結果を示す。図５１は、１５個の異なるデバイス反復物についてのこれらの結果を示し、図５８は、６個の最終反復物だけについての同じデータを示す。
【０５１９】
観察結果
１．ＶＥＧＦレベルは、迅速に解凍し、コラーゲンに加えた凍結保存ｈＡＢＭ−ＳＣと比較して、培養細胞から作製したデバイスにおいてより低かった。
２．ＶＥＧＦレベルは、４ｍｇ／ｍｌコラーゲンと比較して、６ｍｇ／ｍｌコラーゲンで作製した全てのデバイスにおいてより高かった。
３．６ｍｇ／ｍｌコラーゲン濃度を有し、０．００５％または０．０１％のいずれかのグルタルアルデヒドで架橋結合したデバイスは、平均２０ｎｇ以上のＶＥＧＦ量を含む。
４．４ｍｇ／ｍｌコラーゲン濃度のデバイスのうちの最強のものである４６００５および４６０１は、２０ｎｇ未満のＶＥＧＦを含む。
５．より多くの細胞を添加しないか、またはコラーゲン濃度を増加させない状態のゲル容積の増加は、より高いＶＥＧＦ含有量と相関した。
６．強度（グルタルアルデヒド濃度）と生理活性の間には反比例関係があるように思われる；より高い強度またはグルタルアルデヒド濃度は、より低い生理活性と相関する。
７．０．０５％のグルタルアルデヒドで架橋結合した６ｍｇ／ｍｌコラーゲンは、０．０１％のグルタルアルデヒドで架橋結合したデバイスよりもより重い重量に耐えることができる。
８．コラーゲンゲル容積を５ｍｌを超えて増加させると、強度が減少する傾向がみられる。
【０５２０】
最大強度と最高の生理活性を最適化することの間に、妥協点（ｔｒａｄｅ−ｏｆｆ）が観察された。非常に高いＶＥＧＦレベルを有するほとんどのデバイスは、強度に乏しく、より高い強度を有するデバイスは、ＶＥＧＦレベルが低かった（１０ｎｇを下回った）。
【０５２１】
図５８は、図５７のデータと同じであるが、さらに、将来的な製品候補として見なされる６個のデバイスのうちの５個のみについてのデータを示す。６７０１デバイスのデータは、この反復物から作製したデバイスがあまりにも少なく、代わりに他の研究に用いたため、完全ではなかった。これらのデバイス反復物は、製造に適し、以下の最初の目標基準に達することに関して容認できるデバイスを示す；１）非常に薄いこと、２）可撓性があること、３）耐久性があること、４）縫合を保持するのに十分強いこと、および５）所望のサイズおよび形状に切断するのに十分大きいこと。
【０５２２】
これらのデバイス反復物のデータおよび画像を、図５５、表７、および図５８に示す。これらのデバイスの注目すべき違いおよび特色は、以下のとおりである：
−デバイス反復物６６００５は、０．００５％のより低いグルタルアルデヒド濃度を有し、他の最終反復物よりも、インビボでより迅速にこのデバイスが分解することを可能にする。
−デバイス６５０１、６６０１および６７０１は、強度と生理活性の間に良好なバランスを維持し、共に中程度のレベルを有する。
−デバイス６５０１、６６０１および６７０１は、再水分補給後のデバイスの直径および潜在的な厚さが異なる。６５０１は、最小の直径を有し、最も薄いが、６７０１は、最大の直径を有し、より厚い。
【０５２３】
デバイス６５０５および６７０５は、０．０５％のより高いグルタルアルデヒド架橋結合を有するので、約１０ｎｇのＶＥＧＦを有する、はるかに強い生理活性のあるデバイスをもたらす。
【０５２４】
実施例２２
手の腱を修復する、コラーゲンベースの生理活性デバイスの試験
序論
この実施例の第１の目的は、手の屈筋腱修復のヒトの死体モデルにおいて、本発明のコラーゲンベースの生理活性デバイスの柔軟性、使いやすさおよび取り扱いを含む機械的性質を試験することであった。第２の目的は、屈筋腱手術に利点を提供することができるデバイスの、関連する生化学的および物理的な性質を広く考察することであった。最後に、本研究は、ＰＬＧＡベースのデバイスをＣＭＣ関節のスペーサーとして使用する可能性を評価した。これも、同じ死体の肢を用いて模擬試験した。
【０５２５】
方法
１体の新しい凍結死体を利用して、屈筋腱裂傷を模擬実験し、その後、本発明のデバイスを用いて修復を高めた。標準的な方法で、伸張暴露を行い、屈筋腱鞘、屈筋腱および滑車システムを露出させた。標準的な番号１５の刃を用いて、複数の屈筋腱を、ベルダンゾーン（ＶｅｒｄａｎＺｏｎｅ）１〜３（ゾーン１は、ＦＤＳ刺入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）に対して遠位にあり、ゾーン２は、中手指節関節（ＭＣＰ）のレベルまでのＦＤＳ刺入の近位にあり、ゾーン３は、手根横靭帯の遠位程度までのＭＣＰ関節の近位にある）を含む様々な解剖学的ゾーンで傷をつけた。これらの屈筋腱を、改良したバネル縫合（Ｂｕｎｎｅｌｌｓｔｉｔｃｈ）で、４−０Ｆｉｂｅｒｗｉｒｅからなる標準的な技術を用いて修復した。次いで、これらのデバイスを修復する周りに置いた。これらを、６−０Ｐｒｏｌｅｎｅを用いて定位置で縫合するか、または腱の周りでやさしく包み、完全に周囲を覆った。次いで、これらの腱の可動化を行い、このデバイスが、傷をつけた腱の部位から押しのけられないことを確実にした。使いやすさ、柔軟性、縫合を受け入れる能力、および腱の可動化の際に定位置に留まる能力に応じて、いくつかのデバイスを利用して、分析した。
