(57)【要約】  【課題】本発明は  ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ピロリ）の感染持続性を制御する手段に関する。  【解決手段】具体的には、本発明は、持続性感染を確立又は維持できない遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを産生するように配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列が変更された機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリに関する。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
持続性感染を確立又は維持できない遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを産生するように配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列が変更された、単離された機能的ウレアーゼを含む遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ。
【請求項２】
前記配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５のアミノ酸配列が、欠失、突然変異又は挿入によって変更された、請求項１に記載の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ細胞。
【請求項３】
変更される前記アミノ酸が、配列番号１の５４７、５４８及び５４９からなる群より選択される、請求項１又は請求項２に記載の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ細胞。
【請求項４】
前記突然変異が保存的又は非保存的アミノ酸変化を含む、請求項２に記載の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ。
【請求項５】
前記変更が１つ又はそれ以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ。
【請求項６】
前記挿入が１０〜１００のアミノ酸を含む、請求項５に記載の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ。
【請求項７】
少なくとも１つの異種抗原、又はその機能的断片をコードする核酸分子をさらに含む、請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ。
【請求項８】
前記異種抗原、又はその機能的断片が病原微生物由来である、請求項７に記載の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ。
【請求項９】
異種抗原をコードする核酸が得られる病原微生物が、ウイルス、細菌、原虫及び真菌からなる群より選択される、請求項６に記載の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ。
【請求項１０】
前記異種抗原が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ＨＴＬＶ抗原、ＳＩＶ抗原、ＲＳＶ抗原、ＰＩＶ抗原、ＨＳＶ抗原、ＣＭＶ抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ライノウイルス抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、ノーウォークウイルス抗原、トガウイルス抗原、アルファウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、エボラウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、コロナウイルス抗原、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）抗原、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）抗原、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｔｅ）抗原、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）抗原、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）抗原、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗原、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）抗原、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）抗原、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）抗原、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）抗原及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）抗原からなる群より選択される、請求項７又は請求項８に記載の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ。
【請求項１１】
前記アミノ酸挿入が異種抗原又はその機能的断片をコードする、請求項５又は請求項６に記載の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ。
【請求項１２】
前記異種抗原が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ＨＴＬＶ抗原、ＳＩＶ抗原、ＲＳＶ抗原、ＰＩＶ抗原、ＨＳＶ抗原、ＣＭＶ抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ライノウイルス抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、ノーウォークウイルス抗原、トガウイルス抗原、アルファウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、エボラウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、コロナウイルス抗原、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）抗原、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）抗原、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｔｅ）抗原、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）抗原、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）抗原、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗原、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）抗原、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）抗原、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）抗原、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）抗原及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）抗原からなる群より選択される、請求項１１に記載の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ及び薬学的に許容可能な担体を含む、免疫原性組成物。
【請求項１４】
アジュバントをさらに含む、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
免疫学的に有効な量の請求項１３又は請求項１４に記載の免疫原性組成物を投与する工程を含む、哺乳類を病原微生物感染から保護する方法。
【請求項１６】
改変されたウレアーゼのＵｒｅＢサブユニットを産生するように配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列を変更する工程を含み、その際前記ウレアーゼは脱酸機能を保持するが前記ヘリコバクター・ピロリは持続性感染を確立又は維持することができない、ヘリコバクター・ピロリの持続性感染確立能力を制御する方法。
【請求項１７】
持続性感染を確立又は維持できない遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを産生するように配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列が変更された機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類にヘリコバクター・ピロリ感染の予防接種を行う方法。
【請求項１８】
哺乳類への予防接種に使用するための免疫原性組成物であって、持続性感染を確立又は維持できない遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを産生するように配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列が変更された機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ及び薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物。
【請求項１９】
配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５及び薬学的担体から本質的になるペプチドワクチン。
【請求項２０】
アジュバントをさらに含む、請求項１９に記載のペプチドワクチン。
【請求項２１】
被験者に請求項１９又は請求項２０に記載のペプチドワクチンを投与する工程を含む、被験者にヘリコバクター・ピロリの予防接種を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）（Ｈ．ピロリ）の感染持続性を制御する手段に関する。具体的には、本発明は、改変ウレアーゼを有するが、なお持続性が低下された感染が可能であるＨ．ピロリに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター・ピロリは、世界中で何十億人もの胃粘膜に慢性的に感染し、その１０％以上に消化性潰瘍疾患を引き起こすほか、ヒト集団で最も頻繁に見られる致死的悪性腫瘍の１つである胃癌の早期重大危険因子にも関係すると考えられる（非特許文献１）。しかし、Ｈ．ピロリがコロニー形成を確立及び維持するメカニズムは依然として十分に理解されていない。これらのメカニズムが十分に理解されていない間は、Ｈ．ピロリに対する有効なワクチンの開発は困難である。さらに、弱毒化されたＨ．ピロリをペプチドの生物学的送達媒体として使用することは、依然として実現が難しい。
【０００３】
Ｈ．ピロリのコロニー形成に不可欠な第１の特徴的因子（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ）はウレアーゼで、これはヒトが代謝老廃物として排出する尿からアンモニア及びカーボネートを生成することによってＨ．ピロリの直近環境の酸性を低下させる豊富な酵素である（非特許文献２；非特許文献３）。かかるｐＨの局所的制御は不可欠と考えられるが、ウレアーゼ陰性のＨ．ピロリ株は、酸分泌が抑制された子ブタへのコロニー形成が不可能であることが明らかにされている（非特許文献４）。
【０００４】
より有効なＨ．ピロリのワクチン株又は生物学的媒体として使用できる株を作製するために、本発明者らは、ウレアーゼ安定性及びＨ．ピロリの宿主相互作用に対する十二量体表面の寄与を研究した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ
