(57)【要約】  本発明は、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製作するための方法に関する。具体的に、本発明は、生物変換工程を使用してｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2013519380.tif 000016
のステップを含む、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を調製するための方法。
【請求項２】
ａ．ｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよびｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、ｍｙｏ−イノシトールを生物変換工程に掛けるステップ；
ｂ．ステップ（ａ）で製造されたｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよびｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを塩基性化合物および熱を用いて反応させて、ｓｃｙｌｌｏ−イノソースを分解し細胞集団を溶解するステップ；
ｃ．ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体を製造するために、ステップ（ｂ）のｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを、ホウ酸および水酸化ナトリウムで変換するステップ；
ｄ．粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体を硫酸および水で加水分解するステップ；ならびに
ｅ．結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを結晶化させるステップ
を含む、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を調製するための方法。
【請求項３】
生物変換工程が発酵ブロスを作ることを含み、これによって発酵が、ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換することができる微生物により促進される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換することができる微生物が、アセトバクター・セレビシエ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アセトバクター・マロルム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｌｏｒｕｍ）、アセトバクター・オレアネンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｏｒｌｅａｎｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・インドネシエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｄｏｎｅｓｉｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・オリエンタリス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）、アセトバクター・リケファシエンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、アセトバクター・パスツリアナス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、アセトバクター・ハンセニイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、バークホルデリア・アンドロポゴニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ）、バークホルデリア・カリオフィリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ）、およびバークホルデリア・グラミニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換することができる微生物が、凍結乾燥されたおよび／または凍結された培養物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）が、約２０℃から約４０℃の範囲の温度で実行される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）が、約２６℃から約３０℃の範囲の温度で実行される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）の塩基性化合物が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよびこれらの組合せを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）で発酵ブロスに添加される塩基性化合物の量が、発酵ブロスのｐＨを約１０から約１３の範囲の水準にまで高めるのに十分な量である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）で発酵ブロスに添加される塩基性化合物の量が、発酵ブロスのｐＨを約１２から約１３の範囲の水準にまで高めるのに十分な量である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）が、発酵ブロスの温度を高めるために蒸気を直接注入することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
発酵ブロスの温度が、約１００℃から約１５０℃の範囲の水準にまで高められる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
発酵ブロスの温度が、約１１５℃から約１３０℃の範囲の水準にまで高められる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
発酵ブロスが、約１００℃から約１５０℃の範囲の温度にまで加熱された後、ブロスが約８０℃未満の温度にまで冷却される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｃ）の反応が、約６０℃から約８０℃の範囲の温度で実行される、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｃ）のブロス中に組み込まれる水酸化ナトリウムの量が、約８．５から約１１の範囲のｐＨを確立するのに十分である、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｃ）のブロス中に組み込まれる水酸化ナトリウムの量が、約９．５から約１０．５の範囲のｐＨを確立するのに十分である、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｃ）が、ブロスを３０℃未満の温度にまで引き続いて冷却することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｃ）で製造されたｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体が、ステップ（ｄ）に先立って、水平スクロールデカンターを通過する、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｄ）におけるｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体と水との組合せが、硫酸の添加に先立って、約３０℃から約５０℃の範囲の温度にまで加熱される、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｄ）におけるｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体と水との組合せが、硫酸の添加に先立って、約３６℃から約４３℃の範囲の温度にまで加熱される、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｄ）におけるｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体と水との組合せに添加される硫酸の量が、ｐＨを約２から約３．５の範囲の水準にまで低下させるのに十分である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｄ）の反応生成物が、約１５℃から約２６℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｄ）の反応生成物が、約１８℃から約２４℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｅ）が、水を粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに添加すること、続いて反応混合物を加熱すること、および結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールの製造のために引き続いて冷却することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
水をステップ（ｄ）で製造された粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに添加することに引き続いて、水と粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールとの反応混合物が、約７０℃から約１００℃の範囲の温度にまで加熱される、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
水をステップ（ｄ）で製造された粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに添加することに引き続いて、水とｓｃｙｌｌｏ−イノシトールとの反応混合物が、約８５℃から約９５℃の範囲の温度にまで加熱される、請求項２に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｅ）で製造された水と粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールとの反応混合物が、約８℃から約１６℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ｅ）で製造された粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールと水との冷却された溶液が、結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、固体分離工程および乾燥に掛けられる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
固体分離工程が、バスケット遠心分離およびスクロールデカンター遠心分離を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
乾燥工程が、熱空気を流動床ドライヤー、トレイドライヤー、タンブルドライヤー、およびユニドライヤー中で使用することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
【化２】
2013519380.tif 000017
のステップを含む、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を調製するための方法。
【請求項３３】
ａ．ｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよびｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、ｍｙｏ−イノシトールを生物変換工程に掛けるステップ；
ｂ．ステップ（ａ）で製造されたｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよびｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを塩基性化合物および熱を用いて反応させて、ｓｃｙｌｌｏ−イノソースを分解し細胞集団を溶解するステップ
ｃ．結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを結晶化させるステップ
を含む、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を調製するための方法。
【請求項３４】
