(57)【要約】本明細書は、Ｎｏｔｃｈ２受容体を発現する間充織幹細胞（ＭＳＣ）（Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣ）の比較的に純粋な集団を提供する。また、被験者からＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を分離する方法、及びＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を培養する方法を提供する。また、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を被験者に投与することを含む、間葉細胞系列における欠陥又は異常と関連する障害を患っている被験者を治療する方法を提供する。本発明は、複数の継代を通して能力を維持する間充織幹細胞（ＭＳＣ）の集団を、被験者から分離する方法であって、（ａ）前記被験者からＭＳＣを含む生物学的試料を得ること；及び（ｂ）前記生物学的試料からＮｏｔｃｈ２受容体を発現するＭＳＣを選択し、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を得ることを含む方法。
2013518588.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の継代を通して能力を維持する間充織幹細胞（ＭＳＣ）の集団を、被験者から分離する方法であって、
（ａ）前記被験者からＭＳＣを含む生物学的試料を得ること；及び
（ｂ）前記生物学的試料からＮｏｔｃｈ２受容体を発現するＭＳＣを選択し、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を得ることを含む方法。
【請求項２】
工程（ｂ）を、Ｎｏｔｃｈ２受容体抗体を用いて実施する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又は親和性クロマトグラフィーを用いて実施する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記Ｎｏｔｃｈ２受容体抗体が基質と結合している、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記基質が可動式固体支持体である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記可動式固体支持体が蛍光ビーズである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記基質が固定式固体支持体である、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記固定式固体支持体がカラムである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記固定式固体支持体がプレートである、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団が、間充織幹細胞と関連する１つ以上の追加のマーカーを発現する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の追加のマーカーが、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１５６、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ１６６、Ｓｔｒｏ−１、ＦＧＦ１０、Ｐｒｘ１、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇからなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団が、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４、及びＣＤ３１からなる群から選択される造血又は内皮細胞系列と関連する１つ以上のマーカーを発現しない、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団が、ＣＤ１０５及びＣＤ１５６を発現する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記被験者からの試料が、骨髄、脂肪組織、滑膜、骨膜、軟骨膜、軟骨、歯の組織、胎盤組織、肝臓組織、筋肉組織、肺組織、心臓組織、結合組織、及び脾臓組織からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記試料が骨髄である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
Ｎｏｔｃｈシグナル経路の活性化剤の存在下に、ＭＳＣを培養することを含む、請求項１記載の方法に由来するＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を培養する方法。
【請求項１７】
前記Ｎｏｔｃｈシグナル経路の活性化剤がＪａｇｇｅｄ  １である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｎｏｔｃｈシグナル経路の活性化剤が、ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １、ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  ３、ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  ４、Ｊａｇｇｅｄ  ２、Ｄｌｋ１／Ｐｒｅｆ１、ＤＮＥＲ、Ｃｏｎｔａｃｔｉｎ１（Ｆ３）、Ｃｏｎｔａｃｔｉｎ６（ＮＢ３）、ＣＣＮ３／ＮＯＶ、ＭＡＧＰ１、及びＭＡＧＰ２からなる群から選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｎｏｔｃｈシグナル経路の活性化剤が、Ｎｏｔｃｈ受容体の細胞内ドメインである、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｎｏｔｃｈ受容体が、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団が拡張する、請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｊａｇｇｅｄ  １が、培養皿に少なくとも部分的に固定化されている、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の分化誘導薬の存在下にＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を培養することをさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２４】
前記１つ以上の分化誘導薬が、軟骨形成、骨原性又は脂肪細胞形成系列への分化を選択的に誘導する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を被験者に投与することを含む、間葉細胞系列における欠陥又は異常と関連する障害を患っている被験者を治療する方法。
【請求項２６】
前記Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団が、同一又は異なる被験者に由来する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団が、同一の被験者に由来する、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記被験者が、骨又は軟骨の異常を有している、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記骨の異常が骨折骨粗鬆症である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記軟骨の異常が関節軟骨の異常である、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記骨又は軟骨の異常部位又はその近くで、被験者にＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣを投与する、請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣを被験者に全身投与する、請求項２５記載の方法。
【請求項３３】
Ｎｏｔｃｈ２受容体（Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣ）を発現する、ＭＳＣの相対的に純粋な集団。
【請求項３４】
前記Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣが、複数の継代を通して拡張する能力を維持している、請求項３０記載のＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣ。
【請求項３５】
前記Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣが、ＣＤ１０５及びＣＤ１５６を発現する、請求項３０記載のＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣ。
【請求項３６】
前記Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣが、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１５６、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ１６６、Ｓｔｒｏ−１、ＦＧＦ１０、Ｐｒｘ１、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇからなる群から選択される、間充織幹細胞と関連する１つ以上のマーカーを発現する、請求項３０記載のＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣ。
【請求項３７】
前記Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣが、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４及びＣＤ３１からなる群から選択される、造血及び内皮細胞系列と関連する１つ以上のマーカーを発現しない、請求項３０記載のＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣ。
【請求項３８】
請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法により製造された、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの相対的に純粋な集団。
【請求項３９】
請求項３０記載のＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣを被験者に投与することを含む、被験者における骨又は軟骨の異常の治療方法。
【請求項４０】
前記骨又は軟骨の異常部位又はその近くで、被験者にＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣを投与する、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣを被験者に全身投与する、請求項３９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年２月２日に出願された米国特許仮出願第６１／３００，６２５号の優先権の利益を主張し、その全体は本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号ＡＲ０５７０２２−０１及びＡＲ０５９７３３−０１の下、政府支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ＭＳＣは、骨髄、血液、脂肪組織、滑膜、及び胎児組織を含む、種々のヒトの組織及び部分から分離することができる。ヒトのＭＳＣは、培地中でゆっくりと増殖し、細胞の老化が進行し、増殖及び細胞通過の際に、「幹細胞様」の性質を失う傾向にある。ヒトのＭＳＣ（ｈＭＳＣ）集団は、通常、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ４４、Ｓｔｒｏ−１を含む多くの細胞表面マーカーを発現し、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＣＤ３１を含む造血及び内皮細胞系列マーカーを発現しない。これらのマーカーの多くは、骨髄からのコロニー形成前駆細胞集団を濃縮するための使用に成功してきた。骨髄間室細胞のサブセットのみがコロニー形成性及び多分化能であり、それ故、真のＭＳＣとして同定され得る。コロニー形成性及び多分化能ＭＳＣは、コロニー形成単位−繊維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）アッセイを用いて古典的に同定されてきた。貯蔵した時、又は骨髄間室細胞を低密度で培養した時に、単一の細胞−拡張コロニーを形成する。コロニー形成単位の頻度（ＣＦＵ−Ｆｓ）は、骨髄間室細胞集団から分離された、コロニー形成性及び多分化能ＭＳＣの出現率を用いて直接関連づけられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書において、間充織幹細胞（ＭＳＣ）の集団を被験者から分離する方法が提供される。この方法は、被験者からＭＳＣを含む生物学的試料を得る工程、及び生物学的試料からＮｏｔｃｈ２受容体を発現するＭＳＣを選択し、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を得る工程を含む。また、本発明は、Ｎｏｔｃｈ２受容体を発現するＭＳＣ（Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣ）の相対的に純粋な集団を提供する。
【０００５】
本発明において、Ｎｏｔｃｈシグナル経路の活性化剤の存在下に、ＭＳＣを培養する工程を含む、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を培養する方法が提供される。また、本発明は、間葉細胞系列における欠陥又は異常と関連する疾患を患っている被験者を治療する方法を提供する。この治療法は、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を被験者に投与することを含む。
【０００６】
１つ以上の実施形態の詳細を、添付図面及び以下の詳細な説明に示す。他の特徴、目的及び利点は、詳細な説明及び図面、並びに請求項から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａは、胎生１１．５日齢のマウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＮｏｔｃｈリガンド、Ｊａｇ１、Ｄｌｌ１、及びＤｌｌ４の相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ｂは、胎生１１．５日齢マウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＮｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ１−３の相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ｃは、胎生１１．５日齢マウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＲＢＰｊκ−依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子Ｈｅｓ１、Ｈｅｙ１及びＨｅｙＬの相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ａ〜１ＣのグラフのＹ−軸は、β−アクチンに対して標準化した相対的遺伝子発現を示し、任意の単位を表す。ｈｒ、時間：ｄ、日。図１Ｄ１〜１Ｄ８は、Ｊａｇ１（図１Ｄ１）、Ｄｌｌ１（図１Ｄ２）、Ｄｌｌ４（図１Ｄ３）、Ｎｏｔｃｈ１（図１Ｄ４）、Ｎｏｔｃｈ２（図１Ｄ５）、Ｎｏｔｃｈ３（図１Ｄ６）、Ｈｅｓ１（図１Ｄ７）及びＨｅｙ１（図１Ｄ８）について胎生１１．５日齢マウス胎児からの肢芽ＭＳＣ内でのインサイチューハイブリダイゼーション発現分析を示す顕微鏡写真である。図１Ｄ９及び１Ｄ１０は、Ｎｏｔｃｈ２（図１Ｄ９）及びＨｅｓ１（図１Ｄ１０）について胎生１２．０日齢マウス胎児からの肢芽ＭＳＣ内でのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション発現分析を示す顕微鏡写真である。血管の流路のブラックボックスのアウトライン領域を挿入図に示す。挿入図は、血液細胞を含む血管の高拡大図、並びにＮ１及びＤｌｌ４について周囲の内皮細胞内での遺伝子発現を示す。図１Ｅは、ＤＡＰＴの存在下若しくは非存在下で培養した肢芽誘導ＭＳＣ（ＬＢ−ＭＳＣ）、又は全肢芽（ＷＬＢ）組織由来の、活性型の切断されたＮｏｔｃｈ２タンパク質（ＮＩＣＤ２）のウェスタンブロット分析の画像である。
【図１Ｂ】図１Ａは、胎生１１．５日齢のマウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＮｏｔｃｈリガンド、Ｊａｇ１、Ｄｌｌ１、及びＤｌｌ４の相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ｂは、胎生１１．５日齢マウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＮｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ１−３の相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ｃは、胎生１１．５日齢マウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＲＢＰｊκ−依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子Ｈｅｓ１、Ｈｅｙ１及びＨｅｙＬの相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ａ〜１ＣのグラフのＹ−軸は、β−アクチンに対して標準化した相対的遺伝子発現を示し、任意の単位を表す。ｈｒ、時間：ｄ、日。図１Ｄ１〜１Ｄ８は、Ｊａｇ１（図１Ｄ１）、Ｄｌｌ１（図１Ｄ２）、Ｄｌｌ４（図１Ｄ３）、Ｎｏｔｃｈ１（図１Ｄ４）、Ｎｏｔｃｈ２（図１Ｄ５）、Ｎｏｔｃｈ３（図１Ｄ６）、Ｈｅｓ１（図１Ｄ７）及びＨｅｙ１（図１Ｄ８）について胎生１１．５日齢マウス胎児からの肢芽ＭＳＣ内でのインサイチューハイブリダイゼーション発現分析を示す顕微鏡写真である。図１Ｄ９及び１Ｄ１０は、Ｎｏｔｃｈ２（図１Ｄ９）及びＨｅｓ１（図１Ｄ１０）について胎生１２．０日齢マウス胎児からの肢芽ＭＳＣ内でのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション発現分析を示す顕微鏡写真である。血管の流路のブラックボックスのアウトライン領域を挿入図に示す。挿入図は、血液細胞を含む血管の高拡大図、並びにＮ１及びＤｌｌ４について周囲の内皮細胞内での遺伝子発現を示す。図１Ｅは、ＤＡＰＴの存在下若しくは非存在下で培養した肢芽誘導ＭＳＣ（ＬＢ−ＭＳＣ）、又は全肢芽（ＷＬＢ）組織由来の、活性型の切断されたＮｏｔｃｈ２タンパク質（ＮＩＣＤ２）のウェスタンブロット分析の画像である。
