(57)【要約】  本発明は、動物飼料用添加剤、および、飼料製品中における動物飼料用添加剤の検出に関する。本発明は、さらに、酵母細胞壁の成分、その単離方法、ならびに、該成分を免疫学的に検出するための組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を準備し、
該試料を、（１→４）−α−Ｄ−グルカン、（１→６）−β−Ｄ−グルカン、および、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンからなる群より選択される抗原に結合することができる一次抗体に曝露させ、それによって一次抗体−抗原の複合体を形成し、
該一次抗体と抗原との結合度を、二次抗体を用いて検出する、試料中の酵母細胞壁を検出する方法。
【請求項２】
上記試料が、家畜用飼料、ペット用飼料、一般動物用飼料、完全混合飼料（"ＴＭＲ"；  Ｔｏｔａｌ  Ｍｉｘｅｄ  Ｒａｔｉｏｎ）、飼料（ｆｏｒａｇｅ）、ペレット状飼料、飼料用濃縮物、飼料用事前混合副産物、穀物、醸造粕、糖蜜、食物繊維、飼料（ｆｏｄｄｅｒ）、牧草、乾草、穀粒、葉、粗粉、可溶性飼料、飼料用栄養補助剤、および、これらの製造時に生成する各種中間体からなる群より選択される物質から導出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記導出が、上記物質を抽出して試料を産生することによって達成される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記抽出が、酸抽出、アルカリ抽出、有機抽出、物理的処理、および、これらの組み合わせからなる群より選択されるステップを用いて実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記抽出が、有機溶剤および酸を用いて実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記抽出が、ジメチルスルホキシドおよび塩酸を用いて実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記抽出のステップにおいて、室温より高い温度でインキュベーションを実施する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
上記インキュベーションが７５℃〜８５℃で実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記一次抗体が上記抗原に対して単一特異性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上記一次抗体が多クローン性抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抗体と抗原との結合度の検出が、酵素、蛍光発生物質、発色物質、および、放射標識された同位元素からなる群より選択される物質に接合する二次抗体を補助的に用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記二次抗体が、上記一次抗体との複合体を形成することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記試料が、硬い支持部上に固定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
硬い支持部が、多壁プレート（ｍｕｌｔｉｗａｌｌ）のウェルを備えている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記一次抗体と抗原との結合の検出が、上記一次抗体−抗原の複合体に結合した二次抗体が試料中に存在することに対応するシグナルのレベルを判定することによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
上記シグナルが、発色シグナル、蛍光シグナル、サイズに基づいて検出される分子、吸光度に基づいて検出される分子、放射、および、同位体シグナルからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記検出が、ＥＬＩＳＡイムノアッセイを用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
酵母細胞壁を包含する試料を準備し、
該試料から、酵母細胞壁の炭水化物を、酸の処理、アルカリ処理、および、物理的処理からなる群より選択される作用を用いて抽出し、
該酵母細胞壁の炭水化物を試料から分離し、該酵母細胞壁の炭水化物が、（１→４）−α−Ｄ−グルカン、（１→６）−β−Ｄ−グルカン、および、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンからなる群より選択される炭水化物である、酵母細胞壁の炭水化物を包含する免疫原性組成物を調製する方法。
【請求項１９】
上記抽出が、酸処理を用いて実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記酸が塩酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、分離後の酵母細胞壁の炭水化物を精製する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
上記精製が、サイズに基づく分離、電荷に基づく分離、疎水性に基づく分離、結合分子に対する親和性に基づく分離、および、分子の立体構造に基づく分離からなる群より選択されるステップによって達成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、分離後の酵母細胞壁の炭水化物の軽度な酸化を行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
上記軽度な酸化が、酸化剤で処理することによって達成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
上記軽度の酸化が、酵母細胞壁の炭水化物をジメチルスルホキシドおよび無水酢酸で処理することによって達成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記軽度の酸化の結果、酵母細胞壁の炭水化物が活性化される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
上記活性化が、酵母細胞壁の炭水化物のＣ６部位で起こる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
上記活性化の結果、アルデヒド基が形成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
活性化後の酵母細胞壁の炭水化物を、さらに、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、卵白アルブミン、および、ウシサイログロブリンからなる群より選択されるキャリア分子に曝露させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
上記キャリア分子がウシ血清アルブミンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
タンパク質に共有結合によってリンクする（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンを包含する免疫原性組成物。
【請求項３２】
上記免疫原性組成物が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに属する酵母生物から生成される、請求項３１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
共有結合性リンクが、炭水化物のＣ６原子を介して発生する、請求項３１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
（１→４）−α−Ｄ−グルカン、（１→６）−β−Ｄ−グルカン、および、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンからなる群より選択される酵母細胞壁の炭水化物に結合することができる抗体を包含する組成物。
【請求項３５】
上記抗体が単クローン性抗体である、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３６】
上記抗体が多クローン性抗体である、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３７】
上記抗体が（１→４）−α−Ｄ−グルカンに結合することができる、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３８】
上記抗体が（１→６）−β−Ｄ−グルカンに結合することができる、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３９】
宿主動物を請求項３１に記載の免疫原性組成物で免疫化する、試料中の酵母細胞壁を検出するための抗体を調製する方法。
【請求項４０】
（１→４）−α−Ｄ−グルカン、（１→６）−β−Ｄ−グルカン、および、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンからなる群より選択される酵母細胞壁の炭水化物を放出する抽出ステップを実施するための試薬と、
該抽出ステップにおいて抽出される酵母細胞壁の炭水化物に結合することができ、それによって一次抗体−抗原の複合体を形成する一次抗体と、
該一次抗体−抗原の複合体に付着することができ、それによって一次抗体−抗原−二次抗体の複合体を形成する二次抗体とを備えた、試料中の酵母細胞壁を検出するためのキット。
【請求項４１】
上記二次抗体が、酵素、蛍光発生物質、発色物質、および、放射標識された同位元素からなる群より選択される物質に接合する、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
試料を準備し、
（１→４）−α−Ｄ−グルカン、（１→６）−β−Ｄ−グルカン、および、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンからなる群より選択される化合物の存在を検出する免疫アッセイを、該試料に対して実施し、
該免疫アッセイの結果を伝達する、試料中における酵母細胞壁の成分の存在を判定するプロセス。
【請求項４３】
上記試料が、家畜用飼料、ペット用飼料、一般動物用飼料、完全混合飼料（"ＴＭＲ"；  Ｔｏｔａｌ  Ｍｉｘｅｄ  Ｒａｔｉｏｎ）、飼料（ｆｏｒａｇｅ）、ペレット状飼料、飼料用濃縮物、飼料用事前混合副産物、穀物、醸造粕、糖蜜、食物繊維、飼料（ｆｏｄｄｅｒ）、牧草、乾草、穀粒、葉、粗粉、可溶性飼料、飼料用栄養補助剤、および、これらの製造時に生成する各種中間体からなる群より選択される物質から導出される、請求項４２に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、米国特許仮出願第６１／３３４，９９５（出願日２０１０年５月１４日）に基づいて優先権を主張し、該特許仮出願の内容全体が参照によって引用されるものとする。
【０００２】
〔技術分野〕
本発明は、動物飼料用添加剤、および、飼料製品中における動物飼料用添加剤の検出に関する。本発明は、さらに、酵母細胞壁の成分、その単離方法、ならびに、該成分を免疫学的に検出するための組成物および方法に関する。
【０００３】
〔背景技術〕
動物の栄養に関連する分野では、家畜の効率を向上させるために、多様な添加剤および栄養補助剤が採用されてきた。場合によっては、酵母細胞壁の成分が、動物飼料用添加剤として使用されることもある。その一例が、飼料用添加剤ＭＹＣＯＳＯＲＢ（商標、ＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．社製）である。ＭＹＣＯＳＯＲＢは、食品や飼料中のマイコトキシンである汚染物質に結合し、こうすることによって、マイコトキシンを消化不可能な状態で隔離する。このようなマイコトキシンである汚染物質は、一般に、飼料原料の成分として使用される穀物、穀物の副生成物、および、貯蔵トウモロコシにおける、農場での真菌の成長および収穫後の真菌の成長の両方が原因となって発生する。市販の未加工の飼料成分および加工済み飼料成分は、マイコトキシンの存在について必要とされる監視を受けるが、１００％効果的な監視システムは存在しない。世界中では、マイコトキシンの汚染によって、作物全体の約２５％が影響を受けていると推定される（Council for Agricultural Science and Technology (1989) "Mycotoxins: Economics and Health Risks", Task Force Report No.116, Ames, IA）。したがって、汚染物質が家畜およびペットの飼料のサプライチェーンに混入することは、ほとんど回避不可能である。家畜がマイコトキシンで汚染された飼料を摂食した結果としては、食欲減退、成長不良、性機能および乳生産量の低下、免疫不良、消化不良などがあるが、深刻なケースでは死に到ることもある。したがって、マイコトキシンを隔離することは、自然発生する毒素が持つ、動物およびヒトの健康に悪影響を及ぼす危険性を抑制するための、有用な戦略であることが示されている。
【０００４】
飼料用添加剤を定性的および定量的に検出するための、強力かつ特異的な分析法およびキットの開発は、動物がそのまま摂食できる飼料中に干渉する化合物が多数存在すること、および、該飼料において使用される飼料用添加剤が比較的低濃度であることによって複雑になる。
【０００５】
〔発明の概要〕
本発明は、動物飼料用添加剤、および、飼料製品中における動物飼料用添加剤の検出に関する。本発明は、さらに、酵母細胞壁の成分、その単離方法、ならびに、該成分を免疫学的に検出するための組成物および方法に関する。一部の実施形態では、試料（例えば、飼料の試料、食品である試料、または、これらの抽出物など）中の酵母細胞壁の成分および／または該成分のフラグメントを検出する方法を提供する。このような方法は、例えば、酵母細胞壁の成分（例えば、酵母グルカン、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、飼料用添加剤「ＭＹＣＯＳＯＲＢ」、飼料用添加剤「ＢＩＯＭＯＳＳ」、飼料用添加剤「ＡＣＴＩＧＥＮ」など）を包含する食品用添加剤および飼料用添加剤の存在を、飼料製品（例えば、家畜用飼料、ペット用飼料、または、これらの製造時に生成する各種中間体）中において判定する際に使用可能である。一部の実施形態では、本発明は、酵母細胞壁の成分（例えば、酵母グルカン、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、飼料用添加剤「ＭＹＣＯＳＯＲＢ」など）を、飼料製品（例えば、家畜用飼料、ペット用飼料、または、これらの製造時に生成する各種中間体）から抽出するための方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、特定の酵母細胞壁の成分（例えば、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、および／または、これらの接合体）に対する抗体を産生させる際に使用可能な抗原を提供する。好適な実施形態では、この抗原をタンパク質キャリア（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））などのキャリアに接合させる。一部の実施形態では、本発明は、Ｃ６−ＯＨ部位の炭水化物（例えば、グルコピラノース環を有する炭水化物、グルカン類、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン）を活性化する方法を提供する。一部の実施形態では、この活性化に際して、（例えば、ジメチルスルホキシド／無水酢酸を用いて）軽度の酸化をさせる。一部の実施形態では、本発明は、酵母細胞壁抗原を認識することができる抗体（例えば、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、または、これらの接合体を認識することができる単クローン性抗体または多クローン性抗体；（１→４）−α−Ｄ−グルカン／（１，６）−β−Ｄ−グルカン／ＢＳＡ抗原に対して産生させた単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１または５１３Ａ４３１．１；（１→４）−α−Ｄ−グルカン／（１→６）−β−Ｄ−グルカン／ＢＳＡ抗原に対して産生させた多クローン性抗体；または、これらの精製後の形態、希釈後の形態、接合後の形態、および／または、単一特異性を有する形態）を提供する。一部の実施形態では、本発明は、試料（例えば、飼料の試料、食品である試料、または、これらの抽出物）中の酵母細胞壁の成分（例えば、酵母グルカン、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、飼料用添加剤「ＭＹＣＯＳＯＲＢ」など）を検出するための試薬を備えたキットを提供する。
【０００６】
本発明は、分析に使用される試料の種類にも特質にも限定されない。一部の好適な実施形態では、上記試料は、食料品または飼料製品であるか、または、食料品または飼料製品から導出されるかのいずれかである。食料品または飼料製品は、エネルギーおよび／または栄養分を食事に与え、（例えば、動物によって）摂食される任意の物質を包含する。飼料の例としては、完全混合飼料（"ＴＭＲ"；  Ｔｏｔａｌ  Ｍｉｘｅｄ  Ｒａｔｉｏｎ）、飼料（ｆｏｒａｇｅ）、ペレット状飼料、飼料用濃縮物、事前混合副産物、穀物、醸造粕、糖蜜、食物繊維、飼料（ｆｏｄｄｅｒ）、牧草、乾草、穀粒、葉、粗粉、可溶性飼料、栄養補助剤などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。飼料および食糧は物理的な形状によって限定されるものではない。飼料および食糧は、より小さな粒径になるまで処理してもよい（例えば、チップ状に切っても、粗切りにしても、粉砕しても、挽いてもよい）。また、飼料および食糧は液体状にしてもよい（例えば、抽出しても、煮ても、濃縮しても、シロップなどの粘稠性を有する形態に転化してもよい）。さらに、飼料および食糧は、より大きな粒径になるように処理されてもよい（例えば、まとめても、固めても、圧縮しても、ペレット状、ブロック状、正方形状、フレーク状などの複合形状に加工してもよい）。
【０００７】
本発明は、分析用試料を得るために使用する抽出方法の種類にも特質にも限定されない。一部の実施形態では、分析対象となる元の物質（例えば、食料品または飼料製品、一般動物用飼料）に対してある抽出法が実施されることによって、分析用試料が得られる。抽出法としては、酸抽出法、アルカリ抽出法、有機溶剤を用いた抽出法、バッファを用いた抽出法、塩を用いた抽出法、洗剤を用いた抽出法、物理的抽出法（例えば、沸騰、蒸気抽出、低温抽出、粉砕、または、これらの組み合わせ）などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。一部の実施形態では、分析対象となる物質（例えば、食料品または飼料製品、一般動物用飼料）が、有機溶剤と酸溶液との組み合わせを用いて抽出される。一部の実施形態では、分析対象となる物質（例えば、食料品または飼料製品、一般動物用飼料）が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と塩酸（ＨＣｌ）の溶液を用いて抽出される。
【０００８】
本発明は、元の試料中に存在する分析物（例えば、抗原、酵母細胞壁の成分、酵母グルカン、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、飼料用添加剤「ＭＹＣＯＳＯＲＢ」など）の量によって限定されるものではない。分析物の量は、０．００５ｍｇ未満、０．００５ｍｇ〜０．０５ｍｇ、０．０５ｍｇ〜０．５ｍｇ、０．５ｍｇ〜１ｍｇ、１ｍｇ〜５ｍｇ、５ｍｇ〜１０ｍｇ、１０ｍｇ〜２５ｍｇ、または、２５ｍｇ以上であってもよい。本発明は、検査対象となる元の物質中に存在する分析物（例えば、抗原、酵母細胞壁の成分、酵母グルカン、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、飼料用添加剤「ＭＹＣＯＳＯＲＢ」など）の量によって限定されるものではない。検出される分析物の量は、１トン当たり０．０５ｋｇ未満、１トン当たり０．０５ｋｇ〜０．５ｋｇ、１トン当たり０．５ｋｇ〜１ｋｇ、１トン当たり１．０ｋｇ〜２．０ｋｇ、１トン当たり２．０ｋｇ〜３．０ｋｇ、１トン当たり３．０ｋｇ〜４．０ｋｇ、１トン当たり４．０ｋｇ〜５．０ｋｇ、１トン当たり５．０ｋｇ〜６．０ｋｇ、１トン当たり６．０ｋｇ〜１０．０ｋｇ、または、１トン当たり１０ｋｇ以上であってもよい。
【０００９】
本発明は、分析物（例えば、抗原、酵母細胞壁の成分、酵母グルカン、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、飼料用添加剤「ＭＹＣＯＳＯＲＢ」など）の検出に使用する抗体の作業濃度によって限定されるものではない。抗体（例えば、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、または、これらの接合体を認識することができる単クローン性抗体または多クローン性抗体；（１→４）−α−Ｄ−グルカン／（１→６）−β−Ｄ−グルカン／ＢＳＡ抗原に対して産生させた単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１または５１３Ａ４３１．１；（１→４）−α−Ｄ−グルカン／（１→６）−β−Ｄ−グルカン／ＢＳＡ抗原に対して産生させた多クローン性抗体；または、これらの精製後の形態、希釈後の形態、接合後の形態、および／または、単一特異性を有する形態）の作業希釈度は、１：１００，０００未満、１：５０，０００〜１：１００，０００、１：２０，０００〜１：５０，０００、１：１０，０００〜１：２０，０００、１：５，０００〜１：１０，０００、１：１，０００〜１：５，０００、１：５００〜１：１，０００、１：１００〜１：５００、１：５０〜１：１００、１：１０〜１：５０、１：１〜１：１０、２：１〜１：１、または、２：１を超えてもよい。
【００１０】
