(57)【要約】    【課題】任意の所望の臓器から成体臓器幹細胞を単離するために用いることができ、単離された幹細胞の分化能と相関する、成体臓器幹細胞のマーカを同定し、かかるマーカを用いた成体臓器幹細胞やその使用方法を提供することを課題とする。    【解決手段】造血幹細胞、心臓幹細胞、および腎臓幹細胞をはじめとする単離された成体臓器幹細胞の組成物が、開示される。特に本発明は、成体臓器組織から単離され得るｃ−ｋｉｔ陽性系列陰性（ｌｉｎｅａｇｅ  ｎｅｔａｇｉｖｅ）成体幹細胞を提供する。そのような幹細胞は、単離された臓器組織の細胞系列全てを生成することが可能である。損傷臓器組織を単離された臓器幹細胞で修復する方法も、開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする患者の損傷腎組織を修復および／または再生する方法であって、単離された成体腎臓幹細胞を前記患者に投与することを含み、成体腎臓幹細胞が、前記腎臓組織標本から単離され、系列陰性でｃ−ｋｉｔ陽性であり、前記腎臓幹細胞が、成体腎臓の１種以上の細胞型を生成し、それにより前記損傷組織を修復および／または再生する、前記方法。
【請求項２】
前記単離された成体腎臓幹細胞が、損傷組織に投与される前に培養により増殖される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
損傷組織が、急性腎傷害から生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
損傷組織が、虚血事象から生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
損傷組織が、慢性腎疾患から生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
単離された成体腎臓幹細胞が、損傷組織に投与される前に１種以上のサイトカインに暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
腎臓組織標本が、患者から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
単離された成体腎臓幹細胞が、腎臓静脈または腎臓動脈を通して患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
単離された成体腎臓幹細胞が、腎臓組織への直接の注射により患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
治療有効量の単離された成体腎臓幹細胞および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物であって、前記単離された成体腎臓幹細胞が、ｃ−ｋｉｔ陽性で系列陰性であり成体腎臓組織から単離される、前記医薬組成物。
【請求項１１】
単離された成体腎臓幹細胞が、腎臓細胞系列の１種以上を生成することが可能である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
単離された成体腎臓幹細胞を約２×１０４〜約２×１０７個を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
常在性成体幹細胞を成体臓器から単離する方法であって、
前記臓器からの組織標本を培養し、それにより組織外移植片を形成すること；
培養された外移植片からｃ−ｋｉｔ陽性である細胞を選択すること；および
前記ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を単離すること、を含み、
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、常在性成体幹細胞である、前記方法。
【請求項１４】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、系列陰性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、前記成体臓器の細胞系列の１種以上を生成することが可能である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞を培養により増殖させることを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記成体臓器が、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、腸、肺、胃、脳、網膜、食道、膀胱、表皮、または骨髄である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、クローン原性で多能性かつ自己再生性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
必要とする患者の臓器の損傷組織を修復および／または再生する方法であって、ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞を前記臓器の組織標本から単離すること、および前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞を損傷組織に投与すること、を含み、前記ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が分化された細胞を生成して、それが投与後に新しい臓器組織を集成（ａｓｓｅｍｂｌｅ）し、それにより損傷臓器を修復および／または再生する、前記方法。
【請求項２０】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、損傷組織に投与される前に培養により増殖される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、系列陰性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、前記成体臓器の細胞系列の１種以上を生成することが可能である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
臓器が、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、腸、肺、胃、脳、網膜、食道、膀胱、表皮、または骨髄である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
臓器が、脳である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
臓器が、肺である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、損傷組織に投与される前に１種以上のサイトカインに暴露される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞が、自家性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
治療有効量の単離された成体臓器幹細胞および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物であって、前記単離された成体臓器幹細胞が、ｃ−ｋｉｔ陽性で系列陰性であり成体臓器の組織から単離される、前記医薬組成物。
【請求項２９】
前記臓器が、肝臓、脾臓、膵臓、腸、肺、胃、脳、網膜、食道、膀胱、表皮、または骨髄である、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記臓器が、脳である、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記臓器が、肺である、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記単離された成体臓器幹細胞が、前記成体臓器の細胞系列の１種以上を生成することが可能である、請求項２８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照  
本願は、全体が参照により本明細書に組み入れられた２０１０年１０月５日出願の米国特許出願第１２／８９８，３５０号への優先権を主張するものである。
【０００２】
連邦政府により資金援助を受けた研究によって創られた発明の権利表明
この事業は、一部が、米国国立衛生研究所からの助成金番号：ＨＬ−３８１３２、ＡＧ−１５７５６、ＨＬ−６５５７７、ＨＬ−５５７５７、ＨＬ−６８０８８、ＨＬ−７０８９７、ＨＬ−７６７９４、ＨＬ−６６９２３、ＨＬ−６５５７３、ＨＬ−０７５４８０、ＡＧ−１７０４２およびＡＧ−０２３０７１の助成金により、米国政府の支援を受けた。米国政府は、本発明に対して特定の権利を有し得る。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般に、幹細胞の生物学および再生医薬の分野に関する。特に本発明は、臓器組織を再生することが可能な様々な臓器から単離された成体幹細胞の組成物を提供する。本発明は、成体臓器幹細胞のそのような組成物を投与することにより損傷臓器組織を修復および／または再生する方法も含む。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
健常な成体の細胞全てが、身体の様々な区分に常在する前駆細胞として誕生する。これらの細胞は、プロジェニターと呼ばれる非常に未熟な細胞からも得られ、メチルセルロースまたは寒天などの半固形培地で１〜３週間培養して、細胞を連続したコロニーに発達させることにより、アッセイされる。プロジェニター細胞自体は、幹細胞と呼ばれるプロジェニター細胞の一分類から得られる。幹細胞は、分裂時に、プロジェニターへの自己再生および分化の両方の能力を有する。つまり幹細胞の分裂は、追加の原始幹細と、多少のより分化されたプロジェニター細胞の両方を生成する。幹細胞は、血液細胞の発達における幹細胞の周知役割に加えて、非限定的に肝臓、脳、および心臓をはじめとする他の組織に見出される細胞も生じる。
【０００５】
幹細胞は、無期限に分裂して、特異的細胞型に専門化する可能性を有する。卵子が受精して分裂し始めた後に存在する全能幹細胞（ｔｏｐｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）は、全体的な潜在能力を有し、任意の細胞型になることができる。細胞が胞胚段階に達すると、細胞の潜在能力が低下し、それでも体内の任意細胞に発達することができるが、それらは胚の発達に必要な支持細胞に発達することはできない。その細胞は、依然として多くの細胞型に発達し得るため、万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）とみなされる。発生の間に、これらの細胞はより専門化されるようになり、特異的機能を有する細胞を生じるよう分化決定する。多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）とみなされるこれらの細胞は、ヒト成人において見出され、成体幹細胞と呼ばれる。成体幹細胞は、骨髄、腸、皮膚、および脳をはじめとする様々な臓器中で同定された（Tumbar et al. (2004) Science, Vol. 303: 359-363; Moore and Lemischka (2006) Science, Vol. 311 : 1880-1885; and Naveiras and Daley (2006) Cell Mol Life Sci., Vol. 63: 760-766）。
【０００６】
幹細胞の再生性により、それらは、組織および臓器の潜在的な遺伝子操作のため、または変性疾患もしくは虚血事象から生じた損傷組織を修復するための、未活用の供給源とみなされてきた。しかし、成体幹細胞の同定、特徴づけ、および単離は、依然として不完全であり、そのような成体幹細胞が多くの臓器に存在するかについては、議論がある。つまり、当該技術分野において、任意の所望の臓器から成体臓器幹細胞を単離するために用いることができ、単離された幹細胞の分化能と相関する、成体臓器幹細胞のマーカを同定する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、一部として、ｃ−ｋｉｔマーカが、ホ乳類の成体臓器に常在する、強力な再生能を有する成体幹細胞の集団を同定するために用いられ得る、という発見に基づいている。例えば本発明人は、驚くべきことに、成体心筋内に常在するｃ−ｋｉｔ陽性心筋幹細胞の集団を見出した。これらのｃ−ｋｉｔ陽性心臓幹細胞を、心筋梗塞後の梗塞周囲の心筋に移植すると、それらが損傷領域に遊走して、筋細胞、内皮細胞および平滑筋細胞に分化し、その後、増殖して心筋、冠動脈、細動脈、および毛細血管をはじめとする構造を形成し、梗塞の構造的および機能的完全性を回復させる。本発明人は、成体腎臓内に常在するｃ−ｋｉｔ陽性腎幹細胞の集団も発見した。
【０００８】
したがって本発明は、再生能を有する成体臓器から、常在成体幹細胞を単離する方法を提供する。一実施形態において、その方法は、臓器の組織標本を培養し、それにより組織の外植片を形成すること；培養外植片からｃ−ｋｉｔ陽性である細胞を選択すること；および前記ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を単離すること、を含み、前記選択されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、常在性成体幹細胞である。単離されたｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、クローン原性で多能性かつ自己再生性である。幾つかの実施形態において、ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、単離される成体臓器の細胞系列の１種以上または全てを生成することが可能である。特定の実施形態において、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、系列陰性（ｌｉｎｅａｇｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）である。
【０００９】
本発明は、必要とする患者の臓器の損傷組織を修復および／または再生する方法も提供する。一実施形態において、その方法は、ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞を臓器の組織標本から単離すること、および単離されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞を損傷組織に投与すること、を含み、ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、分化された細胞を生成してそれが投与後に新しい臓器組織を集成（ａｓｓｅｍｂｌｅ）し、それにより損傷臓器を修復および／または再生する。幾つかの実施形態において、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、損傷組織に投与される前に培養で増殖される。特定の実施形態において、ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、系列陰性である。別の実施形態において、本発明の方法により修復および／または再生される損傷組織は、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、腸、肺、胃、脳、網膜、食道、膀胱、表皮、または骨髄からなる群より選択される臓器のものである。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、成体心筋から単離されたｃ−ｋｉｔ陽性心臓幹細胞を投与することにより、必要とする患者の損傷心筋を修復および／または再生する方法を提供する。幾つかの実施形態において、損傷心筋は、虚血事象、心筋梗塞、または心臓血管疾患、例えばアテローム性硬化症、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、先天性心臓血管欠損および動脈炎症、ならびに動脈、細動脈および毛細血管の他の疾患から生じる。特定の実施形態において、ｃ−ｋｉｔ陽性心臓幹細胞は、自家性である。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、成体腎臓から単離されたｃ−ｋｉｔ陽性腎臓幹細胞を投与することにより、必要とする患者の損傷腎臓組織を修復および／または再生する方法を提供する。幾つかの実施形態において、損傷腎臓組織は、急性腎傷害（例えば、虚血性、毒性、または免疫関連）から生じる。別の実施形態において、損傷腎臓組織は、ＩｇＡ腎症、間質性腎炎、ループス腎炎、アルポート症候群、腎不全、糸球体疾患、アミロイドーシスおよび腎疾患、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、髄質性海綿腎、多嚢胞性異形成腎、ネフローゼ症候群、多嚢胞性腎疾患、融合腎、尿細管アシドーシス、腎血管性の病気、単純性腎嚢胞、単腎、尿細管または嚢胞性腎障害から生じる。特定の実施形態において、ｃ−ｋｉｔ陽性腎臓幹細胞は、自家性である。
【００１２】
本発明は、単離された成体臓器幹細胞および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物も含み、前記単離された成体臓器幹細胞は、ｃ−ｋｉｔ陽性で系列陰性であり成体臓器の組織から単離される。単離された成体臓器幹細胞は、単離された成体臓器の細胞系列の１種以上を生成させることができる。一実施形態において、ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、心臓から単離される。別の実施形態において、ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、腎臓から単離される。
【００１３】
本発明は、損傷臓器組織を修復および／または再生する際に使用される本発明の医薬組成物を含むキットも提供する。
【００１４】
本発明は、ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞および臓器組織をインビトロで、場合によりサイトカインの存在下で培養する、臓器組織をエクスビボで生成および／または再生する手段も提供する。ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、単離された臓器の細胞系列の１種以上または全てに分化して、インビトロで増殖し、臓器組織および／または細胞を形成する。これらの組織および細胞が、臓器構造を集成してもよい。インビトロで形成された組織および／または細胞は、その後、例えばグラフトを介して、患者に移植されて、損傷臓器組織に構造的および機能的完全性を回復させることができる。
【００１５】
本開示において、「含む」、「含んでいる」、「含有する」、および「有する」などは、米国特許法に基づく意味を有することができ、「包含する」、「包含している」などを意味することができ；同様に「本質的に〜からなっている」または「本質的に〜からなる」は、米国特許法に基づく意味を有し、その用語は、制約はなく、引用されたものの基本的または新規な特徴が、引用されたもの以外の存在により変更せず、先行技術の実施形態を除外しない限り、引用されたもの以外の存在が可能である。
【００１６】
本発明の方法は、医薬活性の侵害的例外が、生命工学の特許に違反するプロセスの実践に適用されないことを前提として、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２８７（ｃ）（２）（Ａ）（iii）の下で生命工学的方法とみなされる。
【００１７】
これらおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明に開示されるか、またはそれから明白となりそれに包含される。
【００１８】
以下の詳細な説明は、実施例により本発明を説明するために示されており、本発明を記載された具体的な実施形態に限定する意図はなく、参照により本明細書に組み入れられた添付の図面と一緒に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ｃ−ｋｉｔ発現に基づくＦＡＣＳにより選別されたＥＧＦＰトランスジェニックマウスのＬｉｎ−骨髄細胞を示すｌｏｇ−ｌｏｇプロットを示す（ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞の比率（上のゲート）は、６．４％であった。ｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞は、下のゲートに示される。ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞は、ｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞よりも１〜２ｌｏｇ高輝度であった）。
【図２】ＡはＭＩ誘発マウスの組織断片の写真を示す（写真は、骨髄のＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を注射された心筋梗塞（ＭＩ）の領域（矢印）、残存する生存可能な心筋（ＶＭ）、および再生心筋（矢じり）を示す。倍率は、１２倍である）。ＢはＭＩの領域を中心とする、図２Ａの同じ組織断片のより高倍率での写真を示し、倍率は５０倍である。Ｃ及びＤはＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を注射されたＭＩの領域の低倍率および高倍率での組織断片の写真を示し、２Ｃの倍率は２５倍、２Ｄの倍率は５０倍である。ＥはＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞を注射されたＭＩの領域の組織断片の写真を示し、わずかな治癒が明らかであり、倍率は５０倍である（＊壊死筋細胞。赤色＝心臓ミオシン；  緑色＝核のＰＩ標識）。
【図３】Ａ〜ＣはＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を注射されたＭＩの領域を示す、ＭＩ誘発マウスの組織断片の写真を示す（心内膜（ＥＮ）から心外膜（ＥＰ）までの再生心筋の断片が目視できる。写真は全て、心内膜下組織内の梗塞組織（ＩＴ）および心内膜下組織内の温存された（ｓｐａｒｅｄ）筋細胞（ＳＭ）の存在を示すように標識されている）。図３Ａは、ＥＧＦＰの存在を示すように染色されている（緑色）。倍率は、２５０倍である。図３Ｂは、心臓ミオシンの存在を示すように染色されている（赤色）。倍率は、２５０倍である。図３Ｃは、ＥＧＦＰおよびミオシンの両方（赤緑色）の存在に加え、ＰＩ染色された核（青色）を示すように染色されている。倍率は、２５０倍である）；
【図４】Ａは左心室拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）、発生圧（ＬＶＤＰ）、ＬＶ＋圧力上昇速度（ｄＰ／ｄｔ）、およびＬＶ−圧力下降速度（ｄＰ／ｄｔ）に及ぼす心筋梗塞の影響を表すグラフを示す（左から右に向かって、バーは、偽手術マウス（ＳＯ、ｎ＝１１）；Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞を注射されていないマウス（ＭＩ、Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞を注射されたｎ＝５；注射されていないｎ＝６）；Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を注射されたマウス（ＭＩ＋ＢＭ、ｎ＝９）を示す。エラーバーは、標準偏差である。*† ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＳＯおよびＭＩ）；Ｂは心臓の筋肉におけるＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞分化および機能的関連のために提案されたスキームの図面を示す。
【図５】Ａ〜ＩはＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を注射されたＭＩの領域の再生心筋を表すＭＩ誘発マウスの組織断片の写真を示す（図５Ａは、ＥＧＦＰの存在を示すように染色されている（緑色）。倍率は、３００倍である。図５Ｂは、細動脈中のα−平滑筋アクチンの存在を示すように染色されている（赤色）。倍率は、３００倍である。図５Ｃは、ＥＧＦＰおよびα−平滑筋アクチンの両方（黄緑色）の存在に加え、ＰＩ染色された核（青色）の存在を示すように染色されている。倍率は、３００倍である。図５Ｄ〜ＦおよびＧ〜Ｉは、心臓ミオシン陽性細胞中のＭＥＦ２およびＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５の存在を表す。図５Ｄは、ＰＩ染色された核（青色）を示す。倍率は、３００倍である。図５Ｅは、ＭＥＦ２およびＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５の標識を示すように染色されている（緑色）。倍率は、３００倍である。図５Ｆは、心臓ミオシン（赤色）およびＰＩによるＭＥＦ２またはＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５（核内は高輝度蛍光色）を示すように染色されている。倍率は、３００倍である。図５Ｇは、ＰＩで染色された核を示す（青色）。倍率は、３００倍である。図５Ｈは、ＭＥＦ２およびＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５の標識（緑色）を示すように染色されている。倍率は、３００倍である。図５Ｉは、心臓ミオシン（赤色）およびＰＩによるＭＥＦ２またはＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５（核内は高輝度蛍光色）を示すように染色されている。倍率は、３００倍である）；
【図６】Ａ〜ＦはＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を注射されたＭＩの領域内の心筋の再生を示す、ＭＩ誘発マウスの組織断片の写真を示す（図６Ａ〜Ｃは、ＢｒｄＵへの抗体の存在下でインキュベートされた組織を示す。図６Ａは、ＰＩで標識された核を示すように染色されている（青色）。倍率は、９００倍である。図６Ｂは、ＢｒｄＵおよびＫｉ６７で標識された核を示すように染色されている（緑色）。倍率は、９００倍である。図６Ｃは、α−筋節アクチンの存在を示すように染色されている（赤色）。倍率は、９００倍である。図６Ｄ〜Ｆは、Ｋｉ６７への抗体の存在下でインキュベートされた組織を示す。図６Ｄは、ＰＩで標識された核を示すように染色されている（青色）。倍率は、５００倍である。図６Ｅは、ＢｒｄＵおよびＫｉ６７で標識された核を示すように染色されている（緑色）。倍率は、５００倍である。図６Ｆは、α−平滑筋アクチンの存在を示すように染色されている（赤色）。倍率は、５００倍である。高輝度蛍光色：ＰＩとＢｒｄＵ（Ｃ）またはＫｉ６７（Ｆ）の組み合わせ）；
【図７】Ａ〜Ｃは、Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を注射されたＭＩの領域を示す、ＭＩ誘発マウスの組織断片の写真を示す（梗塞を起こした非修復の組織により分離されている、境界域、生存可能な心筋（ＶＭ）および心筋の新しいバンド（ＮＢ）が、表されている（矢印））。図７Ａは、ＥＧＦＰの存在を示すように染色されている（緑色）。倍率は、２８０倍である。図７Ｂは、心臓ミオシンの存在を示すように染色されている（赤色）。倍率は、２８０倍である。図７Ｃは、ＥＧＦＰおよびミオシンの両方（赤緑色）、ならびにＰＩで染色された核（青色）の両方の存在を示すように染色されている。倍率は、２８０倍である）；
【図８】Ａ〜ＦはＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を注射されたＭＩの領域の再生心筋を示す、ＭＩ誘発マウスの組織断片の写真を示す（図８Ａは、ＥＧＦＰの存在を示すように染色されている（緑色）。倍率は、６５０倍である。図８Ｂは、心臓ミオシンの存在を示すように染色されている（赤色）。倍率は、６５０倍である。図８Ｃは、ＥＧＦＰおよびミオシン（黄色）、ならびにＰＩで染色された核（青色）の両方の存在を示すように染色されている。倍率は、６５０倍である。図８Ｄは、ＥＧＦＰの存在を示すように染色されている（緑色）。倍率は、６５０倍である。図８Ｅは、細動脈内のα−平滑筋アクチンの存在を示すように染色されている（赤色）。倍率は、６５０倍である。図８Ｆは、ＥＧＦＰおよびα−平滑筋アクチンの両方（黄赤色）、ならびにＰＩで染色された核（青色）の存在を示すように染色されている。倍率は、６５０倍である）；
【図９】Ａ〜ＣはＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を注射されたＭＩの領域を示し、再生心筋を示す（矢じり）、ＭＩ誘発マウスの組織断片の写真を示す（図９Ａは、心臓ミオシンの存在を示すように染色されている（赤色）。倍率は、４００倍である。図９Ｂは、Ｙ染色体の存在を示すように染色されている（緑色）。倍率は、４００倍である。図９Ｃは、Ｙ染色体（水色）およびＰＩで標識された核（暗青色）の両方の存在を示すように染色されている。心内膜下組織中の梗塞組織（ＩＴ）および心外膜下組織の温存された筋細胞（ＳＭ）中にＹ染色体が存在しないことに留意されたい。倍率は、４００倍である）；
【図１０】Ａ〜Ｃは心臓ミオシン陽性細胞におけるＧＡＴＡ−４を示す、ＭＩ誘発マウスの組織断片の写真を示す（図１０Ａは、ＰＩで染色された核を示す（青色）。倍率は、６５０倍である。図１０Ｂは、ＧＡＴＡ−４標識の存在を示す（緑色）。倍率は、６５０倍である。図１０Ｃは、ＧＡＴＡ−４およびＰＩ（核内の高輝度蛍光色）と組み合わせて心臓ミオシン（赤色）を示すように染色されている。倍率は、６５０倍である）；
【図１１】Ａ〜ＤはＭＩ誘発マウスの組織断片の写真を示す（図１１Ａは、梗塞組織と生存組織の間の境界域を示す。倍率は、５００倍である。図１１Ｂは、再生心筋を示す。倍率は、８００倍である。図１１Ｃは、コネキシン４３（黄緑色）の存在を示すように染色されており、筋細胞間の接触を、矢印で示している。倍率は、８００倍である。図１１Ｄは、α−筋節アクチン（赤色）およびＰＩで染色された核（青色）の両方を示すように染色されている。倍率は、８００倍である）；
【図１２】Ａ〜ＢはＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を注射されたＭＩの領域を示す、ＭＩ誘発マウスの組織断片の写真を示し、再生心筋を示す（図１２Ａは、心臓ミオシン（赤色）およびＰＩで標識された核（黄緑色）の存在を示すように染色されている。倍率は、１０００倍である。図１２Ｂは、図１２Ａと同様で、倍率が７００倍である）；
【図１３】Ａ〜ＢはＭＩ誘発マウスの組織断片の写真を示す（図１３Ａは、サイトカインで処置されたマウスにおける大きな梗塞（ＭＩ）を（倍率は、５０倍である）、形成している心筋（矢じり）と共により高倍率で示す（隣のパネル−８０倍）。図１３Ｂは、非処置マウスにおけるＭＩを示す。治癒は、全体的梗塞を含む（矢じり）（倍率は、５０倍である）。瘢痕化が、より高倍率で認められる。（隣のパネル−８０倍）。赤色＝心臓ミオシン；黄緑色；ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で核を標識；青紫色＝コラーゲンＩ型およびIII型）；
【図１３Ｃ】処置および非処置ＭＩ誘発マウスにおける死亡率および心筋再生率を示すグラフを示す（サイトカインを処置された梗塞マウス、ｎ＝１５；非処置の梗塞マウス、ｎ＝５２、ログランク検定：ｐ＜０．０００１）；
【図１４】梗塞サイズの定量的測定を示すグラフを示す（梗塞または偽手術後２７日目の屠殺の際の、偽手術のマウス（ＳＯ、ｎ＝９）、梗塞非処置マウス（ＭＩ、ｎ＝９）、およびサイトカイン処置マウス（ＭＩ−Ｃ、ｎ＝１１）の左心室自由壁（ＬＶＦＷ）の筋細胞の総数。筋細胞喪失の百分比は、梗塞サイズである。Ｘ±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＳＯ）；
【図１５】Ａ〜Ｃは心筋梗塞の態様、心臓の解剖学的構造および機能を比較したグラフを示す（図１５Ａ〜Ｃは、手術後２７日目の屠殺時のＬＶ寸法を示す；偽手術（ＳＯ、ｎ＝９）、非処置の梗塞（ＭＩ、ｎ＝９）およびサイトカインで処置された梗塞（ＭＩ−Ｃ、ｎ＝１０）；
【図１５Ｄ】超音波心臓検査によるＥＦを示す（ＳＯ、ｎ＝９；ＭＩ、ｎ＝９；およびＭＩ−Ｃ、ｎ＝９）；
【図１５−１】Ｅ〜ＭはＳＯ（ｅ〜ｇ）、ＭＩ（ｈ〜ｊ）およびＭＩ−Ｃ（ｋ〜ｍ）のＭモード超音波心臓検査を示す（新たに形成された収縮心筋（矢印））；
【図１５Ｎ】壁応力を示すグラフを示す；ＳＯ（ｎ＝９）、ＭＩ（ｎ＝８）およびＭＩ−Ｃ（ｎ＝９）（結果は、平均±ＳＤ。＊＊＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  それぞれＳＯおよびＭＩ）；
【図１６−１】Ａ〜Ｄは心筋梗塞の態様、心臓の解剖学的構造および機能を表すグラフを示す（図１６Ａ〜Ｄは、（ＳＯ、ｎ＝９）、（ＭＩ、ｎ＝９）および（ＭＩ−Ｃ、ｎ＝９）での超音波心臓検査によるＬＶＥＳＤ（ａ）、ＬＶＥＤＤ（ｂ）、ＰＷＳＴ（ｃ）およびＰＷＤＴ（ｄ）を示す。
【図１６−２】図１６Ｅ〜Ｇは、（ＳＯ、ｎ＝９）、（ＭＩ、ｎ＝９）および（ＭＩ−Ｃ、ｎ＝１０）での、屠殺の際に解剖学的に測定された壁厚（ｅ）、腔直径（ｆ）および長軸（ｇ）を示す。＊＊＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  それぞれＳＯおよびＭＩ；
【図１６−３】Ｈ〜ＰはＳＯ（ｈ〜ｊ）、ＭＩ（ｋ〜ｍ）およびＭＩ−Ｃ（ｎ〜ｐ）の２次元（２Ｄ）画像およびＭモードトレーシングを示す；
【図１７】Ａ〜Ｄは心室機能の態様を表しているグラフを示す（図１７Ａ〜Ｄは、梗塞または偽手術後２７日目に麻酔下に屠殺されたマウスのＬＶ血行動態を示す；（ＳＯ（ｎ＝９）、ＭＩ（ｎ＝９）およびＭＩ−Ｃ（ｎ＝１０）。記号および統計については、図１３も参照）；
【図１８−１】Ａ〜Ｃは心筋再生の態様のグラフを示す（図１８Ａは、ＭＩおよびＭＩ−Ｃにおいて２７日目のＬＶＦＷの、残留している生存可能な心筋（Ｒｅ）、喪失された心筋（Ｌｏ）および新たに形成された心筋（Ｆｏ）、ＳＯ、梗塞を伴わない心筋として、組織中の細胞を分類している。図１８Ｂは、温存された心筋の細胞肥大の量を示す。図１８Ｃは、再生心筋における細胞増殖を示す。ＢｒｄＵおよびＫｉ６７により標識された筋細胞（Ｍ）、ＥＣおよびＳＭＣ；ｎ＝１１。＊＊＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＭおよびＥＣ。
【図１８−２】図１８Ｄ〜Ｅは、形成された心筋内の筋細胞の容積、数（ｎ＝１１）および分類の分布（バケットサイズ、１００μｍ３；ｎ＝４，４００）を表す；
【図１８−３】Ｆ〜ＨはＴＥＲ−１１９で標識された赤血球膜（緑色蛍光）を有する細動脈を表すＭＩ誘発マウスの組織断片の写真を示す；青色蛍光＝ＰＩでの核の染色；赤色蛍光＝ＳＭＣにおけるα−平滑筋アクチン（図１８Ｆは、８００倍に拡大されている。図１８Ｇ〜Ｈは、１，２００倍に拡大されている）；