【非特許文献２】Ｍａｒｃｕｓ  ＆  Ｓｃｏｔｔ，２００１，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ，６（２），９３−９９
【非特許文献３】Ｈｕ  ＆  Ｍｏｂｌｅｙ，１９９０，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８（４），９９２−９９８
【非特許文献４】Ｅａｔｏｎ  ＆  Ｋｒａｋｏｗｋａ，１９９４，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２（４），９９２−９９８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＵｒｅＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＤ０７１４３．１；配列番号１）の約アミノ酸５２９〜約アミノ酸５５５の領域が、ヘリコバクター・ピロリの持続性感染確立能力を、ウレアーゼ活性に影響することなく制御することを明らかにした。
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様において、本発明は、持続性感染を確立又は維持できない遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを産生するように配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列が変更された機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５のアミノ酸配列は、欠失、突然変異又は挿入によって変更される。当該変更は、保存的又は非保存的アミノ酸変化を含んでもよい。  
【０００９】
いくつかの実施形態において、変更されるアミノ酸は配列番号１の５４７、５４８及び５４９からなる群より選択される。好ましくは、前記アミノ酸変更は、配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列への１つ又はそれ以上の  アミノ酸のインフレーム挿入を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、前記挿入は、１０〜１００のアミノ酸を含む。好ましくは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８，８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９〜１００の  アミノ酸である。最も好ましくは、約２０〜約５０のアミノ酸である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリは、少なくとも１つの  異種抗原又はその機能的断片をコードする１つ又はそれ以上の核酸分子をさらに含むであろう。前記核酸分子は染色体外に存在してもよく、又は好ましくは配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列への挿入を含むであろう。いくつかの実施形態において、前記挿入はアミノ酸５４９と５５０の間である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、異種抗原又はその機能的断片は、病原微生物に由来するであろう。好ましくは、前記病原微生物は、ウイルス、細菌、原虫及び真菌からなる群より選択されるであろう。
【００１３】
いくつかの実施形態において、前記異種抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ＨＴＬＶ  抗原、ＳＩＶ抗原、ＲＳＶ抗原、ＰＩＶ抗原、ＨＳＶ抗原、ＣＭＶ抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ライノウイルス抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、ノーウォークウイルス抗原、トガウイルス抗原、アルファウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、エボラウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、コロナウイルス抗原、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）抗原、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）抗原、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｔｅ）抗原、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）抗原、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）抗原、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗原、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）抗原、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）抗原、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）抗原、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）抗原及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）抗原からなる群より選択される。
【００１４】
第２の態様において、本発明は、持続性感染及び薬学的に許容可能な担体を確立することができない遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを産生するように配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列が変更された機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを含む免疫原性組成物を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、前記免疫原性組成物はアジュバントをさらに含む。
【００１６】
第３の態様において、本発明は、機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ及び薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物を免疫学的に有効な量投与する工程を含む、哺乳類を病原微生物感染から保護する方法を提供し、その際前記ウレアーゼは持続性感染を確立することができない遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを産生するように配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列が変更される。
【００１７】
第４の態様において、本発明は、改変されたウレアーゼのＵｒｅＢサブユニットを産生するように配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列を変更する工程を含み、その際前記ウレアーゼは脱酸機能を保持するが、前記ヘリコバクター・ピロリは持続性感染を確立することができない、ヘリコバクター・ピロリの持続性感染確立能力を制御する方法を提供する。
【００１８】
第５の態様において、本発明は、持続性感染を確立することができない遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを産生するように配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列が変更された機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを哺乳類に投与する工程を含む、前記哺乳類にヘリコバクター・ピロリ感染の予防接種を行う方法を提供する。
【００１９】
第６の態様において、本発明は、哺乳類の予防接種に使用するための免疫原性組成物であって、持続性感染を確立することができない遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを産生するように配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列が変更された機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ及び薬学的に許容可能な担体を含む前記組成物を提供する。
【００２０】
いくつかの態様において、異種抗原は、プラスミドベクターであって（ａ）異種抗原をコードするヌクレオチド配列及び（ｂ）前記ベクターが本発明の改変ヘリコバクター・ピロリに形質転換されたときにヌクレオチド配列の発現を制御することができる、そこに機能的に連結した制御又は調節配列を含むプラスミドベクターに存在するであろう。
【００２１】
本発明に包含される哺乳類の非限定例は、霊長類、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ及びげっ歯類である。
【００２２】
特定の種類及び比率のヘリコバクター・ピロリ、プラスミドベクター及び本明細書に記載のその他の送達機構、並びにその本文が参照により本明細書に明確に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されているもののような、処方技術分野で当業者に既知の処方技法を所与として、本組成物の種々の送達形態は、本発明の実施に使用するために容易に調製される。
【００２３】
第７の態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列の機能に影響することができる作用剤を哺乳類に投与する工程を含む、前記哺乳類のヘリコバクター・ピロリ感染持続を防止する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ウレアーゼの組換え領域及び酵素機能の選択。ａ）ウレアーゼ表面の挿入サイトを示す、ウレアーゼの分子構造。ウレアーゼサブユニットＡ（緑）及びサブユニットＢ（青）が会合して十二量体の超分子を生成する（Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ，８（６），５０５−５０９；Ｐｉｎｋｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，３８（３），３１５−３２０）。挿入サイト１、３、４、及び８は赤色で示されている。サイト２、５、６、及び７（ピンク）で変更された場合はウレアーゼ活性を保持することができない。ｂ）ウレアーゼ基質の尿素を添加した酸性培地上で機能的ウレアーゼを産生する細菌の選択。左側で観察される色の変化は、細菌コロニーが機能的ウレアーゼを産生し、生育していたことを示す（Ｘ４７  野生型）。右側では色の変化は起こっておらず、機能的ウレアーゼが産生されていないために播種されたコロニーが生育できなかったことを示す（Ｘ４７  ΔｕｒｅＡ）。
【図２】組換え型ウレアーゼ活性及び酸安定性。ａ）サイト１、３、４又は８におけるＨ．ピロリ産生ウレアーゼ組換え体のウェスタンブロット解析。レーン１：マーカー（ＭＷ：ＫＤａ表示）；レーン２：Ｘ４７（サイト１）；レーン３：Ｘ４７（サイト３）；レーン４：Ｘ４７（サイト４）；レーン５：Ｘ４７（サイト８）。組換え型ウレアーゼはＵｒｅＡ（レーン２及び３）又はＵｒｅＢ（レーン４及び５）に対する抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出された。ｂ）野生型又は組換え型ウレアーゼを発現する透過処理細菌の、尿素存在下、ｐＨ３でのインキュベーション後に酸を中和する能力。野生型及び組換え型ウレアーゼの酸安定性及び活性を測定するため、ウレアーゼ活性を測定する前に細菌をｐＨ３で０、２又は１０分間インキュベーションした。プレインキュベーションの後、ｐＨを中和し、基質として尿素を添加し、フェノールレッドの色変化によって指示されるｐＨの変化によってウレアーゼ活性を測定した。ｐＨ３におけるプレインキュベーションとは無関係なウレアーゼ活性の大幅な低下は“＊”で注記した。（学生のＴ検定、両側、等分散）。ＳＥＭ表示（ｎ＝３）。
