(57)【要約】場合によっては患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子型に基づき、例えばオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤及びスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストを含む抗癌腫併用療法など、ポリアミン阻害物質による化学的予防法に対する補助的なストラテジーとして、いくつかの局面において、外因性ポリアミンを調節することが利用され得る。例えばオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤と全体的な細胞ポリアミン含量を減少させるためのポリアミン経路を調節する薬剤とを含む抗癌腫併用療法の有効性を予測するために、いくつかの局面において、組織ポリアミンレベル又は組織ポリアミン流入を評価することが使用され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤と、全体的な細胞ポリアミン含量を減少させるためのポリアミン経路を調節する薬剤と、を含む抗癌腫併用療法の有効性を予測するための方法であって、該併用療法で治療しようとする患者における組織ポリアミンレベル又は組織ポリアミン流入を評価することを含み、高組織ポリアミンレベル又は流入が、該治療の有効性が低いことを予測する、方法。
【請求項２】
全体的な細胞ポリアミン含量を減少させるためのポリアミン経路を調節する薬剤が、スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織ポリアミンレベル又は組織ポリアミン流入が、直腸粘膜組織、前立腺組織又は尿から決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織ポリアミンレベル又は組織ポリアミン流入が高くない場合に、前記併用療法で前記患者を治療することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記併用療法の前又は開始時に前記患者を低ポリアミン食に供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一方のＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルの位置＋３１６で前記患者の遺伝子型を調べる試験の結果を得ることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記結果が、前記遺伝子型を含有するレポートを受け取るか又は該遺伝子型を明らかにする患者病歴を取得することにより得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試験が、前記患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の一方のアレルで位置＋３１６のヌクレオチド塩基を決定する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記試験が、前記患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両アレルで位置＋３１６のヌクレオチド塩基を決定する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤が、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）である、請求項１から請求項９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストが、アスピリン非含有非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である、請求項２から請求項１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが、選択的ＣＯＸ−２阻害剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが、スリンダク又はセレコキシブである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが、スリンダクである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが、セレコキシブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤及びスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストを含む抗癌腫併用療法の有効性を予測するための方法であって、該併用療法で治療しようとする患者による食事性ポリアミン摂取を評価することを含み、高レベルの食事性ポリアミン摂取が、該治療の有効性が低いことを予測する、方法。
【請求項１７】
全体的な細胞ポリアミン含量を減少させるためのポリアミン経路を調節する薬剤が、スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記食事性ポリアミンレベルが患者食事歴から判定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
高食事性ポリアミンレベルが３００μｍｏｌポリアミン／日以上として定義される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記食事性ポリアミンレベルが高くない場合、前記併用療法で前記患者を治療することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記併用療法開始前又は開始時に低ポリアミン食に前記患者を供することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つのＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルの位置＋３１６で前期患者の遺伝子型を決定する試験の結果を得ることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記結果が、前記遺伝子型を含有する報告を受け取るか又は該遺伝子型を明らかにする患者病歴を取得することにより得られる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記試験が、前記患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の一方のアレルで位置＋３１６のヌクレオチド塩基を決定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記試験が、前記患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両アレルで位置＋３１６のヌクレオチド塩基を決定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤がα−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）である、請求項１６から請求項２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストがアスピリン非含有非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である、請求項１７から請求項２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが、選択的ＣＯＸ−２阻害剤である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが、スリンダク又はセレコキシブである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが、スリンダクである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが、セレコキシブである、請求項２９に記載の方法。２７．
【請求項３２】
ａ）患者による食事性ポリアミン摂取及び／又は該患者における組織ポリアミンレベルもしくは流入を評価することと、
ｂ）オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤と、全体的な細胞ポリアミン含量又は流入を減少させるためのポリアミン経路を調節する薬剤と、の併用有効量を該患者に投与することと、
を含む、癌腫のある患者を治療するための方法。
【請求項３３】
全体的な細胞ポリアミン含量を減少させるための前記ポリアミン経路を調節する薬剤が、スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記食事性ポリアミンレベルが患者食事歴から判定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
高食事性ポリアミンレベルが３００μｍｏｌポリアミン／日以上として定義される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記組織ポリアミンレベル又は流入が、直腸粘膜組織、前立腺組織又は尿から決定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記併用療法開始前又は開始時に前記患者を低ポリアミン食に供することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも一方のＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルの位置＋３１６で前記患者の遺伝子型を決定する試験の結果を得ることをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記結果が、前記遺伝子型を含有する報告を受け取るか又は該遺伝子型を明らかにする患者病歴を取得することにより得られる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記試験が、前記患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の一方のアレルで位置＋３１６のヌクレオチド塩基を決定する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記試験が、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両アレルで位置＋３１６のヌクレオチド塩基を決定する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤がα−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）である、請求項３２から請求項４１の何れか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストがアスピリン非含有非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である、請求項３３から請求項４２の何れか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが、選択的ＣＯＸ−２阻害剤である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが、スリンダク又はセレコキシブである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが、スリンダクである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが、セレコキシブである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
ＤＦＭＯが全身的に投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
スリンダク又はセレコキシブが全身的に投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＤＦＭＯ又は前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが、経口、動脈内又は静脈内投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＤＦＭＯが経口投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＤＦＭＯの有効量が５００ｍｇ／日である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＤＦＭＯが静脈内投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
ＤＦＭＯの有効量が約０．０５から約５．０ｇ／ｍ２／日である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＤＦＭＯ及び前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが経口投与用に製剤化される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＤＦＭＯ及び前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが硬もしくは軟カプセル又は錠剤として製剤化される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＤＦＭＯ及び前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが１２時間ごとに投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＤＦＭＯ及び前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤが２４時間ごとに投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
スリンダクの有効量が約１０から約１５００ｍｇ／日である、請求項４６に記載の方法。
【請求項６０】
スリンダクの有効量が約１０から約４００ｍｇ／日である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
スリンダクの有効量が１５０ｍｇ／日である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
ＤＦＭＯがスリンダクの前に投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６３】
ＤＦＭＯがスリンダクの後に投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６４】
ＤＦＭＯがスリンダクの前及び後に投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６５】
ＤＦＭＯがスリンダクと同時に投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６６】
ＤＦＭＯが少なくとも２回目に投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６７】
スリンダクが少なくとも２回目に投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６８】
前記患者が固形腫瘍を有し、前記方法が該固形腫瘍の切除をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項６９】
ＤＦＭＯ及びスリンダクが前記切除の前に投与される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
ＤＦＭＯ及びスリンダクが前記切除の後に投与される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記癌腫が、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、脳腫瘍、肺癌、胃癌、血液癌、皮膚癌、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌又は食道癌、子宮頸癌、頭頸部癌、非メラノーマ皮膚癌、神経芽細胞腫及び膠芽細胞腫である、請求項１から請求項７０の何れか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記癌腫が結腸直腸癌である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記結腸直腸癌がステージＩである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記結腸直腸癌がステージＩＩである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記結腸直腸癌がステージＩＩＩである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記結腸直腸癌がステージＩＶである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
ａ）患者による食事性ポリアミン摂取及び／又は該患者における組織ポリアミンレベルを評価することと、
ｂ）オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤とスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストとの併用有効量を該患者に投与することと、を含む、以前に癌腫と診断されたことがある患者の再発を予防するための方法。
【請求項７８】
前記患者が、癌腫瘍の外科的切除を以前に受けたことがある、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
ａ）患者による食事性ポリアミン摂取及び／又は該患者における組織ポリアミンレベルを評価することと、
ｂ）オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤とスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストとの併用有効量を該患者に投与することと、
を含む、患者における癌腫瘍を切除可能にする方法。
【請求項８０】
段階ｂ）の後に、前記患者から前記腫瘍を切除することをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
ａ）患者による食事性ポリアミン摂取、該患者における組織ポリアミンレベル又は組織ポリアミン流入を評価することと、
ｂ）オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤とスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストとの併用有効量を該患者に投与することと、
を含む、癌腫の家族歴を有する患者において癌腫を予防するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その全体において参照により内容全体が本明細書中に組み込まれる、２０１０年５月１４日出願の米国仮出願第６１／３４５，０４８号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ及びＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの契約番号ＮＯ１−ＣＮ７５０１９及び助成金ＣＡ５９０２４、ＣＡ８８０７８、ＣＡ４７３９６、ＣＡ７２００８及びＣＡ９５０６０のもと、政府からの援助を受けてなされた。政府は本発明においてある一定の権利を有する。
【０００３】
Ｉ．発明の分野
本発明は、全般的に、癌生物学及び医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、癌腫及びそのリスク因子の診断、予防及び治療のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
結腸直腸癌及び他の癌腫を治療及び予防するためのより有効な方法が今もなお必要とされている。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによると、２００９年、米国でおよそ１４７，０００例の新規症例があり、結腸癌による死亡は５０，０００例にのぼった。現在の治療プロトコール、特に結腸癌及びポリープに対するプロトコールには、腫瘍切除、化学療法及び放射線療法が含まれる。
【０００５】
結腸直腸腫瘍形成を説明するキーメカニズムを理解することによって、結腸直腸癌予防に対する新しいアプローチの開発が促進されよう。実験的及び疫学的研究を受け入れることによって、食事及び栄養要因が、正常上皮の明らかな癌腫への形質転換を調節することにおいて重要な因子であることが示される。抗腫瘍活性のある食品成分を同定し、それらの作用機序を調べることによって、特に結腸内で、癌予防が顕著に促進され得る。Ｌｉｎｓａｌａｔａ  Ｍ，Ｒｕｓｓｏ  Ｆ：Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ２４：３８２−９，２００８。
【０００６】
ポリアミンは、生きている全ての細胞で見られる有機陽イオンである。Ｗａｌｌａｃｅ  ＨＭ：Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  ｈｅａｌｔｈ．Ｐｒｏｃ  Ｎｕｔｒ  Ｓｏｃ  ５５：４１９−３１，１９９６。これらは、律速酵素オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）によりアルギニン由来生成物、オルニチンから内因的に合成される。Ｇｅｒｎｅｒ  ＥＷ，Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ＦＬ，Ｊｒ．：Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ：ｏｌｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｎｅｗ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ４：７８１−９２，２００４。オルニチンはＯＤＣによりプトレッシンに変換され、これがＳＳＡＴ（スペルミンスペルミジンアセチルトランスフェラーゼ）によりスペルミン及びスペルミジンへと連続的に変換され；これらの３種類の分子は相互交換可能である。ポリアミンと癌との間の関連は、数十年にわたり立証されてきた。結腸直腸癌腫形成に関与する、詳細に報告されている一連の生化学的、遺伝学的及び疫学的変化に加えて、上皮ポリアミン含量上昇はＣＲＣ癌腫形成と一貫して関連付けられてきた。Ｇｅｒｎｅｒ  ＥＷ，Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ＦＬ，Ｊｒ．：Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ：ｏｌｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｎｅｗ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ４：７８１−９２，２００４；Ｆｅａｒｏｎ  ＥＲ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ：Ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  ６１：７５９−６７，１９９０；Ｊａｓｓ  ＪＲ，Ｗｈｉｔｅｈａｌｌ  ＶＬ，Ｙｏｕｎｇ  Ｊら：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２３：８６２−７６，２００２。直腸粘膜におけるＯＤＣの過剰発現は、結腸直腸癌リスクと関連付けられており、ＣＲＣにおける増殖の生化学的マーカーとなる可能性があることが分かっている。Ｗａｎｇ  Ｗ，Ｌｉｕ  ＬＱ，Ｈｉｇｕｃｈｉ  ＣＭ：Ｍｕｃｏｓａｌ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６３：２５２−７，１９９６；ＭｃＧａｒｒｉｔｙ  ＴＪ，Ｐｅｉｆｆｅｒ  ＬＰ，Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ  ＭＪら：Ｃｏｌｏｎｉｃ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｉｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ａｄｅｎｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ６６：１５３９−４３，１９９０；Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ  Ｊ，Ｌｏｒｄ  ＲＶ，Ｄａｎｅｎｂｅｒｇ  ＫＤら：Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｓｕｒｇ  ５：１７４−８１；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １８２，２００１。ポリアミンは、転写及び転写後プロセスを通じて癌遺伝子発現及び機能を制御することが報告されている。Ｔａｂｉｂ  Ａ，Ｂａｃｈｒａｃｈ  Ｕ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３１：１２８９−９５，１９９９；Ｂａｃｈｒａｃｈ  Ｕ，Ｗａｎｇ  ＹＣ，Ｔａｂｉｂ  Ａ：Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ：ｎｅｗ  ｃｕｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｎｅｗｓ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃｉ  １６：１０６−９，２００１。ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ、エフロルニチン）は、ＯＤＣを不可逆的に阻害し、その結果、ポリアミン合成が低下する。ＤＦＭＯは、動物モデルにおいて癌の発現を抑制するポリアミン代謝阻害剤の中で広く研究が行われている例である。Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ＦＬ，Ｊｒ．，Ｇｅｒｎｅｒ  ＥＷ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ（ＤＦＭＯ）ａｓ  ａ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５：９４５−５１，１９９９。ＮＳＡＩＤスリンダクと一緒に、ヒト臨床試験において、近年ＤＦＭＯが異時性結腸直腸腺腫の発生率を低下させることが示された。Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ＦＬ，ＭｃＬａｒｅｎ  Ｃ．Ｅ．，Ｐｅｌｏｔ  Ｄ．，Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｓ．ら：Ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｐｌｕｓ  ｓｕｌｉｎｄａｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｍａｓ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｔｒｉａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １：３２−３８，２００８。
