(57)【要約】下式（Ｉ）を有する修飾ポリマーを含むポリヌクレオチド送達ビヒクルが本明細書では提供される［式中、Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５、Ｗ６、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ９、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は本明細書で定義されている］。また、ポリヌクレオチドを選択された組織型または細胞型の細胞質に送達する方法および前記修飾ポリマーを用いて、遺伝子の発現を減少させることを必要とする細胞または対象において遺伝子の発現を減少させる方法が開示されている。2013528665.tif 000097
2013528665.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＶＩ）の修飾ポリアセタール：
【化７２】
2013528665.tif 000077
［式中、
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５およびＷ６はそれぞれ独立に、共有結合またはポリアセタール主鎖に連結している−Ｃ（Ｏ）を有する−Ｃ（Ｏ）−Ｙ−であり；
Ｙは、−［Ｃ（Ｒ９Ｒ１０）］ａ−または−［Ｃ（Ｒ９Ｒ１０）］ａ−Ｘ１−［Ｃ（Ｒ９Ｒ１０）］ｂ−であり；
Ｘ１は、酸素原子、硫黄原子または−ＮＲ１１であり；
Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、５員から１２員のヘテロアリールまたはＣ３〜８シクロアルキルであり；
Ｒ１１は、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、５員から１２員のヘテロアリール、Ｃ３〜８シクロアルキルまたは−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜３アルキルであり；
Ｚ９は、Ｚ６−Ｔ１またはＺ８であり；
Ｔ１は、−Ｚ７−Ｒ６であり；
Ｚ８は、１個または複数の−Ｚ７−Ｒ６で置換されていて、かつ−Ｑ−Ｒ１、−Ｑ−Ｒ３、−Ｑ−Ｒ４および−Ｑ−Ｒ５からなる群から選択される１個または複数の置換基で置換されていてもよい線状または分岐ポリアミノ部分であり；
Ｑはそれぞれ独立に、共有結合または−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６はそれぞれ独立に、共有結合、−ＮＲ１７または−ＮＲ１７Ｒ１８−であり、ここで、Ｒ１７およびＲ１８はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ２〜８アルキルまたは−Ｃ２〜１０アルキル−Ｎ（Ｒｘ）−であり、Ｒｘは、Ｈまたはアミノ酸のカルボニル基を介して窒素に結合しているアミノ酸であるか；またはＲ１７およびＲ１８はそれらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される０または１個の追加のヘテロ原子を含有する４員から７員のヘテロシクロアルキル環を形成しており；
Ｚ７はそれぞれ独立に、Ｔ３がＲ６に連結している−Ｃ（Ｏ）−Ｔ２−Ｔ３−または−Ｎ（Ｒ’）−Ｔ２−Ｔ３−であり、ここで、Ｒ’はＨまたはＣ１〜６アルキルであり、Ｔ２は、アルキルチオアリール、アリールチオアルキル、アルキルチオアルキル、アリールチオアリール、アルキルジチオアリール、アリールジチオアルキル、アルキルジチオアルキルおよびアリールジチオアリールから選択され、Ｔ３は、共有結合、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）−Ｃ１〜８アルキル、−Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜８アルキルまたはＣ１〜８アルキルであり、ここで、Ｒ”は、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；
ａおよびｂはそれぞれ独立に、両端を含む１から６の間の整数であり；
ｎ、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６はそれぞれ、０から１の間の範囲である対応するポリアセタール単位のモル分率であり；ｎ＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＋ｎ５＋ｎ６＝１であるが；但し、ｎもｎ６も０ではないことを条件とし；
Ｒ１は、選択された組織、病原体、細胞または細胞位置のためのターゲティング基であり；
Ｒ２は、−Ｑ−Ｒ１、−Ｑ−Ｒ３、−Ｑ−Ｒ４および−Ｑ−Ｒ５からなる群から選択される１個または複数の置換基で置換されていてもよい電荷基であり；
Ｒ３は、電荷変更基であり；
Ｒ４は、疎水基であり；
Ｒ５は、保護基であり；
Ｒ６は、ポリヌクレオチドであり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ１の数の比（ｍ１）は、０から０．２５であり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ３の数の比（ｍ３）は、０から１００であり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ４の数の比（ｍ４）は、０から３０であり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ５の数の比（ｍ５）は、０から０．０３であり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ６の数の比（ｍ６）は、０．０００４から０．１０であり；
前記ポリアセタール主鎖は、約１０ｋＤａから約２５０ｋＤａの分子量を有する］。
【請求項２】
ｍ１が０．００２から０．２５であり；
ｍ３が０．００２から１００であり；
ｍ４が０．０３から０．３０であり；
ｍ５が０．０１から０．０３である、請求項１に記載の修飾ポリアセタール。
【請求項３】
Ｚ９がＺ６−Ｔ１である場合に、
（ｉ）ｎ１が０ではなく、かつｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５がそれぞれ０であるか；
（ｉｉ）ｎ１もｎ２も０ではなく、かつｎ３、ｎ４およびｎ５がそれぞれ０であるか；
（ｉｉｉ）ｎ１、ｎ２およびｎ３のいずれも０ではなく、かつｎ４およびｎ５がそれぞれ０であるか；
（ｉｖ）ｎ１、ｎ２およびｎ４のいずれも０ではなく、かつｎ３およびｎ５がそれぞれ０であるか；
（ｖ）ｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４のいずれも０ではなく、かつｎ５が０であるか；
（ｖｉ）ｎ１もｎ４も０ではなく、かつｎ２、ｎ３およびｎ５がそれぞれ０であるか；
（ｖｉｉ）ｎ２が０ではなく、かつｎ１、ｎ３、ｎ４およびｎ５がそれぞれ０であるか；
（ｖｉｉｉ）ｎ２もｎ３も０ではなく、かつｎ１、ｎ４およびｎ５がそれぞれ０であるか；
（ｉｘ）ｎ２もｎ４も０ではなく、ｎ１、ｎ３およびｎ５がそれぞれ０であるか；
（ｘ）ｎ２、ｎ３およびｎ４のいずれも０ではなく、ｎ１およびｎ５がそれぞれ０であるか；
（ｘｉ）ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５のいずれも０ではないか；または
（ｘｉｉ）ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５がそれぞれ０である、請求項１または２に記載の修飾ポリアセタール。
【請求項４】
Ｚ９がＺ６−Ｔ１である場合に、
ｎが、両端を含む約０．０１から約０．９９９６の間であり；
ｎ１が、両端を含む約０．００２から約０．２５の間であり；
ｎ２が、両端を含む約０．０２から約０．９０の間であり；
ｎ３が、両端を含む約０．０２から約０．８１の間であり；
ｎ４が、両端を含む約０．０３から約０．３０の間であり；
ｎ５が、両端を含む約０．０１から約０．０３の間であり；
ｎ６が、両端を含む約０．１０から約０．０７７の間であるか、または両端を含む約０．０００６から約０．００２の間である、請求項１または２に記載の修飾ポリアセタール。
【請求項５】
Ｚ９がＺ８である場合に、ｎ１、ｎ３、ｎ４およびｎ５がそれぞれ０であり、Ｒ２が、−Ｑ−Ｒ１、−Ｑ−Ｒ３、−Ｑ−Ｒ４および−Ｑ−Ｒ５からなる群から選択される１個または複数の置換基で置換されていてもよい線状または分岐ポリアミノ部分である、請求項１または２に記載の修飾ポリアセタール。
【請求項６】
Ｚ９がＺ８である場合に、
（ｉ）ｍ１が０ではなく、かつｍ３、ｍ４およびｍ５がそれぞれ０であるか；
（ｉｉ）ｍ１もｍ４も０ではなく、かつｍ３およびｍ５がそれぞれ０であるか；
（ｉｉｉ）ｍ１、ｍ４およびｍ５のいずれも０ではなく、かつｍ３が０であるか；
（ｉｖ）ｍ１もｍ３も０ではなく、かつｍ４およびｍ５がそれぞれ０であるか；
（ｖ）ｍ１、ｍ３およびｍ４のいずれも０ではなく、かつｍ５が０であるか；または
（ｖｉ）ｍ１、ｍ３、ｍ４およびｍ５のいずれも０ではない、請求項１、２または５に記載の修飾ポリアセタール。
【請求項７】
Ｚ９がＺ８である場合に、
ｎが、両端を含む約０．７０から約０．９９の間であり；
ｎ１、ｎ３、ｎ４およびｎ５がそれぞれ０であり；
ｍ１が、０．００２から０．２５であり；
ｍ３が０．００２から１００であり；
ｍ４が０．０３から０．３０であり；
ｍ５が０．０１から０．０３であり；
ｍ６が０．０００４から０．１０である、請求項１、２または５に記載の修飾ポリアセタール。
【請求項８】
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６がそれぞれ独立に、エチレンジアミン、ピペラジン、ビス（ピペリジン）、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、デカメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、アグマチンまたはオルニチンである、請求項１から７のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項９】
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６がそれぞれ
【化７３】
2013528665.tif 000078
である、請求項１から８のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項１０】
Ｚ７が
【化７４】
2013528665.tif 000079
【化７５】
2013528665.tif 000080
［式中、−Ｃ（Ｏ）または−ＮＨは、前記ポリアセタール主鎖へと配向されている］
である、請求項１から９のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項１１】
Ｚ７が
【化７６】
2013528665.tif 000081
［式中、−Ｃ（Ｏ）は、前記ポリアセタール主鎖へと配向されている］
である、請求項１から１０のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項１２】
Ｚ８が、他に置換基がなければ、
【化７７】
2013528665.tif 000082
【化７８】
2013528665.tif 000083
または
（９）ポリ−Ｌ−リシン、ポリ（プロピレンイミン）およびポリ（アミドアミン）デンドリマーから選択される第２〜１０世代のいずれかのデンドリマーであり；
上式中、
Ｒｙは、アミノ酸のカルボニル基を介して窒素に結合しているアミノ酸または線状もしくは分岐ポリアミノ部分であり；
Ｒｚは、Ｈまたは線状もしくは分岐ポリアミノ部分であり；
ｃは、両端を含む２から６００の間の整数であり；
ｄは、両端を含む０から６００の間の整数であり；
ｅは、両端を含む１から１５０の間の整数であり；
ｄ２は、両端を含む２から２０の間の整数であり；
ｄ３は、両端を含む２から２００の間の整数である、請求項１、２および５から１１のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項１３】
Ｚ８が、他に置換基がなければ、
（１）約５００から約２５０００ダルトンの分子量を有する線状ポリエチレンイミン；
（２）約５００から約２５０００ダルトンの分子量を有する分岐ポリエチレンイミン；
（３）
【化７９】
2013528665.tif 000084
である、請求項１、２および５から１２のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項１４】
Ｚ８が、他に置換基がなければ、約５００から約２５００ダルトンの分子量を有する線状ポリエチレンイミンまたは約５００から約１２００ダルトンの分子量を有する分岐ポリエチレンイミンである、請求項１、２および５から１３のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項１５】
ＲｙおよびＲｚがそれぞれ独立に、−［Ｃ２〜６アルキル−ＮＨ］−のモノマー単位を含むポリアミノ部分である、請求項１２または１３に記載の修飾ポリアセタール。
【請求項１６】
Ｒ１が、ガラクトサミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、葉酸、ＲＧＤペプチド、ＬＨＲＨ受容体ターゲティングペプチド、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）受容体ターゲティングペプチド、前立腺特異的膜結合抗原（ＰＳＭＡ）ターゲティングペプチド、リポタンパク質受容体ＬＲＰ１ターゲティングリガンド、ＡｐｏＥタンパク質由来ペプチドまたはトランスフェリンを含む、請求項１から１５のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項１７】
Ｒ２が、
【化８０】
2013528665.tif 000085
【化８１】
2013528665.tif 000086
（７）約５００から約２５０００ダルトンの分子量を有する線状ポリエチレンイミン；
（８）約５００から約２５０００ダルトンの分子量を有する分岐ポリエチレンイミン；
【化８２】
2013528665.tif 000087
［式中、
Ｒｚは、Ｈまたは線状もしくは分岐ポリアミノ部分であり；
ｄは、両端を含む０から６００の間の整数であり；
ｅは、両端を含む１から１５０の間の整数である］
である、請求項１から１６のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項１８】
Ｒ３が式（ＸＶＩ）である、請求項１から１７のいずれかに記載の修飾ポリアセタール：
【化８３】
2013528665.tif 000088
［式中、
Ｒ１２は、水素、Ｃ１〜５アルキルまたはＣ６〜１０アリールであり；
Ｒ１３は、水素、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ６〜１０アリール、−（ＣＨ２）ｇ−ＣＯ２Ｒ１４、−（ＣＨ２）ｇ−Ｃ（Ｏ）ＳＲ１４、−（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）Ｓ（ＣＨ２）ｇＣＯ２Ｒ１４または−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＨＲ１５であり；
Ｒ１４は、水素またはＣ１〜５アルキルであり；
Ｒ１５は、水素、Ｃ１〜５アルキル、Ｃ６〜１０アリール、アラルキル、アルキルジチオアリール、アリールジチオアルキル、アルキルジチオアルキル、アリールジチオアリール、−（ＣＨ２）ｇＣＨＯまたはＲ１であり；
ｇは、両端を含む１から５の間の整数であり；ｑは、両端を含む０から５の間の整数であり；
【化８４】
2013528665.tif 000089
は、単結合または二重結合である］。
【請求項１９】
Ｒ３が：
【化８５】
2013528665.tif 000090
【化８６】
2013528665.tif 000091
［式中、Ｒ１６は、水素またはＣ１〜２アルキルである］
である、請求項１から１８のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項２０】
Ｒ４が、Ｃ５〜２０飽和もしくは不飽和脂肪酸、Ｃ６〜２２アルキルアミン、コレステロール、コレステロール誘導体またはアミノ含有脂質を含む、請求項１から１９のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項２１】
Ｒ４が：
【化８７】
2013528665.tif 000092
である、請求項１から２０のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項２２】
Ｒ６が天然、合成もしくは半合成ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドである、請求項１から２１のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項２３】
Ｒ６が、約１２から約３０個までのヌクレオチドを有する二本鎖オリゴヌクレオチドまたは約８から約６４個までのヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１から２２のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項２４】
前記ポリアセタール主鎖が約１００ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約６０ｋＤａまたは約４０ｋＤａの分子量を有する、請求項１から２３のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項２５】
Ｒ２が、
【化８８】
2013528665.tif 000093
、約５００から約２５００ダルトンの分子量を有する線状ポリエチレンイミンまたは約５００から約１２００ダルトンの分子量を有する分岐ポリエチレンイミンである、請求項１から２４のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項２６】
Ｒ３が、
【化８９】
2013528665.tif 000094
［式中、
【化９０】
2013528665.tif 000095
は、単結合または二重結合である］
である、請求項１から２５のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項２７】
Ｒ４が、
【化９１】
2013528665.tif 000096
である、請求項１から２６のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項２８】
前記修飾ポリアセタールを選択された組織型または細胞型と接触させることによって、ポリヌクレオチドを前記選択された組織型または細胞型の細胞質に送達するのに使用するための、請求項１から２７のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項２９】
前記組織型が肝臓組織または腎臓組織であり、前記細胞型が血液細胞、内皮細胞、癌細胞、膵臓細胞または神経細胞である、請求項２８に記載の使用のための修飾ポリアセタール。
【請求項３０】
細胞の細胞質に有効量の前記修飾ポリアセタールを送達することによって、細胞における遺伝子の発現を減少させるのに使用され、前記修飾ポリアセタールが、前記遺伝子の少なくとも一部に相補的であるポリヌクレオチドを含有する、請求項１から２７のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【請求項３１】
遺伝子の発現を減少させることを必要とする対象に、有効量の請求項１から２６のいずれかに記載の修飾ポリアセタールを投与することによって、前記対象において遺伝子の発現を減少させるのに使用され、前記修飾ポリアセタールが、前記遺伝子の少なくとも一部に相補的であるポリヌクレオチドを含有する、請求項１から２７のいずれかに記載の修飾ポリアセタール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１０年３月２６日に出願された米国特許出願第６１／３１７，９０７号を参照として援用し、ならびに米国特許法§１１９（ｅ）の下、この米国特許出願第６１／３１７，９０７号の利益およびこの米国特許出願第６１／３１７，９０７号に対する優先権を主張する。この出願の内容は、その全体が本明細書において参照として援用される。
【０００２】
発明の分野
本開示は、ｓｉＲＮＡなどのポリヌクレオチド治療物質を細胞に送達するのに有用な修飾ポリマーに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
オリゴヌクレオチドは、医薬品において重要な治療用途を有する。オリゴヌクレオチドは、特定の疾患の原因である遺伝子を沈黙させるか、または生体に有利であるように、遺伝子の発現レベルを変化させるために使用することができる。遺伝子サイレンシングは、翻訳を阻害するか、特定のＲＮＡ種の安定性に影響を及ぼすか、または特定の遺伝子座位の転写量に影響を及ぼすことによって、タンパク質生成物の形成を妨げる。重要なことに、遺伝子サイレンシング薬は、疾患に関連しているタンパク質の機能を阻害する従来の小さな有機化合物に対する有望な代案である。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡは、上記のとおりに遺伝子サイレンシングを実施するオリゴヌクレオチドである。
【０００４】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、低分子干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと称されるＲＮＡが同じか、またはほぼ同じ配列を有する遺伝子（即ち、阻害ＲＮＡが生理学的条件下でハイブリッド形成し得る細胞内ＲＮＡ）の発現を阻害するプロセスである。多くの場合に、阻害は、標的遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解によってもたらされる。そのようなＲＮＡｉ指向性標的ＲＮＡ分解を生じさせる機構および細胞機序は、遺伝的および生化学的の両方の手法を使用して調べられている。ｄｓＲＮＡ（形質移入されたｄｓＲＮＡ、導入された発現ベクターによってコードされるｓｈＲＮＡ、または活性なＲＮＡｉ部分になるようにプロセシングされていてよい内因性ＲＮＡによって代表される）の場合は、プロセシングは細胞の細胞質で生じ；必要な場合には、ＲＮＡｉ分子（またはその前駆体）は初めに、２１から２５ヌクレオチド長のＲＮＡ断片にプロセシングされる。次いで、これらのＲＮＡｉ分子をダイサー複合体に負荷することができ、そこで、それらは、標的ＲＮＡ分子の切断を指示する。
【０００５】
多くの疾患が、特定の遺伝子座位、遺伝子または遺伝子群の異常な発現から生じるので、ＲＮＡｉが標的遺伝子の発現に特異的に影響を及ぼす能力は、治療的に有利であり得る。多くの場合に、治療上の価値は、遺伝子の変異体型の発現を特異的に阻害することに由来し得る。具体的な実施形態では、ＲＮＡｉは、有害な遺伝子の発現を阻害または緩和し、したがって、疾患の症状を緩和するか、または治療もしくは治癒をもたらすために使用することができる。例えば癌性状況、ウイルスの複製、または筋緊張性ジストロフィーなどの優性遺伝疾患の一因となっている遺伝子を阻害することができる。別法では、例えばサプレッサー遺伝子のダウンレギュレーションによって、経路の間接的な遺伝子活性化もまた可能である。関節炎などの炎症性疾患もまた、ＮＦ−κＢ、シクロオキシゲナーゼまたはサイトカインなどの遺伝子を阻害することによって治療することができる。標的とされる臓器の例には例えば、肝臓、肺、膵臓、脾臓、腎臓、皮膚、脳、前立腺および心臓が包含される。
【０００６】
アンチセンス法は一般に、合成核酸配列をｍＲＮＡまたはＤＮＡに相補的にハイブリダイゼーションさせて、これらの細胞内核酸のタンパク質合成などの正常な機能を途絶させることを記載している。ハイブリダイゼーションは、ワトソン−クリック型塩基対を介したオリゴヌクレオチドとＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡとの配列特異的水素結合である。そのような塩基対は、互いに相補的であると言われる。ハイブリダイゼーション停止の１つの機構では、オリゴヌクレオチド阻害因子が標的ポリヌクレオチドに結合し、それにより、必須タンパク質、最も多くの場合にリボソームとポリヌクレオチドとの結合を単純な立体障害によって妨げる。アンチセンスオリゴヌクレオチドがポリヌクレオチド機能を途絶させることによる他の手段は、標的ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション、それに続く、細胞内ＲＮアーゼＨによる標的とされたＲＮＡの酵素的切断による。機能の途絶はまた、標的とされたＲＮＡの細胞内輸送の変更を介して生じさせることもできる。
【０００７】
マイクロＲＮＡは、生体中で天然に産生される低分子ＲＮＡからなる大きな群であり、そのうちの少なくとも一部が、標的遺伝子の発現を調節している。マイクロＲＮＡは、約７０ヌクレオチド一本鎖ヘアピン型前駆体転写体からダイサーによって形成されている。多くの例で、マイクロＲＮＡは、以前はその機能が未知であったＤＮＡ配列の一部分から転写される。したがって、これらのコーディング領域は実際には、遺伝子座位とみなすことができる。マイクロＲＮＡは、タンパク質には翻訳されず、むしろ多くの場合に、特異的メッセンジャーＲＮＡに結合し、結合したＲＮＡの翻訳に影響を及ぼし得る。
【０００８】
多くの化合物の生細胞への輸送は、細胞の複雑な膜系によって高度に制限されるので、ポリヌクレオチドなどの様々な治療用化合物の細胞内送達は損なわれる。特異的な輸送体は、栄養素または調節分子の選択的な進入を可能とする一方で、ポリヌクレオチドおよびタンパク質などの大抵の外因性分子を排除する。脂質担体、生分解性ポリマーおよび様々なコンジュゲート系を包含する様々な戦略を使用して、細胞へのポリヌクレオチドの輸送を改善することができる。細胞への外来ポリヌクレオチドの輸送を改善するために最もよく研究されている手法は、ウイルス性ベクターまたは陽イオン性脂質および関連サイトフェクチンの使用を伴う。ウイルス性ベクターを使用して、遺伝子を効率的に一部の細胞型に移すことができるが、これらは一般に、化学的に合成された分子を細胞に導入することはできない。別の手法は、ポリヌクレオチドと一方の終端部を介して、かつ脂質または膜系と他方の終端部を介して相互作用する陽イオン性脂質が組み込まれている送達製剤を使用することである。生物学的活性化合物を送達するための他の手法は、コンジュゲートの使用を伴う。コンジュゲートは多くの場合に、例えば受容体媒介細胞内取り込み作用を介して特異的な細胞に選択的に輸送されるある種の分子の能力を元に選択される。活性化合物を、細胞膜を通過して能動的に輸送される分子に結合させることによって、細胞または特異的な細胞器官へのその化合物の有効な輸送を実現することができる。他の場合には、送達ビヒクルへの活性化合物の組み込みを媒介するために、コンジュゲートを使用することができる。別法では、能動輸送機構を用いずに細胞膜を透過することができる分子、例えば様々な親油性分子を使用して、該当する化合物を送達することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
生物学的活性分子、特にｓｉＲＮＡなどのポリヌクレオチド治療物質の全身および局所送達の効率を改善するための組成物および方法が必要とされている。本開示は、この必要性を満たし、本明細書に記載されている追加の利点をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、本発明は、式（Ｉ）の修飾ポリマーを含む生分解性でのポリヌクレオチド送達ビヒクルを特徴とする：
【００１１】
【化１】
2013528665.tif 000003
［式中、
Ｂはそれぞれ独立に、同じか、または異なるポリマー単位であり；
Ｌ１は、Ｂ単位およびＲ１との間のリンカーであり、ここで、Ｒ１は、選択された組織、病原体、細胞または細胞位置のためのターゲティング基であり；
Ｌ２は、Ｂ単位とＲ２との間のリンカーであり、ここで、Ｒ２は、電荷基であり；
Ｌ３は、Ｂ単位とＲ３との間のリンカーであり、ここで、Ｒ３は、電荷変更基であり；
Ｌ４は、Ｂ単位とＲ４との間のリンカーであり、ここで、Ｒ４は、疎水基であり；
Ｌ５は、Ｂ単位とＲ５との間のリンカーであり、ここで、Ｒ５は、保護基であり；
Ｌ６は、Ｂ単位とＲ６との間のリンカーであり、ここで、Ｒ６は、ポリヌクレオチドであり；
ｎ、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６はそれぞれ、両端を含む０から１の間の範囲である対応するポリマー単位のモル分率であり；ｎ＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＋ｎ５＋ｎ６＝１であるが；但し、ｎもｎ６も０ではないことを条件とする］。
【００１２】
式（Ｉ）において、ポリマー単位、例えば［Ｂ−Ｌ１−Ｒ１］、［Ｂ−Ｌ２−Ｒ２］、［Ｂ−Ｌ３−Ｒ３］、［Ｂ−Ｌ４−Ｒ４］、［Ｂ−Ｌ５−Ｒ５］および［Ｂ−Ｌ６−Ｒ６］の間の破線は、それらの単位が、任意の順序で互いに連結していてよいことを示している。言い換えると、付加基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布していてよい。
【００１３】
詳細には、本発明は、式（ＶＩ）の修飾ポリアセタールを特徴とする：
【００１４】
【化２】
2013528665.tif 000004
［式中、
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５およびＷ６はそれぞれ独立に、共有結合またはポリアセタール主鎖に連結している−Ｃ（Ｏ）を有する−Ｃ（Ｏ）−Ｙ−であり；
Ｙは、−［Ｃ（Ｒ９Ｒ１０）］ａ−または−［Ｃ（Ｒ９Ｒ１０）］ａ−Ｘ１−［Ｃ（Ｒ９Ｒ１０）］ｂ−であり；
Ｘ１は、酸素原子、硫黄原子または−ＮＲ１１であり；
Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、５員から１２員のヘテロアリールまたはＣ３〜８シクロアルキルであり；
Ｒ１１は、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、５員から１２員のヘテロアリール、Ｃ３〜８シクロアルキルまたは−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜３アルキルであり；
Ｚ９は、Ｚ６−Ｔ１またはＺ８であり；
Ｔ１は、−Ｚ７−Ｒ６であり；
Ｚ８は、１個または複数の−Ｚ７−Ｒ６で置換されていて、かつ−Ｑ−Ｒ１、−Ｑ−Ｒ３、−Ｑ−Ｒ４および−Ｑ−Ｒ５からなる群から選択される１個または複数の置換基で置換されていてもよい線状または分岐ポリアミノ部分であり；
Ｑはそれぞれ独立に、共有結合または−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６はそれぞれ独立に、共有結合、−ＮＲ１７または−ＮＲ１７Ｒ１８−であり、ここで、Ｒ１７およびＲ１８はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ２〜８アルキルまたは−Ｃ２〜１０アルキル−Ｎ（Ｒｘ）−であり、Ｒｘは、Ｈまたはアミノ酸のカルボニル基を介して窒素に結合しているアミノ酸であるか；またはＲ１７およびＲ１８はそれらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される０または１個の追加のヘテロ原子を含有する４員から７員のヘテロシクロアルキル環を形成しており；
