(57)【要約】本発明は、ペルオキシレドキシン（Peroxiredoxin,Prx）タンパク質に放射線を照射してシャペロン活性を増進させる方法に関する。詳細には、ペルオキシレドキシンの二つの活性システインモチーフ（Active cysteine motif）である二種類のペルオキシレドキシン（２−Ｃｙｓ，３−Ｃｙｓ）に放射線を照射した後、タンパク質の構造変化及びシャペロン活性を分析した結果、放射線の照射によってαヘリックス構造が減少して、βシート構造が増加するというシャペロン活性増加の特徴が観察された。したがって、ペルオキシレドキシンのシャペロン活性を増進させて多様な環境ストレスに対する抵抗性を提供する組換えタンパク質及びその製造に有用に使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシレドキシン（Peroxiredoxin）タンパク質に放射線を照射して、シャペロン活性を増進させる方法。
【請求項２】
ペルオキシレドキシンタンパク質が、２個または３個のシステイン残基を有する２−システインペルオキシレドキシンであることを特徴とする、請求項１に記載のシャペロン活性を増進させる方法。
【請求項３】
ペルオキシレドキシンタンパク質が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項２に記載のシャペロン活性を増進させる方法。
【請求項４】
放射線が、ガンマ線、電子線（ベータ線）及び紫外線からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載のシャペロン活性を増進させる方法。
【請求項５】
ガンマ線の照射線量が、１〜５００ｋＧｙであることを特徴とする、請求項４に記載のシャペロン活性を増進させる方法。
【請求項６】
電子線の照射線量が、１〜３０ｋＧｙであることを特徴とする、請求項４に記載のシャペロン活性を増進させる方法。
【請求項７】
紫外線の照射線量が、５〜２４０Ｗであることを特徴とする、請求項４に記載のシャペロン活性を増進させる方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法によって製造された、シャペロン活性が増進したペルオキシレドキシン。
【請求項９】
請求項８に記載のペルオキシレドキシンを有効成分として含有する環境ストレス抵抗性増進用組成物。
【請求項１０】
環境ストレス抵抗性増進用組成物を製造するための、請求項８に記載のペルオキシレドキシンの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシレドキシンタンパク質のシャペロン活性を増進させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素種（ＲＯＳ）は、好気性代謝過程や、生物個体が多様なストレス条件に露出した時に発生する（非特許文献１）。このような活性酸素種は、生物学的巨大分子（タンパク質、脂質、核酸など）の酸化的機能阻害や構造変化などの深刻な被害を与え、多様な疾病の原因になる（非特許文献２）。すべての好気性生物体は、酸化的ストレスや活性酸素種によって媒介されるタンパク質の変性（Denaturation）とそのような変性から誘導されるタンパク質の凝集（Aggregation）から自身を保護するために、多様な抗酸化タンパク質とともに熱ショックタンパク質のような多様な形態の分子的シャペロン（Chaperone）を有している。
【０００３】
ペルオキシレドキシン（Peroxiredoxin，Ｐｒｘ）は、大部分の真核細胞と原核細胞で発見された（非特許文献３）。ペルオキシレドキシンは、チオレドキシン構造部分を有するタンパク質と全体的なアミノ酸配列において類似性は高くないが、チオレドキシン部類に分類されている（非特許文献４）。ペルオキシレドキシンタンパク質は、保存されたシステイン（Ｃｙｓ）残基の数によって１−システインペルオキシレドキシンと２−システインペルオキシレドキシンに分類される。それらはよく保存されたシステイン残基と構造的、触媒的特徴によって、１−Ｃｙｓ  Ｐｒｘ、２−Ｃｙｓ  Ｐｒｘ、ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｐｒｘ（Ｐｒｘ  ＩＩ）、Ｐｒｘ  Ｑ及びＧＰｘｓの５種類に区分される。その中でも特に、２−システインペルオキシレドキシン（2-Cys peroxiredoxin）が最も広範囲に研究されている。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）において２−システインペルオキシレドキシンは、葉緑体においてチラコイド膜のストロマ表面に付着して酸化的損傷から葉緑体タンパク質を保護することが知られている（非特許文献５）。活性酸素種によって誘導されるストレスから葉緑体を保護するために、２−システインペルオキシレドキシンの活性部位のシステイン残基は、スルフェン形態及びスルフィン形態に酸化されて、スルフェン形態はチオレドキシン−ｈ（Ｔｒｘ−ｈ）、チオレドキシン−ｆ（Ｔｒｘ−ｆ）、チオレドキシン−ｍ（Ｔｒｘ−ｍ）によって再び還元され（非特許文献６、非特許文献７）、スルフィン形態はスルフィレドキシンとセストリンというタンパク質によって還元される（非特許文献８）。ペルオキシレドキシンは、過酸化物媒介シグナル伝達過程を調節するという報告とともに、細胞の増殖、分化、免疫反応、成長調節、癌細胞の増殖、細胞死過程、そして定義されない多くの機能を有することが知られている（非特許文献９、非特許文献１０）。
【０００４】
また、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンは、多様な種類の癌やアルツハイマー病、ピック病、ダウン症候群のような退行性脳疾患で発現すると報告された（非特許文献１１〜１６）。このような２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンの発現の増加は、癌細胞と退行性疾患において、酸化的ストレスから細胞を保護するためであると推定されている。
【０００５】
【化１】
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【０００６】
【化２】
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ペルオキシダーゼ活性としては、ＮＡＤＰＨがＮＡＤＰ＋に転換されながら電子（Ｈ＋）をチオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）に伝達して、このＴＲは再びチオレドキシン（Ｔｒｘ）に電子を伝達しながら酸化されて、ＴＲから電子を受けて還元されたＴｒｘは、ペルオキシレドキシンに電子を伝達してＴｒｘは酸化され、還元されたペルオキシレドキシンはＨ２Ｏ２をＯ２＋Ｈ２Ｏに分解する。このようなサイクルはＮＡＤＰＨの消耗によって継続的に反復される。
【０００７】
シャペロン（Chaperone）は、タンパク質のフォールディング（Folding）に関与するタンパク質で、例えばタンパク質が熱衝撃のようなストレスを受けると、タンパク質は正しくフォールディングされた３次元構造が解かれて自身の役割を正常に遂行することができなくなる。シャペロンはこのように解かれたタンパク質を認識して結合し、それらが正しくフォールディングすることができる適切な環境を作る役割をするタンパク質を意味する。