【０５２６】
結果
３個の別々のコラーゲンベースの生理活性デバイス（４６０００、４６００１、および４６０００−００１；図５９）の試験に基づいて、第１のデバイス（架橋結合した４６００１）は、評価した後者のデバイス（架橋結合しなかった４６０００、および風乾し、架橋結合し、風乾した４６０００−００１）よりも取り扱いが容易であった。全３個のデバイスは、一般的に、腱の上（ｅｐｉ−ｔｅｎｄｉｎｏｕｓ）の修復に用いられる縫合（Ｐｒｏｌｅｎｅ、６−０口径）を受け入れることができた。このデバイスを、標準的な顕微手術法を用いて、容易に、腱自体にうまく縫った（図６０）。より困難であったが、このデバイス自体に縫うことができた。
【０５２７】
滅菌水にこれらのデバイスを浸した後、全てのデバイスは柔軟性があり、周囲のパターンで腱に適合することができた。しかし、架橋結合していないデバイス４６０００が、さらなる操作でネバネバになり、固体でなくなったことは、少なくとも架橋結合していないデバイスについては、適用前に、事前に湿らすことは望ましくない可能性を示唆する。術後数日以内に利用される場合が多い初期のリハビリテーションプロトコールを模擬実験すると（すなわち、初期の活動的な動きをセットし、そのままの状態でいると）、腱の活発な可動化によって含水した（ｈｙｄｒａｔｅｄ）デバイスもよじれた。結果として、初期の動きによる「よじれおよび集積（ｂｕｎｃｈｉｎｇ）」を最小限にする選択肢として、これらのデバイスを乾燥形態で適用するという考え、および／またはこれらのデバイスを条片に切断するという考えが考察された（図６１）。次いで、これらのデバイスを、乾燥形態で試験した。事前に湿らせたデバイスとは異なり、これらのデバイスは、集積しないで、基礎をなす腱とうまく統合するように思われた。実施形態において、腱の活発な可動化がない手術後の早期に、因子を即時放出する製品が、より遅い持続放出型の製品よりも効果的であり得る。このデバイスは、修復領域から移動すべきであるが、局所因子は、局部組織で作用することができない。一実施形態において、このデバイスを腱の背面に備え付けると、手掌面上で基材が動くことを防ぐ可能性がある。
【０５２８】
親指の関節炎手術のための現在の外科治療の選択肢（ＣＭＣ関節形成）は、親指の関節炎手術中に、大菱形骨の一部または全体を切除する手順からなる。この普通型の関節炎を治療するための様々な技術および変更について記載されている。本発明のデバイス（図６２）を、所定の死体解剖後に、親指のＣＭＣ関節に取り付けた。スペーサーは、この関節に対して適切なサイズであり、この空間にうまく適合するように思われた（図６３）。
【０５２９】
実施例２３
手の腱を修復する、コラーゲンベースの生理活性デバイスの試験
序論
本研究の第１の目的は、手の屈筋腱修復のヒトの死体モデルにおいて、本発明に係るコラーゲンベースの生理活性デバイスのサイズ、形状、柔軟性、および取り扱いを含む物理的および機械的な性質を試験することであった。これらの試験の主要目的は、屈筋腱手術に利点を提供することができる単一の好ましいデバイスを同定するために、複数のデバイスを評価することであった。
【０５３０】
研究設計
最初に、デバイスを、それらの全体的な物理的外観；サイズ、形状、柔軟性、耐久性、操作の容易さについて評価した。
【０５３１】
予備的な物理的評価に基づいて適切と判断したデバイスを、条片に切断し、腱に適用した。
【０５３２】
腱にまたは腱の周囲にうまく適用することができたデバイスを、動きに耐える能力について評価した。
【０５３３】
方法
