(57)【要約】  本発明は、溶液中で高感度の電気化学的検出を用いて均質イムノアッセイ様式を実施するための方法であって、試薬である２つの異なる結合体がサンプルまたはサンプル／緩衝液混合物と合わせられ、１つ目の結合体が酸化還元マーカーと分析物分子とを含み、２つ目の結合体が抗酸化還元マーカー抗体または特異的に結合するその断片と分析物に特異的に結合する分子とを含む方法に関する。  本方法は、診断における洗浄不要および分離不要なイムノアッセイ、特に自動化されたマイクロ流体イムノアッセイに適している。本方法はまた、安価なイムノアッセイシステムおよび使い切り試験紙にも適している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中で電気化学的検出を用いて均質イムノアッセイ様式を実施するための方法であって、試薬である２つの異なる結合体がサンプルまたはサンプル／緩衝液混合物と合わせられ、１つ目の結合体が酸化還元マーカーと分析物分子とを含み、２つ目の結合体が抗酸化還元マーカー抗体または特異的に結合するその断片と前記分析物に特異的に結合する分子とを含む方法。
【請求項２】
前記サンプル中に遊離の分析物の存在は、前記抗酸化還元マーカー抗体に対する前記酸化還元マーカーの結合を誘導または促進し、この結合によって、前記結合した酸化還元マーカーの酸化還元活性が阻害され（「消失され」）、それによって、検出可能なシグナルが発生するまたは変化する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸化還元マーカーは、フェロセンおよびフェロセン誘導体、ビスビピリジルオスミウム複合体およびその他のオスミウム系複合体、ビピリジルルテニウム複合体およびその他のルテニウム系複合体、ｐ−アミノフェノール、ヘキサシアノ鉄酸塩（ＩＩ／ＩＩＩ）、キノンならびに電気化学的イムノアッセイ用として公知であるその他の酸化還元マーカーの群から選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化還元マーカーはフェロセニウムであり、前記抗酸化還元マーカー抗体は好ましくはモノクローナル抗フェロセニウム抗体である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記分析物に特異的に結合する分子は、前記分析物に特異的に結合する、抗分析物抗体、アプタマー、ペプチド、核酸またはキレート剤を表す請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記分析物に特異的に結合する前記分子は、抗分析物抗体またはその断片である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記２つの結合体は、水溶性リンカー分子、特にＰＥＧリンカーを含む請求項１から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
必要な試薬は可溶形態で添加され、前記結合事象の電気化学的検出はリアルタイムに実行される請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記必要な試薬の全ては既製の混合物として前記サンプルに添加され、前記結合事象の電気化学的検出はリアルタイムに実行される請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記必要な試薬の全ては、適切な反応容器中に乾燥試薬として提供され、前記サンプルおよび任意に緩衝液の添加によって溶解されるだけであり、その添加が前記分析の開始を示す、請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記イムノアッセイは、マイクロ流体分析システム（ラボオンチップ）および／または完全自動化分析装置で実施される請求項１から１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
単一電極の代わりに構造電極、例えばくし形電極が前記検出に使用される請求項１から１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
単純な電気化学的酸化還元反応の代わりに、酵素的に触媒される環状反応が利用される請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
フェロセンおよびフェロセン誘導体、ビスビピリジルオスミウム複合体およびその他のオスミウム系複合体、ビピリジルルテニウム複合体およびその他のルテニウム系複合体、ｐ−アミノフェノール、ヘキサシアノ鉄酸塩（ＩＩ／ＩＩＩ）、キノンならびに電気化学的イムノアッセイ用として公知であり適切なその他の酸化還元マーカーの群から選択される酸化還元マーカーに特異的に結合し、結合した前記酸化還元マーカーの酸化還元活性を大幅に、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超または完全に阻害する（消失させる）酸化還元マーカー抗体またはその断片。
【請求項１５】
抗フェロセニウム抗体またはその断片であり、それに結合した前記フェロセニウムの酸化還元活性を大幅にまたは完全に阻害する請求項１４に記載の酸化還元マーカー抗体またはその断片。
【請求項１６】
請求項１から１３の何れか１項に記載の方法を実施するための二重特異性抗体結合体であって、請求項１４または１５に記載の酸化還元マーカー抗体またはその断片および抗分析物抗体またはその断片を含む二重特異性抗体結合体。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、溶液中の抗体抗原結合反応および他の生化学的相互作用の直接的で高感度な電気化学的検出方法に関する。本方法は、診断において洗浄不要および分離不要なイムノアッセイ、特に自動化されたマイクロ流体イムノアッセイに適している。本方法はまた、安価なイムノアッセイシステムおよび使い切り試験紙にも適している。
【０００２】
