(57)【要約】  本開示は、インターロイキン１受容体（ＩＬ−１Ｒ１）またはＩＬ−１αに対する抗体およびアンタゴニストを用いて、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の増悪を治療する方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
気道炎症の縮小を必要とする患者の気道炎症を低減させる方法であって、該患者は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）増悪を有する患者であり、該方法は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合してＩＬ−１Ｒ１を阻害する抗体を含む組成物の有効量を、該患者に投与することを含む、方法。
【請求項２】
ＩＬ−１αシグナル伝達の低減を必要とする患者のＩＬ−１αシグナル伝達を低減させる方法であって、該患者は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）増悪を有する患者であり、該方法は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合して該ＩＬ−１Ｒ１を阻害する抗体を含む組成物の有効量を、該患者に投与することを含む、方法。
【請求項３】
前記抗体はＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの結合を阻害する組み換え抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体はＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合を阻害する組み換え抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
気道炎症を低減させることはＣＯＰＤ増悪の治療方法の一部である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
気道炎症を低減させることは、肺への好中球流入の低減を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記抗体は約２５キロダルトン以上の分子量を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記抗体はＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの、およびＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合を阻害する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記組み換え抗体はヒト抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記方法はＣＯＰＤを治療するための治療計画の一部である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＯＰＤを治療するための治療計画はステロイドの投与を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＯＰＤ増悪は細菌感染により引き起こされる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＯＰＤ増悪はウイルス感染により引き起こされる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＯＰＤ増悪は煙により引き起こされる、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）で測定した場合に５０ｐＭ以下のＫＤでＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物の投与は全身投与である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記方法は前記組成物の鼻腔内投与を含まない、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記患者は、ＣＯＰＤ増悪の前に、ＧＯＬＤ  ＩＩＩ期またはＧＯＬＤ  ＩＶ期に分類されるＣＯＰＤを有している、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
気道炎症の縮小を必要とする患者の気道炎症を低減させる方法であって、該患者は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）増悪を有する患者であり、該方法は、ＩＬ−１αと特異的に結合してＩＬ−１αのＩＬ−１Ｒ１への結合を阻害する組み換え抗体を含む組成物の有効量を、該患者に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
ＣＯＰＤ増悪を治療するための、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合してＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの結合を阻害する抗体。
【請求項２１】
ＣＯＰＤ増悪を治療するための、ＩＬ−１αと特異的に結合してＩＬ−１αのＩＬ−１Ｒ１への結合を阻害する抗体。
【請求項２２】
ＣＯＰＤ増悪の治療を必要とする患者のＣＯＰＤ増悪を治療する方法であって、該患者はヒトライノウイルス誘発性の気道炎症に起因するＣＯＰＤ増悪を有する患者であり、該方法は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合してＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの結合を阻害する抗体を含む組成物の有効量を、該患者に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
ＣＯＰＤ増悪の治療を必要とする患者のＣＯＰＤ増悪を治療する方法であって、該患者はウイルス感染または細菌感染に起因するＣＯＰＤ増悪を有する患者であり、該方法は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合してＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの結合を阻害する抗体を含む組成物の有効量を、該患者に投与することを含む、方法。
【請求項２４】
気道炎症を低減させることはＣＯＰＤ増悪の治療方法の一部である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
気道炎症を低減させることは、肺への好中球流入の低減を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＣＯＰＤ増悪の治療は気道炎症を低減させることを含む、請求項２０〜２４のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項２７】
ＣＯＰＤ増悪の治療は肺への好中球の流入を低減することを含む、請求項２０〜２５のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項２８】
前記抗体は約２５キロダルトン以上の分子量を有する、請求項２０〜２７のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項２９】
前記抗体は約１５０キロダルトンの分子量を有する、請求項２０〜２７のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項３０】
前記抗体はＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの、およびＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合を阻害する、請求項２０または請求項２２〜２９のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項３１】
前記抗体はヒト抗体である、請求項２０〜３０のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項３２】
前記抗体はヒトＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合できる組み換え抗体である、請求項２０または請求項２２〜３１のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項３３】
前記抗体は、非ヒト霊長類の１つ以上の種に由来するＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合できる組み換え抗体である、請求項２０または請求項２２〜３２のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項３４】
前記抗体はマウスＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合しない、請求項２０または請求項２２〜３３のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項３５】
前記方法または抗体はＣＯＰＤを治療するための治療計画の一部である、請求項２０〜３４のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項３６】
前記ＣＯＰＤを治療するための治療計画はステロイドの投与を含む、請求項３５に記載の方法または抗体。
【請求項３７】
ＣＯＰＤ増悪は細菌感染、ウイルス感染、またはこれらの組み合わせにより引き起こされる、請求項２０〜３６のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項３８】
前記患者は、ＣＯＰＤ増悪の前に、ＧＯＬＤ  ＩＩＩ期またはＧＯＬＤ  ＩＶ期に分類されるＣＯＰＤを有している、請求項２０〜３７のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項３９】
前記抗体は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）で測定した場合に５０ｐＭ以下のＫＤでＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合する、請求項２０または請求項２２〜３８のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項４０】
前記組み換え抗体は抗体６であるか、または抗体６のＣＤＲを有する抗体である、請求項２０または請求項２２〜３９のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項４１】
前記組み換え抗体は、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対してＩＬ−１Ｒａと競合する、請求項２０または請求項２２〜３９のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項４２】
投与は全身投与である、請求項２０〜４１のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項４３】
前記方法は前記組成物の鼻腔内投与を含まない、請求項２０〜４２のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項４４】
前記方法は、前記組成物の鼻腔内投与を含まず、かつ、前記組成物を肺に送達する他の形態の局所投与を含まない、請求項２０〜４２のいずれかに記載の方法または抗体。
【請求項４５】
ウイルス感染または細菌感染に起因するＣＯＰＤ増悪を治療するための、ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αと特異的に結合し阻害する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１０年４月１６日に出願された米国特許仮出願第６１／３２５，２４１号、および２０１０年１１月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／４１６，１０２号の、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく利益を主張するものである。これらの開示物の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（配列表の参照）
本願は配列表を含み、この配列表はＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出済みであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このＡＳＣＩＩファイルのコピーは２０１１年４月１８日に作成され、ＭＥＤ５６２ＰＣ．ｔｘｔという名称であり、サイズは２１，０７９バイトである。
【０００３】
本開示は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）増悪を、抗体等の抗ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストおよび抗ＩＬ−１αアンタゴニストを使用して治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＣＯＰＤは、深刻かつ増加中の全世界の健康問題となっている。ＣＯＰＤは、世界で最も一般的な死因として（現在の）６位から２０２０年には３位に増加すると予想されている。現在、英国におけるＣＯＰＤによる死者は年間３０，０００人に上り、米国では、毎年最大１２０，０００人がＣＯＰＤで死亡していると考えられている（Ｌｏｐｅｚ＆Ｍｕｒｒａｙ  １９９８）。臨床的には、ＣＯＰＤは、主に２つの病理学的症状を含む異質疾患である。２つの症状とは、線維症および末梢気道閉塞を伴う慢性閉塞性気管支炎と、気腔の拡張、肺実質の破壊、肺弾性の損失、末梢気道の閉鎖を伴う肺気腫であり、多くの場合、両方の状況が同一患者に見られる（Ｂａｒｎｅｓ  ２００４）。
【０００５】
ＣＯＰＤの増悪は、患者に対する有害影響が持続し、疾患進行が加速し、医療費が高額であるという点で、重要性が高い（Ｗｅｄｚｉｃｈａ＆Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ２００３）。
【０００６】
インターロイキン（ＩＬ）−１は多機能サイトカインであり、免疫介在性疾患および感染時の炎症反応で主要な役割を果たす。細菌産物、ウイルス、サイトカイン、または免疫複合体による刺激の後、様々な細胞型からＩＬ−１が産生される。ＩＬ−１は、様々な細胞型に対してオートクリン活性およびパラクリン活性を示し、炎症メディエーター（例えばプロスタグランジン、一酸化窒素、サイトカイン、ケモカイン、メタロプロテアーゼ、接着分子等）の産生を促進する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＣＯＰＤ増悪は、ＣＯＰＤ患者にとって重篤な合併症である。ＣＯＰＤの増悪（ＣＯＰＤ増悪）の治療法が必要とされている。この特徴的な患者小集団（すなわち、増悪を伴うか増悪期にある患者）が存在することから、ＣＯＰＤ関連の罹患率と死亡率が上昇している（有意な疾患進行リスクの増大を含む）。こうした薬剤のうちの一部類の薬剤は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合して、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの結合を阻害し、任意で、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合も阻害する。別の部類の薬剤は、ＩＬ−１αと特異的に結合して、ＩＬ−１αがＩＬ−１Ｒ１と結合するのを阻害する。ある実施形態では、本開示の薬剤はアンタゴニストである。ある実施形態では、本開示の薬剤は抗体または抗体断片である。
【０００８】
本開示は、ＣＯＰＤ増悪の治療方法に関する。ある実施形態では、本開示は、気道炎症の縮小を必要とする患者の、気道炎症を低減させる方法に関する。ある実施形態では、本開示は、肺機能の増大を必要とする患者の、肺機能を増大する方法に関する。
【０００９】
第１の態様において、本開示は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）増悪を有し気道炎症の縮小を必要とする患者の、気道炎症を低減させる方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合する抗体を含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。例えば、この抗体はＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合して、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの結合を阻害する。ある実施形態では、この抗体は、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合も阻害する。
【００１０】
別の態様において、本開示は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）増悪の治療を必要とする患者のＣＯＰＤ増悪を治療する方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合する抗体を含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。例えば、この抗体はＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合して、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの結合を阻害する。ある実施形態では、この抗体は、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合も阻害する。
【００１１】
別の態様において、本開示は、ヒトライノウイルス誘発性の気道炎症に起因するＣＯＰＤ増悪を有し、ＣＯＰＤ増悪の治療を必要とする患者の、ＣＯＰＤ増悪を治療する方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合する抗体を含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。例えば、この抗体はＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合して、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの結合を阻害する。ある実施形態では、この抗体は、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合も阻害する。
【００１２】
別の態様において、本開示は、ウイルス感染に起因するＣＯＰＤ増悪を有し、ＣＯＰＤ増悪の治療を必要とする患者の、ＣＯＰＤ増悪を治療する方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合する抗体を含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。例えば、この抗体はＩＬ−１Ｒと特異的に結合して、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの結合を阻害する。ある実施形態では、この抗体は、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合も阻害する。
【００１３】
別の態様において、本開示は、細菌感染に起因するＣＯＰＤ増悪を有し、ＣＯＰＤ増悪の治療を必要とする患者の、ＣＯＰＤ増悪を治療する方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合する抗体を含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。例えば、この抗体はＩＬ−１Ｒと特異的に結合して、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの結合を阻害する。ある実施形態では、この抗体は、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合も阻害する。
【００１４】
別の態様において、本開示は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）増悪を有し、ＩＬ−１αのシグナル伝達の縮小を必要とする患者の、ＩＬ−１αのシグナル伝達を低減させる方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合してＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの結合を阻害する抗体を含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。
【００１５】
治療方法には、単回投与、および治療スケジュールに基づく複数回投与が含まれる。
【００１６】
以下に列記する種々の特徴は、本開示の上記または下記の態様（および実施形態）のいずれにも該当する。ある実施形態では、気道炎症を低減させることは、ＣＯＰＤ増悪の治療方法の一部である。ある実施形態では、気道炎症を低減させることは、肺への好中球の流入を低減することを含む。ある実施形態では、ＣＯＰＤ増悪の治療は、気道炎症を低減させることを含む。ある実施形態では、ＣＯＰＤ増悪の治療は、肺への好中球の流入を低減することを含む。
【００１７】
ある実施形態では、抗体は約２５キロダルトン以上の分子量を有する。ある実施形態では、抗体は約１５０キロダルトンの分子量を有する。
【００１８】
ある実施形態では、当該抗体は、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの、およびＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合を阻害する。
【００１９】
ある実施形態では、当該抗体はヒト抗体である。ある実施形態では、当該抗体はヒトＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合することができる。ある実施形態では、当該抗体は、非ヒト霊長類の１つ以上の種に由来するＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合することができる。ある実施形態では、当該抗体は、マウスあるいはげっ歯類のＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合しない。
【００２０】
ある実施形態では、当該方法は、ＣＯＰＤを治療するための治療計画の一部である。ある実施形態では、ＣＯＰＤを治療するための治療計画は、ステロイドの投与を含む。
【００２１】
ある実施形態では、細菌感染、ウイルス感染、またはこれらの組み合わせによりＣＯＰＤ増悪が生じる。ある実施形態では、当該患者は、ＣＯＰＤ増悪の前に、ＧＯＬＤ  ＩＩＩ期またはＧＯＬＤ  ＩＶ期に分類されるＣＯＰＤを有していた。
【００２２】
ある実施形態では、当該抗体は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）で測定した場合に５０ｐＭ以下のＫＤでＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合する。ある実施形態では、当該抗体は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）で測定した場合に３００ｐＭ以下のＫＤでＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合する。
【００２３】
ある実施形態では、当該抗体は、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対してＩＬ−１Ｒａと競合する。
【００２４】
ある実施形態では、投与は全身投与である。ある実施形態では、当該方法は、上記組成物の鼻腔内投与を含まない。ある実施形態では、当該方法は、上記組成物の鼻腔内投与を含まず、かつ、上記組成物を肺に送達する他の形態の局所投与を含まない。ある特定の、他の実施形態では、２つの異なる投与経路を介してアンタゴニストを投与する。この投与は同時に行ってもよく、時間を変えて行ってもよい。例えば、ある実施形態では、全身投与（例えば静脈内投与）および鼻腔内投与によりアンタゴニストを投与する。他のいくつかの実施形態では、全身経路および肺への局所送達経路を介してアンタゴニストを投与する。
【００２５】
別の態様において、本開示は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）増悪を有し、気道炎症の縮小を必要とする患者の、気道炎症を低減させる方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１αと特異的に結合してＩＬ−１αのＩＬ−１Ｒ１への結合を阻害する抗体を含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。同様に、ＩＬ−１αのアンタゴニストを投与することも企図されている。
【００２６】
別の態様において、本開示は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）増悪の治療を必要とする患者の、ＣＯＰＤ増悪を治療する方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１αと特異的に結合してＩＬ−１αのＩＬ−１Ｒ１への結合を阻害する抗体を含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。同様に、ＩＬ−１αのアンタゴニストを投与することも企図されている。
【００２７】
別の態様において、本開示は、ヒトライノウイルス誘発性の気道炎症に起因する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）増悪を有し、ＣＯＰＤ増悪の治療を必要とする患者の、ＣＯＰＤ増悪を治療する方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１αと特異的に結合してＩＬ−１αのＩＬ−１Ｒ１への結合を阻害する抗体を含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。同様に、ＩＬ−１αのアンタゴニストを投与することも企図されている。
【００２８】
別の態様において、本開示は、ウイルス感染に起因するＣＯＰＤ増悪を有し、ＣＯＰＤ増悪の治療を必要とする患者の、ＣＯＰＤ増悪を治療する方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１αと特異的に結合してＩＬ−１αのＩＬ−１Ｒ１への結合を阻害する抗体を含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。同様に、ＩＬ−１αのアンタゴニストを投与することも企図されている。
【００２９】
別の態様において、本開示は、細菌感染に起因するＣＯＰＤ増悪を有し、ＣＯＰＤ増悪の治療を必要とする患者の、ＣＯＰＤ増悪を治療する方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１αと特異的に結合してＩＬ−１αのＩＬ−１Ｒ１への結合を阻害する抗体を含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。同様に、ＩＬ−１αのアンタゴニストを投与することも企図されている。
【００３０】