【０００７】
内因性ポリアミン生成に加えて、食事性ポリアミン及び腸内微生物によるそれらの代謝は、全身ポリアミンプールの主要な決定因子であることが分かっている。Ｚｏｕｍａｓ−Ｍｏｒｓｅ  Ｃ，Ｒｏｃｋ  ＣＬ，Ｑｕｉｎｔａｎａ  ＥＬら．：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｉｎｔａｋｅ．Ｊ  Ａｍ  Ｄｉｅｔ  Ａｓｓｏｃ  １０７：１０２４−７，２００７。重要な食事性ポリアミンとしては、スペルミン、スペルミジン及びプトレッシンが挙げられる。ポリアミン吸収は胃腸で起こり、様々な形態のポリアミンが厳しいＯＤＣ制御下で組織において代謝される。Ｔｈｏｍａｓ  Ｔ，Ｔｈｏｍａｓ  ＴＪ：Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７：１１３−２６，２００３。食事性ポリアミンに関する広範な証拠にもかかわらず、食事性ポリアミンがヒトにおいて組織ポリアミン又は腺腫形成に影響を与えるか否かは分かっていない。食事性ポリアミン摂取が癌リスク因子に影響を及ぼし得るか否か及びどのように影響を及ぼすかならびに予防的及び治療的処置プロトコールにそれが組み入れられるか否か又はどのように組み入れられるかを決定することは大きな進歩となろう。
【発明の概要】
【０００８】
ある局面において、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤と、全体的な細胞ポリアミン含量を減少させるためのポリアミン経路を調節する薬剤と、を含む抗癌腫併用療法の有効性を予測するための方法であって、この併用療法で治療しようとする患者における組織ポリアミンレベル又は組織ポリアミン流入を評価することを含み、高組織ポリアミンレベル又は流入によって、治療の有効性が低いことが予測される、方法が提供される。
【０００９】
いくつかの実施態様において、全体的な細胞ポリアミン含量を減少させるためのポリアミン経路を調節する薬剤は、スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストである。いくつかの実施態様において、この組織ポリアミンレベル又は組織ポリアミン流入は、直腸粘膜組織、前立腺組織又は尿から決定される。
【００１０】
いくつかの実施態様において、本方法は、前記組織ポリアミンレベル又は組織ポリアミン流入が高くない場合、前記併用療法で前記患者を治療することをさらに含む。いくつかの実施態様において、本方法は、前記併用療法開始前又は開始時に低ポリアミン食に前記患者を供することをさらに含む。いくつかの実施態様において、本方法は、少なくとも一方のＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルの位置＋３１６で前記患者の遺伝子型を決定する試験の結果を得ることをさらに含む。
【００１１】
いくつかの実施態様において、前記結果は、前記遺伝子型を含有する報告を受け取るか又は該遺伝子型を明らかにする患者病歴を取得することにより得られる。いくつかの実施態様において、前記試験は、前記患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の一方のアレルで位置＋３１６のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施態様において、前記患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルの位置＋３１６のヌクレオチド塩基を決定する。
【００１２】
上記実施態様の何れかにおけるいくつかの変形物において、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤はα−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）である。上記実施態様の何れかにおけるいくつかの変形物において、スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストは、アスピリン非含有非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である。
【００１３】
いくつかの実施態様において、アスピリン非含有ＮＳＡＩＤは、選択的ＣＯＸ−２阻害剤である。いくつかの実施態様において、アスピリン非含有ＮＳＡＩＤは、スリンダク又はセレコキシブである。いくつかの実施態様において、アスピリン非含有ＮＳＡＩＤはスリンダクである。いくつかの実施態様において、アスピリン非含有ＮＳＡＩＤはセレコキシブである。
【００１４】
別の態様において、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤及びスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストを含む抗癌腫併用療法の有効性を予測するための方法であって、該併用療法で治療しようとする患者による食事性ポリアミン摂取を評価することを含み、高食事性ポリアミン摂取レベルによって、該治療の有効性が低いことが予測される、方法が提供される。
【００１５】
いくつかの実施態様において、全体的な細胞ポリアミン含量を減少させるためのポリアミン経路を調節する薬剤は、スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストである。いくつかの実施態様において、食事性ポリアミンレベルは患者食事歴から判定される。
【００１６】
いくつかの実施態様において、高食事性ポリアミンレベルは、３００μｍｏｌポリアミン／日以上として定義される。いくつかの実施態様において、その食事性ポリアミンレベルが高くない場合、患者を前記併用療法で。いくつかの実施態様において、本方法は、前記併用療法開始前又は開始時に、その患者を低ポリアミン食に供することをさらに含む。いくつかの実施態様において、本方法は、少なくとも一方のＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルの位置＋３１６で前記患者の遺伝子型を調べる試験の結果を得ることをさらに含む。
いくつかの実施態様において、前記結果は、前記遺伝子型を含有する報告を受け取るか又は該遺伝子型を明らかにする患者病歴を取得することにより得られる。
【００１７】
いくつかの実施態様において、前記試験は、前記患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の一方のアレルで位置＋３１６のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施態様において、前記試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両アレルで位置＋３１６のヌクレオチド塩基を決定する。上記実施態様の何れかにおけるいくつかの変形物において、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤は、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）である。上記実施態様の何れかにおけるいくつかの変形物において、スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストは、アスピリン非含有非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である。いくつかの実施態様において、前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤは、選択的ＣＯＸ−２阻害剤である。いくつかの実施態様において、前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤは、スリンダク又はセレコキシブである。いくつかの実施態様において、前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤは、スリンダクである。いくつかの実施態様において、前記アスピリン非含有ＮＳＡＩＤは、セレコキシブである。
【００１８】
他の局面において、
ａ）患者による食事性ポリアミン摂取及び／又はその患者における組織ポリアミンレベル又は流入を評価することと、
ｂ）オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤と、全体的な細胞ポリアミン含量又は流入を減少させるためのポリアミン経路を調節する薬剤と、の併用有効量をその患者に投与することと、
を含む、癌腫を有する患者を治療するための方法が提供される。
【００１９】
いくつかの実施態様において、全体的な細胞ポリアミン含量を減少させるためのポリアミン経路を調節する薬剤は、スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストである。いくつかの実施態様において、食事性ポリアミンレベルは患者食事歴から判定される。いくつかの実施態様において、高食事性ポリアミンレベルは３００μｍｏｌポリアミン／日以上として定義される。いくつかの実施態様において、組織ポリアミンレベル又は流入は、直腸粘膜組織、前立腺組織又は尿から決定される。いくつかの実施態様において、本方法は、前記併用療法開始前又は開始時に、患者を低ポリアミン食に供することをさらに含む。いくつかの実施態様において、本方法は、少なくとも一方のＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルの位置＋３１６で前記患者の遺伝子型を調べる試験の結果を得ることをさらに含む。いくつかの実施態様において、前記結果は、前記遺伝子型を含有する報告を受け取るか又は該遺伝子型を明らかにする患者病歴を取得することにより得られる。いくつかの実施態様において、前記試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の一方のアレルで位置＋３１６のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施態様において、前記試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両アレルで位置＋３１６のヌクレオチド塩基を決定する。
【００２０】
上記実施態様の何れかにおけるいくつかの変形物において、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤は、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）である。上記実施態様の何れかにおけるいくつかの変形物において、スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストは、アスピリン非含有非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である。
【００２１】
いくつかの実施態様において、アスピリン非含有ＮＳＡＩＤは、選択的ＣＯＸ−２阻害剤である。いくつかの実施態様において、アスピリン非含有ＮＳＡＩＤは、スリンダク又はセレコキシブである。いくつかの実施態様において、アスピリン非含有ＮＳＡＩＤは、スリンダクである。いくつかの実施態様において、アスピリン非含有ＮＳＡＩＤは、セレコキシブである。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯは全身的に投与される。いくつかの実施態様において、スリンダク又はセレコキシブは全身的に投与される。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯ又はアスピリン非含有ＮＳＡＩＤは、経口、動脈内又は静脈内投与される。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯは経口投与される。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯの有効量は５００ｍｇ／日である。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯは静脈内投与される。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯの有効量は約０．０５から約５．０ｇ／ｍ２／日である。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯ及びアスピリン非含有ＮＳＡＩＤは、経口投与用に製剤化される。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯ及びアスピリン非含有ＮＳＡＩＤは、硬もしくは軟カプセル又は錠剤として製剤化される。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯ及びアスピリン非含有ＮＳＡＩＤは１２時間ごとに投与される。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯ及びアスピリン非含有ＮＳＡＩＤは２４時間ごとに投与される。いくつかの実施態様において、スリンダクの有効量は約１０から約１５００ｍｇ／日である。いくつかの実施態様において、スリンダクの有効量は約１０から約４００ｍｇ／日である。いくつかの実施態様において、スリンダクの有効量は１５０ｍｇ／日である。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯはスリンダクの前に投与される。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯはスリンダクの後に投与される。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯはスリンダクの前及び後に投与される。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯはスリンダクと同時に投与される。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯは少なくとも２回目に投与される。いくつかの実施態様において、スリンダクは少なくとも２回目に投与される。いくつかの実施態様において、患者は固形腫瘍を有し、前記方法には、固形腫瘍の切除がさらに含まれる。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯ及びスリンダクは切除前に投与される。いくつかの実施態様において、ＤＦＭＯ及びスリンダクは切除後に投与される。
【００２２】
上記実施態様の何れかにおけるいくつかの変形物において、癌腫は、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、脳腫瘍、肺癌、胃癌、血液癌、皮膚癌、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌又は食道癌、子宮頸癌、頭頸部癌、非メラノーマ皮膚癌、神経芽腫及び膠芽細胞腫である。いくつかの実施態様において、癌腫は結腸直腸癌である。いくつかの実施態様において、結腸直腸癌はステージＩである。いくつかの実施態様において、結腸直腸癌はステージＩＩである。いくつかの実施態様において、結腸直腸癌はステージＩＩＩである。いくつかの実施態様において、結腸直腸癌はステージＩＶである。
【００２３】
別の態様において、
ａ）患者による食事性ポリアミン摂取及び／又はその患者における組織ポリアミンレベルを評価することと、
ｂ）オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤と、スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストと、の併用有効量をその患者に投与することと、
を含む、以前に癌腫と診断されたことがある患者の再発を予防するための方法が提供される。
【００２４】
いくつかの実施態様において、患者は癌腫瘍の外科的切除を以前に受けたことがある。
【００２５】
別の態様において、
ａ）患者による食事性ポリアミン摂取及び／又はその患者における組織ポリアミンレベルを評価することと、
ｂ）オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤とスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストとの併用有効量をその患者に投与することと、
を含む、患者における癌腫瘍を切除可能にする方法が提供される。
【００２６】
いくつかの実施態様において、本方法は、段階ｂ）の後に患者から腫瘍を切除することをさらに含む。
【００２７】
他の局面において、
ａ）患者による食事性ポリアミン摂取、その患者における組織ポリアミンレベル又は組織ポリアミン流入を評価することと、
ｂ）オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤とスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストとの併用有効量をその患者に投与することと、
を含む、癌腫の家族歴を有する患者において癌腫を予防するための方法が提供される。
【００２８】
上記実施態様の変形物において、患者はヒトである。
【００２９】
「ａ」又は「ａｎ」という語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において、「を含む」という用語と一緒に使用される場合、「１」を意味し得るが、「１以上の」、「少なくとも１つ」及び「１又は１を超える」の意味とも一致する。
【００３０】
本願を通じて、「約」という用語は、値が、その値を決定するために使用される機器、方法に対する固有の誤差の変動又は研究対象間に存在する変動を含むことを指すために使用される。
【００３１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、非制限の連結動詞である。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ)」、「有する（ｈａｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などのこれらの動詞の１以上の何らかの形態又は時制も非制限である。例えば、１以上の段階を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」何らかの方法は、これらの１以上の段階のみを保持することに限定されず、他の列挙されていない段階も包含する。
【００３２】
「有効な」という用語は、この用語が明細書及び／又は特許請求の範囲で使用される場合、望ましいか、予想されるか又は意図される結果を完遂するのに適切であることを意味する。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「ＩＣ５０」という用語は、得られる最大反応の５０％である阻害用量を指す。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「患者」又は「対象」という用語は、生きている哺乳動物、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット又はそれらのトランスジェニック種などを指す。ある種の実施態様において、患者又は対象は霊長類である。ヒト対象の非限定例は、成人、若年者、幼児及び胎児である。
【００３５】
「医薬的に許容可能な」は、一般に安全で、無毒性であり、生物学的にも他の意味でも望ましくないものではない医薬組成物を調製することにおいて有用であることを意味し、これには獣医学での使用ならびにヒトの医薬的使用に対して許容可能であるものが含まれる。
【００３６】
「予防」又は「予防すること」とは、（１）リスクがあり得る及び／又は疾患に罹患し易いが、その疾患の病的状態又は症状の何れか又は全てをまだ経験していないか又は示していない対象又は患者における疾患の発現を抑制すること及び／又は（２）リスクがあり得る及び／又は疾患に罹患し易いが、その疾患の病的状態又は症状の何れか又は全てをまだ経験していないか又は示していない対象又は患者における疾患の病的状態又は症状の発現を遅延させることを含む。
【００３７】
「有効量」、「治療的有効量」又は「医薬的有効量」は、疾患を治療するために対象又は患者に投与される場合、その疾患に対してそのような治療を実現させるのに十分な量を意味する。
【００３８】
「治療」又は「治療すること」とは、（１）ある疾患の病的状態又は症状を経験するか又は示す対象又は患者においてその疾患を抑制し（例えば、病的状態及び／又は症状のさらなる発現を抑止すること）、（２）ある疾患の病的状態又は症状を経験しているか又は示している対象又は患者においてその疾患を改善すること（例えば病的状態及び／又は症状を回復させること）及び／又は（３）その疾患の病的状態又は症状を経験しているか又は示している対象又は患者において疾患の何らかの測定可能な低下をもたらすことを含む。
【００３９】
本明細書中に参照により組み込まれる参考文献の何れかにおける定義の何らかの不一致に対しては、上記定義が優先する。しかし、ある一定の用語が定義されるということは、定義されていない何らかの用語が限定されていないことを示すものとしてみなすべきではない。むしろ、使用される用語は全て、当業者が本発明の範囲及び実施を認識し得るように、本発明を説明すると考えられる。
【００４０】
次の詳細な説明から本開示のその他の目的、特性及び長所が明らかになろう。しかし、詳細な説明及び具体的な例は、本発明の具体的な実施態様を示す一方で、単なる説明のためのものであるので、本発明の精神及び範囲内の様々な変化及び変更がこの詳細な説明から当業者に明らかになろうことを理解されたい。単に特定の化合物はある特定の一般的手段に起因するので、別の一般的手段にも属し得ないことを意味するものではないことに注意されたい。
【００４１】
次の図面は、本明細書の一部をなし、本開示のある特定の局面をさらに明らかにするために含まれる。本発明は、本明細書中で提示される具体的な実施態様の詳細な説明と合わせて、これらの図面の１つを参照することにより、より良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＭＡＤ１及びｃ−ＭＹＣによるポリアミン制御の差別的効果。ＯＤＣ１＋３１６マイナーＡ−アレルにおけるＭＡＤ１及びｃ−ＭＹＣによる、ポリアミン制御の差別的効果の案を示す概略図。ＯＤＣ阻害剤ＤＦＭＯ（ジフルオロメチルオルニチン）の効果も示す。
【図２】結腸直腸癌−特異的予測生存率。この図は、ＯＤＣ１＋３１６遺伝子型によって層別される、ステージＩＩＩ結腸直腸癌の症例に対するカプラン・マイヤー結腸直腸癌−特異的予測生存率を示す。１９９４年から１９９６年の間に診断され、２００８年３月までフォローアップした、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｒｖｉｎｅ  Ｇｅｎｅ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒからの症例が含まれる：ＯＤＣ１  ＧＧ（６４例、結腸直腸癌特異的死亡例１５例）、ＯＤＣ１  ＧＡ／ＡＡ（６２例、結腸直腸癌特異的死亡例２５例）。
【図３】Ａ及び３Ｂ：ＯＤＣ１プロモーターＳＮＰの位置及び分析。図Ａは、ＯＤＣ１Ａ、プロモーターＳＮＰの位置を示す。この実験で調べているＳＮＰは、ＯＤＣ１転写開始部位の３’の３１６ヌクレオチド（＊）である。このＳＮＰは、下線を付した配列により示されるような２個のコンセンサスＥ−ボックスの間にあり、ＰｓｔＩ制限部位（ボックス）（配列番号５）に影響を与える。図３Ｂは、ＯＤＣ１  ＳＮＰの制限断片長遺伝多型分析を示す。２種類の細胞型からＤＮＡを得て、ＯＤＣ１  ＳＮＰ部位周囲の領域の配列を決定した。ＯＤＣ１  ＳＮＰ遺伝子座において、結腸由来ＨＴ２９細胞はヘテロ接合ＧＡであることが分かり、一方ＨＣＴ１１６細胞はホモ接合ＧＧであることが分かった。各細胞型からこの領域の３５０−ｂｐのＰＣＲ産物が得られ、これをＰｓｔＩで消化した。制限産物が＜３５０ｂｐであることによりＡ−アレルの証拠が示された。
【図４】Ａ及び４Ｂ：Ｅ−ボックス発現及び免疫沈降分析。ＯＤＣ１プロモーターＳＮＰの位置。図４Ａは、結腸由来細胞におけるＥ−ボックスタンパク質発現を示す。ウエスタンブロット分析によって、＋３１６ＯＤＣ１  ＳＮＰへの結合について評価しようとするタンパク質の発現を評価した。ｃ−ＭＹＣ、ＭＡＤ１及びＭＡＤ４についてＨＴ２９及びＨＣＴ１１６細胞両方の抽出物を評価し、β−アクチンを添加対照として使用した。図４Ｂは、下記の実施例セクションで記載のように行ったクロマチン免疫沈降分析による、アレル特異的転写因子結合に対する考証を示す。ＨＴ２９細胞は、この部位でヘテロ接合ＧＡなので、これらの細胞はＯＤＣ１  Ａ−アレルのソースであった。ＯＤＣ１  Ｇ−アレルのソースとしてＨＣＴ１１６細胞を使用した。
【図５】Ａ及び５Ｂ：ＯＤＣ１活性におけるｃ−ＭＹＣ及びＭＡＤ１発現の効果。図５Ａは、ＨＴ２９結腸由来細胞におけるＯＤＣ１アレル特異的プロモーター活性に対するｃ−ＭＹＣ発現の効果を示す。ｐｃＤＮＡ３．０プラスミド又はＣＭＶ−ＭＹＣ発現ベクターと同時形質移入してＯＤＣ１プロモーターレポータープラスミドを形質移入した後、プロモーター活性を測定した。プロモーターコンストラクトは、−４８５から−４８０ｂｐの位置の第一のＥ−ボックスエレメントの存在の点で異なる（野生型配列の場合は「ｗｔＥ−ボックス１」又は突然変異体配列の場合は「ｍｕｔＥ−ボックス１」）。このコンストラクトはＯＤＣ１＋３１６ＳＮＰも異なる（「＋３１６Ｇ」又は「＋３１６Ａ」）。＊、ｐｃＤＮＡ３．０同時形質移入によるプロモーター活性に対する４種類の比較のそれぞれに対してＰ≦０．０１３。図５Ｂは、ＨＴ２９結腸腫瘍由来細胞におけるＯＤＣ１アレル特異的プロモーター活性に対するＭＡＤ１発現の効果を示す。ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド又はｐｃＤＮＡ−ＭＡＤ１プラスミドと同時形質移入したＯＤＣ１プロモーターレポータープラスミドを形質移入した後、プロモーター活性を測定した。使用したプロモーターコンストラクトはこの図のパネルＡに対する説明に記載した。＊、Ｐ＝０．０２７、ｐｃＤＮＡ３．１同時形質移入によるプロモーター活性に対して統計学的に有意。
