(57)【要約】本発明は、ｐＨ安定化されたＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質及び骨形成タンパク質を含むシステインノットタンパク質の処方物を提供する。特に、本発明は、ある緩衝液が、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質及び骨形成タンパク質を含むシステインノットタンパク質の安定性を増強するという観察結果に関する。特に、本明細書中で開示されるのは、処方物のｐＨを安定化させるためにグリシルグリシン及び酒石酸緩衝液を用いて調製された液体及び凍結乾燥処方物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成タンパク質及び水性グリシルグリシン緩衝液を含む溶液。
【請求項２】
前記骨形成タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６及びＧＤＦ−７から選択される、請求項１記載の溶液。
【請求項３】
前記溶液のｐＨが約２．５〜約４．０である、請求項１記載の溶液。
【請求項４】
前記溶液のｐＨが、約２．８〜約３．５である、請求項１記載の溶液。
【請求項５】
前記溶液のｐＨが、約２．８〜約３．２である、請求項１記載の溶液。
【請求項６】
前記緩衝液が、約１ｍＭ〜約１００ｍＭのグリシルグリシン濃度を有する、請求項１記載の溶液。
【請求項７】
前記緩衝液が、約２ｍＭ〜約２０ｍＭのグリシルグリシン濃度を有する、請求項１記載の溶液。
【請求項８】
前記緩衝液が、約５ｍＭ〜約１５ｍＭのグリシルグリシン濃度を有する、請求項１記載の溶液。
【請求項９】
前記緩衝液が、約１０ｍＭのグリシルグリシン濃度を有する、請求項１記載の溶液。
【請求項１０】
４０℃で６ヶ月間の貯蔵に際して、ｐＨが約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない、請求項１記載の溶液。
【請求項１１】
４０℃で３６ヶ月の貯蔵に際して、ｐＨが約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない、請求項１記載の溶液。
【請求項１２】
前記骨形成タンパク質の濃度が約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項１記載の溶液。
【請求項１３】
前記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項１記載の溶液。
【請求項１４】
前記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬである、請求項１記載の溶液。
【請求項１５】
前記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬである、請求項１記載の溶液。
【請求項１６】
リオプロテクタントをさらに含む、請求項１記載の溶液。
【請求項１７】
前記リオプロテクタントが糖である、請求項１６記載の溶液。
【請求項１８】
前記リオプロテクタントが、マンニトール、ラクトース、スクロース及びトレハロース並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６記載の溶液。
【請求項１９】
前記リオプロテクタントがトレハロースである、請求項１８記載の溶液。
【請求項２０】
前記トレハロースが約１％〜約１５％（ｗ／ｖ）の量で存在する、請求項１９記載の溶液。
【請求項２１】
前記トレハロースが約３％〜約９％の量で存在する、請求項２０記載の溶液。
【請求項２２】
酸化防止剤をさらに含む、請求項１記載の溶液。
【請求項２３】
前記酸化防止剤が、メチオニン、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール及びチオグリセロールからなる群から選択される、請求項２２記載の溶液。
【請求項２４】
請求項１記載の溶液を凍結乾燥するステップを含む方法により製造される固体組成物。
【請求項２５】
（ｉ）骨形成タンパク質；及び
（ｉｉ）グリシルグリシン、グリシルグリシン塩、又はそれらの組み合わせを含む、固体組成物。
【請求項２６】
前記グリシルグリシン塩がグリシルグリシンＨＣｌである、請求項２５記載の固体組成物。
【請求項２７】
リオプロテクタントをさらに含む、請求項２５記載の固体組成物。
【請求項２８】
前記リオプロテクタントが糖である、請求項２７記載の固体組成物。
【請求項２９】
前記リオプロテクタントが、マンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２７記載の固体組成物。
【請求項３０】
前記リオプロテクタントがトレハロースである、請求項２９記載の固体組成物。
【請求項３１】
骨形成タンパク質のトレハロースに対する比が、約７×１０−５：１〜約１．３：１（ｗ／ｗ）である、請求項３０記載の固体組成物。
【請求項３２】
骨形成タンパク質のグリシルグリシン、グリシルグリシン塩、又はそれらの組み合わせに対する比が、約８×１０−４：１〜約３１０：１（ｗ／ｗ）である、請求項２５記載の固体組成物。
【請求項３３】
酸化防止剤をさらに含む、請求項２５記載の固体組成物。
【請求項３４】
前記酸化防止剤が、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール、チオグリセロール及びメチオニンからなる群から選択される、請求項３３記載の固体組成物。
【請求項３５】
骨形成タンパク質及び水性酒石酸緩衝液を含む溶液。
【請求項３６】
前記骨形成タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６及びＧＤＦ−７から選択される、請求項３５記載の溶液。
【請求項３７】
前記溶液のｐＨが約２．５〜約４．０である、請求項３５記載の溶液。
【請求項３８】
前記溶液のｐＨが約２．８〜約３．５である、請求項３５記載の溶液。
【請求項３９】
前記溶液のｐＨが約２．８〜約３．２である、請求項３５記載の溶液。
【請求項４０】
前記緩衝液が約１ｍＭ〜約１００ｍＭの酒石酸濃度を有する、請求項３５記載の溶液。
【請求項４１】
前記緩衝液が約２ｍＭ〜約２０ｍＭの酒石酸濃度を有する、請求項３５記載の溶液。
【請求項４２】
前記緩衝液が約５ｍＭ〜約１５ｍＭの酒石酸濃度を有する、請求項３５記載の溶液。
【請求項４３】
前記緩衝液が約１０ｍＭの酒石酸濃度を有する、請求項３５記載の溶液。
【請求項４４】
４０℃で６ヶ月間の貯蔵に際して、ｐＨが約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない、請求項３５記載の溶液。
【請求項４５】
４０℃で３６ヵ月間の貯蔵に際して、ｐＨが約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない、請求項３５記載の溶液。
【請求項４６】
前記骨形成タンパク質の濃度が約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬである、請求項３５記載の溶液。
【請求項４７】
前記タンパク質の濃度が約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項３５記載の溶液。
【請求項４８】
前記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬである、請求項３５記載の溶液。
【請求項４９】
前記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項３５記載の溶液。
【請求項５０】
リオプロテクタントをさらに含む、請求項３５記載の溶液。
【請求項５１】
前記リオプロテクタントが糖である、請求項５０記載の溶液。
【請求項５２】
前記リオプロテクタントが、マンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５１記載の溶液。
【請求項５３】
前記リオプロテクタントがトレハロースである、請求項５２記載の溶液。
【請求項５４】
前記トレハロースが約１％〜約１５％（ｗ／ｖ）の量で存在する、請求項５３記載の溶液。
【請求項５５】
前記トレハロースが約９％の量で存在する、請求項５４記載の溶液。
【請求項５６】
酸化防止剤をさらに含む、請求項３５記載の溶液。
【請求項５７】
前記酸化防止剤が、メチオニン、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール、及びチオグリセロールからなる群から選択される、請求項５６記載の溶液。
【請求項５８】
請求項３５記載の溶液を凍結乾燥するステップを含む方法により製造される固体組成物。
【請求項５９】
（ｉ）骨形成タンパク質；及び
（ｉｉ）酒石酸、酒石酸塩又はそれらの組み合わせ
を含む、固体組成物。
【請求項６０】
リオプロテクタントをさらに含む、請求項５９記載の固体組成物。
【請求項６１】
前記リオプロテクタントが糖である、請求項６０記載の固体組成物。
【請求項６２】
前記リオプロテクタントが、マンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６１記載の固体組成物。
【請求項６３】
前記リオプロテクタントがトレハロースである、請求項６２記載の固体組成物。
【請求項６４】
骨形成タンパク質のトレハロースに対する比が、約７×１０−５：１〜約１．３：１（ｗ／ｗ）である、請求項６３記載の固体組成物。
【請求項６５】
骨形成タンパク質の酒石酸、酒石酸塩、又はその組み合わせに対する比が、約７×１０−４：１〜約２７０：１（ｗ／ｗ）である、請求項６４記載の固体組成物。
【請求項６６】
酸化防止剤を更に含む、請求項５９記載の固体組成物。
【請求項６７】
前記酸化防止剤が、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール、チオグリセロール及びメチオニンからなる群から選択される、請求項６６記載の固体組成物。
【請求項６８】
骨形成タンパク質、水性緩衝液、並びにプロリン、グリシン、バリン、イソロイシン、及びロイシンからなる群から選択される安定剤を含む溶液。
【請求項６９】
前記安定剤がプロリンを含む、請求項６８記載の溶液。
【請求項７０】
（ｉ）骨形成タンパク質；
（ｉｉ）グリシルグリシン塩又は酒石酸塩；及び
（ｉｉ）プロリン、グリシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリンの塩、グリシンの塩、バリンの塩、イソロイシンの塩、又はロイシンの塩からなる群から選択される化合物
を含む、固体組成物。
【請求項７１】
前記化合物がプロリン又はプロリンの塩である、請求項７０記載の固体組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／２４３，３８３号（その内容は、参照することによって本明細書中に組み込まれる）の優先権および利益を主張する。
【０００２】