【０００８】
分子的シャペロン活性は、ホルダーゼ（Holdase）活性とフォールダーゼ（Foldase）活性とに区別される。タンパク質がストレス（酸化的ストレス、熱ストレス）に露出すると、フォールディングしていた３次構造の一部が変性により解かれ、疎水性のアミノ酸残基が露出するようになり、このような過程が進むと変性したタンパク質は不規則的にまとまって凝集体（Aggregates）に変化し、タンパク質分解酵素によって分解されてなくなるが、ホルダーゼは、例えばシャペロンタンパク質（ＳＨＳＰｓ，ＤｎａＪ）がストレスによって部分的に解かれたタンパク質の疎水性アミノ酸に結合して凝集体に進行することを防止し、元の３次元構造に戻ることができる環境を作り出す機能を有する。
【０００９】
【化３】
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新しいタンパク質がｍＲＮＡを鋳型にリボソームタンパク質によって合成されると、元来定められた３次元構造でタンパク質がフォールディングするが、フォールダーゼは、その時にシャペロンタンパク質（ＧｒｏＥＬ／ＥＳ，ＤｎａＫ／Ｊ／Ｅ）が新たに伸びたアミノ酸鎖に結合して正確な３次元構造にフォールディングされるのを助ける環境を作り出す機能を有する。
【００１０】
【化４】
2013541341.tif 000006
２−システインペルオキシレドキシンが、ペルオキシダーゼとシャペロンの二重酵素活性を有することは既に知られている。また、２個のシステイン以外の過剰なシステインがペルオキシレドキシンの構造的変化に影響を及ぼすことが知られている。特に、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０のＰＰ１０８４タンパク質は、２−システインペルオキシレドキシンタンパク質であって二重酵素活性を有するが、その中でもシャペロン活性が非常に強力で、高分子構造を比較的形成し易いことが明らかにされた。また、二つの活性システインの間に追加のシステインがあり、そのシステインによる構造的変化がその強力なシャペロン活性に影響を及ぼすことが報告された。
【００１１】
そこで、本発明者らはペルオキシレドキシンタンパク質（２−Ｃｙｓ、３−Ｃｙｓ）のシャペロン活性を増進させるように努力した結果、ペルオキシレドキシンタンパク質がガンマ線の照射によって低分子化されて、ジチロシン結合が増加し、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンタンパク質ではβシートとランダムコイルの増加、及びαヘリックスとターン構造の減少が観察され、３−Ｃｙｓペルオキシレドキシンタンパク質では二次構造の変化が観察されないということを明らかにすることで、シャペロン活性増進に係わるタンパク質の構造変化に対する新しい結果を提示し、そのようなペルオキシレドキシンタンパク質の構造変化はシャペロン活性に関与する疎水性の増加を誘導し、具体的には１５〜３０ｋＧｙのガンマ線の照射範囲で、ペルオキシレドキシンタンパク質のシャペロン活性が非照射群に比べて３倍以上増加することから、その活性が最適化されることを確認して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Finkel T.,Curr.Opin.Cell Biol.,2003年,第15巻,p.247-254
【非特許文献２】Neumannら,Nature,2003年,第424巻,p.561-565
【非特許文献３】Chaeら,J.Biol.Chem.,1994年,第69巻,p.27670-27678
【非特許文献４】Schroderら,Protein Sci.,1998年,第7巻,p.2465-2468
【非特許文献５】Baierら,Plant Phsiol.,1999年,第199巻,p.1407-1414
【非特許文献６】Motohashiら,Proc.Natl.Acad.Sci., 2001年,第98,p.11224-11229
【非特許文献７】Balmerら,Proc.Natl.Acad.Sci.,2003年,第100巻,p.370-375
【非特許文献８】Beteauら,Nature,第425巻,p.980-984
【非特許文献９】Neumannら,Nature,2003年,第424巻,p.561-565
【非特許文献１０】Hirotsuら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1999年,第96巻,p.12333-12338
【非特許文献１１】Noh,D.Y.ら,Anticancer Res,2001年
【非特許文献１２】Yanagawa,T.ら,Cancer Lett,1999年
【非特許文献１３】Kinnula,V.L.ら,J.Pathol.,2002年
【非特許文献１４】Chang,W.J.ら,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2001年
【非特許文献１５】Multhaup,G.ら,Biochem.Pharmacol,1997年
【非特許文献１６】Krapfenbauer,K.ら,Brain Res.,2003年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、ペルオキシレドキシン（Peroxiredoxin，Ｐｒｘ）タンパク質のシャペロン活性を増進させる方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記方法によって製造されたシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンタンパク質及びその使用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明はペルオキシレドキシンタンパク質に放射線を照射してシャペロン活性を増進させる方法を提供する。
また、本発明は放射線の照射によってシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンを提供する。
【００１５】
また、本発明はシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンを有効成分として含有する環境ストレス抵抗性増進用組成物を提供する。