Ｚ７はそれぞれ独立に、Ｔ３がＲ６に連結している−Ｃ（Ｏ）−Ｔ２−Ｔ３−または−Ｎ（Ｒ’）−Ｔ２−Ｔ３−であり、ここで、Ｒ’はＨまたはＣ１〜６アルキルであり、Ｔ２は、アルキルチオアリール、アリールチオアルキル、アルキルチオアルキル、アリールチオアリール、アルキルジチオアリール、アリールジチオアルキル、アルキルジチオアルキルおよびアリールジチオアリールから選択され、Ｔ３は、共有結合、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）−Ｃ１〜８アルキル、−Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜８アルキルまたはＣ１〜８アルキルであり、ここで、Ｒ”は、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；
ａおよびｂはそれぞれ独立に、両端を含む１から６の間の整数であり；
ｎ、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６はそれぞれ、０から１の間の範囲である対応するポリアセタール単位のモル分率であり；ｎ＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＋ｎ５＋ｎ６＝１であるが；但し、ｎもｎ６も０ではないことを条件とし；
Ｒ１は、選択された組織、病原体、細胞または細胞位置のためのターゲティング基であり；
Ｒ２は、−Ｑ−Ｒ１、−Ｑ−Ｒ３、−Ｑ−Ｒ４および−Ｑ−Ｒ５からなる群から選択される１個または複数の置換基で置換されていてもよい電荷基であり；
Ｒ３は、電荷変更基であり；
Ｒ４は、疎水基であり；
Ｒ５は、保護基であり；
Ｒ６は、ポリヌクレオチドであり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ１の数の比（ｍ１）は、０から０．２５であり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ３の数の比（ｍ３）は、０から１００であり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ４の数の比（ｍ４）は、０から３０であり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ５の数の比（ｍ５）は、０から０．０３であり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ６の数の比（ｍ６）は、０．０００４から０．１０であり；
前記ポリアセタール主鎖は、約１０ｋＤａから約２５０ｋＤａの分子量を有する］。
【００１５】
式（ＶＩ）において、式（Ｉ）のポリマー単位の間の破線のようなポリアセタール単位間の断絶またはギャップは、単位が任意の順序で互いに連結していてよいことを示している。言い換えると、付加基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布していてよい。
【００１６】
式（Ｉ）および（ＶＩ）のポリマーは、下記の特徴のうちの１つまたは複数を包含してよい。
【００１７】
ｍ１は、０．００２から０．２５である。
【００１８】
ｍ３は、０．００２から１００である。
【００１９】
ｍ４は、０．０３から０．３０である。
【００２０】
ｍ５は、０．０１から０．０３である。
【００２１】
Ｚ９がＺ６−Ｔ１である場合、
（ｉ）ｎ１は０ではなく、かつｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｉｉ）ｎ１もｎ２も０ではなく、かつｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｉｉｉ）ｎ１、ｎ２およびｎ３のいずれも０ではなく、かつｎ４およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｉｖ）ｎ１、ｎ２およびｎ４のいずれも０ではなく、かつｎ３およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｖ）ｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４のいずれも０ではなく、かつｎ５は０であるか；
（ｖｉ）ｎ１もｎ４も０ではなく、かつｎ２、ｎ３およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｖｉｉ）ｎ２が０ではなく、かつｎ１、ｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｖｉｉｉ）ｎ２もｎ３も０ではなく、かつｎ１、ｎ４およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｉｘ）ｎ２もｎ４も０ではなく、ｎ１、ｎ３およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｘ）ｎ２、ｎ３およびｎ４のいずれも０ではなく、ｎ１およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｘｉ）ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５のいずれも０ではないか；または
（ｘｉｉ）ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ０である。
【００２２】
Ｚ９がＺ６−Ｔ１である場合、
ｎは、両端を含む約０．０１から約０．９９９６の間であり；
ｎ１は、両端を含む約０．００２から約０．２５の間であり；
ｎ２は、両端を含む約０．０２から約０．９０の間であり；
ｎ３は、両端を含む約０．０２から約０．８１の間であり；
ｎ４は、両端を含む約０．０３から約０．３０の間であり；
ｎ５は、両端を含む約０．０１から約０．０３の間であり；
ｎ６は、両端を含む約０．０００４から約０．１０の間である。
【００２３】
Ｚ９がＺ８である場合、ｎ１、ｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ０である。
【００２４】
Ｚ９がＺ８である場合、Ｒ２は、−Ｑ−Ｒ１、−Ｑ−Ｒ３、−Ｑ−Ｒ４および−Ｑ−Ｒ５からなる群から選択される１個または複数の置換基で置換されていてもよい線状または分岐ポリアミノ部分である。
【００２５】
Ｚ９がＺ８である場合、
（ｉ）ｍ１は０ではなく、かつｍ３、ｍ４およびｍ５はそれぞれ０であるか；
（ｉｉ）ｍ１もｍ４も０ではなく、かつｍ３およびｍ５はそれぞれ０であるか；
（ｉｉｉ）ｍ１、ｍ４およびｍ５のいずれも０ではなく、かつｍ３は０であるか；
（ｉｖ）ｍ１もｍ３も０ではなく、かつｍ４およびｍ５はそれぞれ０であるか；
（ｖ）ｍ１、ｍ３およびｍ４のいずれも０ではなく、かつｍ５は０であるか；または
（ｖｉ）ｍ１、ｍ３、ｍ４およびｍ５のいずれも０ではない。
【００２６】
Ｚ９がＺ８である場合、
ｎは、両端を含む約０．７０から約０．９９の間であり；
ｍ１は、０．００２から０．２５であり；
ｍ３は、０．００２から１００であり；
ｍ４は、０．０３から０．３０であり；
ｍ５は、０．０１から０．０３であり；
ｍ６は、０．０００４から０．１０である。
【００２７】
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６はそれぞれ独立に、エチレンジアミン、ピペラジン、ビス（ピペリジン）、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン（即ち、プトレシン）、１，５−ジアミノペンタン（即ち、カダベリン）、デカメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、アグマチンまたはオルニチンであってよい。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＴ１はそれぞれ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６のＮ原子にそれぞれ結合しており、そのＮ原子は、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５またはＺ６がポリアセタール主鎖にそれを介して結合しているアミド部分のＮ原子ではない。例えばＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６はそれぞれ、
【００２８】
【化３】
2013528665.tif 000005
である。
【００２９】
Ｔ２は、−Ｃ１〜８アルキルチオ−Ｃ６〜１０アリール、−Ｃ６〜１０アリールチオ−Ｃ１〜８アルキル、−Ｃ１〜８アルキルチオ−Ｃ１〜８アルキル、−Ｃ６〜１０アリールチオ−Ｃ６〜１０アリール、−Ｃ１〜８アルキルジチオ−Ｃ６〜１０アリール、−Ｃ６〜１０アリールジチオ−Ｃ１〜８アルキル、−Ｃ１〜８アルキルジチオ−Ｃ１〜８アルキルまたは−Ｃ６〜１０アリールジチオ−Ｃ６〜１０アリールであってよい。
【００３０】
Ｚ７は、下式
【００３１】
【化４】
2013528665.tif 000006
であってよい
［式中、−Ｃ（Ｏ）または−ＮＨは、ポリアセタール主鎖へと配向されている］。
【００３２】
Ｚ７は、下式であってよい
【００３３】
【化５】
2013528665.tif 000007
［式中、−Ｃ（Ｏ）は、ポリアセタール主鎖へと配向されている］。
【００３４】
Ｚ８は、他に置換基がなければ、
【００３５】
【化６】
2013528665.tif 000008
または
（９）ポリ−Ｌ−リシン、ポリ（プロピレンイミン）およびポリ（アミドアミン）デンドリマーから選択される第２〜１０世代のいずれかのデンドリマーであってよく；
上式中、
Ｒｙは、アミノ酸のカルボニル基を介して窒素に結合しているアミノ酸または線状もしくは分岐ポリアミノ部分であり；
Ｒｚは、Ｈまたは線状もしくは分岐ポリアミノ部分であり；
ｃは、両端を含む２から６００の間の整数であり；
ｄは、両端を含む０から６００の間の整数であり；
ｅは、両端を含む１から１５０の間の整数であり；
ｄ２は、両端を含む２から２０の間の整数であり；
ｄ３は、両端を含む２から２００の間の整数である。
【００３６】
例えばＺ８は、その外には非置換である場合、（１）約５００から約２５０００ダルトン（例えば約５００から約２５００ダルトン）の分子量を有する直鎖ポリエチレンイミン；（２）約５００から約２５０００ダルトン（例えば約５００から約１２００ダルトン）の分子量を有する分岐ポリエチレンイミン；
【００３７】
【化７】
2013528665.tif 000009
である。
【００３８】
ＲｙおよびＲｚはそれぞれ独立に、−［Ｃ２〜６アルキル−ＮＨ］−のモノマー単位を含むポリアミノ部分であってよい。
【００３９】
Ｒ１は、ガラクトサミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、葉酸、ＲＧＤペプチド、ＬＨＲＨ受容体ターゲティングペプチド、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）受容体ターゲティングペプチド、前立腺特異的膜結合抗原（ＰＳＭＡ）ターゲティングペプチド、リポタンパク質受容体ＬＲＰ１ターゲティングリガンド、ＡｐｏＥタンパク質由来ペプチドおよび／またはトランスフェリンを含んでよい。
【００４０】
Ｒ２は、
【００４１】
【化８】
2013528665.tif 000010
（７）約５００から約２５０００ダルトンの分子量を有する線状ポリエチレンイミン；
（８）約５００から約２５０００ダルトンの分子量を有する分岐ポリエチレンイミン；
【００４２】
【化９】
2013528665.tif 000011
［式中、
Ｒｚは、Ｈまたは線状もしくは分岐ポリアミノ部分であり；
ｄは、両端を含む０から６００の間の整数であり；
ｅは、両端を含む１から１５０の間の整数である］であってよい。
【００４３】
例えば、Ｒ２は、
【００４４】
【化１０】
2013528665.tif 000012
、約５００から約２５００ダルトンの分子量を有する線状ポリエチレンイミンまたは約５００から約１２００ダルトンの分子量を有する分岐ポリエチレンイミンである。
【００４５】
Ｒ３は式（ＸＶＩ）を有してよい：
【００４６】
【化１１】
2013528665.tif 000013
［式中、
Ｒ１２は、水素、Ｃ１〜５アルキルまたはＣ６〜１０アリールであり；
Ｒ１３は、水素、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ６〜１０アリール、−（ＣＨ２）ｇ−ＣＯ２Ｒ１４、−（ＣＨ２）ｇ−Ｃ（Ｏ）ＳＲ１４、−（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）Ｓ（ＣＨ２）ｇＣＯ２Ｒ１４または−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＨＲ１５であり；
Ｒ１４は、水素またはＣ１〜５アルキルであり；
Ｒ１５は、水素、Ｃ１〜５アルキル、Ｃ６〜１０アリール、アラルキル、アルキルジチオアリール、アリールジチオアルキル、アルキルジチオアルキル、アリールジチオアリール、−（ＣＨ２）ｇＣＨＯまたはＲ１であり；
ｇは、両端を含む１から５の間の整数であり；ｑは、両端を含む０から５の間の整数であり；
【００４７】
【化１２】
2013528665.tif 000014
は、単結合または二重結合である］。
【００４８】
例えば、Ｒ３は
【００４９】
【化１３】
2013528665.tif 000015
【００５０】
【化１４】
2013528665.tif 000016
［式中、Ｒ１６は、水素またはＣ１〜２アルキルである］
である。詳細には、Ｒ３は、
【００５１】
【化１５】
2013528665.tif 000017
である。
【００５２】
Ｒ４には、不飽和脂肪酸、Ｃ６〜２２アルキルアミン、コレステロール、コレステロール誘導体またはアミノ含有脂質が包含され得る。例えばＲ４は、
【００５３】
【化１６】
2013528665.tif 000018
である。
【００５４】
Ｒ６は、天然、合成または半合成ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドであってよい。例えばＲ６は、約１２から約３０個のヌクレオチドを有する二本鎖オリゴヌクレオチドまたは約８から約６４個のヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００５５】
ポリアセタール主鎖は、約１００ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約６０ｋＤａまたは約４０ｋＤａの分子量を有してよい。
【００５６】
他の態様では、本発明は、選択された組織型または細胞型の細胞質にポリヌクレオチドを送達する方法を特徴とする。その方法は、式（Ｉ）の修飾ポリマー、例えば式（ＶＩ）の修飾ポリアセタールを選択された組織型（例えば肝臓組織または腎臓組織）または細胞型（例えば血液細胞、内皮細胞、癌細胞、膵臓細胞または神経細胞）と接触させることを含む。
【００５７】
本発明では、細胞において遺伝子の発現を減少させる方法も提供する。その方法は、細胞の細胞質に、有効量の式（Ｉ）の修飾ポリマー、例えば式（ＶＩ）の修飾ポリアセタールを送達することを含み、その修飾ポリマー（例えばポリアセタール）は、その遺伝子の少なくとも一部に相補的であるポリヌクレオチドを含有する。
【００５８】
また他の態様では、本発明は、対象において遺伝子の発現を減少させる方法に関する。その方法は、それを必要とする対象に、有効量の式（Ｉ）の修飾ポリマー、例えば式（ＶＩ）の修飾ポリアセタールを投与することを包含し、その修飾ポリアセタールは、その遺伝子の少なくとも一部に相補的であるポリヌクレオチドを含有する。
【００５９】
別段に定義されていない限り、本明細書で使用されている全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において、単数形は、その内容が別段に明確に規定されていない限り、複数形も包含する。本明細書に記載されているのと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を下記に記載する。本明細書で述べられている全ての出版物、特許出願、特許および他の参照文献は、参照によって組み込まれる。本明細書で挙げられている参照文献は、特許請求の範囲に記載されている本発明の先行技術であることを認めるものではない。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書を優位とする。加えて、材料、方法および例は単なる例示であり、制限を意図したものではない。
【００６０】
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および請求項から明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
本明細書に記載されているのは、修飾ポリマー、詳細には、特異的な種類の細胞にポリヌクレオチドを送達するために使用することができる修飾ポリマーである。ポリマー主鎖は、ポリヌクレオチド基ならびに場合によって、標的である所望の細胞型へと修飾ポリマーを差し向ける機能を有する基および細胞への送達を容易にする基を結合させることによって修飾されている。これらの修飾ポリマーの有利な特徴は、ｓｉＲＮＡなどの治療薬を包含する幅広い様々なポリヌクレオチドを結合させ得ることである。他の官能基の種類および量を変えることによって、標的である多くの異なる細胞型へと差し向けることおよびそれらに送達することが可能となる。一実施形態では、本明細書に記載されている修飾ポリマーは、クリアランスまたは分解前に有効量のポリヌクレオチドを標的位置に提供するのに十分な溶解性、ステルス性、生分解性およびターゲティング性を有する。さらに、そのような特性は、効力の低下または毒性さえももたらし得る標的外での結合の発生（または、そのような結合が有害であろう組織または細胞における標的とされる結合も）を禁じ得る。修飾ポリマーの他の特徴および利点を下記で詳細に記載する。
【００６２】
専門用語
本発明を詳細に記載する前に、本明細書で使用されるある種の用語の定義を提供する。化合物は、標準的な命名法を使用して記載されている。別段に定義されていない限り、本明細書で使用されている全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。
【００６３】
下記の明細および請求項の両方における冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の使用は、本明細書中で別段に示されていない限り、または内容によって明確に否定されていない限り、単数および複数の両方に及ぶと解釈されるべきである。「含む」、「有する」、「包含する」および「含有する」という用語は、別段に示されていない限り、オープンタームとして（即ち、「これらに限られないが〜を包含する」を意味すると）解釈されるべきである。加えて、「含む」または他のオープンエンドの用語が実施形態で使用される場合には常に、同じ実施形態を、中間的な用語「主に〜からなる」またはクローズドターム「〜からなる」を使用してより狭く請求することができることを理解されたい。
【００６４】
値の範囲についての言及は、本明細書中で別段に示されていない限り、範囲内に該当するそれぞれ別々の値を個々に言及することの簡便な方法として役立てることが単に意図されており、本明細書中に個々に言及されているかのように、それぞれ別々の値が、明細書中に組み込まれる。本明細書で使用される範囲には、別段に規定されていない限り、その範囲の２つの限界値が包含される。例えば「ｘは、１から６の間の整数である」および「ｘは、１から６の整数である」という表現は両方とも、「ｘは、１、２、３、４、５または６である」ことを意味している。「重量％」という用語は、重量によるパーセントを指している。本明細書に記載されている方法は全て、本明細書中で別段に示されていない限り、または内容によって別段に明確に否定されていない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で示されている任意および全ての例または例示的な言葉（例えば「など」）の使用は、本発明をより良く説明することを単に意図しており、別段に明示して請求されていない限り、特許請求の範囲に対する制限として解釈されるべきではない。明細書中のどんな言葉も、何らかの請求されていない要素が、請求されていることの必須要素であることを示していると解釈されるべきではない。
【００６５】
アステリスク（「＊」）は、置換基または連結基のための結合点として機能する結合を示すために使用されている。例えば
【００６６】
【化１７】
2013528665.tif 000019
は、置換基とアステリスクに隣接しているケト基との単結合を介して他の基へ共有結合している。
【００６７】
「アルキル」は、規定の数の炭素原子、一般に１から約１２個の炭素原子を有する分岐および直鎖（線状）飽和脂肪族炭化水素基の両方を包含することが意図されている。Ｃ１〜６アルキルという用語は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６アルキル基を包含することが意図されている。Ｃ１〜８アルキルは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８アルキル基を包含することが意図されている。アルキルの例には、これらに限られないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル３−メチルブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｓ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチルおよびｎ−オクチルが包含される。
【００６８】
一部の実施形態では、直鎖または分岐アルキルは、６個以下の炭素原子（例えば直鎖ではＣ１〜Ｃ６、分岐鎖ではＣ３〜Ｃ６）を有し、他の実施形態では、直鎖または分岐アルキルは４個以下の炭素原子を有する。
【００６９】
「置換アルキル」は、炭化水素主鎖の１個または複数の炭素上の１個または複数の水素原子に置き換わっている置換基を有するアルキル部分を意味する。そのような置換基には、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを包含）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを包含）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が包含され得る。「アリールアルキル」または「アラルキル」部分は、アリールで置換されているアルキル（例えばフェニルメチル（ベンジル））である。「アルキルアリール」部分は、アルキルで置換されているアリール（例えばメチルフェニル）である。
【００７０】
「アリール」には、少なくとも１個の芳香環を有し、環構造中にヘテロ原子を何ら含有しない「コンジュゲートされている」か、または多環の系を包含する芳香族性を有する基が包含される。例には、フェニル、ベンジル、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレニルなどが包含される。
【００７１】
「ヘテロアリール」基は、上記で定義されたとおりであるが、但し、環構造中に１から４個のヘテロ原子を有するアリール基であり、「アリール複素環」または「ヘテロ芳香族」とも称され得る。本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」という用語は、炭素原子と、窒素、酸素および硫黄から独立に選択される１個または複数のヘテロ原子、例えば１個または１〜２個または１〜３個または１〜４個または１〜５個または１〜６個のヘテロ原子とからなる安定な５員、６員もしくは７員の単環式または７員、８員、９員、１０員、１１員もしくは１２員の二環式芳香族複素環式環を包含することが意図されている。窒素原子は、置換または非置換であってよい（即ち、ＮまたはＮＲであり、ここで、ＲはＨまたは定義されたとおりの他の置換基である）。窒素および硫黄ヘテロ原子は場合によって、酸化されていてよい（即ち、Ｎ→ＯおよびＳ（Ｏ）ｏ、ここで、ｏは、１または２の整数である）。芳香族複素環中のＳおよびＯ原子の総数は、１以下であることに留意されたい。ヘテロアリールには、部分的に芳香族である基、例えば４−ベンゾ［ｄ］−イミダゾロンが包含される。
【００７２】
ヘテロアリール基の例には、ピロール、フラン、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジンなどが包含される。
【００７３】
さらに、「アリール」および「ヘテロアリール」という用語には、多環式アリールおよびヘテロアリール基、例えば三環式、二環式、例えばナフタレン、ベンゾオキサゾール、ベンゾジオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチオフェン、メチレンジオキシフェニル、キノリン、イソキノリン、ナフチリジン（ｎａｐｈｔｈｒｉｄｉｎｅ）、インドール、ベンゾフラン、プリン、ベンゾフラン、デアザプリン、インドリジンが包含される。
【００７４】
多環式芳香環の場合、環のうちの１個だけは芳香族である必要があるが（例えば２，３−ジヒドロインドール）、環の全部が芳香族であってもよい（例えばキノリン）。第２の環はまた、縮合または架橋していてよい。
【００７５】
アリールまたはヘテロアリール芳香環は、１つまたは複数の環位置で、上記のとおりの置換基、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル（ａｋｙｎｙｌ）、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを包含）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを包含）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分で置換されていてよい。アリール基はまた、芳香族ではない脂環式または複素環式環と縮合または架橋して、多環式系（例えばテトラリン、メチレンジオキシフェニル）を形成していてよい。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」という用語は、３から３０個の炭素原子（例えばＣ３〜Ｃ１０）を有する飽和または不飽和の非芳香族炭化水素単環または多環系を指す。シクロアルキルの例には、これらに限られないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニルおよびアダマンチルが包含される。「ヘテロシクロアルキル」という用語は、別段に規定されていない限り、１個または複数のヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、ＳまたはＳｅなど）を有する飽和または不飽和の非芳香族３員〜８員単環式、８員〜１２員二環式または１１〜１４員三環式環系を指す。ヘテロシクロアルキル基の例には、これらに限られないが、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、イソインドリニル、インドリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル（ｔｅｔｒａｈｙｒｏｆｕｒａｎｙｌ）、オキシラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、ピラニル、モルホリニルなどが包含される。
【００７７】
シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環は、１つまたは複数の環位置（例えば環形成炭素またはＮなどのヘテロ原子）で、上記の通りの置換基、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを包含）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを包含）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分で置換されていてよい。アリールおよびヘテロアリール基はまた、芳香族ではない脂環式または複素環式環と縮合または架橋して、多環式系（例えばテトラリン、メチレンジオキシフェニル）を形成していてよい。
【００７８】
「アミン」または「アミノ」は、非置換または置換の−ＮＨ２を指す。「アルキルアミノ」には、窒素が少なくとも１個のアルキル基に結合している化合物の基が包含される。アルキルアミノ基の例には、ベンジルアミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、フェネチルアミノなどが包含される。「ジアルキルアミノ」には、窒素原子が少なくとも２個の追加のアルキル基に結合している基が包含される。ジアルキルアミノ基の例には、これらに限られないが、ジメチルアミノおよびジエチルアミノが包含される。「アリールアミノ」および「ジアリールアミノ」には、窒素がそれぞれ少なくとも１個または２個のアリール基に結合している基が包含される。「アルキルアリールアミノ」、「アルキルアミノアリール」または「アリールアミノアルキル」は、少なくとも１個のアルキル基および少なくとも１個のアリール基に結合しているアミノ基を指す。「アルカミノアルキル」は、アルキル基にも結合している窒素原子に結合しているアルキル、アルケニルまたはアルキニル基を指す。「アシルアミノ」には、窒素がアシル基に結合している基が包含される。アシルアミノの例には、これらに限られないが、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイド基が包含される。
【００７９】
「アミド」または「アミノカルボキシ」は、カルボニルまたはチオカルボニル基の炭素に結合している窒素原子を含有する化合物または部分を意味する。この用語には、カルボニルまたはチオカルボニル基の炭素に結合しているアミノ基に結合しているアルキル、アルケニルまたはアルキニル基を包含する「アルカミノカルボキシ」基が包含される。これにはまた、カルボニルまたはチオカルボニル基の炭素に結合しているアミノ基に結合しているアリールまたはヘテロアリール部分を包含する「アリールアミノカルボキシ」基が包含される。「アルキルアミノカルボキシ」、「アルケニルアミノカルボキシ」、「アルキニルアミノカルボキシ」および「アリールアミノカルボキシ」という用語には、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアリール部分がそれぞれ、窒素原子に結合していて、その窒素原子がさらに、カルボニル基の炭素に結合している部分が包含される。アミドは、直鎖アルキル、分岐アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環などの置換基で置換されていてよい。アミド基上の置換基は、さらに置換されていてよい。
【００８０】
「ポリアミン」または「ポリアミノ」は、２個以上のアミノ（例えば第一級アミノ、第二級アミノまたは第三級アミノ基）またはアミド基を含有する部分を意味する。ポリアミノの例には、これらに限られないが、エチレンジアミン、ピペラジン、ビス（ピペリジン）、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、デカメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、カダベリン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、アグマチンまたはオルニチン、線状または分岐ポリエチレンイミンなどの−［Ｃ２〜６アルキル−ＮＨ］−の繰り返し単位を含有する線状または分岐ポリマー、ポリアミノ酸ならびにポリ−Ｌ−リシン、ポリ（プロピレンイミン）およびポリ（アミドアミン）デンドリマーから選択される第２〜１０世代のいずれかのデンドリマーが包含される。「ビス（ピペリジン）」という用語は、共有結合または下式などのアルキルリンカーのいずれかによって連結している２個のピペリジン環を含有する部分を指す。
【００８１】
【化１８】
2013528665.tif 000020