【図３】組換え型ウレアーゼの細菌コロニー形成への影響。ａ）コロニー形成のパーセンテージとして表した１５カ月の持続性（ｎ＝５〜１５）。ｂ）組換え型ウレアーゼを発現するＨ．ピロリに感染したマウスの１５カ月後のコロニー形成レベル（ｎ＝５；中央値を表示）。ｃ）抗Ｈ．ピロリＩｇＧレベルによって示された組換え型ウレアーゼ発現Ｈ．ピロリの持続性（ｎ＝１２〜２０；中央値を表示）。菌株は、ウレアーゼのサイト１、４又は８のいずれかにおける組換え体。ｄ）野生型ウレアーゼを発現するＸ４７（Ｘ４７（ｗｔ））、又はサイト８におけるウレアーゼ組換え体（Ｘ４７（サイト８））の３カ月間のマウスコロニー形成の結果得られた抗Ｈ．ピロリＩｇＧ及び抗ＵｒｅＢ  ＩｇＧレベルの比較（ｎ＝１０〜２０；中央値を表示）。
【図４】組換え型ウレアーゼは、マウスコロニー形成細菌内で安定である。抗ＦＬＡＧでプローブした、１０カ月のコロニー形成後のマウスから抽出したＨ．ピロリのウェスタンブロット解析。記述される場合、各レーンは、個々のマウスから採取した細菌のプールから抽出したタンパク質を表す。ａ）レーン１〜３：個々のマウスからのＸ４７（ｗｔ）のプール；レーン４：分子サイズマーカー（ＭＷ：ＫＤａを表示）；レーン５：Ｘ４７（サイト１）；レーン６：Ｘ４７（サイト４）；レーン７：Ｘ４７（サイト８）。ｂ）レーン１〜５：個々のマウスからのＸ４７（サイト１）のプール；レーン７：分子サイズマーカー；レーン８：Ｘ４７（サイト１）。ｃ）レーン１〜５：個々のマウスからのＸ４７（サイト４）のプール；レーン７：分子サイズマーカー。ｄ）レーン１〜３：個々のマウスからのＸ４７（サイト８）のプール；レーン５：分子サイズマーカー；レーン６：Ｘ４７（サイト８）。タンパク質試料の完全性を確認するため、野生型Ｘ４７及びＦＬＡＧ発現が検出されなかったマウスからのＸ４７（サイト１）のプールでウレアーゼ発現を確認した（＊で注記；データ非表示）。標準的なタンパク質の分子（ＫＤａ）を、マーカーのすぐ隣に示す。
【図５】エピトープ及びリンカーをコードするＤＮＡのウレアーゼ遺伝子座における挿入サイトを示す模式図。挿入は、ＵｒｅＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＤ０７１４４．１；配列番号３）のアミノ位置１０２（サイト１）及び２３８（サイト３）、並びにＵｒｅＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＤ０７１４３．１  配列番号１）のアミノ酸位置１（サイト４）及び５４９（サイト８）の後の挿入に対応するＤＮＡで行われた。サイト３及び４における挿入は、それぞれＵｒｅＡ及びＵｒｅＢのＣ及びＮ末端に対応する。ＤＮＡのコードは、ＨＡ（Ｔ）：ヘマグルチニンＴ細胞エピトープ；ＨＡ（Ｂ）ヘマグルチニンＢ細胞エピトープ；ＳＲリンカー：セミランダムリンカー；リンカー：ＧＰＳＬリンカー；ＦＬＡＧ：ＦＬＡＧエピトープ；ＳＴＯＰ：終結コドンであった。
【図６】サイト８領域におけるウレアーゼの保存を示す配列比較。結晶構造を決定した（ＰＤＢｅ  Ｅｎｔｒｙ：１ｅ９ｙ）サイト８領域におけるＨ．ピロリＵｒｅＢ（ｓｐ｜Ｐ６９９９６；配列番号２３）及び異なる種からのウレアーゼの配列比較。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号を表示。
【００２５】
配列の簡単な説明  
【００２６】
以下の核酸及びアミノ酸配列は、本発明の記述全体を通して参照される。
【００２７】
配列番号１−ヘリコバクター・ピロリ由来ウレアーゼのＵｒｅＢサブユニットのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＤ０７１４３．１）；
【００２８】
配列番号２−ヘリコバクター・ピロリ由来ウレアーゼのＵｒｅＢサブユニットをコードするヌクレオチド配列；
【００２９】
配列番号３−ヘリコバクター・ピロリ由来ウレアーゼのＵｒｅＡサブユニットのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＤ０７１４４．１）；
【００３０】
配列番号４−ヘリコバクター・ピロリ由来ウレアーゼのＵｒｅＡサブユニットのヌクレオチド配列；
【００３１】
配列番号５−プライマー  ＵＦ５−２３４
【００３２】
配列番号６−プライマー  ＵＲ２−２３４
【００３３】
配列番号７−プライマー  ＵＲ２−５６
【００３４】
配列番号８−プライマー  ＵＦ５−５６
【００３５】
配列番号９−プライマー  ｒｐｓＬ−Ｆ
【００３６】
配列番号１０−プライマー  ｅｒｍＲ
【００３７】
配列番号１１−プライマー  ｓｉ１ａＦ３
【００３８】
配列番号１２−プライマー  ｓｉ３Ｆ３
【００３９】
配列番号１３−プライマー  ｓｉ４Ｆ３
【００４０】
配列番号１４−プライマー  ｓｉ８Ｆ３
【００４１】
配列番号１５−プライマー  ＨＡＦＬＡＧ
【００４２】
配列番号１６−プライマー  ＨＡＦＬＡＧ（ｒｃ）
【００４３】
配列番号１７−プライマー  ＵＦ１
【００４４】
配列番号１８−プライマー  ＵＲ６
【００４５】
配列番号１９−プライマー  ｓｉ１ａＲ１
【００４６】
配列番号２０−プライマー  ｓｉ３Ｒ１
【００４７】
配列番号２１−プライマー  ｓｉ４Ｒ１
【００４８】
配列番号２２−プライマー  ｓｉ８Ｒ１
【００４９】
配列番号２３−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｐ６９９９６）
【００５０】
配列番号２４−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｐ４２８２３）
【００５１】
配列番号２５−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ９３ＰＪ４）
【００５２】
配列番号２６−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ１７ＹＪ８）
【００５３】
配列番号２７−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ４ＣＨＥ３）
【００５４】
配列番号２８−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ９ＫＧ５９）
【００５５】
配列番号２９−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ０７３９７）
【００５６】
配列番号３０−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ１ＸＬＳ１）
【００５７】
配列番号３１−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ５ＫＹＭ１）
【００５８】
配列番号３２−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ５ＦＢ２３）
【００５９】
配列番号３３−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜ＱＯＶＫＹ１）
【００６０】
配列番号３４−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ７３３Ｊ６）
【００６１】
配列番号３５−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ２ＪＱ８８）
【００６２】
配列番号３６−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ４ＩＸＤ２）
【００６３】
配列番号３７−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜０５２３０５）
【００６４】
配列番号３８−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ２１Ｐ９４）
【００６５】
配列番号３９−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｐ７３０６１）
【００６６】
配列番号４０−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ２ＳＹＦ７）
【００６７】
配列番号４１−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ１ＦＸ０９）
【００６８】
配列番号４２−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ０５ＰＱ２）
【００６９】
配列番号４３−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ１１ＥＷ４）
【００７０】
配列番号４４−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜ＱＯＡＣ９８）
【００７１】
配列番号４５−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜ＡＯＦＷＹ４）
【００７２】
配列番号４６−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ８ＤＭＶ６）
【００７３】
配列番号４７−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ２ＳＤＱ１）
【００７４】
配列番号４８−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ５ＬＳＱ２）
【００７５】
配列番号４９−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ２ＢＬＣ２）
【００７６】
配列番号５０−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ１６１Ｓ８）
【００７７】
配列番号５１−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ４６ＩＹ３）
【００７８】
配列番号５２−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜０３０３３７）
【００７９】
配列番号５３−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ８ＸＸＴ１）
【００８０】
配列番号５４−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｐ７７８３７）
【００８１】
配列番号５５−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ３ＫＩＴ２）
【００８２】
配列番号５６−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ａ０Ｌ６Ｆ２）
【００８３】
配列番号５７−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ３１Ｂ４９）
【００８４】
配列番号５８−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ９Ｚ３６９）
【００８５】
配列番号５９−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ１ＹＵＢ５）
【００８６】
配列番号６０−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ２ＺＧＴ０）
【００８７】
配列番号６１−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ａ０ＪＲＨ４）
【００８８】
配列番号６２−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ７Ｖ１Ｂ６）
【００８９】
配列番号６３−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ０ＬＦＪ０）
【００９０】