同時に、本発明は環境ストレス抵抗性増進用組成物を製造するための、放射線の照射によってシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンの使用方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のペルオキシレドキシンタンパク質にガンマ線を照射してシャペロン活性を増進させる方法は、ガンマ線の照射によってシャペロンの活性が最適化する条件を確立し、このようなシャペロン活性の増進がペルオキシレドキシンタンパク質の構造変化と関係するものであるということを明らかにし、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンタンパク質では一般的に知られているαヘリックス構造の減少及びβシート構造の増加が観察された一方、３−Ｃｙｓペルオキシレドキシンタンパク質では二次構造の変化が観察されないということを明らかにすることにより、シャペロン活性増進に係わるタンパク質の構造変化に対する新しい結果を提示する。本発明によるシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンは環境ストレスに対する耐性を増進させることができるので、農作物を含む多様な生物体の生産性増大及び有用成分の大量生産に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】発現ベクターｐＲＳＥＴａにＰＰ１０８４（３−Ｃｙｓ）遺伝子をサブクローニングしたことを確認した図である。Ｍ：マーカー、１２〜１５：ｐＲＳＥＴａ：：ＰＰ１０８４（３−Ｃｙｓ）。
【図２】発現ベクターｐＲＳＥＴａにＰＡ３５２９（２−Ｃｙｓ）遺伝子をサブクローニングしたことを確認した図である。Ｍ：マーカー、１〜５：ｐＲＳＥＴａ：：ＰＡ３５２９（２−Ｃｙｓ）。
【図３】大腸菌（ＫＲＸ）でＰＰ１０８４タンパク質の発現を確認した図である。Ｍ：マーカー、Ｃ：ＰＰ１０８４タンパク質を過発現させない対照群、１〜１１：０．２％ラムノ−ス（L-rhamnose）を添加してＰＰ１０８４タンパク質の過発現を誘導したＰＰ１０８４形質転換体。
【図４】大腸菌（ＫＲＸ）でＰＡ３５２９タンパク質の発現を確認した図である。Ｍ：マーカー、１〜５：０．２％ラムノ−ス（L-rhamnose）を添加してＰＡ３５２９タンパク質の過発現を誘導したＰＡ３５２９形質転換体。
【図５】ＰＰ１０８４タンパク質を精製して得た分画物を確認した図である。Ｍ：マーカー、１：分画物１、２：分画物２、３：分画物３。
【図６】ＰＰ１０８４タンパク質にガンマ線を照射した後、構造変化をポリアクリルアミドゲルにローディングして確認した図である。Ｍ：マーカー、１：０ｋＧｙのガンマ線を照射した群、２：５ｋＧｙのガンマ線を照射した群、３：１５ｋＧｙのガンマ線を照射した群、４：３０ｋＧｙのガンマ線を照射した群、５：５０ｋＧｙのガンマ線を照射した群、６：１００ｋＧｙのガンマ線を照射した群、７：２００ｋＧｙのガンマ線を照射した群、８：３００ｋＧｙのガンマ線を照射した群、９：４００ｋＧｙのガンマ線を照射した群、１０：５００ｋＧｙのガンマ線を照射した群。
【図７】ＰＡ３５２９タンパク質にガンマ線を照射した後、構造変化をポリアクリルアミドゲルにローディングして確認した図である。Ｍ：マーカー、１：０ｋＧｙのガンマ線を照射した群、２：５ｋＧｙのガンマ線を照射した群、３：１５ｋＧｙのガンマ線を照射した群、４：３０ｋＧｙのガンマ線を照射した群、５：５０ｋＧｙのガンマ線を照射した群、６：１００ｋＧｙのガンマ線を照射した群、７：２００ｋＧｙのガンマ線を照射した群、８：３００ｋＧｙのガンマ線を照射した群、９：４００ｋＧｙのガンマ線を照射した群、１０：５００ｋＧｙのガンマ線を照射した群。
【図８】ガンマ線照射量によるＰＰ１０８４タンパク質のシャペロン活性変化を確認したグラフである。
【図９】ガンマ線照射量によるＰＡ３５２９タンパク質のシャペロン活性変化を確認したグラフである。
【図１０】高線量ガンマ線によるＰＰ１０８４タンパク質の構造変化をＦＰＬＣを用いて分析した結果を示したグラフである。
【図１１】高線量ガンマ線によるＰＡ３５２９タンパク質の構造変化をＦＰＬＣを用いて分析した結果を示したグラフである。
【図１２】高線量ガンマ線によるＰＰ１０８４タンパク質の部分的構造的変化を確認した結果を示した図である。
【図１３】高線量ガンマ線によるＰＡ３５２９タンパク質の部分的構造的変化を確認した結果を示した図である。
【図１４】高線量ガンマ線によるＰＰ１０８４タンパク質のジチロシン結合の増加を確認した結果を示した図である。
【図１５】高線量放射線の一ＰＰ１０８４タンパク質の疎水性変化を分析したグラフである。
【図１６】高線量放射線の一ＰＡ３５２９タンパク質の疎水性変化を分析したグラフである。
【図１７】高線量放射線によるＰＰ１０８４タンパク質の二次構造変化を分析したグラフである。
【図１８】高線量放射線によるＰＡ３５２９タンパク質の二次構造変化を分析したグラフである。
【図１９】ＵＶ線の照射によるＰＡ３５２９タンパク質のシャペロン活性の増加を示したグラフである。
【図２０】ＵＶ線の照射によるＰＡ３５２９タンパク質のチオレドキシンペルオキシダーゼ活性の減少を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、ペルオキシレドキシンタンパク質に放射線を照射してシャペロン活性を増進させる方法を提供する。
【００１９】
シャペロン活性を増進させる方法において、ペルオキシレドキシンタンパク質は、２−システインペルオキシレドキシンまたは３−システインペルオキシレドキシンであることを特徴とするが、これらに限定されない。２−システインペルオキシレドキシンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とするが、これに限定されず、３−システインペルオキシレドキシンタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とするが、これに限定されない。
【００２０】
シャペロンの活性を増進させるために照射される放射線は、ガンマ線、電子線（ベータ線）、エックス線及び紫外線からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましく、ガンマ線または紫外線であることがさらに好ましいがそれらに限定されない。シャペロンの活性を増進させるために照射されるガンマ線は、１〜５００ｋＧｙであることが好ましく、さらに２〜１００ｋＧｙであることが好ましく、１５〜３０ｋＧｙであることが最も好ましいが、これに限定されない。また、シャペロンの活性を増進させるために照射される電子線は、１〜３０ｋＧｙであることが好ましく、１５〜３０ｋＧｙであることがさらに好ましいが、これに限定されない。同時に、シャペロンの活性を増進させるために照射される紫外線は、５〜２４０Ｗであることが好ましいが、これに限定されない。
【００２１】
本発明の実施例において、緑膿菌ＰＡＯ１及びシュードモナス・プチダＫＴ２４４０からのＰＰ１０８４（３−Ｃｙｓ）遺伝子及びＰＡ３５２９（２−Ｃｙｓ）遺伝子を発現ベクターｐＲＳＥＴａにクローニングした後、それを用いてタンパク質を生産して精製した（図１ないし図５参照）。精製された２種類のＰｒｘタンパク質（ＰＰ１０８４、ＰＡ３５２９）に０〜５００ｋＧｙのガンマ線を照射して、構造を変化させるガンマ線量を確認した。２種類のＰｒｘタンパク質はともに、１００ｋＧｙ以上を照射した時にその構造がほぼ破壊されることを確認することができた（図６及び図７参照）。
【００２２】
