(57)【要約】  個体においてアテローム性動脈硬化及び／又は関係するコンディションを治療又は予防するための免疫刺激方法及びシステム、並びに関連する化合物及び組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体におけるアテローム性動脈硬化を治療及び／又は予防する方法であって、
前記個体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係している１又は２以上のＣＤ４＋Ｔ細胞受容体を阻害する治療上有効量の化合物を投与することを含み、
前記１又は２以上のＣＤ４＋Ｔ細胞受容体は、アルファ可変領域を有するα鎖を含む、方法。
【請求項２】
前記１又は２以上のＣＤ４＋Ｔ細胞受容体は、ＴＲＡＶ１４によりコードされたα鎖、ＴＲＡＶ１２によりコードされたα鎖、ＴＲＡＶ４によりコードされたα鎖、及び／又はＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ４に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたα鎖を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１又は２以上のＣＤ４＋Ｔ細胞受容体はさらに、ベータ可変領域を含むβ鎖を含む、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記１又は２以上のＣＤ４＋Ｔ細胞受容体はさらに、ＴＲＢＶ３０によりコードされたβ鎖、ＴＲＢＶ３１によりコードされたβ鎖、及び／又はＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたβ鎖を含む、
ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害は、ＡｐｏＢ１００又はそのフラグメントとの前記１又は２以上のＣＤ４＋Ｔ細胞受容体の結合を阻害することにより行われる、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
個体におけるアテローム性動脈硬化を治療及び／又は予防する方法であって、
１又は２以上のＴ細胞受容体に対して前記個体を免疫することを含み、
前記１又は２以上のＴ細胞受容体は、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ４、及び／又はＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ４に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされた１又は２以上のα鎖と、ＴＲＢＶ３０、ＴＲＢＶ３１、及び／又はＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされた１又は２以上のβ鎖との両方又はいずれか一方を含む、方法。
【請求項８】
前記免疫は、ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１のＣＤＲ２可変領域の免疫原性のフラグメント、ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３０のＣＤＲ２可変領域の免疫原性のフラグメント、ＴＣＲ  ＴＲＡＶ１４の免疫原性のフラグメント、ＴＣＲ  ＴＲＡＶ１２の免疫原性のフラグメント、及び／又はＴＣＲ  ＴＲＡＶ４の免疫原性のフラグメントを投与することで行われる、
ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫は、配列番号１、配列番号５６若しくは配列番号５８の配列を有するペプチド、又はその免疫原性のフラグメント若しくはその誘導体を投与することで行われる、
ことを特徴とする請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫は、配列番号６１、配列番号６３及び／若しくは配列番号６５の配列を有するタンパク質、又はその免疫原性の部分若しくはその誘導体を投与することで行われる、
ことを特徴とする請求項７乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
薬学的に許容可能なアジュバント及び／又は賦形剤とともに、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係している１又は２以上のＴ細胞受容体を阻害することのできる剤を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
アテローム性動脈硬化を治療及び／又は予防するためのワクチンであって、
ＴＲＡＶ１４によりコードされたα鎖、ＴＲＡＶ１２によりコードされたα鎖、ＴＲＡＶ４によりコードされたα鎖、及び／又はＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ４に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたα鎖を含むＴ細胞受容体に対する免疫原性の剤（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）を含むワクチン。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞受容体はさらに、ＴＲＢＶ３０によりコードされたβ鎖、ＴＲＢＶ３１によりコードされたβ鎖、及び／又はＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたβ鎖を含む、
ことを特徴とする請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記剤は、ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１又はそのフラグメントである、
ことを特徴とする請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記剤は、配列番号１、配列番号５６若しくは配列番号５８の配列を有するペプチド、又はそのフラグメント若しくはその誘導体である、
ことを特徴とする請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記剤は、ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３０又はそのフラグメントである、
ことを特徴とする請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞受容体は、ＴＲＡＶ１４によりコードされたα鎖を含み、前記剤は、ＴＣＲ  ＴＲＡＶ１４又はその免疫原性の部分である、
ことを特徴とする請求項１２乃至１６のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記剤は、配列番号６３の配列を有するタンパク質、又はその免疫原性の部分若しくはその誘導体である、
ことを特徴とする請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞受容体は、ＴＲＡＶ１２によりコードされたα鎖を含み、前記剤は、ＴＣＲ  ＴＲＡＶ１２又はその免疫原性の部分である、
ことを特徴とする請求項１２乃至１８のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項２０】
前記剤は、配列番号６６の配列を有するタンパク質、又はその免疫原性の部分若しくはその誘導体である、
ことを特徴とする請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記Ｔ細胞受容体は、ＴＲＡＶ４によりコードされたα鎖を含み、前記剤は、ＴＣＲ  ＴＲＡＶ４又はその免疫原性の部分である、
ことを特徴とする請求項１２乃至２０のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記剤は、配列番号６９の配列を有するタンパク質、又はその免疫原性の部分若しくはその誘導体である、
ことを特徴とする請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記剤は、Ｔ細胞受容体  ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１又はそのフラグメント若しくはその誘導体に反応する抗体である、
ことを特徴とする請求項１３に記載のワクチン。
【請求項２４】
前記剤は、配列番号１、配列番号５６若しくは配列番号５８の配列を有するタンパク質、又はそのフラグメント若しくはその誘導体に反応する抗体である、
ことを特徴とする請求項１３に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記剤は、Ｔ細胞受容体  ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３０又はそのフラグメント若しくはその誘導体に反応する抗体である、
ことを特徴とする請求項１３に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記剤は、Ｔ細胞受容体  ＴＣＲ  ＴＲＡＶ１４又はそのフラグメント若しくはその誘導体に反応する抗体である、
ことを特徴とする請求項１３に記載のワクチン。
【請求項２７】
前記剤は、配列番号６１の配列を有するタンパク質、又はそのフラグメント若しくはその誘導体に反応する抗体である、
ことを特徴とする請求項２６に記載のワクチン。
【請求項２８】
前記剤は、Ｔ細胞受容体  ＴＣＲ  ＴＲＡＶ１２又はそのフラグメント若しくはその誘導体に反応する抗体である、
ことを特徴とする請求項１３に記載のワクチン。
【請求項２９】
前記剤は、配列番号６３の配列を有するタンパク質、又はそのフラグメント若しくはその誘導体に反応する抗体である、
ことを特徴とする請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３０】
前記剤は、Ｔ細胞受容体  ＴＣＲ  ＴＲＡＶ４又はそのフラグメント若しくはその誘導体に反応する抗体である、
ことを特徴とする請求項１３に記載のワクチン。
【請求項３１】
前記剤は、配列番号６５の配列を有するタンパク質、又はそのフラグメント若しくはその誘導体に反応する抗体である、
ことを特徴とする請求項３０に記載のワクチン。
【請求項３２】
ＴＲＡＶ１４によりコードされたα鎖、ＴＲＡＶ１２によりコードされたα鎖、ＴＲＡＶ４によりコードされたα鎖、及び／又はＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ４に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたα鎖と、その免疫原性のフラグメント又はその誘導体とのいずれか一方を含む、医薬としての使用のためのＴ細胞受容体。
【請求項３３】
ＴＲＢＶ３０によりコードされたβ鎖、ＴＲＢＶ３１によりコードされたβ鎖、又はＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたβ鎖をさらに含む、請求項３２に記載のＴ細胞受容体。
【請求項３４】
ＴＲＡＶ１４によりコードされたα鎖、ＴＲＡＶ１２によりコードされたα鎖、ＴＲＡＶ４によりコードされたα鎖、及び／又はＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ４に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたα鎖と、その免疫原性の部分又はその誘導体とのいずれか一方を含む、アテローム性動脈硬化の治療における使用のためのＴ細胞受容体。
【請求項３５】
ＴＲＢＶ３０によりコードされたβ鎖、ＴＲＢＶ３１によりコードされたβ鎖、又はＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたβ鎖をさらに含む、請求項３４に記載のＴ細胞受容体。
【請求項３６】
医薬としての使用のための、Ｔ細胞受容体又はそのフラグメントに反応する抗体であって、
前記Ｔ細胞受容体は、ＴＲＡＶ１４によりコードされたα鎖、ＴＲＡＶ１２によりコードされたα鎖、ＴＲＡＶ４によりコードされたα鎖、及び／又はＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ４に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたα鎖、又はその免疫原性の部分若しくはその誘導体を含む、
ことを特徴とする抗体。
【請求項３７】
ＴＲＢＶ３０によりコードされたβ鎖、ＴＲＢＶ３１によりコードされたβ鎖、又はＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたβ鎖をさらに含む、請求項３６に記載の抗体。
【請求項３８】
アテローム性動脈硬化の治療における使用のための、Ｔ細胞受容体又はそのフラグメントに反応する抗体であって、
前記Ｔ細胞受容体は、ＴＲＡＶ１４によりコードされたα鎖、ＴＲＡＶ１２によりコードされたα鎖、ＴＲＡＶ４によりコードされたα鎖、及び／又はＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ４に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたα鎖を含む、
ことを特徴とする抗体。
【請求項３９】
ＴＲＢＶ３０によりコードされたβ鎖、ＴＲＢＶ３１によりコードされたβ鎖、又はＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたβ鎖をさらに含む、請求項３２に記載の抗体。
【請求項４０】
個体におけるアテローム性動脈硬化を治療及び／又は予防するためのシステムであって、
ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性を阻害するのに適した１又は２以上の剤と、個体における低減された反応を検出するのに適した１又は２以上の剤と、を含み、
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞は、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係している、アルファ可変領域を有するα鎖を含む１又は２以上のＴ細胞受容体を提示する、
ことを特徴とするシステム。
【請求項４１】
個体におけるアテローム性動脈硬化を治療及び／又は予防するためのシステムであって、
前記個体のＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係している、アルファ可変領域を有するα鎖を含む１又は２以上のＴ細胞受容体を阻害するのに適した１又は２以上の剤と、前記個体における前記阻害を検出するのに適した１又は２以上の剤と、を含むシステム。
【請求項４２】
個体におけるアテローム性動脈硬化を治療及び／又は予防するためのシステムであって、
前記個体のＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係している、アルファ可変領域を有するα鎖を含む１又は２以上のＴ細胞受容体に対して前記個体を免疫するのに適した１又は２以上の剤と、
前記個体における前記免疫を検出するのに適した１又は２以上の剤と、を含むシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、具体的にはアテローム性動脈硬化及び／又はそれに関係するコンディションの治療及び／又は予防に適した免疫調節方法及びシステム、並びに関連するタンパク質、ペプチド及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化は現在、動脈壁の慢性的な脂質関連疾患及び免疫介在型の炎症性疾患として知られる。アテローム性動脈硬化に関与する多くの免疫成分が同定され、前臨床試験が、これらの成分を標的とする免疫調節療法がアテローム性動脈硬化を軽減させることを示唆する結果を約束してきた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本明細書において、個体において免疫調節的反応を誘導するための方法及びシステムが提供される。いくつかの実施態様において、本発明の方法及びシステムにより誘導された免疫調節的反応は、個体におけるアテローム性動脈硬化又はそれに関係するコンディションに関連する治療的又は予防的効果に関係している。
【０００４】
本発明の第１の観点によると、個体におけるアテローム性動脈硬化を治療及び／又は予防するための方法及びシステムが記載される。該方法は、個体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応を阻害することを含み、それは具体的には、前記反応を阻害することのできる治療上有効量の化合物を投与することによる。該システムは、個体のＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応を阻害するのに適する１又は２以上の剤、及び個体において軽減された反応を検出するのに適する１又は２以上の剤を含む。
【０００５】
本発明の第２の観点によると、個体におけるアテローム性動脈硬化を治療及び／又は予防するための方法及びシステムが記載される。該方法は、個体において、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係する１又は２以上のＴ細胞受容体を阻害することを含み、それは具体的には、前記の受容体を阻害することのできる治療上有効量の化合物を投与することによる。より具体的には、該方法は、個体において、Ｔ細胞受容体アルファ可変遺伝子（ＴＲＡＶ）４によって少なくとも部分的にコードされたアルファ鎖、Ｔ細胞受容体アルファ可変遺伝子（ＴＲＡＶ）１２によって少なくとも部分的にコードされたアルファ鎖、Ｔ細胞受容体アルファ可変遺伝子（ＴＲＡＶ）１４によって少なくとも部分的にコードされたアルファ鎖、及び／又はＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ１４のＤＮＡ配列に高い相同性を有するＤＮＡ配列によって少なくとも部分的にコードされたアルファ鎖を含む、１又は２以上のＴ細胞受容体を阻害することを含む。加えて又は代わりに、該方法は、個体において、Ｔ細胞受容体ベータ可変遺伝子（ＴＲＢＶ）３０によって少なくとも部分的にコードされたベータ鎖、Ｔ細胞受容体ベータ可変遺伝子（ＴＲＢＶ）３１によって少なくとも部分的にコードされたベータ鎖、及び／又はＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１のＤＮＡ配列に高い相同性を有するＤＮＡ配列によって少なくとも部分的にコードされたベータ鎖を含む、１又は２以上のＴ細胞受容体を阻害することを含み得る。具体的には、該阻害は、前記受容体を阻害することのできる治療上有効量の化合物を投与することによりなされ得る。該システムは、個体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係する１又は２以上のＴ細胞受容体を阻害するのに適する１又は２以上の剤、及び個体において該阻害を検出するのに適する１又は２以上の剤を含み得る。
【０００６】
本発明の第３の観点によると、個体においてアテローム性動脈硬化を治療及び／又は予防するための方法及びシステムが記載される。該方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係する１又は２以上のＴ細胞受容体に対して個体に免疫することを含み、該Ｔ細胞受容体は、アルファ可変領域及び／又はベータ可変領域を含む。該方法は、具体的には、Ｔ細胞受容体のアルファ及び／又はベータ可変領域の１若しくは２以上の免疫原性フラグメントと、それらの免疫原性の部分又はそれらの誘導体とのいずれか一方を、個体に投与することによりなされ得る。より具体的には、該方法は、ＴＲＡＶ４によりコードされたアルファ可変領域の少なくとも１つのフラグメント、ＴＲＡＶ１２によりコードされたアルファ可変領域の少なくとも１つのフラグメント、ＴＲＡＶ１４によりコードされたアルファ可変領域の少なくとも１つのフラグメント、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２、又はＴＲＡＶ１４に高い相同性を有するＤＮＡ配列によってコードされたアルファ可変領域の少なくとも１つのフラグメント、それらの免疫原性の部分、及び／又はそれらの誘導体を、個体に投与することを含み得る。加えて又は代わりに、該方法は、ＴＲＢＶ３０によってコードされたベータ可変領域のフラグメント、ＴＲＢＶ３１によってコードされたベータ可変領域のフラグメント、ＴＲＢＶ３０又はＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によってコードされたベータ可変領域のフラグメント、それらの免疫原性の部分、及び／又はそれらの誘導体を、個体に投与することを含み得る。例えば、ある実施態様において、該方法は、配列番号１のＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１ペプチド、又は具体的にはＣＤＲ２可変領域単独若しくは配列番号６１、６３及び６５のペプチドのうちのいずれか１つ若しくはこれらの免疫原性の部分との組み合わせにおけるＣＤＲ２可変領域由来の他のＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１ペプチドの免疫原性フラグメントを投与することを含み得る。付加的な、典型的な実施態様において、該方法は、ＴＲＢＶ３１に相同性を有するＴ細胞受容体に対して個体を免疫することを含み得、例えば、相同性を有する（ヒト）ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３０ペプチド、又は具体的にはＣＤＲ２可変領域単独若しくは配列番号６１、６３及び６５のペプチドのうちのいずれか１つとの組み合わせにおけるＣＤＲ２可変領域由来のＴＣＲ  ＴＲＢＶ３０の免疫原性フラグメントを投与することによる。該システムは、例えば個体のＴ細胞受容体に対して個体を免疫するのに適した１又は２以上の剤、及び個体における該免疫を検出するのに適した１又は２以上の剤を含み得る。具他的には、例えば、いくつかの実施態様において、該システムは、Ｔ細胞受容体ベータ可変３−１、及び／又は個体のＴ細胞受容体のアルファ可変ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２及びＴＲＡＶ４のうち少なくとも１つに対して個体を免疫するのに適した１又は２以上の剤、並びに個体における該免疫を検出するのに適した１又は２以上の剤を含み得る。
【０００７】
本発明の第４の観点によると、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係するＴ細胞受容体、その免疫原性のフラグメント若しくはその誘導体が、医薬としての使用のためのＴ細胞受容体として記載される。Ｔ細胞受容体は、ＴＲＡＶ４によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ１２によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ１４によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ１４に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたアルファ可変領域、それらの免疫原性の部分又はそれらの誘導体を含み得る。Ｔ細胞受容体はまた、ＴＲＢＶ３０によりコードされたベータ可変領域、ＴＲＢＶ３１によりコードされたベータ可変領域、ＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたベータ可変領域、それらの免疫原性の部分又はそれらの誘導体を含み得る。
【０００８】
本発明の第５の観点によると、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係するＴ細胞受容体、その免疫原性のフラグメント若しくはその誘導体が、アテローム性動脈硬化の治療における使用に対して記載される。Ｔ細胞受容体は、ＴＲＡＶ４によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ１２によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ１４によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ１４に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたアルファ可変領域、それらの免疫原性の部分又はそれらの誘導体を含み得る。Ｔ細胞受容体はまた、ＴＲＢＶ３０によりコードされたベータ可変領域、ＴＲＢＶ３１によりコードされたベータ可変領域、ＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたベータ可変領域、それらの免疫原性の部分又はそれらの誘導体を含み得る。