【図６】腺腫性ポリープの減少。この図は、患者の腺腫性ポリープをＤＦＭＯ及びスリンダクで治療した場合の腺腫性ポリープの％再発を、プラセボと比較して示す。腺腫総数は７０％減少し、進行性腺腫は９２％減少し、多発性腺腫は９５％減少した。
【図７】＋３１６ＯＤＣ１遺伝子型に基づく薬理ゲノミクスベネフィット／リスク分析。この図は、患者の＋３１６ＯＤＣ１遺伝子型の関数として、治療及びプラセボ群に対して、プラセボと比較した場合の３年間の最後の腺腫再発の％低下と、％聴器毒性と、を比較する。聴力検査を用いて聴器毒性を判定した。
【図８】Ａ−Ｃ：＋３１６ＯＤＣ１遺伝子型に基づく薬理ゲノミクスベネフィット／リスク分析。この図は、患者の＋３１６ＯＤＣ１遺伝子型の関数として、治療及びプラセボ群に対して、ベネフィットである３年間の最後の％腺腫再発の低下を、リスクである％聴器毒性と比較する。聴力検査を用いて聴器毒性を判定した。
【図９】Ｍｉｎ／＋マウスの結腸における大きさによる平均腫瘍数。この図は、未処置対照と比較した、３種類の治療群の結腸における大きさ別の平均腫瘍数を示す。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍｅ．）より購入したマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＡｐｃＭｉｎ／＋雄マウス及びＣ５７／ＢＬ６雌マウスと交配させた。ｔａｉｌ−ｔｉｐ  ＤＮＡを用いてアレル特異的ＰＣＲアッセイにより離乳時に遺伝子型を調べることにより、ヘテロ接合ＭｉｎマウスＡｐｃＭｉｎ／Ａｐｃ＋）：（Ａｐｃのコドン８５０におけるナンセンス突然変異に対するヘテロ接合）を同定した。ホモ接合（Ａｐｃ＋／Ａｐｃ＋）同腹仔を対照とした。一方の処置は、２％ＤＦＭＯ（Ｍｅｒｒｅｌｌ  Ｄｏｗ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔ．）入りの飲用水を試験第８日目に補給することから構成された。他方の処置において、試験第２１日に１６７ｐｐｍのスリンダク（Ｈａｒｌｅｎ  Ｔｅｋｌａｄ）をＡＩＮ−９３Ｇマウス飼料に添加した。第三の処置はＤＦＭＯ及びスリンダクの併用であった。１１４日後、ＣＯ２窒息によりマウスを屠殺した。小腸及び結腸片をマウスから取り出し、縦方向に切り、標本にして７０％エタノール中で固定し、腫瘍スコア化のために４℃に置いた。組織病理評価のためにも代表的な組織を採取した。
【図１０】Ｍｉｎ／＋マウスの小腸における大きさ別の平均腫瘍数。この図は、未処置対照と比較した、３種類の治療群の小腸における大きさ別の平均腫瘍数を示す。実験の詳細については上記図９の記述を参照のこと。
【図１１】Ｍｉｎ／＋マウスにおける治療の関数としての高悪性度腺腫数。この図は、高悪性度腺腫数が治療のタイプによってどのように変動するかを示す。実験の詳細については上記図９の記述を参照のこと。
【図１２】１日の総食事性ポリアミン及び１日の総タンパク質摂取。全供給源からの１日の総食事性ポリアミン摂取と１日の総タンパク質摂取との間のベースライン時の相関。Ｐ値はスピアマンの順位相関係数（ｒｓ）を用いて報告する。
【図１３】１日の総食事性ポリアミン及び１日の総アルギニン摂取。１日の食事からの総ポリアミン摂取と１日の総アルギニン摂取との間のベースライン時の相関。Ｐ値はスピアマンの順位相関係数（ｒｓ）を用いて報告する。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
場合によっては患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子型に基づき、例えばオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤及びスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストを含む抗癌腫併用療法など、ポリアミン阻害物質による化学的予防に対する補助的なストラテジーとして、いくつかの局面において、外因性ポリアミンを調節することが利用され得る。例えばオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤と、全体的な細胞ポリアミン含量を減少させるためのポリアミン経路を調節する薬剤と、を含む抗癌腫併用療法の有効性を予測するために、いくつかの局面において、組織ポリアミンレベル又は組織ポリアミン流入を評価することが使用され得る。
【００４４】
本発明はまた、いくつかの局面において、癌の発症を予防するための及び／又は、新規異常陰窩巣の形成、新規腺腫性ポリープの形成又は異形成のある新規腺腫などの癌リスク因子の発現を予防するための、前癌症状を示す個体への治療用化合物の送達も含む。このカテゴリーの細胞には、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子型に少なくとも一部基づき、癌状態に進行する可能性があることを示す、ポリープ及びその他の前癌病変、前悪性、前腫瘍性又は他の異常な表現型が含まれる。
【００４５】
Ｉ．ポリアミン代謝
過剰なポリアミン形成は、長年にわたり、上皮癌腫形成、特に結腸直腸癌腫形成と関連付けられてきた。ポリアミンは、転写、ＲＮＡ安定化、イオンチャネルゲーティングその他を含む様々なプロセスに関与するユビキタスな小分子である（Ｗａｌｌａｃｅ、２０００）。ポリアミン合成における最初の酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）は、哺乳動物において正常な発現及び組織修復に必須であるが、殆どの成体組織では下方制御されている（Ｇｅｒｎｅｒ及びＭｅｙｓｋｅｎｓ、２００４）。ポリアミン代謝及び輸送の調節に複数の異常があるとポリアミンレベルが上昇するが、これは一部の組織において腫瘍形成を促進し得る（Ｔｈｏｍａｓ及びＴｈｏｍａｓ、２００３）。
【００４６】
結腸及び他の癌のリスクが高いことと関連する症候群である、家族性腺腫性ポリープ症（ＦＡＰ）を有するヒトの腸上皮組織において、ポリアミン代謝が上方制御される（Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏら、１９９７）。
【００４７】
ＦＡＰは、腺腫性大腸ポリポーシス（ＡＰＣ）腫瘍抑制因子遺伝子における突然変異により起こり得、ＡＰＣシグナル伝達は、ヒト細胞（Ｆｕｌｔｚ及びＧｅｒｎｅｒ、２００２）及びＦＡＰのマウスモデル（Ｅｒｄｍａｎら、１９９９）の両方でＯＤＣ発現を制御することが示されている。
【００４８】
野生型ＡＰＣ発現によりＯＤＣ発現が低下し、一方で突然変異体ＡＰＣによりＯＤＣ発現が上昇する。ＯＤＣのＡＰＣ−依存性制御のメカニズムには、転写活性化因子ｃ−ＭＹＣ及び転写抑制因子ＭＡＤ１を含むＥ−ボックス転写因子が含まれる（Ｆｕｌｔｚ及びＧｅｒｎｅｒ、２００２；Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００３）。他の研究者により、ｃ−ＭＹＣがＯＤＣ転写を制御することが示された（Ｂｅｌｌｏｆｅｒｎａｎｄｅｚら、１９９３）。ポリアミン代謝に関与する一部の遺伝子は、殆どの生物での最適発育のための必須遺伝子であり、非増殖及び／又は成体細胞及び組織において下方制御される（Ｇｅｒｎｅｒ及びＭｅｙｓｋｅｎｓ、２００４）。他所で総説されているように、ポリアミンは、ある部分、遺伝子発現パターンに影響を及ぼすことによって、特異的な細胞表現型に影響を与える（Ｃｈｉｌｄｓら、２００３）。
【００４９】
下記で述べるように、ＯＤＣ活性（即ちポリアミン合成の律速酵素）の阻害及び／又は細胞ポリアミンレベル低下を含むストラテジーは、ヒトにおける結腸直腸ポリープ再発の予防において顕著な有効性が明らかになっている。本研究による疫学的及び実験的な結果から、ＯＤＣにおける遺伝多型によるポリアミンホメオスタシスの条件付制御が明らかとなり、＋３１６ＯＤＣ  ＳＮＰが結腸腺腫再発に対する保護的なものであり得、結腸癌診断後の生存に有害であり得るというモデルが示唆される。結腸癌予後を判定するためにこの情報を使用し得る。癌進行／再発のリスクが高い患者を同定することにより、三次予防管理ストラテジーの早期実現を導入することができる。さらに、この研究は、三次癌予防療法から恩恵を受ける、ハイリスクであるがそれ以外は最適に処置されている局所結腸直腸癌患者を同定するために使用することができる。
【００５０】
患者の食事に依存して、ポリアミン、例えばプトレッシンが多くの一般的な食品に存在し、例えばオレンジジュースではおよそ４００ｐｐｍのプトレッシンを含有するという事実により、過剰ポリアミンの問題がさらに複雑化し得る。この点で、高ポリアミン食は禁忌であり、本明細書中で提供される実施態様の一部に対して、このような食事は回避すべきものである。
【００５１】
ＩＩ．食事性ポリアミン摂取の評価
ポリアミン含量が高いものを含む様々な食品の１日の平均摂取量を記録する患者の病歴を得ることによって、対象の食事性摂取を正確に推定することができる。例えば、Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒの食物摂取頻度調査票（ＦＦＱ）及びこの手段に対する分析アルゴリズムを使用することができる。Ｋｒｉｓｔａｌ  ＡＲ，Ｓｈａｔｔｏｃｋ，Ａ．Ｌ．及びＷｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｅ．：Ｆｏｏｄ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｅｔ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  １７ｔｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｄａｔａｂａｎｋ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，１９９２，１９９２；Ｓｃｈａｋｅｌ  ＳＦ，Ｂｕｚｚａｒｄ，ＩＭ．及びＧｅｂｈａｒｄｔ，Ｓ．Ｅ．：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｖａｌｕｅｓ  ｆｏｒ  ｆｏｏｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｄａｔａｂａｓｅｓ．Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｃｏｍｐ  Ａｎａｌ  １０：１０２−１４，１９９７。食事性ポリアミン摂取量を推定するために、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＣＣ）Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｄａｔａｂａｓｅを食品含量データの主な情報源とし、開発し、ＦＦＱにリンクさせたポリアミン食品含量データベースを使用し得る（Ｚｏｕｍａｓ−Ｍｏｒｓｅ  Ｃ，Ｒｏｃｋ  ＣＬ，Ｑｕｉｎｔａｎａ  ＥＬら：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｉｎｔａｋｅ．Ｊ  Ａｍ  Ｄｉｅｔ  Ａｓｓｏｃ  １０７：１０２４−７、２００７）。個々の食品中のスペルミン、スペルミジン及びプトレッシンに対する値を使用し得るが、あるいは、食事性の総ポリアミン摂取の主要な貢献因子として食事中のプトレッシンを単独で評価し得る。結果をエネルギーで補正することもできる。
【００５２】
ＩＩＩ．組織ポリアミンレベルの評価
直腸粘膜組織、前立腺組織及び尿を含む様々な異なる組織供給源を用いて、生検から組織ポリアミン含量を決定することができる。好ましくは、組織は、不快感及び回復時間を最小限に抑える、比較的非侵襲性の組織生検プロセスが可能なものである。文献に記載のように、使用されてきた特定のソースは直腸粘膜である。Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ＦＬ，Ｇｅｒｎｅｒ  ＥＷ，Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｓら：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｙｉｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｏｎ  Ｒｅｃｔａｌ  Ｍｕｃｏｓａｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９０：１２１２−１２１８，１９９８；Ｂｏｙｌｅ  ＪＯ，Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ＦＬ，Ｊｒ．，Ｇａｒｅｗａｌ  ＨＳら：Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ  ｉｎ  ｒｅｃｔａｌ  ａｎｄ  ｂｕｃｃａｌ  ｍｕｃｏｓａｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｒａｌ  ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  １：１３１−５，１９９２，これらは両者とも本明細書中に参照により組み込まれる。試料に氷冷食塩水をフラッシュし、使用まで−８０℃で凍結保存し得る。
【００５３】
適切なアッセイ用に試料を処理し、内部標準として１，７−ジアミノヘプタンを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーなどの許容可能な方法によって、ポリアミン含量（プトレッシン、カダベリン、ヒスタミン、スペルミジン、スペルミンならびにプトレッシン、スペルミジン及びスペルミンのモノアセチル誘導体）について評価する。Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ＦＬ，Ｇｅｒｎｅｒ  ＥＷ，Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｓら：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｏｎ  Ｒｅｃｔａｌ  Ｍｕｃｏｓａｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９０：１２１２−１２１８，１９９８；Ｓｅｉｌｅｒ  Ｎ，Ｋｎｏｄｇｅｎ  Ｂ：Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｍｏｎｏａｃｅｔｙｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２２１：２２７−２３５，１９８０、これらは両者とも本明細書中に参照により組み込まれる。市販のＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に記載のものなど、当技術分野で公知の技術を用いて試料中の総タンパク質含量を調べることができる。
【００５４】
ＩＶ．低ポリアミン食
対象の組織ポリアミンレベルが高いか又は食事から摂取されるポリアミンが許容できないほど高いことが分かった場合、その対象は、本発明によるオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤及びスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストを含む治療レジメンの前に又はその一部として、それらのポリアミン摂取を減少させることが推奨され得る。組織ポリアミン又は食事性摂取が中程度である対象でも、低ポリアミン食から利益を得ることができる。
【００５５】
食品のポリアミン含量は多岐にわたるが、一般的に、ポリアミン摂取を減少させたい場合、次の食品は避けるべきである：オレンジ、グレープフルーツ、ナシ、バナナ、チーズ、ジャガイモ、プディング、塩漬け肉、ソーセージ、豚肉煮込み、タラ、魚のフライ、アンチョビ、エンドウ、豆類、タマネギ、トマト、赤ワイン、ナッツ類、ハーブ類、レンティル。これらの食品の少なくとも一部の摂取量を減少させ、オレンジ、グレープフルーツ、チーズ及びトマトなどの数種類を排除することによって、ポリアミンレベルに対して大きな影響が与えられ得る。
【００５６】
Ｖ．家族性腺腫性ポリポーシス
遺伝性ポリポーシス症候群である家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）は、腺腫性大腸ポリポーシス（ＡＰＣ）腫瘍抑制因子遺伝子の生殖系列突然変異の結果である（Ｓｕら、１９９２）。発現が様々であるこの常染色体優性状態は、孤発性の結腸癌に対する平均診断年齢よりも２０年早く、４０歳までに腺癌に一様に進行する数百の結腸腺腫の発生に関与する（Ｂｕｓｓｅｙ、１９９０）。発症前のＦＡＰ個体の先行研究において、正常な家族構成員対照と比較した場合、正常に見える結腸直腸生検組織中でポリアミン、スペルミジン及びスペルミンならびにそれらのジアミン前駆体プトレッシンレベルの上昇が検出されている（Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏら、１９９７）。哺乳動物ポリアミン合成における第一の酵素であり律速酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の活性もＦＡＰ患者由来の見かけ上正常な結腸粘膜生検組織において上昇している（Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏら、１９９７；Ｌｕｋ及びＢａｙｌｉｎ、１９８４）。ポリアミンが最適な細胞増殖に必要なので、これらの知見は興味深い（Ｐｅｇｇ、１９８６）。さらに、癌原物質で処理したげっ歯類動物において、酵素で活性化される不可逆的阻害剤ＤＦＭＯを用いたＯＤＣ活性の抑制によって、結腸癌腫形成が抑制される（Ｋｉｎｇｓｎｏｒｔｈら、１９８３；Ｔｅｍｐｅｒｏら、１９８９）。
【００５７】
下記で詳述するように、ＦＡＰと共通する変異ＡＰＣ／ａｐｃ遺伝子型を有するＭｉｎ（多発性腸腫瘍）マウスは、ヒトＦＡＰ患者に対する有用な実験動物モデルである（Ｌｉｐｋｉｎ、１９９７）。Ｍｉｎマウスは、生後１２０日までに消化管全体にわたり１００個を超える胃腸腺腫／腺癌を発生させ得、ＧＩ出血、閉塞を引き起こし、死に至る。ＤＦＭＯ及びスリンダクの併用療法は、これらのマウスにおいて腺腫を減少させるために有効であることが示された（米国特許第６，２５８，８４５号；Ｇｅｒｎｅｒ及びＭｅｙｓｋｅｎｓ、２００４）。結腸又は小腸の何れかでの腫瘍形成におけるＤＦＭＯ単独、スリンダク単独又はＤＦＭＯ及びスリンダクの併用の何れかによるＭｉｎマウスの処置の結果を図９から１１に示す。
【００５８】
ＶＩ．オルニチンデカルボキシラーゼ−１遺伝多型
ポリアミン合成における第一の酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の活性は正常な発育に必要であり、結腸直腸癌を含む多くの癌において上昇している。本明細書中で、ＣＲＣ症例中での結腸直腸癌（ＣＲＣ）−特異的生存率と＋３１６ＯＤＣ一塩基多型（ＳＮＰ）の関連を調べ、結腸癌細胞におけるその機能的意義を調べた。
【００５９】
ヒトＯＤＣ１遺伝子のイントロン−１における一塩基多型（ＳＮＰ）は、ＯＤＣ１転写に影響を及ぼし（Ｇｕｏら、２０００）、結腸直腸腺腫（ＣＲＡ）リスクに対する遺伝的マーカーとして研究されてきた（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００３；Ｂａｒｒｙら、２００６；Ｈｕｂｎｅｒら、２００８）。報告されたマイナーＡ−アレル頻度はおよそ２５％であり、人種／民族間の差にもかかわらず、ＯＤＣ１遺伝子型分布は、各人種内でハーディー・ワインベルグ平衡にある（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、２００４；Ｚｅｌｌら、２００９）。ＯＤＣ１マイナーＡ−アレルに対してホモ接合である個体は、メジャーＧ−アレルの個体と比較して腺腫再発リスクが低い（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００３；Ｈｕｂｎｅｒら、２００８）。さらに、ＯＤＣ１Ａ−アレル（ＡＡ又はＧＡ遺伝子型であるがＧＧ遺伝子型ではない）及びアスピリン使用の報告は、結腸ポリープ再発減少と関連付けられており（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００３；Ｂａｒｒｙら、２００６；Ｈｕｂｎｅｒら、２００８）、進行性腺腫のリスクが統計学的に有意に５０％低かった（Ｂａｒｒｙら、２００６）。
【００６０】
Ｅ−ボックス転写因子のＯＤＣアレル特異的結合を調べ、２個のＥ−ボックス間に位置する＋３１６ＯＤＣ  ＳＮＰの機能的意義を評価した（図２Ａで示されるＥ−ボックス２及び３）。各細胞株遺伝子型は、この領域においてコンセンサスＰｓｔ１制限部位に影響を与える。図２Ｂは、ヒト結腸ＨＴ２９細胞から生成されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物が、ある程度はＰｓｔ１切断に感受性があることを示しており、これらの細胞が少なくとも１つのＯＤＣ  Ａ−アレルを含有することが示唆された。同じプライマーを用いてヒト結腸ＨＣＴ１１６細胞から生成されるＰＣＲ産物はＰｓｔＩの作用に対して不感受性であり、これらの細胞に含有されるのはＯＤＣ  Ｇ−アレルのみであることが示唆された。直接ＤＮＡ配列決定によりこの結果を確認した。
【００６１】
ウエスタンブロッティングを行うことによって、ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６細胞（例えばＭＡＤ１及びＭＡＤ４）における転写活性化因子ｃ−ＭＹＣ及びいくつかの転写抑制因子を含む特異的Ｅ−ボックス結合タンパク質の発現を確証した（図３Ａ）。これらのタンパク質に対する抗体を用いて、ＯＤＣプロモーターの＋３１６周辺領域のクロマチン免疫沈降（ＣＨＩＰ）の分析を行った。図３Ｂで示されるように、ｃ−ＭＹＣ、ＭＡＤ１又はＭＡＤ４に対する抗体によるクロマチン免疫沈降後に得られたＨＴ２９  ＤＮＡから、ＯＤＣプロモーター特異的ＰＣＲ産物が合成された。同様のクロマチン免疫沈降後にＨＣＴ１１６ＤＮＡから合成されたＰＣＲ産物は、ＨＴ２９  ＤＮＡから合成されたものと比較して実質的に少なかった。これらの結果の定量から、ＯＤＣ−Ｇアレルのみを含有したＨＣＴ１１６細胞と比較して、１つのＯＤＣ−Ａアレルを含有したＨＴ２９細胞においてＯＤＣ  ＳＮＰ領域へのｃ−ＭＹＣ、ＭＡＤ１及びＭＡＤ４結合が４から１４倍大きかったことが示された。
【００６２】
ＯＤＣアレル特異的プロモーター活性を評価した。Ｅ−ボックス活性化因子及び抑制因子の発現に依存して＋３１６ＯＤＣ  ＳＮＰがＯＤＣ発現に影響を及ぼすという仮説を次のように検証した。転写活性化因子ｃ−ＭＹＣ又は抑制因子ＭＡＤ１の何れかを発現するベクターと組み合わせてＯＤＣアレル特異的プロモーターコンストラクトを用いて結腸癌由来ＨＴ２９細胞に対して一過性同時形質移入を行った（図４Ａ及びＢ）。示される標準誤差バーは、１回の代表的実験内の三つ組み測定における変動を反映しており、これは再現されている。これらの実験で使用したアレル特異的プロモーターレポーターには、図２Ａで示される３個のＥ−ボックス全てが含まれた。図４Ａで示されるように、３個のコンセンサスＥ−ボックス及びＯＤＣ−Ａアレルを含有するプロモーターに対して、ｃ−ＭＹＣ発現が最大の刺激作用を有していた（ｗｔＥ−ボックス１＋３１６  Ａ、Ｐ＝０．００１４）。上流Ｅ−ボックスの欠失によりプロモーター活性が低下したが、ｃ−ＭＹＣ発現がこの活性を刺激し続けた（ｍｕｔＥ−ボックス１＋３１６  Ａ、Ｐ＝０．００１３）。＋３１６ＳＮＰ位置のＡからＧへの置換によって、無傷の５’フランキングコンセンサスＥ−ボックスがあっても、ｃ−ＭＹＣのプロモーター活性刺激能が低下した。５’フランキングコンセンサスＥ−ボックスの突然変異は、ＯＤＣ−Ｇアレルとの組み合わせで、プロモーター活性をさらに低下させた。
【００６３】
ｃ−ＭＹＣではなくＭＡＤ１をＯＤＣアレル特異的プロモーターレポーターとともに同時形質移入した場合（図４Ｂ）、抑制因子は、３個全てのＥ−ボックス及び野生型＋３１６Ａ−アレルを含有したＯＤＣプロモーターの活性のみを低下させることができた（Ｐ＝０．０２７）。上流Ｅ−ボックスの欠失（ｍｕｔＥ−ボックス１＋３１６Ａ）により、ＯＤＣプロモーター活性に対するＭＡＤ１の効果が顕著に低下した。＋３１６位置でのＡからＧへの置換によって、２又は３個のＥ−ボックスの何れかを含有するプロモーターがＭＡＤ１抑制に反応しなくなった。
【００６４】
ＶＩＩ．ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）
エフロルニチンとしても知られるＤＦＭＯは次の化学式、２−（ジフルオロメチル）−ｄｌ−オルニチンを有する。これは、ポリアミン生合成経路の律速酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の、酵素により活性化される不可逆的阻害剤である。このポリアミン合成阻害の結果、この化合物は、多くの器官系における癌形成の阻止、癌発育の抑制及び腫瘍の縮小化に有効となる。これは、他の抗腫瘍薬との相乗作用も有する。
【００６５】
ＤＦＭＯはマウスにおいてＡＰＣ依存性腸腫瘍形成を抑制することが示されている（Ｅｒｄｍａｎら、１９９９）。ヒトに経口ＤＦＭＯを毎日投与することによって、多くの上皮組織においてＯＤＣ酵素活性が阻害され、ポリアミン含量が低下する（Ｌｏｖｅら、１９９３；Ｇｅｒｎｅｒら、１９９４；Ｍｅｙｓｋｅｎｓら、１９９４；Ｍｅｙｓｋｅｎｓら、１９９８；Ｓｉｍｏｎｅａｕら、２００１；Ｓｉｍｏｎｅａｕら、２００８）。近年、発明者らは、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）スリンダクと組み合わせて、ＤＦＭＯが、ランダム化臨床試験においてプラセボと比較した場合、結腸腺腫を有する個体間で腺腫再発率を顕著に低下させることが報告されていることを報告した（Ｍｅｙｓｋｅｎｓら、２００８）。
【００６６】
ＤＦＭＯは最初、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｍｅｒｒｅｌｌ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇにより合成され；現在のＦＤＡ承認には次のものが含まれる：
・アフリカ睡眠病。高用量全身ＩＶ剤−市販されていない（Ｓａｎｏｆｉ／ＷＨＯ）。
・多毛症（アンドロゲン誘発性の過剰毛髪発育）局所製剤。経口製剤は現在のところ承認されていない。
【００６７】
良性前立腺肥大の治療におけるＤＦＭＯ及びその使用は、米国特許第４，４１３，１４１号及び同第４，３３０，５５９号という２つの特許に記載されている。米国特許第４，４１３，１４１号は、インビトロ及びインビボの両方でのＯＤＣの強力な阻害剤であるものとしてＤＦＭＯを記載する。ＤＦＭＯの投与により、プトレッシン及びスペルミジンが通常は活発に産生される細胞においてこれらのポリアミン濃度が低下する。さらに、ＤＦＭＯは、標準的腫瘍モデルで試験した際に、腫瘍細胞増殖を遅延させることができることが分かっている。米国特許第４，３３０，５５９号は、良性前立腺肥大の治療のためのＤＦＭＯ及びＤＦＭＯ誘導体の使用を記載する。急速な細胞増殖を特徴とする多くの疾患状態のように、良性前立腺肥大にはポリアミン濃度の異常な上昇が付随する。この参考文献内に記載される治療薬を経口又は非経口の何れかで患者に投与することができる。