また、本発明の実施例において、前記精製された２種類のＰｒｘタンパク質に対するガンマ線の照射範囲を把握した後、ガンマ線の照射によってシャペロン活性が増加するか否かを確認した結果、３０ｋＧｙのガンマ線照射量でＰＰ１０８４タンパク質及びＰＡ３５２９タンパク質の両方においてシャペロン活性が最も増加することが確認された（図８及び図９参照）。このように増加したシャペロン活性とＰｒｘタンパク質の構造変化との関係を確認するために、ガンマ線を照射した２種類のＰｒｘタンパク質の構造をＦＰＬＣを用いて分析した。その結果、ＰＰ１０８４（３−Ｃｙｓ）タンパク質及びＰＡ３５２９（２−Ｃｙｓ）タンパク質は、ガンマ線照射後、分子量が大きいタンパク質グループ及び分子量が小さいタンパク質グループを生成して、低分子化されることが確認された（図１０及び図１１参照）。
【００２３】
また、本発明の実施例において、高線量ガンマ線を照射した後のＰｒｘタンパク質の構造変化を確認するために、照射されたＰｒｘタンパク質を還元環境でＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した。その結果、ガンマ線を照射しないＰｒｘタンパク質では２５ｋＤａの分子量が観察されたが、ガンマ線を照射したタンパク質では還元剤によって還元されない新しい共有結合が生成された。生成された共有結合を確認するために、一般的に酸化状態で生成されることが知られているジチロシン結合の生成の有無を、ガンマ線が照射されたＰＰ１０８４タンパク質について確認した結果、チロシン結合が３０ｋＧｙと５０ｋＧｙで増加することが確認された（図１２ないし図１４参照）。
【００２４】
また、本発明の実施例において、シャペロン活性に影響を及ぼすタンパク質の疎水性変化を確認するために、ガンマ線の照射によるＰｒｘタンパク質の疎水性変化を観察した結果、シャペロン活性を最も多く増進させた３０ｋＧｙのガンマ線量でＰＰ１０８４タンパク質及びＰＡ３５２９タンパク質の疎水性が増加することが確認された（図１５及び図１６参照）。
【００２５】
また、本発明の実施例において、ガンマ線の照射後のＰｒｘタンパク質の二次構造の変化を観察した。一般的にシャペロン活性が増進した時に観察されるαヘリックスの減少とβシートの増加が、２−Ｃｙｓ  ＰＡ３５２９タンパク質で観察されたが、３−Ｃｙｓ  ＰＰ１０８４タンパク質では二次構造の変化は観察されなかった（図１７及び図１８参照）。
【００２６】
また、本発明の実施例において、紫外線の照射によってシャペロン活性が増加するか否かを確認するため、紫外線の照射後のシャペロン活性及びチオレドキシンペルオキシダーゼ活性を測定した結果、紫外線の照射時間が増加するにつれて分子シャペロン活性が増加した一方、チオレドキシンペルオキシダーゼ活性は減少することが確認された（図１９及び図２０参照）。
【００２７】
以上より、放射線の照射によってペルオキシレドキシンタンパク質のシャペロン活性が非照射群に比べて顕著に増加することが明らかになった。したがって、本発明により、放射線の照射を用いてペルオキシレドキシンのシャペロン活性を増進できることが判明した。
【００２８】
より具体的には、ペルオキシレドキシンタンパク質がガンマ線の照射によって低分子化されて、ジチロシン結合が増加し、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンタンパク質ではタンパク質二次構造のβシートとランダムコイルが増加して、αヘリックス及びターン構造の減少が観察された一方、３−Ｃｙｓペルオキシレドキシンタンパク質では二次構造の変化が観察されないということを明らかにすることで、シャペロン活性増進に係わるタンパク質の構造変化に対する新しい結果を提示した。また、このようなペルオキシレドキシンタンパク質の構造変化は、シャペロン活性に関与する疎水性の増加を誘導して、１５〜３０ｋＧｙのガンマ線の照射範囲でペルオキシレドキシンタンパク質のシャペロン活性が非照射群に比べて３倍以上増加することから、その活性が最適化されることを確認した。また、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンタンパク質がガンマ線以外に紫外線の照射によってもシャペロン活性が非照射群に比べて顕著に増加する結果を提示した。
【００２９】
したがって、本発明による放射線を照射する方法を、ペルオキシレドキシンのシャペロン活性を増進させる方法として有用に使用することができる。
また、本発明は、放射線の照射によってシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンを提供する。
【００３０】
本発明において、ペルオキシレドキシンタンパク質は、２−システインペルオキシレドキシンまたは３−システインペルオキシレドキシンであることを特徴とするが、これらに限定されない。２−システインペルオキシレドキシンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とするが、これに限定されず、３−システインペルオキシレドキシンタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とするが、これに限定されない。
【００３１】
本発明において、放射線は、ガンマ線、電子線（ベータ線）、エックス線及び紫外線からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましく、ガンマ線または紫外線であることがさらに好ましいが、それらに限定されない。シャペロンの活性を増進させるために照射するガンマ線は、１〜５００ｋＧｙであることが好ましく、２〜１００ｋＧｙであることがさらに好ましく、最も好ましいのは１５〜３０ｋＧｙであるが、これに限定されない。また、シャペロンの活性を増進させるために照射される電子線は、１〜３０ｋＧｙであることが好ましく、１５〜３０ｋＧｙであることがさらに好ましいが、これに限定されない。同時に、シャペロンの活性を増進させるために照射される紫外線は、５〜２４０Ｗであることが好ましいが、これに限定されない。
【００３２】
本発明の実施例において、ガンマ線または紫外線などの放射線の照射によってペルオキシレドキシンのシャペロン活性が増進されることが観察され、１５〜３０ｋＧｙ範囲のガンマ線をペルオキシレドキシンに照射した時、ペルオキシレドキシンの低分子化、ジチロシン結合の増加のような構造変化が観察され、このような構造変化がペルオキシレドキシンタンパク質の疎水性を増加させることによってシャペロンの活性を非照射群に比べて３倍以上増進させるということが明らかとなった。また、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンタンパク質が、ガンマ線以外に紫外線の照射によってもシャペロン活性が非照射群に比べて顕著に増加する結果を提示した。
【００３３】
したがって、本発明による放射線を照射する方法を用いて、シャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンタンパク質を製造することができる。
また、本発明は、本発明によるシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンを有効成分として含有する環境ストレス抵抗性増進用組成物を提供する。
【００３４】
同時に、本発明は環境ストレス抵抗性増進用組成物を製造するための本発明によるシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンの使用方法を提供する。