一部の実施形態では、本発明は、酵母細胞壁の成分を包含する免疫原性組成物を提供する。一部の実施形態では、酵母細胞壁の成分が酵母グルカンを包含する。一部の実施形態では、グルカンは、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、または、これらの接合体もしくは誘導体を包含する。一部の実施形態では、本発明は、キャリア（例えば、タンパク質キャリア）に接合する、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカンおよび酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンを提供する。キャリアが、宿主動物において免疫原性および／または安定性を促進してもよい。キャリアの例としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ウシサイログロブリン（ＴＨＹ）、および、アヒルＢ型肝炎核抗原（ＤＨＢｃＡｇ）などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない（Gathuru et al. (2005) Vaccine 23:4727-4733）。本発明は、抗原とキャリアとの間のリンクの位置によって限定されない。一部の好適な実施形態では、抗原（例えば、炭水化物抗原、グルカン、グルコピラノース環を有する炭水化物、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン）は、抗原を基準とする１つ以上のＯ６部位でキャリアに接合する。一部の実施形態では、抗原は、Ｃ６部位でＢＳＡに接合する酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンである。
【００１１】
本発明の抗体は、抗体を産生させる宿主の種によって限定されるものではない。宿主の種としては、ラット種、マウス種、モルモット種、ハムスター種、ウサギ種、ヤギ種、ヒツジ種、ニワトリ種、ロバ種、ウマ種、ウシ種、イヌ種、ネコ種、ブタ種、サル種、ヒト種、または、その他の任意の種などがあげられる。本発明の抗体は、抗体を産生させるために使用される接種計画、抗原の調製方法、および、抗原のデリバリー方法のいずれによっても限定されるものではない。抗原は、免疫刺激剤（例えばアジュバント）、バッファ、塩、溶媒、溶解度向上性化合物などの存在または非存在下で提示されてもよい。宿主の種は、抗原で１回、２回、３回、４回、５回、５回〜１０回、１０回〜２０回、または、２１回以上免疫化されてもよい。本発明の抗体は、クローン性（例えば、単クローン性、多クローン性）によって限定されるものではない。抗体は粗抗体の形態で使用されても、精製抗体の形態で使用されてもよい。抗体は多特異性を有していても、単一特異性を有していてもよい。好適な実施形態では、抗体は、抗体を産生させるために使用される抗原を特異的認識することができる。一部の好適な実施形態では、本発明の抗体は、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞壁から抽出される（１→４）−α−Ｄ−グルカン／（１→６）−β−Ｄ−グルカンを特異的認識することができる。一部の好適な実施形態では、本発明の抗体は、多クローン性抗体を包含する。一部の実施形態では、本発明は、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、または、これらのフラグメント、変異株、もしくは、接合体を認識することができる単クローン性抗体または多クローン性抗体を提供する。一部の実施形態では、本発明の抗体組成物は、酵母細胞壁（１→４）−α−Ｄ−グルカンには結合するが、酵母細胞壁（１→４）−α−Ｄ−グルカン含有重合体（例えば、酵母細胞壁（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母細胞壁（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、または、これらのフラグメント、変異株、もしくは、接合体）以外の物質中に存在する（１→４）−α−Ｄ−グルカン含有部には結合しない。一部の実施形態では、本発明の抗体組成物は、酵母細胞壁（１→６）−β−Ｄ−グルカンには結合するが、酵母細胞壁（１→６）−β−Ｄ−グルカン含有重合体（例えば、酵母細胞壁（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母細胞壁（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、または、これらのフラグメント、変異株、もしくは、接合体）以外の物質中に存在する（１→６）−β−Ｄ−グルカン含有部には結合しない。一部の実施形態では、本発明の抗体組成物は、酵母細胞壁（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンには結合するが、酵母細胞壁（例えば、酵母細胞壁（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、または、これらのフラグメント、変異株、もしくは、接合体）以外の物質中に存在する（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン含有部には結合しない。
【００１２】
本発明の一部の抗原検出法は免疫検出方法を包含する。一部の好適な実施形態では、免疫検出方法がＥＬＩＳＡを包含する。一部の実施形態では、ＥＬＩＳＡが、分析対象となる元の物質（例えば、食料品または飼料製品、一般動物用飼料、これらの抽出物など）、および、一次抗体（例えば、酵母細胞壁の成分を認識することができる抗体、酵母グルカンを認識することができる抗体、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、および／または、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンを認識することができる抗体）から導出される試料を用いて実施される。一部の実施形態では、抗体は、検出可能なシグナルを生成することができる物質（例えば、発色物質、蛍光発生物質、放射標識された同位元素など）に直接リンクされている。一部の実施形態では、抗体は、検出可能なシグナルを生成することができる別の薬剤（例えば、発色物質、蛍光発生物質、放射標識、同位元素など）と直接または間接的に関連する。
【００１３】
一部の実施形態では、本発明は、試料（例えば、食料品または飼料製品、一般動物用飼料、これらの抽出物など）中の分析物（例えば、抗原、酵母細胞壁の成分、酵母グルカン、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、および／または、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン）を検出するためのキットを提供する。キットの成分としては、各種の試薬、抽出用バッファ、溶媒、洗剤、遮断薬、チューブ、抗体、標準品、説明書、および、これらの任意の組み合わせなどがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。
【００１４】
一部の実施形態では、本発明は、分析対象となる元の物質（例えば、食料品または飼料製品、一般動物用飼料、これらの抽出物など）について、分析物（例えば、抗原、酵母細胞壁の成分、酵母グルカン、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、および／または、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン）の濃度に関する情報が得られるサービスを提供する。一部の実施形態では、分析は、エンドユーザ（例えば、農業家、家畜の所有者、家畜取扱業者、畜産家、ペットの所有者、ペット取扱業者、ペットの飼育者、獣医師、飼料または食料品製造業者、飼料または食料品流通業者、監督担当官）によって実施される。一部の実施形態では、試料または元の物質が、エンドユーザ（例えば、農業家、家畜の所有者、家畜取扱業者、畜産家、ペットの所有者、ペット取扱業者、ペットの飼育者、獣医師、飼料または食料品製造業者、飼料または食料品流通業者、監督担当官）から第三者に提出されて、第三者が分析を実施する。一部の実施形態では、第三者は、解析結果に関する情報をエンドユーザ（例えば、農業家、家畜の所有者、家畜取扱業者、畜産家、ペットの所有者、ペット取扱業者、ペットの飼育者、獣医師、飼料または食料品製造業者、飼料または食料品流通業者、監督担当官）へ伝達する。一部の実施形態では、第三者は、分析結果についての情報をさらに別の第三者へ伝送する。
【００１５】
さらに他の実施形態は、関連分野の当業者にとって、本明細書の開示内容から明らかであろう。
【００１６】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、グルカン画分Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、および、Ｓ１、Ｓ２、および、Ｓ３の生成の概略図を示している（例えば、実施例１を参照）。
【００１７】
図２は、元のウサギの抗血清の応答性、および、親和性精製済み抗血清の４つの上清の応答性を示している。親和性精製済み抗血清は、β−（１，６）−グルカンに特異的な（Ｇａｂ１〜Ｇａｂ４）抗体を、ＢＳＡでコーティングされたマイクロウェルプレートに分離することによって得られた（例えば、実施例３を参照）。
【００１８】
図３は、本明細書記載する方法で生成した、精製済みの抗（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン−ＢＳＡ多クローン性ウサギ抗体を使用して作成した較正曲線を示している（例えば、実施例２および３を参照）。
【００１９】
図４は、ＭＹＣＯＳＯＲＢの６つの含有レベルを用いて乳業用飼料物質において実施した、５つのアッセイから得られた平均検量線を示している。右側のｙ軸は、検量線に対する、日内（％ＣＶｉｎｔｒａ）併行精度および日間（％ＣＶｉｎｔｅｒ）併行精度を示す。
【００２０】
図５は、ＭＹＣＯＳＯＲＢの６つの含有レベルを用いてニワトリ用飼料物質において実施した、５つのアッセイから得られた平均検量線を示している。右側のｙ軸は、検量線に対する、日内（％ＣＶｉｎｔｒａ）併行精度および日間（％ＣＶｉｎｔｅｒ）併行精度を示す。
【００２１】
図６は、ＭＹＣＯＳＯＲＢの６つの含有レベルを用いてブタ用飼料物質において実施した、５つのアッセイから得られた平均検量線を示している。右側のｙ軸は、検量線に対する、日内（％ＣＶｉｎｔｒａ）併行精度および日間（％ＣＶｉｎｔｅｒ）併行精度を示す。
【００２２】
図７は、複数のマイクロタイタープレートを分散配置した場合において、干渉物の平均の光学濃度読み取り値（ΔＯＤ４５０）の差を、ニワトリ用飼料において得られるＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物のシグナルから減じた値を示している（実施例７）。干渉物は、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物（１００％、１．０ｋｇ／Ｔ）とともに、５０％、１００％、２００％（ｗ／ｗ）の割合で加えた。
【００２３】
図８は、単一のマイクロタイタープレートを配置した場合において、干渉物の平均の光学濃度読み取り値（ΔＯＤ４５０）の差を、ニワトリ用飼料において得られるＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物のシグナルから減じた値を示している（実施例７）。干渉物は、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物（１００％、１．０ｋｇ／Ｔ）とともに、５０％、１００％、２００％（ｗ／ｗ）の割合で加えた。
【００２４】
図９は、濃度が１：１００（上側のグラフ）および１：２００（下側のグラフ）である各場合の、単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【００２５】
図１０は、濃度が１：５００（上側のグラフ）および１：１０００（下側のグラフ）である各場合の、単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【００２６】
図１１は、濃度が１：１５００（上側のグラフ）および１：２０００（下側のグラフ）である各場合の、単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【００２７】
図１２は、濃度が１：１００（上側のグラフ）および１：２００（下側のグラフ）である各場合の、単クローン性抗体５１３Ａ４３１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【００２８】
図１３は、濃度が１：５００（上側のグラフ）および１：１０００（下側のグラフ）である各場合の、単クローン性抗体５１３Ａ４３１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【００２９】
図１４は、濃度が１：１５００（上側のグラフ）および１：２０００（下側のグラフ）である各場合の、単クローン性抗体５１３Ａ４３１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【００３０】
図１５は、希釈せずに、または、ＰＢＳもしくはＰＢＳ＋３％脱脂乾燥乳で１：１に希釈してプレートにセットした、平均のＥＬＩＳＡアッセイ吸光度読み取り値と、３つの酵母細胞壁抽出標準品の標準偏差とを示している（実施例６）。
【００３１】
図１６は、実施例６に記載のＥＬＩＳＡミクロプレート用コーティング時間および温度によって実施したインキュベーションについて、飼料抽出物の検量線のグラフを示している。
【００３２】
〔定義〕
本発明の理解の一助として、いくつかの用語および表現について以下のように定義する。
【００３３】
本明細書では、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および、「タンパク質」という用語は、全て、共有結合性「ペプチド結合」によって繋がっているアミノ酸の一次配列を指す。一般にペプチドは数個のアミノ酸からなり、通常は２個〜５０個のアミノ酸からなり、タンパク質に比べて短い。「ポリペプチド」という用語には、ペプチドおよびタンパク質を含める。一部の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、または、タンパク質は合成されたものであるが、一方で、別の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、または、タンパク質は組換え型であっても、天然型であってもよい。合成ペプチドとは、人工的な手段によってインビトロで生成される（つまり、インビボで生成されたのではない）ペプチドである。
【００３４】
「糖タンパク質」および「糖ペプチド」という用語は、それぞれ、ポリペプチド鎖に共有結合によって結合した１つ以上の炭水化物残基を有する、タンパク質およびペプチドをそれぞれ指す。「セレン含有タンパク質」および「セレノペプチド」という用語は、それぞれ、１つ以上のセレン原子を有するタンパク質およびペプチドを指す。通常、セレン原子は、セレノシステインやセレノメチオニンなどのセレン含有アミノ酸内では、タンパク質に取り込まれる。
【００３５】
「セレノ糖タンパク質」および「セレノ糖ペプチド」という用語（「ＳＧＰ」と略記することもある）は、それぞれ、１つ以上のセレン原子を取り込んだ糖タンパク質および糖ペプチドを指す。通常、「セレノ糖タンパク質」は１つ以上のセレン含有アミノ酸を有する。「セレノ糖タンパク質」は、任意の数の互いに異なる形態で、複数の炭水化物を有していてもよい。
【００３６】
「試料」および「標本」という用語は、各用語の最も広い意味で使用し、任意の供給源から得られる試料および標本を含む。本明細書では、「試料」という用語は、（ヒトを含めた）動物から得られる生物学的試料を指すために使用し、各種の流体、固形物、組織、および、気体を含む。本発明の一部の実施形態において、試料には、植物から導出される物質（貯蔵物、穀物、処理済み家畜用飼料、製造の中間段階における飼料製品）を含有する試料を含める。ただし、これらの例は、本発明において使用可能な試料の種類を限定するものであると解釈すべきではない。
【００３７】
本明細書では、「酵母」および「酵母細胞」という用語は、真菌界に分類される真核微生物を指し、細胞壁、細胞膜、および、細胞内の成分を有する。酵母は、分類学上または系統発学上の特定のグループを構成しない。現在、約１，５００種が知られており、全ての酵母種のわずか１％しか文献に記載されていないと推定される。「酵母」という用語は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの異名であると見なされることが多いが、酵母が持つ系統発生上の多様性は、子嚢菌門に属する酵母も、担子菌門に属する酵母も両方が存在することによって示される。「酵母」という用語には、ビール酵母、醸造酵母、および、パン酵母を含める。出芽酵母（「真性酵母」）は、サッカロミセス目に分類される。酵母種の一部は二分裂によって繁殖するが、大半は出芽によって無性生殖的に繁殖する。酵母は単細胞である。ただし、一部の種は、仮性菌糸、つまり偽の菌糸（ｆａｌｓｅ  ｈｙｐｈａｅ）として知られている、一繋がりの出芽細胞を形成することによって多細胞になる。酵母のサイズは種によって大きく異なるが、通常は直径が３μｍ〜４μｍである。ただし、中には４０μｍを超える酵母もある。本明細書では、「ＹＣＷ」とも称される「酵母細胞壁」という用語は、酵母の原形質膜および細胞内の成分を囲む酵母生物の細胞壁を指す。酵母細胞壁には、酵母細胞壁の外層（主にマンナン）も内層（主にグルカンおよびキチン）も含める。細胞壁の一つの機能は、構造を提供し、酵母内部（酵母の代謝活性の中心）を保護することである。シグナル伝達経路および認識経路は、酵母細胞壁において発生する。酵母細胞壁の組成は、個々の株ごとに、かつ、酵母の増殖条件によって異なる。
【００３８】
本明細書では、「酵母細胞壁抽出物」という用語は、（例えば、破裂段階および溶解段階において）破裂または「溶解」し、酵母細胞の可溶性細胞内の成分から分離された酵母の酵母細胞壁を指す。
【００３９】
本明細書では、ｗ／ｗ（重量／重量）という用語は、組成物中において、重量に基づいて示した、ある任意の物質の含有量を指す。例えば、動物飼料が本発明の食餌飼料用栄養補助剤を０．０２％ｗ／ｗ含むとは、食餌飼料用栄養補助剤の質量が動物飼料の全質量の０．０２％である（例えば、動物飼料９０７，２００ｇ中に、本発明の食餌飼料用栄養補助剤である組成物が２００ｇ含まれている）ことを意味する。
【００４０】
本明細書では、「精製」という用語は、試料から各成分を除去することを指す。例えば、酵母細胞壁または酵母細胞壁抽出物は、酵母細胞壁の成分ではない成分（例えば、細胞膜および／または酵母の細胞内の成分）を除去することによって精製される。また、酵母細胞壁または酵母細胞壁抽出物は、汚染物質、つまり、酵母細胞壁以外の物質を除去することによっても精製される。酵母細胞壁ではない成分および／または酵母細胞壁ではない汚染物質を除去することによって、試料中の酵母細胞壁または酵母細胞壁の成分が占める割合が増加する。分子レベルでは、「精製された」、「精製した」、「精製済みの」という用語は、自然環境から切り離された、単離された、または、分離された分子（例えば、炭水化物、糖タンパク質など）を指す。したがって、「単離済み炭水化物」とは、精製済みの炭水化物のことである。分子が「実質的に精製済み」であるとは、その少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％が、自然環境であれば関連する他の成分を含まないということである。本明細書では、「精製」という用語は、さらに、試料から汚染物質を除去することをも指す。汚染するタンパク質を除去することによって、試料中の注目しているポリペプチドの割合が増加する。さらに、組換え型ポリペプチド（例えば、糖タンパク質）は植物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、または、哺乳類宿主細胞において発現する、あるいは、これらの宿主細胞から精製され、このポリペプチドが宿主細胞のタンパク質を除去することによって精製される。こうすることによって、試料中の組換え型ポリペプチドの割合が増加する。本明細書では、「動物」という用語は、動物界に属していることを意味する。動物には、家畜、農畜用動物、牧畜動物、ペット動物、海洋性動物および淡水性動物、ならびに、野生動物を含めるが、これらの例に限定されるものではない。
【００４１】
本明細書では、「家畜」は「家畜種」とも、「農畜用動物」とも、「商用目的で飼育される動物」とも称され、この用語は、食物または繊維を生産するために、または、労働力もしくはペットとして、農業の環境または水産養殖環境において意図的に飼育される飼い慣らされた動物を指す。
【００４２】
本明細書では、「栄養補助食品」や「栄養補助食品組成物」などの用語は、食餌の一部として（例えば、動物飼料に加えるものとして）使用される食餌補助食品または栄養補助食品として配合される食品を指す。本発明では、栄養補助食品組成物の複数の例について記載する。
【００４３】
本明細書では、「キット」という用語は、試薬や書類などを組み合わせたものを指して使用する。キットが、抽出用溶液、抗体、検出用試薬などの試薬を備えていてもかまわない。「キット」という用語は、試薬および／または書類の特定の組み合わせに限定されるものではない。
【００４４】
本明細書では、「有毒」という用語は、被験体、細胞、または、組織に対して、毒物投与前の同一細胞または組織に比較して、任意の害を及ぼすまたは有害な効果を指す。
【００４５】
本明細書では、「フリーズドライ」、「凍結乾燥」、および、「低温乾燥」という用語は、凍結状態にある物質から昇華によって溶媒を除去することを指す。これは、共融点より低い温度で乾燥するように物質を凍結させた後に、昇華潜熱を与えることによって達成される。熱供給を精密に制御することによって、生成物を再度融解させずに凍結状態で乾燥させることができる。実用的な応用では、このプロセスは減圧条件下で加速され、かつ、精密に制御される。
【００４６】
本明細書では、「乾燥自由流動粉末」という用語は、例えば、器、袋、容器などから障害となる大きな凝集塊を形成せずに注ぐことができる粉末などの、自由流動する乾燥粉末を指す。
【００４７】
本明細書では、「粉砕」という用語は、衝撃、剪断、または、摩擦によって粒径を小さくすることを指す。
【００４８】
本明細書では、「洗浄」という用語は、不純物または調製物の不所望の可溶性成分を（例えば、任意の種類の溶質（例えば、蒸留水、バッファ、または、溶媒）または混合物を用いて）除去または洗い落とすことを指す（例えば、酵母細胞壁抽出物を洗浄して、酵母細胞壁の成分ではない成分を試料から除去したり、マイクロタイタープレートのウェルを洗浄して、非結合性または非特異的に結合する成分を除去したりする）。
【００４９】
「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、特異抗原に結合するタンパク質を指す。免疫グロブリンとしては、多クローン性抗体、単クローン性抗体、キメラ性抗体、および、ヒト化抗体、抗原結合性フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントなどがあげられるが、これらの例に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｂＥ、および、分泌免疫グロブリン（ｓＩｇ）の各綱の免疫グロブリンを含める。免疫グロブリンは、一般に、２つの同一重鎖および２つの軽鎖を有する。ただし、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語には、さらに、単鎖抗体および二鎖抗体も含める。抗体は、公知の方法のいずれによって生成されてもよい（例えば、Current Protocols in Immunology (1998)John Wiley and Sons, Inc.,N.Y.を参照）。