別の態様において、本開示は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）増悪を有し、ＩＬ−１αのシグナル伝達の縮小を必要とする患者の、ＩＬ−１αのシグナル伝達を低減させる方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１αと特異的に結合してＩＬ−１αのＩＬ−１Ｒ１への結合を阻害する抗体を含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。同様に、ＩＬ−１αのアンタゴニストを投与することも企図されている。
【００３１】
治療方法には、単回投与、および治療スケジュールに基づく複数回投与が含まれる。
【００３２】
以下に列記する種々の特徴は、本開示の上記または下記の態様（および実施形態）のいずれにも該当する。ある実施形態では、気道炎症を低減させることは、ＣＯＰＤ増悪の治療方法の一部である。ある実施形態では、気道炎症を低減させることは、肺への好中球の流入を低減することを含む。ある実施形態では、ＣＯＰＤ増悪の治療は、気道炎症を低減させることを含む。ある実施形態では、ＣＯＰＤ増悪の治療は、肺への好中球の流入を低減することを含む。
【００３３】
ある実施形態では、当該抗体は約２５キロダルトン以上の分子量を有する。ある実施形態では、当該抗体は約１５０キロダルトンの分子量を有する。
【００３４】
ある実施形態では、当該抗体はヒト抗体である。ある実施形態では、当該抗体はヒトＩＬ−１αと特異的に結合することができる。ある実施形態では、当該抗体は、非ヒト霊長類の１つ以上の種に由来するＩＬ−１αと特異的に結合することができる。ある実施形態では、当該抗体は、マウスＩＬ−１αと特異的に結合しない。
【００３５】
ある実施形態では、当該方法は、ＣＯＰＤを治療するための治療計画の一部である。ある実施形態では、ＣＯＰＤを治療するための治療計画は、ステロイドの投与を含む。ある実施形態では、細菌感染、ウイルス感染、またはこれらの組み合わせによりＣＯＰＤ増悪が生じる。ある実施形態では、当該患者は、ＣＯＰＤ増悪の前に、ＧＯＬＤ  ＩＩＩ期またはＧＯＬＤ  ＩＶ期に分類されるＣＯＰＤを有している。
【００３６】
ある実施形態では、投与は全身投与である。ある実施形態では、当該方法は、上記組成物の鼻腔内投与を含まず、かつ、上記組成物を肺に送達する他の形態の局所投与を含まない。ある実施形態では、当該方法は、上記組成物の鼻腔内投与を含まない。他のいくつかの実施形態では、２つの異なる投与経路を介してアンタゴニストを投与する。この投与は同時に行ってもよく、時間を変えて行ってもよい。例えば、ある実施形態では、全身投与（例えば静脈投与）および鼻腔内投与によりアンタゴニストを投与する。他のいくつかの実施形態では、全身経路および肺への局所送達経路を介してアンタゴニストを投与する。
【００３７】
別の態様において、本開示は、ヒトライノウイルス誘発性の気道炎症に起因するＣＯＰＤ増悪を有し、ＣＯＰＤ増悪の治療を必要とする患者の、ＣＯＰＤ増悪を治療する方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合してＩＬ−１Ｒ１を阻害するＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストを含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。ある実施形態では、ＩＬ−１Ｒ１のアンタゴニストはＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合して、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの、および／またはＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合を阻害する。ある実施形態では、本明細書に記載の任意のアッセイを使用して、拮抗作用を評価する。
【００３８】
別の態様において、本開示は、ウイルス感染に起因するＣＯＰＤ増悪を有し、ＣＯＰＤ増悪の治療を必要とする患者の、ＣＯＰＤ増悪を治療する方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合してＩＬ−１Ｒ１を阻害するＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストを含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。ある実施形態では、ＩＬ−１Ｒ１のアンタゴニストはＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合して、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの、および／またはＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合を阻害する。ある実施形態では、本明細書に記載の任意のアッセイを使用して、拮抗作用を評価する。
【００３９】
別の態様において、本開示は、細菌感染に起因するＣＯＰＤ増悪を有し、ＣＯＰＤ増悪の治療を必要とする患者の、ＣＯＰＤ増悪を治療する方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合してＩＬ−１Ｒ１を阻害するＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストを含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。ある実施形態では、ＩＬ−１Ｒ１のアンタゴニストはＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合して、ＩＬ−１Ｒ１とのＩＬ−１αへの、および／またはＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合を阻害する。ある実施形態では、本明細書に記載の任意のアッセイを使用して、拮抗作用を評価する。
【００４０】
治療方法には、単回投与、および治療スケジュールに基づく複数回投与が含まれる。
【００４１】
以下に列記する種々の実施形態は、本開示の上記または下記の態様（および実施形態）のいずれにも該当する。ある実施形態では、当該アンタゴニストはヒトＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合して、ヒトＩＬ−１Ｒ１を阻害する。
【００４２】
ある実施形態では、ＩＬ−１Ｒ１のアンタゴニストは、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合するヒト抗体およびＩＬ−１Ｒａから選ばれる。ある実施形態では、ＩＬ−１Ｒ１のアンタゴニストは組み換えＩＬ−１Ｒａである。ある実施形態では、このアンタゴニストはＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合して、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの結合を阻害する。
【００４３】
ある実施形態では、ＣＯＰＤ増悪の治療は、気道炎症を低減させることを含む。ある実施形態では、ＣＯＰＤ増悪の治療は、肺への好中球の流入を低減することを含む。
【００４４】
ある実施形態では、当該アンタゴニストは約２５キロダルトン以上の分子量を有する。
【００４５】
ある実施形態では、当該方法は、ＣＯＰＤを治療するための治療計画の一部である。ある実施形態では、ＣＯＰＤを治療するための治療計画は、ステロイドの投与を含む。
【００４６】
ある実施形態では、当該アンタゴニストは、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対してＩＬ−１Ｒａと競合する。
【００４７】
ある実施形態では、投与は全身投与である。ある実施形態では、当該方法は、上記組成物の鼻腔内投与を含まない。ある実施形態では、当該方法は、上記組成物の鼻腔内投与を含まず、かつ、上記組成物を肺に送達する他の形態の局所投与を含まない。他のいくつかの実施形態では、２つの異なる投与経路を介してアンタゴニストを投与する。この投与は同時に行ってもよく、時間を変えて行ってもよい。例えば、ある実施形態では、全身投与（例えば静脈投与）および鼻腔内投与によりアンタゴニストを投与する。他のいくつかの実施形態では、全身経路および肺への局所送達経路を介してアンタゴニストを投与する。
【００４８】
ある実施形態では、当該患者は、ＣＯＰＤ増悪の前に、ＧＯＬＤ  ＩＩＩ期またはＧＯＬＤ  ＩＶ期に分類されるＣＯＰＤを有している。
【００４９】
本開示では、上記の態様および実施形態のあらゆる組み合わせ、ならびに、詳細な説明および実施例に記載のあらゆる実施形態との組み合わせを企図している。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＩＬ−１Ｒ１遮断により、ＩＬ−１β活性がインビトロおよびインビボで阻害されることを示す。図１Ａは、初代ヒトＣＯＰＤ肺線維芽細胞において、抗体６が、ＩＬ−１β誘発性のＩＬ−６放出をインビトロで阻害することを示す。図１Ｂは、マウスの肺において、ＩＬ−１βに誘発された好中球介在性炎症をアナキンラが阻害することを示す。図中のデータは、ＩＬ−１β＋／−抗体処置を伴う気管内攻撃から４時間後の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）から定量化した、好中球の総数である。
【図２】タバコ煙誘発性肺炎症モデルの概略図を示す。
【図３】ＩＬ−１βの遮断で、タバコ煙誘発性炎症が阻害されることを示す。図には４つのパネルがあり、実験終了時の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）から定量化した総細胞、好中球、マクロファージ、およびリンパ球の総数を、実験グループ別の概略で表示している。実験グループとは、室内空気またはタバコ煙（ＣＳ）攻撃を伴う対照群、タバコ煙攻撃を伴うアイソタイプ対照群（ＭＡＢ００５）、タバコ煙攻撃を伴うＩＬ−１Ｒ１抗体（３５Ｆ５）、タバコ煙攻撃を伴うアナキンラ（ＡＬＺＥＴ浸透圧ポンプ）である。
【図４】ＩＬ−１Ｒ１に依存し、カスパーゼ−１には依存しない好中球性炎症反応を誘発するタバコ曝露モデルにおいて、ＩＬ−１αとＩＬ−１βが発現することを示す。（Ａ）は、室内空気および煙に曝露したマウスにおいてＩＬ−１αとＩＬ−１βが発現することを示す、代表的画像である。挿入図は、間質腔から現れたマクロファージを表す。室内空気と煙に曝露した動物（ｎ＝５マウス／グループ）の肺ホモジネートから、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１α（Ｂ）とＩＬ−１β（Ｃ）の総タンパク質レベルを測定した。野生型マウス、およびＩＬ−１Ｒ１欠損マウス（ｎ＝５マウス／グループ）（Ｄ〜Ｆ）またはカスパーゼ−１欠損マウス（Ｇ〜Ｉ）（ｎ＝３〜６マウス／グループ）を、室内空気またはタバコ煙を曝露させた。室内空気と煙に曝露したマウスの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液において、総細胞（ＤとＧ）、単核球（ＥとＨ）、および好中球（ＦとＩ）を評価した。室内空気と煙に曝露した野生型マウスおよびカスパーゼ−１欠損マウス（ｎ＝４〜６マウス／グループ）の肺ホモジネートから、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１α（Ｊ）とＩＬ−１β（Ｋ）の総タンパク質レベルを測定した。
【図５】ＩＬ−１βでなくＩＬ−１αの抗体遮断により、タバコ煙誘発性炎症が阻害されることを示す。煙に曝露させたマウスと室内空気対照マウスを、未処置のままとするか（Ｎｏ  Ｒｘ）、またはアイソタイプ抗体（ＩｇＧアイソタイプ）もしくは抗ＩＬ−１α、抗ＩＬ−１βのどちらかの遮断抗体をマウスに投与した。（Ａ）気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の好中球数をカウントした（ｎ＝４〜５マウス／グループ）。処置しない室内空気対照動物群（ｎ＝５マウス／グループ）を基準にして、ｃｘｃｌ−１（Ｂ）、ｉｌ−１β（Ｄ）、またはｃｘｃｌ−２、ｃｘｃｌ−１０、もしくはｃｘｃｌ５（Ｆ）の転写産物の発現をフリューダイムアレイ（ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ａｒｒａｙ）で評価し、ＣＸＣＬ−１（Ｃ）とＩＬ−１β（Ｅ）の総タンパク質レベルをメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）技術を用いて測定した（ｎ＝１０マウス／グループ）。
【図６】煙曝露マウスのＩＬ−１Ｒ１発現パターンがＣＯＰＤ患者の発現パターンを再現しており、煙誘発性炎症には、放射線抵抗性の非造血細胞上にこの発現パターンが必要とされることを示す。（Ａ）室内空気および煙に曝露させたマウスから得た代表的画像に現れるＩＬ−１Ｒ１発現である。（Ｂ）ＧＯＬＤ  ＩＩＩ期のＣＯＰＤ患者から得た肺生検検体で評価した、ＩＬ−１Ｒ１の発現を示す代表的画像である。（Ｃ）種々のキメラマウス（骨髄ドナー遺伝子型からレシピエント遺伝子型へとコードされたマウス）が産生された。（Ｄ）室内空気またはタバコ煙に曝露した骨髄キメラマウスの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）から、好中球数をカウントした（ｎ＝５〜７マウス／グループ）。フリューダイムアレイにより、ｃｘｃｌ−１（Ｅ）、ｇｍ−ｃｓｆ（Ｆ）、およびｍｍｐ−１２（Ｇ）の発現を測定した（ｎ＝６〜８マウス／グループ）
【図７】マウスのＬＰＳ吸入急性肺炎症モデルにおいて、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストが、ＬＰＳ介在による肺への炎症細胞の流入を阻害することを示す。図には４つのパネルがあり、吸入攻撃から４８時間後の実験終了時のＢＡＬから定量した、総細胞数、好中球数、マクロファージ数、およびリンパ球数を示している。図中のデータは、動物グループ別、すなわち、処置を受けないグループ（無処置）、媒体またはアナキンラ（ＡＬＺＥＴポンプ経由）を投与されたグループ、および生理食塩水またはＬＰＳ吸入攻撃データを受けたグループについて表示している。
【図８】ＩＬ−１Ｒ１の遮断により、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）誘発性炎症がインビトロで縮小することを示す。図８Ａは、ＨＲＶ１４感染およびＢＥＡＳ−２ｂ／Ｈ２９２（上皮細胞株）細胞のＩＬ−１Ｒ１アンタゴニスト処置に関する実験プロトコルを示す。図８Ｂは、ＢＥＡＳ−２ｂ／Ｈ２９２細胞のＨＲＶ１４依存性ＩＬ−８放出に対する、ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニスト処置の効果を示す。図８Ｃは、ＨＲＶ１４感染およびＢＥＡＳ−２ｂ細胞のＩＬ−１Ｒ１アンタゴニスト処置に関する別の実験計画を示す。図８Ｄは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞によるＨＲＶ誘発性ＩＬ−８の放出に対して、本プロトコルを用いてＩＬ−８の放出を低減させるアナキンラの用量範囲を示す。図８Ｅは、初代正常ヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞におけるＨＲＶ１４に対するＩＬ−８反応について、この反応を低減させるアナキンラおよびＩＬ−１Ｒ１抗体の効果を、効果の見られないアイソタイプ対照抗体との比較により示す。
【図９】マウスのライノウイルス誘発性急性肺炎症モデルにおいて、ＩＬ−１Ｒ１抗体がウイルス誘発性炎症を縮小させることを示す。図中の各グループは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、アイソタイプ対照抗体（ＭＡＢ００５）、または抗ＩＬ−１Ｒ１抗体（３５Ｆ５）のいずれかで、図示の用量において腹腔内または鼻腔内において処置し、かつ、鼻腔内においてＰＢＳ、ＨＲＶ−１ｂ、ＵＶ照射ＨＲＶ１ｂ（ＵＶ−ＨＲＶ１ｂ）のいずれかで処置したものである。細胞測定個数は、ＨＲＶ処置または食塩水投与から２４時間後の実験終了時にＢＡＬから定量した総細胞数である。ＨＲＶ処置の２４時間前に、抗体または食塩水を投与した。
【図１０】ＩＬ−１Ｒ１受容体の遮断または欠損が、煙、煙＋ウイルス、煙およびウイルス模倣体に誘発される炎症に及ぼす影響を示す。図１０Ａは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞における煙＋ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストの実験計画を示す。図１０Ｂは、煙に誘発されるＩＬ−８放出に対する、アナキンラの用量依存効果を示す。図１０Ｃは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞における煙＋ウイルス＋ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト（アナキンラ）の実験計画を示す。図１０Ｄは、煙とウイルスの両方を炎症刺激として使用した場合に見られるＩＬ−８放出の増加が、アナキンラに阻害されることを示す。図１０Ｅは、煙に曝露した精密切断肺切片（ＰＣＬＳ）におけるＩＬ−１Ｒ１の欠損が、ウイルス刺激に対する肺常在性反応を減弱させることを示す。室内空気またはタバコ煙に曝露した野生型動物およびＩＬ−１Ｒ１欠損動物から作製したＰＣＬＳを、ウイルス模倣体であるｐｏｌｙＩ：Ｃでエキソビボで刺激した。ｃｘｃｌ−１（パネル１０Ｅの左端のグラフ）、ｃｘｃｌ−２（パネル１０Ｅの中央のグラフ）、およびｃｘｃｌ−５（パネル１０Ｅの右端のグラフ）の発現を、室内空気対照群である偽刺激ＰＣＬＳ（データ非表示）との比較により、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲで評価した（ｎ＝３つの独立した実験から取得した７〜１４の肺切片）。
【図１１】煙に曝露したマウスのＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス感染モデルにおいて、ＩＬ−１Ｒ１欠損およびＩＬ−１α抗体遮断が過剰炎症を減弱させることを示す。（Ａ）〜（Ｃ）室内空気または煙に曝露した野生型マウスまたはＩＬ−１Ｒ１欠損マウスに、媒体を点滴投与するかＨ１Ｎ１インフルエンザＡウイルスを感染させた。感染から５日後に、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液から総細胞（Ａ）、単核球（Ｂ）、および好中球（Ｃ）の個数をカウントした（ｎ＝１９〜２０マウス／グループ）。室内空気または煙に曝露させ、アイソタイプ抗体またはＩＬ−１α遮断抗体で毎日処置した野生型マウスに、媒体を点滴投与するかＨ１Ｎ１インフルエンザＡウイルスを感染させた。感染から５日後に、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液から総細胞（Ｄ）、単核球（Ｅ）、および好中球（Ｆ）の個数をカウントした（ｎ＝４〜５マウス／グループ）。
【図１２】ＣＯＰＤ増悪期のＣＯＰＤ患者のＩＬ−１αおよびＩＬ−１βのレベルを示す。パネルＡは、疾患の安定期または増悪期のＣＯＰＤ患者のＩＬ−１αレベルとＩＬ−１βレベルを、喀痰測定値で示したものである。青色の棒は増悪期、赤色の線はＩＬ−１α、緑色の線はＩＬ−１βを表す。パネルＢは、ＣＯＰＤの肺に存在する細菌に付随してＩＬ−１βレベルが増加することを示す。
【図１３】ＣＯＰＤ患者の肺においてＩＬ−１αとＩＬ−１βが増加することを示す。図に示す代表画像は、ＧＯＬＤ  Ｉ期／ＩＩ期のＣＯＰＤ患者の肺生検検体を評価して得た、ＩＬ−１α（Ａ）およびＩＬ−１β（Ｂ）の発現を示している。（Ｃ）各患者から取得した２つの生検検体から、陽性細胞の数をカウントした（非ＣＯＰＤ患者ｎ＝５、ＧＯＬＤ  Ｉ〜ＩＩ期のＣＯＰＤ患者ｎ＝９）。同一患者の多回サンプリングを考慮に入れるため、（分散を調整する）負の２項式を伴う一般化線形混合効果モデルを用いて統計的有意性を特定した。ボックスプロットのひげで表す範囲は、１〜９９パーセンタイルである。同一の生検検体から得た複数の肺切片を、上皮のＩＬ−１α（Ｄ）およびＩＬ−１β（Ｅ）の染色について次のように点数化した。０：染色なし、１：ところどころに染色、２：著しい局所的な染色、３：著しい拡散的な染色。層別化ウィルコクソン順位和検定を使用して染色分類（０、１、２、および３）の頻度を比較し、グラフで表示した（ブロックのサイズが頻度に比例する）。ＩＬ−１αの上皮染色については、非ＣＯＰＤ検体とＣＯＰＤ検体の間に有意差はなかったが、ＩＬ−１βの染色では、ＣＯＰＤ検体と非ＣＯＰＤ検体は有意に異なっていた（ｐ＜０．０００１）。安定病態期の登録時（Ｆ）、増悪発症時（Ｇ）、増悪後７日（Ｈ）、および増悪後３５日（Ｉ）の患者から喀痰検体を取得し、ＩＬ−１αとＩＬ−１βのレベルを測定した。すべての病態で、ＩＬ−１αとＩＬ−１βが有意に相関していた。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
（詳細な説明）
（ｉ）序文
炎症はＣＯＰＤの特徴として確立しており、ＣＯＰＤの増悪時に増加する（増悪の期間中増加する）。しかし、こうした炎症反応を起こす分子メカニズムはよく分かっていない。本明細書では、気道炎症を低減させる方法、およびＣＯＰＤ増悪の治療方法を開示する。特に本方法は、ＩＬ−１Ｒと結合してＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１βを阻害する抗体を使用することを含む。気道炎症の縮小を測定する方法については、炎症促進メディエーターおよび副産物（例えばサイトカインや、炎症細胞の流入）の減少を測定することにより、ミクロレベルで測定でき、また、慢性閉塞性肺疾患のためのグローバルイニシアティブ（ＧＯＬＤ）によるＣＯＰＤ重篤度の５つの病期分類で分類されているように、肺機能の増大をもとにマクロレベルで測定できる。
【００５２】
平滑筋の肥大化、気道組織の慢性炎症、および気管壁のあらゆる部分での全般的肥厚が生じると、ＣＯＰＤ患者の気道径が縮小し得る。気道を囲む組織に炎症と浮腫が生じた場合も、気道径が縮小し得る。気道壁内の組織から炎症メディエーターが放出され、このメディエーターが刺激となって、気道の平滑筋収縮を起こす場合がある。炎症メディエーターの産生・放出を減少させる治療を使用すれば、平滑筋収縮、気道炎症、および浮腫を縮小し得る。炎症メディエーターの例として、サイトカイン、ケモカイン、ヒスタミンがある。炎症メディエーターを産生・放出する組織の例としては、気道平滑筋、上皮、マスト細胞がある。本明細書に開示する組成物および方法を用いた治療により、炎症メディエーターを産生または放出する気道細胞の能力が減少し得る。炎症メディエーターの放出が減少すれば、慢性炎症が縮小するだけでなく、ＣＯＰＤ増悪期に見られる急性炎症も減少し、よって気道内径が増大する。さらに、気道平滑筋の過剰反応性が低下する可能性もある。
【００５３】
サイトカインのＩＬ−１ファミリーは１１の個別メンバーからなり、中でもそのうちの４つ、すなわちＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１８、およびＩＬ−１Ｒａ（ＩＬ−１受容体アンタゴニスト）は他のメンバーより十分に特徴付けられており、種々の疾患における病理過程と関連付けられている［１］。ＩＬ−１は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βという２種類の形態で存在する。これらは別個の遺伝子の産物である。これらのタンパク質はアミノ酸レベルで関連性があり、ＩＬ−１αとＩＬ−１βは２２％の相同性を共有し、ＩＬ−１αとＩＬ−１Ｒａは１８％の相同性を共有する。ＩＬ−１βとＩＬ−１Ｒａは２６％の相同性を共有する。ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１Ｒａの遺伝子は、ヒト染色体２ｑ１４の類似領域に位置する［２、３］。
【００５４】
ＩＬ−１αとＩＬ−１βの両方とも、３１ｋＤａの前駆体ペプチドとして合成され、切断されて１７ｋＤａの成熟したＩＬ−１α、ＩＬ−１βが生成される。ＩＬ−１βは、上皮細胞やマクロファージを含む種々の細胞型により産生される。ＩＬ−１βは、システインプロテアーゼカスパーゼ−１（ＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ））に切断された後、放出される［４］。ＩＬ−１αは、カルパインプロテアーゼに切断されるが、原形質膜上に残ることができ、そこから、細胞間の直接の接触により、細胞を活性化するようである［５］。Ｐｒｏ−ＩＬ−１αは、自身のアミノ末端に核局在配列を含み、この配列から、種々の細胞経路の活性化が生じ得る［６］。
【００５５】
ＩＬ−１Ｒａは、天然由来の、ＩＬ−１系の阻害物質である。ＩＬ−１Ｒａは、選択的ｍＲＮＡスプライシングおよび選択的翻訳開始から派生した、４種類のアイソフォームとして産生される。ＩＬ−１Ｒａの１７ｋＤａの分泌型アイソフォームは、可変的にグリコシル化された２２〜２５ｋＤａの種として発現し［７、８］、現在はｓＩＬ−１Ｒａと称される。１８ｋＤａの細胞内アイソフォームは、ｉｃＩＬ−１Ｒａ１と称される［９］。アイソフォームｉｃＩＬ−１Ｒａ２は、選択的転写性スプライスにより、ｉｃＩＬ−１Ｒａ１とｓＩＬ−１Ｒａの第１エクソンの間に位置するエクソンから産生される［１０］。ｉｃＩＬ−１Ｒａ３と呼ばれる、第３の１６ｋＤａの細胞内アイソフォームも同定されている［１１］。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）（別名アナキンラ）は、組み換え型で、非グリコシル化形態のヒトインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）である。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）は、アミノ末端に単一のメチオニン残基の付加を有するという点で、天然ヒトＩＬ−１Ｒａとは異なる。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）は１５３個のアミノ酸からなり、１７．３キロダルトンの分子量を有する。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）は、中程度〜重度の活動性関節リウマチの治療用として承認されている。アナキンラ（本明細書ではアナキンラおよび／またはＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）と称する）は、ＩＬ−１Ｒ１のシグナル伝達に拮抗するＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストの一例である。ある実施形態では、本開示の方法は、ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニスト（例えばアナキンラや、類似形態のＩＬ−１Ｒａ）を投与することを含む。
【００５６】
ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、ＩＬ−１受容体ファミリーに属する膜貫通受容体であるＩＬ−１Ｒ１（ヒトＩＬ−１Ｒ１についてはＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿００８７７）と結合することにより、それぞれの生物学的効果を及ぼす。ＩＬ−１受容体ファミリーには３つのメンバー、すなわちＩＬ−１受容体１（ＩＬ−１Ｒ１）（８０ｋＤａ）、ＩＬ−１ＲＩＩ（６８ｋＤａ）、およびＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲａｃＰ）がある。ＩＬ−１Ｒ１とＩＬ１ＲａｃＰは、細胞膜中で複合体を形成して、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βの結合時にシグナル伝達できる高親和性の受容体を産生する。ＩＬ−１ＲａはＩＬ−１Ｒ１と結合するが、ＩＬ−１ＲＡｃＰとは相互作用しない。ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１Ｒａは、細胞内シグナル伝達ドメインを持たないＩＬ−ＲＩＩとも結合する。
【００５７】