本発明は、骨形成タンパク質組成物のｐＨを安定化させるための組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のファミリーを含む、システインノットタンパク質及びＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質の溶液及び凍結乾燥処方物の安定性は、処方物のｐＨに依存する。これらのタンパク質は塩基性であり、中性緩衝液に添加すると、ｐＨが増加する。低濃度のこれらのタンパク質の添加は、結果としての処方物のｐＨに著しい影響を及ぼさない。しかし、処方物中のこれらのタンパク質の濃度が増加するにつれ、処方物のｐＨが増加し、それによりこれらの処方物の安定性が低下する。したがって、処方物を望ましいｐＨに戻すために、ＨＣｌなどの強酸を添加する。ｐＨを所望の範囲に戻すために必要な体積を減少させるために、強酸を使用する。しかし、ＨＣｌを添加すると処方物のイオン強度が増大し、これによりそれらの安定性が低下する。したがって、ＢＭＰを含む、システインノットタンパク質及びＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質のｐＨをより良好に制御する新規方法及び組成物を特定する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ある緩衝液が、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のファミリーを含む、システインノットタンパク質及びＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質の処方物、特に液体又は溶液処方物及び凍結乾燥処方物の安定性を増強するという発見に基づく。特に、塩基性であるこれらのタンパク質をある緩衝液に高濃度で添加すると、緩衝液のｐＨが増加する。特に治療計画におけるＢＭＰの最適使用に対するこれまでの限定要因は、３．０±０．２を超えるｐＨを有する液体溶液ＢＭＰ処方物及び３．５を超えるｐＨを有する凍結乾燥ＢＭＰ処方物が、長期間安定ではなく、変性及び凝集を受けやすいことである。乳酸ナトリウムなどの従来技術の緩衝剤の使用は、処方物中のＢＭＰ濃度が限定され、これらの処方物中のＢＭＰの安定性も限定される。なぜなら、ｐＨを安定化させるために強酸を添加しなければならず、これにより処方物のイオン強度が増大するからである。本発明により、当業者は、治療指標で使用するための種々のさらに高度に濃縮されかつ安定なＢＭＰ処方物を調製することが可能になる。さらに、本発明は、製造プロセス中のｐＨのさらなる制御を可能にし、これにより製造されるＢＭＰ処方物のロット間のさらなる均一性を提供する、さらに確固とした製造プロセスを提供する。
【０００５】
一態様では、本発明は、骨形成タンパク質及び水性グリシルグリシン緩衝液を含む溶液を想定する。一実施形態によれば、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、又はＧＤＦ−７のうちのいずれかであり得る。好ましい実施形態では、ＢＭＰはＢＭＰ−７である。溶液のｐＨは、約２．５〜約４．０、さらに好ましくは約２．８〜約３．５、なおいっそう好ましくは約２．８〜約３．２の範囲であり得る。グリシルグリシン緩衝液は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２ｍＭ〜約２０ｍＭ、さらには約５ｍＭ〜約１５ｍＭ、又は約１０ｍＭの濃度を有し得る。溶液中の骨形成タンパク質濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬ、又は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、又は約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬであり得る。一実施形態によれば、溶液のｐＨは５〜４０℃で６ヶ月間、又は３６ヶ月もの貯蔵に際して約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない。
【０００６】
溶液は、リオプロテクタント、たとえば、マンニトール、マンノース、ラクトース、スクロース、若しくはトレハロースなどの糖、又はこれらの糖の任意の組み合わせも含み得る。別の実施形態では、リオプロテクタントは、好ましくは、マンニトール、マンノース、又はトレハロースである。たとえば、トレハロースは、約１％〜約１５％（ｗ／ｖ）、又は約３％〜約１０％（ｗ／ｖ）の量で含まれ得る。好ましい実施形態では、トレハロースは９％（ｗ／ｖ）を超えない。
【０００７】
溶液は酸化防止剤も含み得る。たとえば、酸化防止剤は、メチオニン、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール、ＥＤＴＡ、メタ重硫酸ナトリウム、又はチオグリセロールであり得る。好ましい実施形態では、酸化防止剤はメチオニンである。さらに別の実施形態では、溶液は酸化防止剤を含まない。
【０００８】
別の態様では、本発明は、骨形成タンパク質及びグリシルグリシン、グリシルグリシン塩、又はグリシルグリシ及びグリシルグリシン塩の組み合わせを含む固体組成物を想定する。さらなる実施形態では、グリシルグリシン塩はグリシルグリシンＨＣｌである。固体組成物は、リオプロテクタント、たとえば、糖を含み得る。糖は、マンニトール、ラクトース、スクロース、若しくはトレハロース又はこれらの糖の任意の組み合わせであり得る。たとえば、糖はトレハロースであり得、これは、たとえば、骨形成タンパク質のトレハロースに対する比が約７×１０−５：１（ｗ／ｗ）〜約１．３：１（ｗ／ｗ）で含まれ得る。骨形成タンパク質のグリシルグリシン、グリシルグリシン塩、グリシルグリシンＨＣｌ又はグリシルグリシン及びグリシルグリシン塩の組み合わせに対する比は、たとえば、約８×１０−４：１（ｗ／ｗ）〜約３００：１（ｗ／ｗ）であり得る。固体組成物は、酸化防止剤も含み得る。酸化防止剤は、たとえば、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール、チオグリセロール、及びメチオニンであり得る。好ましい実施形態では、酸化防止剤はメチオニンである。
【０００９】
固体組成物は、界面活性剤も含み得る。たとえば、一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、又はポロキサマー４０７のうちの１つである。界面活性剤は、約０．００１％〜０．５％（ｗ／ｗ）の範囲で存在し得る。好ましい実施形態では、界面活性剤は約０．０１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート２０である。一実施形態では、組成物は界面活性剤を含まない。
【００１０】
固体組成物は、骨形成タンパク質及びグリシルグリシンの溶液を凍結乾燥することによって調製することができる。一実施形態では、凍結乾燥された組成物はマンニトールを含まない。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は、骨形成タンパク質及び水性酒石酸緩衝液を含む溶液を想定する。一実施形態では、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、又はＧＤＦ−７のうちのいずれかであり得る。好ましい実施形態では、ＢＭＰはＢＭＰ−７である。溶液のｐＨは、約２．５〜約４．０、さらに好ましくは約２．８〜約３．５、なおいっそう好ましくは約２．８〜約３．２の範囲であり得る。酒石酸緩衝液は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２ｍＭ〜約２０ｍＭ、さらには約５ｍＭ〜約１５ｍＭ、又は約１０ｍＭの濃度を有し得る。溶液中の骨形成タンパク質濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬ、又は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである。一実施形態では、溶液のｐＨは、液体処方物中、凍結乾燥物として、又は凍結乾燥物から調製される再構成された溶液として、約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない。
【００１２】
酒石酸の発明の場合、溶液は、リオプロテクタント、たとえば、マンニトール、ラクトース、スクロース、若しくはトレハロースなどの糖、又はこれらの糖の任意の組み合わせも含み得る。たとえば、トレハロースは、約１％〜約１５％（ｗ／ｖ）、又は３％〜約１０％（ｗ／ｖ）の量で含まれ得る。好ましい実施形態では、トレハロースは９％（ｗ／ｖ）を超えない。溶液は酸化防止剤も含み得る。たとえば、酸化防止剤は、メチオニン、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール、又はチオグリセロールであり得る。好ましい実施形態では、酸化防止剤はメチオニンである。さらに別の実施形態では、溶液は酸化防止剤を含まない。固体組成物は、界面活性剤も含み得る。たとえば、一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、又はポロキサマー４０７である。界面活性剤は、たとえば、約０．００１％〜０．５％（ｗ／ｗ）の範囲で存在する。好ましい実施形態では、界面活性剤は約０．０１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート２０である。一実施形態では、組成物は界面活性剤を含まない。
【００１３】
関連する態様では、本発明は、骨形成タンパク質並びに酒石酸、酒石酸塩、又は酒石酸及び酒石酸塩の組み合わせを含む固体組成物を想定する。酒石酸及び／又は酒石酸塩は、（＋）酒石酸（右旋性酒石酸としても知られる）、（−）酒石酸（左旋性酒石酸としても知られる）、それらの組み合わせ（ラセミ酸としても知られる）、及び右旋性酒石酸の立体異性体（メソ酒石酸としても知られる）をはじめとする酒石酸塩の任意のエナンチオマー又は立体異性体を含み得る。好ましい実施形態では、酒石酸は、（＋）酒石酸、すなわち右旋性酒石酸である。固体組成物はリオプロテクタント、たとえば糖を含み得る。糖は、マンニトール、ラクトース、スクロース、若しくはトレハロース又はこれらの糖の任意の組み合わせであり得る。たとえば、糖はトレハロースであり得、これは、たとえば骨形成タンパク質のトレハロースに対する比が約７×１０−５：１（ｗ／ｗ）〜約１．３：１（ｗ／ｗ）で含まれ得る。骨形成タンパク質の酒石酸、酒石酸塩、又は酒石酸及び酒石酸塩の組み合わせに対する比は、たとえば、約７×１０−４：１〜約２７０：１（ｗ／ｗ）であり得る。好ましい実施形態では、この比は、約０．０７：１〜約１３：１（ｗ／ｗ）（タンパク質対酒石酸、酒石酸塩、又は酒石酸及び酒石酸塩の組み合わせ）である。固体組成物は、酸化防止剤も含み得る。酸化防止剤は、たとえば、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール、チオグリセロール、及びメチオニンであり得る。固体組成物は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、又はポロキサマー４０７などの界面活性剤も含み得る。界面活性剤は、約０．００１％〜０．５％（ｗ／ｗ）の範囲で存在し得る。好ましい実施形態では、界面活性剤は約０．０１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート２０である。別の実施形態では、組成物は界面活性剤を含まない。
【００１４】
固体組成物は、骨形成タンパク質及び酒石酸の溶液を凍結乾燥することによって調製することができる。一実施形態では、凍結乾燥組成物はマンニトールを含まない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例２に記載するような、酒石酸（１）、グリシルグリシン（２）、リンゴ酸（３）、乳酸（４）、アスパラギン酸（５）、又はコハク酸（６）のいずれか及び９％のトレハロースを含む溶液のｐＨに対してＢＭＰ−７（ｍｇ／ｍＬ）の濃度をプロットした線グラフである。