【図１Ｃ】図１Ａは、胎生１１．５日齢のマウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＮｏｔｃｈリガンド、Ｊａｇ１、Ｄｌｌ１、及びＤｌｌ４の相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ｂは、胎生１１．５日齢マウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＮｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ１−３の相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ｃは、胎生１１．５日齢マウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＲＢＰｊκ−依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子Ｈｅｓ１、Ｈｅｙ１及びＨｅｙＬの相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ａ〜１ＣのグラフのＹ−軸は、β−アクチンに対して標準化した相対的遺伝子発現を示し、任意の単位を表す。ｈｒ、時間：ｄ、日。図１Ｄ１〜１Ｄ８は、Ｊａｇ１（図１Ｄ１）、Ｄｌｌ１（図１Ｄ２）、Ｄｌｌ４（図１Ｄ３）、Ｎｏｔｃｈ１（図１Ｄ４）、Ｎｏｔｃｈ２（図１Ｄ５）、Ｎｏｔｃｈ３（図１Ｄ６）、Ｈｅｓ１（図１Ｄ７）及びＨｅｙ１（図１Ｄ８）について胎生１１．５日齢マウス胎児からの肢芽ＭＳＣ内でのインサイチューハイブリダイゼーション発現分析を示す顕微鏡写真である。図１Ｄ９及び１Ｄ１０は、Ｎｏｔｃｈ２（図１Ｄ９）及びＨｅｓ１（図１Ｄ１０）について胎生１２．０日齢マウス胎児からの肢芽ＭＳＣ内でのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション発現分析を示す顕微鏡写真である。血管の流路のブラックボックスのアウトライン領域を挿入図に示す。挿入図は、血液細胞を含む血管の高拡大図、並びにＮ１及びＤｌｌ４について周囲の内皮細胞内での遺伝子発現を示す。図１Ｅは、ＤＡＰＴの存在下若しくは非存在下で培養した肢芽誘導ＭＳＣ（ＬＢ−ＭＳＣ）、又は全肢芽（ＷＬＢ）組織由来の、活性型の切断されたＮｏｔｃｈ２タンパク質（ＮＩＣＤ２）のウェスタンブロット分析の画像である。
【図１Ｄ】図１Ａは、胎生１１．５日齢のマウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＮｏｔｃｈリガンド、Ｊａｇ１、Ｄｌｌ１、及びＤｌｌ４の相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ｂは、胎生１１．５日齢マウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＮｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ１−３の相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ｃは、胎生１１．５日齢マウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＲＢＰｊκ−依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子Ｈｅｓ１、Ｈｅｙ１及びＨｅｙＬの相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ａ〜１ＣのグラフのＹ−軸は、β−アクチンに対して標準化した相対的遺伝子発現を示し、任意の単位を表す。ｈｒ、時間：ｄ、日。図１Ｄ１〜１Ｄ８は、Ｊａｇ１（図１Ｄ１）、Ｄｌｌ１（図１Ｄ２）、Ｄｌｌ４（図１Ｄ３）、Ｎｏｔｃｈ１（図１Ｄ４）、Ｎｏｔｃｈ２（図１Ｄ５）、Ｎｏｔｃｈ３（図１Ｄ６）、Ｈｅｓ１（図１Ｄ７）及びＨｅｙ１（図１Ｄ８）について胎生１１．５日齢マウス胎児からの肢芽ＭＳＣ内でのインサイチューハイブリダイゼーション発現分析を示す顕微鏡写真である。図１Ｄ９及び１Ｄ１０は、Ｎｏｔｃｈ２（図１Ｄ９）及びＨｅｓ１（図１Ｄ１０）について胎生１２．０日齢マウス胎児からの肢芽ＭＳＣ内でのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション発現分析を示す顕微鏡写真である。血管の流路のブラックボックスのアウトライン領域を挿入図に示す。挿入図は、血液細胞を含む血管の高拡大図、並びにＮ１及びＤｌｌ４について周囲の内皮細胞内での遺伝子発現を示す。図１Ｅは、ＤＡＰＴの存在下若しくは非存在下で培養した肢芽誘導ＭＳＣ（ＬＢ−ＭＳＣ）、又は全肢芽（ＷＬＢ）組織由来の、活性型の切断されたＮｏｔｃｈ２タンパク質（ＮＩＣＤ２）のウェスタンブロット分析の画像である。
【図１Ｅ】図１Ａは、胎生１１．５日齢のマウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＮｏｔｃｈリガンド、Ｊａｇ１、Ｄｌｌ１、及びＤｌｌ４の相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ｂは、胎生１１．５日齢マウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＮｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ１−３の相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ｃは、胎生１１．５日齢マウス胎児から分離し、６時間、３日間又は７日間培養した肢芽ＭＳＣ内のＲＢＰｊκ−依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子Ｈｅｓ１、Ｈｅｙ１及びＨｅｙＬの相対的遺伝子発現として発現するリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。図１Ａ〜１ＣのグラフのＹ−軸は、β−アクチンに対して標準化した相対的遺伝子発現を示し、任意の単位を表す。ｈｒ、時間：ｄ、日。図１Ｄ１〜１Ｄ８は、Ｊａｇ１（図１Ｄ１）、Ｄｌｌ１（図１Ｄ２）、Ｄｌｌ４（図１Ｄ３）、Ｎｏｔｃｈ１（図１Ｄ４）、Ｎｏｔｃｈ２（図１Ｄ５）、Ｎｏｔｃｈ３（図１Ｄ６）、Ｈｅｓ１（図１Ｄ７）及びＨｅｙ１（図１Ｄ８）について胎生１１．５日齢マウス胎児からの肢芽ＭＳＣ内でのインサイチューハイブリダイゼーション発現分析を示す顕微鏡写真である。図１Ｄ９及び１Ｄ１０は、Ｎｏｔｃｈ２（図１Ｄ９）及びＨｅｓ１（図１Ｄ１０）について胎生１２．０日齢マウス胎児からの肢芽ＭＳＣ内でのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション発現分析を示す顕微鏡写真である。血管の流路のブラックボックスのアウトライン領域を挿入図に示す。挿入図は、血液細胞を含む血管の高拡大図、並びにＮ１及びＤｌｌ４について周囲の内皮細胞内での遺伝子発現を示す。図１Ｅは、ＤＡＰＴの存在下若しくは非存在下で培養した肢芽誘導ＭＳＣ（ＬＢ−ＭＳＣ）、又は全肢芽（ＷＬＢ）組織由来の、活性型の切断されたＮｏｔｃｈ２タンパク質（ＮＩＣＤ２）のウェスタンブロット分析の画像である。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、ＤＡＰＴで仲介されるＮｏｔｃｈの阻害が、細胞系列の決定を偏らせることなく、肢芽ＭＳＣ分化を促進することを示す画像及びグラフである。具体的には、図２Ａ〜２Ｃは、肢芽ＭＳＣ培養、それに続く、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＤＡＰＴ（１μＭ）又は媒体による連続処理の染色及び分析を示す。図２Ａは、微量の肢芽ＭＳＣ軟骨結節のアルシアンブルー染色の顕微鏡写真、並びに初期の軟骨形成マーカー、Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１及びＡｇｃ１のＲＴ−ＰＣＲ発現レベルのグラフを示す。図２Ｂは、肢芽ＭＳＣ骨形成単層培養物のアルカリホスファターゼ染色の顕微鏡写真、並びに骨形成マーカー、Ｃｏｌｌａ１、ＡＰ及びＯｃのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現レベルの画像を示す。図２Ｃは、肢芽ＭＳＣ脂肪細胞形成単層培養物のオイルレッド−Ｏ染色の顕微鏡写真、並びに脂肪細胞形成マーカー、ＰｐａｒγのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現レベルのグラフを示す。グラフのＹ−軸は、βアクチン及び対照に対して標準化した相対的遺伝子発現を示す。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）ｈｒ、時間：ｄ、日。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、ＤＡＰＴで仲介されるＮｏｔｃｈの阻害が、細胞系列の決定を偏らせることなく、肢芽ＭＳＣ分化を促進することを示す画像及びグラフである。具体的には、図２Ａ〜２Ｃは、肢芽ＭＳＣ培養、それに続く、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＤＡＰＴ（１μＭ）又は媒体による連続処理の染色及び分析を示す。図２Ａは、微量の肢芽ＭＳＣ軟骨結節のアルシアンブルー染色の顕微鏡写真、並びに初期の軟骨形成マーカー、Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１及びＡｇｃ１のＲＴ−ＰＣＲ発現レベルのグラフを示す。図２Ｂは、肢芽ＭＳＣ骨形成単層培養物のアルカリホスファターゼ染色の顕微鏡写真、並びに骨形成マーカー、Ｃｏｌｌａ１、ＡＰ及びＯｃのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現レベルの画像を示す。図２Ｃは、肢芽ＭＳＣ脂肪細胞形成単層培養物のオイルレッド−Ｏ染色の顕微鏡写真、並びに脂肪細胞形成マーカー、ＰｐａｒγのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現レベルのグラフを示す。グラフのＹ−軸は、βアクチン及び対照に対して標準化した相対的遺伝子発現を示す。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）ｈｒ、時間：ｄ、日。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、ＤＡＰＴで仲介されるＮｏｔｃｈの阻害が、細胞系列の決定を偏らせることなく、肢芽ＭＳＣ分化を促進することを示す画像及びグラフである。具体的には、図２Ａ〜２Ｃは、肢芽ＭＳＣ培養、それに続く、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＤＡＰＴ（１μＭ）又は媒体による連続処理の染色及び分析を示す。図２Ａは、微量の肢芽ＭＳＣ軟骨結節のアルシアンブルー染色の顕微鏡写真、並びに初期の軟骨形成マーカー、Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１及びＡｇｃ１のＲＴ−ＰＣＲ発現レベルのグラフを示す。図２Ｂは、肢芽ＭＳＣ骨形成単層培養物のアルカリホスファターゼ染色の顕微鏡写真、並びに骨形成マーカー、Ｃｏｌｌａ１、ＡＰ及びＯｃのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現レベルの画像を示す。図２Ｃは、肢芽ＭＳＣ脂肪細胞形成単層培養物のオイルレッド−Ｏ染色の顕微鏡写真、並びに脂肪細胞形成マーカー、ＰｐａｒγのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現レベルのグラフを示す。グラフのＹ−軸は、βアクチン及び対照に対して標準化した相対的遺伝子発現を示す。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）ｈｒ、時間：ｄ、日。
【図３Ａ】図３Ａ１〜３Ａ８は、インビボにおけるＲＢＰｊκ−依存性Ｎｏｔｃｈシグナルが四肢発生の際に軟骨形成を加速することを示す画像を示し、図３Ｂはグラフを示す。図３Ａ１及び３Ａ２は、野生型（ＷＴ）及びＰｒｘ１Ｃｒｅ／Ｒｂｐｊκｆ／ｆ  （ＲＢＰｊκ）胎生１２．５日齢後肢のアルシアンブルー染色を示す。図３Ａ３〜３Ａ８は、軟骨形成マーカー遺伝子Ｓｏｘ９（図３Ａ３及び３Ａ４）、Ｃｏｌ２ａ１（図３Ａ５及び３Ａ６）及びＡｇｃ１（図３Ａ７及び３Ａ８）のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション遺伝子発現分析を示す。図３Ｂは、ＷＴ及びＲＢＰｊκ変異体胎生１２．５日齢後肢の全肢芽からのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現のグラフを示す。グラフのＹ−軸は、β−アクチン及びＷＴ対照に対して標準化した相対的遺伝子発現を示す。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）
【図３Ｂ】図３Ａ１〜３Ａ８は、インビボにおけるＲＢＰｊκ−依存性Ｎｏｔｃｈシグナルが四肢発生の際に軟骨形成を加速することを示す画像を示し、図３Ｂはグラフを示す。図３Ａ１及び３Ａ２は、野生型（ＷＴ）及びＰｒｘ１Ｃｒｅ／Ｒｂｐｊκｆ／ｆ  （ＲＢＰｊκ）胎生１２．５日齢後肢のアルシアンブルー染色を示す。図３Ａ３〜３Ａ８は、軟骨形成マーカー遺伝子Ｓｏｘ９（図３Ａ３及び３Ａ４）、Ｃｏｌ２ａ１（図３Ａ５及び３Ａ６）及びＡｇｃ１（図３Ａ７及び３Ａ８）のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション遺伝子発現分析を示す。図３Ｂは、ＷＴ及びＲＢＰｊκ変異体胎生１２．５日齢後肢の全肢芽からのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現のグラフを示す。グラフのＹ−軸は、β−アクチン及びＷＴ対照に対して標準化した相対的遺伝子発現を示す。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）
【図４Ａ】図４Ａ１〜４Ａ６及び４Ｂ１〜４Ｂ１０は、骨格の発達の際のＭＳＣ分化を抑制するＮｏｔｃｈシグナルの持続的活性化を示す画像を示し、図４Ｃはグラフを示す。図４Ａ１〜４Ａ６は、野生型（ＷＴ）及びＰｒｘ１Ｃｒｅ／Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋（ＮＩＣＤ）変異体胎生１８．５日の全骨格（図４Ａ１及び４Ａ２）、前肢（図４Ａ３及び４Ａ４）、及び後肢（図４Ａ５及び４Ａ６）のアルシアンブルー／アリザリンレッド染色を示す。黒い矢印は、ＮＩＣＤ変異前肢及び後肢を示す。図４Ｂ１及び４Ｂ２は、胎生１２．５日におけるＷＴ及びＮＩＣＤ後肢のアルシアンブルー染色を示す。図４Ｂ３〜４Ｂ８は、骨形成マーカー遺伝子Ｓｏｘ９（図４Ｂ３及び４Ｂ４）、Ｃｏｌ２ａ１（図４Ｂ５及び４Ｂ６）及びＡｇｃ１（図４Ｂ７及び４Ｂ８）のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション遺伝子発現レベルを示す。図４Ｂ９及び４Ｂ１０は、ＷＴ（図４Ｂ９）及びＮＩＣＤ変異体（図４Ｂ１０）後肢におけるＮＩＣＤ発現及び活性を評価するために記録されたＧｆｐ発現を示す。図４Ｃは、骨形成マーカー、Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、Ａｇｃ１及びＲｕｎｘ２、並びにＲＢＰＪκ−依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子Ｈｅｓ１、Ｈｅｙ１及びＨｅｙＬについての全肢芽からのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現のグラフを示す。グラフのＹ−軸は、β−アクチン及びＷＴ対照に対して標準化した相対的遺伝子発現を示す。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）。ｄ、桁；ｒ、半径；ｕ、尺骨；ｈ、上腕；ｓ、肩甲骨；ｔ、脛骨；ｆｉ、排骨；ｆｅ、大腿骨；ｉｌ、イリウム；ｐｕ、恥骨。
【図４Ｂ】図４Ａ１〜４Ａ６及び４Ｂ１〜４Ｂ１０は、骨格の発達の際のＭＳＣ分化を抑制するＮｏｔｃｈシグナルの持続的活性化を示す画像を示し、図４Ｃはグラフを示す。図４Ａ１〜４Ａ６は、野生型（ＷＴ）及びＰｒｘ１Ｃｒｅ／Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋（ＮＩＣＤ）変異体胎生１８．５日の全骨格（図４Ａ１及び４Ａ２）、前肢（図４Ａ３及び４Ａ４）、及び後肢（図４Ａ５及び４Ａ６）のアルシアンブルー／アリザリンレッド染色を示す。黒い矢印は、ＮＩＣＤ変異前肢及び後肢を示す。図４Ｂ１及び４Ｂ２は、胎生１２．５日におけるＷＴ及びＮＩＣＤ後肢のアルシアンブルー染色を示す。図４Ｂ３〜４Ｂ８は、骨形成マーカー遺伝子Ｓｏｘ９（図４Ｂ３及び４Ｂ４）、Ｃｏｌ２ａ１（図４Ｂ５及び４Ｂ６）及びＡｇｃ１（図４Ｂ７及び４Ｂ８）のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション遺伝子発現レベルを示す。図４Ｂ９及び４Ｂ１０は、ＷＴ（図４Ｂ９）及びＮＩＣＤ変異体（図４Ｂ１０）後肢におけるＮＩＣＤ発現及び活性を評価するために記録されたＧｆｐ発現を示す。図４Ｃは、骨形成マーカー、Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、Ａｇｃ１及びＲｕｎｘ２、並びにＲＢＰＪκ−依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子Ｈｅｓ１、Ｈｅｙ１及びＨｅｙＬについての全肢芽からのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現のグラフを示す。グラフのＹ−軸は、β−アクチン及びＷＴ対照に対して標準化した相対的遺伝子発現を示す。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）。ｄ、桁；ｒ、半径；ｕ、尺骨；ｈ、上腕；ｓ、肩甲骨；ｔ、脛骨；ｆｉ、排骨；ｆｅ、大腿骨；ｉｌ、イリウム；ｐｕ、恥骨。