【図１９】Ａ〜ＤはＫｉ６７（Ａ、Ｂ）およびＢｒｄＵ（Ｃ、Ｄ）への抗体と共にインキュベートされたＭＩ誘発マウスの組織断片の写真を示す（図１９Ａは、心臓ミオシンによる筋細胞の標識を示す。核の高輝度蛍光は、ＰＩとＫｉ６７との組み合わせを表している。倍率は、８００倍である。図１９Ｂは、α−平滑筋アクチンによるＳＭＣの標識を示す。核の高輝度蛍光は、ＰＩとＫｉ６７との組み合わせを表している。倍率は、１，２００倍である。図１９Ｃは、α−平滑筋アクチンによるＳＭＣの標識を示す。核の高輝度蛍光は、ＰＩとＢｒｄＵとの組み合わせを表している。倍率は、１，２００倍である。図１９Ｄは、第VIII因子による、形成している心筋の中のＥＣ標識を示す。核の高輝度蛍光は、ＰＩとＢｒｄＵとの組み合わせを表している。倍率は、１，６００倍である）；
【図２０】Ａ〜Ｆは分化している心臓細胞のマーカを示すＭＩ誘発マウスの組織断片の写真を示す（図２０Ａは、ネスチンにより筋細胞の標識を示すように染色されている（黄色）。赤色蛍光は、心臓ミオシンを示す。倍率は、１，２００倍である。図２０Ｂは、デスミンの標識を示すように染色されている（赤色）。倍率は、８００倍である。図２０Ｃは、コネキシン４３の標識を示すように染色されている（緑色）。赤色蛍光は、心臓ミオシンを示す。倍率は、１，４００倍である。図２０Ｄは、ＶＥ−カドヘリンを示し（矢印）、黄緑色蛍光は、ｆｌｋ−１によるＥＣの標識を表す（矢印）。倍率は、１，８００倍である。図２０Ｅは、ＥＣにおける第VIII因子を示す赤色蛍光を示し、黄緑色蛍光は、ｆｌｋ−１によるＥＣの標識を表す（矢印）。倍率は、１，２００倍である。図２０Ｆは、ｆｌｋ−１によるＳＭＣ細胞質の緑色蛍光標識およびｆｌｋ−１により標識された内皮内層を示す。赤色蛍光は、α−平滑筋アクチンを示す。青色蛍光は、ＰＩでの核の標識を示す。倍率は、８００倍である）；
【図２１】Ａ〜ＣはＭＩ誘発マウスの組織断片を示す（図２１Ａは、高輝度蛍光を用いて、ＰＩでの核の標識とＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５との組み合わせを表している。倍率は、１，４００倍である。図２１Ｂは、高輝度蛍光を用いて、ＰＩでの核の標識とＧＡＴＡ−４との組み合わせを表している。倍率は、１，２００倍である。図２１Ｃは、高輝度蛍光を用いて、ＰＩでの核の標識とＭＥＦ２との組み合わせを表している。倍率は、１，２００倍である（赤色蛍光は、心臓ミオシン抗体の染色を示し、青色蛍光は、ＰＩでの核の標識を表す。Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４およびＭＥＦ２により標識された筋細胞の核の比率は、それぞれ６３±５％（抽出された核＝２，７９０；ｎ＝１１）、９４±９％（抽出された核＝２，８１０；ｎ＝１１）および８５±１４％（抽出された核＝３，０９０；ｎ＝１１）であった）；
【図２２Ａ−Ｆ】正常な心臓、増殖因子での処置および非処置の梗塞心臓における心臓原始細胞を示す共焦点顕微鏡像である。図２２Ａ〜Ｆは、偽手術マウスの心房心筋の断片を示す。図２２ＡとＢ、２２ＣとＤ、ならびに２２ＥとＦは、異なる染色剤を用いた心房心筋の同領域を示す顕微鏡像の対である。ｃ−Ｍｅｔ（２２Ａ、黄色）は、ｃ−ｋｉｔｐｏｓ（２２Ｂ、緑色）細胞（２２Ｂ、黄緑色）内で発現されている。同様にＩＧＦ−ＩＲ（２２Ｃ、黄色）は、ＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｄ、緑色）細胞（２２Ｄ、黄緑色）内で検出されている。ｃ−Ｍｅｔ（２２Ｅ、赤色）およびＩＧＦ−ＩＲ（２２Ｅ、黄色）の共局在が、ＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｆ、緑色）細胞（２２Ｆ、赤黄緑色）において見出される。矢印は、ｃ−ｋｉｔｐｏｓおよびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞におけるｃ−ＭｅｔおよびＩＧＦ−ＩＲを指す。筋細胞の細胞質は、赤紫色に染色され、心臓ミオシンを含む。
【図２２Ｇ−Ｈ】２２Ｇ：黄色の線が、増殖因子で処置されたマウスにおいて、アポトーシスの筋細胞（高輝度の核、ＰＩおよびヘパリン１）を有する梗塞心筋（ＭＩ）を、生存可能な筋細胞（青色の核、ＰＩのみ）を有する境界域（ＢＺ）から分離している。生存可能なｃ−ｋｉｔｐｏｓ細胞（青色の核、ＰＩ；ｃ−ｋｉｔ、緑色）が、ＭＩおよびＢＺ内に存在する（矢印）。筋細胞の細胞質は、赤色に染色され、心臓ミオシンを含む。２２Ｈ：黄色の線は、増殖因子で処置されたマウスにおいて、壊死筋細胞（高輝度の核、ＰＩおよびヘパリン２）を有するＭＩを、生存可能な筋細胞（青色の核、ＰＩのみ）を有するＢＺから分離している。生存可能なＭＤＲ１ＰＯＳ細胞（青色の核、ＰＩ；ＭＤＲ１、緑色）が、ＭＩおよびＢＺ内に存在する（矢印）。筋細胞の細胞質は、赤色に染色され、心臓ミオシンを含む。
【図２２Ｉ−Ｊ】２２Ｉおよび２２Ｊ；アポトーシス筋細胞（２２Ｉおよび２２Ｊ、高輝度の核、ＰＩおよびヘパリン１）およびｃ−ｋｉｔｐｏｓ（２２Ｉ、緑色の環）およびＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｊ、緑色の環）細胞は、２種の非処置マウスの梗塞領域において、アポトーシスを受けている（２２Ｉおよび２２Ｊ、高輝度の核、ＰＩおよびヘパリン１；矢印）。生存可能な細胞は、青色の核を有する（ＰＩのみ）。生存可能なｃ−ｋｉｔｐｏｓ細胞が、梗塞心筋内に存在する（２２Ｉ、緑色の環、青色の核、ＰＩのみ；矢じり）。筋細胞の細胞質は、赤色に染色され、心臓ミオシンを示す。
【図２２Ｋ−Ｌ】２２Ｋおよび２２Ｌ：ｃ−ｋｉｔｐｏｓ（２２Ｋ、緑色の環；矢印）およびＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｌ、緑色の環；矢印）細胞が、増殖因子で処置されたマウスの梗塞心筋内に存在する（黄色の点は、アポトーシスの核である）。ｃ−ｋｉｔｐｏｓ（２２Ｋ）およびＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｌ）細胞内の高輝度蛍光は、核のＫｉ６７標識に対応する。２２Ａ〜Ｌ、バー＝１０μｍ。
【図２２Ｍ】手術後７〜８時間目および増殖因子（処置）または生理食塩水（ＳＯ、非処置）の投与後２〜３時間目に屠殺された偽手術マウス（ＳＯ）、梗塞処置マウス（処置）および梗塞非処置マウス（非処置）における心臓の様々な領域の生存可能な、および死滅したｃ−ｋｉｔｐｏｓ（２２Ｍ）およびＭＤＲ１ＰＯＳ（２２Ｎ）細胞の分布を表すグラフである。略語は、以下の通りである：Ａ、心房；ＬＶ、左心室；Ｒ、梗塞から遠隔の生存可能な心筋；Ｂ、梗塞に隣接する生存可能な心筋；Ｉ、生存可能でない梗塞心筋。２２Ｍおよび２２Ｎの両方の結果は、平均±ＳＤとして表される。＊＊＊は、Ｐ＜０．０５  ｖｓ  それぞれＳＯおよびｖｓ処置を示す。
【図２２Ｎ】同上。
【図２３Ａ】は、梗塞のサイズおよび左心室の血行動態の評価を表すグラフである。結果は、平均±ＳＤとして表される。＊＊＊は、Ｐ＜０．０５  ｖｓ  それぞれ偽手術マウス（ＳＯ）および非処置梗塞マウス（ＭＩ）を意味する。略語は、以下の通りである：ＭＩ−Ｔ，処置された梗塞マウス；ＬＶ、左心室および中隔。２３Ａ：梗塞サイズに及ぼす、生存する心筋中の心肥大の影響および時間を経た壊死領域の治癒の影響を最小にするために、梗塞寸法は、左心室および中隔内の筋細胞の喪失により測定した。この測定は、生存可能な組織内の反応性肥大（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｈｙｐｒｅｔｒｏｐｈｙ）および瘢痕形成を伴う壊死心筋の縮小とは独立している（８７）。
【図２３Ｂ】２３Ｂ：ＬＶ血行動態の評価は、ＬＶ拡張終期圧、ＬＶ発生圧、ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔおよびＬＶ−ｄＰ／ｄｔのデータにより表されている。
【図２３Ｃ−Ｄ】非処置マウス（２３Ｃおよび２３Ｄ）および２匹の処置マウス（２３Ｅ〜２３Ｈ）における左心室の大きな梗塞を表す共焦点顕微鏡像である。２３Ｃ、２３Ｅおよび２３Ｇ（バー＝１ｍｍ）のゲートにより画定された領域は、２３Ｄ、２３Ｆおよび２３Ｈ（バー＝０．１ｍｍ）ではより高倍率で示されている。２３Ｃおよび２３Ｄにおいて、心筋再生の欠如が、壁の梗塞領域におけるコラーゲンＩ型およびコラーゲンIII型（青色）の蓄積により示される（矢印）。温存された筋細胞および炎症細胞の核が、明示されている（緑色、ＰＩ）。生存可能な筋細胞の小さい層が、心外膜下組織内に存在する（赤色、心臓ミオシン）。
【図２３Ｅ−Ｆ】２３Ｅ〜２３Ｈにおいて、筋細胞の再生が、心臓ミオシン抗体の赤色蛍光により示される。コラーゲンＩ型およびIII型の小さな病巣（青色、矢じり）が、梗塞領域において検出された。核は、黄緑色（ＰＩ）である。略語は、以下の通りである：ＩＳ、心室中隔；ＭＩ、心筋梗塞；ＲＶ、右心室。
【図２３Ｇ−Ｈ】同上。
【図２４Ａ−Ｄ】冠動脈結さつ前および結さつ後１５日目の１つのマウス心臓の超音波心臓検査結果を示す。共焦点顕微鏡検査は、同じ心臓の断面図を示す。２４Ａは、冠動脈結さつ前のベースライン超音波心臓検査結果を示す。２４Ｂおよび２４Ｃは、２４Ａおよび２４Ｄで評価された心臓断面の低倍率（２４Ｂ、バー＝１ｍｍ）および高倍率（２４Ｃ、バー＝０．１ｍｍ）での共焦点顕微鏡検査を示す。用いられた略語は、以下の通りである：ＲＶ、右心室；ＩＳ、心室中隔；ＭＩ、心筋梗塞。２４Ｄは、梗塞後１５日目の同じ心臓の収縮機能の超音波心臓検査による証拠資料を示す（矢じり）。
【図２４Ｅ】２４Ｅは、平均±ＳＤとして報告された結果を含む駆出率を表すグラフである。＊＊＊は、Ｐ＜０．０５  ｖｓ  それぞれ偽手術マウス（ＳＯ）および非処置梗塞マウス（ＭＩ）。ＭＩ−Ｔは、処置された梗塞マウスを指す。
【図２５Ａ−Ｂ】再生筋細胞の特性を詳述する共焦点顕微鏡像を示す。これらの特性は、２５Ｇ〜Ｊのグラフにおいて定量される。２５Ａおよび２５Ｂは、増殖因子で処置された心臓の梗塞心室の再生部分（２５Ａ）および生存する心筋（２５Ｂ）の酵素溶解された筋細胞を示す。２５Ａは、小さな筋細胞（赤色、心臓ミオシン）、高輝度の核（ＰＩおよびＢｒｄＵ）、および青色の核（ＰＩのみ）を示すように染色されている。２５Ｂは、大きな肥大筋細胞（赤色、心臓ミオシン）、高輝度の核（ＰＩおよびＢｒｄＵ）および青色の核（ＰＩのみ）を示す。２５Ａおよび２５Ｂの両方において、バーは、５０μｍである。
【図２５Ｃ−Ｊ】新しい筋細胞（２５Ｃおよび２５Ｄ）および温存された筋細胞（２５Ｅおよび２５Ｆ）の機械的特性が、梗塞後に増殖因子で処置されたマウスにおいて示されている。Ｒは、筋細胞の弛緩状態を指し、Ｃは、収縮状態である。細胞短縮（ｃｅｌｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）（Ｇ）、短縮の速度（Ｈ）、最大短縮までの時間（Ｉ）および５０％再延長までの時間（Ｊ）が、Ｎ（新しい小筋細胞）およびＳ（温存された肥大筋細胞）のために示された結果により表される。結果は、平均±ＳＤとして表されている。＊は、Ｐ＜０．０５  ｖｓ  Ｓの値を示す。
【図２６Ａ−Ｆ】成熟した筋細胞の様々なマーカを示す共焦点顕微鏡像の対を示す（２６Ａ〜２６Ｎ、バー＝１０μｍ）。２６Ａ〜２６Ｆにおいて、核のＢｒｄＵ標識が、２６Ａ、２６Ｃおよび２６Ｅにおいて緑色として示され、ネスチン（２６Ｂ、赤色）、デスミン（２６Ｄ、赤色）、心臓ミオシン（２６Ｆ、赤色）の局在化が、再生心筋の組織断片の筋細胞において示される。核は、２６Ｂ、２６Ｄおよび２６Ｆ（青色）においてＰＩのみにより標識され、そして２６Ｂ、２６Ｄおよび２６Ｆ（高輝度）においてＢｒｄＵおよびＰＩにより一緒に標識している。
【図２６Ｇ−Ｊ】２６Ｇ〜２６Ｎは、発生している心筋の断片（２６Ｇ〜２６Ｊ）および単離された筋細胞の断片（２６Ｋ〜２６Ｎ）において、コネキシン４３（２６Ｇ、２６Ｈ、２６Ｋおよび２６Ｌ、黄色）およびＮ−カドヘリン（２６Ｉ、２６Ｊ、２６Ｍおよび２６Ｎ、黄色）の同定を示している。筋細胞は、心臓ミオシン（２６Ｈ、２６Ｊ、２６Ｌおよび２６Ｎ、赤色）により染色され、核は、ＢｒｄＵのみ（２６Ｇ、２６Ｉ、２６Ｋおよび２６Ｍ、緑色）、ＰＩのみ（２６Ｈおよび２６Ｊ、青色）ならびにＢｒｄＵおよびＰＩで一緒に（２６Ｈ、２６Ｊ、２６Ｌおよび２６Ｎ、高輝度）染色されている。
【図２６Ｋ−Ｎ】同上。
【図２７】新たに形成された冠動脈血管構造を示す一連の共焦点顕微鏡像である。２７Ａ〜２７Ｄにおいて、細動脈を、ＴＥＲ−１１９で標識された赤血球膜（緑色）、核のＰＩ染色（青色）、および平滑筋細胞のα−平滑筋アクチン染色（赤色）により示している。全ての顕微鏡像において、バーは、１０μｍである。
【図２８Ａ−Ｂ】免疫磁気ビーズ（ａ）およびＦＡＣＳ（ｂ）を用いて得られたＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞の同定および増殖。ａ、ｂ：ＮＳＣＭにおけるｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞は、心臓細胞系列の細胞質蛋白質に対して陰性であり；核は、ＰＩ（青色）により、そしてｃ−ｋｉｔはｃ−ｋｉｔ（緑色）抗体により染色されている。
【図２８Ｃ−Ｆ】ｃ〜ｆ：ＰＩでのＤＭにおいて、培養細胞は、核のＮｋｘ２．５（ｃ）、ＭＥＦ２（ｄ）、ＧＡＴＡ−４（ｅ）およびＧＡＴＡ−５（ｆ）標識において紫色蛍光により示される。
【図２８Ｇ−Ｈ】ｇ、ｈ：幹細胞を、ＮＳＣＭにより選択して、低密度（ｇ）で播種して、小さな個々のコロニー（ｈ）を発生させた。バー＝１０μｍ。
【図２９Ａ−Ｄ】コロニー細胞の自己再生性および多能性。ａ：クローンにおけるｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞：核＝青色、ｃ−ｋｉｔ＝緑色（矢じり）。ｂ：３個のｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞（緑色、矢じり）のうちの２個は、核（青色）におけるＫｉ６７（紫色、矢印）を表している。ｃ、ｄ：Ｋｉ６７陽性（ｃ）中期染色体（赤色）。ｄ：ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞（緑色）においてＫｉ６７およびＰＩ（紫色）により標識された中期染色体。
【図２９Ｅ−Ｈ】ｅ〜ｈ：クローンにおいて、Ｍ（ｅ）、ＥＣ（ｆ）、ＳＭＣ（ｇ）およびＦ（ｈ）の細胞質（赤色）は、それぞれ心臓ミオシン、第VIII因子、α−平滑筋アクチンおよびビメンチンにより染色されている。核＝青色。Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞（緑色、矢じり）が、存在する。バー＝１０μｍ。
【図３０Ａ−Ｄ】クローン原性細胞および球体クローン。ａ：ＮＳＣＭ中に懸濁された球体クローン（矢じり）。ｂ：クローン内のｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞（緑色、矢じり）および陰性細胞のクラスター。核＝青色。ｃ：細胞核が包まれた球体（青色）および多量のネスチン（赤色）。ｄ：球体内の非分解ネスチン（赤色）の蓄積。核＝青色。
【図３０Ｅ−Ｈ】ｅ：球体から遊走した細胞と共にＤＭ中で播種された球体。ｆ〜ｈ：球体から遊走して分化しているＭ（ｆ）、ＳＭＣ（ｇ）およびＥＣ（ｈ）は、それぞれ心臓ミオシン、α−平滑筋アクチンおよび第VIII因子により染色された細胞質（赤色）を有する。核＝青色。バー＝１０μｍ。
【図３１Ａ−Ｃ】心筋の修復。ａ〜ｃ：梗塞を起こして処置されたラット（ＭＩ）において生成している心筋（ａ、ｂ、矢じり）。新しいＭ＝ミオシン（赤色）；核＝黄緑色。注射の部位（矢印）。ｃ：梗塞を起こし非処置のラットにおける心筋の瘢痕化（青色）。＊温存された筋細胞。
【図３１Ｄ−Ｅ】ｄ〜ｎ：移植された細胞から生じた筋細胞（ｈ、ミオシン）および冠血管（ｋ、ＥＣ＝第VIII因子；ｎ、ＳＭＣ＝α−平滑筋アクチン）は、ＢｒｄＵ（緑色）陽性核により同定されている（ｇ、ｊ、ｍ）。青色の核＝ＰＩ（ｆ、ｉ、ｌ）。２０日目の筋細胞（ｐ）は、１０日目（ｏ）よりも分化されている。コネキシン４３＝緑色（矢じり）。ミオシン＝赤色。核＝青色。ＢｒｄＵ＝白色。バー＝１ｍｍ（ａ）。１００μｍ（ｂ、ｃ）、１０μｍ（ｄ〜ｐ）。
【図３１Ｆ−Ｎ】同上。
【図３１Ｏ−Ｐ】同上。
【図３２】新たに生成された筋細胞。ａ：修復心筋バンドから酵素により解離された細胞。心臓ミオシン＝赤色。ＢｒｄＵ＝緑色。核＝青色。ｂ〜ｅ：新しい筋細胞の分化。コネキシン４３＝黄色（ｂ、ｃ）；Ｎ−カドヘリン＝黄色（ｄ、ｅ）。心臓ミオシン＝赤色；ＢｒｄＵ＝緑色；核＝青色；バー＝１０ｍｍ。
【図３３】筋細胞の機械的特性。ａ〜ｄ：梗塞後に処置されたラットにおいて再生心筋および残りの心筋からそれぞれ得られた、新しい筋細胞（Ｎ）および温存された筋細胞（Ｓ）；Ｒ＝弛緩。Ｃ＝収縮。ｅ〜ｈ：Ｎ（ｅ、ｇ）およびＳ（ｆ、ｈ）筋細胞の細胞短縮および短縮速度に及ぼす刺激の影響。ｉ〜ｌ：結果は、平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ  Ｓ。
【図３４】ラット心臓における原始細胞。２２月齢フィッシャーラットの左心室心筋の断片。Ａ：核は、ヨウ化プロピジウムの青色蛍光により示される。Ｂ：緑色蛍光は、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の証拠である。Ｃ：ＰＩとｃ−ｋｉｔとの組み合わせは、緑色蛍光および青色蛍光により示される。筋細胞の細胞質が、α−筋節アクチン抗体染色の赤色蛍光により認識される。共焦点顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図３５】ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞のＦＡＣＳ分析。ｃ−ｋｉｔ発現レベルｖｓ細胞内ＤＮＡを示す、雌フィッシャー３４４ラットの左心室から得られた心臓細胞の二変量分布。細胞を、細胞１０６個／ｍｌ  ＰＢＳの濃度で懸濁させた。細胞の蛍光を、ＵＶ光を発光するヘリウム−カドミウムレーザと組み合わせたアルゴンイオンレーザ（４８８ｎｍで発光）を用いて、ELITE ESPフローサイトメータ／細胞選別機（Coulter Inc.）により測定した。矢印は、最小ｃ−ｋｉｔレベルを表す閾値を示す。ＦＡＣＳ分析では、細胞をｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）コンジュゲートラットモノクローナルｃ−ｋｉｔ抗体（Pharmingen）と共にインキュベートした。Ｒ−ＰＥイソタイプ標準を、陰性対照として用いた。
【図３６】心臓ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞（Ａ）およびＮＳＣＭ中の心臓ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞（Ｂ）の回収のためのスキーム。Ａ、ｃ−ｋｉｔ表面受容体を発現する未分化細胞を、ｃ−ｋｉｔ抗体に暴露し、続いてＩｇＧ抗体によりコーティングされた免疫磁気ビーズに暴露する。ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を磁石で回収して、ＮＳＣＭ中で培養する。Ｂ、免疫磁気ビーズを、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞の表面に付着させる（矢じり）。ｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞の非存在が、明白である。位相差顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図３７】免疫磁気ビーズで回収された、新たに単離された細胞中のｃ−ｋｉｔ蛋白質。ｃ−ｋｉｔ蛋白質が、ｃ−ｋｉｔ抗体の緑色蛍光により示される。細胞に接着されたビーズは、赤色蛍光により示される。青色蛍光は、核のＰＩ標識を示す。つまり、ビーズを用いて選択された細胞は、ｃ−ｋｉｔＰＯＳであることが見出された。共焦点顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図３８】心筋細胞分化の転写因子。ビーズの除去後に、またはＦＡＣＳ分離の直後に、スメアを生成して、細胞をＮｋｘ２．５、ＭＥＦ２およびＧＡＴＡ−４の検出のために染色した。パネルＡ〜Ｃにおける青色蛍光は、核のＰＩ標識に対応する。核内の紫色蛍光は、Ｎｋｘ２．５（Ａ）、ＭＥＦ２（Ｂ）およびＧＡＴＡ−４（Ｃ）の発現を示す。共焦点顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図３９】ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞および骨格筋分化の転写因子。パネルＡ〜Ｃは、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を示す（緑色蛍光、ｃ−ｋｉｔ抗体；青色蛍光、ＰＩ標識）。パネルＤ〜Ｆは、核内の緑色蛍光によるＭｙｏＤ（Ｄ）、ミオゲニン（Ｅ）、およびＭｙｆ５（ｆ）のための陽性対照（Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞系）を示す（赤色蛍光、ＰＩ標識）。ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞は、これらの骨格筋転写因子に対して陰性であった。共焦点顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図４０】分化培地（ＤＭ）中でのｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞の増殖。播種されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞から得られたコンフルエント細胞の単層。免疫磁気ビーズを、ＤＮａｓｅ  Ｉによる細胞の穏やかな消化により除去した。この手順により、ビーズと抗ＩｇＧ抗体との短いＤＮＡリンカーが分解された。位相差顕微鏡検査；バー＝２０μｍ。
【図４１】ＤＭにおける細胞周期中の細胞の核。Ｋｉ６7（紫色蛍光）は、その視野に含まれる核の大部分において発現される。青色蛍光は、核のＰＩ標識を示す。共焦点顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図４２】ｃ−ｋｉｔＰＯＳ由来細胞の増殖率。Ｐ２およびＰ４の細胞の指数関数増殖曲線。ｔＤ：細胞数が倍増するのに必要な時間。各ポイントは、５または６個の独立した測定に対応する。垂直のバー：ＳＤ
【図４３】心臓Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞の同定および増殖。Ｐ３のＤＭにおいて、Ｍ（Ａ）、ＥＣ（Ｂ）、ＳＭＣ（Ｃ）およびＦ（Ｄ）の細胞質（緑色）は、それぞれ心臓ミオシン、第VIII因子、α−平滑筋アクチンおよびビメンチン（第VIII因子陰性）により染色される。核＝赤色。共焦点顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図４４】神経細胞の細胞質マーカ。パネルＡ〜Ｃは、Ｐ１のＤＭ中の細胞を示す（赤色蛍光、α−筋節アクチン；青色蛍光、ＰＩ標識）。パネルＤ〜Ｆは、細胞質（青色蛍光、ＰＩ標識）中の緑色蛍光による、ＭＡＰｌｂ（Ｄ：ニューロン２Ａ細胞系）、神経フィラメント２００（Ｅ、ニューロン２Ａ細胞系）、およびＧＦＡＰ（Ｆ、星状細胞III型、クローンＣ８−Ｄ３０）の陽性対照を示す。ｃ−ｋｉｔＰＯＳ由来細胞は、これらの神経蛋白質に対して陰性である。共焦点顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図４５】線維芽細胞の細胞質メーカ。パネルＡ〜Ｃは、ＮＳＣＭにおける未分化細胞の小さなコロニーを示す（緑色蛍光、ｃ−ｋｉｔ；青色蛍光、ＰＩ標識）。パネルＤ〜Ｆは、細胞質（青色蛍光、ＰＩ標識）中の赤色蛍光により、フィブロネクチン（Ｄ）、プロコラーゲンＩ型（Ｅ）およびビメンチン（Ｆ）に対する陽性対照（ラット心臓線維芽細胞）を示す。ｃ−ｋｉｔＰＯＳ由来細胞は、これらの線維芽細胞蛋白質に対して陰性である。共焦点顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図４６】ＦＡＣＳ−単離ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞：クローン原性細胞の多能性。クローンにおいて、Ｍ（Ａ）、ＥＣ（Ｂ）、ＳＭＣ（Ｃ）およびＦ（Ｄ）の細胞質（赤色）は、それぞれ心臓ミオシン、第VIII因子、α−平滑筋アクチンおよびビメンチンにより染色される。青色蛍光、核のＰＩ標識。Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞（緑色蛍光、矢じり）が存在する。共焦点顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図４７】早期分化の心臓細胞系列。Ａ、Ｂ：早期分化における細胞の細胞質中のネスチン単独の発現。Ｃ、Ｄ：発生している筋細胞（矢じり）におけるネスチン（緑色、Ｃ）および心臓ミオシン（赤色、Ｄ）の発現。Ｅ、Ｆ：発生している内皮細胞（矢じり）におけるネスチン（緑色、Ｅ）および第VIII因子（赤色、Ｆ）の発現。Ｇ、Ｈ：発生した平滑筋細胞（矢じり）におけるネスチン（緑色、Ｇ）およびα−平滑筋アクチン（赤色、Ｈ）の発現。共焦点顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図４８】梗塞サイズおよび心筋修復。Ａ：１０日目に、冠動脈閉塞により、非処置ラット（ＭＩ）および処置ラット（ＭＩ−Ｔ）の左心室の筋細胞数がそれぞれ４９％および５３％喪失した。２０日目に、冠動脈閉塞により、非処置ラット（ＭＩ）および処置ラット（ＭＩ−Ｔ）の左心室の筋細胞数がそれぞれ５５％および７０％喪失した。ＳＯ：偽手術動物。＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＳＯ。†Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＭＩ。Ｂ：細胞移植で処置された動物の冠動脈閉塞後１０日目および２０日目の壁の梗塞領域内の新たに形成された心筋の百分比（ＭＩ−Ｔ）。細胞移植により１０日目および２０日目に形成された新しい心筋量を、形態計測学的に測定した（黒いバー）。梗塞後に残留している心筋（Ｒ）および喪失した心筋（Ｌ）は、それぞれ斜線のバーおよび網目模様のバーで表されている。生成された組織（Ｆ）は、残留している心筋（Ｒ＋Ｆ）では増加し、喪失した心筋（Ｌ−Ｆ）では同量減少した。結論として、心筋の修復により、細胞移植で処置されたラットの両群において、梗塞サイズが減少した。結果は、平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＭＩ。†Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＭＩ−ＴにおけるＬｏおよびＦｏ。
【図４９】心筋の修復。Ａ、Ｂ：２つの梗塞を起こして処置された心臓の再生心筋のバンド。赤色蛍光は、新たに形成された筋細胞の心臓ミオシン抗体染色に対応する。黄緑色蛍光は、核のＰＩ標識を示す。青色蛍光（矢じり）は、壁の梗塞領域内にコラーゲンが蓄積した小さな病巣を示す。共焦点顕微鏡検査；バー＝１００μｍ。
【図５０】毛細血管の新形成。毛細血管プロファイルにおける移植された細胞の分化が、内皮細胞のＢｒｄＵ標識により同定された。Ａ：核のＰＩ標識（青色）；Ｂ：核のＢｒｄＵ標識（緑色）；Ｃ：ＢｒｄＵにより標識された毛細血管内皮（赤色）および内皮細胞の核（青色および緑色）。共焦点顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図５１】再生心筋の容積組成。１０日〜２０日の期間に、筋細胞（Ｍ）、毛細血管（Ｃａｐ）および細動脈（Ａｒｔ）の容積比率が、それぞれ２５％、６２％および１４０％増加した。反対に、コラーゲンＩ型（Ｃ−Ｉ）およびコラーゲンIII型（Ｃ−III）の容積百分比が、それぞれ７３％および７１％減少した。結果は、平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ  １０日間。
【図５２】再生心筋の細胞増殖。１０〜２０日の期間に、Ｋｉ６７により標識された筋細胞（Ｍ）、内皮細胞（ＥＣ）および平滑筋細胞（ＳＭＣ）の比率が、それぞれ６４％、６３％および５９％減少した。結果は、平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ  １０日間。
【図５３】ＢｒｄＵ標識による再生筋細胞の同定。Ａ、Ｄ：核は、ＰＩの青色蛍光により示される。Ｂ、Ｅ：緑色蛍光は、核のＢｒｄＵ標識の証拠である。Ｃ、Ｆ：筋細胞の細胞質は、α−心臓アクチニン（Ｃ）またはα−筋節アクチン（Ｆ）の赤色蛍光により認識される。新しい筋細胞において、暗青色および明青色の蛍光は、筋細胞の核のＰＩ標識とＢｒｄＵ標識との組み合わせを示している（Ｃ、Ｆ）。共焦点顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図５４】新たに形成された筋細胞の数および容積に及ぼす時間の影響。１０から２０日の期間に、発生した筋細胞は、サイズを有意に増加させた。しかし、細胞数は、本質的に一定のままであった。サイズ分布は、１０日目よりも２０日目で広域になった。
【図５５】新たに形成された冠血管構造の発達に及ぼす時間の影響。新たに形成された細動脈（Ａｒｔ）および毛細血管（Ｃａｐ）の数密度は、１０日から２０日までの期間に有意に増加した。結果は、平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ  １０日間。
【図５６】梗塞心室において温存された筋細胞。Ａ、Ｂ：左心室および心室中隔の残留する生存可能な細胞から単離された大きな肥大筋細胞。赤色蛍光は、心臓ミオシン抗体染色に対応し、青色蛍光は、ＰＩ標識に対応する。細胞の辺縁の黄色蛍光は、コネキシン４３（Ａ）およびＮ−カドヘリン（Ｂ）を示す。共焦点顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図５７】細胞移植および超音波心臓検査。心筋再生は、心室拡張を緩和し（Ａ）、壁の生存部分の厚さには影響を及ぼさず（Ｂ）、心室の梗塞領域の厚さを増加させ（Ｃ）、駆出率を改善した（Ｄ）。ＳＯ＝偽手術；ＭＩ＝非処置の梗塞；ＭＩ−Ｔ＝処置された梗塞。結果は、平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＳＯ；＊＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＭＩ。
【図５８】超音波心臓検査によるトレーシング。非処置の梗塞ラット（Ａ、Ｂ、Ｃ）および処置された梗塞ラット（Ｄ、Ｅ、Ｆ）の二次元画像およびＭ−モードトレーシング。パネルＡおよびＤは、冠動脈閉塞前のベースライン状態に対応する。収縮の再現が、パネルＦにおいて示される（矢じり）。
【図５９】心室機能および壁応力。細胞移植は、梗塞後に心室機能を改善し（Ａ〜Ｄ）、拡張期壁応力の増加を緩和した（Ｅ）。ＳＯ＝偽手術；ＭＩ＝非処置の梗塞；ＭＩ−Ｔ＝処置された梗塞；ＬＶＥＤＰ＝左心室拡張終期圧；ＬＶＤＰ＝左心室発生圧；＋ｄＰ／ｄｔ＝圧力上昇速度、−ｄＰ／ｄｔ＝圧力下降速度。結果は、平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＳＯ；＊＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＭＩ。
【図６０】正常な心筋における細胞移植。Ｐ２で得られたＢｒｄＵ標識細胞を、偽手術ラットに注射した。２０日後に、わずかな数の未分化細胞が、同定された。Ａ、Ｃ：緑色蛍光は、核のＢｒｄＵ標識の証拠である。Ｂ、Ｄ：筋細胞の細胞質が、α−筋節アクチンの赤色蛍光により認識される。核は、ＰＩの青色蛍光により示される。注射された細胞において（矢じり）、高輝度青色蛍光は、ＰＩ標識とＢｒｄＵ標識の組み合わせを示す（Ｂ、Ｄ）。共焦点顕微鏡検査；バー＝１０μｍ。
【図６１】遊走および浸潤のアッセイ。結果は、平均±ＳＤとして報告される。＊は、増殖因子に暴露されなかった細胞との統計学的有意差、即ち、Ｐ＜０．０５を示す。
【図６２】同上。
【図６３】マトリックスメタロプロテアーゼ活性のアッセイ。ゼラチンザイモグラフィーから得られたゲルのデジタル写真。
【図６４】増殖因子受容体を発現する原始細胞のグラフ。手術後７〜８時間目、および増殖因子（処置）または生理食塩水（ＳＯ、非処置）の投与後２〜３時間目に屠殺された、偽手術マウス（ＳＯ）、梗塞を起こして処置されたマウス（処置）および梗塞を起こして非処置のマウス（非処置）の心臓の様々な領域におけるｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞へのｃ−ｍｅｔおよびＩＧＦ−ＩＲの分布が示されている。これらの測定は、進行中のアポトーシスと独立して、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の全てを含む。用いられた略語は、以下の通りである。Ａ、心房；ＬＶ、左心室；Ｒ、梗塞から遠隔の生存可能な心筋；Ｂ、梗塞に隣接する生存可能な心筋；Ｉ、生存可能でない梗塞心筋。全ての結果は、平均±ＳＤとして報告される。
【図６５】細胞周期中の原始細胞の位置を示すグラフ。手術後７〜８時間目および増殖因子（処置）または生理食塩水（ＳＯ、非処置）の投与後２〜３時間目に屠殺された、偽手術マウス（ＳＯ）、梗塞を起こして処置されたマウス（処置）および梗塞を起こして非処置のマウス（非処置）の心臓の様々な領域における生存するＫｉ６７標識ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の百分比が表される。用いられた略語は、以下の通りである。Ａ、心房；ＬＶ、左心室；Ｒ、梗塞から遠隔の生存可能な心筋；Ｂ、梗塞に隣接する生存可能な心筋；Ｉ、生存可能でない梗塞心筋。示された結果は、平均±ＳＤである。
【図６６】周期中でない筋細胞（黒い線）および周期中の筋細胞（破線：Ｋｉ６７陽性の核）におけるＤＮＡ含量の頻度分布を示すグラフ。新しい筋細胞および古い筋細胞の両方が、２ｎ染色体に対応するクロマチン量を示した。２ｎよりも多いＤＮＡ含量は、周期中の核に限定された。測定された周期中でない核は、二倍体リンパ球に匹敵する蛍光強度を示した。抽出には、新しい筋細胞６００個、古い筋細胞１０００個およびリンパ球１０００個が含まれた。
【図６７】心臓の解剖学的構造および拡張期負荷に及ぼす心筋梗塞の影響を示すグラフ。結果は、平均±ＳＤとして表される。＊＊＊は、Ｐ＜０．０５  ｖｓ  偽手術マウス（ＳＯ）および非処置の梗塞マウス（ＭＩ）の値を示す。ＭＩ−Ｔは、処置された梗塞マウスを指す。
【図６８】心筋サイズの頻度分布を示すグラフ。新たに生成された筋細胞の容積を、デスミンおよびラミニン抗体ならびにＰＩで染色された断片において測定した。中央に位置する核を含む長軸方向に配列された細胞を含めた。核を通る長さおよび直径を、各筋細胞で回収し、細胞容積を計算して円筒形状を推定した。４００個の細胞を、各心臓において測定した。