【図２】図２は、実施例３で記載するような、グリシルグリシンｐＨ３．１（１）、乳酸塩ｐＨ３．５（２）、酒石酸塩ｐＨ３．１（３）、乳酸塩＋１０ｍＭのＮａＣｌｐＨ３．１（４）、及び乳酸塩＋１０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのメチオニンｐＨ３．１（５）の存在下での経時的なＢＭＰ−７の凝集率（％）をプロットした線グラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、４０℃で保持した１ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７の凍結乾燥処方物の経時的な凝集率（％）をプロットした線グラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、４０℃で保持した１６ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７の凍結乾燥処方物の経時的な凝集率（％）をプロットした線グラフである。
【図４】図４は、１０ｍＭのグリシルグリシン、１０ｍＭの乳酸塩又は１０ｍＭの酒石酸塩を含む１ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７の凍結乾燥処方物の経時的な凝集率（％）をプロットした線グラフである。
【図５】図５は、成熟ヒトＢＭＰ−７（配列番号１）のアミノ酸配列である。
【図６】図６は、成熟ヒトＢＭＰ−２（配列番号２）のアミノ酸配列である。
【図７】図７は、成熟ヒトＢＭＰ−６（配列番号３）のアミノ酸配列である。
【図８】図８は、成熟ヒトＢＭＰ−４（配列番号４）のアミノ酸配列である。
【図９】図９は、成熟ヒトＢＭＰ−５（配列番号５）のアミノ酸配列である。
【図１０】図１０は、成熟ヒトＧＤＦ−５（配列番号６）のアミノ酸配列である。
【図１１】図１１は、成熟ヒトＧＤＦ−６（配列番号７）のアミノ酸配列である。
【図１２】図１２は、成熟ヒトＧＤＦ−７（配列番号８）のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ＢＭＰ等のＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質を含む液体の又は再構成されたシステインノットファミリータンパク質の安定性は、処方物のｐＨ及びイオン強度に依存し、所望のｐＨ範囲は３．０±０．２である。低濃度のこれらのタンパク質、すなわち２ｍｇ／ｍＬ未満の添加は、結果として得られる処方物のｐＨに有意な影響を及ぼさない。しかし、これらのタンパク質の濃度が増大するにつれ、すなわち、２ｍｇ／ｍＬを超えると、処方物のｐＨは、例えば３．４を超えるｐＨに増大する。増大したイオン強度でこれらのタンパク質は不安定であるので、ｐＨで観察される増加を軽減するために用いることができる緩衝剤及びｐＨ調節酸の濃度には制限がある。
【００１７】
本出願者等は、驚くべきことに、そして意外にも、これらのタンパク質処方物、例えばＢＭＰを含むものを、水性グリシルグリシン緩衝液又は酒石酸緩衝液を用いて調製することにより、タンパク質を添加した後に強酸を添加することによって、処方物のｐＨを低下させる必要がなくなることを見出した。
【００１８】
更に広いＢＭＰ濃度範囲全体にわたってｐＨを制御する緩衝剤を選択する利点には、処方物のｐＨを、ＨＣｌなどの強酸、又はＮａＯＨなどの強塩基で調節する必要を排除又は軽減することなど、製造プロセス操作が少ないことが含まれる。これにより、処方物のイオン強度を低下させることによってＢＭＰ製剤の安定性が増強され、ＢＭＰタンパク質の変性及び／又は凝集が減少し、そしてＢＭＰの安定な凍結乾燥製剤について可能な濃度範囲が増加する。
【００１９】
ＢＭＰを含む処方物を、適切なｐＨ３．０±０．２で調製するのが重要である。なぜなら、タンパク質のＢＭＰファミリーのメンバーは、生理的条件下で、すなわち生理的ｐＨ、特に約１ｍｇ／ｍＬを超える濃度で本質的に不溶性であるからである。したがって、ｐＨを制御して、処方物中の必要な量のＢＭＰタンパク質の溶解度を保証することが必要である。
【００２０】
処方物
本発明による処方物には、これに限定されるものではないが、再構成された凍結乾燥物などの溶液（液体形態）並びに、これらに限定されるものではないが、凍結乾燥形態、ゲル、マイクロカプセル化粒子、及びペーストなどの固体形態が含まれる。ゲル、ペースト、又は粒子と組み合わせて用いられる再構成された凍結乾燥物から調製される液体処方物、凍結乾燥物、及び液体溶液の組み合わせも、本発明により想定される。
【００２１】
たとえば、本発明による一実施形態では、処方物は、水性緩衝液及びＢＭＰタンパク質を含む溶液である。たとえば、緩衝剤は、グリシルグリシン、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、アスパラギン酸、又はコハク酸であり得る。好ましい実施形態では、緩衝剤はグリシルグリシンであり、別の好ましい実施形態では、緩衝剤は酒石酸である。別の実施形態では、緩衝剤は、グリシルグリシン、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、アスパラギン酸、又はコハク酸の２以上の組み合わせである。たとえば、一実施形態では、緩衝剤はグリシルグリシン及び酒石酸である。
【００２２】
さらに別の実施形態では、グリシルグリシン緩衝剤は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、さらに好ましくは約２ｍＭ〜約２０ｍＭ、なおいっそう好ましくは約５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度を有し、そしてなおいっそう好ましくは、グリシルグリシン緩衝剤の濃度は約１０ｍＭである。
【００２３】
別の実施形態によれば、液体溶液処方物は、安定剤をさらに含む。たとえば、安定剤は、プロリン、グリシン、バリン、イソロイシン、又はロイシンであり得る。好ましい一実施形態では、安定剤はプロリンであり、一方、さらに別の実施形態では、安定剤は、プロリン、グリシン、バリン、イソロイシン、又はロイシンの２以上の組み合わせである。
【００２４】
一実施形態によれば、ＢＭＰはＢＭＰ−７である。別の実施形態によれば、ＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、又はＢＭＰ−９である。別の実施形態によれば、ＢＭＰは、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、又はＧＤＦ−７である。処方物中のＢＭＰ濃度は、たとえば、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬである。さらに別の実施形態では、ＢＭＰタンパク質の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである。ＢＭＰの好ましい濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬであり；ＢＭＰのさらに好ましい濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬであり；ＢＭＰの最も好ましい濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬである。
【００２５】
さらに別の実施形態では、処方溶液のｐＨは、約２．５〜約４．０、さらに好ましくは約２．８〜約３．５、そしてなお一層好ましくは約２．８〜約３．２である。
【００２６】
別の実施形態では、本明細書中で開示される本発明の液体処方物の凍結乾燥により、固体処方物を得る。
【００２７】
別の実施形態では、処方物は、緩衝剤及びＢＭＰタンパク質の溶液から誘導される固体形態である。たとえば、緩衝剤は、グリシルグリシン、酒石酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、アスパラギン酸塩、コハク酸塩、又はグリシルグリシン、酒石酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、アスパラギン酸塩、若しくはコハク酸塩の塩であり得る。好ましい実施形態では、緩衝剤は、グリシルグリシン又はグリシルグリシンの塩である。更に別の好ましい実施形態では、緩衝剤は酒石酸塩である。
【００２８】
別の実施形態によれば、固体処方物は安定剤を含む。たとえば、安定剤は、プロリン、グリシン、バリン、イソロイシン、又はロイシンであり得る。好ましい一実施形態では、安定剤はプロリンである。さらに別の実施形態では、安定剤は、プロリン、グリシン、バリン、イソロイシン、又はロイシンのうちの２以上の組み合わせである。
【００２９】
一実施形態によれば、ＢＭＰはＢＭＰ−７である。別の実施形態によれば、ＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、又はＢＭＰ−９である。別の実施形態によれば、ＢＭＰは、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、又はＧＤＦ−７である。
【００３０】
一実施形態では、ＢＭＰの緩衝剤に対する比は、約７．７×１０ー４：１〜約３１０：１（ｗ／ｗ）である。たとえば、ＢＭＰのグリシルグリシン塩に対する比は、約７．７×１０ー４：１〜約３１０：１（ｗ／ｗ）である。たとえば、ＢＭＰの酒石酸又は塩に対する比は、約６．７×１０ー４：１〜約２７０：１である。
【００３１】
別の実施形態では、液体又は固体形態処方物は、リオプロテクタントをさらに含む。一実施形態では、リオプロテクタントは糖である。たとえば、糖は、マンニトール、ラクトース、スクロース、若しくはトレハロース、又はこれらの糖の２以上の組み合わせであり得る。好ましい実施形態では、糖はトレハロースである。糖を約１％〜約１５％（ｗ／ｖ）の量で、さらに好ましくは約３％〜約１０％（ｗ／ｖ）で、液体形態の本発明の処方物に添加することができる。好ましい実施形態では、糖は９％（ｗ／ｖ）を超えない。別の実施形態では、糖は、固体形態の処方物中、約１：７×１０ー５の約１：１．３（ｗ／ｗ）（糖：ＢＭＰ）の量で存在する。
【００３２】
さらに別の実施形態では、液体又は固体形態処方物は、酸化防止剤をさらに含む。たとえば、酸化防止剤は、メチオニン、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール、又はチオグリセロールであり得る。好ましい酸化防止剤はメチオニンである。
【００３３】
下記表１は、本発明にしたがって作製することができる種々のグリシルグリシン緩衝液の成分を示す。グリシルグリシン緩衝剤は、グリシルグリシン、グリシルグリシン−ＨＣｌ、グリシルグリシン塩、又はそれらの組み合わせから構成される。処方物の成分、特にトレハロースの百分率を調節して、目標の容量オスモル濃度を得ることができる。
【００３４】
【表１】
2013518808.tif 000002
下記表２は、本発明にしたがって作製することができる種々の酒石酸塩緩衝液の成分を示す。処方物の成分、特にトレハロースの百分率を調節して、目標の重量オスモル濃度を得ることができる。
【００３５】
【表２】
2013518808.tif 000003
本発明の処方物の予想外の利点のうちの１つは、処方物が時間をわたってそれらの安定性を維持することである。たとえば、本発明による溶液処方物を４０℃で６ヶ月間貯蔵する場合、ｐＨは約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない。