【０００９】
本発明の第６の観点によると、Ｔ細胞受容体のアルファ可変ＴＲＡＶ１４に高い相同性を有するＴ細胞受容体、Ｔ細胞受容体のアルファ可変ＴＲＡＶ１２、又はＴ細胞受容体のアルファ可変ＴＲＡＶ４が、アテローム性動脈硬化の治療において用いられる。
【００１０】
本発明の第７の観点によると、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係するＴ細胞受容体、その免疫原性のフラグメント又はその誘導体に反応する抗体が、医薬としての使用に対して記載される。該Ｔ細胞受容体は、ＴＲＡＶ４によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ１２によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ１４によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ１４に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたアルファ可変領域、それらの免疫原性の部分又はそれらの誘導体を含み得る。該Ｔ細胞受容体はまた、ＴＲＢＶ３０によりコードされたベータ可変領域、ＴＲＢＶ３１によりコードされたベータ可変領域、ＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたベータ可変領域、それらの免疫原性の部分又はそれらの誘導体を含み得る。
【００１１】
本発明の第８の観点によると、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２及び／又はＴＲＡＶ４に相同性を有するＴ細胞受容体に反応する抗体が、医薬としての使用に対して記載される。
【００１２】
本発明の第９の観点によると、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係するＴ細胞受容体、その免疫原性のフラグメント又はその誘導体に反応する抗体が、アテローム性動脈硬化の治療における使用に対して記載される。該Ｔ細胞受容体は、ＴＲＡＶ４によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ１２によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ１４によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ１４に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたアルファ可変領域、それらの免疫原性の部分又はそれらの誘導体を含み得る。該Ｔ細胞受容体はまた、ＴＲＢＶ３０によりコードされたベータ可変領域、ＴＲＢＶ３１によりコードされたベータ可変領域、ＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたベータ可変領域、それらの免疫原性の部分又はそれらの誘導体を含み得る。
【００１３】
本発明の第１０の観点によると、アテローム性動脈硬化の治療における使用のための抗体が記載され、該抗体は、ＴＲＢＶ３１に相同性を有するＴ細胞受容体（例えば、相同ヒトＴＣＲ  ＴＲＢＶ３０）、具体的にはＣＤＲ２可変領域由来のＴＣＲ  ＴＲＢＶ３０の免疫原性フラグメント、並びに／又はＴ細胞受容体のアルファ可変ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２及び／若しくはＴＲＡＶ４又はそのフラグメントに高い相同性を有するＴ細胞受容体に反応する。
【００１４】
本発明の第１１の観点によると、組成物及び具体的にはワクチンが記載され、該組成物は、アジュバント及び／若しくは賦形剤とともに、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係する少なくとも１若しくは２以上のＴ細胞受容体、その免疫原性フラグメント、その誘導体、又は抗体を含む。具体的には、該Ｔ細胞受容体は、ＴＲＡＶ４によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ１２によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ１４によりコードされたアルファ可変領域、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ１４に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたアルファ可変領域、それらの免疫原性の部分又はそれらの誘導体を含み得る。該Ｔ細胞受容体はまた、ＴＲＢＶ３０によりコードされたベータ可変領域、ＴＲＢＶ３１によりコードされたベータ可変領域、ＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされたベータ可変領域、それらの免疫原性の部分又はそれらの誘導体を含み得る。いくつかの実施態様において、アジュバント及び／又は賦形剤は、薬学的に許容可能であり、該組成物は、医薬組成物である。
【００１５】
本発明の第１２の観点によると、組成物及び具体的にはワクチンが記載され、該組成物は、アジュバント及び／若しくは賦形剤とともに、少なくとも１つのＴ細胞受容体のベータ可変３１（ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１）、少なくとも１つのＴ細胞受容体のアルファ可変ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２及び／若しくはＴＲＡＶ４、それらの免疫原性フラグメント、それらの誘導体、又は抗体を含む。いくつかの実施態様において、アジュバント及び／又は賦形剤は、薬学的に許容可能であり、該組成物は、医薬組成物である。
【００１６】
本発明の第１３の観点によると、ｏｘＬＤＬで免疫され、導入遺伝子（ｈｕＢ１００ｔ９）としてヒトＡｐｏＢ１００を有するマウス由来のハイブリドーマ、具体的には、２００９年１月２２日に受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９８６で、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）にブタペスト条約により寄託されたハイブリドーマクローン４８−５が記載される。また、開示される発明の範囲に含まれる付加的なハイブリドーマは、本明細書に記載されるハイブリドーマ１５−２及び４５−１を含む。
【００１７】
本発明の第１４の観点によると、２００９年１月２２日に受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９８６で、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）にブタペスト条約により寄託されたハイブリドーマクローン４８−５は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応を阻害する化合物を同定するために用いられる。該化合物は、ＡｐｏＢ１００又はそのフラグメントへの暴露により４８−５の活性化を抑制する能力によって同定される。いくつかの実施態様において、該化合物は、本明細書に記載されるＴＣＲアルファ可変領域又はＴＣＲベータ可変領域のフラグメントである。
【００１８】
本明細書に記載される方法及びシステムは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応の阻害、ＡｐｏＢ１００に結合するＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞受容体の阻害、具体的には、ＡｐｏＢ１００に結合するＣＤ４＋のＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２、及び／若しくはＴＲＡＶ４の単独での阻害又はＡｐｏＢ１００に結合するＣＤ４＋のＴＲＢＶ３１及び／若しくはＴＲＢＶ３０の阻害との組み合わせ、並びに／又は個体のアテローム性動脈硬化に対する治療的若しくは予防的効果が望まれる適用に関連して用いられ得る。
【００１９】
開示される１又は２以上の実施態様の詳細が、添付される図面及び発明の詳細な説明に記載される。他の特徴、目的、及び利点は、発明の詳細な説明及び図面より、並びに特許請求の範囲より明白である。
【００２０】
本明細書に取り込まれ本明細書の一部を構成する、添付される図面は、本開示の１又は２以上の実施態様を図示し、発明の詳細な説明及び実施例のセクションととともに、本開示の原理及び実施を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本明細書に記載される実施態様による、天然のＬＤＬ及びＡｐｏＢ１００のＴ細胞の認識に関連した結果を示す図である。
【図２】本明細書に記載される実施態様による、ＬＤＬの酸化とＴ細胞の活性化との間の逆相関をサポートする結果を示す図である。
【図３】本明細書に記載される実施態様において、ハイブリドーマの反応がＩ−Ａｂ拘束されたことをサポートする結果を示す図である。
【図４】本明細書に記載される実施態様において、ハイブリドーマの反応がＣＤ１及びＭＨＣ−１提示に依存的ではないことをサポートする結果を示す図である。
【図５】本明細書に記載される実施態様において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の遺伝子型決定をサポートする実験結果を示す図である。
【図６】本明細書に記載される実施態様において、ＦＡＣＳにより高められたＴＣＲ発現に関連する結果を示す図である。
【図７】本明細書に記載される実施態様によるコレステロール及びトリグリセリドの血漿レベルを示す結果を表す図である。
【図８】本明細書に記載される実施態様において、ｏｘＬＤＬ及びＬＤＬに対する抗体の力値を示す結果を表す図である。
【図９】本明細書に記載される実施態様において、ＴＲＢＶ３１＋細胞の枯渇がＡｐｏＢ１００へのＴ細胞の反応を低減させることを示す図及び写真の図である。
【図１０】本明細書に記載される実施態様において、ＴＲＢＶ３１に対する免疫が抗体の遮断を引き起こすことを示す結果を表す図である。
【図１１】本明細書に記載される実施態様において、ＴＲＢＶ３１に対する免疫がアテローム性動脈硬化を軽減することを示す結果を表す図である。
【図１２】本明細書に記載される実施態様による天然のＬＤＬ及びＡｐｏＢ１００のＴ細胞の認識に関連する結果を表す図である。
【図１３】本明細書に記載される実施態様による酸化ＬＤＬ及びＡｐｏＢ１００のＴ細胞の認識に関連する結果を表す図である。
【図１４】本明細書に記載される実施態様において、抗体の調製は、細胞に毒性を与えないことを示す結果を表す図である。
【図１５】本明細書に記載される実施態様において、ｏｘＬＤＬ又はＡｐｏＢ１００による免疫が、ＬＤＬの天然のエピトープを認識するＴ細胞集団を増加させ、ｏｘＬＤＬ、天然のＬＤＬ及びＡｐｏＢ１００への抗体を誘導することを示す結果を表す図である。
【図１６】本明細書に記載される実施態様において、免疫がＴ細胞のプライミング及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖の検出に必要であることを示す結果を表す図である。
【図１７】本明細書に記載される実施態様において、ＴＲＢＶ３１＋Ｔ細胞がＡｐｏＢ１００を認識することを示す結果を表す図である。
【図１８】本明細書に記載される実施態様において、ＴＲＢＶ３１に対する免疫がアテローム性動脈硬化を軽減させることを示す結果を表す図である。
【図１９】本明細書に記載される実施態様において、ＴＲＢＶ３１に対する免疫がアテローム性動脈硬化性病変における炎症を軽減させることを示す結果を表す図である。
【図２０】本明細書に記載される実施態様において、ＴＲＢＶ３１ペプチド又はＫＬＨによる免疫が血漿中のＡｐｏＢ１００又は脂質レベルに影響を与えないことを示す結果を表す図である。
【図２１】導入遺伝子としてＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１及びＴＲＡＶ１２を有する３匹のマウス由来の結果を表す図である。ＴＣＲトランスジェニックマウス（マウス＃４、３１及び３３）由来又はコントロールの野生型マウス由来の脾臓細胞をヒトＡｐｏＢ１００（１０μｇ／ｍＬ）と培養した。７２時間後、（Ａ）上清をＥＬＩＳＡによるＩＦＮγの評価に供し、（Ｂ）細胞をＴ細胞活性化の指標として細胞増殖（ＤＮＡ複製の分析）に対して１μＣｉ（３Ｈ−チミジン）でパルスした。結果を、各マウスに対してデュプリケートのウェルの結果の平均±ＳＥＭとして表した。データは、ＴＣＲトランスジェニックマウスは、コントロールマウスとは異なり、ＡｐｏＢ１００に明らかに反応することを、ＩＦＮγ分泌及び増殖によって示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書において、個体におけるアテローム性動脈硬化又はそれに関係するコンディションを治療及び／又は予防するための方法、システム、関連する製品及び組成物が提供される。
【００２３】
本明細書で用いられる“治療する”又は“治療”という用語は、医学的又は外科的なコンディションのための医学的ケアに関連し、又は医学的に又は外科的にコンディションを処置するあらゆる活動を示唆する。本明細書で用いられる“予防する”又は“予防”という用語は、個体におけるコンディションに由来する死亡率又は疾病率の負担を軽減する、あらゆる活動を示唆する。これは、第一、第二及び第三の予防レベルで行われ、ここで：ａ）第一の予防は、疾患の進展を回避する；ｂ）第二の予防活動は、早期の疾患の治療を標的とし、それにより疾患の進展及び症状の発現を抑える介入の機会を向上させることができる；並びにｃ）第三の予防は、機能を回復させ、疾患に関連した合併症を低減させることにより既に確立された疾患の悪影響を低減させる。
【００２４】
本明細書で用いられる“コンディション”という用語は通常、完全な身体的、精神的、及び場合により社会的な幸福の状態に関係する個体（全身又は１若しくは２以上の部分）の身体的な状態に適合しない、個体の身体（全身又は１若しくは２以上の部分）の身体的状態を示唆する。本明細書に記載されるコンディションは、限定されることなく、不調（ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）及び疾患（ｄｉｓｅａｓｅｓ）を含み、ここで、“不調（ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）”の用語は、身体又はそのいずれかの部分の機能的な異常に関係する、生きている個体のコンディションを示唆し、“疾患（ｄｉｓｅａｓｅｓ）”の用語は、身体又はそのいずれかの部分の正常な機能を損ない、典型的には特徴的なサイン及び兆候が認められる、生きている個体のコンディションを示唆する。典型的なコンディションは、限定されることなく、外傷、障害、不調（ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）（精神的及び身体的不調）、シンドローム、感染症、個体の逸脱行動、並びに個体又はその部分の身体の構造及び機能の非定型的な変化を含む。
【００２５】
２つの事項に関連して本明細書において用いられる“に関係する”という言葉は、第一の事項の発生が第二の事項の発生に伴うというように、２つの事項の間の関係を示唆し、それは、限定されることなく、因果関係及びサイン／徴候−疾患の関係を含む。
【００２６】
本明細書において用いられる“個体”という用語は、高等生物といった単一の生物有機体、具体的には哺乳類といった脊椎動物、より具体的にはヒトを示唆する。
【００２７】
アテローム性動脈硬化は現在、動脈壁の慢性的な脂質関連疾患及び免疫介在性の炎症性疾患として認められている。多くの免疫成分がアテローム性動脈硬化に関与するとして同定され、前臨床試験が、これらの成分を標的とする免疫調節療法がアテローム性動脈硬化を軽減させることを示唆する結果を約束してきた。
【００２８】
本明細書において用いられる“アテローム性動脈硬化”という用語は、炎症性コンディションを示唆し、具体的には、動脈壁の内膜における炎症反応を誘発するリポタンパク質の蓄積により特徴付けられる慢性の炎症性疾患を示唆する。内膜（又は被膜）は、動脈又は静脈の最内部の層である。被膜は典型的には、内皮細胞の一層により形成され、内部の弾性体により支持されている。被膜において、内皮細胞は、血流に直接的に接触している。クローン的に拡大したＴ細胞集団に関与する適応的免疫反応は、この免疫プロセスや、マクロファージ及び他の細胞により開始される先天的な免疫反応に寄与する。エビデンスのいくつかのラインは、血管性炎症のトリガーとして低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子の成分を指摘している。
【００２９】
本明細書で用いられる“低比重リポタンパク質”又は“ＬＤＬ”という用語は、コレステロール及びトリグリセリドを肝臓から末梢組織に輸送するタイプのリポタンパク質を示唆する。ＬＤＬは、リポタンパク質の５つの主要なグループのうちの１つであり、これらのグループは、カイロミクロン、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間比重リポタンパク質（ＩＤＬ）、低比重リポタンパク質、及び高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）を含む。すべてのリポタンパク質と同様に、ＬＤＬは、血流の水性溶液内で脂肪及びコレステロールを移動できるようにする。典型的には天然のＬＤＬ粒子は、脂肪酸を循環させる単一のアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）分子を含み、水性環境において脂肪酸を可溶性に維持する。ＬＤＬ粒子におけるＡｐｏＢは、身体内の種々の細胞におけるＬＤＬ受容体に対するリガンドとして機能する。該タンパク質は、血漿中にて、ＡｐｏＢ４８及びＡｐｏＢ１００の２つの主要なアイソフォームを生じる。一つ目は、小腸により独占的に合成され、二つ目は、肝臓により合成される。アポリポタンパク質Ｂ−１００分子は、４５３６のアミノ酸残基及び約５１４ｋＤの分子量を有する。加えて、ＬＤＬは典型的には、リノレエートとして知られるポリ不飽和脂肪酸及び１５００のエステル化されたコレステロール分子からなる高度に疎水性のコアを有する。このコアは、リン脂質及びエステル化されていないコレステロールやＡｐｏＢ１００の単一のコピーのシェルにより取り囲まれている。ＬＤＬ粒子は、直径約２２ｎｍであり、約３００万ダルトンの大きさを有する。低比重リポタンパク質の受容体は、多くのタイプの細胞の外側表面に存在し、それらは血流中で循環している低比重リポタンパク質をピックアップして細胞内に輸送する。低比重リポタンパク質は、細胞内に取り込まれると、壊されて、コレステロールを放出する。該コレステロールは、その後、細胞により使われ、保存され、又は身体から除去される。低比重リポタンパク質の受容体はその貨物を降ろし終えると、細胞表面に戻されてさらなる低比重リポタンパク質をピックアップする。ＬＤＬ粒子が被膜に浸透すると、酸化的変性を受けやすくなる。このような変化はおそらく、ミエロペルオキシダーゼ及びリポキシゲナーゼによる酵素的なアタックや非酵素的な酸化反応を含む。酸化の初期の結果として、リン脂質、コレステロールエステル及びトリグリセリドにおける脂肪酸残基の二重結合が切断され、反応性のアルデヒド及び切断された脂肪を生成する。リゾホスファチジルコリン及び酸化された１−パルミトイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（ｏｘ−ＰＡＰＣ）といった変性されたリン脂質が、内皮細胞、マクロファージ及びＢ１−型Ｂ細胞を活性化して、内部の免疫反応を引き起こし得、それには接着分子の発現、ケモカインの生成、及び天然の抗体の分泌が含まれる。ＬＤＬのタンパク質部分もまた、酸化的変性のターゲットとなる。それらは、アポタンパク質Ｂ−１００（ＡｐｏＢ１００）のリシル残基におけるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、４−ヒドロキシノネナール及び他の分子種の付加物の形成を含む。抗体は、ＭＤＡ−リジン及びＬＤＬ粒子の他の酸化的に生成されたエピトープに対して形成される（Ｋｅｔｅｌｈｕｔｈ，Ｄ．Ｆ．，Ｔｏｎｉｎｉ，Ｇ．Ｃ．，Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｍ．Ｄ．，Ｒａｍｏｓ，Ｒ．Ｆ．，Ｂｏｓｃｈｃｏｖ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｇｉｄｌｕｎｄ，Ｍ．（２００８）．Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＬＤＬ  ｉｎ  ｕｎｓｔａｂｌｅ  ａｎｇｉｎａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６８，４５６−４６２）。このような抗体は末梢血中で循環し、またアテローム性動脈硬化性の病変において見出され得る。Ｂ１細胞により産生された酸化リン脂質に対する天然の抗体とは対照的に、ａｎｔｉ−ＭＤＡ−ＡｐｏＢ１００抗体の大部分は、ＩｇＧ分子である（Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ，Ｓ．，Ｐａｌｉｎｓｋｉ，Ｗ．，Ｂｕｔｌｅｒ，Ｓ．Ｗ．，Ｐｉｃａｒｄ，Ｓ．，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｗｉｔｚｔｕｍ，Ｊ．Ｌ．（１９９４）．Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎ  ＩｇＧ  ｔｈａｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＬＤＬ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  １４，３２−４０．）。これは、Ｂ細胞においてスイッチングするアイソタイプを活性化するのを助けるＴ細胞の関与を示唆する。
【００３０】
いくつかの実施態様において、本明細書で開示される個体においてアテローム性動脈硬化を治療及び／又は予防するための方法は、個体においてＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応において阻害することを含む。
【００３１】
“Ｔ細胞”という用語は、リンパ球として知られる白血球細胞のグループを示唆し、それは細胞介在型の免疫において中心的な役割を果たし、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれる細胞表面上の特定の受容体の存在によってＢ細胞及びナチュラルキラー細胞といった他のリンパ球のタイプから区別され得る。Ｔ細胞の、省略形のＴは、胸腺を表し、それはＴ細胞の発達において主要な臓器である。Ｔ細胞は、高コレステロールマウスにおいても、ヒトのアテローム性動脈硬化性の病変から分離されたクローンにおいても同定されており、Ｔ細胞のエピトープの分子特性は、ＬＤＬ粒子の生化学的な複雑性及び酸化的プロセスによってはあまり理解されない。抗体は通常、プラズマ細胞により産生され、それは、活性化されたＣＤ４＋Ｔリンパ球により、及び直接的なＴリンパ球−Ｂリンパ球の相互作用により産生される種々のサイトカインの存在下でＢリンパ球から成熟する。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、Ｂリンパ球及びマクロファージといった主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ−提示細胞により抗原性ペプチドと出会うときに、活性化される。Ｔリンパ球による主要組織適合遺伝子複合体の認識は、それゆえ、免疫反応及び抗体産生の進展の中核をなす。主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ分子は、α及びβ鎖からなる、高度に多型のヘテロ二量体型の膜糖タンパク質である。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子の機能は、主に細胞外のタンパク質に由来する短いペプチドに結合して、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の適切なＴ細胞受容体に相互作用する主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩペプチド複合体を形成することである。成熟すると、ＭＨＣ分子は細胞膜に固定され、ＭＨＣ分子はＴ細胞受容体（ＴＣＲｓ）を介してＴ細胞に短いペプチドを提示する。すべてのＭＨＣ分子は、細胞（ＭＨＣ分子がその一部となる）内からポリペプチドを受け取り、Ｔ細胞による認識のために細胞の外側表面にそれらを提示する。
【００３２】