【図６９】心臓の修復を示すグラフ。偽手術（ＳＯ）マウスにおけるＬＶの容積、ならびに非処置マウス（ＭＩ）での梗塞サイズ４２％および処置マウス（ＭＩ−Ｔ）での６７％に基づき、残存が見込まれる心筋（Ｒ）および喪失が見込まれる心筋（Ｌ）の容積が、梗塞マウスの２群において計算された。新たに形成された心筋容積（Ｆ）が、処置マウスにおいて定量的に測定された。心筋再生は、残留する心筋の容積（Ｒ＋Ｆ）を増加させ、失った心筋の容積（Ｌ−Ｆ）を同量減少させた。それゆえ、処置マウスの梗塞サイズは、１５％減少した。
【図７０Ａ−Ｃ】ヒト心臓プロジェニター細胞の単離物および培養物の顕微鏡写真。心臓細胞の増殖のためのヒト心筋試料（ＭＳ）の播種（ＡおよびＢ）；約２週間目に細胞のクラスター（Ｃ；ビメンチン、緑色）が、中心にある外移植片を包囲する。
【図７０Ｄ−Ｆ】ｃ−ｋｉｔ（Ｄ：緑色、矢印）、ＭＤＲ１（Ｅ；赤紫色、矢印）およびＳｃａ−１様蛋白質（Ｆ；黄色、矢印）に対して陽性の細胞が、存在する。幾つかの核は、ＧＡＴＡ４（Ｅ；白色）およびＭＥＦ２Ｃ（Ｆ；赤紫色）を発現した。
【図７０Ｇ−Ｊ】筋細胞（Ｇ；α−筋節アクチン、赤色）、ＳＭＣ（Ｈ；α−ＳＭアクチン、赤紫色）、ＥＣ（Ｉ；フォンヴィレブランド因子、黄色）および神経フィラメント２００に対して陽性の細胞（Ｊ；白色）が、小さなｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞（緑色、矢印）と共に、増殖した細胞において検出された。
【図７１Ａ−Ｃ】ヒト心臓プロジェニター細胞の増殖特性。選別されたｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞（緑色）は、系列陰性であるか（矢じり）またはそれらの核においてＧＡＴＡ４を発現する（Ａ；白色）。複数のｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞が、Ｋｉ６７により標識され（Ｂ；赤色、矢じり）、１つはｐ１６ＩＮＫ４αを発現する（Ｃ；黄色、矢じり）。
【図７１Ｄ】Ｄ：ＦＡＣＳ分析により、心臓プロジェニター細胞（Ｐ１〜Ｐ３）は、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１３３に対して陰性であり、５２％が、ＣＤ７１に対して陽性であった。
【図７１Ｅ−Ｇ】イソタイプ、黒色；抗原、赤色。免疫細胞化学により示された通り、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞（Ｅ；緑色）は、細胞質においてネスチン（Ｆ；赤色）を発現する。ｃ−ｋｉｔおよびネスチンの共局在が、パネルＧ（黄色）において示された。
【図７１Ｈ】Ｈ：個々のｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞（緑色）を、１つのウェルに播種して、１つの創始ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞からのクローンの形成が、パネルＩにおいて示される。
【図７１Ｉ】同上。
【図７１Ｊ】Ｊ；分化培地におけるｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞が、筋細胞（α−筋節アクチン、赤色）、ＳＭＣ（α−ＳＭアクチン、赤紫色）およびＥＣ（フォンヴィレブランド因子、黄色）を形成する。
【図７２Ａ】ヒトｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞は、梗塞心筋を再生する。７２Ａ〜Ｃは、顕微鏡写真である。７２Ａは、ヒトｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を注射され、２１日後に屠殺された免疫欠損マウスにおける梗塞心臓を表す。大きな横断部分は、梗塞（ＭＩ）内の再生された心筋のバンド（矢じり）を示す。ＢＺ：境界域。長方形に含まれる２つの領域は、下のパネルではより高倍率で示されている。新たに形成された筋細胞におけるＡｌｕプローブの局在化が、核内の緑色蛍光の点により示されている。新たに形成された筋細胞が、α−筋節アクチンにより同定される（赤色：矢じり）。筋細胞の核は、ヨウ化プロピジウムにより標識される（青色）。アスタリスクは、温存された筋細胞を示す。
【図７２Ｂ−Ｃ】ＢおよびＣ：免疫欠損マウス（Ｂ）および免疫抑制ラット（Ｃ）において梗塞およびヒト細胞の注射後１２および１４日目の再生心筋の例（矢じり）。新たに形成された筋細胞は、α−筋節アクチンにより同定される（赤色）。筋細胞の核は、Ａｌｕ（緑色）およびＢｒｄＵ（白色）により標識される。アスタリスクは、温存されたマウスおよびラット筋細胞を示す。
【図７２Ｄ】７２Ｄは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された断片を含み、試料採取プロトコルを示す：同じく、再生された梗塞心筋におけるヒトＤＮＡの検出に用いられたゲルの写真も提供されており；ヒト血液（ヒト）およびインタクトラット心筋（ラット）を、陽性対照および陰性対照として用いた。梗塞心筋におけるＭＬＣ２ｖ  ＤＮＡのシグナルは、壁の心内膜下および／または心外膜下領域における温存された筋細胞の存在を示す（図７２Ａ〜Ｃ参照）。
【図７２Ｅ−Ｈ】７２ＥとＦ、ならびにＧとＨは、同じ視野を示す顕微鏡写真である。新たに形成された筋細胞（Ｅ〜Ｈ；トロポニン１、量子ドット６５５、赤色）は、ＧＡＴＡ４（Ｅ；量子ドット６０５、白色）およびＭＥＦ２Ｃ（Ｇ：量子ドット６０５、黄色）を発現している。ラミニン：量子ドット５２５、白色。筋細胞の核は、Ａｌｕにより標識されている（ＦおよびＨ；緑色）。
【図７２Ｉ−Ｊ】コネキシン４３（Ｉ；量子ドット６０５、黄色、矢じり）およびＮ−カドヘリン（Ｊ；量子ドット６０５、黄色、矢じり）は、心臓ミオシン重鎖（ＭＨＣ；量子ドット６５５、赤色）により、発生中の心筋の間に検出される。これらの構造は、Ａｌｕに対して陽性である。筋節の線条が、新たに形成された筋細胞の幾つかにおいて明白である（Ｅ〜Ｊ）。Ａ、Ｂ、Ｅ，Ｆ、Ｉ、Ｊ：梗塞を起こした免疫欠損マウス、細胞移植後２１日目。Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ：梗塞を起こした免疫抑制ラットの細胞移植後１４日目。
【図７３Ａ−Ｆ】７３Ａ〜ＦおよびＨは、冠微小血管構造および細胞融合を表す顕微鏡写真である。ＳＭＣの層を有するヒト冠細動脈（Ａ〜Ｃ；α−筋節アクチン、量子ドット６５５、赤色）。Ｃにおける細動脈の内皮内層が、フォンヴィレブランド因子（量子ドット６０５、黄色）によりＤに示される。ＥおよびＦ：ヒト毛細血管（フォンヴィレブランド因子、量子ドット６０５、黄色）。核は、Ａｌｕにより標識される（Ａ〜Ｆ；緑色）。
【図７３Ｇ】７３Ｇは、ヒト心筋の血管形成の範囲を示すグラフを表す；結果は、平均±ＳＤである。
【図７３Ｈ】Ｈ：再生された筋細胞および梗塞の中央領域の血管におけるヒトＸ染色体（白色の点；矢じり）。マウスＸ染色体（赤紫色の点；矢印）は、再生されたヒト筋細胞の付近の境界域にある筋細胞の中に存在する。核は、細胞融合を除いて、わずか２つのヒトＸ染色体を示す。
【図７４Ａ】心筋再生および心臓機能。７４Ａ〜Ｃは、貫壁性梗塞を示す顕微鏡写真である。非処置ラットの貫壁性梗塞が、７４Ａに示されている（矢じり）；長方形内の領域は、下のパネルでより高倍率で示されている。核を含まない死滅した筋細胞（死滅、α−筋節アクチン、赤色）。結合組織の細胞核（青色）。超音波心臓検査像には、壁の梗塞領域に収縮がないことが示される（矢印）。
【図７４Ｂ】Ｂ：処置ラットにおける貫壁性梗塞（矢じり）；長方形内に含まれる領域は、下のパネルでより高倍率で示されている。ヒト筋細胞（α−筋節アクチン、赤色）は、Ａｌｕにより標識される（緑色）。超音波心臓検査像には、壁の梗塞領域に収縮の存在が示される（矢じり）。
【図７４Ｃ】パネルＣは、梗塞の中央領域における再生されたヒト筋細胞（α−筋節アクチン、赤色）がＡｌｕ（緑色）により標識されている（緑色）、処置ラットにおける高倍率の別の貫壁性梗塞を示す（矢じり）。その超音波心臓検査像には、壁の梗塞領域に収縮の存在が示される（矢じり）。
【図７４Ｄ】７４Ｄは、駆出率が上昇した処置ラットの心臓における心筋再生を示すグラフである。マウスの超音波心臓検査を、過去に示された通り１３、処置マウスの収縮の検出のためだけに利用した。
【図７４Ｅ】７４ＥおよびＦは、梗塞心臓の解剖学的構造および機能に及ぼす心筋再生の影響を示すグラフである。データは、平均±ＳＤである。＊、† は、差、ｐ＜０．０５  ｖｓ  それぞれＳＯおよびＭＩを示す。
【図７４Ｆ】同上。
【図７５】ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞の多能性を示すグラフ。様々な継代（Ｐ）でのｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞が、心臓の分化決定を獲得し（ＧＡＴＡ４陽性）、筋細胞（α−筋節アクチン陽性）、ＳＭＣ（α−ＳＭアクチン陽性）およびＥＣ（フォンヴィレブランド因子陽性）を生成させることができる。結果は、平均±ＳＤである。
【図７６Ａ−Ｃ】再生されたヒト心筋の特徴を示す顕微鏡写真。梗塞およびヒト細胞移植の後に再生された筋細胞および冠細動脈；新たに形成された筋細胞（Ａ；心臓ミオシン重鎖、赤色）、ＳＭＣ（Ｂ、Ｄ、Ｅ；α−ＳＭアクチン、赤紫色）およびＥＣ（Ｃ、Ｆ、Ｇ；フォンヴィレブランド因子、黄色）が、存在する。筋細胞の間のラミニンの分布は、白色蛍光により示される（Ａ）。パネルＤとＥ、ならびにパネルＦとＧは、同じ視野を示す。
【図７６Ｄ−Ｇ】分散されたＳＭＣ（ＤおよびＥ；矢印）およびＥＣ（ＦおよびＧ；矢印）が、存在する。ＧＡＴＡ６（Ｄ；核内の赤色の点）およびＥｔｓｌ（Ｆ；核内の赤紫色の点）が、それぞれＳＭＣおよびＥＣにおいて検出される。これらの構造は、Ａｌｕプローブに対して陽性である（緑色）。Ａ〜Ｇ：梗塞を起こした免疫欠損マウス、細胞移植後２１日目。
【図７７】ヒト筋細胞の容積を示すグラフ。梗塞マウスおよびラットにおける新たに形成されたヒト筋細胞のサイズ分布。
【図７８】機能的コンピテントなヒト心筋を示す顕微鏡写真。梗塞の中央領域の再生ヒト筋細胞が、α−筋節アクチン（赤色）に対して陽性である、処置マウスの貫壁性梗塞（矢じり）。ヒトの核が、Ａｌｕプローブ（緑色）により標識される。超音波心臓検査像には、壁の梗塞領域に収縮の存在が示される（矢じり）。
【図７９Ａ】活性化ＣＳＣのホーミングおよび生着。ａ．梗塞後２４時間目のＧＦ活性化クローン原性ＣＳＣ発現ＥＧＦＰ（緑色）の注射部位。
【図７９Ｂ−Ｃ】ｂ〜ｄ：一部の活性化ＣＳＣは、１２時間目に標識されたＴｄＴであり（ｂ；赤紫色、矢じり）、複数が、２４時間目の細胞周期蛋白質Ｋｉ６７に対して陽性である（ｃ；白色、矢印）。ｄ：注射後１２時間目、２４時間目および４８時間目の活性化ＣＳＣのアポトーシスおよび増加の割合。値は、平均±ＳＤである。＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ  １２時間；＊＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ  ２４時間目。
【図７９Ｄ】同上。
【図７９Ｅ−１】ｅ：コネキシン４３、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリンおよびＬ−セレクチン（白色）が、梗塞および細胞注射後４８時間目に、ＥＧＦＰ陽性心臓プロジェニター細胞の間に（矢印）、そしてＥＧＦＰ陽性心臓プロジェニター細胞とＥＧＦＰ陰性レシピエント（矢印）の間に発現される；筋細胞が、α−筋節アクチンにより染色され（赤色）、線維芽細胞がプロコラーゲンにより染色される（黄色）。
【図７９Ｅ−２】同上。
【図７９Ｅ−３】同上。
【図７９Ｆ】ｆ：アポトーシスＥＧＦＰ陽性細胞（ＴｄＴ、赤紫色、矢印）は、Ｌ−セレクチンを発現していない（白色）。
【図７９Ｇ】ｇ：インタクト非梗塞心臓における移植後１ヶ月目のＥＧＦＰ陽性のＧＦ活性化クローン原性ＣＳＣの注射部位。核、ＰＩ（青色）。
【図８０Ａ】血管の再生。ａ：２週間目の、梗塞を起こして処置された心臓の心筋外膜は、温存された心筋内（矢印）および境界域（ＢＺ、矢じり）に存在する３つの新たに形成された冠動脈（上のパネル、ＥＧＦＰ、緑色）を示す。分枝した血管も、目視できる（白抜きの矢印）。ＥＧＦＰおよびα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の共局在が、下のパネルに示される（橙色）。血管の極小さな直径が、示されている。１８０μｍの直径を有する血管が、内弾性板（挿入図；ＩＥＬ、赤紫色）を有する。既存の冠血管分枝は、ＥＧＦＰ陰性であり（上のパネル）、α−ＳＭＡ陽性である（下のパネル、赤色、アスタリスク）。ＥＧＦＰ陽性細胞のクラスターが、注射部位（ＳＩ）に存在する。筋細胞が、α−筋節アクチン（α−ＳＡ）により標識される。
【図８０Ｂ】ｂ：２週間目の心内膜層の温存された心筋は、複数の大きな再生冠動脈を含み（上のパネル、ＥＧＦＰ、緑色）、ＥＧＦＰおよびα−ＳＭＡを発現する（下のパネル、ＥＧＦＰ−α−ＳＭＡ、橙色）。
【図８０Ｃ】ｃ：壁の中央領域における梗塞心筋は、再生された中および小サイズの冠動脈を示し（上のパネル、ＥＧＦＰ、緑色）、それらはＥＧＦＰおよびα−ＳＭＡを発現する（下のパネル、ＥＧＦＰ−α−ＳＭＡ、橙色）。
【図８０Ｄ】ｄ：心臓における血管形成の規模。値は、平均±ＳＤである。
【図８０Ｅ】ｅ：再生冠細動脈におけるＳＭＣおよびＥＣは、多くても２つのＸ染色体を示す。ＥＧＦＰ−α−ＳＭＡ：橙色。Ｘ染色体：白色の点。
【図８１Ａ】新たに形成された冠動脈は、機能的コンピテントである。ａ〜ｆ：２週間目（ａ〜ｃ）および１ヶ月目（ｄ〜ｆ）の処置ラットの心外膜層の生存可能な心筋（ａ、ｆ）および梗塞心筋（ｂ〜ｅ）内に位置する大きな冠動脈および分枝は、ローダミン標識デキストラン（赤色）を含み、ＥＧＦＰ陽性壁（緑色）を有する。コラーゲン（青色）が、梗塞内（ｂ〜ｅ）、および生存する心筋のほぼ血管周辺（ａ、ｆ）に豊富に存在する。血管直径が、示される。パネルｅにおける血管および分枝は、ＥＧＦＰ陽性細胞に包囲されており、梗塞心筋内に存在する。パネルｆは、新たに形成された血管（ＥＧＦＰ陽性壁、緑色）と常在性の血管（ＥＧＦＰ陰性壁）との機能的統合性を証明している。白色の円は、吻合部位の範囲を定めている。
【図８１Ｂ−Ｄ】同上。
【図８１Ｅ】同上。
【図８１Ｆ】同上。
【図８１Ｇ】ｇ：心室の解剖学的構造および梗塞細部。
【図８１Ｈ】ｈ：心室機能。左心室拡張終期圧、ＬＶＥＤＰ；ＬＶ発生圧、ＬＶＤＰ。値は、平均±ＳＤである。非処置の心筋梗塞、ＭＩ。処置された心筋梗塞、ＭＩ−Ｔ。
【図８２】実験プロトコル。恒久的冠血管閉塞は、左冠動脈前下行枝（ＬＤＡ）の結さつにより誘導した。２種の形式の処置を用いた：１、合計８０，０００〜１００，０００のクローン原性ＥＧＦＰＰＯＳ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ−ＣＳＣ（非活性化ＣＳＣ）の注射；２、インビボ移植前に２時間ごとにＧＦをインビトロで前処置されたＥＧＦＰＰＯＳ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ−ＣＳＣの注射。注射は、境界域（ＢＺ）から離れた、結さつの上、横および下の複数の部位（黒色の点）で実施した。ＭＩ、心筋梗塞。
【図８３Ａ】多数のクローン原性ＥＧＦＰ陽性（緑色）ＣＳＣを、注射後２４時間目にＴＤＴ（赤紫色、矢じり）により標識する。生存可能な筋細胞は、α−筋節アクチンにより染色される（白色）。核は、ヨウ化プロピジウムにより標識される（ＰＩ、青色）。
【図８３Ｂ】注射後１２時間目、２４時間目および４８時間後のＣＳＣのアポトーシスおよび増殖の割合。値は、平均±ＳＤである。
【図８４Ａ】血管の再生。ａ：１ヶ月目の心外膜層の温存された心筋は、複数の大きな再生冠動脈を含み（上のパネル、ＥＧＦＰ、緑色）、それらはＥＧＦＰおよびα−ＳＭＡを発現する（下のパネル、ＥＧＦＰ−α−ＳＭＡ、橙色）。
【図８４Ｂ−Ｃ】ｂ：壁の中央領域における梗塞心筋は、再生された大、中および小サイズの冠動脈を示し（上のパネル、ＥＧＦＰ、緑色）、それらはＥＧＦＰおよびα−ＳＭＡを発現する（下のパネル、ＥＧＦＰ−α−ＳＭＡ、橙色）。ｃ：梗塞心筋の再生された毛細血管は、ＥＧＦＰ（緑色）を発現し、フォン（ｖｏｎ）は、ＥＣ特異性レクチンにより標識される（白色）。
【図８５】多光子顕微鏡により検査されたＥ９の胚マウス腎臓。エクスビボ調製物は、腎臓プロファイル（Ａ）を示し、その後、ｃ−ｋｉｔ陽性−ＥＧＦＰ陽性細胞（Ｂ、緑色）の存在を示す。パネルＣは、これらの構造の併合を示す。
【図８６】成体マウス腎臓の糸球体の光学切片の再構成。糸球体係蹄内のｃ−ｋｉｔ陽性−ＥＧＦＰ陽性細胞の局在化が、緑色蛍光により示される。
【図８７】ｃ−ｋｉｔ（赤色）に対して陽性の細胞を示す共焦点顕微鏡像が、成体マウス腎臓糸球体（左のパネル）および尿細管（右のパネル）内に存在する。
【図８８】ｃ−ｋｉｔ陽性−ＥＧＦＰ陽性細胞（右のパネル、緑色）を示す、培養された成体マウス糸球体（左のパネル）。
【図８９−１】ｃ−ｋｉｔ抗体により染色された、増殖された糸球体細胞のＦＡＣ分析からのドットプロット。緑色の点は、ｃ−ｋｉｔ陽性ＫＳＣに対応する。上のパネルは、ラット胚腎臓細胞に対応する。
【図８９−２】中央のパネルは、ラット新生期腎細胞に対応する。
【図８９−３】下のパネルは、インビトロでの追加的増殖およびｃ−ｋｉｔでの免疫選別の後のラット新生期腎細胞に対応する。
【図９０】ラット糸球体から単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、培養によりクローンを形成する。位相差顕微鏡検査（左のパネル）と、免疫標識および共焦点顕微鏡検査（右のパネル：ｃ−ｋｉｔ、緑色）による２例が示される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
本発明は、一部として、ｃ−ｋｉｔ抗体が臓器組織を再生する能力を有する常在性成体臓器幹細胞のマーカである、という発見に基づいている。例えば本発明人は、成体心臓内に常在するｃ−ｋｉｔ陽性心臓幹細胞を同定したが、これらの幹細胞は、虚血性損傷後に機能的心筋の広範にわたる再生を誘導する。加えて本発明人は、成体腎臓に常在するｃ−ｋｉｔ陽性腎臓幹細胞も同定した。つまり一実施形態において、本発明は、臓器組織からそのような常在性成体臓器幹細胞を単離する方法を提供する。
【００２１】
本明細書において用いられる「臓器幹細胞」は、成体臓器組織内に常在し、クローン原性で自己再生性であり、単離される臓器を含む細胞系列の１つ以上または全てを生じる（例えば、多能性の）幹細胞を指す。本発明の方法および組成物において用いられる臓器幹細胞は、自家または同種異系であってもよい。本明細書において用いられる「自家」は、同じ個体から得られた、または移されたものを指す（即ち、自家輸血；自家骨髄移植片）。本明細書で用いられる「同種異系」は、同じ種に属するまたはそれから得られるが、遺伝子が異なるものを指す（例えば、同種異系組織グラフトまたは臓器移植片）。
【００２２】
本明細書において用いられる「成体」幹細胞は、胚を起源としない、または胚もしくは胎仔組織から得られない幹細胞を指す。同様に「成体」臓器は、出生後の動物の臓器を指す。
【００２３】
一実施形態において、成体臓器から常在性成体幹細胞を単離する方法は、前記臓器の組織標本を培養し、それにより組織外移植片を形成すること、ｃ−ｋｉｔ陽性である培養された外移植片から細胞を選択すること、および前記ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を単離すること、を含み、前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、常在性成体幹細胞である。任意の成体臓器から得られた組織標本を、該方法において用いることができる。例えば成体臓器は、非限定的に、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、腸、肺、胃、脳、網膜、食道、膀胱、表皮、または骨髄であってもよい。幾つかの実施形態において、臓器は、心臓である。他の実施形態において、臓器は、腎臓である。
【００２４】
組織培養外移植片は、所望の臓器から得られた組織標本を適切な培地中で培養することにより作製される。組織外移植片を作製する方法は、当業者に公知である。例えばそのような一方法は、組織標本を細断すること、および細断された切片を適切な培地に配置すること、を含む（例えば、実施例１３参照）。最初の培養後およそ１〜２週間以内に、組織標本から増殖された臓器幹細胞を、得ることができる。最初の培養後およそ４週間目に、増殖された臓器幹細胞が、遠心分離により回収され、ｃ−ｋｉｔ発現について選択されてもよい。
【００２５】
用語「ｃ−ｋｉｔ」は、幹細胞因子（ＳＣＦ）の受容体として働く細胞表面抗原を指す。ｃ−ｋｉｔを発現する臓器幹細胞の集団を単離する陽性選択法は、当業者に周知である。可能な方法の例としては、非限定的に、様々な型の細胞選別、例えば蛍光標識細胞選別（ＦＡＣＳ）および磁気細胞選別、ならびにアフィニティークロマトグラフィーの改良形態が挙げられる。ｃ−ｋｉｔ発現について選択された臓器幹細胞が、好ましくは単離される。本明細書で用いられる「単離される」は、臓器幹細胞が他の細胞、組織、および細胞片から分離されることを意味する。幾つかの実施形態において、単離された臓器幹細胞は、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％よりも大きな純度である（即ち、他の細胞成分を８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％含まない）。
【００２６】
幾つかの実施形態において、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、インビトロで培養されて更に増殖される。単離されたｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞が、幾つかの実施形態において、例えば細胞培養プレートの１つのウェルに、個々に播種されて、個々の臓器幹細胞からクローンを得てもよい。最初の臓器組織外移植片を培養するため、または単離されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞を更に増殖させるために用いられ得る培地の非限定的例は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、患者血清、インスリン、トランスフェリン、および亜セレン酸ナトリウムを含むことができる。特定の実施形態において、培地は、ヒト組換えｂＦＧＦ、ヒト組換えＥＧＦ、ウリジンおよびイノシンの１種以上を更に含むことができる。
【００２７】
一実施形態において、培地の成分は、以下の概算範囲内で存在し得る：
成分                     最終濃度
患者血清                 ５〜２０重量％
ヒト組換えｂＦＧＦ       １０〜１００ｎｇ／ｍｌ
ヒト組換えＥＧＦ         １０〜１００ｎｇ／ｍｌ
インスリン               ２〜２０μｇ／ｍｌ
トランスフェリン         ２〜２０μｇ／ｍｌ
亜セレン酸ナトリウム     ２〜１０ｎｇ／ｍｌ
ウリジン                 ０．２４〜２．４４ｍｇ／ｍｌ
イノシン                 ０．２７〜２．６８ｍｇ／ｍｌ
【００２８】
別の実施形態において、培地の成分の置換を、当業者に公知の通り行ってもよい。例えばインスリンは、インスリン様増殖因子Ｉと置換することができる。ウリジンおよびイノシンは、アデノシン、グアノシン、キサンチン、チミジン、およびシチジンをはじめとする他のヌクレオオチドの混合物と置換することができる。培地成分を、培養される特定の臓器組織外移植片に適合させるように、細胞培地への他の調整を行うことができる。
【００２９】
更なる実施形態において、１種以上の増殖因子が、本明細書において提供される培地に存在することができるため、一実施形態において、培地は、１種以上の増殖因子、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、患者血清、インスリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸ナトリウム、そして場合により１種以上のヒト組換えｂＦＧＦ、ヒト組換えＥＧＦ、ウリジンおよびイノシンを含む。培地の成分が、本明細書に記載の量で存在し得ることが企図され、当業者は、それに接触した任意の幹細胞の活性化を得るための１種以上の増殖因子の十分な量を決定することができよう。
【００３０】
本発明の一実施形態において、上記培地は、臓器の損傷または梗塞領域において新しい臓器組織を再生または作製するために投与される臓器幹細胞の培養および増殖の間に使用することができる。
【００３１】
特定の実施形態において、ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、系列陰性である。用語「系列陰性」は、細胞が特異的細胞系列に特徴的な抗体を発現しないことを意味することとして、当業者に公知である。例えば、ｃ−ｋｉｔ陽性系列陰性臓器幹細胞は、分化決定された抗原感作細胞系列の検出可能なレベルのマーカ、例えば心臓マーカ、肝臓マーカ、造血系マーカ、内皮細胞マーカ、平滑筋細胞マーカ、神経マーカ、骨格筋マーカ、骨形成マーカ、腎臓マーカ、軟骨細胞マーカ、脂肪細胞マーカなどを発現しない。
【００３２】
系列陰性臓器幹細胞は、非限定的に、ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞集団を細胞系列マーカに対する抗体と接触させることにより系列陽性（ｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞を除去し、続いて磁気ビーズおよびバイオマグネットにコンジュゲートさせた抗イムノグロブリン抗体を用いることにより抗体結合細胞を単離すること、をはじめとする様々な手段により単離することができる。あるいは、抗体結合された系列陽性幹細胞を、抗イムノグロブリン抗体にコンジュゲートさせたビーズを含有するカラムに保持させてもよい。免疫磁気ビーズに結合していない細胞は、系列陰性幹細胞分画を表しており、単離されてもよい。例えば、特異的細胞系列のマーカ（例えば、心臓、造血系、血管、神経、肝臓、骨格筋、骨形成、腎臓、軟骨細胞、および脂肪細胞マーカ）を発現する細胞が、ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞集団から除去されて、系列陰性ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞を単離してもよい。血管系列のマーカとしては、非限定的に、ＧＡＴＡ６（ＳＭＣ転写因子）、Ｅｔｓ１（ＥＣ転写因子）、Ｔｉｅ−２（アンジオポエチン受容体）、ＶＥ−カドヘリン（細胞接着分子）、ＣＤ６２Ｅ／Ｅ−セレクチン（細胞接着分子）、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ、収縮性蛋白質）、ＴＧＦβ１受容体、Ｅｒｇ１、ビメンチン、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）、フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ；第VIII因子の担体）、Ｆｌｋ１（ＶＥＧＦＲ−２受容体）、バンデイラエラ・シンプリシフォリアおよびハリエニシダのレクチン（ＥＣ表面糖蛋白質結合分子）が挙げられる。筋細胞系列のマーカとしては、非限定的に、ＧＡＴＡ４（心臓転写因子）、Ｎｋｘ２．５およびＭＥＦ２Ｃ（筋細胞転写因子）、ならびにα−筋節アクチン（α−ＳＡ、収縮蛋白質）が挙げられる。神経系列のマーカとしては、非限定的に、神経フィラメント２００、ＧＦＡＰ、およびＭＡＰ１ｂが挙げられる。造血細胞系列のマーカとしては、非限定的に、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ８、ＣＤ２０、およびグリコホリンＡが挙げられる。他の細胞系列マーカは、当業者に公知であり、ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞集団から系列陽性細胞を除去するのに用いることができる。
【００３３】
幾つかの実施形態において、ｃ−ｋｉｔ陽性系列陰性成体臓器幹細胞を、他のマーカの発現について選択することができる。例えばｃ−ｋｉｔ陽性系列陰性心臓幹細胞の亜集団は、ＶＥＧＦ−Ｒ２受容体（Ｆｌｋ１）、ｃ−ＭＥＴ受容体、およびＩＧＦ−１Ｒ受容体を発現した（例えば、実施例８参照）。他の臓器から単離された成体ｃ−ｋｉｔ陽性系列陰性幹細胞は、ＶＥＧＦ−Ｒ２（Ｆｌｋ１）、ｃ−ＭＥＴ、およびＩＧＦ−１Ｒをはじめとするこれらの追加的マーカの１種以上の発現に関して選択することができる。
【００３４】
幾つかの実施形態において、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、単離される成体臓器の細胞系列の１種以上を生成することが可能である。例えば、成体心臓から単離されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞をはじめとする心像系列の細胞型全てに分化することが可能である。理論に拘束されることを望むものではないが、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、典型的には単離される臓器の細胞系列のみを生成させることが可能である。例として、心臓から単離された成体ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、心臓系列以外の細胞系列を生成することができない。しかし幾つかのｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、他の細胞系列を生成する、わずかな限定的能力を有し得る。例えば、骨髄から単離されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、幾つかの例において、心臓系列の細胞を生成させることができる（実施例１および２参照）。
【００３５】
つまり、腎臓から単離されたｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、成体腎臓の細胞型、例えば糸球体細胞（糸球体壁側細胞、蛸足細胞）、近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレのループの細い部分の細胞、尿細管細胞（例えば、後腎の尿細管細胞）、集合尿細管細胞、および腎間質細胞の１種以上に分化することが可能である。網膜から単離されたｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、成体網膜の細胞型、例えばかん体細胞、錐体細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、ミュラー細胞、水平細胞、またはグリア細胞の１種以上に分化することが可能である。肺から単離されたｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、成体肺の細胞型（例えば、気管支細胞、肺胞細胞、線毛上皮細胞、杯細胞、基底細胞、肺血管細胞）の１種以上に分化することが可能である。腸から単離されるｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、成体腸の細胞型（例えば、腸吸収細胞、腸分泌細胞、パネート細胞、杯細胞）の１種以上に分化することが可能である。肝臓から単離されたｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、成体肝臓の細胞型（肝細胞）の１種以上に分化することが可能である。脾臓、膵臓、胃、脳、食道、膀胱、表皮、および骨髄から単離されたｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、それぞれ、成体脾臓、膵臓、胃、脳、食道、膀胱、表皮、および骨髄の細胞型の１種以上に分化することが可能である。
【００３６】
本発明は、必要とする患者の臓器の損傷組織を修復および／または再生する方法も提供する。一実施形態において、該方法は、前記臓器の組織標本からｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞を単離すること、および前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞を損傷組織に投与すること、を含み、前記ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、投与に続いて新しい臓器組織に集成する分化された細胞を発生し、それにより損傷臓器を修復および／または再生する。組織標本は、処置を必要とする患者のものであってもよく、つまり患者自身の幹細胞（自家幹細胞）を受けるか、または組織標本が適合するドナーのものであれば、患者は同種異系幹細胞を受けてもよい。
【００３７】
別の実施形態において、該方法は、患者の臓器の組織標本から単離されて、場合により培養で増殖された、単離されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞を受容すること、および前記単離されたｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞を損傷組織に投与すること、を含み、前記ｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞は、投与後に分化された細胞を生成して新しい臓器組織を集成し、それにより損傷臓器を修復および／または再生する。
【００３８】
本明細書において用いられる「患者」または「対象」は、非限定的にヒト、ホ乳類、ハ虫類、両生類および魚類をはじめとする任意の脊椎動物を包含してもよい。しかし、有利には患者または対象は、ヒトなどのホ乳類、または家畜などのホ乳動物、例えばイヌ、ネコ、馬など、または生産ホ乳類、例えばウシ、ヒツジ、ブタなどである。一実施形態において、患者は、ヒトの患者である。
【００３９】
本明細書で用いられる「損傷組織」は、暴露された組織内の細胞を死滅させる虚血または毒性状態へ暴露された臓器の組織または細胞を指す。虚血状態は、例えば卒中、動脈瘤、心筋梗塞、または他の心臓血管疾患もしくは関連の病気を原因とする血流の欠如により、引き起こされる可能性がある。酸素の欠乏は、周囲領域の細胞の死滅を引き起こして梗塞を残し、それは最終的には瘢痕となる。虚血は、酸素供給不足に陥った任意の臓器において起こる可能性がある。
【００４０】
一実施形態において、損傷組織は、虚血事象から生じる。「虚血事象」または「虚血傷害」は、臓器組織への血液供給を欠乏させる、または欠乏させ得る任意の例である。虚血事象または傷害としては、非限定的に、低血糖、頻脈、アテローム性硬化症、低血圧、血栓塞栓症、血管の外的圧迫、塞栓症、鎌状細胞症、炎症性プロセスが挙げられ、それらは多くの場合、炎症血管の管腔内血栓、出血、心不全および心停止、敗血性ショックおよび心原生ショックをはじめとするショック、高血圧、狭心症ならびに低体温を伴う。
【００４１】
本明細書において用いられる「集成する（assemble）」は、臓器幹細胞から生成された分化細胞の、機能的臓器構造、即ち心筋および／または心筋細胞、動脈、細動脈、毛細血管、腎尿細管、肺胞上皮、腸上皮絨毛／陰窩構造などへの集成を指す。