【００５０】
「抗原」という用語は、抗原分子の一部に対して特異的な抗体と反応性を有する、炭水化物、タンパク質、糖タンパク質、リポ蛋白、脂質などの物質を指す。
【００５１】
本明細書では、「分析物」という用語は、原子、分子、原子団および／または分子団、物質、または、化学的構成物質を指す。分析物はそれ自身を測定することはできないが、分析的手順（例えばＨＰＬＣやＮＭＲ）によって、分析物の持つ（例えば、物理的、化学的、生物学的）態様または性質を決定することはできる。例えて言えば、「椅子」（分析物としての成分）そのものを測定することはできないが、椅子の高さや幅は測定可能であることと同じである。これと同様に、マイコトキシンを測定することはできないが、マイコトキシンの濃度に関連するマイコトキシンシグナル（例えば、発色シグナル、蛍光シグナル）を測定することはできる。
【００５２】
「免疫沈降」、「免疫精製」、および、「親和性精製」、という用語、ならびに、例えば動詞や形容詞などの文法的な変化形は、抗体を使用して、該抗体に対する抗原または抗原の一部を他の分子の混合物から分離することを指す。
【００５３】
「免疫検出」という用語、および、文法的な変化形は、抗体を使用して、抗原または抗原の一部の存在を他の分子の混合物から特定することを指す。
【００５４】
「染色」という用語は、ある物質（例えば、試料、飼料の試料、飼料の試料の抽出物、単数個の細胞、複数個の細胞）が持つ特定の成分および／または特徴をより良好に可視化、区別、または、特定するために使用される、当業者にとって公知の任意の数のプロセスを指す。
【００５５】
「免疫蛍光法」という用語は、当業者にとって公知の手順によって特定、マーキング、標識、可視化、または、可視化するために使用される染色法であって、配位子（通常は抗体）が受容体（通常は抗原）に結合し、この配位子が（抗体である場合には）蛍光分子に接合するか、あるいは、配位子が配位子に特異的な抗体に結合され、該抗体が蛍光分子に接合し、さらに、該蛍光分子が適切な機器（例えば、蛍光顕微鏡）を用いて視覚化可能である、染色法を指す。
【００５６】
「抗原決定基」という用語は、特定の抗体と接触する抗原の一部（例えば、エピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質のフラグメントを使用して宿主動物を免疫化すると、該タンパク質上の任意の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の生成を、該タンパク質の多数の領域が惹起することがあり、これらの領域または構造は、抗原決定基と称される。抗原決定基は、抗体に結合しようとする際に、インタクトな抗原（免疫応答を誘発するために用いる「免疫原」）と競合することもある。
【００５７】
本明細書では、「イムノアッセイ」という用語は、試料中の抗原の検出を可能にすることを意図する定性的または定量的な検査を指す。イムノアッセイは、通常、抗原を認識する抗体を使用する。抗原を認識する抗体を、例えば、発色性または蛍光発生性マーカーまたは酵素などの、可視化ステップに直接的または間接的に関連させてもよい。イムノアッセイの例としては、酵素結合免疫吸着測定法（「ＥＬＩＳＡ」）、側方流動試験、ウエスタンブロット、微小粒子系アッセイ（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイ）、磁気イムノアッセイ、ドットブロット、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、計数イムノアッセイ（ＣＩＡ）などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。イムノアッセイは競合的であってもよく、非競合的であってもよい。
【００５８】
本明細書では、「酵素結合免疫吸着測定法」または「ＥＬＩＳＡ」（時には「サンドイッチアッセイ」とも称される）という用語は、特定の種類のイムノアッセイを指す。通常は、未知の量の抗原が、硬い表面上で吸収または固定化され、該抗原を認識することができる抗体に曝露する。結合する抗体の量は、蛍光発生性または発色性酵素への直接的または間接的なリンクによってほぼ決まる。ＥＬＩＳＡの種類としては、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡなどがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。本明細書では、「ＥＬＩＳＡ」という用語は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＩＡ）を指す。多数のＥＬＩＳＡ法および応用法が当該技術分野において知られており、多くの文献中に記載されている（例えば、Crowther, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)," in Molecular Biomethods Handbook, Rapley et al. (eds.), pp. 595-617, Humana Press, Inc., Totowa, N.J. (1998); Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology,Ch. 11, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994)を参照）。さらに、多数の市販のＥＬＩＳＡ検査システムも存在する。本明細書では、「食物」、「食糧」、「飼料」、「飼料製品」、「一般動物用飼料」などの用語は、エネルギーおよび／または栄養分を食事に供与する（例えば、動物が）摂食する任意の物質を指す。例としては、完全混合飼料（ＴＭＲ）、飼料（ｆｏｒａｇｅ）、ペレット、濃縮物、事前混合副産物、穀物、醸造粕、糖蜜、食物繊維、飼料（ｆｏｄｄｅｒ）、牧草、乾草、穀粒、葉、粗粉、可溶物、栄養補助剤などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。食糧はその物理的な形状によって限定されるものではない。食糧は、より小さな粒径になるまで処理されてもよい（例えば、チップ状に切っても、粗切りにしても、粉砕しても、挽いてもよい）。また、食糧は液体状にしてもよい（例えば、抽出しても、煮ても、濃縮しても、シロップなどの粘稠性を有する形態に転化してもよい）。さらに、食糧は、より大きな粒径になるように処理されてもよい（例えば、まとめても、固めても、圧縮しても、ペレット状、ブロック状、正方形状、フレーク状などの複合形状に加工してもよい）。
【００５９】
本明細書では、「添加剤」または「栄養補助剤」は、名詞として使用した場合、別の物質またはものに加えられる、または、別の態様で含められる物質またはものを指す。さらに、本明細書では、「添加剤」という言葉と「栄養補助剤」という言葉とは、名詞として使用した場合、動物に与えられる前に動物飼料に混ぜられる「添加剤」または「栄養補助剤」に言及する際には、互換的に使用可能である。
【００６０】
本明細書では、「グルカン」という用語は、任意のグルコースを含有する炭水化物の重合体を指す。一部の実施形態では、グルカンはＤ−グルコースの重合体であって、重合度も、他の重合体との共有結合性の関連または非共有結合性の関連も、正確な炭水化物の組成も限定されない。グルカン重合体の長さ全体にわたって、Ｄ−グルコース単位が、α−リンクおよびβ−リンクのいずれか一方または両方に関与している。
【００６１】
本明細書では、「炭水化物」という用語は、一般式Ｃｍ（Ｈ２Ｏ）ｎで表される有機化合物に言及するために使用される。炭水化物は、炭素原子、水素原子、および、酸素原子のみからなり、水素原子と酸素原子との原子比は２：１である。
【００６２】
本明細書では、「シグナル」という用語は、概ね、反応（例えば、抗体の抗原との結合）が起こったことを示唆する任意の検出可能なプロセスに言及するために使用される。放射能や蛍光定量的または比色分析的生成物／試薬の形態のシグナルは、いずれも本発明において使用されてもかまわない。本発明の一部の実施形態ではシグナルが質的に評価されるが、別の実施形態ではシグナルが定量的に評価される。
【００６３】
本明細書では、「硬い支持部」という用語は、試薬（例えば、抗体、抗原などの他の検査成分）を付着させる、任意の固体物質または動かない物質に言及するために使用される。例えば、ＥＬＩＳＡ法では、マイクロタイタープレートのウェルが、硬い支持部を提供する。硬い支持部の別の例としては、顕微鏡のスライド、カバーガラス、ビーズ、粒子、細胞培養用フラスコ、さらに多数のその他の適切な品目があげられる。
【００６４】
「特異的結合」および「特異的に結合」という用語は、抗体と抗原との間の相互作用に言及するために使用される場合、抗原上に特定の構造（つまり、抗原決定基またはエピトープ）が存在することに依存する相互作用について説明する。換言すれば、抗体は、抗原に固有のタンパク質構造を認識してこれに結合するのであって、一般的に全てのタンパク質に結合（つまり、非特異的結合）するのではない。
【００６５】
〔発明の詳細な説明〕
酵母細胞壁（ＹＣＷ）は、（１→２）（１→３）（１→６）−α−Ｄ−マンナンおよび（１→３）（１→６）−β−Ｄ−グルカンという、２つの主な多糖である成分を含む複雑な構造を備えている。これらの多糖は、最近報告されたレビュー記事（Lesage et al. (2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70:317-343。この記事の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）において議論されているように、Ｏ−およびＮ−グリコシジル（ｇｌｙｃｏｓｉｄｙｌ）結合を介してＹＣＷタンパク質に接続されている。工業規模であれば、ＹＣＷは、D.A. HowesとK.E. Newmanとが報告するように（例えば、米国特許第６，０４５，８３４号明細書を参照。この特許文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）、通常、溶解状態にある酵母生物から遠心分離および洗浄によって分離または抽出される。この段階では、ＹＣＷは水に可溶ではない。これに続く、一次ＹＣＷの酵素処理および化学的処理によって、多糖およびタンパク質の構造が改質され、こうすることによって、これらのＹＣＷの成分は少なくとも部分的に水およびジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）に可溶になる。上記生成物の可溶部および不溶部の組成は、プロセスの条件に依存する。
【００６６】
イムノアッセイは、このように複雑な非同種の混合物に対して使用可能な高感度分析法を包含する。本発明の一部の方法実施形態では、細胞壁の全ての主な構造成分を相互に接続する酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカンを含有する抗原で免疫化された動物から得られる抗体（Kollar et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:17762-17775を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）は、この多糖を認識し、強力かつ高感度のイムノアッセイを確立することを可能にする。本発明の一部の実施形態では、定量的イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が、動物飼料の試料において、ＹＣＷから導出される栄養添加剤であるＭＹＣＯＳＯＲＢ（ＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．社）の分析を可能にする。ＹＣＷから（１→６）−β−Ｄ−グルカンを検出するアッセイは、（１→６）−β−Ｄ−グルカンが植物の炭水化物の中では非常に希少なので、ＹＣＷの定量化における特異性が非常に高い。したがって、このＹＣＷの多糖を標的とする抗体は、動物飼料中に存在する植物多糖と大きな相互作用は起こさず、アッセイのバックグラウンドが確実に低くなる。
【００６７】
さらに、本発明の一部の実施形態は、（１）例えば、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンを認識する抗体を調製するための抗原として、可溶性（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンを酵母細胞壁から分離する方法（Kwiatkowski et al. (2009) J. Instit. Brew. 115:1031、および、Arvindekar et al. (2002) Yeast 19:131-139を参照。いずれの文献も内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）；この多糖のヒドロキシル基をアルデヒド基に転化するために（Zekovic et al. (2006) Chem. Papers 60:243-248を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）、該ヒドロキシル基をグルコピラノース環のＣ６部位でＰｆｉｚｎｅｒ−Ｍｏｆｆａｔ試薬を用いて酸化する方法（Pfizner et al. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:3027を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）；および、多糖−タンパク質の接合体を生成するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のリジン残基を用いて、この酸化型の（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンの、還元性アミノ化反応における使用方法（Abdel-Magid et al. (1996) J. Org. Chem. 61:3849-3862を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）も提供する。一部の実施形態では、本発明は、動物（例えば、ウサギ）の免疫化において可溶性免疫原として使用される（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン−ＢＳＡ接合体を（例えば、イオン交換、ＤＥＡＥセルロース、および、イオン強度が異なるＮａ２ＨＰＯ４バッファを用いて）分離精製する方法を提供する（Howard et al. (2001) Basic Methods in Antibody Production and Characterization, CRC Press, pp. 11-18 and 31-50を参照）。一部の実施形態では、本発明は、ＢＳＡでコーティングされた親和相樹脂を調製する方法（Matejtschuk (1997) Affinity Separations: a Practical Approach, Oxford University Pressを参照）と、ＢＳＡに特異的な抗体および（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンに特異な抗体をどちらも含有するウサギ血清からＢＳＡに特異的な抗体を吸収する際に、この親和相樹脂を使用する方法とを提供する。本発明の一部の実施形態では、多糖をタンパク質に接合する方法が、ヒトワクチンおよび動物ワクチンを生成する際に使用可能である。これは、この接合方法では多糖の元の構造が保存され、典型的な接合方法とは異なり、多糖の還元末端が改質されないからである（米国特許第６，５９６，８６１号明細書を参照。この特許文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。
【００６８】
〔Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅの細胞壁のグルカン〕
グルカンは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞壁の多糖中に多く存在する（Kwiatkowski et al. (2009) J. Instit. Brew. 115:151-158を参照）。酵母細胞壁の形状および剛性の維持における（１→３）−β−Ｄ−グルカンの役割（Klis et al. (2006) Yeast 23:185-202; Lesage et al. (2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70:317-343を参照。いずれの文献も内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）、および、全ての細胞壁の多糖をリンクする多糖としての（１→６）−β−Ｄ−グルカンについては、文献に記載されている（Aimaniada et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:13401-13412; Kollar et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:17762-1777; Klis et al. (2002) FEMS Microbiology Rev. 26:239-256を参照。いずれの文献も内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。好気的に成長したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞中における可溶性および不溶性グリコーゲン状の（１→４）−α−Ｄ−グルカンの存在については、初期の酵母に関する文献で頻繁に言及されている（Gunja-Smith et al. (1974) Biochem. Biophys. Res. Com. 56:588-592; Grba et al. (1975) Appl. Microbiol. Biotechnol. 2:29-37を参照。いずれの文献も内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。また、２つの形態のグリコーゲンシンターゼが特定されている（Gunja-Smith et al. (1977) J. Bacteriol. 130:818-825; Rothman-Denes et al. (1970) PNAS 66:967-974を参照。いずれの文献も内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。グリコーゲンは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによって蓄積される、エネルギーを貯蔵する炭水化物であって、酵母の餌の不足時に利用可能である。グリコーゲンは、１→４リンクによって繋がった１０〜１４のα−Ｄ−グルコースの残基を含む分岐鎖状構造を有する、分子量が約１０８のα−Ｄ−グルコースの重合体である（Aklujkar et al. (2008) J. Instit. Brew. 114:205-208; Boulton et al. (2001) The Biochemistry of Fermentation. In: Brewing Yeast and Fermentation, Blackwell Science, Iowa, pp. 89-92を参照。いずれの文献も内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。
【００６９】
酵母細胞壁中の（１→４）−α−Ｄ−グルカンの含有率は、細胞の栄養状態、単離方法、環境条件、および、細胞を回収した時期次第で、乾燥重量の１％という低い値（Lille et al. (1980) J. Bacteriol. 143:1384-1394を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）から２９％という高い値（Sedmak et al.、米国特許出願公開第２００６／０２６３４１５を参照。この特許文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）まで、ばらつきがある（Lille et al. (1980) J. Bacteriol. 143:1384-1394を参照）。工業的に生成されたビール酵母細胞（Sedmak et al.、米国特許出願公開第２００６／０２６３４１５を参照。この特許文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）は、グルカンを２８．９％の乾燥重量（ｄ．ｗ．）濃度で含有し、そのうちの１２．４％ｄ．ｗ．が（１→４）−α−Ｄ−グルカンであった。これらの細胞をアルカリプロテアーゼで処理すると、水不溶性の細胞壁の成分が５４．５％ｄ．ｗ．のグルカンを含有し、また、（１→４）−α−Ｄ−グルカンの重量の半分を超える量（２９．２％ｄ．ｗ．）を含有していた。
【００７０】
２００２年に、ＡｒｖｉｎｄｅｋａｒとＰａｔｉｌとが（Arvindekar et al. (2002) Yeast 19:131-139を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）、（１→４）−α−Ｄ−グルカンが（１→６）−β−Ｄ−グルカンに共有結合しているという自らの知見に基づいて、他の研究者が「洗い流すには困難」な酵母グリコーゲンであると規定した不溶性画分（Fleet et al. (1976) J. Gen. Microbiol. 94:180-192を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）が酵母細胞壁内に存在することに対して、説明を提案した。しかしながら、これは、Ｋｏｌｌａｒらが報告した１９９７年の論文とは矛盾していた（Kollar et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:17762-17775を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。また、酵母細胞壁内の（１→６）−β−Ｄ−グルカンの役割および構造について、Ａｉｍａｎｉａｄａらによる報告とも矛盾していた（Aimaniada et al. (2009) J. Biol. Chem. 184:13401-13412を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。なお、ＡｒｖｉｎｄｅｋａｒとＰａｔｉｌとの知見については、両者が酵母細胞壁を酵素加水分解して得られた生成物の極微量の画分を用いて、分離した生成物の定量化にも構造決定にもＮＭＲを採用しなかったので、構造的な検証が必要である。本発明の実施形態を実現する過程で実施された実験では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞壁から得られる混合した状態の（１→４）−α−Ｄ−グルカン／（１→６）−β−Ｄ−グルカン多糖を単離するために、大規模な分離方法を開発し、この生成物の構造を、ＮＭＲ分光法を用いて確定した。
【００７１】
〔動物用食物および飼料〕