本発明の実施例において、ガンマ線または紫外線などの放射線の照射によってペルオキシレドキシンのシャペロン活性が増進されることが確認され、１５〜３０ｋＧｙ範囲のガンマ線をペルオキシレドキシンに照射した時、ペルオキシレドキシンの低分子化、ジチロシン結合の増加のような構造変化が観察され、このような構造変化がペルオキシレドキシンタンパク質の疎水性を増加させることによってシャペロンの活性を非照射群に比べて３倍以上増進させるということを明らかにした。また、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンタンパク質が紫外線の照射によってもシャペロン活性が非照射群に比べて顕著に増加する結果を提示した。
【００３５】
したがって、本発明による放射線の照射によって製造されたシャペロン活性が増進したペルオキシレドキシンは、環境ストレスに対する耐性を増進させることができるので、環境ストレス抵抗性増進用組成物として有用に使用することができる。
【００３６】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
ただし、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞ペルオキシレドキシン（ＰＰ１０８４，ＰＡ３５２９）タンパク質の製造
＜１−１＞ペルオキシレドキシン（ＰＲＸ）遺伝子のクローニング
ＰＲＸ遺伝子を、緑膿菌ＰＡＯ１及びシュードモナス・プチダＫＴ２４４０のゲノムＤＮＡからそれぞれポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて得、クローニングベクターであるｐＧＥＭＴ−easyベクターにクローニングし、塩基配列分析を用いて遺伝子を確認した。その後、発現ベクターであるｐＲＳＥＴａベクターの多重クローニング部位の制限酵素位置に遺伝子をサブクローニングした。
【００３７】
まず、ＰＰ１０８４遺伝子のクローニングのために下記の条件でＰＣＲを行なった。ＰＣＲ条件は、緑膿菌ＰＡＯ１及びシュードモナス・プチダＫＴ２４４０のゲノムＤＮＡ  １０ｎｇ、ｄＮＴＰ  ０．２ｕＭ、正方向プライマー２０ｐｍｏｌ、逆方向プライマー２０ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリメラーゼ１ユニット、及び蒸留水を添加して総体積が２０μｌになるようにした。９４℃で１分間の変性過程を１回経た後、９４℃で３０秒間変性、５０℃で３０秒間アニーリング、及び７２℃で４５秒間延長の過程を３５回反復した。その後、７２℃で１０分間の最後の延長過程を１回経た後、ＰＣＲ産物を獲得した。ＰＣＲに使用したプライマーは下記のとおりである。
【００３８】
緑膿菌ＰＡＯ１正方向プライマー：5’-ccgctcgagatgagcgtactc-3’（配列番号３）、
緑膿菌ＰＡＯ１逆方向プライマー：3’-cgagctcttacagcttgccagc-5’（配列番号４）、
シュードモナス・プチダＫＴ２４４０正方向プライマー：
5’-ccgctcgagatgagcgtactcgta -3’（配列番号５）、及び
シュードモナス・プチダＫＴ２４４０逆方向プライマー：
3’-cccaagcttttacagcttgctggc-5’（配列番号６）。
【００３９】
緑膿菌ＰＡＯ１のゲノムＤＮＡでは、ＸｈｏＩ及びＳｃａＩ制限酵素配列を含む配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲ産物を獲得し、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０ゲノムＤＮＡでは、ＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素配列を含む配列番号５及び配列番号６のプライマーを用いてＰＣＲ産物を獲得した。獲得した２種類のＰＲＸ遺伝子をクローニングベクターであるｐＧＥＭＴ−easyベクターに挿入し、塩基配列分析を用いて二つの遺伝子の塩基配列を確認した。そして、発現ベクターであるｐＲＳＥＴａベクターの多重制限酵素クローニング部位の制限酵素位置にそれぞれの遺伝子をサブクローニングした。
【００４０】
その後、発現ベクターｐＲＳＥＴａに挿入されたＰＰ１０８４遺伝子からのＰｒｘタンパク質の発現及び分離精製のために、大腸菌（ＫＲＸ株；Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）を前記ベクターで形質転換した。ｐＲＳＥＴａベクターシステムにおいて、Ｔ７プロモーターを用いて挿入されたＰｒｘタンパク質を過発現させ、Ｐｒｘタンパク質の純粋分離を容易にするためにＰｒｘタンパク質のＮ−末端に６個のヒスチジン（Ｈｉｓ）を付加してタンパク質を合成した。ｐＲＳＥＴａベクターシステムのＴ７プロモーター作動のために、宿主大腸菌細胞内でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを供給した。ＫＲＸ株は、Ｌ−ラムノ−スによってＴ７ＲＮＡポリメラーゼの供給が調節される宿主大腸菌である。Ｐｒｘタンパク質の分離精製のためにＰＰ１０８４タンパク質形質転換体クローンを作成し、１〜１１の番号を付与した（図１）。また、ＰＡ３５２９タンパク質形質転換体クローンを作成し、１〜５の番号を付与した（図２）。
【００４１】
ＰＰ１０８４クローン及びＰＡ３５２９クローンを５ｍｌのＬＢ（Luria-Bertani）培地が入っている１５ｍｌのテストチューブに１：１００の比率で接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで培養した。ＯＤ６００ｎｍの数値が０．４になるまで培養した後、２０％Ｌ−ラムノ−ス（最終０．２％）を添加して、３７℃、１２０ｒｐｍで２時間培養した。１ｍｌのＬ−ラムノ−スによって誘導された細胞を４℃、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得、１００μｌの１×ゲルローディングバッファーを添加して再び懸濁し、１００℃で５分間沸騰させた。用意したそれぞれの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに７μｌずつローディングして電気泳動し、ＰＰ１０８４タンパク質及びＰＡ３５２９タンパク質の過発現を確認した（図３及び図４）。
＜１−２＞ＰＲＸタンパク質の精製