【００４２】
特定の実施形態において、ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、本明細書に記載された通り系列陰性である。ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、損傷組織への投与前に、先に記載された通り培養により増殖させることができる。ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、任意の臓器から単離することができ、その臓器の損傷組織を修復および／または再生することができる。例えばｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、腸、肺、胃、脳、網膜、食道、膀胱、表皮、または骨髄からなる群より選択される任意の臓器の損傷組織を修復するのに用いることができる。一実施形態において、臓器は、心臓である。別の実施形態において、臓器は、腎臓である。
【００４３】
幾つかの実施形態において、ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、成体心筋から単離されて、必要とする患者に投与され、損傷心筋を修復および／または再生する。特定の実施形態において、患者は、アテローム性硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、先天性心血管欠損、心筋梗塞および動脈炎症、ならびに動脈、細動脈および毛細血管の他の疾患からなる群より選択される心臓血管疾患または障害に罹患している。本発明の一実施形態において、成体心筋から単離されたｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞を投与することによる、冠動脈または血管の閉塞または遮断を含む血管障害または疾患の処置のための方法および組成物が提供される。本発明は、心臓バイパス手術の代替法として、またはそれと併用で、そのような治療的処置に用いられ得る方法および組成物を提供する。
【００４４】
別の実施形態において、ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、成体腎臓組織から単離され、必要とする患者に投与され、損傷腎臓組織を修復および／または再生する。一実施形態において、損傷腎臓組織は、急性腎傷害（例えば、虚血性、免疫、毒性または外傷性傷害）によるものである。別の実施形態において、損傷腎組織は、慢性腎疾患によるものである。本発明の方法は、ＩｇＡ腎症、間質性腎炎、ループス腎炎、アルポート症候群、腎不全、糸球体疾患、アミロイドーシスおよび腎疾患、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、髄質性海綿腎、多嚢胞性異形成腎、ネフローゼ症候群、多嚢胞性腎疾患、融合腎、腎尿細管アシドーシス、腎血管性の状態、単純性腎嚢胞、単腎、尿細管および嚢胞性腎障害からなる群より選択される腎疾患または障害により損傷腎臓組織を修復および／または再生するために用いることができる。
【００４５】
本発明の別の実施形態において、ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞、好ましくは培養および増殖されたｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞は、損傷組織に移植または送達される前に、１種以上のサイトカインまたは増殖因子への暴露により活性化される。一実施形態において、臓器幹細胞は、１種以上の増殖因子またはサイトカインと接触される。適切な増殖因子またはサイトカインは、非限定的に：それぞれの全体的教示が参照により本明細書に組み入れられた、Ko, 2006; Kanemura, 2005; Kaplan, 2005; Xu, 2005; Quinn, 2005; Almeida, 2005; Barnabe-Heider, 2005;Madlambayan, 2005; Kamanga-Sollo, 2005 ; Heese, 2005; He, 2005; Beattie, 2005; Sekiya, 2005; Weidt, 2004; Encabo, 2004;および Buytaeri-Hoefen, 2004に記載された、アクチビンＡ、アンジオテンシンII、骨形成蛋白質２、骨形成蛋白質４、骨形成蛋白質６、カルジオトロフィン−１、線維芽細胞増殖因子１，線維芽細胞増殖因子４、Ｆｌｔ３リガンド、グリア由来神経栄養因子、ヘパリン、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子−Ｉ、インスリン様増殖因子−II、インスリン様増殖因子結合蛋白質−３、インスリン様増殖因子結合蛋白質−５、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−８、白血病阻害因子、ミッドカイン、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＢＢ、プロゲステロン、プトレッシン、幹細胞因子、間質由来因子−１、トロンボポエチン、形質転換増殖因子−α、形質転換増殖因子−β１、形質転換増殖因子−β２、形質転換増殖因子−β３、血管内皮増殖因子、Ｗｎｔ１，Ｗｎｔ３ａ、およびＷｎｔ５ａをはじめとする、本明細書に記載された任意のものであってもよい。当業者は、１種以上の適当な増殖因子を選択することができる。好ましい一実施形態において、臓器幹細胞は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および／またはインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）と接触される。一実施形態において、ＨＧＦは、約０〜４００ｎｇ／ｍｌの量で存在する。更なる実施形態において、ＨＧＦは、約２５、約５０、約７５
、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、または約４００ｎｇ／ｍｌの量で存在する。別の実施形態において、ＩＧＦ−１が、約０〜５００ｎｇ／ｍｌの量で存在する。更に別の実施形態において、ＩＧＦ−１は、約２５、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、客３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、または約５００ｎｇ／ｍｌの量で存在する。
【００４６】
上述のサイトカインまたは増殖因子の機能的バリアントを、本発明において用いることもできる。機能的サイトカイン／増殖因子バリアントは、対応する受容体に結合してそれを活性化する能力を保持する。バリアントは、ネーティブ蛋白質のアミノ酸置換、挿入、欠失、選択的スプライシングバリアントまたはフラグメントを含むことができる。例えば、ＮＫ１およびＮＫ２は、ＨＧＦの天然スプライシングバリアントであり、ｃ−ＭＥＴ受容体に結合することができる。機能を保持するサイトカイン／増殖因子蛋白質のこれらの型の天然由来スプライシングバリアントおよび遺伝子操作バリアントは、本発明の臓器幹細胞を活性化するのに用いることができる。
【００４７】
本発明の一実施形態において、活性化された臓器幹細胞、好ましくは成体心筋から単離された活性化ｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞（例えば、心臓幹細胞）は、治療または修復を必要とする血管構造の領域に送達または移植される。例えば一実施形態において、活性化された幹細胞は、閉塞または遮断された心臓血管または動脈の部位に送達または移植される。本発明の一実施形態において、ｃ−ｋｉｔ陽性であり、ｆｌｋ−１エピトープ（ＶＥＧＦ−Ｒ２）を含む心臓幹細胞は、治療または修復を必要とする領域に送達または移植される。本発明の別の実施形態において、活性化された幹細胞は、幹細胞が送達または移植される部位で動脈または血管を形成する。更なる実施形態において、形成された動脈または血管は、１００μｍを超える直径を有する。更なる実施形態において、形成された動脈または血管は、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、または少なくとも２７５μｍの直径を有する。本発明の更に別の実施形態において、形成された動脈または血管は、閉塞または遮断の周辺をはじめとする治療または修復を必要とする領域の周辺に「生体バイパス」を提供することで、血流、血圧および循環を回復または改善する。本発明の更に別の実施形態において、活性化された幹細胞の投与は、他の治療手段、例えば、非限定的に１種以上の増殖因子を含む他の治療薬の投与と一緒に実行することができる。
【００４８】
本発明は更に、臓器の損傷組織に適用される臓器幹細胞の治療有効用量または治療有効量に関わる。有効用量は、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。前記用量は、１回以上の投与で投与することができる。臓器幹細胞の有効用量は、約２×１０４〜約２×１０７、約１×１０５〜約６×１０６、または約２×１０６であってもよい。以下の実施例において、２×１０４〜１×１０５個の幹細胞が、マウスモデルにおいて投与された。マウスの臓器とヒトの臓器とでは明らかなサイズの差があるが、この範囲の幹細胞は、ヒトでも十分となる可能性がある。しかし、有効用量とみなされる量の正確な決定は、サイズ、年齢、処置される臓器のタイプ、損傷組織の領域および重症度、ならびに損傷からの経過時間など、各患者に固有の因子に基づいていてもよい。当業者、特に医師は、過度の実験をせずとも、有効用量となる幹細胞の数を決定することができよう。
【００４９】
本発明の別の態様において、幹細胞は、臓器に送達される。幾つかの実施形態において、臓器幹細胞は、特に臓器の梗塞領域の隣接領域に送達される。当業者に承知される通り、梗塞領域は、目視可能であるため、この特定の幹細胞配置が可能である。
【００５０】
臓器幹細胞は、有利には注射、特に処置を必要とする臓器への直接の注射により投与される。例えば、成体心筋から単離されたｃ−ｋｉｔ陽性臓器幹細胞（例えば、心臓幹細胞）は、心筋内注射により投与することができる。当業者に承知される通り、心臓は機能筋であるため、これは心臓への好ましい幹細胞送達法である。幹細胞を心臓に注射することにより、心臓の収縮運動による幹細胞の喪失が確実になくなる。本発明の更なる態様において、心臓幹細胞が、注射により経心内膜または経心外膜投与される。この好ましい実施形態は、幹細胞を保護的周囲膜に透過させることができ、細胞を心筋内注射する実施形態に必要とされる。
【００５１】
本発明の別の実施形態において、臓器幹細胞は、カテーテルシステムの使用により臓器の損傷組織に送達することができる。例えば、処置を必要とする臓器への幹細胞のカテーテル送達は、臓器を灌流する血管（例えば、腎臓動脈／静脈、肺動脈／静脈、肝臓動脈／静脈、冠動脈／静脈など）を通して実行することができる。カテーテルの使用により、体腔の切開を必要とするより侵襲的な送達方法が排除される。当業者に承知される通り、本明細書に概説される通り、カテーテルアプローチを含む侵襲性がより小さい手順により、最適回復時間が可能となる。臓器幹細胞が心臓に送達される実施形態において、ＮＯＧＡカテーテルまたは類似のシステムを、用いることができる。ＮＯＧＡカテーテルシステムは、該当する領域の電気機械的マッピングと、目的の注射液を送達する、または目的の領域に治療薬を浴びせるために用いられ得る伸縮可能ニードルとを備えることにより、誘導投与を容易にする。当業者には、本発明と共に使用され得る造影とカテーテル送達システムとの一体化により目的の処置を行う能力も提供する別のシステムが、認識されよう。ＮＯＧＡおよび類似のシステムの使用に関する情報は、例えばそれぞれの教示が全体として本明細書に組み入れられた、Sherman, 2003; Patel, 2005;およびPerrin, 2003に見出すことができる。
【００５２】
本発明の更なる実施形態は、損傷臓器組織に遊走して該臓器を含む細胞系列に分化する臓器幹細胞を必要とする。修復される臓器の１種以上の細胞系列への分化は、損傷組織に構造的および機能的完全性を少なくとも一部回復させるために重要である。損傷心筋を修復する場合、心臓幹細胞が、筋細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞に分化する。
これらの型の細胞が構造的および機能的完全性の両方を回復させるために存在しなければならないことは、当該技術分野において公知である。梗塞または虚血組織を修復する別のアプローチ、例えば米国特許第６，１１０，４５９号および第６，０９９，８３２号は、これらの細胞を直接、または培養されたグラフトとして心臓に移植することを含んだ。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、分化細胞の増殖、および該細胞による臓器構造の形成を含む。例えば、心臓幹細胞により生成された分化筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞は、冠動脈、細動脈、毛細血管、および心筋をはじめとする心臓構造を集成する。当業者に承知される通り、これらの構造の全てが、適正な心臓機能に不可欠である。文献に示されるように、内皮細胞および平滑筋細胞などの細胞の移植が、移植細胞を梗塞領域内で生育させることができるが、必要な構造を形成して心臓の完全な機能性を回復させることはできない。損傷臓器組織に機能的および構造的完全性の両方を少なくとも一部回復させる能力が、本発明の更に別の態様である。
【００５４】
本発明は、治療有効量の単離された成体臓器幹細胞と、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物も含み、前記単離された成体臓器幹細胞は、ｃ−ｋｉｔ陽性で系列陰性であり成体臓器の組織から単離される。本明細書に記載される通り、単離された成体臓器幹細胞は、単離される成体臓器の細胞系列の１種以上または全てを生成することが可能である。例えば、成体臓器幹細胞が単離され得る臓器としては、非限定的に、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、腸、肺、胃、脳、網膜、食道、膀胱、表皮、または骨髄が挙げられる。一実施形態において、臓器は、心臓である。別の実施形態において、臓器は、腎臓である。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、治療薬として、即ち、治療用途に使用してもよい。本明細書において、用語「処置」および「治療」は、治癒効果、緩和効果、および予防効果を含む。
【００５６】
幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、有効量の臓器幹細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、間質細胞由来因子−１、スチール因子、血管内皮増殖因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、もしくはインターロイキン−３、または幹細胞を刺激および／もしくは動員し得る任意のサイトカインからなる群より選択されるサイトカインと組み合わせて含む。サイトカインは、単独でも、または幹細胞の刺激および／または動員；早期および後期造血の維持（以下参照）；単球の活性化（以下参照）、マクロファージ／単球増殖；分化、運動性および生存（以下参照）；心臓または血管状態の処置が、可能な任意の他のサイトカインまたは医薬剤、ならびに薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤（これらの組み合わせを含む）と併用しても、または一緒に投与してもよい
【００５７】
本発明の医薬組成物中のサイトカインは、早期および後期造血の維持に関わることが公知のメディエータ、例えばＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３；コロニー刺激因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、幹細胞因子、ｆｉｔ−３リガンド、肝細胞増殖因子、腫瘍壊死因子α、白血病阻害因子、形質転換増殖因子β１およびβ３；マクロファージ炎症蛋白質１α）、血管原性因子（線維芽細胞増殖因子１および２、血管内皮増殖因子）、および結合組織形成細胞を通常の標的（および供給源）とするメディエータ（血小板由来増殖因子Ａ、表皮増殖因子、形質転換増殖因子αおよびβ２、オンコスタチンＭ、ならびにインスリン様増殖因子−１）、または神経細胞（神経成長因子）（Sensebe, L., et al., Stem Cells 1997;15;133−43）、血小板および巨核細胞中に存在するＶＥＧＦポリペプチド（Wartiovaara, U., et al., Thromb Haemosi 1998; 80: 1 71 -5; Mohle, R., Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:663-8）ＨＩＦ−１、低酸素への応答に関与する数種の遺伝子のプロモータに結合してそれを刺激する強力な転写因子、内皮ＰＡＳドメイン蛋白質１（ＥＰＡＳ１）、単球走化性蛋白質−１（ＭＣＰ−１）などの付随機能を増進するための単球由来サイトカインも含むことができる。
【００５８】
一態様において、本発明の医薬組成物は、注射により送達される。これらの投与（送達）経路としては、非限定的に、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻腔内投与をはじめとする皮下または非経口投与に加え、髄腔内および輸注法が挙げられる。したがって、好ましくは医薬組成物は、注射に適した形態である。
【００５９】
本発明の医薬組成物を非経口投与するに場合、それは一般に、単位用量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で配合される。注射に適した医薬配合剤としては、滅菌水溶液または分散液、および注射可能な滅菌溶液または分散液に再構成される滅菌粉末が挙げられる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。
【００６０】
例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合には必要な粒径を維持すること、および界面活性剤を使用することにより、適正な流動性を維持することができる。非水性ビヒクル、例えば綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ヒマワリ油、またはピーナッツ油、およびミリスチン酸イソプロピルなどのエステルを、組成物の溶媒系として使用してもよい。
【００６１】
加えて、抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート化剤、および緩衝剤をはじめとする、組成物の安定性、滅菌性、および等張性を増進する種々な添加剤を、添加することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより確実にすることができる。多くの場合、等張剤、例えば砂糖、塩化ナトリウムなどを含めるのが、望ましい。注射可能な医薬形態の長期吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。しかし本発明によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤、または添加剤が、臓器幹細胞と適合性でなければならない。
【００６２】
滅菌注射可能溶液は、本発明を実施する際に使用される化合物を、所望により様々な量の他の成分と共に必要量の適当な溶媒中に組み入れることにより、調製することができる
【００６３】
例えば治療有効量の臓器幹細胞を含む、本発明の医薬組成物は、任意の適合性担体、例えば様々なビヒクル、アジュバント、添加剤、および希釈剤を含有する注射可能配合剤中で患者に投与することができ、または本発明において用いられる化合物は、徐放性皮下移植片または標的送達システム、例えばモノクローナル抗体、イオン泳動、ポリマーマトリクス、リポソーム、およびミクロスフェアの形態で患者に非経口投与することができる。
【００６４】
本発明に用いられる医薬組成物は、患者に経口投与することができる。錠剤、懸濁液、溶液、エマルジョン、カプセル、粉末、シロップなどで化合物を投与するなど、従来の方法が、使用可能である。化合物を経口または静脈内送達して、生物活性を維持する公知の技術が、好ましい。
【００６５】
一実施態様において、本発明の組成物は、最初に投与し、その後、更なる投与により維持することができる。例えば、本発明の組成物は、１つのタイプの組成物で投与し、その後、異なる、または同じタイプの組成物を更に投与することができる。例えば、本発明の組成物は、静脈注射により投与して、血中レベルを適切なレベルにすることができる。その後、患者のレベルが、経口投薬剤型により維持されるが、患者の状態に応じて他の投与形態を用いることができる。
【００６６】
ヒトが、一般にマウスや他の実験動物よりも長期にわたり処置を受け、処置が、疾患の進行期間や薬剤有効性に比例した期間となることに留意されたい。投薬は、単回投薬または数日間にわたる複数回投薬とし得るが、単回投薬が好ましい。つまり過度の実験をせずとも、本開示、本明細書の引用文献、および技術分野の知識から得られる技法により、ラット、マウスなどの動物実験からヒトに拡大することができる。
【００６７】
処置は、一般に疾患の進行期間、薬剤有効性、および処置される患者に比例した期間を有する。
【００６８】
投与される医薬組成物の量は、処置される患者および処置される臓器のタイプにより変動する。好ましい実施態様において、臓器幹細胞２×１０４〜１×１０５個およびサイトカイン１日あたり５０〜５００μｇ／ｋｇが、患者に投与される。マウスの臓器とヒトの臓器とでは明らかなサイズの差があるが、幹細胞２×１０４〜１×１０５個は、ヒトでも十分となる可能性がある。しかし、有効用量とみなされる量の正確な決定は、サイズ、年齢、処置される臓器、損傷組織の領域および重症度、ならびに損傷からの経過時間など、各患者に固有の因子に基づいてもよい。それゆえ投与量は、本開示および技術分野の知識から当業者により容易に確定され得る。つまり当業者は、本発明の方法において投与される組成物中の化合物および任意の添加剤、ビヒクル、ならびに／または担体の量を容易に決定することができる。典型的には、任意の添加剤が（活性幹細胞および／またはサイトカインに加えて）、リン酸緩衝生理食塩水中０．００１〜５０重量％溶液の量で存在し、有効成分は、マイクログラム〜ミリグラムの桁で、例えば約０．０００１〜約５重量％、好ましくは約０．０００１〜約１重量％、最も好ましくは約０．０００１〜約０．０５重量％、または約０．００１〜約２０重量％、好ましくは約０．０１〜約１０重量％、最も好ましくは約０．０５〜約５重量％で存在する。もちろん、動物またはヒトに投与される任意の組成物に関して、および更に任意の特定の投与方法に関して、適切な動物モデル、例えばマウスなどのげっ歯類において致死量（ＬＤ）およびＬＤ５０を決定することにより毒性を、そして適切な応答を誘発する組成物の投与量、組成物成分の濃度、組成物を投与するタイミングを決定することが好ましい。そのような決定は、過度の実験を必要とせず、当業者の知識、本開示、本明細書の引用文献から得られる。そして逐次投与の時間は、過度の実験をせずとも確定される。
【００６９】
本発明の治療薬を含む組成物の例としては、開口部、例えば口腔、鼻腔、肛門、膣、経口、胃内、粘膜（例えば、経舌、歯槽、歯肉、嗅覚、または呼吸器粘膜）などのための液体製剤、例えば懸濁液、シロップ、またはエリキシル剤などの投与、および非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与（例えば、注射投与）用の製剤、例えば滅菌懸濁液またはエマルジョンが挙げられる。そのような組成物は、適当な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコースなどと混和されていてもよい。組成物は、凍結乾燥することもできる。組成物は、投与経路および所望の製剤に応じて、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または増粘用添加剤、防腐剤、着香剤、着色剤などの補助物質を含有することができる。過度の実験をせずとも、参照により本明細書に組み入れられた、“REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17版, 1985年などの標準教書を調べて、適切な製剤を調製してもよい。
【００７０】
本発明の組成物は、選択されたｐＨに緩衝され得る液体製剤、例えば等張性水溶液、懸濁液、エマルジョン、または粘性組成物として簡便に提供される。消化管吸収が好ましい場合には、本発明の組成物は、持続放出性であるか、または液体充填物を有する「固体」製剤、例えばゼラチンが胃内で溶解して消化管送達を果たすゼラチン被覆液をはじめとする、丸薬、錠剤、カプセル、カプレットなどの「固体」形態であってもよい。鼻腔または呼吸器（粘膜）投与が望まれる場合、組成物は、圧迫式噴霧ディスペンサ、ポンプ式ディスペンサ、またはエアロゾルディスペンサによる形態で、分散されてもよい。エアロゾルは、通常は炭化水素による圧力下にある。ポンプ式ディスペンサは、好ましくは一定用量、または特定の粒径を持つ用量を分配することができる。
【００７１】
本発明の組成物は、特に経口投与される場合には、より興味を引くように、薬学的に許容し得る着香剤および／または着色剤を含むことができる。粘性組成物は、ゲル、ローション、軟膏、クリームなど（例えば、経皮投与用）の形態であってもよく、典型的には、粘度が２５００〜６５００ｃｐｓになるのに十分な量の増粘剤を含有するが、最大１０，０００ｃｐｓのより粘稠な組成物を用いてもよい。粘性組成物は、好ましくは２５００〜５０００ｃｐｓの粘度を有し、この範囲を超えると投与がより困難になる。しかし、その範囲を超えると、組成物は、固体またはゼラチン形態に近付き、そうすれば経口摂取用の経口嚥下丸薬として容易に投与することができる。
【００７２】
液体製剤は、通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物より調製が容易である。加えて液体組成物は、特に注射や経口により、投与が幾分か簡便である。他方で、粘性組成物は、適当な粘度範囲で配合されると、胃の内膜または鼻腔粘膜などの粘膜と長時間接触することができる。
【００７３】
明白であろうが、適当な担体および他の添加剤の選択は、厳密な投与経路、特定の投与形態の性質、例えば液体投与形態（例えば、組成物が溶液、懸濁液、ゲルまたはその他の液体形態に配合されるか）または固体投与形態（例えば、組成物が丸薬、錠剤、カプセル、カプレット、徐放性形態または液体充填形態に配合されるか）に依存する。
【００７４】
溶液、懸濁液、およびゲルは、通常、活性化合物に加えて大量の水（好ましくは、精製水）を含有する。微量の他の成分、例えばｐＨ調整剤（例えば、ＮａＯＨなどの塩基）、乳化剤または分散剤、緩衝剤、防腐剤、湿潤剤、ゲル化剤（例えば、メチルセルロース）、着色剤、および／または着香剤が、存在してもよい。組成物は、等張性、即ち血液や涙液と同じ浸透圧性を有することができる。
【００７５】
本発明の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、または他の薬学的に許容し得る薬剤、例えばデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロプレングリコールまたは他の無機もしくは有機溶質を用いて達成することができる。塩化ナトリウムは、特にナトリウムイオンを含有する緩衝剤に好ましい。
【００７６】
組成物の粘度は、薬学的に許容し得る増粘剤を用いて選択したレベルに維持してもよい。容易に且つ経済的に入手できて扱い易いことから、メチルセルロースが好ましい。他の適切な増粘剤としては、例えばキサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の好ましい濃度は、選択された薬剤に依存する。重要なことは、選択した粘度に到達させる量を使用することである。粘性組成物は、通常、そのような増粘剤の添加により溶液から調製される。
【００７７】
薬学的に許容し得る防腐剤を用いて、組成物の有効期間を延長することができる。ベンジルアルコールが適切であるが、例えばパラベン、チメロサール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムをはじめとする様々な防腐剤を使用することもできる。防腐剤の適切な濃度は、総重量に基づいて０．０２％〜２％であるが、選択された薬剤に応じて適度に変動してもよい。
【００７８】
組成物の成分が、活性化合物に関して化学的に不活性であるよう選択されるべきであることは、当業者に認識されよう。これは、化学および医薬原理の当業者にとって何ら問題を提示せず、または標準科書の参照もしくは単純な実験により（過度の実験を含まずに）、本開示および本明細書の引用文献から、問題を容易に回避することができる。
【００７９】
本発明の組成物は、一般に許容される手順に従って成分を混合することにより調製される。例えば、選択された成分は、ブレンダまたは他の標準装置で単に混合して濃縮混合物を製造し、その後、水または増粘剤を、そしてことによると緩衝剤を添加してｐＨを制御するか、または溶質を添加して等張性を制御することにより、最終的な濃度および粘性に調整してもよい。一般に、ｐＨは、約３〜７．５であってもよい。組成物は、年齢、性別、体重、特定の患者の状態、投与に用いられる組成物の形態（例えば、固体か液体か）などの因子を考慮して、医学および獣医学の当業者に周知の投与量および技術で投与することができる。ヒトまたは他のホ乳類の投与量は、本開示、本明細書に引用された文献、および当該技術分野の知識から、過度の実験をせずとも、当業者により決定することができる。
【００８０】
初回投与および追加投与または逐次投与の適切なレジメンも様々であり、初回投与の後に逐次投与を含んでいてもよいが、言うまでもなく、本開示、本明細書に引用された文献、および当該技術分野の知識から、当業者により確認されてもよい。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、急性組織傷害（例えば、虚血性、毒性、免疫関連の損傷）または様々な慢性変性疾患から生じた損傷臓器組織を修復および／または再生するのに用いられる。したがって本発明は、これらの状態の任意の１種以上の処置または予防のための、本明細書において議論された臓器幹細胞の単独での、または本明細書において議論された１種以上のサイトカインと併用での投与、そのような処置または予防の組成物、そのような組成物を配合するための、本明細書に議論された臓器幹細胞の単独での、または本明細書において議論された１種以上のサイトカインと併用での使用、ならびにそのような組成物の調製および／またはそのような処置もしくは予防のための、本明細書に議論された幹細胞を単独で、または本明細書において議論された１種以上のサイトカインと一緒に含むキットを含む。そして有利な投与経路は、これらの状態を処置するのに最適なもの、例えば、非限定的に静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻腔内投与など皮下または非経口注射によるもの、ならびに髄腔内、輸注法を含む。
【００８２】
本発明の別の態様は、常在性臓器幹細胞を動員するためのサイトカインの投与に関する。このサイトカインは、サイトカインの群から選択されてもよく、またはサイトカインの組み合わせを含んでいてもよい。幹細胞因子（ＳＣＦ）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、幹細胞の血流への動員を誘発する刺激因子として当業者に公知である（Bianco et al,2001, Clutterbuck, 1997, Kronewett et al, 2000, Laluppa et al, 1997, Patchen et al, 1998）。間質細胞由来因子−１は、幹細胞動員を走化性により刺激することが示されており、スチール因子は、走化性および化学運動性を有する（Caceres-Cortes et al, 2001, Jo et al, 2000, Kim and Broxmeyer, 1998, Ikuta et al, 1991）。血管内皮増殖因子は、動員の間に遊走を容易にする助けとなるパラクリンループに携わると推測されている（Bautz et al, 2000, Janowska-Wieczorek et al, 2001）。マクロファージコロニー刺激因子および顆粒球マクロファージ刺激因子は、幹細胞の動員を刺激することにより、ＳＣＦおよびＧ−ＣＳＦと同じ手法で機能することが示されている。インターロイキン−３も、幹細胞の動員を刺激することが示されており、他のサイトカインと組み合わせると特に強力になる。
【００８３】
サイトカインは、サイトカインをインビボで発現するベクターを介して投与することができる。インビボ発現用のベクターは、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、ＭＶＡ、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣなど）、レンチウイルス、またはＤＮＡプラスミドベクターなど、参照により本明細書に組み入れられた任意の文献に引用された、または当該技術分野で使用される、ベクターまたは細胞または発現系であってもよく、サイトカインは、そのようなベクターもしくは細胞もしくは発現系、またはその他のもの、例えばバキュロウイルス発現系、エシェリヒア・コリなどの細菌ベクター、およびＣＨＯ細胞などのホ乳類細胞、を介したインビトロ発現のものであってもよい。例えば、米国特許第６，２６５，１８９号、同第６，１３０，０６６号、同第６，００４，７７７号、同第５，９９０，０９１号、同第５，９４２，２３５号、同第５，８３３，９７５号を参照されたい。サイトカイン組成物は、幹細胞調製に有利または好ましいことが記述された経路以外の経路により投与させてもよいが、サイトカイン組成物は、有利には幹細胞調製に有利または好ましいと記述された経路で投与されてもよい。
【００８４】
本発明の別の態様は、治療有効用量または治療有効量のサイトカインの投与を含む。有効用量は、有益な、または所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。前記用量は、１回以上の投与で投与される。好ましい実施形態において、用量は、治療開始後約２、３日の間に与えられる。しかし有効用量とみなされる量の正確な決定は、サイズ、年齢、梗塞サイズ、投与されるサイトカインまたはサイトカインの組み合わせ、損傷からの経過時間など、患者に固有の因子に基づいていてもよい。当業者、特に医師または心臓専門医は、過度の実験をせずとも、有効用量を構成するサイトカインの十分な量を決定し得るであろう。
【００８５】