「チオアルキル」は、硫黄原子を介して結合している指定の数の炭素原子を有する本明細書で定義されるとおりのアルキル基を意味する。Ｃ１〜６アルキルチオは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６アルキルチオ基を包含することが意図されている。Ｃ１〜８アルキルチオは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８アルキルチオ基を包含することが意図されている。チオアルキル基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、カルボキシ酸、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを包含）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを包含）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分などの基で置換されていてよい。
【００８２】
「チオカルボニル」または「チオカルボキシ」には、硫黄原子に二重結合で連結している炭素を含有する化合物および部分が包含される。
【００８３】
「チオエーテル」には、２個の炭素原子またはヘテロ原子に結合している硫黄原子を含有する部分が包含される。チオエーテルの例には、これらに限られないが、アルクチオアルキル、アルクチオアルケニルおよびアルクチオアルキニルが包含される。「アルクチオアルキル」という用語には、アルキル基に結合している硫黄原子に結合しているアルキル、アルケニルまたはアルキニル基を有する部分が包含される。同様に、「アルクチオアルケニル」という用語は、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基が、アルケニル基に共有結合している硫黄原子に結合している部分を指し；アルクチオアルキニル」は、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基が、アルキニル基に共有結合している硫黄原子に結合している部分を指す。
【００８４】
「チオアリール」は、硫黄原子を介して結合している指定の数の炭素原子を有する本明細書で定義されるとおりのアリール基を意味する。
【００８５】
「アルキルジチオアリール」、「アリールジチオアルキル」、「アルキルジチオアルキル」または「アリールジチオアリール」は、ジスルフィド橋を介してチオアリール基に連結しているチオアルキル基を含有する部分を意味する。
【００８６】
「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。「ペルハロゲン化」という用語は一般に、水素原子が全てハロゲン原子によって置き換えられている部分を指す。
【００８７】
「カルボン酸」は、１個の式−ＣＯ２Ｈの基を含む化合物を指す。
【００８８】
「ジカルボン酸」は、２個の式−ＣＯ２Ｈの基を含む化合物を指す。
【００８９】
「アシル」には、アシルラジカル（−Ｃ（Ｏ）−）またはカルボニル基を含有する部分が包含される。「置換アシル」には、１個または複数の水素原子が、例えばアルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを包含）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを包含）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分によって置き換えられているアシル基が包含される。
【００９０】
「アルカノイル」は、ケト（−（Ｃ＝Ｏ）−）橋を介して結合している上記で定義されたとおりのアルキル基を意味する。アルカノイル基は、指定の数の炭素原子を有し、その際、ケト基の炭素は数字を付された炭素原子の中に包含される。例えばＣ２アルカノイル基は、式ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）−を有するアセチル基である。
【００９１】
上記で述べられたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アミノ、アリール、ヘテロアリール、チオアルキルおよび他の有機部分には、置換および非置換部分の両方が包含される。適切な置換基は、本明細書に記載されているものである。
【００９２】
「生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）」は、体液または生きている細胞もしくは組織と接触している間に最小の破壊的なまたはホストの応答作用を発揮する化合物を記述することが意図されている。したがって、生体適合性基は、本明細書で使用される場合、上記および本明細書で定義されたとおりの生体適合性という用語の定義内に該当する脂肪族、脂環式、ヘテロ脂肪族、ヘテロ脂環式、アリールまたはヘテロアリール部分を指す。「生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）」という用語もまた本明細書で使用される場合、そのような相互作用が特に望まれない限り、認識タンパク質、例えば天然に生じる抗体、細胞タンパク質、細胞および生物系の他の成分との最小の相互作用を意味することとする。したがって、上記の作用をもたらすことが特に意図されている物質および官能基、例えば薬物およびプロドラッグは、生体適合性であると解釈される。好ましくは（例えば抗新生物薬などの細胞毒性であることが意図されている化合物を除いて）、意図されている全身ｉｎ  ｖｉｖｏ濃度と同様の濃度でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの正常細胞へのその添加が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの化合物の半減期（例えばｉｎ  ｖｉｖｏ投与された化合物のうちの５０％が除去／クリアランスされるために必要な期間）と同等の時間の間に１％以下の細胞死をもたらし、そのｉｎ  ｖｉｖｏ投与が、最小限かつ医学的に許容される炎症、異物反応、免疫毒性、化学的毒性または他のそのような有害作用を誘発するならば、化合物は「生体適合性」である。上記の文章において、「正常細胞」という用語は、試験されている化合物によって破壊されるか、または別段に有意な影響を受けることが意図されていない細胞を指す。
【００９３】
「生分解性」ポリマーは、ｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的なプロセッシングを受け易いポリマーである。本明細書で使用される場合、「生分解性」化合物は、細胞によって取り込まれると、リソソームもしくは他の化学的機序によって、または加水分解によって、細胞が再利用するか、細胞に対する有意な毒性作用なしに片付けることができる成分へと壊され得る化合物である。分解断片は好ましくは、臓器または細胞過負荷またはそのような過負荷もしくは他の有害作用が原因である病的プロセスをｉｎ  ｖｉｖｏで誘発しないか、またはほとんど誘発しない。生分解性プロセスの例には、酵素および非酵素加水分解、酸化ならびに還元が包含される。様々なコンジュゲートのポリマー主鎖を非酵素加水分解するための適切な条件には、例えば、リソソームの細胞内区画の温度およびｐＨで生分解性コンジュゲートを水に曝露することが包含される。一部のコンジュゲート主鎖、例えば本発明のポリアセタールコンジュゲートの生分解をまた、細胞外で、例えば動物の身体の低いｐＨ領域、例えば炎症部分で、分解を促進する因子を放出している活性化マクロファージまたは他の細胞の近接で、増大させることができる。一部の実施形態では、ｐＨ約７．５でのポリマー分子の有効サイズは、１から７日間にわたって検出可能なほどには変化せず、元のポリマーサイズの５０％以内を少なくとも数週間は維持する。他方でｐＨ約５では、ポリマーは、１から５日間にわたって好ましくは検出可能に分解され、２週間から数ヶ月の時間の枠内で、低分子量の断片へと完全に変換される。そのような試験でのポリマーの完全性は、例えばサイズ排除ＨＰＬＣによって測定することができる。より早急な分解が一部の場合には好ましいこともあるが、一般に、ポリマーは細胞内で、細胞によるポリマー断片の代謝または排出の速度を超えない速度で分解されることがより望まれ得る。好ましい実施形態では、ポリマーおよびポリマー生分解副産物は、生体適合性である。
【００９４】
ポリマーモノマー単位上の置換基に関する場合の「親水性」は、当分野においてこの用語に共通する意味と本質的に変わらず、イオン性、極性もしくは極性原子を含有するか、または別段に水分子によって溶媒和され得る化学的部分を示している。したがって、親水性基は、本明細書で使用される場合、上記で定義されたとおりの親水性という用語の定義に該当する脂肪族、脂環式、ヘテロ脂肪族、ヘテロ脂環式、アリールまたはヘテロアリール部分を指す。適切な特定の親水性有機部分の例には、限定ではないが、約１から１２個の間の原子範囲の原子からなる鎖を含む脂肪族またはヘテロ脂肪族基、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、アミン、カルボキシル、アミド、カルボン酸エステル、チオエステル、アルデヒド、ニトロ（−ＮＯ２）、ニトリル（−ＣＮ）、イソニトリル（−ＮＣ）、ニトロソ（−ＮＯ）、ヒドロキシルアミン、メルカプトアルキル、複素環、カルバメート、カルボン酸およびその塩、スルホン酸およびその塩、スルホン酸エステル、リン酸およびその塩、リン酸エステル、ポリグリコールエーテル、ポリアミン、ポリカルボキシレート、ポリエステルならびにポリチオエステルが包含される。好ましい本発明の実施形態では、ポリマーモノマー単位のうちの少なくとも１個は、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）、アルデヒド基（ＣＨＯ）、メチロール（ＣＨ２ＯＨ）またはグリコール（例えばＣＨＯＨ−ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ−（ＣＨ２ＯＨ）２を包含する。
【００９５】
ポリマーに関する場合の「親水性」は一般に、当分野におけるこの用語の使用と変わらず、上記で定義されたとおりの親水性官能基を含むポリマーを示す。一部の実施形態では、親水性ポリマーは、水溶性ポリマーである。ポリマーの親水性は、水和エネルギーの決定を介して直接的に測定することができるか、または２つの液相の間の検査を介して、または例えばＣ４もしくはＣ１８などの既知の疎水性を有する固相上でのクロマトグラフィーによって決定することができる。
【００９６】
「生理学的条件」は、本明細書で使用される場合、生体組織の細胞外液体中で遭遇するであろう化学的（例えばｐＨ、イオン強度）および生化学（例えば酵素濃度）条件の範囲に関する。大抵の正常な組織では、生理学的ｐＨは、約７．０から７．４である。循環血漿および正常な間隙液が、正常な生理学的条件の典型的な例を代表する。
【００９７】
「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２個のヌクレオチドを含有するポリマーを意味する。「ヌクレオチド」は、核酸ポリマーのモノマー単位である。１２０未満のモノマー単位を有するポリヌクレオチドは多くの場合に、オリゴヌクレオチドと呼ばれる。
【００９８】
「ＰＨＦ」は、商標ＦＬＥＸＩＭＥＲ（登録商標）で入手可能なポリマーのポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチル−ホルマール）を指す。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「ポリマー単位」、「モノマー単位」、「モノマー」、「モノマー単位」、「単位」という用語は全て、ポリマー中の繰り返し構造単位を指す。
【０１００】
別段に規定されていない限り、式（Ｉ）および（ＶＩ）においてのものなど、本明細書に包含される式中のポリマー単位間の破線または断絶は、それらの単位がランダムな順序で配置されていることを示している。例えば下式
【０１０１】
【化１９】
2013528665.tif 000021
中の破線は、−［ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ］−単位および−［ＣＨ２ＣＨ２ＮＲｙ］−単位がランダムに配置されていることを意味している。
【０１０２】
「遺伝子」または「標的遺伝子」は、これらに限られないが、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を包含する、ＲＮＡ、例えば核酸配列をコードするポリヌクレオチドを意味する。標的遺伝子は、細胞に由来する遺伝子、内因性遺伝子、導入遺伝子または、それに感染した後に細胞内に存在する病原体、例えばウイルスの遺伝子などの外因性遺伝子であってよい。標的遺伝子を含有する細胞は、生体、例えば植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌または真菌に由来するか、またはそれに含有されていてよい。さらに、標的遺伝子は、特異的な組織で、またはより広汎に、もしくは遍在して（即ち生物の多くまたは全ての組織で）発現されてよく、特異的遺伝子の野生型または変異型対立遺伝子を含んでよい。
【０１０３】
本発明は、本化合物において生じる原子の全ての同位体を包含することが意図されている。同位体には、同じ原子番号を有するが、異なる質量数を有する原子が包含される。一般的な例であって限定ではないが、水素の同位体には、トリチウムおよびジュウテリウムが包含される。炭素の同位体には、Ｃ−１３およびＣ−１４が包含される。
【０１０４】
修飾ポリマー主鎖
上述のとおり、修飾生分解性、生体適合性ポリマーを、ポリヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡなどのポリヌクレオチド治療物質のための送達ビヒクルとして使用することができる。ポリマー主鎖は、付加官能基が化学的リンカーを介してポリマー単位の一部に結合する足場を提供する。
【０１０５】
一実施形態では、ポリマー主鎖は、炭水化物、グリコ多糖、糖脂質、グリココンジュゲート、ポリアセタール、ポリケタールおよびそれらの誘導体から選択される親水性で生分解性の生体適合性ポリマーである。他の実施形態では、ポリマー主鎖は、セルロース、アミロース、デキストラン、レバン、フコイダン、カラギナン（ｃａｒｒａｇｉｎａｎ）、イヌリン、ペクチン、アミロペクチン、グリコーゲンおよびリセナン（ｌｉｘｅｎａｎ）から選択される天然に生じる線状および分岐の生分解性で生体適合性のホモ多糖である。また他の実施形態では、ポリマー主鎖は、アガロース、ヒルロナン（ｈｙｌｕｒｏｎａｎ）、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、アルギン酸およびヘパリンから選択される天然に生じる線状および分岐の生分解性で生体適合性のヘテロ多糖である。
【０１０６】
また他の実施形態では、ポリマー主鎖は、ポリアクリレート、ポリビニルポリマー、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリアミド、ポリペプチドおよびその誘導体から選択される親水性ポリマーである。
【０１０７】
他の実施形態では、ポリマー主鎖は、１個または複数の修飾因子をコンジュゲートする前に、１，２−、１，４−、１，６−および２，６−ピラノシドおよび１，２−、１，５−、１，６−フラノシドの環式ビシナルジオールの選択的酸化によって、またはラテラル６−ヒドロキシおよび５，６−ジオール含有多糖の酸化によって活性化された多糖を含む。
【０１０８】
一実施形態では、ポリマー主鎖は、下式の化学構造によって表されるポリアセタール部分０．１％から１００％を含む活性化された親水性の生分解性で生体適合性のポリマーを含む：
（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨＲ７−Ｏ−ＣＨＲ８−）ｏ
［式中、
Ｒ７およびＲ８は独立に、水素、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル（例えば−ＣＨ２ＯＨ）、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＯＨ）または−カルボニルであり；
ｏは、両端を含む２０から２０００の間の整数である］。
【０１０９】
一実施形態では、ポリマーは、部分的に酸化されたデキストラン（β１→６）−Ｄ−グルコース）から得ることができる。この実施形態では、ポリマーは、下式の構造の未修飾のデキストラン（Ａ）、部分的に酸化されたデキストランアセタール単位（Ｂ）および網羅的にデキストランアセタール単位（Ｃ）のランダムな混合物を含む：
【０１１０】
【化２０】
2013528665.tif 000022
他の実施形態では、ポリマー主鎖は、未修飾のアセタール単位、即ち、ポリアセタールセグメントを含む。一部の実施形態では、ポリアセタールは、網羅的に酸化されたデキストランに由来してよい。これらのポリマーは、米国特許第５，８１１，５１０号に記載されており、これは、２欄の６５行から８欄の５５行のポリアセタールについてのその記載および１０欄の４５行から１１欄の１４行でのその合成に関して、参照によって本明細書に組み込まれる。一実施形態では、未修飾のポリアセタールポリマーは、ポリ（ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）ポリマー（ＰＨＦ）である。
【０１１１】
ポリ（ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）ポリマーに加えて、修飾ポリマーの主鎖はまた、ポリ（ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）ブロックと、他のアセタールまたは非アセタールモノマーもしくはポリマーとのコポリマーを含んでもよい。例えばポリエチレングリコールポリマーは、ポリマー主鎖中のステルス剤として有用である。それというのも、これらは、付加官能基のポリマー側鎖間の相互作用を減少させ得るためである。そのような基はまた、血清因子と修飾ポリマーとの間などの相互作用を制限するのに有用であり得る。ポリマー主鎖に包含させるための他のステルス剤モノマーには、例えばエチレンイミン、メタクリル酸、アクリルアミド、グルタミン酸およびそれらの組合せが包含される。
【０１１２】
アセタール単位は、生体適合性を促進するのに有効な量で、修飾ポリマー中に存在する。未修飾のアセタール単位は、生体適合性および溶解性を修飾ポリマーに与える「ステルス剤」として記載され得る。加えて、ポリアセタールポリマーへのコンジュゲーションは、それに結合している部分の代謝および分解に対する感受性を変更し、かつ生体内分布、クリアランスおよび分解に影響を及ぼし得る。未修飾のアセタール単位は、式（ＩＩ）のモノマーである：
【０１１３】
【化２１】
2013528665.tif 000023
未修飾のポリアセタール単位のモル分率ｎは、修飾ポリマー中のポリマー単位の総数に対して、生体適合性、溶解性を促進し、半減期を長くするために利用可能なモル分率である。モル分率ｎは、生体適合性、溶解性、安定性または特定の半減期を得るのに必要な未修飾のモノマーアセタール単位の最小限の分率であってよいか、または多少より大きな分率であってよい。細胞毒性の最も望ましい程度は、実質的にゼロである、即ち、修飾ポリマーは、対象に対して実質的に不活性である。しかしながら、当業者であれば理解するとおり、治療されている疾患または症状の重症度、治療の効力、免疫応答の種類および程度ならびに同様の検討に応じて、多少の程度の細胞毒性は許容され得る。
【０１１４】
一実施形態では、式（Ｉ）の修飾ポリマーにおいて、基Ｒ１〜Ｒ６を含有する１つまたは複数のポリマー単位は、ポリアセタール単位である。特に、式（Ｉ）のポリマーの修飾セグメントは、式（ＩＩＩ）の単位を含む：
【０１１５】
【化２２】
2013528665.tif 000024
［式中、
Ｌ−Ｒは、Ｌ１−Ｒ１、Ｌ２−Ｒ２、Ｌ３−Ｒ３、Ｌ４−Ｒ４、Ｌ５−Ｒ５およびＬ６−Ｒ６の１つまたは複数であり、ここで、Ｌはそれぞれリンカーであり、Ｒはそれぞれ官能基であり、ｎ’はｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６の１つまたは複数を表し、ここで、ｎ１はＬ１−Ｒ１で修飾されたポリマー単位のモル分率を表し、ｎ２は、Ｌ２−Ｒ２で修飾されたポリマー単位のモル分率を表し、以下も同様である］。各Ｌおよび各Ｒは独立に選択され、Ｌ−Ｒの組合せのモル分率はそれぞれ、０から１で変動するが、修飾および未修飾ポリマー単位のモル分率の合計は１であるという制限がある。
【０１１６】
本明細書に記載されている式（ＩＩＩ）および他の式に示されているとおり、ポリアセタール単位はそれぞれ、その単位のグリセロール部分に結合している単一のヒドロキシル基およびその単位のグリコールアルデヒド部分に結合している単一のＬ−Ｒ基を有する。これは単に簡便さのためであって、本明細書に記載されている式（ＩＩＩ）および他の式（例えば下記の式（ＩＶ））の単位を有するポリマーは、その単位のグリコールアルデヒド部分に結合している単一のＬ−Ｒ基を有する単位およびその単位のグリセロール部分に結合している単一のＬ−Ｒ基を有する単位、さらに一方はその単位のグリコールアルデヒド部分に結合していて、他方はその単位のグリセロール部分に結合している２個のＬ−Ｒ基を有する単位のランダムな分布を含有してよいと解釈すべきである。Ｌ−Ｒはそれぞれ独立に、Ｌ１−Ｒ１、Ｌ２−Ｒ２、Ｌ３−Ｒ３、Ｌ４−Ｒ４、Ｌ５−Ｒ５およびＬ６−Ｒ６から選択される。
【０１１７】
一実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）の修飾ポリマーを記載する：
【０１１８】
【化２３】
2013528665.tif 000025
［式中：
Ｌ１は、アセタール単位とＲ１との間のリンカーであり、ここで、Ｒ１は、選択された組織、病原体、細胞または細胞位置のためのターゲティング基であり；
Ｌ２は、アセタール単位とＲ２との間のリンカーであり、ここで、Ｒ２は、電荷基であり；
Ｌ３は、アセタール単位とＲ３との間のリンカーであり、ここで、Ｒ３は電荷変更基であり；
Ｌ４は、アセタール単位とＲ４との間のリンカーであり、ここで、Ｒ４は疎水基であり；
Ｌ５は、アセタール単位とＲ５との間のリンカーであり、ここで、Ｒ５は保護基であり；
Ｌ６は、アセタール単位とＲ６との間のリンカーであり、ここで、Ｒ６はポリヌクレオチドであり；
ｎ、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６はそれぞれ、０から１の間の範囲である対応するポリマー単位のモル分率であり；ｎ＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＋ｎ５＋ｎ６＝１であるが；但し、ｎもｎ６も０ではないことを条件とする］。
【０１１９】
式（ＩＶ）の修飾ポリマーにおいて、サブ単位は、任意の順序（即ち、規則的か、ランダムか、または統計学的な分布）でポリマー主鎖に沿って分布していてよく、全てのサブ単位が必要ということではない。
【０１２０】
式（ＩＶ）の修飾ポリマーに使用されるポリマー主鎖は、約１０ｋＤａから約２５０ｋＤａまたは約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約１００ｋＤａまたは約２５０ｋＤａの分子量を有してよい。他の実施形態では、ポリマー主鎖は、約７０ｋＤａの分子量を有する。また他の実施形態では、ポリマー主鎖は、約３５ｋＤａの分子量を有する。
【０１２１】
本明細書で提供される修飾ポリマーは水溶性で、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１．０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの水溶性を有する。
【０１２２】
本明細書で提供される修飾ポリマーによって、結合させたポリヌクレオチドなどの結合させた治療薬のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は長くなる。例えば本明細書で提供される一部の修飾ポリマーによって、結合させた治療薬のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、修飾ポリマーに結合されていない治療薬のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期に対して１０倍、１００倍または１０００倍長くなる。
【０１２３】
本明細書で提供されるある種の実施形態では、治療薬を修飾ポリマーに結合させて投与すると、遊離な形態で投与された場合のその生体内分布に比べて、治療薬の生体内分布が変わる。例えば標的組織が腫瘍である場合、修飾ポリマーに結合させて投与された治療薬での腫瘍／肝臓比は、遊離な形態で投与された治療薬の腫瘍／肝臓比に対して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍高くなり得る。
【０１２４】
官能基
ポリマー主鎖上の付加官能基には、ポリヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ、さらに、例えばターゲティング基、電荷変更基、疎水基、陽イオン性基、細胞への取り込みを容易にする基、エンドソームからの放出を容易にする基およびポリヌクレオチド分解を遅くする基が包含されるポリマーに機能性を与える基が包含される。官能基を、化学的に例えば陽イオン性、疎水性であるか；機能性で例えばターゲティング性、電荷変更性であるか；またはそれらの組合せであると定義することができる。
【０１２５】
相互作用修飾因子
ポリヌクレオチド以外の官能基はまとめて、相互作用修飾因子と称することができる。相互作用修飾因子を含有しない同じ分子に対して、相互作用修飾因子は、分子がそれ自体または他の分子と相互作用する方法を変化させる。この修飾の結果は、自己相互作用または他の分子との相互作用を上昇させるか、または低下させるかのいずれかである。下記の検討では、相互作用は、理論化された機能（例えば「ターゲティング基」）か、説明（例えば「陽イオン性基」）か、またはそれらの組合せによって分類されると理解されたい。しかしながら、そのような分類は単に便宜のためであって、単一の基が１つまたは複数のカテゴリーに当てはまることもあり、例えば一部の状況における陽イオン性基がまた、ターゲティング基として機能することも示され得ると理解されたい。したがって、基の１つの種類としての化学的部分の分類は、その部分が他の機能または特性を有しないことを暗示しているのではない。
【０１２６】
リンカーＬ１−Ｌ６
付加基を、直接か、またはリンカーを介して足場に結合させる。リンカーは、ポリマー主鎖に、かつ相互作用修飾因子またはポリヌクレオチドに共有結合している結合体である。付加基を結合させることに加えて、リンカーは、ポリマー主鎖と付加基との間の距離を長くする手段を提供するか、付加基のより良好な提示または配向を提供するか、または付加基を特に他の付加基、ポリマー主鎖自体または修飾ポリマーの環境中の薬剤から遮蔽するように機能し得る。リンカーは、中性または荷電、親水性または疎水性であってよく、かつ場合によって、１種または複数の不安定な結合を包含してよい。
【０１２７】
例示的なリンカーには、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１２アリールアルキル、Ｃ６〜Ｃ１２アリールアルケニル、Ｃ６〜Ｃ１２アリールアルキニル、エステル、エーテル、ケトン、アルコール、ポリオール、アミド、アミン、ポリグリコール、ポリエーテル、ポリアミン、チオール、チオエーテル、チオエステル、リン含有リンカーおよび複素環式リンカーが包含される。
【０１２８】
一実施形態では、リンカーは不安定な結合を含む。不安定な結合は、選択的に破断され得る共有結合である、即ち、他の共有結合の存在下で他の共有結合を破断することなく、不安定な結合は破断することができる。不安定な結合は、ｐＨ、酸化もしくは還元条件または薬剤、温度、塩濃度、酵素（ヌクレアーゼおよびプロテアーゼを包含するエステラーゼなど）の存在または加えられた薬剤の存在に対して感受性があり得る。例えば分子中に同じく存在し得る炭素−炭素、炭素−酸素、炭素−硫黄、炭素−窒素結合などの他の結合をいずれも切断することなく、チオールの存在下で、ジスルフィド結合を破断することができる。不安定性とはまた、切断可能なことを意味する。したがって、不安定性リンカーは、不安定な結合を含有し、ポリマー足場と付加基との間などの２つの他の基の間に連結またはスペーサーをもたらすリンカーである。不安定性リンカー中の不安定な結合が破断されると、不安定性リンカーを介してポリマー足場に結合されている付加基が放出される。一実施形態では、酵素による切断反応によって、リンカーを切断することができる。この実施形態では、リンカーは、例えば核酸またはペプチドリンカーである。例えばリンカーは、プロテアーゼ反応性またはプロテアーゼ特異的配列を含有してよい。例には、エキソ−およびエンドペプチダーゼ、細胞外金属プロテアーゼ、カテプシン（カテプシンＢ）、ＨＩＶプロテアーゼなどのリソソームプロテアーゼ、さらに、セクレターゼ、転移酵素、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、オキシドレダクターゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、ホスホリパーゼ、エンドヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼおよびβ−ラクタマーゼの認識モチーフが包含される。
【０１２９】
一実施形態では、不安定性リンカーはｐＨ不安定性リンカーである。「ｐＨ不安定性」は、酸性条件（ｐＨ＜７）または塩基性条件（ｐＨ＞７）下での共有結合の選択的破断を指す。即ち、ｐＨ不安定な結合は、酸性または塩基性条件下で、他の共有結合の存在下でそれらの破断を伴うことなく破断される。置換マレイン酸無水物を使用して、ｐＨ不安定な結合を提供することができる。該当する化合物上のアミンと無水物との反応によって形成される共有結合は酸性ｐＨで容易に切断される。したがって、マレイン酸無水物誘導体をアミン含有化合物に可逆的に結合させることができる。他の実施形態では、不安定な結合を酸化または還元条件下で切断する。例えば２個のアルキルチオールから構成されるジスルフィドをチオールまたは還元剤の存在下で、炭素−炭素結合を切断することなく、還元によって破断することができる。この例では、炭素−炭素結合は、還元条件に対して不安定ではない。他の実施形態では、不安定な結合は、生理学的条件下または酵素によって切断される。例えばエステル結合は、約４から約８のｐＨ範囲で切断され得るか、またはエステラーゼ酵素によって切断され得る。
【０１３０】
一実施形態では、リンカーは、付加基Ｒなどの、他の化合物とイオン結合または共有結合のいずれかを形成し得る反応性基を含む。反応性基の例には、求核体および求電子体が包含される。共有結合を形成する反応性基には、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、酸ハライド、Ｏ−アシル尿素、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミドエステル、チオエステル、アミド、尿素、スルホニルクロリド、アルデヒド、ケトン、エーテル、エポキシド、カルボネート、アルキルハライド、イミドエステル、カルボキシレート、アルキルホスフェート、アリールハライド（例えばジフルオロ−ジニトロベンゼン）および無水物が包含される。
【０１３１】
一実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の修飾ポリマーを記載する：
【０１３２】
【化２４】
2013528665.tif 000026
［式中、
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５およびＷ６はそれぞれ独立に、共有結合またはポリアセタール主鎖に連結している−Ｃ（Ｏ）を有する−Ｃ（Ｏ）−Ｙ−であり；
Ｙは、−［Ｃ（Ｒ９Ｒ１０）］ａ−または−［Ｃ（Ｒ９Ｒ１０）］ａ−Ｘ１−［Ｃ（Ｒ９Ｒ１０）］ｂ−であり；
Ｘ１は、酸素原子、硫黄原子または−ＮＲ１１であり；
Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、５員から１２員のヘテロアリールまたはＣ３〜８シクロアルキルであり；