【００３６】
骨形成タンパク質
ＢＭＰは、本発明の組成物の好ましい例示的タンパク質である。ＢＭＰは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する。ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は、６つの保存されたシステイン残基により特徴付けられるサイトカインである。ヒトゲノムは、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質をコード化する約４２のオープンリーディングフレームを含む。ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は、配列類似性及びそれらが活性化する特定のシグナリング経路に基づいて、ＢＭＰサブファミリー及びＴＧＦ−βサブファミリーに少なくとも分類することができる。ＢＭＰサブファミリーには、これらに限定されるものではないが、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３（オステオゲニン）、ＢＭＰ−３ｂ（ＧＤＦ−１０）、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２ｂ）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（骨形成タンパク質−１又はＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＯＰ−２）、ＢＭＰ−８Ｂ（ＯＰ−３）、ＢＭＰ−９（ＧＤＦ−２）、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１（ＧＤＦ−１１）、ＢＭＰ−１２（ＧＤＦ−７）、ＢＭＰ−１３（ＧＤＦ−６、ＣＤＭＰ−２）、ＢＭＰ−１５（ＧＤＦ−９）、ＢＭＰ−１６、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１、ＭＰ−５２）、及びＧＤＦ−８（ミオスタチン）が含まれる。本発明に関して、好ましいスーパーファミリータンパク質としては、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７、並びにＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、及びＧＤＦ−７、並びにＭＰ−５２が挙げられる。特に好ましいタンパク質としては、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７並びにＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、及びＧＤＦ−７が挙げられる。最も好ましい例示的ＢＭＰは、ヒトＢＭＰ−７である。さらに、ヒト集団の異なるメンバー間ではＢＭＰ配列において対立遺伝子変異があり、今までに見いだされ、特徴づけられたＢＭＰ間では種間変動がある。本明細書中で用いられる場合、「ＢＭＰサブファミリー」、「ＢＭＰ」、「ＢＭＰリガンド」及びその文法的に同等の語句は、特に別段の記載がない限り、ＢＭＰサブファミリーのメンバーを指す。本明細書中で開示されるＢＭＰサブファミリーのメンバーのいずれかは、本発明による処方物中に含まれ得る。
【００３７】
ＴＧＦ−βサブファミリーには、これらに限定されるものではないが、ＴＧＦ（たとえば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−β３）、アクチビン（たとえば、アクチビンＡ）及びインヒビン、マクロファージ阻害サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）、ミュラー阻害物質、抗ミュラーホルモン、及びグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）が含まれる。本明細書中で用いられる場合、「ＴＧＦ−βサブファミリー」、「ＴＧＦ−β」、「ＴＧＦ−βリガンド」及びそれらの文法的に同等の語句は、特に別段の記載がない限り、ＴＧＦ−βサブファミリーのメンバーを指す。
【００３８】
次に、ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、システインノットサイトカインスーパーファミリーのサブセットである。システインノットサイトカインスーパーファミリーの更なるメンバーとしては、これらに限定されるものではないが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、ノギン、ニューロトロフィン（ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、及びβＮＧＦ）、ゴナドトロピン、フォリトロピン、ルトロピン、インターロイキン−１７、及びコアグロゲンが挙げられる。
【００３９】
これらの配列、並びにそれらの化学的及び物理的特性を開示する刊行物としては次のものが挙げられる：ＢＭＰ−７及びＯＰ−２（米国特許第５，０１１，６９１号；米国特許第５，２６６，６８３号；Ｏｚｋａｙｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ９，  ｐｐ．  ２０８５−２０９３（１９９０）；ＯＰ−３（ＷＯ９４／１０２０３（ＰＣＴ  ＵＳ９３／１０５２０））、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、（ＷＯ８８／００２０５；Ｗｏｚｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２，  ｐｐ．  １５２８−１５３４（１９８８））、ＢＭＰ−５及びＢＭＰ−６、（Ｃｅｌｅｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ８７，  ９８４３−９８４７（１９９０））、Ｖｇｒ−１（Ｌｙｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ８６，  ｐｐ．  ４５５４−４５５８（１９８９））；ＤＰＰ（Ｐａｄｇｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２５，  ｐｐ．  ８１−８４（１９８７））；Ｖｇ−１（Ｗｅｅｋｓ，  Ｃｅｌｌ，  ５１，  ｐｐ．  ８６１−８６７（１９８７））；ＢＭＰ−９（ＷＯ９５／３３８３０（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７０８４）；ＢＭＰ−１０（ＷＯ９４／２６８９３（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２９０）；ＢＭＰ−１１（ＷＯ９４／２６８９２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２８８）；ＢＭＰ−１２（ＷＯ９５／１６０３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）；ＢＭＰ−１３（ＷＯ９５／１６０３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）；ＧＤＦ−１（ＷＯ９２／００３８２（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０９６）及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ，  ８８，  ｐｐ．  ４２５０−４２５４（１９９１）；ＧＤＦ−８（ＷＯ９４／２１６８１（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０３０１９）；ＧＤＦ−９（ＷＯ９４／１５９６６（ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６８５）；ＧＤＦ−１０（ＷＯ９５／１０５３９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１４４０）；ＧＤＦ−１１（ＷＯ９６／０１８４５（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０８５４３）；ＢＭＰ−１５（ＷＯ９６／３６７１０（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０６５４０）；ＭＰ−１２１（ＷＯ９６／０１３１６（ＰＣＴ／ＥＰ９５／０２５５２）；ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１、ＭＰ５２）（ＷＯ９４／１５９４９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６５７）及びＷＯ９６／１４３３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２８１４）及びＷＯ９３／１６０９９（ＰＣＴ／ＥＰ９３／００３５０））；ＧＤＦ−６（ＣＤＭＰ−２、ＢＭＰ１３）（ＷＯ９５／０１８０１（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７６２）及びＷＯ９６／１４３３５及びＷＯ９５／１０６３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０））；ＧＤＦ−７（ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ１２）（ＷＯ９５／１０８０２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７９９）及びＷＯ９５／１０６３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０））。前記刊行物は、参照することにより本明細書中に組み込まれる。
【００４０】
本明細書中で用いられる場合、「ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバー」又は「ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質」とは、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーとして当業者等に公知のタンパク質を意味する。構造的に、そのようなタンパク質は、疎水性シグナル配列、数百のアミノ酸のＮ末端プロ領域、並びに可変Ｎ末端領域と、保存された６又は７システイン骨格を有する特徴的なシステインモチーフを有する約１００のアミノ酸を含む高度に保存されたＣ末端領域とを含む成熟ドメインを含む大きな前駆体ポリペプチド鎖として発現されるホモダイマー又はヘテロダイマーである。これらの構造的に関連するタンパク質は、種々の発生事象に関与することが確認されている。
【００４１】
「形態形成タンパク質」という用語は、真の形態発生活性を有するタンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質を指す。例えば、そのようなタンパク質は、前駆細胞を誘導して増殖及び／又は局所環境キューに応じて、軟骨、骨、腱、靱帯、神経又は他の種類の分化組織の形成に至る分化経路における事象のカスケードを開始するようにすることができる。したがって、本発明で有用な形態形成タンパク質は、異なる環境において異なって挙動できる。ある実施形態では、本発明の形態形成タンパク質は、ホモダイマー種又はヘテロダイマー種であり得る。