イムノアッセイは、血液、血清、尿または食品など複雑な媒体中の最小濃度の分析物を特異的に検出するために抗原抗体反応を使用する。数十年もの間、イムノアッセイは臨床診断、環境および食品分析において最小濃度のホルモン、代謝物、タンパク質、バイオマーカー、毒物、農薬、病原性細菌およびウイルスを検出するのに不可欠な道具となってきた。高感度（ナノモル以下の濃度の検出）および高特異性（化学的に類似した構造を持つ干渉物質の存在下での分析物の検出）の同等の組合せを提供する代替となる分析化学的方法が存在しないので、最も重要な臨床診断分析物の多くは、イムノアッセイでしか安価にすばやく測定できない。クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー）などの代替方法は、例えば抽出および化学誘導体化による多段階のサンプル調製をしばしば必要とする。
【０００３】
５０年前にＲｏｓａｌｙｎ  ＹａｌｏｗおよびＳａｌｏｍｏｎ  Ｂｅｒｓｏｎによってイムノアッセイが発明されて以来、異なるイムノアッセイ様式を表す多数の異なる実施形態が開発されてきた。ＥＬＩＳＡ法（酵素結合イムノアッセイ法）など不均質な様式と均質な様式との基本的な相違点は、検出に利用される抗体の会合状態に基づく：不均質なアッセイでは、抗体（抗原よりはるかに少ない）が表面（反応チューブ、マイクロタイタープレート、試験紙）に固定されている；洗浄および分離ステップなど、同様に検出などの全反応ステップがその表面上で行われる。均質な様式では、いずれの結合パートナーも固定されておらず、洗浄および分離ステップは必要なく、同様に検出は溶液中で行われる。
【０００４】
これらを区別する別の可能性は、使用される検出方法に起因する。抗体抗原結合反応を直接見ることは不可能なので、結合パートナーの一方を分子マーカーまたは「標識」と化学的に共役させなければならない（例外：結合パートナーの一方を高感度な表面に固定する場合、表面プラスモン共鳴、格子結合器、水晶振動子マイクロバランス、弾性表面波およびリアルタイムに分子結合反応を直接測定する類似技術に基づいた質量感受性バイオセンサ。しかし、これらの方法はこれまで、ルーチン分析でなく研究用途にだけ利用されている）。適切な標識は、高い「比活性度」を有しなければならず、すなわち標識分子当たり可能な限り多くのシグナリング事象を生成しなければならない。最も多用される標識には、放射性同位元素（ラジオイムノアッセイ、「ＲＩＡ」）、蛍光色素（フルオレセイン、ローダミンなど）、蛍光半導体ナノ粒子（「量子ドット」）、ポリマーナノ粒子（「ラテックスビーズ」、凝集イムノアッセイ）、およびペルオキシダーゼなどの酵素と比色、蛍光発生または化学発光の酵素基質（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。放射性同位元素は最高の比活性度を有し、単一の標識分子の検出さえ可能にする。放射活性から発生する健康被害、関連する実験室要件の高さ（「アイソトープ実験室」）および残渣処理の高額な費用により、放射活性イムノアッセイは、ＥＬＩＳＡなど代替方法に次第に取って代わられる。
【０００５】
異なるイムノアッセイ間の別の相違点は、使用する抗体の型に起因する。抗体は、構造を決定し、全ての抗体クラスにおいて類似して構成される定常領域および抗原結合部位を形成する非常に可変的な領域を有する複雑な構造のタンパク質である。様々な特異性および親和性を持つ多数の抗体を含んでいる当初使用されたポリクローナル血清は、多くの用途において、明確に定義された特異性および親和性を持つ厳密に１つの抗体実体（「クローン」）だけを含むモノクローナル抗体に取って代わられる。理論的には、モノクローナル抗体は、同じ特性で多量に生成できる。さらに、完全な抗体から酵素消化によって生成できるいわゆる抗体断片もいくつかの分析用として使用された。単鎖抗体は、遺伝子工学的方法で生成できる組み換え抗体断片である。原理的には、全ての型の抗体およびそれから得られる分子結合体が公知のイムノアッセイ様式に使用できる。
【０００６】
イムノアッセイで検出できる最もよく知られた臨床的分析物には、ｈＣＧ（妊娠試験）、ＴＳＨなど甲状腺ホルモン（甲状腺障害）、ステロイドホルモン（内分泌学、受胎能）およびＰＳＡ（前立腺癌に対するバイオマーカー）が含まれる。
【０００７】
要約すると、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清に基づくイムノアッセイは、生物工学、臨床診断、環境および食品分析に最も重要な分析化学的方法の一つであり、高い商品価値を有すると言える。
【０００８】
イムノアッセイを実施するための多数の方法が先行技術に記述されている。ほとんどの不均質イムノアッセイは、例えばピペット操作ステップ、サンプル希釈、洗浄ステップなどいくつかの手作業の工程を必要とし、これらは正確な時間手順に従わなければならない。したがって、そのようなアッセイを正しく実施するには、訓練された人材およびこれら工程のために特別に用意された実験室が通常必要とされる。必要な検出デバイス（「ＥＬＩＳＡリーダー」、マイクロタイタープレートリーダー、イムノアッセイアナライザ）は、高価であり携帯できない。ＥＬＩＳＡ試験を実施する手順が、例えば特許［米国特許第４０１６０４３Ａ号、米国特許第３８３９１５３Ａ号］に記述されている。そのような複雑な分析工程が、訓練された人材によってのみ、および適切な実験環境においてのみ実施され得ることは、当業者には容易に認識される。そのような工程の自動化は極めて困難であり、非常に複雑な自動装置を必要とする。
【０００９】
不均質なラテラルフローイムノアッセイ様式（「試験紙」イムノアッセイ）が、現場使用に受け入れられてきた。米国特許第６１５６２７１Ａ号に、このアッセイ様式の最新の変形が記述されている。この試験は、サンプル溶液の添加後にそれだけで実行され、単に目視で検出する（試験紙上の１または２本の着色した帯の存在を使用者が読み取る）。そのような読み取り方法により定量的結果（すなわち正確な濃度の測定）が得られないことは明らかであり、存否提示または半定量提示（濃度が特定の閾値以下／以上である）しかできない。
【００１０】