本発明は、注射、特に皮下または静脈内注射により送達される、治療有効用量または治療有効量のサイトカインの投与も含む。当業者に承知される通り、皮下注射または静脈内送達は、極めて一般的であり、適時に血流に取り込ませ、循環させる手法で、特定用量を送達する効果的方法を提示する。
【００８６】
本発明の更なる態様は、患者の常在性幹細胞を刺激し、血流への動員を誘発する、投与されたサイトカインを含む。前述の通り、所与のサイトカインは、前記動員を促進する能力について、当業者に周知である。
【００８７】
有利には、幹細胞が、血流中に動員化されたならば、幹細胞は、臓器の損傷領域にホーミングする。
【００８８】
本発明の更なる実施形態は、有効量の１種以上のサイトカインを注射により臓器に投与することを含む。好ましくはサイトカインは、梗塞／虚血領域または梗塞／虚血領域に隣接する領域に送達される。当業者に承知される通り、梗塞領域は、目視可能であるため、この特定のサイトカイン配置が可能である。
【００８９】
本発明の更なる実施形態は、単回投与によるサイトカインの送達を含む。本発明の更なる実施形態は、同用量のサイトカインを臓器に複数回投与することを含む。本発明の更なる実施形態は、勾配が形成するようにして、サイトカインを臓器に複数回（２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、または６回以上）投与することを含む。例えばサイトカインの勾配は、臓器内の保存領域または幹細胞ニッシェから、臓器内の損傷組織の領域まで生成させることができる。幾つかの実施形態において、勾配は、保存領域または幹細胞ニッシェから臓器内の損傷組織まで、少なくとも１種のサイトカインを２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上間隔をあけて注射することにより生成される。サイトカイン濃度は、損傷組織の方向に増加させることができ、即ち、損傷組織に最も近い場所への注射が、最高濃度のサイトカインを含有する。
【００９０】
本発明の更なる実施形態は、常在性臓器幹細胞の刺激、遊走、増殖、および／または分化を含む。
【００９１】
本発明の更なる態様は、患者の常在性臓器幹細胞を刺激して、血流への動員を誘発する、投与されたサイトカインを含む。先に言及された通り、所与のサイトカインは、前記動員を促進する能力について、当業者に周知である。同じく、幹細胞が、血流中に動員化されたならば、幹細胞は、臓器の損傷領域にホーミングする。つまり特定の実施形態において、移植された臓器幹細胞および動員された臓器幹細胞の両方が、損傷組織に遊走して、臓器の細胞系列の１種以上または全てに分化する。
【００９２】
心臓構造は、エクスビボで生成され、その後、グラフトの形態で移植することができ、グラフトの移植は、単独であるか、または本開示内の臓器幹細胞と組み合わせるか、または臓器幹細胞および少なくとも１種のサイトカインと組み合わせる。損傷臓器組織をエクスビボで生成および／または再生する手段は、場合によりサイトカインの存在下で、インビトロで培養された臓器幹細胞および臓器組織を取り込んでもよい。臓器幹細胞は、単離された臓器の細胞系列の１種以上または全てに分化し、インビトロで増殖して、臓器特異性組織および／または細胞を形成する。これらの組織および細胞は、臓器組織に集成してもよい。その後、インビトロで形成された組織および／または細胞は、患者に、例えばグラフトにより移植して、損傷臓器組織に構造的および機能的完全性を回復させてもよい。
【００９３】
追加または代わりとして、グラフトされる組織の供給源は、臓器のグラフトに使用される組織の他の供給源に由来するものであってもよい。
【００９４】
臓器組織の機能的および構造的完全性の回復または一部回復（有利には過去に生じたものを超える）が、本発明の更に別の態様である。
【００９５】
したがって本発明は、更なる態様において、例えば損傷臓器組織を修復および／または再生する発明的方法に使用するための、臓器幹細胞および／または少なくとも１種のサイトカインを含む医薬組成物などの組成物を調製する方法を含む。
【００９６】
追加として本発明は、本発明およびその多数の利点のより良い理解を提供する以下の非限定的な実施例により説明される。
【００９７】
以下の実施例において参照される材料、試薬、化学薬品、アッセイ、サイトカイン、抗体、およびその他諸々の全てが、非限定的に、Genzyme、Invitrogen、GibcoBRL、Clonetics、Fisher Scientific、R&D Systems、MBL International Corporation、CN Biosciences Coorporate、Sigma Aldrich、およびCedarLane Laboratories,Limitedをはじめとする供給業者を通して、研究施設に容易に入手可能である。
【００９８】
例えば、
幹細胞因子は、ＳＣＦ（組換えヒト、組換えマウス、およびこれらに対する抗体の複数形態）の名称でR&D Systems(614 McKinley Place N.E.,Minneapolis, MN 55413)から入手可能であり；
顆粒球コロニー刺激因子は、Ｇ−ＣＳＦ（組換えヒト、組換えマウス、およびこれらに対する抗体の複数形態）の名称でR&D Systemsから入手可能であり；
幹細胞抗体−１は、ＳＣＡ−１の名称でMBL International Corporation(200 Dexter Avenue, Suite D, Watertown, MA 02472)から入手可能であり；
多剤耐性抗体は、抗ＭＤＲの名称でCN Biosciences Corporateから入手可能であり；
ｃ−ｋｉｔ抗体は、ｃ−ｋｉｔ（Ａｂ−１）ポリクローナル抗体の名称でCN Biosciences Corporate(Merck KgaA(Darmstadt、ドイツ）の関連会社。本社は10394 Pacific Center Court, San Diego, CA 92121)から入手可能である。
【００９９】
実施例
実施例１：梗塞心筋の造血幹細胞（ＨＳＣ）の修復
Ａ．造血幹細胞の採取
強化緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）を発現する雄トランスジェニックマウスの大腿骨および脛骨から、骨髄を採取した。大腿骨および脛骨を摘出した後、筋肉を切除し、骨の上面および下面を切開し、回収用緩衝液を骨髄に浸潤させた。緩衝液と細胞を含有する液体を、１．５ｍｌエッペンドルフチューブなどの試験管に回収した。骨髄細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＰＢＳ中に懸濁させ、以下の造血細胞系列に特異的なラット抗マウスモノクローナル抗体と共に氷上でインキュベートした：ＣＤ４およびＣＤ８（Ｔリンパ球）、Ｂ−２２０（Ｂリンパ球）、Ｍａｃ−１（マクロファージ）、ＧＲ−１（顆粒球）（Caltag Laboratories）およびＴＥＲ−１１９（赤血球）（Pharmingen）。その後、細胞をＰＢＳですすぎ、ヤギ抗ラットイムノグロブリン（Polyscience Inc.）でコーティングした磁気ビーズと共に３０分間インキュベートした。バイオマグネットにより系列陽性細胞（Ｌｉｎ＋）を除去し、系列陰性（Ｌｉｎ−）をＡＣＫ−４ビオチン（抗ｃ−ｋｉｔｍＡｂ）で染色した。細胞をＰＢＳですすぎ、ストレプトアビジンコンジュゲートフィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）（Caltag Labs.）で染色し、FACS Vantage機器（Becton Dickinson）を用いた蛍光標識細胞選別（ＦＡＣＳ）により選別した。ＥＧＦＰおよびＡＣＫ−４−ビオチン−ＳＡ−ＥＰの励起が、波長４８８ｎｍで起こった。Ｌｉｎ−細胞を、染色強度の１〜２ｌｏｇの差によりｃ−ｋｉｔ陽性（ｃ−ｋｉｔＰＯＳ）およびｃ−ｋｉｔ陰性（ｃ−ｋｉｔＮＥＧ）に選別した（図１）。ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を、ＰＢＳ  ５μｌ中２×１０４〜１×１０５個に懸濁させ、ｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞をＰＢＳ  ５μｌ中１×１０５個の濃度に懸濁させた。
【０１００】
Ｂ．マウスにおける心筋梗塞の誘発
２月齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、Ｌｉら（１９９７）により記載された通り心筋梗塞を誘発させた。梗塞後３〜５時間目に、マウスの胸腔を再度開き、Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を含有するＰＢＳ  ２．５μｌを、梗塞に隣接する生存可能な心筋の前面および後面に注射した（図２）。未注射またはＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞を注射した梗塞マウス、および偽手術のマウス、即ち、開胸したが梗塞を誘発しなかったマウスを、対照として使用した。全動物を、手術後９±２日目に屠殺した。プロトコルは、治験審査委員会により認可されたものであった。結果は、平均±ＳＤで表されている。２つの測定値間の有意性は、スチューデントｔ検定により決定し、多重比較において、ボンフェローニ法（Scholzen and Gerdes,2000）により評価した。Ｐ＜０．０５を、有意とみなした。
【０１０１】
雄性Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ骨髄細胞を、雌マウスの梗塞左心室周辺へ注射した結果、心筋が再生した。梗塞周辺領域とは、梗塞に隣接する生存可能な心筋の領域である。３０匹中１２匹のマウス（４０％）において、修復が得られた。梗塞再構成の失敗は、６００拍／分（ｂｐｍ）で収縮する組織への細胞移植の困難さに起因した。しかし、ドナー骨髄細胞のＹ染色体上の組織適合性抗原に対する免疫反応により、一部の雌レシピエントにおける修復欠如を説明することができる。密集した筋細胞は、梗塞領域の６８±１１％を占め、心室の前面から後面まで広がっていた（図２Ａ〜Ｄ）。新しい筋細胞は、Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞を注射されたマウスにおいては見出されなかった（図２Ｅ）。
【０１０２】
Ｃ．心室機能の決定
マウスを、抱水クロラール（４００ｍｇ／ｋｇ体重、ｉ．ｐ．）で麻酔し、非開胸式処置において左心室（ＬＶ）圧およびＬＶ＋および−ｄＰ／ｄｔを測定するためにマイクロチップ血圧トランスデューサ（モデルSPR-671、Millar）を右頸動脈にカニューレ挿入し、ＨＳＣ移植片から得られた発生筋細胞が機能に影響を及ぼすかを決定した。未注射またはＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞を注射された梗塞マウスを、統計学的にまとめた。偽手術群との比較において、梗塞群は、心不全の徴候を示した（図３）。Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞で処置されたマウスにおいて、ＬＶ拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）は、３６％低下し、発生圧（ＬＶＤＰ）、ＬＶ＋および−ｄP／ｄｔは、それぞれ３２％、４０％、および４１％上昇した（図４Ａ）。
【０１０３】
Ｄ．細胞増殖決定およびＥＧＦＰ検出
腹大動脈にカニューレを挿入し、塩化カドミウム（ＣｄＣｌ２）を注射して心臓拡張期に心臓を停止させ、１０％緩衝ホルマリンにより心筋を逆潅流した。左心室の基部から頂部までの３種の組織断片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。冠動脈閉塞後９±２日目に、心室の梗塞部分は、肉眼でも組織検査でも容易に同定可能であった（図２Ａ参照）。梗塞領域を定める心内膜面および心外膜面の長さ、ならびに左心室全体の心内膜および心外膜を、各断片で測定した。次に、それらの比を計算して、各例における平均梗塞サイズを得た。これは、顕微鏡に接続された画像分析装置を使用して倍率４倍で実行した。梗塞領域を定める心内膜周長と心外膜周長の比（Pfeffer and Braunwald, 1990; Li et al., 1997）は、非処置マウス（７８±１８％、ｎ＝８）と、Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ（７５±１４％、ｎ＝１２）またはＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞（７５±１５％、ｎ＝１１）で処置したマウスとで異ならなかった。
【０１０４】
Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞が心筋再生をもたらすか確定するために、ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ体重、ｉ．ｐ．）を動物に連続４〜５日間、連日投与した後、屠殺し、活発増殖期の累積細胞分裂を決定した。断片を抗ＢｒｄＵ抗体と共にインキュベートし、Ｓ期における心臓細胞核のＢｒｄＵ標識を測定した。更に、ウサギポリクローナル抗マウスＫｉ６７抗体（Dako Corp）で試料を処置することにより、核内のＫｉ６７発現（Ｋｉ６７は、細胞周期中のＧ１、Ｓ、Ｇ２期、および早期有糸分裂期の細胞内で発現される）を評価した。ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧを、二次抗体として用いた（図５および図６）。ＥＧＦＰを、ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ（Molecular Probes）を用いて検出した。マウスモノクローナル抗心臓ミオシン重鎖（MAB 1548；Chemicon）またはマウスモノクローナル抗α−筋節アクチン（クローン5C5；Sigma）を用いて筋細胞を認識し、ウサギポリクローナル抗ヒトVIII因子（Sigma）を用いて内皮細胞を認識し、マウスモノクローナル抗α−平滑筋アクチン（クローン1A4；Sigma）を用いて平滑筋細胞を認識した。核は、１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。ＢｒｄＵおよびＫｉ６７で標識された筋細胞（Ｍ）、内皮細胞（ＥＣ）、および平滑筋細胞（ＳＭＣ）の核の百分比を、共焦点顕微鏡検査により得た。これは、標識された核の数を検査された核の総数で割ることにより実行した。各細胞集団において抽出された核の数は、以下の通りであった；ＢｒｄＵ標識：Ｍ＝２，９０８；ＥＣ＝２，１５３；ＳＭＣ＝４，８７７。Ｋｉ６７標識：Ｍ＝３，７７１；ＥＣ＝４，０５１；ＳＭＣ＝４，７５２。ＥＧＦＰ標識についてカウントされた細胞数：Ｍ＝３，２７８；ＥＣ＝２，０５６；ＳＭＣ＝１，２７４。各例において、心臓ミオシン染色細胞で占められた面積を、梗塞領域により示される総面積で割った値で表示することにより、再生心筋中の筋細胞の百分比を決定した。筋細胞増殖は、ＢｒｄＵおよびＫｉ６７により測定した場合、内皮細胞よりもそれぞれ９３％（ｐ＜０．００１）および６０％（ｐ＜０．００１）高く、平滑筋細胞よりも２２５％（ｐ＜０．００１）および１７６％（ｐ＜０．００１）高かった。
【０１０５】
形成した心筋における細胞の起源を、ＥＧＦＰの発現により決定した（図７および図８）。ＥＧＦＰ発現は、細胞質に限定され、Ｙ染色体は、新しい心臓細胞の核に限定された。ＥＧＦＰを、筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞に特異的な蛋白質の標識と組み合わせた。それにより、各心臓細胞の型を同定し、冠血管内に組織された内皮細胞核および平滑筋細胞を認識することができた（図５、図７、および図８）。ＥＧＦＰを発現した新しい筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞の百分比は、それぞれ５３±９％（ｎ＝７）、４４±６％（ｎ＝７）、および４９±７％（ｎ＝７）であった。これらの値は、ＥＧＦＰを発現した移植Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ骨髄細胞の割合４４±１０％（ｎ＝６）と一致した。筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞の平均５４±８％（ｎ＝６）が、ドナートランスジェニックマウスの心臓においてＥＧＦＰを発現した。
【０１０６】
Ｅ．Ｙ染色体の検出
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイのために、断片を７０％ホルムアルデヒドを含有する変性溶液に暴露した。エタノールで脱水した後、断片を、DNA Probe CEP Y（Satellite III）Spectrum Green（Vysis）を用いて３時間ハイブリダイズした。核をＰＩで染色した。
【０１０７】
Ｙ染色体は、心室の残存部分由来の細胞中には検出されなかった。しかし、新たに形成された筋細胞中にはＹ染色体が検出され、それらの起源が注射された骨髄細胞に由来することが示された（図９）。
【０１０８】
Ｆ．転写因子およびコネキシン４３の検出
断片を、ウサギポリクローナル抗ＭＥＦ２（C-21;Santa Cruz）、ウサギポリクローナル抗ＧＡＴＡ−４（H-112;Santa Cruz）、ウサギポリクローナル抗Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５（Dr.Izumoから入手）、およびウサギポリクローナル抗コネキシン４３（Sigma）と共にインキュベートした。ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Sigma）を、二次抗体として使用した。
【０１０９】
新たに形成された筋細胞が、機能的コンピテンスを図る成熟細胞となったことを確認するために、筋細胞エンハンサ因子２（ＭＥＦ２）、心特異的転写因子ＧＡＴＡ−４および早期筋細胞発生マーカＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５の発現を検査した。心臓において、ＭＥＦ２蛋白質は、ＧＡＴＡ−４により補充され、ミオシン軽鎖、トロポニンＴ、トロポニンＩ、α−ミオシン重鎖、デスミン、心房性ナトリウム利尿因子、およびα−アクチンなどの複数の心遺伝子のプロモータを相乗的に活性化する（Durocher et al.,1997;Morinet al.,2000）。Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５は、筋細胞分化の初期段階に限定される転写因子である（Durocher et al.,1997）。再構成された心臓において、心臓ミオシン標識細胞の全ての核が、ＭＥＦ２（図７Ａ〜Ｆ）およびＧＡＴＡ−４（図１０）を発現したが、４０±９％のみが、Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５を発現した（図７Ｇ〜７Ｉ）。これら筋細胞の性質を更に特徴づけるために、コネキシン４３の発現を決定した。この蛋白質は、筋細胞間に原形質膜チャネルを生成することで細胞間結合および電気的結合を担い（Beardsle et al.,1998;Musil et al.,2000）、コネキシン４３が、細胞の細胞質中および密に整列する分化細胞の表面で明らかとなった（図１１Ａ〜１１Ｄ）。これらの結果は、心筋表現型の予期された機能的コンピテンスと一致した。加えて、様々な成熟段階にある筋細胞が、同じバンドおよび異なるバンド内で検出された（図１２）。
【０１１０】
実施例２：梗塞心筋を修復するための骨髄細胞の動員
Ａ．心筋梗塞およびサイトカイン
２月齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス  １５匹を脾摘し、２週間後に、組換えラット幹細胞因子（ＳＣＦ）２００μｇ／ｋｇ／日および組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）５０μｇ／ｋｇ／日（Amgen）を１日１回、５日間にわたり皮下注射した（Bodine et al.,1994;Orlic et al.,1993）。エーテル麻酔下、左心室（ＬＶ）を露出させ、冠動脈を結さつした（Orlic et al.,2001;Li et al.,1997;Li et al.,1999）。ＳＣＦおよびＧ−ＣＳＦを、更に３日間与えた。対照は、脾摘して梗塞を起こさせたマウスおよび生理食塩水を注射された偽手術マウス（ＳＯ）からなった。５０ｍｇ／ｋｇ体重のＢｒｄＵを、屠殺前に１日１回、１３日間にわたり与え、２７日後にマウスを殺処分した。プロトコルはニューヨーク医科大学により認可されたものであった。結果は、平均±ＳＤである。有意性はスチューデントｔ検定およびボンフェローニ法（Li et al.,1999）により決定した。対数順位検定により、致死率を計算した。Ｐ＜０．０５を、有意とした。
【０１１１】
骨髄Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞が、心原性細胞系列に分化転換する能力を前提とし（Orlic et al.,2001）、死滅した心筋領域にホーミングする確率を高めるために、末梢循環における該細胞の数を最大にするプロトコルを用いた。正常動物では、Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞の血中頻度は、骨髄中に存在する同様の細胞のほんのわずかである（Bodine et al.,1994;Orlic et al.,1993）。前述した通り、本明細書で用いられるサイトカイン処置は、骨髄中のＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞の著しい増加、およびこれらの細胞の骨髄から末梢血への再分配を促進する。このプロトコルで、循環中のＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞は２５０倍増加する（Bodine et al.,1994;Orlic et al.,1993）。
【０１１２】
現在の研究おいて、ＳＣＦおよびＧ−ＣＳＦによるＢＭＣ動員は、梗塞マウスの生存率を劇的に増加させ、サイトカイン処置により７３％のマウス（１５匹中１１匹）が、２７日間生存したが、非処置梗塞マウスにおいては、致死率が非常に高かった（図１３Ａ）。この群の多数の動物が、心筋梗塞（ＭＩ）後３〜６日で死亡し、わずか１７％（５２匹中９匹）が２７日目に至った（ｐ＜０．００１）。手術による外傷の影響を最小にするために、ＭＩ後４８時間以内に死亡したマウスは、致死率曲線に含めなかった。左心房自由壁（ＬＶＦＷ）中の喪失筋細胞数により測定したところ、２７日目に、サイトカイン注射動物（６４±１１％、ｎ＝１１）と生理食塩水注射動物（６２±９％、ｎ＝９）で、梗塞サイズは同様であった（図１４）。
【０１１３】
重要なこととして、手術後２７日目に屠殺されたサイトカイン処置梗塞マウスの１１匹全てにおいて、骨髄細胞動員により心筋再生が促進された（図１３Ｂ）。梗塞内の心筋成長は、６日目（ｎ＝２）および９日目（ｎ＝２）に早期死亡したマウス４匹にも見られた。心臓修復は、損傷領域の大半を占める、新たに形成された心筋バンドを特徴とした。発生組織は、損傷領域の境界域から内側に、そしてＬＶＦＷの心内膜から心外膜へと広がっていた。サイトカインの非存在下において、心筋置換は全く観察されず、瘢痕形成を伴う治癒が明らかとなった（図１３Ｃ）。反対に処置マウスでは、小さなコラーゲン蓄積領域が検出された。
【０１１４】
Ｂ．超音波心臓検査および血行動態によるＢＭＣ動員の検出
１３−ＭＨｚ線形トランスデューサ（１５Ｌ８）を備えたSequoia256c（Acuson）を用いて、覚醒マウスにおいて超音波心臓検査を実施した。前胸部を剪毛し、乳頭筋の位置で傍胸骨短軸から二次元（２Ｄ）画像およびＭモードトレーシングを記録した。Ｍモードトレーシングから、心臓拡張期および収縮期における解剖学的パラメータを得た（Pollick et al.,1995）。２Ｄ短軸視像におけるＬＶ断面積から、駆出率（ＥＦ）を導いた（Pollick et al.,1995）：ＥＦ＝［（ＬＶＤＡ−ＬＶＳＡ）／ＬＶＤＡ］×１００（式中、ＬＶＤＡおよびＬＶＳＡは、心臓拡張期および収縮期におけるＬＶ面積に対応する）。マウスを抱水クロラール（４００ｍｇ／ｋｇ体重、ｉｐ）で麻酔し、チャート式記録計に接続されたマイクロチップ圧力トランデューサ（SPR-671、Millar）をＬＶに進入させ、非開胸処置における血圧、ならびに＋および−ｄＰ／ｄｔを評価した（Orlic et al.,2001;Li et al.,1997;Li et al.,1999）。
【０１１５】
ＥＦは、冠動脈閉塞後９、１６、および２６日目において、非処置マウスよりも処置マウスでそれぞれ４８％、６２％、および１１４％高かった（図１５Ｄ）。サイトカインに暴露されたマウスにおいて、収縮機能が、壁の梗塞領域内で時間と共に発生した（図１５Ｅ〜Ｍ；図１６Ｈ〜Ｐ、www.pnas.org）。反対に、ＬＶ拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）は、非処置マウスにおいて７６％高かった。ＬＶ収縮期圧（図示しない）、発生圧（ＬＶＤＰ）、＋および−ｄＰ／ｄｔの変動も、サイトカイン処置の非存在下でより激しくなった（図１７Ａ〜Ｄ）。加えて、梗塞に隣接する領域および梗塞から遠隔の領域における心臓拡張期応力の増加は、サイトカイン処置マウスにおいて６９〜７３％少なかった（図１５Ｎ）。したがって、サイトカイン介在での梗塞修復により、再生心筋において注目に値するレベルの収縮が回復し、拡張期壁応力が低下し、心室性能が向上した。梗塞心臓のインビボ変化の間に、心筋再生により、腔拡張および壁厚減少が緩和された。
【０１１６】
超音波心臓検査によれば、ＬＶ収縮終期直径（ＬＶＥＳＤ）および拡張終期直径（ＬＶＥＤＤ）は、梗塞後９、１６、および２６日目に、サイトカイン処置マウスよりも非処置マウスでより増加した（図１６Ａ〜Ｂ）。心臓収縮期（ＡＷＳＴ）および拡張期（ＡＷＤＴ）前壁厚の評価は、梗塞により妨げられた。測定可能な場合は、収縮期（ＰＷＳＴ）および拡張期（ＰＷＤＴ）の後壁厚は、処置マウスにおいてより大きくなった（図１６Ｃ〜Ｄ）。解剖学的には、梗塞に隣接する壁および梗塞から遠隔の壁は、サイトカイン注射マウスにおいて２６％および２２％厚かった（図１６Ｅ）。ＢＭＣ誘導修復は、壁厚対腔半径比を４２％上昇させた（図１５Ａ）。加えて、組織再生により、腔直径（−１４％）、長軸（−５％）（図１６Ｆ〜Ｇ）、および腔容積（−２６％）（図１５Ｂ）の増大が抑制された。重要なこととして、処置動物において心室質量対腔容積比が、３６％上昇した（１５Ｃ）。したがって、筋細胞および血管構造の新規集団の増殖および分化をもたらすＢＭＣ動員は、心代償不全の定義となる解剖学的変数を低減した。
【０１１７】
Ｃ．心臓の解剖学的構造および梗塞サイズの決定
血行動態測定に続き、腹大動脈にカニューレを挿入し、心臓をＣｄＣｌ２で心臓拡張期に停止させ、心筋を１０％ホルマリンで潅流した。ＬＶの腔に、固定剤をインビボ測定された拡張終期圧に等しい圧力で充填した（Li et al.,1997;Li et al.,1999）。ＬＶ腔内軸を測定し、基部、中間部および頂部から得た３種の横断切片を、パラフィンに包埋した。中間部を用いてＬＶ厚、腔直径、および容積を測定した（Li et al.,1997;Li et al.,1999）。梗塞サイズは、ＬＶＦＷから喪失された筋細胞の数により決定した（Olivetti et al.,1991;Beltrami et al.,1994）。
【０１１８】
心室質量に対する発生バンドの寄与を定量するために、最初にＬＶＦＷ容積（重量を１．０６ｇ／ｍｌで割った値）を、各群のマウスにおいて決定した。データは、偽手術（ＳＯ）において５６±２ｍｍ３、梗塞非処置動物において６２±４ｍｍ３（生存可能ＦＷ＝４１±３；梗塞ＦＷ＝２１±４）、および梗塞サイトカン処置マウスにおいて５６±９ｍｍ３（生存可能ＦＷ＝３７±８；梗塞ＦＷ＝１９±５）であった。非処置動物およびサイトカン処置動物における梗塞サイズを前提として、これらの値を、２７日目の温存心筋および喪失心筋の予測値と比較した。ＳＯにおけるＬＶＦＷ容積（５６ｍｍ３）と非処置マウス（６２％）および処置マウス（６４％）における梗塞サイズから、冠動脈閉塞後２７日目に、残存が見込まれる心筋体積（非処置＝２１ｍｍ３；処置＝２０ｍｍ３）および喪失が見込まれる心筋体積（非処置＝３５ｍｍ３；処置＝３６ｍｍ３）を計算することができた（図１８Ａ）。新たに形成された心筋の体積を、サイトカイン処置マウスのみで検出すると、１４ｍｍ３であることが見出された（図１８Ａ）。つまり、修復バンドにより、梗塞サイズが６４％（３６ｍｍ３／５６ｍｍ３＝６４％）から３９％［（３６ｍｍ３−１４ｍｍ３）／５６ｍｍ３＝３９％］に縮小した。２７日目のＬＶＦＷの温存部分は、非処置マウスおよび処置マウスにおいて４１ｍｍ３および３７ｍｍ３であったため（上記参照）、図１８ａに示された残存心筋は、それぞれ９５％（ｐ＜０．００１）および８５％（ｐ＜０．００１）肥大した。一貫して、筋細胞容積は９４％および７７％増加した（図１８Ｂ）。
【０１１９】
Ｄ．形成された心筋の総容積の決定
３種の断片それぞれにおいて、回復組織が占める面積および断片厚を測定することにより、再生心筋の体積を決定した。これら２つの変数の積から、各断片における組織修復体積を得た。３種の断片の値を加算し、形成された心筋の総体積を得た。加えて、各心臓において、筋細胞４００個の容積を、測定した。断片を、デスミンおよびラミニン抗体ならびにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。核が中心に位置する、長軸方向に配列された細胞のみを含めた。各筋細胞において、核を通る長さおよび直径を収集し、円筒形と仮定して細胞容積を計算した（Olivetti et al.,1991;Beltrami et al.,1994）。筋細胞を分類に分けて、筋細胞の分類総容積と平均細胞容積の比から、各分類の筋細胞数を計算した（Kajstura et al.,1995;Reiss et al.,1996）。心筋単位面積あたりの細動脈および毛細血管プロファイルの数を、過去に行われたものと同様に測定した（Olivetti et al.,1991;Beltrami et al.,1994）。
【０１２０】
断片を、ＢｒｄＵまたはＫｉ６７抗体と共にインキュベートした。マウスモノクローナル抗心臓ミオシンを用いて筋細胞（Ｍ）を認識し、ウサギポリクローナル抗第VIII因子を用いて内皮細胞（ＥＣ）を認識し、マウスモノクロ−ナル抗α−平滑筋アクチンミオシンを用いて平滑筋細胞（ＳＭＣ）を認識した。ＢｒｄＵおよびＫｉ６７で標識されたＭ、ＥＣ、およびＳＭＣ核の比率を、共焦点顕微鏡検査により得た（Orlic et al.,2001）。核は、サイトカイン処置マウス１１匹において抽出した；ＢｒｄＵ：Ｍ＝３，５４１；ＥＣ＝２，６０４；ＳＭＣ＝１，８２４、Ｋｉ６７：Ｍ＝３，０９６；ＥＣ＝２，４６５；ＳＭＣ＝１，４０４。
【０１２１】
細胞増殖の累積度を測定するために、１４日目から２６日目にかけてＢｒｄＵを連日注射し、一方で屠殺時に細胞周期中の細胞数を決定するために、Ｋｉ６７をアッセイした。Ｋｉ６７は、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、前期および中期にある細胞を同定し、後期および終期には減少する（Orlic et al.,2001）。ＢｒｄＵおよびＫｉ６７陽性筋細胞の百分比は、それぞれＥＣよりも１．６倍および１．４倍高く、ＳＭＣよりも２．８倍および２．２倍高かった（図１８Ｃ、１９）。形成した心筋は、梗塞の７６±１１％を占め；筋細胞は６１±１２％を構成し、新血管は１２±５％を、その他の成分は３±２％を構成した。バンドは、再生筋細胞１５×１０６個を含み、これらの細胞は活発な増殖期にあり、広いサイズ分布を有した（図１８Ｄ〜Ｅ）。ＥＣおよびＳＭＣの増殖の結果、新たな心筋１ｍｍ２あたり細動脈１５±５個および毛細血管３４８±８２個が形成された。幾つかのＳＭＣ層を有し、管腔直径が１０〜３０μｍである壁の厚い細動脈は、分化早期における血管を表した。時には、定着過程における修復心筋内の冠動脈分枝の不完全な潅流が、赤血球を含む細動脈および毛細血管をもたらすことがあった（図１８Ｆ〜Ｈ）。これらの結果から、新たな血管は機能的コンピテントであり、冠動脈循環と接続していることが立証された。それゆえ、組織修復により梗塞サイズは減少し、筋細胞増殖は血管形成を上回っており、筋量置換は梗塞心臓の優勢な特徴であった。
【０１２２】
Ｅ．細胞分化の決定
細胞質マーカおよび核マーカを使用した。筋細胞核：ウサギポリクローナルＣｓｘ／Ｎｋｘ２．５、ＭＥＦ２、およびＧＡＴＡ４抗体（Orlic et al.,2001;Lin et al.,1997; Kasahara et al.,1998）；細胞質：マウスモノクローナルネスチン（Kachinsky et al.,1995）、ウサギポリクローナルデスミン（Hermann and Aebi;1998）、心臓ミオシン、マウスモノクローナルα−筋節アクチンおよびウサギポリクローナルコネキシン４３抗体（Orlic et al.,2001）。ＥＣ細胞質：マウスモノクローナルｆｌｋ−１、ＶＥ−カドヘリンおよび第VIII因子抗体（Orlic et al.,2001;Yamaguchi et al.,1993;Breier et al.,1996）。ＳＭＣ細胞質：ｆｌｋ−１およびα−平滑筋アクチン抗体（Orlic et al.,2001;Couper et al.,1997）。コラーゲンＩ型抗体とコラーゲンIII型抗体との混合物により、瘢痕を検出した。
【０１２３】
５種の細胞質蛋白質：ネスチン、デスミン、α−筋節アクチン、心臓ミオシンおよびコネキシン４３を同定し、筋細胞の分化の状態を確定した（Orlic et al.,2001;Kachinsky et al.,1995;Hermann and Aebi,1998）。形成したバンドに分散する個々の細胞において、ネスチンが認識された（図２０Ａ）。これを例外とし、その他全ての筋細胞が、デスミン（図２０Ｂ）、α−筋節アクチン、心臓ミオシン、およびコネキシン４３（図２０Ｃ）を発現した。数種の心筋構造遺伝子のプロモータの活性化に関わる３種の転写因子：Ｃｓｘ／Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４、およびＭＥＦ２を検査した（Orlic et al.,2001;Lin et al.,1997;Kasahara et al.,1998）（図２１Ａ〜Ｃ）。２種のＥＣマーカであるｆｌｋ−１およびＶＥ−カドヘリンに対して陽性の単細胞（Yamaguchi et al.,1993;Breier et al.,1996）が、修復組織中に存在し（図２０ＤおよびＥ）；単離されたＳＭＣまたは動脈壁内のＳＭＣ中で、ｆｌｋ−１が検出された（図２０Ｆ）。このチロシンキナーゼ受容体は、血管形成の間にＳＭＣの遊走を促進する（Couper et al.,1997）。それゆえ梗塞心臓の修復は、全ての心臓細胞集団の増殖および分化に関与し、デノボ心筋をもたらした。
【０１２４】
実施例３：成体マウス心臓における原始心臓細胞の遊走