Ｒ１１は、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、５員から１２員のヘテロアリール、Ｃ３〜８シクロアルキルまたは−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜３アルキルであり；
Ｚ９は、Ｚ６−Ｔ１またはＺ８であり；
Ｔ１は、−Ｚ７−Ｒ６であり；
Ｚ８は、１個または複数の−Ｚ７−Ｒ６で置換されていて、かつ−Ｑ−Ｒ１、−Ｑ−Ｒ３、−Ｑ−Ｒ４および−Ｑ−Ｒ５からなる群から選択される１個または複数の置換基で置換されていてもよい直鎖または分岐ポリアミノ部分であり；
Ｑはそれぞれ独立に、共有結合または−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６はそれぞれ独立に、共有結合、−ＮＲ１７または−ＮＲ１７Ｒ１８−であり、ここで、Ｒ１７およびＲ１８はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ２〜８アルキルまたは−Ｃ２〜１０アルキル−Ｎ（Ｒｘ）−であり、Ｒｘは、Ｈまたはアミノ酸のカルボニル基を介して窒素に結合しているアミノ酸であるか；またはＲ１７およびＲ１８はそれらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される０または１個の追加のヘテロ原子を含有する４員から７員のヘテロシクロアルキル環を形成しており；
Ｚ７はそれぞれ独立に、Ｔ３がＲ６に連結している−Ｃ（Ｏ）−Ｔ２−Ｔ３−または−Ｎ（Ｒ’）−Ｔ２−Ｔ３−であり、ここで、Ｒ’はＨまたはＣ１〜６アルキルであり、Ｔ２は、アルキルチオアリール、アリールチオアルキル、アルキルチオアルキル、アリールチオアリール、アルキルジチオアリール、アリールジチオアルキル、アルキルジチオアルキルおよびアリールジチオアリールから選択され、Ｔ３は、共有結合、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）−Ｃ１〜８アルキル、−Ｎ（Ｒ”）Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜８アルキルまたはＣ１〜８アルキルであり、ここで、Ｒ”は、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；
ａおよびｂはそれぞれ独立に、両端を含む１から６の間の整数であり；
ｎ、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６はそれぞれ、０から１の間の範囲である対応するポリアセタール単位のモル分率であり；ｎ＋ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＋ｎ５＋ｎ６＝１であるが；但し、ｎもｎ６も０ではないことを条件とし；
Ｒ１は、選択された組織、病原体、細胞または細胞位置のためのターゲティング基であり；
Ｒ２は、−Ｑ−Ｒ１、−Ｑ−Ｒ３、−Ｑ−Ｒ４および−Ｑ−Ｒ５からなる群から選択される１個または複数の置換基で置換されていてもよい電荷基であり；
Ｒ３は、電荷変更基であり；
Ｒ４は、疎水基であり；
Ｒ５は、保護基であり；
Ｒ６は、ポリヌクレオチドであり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ１の数の比（ｍ１）は、０から０．２５であり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ３の数の比（ｍ３）は、０から１００であり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ４の数の比（ｍ４）は、０から３０であり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ５の数の比（ｍ５）は、０から０．０３であり；
前記ポリアセタールのポリアセタール単位の総数に対するＲ６の数の比（ｍ６）は、０．０００４から０．１０であり；
前記ポリアセタール主鎖は、約１０ｋＤａから約２５０ｋＤａの分子量を有する］。
【０１３３】
例えばＹは、−（ＣＨ２）２−または−（ＣＨ２）３−である。
【０１３４】
例えば、Ｔ２は、−Ｃ１〜８アルキルチオ−Ｃ６〜１０アリール、−Ｃ６〜１０アリールチオ−Ｃ１〜８アルキル、−Ｃ１〜８アルキルチオ−Ｃ１〜８アルキル、−Ｃ６〜１０アリールチオ−Ｃ６〜１０アリール、−Ｃ１〜８アルキルジチオ−Ｃ６〜１０アリール、−Ｃ６〜１０アリールジチオ−Ｃ１〜８アルキル、−Ｃ１〜８アルキルジチオ−Ｃ１〜８アルキルまたは−Ｃ６〜１０アリールジチオ−Ｃ６〜１０アリールである。
【０１３５】
例えば、ｍ１は０．００２から０．２５である。
【０１３６】
例えば、ｍ３は０．００２から１００である。
【０１３７】
例えば、ｍ４は０．０３から０．３０である。
【０１３８】
例えば、ｍ５は０．０１から０．０３である。
【０１３９】
例えば、Ｚ９がＺ６−Ｔ１である場合、
（ｉ）ｎ１は０ではなく、かつｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｉｉ）ｎ１もｎ２も０ではなく、かつｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｉｉｉ）ｎ１、ｎ２およびｎ３のいずれも０ではなく、かつｎ４およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｉｖ）ｎ１、ｎ２およびｎ４のいずれも０ではなく、かつｎ３およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｖ）ｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４のいずれも０ではなく、かつｎ５は０であるか；
（ｖｉ）ｎ１もｎ４も０ではなく、かつｎ２、ｎ３およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｖｉｉ）ｎ２が０ではなく、かつｎ１、ｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｖｉｉｉ）ｎ２もｎ３も０ではなく、かつｎ１、ｎ４およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｉｘ）ｎ２もｎ４も０ではなく、ｎ１、ｎ３およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｘ）ｎ２、ｎ３およびｎ４のいずれも０ではなく、ｎ１およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｘｉ）ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５のいずれも０ではないか；または
（ｘｉｉ）ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ０である。
【０１４０】
例えばＺ９がＺ６−Ｔ１である場合：
（ｉ）ｎ２は０ではなく、ｎ１、ｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｉｉ）ｎ１、ｎ２およびｎ４のいずれも０ではなく、ｎ３およびｎ５はそれぞれ０であるか；
（ｉｉｉ）ｎ１、ｎ２、ｎ３およびｎ４のいずれも０ではなく、ｎ５は０である。
【０１４１】
例えばＺ９がＺ６−Ｔ１である場合、
ｎは、両端を含む約０．０１から約０．９９９６の間（例えば、両端を含む約０．１０から約０．８０の間；両端を含む約０．３０から０．４５の間；両端を含む約０．３０から０．４０の間；両端を含む約０．４５から０．９７の間；両端を含む約０．５１から０．９５の間；両端を含む約０．６５から０．９９８の間；両端を含む約０．７２から０．９９８の間；両端を含む約０．９２から０．９９９６の間または両端を含む約０．９９８から０．９９９４の間）であり；
ｎ１は、両端を含む約０．００２から約０．２５の間であり；
ｎ２は、両端を含む約０．０２から約０．９０の間（例えば、両端を含む約０．０２から約０．８１の間；両端を含む約０．１６から約０．４９の間；両端を含む約０．１６から約０．９０の間または両端を含む約０．５５から約０．７０の間）であり；
ｎ３は、両端を含む約０．０２から約０．８１の間（例えば、両端を含む約０．１６から約０．４９の間）であり；
ｎ４は、両端を含む約０．０３から約０．３０の間（例えば、両端を含む約０．０５から約０．１５の間）であり；
ｎ５は、両端を含む約０．０１から約０．０３の間（例えば約０．０２）であり；
ｎ６は、両端を含む約０．０００４から約０．１０の間（例えば両端を含む約０．０００６から約０．００２の間）である。
【０１４２】
例えば、Ｚ９がＺ８である場合、ｎ１、ｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ０であり、Ｒ２は、−Ｑ−Ｒ１、−Ｑ−Ｒ３、−Ｑ−Ｒ４および−Ｑ−Ｒ５からなる群から選択される１個または複数の置換基で置換されていてもよい線状または分岐ポリアミノ部分である。
【０１４３】
例えば、−Ｑ−Ｒ１、−Ｑ−Ｒ３、−Ｑ−Ｒ４および−Ｑ−Ｒ５はそれぞれ、Ｒ２のＮ原子に結合している。
【０１４４】
例えば、−Ｚ７−Ｒ６、−Ｑ−Ｒ１、−Ｑ−Ｒ３、−Ｑ−Ｒ４および−Ｑ−Ｒ５はそれぞれ、Ｚ８のＮ原子に結合している。
【０１４５】
例えば、Ｚ９がＺ８である場合、
（ｉ）ｍ１は０ではなく、かつｍ３、ｍ４およびｍ５はそれぞれ０であるか；
（ｉｉ）ｍ１もｍ４も０ではなく、かつｍ３およびｍ５はそれぞれ０であるか；
（ｉｉｉ）ｍ１、ｍ４およびｍ５のいずれも０ではなく、かつｍ３は０であるか；
（ｉｖ）ｍ１もｍ３も０ではなく、かつｍ４およびｍ５はそれぞれ０であるか；
（ｖ）ｍ１、ｍ３およびｍ４のいずれも０ではなく、かつｍ５は０であるか；または
（ｖｉ）ｍ１、ｍ３、ｍ４およびｍ５のいずれも０ではない。
【０１４６】
例えば、Ｚ９がＺ８である場合、
ｎは、両端を含む約０．７０から約０．９９の間（例えば両端を含む約０．８０から約０．９９の間または両端を含む約０．９２から約０．９８の間）であり；
ｎ２＋ｎ６は、両端を含む約０．１０から約０．３０の間（例えば両端を含む約０．１０から約０．２０の間または両端を含む約０．０２から約０．０８の間）であり；
ｎ１、ｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ０であり；
ｍ１は０．００２から０．２５であり；
ｍ３は０．００２から１００であり；
ｍ４は０．０３から０．３０であり；
ｍ５は０．０１から０．０３であり；
ｍ６は０．０００４から０．１０である。
【０１４７】
例えば、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６はそれぞれ独立に、エチレンジアミン、ピペラジン、ビス（ピペリジン）、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン（即ち、プトレシン）、デカメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、カダベリン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、アグマチンまたはオルニチンであってよい。
【０１４８】
例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＴ１はそれぞれ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６のＮ原子にそれぞれ結合しており、そのＮ原子は、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５またはＺ６がポリアセタール主鎖にそれを介して結合しているアミド部分のＮ原子ではない。
【０１４９】
例えば、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６はそれぞれ、
【０１５０】
【化２５】
2013528665.tif 000027
である。
【０１５１】
例えばＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６がそれぞれ独立に、エチレンジアミンである場合、修飾アセタール単位は、式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）によって表される：
【０１５２】
【化２６】
2013528665.tif 000028
式（ＶＩＩ）では、エチレンジアミン部分は、エチレンジアミン部分の窒素原子を通じてのカルバメート結合を介して、アセタール単位のヒドロキシル基に直接連結しており；式（ＶＩＩＩ）では、エチレンジアミン部分は、一方のカルボン酸基がアミド結合を介してエチレンジアミン部分の窒素原子に連結していて、他方のカルボン酸基がエステル結合を介してアセタール単位のヒドロキシル基に連結しているジカルボン酸化合物を介して、アセタール単位のヒドロキシル基に間接的に連結している。
【０１５３】
例えば、Ｚ７は
【０１５４】
【化２７】
2013528665.tif 000029
［式中、−Ｃ（Ｏ）または−ＮＨは、ポリアセタール主鎖へと配向されている］
である。
【０１５５】
例えば、Ｚ７は
【０１５６】
【化２８】
2013528665.tif 000030
［式中、−Ｃ（Ｏ）は、ポリアセタール主鎖へと配向されている］
である。
【０１５７】
例えば、Ｚ８は、他に置換基がなければ、
【０１５８】
【化２９】
2013528665.tif 000031
または
（９）ポリ−Ｌ−リシン、ポリ（プロピレンイミン）およびポリ（アミドアミン）デンドリマーから選択される第２〜１０世代のいずれかのデンドリマーであり；
上式中、
Ｒｙは、アミノ酸または線状もしくは分岐ポリアミノ部分のカルボニル基を介して窒素に結合しているアミノ酸であり；
Ｒｚは、Ｈまたは線状もしくは分岐ポリアミノ部分であり；
ｃは、両端を含む２から６００の間の整数であり；
ｄは、両端を含む０から６００の間の整数であり；
ｅは、両端を含む１から１５０の間の整数であり；
ｄ２は、両端を含む２から２０の間の整数であり；
ｄ３は、両端を含む２から２００の間の整数である。
【０１５９】
例えばＺ８は、他に置換基がなければ、（１）約５００から約２５０００ダルトン（例えば約５００から約５０００ダルトン；または約５００から約２５００ダルトン）の分子量を有する線状ポリエチレンイミン；（２）約５００から約２５０００ダルトン（例えば約５００から約１５００ダルトンまたは約５００から約１２００ダルトンまたは約５００から約８００ダルトン）の分子量を有する分岐ポリエチレンイミン；
【０１６０】
【化３０】
2013528665.tif 000032
である。
【０１６１】
例えばＲｙおよびＲｚはそれぞれ独立に、−［Ｃ２〜６アルキル−ＮＨ］−のモノマー単位を含むポリアミノ部分である。
【０１６２】
例えばＺ８は、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、線状ポリエチレンイミン、分岐ポリエチレンイミン、スペルミン、スペルミジン、ノルスペルミジン、ポリリシン、ポリアルギニンまたはアミノを含有するデンドリマーである。
【０１６３】
例えば非置換Ｚ８が線状または分岐ポリエチレンイミンである場合、修飾アセタール単位は、式（ＩＸ）または（Ｘ）によって表される：
【０１６４】
【化３１】
2013528665.tif 000033
式（ＩＸ）では、線状または分岐ポリエチレンイミン部分は、エチレンジアミン、線状または分岐ポリエチレンイミン部分の窒素原子を通じてのカルバメート結合を介して、アセタール単位のヒドロキシル基に直接連結している一方で、式（Ｘ）では、線状または分岐ポリエチレンイミン部分は、一方のカルボン酸基はアミド結合を介して線状または分岐ポリエチレンイミン部分の窒素原子に連結していて、他方のカルボン酸基は、エステル結合を介してアセタール単位のヒドロキシル基に連結しているジカルボン酸化合物を介して、アセタール単位のヒドロキシル基に間接的に連結しており；かつＲｚおよびｃは本明細書で定義されるとおりである。
【０１６５】
ターゲティング基Ｒ１
ターゲティング基Ｒ１は、修飾ポリマーを特異的な組織、細胞または細胞中の位置へと向かわせる。一実施形態では、標的に達するターゲティング基含有修飾ポリマーの、何らターゲティング基を有さない修飾ポリマーに対する比は、１を超える。他の実施形態では、ターゲティング基は、ターゲティング基不含修飾ポリマーの標的組織比よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍高い標的組織比をターゲティング基含有修飾ポリマーに与える。他の実施形態では、ターゲティング基は、ターゲティング基不含修飾ポリマーの標的組織／肝臓比よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍高い標的組織／肝臓比をターゲティング基含有修飾ポリマーに与え、逆もまた同様である。
【０１６６】
ターゲティング基は、標的である培養物に、または生体全体に、またはそれら両方に修飾ポリマーを向かわせることができる。いずれの場合も、ターゲティング基は、標的とされた細胞（複数可）の細胞表面に存在するリガンドを有し、それに、有効な特異性、親和性および結合活性で結合する。一部の実施形態では、ターゲティング基は、標的である肝臓以外の組織に修飾ポリマーを差し向ける。他の実施形態では、ターゲティング基は、標的である肝臓、腎臓、肺または膵臓などの特異的な組織に修飾ポリマーを差し向ける。ターゲティング基は、標的である癌細胞など標的細胞、癌細胞などの細胞で発現される受容体、マトリックス組織または腫瘍抗原などの癌に関連するタンパク質などに修飾ポリマーを差し向けることができる。別法では、腫瘍血管系を含む細胞を標的とすることができる。クッパー細胞とは対照的に肝臓中の肝細胞への特異的ターゲティングなど、ターゲティング基は特異的な種類の細胞にポリマーを向かわせることができる。他の場合には、ターゲティング基はポリマーを、網様内皮もしくはリンパ系の細胞に、またはマクロファージもしくは好酸球などの専門の食細胞に向かわせることができる。（そのような場合、ポリマー自体もまた、特異的ターゲティングを必要としない有効な送達系であることがある）。
【０１６７】
さらに他の実施形態では、ターゲティング基は、標的である、例えば核、細胞質またはエンドソームなどの細胞内のある位置に修飾ポリマーを差し向ける。具体的な実施形態では、ターゲティング基は、受容体への細胞結合または核への細胞質輸送および核進入またはエンドソームもしくは他の細胞内ベシクルからの放出を増大させ得る。
【０１６８】
ターゲティング基は、タンパク質、ペプチド、脂質、ステロイド、糖、炭水化物、ポリヌクレオチド、抗体または合成化合物であってよい。例示的なターゲティング基には、細胞表面分子に対して親和性を有する基、さらに、細胞表面分子に対して親和性を有する細胞受容体リガンド（天然に生じるか、または合成）、抗体、抗体断片および抗体模倣物質が包含される。
【０１６９】
一実施形態では、ターゲティング基は、細胞受容体リガンドを含む。標的である細胞および特異的な細胞受容体に薬物および遺伝子を差し向けるために、様々なリガンドが使用されている。細胞受容体リガンドには、例えば炭水化物、グリカン、糖（これらに限られないが：ガラクトース、ガラクトース誘導体、マンノースおよびマンノース誘導体が包含される）、ビタミン、葉酸塩、ビオチン、アプタマーおよびペプチド（これらに限られないが：ＲＧＤ−含有ペプチド、インスリン、ＥＧＦおよびトランスフェリンが包含される）が包含される。ターゲティング基の例には、アシアロ糖タンパク質またはガラクトース残基を使用することによって標的であるアシアロ糖タンパク質受容体に差し向けるものが包含される。例えば肝細胞は、ＡＳＧＰ受容体を含有する。したがって、ガラクトース含有ターゲティング基は、肝細胞を標的とするために使用することができる。ガラクトース含有ターゲティング基には、これらに限られないが：ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、オリゴ糖および糖クラスター（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−（アミノヘキシルＧａｌＮＡｃ）３、リシンベースのガラストースクラスターおよびコランベースのガラクトースクラスターなど）が包含される。さらに適切なコンジュゲートには、アシアロ糖タンパク質−受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）に見出される炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）に結合し得るオリゴ糖が包含され得る。オリゴ糖および／または炭水化物複合体を含有するコンジュゲート部分の例は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，５２５，０３１号に示されている。
【０１７０】
他の実施形態では、特異的リガンドを使用して、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を標的とする。ＧＰＣＲは、細胞表面で発現される膜貫通受容体であり、多くの場合に、組織特異的または制限的に発現される。幅広い多様なＧＰＣＲリガンドが公知であり、天然に生じる分子および合成分子の両方を多数含む。ＧＰＣＲリガンドは、その同族受容体に高い親和性で特異的に結合し、結合すると、結合された受容体のシグナル伝達を活性化（アゴナイズ）または不活性化（アンタゴナイズ）し得る。他の場合には、リガンドは、シグナル自体の活性化または不活性化を媒介しなくてもよいが、特異的なＧＰＣＲと結合することによって、天然に生じるか、またはそれ以外の他のリガンドと拮抗し、かつ／またはそれに置き換わる。しかしながらいずれの場合も、ＧＰＣＲと同族リガンドとの会合は、リガンドの由来またはＧＰＣＲのシグナル伝達活性における固有の作用とは関わらず、指定されている臓器または組織を標的とする際に利用することができる高度に特異的な結合事象を表す。このように、ＧＰＣＲ特異的リガンドを、対応する同族ＧＰＣＲを発現する細胞にその薬剤が送達されるような送達が望まれている薬剤に結合させることによって、ターゲティングを達成する。
【０１７１】
抗体は、ターゲティングに有用な他の群の分子を表す。「抗体」という用語は本明細書で使用される場合、抗原上の特異的エピトープに特異的に結合し得る免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであってよく、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性の部分であってよい。抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体（「細胞内抗体」）、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、さらに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ラクダ抗体およびヒト化抗体を包含する様々な形態で存在してよい。
【０１７２】
一実施形態では、抗体は、腫瘍細胞などの細胞上の受容体に結合する。腫瘍関連抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、標的である腫瘍に、毒素、放射性ヌクレオチドおよび化学療法用コンジュゲートを差し向ける試みにおいて使用されている。今日までに、腫瘍細胞に対して細胞溶解活性を誘発する様々なモノクローナル抗体が開発されている。腫瘍細胞上に存在する抗原と特異的に相互作用する追加の抗体またはリガンドが発見されている。例えばＰ１８５の細胞外ドメイン、成長因子受容体（ＨＥＲ２）に対して向けられるモノクローナル抗体ＭｕＭＡｂ４Ｄ５のヒト化バージョンは、ヒト乳癌を治療するために使用されている。他の実施形態では、細胞はＢリンパ球であり、その抗体は、細胞受容体であるＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ３９、ＣＤ４０またはこれらの受容体に対するリガンドに対するものであってよい。
【０１７３】
抗体を、細胞特異的抗原、特異的細胞型で発現される受容体に対して、または病原体に感染した細胞によって特異的に発現される抗原に対して向かわせることができる。後者の場合には、そのような抗原にはまた、感染因子によってコードまたは発現されるものが包含されるであろう。
【０１７４】
他の実施形態では、ターゲティング基はアプタマーである。アプタマーは、特異的標的分子に結合する核酸またはペプチド分子である。大きくランダムな配列プールからそれらを選択することによって、アプタマーを決定することができる。核酸アプタマーは、小分子、タンパク質、核酸およびさらに細胞、組織および生体などの様々な分子標的に結合させるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択または同等に、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）の繰り返しラウンドを介して操作されている核酸種である。核酸アプタマーは、ワトソン−クリック型塩基対および非ワトソン−クリック型塩基対を包含する相互作用を介して、分子への特異的結合親和性を有する。ペプチドアプタマーは、細胞内での他のタンパク質相互作用に干渉するように設計されているタンパク質である。これらは、タンパク質足場に両末端で結合している可変性ペプチドループからなる。この二重の構造的制約によって、ペプチドアプタマーの結合親和性は、抗体に比較し得るレベルまで大きく高められる（ナノモル範囲）。ペプチドアプタマーは、酵母ツーハイブリッドシステムなどの種々のシステムを使用して選択することができる。
【０１７５】
一実施形態では、ターゲティング基は、ウイルス形質導入ドメインなどの形質導入ドメインである。本明細書で使用される場合、形質導入ドメインはそれ自体および結合分子を、膜を貫通して輸送する。これらの形質導入シグナルの例は、ＨＩＶからのＴａｔおよび単純ヘルペスウイルスからのＶＰ２２ならびにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ、ＡＮＴＰからの転写因子などのウイルスコートタンパク質に由来する。加えて、正味総陽イオン電荷以外に相同性を有さない合成ペプチドのレポートもまた形質導入活性を有することが示されている。
【０１７６】
他のターゲティング基を使用して、細胞のある種の部分へのポリヌクレオチドの送達を増やすことができる。例えばターゲティング基を使用して、エンドソームを破壊することができ、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を使用して、核を標的とすることができる。様々なリガンドを使用して、標的である細胞および特異的細胞受容体に薬物および遺伝子を差し向けることができる。リガンドは、標的を細胞膜内に、細胞膜上に、または細胞付近に捜し求めることができる。受容体へのリガンドの結合は典型的には、細胞内取り込み作用を起動する。細胞内取り込みされない受容体に結合するリガンドも、ポリヌクレオチド送達のために使用することができるであろう。例えば、インテグリン受容体に結合するＲＧＤペプチド配列を含有するペプチドを使用することができるであろう。加えて、ウイルスタンパク質を使用して、複合体を細胞に結合させることができるであろう。脂質およびステロイドを使用して、複合体を細胞膜に直接挿入することができるであろう。ポリマーはまた、切断可能な基をそれ自体の内部に含有してよい。ターゲティング基に結合されている場合、切断によって、複合体とターゲティング基の受容体との間の相互作用が低下する。切断可能な基には、これらに制限されないが、ジスルフィド結合、ジオール、ジアゾ結合、エステル結合、スルホン結合、アセタール、ケタール、エノールエーテル、エノールエステル、エナミンおよびイミン、アシルヒドラゾンおよびシッフ塩基が包含される。
【０１７７】
核局在化ターゲティング基は、核付近への遺伝子のターゲティングおよび／または核へのその進入を増大させる。そのような核輸送シグナルは、ＳＶ４０の大きなＴ抗原ＮＬＳまたはヌクレオプラスミンＮＬＳなどのタンパク質またはペプチドであってよい。これらの核局在化シグナルは、ＮＬＳ受容体（カリオフェリンアルファ）などの様々な核輸送因子と相互作用し、ＮＬＳ受容体（カリオフェリンアルファ）は次いで、カリオフェリンベータと相互作用する。核輸送タンパク質自体も、ＮＬＳとして機能し得るであろうが、それというのも、それらは、標的である核膜孔および核に差し向けられているためである。
【０１７８】
細胞内区画からの放出を増大させるターゲティング基（放出性ターゲティング基）は、エンドソーム（初期および後期）、リソソーム、ファゴソーム、ベシクル、小胞体、ゴルジ体、トランスゴルジ網（ＴＧＮ）および筋小胞体などの細胞内区画からのポリヌクレオチド放出をもたらし得る。放出には、細胞内区画から細胞質へ、または核などのオルガネラへの移動が包含される。放出シグナルには、クロロキン、バフィロマイシンまたはブレフェルジンＡｌなどの化学物質およびＥＲ保持シグナル（ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）サブユニットＨＡ−２ペプチドおよび他の種類の両親媒性ペプチドなどのウイルス成分が包含される。細胞受容体シグナルは、修飾ポリマーと細胞との会合を増大させるシグナルである。これは、修飾ポリマーと細胞表面との結合および／または細胞内区画とのその会合を増やすことによって、例えば：細胞表面への結合を増大させることによって細胞内取り込み作用を増大させるリガンドによって達成され得る。これには、アシアロ糖タンパク質またはガラクトース残基を使用することによって、アシアロ糖タンパク質受容体を標的とする薬剤が包含される。インスリン、ＥＧＦまたはトランスフェリンなどの他のタンパク質をターゲティングのために使用することができる。細胞上のスルフヒドリルまたはジスルフィド基と反応する化学基もまた、多くの種類の細胞を標的とするために使用することができる。葉酸塩および他のビタミンもまた、ターゲティングのために使用することができる。加えてウイルスタンパク質を、細胞に結合するために使用することができるであろう。
【０１７９】
レポーターまたはマーカー分子は、容易に検出することができる化合物である。典型的にはこれらは、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ｃｙ５、ｃｙ３またはダンシル化合物などの蛍光化合物である。これらは、ＵＶもしくは可視分光法によって、抗体相互作用によって、または電子スピン共鳴によって検出することができる分子であってよい。ビオチンは、標識アビジンによって検出することができる他のレポーター分子である。ビオチンもまた、ターゲティング基を結合するために使用することができるであろう。
【０１８０】
一実施形態では、１種を超えるターゲティング基Ｒ１を、１つの修飾ポリマー中で使用する。この実施形態では、ターゲティング基Ｒ１のそれぞれの種類を同じか、または異なる組成のリンカー基Ｌ１を介して、ポリマー主鎖に個別に結合させる。一実施形態では、ターゲティング基Ｒ１をそれぞれ、カルバメート結合を介してポリマー主鎖に直接連結させる。他の実施形態では、ターゲティング基Ｒ１をそれぞれリンカー基Ｌ１を介して、ポリマー主鎖に結合させる。
【０１８１】