【図４Ｃ】図４Ａ１〜４Ａ６及び４Ｂ１〜４Ｂ１０は、骨格の発達の際のＭＳＣ分化を抑制するＮｏｔｃｈシグナルの持続的活性化を示す画像を示し、図４Ｃはグラフを示す。図４Ａ１〜４Ａ６は、野生型（ＷＴ）及びＰｒｘ１Ｃｒｅ／Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋（ＮＩＣＤ）変異体胎生１８．５日の全骨格（図４Ａ１及び４Ａ２）、前肢（図４Ａ３及び４Ａ４）、及び後肢（図４Ａ５及び４Ａ６）のアルシアンブルー／アリザリンレッド染色を示す。黒い矢印は、ＮＩＣＤ変異前肢及び後肢を示す。図４Ｂ１及び４Ｂ２は、胎生１２．５日におけるＷＴ及びＮＩＣＤ後肢のアルシアンブルー染色を示す。図４Ｂ３〜４Ｂ８は、骨形成マーカー遺伝子Ｓｏｘ９（図４Ｂ３及び４Ｂ４）、Ｃｏｌ２ａ１（図４Ｂ５及び４Ｂ６）及びＡｇｃ１（図４Ｂ７及び４Ｂ８）のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション遺伝子発現レベルを示す。図４Ｂ９及び４Ｂ１０は、ＷＴ（図４Ｂ９）及びＮＩＣＤ変異体（図４Ｂ１０）後肢におけるＮＩＣＤ発現及び活性を評価するために記録されたＧｆｐ発現を示す。図４Ｃは、骨形成マーカー、Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、Ａｇｃ１及びＲｕｎｘ２、並びにＲＢＰＪκ−依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子Ｈｅｓ１、Ｈｅｙ１及びＨｅｙＬについての全肢芽からのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現のグラフを示す。グラフのＹ−軸は、β−アクチン及びＷＴ対照に対して標準化した相対的遺伝子発現を示す。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）。ｄ、桁；ｒ、半径；ｕ、尺骨；ｈ、上腕；ｓ、肩甲骨；ｔ、脛骨；ｆｉ、排骨；ｆｅ、大腿骨；ｉｌ、イリウム；ｐｕ、恥骨。
【図５Ａ】図５Ａ１〜５Ａ６及び５Ｃ１〜５Ｃ２は、肢間充織内のＮｏｔｃｈシグナルの持続する活性化が、肢の様式又はアポトーシスに著しく影響しないが、肢の発達の際にＭＳＣの増殖を増大させることを示す画像であり、図５Ｂ及び５Ｃ３〜５Ｃ４はグラフを示す。図５Ａ１〜５Ａ６は、胎生１１．０日における野生型（ＷＴ）（図５Ａ１、５Ａ３及び５Ａ５）及びＰｒｘ１Ｃｒｅ／Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋変異体（ＮＩＣＤ）（図５Ａ２、５Ａ４及び５Ａ６）肢芽のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を示す。肢芽増殖及びパターニン形成マーカー：Ｆｇｆ８（図５Ａ１及び５Ａ２）、Ｆｇｆ１０（図５Ａ３及び５Ａ４）、及びＰｔｃ１（図５Ａ５及び５Ａ６）について遺伝子発現パターンを分析した。図５Ｂは、胎生１１．０日において、ＷＴ及びＮＩＣＤ変異体について実施したＭＳＣアポトーシスの蛍光ＴＵＮＥＬ染色及び統計分析を示す。胎生１１．５日において、ＷＴ（図５Ｃ１）及びＮＣＩＤ変異体（図５Ｃ２）についてＭＳＣ増殖ののＢｒｄＵ免疫組織学（図５Ｃ１及び５Ｃ２）及び統計分析（図５Ｃ３）を実施した。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）。ＡＺ、頂端領域。破線を引いた部分は、ＭＳＣ増殖について分析した領域を示す。図５Ｃ４は、ＮＩＣＤ変異体及び対照肢芽に由来するＲＮＡを用いた、Ｅ１１．５におけるｃｙｃｌｉｎＤ１のＲＴ−ＰＣＲレベルを示す。
【図５Ｂ】図５Ａ１〜５Ａ６及び５Ｃ１〜５Ｃ２は、肢間充織内のＮｏｔｃｈシグナルの持続する活性化が、肢の様式又はアポトーシスに著しく影響しないが、肢の発達の際にＭＳＣの増殖を増大させることを示す画像であり、図５Ｂ及び５Ｃ３〜５Ｃ４はグラフを示す。図５Ａ１〜５Ａ６は、胎生１１．０日における野生型（ＷＴ）（図５Ａ１、５Ａ３及び５Ａ５）及びＰｒｘ１Ｃｒｅ／Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋変異体（ＮＩＣＤ）（図５Ａ２、５Ａ４及び５Ａ６）肢芽のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を示す。肢芽増殖及びパターニン形成マーカー：Ｆｇｆ８（図５Ａ１及び５Ａ２）、Ｆｇｆ１０（図５Ａ３及び５Ａ４）、及びＰｔｃ１（図５Ａ５及び５Ａ６）について遺伝子発現パターンを分析した。図５Ｂは、胎生１１．０日において、ＷＴ及びＮＩＣＤ変異体について実施したＭＳＣアポトーシスの蛍光ＴＵＮＥＬ染色及び統計分析を示す。胎生１１．５日において、ＷＴ（図５Ｃ１）及びＮＣＩＤ変異体（図５Ｃ２）についてＭＳＣ増殖ののＢｒｄＵ免疫組織学（図５Ｃ１及び５Ｃ２）及び統計分析（図５Ｃ３）を実施した。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）。ＡＺ、頂端領域。破線を引いた部分は、ＭＳＣ増殖について分析した領域を示す。図５Ｃ４は、ＮＩＣＤ変異体及び対照肢芽に由来するＲＮＡを用いた、Ｅ１１．５におけるｃｙｃｌｉｎＤ１のＲＴ−ＰＣＲレベルを示す。
【図５Ｃ】図５Ａ１〜５Ａ６及び５Ｃ１〜５Ｃ２は、肢間充織内のＮｏｔｃｈシグナルの持続する活性化が、肢の様式又はアポトーシスに著しく影響しないが、肢の発達の際にＭＳＣの増殖を増大させることを示す画像であり、図５Ｂ及び５Ｃ３〜５Ｃ４はグラフを示す。図５Ａ１〜５Ａ６は、胎生１１．０日における野生型（ＷＴ）（図５Ａ１、５Ａ３及び５Ａ５）及びＰｒｘ１Ｃｒｅ／Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋変異体（ＮＩＣＤ）（図５Ａ２、５Ａ４及び５Ａ６）肢芽のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を示す。肢芽増殖及びパターニン形成マーカー：Ｆｇｆ８（図５Ａ１及び５Ａ２）、Ｆｇｆ１０（図５Ａ３及び５Ａ４）、及びＰｔｃ１（図５Ａ５及び５Ａ６）について遺伝子発現パターンを分析した。図５Ｂは、胎生１１．０日において、ＷＴ及びＮＩＣＤ変異体について実施したＭＳＣアポトーシスの蛍光ＴＵＮＥＬ染色及び統計分析を示す。胎生１１．５日において、ＷＴ（図５Ｃ１）及びＮＣＩＤ変異体（図５Ｃ２）についてＭＳＣ増殖ののＢｒｄＵ免疫組織学（図５Ｃ１及び５Ｃ２）及び統計分析（図５Ｃ３）を実施した。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）。ＡＺ、頂端領域。破線を引いた部分は、ＭＳＣ増殖について分析した領域を示す。図５Ｃ４は、ＮＩＣＤ変異体及び対照肢芽に由来するＲＮＡを用いた、Ｅ１１．５におけるｃｙｃｌｉｎＤ１のＲＴ−ＰＣＲレベルを示す。
【図６Ａ】図６Ａ１〜６Ａ４及び６Ｂ１〜６Ｂ１５は、Ｎｏｔｃｈシグナルが、ＲＢＰ−Ｊκ−依存様式でＭＳＣの分化を抑制することを示す画像である。図６Ａ１〜６Ａ４は、野生型（ＷＴ）、Ｐｒｘ１Ｃｒｅ／Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋（ＮＩＣＤ）、Ｐｒｘ１Ｃｒｅ／Ｒｂｐｊκｆ／ｆ（ＲＢＰｊκ）、及び、Ｐｒｘ１Ｃｒｅｆ／Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋／Ｒｂｐｊκｆ／ｆ  （ＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκ）変異体胎生１８．５日の全骨格のアルシアンブルー／アリザリンレッド染色を示す。黒い矢印は、ＮＩＣＤ変異前肢及び後肢を示す。灰色の矢印は、ＷＴ、ＲＢＰｊκ、及びＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκの脛骨の長さを示す。図６Ｂ１〜６Ｂ３は、胎生１２．５日における、ＷＴ、ＮＩＣＤ及びＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκ同腹子の後肢のアルシアンブルー染色を示す（Ｂ１〜Ｂ３）。図６Ｂ４〜６Ｂ１２は、軟骨形成マーカー遺伝子Ｓｏｘ９（図６Ｂ４〜６Ｂ６）、Ｃｏｌ２ａ１（図６Ｂ７−６Ｂ９）、及びＡｇｃ１（図６Ｂ１０〜６Ｂ１２）のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション遺伝子発現分析を示す。図６Ｂ１３〜６Ｂ１５は、ＷＴ（図６Ｂ１３）、ＮＩＣＤ変異体（図６Ｂ１４）、及びＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκｒｅｓｃｕｅ（図６Ｂ１５）の後肢部分におけるＮＩＣＤ発現及び活性を評価するために記録されたＧｆｐ発現を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ１〜６Ａ４及び６Ｂ１〜６Ｂ１５は、Ｎｏｔｃｈシグナルが、ＲＢＰ−Ｊκ−依存様式でＭＳＣの分化を抑制することを示す画像である。図６Ａ１〜６Ａ４は、野生型（ＷＴ）、Ｐｒｘ１Ｃｒｅ／Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋（ＮＩＣＤ）、Ｐｒｘ１Ｃｒｅ／Ｒｂｐｊκｆ／ｆ（ＲＢＰｊκ）、及び、Ｐｒｘ１Ｃｒｅｆ／Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋／Ｒｂｐｊκｆ／ｆ  （ＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκ）変異体胎生１８．５日の全骨格のアルシアンブルー／アリザリンレッド染色を示す。黒い矢印は、ＮＩＣＤ変異前肢及び後肢を示す。灰色の矢印は、ＷＴ、ＲＢＰｊκ、及びＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκの脛骨の長さを示す。図６Ｂ１〜６Ｂ３は、胎生１２．５日における、ＷＴ、ＮＩＣＤ及びＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκ同腹子の後肢のアルシアンブルー染色を示す（Ｂ１〜Ｂ３）。図６Ｂ４〜６Ｂ１２は、軟骨形成マーカー遺伝子Ｓｏｘ９（図６Ｂ４〜６Ｂ６）、Ｃｏｌ２ａ１（図６Ｂ７−６Ｂ９）、及びＡｇｃ１（図６Ｂ１０〜６Ｂ１２）のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション遺伝子発現分析を示す。図６Ｂ１３〜６Ｂ１５は、ＷＴ（図６Ｂ１３）、ＮＩＣＤ変異体（図６Ｂ１４）、及びＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκｒｅｓｃｕｅ（図６Ｂ１５）の後肢部分におけるＮＩＣＤ発現及び活性を評価するために記録されたＧｆｐ発現を示す。
【図７Ａ】図７Ａ１〜７Ａ６は、Ｈｅｓ１が、ＭＳＣの分化及び軟骨形成を制御する、ＲＢＰｊκ−依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子であることを示す画像を、図７Ｂはグラフを示す。図７Ａ１〜７Ａ６は、微量で３、４又は７日間培養した、感染した対照（図７Ａ１、７Ａ３及び７Ａ５）及び感染したＨｅｓ１  ｓｈＲＮＡ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ（ｓｈＨｅｓ１）（図７Ａ２、７Ａ４及び７Ａ６）の肢芽ＭＳＣ細胞のアルシアンブルー染色を示す。図７Ｂは、インビトロにおける軟骨形成、それに続くＨｅｓ１のノックダウンの際の軟骨形成マーカーＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、Ａｇｃ１についてのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。グラフのＹ−軸は、３日における、βアクチン及び対照に対して標準化した相対的遺伝子発現を示す。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）ｄ、日。
【図７Ｂ】図７Ａ１〜７Ａ６は、Ｈｅｓ１が、ＭＳＣの分化及び軟骨形成を制御する、ＲＢＰｊκ−依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子であることを示す画像を、図７Ｂはグラフを示す。図７Ａ１〜７Ａ６は、微量で３、４又は７日間培養した、感染した対照（図７Ａ１、７Ａ３及び７Ａ５）及び感染したＨｅｓ１  ｓｈＲＮＡ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ（ｓｈＨｅｓ１）（図７Ａ２、７Ａ４及び７Ａ６）の肢芽ＭＳＣ細胞のアルシアンブルー染色を示す。図７Ｂは、インビトロにおける軟骨形成、それに続くＨｅｓ１のノックダウンの際の軟骨形成マーカーＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、Ａｇｃ１についてのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。グラフのＹ−軸は、３日における、βアクチン及び対照に対して標準化した相対的遺伝子発現を示す。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）ｄ、日。
【図８】図８は、ＷＴ及びＮＩＣＤ変異体の肢間充織からの胎生１１．５日齢の切片におけるアポトーシス細胞の数値を示すグラフである。活性化カスパーゼ−３免疫組織学を用い、データは、肢間充織中のＮｏｔｃｈシグナルの持続的活性化がＭＳＣアポトーシスに影響しないことを示す。
【図９−１】図９Ａ１〜９Ａ６及び９Ｂ１〜９Ｂ６は、Ｈｅｓ１が軟骨形成のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２モデルにおけるＭＳＣ分化の重要な調節因子である画像を示し、図９Ｃ及び９Ｄはグラフを示す。図９Ａ１〜９Ａ６及び９Ｂ１〜９Ｂ６は、小塊で５、１０又は１４日培養した、対照で感染した（図９Ａ１、９Ａ３及び９Ａ５）、Ｈｅｓ１  ｓｈＲＮＡで感染した（ｓｈＨｅｓ１）（図９Ａ２、９Ａ４、及び９Ａ６）、対照で形質移入された（図９Ｂ１、９Ｂ３及び９Ｂ５）、及び、Ｈｅｓ１で形質移入された（ＣＭＶ−Ｈｅｓ１）（図９Ｂ２、９Ｂ４、及び９Ｂ６）Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルシアンブルー染色を示す。図９Ｃ及び９Ｄは、インビトロにおける軟骨形成、それに続くＨｅｓ１のノックダウン（図９Ｃ）又はＨｅｓ１の過剰発現（図９Ｄ）の際の軟骨形成マーカーＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、Ａｇｃ１及びＮｏｔｃｈ標的遺伝子、Ｈｅｓ１についてのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。グラフのＹ−軸は、５日における、βアクチン及び対照に対して標準化した相対的遺伝子発現を示す。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）ｄ、日。
【図９−２】図９Ａ１〜９Ａ６及び９Ｂ１〜９Ｂ６は、Ｈｅｓ１が軟骨形成のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２モデルにおけるＭＳＣ分化の重要な調節因子である画像を示し、図９Ｃ及び９Ｄはグラフを示す。図９Ａ１〜９Ａ６及び９Ｂ１〜９Ｂ６は、小塊で５、１０又は１４日培養した、対照で感染した（図９Ａ１、９Ａ３及び９Ａ５）、Ｈｅｓ１  ｓｈＲＮＡで感染した（ｓｈＨｅｓ１）（図９Ａ２、９Ａ４、及び９Ａ６）、対照で形質移入された（図９Ｂ１、９Ｂ３及び９Ｂ５）、及び、Ｈｅｓ１で形質移入された（ＣＭＶ−Ｈｅｓ１）（図９Ｂ２、９Ｂ４、及び９Ｂ６）Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルシアンブルー染色を示す。図９Ｃ及び９Ｄは、インビトロにおける軟骨形成、それに続くＨｅｓ１のノックダウン（図９Ｃ）又はＨｅｓ１の過剰発現（図９Ｄ）の際の軟骨形成マーカーＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、Ａｇｃ１及びＮｏｔｃｈ標的遺伝子、Ｈｅｓ１についてのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。グラフのＹ−軸は、５日における、βアクチン及び対照に対して標準化した相対的遺伝子発現を示す。（＊対照に対し、ｐ＜０．０５）ｄ、日。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、ｈＭＳＣ中で発現するＮｏｔｃｈ分子を示すグラフである。遺伝子発現をベータ−アクチンに対して標準化し、任意の単位で表した。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、多分化能幹細胞マーカー及びｈＭＳＣ増殖の組換えＪａｇｇｅｄ１誘導を示すグラフである。図１１Ａは、Ｎｏｔｃｈ成分、及び継代１（Ｐ１）及び継代１５（Ｐ１５）におけるｈＭＳＣ内での幹細胞多分化能の調節因子についての遺伝子発現レベルを示す。図１１Ｂは、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子、及び対照ＩｇＧ又はＪａｇ１をコーティングしたプレートで培養したｈＭＳＣ内での幹細胞多分化能の調節因子についての遺伝子発現レベルを示す。全ての遺伝子発現をベータ−アクチンに対して標準化し、次いでＰ１対照（図１１Ａ）又はＩｇＧ対照（図１１Ｂ）に対して標準化した。図１１Ｃは、ＩｇＧ対照又はＪａｇ１コーティングプレートにおいて培養したｈＭＳＣの増殖を測定するＢｒｄＵ  ＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図１２】図１２Ａ及びＢは、標準的なｈＭＳＣ培養条件における継代２及び１０に続く、ｈＭＳＣ細胞表面マーカー、ＣＤ１０５（Ａ）、及びＮｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ２（Ｂ）についてのフローサイトメトリーのデータを示す。