ＩＬ−１Ｒ１はシグナル伝達受容体と称される。その理由は、リガンド結合時およびＩＬ−１ＲＡｃＰとの複合体形成時に、ＩＬ−１Ｒ１の２１３個のアミノ酸残基の細胞質側末端を介してシグナル伝達が開始されるからである［１２］。最新の文献は、Ｌ−１ＲＩＩは、可溶型として細胞表面または細胞外で「デコイ受容体」の働きをするに過ぎないと示唆している［１３］。ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの、および／またはＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合を調節することは、ＩＬ−１のシグナル伝達を調節する１つの方法である。
【００５８】
ＩＬ−１のシグナル伝達は、多くの慢性炎症性疾患で重要な役割を持つ。ある実施形態では、本開示は、（ＣＯＰＤ増悪治療の一部として）ＩＬ−１Ｒ１抗体を投与することにより、ＩＬ−１のシグナル伝達を阻害することを含む。このＩＬ−１Ｒ１抗体はＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合して、少なくともＩＬ−１αとの結合を少なくとも阻害することにより、ＩＬ−１Ｒ１活性を阻害する。ある実施形態では、この抗体はＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合も阻害する。ある実施形態では、本開示は、ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒ１のアンタゴニスト）を（ＣＯＰＤ増悪治療の一部として）投与することにより、ＩＬ−１のシグナル伝達を阻害することを含む。上記のＩＬ−１Ｒ１抗体は、こうしたＩＬ−１Ｒ１のアンタゴニストの例である。他の例として、アナキンラや、天然ＩＬ−１Ｒａが挙げられる。ある実施形態では、本開示は、（ＣＯＰＤ増悪治療の一部として）ＩＬ−１αと特異的に結合して、ＩＬ−１αのＩＬ−１Ｒ１への結合を阻害するＩＬ−１α抗体を投与することにより、ＩＬ−１のシグナル伝達を阻害することを含む。
【００５９】
これらの方法の他の特徴、およびこれらの方法で使用できる組成物を、本明細書で説明する。
【００６０】
（ｉｉ）用語
本開示のさらに詳細な説明を続ける前に、本開示は特定の組成物や工程ステップに限定されるものではなく、これらは変更可能であることを理解するものとする。本明細書および添付の請求項において、文脈上明らかに別の指示をしている場合を除き、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の指示物を含むことに留意しなければならない。
【００６１】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する専門用語および科学用語はすべて、本開示が関係する技術分野の当業者が一般に理解している意味と同じ意味を有する。当業者は、例えば、ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓから、本開示で使用されている語の多くを含む一般的辞書を得ることができる。
【００６２】
アミノ酸については、本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生物化学命名法委員会が推奨する、一般に知られている３文字の記号または１文字の記号で示す場合がある。ヌクレオチドについても、一般に容認されている１文字コードで指し示す場合がある。
【００６３】
抗体の可変領域、相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびフレームワーク領域（ＦＲ）にあるアミノ酸の番号付けについては、別段の指示がない限り、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に規定されているＫａｂａｔの定義に従う。この番号付け体系を使用すると、可変領域のＦＲもしくはＣＤＲの短縮またはＦＲもしくはＣＤＲへの挿入に対応して、実際の直鎖状アミノ酸配列に含まれるアミノ酸が減少または増加する場合がある。例えば、重鎖の可変領域で、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸（Ｋａｂａｔに従い５２ａ）が挿入され、重鎖ＦＲの残基８２の後に残基（例えば、Ｋａｂａｔに従い残基８２ａ、８２ｂ、８２ｃ等）が挿入されることがある。抗体の配列相同領域で「標準」のＫａｂａｔ番号付け配列と整列することにより、所与の抗体のＫａｂａｔ番号付けを決定することができる。フレームワーク残基を最大限に整列するには、Ｆｖ領域で使用できるようにするため、番号付け体系に「スペーサー」残基を挿入する必要があることが多い。加えて、種間または対立遺伝子に相違があるため、任意のＫａｂａｔ部位番号位置の特定の個々の残基の同一性が、抗体鎖ごとに異なる場合がある。
【００６４】
本明細書で使用する「抗体」という語は、免疫グロブリンとも呼ばれ、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２種類のエピトープ結合断片から形成される多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物活性を示す抗体断片（例えば、抗原結合部分）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本開示の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、細胞内抗体、および上記抗体のエピトープ結合断片が包含される。特に、抗体には、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、少なくとも１つの抗原結合部位を有する分子が含まれる。免疫グロブリンは、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹ）、サブイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、またはアロタイプ（例えばＧ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ、またはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、またはｃ）等のＧｍ、Ａｍ、Ｅｍ、Ｋｍ（１、２、または３））であり得る。抗体は、限定されないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス等を任意の哺乳動物、または鳥類（例えばニワトリ）等の他の動物に由来してもよい。ある実施形態では、分子量に基づいて抗体をさらに詳しく説明することができる。ある実施形態では、分子量は２５キロダルトン以上である。ある実施形態では、抗体は定常領域を含む完全長抗体である。
【００６５】
本明細書で使用する「アンタゴニスト」という語は、生物活性を阻害する化合物をいう。例えばＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストは、ＩＬ−１Ｒ１のシグナル伝達に対するアンタゴニストである。例えば、ＩＬ−１Ｒ１と結合して、ＩＬ−１Ｒ１を介するＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１βのシグナル伝達を阻害する化合物は、ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストである。例えば、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合して、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの、および／またはＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合を阻害する抗体等の中和抗体は、ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストの例である。ＩＬ−１Ｒａ化合物（例えばアナキンラ）は、ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストの別の例である。ある実施形態では、アンタゴニストはタンパク質であり得る。ある実施形態では、アンタゴニストは非ポリペプチドアンタゴニスト（例えば核酸や小分子）であり得る。
【００６６】
過剰な抗体が、受容体と結合するリガンドの量を（インビトロの競合的結合アッセイで測定して）少なくとも５０％、６０％、または８０％、より一般的には約８５％超低減すると、抗体はリガンドの受容体への結合を阻害する。
【００６７】
本明細書で使用する「気道」という語は、空気に曝露される対象の呼吸器系の一部または全体を意味する。したがって、「気道」には上部と下部の気道経路が含まれ、それには、気管、気管支、細気管支、終末細気管支、呼吸細気管支、肺胞管、および肺胞嚢が含まれるが、これらに限定されない。気道には、洞、鼻道、鼻粘膜、および鼻粘膜上皮が含まれる。また、咽頭、喉頭、気管気管支樹、扁桃も気道に含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書で使用する「ＩＬ−１Ｒ１」という語は、インターロイキン１受容体１を意味する。ヒトＩＬ−１Ｒ１の核酸配列およびアミノ酸配列は公表されている（ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿０００８７７）。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１Ｒ１はヒトまたはカニクイザルのＩＬ−１Ｒ１であり得る。本明細書の別の箇所に記載するように、ＩＬ−１Ｒ１は組換え型でよく、かつ／またはグルコシル化型もしくは非グリコシル化型でよい。
【００６９】
本明細書で使用する「ＩＬ−１α」あるいは「ＩＬ−１アルファ」という語は、インターロイキン１αを意味する。ヒトＩＬ−１αの核酸配列およびアミノ酸配列は公表されている（ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿０００５７５．３）。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１αはヒトまたはカニクイザルのＩＬ−１αでよい。本明細書の別の箇所に記述するように、ＩＬ−１αは組換え型でよく、かつ／またはグルコシル化型もしくは非グリコシル化型でよい。
【００７０】
本明細書で使用する「ＩＬ−１β」あるいは「ＩＬ−１ベータ」という語は、インターロイキン１βを意味する。ヒトＩＬ−１βの核酸配列およびアミノ酸配列は公表されている（ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿０００５７６）。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１βはヒトまたはカニクイザルのＩＬ−１βでよい。本明細書の別の箇所に記述するように、ＩＬ−１βは組換え型でよく、かつ／またはグルコシル化型もしくは非グリコシル化型でよい。
【００７１】
本明細書で使用する「Ｇｅｏｍｅａｎ」（幾何平均とも呼ばれる）という語は、元の底１０の数字に変換された、データセットの対数値の平均をいう。これを求めるには、少なくとも２つの測定値、例えば、少なくとも２、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０の繰り返しの存在が必要とされる。当業者であれば、繰り返しの数が多いほど、ｇｅｏｍｅａｎ値がより強固になることを理解するであろう。繰り返し数の選択は、当業者の判断に委ねることができる。
【００７２】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という語は、同一のエピトープに特異的に結合する抗体の実質的に均質な集団から得られた抗体をいう。「ｍＡｂ」という語はモノクローナル抗体を指す。
【００７３】
本明細書で使用する「および／または」は、特定の２つの特徴または構成要素の各々を、他方を伴うかまたは伴わない具体的開示として解釈されることを指摘することは都合が良い。例えば「Ａおよび／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、（ｉｉｉ）ＡおよびＢ、の各々が本明細書で個別に記述されているかの如く、各々が具体的に開示されたものと解釈される。
【００７４】
本明細書で使用する「増悪」という語は、各患者のベースライン状態と比較して、ＣＯＰＤの症状が悪化することをいう。ある実施形態では、ＣＯＰＤ増悪の定義として、疾患の自然経過において、患者のベースラインの肺機能、呼吸困難、咳、および／または喀痰が変化することを特徴とし、この変化が通常の日々の変化量を超え、発症が急性的であり、根底にＣＯＰＤを有する患者の投薬変更が正当化される可能性がある事象、と定義され得る。ある実施形態では、ＣＯＰＤの増悪とは、息切れおよび／または喘鳴の症状の急激な増加、および／または膿性痰（膿を含む喀痰）産生量の増加であり得る。
【００７５】
（ｉｉｉ）抗体およびアンタゴニスト
本明細書で開示するＣＯＰＤ増悪の治療方法は、ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αと結合するアンタゴニストおよび／または抗体を含む組成物を投与することを含む。ある実施形態では、アンタゴニストとは、標的と結合して標的を阻害し、場合によっては他のリガンドによる結合を阻止する、タンパク質、核酸、または小分子であり得る。
【００７６】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法で使用する抗体は、ＩＬ−１Ｒ１と結合してＩＬ−１Ｒ１を阻害するＩＬ−１Ｒ１抗体である（米国特許出願公開第２００４００９７７１２号および第２０１００２２１２５７号。この文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる）。ある実施形態では、当該抗体はＩＬ−１Ｒ１（例えばヒトＩＬ−１Ｒ１）と特異的に結合する。ある実施形態では、当該抗体はＩＬ−１Ｒ１と結合して、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの、および／またはＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１βへの結合を阻害する。ある実施形態では、当該抗体はヒト抗体である。ある実施形態では、当該抗体は、抗体６と同一のエピトープと結合するか、または、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対して抗体６と競合する。ある実施形態では、当該抗体は、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対してＩＬ−１Ｒａと競合する。ある実施形態では、本開示の抗体は、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対してＩＬ−１Ｒａとの競合を行わない。
【００７７】
例として、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合する代表的なヒト抗体を本明細書に記述する。表１ａと表１ｂに、これらのヒト抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を示す。これらの抗体の１つ（抗体６）について、ＶＨとＶＬのアミノ酸配列、およびその生殖細胞系バージョンを本明細書に示す。ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合する代表的なげっ歯類抗体の１つは、ＢＤファーミンゲン／ＢＤバイオサイエンスから市販されている３５Ｆ５抗体である。
【００７８】
別の実施形態では、代表的なヒト抗体には、米国特許出願公開第２００４００９７７１２号に開示されている抗体が含まれ、米国特許出願第２００４００９７７１２号の図５、６、７、８、９、１０、および１１に開示されている２６Ｆ５、２７Ｆ２、１５Ｃ４が含まれる（これらの図は、参照により明確に組み込まれる）。これらの抗体のアミノ酸配列を本明細書に示す。
【００７９】
上記抗体をはじめとする、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合してＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１βとの結合を阻害する抗体は、本発明の方法において有用な代表的ＩＬ−１Ｒ１抗体である。このような抗体は、ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストの例でもある。
【００８０】
ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストのさらなる代表例として、アナキンラまたは他の形態のＩＬ−１Ｒａが含まれる。
【００８１】
本開示の方法での使用に適する可能性のある、ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αのさらに別のアンタゴニストは、少なくとも以下の国際公開特許出願に開示されている：国際公開第２００４／０２２７１８号、国際公開第２００５／０２３８７２号、国際公開第２００７／０６３３１１号、国際公開第２００７／０６３３０８号、国際公開第２００５／０８６６９５号、国際公開第１９９５／０１４７８０号、および国際公開第２００６／０５９１０８号。
【００８２】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法で使用する化合物は、ＩＬ−１αと特異的に結合して、ＩＬ−１αのＩＬ−１Ｒ１への結合を阻害する。代表的な化合物は、ＩＬ−１αと特異的に結合する抗体であり、例として、Ｒ＆Ｄシステムズが市販している抗体ＡＬＦ１６１（カタログ番号ＭＡＢ４００１）が挙げられる。
【００８３】
請求項でクレームされている方法で使用する抗体およびアンタゴニストを表し得る代表的特徴を、以下に記述する。
【００８４】
別の実施形態では、請求項でクレームされている方法で使用する抗体またはアンタゴニストは、３０ｐＭのＩＬ−１β存在下のヒト全血において、平均がＩＬ−１β誘導性のＩＬ−６産生の阻害に対して、１ｎＭ未満のＩＣ５０値を有する。さらなる実施形態では、このＩＣ５０値の平均は、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、または１００ｐＭ未満である。
【００８５】
本開示のアンタゴニスト（抗体または非抗体アンタゴニスト）は、ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αと結合し、例えば高い効力を伴って、ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αを中和する。中和とは、ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αの生物活性を阻害することを意味する。本開示のアンタゴニストは、ＩＬ−１Ｒ１の１つ以上の生物活性を中和することができ、通常は、請求項でクレームされている方法で使用するアンタゴニストは、ＩＬ１αおよびＩＬ１βのＩＬ−１Ｒ１への結合を阻害する。
【００８６】
ある実施形態では、抗体またはアンタゴニストは、ヒトＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合して、ヒトＩＬ−１Ｒ１を阻害する。ある実施形態では、抗体またはアンタゴニストは、ヒトＩＬ−１αと特異的に結合して、ヒトＩＬ−１αを阻害する。また、ある実施形態では、抗体またはアンタゴニストは、非ヒトＩＬ−１Ｒ１または非ヒトＩＬ−１α（すなわち、ヒト以外の種で天然由来のＩＬ−１Ｒ１相同分子種またはＩＬ−１α相同分子種）と結合して、非ヒトＩＬ−１Ｒ１または非ヒトＩＬ−１αを中和することができる。ある実施形態では、ヒト以外の種は、非ヒト霊長類の１つ以上の種、例えばカニクイザルである。
【００８７】
例えば標準の競合アッセイにおいて、結合の特異性を判定または実証することができる。
【００８８】
ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αの中和を測定するための好適なアッセイの例として、リガンド受容体生化学アッセイおよび表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）（例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標））が挙げられる。
【００８９】
ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１α抗体およびアンタゴニストの結合動態および親和性（平衡解離定数ＫＤで表される）は、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））を使用して判定できる。本開示の抗体およびアンタゴニストは、通常、ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１α（例えばヒトＩＬ−１Ｒ１またはヒトＩＬ−１α）に対して約１ｎＭ未満の親和性（ＫＤ）を有し、いくつかの実施形態では、約５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭのＫＤを有し、他の実施形態では、約５０ｐＭ未満のＫＤを有し、他の実施形態では、約２５ｐＭ未満のＫＤを有し、他の実施形態では、約１０ｐＭ未満のＫＤを有し、他の実施形態では、約１ｐＭ未満のＫＤを有する。
【００９０】
抗体またはアンタゴニストの、その抗原に対する結合親和性の測定のために、いくつかの方法が利用可能であり、その１つはＫｉｎＥｘＡである。Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＫｉｎＥｘＡ）は、抗原／抗体相互作用に対する平衡解離定数および結合・解離速度定数を測定できる、汎用の免疫測定プラットフォーム（基本的にフロー蛍光分光計）である。ＫｉｎＥｘＡは平衡を得た後で実施するので、相互作用のオフ速度が非常に低くなり得る親和性の高い相互作用のＫＤを測定する際に使用する方法として、有利な手法である。ＫｉｎＥｘＡの使用が特に適するのは、表面プラズモン共鳴法分析で正確に予測可能な親和性より、抗体と抗原の親和性が高い場合である。Ｄｒａｋｅら（２００４）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２８，３５−４３の説明に従って、ＫｉｎＥｘＡの技法を実施できる。
【００９１】
本開示の一実施形態では、本開示の抗体またはアンタゴニストは、ＫｉｎＥｘＡ技法で測定してＫＤが３００ｐＭ以下の、ＩＬ−１Ｒ１に対する特異性を有する。あるいは、ＫＤ値は２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、または１ｐＭ以下である。
【００９２】
生物活性の阻害は、部分的または完全であり得る。アンタゴニストは、ＩＬ−１Ｒ１の生物活性（例えば、ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞中のＩＬ−１β誘発によるＩＬ−８の放出、またはＨｅＬａ細胞中のＩＬ−１αおよびＩＬ−１β誘発によるＩＬ−８の放出）を１００％阻害することができる。あるいは、アンタゴニストの非存在下で最大可能活性の５０％または８０％を誘発するＩＬ−１α濃度またはＩＬ−１β濃度の活性の、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％を阻害することができる。アンタゴニストは、ＩＬ−１αの生物活性（例えば、ＨｅＬａ細胞中のＩＬ−１α誘発によるＩＬ−８の放出）を１００％阻害することができる。あるいは、アンタゴニストの非存在下で最大可能活性の５０％または８０％を誘発するＩＬ−１α濃度の活性の、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％を阻害することができる。
【００９３】
別段の記載がない限り、アンタゴニストの中和能力は、単位ｎＭのＩＣ５０値で表す。機能アッセイでは、ＩＣ５０とは、生物学的反応の最大量を５０％低下させるアンタゴニスト濃度である。リガンド結合実験では、ＩＣ５０とは、受容体結合の最大特異的結合レベルを５０％低下させる濃度である。ＩＣ５０は、アンタゴニスト濃度の対数の関数として最大生物学的応答の％値をプロットし、Ｐｒｉｓｍ（グラフパッドソフトウェア社、米国カリフォルニア州ラホーヤ）等のソフトウェアプログラムを使用して、シグモイド関数をデータに当てはめてＩＣ５０値を生成することにより計算できる。効力については、当業者に対して公知の１つ以上のアッセイを使用して、かつ／または、本明細書において説明または参照する方法で特定または測定できる。アンタゴニストの中和効力をｇｅｏｍｅａｎとして表すことができる。
【００９４】
ある実施形態では、当該アンタゴニストがＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αと結合し中和することを示す本明細書に記載のアッセイまたは任意の標準アッセイを使用して、アンタゴニストによるＩＬ−１Ｒ１活性またはＩＬ−１α活性の中和が実証される。アンタゴニストのＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αへの結合の測定に使用できる他の方法には、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、免疫沈降、親和性クロマトグラフィー、および生化学アッセイが含まれる。
【００９５】
請求項でクレームされている方法において使用する本開示のアンタゴニストは、他の種のＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αに対する親和性と比較して、ヒトＩＬ−１Ｒ１またはヒトＩＬ−１αに対して同等または強力な親和性を有し得る。ヒトＩＬ−１Ｒ１またはヒトＩＬ−１αに対するアンタゴニストの親和性は、カニクイザルＩＬ−１Ｒ１またはカニクイザルＩＬ−１αに対する親和性と同等か、または、例えば５倍以内もしくは１０倍以内であり得る。
【００９６】
請求項でクレームされている方法において使用する本開示のアンタゴニストは、ある実施形態では、１つ以上のＣＤＲ（例えば、フレームワーク内の「ＣＤＲ一式」）を含むＩＬ−１Ｒ１結合モチーフを含む。ＣＤＲ一式は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３（ここでＨは重鎖を指し、Ｌは軽鎖を指す）から選ばれる１つ以上のＣＤＲを含む。一実施形態では、ＣＤＲ一式は、表１ａまたは表１ｂに記載のＨＣＤＲ３を含み、表１ａまたは表１ｂに記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３から選ばれる１つ以上のＣＤＲと任意で組み合わされる。別の実施形態では、ＣＤＲ一式は、表１ａまたは表１ｂに記載のＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２から選ばれる１つ以上のＣＤＲ（例えば、表１ａまたは表１ｂに記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２から選ばれる１つ以上のＣＤＲ）と任意で組み合わされる。別の実施形態では、ＣＤＲ一式は、表１ａまたは表１ｂに記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。
【００９７】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体は、表１ａに表示されているＣＤＲを有する抗体である。手短に述べると、表１ａに示すＣＤＲ配列一式を有するヒト親抗体分子が単離された（抗体１を参照）。最適化プロセスを通じて、親ＣＤＲ配列から派生したＣＤＲ配列を有し、かつ表１ａに示す位置に修飾を有する、２〜３の番号が付けられたヒト抗体クローンの一団が作製された。したがって、例えば、表１ａから分かるように、抗体２は親のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２を有する。また親のＨＣＤＲ３の配列を有するが、この配列のＫａｂａｔ残基１００ＥはＴで置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＦはＶで置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＧはＤで置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＨはＡで置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＩはＡで置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１０１はＶで置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１０２はＤで置き換えられている。