“Ｔ細胞受容体又はＴＣＲ”という用語は、Ｔリンパ球（又はＴ細胞）の表面上で見出される分子を示唆し、それは概して主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合する抗原を認識する役割を果たす。ＴＣＲは、Ｔ細胞の９５％でアルファ及びベータ鎖からなるヘテロ二量体であり、一方、Ｔ細胞の５％は、ガンマ及びデルタ鎖からなるＴＣＲを有する。免疫グロブリン（Ｉｇ）と同様に、各々のＴＣＲ鎖は、Ｔ細胞の発達の間、体細胞の組み換えにより結合される別々の遺伝子セグメントによりコードされる。機能的なアルファ及びベータ鎖遺伝子は、完全な免疫グロブリン遺伝子が作られるのと同じように産生される。α鎖に対しては、Ｖα（ＴＲＡＶ）遺伝子セグメントが、Ｊα（ＴＲＡＪ）遺伝子セグメントに再アレンジして、機能的な種々の領域のエクソンを作り出す。ＶＪαエクソンからＣα（ＴＲＡＣ）への転写及びスプライシングは、翻訳されてＴ細胞受容体のα−鎖タンパク質を作るｍＲＮＡを産生する。β鎖に対しては、免疫グロブリンの重鎖のように、種々のドメインが、３つの遺伝子セグメントであるＶβ（ＴＲＢＶ）、Ｄβ（ＴＲＢＤ）及びＪβ（ＴＲＢＪ）においてコードされている。これらの遺伝子セグメントの再アレンジメントは、Ｃβ（ＴＲＢＣ）遺伝子に結合するように転写及びスプライシングされる機能的なＶＤＪβ可変領域のエクソンを生成し、そのｍＲＮＡはＴ細胞受容体β鎖を作るように翻訳される。α及びβ鎖は、生合成の後すぐにペアとなり、α：βのＴ細胞受容体ヘテロ二量体を作る。免疫グロブリン（Ｉｇ）と同様に、この遺伝子の再アレンジメントのプロセスは、自身の特異的な再アレンジメントのイベントを経験している各々の細胞において遺伝子のセグメントが結合されている態様における相違によって、集められた遺伝子の多様性を引き起こす。
【００３３】
抗原及びＭＨＣによるＴＣＲの関与は、関係する酵素、共受容体及び特定のアクセサリー分子により介在された生化学的な一連のイベントを介してのＴリンパ球の活性化をもたらす。ＴＣＲ  α鎖及びβ鎖の両方の可変ドメインは、３つの高頻度可変性又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を有し、β鎖の可変領域は、通常は抗原と接触せず、それゆえＣＤＲではないと考えられている付加的な高度可変領域（ＨＶ４）を有する。アルファ鎖のＣＤＲ１はまた抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用し、ベータ鎖のＣＤＲ１は該ペプチドのＣ末端部分と相互作用するが、ＣＤＲ３は、処理された抗原の認識において主要な役割を果たすＣＤＲである。ＣＤＲ２領域は、ペプチドを提示するＭＨＣ分子と相互作用する。Ｔ細胞複合体からのシグナルは、特定の共受容体によるＭＨＣ分子の同時の結合により促進される。
【００３４】
本明細書で用いられる“ＣＤ４＋Ｔ細胞”は、Ｔ細胞を示唆し、具体的には、ヘルパーＴ細胞及び制御性Ｔ細胞であり、共受容体ＣＤ４をそれらの表面に提示する。ヘルパーＴ細胞において、ＣＤ４は独占的にクラスＩＩ  ＭＨＣに結合する。該共受容体は、正確に提示される抗原に対するＴＣＲの特異性を保証するばかりでなく、抗原提示細胞とＴ細胞との間の延長された関与を許容し、ひいては活性化されたＴリンパ球のシグナリングに関与する細胞内での必須分子（例えば、Ｌｃｋ）の動員を促進する。例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合する抗原は、ＩＬ−２及びいくつかの他のサイトカインの分泌、並びにＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）の発現を刺激する。
【００３５】
いくつかの実施態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体を提示しているＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＴＣＲ  α鎖は、Ｔ細胞受容体アルファ可変遺伝子ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２又はＴＲＡＶ１４により少なくとも部分的にコードされている。したがって、これらの実施態様において、Ｔ細胞受容体は、ＴＣＲアルファ可変ＴＲＡＶ４（ＴＣＲ  ＴＲＡＶ４）、ＴＣＲアルファ可変ＴＲＡＶ１２（ＴＣＲ  ＴＲＡＶ１２）及びＴＣＲアルファ可変ＴＲＡＶ１４（ＴＣＲ  ＴＲＡＶ１４）と各々称される。ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２及びＴＲＡＶ１４という用語はまた本明細書において、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ１４を少なくとも部分的にコードするＤＮＡ配列、それらによりコードされるアミノ酸配列、それらの部分又はフラグメントを参照することにより用いられる（それは本発明の開示を考慮して当業者により理解される）。
【００３６】
他の実施態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体を提示するＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＴＣＲ  α鎖は、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２又はＴＲＡＶ１４の遺伝子のＤＮＡ配列と高い相同性を有するＤＮＡ配列により、少なくとも部分的にコードされる。
【００３７】
他の実施態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体を提示するＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＴＣＲ  β鎖は、Ｔ細胞受容体ベータ可変遺伝子ＴＲＢＶ３０又は３１により少なくとも部分的にコードされる。したがって、これらの実施態様において、Ｔ細胞受容体は、ＴＣＲベータ可変ＴＲＢＶ３０（ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３０）及びＴＣＲベータ可変ＴＲＢＶ３１（ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１）と各々称される。ＴＲＢＶ３０及びＴＲＢＶ３１という用語はまた本明細書において、ＴＲＢＶ３０及びＴＲＢＶ３１を少なくとも部分的にコードするＤＮＡ配列、それらによりコードされるアミノ酸配列、それらの部分又はフラグメントを参照することにより用いられる（それは本発明の開示を考慮して当業者により理解される）。
【００３８】
他の実施態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体を提示するＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＴＣＲ  β鎖は、ＴＲＢＶ３０又はＴＲＢＶ３１のＤＮＡ配列と高い相同性を有するＤＮＡ配列により、少なくとも部分的にコードされる。
【００３９】
いくつかの実施態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体を提示するＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＴＣＲ  α鎖は、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ１４の遺伝子又はＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ１４のＤＮＡ配列と高い相同性を有するＤＮＡ配列により、少なくとも部分的にコードされ、ＴＣＲ  β鎖は、ＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１の遺伝子又はＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１のＤＮＡ配列と高い相同性を有するＤＮＡ配列により、少なくとも部分的にコードされる。
【００４０】
本明細書において化合物又は官能基に関連して用いられる“提示する”という用語は、付着される化合物又は官能基の化学的及び／又は生物学的反応性を維持するように行われる付着を示唆する。したがって、細胞上に提示されたタンパク質は、適切なコンディション下で、化学的及び／又は生物学的にタンパク質を特徴付ける１又は２以上の化学的及び／又は生物学的な反応を行うことができる。
【００４１】
本明細書において核酸又はタンパク質の配列に関連して用いられる“相同的”又は“相同性”という用語は、配列の共通の祖先の観点で規定される。例えば、２つのＤＮＡ配列は、種形成のイベント（オルソログ）又は複製のイベント（パラログ）のいずれか一方に起因して、共通の祖先を有し得る。本明細書において用いられる相同的な配列はまた、参照配列の免疫原性特性を特に関連した、生物学機能的に同等のものである（それは本発明の開示を考慮して当業者により理解される）。タンパク質又はＤＮＡ配列間の相同性はまた、配列の同等性を基礎に特定され得る。“相同性”、“同等性”及び“アイデンティティー”という用語はしばしば、配列に関連して置き換え可能として用いられる。
【００４２】
相同性を有する配列は、参照配列の観点で同等性に依存するオルソログ又はパラログであり得る。オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ又はｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）の配列は、単一の共通の祖先の配列由来の垂直の系統により同定され得る配列である。パラログの配列は、共通の祖先の複製のイベントを別々にフォローして同定され得る配列である。
【００４３】
したがって、本明細書で用いられるように、示される第一の遺伝子に“高い相同性を有するＤＮＡ配列”によりコードされるＴ細胞受容体の用語は、第一の遺伝子にオルソログである第二の遺伝子のＤＮＡ配列によりコードされるＴ細胞受容体を意味する（それは本技術分野の当業者により認識され得る）。
【００４４】
いくつかの実施態様において、本技術分野の当業者により認識され得る種々のデータベース及び他のリソース（限定されることなくＴｒｅｅＦａｍ（系図のファミリーのデータベース、ｗｗｗ．ｔｒｅｅｆａｍ．ｏｒｇ）を含む）が、参照配列のオルソログ及びパラログ、並びに、場合によっては、遺伝子ファミリーの進化の歴史を特定するために用いられ得る。例えば、本開示の出願時のＴｒｅｅｆａｍにおいて特定されるように、ＴＲＢＶ３１遺伝子のヒトのオルソログは、ＴＲＢＶ３０である。
【００４５】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるＴ細胞受容体のホモログ、フラグメント及びその一部は、オリジナルの遺伝子配列が機能的に同等のコドンが同じタンパク質の配列をコードするように形成されているように修飾されている限り、遺伝子配列をコードするオリジナルに高度に類似するＤＮＡ配列によりコードされ得る。“機能的に同等のコドン”という用語は、本技術分野で良く理解されるように、同じアミノ酸に対してコードする遺伝子のコドンのグループを意味する（下述のコドンの表を参照）。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
本開示のいくつかの実施態様は、少なくとも部分的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応が個体におけるアテローム性動脈硬化及び関連するコンディションの進展に寄与することを示唆する結果に関連する（実施例１−５及び１０を参照）。
【００４８】
したがって、いくつかの実施態様において、個体におけるアテローム性動脈硬化を治療及び／又は予防するための方法及びシステムが記載される。該方法は、個体のＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応を阻害することを含み、それは具体的には、前記反応を阻害することのできる治療上有効量の化合物を投与することによる。
【００４９】
いくつかの実施態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応を阻害する化合物は、ＡｐｏＢ１００又はそのフラグメントへの暴露によるハイブリドーマ４８−５の活性化を抑制する能力により特定される化合物であり得る。ハイブリドーマクローン４８−５は、２００９年１月２２日に受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９８６で、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）にブタペスト条約により寄託され、（該化合物は）ＡｐｏＢ１００又はそのフラグメントへの暴露による４８−５の活性化を抑制する能力を有する。
【００５０】
いくつかの実施態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応を阻害することは、前記反応に関係しているＣＤ４＋Ｔ細胞の１又は２以上のＴ細胞受容体を阻害することにより行われる。具体的には、いくつかの実施態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応の阻害は、Ｔ細胞受容体アルファ可変遺伝子ＴＲＡＶ４により少なくとも部分的にコードされたＴＣＲ  α鎖、Ｔ細胞受容体アルファ可変遺伝子ＴＲＡＶ１２により少なくとも部分的にコードされたＴＣＲ  α鎖、Ｔ細胞受容体アルファ可変遺伝子ＴＲＡＶ１４により少なくとも部分的にコードされたＴＣＲ  α鎖、又はＴＲＡＶ４、１２及び１４の遺伝子のうちの１つに高い相同性を有するＤＮＡ配列により少なくとも部分的にコードされたＴＣＲ  α鎖を含むＴ細胞受容体を阻害することにより行われる。
【００５１】
いくつかの実施態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応の阻害は、Ｔ細胞受容体ベータ可変遺伝子ＴＲＢＶ３０により少なくとも部分的にコードされたＴＣＲ  β鎖、Ｔ細胞受容体ベータ可変遺伝子ＴＲＢＶ３１により少なくとも部分的にコードされたＴＣＲ  β鎖、又はＴＲＢＶ３０及び３１の遺伝子のうちの１つに高い相同性を有するＤＮＡ配列により少なくとも部分的にコードされたＴＣＲ  β鎖を含むＴ細胞受容体を阻害することにより行われる。
【００５２】
いくつかの実施態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応を阻害することは、ＴＣＲ  α鎖及びＴＣＲ  β鎖を含む、Ｔ細胞受容体を阻害することにより行われる。いくつかの実施態様において、ＴＣＲ  α鎖は、Ｔ細胞受容体アルファ可変遺伝子ＴＲＡＶ４、１２若しくは１４、又はＴＲＡＶ４、１２及び１４の遺伝子のうちの１つに高い相同性を有するＤＮＡ配列により少なくとも部分的にコードされ得る。いくつかの実施態様において、ＴＣＲ  β鎖は、Ｔ細胞受容体ベータ可変遺伝子ＴＲＢＶ３０若しくは３１、又はＴＲＢＶ３０及び３１の遺伝子のうちの１つに高い相同性を有するＤＮＡ配列により少なくとも部分的にコードされ得る。
【００５３】
本開示のいくつかの実施態様は、少なくとも部分的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応により、ＴＣＲアルファ可変ＴＲＡＶ４、１２、１４及び／又はＴＣＲベータ可変ＴＲＢＶ３１（ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１）が発現することを示唆する結果に関連する（実施例１、６を参照）。
【００５４】
具体的には、いくつかの実施態様において、個体におけるアテローム性動脈硬化を治療及び／又は予防するための方法は、個体において、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係している１又は２以上のＴ細胞受容体を阻害することを含み、それは具体的には、前記受容体を阻害することのできる治療上有効量の化合物を投与することによる。
【００５５】
いくつかの実施態様において、個体におけるアテローム性動脈硬化及び／又はそれに関係するコンディションの治療及び／又は予防は、アポリポタンパク質Ｂ−１００又はそのフラグメントを含む分子への、１又は２以上のＴ細胞受容体の結合を阻害する治療上有効量の化合物を投与することにより行われ得る。具体的には、Ｔ細胞受容体は、アルファ可変領域及び／又はベータ可変領域を含む。
【００５６】
いくつかの実施態様において、アポリポタンパク質Ｂ−１００又はそのフラグメントを含む分子への、１又は２以上のＴ細胞受容体の結合が阻害される。具体的には、いくつかの実施態様において、１又は２以上のＴ細胞受容体は、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ１４、又はＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ１４に高い相同性を有するＤＮＡ配列により少なくとも部分的にコードされているα鎖を含む。いくつかの実施態様において、１又は２以上のＴ細胞受容体は、ＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１、又はＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列により少なくとも部分的にコードされているβ鎖を含む。いくつかの実施態様において、１又は２以上のＴ細胞受容体は、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ１４、又はＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２若しくはＴＲＡＶ１４に高い相同性を有するＤＮＡ配列により少なくとも部分的にコードされているα鎖を含み、ＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１、又はＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列により少なくとも部分的にコードされているβ鎖をさらに含む。
【００５７】
本開示のいくつかの実施態様は、少なくとも部分的には、ＴＣＲアルファ可変ＴＲＡＶ４、１２、１４及び／若しくはＴＣＲベータ可変ＴＲＢＶ３１（ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１）を提示するＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇、又はＴＣＲアルファ可変ＴＲＡＶ４、１２、１４及び／若しくはＴＣＲベータ可変ＴＲＢＶ３１（ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１）の不活性化がアテローム性動脈硬化に効果を奏することを示唆する結果に関連する（実施例７−９を参照）。
【００５８】
したがって、いくつかの実施態様において、個体におけるアテローム性動脈硬化を治療及び／又は予防するための方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係している１又は２以上のＴ細胞受容体に対して個体を免疫することを含み、それは具体的には、Ｔ細胞受容体又はその免疫原性のフラグメント若しくはその誘導体を個体に投与することによる。
【００５９】
ワクチン接種による抗原特異的な免疫調節は、慢性の炎症性疾患を予防又は治療するための魅力的なアプローチである。抗原特異的な態様で保護的な免疫反応を動員することにより、感染に対して阻まれた宿主防衛に起因する副作用が回避される。その結果、病的な自己免疫の抗原特異的な抑制は、アテローム性動脈硬化といった慢性の炎症性疾患において興味深い。
【００６０】
抗原特異的な免疫保護は、いくつかの異なるメカニズムにより成し遂げられ得、それは例えば、保護的な抗体の産生、病的なＴ細胞クローンの分解若しくは不活性化（アネルギー）、又は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のファミリーにより介在される抑制的な細胞性免疫の誘導である。
【００６１】
いくつかの実施態様において、免疫付与は、（Ｔ細胞受容体による抗原認識を遮断し、及び／又はＴ細胞受容体又は他の抗体による抗原認識を遮断する免疫原として機能することができる）免疫原性の剤（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）により行われ得、それはターゲットのＴ細胞に特異的である。
【００６２】
具体的には、いくつかの実施態様において、免疫付与は、ＴＣＲα及び／若しくはＴＣＲβ可変領域由来の１若しくは２以上のフラグメント、その免疫原性のフラグメント、並びに／又はその誘導体を個体に投与することにより行われ得る。具他的には、いくつかの実施態様において、ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ可変領域由来の１又は２以上のペプチドは、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＢＶ３０、ＴＲＢＶ３１の遺伝子、又はＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされ得る。より具体的には、いくつかの実施態様において、免疫付与は、ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１のフラグメントを投与することにより行われ得、それは、本明細書においてＴＲＢＶ３１ペプチドとも示される、ＴＣＲのβ鎖のＣＤＲ２可変領域の部分（アミノ酸残基４５−６２、ＡＴＧＧＴＬＱＱＬＦＹＳＩＴＶＧＱＶ（配列番号１））を含む。
【００６３】
いくつかの実施態様において、免疫付与は、ＴＣＲ  Ｖアルファ４のフラグメントを投与することにより行われ得、それは、本明細書においてＴＲＡＶ４ペプチドとも示される、ＴＣＲのα鎖の可変領域の免疫原性の部分（ペプチド配列、配列番号６３）を含む。
【００６４】
いくつかの実施態様において、免疫付与は、ＴＣＲ  Ｖアルファ１２のフラグメントを投与することにより行われ得、それは、本明細書においてＴＲＡＶ１２ペプチドとも示される、ＴＣＲのα鎖の可変領域の免疫原性の部分（ペプチド配列、配列番号６６）を含む。
【００６５】
ＴＣＲ  Ｖアルファ１４のフラグメントを投与することにより行われ得、それは、本明細書においてＴＲＡＶ１４ペプチドとも示される、ＴＣＲのα鎖の可変領域の免疫原性の部分（ペプチド配列、配列番号６９）を含む。
【００６６】
いくつかの実施態様において、免疫付与は、上述される複数のＴ細胞受容体の免疫原性のフラグメントを組み合わせて個体に投与することにより行われ得る。
【００６７】
本明細書で用いられる“タンパク質”又は“ポリペプチド”という用語は、２若しくは３以上のアミノ酸モノマー及び／又はその類似体からなる有機体ポリマーを示唆する。“ポリペプチド”という用語は、タンパク質及びペプチドの全長や、その類似体及びフラグメントを含む、あらゆる長さのアミノ酸ポリマーを含む。３又は４以上のアミノ酸のポリペプチドはまた、オリゴペプチドとも称される。本明細書で用いられる“アミノ酸”、“アミノ酸モノマー”又は“アミノ酸残基”という用語は、２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかを意味し、それには天然ではない側鎖による合成的なアミノ酸が含まれ、Ｄ及びＬの光学異性体が含まれる。“アミノ酸類似体”という用語は、１又は２以上の個別の原子が異なる原子、同位体で、又は異なる官能基で置換されるが、さもなければ天然のアミノ酸類似体と同一であるアミノ酸を意味する。
【００６８】
本明細書で用いられる“フラグメント”という用語は、あらゆる長さのポリペプチドの部分を示唆する。ＴＣＲ  ＴＲＡＶ４といったＴ細胞受容体の免疫原性のフラグメントは、結果的には、個体において免疫反応を誘発するといった免疫原性の特性を示す、ＴＣＲ  ＴＲＡＶ４の一部である。本明細書に記載されるＴ細胞受容体の免疫原性のフラグメントはまた、いかようにも合成されたペプチド及び可能性のあるその誘導体を含む。ペプチドの免疫原性は、免疫反応を誘導するペプチドの能力により特定され得、それには限定されることなく、体液性及び細胞介在型の免疫反応が含まれる。ペプチドの免疫原性（時には抗原性として知られる）はまた、免疫反応の最終産物（例えば、分泌された抗体及び／又はＴ細胞）へのペプチドの特異的な結合能が反映され得る。
【００６９】
免疫原性のフラグメント及び／又はペプチドの活性部位／エピトープを特定するための種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの技術及び方法が、本技術分野において知られている。例えば、ペプチドの免疫原性は、Ｂ細胞又は特定の抗体産生Ｂ細胞をミエローマ（Ｂ細胞癌）細胞と融合することで産生されるハイブリット細胞株（ハイブリドーマ）といった、特定の抗体産生細胞株において、該ペプチドが抗体分泌を誘導するかどうかを調べることによりテストされ得る。
【００７０】
ペプチドの免疫原性は、該ペプチドが、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は免疫沈降法といった、アフィニティー結合アッセイにより、特定の抗体と結合するかどうかを調べることによりテストされ得る。
【００７１】