それに対し、迅速かつ定量的な完全自動化イムノアッセイを実現するのに均質イムノアッセイが特に適していることは、当業者には公知である。均質イムノアッセイにおいて、シグナル発生は結合反応と同時に実行される。上述の不均質イムノアッセイと異なり、均質イムノアッセイはほとんどの場合、わずか１または数回の試薬注入操作、インキュベーション時間および検出ステップから成る。理想的な場合、最終値を測定できる前に必要なことは、サンプルと既製の試薬混合物を混合することだけである（いわゆる「混合と測定（mix and measure）」試験）。１：１の混合物、すなわちサンプルと試薬混合物が同じ容積比率の場合、最も単純な手段を用いて高精度での試薬注入が可能になる。
【００１１】
抗体と抗原とが結合平衡に達した直後に測定できるので、均質イムノアッセイによって最短の分析時間も可能になることは、当業者には容易に理解される。
【００１２】
均質イムノアッセイの短所は、結合反応をシグナル発生と共役させるのに高額な化学合成費用が必要なことである。
【００１３】
米国特許第４９６０６９３Ａ号には、抗原−酵素断片２結合体が結合した後にしか機能的な酵素（「ホロ酵素」）が形成されないような、抗体−酵素断片１結合体の合成が記述されている。そのような結合体の化学合成は立体配置的に困難であり、全ての型の分析物に対して同等に適切とは限らない。さらに、酵素反応と共役させるために追加的な反応時間を必要とすることが、本原理が受け入れられなかった理由である。
【００１４】
低分子分析物に対してさらに汎用性があり化学的に容易な方法は、例えば欧州特許出願公開第０２００９６０Ａ号に記述される蛍光偏光イムノアッセイである。この工程において、分析物（ここでは：エストリオール）と蛍光色素（ほとんどの場合フルオレセイン）との結合体が合成される。測定溶液は、直線偏光励起光で照射される。結合体が溶液中に遊離している限り放出される蛍光は偏光されない（偏光解消される）。抗体に結合した後にだけ、放出される蛍光も偏光される程度まで、結合体の回転速度が制限される。これよって、結合平衡をリアルタイムに測定できる。この方法の短所は、検出に偏光単色光源と偏光フィルタを備える２台の蛍光検出器が必要なので、検出用装備に関する費用が高額なことである。したがって本原理は、専門的な実験用途にしか受け入れられず、日常の診断および現場使用には受け入れられなかった。加えてその原理は、低分子分析物にしか適さない。追加的な方法がタンパク質分析物に必要である。
【００１５】
低分子分析物の技術的に容易な検出が、ユウロピウムクリプテートイムノアッセイ（略語：ＥｕＣｒ）を使用するＳｅｌｌｒｉｅらの方法で実現された、例として［米国特許第２００８１９９９７２Ａ号］。この場合、ＥｕＣｒ−フルオレセイン結合体が合成され、ＥｕＣｒとフルオレセインとの間には１〜３個以下のメチレン基から成る可能な限り短いリンカーが存在できる。抗ＥｕＣｒ抗体の他に、フルオレセインに結合した後にフルオレセインの蛍光を消光する抗フルオレセイン抗体が、さらに利用される。シグナル発生の原理は、立体的な理由により２つの抗体のうち一方しか結合体に結合できないという事実に基づいている。したがって、結合平衡および蛍光強度は遊離のＥｕＣｒ濃度によって決まり、リアルタイムに直接測定することができる。この系の利点は、従来の蛍光検出器を１つしか必要としないことである。短所は、同様に低分子分析物にしか適しておらず、その結合体の合成が化学的に困難なことである。
【００１６】
結合依存的蛍光消光の原理に同様に基づいた、低分子分析物のための代替となる均質イムノアッセイ方法がＣｏｉｌｌｅらによって、および改変された形態がＴａｎらによって発表された［Ｉ．Ｃｏｉｌｌｅ，Ｓ．Ｒｅｄｅｒ，Ｓ．ＢｕｃｈｅｒおよびＧ．Ｇａｕｇｌｉｔｚ、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ、１８巻（２００２年）、２７３〜２８０頁；Ｃｈｏｎｇｘｉａｏ  Ｔａｎ，Ｎｅｎａｄ  Ｇａｊｏｖｉｃ−Ｅｉｃｈｅｌｍａｎｎ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｆ．Ｍ．Ｓｔｏｅｃｋｌｅｉｎ，Ｒａｉｎｅｒ  Ｐｏｌｚｉｕｓ，Ｆｒａｎｋ  Ｆ．Ｂｉｅｒ、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、６５８巻（２０１０年）、１８７〜１９２頁］。この場合、分析物（テトラヒドロカンナビノール）はタンパク質（ウシ血清アルブミン）に共役しており、タンパク質はさらにいくつかの蛍光消光分子を表面に有する。抗テトラヒドロカンナビノール抗体を蛍光分子と結合させる。この抗体が結合体に結合すると、蛍光は消光される。分析サンプルが遊離のテトラヒドロカンナビノールを含む場合、抗体はこれを結合し再び蛍光を発する。この方法の利点は、Ｓｅｌｌｒｉｅらと同様に、単純な測定設備を使用して蛍光を測定できることである。この場合もまた、分析物−消光物質結合体および抗体−発蛍光団結合体の化学的に難しい合成が短所になる。
【００１７】
蛍光測定技術は、生物科学において頻繁に利用されるにもかかわらず、複雑であり、したがって高価な測定技術である。安価で小型の検出器（例えば現場使用のための）は、他の検出方法でむしろ実現されている。電気化学的検出方法により、技術的に最も単純で最も強く統合された測定デバイスが可能になり、例えば総じて光学的測定方法であったグルコース用の使い捨てバイオセンサ分野において受け入れられた。したがって、長年に渡る取り組みにより単純な電気化学的検出原理に基づいた均質イムノアッセイが実現した。
【００１８】
電気化学的検出を用いる均質イムノアッセイの必要条件は、高感度な電気分析方法および高い比活性度を有する酸化還元活性のある標識／マーカーが利用可能なことである。電流測定およびボルタンメトリ法は、高感度で適切な方法である。酸化還元標識／マーカーの比活性度は主に、電極による不均質な電子移動および検出電位の速度定数によって決まる。当業者は、−２００ｍＶ〜＋２００ｍＶの検出電位（銀／塩化銀参照電極に対する、以下Ａｇ／ＡｇＣｌに対すると略記する）が血液など生体液の測定に最適であるという合意におよんでいる。電子移動定数は、酸化還元標識／マーカーの化学構造ならびに拡散係数および使用される電極材料の関数である。有益な電気化学的特性を備え、したがって原理的にイムノアッセイ用として適切な標識／マーカーである多数の酸化還元媒介物が、当業者に公知である。生物学的媒質に使用する場合、酸化還元媒介物はサンプル成分と反応してはならず、酸化および還元状態で安定であり十分に水溶性でなければならない。これらには、例えばヒドロキノン／キノン、ｐ−アミノフェノールなどの有機分子、フェロセンなど有機／無機のサンドイッチ分子、および例えばヘキサシアノ鉄酸（ＩＩ／ＩＩＩ）またはビスビピリジンオスミウムなどの無機複合体が含まれる。ほとんどの場合水溶性誘導体がこの接続に利用されるように、フェロセンおよびビスビピリジンオスミウムの水溶性は低い。