【００６８】
ＤＦＭＯは、顕著な抗腫瘍効果を継続的に与え得る可能性がある。この薬物は、ヒトに対して０．４ｇ／ｍ２／日という低用量では比較的毒性がなく、同時に腫瘍においてプトレッシン合成の阻害を引き起こす。ラット腫瘍モデルにおける研究から、末梢血小板数を抑制することなく、ＤＦＭＯ点滴により腫瘍プトレッシンレベルが９０％低下し得ることが明らかになる。
【００６９】
ＤＦＭＯとともに認められる副作用には４ｇ／Ｍ２／日の高用量での聴力に対する影響が含まれるが、これは投与を中断すると解決する。聴力におけるこれらの影響は、１年以下の投与の場合、０．４ｇ／Ｍ２／日という低用量では認められない（Ｍｅｙｓｋｅｎｓら、１９９４）。さらに、薬物を中断すると解決する眩暈／目まいの例が数例見られる。ＤＦＭＯの高治療用量（＞１．０ｇ／ｍ２／日）を用いた研究において及び主に以前に化学療法を受けたことがある癌患者又は骨髄に障害がある患者において、血小板減少症が主に報告されている。一般に、限られた臨床試験において、ＤＦＭＯ療法に付随する毒性は他のタイプの化学療法ほど重くないが、用量に関連して血小板減少症を促進させることが分かった。さらに、ラットにおける研究から、１２日間にわたるＤＦＭＯの連続点滴により、対象と比較して血小板数が顕著に減少することが分かった。他の研究から、血小板減少症が連続ｉ．ｖ．ＤＦＭＯ療法の主要な毒性であるという同様の所見が得られている。これらの知見から、ＤＦＭＯが、巨核球の骨髄前駆細胞のＯＤＣ活性を顕著に抑制し得ることが示唆される。ＤＦＭＯは、上皮創傷治癒などの増殖性修復プロセスを阻害し得る。
【００７０】
第ＩＩＩ相臨床試験では、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）＋スリンダク又は対応するプラセボでの３６ヶ月にわたる治療後の腺腫性ポリープ再発を評価した。一時的難聴は、ＤＦＭＯによる治療の既知の毒性であり、従って、連続空気伝導聴力図を分析するために、包括的アプローチを開発した。周波数での反復測定による対象内相関を考慮しながら、一般化推定方程式法により、空気伝導純音閾値の変化に関して治療群間の平均差を推定した。２９０名の対象に基づき、プラセボで処置した対象と比較して、ベースライン値、年齢及び周波数に対して調整して、ＤＦＭＯ＋スリンダクで治療した対象間で０．５０ｄＢの平均差があった（９５％信頼区間、−０．６４から１．６３ｄＢ；Ｐ＝０．３９）。５００から３，０００Ｈｚの通常の会話音域で、０．９９ｄＢ（−０．１７から２．１４ｄＢ；Ｐ＝０．０９）という推定差が検出された。用量強度はモデルに対する情報を追加しなかった。ＤＦＭＯ＋スリンダク群では１５１名中１４名（９．３％）、プラセボ群では１３９名中４名（２．９％）で、試験した全領域にわたり、２以上の連続した周波数でベースラインからの少なくとも１５ｄＢの聴覚低下が見られた（Ｐ＝０．０２）。治療終了後、少なくとも６ヶ月で行ったフォローアップ空気伝導から、治療群間で１．０８ｄＢの聴覚閾値で調整済み平均差が示された（−０．８１から２．９６ｄＢ；Ｐ＝０．２６）。プラセボ群と比較して、臨床的に意義のある難聴があったＤＦＭＯ＋スリンダク群の対象の割合に有意差はなかった。薬物曝露からの聴器毒性の推定寄与リスクは８．４％である（９５％信頼区間，−２．０％から１８．８％；Ｐ＝０．１２）。プラセボで処置した患者と比較して、ＤＦＭＯ＋スリンダクで治療した患者に対する平均閾値の差は＜２ｄＢである。この研究の結果は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれるＭｃＬａｒｅｎら、２００８に詳細に記載されている。本明細書中で、ＤＦＭＯ及びスリンダクなどの薬物で治療する患者の聴器毒性を軽減し及び／又は予防する方法が提供される。
【００７１】
ＶＩＩＩ．ＮＳＡＩＤ
ＮＳＡＩＤは、ステロイドではない抗炎症剤である。抗炎症作用に加えて、これらは、鎮痛、解熱及び血小板抑制作用を有する。これらは最初、慢性関節炎状態及び疼痛及び炎症を伴うある種の軟組織障害の治療において使用された。これらは、プロスタグランジンの前駆体である環状エンドペルオキシドへとアラキドン酸を変換するシクロオキシゲナーゼを阻害することによりプロスタグランジンの合成を阻止することによって作用する。プロスタグランジン合成阻害はそれらの鎮痛、解熱及び血小板抑制作用の主な要因であり；それらの抗炎症効果には他のメカニズムが関与し得る。ある種のＮＳＡＩＤのみ、リポキシゲナーゼ酵素もしくはホスホリパーゼＣも阻害し得るか又はＴ細胞機能も調節し得る（ＡＭＡ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ  Ａｎｎｕａｌ，１８１４−５，１９９４）。
【００７２】
アスピリン、イブプロフェン、ピロキシカム（Ｒｅｄｄｙら、１９９０；Ｓｉｎｇｈら、１９９４）、インドメタシン（Ｎａｒｉｓａｗａ、１９８１）及びスリンダク（Ｐｉａｚｚａら、１９９７；Ｒａｏら、１９９５）を含む非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）は、ＡＯＭ−処置ラットモデルにおいて効果的に結腸癌腫形成を抑制する。ＮＳＡＩＤは、活性化Ｋｉ−ｒａｓを有する腫瘍の発生も抑制する（Ｓｉｎｇｈ及びＲｅｄｄｙ、１９９５）。ＮＳＡＩＤは、腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導を介して癌腫形成を抑制すると思われる（Ｂｅｄｉら、１９９５；Ｌｕｐｕｌｅｓｃｕ、１９９６；Ｐｉａｚｚａら、１９９５；Ｐｉａｚｚａら、１９９７ｂ）。多くの研究から、アポトーシスの誘導を含むＮＳＡＩＤの化学予防特性が、それらのプロスタグランジン合成阻害能の機能であることが示唆される（ＤｕＢｏｉｓら、１９９６；Ｌｕｐｕｌｅｓｃｕ、１９９６；Ｖａｎｅ及びＢｏｔｔｉｎｇ、１９９７において概説）。しかし、研究から、ＮＳＡＩＤがプロスタグランジン依存性及び非依存性メカニズムの両方を通じて作用し得ることが示される（Ａｌｂｅｒｔｓら、１９９５；Ｐｉａｚｚａら、１９９７ａ；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９５；Ｈａｎｉｆ、１９９６）。ＮＳＡＩＤスリンダクの代謝産物である、スルホン化スリンダクはＣＯＸ−阻害活性を欠くが、それでも腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し（Ｐｉａｚｚａら、１９９５；Ｐｉａｚｚａら、１９９７ｂ）、一部の癌腫形成げっ歯類モデルにおいて腫瘍発生を阻害する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９５；Ｐｉａｚｚａら、１９９５、１９９７ａ）。
【００７３】
一部のＮＳＡＩＤはヒト臨床試験においてそれらの効果について試験されている。イブプロフェンの第ＩＩａ相臨床試験（１ヶ月）が完了しており、３００ｍｇ／日という用量でも、平坦粘膜におけるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）レベルの顕著な低下が見られた。イブプロフェンの３００ｍｇという用量は非常に低く（治療用量は、１日に１２００から３０００ｍｇの範囲又はそれ以上）、長期間でも毒性が見られる可能性は少ない。しかし、動物の化学的予防モデルにおいて、イブプロフェンは他のＮＳＡＩＤよりも効果が低い。
【００７４】
Ａ．スリンダク及びその主要な代謝産物、スルホン化スリンダク及びスリンダク硫化物
スリンダクは、次の化学名を有する非ステロイド、抗炎症性インデン誘導体である；（Ｚ）−５−フルオロ−２−メチル−１−（（４（メチルスルフィニル）フェニル）メチレン）１Ｈ−インデン−３−酢酸（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、１９９９）。スルフィニル部分は、インビボで可逆性の還元によりスルフィド代謝産物に変換され、不可逆的酸化によりスルホン代謝産物（エクシスリンド）に変換される。その全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第６，２５８，８４５号を参照のこと。Ｋｉ−ｒａｓ活性化も阻害するスリンダクは、ＣＯＸ阻害能が異なる２つの異なる分子に代謝されるが、それでも両者ともアポトーシスの誘導を介して化学予防効果を発揮することができる。スルホン化スリンダクはＣＯＸ−阻害活性を欠きプロスタグランジン合成依存性に殆どがアポトーシスの誘導を促進すると思われる。入手可能な証拠から、スルフィド誘導体が生物学的に活性のある化合物の少なくとも１つであることが示される。これに基づき、スリンダクはプロドラッグとみなされ得る。
【００７５】
スリンダク（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ（登録商標））は例えば１５０ｍｇ及び２００ｍｇ錠剤として入手可能である。成人に対する最も一般的な投与量は１日２回１５０から２００ｍｇであり、最大１日用量は４００ｍｇである。経口投与後、薬物の約９０％が吸収される。空腹状態の患者では約２時間でピーク血漿濃度に到達し、食後投与の場合は３から４時間で到達する。スリンダクの平均半減期は７．８時間であり、スルフィド代謝産物の平均半減期は１６．４時間である。米国特許第３，６４７，８５８号及び同第３，６５４，３４９号はスリンダクの調製を包含するが、両者ともそれらの全体において本明細書中に参照により組み込まれる。
【００７６】
スリンダクは、変形性関節症、関節リウマチ、強直性脊椎炎、急性痛風及び急性肩痛の兆候及び症状の短期的及び長期的緩和のために適用される。スリンダク（４００ｍｇ／日）によりもたらされる鎮痛及び抗炎症効果は、アスピリン（４ｇ／日）、イブプロフェン（１２００ｍｇ／日）、インドメタシン（１２５ｍｇ／日）及びフェニルブタゾン（４００から６００ｍｇ／日）により達成される効果に匹敵する。スリンダクの副作用には、患者のほぼ２０％における軽度の胃腸への影響が含まれ、腹痛及び吐き気が最も頻度の高い訴えである。ＣＮＳ副作用が見られるのは患者の１０％以下であり、眠気、頭痛及び神経過敏が最もよく報告される。皮膚発疹及び掻痒が起こるのは患者のうち５％である。スリンダクによる長期治療により、出血、潰瘍形成及び穿孔などの重篤な消化管毒性が起こり得る。
【００７７】
癌及び特に結腸直腸ポリープの化学的予防法のためのスリンダク使用の可能性について、詳細に研究されてきた。２つの最近の米国特許第５，８１４，６２５号及び同第５，８４３，９２９号は、ヒトにおけるスリンダクの化学予防の使用の可能性について詳述している。両特許ともそれらの全体において本明細書中に組み込まれる。米国特許第５，８１４，６２５号で主張されるスリンダクの用量は、１０ｍｇから１５００ｍｇ／日の範囲であり、好ましい用量は５０ｍｇから５００ｍｇ／日である。しかし、高用量において、化学的予防における単剤としてのスリンダクの使用に伴うより大きな問題は、その周知の毒性及びやや高い不耐性のリスクである。６０代を超えると副作用発生率が高くなるので、高齢者は特に脆弱であると思われる。この年齢群は結腸直腸癌が発生する可能性が最も高く、従って化学的予防法により利益を受ける可能性が最も高いことに注意されたい。
【００７８】
スリンダク及びそのスルホン代謝産物エクシスリンドはいくつかの癌タイプの予防及び治療について試験され、臨床試験が継続中である。Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈデータベースから、２０１０年５月１０日現在で次の概要が提供される。
【表１】
2013528376.tif 000002
2013528376.tif 000003
2013528376.tif 000004
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【００７９】
Ｂ．ピロキシカム
４−ヒドロキシ−２−メチル−Ｎ−２−ピリジル−２Ｈ−１，２−ベンゾチアジン−３−カルボキサミド１，１−ジオキシドの化学名を有する、関節リウマチ及び変形性関節症の治療において定着している非ステロイド抗炎症剤。筋骨格障害、月経困難症及び術後疼痛の治療においてもその有用性が明らかにされている。これは半減期が長いので、１日１回投与が可能である。この薬物は、直腸投与される場合、有効であることが示されている。副作用として報告される主訴は胃腸に関するものである。
【００８０】
ピロキシカムは、動物モデルにおいて有効な化学的予防薬であることが示されているが（Ｐｏｌｌａｒｄ及びＬｕｃｋｅｒｔ、１９８９；Ｒｅｄｄｙら、１９８７）、最近のＩＩｂ臨床試験において副作用が明らかとなった。ＮＳＡＩＤの副作用の大規模メタ解析からも、ピロキシカムが他のＮＳＡＩＤよりも副作用が大きいことが示されている（Ｌａｎｚａら、１９９５）。スリンダクは、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）患者において腺腫を退縮させることが示されているものの（Ｍｕｓｃａｔら、１９９４）、孤発性の腺腫における少なくとも１つの研究からこのような効果がないことが示されている（Ｌａｄｅｎｈｅｉｍら、１９９５）。
【００８１】
ＤＦＭＯ及びピロキシカムの併用は、結腸癌腫形成のＡＯＭ処置ラットモデルにおいて相乗的な化学予防効果があることが分かっているが（Ｒｅｄｄｙら、１９９０）、各薬剤を個別に投与した場合、ＤＦＭＯはＫｉ−ｒａｓ突然変異及び腫瘍形成に対してピロキシカムよりも大きな抑制効果を発揮した（Ｒｅｄｄｙら、１９９０）。ある研究において、ＡＯＭ処置ラットに対するＤＦＭＯ又はピロキシカムの投与により、Ｋｉ−ｒａｓ突然変異を有する腫瘍数が９０％からそれぞれ３６％及び２５％に減少した（Ｓｉｎｇｈら、１９９４）。両薬剤とも、既存の腫瘍において生化学的活性のあるｐ２１ｒａｓの量も低下させた。
【００８２】
Ｃ．ＮＳＡＩＤの併用
様々なＮＳＡＩＤの併用療法も様々な目的で使用されている。２以上のＮＳＡＩＤをより低用量で使用することによって、より高用量の個々のＮＳＡＩＤに付随する副作用又は毒性を抑えることができる。例えば、いくつかの実施態様において、スリンダクをセレコキシブと一緒に使用し得る。いくつかの実施態様において、ＮＳＡＩＤＳの一方又は両方が選択的ＣＯＸ−２阻害剤である。単独で又は併用において使用し得るＮＳＡＩＤＳの例としては、次のものが挙げられるがこれらに限定されない：イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、ジクロフェナク、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、セレコキシブ  ロフェコキシブ  バルデコキシブ  パレコキシブ、ルミラコキシブ又はエトリコキシブ。
【００８３】
ＩＸ．エフロルニチン／スリンダク併用療法
低用量で併用で与えられた化学的予防薬の前臨床試験は、さらなる毒性が殆どなく、腺腫の予防において顕著な有効性を示しており、このことから再発性腺腫の予防に対してリスクベネフィット比を向上させるためのストラテジーが示唆される。
【００８４】
上述のように、ＦＡＰと共通する突然変異ＡＰＣ／ａｐｃ遺伝子型を有するＭｉｎ（多発性腸腫瘍）マウスは、ヒトＦＡＰ患者に対する有用な実験動物モデルとなる（Ｌｉｐｋｉｎ、１９９７）。Ｍｉｎマウスは、生後１２０日までに消化管全体にわたり１００個を超える胃腸腺腫／腺癌を発生させ得、ＧＩ出血、閉塞を引き起こし、死に至る。ＤＦＭＯ及びスリンダクの併用療法は、これらのマウスにおいて腺腫を減少させるのに有効であることが示された（米国特許第６，２５８，８４５号；Ｇｅｒｎｅｒ及びＭｅｙｓｋｅｎｓ、２００４）。結腸又は小腸の何れかでの腫瘍形成に対して、ＤＦＭＯ単独、スリンダク単独又はＤＦＭＯ及びスリンダク併用の何れかでＭｉｎマウスを処置した結果を図９から１０で示す。図９は、未処置対照と比較した、この３種類の治療群の結腸における、大きさ別の平均腫瘍数を示す。図１０は、未処置対照と比較した、この３種類の治療群の小腸における、大きさ別の平均腫瘍数を示す。図１１は、高悪性度腺腫数が治療法、単独又は併用によってどのように変動するかを示す。
【００８５】
Ｘ．患者プロファイルに基づくポリアミン抑制療法の有効性
ＣＲＡ患者間での、経口Ｄ，Ｌ−α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ、エフロルニチン）及びスリンダクの長期連日投与による、ポリアミン抑制併用療法の有効性が明らかになったが（Ｍｅｙｓｋｅｎｓら、２００８）、治療には、中等度の無症候性聴器毒性が付随し（ＭｃＬａｒｅｎら、２００８）、ベースライン時心血管系リスクが高い患者では心血管系イベントがより多かった（Ｚｅｌｌら、２００９）。プラセボと比較して、エフロルニチン及びスリンダク治療後では、腺腫再発、組織ポリアミン反応又は毒性プロファイルに対してＯＤＣ１遺伝子型が与える影響が異なることが明らかになった。２０１０年５月１４日出願の、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｇｅｒｎｅｒ，Ｊａｓｏｎ  Ｚｅｌｌ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｍｃｌａｒｅｎ，Ｆｒａｎｋ  Ｍｅｙｓｋｅｎｓ，Ｈｏｄａ  Ａｎｔｏｎ−Ｃｕｌｖｅｒ及びＰａｔｒｉｃｉａ  Ａ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎによる米国仮出願、題名「Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＯＤＣ１  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ」、これはその全体において参照により組み込まれる。
【００８６】
腺腫（≧３ｍｍ）切除歴がある３７５名の患者を無作為に指名して、経口ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）５００ｍｇ及びスリンダク１５０ｍｇを１日１回又は適合するプラセボを３６ヶ月間投与し、ベースライン時及び試験実施医療機関での低用量アスピリン（８１ｍｇ）使用によって層別化した。ランダム化又は試験脱落から３年後にフォローアップ大腸内視鏡検査を行った。対数の二項分布回帰により群間で結腸直腸腺腫再発について比較した。プラセボ投与を受けた患者と活性薬投与を受けた患者との転帰を比較すると、（ａ）１以上の腺腫再発はそれぞれ４１．１％及び１２．３％であり（リスク比、０．３０；９５％信頼区間、０．１８−０．４９；Ｐ＜０．００１）；（ｂ）１以上の進行性腺腫を有するのはそれぞれ患者の８．５％及び０．７％であり（リスク比、０．０８５；９５％信頼区間、０．０１１−０．６５；Ｐ＜０．００１）；（ｃ）複数の腺腫（＞１）を有するのは、最終的な大腸内視鏡検査でそれぞれ１７名（１３．２％）と１名であった（０．７％；リスク比、０．０５５；０．００７４−０．４１；Ｐ＜０．００１）。重篤な有害事象（グレード≧３）はプラセボ群の患者の８．２％で起こり、それに対して活性薬介入群では１１％で起こった（Ｐ＝０．３５）。ベースラインからの聴覚変化を報告した患者の割合に有意差はなかった。経口低用量ＤＦＭＯ及びスリンダクの併用によって、少ない副作用で再発性腺腫性ポリープを顕著に減少させることができる。この試験の詳細は下記及びその全体において参照により本明細書中に組み込まれるＭｅｙｓｋｅｎｓら、２００８で詳細に論じる。
【００８７】
２６７名の患者が試験終了時の大腸内視鏡検査を完了した後、Ｄａｔａ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｏａｒｄ（ＤＳＭＢ）によりこの試験は中止された（試験がその有効性エンドポイントに達したため）。ＤＳＭＢは安全性及び有効性エンドポイントを全て監視した。実施例セクションでさらに詳細に論じるように、この試験には、多施設第ＩＩＩ相結腸腺腫予防試験からの患者データの分析が含まれた。その全体において参照により本明細書中に組み込まれる（Ｍｅｙｓｋｅｎｓら、２００８）も参照のこと。
【００８８】
Ａ．ＯＤＣ１遺伝子型分布
ＵＣ  Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＲＣ  Ｇｅｎｅ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙから確認された全部で４４０名の結腸直腸癌（ＣＲＣ）症例を症例のみ分析において使用した。フォローアップ期間中央値は１１年であった。２７０例の（６１％）結腸癌症例、１６２例の（３７％）直腸癌症例及び８例（２％）の位置不明のＣＲＣ症例があった。結腸及び直腸癌症例に対する臨床病理学的データを表１で示す。全ＣＲＣ症例間のＯＤＣ＋３１６遺伝子型分布は、５３％ＧＧ、４１％ＧＡ及び７％ＡＡであった。ＣＲＣ例においてＯＤＣ＋３１６遺伝子型分布は、家族歴の有無にかかわらず同様であった。年齢（Ｐ＝０．３８）、性別（Ｐ＝０．５６）、家族歴（Ｐ＝０．９４）、結腸直腸内の部位（Ｐ＝０．５５）、組織学（Ｐ＝０．４６）又は腫瘍グレード（Ｐ＝０．７３）別でＯＤＣ遺伝子型分布において有意差はなかった。ＯＤＣ遺伝子型分布は、診断時のステージにより有意差はなかった：ステージＩ（４９％ＧＧ、４２％ＧＡ、８％ＡＡ）、ステージＩＩ（５６％ＧＧ、３８％ＧＡ、６％ＡＡ）、ステージＩＩＩ（５１％ＧＧ、４３％ＧＡ、６％ＡＡ）、ステージＩＶ（５９％ＧＧ、３７％ＧＡ、４％ＡＡ）（Ｐ＝０．８７）。ＯＤＣ遺伝子型分布は民族による有意差が明らかになった：白人（３８２例：５３％ＧＧ、４１％ＧＡ、６％ＡＡ、マイナー−Ａアレル頻度＝２６％）、アフリカ系アメリカ人（７例：７１％ＧＧ、２９％ＧＡ、０％ＡＡ、マイナー−Ａアレル頻度＝１５％）、ヒスパニック系（２１例：５７％ＧＧ、４３％ＧＡ、０％ＡＡ、マイナー−Ａアレル頻度＝２１％）及びアジア系（２７例：３３％ＧＧ、４１％ＧＡ、２６％ＡＡ、マイナー−Ａアレル頻度＝４６％）（Ｐ＝０．００９）。しかし、各人種内で、ＯＤＣ遺伝子型分布はハーディー・ワインベルグ平衡になった（白人Ｐ＝０．３６、アフリカ系アメリカ人Ｐ＝０．６６、ヒスパニック系Ｐ＝０．２１、アジア人系Ｐ＝０．３５）。
【００８９】
Ｂ．腺腫再発
ＯＤＣ１遺伝子型分布は、１２６ＧＧ（５５％）、８７ＧＡ（３８％）及び１５ＡＡ（７％）であった。ベースライン臨床特性から表１で示されるように差が明らかとなった。年齢、性別、人種、アスピリン使用、治療、ＯＤＣ１遺伝子型及び治療という予測因子を用いた回帰モデルにおいて、治療は、腺腫再発、組織ポリアミン反応及び聴器毒性の差異に関与する唯一の因子であった。腺腫再発に対するフルモデルにおいてＯＤＣ１遺伝子型及び治療に対して統計学的に有意な相互作用が検出され（Ｐ＝０．０２１）、プラセボ患者間の腺腫再発パターンは、ＧＧ−５０％、ＧＡ−３５％、ＡＡ−２９％であり、一方、エフロルニチン／スリンダク患者ではＧＧ−１１％、ＧＡ−１４％、ＡＡ−５７％であった。
【００９０】
このモデルにおけるＯＤＣ１遺伝子型と治療との間で統計学的に有意な相互作用が検出された（Ｐ＝０．０３８）。ＯＤＣ１遺伝子型は完全回帰モデルにおいて組織プトレッシンレスポンス又はスペルミジン：スペルミン比レスポンスと有意な関連はなかった（データは示さず。）。完全回帰モデルにおける治療に関連する腺腫再発に対する調整済み相対的リスク（ＲＲ）は、０．３９（９５％ＣＩ  ０．２４−０．６６）であった。心血管系又は消化管系有害事象に関して、治療とＯＤＣ１遺伝子型群との間で有意な関連はなかった（表３及び４）。
【００９１】
ここで、少なくとも１つのＡ−アレルを有するアスピリン投与ＣＲＡ患者間で再発性腺腫のリスクが低下したことを示す以前の報告とは異なり、エフロルニチン及びスリンダクの腺腫抑制効果は、メジャーＧホモ接合ＯＤＣ１遺伝子型を有する場合により大きいことが認められた（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００３；Ｂａｒｒｙら、２００６；Ｈｕｂｎｅｒら、２００８）。ＯＤＣ１遺伝子型分布は以前のアスピリンに基づく臨床試験での報告と同様であり（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００３；Ｂａｒｒｙら、２００６；Ｈｕｂｎｅｒら、２００８）、以前の報告と一致して、Ａ−アレルは、プラセボ群において、有意ではない、より低い再発性腺腫リスクと関連があった（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００３；Ｈｕｂｎｅｒら、２００８）。これらの結果から、ＯＤＣ１Ａ−アレルキャリアでは、ＧＧ遺伝子型患者と比較して、エフロルニチン及びスリンダクでの長期曝露に対する反応性の点が異なり、Ａ−アレルキャリアは腺腫再発に関してベネフィットが少なく、特にＡＡホモ接合型では聴器毒性を発生するリスクが高くなる可能性があることが明らかになる。
【００９２】
Ｃ．生存解析
４４０例のＣＲＣ症例のうち、解析時に１３８例（３１％）が死亡していた。ＡＡ／ＡＧ遺伝子型を有する例で死亡例が７４例（５４％）であったことと比較して、ＧＧ遺伝子型を有する症例で死亡例は６４例（４６％）であった。死因は１３８例の死亡ＣＲＣ症例のうち１０２例については入手可能であった。８５例（８３％）のＣＲＣ症例は、ＣＲＣが死因であった。少なくとも１つのＡ−アレル（ＯＤＣ  ＧＡ／ＡＡ）を有する例（１０年生存率＝７６％；Ｐ＝０．０３１）と比較して、ＯＤＣ  Ｇ−アレルに対してホモ接合のＣＲＣ症例全てにおいて統計学的に有意なＣＲＣ特異的生存率の向上が認められた（１０年生存率＝８４％）。ステージ別のＣＲＣ特異的生存率解析から、ＡＪＣＣステージＩ（Ｐ＝０．０５５）、ＩＩ（Ｐ＝０．６１）又はＩＶ（Ｐ＝０．６５）ＣＲＣに対して、生存率の違いにおいて有意差が認められなかったことが明らかになった。しかし、ステージＩＩＩのＣＲＣの症例の間で、ＯＤＣ  ＧＧ遺伝子型はＣＲＣ特異１０年生存率の向上と関連しており、ＯＤＣ  ＧＡ／ＡＡ遺伝子型の例では６０％であるのに対して７５％であった；Ｐ＝０．０２４（図１）。結腸癌症例の間で、ＯＤＣ  ＧＡ／ＡＡ例と比較して、ＯＤＣ  ＧＧ遺伝子型を有する例に対して統計学的に有意なＣＲＣ特異的生存率ベネフィットが認められ（１０年生存率＝８７％対７９％；Ｐ＝０．０２９）；これは直腸癌症例では見られなかった（ＯＤＣ  ＧＧ例の場合１０年生存率＝７８％、一方でＯＤＣ  ＧＡ／ＡＡ例の場合７２％；Ｐ＝０．４２）。
【００９３】
年齢（歳）、性別、民族、ＣＲＣ家族歴、診断時ＴＮＭステージ、結腸内の腫瘍部位、組織学的サブタイプならびに手術、放射線療法及び化学療法による治療について調整した後のＯＤＣ遺伝子型に基づく、全ＣＲＣ症例間のＣＲＣ特異的予測生存率は、次の通りであった：ＯＤＣ  ＧＧハザード比（ＨＲ）＝１．００（基準値）、ＯＤＣ  ＧＡ  ＨＲ＝１．７３及びＯＤＣ  ＡＡ遺伝子型ＨＲ＝１．７３（Ｐ−トレンド＝０．０２８３）。結腸症例のみの間で、ＣＲＣ特異的生存率解析から、上記の臨床的変数に対する調整後、ＯＤＣ＋３１６ＳＮＰがＣＲＣ特異的生存率の独立予測因子であることが明らかになった。ＯＤＣ  ＧＧ結腸癌症例と比較して、死亡のＣＲＣ特異リスク（ＨＲ）は、ＯＤＣ  ＧＡ遺伝子型の場合２．３１（１．１５−４．６４）であり、ＯＤＣ  ＡＡ遺伝子型の場合３．７３（０．９３−１４．９９）であった（Ｐ−トレンド＝０．００６）（表２）。これらの結腸癌症例の全生存期間解析はＣＲＣ特異的生存率解析と一致した（表２）。直腸癌症例間で、ＣＲＣ特異的生存率解析から、上述の臨床的変数に対して調整後に、ＯＤＣ＋３１６ＳＮＰがＣＲＣ特異的生存率の独立予測因子ではないことが明らかになった。ＯＤＣ  ＧＧ直腸癌症例と比較して（ＨＲ＝１．００、基準値）、ＣＲＣ特異的死亡リスク（ＨＲ）は、ＯＤＣ  ＧＡヘテロ接合体の場合１．７２（０．８３−３．５７）であり、ＯＤＣ  ＡＡホモ接合体の場合１．９３（０．５６−６．６７）であった（Ｐ−トレンド＝０．１２）。