【図１３】図１３Ａ〜Ｃは、Ｎｏｔｃｈ２選択的ｈＭＳＣにおける、Ｊａｇ１が介在するＮｏｔｃｈ活性化が、幹細胞調節因子、細胞増殖、及び幹細胞膨張を誘導することを示す。図１３Ａは、Ｊａｇ１コーティングプレートで培養した、全ｈＭＳＣ及びＮｏｔｃｈ選択的ｈＭＳＣ内でのＮｏｔｃｈシグナル分子（Ｎｏｔｃｈ２及びＨｅｓ１）、重要な幹細胞制御分子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇ）、及び細胞増殖のマーカー（ＣｙｃＤ１）についてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現分析を示す。図１３Ｂは、Ｊａｇ１コーティングプレートで培養した、全ｈＭＳＣ、Ｎｏｔｃｈ２陰性ｈＭＳＣ、およびＮｏｔｃｈ２陽性ｈＭＳＣ上で行われたＢｒｄＵ  ＥＬＬＩＳＡアッセイを示す。図１３Ｂは、Ｊａｇ１コーティングプレート上での培養に続いて行われた、全ｈＭＳＣ、Ｎｏｔｃｈ２陰性ｈＭＳＣ、およびＮｏｔｃｈ２陽性ｈＭＳＣ上でのＣＦＵ−Ｆアッセイを示す。
【図１４】図１４Ａ〜Ｄは、Ｎｏｔｃｈ２−選択的ｈＭＳＣが、Ｊａｇ１が介在する維持及び拡張に次ぎ、軟骨形成及び骨形成の向上を示すことを示す。図１４Ａ及びＣは、２又は３週間、軟骨形成又は骨形成条件で培養した後の、全Ｎｏｔｃｈ２−陰性及びＮｏｔｃｈ２−陽性ｈＭＳＣ由来の軟骨形成（Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、及びＡｇｃ１）（Ａ）及び骨形成（Ｃｏｌ１ａ１、Ａｐ、及びＯｃ）（Ｃ）マーカー遺伝子についてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現分析を示す。図１４Ｂは、軟骨形成分化に続く、全Ｎｏｔｃｈ２−陰性及び陽性ｈＭＳＣ（継代２）のアルシアンブルー染色を示す。図１４Ｄは、骨形成分化に続く、Ｎｏｔｃｈ２−陰性及び陽性ｈＭＳＣ（継代２及び５）のＡＰ染色を示す。ｈＭＳＣは、最初にＪａｇ１コーティングプレートで２代継代培養した（３〜４日／継代）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
間充織幹細胞（ＭＳＣ）内におけるＮｏｔｃｈ経路についての作用の正確な役割及び様式を決定するため、組織特異的機能喪失（Ｐｒｘ１Ｃｒｅ；Ｒｂｐｊκｆ／ｆ）、機能獲得（Ｐｒｘ１Ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋）及び遺伝子レスキューマウス（Ｐｒｘ１Ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋；Ｒｂｐｊκｆ／ｆ）を生成し、初期肢発生の際のＭＳＣ増殖及び分化における欠陥について分析した。結果を以下の実施例１に示す。データは、Ｈｅｓ１が、ＭＳＣ内で発現するＨｅｓ／Ｈｅｙファミリーの主要なＲＢＰｊκ−依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子であることを示す。さらに、これらのデータは、ＲＢＰｊκ−依存Ｎｏｔｃｈシグナル経路が、骨格発達の際のＭＳＣの維持及び拡張のために重要であることを示す。したがって、Ｎｏｔｃｈ経路の操作は、ＭＳＣ集団を利用する、骨格修復及び再生医療用途のために、ＭＳＣの分化を維持、拡張及び調節する手段を提供する。ｈＭＳＣのＮｏｔｃｈ活性化の制御は、ｈＭＳＣの維持及び拡張を促進するが、それらの軟骨形成、骨形成及び脂肪細胞形成分化の可能性を維持する。したがって、本明細書に開示されるものは、ＭＳＣの相対的に純粋な集団、及びＭＳＣの分離及び培養方法を開示する。
【０００９】
Ｎｏｔｃｈ２受容体（Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣ）を発現するＭＳＣの相対的に純粋な集団が提供される。本明細書で用いられる場合、相対的に純粋という用語は、Ｎｏｔｃｈ２を発現する集団における、ＭＳＣの少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％を意味する。場合により、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣは、複数の継代を通じて拡張する能力を維持する。Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣは、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１５６、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ１６６、Ｓｔｒｏ−１、ＦＧＦ１０、Ｐｒｘ１、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇからなる群から選択される間充織幹細胞と関連する１つ以上の追加のマーカーを発現する。場合により、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣは、ＣＤ１０５及びＣＤ１５６を発現する。場合により、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４及びＣＤ３１からなる群から選択される造血又は表皮細胞系列と関連する１つ以上のマーカーを発現しない。
【００１０】
Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの比較的に純粋な集団は、非分化培養条件において安定である。本明細書で用いられる場合、非分化培養条件には、分化を促進せずに増殖を促進する培養条件が含まれるが、これに限定されない。例えば、細胞は、ウシ胎児血清、又は分化を起こさない血清を含まない代替物の存在下に、例えばＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ等で維持することができる。
【００１１】
具体的には、被験者からＭＳＣを分離する方法が提供される。この方法は、被験者からＭＳＣを含む生物学的試料を得、生物学的試料からＮｏｔｃｈ２受容体を発現するＭＳＣを選択し、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を得る工程を含む。また、提供される方法により製造されるＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの相対的に純粋な集団が提供される。ＭＳＣは、複数の継代を通じて拡張する能力を維持している。ＭＳＣは、少なくとも約５、１０、１５又は２０回、又は５〜２０回の任意の回数継代することができる。場合により、ＭＳＣは１０回以上継代することができる。例えば、ＭＳＣは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０回継代することができる。
【００１２】
本明細書で用いられる場合、「継代」又は「継代する」は、細胞を継代培養することを意味する。細胞を培養及び継代培養する方法及び材料は公知である。例えば、細胞は、インキュベーター内の、例えば、皿又はプレートのような培地を含む基質上で増殖させられる。継代培養の際、培地を除去し、細胞を洗浄し、次いで、基質から細胞を分離する薬剤を加える。分離した培地を懸濁し、懸濁液内の適切な数の細胞を新しい基質に移し、新しい培地を加え、新しい基質をインキュベーターに入れ、そのサイクルを再度開始する。細胞は、場合により、１００％未満（増殖の対数期）であるが、密集の１０％以上に維持される。細胞は、少なすぎるかあまりに密集すると死滅する。
【００１３】
選択工程は、フローサイトメトリー、磁気ビーズ分離、パニング、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又は親和性クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない種々の方法の任意の１つを用いて実施される。例えば、フローサイトメトリー又はＦＡＣＳは、蛍光強度、並びに細胞のサイズ及び光の散乱のようなその他のパラメータに基づき細胞集団を分離するために用いられることができる。
【００１４】
選択工程は、場合により、Ｎｏｔｃｈ２受容体抗体又は他のＮｏｔｃｈ２受容体リガンドを用いて実施される。場合により、抗体又はリガンドは基質に結合し、例えば、基質は可動式又は固定式の固体支持体であってもよい。場合により、可動式固体支持体は蛍光ビーズである。場合により、固定式固体支持体はカラム又はプレートである。試料を基質と接触させ、Ｎｏｔｃｈ２＋細胞を有する基質をＮｏｔｃｈ２＋細胞を欠く基質から選別するか、試料中の結合ＭＳＣを、例えば競争結合工程によって基質から分離する。蛍光ラベル又は他の標識手段は、ＭＳＣを選別するために用いることができる。ＦＡＣＳのような選別方法を用いて、特に所望の発現プロフィールを有するＭＳＣの種々の集団を選別することができる。
【００１５】
被験者からの試料は、例えば、骨髄、脂肪組織、滑膜、骨膜、軟骨膜、軟骨、歯の組織、胎盤組織、肝臓組織、筋肉組織、肺組織、心臓組織、結合組織、及び脾臓組織からなる群から選択されるＭＳＣ含有試料から選択される。
【００１６】
分離したＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣを、例えば、細胞の生存度を維持する任意の適切な培地内に集める。場合により、培地は、収集容器、例えば、試験管に配置される。種々の培地は市販されており、それを用いてもよく、場合によりウシ胎児血清を追加していてもよい、ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ｄＰＢＳ）、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地、Ｉｓｃｏｖｅ培地等を含むが、これらに限定されない。
【００１７】
また、Ｎｏｔｃｈシグナル経路の活性化剤の存在下に、ＭＳＣを培養する工程を含む、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団の培養法法が提供される。場合により、培養条件は、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団が拡張される条件である。種々の培地が市販されており、ＭＳＣを培養するために用いてもよく、これらは場合によりウシ胎児血清を追加していてもよいＤＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ培地、Ｉｓｃｏｖｅ培地等を含むがこれらに限定されない。
【００１８】
場合により、Ｎｏｔｃｈシグナル経路の活性化剤は、ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １、ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  ３、ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  ４、Ｊａｇｇｅｄ  １、Ｊａｇｇｅｄ  ２、Ｄｌｋ１／Ｐｒｅｆ１、ＤＮＥＲ、Ｃｏｎｔａｃｔｉｎ１（Ｆ３）、Ｃｏｎｔａｃｔｉｎ６（ＮＢ３）、ＣＣＮ３／ＮＯＶ、ＭＡＧＰ１、及びＭＡＧＰ２からなる群から選択される。場合により、Ｎｏｔｃｈシグナル経路の活性化剤は、Ｎｏｔｃｈ受容体の細胞内ドメインである。場合により、Ｎｏｔｃｈ受容体は、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３又はＮｏｔｃｈ４である。Ｎｏｔｃｈシグナル経路の活性化剤は、培養皿に部分的又は完全に固定化していてもよい。また、活性化剤は培地内で可溶性であってもよい。
【００１９】
Ｎｏｔｃｈ活性化は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の切断及び遊離を引き起こすリガンドにより誘導され得る。ＮＩＣＤは核へ転位し、ＲＢＰｊｋと相互作用し、標的遺伝子を活性化する。ＭＳＣ内でのＮｏｔｃｈシグナルは、Ｎｏｔｃｈ  ＩＣＤを直接発現することによっても活性化され得る。Ｎｏｔｃｈ  ＩＣＤの発現は、細胞内でペプチドを発現させる任意の手段を用い、例えば発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）を用いて提供することができる。Ｎｏｔｃｈ  ＩＣＤの発現は一時的であるか、又は安定である。
【００２０】
培養方法は、１つ以上の分化誘導薬の存在下にＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を培養する工程をも含む。Ｎｏｔｃｈの活性化が「停止し」、細胞の分化が可能になる。場合により、１つ以上の分化誘導薬は、軟骨形成、骨形成又は脂肪細胞形成系列への分化を選択的に誘導する。異なる培養条件下でのＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの培養は、所望のタイプの表現型、例えば、脂肪細胞、軟骨細胞等を有する選択細胞を濃縮する培養環境においてＭＳＣを培養又は分化させることにより実施される。したがって、培地は、特定の系列への分化を増大させる薬剤を含んでいてもよい。例えば、軟骨形成分化は、９−グリセロールホスフェート、アスコルビン酸及びレチン酸を含む培地中でＭＳＣを培養することにより増大させることができる（Ｃｏｗａｎら、（２００５）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：６４５−６５８）。脂肪細胞形成分化は、例えば、デキサメタゾン、インドメタシン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）及びインスリンを含む培地中でＭＳＣを培養し、次いでインスリンを含む培地内で維持することにより、増大させることができる。筋細胞分化は、例えば、５−アザシチジンを含む培地（Ｆｕｋｕｄａら、（２００１）Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎｓ  ２５：１８７）、又はウマ血清、デキサメタゾン及びヒドロコルチゾンを含む培地（Ｅｕｎら（２００４）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：６１７−６２４）内で培養することにより、増大させることができる。軟骨細胞分化は、例えば、
【数１】
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（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（２００３）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（４）：６７９）を含むか又は含まない、デキサメタゾン、アスコルビン酸２−ホスフェート、インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸を含む培地中で培養することにより増大させることができる。培養における分離に続き、得られた細胞を直接用いるか、例えば、ＭＳＣ及び他の未分化細胞を除去するための陰性選択においてさらに分離してもよい。さらに、所望の細胞型の濃縮は、細胞に特有のマーカーの選択により、例えば、フローサイトメトリー、磁気ビーズ分離、パニング等により得られることは公知である。
【００２１】
Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を被験者に投与することを含む、間葉細胞内の欠陥又は異常に関連する疾患を患っている患者の治療方法を提供する。Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団は、同一又は異なる被験者に由来する。
【００２２】
Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣは、必要に応じて被験者に投与される。例えば、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣは、骨又は軟骨の異常部位又はその近くで被験者に投与され、又は被験者に全身投与される。Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣは、意図する組織に移植され、移動し、機能的欠陥部位を再構成又は再生できるような方法で投与される。場合により、ＭＳＣの表面の標的分子は、所望の部位への適切な移動を促進するように用いられる。例えば、ＭＳＣは、軟骨、成長板、骨及び腱／靱帯、並びに自家軟骨細胞移植片を設計するために用いることができる。したがって、ＭＳＣの投与は、比較的に純粋な集団により、又は再生医療を用いて生成される構築物内で細胞を投与することにより、実施することができる。
【００２３】
Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの投与は、骨の手術（骨の手術は、顔の形成、上顎又は下顎の再構築、骨折修復、骨移植、プロテーゼ移植、関節置換術（臀部及び膝置換術）からなる群から選択される）に続く骨の形成を促進し得る。
【００２４】
場合により、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣは分化し（上述したように）、被験者の患部に送達される。例えば、骨形成系列は、骨の疾患又は欠陥を患っている被験者に送達することができる。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、骨の疾患又は欠陥は、骨に対する健康又は完全な状態の喪失をもたらすか、それにより特徴づけられる、あらゆる骨の欠陥、疾患又は病状を意味し、骨粗鬆症、骨減少症、不完全な骨形成又は骨吸収、パジェット病、骨の破砕及び骨折、癌の骨への転位、骨化石症、骨硬化症及び骨軟骨症を含むが、これらに限定されない。骨の欠陥及び疾患には、骨折、及び先天性又は後天性の病状、例えば、骨形成不全症又は骨粗鬆症が含まれる。本明細書に開示される方法にしたがって治療及び／又は予防することのできる骨の疾患又は欠陥には、対応する病気ではない骨のものと比較して減少した骨質量によって特徴付けられる骨の疾患（例えば、骨粗鬆症、骨減少症及びパジェット病）が含まれる。軟骨の欠陥には、外相、又は、変形性関節症又はリウマチ性関節炎のような疾患により引き起こされうる関節軟骨の欠陥又は脊椎版の欠陥が含まれる。
【００２６】
骨又は軟骨の欠陥若しくは疾患、又は、骨若しくは軟骨の欠陥若しくは疾患に関連する症状の治療は、発症後に、症状を遅くし、改善すること、又は、疾患若しくは症状を反転させることに積極的に介在することを包含する。本明細書で用いられる場合、治療は、骨又は軟骨の質量又は完全性を、対応する影響を受けていない骨（同じタイプの対応する骨、例えば、長い脊椎部分の骨）、又は、病気でない、若しくは、影響を受けていない状態の軟骨のものに、より近似させる方法を意味する。例として、手術後の治療の後、骨又は軟骨が、健康で外科的に影響を受けていない骨のようになる。
【００２７】
Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣは、医薬組成物の形態で投与することができる。このような組成物は、治療的有効量のＭＳＣ及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む。このような担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水及びそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。製剤は、投与様式に適したものとすべきである。場合により、ＭＳＣ組成物は、静脈、関節内、又は椎間投与用に製剤化される。静脈投与用組成物は、例えば、無菌の等張水性バッファーによる溶液である。
【００２８】
本明細書に開示された方法に用いるためのＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣを含む組成物は、持続性及び／又は持効性製剤として製剤化することもできる。このような、持続性及び／又は持効性製剤は、持続放出手段、送達装置又は組織工学による構築物により製造することができる。組成物は、１つ以上の活性成分をゆっくりと又は持続的な放出を提供するためにのために用いることができ、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマー材料、ゲル、透過膜、浸透システム、多層コーティング、微粒子、リポソーム、ミクロスフェア又はそれらの組合せを用いて、種々の特性において所望の放出プロフィールを与えることができる。種々の適切な持続放出製剤は、本明細書に開示された組成物と一緒に用いられるために容易に選択することができる。場合により、組成物は制御放出システムにより送達することができる。例えば、組成物は、静脈内注射、移植可能な浸透圧ポンプ、リポソーム、又は他の投与法法を用いて投与することができる。制御放出システムは、標的の近くに置くことができる。例えば、マイクロポンプは、関節に直接、又は、骨若しくは軟骨に直接に制御用量を送達することができ、その結果、全身投与量の一画分のみが必要となった。（例えば、少なくともマイクロポンプに関する資料について、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８を参照されたい）。他の例においては、組成物は、ヒドロゲル用いて製剤化される（例えば、少なくともヒドロゲルに関する資料について、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７０２，７１７号；第６，１１７，９４９号；第６，２０１，０７２号を参照されたい）。
【００２９】
組成物を局所的に、すなわち治療を必要とする領域に投与することが望ましい。局所投与は、例えば、手術の際の点滴、局所投与、注射又はインプラントによる局所注射により達成される。インプラントは、浸透性、非浸透性、若しくはシリコン膜のような膜を含むゼリー状の材料であってもよく、骨若しくは軟骨のような組織を置換するように設計された組織再生医療構築物を含む。
【００３０】
Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣは有効量で用いられる。一般に、このような量は、体重１ｋｇあたり少なくとも１×１０４ＭＳＣから体重１ｋｇあたり３×１０５ＭＳＣの範囲である。場合により、ＭＳＣは、１×１０６ＭＳＣ／体重１ｋｇで投与される。ＭＳＣは、例えば、１日あたり１〜３回投与され、最適な効果及び薬学的用量に適合するように調整してもよい。当業者は、投与経路、受容者の年齢、性別、健康状態及び体重、症状の性質及び程度、同時に行っている治療の種類、治療の頻度及び所望の効果に基づき、投与量及び頻度を決定することができる。
【００３１】
また、本発明は、本明細書に記載された１つ以上の成分（例えば、Ｎｏｔｃｈシグナル経路の活性化剤、又はＮｏｔｃｈ２＋ＭＳＣ）で満たされた１個つ以上の容器を含む、パック又はキットを提供する。したがって、例えば、本明細書に開示されたキットは、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣの集団を含む。また、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣを分離するための組成物を含むキットが開示されている。場合により、キットは、Ｎｏｔｃｈ２＋ＭＳＣを培養するための薬剤をさらに含む。このようなキットは、必要に応じ、又は所望であれば、溶液及びバッファーを含んでいてもよい。場合により、使用のための使用説明書が、このようなパック又はキットに関連付けられる。
【００３２】
明細書を通して用いられるように、被験者は個体を意味する。したがって、被験者には、例えば、ネコ及びイヌのような家畜、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ及びヤギ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット及びモルモット）、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、霊長類、非ヒト霊長類、げっ歯類動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類及び他の任意の動物が含まれる。被験者は、霊長類はヒトのような動物であってもよい。
【００３３】
用いることができ、併せて用いることができ、製造のために用いることができ、開示される方法及び組成物の産物である、材料、組成物及び成分が開示される。これらの及びその他の材料は本明細書に開示されており、そして、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されるとき、様々な単位の各々や集合的な組み合わせと並べ替えの具体的な参照は明確に開示されないかもしれないが、それぞれが具体的に熟慮され、本明細書に記載されることが理解される。例えば、方法が開示され議論され、この方法になし得る多くの修飾が議論されているなら、方法のありとあらゆる組み合わせ及び並べ替え、可能な修飾は、そうではないと特に示されない限り、特に熟考される。同様に、これらのあらゆるサブセット又は組み合わせも、具体的に熟考され、議論される。この概念は、これらに限定されないが、ＭＳＣ自体及び開示されたＭＳＣを分離し、培養し、使用する方法の工程を含む本開示の全ての態様に当てはまる。したがって、実施可能な様々な追加の工程がある場合、これらの追加の工程のそれぞれは、開示された方法のうちの任意の特定の方法工程、又は、方法工程の組み合わせと共に実施することができ、そのような組み合わせの各々、又は、組み合わせのサブセットが特に熟考され、開示されていると考えるべきであると理解される。
【００３４】
本明細書を通じて種々の出版物に言及される。これらの出版物の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３５】
多くの態様が開示されてきた。それにもかかわらず、種々の改変をなし得ることが理解されるであろう。さらに、１つの特徴又は工程が開示されているなら、組み合わせが明確に示されていなくても、それは任意の他の特徴又は工程と組み合わせることができる。したがって、他の態様は、請求項の範囲内である。
【実施例】
【００３６】
実施例１：  骨格発達の間にＲＢＰｊｋ依存性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は間充織幹細胞（ＭＳＣ）を維持し、増殖させる。
【００３７】
材料と方法
マウス系統Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤ、Ｒｂｐｊκ、及び、Ｐｒｘ１Ｃｒｅを含む全てのマウス系統は以前に説明されている（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４：６３７−４５  （２００２）、Ｌｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ３３：７７−８０  （２００２）、及び、Ｍｕｒｔａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  １００：１４２９０−５  （２００３））。Ｐｒｘ１ＣｒｅマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、メーン州）より手に入れられた。
【００３８】
マウス胚の解析
マウス胚は胎生１１．０日より胎生１２．５日にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に回収され、１０％の中性緩衝ホルマリン中において一晩室温で固定され、それから、４μｍの切片を作成する前に加工されてパラフィンに包埋された。組織構造、及び、肢芽の軟骨の構成を解析するために、標準的なアルシアンブルー／オレンジＧ染色が行われた。Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、以前に説明されたように（Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３２：４３３９−５１  （２００５）、Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ３０８：９３−１０５  （２００７）、及び、Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １４：３０６−１４  （２００８））、３５Ｓで標識されたリボプローブを用いて行われた。未発表のリボプローブは次のｃＤＮＡクローンより作成された。Ｓｏｘ９（４１６５４６９）、Ａｇｃ１（５３４５９３１）、Ｈｅｓ１（１０４６９６０６）、Ｈｅｙ１（９７９２７１３）、Ｊａｇ１（１０６９９１８７）、Ｄｌｌ１（１０６９８８８８）、及び、Ｄｌｌ４（７４９２８２８）。ｃＤＮＡクローンはＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、アラバマ州）、又は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）より入手可能である。Ｇｆｐプローブは強化型Ｇｆｐコーディング配列をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターにクローニングすることにより作成された。Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｆｇｆ８、及び、Ｆｇｆ１０のｃＤＮＡとリボプローブは説明されるとおりである（Ｂｅｌｌｕｓｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：４８６７−７８  （１９９７）、Ｃｒｏｓｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１：４３９−５１  （１９９５）、及び、Ｍｉｔｓｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３０：４０７−１８  （１９９５））。ＢｒｄＵ免疫染色解析のために、妊娠中の雌マウスは、回収の２時間前に０．１ｍｇ／ｇ体重の割合でＢｒｄＵを注入された。ＢｒｄＵの検出は、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（サンフランシスコ、カリフォルニア州）発売のキットを用いて、製造業者の説明書にしたがい、バラフィン切片上で行われた。増殖に関する研究は、製造業者の説明書にしたがうマウス肢芽パラフィン切片の抗Ｋｉ６７免疫染色（ＤＡＫＯ、デンマーク）を用いて確認された。アポトーシス性のＭＳＣの解析は、製造業の説明書にしたがうマウス肢芽パラフィン切片上の抗Ｃｌｅａｖｅｄ  Ｃａｓｐａｓｅ−３免疫染色（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；Ｄａｎｖｅｒｓ、マサチューセッツ州）とＴＵＮＥＬ染色（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｋｉｔ；Ｒｏｃｈｅ；バーゼル、スイス）を用いて行われた。胚の全組織標本骨格染色は以前に説明されたように行われた（Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３２：４３３９−５１  （２００５）、ＭｃＬｅｏｄ，  Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ  ２２：２９９−３０１  （１９８０））。
【００３９】
肢芽ＭＳＣ細胞培養、及び、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞培養
肢芽由来ＭＳＣは胎生１１．５日のＣＤ１マウス胚より以前に説明されたように単離された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｏｎｅ  ３４：８０９−１７  （２００４））。軟骨形成分化のため、ＭＳＣは小塊状で（１０Ｔｌ中１×１０５細胞）１．５時間、１２穴プレートに接種され、その後、標準培地、ＤＡＰＴ（１μＭ）を含む培地、又は、Ｈｅｓ１  ｓｈＲＮＡレンチウィルスを含む培地が加えられた。軟骨染色（１％アルシアンブルー／３％氷酢酸）、又は、全ＲＮＡ単離のために回収される前に、細胞は６時間、３日、５日、及び、７日のタイムコースで培養された。肢芽由来ＭＳＣはまた２１日間単層培養され、ＤＡＰＴを含む、及び、含まない骨形成性培地（１０ｎＭデキサメタゾン、５０mＭアスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロールリン酸）、又は、脂肪細胞形成性培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，マサチューセッツ州）のどちらかの培地で処理された。固定されたＭＳＣは、造骨細胞分化についてはアルカリホスファターゼ染色法（ニトロブルーテトラゾリウムクロリド／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリホスフェート  Ｐ−トルイジン塩）を用いて染色され、脂肪細胞分化についてはオイルレッド−Ｏ染色溶液（０．３６％）を用いて染色された。全ＲＮＡは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで使用するために２１日目の単層培養細胞から単離された。
【００４０】
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は以前に説明されたように増殖させられ、実験のために単層になるようプレートに蒔かれた（Ｄｅｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６４：６７−７６  （１９９９）、Ｈａａｓ  ａｎｄ  Ｔｕａｎ，  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６４：７７−８９  （１９９９））。単層培養細胞は、製造業者のプロトコルで示唆されるように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を用いて５００ｎｇのＣＭＶ−Ｈｅｓ１、若しくは、ＣＭＶ対照プラスミドで形質移入されるか、又は、対照ィルスに、若しくは、Ｈｅｓ１、Ｈｅｙ１、及び、ＨｅｙＬ（Ｓｉｇｍａ；セントルイス、ミズーリ州）に対するｓｈＲＮＡレンチウィルスで感染させられるかのどちらかであった。形質移入／感染の１日後、細胞はトリプシン処理され、１２穴プレートの各穴に１０Ｔｌの培地あたり１ｘ１０５細胞の密度で小塊状に再び蒔かれた。細胞はアルシアンブルー染色と全ＲＮＡ単離のために５日目、１０日目、及び、１４日目に回収された。
【００４１】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
胚性肢芽組織、又は、小塊培養物は液体窒素で凍結され、それから、２５ゲージの注射針と注射筒を通してＴｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）の中でホモジネート化された。全細胞性ＲＮＡが製造業者のプロトコルにしたがって抽出された。ＲＮＡはＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ；Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、デラウェア州）を用いて定量され、等濃度の全ＲＮＡがｃＤＮＡの合成のためにプールされた。製造業の説明書にしたがってｉＳｃｒｉｐｔＴＭ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）を使用して全ＲＮＡ（１μｇ）が逆転写された。逆転写されたｃＤＮＡは、Ｓｏｘ９、Ｒｕｎｘ２、Ｃｏｌ２ａ１、Ａｇｃ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｐ、Ｏｃ、Ｐｐａｒg、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ１、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ３、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ３、Ｈｅｓ５、Ｈｅｓ７、Ｈｅｙ１、Ｈｅｙ２、ＨｅｙＬ、及び、ＣｙｃｌｉｎＤ１に対するマウス特異的なプライマーを用いるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって解析された。プライマーはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて設計された。配列は請求に応じて利用可能である。ＤＮＡ増幅はＳＹＢＲ(R)  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）、及び、ＲｏｔｏｒＧｅｎｅリアルタイムＤＮＡ増幅システム（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；シドニー、オーストラリア）を使用して成し遂げられた。遺伝子発現はβ‐アクチン発現レベルに対して正規化され、その後、対照サンプルに対して正規化された。
【００４２】
ウェスタンブロット解析
