(57)【要約】  本発明は、国際公開ＷＯ２０１１−０２７２９０号公報に記載されているように、微生物ストレプトマイセス種（ＰＭ０６２６２７１／ＭＴＣＣ ５４４７）の発酵によって得られる式Ｉの化合物と薬物送達用生分解性脂質とを含む生分解性の吸入可能微粒子製剤であって、脂質に対する薬物（式Ｉの化合物）比が１：１５〜１：２５である微粒子製剤に関する。また本発明は、上記製剤を調製するためのプロセスおよび治療上効果的な量の上記製剤をそれを必要とする哺乳類に投与することによる、肺結核、多剤耐性結核（ＭＤＲＴＢ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）肺炎およびメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）肺炎の治療法に関する。本発明はさらに、微粒子製剤をそれを必要とする哺乳類に送達する方法であって、上記製剤は肺送達のために吸入または気管内注入によって投与される送達方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式Ｉの化合物と薬物送達用生分解性脂質とを含み、脂質に対する薬物（式Ｉの化合物）の比が１：１５〜１：２５であり、生分解性であり吸入可能である製剤である微粒子製剤。
【化１】
2013532722.tif 000024
【請求項２】
式Ｉの化合物は、前記製剤の１％〜５％（ｗ／ｗ）を構成する、請求項１に記載の微粒子製剤。
【請求項３】
前記生分解性脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）である、請求項１または２に記載の微粒子製剤。
【請求項４】
前記微粒子の粒径は、０．５ミクロンと１０ミクロンとの間の範囲である、請求項１から３のいずれか１項に記載の微粒子製剤。
【請求項５】
前記微粒子の少なくとも９０％は、１０ミクロン未満の粒径である、請求項４に記載の微粒子製剤。
【請求項６】
前記製剤は水性リポソーム分散液である、請求項１から５のいずれか１項に記載の微粒子製剤。
【請求項７】
前記製剤のｐＨは６から７の範囲である、請求項１から５のいずれか１項に記載の微粒子製剤。
【請求項８】
前記製剤の相転移温度は４１℃から４３℃の範囲である、請求項１から５のいずれか１項に記載の微粒子製剤。
【請求項９】
請求項１で定義されるような式Ｉの化合物とジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）とを含み、ＤＰＰＣに対する薬物（式Ｉの化合物）の比が１：１〜１：２０である微粒子製剤の調製のためのプロセスであって、
（ａ）  式Ｉの化合物およびＤＰＰＣ（１：１〜１：２０の比）を３ｍＬ〜１５ｍＬのクロロホルムに溶解し、溶液を得る工程と、
（ｂ）  ２０ｍＬ〜４５ｍＬのメタノールを工程（ａ）の溶液に加え、十分混合し、確実に均質性を得る工程と、
（ｃ）  ２０ｍＬ〜５０ｍＬの模擬肺液（ＳＬＦ）を工程（ｂ）の溶液に加える工程と、
（ｄ）  溶媒を蒸発させる工程と、
（ｅ）  工程（ｄ）で得た量をＳＬＦで３０ｍＬにし、１５０００Ｇ〜３５０００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離しペレットを得る工程と、
（ｆ）  工程（ｅ）で得たペレットをＳＬＦ中に再懸濁し、濃度０．５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの懸濁液を得る工程と、
（ｇ）  工程（ｆ）で得た懸濁液を０．５μｍ〜５μｍのポリカーボネートフィルターを通してろ過し、形成された微粒子の粒径を均一にする工程と、を含むプロセス。
【請求項１０】
前記微粒子の粒径は０．５ミクロンと１０ミクロンとの間の範囲である、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記微粒子の少なくとも９０％が１０ミクロン未満のサイズである、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
請求項１で定義されるような式Ｉの化合物とジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）とを含み、ＤＰＰＣに対する薬物（式Ｉの化合物）の比が１：１〜１：２０である微粒子製剤の調製のためのプロセスであって、
(ｉ)  ２０ｍＬ〜４５ｍＬの模擬肺液（ＳＬＦ）を、式Ｉの化合物とＤＰＰＣとの混合物（１：１〜１：２０の比）に加える工程と、
(ｉｉ)  工程（ｉ）の混合物を、４５℃で１時間、１００ｒｐｍ〜２００ｒｐｍで回転させ、懸濁液を得る工程と、
(ｉｉｉ)  工程（ｉｉ）で得た懸濁液を、１５０００Ｇ〜３５０００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、ペレットを得る工程と、
