(57)【要約】  候補タンパク質治療薬を高速スクリーニングするための組成物および方法がここに開示されている。より特定的には本発明は、複合生体液中の候補タンパク質治療薬の挙動を検定しかかる体液中で望ましい薬物動態特性を示す候補タンパク質治療薬を同定するための組成物および方法を提供する。
2013518257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補タンパク質治療薬の生理化学的特性の分析方法であって、
（ａ）前記候補タンパク質治療薬を標識化する段階と、
（ｂ）前記標識化候補タンパク質治療薬を複合生体液に接触させる段階と、
（ｂ）前記標識化候補タンパク質治療薬を含む前記複合生体液のサンプルを採取する段階と、
（ｃ）マイクロ流体デバイスにおいて前記サンプルの構成成分を候補タンパク質治療薬の物理的特性に基づいて分離する段階と、
（ｄ）分離したサンプル中の前記候補タンパク質治療薬の生理化学的特性を判定するために前記標識を検出する段階、
とを含む分析方法。
【請求項２】
前記標識が蛍光標識である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光標識がＰｉｃｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（登録商標）染料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記候補タンパク質治療薬が、抗体、抗体ミメティック、酵素、サイトカイン、サイトカイン受容体、リンホカイン、リンホカイン受容体およびホルモンから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記特性が、（ａ）候補タンパク質治療薬の断片化プロフィル、（ｂ）候補タンパク質治療薬の凝集傾向、（ｃ）候補タンパク質治療薬の活性低下傾向、（ｄ）候補タンパク質治療薬の他の薬物動態特性、から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記特性が候補タンパク質治療薬の断片化プロフィルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記特性が候補タンパク質治療薬の凝集傾向である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記特性が候補タンパク質治療薬の別の薬物動態特性である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記薬物動態特性が、候補タンパク質治療薬の吸収速度、分布速度、代謝速度、排泄速度、吸収範囲、分布範囲、代謝範囲および排泄範囲から成る群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複合生体液が、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、脳脊髄液および唾液から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複合生体液が血清である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離が電気泳動分離である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記電気泳動分離が毛管電気泳動である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記毛管電気泳動がＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ計器を使用して実行される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、２０１０年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／２９８，０２８号の出願日の優先権を主張するものであり、その全部が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
本発明は候補タンパク質治療薬を高速スクリーニングするための組成物および方法に関する。より特定的には本発明は、複合生体液中の候補タンパク質治療薬の挙動を検定しこのような体液中で望ましい薬物動態特性を示す候補タンパク質治療薬を同定するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
治療用途の生物製剤の開発においては、候補化合物の安定性および活性を早期に評価できることが重要である。多数の候補を試験する必要があるとき、インビボ評価は実用的でない。従って、安定性および活性に関する予備データを提供するためのインビトロ分析技術が開発されてきた。しかしながらかかる技術は、候補化合物が治療的に有効であるためには複合生体液内で安定かつ活性的でなければならないため、標準バッファおよび複合生体液環境に近似させたしかし決定的に異なり得る明確に定義された条件を用いて一般的に行われている。抗体および他の組換え発現ポリペプチドのようなタンパク質治療薬は血液中を循環した後で回収されたときに薬効の低下を含む生理化学的特性の変化を示すことが過去数年間で明らかになった。したがって、標準的なバッファおよび条件を使用して候補タンパク質治療薬の迅速な評価および選択を行うという現在の主導的な薬剤開発は、臨床的な効果および安定性を正確に評価するために不十分なデータを提供する可能性が潜在する。特に、慣用のアッセイは、複合生体液中で安定でありかつ望ましい薬物動態（“ＰＫ”）特性を示す候補タンパク質治療薬を不安定で効能の劣る候補から識別することができない。