【００９８】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体は、表１ｂに表示されているＣＤＲを有する抗体である。手短に述べると、表１ｂに示すＣＤＲ配列一式を有する第２の親ヒト抗体分子が単離された（抗体４を参照）。最適化プロセスを通じて、親ＣＤＲ配列から派生したＣＤＲ配列を有し、かつ表１ｂに示す位置に修飾を有する、５〜１０の番号が付けられたヒト抗体クローンの一団が作製された。したがって、例えば、表１ｂから分かるように、抗体５は親のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２を有する。また、親のＨＣＤＲ３の配列を有するが、この配列のＫａｂａｔ残基１００ＡはＡで置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＢはＰで置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＣはＰで置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＤはＰで置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＥはＬで置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＦはＧで置き換えられ、Ｋａｂａｔ残基１００ＩはＧで置き換えられている。
【００９９】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体またはアンタゴニストは、表１ａまたは表１ｂに記載のＣＤＲの１個以上（１、２、３、４、５、または６個）を有するヒト抗体である。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体は、表１ａまたは表１ｂに記載のＣＤＲを有するヒト抗体であるが、この場合、ＣＤＲのうち１つ以上は、１つ以上のアミノ酸の付加、置換、欠失、および／または挿入を有する。例えば、ある実施形態では、そのような抗体は、抗体１または抗体４の親配列に対して、１〜５個（１、２、３、４、または５個）の付加、置換、欠失、および／または挿入を有し、かつ、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合する能力を保持する。
【０１００】
ある実施形態では、当該抗体またはアンタゴニストは、抗体６のＣＤＲを有する。ある実施形態では、当該抗体またはアンタゴニストは、抗体６の生殖細胞系バージョンである。ある実施形態では、当該抗体は、抗体６のＶＨおよび／もしくはＶＬ、またはその生殖細胞系バージョンを含む。抗体６のアミノ酸配列、および抗体６の生殖細胞系バージョンが、本明細書に示されている。ある実施形態では、当該抗体は、抗体６と同一または実質的に同一のエピトープと結合する。ある実施形態では、当該抗体は、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対して抗体６と競合する。
【０１０１】
ある実施形態では、当該抗体またはアンタゴニストは、以下の置換または欠失の１つ以上を伴う抗体１のＨＣＤＲ３を含む：
Ｋａｂａｔ残基１００ＥがＴに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＦがＶまたはＬに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＧがＤに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＨがＡまたはＰに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＩがＡまたはＰに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１０１がＶまたはＧに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１０２がＤまたはＶに置き換わる。
【０１０２】
ある実施形態では、当該抗体またはアンタゴニストは、以下の置換または欠失の１つ以上を伴う抗体４のＨＣＤＲ３を含む：
Ｋａｂａｔ残基１００ＡがＡまたはＥに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＢがＰ、Ｑ、またはＡに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＣがＰ、Ｙ、Ｓ、またはＬに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＤがＰ、Ｇ、またはＡに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＥがＬまたはＶに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＦがＧ、Ｖ、またはＰに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＧがＶに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＨがＹに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＩがＧまたはＤに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＪがＡに置き換わるか欠失する；
Ｋａｂａｔ残基１０１がＦに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１０２がＶに置き換わる。
【０１０３】
ある実施形態では、当該抗体またはアンタゴニストは、以下の置換の１つ以上を伴う抗体１のＬＣＤＲ３を含む：
Ｋａｂａｔ残基９４がＨまたはＡに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基９５がＡに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基９５ＡがＥまたはＲに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基９５ＢがＱまたはＶに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基９７がＨまたはＬに置き換わる；
いくつかの実施形態では、当該抗体またはアンタゴニストは、以下の置換の１つ以上を伴う抗体４のＬＣＤＲ３を含み得る：
Ｋａｂａｔ残基９４がＡ、Ｖ、Ｄ、Ｈ、Ｌ、またはＲに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基９５がＧ、Ｒ、またはＡに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基９５ＡがＧ、Ｌ、Ａ、Ｖ、またはＤに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基９５ＢがＨ、Ｒ、Ａ、またはＤに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基９６がＨ、Ｐ、またはＡに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基９７がＨ、Ｖ、またはＱに置き換わる。
【０１０４】
ある実施形態では、当該抗体またはアンタゴニストは、以下の置換または付加の１つ以上を伴う抗体６のＨＣＤＲ３を含む：
Ｋａｂａｔ残基１００ＡがＧまたはＡに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＢがＳ、Ｐ、またはＡに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＣがＤ、Ｐ、Ｓ、またはＬに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＤがＹ、Ｐ、またはＡに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＥがＴまたはＬに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＦがＴ、Ｇ、またはＰに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＧがＶに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＨがＹに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１００ＩがＧまたはＤに置き換わる；
抗体６で欠失したＫａｂａｔ残基１００ＪがＡまたはＦとして復活する；
Ｋａｂａｔ残基１０１がＤに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基１０２がＩに置き換わる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、当該抗体またはアンタゴニストは、以下の置換の１つ以上を伴う抗体６のＬＣＤＲ３を含む：
Ｋａｂａｔ残基９４がＳ、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｌ、またはＲに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基９５がＬ、Ｇ、またはＡに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基９５ＡがＳ、Ｇ、Ａ、Ｖ、またはＤに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基９５ＢがＧ、Ｒ、Ａ、またはＤに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基９６がＳ、Ｐ、またはＡに置き換わる；
Ｋａｂａｔ残基９７がＬ、Ｈ、またはＱに置き換わる。
【０１０６】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用するアンタゴニストは、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対して、ＩＬ−１Ｒａと競合もしくは交差競合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）するものであり得、かつ／または、表１ａと表１ｂに記載のＣＤＲを有する抗体と競合もしくは交差競合するものであり得る。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用するアンタゴニストは、表１ａと表１ｂに記載のＣＤＲを有する抗体と同一のエピトープに結合するものであり得る。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用するアンタゴニストは、抗体６または抗体６のＣＤＲを含む抗体と同一のエピトープと結合するアンタゴニストである。アンタゴニスト間の競合は、インビトロで容易にアッセイすることができる。例えばＥＬＩＳＡの使用により、かつ／または、標識されていない他の１つ以上のアンタゴニストの存在下で検出できる、単一のアンタゴニストに対して特異的なレポーター分子を標識することにより、同一エピトープまたは重複しているエピトープと結合するアンタゴニストを特定できる。このような方法は、当業者に容易に周知であり、本明細書でもさらに詳しく説明する。
【０１０７】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用するＩＬ−１Ｒ１抗体またはＩＬ−１α抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である。この抗体は、特に、ヒト、マウス、キメラ、またはヒト化由来のモノクローナル抗体であってよく、当業者によく知られた標準の方法に従って取得できる。ある実施形態では、この抗体は、非抗体アンタゴニスト（ｎｏｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）である。
【０１０８】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用するＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストは、抗体６のＶＨ領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨ領域を含むか、または、表１ａもしくは表１ｂに示すＨＣＤＲ一式（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、および／またはＨＣＤＲ３）を含む、抗体である。また、この抗体分子は、任意で、抗体６のＶＬ領域、または表１ａもしくは表１ｂに示すＬＣＤＲ一式（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、および／またはＬＣＤＲ３）と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬ領域を含んでいてもよい。２つのアミノ酸配列間の同一性％の計算に使用できるアルゴリズムの例として、ＢＬＡＳＴ［１４］、ＦＡＳＴＡ［１５］、スミス・ウォーターマンアルゴリズム［１６］等が挙げられ、例えばデフォルトパラメーターを採用することができる。
【０１０９】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用するＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストは、ヒト抗体２６Ｆ５、２７Ｆ２、もしくは１５Ｃ４のＶＨ領域、および／またはヒト抗体２６Ｆ５、２７Ｆ２、もしくは１５Ｃ４のＶＬ領域を含む、抗体である。ある実施形態では、この抗体はヒト抗体であり、ヒト抗体２６Ｆ５のＶＨおよびＶＬ領域、またはヒト抗体２７Ｆ２のＶＨおよびＶＬ領域、またはヒト抗体１５Ｃ４のＶＨおよびＶＬ領域を含む。他の実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用するＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストは、ヒト抗体２６Ｆ５、２７Ｆ２、または１５Ｃ４のＣＤＲを１個、２個、３個、４個、５個、または６個含む抗体である。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用するＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストは、ヒト抗体２６Ｆ５、２７Ｆ２、もしくは１５Ｃ４のＶＨ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくは９９％の同一性を有するＶＨ領域、および／または、ヒト抗体２６Ｆ５、２７Ｆ２、もしくは１５Ｃ４のＶＬ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくは９９％の同一性を有するＶＬ領域を含む抗体である。
【０１１０】
請求項でクレームされている方法において使用する抗体は、さらに、抗体の定常領域またはその部分（例えば、ヒト抗体の定常領域またはその部分）を含み得る。例えば、ＶＬ領域がそのＣ末端において、抗体の軽鎖定常領域（ヒトＣκ鎖またはＣλ鎖を含む）に結合してもよい。同様に、ＶＨ領域に基づくアンタゴニストがそのＣ末端において、任意の抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびアイソタイプの任意のサブクラス、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）に由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部（例えばＣＨ１領域）と結合してよい。ＩｇＧ１は、製造が容易で、安定性（例えば半減期）があるので好都合である。アンタゴニストの機能および／または特性を調節する（例えば可変領域を安定化する）、合成等による定常領域変種も、本開示で有用となり得る。
【０１１１】
さらに、本開示によれば、本明細書に記載のアミノ酸配列を修飾することが所望される可能性がある。特に、ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列を修飾して、所望のアロタイプ（例えば、白人に見られるアロタイプ）に配列を適応させることが所望され得る。
【０１１２】
ある実施形態では、当該抗体はヒト生殖細胞遺伝子配列のフレームワーク領域を含むか、または、当該抗体は非生殖細胞系であってよい。したがって、フレームワークは生殖系列化されてもよく、この場合、フレームワーク内の１つ以上の残基が、最も類似性の高いヒト生殖細胞系フレームワークの同等位置の残基と一致するように変更される。したがって、請求項でクレームされている方法において使用するアンタゴニストは、ヒト生殖細胞系フレームワーク（例えば、ヒト生殖細胞系ＩｇＧ  ＶＨフレームワーク）内にＨＣＤＲ一式を含むＶＨ領域を有する単離されたヒト抗体分子であり得る。このアンタゴニストはまた、例えばヒト生殖細胞系ＩｇＧ  ＶＬフレームワーク内にＬＣＤＲ一式を含むＶＬ領域を有してもよい。
【０１１３】
ある実施形態では、当該抗体には、１つ以上のアミノ酸残基の非天然由来アミノ酸もしくは非標準アミノ酸による置き換え、１つ以上のアミノ酸残基の非天然由来型もしくは非標準型への修飾、または、配列への１つ以上の非天然由来アミノ酸もしくは非標準アミノ酸の挿入が含まれてよい。本明細書の別の箇所で、配列変更の数と位置の例を説明する。天然由来のアミノ酸には、標準の一文字コードでＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅとして識別される、２０個の「標準」のＬ−アミノ酸が含まれる。非標準アミノ酸には、ポリペプチド骨格に組み込むことができる、または既存のアミノ酸残基の修飾の結果として生じる、任意の他の残基が含まれる。非標準アミノ酸は、天然由来でも、非天然由来でもよい。いくつかの天然由来の非標準アミノ酸は当該技術分野で公知であり、例えば、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、３−メチルヒスチジン、Ｎ−アセチルセリン等がある［１７］。これらのアミノ酸残基のうち、Ｎ−α位置で誘導体化されたものは、アミノ酸配列のＮ−末端のみに位置する。通常、アミノ酸はＬ−アミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸であってもよい。したがって、Ｌ−アミノ酸を修飾してＤ−アミノ酸にすること、またはＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に置き換えることが、変更に含まれてよい。アミノ酸のメチル化、アセチル化、および／またはリン酸化した形態も公知であり、本開示のアミノ酸は、これらの修飾を受けてよい。
【０１１４】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体は、選択された１つ以上のＶＨ遺伝子および／またはＶＬ遺伝子の無作為変異誘発を使用して、可変領域全体の中に突然変異を発生させることにより、産生される。この技法は、Ｇｒａｍらが変異性ＰＣＲを使用して説明している［１８］。いくつかの実施形態では、全体の可変領域内またはＣＤＲ一式内で１つまたは２つのアミノ酸置換が行われる。
【０１１５】
使用し得る他の方法は、ＶＨ遺伝子またはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に突然変異誘発を向けることである。こうした手法は、Ｂａｒｂａｓら［１９］およびＳｃｈｉｅｒら［２０］に開示されている。
【０１１６】
上記のすべての手法は、当該技術分野において、そのように公知であり、当業者であれば、当該技術分野の日常的方法を用い、これらの手法を使用して本開示のアンタゴニストを提供できるであろう。
【０１１７】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体またはアンタゴニストは、抗体断片である。断片の例として以下の（ｉ）〜（ｉｘ）が挙げられる：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、定常軽鎖領域（ＣＬ）、および定常重鎖領域１（ＣＨ１）の各領域からなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ領域およびＣＨ１領域からなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ領域とＶＨ領域からなるＦｖ断片、（ｉｖ）ＶＨ領域またはＶＬ領域からなるｄＡｂ断片［２１、２２、２３］、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの連結したＦａｂ断片を含む、二価断片のＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉｉ）２つの領域を結合して抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーによってＶＨ領域とＶＬ領域が連結された、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）［２４、２５］、（ｖｉｉｉ）（例えば国際公開第ＷＯ１９９３／０１１１６１号で開示されている）二重特異性の一本鎖Ｆｖ二量体、および（ｉｘ）（例えば国際公開第ＷＯ９４／１３８０４号および［２６］で開示されている）遺伝子融合によって構築される多価または多特異的な断片である「二特異性抗体」。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または二特異性抗体分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域を連結するジスルフィド架橋を組み込むことによって安定化できる［２７］。ＣＨ３領域に接合するｓｃＦｖを含むミニ抗体も、作製することができる［２８］。結合断片の他の例として、Ｆａｂ’とＦａｂ’−ＳＨがある。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１領域のカルボキシル末端に、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含むいくつかの残基を添加する点で、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。
【０１１８】
ある実施形態では、好適な断片は、本明細書に開示される任意のヒト抗体またはげっ歯類抗体から取得することができる。他の実施形態では、好適な断片は、本明細書に開示される抗体と同一のエピトープと結合するヒト抗体またはげっ歯類抗体から、あるいは、抗原への結合に対して本明細書に開示される抗体と競合するヒト抗体またはげっ歯類抗体から得られる。
【０１１９】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体またはアンタゴニストは、標識や、半減期増加のための修飾等が行われる。例えば、ある実施形態では、当該抗体またはアンタゴニストは、ＰＥＧ化やリポソームへの取り込み等による化学修飾が行われる。
【０１２０】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用するアンタゴニストは、非抗体分子内に抗原結合部位を含んでよい。通常、この抗原結合部位は、後で詳述するように、非抗体タンパク質足場（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）内の１つ以上のＣＤＲ（例えばＣＤＲ一式）により提供される。
【０１２１】
抗原結合部位は、非抗体タンパク質足場（例えばフィブロネクチン、シトクロムＢ等）上のＣＤＲの配置を用いて［２９、３０、３１］、あるいは、タンパク質足場内ループのアミノ酸残基を無作為化または変異導入して、所望の標的に対する結合特異性を与えることによって提供できる。タンパク質中で新規の結合部位を操作するための足場については、Ｎｙｇｒｅｎらが詳細に論じている［３１］。抗体模倣体に対するタンパク質足場は、国際公開第ＷＯ２０００３４７８４号に開示されており（この文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる）、この文献において発明者らは、少なくとも１つの無作為化ループを有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むタンパク質（抗体模倣体）を説明している。１つ以上のＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ一式）の移植先として好適な足場を、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーから提供することができる。この足場は、ヒトタンパク質または非ヒトタンパク質であってよい。非抗体タンパク質足場の利点は、少なくともいくつかの抗体分子と比べて小さく、かつ／または製造しやすい足場分子内に、抗原結合部位を提供できることである。アンタゴニストが小サイズであれば、生理学的に有用な特性が得られる。例えば、細胞に進入して組織の奥深くに浸透する能力や、他の組織内の標的に到達する能力や、標的抗原のタンパク質空洞内で結合する能力が得られる。非抗体タンパク質足場での抗原結合部位の使用については、Ｗｅｓｓ，２００４で概説されている［３２］。安定した骨格と１つ以上の可変ループを有するタンパク質が典型的であり、このループのアミノ酸配列が特異的または無作為に変異することにより、標的抗原と結合する抗原結合部位が作製される。このようなタンパク質には、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのＩｇＧドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン（例えば、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）、リポカリン、ならびにガンマ結晶性および他のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）足場タンパク質（シルプロテインズ（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ））が含まれる。他のアプローチの例としては、サイクロチドに基づく合成「ミクロボディ」（分子内ジスルフィド結合を有する小型タンパク質）、ミクロプロテイン（Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ（商標）、米国カリフォルニア州マウンテンビュー、アミュニックス（Ａｍｕｎｉｘ）社）、およびアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ、モルキュラーパートナーズ社、スイス国チューリヒシュリーレン）が挙げられる。また、操作により作製される小型のタンパク質ドメイン、例えば、イムノドメイン等も、これらのタンパク質に含まれる（例えば、米国特許公開第２００３／０８２６３０号および第２００３／１５７５６１号を参照）。イムノドメインは、抗体の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１２２】
ある実施形態では、アンタゴニストは、例えば折り畳みドメイン等のペプチドまたはポリペプチドを形成する他のアミノ酸を含むことができ、あるいは、抗原結合能力に加えて別の機能的特徴を分子に与える他のアミノ酸を含むことができる。アンタゴニストは、検出可能な標識を保有してよく、（例えば、ペプチジル結合またはリンカーを介して）毒素、標的化部分、もしくは酵素に複合体化されてもよい。