【００４２】
「骨形成タンパク質（ＯＰ）」という用語は、軟骨及び／又は骨を形成するように前駆細胞を誘導することもできる形態形成タンパク質を指す。骨は、膜性骨又は軟骨性骨であり得る。ほとんどの骨形成タンパク質は、ＢＭＰサブファミリーのメンバーであり、したがってＢＭＰでもある。しかし、逆は真ではない可能性がある。本発明によれば、ＤＮＡ配列相同性又はアミノ酸配列同一性により同定されるＢＭＰは、機能的バイオアッセイにおいて骨形成タンパク質となる明らかな骨形成又は軟骨形成活性も有するはずである。適切なバイオアッセイは、当該技術分野で周知であり；特に有用なバイオアッセイは、異所性骨形成アッセイである（例えば、米国特許第５，０１１，６９１号；米国特許第５，２６６，６８３号を参照）。
【００４３】
ＢＭＰは、長いプロドメイン、１以上の切断部位、及び成熟ドメインを含むプロタンパク質として天然に発現される。このプロタンパク質は次いで細胞機構によってプロセッシングされて、ダイマー成熟ＢＭＰ分子を生成する。プロドメインは、ＢＭＰの正しいフォールディング及びプロセッシングを援助すると考えられる。さらに、全てではないが幾つかのＢＭＰで、プロドメインは成熟ドメインを非共有結合することができ、シャペロン、並びに阻害剤として作用することができる（例えば、Ｔｈｉｅｓ  ｅｔ．  ａｌ．（２００１）  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，  １８：２５１−２５９）。
【００４４】
構造的に、ＢＭＰは、ダイマーシステインノットタンパク質である。各ＢＭＰモノマーは、複数の分子内ジスルフィド結合を含む。さらなる分子間ジスルフィド結合は、ほとんどのＢＭＰにおける二量体化を媒介する。ＢＭＰはホモダイマーを形成することができる。いくつかのＢＭＰはヘテロダイマーを形成することができる。
【００４５】
ＢＭＰシグナル伝達は、ＢＭＰダイマーが２つのＩ型及び２つのＩＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体を結合する場合に開始される。Ｉ型受容体としては、これらに限定されるものではないが、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−２（ＡｃｔＲｌａ又はＡｃｔＲＩとも呼ばれる）、ＡＬＫ−３（ＢＭＰＲＩａとも呼ばれる）、及びＡＬＫ−６（ＢＭＰＲＩｂとも呼ばれる）が挙げられる。ＩＩ型受容体としては、これらに限定されるものではないが、ＡｃｔＲＩＩａ（ＡｃｔＲＩＩとも呼ばれる）、ＡｃｔＲＩＩｂ、及びＢＭＰＲＩＩが挙げられる。ヒトゲノムは、７つのＩ型及び５つのＩＩ型受容体を含む受容体セリン／トレオニンキナーゼファミリーの１２のメンバーを含み、これらは全てＴＧＦ−βシグナリングに関与する（Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２、その開示は参照することによって本明細書中に組み込まれる）。ＢＭＰ結合後、ＩＩ型受容体はＩ型受容体をリン酸化し、Ｉ型受容体は転写因子のＳｍａｄファミリーのメンバーをリン酸化し、そしてＳｍａｄは核にトランスロケーションし、多くの遺伝子の発現を活性化する。
【００４６】
ＢＭＰはまた、これらに限定されるものではないが、ＢＡＭＢＩ（ＢＭＰ及びアクチビン膜結合阻害剤）、ＢＭＰＥＲ（ＢＭＰ結合内皮細胞前駆体由来の調節物質）、セルベルス、コルジン（ｃｏｒｄｉｎ）、コルジン様、ダン（Ｄａｎ）、ダンテ（Ｄａｎｔｅ）、フォリスタチン、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）、エクトジン（ｅｃｔｏｄｉｎ）、グレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）、ノギン、ダン及びセルベルスに関連するタンパク質（ＰＲＤＣ）、スクレロスチン、スクレロスチン様、及び子宮感作関連遺伝子−１（ＵＳＡＧ−１）をはじめとする阻害剤、可溶性受容体、及び囮（ｄｅｃｏｙ）受容体とも相互作用する。さらに、ＢＭＰは、補助受容体と相互作用することができ、例えばＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４は補助受容体ＤＲＡＧＯＮ（Ｓａｍａｄ  ｅｔ．  ａｌ．（２００５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２８０：１４１２２−１４１２９）、並びに硫酸ヘパリン及びヘパリンなどの細胞外マトリックス成分を結合する（Ｉｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３０８：  ８５８−８６５）。
【００４７】
本明細書中で想定されるように、「ＢＭＰ」という用語は、ＤＮＡ相同性及びアミノ酸配列同一性に基づいて定義されるタンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰサブファミリーに属するタンパク質を指す。本発明によれば、タンパク質は、ＢＭＰサブファミリーを特徴づける保存されたＣ末端のシステインリッチなドメイン内の既知ＢＭＰサブファミリーメンバーと少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する場合にＢＭＰサブファミリーに属する。ＢＭＰサブファミリーのメンバーは、全体的に５０％未満のＤＮＡ又はアミノ酸配列同一性を有し得る。本明細書中で用いられる場合、「ＢＭＰ」という用語はさらに、天然に存在する骨形成タンパク質のアミノ酸配列変異体、ドメイン交換変異体、並びにトランケーション及び活性フラグメントであるタンパク質、並びにＢＭＰ−２／７；ＢＭＰ−４／７：ＢＭＰ−２／６；ＢＭＰ−２／５；ＢＭＰ−４／７；ＢＭＰ−４／５；及びＢＭＰ−４／６ヘテロダイマーなどの２つの異なるモノマーＢＭＰペプチドから形成されるヘテロダイマータンパク質を指す。好適なＢＭＰ変異体及びヘテロダイマーには、ＵＳ２００６／０２３５２０４；ＷＯ０７／０８７０５３；ＷＯ０５／０９７８２５；ＷＯ００／０２０６０７；ＷＯ００／０２０５９１；ＷＯ００／０２０４４９；ＷＯ０５／１１３５８５；ＷＯ９５／０１６０３４及びＷＯ９３／００９２２９で記載されているものが含まれる。
【００４８】
一実施形態によれば、本発明による処方物において用いられるＢＭＰは、対応する野生型ＢＭＰタンパク質配列と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を維持し得る。
【００４９】
一実施形態によれば、本発明による処方物で使用されるＢＭＰは、対応する野生型ＢＭＰタンパク質配列のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を維持し得る。
【００５０】
「対応する野生型タンパク質」により、修飾されたＢＭＰの野生型バージョンを意味する。たとえば、修飾されたＢＭＰが修飾されたＢＭＰ−７であるならば、対応する野生型ＢＭＰは野生型ＢＭＰ−７である。
【００５１】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の同一性（％）を決定するために、最適比較目的で配列を整列させる（たとえば、第２アミノ酸又は核酸配列との最適アラインメントのために、第１アミノ酸又は核酸配列の配列中にギャップを導入することができる）。２つの配列間の同一性（％）は、配列が共有する同じ位置の数の関数である（すなわち、％相同性＝同じ位置の数／位置の合計数×１００）。２つの配列間の相同性（％）の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７で記載されているようにして変更された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施することができる。比較目的でギャップ付アラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５（１７）：３３８９−３４０２で記載されているようにして用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（たとえば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を用いることができる。
【００５２】
治療用途
固体形態の本発明のＢＭＰ処方物を、ヒトなどの哺乳動物患者中に移植して、種々の状態を治療することができる。本発明のＢＭＰ処方物を、固体、ゲル若しくはペースト形態で移植することができるか、又はゲル、ペースト若しくは液体形態で患者に注射することができる。
【００５３】
本発明のＢＭＰ処方物は多種多様な状態を治療するために有用である。たとえば、ＢＭＰを含む処方物を用いて、外傷又は炎症性疾患に起因するかどうかにかかわらず、軟骨変性をはじめとする骨格の障害を治療することができる。たとえば、本発明の処方物によって治療可能な疾患としては、関節リウマチ（ＲＡ）及び変形性関節症（ＯＡ）、並びに全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）及び強皮症などの自己免疫疾患が挙げられる。
【００５４】
本発明のＢＭＰ処方物は、骨格の疾患又は傷害を治療するために有効に用いることができる。たとえば、処方物を用いて、開放骨折又は閉鎖骨折などの骨折を治療することができる。閉鎖骨折の治療に関して、処方物を好ましくは骨折部位で注射する。開放骨折、重大なサイズ欠陥又は持続性偽関節に関して、処方物を外科的移植により骨折部位で投与することができる。どちらの場合も、処方物を単独、或いは好適な担体、マトリックス又は足場、たとえば骨セメント、リン酸カルシウム材料、ゲル材料若しくはコラーゲンマトリックスとの組み合わせで投与することができる。好適な担体、マトリックス及び足場には、米国特許第６，９１９，３０８号；第６，９４９，２５１号；及び第７，０４１，６４１号で開示されているものが含まれる。
【００５５】
好ましい実施形態では、本発明のＢＭＰ処方物を用いて、軟骨退化又は軟骨欠損の原因となる疾患又は傷害を治療することができる。たとえば、処方物を軟骨欠損部位、たとえば変性椎間板、又は腱、靱帯若しくは半月板をはじめとする他の線維軟骨組織に適用することができる。そのような方法は、米国特許第６，９５８，１４９号に記載されている。本発明の処方物はまた、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ０５／１１５４３８に記載されているように、関節軟骨、たとえば膝、肘、腰、又は肩を含む滑膜性の連結等の関節の内層（ｌｉｎｉｎｇ）の欠損又は変性を治療するために用いることもできる。この実施形態では、処方物を、好ましくは関節の滑膜腔中に注射する。別の実施形態では、本発明の処方物を用いて、関節における関節軟骨欠損部位、たとえば軟骨欠損又は骨軟骨欠損を治療する。そのような関節軟骨欠損は、変形性関節症若しくは関節リウマチなどの疾患経過の結果であり得るか、又は関節の傷害のためであり得る。この実施形態では、処方物を関節腔中に注射することができるか、又は外科的に移植することができる。たとえば、処方物を欠陥内に単独或いは１以上のさらなる活性剤、支持マトリックス若しくは足場、又は骨髄間質細胞と組み合わせて配置することができる。処方物を、場合によって好適な被膜、たとえば筋肉弁又は生体吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）膜、たとえばコラーゲン膜で覆うことができる。