(ｉｖ)  工程（ｉｉｉ）で得たペレットをＳＬＦ中に再懸濁し、濃度０．５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの懸濁液を得る工程と、
(ｖ)  工程（ｉｖ）で得た懸濁液を０．５μｍ〜５μｍのポリカーボネートフィルターを通してろ過し、形成された微粒子の粒径を均一にする工程と、を含むプロセス。
【請求項１３】
請求項１に記載の微粒子製剤をそれを必要とする哺乳類に吸入によって投与することを含む、肺結核、多剤耐性結核、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）肺炎またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌肺炎の治療のための方法。
【請求項１４】
前記方法は肺胞マクロファージを標的とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記製剤は肺送達のために吸入または気管内注入によってそれを必要とする哺乳類に投与される、請求項１に記載の微粒子製剤を該哺乳類に送達する方法。
【請求項１６】
前記製剤は吸入によって投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記吸入による製剤の投与は、前記薬物（式Ｉの化合物）を微粒子に封入した噴霧により行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記封入された式Ｉの化合物の保持率は、３０％から７０％の範囲である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記吸入によって投与された製剤に含まれる薬物（式Ｉの化合物）は、肺に２４時間を超えて保持される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
吸入のための投与量は、０．０５と１０ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の範囲である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は非侵襲である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
肺結核、多剤耐性結核、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌肺炎またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌肺炎の治療のための、式Ｉの化合物と薬物送達用生分解性脂質とを含み、脂質に対する薬物（式Ｉの化合物）の比が１：１５〜１：２５である、微粒子製剤の使用。
【請求項２３】
肺結核、多剤耐性結核、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌肺炎およびメチシリン感受性黄色ブドウ球菌肺炎の治療のための薬剤の製造のための、式Ｉの化合物と薬物送達用生分解性脂質とを含み、脂質に対する薬物（式Ｉの化合物）の比が１：１５〜１：２５である、微粒子製剤の使用。
【請求項２４】
肺結核、多剤耐性結核、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌肺炎またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌肺炎の治療のための、式Ｉの化合物と薬物送達用生分解性脂質とを含み、脂質に対する薬物（式Ｉの化合物）の比が１：１５〜１：２５である、微粒子製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国際公開ＷＯ２０１１−０２７２９０号公報に記載されているように、微生物ストレプトマイセス種（ＰＭ０６２６２７１／ＭＴＣＣ ５４４７）の発酵によって得られる化合物（本明細書では、式Ｉの化合物と呼ぶ）と、薬物送達用生分解性脂質とを含む生分解性の吸入可能微粒子製剤であって、脂質に対する薬物（式Ｉの化合物）比が１：１５〜１：２５である微粒子製剤に関する。本発明はまた、治療上効果的な量の当該製剤をそれを必要とする哺乳類に投与することによる、肺結核、多剤耐性結核（ＭＤＲＴＢ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）肺炎およびメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）肺炎の治療法に関する。本発明はまた、肺結核、ＭＤＲＴＢ、ＭＲＳＡ肺炎およびＭＳＳＡ肺炎の治療のための当該微粒子製剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核は身体の器官に影響を及ぼし、いくつかの異なる症状が現れるが、初期感染部位は肺である。