【００９４】
上述のように、ＯＤＣ＋３１６遺伝子型分布は民族間で異なっていた。偶然を除き、観察された死亡リスクは、ＯＤＣ遺伝子型に基づく相違を反映すると思われるが、しかしリスクは特定の民族グループに限定され得る。従って、白人結腸癌症例の間で多変量解析を行い、この単一民族内の遺伝子型特異的死亡リスクを評価した。２３４例の白人結腸癌症例中、ＣＲＣ−関連死が３７例あった。多変量ＣＲＣ特異的生存率解析から、上述の関連臨床変数に対して調整後、ＯＤＣ＋３１６ＳＮＰが、白人結腸癌症例においてＣＲＣ特異的生存率の独立予測因子であることが明らかになった。ＯＤＣ  ＧＧ遺伝子型の例と比較して（ＨＲ＝１．００、基準値）、ＣＲＣ特異的死亡リスク（ＨＲ）は、ＯＤＣ  ＧＡ遺伝子型の場合は２．６７（１．２２−５．８２）であり、ＯＤＣ  ＡＡ遺伝子型の場合は６．２８（１．４６−２６．９５）であった（Ｐ−トレンド＝０．００１８）。
【００９５】
ＣＲＣ症例における遺伝子型特異的生存率の差は結腸癌症例に限定され、ＯＤＣ  ＧＧ遺伝子型の症例と比較して（ＨＲ＝１．００、基準値）、調整済みのＣＲＣ−ＳＳハザード比（ＨＲ）は、ＯＤＣ  ＧＡ症例の場合２．３１（１．１５−４．６４）であり、ＯＤＣ  ＡＡ症例の場合３．７３（０．９３−１４．９９）であった（Ｐ−トレンド＝０．００６）。結腸癌細胞において、２個のＥ−ボックスに隣接するＯＤＣ＋３１６ＳＮＰにより、ＯＤＣプロモーター活性が予測される。Ｅ−ボックス活性化因子ｃ−ＭＹＣ及び抑制因子ＭＡＤ１及びＭＡＤ４は、培養細胞中で、メジャーＧ−アレルと比較してマイナーＡ−に選択的に結合する。
【００９６】
１１年間のフォローアップ期間がある結腸直腸癌症例でのこの母集団ベース分析に基づいて、結腸癌症例において、＋３１６ＯＤＣ  ＳＮＰが結腸直腸癌特異的生存率に関連することが認められた。年齢、性別、民族、腫瘍ステージ、ＣＲＣ家族歴、腫瘍部位、組織学ならびに手術、放射線療法及び化学療法による治療に対する調整後、結腸癌症例において、ＯＤＣ  Ａアレルが付加される度に（即ちＯＤＣ  ＧＧからＧＡ、そしてＡＡへ）、ＣＲＣ特異的死亡リスクの統計学的に有意な上昇が認められた（Ｐ−トレンド＝０．００６）。
【００９７】
Ｄ．転写因子のアレル特異的制御
結腸癌上皮細胞において、Ｇ−、アレルと比較してＡ−を含有するプロモーターエレメントへのＥ−ボックス転写因子の結合が多いことにより証明されるように、ＯＤＣ＋３１６ＳＮＰが機能的に意義があることが示されている。活性化因子ｃ−ＭＹＣ及び抑制因子ＭＡＤ１の両者とも、Ｇ−アレルよりもＡ−を含有するレポーターエレメントにおけるプロモーター活性に対してより大きな影響を示す。これらの結果から、Ｅ−ボックス転写因子によるＯＤＣのアレル特異的制御が示唆される。ＯＤＣタンパク質酵素活性はＯＤＣ＋３１６ＳＮＰ遺伝子型により明らかな影響は受けず、ＯＤＣ＋３１６ＳＮＰ遺伝子型はＯＤＣ転写に影響を及ぼすと発明者らは考える。
【００９８】
結腸細胞において、正常結腸粘膜で発現される遺伝子である野生型ＡＰＣの条件付き発現が、ｃ−ＭＹＣを抑制し、ＭＡＤ１発現を向上させることが示されている（Ｆｕｌｔｚ及びＧｅｒｎｅｒ、２００２）。さらに、＋３１６ＳＮＰ依存性に野生型ＡＰＣがＯＤＣプロモーター活性を制御することができることが報告されている（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００３）。野生型ＡＰＣは、ＦＡＰに罹患していない個体の見かけ上正常な結腸粘膜において発現され、一方で孤発性の結腸腺腫の大分部は、ＡＰＣに突然変異又は欠失があるという所見が認められる（Ｉｗａｍｏｔｏら、２０００）。ＭＹＣは、正常腸粘膜では発現レベルが低いが、ＡＰＣＭｉｎ／＋マウスの腸腺腫では上昇している。腸上皮ＭＹＣ発現の条件付きノックアウトにより、ＡＰＣＭｉｎ／＋マウスにおいて腸腫瘍形成が抑制される（Ｉｇｎａｔｅｎｋｏら、２００６）。上述のように、発明者らのグループによる先行研究（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００３）及びその他（Ｈｕｂｎｅｒら、２００８）から、臨床予防試験において結腸ポリープ再発に対して、特にアスピリン使用者において、ＯＤＣ  Ａ−アレルに関する予防的役割が明らかになった。しかし、本明細書中で提示される母集団ベース研究において、ＯＤＣ  Ａ−アレルは低生存率と関連があった。この明らかな矛盾は、本明細書中で示される結果により説明され得、このことから、Ｅ−ボックス活性化因子及び抑制因子の両者とも選択的にＯＤＣ  Ａ−アレルに結合することが示される。Ｅ−ボックス抑制因子を発現する正常上皮から腫瘍上皮への遷移はＯＤＣ  Ａ−アレルを有する個体において遅延し得る。この効果は、ポリアミン合成抑制の結果によるものであり得る。しかし、形質転換上皮がＥ−ボックス活性化因子（ｃ−ＭＹＣなど）を発現し始めたら、ＯＤＣ  Ａ遺伝子型を有する個体において癌進行が起こる可能性が高くなり得る。結腸癌特異的死亡リスクに対する結果は、前立腺癌リスクが、遺伝子環境相互作用の結果として特定の個人の間でＯＤＣ  Ａ−アレルと関連があり得ることを示す結果と一致する（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、２００４；Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎら、２００４）。このような結腸癌進行は、前立腺癌に対して既に明らかにされているように、ポリアミン合成の促進によるものであり得る（Ｓｉｍｏｎｅａｕら、２００８）。
【００９９】
ＯＤＣ  ＳＮＰなどの因子が癌腫形成に対して促進及び抑制効果両方を有し得るというこの知見は特別なものではない。例えば、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）は、癌腫形成及び癌進行において多様な役割を有する（Ｄｅｒｙｎｃｋら、２００１；Ｐａｒｄａｌｉ及びＭｏｕｓｔａｋａｓ、２００７；Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＷａｋｅｆｉｅｌｄ、２００３）。形質転換された細胞におけるＴＧＦ−βは、細胞増殖を抑制し、アポトーシスを誘導する。また、これはヒト腫瘍全てによって過剰発現され、末期癌の進行、具体的には腫瘍浸潤及び転移に関連する。ヒト結腸直腸腫瘍におけるＯＤＣ活性を報告する１つの研究から、高レベルのＯＤＣ発現が生存率向上と顕著に関連することが明らかになった（Ｍａｔｓｕｂａｒａら、１９９５）。このことから、ＯＤＣ過剰発現がヒト結腸直腸腺腫の形成を促進するにもかかわらず、既存病変において、ＯＤＣ過剰発現により増殖が促進され、抗増殖治療に対する反応性向上と関連する可能性があることが示唆される。しかし、その研究には、ＯＤＣ遺伝子型による層別化は含まれておらず、これらの効果がＯＤＣ遺伝子型に独立であるか否かは分からない。
【０１００】
ＣＲＣ特異的死亡率とのＯＤＣ＋３１６ＳＮＰの関連が認められるのは、結腸癌の症例に限定されていた。結腸癌症例の間で、白人については特に強い効果が認められた。他の報告と同様に、ＯＤＣ＋３１６ＳＮＰアレル頻度は民族によって大きく異なる（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、２００４）。生存率解析が白人（即ちこのような解析に対して十分な検出力がある唯一の民族グループ）のみに限定された場合、ＯＤＣ＋３１６ＳＮＰの関連は有意であり、コホート全体に対して認められた推定値よりも大きかった。
【０１０１】
疫学的研究は、併発状態におけるデータ不足、一般状態及び使用される特定の化学療法レジメンを含め、他の母集団ベース分析と同じ制限を有する。さらに、家族性結腸直腸癌のＵＣ  Ｉｒｖｉｎｅ  Ｇｅｎｅ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙの参加者から得られた組織生検試料はパラフィン包埋検体であり、従って高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による組織ポリアミン定量の正確な評価には使用できない。中央値１６ヶ月という、ＣＲＣ診断から試験登録までの遅延があったため、ＣＲＣ生存者のうち比較的健康な群が優先されがちであるという選択バイアスの可能性もある。本発明において考慮されなかったポリアミン代謝に影響を及ぼす他の因子により発明者らの所見が説明され得る。例えば、アスピリンはポリアミンアセチル化及び輸出を活性化し、細胞及び組織ポリアミン含量を減少させるためにＯＤＣ  Ａ−アレルとともに作用する（Ｇｅｒｎｅｒら、２００４；Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００３；Ｂａｂｂａｒら、２００６）。
【０１０２】
まとめると、結腸癌症例でのＣＲＣ特異的死亡率におけるＯＤＣ＋３１６ＳＮＰの臨床的帰結が認められた。さらに、ヒト結腸癌細胞におけるこの遺伝子のｃ−ＭＹＣ−及びＭＡＤ１−依存性転写におけるＯＤＣ＋３１６ＳＮＰの機能的意義がより詳細に理解される。総合すると、これらの実験的及び疫学的知見から、結腸腺腫への進行において以前報告されていた役割とは異なる、結腸癌の進行におけるＯＤＣ＋３１６ＳＮＰの役割が示唆される。これらの知見は、結腸癌進行リスクを評価するために使用することができ、患者特異的薬理遺伝学的管理、サーベイランスモニタリングを指導し、二次及び三次結腸癌予防に対する新規の標的となるアプローチを知らせるために使用し得る。
【０１０３】
Ｅ．要約
腺腫再発に対する完全モデルにおいてＯＤＣ１遺伝子型及び治療に対して統計学的に有意な相互作用が検出され（Ｐ＝０．０２１）、プラセボ患者間の腺腫再発パターンはＧＧ−５０％、ＧＡ−３５％、ＡＡ−２９％であり、それに対してエフロルニチン／スリンダク患者では：ＧＧ−１１％、ＧＡ−１４％、ＡＡ−５７％であった。ここで、エフロルニチン及びスリンダクの腺腫抑制効果は、少なくとも１つのＡ−アレルを有するアスピリン投与ＣＲＡ患者における再発性腺腫リスク低下を示す以前の報告と対照的に、メジャーＧホモ接合ＯＤＣ１遺伝子型の患者でより大きかった（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００３；Ｂａｒｒｙら、２００６；Ｈｕｂｎｅｒら、２００８）。これらの結果から、ＯＤＣ１Ａ−アレルキャリアが、ＧＧ遺伝子型患者と比較して、エフロルニチン及びスリンダクでの長期曝露に対する反応性の点で異なり、Ａ−アレルキャリアは腺腫再発に関してベネフィットが少なく、特にＡＡホモ接合型では聴器毒性を発生するリスクが高くなる可能性があることが明らかになる。
【０１０４】
ＸＩ．ＤＦＭＯ及びスリンダクによる治療と食事性ポリアミン摂取との間の相互作用
下記実施例セクションで詳細に記載する研究において、発明者らは、結腸直腸腺腫予防臨床試験で、再発性腺腫のリスクにおいてＤＦＭＯ＋スリンダクによる治療と食事性ポリアミン摂取との間の有意な相互作用を認めた。ポリアミン摂取量が下位４分の３に相当する患者では８１％のリスク低下が認められるのに対して、食事性ポリアミン摂取量が上位４分の１に相当する患者は、ＤＦＭＯ＋スリンダクでの治療後、異時性腺腫リスク低下が示されなかった。
【０１０５】
この実験において、ベースライン時で、最大食事性ポリアミン摂取群の患者は組織ポリアミンレベルがより高く、大きな腺腫（４３．６％対２６．４％、Ｐ＝０．０１６）及び進行性腺腫（５２．７％対３５．９％、Ｐ＝０．０２８）の割合がより大きかった（表２）。さらに、最大食事性ポリアミン摂取群の患者のより多くの割合が高悪性度腺腫を有したが（３２．７％対２０．４％、Ｐ＝０．０６０）、この差は有意ではなかった。これらの結果は全般的に、食事性ポリアミン摂取増加が腸腺腫異形成のグレード上昇と顕著に関連しているというマウスモデル研究の結果を反映する。Ｉｇｎａｔｅｎｋｏ  ＮＡ，Ｂｅｓｓｅｌｓｅｎ  ＤＧ、Ｒｏｙ  ＵＫら：Ｄｉｅｔａｒｎｙ  ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｕｌｉｎｄａｃ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ．Ｎｕｔｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ５６：１７２−８１，２００６。別の動物実験において、食事を介したビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）の投与によってポリアミン吸収が低下した結果、細胞増殖速度ならびにＯＤＣ活性を抑制することにより、結腸腫瘍発生率、腫瘍多発性が顕著に抑制され、腫瘍サイズが縮小することが認められた。Ｓｉｎｇｈ  Ｊ，Ｒｉｖｅｎｓｏｎ  Ａ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｍら：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ，ａ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １８：８３３−４１，１９９７。
【０１０６】
これらの結果から、食事性ポリアミン摂取量が上位４分の１に相当する患者においてベースライン組織スペルミン及びスペルミジンレベルが上昇した。これらの知見は、全般的に、食事性のプトレッシン補充がＡＰＣＭｉｎ／＋マウスにおける腸組織プトレッシンレベルを上昇させたというＩｇｎａｔｅｎｋｏにより行われた実験的研究と一致する。Ｉｇｎａｔｅｎｋｏ  ＮＡ，Ｂｅｓｓｅｌｓｅｎ  ＤＧ，Ｒｏｙ  ＵＫら：Ｄｉｅｔａｒｙ  ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｕｌｉｎｄａｃ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ．Ｎｕｔｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ５６：１７２−８１，２００６。しかし、本分析において、組織プトレッシンレベルは、ベースラインの食事性ポリアミン摂取とは関連がなかった。これは、身体組織に保持される割合が食事性スペルミジンの場合は４０％であるのに対して、食事性プトレッシンのうち身体組織に保持されるのは僅か１０％であるからであり得る。Ｈｕｇｈｅｓ  ＥＬ，Ｇｒａｎｔ  Ｇ，Ｐｕｓｚｔａｉ  Ａら：Ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒ−ｏｒｇａｎ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ２６：Ｓ３６９，１９９８。外部から得られたポリアミンは、細胞外間隙から細胞に輸送され、細胞内に入ると、外因性プトレッシンはスペルミジン及びスペルミンへと迅速に変換される（これらは相互交換可能）。Ｍｉｌｏｖｉｃ  Ｖ，Ｔｕｒｈａｎｏｗａ  Ｌ，Ｆａｒｅｓ  ＦＡら：Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ  ａｒｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｇｒｏｗ  ｂｙ  ＥＧＦ．Ｚ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ３６：９４７−５４，１９９８。
【０１０７】
試験の目的の１つは、異時性腺腫リスク低下における食事性ポリアミン摂取及びＤＦＭＯ＋スリンダクによる治療の相互作用を評価することであり、統計学的に有意な相互作用が認められた（Ｐ＝０．０１）。ここで、発明者らは、ＤＦＭＯ＋スリンダクによる低食事性ポリアミン群における８１％の異時性腺腫リスク低下を報告したが、これは７０％腺腫リスク低下が認められた親試験と比較して実質的なリスク低下である。これは、食事性ポリアミン摂取の制限が結腸直腸腫瘍の予防に有用である可能性があることを強調する。発明者らはまた、低食事性ポリアミン群における進行性腺腫の９４％リスク低下にも注目したが、これは、親実験で報告されたものと同様であった。しかし最大食事性ポリアミン群において、ＤＦＭＯ＋スリンダク（対プラセボ）でのベネフィットは認められなかった［ＲＲ、１．０４；９５％ＣＩ、０．３２−３．３６］。マウスの実験的研究において、ＮＳＡＩＤによる、ＯＤＣの阻害、スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼの誘導及びポリアミン輸送の誘導は、細胞内ポリアミン含量及びアポトーシスの減少に寄与した。細胞へのスペルミジン添加によってアポトーシスが阻止され、細胞数が保持され、このことから、発明者らの研究で認められたように、外因性ポリアミンがＮＳＡＩＤの有効性を反転させ得ることが示唆される。Ｉｇｎａｔｅｎｋｏ  ＮＡ，Ｂｅｓｓｅｌｓｅｎ  ＤＧ，Ｒｏｙ  ＵＫら．：Ｄｉｅｔａｒｙ  ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｕｌｉｎｄａｃ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ．Ｎｕｔｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ５６：１７２−８１，２００６；Ｈｕｇｈｅｓ  Ａ，Ｓｍｉｔｈ  ＮＩ，Ｗａｌｌａｃｅ  ＨＭ：Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３７４：４８１−８，２００３。これらのデータは、外因性ポリアミンがポリアミンホメオスタシスを支配し、ＤＦＭＯ及びスリンダクの有効性に影響を与えることを示すマウス実験による結果を補強する。低食事性ポリアミン群（即ち試験母集団の下位４分の３）において、プラセボと比較して、ＤＦＭＯ＋スリンダクによって腺腫再発リスクが低下することから、ＯＤＣ阻害がこの群での結腸癌の化学的予防における有望なアプローチとして確認される。
【０１０８】
ポリアミン制御の他のソースが考慮されるべきである。ＯＤＣ１における遺伝的多型は、結腸直腸癌生存率と関与することが示されており、ＤＦＭＯ＋スリンダクによる治療後の腺腫再発リスクに影響を及ぼし得る。Ｚｅｌｌ  ＪＡ，Ｚｉｏｇａｓ  Ａ，Ｉｇｎａｔｅｎｋｏ  Ｎら：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６２０８−１６，２００９；Ｚｅｌｌ  ＪＡ，ＭｃＬａｒｅｎ  ＣＥ，Ｃｈｅｎ  Ｗ−Ｐら：Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（Ｏｄｃ）−１  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｍａ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ａｄｅｎｏｍａ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＤＦＭＯ＋ｓｕｌｉｎｄａｃ  ｖｅｒｓｕｓ  ｐｌａｃｅｂｏ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６Ｓ：Ａｂｓｔｒａｃｔ  １５０２，２００８。従ってＯＤＣ１遺伝子型と食事性ポリアミン摂取との間の相互作用は、ポリアミンホメオスタシスに影響を与え得る。しかし、発明者らは、ＯＤＣ遺伝子型により本分析を層別化する十分な分析力がない。
【０１０９】
ここで、発明者らは、ベースライン時の食事性ポリアミン摂取と組織ポリアミンレベルとの間の関係を明らかにすることによって、以前に確立されたポリアミンデータベースを検証する。ナッツ類、ある種のチーズ及び肉を含むいくつかの食品においてポリアミン含量が高い。肉の消費は、ポリアミン消費に取って代わるものであるが、食事性ポリアミンの相当量がオレンジジュース、トウモロコシ及びエンドウなどの様々な食品からも得られる。総ポリアミン摂取及び１日の総アルギニンに対して観察された関連性（ｒｓ＝０．６４）は、動物由来タンパク質摂取に対して認められたものよりも大きかった（ｒｓ＝０．４９）。このアルギニンと食事性ポリアミンとの間の関係は、食事性アルギニンにより誘発される腸腫瘍形成をＤＦＭＯ及びＮＳＡＩＤなどのポリアミン−阻害物質により抑制することができることを示す、ＡＰＣＭｉｎ／＋マウスにおける以前の研究を裏付ける。Ｚｅｌｌ  ＪＡ，Ｉｇｎａｔｅｎｋｏ  ＮＡ，Ｙｅｒｕｓｈａｌｍｉ  ＨＦら：Ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｉｎｔａｋｅ  ａｎｄ  ｍｅａｔ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ１２０：４５９−６８，２００７。
【０１１０】
この研究にはいくつかの制限がある。主要な制限は、再発リスクの分析において被験者数が比較的少数（ｎ＝１８８）であることである。このように少数であったため、この研究は、特に最大食事性ポリアミン群において詳細なサブセット分析を行うのに十分な分析力がなかった。また、認められるべきこととして、この試験計画が、ベースラインの食事性ポリアミン摂取に基づく層別化を含まなかった。特に発明者らの分析がベースラインの食事に関する質問表に基づき、本研究中に様々な時間間隔におけるものでないことを考えれば、人々の食生活が時間とともに変化し得、これが発明者らの結果に影響し得ることが認識される。しかし、中年から高齢層の患者は一般に食事パターンが安定しており一定であるので、生命にかかわる新しい医学的状態がない場合、３年間の試験中に中年から高齢層では大きな食事の変化の可能性が低いことが推定されることに着目されたい。従って、この分析における単回の最初のＦＦＱからのデータを使用することは妥当である。自己報告に基づく食事評価法は全て、正確性に限界があり、精密な摂取測定を与えるというよりも、（この研究において分析されるように）精々高摂取と低摂取を区別することができる程度である。患者のほぼ５０％が、ポリアミンの体内プールを調整し得るアスピリンを服用していたが、最終的な推定をアスピリン使用に対して調整し、発明者らは、ロジスティック回帰モデルにおいてベースラインの食事性ポリアミン摂取とアスピリンとの間で有意な相互作用を認めなかった。
【０１１１】
親研究において、３年間の治療期間にわたるＤＦＭＯ（ポリアミン合成の選択的阻害剤）及びスリンダク（ＮＳＡＩＤ）の併用の前向きランダム化プラセボ比較臨床試験の結果、プラセボと比較して、全異時性腺腫の再発が７０％減少し、進行性及び多重腺腫の再発が＞９０％減少した。この食事性ポリアミン分析で与えられる知見から、低量から通常量の食事性ポリアミン摂取を報告している患者間で、異時性腺腫のリスクが８１％低下し、進行性腺腫が９４％減少したことが明らかとなり、このことから、食事性ポリアミンが腺腫予防における重要な因子であり得ることが示唆される。ポリアミン阻害物質による化学的予防に対する補助的ストラテジーとして外因性ポリアミンの調節を使用し得、例えばポリアミン−阻害物質を用いた二次及び三次結腸直腸癌予防試験が展開される。
【０１１２】
ＸＩＩ．遺伝多型分析
実施例セクションに記載される具体的な方法を含む、下記で提供される方法を用いて、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の＋３１６位置での遺伝子型を決定することができる。これらの方法は、当業者により適用されるように分子生物学の原理及び技術を用いてさらに改変し、最適化し得る。このような原理及び技術は、例えば参照により本明細書中に組み込まれるＳｍａｌｌら、（２００２）で教示される。一塩基多型（ＳＮＰ）の同定のために使用される一般的方法を下記で与える。Ｋｗｏｋ及びＣｈｅｎ（２００３）及びＫｗｏｋ（２００１）の参考文献は、これらの方法のいくつかの概要を提供し、これらは両者とも参照により具体的に組み込まれる。
【０１１３】
ＯＤＣ１に関連するＳＮＰの特徴は、これらの方法又はその適切な改法の何れかの使用であり得る。このような方法には、部位の直接又は間接的配列決定、その部位の個々のアレルが制限部位を生成させるか又は破壊する制限酵素の使用、アレル特異的ハイブリッド形成プローブの使用、遺伝多型の異なるアレルによりコードされるタンパク質に特異的な抗体の使用又は何らかの他の生化学的解釈が含まれる。
【０１１４】
Ａ．ＤＮＡ配列決定
一般に使用される、遺伝多型の特徴評価の方法は、遺伝多型に隣接し、遺伝多型を含む遺伝子座の直接的ＤＮＡ配列決定である。「サンガー法」としても知られる「ジデオキシ連鎖停止法」（Ｓａｎｇｅｒら、１９７５）又は「マクサムギルバート法」としても知られる「化学分解法」（Ｍａｘａｍら、１９７７）の何れかを用いてこのような分析を遂行することができる。望ましい遺伝子の回収を容易にするために、ポリメラーゼ連鎖反応などのゲノム配列特異的増幅技術と組み合わせて配列決定を使用し得る（Ｍｕｌｌｉｓら、１９８６；欧州特許出願第５０，４２４号；欧州特許出願第８４，７９６号、欧州特許出願第２５８，０１７号、欧州特許出願第２３７，３６２号；欧州特許出願第２０１，１８４号；米国特許第４，６８３，２０２号；同第４，５８２，７８８号；及び同第４，６８３，１９４号、これらは全て参照により本明細書中に組み込まれる）。
【０１１５】
Ｂ．エキソヌクレアーゼ抵抗性
多型部位に存在するヌクレオチドの正体を調べるために使用することができる他の方法は、特別なエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチド誘導体を利用する（米国特許第４，６５６，１２７号）。多型部位のすぐ３’側にあるアレル配列に相補的なプライマーは、研究対象下のＤＮＡとハイブリッド形成する。ＤＮＡにおける多型部位が、存在する特定のエキソヌクレオチド抵抗性ヌクレオチド誘導体と相補的であるヌクレオチドを含有する場合、誘導体はハイブリッド形成されるプライマーの末端にポリメラーゼにより組み込まれる。このような組み込みにより、プライマーがエキソヌクレアーゼ切断に対して抵抗性になり、それによってその検出が可能になる。エキソヌクレオチド抵抗性誘導体の正体が分かっているので、ＤＮＡの多型部位に存在する特異的ヌクレオチドを決定することができる。
【０１１６】
Ｃ．ミクロシークエンシング
ＤＮＡにおける多型部位をアッセイするためのいくつかの他のプライマー誘導性ヌクレオチド組み込み手段が記載されている（Ｋｏｍｈｅｒら、１９８９；Ｓｏｋｏｌｏｖ，１９９０；Ｓｙｖａｎｅｎ  １９９０；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙら、１９９１；Ｐｒｅｚａｎｔら、１９９２；Ｕｇｏｚｚｏｌｌら、１９９２；Ｎｙｒｅｎら、１９９３）。これらの方法は、多型部位において塩基と塩基とを区別するための標識付加デオキシヌクレオチドの組み込みによる。シグナルは組み込まれるデオキシヌクレオチド数に比例するので、同じヌクレオチドの分析中に生じる多型の結果、その分析の長さに比例するシグナルが得られる（Ｓｙｖａｎｅｎら、１９９０）。
【０１１７】
Ｄ．溶液中での伸長
仏国特許第２，６５０，８４０号及びＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号は、多型部位のヌクレオチドの正体を決定するための溶液ベースの方法を考察する。これらの方法に従い、多型部位のすぐ３’側にあるアレル配列に相補的なプライマーを使用する。その部位のヌクレオチドの正体は、多型部位のヌクレオチドと相補的である場合、プライマーの末端に組み込まれる標識化ジデオキシヌクレオチド誘導体を使用して決定される。