生物変換ステップが発酵混合物を作ることを含み、これによって発酵が、ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換することができる微生物により促進される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換することができる微生物が、アセトバクター・セレビシエ、アセトバクター・マロルム、アセトバクター・オレアネンシス、アセトバクター・インドネシエンシス、アセトバクター・オリエンタリス、アセトバクター・アセチ、アセトバクター・リケファシエンス、アセトバクター・パスツリアナス、アセトバクター・ハンセニイ、バークホルデリア・アンドロポゴニス、バークホルデリア・カリオフィリ、およびバークホルデリア・グラミニスを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換することができる微生物が、凍結乾燥された培養物および冷凍された培養物を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ａ）が、約２０℃から約４０℃の範囲の温度で実行される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ａ）が、約２６℃から約３０℃の範囲の温度で実行される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｂ）の塩基性化合物が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、炭酸カルシウムおよびこれらの組合せを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ｂ）の塩基性化合物が、水酸化ナトリウムを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ｂ）で発酵混合物に添加される塩基性化合物の量が、発酵混合物のｐＨを約１０から約１３の範囲の水準にまで高めるのに十分な量である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ｂ）で発酵混合物に添加される塩基性化合物の量が、発酵混合物のｐＨを約１２から約１３の範囲の水準にまで高めるのに十分な量である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（ｂ）の塩基性化合物が、水素化ホウ素ナトリウムを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ｂ）で発酵混合物に添加される塩基性化合物の量が、発酵混合物のｐＨを約６から約８の範囲の水準にまで高めるのに十分な量である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（ｂ）が、発酵混合物の温度を高めるために蒸気を直接注入することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４６】
発酵混合物の温度が、約１００℃から約１５０℃の範囲の水準にまで高められる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
発酵混合物の温度が、約１１５℃から約１３０℃の範囲の水準にまで高められる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
発酵混合物の温度が、約５０℃から約７０℃の範囲の水準にまで高められる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
発酵混合物の温度が、約８５℃から約９５℃の範囲の水準にまで高められる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
ステップ（ｂ）の反応生成物が、約１５℃から約２６℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却される、請求項３３に記載の方法。
【請求項５１】
ステップ（ｂ）の反応生成物が、約１８℃から約２４℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却される、請求項３３に記載の方法。
【請求項５２】
ステップ（ｂ）が、発酵混合物を硫酸の添加により引き続いて酸性化することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５３】
発酵混合物に添加される硫酸の量が、発酵混合物のｐＨを約３．５以下の水準にまで低下させるのに十分な量である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
発酵混合物のｐＨが、約３．５以下の水準にまで低下した後、発酵混合物が約８０℃から約１００℃の範囲の温度にまで引き続いて加熱される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ステップ（ｃ）が、水を粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに添加すること、続いて反応混合物を加熱すること、および結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために引き続いて冷却することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５６】
水をステップ（ｂ）で製造された粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに添加することに引き続いて、水と粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールとの反応混合物が、８０℃を超える温度にまで加熱される、請求項３３に記載の方法。
【請求項５７】
ステップ（ｃ）で製造された水と粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールとの反応混合物が、約８℃から約１６℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ステップ（ｅ）で製造された粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールと水との冷却された溶液が、結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールの製造のために、固体分離工程および乾燥に掛けられる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
固体分離工程が、バスケット遠心分離およびスクロールデカンター遠心分離を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
乾燥工程が、熱空気を流動床ドライヤー、トレイドライヤー、タンブルドライヤー、およびユニドライヤー中で使用することを含む、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年２月１５日に出願された米国仮出願第６１／３０４，５８１号の優先権を主張し、この内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製作するための方法に関する。具体的に、本発明は、生物変換工程を使用してｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）［ＣＡＳ登録番号４８８−５９−５］は、種々の天然源中に存在することが見出されているヘキサヒドロシクロヘキサンの９個の立体異性体の１つである。しかし、広汎に使用されている栄養補助食品ｍｙｏ−イノシトール（２）［ＣＡＳ登録番号８７−８９−８］に比べると、ほんの少量しか存在しない（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃａｓｔｒｏら、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００４年、第８７巻、３２５頁）。ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）はまた、種々の哺乳類の組織中に存在し（Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９６８年、第７巻、８１９頁）、アルツハイマー病を患っている個人の脳には高濃度で存在する（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓら、ＮＭＲ  Ｂｉｏｍｅｄ．、１９９３年、第６巻、１０５頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、同書、２００７年、第２０巻、７０９頁）。さらに、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）は、アルツハイマー病を患っている個人に蓄積する老人斑の神経毒成分（例えば、Ａβ４２ペプチド）の大部分と相互作用することができ、この二次構造に変化を誘発し、小さなＡβ−オリゴマーを安定化し、フィブリル形成を完全に阻止することが実証されている（ＭｃＬａｕｒｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９８年、第２７８巻、１８３頁；ＭｃＬａｕｒｉｎら、同書、２０００年、第２７５巻、１８４９５頁；Ｆｅｎｉｌｉら、同書、２００７年、第８５巻、６０３頁およびＷＯ２００４／０７５８８２）。
【０００４】
【化１】
2013519380.tif 000002
【０００５】
これらの研究成果の結果、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）は、現在、アルツハイマー病の治療におけるこの効力を評価しこの有用性を決定するためのさらなる臨床試験が行われている（Ｗｏｌｆｓｏｎ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００８年、８９頁）。
【０００６】
ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を調製するための種々の方法が報告されている。調製方法の１つは、アセトバクター・サブオキシダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）を使用してｍｙｏ−イノシトール（２）から調製された２，４，６／３，５−ペンタヒドロキシシクロヘキサノン（ｍｅｓｏ−２−イノソース）の酵素的手法（Ｋｌｕｙｖｅｒら、Ｒｅｃ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ．、１９３９年、第５８巻、９５６頁）に基づいており、他の調製方法は、酸性媒体中でのナトリウムアマルガム試薬によるｍｅｓｏ−２−イノソースの還元を経由し、続いて分離するもの（Ｐｏｓｔｅｒｎａｋ、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９４１年、第２４巻、１０４５頁）または水素化ホウ素ナトリウム還元剤を使用する収率の低いもの（Ｒｅｙｍｏｎｄ、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９５７年、第４０巻、４９２頁）である。他の調製方法は、低収率でヘキサヒドロキシベンゼンから出発することに基づいており（Ａｎｇｙａｌら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９５７年、３６８２頁）、またはコンズリトールを原料として利用すること（Ｎａｋａｊｉｍａら、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１９５９年、第９２巻、１７３頁）に基づいている。追加の調製方法は、イオン交換樹脂上での分離（Ｓａｓａｋｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．、１９８７年、第１６７巻、１７１頁）、錯体形成によるクロマトグラフ分離（Ｓａｓａｋｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．、１９８８年、第１８３巻、１頁）またはシリカＨＰＬＣカラム上での化学的分離（Ｇｈｉａｓ−ｕｄ−ｄｉｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１９８１年、第２１１巻、２９５頁）による。さらなる方法は、ｍｙｏ−イノシトール（２）から出発し、酸化を経由し続いて、得られたｍｙｏ−イノソースペンタアセテートを還元および加水分解する（Ｋｏｈｎｅら、Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．、１９８５年、第４巻、８６６頁；ＤＥ１９８５／３４０５６６３）が、他の方法は、ｍｙｏ−イノシトール（２）から出発し、塩基性の条件下でラネーニッケルを使用して平衡化することを経由（Ｈｕｓｓｏｎら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．、１９９８年、第３０７巻、１６３頁）し、他の方法は、６−Ｏ−アセチル−５−エノピラノシドから出発して一連の環化付加反応のためのパラジウム触媒を組み込む（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、第６６巻、２７０５頁）。追加の調製方法は、スルホネート基を使用する選択的保護を経由し、続いて酸化および還元をする、ｍｙｏ−イノシトール（２）の使用により実証された（Ｓａｒｍａｈら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．、２００３年、第３３８巻、９９８頁）。代替法として、ｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）を経由して、調製方法は、シュードモス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｓ）およびアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）を使用してｍｙｏ−イノシトール（２）から出発することを含む（Ｋｅｎｊｉら、ＪＰ２００３／１０２４９２）。他の調製方法は、ベンゾキノンから調製されたコンズリトールから出発するもの（Ｂｏｌｃｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、第１０巻、１９５８頁）、有機シリル基を保護に使用し、次いで化学的もしくは酵素的な還元を行う（Ｋｅｎｊｉら、ＪＰ２００３／１０７２８７ことに基づく、またはｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）の酵素的還元（Ｋｅｎｊｉら、ＷＯ２００５／０３５７７４）を経由してｍｙｏ−イノシトール（２）から調製されたｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）を経由するもの、またはｍｙｏ−イノシトール（２）から（Ｃｒｕｚら、ＷＯ２００７／１１９１０８）のものを含む。