肺に影響を及ぼす結核は肺結核として知られている。肺結核は結核の最も圧倒的に起こり得る形態である（「結核」（Tuberculosis）、２００５年、８５、ｐ．２２７−２３４）。肺結核を治療するための現在の化学療法レジメンは、４か月間にわたって１次抗結核薬（イソニアジド、リファンピシン、エサンブトールおよび／またはピラジナミド）の同時投与を行い、その後、イソニアジド、リファンピシンおよび／またはエサンブトールで２か月間治療を行うことからなるが、結核の種類によっては、治療期間はさらに延長され９か月から２年の範囲であり得る。この化学療法レジメンは、１日に一度経口投与の形態で行われ、短い血漿内半減期（「薬剤学の国際学術雑誌」（International Journal of Pharmaceutics）、２００４年、２７６、ｐ．４１−４９）と、過剰用量による副作用（「抗菌化学療法の学術雑誌」（Journal of Antimicrobial Chemotherapy）、２００４年、５４、ｐ．７６１−７６６）とに関係する。これらの副作用は望ましくない体内分布特性に起因する。さらに、経口投与薬については、少量の薬物のみが作用部位（即ち、肺）に到達し、数時間のうちになくなる（「結核」（Tuberculosis）、２００５年、８５、ｐ．２２７−２３４）ということが観察されている。上記の問題は、患者の服薬遵守不良に関連し、多剤耐性結核（ＭＤＲＴＢ）の発生につながる。
【０００３】
ＭＤＲＴＢは少なくとも２つの最良の抗結核薬（イソニアジドおよびリファンピシン）に対して耐性を有する結核の形態である（「多剤耐性結核ファクトシート」（Multidrug resistant tuberculosis fact sheet）、疾病管理センター、２００８年）。ＭＤＲＴＢはフルオロキノロン、アミカシン、カナマイシンやカプレオマイシンのようなアミノグリコシド、ｐ−アミノサリチル酸およびチオアセタゾンのような２次抗結核薬で治療される（「薬物耐性結核の治療、ファクトシート」（Treatment of drug resistant tuberculosis, fact sheet）、疾病管理センター、２００７年）。２次結核薬は、用量に関連した副作用や、肺における生物学的利用能不良と係わっており、疾病の根絶の障害となっている。
【０００４】
肺結核の問題に類似して、薬物の生物学的利用能不良や多量投与によって引き起こされる副作用という問題は、ＭＲＳＡやＭＳＳＡ肺炎の治療においても起こる。ＭＲＳＡによる院内肺炎と人工呼吸器関連肺炎は高い死亡率と関係があり（「抗菌剤の国際学会雑誌」（International Journal of Antimicrobial Agents）、２００７年、３０、ｐ．１９−２４）、それは不十分な治療でによる。
【０００５】
ＭＲＳＡ肺炎を治療するために用いられる１次薬はバンコマイシンとリネゾリドを含む。ＭＲＳＡ肺炎を治療するために選択される薬物であるバンコマイシンは、肺組織における不十分な薬物動態学的な特性と係わりがあり、ちょうど血漿濃度２０％である肺濃度を有する（「抗菌剤化学療法」（Antimicrob. Agents Chemother.）、１９９９年、３７、ｐ．２８１−２８６）。さらに、バンコマイシンの長期投与は用量規制因子である腎毒性と係わっている（「臨床微生物学と感染症」（Clin. Microbiol Infect.）、２００６年、１２、ｐ．９２−９５）。ＭＲＳＡ肺炎療法のために受け入れられているリネゾリドは、良好な経口生物学的利用能（１日当たり２回６００ｍｇが経口で投与される）を示すが、胃腸の副作用、血小板減少症および可逆性貧血に関係がある（「臨床感染症」（Clinical Infect. Dis.）、２００３年、３７、ｐ．１６０９−１６１６）。まれに、リネゾリドの投与は視神経症や末梢神経障害にも係わっている（「抗菌化学療法の学術雑誌」（J Antimicrob. Chemother.）、２００４年、５３、ｐ．１１１４−１１１５）。
【０００６】
ベータラクタム剤（アンピシリンやセファロスポリンなど）は１次療法としてＭＳＳＡ肺炎に対して非常に効果的である。バンコマイシンは次の療法として考えられているが、ＭＳＳＡによって引き起こされる感染においてはベータラクタムほど効果的ではない。また、バンコマイシンは糸球体ろ過によって尿中に排出され、代謝されない。また、バンコマイシンは肺組織へ比較的浸透しない（「米国呼吸器疾患」（US Respiratory Disease）、２００６年、ｐ．６２−６４）。要約すると、ＭＲＳＡ／ＭＳＳＡ肺炎療法は、薬物の肺生物学的利用能不良、薬物の投与量に起因する毒性などのようないくつかの欠点がある。
【０００７】