【０１１８】
Ｅ．ジェネティックビット（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ）分析又は固相伸長
ＰＣＴ出願第Ｗ０９２／１５７１２号は、標識化ターミネーター及び、多型部位の３’側の配列に相補的なプライマーの混合物を使用する方法を記載する。組み込まれる標識化ターミネーターは、評価している標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドに相補的であり、従って同定される。この方法では、このプライマー又は標的分子は固相に固定される。
【０１１９】
Ｆ．オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）
これは、異なる方法論を利用する別の固相法である（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、１９８８）。標的ＤＮＡの１本鎖の隣接配列とハイブリッド形成可能な２つのオリゴヌクレオチドを使用する。これらのオリゴヌクレオチドのうち一方が生合成され、その一方で他方が検出可能に標識される。的確な相補配列が標的分子中に見つけられる場合、オリゴヌクレオチドが、それらの末端が隣接し、ライゲーション基質を形成するように、ハイブリッド形成する。ライゲーションにより、アビジンを使用することによって標識化オリゴヌクレオチドの回収が可能となる。ＰＣＲと組み合わせた、この方法に基づく他の核酸検出アッセイも記載されている（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら、１９９０）。この方法では、標的ＤＮＡの指数関数的増幅を達成するためにＰＣＲを使用し、次いでＯＬＡを用いてこの標的ＤＮＡを検出する。
【０１２０】
Ｇ．リガーゼ／ポリメラーゼが介在するジェネティックビット（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ）分析
米国特許第５，９５２，１７４号は、標的分子の隣接配列に対してハイブリッド形成可能な２つのプライマーも含む方法を記載する。標的が固定された固体支持体上でハイブリッド形成生成物が形成される。ここで、１ヌクレオチド分のスペースによりプライマーが互いに分離されるようにハイブリッド形成が起こる。ポリメラーゼ、リガーゼ及び、少なくとも１つのデオキシヌクレオシド三リン酸を含有するヌクレオシド三リン酸混合物の存在下でこのハイブリッド形成生成物をインキュベートすると、隣接するハイブリッド形成オリゴヌクレオチドの何れかのペアのライゲーションが可能になる。リガーゼを添加すると、その結果、シグナル生成に必要な２つの事象である伸長及びライゲーションが起こる。これにより、伸長又は連結の何れかのみを使用する方法よりも特異性が高く、「ノイズ」が少なくなり、そしてポリメラーゼに基づくアッセイとは異なり、この方法では、シグナルを固相に連結させるための第二のハイブリッド形成及びライゲーション段階と組み合わせることによって、ポリメラーゼ段階の特異性が向上している。
【０１２１】
Ｈ．侵出開裂反応（Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ)
特定の遺伝多型について細胞ＤＮＡを評価するために、侵出開裂反応を使用することができる。ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）と呼ばれる技術はこのような反応を使用する（例えば、参照により組み込まれる、ｄｅ  Ａｒｒｕｄａら、２００２；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００３）。一般に、３種類の核酸分子がある：１）標的部位上流のオリゴヌクレオチド（「上流オリゴ」）、２）標的部位を包含するプローブオリゴヌクレオチド（「プローブ」）及び３）標的部位のある１本鎖ＤＮＡ（「標的」）。これらの上流オリゴ及びプローブは重複しないが、連続配列を含有する。プローブは、フルオレセインなどの供与体フルオロフォア及びダブシルなどのアクセプター色素を含有する。上流オリゴの３’末端のヌクレオチドは、プローブ−標的２量体の最初の塩基対と重複（「侵出」）する。次いで、構造特異的５’ヌクレアーゼによりプローブが切断され、フルオロフォア／クエンチャーペアの分離が起こり、検出できる蛍光量が増加する。Ｌｕら、２００４参照。
【０１２２】
一部の例では、固体表面上で又はアレイ方式でアッセイが行われる。
【０１２３】
Ｉ．ＳＮＰを検出するための他の方法
遺伝多型検出及び同定のためのいくつかの他の具体的方法を下記で与えるが、これらは、本発明におけるＯＤＣ１遺伝子の多型を同定することと組み合わせて、そのまま又は適切な改変を行って使用され得る。参照により本明細書中に組み込まれるＮＣＢＩのＳＮＰウェブサイト、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ａｔ  ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ上にもいくつかの他の方法が記載されている。
【０１２４】
特定の実施態様において、集団において任意の遺伝子座で拡張したハプロタイプを決定し得、これによって正確にどのＳＮＰが冗長であるか及びどれが関連研究に必須であるかを同定できるようになる。後者は「ハプロタイプタグＳＮＰ（ｈｔＳＮＰ）」と呼ばれ、連鎖不平衡の遺伝子又は領域のハプロタイプを捕捉するマーカーである。それぞれ、例示的方法として、参照により本明細書中に組み込まれるＪｏｈｎｓｏｎら（２００１）及びＫｅ及びＣａｒｄｏｎ（２００３）を参照のこと。
【０１２５】
ＶＤＡ−アッセイは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ試薬及び他の標準的反応条件を用いたロングＰＣＲ法によるゲノムセグメントのＰＣＲ増幅を利用する。長い増幅によって、約２，０００から１２，０００ｂｐの大きさのＤＮＡが増幅され得る。変異体検出用アレイ（ＶＤＡ）と産物とのハイブリッド形成は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒによって行い、コンピュータソフトウェアで分析することができる。
【０１２６】
チップアッセイと呼ばれる方法は、標準的又はロングＰＣＲプロトコールによるゲノムセグメントのＰＣＲ増幅を使用する。ハイブリッド形成産物は、ＶＤＡ（参照により本明細書中に組み込まれる、Ｈａｌｕｓｈｋａら（１９９９））により分析される。ＳＮＰは一般に、ハイブリッド形成パターンのコンピュータ分析に基づき、「確実」又は「可能性が高い」として分類される。ヌクレオチド配列決定などの代替的検出法との比較により、「確実」なＳＮＰは１００％確証され、「可能性が高い」ＳＮＰの場合、この方法によって確証されるのは７３％である。
【０１２７】
他の方法は、単に、関連制限酵素での消化後、ＰＣＲ増幅を含む。さらに他のものは、既知のゲノム領域からの精製ＰＣＲ産物の配列決定を含む。
【０１２８】
また別の方法において、個々のエクソン又は大きなエクソンの重複断片をＰＣＲ増幅する。プライマーは公開又はデータベース配列から設計し、次の条件を用いてゲノムＤＮＡのＰＣＲ−増幅を行う：２００ｎｇ  ＤＮＡテンプレート、プライマー各０．５μＭ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰ各８０μＭ、５％ホルムアミド、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、Ｔａｑポリメラーゼ０．５Ｕ及びＴａｑ緩衝液０．１体積。サーマルサイクリングを行い、様々な条件下、例えば１５％尿素入りで５％グリセロールを含むか又は含まない５又は１０％ポリアクリルアミドゲルでのＰＣＲ−１本鎖高次構造多型（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）分析によって、得られたＰＣＲ産物を分析する。電気泳動を一晩行う。移動変化を示すＰＣＲ産物を再増幅し、ヌクレオチド変異を同定するために配列決定する。
【０１２９】
ＣＧＡＰ−ＧＡＩ（ＤＥＭＩＧＬＡＣＥ）と呼ばれる方法において、配列及びアラインメントデータ（ＰＨＲＡＰ．ａｃｅファイルより）、配列ベースコールに対する品質スコア（ＰＨＲＥＤ品質ファイルより）、距離情報（ＰＨＹＬＩＰ  ｄｎａｄｉｓｔ及びｎｅｉｇｈｂｏｕｒプログラムより）及びベースコールデータ（ＰＨＲＥＤ’−ｄ’スイッチより）をメモリに加える。配列をアラインし、得られたアセンブリの各垂直チャンク（「スライス」）を不一致に対して調べる。このようなスライスは何れもＳＮＰ候補と考えられる（ＤＥＭＩＧＬＡＣＥ）。ＤＥＭＩＧＬＡＣＥでは、真の多型に当てはまる可能性が少ないスライスを排除するために多くのフィルターが使用される。これらには、（ｉ）隣接配列品質スコアが４０％以上低下する場合、所定スライス中の配列をＳＮＰの検討から除外する；（ｉｉ）ピーク幅がそのヌクレオチドタイプに対する全てのベースコールの１５パーセンタイル以下であるコールを除外する；（ｉｉｉ）コンセンサスとの不一致を多数有する配列領域を不適格とし、ＳＮＰ計算に加えない；（ｉｖ）コールされるピーク中でピーク面積の２５％以上を占める代替コールがある何れのベースコールも検討から除外する；（ｖ）ある１つの読み取り方向でのみ起こる変動を除外する、フィルターが含まれる。ＰＨＲＥＤ品質スコアをスライス中の各ヌクレオチドに対して誤識別値に変換する。標準ベイズ法を使用して、ある一定の位置でヌクレオチド異質性の証拠がある事後確率を計算する。
【０１３０】
ＣＵ−ＲＤＦ（ＲＥＳＥＱ）と呼ばれる方法において、各ＳＮＰに対する特異的プライマーを用いて、血液から単離されるＤＮＡからＰＣＲ増幅を行い、使用されなかったプライマー及び遊離ヌクレオチドを除去するための典型的なクリーンアッププロトコールの後、同じ又はネステッドプライマーを用いて直接配列決定を行う。
【０１３１】
ＤＥＢＮＩＣＫと呼ばれる方法において（方法−Ｂ）、クラスター化ＥＳＴ配列の比較分析を行い、蛍光を用いたＤＮＡ配列決定により確認する。ＤＥＢＮＩＣＫと呼ばれる関連法（方法−Ｃ）において、ミスマッチ部位でｐｈｒｅｄクオリティーが＞２０であり、ＳＮＰの５’−ＦＬＡＮＫ及び３’側の５塩基にわたり平均ｐｈｒｅｄクオリティーが≧２０で、ＳＮＰの５’及び３’側の５塩基でミスマッチがなく、各アレルの出現が少なくとも２回であるクラスター化ＥＳＴ配列の比較分析を行い、トレースを調べることにより確認する。
【０１３２】
ＥＲＯ（ＲＥＳＥＱ）により同定される方法において、電子公開されているＳＴＳに対して新しいプライマーセットを設計し、１０種類の様々なマウス系統からＤＮＡを増幅させるために使用する。次に、各系統からの増幅産物をゲル精製し、３３Ｐ−標識ターミネーターを用いた標準的なジデオキシ、サイクル配列決定技術を用いて配列決定する。次いでｄｄＡＴＰで停止した反応を全て、配列決定ゲルの隣接レーンに載せ、続いてｄｄＧＴＰ反応物全てを同様に載せる。放射線写真を目視で走査することによりＳＮＰを同定する。
【０１３３】
ＥＲＯ（ＲＥＳＥＱ−ＨＴ）として認識される別の方法において、電子公開されているマウスＤＮＡ配列に対して新しいプライマーセットを設計し、１０種類の様々なマウス系統からＤＮＡを増幅するために使用する。エキソヌクレアーゼＩ及びエビアルカリホスファターゼで処理することによって、各系統からの増幅産物を配列決定用に調製する。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて配列決定を行い、配列試料を３７００ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（９６キャピラリーシークエンサー）にかける。
【０１３４】
ＦＧＵ−ＣＢＴ（ＳＣＡ２−ＳＮＰ）は、プライマーＳＣＡ２−ＦＰ３及びＳＣＡ２−ＲＰ３を用いて、ＳＮＰ含有領域をＰＣＲ増幅した方法である。５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ  ＫＣｌ、０．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％ゼラチン、プライマー各２０ｐｍｏｌ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕの最終濃度を含有する５０ｍＬの反応体積でおよそ１００ｎｇのゲノムＤＮＡを増幅させる。試料を変性させ、アニーリングさせ、伸長させて、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアガロースゲルから切り出されたバンドからＰＣＲ産物を精製し、ＰＣＲプライマーを用いてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７自動ＤＮＡシークエンサー上でダイターミネーター化学法を用いて配列決定する。
【０１３５】
ＪＢＬＡＣＫ（ＳＥＱ／ＲＥＳＴＲＩＣＴ）として認識される方法において、ゲノムＤＮＡを用いて２種類の独立したＰＣＲ反応を行う。第一の反応由来の産物を配列決定により分析し、これによりユニークなＦｓｐＩ制限部位が示される。ＦｓｐＩで消化することにより第二のＰＣＲ反応産物において突然変異を確認する。
【０１３６】
ＫＷＯＫ（１）として記載される方法において、ダイターミネーター化学法を用いたＰＣＲ産物の直接ＤＮＡ配列決定による、無作為に選択した４個体の高品質ゲノム配列データを比較することによって、ＳＮＰを同定する（Ｋｗｏｋら、１９９６参照）。ＫＷＯＫ（２）として認識される関連法において、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）又はＰＩベースの人工染色体（ＰＡＣ）などの重複する大きなインサートクローン由来の高品質ゲノム配列データを比較することによって、ＳＮＰを同定する。次に、このＳＮＰを含有するＳＴＳを構築し、プールＤＮＡ配列決定により、様々な集団におけるＳＮＰの存在を確認する（Ｔａｉｌｌｏｎ−Ｍｉｌｌｅｒら、１９９８参照）。ＫＷＯＫ（３）と呼ばれる別の同様の方法において、重複する大きなインサートクローンＢＡＣ又はＰＡＣからの高品質のゲノム配列データを比較することによってＳＮＰを同定する。このアプローチにより見出されるＳＮＰは、２つのドナー染色体間のＤＮＡ配列変動に相当するが、一般集団におけるアレル頻度が決定されたことはない。方法ＫＷＯＫ（５）において、ダイターミネーター化学法でのＰＣＲ産物の直接ＤＮＡ配列決定によるホモ接合ＤＮＡ試料及び１以上のプールＤＮＡ試料の高品質ゲノム配列データを比較することによってＳＮＰを同定する。使用するＳＴＳは、一般利用可能なデータベースで見出される配列データから作製される。具体的に、全ての遺伝子座でホモ接合であることが示されている全胞状奇胎（ＣＨＭ）及び８０名のＣＥＰＨ親からのＤＮＡ試料に対するＰＣＲによりこれらのＳＴＳが増幅される（Ｋｗｏｋら、１９９４参照）。
【０１３７】
別のこのような方法であるＫＷＯＫ（ＯｖｅｒｌａｐＳｎｐＤｅｔｅｃｔｉｏｎＷｉｔｈＰｏｌｙＢａｙｅｓ）において、ラージインサートヒトゲノムクローン配列の重複領域の自動コンピュータ分析によりＳＮＰを発見する。データ取得のために、大規模配列決定センターから直接クローン配列を得る。これが必要であるのは、ベースクオリティー配列がＧｅｎＢａｎｋに存在しない／ＧｅｎＢａｎｋから入手不可能なためである。生データ処理には、整合性に対する、クローン配列及び付随するベースクオリティー情報の分析が含まれる。関連ベースクオリティー配列のない終了した（「ベースパーフェクト（ｂａｓｅ  ｐｅｒｆｅｃｔ）」、エラー率１０，０００ｂｐ中１未満）配列に一定のベースクオリティー値４０を割り当てる（エラー率１０，０００ｂｐ中１個）。ベースクオリティー値内のドラフト配列を除外する。処理した配列をローカルデータベースに入力する。マスクされる既知のヒトリピート配列がある各配列も保存する。リピートマスキングは、プログラム「ＭＡＳＫＥＲＡＩＤ」により行われる。重複検出：プログラム「ＷＵＢＬＡＳＴ」で推定重複を検出する。その後、偽の重複検出結果、即ち、真の重複ではなく、配列重複ゆえに生じるクローン配列ペア間の類似性を除外するために、いくつかのフィルタリング段階を行う。重複の全長、全体的類似度（パーセント）、ベースクオリティー値が高いヌクレオチド間で異なる配列数「ハイクオリティーミスマッチ」。結果は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒでのゲノムクローンの制限断片マッピングの結果、重複に関する完了者の報告及びＮＣＢＩでの配列コンティグ構築の取り組みの結果とも比較する。ＳＮＰ検出：「ＰＯＬＹＢＡＹＥＳ」ＳＮＰ検出ソフトウェアを用いて候補となるＳＮＰ部位に対してクローン配列の重複ペアを分析する。配列決定エラーに対立するものとして、真の配列変動を示す可能性について、配列ペア間の配列の相違をスコア化する。この過程には、両配列に対してベースクオリティー値が存在する必要がある。高スコア候補を抽出する。検索は置換型の一塩基変動に対して制限される。ＰＯＬＹＢＡＹＥＳソフトウェアにより候補ＳＮＰの信頼スコアを計算する。
【０１３８】
ＫＷＯＫにより識別される方法（ＴａｑＭａｎアッセイ）において、９０例のランダム個体に対して遺伝子型を決定するためにＴａｑＭａｎアッセイを使用する。ＫＹＵＧＥＮ（Ｑｌ）として識別される方法において、指定集団のＤＮＡ試料をプールし、ＰＬＡＣＥ−ＳＳＣＰにより分析する。プール分析における各アレルのピークの高さをヘテロ接合体におけるものにより補正し、続いてアレル頻度の計算に対して使用する。１０％より高いアレル頻度は、この方法によって高い信頼性をもって定量される。アレル頻度＝０（ゼロ）とは、個体間でアレルが見出されたが、プールの試験では対応するピークが見られないことを意味する。アレル頻度＝０−０．１とは、プールにおいてマイナーアレルが検出されるが、ピークが低すぎて信頼性をもって定量できないことを指す。
【０１３９】
ＫＹＵＧＥＮ（方法１）として識別されるさらに別の方法において、ＰＣＲ産物を蛍光色素で後標識し、ＳＳＣＰ条件下で自動キャピラリー電気泳動システムにより分析する（ＰＬＡＣＥ−ＳＳＣＰ）。一連の実験において、２種類のプールＤＮＡ（日本人プール及びＣＥＰＨ親プール）とともに又はそれらなしで４以上の個々のＤＮＡを分析する。目視によりアレルを同定する。遺伝子型が異なる個々のＤＮＡの配列決定を行い、ＳＮＰを同定する。ヘテロ接合体におけるピーク高を用いたシグナルバイアス補正後、プール試料においてピーク高からアレル頻度を推定する。ＰＣＲに対して、両鎖の後標識のためにプライマーの末端に５’−ＡＴＴ又は５’−ＧＴＴを有するようにタグの付加を行う。緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３又は９．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、プライマー各０．２５μＭ、ｄＮＴＰ各２００μＭ及び抗Ｔａｑ抗体と予め混合されているＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ０．０２５単位／Ｌを含有する反応混合液中でＤＮＡ試料（１０ｎｇ／ｕＬ）を増幅する。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片の交換反応により、ＰＣＲ産物の２本の鎖をＲ１１０及びＲ６Ｇで修飾されたヌクレオチドで別々に標識する。ＥＤＴＡ添加によって反応を停止させ、ウシ腸アルカリホスファターゼを添加することによって、取り込まれなかったヌクレオチドを脱リン酸化する。ＳＳＣＰの場合：蛍光標識ＰＣＲ産物及びＴＡＭＲＡ−標識内部マーカーのアリコートを脱イオン化ホルムアミドに添加し、変性させる。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてキャピラリーにおいて電気泳動を行う。データ回収及びデータ処理のためにＧｅｎｅｓｃａｎソフトウェア（Ｐ−Ｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる。ＳＳＣＰにおいて異なる遺伝子型を示したものを含む個々のＤＮＡ（２から１１）に対して、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０シークエンサーにおいてビッグダイターミネーター化学を用いて直接配列決定を行う。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０から得た複数の配列トレースファイルを処理し、Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐによりアラインし、Ｃｏｎｓｅｄ  ｖｉｅｗｅｒを用いて調べる。Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄソフトウェア及び目視によりＳＮＰを同定する。
【０１４０】
ＫＹＵＧＥＮとして認識されるさらに別の方法（方法２）において、変性ＨＰＬＣ（ＤＨＰＬＣ）又はＰＬＡＣＥ−ＳＳＣＰ（Ｉｎａｚｕｋａら、１９９７）により遺伝子型が異なる個体を探し、ＳＮＰを同定するためにそれらの配列を決定する。両鎖の後標識のためにそれらの末端で５’−ＡＴＴ又は５’−ＧＴＴによりタグ付加したプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＷＡＶＥ  ＤＮＡ断片分析システム（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を用いてＤＨＰＬＣ分析を行う。ＰＣＲ産物をＤＮＡＳｅｐカラムに注入し、ＷＡＶＥＭａｋｅｒプログラム（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を用いて決定された条件下で分離する。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片の交換反応により、ＰＣＲ産物の２本の鎖をＲ１１０及びＲ６Ｇで修飾されたヌクレオチドで別々に標識する。ＥＤＴＡ添加によって反応を停止させ、ウシ腸アルカリホスファターゼを添加することによって取り込まれなかったヌクレオチドを脱リン酸化する。ＳＳＣＰ後に、続いてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてキャピラリー中で電気泳動を行う。Ｇｅｎｅｓｃａｎソフトウェア（Ｐ−Ｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＤＨＰＬＣ又はＳＳＣＰにおいて異なる遺伝子型を示したものを含む個々のＤＮＡに対して、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０シークエンサーにおいてビッグダイターミネーター化学を用いて直接配列決定を行う。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０から得た複数の配列トレースファイルを処理し、Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐによりアラインし、Ｃｏｎｓｅｄ  ｖｉｅｗｅｒを用いて調べる。Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄソフトウェア及び目視によりＳＮＰを同定する。ＵｎｉｇｅｎｅにおけるＥＳＴ配列のトレースクロマトグラムデータをＰＨＲＥＤで処理する。可能性のあるＳＮＰを同定するために、各ＵｎｉｇｅｎｅクラスターについてプログラムＰＨＲＡＰ、ＢＲＯ及びＰＯＡによって生成された多重配列アラインメントから一塩基ミスマッチが報告される。ＢＲＯは、間違って報告される可能性があるＥＳＴ方向を補正し、一方ＰＯＡは、偽ＳＮＰを生じさせ得る遺伝子混合／キメラを指す非線形アラインメント構造を同定し、分析する。生クロマトグラム高、尖鋭度、重複及び間隔；配列決定エラー率；コンテクスト感受性（ｃｏｎｔｅｘｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）；ｃＤＮＡライブラリ起源などのデータを評価しながら、ベイズ推論を使用し、配列決定エラー、ミスアラインメント又は曖昧性、ミスクラスター化又はキメラＥＳＴ配列に対して真の遺伝多型に対する証拠を比較検討する。
【０１４１】
ＸＩＩＩ．製剤処方及び投与経路
本開示の治療用化合物は、様々な方法、例えば経口により又は注射（例えば皮下、静脈内、腹腔内など）により投与し得る。投与経路に依存して、活性化合物は、その化合物を不活性化し得る酸及びその他の天然の状態の作用から化合物を保護する材料中で被覆され得る。これらはまた、疾患又は創傷部位の連続かん流／点滴により投与し得る。
【０１４２】
非経口投与以外の方法により治療用化合物を投与するためには、その化合物の不活性化を防ぐための材料で化合物を被覆するか又は不活性化を防ぐための材料とともにその化合物を同時投与する必要があり得る。例えば、適切な担体、例えばリポソーム又は希釈剤中で本治療用化合物を患者に投与し得る。医薬的に許容可能な希釈剤としては、生理食塩水及び水性緩衝液溶液が挙げられる。リポソームとしては、水中油中水ＣＧＦ乳剤ならびに従来のリポソームが挙げられる（Ｓｔｒｅｊａｎら、１９８４）。
【０１４３】
本治療用化合物はまた、非経口、腹腔内、髄腔内又は脳内投与することもできる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中及び油中で分散液を調製し得る。通常の保管及び使用状態下で、これらの調製物には、微生物の増殖を防ぐための保存料が含有され得る。
【０１４４】
注射としての使用に適切な医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性である場合）又は分散液及び、滅菌水溶液又は分散液の即時調整のための滅菌粉末が挙げられる。全ての例において、組成物は滅菌状態でなければならず、容易にシリンジに吸い取ることができる程度に流動性がなければならない。これは、製造及び保管の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。例えば、レシチンなどの被覆を使用することによって、分散液の場合は要求される粒子サイズの維持によって及び界面活性剤の使用によって、的確な流動性を維持することができる。様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって微生物作用の防御を達成することができる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウム又はポリアルコール、例えばマンニトール及びソルビトールなど、を含むことが好ましいであろう。吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムを又はゼラチンを組成物中に含めることによって、注射用組成物の持続的吸収を行うことができる。
【０１４５】
滅菌注射溶液は、上述の成分の１つ又は組み合わせとともに、適切な溶媒中で、必要とされる量、治療用化合物を組み込み、続いて必要に応じてろ過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒及び上述のもののうち必要とされる他の成分を含有する滅菌担体に本治療用化合物を組み込むことにより調製する。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、その予めろ過滅菌した溶液から活性成分（即ち治療用化合物）＋何らかのさらなる望ましい成分の粉末が得られる真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１４６】