【００５６】
当業者には理解されるように、治療組成物において記載される化合物の濃度は、これらに限定されるものではないが、投与される薬剤の投薬量及び投与経路をはじめとする多くの因子によって変わるであろう。投与される薬剤の好ましい投薬量はまた、これらに限定されるものではないが、疾患の種類及び程度、組織損失又は欠損、特定の患者の全体的な健康状態、選択された化合物の相対的な生物学的有効性、化合物の処方、処方物中の賦形剤の存在及び種類、並びに投与経路をはじめとする変数に依存する可能性が高い。本発明を個体に提供することができ、この場合、典型的な用量は、１日につき体重１ｋｇあたり約１０ｎｇ〜約１ｇの範囲であり；好ましい用量範囲は、体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜１００ｍｇであり、さらに特に好ましい投薬量範囲は１０〜１０００μｇ／用量である。特に好ましい実施形態では、１０〜１０００μｇのＢＭＰ−７の投与量を変形性関節症にかかった個体に投与する。
【００５７】
さらに、後述するように、タンパク質処方物、好ましくは本発明のＢＭＰ処方物を用いて、非骨格組織の疾患又は傷害を治療することができる。本発明によってさらに想定されるように、ＢＭＰは哺乳動物における骨形態形成及び、骨又は骨軟骨とは異なる種々の組織の組織形態形成の発生カスケードを誘導することができる。この形態発生活性は、前駆細胞の増殖及び分化を誘導する能力、並びに骨、軟骨、非ミネラル化骨格又は結合組織、及び他の成体組織の形成をもたらす事象の進行を通して分化型表現型を支持し、維持する能力を含む。
【００５８】
たとえば、代謝性骨疾患において骨量の損失を防止する及び／又は骨量を増加させるための治療をするためにＢＭＰを用いることができる。骨形成タンパク質を用いた代謝性骨疾患における骨量の損失を防止する及び／又は骨量を増加させるための治療の一般的方法は、米国特許第５，６７４，８４４号で開示され、その開示は参照することによって本明細書中に組み込まれる。本発明のＢＭＰを、歯周組織再生のために使用することができる。骨形成タンパク質を用いた歯周組織再生のために一般的方法は、米国特許第５，７３３，８７８号に開示され、その開示は、参照することによって本明細書中に組み込まれる。ＢＭＰを肝臓再生に用いることができる。骨形成タンパク質を用いた肝臓再生のための一般的方法は、米国特許第５，８４９，６８６号に開示され、その開示は、参照することによって本明細書中に組み込まれる。ＢＭＰを慢性腎不全の治療に用いることができる。骨形成タンパク質を用いた慢性腎不全の治療のための一般的方法は、米国特許第６，８６１，４０４号に開示され、その開示は、参照することによって本明細書中に組み込まれる。中枢神経系虚血又は外傷後の機能的回復を強化するために、ＢＭＰを用いることができる。骨形成タンパク質を用いて中枢神経系虚血又は外傷後の機能回復を強化するための一般的方法は、米国特許第６，４０７，０６０号に開示され、その開示は、参照することによって本明細書中に組み込まれる。樹状突起成長を誘導するためにＢＭＰを用いることができる。骨形成タンパク質を用いて樹状突起成長を誘導するための一般的方法は、米国特許第６，９４９，５０５号で開示され、その開示は、参照することによって本明細書中に組み込まれる。神経細胞接着を誘導するためにＢＭＰを用いることができる。骨形成タンパク質を用いて神経細胞接着を誘導するための一般的方法は、米国特許第６，８００，６０３号で開示され、その開示は、参照することによって本明細書中に組み込まれる。パーキンソン病の治療及び予防のためにＢＭＰを用いることができる。骨形成タンパク質を用いてパーキンソン病を治療及び予防するための一般的方法は、米国特許第６，５０６，７２９号に開示され、その開示は、参照することによって本明細書中に組み込まれる。
【００５９】
別の例として、ＢＭＰはまた、象牙質形成を誘導するためにも用いることができる。今日まで、歯髄組織の傷害に対する予測不可能な反応は、歯科学における基本的臨床問題である。さらに別の例として、ＢＭＰは、中枢神経系（ＣＮＳ）修復に対して再生効果を誘導することができ、これはラット脳穿刺モデルを用いて評価することができる。
【実施例】
【００６０】
実施例１  グリシルグリシン緩衝液及び酒石酸緩衝液は、ＢＭＰの増大する濃度でＢＭＰ処方物のｐＨを安定化させる。
【００６１】
緩衝液が高濃縮ＢＭＰ処方物で観察されるｐＨの増加を軽減する可能性を評価するために、例示的ＢＭＰ、ＢＭＰ−７を用いて６種類の緩衝液を試験した：酒石酸（ｐＫａ２．９８、４．３４）、グリシルグリシン（ｐＫａ３．１４）、リンゴ酸（ｐＫａ３．４０）、乳酸（ｐＫａ３．８６）、アスパラギン酸（ｐＫａ３．９０）、及びコハク酸（ｐＫａ４．２１）。
【００６２】
各緩衝液を１０ｍＭの濃度で調製し、必要に応じて１ＮのＨＣｌ又は１ＮのＮａＯＨでｐＨを調節して、最終ｐＨ３．０を得た。各緩衝液はまた、９％のトレハロースを含んでいた。５０ｍＭの酢酸中ＢＭＰ−７（１．６ｍｇ／ｍＬ）を１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、次いで６種類の緩衝液のそれぞれに透析した。透析後、各緩衝液中のタンパク質濃度は１５〜１６ｍｇ／ｍＬであった。室温でのタンパク質の濃度及びｐＨを各緩衝液について測定した。その後、タンパク質溶液のそれぞれをそれらの各緩衝液で８ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬまで希釈した。室温でのｐＨ及びタンパク質濃度を希釈濃度のそれぞれで測定した。ＢＭＰ−７濃度の関数としてのｐＨの結果を図１に示す。
【００６３】
図１に示されるように、リンゴ酸、乳酸、アスパラギン酸、及びコハク酸の緩衝液について、ＢＭＰ−７の濃度が増加するにつれ、ｐＨにおいて望ましくない増加が観察される。対照的に、酒石酸又はグリシルグリシンの緩衝液では、ＢＭＰ−７の濃度が増加するにつれて有意な増加は観察されない。したがって、ＢＭＰ−７を緩衝液に添加することに起因するｐＨの増加を軽減するために、酒石酸又はグリシルグリシンのいずれかを緩衝剤として用いることができる。
【００６４】
実施例２  グリシルグリシン緩衝液及び酒石酸緩衝液は凝集を軽減することによって長時間にわたりＢＭＰ液体処方物に安定性を付与する
液体安定性研究を実施して、例示的ＢＭＰであるＢＭＰ−７と、１０ｍＭのグリシルグリシン（ｐＨ３．１）、１０ｍＭの酒石酸塩（ｐＨ３．１）、１０ｍＭの乳酸塩（ｐＨ３．５）、１０ｍＭの乳酸塩と１０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ３．１）、及び１０ｍＭの乳酸塩と１０ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのメチオニン（ｐＨ３．１）の緩衝液を使用し、ＢＭＰ処方物中のタンパク質凝集を評価した。凝集をはじめとするタンパク質における変化を最小限に抑える処方物は、凍結乾燥製剤の改善された安定性及びコンシステンシーを提供する。ＢＭＰ−７濃度は１６ｍｇ／ｍＬであった。処方物を加速された安定性条件下、４０℃で４週間保持した。液体処方物におけるＢＭＰ−７の凝集率（％）をサイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、結果を図２に示す。
【００６５】
図２に示すように、ｐＨ３．１でグリシルグリシン緩衝液を含む処方物は、４週間にわたって最低の凝集増加率を示し、このことは、グリシルグリシンが試験した他の緩衝液よりも高い安定性をＢＭＰ−７処方物に付与することを示す。
【００６６】
実施例３  グリシルグリシン緩衝液及び酒石酸緩衝液は凝集を減少させることによって長時間にわたりＢＭＰ凍結乾燥処方物に安定性を付与する。
【００６７】
凍結乾燥液体並びに凍結乾燥ＢＭＰ及び緩衝液処方物の両方の加速された安定性試験を実施して、例示的ＢＭＰであるＢＭＰ−７を用い、１０ｍＭのグリシルグリシンＨＣｌ（ｐＨ３．１）、１０ｍＭの酒石酸塩（ｐＨ３．１）、１０ｍＭの乳酸塩（ｐＨ３．１）、１０ｍＭの乳酸塩と１０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ３．１）、並びに１０ｍＭの乳酸塩と１０ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのメチオニン（ｐＨ３．１）の緩衝液を含む処方物中で、ＢＭＰの凝集を評価した。ＢＭＰ−７濃度は、１ｍｇ／ｍＬ又は１６ｍｇ／ｍＬのいずれかであった。液体安定性研究用の処方物をバイアル中に分注し、そして４０℃で２ヶ月間保持するか、又は凍結乾燥し、４０℃で６ヶ月間保持した。
【００６８】
図３Ａに示すように、乳酸塩とメチオニン及びグリシルグリシンを含むＢＭＰ−７処方物は、６ヶ月、１ｍｇ／ｍＬで、これらの処方緩衝液について最低の凝集率を有していた。図３Ｂで示すように、１６ｍｇ／ｍＬで、試験した全ての緩衝液についてタンパク質凝集において増加が観察された。最低の凝集は、酒石酸塩を含む処方物中で見られた。この実施例は、１０ｍＭの乳酸塩を含む処方物と比較して、１０ｍＭのグリシルグリシン、９％のトレハロースを含むＢＭＰ−７処方物、ｐＨ３．０及び１０ｍＭの酒石酸塩、９％のトレハロースを含むＢＭＰ−７処方物、ｐＨ３．０に関連して改善された安定性を示した。
【００６９】
実施例４  グリシルグリシン及び酒石酸緩衝液処方物からのＢＭＰは生物学的活性を有する。
【００７０】
４０℃で６ヶ月間保持されたＢＭＰ及びグリシルグリシン緩衝液又は酒石酸緩衝液の溶液からのＢＭＰが、ラット骨肉腫細胞系ＲＯＳ１７／２．８においてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を誘導する能力を分析する。例示的ＢＭＰであるＢＭＰ−７を９ポイント用量反応において３連で試験する。特に、ＲＯＳ１７／２．８細胞を９６ウェル組織培養プレート中に蒔く。グリシルグリシン溶液又は酒石酸溶液からのＢＭＰを以下の投薬量：６０００、２０００、６６６、２２２、７４、２４、８、２、及び０．９ｎｇ／ｍｌで細胞に添加し、そして４８時間インキュベートする。細胞をその後溶解させ、ＢＭＰ−７がＡＬＰ活性を誘導する効力を試料の平均光学密度（ＯＤ）の非線形回帰から誘導されたＥＣ５０に基づいて評価する。グリシルグリシン溶液及び酒石酸溶液からの例示的ＢＭＰであるＢＭＰ−７はどちらも強力な生物学的活性を示す。
【００７１】
実施例５  グリシルグリシン緩衝液を含むＢＭＰ処方物
ＢＭＰ、例えばＢＭＰ−７を用いた透析、タンジェンシャルフロー濾過、又は限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）プロセスにより緩衝液交換を実施することにより、本発明による処方物を調製する。１０ｍＬの透析緩衝液中１００ｍｇのＢＭＰ−７を３００ｍＬの１０ｍＭのグリシルグリシン緩衝液、９％のトレハロース、及び２０ｍＭのメチオニン（ｐＨ３．０±０．２）に対して透析する（透析緩衝液を３回替える）。５００ｍＬの１０ｍＭのグリシルグリシン−ＨＣｌ溶液（ｐＨ２．６）を２１０ｍＬの１０ｍＭのグリシルグリシン（ｐＨ５．７）と混合することにより、グリシルグリシン緩衝液を調製する。ＢＭＰ−７の結果としての濃度を、透析緩衝液を用いて１ｍｇ／ｍＬ（約１００ｍＬ）に調節し、０．０１％のポリソルベート２０又は０．０１％のポリソルベート８０を添加する（最終ｐＨ３．０±０．２）。同様に、約１０ｍＬ〜１０００ｍＬの透析緩衝液中約１００ｍｇ〜１０ｇのＢＭＰ−７をＵＦ／ＤＦにより約１０×体積の１０ｍＭのグリシルグリシン緩衝液に対して交換する。トレハロース、メチオニン、及び／又はポリソルベート２０などのさらなる処方物の構成成分を所望の量まで添加する。処方緩衝液を用いて処方物を所望の濃度まで希釈し、最終処方物のｐＨは３．０±０．２である。