現在の標準的な治療レジメンと患者の服薬不履行に関連する問題点を克服するために、作用部位に直接達し、結核菌の住処である肺マクロファージを標的とする可能性および薬物関連の全身毒性を低減する可能性とを有する薬物送達システムを開発することが必要不可欠である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、微生物ストレプトマイセス種（ＰＭ０６２６２７１／ＭＴＣＣ５４４７）の発酵によって得られる式Ｉ（本明細書に記載されるような）の化合物と、薬物送達用生分解性脂質とを含む生分解性の吸入可能微粒子製剤であって、脂質に対する薬物（式Ｉの化合物）の比が１：１５〜１：２５である微粒子製剤に関する。
【０００９】
本発明はまた、微粒子製剤の調製のためのプロセスに関する。
【００１０】
本発明はさらに、治療上効果的な量の微粒子製剤をそれを必要とする哺乳類に投与することによる、肺結核、ＭＤＲＴＢ、ＭＲＳＡ肺炎およびＭＳＳＡ肺炎の治療法に関する。
【００１１】
本発明はまた、微粒子製剤をそれを必要とする哺乳類に送達する方法であって、製剤は肺送達のために吸入または気管内注入によって投与される送達方法に関する。
【００１２】
本発明はさらに、肺結核、ＭＤＲＴＢ、ＭＲＳＡ肺炎およびＭＳＳＡ肺炎の治療のための、式Ｉの化合物と薬物送達用生分解性脂質とを含み、脂質に対する薬物（式Ｉの化合物）の比が１：１５〜１：２５である微粒子製剤の使用に関する。
【００１３】
本発明はさらに、肺結核、ＭＤＲＴＢ、ＭＲＳＡ肺炎およびＭＳＳＡ肺炎の治療のための薬剤の製造のための、式Ｉの化合物と薬物送達用生分解性脂質とを含み、脂質に対する薬物（式Ｉの化合物）の比が１：１５〜１：２５である微粒子製剤の使用に関する。
【発明の詳細】
【００１４】
本発明の詳細を説明する前に、当然のことながら本発明は特定の実施形態に限定されるものではない。また、当然のことながら、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明する目的のためであり、限定する意図はない。
【００１５】
本明細書および請求項において用いられるように、文脈に特に明確に記載されない限り、単数形は複数表記を含む。
【００１６】
特段の断りがない限り、本明細書において使用される全ての技術的、科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される用語と同様の意味を有する。
定義
封入効率：封入効率とは、溶液中における初期の薬物全量に対する微粒子製剤中に物理的に封入され結合した薬物の割合である。
【００１７】
薬物：薬物は、疾病の診断、治癒、緩和、治療または予防における使用を意図されたあるいは身体の構造や機能に影響を与えるように意図された任意の物質として定義される。本明細書にて用いられると、式Ｉの化合物は薬物である。
【００１８】
マスバランス：マスバランス（物質収支とも呼ぶ）とは、質量保存を物理系の分析へ適用することである。系に入る物質と系を出る物質を分析することによって、この手法なしでは未知であったかもしれぬ、または測定が困難であったかもしれぬマスフローを同定することができる。
【００１９】
重量モル浸透圧濃度：重量モル浸透圧濃度とは、溶媒１キログラムあたりの溶質のオスモル数（ｍＯｓｍ）として定義される溶質濃度（ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇまたはｍＯｓｍ／ｋｇ）の尺度である。
【００２０】
相転移：相転移とは、物質の１つの相または状態から別の相または状態への熱力学系の変化である。物質の熱力学系の相と状態は、本質的に均一な物理的性質を有する。ある媒質の相転移の間、温度や圧力などのようないくつかの外部条件により、その媒質のある性質は、多くの場合不連続的に変化する。変化が起こる外部条件の測定値は、相転移点と呼ばれる。
【００２１】
エアロゾル化：エアロゾル化とは、エアロゾル、つまり微小粒子を含む微細ミストまたはスプレーの生成である。
【００２２】
噴霧：噴霧とは、液状薬物をより即効性のある吸入ミストに変化させるプロセスを含む。噴霧は、喘息または嚢胞性繊維症のような呼吸器異常を治療するために用いられる。ネブライザーは、医薬を直接個人の呼吸気管に効果的に送達するので、医薬は迅速に肺に到達することができる。ネブライザーの非限定例は、圧縮器とマウスピースまたはフェイスマスクを備えた装置である。
【００２３】
粒径：粒径とは、固体粒子や液体粒子（液滴）の寸法を比較するために導入される概念である。液滴とエアロゾルには、「空気動力学径」および「空気力学的質量中位径（ＭＭＡＤ）」などの用語が用いられる。その定義を以下に記載する。
【００２４】
空気動力学径：当粒子と同一の終末沈降速度を有する単位密度球体の直径。これは、そのような粒子が呼吸気管のどこに沈着するかを予測するために用いられる。
【００２５】
空気力学的質量中位径：幾何平均空気動力学径。粒子の５０重量％はＭＭＡＤよりも小さく、５０％は大きい。
【００２６】