加えて、Ｔｅｐｉｔｏｐｅ（Ｒａｄｒｉｚｚａｎｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）、Ａｄｅｐｔ（Ｍａｋｓｕｙｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ  １９９３）、ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘ（Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  １９８８）といったコンピュータベースのアルゴリズム及びその他は、関連する配列が知られている場合、ペプチドのエピトープ及び／又は免疫学的な活性部位を特定するために用いられ得る。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法のさらなる詳細は、下記の文献において見出され得る：Ｃｈｏｕ  ＰＹ，Ｆａｓｍａｎ  ＧＯ，Ａｄｖ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  Ｒｅｌａｔ  Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９７８；４７：４５−１４８．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅｉｒ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ；Ｍａｒｇａｌｉｔ  Ｈ，Ｓｐｏｕｇｅ  ＪＬ，Ｃｏｒｎｅｔｔｅ  ＪＬ，Ｃｅａｓｅ  ＫＢ，Ｄｅｌｉｓｉ  Ｃ，Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ＪＡ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７  Ａｐｒ  １；１３８（７）：２２１３−２９．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｉｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ；Ｊａｍｅｓｏｎ  ＢＡ，Ｗｏｌｆ  Ｈ．，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ  ９１  １２５，Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  ＢｉｏｓｃＬ  １９８８  Ｍａｒ；４（ｌ）：１８１−６．Ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ；Ｒｅｙｅｓ  ＶＥ，Ｌｅｗ  ＲＡ，Ｌｕ  Ｓ．，Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ＲＥ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９１；２０２：２２５３８．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｔｒｉｐ−ｏｆ−ｈｅｌｉｘ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ（ＳＯＨＨＩ）；Ｍａｋｓｙｕｔｏｖ  ＡＺ，Ｚａｇｒｅｂｅｌｎａｙａ  ＥＳ，Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  ＢｉｏｓｃＬ  １９９３  Ｊｕｎ；９（３）：２９１−７．ＡＤＥＰＴ：ａ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ；Ｐｅｌｌｅｑｕｅｒ  ＪＬ，Ｗｅｓｔｈｏｆ  Ｅ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｇｒａｐｈ．  １９９３  Ｓｅｐ；１１（３）：２０４−１０，１９１２．ＰＲＥＤＩＴＯＰ：ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｂｔｅｃｈ，ｖｏｌ．９，Ｊｕｌ．１９９１  ｐｐ．２３８−２４２  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ；及びＬａｕｒａ  Ｒａｄｄｒｉｚｚａｎｉ  ａｎｄ  Ｊｕｅｒｇｅｎ  Ｈａｍｍｅｒ  ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｖｏｌ  ｉ．ｎｏ  ２．１７９−１８９��Ｍａｙ  ２０００  Ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｖｉｒｔｕａｌ  Ｍａｔｒｉｘ−ｂａｓｅｄ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（各々の開示は、全体において参照により本明細書に取り込まれる）。
【００７２】
いくつかの実施態様において、本明細書で記載されるＴ細胞受容体は、本発明の方法及びシステムに関連して使用するのに適した１以上の免疫原性のフラグメントを含み得、それにはＴＣＲα及びβ可変領域由来の抗原性フラグメントが含まれる。具体的には、いくつかの実施態様において、Ｔ細胞受容体の免疫原性のフラグメントは、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＢＶ３０、ＴＲＢＶ３１及び／又はそれらに高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされる。
【００７３】
第一のポリペプチド（例えば、ＴＣＲ  ＴＲＡＶ４抗原性フラグメント）に関連して本明細書において記載される“誘導体”という用語は、第一のポリペプチドに構造的に関連し、第一のポリペプチドに存在しない特徴を導入する修飾によって第一のポリペプチドに由来するが、第一のポリペプチドの機能的特性を残している第二のポリペプチドを示唆する。したがって、ＴＣＲ  ＴＲＡＶ４（又は本明細書に記載される他のタイプのＴ細胞受容体）の抗原性フラグメントの誘導体ポリペプチドはたいてい、オリジナルのポリペプチド又はその一部に存在しない付加的な機能に関係している又は関係していないアミノ酸配列の修飾によって、オリジナルのポリペプチド又はその一部とは異なる。しかしながら、Ｔ細胞受容体の免疫原性のフラグメントの誘導体ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体又はその免疫原性のフラグメントに関連して記載されるものに匹敵する免疫原性の特性を保持している。
【００７４】
本発明のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドのアミノ酸配列の誘導体は、置換型、挿入型、又は欠失型の変異体であり得る。欠失型の変異体は、機能又は免疫原性の活性に不可欠ではない天然のタンパク質の１又は２以上の残基を欠損している。他の通常のタイプの欠失型の変異体は、分泌のシグナルの配列又は細胞の特定の部位に結合するタンパク質を指向するシグナルの配列を欠損したものである。挿入型のミュータントは典型的には、ポリペプチドの末端ではない部位でのマテリアルの付加に関与する。これは、免疫反応性のエピトープの挿入又は単一の残基の挿入を含み得る。フュージョンタンパク質と呼ばれる末端の付加については、下述される。
【００７５】
置換型の変異体は典型的には、タンパク質内の１又は２以上の部位で１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置き換わることを含み、他の機能又は特性を失うことなく、タンパク質分解的切断に対する耐性といった、ポリペプチドの１又は２以上の特性を調節するようにデザインされ得る。この種の置換は好ましくは、保存的であり、すなわち、一つのアミノ酸が同様の形及び変化のものと置き換えられる。保存的な置換は、本技術分野においてよく知られており、例えば、アラニンからセリン；アルギニンからリジン；アスパラギンからグルタミン又はヒスチジン；アスパラギン酸塩からグルタミン酸塩；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸塩からアスパラギン酸塩；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギン又はグルタミン；イソロイシンからロイシン又はバリン；ロイシンからバリン又はイソロイシン；リジンからアルギニン；メチオニンからロイシン又はイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン，ロイシン又はメチオニン；セリンからスレオニン；スレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファン又はフェニルアラニン；及びバリンからイソロイシン又はロイシンへの変化を含む。
【００７６】
“生物学的な機能同等物”は、本技術分野において理解され、さらに本明細書において詳細に規定される。つまり、約７０％〜約８０％；より好ましくは約８１％〜約９０％；さらにより好ましくは約９１％〜約９９％のアミノ酸を有する配列であり、模倣体の生物学的活性を与えられたペプチド模倣体のアミノ酸と一致又は機能的に同等である配列が維持される。
【００７７】
下記は、同等物を作るためのタンパク質のアミノ酸の変化を示す典型的なアプローチであり、それは可能性のある改良され、二次的に産生された分子を含む。例えば、あるアミノ酸は、例えば抗体の抗原−抗体認識部位若しくはＴ細胞受容体又は基質分子上の結合部位といった構造との相互作用的な結合能を大きく失うことなく、タンパク質構造において他のアミノ酸と置換され得る。それはタンパク質の生物学的機能活性を規定する相互作用的な能力及びタンパク質の特性であるため、あるアミノ酸の置換は、タンパク質配列において及びその内在するＤＮＡコーディング配列においてなされ得、それにもかかわらず同様の特性を有するタンパク質を作り得る。このように、種々の変化が、下述されるように、その生物学的有用性又は活性を大きく失うことなく、遺伝子のＤＮＡ配列においてなされ得ることが発明者らにより意図される。
【００７８】
このような変化をなすことにおいて、アミノ酸のハイドロパシー指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与えることにおけるアミノ酸のハイドロパシー指標の重要性が概して理解される（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９８２  Ｍａｙ  ５；１５７（１）：１０５−３２）。アミノ酸の相対的なハイドロパシーの特性がタンパク質の二次構造に寄与することが認められ、それは同様に、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原及び同様物とのタンパク質の相互作用を規定する。
【００７９】
アミノ酸の置換は親水性に基づいて効果的になされ得ることもまた、本技術分野において理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（参照により本明細書に取り込まれる）は、タンパク質の最も低い平均の親水性は、隣接するアミノ酸の親水性により支配されるように、タンパク質の生物学的特性と関連することを説明している。本技術分野において知られるように、下記の親水性の値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン＊−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００８０】
アミノ酸は同等の親水性の値を有する他のものと置換され得、さらに生物学的同等物及び免疫学的に同等なタンパク質を作ることが理解されている。このような変化において、親水性の値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の置換が特に好ましく、±０．５以内の置換がさらに特に好ましい。
【００８１】
上記で概要を説明したように、アミノ酸の置換は概して、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズ、及び同様物といった、アミノ酸側鎖の置換の相対的な同等性に基づく。種々の前述の特徴を考慮に入れた典型的な置換は、本技術分野の当業者によく知られており、アルギニン及びリジン；グルタミン酸塩及びアスパラギン酸塩；セリン及びスレオニン；グルタミン及びアスパラギン；並びにバリン、ロイシン及びイソロイシンを含む。
【００８２】
さらなる実施態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係しているＴ細胞受容体、又はその免疫原性のフラグメント若しくはその誘導体が記載される。
【００８３】
いくつかの実施態様において、本明細書において記載されるＴ細胞受容体並びに／又はそのフラグメント及び／若しくは誘導体は、剤（例えば、一連のポリペプチド又はタンパク質）を同定するために用いられ得、それはＴ細胞受容体による抗原認識を遮断することができ、及び／又はＴ細胞受容体若しくは他の抗体による抗原認識を遮断する免疫原として機能し得る。
【００８４】
いくつかの実施態様において、本明細書において記載されるＴ細胞受容体並びに／又はそのフラグメント及び／若しくは誘導体は、薬剤としての使用に対して、具体的にはアテローム性動脈硬化の治療における使用に対して記載される。
【００８５】
より具体的には、いくつかの実施態様において、Ｔ細胞受容体は、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ１４の遺伝子により、又はＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ１４に高い相同性を有するＤＮＡ配列により、少なくとも部分的にコードされるα鎖を含む。いくつかの実施態様において、Ｔ細胞受容体は、ＴＲＢＶ３０、ＴＲＢＶ３１の遺伝子により、又はＴＲＢＶ３０、ＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列もより、少なくとも部分的にコードされるベータ鎖を含む。いくつかの実施態様において、Ｔ細胞受容体は、ＴＲＡＶ４の遺伝子により少なくとも部分的にコードされるα鎖、ＴＲＡＶ１２の遺伝子により少なくとも部分的にコードされるα鎖、ＴＲＡＶ１４の遺伝子により少なくとも部分的にコードされるα鎖、又はＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ１４に高い相同性を有するＤＮＡ配列により、少なくとも部分的にコードされるα鎖を含み、ＴＲＢＶ３０の遺伝子により少なくとも部分的にコードされるベータ鎖、ＴＲＢＶ３１の遺伝子により少なくとも部分的にコードされるベータ鎖、又はＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列により少なくとも部分的にコードされるベータ鎖をさらに含む。
【００８６】
いくつかの実施態様において、Ｔ細胞受容体のフラグメントは、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＢＶ３０、ＴＲＢＶ３１の遺伝子により、及び／又はＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＢＶ３０若しくはＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡ配列によりコードされる。
【００８７】
本発明の第６及び第７の観点によると、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係しているＴ細胞受容体、又はその免疫原性のフラグメント若しくはその誘導体に反応する抗体が記載される。
【００８８】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応に関係しているＴ細胞受容体、又はその免疫原性のフラグメント若しくはその誘導体に反応する抗体が、薬剤としての使用に対して、具体的にはアテローム性動脈硬化の治療における使用に対して記載される。
【００８９】
本明細書で用いられる“抗体”という用語は、抗原による刺激の後、Ｂ細胞が活性化さされることにより作られ、生物学的なシステムにおいて免疫反応を促進する抗原に特異的に結合し得るタンパク質の種類をいう。抗体全体は典型的には、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む４つのサブユニットからなる。抗体という用語は、天然の抗体及び合成の抗体を含み、それには限定されることなく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又はそのフラグメントが含まれる。典型的な抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ及び同様物を含む。典型的なフラグメントは、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及び同様物を含む。モノクローナル抗体は、“エピトープ”と呼ばれる他の生体分子の単一の特定の空間的及び極性の機構に特異的に結合しそれにより補完するものとして規定される抗体である。いくつかの形態において、モノクローナル抗体はまた、同じ構造を有し得る。ポリクローナル抗体は、異なるモノクローナル抗体の混合物を意味する。いくつかの形態において、ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体のうち少なくとも２つが異なる抗原性のエピトープに結合するモノクローナル抗体の混合物であり得る。異なる抗原性のエピトープは、同じターゲット、異なるターゲット、又は組み合わせに存在し得る。抗体は、宿主の免疫及び血清（ポリクローナル）の収集といった、本技術分野でよく知られている技術により、又は継続的なハイブリドーマ細胞株の調製及び分泌されたタンパク質（モノクローナル）の収集により調製され得る。
【００９０】
いくつかの実施態様において、本明細書で記載される、Ｔ細胞受容体を阻害するためのタンパク質（抗体を含む）、ペプチド及び／又は剤が、適切なアジュバント及び／又は賦形剤とともに組成物中に含まれる。
【００９１】
本明細書で用いられるアジュバントという用語は、それ自体を投与されてもほとんど直接的な作用をもたらさないが、他の剤（例えば、薬剤、ワクチン）の作用を調節する、薬学的又は免疫学的な剤を示唆する。それらはしばしば、最小限で注入された外因性のマテリアルを維持している間、供給された抗原に対するレシピエントの免疫反応を亢進させるようにワクチンに含まれる。アジュバントのタイプは、それ自体特定の抗原的な作用を何ら持たずに、免疫システムを刺激しワクチンに対する反応を増強させる免疫学的アジュバントを含む。
【００９２】
本明細書において用いられる賦形剤という用語は、薬剤の活性成分に対するキャリアとして用いられる不活性物質を示唆する。典型的な賦形剤はまた、有効な活性成分を含む製剤のかさを増すために用いられ得、便利で正確な用量を可能とする。単回投与の量での使用に加えて、賦形剤は、関連する活性物質の処理において一助となるように製造プロセスにおいて用いられ得る。投与のルート及び薬剤の形態に依存して、当業者に認識可能な異なる賦形剤が用いられ得る。
【００９３】
いくつかの実施態様において、組成物は、Ｔ細胞受容体の選択された（免疫原性の）ペプチドフラグメント及び可能な毒素（ｔｏｘｉｎｓ）／トキソイド（ｔｏｘｏｉｄｓ）（破傷風毒素、ジフテリア毒素、コレラ毒素のＢサブユニット、ＢＳＡ、ＨＡＳ、ｒＨＳＡ、ＫＬＨ、オボアルブミン）を含む。具体的には、いくつかの実施態様において、Ｔ細胞受容体の選択されたペプチドフラグメントは、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＢＶ３０、ＴＲＢＶ３１の遺伝子、又はＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＢＶ３０、ＴＲＢＶ３１に高い相同性を有するＤＮＡによりコードされる。
【００９４】
いくつかの実施態様において、アジュバント及び賦形剤は、薬学的に許容可能であり、組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、ワクチンである。
【００９５】
本明細書に開示されるように、ＣＤ４＋Ｔ細胞受容体のＡｐｏＢ１００への反応及び／又は本明細書で記載されるＴＣＲ受容体のＡｐｏＢ１００への結合を阻害するための剤が、治療及び／又は予防するためのシステムの一部として提供され得る。該システムは、アレイ又はキットの一部の形態で提供され得る。
【００９６】
キットの一部において、阻害及び／又は免疫を検出するアッセイを行うための剤及び他の試薬が、独立してキットに含まれ得る。剤は１又は２以上の組成物中に含まれ得、各々の剤は適切なビヒクルとともに組成物中に含まれ得る。
【００９７】
本明細書で用いられる“検出する”又は“検出”という用語は、限定されることなくサンプル、反応混合物、分子混合物及び基質を含む、空間の限られた部分における、ターゲットの実存、存在、又は事実の決定を示唆する。本明細書で用いられる“検出する”又は“検出”という用語は、ターゲットの化学的及び／又は生物学的特性の決定を含み、それには、限定されることなく、他の化合物と相互作用する（具体的には結合する）能力、他の化合物及び本開示を読んだ当業者に認識可能な付加的な特性を活性化する能力が含まれる。検出は、定量的又は定性的であり得る。ターゲット又はシグナルの量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）又は量（ａｍｏｕｎｔ）の測定（定量とも称される）に言及し、関係し、又は関与する場合には、検出は“定量的”であり、それには限定されることなく、ターゲット又はシグナルの量又は割合を決定するようにデザインされたあらゆる分析が含まれる。他のターゲット又はシグナルに対する相対存在量の観点でターゲット又はシグナルの質（ｑｕａｌｉｔｙ）又は性質（ｋｉｎｄ）の認識に言及し、関係し、又は関与する場合には、検出は“定性的”であり、それは定量化されない。
【００９８】
付加的な成分は、標識された分子、具体的には、標識されたポリヌクレオチド、標識された抗体、標識剤（ｌａｂｅｌｓ）、マイクロ流体チップ、標準品、及び本開示を読んだ当業者により認識される付加的な成分を含み得る。本明細書において複合体又は分子の成分として用いられる“標識”及び“標識された分子”という用語は、検出可能な分子に言及し、それには限定されることなく、放射性同位体、フルオロフォア、化学発光染料、発色団、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害剤、染料、金属イオン、ナノ粒子、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、アビチン、ストレプトアビジン又はヘプテン）及び同様物が含まれる。“フルオロフォア”という用語は、検出イメージに蛍光を示すことのできる物質又はその一部を意味する。結果として、本明細書で用いられる“標識シグナル”という用語は、標識の検出を可能にする標識剤から放出されるシグナルを示唆し、それには限定されることなく、放射性活性、蛍光、化学発光、酵素反応による化合物の生成、及び同様物が含まれる。
【００９９】
いくつかの実施態様において、阻害及び／又は免疫の検出は、標識された抗体がフルオロフォアで標識されている蛍光ベースの読み出し（ｒｅａｄｏｕｔｓ）により行われ得、それには限定されることなく、小分子染料、タンパク質発色団、量子ドット、及び金ナノ粒子が含まれる。付加的な技術は、本開示を読んだ当業者により認識可能であり、さらに詳細には記載しない。
【０１００】
具体的には、キットの成分は、本明細書に記載される方法を実施するための、適切な説明書及び他の必要な試薬とともに提供され得る。キットは通常、別々の容器において組成物を含有する。アッセイを実施するための、紙又はテープ若しくはＣＤ−ＲＯＭといった電子的サポートにおける説明書（例えば、紙に書かれた又はオーディオの説明書）は通常、キットに含まれる。キットはまた、用いられる具体的な方法に依存して、他のパッケージされた試薬及びマテリアル（すなわち洗浄バッファー及び同様物）を含み得る。
【０１０１】
具体的には、いくつかの実施態様において、１又は２以上の混合可能かつ薬学的に許容可能なビヒクルと、具体的には薬学的に許容可能な希釈剤又は賦形剤と混合された、本明細書で記載される少なくとも一つの剤を含む医薬組成物が開示される。医薬組成物において、剤は、個体のコンディションの治療又は予防のために活性成分として投与され得る。
【０１０２】
いくつかの実施態様において、ｏｘＬＤＬで免疫され導入遺伝子（ｈｕＢ１００ｔ９）としてヒトＡｐｏＢ１００を有するマウス由来のハイブリドーマの使用が、ＣＤ４＋Ｔ細胞受容体のＡｐｏＢ１００への反応を阻害するための適切な剤を同定するために記載される。具体的には、２００９年１月２２日に受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９８６で、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）にブタペスト条約により寄託されたハイブリドーマクローン４８−５、並びに関連する使用及びシステムである。
【０１０３】
キットのパーツの形態であり得る方法の実施のためのシステム、組成物の適切なキャリア、剤、又は補助剤とともに剤及び他の試薬を含む関連する組成物、キットの製造及びパッケージを含む、本明細書で記載されるハイブリドーマ、剤、組成物、方法の実施に関するさらなる詳細が、本開示を読んだ当業者により認識可能である。