全タンパク質が、Ｇｏｌｄｅｎ溶解緩衝液を用いて、マウス肢芽組織全体、又は、肢芽由来ＭＳＣ培養細胞のどちらかより単離された。肢芽由来ＭＳＣ培養細胞は１０ｃｍのディッシュに６Ｘ１０６の濃度で蒔かれ、ＤＡＰＴ（１ｕｍ）を含む、そして、含まない１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ培地中で一晩培養された。各単離に由来するタンパク質サンプル（〜１００μｇ）はその後、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドで分離され、ＰＶＤＦ膜に転写された。ＮＩＣＤ１とＮＩＣＤ２の切断されたタンパク質はｂＴＡＮ２０（Ｎｏｔｃｈ１）一次抗体、及び、Ｃ６５１．６ＤｄＨＮ（Ｎｏｔｃｈ２）一次抗体（０．４μｇ／ｍｌ）を用い、並びに、さらに適切な二次抗体（３０００倍希釈）で探索されて検出された。等量のタンパク質を添加したことについて、抗β‐アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ；セントルイス、ミズーリ州）が対照として使用された。免疫ブロットはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  （Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）を用いて検出された。
【００４３】
結果
インビトロとインビボのＭＳＣ分化の間に起こるＮｏｔｃｈ経路構成因子の発現
５種類のマウスＮｏｔｃｈリガンド（Ｊａｇｇｅｄ１（Ｊａｇ１）、Ｊａｇｇｅｄ２（Ｊａｇ２）、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ１（Ｄｌｌ１）、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ３（Ｄｌｌ３）、及び、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ４（Ｄｌｌ４））、４種類のＮｏｔｃｈレセプター（Ｎｏｔｃｈ１（Ｎ１）、Ｎｏｔｃｈ２（Ｎ２）、Ｎｏｔｃｈ３（Ｎ３）、Ｎｏｔｃｈ４（Ｎ４））、及び、６種類のＮｏｔｃｈ標的遺伝子（Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５、Ｈｅｓ７、Ｈｅｙ１、Ｈｅｙ２、及び、ＨｅｙＬ）の肢芽ＭＳＣ分化中の、及び、インビトロ軟骨形成中の正確な時間的発現を同定するためにリアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲが行われた。胎生１１．５日のマウス胚から肢芽ＭＳＣが単離され、小塊状で６時間、３日間、及び、７日間培養された。５種類のＮｏｔｃｈリガンドの可能性があるものの内、Ｊａｇ１、Ｄｌｌ１、及び、Ｄｌｌ４のみがかなりのレベルで検出され、Ｊａｇ１は全ての時点で最も高い発現レベルを示した（図１Ａ）。４種類のＮｏｔｃｈレセプターの内３種類（Ｎ１、Ｎ２、及び、Ｎ３）のみが肢芽ＭＳＣ分化の間に検出され、Ｎｏｔｃｈ２はその他のＮｏｔｃｈレセプターと比較して各時点で劇的に高い発現レベルを示した（図１Ｂ）。肢芽ＭＳＣ分化と軟骨形成に重要なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の下流に位置する構成因子を判定するために、ＲＢＰｊκ依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子の発現が調査された。６種類の標的の可能性があるものの内、Ｈｅｓ１、Ｈｅｙ１、及び、ＨｅｙＬのみが同定された。Ｈｅｙ１とＨｅｙＬは最も大量に存在するＮｏｔｃｈ標的遺伝子で、インビトロでのＭＳＣ分化の間に増加し、各時点で同様の発現レベルを示した（図１Ｃ）。Ｈｅｓ１はＨｅｙ１、及び／又は、ＨｅｙＬと比較して低レベルの発現を示したが、Ｈｅｓ１の発現は初期肢芽ＭＳＣにおいて最も顕著であり、ＭＳＣ分化の間に発現レベルが低下した（図１Ｃ）。これは、軟骨細胞系列へのＭＳＣのコミットメントの初期段階の制御における潜在的な役割を示している。
【００４４】
ＲＴ−ＰＣＲ解析で同定されたＮｏｔｃｈシグナル伝達分子について正確なインビボでの空間的発現パターンを同定するために、Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析が胎生１１．５日および胎生１２．０日の肢芽切片に対して行われた。これらのデータは、ＮｏｔｃｈリガンドであるＪａｇ１、Ｄｌｌ１、及び、Ｄｌｌ４は全て、非常に異なる発現特性を持つことを示した。胎生１１．５日目で、Ｊａｇ１は肢芽間充織の大部分において中程度に発現されるが、頂端領域に隣接する先端部内側間充織の集中した領域で大いに発現した（図１Ｄ１）。その他の二種類のＮｏｔｃｈリガンドのうち、胎生１１．５日目でＤｌｌ１は肢芽間充織を通じて散発的に発現し（図１Ｄ２）、一方、Ｄｌｌ４は血管構造の周りにより集中する発現パターンを示した（図１Ｄ３、高倍率挿入図）。Ｄｌｌ４は血管新生の制御因子で、それは、Ｎｏｔｃｈ１とともに血管内皮の重要な制御因子である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４４５：７７６−８０  （２００７）、Ｓｈｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １４：１３１３−８  （２０００））。ＮｏｔｃｈレセプターＮｏｔｃｈ１はまた、胎生１１．５日目で、血管性組織の領域（図１Ｄ４、高倍率挿入図）と初期外肺葉で主に発現し、肢芽間充織のある部分ではより低レベルの発現が観察される。Ｎｏｔｃｈ２は同時期で肢芽の大部分においてより広範囲に発現する（図１Ｄ５）。Ｎｏｔｃｈ３は肢芽間充織内で散発的に、基部ＭＳＣおよび末梢ＭＳＣにおいてより高い濃度で発現する。Ｈｅｓ１発現のわずかな上昇が、Ｊａｇ１発現が集中する領域と重なる遠位内側ＭＳＣにおいて観察されることができたが（図１Ｄ１、及び、１Ｄ７）、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子、Ｈｅｓ１およびＨｅｙ１は、胎生１１．５日目で、それぞれＮｏｔｃｈ２のそれに類似する発現パターンを有した（図１Ｄ５、１Ｄ７、及び、１Ｄ８）。胎生１２．０日目から胎生１２．５日目までに、ほとんどのＮｏｔｃｈ経路構成因子はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出することが困難である。Ｎｏｔｃｈ２とＨｅｓ１の発現のみが軟骨形成凝集の周囲の肢芽ＭＳＣにおいて維持されたが、凝集そのものの内側においてはわずかな発現低下を示し（図１Ｄ９、及び、１Ｄ１０、白黒の輪郭）、一方、Ｈｅｙ１のような構成因子はより広範に分布する発現パターンを維持した。
【００４５】
どのＮｏｔｃｈレセプターが肢芽間充織において活性があるのか決定するために、Ｎｏｔｃｈ阻害剤であるＮ−（３，５−ジフルオロフェニルアセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシン  ｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；サンディエゴ、カリフォルニア州）存在下、および、非存在下で培養されたＭＳＣから、又は、野生型胎生１１．５日齢の全肢芽組織から全タンパク質が直接的に単離され、前記レセプターの切断型、若しくは、活性型（ＮＩＣＤ）を検出することができるＮｏｔｃｈ１抗体、及び、Ｎｏｔｃｈ２抗体を用いたウェスタンブロット解析を行った。ウェスタンブロット解析により、Ｎｏｔｃｈ２は胎生１１．５日齢の肢芽ＭＳＣにおいて活性化される顕著なレセプターであり、培養ＭＳＣのＤＡＰＴ処理は大量に存在する切断型Ｎｏｔｃｈ２（ＮＩＣＤ２）を減少させることができることが明らかにされた（図１Ｅ）。Ｎｏｔｃｈ１（ＮＩＣＤ１）は、１００μｇまでのタンパク質濃度ではほぼ検出不可能であった。それゆえ、まとめると、これらのデータは、Ｎｏｔｃｈ２はＭＳＣで活性化される主要なＮｏｔｃｈレセプターであり、一方、Ｎｏｔｃｈ経路のその他の構成因子（Ｊａｇ１、Ｄｌｌ１、Ｎ３、Ｈｅｓ１、Ｈｅｙ１、及び、ＨｅｙＬ）はまた、肢発生の間、ＭＳＣの増殖と分化に重要なメディエーターでありうることを示唆する。
【００４６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達はＭＳＣ分化の全般的な制御因子である。
【００４７】
ＭＳＣにおけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の役割を判定するために、Ｎｏｔｃｈ機能欠損アッセイが、Ｎｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴを用いた胎生１１．５日齢の肢芽由来のＭＳＣ培養物に対して行われた。軟骨形成はまず、１mＭ  ＤＡＰＴの存在下、及び、非存在下での軟骨小結節形成を測定することにより、肢芽小塊培養物において調査された。ＤＡＰＴ処理は軟骨小結節形成を大いに増強した（図２Ａ）。これは、Ｎｏｔｃｈ阻害がＭＳＣの軟骨細胞系列へのコミットメントを加速することを示し、ある先行研究（Ｆｕｊｉｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｍｅｔａｂ．  ２４：１９１−８  （２００６））と一致する発見である。ＤＡＰＴの効果はまた、軟骨形成マーカーのＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、及び、Ａｇｃ１の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価された。未処理の培養物と比較すると、ＤＡＰＴは培養３日目から５日目の間にＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、及び、Ａｇｃ１の発現（図２Ａ）を増強したが、Ａｇｃ１の発現は７日目までに大いに減少した。このことは、Ｎｏｔｃｈは軟骨細胞成熟、又は、コミットした軟骨細胞表現型の維持において後期の役割を果たすことを示す。
【００４８】
Ｎｏｔｃｈが軟骨形成を特異的に調節するのか、又は、ＭＳＣ分化を全般的に制御するのかどうか判定するために、肢芽ＭＳＣ分化アッセイが骨形成性条件、及び、脂肪細胞形成性条件の両方の条件で行われた。肢芽ＭＳＣは単層に蒔かれ、そして、ＤＡＰＴ（１mＭ）の非存在下、及び、存在下、骨形成性培地において２１日間培養された（図２Ｂ）。ＤＡＰＴ処理はＭＳＣの正常な造骨細胞への分化を増強した。培養物は、上昇したアルカリホスファターゼ染色を示し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は造骨細胞マーカー遺伝子であるＣｏｌ１ａ１、ＡＰ、及び、Ｏｃの発現の著しい増加を示した（図２Ｂ）。最後に、肢芽ＭＳＣは単層に蒔かれ、そして、ＤＡＰＴ（１mＭ）の非存在下、及び、存在下、脂肪細胞形成性培地において２１日間培養された（図２Ｃ）。ＤＡＰＴ処理はＭＳＣの正常な脂肪細胞への分化を同様に増強した。培養物は上昇したオイルレッド−Ｏ染色を示し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は脂肪細胞マーカー遺伝子であるＰｐａｒgの発現の著しい増加を示した（図２Ｃ）。これらのデータは、インビトロでのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害が肢芽ＭＳＣの軟骨細胞系列、造骨細胞系列、及び、脂肪細胞系列への分化を増強することを示すものである。これは、ＭＳＣの維持におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達について全般的な役割を示す。
【００４９】
ＲＢＰｊκ依存性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は軟骨形成の間にＭＳＣ分化を抑制する。
【００５０】
インビボで肢芽ＭＳＣ分化中の、及び、軟骨形成中のＮｏｔｃｈシグナル伝達に対する要件を評価する第一段階として、標準的なＮｏｔｃｈエフェクターであるＲｂｐｊκがＰｒｘ１Ｃｒｅ導入遺伝子を用いて初期肢間充織において選択的に欠質させられる（Ｐｒｘ１Ｃｒｅ；  Ｒｂｐｊκｆ／ｆ、“ｆ”はｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子であることを表す。）マウスにおいて胚性マウス肢芽が解析された（図３）。Ｐｒｘ１Ｃｒｅは、発達中の肢の内部で軟骨細胞、造骨細胞、及び、結合組織細胞を生じるが、筋芽細胞、血液系譜細胞、若しくは、血管内皮細胞を生じない側板中胚葉のＭＳＣを特異的に標的とするので、本研究においてＰｒｘ１Ｃｒｅマウス系列が使用された。肢芽ＭＳＣの軟骨細胞系列の細胞へのコミットメントにおける変化をアッセイするために、アルシアンブルー染色、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲがＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、及び、Ａｇｃ１に対して行われた。胎生１２．５日齢のＰｒｘ１Ｃｒｅ；  Ｒｂｐｊκｆ／ｆ変異（ＲＢＰｊκ）肢芽は、ほとんど検出不可能なレベルのアルシアンブルー染色を示す対照と比較して、軟骨形成原基痕跡のアルシアンブルー染色の増加を示した（図３Ａ１、及び、３Ａ２）。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析により、ＲＢＰｊκ変異体切片におけるＣｏｌ２ａ１、及び、Ａｇｃ１の両方の発現の増加が明らかになった。Ｃｏｌ２ａ１陽性の変異体細胞の全てはまた、Ａｇｃ１を発現した（図３Ａ６、及び、３Ａ８）。これは、これらの細胞はこの時点で完全にコミットした軟骨細胞であることを示す。この時期の野生型切片により、Ｃｏｌ２ａ１陽性細胞のうちの中央部の芯にあたる細胞のみがＡｇｃ１を発現することが示された（図３Ａ５、及び、３Ａ７）。これは、軟骨細胞分化の正常な進行を強調するものである。さらに、ＲＢＰｊκ変異体切片はＳｏｘ９発現レベルの低下を示した。これは、前記変異体細胞が軟骨形成の最初期の段階を越えて進行したことを示唆する。胎生１２．５日齢の肢芽全体より単離したｍＲＮＡに対して行われたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は、軟骨形成マーカー遺伝子であるＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、及び、Ａｇｃ１の各々についてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果と一致する（図３Ｂ）。より初期の肢芽（胎生１１．５日齢）に対して行われたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲでは、ＲＢＰｊκ変異体サンプルから上昇した全ての軟骨形成マーカーの発現が示された。これらのデータは、ＲＢＰｊκ依存性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が肢芽ＭＳＣを正常に維持し、そして、ＲＢＰｊκの欠損が、軟骨形成の過程を経ると決定されているこれらの細胞に関して軟骨形成分化を促進するということを示唆する。
【００５１】
持続的Ｎｏｔｃｈ活性化がＲＢＰｊκ依存的な方法でＭＳＣを維持、増殖させる。
【００５２】
インビトロのＮｏｔｃｈ活性化が発生中の肢におけるＭＳＣ分化と軟骨形成を抑制することができるか、又は、遅らせることができるかどうか判定するために、Ｎｏｔｃｈ機能獲得型実験が行われた。マウスＮｏｔｃｈ１の細胞内ドメインとＧＦＰ（ＮＩＣＤ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）がｌｏｘＰ部位によって挟み込まれた転写停止配列を上流に含むＲｏｓａ２６レポーター遺伝子座を標的とする（Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）マウスモデルシステムを用いて機能獲得型実験が行われた。Ｃｒｅ活性化に引き続き、Ｃｒｅを発現する細胞集団内に特異的にＮＩＣＤとＧＦＰの発現が維持されることが確定されてきている（Ｍｕｒｔａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  １００：１４９２０−５  （２００３））。Ｐｒｘ１Ｃｒｅ導入遺伝子が、軟骨形成の前に初期肢芽ＭＳＣ内でＮＩＣＤ発現を誘導し、持続的Ｎｏｔｃｈ活性を誘導するために使用された（Ｐｒｘ１Ｃｒｅ；  Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋）。これより後、このマウスはＮＩＣＤ変異体と称される。胎生１８．５日齢のＮＩＣＤ変異体骨格標本の解析は、Ｐｒｘ１Ｃｒｅが特異的に発現する領域の全てである肢（黒矢印）、頭蓋（星印）、及び、胸骨（灰色矢印）の正常な形成の明白な抑制を示した（図４Ａ１、及び、４Ａ２）。前記肢をより詳しく調査することにより、最基底部、及び、最先端部軟骨原基痕跡のうちのわずか少数がＮＩＣＤ変異体において発生したが、これらの単位は、遅滞した軟骨発生の証拠を有し、低形成である（図４Ａ３〜４Ａ６）。前記肢の表現型が軟骨形成の間のＭＳＣ分化の抑制から生じるのかどうか判定するために、同腹仔のＮＩＣＤ変異体と野生型対照で胎生１２．５日齢の肢芽が解析された。ＮＩＣＤ変異体肢芽の切片は凝集をほとんど示さず、対照と比較して低下したアルシアンブルー染色を示した（図４Ｂ１、及び、４Ｂ２）。変異体は常に３本の指の凝集（第１指、及び、第５指の明らかな喪失）を示し、しばしば、より先端の領域で凝集を発達させなかった。基底部の凝集が起きるとき、それらは常に低形成であり、軟骨形成分化過程において遅滞した。軟骨形成とＭＳＣ分化における混乱を評価するために、Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、及び、Ａｇｃ１についてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが行われた。ＮＩＣＤ変異体切片はこれらのマーカー遺伝子のほぼ完全な抑制を示したが、形成された原基痕跡指凝集では、各マーカー遺伝子がかなりのレベルで発現したようである（図４Ｂ３〜４Ｂ８）。これらの原基痕跡凝集がＮＩＣＤ変異体においていったい何故起きたのか調べるために、ＮＩＣＤ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ転写産物を活発に発現し、そのためにＮｏｔｃｈ活性化を有するＭＳＣに印をつけるＧＦＰについてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが行われた。原基痕跡凝集のそれぞれは明らかなＧＦＰ発現を示さなかったが、一方、肢芽内部のその他のほとんどのＭＳＣは強度のＧＦＰ発現を示した（図４Ｂ９、及び、４Ｂ１０）。このことは、Ｐｒｘ１Ｃｒｅ導入遺伝子はこの細胞集団を効率的に標的としていなかったことを示唆する。胎生１２．５日齢の肢芽全体から単離されたｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ解析が行われた。これらのデータはＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、及び、Ａｇｃ１の��なりの発現低下を示し（図４Ｃ）、前記骨形成マーカー遺伝子の各々についてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果と一致する。初期造骨細胞分化制御因子であるＲｕｎｘ２はＳｏｘ９のようにＮＩＣＤ変異体においてかなり低下したレベルの発現を示すが、そのＲｕｎｘ２もまた発現した（図４Ｃ）。ＲＢＰｊκ依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子であるＨｅｓ１、Ｈｅｙ１、及び、ＨｅｙＬの解析により、同腹仔である野生型対照と比較してＮＩＣＤにおいて上昇した発現レベルが示された（図４Ｃ）。これらのデータは、おそらくＲＢＰＪκ依存的シグナル伝達機構を介して、Ｓｏｘ９、及び、Ｒｕｎｘ２の上流で作用する局所的で、そしておそらく細胞自律的な方法でのＭＳＣ分化をＮｏｔｃｈシグナル伝達が抑制することを示唆する。