原始細胞集団が、成体心室心筋中に存在するか、そしてこれらの細胞が、遊走能を有するかを決定するために、３種の主要増殖因子：肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、および顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を、化学誘引物質として使用した。ＳＣＦおよびＧＭ−ＣＳＦは、造血幹細胞の移行(ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ)を促進することが示されているため選択した。ＨＧＦは、造血幹細胞の遊走を誘発するが、この増殖因子は、心臓発生早期において心臓細胞前駆体の有糸分裂、分化および遊走に大きく関与する。これに基づき、マウス心臓から酵素作用により解離させた細胞を、サイズに応じて分別した。心臓細胞を心臓組織から解離する方法は、当業者に周知であり、それゆえ過度の実験は、必要ない（参照により全体が本明細書に組み入れられた米国特許第６，２５５，２９２号参照）。直径５〜７μｍで高い核対細胞質比を有する、小未分化細胞を含む均一な解離心臓細胞集団を、５μｍ細孔を含むゼラチンコーティングフィルタを特徴とするボイデンマイクロチャンバにおいて（Boyden et al., 1962, J.Exptl.Med. 115:453-456）遊走アッセイに供試した。
【０１２５】
３種の増殖因子の存在下における遊走細胞の用量反応曲線に、大きな差異は検出されなかった。しかし、ＨＧＦは、濃度１００ｎｇ／ｍｌで多数の細胞を動員するようであった。加えて、ＨＧＦに対して走化性反応を示した細胞は、ｃ−ｋｉｔ陽性（ｃ−ｋｉｔＰＯＳ）細胞１５％、多剤耐性−１（ＭＤＲ−１）標識細胞５０％、および幹細胞抗原−１（Ｓｃａ−１）発現細胞３０％からなった。動員された細胞を１５％ウシ胎仔血清中で培養すると、それらは筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞に分化した。心臓ミオシン陽性筋細胞は、標本の５０％を構成したが、第VIII因子標識細胞は１５％、α−平滑筋アクチン染色細胞は４％、およびビメンチン陽性第VIII陰性線維芽細胞は２０％含まれた。残りの細胞は、小未分化細胞であり、これら４種の抗体で染色されなかった。結論として、マウス心臓は、増殖因子により動員される原始細胞を有する。ＨＧＦは、インビトロで４種の心臓細胞系列に分化する細胞を移行する。
【０１２６】
実施例４：心臓ｃ−ｋｉｔ陽性細胞はインビトロで増殖し、インビボで新たな心筋を生成する
原始ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞が老齢フィッシャー３４４ラットに存在するかを決定するために、解離した心臓細胞を、ｃ−ｋｉｔ受容体抗体（ＡＣＫ−４−ビオチン、抗ｃ−ｋｉｔ  ｍＡｂ）でコーティングされた磁気ビーズに暴露した。分離後、これら小未分化細胞を、１０％ウシ胎仔血清中で培養した。細胞を数日間付着させると、１週間目に増殖を開始した。７〜１０日目に、コンフルエントに達した。継代Ｐ２およびＰ４で達成された倍増時間は、それぞれ３０時間および４０時間であった。細胞は、老齢期に達することなく、Ｐ１８（第９０代）まで増殖した。複製能力は、Ｋｉ６７標識により確定され、Ｐ２において、８８±１４％の細胞が、核内にＫｉ６７蛋白質を含んだ。Ｐ１〜Ｐ４の間に、追加の測定値を得た。細胞の４０％がα−筋節アクチンまたは心臓ミオシンを、１３％がデスミンを、３％がα−平滑筋アクチンを、１５％が第VIII因子またはＣＤ３１を、１８％がネスチンを発現した。これらのインビトロ条件下では、細胞は、筋節が適正に整列した明らかな筋原線維組織を示さず、自発的な収縮もなんら観察されなかった。同様に、ＡｎｇII、ノルエピネフリン、イソプロテレノール、機械的伸長および電界刺激でも、収縮機能を開始することはできなかった。これに基づき、筋原性の平滑筋細胞系列および内皮細胞系列に関わるこれらの細胞が、それらの生物学的特性を永久に失ったか、あるいはそれらの役割がインビボで再建され得るかを評価することにした。Ｐ２における細胞のＢｒｄＵ標識に続き、冠動脈閉塞後３〜５時間目に、梗塞フィッシャー３４４ラットの損傷領域に、ＢｒｄＵ陽性細胞を注射した。２週間後に、動物を屠殺し、梗塞領域の特徴を検査した。長軸に沿って平行に配列された筋原線維を含む筋細胞が、核のＢｒｄＵ標識との組み合わせで認識された。更に、細動脈および毛細血管プロファイルを含む血管構造が存在し、同じくＢｒｄＵに対して陽性であった。結論として、原始ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、老齢心臓に常在し、損傷を受け機能低下した心筋に移植すると、増殖して実質細胞および冠血管へ分化する能力を維持している。
【０１２７】
実施例５：心臓幹細胞は若年および老齢ラット心臓における筋細胞複製を媒介する
心臓は、分裂終了臓器ではなく、生理学的には細胞分裂して死滅細胞と入れ替わる筋細胞亜集団を含む。筋細胞増殖は、病理学的過負荷の間に増進され、筋量を増大し、心臓の性能を維持する。しかし、これらの複製筋細胞の起源は、依然として同定されていない。それゆえ、幹細胞／プロジェニター細胞の特徴を有する原始細胞を、フィッシャー３４４ラットの心筋において探索した。若年および老齢動物を試験して、加齢が幹細胞および分裂筋細胞のサイズ占有数に影響を及ぼすかを決定した。４月齢のラットにおけるｃ−ｋｉｔ陽性細胞およびＭＤＲ１陽性細胞の数は、それぞれ１１±３および１８±６／１００ｍｍ２組織であった。２７月齢のラットにおける値は、３５±１０および４２±１３／１００ｍｍ２組織であった。新たに生成された小さな筋細胞が多数同定され、それらはやはりｃ−ｋｉｔ陽性またはＭＤＲ１陽性であった。細胞周期中の細胞の核内で発現されるＫｉ６７蛋白質は、４月齢および２７月齢においてそれぞれ筋細胞の１．３±０．３％および４．１±１．５％で検出された。６回または５６回の注射後のＢｒｄＵ局在化は、４月齢において１．０±０．４％および４．４±１．２％、２７月齢において４．０±１．５％および１６±４％であった。組織片中で測定した有糸分裂指数から、有糸分裂中の筋細胞核の画分は、４月齢および２７月齢においてそれぞれ８２±２８／１０６および４８５±９８／１０６含むことが示された。これらの決定を解離筋細胞において確認して、細胞有糸分裂指数を得た。このアプローチにより、多核筋細胞の全ての核が同時に有糸分裂期にあったことを立証することができた。この情報は、組織断片では得られなかった。収集された値から、４月齢で９５±３１／１０６筋細胞が、２７月齢で６２０±９８／１０６が分裂中であることが示された。両月齢区間において、紡錘体、収縮環の形成、核膜の分解、核分裂および細胞質分裂が、証明された。結論として、原始未分化細胞は、成体心臓に存在し、加齢によるそれらの増加は、細胞周期に入り核分裂および細胞質分裂を起こす筋細胞数の増加と並行する。この関連性から、心臓幹細胞が老化した心臓における筋細胞増殖のレベルおよび運命を調節し得ることが示唆される。
【０１２８】
実施例６：ヒト心臓のキメラ現象および幹細胞の役割
損傷された心臓のリモデリングにおいて常在性原始細胞が果たす重要な役割は、雌性心臓の雄レシピエントへの移植に関連して臓器キメラ現象を考慮する際に、十分に理解される。このために、雄宿主に移植された雌性心臓８個を、分析した。グラフトされた雌性心臓への雄性細胞の移行を、Ｙ染色体に関するＦＩＳＨにより同定した（実施例１Ｅ参照）。このアプローチによれば、Ｙ染色体で標識された筋細胞、冠細動脈および毛細血管プロファイルの百分比は、それぞれ９％、１４％、および７％であった。同時に、移植された雌性心臓内の未分化ｃ−ｋｉｔ陽性細胞および多剤耐性−１（ＭＤＲ１）陽性細胞の数を測定した。加えて、これらの細胞がＹ染色体を含む可能性を確定した。心臓移植では、レシピエントの心房の一部を保存し、そこにドナー心臓をその心房の一部で取付ける。この外科処置は、宿主およびドナーに由来する心房が、移植心臓の複雑なリモデリング過程に寄与し得る未分化細胞を含むかを理解する上で重要である。定量的には、ｃ−ｋｉｔ標識細胞およびＭＤＲ１標識細胞の値は、対照非移植心臓では非常に低く、左心室心筋１００ｍｍ２あたりｃ−ｋｉｔが３、ＭＤＲ１が５であった。反対に、レシピエントの心房におけるｃ−ｋｉｔ細胞およびＭＤＲ１細胞の数は、１５および４２／１００ｍｍ２であった。ドナーの心房における対応する値は、１５および５２／１００ｍｍ２であり、心室においては１１および２１／１００ｍｍ２であった。移植は、心臓における原始未分化細胞の著しい増加を特徴とした。宿主の心房中の幹細胞は、Ｙ染色体を含み、ドナーの心房および心室において、それぞれ平均５５％および６３％のｃ−ｋｉｔ細胞およびＭＤＲ１細胞が、Ｙ染色体を呈した。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞およびＭＤＲ１陽性細胞の全てが、ＣＤ４５に対して陰性であった。これらの観察から、移植心臓への雄性細胞の移行はドナー心筋の再構築に大きな影響を及ぼしたことが示唆される。結論として、幹細胞は、成体心臓に広範に分布しており、それらの柔軟性および遊走能のために、高度に分化する筋細胞、冠細動脈および毛細血管構造を生成する。
【０１２９】
実施例７：成体マウス心臓における幹細胞の同定および局在化
筋細胞のターンオーバーは、正常心臓において起こり、心筋損傷は、筋細胞増殖および血管成長の活性化をもたらす。このような適応性は、多能性の原始細胞が心臓に存在し、死滅筋細胞の生理学的置換および損傷後の細胞増殖応答に関与する可能性を上昇させる。これに基づき、正常マウス心臓における未分化細胞の存在を、幹細胞因子の受容体であるｃ−ｋｉｔ、細胞色素、毒性物質および薬物から排出し得るＰ−糖蛋白質である多剤耐性−１（ＭＤＲ１）、ならびに細胞シグナリングおよび細胞接着に関与する幹細胞抗原−１（Ｓｃａ−１）を含む表面マーカを用いて決定した。左心房および右心房、ならびに心室の基部、中間部、および頂部からなる４つの別個の領域を分析した。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞数は、心房、心室の頂部、基部、中間部においてそれぞれ２６±１１、１５±５、１０±７および６±３／１００ｍｍ２であった。基部および中間部と比較すると、心房および心室頂部おけるｃ−ｋｉｔ陽性細胞の大きな比率は、統計的に有意であった。ＭＤＲ１陽性細胞数は、ｃ−ｋｉｔを発現するものより大きかったが、同様の局在化パターンを示し、心房、心室頂部、基部、および中間部において４３±１４、２９±１６、１４±７および１２±１０／１００ｍｍ２であった。同じく、心房および心室頂部における値は、他の２つの部位よりも高かった。Ｓｃａ−１標識細胞は、最高値を示し、心房において１５０±３６／１００ｍｍ２個の陽性細胞が見出された。ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ１、およびＳｃａ−１に対して陽性の細胞は、ＣＤ４５に対して、そして筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞の細胞質蛋白質に対して陰性であった。加えて、ｃ−ｋｉｔおよびＭＤＲ１の両方に対して陽性の細胞数を測定し、２種の幹細胞マーカを有する細胞を認識させた。心臓全体で、３６％のｃ−ｋｉｔ標識細胞が、ＭＤＲ１を発現し、１９％のＭＤＲ１細胞が、ｃ−ｋｉｔも有した。結論として、幹細胞は、マウス心臓全体に分布しているが、心房および心室頂部といった低応力の領域に蓄積する傾向にある。
【０１３０】
実施例８：常在性心臓幹細胞の遊走、侵入および発現アッセイによる梗塞心筋の修復
ＨＧＦ受容体であるｃ−Ｍｅｔは、造血幹細胞および肝幹細胞において同定されているが（１２６，９０）、最も重要には星状骨格筋細胞（９２）および胚性心筋細胞（１２７）において同定されている。これらの所見により、著者は、ｃ−ＭｅｔがＣＳＣ中に存在するか、そしてそのリガンドＨＧＦがこれらの未分化細胞に生物学的影響を及ぼすかを決定することにした。ＨＧＦは、インビトロでＣＳＣの遊走および侵入を促進し、インビボで貯蔵領域から梗塞心筋部位への移行を助成するという仮説を設けた。ＨＧＦは、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（９４、９５）の発現および活性化を通して細胞遊走に影響を及ぼす（１２８）。この酵素ファミリーは、細胞外マトリックス中の障壁を破壊することができ、ＣＳＣの移動、ホーミング、および組織回復を容易にすることができる。
【０１３１】
ＩＧＦ−１は、有糸分裂誘発性および抗アポトーシス性であり、神経幹細胞の増殖および分化に必要である（９６、９７、９８）。ＣＳＣがＩＧＦ−１Ｒを発現する場合、ＩＧＦ−１は、同等の手法でＣＳＣに影響を及ぼし、損傷心筋へ遊走する間にそれらの生存可能性を保護することができる。ＩＧＦ−１過剰発現は、成体マウス心臓における筋細胞増殖を特徴とし（６５）、この細胞増殖の形態は、ＣＳＣ活性化、分化および生存に依存し得る。
【０１３２】
本試験の最初の部分で、遊走および侵入アッセイを実施して、走化性ＨＧＦの存在下でのｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の動員性を確定した。
【０１３３】
心臓細胞を酵素作用により解離し、筋細胞を除去した（１２４）。小細胞を無血清培地（ＳＦＭ）中に再懸濁させた。上方ウェルおよび下方ウェルを有する改変ボイデンチャンバ（Neuro Probe, Gaithersburg, MD）を用いて、細胞遊走を測定した。４８ウェルプレート用フィルタは、直径５μｍの細孔を有するゼラチンコーティングポリカーボネート膜からなった。０．１％ＢＳＡおよび漸増濃度のＨＧＦを含有するＳＭＦを、下方ウェルに充填し、小細胞懸濁液５０μｌを、上方ウェルに入れた。５時間後、フィルタを、４％パラホルムアルデヒド中で４０分間固定し、ＰＩ、ｃ−ｋｉｔ、およびＭＤＲ１抗体で染色した。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＩｇＧを、二次抗体として使用した。各ＨＧＦ濃度で、６種の別個の実験を行った。各アッセイにおいて、各ウェル内の無作為に選択した４０個の領域をカウントし、用量反応曲線を作成した（図６１）。小細胞に及ぼすＩＧＦ−１の分裂促進作用は、ＩＧＦ−１単独の、またはＨＧＦと組み合わせた遊走アッセイ（データは示さない）を実施することにより除外した。２４ウェルおよび１２種の細胞培養インサートを備えたチャンバ（Chemicon、Temecula、CA）を使用して、侵入アッセイを実施した。増殖因子が枯渇した細胞外マトリックスの薄層を、インサート表面に広げた。反対に、１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを、下方チャンバに入れた。侵入細胞は、コーティングを消化し、ポリカーボネート膜の底部に付着した。遊走アッセイで記載したのと同じプロトコルに従って、移行した細胞の数を４８時間後に測定した。４種の別個の実験を実施した（図６２）。遊走アッセイで得られた結果と一致し、ＩＧＦ−１は細胞侵入に何ら影響しなかった（データは示さない）。
【０１３４】
遊走は、両方の細胞型において類似しており、１００ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦでピークに達した。５時間後、下方チャンバに遊走したｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の数は、それぞれ対照細胞の３倍および２倍であった。ＨＧＦ濃度を高くしても、細胞遊走は改善されなかった（図６１および６２）。これに基づき、１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを使用して、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の、侵入チャンバの合成細胞外マトリックスを透過する能力も決定した。４８時間以内に、該増殖因子は、チャンバの下部におけるｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の数をそれぞれ８倍および４倍増加させた（図６１および６２）。ＩＧＦ−１は、２５〜４００ｎｇ／ｍｌで変動する濃度で、上記ＣＳＣの動員性に影響を及ぼさなかった。ＩＧＦ−１をＨＧＦに添加しても、ＨＧＦ単独で得られるｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の遊走性および侵入性を改変しなかった。
【０１３５】
小未分化ｃ−ＭｅｔＰＯＳ細胞を、免疫磁気ビーズを用いて回収し、これらの細胞のゼラチンを開裂する能力を、ザイモグラフィーにより評価した（図６３）。手短に言えば、小細胞を、心臓（ｎ＝４）から単離し、次にｃ−Ｍｅｔ抗体をコーティングされたマイクロビーズ（Miltenyi、Auburn、CA）により分離した。細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦに３７℃で３０分間暴露した。細胞溶解物を、０．１％ゼラチンと共重合した１０％ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen、Carlsbad、CA）で泳動させた。ゲルを、クーマシーブルー染色液（０．５％）中でインキュベートし、ゼラチン溶解活性領域を、灰色背景に対する透明バンドとして検出した。これを行って、ｃ−ＭｅｔＰＯＳ細胞がマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を発現し、ゲル中に存在する基質を消化できるかを実証した（９４、９５）。肯定的な結果が得られ（図６３）、これらの原始細胞の動員性が、少なくとも一部は、ＭＭＰの活性化によることが示唆された。合わせると、これらのインビトロアッセイは、ＣＳＣにおけるＨＧＦの走化性機能を示している。そのようなＨＧＦの役割は、ｃ−Ｍｅｔ受容体への結合と、それに続くＭＭＰ合成の刺激により仲介されるようである（９４、９５）。
【０１３６】
マウスにおける心筋梗塞
心筋梗塞をマウスにおいて作製し、５時間後、ＨＧＦおよびＩＧＦ−１を含有する溶液を、心房から境界域にかけて４箇所に注射した。ＨＧＦを漸増濃度で投与し、貯蔵ＣＳＣと死滅組織間で走化性勾配を作出した。このプロトコルは、損傷領域へのＣＳＣのホーミングを増進し、新しい心筋を生成するよう導入された。これが成立すれば、動物死に関連する大きな梗塞は急速に縮小し、梗塞サイズおよび生存の限界が、この介入により拡大する。
【０１３７】
雌ＳＶ−ＥＶマウス１２９匹を、使用した。麻酔（ケタミン１５０ｍｇ−アセプロマジン１ｍｇ／ｋｇ体重、ｉ．ｍ．）に続いてマウスを人工呼吸させ、心臓を露出させ、左冠動脈を結さつした（６１、８７）。増殖因子で処置される動物における冠動脈結さつは、非常に大きな梗塞を誘発するよう大動脈の起点の可能な限り近くで実施した。次に、閉胸し、動物を覚醒させた。５時間後、マウスを麻酔し、再度開胸し、各２．５μｌのＨＧＦ−ＩＧＦ−１を心房から梗塞に隣接する領域にかけて４箇所に注射した。最後の２つの注射は、境界域の両側に行った。ＨＧＦの濃度は、梗塞に向かって５０から１００および２００ｎｇ／ｍｌに漸増させた。ＩＧＦ−１は、２００ｎｇ／ｍｌの一定濃度で投与した。６〜１６日目にマウスにＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を注射し、この期間に、新たに形成され増殖した小さな心筋細胞を同定した。偽手術マウスおよび梗塞非処置マウスには、標準生理食塩水を同じ４部位に注射した。
【０１３８】
臓器修復に及ぼすＣＳＣの影響を議論する前に、ｃ−ｋｉｔおよびＭＤＲ１を発現する細胞におけるｃ−ＭｅｔおよびＩＧＦ−ＩＲの存在を、対照マウスの心房および左心室（ＬＶ）で測定した。同一の分析を、冠動脈閉塞に供されたマウスの心房、梗塞ＬＶ、および非梗塞ＬＶで行った。この決定は、増殖因子投与後２〜３時間目に実施し、つまり冠動脈閉塞後７〜８時間目を表している（目的は、原始細胞が死滅細胞および周辺の生存心筋に侵入すること、ならびにＨＧＦおよびＩＧＦ−１がこのプロセスに関与することを証明することであった）。
【０１３９】
ｃ−ＭｅｔおよびＩＧＦ−１Ｒを、正常心臓（ｎ＝５）、梗塞処置心臓（ｎ＝６）、および梗塞非処置心臓（ｎ＝５）の領域に分散するｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞において検出した（図２２Ａ〜Ｆ）。ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の大部分が、ｃ−ＭｅｔおよびＩＧＦ−１Ｒを単独でまたは一緒に発現した。心筋梗塞および増殖因子の投与は、心筋内のｃ−ＭｅｔおよびＩＧＦ−１Ｒが存在する、しないにかかわらず、一貫してＣＳＣの相対的割合を変化させることはなかった（図６４）。ヘアピン１（アポトーシス）およびヘアピン２（壊死）標識ならびに核内のＫｉ６７発現（細胞周期中の細胞）を利用して、損傷心臓および非損傷心臓の様々な部位におけるｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の生存可能性および活性化をそれぞれ確認した（図２２Ｇ〜Ｌ）。
【０１４０】
ＣＳＣは、対照マウスにおいて、心室より心房に多く存在した。急性心筋梗塞および増殖因子投与は、心臓内の原始細胞の数および分布を著しく変化させた。生存可能なｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞は、境界域および遠隔組織の温存する心筋だけでなく、梗塞領域の死滅心筋においても有意に増加した。重要なこととして、ＣＳＣは、心房では減少しており（図２２ＭおよびＮ）、この貯蔵部位から応力をかけられた生存心筋および死滅心筋に原始細胞の移行が生じたことが示唆された。生存可能なＣＳＣが、心室よりも心房に残存する、という異なる現象が、梗塞非処置マウスにおいて認められた。対照動物および梗塞処置マウスにおいて、アポトーシスおよび壊死は、梗塞心筋および周辺心筋内のｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞において検出されなかった。Ｋｉ６７標識は、境界域および梗塞に分布する未分化細胞のそれぞれ約３５％および２０％において同定された（図６５）。梗塞非処置マウスにおいて、梗塞内のｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の大半が、アポトーシスであった（図２２ＭおよびＮ）。壊死は、認められなかった。アポトーシスＣＳＣの死滅勾配が、梗塞から離れた心筋および心房組織まで観察された。これらのマウスにおいて、生存可能ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞およびＭＤＲ１ＰＯＳ細胞の１０〜１４％だけが、Ｋｉ６７を発現した（図６５）。
【０１４１】
つまりこれらの結果は、ＣＳＣがｃ−ＭｅｔおよびＩＧＦ−１Ｒを発現し、それによりＨＧＦおよびＩＧＦ−１が梗塞心臓におけるＣＳＣのコロニー形成、増殖、および生存に肯定的な影響を有するという概念を裏づけている。インビトロおよびインビボデータに基づけば、ＨＧＦは、細胞遊走において、そしてＩＧＦ−１は細胞分裂および生存可能性において優勢な役割を有するようである。しかし、梗塞非処置マウスにおいて、ＣＳＣは、梗塞領域に移行せず、既存の原始細胞は、アポトーシスにより死滅する。即ち、重要な疑問は、梗塞内に位置するＣＳＣが様々な心臓細胞系列に分化して死滅心筋を再構成することが可能であるか、であった。肯定的な所見から、梗塞処置マウスにおける心臓修復のメカニズム、および梗塞非処置マウスにおける心筋再生の欠如の可能な説明が得られるであろう。
【０１４２】
解剖学的測定のために、心臓をＣｄＣｌ２により拡張期で停止させ、心筋を１０％ホルマリンで潅流した。インビボで測定された拡張終期圧に等しい圧力でＬＶ腔に固定剤を充填した。ＬＶ腔内軸を決定し、中間部を使ってＬＶ厚および腔直径を得た。梗塞サイズは、心室中隔を含むＬＶから喪失された筋細胞の数により測定した（８７）。
【０１４３】
１６日目の心筋梗塞は、非処置マウスおよびＨＧＦ−ＩＧＦ−１処置マウスの左心室および中隔においてそれぞれ４２％（ｎ＝１５）および６７％（ｎ＝２２）の筋細胞を喪失させた（図２３Ａ）。６０％という大きな梗塞にもかかわらず、増殖因子に暴露されたマウスは、心機能をより良好に保存した（図２３Ｂ）。ＨＧＦ−ＩＧＦ−１は、ＬＶ拡張終期圧の上昇および＋ｄＰ／ｄｔおよび−ｄＰ／ｄｔの減少を抑える結果となった。梗塞サイズの差は、致死率に影響を及ぼさず、これは２つのマウス群で同様であり、非処置群において４３％、処置群において４０％であった。重要なこととして、増殖因子を受容したマウス２２匹中１４匹が、ＬＶの６０％を超える梗塞が有りながら生存した。これらのマウスのうち７匹には、ＬＶの７５％から８６％に及ぶ梗塞があった。非処置マウスは、６０％を超えない梗塞を有していた（図２３ＣおよびＤ）。注射されたマウスとは異なり、ＬＶ壁の後側の一部および心室中隔全体は、非処置動物が生存するためには保存されなければならなかった。６０％より大きな梗塞は、マウス、ラット、イヌ、およびその他の任意ホ乳類の生命と相容れない。４６％梗塞を有するヒトの場合、不可逆的心原性ショックおよび死が併発する（９９）。
【０１４４】
偽手術マウスのＬＶ容積、ならびに非処置および処置動物の梗塞サイズから、冠動脈閉塞後１６日目に生存および喪失するであろう心筋体積を計算することが可能であった。筋細胞、血管構造、およびその他の組織成分を含む新たに形成された心筋の体積を、増殖因子処置マウスのみで検出したところ、８ｍｍ３であることが見出された。つまり修復バンドにより、梗塞サイズが６７％から５７％に縮小した（図６８および６９）。
【０１４５】
ＨＧＦ−ＩＧＦ−１の走化性および有糸分裂誘発性は、壁の梗塞領域において原始細胞の動員、増殖および分化をもたらして、新しい心筋を生成した。小動物におけるこの方法論的アプローチの複雑さにもかかわらず、８５％（マウス２６匹中２２匹）の例で梗塞内の心筋バンドの形成が得られた。バンドは、損傷領域の６５±８％を占め、壁の内層および外層から等距離の梗塞中間部に位置した。非常に大きな梗塞において、壁の全体的厚さが、発生心筋により置換された（図２３Ｅ〜Ｈ）。
【０１４６】
解剖学的には、長軸および腔直径は、２群の梗塞マウスで同様であり、治療的介入が積極的な心室リモデリングを促進したことが示される。この概念は、処置マウスにおける６０％という大きな梗塞サイズと一致する。加えて、壁厚対腔半径比は、非処置マウスより処置マウスで低下が少なかった。この関連性は、処置マウスにおいてＬＶ拡張終期圧の上昇がより小さかったことと合わせて、この群における拡張期壁応力の増加を有意に緩和した（図６７）。
【０１４７】
原始細胞を、モノクローナルｃ−ｋｉｔおよびＭＤＲ１抗体で標識した（８２、８３）。ＢｒｄＵ取込みを、ＢｒｄＵ抗体により検出した（６１、８７）。抗第VIII因子を用いて内皮細胞を、そして抗α−平滑筋アクチンを用いて平滑筋を認識させた。筋細胞分化については、ネスチン、デスミン、心臓ミオシン、α−筋節アクチン、Ｎ−カドヘリンおよびコネキシン４３抗体を使用した。梗塞内の瘢痕形成は、抗コラーゲンＩ型と抗コラーゲンIII型との混合物により検出した（８３、６１、８７）。
【０１４８】
修復心筋の組成を、形態計測により評価した。筋細胞、内皮細胞、および平滑筋に特異的な抗体を、実質細胞および血管プロファイルの認識に使用した（６１、８７）。更に、細胞のＢｒｄＵ標識を、経時的な再生組織のマーカとして使用した。筋細胞が、バンドの８４±３％を、冠血管構造が１２±３％を、そしてその他の構成成分が４±１％を占めた。新たな筋細胞は、６００〜７，２００μｍ３で変動し、平均容積は２，２００±４００μｍ３であった（図６８および６９）。合わせると、筋細胞３．１±１．１×１０６個が形成され、２．４±０．８×１０６個の細胞の喪失を補てんした。このわずかに過剰な細胞再生は、筋細胞サイズと矛盾していた。偽手術心臓において、筋細胞容積の１８，０００±３，６００μｍ３は、増殖細胞の８．２倍であった。重要なこととして、筋量喪失の１６％が、梗塞後１６日で再構成された（喪失筋量：１８，０００×２．４×１０６＝４３ｍｍ３；再生筋量：２，２００×３．１×１０６＝７．０ｍｍ３；７．０：４３＝１６％）。新たな筋細胞は、依然として成熟中であったが、インビボでは超音波心臓検査で、そしてインビトロでは機械的検査で実証された通り、機能的コンピテントであった。
【０１４９】
超音波心臓検査を、１３−ＭＨｚ線形トランスデューサを備えたAcuson Sequoia 256cを使用することにより、覚醒マウスにおいて実施した（８７）。乳頭筋の位置で傍胸骨短軸から二次元（２Ｄ）画像およびＭモードトレーシングを記録した。駆出率（ＥＦ）を、２Ｄ短軸視像におけるＬＶ断面積から得た。ＥＦ＝［（ＬＶＤＡ−ＬＶＳＡ）／ＬＶＤＡ］×１００（式中、ＬＶＤＡおよびＬＶＳＡは、心臓拡張期および収縮期におけるＬＶ面積に対応する）。血行動態測定では、マウスを麻酔し、チャート式記録計に接続されたMillerマイクロチップ圧力トランデューサをＬＶに進入させ、非開胸処置において圧力、ならびに＋および−ｄＰ／ｄｔを評価した。１５日目に実施された超音波心臓検査から、処置された梗塞壁の再生部分において収縮作用が一部回復されたことが示された。駆出率も、非処置マウスよりも処置マウスで高くなった（図２４Ａ〜Ｅ）。即ち、構造的修復は、機能的修復を伴った。
【０１５０】
新たな筋細胞が機能的コンピテンスに達して、心室性能の向上に寄与したことを確認するために、これらの細胞を、壁の梗塞領域の再生心筋から酵素作用により解離して（１２９）、収縮的挙動をインビトロで評価した（１２４、１３０）。梗塞処置マウス（ｎ＝１０）からコラゲナーゼ消化により単離した筋細胞を、１．０ｍＭのＣａ２＋を含む細胞浴（３０±０．２℃）に入れ、０．５Ｈｚの方形脱分極パルスにより心臓拡張閾値の２倍の強度で３〜５ｍｓの期間刺激した。パラメータは、コンピュータに記憶させたビデオ画像から取得した（１２４、１３０）。発生筋細胞は小さく、筋原繊維は筋細胞膜下領域内の細胞の周囲に位置した。新たな筋細胞は、新生仔細胞に類似し、ＤＮＡを活発に複製した。それらは、温存された肥大心室筋細胞よりも著しく小さかった（図２５ＡおよびＢ）。生存している古い筋細胞と比較して、増殖中の細胞は、最大短縮および短縮速度が大きく、最大短縮までの時間が短かった（図２５Ｃ〜Ｊ）。
【０１５１】
単離された、新たに生成された筋細胞をＫｉ６７で染色して、これらの細胞が細胞周期中であり、それゆえＤＮＡを合成しているかを決定した。梗塞処置マウスの単離された生存肥大筋細胞に理想的なプロトコルを、適用した。これに基づき、単核細胞および二核細胞における各筋細胞核のＤＮＡ量を、ＰＩ染色および共焦点顕微鏡検査により評価した（図２５ＡおよびＢ）。対照の２倍体マウスリンパ球を、ベースラインとして使用した。目的は、細胞系列への分化決定の前にＣＳＣ中で細胞融合が起こるか確認することである。この可能性は、近年、インビトロ試験により示唆された（１３１、１３２）。周期中でない新たな筋細胞および肥大した温存された細胞は、２倍体核のみを有し、そのような現象が心修復における役割を担うことは、除外された（図６６）。
【０１５２】
バンド内の成熟中の筋細胞の分化レベルを確定するために、ネスチン、デスミン、心臓ミオシン重鎖、α−筋節アクチン、Ｎ−カドヘリン、およびコネキシン４３の発現を、評価した。Ｎ−カドヘリンは、筋膜接着を同定し、コネキシン４３は、介在板内の細隙結合を同定する。これらの蛋白質は、発生の過程で調節される。コネキシン４３は、筋細胞の電気的結合および収縮の同調性にとっても不可欠である。これら６種の蛋白質は、新たに形成された筋細胞の実質的に全てで検出された（図２６Ａ〜Ｎ）。ＢｒｄＵにより標識された筋細胞の百分比は、８４±９％であり、再生組織において細胞増殖が進行中であることが示された。心修復には、毛細血管および細動脈の形成が含まれた（図２７Ａ〜Ｄ）。管腔内の赤血球の存在は、血管が冠血管循環に連結していることを示した。しかし、この段階の心筋回復は、毛細血管構造よりも抵抗細動脈の優勢な成長を特徴とした。新たな心筋１ｍｍ２あたり、５９±２９個の細動脈および１３７±８０個の毛細血管が存在した。
【０１５３】
現在の所見は、常在性ＣＳＣがその貯蔵域から動員され、梗塞心筋においてコロニー形成し、そこで心臓細胞系列に分化し、組織再生をもたらすことを示す可能性がある。ここで使われた介入は、通常はホ乳類の生命と適合しない梗塞サイズの動物を救うことができた。
【０１５４】
実施例９：心臓幹細胞はインビトロで分化し、インビボで機能的コンピテンスを獲得する
Ａ．細胞の回収およびクローニング
心臓細胞を、２０〜２５月齢雌フィッシャーラットから単離した（１１１、１１２）。インタクト細胞を分離し、筋細胞を除去した。小細胞を再懸濁させ、凝集体をろ過器で除去した。細胞を、膜の外面に局在するＮ末端エピトープを認識するウサギｃ−ｋｉｔ抗体（H-300、Santa Cruz）と共にインキュベートした（１２１）。細胞を、抗ウサギＩｇＧ（Dynal）でコーティングされた磁気ビーズに暴露し、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を、磁石を使って回収した（ｎ＝１３）。ＦＡＣＳ（ｎ＝４）については、細胞を、ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートラットモノクローナル抗ｃ−ｋｉｔ（Pharmingen）で染色した。両方法を用いれば、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞は、小細胞集団の６〜９％で変動した。
【０１５５】
ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞は、筋細胞（α−筋節アクチン、心臓ミオシン、デスミン、α−心臓アクチニン、コネキシン４３）、内皮細胞（ＥＣ；第VIII因子、ＣＤ３１、ビメンチン）、平滑筋細胞（ＳＭＣ；α−平滑筋アクチン、デスミン）、および線維芽細胞（Ｆ；ビメンチン）細胞質蛋白質に対して陰性を示した。筋細胞系列の核マーカ（Ｎｋｘ２．５、ＭＥＦ２、ＧＡＴＡ−４）は、細胞の７〜１０％において、細胞質蛋白質は、細胞の１〜２％において検出された。ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞は、骨格筋転写因子（ＭｙｏＤ、ミオゲニン、Ｍｙｆ５）、即ち、骨髄、リンパ球および赤血球細胞系列のマーカ（ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ８、ＴＥＲ−１１９）を発現せず、細胞がＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞であることが示された。
【０１５６】
ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を、１〜２×１０４細胞／ｍｌ  ＮＳＣＭで播種して、神経幹細胞の選択および増殖に用いた（１２２）。これは、ダルベッコＭＥＭおよびハムＦ１２（比１：１）、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、インスリン−トランスフェリン−セレナイトにより構成された。ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞は、２週間以内に付着し、増殖を開始した（図２８ａ、ｂ）。その後、ＮＳＣＭを分化培地（ＤＭ）と交換し、７〜１０日間でコンフルエンスに達した。細胞を、トリプシン処理により継代した。Ｋｉ６７発現により決定される細胞周期中の細胞は、各代（Ｐ）Ｐ１〜Ｐ５（各Ｐにおいてｎ＝５）で７４±１２％〜８４±８％で変動した。Ｐ２およびＰ４における倍増時間は、平均４１時間であった。細胞は、増殖停止および老齢期に達することなくＰ２３まで分裂し続け、その時点で細胞を凍結した。心臓細胞系列は、Ｐ０〜Ｐ２３で同定された。Ｐ０（ｎ＝７）、Ｐ３（ｎ＝１０）、Ｐ１０（ｎ＝１３）およびＰ２３（ｎ＝１３）において、筋細胞は２９〜４０％、ＥＣは２０〜２６％、ＳＭＣは１８〜２３％、およびＦは９〜１６％であった。液体窒素中で６ヶ月後に増殖したＰ２３のアリコートは、親細胞と同じ表現型を発現した。