【０００７】
これらの中では、限られた方法のみが、大きなスケールで、特に、医薬用途に適した高品質でのｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の調製に適している。しかし、Ｋｅｎｊｉら（ＷＯ２００５／０３５７７４）により記述された方法は、アセトバクター属に属する微生物を使用するｍｙｏ−イノシトール（２）のｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）への変換、続いてｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）のｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）への酵素的還元に基づいているものであるが、キログラムスケールの操作に適していることが示された。
【０００８】
上の段落に記述した方法では、ｍｙｏ−イノシトール（２）が最初にｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）に変換され、次いでそれが大きな百分率でｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）に変換されるが、大部分のｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）が未反応のまま残り、結果的に混合物をもたらす。さらに、この変換においては、多量のｓｃｙｌｌｏ−クエルシトール（６）も、副生成物として形成される。所望のｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を未反応のｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）および副生成物のｓｃｙｌｌｏ−クエルシトール（６）の混合物から分離するために、Ｋｅｎｊｉら（ＷＯ２００５／０３５７７４）は、最初に細胞を分離し、続いてｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）をｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム複合体（ＳＢＣ塩、５）に化学的に変換し、続いてメタノールと水との混合物中で塩酸を使用して加水分解した。この変換は、ＳＢＣ塩（５）の形成のためにホウ酸の使用（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９５７年、第２３巻、３２９頁およびＧｒａｉｎｇｅｒ、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．、１９８１年、第Ｂ３７巻、５６３頁）、および単に装置を腐食させるだけでなく有害な煙霧に対する安全確保のために特別の操作手順を必要とする濃塩酸の使用を必要とする。加えて、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の原体中の関連物質不純物である、いかなる残留量のＤ−およびＬ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（７および８）の両方の形成または存在も判定されていない。
【０００９】
【化２】
2013519380.tif 000003
【００１０】
さらに、この方法は、ＳＢＣ塩（５）への化学的選択的誘導体化のために、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の回収中にホウ酸を使用することを必要とするため、ホウ酸を引き続きのステップで、最終原体中の適当レベルにまでＩＣＨおよび規制ガイドラインに従って除去することが重要となる。加えて、生物変換ステップの終了時に多量で存在する未反応のｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）が、塩基および熱分解により破壊されるという事実により、この操作に起因する潜在的な収率損失は不可避である。それゆえ、試薬、全体収率および生成物の品質確保に関して、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の改善された製作方法に対する必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００４／０７５８８２号
【特許文献２】独国特許発明第１９８５／３４０５６６３号明細書
【特許文献３】特開２００３／１０２４９２号公報
【特許文献４】特開２００３／１０７２８７号公報
【特許文献５】国際公開第２００５／０３５７７４号
【特許文献６】国際公開第２００７／１１９１０８号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃａｓｔｒｏら、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００４年、第８７巻、３２５頁
【非特許文献２】Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９６８年、第７巻、８１９頁
【非特許文献３】Ｍｉｃｈａｅｌｉｓら、ＮＭＲ  Ｂｉｏｍｅｄ．、１９９３年、第６巻、１０５頁
【非特許文献４】Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、同書、２００７年、第２０巻、７０９頁
【非特許文献５】ＭｃＬａｕｒｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９８年、第２７８巻、１８３頁
【非特許文献６】ＭｃＬａｕｒｉｎら、同書、２０００年、第２７５巻、１８４９５頁
【非特許文献７】Ｆｅｎｉｌｉら、同書、２００７年、第８５巻、６０３頁
【非特許文献８】Ｗｏｌｆｓｏｎ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００８年、８９頁
【非特許文献９】Ｋｌｕｙｖｅｒら、Ｒｅｃ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ．、１９３９年、第５８巻、９５６頁
【非特許文献１０】Ｐｏｓｔｅｒｎａｋ、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９４１年、第２４巻、１０４５頁
【非特許文献１１】Ｒｅｙｍｏｎｄ、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９５７年、第４０巻、４９２頁
【非特許文献１２】Ａｎｇｙａｌら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９５７年、３６８２頁
【非特許文献１３】Ｎａｋａｊｉｍａら、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１９５９年、第９２巻、１７３頁
【非特許文献１４】Ｓａｓａｋｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．、１９８７年、第１６７巻、１７１頁
【非特許文献１５】Ｓａｓａｋｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．、１９８８年、第１８３巻、１頁
【非特許文献１６】Ｇｈｉａｓ−ｕｄ−ｄｉｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１９８１年、第２１１巻、２９５頁
【非特許文献１７】Ｋｏｈｎｅら、Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．、１９８５年、第４巻、８６６頁
【非特許文献１８】Ｈｕｓｓｏｎら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．、１９９８年、第３０７巻、１６３頁
【非特許文献１９】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、第６６巻、２７０５頁
【非特許文献２０】Ｓａｒｍａｈら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．、２００３年、第３３８巻、９９８頁
【非特許文献２１】Ｂｏｌｃｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、第１０巻、１９５８頁
【非特許文献２２】Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９５７年、第２３巻、３２９頁
【非特許文献２３】Ｇｒａｉｎｇｅｒ、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．、１９８１年、第Ｂ３７巻、５６３頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の調製のための効率的で安全な手法を提供する。本発明のある実施形態において、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールは以下の方法に従って製造される。
【００１４】
【化３】
2013519380.tif 000004
【００１５】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）ｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）およびｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を製造するために、ｍｙｏ−イノシトール（２）を生物変換工程に掛けるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）で製造されたｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよびｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを塩基性化合物と反応させ、加熱してｓｃｙｌｌｏ−イノソースを分解し細胞集団を溶解するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）のｓｃｙｌｌｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体に、ホウ酸および水酸化ナトリウムを使用して変換するステップ；（ｄ）粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体を加水分解するステップ；ならびに（ｅ）結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを結晶化させるステップを含む、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を調製するための方法を含む。ステップ（ａ）の生物変換は発酵を含んでもよく、これによって発酵は、ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換することができる微生物により促進される。ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換することができる微生物は、アセトバクター・セレビシエ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アセトバクター・マロルム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｌｏｒｕｍ）、アセトバクター・オレアネンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｏｒｌｅａｎｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・インドネシエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｄｏｎｅｓｉｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・オリエンタリス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）、アセトバクター・リケファシエンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、アセトバクター・パスツリアナス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、アセトバクター・ハンセニイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、バークホルデリア・アンドロポゴニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ）、バークホルデリア・カリオフィリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ）およびバークホルデリア・グラミニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）を含む。一般に、ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換することができる微生物は、凍結乾燥されたまたは凍結された培養物の形態で提供される。本方法のステップ（ａ）は、約２０℃から約４０℃の範囲の温度で実行される。他の実施形態において、ステップ（ａ）は、約２６℃から約３０℃の範囲の温度で実行される。