【００１９】
米国特許出願公開第２００７／０５４３１７号に、上述の有益な特性を有する水溶性オスミウム系酸化還元分子および異なる電気化学的イムノアッセイ様式および電極形状、例えばそれを用いて前述の水溶性酸化還元分子を高感度な方法で検出できるくし形電極、が記述されている。新たな酸化還元媒介物ならびに抗体およびこれに基づく抗原結合体の使用は別として、米国特許出願公開第２００７／０５４３１７号に記述されるアッセイ様式は、先行技術を上回らない；特に、新たな高感度の均質イムノアッセイ様式は記述されていない。
【００２０】
欧州特許出願公開第１３３１４８２Ａ１号には、フェロセンおよび他の酸化還元媒介物の分析物との結合体が利用される電気化学的イムノアッセイ法が記述されている。検出には、酵素バイオセンサ（例えばグルコースセンサ）が使用され、フェロセン−分析物結合体の放出によりグルコースセンサの電気化学的シグナルの変化がもたらされる。記述された共役化学の短所は、ヒト血清アルブミンなどタンパク質を使用して水溶性が良い結合体を生成することである。正確に規定された化学量論比率を持つタンパク質−酸化還元媒介物結合体を合成することが不可能なことは、当業者に公知である。したがって、試験の特性はあるバッチと別とで常に異なる。そのような間接的なシグナリング法は、酵素反応由来の阻害物質が酸化還元媒介物−分析物結合体のように酵素反応を変化させ得る危険性を伴うという事実も、当業者には公知である。酸化還元媒介物結合体が電気化学的シグナルを直接変化させる方法は、それ以上に強力になりうる。
【００２１】
Ｓｕｎｇらによるマイクロ流体チップ内での馬尿酸に対する均質な電気化学的アッセイは、そのような原理に基づいて設計されている［Ｓｕｎｇ  Ｊｕ  Ｙｏｏ，Ｙｏｕｎｇ  Ｂｏｎｇ  Ｃｈｏｉ，Ｊｏｎｇ  Ｉｌ  Ｊｕ，Ｇｕｎ−Ｓｉｋ  Ｔａｅ，Ｈｙｕｇ  Ｈａｎ  ＫｉｍおよびＳａｎｇ−Ｈｏｏｎ  Ｌｅｅ、Ａｎａｌｙｓｔ、１３４巻（２００９年）２４６２〜２４６７頁］。フェロセン−馬尿酸結合体が合成され、抗馬尿酸抗体が使用される。その結合体、およびポリマー粒子に結合した抗体を、正確に規定した量でサンプルに添加する。サンプルが遊離の馬尿酸を含まない場合、その結合体は抗体を積んだ粒子に結合し、粒子と一緒に遠心分離される。ボルタンメトリ実験では、対応する小さな電流がフェロセンの酸化電位で上清中に流れることになる。しかし、サンプルが遊離の馬尿酸を含む場合、粒子に結合した抗体はむしろ遊離の馬尿酸に結合し、遠心分離の間その結合体は溶液中に残り、ボルタンメトリ実験において対応する高い電流が流れることになる（フェロセンの酸化電位で）。このアッセイおよびこの原理に基づく全てのアッセイには、診断に使用できない実用的に深刻な短所がある。
【００２２】
第１に、フェロセンの酸化電位（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して＋４００ｍＶ）は、血液および血清における選択的な検出には高すぎる。第２に、遠心分離ステップはほとんどの現場用途には受け入れられない。第３に、分離ステップ（遠心分離）があるにもかかわらず、この方法は非常に低感度である。例えばＳｕｎｇらは、最低濃度として約１０ｍｇ／ｍＬの馬尿酸を測定した；これは５５ｍＭの濃度に相当する。しかし、典型的なイムノアッセイの分析物は、ナノモル（またはさらに低い）濃度範囲、すなわち１，０００，０００倍以上高感度で測定する必要がある。
【００２３】
分離ステップ無しで行う均質な電気化学的アッセイが、Ｄｉ  Ｇｌｅｒｉａらによって示された［Ｋａｔａｌｉｎ  Ｄｉ  Ｇｌｅｒｉａ，Ｈ．Ａｌｌｅｎ，Ｏ．Ｈｉｌｌ，Ｃａｌｕｍ  Ｊ．ＭｃＮｅｉｌ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８年、５８巻、１２０３〜１２０５頁］。この場合、フェロセンと分析物の結合体、リドカインならびに抗分析物抗体もサンプルに添加される。検出原理としては、酵素反応を使用してフェロセニウム−抗原結合体が酸化還元媒介物として機能している。サンプルが遊離の分析物を含まない場合、結合体が抗体に結合し、酵素反応（ここではグルコースオキシダーゼ）が遅延し、電流測定電流は小さくなる。この様式の短所は、典型的なイムノアッセイ用として感度が不十分なことである。例えば血清において、典型的なイムノアッセイより約１０００倍高濃度である約５μＭの検出下限を得た。
【００２４】
酸化還元媒介物結合体が直接電気化学的に測定されるこの均質な酸化還元イムノアッセイの変形が記述された。この場合も同様に、不十分な検出限界しか達成されなかった。
【００２５】
このアッセイおよび類似の原理（すなわち抗体結合による拡散定数の変化）に従う全てのアッセイには、診断における使用を難しくする深刻な短所がある。主な短所は、拡散定数の変化がわずかなシグナル変化しか引き起こさないので低感度なことである：たとえ酸化還元活性のある結合体が全て抗体に結合しても、まだ相当な電流測定またはボルタンメトリシグナルを測定することができる。抗体と結合した結合体が電気化学的シグナルを全く生成しなくなることが望ましい。
【００２６】
同じことが、抗体に結合した後の酸化還元媒介物の枯渇による酵素反応の変化の原理に適用される。この様式も、マイクロモル（またはより高い）濃度しか検出できない可能性がある。
【００２７】
要約すると、低分子結合体の拡散定数の変化または抗体に結合した後の酸化還元媒介物の枯渇よる酵素反応の変化に基づく均質な電気化学的イムノアッセイは、イムノアッセイ分析物に典型的であるナノモル（またはより低い）範囲の濃度を測定するには感度が不十分であると言える。したがって、安価な検出系であるにもかかわらず、これらアッセイのどれも注目すべき商業的応用に使用できない。