例えば不活性希釈剤又は吸収可能な可食担体とともに本治療用化合物を経口投与することができる。本治療用化合物及び他の成分を硬又は軟殻ゼラチンカプセルに封入するか、圧縮して錠剤にするか又は対象の食餌中に直接組み込むこともできる。経口による治療薬投与の場合、本治療用化合物を賦形剤とともに組み込み、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、縣濁液、シロップ剤、ウエハース剤などの形態で使用し得る。本組成物及び調製物中の治療用化合物のパーセンテージは、当然ではあるが変動し得る。このような治療上有用な組成物中の本治療用化合物の量は、適切な投与量が得られるようなものである。
【０１４７】
投与し易くし、投与量を均一にするために、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することは特に有利である。投与単位形態とは、本明細書中で使用される場合、治療しようとする対象に対して統一された投与量として適した物理的に個別化された単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体と結び付いて望ましい治療効果をもたらすように計算された所定量の治療用化合物を含有する。本発明の投与単位形態に対する規格は、（ａ）本治療用化合物及び達成しようとする特定の治療効果の独特の特徴及び（ｂ）患者における選択された状態の治療に対するこのような治療用化合物の化合の技術分野に固有の制限に左右され、これらに直接依存する。
【０１４８】
本治療用化合物は、皮膚、眼又は粘膜に局所投与することもできる。あるいは、肺への局所的送達が望ましい場合、乾燥粉末又はエアロゾル製剤中での吸入によって本治療用化合物を投与し得る。
【０１４９】
患者における状態に関連する状態を治療するのに十分な治療的有効投与量で活性化合物を投与する。例えば、実施例及び図面で示されるモデルシステムなど、ヒトにおける疾患の治療での有効性を予測し得る動物モデル系において化合物の有効性を評価することができる。
【０１５０】
対象に投与される本開示の化合物又は本開示の化合物を含む組成物の実際の投与量は、年齢、性別、体重、状態の重症度、治療される疾患のタイプ、以前の又は現在の治療的介入、対象の特発性疾患などの身体的及び生理学的因子ならびに投与経路により決定され得る。これらの因子は、熟練者により決定され得る。投与責任医師は一般的に組成物中の活性成分濃度及び個々の対象に対する適切な用量を決定する。何らかの合併症のイベントにおいて個々の医師により投与量が調整され得る。
【０１５１】
有効量は一般的に、１日１回以上の投与で、１日又は数日にわたり、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約７５０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇ、約１０．０ｍｇ／ｋｇから約１５０ｍｇ／ｋｇと変動する（当然ではあるが投与形式及び上記で論じた因子に依存する。）。他の適切な用量範囲としては、１ｍｇから１００００ｍｇ／日、１００ｍｇから１００００ｍｇ／日、５００ｍｇから１００００ｍｇ／日及び５００ｍｇから１０００ｍｇ／日が挙げられる。いくつかの特定の実施態様において、この量は１０，０００ｍｇ／日未満、７５０ｍｇから９０００ｍｇ／日の範囲である。
【０１５２】
有効量は、１ｍｇ／ｋｇ／日未満、５００ｍｇ／ｋｇ／日未満、２５０ｍｇ／ｋｇ／日未満、１００ｍｇ／ｋｇ／日未満、５０ｍｇ／ｋｇ／日未満、２５ｍｇ／ｋｇ／日未満又は１０ｍｇ／ｋｇ／日未満であり得る。あるいは、これは、１ｍｇ／ｋｇ／日から２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり得る。例えば、糖尿病患者の治療に関して、単位投与量は、未処置対象と比較した場合に血中グルコースを少なくとも４０％低下させる量であり得る。別の実施態様において、単位投与量は、非糖尿病対象の血糖値の±１０％であるレベルに血中グルコースを低下させる量である。
【０１５３】
他の非限定例において、用量はまた、投与１回あたり、約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重以上及びこれらにおいて導き出せる何らかの範囲も含み得る。本明細書中で列挙される数字から導き出せる範囲の非限定例において、約５ｍｇ／ｋｇ／体重から約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重から約５００ｍｇ／ｋｇ／体重などの範囲を上述の数字に基づき投与し得る。
【０１５４】
ある種の実施態様において、本開示の医薬組成物は、本開示の化合物を例えば少なくとも約０．１％含み得る。その他の実施態様において、本開示の化合物は、単位重量の約２％から約７５％の間又は約２５％から約６０％の間、例えばこれらにおいて導き出せる何らかの範囲を占め得る。
【０１５５】
薬剤の単回又は複数回投与が企図される。複数回投与量の送達のための望ましい時間間隔は、通常の実験のみを使用して、当業者により決定され得る。例として、対象におよそ１２時間の間隔で１日２回投与し得る。いくつかの実施態様において、薬剤を１日１回投与する。
【０１５６】
通常のスケジュールで薬剤を投与し得る。本明細書中で使用される場合、通常のスケジュールとは、予め定められた指定の期間を指す。通常のスケジュールは、このスケジュールが予め定められたものである限り、長さが同一であるか又は異なる期間を包含し得る。例えば、通常のスケジュールは、１日２回、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、毎週、毎月又はそれらの間の日数もしくは週数の何らかのセットを含み得る。あるいは、予め定められた通常スケジュールは、第１週に１日２回、次いで数ヶ月にわたり毎日などの投与を含み得る。その他の実施態様において、本発明は、薬剤が経口で摂取され得、そのタイミングが食物摂取に依存するか又は依存しないことを提供する。従って、例えば、対象がいつ食べたか、いつ食べるのかにかかわらず、薬剤が毎朝及び／又は毎夕摂取され得る。
【０１５７】
ＸＩＶ．併用療法
単一組成物又は両薬剤を含む医薬製剤を用いて又は、一方の組成物が本発明の化合物を含み、他方が第二の薬剤を含み、同時投与される２種類の個別の組成物もしくは製剤を使用して、有効な併用療法を達成し得る。あるいは、本治療薬を先に投与し、続いて分単位から月単位の範囲の間隔で他方の薬剤を投与し得る。
【０１５８】
様々な併用投与を使用し得るが、「Ａ」が第一の薬剤（例えば、ＤＦＭＯ）に相当し、「Ｂ」が第二の薬剤（例えばスリンダク）に相当するものとして、これらの非限定例を下記で述べる：
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ。
【０１５９】
ＸＶ．実施例
次の実施例は、本発明の好ましい実施態様を明らかにするために含まれる。当業者にとって当然のことながら、続く実施例で開示される技術は本発明の実施において良好に機能することが本発明者により発見された代表的技術を表し、従ってその実施に対する好ましい方式を構成すると考えられ得る。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施態様において多くの変更がなされ得、それでも本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、同様の結果を得ることができることを認識するであろう。
【０１６０】
実施例１−疫学的研究：ＣＲＣ特異的生存率とＯＤＣ＋３１６ＳＮＰとの関連
実験計画：本研究には、集団ベースのＵＣ  Ｉｒｖｉｎｅ  Ｇｅｎｅ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  ＣＲＣ（１９９４から１９９６年に診断、２００８年３月までフォローアップ）からの４４０例の偶発ＣＲＣ症例が含まれた。一次アウトカムは、ＯＤＣ遺伝子型（ＧＧ対ＡＡ／ＧＡ）によるＣＲＣ特異的生存率（ＣＲＣ−ＳＳ）であった。ヒト結腸癌細胞株において、ウエスタンブロッティング及びクロマチン免疫沈降（ＣＨＩＰ）アッセイを介してＥ−ボックス転写因子のＯＤＣアレル特異的結合を調べた。転写活性化因子ｃ−ＭＹＣ又は抑制因子ＭＡＤ１の何れかを発現するベクターと組み合わせてプロモーターコンストラクトを用いて、ＯＤＣアレル特異的プロモーター活性を調べた。
【０１６１】
結果：ＣＲＣ症例間の遺伝子型特異的生存率の相違は結腸癌症例に限定されており、ＯＤＣ  ＧＧ遺伝子型症例と比較して（ＨＲ＝１．００、基準値）、ＯＤＣ  ＧＡの場合、調整済みＣＲＣ−ＳＳハザード比（ＨＲ）は２．３１（１．１５−４．６４）であり、ＯＤＣ  ＡＡ症例の場合、３．７３（０．９３−１４．９９）であった（Ｐ−トレンド＝０．００６）。結腸癌細胞において、２個のＥ−ボックスが隣接するＯＤＣ＋３１６ＳＮＰは、ＯＤＣプロモーター活性を予測する。Ｅ−ボックス活性化因子−ＭＹＣ及び抑制因子ＭＡＤ１及びＭＡＤ４は、培養細胞において、メジャーＧ−、アレルと比較してマイナーＡ−に選択的に結合する。
【０１６２】
試験対象母集団。発明者らは、１９９４年から１９９６年の間に行われ、２００８年３月までフォローアップを行った、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｇｅｎｅ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｐｅｅｌら、２０００；Ｚｅｌｌら、２００７）に登録された侵襲性ＣＲＣの偶発症例について研究を行った。結腸直腸癌症例の大規模集団ベースコホートにおけるＨＮＰＣＣ発生率を調べるために親研究を計画した。２００８年４月のデータファイルを使用して、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｃｏｕｎｔｙ／Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌの集団ベースの癌登録を通じて参加者を特定した。親研究において（Ｐｅｅｌら、２０００）、１９９４年から１９９６年の間にＯｒａｎｇｅ  Ｃｏｕｎｔｙ、ＣＡで全年齢でＣＲＣと診断された対象全てを確認した。Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ及びＩｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｕｎｔｉｅｓ、ＣＡで１９９４年から１９９５年の間に＜６５歳で診断された対象全ても確認した。次に、対象が本研究にふさわしかった場合（確認時に生存しており、連絡先がある。）及びその対象の担当医師が連絡許可を拒否しなかった場合、その対象に連絡を取った。試験エントリー時に、対象は血液採取及び医学的情報の公開を許可する同意書に署名した。この研究は、ＵＣ  Ｉｒｖｉｎｅ治験審査委員会（＃９３−２５７）により承認を受けた。既に記載のように、地域癌登録データベースとの連携を通じて生命状態及びフォローアップを含む臨床及び人工統計学的データを得た（Ｐｅｅｌら、２０００；Ｚｅｌｌら、２００７；Ｚｅｌｌら、２００８）。腫瘍、結節、転移（ＴＮＭ）ステージ決定は、利用可能な場合は既存のＡＪＣＣコードであり、以前に報告されているように、疾患コードの範囲の変換によるものであった（Ｌｅら、２００８）。登録時に行った電話インタビュー中に第一度近親者中の癌の家族歴を自己報告により確認した（Ｚｅｌｌら、２００８；Ｚｉｏｇａｓ及びＡｎｔｏｎ−Ｃｕｌｖｅｒ、２００３）。Ａｍｓｔｅｒｄａｍ基準により判定した遺伝性非ポリポーシス結腸癌（ＨＮＰＣＣ）の２２例を同定し、本分析から除外した。ＣＲＣ診断から試験エントリー（即ち家族歴インタビューの日）までの時間の中央値は１６ヶ月であった（９５％ＣＩ  １２−２３ヶ月）。
【０１６３】
ＤＮＡ抽出物及びＯＤＣ＋３１６ＳＮＰ遺伝子型決定。製造者の説明書に従い、ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡＭｉｄｉ又はＭｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して２．０ｍＬの赤血球細胞クロット試料からＤＮＡを抽出した。＋３１６に多型塩基を含有する１７２ｂｐ断片を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＯＤＣ＋３１６ＳＮＰの遺伝子型決定を行った（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。異なる５’標識（６−カルボキシフルオレセイン又はＶＩＣ）及び同じ３’クエンチャー色素（６−カルボキシテトラメチルローダミン）を用いてアレル特異的ＴａｑＭａｎプローブを合成した（２３）。各ＰＣＲ反応液（全部で５μＬ）は、以前に報告されるとおり、１０ｎｇの参加者ＤＮＡ、プライマー各３０ｐｍｏｌ、ＴａｑＭａｎプローブ各１２．５ｐｍｏｌ及び１ｘＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含有した（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００３；Ｇｕｏら、２０００）。
【０１６４】
統計学的解析−集団ベース研究。ＯＤＣ  ＧＧ遺伝子型とＯＤＣ  ＧＡ／ＡＡ遺伝子型との推定１：１比に基づいて被験者数を決定した（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００３；Ｂａｒｒｙら．２００６；Ｈｕｂｎｅｒら、２００８；Ｇｕｏら、２０００）。ＵＣ  Ｉｒｖｉｎｅ  Ｇｅｎｅ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  ＣＲＣにおける１１５４例の結腸及び直腸癌症例からのデータの以前の分析から、１０年間のＣＲＣ特異的生存率が６６％と概算されたことが明らかになった（Ｚｅｌｌら、２００８）。発明者らは、発明者らの被験数計算に対して、ＯＤＣ遺伝子型のみに基づき、ＣＲＣ特異的生存率において１５％以上の差があるという考えを提示した。従って、８０％検出力で５％有意レベルで、提示した２群間の１０年ＣＲＣ特異的生存率の差：第１群で５５％であり第２群で７０％、を検出するために全部で３１５名の対象が必要があった。４８１検体のＤＮＡ試料のうち４４０検体の遺伝子型決定に成功した。４１検体（８．５％）では、ＤＮＡ濃度が低いこと及び／又はＤＮＡ品質が低いことによりＯＤＣ＋３１６遺伝子型を決定できなかったが、遺伝子型決定に成功した例と失敗した例との間で臨床病理学的な相違は認められなかった。従って、本研究は、主要エンドポイントに対処するのに十分に分析力が与えられている。
【０１６５】
ピアソンのカイ二乗検定又は名義変数に対するフィッシャーの正確確立検定及び連続変数に対するスチューデントのｔ検定を用いて、結腸及び直腸症例間の人口統計学的、臨床及び病理学的変数の比較を行った。結腸直腸癌特異的生存率は、ＣＲＣそれ自身による死亡として定義し、次の場合はデータ取得を打ち切った：フォローアップ終了時の生存、フォローアップ不能又はＣＲＣを除く何れかの原因による死亡。全生存期間（ＯＳ）は、あらゆる原因による死亡により定めた。カプラン・マイヤー法を用いて結腸及び直腸癌症例に対して生存曲線を作成し、単変量解析のためにログランク検定により分析した。診断からの時間を用いて、ＣＲＣ症例、結腸癌症例及び直腸癌症例の全てに対してコックス比例ハザードモデル法を行い、ＯＤＣ遺伝子型に基づく全体的及びＣＲＣ特異的死亡の調整済みリスクの概略を調べた。コックスモデルにおいて、次の共変量に対して調整して、生存におけるＯＤＣ遺伝子型（ＧＧ、ＧＡ又はＡＡ）の影響を分析した：年齢、性別、民族、ＣＲＣ家族歴、診断時のＴＮＭステージ、結腸内の腫瘍部位，組織学的サブタイプならびに外科手術、放射線療法及び化学療法による治療。ダミー変数を用いてこのモデルにおける各変数をコード化した。ＳＡＳ９．２統計ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて全分析を行った。両側Ｐ値＜０．０５の場合、統計学的有意とみなした。
【０１６６】
実施例２−実験的研究：結腸癌細胞におけるＯＤＣ＋３１６ＳＮＰ制御
細胞培養。マッコイ５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中でヒト結腸癌細胞株ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６を維持した。使用した培地は全て、１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補給した。３７℃で５％ＣＯ２の湿潤雰囲気中で培養物を維持した。
【０１６７】
遺伝子型決定アッセイ。ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６細胞からのＤＮＡ試料をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に供して、多型ＰｓｔＩ部位を検出した。次のプライマー：５’−ＴＣＴＧＣＧＣＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴ−３’（配列番号１）及び５’−ＴＴＴＣＣＣＡＡＣＣＣＴＴＣＧ−３’（配列番号２）を用いてＰＣＲにより配列を増幅させた。各反応液には、最終体積２５μＬ中、１μＬ  ＤＮＡ、プライマー各４ｐｍｏｌ、２ｘＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘｅｓ緩衝液「Ｇ」１２．５μＬ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ０．５単位が含有されていた。ＰＣＲ産物の予想サイズは３５１ｂｐであった。増幅後、３７℃で２時間、３０μＬ中で１０単位のＰｓｔＩにより１０から２０μＬのＰＣＲ産物を消化した。ＰｓｔＩ部位を含有するＨＴ２９細胞（ＧＡ）由来のＤＮＡから１５６及び１９５ｂｐの２つの断片が生じた。
【０１６８】
ウエスタンブロット分析。細胞を回収し、溶解させ、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でタンパク質を分離した。電気泳動によりＨｙｂｏｎｄ−Ｃメンブレン上にタンパク質を転写した。Ｂｌｏｔｔｏ  Ａ（ＴＴＢＳ溶液中５％ブロッキンググレード粉乳）によってメンブレンをブロッキング処理し、Ｂｌｏｔｔｏ  Ａ中で１：３００希釈した一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用いて調べた。４℃で一晩一次抗体をインキュベートし、次に適切なＨＲＰタグ付加二次抗体（１：１０００希釈）とともに室温にて１時間インキュベートした。ＥＣＬウエスタン検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて化学発光検出を行い、Ｂｉｏｍａｘ  ＸＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ）上で曝露した。
【０１６９】
クロマチン免疫沈降（ＣＨＩＰ）。製造者により推奨されるように、市販のキットを用いて、ＣＨＩＰアッセイを行った（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）。簡潔に述べると、細胞を１％ホルムアルデヒドで処理し、ＤＮＡ及びタンパク質を架橋し、超音波処理により２００から１０００ｂｐの間の長さになるようにＤＮＡ−タンパク質複合体を破壊した。プロテアーゼ阻害剤を含有する免疫沈降（ＩＰ）希釈緩衝液で細胞溶解液を１０倍希釈した。ｃ−ＭＹＣ、ＭＡＤ１及びＭＡＤ４に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を使用してクロマチンを沈殿させ、一方でさらなる試料を抗体なし（−Ａｂ）対照群とした。試料を回転させながら４℃で一晩免疫沈降させた。６０μＬのサケ精子ＤＮＡ／プロテインＡアガローススラリーを添加し、回転させながら４℃で１時間インキュベートして、続いて穏やかに遠心分離（１０００ｒｐｍ、１分）することによって、免疫複合体を得た。プロテインＡアガロースペレットを低塩緩衝液、高塩緩衝液、ＬｉＣｌ緩衝液及びＴＥ緩衝液で洗浄した。次いで、２５０μＬの溶出緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、１％ＳＤＳ）を２回添加することによって複合体を溶出し、投入ＤＮＡ及び−Ａｂ  ＤＮＡ対照を含め、全試料に対して６５℃で４時間加熱することによって、０．２Ｍ  ＮａＣｌを用いてＤＮＡ−タンパク質架橋を無効にした。３０μＬのｄｄＨ２Ｏ中でＤＮＡを再懸濁した。ＰＣＲ産物及びその大きさを視覚化するために、標準的ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲのために使用されるＯＤＣプライマーの配列は５’−ＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＧＧＴ−３’（配列番号３）（１７ｍｅｒ）及び５’−ＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＡ−３’（配列番号４）（１７ｍｅｒ）であった。ＡＢＩ７７００配列検出システム上でＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行った。相対的結合の計算に関する詳細は、製造者のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）で見ることができる。
【０１７０】
一過性形質移入。補足ファイル中で詳述されるように製造者のプロトコールに従い、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて一過性形質移入を行った。ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９細胞に対して、０．０１μｇのウミシイタケ−ＴＫプラスミドとともに１μｇのｐＧＬ３−ＯＤＣ／Ａ又はｐＧＬ３−ＯＤＣ／Ｇプラスミドにより形質移入を行った（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００３）。ウミシイタケ−ＴＫプラスミドはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入し、全てのプロモーター−レポーター形質移入実験において形質移入効率対照群として使用した。ｃ−ＭＹＣ実験の場合、ＯＤＣ  ｐＧＬ３−プラスミドをｐｃＤＮＡ３．０又はＣＭＶ−ｃ−ＭＹＣ発現ベクターの何れかと同時形質移入した（ＯｒｉＧｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）。ＭＡＤ１実験の場合は、ＯＤＣプラスミドをｐｃＤＮＡ３．１又はｐｃＤＮＡ−ＭＡＤ１の何れかと同時形質移入した。ｃ−ＭＹＣ及びＭＡＤ１同時形質移入に対して、ｐＧＬ３ベクターにクローニングしたＯＤＣ遺伝子の最初の１．６ｋｂを含有するＯＤＣプロモーターレポーターコンストラクトを調製した。このコンストラクトには、Ｅ−ボックス１（−４８５から−４８０ｂｐ）インタクト（ｗｔＥ−ボックス１）又は欠失（ｍｕｔＥ−ボックス１）が含まれた。さらに、＋３１６ＯＤＣ  ＳＮＰの両変異体を使用し、全部で４種類の異なるコンストラクトを作製した。インキュベート６時間後、２０％ＦＢＳを含有する完全培地を細胞に補充し、一晩増殖させた。翌日、形質移入後、２０％ＦＢＳ−含有完全培地から１０％ＦＢＳ−含有培地に置き換えた。形質移入から４８時間後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ緩衝液中で溶解させた。製造者により記載のようにＴｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ＴＤ−２０／２０照度計を用いて二重ルシフェラーゼ活性を測定し、相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として示した。３つ組みで実験を行い、少なくとも２回繰り返した。
【０１７１】
統計学的解析−実験的研究。一過性形質移入実験の場合、２試料ｔ検定を使用した（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）。第一のＥ−ボックスエレメントの有無が異なるＯＤＣプロモーターコンストラクト：（ａ）野生型（ｗｔ）Ｅ−ボックス１＋３１６Ｇ、（ｂ）突然変異体（ｍｕｔ）Ｅ−ボックス１＋３１６Ｇ、（ｃ）ｗｔＥ−ボックス１＋３１６Ａ及び（ｄ）ｍｕｔＥ−ボックス１＋３１６Ａを用いて、ＨＴ２９結腸癌細胞中でＯＤＣアレル特異的プロモーター活性に対するｃ−ＭＹＣ発現の影響を調べた。各プロモーターコンストラクトに対して、ｐｃＤＮＡ３．０プラスミドを同時形質移入した細胞とＣＭＶ−ｃ−ＭＹＣ発現ベクターで形質移入した細胞との間で、２試料ｔ検定を使用してプロモーター活性を比較した。同様に、ＯＤＣアレル特異的プロモーター活性に対するＭＡＤ１発現の影響を調べるために、２試料ｔ検定を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドを同時形質移入したプロモーターコンストラクトのプロモーター活性の効果とｐｃＮＡ−ＭＡＤ１プラスミドで形質移入したものの効果とを比較した。両側Ｐ値＜０．０５の場合、統計学的に有意とみなした。
【０１７２】
実施例３−ＯＤＣ１遺伝子型の異なる影響
本研究は、多施設第ＩＩＩ相結腸腺腫予防試験由来の患者データの分析を含む（Ｍｅｙｓｋｅｎｓら、２００８）。３７５名の患者が登録され、２６７名の患者において試験終了時の大腸内視鏡検査を完了した後、Ｄａｔａ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｏａｒｄ（ＤＳＭＢ）により中止された（試験がその有効性エンドポイントに達したため）。ＤＳＭＢは全ての安全性及び有効性エンドポイントを監視した。ＯＤＣ１  ＳＮＰの重要性を示すデータ（２）に照らしてプロトコールを改変した場合、２００２年１１月以降、遺伝子型決定分析のために２２８名の同意のある試験患者において血液標本を回収した（この日付前にランダム化した２４６名の患者のうち１５９名及びこの日付の後にランダム化した１２９名の患者のうち６９名を含む。）。既に記載されるように（Ｇｕｏら、２０００）、アレル特異的ＴａｑＭａｎプローブを用いて患者由来ゲノムＤＮＡに対してＯＤＣ１（ｒｓ２３０２６１５）遺伝子型決定を行った。無作為に選択した８検体の直腸粘膜生検標本のうち３検体を使用して、既に記載されるように（Ｍｅｙｓｋｅｎｓら、１９９８；Ｓｅｉｌｅｒ及びＫｎｏｄｇｅｎ、１９８０）直腸組織ポリアミン含量を調べた。２５％から４５％の範囲の反応値に対して組織ポリアミン反応を行った。
【０１７３】