１体の新しい凍結死体を利用して、屈筋腱裂傷を模擬実験し、その後、本発明の移植可能な軟組織医療デバイスを用いて修復を高めた。標準的な方法で、伸張暴露を行い、屈筋腱鞘、屈筋腱および滑車システムを露出させた。標準的な番号１５の刃を用いて、屈筋腱を、ベルダンゾーン１〜３（ゾーン１は、ＦＤＳ刺入に対して遠位であり、ゾーン２は、中手指節関節（ＭＣＰ）のレベルまでのＦＤＳ刺入の近位にあり、ゾーン３は、手根横靭帯の遠位程度までのＭＣＰ関節の近位にある）を含む様々な解剖学的ゾーンで傷をつけた。これらの屈筋腱を、改良したバネル縫合で、４−０Ｆｉｂｅｒｗｉｒｅからなる標準的な技術を用いて修復した（図６４）。これらのデバイスを、遭遇することが多い解剖学的制約を再現する目的で、屈筋腱滑車システム内の様々なレベル（ゾーン１〜３）にある位置で縫合した。特に、中指の屈筋腱を、本発明のデバイスでの増強に加えて、主要な屈筋腱の修復の両方必要とするゾーン３の領域で切除した。人さし指を、特に、その滑車システムの重要な性質ならびに追加した容積（ｂｕｌｋ）を理論的に受け入れるための限られた空間により、伝統的に、修復が困難である領域であるゾーン２でデバイスを受け入れるように調製した。
【０５３４】
適用前に、円形のデバイスを３〜４つの条片に切断した。真ん中の条片を最初に用いた。このデバイスの条片を、真っすぐに重ねる形状か、または重ねない「チョウネクタイ」の形状のいずれかで周囲を包むことによって、修復した腱または正常な腱のいずれかに適用した。真っすぐに重ねる適用において、このデバイスを、腱の上に重ねて、真っすぐにかつ完全に腱の周りを包み、重ねたデバイスの端を通って、デバイス自体の下まで一針縫うことで（ｗｉｔｈ  ｏｎｅ  ｓｔｉｔｃｈ）固定した。場合によって、「チョウネクタイ」での適用を行い、これには、重ねないで、腱の周囲をこのデバイスで包み、代わりに両端を互いに平行に置くことが含まれた。この形状では、各デバイス端から腱に至るまで一針縫い、このデバイスの隣接する小片をまとめるために中央で一針縫うことにより、このデバイスを３つの場所で腱に固定した。このデバイスを腱に固定する際、６−０Ｐｒｏｌｅｎｅ縫合糸を用いた。次いで、このデバイスが、傷をつけた腱の部位から離れて動かないことを確実にするために、これらの腱の可動化を行った。物理的な寸法、使いやすさ、柔軟性、縫合を受け入れる能力、および腱の可動化の際に、定位置に留まる能力に応じて、いくつかのデバイス反復物を利用して、乾燥状態および（水中で１０分間含水させた）含水状態の両方で評価した。
【０５３５】
結果、６個の異なるコラーゲンベースの生理活性デバイスの概説を以下に示す（５個の反復物を図６５に示す）。表８は、寸法、縫合保持、屈筋腱修復への適切な使用および適用についての判定後の各デバイスの総合評価を示す。
【０５３６】
【表８】
2013528175.tif 000016
【０５３７】
表８は、屈筋腱修復への適用後の寸法および縫合保持の許容性についての、乾燥状態および含水状態の両方における全ての原型のデバイス反復物の試験結果をまとめたものである（ＮＰ＝試験せず；ＮＣ＝コメントなし）。
【０５３８】
以下の節で、この研究で試験した６個のデバイス反復物のそれぞれの試験中に行った具体的なコメントを考察する。
【０５３９】
６５０１デバイス：
乾燥状態の６５０１デバイスの直径は、ゾーン３の中の、中指の切除した屈筋腱の周りを完全に包むことができたが、追加操作用の過剰な材料が残っていなかった（図６６）。湿った状態の６５０１デバイスの直径は非常に小さいが、厚さは許容できるものであった。このデバイスの柔軟性および縫合強度は良好であった。
【０５４０】
６６０１デバイス：
６６０１デバイスの条片を、小指のゾーン３の腱に適用した。直径は非常に許容できるものであり、過剰な材料により、長さは、チョウネクタイ形状を可能にした（図６７に示した）。このデバイスの腱への適用中、乾燥状態および含水状態の両方におけるこのデバイスの取り扱いおよび柔軟性は、許容できるものであった。６６０１デバイスの条片は、腱およびデバイス自体の両方の下まで十分に縫合を受け入れた。特に、小指のゾーン３のこの位置は、腱の周りに限定された空間を有するが、このデバイスを、容易にこの腱に適用し、この空間内を滑らかな動きで縫合した。腱の可動化中に、このデバイスは、周囲に沿って定位置にとどまり、腱と共に滑らかに動いた。
【０５４１】
６７０１デバイス：
６７０１デバイスを、複数の条片に切断することができた。１つの乾燥させた条片を、Ａ２滑車修復下に置き、人さし指の屈筋腱を囲い、その後、鞘を閉じると、このデバイスがゾーン２の滑走する腱に付着したまま、指の可動化に十分耐えた（図６８ａ）。人さし指の屈筋腱に沿ってこの位置の中で利用できる空間は、特に狭く、限定されているが、このデバイスを、腱に適切に適用し、縫合することができ、その後、これは、滑車の滑走中に付着したままであった。
【０５４２】
しかし、再び水分を補給させ、中指のゾーン３に適用した６７０１デバイスの条片は、厚くなりすぎ、腱への適用中に、十分に縫合を保持しなかった（図６８ｂ）。６７０１デバイスの直径は、腱の周りを包んだ後、追加の操作を可能にするために余分な長さを有することが好ましかった。