【０１２３】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用するアンタゴニストまたは抗体の半減期は、少なくとも約４〜７日である。ある実施形態では、平均半減期は少なくとも約２〜５日、３〜６日、４〜７日、５〜８日、６〜９日、７〜１０日、８〜１１日、８〜１２日、９〜１３日、１０〜１４日、１１〜１５日、１２〜１６日、１３〜１７日、１４〜１８日、１５〜１９日、または１６〜２０日である。
【０１２４】
別の実施形態では、本開示は、容器を含む製造品を提供する。この容器は、本明細書で開示するアンタゴニストまたは抗体を含有する組成物と、この組成物を使用してＣＯＰＤ増悪および／またはＣＯＰＤ増悪症状を治療できることを示す添付文書またはラベルを含む。
【０１２５】
他の実施形態では、本開示はキットを含む。このキットは、本明細書で開示するアンタゴニストまたは抗体を含有する組成物と、治療を必要とする対象に当該組成物を投与するための説明書を含む。
【０１２６】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体またはアンタゴニストは、変異Ｆｃ領域を含む。変異Ｆｃ領域とは、非天然由来のＦｃ領域、例えば、１つ以上の非天然由来のアミノ酸残基を含むＦｃ領域である。また、アミノ酸の欠失、付加、および／または修飾を含むＦｃ領域も、本開示の変異Ｆｃ領域に包含される。
【０１２７】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体またはアンタゴニストは、約２５キロダルトン以上の分子量を有する。別の実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体またはアンタゴニストは、少なくとも約５０、約７５、約９０、約１００、約１１０、または約１２５キロダルトンの分子量を有する。他の実施形態では、抗体またはアンタゴニストは、約１５０キロダルトン以上の分子量を有する。
【０１２８】
本開示では、上記特徴の１つ以上の任意の組み合わせを有する抗体およびアンタゴニストの使用を企図している。例えば、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合してＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１βの結合を阻害し、かつ、上記特徴の１つ以上を有し得る抗体またはアゴニストを、本明細書に記載の方法において使用することができる。同様に、ＩＬ−１αと特異的に結合してＩＬ−１αとＩＬ−１Ｒ１間の結合を阻害し、かつ、上記特徴の１つ以上を有し得る抗体またはアゴニストを、本明細書に記載の方法において使用することができる。
【０１２９】
（ｉｖ）使用方法
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体およびアンタゴニストは、ＣＯＰＤの増悪を治療および／または防止する上で有用である。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体およびアンタゴニストは、ＣＯＰＤの増悪期に肺機能を増大させる上で有用である。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体およびアンタゴニストは、ＣＯＰＤの増悪期間を短縮する上で有用である。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体およびアンタゴニストは、増悪の頻度を低減する上で有用である。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体およびアンタゴニストは、増悪期の気道炎症を低減させる上で有用である。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体およびアンタゴニストは、増悪期のＩＬ−１αのシグナル伝達を減少させる上で有用である。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体およびアンタゴニストは、増悪期のＩＬ−１αおよびＩＬ−１βのシグナル伝達を減少させる上で有用である。ある実施形態では、ＣＯＰＤの増悪は、肺感染（例えば、ウイルス感染、ヒトライノウイルス誘発性の気道炎症、細菌感染）または大気汚染（例えば、煙）に起因する。ある実施形態では、気道炎症を低減させることは、ＣＯＰＤ増悪の治療方法の一部である。ある実施形態では、気道炎症を低減させることは、肺への炎症細胞の流入を低減することを含む。ある実施形態では、ＣＯＰＤ増悪の治療は、肺への炎症細胞の流入を低減することを含む。ある実施形態では、炎症細胞は好中球である。ある実施形態では、炎症細胞はマクロファージである。ある実施形態では、炎症細胞はリンパ球である。ある実施形態では、炎症細胞は単核球である。ある実施形態では、ＣＯＰＤ増悪の治療は、気道炎症を低減させることを含む。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体は、約２５キロダルトン以上の分子量を有する。ある他の実施形態では、使用する当該抗体は、少なくとも約５０、約６０、約７５、約１００、約１１０、約１２５、または約１５０キロダルトンの分子量を有する。ある実施形態では、使用する当該抗体は、約１５０キロダルトンの分子量を有する。同様に、ある実施形態では、上記のいずれかの範囲の分子量を有する非抗体アンタゴニストを使用する。
【０１３０】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体を使用して、ＣＯＰＤの症状の増悪を治療および／または防止することができる。ある実施形態では、ＣＯＰＤの増悪の症状は、次の１つ以上を含む：息切れの増加、咳および喀痰生成の増加、喀痰の色および／または濃さの変化、喘鳴、胸部圧迫感、発熱。ＣＯＰＤの増悪は、患者のベースラインである平均のＣＯＰＤ状態の変化を表し、例えば肺機能を評価することにより、この変化を評価できる。
【０１３１】
慢性閉塞性肺疾患のためのグローバルイニシアティブ（ＧＯＬＤ）は、治療方法の指針とする目的で、ＣＯＰＤの重症度を５つの病期に分類した（Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｓｕｍｍａｒｙ：Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＯＰＤ（２００９年改訂））。ＣＯＰＤ患者において、０期は、咳、痰、気道閉塞を伴わない息切れという、伝統的な臨床症状で特徴付けられる状態と定義される（例えば、スパイロメトリーは正常）。Ｉ期は、１秒量の強制呼気量（ＦＥＶ１）／努力肺活量（ＦＶＣ）＜７０％を有し、ＦＥＶ１＞８０％が予測される患者と定義され、慢性症状の有無を問わず、疾患状態を認識しているかを問わない。ＩＩ期（ＦＥＶ１／ＦＶＣ＜７０％、ＦＥＶ１  ３０〜７９％）は、患者が経験する増悪の速度に応じてＩＩａ（ＦＥＶ１  ５０〜７９％）、ＩＩｂ（ＦＥＶ１  ３０〜４９％）の２つのサブステージに分かれる。ＩＩｂ期の方が増悪の速度が高く、健康状態と反比例する。しかし、当該技術分野および本明細書では、サブステージＩＩｂをＩＩＩ期と称する場合が多い。ＩＶ期（ＦＥＶ１／ＦＶＣ＜７０％かつ、予測ＦＥＶ１＜３０％、低酸素血症、右心不全の臨床徴候のいずれか）は、最悪の健康状態と関連付けられると予想される。
【０１３２】
したがって、ある実施形態では、本開示の方法は、増悪前に測定したＧＯＬＤスコアがＩ期以降のＣＯＰＤを有する患者を治療する目的で使用できる。ある実施形態では、本開示の方法は、ＧＯＬＤスコアがＩＩ期以降のＣＯＰＤを有する患者を治療する目的で使用できる。ある実施形態では、本開示の方法は、増悪前に評価したＧＯＬＤスコアがＩＩＩ期以降のＣＯＰＤを有する患者を治療する目的で使用できる。ある実施形態では、本開示の方法は、増悪前に評価したＧＯＬＤスコアがＩＶ期のＣＯＰＤを有する患者を治療する目的で使用できる。
【０１３３】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体を使用して、ウイルス感染、細菌感染、および／または環境要因に起因するＣＯＰＤ症状の増悪を予防または低減できる。ある実施形態では、この環境要因はタバコ煙である。ある実施形態では、細菌感染はＬＰＳと関連がある。ある実施形態では、ウイルス感染はヒトライノウイルス（ＨＲＶ）感染である。
【０１３４】
ある実施形態では、ヒトライノウイルス誘発性の気道炎症に起因するＣＯＰＤ増悪を有し、ＣＯＰＤ増悪の治療を必要とする患者のＣＯＰＤ増悪を治療する方法を提供する。この場合、この治療方法は、ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合してＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの結合を阻害する抗体を含む組成物の有効量を、当該患者に投与することを含む。ＨＲＶ感染は好中球の流入を引き起こし、炎症性サイトカインを増加させる。宿主の炎症反応、特にＩＬ−８は、一般的な感冒症状の発症で重要な役割を果たす。慢性肺疾患を有する患者でこれが発生すると、基礎疾患である呼吸器病態の症状悪化につながることがある。ＣＯＰＤ増悪の３分の２は、先にウイルス感染が発生する。急性増悪で入院する患者の４０％は、鼻および／または喀痰の検体にＨＲＶが存在する。ゆえに、ヒトライノウイルス誘発性の気道炎症に起因するＣＯＰＤ増悪を有する患者を治療することは、重要な治療介入であり、この治療介入により、ＣＯＰＤ増悪のリスクを有意に低減し、かつＣＯＰＤを有する患者の健康を有意に改善できる可能性がある。ゆえに、本発明の組成物および方法は、ＨＲＶまたは他の気道ウイルス感染に誘発されるＣＯＰＤ増悪を治療、低減、および防止する上で、有用となり得る。
【０１３５】
ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体は、抗体断片であり、例えば、２５キロダルトン以上の分子量を有する断片である。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体またはアンタゴニストは、ヒトＩＬ−１Ｒ１またはヒトＩＬ−１αと特異的に結合できる。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体またはアンタゴニストは、ヒト由来および／または非ヒト霊長類の１つ以上の種に由来するＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αと特異的に結合できる。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体は、マウスＩＬ−１Ｒ１およびマウスＩＬ−１αと特異的に結合しない。
【０１３６】
ある実施形態では、当該方法は、ＣＯＰＤ増悪を管理することによりＣＯＰＤを治療するための治療計画の一部である。ある実施形態では、ＣＯＰＤを治療するための治療計画は、ステロイドの投与を含む。ある実施形態では、抗体またはアンタゴニストは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）で測定した場合に５０ｐＭ以下のＫＤでヒトＩＬ−１Ｒ１またはヒトＩＬ−１αと特異的に結合する。ある実施形態では、請求項でクレームされている方法において使用する抗体は、抗体６または抗体６ｇｌ（生殖細胞系）である。ある実施形態では、抗体またはアンタゴニストは、ＩＬ−１Ｒ１への結合に対してＩＬ−１Ｒａと競合する。ある実施形態では、投与は全身投与である。ある実施形態では、当該方法は、上記組成物の鼻腔内投与を含まない。ある実施形態では、当該方法は、２つの投与経路、すなわち全身投与と局所投与を通じてアンタゴニストを投与することを含む。例えば、アンタゴニストを静脈内投与等により全身に投与し、かつ、鼻腔内投与または他の形態の局所投与により肺に送達する。ある実施形態では、当該方法は、１日１回以下の投与計画で上記組成物を投与することを含む。
【０１３７】
ある実施形態では、治療前、治療中、または治療後にＣＯＰＤの症状をモニタリングする。ある実施形態では、モニタリングは継続的に行う。ある実施形態では、モニタリングは治療中定期的に、例えば１時間ごと、１日に１回、または１週間ごとに行う。ある実施形態では、モニタリングは治療後定期的に、例えば１日に１回、１週間ごと、または１ヶ月ごとに行う。当業者であれば、状態の重篤度に応じて、モニタリングの間隔を容易に決定できる。ある実施形態では、スパイロメトリー等の肺機能検査によりＣＯＰＤの症状をモニタリングする。ある実施形態では、胸部Ｘ線および／またはコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンでＣＯＰＤの症状をモニタリングする。胸部Ｘ線またはＣＴスキャンにより、ＣＯＰＤの主因の１つである気腫を確認できる。ある実施形態では、動脈血ガス分析によりＣＯＰＤの症状をモニタリングする。ある実施形態では、喀痰検査によりＣＯＰＤの症状をモニタリングする。ある実施形態では、上記検査の１つ以上を用いて治療効果を評価する。ある実施形態では、治療により、増悪の重症度、期間、または頻度が低減する。ある実施形態では、治療後、患者の状態（例えば、ベースライン肺機能等）が増悪前のベースラインレベルに戻る。
【０１３８】
ある実施形態では、当業者に対して公知の煙曝露動物モデル、動物ライノウイルスモデル、または慢性肺疾患モデル（例えば、Ｃｏｎｔｏｌｉら，  Ｃｏｎｔｒｉｂ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７；１４：１０１−１２）において、本開示の組成物または方法を分析する。ある実施形態では、この動物モデルはマウスモデルである（例えば、Ｂａｒｔｌｅｔｔら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００８  Ｆｅｂ；１４（２）：１９９−２０４）。ある実施形態では、このマウスモデルは、エラスターゼおよびＬＰＳ曝露マウスモデルから選ばれる（Ｓａｊｊａｎら，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９  Ｎｏｖ；２９７（５）：Ｌ９３１−４４を参照）。ある実施形態では、実施例に記載の細胞モデルまたは動物モデルのどれを使用してもよい。
【０１３９】
ある実施形態では、症状が重篤な場合は、入院が必要とされる。ある実施形態では、症状が比較的軽度の場合は、外来患者として患者を治療してよい。
【０１４０】
ある実施形態では、喫煙、入院、肺リハビリプログラムび欠如、吸入器の不適正使用、および薬物療法プログラム遵守不徹底のすべてが、ＣＯＰＤ増悪症状の高頻度化および／または長期化と関連する。ある実施形態では、次の１つ以上を示す患者を治療する目的で、本開示の方法を使用してよい：喫煙、入院、肺リハビリプログラムの欠如、吸入器の不適正使用、薬物療法プログラム遵守の不徹底。ある実施形態では、本開示の方法を、ＣＯＰＤ悪化症状が高頻度化および／または長期化している患者の治療に使用してよい。ある実施形態では、本開示の方法を、ＣＯＰＤ増悪の特定のリスクがある患者を治療する目的で使用してよい。
【０１４１】
本開示はまた、ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αの少なくとも１つの効果に拮抗する方法を提供する。この拮抗方法は、本開示の１つ以上のアンタゴニストの有効量を接触させるか投与することを含み、それにより、上記ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αの少なくとも１つの効果に拮抗する。本開示の上記方法により拮抗できるＩＬ−１Ｒ１の効果の例には、ＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１が介在する生物学的反応、および、こうした結合反応の結果として生じる下流効果が含まれる。本開示の複数のアンタゴニストを投与する場合は、同時に投与してもよく、異なる時間に投与してもよい。ある実施形態では本開示の複数のアンタゴニストを使用し、当該方法は、ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニスト（例えば抗体）およびＩＬ−１αアンタゴニスト（例えば抗体）を投与することを含む。複数のアンタゴニストを投与する場合は、同一の投与経路を介してもよく、異なる投与経路を介してもよい。
【０１４２】
上記のいずれの場合も、当該方法は一般に、適切な用量の抗ＩＬ−１Ｒ１剤または抗ＩＬ−１α剤を含む組成物を投与することを含む。
【０１４３】
「治療」、「治療する」等の語は、本明細書で使用する場合、治療を必要とする対象に薬剤を提供することにより、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得て、当該対象の状態を改善することを一般に意味する。ある実施形態では、治療には、増悪の頻度および／または重症度を低減することが含まれ得る。ある実施形態では、治療には、気道炎症を治療することが含まれ得る。ある実施形態では、治療には、炎症細胞（例えば好中球）が肺に流入するのを防止または低減することが含まれ得る。本明細書で使用する「治療」には、以下の（ａ）または（ｂ）が含まれる：（ａ）増悪を阻止すること（例えば、発生を抑止して、症状が悪化しないようにする）、または（ｂ）疾患または状態を軽減すること（例えば、疾患または状態の退行を起こすこと、１つ以上の症状を改善させること、増悪期間を短縮すること、増悪頻度を低下させること）。どの状態も、当該技術分野で公知の標準の方法および手法に従って、容易に改善を評価することができる。ある実施形態では、有効な治療の後、患者の状態は増悪前の当該患者のベースライン状態に戻る。ある実施形態では、当該患者は、増悪前に中程度または重度のＣＯＰＤ（例えば、ＧＯＬＤ  ＩＩＩ期またはＧＯＬＤ  ＩＶ期に分類されるＣＯＰＤ）を有する。
【０１４４】
「治療効果量」あるいは「効果量」という語は、投与目的である所望の効果を及ぼす用量を意味する。正確な用量は治療目的によって異なり、当業者であれば、公知の手法を用いて正確な用量を確認できるであろう（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ  Ａｒｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照）。
【０１４５】
本開示は、上記または下記態様の１つ以上および／または本開示の実施形態を組み合わせた方法を企図している。例えば、本明細書に記載のどの方法においても、任意の抗体またはアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αに拮抗する任意の組成物）を使用できる。さらに、本明細書に記載のどの抗体またはアンタゴニストも、単独で使用しても、組み合わせて使用してもよい（例えば、本開示の別の抗体またはアンタゴニストと組み合わせて使用してよい）。
【０１４６】
（ｖ）医薬組成物
したがって、本開示のさらなる態様では、本明細書に記載するＣＯＰＤ増悪を治療する目的での抗体またはアンタゴニストの使用を提供する。抗体およびアンタゴニストは、組成物として、例えば抗体またはアンタゴニストを含む医薬組成物として投与することができる。ある実施形態では、当該抗体またはアンタゴニストを組み換えにより、例えば、当該抗体またはアンタゴニストをコードする核酸を宿主細胞において発現させることにより製造する。薬剤的に許容可能な賦形剤中で組成物を製剤することができる。ある実施形態では、組成物は発熱物質（ｐｙｒｏｇｅｎ）を含まないか、または実質的に含まない。
【０１４７】
薬剤的に許容可能な賦形剤は、二次反応を誘発せずに医薬組成物中に入り、例えば、活性化合物の投与の促進、当該化合物の体内寿命および／または効力の増大、溶液中の溶解度の向上、あるいは保存時の改善等を可能にする化合物または複数化合物の組み合わせであり得る。こうした薬剤的に許容可能な賦形剤はよく知られており、当業者は、選択された活性化合物の性質および投与方法に応じて賦形剤を適応させるであろう。
【０１４８】
本開示の抗体およびアンタゴニストは、通常は医薬組成物の形態で投与され、この医薬組成物は、当該アンタゴニストに加えて少なくとも１つの成分を含んでよい。したがって、本開示による医薬組成物および本開示に従って使用される医薬組成物は、活性成分に加えて、薬剤的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知の他の物質を含んでよい。こうした物質は無毒であるべきであり、活性成分の効力に干渉すべきでない。担体または他の物質の厳密な性質は、投与経路により異なる。ある実施形態では、組成物を全身に、例えば静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、または皮下注射により投与する。ある実施形態では、組成物を経口投与する。ある実施形態では、当該方法は、組成物を、例えば吸入、肺洗浄、鼻腔内送達等により肺に直接投与することを特定的に含まない。他の実施形態では、同一または異なる複数の抗体／アンタゴニストを、同一または異なる複数の投与経路を介して投与する。例えば、ある抗体を全身投与し、かつ、同一または別のアンタゴニストを全身投与または局所投与してよい。
【０１４９】
液状医薬組成物は、一般に、水、石油、動物油、植物油、鉱油、合成油等の液状担体を含む。生理食塩溶液、デキストロースもしくは他の糖溶液、またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコール）を使用または含有してよい。
【０１５０】
静脈内注射の場合、有効成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性、および安定性を有する、非経口的に許容可能な水溶液の形態にする。当業者であれば、例えば、等張性媒体を使用した適切な溶液、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液等を調製する十分な能力を有する。保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、および／または他の添加物を必要に応じて使用してよい。これらの例として、リン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸類等の緩衝剤；アスコルビン酸、メチオニン等の抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチル、プロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、デキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０１５１】
本開示のアンタゴニストおよび抗体は、分子の物理化学特性および送達経路に応じて、液体、半固体、または固体の形状で製剤化してよい。製剤には、糖、アミノ酸、界面活性剤等の賦形剤、または複数の賦形剤の組み合わせが含まれていてよい。液状製剤では、広範囲の抗体濃度およびｐＨを含むことができる。固体製剤の場合は、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、または超臨界流体技術を使用した乾燥により製造してよい。
【０１５２】
ある実施形態では、本開示の組成物（医薬組成物を含む）は非発熱性である。換言すれば、ある実施形態では、当該組成物は発熱物質を実質的に含まない。一実施形態では、当該製剤は、エンドトキシンおよび／または関連の発熱性物質を実質的に含まない、発熱物質不含の製剤である。エンドトキシンは、微生物の内部に閉じ込められた毒素を含み、微生物が破壊されるか壊死したときのみ、この毒素が放出される。発熱性の物質には、細菌および他の微生物の外膜に由来する、発熱を誘発し耐熱性がある物質（糖タンパク質）も含まれる。どちらの物質も、ヒトに投与すると発熱、血圧低下、およびショックを引き起こすことがある。エンドトキシンは潜在的有害性を有するため、たとえ少量であっても、静脈内投与する薬剤溶液から除去しなければならない。米食品医薬品局（ＦＤＡ）では、静脈内薬物投与に関し、服用回数１回あたり、体重１キログラムあたりの１時間中の上限を５エンドトキシンユニット（ＥＵ）に設定している（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００））。抗体の場合にあり得るように、体重１キログラムあたり数百ミリグラムまたは数千ミリグラムの治療用タンパク質を投与するときは、たとえ微量でも、有害で危険なエンドトキシンを必ず除去しなければならない。ある特定の実施形態では、組成物中のエンドトキシンおよび発熱物質のレベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、または５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【０１５３】
ある実施形態では、当該組成物を静脈点滴により投与する。ある実施形態では、点滴時間は少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも２０分、または少なくとも３０分である。ある実施形態では、点滴時間は少なくとも６０分、９０分、または１２０分である。本開示では、点滴時間にかかわらず、個々の点滴は全体的治療計画の一部であり、定期的スケジュール（例えば１日に１回、１週間ごと、１ヶ月ごと等）に従って、抗体またはアンタゴニストが投与されることを企図している。同様に、本開示では、投与経路にかかわらず、個々の服用は全体的治療計画の一部であり、定期的スケジュール（例えば１日に１回、１週間ごと、１ヶ月ごと等）に従って、抗体またはアンタゴニストが投与されることを企図している。
【０１５４】
ある実施形態では、本開示の組成物（例えば、抗ＩＬ−１Ｒ１抗体、抗ＩＬ−１ａ抗体、抗ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニスト）を、ＣＯＰＤ増悪を治療するための併用療法または治療計画の一部として使用してよい。併用療法、特に抗ＩＬ−１Ｒ１または抗ＩＬ−１αアンタゴニストと他の１つ以上との薬剤との組み合わせにより、相加的効果または相乗効果を提供できる。治療計画に従って複数の化合物（例えば、薬剤、生物剤）を投与する場合は、当該化合物は、例えば同時または順次的に投与してもよく、あるいは組み合わせ調合剤として投与してもよい。ある実施形態では、治療計画にステロイド療法が含まれる。
【０１５５】
ある実施形態では、本開示の組成物を、ＣＯＰＤの１つ以上の使用可能な治療法を伴う治療計画の一部として使用してよい。
【０１５６】
本開示による組成物は、単独療法として提供してもよく、あるいは、本開示の他の１つ以上の薬剤を組み合わせるか添加して、かつ／または、以下の１つ以上の薬剤を組み合わせるか添加して提供してよい：
−グルココルチコイド、例えば、フルニソリド、トリアムシノロンアセトニド、ジプロピオン酸ベクロメタソン、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、シクレソニド、および／またはフロ酸モメタゾン；
−抗菌剤、例えば、ペニシリン誘導体、テトラサイクリン、マクロライド、β−ラクタム、フルオロキノロン、メトロニダゾール、および／または吸入アミノグリコシド；および／または抗ウイルス剤、例えば、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、シドフォビル；アマンタジン、リマンタジン；リバビリン；ザナマビル（ｚａｎａｍａｖｉｒ）および／またはオセルタマビル（ｏｓｅｌｔａｍａｖｉｒ）；プロテアーゼ阻害剤、例えば、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、および／またはサキナビル；ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、例えば、ジダノシン、ラミブジン、スタブジン、ザルシタビン、ジドブジン；非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、例えば、ネビラピン、エファビレンツ。
【０１５７】
併用療法に抗生物質が含まれていてもよい。急性増悪の約５０％は、主として細菌の肺炎球菌（肺炎を惹起）、インフルエンザ菌（インフルエンザを惹起）、およびカタル球菌（肺炎を惹起）に起因する。多くの抗生物質がこれらの感染を効果的に治療し得る。
【０１５８】