【０１５７】
ＤＭ中で増殖させた場合のＰ０およびＰ１において、細胞の５０％がＮｋｘ２．５を、６０％がＭＥＦ２を、３０％がＧＡＴＡ−４を、および５５％がＧＡＴＡ−５を示した（図２８ｃ〜ｆ）。反対に、骨格筋（ＭｙｏＤ、ミオゲニン、Ｍｙｆ５）、血液細胞（ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ８、ＴＥＲ−１１９）、および神経（ＭＡＰ１ｂ、神経フィラメント２００、ＧＦＡＰ）マーカは、同定されなかった。
【０１５８】
クローニングのために、細胞を１０〜５０個／ｍｌ  ＮＳＣＭで播種した（図２８ｇ）（１０９、１１０）。１週間後、単一の細胞に由来するコロニーを認識させると（図２８ｈ）、フィブロネクチン、プロコラーゲンＩ型およびビメンチンは存在せず、線維芽細胞系列が除外された。個々のコロニーをクローニングシリンダにより剥離し、播種した。複数のクローンが発生し、各調製物において１つのクローンを選択し、特徴づけを行った。１０％ＦＣＳおよび１０−８Ｍデキサメタゾンを含有するＭＥＭを用いて、分化を誘発した（ＤＭ）。サブクローニングのために、複数クローン由来の細胞を、１０〜５０細胞／ｍｌ ＮＳＣＭで播種した。単一のサブクローンを単離し、ＤＭ中で播種した。各サブクローニングステップで、細胞アリコートを懸濁液中で増殖させ、クローン球を発生させた。
【０１５９】
各クローンは、Ｌｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞２〜３個の群を複数含んでいたが（図２９ａ）、これら細胞の大部分（約２０〜５０個）はｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞の中に分散されていた。一部の細胞はＫｉ６７陽性であり、有糸分裂中のものもあった（図２９ｂ〜ｄ）。心臓ミオシンおよびα−筋節アクチンを発現する筋細胞、第VIII因子、ＣＤ３１およびビメンチンを発現するＥＣ、α−平滑筋アクチンを発現するＳＭＣ、ならびにビメンチンのみを発現するＦが、各クローンにおいて同定された（図２９ｅ〜ｈ）。ネスチンを含有する小細胞の凝集体も、存在した（補足情報）。つまり、心筋から単離されたＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞は、幹細胞について予測された特性を有した。それらは、クローン原性、自己再生性および多能性であり、主要心臓細胞型の起源を与えた。数個の一次クローンをサブクローン分析し、一次クローンの表現型の安定性、つまりクローン原性、自己再生性および多能性を確認した。ほとんどのクローンの表現型は、一次クローンのものと区別されなかった。しかし、８個のサブクローンのうち２個において、一方では筋細胞のみが得られ、他方では独占的にＥＣが同定された。
【０１６０】
コーニング非処理皿内の懸濁液中で増殖させたクローン原性細胞は、球状クローンを生成した（図３０ａ）。この固定剤非依存性の増殖は、幹細胞に典型的である１４，１５。球状体は、ｃ−ｋｉｔＰＯＳおよびｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞のクラスターと、多量のネスチンとから構成されていた（図３０ｂ〜ｄ）。他の幹細胞と同様に１４，１５、ＤＭに播種した後、球状体は容易に付着し、細胞は球状体の外に遊走し、分化した（図３０ｅ〜ｈ）。
【０１６１】
細胞を、４％パラホルムアルデヒド中に固定し、未分化細胞を、ｃ−ｋｉｔ抗体で標識した。筋細胞用マーカは、Ｎｋｘ２．５、ＭＥＦ２、ＧＡＴＡ−４、ＧＡＴＡ−５、ネスチン、α−筋節アクチン、α−心臓アクチニン、デスミンおよび心臓ミオシン重鎖などであった。ＳＭＣ用マーカは、α−平滑筋アクチンおよびデスミン、ＥＣ用は第VIII因子、ＣＤ３１およびビメンチン、Ｆ用は第VIII因子の非存在下のビメンチン、フィブロネクチン、およびプロコラーゲンＩ型で構成した。ＭｙｏＤ、ミオゲニンおよびＭｙｆ５を、骨格筋細胞マーカとして使用した。ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ８およびＴＥＲ−１１９を使用して、造血細胞系列を除外した。ＭＡＰ１ｂ、神経フィラメント２００およびＧＦＡＰを使用して、神経細胞系列を認識した。ＢｒｄＵおよびＫｉ６７を使用して、細胞周期中の細胞を同定した（６１、８７）。核を、ＰＩにより染色した。
【０１６２】
筋細胞およびＳＭＣは、インビトロで収縮することができなかった。アンジオテンシンII、イソプロテレノール、ノルエピネフリンおよび電気刺激は、収縮を促進しなかった。ＥＣは、ｅＮＯＳなどの完全分化マーカを発現しなかった。
【０１６３】
Ｂ．心筋梗塞および細胞移植
ＢｒｄＵ標識細胞（Ｐ２；陽性細胞＝８８±６％）を移植した。心筋梗塞を、２月齢の雌フィッシャーラットにおいて作製した（１１１）。５時間後に、ラット２２匹の梗塞を境界とする両側に、２×１０５個の細胞を注射し、１２匹は１０日目に、１０匹は２０日目に屠殺した。各期間に、梗塞ラット８〜９匹および偽手術ラット１０匹に生理食塩水を注射し、５匹にＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞を注射し、対照として用いた。２０日後に殺処分したラットのみで、ケタミン麻酔下、９日後と１９日後に超音波心臓検査を実施した。Ｍモードトレーシングから、ＬＶ拡張終期の直径および壁厚を得た。駆出率を、計算した（８７）。１０日目および２０日目に、動物を麻酔して、非開胸処置においてＬＶ圧、ならびに＋および−ｄＰ／ｄｔを評価した（１１１）。術後１０日目および２０日目において、致死率は、非処置ラットよりも処置ラットで低かったが、統計的な有意性はなく、全群合わせて平均３５％であった。プロトコルは、治験審査委員会により認可されたものであった。
【０１６４】
Ｃ．解剖学的および機能的結果
心臓を拡張期に停止させ、ホリマリンで固定した。梗塞サイズは、左心室から喪失された筋細胞の比率により（８７）、１０日目には処置ラットおよび非処置ラットにおいてそれぞれ５３±７％および４９±１０％（ＮＳ）、２０日目には処置ラットおよび非処置ラットにおいてそれぞれ７０±９％および５５±１０％（Ｐ＜０．００１）と決定された。各心臓において、新たな筋細胞４００個の容積を測定した。断片を、デスミンおよびラミニンおよびＰＩで染色した。核が中央に位置し長軸方向に配列された筋細胞において、核を通る細胞長および直径を収集して、細胞容積を計算した（８７）。
【０１６５】
断片を、ＢｒｄＵおよびＫｉ６７抗体と共にインキュベートした。１０日目の処置梗塞１２個のうち９個において、そして２０日目の処置梗塞１０個全てにおいて、再生した心筋のバンドが、同定された。１０日目では、バンドは薄く不連続であったが、２０日目では、より太くなり、梗塞領域全体に存在した（図３１ａ〜ｃ）。筋細胞（Ｍ）、ＥＣ、ＳＭＣおよびＦは、それぞれ心臓ミオシン、第VIII因子、α−平滑筋アクチン、および第VIII因子の非存在下でのビメンチンにより同定した。筋細胞は、心臓ミオシン抗体およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によっても同定した。１０日目および２０日目に、それぞれ３０ｍｍ３および４８ｍｍ３の新たな心筋が、測定された。組織再生により、梗塞サイズが１０日目に５３±７％から４０±５％に（Ｐ＜０．００１）、そして２０日目には７０±９％から４８±７％に（Ｐ＜０．００１）縮小した。
【０１６６】
ＢｒｄＵおよびＫｉ６７により標識された細胞を、共焦点顕微鏡検査により同定した（１０３、１０５）。ＢｒｄＵ標識のために抽出された核数は：Ｍ＝５，２２９；ＥＣ＝３，５７２；ＳＭＣ＝４，０１０；Ｆ＝５，５２９であった。Ｋｉ６７の対応する値は：Ｍ＝９，２９０；ＥＣ＝９，１０３；ＳＭＣ＝８，３９２であった。筋細胞分化は、心臓ミオシン、α−筋節アクチン、α−心筋アクチニン、Ｎ−カドヘリンおよびコネキシン４３を用いて確認した。コラーゲンは、コラーゲンＩ型およびIII型抗体により検出した。
【０１６７】
移植細胞を、ＢｒｄＵにより標識したため、発生心筋内の細胞の起源を、このマーカにより同定した。筋細胞、細動脈（図３１ｆ〜ｎ）および毛細血管プロファイルを、検出した。１０日目は、２０日後よりも筋細胞、毛細血管および細動脈の割合が低く、コラーゲンは高かった。Ｋｉ６７により評価された細胞増殖は、１０日目は増大し、２０日目には減少した（補足情報）。
【０１６８】
心臓ミオシン、α−筋節アクチン、α−心臓アクチニン、Ｎ−カドヘリンおよびコネキシン４３が、筋細胞において検出された（図３１ｏ〜ｐ；補足情報）。１０日目は、筋細胞は小さく、筋節はほとんど検出されず、Ｎ−カドヘリンおよびコネキシン４３はほとんどが細胞質中に存在していた（図３１ｏ）。筋細胞容積は、平均で１，５００μｍ３であり、筋細胞１３．９×１０６個が、形成された。２０日目は、筋細胞は密集し、筋原線維はより豊富になり、Ｎ−カドヘリンおよびコネキシン４３が、筋膜接着および介在板のネクサスを画定した（図３１ｐ）。筋細胞容積は、平均で３，４００μｍ３であり、１３×１０６個の筋細胞が存在した。
【０１６９】
筋細胞アポトーシスを、単一塩基が突出したヘアピン型オリゴヌクレオチドプローブのインサイチュライゲーションより測定した。アポトーシス用に抽出された核の数は、１０日目で３０，４６４個、２０日目で１２，７６０個であった。１０日目から２０日目までの筋細胞数の保存は、Ｋｉ６７標識の減少、およびアポトーシスの増加と一致していた（０．３３±０．２３％に対して０．８５±０．３１％、Ｐ＜０．００１）。
【０１７０】
つまり、初期は筋細胞増殖が優勢であり、後には筋細胞肥大が優勢となった。１０日目〜２０日目に、血管数がほぼ倍増された。
【０１７１】
新たな筋細胞の機械的特性を決定する手順は、既に記載されている３０。梗塞処置ラット（ｎ＝４）から単離された筋細胞を、１．０ｍＭ  Ｃａ２＋を含む細胞浴（３０±０．２℃）内で播種し、０．５Ｈｚの方形脱分極パルスにより、心臓拡張期閾値の２倍の強度で３〜５ｍｓの期間刺激した。コンピュータに記憶させたビデオ画像から、機械的パラメータを取得した。処置された心臓の梗塞領域および非梗塞領域から単離された筋細胞の機械的挙動を、２０日目に測定した（図３２ａ〜ｅ）。新しい細胞はカルシウム耐性があり、刺激に応答した。しかし、温存された筋細胞と比較すると、成熟中の細胞は、最大短縮および短縮速度が低く、最大短縮までの時間および５０％再伸長までの時間は、２群の細胞で同様であった（図３３ａ〜ｌ）。発生筋細胞は、ほとんど周囲に分布した筋原線維を有し、筋節線紋が明らかであった（図３２ａ〜ｅ）。
【０１７２】
細胞移植により、梗塞サイズおよび腔拡張は減少し、壁厚および駆出率は増加した。２０日目に、収縮が、梗塞心室壁において再現され、拡張終期圧、発生圧、ならびに＋および−ｄＰ／ｄｔは、改善した。拡張期応力は、処置ラットにおいて５２％低かった（補足情報）。つまり、心修復により促進された構造的および機能的改変により、拡張期負荷が低下し、心室性能が向上した。梗塞サイズはラットの２つの群で同様であったにもかかわらず、この有益な効果が生じた。
【０１７３】
移植細胞のコロニー形成、複製、分化、および組織再生には、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞および損傷心筋が必要であった。偽手術ラットに注射されたｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞は、グラフトが不十分であり、分化しなかった。梗塞の周辺へのｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞の注射は、心修復に効果がなかった。
【０１７４】
本明細書で報告されるＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞の多能性表現型は、ニワトリ（１１３）、ゼブラフィッシュ（１１４）、およびホ乳類（１１５）における心臓細胞系列決定と明らかに反するものになり、筋細胞、ＳＭＣ、およびＥＣのそれぞれが、別個の系列を起源とすることが結論づけられる。しかし、全ての研究が一致しているわけではない（１１６）。これらの実験（１１３、１１４、１１５、１１６）は、本明細書において実施された通り、マーキングされた細胞のいずれかの発生可能性を扱っているわけではないため、異なる結果は、正常な発生運命と発生可能性との差の別例を表している可能性がある。加えて、損傷心筋を修復する手段としての、ヒト胚性幹細胞（１１７）、プロジェニター内皮細胞（１０１）およびクローン原性細胞（５２）の柔軟性が、近年になり証明されている（１０１、５２）。
【０１７５】
実施例１０：増殖因子による心臓幹細胞（ＣＳＣ）の動員は覚醒イヌにおいて梗塞心筋の修復を促進し、局部的および全体的心機能を改善する
上述の非限定的な実施例の方法を、下記の例外を含みながら使用した。
【０１７６】
げっ歯類における梗塞後の幹細胞ホーミングおよび分化による心筋再生は、同様のタイプの心臓修復が大型ホ乳類に起こるか、という疑問には答えていない。更に、新たな心筋が、梗塞部分の機能異常に作用して収縮を回復し得るかについても、未知である。この目的で、血行動態および局部的壁機能を測定するために、イヌに慢性的に計器を取り付けた。拍出量およびＥＦも、測定した。左前下行冠動脈の付近で水圧オクルダーを膨張させることにより、心筋梗塞を誘発させた。４時間後、ＨＧＦおよびＩＧＦ−１を境界域に注射し、幹細胞を動員および活性化し、その後、イヌを最長３０日間モニタリングした。増殖因子により慢性的な心臓修復が導入され、梗塞の膨張が後退し、セグメント短縮は−２．０±０．７％から＋５．５±２．２％に、拍出力は−１８±１１から＋５３±１０ｍｍ×ｍｍＨｇに、拍出量は２２±２から４５±４ｍｌに、駆出率は３９±３から６４±４％に上昇した。梗塞後８時間目の処置イヌにおいて、原始細胞数が、ベースラインの２４０±４０個から１７００±４００個（遠隔心筋）、４４００±１２００個（境界域）、および３１００±９００個（梗塞領域）のｃ−ｋｉｔ陽性細胞／１００ｍｍ２に増加した。Ｋｉ６７標識は、遠隔、隣接、および梗塞心筋の、それぞれ４８％、４６％および２６％のｃ−ｋｉｔ陽性細胞において検出された。つまり、これらの細胞は、高度に複製されていた。このような効果は、梗塞非処置イヌにおいて、実質的になかった。急性実験に、冠動脈閉塞後１０〜３０日目の移植結晶（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌｓ）により定義された梗塞心筋の定量分析を補足した。新たな心筋における奇異性運動から正常収縮への変化は、４００〜１６，０００μｍ３のサイズで変動し、平均容積２，０００±６４０μｍ３である筋細胞の生成を特徴とした。ＢｒｄＵ標識された内皮および平滑筋細胞を含む抵抗血管は、８７±４８／ｍｍ２組織であった。毛細血管は、細動脈の２〜３倍存在した。合わせると、梗塞の１６±９％が、健常な心筋により置換された。つまり、イヌ科常在性原始細胞は、貯蔵部位から動員され、死滅心筋に到達することができる。幹細胞の活性化および分化により、梗塞心臓の修復が促進され、局所的な壁運動および全身的な血行動態が改善される。
【０１７７】
実施例１１：常在性心臓幹細胞の動員は梗塞心臓におけるアンジオテンシンII遮断に対する重要な追加的処置を構成する
上述の非限定的な実施例の方法を、下記の例外を含みながら使用した。
【０１７８】
心筋梗塞（ＭＩ）の主要な合併要因の２つは、筋量喪失と腔拡張であり、両者ともネガティブな左心室（ＬＶ）リモデリングと心性能の低下に寄与する。これらのＭＩの悪影響を阻止しようとして、常在性心臓幹細胞（ＣＳＣ）を動員および活性化して組織再生を促進し、ＡＴ１受容体遮断薬ロサルタン（Ｌｏｓ）を２０ｍｇ／ｋｇ体重／日で投与して細胞肥大と、それによる腔容積の増加を抑制した。これに基づき、ＭＩをマウスにおいて作製し、動物を４群に再分別した：１．偽手術（ＳＯ）；２．ＭＩのみ；３．ＭＩ−Ｌｏｓ；４．Ｍｉ−Ｌｏｓ−ＣＳＣ。ＭＩ後１ヶ月目に、動物を屠殺し、ＬＶ機能、梗塞寸法、心臓リモデリングを評価した。ＣＳＣ処置マウスにおいて、心筋再生も測定した。ＬＶが失った筋細胞の数に基づく梗塞サイズは、ＭＩで４７％、ＭＩ−Ｌｏｓで５１％、およびＭｉ−Ｌｏｓ−ＣＳＣで５３％であった。ＭＩおよびＭＩ−Ｌｏｓと比較し、ＬｏｓおよびＣＳＣで処置されたＭＩでは、腔直径がＭＩに対して−１７％およびＭＩ−Ｌｏｓに対して−１２％、長軸がＭＩに対して−２６％（ｐ＜０．００１）およびＭＩ−Ｌｏｓに対して−８％（ｐ＜０．００２）、腔容積がＭＩに対して−４０％（ｐ＜０．０１）およびＭＩ−Ｌｏｓに対して−３５％（ｐ＜０．０４）と、損傷心臓よりも好適な転帰が得られた。ＬＶ量対腔容積比は、ＭＩおよびＭＩ−ＬｏｓよりもＭＩ−Ｌｏｓ−ＣＳＣにおいてそれぞれ４７％（ｐ＜０．０１）および５６％（ｐ＜０．０１）高かった。ＭＩ−Ｌｏｓ−ＣＳＣにおける組織修復は、９００μｍ３の新たな筋細胞１０×１０６個で構成された。更に、このマウス群において、心筋１ｍｍ２あたり細動脈７０個および毛細血管２００個が存在した。９ｍｍ３の新たな心筋が生成され、ＭＩサイズは２２％減少し、ＬＶは５３％から４１％となった。超音波心臓検査によれば、ＭＩ−Ｌｏｓ−ＣＳＣマウスの壁の梗塞領域において、収縮機能が再現された。血行動態検査によれば、ＭＩ−Ｌｏｓ−ＣＳＣマウスは、ＬＶＥＤＰが低く、＋および−ｄＰ／ｄｔが高かった。結論として、心室リモデリングに及ぼすロサルタンの肯定的影響は、梗塞領域へのＣＳＣ移行を介した心修復過程により増強される。動員されたＣＳＣは、梗塞サイズおよび心室拡張を低減し、それにより梗塞心臓の収縮挙動を更に向上させる。
【０１７９】
実施例１２：肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）はｃ−ｍｅｔの核への移行を誘発し、ＧＡＴＡ−４の発現および心臓幹細胞（ＣＳＣ）分化を活性化する
上述の非限定的な実施例の方法を、下記の例外を含みながら使用した。
【０１８０】
予備試験において、著者らは、ｃ−ｋｉｔまたはＭＤＲ−１に対して陽性のＣＳＣが表面受容体ｃ−ｍｅｔを発現することを証明することができた。ｃ−ｍｅｔは、ＨＧＦの受容体であり、リガンド結合は、マトリックスメタロプロテアーゼの合成を介して細胞運動性を促進した。しかし、ｃ−ｍｅｔ活性化がＣＳＣの生態および機能に更なる影響を有するかは、知られていない。この目的で、ＮＳＣＭにおいて５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦに暴露されたＣＳＣ上のｃ−ｍｅｔが、細胞内内在化および移行により増殖因子に応答するかを試験した。驚くべきことに、原始的特性を維持したこれらの被刺激細胞において、ｃ−ｍｅｔの核内局在化が、共焦点顕微鏡検査により検出された。ＨＧＦがｃ−ｍｅｔに及ぼすこの異例の影響により、動員された受容体が他の核内蛋白質と相互作用して、ＣＳＣの細胞増殖および分化に関与し得る可能性が生じた。細胞系列の分化決定における心特異的転写因子ＧＡＴＡ−４の重要な役割から、免疫沈降およびウエスタンブロット法により、ｃ−ｍｅｔおよびＧＡＴＡ−４により生成された蛋白質複合体を同定した。１回のＨＧＦ刺激に続く時間依存性分析により、ｃ−ｍｅｔ−ＧＡＴＡ−４複合体が１５分から３日目までに漸増したことが示された。時間を、原始細胞の、筋細胞および他の心臓細胞への分化とも結びつけた。ＧＡＴＡ−４とｃ−ｍｅｔのＤＮＡレベルの間の分子内相互作用を確定するために、ＨＧＦで１時間刺激された細胞から単離された核抽出物に、ゲルシフトアッセイを実施した。ＧＡＴＡ配列を含むプローブを用いて、シフトしたバンドを得た。しかし、ＧＡＴＡ−４抗体の追加により、極度にシフトしたバンドが得られた。反対に、ｃ−ｍｅｔ抗体の包含により、ＧＡＴＡバンドの光学密度は低減した。ＴＡＴＡボックス上流のＧＡＴＡ配列が、ｃ−ｍｅｔプロモータにおいて同定されたため、第二移動性シフトアッセイを実施した。この場合、ＨＧＦ刺激細胞由来の核抽出物は、ｃ−ｍｅｔ抗体により軽減されたバンドシフトをもたらした。反対に、ＧＡＴＡ−４抗体は、極度にシフトしたバンドを誘発した。即ち、核レベルでのＨＧＦ介在ｃ−ｍｅｔ移行は、ｃ−ｍｅｔに転写因子機能を授与することができ、今後の試験では、このＤＮＡ結合がＧＡＴＡ−４発現を増強し、未成熟心臓細胞の分化をもたらすかを実証することになろう。
【０１８１】
実施例１３：ヒト心臓幹細胞の単離および増殖、ならびにそれに有用な培地の調製
作業室内の滅菌条件下で、心筋組織（平均重量１ｇ以下）を採取した。
【０１８２】
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Cambrex 12-719F）４２５〜４５０ｍｌ、５〜１０％の患者血清（心耳組織と共に得られた患者血液１００〜１５０ｍｌから得られた血清５０〜７５ｍｌ）、２０ｎｇ／ｍｌヒト組換えｂＦＧＦ（Peprotech 100-18B）、２０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＥＧＦ（Sigma E9644）、５μｇ／ｍｌインスリン（RayBiotech IP-01-270）、５μｇ／ｍｌトランスフェリン（RayBiotech IP-03-363）、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム（Sigma S5261）、１．２２ｍｇ／ｍｌウリジン（Sigma U-3003）、および１．３４ｍｇ／ｍｌイノシン（Sigma I-1024）を使って、増殖培地を調製した。
【０１８３】
増殖培地を充填した滅菌ペトリ皿内に組織を浸漬し、その後、滅菌条件下で小片（２００〜４００ｍｇ）に切断した。その後、各組織片を、凍結培地１ｍｌを含む１．２ｍｌ低温保存バイアルに移した（凍結培地は、増殖培地とＤＭＳＯとの容積比９：１の混合物、例えば、培地９ｍｌとＤＭＳＯ１ｍｌの混合物で構成された）。
【０１８４】
低温保存バイアルを、−７０℃〜−８０℃に予冷したナルゲン容器内で凍結させ、その後、−７０℃〜−８０℃で少なくとも３日間貯蔵した。
【０１８５】
３７℃に加温された水浴内に蒸留水中の７０％エタノール溶液を含有する容器に浸漬することにより、試料を（３７℃で）解凍した。２分後、バイアルをフード下に置き、開封して、ピペッティングにより上澄みを除去し、室温に保たれた標準生理食塩水で置換した。その後、試料を１００ｍｍペトリ皿に移し、生理食塩水で２回洗浄した。Steri250（Inotech）で滅菌したピンセットを使用して、心標本から線維組織および脂肪を手作業で分離した。その後、試料を増殖培地に移し、１〜２ｍｍ２の薄片に細断した。
【０１８６】
上記の通り５〜１０％ヒト血清で富養化した増殖培地を含有する、カバーガラス下の非コーティングディッシュに、薄片を播種した。ペトリ皿を５％ＣＯ２下３７℃のインキュベータに入れた。
【０１８７】
組織播種後１〜２週間目に、ＣＳＣの成長は明らかとなった。細胞増殖の全期間にわたり週２回、増殖培地を交換した。培地を４℃で貯蔵し、使用前に３７℃で加温した。合計８ｍｌの培地を、１００ｍｍペトリ皿中で使用した。培養片または細胞により生成された調整培地を保存するために、１回に培地６ｍｌのみを取出し、新鮮な培地６ｍｌを添加した。
【０１８８】
更に２週間後、約５，０００個の心筋細胞クラスターが、各組織断片を包囲すると予測された。
【０１８９】
サブコンフルエンス状態で、増殖培地を除去し、一皿あたりトリプシン（０．２５％）［Carnbrexカタログ番号10170；内毒素は無視し得るレベル］４ｍｌを用いて、５〜７分かけて細胞を剥離させた。血清含有培地６ｍｌを用いて、反応を停止させた。
【０１９０】
その後、Myltenyi免疫磁気ビーズを使用して、細胞を選別し、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を得た。抗ｃ−ｋｉｔＨ３００（sc-5535 Santa Cruz）を一次抗体として使用し、マイクロビーズとコンジュゲートさせた抗ウサギ抗体（130048602 Miltenyi）を二次抗体として使用する間接法により、細胞選別を実施した。心筋試料から増殖した細胞を、１５ｍｌファルコンチューブに入れ、８５０ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。培地を除去し、細胞を１０ｍｌ ＰＢＳ中に再懸濁させた。細胞を再度、洗浄の目的で、８５０ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。ＰＢＳを除去し、細胞ペレットを９７５μｌ ＰＢＳ中に再懸濁させてから、１．５ｍｌ試験管に移した。２５μｌの抗ｃ−ｋｉｔ抗体（２５μｇの抗体に相当）H-300（sc-5535 Santa Cruz）を添加した。３６０度回転シェーカー中のバイアルにて、抗体と共に４℃で１時間インキュベートした。
【０１９１】
インキュベーション後、細胞を８５０ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、ＰＢＳ  １ｍｌ中に再懸濁させ、再度遠心分離した。その後、シェーカー内のバイアルを１８０度回転させながら、細胞を、免疫ビーズにコンジュゲートさせた二次抗体（ＰＢＳ  ８０μｌおよび抗体２０μｌ）と共に４℃で４５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＳ  ４００μｌを添加し、細胞懸濁液を分離カラムに通して磁気選別した（Miltenyi 130042201）。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞はカラムに付着し、それを回収し、１．５ｍｌ試験管に入れた。細胞を遠心分離し、予め加温（３７℃）された培地１ｍｌに再懸濁させ、２４ウェルプレートに播種した。
【０１９２】
その後、ｃ−ｋｉｔ＋細胞を、増殖培地に播種して、増殖させた。３〜４ヶ月後（±１ヶ月）、およそ百万個の細胞が得られた。増殖培地を、細胞増殖の全期間にわたり週２回交換した。培地は４℃で貯蔵し、使用前に３７℃で加温した。合計１ｍｌの培地を、２４ウェル各々において使用した。所望の数の注射用細胞を得るために、細胞をサブコンフルエントで３回継代した：１）３５ｍｍペトリ皿に培地２ｍｌを充填；２）６０ｍｍペトリ皿に培地４ｍｌを充填；および３）１００ｍｍペトリ皿に培地８ｍｌを充填。培養細胞により生成された調整培地を保存するために、各継代で培地の２／３のみを交換した。
【０１９３】
ｃ−ｋｉｔ＋細胞（ＣＳＣ）の特性を、（ａ）転写因子、例えばＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、Ｅｔｓｌ、およびＧＡＴＡ６、ならびに（ｂ）その他の抗原、例えばａ−筋節アクチン、トロポニンＩ、ＭＨＣ、コネキシン４３、Ｎ−カドヘリン、フォンヴィレブランド因子、平滑筋アクチンなどの、ｃ−ｋｉｔに対する抗体および心臓細胞系列の分化決定されたもの（即ち、心臓の筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞）のマーカに対する抗体を用いて、免疫細胞化学法およびＦＡＣＳにより分析した。所望なら、その他のマーカおよび／またはｆｌｋ−１などのエピトープについて、細胞を分析することもできる。
【０１９４】
ＣＳＣを活性化するために、ＣＳＣを、２００ｎｇ／ｍｌ肝細胞増殖因子および２００ｎｇ／ｍｌインスリン様増殖因子−１を更に含有する増殖培地と共に、２時間インキュベートした。
【０１９５】
実施例１４：ヒト心臓幹細胞の単離および増殖、ならびに心筋梗塞治療における使用
先に記載された通り、心臓手術を受けた同意のある患者５１人から、除去された心筋標本を入手した。試料を細断し、肝細胞増殖因子およびインスリン様増殖因子−１をそれぞれ２００ｎｇ／ｍｌおよび２００ｎｇ／ｍｌの濃度で補充された培地を含む非コーティングペトリ皿の表面に播種した。２９例で、細胞の増殖に成功した。このサブセットにおいて、細胞増殖は、播種後約４日目に明らかとなり、約２週間目には細胞約５，０００〜７，０００個のクラスターが、各組織片を包囲した（図７０Ａ〜Ｃ）。組織から増殖した細胞を、免疫ビーズを用いてｃ−ｋｉｔについて選別し、培養した（Beltrami,2003; Linke,2005）。先に記載された通り、細胞表現型をＦＡＣＳおよび免疫細胞化学法により定義した（Beltrami,2003;Orlic,2001,Urbanek,2005）。選別したｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を固定し、心臓、骨格筋、神経、造血系の細胞系列のマーカについて試験して（下記表１）、系列陰性（Ｌｉｎ−）−ｈＣＳＣを検出した（Beltrami,2003; Linke,2005; Urbanek,2005）。Ｐ０の心筋試料由来の細胞増殖画分は、幹細胞抗原ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ１およびＳｃａ−１様を発現し（図７０Ｄ〜Ｆ）、これらは、それぞれ細胞集団全体の１．８±１．７、０．５±０．７、１．３±１．９％を構成した。これらの細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ８、ＣＤ２０およびグリコホリンＡを含む造血細胞マーカに対して陰性であった（下記表１）。
【表１】
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【０１９６】
心転写因子ＧＡＴＡ４および筋細胞転写因子ＭＥＦ２Ｃは、これらの細胞の一部に存在した。細胞の大部分が、筋細胞、ＳＭＣ、およびＥＣの細胞質蛋白質を発現した。一部の細胞が、神経フィラメント２００に対して陽性であった（図７０Ｇ〜Ｊ）。未分画細胞のＦＡＣＳ分析で、免疫標識により得られたデータを確認した。細胞化学のために、可能な場合には、交差反応および自己蛍光を防ぐために、抗体を蛍光色素または量子ドットにより直接標識した（表１、オンライン）（Linke,2005;Urbanek,2005）。未分画細胞およびｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞のＦＡＣＳに使用した抗体を、表２に列挙する（Beltrami,2003;Urbanek,2005）。
【表２】
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【０１９７】
動物における過去の結果から（Beltrami,2001;Linke,2005）、免疫ビーズを用いて細胞をＰ０でｃ−ｋｉｔについて選別した。ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞は、Ｌｉｎ−細胞５２±１２％および早期分化決定細胞４８±１２％を含んだ（図７１Ａ）。ヒト血清の存在下で播種されたｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞は、急速に付着し、Ｐ８まで増殖し続け、細胞集団は約２５回倍増した。細胞は安定した表現型を維持し、Ｐ８において増殖停止または老齢期に達しなかった。ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞の百分比は、Ｐ１からＰ８まで変動せず、平均７１±８％であった。細胞周期中のＫｉ６７ＰＯＳ細胞（図７１Ｂ）は、Ｐ１からＰ８まで一定していて、平均４８±１０％であった。しかし、細胞の６±４％は、細胞老化マーカであるｐ１６ＩＮＫ４ａを発現した（図７１Ｃ）。ＦＡＣＳ分析により、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞が造血細胞系列に対して陰性を保ち、大部分が、トランスフェリン受容体ＣＤ７１を発現し、これがＫｉ６７と密接に相関する（図７１Ｄ）ことが示された。未分化状態のｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞（６３±６％）が、心臓細胞の核蛋白質および細胞質蛋白質の非存在により確定された（表１）。幹細胞性を示す中間径のフィラメントネスチンが、６２±１４％のｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞において見出された（図７１Ｅ〜Ｇ）。
【０１９８】
クローニングアッセイ
ヒトｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を、Ｐ０で選別し、顕微鏡による制御下で、個々のｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を、テラサキプレートの各ウェルに０．２５〜０．５個／ウェルの密度で播種した（図７１Ｈ）（Beltrami,2003;Linke,2005）。１を超える細胞を含有するウェルは、除外し、定着されるｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞の５０±１０％が、Ｌｉｎ−であった。ＢｒｄＵ（１０μＭ）を１日３回、５日間にわたり添加した（Beltrami,2003;Linke,2005）。約３〜４週間後、５３個の小クローンが、６，７００個の単一播種細胞から産生された。つまり、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ−ｈＣＳＣは、０．８％クローニング効率を有した。クローン中の細胞数は、２００〜１，０００で変動した（図７１Ｉ）。クローン５３個のうち１２個は、更に増殖しなかった。残りのクローン４１個は、増殖して、免疫細胞化学法により特徴づけられた。倍増時間は２９±１０時間であり、５日後の細胞の９０±７％が、ＢｒｄＵＰＯＳであった。デキサメタゾンを使用して、分化を誘発し（Beltrami,2003;Linke,2005）、その結果、心臓細胞系が、検出された。それらは、筋細胞、ＳＭＣ、およびＥＣを含んでいた（図７１Ｊ）。筋細胞は、優勢な細胞集団であり、ＥＣおよびＳＭＣが、それに続いた（図７５）。
【０１９９】
心筋梗塞
心筋梗塞を、標準的な免疫抑制レジメン（Zimmermann,2002）で処置された麻酔下の雌免疫欠損スキッドマウス（Urbanek,2005）およびフィッシャー３４４ラット（Beltrami,2003）において作製した。ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を、先に記載された通り心臓手術を受けた患者８名の心筋試料（約３標本／患者）から単離し、増殖させた。これらの試験において、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞約２００，０００個を、各試料から入手する際に、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を、Ｐ2で回収した。このプロトコルには、約７週間を要した。冠動脈閉塞後まもなく、約４０，０００個のヒトｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を、境界域の両側で２箇所に注射した（Beltrami,2003;Orlic,2001;Lanza,2004）。動物をＢｒｄＵに暴露し、梗塞および細胞移植後２〜３週間で屠殺した（Beltrami,2003; Orlic,2001; Urbanek,2005; Lanza,2004）。超音波心臓検査を実施し、その２〜３日後に、左心室（ＬＶ）圧およびｄＰ／ｄｔを測定した（Beltrami,2003;Orlic,2001;Urbanek,2005;Lanza,2004）。心臓を拡張期に停止させ、ホルマリンでの潅流により固定した。各心臓において、梗塞サイズ、ならびにヒト筋細胞、細動脈、および毛細血管の形成を測定した（Anversa,2002）。