動物飼料とは、飼い慣らされた家畜（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、家禽類、水牛、アルパカ、ラマ、ロバ、ラバ、ウサギ、ニワトリ、ガチョウ、シチメンチョウ、ブタなど）に食べさせるという特定の目的で使用される任意の食糧である。動物飼料には、乾草、麦わら、貯蔵物、圧縮飼料およびペレット状飼料、油、混合飼料、さらに、発芽した穀物およびマメ科植物などが含まれることが多い。世界中の動物飼料産業は、２００６年には６３，５００万トンの飼料を消費し、年間成長速度は約２％であった。人の食品ではなく飼料を育てるために農地を使用することには、議論の余地がある。ある種類の飼料（例えばトウモロコシ）は人の食品ともなるが、そうはならない種類の飼料（例えば牧草）もある。動物に対してエネルギー源を提供する以外に、動物飼料は、体が用いる栄養分（例えばセレン）をも提供する。動物飼料は、動物に与えられる前に、栄養補助剤および／または添加剤（例えば、ＭＹＣＯＳＯＲＢ）と混合されることが多い。
【００７２】
〔免疫検出方法〕
本発明は、免疫検出アッセイ（つまりイムノアッセイ）を包含する、試料中の物質を検出するための方法を提供する。イムノアッセイ（免疫検出アッセイ、免疫検出方法）は、抗体を使用して、抗体が結合する物質（例えば、抗原）を検出（可視化、定性的特定、定量的検出）することを包含する。抗体が認識する抗原は、巨大分子またはそのフラグメント（例えば、重合体、炭水化物、糖タンパク質、タンパク質、巨大分子の一部分または単量体）であってもよい。例えば、本発明の一部の方法は、酵母細胞壁のグルカン（例えば、（１→４）−α−Ｄ−グルカン、（１→６）−β−Ｄ−グルカン、および／または、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン）の検出において使用可能である。
【００７３】
物質（例えば、低濃度で存在する物質、複雑な混合物中に存在する物質、炭水化物系物質、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン）の定性的または定量的検出において、様々なイムノアッセイが使用可能である。イムノアッセイの種類としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、側方流動試験、ウエスタンブロット、微小粒子系アッセイ（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイ）、磁気イムノアッセイ、ドットブロット、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、計数イムノアッセイ（ＣＩＡ）などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない（例えば、Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  "Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，３ｒｄ  Ｅｄ．"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫを参照）。イムノアッセイは競合的であってもよく、非競合的であってもよい。
【００７４】
〔酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）〕
酵素結合免疫吸着測定法（「ＥＬＩＳＡ」）は、各種工業分野において品質管理チェックに使用されるとともに、医学および植物病理学において診断上の道具として使用されている。典型的なＥＬＩＳＡの１つの例では、プローブ分子を利用する。まず、このプローブ分子を、ポリスチレン製ミクロプレートまたはその他の表面上に固定化する。次に、例えばＢＳＡなどの遮断薬を塗布およびインキュベーションする。未知の濃度を有する特定の標的分子（タンパク質であることが多い）を含有する生物学的試料またはその他の試料を、固定化済みプローブ分子に接触させる。存在していれば、標的分子は、標的分子の濃度に比例してプローブによって捕捉される。次に、典型的には、表面を弱い洗剤溶液で洗浄して、特異的に結合していない分子をすべて除去する。次に、例えば第二抗体などの別の分子を塗布して、捕捉プローブ、標的分子、および、標識済み検出プローブを有する「サンドイッチ」状複合体を形成する。この２つ目の分子は、検出プローブまたは検出抗体と称されることが多く、一般的に、酵素、ハプテン、または、その他の標識化分子に共有結合によってリンクされている。
【００７５】
最後の洗浄ステップ後に、上記標識済み検出抗体に結合し、酵素性基質、蛍光標識済み検出用試薬、または、その他の種々のレポーターを含有する接合体を加えることによって、プレートを処理する。レポーターは、試料中の対象となる抗原の量に比例する、検出可能なシグナルを生成する。典型的には、ＥＬＩＳＡを比色分析または蛍光プレート読み取り装置を用いて読み取り、この結果、各ウェルについて、１つの対象分析物測定結果が得られる。ＥＬＩＳＡアッセイのその他の変形例としては、間接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡなどがあげられるが、これらの例に限定されるものではない（例えば、Crowther et al. (2008) "The ELISA Guidebook, 2ndEd.", Humana Pressを参照）。
【００７６】
多数の場合に、ＥＬＩＳＡは、自動化機器を用いた処理を可能にする標準化フォーマットに合うように製作されたミクロプレートにおいて実施される。これらの標準規格は、Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＳ）によって確立され、ＳＢＳ規格として知られている。ＳＢＳ規格によれば、マルチウェルプレートの所謂「フットプリント（設置面積）」は、約８５ｍｍ×１２５ｍｍであり、ウェルはウェルの総数に応じて指定された位置フォーマットに配置される。米国国家規格協会（"ＡＮＳＩ"；  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、ミクロプレート用のＳＢＳ規格について、「Ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ」（ＡＮＳＩ／ＳＢＳ１−２００４）、「Ｈｅｉｇｈｔ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ」（ＡＮＳＩ／ＳＢＳ２−２００４）、「Ｂｏｔｔｏｍ  Ｏｕｔｓｉｄｅ  Ｆｌａｎｇｅ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ」（ＡＮＳＩ／ＳＢＳ３−２００４）、および、「Ｗｅｌｌ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」（ＡＮＳＩ／ＳＢＳ４−２００４）という印刷物として発行している。もっとも一般的には、ＥＬＩＳＡのユーザは、単一のプレートに９６個のウェルを採用する。あるいは、１回のアッセイに９６個未満のウェルが必要なのであれば、９個のウェルを有する「ストリップ」を最大で１２個まで採用し、１度に９６個のウェルの一部だけを使用することが可能である。
【００７７】
〔検査サービス〕
一部の実施形態では、コンピュータを用いた分析プログラムを使用して、アッセイ（例えば、イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ）によって生成した生データを翻訳して（例えば、抗原の存在、非存在、または、量）（例えば、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン）、エンドユーザ（例えば、家畜またはペットの飼育者または取扱業者、獣医師、農業家、消費者）に提供する予測値のデータを得る。エンドユーザは、任意の適切な手段を用いて、この予測データにアクセスすることができる。こうすることによって、一部の実施形態では、本発明は、イムノアッセイ分析の訓練を受けていない可能性が高いエンドユーザが、生データを理解する必要がないという、さらなる利点を提供する。データは、もっとも有用な形態でエンドユーザに直接提示される。したがって、エンドユーザは、情報をただちに使用して、被験体（例えば、家畜またはペット）の世話の仕方を最適化することができる。
【００７８】
本発明には、アッセイを実施する研究室から、および、該研究室へ、試料に関する情報を受信、処理、および、伝送することができる任意の方法をも含む。例えば、本発明の一部の実施形態では、試料（例えば、飼料の試料、飼料の試料の抽出物など）が得られ、生データを生成するために、所在地が世界中のどこであってもよい（例えば、被験体が存在する国、または、情報が最終的に使用される国と一致する、または、それらの国とは別の国にあってもよい）プロファイリングサービス（例えば、研究室など）に提出される。エンドユーザは、第三者に試料（例えば、飼料抽出物）を取得してもらい、プロファイリングセンターへ送ってもらってもよい。あるいは、被験体が自ら試料を収集し、プロファイリングセンターへ直接送ってもよい。試料が以前に求めた情報を含んでいるのであれば、エンドユーザが、この情報をプロファイリングサービスへ直接送ってもよい（例えば、情報を記録した情報カードをコンピュータでスキャンし、電子通信システムを用いて、データをプロファイリングセンターのコンピュータへ伝送してもよい）。プロファイリングサービスは、試料を受け取ると、これを処理して、エンドユーザにとって望ましい診断情報または予後情報に特異性を有するプロファイリングを実施する（例えば、抗原の含有量を求める）。
【００７９】
そして、プロファイリングデータを、エンドユーザが解釈できるように適切なフォーマットに整える。例えば、生データを提供するのではなく、フォーマットを調製することによって、エンドユーザにリスクアセスメント（例えば、抗原が存在する可能性）を提示したり、さらに、特定の家畜の世話の選択肢を勧める勧告を出したりすることができる。データは、任意の適切な方法によってエンドユーザに提示されればよい。例えば、一部の実施形態では、プロファイリングサービスは、エンドユーザのために（例えば、接触する場所や家畜を世話する場所において）印刷可能な報告書を作成、または、エンドユーザに対してコンピュータモニタ上に提示する。
【００８０】
一部の実施形態では、情報は、家畜を世話する場所、または、地域の施設においてまず分析される。そして、さらに分析、および／または、生データをエンドユーザもしくは別の関係者にとって有用な情報に変換するために、生データは中央処理施設へ送られる。中央処理施設は、プライバシー（全てのデータが、一様なセキュリティプロトコールを用いて中央の施設で記憶される）、速度、および、データ解析の一様性という効果をもたらす。そして、中央処理施設は、エンドユーザとの通信後に、データの最終的な処理法を制御する。例えば、中央の施設は、電子通信システムを用いて、データをエンドユーザへ提供する。
【００８１】
一部の実施形態では、エンドユーザは、電子通信システムを用いてデータに直接アクセスすることができる。エンドユーザは、結果に基づいて、さらにアドバイスを求めてもよい。一部の実施形態では、データは研究目的に使用される。例えば、データは、家畜またはペットの栄養摂取計画をさらに最適化するために使用されてもよい。
【００８２】
〔組成物およびキット〕
一部の実施形態の方法において使用する（例えば、該方法にとって十分な、必要な、または、有用な）本発明の組成物は、特異抗原（例えば、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン）の存在または非存在を検出するための試薬を含む。これらの組成物のうちのいずれも、単独で、または、本発明の別の組成物と組み合わせて、キットの形態で提供されてもよい。キットは、適切なコントロール用試薬および／または検出用試薬をさらに備えていてもよい。
【００８３】
〔抗原−キャリア接合〕
一部の実施形態では、本発明は、酵母細胞壁物質の分析（例えば、免疫学的分析、抗体調整のためなど）において使用可能な組成物（例えば、抗原）を提供する。一部の実施形態では、本発明は、可溶性の（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンを、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカンに対する抗原として、酵母細胞壁から分離するための方法を提供する（Kwiatkowski et al. (2009) J. Instit. Brew. 115:1031; Arvindekar et al. (2002) Yeast 19:131-139を参照。いずれの文献も内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。また、一部の実施形態では、本発明は、この多糖のヒドロキシル基を、Ｐｆｉｚｎｅｒ−Ｍｏｆｆａｔ試薬を用いてグルコピラノース環のＣ６部位で酸化（Pfizner et al. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:3027を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）させて、アルデヒド基に転化するための方法を提供する（Zekovic et al. (2006) Chem. Papers 60:243-248を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。さらに、一部の実施形態では、本発明は、この酸化型（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンを、キャリア（例えば、ＢＳＡなどの担体タンパク質）のリジン残基との還元性アミノ化反応において使用し、多糖−キャリア接合体を生成するための方法を提供する（Abdel-Magid et al. (1996) J. Org. Chem. 61:3849-3862を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。一部の実施形態では、本発明は、動物（例えば、ウサギ）を免疫化するための可溶性免疫原として使用される、純粋な抗原（例えば、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン−ＢＳＡ接合体）の分離における分離法の応用（例えば、イオン交換、様々なイオン強度のＤＥＡＥセルロースおよびＮａ２ＨＰＯ４のバッファ）に関する（Howard et al. (2001) "Basic Methods in Antibody Production and Characterization", CRC Press, pp. 11-18 and 31-50を参照）。一部の実施形態では、本発明は、さらに、ＢＳＡでコーティングされた親和相の調製（Matejtschuk (1997) "Affinity Separations: A Practical Approach", Oxford University Pressを参照）、および、キャリア（例えば、ＢＳＡ）に対する抗体と抗原（例えば、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン）とをどちらも含有する抗血清（例えば、ウサギ血清）からキャリアに特異的な（例えば、ＢＳＡに特異的な）抗体を吸収する際に該親和相を使用することによって、結果的に得られる抗体調整物の特異性を促進することにも関する。本発明の一部の実施形態における、多糖をキャリア（例えば、ＢＳＡなどのタンパク質キャリア）に接合させる方法は、典型的な接合法とは異なり、還元末端の改質を引き起こさず、多糖の構造を保存するので、ヒトワクチンおよび動物ワクチンの生成において使用可能である（Moreauら、米国特許第６，５９６，８６１号明細書を参照。この特許文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。
【００８４】
多糖またはオリゴ糖の弱い抗原性は、抗原として使用する前に改質する必要があることが多い。本発明の一部の実施形態では、（（１→６）−β−Ｄ−グルカンを含有する）多糖抗原を、免疫化に使用する種とは異なる動物種に由来する、または、これから導出されるキャリア（例えば、ＢＳＡなどのタンパク質キャリア）に接合する合成法を開発した（Howard et al. (2001) "Basic Methods in Antibody Production and Characterization", CRC Press, pp. 11-18 and 31-50; Matejtschuk (1997) "Affinity Separations: A Practical Approach", Oxford University Pressを参照）。本発明は、使用されるキャリアの特質または種類によって限定されるものではないが、ＢＳＡが好適であり、これは、ＢＳＡが市販されていること、および、種々の化学的な方法によって多糖またはオリゴ糖に接合可能な遊離アミノ基をそれぞれ１つずつ有するリジン残基が５つ存在することが理由である（Abdel-Magid et al. (1996) J. Org. Chem. 61:3849-3862; Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198; Pawlowski et al. (1999)Vaccine 17:1474-1483を参照。いずれの文献も内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。一部の好適な実施形態では、接合に使用される抗原およびキャリアの糖鎖は水溶性である。一部の実施形態では、抗原としての糖鎖（例えば、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン多糖）の還元末端のアルデヒド基は、キャリア（例えば、ＢＳＡ）に対する直接的な接合には使用されないが、これは、使用すると、多糖である抗原が有する構造および結合能を大きく変化させてしまうからである。一部の実施形態では、本発明は、無水酢酸／ジメチルスルホキシド（Ａｃ２Ｏ／ＤＭＳＯ）系を用いて、最大限に保存された糖鎖の構造を可能にし（Zekovic et al. (2006) Chem. Papers 60:243-248を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）、こうすることによって、Ｃ３以外の部位において酸化させることが可能になる。
【００８５】
一部の実施形態では、本発明は、抗体（例えば、多クローン性抗体）を生成する際に使用する抗原（例えば、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン−ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））接合体の合成において、酵母細胞壁の成分（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞壁から得られる可溶性の（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン）を使用する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンを包含する免疫原性組成物、および／または、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンを包含する接合体（例えば、タンパク質接合体または糖接合体）を提供する。一部の実施形態では、本発明の抗体組成物は、注目している試料（例えば、動物飼料の試料、または、その誘導体、画分、もしくは、抽出物）中の酵母細胞壁生成物の検出において使用可能である。一部の実施形態では、本発明の組成物は、例えば酸抽出物によって、グルカン濃縮物質またはグルカン濃縮生成物（ＧＥＭ、ＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．社、Ｎｉｃｈｏｌａｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ、米国）から抽出される（Kwiatkowski et al. (2009) J. Instit. Brew. 115:1031を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。一部の実施形態では、多糖（例えば、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）混合物を用いてグルコピラノース環のＣ６部位で軽度に酸化（Pfizner et al. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:3027を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）させることによって、Ｃ６部位のヒドロキシメチレン（−ＣＨ２ＯＨ）基をアルデヒド（−ＣＨ＝Ｏ）基に転化（Zekovic et al. (2006) Chem. Papers 60:243-248を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）し、さらに、酸化型の抗原（例えば、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン）をキャリア（例えば、ＢＳＡ）と還元的アミノ化を起こすことができるようにする（Moreau et al.、米国特許第６，５９６，８６１号明細書、および、Abdel-Magid et al. (1996) J. Org. Chem. 61:3849-3862を参照。いずれの文献も内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。
【００８６】
本発明の接合法（例えば、Ｃ６−ＯＨ部位における多糖の活性化を含む方法）は、多糖部の完全に保全された元の構造を提供し、したがって、抗原の調製にとって好適である。過ヨウ素酸酸化を含む（Hay et al. (1973) Methods Carb. Chem. 5:357-370を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）、または、ＣＤＡＰの活性化を含む（Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198を参照）、多糖またはオリゴ糖を活性化する他の方法（ただし、これに限定されるものではない）では、かなり改質された多糖が産生され、多糖またはオリゴ糖の抗原としての有用性が弱くなる。
【００８７】
〔抗体〕
本発明のもう１つの態様は、被験体を酵母細胞壁の成分（例えば、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン−ＢＳＡ、または、これらの他のフラグメント、変異株、もしくは、接合体）で免疫化するステップと、免疫グロブリンをレシピエントから単離するステップとを含む、酵母細胞壁の成分（例えば、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン）を検出するアッセイにおいて使用するための免疫グロブリンを調製する方法である。この方法によって調製された免疫グロブリンが、本発明のさらにもう１つの態様である。