配列番号６４−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ１ＦＪ３９）
【００９１】
配列番号６５−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ４７Ｇ５５）
【００９２】
配列番号６６−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ８ＹＱＺ０）
【００９３】
配列番号６７−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ９ＲＹＪ４）
【００９４】
配列番号６８−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ３Ｊ７７０）
【００９５】
配列番号６９−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ０ＦＱＸ６）
【００９６】
配列番号７０−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｐ４２８８５）
【００９７】
配列番号７１−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｓｐ｜Ｑ７Ｖ３Ｖ２）
【００９８】
用語の定義  
【００９９】
本明細書で使用するとき、特定の用語は以下の明確な意味を有する場合がある。本明細書及び特許請求の範囲において使用するとき、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、状況が明らかに別のものを指示しない限り複数への言及を包含する。たとえば「細胞」という用語は、その混合物を含めた複数の細胞を包含する。同様に、本明細書に記載される処置又は薬物調製のための「化合物」の使用は、状況が明らかに別のものを指示しない限り、本発明の化合物の１つ又はそれ以上をかかる処置又は調製に使用することを意図する。
【０１００】
本明細書で使用するとき、「含む」は、その組成物及び方法が列挙された要素を包含するが、他を排除するものではないことを意味することを意図する。「から本質的になる」は、組成物及び方法を定義するために使用されるとき、その組合せにとって本質的に重要な他の要素を排除することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、単離及び精製方法からの微量混入物、並びにリン酸緩衝生理食塩水及び保存料等のような薬学的に許容可能な担体を排除しない。「からなる」は、他の成分の微量を超える要素及び本発明の組成物を投与するための実質的方法の工程を除外することを意味するものとする。これらの遷移用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１０１】
ヘリコバクター・ピロリの菌株は、それが機能的ウレアーゼ遺伝子を有する限り、すべて本願の範囲に含まれる。特に好ましいヘリコバクター・ピロリの菌株としては、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）にてＡＴＣＣ寄託番号：４３５０４；４３５０４Ｄ−５；４３５２６；４３５７９；４３６２９；４９３９６；４９５０３；５１１１０；４９５０３；５１１１１；５１４０７；５１６５２；５１６５３；５１９３２；及び５３７２７で寄託されている菌株が挙げられる。さらに、たとえば、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４５９，０４１号も参照。他の好ましいヘリコバクター・ピロリの菌株としては、オーストラリア国立計測標準研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に寄託番号Ｖ０９／００９１０１；Ｖ０９／００９１０２；Ｖ０９／００９１０３；Ｖ１０／０１４０５９；Ｖ１０／０１４０６０及びＶ０９／００９１０４で寄託されている菌株が挙げられる。
【０１０２】
本明細書で使用するとき、用語「単離された」は、あるヘリコバクター・ピロリ細胞、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、該ヘリコバクター・ピロリ細胞、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが天然に存在する環境とは異なる環境にあることを表すことを意味する。単離された遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ細胞は、ヘリコバクター・ピロリ細胞の混合固体群の中に存在してもよい。
【０１０３】
「遺伝子改変（された）」ヘリコバクター・ピロリとは、その表現型及び／又は遺伝子型が、ヘリコバクター・ピロリに存在するウレアーゼ遺伝子への変更を含む点で、対応する野生型ヘリコバクター・ピロリのそれと異なるヘリコバクター・ピロリ細菌を指す。遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリは、一方でウレアーゼ活性を維持するが、他方で持続感染を確立するために必要な要素は「ノックアウト」又は「変更」される。ヘリコバクター・ピロリの遺伝子改変方法は当該技術分野において周知である；たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１），“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ参照。
【０１０４】
ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼをコードする遺伝子は、記載及び配列決定されている（Ｌａｂｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３：１９２０−１９３１）。ウレアーゼ発現及び分泌に関与する７つの遺伝子のうち、２つの遺伝子のみが、ウレアーゼ酵素の２つの構造的サブユニットであるウレアーゼＡ及びＢをコードする；ｕｒｅＡ（配列番号３）及びｕｒｅＢ（配列番号１）。これらの２つのポリペプチドは、ウレアーゼ活性を有するポリペプチド複合体を形成する。
【０１０５】
ウレアーゼ活性は、多数の方法で測定できる。たとえば、ウレアーゼは尿素を炭酸アンモニウムに変換し、続いて炭酸アンモニウムはアンモニアと二酸化炭素に分解することが知られている。その結果、従来、ヘリコバクター・ピロリの存在を検出する１つの試験は、胃物質の試料を尿素及び指示薬（すなわちｐＨが上昇すると色が変化するｐＨ指示薬）を含有する組成物に接触させる工程を包含した。ウレアーゼが胃物質中に存在する場合、それは尿素に分解し、その結果さらなる分解後にアンモニアが生成し、ｐＨ指示薬の色変化が起こる。ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ活性は、被験者に尿素を経口投与し、その後吐き出される二酸化物及びアンモニアを観測することによっても検出できる。ウレアーゼ活性の種々の試験が、米国特許第４，７４８，１１３号及び米国特許出願第２００３００８２６６４に記載されており、これらを参照により本願に組み込む。
【０１０６】
用語「機能的断片」は、本明細書でウレアーゼを参照して使用されるとき、尿素を炭酸アンモニウムに変換する能力を依然として有する、ヘリコバクター・ピロリ・ウレアーゼの任意の断片を指す（すなわち、天然物と比較してサイズ縮小又は切断された分子）。ウレアーゼ又はその機能的断片の尿素を炭酸アンモニウムに変換する能力の測定は、これに関連して、定性的及び定量的（すなわち、数量化可能な測定として）のいずれでも行ってもよい。
【０１０７】
用語「核酸」は、本明細書で使用するとき、任意の長さの高分子形態のヌクレオチドを指し、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、又は多重鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー又はその他の天然、化学的若しくは生物化学的に修飾された、非天然、又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を包含するがこれらに限定するものではない。
【０１０８】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書で互換可能に使用され、任意の長さの高分子形態のアミノ酸を指し、コード化及び非コード化アミノ酸、化学的若しくは生物化学的に修飾された又は誘導体化されたアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを指す。
【０１０９】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の「相同性（類似性）」は、１９９０年のＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８，１９９０）をＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）のように修正して、用いて決定される。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）に組み込まれている。本発明の核酸分子に類似したヌクレオチド配列を得るには、ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索が、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて、スコア＝１００、ワード長＝１２で行われる。参照ポリペプチド（たとえば、配列番号２）に類似したアミノ酸配列を得るには、ＢＬＡＳＴタンパク質探索が、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて、スコア＝５０、ワード長＝３で行われる。比較の目的で、ギャップが存在する配列比較を得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように、ギャップＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）プログラムが用いられる。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、各プログラム（たとえば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期値パラメータが用いられる。これらはワールドワイドウェブのＵＲＬ”ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ”でおそらく見ることができる。
【０１１０】
本明細書で使用するとき、用語「外因性核酸」は、通常又は天然ではヘリコバクター・ピロリ中に存在しない及び／又は天然ではヘリコバクター・ピロリによって産生されない核酸を指す。本明細書で使用するとき、用語「内因性核酸」は、通常ヘリコバクター・ピロリ中に存在する及び／又は天然にヘリコバクター・ピロリによって産生される核酸を指す。「内因性核酸」は「未変性核酸」又はヘリコバクター・ピロリに「天然の」核酸とも呼ばれる。
【０１１１】
用語「異種核酸」は、本明細書で使用するとき、次のうち少なくとも１つに当てはまる核酸を指す：（ａ）その核酸が、ヘリコバクター・ピロリにとって異物（「外因性」）である（すなわち、天然でその中に見出されない）；（ｂ）核酸が、ヘリコバクター・ピロリ中に天然に見出される（たとえば、内因性の）ヌクレオチド配列を含む（たとえば、核酸がヘリコバクター・ピロリに内在するヌクレオチド配列を含む）が、不自然な（たとえば、予想を超える又は天然に見出されるよりも多い）量で細胞内に産生される、又は内因性ヌクレオチド配列と配列が異なり、その結果内在的に見られるのと同じコードされたタンパク質（同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を有する）が不自然な（たとえば、予想を超える又は天然物で見られるよりも多い）量で細胞内に産生される；（ｃ）核酸が天然において互いに同じ関係では見出されない、たとえば核酸が組換え型であるヌクレオチド配列又はセグメントを２つ又はそれ以上含む。
【０１１２】