【００７２】
実施例６  酒石酸緩衝液を含むＢＭＰ処方物
ＢＭＰ、例えばＢＭＰ−７を用いた透析又はタンジェンシャルフロー濾過により緩衝液交換を実施することによって、本発明による処方物を調製する。１０ｍＬの透析緩衝液中１００ｍｇのＢＭＰ−７を３００ｍＬの１０ｍＭの酒石酸緩衝液、９％のトレハロース、及び２０ｍＭのメチオニン（ｐＨ３．０±０．２）に対して透析する（透析緩衝液を３回交換する）。８４０ｍＬの１０ｍＭの酒石酸溶液を３１０ｍＬの１０ｍＭの酒石酸カリウムナトリウム（ｐＨ７．２）と混合することによって酒石酸緩衝液を調製する。透析緩衝液を用いてＢＭＰの結果としての濃度を１ｍｇ／ｍＬ（約１００ｍＬ）に調節し、０．０１％のポリソルベート２０又は０．０１％のポリソルベート８０を最終ｐＨ３．０±０．２で添加する。同様に、約１０ｍＬ〜１０００ｍＬ中約１００ｍｇ〜約１０ｇのＢＭＰ−７をＵＦ／ＤＦにより約１０×体積の１０ｍＭの酒石酸塩緩衝液に対して交換する。トレハロース、メチオニン、及び／又はポリソルベート２０などのさらなる処方物の構成成分を所望の量まで添加する。処方緩衝液を用いて処方物を所望の濃度まで希釈し、最終処方物のｐＨは３．０±０．２である。
【００７３】
実施例７  酒石酸緩衝液及びトレハロースを含むＢＭＰ処方物
本明細書中で示されるように、グリシルグリシン及び酒石酸塩は、ＢＭＰ−７処方物のｐＨを乳酸塩よりも更に有効に制御し、製剤の処方において有利であり得る。グリシルグリシン及び酒石酸塩中の凍結乾燥されたＢＭＰ−７の安定性を評価するために、長期凍結乾燥安定性研究を開始した。
【００７４】
３ロットのＢＭＰ−７を、１０ｍＭの乳酸塩、９％のトレハロース、ｐＨ３．０中；１０ｍＭのグリシルグリシン、９％のトレハロース、ｐＨ３．０中；又は１０ｍＭの酒石酸塩、９％のトレハロース、ｐＨ３．０中のいずれかで１ｍｇ／ｍＬにて処方した。全処方物のｐＨを３．０±０．２以内に制御した。処方した製剤を凍結乾燥し、長期安定性研究を５℃又は３０℃で開始した。３ロットの安定性を２、６、及び９ヶ月にわたって評価した。
【００７５】
乳酸塩を含む処方物におけるＢＰＭ−７凝集は、当初はグリシルグリシン又は酒石酸塩中よりも高かった。処方物のいずれについても５℃で凝集に関連する変化はなかった。３０℃で全ての処方物について凝集が増加し、最低の凝集は、グリシルグリシンを含む処方物について観察された（図４を参照）。結果は、１０ｍＭのグリシルグリシン又は１０ｍＭの酒石酸塩を含むＢＭＰ−７処方物が、１０ｍＭの乳酸塩での緩衝と比較して、凍結乾燥製剤の安定性を改善できることを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年5月16日(2012.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
固体組成物は、骨形成タンパク質及び酒石酸の溶液を凍結乾燥することによって調製することができる。一実施形態では、凍結乾燥組成物はマンニトールを含まない。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
骨形成タンパク質及び水性グリシルグリシン緩衝液を含む溶液。
（項目２）
上記骨形成タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６及びＧＤＦ−７から選択される、項目１記載の溶液。
（項目３）
上記溶液のｐＨが約２．５〜約４．０である、項目１記載の溶液。
（項目４）
上記溶液のｐＨが、約２．８〜約３．５である、項目１記載の溶液。
（項目５）
上記溶液のｐＨが、約２．８〜約３．２である、項目１記載の溶液。
（項目６）
上記緩衝液が、約１ｍＭ〜約１００ｍＭのグリシルグリシン濃度を有する、項目１記載の溶液。
（項目７）
上記緩衝液が、約２ｍＭ〜約２０ｍＭのグリシルグリシン濃度を有する、項目１記載の溶液。
（項目８）
上記緩衝液が、約５ｍＭ〜約１５ｍＭのグリシルグリシン濃度を有する、項目１記載の溶液。
（項目９）
上記緩衝液が、約１０ｍＭのグリシルグリシン濃度を有する、項目１記載の溶液。
（項目１０）
４０℃で６ヶ月間の貯蔵に際して、ｐＨが約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない、項目１記載の溶液。
（項目１１）
４０℃で３６ヶ月の貯蔵に際して、ｐＨが約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない、項目１記載の溶液。
（項目１２）
上記骨形成タンパク質の濃度が約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである、項目１記載の溶液。
（項目１３）
上記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである、項目１記載の溶液。
（項目１４）
上記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬである、項目１記載の溶液。
（項目１５）
上記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬである、項目１記載の溶液。
（項目１６）
リオプロテクタントをさらに含む、項目１記載の溶液。
（項目１７）
上記リオプロテクタントが糖である、項目１６記載の溶液。
（項目１８）
上記リオプロテクタントが、マンニトール、ラクトース、スクロース及びトレハロース並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１６記載の溶液。
（項目１９）
上記リオプロテクタントがトレハロースである、項目１８記載の溶液。
（項目２０）
上記トレハロースが約１％〜約１５％（ｗ／ｖ）の量で存在する、項目１９記載の溶液。
（項目２１）
上記トレハロースが約３％〜約９％の量で存在する、項目２０記載の溶液。
（項目２２）
酸化防止剤をさらに含む、項目１記載の溶液。
（項目２３）
上記酸化防止剤が、メチオニン、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール及びチオグリセロールからなる群から選択される、項目２２記載の溶液。
（項目２４）
項目１記載の溶液を凍結乾燥するステップを含む方法により製造される固体組成物。
（項目２５）
（ｉ）骨形成タンパク質；及び
（ｉｉ）グリシルグリシン、グリシルグリシン塩、又はそれらの組み合わせを含む、固体組成物。
（項目２６）
上記グリシルグリシン塩がグリシルグリシンＨＣｌである、項目２５記載の固体組成物。
（項目２７）
リオプロテクタントをさらに含む、項目２５記載の固体組成物。
（項目２８）
上記リオプロテクタントが糖である、項目２７記載の固体組成物。
（項目２９）
上記リオプロテクタントが、マンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目２７記載の固体組成物。
（項目３０）
上記リオプロテクタントがトレハロースである、項目２９記載の固体組成物。
（項目３１）
骨形成タンパク質のトレハロースに対する比が、約７×１０−５：１〜約１．３：１（ｗ／ｗ）である、項目３０記載の固体組成物。
（項目３２）
骨形成タンパク質のグリシルグリシン、グリシルグリシン塩、又はそれらの組み合わせに対する比が、約８×１０−４：１〜約３１０：１（ｗ／ｗ）である、項目２５記載の固体組成物。
（項目３３）
酸化防止剤をさらに含む、項目２５記載の固体組成物。
（項目３４）
上記酸化防止剤が、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール、チオグリセロール及びメチオニンからなる群から選択される、項目３３記載の固体組成物。
（項目３５）
骨形成タンパク質及び水性酒石酸緩衝液を含む溶液。
（項目３６）
上記骨形成タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６及びＧＤＦ−７から選択される、項目３５記載の溶液。
（項目３７）
上記溶液のｐＨが約２．５〜約４．０である、項目３５記載の溶液。
（項目３８）
上記溶液のｐＨが約２．８〜約３．５である、項目３５記載の溶液。
（項目３９）
上記溶液のｐＨが約２．８〜約３．２である、項目３５記載の溶液。
（項目４０）
上記緩衝液が約１ｍＭ〜約１００ｍＭの酒石酸濃度を有する、項目３５記載の溶液。
（項目４１）
上記緩衝液が約２ｍＭ〜約２０ｍＭの酒石酸濃度を有する、項目３５記載の溶液。
（項目４２）
上記緩衝液が約５ｍＭ〜約１５ｍＭの酒石酸濃度を有する、項目３５記載の溶液。
（項目４３）
上記緩衝液が約１０ｍＭの酒石酸濃度を有する、項目３５記載の溶液。
（項目４４）
４０℃で６ヶ月間の貯蔵に際して、ｐＨが約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない、項目３５記載の溶液。
（項目４５）
４０℃で３６ヵ月間の貯蔵に際して、ｐＨが約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない、項目３５記載の溶液。
（項目４６）
上記骨形成タンパク質の濃度が約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬである、項目３５記載の溶液。
（項目４７）
上記タンパク質の濃度が約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである、項目３５記載の溶液。
（項目４８）
上記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬである、項目３５記載の溶液。
（項目４９）
上記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである、項目３５記載の溶液。
（項目５０）
リオプロテクタントをさらに含む、項目３５記載の溶液。
（項目５１）
上記リオプロテクタントが糖である、項目５０記載の溶液。
（項目５２）
上記リオプロテクタントが、マンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目５１記載の溶液。
（項目５３）
上記リオプロテクタントがトレハロースである、項目５２記載の溶液。
（項目５４）
上記トレハロースが約１％〜約１５％（ｗ／ｖ）の量で存在する、項目５３記載の溶液。
（項目５５）
上記トレハロースが約９％の量で存在する、項目５４記載の溶液。
（項目５６）
酸化防止剤をさらに含む、項目３５記載の溶液。
（項目５７）
上記酸化防止剤が、メチオニン、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール、及びチオグリセロールからなる群から選択される、項目５６記載の溶液。
（項目５８）
項目３５記載の溶液を凍結乾燥するステップを含む方法により製造される固体組成物。
（項目５９）
（ｉ）骨形成タンパク質；及び
（ｉｉ）酒石酸、酒石酸塩又はそれらの組み合わせ
を含む、固体組成物。
（項目６０）
リオプロテクタントをさらに含む、項目５９記載の固体組成物。
（項目６１）
上記リオプロテクタントが糖である、項目６０記載の固体組成物。
（項目６２）
上記リオプロテクタントが、マンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目６１記載の固体組成物。
（項目６３）
上記リオプロテクタントがトレハロースである、項目６２記載の固体組成物。