【００５３】
持続的なＮｏｔｃｈ活性化が骨格パターン形成、及び、成長を損なった、又は、ＭＳＣのアポトーシスを大量に誘導したという可能性を排除するために、肢パターン形成制御因子の発現が解析され、細胞増殖とアポトーシスにおける変化が評価された。肢発生とパターン形成の重要な制御因子がＮＩＣＤの過剰発現によってかなり影響を受けるかどうか判定するために、ＦＧＦ、及び、Ｓｈｈシグナル伝達分子であるＦｇｆ８、Ｆｇｆ１０、及び、Ｐｔｃ１について、胎生１１．０日齢の後肢切片に対してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション研究が行われた。ＡＥＲのわずかな肥厚とＦｇｆ８、及び、Ｆｇｆ１０の発現上昇が観察された（図５Ａ１〜５Ａ４）が、一方、これらの動物において先に観察されたＭＳＣ分化の細胞自律的抑制をこのことで説明できるとは考えられなかった。さらに、Ｐａｔｃｈｅｄ１  （Ｐｔｃ１）発現はＮＩＣＤ切片と野生型切片の間で変化せず（図５Ａ５、及び、５Ａ６）、正常な指パターン形成と指アイデンティティーのために重要な不断のＳｈｈ活性を示した。胎生１１．０日齢の後肢切片でアポトーシスを起こしているＭＳＣを検出するために、ＴＵＮＥＬ標識と切断型Ｃａｓｐａｓｅ−３免疫組織化学実験がその後に行われた。同腹仔の野生型対照と比較して、ＮＩＣＤ変異体切片はＭＳＣのアポトーシスについて有意な変化を示さなかった（図５Ｂ、及び、図８）。ＭＳＣ分化のもっと後の時点でのアポトーシスに有意な変化は検出されなかった。最後に、持続的Ｎｏｔｃｈ活性化がＭＳＣ細胞増殖と肢成長に有害な効果を持つかどうか判定するために、胎生１１．５日齢の後肢切片でＢｒｄＵ標識実験が行われた。データは、ＮＩＣＤ変異体切片が肢芽中でＢｒｄＵ標識された細胞核のパーセンテージのかなり上昇を示すが、高増殖性の頂端領域（ＡＺ）、又は、進行帯の近傍の領域（破線のボックス）においてそれはたいへん明白であった（図５Ｃ１〜５Ｃ３）。ＢｒｄＵデータを確認するために、細胞増殖と細胞周期の制御因子であるＣｙｃｌｉｎＤ１について、胎生１１．５日齢のＮＩＣＤ変異体肢芽と対照肢芽に由来するＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲが行われた。ＮＩＣＤ変異体は対照と比較して３０％以上のＣｙｃｌｉｎＤ１発現の増加を示した（図５Ｃ４）。これらのデータにより、ＮＩＣＤ変異体における肢表現型はＭＳＣ分化の細胞自律的抑制により生じたものであるようであり、肢パターン形成の混乱、ＭＳＣアポトーシス、又は、ＭＳＣ細胞増殖によるものではないようであるということが示された。さらに、これらのデータにより、肢芽ＭＳＣにおける持続的なＮｏｔｃｈ活性化がこの細胞集団を維持し、且つ、増殖させることが示される。
【００５４】
ＭＳＣ分化および軟骨形成のＮｏｔｃｈ抑制がもっぱらＲＢＰｊκ依存シグナル伝達機構によって仲介されたかどうか判定するために、Ｎｏｔｃｈの機能獲得型の実験がＲＢＰｊκ転写エフェクターのない状態で行なわれた。Ｐｒｘ１Ｃｒｅ導入遺伝子、活性化可能Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤ対立遺伝子、及び、ホモ接合型Ｒｂｐｊκ  ｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子（Ｐｒｘ１Ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋；Ｒｂｐｊκｆ／ｆ）を持つマウスが作成された（ＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκ）。アリザリンレッドおよびアルシアンブルーで染色された胎生１８．５日齢の骨格の分析により、正常な四肢、特定の頭蓋骨、及び、胸骨を欠くＮＩＣＤ変異体とは対照的に、ＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκ変異体動物はこれらの単位の発生において類似の停止を示しそこなうことが示された（図６Ａ１、６Ａ２、及び、６Ａ４）。より詳しく調査すると、ＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκ変異体動物は、同腹仔の野生型と比較して短い骨格単位（矢印は脛骨の長さを強調する。）を持つＲＢＰｊκ変異体の骨格と極めて似ていた（図６Ａ１、６Ａ３、及び、６Ａ４）。同腹仔の野生型、ＮＩＣＤ変異体、及び、ＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκ変異体に由来する胎生１２．５日齢の後肢切片の詳細な組織学的、及び、分子的解析により、Ｎｏｔｃｈ活性化によるＭＳＣ分化の抑制にＲＢＰｊκが必要とされることがさらに示された。本実験のためにＰｒｘ１Ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋；Ｒｂｐｊκｆ／＋の遺伝子型を持つＮＩＣＤ変異体は、先述したＰｒｘ１Ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−ＮＩＣＤｆ／＋変異体マウスと同一の表現型を示した（図４のＮＩＣＤ変異体と比較される図６のＮＩＣＤ変異体）。Ｒｂｐｊκ対立遺伝子の一つを欠くＮＩＣＤ突然変異体は、ＭＳＣ分化のほぼ完全な抑制をまたも示し、先端部に３か所だけの指凝集を備えた四肢を生じた。胎生１２．５日齢のＮＩＣＤ肢芽切片は、先端部の３か所の指に限局される細胞内を除いて、アルシアンブルー染色の低下、及び、軟骨形成マーカー遺伝子発現（Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１およびＡｇｃ１）の完全な喪失を示した（図６Ｂ２、６Ｂ５、６Ｂ８および６Ｂ１１）。Ｇｆｐ発現が評価されたとき、３か所の指凝集は再度、Ｇｆｐ発現のほぼ不在と、それ故、持続的なＮＩＣＤ活性化の欠如を示した（図６Ｂ１４）。両方のＲｂｐｊκ対立遺伝子を欠くＮＩＣＤ変異体（ＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκ）は、ＭＳＣ分化と軟骨形成の完全な救出を示した。胎生１２．５日齢のＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκ変異体肢芽切片は、同腹仔の野生型対照と比較されるとき、わずかに拡大し、より強くなったアルシアンブルー染色を有するあらゆる軟骨形成単位の再出現を示した（図６Ｂ１、６Ｂ３）。さらに、ＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκ変異体切片のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析は、前記二重変異体は同腹仔の野生型対照と比較して増加され拡大したＳｏｘ９、Ｃｏｌ２、及び、Ａｇｃ１発現を示し、それは同腹仔のＲＢＰｊκ変異体に極めて類似した表現型であった（図６Ｂ４、６Ｂ６、６Ｂ７、６Ｂ９、６Ｂ１０、及び、６Ｂ１２）。ＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκ変異体におけるＭＳＣ分化の遺伝的な救出は不完全な組換えとＮＩＣＤ発現の喪失のためではないということを確定するために、隣接する切片に対してＧｆｐ発現についてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析が行われた。ＮＩＣＤ；ＲＢＰｊκ変異体は、ＮＩＣＤ変異体切片で先に同定された領域を除外して、強度のＧｆｐ発現を、それ故、ＮＩＣＤ活性化を示した（図６Ｂ１４、６Ｂ１５）。それ故、これらのデータは、ＭＳＣ分化と軟骨形成のＮｏｔｃｈ抑制はＲＢＰｊκ依存的シグナル伝達機構によってのみ仲介されるということを初めて示すものである。
【００５５】
ＲＢＰｊκ依存的Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子Ｈｅｓ１は軟骨形成の間のＭＳＣ分化に重要な制御因子である。
【００５６】
前記データは軟骨形成のＮｏｔｃｈ制御はＲＢＰｊκ依存的Ｎｏｔｃｈシグナル伝達機構によって仲介されることを示す。Ｈｅｓ、及び、ＨｅｙファミリーのいくつかのＲＢＰｊκ依存的Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子は、いくつかの器官系において幹細胞／前駆細胞分化のＮｏｔｃｈ制御を仲介する。Ｈｅｓ１、Ｈｅｙ１、及び、ＨｅｙＬは、高密度の小塊で培養される肢芽ＭＳＣ、及び、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２間葉細胞においてかなり発現される数少ない古典的なＮｏｔｃｈ標的遺伝子である（図１Ｂ）。それ故、高密度の小塊で培養されている間に容易に形質導入可能なＣ３Ｈ１０Ｔ１／２間葉細胞をＨｅｓ１  ｓｈＲＮＡウィルス、Ｈｅｙ１  ｓｈＲＮＡウィルス、及び、ＨｅｙＬ  ｓｈＲＮＡウィルスで感染させることにより機能喪失型実験が行われた。肢芽ＭＳＣと同様に、多分化能間葉細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は、２週間の培養時間に高密度小塊で培養されると、軟骨形成を起こす（Ｄｅｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６４：６７−７６  （１９９９）、及び、  Ｈａａｓ  ａｎｄ  Ｔｕａｎ，  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６４：７７−８９  （１９９９））。Ｈｅｙ１  ｓｈＲＮＡ、又は、ＨｅｙＬ  ｓｈＲＮＡではなくＨｅｓ１  ｓｈＲＮＡウィルスで形質導入されたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２では、その他のＮｏｔｃｈ機能喪失型研究と同様にアルシアンブルー染色とＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、及び、Ａｇｃ１についてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりアッセイされ、軟骨形成の促進、又は、増強が生じた（図９Ａ１〜９Ａ６、及び、９Ｃ）。Ｈｅｙ１  ｓｈＲＮＡ、及び／又は、ＨｅｙＬ  ｓｈＲＮＡで形質導入された培養物はアルシアンブルー染色では有意な変化を示さず、一貫性が無く比較的変化のない軟骨形成マーカー遺伝子発現を有した。さらに、一時的なＣＭＶ−Ｈｅｓ１過剰発現機能獲得型実験がＣ３Ｈ１０Ｔ１／２小塊培養物で行われ、その実験はアルシアンブルー染色でアッセイすると軟骨形成のかなりの抑制を示し（図９Ｂ１〜９Ｂ６）、ＲＴ−ＰＣＲ解析がその他のＮｏｔｃｈ機能獲得型研究と同様にＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、及び、Ａｇｃ１の軟骨形成マーカーのそれぞれについて行われた（図９Ｄ）。Ｈｅｓ１はＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞モデルを用いる間葉細胞分化と軟骨形成の重要な制御因子であるように見えたので、類似のＨｅｓ１  ｓｈＲＮＡ機能喪失型研究が、３日間、５日間、及び、７日間、高密度小塊で培養された肢芽由来ＭＳＣを使用して行われた。Ｈｅｓ１発現の著しい低下により軟骨形成が促進されることとなり、Ｈｅｓ１  ｓｈＲＮＡ培養物においてアルシアンブルー染色が増強され（図７Ａ１〜７Ａ６）、軟骨形成マーカーであるＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、及び、Ａｇｃ１の遺伝子発現がほぼすべての時点で上昇した（図７Ｂ）。後半のタイムポイントである５日目と７日目では、Ａｇｃ１発現は変化しなかった、又は、軽度に抑制された。これは、軟骨細胞の成熟の促進、又は、コミットした軟骨細胞表現型の維持におけるＨｅｓ１の役割を示すものである。これは、高密度小塊で培養された肢芽由来ＭＳＣがＮｏｔｃｈ阻害剤のＤＡＰＴで処理される実験（図２Ａ）と一致した。総体として、これらのデータにより、Ｈｅｓ１がＭＳＣにおい��発現されるＨｅｓ／Ｈｅｙファミリーの主要なＲＢＰｊκ依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子であり、それは軟骨形成中のＭＳＣ分化のＮｏｔｃｈを介した抑制に必要とされるということが示された。さらに、これらのデータは、ＲＢＰｊκ依存性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は骨格発達の間にＭＳＣの維持と増殖に重要であることを示した。したがって、Ｎｏｔｃｈ経路の操作により、骨格修復およびＭＳＣ集団を利用する組織工学的応用を目的として、生体外でＭＳＣの分化を維持し、増殖させ、制御する手段が提供される。
【００５７】
実施例２：  ヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）のＮｏｔｃｈ制御
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達がどのようにｈＭＳＣの維持と増殖を制御するのか探求するために、Ｌｏｎｚａ  Ｉｎｃ．（バーゼル、スイス）より購入された第１継代培養で骨髄由来のｈＭＳＣからの各Ｎｏｔｃｈレセプター、及び、すべての既知のＲＢＰｊκ依存性Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子（Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５、Ｈｅｓ７、Ｈｅｙ１、Ｈｅｙ２、ＨｅｙＬ）の発現特性（図１０）。全てのＮｏｔｃｈレセプター、および、Ｈｅｓ／Ｈｅｙ標的遺伝子のほとんどは様々なレベルで発現した。Ｎｏｔｃｈ２（図１０Ａ）およびＨｅｓ１（図１０Ｂ）は最も高発現であるｈＭＳＣのＮｏｔｃｈ構成因子として同定された。これは、初期発生中のマウス肢骨格のＭＳＣにおけるＮｏｔｃｈ構成因子発現と機能を解析した実施例１のデータと一致した。
【００５８】
ｈＭＳＣをレンチウィルスコンストラクトと感染させ、Ｊａｇ１をコートしたプレートによってｈＭＳＣにおけるＮｏｔｃｈシグナル伝達を誘導する能力を示すため、いくつかの対照実験が行われた。ｈＭＳＣはまず、ＡＴＣＣより入手されたＥＦ．ｖ．ＣＭＶ．ＧＦＰ対照レンチウィルスコンストラクトで感染させられた。このレンチウィルスは、２４時間後に、及び、細胞の多数の継代の間に感染効率を決定することを可能にするＧＦＰを発現する。その結果は、長期にわたる培養と継代の間にｈＭＳＣ成長に、又は、細胞生存に明らかな変化もなく維持される２４時間以内の８５％以上の感染効率を示した。５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、及び、１５μｇ／ｍｌの濃度のＪａｇ１と１０μｇ／ｍｌのＩｇＧを対照として用いる組換えＪａｇ１タンパク質で培養ディッシュをコートするプロトコルが確立された。コートされたプレート上のＪａｇ１タンパク質の抗Ｊａｇ１抗体を用いる免疫染色および呈色反応により、１０μｇ／ｍｌの濃度の組換えＪａｇ１タンパク質で最大で均一なプレートのコーティングが達せられることが示された。それ以上高い濃度が前記培養ディッシュに結合したＪａｇ１の量を増加させるようには見えなかった。あるいは、５μｇ／ｍｌの濃度により、かなり低い濃度であり、並びに、前記ディッシュの周辺部の周りにタンパク質が不均一に分布するように見えるＪａｇ１コーティングが示された。ＩｇＧ対照プレートはまた、Ｊａｇ１組換えタンパク質を含まないプレートについて予想されるように、呈色反応を示さなかった。次に、このＪａｇ１コーティング技法がｈＭＳＣにおいてＮｏｔｃｈシグナル伝達を誘導することを確認するために、ＲＢＰｊＰ依存性Ｎｏｔｃｈルシフェラーゼレポーターで形質移入されたｈＭＳＣが５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、及び、１５μｇ／ｍｌの濃度のＪａｇ１とＩｇＧでコートされたプレート上で培養された。そのデータにより、１０μｇ／ｍｌのＪａｇ１タンパク質が最大ルシフェラーゼ活性を誘導することが示された。ｈＭＳＣは、細胞のサイズ、形態、又は、細胞生存について明らかな変化も無くＩｇＧコートプレート、及び、Ｊａｇ１コートプレートの両方で正常に成長するように見えたことはまた注目に値する。
【００５９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達はｈＭＳＣの「幹細胞性」の強力な制御因子なので、初期継代ｈＭＳＣにおいて高発現するＮｏｔｃｈ分子（Ｎｏｔｃｈ２およびＨｅｓ１）は、細胞が幾世代か継代するにつれ、その発現レベルを変化させ、徐々にその「幹細胞様の」特質を失うであろう。同じ合理がＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、及び、Ｎａｎｏｇを含む「幹細胞性」の重要な制御因子に当てはまるであろう。それ故、ＲＴ−ＰＣＲ実験が行われ、通常の培養プレート上の間充織幹細胞成長培地（ＭＳＣＧＭＴＭ）（Ｌｏｎｚａ，  Ｉｎｃ；バーゼル、スイス）中で継代されたｈＭＳＣに由来するＮｏｔｃｈ２、Ｈｅｓ１、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及び、Ｎａｎｏｇの遺伝子発現を解析した。第１継代培養（Ｐ１）、及び、第１５代継代培養（Ｐ１５）に引き続いてこれらの遺伝子の発現が比較された。これらのデータはＮｏｔｃｈ分子（Ｎｏｔｃｈ２、Ｈｅｓ１）と多分化能幹細胞マーカー（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ）はＰ１５  ｈＭＳＣではＰ１と比較して著しく減少したことを示す（図１１Ａ）。これらのデータは、これらの細胞が生体外で継代する間にｈＭＳＣの「幹細胞性」の維持においてこれらの因子の各々が持つ役割を示す。標準的なｈＭＳＣ培養条件での第２継代培養、及び第１０継代培養に引き続く、ｈＭＳＣ細胞表面マーカーＣＤ１０５とＮｏｔｃｈレセプターＮｏｔｃｈ２についてのフローサイトメトリーのデータがまた行われた（図１２Ａ、及び、１２Ｂ）。