【００１６】
ステップ（ｂ）の塩基性化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよびこれらの組合せを含み得る。ステップ（ｂ）で発酵混合物に添加される塩基性化合物の量は、一般に、発酵混合物のｐＨを約１０から約１３の範囲の水準にまで高めるのに十分な量である。他の実施形態において、ステップ（ｂ）で発酵混合物に添加される塩基性化合物の量は、発酵混合物のｐＨを約１２から約１３の範囲の水準にまで高めるのに十分な量である。ステップ（ｂ）の加熱工程は、典型的には、発酵混合物の温度を高めるために、蒸気を直接注入することを含み、温度は約１００℃から約１５０℃の範囲の水準にまで高められる。他の実施形態において、発酵混合物の温度は、約１１５℃から約１３０℃の範囲の水準にまで高められる。追加の実施形態において、ステップ（ｂ）で製造された反応混合物は、約８０℃未満の温度にまで引き続いて冷却され得る。
【００１７】
ステップ（ｃ）の反応は、典型的には、約６０℃から約８０℃の範囲の温度で実行される。ステップ（ｃ）の反応混合物中に組み込まれる水酸化ナトリウムの量は、一般に、約８．５から約１１の範囲のｐＨを確立するのに十分である。他の実施形態において、ステップ（ｃ）の反応混合物中に組み込まれる水酸化ナトリウムの量は、約９．５から約１０．５の範囲のｐＨを確立するのに十分である。ステップ（ｃ）は、反応混合物を３０℃未満の温度にまで引き続いて冷却することをさらに含み得る。ステップ（ｃ）で製造されたｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体は、ステップ（ｄ）に先立って、水平スクロールデカンターを引き続いて通過してもよい。
【００１８】
ステップ（ｄ）において、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体と水との組合せは、硫酸の添加に先立って、約３０℃から約５０℃の範囲の温度にまで加熱される。他の実施形態において、ステップ（ｄ）におけるｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体と水との組合せは、硫酸の添加に先立って、約３６℃から約４３℃の範囲の温度にまで加熱される。ステップ（ｄ）におけるｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体と水との組合せに添加される硫酸の量は、ｐＨを約２から約３．５の範囲の水準にまで低下させるのに十分である。ステップ（ｄ）の反応生成物は、約１５℃から約２６℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却され得る。他の実施形態において、ステップ（ｄ）の反応生成物は、約１８℃から約２４℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却されてもよい。
【００１９】
ステップ（ｅ）は、典型的には、水をステップ（ｄ）で製造された粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに添加すること、続いて反応混合物を加熱すること、および結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールの製造のために引き続いて冷却することを含む。具体的に、水をステップ（ｄ）で製造された粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに添加することに引き続いて、水と粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールとの反応混合物は、約７０℃から約１００℃の範囲の温度にまで加熱される。他の実施形態において、水とｓｃｙｌｌｏ−イノシトールとの反応混合物は、約８５℃から約９５℃の範囲の温度にまで加熱されてもよい。ステップ（ｅ）で製造された水と粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールとの反応混合物は、約８℃から約１６℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却される。一般には、冷却後、ステップ（ｅ）で製造された粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールと水との溶液は、結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、固体ろ過または遠心分離のいずれかによる固体分離工程および乾燥に掛けられる。ある実施形態において、固体分離工程は、バスケット遠心分離およびスクロールデカンター遠心分離を含み得る。さらに、他の実施形態において、乾燥工程は、熱空気を流動床ドライヤー、トレイドライヤー、タンブルドライヤー、およびユニドライヤー中で使用することを含み得る。
【００２０】
さらなる実施形態において、本発明は、以下のステップに従う、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体中間体を製造することなく、ｍｙｏ−イノシトールを製造するための方法を含む。
【００２１】
【化４】
2013519380.tif 000005
【００２２】
具体的に、本発明は、（ａ）ｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）およびｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を製造するために、ｍｙｏ−イノシトール（２）を生物変換工程に掛けるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）で製造されたｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよびｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを塩基性化合物と反応させ、加熱してｓｃｙｌｌｏ−イノソースを分解し細胞集団を溶解するステップ；ならびに（ｃ）結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを結晶化させるステップを含む、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を調製するための方法を含む。ステップ（ａ）の生物変換は発酵を含んでもよく、これによって発酵は、ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換することができる微生物により促進される。ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換することができる微生物は、アセトバクター・セレビシエ、アセトバクター・マロルム、アセトバクター・オレアネンシス、アセトバクター・インドネシエンシス、アセトバクター・オリエンタリス、アセトバクター・アセチ、アセトバクター・リケファシエンス、アセトバクター・パスツリアナス、アセトバクター・ハンセニイ、バークホルデリア・アンドロポゴニス、バークホルデリア・カリオフィリおよびバークホルデリア・グラミニスを含む。一般に、ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換することができる微生物は、凍結乾燥され冷凍された培養物の形態で提供される。本発明のステップ（ａ）は、約２０℃から約４０℃の範囲の温度で実行される。他の実施形態において、ステップ（ａ）は、約２６℃から約３０℃の範囲の温度で実行される。
【００２３】
ステップ（ｂ）の塩基性化合物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよびこれらの組合せを含み得る。ステップ（ｂ）で発酵混合物に添加される塩基性化合物の量は、一般には、発酵混合物のｐＨを約１０から約１３の範囲の水準にまで高めるのに十分な量である。他の実施形態において、ステップ（ｂ）で発酵混合物に添加される塩基性化合物の量は、発酵混合物のｐＨを約１２から約１３の範囲の水準にまで高めるのに十分な量である。ステップ（ｂ）の加熱工程は、典型的には、発酵混合物の温度を高めるために蒸気を直接注入することを含み、温度が、約１００℃から約１５０℃の範囲の水準にまで高められる。他の実施形態において、発酵混合物の温度は、約１１５℃から約１３０℃の範囲の水準にまで高められる。追加の実施形態において、ステップ（ｂ）で製造された反応混合物は、約８０℃未満の温度にまで引き続いて冷却されてもよい。
【００２４】
ステップ（ｃ）は、典型的には、水をステップ（ｂ）で製造された粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに添加すること、続いて反応混合物を加熱すること、および結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために引き続いて冷却することを含む。ステップ（ｃ）で製造された水と粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールとの反応混合物は、約８℃から約１６℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却される。一般に、冷却後、ステップ（ｃ）で製造された粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールと水との溶液は、結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールの製造のために、固体ろ過または遠心分離のどちらかによる固体分離工程および乾燥に掛けられる。ある実施形態において、固体分離工程は、バスケット遠心分離およびスクロールデカンター遠心分離を含み得る。さらに、他の実施形態において、乾燥工程は、熱空気を流動床ドライヤー、トレイドライヤー、タンブルドライヤー、およびユニドライヤー中で使用することを含み得る。
【００２５】
本発明の他の利点は、以下の詳細な説明を付属している図面と関連して考慮しながら参照することによってよりよく理解されることになるので、容易に認識されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の商業的スケールでの方法を示す図である。具体的に、図１は、以下のステップ、生物変換のステップ；発酵混合物に適用される塩基および熱ストレスによる分解のステップ；ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体を製造するためのホウ酸および水酸化ナトリウムとの反応のステップ；粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するための硫酸および水との反応によるｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体の加水分解のステップならびに結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するための粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールの結晶化のステップによる、ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換するための方法を示す。