【００８８】
多クローン性抗体を生成するための接種は、通常、抗原性組成物を生理的に容認できる希釈液（例えば、生理食塩水や他のアジュバント）中で分散させて、水性組成物を形成することによって調製される。免疫賦活性量の接種を被験体に投与し、次に、接種後の被験体を、抗原性組成物が感染防御抗体を惹起するために十分な時間維持する。
【００８９】
抗体は、周知の手法、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって所望の程度にまで単離可能である（例えば、Harlow and Lane, Antibodies; a Laboratory Manual (1988) Cold Springs Harbor Laboratory Pressを参照）。
【００９０】
抗体は、種々の一般に使用される動物（例えば、ヤギ類、霊長類、ウサギ類、ロバ類、ブタ類、ウマ類、モルモット類、ラット類、または、ヒト）から得られる抗血清調製物を含む。動物から血液を採集し、血清を回収する。
【００９１】
本発明にしたがって生成された免疫グロブリンは、抗体全体、抗体のフラグメント、または、抗体のサブフラグメントを含有していてもよい。抗体は、任意の綱の免疫グロブリン全体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、または、ＩｇＥ）、キメラ性抗体、または、本発明の２つ以上の抗原に対して二重の特異性を有するハイブリッド抗体であってもよく、さらに、ハイブリッドフラグメントを含めた、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖなどのフラグメントであってもよい。
【００９２】
あるいは、単鎖抗体の生成をするために説明した手法を、当該技術分野において公知の方法を用いて、特定の抗原に特異的に結合する単鎖抗体を生成するように適合させてもよい。関連する特異性を有するが、明確に異なるイディオタイプの組成を有する抗体を、ランダムに組み合わせた免疫グロビンのライブラリーから、チェインシャフリング法（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）によって生成してもよい（例えば、Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120 23, 1991を参照）。
【００９３】
単鎖抗体も、雑種細胞ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて、例えばＰＣＲなどのＤＮＡ増幅法で作製可能である（例えば、Thirion et al., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11を参照）。単鎖抗体は単一特異性であっても二重特異性であってもよく、二価であっても四価であってもよい。二重特異性を有する四価の単鎖抗体の作製は、例えば、Coloma & Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 159-63に教唆されている。二重特異性を有する二価の単鎖抗体の作製は、例えば、Mallender & Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269, 199-206に教唆されている。
【００９４】
単鎖抗体をコード化するヌクレオチド配列を、後述のように、手動または自動ヌクレオチド合成法を用いて作製し、組換え型ＤＮＡ法を用いた標準的な方法でクローン化して発現作製物に組み込み、さらに、コード配列を発現させる細胞に導入してもよい。あるいは、単鎖抗体を、例えば繊維状ファージ技術を用いて直接生成してもよい（例えば、Verhaar et al., 1995, Int. J. Cancer 61, 497-501; Nicholls et al., 1993, J. Immunol. Meth. 165, 81-91を参照）。
【００９５】
特定の抗原に特異的に結合する抗体は、リンパ球の集団においてインビボ生成を惹起することによって、または、免疫グロブリンライブラリー、もしくは、文献（例えば、Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833 3837, 1989; Winter et al., Nature 349, 293 299, 1991を参照）に開示されている非常に特異的に結合する試薬のパネルをスクリーニングすることによっても生成可能である。
【００９６】
キメラ性抗体は、ＷＯ９３／０３１５１に開示されているように作製することができる。免疫グロブリンから導出され、多選択性を有する多価の結合タンパク質（例えば、ＷＯ９４／１３８０４に記載の「二重特異性抗体」）も調製可能である。抗体は、当該技術分野において周知の方法で精製可能である。例えば、抗体は、適切な関連する抗原を結合させたカラム上を通過させることによって親和性精製可能である。この場合、結合した抗体を、高塩濃度のバッファを用いてカラムから溶出させることができる。
【００９７】
本発明の免疫原性組成物は、特定の免疫原性組成物からの攻撃に反応して生成される免疫グロブリンの供給源として作用する被験体に投与可能である。このように処理された被験体は、従来の血漿分画法で過免疫性グロブリンがそこから得られると考えられる血漿を提供する。
【００９８】
本発明の組成物としては、任意の綱の免疫グロブリン全体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、または、ＩｇＥ、キメラ性抗体）、または、本発明の２つ以上の抗原に対して特異性を有するハイブリッド抗体などの抗体（例えば、単クローン性抗体および／または多クローン性抗体）があげられるが、これらの例に限定されるものではない。さらに、本発明の組成物としては、ハイブリッドフラグメントを含めた、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖなどのフラグメントであってもよい。
【００９９】
単クローン性抗体の作製方法は、当該技術分野において周知であり、脾細胞を骨髄腫細胞に融合させることを含んでもよい（例えば、Kohler and Milstein 1975 Nature 256; 495; Harlow and Lane, Antibodies; a Laboratory Manual (1988) Cold Springs Harbor Laboratory Pressを参照）。あるいは、単クローン性Ｆｖフラグメントは、適切なファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって得られる（例えば、Vaughan TJ et al 1998 Nature Biotechnology 16; 535を参照）。単クローン性抗体は、公知の方法でヒト化されても、部分的にヒト化されてもよい。
【０１００】
本発明の一部の実施形態では、抗体組成物は、酵母細胞壁抗原を認識することができる（例えば、単クローン性抗体または多クローン性抗体は、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、または、これらの他のフラグメント、変異株、もしくは、接合体を認識することができる）。一部の実施形態では、本発明の抗体組成物は、酵母細胞壁（１→４）−α−Ｄ−グルカンに結合するが、酵母細胞壁（１→４）−α−Ｄ−グルカンを含有する重合体（例えば、酵母細胞壁（１→４）−α−Ｄ−グルカン、酵母細胞壁（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、または、これらの他のフラグメント、変異株、もしくは、接合体）以外の物質中に存在する（１→４）−α−Ｄ−グルカンを含有する部分には結合しない。一部の実施形態では、本発明の抗体組成物は、酵母細胞壁（１→６）−β−Ｄ−グルカンに結合するが、酵母細胞壁（１→６）−β−Ｄ−グルカンを含有する重合体（例えば、酵母細胞壁（１→６）−β−Ｄ−グルカン、酵母細胞壁（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、または、これらの他のフラグメント、変異株、もしくは、接合体）以外の物質中に存在する（１→６）−β−Ｄ−グルカンを含有する部分には結合しない。一部の実施形態では、本発明の抗体組成物は、酵母細胞壁（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンに結合するが、酵母細胞壁（例えば、酵母細胞壁（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン、または、これらの他のフラグメント、変異株、もしくは、接合体）以外の物質中に存在する（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンを含有する部分には結合しない。
【０１０１】
〔実施例〕
以下の実施例は、本発明のある好適な実施形態および態様を実証し、さらに説明するために提供されるものであって、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１０２】
〔実施例１〕
〔食物グレードのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに属する酵母細胞壁β−グルカンからの（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンの抽出〕
〔酵母細胞壁のグルカンの調製〕
酵素／アルカリ／熱処理によってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから生成した工業グレードの（１→６）−β−Ｄ−グルカン（ＡＬＬ−ＢＧＹ、ＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．社、Ｎｉｃｈｏｌａｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ、米国）を脱イオン水で４回洗浄して、可溶性残留物を全て除去した。フリーズドライした後に、「グルカン濃縮物質」（「ＧＥＭ」）が得られた。
【０１０３】
〔酵母細胞壁のグルカンの酸性消化〕
図１は、各画分の調製を図示している。酵母細胞壁のグルカンの酸性消化を、Kwiatkowski et al. (2009) J. Instit. Brew. 115:151-158に記載されているように実施した（該文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。「グルカン濃縮物質」（「ＧＥＭ」）（７０ｇ）を、１００ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ値２．２）を７００ｍｌ用いて８０℃で６時間加水分解した。この６時間の加水分解終了後に、混合物を１３，５００×ｇ／１０℃／１０分で遠心分離し、上清を収集した。ペレットを１５０ｍｌの脱イオン水で２回抽出し、凍結乾燥させると、５７．９ｇの白色の非結晶生成物（Ｐ１）が得られた。
【０１０４】
これら２つの洗浄物を元の上清と合わせ、２ＮのＮａＯＨで中和してｐＨ値を７．０にした。形成した沈殿物を遠心分離から収集し（ペレットＰ１／７）（凍結乾燥後には１．８２ｇであった）、３７℃未満の温度でＢｕｃｈｉ社の真空ロータリーエバポレーターを用いて、上清を体積４５０ｍｌまで濃縮した。この溶液を、５ｋＤａ  ＡＭＩＣＯＮ  １５型限外濾過遠心分離器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｄｅｌａｗａｒｅ、米国）を用いてさらに濃縮した。この濃縮物（約１５０ｍｌ）を、同じ限外濾過器を用いて、２つの等しい体積の脱イオン水で遠心分離によって２回洗浄して、酸加水分解が原因となって生じる塩と低分子量成分とを除去した。洗浄済み濃縮物（Ｓ１）を凍結乾燥すると、７．５ｇの白色の非結晶生成物が得られた。ペレットＰ１の一部に対して、１回目の０．１ＮのＨＣｌを用いた抽出と同じ試薬比および条件で、２回目の抽出を実施した。これらの生成物を凍結乾燥すると、Ｐ２およびＳ２が得られた。この０．１ＮのＨＣｌを用いた２回目の抽出では、上清を中和した後も沈殿物は生成しなかった。ペレットＰ２の一部に対して、１回目の０．１ＮのＨＣｌを用いた抽出と同じ試薬比および条件で、３回目の抽出を実施し、生成物を凍結乾燥してＰ３およびＳ３を得た。０．１ＮのＨＣｌを用いた３回目の抽出では、上清を中和した後も沈殿物は生成しなかった。０．１ＮのＨＣｌを用いた抽出で得られた可溶性画分および非可溶性画分の炭水化物組成および多糖構造を、１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって確立した。試料中のマンノースおよびグルコースの含有量を、Ｈ２ＳＯ４−ＨＰＬＣ組成分析法で分析した（Dallies et al. (1998) Yeast 14:1297-1306を参照。この文献の内容全体が、参照によって本明細書に引用されるものとする）。タンパク質の推定含有量を、ＬＥＣＯ燃焼分析法で、窒素の含有量に乗数６．２５を乗じることによって算出した。
【０１０５】
〔実施例２〕
〔抗原の調製〕
〔（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン調製物のＡｃ２Ｏ／ＤＭＳＯ酸化〕
５８０ｍｇの「可溶性」グルカンを、磁気攪拌棒を備えゴム製中隔で蓋留めした２２ｍｌのガラス製バイアルに仕込んだ。このバイアル中に、１０ｍｌの無水ＤＭＳＯおよび１１０μｌの無水酢酸を、注射筒を用いて室温で攪拌しながら加えた。グルカンの懸濁液は、２０℃で攪拌を４時間続けると完全に溶解した。この混合物の攪拌を２４時間継続した後に、反応混合物を４０ｍｌの水で希釈した。得られた透明な溶液を、３０ｋＤａ  Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）１５型限外濾過遠心分離器を用いて濃縮し、フィルタ上の残留物を１回につき１２ｍｌの脱イオン水で５回洗浄して、溶媒および反応物の酸化生成物を分離および精製した。遠心分離はどの回も４，７５０×ｇ／３０分／１０℃で実施した。フィルタ上の最終的な残留物を収集しフリーズドライすると、５０２ｍｇの酸化した（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンが白色粉末の形態で得られた。この生成物は水には部分可溶性であり、ＤＭＳＯには完全可溶性であった。
【０１０６】
〔元素分析〕
酸化グルカンについて、Ｃ４０．０５％、Ｈ６．６１％であった。Ｃ６Ｈ８Ｏ５×Ｈ２Ｏについて、Ｃ４０．４８％、Ｈ５．６６％が算出された。
【０１０７】
〔ＢＳＡを用いた、酸化（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンの還元的アミノ化〕
酸化（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンの試料（４１２ｍｇ）を、２０ｍｌの脱イオン水に溶解させ、磁気攪拌しながら２ｍｌの脱イオン水中で２５６ｍｇのＢＳＡの溶液と合わせた。次に、この混合物を、６０ｍｇの固体シアノ水素化ホウ素ナトリウムで処理した。反応用バイアルをゴム製中隔で蓋留めし、混合物を２０℃で２４時間攪拌した。この２４時間の攪拌終了後に、１００ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを加え、混合物をさらに２２時間攪拌した。その後、透明な溶液を、３０ｋＤａ  Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）１５型限外濾過遠心分離器を用いて４，７５０×ｇ／３０分／１０℃で濾過した。残留物をフィルタ上で１回につき１２ｍｌの水で４回洗浄し、最終的な濃縮物を凍結乾燥すると、５７３ｍｇの白色粉末が得られた。
【０１０８】
〔元素分析〕
Ｃ４５．０１％、Ｈ６．４０％、Ｎ２．１１％であった。
【０１０９】
〔（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン−ＢＳＡ接合体の、ＤＥＡＥセルロースイオン交換クロマトグラフィーによる分離〕
未精製の上記接合体（４００ｍｇ）を５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（５ｍｌ）に溶かした溶液を、５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４に溶かした５０ｇのＤＥＡＥセルロースを含有する２×５５ｃｍのガラス製クロマトグラフィー用カラムの最上部に導入した。溶出には、様々な濃度のＮａ２ＨＰＯ４を使用した。具体的には、４０．１ｍｇの（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン（２２０ｍｌ、５ｍＭ）と、１３２．３ｍｇの純粋（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン−ＢＳＡ接合体（２８０ｍｌ、５５ｍＭ）と、９６．７ｍｇのＢＳＡ（８０ｍｌ、１００ｍＭ）とを用いた。純粋（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン−ＢＳＡ接合体の溶液を、３０ｋＤａ  ＡＭＩＣＯＮ１５型限外濾過遠心分離器を用いて体積が２ｍｌになるまで濃縮し、脱イオン水で洗浄し、凍結乾燥すると、１３２．３ｍｇ（全収率は２４．４％）の白色粉末状の生成物が得られた。ゲル電気泳動を実施すると、クマシーブルー（Ｃｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）およびＰＡＳ染色によって、約１７０ｋＤａを中央にして広いバンドが存在することが示された。電気泳動図では、遊離ＢＳＡなどの不純物が全く検出されなかった。
【０１１０】
〔元素分析〕
Ｃ４０．１１％、Ｈ６．２３％、Ｎ３．０６％（ＢＳＡの２０．４４ｗ％）であった。計算によって求めたβ−グルカン：ＢＳＡの比は４：１であった。
【０１１１】
〔実施例３〕
〔多クローン性抗体の調整および精製〕
〔抗原の調製およびウサギの免疫化〕
実施例２の記載のように調製したＢＳＡ接合抗原（１０ｍｇ）を凍結乾燥し、４℃で保存し、３羽のウサギの免疫化に使用した（１回の免疫化について抗原２００μｇ）。免疫化プロトコールを表１に列挙する。
【０１１２】
【表１】
2013532276.tif 000002
【０１１３】
〔多クローン性抗体の親和相の精製〕
１ｇのエポキシ活性化アガロース（Ｓｉｇｍａ社、Ｅ６６３２）を、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（２７ｍｌ）に溶かしたＢＳＡ（２．６８ｇ）（ＳＩＧＭＡ社、Ａ２１５３）の溶液中に懸濁し、混合物を氷水浴中で４℃で４時間攪拌した。この４時間の攪拌終了後に、混合物を２５００×ｇ／５分／１０℃で遠心分離し、ペレットを洗浄し、各回について３０ｍｌの１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／０．０５ｗ％のＮａＮ３を用いてさらに４回遠心分離した。
【０１１４】
ＢＳＡでコーティングされた親和相（前述）の最終回の遠心分離で得られたペレットを、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／０．０５ｗ％のＮａＮ３（２０ｍｌ）に溶かした（「可溶性」グルカン−ＢＳＡ接合体で免疫済みのウサギから収集した）７５０μｌの血清の溶液中に懸濁し、２時間室温で転動（ｔｕｍｂｌｉｎｇ）し、そして１５００×ｇ／５分／１０℃で遠心分離した。上清を収集し、ペレットを２０ｍｌの同じバッファでさらに３回洗浄すると、さらに３つの上清が得られた。これらの上清を、図２に示すように、ＢＳＡおよび「可溶性」グルカンに対する特異性について精査した。多量の量抗体を含有する第１および第２の上清をともにプールし、１０ｋＤａ  ＡＭＩＣＯＮ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅを用いて５０００×ｇ／５分／１０℃で遠心分離することによって、体積が２．５ｍｌになるまで濃縮した。濃縮物をフィルタ上で１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／０．０５ｗ％のＮａＮ３を用いて洗浄し、同じバッファで体積が６ｍｌ（６ｇ）になるまで希釈した。この「親和性精製済み抗体」を１：８００に希釈した溶液を、動物飼料におけるＭＹＣＯＳＯＲＢのＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用した。得られた較正曲線を図３に示す。
【０１１５】
〔実施例４〕
〔ＥＬＩＳＡによる酵母細胞壁の（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカンの検出〕
〔物質および方法〕
〔試薬〕
特に明記しないかぎり認められている分析グレードの試薬を、脱イオン化または脱塩した水または等価の純度の水を使用した（１８，２ＭΩ／ｃｍ、２５℃）。
【０１１６】
試薬および試薬液の調製は、以下のようである。
・  塩酸、１２．１ＮのＨＣｌ
・  希塩酸、１ＮのＨＣｌ。１２１ＮのＨＣｌ（４１．３ｍｌ）を、４００ｍｌの脱イオン水にゆっくりと加え、攪拌プレート上で攪拌棒を用いて冷めるまで混合した。この溶液を５００ｍｌのメスフラスコに移し替え、脱イオン水で体積を調整し、その後、室温で保存した。
・  ジメチルスルホキシド。使用したＤＭＳＯは高純度であり、分光光度法、液体クロマトグラフィー、および、ガスクロマトグラフィーに適している。
・  抽出用試薬。抽出用試薬を調製するために、９００ｍｌのＤＭＳＯを、９８．７５ｍｌの脱イオン水および１．２５ｍｌのＨＣｌ（１２，１Ｎ）に混合した。この溶液を、攪拌プレート上で攪拌棒を用いて中程度の速度および室温で混合し、その後、２０℃以上で保存した。
・  塩化ナトリウム（「ＮａＣｌ」）
・  塩化カリウム（「ＫＣｌ」）
・  リン酸水素二ナトリウム（「Ｎａ２ＨＰＯ４」）
・  リン酸二水素カリウム（「ＫＨ２ＰＯ４」）
・  リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）（１０×）。１０×のＰＢＳを調製するために、８０．０ｇの塩化ナトリウム［ＮａＣｌ］と、２．０ｇの塩化カリウム［ＫＣｌ］と、１４．２ｇのリン酸水素二ナトリウム［Ｎａ２ＨＰＯ４］と、２．４ｇのリン酸二水素カリウム［ＫＨ２ＰＯ４］とを、約８００ｍｌの脱イオン水に混ぜた。この溶液を、固形物が完全に溶解するまで、攪拌プレート上で攪拌棒を用いて攪拌した。溶液を１０００ｍｌのメスフラスコに移し替え、脱イオン水で体積を調整し、その後、室温または２℃〜８℃で保存した。最長保存期間は、２℃〜８℃で無希釈液体として６ヶ月であった。溶液は、使用前に室温まで暖めた。
・  希釈ＰＢＳ（１×）。１×のＰＢＳを調製するために、１０×、１体積のＰＢＳを９体積の脱イオン水で希釈した。この希釈物を攪拌プレート上で攪拌棒を用いて中程度の速度および室温で混合した。最長保存期間は１日であった。
・  ポリソルベート２０