他の実施形態では、ターゲティング基Ｒ１はそれぞれ、例えばガラクトース、ガラクトース誘導体、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、マンノース誘導体、−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−（アミノヘキシルＧａｌＮＡｃ）３、リシンベースのガラクトースクラスターおよびコランベースのガラクトースクラスターなどの糖；例えばビオチン、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＥ、ビタミンＡなどのビタミン；例えばインテグリンターゲティングペプチド（ＲＧＤペプチド）、ＬＨＲＨ受容体ターゲティングペプチド、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）受容体ターゲティングペプチド、前立腺特異的膜結合抗原（ＰＳＭＡ）ターゲティングペプチド、リポタンパク質受容体ＬＲＰ１ターゲティング、ＡｐｏＥタンパク質由来ペプチド、ＡｐｏＡタンパク質ペプチド、ソマトスタチン受容体ターゲティングペプチド、クロロトキシン由来ペプチド、ボンベシンなどのペプチドまたはペプチド模倣物質；例えばインスリン、トランスフェリン、フィブリノゲン−ガンマ断片、トロンボスポンジン、クローディン、アポリポタンパク質Ｅなどのタンパク質；例えばＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ３２６、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＧＦＲ１、ＥｐｈＡ２、５Ｔ４、ＴＲＰＶ１、ＣＦＴＲ、ｇｐＮＭＢ、ＣＡ９、Ｃｒｉｐｔｏ、ＡＣＥ、ＡＰＰ、アドレナリン作動性受容体−ベータ２、クローディン３、メソテリン、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−１３受容体、インテグリン（αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、α１β４、α４β１、α５β１、α６β４インテグリンを包含）などの細胞表面マーカーに特異的な抗体または抗体由来Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ｓｃＦｖまたはラクダ抗体Ｈ鎖断片；例えばＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ３２６、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＧＦＲ１、ＥｐｈＡ２、５Ｔ４、ＴＲＰＶ１、ＣＦＴＲ、ｇｐＮＭＢ、ＣＡ９、Ｃｒｉｐｔｏ、ＡＣＥ、ＡＰＰ、アドレナリン作動性受容体−ベータ２、クローディン３、メソテリン、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−１３受容体、インテグリン（αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、α１β４、α４β１、α５β１、α６β４インテグリンを包含）などの細胞表面マーカーに特異的なアプタマーを含む。
【０１８２】
また他の実施形態では、ターゲティング基Ｒ１はそれぞれ、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、葉酸、ＲＧＤペプチド、ＬＨＲＨ受容体ターゲティングペプチド、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）受容体ターゲティングペプチド、前立腺特異的膜結合抗原（ＰＳＭＡ）ターゲティングペプチド、リポタンパク質受容体ＬＲＰ１ターゲティング、ＡｐｏＥタンパク質由来ペプチドまたはトランスフェリンを含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、ターゲティング基Ｒ１は下式である：
【０１８４】
【化３２】
2013528665.tif 000034
【０１８５】
【化３３】
2013528665.tif 000035
［式中、
ｆは、両端を含む２から２４の間の整数であり；
ｇは、両端を含む１から５の間の整数であり；
Ｒ３は、電荷変更基である］。
【０１８６】
一実施形態では、ｆは、両端を含む２から１２の間の整数として選択される。他の実施形態では、ｆは、両端を含む２から６の間の整数として選択される。また他の実施形態では、ｆは２または３である。
【０１８７】
ターゲティング基Ｒ１を、直接、または多価リンカー基を介してＺ１に結合させることができる。ターゲティング基Ｒ１が多価リンカーを介してＺ１に連結している一実施形態では、Ｒ１および多価リンカーは一緒に、式（ＸＩ）によって表されるターゲティング基Ｒ１’とみなすことができる：
【０１８８】
【化３４】
2013528665.tif 000036
［式中、
ｄ４は、両端を含む０から１２０の間の整数であり；
Ｓｐａｃｅｒは、Ｓｐａｃｅｒの一番左の原子でＺ１に連結している−ＳＲ１９−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル−Ｓ−ＳＲ１９−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ１〜６アルキル−Ｓ−ＳＲ１９−Ｃ（Ｏ）−またはＮ（Ｈ）Ｒ１９−Ｃ（Ｏ）−であり、ここで、Ｒ１９は、１個または複数の炭素原子がＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）またはＣ（＝ＮＨ）で置き換えられていてもよいＣ１〜２０アルキルリンカーであるか、またはＲ１９は、ＰＥＧが約５００ｋＤａから約５０００ｋＤａの分子量を有するカルボニル活性化ＰＥＧ部分である］。
【０１８９】
例えば式（ＸＩ）のＲ１’は下式である：
【０１９０】
【化３５】
2013528665.tif 000037
【０１９１】
【化３６】
2013528665.tif 000038
【０１９２】
【化３７】
2013528665.tif 000039
【０１９３】
【化３８】
2013528665.tif 000040
［式中、
ｔはそれぞれ独立に、両端を含む３から１２の間の整数であり；かつ
Ｒｗは下式：
【０１９４】
【化３９】
2013528665.tif 000041
である］。
【０１９５】
ターゲティング基の種類および修飾ポリマーにおけるターゲティング基の量は、ターゲティング基が存在しない場合に供給されるであろうよりも多くの量の修飾ポリマーが所望の標的に供給されるように選択する。本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、ｎ１は０であってよい、即ち、ターゲティング基が組み込まれていないか、またはｎ１は、修飾ポリマーにおけるターゲティング基のモル分率に基づき、両端を含む約０．００２から約０．２５の間であってよい。
【０１９６】
電荷基Ｒ２：陽イオン性基、陰イオン性基および両性基
陽イオン性および／または陰イオン性基Ｒ２を、ポリマー主鎖に付加して、追加の電荷を導入するか、または修飾ポリマーに既に存在する電荷を中和することができる。したがって、これらの基を使用して、所望の実効電荷またはゼータ電位を有するポリマーを形成することができる。
【０１９７】
例示的な陽イオン性基には、リシン、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、１，３−ジアミノプロパン、ヘキサメチレンジアミン、テトラエチルメチレンジアミン、線状ポリエチレンイミン、分岐ポリエチレンイミン、スペルミン、スペルミジン、ノルスペルミジン、プトレシン、カダベリン、アグマチン、アルギニン、オルニチンまたは１−（３−アミノプロピル）イミダゾールが含まれる。
【０１９８】
例示的な陰イオン性基には、アスパルテート、グルタメート、シトレートおよびマレートが包含される。
【０１９９】
例示的な両性電解質には、グリシン、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、トリメチルグリシンヒドロキシド分子内塩（ベタイン）、アラニン、β−アラニン、バリン、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンおよびメチオニンなどの陰イオン性または陽イオン性アミノ酸以外のアミノ酸；グリシルグリシンなどのジペプチド；薬学的に許容されるスルホン酸またはタウリンなどのその誘導体；クレアチニンおよびエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）が包含される。
【０２００】
陽イオン性およびイオン性基をまた、他の目的で付加することができる。例えばポリカチオンは、ポリヌクレオチドと複合して、ヌクレアーゼ分解に対してポリヌクレオチドを保護し、標的細胞表面へのポリヌクレオチドの結合をもたらし得る多機能性付加基である。例示的なポリカチオンには、ポリリシンおよびポリアルギニンが包含される。
【０２０１】
具体的なポリアニオンは、ｐＨ依存性膜破壊をもたらし得るポリアクリル酸である。
【０２０２】
ポリ両性電解質は、同じポリマー中にポリカチオンおよびポリアニオンの両方を含有する共重合体電解質である。具体的なポリ両性電解質は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をポリメタクリル酸（ＰＥＩ−ｐＭＡＡ）およびポリグルタミン酸（ＰＥＩ−ｐＧｌｕ）と共に含む線状オリゴマーである。理論に束縛されることはないが、ｐＭＡＡは外殻として位置しており、血清タンパク質との複合体の相互作用を阻害することによって機能すると考えられる。ポリ両性電解質は、米国特許第７，０９８，０３０号に既に記載されており、ポリ両性電解質に関するその教示について３〜１４欄が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２０３】
一実施形態では、１種を超える電荷基Ｒ２を１つの修飾ポリマー中で使用することができる。この実施形態では、電荷基Ｒ２のそれぞれの種類を、同じか、または異なる組成のリンカー基Ｌ２を介して、ポリマー主鎖に個別に結合させる。基の種類および目的に依存するであろう所望の機能性をポリマーに供給するように、修飾ポリマーにおける陽イオン性基、陰イオン性基および両性基のそれぞれの種類および量を選択する。
【０２０４】
一実施形態では、Ｒ２は、例えばエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ピペラジン、ビス（ピペリジン）、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、テトラエチルメチレンジアミン、ペンタエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、線状ポリエチレンイミン、分岐ポリエチレンイミン、スペルミン、スペルミジン、ノルスペルミジン、カダベリン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、アグマチン、オルニチンおよび１−（３−アミノプロピル）イミダゾールなどのアミン含有部分である。
【０２０５】
一実施形態では、Ｒ２は出現するごとに独立に、
【０２０６】
【化４０】
2013528665.tif 000042
【０２０７】
【化４１】
2013528665.tif 000043
または
（１２）ポリ−Ｌ−リシン、ポリ（プロピレンイミン）およびポリ（アミドアミン）デンドリマーから選択される第２〜１０世代のいずれかのデンドリマー
である［式中、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｒｚ、ｃ、ｄ、ｅ、ｄ１、ｄ２およびｄ３は本明細書で定義されるとおりである］。
【０２０８】
一部の実施形態では、Ｒ２は出現するごとに独立に、
【０２０９】
【化４２】
2013528665.tif 000044
（７）約５００から約２５０００ダルトン；または約５００から約５０００ダルトン；または約５００から２５００ダルトンの分子量を有する線状ポリエチレンイミン；
（８）約５００から約２５０００ダルトン；または約５００から約１５００ダルトン；または約５００から約８００ダルトンの分子量を有する分岐ポリエチレンイミンである；
【０２１０】
【化４３】
2013528665.tif 000045
［式中、ｄおよびｅは本明細書で定義されるとおりである］。
【０２１１】
具体的な実施形態では、Ｒ２は、約５００から２５００ダルトンの分子量を有する線状ポリエチレンイミンまたは約５００から約８００ダルトンの分子量を有する分岐ポリエチレンイミンまたは
【０２１２】
【化４４】
2013528665.tif 000046
である。
【０２１３】
一実施形態では、Ｒ２はエチレンジアミンである。他の実施形態では、Ｒ２は線状または分岐ポリエチレンイミンである。また他の実施形態では、エチレンジアミンまたは線状もしくは分岐ポリエチレンイミンに直接連結している修飾アセタール単位は、それぞれ式（ＸＩＩ）および式（ＸＩＩＩ）によって表される：
【０２１４】
【化４５】
2013528665.tif 000047
［式中、
Ｒｚおよびｃは、本明細書で定義されるとおりであり；
エチレンジアミンまたはポリエチレンイミン部分は、エチレンジアミンまたはポリエチレンイミン部分の窒素原子を通じてのカルバメート結合を介して、アセタール単位のヒドロキシル基に直接連結している］。
【０２１５】
他の実施形態では、エチレンジアミンまたは線状もしくは分岐ポリエチレンイミンに連結している修飾アセタール単位は、それぞれ式（ＸＩＶ）および式（ＸＶ）によって表される：
【０２１６】
【化４６】
2013528665.tif 000048
［式中、
Ｒｚ、Ｙおよびｃは、本明細書で定義されるとおりであり；
エチレンジアミン、線状または分岐ポリエチレンイミンは、一方のカルボン酸基がアミド結合を介してエチレンジアミン、線状または分岐ポリエチレンイミンの窒素原子に連結していて、他方のカルボン酸基がエステル結合を介してアセタール単位のヒドロキシル基に連結しているジカルボン酸化合物を介して、アセタール単位のヒドロキシル基に間接的に連結している］。
【０２１７】
一実施形態では、ｎ２は０であってよい、即ち、電荷基が組み込まれていない。
【０２１８】
Ｚ９がＺ６−Ｔ１である他の実施形態では、ｎ２は、それぞれ修飾ポリマー中のＲ２のモル分率に基づき、両端を含む約０．０２から約０．９０の間；両端を含む約０．０２から約０．８１の間；両端を含む約０．１６から約０．４９の間；両端を含む約０．１６から約０．９０の間；または両端を含む約０．５５から約０．７０の間であってよい。例えばＲ２がエチレンジアミンである場合、ｎ２は、それぞれ修飾ポリマー中のエチレンジアミンのモル分率に基づき、両端を含む約０．０２から約０．９０の間；両端を含む約０．０２から約０．８１の間；両端を含む約０．１６から約０．４９の間；両端を含む約０．１６から約０．９０の間または両端を含む約０．５５および約０．７０の間である。
【０２１９】
Ｚ９がＺ８であり、Ｚ８およびＲ２がそれぞれポリアミノ部分（例えば線状または分岐ポリエチレンイミン）であるまた他の実施形態では、ｎ２＋ｎ６は、両端を含む約０．０１から約０．３０の間；両端を含む約０．０１０から約０．２０の間または両端を含む約０．０２から約０．０８の間である。この実施形態では、ｎ１、ｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ、０であってよい。
【０２２０】
電荷変更基Ｒ３
電荷変更基Ｒ３は、ポリマーの状態が変化したら、修飾ポリマーの電荷の変更をもたらすために使用される基である。例えば電荷変更基を付加すると、ｐＨが変化したらポリマーの全体電荷を減らすか、もしくは増やすか、または膜を貫通して輸送されたら、一方から他方へと修飾ポリマーの電荷を変化させることができる（即ち、負に荷電している分子から正に荷電している分子へと変化）。また、この基を使用して、追加の電荷を導入するか、または既に存在している電荷を中和することができる。したがって、電荷の変更を使用して、細胞外空間からエンドソーム／リソソームへの遷移など、ポリマーが一方の環境から他方の環境へと動く際に、所望の実効電荷またはゼータ電位を有するポリマーを形成することができる。
【０２２１】
また、電荷修飾因子を使用して、所望の環境に達するまで、特定の官能基をマスキングすることができる。
【０２２２】
電荷修飾因子は、ポリマー上の電荷基を中和するか、またはポリマーイオンの電荷を正から負に、もしくは負から正に逆転させることができる。ポリイオンの電荷変更によって、ポリイオンの電荷を減らすか、逆の電荷のポリイオンを形成するか、またはポリ両性電解質を形成することができる。また、電荷変更を使用して、所望の実効電荷密度を有するポリマーを形成することができる。
【０２２３】
例えば下記に示されているとおり、電荷変更基は、ポリマー上のアミンなどの部分と、化合物のカルボニル基のうちの１個との間に可逆性の共有結合を形成することによって、ポリマー種の電荷を変えることができる：
【０２２４】
【化４７】
2013528665.tif 000049
この例では、ポリマー種は、アミン官能基と電荷変更剤との反応の結果として、正から負への電荷変化を受けて、中性アミドおよび負に荷電しているカルボキシレートを生じる。
【０２２５】
電荷変更基Ｒ３の例には、これらに限られないが、式（ＸＶＩ）のものが包含される：
【０２２６】
【化４８】
2013528665.tif 000050
［式中、
Ｒ１２は、水素、Ｃ１〜５アルキルまたはＣ６〜１０アリールであり；
Ｒ１３は、水素、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ６〜１０アリール、−（ＣＨ２）ｇ−ＣＯ２Ｒ１４、−（ＣＨ２）ｇ−Ｃ（Ｏ）ＳＲ１４、−（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）Ｓ（ＣＨ２）ｇＣＯ２Ｒ１４または−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＨＲ１５であり；
Ｒ１４は、水素またはＣ１〜５アルキルであり；
Ｒ１５は、水素、Ｃ１〜５アルキル、Ｃ６〜１０アリール、アラルキル、アルキルジチオアリール、アリールジチオアルキル、アルキルジチオアルキル、アリールジチオアリール、−（ＣＨ２）ｇＣＨＯまたはＲ１であり；
ｇは、両端を含む１から５の間の整数であり；
ｑは、両端を含む０から５の整数であり；
【０２２７】
【化４９】
2013528665.tif 000051
は、単結合または二重結合である］。
【０２２８】
一部の実施形態では、式（ＸＶＩ）の電荷変更基は下式である
【０２２９】
【化５０】
2013528665.tif 000052
【０２３０】
【化５１】
2013528665.tif 000053
［式中、Ｒ１６は、水素またはＣ１〜２アルキルである］。
【０２３１】
ある種の実施形態では、電荷変更剤は、２−プロピオニック−３−メチルマレイン酸無水物、ＣＤＭ（即ち、式（ＸＶＩ）の化合物で、Ｒ１２はＣＨ３であり、Ｒ１３は−（ＣＨ２）２−ＣＯ２Ｈである）である。ＣＤＭを使用して、例えばＣＤＭ−チオエステル、ＣＤＭ−マスキング剤、ＣＤＭ−立体安定剤、ＣＤＭ−リガンド、ＣＤＭ−ＰＥＧまたはＣＤＭ−ガラクトースを形成することができる。したがって、電荷変更剤を使用して、ポリマー種の電荷を変えることができる一方で、これはまた、ターゲティング部分または疎水性部分などの他の部分をポリマーに連結させることができる連結部分として役立ち得る。例えばＰＥＧ部分が組み込まれている電荷変更基を使用して、ポリマー種の電荷を変え、また、ＰＥＧ部分を可逆的に組み込むことができる：
【０２３２】
【化５２】
2013528665.tif 000054
［式中、ｐ１は、両端を含む約１から約１０００の間の整数である］。
【０２３３】
具体的な実施形態では、電荷変更基Ｒ３は、下式を有する：
【０２３４】
【化５３】
2013528665.tif 000055
実施形態では、１種を超える電荷変更基Ｒ３を１つの修飾ポリマー中で使用することができる。この実施形態では、電荷変更基Ｒ３の種類をそれぞれ、同じか、または異なる組成のリンカー基Ｌ３を介して、ポリマー主鎖に個別に結合させる。基の種類および目的ならびに変更される電荷に依存するであろうが、所望の官能基をポリマーに提供するように、電荷変更基のそれぞれの種類および量を選択する。ポリマーがモノマー１個当たり１個を超える電荷基を含有する実施形態では、電荷変更基は、ポリマー鎖に沿って統計学的に分布する。
【０２３５】
一実施形態では、電荷変更基Ｒ３を、Ｚ３、Ｚ８またはＲ２のＮ原子に結合させる。
【０２３６】
一実施形態では、ｎ３は０であってよい、即ち、電荷変更基が、−Ｗ３−Ｃ（Ｏ）−Ｚ３−リンカーを介してポリマー主鎖に連結していない。
【０２３７】
Ｚ９がＺ６−Ｔ１である実施形態では、ｎ３は、両端を含む約０．０２から約０．８１の間または両端を含む約０．１６から約０．４９の間である。
【０２３８】
Ｚ９がＺ８であり、Ｚ８およびＲ２のそれぞれがポリアミノ部分（例えば線状または分岐ポリエチレンイミン）であるまた他の実施形態では、Ｒ３は、−Ｗ３−Ｃ（Ｏ）−Ｚ３−リンカー、Ｚ８および／またはＲ２を介してポリマー主鎖に連結していてよく、ｍ３は、０．００２〜１００である。この実施形態では、ｎ１、ｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ、０または０ではない値であってよい。
【０２３９】
疎水基Ｒ４
疎水基Ｒ４は、非水溶性であり、水素結合を形成しない傾向を有する。疎水基は、ポリマーのＨＬＢ（親水性−親油性バランス）を変更するように機能し得る。ある種の疎水基は細胞膜と相互作用して、修飾ポリマーの取り込みを改善し、かつ／または修飾ポリマーの生体内分布を変える。疎水基を使用して、修飾ポリマーによる水の浸透および／または取り込みを変更して、それによって、修飾ポリマーからの治療薬の放出速度を変更することができる。好ましい疎水基は、マイナスではないオクタノール／水分配係数を有し、より好ましくは疎水基は、１超、２超、またはより好ましくは３超のオクタノール／水分配係数を有する。
【０２４０】
疎水基には、飽和、不飽和および芳香族炭化水素が包含される。一実施形態では、疎水基は、不飽和炭素、場合によってアミドおよびエステル基を含有してよい３〜３０個の炭素を有するアルキル基であり、分岐していてよい。一実施形態では、炭化水素基は、３〜３０個の炭素長さであり、不飽和炭素、アミド基およびエステルを含有してよく、分岐を包含してよい。
【０２４１】
追加の疎水基には、脂質が包含される。使用することができる脂質には、これらに限られないが、下記の群の脂質が包含される：脂肪酸および誘導体、モノ−、ジおよびトリグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロールおよびステロイド誘導体、テルペンおよびビタミン。脂肪酸およびその誘導体には、これらに限られないが、飽和および不飽和脂肪酸、奇数および偶数の脂肪酸、シスおよびトランス異性体ならびにアルコール、エステル、無水物、ヒドロキシ脂肪酸およびプロスタグランジンを包含する脂肪酸誘導体が包含され得る。使用することができる飽和および不飽和脂肪酸には、これらに限られないが、線状または分岐形態のいずれかで約１２個の炭素原子から約２２個の炭素原子を有する分子が包含される。使用することができる飽和脂肪酸の例には、これらに限られないが、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸およびステアリン酸が包含される。使用することができる不飽和脂肪酸の例には、これらに限られないが、ラウリン酸、フィセテリン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペテロセリン酸およびオレイン酸が包含される。使用することができる分岐脂肪酸の例には、これらに限られないが、イソラウリン酸、イソミリスチン酸、イソパルミチン酸およびイソステアリン酸ならびにイソプレノイドが包含される。脂肪酸誘導体には、１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３イル）カルボニル）メチルアミノ）−オクタデカン酸；Ｎ−［１２−（（（７’ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチル−アミノ）オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸、Ｎスクシニル−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびパルミトイル−ホモシステイン；および／またはそれらの組合せが包含される。使用することができるモノ−、ジ−およびトリグリセリドまたはそれらの誘導体には、これらに限られないが、６個から２４個の間の炭素原子の脂肪酸または脂肪酸の混合物を有する分子、ジガラクトシルジグリセリド、１，２−ジオレオイル−グリセロール；１，２−ｃジパルミトイル（ｃｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ）−３スクシニルグリセロール；および１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロールが包含される。
【０２４２】
使用することができるリン脂質には、これらに限られないが、ホスファチジン酸、飽和および不飽和脂質の両方を含むホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジル誘導体、カルジオリピンおよびβ−アシル−ｙ−アルキルリン脂質が包含される。リン脂質の例には、これらに限られないが、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、ジトリコサノイルホスファチジルコリン（ＤＴＰＣ）、ジリグノセロイルファチジルコリン（ＤＬＰＣ）などのホスファチジルコリン；およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンまたは１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミンなどのホスファチジルエタノールアミンが包含される。不斉アシル鎖（例えば６個の炭素からなる１つのアシル鎖および１２個の炭素からなる別のアシル鎖を有する）を有する合成リン脂質もまた使用することができる。
【０２４３】
疎水基として使用することができるスフィンゴ脂質には、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシド、ガングリオシド、スルファチドおよびリゾスルファチドが包含される。スフィンゴ脂質の例には、これらに限られないが、ガングリオシドＧＭ１およびＧＭ２が包含される。
【０２４４】
疎水基として使用することができるステロイドには、これらに限られないが、コレステロール、コレステロールスルフェート、コレステロールヘミスクシネート、６−（５−コレステロール３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−α−Ｄマンノピラノシドおよびコレステリル）４’−トリメチル３５アンモニオ）ブタノエートが包含される。
【０２４５】
使用することができる追加の脂質化合物には、トコフェロールおよび誘導体、ならびに油およびステアリールアミンなどの誘導体化された油が包含される。
【０２４６】
ＤＯＴＭＡ、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド；ＤＯＴＡＰ、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン；およびＤＯＴＢ、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−グリセロールなどの様々な陽イオン性脂質を使用することができる。
【０２４７】
他の疎水基には、トリプトファン、チロシン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンなどの疎水性アミノ酸ならびにアルキルパラベン、例えばメチルパラベンおよび安息香酸などの芳香族基が包含される。
【０２４８】
他の種類の疎水基には、脂肪酸、コレステロール、ダンシル化合物およびアンホテリシン誘導体などの膜と相互作用する分子が包含される。一実施形態では、疎水基は、脂質、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘキサデシルグリセロール、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸およびフェノキサジンを含む基；ならびにジメトキシトリチル基などの基、オレイル、レチニルおよびコレステリルなどのステロイド、ゲラニルオキシヘキシル基およびヘプタデシル基を包含する親油性基である。
【０２４９】
他の実施形態では、疎水基Ｒ４はそれぞれ独立に、Ｃ４〜Ｃ１８アルカノイル、トリプトファン、イソロイシンおよびバリンから選択される疎水性アミノ酸、アルキルパラベンならびにリン脂質である。
【０２５０】
一実施形態では、疎水基Ｒ４をそれぞれ、リンカー基Ｌ４を介してポリマー主鎖に結合させている。他の実施形態では、１種を超える疎水基Ｒ４を１つの修飾ポリマー中で使用する。
【０２５１】
一実施形態では、疎水基Ｒ４は、ヘキサン酸、ヘプタン酸、６−メチルヘプタン酸パルミチン酸、ミリスチン酸およびオレイン酸などのＣ５〜２０飽和または不飽和脂肪酸；オクチルアミン、デシルアミン、ドデシルアミン、オクタデシルアミンなどのＣ６〜２２アルキルアミン；コレステロール、コール酸などのコレステロール誘導体；またはホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリンなどのアミノ含有脂質を含む。
【０２５２】
一実施形態では、Ｒ４はそれぞれ独立に、下式である：
【０２５３】
【化５４】
2013528665.tif 000056
一実施形態では、１種を超える疎水基Ｒ４を１つの修飾ポリマー中で使用することができる。この実施形態では、疎水基Ｒ４のそれぞれの種類を、同じか、または異なる組成のリンカー基Ｌ４を介して、ポリマー主鎖に個別に結合させる。基の種類および目的に依存するであろうが、所望の特性および機能性をポリマーに提供するように、修飾ポリマー中での各疎水基の種類および量を選択する。
【０２５４】
一実施形態では、ｎ４は０であってよい、即ち、疎水基が、−Ｗ４−Ｃ（Ｏ）−Ｚ４−リンカーを介してポリマー主鎖に連結していない。
【０２５５】
Ｚ９がＺ６−Ｔ１である実施形態では、ｎ４は、両端を含む約０．０３から約０．３０の間；または両端を含む約０．０５から約０．１５の間である。
【０２５６】
Ｚ９がＺ８であり、Ｚ８およびＲ２がそれぞれポリアミノ部分（例えば線状または分岐ポリエチレンイミン）であるまた他の実施形態では、Ｒ４は、−Ｗ４−Ｃ（Ｏ）−Ｚ４−リンカーを介してポリマー主鎖に連結していてよく、Ｚ８および／またはＲ２およびｍ４は、０．０３〜０．３０または０．０５〜０．１５である。この実施形態では、ｎ１、ｎ３、ｎ４およびｎ５のそれぞれは、０であるか、または０ではない値であってよい。
【０２５７】
一実施形態では、疎水基Ｒ４を、Ｚ４、Ｚ８またはＲ２のＮ原子に結合させる。
【０２５８】
保護基Ｒ５
一実施形態では、Ｒ５はそれぞれ独立に、同じか、または異なる。この実施形態では、基Ｒ５のそれぞれの種類を、同じか、または異なる組成のリンカー基Ｌ５を介して、ポリマー主鎖に個別に結合させる。基の種類および目的に依存するであろうが、所望の特性および機能性をポリマーに供給するように、修飾ポリマー中での各Ｒ５基の種類および量を選択する。
【０２５９】
一実施形態では、ｎ５は、０であってよい、即ち、保護基が、−Ｗ５−Ｃ（Ｏ）−Ｚ５−リンカーを介してポリマー主鎖に連結していない。
【０２６０】
Ｚ９がＺ６−Ｔ１である実施形態では、ｎ５は、両端を含む約０．０１から約０．０３の間であるか、またはｎ５は約０．０２である。
【０２６１】
Ｚ９がＺ８であり、Ｚ８およびＲ２のそれぞれが、ポリアミノ部分（例えば線状または分岐ポリエチレンイミン）であるまた他の実施形態では、Ｒ５は、−Ｗ５−Ｃ（Ｏ）−Ｚ５−リンカー、Ｚ８および／またはＲ２を介してポリマー主鎖に連結していてよく、ｍ５は、両端を含む０．０１から約０．０３であるか、またはｎ５は約０．０２である。この実施形態では、ｎ１、ｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ、０であるか、０ではない値であってよい。
【０２６２】
一実施形態では、保護基Ｒ５は、Ｚ５、Ｚ８またはＲ２のＮ原子に結合している。
【０２６３】
ポリヌクレオチドＲ６
幅広い多様なポリヌクレオチドをポリマー主鎖に、Ｒ６として付加することができる。ポリヌクレオチドの機能は特に限定されず、例えば治療薬、バイオマーカー、アッセイ薬または診断薬であってよい。他の実施形態では、ポリヌクレオチドを細胞に送達して、外因性ヌクレオチド配列を発現させるか、内因性ヌクレオチド配列の発現を阻害、除去、増加もしくは変化させるか、または細胞に天然には関連しない特異的な生理学的特性に影響を及ぼす。
【０２６４】