【図２】本発明の生物変換を実行するための１つの可能な方法を示す図である。具体的に、図２は、作業用ストックバイアル（単数または複数）が解凍され培地を含有するフラスコ（単数または複数）中に播種され、培養物を繁殖させるように撹拌下でインキュベートされる工程を示す。フラスコ（単数または複数）またはこの一部は、成長培地を含有する種発酵槽に播種するのに使用され、細胞集団をさらに繁殖させるためにインキュベートされる。１つの種発酵槽またはこの一部は、ｍｙｏ−イノシトールを含む製造培地を含有する製造発酵槽に播種するのに使用される。スペアとして用意された余分な種発酵槽は廃棄される。発酵のサイクルは、ｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）中間体を経由してｍｙｏ−イノシトール（２）のｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）への生物変換を完了するために無菌条件で実行される。発酵時間の終了時に、ｍｙｏ−イノシトール（２）は消費され、中間体ｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）は、ｇ／ｌの量で存在し、生成物ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）は、発酵ビール中の主生成物である。
【図３】製造発酵槽中への播種に先立って培養物が成長するにつれて、図２に記載した種発酵槽でモニターした典型的な反応パラメーターを示す図である。具体的に、図３は、空気流量、背圧、ＣＥＲ（二酸化炭素発生率二酸化炭素発生率）、ＤＯ（溶存酸素）、ＯＵＲ（酸素取り入れ速度）、ｐＨ、撹拌、ＲＱ（呼吸係数、ＣＥＲ／ＯＵＲ）、および温度などのパラメーターを示す。
【図４】培養物がｍｙｏ−イノシトールを生物変換し所定の時間反応するにつれて、図２に記載した種発酵槽でモニターした典型的な反応パラメーターを示す図である。具体的に、図４は、空気流量、背圧、ＣＥＲ（二酸化炭素発生率）、ＤＯ（溶存酸素）、ＯＵＲ（酸素取り入れ速度）、ｐＨ、撹拌、温度および重量などのパラメーターを示す。
【図５】出発物質であるｍｙｏ−イノシトール（ＭＩ）の最終生成物ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（ＳＩ）への変換の高速液体クロマトグラフィ分析を示す図である。具体的に、図５は、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールが時間とともにどのように製造されるか、ならびにｍｙｏ−イノシトールならびにｓｃｙｌｌｏ−イノソース（ＳＩＳ）およびｓｃｙｌｌｏ−クエルシトール（ＳＱ）などのその他の全ての不要な副生成物がどのように最少量で製造されるかを示す。
【図６】ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体中間体が発生することなく、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールをｍｙｏ−イノシトールから製造するためのパイロットスケールの方法を示す図である。
【図７】ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体中間体が発生することなく、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールをｍｙｏ−イノシトールから製造するための実験室スケールの方法を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールをｍｙｏ−イノシトールから製造するためのより効率的で安全な方法に関する。本方法はまた、当技術分野で現在公知のｓｃｙｌｌｏ−イノシトールの方法により典型的に製造される不要な副生成物の製造を最少とする。ある実施形態において、本発明は以下の方法を含む。
【００２８】
【化５】
2013519380.tif 000006
【００２９】
示されているように、本発明は、（ａ）ｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよびｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、ｍｙｏ−イノシトールを生物変換工程に掛けるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）で製造されたｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよびｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを塩基性化合物および熱を用いて反応させて、ｓｃｙｌｌｏ−イノソースを分解し細胞集団を溶解するステップ；（ｃ）ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体を製造するために、ステップ（ｂ）のｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを、ホウ酸および水酸化ナトリウムで変換するステップ；（ｄ）粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体を加水分解するステップ；ならびに（ｅ）結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを結晶化させるステップを含む、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を調製するための方法を対象とする。本方法は、バッチ法または連続法のいずれかとして行われてもよい。
【００３０】
ステップ（ａ）の生物変換工程は、一般に、化学反応を実行するために、生きている生物、しばしば微生物を使用するものとして記述され得る。本発明において、微生物は、ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換することができる発酵混合物を作るために使用される。変換工程は、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールおよびｓｃｙｌｌｏ−イノソースを含む複数の生成物の混合物を製造し得ると理解される。ｓｃｙｌｌｏ−イノソースは、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールの構造誘導体であり、これは長時間反応させると最終生成物のｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換し得る。本発明の目的は、本発明の方法により製造されるｓｃｙｌｌｏ−イノシトールの量を最大化することであるが、ｍｙｏ−イノシトールが消費された後もいくらかの残留ｓｃｙｌｌｏ−イノソースが残存し得ると理解される。「残留」ｓｃｙｌｌｏ−イノソースと言う用語は、一般には、ｍｙｏ−イノシトールの初期量の約５重量％から約１５重量％の範囲の量のｓｃｙｌｌｏ−イノソースを含むと定義される。
【００３１】
様々な微生物が、所望の属種に依存して、ｍｙｏ−イノシトールをｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよびｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換するのに使用し得ると理解される。生物変換ステップ中に組み込まれ得る微生物の適切な例としては、アセトバクター・セレビシエ、アセトバクター・マロルム、アセトバクター・オレアネンシス、アセトバクター・インドネシエンシス、アセトバクター・オリエンタリス、アセトバクター・アセチ、アセトバクター・リケファシエンス、アセトバクター・パスツリアナス、アセトバクター・ハンセニイ、バークホルデリア・アンドロポゴニス、バークホルデリア・カリオフィリおよびバークホルデリア・グラミニスならびにこれらの組合せが含まれるが、これらに限られない。ある実施形態において、生物変換工程中に組み込まれる微生物は、アセトバクター属種を含む。選択される微生物に関係なく、微生物は、前もってフリーズドライされた凍結乾燥された属種を含んでもよく、これは典型的には、冷凍温度で保存される。さらに、典型的には、−７０℃以下の温度で保存される冷凍バイアルが使用される。冷凍バイアルがステップ（ａ）の生物変換工程中に組み込まれる場合、微生物は、フラスコの培地中への導入に先立って解凍されるべきである。ステップ（ａ）の生物変換工程は、典型的には、約２０℃から約４０℃の範囲の温度で実行される。他の実施形態において、ステップ（ａ）は、約２６℃から約３０℃の範囲の温度で実行される。さらなる実施形態において、ステップ（ａ）は、約２８℃の温度で実行される。
【００３２】
ステップ（ａ）の温度範囲に加えて、生物変換工程は、典型的には、約５から約９のｐＨ範囲で始められる。ある実施形態において、発酵工程の開始時の初期のｐＨは、約７である。ｐＨの水準は、酸性の副生成物が製造されるにつれて、発酵工程の間に高まり得るまたは低下し得ると理解される。ｐＨの水準が、発酵工程の完結までにｐＨ４未満の水準にまで低下することは珍しいことではない。発酵工程の長さは、変換されるｍｙｏ−イノシトールの量、ならびに生物変換工程のために選択される微生物のタイプに依存して変化し得る。
【００３３】
当業者ならば、生物変換工程は、当技術分野で公知の任意の発酵工程を利用し得ることが理解されよう。ある実施形態において、微生物は、製造発酵工程に直接播種してもよく、これによって、ｍｙｏ−イノシトールは直ちに変換される。他の実施形態において、ステップ（ａ）は、フラスコおよび種発酵槽繁殖段階ならびに製造発酵段階を含む培養物の増殖のいくつかの段階を含み得る。この工程では、微生物は、１個または複数の種発酵槽タンク中に組み込まれ、設定された長さの時間、培地上で成長させられる。種発酵槽中での成長は、それがｍｙｏ−イノシトールを生物変換し所望の最終生成物の製造を開始することができる製造発酵槽に播種するのに引き続いて使用される十分な量の微生物を展開する。図２に１つの例示実施形態が示されており、図２は、十分な培養物集団を展開するためにフラスコ（単数または複数）および種発酵槽（単数または複数）が使用される系を示す。スペアとして設定され得る余分なフラスコおよび種発酵槽は廃棄される。種発酵槽は次いで、製造発酵槽に播種するために使用される。一方で、種発酵槽に組み込まれる特定の条件は、所望の生成物に依存して変化し得るが、図３は、種発酵槽中に組み込まれるパラメーターに関する１つの例示的な種プロファイルを提供し、パラメーターには空気流量、背圧、ＣＥＲ（二酸化炭素発生率）、ＤＯ（溶存酸素）、ＯＵＲ（酸素取り入れ速度）、ｐＨ、撹拌、ＲＱ（呼吸係数、ＣＥＲ／ＯＵＲ）、および温度が含まれる。さらに、図４は、１つの例示的な実施形態を示し、これによってグラフは、空気流量、背圧、ＣＥＲ（二酸化炭素発生率）、ＤＯ（溶存酸素）、ＯＵＲ（酸素取り入れ速度）、ｐＨ、撹拌、温度および重量を含む製造発酵槽タンクの種々のパラメーターを示す。さらに、図５は、ステップ（ａ）に類似の典型的な発酵工程についての高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析を示す。具体的に、図５で示されたように、ｍｙｏ−イノシトールは、ｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよびｓｃｙｌｌｏ−クエルシトールを含む他の副生成物を発酵の間に最少量しか形成せず、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに変換される。当業者ならば、「最少量の副生成物」という用語が、ｍｙｏ−イノシトールの初期量の約１０−１５％未満の量の副生成物を含むと解釈される得ることが理解されよう。
【００３４】
本方法のステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）で製造されたｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよびｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを塩基性化合物と反応させ、加熱して残留ｓｃｙｌｌｏ−イノソースを分解することを含む。一般に、ステップ（ｂ）に使用される塩基性化合物は、発酵混合物のｐＨを所望の水準にまで上昇させることができる任意の化合物を含み得る。ステップ（ｂ）の塩基性化合物としては、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水素化ホウ素ナトリウム、炭酸カルシウムおよびこれらの組合せを含み得るが、これらに限られない。本方法のステップ（ｂ）は、一般に、約１０から約１４の範囲のｐＨ水準で実行される。他の実施形態において、ステップ（ｂ）は、一般に、約１２から約１３の範囲のｐＨ水準で実行される。それゆえ、ステップ（ｂ）の反応中に組み込まれる塩基性化合物は、典型的には、ｐＨを所望の水準にまで上昇させるのに十分な量で添加される。このように、反応ステップ（ｂ）中に組み込まれる塩基性化合物の量は、当業者により容易に決定され得る。
【００３５】
ステップ（ｂ）の加熱工程は、典型的には、ｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよび反応細胞集団の分解を促進するために反応温度を高めることができる任意の工程を含む。反応混合物を加熱する手段は、設備の製作制限に依存して変化し得る。ある実施形態において、発酵混合物の温度を高めるために直接蒸気を注入することが使用され得る。他の実施形態において、ステップ（ｂ）は、反応温度を高めるために熱交換器を組み込んでもよい。使用される加熱機構に関係なく、発酵混合物の温度は、約１００℃から約１５０℃の範囲の水準にまで高められる。他の実施形態において、ステップ（ｂ）の発酵混合物の温度は、一般には、約１１５℃から約１３０℃の範囲の水準にまで高められる。さらなる実施形態において、発酵混合物の温度は、一般には、約１２０℃から約１２５℃の範囲の水準にまで高められる。