【０００４】
このような慣用の分析技術の一例として、Ｃｈｅｎら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９（３）：２４０−２４９（２００９）は、ヒト血清中に存在するモノクローナル抗体の電気泳動分析を記載している。Ｃｈｅｎらによって使用された分析技術では、いくつかの生理化学的特性を同定するために対象とする抗体を電気泳動分離する前に、それらの抗体を最初にアフィニティ単離によって血清サンプルから取り出し、次に標準的なリン酸塩緩衝生理食塩水（“ＰＢＳ”）溶液に再懸濁させる必要がある。したがってこの技術は、ヒト血清の接触が抗体の生理化学的特性に与えた特異的な効果を、アフィニティ単離およびＰＢＳ再懸濁が与えた効果から分離することができない。さらに、アフィニティ単離および再懸濁の段階は抗体特性評価技術に時間とコストをかなり増加させる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９（３）：２４０−２４９（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血液、血清、血漿、リンパ液、尿および唾液のような複合生体液中の候補タンパク質治療薬を高速度、高精度および高感度で分析できる高スループット技術は、開発コストを節減するだけでなく、多数の候補分子の効率的なスクリーニングを促進するであろう。本発明はこれらの要望に応えようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
いくつかの実施形態において本発明は、候補タンパク質治療薬の生理化学的特性を分析する方法を目的とする。該方法は、候補タンパク質治療薬を最初に標識化し、次に複合生体液に接触させ、その後で標識化候補タンパク質治療薬を含む複合生体液のサンプルを採取し、候補タンパク質治療薬の物理的特性に基づいて分離し、標識を検出して候補タンパク質治療薬の生理化学的特性を判定する段階を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、候補タンパク質治療薬の標識は蛍光標識である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、候補タンパク質治療薬の蛍光標識はＰｉｃｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（登録商標）染料（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）である。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態において、候補タンパク質治療薬は、抗体、免疫接着分子のような抗体ミメティック、酵素、サイトカイン、サイトカイン受容体、リンホカイン、リンホカイン受容体およびホルモンから成る群から選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、検定すべき生理化学的特性は、（ａ）候補タンパク質治療薬の断片化プロフィル、（ｂ）候補タンパク質治療薬の凝固傾向、（ｃ）候補タンパク質治療薬の活性低下傾向、（ｄ）候補タンパク質治療薬の他の薬物動態特性、から成る群から選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、検定すべき生理化学的特性は、候補タンパク質治療薬の吸収速度、分布速度、代謝速度、排泄速度、吸収範囲、分布範囲、代謝範囲および排泄範囲から成る群から選択される候補タンパク質治療薬の薬物動態特性である。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態において、候補タンパク質治療薬を接触させる複合生体液は、血液、血漿、血清、リンパ液、尿および唾液から成る群から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、候補タンパク質治療薬を含む複合生体液の分離は電気泳動分離である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、電気泳動分離は毛管電気泳動、たとえば、ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ計器（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を使用して行う毛管電気泳動である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】５℃でのならびに２５℃および４０℃でそれぞれ６ヶ月および３ヶ月加熱後のｍＡｂ−１サンプルのタンパク質組成を示す電気泳動図の総括グラフである。“ＬＣ”はＬ鎖を表し、“ＨＣ”はＨ鎖を表し、“Ｆａｂ”はＦａｂフラグメントを表す。Ｆａｂフラグメントは、発明の詳細な説明においてより詳細に記載されている通り抗体の抗原結合性領域を含む。“Ｆｃ”はＦｃフラグメントを表す。Ｆｃフラグメントは、発明の詳細な説明においてより詳細に記載されている通り抗体の定常領域を含む。“集合体”は抗体の集合を表す。
【図２】全血中で４および２４時間のインキュベーション後に得られたｍＡｂ−１に関するデータ（ｎ＝３）の精度を示す電気泳動図の総括グラフである。