併用療法に呼吸刺激薬が含まれていてもよい。ＣＯＰＤの急性増悪において、副腎皮質ステロイドが有効となり得る。ステロイドは静脈内に与えてよい。急性増悪期は、急性気管支けいれんを低減するために気管支拡張剤の用量を増加してよい。ＣＯＰＤの急性増悪期は、テオフィリンを使用してよい。
【０１５９】
ある実施形態では、酸素需要量が増加する場合があり、酸素補給を行ってよい。
【０１６０】
ＣＯＰＤの急性増悪期の患者は、呼吸不全を発症する危険性がある。呼吸要求量が呼吸器系の応答能力を超えると、呼吸不全が発生する。ある実施形態では、組み合わせに人工呼吸を含めてよい。
【０１６１】
人工呼吸という手段では、患者が自身の呼吸筋を使って空気を吸い込む代わりに、人工呼吸器で患者の肺に空気を送り込む。したがって、人工呼吸により患者の呼吸作業は低減または排除され、患者は継続的に肺へと空気を受け取り、何ら作業なしに受動的に吐き出す。ＣＯＰＤにおける人工呼吸では、一般に、非侵襲的方法と侵襲的方法という２種類の方法が使われる。
【０１６２】
侵襲的な人工呼吸の際には、気管内チューブ（プラスチックの小径管）を気管に挿入し、人工呼吸器と接続して、人工呼吸器から肺に空気を送り込む。侵襲的な人工呼吸は、意識不明または重度の鎮静状態の患者に対して実施してよい。また、非侵襲的な人工呼吸より効果が高い。
【０１６３】
非侵襲的な人工呼吸は、意識があり協力的な患者に対して使用してよい。この方法では、鼻、または口と鼻の周囲を密閉するマスクを通じて酸素を送達する。
【０１６４】
ある実施形態では、併用療法に肺炎ワクチンおよび／または年１回のインフルエンザワクチンを含めてよい。
【０１６５】
本開示に従い、提供される組成物をヒト患者等の哺乳動物に投与してよい。通常、投与は「有効量」で行う。有効量とは、患者に利益を示すのに十分な量である。そのような利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも回復であり得る。代表的症状の例として、気道炎症、肺への好中球の流入、肺気量の減少が挙げられる。
【０１６６】
実際の投与量、および投与速度と経時変化は、治療対象の性質と重症度、治療対象の特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、組成物の送達部位、アンタゴニストの種類、投与方法、投与スケジュール、および医療従事者が知る他の要因によって異なる。処置の処方、例えば投与量等の決定は、一般開業医その他の医師の責任の範囲内にあり、また、治療する疾患の症状の重篤度および／または進行に応じて異なる場合がある。抗体の適切な用量は当該技術分野でよく知られている［３３、３４］。本明細書または文献（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  （２００３））に示されている特定の用量を、投与する薬剤の種類に応じて適宜、使用してよい。治療有効量または適当な用量を、そのインビトロの活性と動物モデルでのインビボの活性を比較することにより、決定することができる。マウスおよび他の試験動物の有効投与量をヒトに外挿する方法は、公知となっている。正確な用量は、抗体の詳細な性質（例えば、全抗体、断片、二特異性抗体）、患者の状態、投与スケジュールによって異なる。抗体の通常の用量は、全身投与の場合、１００μｇ〜１ｇの範囲にある。ある実施形態では、開始時は比較的高い負荷投与量とし、次いで比較的低用量を１回以上投与してよい。一般に、抗体は全抗体であり、例えばＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプ、またはＩｇＧ４アイソタイプである。これは成人患者の単回処置の用量であり、小児および幼児に対しては比例調整してよく、また他の抗体形式についても分子量に比例して調整してよい。処置は１日に１回、週２回、１週間ごと、または１ヶ月ごとの間隔で、医師の裁量で繰り返してよい。ある実施形態では、処置は皮下投与の場合は２〜４週ごと、静脈内投与の場合は４〜８週ごとでよい。ある実施形態では、本開示の組成物を対象の生存期間に渡って定期的に投与する必要がある。
【０１６７】
ある実施形態では、本開示の組成物は全身に投与する。ある実施形態では、本開示の組成物は静脈内に投与する。ある実施形態では、本開示の組成物は、吸入では効果的に送達されない。ある実施形態では、本開示の組成物は、非全身投与では効果的に送達されない。ある実施形態では、本開示の組成物は持続投与を必要とする。ある実施形態では、本開示の組成物は、２、３、４、５、６、または７日間の持続投与を必要とする。ある実施形態では、本開示の組成物は、２、３、４、５、または６週間の持続投与を必要とする。ある実施形態では、本開示の組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月間の持続投与を必要とする。ある実施形態では、本開示の組成物は、対象の生存期間に渡る持続投与を必要とする。
【０１６８】
（ｖｉ）抗体およびアンタゴニストの調製
ある態様においては、本開示は、効果的薬剤がＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合する抗体である方法を提供する。ある態様においては、本開示は、効果的薬剤がＩＬ−１αと特異的に結合する抗体である方法を提供する。代表的な抗体には、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のほか、抗原結合性断片が含まれる。当該技術分野でよく知られている方法を使用して、好適な抗体を調製することができる。例えば、組み換えによる作製、ファージディスプレイを用いた作製、ハイブリドーマ技術を用いた産生等により、抗体を作製できる。非制限的な技術例を以下に簡単に記載する。
【０１６９】
一般に、モノクローナル抗体またはその機能的断片、とりわけマウス由来のものを調製する場合、特に手引書「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」［３５］に記載されている手法、または文献（Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）［３６］に記載されているハイブリドーマからの調製手法を参照することが可能である。
【０１７０】
モノクローナル抗体は、例えば、ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αに対して免疫した動物から取得した細胞から、あるいは、当該モノクローナル抗体が認識するエピトープを含む断片の１つから、モノクローナル抗体を得ることができる。これらを含む適切な断片およびペプチドまたはポリペプチドを使用して動物を免疫し、ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１αに対する抗体を産生できる。当該ＩＬ−１Ｒ１もしくはＩＬ−１α、またはその断片の１つを、特に、ＩＬ−１Ｒ１もしくはＩＬ−１αまたはその断片をコードするｃＤＮＡ配列に含まれる核酸配列で開始する遺伝子組み換えにより、ＩＬ−１Ｒ１もしくはＩＬ−１αおよび／またはその断片のペプチド配列に含まれるアミノ酸配列から開始するペプチド合成により、通常の作業方法に従って産生することができる。
【０１７１】
このモノクローナル抗体を、例えば、当該モノクローナル抗体が認識するエピトープを含むＩＬ−１Ｒ１もしくはＩＬ−１αまたはその断片が予め固定された親和性カラム上で精製することができる。より詳細には、プロテインＡおよび／またはＧ上でのクロマトグラフィーによりモノクローナル抗体を精製し、次いで、残りのタンパク質汚染物および当該抗体自体のＤＮＡとリポ多糖（ＬＰＳ）を除去することを目的としたイオン交換クロマトグラフィーを実施するか実施せずに、次いで、二量体または他の多量体が存在することに起因する潜在的凝集物を除去することを目的とした、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ゲル上の排除クロマトグラフィーを実施するか実施せずに、モノクローナル抗体を精製することができる。一実施形態では、これらの手法全体を同時または順次的に使用することができる。
【０１７２】
モノクローナル抗体および他の抗体を使用し、組み換えＤＮＡ技術の手法を用いることにより、標的抗原と結合する他の抗体またはキメラ分子を産生することが可能である。このような手法では、抗体の免疫グロブリン可変領域またはＣＤＲをコードするＤＮＡを、別の免疫グロブリンの定常領域、または定常領域＋フレームワーク領域に導入することを伴う場合がある。例えば、欧州特許第１８４１８７（Ａ）号、英国特許第２１８８６３８（Ａ）号、または欧州特許第２３９４００（Ａ）号、および多数の後続文献を参照のこと。ハイブリドーマその他の抗体産生細胞は、遺伝子突然変異等の変化を受けてもよく、この変化により、産生された抗体の結合特異性を変化させても、変化させなくてもよい。
【０１７３】
抗体工学分野で利用可能なさらなる手法により、ヒト抗体およびヒト化抗体の単離が可能になった。例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ＆Ｄｕｂｅｌ［３７］に記述されているように、ヒトハイブリドーマの作製が可能である。アンタゴニストを作製する別の確立された手法であるファージディスプレイについては、次のような多くの公開文献に詳述されている：Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ＆Ｄｕｂｅｌ［３７］および国際公開第９２／０１０４７号（さらに以下で考察）、および米国特許第５，９６９，１０８号、米国特許第５，５６５，３３２号、米国特許第５，７３３，７４３号、米国特許第８５８，６５７号、米国特許第５，８７１，９０７号、米国特許第５，８７２，２１５号、米国特許第５，８８５，７９３号、米国特許第５，９６２，２５５号、米国特許第６，１４０，４７１号、米国特許第６，１７２，１９７号、米国特許第６，２２５，４４７号、米国特許第６，２９１，６５０号、米国特許第６，４９２，１６０号、および米国特許第６，５２１，４０４号。
【０１７４】
マウスの抗体遺伝子を不活性化し、機能的にヒト抗体遺伝子と置き換え、一方でマウスの免疫系の他の構成要素は無処置のままにしたトランスジェニックマウスを使用してヒト抗体を単離することができる［３８］。ヒト化抗体の作製については、当該技術分野において公知の手法、例えば国際公開第９１／０９９６７号、米国特許第５，５８５，０８９号、欧州特許第５９２１０６号、および国際公開第９３／１７１０５号に開示されている手法を用いて作製できる。さらに、国際公開第２００４／００６９５５号に記載されている抗体のヒト化方法は、非ヒト抗体の可変領域のＣＤＲ配列に対する標準的ＣＤＲ構造と、ヒト抗体配列（例えば、生殖細胞系抗体遺伝子セグメント）のライブラリーから得られる、対応するＣＤＲの標準的ＣＤＲ構造タイプとを比較することにより、ヒト抗体遺伝子由来の可変領域フレームワーク配列とを選択することに基づく。非ヒトＣＤＲと類似の標準的ＣＤＲ構造タイプを有するヒト抗体可変領域は、ヒトフレームワーク配列を選択するときの選択対象であるメンバーヒト抗体配列サブセットを構成する。このサブセットメンバー群を、ヒトＣＤＲ配列と非ヒトＣＤＲ配列間のアミノ酸類似性により、さらにランク付けできる。国際公開第２００４／００６９５５号の方法では、トップランクのヒト配列を選択することにより、キメラ抗体を構築するためのフレーム枠配列を提供する。このキメラ抗体は、選択されたサブセットメンバーヒトフレームワークを使用して、ヒトＣＤＲ配列を機能的に非ヒトＣＤＲ相当物と置き換える。これにより、非ヒト抗体とヒト抗体間のフレームワーク配列を比較する必要なしに、高親和性かつ低免疫原性のヒト化抗体が得られる。この方法により作製されるキメラ抗体も開示されている。
【０１７５】
例えばＫｎａｐｐｉｋら［３９］やＫｒｅｂｓら［４０］が説明しているように、適切な発現ベクター内でオリゴヌクレオチドを合成、構築し、このオリゴヌクレオチドを用いて産生した遺伝子から発現させることにより、合成抗体分子を作製することができる。
【０１７６】
留意すべきは、関心対象の抗体が最初に同定または作製された方法にかかわらず、そのような抗体のいずれも、その後、組み換え手法を用いて作製できることである。例えば、宿主細胞において、当該抗体をコードする核酸を発現することができる。具体的には、重鎖と軽鎖をコードする核酸配列を個別のベクターから発現させる、これらの核酸配列を同じベクターから発現させる、といった方法がある。各種細胞型を使用した上記および他の手法は、当該技術分野でよく知られている。
【０１７７】
１つ以上のアッセイで抗体の適切さを試験できる。例えば、実施例に示す任意のアッセイで抗体を試験して、各抗体の代表的な抗体と同一の機能特性を有するかを確認できる。追加または代替して、抗体を試験して、対象抗体と同一または実質的に同一のエピトープと結合するかどうかを評価できる。また、結合アッセイを実施することにより、抗体が、１つ以上の所望の種に由来する標的抗原と特異的に結合することを確認することもできる。さらに、中和能（例えば、抗ＩＬ−１Ｒ１抗体が、ＩＬ−１Ｒ１のＩＬ−１αへの、および／またはβへの結合を阻止する能力）も試験できる。
【０１７８】
非抗体アンタゴニストの場合、当該技術分野で公知の方法を用いて調製することができる。例えば、組み換え技術を使用するか合成により、タンパク質アンタゴニストを調製できる。代表的なタンパク質アンタゴニストとして、ＩＬ−１Ｒａの市販品型であるＫＩＮＥＲＥＴがある。
【実施例】
【０１７９】
ここで本開示の概要を説明したが、下記実施例を参照することにより、本開示がより容易に理解されるであろう。下記実施例は、本開示のいくつか特定の態様および実施形態を例示する目的で記載するものであり、本開示を制限することは意図されていない。例えば、本明細書で開示する特定の構築物および実験計画は、適切に機能することを確認するための代表的なツールおよび方法を表す。
【０１８０】
実施例１−ＩＬ−１Ｒ１の遮断により、ＩＬ−１βの効果がインビトロとインビボで阻害される
本実施例および後続の実施例で使用されたツールの一部は、抗体６（ＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合するヒト抗体。配列は本明細書に記載されている）およびアナキンラ（別名ＫＩＮＥＲＥＴ）である。抗体６は、初代ヒトＣＯＰＤ線維芽細胞においてＩＬ−１βに誘発されたＩＬ−６を完全に阻害した（図１Ａ）。アナキンラは、マウスの気管内に滴下注入された際、４時間後のＢＡＬで回収された好中球では、好中球を増加させるＩＬ−１βの能力を７１％阻害した（図１Ｂ）。アナキンラおよび他の抗ＩＬ−１Ｒ１抗体（例えば、抗マウスＩＬ−１Ｒ１抗体３５Ｆ５）に関する文献でも、ＩＬ−１Ｒ１でのＩＬ−１β介在性の効果を阻害することが示されており、この実験結果は文献と一致する。実施例でさらに説明するように、本開示により、ＩＬ−１α介在性の活性に対する追加の驚くべき効果が明らかになり、ゆえにＣＯＰＤにおけるＩＬ−１αの関与が初めて示された。
【０１８１】
ＣＯＰＤ組織中のＩＬ−１βに対するＩＬ−１Ｒ１の効果を試験するため、ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストで処置した初代ＣＯＰＤ肺線維芽細胞中のＩＬ−６レベルを試験した。ＩＬ−１Ｒ１拮抗性抗体６（ヒトＩＬ−１Ｒ１と特異的に結合するヒト抗体；この実験では生殖細胞系を使用）は、ＣＯＰＤの肺線維芽細胞において、ＩＬ−１βに誘発されるＩＬ−６放出を阻害した（図１Ａ）。ＩＬ−１β処置濃度は０．５ｎｇ／ｍｌ（約ＥＣ８０）であった。
【０１８２】
上記の通り、マウス肺において、ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニスト処置がＩＬ−１β誘発性の好中球介在性炎症に与える影響も試験した（図１Ｂ）。５ｎｇ／５０μｌのＩＬ−１βの処置の１時間前に、アナキンラ（ＫＩＮＥＲＥＴ（商標））を皮下投与した。４時間後、ＢＡＬにより細胞数をカウントした。ＩＬ−１処置した対照動物群と比較して、アナキンラは細胞数を７１％低下させていた。
【０１８３】
インビトロの方法：
肺移植を受けている重症ＣＯＰＤ患者の肺組織から内皮細胞を産生する際の副産物として、ＣＯＰＤ線維芽細胞を産生させた。組織を除去するときの患者の疾患は安定しており、増悪していなかった。
【０１８４】
細菌ろ過の後で組織培養フラスコにゼラチン（蒸留水中０．２％）を塗布し、細胞培養液ですすいでから使用した。
【０１８５】
胸膜を切断して組織を取り出し、ＲＰＭＩ＋培養液中でメザルーナ（ｍｅｚｚａｌｕｎａ）を用いて切り刻んだ（ＲＰＭＩ＋は、ＲＰＭＩ培養液＋１０％  ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／アムホテリシンＢ溶液）。切り刻んだ組織（標準のパスツールピペットに容易に吸引できるほど十分に微細になった組織）を４０ミクロンフィルター上で洗浄し、壊死組織片と赤血球を除去した。滅菌器具を使ってフィルターから細胞を取り除き、消化のためＲＰＭＩ、０．１％  ＢＳＡ、０．２％  ＩＩ型コラゲナーゼ中で再度懸濁させた。室温で２時間、ローラー上で組織をインキュベートした。チューブをときおり静かに振り動かして、組織が凝集し定着するのを防止した。２時間後、懸濁液を静かに撹拌してから、目の大きなストレーナーに通してろ過し、次いで１００ミクロンフィルターでろ過した。次に、室温、１２００ｒｐｍで５分間、ろ液を回転させた。次に、細胞ペレットをＲＰＭＩ＋で洗浄して、回転と洗浄を繰り返した。次に、細胞を内皮細胞培養液（ＥＧＭ−２−ＭＶ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ、ＣＬｏｎｅｔｉｃｓ  ＃ＣＣ３２０２）中で再懸濁させ、ゼラチンを塗布したフラスコに細胞を蒔いた。Ｔ２２５フラスコ１個あたり約２ｅ７細胞の割合で細胞を蒔いた。翌日、細胞全体に培養液を流し、細胞がコンフルエントな状態に近づいたとき、細胞解離液を使用して継代した。この時点で、ＣＤ３１  Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用して上皮細胞を濃縮した。ビーズとの結合に対して陰性の細胞は大部分が線維芽細胞であり、カウントが可能で、ＣＯＰＤ線維芽細胞アッセイに使用することができた。
【０１８６】
この時点から、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したＤＭＥＭ中で細胞を培養した。ウェル１つあたり１ｅ５細胞の割合で９６ウェル平底ポリスチレンプレートに線維芽細胞を蒔き、３７℃で一晩インキュベートし付着させた。抗体または培地のみを重複ウェル（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｗｅｌｌ）中で細胞とともにあらかじめ３０分間インキュベートしてから、最終アッセイ濃度０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β濃度でＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄシステムズ２０１−ＬＢ／ＣＦ）を添加した。各ウェルの最終量は２００μｌであった。プレートを３７℃、５％  ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。プレートを短時間回転させてから、上清を除去し、Ｒ＆ＤシステムズのＥＬＩＳＡ（ＤＹ２０６）を使用してＩＬ−６のレベルを分析した。
【０１８７】
インビボの方法：
成体Ｂａｌｂ／ｃ雌性マウスを使用した。アナキンラを皮下投与してから１時間後に、ＩＬ−１βを５０μｌ中５ｎｇの用量でマウスの肺に気管内投与した。４時間後、基本的に急性煙モデル（実施例２）と同様に、マウスの肺を洗浄し、総細胞数および分画細胞数をカウントした。
【０１８８】
実施例２−ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストは、急性タバコ煙肺炎症モデルにおいて、細胞流入を阻止する。
【０１８９】
抗体３５Ｆ５は、マウスのＩＬ−１Ｒ１と結合して、ＩＬ−１βとＩＬ−１αの両方が受容体ＩＬ−１Ｒ１と結合するのを阻止するモノクローナル抗体である。アナキンラは、ＩＬ−１βとＩＬ−１αの両方の効果に拮抗する。インターロイキン１は、ヒトの炎症過程において、安定病態、および喫煙が誘発する変化との強力な疾病関連性を示す。この実施例に示すデータで確認されることは、ＣＯＰＤに関連する刺激（例えば煙）により誘発された急性のマウス肺炎症モデルにおいて、３５Ｆ５がＩＬ−１Ｒ１を阻害することにより、炎症が減少することである。このことは、以前の公知の観察事項と一致しており、ＩＬ−１Ｒａ（アナキンラ；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト）を使用した別の実験とも一致している。このマウスモデルでは、タバコ煙は、煙の吸入から４時間後に好中球ＢＡＬ細胞数を著しく増加させる。タバコ煙吸入に対する急性炎症反応に及ぼすＩＬ−１Ｒ１経路阻害の影響を調べるため、５日間、Ｂａｌｂ／ｃマウスをタバコ煙に１日に２回（５０分間）曝露させた。また、煙への初回曝露の４８時間前から連続して４日間、３５Ｆ５、アイソタイプ対照のラットＩｇＧ１（ＭＡＢ００５）、または食塩水を１日に１回腹腔内投与した。５日目に動物を屠殺しＢＡＬを行った。さらに追加の処置群を含めた。この群は、動物をタバコ煙に曝露させる点は上記と同じであるが、初回の煙曝露の４８時間前から、注入ポンプ（ＡＬＺＥＴ）を用いて連続的にアナキンラを皮下投与した。３５Ｆ５と、ＡＬＺＥＴで投与したアナキンラのどちらも、マウスのＢＡＬ中において、タバコ煙誘発性の急性炎症細胞の浸潤が有意に阻害されていた。これに対して、アイソタイプ対照抗体（ＭＡＢ００５）はまったく効果がなかった。３５Ｆ５は、煙に誘発される総細胞、好中球、およびリンパ球の増加を有意に低減した（総細胞ｐ＜０．００１、好中球ｐ＜０．０１、リンパ球ｐ＜０．００１）。この実験では、煙曝露に対してＢＡＬ中のマクロファージの有意な増加はなかった。図３に、煙曝露が肺炎症細胞に与える影響と、ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストによる肺炎症細胞の阻害の概要を示す。図２に、この実験のプロトコルを示す。また「方法」に本実験のプロトコルを記述する。ＡＬＺＥＴ処置用の浸透圧ポンプは、処置前に回収できるようにするため、順応と処置の間に植え込みをした。３５Ｆ５は、ＢＤバイオサイエンス／ＢＤファーミンゲンから市販されているげっ歯類抗体である。ＭＡＢ００５アイソタイプ対照は、Ｒ＆Ｄシステムズから入手できる。
【０１９０】
方法：
両試験で成体Ｂａｌｂ／ｃ雌性マウスを使用した。ＢＤバイオサイエンス（サンディエゴ）から、抗体３５Ｆ５（精製ＮＡ／ＬＥラット抗マウスＣＤ１２１ａカタログ番号６２４０９４）を調達した。この抗体は、ＩＬ−１Ｒ１に特異的なラットＩｇＧ１モノクローナル抗体であった。この抗体は超低レベルのエンドトキシン（＜０．０１ｎｇ／μｇエンドトキシン）を含有し、防腐剤は含有していなかった。Ｒ＆Ｄシステムズから、ラットアイソタイプ対照（カタログ番号ＭＡＢ００５、バッチＣＡＮ０７０９０５Ａ）を調達した。この対照は、低レベルのエンドトキシン（＜０．１ＥＵ／μｇ）を含有していた。薬局からアナキンラ−Ｋｉｎｅｒｅｔ  ＤＢ０００２６（ＢＴＤ０００６０；ＢＩＯＤ０００６０）ロット番号１００４７２９（００４６９９）ｅｘｐ  ０７２００９（Ａｍｇｅｎ）を購入した。ケンタッキーリサーチ等級ＩＲ３Ｆの紙巻タバコを、フィルターを除去して使用した（ケンタッキー大学、タバコ健康研究所（Ｔｏｂａｃｃｏ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））。一部のマウスにアナキンラを持続投与するための浸透圧ポンプとして、公称性能（３７℃時）０．９３ｕｌ／ｈｒ、持続期間７日、リザーバー容量０．２３ｍｌのＡＬＺＥＴモデル２００１を使用した。アナキンラを事前に室温にしてから（遮光する）、ポンプに充填した。用量４８ｍｇ／ｋｇ／日を投与するため、１５０ｍｇ／ｍｌのストックを等張食塩水で希釈し、製造者の指示に従って滅菌状態でポンプに充填した。
【０１９１】
実験開始の７日前までに動物を受け取り、煙を受けさせずに、スモーキングマシンに接続した曝露ボックスに長時間順応させ、温度２１±２℃、湿度５５±１５％、明暗周期１２時間の設備内に保管した。これらの動物に標準の固形飼料と水道水を与え、自由に摂食、飲用させた。実験開始前に、これらの動物を無作為にグループ分けした。浸透圧ポンプを植え込む動物群は、重量測定してからイソフルラン混合物（Ｎ２Ｏ、Ｏ２  １．４：１．２、および３％イソフルラン）で麻酔し、麻酔下で左肩甲骨領域を剃毛し洗浄した後、ｍａｒｇｕｓ尾側肩甲骨の後ろ５ｍｍの背腹方向の皮膚を小さく切開した。切開領域を消毒液（Ｍａｒｃａｉｎ  ５０ｍｇ／ｍｌ）に浸してから、皮下組織内のポケットをハサミで開いた。切開部分との相互作用を最小化するため、充填したポンプの送達口を先にしてポケットに挿入した。滅菌条件下で縫合により切開部分を閉じ、回復するまでマウスを観察した。この手技から４８時間以上が経過してから、タバコ煙（ＣＳ）セッションを開始した。
【０１９２】
容量２００μｌ未満から１０ｍｌ／ｋｇ（体重）以下の抗体（アナキンラ腹腔内投与群の場合はアナキンラ）を、腹腔内投与した（個々の実験スケジュールに従い４回注射）。投与した抗体（アナキンラ腹腔内投与群の場合はアナキンラ）の設定濃度（ｎｏｍｉｎａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）は、１５ｍｇ／ｋｇであった。
【０１９３】
浸透圧ポンプの植え込みから４８時間後、または抗体の腹腔内投与から１時間後、マウスに１回目の煙セッションを与えた。個々の煙曝露セッションでマウスを全身曝露ボックス内に無作為に配置し、１日目〜４日目の間、１日に２回、５０分間煙に曝露させた。５０分間の煙はタバコ１０本に相当し、スモークマシンは空気と煙の吐き出しを交互に行う。対照群の手順も同じであるが、煙でなく空気に曝露させた。５日目（煙の最終曝露から１６時間後）に、ペントバルビタールを投与してマウスを屠殺した。気管を露出した後、室温のＰＢＳ（ＭｇとＣａを含まない）を使用して、２３ｃｍの静水圧で肺を洗浄した（２分注入、１分排出、および繰り返し）。細胞を遠心分離したところ、上清のメディエーター（介在物質）の分析が可能となり、Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＴ−１８００ｉ  Ｖｅｔ等の自動計数器を使って総細胞数および分画細胞数を分析した。動物群間の有意差の計算には、最小有意性として片側分散分布および２標本不等分散を用いたスチューデントｔ検定を使用した（片側スチューデントｔ検定、不等分散）。ｐ値の限界値はｐ≦０．０５である。
【０１９４】
実施例３−急性マウスモデルのタバコ煙に起因する炎症において、ＩＬ−１αが重要な役割を果たす。
【０１９５】
煙誘発性炎症モデルにおけるＩＬ−１αの阻害を説明する実験は存在しない。ＩＬ−１αとＩＬ−１βのどちらも、同等濃度の単純なインビトロの活性検査では、ＩＬ−１Ｒ１の同等の活性化を誘発する。よって我々は、ＩＬ−１αとＩＬ−１βが疾患に存在する場合に、両方ともＩＬ−１Ｒ１を活性化すると仮定した。しかし、文献では、ＩＬ−１αが疾患に何らかの関わりをすることは、まだ説明されていなかった。そこで我々は、煙誘発性の急性炎症でＩＬ−１αが決定的役割を果たすことを以下の通り実証する。
【０１９６】
最初に、煙に曝露したマウスの肺にＩＬ−１αとＩＬ−１βの両方が存在することを実証した。室内空気対照マウス群では、ＩＬ−１αの発現は、主に肺胞腔内のマクロファージに限定され、ときおり細気管支粘膜内の上皮内細胞に発現し、細気管支上皮細胞と上皮分泌細胞のところどころで低度の染色が確認された（図４Ａ）。煙に曝露したマウス群では、拡大した肺胞マクロファージ集団での顕著なＩＬ−１α発現が主要な組織学的表現型であったが、ところどころ過形成の細気管支上皮細胞でもＩＬ−１αの染色が確認された。注目すべきは、細気管支コンパートメントおよび外膜コンパートメント内の浸潤細胞が陰性であったことである。
【０１９７】
ＩＬ−１αの発現パターンとは対照的に、室内空気、煙曝露のどちらのマウスにも、広範な組織にＩＬ−１βが発現しているのが観察された（図４Ａ）。室内空気対照群では、肺胞マクロファージ集団に可変性の発現が見られた。加えて、Ｉ型肺胞細胞（ＡＴＩ）およびＡＴＩＩ細胞、特に、ＡＩＴＴ細胞の肺胞終末芽および、ときおり肥大するＡＴＩＩ細胞に発現が見られた。煙に曝露した動物群では、拡大した肺胞マクロファージ集団に著しい染色が観察された。さらに、ＡＴＩ細胞とＡＴＩＩ細胞の両方、特に肥大型の細胞で発現の増加が観察された。また、細気管支上皮でも、ＩＬ−１βの広範かつ顕著な発現が観察された。このことは特に、肥大型細胞および上皮分泌細胞で明らかであった。実施例１２および図１３Ａ、１３Ｂと比較すると分かるように、煙に曝露したマウスの組織におけるＩＬ−１α、ＩＬ−１βの発現は、ＣＯＰＤ患者に見られる炎症性浸潤および常在細胞の集団に似た集団を伴っている。