【０５４３】
６５０５デバイス：
このデバイスは、６５０１の直径と似た直径を有することが観察され、非常に小さかったので、この６５０５デバイスをさらに試験しなかった。腱への適用を行わなかった。
【０５４４】
６７０５デバイス：
乾燥時も、含水後も、６７０５デバイスの柔軟性は良好で、厚さは満足のいくものであった。このデバイスの適用は、腱の周囲への適用中、柔軟性において非常に許容できるものであった。各デバイス条片の端を腱へ縫合し、隣接するデバイスの小片を貫いて縫合した、人さし指のゾーン３の腱への「チョウネクタイ」適用は、十分な縫合ができた（３針の縫合を図６９に示した）。人さし指の屈筋腱に沿って利用できる空間は、特に狭く、限定されていたが、このデバイスを適切に腱に適用し、縫合することができた。
【０５４５】
６６００５デバイス：
６６００５デバイスの直径および厚さは、乾燥状態および再水分補給状態の両方において、非常に許容できるものであった。乾燥状態における６６００５デバイスの条片を、真っすぐに重ねる形状を用いて、薬指のゾーン３の腱に適用した。腱の可動化の際に、このデバイスは、「集積」に耐え、腱からこのデバイスをずらすと、縫合部位で裂けた。第２の条片を、チョウネクタイ形状で適用し、腱に縫合した。滑車システムを使用した時、可動化は許容できるものであった。
【０５４６】
結論
６個の別々のコラーゲンベースの生理活性デバイス（６５０１、６６０１、６７０１、６５０５、６７０５、および６６００５；図６５−６６００５は写真に含まれていないことに留意されたい）の試験に基づいて、全てのデバイスは、実施例２２で評価したデバイスと比較して、改良されたバージョンであった。全ての第２世代のデバイスは、改善された取り扱いにより、特に、含水状態でより耐久性があった。６個のデバイスのうちの４個は、一般的に、腱上の修復で用いられる縫合糸（Ｐｒｏｌｅｎｅ、６−０口径）を十分に許容することができた（１個は許容できず、もう１個は試験をしなかった）。これらの４個のデバイスは、容易に腱に固定され（腱およびデバイス自体の両方への縫合）、このデバイスが腱から離れて動くことなく、腱の可動化に耐えた。人さし指のゾーン２および小指のゾーン３の限定された空間を含むゾーン２およびゾーン３の腱に適用した全てのデバイスは、腱の可動化の適用中および適用後に、腱の周りの空間内で容易に適合することができた。これらのデバイスの取り扱いおよび縫合によるこれらのデバイスの腱への適用は、乾燥状態が好ましかった。概して、６６０１デバイス反復物が、試験状況、デバイスの寸法、柔軟性、取り扱い、縫合による腱への適用および固定に基づいて、好ましいデバイスであった。
【０５４７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年1月29日(2013.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
前臨床研究の代表的な結果
インビボの前臨床薬理学的研究は、心筋梗塞および脳卒中の治療におけるＡＢＭ−ＳＣの有益な効果を示した。例えば、心筋梗塞のラットモデルにおけるｈＡＢＭ−ＳＣの心臓内注射の効果を調べる（特に、ＡＭＩ（急性心筋梗塞）後の心機能回復におけるｈＡＢＭ−ＳＣの有効性を判定し、ｈＡＢＭ−ＳＣの分布および配置を評価する）ための研究において、ｈＡＢＭ−ＳＣが心機能を著しく改善し、線維症を著しく低下させることを示した。さらに、このｈＡＢＭ−ＳＣは、心臓注射から４週間後の心臓内にも、注射から８週間後の調べた末梢臓器のいずれにも残らないことが観察された。さらに、ブタのＡＭＩモデルにおけるブタおよびヒトのＡＢＭ−ＳＣの安全性ならびに有効性を調べるための（特に、ＭＹＯＳＴＡＲ（商標）カテーテルを介した、細胞の経皮的なＮＯＧＡ（商標）誘導性心内膜心筋投与の実行可能性、安全性および有効性を評価する）研究において、この特定の送達法は十分に許容され、心臓パラメータに著しい改善をもたらすことが証明された。同様に、（特に、虚血性脳卒中からの神経運動回復の促進におけるｈＡＢＭ−ＳＣの有効性を判定するために）ｈＡＢＭ−ＳＣの送達法および脳卒中の回復の比較において、Ｉ．Ｖ．治療または大脳内治療が神経運動活性に著しい改善をもたらすことが観察された。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