【図３（Ａ）−（Ｂ）】図３（Ａ）−３（Ｂ）は全血中でＴ＝０時間、Ｔ＝４時間およびＴ＝２４時間のインキュベーション後の（Ａ）ＤＶＤ−１分子および（Ｂ）ｍＡｂ−１分子について得られた電気泳動図の総括グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は候補タンパク質治療薬を高速スクリーニングするための組成物および方法に関する。より特定的には本発明は、複合生体液中の候補タンパク質治療薬の挙動を検定しこのような体液中で望ましいＰＫ特性を示す候補タンパク質治療薬を同定するための組成物および方法を提供する。
【００１８】
限定ではなく明快な説明のため、詳細な説明を下記項目に分けて説明する：
１．定義
２．分析すべき特性  および
３．分析方法。
【００１９】
１．定義
本発明がより容易に理解されるように最初にいくつかの用語を定義する。
【００２０】
本明細書で使用する“タンパク質”という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む組成物を表すものとする。本明細書で使用するタンパク質という用語は“ポリペプチド”という用語と同義であることもでき、またはさらに、ジスルフィド架橋によって互いに結合されたＨ鎖およびＬ鎖の双方のポリペプチド分子を含む抗体のような２つ以上のポリペプチドの複合体を表すこともできる。
【００２１】
本明細書で使用する“抗体”という用語は、免疫グロブリン含有分子を表すものとする。免疫グロブリンは４つのポリペプチド鎖から構成され、２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖がジスルフィド結合によって相互接続されている。各Ｈ鎖はＨ鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨと略記）とＨ鎖定常領域（ＣＨ）とから成る。Ｈ鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から成る。各Ｌ鎖はＬ鎖可変領域（ＬＣＶＲまたはＶＬと略記）とＬ鎖定常領域とから成る。Ｌ鎖定常領域は１つのドメインＣＬから成る。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分され、その間にフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存性の領域が散在している。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲと４つのＦＲとから構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配列されている。免疫グロブリンには５つのクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、各クラスはそれらのＨ鎖定常領域の構造に基づいて同定される。ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧのそれぞれのＨ鎖定常領域は３つのＩｇドメインと柔軟性を与えるための１つのヒンジ領域とを有している。他方、ＩｇＥおよびＩｇＭの定常領域は４つのＩｇドメインを有している。ＩｇＡおよびＩｇＧのクラスはさらにそれぞれ２つおよび４つの個別アイソタイプに分類される（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）。
【００２２】
本明細書中、いくつかの抗体フラグメントが、抗体（または“抗体部分”）の“抗原結合性部分”を含むと記載されている。これらのフラグメントは、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体部分を含んでいる。抗体の“抗原結合性部分”という用語の範囲に包含される抗原結合性フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを含む一価のフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとを含むＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームにＶＬドメインとＶＨドメインとを含むＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインを含むｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６、この文献の教示全部が参照によって本明細書に組込まれる）、および、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え方法を使用してこれらのドメインを合成リンカーによって接合し、ＶＬ領域とＶＨ領域との対が一価の分子を形成しているタンパク質単鎖を作製できる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知、Ｂｉｒｄら（１９８８）：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３、これらの文献の教示全部が参照によって本明細書に組込まれる）。このような単鎖抗体もまた抗体の“抗原結合性部分”という用語に包含されるものとする。ジアボディのような単鎖抗体の他の形態も包含される。ジアボディは、ＶＨドメインとＶＬドメインとを単一のポリペプチド鎖上で発現させるが、同一鎖上で２つのドメインを対合させるには短すぎるリンカーを使用しドメインを別の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させて２つの抗原結合性部位を作成した二価の二重特異性抗体である（たとえば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照、これらの文献の教示全部が参照によって本明細書に組込まれる）。