【０１９８】
ＣＯＰＤ患者から得た検体と上記マウスモデルの間でＩＬ−１αとＩＬ−１βの発現プロファイルが類似していることから、この実験モデルを土台にして、タバコ煙誘発性の炎症およびウイルス性増悪に対するＩＬ−１αとＩＬ−１βの機能的重要性を調べた。上記がＣＯＰＤおよびＣＯＰＤ増悪を模倣するものと期待される。対照群と比較して、煙に曝露した動物群の肺では、ＩＬ−１αとＩＬ−１βの全体レベルが増加していることが観察された（それぞれ図４Ｂ、図４Ｃ）。
【０１９９】
我々のモデルで好中球性炎症が果たす役割を評価するため、ＩＬ−１Ｒ１欠損マウスと野生型マウスをタバコ煙に曝露させた。野生型対照群と比較して、ＩＬ−１Ｒ１欠損動物群は、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の好中球増加が完全に減弱していた（図４Ｆ）。煙曝露マウスのＢＡＬ内の総細胞数と単核球数に対しては、ＩＬ−１Ｒ１欠損の影響はなかった（それぞれ図４Ｄ、図４Ｅ）。野生型マウスでは、煙に曝露した後、好中球動員ケモカインであるＣＸＣＬ−１、ＣＸＣＬ−２、ＣＸＣＬ−５が増加したのに対し、ＩＬ−１Ｒ１欠損群では、この誘発が有意に減少していた。
【０２００】
カスパーゼ−１が成熟前のＩＬ−１を切断して生物活性型に変えること、および、このプロセスがタバコ煙誘発性の好中球性炎症に寄与することが示されていることから、カスパーゼ−１欠損マウスをタバコ煙に曝露させた。カスパーゼ−１欠損群では、ＢＡＬ中の煙誘発性好中球増加は有意に変化していなかった（図４Ｉ）。同様に、野生型対照群と比較して、煙に曝露したカスパーゼ−１欠損マウスは、ＢＡＬの総細胞数と単核球数が減少していなかった（それぞれ図４Ｇ、図４Ｈ）。興味深いことに、野生型マウスとカスパーゼ−１欠損マウスでは、ＩＬ−１αとＩＬ−１βのタンパク質レベルがほぼ同じであることが認められた（図４Ｊ、図４Ｋ）。このことは、カスパーゼ−１と無関係に、あるいはカスパーゼ−１の非存在下でも、ＩＬ−１βのプロセシングと活性化は達成可能であること、あるいは、ＩＬ−１βを検出しても、不活性の成熟前ＩＬ−１βと活動型の成熟ＩＬ−１βが区別されないことを示唆している。
【０２０１】
好中球性炎症に対するＩＬ−１αとＩＬ−１βの相対的役割を確認するため、タバコ煙に曝露したマウスに、抗ＩＬ−１α遮断抗体、抗ＩＬ−１β遮断抗体、アイソタイプ対照抗体のいずれかを投与した。抗ＩＬ−１αへの介入が煙誘発性の好中球増加を抑止したのに対し（図５Ａ）、抗ＩＬ−１β遮断とアイソタイプ対照投与の両方は、タバコ煙誘発性の炎症にまったく影響していなかった。これらのデータは、タバコ煙誘発性炎症の介在に際して、ＩＬ−１αが決定的役割を果たしていることを示唆している。
【０２０２】
ＩＬ−１αが、煙曝露マウスの肺への好中球の動員を大幅に減弱したことから、ＩＬ−１αを遮断すれば好中球動員ケモカインが優先的に減少するかどうかを評価した。タバコ煙に曝露した後、ＣＸＣＬ−１のＲＮＡとタンパク質の発現が有意に増加することを観察した（それぞれ図５Ｂ、図５Ｃ）。抗ＩＬ−１αにより、煙に曝露したマウスのＣＸＣＬ−１のＲＮＡとタンパク質の発現が減少したが、抗ＩＬ−１βでは減少しなかった。アイタイプ抗体送達群では、転写産物発現、タンパク質発現のどちらのレベルも変化しなかった。さらに、煙曝露の後に増加したＣＸＣＬ−２、ＣＸＣＬ−１０、およびＣＸＣＬ−５の遺伝子発現については、抗ＩＬ−１αで処置した後はこれらが減少し、ＩＬ−１βでは減少しなかった（図５Ｆ）。まとめると、これらのデータと合致する結論として、煙に曝露した動物に見られる好中球性炎症にはＣＸＣＬ−１、ＣＸＣＬ−２、ＣＸＣＬ−５の発現が必要であり、ＩＬ−１αの遮断でこれらの因子の発現が減弱するが、ＩＬ−１βの遮断では減弱しない、という結論が得られる。
【０２０３】
ＩＬ−１αとＩＬ−１βのどちらもＩＬ−１Ｒ１を通じてシグナル伝達するので、次の実験として、ＩＬ−１αの阻害がＩＬ−１βの発現を減少させるかどうかを調べた。図５は、抗ＩＬ−１α抗体を投与されたタバコ煙曝露したマウスにおいて、ＩＬ−１βの転写産物とタンパク質のレベルが大幅に減少したことを示す。同様に、最近、タバコ煙誘発性炎症と関係付けられているサイトカインであるＧＭ−ＣＳＦの発現が減少することも観察された。また、抗ＩＬ−１αにより、マクロファージエラスターゼＭＭＰ−１２の発現レベルが有意に減少したが、ＩＬ−１βの阻害では有意に減少しないことを確認した。これらのデータは、煙曝露マウスの肺に好中球を蓄積させるシグナルを伝達する上で、ＩＬ−１αが非常に重要であり、ＩＬ−１βは重要でないことを示している。
【０２０４】
動物。チャールズ・リバーラボラトリーズ（カナダ国モントリオール）からＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）を購入した。ジャクソン研究所（米国メイン州バーハーバー）から、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＩＬ−１Ｒ１欠損マウス、およびカスパーゼ−１欠損マウスを入手した。立ち入り制限区域内の無菌条件下でマウスを保管し、明暗周期１２時間で、食物と水を随時与えた。
【０２０５】
タバコ煙への曝露。上記のように、ＳＩＵ−４８全身煙曝露システム（Ｐｒｏｍｅｃｈ  Ｌａｂ  ＡＢ、スウェーデン国Ｖｉｎｔｒｉｅ）を使用して、マウスをタバコ煙に曝露させた。手短に述べると、フィルターを除去した１２  ２Ｒ４Ｆ基準紙巻きタバコ（米国ケンタッキー州レキシントン、ケンタッキー大学タバコ健康研究所）に約５０分間、マウスを曝露させた。この煙曝露プロトコルはバリデーションが実施され、血中一酸化炭素ヘモグロビンおよびコチニン濃度が、習慣的ヒト喫煙者に見られる濃度に匹敵することが示されている。対照動物群は、室内空気のみに曝露させた。
【０２０６】
抗体の投与。初回の煙曝露より１２時間前と、２回目の煙曝露後の毎日１時間、抗ＩＬ−１α抗体（クローンＡＬＦ１６１；Ｒ＆Ｄシステムズ、カナダ国バーリントン）、抗ＩＬ−１β抗体（クローンＢ１２２；Ｒ＆Ｄシステムズ）、アルメニアンハムスターアイソタイプ対照抗体（ジャクソンイムノリサーチ、カナダ国バーリントン）のいずれかを４００μｇずつ、マウスの腹腔内に注射した。ＩＬ−１α抗体とＩＬ−１β抗体は、ｂＥｎｄ−３（マウス内皮細胞株）細胞からのＩＬ−１誘発性ＩＬ−６放出の阻害を示したため、これらの抗体の生物活性が（供給者の品質管理手順に加えて）インビトロで確認された。
【０２０７】
標本の収集および測定。肺に０．２５ｍｌの氷冷１ｘ  ＰＢＳを満たし、次いで０．２ｍｌの１ｘ  ＰＢＳを満たした後、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を回収した。血球計数器を使用して総細胞数を得た。分画細胞の計数のためサイトスピンを調製し、Ｈｅｍａ３（バイオケミカルサイエンス社、米国ニュージャージー州スウェーデスボロ）で染色した。サイトスピン１つあたり細胞３００個をカウントし、標準の血球細胞学的基準を用いて単核球、好中球、および好酸球に分類した。
【０２０８】
組織学的解析および免疫組織化学検査。マウス肺のＢＡＬの後、１０％ホルマリンを用いて圧力３０ｃｍ  Ｈ２Ｏで左葉を固定した。肺をパラフィンブロックに包埋し、４μｍ厚の断片を作製した。ＩＬ−１αとＩＬ−１βの染色のため、抗体の一次インキュベーションの前に、各スライドにＲｏｄｅｎｔ  Ｍ  Ｂｌｏｃｋ（バイオケアメディカル、米国カリフォルニア州コンコード）を加えて３０分置き、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）で洗い流した。１０μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩＬ−１α、ＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄシステムズ、米国ミネソタ州ミネアポリス）をＵｌｔｒａ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（サーモサイエンティフィック、米国イリノイ州ロックフォード）中で調製し、スライドとともに１時間インキュベートした。製造者の指示に従い（バイオケアメディカル、米国カリフォルニア州コンコード）、二次ヤギポリマー（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｏａｔ  ｐｏｌｙｍｅｒ）西洋ワサビペルオキシダーゼを使用した。
【０２０９】
フリューダイム解析のためのＲＮＡ抽出。製造者（キアゲン、ドイツヒルデン）のプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｔｉｓｓｕｅキットを使用して単一のマウス肺葉から抽出した。ＲＮＡを定量して均一化し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔを用いたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント、米国カリフォルニア州サンタクララ）によりＲＮＡの完全性を評価した。ライフテクノロジーズが提供するＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩキットを使用して、製造者（ライフテクノロジーズ、米国カリフォルニア州カールスバッド）のプロトコルに従ってｃＤＮＡを作製した。上記関心部位の転写産物を調べるため、プローブをセットしたＦｌｕｉｄｉｇｍ  Ｂｉｏｍａｒｋダイナミックアレイを用いて転写産物の相対的発現を評価した。
【０２１０】
ＥＬＩＳＡおよびメソスケールディスカバリー解析。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β用の酵素結合免疫測定キットをＲ＆Ｄシステムズ（米国ミネソタ州ミネアポリス）から購入し、推奨プロトコルに従ってアッセイを行った。メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）が開発したマルチアレイマウス炎症促進性およびＴｈ１／Ｔｈ２ケモカインパネル検出システムを使用して、ケラチン由来サイトカイン（ＫＣ）およびＩＬ−１βのマルチアレイプラットフォームサイトカイン検出を行った。
【０２１１】
データおよび統計解析。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン５（米国カリフォルニア州ラホーヤ）を使ってデータを解析し、平均値±標準誤差でデータを表した。統計解析には、ＳＰＳＳ統計ソフトウェアバージョン１７．０（米国イリノイ州シカゴ）を使用した。ＳＰＳＳの一変量一般線形モデルを使って有意性（ｐ＜０．０５）を評価した後、２群の比較にはｔ−検定、多群の比較には、Ｄｕｎｎｅｔｔ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを実施した。
【０２１２】
実施例４−タバコ煙誘発性炎症には、放射線抵抗性のストローマ細胞にＩＬ−１受容体が発現することが不可欠である。
【０２１３】
図６Ａと図６Ｂを比較すると分かるように、煙に曝露したマウスのＩＬ−１Ｒ１組織発現は、ＣＯＰＤ患者に見られる常在細胞集団に似た集団を伴う。
【０２１４】
ＣＯＰＤのタバコ煙誘発炎症モデルにおける造血細胞と非造血細胞間のクロストークの重要性を試験するため、ＩＬ−１Ｒ１欠損骨髄キメラマウスを作製した。野生型またはＩＬ−１Ｒ１欠損型マウス由来の骨髄細胞を、照射を受けた野生型またはＩＬ−１Ｒ１欠損型のレシピエントマウスの静脈内に移植した（図６Ｃ）。８週間の再構成の後、マウスをタバコ煙に曝露させ、種々の炎症パラメーターを評価した。野生型骨髄細胞が移植された野生型動物（ＷＴ→ＷＴ）は、タバコ煙曝露に反応して強い好中球増加症を発症した（図６Ｄ）。これに対して、ＩＬ−１Ｒ１が欠損した骨髄細胞で再構成されたＩＬ−１Ｒ１欠損動物（ＫＯ→ＫＯ）には、好中球増加症がまったく認められなかった。照射を受けたＩＬ−１Ｒ１欠損マウスに野生型の造血細胞を移植して作製したキメラマウス（ＷＴ→ＫＯ）の場合、煙に対する好中球反応を示さなかった。このことは、タバコ煙誘発性の炎症には、放射線抵抗性の非造血細胞にＩＬ−１Ｒ１が発現することが不可欠であったことを示唆している。最後に、照射を受けた野生型のレシピエントマウスに、ＩＬ−１Ｒ１欠損造血細胞を移植したケースでは（ＫＯ→ＷＴ）、有意ではあるが部分的な、タバコ煙誘発性の好中球増加症の低下を示した。
【０２１５】
また、ＣＸＣＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−１２（それぞれ図６Ｅ、図６Ｆ、図６Ｇ）を含む各種遺伝子の発現を調べたところ、ＩＬ−１Ｒ１欠損骨髄細胞で再構成されたＩＬ−１Ｒ１欠損動物で、これらのすべての発現が減少していた。興味深いことに、ＷＴ→ＷＴ対照動物群と比較して、タバコ煙に曝露したＷＴ→ＫＯキメラ動物群で遺伝子発現が有意に減少したのに対し、ＫＯ→ＷＴ動物群は有意に減少しなかった。これらの結果は次のことを裏付ける。すなわち、ＩＬ−１Ｒ１の介在により非造血細胞が活性化することは、タバコ煙誘発性の炎症が生じるための前提条件であるが、好中球浸潤が最大になるには、造血細胞上にＩＬ−１Ｒ１が発現する必要がある。このことは重要である。なぜなら、肺の中で上方制御されているＩＬ−１αとＩＬ−１βは、理論上は、ＩＬ−１Ｒ１を発現する肺常在細胞に急速かつ局所的に作用して、炎症を誘導するからである。理論に拘束されるものではないが、これらの結果は次のことを示唆すると考えられる。すなわち、可溶性のＩＬ−１を遮断するより、ＩＬ−１Ｒ１を遮断する戦略の方が効果が高く、肺と全身の両方でＩＬ−１Ｒ１を遮断すれば、さらに有益となる可能性がある。
【０２１６】
方法：
ヒト切片でのＩＬ−１Ｒ１染色の免疫化学については、実施例１２を参照のこと。マウスの免疫化学は基本的に実施例３と同様であるが、抗ＩＬ−１αまたはβ抗体の代わりに、ヤギ抗マウスＩＬ−１Ｒ１抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ、米国ミネソタ州ミネアポリス）５μｇ／ｍｌを、スライド上で１時間インキュベートしたものを用いた。
【０２１７】
ＩＬ−１Ｒ１欠損骨髄細胞キメラマウスの作製。照射（線量５５０ラド×２（計１１グレイ））を受けたレシピエントＣ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウス、またはＩＬ−１Ｒ１欠損（ノックアウト（ＫＯ））マウスに対し、Ｃ５７ＢＬ／６野生型またはＩＬ−１Ｒ１欠損型の５００万個の骨髄細胞を静脈内注射した。照射前の１週間と照射後の２週間、レシピエントマウスに対し、トリメトプリムとスルファメトキサゾールで抗生物質処置した水を与えた。マウスを８週間放置して、造血性の骨髄細胞を再構成させた。煙の投与は、実施例３と基本的に同様であった。
【０２１８】
次の実施例は、ＣＯＰＤの急性増悪（ＡＥＣＯＰＤ）に関連するモデルに関する。
【０２１９】
実施例５−ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストは、ＬＰＳ介在性の肺への炎症細胞流入を阻止した。
【０２２０】
リポ多糖（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌の細菌細胞壁の構成成分である。ＣＯＰＤ急性増悪を引き起こす誘因の１つにこうした細菌があることが示されており、ＬＰＳ吸入誘発性の炎症を１つの方法として、こうした事象をモデル化できる。ＬＰＳ介在性の肺への炎症細胞流入のマウスモデルにおいて、ＩＬ−１Ｒ１アンタゴニストであるアナキンラの効果を調べた。ＢＡＬで測定したところ、アナキンラは、ＬＰＳ介在性の炎症細胞の流入を阻害していた。対照ＬＰＳで処置したマウスと比べて、肺に流入する総細胞数が４７％阻止されていた（Ｐ＜０．００１）（図７）。
【０２２１】
方法：
急性煙モデルの説明と同様に、ＡＬＺＥＴ浸透圧ポンプを使ってアナキンラを送達した。また、ＬＰＳ投与の４８時間前にも、マウスにアナキンラを投与した。使用したマウスは、成体雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスである。
【０２２２】
半開放の曝露吸入ボックスにマウスを入れ（最大１０匹）、エアロゾル化したＬＰＳに１回曝露させた。全体の吸入セッション時間は１２分である。濃度５ｍｇ／ｍｌの緑膿菌ＬＰＳを使用し、ネブライザー（例えばＰａｒｉＳｔａｒ  Ｊｅｔ  Ｓｔａｒネブライザー）を用いて、５ｍｌ量を充填してエアロゾル化した。ネブライザーからの流量は５ｌ／分であった（圧力＝２バール）。対照群にも同じ手順を施したが、ＰＢＳを用いた点が異なる。ＬＰＳ攻撃から４８時間後、ペントバルビタールを腹腔内注射してマウスを屠殺し、気管を露出し、室温のＰＢＳ（ＣａとＭｇを含まない）を使用して、２３ｃｍ流体圧力で肺を洗浄した（２分注入、１分排出、以降この手技を繰り返す）。次にＢＡＬを遠心分離し、標準の自動細胞計数および分画細胞計数により細胞ペレットを分析した。また、ホモジナイト（均質化）してｍＲＮＡまたはサイトカイン／メディエーターを分析する目的で、肺を除去した。片側分散分布と２標本不等分散を用いたスチューデントｔ検定を使用して、群間の有意差を計算した。不等分散Ｔ−検定を使用したｐ値の限度はｐ＜０．０５である。
【０２２３】
実施例６−ＩＬ−１Ｒ１はライノウイルス感染に対する肺上皮細胞株と初代正常ヒト気管支上皮細胞の反応を調節する。
【０２２４】
ヒトライノウイルスは、ＣＯＰＤの急性増悪（ＡＥＣＯＰＤ）と関連付けされている一般的なウイルスである。ライノウイルスに対して、ＣＯＰＤ患者が増悪反応を有することが示されている。ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）が介在する炎症反応でのＩＬ−１の役割を調べるため、ＰＥＧで精製されたＨＲＶ１４を使ってＢＥＡＳ−２ｂ／Ｈ２９２細胞（ＡＴＣＣから入手可能なヒト細胞）に感染させ、同時にこれらの細胞をＩＬ−１Ｒアンタゴニストに曝露させた（図８Ａ）。方法については、実施例８を参照のこと。細胞を処置してＨＲＶ１４に感染させた後、原型炎症性メディエーターＩＬ−８（ＣＸＣＬ−１）を調べた（図８）。生殖細胞系抗体６、アナキンラの両方でＩＬ−８レベルが減少したが、アイソタイプ対照抗体では減少しなかった。この細胞に使用したアナキンラの濃度は２５ｎＭであった。図８Ｃに示すように、別のプロトコルを追加して実施した。結果を図８Ｄに示す。アナキンラを３種類の濃度で試験したところ、いずれも、ＨＲＶ１４への反応によるＢＥＡＳ−２Ｂ細胞中のＩＬ−８放出が減少した。ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞とＨ２９２細胞は上皮細胞株であるため、より生理学的関連性が高い初代正常ヒト気管支上皮細胞をロンザ社から調達し、この細胞でさらに反応を分析した（図８Ｅ）。正常ヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞がヒトライノウイルス（ＨＲＶ１ｂ）に感染した結果、感染から４８時間後に測定したとき、培地に放出されるＩＬ−８が増加していた。ライノウイルス＋アイソタイプ対照と比較して、生殖細胞系抗体６（Ａｂ６ＧＬ；１０ｎＭ）は、ライノウイルスに対する反応を有意に阻害した。正の対照としてアナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））を使用したところ、Ａｂ６ＧＬはアナキンラと同程度に反応を阻害した。アナキンラ（１０ｎＭ）については、ライノウイルスのみの群と比較して、ライノウイルス感染に反応して上皮細胞から産生されるＩＬ−８に有意な影響を及ぼした（図８Ｅ）。この実験では、ヒトライノウイルス−１ｂ（少数群ウイルス）を使用し、ＩＬ−１Ｒ１遮断の影響をインビトロとインビボで比較できるようにした（実施例７を参照）。ヒトライノウイルス−１ｂがマウスに感染できるのに対し、多数群ＨＲＶ（ＨＲＶ１４等）はマウスに感染できない。ライノウイルスに誘発されたＩＬ−８産生に対するＩＬ−１遮断のインビトロの効果は、少数群と多数群のライノウイルス（ＨＲＶ１４）で同様の傾向を示した。このことは、ＩＬ−１Ｒ１の遮断により、ヒトライノウイルスに対する炎症促進反応がインビトロで減少することを具体的に示している。ライノウイルス感染に対するＣＯＰＤ増悪反応を常態に戻す上で、この属性は有用である。
【０２２５】
実施例７−ＨＲＶに反応する急性煙マウスにおいて、ＩＬ−１Ｒ１遮断がウイルス誘発性炎症を低減させる。
【０２２６】
ウイルスに対する好中球の炎症促進反応を抗ＩＬ−１Ｒ１が抑止できるかどうかを調べるため、市販の抗マウスＩＬ−１Ｒ１抗体３５Ｆ５（上述）をマウスＨＲＶ攻撃モデルにおいて使用した。少数群の血清型ＨＲＶ１ｂは、マウスの上皮細胞に感染してマウス肺に急性炎症を誘発することが示されているため、本実験ではこのＨＲＶ１ｂを使用した。インビボのウイルス攻撃モデルでも抗ＩＬ−１Ｒ１阻害が同様の抗炎症効果を有するかを試験するため、全身および鼻腔内に投与した３５Ｆ５が、ＨＲＶ誘発性の肺の細胞炎症を低減させる能力を測定した。ヒトライノウイルス−１ｂ（精製ウイルス、１０７プラーク形成単位［ｐｆｕ］／ｍＬ）を鼻腔内投与したところ、ウイルス投与から２４時間後に、ＢＡＬ液中の総細胞数および好中球数が有意に増加していた。このモデルは急性性質を有するため、ウイルス負荷は測定しなかった。紫外線照射されたライノウイルスの場合、ＢＡＬへの細胞浸潤で測定すると炎症性反応が無処置ウイルスより少なかった。このことは、炎症反応のかなりの部分が無処置ウイルスに依存することを示す。精製ＨＲＶ１ｂで鼻腔内攻撃する２４時間前に、抗マウスＩＬ−１Ｒ１抗体３５Ｆ５またはアイソタイプ対照（ラットＩｇＧ１；ＭＡＢ００５）を、単回投与としてマウスに１５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与するか１００μｇを鼻腔内投与した。ウイルス注入から２４時間後、動物のＢＡＬ液中の細胞浸潤を測定した。３５Ｆ５の投与により、全体の細胞浸潤が減少し（図９）、ＨＲＶ１ｂ攻撃に反応してマウスのＢＡＬに流入する好中球も減少していた。基本的に慢性炎症がありウイルス感染で増悪するＣＯＰＤにおいて、ウイルス感染に反応する好中球性炎症が減少することは有益であると考えられる。
【０２２７】
実施例８−ＩＬ−１Ｒ１の遮断により、上皮細胞での煙および煙＋ウイルスへの反応による炎症が低減させる。
【０２２８】
上皮細胞のインビトロの炎症反応を測定するため、煙条件培養液、または煙条件培養液とウイルスに対する反応で測定した。タバコ煙を組織培養（ＴＣ）液に通してバブリングすることにより、煙条件培養液を作製した。本実施例では以下、この煙条件培養液を「煙」または細胞の「煙処置」と称する。フィルターを除去し２５ｍＬの培養液を通してバブリングした紙巻きタバコ１本が、１００％煙処置培養液に相当する。ＩＬ−８の放出とＢＥＡＳ−２ｂ細胞のコンフルエンスを目的として、タバコ煙で処置した培養液を滴定した。２０％煙処置培養液が、有意な細胞死なく炎症促進性サイトカインの放出を誘発したため、すべての実験で２０％煙処置培養液を使用した。
【０２２９】
煙とウイルスに誘発される炎症におけるＩＬ−１Ｒの役割を調べるため、最初に、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストの前処置を行って細胞を煙処置した。次に、必要に応じて、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト、アナキンラの別の前処置を行って、細胞をＨＲＶウイルスに感染させた（図１０Ａ、１０Ｃ）。（図示の通り）アナキンラの濃度を変えて４回実験を行った。
【０２３０】
アナキンラで処置した結果、煙に誘発されるＩＬ−８反応が部分的に阻害された（図１０Ｂ）。煙＋ウイルス刺激は、ＩＬ−８反応の点で相加的であった。煙とウイルス曝露後のアナキンラ処置により、煙とウイルスに対する複合的なＩＬ−８反応が阻害された（図１０Ｄ）。濃度に依存した完全な阻害が達成された。これらの結果から、ＩＬ−８反応の阻害で評価した場合、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストで処置すると、ウイルス感染に対する炎症性反応を阻害でき、また、煙とウイルス感染の組み合わせに対する反応も阻害できることが分かる。
【０２３１】
方法（実施例６、実施例８の両方に関連）：
煙とウイルスに対する上皮の実験で使用した細胞は、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞またはＨ２９２細胞であった。ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞はＡＴＣＣから入手し（カタログ番号ＣＲＬ−９６０９）、供給者の指示に従って生育させた。Ｈ２９２細胞はＥＣＡＣＣから入手し（カタログ番号９１０９１８１５  ＮＣＩ−Ｈ２９２）、同様に供給者の指示に従って生育させた。
【０２３２】
火のついたタバコ（フィルターなし）を、組織培養液を入れガラスのフラスコで支えたファルコンチューブ（容量５０ｍｌ）に管で接続した。ぜん動ポンプで管から煙を抜き取り、組織培養液に注入した。廃棄煙は、洗剤の入ったビーカーに抜き取った。作業者および実験室の他の使用者を保護するため、この手技全体をヒュームフードの内部で行った。したがって、この手技は無菌化しなかった。可能な限り無菌性を維持するため、培養液の入ったファルコンチューブを三角フラスコに置く際、７０％エタノールで拭いたピンセットを使用した。栓に挿して煙を組織培養液に送達するピペットは、毎回交換して、次の手順の直前に７０％エタノールできれいに拭いた。ピンセットでファルコンチューブを取り出し、できるだけ速やかに蓋を元に戻した。次に、できるだけ速やかに、好ましくは煙処置手技の完了から１時間以内に、煙処置した培養液を希釈し細胞上に注入した［注意：煙抽出手技で培養液に血清が含まれなかった］。加えて、上記細胞用の標準の培養液／アッセイ培地には抗生物質（ゲンタマイシン）を含めた。この細胞株の基本培地（ＢＥＢＭ）および添加剤はすべて、ロンザ／クローネティックス社からキット（ＢＥＧＭ、キットカタログ番号ＣＣ−３１７０）として入手した。
【０２３３】
示されたスケジュールに従って、細胞をライノウイルス（Ｈｅｌａ−Ｏｈｉｏ細胞を使用して標準技法で調製、滴定された多数群ＨＲＶ１４。粗製ウイルスまたはウイルスのＰＥＧ沈殿物を使用）に曝露させた。
【０２３４】
底が平らで透明のプレートにコラーゲンを塗布し、このプレートに細胞を播種して、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートしてから、一晩放置して定着させた。ウェルから培養液を除去し、培養液＋／−１５０μｌ中アナキンラ（２ｘ最終濃度のアナキンラ）を入れ替えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。上記のように煙培養液を調製した（ケンタッキー研究所等級の紙巻きタバコを使って煙抽出液を調製できる）。煙抽出液を培養液で４０％に希釈して、培養液＋／−アナキンラを除去していない１５０μｌ中の細胞に加えた。一部の細胞は、対照として培養液のみを有した。これらを２４時間インキュベートした。上清２００μｌを除去し、その後のサイトカイン分析用に凍結した。残りの培養液を除去し、廃棄した。アナキンラまたは培養液を１００ｕｌ中の細胞に移し、３０分後、ＨｅＬａ  ＯＨＩＯ細胞に対するウイルスストックの力価で決定される希釈度でウイルスを加えて、追加の１００ｕｌ中に作製される各バッチの等価活性（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を決定した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。細胞から培養液を完全に除去し、細胞にアナキンラまたは新しい培養液を加えて、３７℃、５％  ＣＯ２でさらに４８時間インキュベートした。
【０２３５】
ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤシステムズＤｕｏｓｅｔ  ＤＹ２０８）を使用し、製造者の指示に従って、またアッセイの基準としてＲ＆Ｄの組み換えタンパク質を使用して、上清内のＩＬ−８を測定した。
【０２３６】
実施例９−煙に曝露した精密切断肺切片（ＰＣＬＳ）において、ＩＬ−１Ｒ１の欠損が、ウイルス刺激に対する肺常在反応を減弱させる。
【０２３７】