「組換え型」は、本明細書で使用するとき、特定の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が、天然系で見られる内因性核酸と区別できる構造的コード又は非コード配列を有するコンストラクトを生じるクローニング、制限、及び／又はライゲーション工程の種々の組合せの産物であることを意味する。一般的に、構造的コード配列をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片及び短いオリゴヌクレオチドリンカーから、又は一連の合成オリゴヌクレオチドから、細胞中又は無細胞転写翻訳系に含有される組換え転写単位から発現できる合成核酸を提供するように組み立てることができる。かかる配列は、一般的に真核生物遺伝子に存在する内部非翻訳配列すなわちイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供されうる。関連する配列を含むゲノムＤＮＡは、組換え遺伝子又は転写単位の形成にも使用されうる。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’又は３’に存在してもよく、そこではかかる配列はコード領域の操作又は発現に干渉せず、実際に様々なメカニズムによって所望の産物の産生を調節するように作用する可能性がある。
【０１１３】
したがって、たとえば、「組換え型」ポリヌクレオチド又は「組換え型」核酸という用語は、天然に存在しない、たとえば、そうでなければ分離されている２つの配列セグメントのヒトの介入による人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせはしばしば、化学合成手段によって、又は単離された核酸セグメントの人工的な操作によって、たとえば遺伝子工学的技法によって達成される。これは通常、典型的には配列認識部位を導入又は除去しながら、あるコドンを同じ又は保存的アミノ酸をコードする冗長なコドンで置き換えるために行われる。又は、望ましい機能の組み合わせを生成するように所望の機能の核酸セグメントを互いに連結させることが行われる。この人工的な組み合わせはしばしば、化学合成手段によって、又は単離された核酸セグメントの人工的な操作によって、たとえば遺伝子工学的技法によって達成される。
【０１１４】
同様に、用語「組換え型」ポリペプチドという用語は、天然に存在しない、たとえばそうでなければ分離されている２つのアミノ配列のセグメントのヒトの介入による人工的な組み合わせによって作製されるポリペプチドを指す。したがって、たとえば異種アミノ酸配列を含むポリペプチドは組換え型である。
【０１１５】
「ベクター」とは、特異的ヌクレオチド配列の発現及び／又は増殖を目的として生成された、又は他の組換え型ヌクレオチド配列の構築のために用いられる、組換え型核酸、一般的に組換え型ＤＮＡを意味する。
【０１１６】
用語「ＤＮＡ調節配列」、「制御因子」、及び「調節因子」は、本明細書において互換的に用いられ、ヘリコバクター・ピロリ細胞内でコード配列の発現及び／又はコードされるポリペプチドの産生を提供及び／又は調節するプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル等のような転写及び翻訳制御配列を指す。
【０１１７】
用語「形質転換」は、本明細書において「遺伝子改変」と互換的に用いられ、新しい核酸の導入後にヘリコバクター・ピロリ細胞において誘導される永続的又は一過性の遺伝的変化を指す。遺伝的変化（「改変」）は、ヘリコバクター・ピロリ細胞のウレアーゼ遺伝子への新しいＤＮＡの取り込みによって、又は組換え型ヘリコバクター・ピロリ細胞におけるその維持を補佐するために１つ又はそれ以上の選択可能なマーカーを含有してもよいプラスミド又は発現ベクターのようなエピソーム因子としての新しいＤＮＡの一過性若しくは安定な維持によってのいずれかで達成できる。遺伝子改変に適した方法には、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、電気穿孔、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション等が含まれる。これらの方法に関する一般的な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５に見ることができる。
【０１１８】
「核酸配列の形質転換」は、本明細書で使用するとき、プラスミドベクター、又は抗原をコードする核酸配列を含有するその他の発現カセットを意味する。本発明のいくつかの実施形態において、核酸配列は１つ又はそれ以上の抗原をコードすることができる。「核酸配列の形質転換」は、本発明の特定の実施形態にしたがい、「導入遺伝子」を意味するためにも使用できる。本発明の別の実施形態において、核酸配列の形質転換は、プロモーター及び／又はその他の調節因子のコードのための核酸配列を包含する。
【０１１９】
「機能的に連結されている」とは、そのように記述された成分がその意図される様式で機能することを許容する関係で並置されていること指す。たとえば、プロモーターがその転写又は発現に影響を及ぼす場合、そのプロモーターはコード配列に機能的に連結されている。本明細書で使用するとき、「異種プロモーター」及び「異種制御領域」は、天然では特定の核酸に通常結合していないプロモーター及び他の制御領域を指す。たとえば、「コード領域に対して異種である転写制御領域」は、天然ではコード領域に通常結合していない転写制御領域である。
【０１２０】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。たとえば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンからなり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンからなり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリジン、アルギニン、及びヒスチジンからなり；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。
【０１２１】
本発明の遺伝子改変Ｈ．ピロリは持続性感染を確立又は維持することができない。「持続性感染」とは、免疫応答の誘導後も感染哺乳類からＨ．ピロリが除去又は排除されない感染である。持続性感染は、慢性感染又は潜在性感染となりうる。潜在性感染は、実証可能な感染性Ｈ．ピロリが存在しないことを特徴とする。慢性感染は、一次感染後にＨ．ピロリが存在し続けることを特徴とする。急性感染は比較的短期間（数日〜数週間続く）で、免疫系によって身体から分離されるが、持続性感染は、たとえば数カ月、数年、又は生涯にさえわたって続く可能性がある。これらの感染は、長期間にわたって頻繁に再発する可能性もあり、細胞死滅又は宿主細胞への過度の損傷も生じることなく、無症状感染及び増殖性感染の段階を伴う。持続性感染はしばしば、宿主細胞を急速に殺すことなく、又は宿主細胞の過度の損傷も生じることなく、無症状感染及び増殖性感染の両方の段階を伴う。通常、Ｈ．ピロリ感染の急性期は約１０〜１４日間持続し、慢性感染は約３カ月後に確立され、生涯にわたるコロニー形成又は持続につながると考えられる。したがって、本発明において、本発明の遺伝子改変Ｈ．ピロリは初期感染を確立することができるが、この感染は、生涯残存する可能性のある野生型ヘリコバクター・ピロリへの感染と比較して、約１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２カ月を超えて残存しない。
【０１２２】
「ワクチン組成物」、「ワクチン」、「免疫原性組成物」、及び類似の用語は、哺乳類に投与したきに当該細菌が哺乳類の体内でヘリコバクター・ピロリ内に発現した抗原に対する免疫応答を誘導し、それによって、抗原が単離された生物に対する少なくとも部分的な防御免疫を提供するような、少なくとも１つの抗原を発現する生きた遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリの菌株を含む組成物を指す。かかる防御免疫は、種々の観察可能又は検出可能な状態によって証明され、その例としては、これらに限定されるものではないが、１つ又はそれ以上の病徴の減少、疾病持続期間の短縮、組織損傷の減少、健康な組織の再生、哺乳類からの病原微生物の除去、当該哺乳類による幸福感の増大が挙げられる。非常に望まれることであるが、ワクチンを投与したあらゆる個人で疾患からの完全な防御を誘導すると期待されるワクチンはないこと又は防御免疫はワクチン組成物の定期的な「追加免疫」投与を行うことなく個人の生涯にわたって持続することが期待されることは、当業者に理解される。本明細書に記載の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを含む生ワクチンは、疾患の症状は現れていないが感染の危険があると考えられる個人、又はたとえば感染哺乳類、汚染された空気、液体若しくは表面への接近若しくは接触によってすでに疾患に暴露したことが知られている個人に、医療専門家の判断で投与されてもよいことも理解される。
【０１２３】
本発明の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリ又は本明細書に記載のように前記Ｈ．ピロリによって発現される抗原の「治療的に有効な量」は、所望の応答を誘導するのに有効であるが中毒反応を引き起こすには不十分な量を含むと理解される。所望の応答は、たとえば、血液試料において、十分な及び／又は許容可能な検出可能な抗体価レベルの形成を構成してもよい。哺乳類に投与される調剤の投与量及び処置持続時間は、処置が必要な哺乳類被験者を担当する医療専門家によって決定され、被験者の年齢、性別及び体重、並びに発現されている特定のヘリコバクター・ピロリ及び核酸分子が考慮されるであろう。
【０１２４】
用語「経口」、「経腸」、「経腸的」、「経口的」、「非腸管外」及び「非腸管外的」等は、消化管に沿った経路又は方法による、哺乳類への本発明の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリの投与を指す。ワクチン組成物の投与の「経口」経路の例としては、これらに限定されるものではないが、口からの液体又は固体形態のワクチン組成物の嚥下、経鼻空腸管又は胃瘻管を介するワクチン組成物の投与、ワクチン組成物の十二指腸内投与、及びたとえば本明細書に記載の細菌性生ワクチン株を消化管の下部消化管に放出する坐薬を用いる直腸投与が挙げられる。
【０１２５】
用語「抗原に対して免疫寛容を誘導する」は、哺乳類の免疫応答関連疾患の治療を目的とした粘膜送達用の薬物、病人用特別食又は栄養補助食品の調製のための、抗原を分泌する単離された遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリによる抗原の粘膜送達を含み、その際前記抗原は好ましくは前記哺乳類中に継続的に存在する。
【０１２６】
「異種」抗原は、ヘリコバクター・ピロリに天然ではない抗原、すなわち、天然に又はヘリコバクター・ピロリへの導入の前にヘリコバクター・ピロリによって発現されない抗原である。
【０１２７】
本明細書で使用するとき、「検出可能な免疫応答」は、抗原に応答して哺乳類内で形成される抗体（液性）又は細胞傷害（細胞性）応答のいずれかであり、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）、免疫蛍光測定法（ＩＦＡ）、補体結合測定法（ＣＦ）、ウェスタンブロット（ＷＢ）又はそれらの同等物を含むがこれらに限定されない日常的実験室法を用いて測定することができる。
【発明を実施するための形態】
【０１２８】
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、具体的に例示された方法に限定されるものでなく、当然、変化してもよいことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、本発明の具体的な実施形態を記述することのみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される範囲を制限することを意図しないことも理解されるべきである。
【０１２９】
本明細書において引用されている全ての刊行物、特許及び特許出願は、上記か下記かを問わず、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ただし、本明細書に記載の刊行物は、当該刊行物に報告された及び本発明に関連して使用される可能性のあるプロトコル、試薬及びベクターを記述及び開示する目的で引用され、先行発明を理由として、本発明がかかる開示に先行する権利がないことを承認すると解されるべきではない。