他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、天然、合成または半合成である。天然ポリヌクレオチドは、リボース−ホスフェート主鎖を有する。人工または合成ポリヌクレオチドは、化学合成などによってｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは細胞不含系において重合され、同じか、または類似の塩基を含有するが、天然リボース−ホスフェート主鎖以外の種類の主鎖を含有することができるポリヌクレオチドである。これらの主鎖には、例えばＰＮＡ（ペプチド核酸）、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロジアミデート、モルホリノおよび天然ポリヌクレオチドのホスフェート主鎖の他の変形が包含される。塩基には、プリンおよびピリミジンが包含され、これにはさらに、天然化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシンおよび天然類似体が包含される。プリンおよびピリミジンの合成誘導体には、これらに限られないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレートおよびアルキルハライドなどの新たな反応性基を配置している変更形態が包含されるがこれらに限られない。塩基という用語には、これらに限られないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミノプリンを包含するＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかが包含される。ポリヌクレオチドという用語には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）が包含される。
【０２６５】
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ重合ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡの一部、ウイルスに由来する遺伝物質、線状ＤＮＡ、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、組換えＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、ニックドＤＮＡまたはこれらの群の誘導体の形態であってよい。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ重合ＲＮＡ、組換えＲＮＡ、オリゴヌクレオチドＲＮＡ、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、キメラ配列、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、外部ガイド配列、ｓｎｍＲＮＡ（低分子非メッセンジャーＲＮＡ）、ｕｔＲＮＡ（非翻訳ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（２４マー、アンチセンス機構によって作用する修飾ｓｎｍＲＮＡ）、タイニー（ｔｉｎｙ）非コードＲＮＡ（ｔｎｃＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、非ロックド核酸（ＵＮＡ）および他のＲＮＡ機能阻害因子および活性化因子、リボザイムなどならびにこれらの群の誘導体の形態であってよい。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの機能に干渉するポリヌクレオチドであるアンチセンスポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドはまた、細胞中におけるその存在または発現が細胞遺伝子またはＲＮＡの発現または機能を変える配列であってよい。加えて、ＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖、二本鎖、三本鎖または四本鎖であってよい。
【０２６６】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、タンパク質の全体もしくは一部またはＲＮＡ（ｓｈＲＮＡを包含）を発現するようにコードされた発現カセットを含有する。発現カセットは、天然ポリヌクレオチドまたは１種または複数のＲＮＡ転写体を発現し得る組換えによって産生されたポリヌクレオチドを指す。組換えという用語は本明細書で使用される場合、分子生物学的技術によって一緒に合わされたポリヌクレオチドのセグメントからなるポリヌクレオチドを指す。カセットは、遺伝子の発現に影響を及ぼす任意の他の配列と共に該当する遺伝子のコーディング領域を含有する。ＤＮＡ発現カセットは典型的には、プロモーター（転写開始を可能にする）および１種または複数のタンパク質をコードする配列を包含する。場合によって、発現カセットは、これらに限られないが、転写エンハンサー、非コーディング配列、スプライシングシグナル、転写終了シグナルおよびポリアデニル化シグナルを包含し得る。ＲＮＡ発現カセットは典型的には、転写開始コドン（転写開始を可能にする）および１種または複数のタンパク質をコードする配列を包含する。場合によって、発現カセットは、これらに限られないが、転写終了シグナル、ポリアデノシン配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および非コーディング配列、さらに、ｓｈ、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを包含し得る。
【０２６７】
他の実施形態では、ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、自己相補性である、即ち、両方の鎖中のヌクレオチドの少なくとも一部が、ヌクレオチド対に必要とされるか、またはそれらが、オーバーハング、バルジ、ループなどの１つまたは複数などの一本鎖領域を形成し得る。オーバーハングは、存在する場合には、具体的には１から４ヌクレオチド長、さらに具体的には２または３ヌクレオチド長を有する。一実施形態では、オーバーハング（複数可）の長さは、１００または５０または２０または１０または５ヌクレオチドを超えない。それらは、いずれかの鎖の３’末端または５’末端に位置していてよいが、具体的な実施形態は、アンチセンス鎖または両方の鎖の３’末端上に少なくとも１個のオーバーハングを含む。
【０２６８】
ポリヌクレオチドの少なくとも一部が自己相補性である実施形態では、二重鎖構造を形成する２本の鎖は、１個のより大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってよいか、またはそれらは、別々のＲＮＡ分子であってよい。２本の鎖が１つのより大きな分子の一部であり、したがって、一方の鎖の３’末端と個々の他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続鎖によって連結されていて、二重鎖構造を形成している場合、連結ＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と称される。２本の鎖が、一方の鎖の３’末端と個々の他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続鎖以外の手段によって共有で連結されていて、二重鎖構造を形成している場合、その連結構造は鎖連結と称される。２本の鎖がヘアピンループによって連結されていて、二重鎖構造が３０以下のヌクレオチド対からなる場合、ＲＮＡｉ因子はこの場合、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と称され得る。２本の鎖が連結されていないか、または鎖連結によって連結されていて、二重鎖構造が３０個以下のヌクレオチド対からなる場合、ＲＮＡｉ因子はこの場合、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称され得る。
【０２６９】
本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、第２ヌクレオチド配列に関して第１ヌクレオチド配列を記載するために使用される場合、当業者には理解されるであろうとおり、第１ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、ある種の条件下で、第２ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二重鎖構造を形成する能力を指す。そのような条件は例えばストリンジェントな条件であってよく、ここで、ストリンジェントな条件には：４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間、続く洗浄が包含される。「相補的」配列は、完全に相補的であってよいか、または選択された条件下でなおハイブリダイズすることができる限り、それらはミスマッチを包含してよい。一実施形態では、相補的配列には、もしあるとしたら１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下または５つ以下のミスマッチが包含される。相補性の程度は、相補的と称される配列を含む２つのオリゴヌクレオチドの間に安定かつ特異的な結合が生じるような程度である。特異的な結合が望まれる条件下で、即ち、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合には生理学的条件下で、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合には、アッセイが行われる条件下で、特異的な結合は、非標的配列に対する相補性の十分な欠如を必要とする。ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡターゲティングに識別を供給するためには、標的配列と非標的配列との間の単一ミスマッチで十分であり得ることが示されている。
【０２７０】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ機能阻害因子である。ＲＮＡ機能阻害因子（「阻害因子」）は、細胞中でのその存在または発現が配列特異的に特異的細胞ＲＮＡ、通常はｍＲＮＡの安定性もしくは輸送を変えるか、またはその機能または翻訳を阻害する配列（「阻害配列」）を含有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド類似体を含む。したがって、ｍＲＮＡの場合には、ＲＮＡの阻害は、ＲＮＡが転写される遺伝子の発現を有効に阻害し得る。「阻害する」または「ダウンレギュレートする」とは、遺伝子発現産物の活性またはＲＮＡもしくは同等のＲＮＡのレベルが、そのポリヌクレオチドが存在しない場合に観察されるもの未満に減ぜられることを意味する。一実施形態では、ポリヌクレオチドでの阻害は、応答を媒介することができない不活性か、または減衰された分子が存在する場合に観察されるレベル未満である。他の実施形態では、ポリヌクレオチドでの遺伝子発現の阻害は、ポリヌクレオチドが存在しない場合よりも、ポリヌクレオチドが存在する場合においてより大きい。
【０２７１】
例示的なＲＮＡ機能阻害因子には、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは人工ポリヌクレオチドであってよい、ｓｉＲＮＡ、干渉ＲＮＡまたはＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ転写ＤＮＡ、リボザイムおよびアンチセンスポリヌクレオチドが包含される。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、典型的には１５から５０個の塩基対、好ましくは２１から２５個の塩基対を含有し、かつ細胞内で発現される標的遺伝子またはＲＮＡと同一またはほぼ同一のヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含む。またｓｉＲＮＡには、２７−ヌクレオチドダイサー基質などの修飾ｓｉＲＮＡ、メロデュプレクス（ｍｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）ｓｉＲＮＡ（センス鎖中にニックまたはギャップを有するｓｉＲＮＡ）およびｕｓｉＲＮＡ（非ロックドヌクレオ塩基類似体として公知の非ヌクレオチド非環式モノマーで修飾されているｓｉＲＮＡ）ならびに他の修飾ｓｉＲＮＡが包含される。アンチセンスポリヌクレオチドには、これらに限られないが：モルホリノ、２’−Ｏ−メチルまたは２’Ｆポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸などが包含される。ＲＮＡポリメラーゼ転写ＤＮＡは転写されると、ｓｉＲＮＡとして機能し得る細胞中の低分子ヘアピン型ＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡとして機能し得る線状ＲＮＡを産生することができる。阻害因子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで重合されてよく、ＲＮＡを産生する組換え構造として細胞に送達されてよく、キメラ配列またはこれらの群の誘導体を含有してよい。阻害因子は、標的ＲＮＡおよび／または遺伝子を阻害するようなリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチドまたは任意の適切な組合せを含有してよい。加えて、ポリヌクレオチドのこれらの形態は、一本鎖、二本鎖、三本鎖または四本鎖であってよい。
【０２７２】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、化学的に未修飾か、または修飾されていてよいｓｉＲＮＡ、短鎖ポリヌクレオチド分子である。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１５〜３０マー、具体的には１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０マーのｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの効率は、標的転写体またはタンパク質の量を減らして、その転写体またはタンパク質に関連する機能特性を損なう能力によって決定することができる。ｓｉＲＮＡは、化学的に、もしくは酵素によって合成することができるか、またはベクターから発現させることができる。他の実施形態では、マイクロまたは他の細胞内ＲＮＡ種の発現レベルを低下させるために使用することができる化学的に合成されたｓｉＲＮＡを提供する。
【０２７３】
一実施形態では、ＲＮＡｉ因子のアンチセンス鎖は、そのＲＮＡｉ因子が標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生を阻害するほどに、標的ＲＮＡに対して「十分に相補的」である。標的ＲＮＡは例えば対象または生体に内因性するプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡであってよい。他の実施形態では、ＲＮＡｉ因子は、標的ＲＮＡに対して「完全に相補的」であり、例えば標的ＲＮＡおよびＲＮＡｉ因子はアニリーングして、正確な相補性の領域でワトソン−クリック型塩基対から専ら成るハイブリッドを形成する。「十分に相補的な」ＲＮＡｉ因子アンチセンス鎖は、標的ＲＮＡに対して正確に相補的な領域（例えば少なくとも７つのヌクレオチドからなる）を包含し得る。さらに、一部の実施形態では、ＲＮＡｉ因子は特異的に、単一のヌクレオチド差違を識別する。この場合、正確な相補性が単一ヌクレオチド差違の領域に見出されると、そのＲＮＡｉ因子が、ｍＲＮＡからの遺伝子発現のみをダウンレギュレーションする。
【０２７４】
一部の実施形態はｓｉＲＮＡに焦点を当てているが、本開示は、ｓｉＲＮＡに限定されると解釈されるべきではなく、短鎖ポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、メロデュプレクスｓｉＲＮＡ、ｕｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、デオキシリボースポリヌクレオチド干渉（ＤＮＡｉ）および短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、酵素ポリヌクレオチド分子またはアンチセンスポリヌクレオチド分子を用いて実施される関連組成物および方法も包含する。
【０２７５】
本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、ｎ６またはｍ６は、両端を含む約０．０００４から約０．１０の間、両端を含む約０．０００４から約０．０７７の間または両端を含む約０．０００６から約０．００２の間であってよい。
【０２７６】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、約１２から約３０の間のヌクレオチドを有する二本鎖オリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、約８から約６４の間のヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【０２７７】
一実施形態では、１種類を超えるポリヌクレオチドを１つの修飾ポリマーに付加することができる。この実施形態では、ポリヌクレオチドＲ６のそれぞれの種類を、同じか、または異なる組成のリンカー基Ｌ６を介して、ポリマー主鎖に個別に結合させる。
【０２７８】
一実施形態では、ポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端を通じてリンカー基Ｌ６を介して修飾ポリマーに連結させる。
【０２７９】
修飾ポリマー候補の評定
候補因子および対照分子を適切な条件に曝露し、選択された特性の存在について評定することによって、修飾ポリマー候補を選択された特性について評定する。例えば分解因子に対する耐性は下記のとおりに評定することができる。修飾ポリマー候補を分解条件に曝露する、例えばヌクレアーゼなどの分解剤、血液もしくは血清などの治療用途で遭遇するであろう環境と類似の生体試料または細胞不含ホモジネートもしくは破壊細胞などの細胞画分を包含する環境に曝露する。次いで、候補および対照を、いくつかの手法のうちのいずれかによる分解に対する耐性について評定する。例えば、好ましくは曝露の前に、候補および対照を、例えば放射性標識、酵素標識またはＣｙ３もしくはＣｙ５などの蛍光標識で標識しておくことができる。対照およびＲＮＡ候補を分解剤および場合によって対照、即ち、熱不活性化などの不活性化分解剤と共にインキュベートすることができる。次いで、物理的パラメーター、例えば試験分子および対照分子のサイズを決定する。分子がその元の長さを維持しているかを評価するか、または機能的に評価するために、決定は物理的方法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動、サイジングカラムまたは分析用ＨＰＬＣ／質量分析法によってよい。別法では、ノーザンブロット分析を使用して、未標識の分子の長さをアッセイすることができる。ｑＲＴ−ＰＣＲもまた、無傷のＲＮＡの量を決定するために使用することができる。
【０２８０】
機能性アッセイもまた、修飾ポリマー候補を評定するために使用することができる。機能性アッセイを初めに、またはその前の非機能性アッセイ（例えば分解に対する耐性についてのアッセイ）の後に適用して、修飾ポリアセタール構造が遺伝子発現を阻害する分子の能力を変えるかどうかを決定することができる。例えばマウスまたはヒト細胞などの細胞に、そのレベルを容易に、かつ定量的に推定することができるレポーター遺伝子を発現するプラスミドを同時トランスフェクションすることができる。そのようなレポーターは、酵素、または一部の実施形態では、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質であってよい。いずれの場合も、レポーター転写体をコードする転写体と相同なＲＮＡｉにコンジュゲートされている候補ポリマー（例えば参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ００／４４９１４を参照されたい）をレポーターを発現する細胞に曝露し、レポーターのレベルを、時間および／またはポリマー−ＲＮＡｉコンジュゲートの濃度を関数として定量する。例えばトランスフェクションがＲＮＡｉ修飾ポリマー候補を包含しなかった対照細胞、例えば修飾ポリマーが加えられていない対照および／または対照と比較して、細胞蛍光の低下を監視することによって、ＧＦＰ  ｍＲＮＡと相同なＲＮＡｉ修飾ポリマー候補を、ＧＦＰ発現を阻害する能力についてアッセイすることができる。修飾および未修飾ＲＮＡｉの存在下での細胞蛍光を比較することによって、遺伝子発現に対する修飾ポリマー候補の効力を評価することができる。加えて、ＧＦＰまたは任意の他の適切なレポーター転写体を、ポリマーコンジュゲートとして試験されているＲＮＡｉに相同な１つまたは複数の領域を含有する非相同ＲＮＡ配列への融合として発現させてよい。
【０２８１】
別の機能性アッセイでは、細胞を内因性遺伝子に相同なＲＮＡｉ修飾ポリマー候補に曝露して、遺伝子の発現を阻害するその修飾ポリマーの能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで評価することができる。表現型は、修飾ポリマーが発現を阻害しているインジケーターとして監視することができる。別法では、標的ＲＮＡのレベルの低下を検出するノーザンブロット、ｑＲＴ−ＰＣＲもしくはｂＤＮＡアッセイによって、または陰性対照と比較して標的タンパク質のレベルの低下をアッセイするウェスタンブロットもしくはＥＬＩＳＡアッセイによって、標的ＲＮＡレベルに対する修飾ポリマー候補の作用を実証することができる。対照には、修飾ポリマーが加えられていない細胞、非ポリアセタールＲＮＡが加えられていて、ポリアセタールとコンジュゲートされている無意味なＲＮＡが評定された細胞（またはｉｎ  ｖｉｖｏ生体）が包含され得る。
【０２８２】
ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡを標的とするＲＮＡｉ修飾ポリマーは、それが結合するｍｉＲＮＡのレベルを直接測定することによって（ｑＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットによって）か、または標的とされた転写体の発現を監視することによって、アッセイすることができる。例えば内因性酵素を標的とするｍｉＲＮＡと結合するように設計されたＲＮＡｉ修飾ポリマーは、対照細胞と比較して、ｍＲＮＡ転写体レベルの上昇またはそのコードされたタンパク質産物を監視することによって、評価することができる。
【０２８３】
いずれの場合も、ＲＮＡｉ修飾ポリマーを、遺伝子発現を調節するその能力に関して評定することができる。例えばその場でハイブリダイゼーションすることによって、またはＲＮＡｉ修飾ポリマーに曝露する前およびその後に組織から、ＲＮＡを単離することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現のレベルを測定することができる。組織を収集するために、動物を屠殺する必要がある場合には、未処置の対照動物が、比較のために役立つ。これらに限られないが、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、分岐ＤＮＡアッセイまたはＲＮＡアーゼ保護アッセイを包含する方法によって、標的ｍＲＮＡを検出することができる。さらに、標的とされたＲＮＡ上でのＲＮＡｉの作用によって生じた切断産物を、５’−ＲＡＣＥアッセイを使用して半定量的に検出することができる。別法では、またはそれに加えて、ＲＮＡｉ修飾ポリマーで処置された組織抽出物でウェスタンブロット分析を行うことによって、遺伝子発現を監視することができる。
【０２８４】
ｂＤＮＡアッセイでは、分岐ＤＮＡを、試験される試料と混合する。検出は、非放射性方法を包含し、検出されるＲＮＡポリヌクレオチドの逆転写ステップを必要としない。アッセイは、原則としてハイブリダイゼーションに全面的に依存している。ハイブリダイゼーションの規模を示すために酵素を使用するが、ポリヌクレオチドを操作するためには使用しない。したがって、逆転写ステップ（ＲＮＡの場合）および／またはＰＣＲを用いることなく、少量のポリヌクレオチドを検出および定量することができる。このアッセイによって、遺伝子発現に対する作用を多数の試料において平行して評定することができ、そのことによってこれは、スクリーニング（即ちｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡｉ修飾ポリマーに曝露された多数の試料における遺伝子発現の評定）と、さらにＲＮＡｉ修飾ポリマーが投与された多数の動物に由来する様々な臓器または組織における遺伝子発現の評価との両方に適する。
【０２８５】
数種の異なる短鎖一本鎖ＤＮＡ分子（オリゴヌクレオチド）を分岐ＤＮＡアッセイでは使用する。キャプチャーおよびキャプチャー−エクステンダーオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡに特異的に結合し、それを固体支持体上に固定化する。固体支持体に標的を固定化することによって、十分な洗浄が容易になり、このことによって、誤ったプラスの結果が減る。標識オリゴヌクレオチドは固定化された標的ポリヌクレオチドに結合して、分岐ＤＮＡは、標識オリゴヌクレオチドにアニーリングする。分岐ＤＮＡを、酵素（例えばアルカリホスファターゼ）にカップリングさせる。ＤＮＡの分岐は、酵素での標的−標識複合体の非常に密な装飾を可能にし、このことは、アッセイの高い感度に重要である。アルカリホスファターゼの場合には、酵素は、基質の反応を触媒して、光を発生させる（ルミノメーターで検出可能）。放出される光の量は、試料中に存在する特異的ＲＮＡポリヌクレオチドの量に比例する。
【０２８６】
典型的なｂＤＮＡアッセイでは、細胞は溶解して、ＲＮＡを放出する。標的ＲＮＡキャプチャーの特異性を決定するために、プローブセットのオリゴヌクレオチドを設計する。典型的なプローブセットであるオリゴヌクレオチド（キャプチャーエクステンダー（ＣＥ）、標識エクステンダー（ＬＥ）およびブロッキングプローブ（ＢＬ））は、標的ＲＮＡの隣接領域と結合し、ＣＥ（キャプチャーエクステンダー）は、協調的なハイブリダイゼーションによって、標的ＲＮＡを９６−ウェルキャプチャープレートへと一晩のインキュベーションの間に選択的にキャプチャーする。連結エクステンダーの連続ハイブリダイゼーションを介して、シグナル増幅を行う。ＬＥの数によって、アッセイ感度が決まる。化学発光性（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｇｅｎｉｃ）基質を加えると、蛍光シグナルが生じ、これは、試料中に存在する標的ｍＲＮＡの量に比例する。
【０２８７】
ＲＮＡのレベルはまた、定量ＰＣＲを使用して評価することができる。
【０２８８】
医薬組成物
安定剤、緩衝剤などの許容される担体中に本明細書に開示されているとおりの１種または複数の修飾ポリマーを含む医薬組成物もまた包含される。修飾ポリマーは、標準的な手段によって、医薬組成物を形成するための安定剤、緩衝剤などを用いて、または用いずに、対象に投与および導入することができる。投与は、局所投与（眼ならびに膣および直腸送達を包含する粘膜への投与を包含する）、例えばネブライザーによる投与を包含する散剤またはエアロゾルの吸入または注入による肺投与；気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口投与、または静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは点滴もしくは頭蓋内、例えばクモ膜下もしくは脳室内投与を包含する非経口投与であってよい。修飾ポリマーは、注射投与のための無菌液剤および／または懸濁剤；注射／点滴の前に再構成するための凍結乾燥散剤；局所組成物として；経口投与のための錠剤、カプセル剤またはエリキシル剤；または直腸投与のための坐剤ならびに当分野で公知の他の組成物として製剤化し、使用することができる。
【０２８９】
薬理学的組成物または製剤は、投与、例えば細胞または例えばヒトを包含する対象に全身投与するために適した形態の組成物または製剤を指す。適切な形態は一部では、使用または進入経路、例えば経口、吸入、経皮、または注射／点滴に左右される。そのような形態は、組成物または製剤が標的細胞（即ち、負に荷電されているポリヌクレオチドが送達されることが望ましい細胞）に達するのを妨げるべきではない。例えば血流に注入された薬理学的組成物は、可溶性であるべきである。他の因子は当分野で公知であり、組成物または製剤がその作用を発揮することを妨げる毒性および形態などの検討を包含する。
【０２９０】
「全身投与」とは、血流への修飾ポリマーのｉｎ  ｖｉｖｏでの全身吸収または蓄積、それに続く身体全体への分布を意味する。全身吸収をもたらす投与経路には、限定ではないが：静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内および筋肉内が包含される。これらの投与経路はそれぞれ、修飾ポリマーをアクセス可能な疾患組織に曝露する。循環への活性薬剤の進入速度は、分子量またはサイズと相関していることが判明している。修飾ポリマーを使用することによって、ポリヌクレオチドを網様内皮系（ＲＥＳ）の組織などの特定の組織型へと強力に局在化することができる。この手法は、癌細胞などの異常な細胞のマクロファージおよびリンパ球免疫認識の特異性を利用することによって、標的細胞へのポリヌクレオチドの送達を増大させることができる。
【０２９１】
「薬学的に許容される製剤」は、その所望の活性に最も適した身体的位置に修飾ポリマーを有効に分布させることを可能にする組成物または製剤を意味する。一実施形態では、有効な送達は、細網内皮系によるクリアランスの前か、または効力の低下または毒性をもたらし得る標的外結合の生じる前に生じる。修飾ポリマーを有する製剤に適した薬剤の非限定的例には：ＣＮＳへの活性薬剤の進入を増大させ得るＰ−糖タンパク質阻害因子（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５など）；脳内インプラント後に持続放出送達するためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）マイクロスフェアなどの生分解性ポリマー、；および血液脳関門を通過させて活性薬物を送達することができ、神経取り込み機構を変えることができるポリブチルシアノアクリレートから製造されるものなどの負荷ナノ粒子が包含される。
【０２９２】
薬学的有効量の所望の修飾ポリマーを薬学的に許容される担体または希釈剤中に包含する貯蔵または投与のために調製された医薬組成物もまた、本明細書には包含される。治療のための使用に許容される担体または希釈剤は医薬分野で周知である。例えば緩衝剤、保存剤、増量剤、分散剤、安定剤、染料を加えることができる。加えて、抗酸化剤および懸濁化剤を使用することができる。
【０２９３】
「薬学的有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、同定された疾患もしくは状態を治療、改善もしくは予防するか、または検出可能な治療もしくは阻害効果を示す薬剤の量を指す。当分野で公知の任意のアッセイ方法によって、効果を検出することができる。対象についての厳密な有効量は、対象の体重、体格および健康；状態の性質および規模；ならびに投与のために選択される治療物質または治療物質の組合せに左右される。臨床家の技能および判断の範囲内である常套的な実験によって、所定の状況での薬学的有効量を決定することができる。好ましい態様では、遺伝子サイレンシングを介して、疾患または状態を治療することができる。
【０２９４】