ｐＲＳＥＴａ発現ベクターにクローニングされた２種類のＰＲＸ遺伝子（ＰＰ１０８４及びＰＡ３５２９）を大量生産するために、実施例＜１−１＞で製造したそれぞれの遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）システムを用いて過発現させた後、ＰＰ１０８４クローン及びＰＡ３５２９クローンを４００ｍｌのＬＢ（Luria-Bertani）培地が入っている２ｌ三角フラスコに１：１００の比率で接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで培養した。ＯＤ６００ｎｍの数値が０．４になるまで培養した。その後、２０％Ｌ−ラムノ−ス（最終０．２％）を添加して、３０℃、１２０ｒｐｍで培養した。Ｌ−ラムノ−スによって誘導された細胞を４℃、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得て、０．０２％トリトンＸ−１００が添加されたバインディングバッファー［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール］を用いて懸濁した後、冷凍保管した。バインディングバッファーは、４００ｍｌ  ＬＢに対して３０ｍｌの割合で添加した。超音波粉砕機（Sonicator）を用いて細胞を溶解させた後、溶解物を４℃、１５０００ｒｐｍで４０分間遠心分離して上澄み液のみを分離した。あらかじめ平衡させたＮＴＡ−キレートレジン（peptron,韓国大田市）に前記細胞溶解物を添加した後、４℃で１時間以上ローテーティングホイール（Rotating wheel）で撹拌してレジンに結合させた。撹拌が終わった後、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離してレジンと上澄み液とを分離した。分離したレジンに、レジンの量に対して約５倍程度の洗浄バッファー［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール］を添加して、４℃で１時間以上ローテーティングホイールで撹拌して上澄み液を除去する過程を５回反復した。レジンに対して０．５〜１倍程度の溶出バッファー［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２００〜４００ｍＭイミダゾール］を洗浄したレジンに添加して、１時間以上４℃でローテーティングホイールで撹拌した後、上澄み液を得た。溶出バッファーを添加して上澄み液を得る過程を３回反復した後、得られた上澄み液を溶出画分１、２、及び３に分離して保管した。前記得られた溶出画分をメンブレンチューブに移した後、１ｌの５０ｍＭヘペス（ｐＨ８．０）を用いて３回透析し、バッファーを交換した。その後、セントリコン（Centricon）を用いて濃縮し、実験に用いるまで−８０℃で冷凍保管した。
＜１−３＞ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた精製されたＰｒｘタンパク質の確認
セントリコンを用いて濃縮したタンパク質を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて濃縮されたＰｒｘタンパク質の純度及び濃度を確認した（図５）。
【００４２】
溶出分画物１、２、３のタンパク質をウエスタンブロットを用いて確認した結果、図５に示すように、２５ｋＤａサイズのＰｒｘタンパク質が検出された（図５）。
＜実施例２＞Ｐｒｘタンパク質（２−Ｃｙｓ、３−Ｃｙｓ）の構造変化及びシャペロン活性増進のためのガンマ線線量探索
＜実施例１＞で分離、精製した二種類のＰｒｘタンパク質を１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した後、それぞれ１ｍｌずつエッペンドルフチューブに分注し、０〜５００ｋＧｙ範囲の高線量ガンマ線を照射した。高線量ガンマ線の照射のために、韓国原子力研究院放射線科学研究所の６０Ｃｏガンマ線照射装置（６０Ｃｏ，ｃａ．１５０ＴＢｑキャパシティ；Atomic energy of canada limited，カナダ）を用いた。ガンマ線は、０、２、５、１５、３０、５０、１００、２００、３００、４００、５００ｋＧｙでそれぞれ照射した。
【００４３】
ガンマ線を照射した後、タンパク質の構造変化を確認するためにポリアクリルアミドゲル分析法を用いてタンパク質を分析した。非還元ＰＡＧＥ分析法とネイティブＰＡＧＥ（Native-PAGE）分析法を用いたが、非還元ＰＡＧＥ分析法は、非還元状態のタンパク質構造の分析法であり、ジスルフィド結合によって維持される構造のみを確認することができる。ネイティブＰＡＧＥ分析法は、タンパク質の構造を構成する共有結合及び非共有結合によるタンパク質構造を分析することができる。
【００４４】
０、２、５、１５、３０、５０、１００、２００、３００、４００、５００ｋＧｙのガンマ線を照射した後、同量のタンパク質を電気泳動し、タンパク質をクマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色してタンパク質構造変化を分析した。
【００４５】
その結果、図６に示されるように、ＰＰ１０８４タンパク質は、非還元ＰＡＧＥ分析及びネイティブＰＡＧＥ分析を通じて、ガンマ線を照射しない１番レーンに比べて、５ｋＧｙを照射した時には観察されるバンドの濃さが増加し、１００ｋＧｙからはタンパク質バンドが観察されないという結果を示した。これは照射されたガンマ線によってタンパク質の構造が破壊されて低分子化されたことを示す。また、図７に示されるように、ＰＡ３５２９もガンマ線を照射しない１番レーンに比べて、５〜５０ｋＧｙの強さではバンドが濃くなってから減少する傾向を示し、１００ｋＧｙからはＰＰ１０８４タンパク質と同様に、照射されたガンマ線によってタンパク質の構造が破壊されてタンパク質バンドが観察されないという結果を示した（図６及び図７）。
＜実施例３＞Ｐｒｘタンパク質（２−Ｃｙｓ、３−Ｃｙｓ）のシャペロン活性測定
一般的な例として、タンパク質がストレス（酸化的ストレス、熱ストレス）に露出すると変性してフォールディングされていた３次構造の一部が解け、疎水性のアミノ酸残基が露出する。このような過程がひどくなるにつれて変性したタンパク質が不規則的な凝集体に変化し、タンパク質分解酵素によって分解されてなくなる。ここで、シャペロンタンパク質（例えば、ｓＨＳＰｓ、ＤｎａＪ）は、ストレスによって部分的に解けたタンパク質の疎水性アミノ酸に結合して凝集体に進行することを防止し、元の３次元構造に戻ることができる環境を作り出す機能を有する。
【００４６】
【化５】
2013541341.tif 000007
分子シャペロン活性は、ホルダーゼ（Ｈｏｌｄａｓｅ）活性及とフォールダーゼ（Ｆｏｌｄａｓｅ）活性とに区別され、本実験ではシャペロン機能の中でもホルダーゼの機能を分析した。熱ストレスに敏感なリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）を４３℃に加熱すると、ＭＤＨは変性し始めて凝集体に変化し、ＯＤ６５０ｎｍはＭＤＨの変性によって加熱時間に比例して増加する。しかし、シャペロン活性を有するタンパク質とＭＤＨが共存する状態で４３℃に加熱すると、ＭＤＨの変性は抑制され、したがって吸光度が増加しない。ホルダーゼの機能分析は、この現象を利用するものである。
【００４７】
具体的には、ＭＤＨタンパク質のみが存在する状態で４３℃に加熱しながら、ＯＤ６５０ｎｍの増加率を測定した。また、ＭＤＨタンパク質に対するそれぞれの割合でペルオキシレドキシンタンパク質を添加して４３℃に加熱しながら、ＯＤ６５０ｎｍの増加率を測定した。測定は、下記の表１及び表２に示す条件で行った。
【００４８】
【表１】
2013541341.tif 000008
【００４９】
【表２】
2013541341.tif 000009
図８及び図９に示されるように、３−Ｃｙｓを有するＰＰ１０８４タンパク質と２−Ｃｙｓを有するＰＡ３５２９タンパク質に、０、５、１５、３０、５０、１００、３００、５００ｋＧｙのガンマ線を照射した後にＯＤ値を測定した結果、３０ｋＧｙで最も低い吸光度を示し、シャペロン活性が最も高くなる結果となった（図８及び図９）。