[0001]
さらに、本発明の実施は、特記のない限り、製薬学、分子生物学（組換え技法を含む）、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来技法を当業者の技能範囲内で利用する。かかる技法は当業者に周知であり、文献に十分に説明されている。たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”（１９９９）Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ及びＩＩ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ＆  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）（２００１）；及びＢａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｏｌｌｉｓ，Ｄ．Ｆ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，１９８６；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌｓ）“Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；及び“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）を参照。
【０１３０】
最も広い態様において、本発明は単離された遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを提供する。いくつかの実施形態において、前記ヘリコバクター・ピロリは、Ｈ．ピロリに慢性感染した哺乳類被験者から採取した臨床試料から最初に単離される。続いて、ウレアーゼｕｒｅＢ遺伝子（配列番号１）が、欠失、突然変異又は挿入によって改変され、その結果前記ウレアーゼは機能性、すなわち尿素を炭酸アンモニウムに変換する能力を維持し、前記炭酸アンモニウムはその後アンモニア及び二酸化炭素に分解する。
【０１３１】
改変されるウレアーゼの領域は、ＵｒｅＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＤ０７１４３．１；配列番号１）の約アミノ酸５２９〜約アミノ酸５５５である。いくつかの実施形態において、前記領域は５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４及び５５５の間である。いくつかの実施形態において、変更されるアミノ酸は、配列番号１の５４７、５４８及び５４９からなる群より選択される。
【０１３２】
変更は、オリゴヌクレオチド媒介性（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発のような当該技術分野で既知の方法を用いて行うことができる。部位特異的突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１；Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７）、カセット突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５），Ｇｅｎｅ，３４：３１５）、制限部位選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６），Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５）又は他の既知の手法を、クローニングされたＤＮＡに対して行うことにより、ウレアーゼ変異型ＤＮＡを生成することができる。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、ヘリコバクター・ピロリの単離株から得たゲノムＤＮＡは、その形質転換性を評価するために、適切なシャトルベクター、たとえば選択可能なマーカー（たとえば抗生物質マーカー）を有するシャトルプラスミドに挿入される。広義には、適切なシャトルベクターは、クローニング部位、ヘリコバクター・ピロリ複製起点、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、及び抗生物質耐性遺伝子並びに／又は選択可能なマーカーという特徴の１つ、２つ、３つ又はそれ以上を包含するであろう。この目的に適した、又はこの目的に容易に適応できる当該分野で既知のベクターとしては、たとえば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖ  Ｍｉｒｃｏｂｉｏｌ．，５４：２６８−２７０（１９８８））が記載した組換えシャトルプラスミドｐＨＲ１０６；Ｂａｎｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｓｍｉｄ，２９：２３３−２３５（１９９３））が記載したＰＪＩＲ７５０及びＰＪＩＲ７５１プラスミド；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｓｍｉｄ，３１，３１７−３１９（１９９４））のプロモーターレスＰＰＳＶプロモーター選択ベクター；Ｌｙｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｓｍｉｄ，３９，１６０−１６４（１９８８））が記載したシャトルプラスミドｐＪＩＲ１４５６及びｐＪＩＲ１４５７；並びにＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，３６０−３６５（１９８９））が記載したｐＡＫ２０１シャトルベクターが挙げられ、この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ヘリコバクター・ピロリ複製起点の除去は、シャトルベクターを自殺ベクターに変換する。
【０１３４】
あるいは、相同組換えを使用して、突然変異又は外因性配列をウレアーゼ遺伝子に導入することができる。
【０１３５】
いったん変更が行われると、形質転換／形質移入、電気穿孔法、リポソーム媒介核酸転移、Ｎ−［１−（２，３−ジオロイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート媒介形質転換等の核酸転移プロトコルが使用される。当業者は、当該分野の知識及び設計選択にしたがってヘリコバクター・ピロリの遺伝子改変に適したツール及び方法を用意に選択できるであろう。  
【０１３６】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の単離された遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリによって分泌される免疫優性抗原の粘膜送達に関する。前記送達の目的は、局所的及び全身的なＴ細胞応答の抑制である。この抗原送達のアプローチは、確立された過敏症の環境においても経口免疫寛容を増強する能力がある。したがって、病原体によって引き起こされる疾患の予防（すなわち予防接種）だけでなく、自己免疫疾患及び／又はアレルギー疾患の治療にも適用できる。
【０１３７】
したがって、いくつかの実施形態において、前記アミノ酸変更は、配列番号１のアミノ酸５２９〜アミノ酸５５５の近接アミノ酸配列への１つ又はそれ以上のアミノ酸のインフレーム挿入を含み、これは１つ又はそれ以上の抗原又はその機能的断片をコードする。好ましくは、挿入はアミノ酸５４９と５５０の間である。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、挿入は１０〜１００のアミノ酸を含むであろう。好ましくは、約２０〜約５０のアミノ酸である。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、異種抗原又はその機能的断片は病原微生物に由来するであろう。好ましくは、前記病原微生物は、ウイルス、細菌、原虫及び真菌からなる群より選択される。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、異種抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ＨＴＬＶ抗原、ＳＩＶ抗原、ＲＳＶ抗原、ＰＩＶ抗原、ＨＳＶ抗原、ＣＭＶ抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ライノウイルス抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、ノーウォークウイルス抗原、トガウイルス抗原、アルファウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、エボラウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、コロナウイルス抗原、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）抗原、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）抗原、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｔｅ）抗原、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）抗原、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）抗原、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗原、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）抗原、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）抗原、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）抗原、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）抗原及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）抗原からなる群より選択される。
【０１４１】
好ましくは、抗原はヘリコバクター・ピロリの表面に示されるか又は分泌される。
【０１４２】
本発明の１つの態様において、抗原に対する免疫寛容を誘導するための方法が提供され、該方法は哺乳類の免疫応答関連疾患の治療を目的とした粘膜送達用の薬物、病人用特別食又は栄養補助食品の調製のための抗原を分泌する単離された遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリによる前記抗原の粘膜送達を含み、その際前記抗原は好ましくは前記哺乳類中に継続的に存在する。
【０１４３】
好ましくは、免疫寛容は、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ及びヒトからなる群より選択される哺乳類で誘導される。好ましくは、前記哺乳類はヒトである。好ましくは、免疫寛容は粘膜寛容である。
【０１４４】
本明細書で使用するとき、粘膜は、口腔粘膜、直腸粘膜、尿道粘膜、膣粘膜、眼粘膜、頬粘膜、肺粘膜及び鼻粘膜のようないかなる粘膜でもありうる。本明細書全体を通じて使用される粘膜送達は、粘膜への送達を包含する。経口粘膜送達は、口腔内、舌下及び歯肉経路の送達を包含する。したがって、本発明は、前記粘膜送達が、直腸送達、口腔内送達、肺内送達、眼内送達、経鼻送達、膣内送達及び経口送達からなる群から選択される方法に関するものである。好ましくは、前記粘膜送達  は経口送達であり、前記寛容は経口寛容である。
【０１４５】
本出願の全体を通じて使用する粘膜寛容は、哺乳類（ヒトを含む）が粘膜経路で抗原に暴露された後の、動物における前記抗原に対する特異的免疫応答性の阻害である。好ましくは、前記粘膜寛容は全身寛容である。抗原のその後の暴露は、非経口注射による暴露、粘膜送達による暴露、又は自己抗原の場合のような内因性産生による暴露のような、当業者に既知のそれぞれの暴露でありうる。経口寛容は、哺乳類（ヒトを含む）が経口経路で抗原に暴露された後の、前記哺乳類における抗原に対する特異的免疫応答性の阻害である。