【００６０】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が幹細胞維持の重要な制御因子を誘導することができるかどうか判定するために、第３継代培養ｈＭＳＣがＪａｇ１コートプレート、及び、ＩｇＧコートプレート上で２４時間培養され、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析のためにＲＮＡが単離された（図１１Ｂ）。この研究は、Ｊａｇ１コートプレート（１０μｇ／ｍｌ）は効率的にＲＢＰｊＰ依存性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を誘導し、対照に対して約７倍にＨｅｓ１発現を強化することを示した。さらに、Ｊａｇ１はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、及び、Ｎａｎｏｇの発現を誘導したが、Ｏｃｔ４発現はＳｏｘ２、及び、Ｎａｎｏｇと比較して軽度に増強されただけであった。それ故、Ｊａｇ１／Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、幹細胞因子のこのネットワークによりｈＭＳＣの維持と増殖を制御した。最後に、比較的短い間隔の時間でＪａｇ１がｈＭＳＣの細胞増殖を制御できるかどうか判定するために、同じ培養系と第３継代培養ｈＭＳＣが用いられた。ＢｒｄＵ酵素結合性免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）が、Ｊａｇ１コートプレート、及び、ＩｇＧコートプレート上で２４時間培養されたｈＭＳＣに対して行われた。データは、Ｊａｇ１誘導Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、対照と比較して５０％を超える値にまでＢｒｄＵの取り込みを増加させることを示した（図１１Ｃ）。これはＮｏｔｃｈシグナル伝達が生体外でのｈＭＳＣの維持と増殖の両方を制御したことを示す。
【００６１】
実施例３：  Ｎｏｔｃｈ２で選択されたｈＭＳＣにおけるＪａｇｇｅｄ−１を介したＮｏｔｃｈ活性化
図１３Ａで示すように、Ｎｏｔｃｈ２で選択されたｈＭＳＣにおけるＪａｇｇｅｄ−１を介したＮｏｔｃｈ活性化は幹細胞制御因子、細胞増殖、及び、幹細胞増殖を誘導した。より具体的には、Ｊａｇ１コートプレート上の総ｈＭＳＣ培養、及び、Ｎｏｔｃｈ２で選択されたｈＭＳＣ培養におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達分子（Ｎｏｔｃｈ２、及び、Ｈｅｓ１）、重要な幹細胞制御分子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及び、Ｎａｎｏｇ）、及び、細胞増殖のマーカー（ＣｙｃＤ１）についてのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現解析により、Ｎｏｔｃｈ２で選択されたｈＭＳＣにおける遺伝子発現の上昇が示された。図１３Ｂは、Ｊａｇ１コートプレート上で培養された総ｈＭＳＣ、Ｎｏｔｃｈ２陰性ｈＭＳＣ、及び、Ｎｏｔｃｈ２陽性ｈＭＳＣに対し行われたＢｒｄＵ  ＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。総ｈＭＳＣ、又は、Ｎｏｔｃｈ２陰性ｈＭＳＣと比較して、Ｎｏｔｃｈ２陽性ｈＭＳＣは細胞増殖の増強を示した。図１３Ｃは、Ｊａｇ１コートプレート上で培養された総ｈＭＳＣ、Ｎｏｔｃｈ２陰性ｈＭＳＣ、及び、Ｎｏｔｃｈ２陽性ｈＭＳＣに対し行われたＣＦＵ−Ｆアッセイの結果を示す。総ｈＭＳＣ、又は、Ｎｏｔｃｈ２陰性ｈＭＳＣと比較して、Ｎｏｔｃｈ２で選択されたｈＭＳＣは幹細胞増殖の増大を示した。
【００６２】
実施例４：  Ｎｏｔｃｈ２で選択されたｈＭＳＣは軟骨形成と骨形成の強化された特質を示す。
【００６３】
図１４Ａ、及び、１４Ｃで示されるように、Ｎｏｔｃｈ２で選択されたｈＭＳＣは軟骨形成と骨形成の強化された特質を示した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現解析により、二週間から三週間、軟骨形成性条件、又は、骨形成性条件での培養の後、総ｈＭＳＣ、及び、Ｎｏｔｃｈ２陰性ｈＭＳＣと比較して、Ｎｏｔｃｈ２陽性ｈＭＳＣにおける軟骨形成マーカー遺伝子（Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、及び、Ａｇｃ１）（Ａ）及び骨形成マーカー遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ａｐ、及び、Ｏｃ）（Ｃ）の増加が示された。軟骨形成分化に引き続く総ｈＭＳＣ、Ｎｏｔｃｈ２陰性ｈＭＳＣ、及び、Ｎｏｔｃｈ２陽性ｈＭＳＣ（第２継代培養）のアルシアンブルー染色が図１４Ｂに示される。軟骨形成分化に引き続くＮｏｔｃｈ２陰性ｈＭＳＣ、及び、Ｎｏｔｃｈ２陽性ｈＭＳＣ（第２継代培養、及び、第５継代培養）のＡＰ染色が図１４Ｄに示される。ｈＭＳＣは、最初、Ｊａｇ１コートプレートで二週間培養された（３日から４日／継代）。
【００６４】
これらの例は、Ｎｏｔｃｈ２及びＨｅｓ１がヒト骨髄由来ＭＳＣ（ｈＭＳＣ）において発現されるＮｏｔｃｈシグナル伝達分子であることを示す。これらのＮｏｔｃｈ遺伝子と重要な幹細胞制御因子の発現は、ｈＭＳＣが継代されるにつれ、減少した。ｈＭＳＣのＮｏｔｃｈ活性化はＮｏｔｃｈ標的遺伝子の発現ばかりか重要な幹細胞制御分子を誘導することもまた示される。さらに、Ｎｏｔｃｈ２で選択されたｈＭＳＣは、Ｎｏｔｃｈ活性化の後、総ｈＭＳＣ，又は、Ｎｏｔｃｈ２陰性ｈＭＳＣと比較して優れたＮｏｔｃｈ経路遺伝子と幹細胞制御分子の発現誘導、及び、優れた幹細胞増殖を示した。Ｎｏｔｃｈ２で選択されたｈＭＳＣはまた、例えば、Ｊａｇｇｅｄ１を介したｈＭＳＣの維持と増殖からはずされた後、総ｈＭＳＣ，又は、Ｎｏｔｃｈ２陰性ｈＭＳＣと比較して、軟骨形成分化、及び、骨形成分化を起こす優れた能力を示した。
【００６５】
実施例５：  生体外で増殖したＮｏｔｃｈ２陽性細胞集団の大腿骨同種移植モデルマウスにおける骨欠損治癒に対する効果
Ｎｏｔｃｈ２陽性細胞集団のインビボの効果を評価するために、本明細書に記載される新規のＭＳＣ選択法、並びに、Ｊａｇｇｅｄ１誘導ＭＳＣ維持法、及び、増殖法を用いて十分な数のＮｏｔｃｈ２陽性マウスＭＳＣが作り出される。Ｎｏｔｃｈ２で選択されたＭＳＣと総マウスＭＳＣ（慣例にしたがって選択されたマウスＭＳＣ）が、前記細胞を生体内で捜し出すことができるＲｏｓａ２６ＬａｃＺマウスより単離される。細胞の維持と増殖に引き続き、ＭＳＣはＪａｇｇｅｄ１コートプレートよりはずされ、重大な分割型骨欠損の大腿骨同種移植モデルマウスへの移植のための失活した同種移植片に前記細胞が接種される。ＭＳＣ無しの失活した同種移植片が負の対照群として働く。ＭＳＣの取り込み、骨新生、及び、同種移植骨結合過程を評価するためのＸ線解析、マイクロＣＴ解析、組織学解析、免疫組織化学（ＩＨＣ）解析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）解析、及び、細胞系列追跡（ＬａｃＺ染色）解析に用いるため、移植後３日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目、及び、２８日目にマウス集団（５〜８匹）から大腿骨が回収される。実験群と対照群の各々に由来する治癒しつつある骨の強度と完全性を評価するために、特定のエンドポイントで生体力学的なねじり試験もまた行われる。
【００６６】
方法
骨同種移植片の失活
失活した同種移植片の提供のため、１２９系統の１０週齢メスマウスがＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓから入手される。簡単に説明すると、マウスは安楽死させられ、４ｍｍの中央骨幹部分（大腿骨長の約２０％）が回転ドレメルと注文により４ｍｍの間隔で並行して取り付けられた２枚のダイヤモンド刃を用いる骨切断により各大腿骨から取り外される。同種移植片は２５ゲージの注射針で骨髄を洗い流され、骨膜は手作業で引きはがされ、移植片は７０％エタノールで少なくとも４時間、繰返し洗浄される。同種移植片は検査され、必要であれば、残っている細胞が最終的に取り除かれる。前記同種移植片は失活過程を完結するために少なくとも３０日間、１００％エタノール中−８０℃で保存される。
【００６７】
失活した同種移植片へのＭＳＣの接種
（上述した）Ｊａｇｇｅｄ１を介したＭＳＣ維持と増殖に引き続き、Ｎｏｔｃｈ２で選択されたｈＭＳＣ、及び、総ＭＳＣが失活した同種移植片に接種される。簡単に説明すると、前記失活した同種移植片は−８０℃の冷凍庫から取り出され、室温に平衡化される。移植片は、５×１０５個のＭＳＣの最初の接種の３０分前に標準培地を含む９６穴培養プレートに配置される。ＭＳＣは失活化した移植片上で、さらに３０分間、３７℃、５％二酸化炭素中で保温される。前記移植片は１８０°回転され、さらに５×１０５個のＭＳＣが移植片の他方の面に接種され、ＭＳＣが完全に、且つ、均一に分布するようにされる。ＭＳＣが接種されて「再活性化した」同種移植片は３７℃、５％二酸化炭素中で約１時間、保温され、細胞が前記移植片に十分に付着して同化する。ＭＳＣを受け取らない前記の失活した同種移植片は移植の前に同じ培養条件におかれる。失活した骨同種移植片、及び、ＭＳＣで再活性化した骨同種移植片のすべては、その後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊレシピエントマウスに作られた４ｍｍの区域性欠損に移植される。
【００６８】
マウス大腿骨欠損の外科的再建
１０週齢のメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスが同種移植のレシピエントとして全ての実験において用いられた。前記マウスはケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ体重）及びキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射により麻酔される。７ｍｍから８ｍｍの側方皮膚切開がなされ、鈍的に筋肉を切開することにより大腿骨の中軸が露出される。４ｍｍの中央骨幹部分が上述したように骨切断により大腿骨から取り外される。２２ゲージの注射針を用いて髄管が近位に、及び、遠位に切開される。前記の調製された失活した同種移植片、及び、ＭＳＣで再活性化された同種移植片が、それから、４ｍｍの前記欠損に挿入され、髄内の髄腔を通して配置される滅菌されたチタニウムのピンによって固定される。髄内のピンは膝と臀部の両方で曲げられ、ピンが固定化される。前記切開は、最初の画像研究を考慮して断続絹糸縫合によって閉じられ、それに引き続いて、皮膚が外科用ホッチキスにより閉じられた。骨移植によって誘起されるどのような激しい疼痛をも制御するために、ブプレノルフィン（０．５ｍｇ／ｋｇ）が手術後に与えられうる。移植されたサンプルは、移植片治癒、並びに、骨形成に対するＭＳＣの寄与の評価のため、３日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目、及び、２８日目に回収される。
【００６９】
マイクロＣＴ骨画像解析
１４日目、２１日目、及び、２８日目のサンプルに由来する再建された大腿骨のうちのいくつか（５サンプル）は、慎重な切開と髄内のピンの除去の後、マイクロＣＴシステム（ＶｉｖａＣＴ  ４０，  Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて画像化される。簡単に説明すると、５５  ｋＶｐおよび１４５  iＡの高解像度（１０．５ミクロン）Ｘ線エネルギー設定、２００ミリ秒の積分時間、及び、円錐ビーム再構築アルゴリズムを利用するプロトコルを用いて前記大腿骨がスキャンされる。移植された同種移植片上の中央部に位置する中央骨幹の約８．００ｍｍ（約８００枚）の領域がスキャンされる。骨と移植片の容積、及び、骨塩量（ＢＭＤ）の定量がＳｃａｎｃｏ解析ソフトウェアを用いて行われる。
【００７０】
生体力学的試験
マイクロＣＴ画像化の後、標本は生理食塩水で湿らされ、生体力学的試験のために融解されるまで−２０℃で凍結される。直線的な軸の配列を確保し、７ｍｍから８ｍｍのゲージ長を維持するために、前記大腿骨の末端は、注文生産の治具内のＰＭＭＡを用いて６．３５ｍｍ平方のアルミニウムチューブホルダーに接着され、各末端で少なくとも３ｍｍの長さがホルダーに収まるようにされる。組織の再水和とＰＭＭＡの硬化を見越して、標本はホルダーに収められた後、室温で２時間ＰＢＳに浸される。標本はＥｎｄｕｒａＴｅｃ  ＴｅｓｔＢｅｎｃｈTMシステム（２００  Ｎ．ｍｍトルクセル；Ｂｏｓｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に据えられ、１°／秒の速度で破損するまでねじれ力について試験される。トルクデータは、回転ひずみ（ゲージ長で正規化され、ｒａｄ／ｍｍで表される。）に対してプロットされ、終局トルク（ＴＵｌｔ）、降伏トルク、ねじり剛性（ＴＲ；トルクで正規化された回転ひずみ曲線の直線部分の傾きから計算される。）、及び、ねじり破断エネルギー（トルクひずみ曲線の下の面積）が決定される。破損するまでの試験されたのち、破損の様式を検討するために、全てのサンプルはＸ線で調べられる。
【００７１】
移植された大腿骨の組織学的、及び、分子的評価
組織学分析、及び、分子的解析に用いられる予定の大腿骨サンプルは中性緩衝ホルマリン中で３日間固定され、１４％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）の中で脱カルシウム化され、そして、パラフィン中で加工される。３日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目、２８日目のサンプル由来のパラフィン包埋サンプル（５サンプル）は５μｍの厚みの切片にされる。治癒しつつある大腿骨内の定められた深度にある、ブロックあたり何枚かの切片がオレンジＧ／アルシアンブルー（Ｈ＆Ｅ）で染色され、軟骨、骨、及び、繊維組織の寄与が判定されるであろう。間に存在する未染色の切片は、先述したようにＳ−３５標識されたリボプローブを用いて軟骨細胞分化の特異的なマーカー（Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１、Ａｇｃ１、Ｃｏｌ１０ａ１、及び、Ｍｍｐ１３）、及び、造骨細胞分化の特異的なマーカー（Ｃｏｌ１ａ１、Ａｐ、Ｂｓｐ、及び、Ｏｃ）についてのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うために使用される。前記骨組織のリモデリングがまたＴＲＡＰ染色法を用いてモニターされるであろう。組織形態計測的解析、並びに、細胞染色と遺伝子発現の領域の定量がＯｓｔｅｏＭｅｔｒｉｃｓシステム、及び、ＯｓｔｅｏＭｅａｓｕｒｅソフトウェアを用いて行われる（Ｔｉｙａｐａｔａｎａｐｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｆｅｍｏｒａｌ  ｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ．  Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  ２００４；２２−６：１２５４−６０．を参照のこと。）。
【００７２】
βガラクトシダーゼ染色、及び、ＭＳＣ細胞系列追跡
ＭＳＣ細胞系列追跡解析に使用される予定の大腿骨サンプルは、４％パラホルムアルデヒドで２時間固定され、１４％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）の中で脱カルシウム化され、１５％と３０％のショ糖勾配を通して加工され、Ｏ．Ｃ．Ｔ．包埋媒体中で凍結される。３日目、１４日目、及び、２８日目のサンプル由来の凍結サンプル（３サンプル）は８μｍの厚みの切片にされるであろう。治癒しつつある大腿骨内のさまざまな深度に由来する切片が集められ、βガラクトシダーゼについて染色されるであろう。切片は以下に説明するように解析される。凍結された切片の何枚かがＬａｃＺ染色細胞の細胞系列の範囲を定めるための二重染色法に利用されるであろう。これらの切片は、まず、βガラクトシダーゼ染色にかけられ、それから直ちに、軟骨細胞系列（Ｃｏｌ２ａ１、Ｃｏｌ１０ａ１）、及び、造骨細胞系列（Ｂｓｐ、Ｏｃ）に特異的なプローブ、及び、抗体を用いるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び／又は、免疫組織化学のために使用されるであろう。二重に標識された組織切片の染色、画像化、及び、画像解析は先に説明されたように行われた（Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００８；１４−３：３０６−１４を参照のこと）。
【００７３】
Ｘ線法、マイクロＣＴ法、組織学的方法、ＩＨＣ法、ＩＳＨ法、ＬａｃＺ染色法、及び、生体力学試験法によって測定されるとき、Ｎｏｔｃｈ２で選択され、維持され、増殖されたマウスＭＳＣは、慣例的に選択されたＭＳＣを用いる再活性化された同種移植片、又は、失活した同種移植片のみよりも強力な効果を再活性化された同種移植片の取り込みに対して示すであろう。さらに、組織学的、及び、分子的解析により、Ｎｏｔｃｈ２で選択されたＭＳＣで再活性化された同種移植片は軟骨形成分化での早い時期の増強とそれに引き続く造骨細胞分化の増強と骨の蓄積を示すことが示されるであろう。骨リモデリング過程は、ＴＲＡＰ染色で評価すると、Ｎｏｔｃｈ２で選択されたＭＳＣ集団と総ＭＳＣ集団の両方において類似するであろう。最後に、Ｎｏｔｃｈ２で選択されたＭＳＣを使用して再活性化された同種移植片に由来するβガラクトシダーゼ染色と細胞系列追跡のデータは、総ＭＳＣを使用して再活性化された同種移植片と比較して、増強された、直接ドナー細胞からの骨形成に至るより多くの軟骨形成に分化した細胞系列と骨形成に分化した細胞系列を示すであろう。
【００７４】
多くの実施形態が記載されてきた。それでも、様々に改変がなされうることが理解されるであろう。したがって、その他の実施形態は、次の請求項の範囲内である。
【図４Ｃ】
2013518588.tif 000004
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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