【００３６】
ステップ（ｂ）の発酵混合物を十分な時間反応させた後に、発酵混合物は、ステップ（ｃ）の反応物の組込みに先立って冷却され得る。一般には、ステップ（ｂ）は、約５分から約６０分の間実行される。さらに、ある実施形態において、ステップ（ｂ）の発酵混合物は、約９０℃未満の温度にまで冷却される。他の実施形態において、ステップ（ｂ）の混合物は、約８０℃未満の温度にまで冷却される。
【００３７】
ステップ（ｃ）の反応は、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体を製造するために実行される。具体的に、ステップ（ｂ）で製造されたｓｃｙｌｌｏ−イノシトールは、上述したｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体を製造するためにホウ酸および水酸化ナトリウムと反応させられる。一般に、ステップ（ｃ）で使用されるホウ酸の量は、約１．５から約４の範囲のホウ酸対ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールのモル比をもたらすのに十分である。他の実施形態において、ホウ酸対ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールのモル比は、約２から約３．５の範囲である。さらなる実施形態において、ホウ酸対ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールのモル比は、約２．５から約３の範囲である。重要なことには、本発明のステップ（ｃ）は、塩化ナトリウムをｓｃｙｌｌｏ−イノシトールからｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体への変換に組み込まない。塩化ナトリウムは、ステンレス鋼および他の装置の表面に対して腐食性であることが公知である。このため、この腐食性試薬の除去は、本方法の効率を改善する。ステップ（ｃ）は、典型的には、約６０℃から約８０℃の範囲の温度で実行される。ステップ（ｃ）の反応混合物中に組み込まれる水酸化ナトリウムの量は、一般に、約８．５から約１１の範囲のｐＨを確立するのに十分である。他の実施形態において、ステップ（ｃ）の混合物中に組み込まれる水酸化ナトリウムの量は、一般に、約９．５から約１０．５の範囲のｐＨを確立するのに十分である。このように、反応ステップ（ｃ）中に組み込まれる水酸化ナトリウムの量は、当業者によって容易に決定され得る。ステップ（ｃ）は、３０℃未満の温度にまで混合物を引き続いて冷却することをさらに含み得る。
【００３８】
ステップ（ｃ）で製造されたｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体は、典型的には、ステップ（ｄ）に先立って、反応混合物中に残存する液体から分離されることに留意されたい。この工程は、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体（ＳＢＣ塩）および溶媒の混合物ではなく、むしろｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体のみを含む反応生成物をもたらす。ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体の分離は重要であり、この理由は、溶媒が典型的には、生成物収率に悪影響を与え得る不純物の多くを含有するためである。それゆえ、溶媒部分を排除し固体のｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体のみを製造することによって、本方法は、より純粋な生成物をより大きな生成物収率で製造することができる。ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体の分離は、当技術分野で現在公知の任意の方法によって実行されてもよい。ある実施形態において、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体は、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体が反応混合物の洗浄または乾燥の必要がなく分離されてさらなるコスト効率が提供されるように、水平スクロールデカンターを通過する。
【００３９】
ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体が分離されると、ステップ（ｃ）の生成物は、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために加水分解される。ステップ（ｄ）において、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体は水と混合され、約３０℃から約５０℃の範囲の温度にまで加熱される。一般には、ステップ（ｄ）で添加される水の量は、ＳＢＣ塩１キログラム当り水約１リットルからＳＢＣ塩１キログラム当り水約７リットルの範囲である。他の実施形態おいて、水は、ステップ（ｄ）で、ＳＢＣ塩１キログラム当り約３から約５リットルの範囲の量で添加される。さらなる実施形態において、水は、ＳＢＣ塩１キログラム当り約４リットルの量で添加される。加えて、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体と水との組合せは、約３６℃から約４３℃の範囲の温度にまで加熱される。本方法が、加水分解工程に有機溶媒を組み込まないが、代わりに主要溶媒として水に頼っていることに留意するのは重要である。有機溶媒は、本方法での使用後の溶媒の廃棄に由来する潜在的な環境汚染に関する問題を引き起こす。溶媒として水を使用することは、有機溶媒の廃棄に伴う汚染問題を排除する。
【００４０】
指定された温度範囲が達成されると、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体の加水分解を誘発するために、鉱酸がｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体と水との組合せに添加される。上記の反応スキームは、硫酸の使用を示すが、当業者ならば、加水分解を誘発し得る任意の鉱酸を使用し得ることが理解されよう。鉱酸としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、次亜塩素酸、塩素酸、過塩素酸、過ヨウ素酸、硫酸、フルオロ硫酸、硝酸、リン酸、フルオロアンチモン酸、フルオロホウ酸、ヘキサフルオロホウ酸、およびクロム酸が含まれるが、これらに限られない。ある実施形態において、鉱酸は、塩酸、硫酸、およびリン酸を含む。さらなる実施形態において、鉱酸は、硫酸を含む。ステップ（ｄ）でのｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体と水との組合せに添加される鉱酸の量は、一般には、ｐＨを４未満の水準にまで低下させるのに十分な量である。ある実施形態において、混合物に添加される鉱酸の量は、ｐＨを約２から約３．５の範囲の水準にまで低下させるのに十分な量である。このように、反応ステップ（ｄ）中に組み込まれる鉱酸の量は、当業者により容易に決定され得る。
【００４１】
ステップ（ｄ）の反応生成物は、約１５℃から約２６℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却され得る。他の実施形態において、ステップ（ｄ）の反応生成物は、約１８℃から約２４℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却され得る。冷却工程が完了すると、ステップ（ｄ）の反応生成物は、余分な水を反応混合物から除去するためにろ過工程に掛けられ得る。ろ過工程は、当技術分野で公知のもののいずれかを含んでもよく、特に、遠心分離を含んでもよい。ステップ（ｄ）の反応生成物は、一般に、反応が完結した後乾燥されないことに留意されたい。代わりに、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールが、ステップ（ｄ）の反応から形成されたウエットケーキとして、ステップ（ｅ）で処理される。乾燥工程は、単に処理時間を増加させるだけでなく、いくらかの生成物の損失を結果としてもたらす。
【００４２】
ステップ（ｅ）は、典型的には、水をステップ（ｄ）で製造された粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに添加すること、続いて反応混合物を加熱すること、および結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために引き続いて冷却することを含む。一般に、水は粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール１キログラム当り水約６から約２０リットルの範囲の量で添加される。他の実施形態において、水は粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール１キログラム当り水約１２から約１８リットルの範囲の量で添加される。さらなる実施形態において、水は粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール１キログラム当り水約１５から約１７リットルの範囲の量で添加される。水をステップ（ｄ）で製造された粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに添加することに引き続いて、水と粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールとの反応混合物は、約７０℃から約１００℃の範囲の温度にまで加熱される。他の実施形態において、水とｓｃｙｌｌｏ−イノシトールとの反応混合物は、約８５℃から約９５℃の範囲の温度にまで加熱されてもよい。ステップ（ｅ）で製造された水と粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールとの反応混合物は、約０℃から約２５℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却される。他の実施形態において、ステップ（ｅ）で製造された水と粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールとの反応混合物は、約８℃から約１６℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却される。一般に、冷却後、ステップ（ｅ）で製造された粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールと水との溶液は、固体ろ過または遠心分離のどちらかによる固体分離工程、および結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するための乾燥に掛けられる。一般に、固体分離工程としては、当技術分野で公知の任意の工程を含み得る。ある実施形態において、固体分離工程は、バスケット遠心分離およびスクロールデカンター遠心分離を含む。遠心分離は、所望の化合物を単離するための、複数の前置および一次フィルターの使用を含んでもよい。さらに、乾燥工程は、当技術分野で現在公知の乾燥のための任意の工程を含んでもよい。ある実施形態において、乾燥方法は、熱空気を流動床ドライヤー、トレイドライヤー、タンブルドライヤーおよびユニドライヤー中で使用することを含む。
【００４３】
この実施形態に記載したように、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するための方法は、当技術分野で公知の方法に比較して複数の利益を提供する。この実施形態の方法は、廃棄に困難さがあり環境に悪影響を与え得る有機溶媒を使用する必要がない。さらに、本実施形態の方法はまた、塩化ナトリウムなどの特定の腐食性反応物を使用する必要はない。これらの利益に加えて、本方法は、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールの予想外の高収率をもたらす。一般に、本方法は、本方法で使用したｍｙｏ−イノシトールの初期量に基づいて、約２０％から約５０％の範囲のｓｃｙｌｌｏ−イノシトールの収率をもたらす。他の実施形態において、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールの収率は、本方法で使用したｍｙｏ−イノシトールの初期量に基づいて、約２５％から約３５％の範囲である。
【００４４】
別の実施形態において、本発明は、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを生物変換ステップで作りｓｃｙｌｌｏ−イノソースを塩基性化合物および熱への曝露によって引き続いて分解し続いて化合物を結晶化させるような、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体が形成されない方法を包含する。この実施形態は以下の各ステップで例示される。