・  ０．０５％のポリソルベート２０（ｐＨ値７．４）を用いた０．０１Ｍのリン酸緩衝食塩水。これを調製するために、１つのパウチの中味を、１０００ｍｌの脱イオン水中に溶解させた。この溶液を、完全に溶解するまで攪拌プレート上で攪拌し、その後、室温または２℃〜８℃で保存した。最長保存期間は、２℃〜８℃で無希釈液体として６ヶ月であった。溶液は、使用前に室温まで暖めた。
・  乾燥脱脂乳
・  ＰＢＳ中の乾燥脱脂乳が３％（ｗ／ｖ）の（１×）遮断薬。１×の遮断薬を調製するために、使用に先立って、乾燥乳を１×のＰＢＳ中に完全に溶解させた。各プレートを遮断するために、１０ｍｌの体積が必要であった。最長保存期間は１日であった。
・  ウサギ多クローン性抗体、一次抗体（抗体溶液１）。本明細書に記載するように調製した親和性精製済み抗体。使用するまで−８０℃で保存した。
・  希釈済みウサギ多クローン性抗体溶液。１μｌの抗体溶液１を１×のＰＢＳ（Ｘｉμｌ）に加えることによって、ＰＢＳ中で１：Ｘｉに希釈した。各マイクロタイタープレートについて、１０ｍｌの体積の溶液が必要であった。希釈済み抗体溶液を、使用前によく混合し、過剰な希釈済み抗体を捨てた。最長保存期間は１日であった。
・  ペルオキシダーゼ接合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  抗Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）、ＨＲＰ二次抗体、参照番号１１１−０３５−０４５（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＰＡ，米国、抗体溶液２）。１．５ｍｌの脱イオン水で再水和し、完全に透明な溶液が得られるまで遠心分離した。使用するまで、１０μｌの部分標本として−８０℃で保存した。最長保存期間は、２℃〜８℃で無希釈液体として６週間であった。
・  希釈済みのヤギの抗ウサギ抗体。１μｌの抗体溶液２を１×のＰＢＳ（Ｙｉμｌ）に加えることによって、ＰＢＳ中で１：Ｙｉに希釈した。希釈済み抗体溶液を、使用前によく混合し、過剰な希釈済み抗体を捨てた。最長保存期間は１日であった。
・  ＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ  マイクロウェル・ペルオキシダーゼ基質。必要な体積を、アンバーＮａｌｇｅｎｅ  ＨＤＰＥおよびＬＤＰＥのボトルだけに再分注した。基質は、使用前に室温まで暖めた。蓋はぴったりと閉鎖したままにして、光から保護した。過剰な基質を捨て、試薬を２℃〜８℃で保存した。最長保存期間は、８℃で保存した場合、製造日から２４ヶ月であった。
・  ＭＹＣＯＳＯＲＢ貯蔵物の試料、バッチ番号２８５９６５（ＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．社、ＫＹ、米国）。均質なＭＹＣＯＳＯＲＢ試料を使用した。
・  一般動物用飼料におけるＭＹＣＯＳＯＲＢの希釈物。２５０ｍｌの遠心分離用ボトル中で、２０ｇの飼料物質とＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物とを、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の量を増やしながら（０．０１ｇ、０．０２ｇ、０．０８ｇ、０．１０ｇ、０．１２ｇ）混合した。これらの混合物は、検量線を生成できるように３部作製した。このボトルを、オービタルシェーカーを用いて４００ｒｐｍで１時間振盪した。飼料物質の重量を測定する精度は±０．０２５ｇに等しく、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物については±０．００５ｇに等しかった。
・  一般動物用飼料中の大バッチの希釈済みＭＹＣＯＳＯＲＢ。飼料中の希釈済みＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の大きな試料を、１．２ｇのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と３００ｇの飼料物質とを用いて、１０００ｍｌの容器中で調製した。ボトルを、オービタルシェーカーを用いて４００ｒｐｍで１時間振盪した。飼料物質中のＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の最終濃度は４．０ｋｇ／Ｔであった。大バッチ（３００．０ｇ）の飼料とＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物との均質化した混合物（２０．０ｇ）を、２５０ｍｌの遠心分離用ボトルに移し替えた。この移し替えをさらに９回繰り返して、１０個の複製試料を得た。混合物は、３つの部分標本を調製するたびに間欠的に振盪して、生成物がボトルの底に沈殿することを防止した。飼料物質の重量を測定する精度は±０．０２５ｇに等しく、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の場合は±０．００５ｇに等しかった。
・  一般動物用飼料中の未知量のＭＹＣＯＳＯＲＢの希釈物。未知量のＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と２０．０ｇ（±０，０２５ｇ）の飼料物質とを５つの遠心分離用ボトル（各２５０ｍｌ）それぞれに移し替えることによって、未知の試料を調製した。ボトルを、４００ｒｐｍで１時間オービタルシェーカーを用いて振盪した。同時に、試料の検量線の試行作成を完了した。
【０１１７】
〔試料の配合〕
アッセイが正しく行われるように、３つの飼料物質（表４、表５、および、表６を参照）を使用した。飼料物質の配合法は、当該技術分野において見られる組成物に合わせて選択した。試料のサイズは、研究室へ送る前に慎重に均質化した飼料物質が合計１５ｋｇであった。研究期間全体を通して、試料を２℃〜８℃で保存した。
【０１１８】
〔試料の均質性の保証〕
飼料中の大バッチの希釈済みＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物を、飼料中のＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の濃度を中程度の４．０ｋｇ／Ｔとして調製することによって、飼料物質中のＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の希釈の均質性を保証した。この試料を１０個の副試料に分割し、上記抽出手順にしたがってさらに抽出した。続いて、１０個の試料それぞれについてＥＬＩＳＡアッセイを４回実施することによって、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物を検出するための変動係数を決定した。
【０１１９】
〔試料の調製〕
標準試料を本明細書に記載するように調製した。調製法については、検査対象となるＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物とともに表２に示す。この場合、本明細書に記載するように、最初の貯蔵物を基準とした。未知の試料を前述の通り調製した。飼料の試料は、抽出手順を実施する前に粉砕することが必要であった（飼料物質がペレット状で提供されていれば、同様に粉砕することが必要になる）。飼料物質を粉砕すると、アッセイの最終的な信頼性に影響することがわかった。
【０１２０】
【表２】
2013532276.tif 000003
【０１２１】
〔抽出手順〕
全ての組のボトルを、オービタルシェーカーを用いて４００ｒｐｍで１時間振盪した。一度に３本のボトルを取り出し、ボトル最上部の容積測定用ディスペンサーを用いて、抽出用試薬（体積８０ｍｌ）を各ボトルに加えた。抽出用試薬がしっかりと完全に混合されるように、全ボトルに蓋をした。全ての試料を手で振盪した。飼料の溶液がしっかりと完全に浸されるように、全ボトルをサーモスタットで８０℃に維持された水浴中に１時間置いた。インキュベーション後に、ボトルを水浴から取り出し、ボトルの中味を、高トルクラボ攪拌機を用いてロッド（ＮＡＬＧＥＮＥ（商標））で混合した。混合物は完全に均質化された。各ＭＹＣＯＳＯＲＢ含有レベルおよび各未知試料について、きれいなロッドを１本ずつ使用した。ボトルを、サーモスタットで８０℃に維持された水浴中に１時間置いた。インキュベーション後に、ボトルを水浴から取り出し、ボトル最上部の容積測定用ディスペンサーを用いて各ボトルに８０ｍｌの脱イオン水を加え、次に、ボトルに蓋をした。完全に混合するまで、ボトルを手で振盪した。この際、必要に応じて、ロッド（ＮＡＬＧＥＮＥ（商標））を高トルクラボ攪拌機とともに使用した。ボトルを８，０００ｇで１０分間の遠心分離にかけた。ガラス製ピペットを用いて、約１０ｍｌの上清を１５ｍｌの遠心分離用無菌チューブへ移し替えた。チューブを４，０００ｇで１０分間遠心分離し、適切に標識した新しい１５ｍｌの遠心分離用無菌チューブに、デカントすることによって移し替えた。ＥＬＩＳＡアッセイに使用するまで、チューブを−２０℃で一晩保存した。
【０１２２】
〔ＥＬＩＳＡ手順〕
ＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ  マイクロウェル・ペルオキシダーゼ基質を使用して、希釈済みＨＲＰ二次抗体との反応を介して比色分析反応をトリガーし、さらに、マイクロタイタープレート上に固定された希釈済みＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物から抽出した、注目している基質と特異的に反応する希釈済み一次抗体自身と反応させた。比色分析反応を最後は２０分後に１ＮのＨＣｌを用いて停止させて、吸光度を、プレート読み取り装置を用いて４５０ｎｍの波長で読み取った。したがって、飼料マトリクスから発生して分光光度計上でバックグラウンドシグナルを与える可能性がある、比色分析のばらつきを考慮するために、飼料物質だけを含有するブランクについて測定を行った。計算には、ブランク値を、各試料から得られる吸光度の値から減じた。
【０１２３】
先に抽出して一晩保存した試料を解凍し、室温まで暖めた。マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするために、ＥＬＩＳＡにおいて使用する前に均質な試料を確実に作製しておけるよう、各試料をボルテックスした。
【０１２４】
各複製試料について、表３に示すように、９６個のウェルを有するマイクロタイタープレート上の３つの各ウェルに、上清を１００μｌずつ移し替えた。プレート上の試料のランダムな分散配置は、プログラム済みのロボット化されたマイクロタイターウェルディスペンサーを備えた研究室で実施してもかまわない。検量線試料および複製試料を、全て、同じ１つのプレート上に分散配置した（つまり、全ての０ｋｇ／Ｔ複製試料を列／行Ｅ１〜Ｆ１０にセットした）。未知のＭＹＣＯＳＯＲＢ複製試料を同じプレート上に分散配置した（つまり、列／行Ａ１１〜Ｃ１２にセットした）。これらのマイクロタイタープレートをミクロプレート用粘着フィルムで封止し、３７℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートの各ウェル内の溶液を取り除き、２５０μｌのＰＢＳ（１×）に置き換えて、１回洗浄した。このオペレーションを合計でさらに２回繰り返した。マイクロタイタープレートの各ウェルを、ＰＢＳ溶液に溶かした希釈済み脱脂乳１００μｌで遮断し、室温で１時間インキュベーションした。インキュベーション後に、各ウェル内の溶液を取り除き、２５０μｌのＰＢＳ（１×）に置き換えて１回洗浄し、続いて、ポリソルベート２０を０．０５％含有する２５０μｌのＰＢＳに置き換えて２回洗浄した。
【０１２５】
体積が１００μｌの希釈済み一次抗体を、各ウェルに加えた。マイクロタイタープレートを、室温で１時間インキュベーションした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートの各ウェル内の溶液を取り除き、ポリソルベート２０を０．０５％含有する２５０μｌのＰＢＳ（１×）に置き換えて３回洗浄した。
【０１２６】
体積が１００μｌの希釈済み二次抗体を、各ウェルに加えた。マイクロタイタープレートを、室温で１時間インキュベーションした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートの各ウェル内の溶液を取り除き、ポリソルベート２０を０．０５％含有する２５０μｌのＰＢＳ（１×）に置き換えて３回洗浄した。
【０１２７】
体積が１００μｌのＴＭＢ基質を予め室温まで暖めておき、これを各ウェルに加え、マイクロタイタープレートを室温で２０分間インキュベーションした。ＴＭＢ基質を用いてちょうど２０分後に、体積が１００μｌのＨＣｌ（１Ｎ）をただちに各ウェルに加えて、比色分析反応の進行を停止させた。各マイクロタイタープレートを、マイクロタイタープレート読み取り装置を用いて４５０ｎｍで読み取った。
【０１２８】
【表３】
2013532276.tif 000004
【０１２９】
〔複製試料からのデータの排除〕
次式で定義されるディクソンのＱ検定をパスせず、その結果、異常値であると特定される複製試料を除けば、全ての複製試料が類似性を有することを保証するために、統計学的なデータ解析が必要であった。
Ｑｎ＝｜ｘｂ−ｘａ｜／Ｒ
ただし、Ｒは全てのデータ点の範囲であり、ｘａは異常値ではないかと疑われるデータ点であり、ｘｂはｘａに最も近いデータ点である。Ｑｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ＞  Ｑｔａｂｌｅであれば、疑わしい点を９５％の信頼区間で棄却する。
【０１３０】
〔検量線の作成〕
較正曲線を使用して定量化を行った。較正曲線は、上記Ｃｏｕｎｃｉｌによる指示９６／２３に記載されているように、生成物の機能範囲内の少なくとも５つのレベル（ゼロを含む）を用いて、各飼料マトリクスについて作成する。各試料群の場合について、ＯＤ４５０での３個のウェルの吸収度の平均値を算出した。ブランク飼料の試料の場合については、ＯＤ４５０での１０個のウェルの吸収度の平均値を算出した。次に、縦軸上で得られる差ΔＯＤ４５０（ＯＤ４５０の試料群−ＯＤ４５０のブランク飼料）と、横軸上の互いに異なるＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の濃度の各範囲（０．５、１．０、４．０、５．０、６．０ｋｇ／Ｔ）とを用いて、検量線（つまり較正曲線）を作成した。
【０１３１】
平均のブランク値によって値を補正した後に、最もよく一致する線ΔＯＤ４５０＝Ａｘ（ＭＹＣＯＳＯＲＢ）を用いて、ＯＤ４５０での吸収度に対してプロットした含有レベルの回帰係数および等式を、直線回帰にしたがって算出した。較正曲線の受容可能範囲および直線性を、０．９５より大きな相関係数（ｒ２）値によって検証した。次に、較正曲線に対応する等式を解くことによって、未知の試料中のＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の含有レベルを求めた。
【０１３２】
〔内挿〕
ｒ２＞０．９５となる相関係数が検量線に見られる場合には、補正した曲線に対応する等式Ｆ（ｘ）＝Ａｘ（バックグラウンドシグナルから減算され、ゼロと交わる）を使用して、未知の試料中のＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の含有レベルを求める。ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の未知の含有レベルについてのＯＤ４５０での１０個の平均値（Ｃ）を算出する。先に算出したブランク飼料の試料については、得られた平均値を、ＯＤ４５０での１０個のウェルの吸収度の平均値から減じる。次に、ＯＤ４５０での平均値を使用して、補正した曲線の等式Ｆ−１（ｙＣ）（ただし、ｙＣ＝ＡｘＣであり、ｘＣ＝ｙＣ／Ａ。ただし、ｙＣは、未知の試料についてのＯＤ４５０で得られる平均値（Ｃ）からブランクのＯＤ４５０で得られる平均値を引いた値であり、ｘＣは、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の対応する含有レベルであり、Ａは、ｋｇ／Ｔ  ＯＤ４５０で表した検量線の勾配である）を解く。
【０１３３】
〔検出限界および定量化限界〕
検出限界（ＬＤ＝３σｂｌａｎｋ）および定量化限界（ＬＱ＝１０σｂｌａｎｋ）を、ＩＵＰＡＣの命名法にしたがって測定し、ΔＯＤ４５０とする。
【０１３４】
検出限界（ＬＤ）および定量化限界（ＬＱ）をマトリクスのブランクの分析から求め、これから、次式にしたがって解いた較正曲線Ｆ（ｘ）＝Ａｘを利用して、平均バックグラウンドＯＤ４５０値から補正した直線回帰に基づいて濃度を算出した。
ＬＤ＝３σblank／Ａ
ＬＱ＝３σblank／Ａ
ただし、ＬＤは、生成物の最小検出可能濃度、つまり、検出限界であり、ＬＱは、生成物の最小定量化濃度、つまり定量化限界である。
【０１３５】
〔均質性〕
均質性の変動係数（ＲＳＤＨ＝ＣＶＨ）を、同じ日に同じ技師によって同じ設備および方法を用いて同じ試料から得られる、１０個の独立した複製試料の平均の変動係数として定義した。
【０１３６】
〔精度、反復率〕
ラン内併行精度（ＲＳＤｉｎｔｒａ＝ＣＶｉｎｔｒａ）を、同じ日に同じ技師によって同じ設備および方法を用いて同じランに対して同じ試料から得られる、反復の平均の変動係数として定義した。
【０１３７】
ラン間併行精度（ＲＳＤＩｎｔｅｒ＝ＣＶＩｎｔｅｒ）とは、異なる日に同じ技師によって同じ設備および方法を用いて異なるランで同じ試料から得られる、独立した複数結果の平均の変動係数である。
【０１３８】
〔精度、全体的な精度〕
精度によって、同一量の連続測定間の一致度の分散（つまり、近さ）が評価できる。１組の測定値における分散（近さ）は、通常標準偏差で表現される。したがって、同じ試料から同じ日に同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られる単一の含有レベルにおける個々の単一の実験の標準偏差、および、同じ技師によって同じ設備および方法を用いて個々のランを比較する標準偏差から、次式を用いて、精度を算出した。
【０１３９】
【数１】
2013532276.tif 000005
【０１４０】
ただし、σＴｏｔａｌは実験全体の集合の標準偏差であり、σｉｎｔｒａは個々の単一の実験の標準偏差であり、σＩｎｔｅｒは複数の実験間の標準偏差であり、ｎは複製数である。
【０１４１】
グループの平均値の分散とグループ内の分散の平均値との間で、Ｆ検定（ｐ値≦０．０５）を用いた分散分析（一方向ＡＮＯＶＡ）によって、標準偏差の比較を行った。
【０１４２】
〔正確さ〕
正確さとは、検査結果と測定対象である生成物の受容されている基準値との間で見られる一致の近さである。したがって、百分率で表した回収率の測定値から、正確さを評価した。この点で、回収率は、抽出されて測定に利用可能な、分析物中に存在している、または、混合された分析物の量の比率を表している。バイアスとは、検査結果と受容される基準値（分析物の添加濃度）との差である。計算は次式にしたがって実施した。
回収率（％）＝１００×（Ｘｃ−Ｘｂ）／ＸＴＨ
ただし、Ｘｃは、添加試料において測定された濃度であり、Ｘｂは非添加試料（ブランク）において測定された濃度であり、ＸＴＨは理論濃度である。
【０１４３】
〔検証検査に使用する飼料物質〕
ＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．社（ＫＹ、米国）にあるＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎにおいて、飼料物質と様々な含有レベルのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物とを混合した、乳業用飼料配合物、ニワトリ用飼料配合物、および、ブタ用飼料配合物について、検査を実施した。飼料配合物の詳細な説明については後述する。
【０１４４】
〔乳業用飼料物質〕
飼料物質は、Ｃｏｒａｌｉｓ  Ｖｅｒｎ社（Ｖｅｒｎ  ｓｕｒ  Ｓｅｉｃｈｅ，Ｆｒａｎｃｅ，参照番号１１１６０５）の"Ｓｐｉｒｉｔ  Ｌａｉｔ  ２Ｌ５"という名称の配合物を用意した（表４）。試料のサイズは、全体で飼料物質が１５ｋｇであり、研究室へ送る前に、この飼料物質を慎重に均質化した。試料は、研究期間全体を通して２℃〜８℃で保存した。乳業用飼料物質は、ペレット状の形態で提供した。抽出手順を実施する前に飼料の試料を粉砕する必要はなかった。
【０１４５】
【表４】
2013532276.tif 000006
【０１４６】
〔ニワトリ用飼料物質〕
飼料物質は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＫｅｎｔｕｃｋｙとＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．社（ＫＹ、米国）との共同研究機関であるＣｏｌｄｓｔｒｅａｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｅｎｔｕｃｋｙにおいて配合した（表５）。調製は、当該技術分野において見られ、ヨーロッパ共同体、北アメリカ、ラテンアメリカなどにおいて一般に見られる配合物に対して一般化可能な組成物に合わせて行った。試料のサイズは、全体で飼料物質が１５ｋｇであり、研究室へ送る前に、この飼料物質を慎重に均質化した。試料は、研究期間全体を通して、２℃〜８℃で保存した。
【０１４７】
【表５】
2013532276.tif 000007
【０１４８】
〔ブタ用飼料物質〕
飼料物質は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＫｅｎｔｕｃｋｙとＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．社（ＫＹ、米国）との共同研究機関であるＣｏｌｄｓｔｒｅａｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｅｎｔｕｃｋｙにおいて配合した（表６）。調製は、当該技術分野において見られ、ヨーロッパ共同体、北アメリカ、ラテンアメリカなどにおいて一般に見られる配合物に対して一般化可能な組成物に合わせて行った。試料のサイズは、全体で飼料物質が１５ｋｇであり、研究室へ送る前に、この飼料物質を慎重に均質化した。試料は、研究期間全体を通して、２℃〜８℃で保存した。
【０１４９】
【表６】
2013532276.tif 000008
【０１５０】
〔乳業用飼料物質を用いた検証〕
ＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．社（ＫＹ、米国）にあるＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎにおいて、固形のヨーロッパタイプの乳業用飼料配合物と５つの異なる濃度のＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物との混合物について、検査を実施した。
【０１５１】
同じマイクロタイタープレート上に分散配置した場合について、それぞれ０．０ｋｇ／Ｔ、０．５ｋｇ／Ｔ、１．０ｋｇ／Ｔ、４．０ｋｇ／Ｔ、５．０ｋｇ／Ｔ、６．０ｋｇ／ＴのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と混合した各乳業用飼料物質を、未知のレベルのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と混合した同じ乳業用飼料物質の試料とともに分析した。