優性モデル：ＡＡ／ＧＡ対ＧＧ患者下でＯＤＣ１遺伝子型を分析した。２つの遺伝子型群にわたる非正規分布する連続変数においてウイルコクスン順位和検定を行った。カイ二乗検定又はフィッシャーの正確確率検定を使用して、ベースラインカテゴリー変数と遺伝子型群との間の関連性を評価した。遺伝子型相互作用によって、予測因子：治療群、年齢、性別、人種（白人対その他）、アスピリン使用、ＯＤＣ１遺伝子型（優性モデルにおける）及び治療に相当する項とともに主要エンドポイント（腺腫再発）において対数二項分布回帰を行った。副次評価項目（直腸組織ポリアミン反応、毒性）に対して、完全対数二項分布モデルを用いて、治療群、遺伝子型及び治療と遺伝子型との間の相互作用の影響を調べた。ＳＡＳ９．２統計ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて統計学的解析を行った。患者は、臨床試験組み入れ及び標本採取／分析に対するインフォームドコンセントに署名した。この研究は、ＵＣ  Ｉｒｖｉｎｅ治験審査委員会（ＩＲＢ治験実施計画書＃２００２−２２６１）による全員参加の委員会審査及び参加試験施設の各地域ＩＲＢによる審査後、承認を受けた。
【０１７４】
ＯＤＣ１遺伝子型分布は：１２６ＧＧ（５５％）、８７ＧＡ（３８％）及び１５ＡＡ（７％）であった。ベースラインの臨床的特徴から、表１で示されるように相違が明らかになった。完全回帰モデルでの調整後の治療に関連する腺腫再発に対する相対リスク（ＲＲ）は０．３９であった（９５％ＣＩ  ０．２４−０．６６）。プラセボ又は治療薬の投与を受けている患者において、それぞれＯＤＣ１  ＧＧ患者では２３％対２２％で、ＯＤＣ１  ＧＡ患者では２０％対２１％で、ＯＤＣ１  ＡＡ患者では０％（７名中０）対５７％（７名中４名）で聴器毒性が起こった。
【０１７５】
実施例４−食事性ポリアミン摂取分析
患者集団、親研究の説明。この研究は、他所に記載のような、多施設結腸腺腫予防試験からの患者データ及び標本の分析を含む。Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ＦＬ，ＭｃＬａｒｅｎ  Ｃ．Ｅ．、Ｐｅｌｏｔ  Ｄ．，Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｓ．ら：Ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｐｌｕｓ  ｓｕｌｉｎｄａｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｍａｓ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｔｒｉａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １：３２−３８，２００８。これは、結腸直腸腺腫の病歴がある患者における、スリンダク１５０ｍｇの連日投与と組み合わせたＤＦＭＯ５００ｍｇの連日投与対プラセボのランダム化二重盲検、プラセボ比較第ＩＩｂ相臨床試験として開始され、その後２００３年に第ＩＩＩ相臨床試験へと拡大された。３７５名の患者をランダム化して、ＤＦＭＯ及びスリンダク又はプラセボの何れかを投与した。試験施設及び以前の低用量アスピリン使用について層別化を行った。計画した治療期間は３６ヶ月であった。ベースライン及び試験終了時に内視鏡検査を行い、８検体の直腸粘膜組織生検をそれぞれ入手した。ベースラインインタビュー時に臨床データを回収し、試験チャートに記録した。試験開始時に患者が記入した食物摂取頻度調査票を回収した。２回目の中間解析時に臨床有効性エンドポイントが達成されたので本研究は中止され、従って、２６７名の患者が本臨床試験を完遂した。Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ＦＬ，ＭｃＬａｒｅｎ  Ｃ．Ｅ．，Ｐｅｌｏｔ  Ｄ．，Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｓ．ら．：Ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｐｌｕｓ  ｓｕｌｉｎｄａｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｍａｓ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｔｒｉａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １：３２−３８，２００８。
【０１７６】
食事性ポリアミン摂取。Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ食物摂取頻度調査票（ＦＦＱ）を用いて、この臨床試験における参加者の食事性摂取を推定したが、この手段に対する解析アルゴリズムは他所で公開されている。Ｋｒｉｓｔａｌ  ＡＲ，Ｓｈａｔｔｏｃｋ，Ａ．Ｌ．及びＷｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｅ．：Ｆｏｏｄ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｅｔ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  １７ｔｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｄａｔａｂａｎｋ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，１９９２．，１９９２；Ｓｃｈａｋｅｌ  ＳＦ，Ｂｕｚｚａｒｄ，Ｉ  Ｍ．及びＧｅｂｈａｒｄｔ，Ｓ．Ｅ．：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｖａｌｕｅｓ  ｆｏｒ  ｆｏｏｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｄａｔａｂａｓｅ．Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｃｏｍｐ  Ａｎａｌ  １０：１０２−１４，１９９７。このＦＦＱに列挙される３７０種類の食品中の食事性ポリアミンを推定するために、ポリアミン食品含量データベースを開発し、ＦＦＱと連結し、Ｚｏｕｍａｓ−Ｍｏｒｓｅらにより記載されるように、このためにＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＣＣ）Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｄａｔａｂａｓｅを食品含量データの主な情報源とした。Ｚｏｕｍａｓ−Ｍｏｒｓｅ  Ｃ，Ｒｏｃｋ  ＣＬ，Ｑｕｉｎｔａｎａ  ＥＬら：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｉｎｔａｋｅ．Ｊ  Ａｍ  Ｄｉｅｔ  Ａｓｓｏｃ  １０７：１０２４−７，２００７。個々の食品中のスペルミン、スペルミジン及びプトレッシンに対する値を計算し、ｎｍｏｌ／ｇとして表した。食事性プトレッシンは総食事性ポリアミン摂取に対する主要な寄与因子であった。１日の総食事性ポリアミン含量は、食事性プトレッシン、スペルミン及びスペルミジンを添加することに由来し、最上位（７５から１００％）４分の１の群と下位４分の３の群（０から２５、２５から５０及び５０から７５％）にさらに分類した。この分析において結果をエネルギーで調整した。
【０１７７】
組織ポリアミン分析。以前に記載のように直腸組織ポリアミン含量を調べた。Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ＦＬ，Ｇｅｒｎｅｒ  ＥＷ，Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｓら：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｏｎ  Ｒｅｃｔａｌ  Ｍｕｃｏｓａｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９０：１２１２−１２１８，１９９８；Ｂｏｙｌｅ  ＪＯ，Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ＦＬ，Ｊｒ．，Ｇａｒｅｗａｌ  ＨＳら：Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ  ｉｎ  ｒｅｃｔａｌ  ａｎｄ  ｂｕｃｃａｌ  ｍｕｃｏｓａｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｒａｌ  ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  １：１３１−５，１９９２、両者とも本明細書中に参照により組み込まれる。無作為に選択した８検体の直腸粘膜生検標本のうち３検体を用いてポリアミン含量を評価した。これらの方法により、プトレッシン、カダベリン、ヒスタミン、スペルミジン、スペルミンならびに、プトレッシン、スペルミジン及びスペルミンのモノアセチル誘導体を測定した。腫瘍のない直腸生検組織を回収し、氷冷生理食塩水をフラッシュし、−８０℃で凍結保存した。試料を処理し、次いで内部標準として１，７−ジアミノヘプタンを用いて逆相高速液体クロマトグラフィーによりポリアミン含量についてアッセイした。Ｓｅｉｌｅｒ  Ｎ，Ｋｎｏｄｇｅｎ  Ｂ：Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｍｏｎｏａｃｅｔｙｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２２１：２２７−２３５，１９８０、これは本明細書中に参照により組み込まれる。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて各試料中のタンパク質含量を測定した。ｎｍｏｌポリアミン／ｍｇタンパク質としてデータを表した。
【０１７８】
統計学的解析。年齢、性別、民族、アスピリン使用歴及びポリープの位置、大きさ及び組織学などの変数の記述的分析を行った。ポリープの大きさ及び組織学的なグレードを考慮に入れた進行性腺腫と呼ばれる変数を生成し、絨毛性組織構造があるか又は大きさ＞１ｃｍの何れの腺腫も進行性腺腫として分類されるようにした。食事性及び組織ポリアミンデータが正規分布しなかったので、最大と低食事性ポリアミン摂取群における数字データの比較のためにノンパラメトリックのウィルコクスン順位和検定を使用した。最大低食事性ポリアミン摂取群と低食事性ポリアミン摂取群における名義データの比較のために独立性に対するカイ二乗検定を使用した。スピアマン順位相関係数（ｒｓ）を使用して、ベースライン時の食事性ポリアミン摂取とタンパク質摂取、動物由来タンパク質及びアルギニンとの間の関係を評価した。ロジスティック回帰モデルを使用して、異時性腺腫の再発リスクを計算した。ロジスティック回帰を使用して、異時性腺腫の再発リスクを推定した。結果変数として異時性腺腫の存在を用いてモデルを形成し、予測因子には、食事性ポリアミン群、ＤＦＭＯ＋スリンダク（対プラセボ）による治療、低用量アスピリンの使用（対照なし）及び食事性ポリアミン群と治療との間の相互作用に相当する項が含まれた。統計学的解析は全て、ＳＡＳ９．２統計ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて行った。
【０１７９】
倫理的配慮。この研究には、第ＩＩＩ相結腸直腸腺腫予防の親試験からのデータ及び組織の分析が含まれた。Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ＦＬ，ＭｃＬａｒｅｎ  Ｃ．Ｅ．，Ｐｅｌｏｔ  Ｄ．，Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｓ．ら：Ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｐｌｕｓ  ｓｕｌｉｎｄａｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｍａｓ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｔｒｉａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １：３２−３８，２００８、これは本明細書中に参照により組み込まれる。親試験は、ＵＣ  Ｉｒｖｉｎｅ治験審査委員会（ＩＲＢ治験実施計画書＃２００２−２２６１）による全員参加の委員会審査及び参加試験施設の各地域ＩＲＢによる審査後、承認を受けた。全患者が、試験への組み入れ及び研究目的での標本採取／分析に対するインフォームドコンセントに署名した。
【０１８０】
本試験母集団の特徴。食事性ポリアミンデータは、３７５名のベースライン試験患者のうち２２２名及び試験終了時の大腸内視鏡検査を完了した患者２６７名のうち１８８名について入手可能であった。本試験母集団の臨床的特徴を表５で示す。患者群は年齢、性別、人種／民族、アスピリン使用、以前のポリープ数、ポリープ歴及びポリープ部位が同様であった。本試験母集団の平均年齢は試験エントリー時に６０歳±８歳標準偏差（ＳＤ）であり、４７歳から７５歳の範囲であった。患者のうち多くの割合が男性であり［１６４（７４％）］、それに対して女性は５８名（２６％）であった。多くの患者が非ヒスパニック系白人［１９２（８６％）］であり、続いてヒスパニック系［１２（５％）］、アフリカ系アメリカ人［８（４％）］及びアジア系アメリカ人［７（３％）］であった。９３名の患者（４２％）から低用量アスピリン使用歴があることが報告され、それに対して１２９名がアスピリン未使用者（５８％）であった。９３名の患者（４２％）においてはベースライン時の腺腫が１個のみであり、ベースライン時ポリープ総数は１から１６個の範囲であった。次のポリープタイプが報告された：管状腺腫１７０例（７７％）、管状絨毛腺腫３０例（１３％）、未分類腺腫１３例（６％）、絨毛腺腫６例（３％）、上皮内癌腫２例（＜１％）及び高度異形成の腺腫１例（＜１％）。ポリープ部位が次のように報告された：直腸（ｎ＝４３、１９％）、左結腸（ｎ＝８７、３９％）、横行結腸（３１、１４％）、右結腸（３５、１６％）及び盲腸（２６、１２％）。
【０１８１】
ベースライン時の食事性ポリアミン及び選択される臨床的特徴。１日の総食事性ポリアミン摂取の中央値は２３３，２６１ｎｍｏｌ／日（４８，６９２から７４０，４４６の範囲）であった。上位４分の１の患者は、３１８，０１６ｎｍｏｌポリアミン／日を超える報告をした者であった（他は全て低ポリアミン摂取群として分類した。）。タンパク質の１日の総摂取量（全栄養源から）、動物由来タンパク質及びアルギニンの中央値はそれぞれ７２．８ｇ、５１．８ｇ及び４．０ｇであった。ベースライン時、１日の総タンパク質摂取量（ｒｓ＝０．６２、Ｐ＜０．０００１；図１２）、１日の総動物由来タンパク質摂取量（ｒｓ＝０．４９、Ｐ＜０．０００１）及び１日の総アルギニン摂取量（ｒｓ＝０．６４、Ｐ＜０．０００１；図１３）で１日の総食事性ポリアミン摂取量を補正した。食事性アルギニン摂取量は個々の食事性ポリアミン成分スペルミン（ｒｓ＝０．９０、Ｐ＜０．０００１）及びスペルミジン（ｒｓ＝０．７４、Ｐ＜０．０００１）とよく相関し、食事性プトレッシンとの相関はそれほど大きくなかった（ｒｓ＝０．４４、Ｐ＜０．０００１）。
【０１８２】
低食事性ポリアミン群におけるベースライン時のポリープの平均数は２．６１（±２．３２ＳＤ）であり、これに対して最大食事性ポリアミン群では２．４１（±１．９０ＳＤ）であり、これは有意ではなかった（Ｐ＝０．９８）。ベースライン時に、最大食事性ポリアミン群で１ｃｍを超える腺腫（４３．６％対２６．４％；Ｐ＝０．０１６）、より高グレードの腺腫（３２．７％対２０．４％Ｐ＝０．０６０）の割合がより大きく、進行性腺腫の割合がより高かった（５２．７％対３５．９％；Ｐ＝０．０２８）。左側腺腫（対右）は、最大食事性ポリアミン群（４９％）に対して、低食事性ポリアミン群（６１．１％）内の患者間でより多かったが、この相違は統計学的に有意ではなかった（表６）。
【０１８３】
食事性ポリアミン摂取及び直腸組織ポリアミン。ベースライン時に、平均直腸組織スペルミジン及びスペルミンレベルは低食事性ポリアミン群の患者間でより低かった（表３）。平均組織スペルミジンレベルは、２．４９対２．９５ｎｍｏｌ／ｍｇ（Ｐ＝０．０２４）であり、平均スペルミンレベルは、低及び最大食事性ポリアミン群の患者に対してそれぞれ７．９０対８．９２ｎｍｏｌ／ｍｇ（Ｐ＝０．０３９）であった。２つの食事性ポリアミン群にわたり、プトレッシン又はスペルミジン：スペルミン比の組織レベルにおいて統計学的有意差はなかった（表７）。
【０１８４】
食事性ポリアミン及びポリープ再発における治療効果。発明者らの本研究の主要な目的は、腺腫再発における食事性ポリアミンとＤＦＭＯ＋スリンダクによる治療との間の相互作用を分析することであった。食事性ポリアミン摂取データが入手可能であり、試験終了時の大腸内視鏡検査結果がある完全な試験データを有する１８８名の患者において分析を行い、ポリープ再発に対する影響を評価した。異時性ポリープ再発に対するロジスティック回帰モデルにおいて、食事性ポリアミン群と治療との間の相互作用に相当する項とともに、治療群（ＤＦＭＯ＋スリンダク対プラセボ）、アスピリン使用及び食事性ポリアミン摂取群を予測因子として使用した。全患者間で、ＤＦＭＯ＋スリンダクでの治療と異時性腺腫リスクがある食事性ポリアミン群との間で有意な相互作用が認められた（Ｐ＝０．０１）。リスク推定値は、下位４分の３の食事性ポリアミン群全体の患者に対して同様であり、従って最終分析（ｎ＝１８８）は２つのポリアミン摂取群とした。発明者らは、低食事性ポリアミン群でＤＦＭＯ＋スリンダクでの治療による異時性腺腫の有意なリスク低下が認められたが（対プラセボ）［ＲＲ、０．１９；９５％ＣＩ  ０．０９−０．４０；Ｐ＜０．０００１］；最大食事性ポリアミン群ではプラセボと比較して治療による差は認められなかった［ＲＲ、１．０４；９５％ＣＩ、０．３２−３．３６；Ｐ＝０．９４］。低食事性ポリアミン群において、次のエンドポイントに関してＤＦＭＯ＋スリンダク治療について有意なリスク低下が認められた（対プラセボ）：大きな腺腫［ＲＲ、０．１１；９５％ＣＩ、０．０１−０．８８；Ｐ＝０．０３］、高悪性度腺腫［ＲＲ、０．０９；９５％ＣＩ、０．０１−０．７１；Ｐ＝０．０２］及び進行性腺腫［ＲＲ、０．０６；９５％ＣＩ、０．００８−０．４４；Ｐ＝０．００５］（表８）。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【０１８５】
本明細書中で開示及び主張される方法は全て、本開示に照らして不用な実験を行うことなく、為され、実行され得る。好ましい実施態様に関して本発明の方法を説明してきたが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本方法に対して及び本明細書中に記載の方法の段階において又は段階の順序において、変更が適用され得ることは当業者にとって明らかである。より具体的には、同じ又は同様の結果を達成しながら、化学的及び生理学的に関連するある一定の物質で本明細書中に記載の物質を置き換え得ることが明らかとなろう。当業者にとって明らかなこのような同様の代替物及び変形は全て、付属の特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の精神、範囲及び概念内に包含されるものとする。
【０１８６】
参考文献
次の参考文献は、それらが、本明細書に記載のものに対する補足となる例示的な手法的又はその他の詳細を提供する程度に、具体的に参照により本明細書中に組み込まれる。
米国特許第３，６４７，８５８号
米国特許第３，６５４，３４９号
米国特許第４，３３０，５５９号
米国特許第４，４１３，１４１号
米国特許第４，５８２，７８８号
米国特許第４，６５６，１２７号
米国特許第４，６８３，１９４号
米国特許第４，６８３，２０２号
米国特許第５，８１４，６２５号
米国特許第５，８４３，９２９号
米国特許第５，９５２，１７４号
米国特許第６，２５８，８４５号
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Ｂａｂｂａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８（４８）：４７７６２−４７７７５，２００３．
Ｂａｒｒｙら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９８（２０）：１４９４−５００，２００６．
Ｂｅｄｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（９）：１８１１−１８１６，１９９５．
Ｂｅｌｌｏｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：７８０４−８，１９９３．
Ｂｕｓｓｅｙ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１２（１）：１７５−６．１９９０
Ｃｈｉｌｄｓら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，６０：１３９４−１４０６，２００３．
ｄｅ  Ａｒｒｕｄａら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，２（５）：４８７−４９６，２００２．
Ｄｅｒｙｎｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２９：１１７−２９，２００１．
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欧州出願第２０１，１８４号
欧州出願第２３７，３６２号
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Ｆｕｌｔｚ及びＧｅｒｎｅｒ，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，３４：１０−８，２００２．
Ｇｅｒｎｅｒ及びＭｅｙｓｋｅｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，４：７８１−９２．，２００４．
Ｇｅｒｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｏｉｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．，３：３２５−３３０，１９９４．
Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（５７）：１９９−２０１，１９９７．
Ｇｕｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０（２２）：６３１４−６３１７，２０００．
Ｈａｌｕｓｈｋａら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２２（３）：２３９−２４７，１９９９．
Ｈａｎｉｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，（５２）：２３７−２４５，１９９６．
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Ｉｎａｚｕｋａら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，７（１１）：１０９４−１１０３，１９９７．
Ｉｗａｍｏｔｏら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２１：１９３５−４０，２０００．
Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２９（２）：２３３−２３７，２００１．
Ｋｅ及びＣａｒｄｏｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１９（２）：２８７−２８８，２００３．
Ｋｅｌｌｅｒ及びＧｉａｒｄｉｅｌｌｏ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２（４  Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ１４０−９，２００３．
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Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１１４３−１１４７，１９９１．
Ｋｗｏｋ及びＣｈｅｎ，Ｃｕｒｒ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，Ａｐｒ；５（２）：４３−６０，２００３．
Ｋｗｏｋら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２３（１）：１３８−１４４，１９９４．
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Ｋｗｏｋら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３１（１）：１２３−６，１９９６．
Ｌａｄｅｎｈｅｉｍら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０８：１０８３−１０８７，１９９５．
Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７−１０８０，１９８８．
Ｌａｎｚａら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ，１５５：１３７１−１３７７，１９９５．
Ｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．，１７：１９５０−６２，２００８．
Ｌｉｐｋｉｎ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ，２８−２９：１４４−７，１９９７．
Ｌｉｐｐｍａｎ，Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｏｎｃｏｌ，３（１０）：５２３，２００６．
Ｌｏｖｅら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８５：７３２−７，１９９３．
Ｌｕら、Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ．，３（６）：１５４４−５６，２００４．
Ｌｕｋ及びＢａｙｌｉｎ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１１（２）：８０−８３，１９８４．
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Ｚｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．Ｒｅｓ．，２（３）：２０９−１２，２００９．
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Ｚｅｌｌら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２０：４５９−６８，２００７．
Ｚｉｏｇａｓ及びＡｎｔｏｎ−Ｃｕｌｖｅｒ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｒｅｖ．Ｍｅｄ．，２４：１９０−８，２００３．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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