【００２８】
この背景に対して、本発明の目的は溶液中でイムノアッセイを実施するための新しく改善された方法を提供することであり、それはもはや先行技術の前述した短所がなく、特に、著しく改善された感度を提示する。
【００２９】
この目的は、請求項１に記載の方法を用いて本発明によって達成される。本発明のより具体的な実施形態およびさらなる態様は、さらなる請求項の主題である。
【００３０】
本発明による電気化学的検出を用いて均質イムノアッセイ様式を実施するための方法は、試薬である２つの異なる結合体がサンプルまたはサンプル／緩衝液混合物と合わせられ、１つ目の結合体が酸化還元マーカーと分析物分子とを含み、２つ目の結合体が抗酸化還元マーカー抗体または特異的に結合するその断片と分析物に特異的に結合する分子とを含む。
【００３１】
分析物は通常、その分子に対する特異的な結合パートナーが存在する、イムノアッセイまたは別の結合アッセイにおいて検出可能などんな分子であってもよい。分析物は、低分子量、すなわち約１０００ダルトン以下の分子量を有する、またはより高いもしくは高い分子量であってよい。より高いおよび高い分子量の分析物の例には、核酸、ペプチドおよびタンパク質がある。特に好ましい分析物は、低分子量の有機分子およびタンパク質／ペプチド、例えばホルモン、酵素、バイオマーカー、生物学的活性があり危険な物質および他の生理的または代謝的な関連物質である。
【００３２】
分析物に特異的に結合する分子は、抗分析物抗体もしくはその断片、アプタマー、ペプチド、核酸または通常の有機キレート剤であることができる。有機キレート剤は、（例えば特異的結合ポケットまたは配位構造において）分析物を特異的に結合するが抗体ではない（「ゲスト分子」に対して「ホスト分子」として文献に記載されることもある）。抗分析物抗体またはその断片が好ましい。
【００３３】
より具体的には、この方法は、サンプル中に遊離の分析物が存在することによって抗酸化還元マーカー抗体または特異的に結合するその断片に対する酸化還元マーカーの結合が誘導または促進され、この結合によって、結合した酸化還元マーカーの酸化還元活性は阻害され（「消失し」）、それによって、検出可能なシグナルを発生するまたは変化させる。本発明による方法は通常、競合アッセイであるまたはこれを含む。
【００３４】
例えば、適切な方法設計は以下の通りである：抗分析物抗体と抗酸化還元マーカー抗体とを含む二重特異性抗体結合体、および酸化還元マーカー−分析物結合体を、緩衝液に溶解させる。結合体分子の一部は二重特異性抗体結合体に結合するが、その大多数は、二重特異性抗体結合体の抗分析物末端に結合する。これは、抗分析物抗体が、特に結合体の立体化学的条件の下に、好ましくは、抗酸化還元マーカー抗体より著しく高い親和定数を有するためである。したがって、結合体の酸化還元マーカー末端は実質的に結合しておらず、そのため電気化学的測定（例えば電流測定またはボルタンメトリ）に自由に利用でき、高い還元電流が測定される。ここで、サンプル由来の遊離の分析物分子が作用し始めると、これらにより分析物−酸化還元マーカー結合体の分析物末端が分析物抗体の結合部位から外される。ここで、結合体の酸化還元マーカー末端は二重特異性抗体結合体の抗酸化還元マーカー抗体部分にしか結合できない、それによって結合した酸化還元マーカーの酸化還元活性が阻害されて（「消失して」）、電気化学的シグナルの減少が測定される。
【００３５】
本発明による方法は、抗体抗原結合によるシグナル「消失」の原理（蛍光消光に類似している）を直接的な電気化学的検出に転用するので、初めて先行技術をはるかに上回る。蛍光消光イムノアッセイは、シグナルが抗体抗原結合に比例してリアルタイムに発生するので、最も高感度であり最も速い均質イムノアッセイに属する。ここで初めてそのようなシグナル特性が電気化学的検出にも実現された。
【００３６】
本発明によれば、フェロセン（またはフェロセンのあらゆる誘導体）、ビスビピリジルオスミウム複合体および他のオスミウム系複合体、ビピリジルルテニウム複合体および他のルテニウム系複合体、ｐ−アミノフェノール、ヘキサシアノ鉄酸塩（ＩＩ／ＩＩＩ）、ヒドロキノン／キノンまたは他の酸化還元媒介物、特にイムノアッセイ用として公知であり適切な他の酸化還元マーカーを、酸化還元活性のあるマーカー（発蛍光団に類似する）として使用できる。イムノアッセイ条件下におけるフェロセンまたは別の酸化還元媒介物の酸化還元活性の「消失」は、これまでの先行技術では不可能であった。フェロセンと弱い結合を形成するカリックスアレーンは、フェロセンの酸化還元活性を完全に消失させることが可能だが、約１０ｍＭ以上の濃度においてだけであることが、Ｎｉｅｌｓｏｎらによる論文［Ｒｏｇｅｒ  Ｍ．Ｎｉｅｌｓｏｎ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｔ．Ｈｕｐｐ、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６年、３５巻、１４０２〜１４０４頁］などに実際に記述された。そのような高濃度の酸化還元消失物質は、イムノアッセイに全く適さない。
【００３７】
驚くべきことに、フェロセンを結合するために発明者の１人によって作製されたモノクローナル抗体が、そのような消失特性を有することが明らかになった。特に有効で新たなモノクローナル抗体は、以下でフェロセニウムと呼ぶ、フェロセンの酸化形態であるフェロセニウム陽イオン（またはフェリシニウム）だけを結合した。結合したフェロセニウムの酸化還元活性は、これよって完全に消失し；結合状態では、もはや電極（ガラス炭素、貴金属）上でそれを還元できない。本発明による方法の例示的実施形態において、フェロセニウム結合抗体は、酸化還元消失物質（蛍光消光物質に類似する）として使用される。
【００３８】