この実施例では、煙に曝露した肺がウイルス攻撃に対して示す様々な反応の根底に、類似のメカニズムが存在する可能性があるかどうかを評価した。室内空気および煙に曝露した野生型マウスとＩＬ−１Ｒ１欠損マウスから、精密切断肺切片（ＰＣＬＳ）を作製した。ＰＣＬＳを、ｄｓＲＮＡリガンドであるポリイノシンポリシチジル酸（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）でエキソビボで刺激して、主要メディエーターの発現を評価した。室内空気に曝露した対照群と比較して、煙に曝露した野生型から作製したＰＣＬＳから、ｐｏｌｙＩ：Ｃの刺激に反応して誘発されるケモカインとして、好中球動員ケモカインであるＣＸＣＬ−１とＣＸＣＬ−５が有意に大きく誘発され、ＣＸＣＬ−２は中程度に増加したことを観察した（図１０Ｅ）。煙に曝露しウイルス模倣体で刺激されたＩＬ−１Ｒ１欠損型ＰＣＬＳでは、測定したすべての転写産物が有意に減弱していた。まとめると、これらのデータは、煙誘発性の炎症を促進する際に肺常在細胞が果たす役割を示し、また、煙に曝露した肺がウイルス感染に対して様々な反応を示す際に、ＩＬ−１Ｒ１が果たす役割を裏付けるものである。
【０２３８】
方法：
精密切断肺切片の作製および培養。以前にＢｅｒｇｎｅｒら，２００２，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １１９：１８７−１９８で説明されている標準プロトコルの修正版を使用して、肺をスライスした。この修正は、さらにＫｈａｎら，２００７，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３０：６９１−７００により説明されている。手短に述べると、アガロース（タイプＩＩＩ−Ａ低ゲル化温度；シグマアルドリッチ、米国ミズーリ州セントルイス）を３７℃に温め、ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）の２％濃度に調製し、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（０．２Ｍ、ｐＨ７．４）を補充し、このアガロース約１．４ｍｌで肺を膨張させた。次いで、アガロース−ＨＢＳＳ溶液を誘導気道から流し出すため、０．２ｍｌの空気を肺に注入した。肺を１５分かけて４℃に冷却することにより、アガロースをゲル化させた。肺葉を切断して取り出し、主気管支に対して並行かつ尾側の肺葉上の平面を切断した。切片の作製時と作製前、肺葉を氷冷の１ｘ  ＨＢＳＳ溶液中に保存した。ビブラトーム（ライカ；モデルＶＴ  １０００Ｓ、カナダ国リッチモンドヒル）を４℃で使用して、１２０μｍ厚の切片を作製した。マウスの各肺葉から約４０の切片を分離した。
【０２３９】
次いで、肺切片をダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、カナダ国バーリントン）に移し、Ｌ−アスコルビン酸（シグマアルドリッチ、カナダ国オークビル）３５μｇ／ｍｌ、トランスフェリン（Ｇｉｂｃｏ、カナダ国バーリントン）５μｇ／ｍｌ、インシュリン（シグマアルドリッチ、カナダ国オークビル）２．８５μｇ／ｍｌ、およびセレン（原子吸光用標準溶液；シグマアルドリッチ、カナダ国オークビル）３．２５ｎｇ／ｍｌを加えて培養した。この溶液を０．２２μｍポアフィルターでろ過して滅菌した。さらに、このＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液にアムホテリシンＢ（シグマアルドリッチ、カナダ国オークビル）２５０ｎｇ／ｍｌと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを追加した。残りのアガロースと細胞残骸を肺切片培養から完全に除去するため、培養の最初の３時間は、１時間おきに培養液を交換した。翌日、ｄｓＲＮＡ模倣性ポリイノシンポリシチジル酸１００μｇ／ｍｌ（ＧＥヘルスケア、カナダ国ミシソーガ）で６時間、肺切片を刺激した。この模倣剤は、リン酸緩衝食塩水で再構成するか、未処置のままにされていたものである。検体をＲＮＡｌａｔｅｒ（アンビオン、米国テキサス州オースチン）に回収し、ＲＮＡの抽出まで−８０℃で保存した。
【０２４０】
精密切断肺切片のＲＮＡ抽出およびリアルタイム定量ＲＴ。ＰＣＲ肺切片を回収して２００μｌのＲＮＡｌａｔｅｒ（キアゲン、カナダ国オンタリオ州ミシソーガ）に格納し、必要時まで−８０℃で保存した。ＲＮＥａｓｙ  Ｋｉｔ（キアゲン、カナダ国オンタリオ州ミシソーガ）の動物組織プロトコルに従って、肺切片からＲＮＡを抽出した。任意実施のオンカラムデオキシリボヌクレアーゼ消化を行った。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー（アジレント・テクノロジーズ、カナダ国オンタリオ州ミシソーガ）を使用して、ＲＮＡを定量した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー（米国カリフォルニア州パロアルト）を使用して、単離したＲＮＡの量と完全性を測定した。次に、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（インビトロジェン、カナダ国バーリントン）の１００Ｕを使用して、総量２０μＬ中で計１００ｎｇのＲＮＡを逆転写した。無作為ヘキサマープライマーを使用して、４０℃で５０分かけてｃＤＮＡを合成した後、７０℃で１５分間インキュベートした。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して、総量２５μｌでリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを３回繰り返した。ＣＸＣＬ−１、ＣＸＣＬ−２、ＣＸＣＬ−５、ＧＡＰＤＨ用のプライマーおよびＦＡＭ標識プローブは、アプライドバイオシステムズから購入した。ＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ配列検出システムおよびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒソフトウェアバージョン２．２（アプライドバイオシステムズ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して、ＰＣＲを行った。データ解析にはデルタデルタＣｔ法を使用した。手短に述べると、遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化し、対照群（室内空気、模擬群）に対する倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）として表した。
【０２４１】
実施例１０−煙曝露マウスのＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス感染モデルにおいて、ＩＬ−１Ｒ１欠損およびＩＬ−１α抗体遮断が過剰炎症を減弱させる
煙誘発性の炎症を誘発するためにＩＬ−１Ｒ１を介してシグナルを伝達する上で、ＩＬ−１αが重要であることが明確になり、また、ウイルス性傷害に反応する際、煙に曝露した肺の常在細胞が役割を果たすことが示されたことから（実施例９を参照）、次の実験として、こうしたメカニズムが、ウイルス感染後に観察される炎症反応の増悪の根底にあるかどうかをインビボで評価することにした。野生型マウスとＩＬ−１Ｒ１欠損マウスをタバコ煙に曝露させ、次いでＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスに感染させた。野生型マウスでは、ウイルス感染した室内空気対照群と比較して、タバコ煙に曝露しウイルス感染したマウスのＢＡＬに、炎症性反応の増悪が観察された（図１１Ａ）。ＩＬ−１Ｒ１欠損マウスでは、煙曝露とインフルエンザ感染を受けたマウスにおいて、ＢＡＬの全体の炎症は中程度に減弱したが（ｐ＝０．０８９）、野生型対照群と比較して、好中球増加が有意に減少していた（図１１Ｃ）。これらのデータは、煙に曝露し、ウイルス感染したマウスの炎症反応の増悪には、ＩＬ−１Ｒ１に依存するメカニズムが寄与していることを示唆している。
【０２４２】
煙曝露とインフルエンザ感染を受けた動物において、ＩＬ−１Ｒ１の欠損が炎症反応の増悪を減少させた可能性もあるが、我々は、この反応の促進でＩＬ−１αが支配的な役割を果たすと仮定した。これを試験するため、タバコ煙の曝露とウイルス感染の経過中、抗ＩＬ−１α抗体またはアイソタイプ抗体を毎日動物に注射した。感染から５日後、タバコ煙を曝露したマウスに、インフルエンザＡウイルス反応の増悪が観察された（図１１Ｄ）。抗ＩＬ−１αの中和により、ＢＡＬ液中の全体の炎症が著しく減弱した。この効果は、単核球に有意に影響したが、好中球には有意に影響していなかった（それぞれ図１１Ｅ、図１１Ｆ）。これらのデータを総合すると、疾患が不安定な期間、特にＣＯＰＤ増悪期では、ＩＬ−１α／ＩＬ−１Ｒ１の遮断を目的とする治療が有効となる可能性がある、という結論が裏付けられる。
【０２４３】
方法：基本的に、実施例３に記載の煙モデルと同様である。また、インフルエンザ感染する動物群は、感染経過中の毎日、腹腔内注射を受けた。
【０２４４】
インフルエンザ感染。３５μｌの１ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）媒体中のマウス適応５０  ＰＦＵのＨ１Ｎ１インフルエンザＡ（Ａ／ＦＭ／１／４７−ＭＡ）ウイルスを、麻酔したマウスの鼻腔内に感染させた。対照動物群には、３５μｌのＰＢＳ媒体を与えた。Ａ／ＦＭ／１／４７−ＭＡは完全に配列が決定され、プラーク精製された調製品であり、マウス肺の感染に関して生物学的特性を示す。ウイルスの送達日およびウイルス感染の経過中、動物群をタバコ煙に曝露させなかった。
【０２４５】
ウイルス実験のため、ＢＡＬの前に右肺から肺葉を１つ取り出し、ウイルスの力価を測定した。右肺の残りはＲＮＡｌａｔｅｒ（アンビオン、米国テキサス州オースチン）内に保存し、左肺の肺葉は、組織学的評価のためホルマリンで膨張させた。
【０２４６】
次の実施例は、特にヒトのＣＯＰＤに関係する。
【０２４７】
実施例１１−ＣＯＰＤ患者の増悪は、ＩＬ−１αレベルとＩＬ−１βレベルの増加と相関関係がある。
【０２４８】
ＣＯＰＤ患者の喀痰測定値をもとに、長期間中の増悪のタイミングとの比較において、ＩＬ−１αとＩＬ−１βのレベルを分析した。喀痰のサイトカイン含量をできるだけ変えないようにするため、ＤＴＴ処理でなくＰＢＳ処理を使用して喀痰を処理した。この患者の場合、ＣＯＰＤの増悪時にＩＬ−１αとＩＬ−１βの両方が上方制御されていた（図１２Ａ）。増悪期間とＩＬ−１α、ＩＬ−１βレベルの上昇は強く相関していた。
【０２４９】
また、患者の別の部分集団で、細菌状態とＩＬ１−βの相関関係を分析した。喀痰細菌検査で陽性の患者は、ＩＬ−１βが有意に高かった（図１２Ｂ）。
【０２５０】
実施例１２−ＣＯＰＤ患者の肺においてＩＬ−１αとＩＬ−１βが増加する。
【０２５１】
この実施例では、ＧＯＬＤ  Ｉ、ＩＩのＣＯＰＤ患者の肺に出現するＩＬ−１αとＩＬ−１βを調べた。ＩＬ−１α、ＩＬ−１βの両方とも、肺切片の生検は陽性に染色された（それぞれ図１３Ａ、図１３Ｂ）。非ＣＯＰＤ対照群と比較して、ＧＯＬＤ  Ｉ、ＩＩのＣＯＰＤ患者から取得した生検検体には、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βの有意に多くの陽性細胞が観察された（図１３Ｃ）。
【０２５２】
炎症反応を惹起する上で肺構造細胞が重要であることから（実施例４を参照）、非ＣＯＰＤ対照群との比較において、ＣＯＰＤ患者の肺上皮のＩＬ−１α、ＩＬ−１βの染色を評価した。非ＣＯＰＤ対照群と比較して、ＣＯＰＤ患者の上皮でＩＬ−１αは増加していなかったが、ＩＬ−１βの染色は有意に増加していた（ｐ＜０．０００１）（それぞれ図１３Ｄ、１３Ｅ）。安定病態中、増悪発症時（追加処置の前）、増悪後７日、および増悪後３５日では、ＣＯＰＤ患者の喀痰から回収したＩＬ−１α、ＩＬ−１βのレベルは有意に相関していた（ｐ＜０．０００１）（図１３Ｆ〜１３Ｉ）。ＩＬ−１αとＩＬ−１βの相関が最も強いのは、増悪後７日目であった。患者の部分集合において、安定病態時に測定したレベルと比べて、増悪時はＩＬ−１αとＩＬ−１βのレベルが増加した。まとめると、これらのデータが裏付ける結論として、ＩＬ−１のシグナル伝達は、安定期のＣＯＰＤだけでなく、急性増悪の発現時にも何らかの役割を果たしており、ＩＬ−１Ｒ１の遮断は、増悪状態を治療する有効な戦略であると言える。
【０２５３】
方法：ヒト肺生検および喀痰検体。ＧＯＬＤ  Ｉ（ｎ＝３、男性１女性２；習慣的喫煙者ｎ＝３；ＦＥＶ１／ＦＶＣ％の平均±標準偏差＝６０±８）、およびＧＯＬＤ  ＩＩ（ｎ＝６、男性４女性２；習慣的喫煙者ｎ＝２；ＦＥＶ１／ＦＶＣ％の平均±標準偏差＝５６±１０）のＣＯＰＤ患者から得た生検検体から、肺切片を取得した。この２群の生検データを組み合わせた。肺癌の解剖学的に正常な肺葉領域の肺葉切除から取得した非ＣＯＰＤ試料と、データとを比較した。安定病態期の登録時、増悪発症時、増悪発症後７日目および３５日目のＣＯＰＤ患者から、喀痰検体を取得した。増悪は、重要な症状（呼吸困難、喀痰量、喀痰の化膿）のうち２つ、または重要な症状１つと軽微な症状（咳、喘鳴、咽頭痛、鼻漏、発熱）のうち１つが、４８時間以上に渡り増加することと定義した。患者には、その時点の状況下で正常な標準的治療を行い、実験調査者の判断で喀痰検体を取得した。
【０２５４】
ヒトのＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１Ｒ１の発現のため、切片を蒸留Ｈ２Ｏ中の０．２％トリプシン／０．２％  ＣａＣｌ２下、３７℃で１０分間インキュベートすることにより抗原回復を行った。６％  Ｈ２Ｏ２を使用して、内因性ペルオキシダーゼ活性を１０分間遮断した。二次抗体の非特異的結合を遮断するため、２０％正常ウサギ血清またはヤギ血清とともに、スライドを２０分間インキュベートした。過剰血清を除去し、ＩＬ−１αウサギ抗ヒト抗体（アブカム、９６１４、２．５μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１βウサギ抗ヒト抗体（アブカム、２１０５、１０μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１Ｒ１ヤギ抗ヒト抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ、Ａｂ−２６９−ＮＡ、１０μｇ／ｍｌ）のいずれか、またはウサギもしくはヤギＩｇＧ陰性対照とともに、スライドを１時間インキュベートした。ビチオン標識したウサギ抗ヤギ二次抗体（１：２００）またはブタ抗ウサギ二次抗体（１：２００）とともに、スライドを２０分間インキュベートした。ヒト組織の各組に対し、以下の２つの抗原検出プロトコルを使用した。１）室温でＳｔｒｅｐ  ＡＢＣｏｍｐｌｅｘ／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ）を２０分、緩衝液洗浄２ｘ１０分、ＤＡＢの適用１分。２）室温でＳｔｒｅｐ  ＡＢＣｏｍｐｌｅｘ／ＡＰ（Ｄａｋｏ）を３０分、緩衝液洗浄２ｘ１０分、Ｆｕｃｈｓｉｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｋｏ）５分。ヘマトキシリン（シグマ）でスライドを対比染色した。各患者から約１０μｍずつ採取した２つの別個の生検検体から、陽性細胞をカウントした。基底膜に２５０ｍｍ２計数線を揃え、隣接する３領域中の固有層内の細胞をカウントした。
【０２５５】
配列：
いくつかの抗体の配列情報を以下に示す。
【０２５６】
抗体６  ＶＨアミノ酸配列＝Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ（配列番号１）
抗体６重鎖ＣＤＲ１＝Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ（配列番号２）
抗体６重鎖ＣＤＲ２＝Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ（配列番号３）
抗体６重鎖ＣＤＲ３＝Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ（配列番号４）
抗体６  ＶＬアミノ酸配列＝Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ（配列番号５）
抗体６軽鎖ＣＤＲ１＝Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ（配列番号６）
抗体６軽鎖ＣＤＲ２＝Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ（配列番号７）
抗体６軽鎖ＣＤＲ３＝Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  （配列番号８）
抗体６  ＶＨ−生殖細胞系＝Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ（配列番号９）
抗体６  ＶＬ−生殖細胞系＝Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ（配列番号１０）
2013525310.tif 000003
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は下線を付け、太字で表示している。
【０２５７】
ＣＤＲ１＝ＮＹＧＭＨ（配列番号３２）
ＣＤＲ２＝ＧＩＷＮＤＧＩＮＫＹＨＡＨＳＶＲＧ（配列番号３３）
ＣＤＲ３＝ＡＲＳＦＤＷＬＬＦＥＦ（配列番号３４）
抗体２６Ｆ５−ＶＬ（軽鎖可変領域）
2013525310.tif 000004
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は下線を付け、太字で表示している。
【０２５８】
ＣＤＲ１＝ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号３６）
ＣＤＲ２＝ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号３７）
ＣＤＲ３＝ＱＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号３８）
抗体２７Ｆ２−ＶＨ（重鎖可変領域）
2013525310.tif 000005
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は下線を付け、太字で表示している。
【０２５９】
ＣＤＲ１＝ＴＦＳＮＹＧＭＨ（配列番号４０）
ＣＤＲ２＝ＡＩＷＮＤＧＥＮＫＨＨＡＧＳＶＲＧ（配列番号４１）
ＣＤＲ３＝ＧＲＹＦＤＷＬＬＦＥＹ（配列番号４２）
抗体２７Ｆ２−ＶＬ（軽鎖可変領域）
2013525310.tif 000006
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は下線を付け、太字で表示している。
【０２６０】
ＣＤＲ１＝ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号３６）
ＣＤＲ２＝ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号３７）
ＣＤＲ３＝ＱＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号３８）
抗体１５Ｃ４−ＶＨ（重鎖可変領域）
2013525310.tif 000007
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は下線を付け、太字で表示している。
【０２６１】
ＣＤＲ１＝ＦＨＷＩＡ（配列番号４４）
ＣＤＲ２＝ＩＩＨＰＧＡＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号４５）
ＣＤＲ３＝ＱＲＥＬＤＹＦＤＹ（配列番号４６）
抗体１５Ｃ４−ＶＬ（軽鎖可変領域）
2013525310.tif 000008
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は下線を付け、太字で表示している。
【０２６２】
ＣＤＲ１＝ＲＡＳＱＳＩＧＳＳＬＨ（配列番号４８）
ＣＤＲ２＝ＹＡＳＱＳＦＳ（配列番号４９）
ＣＤＲ３＝ＨＱＳＳＳＬＰＬＴ（配列番号５０）
（参照による組み込み）
本明細書で言及するすべての出版物および特許は、各出版物または各特許が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示されているかの如く、参照により、ここにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６３】
本件開示の具体的な実施形態を考察したが、上記明細は例示的なものであり、限定的ではない。当業者であれば、本明細書および下記特許請求の範囲を精査後、本開示の多くの変形が明白になるであろう。本開示の全範囲は、特許請求の範囲およびその均等物の全範囲、ならびに本仕様書および当該変形を参照して決定すべきである。
【０２６４】
表１Ａは、抗体１〜３の各々のＣＤＲのアミノ酸配列を列記する。表１Ａは、配列番号２〜３、１１、２〜３、１２、２−３、１３〜１５、１４〜１５、および１４〜１８のそれぞれを出現順に開示している。
【表１Ａ】
2013525310.tif 000009
【０２６５】
表１Ｂは、抗体４〜１０の各々のＣＤＲのアミノ酸配列を列記する。表１Ｂは、配列番号２〜３、１９、２〜３、２０、２〜４、２〜３、２１、２〜３、２２、２〜３、２３、２〜３、２４、６〜７、６〜７、６〜７、６〜７、６〜７、６〜７、６〜７、２５〜２６、８、および２７〜３０のそれぞれを出現順に開示している。
【表１Ｂ】
2013525310.tif 000010
【０２６６】
（参考文献）
本明細書中の任意の箇所で引用されているすべての参考文献は、上記の任意の箇所で引用されているものを含めて、参照により、その全体がすべての目的のために本明細書中に組み込まれる。
【０２６７】
１  Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ２００２
２  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  １９９３
３  Ｓｔｅｉｎｋａｓｓｅｒ  １９９２
４  Ｂｌａｃｋ  １９８８
５  Ｎｉｋｉ  ２００４
６  Ｗｅｓｓｅｎｄｏｒｆ  １９９３
７  Ｃａｒｔｅｒ  １９９０
８  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  １９９０
９  Ｄｅｗｂｅｒｒｙ  ２０００
１０  Ｍｕｚｉｏ  １９９５
１１  Ｇａｂａｙ  １９９７
１２  Ｓｉｍｓ  １９９４
１３  Ｃｏｌｏｔｔａ  １９９４
１４  Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５−４１０
１５  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  （１９８８）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８
１６  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７
１７  Ｖｏｅｔ＆Ｖｏｅｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｗｉｌｅｙ）１９９５．
１８  Ｇｒａｍら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０
１９  Ｂａｒｂａｓら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：３８０９−３８１３
２０  Ｓｃｈｉｅｒら，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７
２１  Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９）
２２  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２−５５４
２３  Ｈｏｌｔら（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，４８４−４９０
２４  Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８
２５  Ｈｕｓｔｏｎら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８
２６  Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８，１９９３
２７  Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６
２８  Ｈｕ，Ｓ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１，１９９６
２９  Ｈａａｎ＆Ｍａｇｇｏｓ（２００４）ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，１２（５）：Ａ１−Ａ６
３０  Ｋｏｉｄｅら（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８４：１１４１−１１５１．
３１  Ｎｙｇｒｅｎら（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：４６３−４６９
３２  Ｗｅｓｓ，Ｌ．Ｉｎ：ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，Ｔｈｅ  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ＢｉｏＢｕｓｉｎｅｓｓ，１２（４２），Ａ１−Ａ７，  ２００４
３３  Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ  Ｊ．Ａ．ら（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：６５９−６６４
３４  Ｂａｇｓｈａｗｅ  Ｋ．Ｄ．ら（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ４：９１５−９２２
３５  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．７２６，１９８８
３６  Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５
３７  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ＆Ｄｕｂｅｌ，Ｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＬＬＣ；２００１，ＩＳＢＮ：３５４０４１３５４５
３８  Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ，１５（２）：１４６−１５６
３９  Ｋｎａｐｐｉｋら  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６，５７−８６
４０  Ｋｒｅｂｓら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５４  ２００１  ６７−８４
【図１】
2013525310.tif 000011
【図２】
2013525310.tif 000012
【図３】
2013525310.tif 000013
【図４】
2013525310.tif 000014
【図５】
2013525310.tif 000015
【図６】
2013525310.tif 000016
【図７】
2013525310.tif 000017
【図８】
2013525310.tif 000018
【図９】
2013525310.tif 000019
【図１０】
2013525310.tif 000020
【図１１】
2013525310.tif 000021
【図１２】
2013525310.tif 000022
【図１３】
2013525310.tif 000023
【配列表】
2013525310000001.app
【国際調査報告】
2013525310.tif 000024
2013525310.tif 000025