骨髄由来の自己複製コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団または上記細胞由来の馴化細胞培養物を含む生体適合性もしくは生分解性のマトリックスであって、上記ＣＦ−ＳＣが多能性分化能をもたず、上記ＣＦ−ＳＣが正常核型を有し、上記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、上記ＣＦ−ＳＣが、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス−１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、上記ＣＦ−ＳＣが、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない、マトリックス。
（項目２）
項目１に記載のマトリックスを含む組織またはネオ組織。
（項目３）
さらに、薬学的に許容される化合物を含む、項目１に記載のマトリックス。
（項目４）
上記化合物が、脂質、タンパク質、核酸、抗炎症薬、抗生物質、ビタミン、およびミネラルからなる群から選択される、項目３に記載のマトリックス。
（項目５）
天然のまたは組換え型のヒト血漿タンパク質、ウシ血漿タンパク質、および／またはブタ血漿タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む、項目１に記載のマトリックス。
（項目６）
上記タンパク質がトロンビンまたはフィブリノゲンである、項目５に記載のマトリックス。
（項目７）
上記マトリックスが、コラーゲンまたはポリグリコール酸を含む、項目１に記載のマトリックス。
（項目８）
上記マトリックスが、４ｍｇ／ｍｌ〜６ｍｇ／ｍｌの濃度でコラーゲンを含む、項目１に記載のマトリックス。
（項目９）
病状の治療を必要としている患者において病状を治療する方法であって、項目１に記載のマトリックスと上記患者とを接触させる工程を包含する、方法。
（項目１０）
上記病状が皮膚科的（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃ）である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記創傷が、糖尿病患者の足の創傷、静脈性の足の潰瘍の創傷、または手術後の創傷である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記病状が整形外科的（ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ）である、項目９に記載の方法。
（項目１３）
上記ＣＦ−ＳＣが非ヒト供給源に由来する、項目１に記載のマトリックス。
（項目１４）
上記非ヒト供給源が、ウマ供給源、ブタ供給源、イヌ供給源、ネコ供給源、ウシ供給源、ヒツジ供給源、ヤギ供給源、ラクダ供給源、マウス供給源からなる群から選択される、項目１３に記載のマトリックス。
（項目１５）
上記患者が非ヒト動物である、項目９に記載の方法。
（項目１６）
医薬組成物を調製する方法であって、上記方法は：
（ａ）可溶性コラーゲンを含む溶液を調製する工程；
（ｂ）骨髄由来の自己複製コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団を懸濁する工程であって、ここで、上記ＣＦ−ＳＣは多能性分化能をもたず、上記ＣＦ−ＳＣは正常核型を有し、上記ＣＦ−ＳＣは不死化されず、上記ＣＦ−ＳＣは、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス−１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、上記ＣＦ−ＳＣは、（ａ）の溶液中で、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない、工程；ならびに
（ｃ）（ｂ）の細胞懸濁液を組織の型に移す工程
を包含する、方法。
（項目１７）
項目１に記載のマトリックスを含む粉末。
（項目１８）
上記マトリックスが、コラーゲンまたはポリグリコール酸を含む、項目１７に記載の粉末。
（項目１９）
病状の治療を必要としている患者において病状を治療する方法であって、項目１７に記載の粉末と上記患者とを接触させる工程を包含する、方法。
（項目２０）