＜実施例４＞高線量ガンマ線によるＰｒｘタンパク質の構造変化分析
高線量のガンマ線を照射したＰｒｘ（ＰＰ１０８４及びＰＡ３５２９）タンパク質の変化したタンパク質構造を分析するために、ＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ；Amersham Biosciences）を用いて一定速度で（０．５ｍｌ／分流速度）Ｐｒｘタンパク質及び５０ｍＭヘペス（ｐＨ８．０）バッファーをスーパーデックス（superdex）２００ＨＲ  １０／３０カラムに通過させて、ＯＤ２８０ｎｍで測定されたタンパク質の量（ピーク）を基にクロマトグラムを描いた。
【００５０】
結果的に、二種類のＰｒｘ（ＰＰ１０８４及びＰＡ３５２９）タンパク質は、二つのタンパク質グループを形成しており、１５〜２０分にカラムを通過した分子量が大きいタンパク質グループ（Ｆ−１）と、２０〜２５分にカラムを通過した分子量が小さいタンパク質グループ（Ｆ−２）とに分類された。また、高線量のガンマ線の照射後にシャペロン活性は増加するが、二種類のＰｒｘ（ＰＰ１０８４及びＰＡ３５２９）タンパク質の分子構造は、ガンマ線によって低分子化されることが確認された（図１０及び図１１）。
＜実施例５＞高線量ガンマ線によるＰｒｘタンパク質の新しい共有結合の生成
＜実施例１＞で分離、精製した二種類のＰｒｘタンパク質を１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した後、それぞれ１ｍｌずつエッペンドルフチューブに分注し、０〜５００ｋＧｙ範囲の高線量ガンマ線を照射した。高線量ガンマ線の照射のために韓国原子力研究院放射線科学研究所の６０Ｃｏガンマ線照射装置（６０Ｃｏ，ｃａ．１５０ＴＢｑキャパシティ；Atomic Energy of Canada Limited，カナダ）を用いた。ガンマ線は、０〜５００ｋＧｙの範囲で照射した。高線量ガンマ線を照射したタンパク質の構造変化分析のために、完全な還元環境下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法により二種類のタンパク質を電気泳動した。同量のタンパク質を電気泳動してタンパク質をクマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色し、タンパク質構造変化を分析した。
【００５１】
その結果、高線量ガンマ線を照射しない二つの対照群タンパク質は、還元状態のＳＤＳ−ＰＡＧＥでともに単量体の分子量である２５ｋＤａ程度の分子量を示した。しかし、ガンマ線を照射したタンパク質の場合、還元剤によって還元されない新しい共有結合が生成されることを確認した。一般的に、強力な酸化的ストレスや極端な酸化状態において、チロシン同士の共有結合であるジチロシン結合が生成されることが報告されている。そこで、本発明者らはこの新たに生成された共有結合がジチロシン結合であると推測して、これを確認することにした。
＜実施例６＞高線量ガンマ線によるジチロシン結合の増加
＜実施例１＞で分離、精製した二種類のＰｒｘタンパク質を１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した後、それぞれ１ｍｌずつエッペンドルフチューブに分注し、０〜５００ｋＧｙ範囲の高線量ガンマ線を照射した。高線量ガンマ線の照射のために韓国原子力研究院放射線科学研究所の６０Ｃｏガンマ線照射装置（６０Ｃｏ，ｃａ．１５０ＴＢｑキャパシティ；Atomic Energy of Canada Limited，カナダ）を用いた。ガンマ線は、０〜５００ｋＧｙの範囲で照射した。高線量ガンマ線によって生成されたジチロシン結合の増加を確認するために、完全な還元環境下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。アンチジチロシン抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分離したタンパク質中のジチロシン結合のみを選択的にイメージ化した。
【００５２】
ＰＰ１０８４タンパク質にそれぞれの線量で高準位ガンマ線を照射した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでそれぞれの分子量別に分離したＰＰ１０８４タンパク質をＮＣ膜（ニトロセルロース膜；Ｂｉｏ−ｒａｄ，米国）に転写した。５％スキムミルクで１時間ブロッキングし、Ｔ−ＴＢＳバッファー［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン−２０］で１０分間、１回洗浄した。アンチジチロシン抗体をＴ−ＴＢＳバッファーに５０００：１で添加して１時間反応させた後、Ｔ−ＴＢＳバッファー中で２０分間強く振とうする洗浄を５回反復した。ＨＲＰ検出キットを用いてアンチジチロシン抗体の付着したジチロシン結合を形成したＰＰ１０８４タンパク質のみを選択的に検出した。
【００５３】
その結果、図１２及び図１３に示されるように、ＰＰ１０８４タンパク質及びＰＡ３５２９タンパク質は、還元状態で２５ｋＤａの単量体サイズを示した（図１２及び図１３の１：０ｋＧｙ）。高線量ガンマ線によって二つのＰｒｘタンパク質の部分的構造変化が起き、具体的には、ガンマ線非照射群に比べて２〜５０ｋＧｙのガンマ線を照射した二つのＰｒｘタンパク質では、５０ｋＤａにおける構造変化が著しいことが確認された（図１２及び図１３）。このようなＰｒｘタンパク質の構造的変化がジチロシン結合によるものか否かを確認するために、アンチジチロシン抗体を用いてジチロシン結合の増減を確認した。３０〜５０ｋＧｙを照射したＰＰ１０８４タンパク質のジチロシン結合が、ガンマ線非処理群に比べて著しく増加することが５０ｋＤａサイズで観察された（図１４）。
＜実施例７＞高線量ガンマ線によるＰｒｘタンパク質の疎水性変化分析
Ｐｒｘタンパク質では、親水性ドメインがタンパク質外部に、疎水性ドメインがタンパク質内部に位置し、水溶性の性質を維持する。しかしながら、シャペロンタンパク質では、比較的高い割合の疎水性のドメインが外部に露出していることが知られている。
【００５４】
実施例２ないし６において、本発明者らは、二つのＰｒｘタンパク質に高線量ガンマ線（１５〜３０ｋＧｙ）を照射すると、シャペロン活性が増加することを確認した。そこで、高線量ガンマ線が二つのＰｒｘタンパク質の疎水性ドメインの露出を増加させてシャペロン活性を増加させたと仮定し、それを検証した。
【００５５】
シャペロン活性を増加させた原因を確認するため、下記の表３及び表４のような構成でｂｉｓ−ＡＮＳ結合実験を行ない、疎水性の変化がシャペロン活性にどのような影響を及ぼすのかを調べた。Ｐｒｘタンパク質を２５℃でｂｉｓ−ＡＮＳ［１，１’−ビ（４−アニリノ）ナフタレン−５，５’−ジスルホン酸］と３０分間反応させ、分光光度計［ＳＦＭ２５分光蛍光計（Kontron,ドイツ）］で３８０〜６００ｎｍまで蛍光分析を行なってタンパク質の疎水性ドメインの露出程度を確認した。
【００５６】
【表３】
2013541341.tif 000010
【００５７】
【表４】
2013541341.tif 000011