（項目６４）
骨形成タンパク質のトレハロースに対する比が、約７×１０−５：１〜約１．３：１（ｗ／ｗ）である、項目６３記載の固体組成物。
（項目６５）
骨形成タンパク質の酒石酸、酒石酸塩、又はその組み合わせに対する比が、約７×１０−４：１〜約２７０：１（ｗ／ｗ）である、項目６４記載の固体組成物。
（項目６６）
酸化防止剤を更に含む、項目５９記載の固体組成物。
（項目６７）
上記酸化防止剤が、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール、チオグリセロール及びメチオニンからなる群から選択される、項目６６記載の固体組成物。
（項目６８）
骨形成タンパク質、水性緩衝液、並びにプロリン、グリシン、バリン、イソロイシン、及びロイシンからなる群から選択される安定剤を含む溶液。
（項目６９）
上記安定剤がプロリンを含む、項目６８記載の溶液。
（項目７０）
（ｉ）骨形成タンパク質；
（ｉｉ）グリシルグリシン塩又は酒石酸塩；及び
（ｉｉ）プロリン、グリシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリンの塩、グリシンの塩、バリンの塩、イソロイシンの塩、又はロイシンの塩からなる群から選択される化合物
を含む、固体組成物。
（項目７１）
上記化合物がプロリン又はプロリンの塩である、項目７０記載の固体組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成タンパク質及び水性グリシルグリシン緩衝液を含む溶液。
【請求項２】
前記骨形成タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６及びＧＤＦ−７から選択される、請求項１記載の溶液。
【請求項３】
前記溶液のｐＨが約２．５〜約４．０である、請求項１記載の溶液。
【請求項４】
前記溶液のｐＨが、約２．８〜約３．５である、請求項１記載の溶液。
【請求項５】
前記溶液のｐＨが、約２．８〜約３．２である、請求項１記載の溶液。
【請求項６】
前記緩衝液が、約１ｍＭ〜約１００ｍＭのグリシルグリシン濃度を有する、請求項１記載の溶液。
【請求項７】
前記緩衝液が、約２ｍＭ〜約２０ｍＭのグリシルグリシン濃度を有する、請求項１記載の溶液。
【請求項８】
前記緩衝液が、約５ｍＭ〜約１５ｍＭのグリシルグリシン濃度を有する、請求項１記載の溶液。
【請求項９】
前記緩衝液が、約１０ｍＭのグリシルグリシン濃度を有する、請求項１記載の溶液。
【請求項１０】
４０℃で６ヶ月間の貯蔵に際して、ｐＨが約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない、請求項１記載の溶液。
【請求項１１】
４０℃で３６ヶ月の貯蔵に際して、ｐＨが約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない、請求項１記載の溶液。
【請求項１２】
前記骨形成タンパク質の濃度が約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項１記載の溶液。
【請求項１３】
前記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項１記載の溶液。
【請求項１４】
前記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬである、請求項１記載の溶液。
【請求項１５】
前記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬである、請求項１記載の溶液。
【請求項１６】
リオプロテクタントをさらに含む、請求項１記載の溶液。
【請求項１７】
前記リオプロテクタントが糖である、請求項１６記載の溶液。
【請求項１８】
前記リオプロテクタントが、マンニトール、ラクトース、スクロース及びトレハロース並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６記載の溶液。
【請求項１９】
前記リオプロテクタントがトレハロースである、請求項１８記載の溶液。
【請求項２０】
前記トレハロースが約１％〜約１５％（ｗ／ｖ）の量で存在する、請求項１９記載の溶液。
【請求項２１】
前記トレハロースが約３％〜約９％の量で存在する、請求項２０記載の溶液。
【請求項２２】
酸化防止剤をさらに含む、請求項１記載の溶液。
【請求項２３】
前記酸化防止剤が、メチオニン、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール及びチオグリセロールからなる群から選択される、請求項２２記載の溶液。
【請求項２４】
請求項１記載の溶液を凍結乾燥するステップを含む方法により製造される固体組成物。
【請求項２５】
（ｉ）骨形成タンパク質；及び
（ｉｉ）グリシルグリシン、グリシルグリシン塩、又はそれらの組み合わせを含む、固体組成物。
【請求項２６】
前記グリシルグリシン塩がグリシルグリシンＨＣｌである、請求項２５記載の固体組成物。
【請求項２７】
リオプロテクタントをさらに含む、請求項２５記載の固体組成物。
【請求項２８】
前記リオプロテクタントが糖である、請求項２７記載の固体組成物。
【請求項２９】
前記リオプロテクタントが、マンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２７記載の固体組成物。
【請求項３０】
前記リオプロテクタントがトレハロースである、請求項２９記載の固体組成物。
【請求項３１】
骨形成タンパク質のトレハロースに対する比が、約７×１０−５：１〜約１．３：１（ｗ／ｗ）である、請求項３０記載の固体組成物。
【請求項３２】
骨形成タンパク質のグリシルグリシン、グリシルグリシン塩、又はそれらの組み合わせに対する比が、約８×１０−４：１〜約３１０：１（ｗ／ｗ）である、請求項２５記載の固体組成物。
【請求項３３】
酸化防止剤をさらに含む、請求項２５記載の固体組成物。
【請求項３４】
前記酸化防止剤が、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール、チオグリセロール及びメチオニンからなる群から選択される、請求項３３記載の固体組成物。
【請求項３５】
骨形成タンパク質及び水性酒石酸緩衝液を含む溶液。
【請求項３６】
前記骨形成タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６及びＧＤＦ−７から選択される、請求項３５記載の溶液。
【請求項３７】
前記溶液のｐＨが約２．５〜約４．０である、請求項３５記載の溶液。
【請求項３８】
前記溶液のｐＨが約２．８〜約３．５である、請求項３５記載の溶液。
【請求項３９】
前記溶液のｐＨが約２．８〜約３．２である、請求項３５記載の溶液。
【請求項４０】
前記緩衝液が約１ｍＭ〜約１００ｍＭの酒石酸濃度を有する、請求項３５記載の溶液。
【請求項４１】
前記緩衝液が約２ｍＭ〜約２０ｍＭの酒石酸濃度を有する、請求項３５記載の溶液。
【請求項４２】
前記緩衝液が約５ｍＭ〜約１５ｍＭの酒石酸濃度を有する、請求項３５記載の溶液。
【請求項４３】
前記緩衝液が約１０ｍＭの酒石酸濃度を有する、請求項３５記載の溶液。
【請求項４４】
４０℃で６ヶ月間の貯蔵に際して、ｐＨが約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない、請求項３５記載の溶液。
【請求項４５】
４０℃で３６ヵ月間の貯蔵に際して、ｐＨが約０．２ｐＨ単位を超えて変化しない、請求項３５記載の溶液。
【請求項４６】
前記骨形成タンパク質の濃度が約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬである、請求項３５記載の溶液。
【請求項４７】
前記タンパク質の濃度が約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項３５記載の溶液。
【請求項４８】
前記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬである、請求項３５記載の溶液。
【請求項４９】
前記タンパク質の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項３５記載の溶液。
【請求項５０】
リオプロテクタントをさらに含む、請求項３５記載の溶液。
【請求項５１】
前記リオプロテクタントが糖である、請求項５０記載の溶液。
【請求項５２】
前記リオプロテクタントが、マンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５１記載の溶液。
【請求項５３】
前記リオプロテクタントがトレハロースである、請求項５２記載の溶液。
【請求項５４】
前記トレハロースが約１％〜約１５％（ｗ／ｖ）の量で存在する、請求項５３記載の溶液。
【請求項５５】
前記トレハロースが約９％の量で存在する、請求項５４記載の溶液。
【請求項５６】
酸化防止剤をさらに含む、請求項３５記載の溶液。
【請求項５７】
前記酸化防止剤が、メチオニン、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール、及びチオグリセロールからなる群から選択される、請求項５６記載の溶液。
【請求項５８】
請求項３５記載の溶液を凍結乾燥するステップを含む方法により製造される固体組成物。
【請求項５９】
（ｉ）骨形成タンパク質；及び
（ｉｉ）酒石酸、酒石酸塩又はそれらの組み合わせ
を含む、固体組成物。
【請求項６０】
リオプロテクタントをさらに含む、請求項５９記載の固体組成物。
【請求項６１】
前記リオプロテクタントが糖である、請求項６０記載の固体組成物。
【請求項６２】
前記リオプロテクタントが、マンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６１記載の固体組成物。
【請求項６３】
前記リオプロテクタントがトレハロースである、請求項６２記載の固体組成物。
【請求項６４】
骨形成タンパク質のトレハロースに対する比が、約７×１０−５：１〜約１．３：１（ｗ／ｗ）である、請求項６３記載の固体組成物。
【請求項６５】
骨形成タンパク質の酒石酸、酒石酸塩、又はその組み合わせに対する比が、約７×１０−４：１〜約２７０：１（ｗ／ｗ）である、請求項６４記載の固体組成物。
【請求項６６】
酸化防止剤を更に含む、請求項５９記載の固体組成物。
【請求項６７】
前記酸化防止剤が、アスコルビン酸、ベンジルアルコール、グルタチオン、ｍ−クレゾール、チオグリセロール及びメチオニンからなる群から選択される、請求項６６記載の固体組成物。
【請求項６８】
（ｉ）骨形成タンパク質；
（ｉｉ）グリシルグリシン塩又は酒石酸塩；及び
（ｉｉ）プロリン、グリシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリンの塩、グリシンの塩、バリンの塩、イソロイシンの塩、又はロイシンの塩からなる群から選択される化合物
を含む、固体組成物。
【請求項６９】
前記化合物がプロリン又はプロリンの塩である、請求項６８記載の固体組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成25年1月23日(2013.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013518808000001.app
【国際調査報告】
2013518808.tif 000017
2013518808.tif 000018
2013518808.tif 000019