【０１５２】
〔適応可能性〕
複合一般動物用飼料におけるＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物を追跡することを目的とするトレーサビリティのエンドポイント過程として、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物および代替物の特異的な分析を実施するために開発されたＥＬＩＳＡアッセイの特性を確定するために、検証を行った。
【０１５３】
検証には、飼料の試料と混合する含有レベル（０．０ｋｇ／Ｔ、０．５ｋｇ／Ｔ、１．０ｋｇ／Ｔ、４．０ｋｇ／Ｔ、５．０ｋｇ／Ｔ、６．０ｋｇ／Ｔ）の機能範囲に対応する６つのレベルのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物を使用した。
【０１５４】
希釈済みウサギ多クローン性抗体溶液。一次抗体の希釈物を、バックグラウンドレベルに合わせて調整した。１μｌの抗体溶液＃１を１．２ｍｌのＰＢＳ（１×）に加えることによって、抗体をＰＢＳ中で１：２，５００まで希釈した。各マイクロタイタープレートには、体積が１０ｍｌの溶液が必要であった。
【０１５５】
希釈済みヤギの抗ウサギ抗体。二次抗体の希釈物を、バックグラウンドレベルに合わせて調整した。１μｌの抗体溶液＃２を２０．０ｍｌＰＢＳ（１×）に加えることによって、抗体をＰＢＳ中で１：２０，０００まで希釈した。
【０１５６】
〔均質性〕
試料の均質性の検証を、実験計画において、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の含有レベルの中央値（４．０ｋｇ／Ｔ）について行った。この特定のレベルについてのアッセイを、各試料について４つの複製を用いて、１０個の各試料に対して５回繰り返した。
【０１５７】
表７に詳細を示した算出値によれば、ＣＶＨは４．５３％であった。
【０１５８】
【表７】
2013532276.tif 000009
【０１５９】
〔較正〕
本明細書に記載する既知の標準試料濃度で、０．０ｋｇ／Ｔ〜６．０ｋｇ／Ｔの範囲のＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と混合した飼料に対して、アッセイの較正を行った。線形曲線近似（ｌｉｎｅａｒ  ｃｕｒｖｅ  ｆｉｔ）（ｙ＝Ａｘ）を利用して、濃度と応答性（ＯＤ４５０）との間の関係を規定した。５回のランから得られた平均検量線を図４に示す。
【０１６０】
〔線形性〕
ブランクを減算した後に、ＯＤ４５０での吸収度に対してプロットした含有レベルの等式にしたがって、切片がゼロである最もよく一致する線（ΔＯＤ４５０＝Ａｘ（ＭＹＣＯＳＯＲＢ））を用いて、回帰係数の計算から、検量線の線形性を評価した。ｒ２が０．９５を超える場合の相関係数の値を用いて、検量線の線形性を検証する（表８）。
【０１６１】
【表８】
2013532276.tif 000010
【０１６２】
〔反復率〕
反復率は、反復率の標準偏差の評価による内部分散の尺度である。同一ランの反復中における反復率の評価は、同じ試料から同じ日に同じランに対して同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、１ラン内の検出のばらつきＣＶｉｎｔｒａを表す（表９）。異なるラン間の反復率の評価は、同じ試料から異なる日に異なるランで同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、ラン間の検出のばらつきＣＶＩｎｔｅｒを表す（表１０）。
【０１６３】
結果は、０．０ｋｇ／Ｔ〜６．０ｋｇ／Ｔの検量線機能範囲に適用される場合、同じ日に得られる検量線も異なる日に得られる検量線もほとんどばらつきがなく、平均日内精度が５．７０％であり、日間精度が７．８６％であることを示している。全体的な精度は８．２８％であった（表１１）。
【０１６４】
【表９】
2013532276.tif 000011
【０１６５】
【表１０】
2013532276.tif 000012
【０１６６】
【表１１】
2013532276.tif 000013
【０１６７】
〔ＬＤおよびＬＱ（感度）〕
ＬＤ値およびＬＱ値を表１２に記載する。得られた各ＬＱ値は、飼料物質における定量化が可能になる、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の最小推奨含有率（２ｋｇ／Ｔ）より低かった。
検出限界    ＬＤ＝０．５０１±０．１０３ｋｇ／Ｔ
定量化限界  ＬＱ＝１．８００±０．３８９ｋｇ／Ｔ
【０１６８】
【表１２】
2013532276.tif 000014
【０１６９】
〔正確さ〕
飼料物質と混合した、濃度が４．０ｋｇ／ＴであるＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物について、各回につき１０個の独立した試料を用いてそれぞれ４つの複製試料において実施した５回の独立した実験から、正確さを測定した。各試料の最終濃度を、上記等式にしたがって、均質性を計算するために得られる観測値を用いて算出した（表１３）。次に、全てのランについて得られる平均の正確さから平均精度を算出し、飼料物質と混合した添加濃度が４．０ｋｇ／ＴのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と比較した。この一連の計算は、上記等式にしたがって実施した。
【０１７０】
結果は、回収率の評価が、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の添加濃度中における飼料物質の実際の含有率を２１％過剰評価する原因となったことを示している（表１４）。
【０１７１】
【表１３】
2013532276.tif 000015
【０１７２】
【表１４】
2013532276.tif 000016
【０１７３】
〔ニワトリ用飼料物質を用いた検証〕
ＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．社（ＫＹ、米国）にあるＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎにおいて、固形のニワトリ用飼料配合物と５つの異なる濃度のＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物との混合物について、検査を実施した。
【０１７４】
同じマイクロタイタープレート上に分散配置した場合について、それぞれ０．０ｋｇ／Ｔ、０．５ｋｇ／Ｔ、１．０ｋｇ／Ｔ、４．０ｋｇ／Ｔ、５．０ｋｇ／Ｔ、６．０ｋｇ／ＴのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と混合したニワトリ用飼料物質を、未知のレベルのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と混合した同じニワトリ用飼料物質の試料とともに分析した。
【０１７５】
〔適応可能性〕
複合一般動物用飼料におけるＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物を追跡することを目的とするトレーサビリティのエンドポイント過程として、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物および代替物を分析するために開発されたＥＬＩＳＡアッセイの特性を確定するために、検証を行った。
【０１７６】
検証には、飼料の試料と混合する含有レベル（０．０ｋｇ／Ｔ、０．５ｋｇ／Ｔ、１．０ｋｇ／Ｔ、４．０ｋｇ／Ｔ、５．０ｋｇ／Ｔ、６．０ｋｇ／Ｔ）の機能範囲に対応する６つのレベルのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物（参照番号２８５９６５）を使用した。
【０１７７】
希釈済みウサギ多クローン性抗体溶液。一次抗体の希釈物を、バックグラウンドレベルに合わせて調整した。１μｌの抗体溶液＃１（４．１５）を７．５ｍｌのＰＢＳ（１×）に加えることによって、抗体をＰＢＳ中で１：７，５００まで希釈した。各マイクロタイタープレートには、体積が１０ｍｌの溶液が必要であった。
【０１７８】
希釈済みヤギの抗ウサギ抗体。二次抗体の希釈物を、バックグラウンドレベルに合わせて調整した。１μｌの抗体溶液＃２を３０．０ｍｌのＰＢＳ（１×）に加えることによって、抗体をＰＢＳ中で１：３０，０００まで希釈した。
【０１７９】
〔均質性〕
試料の均質性の検証を、実験計画において、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の含有レベルの中央値（４．０ｋｇ／Ｔ）について行った。この特定のレベルについてのアッセイを、各試料について４つの複製を用いて、１０個の各試料に対して５回繰り返した（表１５）。
【０１８０】
【表１５】
2013532276.tif 000017
【０１８１】
〔較正〕
既知の標準試料濃度で、０．０ｋｇ／Ｔ〜６．０ｋｇ／Ｔの範囲のＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と混合した飼料に対して、アッセイの較正を行った。線形曲線近似（ｙ＝Ａｘ）を利用して、濃度と応答性（ＯＤ４５０）との間の関係を規定した。５回のランから得られた平均検量線を図５にまとめる。
【０１８２】
〔線形性〕
ブランクを減算した後に、ＯＤ４５０での吸収度に対してプロットした含有レベルの等式にしたがって、切片がゼロである最もよく一致する線（ΔＯＤ４５０＝Ａｘ（ＭＹＣＯＳＯＲＢ））を用いて、回帰係数の計算から、検量線の線形性を評価した。ｒ２が０．９５を超える場合の相関係数の値を用いて、検量線の線形性を検証する。各標準ラン曲線および平均標準ラン曲線について算出した回帰係数を、表１６に記載する。
【０１８３】
【表１６】
2013532276.tif 000018
【０１８４】
〔反復率〕
反復率は、反復率の標準偏差の評価による内部分散の尺度である。同一ランの反復中における反復率の評価は、同じ試料から同じ日に同じランに対して同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、１ラン内の検出のばらつきＣＶｉｎｔｒａを表す（表１７）。異なるラン間の反復率の評価は、同じ試料から異なる日に異なるランで同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、ラン間の検出のばらつきＣＶＩｎｔｅｒを表す（表１８）。
【０１８５】
結果は、同じ日に得られる検量線も異なる日に得られる検量線もほとんどばらつきがなく、平均日内精度が６．００％であることを示している。ただし、試料間の差は、０．０ｋｇ／Ｔ〜６．０ｋｇ／Ｔの検量線機能範囲に適用される場合、より顕著であり、日間精度は２１．５２％であり、全体的な精度は２１．７５％であった（表１９）。
【０１８６】
【表１７】
2013532276.tif 000019
【０１８７】
【表１８】
2013532276.tif 000020
【０１８８】
【表１９】
2013532276.tif 000021
【０１８９】
〔ＬＤおよびＬＱ（感度）〕
ＬＤ値およびＬＱ値を表２０に記載する。得られた各ＬＱ値は、飼料物質における定量化が可能になる、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の推奨含有率より低かった。
検出限界    ＬＤ＝０．５４７±０．２３７ｋｇ／Ｔ
定量化限界  ＬＱ＝１．８６４±０．８０６ｋｇ／Ｔ
【０１９０】
【表２０】
2013532276.tif 000022
【０１９１】
〔正確さ〕
飼料物質と混合した、濃度が４．０ｋｇ／ＴであるＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物について、各回につき１０個の独立した試料を用いてそれぞれ４つの複製試料において実施した５回の独立した実験から、正確さを測定した。各試料の最終濃度を、本明細書に記載するように、均質性を計算するために得られる観測値を用いて算出した（表２１）。次に、全てのランについて得られる平均の正確さから平均精度を算出し、飼料物質と混合した添加濃度が４．０ｋｇ／ＴのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と比較した。この一連の計算は、上記等式にしたがって実施した。
【０１９２】
結果は、回収率が、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の添加濃度中における飼料物質の実際の含有率を１８％過剰評価する原因となったことを示している（表２２）。
【０１９３】
【表２１】
2013532276.tif 000023
【０１９４】
【表２２】
2013532276.tif 000024
【０１９５】
〔ブタ用飼料物質を用いた検証〕
ＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．社（ＫＹ、米国）にあるＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎにおいて、固形のブタ用飼料配合物と５つの異なる濃度のＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物との混合物について、検査を実施した。
【０１９６】
同じマイクロタイタープレート上に分散配置した場合について、それぞれ０．０ｋｇ／Ｔ、０．５ｋｇ／Ｔ、１．０ｋｇ／Ｔ、４．０ｋｇ／Ｔ、５．０ｋｇ／Ｔ、６．０ｋｇ／ＴのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と混合したブタ用飼料物質を、未知のレベルのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と混合した同じブタ用飼料物質の試料とともに分析した。
【０１９７】
〔適応可能性〕
複合一般動物用飼料におけるＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物を追跡することを目的とするトレーサビリティのエンドポイント過程として、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物および代替物を分析するために開発されたＥＬＩＳＡアッセイの特性を確定するために、検証を行った。
【０１９８】
検証には、飼料の試料と混合する含有レベル（０．０ｋｇ／Ｔ、０．５ｋｇ／Ｔ、１．０ｋｇ／Ｔ、４．０ｋｇ／Ｔ、５．０ｋｇ／Ｔ、６．０ｋｇ／Ｔ）の機能範囲に対応する６つのレベルのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物を使用した。
【０１９９】
希釈済みウサギ多クローン性抗体溶液。一次抗体の希釈物を、バックグラウンドレベルに合わせて調整した。１μｌの抗体溶液＃１を３．５ｍｌのＰＢＳ（１×）に加えることによって、抗体をＰＢＳ中で１：３，５００まで希釈した。各マイクロタイタープレートには、体積が１０ｍｌの溶液が必要であった。
【０２００】
希釈済みヤギの抗ウサギ抗体。二次抗体の希釈物を、バックグラウンドレベルに合わせて調整した。１μｌの抗体溶液＃２を３０．０ｍｌのＰＢＳ（１×）に加えることによって、抗体をＰＢＳ中で１：３０，０００まで希釈した。
【０２０１】
〔均質性〕
試料の均質性の検証を、実験計画において、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の含有レベルの中央値（４．０ｋｇ／Ｔ）について行った。この特定のレベルについてのアッセイを、各試料について４つの複製を用いて、１０個の各試料に対して５回繰り返した（表２３）。
【０２０２】
【表２３】
2013532276.tif 000025
【０２０３】
〔較正〕
既知の標準試料濃度で、０．０ｋｇ／Ｔ〜６．０ｋｇ／Ｔの範囲のＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と混合した飼料に対して、アッセイの較正を行った。切片をゼロに設定した線形曲線近似（ｙ＝Ａｘ）を利用して、濃度と応答性（ＯＤ４５０）との間の関係を規定した、５回のランから得られた平均検量線を図６にまとめる。
【０２０４】
〔線形性〕
ブランクを減算した後に、ＯＤ４５０での吸収度に対してプロットした含有レベルの等式にしたがって、切片がゼロである最もよく一致する線（ΔＯＤ４５０＝Ａｘ（ＭＹＣＯＳＯＲＢ））を用いて、回帰係数の計算から、検量線の線形性を評価した。ｒ２が０．９５を超える場合の相関係数の値を用いて、検量線の線形性を検証する。各標準ラン曲線および平均標準ラン曲線について算出した回帰係数を、表２４に記載する。
【０２０５】
【表２４】
2013532276.tif 000026
【０２０６】
〔反復率〕
反復率は、反復率の標準偏差の評価による内部分散の尺度である。同一ランの反復中における反復率の評価は、同じ試料から同じ日に同じランに対して同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、１ラン内の検出のばらつきＣｉｎｔｒａを表す（表２５）。異なるラン間の反復率の評価は、同じ試料から異なる日に異なるランで同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、ラン間の検出のばらつきＣＶＩｎｔｅｒを表す（表２６）。
【０２０７】
結果は、０．０ｋｇ／Ｔ〜６．０ｋｇ／Ｔの検量線機能範囲に適用される場合、同じ日に得られる検量線も異なる日に得られる検量線もほとんどばらつきがなく、平均日内精度が７％であり、日間精度が２０％であることを示している。
【０２０８】
【表２５】
2013532276.tif 000027
【０２０９】
【表２６】
2013532276.tif 000028
【０２１０】
【表２７】
2013532276.tif 000029
【０２１１】
〔ＬＤおよびＬＱ（感度）〕
ＬＤ値およびＬＱ値を表２８に記載する。得られた各ＬＱ値は、飼料物質における定量化が可能になる、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の推奨含有率より低かった。
検出限界    ＬＤ＝０．４０３±０．１５０ｋｇ／Ｔ
定量化限界  ＬＱ＝１．３６３±０．４９８ｋｇ／Ｔ
【０２１２】
【表２８】
2013532276.tif 000030
【０２１３】
〔正確さ〕
飼料物質と混合した、濃度が４．０ｋｇ／ＴであるＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物について、各回につき１０個の独立した試料を用いてそれぞれ４つの複製試料において実施した５回の独立した実験から、正確さを測定した。各試料の最終濃度を、本明細書に記載するように、均質性を計算するために得られる観測値を用いて算出した（表２９）。次に、全てのランについて得られる平均の正確さから平均精度を算出し、飼料物質と混合した添加濃度が４．０ｋｇ／ＴのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と比較した。この一連の計算は、上記等式にしたがって実施した。
【０２１４】
結果は、回収率の評価が、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の添加濃度中における飼料物質の実際の含有率を２０％過剰評価する原因となったことを示している（表３０）。
【０２１５】
【表２９】
2013532276.tif 000031
【０２１６】
【表３０】
2013532276.tif 000032
【０２１７】
〔ニワトリ用飼料物質およびブタ用飼料物質を用いた検証〕
飼料のアッセイにおいてＭＹＣＯＳＯＲＢを検出するためのＥＬＩＳＡを、ニワトリのマトリクスおよびブタのマトリクスにおいて実施し、独立した研究室で検証し、検証結果と比較した。アッセイは、Ａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ，Ｌｔｄ．社（Ｋｏｓｋｅｌｏｎｔｉｅ  １９Ｂ，Ｅｓｐｏｏ、フィンランド）において検証した。
【０２１８】
アッセイの較正を、０．０ｋｇ／Ｔ〜６．０ｋｇ／Ｔの範囲の既知の標準試料濃度のＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と混合した飼料に対して異なる日に２回実施した。切片がゼロであるｙ＝Ａｘを用いた線形曲線近似を利用して、ブタ用飼料およびニワトリ用飼料における濃度と応答性（ＯＤ４５０）との間の関係を規定した。吸光度、および、その結果として得られる較正はラン毎に大幅に異なったが、既知の試料の絶対濃度および盲検試料の絶対濃度は同じである。
【０２１９】
〔線形性〕
ブランクを減算した後に、ＯＤ４５０での吸収度に対してプロットした含有レベルの等式にしたがって、切片がゼロである最もよく一致する線（ΔＯＤ４５０＝Ａｘ（ＭＹＣＯＳＯＲＢ））を用いて、回帰係数の計算から、検量線の線形性を評価した。ｒ２が０．９５を超える場合の相関係数の値を用いて、検量線の線形性を検証する。相関係数の範囲は０．９９１〜０．９９４であった（表３１）。
【０２２０】
【表３１】
2013532276.tif 000033
【０２２１】
〔ＬＤおよびＬＱ（感度）〕
ＬＤ値およびＬＱ値を、４０％の塩酸マトリクスにおいて求めた。ＬＤ値およびＬＱ値の各推定値は、それぞれ、ニワトリ用飼料と混合したＭＹＣＯＳＯＲＢの場合は０．３５ｋｇ／Ｔおよび１．２０ｋｇ／Ｔ、および、ブタ用飼料と混合したＭＹＣＯＳＯＲＢの場合は０．２７ｋｇ／Ｔおよび０．９１ｋｇ／Ｔであった（それぞれ表３２および表３３を参照）。
【０２２２】
【表３２】
2013532276.tif 000034
【０２２３】
【表３３】
2013532276.tif 000035
【０２２４】
〔「既知」の試料の正確さおよび精度〕
飼料物質と混合した、濃度が４．０ｋｇ／ＴであるＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物について、各回につき６つの複製試料において実施した２回の独立した実験から、正確さを測定した。全てのランについて得られる平均の正確さから平均精度を算出し、飼料物質と混合した添加濃度が４．０ｋｇ／ＴのＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物と比較した。
【０２２５】
得られた値は、後述するように、正確さおよび精度のどちらの判断基準も満たした。
【０２２６】
同一ランの反復中における反復率の評価は、同じ試料から同じ日に同じランに対して同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、１ラン内の検出のばらつきＣＶｉｎｔｒａを表す。異なるラン間の反復率の評価は、同じ試料から異なる日に異なるランで同じ技師によって同じ設備および方法を用いて得られ、ラン間の検出のばらつきＣＶＩｎｔｅｒを表す。
【０２２７】
得られた値は、後述するように、ニワトリ用マトリクスおよびブタ用マトリクスについて、正確さおよび精度のどちらの判断基準も満たした（表３４および表３５）。
【０２２８】
【表３４】
2013532276.tif 000036
【０２２９】
【表３５】
2013532276.tif 000037