さらに、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−ＩｇＧ）は、何らかの２つのモノクローナル抗体から加工され親抗体の活性を保存できる二重特異性の四価の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）様分子である（たとえば、Ｗｕら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，１２９０−１２９７参照）。さらにまた、抗体またはその抗原結合性部分は、抗体または抗体部分と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合的または非共有結合的会合によって形成されたより大きい免疫接着分子の一部であってもよい。このような免疫接着分子の例は、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１、この文献の教���全部が参照によって本明細書に組込まれる）、および、二価のビオチニル化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ−末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８、この文献の教示全部が参照によって本明細書に組込まれる）を含む。ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗体部分は、完全抗体のパパイン消化またはペプシン消化のような慣用の技術をそれぞれ使用して完全抗体から調製できる。なお、抗体、抗体部分、免疫接着分子は標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる。
【００２３】
本明細書に示されるいくつかの抗体フラグメントは抗原結合性能力を保持していない。その非限定例はＦｃ抗体フラグメントである。本明細書で使用する“Ｆｃフラグメント”という用語は、免疫グロブリン分子がパパインで消化されたときに産生される抗体フラグメントを表し、Ｌ鎖の可変領域（ＶＬ）と定常領域（ＣＬ）およびＨ鎖の可変領域（ＶＨ）と定常領域（ＣＨ）が除外された免疫グロブリン分子の領域を表す。
【００２４】
本明細書で使用する“複合生体液”という用語は、血液、血清、血漿、リンパ液、尿、脳脊髄液および唾液を非限定的に含む被験者に見出される循環性または非循環性の何らかの生体液を表すものとする。分離分析に先立って複合生体液に最低限の処理を行ってもよい。たとえば、蜂巣状（ｃｅｌｌｕｌａｒ）および／または粗粒状（ｐａｔｉｃｕｌａｒ）の要素を遠心（低速または高速）もしくは濾過もしくは沈殿によって除去してもよく、または、当業界で公知の標準バッファを用いて体液を希釈してもよい。このような処理の後であっても体液は本明細書中“複合生体液”と表すことができる。
【００２５】
本明細書で使用する“全血”という用語は、脊椎動物の心臓、動脈、毛細血管および静脈内を循環し、身体のすべての部分に栄養物と酸素を運びそこから老廃物を運び去る流体を表し、多くの種類の細胞、タンパク質および塩から構成されている。Ｉｓｓａｑら，Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  １０７（８）：３６０１−３６２０（２００７）。凝固することなく血球（ｃｅｌｌ）がこの流体から除去されるとき、残された液体部分は“血漿”である。しかしながら抗凝固剤の非存在下で血球（ｃｅｌｌ）が除去されるとき、液体部分は“血清”と呼ばれる。血清が血漿から異なる点はフィブリンとフィブリンに会合するタンパク質とが除去されていることである。血清は血漿よりもタンパク質が約３から４％少ないと推定されている。血漿は典型的には全タンパク質含量の９９％を構成する約２２種類のタンパク質を含有し、それらは、アルブミン、全ＩｇＧ、トランスフェリン、フィブリノーゲン、全ＩｇＡ、アルファ−２−マクログロブリン、全ＩｇＭ、アルファ−１−抗−トリプシン、Ｃ３補体、ハプトグロブリン、アルファ−１−酸糖タンパク質、アポリポタンパク質−Ｂ、アポリポタンパク質−Ａ１、リポタンパク質（ａ）、Ｈ因子、セルロプラスミン、Ｃ４補体、補体Ｂ因子、プレ−アルブミン、Ｃ９補体、Ｃ１ｑ補体およびＣ８補体を含む。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３（４）：３１１−３２６（２００４）およびＡｎｄｅｒｓｏｎら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １（１１）：８４５−８６７（２００２）。血漿の残りの１％は微量に存在する数百種類のタンパク質から構成されている。このように血清タンパク質は極めて“込み合った”環境を有しており、その排除体積の結果として、抗体治療薬が稠密な構造を採用しかつ血清中の抗原との会合強化を示す。Ｄｅｍｅｕｌｅら，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３８８（２）：２７９−２８７（２００９）。さらに、高レベルのアルブミン、システイン、シスチン、グルタチオン、ホモシステインおよび他の小チオール類はまた、血清から回収された抗体治療薬中のジスルフィド結合の再編成を促進する“レドックス”環境を有している。