粒子の分粒実験の間、懸濁液はサイズの異なる動いている無数の粒子を含む。分粒機がこれらの粒子を分析するとき、最小粒子（１ｎｍであり得る）から最大粒子（１００ミクロンであり得る）におよぶ全ての粒子サイズ範囲にわたる粒子分布曲線を形成する。粒径分布曲線において、粒子に対して累積度数が算出される。Ｄ10は、懸濁液中の粒子の１０％が、ある粒子直径以下の直径を有する場合のその粒子直径である。
【００２７】
Ｄ50：Ｄ10と同様に、Ｄ50は製剤中の粒子集団の５０％に対するカットオフ直径であり、懸濁液中の粒子の５０％が、ある粒子直径以下の直径を有する場合のその粒子直径である。
【００２８】
Ｄ90：Ｄ90は製剤中の粒子集団の９０％に対するカットオフ直径であり、懸濁液中の粒子の９０％が、ある粒子直径以下の直径を有する場合のその粒子直径である。
【００２９】
噴霧での封入薬物保持率（entrapped drug retention）：噴霧プロセスの間に、ネブライザーによって誘導された力によって、一部のリポソームは破裂し、薬物は製剤から浸出し噴霧カップ自体の中に保持される。噴霧プロセスの間に製剤から浸出しない薬物は、噴霧中に製剤中に保持される実際の量の薬物であり、「封入薬物保持率」とされる。噴霧プロセスの間に失われたあるいは浸出した薬物は、噴霧カップから回収される。噴霧カップは適切な溶媒（この場合、メタノール）で洗浄され、カップ中に保持された薬物はＨＰＬＣまたはＬＣ−ＭＳによって定量化される。
【００３０】
液晶相：結晶（固体）状態と等方性（液体）状態との間で観察される物質の明確な相である。
【００３１】
リップルゲル相：液体結晶相とゲル相の間の準安定状態である。
【００３２】
気管内注入：肺への薬物送達のために、気管内チューブを通してまたは経皮注射によって、薬物が気管に投与される薬物投与の方法である。
【００３３】
呼吸補助：医学では、機械的人工呼吸は、自発的呼吸を機械的に補助するまたはそれに替わる方法である。これは、罹患患者の気管内チューブを前述の目的のために設計された人工呼吸器に取り付けることによって達成される。人工呼吸器は、気管内チューブまたは気管切開チューブを通して、患者の気道内圧を変えることによって動作する。ＭＲＳＡ肺炎を含む劇症肺炎の患者は、気管切開され、組織の酸素投与が維持される。
【００３４】
生分解性脂質：生分解性脂質とは、酵素作用または脂質分子がその基礎的構成成分に分解される生得的に起こる生物的プロセスのいずれかによって、インビボ（体内において）で化学分解されやすい脂質である。
【００３５】
治療上効果的な量：治療上効果的な量とは、標的となる感染性生物をインビボ条件で治療または除去するために十分な薬物量である。微粒子製剤中に存在する式Ｉの化合物の治療量は、１％〜５％（ｗ／ｗ）の範囲である。
【００３６】
非侵襲的治療法：非侵襲的治療法とは、気管切開前の個体において行う噴霧や気管内注入のような方法である。その処置は無痛性で、痛みを緩和するための麻酔薬やその関連成分の投与を含む追加の医療行為を必要としない。
【００３７】
本発明は、式Ｉの化合物と薬物送達用生分解性脂質とを含む微粒子製剤であって、脂質に対する薬物（式Ｉの化合物）の比が１：１５〜１：２５であり、生分解性で吸入可能である微粒子製剤に関する。
【００３８】
本発明の一局面によると、式Ｉの化合物は上記製剤の１％〜５％（ｗ／ｗ）を構成する。
【００３９】
式Ｉの化合物は、構造的に以下の式によって表される。
【００４０】
【化１】
2013532722.tif 000002
【００４１】
式Ｉの化合物の産生に用いられ得る微生物は、南極圏のシルマッハーオアシス（Schirmacher Oasis）から採取した土壌試料から分離したストレプトマイセス種（ＰＭ０６２６２７１／ＭＴＣＣ ５４４７）の菌株であり、以降本明細書においては、培養物番号ＰＭ０６２６２７１と呼ぶ。培養物番号ＰＭ０６２６２７１は、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）が承認した国際寄託当局（ＩＤＡ）である微生物工学研究所（Institute of Microbial Technology）、セクター３９Ａ、チャンディーガル、インド、 郵便番号１６００３６の微生物系統保存機関(Microbial Type Culture Collection)（ＭＴＣＣ）に寄託され、受入番号ＭＴＣＣ５４４７が付与されている。
【００４２】
上記化合物は、浸水好気条件下で、１つまたは複数の炭素源および１つまたは複数の窒素源ならびに場合によっては栄養無機塩および／または微量元素を含む栄養培地において、培養物番号ＰＭ０６２６２７１を培養し、培養液から式Ｉの化合物を分離し、当該技術分野において一般的に用いられる精製方法を用いて、式Ｉの化合物を精製する工程などを経て、培養物番号ＰＭ０６２６２７１、その突然変異体（mutants）および変異形（variants）から産生することができる。
【００４３】