任意の修飾ポリマーについて、初めに例えば腫瘍細胞の細胞培養アッセイで、または動物モデル、通常はラット、マウス、ウサギ、イヌまたはブタで、薬学的有効量を推定することができる。また、動物モデルを使用して、適切な濃度範囲および投与経路を決定することもできる。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することができる。細胞培養または実験動物における標準的な医薬手順によって、治療的／予防的効力および毒性、例えばＥＤ５０（個体群の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（個体群の５０％に対して致命的な用量）を決定することができる。毒性と治療効果との用量比は、治療指数であり、比、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表され得る。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。使用される剤形、患者の感度および投与経路に応じて、投薬はこの範囲内で変動し得る。
【０２９５】
一実施形態では、従来のカテーテル技術または点滴の使用を包含する注射による非経口投与のために、修飾ポリマーを製剤化する。注射用の製剤は、単位剤形で、例えばアンプルで、または複数回投与用の容器で、保存剤を添加して提供することができる。修飾ポリマーは、無菌媒体中で非経口投与することができる。修飾ポリマーは、使用されるビヒクルおよび濃度に応じて、ビヒクル中に懸濁または溶解させることができる。有利には、局所麻酔薬、保存剤および緩衝剤などのアジュバントをビヒクルに溶かすことができる。「非経口」という用語には、本明細書で使用される場合、経皮、皮下、血管内（例えば静脈内）、筋肉内またはクモ膜下注射または点滴技術などが包含される。加えて、修飾ポリマーおよび薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。修飾ポリマーのうちの１種または複数は、１種または複数の非毒性で薬学的に許容される担体および／または希釈剤および／またはアジュバントおよび所望の場合には他の活性成分と一緒に存在してよい。
【０２９６】
無菌の注射用調剤はまた、非毒性で非経口で許容される希釈剤または溶媒中の、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液としての無菌の注射用液剤または懸濁剤であってよい。特に使用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌、不揮発性油が、溶媒または懸濁媒として従来使用されている。この目的で、合成モノ−またはジグリセリドを包含する無刺激の不揮発性油を使用することができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が、注射用の製剤で使用される。
【０２９７】
１日当たり体重１キログラム当たり約０．０１ｍｇから約１４０ｍｇの間のオーダーの投薬レベルが、上記で示された条件を治療する際には有用である（１日当たり１対象当たり約０．０５ｍｇから約７ｇの間）。単一剤形を製造するために担体物質と合わせることができる修飾ポリマーの量は、治療される受容者および特定の投与方法に応じて変動する。投薬単位形態は一般に、両端を含む約０．０１ｍｇから約１００ｍｇの間；両端を含む約０．０１ｍｇから約７５ｍｇの間；または両端を含む約０．０１ｍｇから約５０ｍｇの間の修飾ポリマーを含有してよい。
【０２９８】
特定の対象のための具体的な用量レベルは、使用される具体的な修飾ポリマー活性、年齢、体重、全身健康、性別、食事、投与時間、投与経路および排泄速度、他の活性薬剤との組合せおよび治療を受ける特定の疾患の重症度を包含する様々な因子に左右されることは理解される。
【０２９９】
非ヒト動物への投与では、修飾ポリマーを動物用の食餌または飲料水に加えることもできる。動物が治療的に適切な量の修飾ポリマーをその食事と共に摂取できるように、動物用の食餌および飲料水を配合するのが簡便であり得る。また、修飾ポリマーを食餌または飲料水に加えるためのプレミックスとして提供することも簡便であり得る。
【０３００】
修飾ポリマーをまた、対象に他の治療用化合物と組み合わせて投与して、治療効果全体を上げることができる。適応症を治療するために複数の化合物を使用することで、有益効果を上げることができる一方で、副作用の存在を減らすことができる。
【０３０１】
修飾ポリマーの合成
略語
下記の略語を、下記の反応スキームおよび合成例において使用する。このリストは、本出願で使用される略語の包括的なリストであることを意図したものではなく、したがって有機合成の分野の当業者には容易に理解される追加の標準的な略語もまた、合成スキームおよび実施例において使用され得る。
【０３０２】
ＢＳＡ  ウシ血清アルブミン
ＣＤＭ  カルボキシジメチルマレイン酸
ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド
ＥＤＡ  エチレンジアミン
ＧＡ  グルタル酸無水物
ＧＵＡ  Ｎ−（４−アミノブチル）グアニジン
ＨＡ−ＮＨＳ  ヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルヘキサノエート）
ＩＭＡ  １−（３−アミノプロピル）イミダゾール
ＩＭＰＡ  イソプロピルメチルホスホン酸
ＮＡＧ  Ｎ−アセチルグルコサミン
ＮＨＳ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）
ＰＢＳ  リン酸緩衝食塩水
ＰＥＩ  ポリエチレンイミン
ＰＨＦ  ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシルメチルホルマール）またはＦＬＥＸＩＭＥＲ（登録商標）
ＲＰ−ＨＰＬＣ  逆相高速液体クロマトグラフィー
ＳＰＤＰ  Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジスルファニル）−プロピオネート
−ＳＳ−は、共有結合しているジスルフィド基を示している
ＳＳＰ  ２−ピリジルジスルファニル
ＳＳＰｙ  ３−（２−ピリジルジスルファニル）−プロピオネート
スキーム１は、カルバメートリンカーを介してアミノ／ポリアミノ部分に直接連結しているＰＨＦポリマーの合成を示している。
スキーム１
【０３０３】
【化５５】
2013528665.tif 000057
［式中、
Ｙ１は独立に、
【０３０４】
【化５６】
2013528665.tif 000058
またはハロゲンであり；
Ｒ２は、本明細書で定義されるとおりである］。
【０３０５】
Ｒ２は、単一のアミノ／ポリアミノ部分またはアミノ／ポリアミノ部分の混合物であってよい。
【０３０６】
第１の反応の生成物を単離することなく、合成を行う。最終生成物を、限外濾過または沈殿によって精製する。
【０３０７】
スキーム２は、一方のカルボン酸基がアミド結合を介して、アミノ／ポリアミノ部分の窒素原子に連結していて、他方のカルボン酸基がエステル結合を介してアセタール単位のヒドロキシル基に連結しているジカルボン酸化合物を介して、アミノ／ポリアミノ部分に間接的に連結しているＰＨＦポリマーの合成を示している。
スキーム２
【０３０８】
【化５７】
2013528665.tif 000059
［式中、
ＹおよびＲ２は、本明細書で定義されるとおりである］。
【０３０９】
Ｒ２は、単一のアミノ／ポリアミノ部分またはアミノ／ポリアミノ部分の混合物であってよい。
【０３１０】
ポリアセタールポリマーをコハク酸無水物、グルタル酸無水物などの環式無水物と反応させて、中間体ポリマーを形成し、これを単離しない。最終生成物を限外濾過、沈殿または透析によって精製する。
【実施例】
【０３１１】
本明細書に記載されている修飾ポリマーは、下記に一般的に概説される方法によって調製することができる。別段に注記されていない限り１０，０００Ｄａ分子量カットオフ膜を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｉｃａｎ接線流系を使用して、透析濾過を行った。
【０３１２】
本明細書で使用されるＡｐｏＢ１００  ｍＲＮＡ（マウス）特異的ｓｉＲＮＡ配列（ＡｐｏＢ１）は：
アンチセンス：Ｐ−５’Ａｊ８ＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＣＣＡＣＡＵＵＣｊ８ＡＱ２Ｇ
センス：Ｒ２０−５’ＧＡＡｊ８ＵＧｊ８ＵＧＧＧｊ８ＵＧＧｊ８ＣＡＡｊ８Ｃｊ８Ｕｊ８Ｕｊ８Ｕｊ８ＡＱ２Ｇ
である
［配列中、
「Ｐ」はホスフェート基であり、
ヌクレオチドの前の「ｊ８」は、２’−メトキシ修飾ヌクレオチドを表し、
「Ｑ２」は、ホスホロチオエートリンカーを表し、
Ｒ２０は、５’末端に連結している−（ＣＨ２）６−ＳＨである］。
【０３１３】
（実施例１）
ＰＨＦ−ＥＤＡの合成
【０３１４】
【化５８】
2013528665.tif 000060
ＰＨＦ（７０，０００Ｄａ、２ｇ、ＰＨＦモノマー１４．８１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ６０ｍＬに溶かし、続いてビス（ニトロフェノール）カルボネート（２．９３ｇ、９．６３ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を４０℃で４時間撹拌し、周囲温度に冷却し、次いで、エチレンジアミン（８．９ｇ、１４８ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ３０ｍＬ中の溶液に徐々に加えた。生じた溶液を周囲温度で１８時間撹拌し、次いで、脱イオン水９００ｍＬで希釈した。１ＮのＨＣｌを用いて、溶液のｐＨを５．５に調節した。生成物（ＰＨＦ−ＥＤＡ）を脱イオン水４体積に対して透析濾過によって精製し、生じたＰＨＦ−ＥＤＡポリマーを凍結乾燥（収率７５％）によって回収した。ＥＤＡで置換された全ＰＨＦモノマー単位の分率は、元素分析によって決定したところ０．４７であった。
【０３１５】
上記の反応条件を変えることによって、様々な量のエチレンジアミンまたは他のアミノ部分（Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６）（両端を含む約０．０２から約０．９０の間のモル分率）を有する修飾ポリマーを得ることができる。また、上記の条件と同様の条件を使用して、表Ｉ中のコンジュゲート＃４６、５３、５９および６０などの少なくとも２つのジアミノ部分からなる混合物を含有するＰＨＦポリマーを合成した。
【０３１６】
また、下記の方法を使用して、様々な量の官能基を修飾ポリアセタールポリマーに付加することができる。例えば、ターゲティング基、電荷基、電荷変更基、疎水基、保護基およびポリヌクレオチドの相対量を変動させることができる。下記の実施例１６に示されている分析方法を使用して、各成分の相対量を決定することができる。
【０３１７】
（実施例２）
ＰＨＦ−ＥＤＡ−ＮＡＧの合成
【０３１８】
【化５９】
2013528665.tif 000061
ＰＨＦ（７０，０００Ｄａ、２ｇ、１４．８１ｍｍｏｌのＰＨＦモノマー）を無水ＤＭＦ６０ｍＬに溶かし、続いて、ビス（ニトロフェノール）カルボネート（２．９３ｇ、９．６３ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を４０℃で４時間撹拌し、周囲温度に冷却し、次いで、無水ＤＭＦ２ｍＬに溶かしたＮ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）ＮＡＧ（Ｒ１、変数２、０．１２５ｇ、０．４４４ｍｍｏｌ）と混合した。１時間撹拌した後に、反応混合物を無水ＤＭＦ３０ｍＬ中のエチレンジアミン（８．９ｇ、１４８ｍｍｏｌ）に徐々に加えた。生じた溶液を周囲温度で１８時間撹拌し、次いで、脱イオン水９００ｍＬで希釈した。ｐＨを、１ＮのＨＣｌで５．５に調節した。生成物を脱イオン水４体積に対して透析濾過によって精製し、生じたＰＨＦ−ＥＤＡ−ＮＡＧを凍結乾燥によって回収した。
【０３１９】
上記の反応条件を変動させることによって、様々な量のＮＡＧまたは他のターゲティング基（Ｒ１）を有する修飾ポリマーを得ることができる。
【０３２０】
（実施例３）
ＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳＰｙの合成
【０３２１】
【化６０】
2013528665.tif 000062
実施例１に記載されているとおりに調製されたＰＨＦ−ＥＤＡ（１００ｍｇ）を無水ＤＭＦ１０ｍＬに溶かし、無水ＤＭＦ１ｍＬに溶かされたＳＰＤＰ（５ｍｇ、ＰＨＦモノマー当たり３％（ｍｏｌ））と混合し、続いてトリエチルアミン１ｍＬを加えた。生じた溶液を周囲温度で２時間撹拌し、続いて、０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍＬを加えた。生じた生成物を脱イオン水４体積に対して透析濾過によって回収した。精製ＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳＰｙ溶液を、さらに使用するまで−４０℃で凍結貯蔵した。ピリジンチオン分光光度分析によって推定すると、ＳＳＰｙで置換された全ＰＨＦモノマー単位の分率は０．０２であった。
【０３２２】
（実施例４）
ＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡの合成
【０３２３】
【化６１】
2013528665.tif 000063
ＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳＰｙ（水１ｍＬ中の１０．６ｍｇ、実施例３に記載されているとおりに調製）を１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍＬに溶かされたＡｐｏＢ１  ｓｉＲＮＡ−ヘキシレン−ＳＨ（０．８２ｍｇ、ｓｉＲＮＡ／ＰＨＦモノマー  ｍｏｌ＝０．５）と混合した。溶液を室温で２時間撹拌した。生じたＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡをそのまま使用するか、またはＰＢＳ（５０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．０）、０．９％のＮａＣｌ）に対して透析した後に使用した。ＡＥＸ  ＨＰＬＣによる精製ＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡの分析によって、コンジュゲートされたｓｉＲＮＡの含有率＞９５％が示された。
【０３２４】
上記の反応条件を変動させることによって、様々な量のｓｉＲＮＡ（ＡｐｏＢ１）または他のポリヌクレオチド（Ｒ６）を有する修飾ポリマーを得ることができる。
【０３２５】
（実施例５）
ＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ−ヘキサノエートの合成
【０３２６】
【化６２】
2013528665.tif 000064
５％ＮａＨＣＯ３を使用して、ＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ溶液（実施例４に記載されているとおりに調製）のｐＨをｐＨ７．５〜８．０に調節し、次いで、ＤＭＦ０．６ｍＬを加え、続いて、無水ＤＭＦ０．４ｍＬに溶かされたＨＡ−ＮＨＳ（０．３９ｍｇ）を加えた。生じた溶液を２時間撹拌した。生成物（ＨＰＬＣによってヘキサン酸６８％が組み込まれた）をＰＢＳ５ｍＬ（５０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．０）、０．９％ＮａＣｌ）で希釈し、ＰＢＳ４体積に対して透析濾過によって精製した。ＡＥＸ  ＨＰＬＣによる精製ＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ−ヘキサノエートの分析によって、コンジュゲートされたｓｉＲＮＡ含有率＞９５％が示された。
【０３２７】
上記の反応条件を変動させることによって、様々な量のヘキサノエートまたは他の疎水基（Ｒ５）を有する修飾ポリマーを得ることができる。
【０３２８】
（実施例６）
ＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ−ヘキサノエート−ＮＡＧ３の合成
【０３２９】
【化６３】
2013528665.tif 000065
実施例５に記載されているとおりに調製されたＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ−ヘキサノエートに、ＮＡＧ３−ＳＨ（１．８ｍｇ、ＮＡＧ３−ＳＨ、式ＸＩの化合物（変数２）とイミノチオラン（０．１２ｍｇ）とをＤＭＦ０．２ｍＬ中で反応させることによってその場で調製）を加えた。生じた溶液を２時間撹拌した。生成物（ＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ−ヘキサノエート−ＮＡＧ３、ＨＰＬＣ分析によって、ＮＡＧ３の定量的組み込みが示された）をＰＢＳ５ｍＬ（５０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．０）、０．９％のＮａＣｌ）で希釈し、ＰＢＳ４体積に対して透析濾過によって精製した。ＡＥＸ  ＨＰＬＣによる精製ＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ−ヘキサノエート−ＮＡＧ３の分析によって、コンジュゲートされたｓｉＲＮＡの含有率＞９５％が示された。
【０３３０】
上記の反応条件を変動させることによって、様々な量のＮＡＧ３または他のターゲティング基（Ｒ１）を有する修飾ポリマーを得ることができる。
【０３３１】
（実施例７）
ＰＨＦ−ＰＥＩの合成
【０３３２】
【化６４】
2013528665.tif 000066
ＰＨＦ（７０，０００Ｄａ、２ｇ、ＰＨＦモノマー１４．８１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ３０ｍＬに溶かし、続いて、ビス（ニトロフェノール）カルボネート（０．１３７ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を加え、生じた溶液を４０℃で４時間撹拌した。別の線状ＰＥＩ（ＰＥＩ−線状ＭＷ２５００Ｄａ、１．３５ｍｍｏｌ、３．３７５ｇ）を水１００ｍＬに溶かし、１ＮのＨＣｌでｐＨを５．５に調節した後に、氷上で冷却し、次いでこれに、ＰＨＦ−ニトロフェノールカルボネート溶液を徐々に加え、トリエチルアミンを用いて、生じた混合物のｐＨを７．５〜８．０に調節した。溶液を一晩撹拌し、次いで、１ＮのＨＣｌを用いて、ｐＨを５．５に調節した。生成物を脱イオン水４体積に対して透析濾過によって精製し、生じたＰＨＦ−ＰＥＩポリマーを凍結乾燥によって回収した（収率６５％）。ＰＥＩで置換された全ＰＨＦモノマー単位の分率は、元素分析によって推定したところ０．０３であった。
【０３３３】
上記の反応条件を変動させることによって、様々な量のＰＥＩまたは他のポリアミノ部分（Ｒ２およびＺ８）を有する修飾ポリマーを得ることができる。また、様々な量の官能基を、下記に記載されているとおりの修飾ポリアセタールポリマーに付加することも可能である。例えば、ターゲティング基、電荷基、電荷変更基、疎水基、保護基およびポリヌクレオチドの相対量を変動させることができる。下記の実施例１６に示されている分析方法を使用して、各成分の相対量を決定することができる。
【０３３４】
（実施例８）
ＰＨＦ−ＰＥＩ−ＳＳＰｙの合成
【０３３５】
【化６５】
2013528665.tif 000067
ＰＨＦ−ＰＥＩ（実施例７に記載されているとおりに調製、５１９ｍｇ）をＤＭＦ２０ｍＬおよび脱イオン水１０ｍＬに溶かした。１ＮのＮａＯＨを用いて、溶液のｐＨをｐＨ８．０〜８．１に調節した。氷上の混合物に、ＤＭＳＯ３ｍＬに溶かされたＳＰＤＰ（６６ｍｇ）を加えた。反応混合物を氷上で２時間保持し、次いでｐＨをｐＨ５．５〜６．０に調節し、続いて、脱イオン水で１５０ｍＬに希釈した。生じたＰＨＦ−ＰＥＩ−ＳＳＰｙポリマーを、脱イオン水４体積に対して透析濾過することによって精製し、３０，０００Ｄａ  ＭＷカットオフ膜を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｉｃａｎシステムを使用して、約２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。精製ポリマーを凍結乾燥させた。１Ｈ  ＮＭＲおよびＵＶ分光法による分析によって、ＳＳＰｙで置換された全ＰＨＦモノマー単位の分率は０．０２であることが示された。
【０３３６】
（実施例９）
ＰＨＦ−ＰＥＩ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡの合成
【０３３７】
【化６６】
2013528665.tif 000068
ＰＨＦ−ＰＥＩ−ＳＳＰｙ（実施例８に記載されているとおりに調製、脱イオン水４ｍＬ中のポリマー７８ｍｇ）を１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ８．５）３ｍＬと混合した。次いで、ＡｐｏＢ１  ｓｉＲＮＡ−ヘキシレン−ＳＨ（５ｍｇ、ｓｉＲＮＡ／ＰＨＦ−ＰＥＩ＝０．６）を加えた。生じたＰＨＦ−ＰＥＩ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡをそのまま使用するか、またはＰＢＳ（５０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．０）、０．９％のＮａＣｌ）に対して透析した後に使用した。ＡＥＸ  ＨＰＬＣによる精製ＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡの分析によって、コンジュゲートされたｓｉＲＮＡの含有率＞９５％が示された。
【０３３８】
上記の反応条件を変動させることによって、様々な量のｓｉＲＮＡ（ＡｐｏＢ１）または他のポリヌクレオチド（Ｒ６）を有する修飾ポリマーを得ることができる。
【０３３９】
（実施例１０）
ＰＨＦ−ＰＥＩ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ−コレステロールの合成
【０３４０】
【化６７】
2013528665.tif 000069
ＰＨＦ−ＰＥＩ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ（実施例９に記載されているとおりに調製、４ｍｇ、ｓｉＲＮＡ／ＰＨＦ−ＰＥＩ＝０．５）をＤＭＦ３ｍＬと混合し、５％のＮａＨＣＯ３溶液を使用して、溶液のｐＨをｐＨ７．５〜８．０に調節した。生じた溶液を、無水ＤＭＦに溶かされたコレステロールのＮＨＳ誘導体（Ｒ４、変数７、４ｍｇ）と混合した。溶液を２時間撹拌した。生じたＰＨＦ−ＰＥＩ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ−コレステロールコンジュゲートをＰＢＳ５０ｍＬ（５０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．０）、０．９％のＮａＣｌ）で希釈し、ＰＢＳ４体積に対して透析濾過することによって精製した。ＨＰＬＣ分析によって、コレステロール化合物の定量的組み込みが示された。ＡＥＸ  ＨＰＬＣによる精製ＰＨＦ−ＰＥＩ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ−コレステロールコンジュゲートの分析によって、コンジュゲートされたｓｉＲＮＡの含有率＞９５％が示された。
【０３４１】
上記の反応条件を変動させることによって、様々な量のコレステロール誘導体または他の疎水基（Ｒ５）を有する修飾ポリマーを得ることができる。
【０３４２】
（実施例１１）
ＰＨＦ−ＰＥＩ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ−コレステロール−ＮＡＧ３の合成
【０３４３】
【化６８】
2013528665.tif 000070
ＰＨＦ−ＰＥＩ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート（実施例９に記載されているとおりに調製、０．５のｓｉＲＮＡ／ＰＨＦ−ＰＥＩ比、４ｍｇ）をＤＭＦ３ｍＬと混合し、５％のＮａＨＣＯ３溶液を使用して、ｐＨをｐＨ７．５〜８．０に調節した。生じた溶液を、無水ＤＭＦに溶かされたコレステロールのＮＨＳ誘導体（Ｒ４、変数７、１．３ｍｇ）と混合した。２時間撹拌した後に、ＮＡＧ３−ＳＨ（１．８ｍｇ、ＮＡＧ３−ＳＨ、式ＸＩの化合物（変数２）とイミノチオラン（０．１２ｍｇ）とをＤＭＦ０．２ｍＬ中で反応させることによってその場で調製）を溶液に加え、撹拌を２時間継続した。生じたＰＨＦ−ＰＥＩ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ−コレステロール−ＮＡＧ３コンジュゲートをＰＢＳ５０ｍＬ（５０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．０）、０．９％のＮａＣｌ）で希釈し、ＰＢＳ４体積に対して透析濾過することによって精製した。ＡＥＸ  ＨＰＬＣによる精製ＰＨＦ−ＰＥＩ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ−コレステロール−ＮＡＧ３コンジュゲートの分析によって、コンジュゲートされたｓｉＲＮＡの含有率＞９５％が示された。
【０３４４】
上記の反応条件を変動させることによって、様々な量のＮＡＧ３または他のターゲティング基（Ｒ１）を有する修飾ポリマーを得ることができる。
【０３４５】
（実施例１２）
ＰＨＦ−ＧＡ−ブチルジアミンの調製
【０３４６】
【化６９】
2013528665.tif 000071
４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．２６８ｇ、２．９１ｍｍｏｌ）およびグルタル酸無水物（１．３７５ｇ、１２．０６ｍｍｏｌ）をＰＨＦ（３０，０００Ｄａ、１．４８ｇ、ＰＨＦモノマー１０．９６ｍｍｏｌ）のＤＭＡ３００ｍＬおよび無水ピリジン３３．３ｍＬ中の溶液に加えた。反応混合物を６０℃で１８時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、生じた濃厚なオイルを水１００ｍＬに入れた。５ＮのＮａＯＨを用いて、ｐＨをｐＨ６．０〜６．５に調節した。生じた透明な溶液を水で２００ｍＬに希釈し、０．２ミクロンフィルターで濾過し、膜フィルター（５０００分子量カットオフ）を使用する透析濾過によって精製した。水を凍結乾燥によって除去して、ＰＨＦ−ＧＡ１．２８ｇを白色の固体として得た（収率４８％）。１Ｈ  ＮＭＲによって決定すると、グルタル酸で置換された全ＰＨＦモノマー単位の分率は、０．９６％であった。
【０３４７】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．５７９、５．０３ｍｍｏｌ）およびブタン−１，４−ジアミン（３．００ｍＬ、３０．２ｍｍｏｌ）を水中のＰＨＦ−ＧＡ（２６．２ｍＬ）に加えた。生じた溶液を０℃に冷却し、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．９３ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）を少量ずつ３時間かけて加えた。混合物を周囲温度に加温し、ｐＨをｐＨ５．５〜６．０に調節し、撹拌を１８時間継続した。生じたポリマー生成物を、膜フィルター（５０００分子量カットオフ）を使用する透析濾過によって精製した。体積を１０ｍＬまで減らし、ＰＨＦ−ＧＡ−ブチルジアミンを、水（３×５０ｍＬ）を用いて膜上で洗浄した。精製ポリマーを凍結乾燥によって回収して、ＰＨＦ−ＧＡ−ブチルジアミンを白色の固体（１．０３ｇ、収率６２．１％）として得た。ピクリルスルホン酸アッセイによるアミン分析によって、アミンで置換された全ＰＨＦモノマー単位の分率は０．７２であることが示された。
【０３４８】
（実施例１３）
ＰＨＦ−ＧＡ−ブチルジアミン−ＨＡ−ＳＳＰの調製
【０３４９】
【化７０】
2013528665.tif 000072
ＤＭＦ２ｍＬ中の２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−４−（１−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチル）ベンゾエート（ＳＭＰＴ、１５．２ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）をＰＨＦ−ＧＡ−ブチルジアミン（実施例１２に記載されているとおりに調製、２１１ｍｇ、０．６７７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ２ｍＬおよび水０．５００ｍＬ中の溶液に加えた。混合物のｐＨをｐＨ７．５に調節し、反応混合物を２０〜２３℃で１時間撹拌した。次いで、２，５−ジオキソピロリジン−１−イルヘキサノエート（８５．０ｍｇ、０．３９８ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を周囲温度で１８時間継続した。生じた混合物のｐＨをｐＨ５．０〜５．５に調節し、次いで、溶液を０．２ミクロンフィルターで濾過した。生じた生成物を、膜フィルター（５０００分子量カットオフ）を使用する透析濾過によって精製した。体積を２ｍＬまで減らし、ＰＨＦ−ＧＡ−ブチルジアミン−ＨＡ−ＳＳＰを、水（３×１０ｍＬ）を用いて膜上で洗浄した。生成物であるＰＨＦ−ＧＡ−ブチルジアミン−ＨＡ−ＳＳＰ（１５１．２ｍｇ、収率５７％）を濃度１０ｍｇ／ｍＬまで希釈し、さらに使用するまで−４０℃で貯蔵した。１Ｈ  ＮＭＲ分析によって、ヘキサノエートで置換された全ＰＨＦモノマー単位の分率は０．１１５であることが示された。ジスルフィドで置換された全ＰＨＦモノマー単位の分率は、ピリジンチオン分光光学分析によって推定すると、０．０１１であった。
【０３５０】
（実施例１４）
ＰＨＦ−ＧＡ−ブチルジアミン−ＨＡ−ＳＳＰ−ｓｉＲＮＡの調製
【０３５１】
【化７１】
2013528665.tif 000073
脱イオン水０．５ｍｌ中のＰＨＦ−ＧＡ−ブチルジアミン−ＨＡ−ＳＳＰ（実施例１３に記載されているとおりに調製、５ｍｇ）を１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ８．５）０．５ｍＬと混合した。次いで、ＡｐｏＢ１  ｓｉＲＮＡ−ヘキシレン−ＳＨ（０．４１ｍｇ、ｓｉＲＮＡ／ＰＨＦ−ＰＥＩ＝０．５）を加えた。生じたＰＨＦ−ＧＡ−ブチルジアミン−ＨＡ−ｓｉＲＮＡをそのまま使用するか、またはＰＢＳ（５０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．０）、０．９％のＮａＣｌ）に対して透析した後に使用した。ＡＥＸ  ＨＰＬＣによる精製ＰＨＦ−ＥＤＡ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡの分析によって、コンジュゲートされたｓｉＲＮＡの含有率＞９５％が示された。
【０３５２】
上記の反応条件を変動させることによって、様々な量のｓｉＲＮＡ（ＡｐｏＢ１）または他のポリヌクレオチド（Ｒ６）を有する修飾ポリマーを得ることができる。
【０３５３】
（実施例１５）
電荷変更基を含有するコンジュゲート
電荷変更基を含有するポリマーの合成は、電荷変更化合物Ｒ３（特定のモル比で、またはポリマー中の反応性アミンに対して過剰で）を加え、続いて生じた溶液のｐＨをｐＨ８．５〜９．０に調節し、透析濾過することによって調製することができる。生じたポリマーを、さらに使用するまで−４０℃で貯蔵する。
【０３５４】
（実施例１６）
修飾ポリマーの特性決定および分析
ｉ）遊離か、またはコンジュゲートされたｄｓＲＮＡを伴う調剤における一本鎖および二本鎖ＲＮＡ濃度の決定；ｉｉ）ＰＢＳ、血漿および組織抽出物中のｄｓＲＮＡの決定；ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡ安定性の特性決定のために、ＵＶ検出を伴う高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ  ＨＰＬＣ）を使用した。
【０３５５】