【０１４６】
したがって本発明は、本明細書に記載される方法又は使用に関するものであり、ここで、前記免疫寛容の誘導は、前記誘導の前の少なくとも１．５倍、好ましくは２倍、より好ましくは３倍以上である。あるいは、前記抗原は、前記誘導の前の少なくとも１．５倍、２倍、又は３倍以上寛容化される。免疫寛容の誘導は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。好ましくは、前記免疫寛容の誘導は、前記動物におけるサイトカインレベルの調節により測定することができる。調節は、それ自体、サイトカインレベルの増大である可能性があり、たとえば前記サイトカインレベルの増大は、前記誘導の前の少なくとも１．５倍、２倍、又は３倍以上である（たとえばＩＬ−１０又はＴＧＦ−β）。あるいは、前記調節は、特定のサイトカインレベルのレベルの減少であり、たとえば前記サイトカインレベルの減少は、前記誘導の前の少なくとも１．５分の１、２分の１、又は３分の１以下である（たとえばＩＬ−１２、ＩＬ−１７及びＩＦＮ−γ）。調節されるサイトカインは、任意の関連するサイトカインから選択することができ、好ましくは前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＭＣＰ−１、ＴＧＦ−β、ＲＡＮＫ−Ｌ及びＦｌｔ３Ｌからなる群から選択される。
【０１４７】
本発明を、以下の非限定的実施例のみを参照することによってさらに説明する。しかし、以下の実施例は例示的なものであり、いかなる形でも本明細書に記載の発明の一般性に対する制限とみなされるべきではないことが理解されるべきである。
【実施例１】
【０１４８】
挿入による突然変異  
【０１４９】
宿主病原体相互作用におけるウレアーゼ表面の関与の可能性を試験するため、ＵｒｅＡ／ＵｒｅＢ  構造（Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．、２００１，上記）をインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で解析し、２つのエピトープタグの挿入を寛容化する可能性のある表面領域を識別した（図１ａ）。
【０１５０】
続いて、標準的なＰＣＲ技法を用いて、野生型ｕｒｅＡ又はｕｒｅＢ遺伝子ＤＮＡを、ウレアーゼ（図４）の８つのサイトにおいてセミランダムな６つのアミノ酸リンカーによってフランクされたタグ配列をコードするインフレーム挿入突然変異ＤＮＡで染色体置換することによってＨ．ピロリ突然変異株を作製した。
【０１５１】
簡単に述べると、すべてのＰＣＲ構築は、初期増幅のテンプレートとして２６６９５ゲノムＤＮＡを用いた。この研究で使用したプライマーを表１に示し、使用した組合せを表２に示す。オーバーラップＰＣＲによるスプライシングの原理は過去に報告されている（Ｓｈｅｖｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３２（２），ｅ１９）。相同組換え領域にフランクされたｒｐｓＬ．ｅｒｍＢカセット（Ｄａｉｌｉｄｉｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７２（９），５９０８−５９１４）を構築するため、３段階ＰＣＲを実施した。
【０１５２】
本研究に使用されたオリゴヌクレオチドの配列
【０１５３】
【表１】
2013532969.tif 000002
2013532969.tif 000003
2013532969.tif 000004
【０１５４】
改変ＤＮＡを作製するために使用したプライマーの組合せ
【０１５５】
【表２】
2013532969.tif 000005
2013532969.tif 000006
＊  ｍｄａＢ遺伝子座においてｒｐｓＬ．ｅｒｍＢが存在するＸ４７からのゲノムＤＮＡ
【０１５６】
段階１は、ｒｓｐＬ．ｅｒｍＢカセットの増幅、及びウレアーゼ遺伝子座における相同組換え領域のフランキングを含む。段階２は、２ｗａｙ  ＳＯＥ  ＰＣＲを用いて、いずれかのフランキング領域をｒｐｓＬ．ｅｒｍＢカセットに付加し、段階３はこれらの産物をテンプレートとして使用して、２ｗａｙ  ＳＯＥ  ＰＣＲを用いて両方のフランキング領域をｒｐｓＬ．ｅｒｍＢカセットに付加する（表２）。ＨＡ（インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４ヘマグルチニンタンパク質のａａ１５０−１５９及びａａ１１０−１２０；Ｃａｓａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０（３），１２９−１３６）及び４つのアミノ酸リンカーによって分離され、セミランダムな６つのアミノ酸リンカー及び相同組換え領域によってフランクされたＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）エピトープをコードするＤＮＡを作製するため、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（登録商標）  Ｐｆｘ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３段階ＰＣＲを実施した。段階１はフランキングリンカーの付加を含み、段階２は  ＨＡ及びＦＬＡＧエピトープの付加を含み、段階３は２ｗａｙ  ＳＯＥ  ＰＣＲを用いた相同組換えのためのフランキング領域の付加を含む（表２）。サーモサイクル条件は以下の通りである：９４℃で１５秒間、５６℃で２０秒間、６８℃で３．５分間（１０サイクル）。プライマーの添加後、さらに９４℃で１５秒間、６２℃で２０秒間、６８℃で３．５分間を３５サイクル実施し、その後３分間の最終伸長を行った。伸長時間はＰＣＲ産物の長さにしたがって変動した。
【０１５７】
ストレプトマイシン耐性  Ｈ．ピロリ株Ｘ４７をすべての実験で使用した（Ｋｌｅａｎｔｈｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｕｔ，３７，Ａ９４）。細菌は、脳心臓浸出液（ＢＨＩ）ベースに５％ウマ血液及び適切な場合にはエリスロマイシン（１０μｇ／ｍＬ）又はストレプトマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を添加した寒天平板上で、５％ＣＯ２環境下で生育した。
【０１５８】
ＢＨＩベースの寒天平板上で一晩培養したＨ．ピロリを、ＤＥＮＴ（Ｏｘｏｉｄ）を添加した平板上で直径約２ｃｍの菌叢にて継代培養した。ＰＣＲ産物は、形質転換に使用する前に、ＤｐｎＩ処理して残留ゲノムＤＮＡを除去し、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）で精製した。形質転換は、菌叢を６〜８時間生育した後、約１μｇの精製ＰＣＲ産物を添加することによって実施した。一晩インキュベーションした後、推定形質転換体を選択培地上にストリークした。
【０１５９】
機能的ウレアーゼ産生Ｈ．ピロリを、ＢＨＩベースに７％（ｖ／ｖ）ウマ血清、フェノールレッド（１００ｍｇ／Ｌ）、及び尿素（６００ｍｇ／Ｌ）を添加した寒天平板上で選択した。図２に示すように、培地は機能的ウレアーゼ産生Ｈ．ピロリ用に選択した１Ｍ  ＨＣｌを用いてｐＨ３に酸性化した。
【０１６０】
８つの候補サイトのうち４つで、Ｈ．ピロリの生育及び尿素の代謝を可能にする突然変異ウレアーゼ酵素が得られた（図１ｂ）。残りの４つのサイトにおける挿入からは、前記の条件下で機能的ウレアーゼを発現する細菌は単離されなかった。
【０１６１】
Ｈ．ピロリをマウスの胃から集菌し、４日間生育し、採取してＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファ中に再懸濁した。標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法を実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｕｐｒａ）。不連続な１０％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動を実施した。ウェスタンブロットのため、タンパク質をＰＶＤＦ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｌｏｔ  ＰＶＤＦ（０．２μＭ）メンブレン（Ｂｉｏｒａｄ）に移した。メンブレンを、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０添加マレイン酸緩衝液（１００ｍＭマレイン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、２０℃）に２％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ）を含む溶液で一晩ブロックした。ＦＬＡＧを検出するため、メンブレンを、モノクローナル抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０添加１％ブロッキング試薬による１：１０００希釈液で室温にて２時間プローブした。検出のため、メンブレンをホースラディッシュペルオキシダーゼに接合したウサギの抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）と共に同一条件下で室温にて１時間インキュベートした。検出は、化学発光ペルオキシダーゼ基質−３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び富士フィルムＬＡＳ−３０００Ｉｍａｇｅｒを用いて実施した。ウレアーゼは、１：２００希釈の抗ウレアーゼαサブユニット（ｂｃ−１４；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて同様にプローブし、１：２５００希釈のウサギの抗ヤギＨＲＰ接合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて検出した。
【０１６２】
ウェスタンブロット解析で、サイト１、３、４又は８で組換え型ウレアーゼを産生するＨ．ピロリは、エピトープタグの挿入を含有することが確認された（図２ａ）。胃粘膜感染を確立するためにＨ．ピロリが横断しなければならないマウス胃内腔のｐＨは３〜４である（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８），Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６０（１），６３−７０）。ウレアーゼの表面露出ループにおけるこれらの挿入がその活性又は安定性を変更するか否かを明らかにするため、酸（ｐＨ３）暴露後に野生型又は突然変異型ウレアーゼを発現する細菌における酵素活性を測定した。突然変異型ウレアーゼの１つ（サイト１における挿入）は野生型よりも高感度であり、他の３つの突然変異型ウレアーゼは酸処理に対する感度が野生型に類似していた（図２ｂ；学生のＴ−検定；ｐ＜０．０５）。
【実施例２】
【０１６３】
マウスの実験的感染
【０１６４】
ヘリコバクターフリーのＣ５７ＢＬ／６マウスを、アニマル・リソース・センター（西オーストラリア、パース）から購入した。研究は、ＵＷＡ動物倫理委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を受けて実施した（承認番号０７／１００／５９８）。８週齢のマウスに、オーバーナイト寒天平板ベースの培養液からＢＨＩ培地（Ｏｘｏｉｄ）に採取した約１．０×１０９のＨ．ピロリを経口胃接種した。マウスに、野生型又は組換え型ウレアーゼを発現する３つの独立した遺伝的に特性決定されたクローンのプールを接種した。コロニー形成のレベルを測定するため、屠殺した動物から胃を取出し、切開して残留食物を除去した。切開した胃を５００μＬのＰＢＳ中に懸濁し、５ｍｍのステンレス鋼ビーズを用いて、３０（Ｑｉａｇｅｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒ）の設定で２５秒間ホモジナイズした。続いて、組織からの細菌放出を促進するため、試料を１０の設定でさらに２分間ホモジナイズした。ホモジネートの段階希釈液を、アンホテリシンＢ（８μｇ／ｍＬ）、トリメトプリム（５μｇ／ｍＬ）及びバンコマイシン（６μｇ／ｍＬ）、ナリジクス酸（１０μｇ／ｍＬ）、ポリミキシンＢ（１０μｇ／ｍＬ）及びバシトラシン（２００μｇ／ｍＬ）を添加したＢＨＩベースの寒天平板に播種した（Ｄａｉｌｉｄｉｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６），Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７２（９），５９０８−５９１４）。播種５〜７日後に細菌の生育を調べた。    