【０２００】
修復が、処置マウス２５匹中１７匹（６８％）および処置ラット１９匹中１４匹（７４％）において得られた。梗塞再構成の失敗を適正に解釈するために、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を、ローダミン標識小球体と共に注射して、注射部位および細胞の適正投与を確認した（Leri,2005;Kajtsura,2005）。処置に失敗した動物は、処置に成功した動物の適当な対照と見なされた。完全にするために、免疫欠損梗塞マウス１２匹および免疫抑制梗塞ラット９匹にＰＢＳを注射し、追加対照として使用した。梗塞サイズは、全群で同様であり、マウスでは平均４８±９％、ラットでは平均５２±１２％であった。
【０２０１】
ヒト心筋は全ての例に存在し、ヒトｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞が、梗塞マウスおよびラットの境界域内に適切に送達されていた。ヒト心筋のこれらの病巣は、梗塞内に位置し、Ａｌｕプロープを用いたヒトＤＮＡ配列の検出により認識された（Just,2003）。喪失心筋の再構成の程度は、マウスにおいて１．３±０．９ｍｍ３、ラットにおいて３．７±２．９ｍｍ３であった（図７２Ａ〜Ｃ）。新たに形成された細胞の蓄積は、構造のＢｒｄＵ標識によっても決定し、ＢｒｄＵは、観察期間全体を通して動物に与えた。ヒトｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞は、患者８名から得たが、様々なヒト細胞について心修復の程度に明らかな差はなかった。組織再生の変動性は、細胞の供給源と独立しており、その他の要因が処置された心臓の回復に影響を及ぼしたことが示唆される。
【０２０２】
ヒト心筋の形成を、処置ラットの心壁の梗塞部分におけるヒトＡｌｕ ＤＮＡ配列の認識により確認した。加えて、ヒトＭＬＣ２ｖＤＮＡ配列を、ヒトＡｌｕ ＤＮＡと共に同定した（図７２Ｄ）。同じ動物における生存心筋は、ヒトＡｌｕまたはヒトＭＬＣ２ｖ  ＤＮＡ配列を含まなかった。生存可能な心筋は、ラットＭＬＣ２ｖ  ＤＮＡを示した。
【０２０３】
処置マウスにおいて、ヒト心筋は、密集した筋細胞からなり、それが新組織の８４±６％を占める一方、抵抗細動脈および毛細血管プロファイルは、合わせて７±３％を占めた。処置ラットの対応する値は、８３±８％および８±４％であった。単離されたヒト血管プロファイルと共にＳＭＣおよびＥＣを検出したが、それらは梗塞全体に散在されていた（図７６）。注射に失敗した梗塞マウスおよびラット、またはＰＢＳで処置された動物においては、ヒト筋細胞、ＳＭＣおよびＥＣは、検出されなかった。
【０２０４】
インサイチュハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ
ヒト細胞を、ヒト特異的Ａｌｕ反復配列に対するＦＩＴＣ標識プローブ（Biogenex）を用いたインサイチュハイブリダイゼーションにより検出した（Just,2003）。加えて、ヒトＸ染色体、ならびにマウスおよびラットＸ染色体を、同定した（Quaini,2002）。ＤＮＡを、ヒト細胞で処置されたラットの生存可能なＬＶおよび梗塞ＬＶの組織片から抽出した。ヒトＡｌｕ（長さおよそ３００塩基対であり、霊長類ゲノムに特異的に見出され、１０％を超えるヒトゲノムに存在し、ヒトにおいては平均距離４ｋｂで位置する）、ならびにラットおよびヒトミオシン軽鎖２ｖ配列についてＰＣＲを実施した（下記表３参照）。
【表３】
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【０２０５】
二次抗体による非特異的標識を避けるため、ほとんどの一次抗体を、蛍光色素により直接標識した（表１）。この予防策にもかかわらず、組織片に内在する微量の自己蛍光を排除することは、このアプローチでは不可能である（Leri,2005; Linke,2005; Urbanek,2005）。このアーチファクトの原因を除外するために、可能な場合は、一次抗体を量子ドットにコンジュゲートさせ；これらの半導体粒子の励起波長および発光波長を自己蛍光の範囲外とし、変数混同を排除する（Leri,2005）。量子ドット標識は、再生されたヒト心筋バンド内の心筋細胞、ＳＭＣおよびＥＣの転写因子、細胞質蛋白質および膜蛋白質の同定に適用した。
【０２０６】
Ａｌｕプローブによるヒト細胞の認識に続き、心臓ミオシン重鎖およびトロポニンＩを、転写因子ＧＡＴＡ４およびＭＥＦ２Ｃと共に新たな筋細胞中で検出した。加えて、結合蛋白質コネキシン４３およびＮ−カドヘリンを、これらの発生筋細胞の表面で同定した（図７２Ｅ〜Ｊ）。ラミニンも、間質において明らかとなった。ヒト筋細胞は、両動物モデルにおいて１００〜２，９００μｍ３のサイズで著しく変動した（図７７）。
【０２０７】
雌性ヒト細胞を、雌梗塞マウスおよびラットに注射した。それゆえ、ヒトＸ染色体も、マウスおよびラットＸ染色体と共に同定し、ヒト細胞とマウスまたはラット細胞との融合が検出された。ヒトＸ染色体とマウスまたはラットＸ染色体の共局在は、新たに形成された筋細胞、冠細動脈および毛細血管プロファイルにおいてはなんら認められなかった（図７３Ｈ〜Ｍ）。重要なこととして、ヒト筋細胞、ＳＭＣおよびＥＣは、最大２つのＸ染色体を持っていた。それゆえ細胞融合は、キメラ梗塞心臓におけるヒト心筋の形成に、重要な役割を担っていなかった。
【０２０８】
ヒト心筋の特徴
ヒトｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞の注射により媒介される血管形成を、ヒトＳＭＣおよびＥＣのみで構成される冠細動脈および毛細血管により証明した（図７３Ａ〜Ｆ）。マウスまたはラット冠血管構造において、ヒトＳＭＣとＥＣとの目視可能な完全性は存在しなかった。ヒト細胞および非ヒト細胞により形成された血管が見出された例はなかった。ヒト細動脈および毛細血管の数は、ラットおよびマウスと同等であり、両方の例で、筋細胞８個あたり１つの毛細血管が存在した（図７３Ｇ）。加えて、酸素についての拡散距離は、平均１８μｍであった。これらの毛細血管パラメータは、胎仔期後半および新生仔期のヒト心臓において見だされたものと同様である（Anversa,2002）。
【０２０９】
ヒト心筋は機能的コンピテントである
再生されたヒト心筋が機能的コンピテントであり、梗塞心臓の機能を部分的に回復しているかを決定するために、貫壁性梗塞および新規形成ヒト心筋の有無を調べる組織学的証明に続き、超音波心臓図を遡及的に調査した（図７４Ａ〜Ｃ；図７８）。心筋再生を、壁の梗塞域における検出可能な収縮機能に関連づけた（これは、組織再構成がなければ決して起こらなかった）。ヒト心筋の形成により、梗塞心室の駆出率が上昇した（図７４Ｄ）。更に、心筋再生により、腔拡張が緩和され、ＬＶ質量対腔容積比が上昇し（図７４Ｅ）、梗塞後のＬＶＥＤＰの上昇ならびにＬＶＤＰおよび正負ｄＰ／ｄｔの低下を制限することにより、全体的心室機能を改善した（図７４Ｆ）。
【０２１０】
関連するところでは、本実施例全体で提供された結果は、平均±ＳＤである。有意性は、スチューデントｔ検定およびボンフェローニ法により決定した（Anversa,2002）。
【０２１１】
実施例１５：心臓幹細胞による大冠動脈の形成−生体バイパス
血管構造閉塞に及ぼすクローン原性ＥＧＦＰＰＯＳ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ−ＣＳＣ（非活性化ＣＳＣ）ならびにＨＧＦおよびＩＧＦ−１により活性化されたＥＧＦＰＰＯＳ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ−ＣＳＣ（活性化ＣＳＣ）の注射の影響を比較するために、フィッシャー３４４ラットの左冠動脈、を標準的手順により閉塞した。非活性化ＣＳＣまたは活性化ＣＳＣ（活性化は移植の２時間前に行なった）を、閉塞された左冠動脈の近辺に移植した。結さつの解剖学的位置のため、細胞移植部位は、結さつにより発生した心室壁の梗塞領域からは離れていた（図８２）。心筋内に播種された非活性化ＣＳＣは、送達の１２時間および２４時間後から４８時間後まで漸増する高度のアポトーシス率を示した（図８３）。細胞死により、１〜２週間で移植細胞は完全に消失した。反対に増殖因子で活性化されたＣＳＣの移植において、著しい効能が検出された（図７９ａ）。活性化ＣＳＣは、心筋にホーミングし、そこでアポトーシスが急性に細胞複製に勝ったが、続いて細胞分裂が細胞死を上回った（図７９ｂ−ｄ）。
【０２１２】
活性化ＣＳＣおよび非活性化ＣＳＣは、注射部位における非損傷心筋内に蓄積したが、細胞生着は、活性化細胞に限定された。生着には、細胞間接触、ならびに細胞と細胞外マトリクスとの相互作用を成立させる表面蛋白質が合成される必要がある（Lapidot, 2005）。コネキシン４３、Ｎ−およびＥ−カドヘリン、ならびにＬ−セレクチンは、大部分の活性化ＣＳＣにおいてのみ発現された（図７９ｅ）。これらの結合蛋白質および接着蛋白質は、心筋内の非活性化ＣＳＣクラスターには存在しなかった。
【０２１３】
アポトーシスは、生着細胞にはなんら影響を及ぼさず、非生着細胞にのみ関与した（図７９ｆ）。この現象は、プログラム細胞死が細胞間接触の欠如により惹起される、非生着細胞のアノイキスと一致した（Frisch,2001;Melendez,2004）。
【０２１４】
増殖因子によるＣＳＣの活性化が細胞生着において役割を担うこと、および細胞生着が虚血損傷と独立していることを立証するために、活性化ＣＳＣを、対照である非梗塞マウスのインタクト心筋に注射した。１ヶ月後、多量の細胞が、心臓の心外膜域に存在した（図７９ｇ）。これらの細胞は、コネキシン４３および４５、Ｎ−およびＥ−カドヘリン、ならびにＬ−セレクチンを発現した。移植細胞は、恐らく組織損傷が存在せず、喪失心筋を再生する必要があることから、未分化表現型を維持した（Beltrami,2003; Orlic,2001; Mouquet,2005）。
【０２１５】
処置後２日目の定量測定により、注射された非活性化ＣＳＣ  ８０，０００〜１００，０００個の約５％（４，８００±２，６００個）のみが、心筋中に存在することが示された。活性化ＣＳＣの送達後、ＥＧＦＰを発現する多量の細胞が、検出された。しかしこれらは、投与細胞総数４８，０００±１３，０００より明らかに少なかった。これらの細胞は、非生着ＣＳＣおよび生着ＣＳＣのそれぞれ死滅産物および分裂産物であった。
【０２１６】
ＳＤＦ−１ケモカイン１２およびＳＤＦ−１は、虚血に伴いアップレギュレートされ（Abott,2004;Ceradini,2005）、組織内の酸素勾配に関与し得ることから（Butler,2005）、冠動脈閉塞により作り出された心筋環境の変化が、活性化ＣＳＣの血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）および内皮細胞（ＥＣ）への分化に影響を及ぼすかを決定するために、ＳＤＦ−１ケモカイン１２およびＳＤＦ−１の転写調節因子である低酸素症誘導因子−１（ＨＩＦ−１）の発現を測定した。この心筋応答は、梗塞心筋の長軸断面で認められ、低酸素状態は梗塞心室の基部から中間部および頂部に向かって漸増した。反対に、ＨＩＦ−１およびＳＤＦ−１の発現は、頂部の死滅心筋内で最も少なく、中間部でもあまり存在せず、虚血しているが生存可能な心筋基部に向かって非常に明白になった。ＨＩＦ−１およびＳＤＦ−１は、血管壁の内膜に限定されていた。免疫標識は、ウエスタンブロット法によるＨＩＦ−１およびＳＤＦ−１の局所的発現ならびにＥＬＩＳＡで測定されたＳＤＦ−１レベルと一致した。
【０２１７】
梗塞心臓における伝導冠動脈およびその分枝の発達に及ぼす活性化ＣＳＣの影響を、冠動脈結さつおよび処置後２週間目および１ヶ月目に評価した。有意な規模の血管成長は、生後１０〜１５日以内に起こるが（Olivetti,1980; Rakusan,1984）、ラットにおける生後の冠動脈樹構造の成熟にはおよそ１ヶ月を要することから（Anversa,2002）、前記の時点を選択した。梗塞および細胞移植後２週間目に、新たに形成された大きなＥＧＦＰ陽性冠動脈が、注射部位の極近傍の心筋外膜に見出された（図８０ａ、ｂ）。生成された血管は、生存心筋および閉塞冠動脈に近い心臓基部における梗塞境界部を貫通していた。直径１５０μｍ以上の伝導動脈は、弾性内膜を有し、心室の基部および中間部上側の生存可能な心筋に限定された。比較として、左冠動脈の起点は、直径約２７５μｍを有する。新たに形成されたＥＧＦＰ陽性心筋は、再生された血管の隣接域または遠隔域の生存心筋にも全く見出されなかった。このことは、臓器の局地的な必要性に対するＣＳＣの選択的応答を立証しており、幹細胞増殖および分化を調整しているようである（Baxter,2000）。
【０２１８】
直径２５μｍ未満の小抵抗細動脈の存在は、瘢痕化した梗塞領域に限定された（図８０ｃ）。このサイズの抵抗細動脈は、２週間目の温存心筋内では検出されなかった。同様に、少数の毛細血管が存在したが、梗塞心筋内のみであった。全ての例において、血管壁は、ＥＧＦＰ陽性ＳＭＣおよびＥＣのみで構成されていた。再生血管においては、ＥＧＦＰ陰性ＳＭＣまたはＥＣは、存在しなかった。これにより、血管形成における既存のＳＭＣおよびＥＣと活性化ＣＳＣの分化決定したものとによる共同的役割の可能性が排除される。血管形成は、これらの条件下での唯一の血管成長メカニズムのようであった。
【０２１９】
梗塞および細胞療法後１ヶ月目に、形成された冠血管構造がその後に退化する一時的な血管であるか、または時間と共に更に成長する機能的コンピテントな血管であるかを決定するために、観察を行った。この期間は、更なる血管成長の検出のためだけでなく、梗塞治癒の特徴づけにも関係した。梗塞治癒は、げっ歯類において、約４週間で完了し（Fishbein,1978）、壊死細胞内にコラーゲンIII型およびＩ型を蓄積させる。治癒の早期に存在した血管は、アポトーシスにより次第に死滅するため（Cleutjens, 1999）、瘢痕化した心筋は、多くても数個の瘢痕化血管プロファイルを含む。それゆえ、異なる分類のＥＧＦＰ陽性冠血管の分布を、２週間目および１ヶ月目の梗塞心筋および非梗塞心筋において測定した。
【０２２０】
１ヶ月目に、直径が６〜２５０μｍの範囲の多数のＥＧＦＰ陽性冠血管が、壁の生存可能な心筋および梗塞領域の両方に存在しており、時間に応じて冠血管構造が拡大したことが示唆される。１ヶ月目に、毛細血管プロファイルを伴う大、中、および小サイズの冠動脈および細動脈が、心室壁の温存心筋および梗塞部分の両方で検出された。２週間目に認められた通り、再生血管は、ＥＧＦＰ陽性ＳＭＣおよびＥＣのみで構成されていた（図８４）。これらの観察は、１ヶ月後には全クラスの冠血管が発生したことを示す定量的結果により裏づけられた（図８０ｄ）。つまり活性化ＣＳＣは、ラット冠血管樹構造の様々な区分をデノボ生成することができる。
【０２２１】
ＣＳＣの実際の増殖能力を評価するために、冠動脈分類および毛細血管プロファイルの再構成が、常在性ＥＣおよびＳＭＣと注射されたＣＳＣとの融合事象を伴うか（Wagers,2004）を決定した。ヘテロカリオンの形成を、血管壁内のＥＧＦＰ陽性ＥＣおよびＳＭＣの核内性染色体を測定することにより確認した（Urbanek,2005a; Urbanek,2005b; Dawn,2005）。雌性クローン原性ＣＳＣは、雌性心臓に移植されたため、新たに形成された血管のＸ染色体の数を、ＦＩＳＨにより同定した（図８０ｅ）。全ての例において、多くても２つのＸ染色体が、再生ＥＣおよびＳＭＣにおいて見だされ、細胞融合が、あったとしても、活性化ＣＳＣによる冠血管構造の回復における役割は小さいことが示唆された。
【０２２２】
新しい心外膜冠血管が、大動脈および既存の冠循環系に機能的に接続しているかを決定するために、エクスビボ調製を利用した。ローダミン標識デキストラン（ＭＷ７０，０００；赤色蛍光）を含有する酸素化タイロード液を用い、心臓を大動脈により逆方向に連続潅流した。この分子は内皮障壁を通過せず、二光子顕微鏡で冠血管構造全体を可視化することができる（Urbanek,2005;Dawn,2005）。生物学的構造によるレーザ光の散乱のため（Helmchen,2005）、この分析法は最も外側の約１５０μｍの心筋外膜に限定された（心室壁は、厚さ約２．０ｍｍを有する）。常在性冠血管および生成された冠血管を、それぞれ壁のＥＧＦＰ標識（緑色蛍光）非存在および存在により判別した。組織コラーゲンは、二光子励起とコラーゲンの周期的構造の結果である第二高調波発生（青色蛍光）により検出した（Schenke-Layland,2005）。コラーゲンの離散的局在は、生存可能な心筋に対応するものと推定され、広範なコラーゲンの蓄積は、梗塞心筋を表すものと解釈された。
【０２２３】
デキストランを用いた大動脈からの潅流により、２週間目の処置ラットの非梗塞心筋外膜内で、直径ほぼ２００μｍおよびＥＧＦＰ陽性壁の大血管を同定した（図８１ａ）。極微量のコラーゲンが、血管壁近くに認められた。同様の血管が、２週間目および１ヶ月目の瘢痕化心筋においても認められた（図８１ｂ〜ｅ）。時には、新しい冠血管は、ＥＧＦＰ陽性細胞により部分的に置換されていて、心筋再生の離散的病巣（図示しない）に対応する梗塞の心外膜領域を横切っていた（図８１ｅ）。分解能により可能な場合には、既存の（ＥＧＦＰ陰性壁）冠血管と生成された（ＥＧＦＰ陽性壁）冠血管の間の直接接続が認められ（図８１ｆ）、これらの一時的に異なる、冠血管樹構造の新旧セグメントの統合が証明された。
【０２２４】
細胞処置による冠循環の改善は、心室拡張の緩和、ならびに壁厚対腔半径比および心室質量対腔容積比の相対的上昇に関連した（図８１ｇ）。これらの解剖学的変数は、心室機能および心筋負荷に著しく影響する（Pfeffer,1990）。予測された通り、冠循環の再生は、梗塞サイズを縮小しなかった（図８１ｇ）。細胞療法を冠動脈結さつ後まもなく導入すると、閉塞冠動脈により供給された心筋細胞が４〜６時間で死滅した（Anversa,2002）。しかし、左心室拡張終期圧、発生圧、正負のｄＰ／ｄｔ、および拡張期応力における血行動態変化は全て、細胞療法により媒介された冠動脈潅流の改善により部分的に抑制された（図８１ｈ）。
【０２２５】
実施例１６：大動物モデルにおける心臓幹細胞のカテーテル方式冠動脈内送達
ブタ１５頭を、１）心房付属組織を切除および採取すること、ならびに２）遠位の左前下行冠動脈を９０分間閉塞して心筋梗塞を誘発し、次に再潅流すること、という２つの目的で開胸した。ＣＳＣを心房付属物から採取し、先に記載された通りエクスビボで培養および増殖させ、２〜３ヶ月（平均８６日）後に同じブタに冠動脈内注射した。ブタ７頭が冠動脈内ＣＳＣ注射を受け、８頭がビヒクル注射を受けた。全てのブタに、一連の心臓マーカ試験、２Ｄ超音波心臓検査、および（亜群において）侵襲的血行動態モニタリングに加え、内臓の詳細な組織病理学検査を実施した。心臓または組織病理学的検査した様々な臓器において、ＣＳＣ処置に関連する悪影響の徴候はなく、処置されたブタは、心機能改善の傾向を実証した。これらの結果から、この虚血性心筋症の大動物モデルにおけるＣＳＣの冠動脈内送達の安全性および実現可能性が確認された。
【０２２６】
実施例１７：成体腎臓幹細胞の単離
ｃ−ｋｉｔ抗原が、損傷後の広範な心筋再生を誘発し得る常在性成体心臓幹細胞の信頼性のあるマーカであったという著者らの所見に基づいて、著者らは、この同じ幹細胞抗原が、腎臓をはじめとする他の臓器の幹細胞内に存在し得る可能性を検査した。
【０２２７】
著者らは、ＦＡＣＳ分析、二光子顕微鏡検査、ならびに免疫標識および共焦点顕微鏡検査を用いて、マウス腎臓の糸球体および尿細管内のｃ−ｋｉｔ陽性細胞を同定した。最初に、強化緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）がｃ−ｋｉｔプロモータの制御下で存在するトランスジェニックマウスモデルを用いて、胚性期の発生腎臓（図８５）および成体臓器（図８６）におけるｃ−ｋｉｔ陽性細胞の直接視覚化を得た。多光子顕微鏡検査およびエクスビボ腎臓調製を用いて、成体マウス腎臓内のｃ−ｋｉｔ陽性ＥＧＦＰ陽性細胞の分布を定義した。このアプローチは成功し、推定の腎臓幹細胞（ＫＳＣ）を含有する糸球体を、同定した（図８６）。成体マウス腎臓の糸球体および尿細管においてｃ−ｋｉｔ陽性細胞の存在を、免疫標識および共焦点顕微鏡検査により確認した（図８７）。
【０２２８】
これらの結果により、成体マウス腎臓の糸球体の入手、およびｃ−ｋｉｔ陽性ＫＳＣを単離および増殖させる培養条件の確立が促進された（図８８）。複数の調製を、数ヶ月間で実施した。同様の試験を、ｃ−ｋｉｔを潜在的ＫＳＣの幹細胞抗原として用いる胚性および新生仔ラット腎臓において実施した（図８９および９０）。これらの結果から、ｃ−ｋｉｔ陽性ＫＳＣが成体マウスおよびラットの腎臓内に存在し、そのような細胞を培養で増殖させ得ることが示された。次に、同様のｃ−ｋｉｔ陽性細胞がヒト腎臓内に存在するかを確認する試験を実施して、肯定的結果が得られた。免疫標識および共焦点顕微鏡検査を用いることにより、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞が、糸球体係蹄および傍糸球体装置（図示しない）においてボウマン嚢の付近で同定された。加えて、ｃ−ｋｉｔ陽性細胞を、尿細管内および腎実質全体（図示）において同定した。つまりこれらの実施例の結果から、ｃ−ｋｉｔ陽性常在性幹細胞が、腎臓など他の臓器において同定され得ることが実証された。これらの幹細胞を用いて、損傷臓器組織を修復および／または再生することができる。
【０２２９】
実施例１８：成体腎臓幹細胞を用いた損傷腎臓組織の修復
腎臓組織試料をラット、マウス、またはヒトから単離し、試料を細断して培地を含む非コーティングペトリ皿の表面に播種する。組織から増殖された細胞を、免疫ビーズでｃ−ｋｉｔについて選別して、実施例１７に記載された通り培養する。細胞表現型を、実施例１４に記載された通りＦＡＣＳおよび免疫細胞化学により心臓幹細胞について定義する。選別されたｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞を固定し、腎臓、心臓、骨格筋、神経および造血細胞系列のマーカについて試験し、系列陰性（Ｌｉｎ−）腎臓幹細胞（ＫＳＣ）を検出する。
【０２３０】
標準の免疫抑制レジメンにより処置された免疫欠損スキットマウスまたはフィッシャー３４４ラットにおいて急性腎傷害（例えば、腎虚血または腎毒性障害）を誘発した後まもなく、ｃ−ｋｉｔＰＯＳ−ＫＳＣを虚血組織の境界域または傍髄質領域内で、２回注射する。動物をＢｒｄＵに暴露して、損傷および細胞移植後２〜３週間目に屠殺する。各腎臓において、組織損傷のサイズ、ならびにＢｒｄＵ標識腎臓細胞および構造の形成を、決定する。
【０２３１】
ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞−ＫＳＣの注射を受けた動物が、細胞注射を受けていない、またはｃ−ｋｉｔＮＥＧ細胞の注射を受けた動物に比較して、損傷部位でｃ−ｋｉｔＰＯＳ−ＫＳＣによる組織修復を示し、デノボ腎臓細胞（例えば、間質細胞、尿細管細胞、糸球体壁側細胞など）および腎臓構造を生成させると予測される。
【０２３２】
こうして、本発明の好ましい実施形態を詳細に記載したが、添付の請求の範囲により定義される本発明は、本発明の主旨または範囲から逸脱せずとも多くの明らかな変形態様が可能であるため、上記説明で示された特定の詳細に限定されないことが理解されるべきである。
【０２３３】
本明細書に引用された全ての発行物、特許および特許出願が、参照により全体として本明細書に組み入れられる。記載された特定の方法論、プロトコルおよび材料は、変動し得るため、開示された発明がこれらに限定されないことは理解されよう。同じく、本明細書で用いられた用語が、特定の実施形態を説明することを目的としていて、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることは理解されよう。
【０２３４】
当業者は、日常的実験のみを用いれば、本明細書に記載された発明の具体的実施形態の多くの均等物を認識する、またはそれを確認し得るであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されるものとする。
【０２３５】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2013541541.tif 000011
【図７】
2013541541.tif 000012
【図８】
2013541541.tif 000013
【図９】
2013541541.tif 000014
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１５Ｄ】
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【図１５−１】
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【図１５Ｎ】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
2013541541.tif 000026
【図１６−３】
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【図１７】
2013541541.tif 000028
【図１８−１】
2013541541.tif 000029
【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９】
2013541541.tif 000032
【図２０】
2013541541.tif 000033
【図２１】
2013541541.tif 000034
【図２２Ａ−Ｆ】
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【図２２Ｇ−Ｈ】
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【図２２Ｉ−Ｊ】
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【図２２Ｋ−Ｌ】
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【図２２Ｍ】
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【図２２Ｎ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ−Ｄ】
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【図２３Ｅ−Ｆ】
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【図２３Ｇ−Ｈ】
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【図２４Ａ−Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２５Ａ−Ｂ】
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【図２５Ｃ−Ｊ】
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【図２６Ａ−Ｆ】
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【図２６Ｇ−Ｊ】
2013541541.tif 000051
【図２６Ｋ−Ｎ】
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【図２７】
2013541541.tif 000053
【図２８Ａ−Ｂ】
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【図２８Ｃ−Ｆ】
2013541541.tif 000055
【図２８Ｇ−Ｈ】
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【図２９Ａ−Ｄ】
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【図２９Ｅ−Ｈ】
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【図３０Ａ−Ｄ】
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【図３０Ｅ−Ｈ】
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【図３１Ａ−Ｃ】
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【図３１Ｄ−Ｅ】
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【図３１Ｆ−Ｎ】
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【図３１Ｏ−Ｐ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
2013541541.tif 000074
【図４２】
2013541541.tif 000075
【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
2013541541.tif 000093
【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
2013541541.tif 000099
【図６７】
2013541541.tif 000100
【図６８】
2013541541.tif 000101
【図６９】
2013541541.tif 000102
【図７０Ａ−Ｃ】
2013541541.tif 000103
【図７０Ｄ−Ｆ】
2013541541.tif 000104
【図７０Ｇ−Ｊ】
2013541541.tif 000105
【図７１Ａ−Ｃ】
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【図７１Ｄ】
2013541541.tif 000107
【図７１Ｅ−Ｇ】
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【図７１Ｈ】
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【図７１Ｉ】
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【図７１Ｊ】
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【図７２Ａ】
2013541541.tif 000112
【図７２Ｂ−Ｃ】
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【図７２Ｄ】
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【図７２Ｅ−Ｈ】
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【図７２Ｉ−Ｊ】
2013541541.tif 000116
【図７３Ａ−Ｆ】
2013541541.tif 000117
【図７３Ｇ】
2013541541.tif 000118
【図７３Ｈ】
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【図７４Ａ】
2013541541.tif 000120
【図７４Ｂ】
2013541541.tif 000121
【図７４Ｃ】
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【図７４Ｄ】
2013541541.tif 000123
【図７４Ｅ】
2013541541.tif 000124
【図７４Ｆ】
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【図７５】
2013541541.tif 000126
【図７６Ａ−Ｃ】
2013541541.tif 000127
【図７６Ｄ−Ｇ】
2013541541.tif 000128
【図７７】
2013541541.tif 000129
【図７８】
2013541541.tif 000130
【図７９Ａ】
2013541541.tif 000131
【図７９Ｂ−Ｃ】
2013541541.tif 000132
【図７９Ｄ】
2013541541.tif 000133
【図７９Ｅ−１】
2013541541.tif 000134
【図７９Ｅ−２】
2013541541.tif 000135
【図７９Ｅ−３】
2013541541.tif 000136
【図７９Ｆ】
2013541541.tif 000137
【図７９Ｇ】
2013541541.tif 000138
【図８０Ａ】
2013541541.tif 000139
【図８０Ｂ】
2013541541.tif 000140
【図８０Ｃ】
2013541541.tif 000141
【図８０Ｄ】
2013541541.tif 000142
【図８０Ｅ】
2013541541.tif 000143
【図８１Ａ】
2013541541.tif 000144
【図８１Ｂ−Ｄ】
2013541541.tif 000145
【図８１Ｅ】
2013541541.tif 000146
【図８１Ｆ】
2013541541.tif 000147
【図８１Ｇ】
2013541541.tif 000148
【図８１Ｈ】
2013541541.tif 000149
【図８２】
2013541541.tif 000150
【図８３Ａ】
2013541541.tif 000151
【図８３Ｂ】
2013541541.tif 000152
【図８４Ａ】
2013541541.tif 000153
【図８４Ｂ−Ｃ】
2013541541.tif 000154
【図８５】
2013541541.tif 000155
【図８６】
2013541541.tif 000156
【図８７】
2013541541.tif 000157
【図８８】
2013541541.tif 000158
【図８９−１】
2013541541.tif 000159
【図８９−２】
2013541541.tif 000160
【図８９−３】
2013541541.tif 000161
【図９０】
2013541541.tif 000162
【配列表】
2013541541000001.app
【国際調査報告】
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2013541541.tif 000164
2013541541.tif 000165
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