しかし、本発明による方法の範囲内において、試験に使用する酸化還元媒介物を結合し、したがってその酸化還元活性を阻害する（消失させる）いかなる他の抗体も利用できる。これに関連して、その抗体が酸化または還元状態の酸化還元媒介物を結合する場合、本発明には不適である。しかし、酸化された媒介物を結合している抗体は、前述の発明において初めて使用された抗フェロセニウム抗体の場合などいくつかの用途において特定の利点を提示する。この理由は、酸化還元マーカーの還元用として使用できる低い検出電位である（適用例において、検出はＡｇ／ＡｇＣｌに対して＋１００ｍＶで実行さる；酸化用の場合、検出は、血清において非特異的シグナルの増加の原因になる＋２５０〜＋４００ｍＶで行わなければならなくなる）。
【００３９】
消失物質の効果を有するこれら酸化還元マーカー抗体およびこれらを含む二重特異性抗体結合体は、本発明の態様の１つを表す。本発明の消失物質の効果を有する酸化還元マーカー抗体は、結合した酸化還元マーカーの酸化還元活性を大幅に、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上または完全に阻害する（「消失させる」）ことができる。
【００４０】
本出願において「抗体」という用語は一般に、文脈から何か他のものを明白に理解できない限り、特異的に結合するその断片も含むものとする。
【００４１】
本明細書において初めて記述された抗フェロセニウム抗体を用いて、フェロセニウム（またはフェロセン）を検出するための競合イムノアッセイを実現できるが、なんら高い技術的重要性はない。電気化学的イムノアッセイを用いる本法によってどんな分析物も検出できて初めて、本方法は高い技術的利益および高い商品価値を持つ。この趣旨で、標的分析物が相補的な抗体に結合することによってフェロセニウム−抗フェロセニウム結合に変化がもたらされるように、フェロセニウム−抗フェロセニウム免疫複合体の形成は任意のモノクローナル抗体と共役させなければならない。抗農薬抗体または抗フルオレセイン抗体のいずれの場合にも一方だけが結合できるような、非常に短いリンカーで連結した両抗原の結合体を用いて２つの免疫反応を共役させる簡潔な方法は、低分子物質と共役したフェロセン結合体が通常不溶性なので、本発明による方法の場合には使用できなかった、Ｓｅｌｌｒｉｅらによって記述された［米国特許第２００８１９９９７２Ａ号］。実用的な用途のためには、十分高い水溶性を有するフェロセン−分析物結合体を調製しなければならない。生物結合体の合成に使用できる多数の水溶性リンカー分子が、当業者に公知である。優れた水溶性、タンパク質および表面に対する非特異的結合の少なさならびに複数の鎖長および化学官能基の利用可能性から、ポリエチレングリコールリンカー（同義語：ポリエチレンオキシドリンカー、ＰＥＧ、ＰＥＯ）が、最もよく使用される水溶性リンカーに属する。ポリエチレングリコールリンカー（同義語：ポリエチレンオキシドリンカー）は直鎖状分子であり、一方または両端に共役可能な官能基（例えばカルボキシ基、アミノ基、チオール基など）を有することができる。ポリエチレングリコールリンカーの水溶性は非常に高く、リンカーの鎖長を増やすにつれて増加する。
【００４２】
本発明による方法において使用される結合体を調製するには、十分な鎖長の二官能性水溶性リンカー、例えば２つの共役可能な末端官能基を持つ４００〜３０，０００ダルトンのＰＥＧリンカー、好ましくは２０００ダルトンのジアミノＰＥＧリンカーを使用して、フェロセンまたは別の適切な酸化還元媒介物を一方の末端におよび標的分析物を他方の末端に共役させる。十分な長さのＰＥＧリンカーを使用することにより、水に不溶性の分析物も試験に利用できるようになる。２つの異なる共役官能基を有するヘテロ二官能性リンカーと同様に、両端に同じ共役官能基を有するホモ二官能性リンカーを使用することができる。
【００４３】
遊離の抗フェロセニウム抗体、遊離の抗分析物抗体およびフェロセン−分析物結合体の存在下におけるフェロセン−分析物結合体を用いた結合実験では、分析物によってフェロセンシグナルに十分な変化が生じなかったことが示された。測定可能なシグナルを得るには、フェロセニウム−分析物結合体が分析の全期間で酸化状態に保たれなければならないことも示された。驚くべきことに、いくつかの酸性緩衝液においてフェロセンが常に酸化状態のままであるということが発見された。本発明による方法において、アッセイは、好ましくはｐＨ１〜ｐＨ７のｐＨ値で、特に好ましくはｐＨ４〜ｐＨ５で実施される。適切な緩衝塩は、例えばリン酸塩、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリス、ビストリス、酢酸塩、グリシルグリシン、グリシンである。
【００４４】
フェロセニウム−抗フェロセニウム結合反応を分析物−抗分析物結合反応と共役させる驚くほど単純で新しい原理をここに発見した。この意味で、１０個以下の長さのメチレン部分を有する短いリンカーを使用して、抗フェロセニウム抗体を化学量論的比率（１：１）で抗分析物抗体と共役させることにより二重特異性抗体結合体を調製した。これによって、上述した所望のシグナル消失特性を、電気化学的イムノアッセイで初めて得た。
【００４５】
これに関連して、競合プロゲステロンイムノアッセイの例で説明される機能原理は、以下の通りである：抗プロゲステロン抗体と抗フェロセニウム抗体とから成る二重特異性抗体結合体、およびフェロセニウム−プロゲステロン結合体を、緩衝液に溶解させる。結合体分子の一部は二重特異性抗体結合体に結合するが、その大多数が二重特異性抗体結合体の抗プロゲステロン末端に結合する（その抗体がより高い親和定数を有するので）。結合するにはＰＥＧリンカーが短すぎ、エネルギー的に好ましくない屈曲構造もとらなければならないので、結合体のフェロセニウム末端は実質的に結合しない。したがって、フェロセニウム末端は電気化学的測定（電流測定またはボルタンメトリ）に自由に利用でき、高い還元電流が測定される。ここで、サンプル由来の遊離のプロゲステロン分子が作用し始めると、これらによりプロゲステロン−フェロセニウム結合体のプロゲステロン末端がプロゲステロン抗体の結合部位から外される。ここで、結合体のフェロセニウム末端は、二重特異性抗体結合体の抗フェロセニウム抗体部分にしか結合できず、電気化学的シグナルの減少が測定される（図解は図１を参照のこと）。
【００４６】