上記病状が、開放創、皮膚の変形、声帯瘢痕、第３度熱傷および歯周傷害からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄由来の自己複製コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団または前記細胞由来の馴化細胞培養物を含む生体適合性もしくは生分解性のマトリックスであって、前記ＣＦ−ＳＣが多能性分化能をもたず、前記ＣＦ−ＳＣが正常核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣが不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣが、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス−１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、前記ＣＦ−ＳＣが、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない、マトリックス。
【請求項２】
請求項１に記載のマトリックスを含む組織またはネオ組織。
【請求項３】
さらに、薬学的に許容される化合物を含む、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項４】
前記化合物が、脂質、タンパク質、核酸、抗炎症薬、抗生物質、ビタミン、およびミネラルからなる群から選択される、請求項３に記載のマトリックス。
【請求項５】
天然のまたは組換え型のヒト血漿タンパク質、ウシ血漿タンパク質、および／またはブタ血漿タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項６】
前記タンパク質がトロンビンまたはフィブリノゲンである、請求項５に記載のマトリックス。
【請求項７】
前記マトリックスが、コラーゲンまたはポリグリコール酸を含む、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項８】
前記マトリックスが、４ｍｇ／ｍｌ〜６ｍｇ／ｍｌの濃度でコラーゲンを含む、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項９】
病状の治療を必要としている患者において病状を治療するための、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項１０】
前記病状が皮膚科的（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃ）である、請求項９に記載のマトリックス。
【請求項１１】
前記創傷が、糖尿病患者の足の創傷、静脈性の足の潰瘍の創傷、または手術後の創傷である、請求項１０に記載のマトリックス。
【請求項１２】
前記病状が整形外科的（ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ）である、請求項９に記載のマトリックス。
【請求項１３】
前記ＣＦ−ＳＣが非ヒト供給源に由来する、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項１４】
前記非ヒト供給源が、ウマ供給源、ブタ供給源、イヌ供給源、ネコ供給源、ウシ供給源、ヒツジ供給源、ヤギ供給源、ラクダ供給源、マウス供給源からなる群から選択される、請求項１３に記載のマトリックス。
【請求項１５】
前記患者が非ヒト動物である、請求項９に記載のマトリックス。
【請求項１６】
医薬組成物を調製する方法であって、前記方法は：
（ａ）可溶性コラーゲンを含む溶液を調製する工程；
（ｂ）骨髄由来の自己複製コロニー形成体細胞（ＣＦ−ＳＣ）の単離集団を懸濁する工程であって、ここで、前記ＣＦ−ＳＣは多能性分化能をもたず、前記ＣＦ−ＳＣは正常核型を有し、前記ＣＦ−ＳＣは不死化されず、前記ＣＦ−ＳＣは、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＨＬＡクラス−１およびβ（ベータ）２−ミクログロブリンを発現し、前記ＣＦ−ＳＣは、（ａ）の溶液中で、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ＬまたはＣＤ１０６を発現しない、工程；ならびに
（ｃ）（ｂ）の細胞懸濁液を組織の型に移す工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のマトリックスを含む粉末。
【請求項１８】
前記マトリックスが、コラーゲンまたはポリグリコール酸を含む、請求項１７に記載の粉末。
【請求項１９】
病状の治療を必要としている患者において病状を治療するための、請求項１７に記載の粉末。
【請求項２０】
前記病状が、開放創、皮膚の変形、声帯瘢痕、第３度熱傷および歯周傷害からなる群から選択される、請求項１９に記載の粉末。
【国際調査報告】
2013528175.tif 000082