【実施例】
【０１０４】
本明細書に記載の方法及びシステムが下記の実施例においてさらに示され、それは図示の方法により提供され、それに限定されることを意図するものではない。
【０１０５】
具体的には、典型的な方法及びシステムを示す下記の実施例は、ＴＣＲ  ＴＲＶＢ３１由来の特定のペプチドで免疫することによる、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応の阻害に基づく。本技術分野の当業者は、ＴＣＲ  ＴＲＶＢ３１由来の異なるペプチドで行った免疫に対する、又はＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００への反応を阻害する、具体的には本発明によるＴＣＲ  ＴＲＶＢ３１を提示するＣＤ４＋Ｔ細胞を阻害するための他の方法及びシステムに対する、詳細に記載される特徴の適用性を認識する。
【０１０６】
下記の実施例において、他に示唆のない限り、値は、平均値±標準偏差（ＳＥＭ）として表現される。一対比較のために、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定が用いられた。群間の差異は、Ｐが０．０５を下回るときに有意とした。
【０１０７】
下記の実施例を行うための方法及びマテリアルを下記に要約する。
【０１０８】
（ＭＨＣ拘束アッセイ）
ＭＨＣクラスＩＩの拘束性を評価するために、我々は、同系ドナー（Ｃ５７ＢＬ／６；Ｉ−Ａｂ）又は同種異系ドナー（ＢＡＬＢ／ｃ；Ｉ−Ａｄ）由来の４×１０５の照射（１．６Ｇｙ）ＡＰＣの存在のもと、異なる濃度のＡｐｏＢ１００とともに１０５のハイブリドーマ細胞を培養した。独立した実験において、１０５のハイブリドーマ細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ（ＢＤ）に対する遮断抗体の存在下又は非存在下で同系ドナー由来の４×１０５の照射（１．６Ｇｙ）ＡＰＣの存在のもと、ＡｐｏＢ１００とともに培養した。両実験において、Ｔ細胞の活性化は、上清中のＩＬ−２濃度の増加により規定した。
【０１０９】
（リポタンパク質の調製）
過去に開示された通り（Ｈａｖｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９５５）、健康なドナーのプールされた血漿から超遠心分離法によりＬＤＬ（ｄ＝１．０１９−１．０６３ｇ／ｍＬ）を単離した。血漿を調製後、２ｍＭ  ベンザミジン、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、及び０．１Ｕ／ｍＬ  アプロチニンを直ちに加えた。単離後、ＰＢＳに対して広範囲にＬＤＬを透析した。１ｍＭ  ＥＤＴＡを小分けしたＬＤＬに加えて、非修飾ＬＤＬを産生した。同様の手順を用いて、リコンビナントＬＤＬを、ｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−の血漿から調製した。高度に酸化されたＬＤＬを、３７℃で、１８時間、２０μＭ  ＣｕＳＯ４の存在下で１ｍＬのＬＤＬ（１ｍｇ／ｍＬタンパク質含量、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ’  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより決定）をインキュベートすることで得た；異なる程度の酸化が、１、２、４又は８時間、２０μＭ  ＣｕＳＯ４とＬＤＬをインキュベートすることで得られた。酸化の程度を、過去に開示された通り（Ｐｕｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、ＴＢＡＲＳにより評価した。
【０１１０】
（可溶性ＡｐｏＢ１００の調製）
ＡｐｏＢ１００を、過去に開示された方法（Ｓｔｅｅｌｅ  ａｎｄ  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，１９７９；Ｗｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｆｌｉｉｇｇｅ，１９８４）の変法を用いて単離した。端的に言うと、０．４ｍＬ  メタノール、０．１ｍＬ  クロロホルム、及び０．３ｍＬの水を０．１ｍＬのＬＤＬ（１ｍｇ／ｍＬ）に加えた；上清をその後ボルテックスし、１分間９，０００ｇで遠心分離した。上層を除去し、タンパク質が沈殿した下層及び中間層に０．３ｍＬのメタノールを加え、再び混合させ２分間９，０００ｇで遠心分離してタンパク質をペレットとした。可溶性かつ純粋なＡｐｏＢ１００を得るために、タンパク質ペレットが溶解するまで最小量の１０％ＳＤＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中に再懸濁させた。これらの調製液を最初にＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でろ過し、過剰のＳＤＳを除去した。その後Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−  ２００  ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎカラム（０．５ｍＬ／分、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ中、ｐＨ  ７．４）において精製した。ＡｐｏＢ１００調製液は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へのセカンドインジェクションにおいて評価され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析され、９０％以上の純度であった。最後に、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により測定した。
【０１１１】
（ＴＣＲ  Ｖドメイン発現のフローサイトメトリー分析）
商業的に入手可能なａｎｔｉ−マウス  ＴＣＲ−Ｖα及びＴＣＲ−Ｖβ  ｍＡｂ（ＢＤ）を用いて、ＴＣＲ−Ｖα及びＴＣＲ−Ｖβを検出した。それらをａｎｔｉ−ＣＤ３−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ及びａｎｔｉ−ＣＤ４−ＡＰＣと混合させ、Ｔ細胞ハイブリドーマを染色した。免疫していないマウス由来の脾細胞を、すべての抗体に対するポジティブコントロールとして用いた。細胞を、ＣｙＡｎ  ＡＤＰ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｄａｋｏ）で分析した。
【０１１２】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  増殖アッセイ）
免疫したマウス由来の脾細胞を分離し、再懸濁させた。９６ウェルのプレートにおいて、５×１０５の脾細胞を、湿度５％のＣＯ２雰囲気下で、３７℃で７２時間、２００μＬの血清非含有培地、１：１００  ＢＤ  ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ（ＢＤ）、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈｅｐｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピルビン酸塩Ｎａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシンサルフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、図のレジェンドに記載されているように、異なる抗体を用いてデュプリケートで培養した。１マイクロキュリーの［３Ｈ］チミジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を６０時間後に加え、ＤＮＡ複製を、シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ）を用いて測定した。結果は、刺激指標＝（ｓ−ｃ）／ｃとして表現され、ｓは抗原有りのサンプルのｃｐｍであり、ｃは抗原無しのサンプルのｃｐｍである。
【０１１３】
（“蛍光活性化細胞選別”によるＶβ＋Ｔ細胞枯渇）
脾細胞を、１００μｇのＡｐｏＢ１００で免疫したｈｕＡｐｏＢ１００ｔｇ−Ｌｄｌｒ−／−マウスより単離した。３０００万の脾細胞を、ａｎｔｉ−ＴＲＢＶ３１又はａｎｔｉ−ＴＲＢＶ１９（ＢＤ）で染色した。ＴＲＢＶ１９を選別のコントロールとして用いた。ＡｐｏＢ１００を認識するどのハイブリドーマもこのＴＣＲを発現しなかったためである。ＴＲＢＶ１９／ＴＲＡＶ１３．２  ＴＣＲ（９６．７及び９７．３）を発現した２つのクローンは、ＬＤＬ又はＡｐｏＢ１００を認識しなかった（表Ｓ１）。染色後、ＭｏＦｌｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で細胞を選別して、ポジティブイベントを枯渇させた。ネガティブの細胞を収集し、ＡｐｏＢ１００への反応において増殖アッセイに用いた。
【０１１４】
（血漿分析）
ＴＲＢＶ３１ペプチド、ＬＤＬ、ｏｘＬＤＬ及びＡｐｏＢ１００に対する特定の抗体の力値をＥＬＩＳＡにより測定した。端的に言うと、５０μＬの異なる抗原（ｐＨ７．４のＰＢＳ中、１０μｇ／ｍＬ）を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。コーティングされたプレートをＰＢＳで洗浄し、室温にて１時間、ＰＢＳ中の１％ゼラチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロックした。次に、プレートを洗浄し、マウスの血漿でさらに２時間インキュベートし、ＴＢＳ／ゼラチン０．１％中で希釈した。洗浄後、トータルＩｇＧレベルを、酵素コンジュゲートａｎｔｉ−マウス抗体（ＢＤ）を用いて測定した。プレートを洗浄して、比色分析反応を、ＴＭＢ（ＢＤ）を用いて行った。吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ；ＭＤＳ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。血漿コレステロール及びトリグリセリドを、酵素的比色分析キット（Ｒａｎｄｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｔｄ．）を用いて、その使用説明書のプロトコールに従って測定した。ＡｐｏＢ１００レベルを、市販のＥＬＩＳＡにより、その使用説明書（ＡＬｅｒＣＨＥＫ，Ｉｎｃ．）に従って測定した。
【０１１５】
（リポタンパク脂質のプロファイル）
血漿のコレステロールリポタンパク質のプロファイルを、Ｏｋａｚａｋｉらの方法（１９８１）の変法を用いて評価した。端的に言うと、ＴＲＢＶ３１ペプチド又はＫＬＨで免疫したマウス由来の血漿サンプル（５０μＬ）を、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＵＦＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）と組み合わされたＨＲ  １０／３０  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＢＩＯ  ＧＦＣ−５００  ａｓ  ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ（５ｃｍ×７．８ｉ．ｄ．；Ｓｕｐｅｌｃｏ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて画分に分け、ｐＨ７．４のトリス緩衝食塩水で平衡化した。２００μＬのフラクションをＦｏｘｙ  Ｊｒ．ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ，Ｉｎｃ．）を用いて収集し、トータルコレステロールを、酵素的比色分析キット（Ｒａｎｄｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｔｄ．）を用いて各々のフラクションにおいて評価した。
【０１１６】
（組織の処理、免疫組織化学、及び病変分析）
屠殺されたマウス由来の血液を、心穿刺及び滅菌ＲＮａｓｅ非含有ＰＢＳによる血管かん流により収集した。腹部大動脈、脾臓の３分の１、流れ出るＬＮを解剖し、後のＲＮＡ分離のために凍結させた。心臓及び大動脈弓を、免疫組織化学及び病変分析のために解剖し、保存した。病変分析は、記載の通り行った（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉら、１９９８）。端的に言うと、心臓を低温保持装置上で大動脈基部の近位１ｍｍから連続的に切開した。ヘマトキシリン染色及びＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色の切片を、病変サイズの評価に用いた。病変サイズを、大動脈基部の１ｍｍのセグメントにわたって１００μｍごとに収集された、８つのヘマトキシリン染色及びＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色の切片を測定することで評価した。切片ごとに、イメージを、２０×／０．９  対象及びＤＣ３００カメラ（Ｌｅｉｃａ）を備えたＤＭ−ＬＢ２顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で捉え、病変及び血管全体の表面積を測定した。ＣＤ３、ＣＤ６８及びＩ−Ａｂに対する一次抗体（すべてＢＤからのラットａｎｔｉ−マウス）をアセトンで固定した低温切開片に添加し、ＡＢＣアルカリホスファターゼキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検出した。正面像で、ズダンＩＶ染色を用いて免疫されたマウス由来の大動脈弓において脂質の蓄積を評価した。端的に言うと、切開された（大動脈）弓を、中性に緩衝化された４％ホルマリンで固定した。サンプルをその後、長手方向に切り、伸ばして固定して、ズダンＩＶ染色（赤色）を行った。イメージを、ＭＺ６実体顕微鏡に接続されたＤＣ４８０カメラ（両方ともＬｅｉｃａ）を用いて捉えた。大動脈弓におけるすべてのプラークの追加の領域を、（大動脈）弓（血管枝を含まない）の全表面積の割合として算出した。プラークの定量は、イメージＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて行った。免疫組織化学的データを、染色された切片のＱｗｉｎ  ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｌｅｉｃａ）を用いて得た。
【０１１７】
（ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、及びリアルタイムＰＣＲ）
ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、示された組織又は細胞から単離した。トータルＲＮＡを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。逆転写を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ−ＩＩ及びランダムヘキサマー（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行い、ＡＢＩ７７００シークエンスデテクター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ５，ＣＤ３に対するアッセイのオンデマンドのプライマー及びプローブ、並びにヒポキサンチン  グアニン  ホスホリボシル  トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより増幅した。ＴＲＢＶ３１発現分析に対して、遺伝子型決定（表２）において用いられたプライマーを、ＴＣＲβ鎖の定常領域のヌクレオチド配列（５’−ＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴ−３’）に基づきデザインされたプローブと組み合わせた。プローブは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてデザインされ、５’末端に結合された５−カルボキシフルオレスセイン（ＦＡＭ）受容体分子（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成した。データを、式２−ΔΔＣＴを用いた相対発現方法に基づき分析した（ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ（サンプル）−ΔＣＴ（カリブレーター＝グループ内のすべてのサンプルの平均ＣＴ値）、ΔＣＴは、ターゲット遺伝子のＣＴから差し引かれたハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）のＣＴである）。ＴＲＢＶ３１に対して、ＴＲＢＶ３１発現／ＣＤ３発現の平均±ＳＥＭの値が示される。
【０１１８】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＲＢＶ３１＋細胞のＬＤＬへの反応の抗体介在の遮断）
ＫＬＨ免疫マウス又はＴＲＢＶ３１免疫マウス由来のトータルＩｇＧ血漿抗体を、タンパク質Ｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてアフィニティー精製した。１０，０００のハイブリドーマ細胞（クローン４８−５）を、４×１０４照射のＡＰＣの存在下で２０μｇ／ｍＬ  ＬＤＬと培養した。ハイブリドーマの活性を遮断するために、図で示される濃度で、種々の抗体を、培養開始時に添加し、培養中存在させた。２４時間のインキュベート後、上清中のＩＬ−２を測定した。
【０１１９】
（統計分析）
値を、他に示唆のない限り、平均±ＳＥＭとして表現した。一対比較のために、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定を用い、多重比較のために、クラスカル・ワリス検定を用いた。相互関係を、スピアマンテストを用いて算出した。群間の差異は、Ｐ値が０．０５を下回るときに有意とした。
【０１２０】
（実施例１．Ｔ細胞のハイブリドーマによる天然のヒトＬＤＬ及びＡｐｏＢ１００の産生及びテスト）
これらの実験に対して、ＨｕＢ１００ｔｇマウス（導入遺伝子としてヒトＡｐｏＢ１００を有するマウス）を、Ｔ細胞のｏｘＬＤＬへの反応を特徴付けるために用いた。これらのマウスは、肝臓や消化管においてヒトの全３０の長さのＡｐｏＢ１００を発現し、ヒト化リポタンパク質のプロファイルを示す。
【０１２１】
（免疫）
Ｔ細胞ハイブリドーマの産生のために、７週齢の雄ヒトＡｐｏＢ１００トランスジェニックマウス、ｈｕＢ１００ｔｇ（Ｃ５７ＢＬ／６、１２９−Ａｐｏｂｔｍ２ｓｇｙ、ＤＮＸ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、米国）を用いた。
【０１２２】
これらのマウスは、全長のヒトＡＰＯＢ遺伝子を有し（ＡｐｏＢ４８の形成を抑制するようにコドン２１５３をロイシンからグルタミンに変えてある）、ＡｐｏＢ１００のみを産生する（Ｂｏｒｅｎ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｉ．，Ｚｈｕ，Ｗ．，Ａｒｎｏｌｄ，Ｋ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ，Ｔ．Ｌ．（１９９８）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  １００  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ａｐｏ−Ｂ  １００．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０１  ，  １０８４−  １０９３；Ｌｉｎｔｏｎ，Ｍ．Ｆ．，Ｆａｒｅｓｅ，ＲＶ．，Ｊｒ．，Ｃｈｉｅｓａ，Ｇ．，Ｇｒａｓｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｃｈｉｎ，Ｐ．，Ｈａｍｍｅｒ，ＲＥ．，Ｈｏｂｂｓ，Ｈ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓ．Ｇ．（１９９３）．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｐｌａｓｍａ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  １００  ａｎｄ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２，３０２９−３０３７；Ｙａｏ，Ｚ．Ｍ．，Ｂｌａｃｋｈａｒｔ，Ｂ．Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｆ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｈａｕｂｏｌｄ，Ｋ．Ｗ．，ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）．Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ４８  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ｃＤＮＡ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７，１１７５−１１８２．）。
【０１２３】
マウスに完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合した銅で酸化されたヒトＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）５０μｇを皮下投与（ｓ．ｃ．）して最初に免疫し、２週間後、マウスを不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合したｏｘＬＤＬ５０μｇでブーストさせた。酸化されたヒトＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）を下記のように調製した：ＬＤＬ（ｄ＝１．０１９−１．０６３ｇ／ｍＬ）を、Ｈａｖｅｌらにより開示されているように（Ｈａｖｅｌ，ＲＪ．，Ｅｄｅｒ，Ｈ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂｒａｇｄｏｎ，Ｊ．Ｈ．（１９５５）．Ｔｈｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｌｙ  ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ３４，１３４５−１３５３）、健康なドナーのプールされた血漿から超遠心により単離した。単離後、ＬＤＬのみをＰＢＳから透析した。１ｍＭ  ＥＤＴＡを小分けしたＬＤＬに加えて、修飾されていないＬＤＬとして用いた。３７℃で１８時間、２０μＭ  ＣｕＳ０４の存在下で、１ｍＬのＬＤＬ（１ｍｇ／ｍＬのタンパク質含量、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｂｉｏｒａｄ（米国）により評価）をインキュベートすることで、高度に酸化されたＬＤＬを得た。
【０１２４】
（Ｔ細胞ハイブリドーマの産生）
前述の通り、ｏｘＬＤＬの第一の免疫及びブースター注入の後、下記の通り、リンパ節（ＬＮ）細胞を収集し、胸腺腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを産生させた。
【０１２５】
Ｔ細胞ハイブリドーマを、Ｋａｐｐｌｅｒらにより開示されたように（ａｐｐｌｅｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｓｋｉｄｍｏｒｅ，Ｂ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍａｒｒａｃｋ，Ｐ．（１９８１）．Ａｎｔｉｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ，Ｈ−２−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．Ｌａｃｋ  ｏｆ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  Ｈ−２  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １５３，１１９８−１２１４）、５×１０７のリンパ節（ＬＮ）細胞の３×１０７のＢＷ５１４７  胸腺腫細胞との融合をポリエチレングリコールにより誘導して、産生した。端的に言うと、免疫されたマウス由来のＬＮ細胞を融合前、３日間、３μｇ／ｍＬのｏｘＬＤＬで刺激した。融合後、１×１０６の胸腺腫細胞を支持細胞に加え、細胞懸濁液を９６ウェルプレートに撒き、７．５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。融合された細胞を良好に選別するために、インキュベーションの２４時間後、培地にヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）を加えた。培養して生じた２６８のハイブリッドにおいて、１１７でＣＤ３及びＣＤ４を発現していた。２３のＨＡＴ耐性モノクローナルハイブリドーマをその後、限界希釈法によりクローニングし、天然のＬＤＬ、銅によるｏｘＬＤＬに対する反応性をスクリーニングし、修飾されていないＡｐｏＢ１００を精製した。