フェロセニウム−分析物結合体と比べて過剰の二重特異性抗体結合体を添加した場合、ほとんどのフェロセニウム残基が抗体結合体に結合し、その電気化学的シグナルはほぼ０に減少し、したがって消失する。しかし、高感度なアッセイにおいて抗体結合体を不足した量添加するような、プロゲステロンに対して最大感度が得られるような方法で、イムノアッセイにおける抗体濃度または二重特異性抗体濃度が選択されることは、当業者には公知である。この場合、高濃度のプロゲステロンがあっても、（合計の）電気化学的シグナルは完全に消失するとは限らない。プロゲステロンの添加によって電気化学的シグナルが約５０％までしか消失できないとき、プロゲステロンアッセイは最も高感度であることが示された（図２を参照のこと）。
【００４７】
対応する消失分子が使用できなかったので、電気化学的イムノアッセイにおいて得られたシグナル消失特性はこれまで示さなかった。
【００４８】
本発明によって使用された抗フェロセニウム抗体は、そのような酸化還元消失分子の１例である。しかし、他の酸化還元マーカーを結合し、そのシグナルを消失させる類似の抗体を調製することは同様に可能である。また、二重特異性抗体結合体におけるそのような抗体の使用は、本発明の一部でもある。
【００４９】
本発明は、高感度の電気化学的検出を用いて溶液中で直接的に均質イムノアッセイを実施するための方法を提供し、その方法はナノモル濃度の低分子または高分子分析物を測定でき、いずれの試薬も固定されておらず、分離および洗浄ステップを行わず、結合反応がリアルタイムに電気化学的に検出されることを特徴とする。
【００５０】
本発明による方法の技術的な適用は、当業者に公知の異なる電気分析技術と共に利用でき、測定電極のどんな改変（例えば化学的改変、膜、薄膜の塗布、横方向の組織化など）も必要とせず、どんな仕様（電極寸法の縮小、分析量の縮小）にも実質的に拡張性があるので、特に容易である。そのシグナル発生の原理（すなわち任意の酸化還元媒介物の酸化還元活性の消失）は、公知の全ての電気分析測定技術、例えば電流測定法、ボルタンメトリ法、電量分析法、電流滴定法、クーロン滴定法、電位差測定法、インピーダンス分光法などに適用できるので、本発明による方法をこれら全ての方法と併用して、新たなイムノアッセイ用途を作製できる。例えば電流測定は、場合によっては、例えば可能な限り安価な全体システムを提供する、または既存の電流測定検出器（例えばグルコースバイオセンサ測定デバイス）をイムノアッセイ用として利用する方法の選択肢になり得る。原理的に新たにイムノアッセイを開発する必要無しに、特定の適用および所望の分析物に応じて電気分析技術を変形させることが可能になる。
【００５１】
マイクロ流体分析システム（ラボオンチップシステム）に利用される場合、新規なイムノアッセイ原理の多様性および技術的な適用性が特に明らかに示される。固定化した成分がなく、分離ステップがない均質イムノアッセイなので、これが特に容易にできる。試薬は、サンプルの添加によってそれらが放出され、アッセイが始まるように、液体または乾燥形態でラボオンチップシステムに導入できる。測定シグナルは、連続的にまたは分析の開始時および終了時（結合平衡に達した後で）だけで測定できる。分析結果を得るために、薬品注入および洗浄または遠心分離ステップといった工程を同期させる必要はない。多くの光学的測定方法（例えば光度測定、蛍光測定）とは対照的に、電気分析法のＳＮ比は小型化しても悪化しない、すなわち小型化した電極用に新規に精巧な検出器および増幅器を開発する必要がない。
【００５２】
新規な方法の高い価値は、例えばラテラルフローイムノアッセイ原理による現在では普通の妊娠検査においてなど、使い切りの高感度使い捨てイムノセンサーをこの方法で実現できるという事実にも示される。検出に必要な電子機器（例えば電流測定回路）は安価な携帯デバイス（例えばグルコース試験紙用の測定デバイス）に組み込むことができ、または使い捨て電子機器（例えばプリント回路または高度な集積回路）として実現することもできる。
【００５３】
新規な方法は、多数の異なるイムノアッセイを同時に、完全自動化で実施する実験室分析装置にも同様に適している。この場合、１〜５分という本発明による方法の短い分析時間は、著しい効果を有する。
【００５４】
本発明による方法の特定の実施形態において、必要な試薬は可溶形態で添加され、結合事象の電気化学的検出はリアルタイムに実行される。
【００５５】
別の特定の実施形態において、全ての必要な試薬は既製の混合物としてサンプルに添加され、結合事象の電気化学的検出はリアルタイムに実行される（混合と測定の原理）。
【００５６】
別の特定の実施形態において、全ての必要な試薬は、適切な反応容器（例えばエッペンドルフチューブ、マイクロタイタープレート、ラボオンチップシステム、試験紙）中に乾燥試薬として提供され、サンプルおよび場合によっては緩衝液の添加によって溶解されるだけであり、その添加が前記分析の開始を示す。
【００５７】
さらに別の、特に有益な特定の実施形態において、イムノアッセイはマイクロ流体分析システム（ラボオンチップ）で実施される。
【００５８】
典型的な実施形態において、イムノアッセイは完全自動化分析装置で実施される。
【００５９】
検出用として単一電極の代わりに構造電極、例えばくし形電極を使用することによって本発明による方法の別の改善が得られ、それを用いていわゆる酸化還元リサイクル法により分析の感度をさらに高めることができる。
【００６０】
本発明による方法の別の有利な改変は、単純な電気化学的酸化還元反応（例えばフェロセニウムのフェロセンへの還元）の代わりに、酵素的に触媒される環状反応（例えば電気化学的還元とその後に続くフェロセニウムの酵素的再酸化）、いわゆる酵素リサイクリングを利用することであり、それを用いて分析の感度をさらに高めることができる。
【００６１】
本発明による方法は、低いナノモル濃度の範囲の測定に特に適しており、分離ステップがない従来の公知の均質な電気化学的イムノアッセイより約１０００倍高感度である。抗体に結合した後に（従来の公知の方法のように単に拡散定数を低下させる代わりに）酸化還元活性のある結合体の酸化還元活性を完全に消失させることができる上述の新規なシグナリング原理によって、この非常に大きな感度の改善が得られる。
【００６２】