その結果、図１５に示したように、３−Ｃｙｓ  ＰＰ１０８４タンパク質では、ガンマ線非照射群に比べて、５ｋＧｙのガンマ線を照射した群で疎水性が増加したことが確認された。５ｋＧｙよりも高い１５、３０、及び３００ｋＧｙの線量では、ガンマ線を照射しない比較群と同程度かむしろ低い数値を示した。一方、２−Ｃｙｓ  ＰＡ３５２９タンパク質では、図１６に示されるように、非照射群に比べてガンマ線を照射した群全てで疎水性が増加し、３０ｋＧｙで最も疎水性が増加し、５０、１５、５、３００ｋＧｙの順に疎水性が増加したことが確認された（図１５及び図１６）。
＜実施例８＞高線量ガンマ線によるＰｒｘタンパク質の二次構造変化分析
＜実施例７＞のように、高線量ガンマ線がＰｒｘタンパク質の２次元構造にどのような影響を及ぼし、そのような変化がＰｒｘタンパク質のシャペロン機能と構造にどのような影響を及ぼすのかを確認するため、円偏光二色性分光分析（Circular Dichroism Spectroscopy）を行なった。タンパク質の２次元構造のうち、αヘリックス、βシート、ターン、及びランダムコイル構造を観察した。
【００５８】
より良い結果を得るために、Ｐｒｘタンパク質のバッファーを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）バッファーに交換して、分光光度計［Jasco J-715分光偏光計（Jasco,Great Dunmow，英国）］を用いて１９０〜２５０ｎｍまでのＦａｒ  ＵＶ−ＣＤスペクトルを分析することでＰｒｘタンパク質の２次元構造を分析した。
【００５９】
その結果、３−Ｃｙｓ  ＰＰ１０８４タンパク質の２次元αヘリックス、βシート、ターン、及びランダムコイルでは、ガンマ線の照射線量による変化が観察されなかった。しかしながら、２−Ｃｙｓ  ＰＡ３５２９タンパク質の場合、αヘリックス構造は５６％から０％に減少し、βシート構造は０から５５％に増加し、ターン構造は２３．３％から０％に減少し、そしてランダムコイル構造は１９％から４９．６％に増加する変化が観察された。すなわち、２−Ｃｙｓ  ＰＡ３５２９タンパク質では、一般的にシャペロン活性の増加を示すβシートの増加及びαヘリックス構造の減少を観察することができ、３−Ｃｙｓ  ＰＰ１０８４タンパク質ではガンマ線によってシャペロン活性が増進したものの、タンパク質の二次構造の変化は観察されなかった（図１７及び図１８）。
【００６０】
【表５】
2013541341.tif 000012
【００６１】
【表６】
2013541341.tif 000013
＜実施例９＞紫外線の照射によるＰｒｘタンパク質（２−Ｃｙｓ）のシャペロン及びＰＯＤ活性測定
紫外線（ＵＶ）を照射したＰａＰｒｘ（緑膿菌３５２９，ＰＡ３５２９）タンパク質の生理活性変化を確認するため、暗室内で温度を４℃一定に維持し、１５ワット中波（medium wave）ＵＶランプ（Spectroline，米国）を用いて５Ｗの紫外線をＰＡ３５２９タンパク質に一定に照射した。ここで、紫外線の強度はＵＶデジタルラジオメーター＃ＤＲＣ−１００Ｘ（Spectroline，米国）を用いて測定し、それぞれＰａＰｒｘタンパク質に紫外線を０ｈ〜５ｈまで差を与えながら照射した。
＜９−１＞シャペロン活性の測定
リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）を基質に使用して、紫外線を照射されたＰａＰｒｘタンパク質とともに４３℃の熱ストレスを与え、３４０ｎｍの吸光度を１５分間測定することにより、ＭＤＨが凝集する程度から分子シャペロン活性を測定した。ここで、ＰａＰｒｘタンパク質とＭＤＨタンパク質との割合を１：１で反応させて、吸光度測定時にはＤＵ８００分光光度計（Beckmann，米国）を用いた。
【００６２】
その結果、紫外線の照射時間が増加するにつれて分子シャペロン活性が増加することが確認された（図１９）。
＜９−２＞チオレドキシンペルオキシダーゼ活性の測定
紫外線照射されたＰａＰｒｘタンパク質のチオレドキシンペルオキシダーゼ活性をＴｒｘシステム［１０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、１ｕＭ酵母Ｔｒｘ（酵母チオレドキシン）、５ｕＭ  ＴＲ（チオレドキシンレダクターゼ）、１ｕＭ  ＰａＰｒｘタンパク質、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ］を用いて測定した。ここでは、ＮＡＤＰＨが１０μｌのＨ２Ｏ２によって酸化される程度を、３４０ｎｍの吸光度により１０分間測定した。吸光度測定はＤＵ８００分光光度計（Beckmann，米国）を用いた。
【００６３】
その結果、紫外線の照射時間が増加するにつれてチオレドキシンペルオキシダーゼ活性が減少することが確認された（図２０）。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
上述のように、放射線の照射を用いて製造された顕著に増進したシャペロン活性を示すペルオキシレドキシンは、酸化的ストレスまたは熱ストレスなどの多様な環境ストレスに対する強い耐性を提供する。したがって、これを用いて形質転換体を製造することによって、農作物を含む多様な生物体の環境ストレスによる損失を防ぎ、生産性増大及び有用成分の大量生産に寄与することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年4月18日(2013.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシレドキシン（Peroxiredoxin）タンパク質に放射線を照射して、シャペロン活性を増進させる方法。
【請求項２】
ペルオキシレドキシンタンパク質が、２個または３個のシステイン残基を有する２−システインペルオキシレドキシンであることを特徴とする、請求項１に記載のシャペロン活性を増進させる方法。
【請求項３】
ペルオキシレドキシンタンパク質が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項２に記載のシャペロン活性を増進させる方法。
【請求項４】
放射線が、ガンマ線、電子線（ベータ線）及び紫外線からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載のシャペロン活性を増進させる方法。
【請求項５】
ガンマ線の照射線量が、１〜５００ｋＧｙであることを特徴とする、請求項４に記載のシャペロン活性を増進させる方法。
【請求項６】
電子線の照射線量が、１〜３０ｋＧｙであることを特徴とする、請求項４に記載のシャペロン活性を増進させる方法。
【請求項７】
紫外線の照射線量が、５〜２４０Ｗであることを特徴とする、請求項４に記載のシャペロン活性を増進させる方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法によって製造された、シャペロン活性が増進したペルオキシレドキシン。
【請求項９】
請求項８に記載のペルオキシレドキシンを有効成分として含有する環境ストレス抵抗性増進用組成物。
【国際調査報告】
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