当然のことながら、本明細書中に記載の特定の微生物に加え、Ｘ線や紫外線などを含む化学的または物理的変異原の使用によって生産されるものおよび分子生物学的手法によってその遺伝子構造が組み換えられた生物などの微生物の突然変異体もまた上記化合物を産生するために培養されても良い。
【００４４】
式Ｉの化合物を産生する培養物番号ＰＭ０６２６２７１の分離および培養に用いる培地および／または栄養培地は、好ましくは、炭素、窒素および栄養無機塩を含む。炭素源としては、例えば、デンプン、グルコース、スクロース、デキストリン、フルクトース、糖蜜、グリセロール、ラクトースまたはガラクトースのうちの１つまたは複数があげられる。好ましい炭素源は、可溶性デンプンとグルコースである。窒素源としては、例えば、大豆粉、ピーナッツ粉、酵母エキス、牛肉エキス、ペプトン、麦芽エキス、コーンスティープリカー、ゼラチンまたはカザミノ酸のうちの１つまたは複数があげられる。好ましい窒素源は、ペプトンと酵母エキスである。栄養無機塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、塩化ストロンチウム、塩化コバルト、臭化カリウム、フッ化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硫酸第一鉄、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、クエン酸鉄、ホウ酸あるいは硫酸銅、塩化マンガンまたは硫酸亜鉛などの微量塩溶液のうちの１つまたは複数があげられる。炭酸カルシウム、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムは、好ましい栄養無機塩である。
【００４５】
培養物番号ＰＭ０６２６２７１の維持は、２２℃〜３６℃の範囲の温度およびｐＨ約７．５〜８．０で行なってもよい。典型的に、培養物番号ＰＭ０６２６２７１は、２５℃〜２７℃およびｐＨ約７．４〜７．８で維持される。十分増殖した培養物は、４℃〜８℃で冷蔵庫に保存しても良い。
【００４６】
培養物番号ＰＭ０６２６２７１の種培養物培養は、２５℃〜３６℃の範囲の温度およびｐＨ約７．５〜８．０で６６時間〜７５時間２００ｒｐｍ（revolutions per minute）〜２８０ｒｐｍで行なってもよい。典型的に、培養物番号ＰＭ０６２６２７１種は、２９℃〜３１℃およびｐＨ約７．４〜７．８で７２時間２３０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍで培養される。
【００４７】
式Ｉの化合物の産生は、２６℃〜３６℃の範囲の温度およびｐＨ約６．５〜８．５で２４時間〜９６時間６０ｒｐｍ〜１４０ｒｐｍおよび１００ｌｐｍ（liter per minute）〜２００ｌｐｍの通気での発酵によって培養物番号ＰＭ０６２６２７１を培養することによって行なってもよい。典型的に、培養物番号ＰＭ０６２６２７１は、３０℃〜３２℃およびｐＨ７．４〜７．８で４０時間〜９６時間９０ｒｐｍ、１１０ｌｐｍの通気で培養される。
【００４８】
発酵および化合物の産生の進行は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や、公知の微生物寒天平板拡散試験法によってブドウ球菌（Staphylococci）および／または腸球菌（Enterococci）種に対する培養液の生物活性の測定とにより検出することができる。好ましい培養物は、文献において報告されているメチシリンとベータラクタム系抗生物質に耐性のある菌株である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｅ７１０およびバンコマイシンに耐性のあるエンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）Ｒ２（ＶＲＥ）である。得られた培養液において、化合物は培養ろ液中および細胞集団に存在し得、溶媒抽出やカラムクロマトグラフィーのような公知の分離法を用いて分離することができる。式Ｉの化合物は、石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエーテルまたはブタノールのような水不混和性溶媒でｐＨ約５〜９での抽出により、あるいは「ダイヤイオンＨＰ−２０（登録商標）」（三菱化成工業、日本）、「アンバーライトＸＡＤ（登録商標）」（ロームアンドハース工業 米国）などの高分子樹脂、活性炭を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、あるいはｐＨ５〜９でイオン交換クロマトグラフィーにより培養ろ液から回収することができる。活性物質は、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ｎ−プロパノールまたはイソプロパノールなどの水混和性溶媒あるいは石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルまたはブタノールなどの水不混和性溶媒で抽出することによって、細胞集団から回収することができる。他の選択肢としては、石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ｎ−プロパノール、イソプロパノールまたはブタノールから選択される溶媒で全液体培地を抽出することである。典型的には、活性物質は全液体培地から酢酸エチルで抽出される。