【０１２６】
（陽性クローンのスクリーニング）
２３のＨＡＴ耐性モノクローナルハイブリドーマを、同系の照射された抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で、推定上の抗原（天然のＬＤＬ、銅によるｏｘＬＤＬ、及び精製された非修飾ＡｐｏＢ１００）への暴露後、ＩＬ−２生成による活性化（抗原がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するとＩＬ−２分泌を刺激する）に対して評価した。このような細胞を取り出し、抗原処理し、ＭＨＣ分子に結合する抗原性ペプチドの提示を誘導した。同系のＡＰＣ、すなわち、Ｔ細胞として同じＭＨＣを持つマウス由来のＡＰＣが、抗原として外来のＭＨＣ分子を認識するＴ細胞の活性化を抑制するために、必要である。Ｔ細胞の反応性は、異なる抗原と、１×１０５のＴ細胞ハイブリドーマ及び４×１０５の照射された（１．６Ｇｙ）ＡＰＣを用いた９６ウェルプレートのアッセイにおいて評価された。ＬＤＬ及びｏｘＬＤＬを、実施例１において記載されるように調製した。ＡｐｏＢ１００を、Ｗｅｓｓｅｌらが過去に開示した方法（Ｗｅｓｓｅｌ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｆｌｕｇｇｅ，Ｕ．ｌ．（１９８４）Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｄｉｌｕｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄｓ  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３８，１４１−１４３）の変法により得た。端的に言うと、０．１ｍＬのＬＤＬ（１ｍｇ／ｍＬ）、０．４ｍＬのメタノール、０．１ｍＬのクロロホルム、及び０．３ｍＬの水を加え；懸濁液をその後強力に混合し、１分間、９０００×ｇで遠心分離した。上層を除去し、０．３ｍＬのメタノールをタンパク質が沈殿している下層及び中間層に加え、再び強力に混合させ、２分間９０００×ｇで遠心分離し、タンパク質をペレット化した。可溶性でかつ高度に純粋なＡｐｏＢ１００を得るために、ペレット化されたタンパク質が完全に溶けるまで、最小容量の１０％ＳＤＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）溶液に再懸濁させた。これらのＡｐｏＢ１００の調製液をその後、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、以前はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いて最初のろ過に供して、過剰のＳＤＳを除去し、その後、サイズ排除カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００（０．５ｍＬ／分、ｐＨ７．４のＴｒｉｓ−ＨＣｌ中）を用いて精製を行った。ＡｐｏＢ１００を含む第一のピークを収集し、ＬＤＬ精製過程由来の混入タンパク質を含む余分なピークを捨てた。ＡｐｏＢ１００の調製液は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）への第二の注入において評価された時に、９０％以上の純度を示した。最後に、タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）を用いて決定した。
【０１２７】
ＡＰＣを、ナイロンフィルター（１  ００１−ｌｍ）上で脾臓をふるい分けし（ｍｅｓｈｉｎｇ）、その後、赤血球細胞を溶解及び洗浄することにより調製した。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）をポジティブコントロールとして用いた。細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、７．５％ＣＯ２で、３７℃で２４時間培養した。インターロイキン２（ＩＬ−２）を培養液の上清においてＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、英国）により評価し、Ｔ細胞活性化の読み出し（ｒｅａｄ−ｏｕｔ）として用いた。結果を図１Ａで見ることができ、ここで、２３のＨＡＴ耐性モノクローナルハイブリドーマの各々の１×１０５のハイブリドーマ細胞を、４０μｇ／ｍＬのＬＤＬ、ｏｘＬＤＬ、又はＡｐｏＢ１００と、４×１０５照射されたＡＰＣとともにインキュベートした。培地をネガティブコントロールとして用いた。
【０１２８】
驚くべきことに、テストされたすべての２３のモノクローナルＴ細胞ハイブリドーマのうち、１１が天然のヒトＬＤＬ及びＡｐｏＢ１００に反応したが、いずれも酸化されたＬＤＬには反応しなかった。
【０１２９】
（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＴＣＲ遺伝子型決定）
天然のＬＤＬ及びＡｐｏＢ１００に反応し得た１１のクローンを、ＰＣＲにより遺伝子型を決定した。トータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、米国）により１１のハイブリドーマクローンの各々に由来する１×１０７のハイブリドーマ細胞から調製し、ＲＮａｓｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、フランス）の存在下、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー（ｐｄＮ６）により、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。作られたｃＤＮＡを、定常領域Ｃα３’プライマーとともに適切なＶαファミリー特異的５’プライマー（表１）又は定常領域Ｃβ３’プライマーとともに関連性のあるＶβファミリー特異的５’プライマー（表２）を用いて増幅した。
【０１３０】
【表１−１】
2013540753.tif 000003
【０１３１】
【表１−２】
2013540753.tif 000004
【０１３２】
【表２−１】
2013540753.tif 000005
【０１３３】
【表２−２】
2013540753.tif 000006
【０１３４】
国際免疫遺伝学情報システム（ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＩＭＧＴ）の命名法を、Ｔ細胞のＴＣＲ−Ｖ鎖の利用の指定のために用いた。すべてのＴＣＲ−Ｖ鎖の配列は、ＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒｌ））（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．，Ｐｏｍｍｉｅ，Ｃ，Ｒｕｉｚ，Ｍ．，Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．，Ｆｏｕｌｑｕｉｅｒ，Ｅ．，Ｔｒｕｏｎｇ，Ｌ．，Ｔｈｏｕｖｅｎｉｎ−Ｃｏｎｔｅｔ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｇ．（２００３）．ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｏｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７，５５−７７）から抽出された。旧命名法と新命名法との間の対応のために、ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｍｅｓ．  ｆｒ／ｔｅｘｔｅｓ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／ＬｏｃｕｓＧｅｎｅｓ／＃Ｊを参照する。ＰＣＲ反応のためのマスターミックス（ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ｄＮＴＰ及び０．２Ｕ／ｍＬ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）を含んでいた。すべてのプライマーを最終濃度０．２μＭとなるように加えた。反応を、９４℃（４０秒間）での変性、５８℃（４０秒間）でのアニーリング、７２℃（１分間）の重合を用いた３５サイクルで行った。ＰＣＲ生成物を１．５％アガロースゲルで分析し、ゲル赤色染色で視覚化した。
【０１３５】
ＴＣＲ遺伝子型決定に基づき、３つの異なるサブグループを、天然のＬＤＬ及びＡｐｏＢ１００に反応し得た１１のクローンから同定し、各サブグループ（１５−２、４５−１及び４８−５）由来の代表的なデータを、反応無しのクローン２０（９７−３）とともに示す。図１Ｂ−Ｅに示され得るように、修飾されていないＡｐｏＢ１００タンパク質に対して、各々のサブグループ由来のハイブリドーマクローンでは明確な用量反応性が見られた。ＴＣＲのタイプに関連したハイブリドーマクローンの特性を、下記の表３に示す。
【０１３６】
反応性がタンパク質のヒト特異的な修飾に依存していないことを確かめるために、ＬＤＬ及びＡｐｏＢ１００もまたｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスから単離し、ハイブリドーマに対してテストした。これらのマウスは、ヒトＡｐｏＢ１００を含むＬＤＬを作る。しかしながら、これらの粒子は、ヒトのみに生じ得、仮説上免疫反応を引き起こし得る翻訳後修飾を欠く。
【０１３７】
図１Ｂ−Ｅにおいて、１×１０５のハイブリドーマ細胞を、異なる濃度での、ヒトＬＤＬから精製したヒトＡｐｏＢ１００及びｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスから得た（ｘ）トランスジェニックヒトＡｐｏＢ１００とともに、４×１０５照射されたＡＰＣとインキュベートした。両実験において、ＩＬ−２分泌を活性化の読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）として用いた。グラフより、このリコンビナントヒトＡｐｏＢ１００はまたＴ細胞ハイブリドーマのサブグループ１５−２、４５−１及び４８−５により認識されたことが示される。したがって、天然のＬＤＬ及びヒトＡｐｏＢ１００は、これらのＴ細胞により認識されるＴ細胞のエピトープを含む。
【０１３８】
（実施例２：ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬで免疫されたマウス由来のＴ細胞は、天然のＡｐｏＢ１００を認識する）
アテローム硬化性の病変がオリゴクローナルなＴ細胞を含むということが過去に確立し、ｏｘＬＤＬで免疫されたマウスより産生されたハイブリドーマがＬＤＬの天然のＡｐｏＢ１００を認識し得るということを現在見出し、このような自己免疫反応がポリクローナルなＴ細胞集団に生じ得るかどうかが問題とされた。この仮説を、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬ（高度に酸化されている）によるｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスの免疫、その後のｏｘＬＤＬ又は天然のＡｐｏＢ１００によるこれらのマウス由来の脾臓細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）により検証した。これらのマウスは、循環由来のＬＤＬの排泄に関与するＬＤＬ受容体を欠いている。脂肪食を摂取すると、それらは高コレステロール血症及びアテローム性動脈硬化に進展する。ＬＤＬへの免疫反応は、これらの疾患コンディションにおいて増加され、このような反応の分析に適している。
【０１３９】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイ）
ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬで免疫されたｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウス由来の脾臓細胞を分離し、細胞懸濁液を調製した。９６ウェルプレートにおいて、５×１０５の脾臓細胞を、下述の通り、湿度５％のＣＯ２雰囲気下で、３７℃で７２時間、２００μＬの血清非含有培地、１：１００  ＢＤ  ＩＴＳ＋  Ｐｒｅｍｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，米国）、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，２５  米国）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピルビン酸塩Ｎａ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，米国）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）、及び５０μｇ／ｍＬ硫酸ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）中で、異なる抗原とデュプリケートでインキュベートした。５０μＬのＨ３−チミジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、米国、血清非含有培地中１μＣｉ）を加え、１８時間のインキュベート後、Ｔ細胞の増殖を、シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）で評価した。
【０１４０】
図２（Ａ）において、ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬで免疫されたｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウス由来の５×１０５の脾臓細胞を、２０μｇ／ｍＬのヒトｏｘＬＤＬ又は天然のヒトＡｐｏＢ１００でｉｎ  ｖｉｔｒｏチャレンジした（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）。値を、Ｈ３−チミジンの取り込みにより得られた刺激指数の平均±ＳＥＭとして表す。再度、天然のＡｐｏＢ１００は最も高い反応を示し、一方、ｏｘＬＤＬは活性化を引き起こさなかった（図２Ａ）。さらに、このデータは、天然のＬＤＬ又はｏｘＬＤＬのいずれかによる免疫が、ＬＤＬ粒子の天然の（酸化されていない）エピトープを認識するＴ細胞集団の拡大をもたらすことを示す。
【０１４１】
（実施例３：ＬＤＬの酸化は、Ｔ細胞のエピトープの認識を低減させる）
異なる長さの時間、銅により酸化され、異なる程度に酸化されたＬＤＬ粒子の範囲へのＴ細胞の暴露によって、ＬＤＬ粒子の酸化と免疫原性との間の関係がさらに分析された。高度に酸化されたＬＤＬを、３７℃で１８時間、２０〜Ｍ  ＣｕＳ０４の存在下での１ｍＬのＬＤＬ（１ｍｇ／ｍＬのタンパク質含量、Ｂｒａｄｆｏｒｄにより評価、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、米国）のインキュベートにより得；異なる程度の酸化を、１、２、４又は８時間、２０〜Ｍ  ＣｕＳ０４とのＬＤＬのインキュベートにより得た。酸化の程度を、過去に開示された通りのＴＢＡＲＳにより評価した（Ｐｕｈｌ，Ｈ．，Ｗａｅｇ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ，Ｈ．（１９９４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２３３，４２５−４４１）（図２Ｂ）。
【０１４２】
ＬＤＬ又はｏｘＬＤＬで免疫されたｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウス由来の脾臓細胞を、前述の実施例２で記載の通り、分離して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液由来の１．０×１０５のハイブリドーマ細胞を、１、２、４又は８時間、２０〜Ｍ  ＣｕＳ０４とインキュベートされた４０〜ｇ／ｍＬの天然のＬＤＬ又はｏｘＬＤＬとともに４×１０５照射されたＡＰＣと２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベート後、ＩＬ−２分泌を、培養された細胞の上清中で評価した（図２Ｃ＝１５−２クローン；図２Ｄ＝４８−５クローン；図２Ｅ＝４５−１クローン；図２Ｆ＝９７−３ネガティブコントロールクローン）。
【０１４３】
驚くべきことに、酸化の程度とＴ細胞ハイブリドーマのすべてに対する活性化の振幅との間に逆相関性がみられた（図２Ｃ−Ｆ）。このように、天然のＬＤＬは最も高いＩＬ−２反応をもたらし、一方で、高度に酸化されたＬＤＬ（すなわち、１８時間酸化されたＬＤＬ）は全く活性化を引き起こさなかった。ｏｘＬＤＬの、インキュベート後の細胞の生存率に与える影響を検証すると、グループ間で顕著な差異はみられなかった（データ示さず）。これらのデータから、ＬＤＬにおけるエピトープへのＴ細胞の反応は、酸化により次第に減弱することが示唆される。
【０１４４】
異なる長さの時間、銅により酸化されて、一定の範囲に酸化されたＬＤＬ粒子に対してＴ細胞ハイブリドーマを暴露することによるＬＤＬ粒子の酸化と免疫原性との間の関係がさらに分析された（図１２Ｅ−Ｇ）。すべてのＴ細胞ハイブリドーマに対して、酸化の程度と活性化の振幅との間で逆相関性がみられた（図１２Ｅ−Ｇ及び図１３Ａ）。このように、天然のＬＤＬは最も強いＩＬ−２反応を引き起こし、一方で、高度に酸化されたＬＤＬは活性化を引き起こさなかった。
【０１４５】
他のセットの実験において、ＭＤＡ付加物形成によりＬＤＬを修飾した。ＭＤＡは、脂質過酸化の間形成され、ＡｐｏＢ１００における遊離アミノ基と反応して、ＭＤＡ−リジン及び他の修飾残基が生成される（Ｆｏｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｈａｂｅｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｈａｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４）。
【０１４６】
したがって、それは、ＬＤＬの化学的に規定された酸化的修飾として考えられ得る。ＭＤＡの修飾は、リポタンパク質粒子のＭＤＡ暴露に程度に比例して、同様に銅によるＬＤＬの酸化の程度に比例して、Ｔ細胞のＬＤＬ認識を低減させた（図１３Ａ）。注目すべきことに、反応の用量依存性は、所定の濃度でＭＤＡ修飾ＬＤＬ粒子に対して検出され得たが、その振幅は、粒子の修飾の程度に逆相関した（図１３Ａ及びＢ）。同様の知見が、銅で酸化されたＬＤＬで見られた（図１３Ｂ）。
【０１４７】
Ｔ細胞の活性化に対するｏｘＬＤＬの抗原非依存的な、有害な作用を排除するために、出願人は、ＡｐｏＢ１００、天然のＬＤＬ、ＯＶＡ、又はポリクローナルなＴ細胞マイトジェンであるコンカナバリンＡにより活性化されたＴ細胞への影響を試験した。天然のＬＤＬ及びＡｐｏＢ１００を認識するＴ細胞ハイブリドーマは、培養液へのｏｘＬＤＬの添加濃度を増やしていくと活性化が低くなったが、コンカナバリンＡと共インキュベートしたときに活性化レベルは変わらなかった（図１３Ｃ）。また、Ｔ細胞の活性化の未変化が、ＯＶＡを認識するトランスジェニックＴＣＲを有し、その結果ＭＨＣクラスＩＩとの関連でＯＶＡにより活性化されるＯＴ−ＩＩマウス由来の細胞を用いたときに見られた（図１３Ａ及びＣ）。Ｔ細胞の生存率は、この試験において用いられた濃度では、ｏｘＬＤＬにより影響を受けなった（図１４）。トータルで、これらのデータにより、Ｔ細胞のＬＤＬ認識は、ＬＤＬ酸化により次第に失われることが示唆される。
【０１４８】
（実施例４：天然のＡｐｏＢ１００に対する細胞性免疫反応は、ポリクローナルなＴ細胞集団において維持される）
アテローム硬化性病変がオリゴクローナルなＴ細胞を含むということが確立されており（Ｐａｕｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、ｏｘＬＤＬで免疫されたマウス由来のハイブリドーマが天然のＡｐｏＢ１００を認識するということが観察され、このような自己免疫反応がポリクローナルなＴ細胞集団で生じるのかということが問題となった。この仮説を、食餌を与えるとさらに、ヒトＡｐｏＢ１００を含む高い血漿中レベルのＬＤＬにより顕著な高コレステロール血症を進展させるｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて検証した。これらのマウスを、ｏｘＬＤＬ又は天然のＡｐｏＢ１００で免疫し、その後、ｏｘＬＤＬ又は天然のＡｐｏＢ１００でこれらのマウス由来の脾臓のｉｎ  ｖｉｔｒｏチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を行った。前述同様、天然のＡｐｏＢ１００は、最も高い増殖的なＴ細胞反応を誘発し、一方で、ＤＮＡ合成で記録されたように、高度に酸化されたＬＤＬは、活性化を引き起こさなかった。この活性化パターンは、ｏｘＬＤＬ免疫マウス及びＡｐｏＢ１００免疫マウスにおいて同様であった（図１５）。反対に、抗体の反応が、ｏｘＬＤＬ、天然のＬＤＬ、及びＡｐｏＢ１００に対して検出された（図１５Ｂ）。結果として、天然のＡｐｏＢ１００へのＴ細胞の反応は、天然のエピトープと同様に、酸化されたエピトープにおいても、さまざまなエピトープに対してＢ細胞が抗体を産生するのを助け得る。おそらくアッセイの制限された感受性ゆえに、天然のＡｐｏＢ１００へのＴ細胞の反応は、免疫されていないマウス由来の脾臓細胞調製液において検出されておらず、したがって、ＡｐｏＢ１００での免疫による自己反応的なＴ細胞クローンの拡大は、反応を検出することを必要としていた（図１６）。ｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスにおける知見と同様に、天然のマウスＬＤＬによるＡＰＯｅ−／−マウスの免疫は、天然のＬＤＬ粒子へのＴ細胞の反応を消滅させ、このような反応はｈｕＢ１００ｔｇモデルに限定されないことが示唆された。
【０１４９】
（実施例５：天然のＬＤＬ及びＡｐｏＢ１００へのＴ細胞の反応は、特異的なＭＨＣクラスＩＩ分子に依存する）
精製されたＡｐｏＢ１００が、免疫されたマウスから得られたＣＤ４＋Ｔ細胞ハイブリドーマの活性化を誘導することができるため、エピトープは、１−Ａｂハプロタイプの本マウスのケースにおけるＭＨＣクラスＩＩ複合体により提示されるペプチドであるという仮説が立てられた。ＭＨＣクラスＩＩの拘束性の評価のために、１×１０５ハイブリドーマ細胞を、異なる濃度のヒトＡｐｏＢ１００とともに、同系ドナー（Ｃ５７ＢＵ６；Ｉ−Ａｂ）、すなわちＩ−Ａｂハプロタイプであるマウス由来の、又は異なる遺伝子型（ＢＡＬＢ／ｃ；Ｉ−Ａｄ）、すなわちＩ−Ａｄハプロタイプであるマウス由来の４×１０５照射されたＡＰＣとインキュベートした。同時に、ハイブリドーマ細胞を、ａｎｔｉ−ＭＨＣクラスＩＩ遮断抗体とともに、Ｉ−Ａｂハプロタイプの照射されたＡＰＣの存在下で、ＡｐｏＢ１００でチャレンジした（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）。２４時間のインキュベート後、ＩＬ−２分泌を、培養された細胞の上清において評価した（Ａ＝１５−２クローン；Ｂ＝４８−５クローン；Ｃ＝４５−１クローン；Ｄ＝９７−３ネガティブコントロールクローン）。
【０１５０】
図３において、マウスＩ−Ａｂに対する遮断抗体を加えたときに、すべてのクローンに対するＴ細胞活性化の明確な抑制が見られた。ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＡＰＣを発現するミスマッチのＩ−Ａｄは、抗原特異的なＴ細胞ハイブリドーマにＡｐｏＢ１００を提示し得なかった。したがって、抗原特異的なＴ細胞によるＡｐｏＢ１００タンパク質の認識は、抗原性タンパク質成分が同系のＭＨＣクラスＩＩ分子により提示されることを必要とする。
【０１５１】
ＡｐｏＢ１００に結合しＡｐｏＢ１００とともに共精製される可能性のある脂質の抗原が関係しているかどうかを検証するために、Ｉ−Ａｂを有するがＣＤ１ｄを欠くＡＰＣにより提示されたＡｐｏＢ１００へのＴ細胞の反応、及びＴ細胞に脂質抗原を提示するＭＨＣ様分子を評価した。しかしながら、ＡＰＣにおいてＣＤ１ｄを欠いていてもＴ細胞の反応を減弱させなかった（図４）。同様に、ＭＨＣクラスＩ分子を欠くＩ−Ａｂマウス由来のＡＰＣは、Ｔ細胞ハイブリドーマにＡｐｏＢ１００抗原を提示することができた（図４）。これらの結果は、ＡｐｏＢ１００抗原がＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４＋Ｔ細胞により認識されることを示す。また、本実施例において記載された実験により、ＡｐｏＢ１００への細胞性免疫反応がＣＤ４＋タイプのＴ細胞により増強され、反応するＴ細胞として同様のＭＨＣタイプを有するＡＰＣにおけるＭＨＣクラスＩＩ分子に関与する抗原提示を要することが示唆される。このようなシナリオは、細胞外の空間から取り込まれたペプチド抗原のＴ細胞への古典的な提示に特徴的である。