【０２３０】
〔「未知」の試料の正確さおよび精度〕
飼料物質と混合した、濃度が４．０ｋｇ／ＴであるＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物について、各回につき３つの複製試料について実施した２回の独立した実験から、盲検検査において正確さを測定した。得られた値は、後述するように、正確さおよび精度のどちらの判断基準も満たした（表３６および表３７）。
【０２３１】
【表３６】
2013532276.tif 000038
【０２３２】
【表３７】
2013532276.tif 000039
【０２３３】
〔耐久性〕
測定方法が持つ、環境および過程に関連する変数が微量な変化をした場合に結果に生じ得る変化に抵抗する能力を、耐久性分析によって評価する。
【０２３４】
一次抗体の希釈物および二次抗体の希釈物を変化させることによって、ＥＬＩＳＡアッセイ法の安定性を調べ、さらに、検査対象となる異なる試料のマイクロタイタープレート上での分散配置を変更することによって、一次抗体の安定性を調べた（測定する全ての試料、ブランク試料、標準試料、および、未知の試料を備えた単一のプレートと、分析する試料１つ当たりにより多くの反復を備えているが、ブランク試料、標準試料、および、未知の試料が異なるマイクロタイタープレート上にある、複数のマイクロタイタープレート）。表３８にばらつきを示す。この表は、たとえ変更を実施しても結果には一貫性があることを示しており、特に抗体の希釈におけるばらつきに対して上記検査方法が強力な耐久性を有すること示唆している。
【０２３５】
【表３８】
2013532276.tif 000040
【０２３６】
〔実施例５〕
〔単クローン性抗体特異性検査〕
〔方法〕
１７個の化合物をＰＢＳ中で５０μｇ／ｍｌの濃度で検査し、酵母（１→４）−α−Ｄ−グルカン／（１→６）−β−Ｄ−グルカン−ＢＳＡ接合体に対して産生させた単クローン性抗体による交差反応性について判定した。
【０２３７】
検査した化合物は、可溶性澱粉ジャガイモ、澱粉米、澱粉コムギ、澱粉トウモロコシ、ＢＳＡ、（ウサギからの）グリコーゲン、（カキからの）グリコーゲン、（ウシの）グリコーゲン、マンナン、ラミナリン、ザイモシン（Ｚｙｍｏｓｉｎ）Ａ、マルトリンＱＤ、パン酵母から得られるグルカン、Ｅｕｇ．ｇｒａｃｉｌｉｓから得られる（１→３）−β−Ｄ−グルカン、Ｔｏｒｕｌａ酵母、Ｙｃｗ−０２ビーズピーター（ビーズピーターで調製した酵母細胞壁画分）、オオムギから得られるβグルカンであった。
【０２３８】
さらに、酵母細胞壁抽出物（ＭＹＣＯＳＯＲＢ、バッチ番号０８ＦＳ００１）と、単クローン性抗体を産生させるために使用した（１→４）−α−Ｄ−グルカン／（１→６）−β−Ｄ−グルカン−ＢＳＡ抗原とを、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、および、５μｇ／ｍｌの濃度で検査した。どちらの単クローン性抗体（５１３Ａ１６１．１および５１３Ａ４３１．１）も、１：１００、１：２００、１：５００、１：１０００、１：１５００、および、１：２０００の希釈範囲でアッセイした。９６個のウェルを備えたＮｕｎｃ社のマイクロタイタープレート（ロット番号０７０２０１３）を使用した。各プレートを１００μｌ／ウェルの化合物でコーティングし、指先で８回〜１０回はじくことによって攪拌した。これらのプレートを封止用テープで被覆し、３７℃で１時間インキュベーションした。溶液を取り除いて、多チャンネルピペットを用いて１回につき２００μｌのＰＢＳで、プレートを３回洗浄した。洗浄溶液を各回において取り除く前に、プレートを指先８回〜１０回はじいた。各回の洗浄の次の回の洗浄との間には、プレートを紙タオルの上ではじくことによって、過剰な流体を取り除いた。ブロッキングするために、１００μｌ／ウェル３％の（遠心分離にはかけていない）乳を加えた。各プレートを室温で１時間インキュベーションした。ブロッキング溶液を取り除き、ウェルを２００μｌのＰＢＳで１回、２００μｌのＰＢＳと０．０５％のポリソルベート２０とで２回洗浄した。洗浄溶液を各回において取り除く前に、指先で８回〜１０回はじくことによって、プレートを攪拌した。各回の洗浄の次の回の洗浄との間には、プレートを紙タオルの上ではじくことによって、過剰な流体を取り除いた。
【０２３９】
適切な血清の希釈物を各ウェルに１００μｌずつ加えた。ブランクウェルには、ＰＢＳ（１００μｌ／ウェル）を使用した。プレートを被覆した状態で、室温で１時間インキュベーションした。溶液を取り除き、ウェルを１回につき２００μｌのＰＢＳと０．０５％のポリソルベート２０とで３回洗浄した。洗浄物を各回において取り除く前に、プレートを指先で８回〜１０回はじいて攪拌した。各回の洗浄の次の回の洗浄との間には、プレートを紙タオルの上ではじくことによって、過剰な流体を取り除いた。二次抗体（１：１０，０００のヤギ抗マウス、ＩｇＧ−ペルオキシダーゼ接合体）を各ウェルに１００μｌずつ加えた。プレートを被覆した状態で、室温で１ｈインキュベーションした。溶液を取り除き、ウェルを１回につき２００μｌのＰＢＳと０．０５％のポリソルベート２０とで３回洗浄した。洗浄物を各回において取り除く前に、プレートを指先で８回〜１０回はじいて攪拌した。各回の洗浄の次の回の洗浄との間には、プレートを紙タオルの上ではじくことによって、過剰な流体を取り除いた。
【０２４０】
室温のＴＭＢ基質を各ウェルに１００μｌずつを加えた。５分後に、１００μｌ／ウェルの１ＮのＨＣｌを用いて反応を停止させた。プレートの底部を、指紋を残さないようにきれいに拭いた。さらに、１０秒間振盪した後に、マイクロタイタープレート読み取り装置を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【０２４１】
〔結果〕
ＥＬＩＳＡデータの棒グラフを図９〜図１４に示す。５１３Ａ１６１．１と５１３Ａ４３１．１とはどちらも、１μｇ／ｍｌという低い濃度でも抗原４９９−７３−３と非常に激しく反応し、２μｇ／ｍｌで最も高い吸光度読み取り値を示した。抗体は、１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの範囲の濃度で０８ＦＳ００１を認識することもでき、５μｇ／ｍｌで最も高い吸光度読み取り値を示した。ただし、０８ＦＳ００１の場合には、抗原４９９−７３−３の場合に比べて、吸光度が大幅に低かった。抗体５１３Ａ１６１．１はラミナリンを認識し、これとかなり反応したが、５１３Ａ４３１．１は認識しなかった。どちらの抗体も、ザイモシン（Ｚｙｍｏｓｉｎ）Ａに対しては非常に高い吸光度読み取り値を示した。これは、抗原４９９−７３−３の場合に見られる吸光度と同程度であり、時にはより高い吸光度であった。驚くべきことに、各抗体は、ザイモシン（Ｚｙｍｏｓｉｎ）Ａ、マルトリンＱＤ、パン酵母から得られるグルカン、Ｅｕｇ．ｇｒａｃｉｌｉｓから得られる（１→３）−β−Ｄ−グルカン、Ｔｏｒｕｌａ酵母、および、Ｙｃｗ−０２ビーズピーターペレットに対してかなりの交差反応を示したので、定量ＥＬＩＳＡアッセイのために該抗体を使用することは制限された。
【０２４２】
〔実施例６〕
〔飼料から抽出された抗原が検出できるように、単クローン性抗体ＥＬＩＳＡアッセイ条件を最適化する試み〕
〔ＰＢＳにおける希釈とＰＢＳ＋３％脱脂乾燥乳との比較〕
単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１（実施例５）を使用して、飼料から抽出された抗原を定量ＥＬＩＳＡアッセイにおいて検出しようとすると、吸光度読み取り値が低かった。ＰＢＳではなく、３％の乳において抗体を希釈したことが吸光度読み取り値に影響したかどうかを（例えば、飼料抽出物成分と組み合わせた場合に過度なブロッキングを引き起こすことによって）判定するために、以下のプロトコールを実施した。
【０２４３】
酵母細胞壁抽出物（ＭＹＣＯＳＯＲＢ、バッチ番号０８ＦＳ００１）を、０．５％のＨＣｌを含有する溶液にして、実施例４に記載の化学抽出プロセスにかけた。ＥＬＩＳＡアッセイを、実施例５に記載のように、単クローン性抗体５１３Ａ１６１を１：４００の希釈度で一次抗体として用い、さらに、ＰＢＳまたは３％の乳のいずれかにおいて希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（１：１０，０００）を二次抗体として用いて実施した。マイクロタイタープレートを、酵母細胞壁抽出物（１００μｌ／ウェル）またはＰＢＳで１：１に希釈した抽出物（２００μｌ／ウェル）でコーティングした。
【０２４４】
図１５に示した結果によって、抗体希釈液の持つ、軽微であって統計学的には有意でない効果が観察されることが確認された。また、試しに単クローン性抗体を使用して、抗原を３組、０．５％のＨＣｌで抽出した飼料標準品中において検出してみようとすると、複製間の読み取り値のばらつきが大きく、標準偏差が大きく、吸光度読み取り値が異常に増大した。
【０２４５】
〔抗原コーティングステップ、温度と時間〕
試しに単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１を使用（実施例５）して、飼料から抽出した抗原を定量ＥＬＩＳＡアッセイにおいて検出すると、吸光度読み取り値が低かった。マウスの単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１を用いてＥＬＩＳＡの吸光度読み取り値を大きくするために、後述の実験を実施し、抗原コーティング・インキュベーションステップの時間および温度を変更することによって、バックグラウンド／非特異的結合を増加させずに、飼料から抽出した抗原の検出を改善できるかどうかを判断した。
【０２４６】
プロトコールには、飼料抽出を上述のように実施して分析用試料を生成することを含めた。試料の部分標本は、プレート上でただちにコーティングするか、または、−２５℃で一晩保存するかのいずれかの処理を行った。試料の調製を３回繰り返して、３組の抽出物を生成した。ニワトリ用飼料調製物において抗原を使用して、６点からなる検量線（０ｋｇ／Ｔ、０．４ｋｇ／Ｔ、０．８ｋｇ／Ｔ、１．２ｋｇ／Ｔ、１．８ｋｇ／Ｔ、２．４ｋｇ／Ｔ）を作成した。プレートを飼料抽出物でコーティングして放置して、４℃で一晩（安置）、４℃で一晩（振盪）、または、３７℃で１時間（安置）インキュベーションした。ＥＬＩＳＡアッセイを、実施例５に記載のように、３％の乳で１：４００に希釈した単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１を一次抗体として用い、さらに、３％の乳で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（１：１０，０００）を二次抗体として用いて実施した。基質を３０分間インキュベーションし、４５０ｎｍにおける吸光度を求めた。
【０２４７】
図１６に示す結果は、抗原をプレート上にコーティングする時間および温度を変更しても、吸光度を最適な範囲に達するまでには増加させなかったこと、さらに、このような変更が検量線の線形性に影響しなかったことを示唆している。また、バックグラウンドはインキュベーション時間からは独立的に増加した。
【０２４８】
〔実施例７〕
〔多クローン性抗体の選択性（干渉）検査〕
干渉度を求めるために、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物（参照番号２８５９６５）を１ｋｇ／Ｔで含む本明細書に記載のニワトリ用飼料物質と、これを含まない該ニワトリ用飼料物質とを用いて、１セットのアッセイを実施した。なお、このＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物を１ｋｇ／Ｔで含むニワトリ用飼料物質については、飼料配合物中に見られる炭水化物または副生成物に属する、考え得る干渉物を複数の比率（ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の含有レベルに対して５０％、１００％、２００％（ｗ／ｗ））で含んだものと含んでいないものとを用意した。この点において、以下の各生成物について調査および検査して、以下に規定する方法でＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の検出に対する影響を評価した。
・  アミロース（ジャガイモ澱粉）。比が３０：１の（１→４）：（１→６）−α−Ｄ−グルカン
・  マルトデキストリンおよびコーンシロップの固形物。自然のトウモロコシ澱粉から生成される、容易に消化可能な炭水化物、ブドウ糖の重合体
・  （ウシの肝臓から得られるＩＸ型の）グリコーゲン。比が１０：１の（１→４）：（１→６）−α−Ｄ−グルカン
・  （Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａから得られる）ラミナリン。比が３：１の（１→３）：β（１→６）−β−Ｄ−グルカン
・  乾燥醸造粕。トウモロコシからバイオエタノールを生成する際の副生成物
・  （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓから得られる）Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ（登録商標）  パスツール・シャンパーニュ活性乾燥ワイン酵母。酵母および酵母細胞壁（（１→３）：β（１→６）−β−Ｄ−グルカン、タンパク質にリンクした（１→４）：（１→６）−α−Ｄ−ポリマンノース、（１→２）：（１→４）−β−Ｎ−アセチルグルコスマミン（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓｍａｍｉｎｅ）から形成される複合糖質）。
【０２４９】
図７および図８に示すように、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の場合に得られたシグナルと、５０、１００、２００％（ｗ／ｗ）の干渉物質と混合したＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物の場合に得られたシグナルとの間の差の合計は、約ＯＤ４５０値で０であった。この結果は、干渉が欠如していることを説明しており、したがって、様々な炭水化物系干渉物質を含む複合飼料マトリクスにおいてＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物を検出するためのアッセイが有する特異的な特徴を説明している。
【０２５０】
個々の干渉物質に関する詳細な結果、および、一方向ＡＮＯＶＡ検査（信頼区間は９５％）の制約については、表３９〜表４４に示す。なお、表３９〜表４４中では、標準偏差および変動係数だけではなく、光学濃度（４５０ｎｍ）の平均値および試料間の差も算出した。各干渉物質における分散の均等性を、レーベン検定、オブライエン検定、および、ブラウン・フォーサイス検定によって評価した。非一定の分散の場合には、ノンパラメトリックなクラスカル・ワーリスの一方向ＡＮＯＶＡ法を、非正規性に対してより強力で異常値に対する耐性が高い検定を実現するランク変換とともに使用した。分析は、検査対象の干渉物質の濃度ごとに別々のプレート上で、または、単一の個々のプレート上で実施した。２つのプレートの調製物について、同一の結果が得られた。
【０２５１】
【表３９】
2013532276.tif 000041
【０２５２】
【表４０】
2013532276.tif 000042
【０２５３】
【表４１】
2013532276.tif 000043
【０２５４】
【表４２】
2013532276.tif 000044
【０２５５】
【表４３】
2013532276.tif 000045
【０２５６】
【表４４】
2013532276.tif 000046
【０２５７】
本明細書に記載の全ての出版物および特許文献は、参照によって本明細書に引用されるものとする。本発明の上記方法およびシステムの各種の変更および変形例は、当業者には明らかであり、本発明の技術的範囲および精神から逸脱するものではない。本発明については、特定の好適な実施形態との関連において記載してきたが、クレームに規定した本発明がこのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際に、炭水化物化学分野、微生物学、動物飼料および栄養学、免疫学、または、これらに関連する分野の当業者には自明な、本発明を実施するための上記モードの各種変更は、以下に記す請求項の範囲内にあることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０２５８】
【図１】グルカン画分Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、および、Ｓ１、Ｓ２、および、Ｓ３の生成の概略図を示している（例えば、実施例１を参照）。
【図２】元のウサギの抗血清の応答性、および、親和性精製済み抗血清の４つの上清の応答性を示している。親和性精製済み抗血清は、β−（１，６）−グルカンに特異的な（Ｇａｂ１〜Ｇａｂ４）抗体を、ＢＳＡでコーティングされたマイクロウェルプレートに分離することによって得られた（例えば、実施例３を参照）。
【図３】本明細書記載する方法で生成した、精製済みの抗（１→４）−α−／（１→６）−β−Ｄ−グルカン−ＢＳＡ多クローン性ウサギ抗体を使用して作成した較正曲線を示している（例えば、実施例２および３を参照）。
【図４】ＭＹＣＯＳＯＲＢの６つの含有レベルを用いて乳業用飼料物質において実施した、５つのアッセイから得られた平均検量線を示している。右側のｙ軸は、検量線に対する、日内（％ＣＶｉｎｔｒａ）併行精度および日間（％ＣＶｉｎｔｅｒ）併行精度を示す。
【図５】ＭＹＣＯＳＯＲＢの６つの含有レベルを用いてニワトリ用飼料物質において実施した、５つのアッセイから得られた平均検量線を示している。右側のｙ軸は、検量線に対する、日内（％ＣＶｉｎｔｒａ）併行精度および日間（％ＣＶｉｎｔｅｒ）併行精度を示す。
【図６】ＭＹＣＯＳＯＲＢの６つの含有レベルを用いてブタ用飼料物質において実施した、５つのアッセイから得られた平均検量線を示している。右側のｙ軸は、検量線に対する、日内（％ＣＶｉｎｔｒａ）併行精度および日間（％ＣＶｉｎｔｅｒ）併行精度を示す。
【図７】複数のマイクロタイタープレートを分散配置した場合において、干渉物の平均の光学濃度読み取り値（ΔＯＤ４５０）の差を、ニワトリ用飼料において得られるＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物のシグナルから減じた値を示している（実施例７）。干渉物は、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物（１００％、１．０ｋｇ／Ｔ）とともに、５０％、１００％、２００％（ｗ／ｗ）の割合で加えた。
【図８】単一のマイクロタイタープレートを配置した場合において、干渉物の平均の光学濃度読み取り値（ΔＯＤ４５０）の差を、ニワトリ用飼料において得られるＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物のシグナルから減じた値を示している（実施例７）。干渉物は、ＭＹＣＯＳＯＲＢ生成物（１００％、１．０ｋｇ／Ｔ）とともに、５０％、１００％、２００％（ｗ／ｗ）の割合で加えた。
【図９ａ】濃度が１：１００である場合の、単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【図９ｂ】濃度が１：２００である場合の、単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【図１０ａ】濃度が１：５００である場合の、単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【図１０ｂ】濃度が１：１０００である場合の、単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【図１１ａ】濃度が１：１５００である場合の、単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【図１１ｂ】濃度が１：２０００である場合の、単クローン性抗体５１３Ａ１６１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【図１２ａ】濃度が１：１００である場合の、単クローン性抗体５１３Ａ４３１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【図１２ｂ】濃度が１：２００である場合の、単クローン性抗体５１３Ａ４３１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【図１３ａ】濃度が１：５００である場合の、単クローン性抗体５１３Ａ４３１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【図１３ｂ】濃度が１：１０００である場合の、単クローン性抗体５１３Ａ４３１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【図１４ａ】濃度が１：１５００である場合の、単クローン性抗体５１３Ａ４３１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【図１４ｂ】濃度が１：２０００である場合の、単クローン性抗体５１３Ａ４３１．１の交差反応性を示唆する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【図１５】希釈せずに、または、ＰＢＳもしくはＰＢＳ＋３％脱脂乾燥乳で１：１に希釈してプレートにセットした、平均のＥＬＩＳＡアッセイ吸光度読み取り値と、３つの酵母細胞壁抽出標準品の標準偏差とを示している（実施例６）。
【図１６】実施例６に記載のＥＬＩＳＡミクロプレート用コーティング時間および温度によって実施したインキュベーションについて、飼料抽出物の検量線のグラフを示している。
【図１】
2013532276.tif 000047
【図２】
2013532276.tif 000048
【図３】
2013532276.tif 000049
【図４】
2013532276.tif 000050
【図５】
2013532276.tif 000051
【図６】
2013532276.tif 000052
【図７】
2013532276.tif 000053
【図８】
2013532276.tif 000054
【図９ａ】
2013532276.tif 000055
【図９ｂ】
2013532276.tif 000056
【図１０ａ】
2013532276.tif 000057
【図１０ｂ】
2013532276.tif 000058
【図１１ａ】
2013532276.tif 000059
【図１１ｂ】
2013532276.tif 000060
【図１２ａ】
2013532276.tif 000061
【図１２ｂ】
2013532276.tif 000062
【図１３ａ】
2013532276.tif 000063
【図１３ｂ】
2013532276.tif 000064
【図１４ａ】
2013532276.tif 000065
【図１４ｂ】
2013532276.tif 000066
【図１５】
2013532276.tif 000067
【図１６】
2013532276.tif 000068
【国際調査報告】
2013532276.tif 000069