Ｓｕｍｍａら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ６９（２）：３６９−３７８（２００７）；Ｓｏｒｉａｎｉら，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３１２（１）：１８０−１８８（１９９４）；Ｍｉｌｌｓら，Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １３５（５）：３９６−４０１（２０００）；Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔら，Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ  １２３（９）：１２６９−１２８１（２００２）；Ｆｉｓｋｅｒｓｔｒａｎｄら，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ３９（２）：２６３−２７１（１９９３）；Ｄｉ  Ｇｉｕｓｅｐｐｅら，Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １４２（１）：２１−２８（２００３）；および、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ３９（８）：１５９０−１５９７（１９９３）。
【００２６】
本明細書で使用する“薬物動態特性”または“ＰＫ特性”という用語は、被験者体内における候補タンパク質治療薬の配置を記述するパラメーターを表すものとする。代表的な薬物動態特性は非限定的に、被験者体内における候補タンパク質治療薬の吸収、分布、代謝および排泄の範囲または速度（“ＡＤＭＥ特性”）を含む。
【００２７】
本明細書で使用する“電気泳動”という用語は、マトリックス好ましくは高分子マトリックス溶液中で分子を押すかまたは引張るために起電力（“ＥＭＦ”）が使用される技術を表すものとする。分子は慣用の方法でマトリックス内に導入され、電流が印加されたときに分子は、負に荷電されているならばアノードに向かって、正に荷電されているならばカソードに向かって、様々な速度でマトリックス内を移動するであろう。電気泳動マトリックスの例は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離で常用のポリアクリルアミド、ならびに、たとえばＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩＩ計器によって使用されている毛管電気泳動分離のようなマイクロ流体電気泳動分離に使用するための低粘度ポリマー溶液を含む。
【００２８】
本明細書で使用する“被験者”という用語はヒトおよびヒト以外の動物の双方を含む何らかの動物を表すものとする。
【００２９】
本明細書で使用する“約”という用語は、基準値をほぼ１０から２０％上回るかまたは下回る範囲を表すものとする。基準値の性質上、状況によって“約”という用語が基準値から１０から２０％よりも大きいまたは小さい偏差を意味することがあることを当業者は理解するであろう。
【００３０】
２．分析すべき特性
本発明の分析技術は、複合生体液中の候補タンパク質治療薬の挙動を判定しまた候補タンパク質治療薬の１つ以上のＰＫ特性を同定するために使用できる。限定はしないがたとえば本発明の分析技術は、複合生体液との接触によって誘発された幾つかの分子挙動、非限定的には、このような体液中の候補タンパク質治療薬の断片化プロフィル、および、かかる体液中の候補治療薬の集合体形成傾向、などを判定するために使用できる。本発明の分析技術を使用して評価できるＰＫ特性は非限定的に、候補タンパク質治療薬の吸収特性、分布特性、代謝特性および排泄特性を含む。本発明のいくつかの実施形態においてはこのような断片化、凝集およびＡＤＭＥ特性の２つ以上を同時にまたは順次に判定できる。
【００３１】
いくつかの実施形態においては本発明の分析技術が、複合生体液中の候補タンパク質治療薬の断片化プロフィルを判定するために使用される。いくつかの実施形態において断片化プロフィルは、抗体中のＨ鎖およびＬ鎖のポリペプチドの分離のような分子内断片化に関する情報を含むことができる。いくつかの実施形態において断片化プロフィルは、Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ’）２フラグメント、または、完全抗体よりも小さいサブフラグメント、完全単鎖免疫グロブリンよりも小さいサブフラグメント、完全Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ’）２フラグメントよりも小さいサブフラグメントなどを遊離するためのプロテアーゼによる抗体の開裂のような分子間断片化に関する情報を含むことができる。いくつかの実施形態において断片化プロフィルは、分子内断片化および分子間断片化の双方に関する情報を含むことができる。さらに、いくつかの実施形態において本発明の分析技術は、候補タンパク質治療薬との接触の結果として生じた断片化プロフィルを同じ種類の複合生体液の異なるサンプルまたは異なる種類の複合生体液に比較すること、および、断片化プロフィルを候補タンパク質治療薬と体液との接触時間の長さに基づいて比較することが可能である。
【００３２】
いくつかの実施形態においては本発明の分析技術が、複合生体液の存在下の特定の候補タンパク質治療薬の凝集傾向を判定するために使用される。さらにいくつかの実施形態において本発明の分析技術は、ある１つの候補タンパク質治療薬について、該候補タンパク質治療薬を複数の複合生体液に個々に接触させた結果生じた凝集傾向の比較、および、候補タンパク質治療薬とこれらの体液との接触時間の長さに基づく比較が可能である。
【００３３】