【０１６５】
血清を異なる時点でマウスから回収し、ウレアーゼ特異的ＩｇＧの存在について評価した。Ｎｕｎｃの９６ウェルマキシソーププレートに１０μｇ／ｍＬのウレアーゼＢタンパク質（プラスミド  ｐＩＬＬ９２７から発現し、文献Ｆｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏ．，６２（１１），４９８１−４９８９に記載のように精製したもの）の炭酸緩衝液１００μＬをコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで５回洗浄した後、２％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含むＰＢＳ２００μＬを用いて３７℃で２時間ブロックした。ＰＢＳＴで２回洗浄した後、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳＴ１００μＬで１：２０希釈したマウス血清を添加してウェルを複製し、プレートを室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、２％（ｗ／ｖ）を含むＰＢＳＴ１００μＬで１：１０００希釈した抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、２００μＬのニトロフェニルリン酸基質のジエタノールアミン緩衝溶液を各ウェルに添加し、暗所、室温下で４０分プレートをインキュベートした後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１６６】
Ｈ．ピロリをＢＨＩ寒天平板上で２４時間生育した後に採取し、冷却生理食塩水（０．９％  ｖ／ｖ）で洗浄した。この細菌懸濁液を、ＯＤ６００が４になるまで希釈し、１５μＬを、Ｔｗｅｅｎ２０（０．２％ｖ／ｖ）を含む生理食塩水１５μＬに添加した。各試料に９０μＬのＫＣｌ（２００ｍＭ；ｐＨ３）を添加し、試料を室温下、３００ｒｐｍで振盪しながら１０分間インキュベートした。続いて、前記溶液を１２０μＬのＰＢＳ（ｐＨ６．８）の添加によって中和した。各試料１５０μＬに、２５μＬのフェノールレッドナトリウム塩（８０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃に加温した。７５μＬの０．５Ｍ尿素の添加によって反応を開始し、５６０ｎｍの吸光度を７０秒毎に読み取ることによってｐＨの変化を測定した。
【０１６７】
突然変異型ウレアーゼ産生Ｈ．ピロリ株の各々についてＣ５７ＢＬ／６マウスコロニー形成能を試験した。サイト３−突然変異ウレアーゼを有する菌株は、マウスコロニー形成せず（データ非表示）、それ以上研究しなかったのに対し、他の３つの突然変異菌株は、短期（＜３カ月）感染において野生型と同程度の効率でコロニー形成した。サイト８−突然変異ウレアーゼを有するＨ．ピロリの持続性は、時間が長くなると大幅に低下した（図３ａ）。確認では、マウス胃及び血清中の抗Ｈ．ピロリＩｇＧの細菌力価の各々は、この菌株による１０カ月感染の場合、野生型及び他の２つの突然変異型と比べて大幅に低下した（図３ｂ，ｃ）。前記の感染プロトコルで重要なことは、各接種で３つの独立した形質転換クローンのプールを使用したことであり、これによりウレアーゼ内の挿入と異なる二次的突然変異による弱毒化の可能性に対する懸念が排除される。さらなる試験で、接種１０カ月後にマウスから回収したほぼすべての細菌が期待される突然変異型ウレアーゼを依然として発現することが明らかにされ、これによりコロニー形成の成功が挿入ＤＮＡの喪失によるものではないという予想が支持された。唯一の例外として、サイト１突然変異型菌株に初期感染したマウス１匹のみが、１０カ月で復帰突然変異型ウレアーゼを産生しているように見えた（図４）。サイト１突然変異体でウレアーゼの酸安定性が野生型及び他のコロニー形成マウスよりも低い点、並びにサイト８突然変異体で、ウレアーゼ活性は耐酸性では野生型に近いにもかかわらずマウスコロニー形成の持続性は低い点で、インビトロで測定されたウレアーゼ活性低下はコロニー形成能力低下とあまり相関関係がないことも印象的であった。本発明者らは、サイト８（図１ａ）周辺のウレアーゼ表面の別の役割が慢性感染において重要であると提案する。
【０１６８】
要約すると、ウレアーゼ複合体の構造ベースの挿入突然変異誘発は、Ｈ．ピロリのコロニー形成又は持続性に必要な酵素表面上の２つの別個の領域、サイト３及びサイト８を識別した（図１ａ）。サイト３における挿入により組換え型Ｈ．ピロリがマウスコロニー形成できないことは、酸中和とは異なるウレアーゼの別の役割をさらに支持するものであり、さらなる調査の正当な根拠となる。さらに、本発明者らの結果は、サイト８領域はウレアーゼの脱酸機能に不可欠ではなく、むしろ宿主中での持続性に必要な別の機能に関与することを示唆する。サイト８はウレアーゼ複合体の表面においてβ−メアンダーの曲折部に位置する。相同ウレアーゼ配列のこのサイトにおける挿入又は欠失は、多様な生物で見出されず（補足図２）、したがってこのβ−メアンダーの精密構造が、長期的コロニー形成におけるウレアーゼの別の役割にとって重要であると提案する。サイト３及び８は、いずれも３つのα／β三量体と接触する回転軸の近接に位置する点で共通する。酵素活性はα／β三量体の完全性に依存することから、サイト３及び８におけるタグの挿入により、酵素活性を損なうことなく三量体／三量体相互作用表面を修飾することが可能である。
【０１６９】
適応免疫応答は、慢性Ｈ．ピロリ感染の確立及び維持の間に、特に感染サイトにおいて劇的に変化する。ウレアーゼのサイト８は、確立されたＨ．ピロリＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープと重なり、これに応答して脾臓リンパ球はＴｈ２応答のプロモーターであり抗原産生のドライバーであるサイトカインＩＬ−４を産生する（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７），Ｖａｃｃｉｎｅ，２５（１４），２５８３−２５９０）のに対し、サイト１、３及び４はいずれの既知のＢ又はＴ細胞エピトープとも関係しない。本発明者らは、サイト８においてウレアーゼ組換え体を発現するＨ．ピロリは、感染３カ月で動物に感染し、このときその細菌負荷は野生型ウレアーゼを発現する細菌のそれに近く（図３ａ）、ウレアーゼＢサブユニット（ＵｒｅＢ）に対しては弱いホルモン応答を示すが、全Ｈ．ピロリ抗原に対しては正常応答を示す（図３ｄ）ことを指摘する。ウレアーゼは最大で細菌タンパク質の１０％を構成する（Ｍａｒｃｕｓ  ＆  Ｓｃｏｔｔ，（２００１），Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ，６（２），９３−９９；Ｈｕ  ＆  Ｍｏｂｌｅｙ，（１９９０），Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．，５８（４），９９２−９９８）ことから、豊富なＴｈ２ドライバーを除去することで、持続性において重要なＨ．ピロリによる適切な免疫調節が妨げられ、それによって細菌排除が促進される可能性がある。あるいは、胃上皮でのＨ．ピロリのＣＤ７４（ＭＨＣクラスＩＩ）への結合がＩＬ−８分泌及び炎症性サイトカインの上方調節を増大する（Ｂｅｓｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６），Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．，７４（２），１１４８−１１５５））ことを考えると、ウレアーゼサイト８領域のＣＤ７４型宿主細胞受容体との直接的相互作用が宿主細胞のシグナル伝達に影響し、それによって慢性感染を助長すると推測できる。この仮説は、ＣＤ７４受容体が三量体として機能するという観察（Ｂｅｓｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１５：２８５５におけるレビュー）によって支持され、サイト３及び８におけるタグ挿入がα／β三量体の三量体形成に影響する可能性が高い。
【０１７０】
結論として、ウレアーゼ複合体の表面特性は、ウレアーゼ活性自体とは異なり、Ｈ．ピロリのコロニー形成及び持続性にとって重要であることが見出された。抗Ｈ．ピロリワクチン開発への多数の取り組みが失敗していることを考慮すると、持続性に重要な因子の分子的理解を深めることが、新たな、切望される治療的アプローチの開発に貢献するはずである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年11月15日(2011.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
配列番号５６−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ａ０Ｌ６Ｆ２）
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
配列番号５８−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ９Ｚ３６９）
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
配列番号５９−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ１ＹＵＢ５）
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
配列番号６０−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ２ＺＧＴ０）
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
配列番号６１−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ａ０ＪＲＨ４）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
配列番号６３−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ０ＬＦＪ０）
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
配列番号６４−ＵｒｅＢのアミノ酸５３５〜５７５（ｔｒ｜Ｑ１ＦＪ３９）
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
要約すると、ウレアーゼ複合体の構造ベースの挿入突然変異誘発は、Ｈ．ピロリのコロニー形成又は持続性に必要な酵素表面上の２つの別個の領域、サイト３及びサイト８を識別した（図１ａ）。サイト３における挿入により組換え型Ｈ．ピロリがマウスコロニー形成できないことは、酸中和とは異なるウレアーゼの別の役割をさらに支持するものであり、さらなる調査の正当な根拠となる。さらに、本発明者らの結果は、サイト８領域はウレアーゼの脱酸機能に不可欠ではなく、むしろ宿主中での持続性に必要な別の機能に関与することを示唆する。サイト８はウレアーゼ複合体の表面においてβ−メアンダーの曲折部に位置する。相同ウレアーゼ配列のこのサイトにおける挿入又は欠失は、多様な生物で見出されず（図６）、したがってこのβ−メアンダーの精密構造が、長期的コロニー形成におけるウレアーゼの別の役割にとって重要であると提案する。サイト３及び８は、いずれも３つのα／β三量体と接触する回転軸の近接に位置する点で共通する。酵素活性はα／β三量体の完全性に依存することから、サイト３及び８におけるタグの挿入により、酵素活性を損なうことなく三量体／三量体相互作用表面を修飾することが可能である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2013532969.tif 000017
【国際調査報告】
2013532969.tif 000018
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