ｉ）一本鎖および二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造の同定；ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試料における分解のＲＮＡの産物の同定、ｉｉｉ）疎水性修飾因子およびターゲティング基のポリマー含有率の定量決定のために、ＵＶ検出を備えた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ  ＨＰＬＣ）または質量分析検出を伴うＲＰ  ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ）を使用した。
【０３５６】
Ａ．アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ  ＨＰＬＣ）
ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ２００カラム（４×２５０ｍｍ  Ｄｉｏｎｅｘ）を４０℃で使用して、ＡＥＸクロマトグラフィーを実施した。移動相系は、ｉ）移動相Ａ（２５ｍＭのリン酸二水素（ｐＨ７）８０％／アセトニトリル２０％）およびｉｉ）移動相Ｂ（２５ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７）中０．４Ｍの過塩素酸ナトリウム８０％／アセトニトリル２０％）を包含した。分析的決定のために、１．０ｍｌ／分の流速、３０分の直線勾配でＢ１５％〜１００％を使用した。
【０３５７】
Ｂ．質量分析検出を伴う逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ）
Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５μｍ、２．１×５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を８０℃で使用してＲＰ−ＨＰＬＣを行い、ＲＮＡ二本鎖を解離させた。移動相系は、ｉ）移動相Ａ（１００ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノールおよび１．７ｍＭのトリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｌｙａｍｉｎｅ）（ｐＨ７．５）およびｉｉ）移動相Ｂ（相Ａ６０％／メタノール４０％）からなった。流速０．４ｍｌ／分、１２分の直線勾配でＢ１７％〜５０％。質量スペクトル収集および分析をＩｏｎＴｒａｐ  Ｅｓｑｕｉｒｅ３０００（Ｂｒｕｋｅｒ）で行った。
【０３５８】
結合および遊離の両方の電荷変更基（即ち、ＣＤＭ）の定量分析をＲＰ  ＬＣ  ＭＳ／ＭＳによって行った。アセトニトリルを用いてポリマーコンジュゲートを沈殿させた後に、遊離の電荷変更基を上清から回収した（１６０００ｇで２分間の遠心分離）。Ａｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム（３ｃｍ×２．１ｍｍ、２．７μｍ  Ｓｕｐｅｌｃｏ  ｐａｒｔ  ＃：５３８０２−Ｕ）を使用するＲＰ  ＬＣ  ＭＳ／ＭＳによって、上清を分析した。１ＭのＨＣｌで試料を加水分解（１０分、３７℃）した後に、同じ手順を使用して、共有結合している電荷変更基含有率（遊離の電荷変更基に関して補正した後）を決定した。例えばＣＤＭを電荷変更基として使用した場合、ＡＰＩ  ３２００  Ｔｒｉｐｌｅ四重極質量分析計によってモニタリングされる質量の推移は、１３８．９から９４．９および１３８．９から６４．９ｍ／ｚであった。
【０３５９】
ピリジンチオン放出（１０ｍＭのＤＴＴ、１０分、周囲温度）の後に、−ＳＳＰｙまたは−ＳＳＰ修飾ポリマー中のジスルフィド含有率を分光光度によって３４０ｎｍで決定した。
【０３６０】
ポリマーコンジュゲートのアミノ含有率を元素分析データに基づき決定した。さらに、コンジュゲートを調製するためにアミノ部分の混合物を使用した場合には、１Ｈ  ＮＭＲデータを使用して、生成物の分率組成を割り当てた。
【０３６１】
試料を凍結乾燥させ、塩含有率（元素分析データ）および残留している水／ＶＯＣ含有率（恒量まで乾燥させることによって決定）について補正した後に、溶液中での修飾ポリアセタールポリマーの濃度を決定した。
【０３６２】
（実施例１７）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＨＦ  ｓｉＲＮＡ送達系の安定性
本明細書に記載されているｓｉＲＮＡを含有するポリマーは、長期の貯蔵期間にわたって安定であるという特殊な利点を有する。上記および表Ｉに記載されているポリマーを周囲貯蔵条件での３、６または９ヶ月またはそれ以上の後に評価し、各機能性側鎖の安定性を決定した。例えば、２〜８℃で１２ヶ月貯蔵した後の表Ｉ中のコンジュゲート＃６１の分析によって、≧９５％のｓｉＲＮＡが何ら二本鎖分解を示さないことが判明した。
【０３６３】
（実施例１８）
ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ試験  ｂＤＮＡアッセイでのｍＲＮＡノックダウンの測定
下記に提示されている実施例の多くが、マウスＡｐｏＢに対して向けられたｓｉＲＮＡを利用する。したがって、方法は、定量ＲＴ−ＰＣＲによるそのようなｓｉＲＮＡの評定、さらに、ｂＤＮＡアッセイまたは定量ＲＴ−ＰＣＲによるマウスＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ転写体の評定を多少詳細に記載している。しかしながら、そのような方法は、内因性遺伝子によってか、または該当する細胞系、組織もしくは動物に導入されているレポーター遺伝子によって産生される該当する任意の転写体に対して向けられた活性ｓｉＲＮＡの評定において、使用することができる。
【０３６４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイの目的は、ｓｉＲＮＡを組織培養細胞に送達し、それらの細胞における関連ｍＲＮＡ転写体のノックダウンを実施する様々な製剤の能力を評定することであった。アッセイを、マルチウェルフォーマットで行い、その際、複数の製剤を反復試験で、かつ平行して評定することができる。様々な細胞をこのアッセイのために使用することができる。一例では、Ｈｅｐａ１−６（マウス肝細胞癌）細胞を第１スクリーニングアッセイで使用し、マウスＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ転写体のノックダウンを測定した（別法では、評定されるｓｉＲＮＡに重複し、かつ相補的なマウスＡｐｏＢ配列領域の関連領域を含有するレポーター構造を安定に導入することによって、他の非肝臓または非マウス細胞をそのようなアッセイで使用することができる）。
【０３６５】
細胞を３，０００〜５，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに蒔き、２４時間後に、コンジュゲートを所望の濃度で加えた（範囲は３．８４μＭから３．８４ｎＭまで変動する）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭａｘ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（製品番号１３７７８−０７５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者指示に従って使用して、陽性対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。
【０３６６】
ｂＤＮＡアッセイを使用して、特異的ｍＲＮＡ転写体のレベルを検査し、それによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方でｓｉＲＮＡノックダウンの読み取りとして役立てた。ｂＤＮＡアッセイは、プレートフォーマットにおける極めて高感度で均質なサンドイッチポリヌクレオチドハイブリダイゼーション方法アッセイであり、組織培養細胞または動物から収集された組織における少量の試料の分析を可能にする。試料を溶解させ、ｍＲＮＡ転写体を捕捉する配列特異的なプレート固定化プローブに一晩ハイブリダイゼーションさせた。コンジュゲートされたホースラディッシュペルオキシダーゼを有し、基質を加えると、定量検出およびルミノメータープレートリーダーにおける測定を可能にする特異的プローブを加えることによって、ハイブリダイゼーションされた転写体を検出した。一次シグナルを増幅して、非常に高感度かつ定量的であるように、アッセイシステムを設計する。定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して、同様の結果を得ることができる。
【０３６７】
本明細書に記載されているＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡコンジュゲートをスクリーニングする例では、培養中の肝細胞癌腫細胞、例えばＨｅｐａ１−６細胞を使用して、分岐ＤＮＡアッセイによってＡｐｏＢ特異的ｓｉＲＮＡと共にインキュベートされた細胞から単離された全ｍＲＮＡ中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡを決定した。肝細胞癌腫細胞を本明細書に記載されたコンジュゲートに、指定の期間、通常は２４〜７２時間曝露した。コンジュゲートをこれらに限られないが３．８４μＭから３．８４ｎＭを包含する範囲の濃度で、３７℃で細胞に直接加えた。指定の時間終点で、ｂＤＮＡアッセイを細胞で実施し、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのレベルを、様々な対照（例えばｍｏｃｋ処理細胞、ＰＨＦで処理された細胞、単独のｓｉＲＮＡまたは無関係なｓｉＲＮＡにコンジュゲートされたＰＨＦで処理された細胞）に対して決定した。いずれの場合も、ｓｉＲＮＡまたは送達因子によって影響を受けないことが公知であるか、または推定されている内因性「ハウスキーピング」遺伝子のレベルもまた評定して、ＲＮＡ抽出の全体効率（即ち、全ＲＮＡの収率）、細胞毒性またはそれら両方について正規化した。ＧＡＰＤＨまたはアクチンがこの目的のために幅広く使用されている。
【０３６８】
細胞上清および血液試料中のＡｐｏＢ１００タンパク質レベルもまた、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定することができる。そのような分析の詳細は、特異的試薬の利用率および特性に伴って変動し得るが、このアッセイの例は下記のとおりである：ポリクローナル抗体ヤギ抗ヒトアポリポタンパク質Ｂをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１：１０００に希釈し、この希釈液１００μＬを９６ウェルプレートに４℃で一晩コーティングする。ＰＢＳ中１％のＢＳＡ３００μＬでブロックした後に、プレートをＰＢＳで洗浄する。細胞培養上清を解凍し、０．１％のＴｗｅｅｎ２０および０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで１：１に希釈する。この希釈液１００μＬを各ウェルに加える。インキュベーション時間の後に、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで、続いてＰＢＳで３回洗浄する。０．１％のＴｗｅｅｎ２０および３％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中で１：１０００に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートされたヤギ抗ヒトアポリポタンパク質Ｂ−１００ポリクローナル抗体１００μＬを各ウェルに加える。プレートを室温で６０分間インキュベートする。０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで、およびＰＢＳで３回、プレートを洗浄した後に、ウェルを０．０３％の過酸化水素を含有する２４ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中の０．９ｍｇ／ｍＬのｏ−フェニレンジアミンと共にインキュベートする。０．５ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１００７３１）を加えることによって、酵素反応を止め、４９０ｎｍでの吸光度を分光光度計で測定する。下記に記載されているとおり、類似の方法を使用して、動物にｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するｉｎ  ｖｉｖｏ研究に由来する試料中のＡｐｏＢタンパク質レベルを定量することができる。
【０３６９】
表Ｉは、ｍＲＮＡノックダウンを測定するために使用される修飾ポリマーの組成を示している。実施例１から１５に記載されている手順を使用して、ポリマーコンジュゲートを合成した。コンジュゲートの分析には、実施例１６に記載されている方法が包含される。内因性ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルに基づき、表Ｉ中のコンジュゲートは、濃度≦７６．８ｎＭでは毒性ではなかった。「Ｒ６」、「ＰＨＦ」（即ち、未修飾ＰＨＦ）、「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ２＋Ｚ８」、「Ｒ３」および「Ｒ４」と名付けられている表Ｉの欄５から１１はそれぞれ、未修飾ＰＨＦの分率ならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ２とＺ８、Ｒ３およびＲ４によって修飾されている全ＰＨＦモノマー単位の分率を列挙している。説明すると、表Ｉの欄８中の０．２という値は、５個のＰＨＦモノマーのうちの１個のＰＨＦモノマーがＲ２によって修飾されていることを意味している。
表Ｉ
【０３７０】
【表１】
2013528665.tif 000074
ａ  ＝  ＡｐｏＢ１００  ｓｉＲＮＡ．
ｂ  ＝  パラグラフ［０１８４］のＲ１構造（２）（ｆは整数２である）
ｃ  ＝  ヘキサン酸
ｄ  ＝  式（ＸＩ）、構造（２）
ｅ  ＝  ＣＤＭ
ｆ  ＝  パラグラフ［０２５３］のＲ４構造（７）
表ＩＩは、表Ｉに記載のコンジュゲートを３．８４ｎＭから３８４ｎＭの濃度で使用するｍＲＮＡノックダウンでの結果を示している。ｂＤＮＡアッセイを使用して、曝露の４８時間後に、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡノックダウンを評定した。大抵のコンジュゲートを三重にアッセイした。
表ＩＩ
【０３７１】
【表２】
2013528665.tif 000075
＃  ＝  ０〜２４％のノックダウン
＃＃  ＝  ２５〜４９％のノックダウン；
＃＃＃  ＝  ５０〜７４％のノックダウン；
＃＃＃＃  ＝  ７５〜１００％のノックダウン；
ＮＴ  ＝  試験せず
（実施例１９）
マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ研究
ポリマーコンジュゲートの性能および薬物動態、製剤ならびに遺伝子特異的ノックダウンをｉｎ  ｖｉｖｏで評定するために、次の方法を使用した。試験物品を適切な陰性対照と共に、尾静脈注射を介して静脈内（ＩＶ）投与した。指定の時間に、全血、肝臓、空腸、腎臓および肺、（必要ならばさらに他の臓器または組織）を採取した。血液を末端心臓−穿刺を介して、規定の薬物動態時点で予め冷却された（０〜４℃）血液採取管に採取し、直ちに（３）アリコットに分けた：肝臓パネル試験のための血清約１５０μＬ、サイトカイン試験のための血漿約５０μＬ、生化学分析試験（例えばｓｉＲＮＡレベルの評定）のために保存される残りの血漿。血清試料のためのアリコットを０〜４℃で遠心分離し、−８０℃で直ちに凍結させた。血漿試料のためのアリコットを予め冷却されたカリウムＥＤＴＡ含有管に採取し、０〜４℃で遠心分離し、−８０℃で直ちに凍結させた。
【０３７２】
臓器および組織を各時点で収集し、その際、採取を各動物での最後の血液採取の２分以内に行った。行われる様々な分析に従って、各組織を適切な数の試料に解体し、ドライアイス上でスナップ冷凍し、分析まで−８０℃で凍結貯蔵した。組織の一部を、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する管に直ちに移し、処理し、製造者によって推奨されているとおりに貯蔵した。組織試料を適切な温度で貯蔵した。過剰のＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）を除去するためにブロッティングされた試験組織を氷上で微細に切り刻み、秤量した。次いで、試験の準備が整うまで、組織を−８０℃で貯蔵した。組織中のｓｉＲＮＡの量の定量決定と、さらに陰性対照と比較してｍＲＮＡノックダウンを決定するためのｂＤＮＡまたは定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイとの両方について、組織試料を評定した。ＡｐｏＢ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを評定する場合には、マウスＡｐｏＢ１転写体のレベルをこのアッセイで試験し、ＧＡＰＤＨまたはアクチンなどの内因性「ハウスキーピング」遺伝子に対して正規化した。
【０３７３】
表ＩＩＩは、ヌードマウス異種移植片モデルにおける肝臓および腫瘍組織でのｉｎ  ｖｉｖｏでのＡｐｏＢ標的遺伝子ノックダウンの例を表している。試験物品を尾静脈注射を介して０．３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した；投与体積は１０ｍｌ／ｋｇ（０．２００ｍｌ／２０ｇ）であった。組織を注射の４８時間後に収集し；１群につき４匹の動物を使用した。コンジュゲートＩＤ＃６１および＃８１の組成は、表Ｉに示されている。
表ＩＩＩ
【０３７４】
【表３】
2013528665.tif 000076
ＲＱ  ＝  相対定量
上記の結果によって、腫瘍では、未コンジュゲートのｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡの１５％のノックダウンと比較して、コンジュゲート＃６１およびコンジュゲート＃８１はそれぞれ、ｍＲＮＡの約５０％のノックダウンを示し；肝臓では、未コンジュゲートのｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡの１４％ノックダウンと比較して、コンジュゲート＃６１は、ｍＲＮＡの約４５％のノックダウンおよびコンジュゲート＃８１は約５６％のノックダウンを示すことが判明した。
【０３７５】
別法では、そのようなアッセイを実施して、他のｍＲＮＡの遺伝子特異的ノックダウンをｉｎ  ｖｉｖｏで評定することができる：他の内因性転写体、レポーター構造によって生じた転写体またはインプラントされた腫瘍内の転写体のノックダウンは、これらの転写体を認識するｓｉＲＮＡ配列を評定される試験物品に投与すると、試験することができる。そのような研究のための典型的な陰性対照には、これらに限られないが、等量の未製剤化ｓｉＲＮＡ、さらにｓｉＲＮＡもしくはターゲティング基のいずれかまたはそれら両方を欠いているｓｉＲＮＡコンジュゲートが包含される。加えて、任意のマウス遺伝子に関連のないｓｉＲＮＡ二本鎖を対照として使用する。
【０３７６】
他の例では、マウスにおいて発現される導入遺伝子に対して向けられたｓｉＲＮＡを使用することができ、そのｓｉＲＮＡコンジュゲートのノックダウンの評定は、個々の導入遺伝子の定量測定によって評定することができる。多くの場合に、そのような導入遺伝子は、ルシフェラーゼまたはＧＦＰなどのレポーター遺伝子であってよく、遍在して、または組織特異的に発現されてよい。
【０３７７】
ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンのための組織試験：ｂＤＮＡアッセイのために、ｉｎ  ｖｉｖｏからの組織試料を初めに、組織２５ｍｇ当たりＴｒｉｚｏｌ１ｍｌを使用して、Ｔｒｉｚｏｌ試薬中で均質化した。全ての組織が溶解するまで必要ならば繰り返しＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）を２５Ｈｚで３分間使用して、組織を均質化した。クロロホルムをＴｒｉｚｏｌ１ｍＬ当たり２ｍＬの濃度で加えて、手動で振盪した。次いで、試料を遠心分離して、相を分離し、上部水性層をｂＤＮＡアッセイで、１μｇから２００μｇの範囲で試験した。典型的には、試料中の全ＲＮＡの濃度および量を、２６０ｎＭでの吸光度を測定することによって定量する。ＲＮＡの質もまた、ゲル電気泳動によって定性的に評価することができる。遺伝子特異的プローブを使用して、標的遺伝子のｍＲＮＡ（さらに適切な対照および正規化標準）の量を試験する。マウス肝臓におけるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのノックダウンを評定する具体的な一例では、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０アッセイ  Ｋｉｔ（製品番号ＱＳ００１０）およびマウスＡｐｏＢ用のＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ（製品番号ＳＢ−１００３２−０２）およびマウスＧＡＰＤＨ（製品番号ＳＢ−１０００１−０２）を使用する（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／Ｐａｎｏｍｉｃｓ）。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、アッセイ結果を読み取る。
【０３７８】
ノックダウンはまた、定量ＰＣＲ方法を使用して評価することもできる。組織をｂＤＮＡアッセイと同様に均質化し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔを使用して、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを０．０１μｇから１μｇの範囲の濃度で使用して、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品番号Ｎ８０８−０２３４）を用いて、逆転写を行った。ＡｐｏＢ特異的ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイおよびＧＡＰＤＨまたはアクチン遺伝子発現アッセイのいずれかを対照として使用して、ｑＰＣＲをＲＴ反応１〜１０μｌで、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、製品番号４３０４４３７）を用いて行った。
【０３７９】
血漿中のｓｉＲＮＡを定量評定するためのＰＫアッセイ：試料を氷上で解凍し、ｓｉＲＮＡを、ｍｉｒＶａｎａ（商標）Ｐａｒｉｓ（商標）Ｋｉｔ（製品番号ＡＭ１５５６、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して抽出する。次いで、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（製品番号４３６６５９６、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＣｕｓｔｏｍ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡアッセイ  ＩＤ  ＣＣＪ９ＶＯＲ（製品番号４５０００８、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からのＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に特異的なＲＴプライマーを使用して、抽出されたｓｉＲＮＡを逆転写する。次いで、２Ｘ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ（製品番号４３２４０１８、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＣｕｓｔｏｍ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡアッセイ  ＩＤ  ＣＣＪ９ＶＯＲ（製品番号４５０００８、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からのｑＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒを使用して、定量ＰＣＲを行う。既知の量のＡｐｏＢ１  ｓｉＲＮＡ（５００ｎｇから３２ｐｇまで）を未処理の血漿試料に加えてスパイクし、次いで、Ｐａｒｉｓ  Ｋｉｔ抽出からｑＰＣＲへの試験試料と同様に処理することによって、標準曲線を生じさせた。試験試料を標準曲線と比較して、試験試料中に存在するｓｉＲＮＡの絶対量を生じさせた。
【０３８０】
臓器または組織中のｓｉＲＮＡのＰＫ研究のために、組織試料１０ｍｇから５０ｍｇを秤量し、ｍｉｒＶａｎａ（商標）Ｐａｒｉｓ（商標）Ｋｉｔ（製品番号４３６６５９６、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＥｘｉｑｏｎ  ｍｉＲＣＵＲＹ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−Ｔｉｓｓｕｅ（製品番号３００１１１）を使用して、ｓｉＲＮＡを抽出する。次いで、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（製品番号４３６６５９６、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＣｕｓｔｏｍ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡからのＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に特異的なＲＴプライマーを使用して、ＲＮＡを逆転写する。
【０３８１】
アッセイＩＤ  ＣＣＪ９ＶＯＲ（製品番号４５０００８、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。次いで、２Ｘ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ（製品番号４３２４０１８、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＣｕｓｔｏｍ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡアッセイ  ＩＤ  ＣＣＪ９ＶＯＲ（製品番号４５０００８、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からのｑＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒを使用して、定量ＰＣＲを行う。ｑＰＣＲ  Ｃｔ値を、内因性対照マウスｓｉＲＮＡ２０２（製品番号４３８０９１４、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）か、またはその発現が評定されるｓｉＲＮＡまたは送達剤によって影響を受けないと公知であるか、または考えられている適切な同様の内因性ｍｉＲＮＡに対して正規化する。既知の量のＡｐｏＢ１  ｓｉＲＮＡ（５００ｎｇから３２ｐｇ）を均質化された未処置の組織試料にスパイクし、次いで、Ｐａｒｉｓ  Ｋｉｔ抽出からｑＰＣＲへの試験試料のとおりに処理することによって、標準曲線を生じさせる。試験試料を標準曲線と比較して、標準曲線を試験試料中に存在する絶対量のｓｉＲＮＡを算出するために使用した。
【０３８２】
一例では、Ｈｅｐａ１−６異種移植片腫瘍を有するＮｕ／ｎｕマウスにコンジュゲート＃８１を０．３ｍｇ／ｋｇで、コンジュゲート＃６１を１．０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、かつ未コンジュゲートのＡｐｏＢ１ｓｉＲＮＡを３ｍｇ／ｋｇで投与した（全ての用量はｓｉＲＮＡに基づく）。肝臓、空腸、腎臓、肺および腫瘍からの組織を投与前、投与後１分目、５分目および１時間目に収集した。コンジュゲート＃６１および＃８１のそれぞれについて、種々の臓器それぞれにおける蓄積は、未コンジュゲートのｓｉＲＮＡ対照に対して１０〜１００倍高かった。コンジュゲート＃６１は、５分目がピークのｓｉＲＮＡの最も高い腫瘍蓄積を示し、かつ未コンジュゲートｓｉＲＮＡよりも約１００倍高かった。
【０３８３】
ｓｉＲＮＡコンジュゲートの用量依存性ノックダウン活性の決定に加えて、コンジュゲートに関連する毒性もまた評定した。肝臓パネル試験には、次のパラメーター：アルブミン、アルカリホスファターゼ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＣＫ、ＧＧＴ、総ビリルビン、直接ビリルビン、間接ビリルビンおよび総タンパク質の評定が包含された。これらのパラメーターにおける有意な物品関連変化を、毒性の指標または評定される試験物品に関連する耐容性の欠如についてモニタリングした。加えて、血漿中のＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ７０もまた、標準的なＥＬＩＳＡ方法によってアッセイして、コンジュゲートされたｓｉＲＮＡがインターフェロンまたは他の先天免疫応答、多くの場合に他の公知の全身ｓｉＲＮＡ送達技術に随伴する望ましくない出現を誘発したかどうかを決定した。マウスをまた、これらの研究の生存相を通して他の顕著または不利な臨床的徴候について観察した。
【０３８４】
一例では、マウスに、コンジュゲート＃８１を３ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡに基づく）で投与し、血液を投与後の４８時間目に採取した。生化学的分析によって、アルカリホスファターゼ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＣＫ、ＧＧＴ、総ビリルビン、直接ビリルビン、間接ビリルビンおよび総タンパク質を包含する血液生化学マーカーの有意な変化ならびに対照マウス（即ち、ビヒクルのみか、または未コンジュゲートのｓｉＲＮＡで処置されたマウス）に対するサイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の有意な変化は示されない。
【０３８５】
溶血反応または赤血球凝集に関連する他のパラメーターもまた、評定することができる。そのような毒性の機構は、ある種の送達ビヒクルに関連していることが公知である。
【０３８６】
本発明を実施するために、本発明者らには既知の最良の形態を含めた本発明の好ましい実施形態を本明細書では記載している。先行する記載を読めば、当業者には、これらの好ましい実施形態の変形形態は明らかになるはずである。本発明者らは、当業者がそのような変形形態を適切に使用することを期待しており、かつ本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されているのとは別に実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用可能な法律によって許される限り、本明細書に添付されている特許請求の範囲に列挙されている主題の全ての変更形態および均等物を包含する。さらに、本明細書に別段に示されていない限り、または別段に内容によって明確に矛盾していない限り、そのあらゆる可能な変形形態における上記の要素の任意の組合せが本発明に包含される。
【０３８７】
均等物
本発明は、その主旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態で実施することができる。したがって、前述の実施形態はあらゆる点で、本明細書に記載されている本発明を限定するものではなく、例示するものであるとみなされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の明細書ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および均等性の範囲内にある変更形態は全て、本明細書に包含されるものとする。
【国際調査報告】
2013528665.tif 000098
2013528665.tif 000099