【００４５】
【化６】
2013519380.tif 000007
【００４６】
例示されているように、この実施形態は、（ａ）ｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよびｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、ｍｙｏ−イノシトールを生物変換工程に掛けるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）で製造されたｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよびｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを塩基性化合物および熱を用いて反応させてｓｃｙｌｌｏ−イノソースを分解するステップ；ならびに（ｃ）結晶性ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するために、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを結晶化させるステップを含む、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を調製するための方法を含む。本発明のこの実施形態は、図６および７に例示されている。本実施形態のステップ（ａ）および（ｃ）は、前述した実施形態のステップ（ａ）および（ｅ）に、それぞれ類似していることに留意されたい。それゆえ、ステップ（ａ）および（ｅ）に関係しているパラメーターおよび考慮事項は、本実施形態のステップ（ａ）および（ｃ）それぞれに対して参照され、本明細書に組み込まれている。
【００４７】
本実施形態のステップ（ｂ）は、ｓｃｙｌｌｏ−イノソースの分解のための工程を対象とする。前の実施形態と同様に、ｓｃｙｌｌｏ−イノソースの分解のために使用される塩基性化合物は、一般に、反応混合物のｐＨを高めることができるものである。組み込まれ得る塩基性化合物の適切な例としては、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水素化ホウ素ナトリウム、炭酸カルシウムおよびこれらの組合せが含まれるが、これらに限られない。ある実施形態において、塩基性化合物は、水酸化ナトリウムを含む。さらなる実施形態において、塩基性化合物は、水素化ホウ素ナトリウムを含む。
【００４８】
ステップ（ｂ）の反応の温度およびｐＨ範囲は、一般に、ｓｃｙｌｌｏ−イノソースを分解するために利用される塩基性化合物に依存する。ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体を形成しないでｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するための方法のある実施形態において、水酸化ナトリウムは、ステップ（ｂ）の塩基性化合物として利用され、反応混合物のｐＨは、約１２から約１３の範囲の水準にまで高められる。この実施形態において、反応混合物の温度は、約１００℃から約１５０℃の範囲の水準にまで、特に、約１１５℃から約１３０℃の範囲の温度にまで高められる。
【００４９】
ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体を形成しないでｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するための方法の他の実施形態において、水素化ホウ素ナトリウムが、ステップ（ｂ）に使用される塩基性化合物として選択されてもよい。この実施形態において、反応混合物は、典型的には、約６から約８の範囲のｐＨ水準までに調節される。水素化ホウ素ナトリウムは反応混合物に、約５０℃から約７０℃の範囲の温度で添加され得る。他の実施形態において、水素化ホウ素ナトリウムは反応混合物に、約６０℃の温度で添加してもよい。その後、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール、ｓｃｙｌｌｏ−イノソースおよび水素化ホウ素ナトリウムの得られた混合物は、硫酸を使用して、約３．５以下のｐＨ水準にまで酸性化される。酸性化された反応混合物は、次いで、約８０℃から約１００℃の範囲の温度にまで加熱され得る。ある実施形態において、酸性化された反応混合物は、約９０℃の温度にまで加熱され得る。特定のこの実施形態は、図７に例示されている。
【００５０】
ステップ（ｂ）で使用される塩基性化合物に関係なく、ステップ（ｂ）の反応混合物を加熱した後、これはステップ（ｃ）の結晶化工程の準備のために引き続いて冷却される。ステップ（ｂ）の反応混合物は、約０℃から約２５℃の範囲の温度にまで冷却され得る。他の実施形態において、ステップ（ｂ）の反応混合物は、約８℃から約１６℃の範囲の温度にまで引き続いて冷却される。
【００５１】
前の実施形態よりも少ない工程ステップを組み込んでいる本実施形態は、有機酸または特定の腐食性反応物を使用しないｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造するための方法を提供する。従来技術で公知の方法に対するこれらの変更は、より効率的で環境に注意を払ったｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを製造する方法を提供する。
【００５２】
本発明の化合物および方法は、以下の実施例を参照してよりよく理解されるが、これらの実施例は、本発明の範囲の例示として意図しているものであり、本発明の範囲を限定するものではない。それぞれの実施例は、種々の中間体化合物を調製する少なくとも１つの方法を例示し、方法全体において利用される各中間体をさらに例示している。これらは、特定の好ましい実施形態であり、これらの実施形態は本発明の範囲を限定することを意図していない。反対に、本発明は、特許請求の範囲内に含まれ得るような全ての代替、変形および均等物を含み、反応条件、使用する試薬、ならびに生物変換および合成経路の順序の適切な操作を含む通常の実験操作、反応条件に適合し得る任意の化学官能基の保護、およびこの方法の反応順序中の適切な時点での脱保護は、本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【００５３】
[実施例１]
ｍｙｏ−イノシトール（２）のｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）への変換およびｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）および細胞集団の分解
【００５４】
【化７】
2013519380.tif 000008
【００５５】
細胞バンクおよび作業用ストックは、培養物および凍結保護剤（単数および複数）を含有する２０ｍｌのバイアル中で、凍結乾燥アセトバクター属種から作製し、−７０℃以下の温度で保存した。作業用ストックを解凍し、４Ｌフラスコ中で１．５リットルフラスコ培地に播種する。次いでこれを２４０±１０ｒｐｍで約２４時間、２８±２℃の温度でインキュベートする。光学濃度（ＯＤ）および残留グルコースを測定した。フラスコまたはこの一部を、細胞集団の繁殖のために、０．０１から０．１％で種発酵槽に播種するのに使用する。種発酵槽を、２４−３０時間のサイクルで、２８℃、約１５０ｒｐｍの撹拌、および約１ＶＶＭのエアレーションで制御する。種発酵槽またはこの一部を、ｍｙｏ−イノシトール（２）の２５００Ｋｇスケールで、１−５％で、製造発酵槽に播種するのに使用する。発酵条件は以下のようである。温度：２８℃、撹拌：５０ｒｐｍ、エアレーション：０．５ＶＶＭ、０−５時間、および１ＶＶＭへの勾配、および背圧：０．５ｐｓｉｇ。ｐＨは制御せず、開始時の約７の出発ｐＨから発酵の終了時の４未満に下がるのをモニターする。発酵サイクルは、ｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）中間体を経由してｍｙｏ−イノシトール（２）のｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）への生物変換を完了するために、無菌条件で５日間実行した。５日間の発酵時間の終了時に、ｍｙｏ−イノシトール（２）は消費され、ｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）は約１０−１５ｇ／Ｌで存在し、生成物ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）は約５５−６０ｇ／Ｌと測定される。細胞集団、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）および少量のｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）を含有する得られた発酵ブロスのｐＨを、２５％水酸化ナトリウム水溶液を使用して約１２−１３にまで調節し、ブロスを、１２０−１２５℃にまで、１０分以上の間、蒸気を使用して加熱した。得られた暗褐色のストレスを与えたブロスを８０℃未満の温度にまで冷却し、ストレスを与えたブロスの試料について、存在するｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の量をｇ／Ｌ単位で決定するために試験した。アッセイに基づいて、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールの総量は、ストレスを与えたブロス中に１３７７Ｋｇ存在すると推定された。
【００５６】
[実施例２]
ストレスを与えたブロス中のｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）のｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体（ＳＢＣ塩、５）への選択的変換および水平スクロールデカンターを使用する分離
【００５７】
【化８】
2013519380.tif 000009
【００５８】
別のＳＳ反応器中で、１３２３Ｋｇのホウ酸（２．８当量）を、２０６５Ｌの水［ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）１Ｋｇ当り１．５Ｌ］中に懸濁させ、６０℃以内の温度にまで加熱した。得られたスラリーを、塩基−熱ストレスを与えたブロスおよびｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を含有する発酵容器に移した。追加量の水［１３７７Ｌ、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）１Ｋｇ当り１．０Ｌ］をホウ酸反応器へ加え、６０℃以上の温度にまで加熱し、ストレスを与えたブロスを含有する発酵容器へ溶液を移した。ストレスを与えたブロス、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）およびホウ酸を含有する発酵容器中の内容物の総体積は、３２５００Ｌと測定され、これは、ストレスを与えたブロス中のｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）１Ｋｇ当り４Ｌであるステージ−３の出発体積を維持するために、水１９１４Ｌを添加することにより３４４１４Ｌにさらに調節された。混合物の温度を６０−８０℃にまで調節し、混合物のｐＨを９．５−１０．５にまで調節するために、２５％水酸化ナトリウム水溶液を、撹拌下、１時間以上にわたって加えた。ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体（ＳＢＣ塩、５）を含有する得られたスラリーを、反応混合物の温度を６０−８０℃の間に維持しながら、３時間以上の間混合し、次いで３０℃より低い温度にまで冷却した。
【００５９】
別のＳＳ反応容器中で、水２７５３Ｌ［ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）１Ｋｇ当り２．０Ｌ］を取り、１５−２５℃の温度で穏やかに混合した。発酵反応容器からのｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体（ＳＢＣ塩、５）スラリーを、液体からｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体（ＳＢＣ塩、５）を分離するために、固体を別のＳＳ反応容器中の混合水（２７５３Ｌ）中へ直接落としながら、約２２００ＲＰＭで、流速２０−１００Ｌ／ｈで水平スクロールデカンター（ＣＡ−２２５）に通過させた。水平スクロールデカンター（ＣＡ−２２５）からの暗褐色の液体廃棄物を、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体（ＳＢＣ塩、５）の固体が存在しないことを確認するために、定期的に検査した。発酵反応器からの全てのスラリーが通過し全てのｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体（ＳＢＣ塩、５）が分離されＳＳ反応容器中の水中へ落とされるまで、固体が存在しないことを確実にするために、水平スクロールデカンターのＲＰＭおよびスラリー流速を、必要に応じて、調節した。
【００６０】
[実施例３]
ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体（ＳＢＣ塩、５）のｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）への加水分解および粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の単離
【００６１】
【化９】
2013519380.tif 000010
【００６２】
水中にｓｃｙｌｌｏ−イノシトール−ジボレート−ジナトリウム塩複合体（ＳＢＣ塩、５）を含有するＳＳ反応容器に、追加量の水［２７５３Ｌ、［ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）１Ｋｇ当り２．０Ｌ］を加え、混合物を３６−４３℃の温度にまで加熱した。この懸濁液に、激しい撹拌下で、温度を３６−４３℃の間に維持しながら、濃硫酸を１時間以上にわたってゆっくりと加え、ＳＢＣ塩懸濁液のｐＨを、２．０−３．５にまで調節した。硫酸の添加完了後および２．０−３．５の安定ｐＨが達成された後、得られたｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）のスラリーを、温度を３６−４３℃の間に維持しながら、４時間以上の間、混合した。混合物を１８−２４℃の温度にまで冷却し、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を、バスケット遠心分離によるろ過により、ウエットケーキ（１７４６Ｋｇ）として単離し、ドラム中に粗生成物として集めた。それぞれ約３−４個のドラムからの粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）生成物の複数の複合試料を、乾燥減量（ＬＯＤ）について試験し、次のステージに進む前の乾燥量基準でのｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を１３７０Ｋｇと計算した。
【００６３】
[実施例４]
粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）ウエットケーキの結晶化およびｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の単離
【００６４】
【化１０】
2013519380.tif 000011
【００６５】
粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）ウエットケーキを結晶化させ、乾燥し、少しずつ粉砕し、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の全てのサブバッチの処理が完了するまで、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）生成物をブレンダー中に入れた。このようにして、粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）ウエットケーキの乾燥重量に基づいて最大２２０Ｋｇを、純水３６００Ｌ［粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）１Ｋｇ当り１６．５Ｌ］を含有するＳＳ反応容器に加え、懸濁液を、８５−９５℃にまで、１５分以上の間、全ての固体が溶解するまで加熱した。得られた透明で熱いｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）−水の溶液を、前置および一次フィルターのセット［綿の（１μｍ規格）デプス前置フィルター、続いて２つの孔径の膜を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルター（絶対孔径１．０μｍおよび絶対孔径０．２２μｍ）］に通して別のＳＳ結晶化容器中へろ過した。ろ過が完了した後、ＳＳ結晶化容器中の透明な褐色の溶液を、８５−９５℃にまで、１０分以上の間加熱し、徐々に３時間以上にわたって８−１６℃にまで冷却した。得られたスラリーを遠心分離によりろ過し、無色のｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）ウエットケーキを、遠心分離１回当り冷純水１００Ｌ以下で洗浄した。湿ったｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を、流動床ドライヤー（ＦＢＤ）中で１時間以上の間、入口空気温度９０℃で熱空気を使用して、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の複合試料が１．０ｗ／ｗ以上の限度で乾燥減量（ＬＯＤ）試験を満足するまで乾燥した。乾燥されたｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）生成物は、−８４０μｍの篩を含むＣｏｍｉｌを使用して粉砕し、全てのサブバッチをＢｅａｒｄｓｌｅｙ  ＆  Ｐｉｐｅｒブレンダー中に統合する。統合したｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）生成物は、３０ＲＰＭで１５分以上の間ブレンドし、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）生成物の試料を、１．５ｗ／ｗ％以上の限界で乾燥減量（ＬＯＤ）試験について試験する。生成物は次いで、ポリ内装ドラムに包装して、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の７２２．６Ｋｇを全体収率２８．９％で得た。ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールは、バスケット遠心分離によりろ過した。
【００６６】
[実施例５]
ｍｙｏ−イノシトール（２）のｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）への変換、ＳＩＳおよび細胞集団の分解ならびに粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の直接単離
【００６７】
【化１１】
2013519380.tif 000012
【００６８】
作業用ストックを解凍し、４Ｌフラスコ中で１．５リットルフラスコ培地に播種する。これを２４０±１０ｒｐｍで約２４時間、２８±２℃の温度でインキュベートする。光学濃度（ＯＤ）および残留グルコースを測定した。フラスコまたはこの一部を、細胞集団の繁殖のために、０．０１から０．１％で種発酵槽に播種するのに使用する。種発酵槽を、２４−３０時間のサイクルで、２８℃、約１５０ｒｐｍの撹拌、および約１ＶＶＭのエアレーションで制御する。種発酵槽またはこの一部を、ｍｙｏ−イノシトール（２）の４０Ｋｇスケールで、１−５％で、製造発酵槽に播種するのに使用する。発酵条件は以下のようである。温度：２８℃、撹拌：１００ｒｐｍ、エアレーション：０．５ＶＶＭ、０−５時間、および１ＶＶＭへの勾配、ならびに背圧：０．５ｐｓｉｇ。ｐＨは制御せず、開始時の約７の出発ｐＨから発酵の終了時の４未満に下がるのをモニターする。発酵サイクルは、ｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）中間体を経由してｍｙｏ−イノシトール（２）のｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）への生物変換を完了するために、無菌条件で５日間実行した。５日の発酵時間の終了時に、ｍｙｏ−イノシトール（２）は消費され、ｓｃｙｌｌｏ−イノソース（３）は約１０−１５ｇ／Ｌで存在し、生成物ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）は約５５−６０ｇ／Ｌと測定される。発酵ブロスのｐＨを、水酸化ナトリウム溶液を使用して約１２−１３にまで調節し、混合物を１２０−１２５℃にまで１０分以上の間加熱した。得られたストレスブロスを４時間以上にわたって１５℃未満にまで冷却した。得られたスラリーをバスケット遠心分離によりろ過し、ウエットケーキを冷水（８ｋｇ）で洗浄して、薄茶色の結晶性の湿った固体として、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）１７．６ｋｇを得た。
【００６９】
[実施例６]
粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）ウエットケーキの結晶化およびｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の単離
【００７０】
【化１２】
2013519380.tif 000013
【００７１】
粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）ウエットケーキ（乾燥重量に基づいて１２．９ｋｇおよび１１．０ｋｇ）を、水（１７９ｋｇ）を含有する反応器に加え、懸濁液を９０℃以上にまで、１５分以上の間加熱した。得られた透明な溶液を、０．２μｍメンブランフィルターに通して圧力下でろ過した。ろ過した溶液を３時間以上にわたって１５℃未満にまで冷却し、得られたスラリーを遠心分離によりろ過しウエットケーキを冷水（１．５ｋｇ）で洗浄して、無色（白色）の結晶性の湿った固体として１７．６ｋｇのｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を得た。湿ったｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を１００−１０４℃での真空オーブン中で１２時間以上の間乾燥して、４．７５ｋｇの乾燥ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を製造した。
【００７２】
[実施例７]
ｍｙｏ−イノシトール（２）のｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）への変換および粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の単離
【００７３】
【化１３】
2013519380.tif 000014
【００７４】
実施例１で記述したようにして調製された発酵ブロス（２．２Ｌ）の一部を、６０℃にまで加熱し、ｐＨを約７にまで水酸化ナトリウム溶液を使用して調節した。水素化ホウ素ナトリウム（１４．９８ｇ）を分割して添加し、混合物を６０℃で３時間以上の間保った。得られた混合物を、硫酸を使用してｐＨ３．５以下にまで酸性化し、９０℃にまで１５分以上の間加熱して、透明な溶液を形成し、次いで１５℃未満にまで４時間以上にわたって冷却した。得られたスラリーをろ過し、ウエットケーキを冷水（０．１ｋｇ）で洗浄して、薄茶色の結晶性の湿った固体として０．０８２ｋｇのｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を得た。
【００７５】
[実施例８]
粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）ウエットケーキの結晶化およびｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）の単離
【００７６】
【化１４】
2013519380.tif 000015
【００７７】
粗ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）ウエットケーキ（乾燥重量に基づいて０．０８２ｋｇおよび０．０８１ｋｇ）を、水（１．３５ｋｇ）を含有したガラス反応器に加え、懸濁液を９０℃以上にまで１５分以上の間加熱した。得られた透明な溶液を、０．２μｍのメンブランフィルターに通してポンプを使用してろ過した。ろ過された溶液を１５℃未満にまで３時間以上にわたって冷却し、得られたスラリーをろ過し、ウエットケーキを冷水（０．０５Ｋｇ）で洗浄して、湿ったｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を得、これを１００−１０４℃での真空オーブン中で、１２時間以上にわたって乾燥して、白色の結晶性固体として、０．０４７ｋｇのｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（１）を得た。
【００７８】
前述した詳細な説明および付随の実施例は単に例示的なものであり、本発明の範囲に対する限定ととらえるべきではなく、本発明の範囲は付随の特許請求の範囲およびこの均等物によってのみ定義されることが理解される。開示された実施形態に対する種々の変更および修正は、当業者にとって明白である。このような変更および修正は、化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、処方および／または本発明の使用方法に関するものを制限なく含めて、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。
【図１】
2013519380.tif 000018
【図２】
2013519380.tif 000019
【図３】
2013519380.tif 000020
【図４】
2013519380.tif 000021
【図５】
2013519380.tif 000022
【図６】
2013519380.tif 000023
【図７】
2013519380.tif 000024
【国際調査報告】
2013519380.tif 000025