いくつかの実施形態においては本発明の分析技術が、候補タンパク質治療薬の吸収、分布、代謝または排泄の範囲または速度を測定するために使用される。さらにいくつかの実施形態において本発明の分析技術は、ある１つの候補タンパク質治療薬について、該候補タンパク質治療薬を複数の複合生体液に個々に接触させた結果生じた吸収、分布、代謝または排泄の範囲または速度の比較、および、候補タンパク質治療薬とこれらの体液との接触時間の長さに基づく比較が可能である。
【００３４】
３．分析の方法
本発明のいくつかの実施形態は、複合生体液に接触させた候補タンパク質治療薬の生理化学的特性を検定するための方法を目的とする。以下に詳細に説明するようにこれらの方法は生理化学的特性を検定するための数多くの技術、たとえば非限定的に電気泳動分離、サイズ排除クロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフイーを包含し、候補タンパク質治療薬と複合生体液とのインビトロまたはインビボ接触を含み得る。
【００３５】
いくつかの実施形態においては、対象となる候補タンパク質治療薬を複合生体液に接触させる前に標識化する。別の実施形態においては、候補タンパク質治療薬を複合生体液に接触させた後、場合によって電気泳動の前または後に標識化する。特定の実施形態において標識はＰｉｃｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（登録商標）染料のような蛍光染料である。別の実施形態において候補タンパク質治療薬は放射線学的または化学的または酵素的または免疫的に標識化される。いくつかの実施形態においては、候補タンパク質治療薬を標識化せず、代わりに、免疫的相互作用（たとえば、候補タンパク質治療薬に特異的な抗体の結合）、受容体／リガンド相互作用、酵素的相互作用、または、対象となる候補タンパク質治療薬を同定するために十分な他の何らかのタンパク質：タンパク質相互作用もしくは化学的相互作用を介して検出する。
【００３６】
いくつかの実施形態においては、標識化された候補タンパク質治療薬をインビトロ体液サンプルの直接スパイキングによって複合生体液に接触させる。いくつかの実施形態において複合生体液は血液、血漿、血清、リンパ液、尿または唾液である。かかる実施形態においてはサンプルを当業者が有利であると判断したような温度、圧力などの特定条件下で特定の時間インキュベートできる。このような直接スパイキングの後、候補タンパク質治療薬を含有する複合生体液サンプルの１つ以上のアリコートを、当業者が有利であると判断した１つ以上の時点で採取する。いくつかの実施形態においては、次に（１つ以上の）アリコートの構成成分をこれらの構成成分の特定の物理的特性に基づいて分離する。特定の実施形態においては分離が電荷に基づいて行われ、別の実施形態においては分離がサイズ、ｐＨまたは特定のクロマトグラフィー基質に対する親和性のような別の物理的特性に基づいて行われる。分離が電荷に基づく実施形態においては電気泳動を使用して分離を実行できる。特定の実施形態においては（１つ以上の）アリコートの構成成分を電荷によって分離するために毛管電気泳動を使用する。いくつかの実施形態においては、そのフラグメントおよび集合体も含む対象候補タンパク質の分離の分析が、複合生体液に接触させる前にタンパク質に結合させた標識を検出することによって遂行される。
【００３７】
いくつかの実施形態においては候補タンパク質治療薬が、インビボの複合生体液に接触するように被験者（これはヒト被験者でもよくヒト以外でもよい）に投与される。候補タンパク質治療薬は多様な形態のいずれかで被験者に投与できる。これらの形態は非限定的に、液体、半固体および固体の剤形、たとえば、液体溶液（たとえば、注射溶液および注入溶液）、分散液もしくは懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび座薬を含む。形態はたとえば、予定した投薬方法および計画した治療用途に従属する。典型的な組成物は、被験者を抗体で受動免疫感作するために使用される組成物と同様の注射溶液または注入溶液の形態である。１つの投薬方法は非経口（たとえば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。１つのやり方では候補タンパク質治療薬を静脈内への注入または注射によって投与する。別のやり方では候補タンパク質治療薬を筋肉内または皮下への注射によって投与する。
【００３８】
候補タンパク質治療薬を被験者に投与した後、１つ以上の時点で被験者から分析用サンプルを採取する。採取すべきサンプル、たとえば血液、リンパ液、尿または唾液は、対象となる特定の候補タンパク質治療薬に基づいて当業者が決定できる。いくつかの実施形態においては採取すべきサンプルが血液サンプルである。特定実施形態では採取血液をさらに処理して血漿サンプルとする。別の実施形態では採取血液をさらに処理して血清サンプルとする。尚、このようなサンプル採取のタイミングは、対象となる候補タンパク質治療薬および採取すべき複合生体液の既知の特性の双方に基づいて当業者が決定できる。いくつかの実施形態においてはこのようなサンプル採取が、１時間毎、１２時間毎、または、１日毎に行われるであろう。
【００３９】
いくつかの実施形態においては、候補タンパク質治療薬の投与後に採取したサンプルを該サンプルの構成成分の物理的特性に基づいて直接に分析処理する。別の実施形態においては、このような分析に先立ってサンプルをさらに処理する。非限定的例としては、当業界で公知の標準バッファを用いてサンプルを希釈する。サンプルをさらにまたは代替的に遠心処理してもよい。たとえば、血液サンプルを約２．０００ｒｐｍで５分間回転させて血清上清を得ることができる。サンプルをさらにまたは代替的にプロテアーゼインヒビターのような中和化合物に接触させて分析前のタンパク質分解を阻止することができる。