【０１５２】
（実施例６．天然のＬＤＬ及びＡｐｏＢ１００に反応するＴ細胞は、ＴＲＢＶ３１を発現する）
Ｔ細胞ハイブリドーマのＴＣＲは、再アレンジされた可変ドメインのＲＴ−ＰＣＲ増幅を用いたｍＲＮＡレベルにおいて表される。ＲＮＡ分離及びｃＤＮＡ合成を、実施例１に記載の通り行った。
【０１５３】
作製されたｃＤＮＡを、定常領域Ｃβ３’プライマーとともに適切なＶβファミリー特異的５’プライマー（表２）、又は定常領域Ｃα３’プライマーとともに関連するＶαファミリー特異的５’プライマー（表１）を用いて増幅させた。すべてのプライマーのデザインは、過去に公表されたプライマーに基づいていた（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．，Ｐｏｍｍｉｅ，Ｃ，Ｒｕｉｚ，Ｍ．，Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．，Ｆｏｕｌｑｕｉｅｒ，Ｅ．，Ｔｒｕｏｎｇ，Ｌ．，Ｔｈｏｕｖｅｎｉｎ−Ｃｏｎｔｅｔ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｇ．（２００３）．ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２７，５５−７７）。ＰＣＲ反応のためのマスターミックス（ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）は、ｌ０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，５０ｍＭ  ＫＣＩ，１．５ｍＭ  ＭｇＣＩ２，１ｍＭ  ｄＮＴＰ及び０．２Ｕ／ｍＬ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んでいた。すべてのプライマーを最終濃度０．２μＭで加えた。反応を、９４℃（４０秒間）での変性、５６℃（４０秒間）でのアニーリング、７２℃（１分間）の重合を用いた３５サイクルで行った。ＰＣＲ生成物を１．５％アガロースゲルで分析し、エチジウムブロマイド染色で視覚化した。
【０１５４】
リアルタイムＰＣＲを、ＡＢＩ  ７７００シークエンスデテクター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）において、ＣＤ３及びヒポキサンチン  グアニン  ホスホリボシル  トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）に対するアッセイ−オンデマンド型のプライマー及びプローブを用いて行った。
【０１５５】
定量的なＴＲＢＶ３１発現分析のために、遺伝子型決定プライマーを、ＴＣＲβ鎖の定常領域のヌクレオチド配列（５’−ＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴ−３’、配列番号５３）に基づきデザインされたプローブと組み合わせて用いた。プローブは、ＡＢＩプライマー発現ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）を用いてデザインされ、それは、５’末端に結合された６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）受容体分子（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）で合成された。データを式２−ΔΔＣＴによる相対発現方法に基づき分析した。ここで、ΔΔＣＴは＝ΔＣＴ（サンプル）−ΔＣＴ（カリブレーター＝各グループ内のすべてのサンプルの平均のＣＴ値）であり、ΔＣＴは、ターゲット遺伝子のＣＴから減じたハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）のＣＴである（Ｇｉｕｌｉｅｔｔｉ，Ａ，Ｏｖｅｒｂｅｒｇｈ，Ｌ．，Ｖａｌｃｋｘ，Ｄ．，Ｄｅｃａｌｌｏｎｎｅ，Ｂ．，Ｂｏｕｉｌｌｏｎ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｍａｔｈｉｅｕ，Ｃ．（２００１）．Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｑｕａｎｔｉｆｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ  ２５，３８６−４０１）。結果を表３に要約する。
【０１５６】
【表３】
2013540753.tif 000007
【０１５７】
ハイブリドーマ細胞を産生するために用いられた融合パートナーの胸腺腫ＢＷ５１４７（実施例１を参照）は、再アレンジされたＴＲＡＶ２０及びＴＲＢＶ１２．１可変鎖を発現し、すべてのハイブリドーマはまた、ｍＲＮＡレベルでこれらの鎖を発現していた（表１、２及び３、図５）。天然のヒトＬＤＬ及びＡｐｏＢ１００に特異的なすべてのＴ細胞ハイブリドーマは一様に、ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１（Ｔ細胞受容体ベータ可変３−１を有するＴ細胞）を発現し、他のＶβファミリーはそこでは同定されなかった。反対に、反応するハイブリドーマにおけるＶα鎖の使用は、１５−２、４５−１及び４８−５各々に対して異なるファミリーであるＴＲＡＶ３、４及び１３を含んでいた（表３）。反応しないハイブリドーマに対して、ＶβやＶαのＴＣＲ可変鎖は、拘束されない態様で発現され、ＴＲＢＶ３１を含んでいなかった（データは示さず）。ＬＤＬ反応ハイブリドーマの各々において、ＴＲＢＶ３１  Ｔ細胞受容体鎖の表面発現が、フローサイトメトリー分析により確認された（表３及び図６）。すべての商業的に入手可能なａｎｔｉ−マウスＴＣＲ−Ｖα及びＴＣＲ−Ｖβモノクローナル抗体（ｍＡｂ，ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）は、選択されたＴ細胞ハイブリドーマにおいてＴＣＲ−Ｖα及びＴＣＲ−Ｖβを染色するために用いられた。ＴＣＲ−Ｖ  ｍＡｂを、ＰＥ、ＦＩＴＣ、又はビオチン／ストレプトアビジン−Ｃｙ５に結合させた。これらの抗体との組み合わせで、ａｎｔｉ−ＣＤ３−パシフィックブルー及びａｎｔｉ−ＣＤ４−ＡＰＣを用いた。免疫していないマウス由来の脾臓細胞を、すべての抗体に対するポジティブコントロールとして用いた。細胞を、ＣｙＡｎ（商標名）ＡＤＰフローサイトメトリー（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）において分析した。
【０１５８】
（実施例７．ＴＲＢＶ３１＋Ｔ細胞の枯渇は、ＡｐｏＢ１００への増殖性反応を低減させる）
ＡｐｏＢ１００の認識に対するＴＲＢＶ３１可変鎖の全体の重要性を直接的に検証するために、マウスをＡｐｏＢ１００で免疫してブーストさせ、その後ｉｎ  ｖｉｔｒｏで脾臓由来のＴＲＢＶ３１＋Ｔ細胞の枯渇を起こした。ｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスを、ＡｐｏＢ１００で皮下注射により免疫してブーストさせた。脾臓細胞を採取し、蛍光発色セルソーティング（ＦＡＣＳ）により、脾臓由来のＴＲＢＶ３１＋又はＴＲＢＶ１９＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの枯渇を起こした。６０×１０６の脾臓細胞を２つに分け、各々独立してａｎｔｉ−ＴＲＢＶ３１及びａｎｔｉ−ＴＲＢＶ１９（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）で染色した。ＡｐｏＢ１００を認識するどのハイブリドーマもＴＲＢＶ１９利用を提示しなかったため、ＴＲＢＶ１９をソーティング過程のコントロールとして用いた。驚くべきことに、ＬＤＬ又はＡｐｏＢ１００を認識しないＴＲＡＢＶ１９  ＴＲＡＶ１３．２鎖を発現する、クローン９６．７及び９７．３は、ＨＤＬへの反応性を示した（データを示さず）。細胞を染色後、それらを、ポジティブイベントの枯渇のためにＭｏＦｌｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎセルソーター（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，ドイツ）においてソーティングした。ネガティブな細胞をその後収集し、ＡｐｏＢ１００に対する増殖アッセイにおいて用いた。
【０１５９】
その後、５×１０５のＴＲＢＶ３１＋／ＴＲＢＶ１９−又はＴＲＢＶ１９＋／ＴＲＢＶ３１−の脾臓細胞を、異なる濃度のヒトＡｐｏＢ１００で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでチャレンジした（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）。刺激指標を、実施例２に記載の通り、Ｈ３−チミジン取り込みにより得た。脾臓由来のＴＲＢＶ３１＋Ｔ細胞の枯渇は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）におけるＡｐｏＢ１００抗原への反応の顕著な低減を引き起こし、それは、可変鎖、ＴＲＢＶ１９を発現するＴ細胞が脾臓細胞集団から枯渇されたときに観察された（図７）。したがって、このモデルにおけるＡｐｏＢ１００への細胞性免疫反応のかなりの割合については、ＴＲＢＶ３１＋Ｔ細胞により行われる。
【０１６０】
（実施例８．ＴＲＢＶ３１ペプチドに対する免疫は、ＡｐｏＢ１００のＴ細胞認識を阻害する）
Ｔ細胞のＬＤＬタンパク質への反応を阻害するために、出願人は、ＣＤＲドメインを含むＴＲＢＶ３１由来のペプチドを合成し、ＫＬＨキャリアタンパク質に結合させ、ｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスの免疫のための調製に用いた。この処理により、ＴＲＢＶ３１の配列に特異的な抗体が産生された（図１７Ｂ）。免疫されたマウス由来の循環しているＩｇＧ抗体は、ＬＤＬ反応性のＴＲＢＶ３１＋ハイブリドーマには結合する（図１７Ｃ）が、反応しないＴＲＢＶ３１のネガティブハイブリドーマには結合せず（図１７Ｄ）、ＴＲＢＶ３１ペプチドで免疫されたマウス由来のＩｇＧの添加は、ＡｐｏＢ１００への反応におけるＴ細胞ハイブリドーマの活性化を阻害した（図１７Ｅ）。このように、ＴＲＢＶ３１ペプチによるｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスの免疫は、ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１がＬＤＬタンパク質を認識しないようにする遮断抗体の産生を誘導した。我々は、実験動物の動脈及び脾臓においてＴＲＢＶ３１  ｍＲＮＡのレベルが著しく低減され（図１７Ｆ）、これはＴＣＲに結合する抗体がＴＲＢＶ３１＋Ｔ細胞の拡大を妨害するためかもしれないということを見出した。
【０１６１】
（実施例９．ＴＲＢＶ３１＋ＴＣＲに対する免疫は、アテローム性動脈硬化に効果を奏する）
ＡｐｏＢ１００反応性ＴＲＢＶ３１＋Ｔ細胞集団のアテローム性動脈硬化に対する影響を検証するために、ｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスをＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１に由来するペプチドで免疫した。これらの実験において、１１週齢の雄ｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウス（Ｃ５７ＢＬＩ６，１２９＿Ａｐｏｂｔｍ２Ｓｇｙ  ＬｄｌｒｔｍｌＨｅｒ（Ｓｋａｌｅｎ．Ｋ．，Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｍ．，Ｒｙｄｂｅｒｇ，Ｅ．Ｋ．，Ｈｕｌｔｅｎ，Ｌ．Ｍ．，Ｗｉｋｌｕｎｄ，Ｏ．，Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ，Ｔ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｂｏｒｅｎ，Ｊ．（２００２）．Ｓｕｂｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１７，７５０−７５４）、Ｇｏｔｅｂｏｒｇ大学、Ｊａｎ  Ｂｏｒｅｎ氏より提供）を用いた。これらのマウスでは、２００−４００ｍｇ／ｄＬの血清中コレステロールレベルを３０倍上げられており、高脂肪食餌を与えられると非常に高いレベル（＞２，０００ｍｇ／ｄＬ）となる。マウスを１００μｇのＴＲＢＶ３１ペプチドで皮下注射により免疫した。このＴＲＢＶ３１ペプチドは、ＴＣＲのβ鎖のＣＤＲ２可変領域の部分を含む（アミノ酸残基４５−６２、“ＡＴＧＧＴＬＱＱＬＦＹＳＩＴＶＧＱＶ”、配列番号１）。ペプチドを合成し、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ａｎａｓｐｅｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、米国）に結合させた。
【０１６２】
ＫＬＨは、海産軟体動物のキーホールリンペットから単離された天然のタンパク質であり、ハプテン及びイディオタイプのタンパク質といった他の弱い抗原に対する抗原性の免疫反応をｉｎ  ｖｉｖｏで増強させる免疫原性のキャリアタンパク質である。ＴＲＢＶ３１ペプチド−ＫＬＨ結合体を完全フロイントアジュバントで乳化させ、マウスをＩＦＡで乳化された同様の抗原で４週間後にブーストさせた。コントロール群のマウスを、ペプチドに関する同様のプロトコールを用いて、１００μｇのＫＬＨで皮下注射により免疫した。マウスには、免疫後５日後からＣＯ２で屠殺する１０週間後まで、高脂肪食（０．１５％コレステロール）を与え続けた。加えて、Ｃ５６ＢＬ１６のバックグラウンドにおけるマウス由来の照射された脾臓細胞を、ハイブリドーマ実験において抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いた。すべての実験は、地域倫理委員会により承認された。
【０１６３】
フロイントアジュバント中の、ＣＤＲ２ドメインの部分を示しキャリアタンパク質に結合された、このＴＲＢＶ３１ペプチドによる皮下注射の免疫は、ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３に対する抗体の産生を誘導した（図８Ａ−Ｄ）。ＴＲＢＶ３１に特異的な抗体の力値を、ＥＬＩＳＡにより評価した。端的に言うと、５０μＬのＴＲＢＶ３１ペプチド（ｐＨ７．４のＰＢＳ中、５μｇ／ｍＬ）を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃で一晩、インキュベートした。コーティングされたプレートをＰＢＳで洗い、その後、室温で１時間、ＰＢＳ中、１％ゼラチン（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ、米国）でブロックした。次に、プレートを洗浄し、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）／ゼラチン０．１％で希釈されたマウス血漿でさらに２時間インキュベートした。洗浄後、トータルのＩｇＧ及びＩｇＧアイソタイプを、酵素結合ａｎｔｉ−マウス抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ、米国）を用いて検出した。プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質試薬（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ、米国）を用いて発色反応を行った。マイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ、米国）を用いて、吸光度を測定した。図８Ａは、ＥＬＩＳＡにより測定されたＴＲＢＶ３１ペプチドに対するＩｇＧ抗体の力価を示す。このデータは、免疫がＴＲＢＶ３１に由来するペプチドに対する高い力価の抗体を誘導したことを示す。
【０１６４】
アフィニティー精製した免疫されたマウス由来の循環ＩｇＧ抗体は、ＬＤＬ反応ＴＲＢＶ３１＋ハイブリドーマ（４８−５クローン）を染色し（図８Ｂ）、それは、これらのＩｇＧ抗体がこのような細胞のＴＣＲに結合することを示唆する。ＫＬＨ又はＴＲＢＶ３１免疫マウス由来のトータルのＩｇＧ血漿抗体を、ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いてアフィニティー精製した。１×１０４のハイブリドーマ細胞（クローン４８−５）を４×１０４照射されたＡＰＣの存在下で４０μｇ／ｍＬのＡｐｏＢ１００と培養した。ハイブリドーマの活性化の遮断のために、図８Ｃに示されるように、０．１、１、１０、及び１００μｇ／ｍＬの濃度で、異なる抗体（ＫＬＨ  ＩｇＧ又はＴＲＢＶ３１  ＩｇＧ）を培養の始めに加え、培養の間にわたって存在させた。２４時間のインキュベート後、上清中のＩＬ−２を測定した。図８Ｃにおいて、ＴＲＢＶ３１−ペプチド免疫マウス由来のＩｇＧがＡｐｏＢ１００への反応におけるＴ細胞ハイブリドーマ（４８−５）の活性化を阻害したことが見られ得る。このように、免疫は、ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１の抗原認識を抑制する抗体の産生を引き起こした。ハイブリドーマクローン４８−５は、２００９年１月２２日に受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９８６で、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）にブタペスト条約により寄託された。
【０１６５】
最後に、アテローム性動脈硬化におけるＴＲＢＶ３１＋Ｔ細胞の役割を、ｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスによる実験で検証した。これらの動物を、ＫＬＨキャリアタンパク質に結合されたＴＲＢＶ３１−ペプチドで免疫し、その後単回の注入によりブーストさせた；アテローム硬化性病変を免疫から１０週間後に分析した。ＫＬＨのみで免疫されたマウスをコントロールとして用いた。
【０１６６】
アテローム性動脈硬化におけるＴＲＢＶ３１＋Ｔ細胞の役割の検証試験の間、自然発生したアテローム性動脈硬化を進展させるｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスをＴＲＢＶ３１に対して免疫した。これにより、キャリアタンパク質で免疫したコントロールマウスに比して、大動脈基部における病変サイズが６５％減少した（図１８Ａ）。病変サイズは一様に、病変分布において検出可能な変化を見せることなく、ＴＲＢＶ３１免疫マウスの近位大動脈の横断面において減少した（図１８Ａ）。また、病変を、大動脈弓の調製物の正面像で、脂質病変領域のズダンＩＶ染色後に分析した（図１８Ｂ）。
【０１６７】
ここで、ＴＲＢＶ３１免疫により、病変領域における５７％の減少が見られた。血漿コレステロール、トリグリセリド、ＡｐｏＢ１００レベル、及びリポタンパク質のプロファイルについては、ＬＤＬ及びｏｘＬＤＬへの抗体力価と同様に、変化しなかった（図２０）。病変の免疫組織化学により、マクロファージのレベルが５０％減少し（図１９Ａ）、一方で、Ｔ細胞の浸潤において顕著な効果が見られた（図１９Ｃ）ことが示される。我々は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質Ｉ−Ａの発現低下に付随した、炎症の実質的な低下を観察した（図２０Ｂ）。さらに、ケモカイン、ＣＣＬ２（単球走化性タンパク質−１）に対する大動脈のｍＲＮＡが、ペプチド免疫されたマウスで顕著に減少し、一方で、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）は変化しなかった（図１９Ｄ及びＥ）。要約すると、天然のＡｐｏＢ１００のＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１認識の停止により、血管の炎症が低減され、アテローム性動脈硬化の進展が阻害される。
【０１６８】
屠殺されたマウス由来の血液を、心穿刺により収集した。その後、滅菌ＲＮａｓｅ非含有ＰＢＳを用いて血管かん流を行った。胸部大動脈及び心臓を病変分析のために解剖し、保存した。脾臓の３分の２を細胞実験のために保存し、３分の１を後のＲＮＡ分離のために凍結させた。鼠径部からリンパ節を排出させ、また、腹部大動脈をＲＮＡ分離のために凍結させ保存した。病変分析は、過去に開示された通りに行った（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ，Ａ．，ａｖｅｒｉ，Ｓ．，Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，Ｇ．，Ｂａｒｉｅｔｙ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｇ．．（１９９８）．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｐｏ  Ｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０２，９１０−９１８）。端的に言うと、心臓を大動脈基部の近位１ｍｍから連続的に切開した。ヘマトキシリン／Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色の切片を、イメージＪソフトウェア（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，米国）を用いた病変サイズの評価に用いた。図９Ａにおいて、平均病変サイズを、大動脈基部の１−ｍｍセグメントにわたって、１００Ｉ−ｌｍごとに収集された８セクションを評価した後に決定した。図９Ｂは、各セクションに対して捉えられたイメージ並びに病変及び血管全体の表面積を測定したことを示す。フラクション領域の病変（％）は、病変で占められた横断面の領域と血管全体の横断面の領域との間の比率である。
【０１６９】
ＴＲＢＶ３１−ペプチドによる免疫は、ＫＬＨキャリアタンパク質のみで免疫したコントロールマウスに比して、大動脈基部の病変サイズの劇的かつ高度に顕著な７０％の減少をもたらした（ｐ＜０．０１）ことが見られ得た。
【０１７０】
この効果は、ａｎｔｉ−ＴＲＢＶ３１抗体の誘導とパラレルであったが、ｏｘＬＤＬ、血漿コレステロール又はトリグリセリドレベルに対する抗体の力価には影響していなかった（図１０及び１１）。
【０１７１】
血漿コレステロール及びトリグリセリドを、酵素的比色分析特異的キット（Ｒａｎｄｏｘ  Ｌａｂ．Ｌｔｄ．Ｃｒｕｍｉｎ，英国）により、その使用説明書に従って評価した。
【０１７２】
ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１  ｍＲＮＡを、下記の通り、両方の免疫されたグループの動脈でのリアルタイムＰＣＲにより定量した：ＲＮＡ分離及びｃＤＮＡ合成を前述の通り行った（前述を参照）。リアルタイムＰＣＲを、ＡＢＩ７７００シークエンスデテクター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）において、ＣＤ３及びヒポキサンチン  グアニン  ホスホリボシル  トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）に対するアッセイ−オンデマンド型のプライマー及びプローブを用いて、行った。ＴＲＢＶ３１発現の分析のために、遺伝子決定プライマーを、ＴＣＲ１３鎖の定常領域のヌクレオチド配列（５’−ＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴ−３’、配列番号５４）に基づきデザインされたプローブと組み合わせて用いた。プローブを、ＡＢＩプライマー発現ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）を用いてデザインし、５’末端に結合された６−カルボキシフルオレスセイン（ＦＡＭ）受容体分子（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）を用いて合成した。データを、式２ΔΔＣＴを用いた相対発現方法に基づき分析した（ここで、ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ（サンプル）−ΔＣＴ（カリブレーター＝グループ内のすべてのサンプルの平均ＣＴ値）、ΔＣＴは、ターゲット遺伝子のＣＴから差し引かれたハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）のＣＴである）（Ｇｉｕｌｉｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１７３】
ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１  ｍＲＮＡは、コントロールマウスと同様、免疫されたマウスの大動脈においても存在し（図１０Ｄ）、Ｔ細胞のこの集団は減弱されないが、同種抗原の認識をしないようにされていることが確認された。結論として、ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１の天然ＡｐｏＢ１００タンパク質の認識の中止は、アテローム性動脈硬化を阻害する。
【０１７４】
ｏｘＬＤＬ粒子が強い免疫反応を引き起こすことは明白である（例えば、Ｐａｌｉｎｓｋｉ，Ｗ．，Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ，Ｓ．，Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｅ．，Ｂｕｔｌｅｒ，Ｓ．Ｗ．，Ｓｏｃｈｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ，Ｓ．，Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｌ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｗｉｔｚｔｕｍ，Ｊ．Ｌ．  （１９９０）．Ａｎｔｉｓｅｒａ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １０，３２５−３３５  ａｎｄ  Ｚｈｏｕ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ  ２１：１０８−１１４，２００１を参照）。Ｔ細胞依存的な抗体は、ＡｐｏＢにおいてアルデヒド付加物へと形成され、ＡＰＣ−Ｔ細胞培養物のｏｘＬＤＬへの暴露は、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を引き起こし得るため、Ｔ細胞は、天然のアポリポタンパク質の酸化により誘導されたＡｐｏＢ１００においてエピトープを認識すると仮定されてきた。その代わりに、本発明は、ｏｘＬＤＬで免疫されたマウス由来のＴ細胞が天然のＬＤＬにおけるモチーフを選択的に認識することを示す。これらのエピトープは、天然のＡｐｏＢ１００タンパク質の成分であり、その免疫反応性は、ＬＤＬ粒子の酸化的修飾により高められるよりもむしろ消滅される。
【０１７５】
本知見において特定されたＬＤＬへの細胞性免疫反応は、ＣＤ４＋Ｔ細胞により増強され、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性を示した。精製されたＡｐｏＢ１００タンパク質が完全なＬＤＬ粒子と同様の反応を誘発したという事実は、抗原提示細胞におけるＡｐｏＢの細胞内プロセシングが、ペプチド−ＭＨＣ複合体としてＴ細胞により認識されたオリゴペプチドエピトープを産生したことを強く示唆する。Ｉ−ＡｂがＴ細胞反応に必須であり、他のＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｉ−Ａｄによって置換され得るという事実はさらに、ＭＨＣに結合する特異的なオリゴヌクレオチドが、クロノタイプのＴＣＲが相互作用し得るリガンドを構成しているという考えを支持する。
【０１７６】
ＡＰＣがＡｐｏＢ１００エピトープを提示する高い能力を有するため、ＬＤＬに対する自己免疫的反応の著しいリスクが存在する。この種の全身性の反応は、ＬＤＬが循環システム全体及びすべての臓器に存在するために、明らかに有害であり得る。Ｔ細胞クローンに反応するすべてのＡｐｏＢ１００は、早期に胸腺において消失されると過去に仮定されており、すなわち、自己免疫は中枢性トレランスにより回避される。現在のデータは、この可能性を排除している。Ｔ細胞に反応するＬＤＬは、ｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスにおいて存在していることが明確に立証された。これらの知見に従って、免疫システムが多くの末梢の抗原に対してまったく耐性化し得ないこと、及び自己反応的なＴ細胞の存在それ自体が健康な個体において自己免疫の危険性をもたらし得ないことが示唆されてきた。それゆえ、ＡｐｏＢ１００−反応性Ｔリンパ球はおそらく末梢細胞の範囲の一部である。
【０１７７】
自己反応性が早期に中枢性トレランスにより完全に排除されるわけではない場合、自己免疫反応は末梢性トレランスのメカニズムにより回避されなければならない。それらは、例えば、Ｍ２マクロファージ及び制御性Ｔ細胞といった免疫制御性サイトカインを分泌する細胞により、自己反応性の活性抑制に依存する。さらに、肝臓で合成されたタンパク質は、選択的に寛容原性の免疫を誘導することが報告されてきた。ＡｐｏＢ１００は肝臓で生成されるため、通常の環境下では自己免疫アタックを免れ得る。しかしながら、Ｔｈ１エフェクター細胞の活性化に好適な環境下での動脈壁における集積は、耐性のブレイク及びＡｐｏＢ１００成分への免疫反応の誘導をもたらし得る。
【０１７８】
現在のデータは、疾患プロセスへの前アテローム形成寄与因子（ｐｒｏａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒｓ）として、ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１を有し、ＬＤＬの天然のＡｐｏＢ１００タンパク質を認識するＣＤ４＋Ｔ細胞を指摘する。しかしながら、それらは、他の抗原及び免疫細胞の関与を除外していない。したがって、所定のタイプのＬＤＬの修飾が粒子に対して自己免疫反応を引き起こすことは除外され得ない。ｉｎ  ｖｉｖｏで粒子において引き起こされる酸化的変化は、銅といった金属イオンにより引き起こされるそれとは異なり得る。さらに、ハイブリドーマのストラテジーは、細胞のほんの一部における詳細な情報を提供し、ある反応性は分析されたハイブリドーマの範囲では示されないかもしれない。最後に、現在のストラテジーは、エンドサイトーシスのＭＨＣクラスＩＩ拘束性のＣＤ４＋Ｔ細胞への経路を介してプロフェッショナルなＡＰＣにより提示された抗原に焦点をあてていた。ＬＤＬの免疫反応性への付加的な重要な寄与因子は、ＣＤ１を介して提示される脂質抗原を認識するＮＴＫ細胞、ＭＨＣクラスＩ拘束性抗原を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＢ細胞に起因し得る。
【０１７９】
アテローム性動脈硬化を起こしやすいｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスのＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１に対する免疫は、アテローム性動脈硬化の免疫病理学に重要な洞察をもたらした。高度免疫の血清から分離した抗体は、ＡｐｏＢ１００に応えてＴ細胞の活性化を遮断し、フローサイトメトリーによるＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１＋細胞の消滅は、脾臓細胞培養物におけるＴ細胞のＡｐｏＢ１００への反応を鈍らせる。しかしながら、該免疫ストラテジーにより誘導された抗体は、ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１＋Ｔ細胞による抗原認識を遮断したが、大動脈由来のそれらを排除しなかった。
【０１８０】
ａｎｔｉ−ＴＲＢＶ３１抗体遮断の誘導は、ｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化の７０％低減に関係していた。低減の強度は、同様のモデル（Ｕｒｂａｎ，Ｒ．Ｇ．，Ｃｈｉｃｚ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ．Ｊ．Ｌ．（１９９４）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｃｈａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ＨＬＡ−ＤＲ  １  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｔ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｐＨ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８０，７５１−７５５；Ｆｒｅｉｇａｎｇ，Ｓ．，Ｈｏｒｋｋｏ，Ｓ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．，Ｗｉｔｚｔｕｍ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｐａｌｉｎｓｋｉ，Ｗ．（１９９８）．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｄ  ｎａｔｉｖｅ  ＬＤＬ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｔｉｔｅｒｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅｓ．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ  １８，１９７２−１９８２）でのＬＤＬ調製物による免疫で得られたのよりもさらに良好であり、それゆえ、ＡｐｏＢ１００エピトープを認識する一部のＴ細胞がアテローム性動脈硬化の進展において重要な役割を果たしていることを強く示唆する。ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１は、免疫後、大動脈から消失しなかったため、ＭＨＣ抗原複合体の認識の遮断は、疾患プロセスを阻害するのに十分であり得る。
【０１８１】
ｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−モデルの使用は、アテローム性動脈硬化における細胞性自己免疫反応を調査するための明確に定義されたヒトＬＤＬ調製物の使用を可能にした。
【０１８２】
ｏｘＬＤＬのＴ細胞認識の上述の例に従えば、ｏｘＬＤＬで免疫されたマウス由来のＴ細胞ハイブリドーマが作製され、マウスは導入遺伝子（ｈｕＢ１００ｔ９）としてヒトＡｐｏＢ１００を有している。これらのマウスは、高いレベルのＡｐｏＢ１００を産生し、また、天然のヒトＬＤＬに耐性を有することが期待される。
【０１８３】
ゆえに、前述の実施例で例示された実験は、驚くべきことに、ｏｘＬＤＬで免疫されたマウス由来のＴ細胞ハイブリドーマを有し、導入遺伝子（ｈｕＢ１００ｔ９）としてヒトＡｐｏＢ１００を有しているマウスにおいて、天然のＬＤＬ及び精製されたＡｐｏＢ１００に対するＴ細胞の反応が見られ、一方で、ＬＤＬの酸化がこれらの反応を鈍らせたことを示す。反応するＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４＋細胞であり、ＴＲＢＶ３１タイプの可変１３ドメインを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現した。ＴＲＢＶ３１＋Ｔ細胞の排除は、ＡｐｏＢ１００への細胞性免疫反応を弱め、ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１に由来するペプチドに対する高コレステロール血症マウスの免疫は、アテローム性動脈硬化の進展を阻害した。
【０１８４】
これらの結果は、天然のＬＤＬ由来のタンパク質エピトープを認識する自己免疫Ｔ細胞がアテローム性動脈硬化を促進することを強く示唆する。
【０１８５】
（実施例１０．天然の低比重リポタンパク質へのＴ細胞の反応の阻害及びアテローム性動脈硬化に対する関連する効果）
天然のＬＤＬへのＴ細胞の反応の阻害及びアテローム性動脈硬化に対する関連する効果を示す付加的なデータ及び実験は、米国仮出願第６１／３８５，５４８号のＡｐｐｅｎｄｉｘ  Ａとして封入されたＨｅｒｍａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌ  ｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｎａｔｉｖｅ  ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１０  ２０７：１０８１−１０９３（２０１０年３月３日公表、ｄｏｉ：ｌ０．１０８４／ｊｅｍ  ２００９２２４３）の文献において示される（本開示の不可欠な部分を形成し、全体において参照により本明細書に取り込まれる）。
【０１８６】
当業者は、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ａの実験に基づき、本開示を考慮して、Ｔ細胞反応を阻害し、及び／又はアテローム性動脈硬化に治療効果をもたらすのに適する、例えばタンパク質又はそのフラグメント及び／若しくはその誘導体を阻害する、さらなる免疫剤を特定することができる。
【０１８７】
具体的には、本開示において記載される、より具体的には米国仮出願第６１／３８５，５４８号のＡｐｐｅｎｄｉｘ  Ａにおいて記載されるアッセイ及び実験は、ペプチド／フラグメント及び抗体、又はそれらの誘導体といった剤の機能を試験するための典型的な方法を提供する。
【０１８８】
（実施例１１．ＴＲＢＶ３１、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２及び／又はＴＲＡＶ４の配列）
ハイブリドーマ１５−２、４８−５及び４５−１由来のＴＣＲベータ可変３１及びＴＣＲアルファ可変１４、１２及び４の配列が決定され、配列は、下述の表４に示される。
【０１８９】
【表４−１】
2013540753.tif 000008
【０１９０】
【表４−２】
2013540753.tif 000009
【０１９１】
【表４−３】
2013540753.tif 000010
【０１９２】
【表４−４】
2013540753.tif 000011
【０１９３】
【表４−５】
2013540753.tif 000012
【０１９４】
【表４−６】
2013540753.tif 000013
【０１９５】
【表４−７】
2013540753.tif 000014
【０１９６】
【表４−８】
2013540753.tif 000015
【０１９７】
【表４−９】
2013540753.tif 000016
【０１９８】
反応性のハイブリドーマクローンにおける上述のＴＲＡＶ及びＴＲＢＶ配列の発現は、前述の表３で報告される。反応性クローン由来のｃＤＮＡを、定常領域Ｃβ３’プライマーと適切なＶβ−特異的５’プライマー、又は定常領域Ｃα３’プライマーと関連するＶβ−特異的５’プライマーを用いたＰＣＲにより増幅した（表１及び２）。
【０１９９】
ＴＲＢＶ３０の配列はまた、当業者により認識され得、例えば下述の表５に示される配列を含む。
【０２００】
【表５】
2013540753.tif 000017
【０２０１】
上述の配列に関連するさらなるデータが、本出願及びＰＣＴ／ＳＥ２０１０／０５０２９９の図１−６において見出され得る（全体において参照により本明細書に取り込まれる）。
【０２０２】
当業者は、本開示を考慮して、Ｔ細胞反応を阻害し、及び／又はアテローム性動脈硬化に治療効果をもたらすのに適する、例えばタンパク質又はそのフラグメント及び／若しくはその誘導体を阻害する、さらなる免疫剤を特定することができる。具体的には、さらなる剤は、ＴＲＢＶ３１、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１２及びＴＲＡＶ４に対して本明細書に詳細に記載されるハイブリドーマの一つを用いて認識可能である。
【０２０３】
（実施例１２．ＴＣＲトランスジェニック（ＴＲＢＶ３１＋ＴＲＡＶ１２＋）マウス由来の脾臓細胞はヒトＡｐｏＢ１００に反応する）
ＴＣＲ鎖をコードするＤＮＡを、発現ベクターにサブクローニングし、トランスジェニックマウスを作製するために用いた（Ｈｏｉｓｔ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ，１，４０６．２００６）。ＴＣＲトランスジェニックマウス由来の脾臓細胞の刺激は、ＴＣＲ  ＴＲＢＶ３１を有するＴ細胞が強くヒトＡｐｏＢ１００に反応することを示す。
【０２０４】
本明細書において、ＴＲＢＶ３１＋ＴＲＡＶ１２＋細胞で行われた典型的な実施例が報告される。
【０２０５】
３匹のＴＣＲトランスジェニックマウス（マウス＃４、３１及び３３）由来又はコントロールの野生型マウス由来の脾臓細胞を、ヒトＡｐｏＢ１００（１０μｇ／ｍＬ）と培養した。７２時間後、上清をＥＬＩＳＡによるＩＦＮγ評価のために保存し、残りの培養液を増殖の決定のために１μＣｉ（３Ｈ−チミジン）でパルスした。結果を図２１に示し、結果を各マウスのデュプリケートのウェルの結果の平均±ＳＥＭとして表す。
【０２０６】
具体的には、図２１Ａにおいて、ＴＲＢＶ３１＋ＴＲＡＶ１２＋細胞は、同族抗原のヒトＡｐｏＢ１００の認識により高レベルの前炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）のサイトカインであるＩＦＮγを分泌することが示される。図２１Ａで示される結果に一致して、図２１Ｂにおいて、これらの細胞が高速に増殖することも示される。
【０２０７】
トランスジェニックマウスの生殖細胞系列を有する、トランスジェニックＴ細胞受容体がこの反応性を示すという事実は、Ｔ細胞受容体がヒトＬＤＬタンパク質を認識することを裏付ける。具体的には、本明細書において示されるトランスジェニックマウスのデータは、ＴＲＢＶ３１／ＴＲＡＶ１２がＬＤＬのＡｐｏＢ１００タンパク質に特異的であるということを裏付ける。
【０２０８】
当業者は、本開示を考慮して、本明細書に記載された、具体的にはＴＲＢＶ３１、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ１２及びＴＲＡＶ１４に関連する化合物、並びにＴ細胞反応の阻害に関連し、及び／又はアテローム性動脈硬化に治療効果をもたらす、ハイブリドーマにおいて記載された付加的な化合物のさらなる効果を特定することができる。
【０２０９】
要約すると、いくつかの実施態様において、修飾されたＬＤＬに対するＴ細胞の反応を、ｏｘＬＤＬでマウスを免疫することで検証した。Ｔ細胞ハイブリドーマは、このようなマウスで確立され、酸化された又は天然の形態のＬＤＬへの反応性について分析した。反応性クローンは、酸化されたＬＤＬには反応しなかったが、天然のＬＤＬ及び精製されたアポリポタンパク質Ｂ−１００には反応した。反応するハイブリドーマは、ＣＤ３＋４＋８−であり、ＭＨＣクラスＩＩ抗原Ｉ−Ａｂにより拘束され、異なるＶアルファ鎖との組み合わせで単一のＴ細胞受容体可変（Ｖ）ベータ鎖（ＴＲＢＶ３１）を発現していた。ＴＲＢＶ３１に対するｈｕＢ１００ｔｇ×Ｌｄｌｒ−／−マウスの免疫により、アテローム性動脈硬化が低減され、それは、Ｔ細胞のＡｐｏＢ１００認識を遮断するａｎｔｉ−ＴＲＢＶ３抗体の進展とパラレルであった。
【０２１０】
前述で記載された実施例は、本開示の組成物、ペプチド、タンパク質、方法及びシステムの実施態様をどのように作り用いるかについての完全な開示及び説明を本技術分野における当業者に示すために提供され、本発明者らが本開示としてみなす範囲に限定されることを意図するものではない。本技術分野における当業者に明白である、本開示を実施するための上述の形態の変形が、下記の特許請求の範囲の範囲内に含まれるよう意図される。本明細書において説明されたすべての特許及び公表物は、本開示が関係する本技術分野における当業者のスキルのレベルを示す。本開示に引用されたすべての参照は、各参照が個別に全体において参照により取り込まれたように、同程度に参照により取り込まれる。さらに、ともに提出される配列表の紙のコピー及び関連するコンピューター読み出し可能な形態は、両方と、全体において参照により本明細書に取り込まれる。
【０２１１】
背景技術、発明の解決しようとする課題、発明を実施するための形態及び実施例において引用された各文献の全体の開示（特許、特許出願、学術文献、アブストラクト、実験マニュアル、書籍又は他の開示）は、参照により本明細書に取り込まれる。この開示に引用されたすべての参照は、各参照が各々全体において参照により取り込まれたのと同様に、参照により取り込まれる。しかしながら、引用された参照と本開示との間に何らかの矛盾が生じた場合には、本開示が優先される。
【０２１２】
本明細書において用いられた用語及び表現は、明細書の用語として用いられ、限定されることはなく、示された及び記載された特徴の同等物又はその一部を排除する用語及び表現の使用の意図はない。しかし、種々の変形がクレームされた開示の範囲内において可能であると認識される。したがって、本開示は好ましい実施態様により特に開示されているものの、本明細書において開示された典型的な実施例、任意の特徴、コンセプトの変形及びバリエーションが本技術分野における当業者によって見出され、このような変形及びバリエーションが添付された特許請求の範囲により規定される通りの本開示の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。
【０２１３】
また、本明細書で用いられる専門用語は、具体的な実施態様を記載する目的で用いられ、これに限定される意図はないことが理解されるべきである。本明細書及び添付された特許請求の範囲において用いられるように、単数形の用語“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、特に明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。用語“複数”は、特に明確な指示がない限り、２又は３以上の指示対象を含む。他に規定されない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。
【０２１４】
本明細書においてマーカッシュグループ又は他のグルーピングが用いられる場合、グループのすべての個々のメンバー、並びにグループのすべてのコンビネーション及び可能性のあるサブコンビネーションは、本開示において個別に含められるように意図される。本明細書において記載又は例示される成分又はマテリアルの各々のコンビネーションは、他に説明のない限り、本開示を実施するために用いられ得る。本技術分野における当業者は、特に例示されたもの以外の方法、装置要素、及びマテリアルが過度な実験をすることなく本開示の実施において用いられ得ることを認識する。方法、装置要素、及びマテリアルといったすべての技術的に公知の機能的同等物が、本開示において含められるように意図される。例えば、温度の範囲、頻度の範囲、時間の範囲、又は組成物の範囲といった、範囲が本明細書において与えられる場合は、与えられる範囲に含まれる値と同様に、すべての中間の範囲及びすべての部分的な範囲も本開示に含められることが意図される。本明細書に記載される範囲又はグループのいかなる１又は２以上の個々のメンバーも、本開示の特許請求の範囲から除外され得ない。本明細書において図示された開示は、本明細書において特には開示されないいかなる要素（ｅｌｅｍｅｎｔ  ｏｒ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）、制限（ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ）無しに適切に実施され得る。
【０２１５】
本開示のいくつかの実施態様が、記載されている。本明細書において提供された特定の実施態様は、本開示の有用な実施態様の例であり、本開示は本明細書に記載された装置、装置要素、方法の工程の多くのバリエーションを用いて実際され得ることが本技術分野の当業者に明らかである。本技術分野の当業者に明らかであるように、本方法に有用な方法及び装置は、多くの任意の組成物並びに処理要素及び工程を含み得る。
【０２１６】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年９月２２日に出願された米国仮出願第６１／３８５，５４８号（タイトル“Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ”）に基づく優先権を主張しており、この出願の内容は参照として本明細書に含まれる。本出願はまた、２０１１年９月１６日に出願された米国出願第Ｓ／Ｎ  １３／２５７，０４５号（タイトル“Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ”）の一部継続出願であり、その出願に基づく優先権を主張している（それは、２０１０年３月１７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＳＥ２０１０／０５０２９９の米国の国内段階（タイトル“Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ”）であり、２００９年３月１７日に出願されたスウェーデン特許出願第０９５０１６１  −０号（タイトル“Ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”、受領番号２１０４２２２６）に基づく優先権を主張している）（各出願の内容は参照として本明細書に含まれる）。
【図１】
2013540753.tif 000018
【図２】
2013540753.tif 000019
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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