これに関連して、従来通りのコーティングしてない電極（例えばガラス炭素電極）で単純な電流測定またはボルタンメトリ測定を実行するので、電気化学的測定方法は技術的には上述した方法と同程度に単純である。手作業のステップは、試薬の添加およびサンプル溶液の添加に限られる；分離ステップは必要ない。本発明による方法は、混合と測定原理に基づく分析も可能にし、自動化に特に適している。これに関連して、本発明による方法は、十分にスケーラブルであり、すなわち微小量にでき、例えばマイクロ流体用途（ラボオンチップ）に適用できる。この特性および通常は（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して）＋１００ｍＶの低い検出電位のため、本発明による方法は、例えばステロイドホルモンなど低分子分析物および例えばｈＣＧなど高分子分析物、または例えば血液など複雑な生体サンプル中のタンパク質マーカーの直接的な測定に適している。
【００６３】
したがって、本発明による方法は多くの商業的に重要なイムノアッセイに適しており、技術的に精巧であり（したがって高価である）またはかろうじて小型化および自動化され得る既存の検出方法と取って代わることができる。その方法は、臨床診断、環境および食品分析用途に適しており、また小型化および技術的な簡単さに対する優れた適合性により、実験室外の用途（現場用途、ポイントオブケア分析、使い捨てセンサ、ラボオンチップイムノアッセイ）に特に適している。したがって本発明による方法は、多くの用途において、例えば蛍光検出器または蛍光偏光検出器など従来の高価な検出システムに取って代わる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】プロゲステロン検出の例に関する本発明によるイムノアッセイの概略図である。
【図２】本発明による方法に基づいたプロゲステロンの電流測定についての用量効果曲線である。
【発明の詳細な説明】
【００６５】
以下の非限定的な例により本発明をより詳細に説明する。
【００６６】
［例１］
血清の直接競合プロゲステロンイムノアッセイ
デバイス：電気化学的に撹拌されるセル、操作容量１ｍＬ、
電流測定モードのポテンシオスタット
緩衝液：酢酸緩衝液、ｐＨ４．４
サンプル：ヒト血清、原液
較正液：原液、プロゲステロン２ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬと混合したヒト血清
方法ステップ：
・酢酸緩衝液ｐＨ４．４  ４５０μＬで電気化学測定セルを充填する
・（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して）＋１００ｍＶに作用電極を分極させる
・二重特異性抗体結合体１０μＬを添加する（終濃度約０．１μｇ／ｍＬ）
・酸化還元マーカー−プロゲステロン結合体１０μＬを添加する（終濃度約１００ｎＭ）
・Ｈ２Ｏ２／ペルオキシダーゼ３０μＬを添加する（終濃度Ｈ２Ｏ２  ５ｍＭ、ペルオキシダーゼ０．０２ｎＭ）
・基礎シグナルを測定する
・ヒト血清５００μＬ（または較正液５００μＬ）を添加する
・血清添加１８０秒後の最終シグナルを測定する
評価は、あらかじめ測定した用量効果曲線に基づいて、または２点較正に基づいて実施する。
【００６７】
［例２］
唾液の直接競合プロゲステロンイムノアッセイ
デバイス：電気化学的に撹拌されるセル、操作容量１ｍＬ、
電流測定モードのポテンシオスタット
緩衝液：酢酸緩衝液、ｐＨ４．４
サンプル：ヒト唾液（１：５希釈）
較正液：１：５希釈、プロゲステロン２ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬと混合したヒト唾液
方法ステップ：
・酢酸緩衝液ｐＨ４．４  ４５０μＬで電気化学測定セルを充填する
・（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して）＋１００ｍＶに作用電極を分極させる
・二重特異性抗体結合体１０μＬを添加する（終濃度約０．１μｇ／ｍＬ）
・酸化還元マーカー−プロゲステロン結合体１０μＬを添加する（終濃度約１００ｎＭ）
・Ｈ２Ｏ２／ペルオキシダーゼ３０μＬを添加する（終濃度Ｈ２Ｏ２  ５ｍＭ、ペルオキシダーゼ０．０２ｎＭ）
・基礎シグナルを測定する
・ヒト唾液１：５希釈５００μＬ（または較正液５００μＬ）を添加する
・唾液添加１８０秒後の最終シグナルを測定する
評価は、あらかじめ測定した用量効果曲線に基づいて、または２点較正に基づいて実施する。
【００６８】
［例３］
尿の直接競合ヒト絨毛ゴナドトロピンイムノアッセイ（ｈＣＧ）
デバイス：電気化学的に撹拌されるセル、操作容量１ｍＬ、
電流測定モードのポテンシオスタット
緩衝液：酢酸緩衝液、ｐＨ４．４
サンプル：ヒト血清、原液
較正液：原液、ｈＣＧ１０ｍＩＵ／ｍＬ、２０ｍＩＵ／ｍＬ、４０ｍＩＵ／ｍＬ、１００ｍＩＵ／ｍＬ、２００ｍＩＵ／ｍＬと混合したヒト血清
方法ステップ：
・酢酸緩衝液ｐＨ４．４  ４５０μＬで電気化学測定セルを充填する
・（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して）＋１００ｍＶに作用電極を分極させる
・二重特異性抗体結合体１０μＬを添加する（終濃度約０．３μｇ／ｍＬ）
・酸化還元マーカー−ｈＣＧ結合体１０μＬを添加する（終濃度約２００ｎＭ）
・Ｈ２Ｏ２／ペルオキシダーゼ３０μＬを添加する（終濃度Ｈ２Ｏ２  ５ｍＭ、ペルオキシダーゼ０．０２ｎＭ）
・基礎シグナルを測定する
・ヒト血清５００μＬ（または較正液５００μＬ）を添加する
・血清添加１８０秒後の最終シグナルを測定する
評価は、あらかじめ測定した用量効果曲線に基づいて、または２点較正に基づいて実施する。
【図１】
2013526720.tif 000003
【図２】
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【国際調査報告】
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2013526720.tif 000008
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