【００４０】
いくつかの実施形態においては、サンプルの構成成分を特定の物理的特性に基づいて分離することによってこれらの構成成分を分析する。特定の実施形態では分離が電荷に基づき、別の実施形態では分離がこれに代わる物理的特性、たとえばサイズ、ｐＨまたは特定のクロマトグラフィー基質に対する親和性に基づく。分離が電荷に基づく実施形態においては分離が電気泳動法を使用して行われる。特定の実施形態ではサンプルの構成成分を電荷によって分離するために毛管電気泳動が使用される。いくつかの実施形態においては、そのフラグメントおよび集合体を含む対象候補タンパク質の分離の分析が、複合生体液に接触する前にタンパク質に結合させた標識を検出することによって遂行される。
【００４１】
いくつかの実施形態においては、上記に記載の分析が、１種以上の複合生体液中の２種以上の候補タンパク質治療薬の挙動の比較、および、このような体液中の候補タンパク質治療薬の１つ以上のＰＫ特性の比較を可能にする。特定の実施形態においてこのような比較は、モノクローナル抗体の個別のクローンまたはＤＶＤ−ＩｇＧ分子を非限定的に含む様々な候補タンパク質治療薬の格付けを可能にする。
【００４２】
いくつかの実施形態においては、本発明が２種以上の候補タンパク質治療薬の同時分析を可能にする。本発明の特定の実施形態において候補タンパク質治療薬は、非限定的に電荷またはサイズを含む識別可能な物理的特性を有しており、これらは多数の候補治療薬の同時分析を可能にする。別の実施形態において候補タンパク質治療薬は多数のタンパク質治療薬の同時分析を可能にする識別可能な標識を有している。限定はしないがたとえば、第一の候補タンパク質治療薬を第一の波長で発光する第一の蛍光標識で標識化し、第二の候補タンパク質治療薬を第二の波長で発光する第二の蛍光標識で標識化することができる。
【００４３】
いくつかの実施形態においては、本発明が特定の候補タンパク質治療薬の分解経路および代謝産物の分析を可能にする。特定の実施形態においては、特定の候補タンパク質治療薬の特定の代謝産物を標識化し、インビトロまたはインビボで複合生体液に接触させる。特定の候補タンパク質治療薬の特定の代謝産物を含む複合生体液のサンプルの分析が、１つ以上の生体液中の候補タンパク質治療薬の代謝産物の挙動およびこれらの体液中の候補タンパク質治療薬の代謝産物の１つ以上のＰＫ特性に関する情報を提供する。
【００４４】
いくつかの実施形態においては、分析を実行するためにＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ計器または同等のデバイスを使用する。ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ計器はその分析を実行するときに伝統的なゲル電気泳動原理をチップフォーマットで使用する。しかしながらチップフォーマットは分離時間を劇的に短縮し、サイズおよび量の全自動測定情報をデジタルフォーマットで提供する。チップは、分離マトリックスを含む分離チャンネルを接合する相互接続されたマイクロチャンネルセットおよびバッファウェルを内蔵している。マイクロチャンネルの１つはチップの底部から９０度の角度で延びる短い毛細管に接続されている。この毛細管はアッセイ中にマイクロプレートのウェルからサンプルを吸い上げる。
【００４５】
チャンネルが満たされるとチップはサンプルの電気泳動分離を実行するための集積電気回路として機能する。チップホルダーが閉じられたときにチップのウェル内の溶液に接触する電極カートリッジに内蔵された様々な電極によって回路が駆動される。アッセイチャンネルを満たすポリマーマトリックスは、ポリアクリルアミドゲルの使用と同様に、タンパク質が電気泳動によってそこを通過するときにタンパク質をサイズによって篩分けするように設計されている。次に候補タンパク質治療薬を含む複合生体液サンプルをアッセイチャンネル内に電気泳動的に移動させる。フラグメントは、アッセイチャンネルを下方に移動するときにサイズによって分離され、最終的に候補タンパク質治療薬に結合された蛍光染料を励起するレーザーを通過する。ソフトウェアが蛍光強度対時間をプロットし各サンプルの電気泳動図を作成する。
【実施例】
【００４６】
１．全血中のタンパク質の分析
この実施例は、全血から直接回収された前標識化ｍＡｂ分子およびＤＶＤ−ＩｇＧ分子を分析するためのＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ計器の使用を説明する。ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩは、約±１０％のサイズ分解能で約１４から約２００ｋＤａのサイズ測定範囲を有している。アッセイは約５０ｐｇ／μＬから約１００ｍｇ／μＬまでのほぼ４つの対数線形範囲を有している。以下に詳述するように、対象となる分子の標識化は製造業者によって提供されたＰｉｃｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（登録商標）染料で行った。標識化抗体を全血にスパイクし、分析に先立って血液を遠心し、分析用上清をＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩに収集した。上清のアリコートを動電学的に毛細管に充填し、低粘度ポリマー溶液を収容した１４ｍｍ長さの分離チャンネルに分離した。各サンプルの分析は９６または３８４ウェルのプレートから直接に約４０秒で実行した。この試験は、アッセイの高精度、ならびに、方法の分解能および優れた感度を証明する。
【００４７】
Ｐｉｃｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（登録商標）染料の染料溶液とタンパク質ラダーとを製造業者の記載通りに調製した。使用した標識化用バッファは、０．５Ｍの炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．０）であった。この試験にはｍＡｂ−１（モノクローナル抗体）とＤＶＤ−１（二重可変ドメイン抗体）という２つの異なる分子を使用した。抗体を標識化用バッファで２ｍｇ／ｍＬに希釈し、つぎに８μｇを４０μＭの処理用染料溶液と共にインキュベートした（抗体の最終濃度は０．８ｍｇ／ｍＬであった）。標識化反応を１時間進行させ、次に０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．０）中の１Ｍのエタノールアミンで反応停止させた。
【００４８】
次に分子の各々をヒト血液にスパイクし（抗体の最終濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬであった）、５℃で様々な時間（２４時間まで）インキュベートした。次に血液のアリコートを２０００ｒｐｍで５分間遠心し、５μＬの血清を収集し、製造業者から提供されたサンプルバッファを使用して０．０１ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩで分析する前にサンプルを７５℃で５分間加熱した。
【００４９】
５℃のならびに２５℃および４０℃でそれぞれ６カ月および３カ月加熱した後のｍＡｂ−１の分析を図１に示す。得られた電気泳動図は他の計器でＣＥ−ＳＤＳ（変性ドデシル硫酸ナトリウムを使用する毛管電気泳動）によって分析されたフラグメントと同等である。ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩは熱ストレス後に得られた既知のフラグメント全部を示し、また、ｍＡｂ−１の凝集を示した。
【００５０】
全血中に４時間および２４時間維持した後で得られたｍＡｂ−１の詳細データ（ｎ＝３）を図２に示す。個別の３つの分析から得られた電気泳動図はアッセイの優れた再現性を示す。
【００５１】
全血中でＴ＝０時間、Ｔ＝４時間およびＴ＝２４時間のインキュベーション後のＤＶＤ−１分子およびｍＡｂ−１分子について得られた電気泳動図を図３Ａおよび図３Ｂに示す。ＤＶＤ−１分子はｍＡｂ−１分子よりも大きくｍＡｂ−１分子とは異なる泳動時間を有している。双方の分子が全血中で種々のレベルのフラグメントおよび集合体の形成を示す。
【００５２】
２．動物に投与されたタンパク質の分析
この実施例は、被験動物に投与後の全血から直接回収した前標識化ｍＡｂ分子およびＤＶＤ−ＩｇＧ分子を分析するためのＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ計器の使用を説明する。対象となる分子の標識化は製造業者から提供されたＰｉｃｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（登録商標）染料で実行する。標識化抗体を被験動物に投与し、かかる投与後の種々の時点で全血を採取する。分析に先立って血液を遠心し、分析用上清をＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩに収集する。上清のアリコートを動電学的に毛細管に充填し、低粘度ポリマー溶液を収容している１４ｍｍ長さの分離チャンネルに分離する。各サンプルの分析は９６または３８４ウェルプレートから直接に約４０秒で実行する。
【００５３】
Ｐｉｃｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（登録商標）染料の染料溶液とタンパク質ラダーとを製造業者の記載通りに調製する。使用する標識化用バッファは０．５Ｍの炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．０）である。この試験にはｍＡｂ−１（モノクローナル抗体）とＤＶＤ−１（二重可変ドメイン抗体）という２つの異なる分子を使用する。抗体を標識化用バッファで２ｍｇ／ｍＬに希釈し、つぎに８μｇを４０μＭの処理用染料溶液と共にインキュベートする（抗体の最終濃度は０．８ｍｇ／ｍＬであった）。標識化反応を１時間進行させ、次に０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．０）中の１Ｍのエタノールアミンで反応停止させる。
【００５４】
次に分子の各々をマウスに投与する（抗体の最終濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬである）。マウスから血液サンプルを１日一回ずつ１４日間採取する。次に各血液サンプルのアリコートを２０００ｒｐｍで５分間遠心し、５μＬの血清を収集し、製造業者から提供されたサンプルバッファを使用して０．０１ｍｇ／ｍＬに希釈する。ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩで分析する前に各サンプルを７５℃で５分間加熱する。
【００５５】
本明細書は様々な刊行物を引用している。それらの記載内容全部が参照によって本明細書に組込まれるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３（Ａ）−（Ｂ）】
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【国際調査報告】
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