【００４９】
抽出物を濃縮および凍結乾燥すると活性粗材料が得られる。式Ｉの化合物は、順相クロマトグラフィー（固定相としてアルミナまたはシリカゲル；および石油エーテル、酢酸エチル、ジクロロメタン、アセトン、クロロホルム、メタノールまたはそれらの組み合わせなどの溶離液を用いる）；逆相クロマトグラフィー（固定相としてジメチルオクタデシルシリルシリカゲル（ＲＰ−１８）またはジメチルオクチルシリルシリカゲル（ＲＰ−８）などの逆相シリカゲル；ならびに水、緩衝液（例えば、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩（ｐＨ２〜８））および有機溶媒（例えば、メタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフランまたはこれらの溶媒の組み合わせ）などの溶離液を用いる）；ゲル浸透クロマトグラフィー（メタノール、クロロホルム、アセトン、酢酸エチルまたはそれらの組み合わせなどの溶媒中でセファデックスＬＨ−２０（登録商標）（ファルマシア化学工業，スウェーデン）、ＴＳＫゲル（登録商標）トヨパールＨＷ（トーソーハース、東ソー株式会社、日本）、あるいは水でセファデックス（登録商標）Ｇ−１０およびＧ−２５などの樹脂を用いる）；あるいは向流クロマトグラフィー（水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、石油エーテル、ベンゼンおよびトルエンなどの溶媒２つ以上からなる二相溶離液系を用いる）のいずれかを用いて分画法によって粗材料から回収することができる。これらの手法を単独または組み合わせて繰り返して用いても良い。典型的な方法は、シリカゲルを用いた順相でのクロマトグラフィーである。
【００５０】
式Ｉの化合物およびその異性体は、エステルやエーテルのようなその薬学的に許容される塩および誘導体に変換することができ、それらは全て本発明の範囲内である。
【００５１】
上記製剤中に用いられる生分解性脂質は、内因性肺サーファクタントシステムの自然発生のリン脂質であるジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）である。ＤＰＰＣと組み合わせて用いることができる生分解性脂質の他の非限定例は、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）、ＤＰＰＥ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）、コレステロール、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルセリンを含む。
【００５２】
本発明の他の局面において、上記製剤の微粒子のサイズは０．５〜１０ミクロンの範囲である。
【００５３】
本発明のさらに他の局面において、上記製剤の微粒子の９０％は１０ミクロン未満のサイズである。
【００５４】
本発明のさらに他の局面において、上記製剤は水性リポソーム分散液である。
【００５５】
本発明の１つの局面において、上記製剤のｐＨは６から７である。
【００５６】
他の局面において、上記製剤の重量モル浸透圧濃度は３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇから４００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。本発明のさらに他の局面において、上記製剤の相転移温度は４１℃から４３℃である。本発明の他の局面において、上記製剤は、ネブライザーを用いることによって、空気力学的質量中位径１μｍ〜１０μｍにエアロゾル化することができる。
【００５７】
用いることが可能なネブライザーの種類は、ジェットネブライザー、超音波ネブライザーおよび振動メッシュ式ネブライザーを含むが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明はまた、微粒子製剤の調製のためのプロセスに関する。
【００５９】
本発明の１つ局面において、上記製剤の調製のためのプロセスは、以下の工程を含む「溶媒蒸発法」の使用を伴う。
【００６０】
(a) 式Ｉの化合物とＤＰＰＣ（１：１５〜１：２５の比）を３ｍＬ〜１５ｍＬのクロロホルムに溶解し、溶液を得る。
【００６１】
(b) ２０ｍＬ〜４５ｍＬのメタノールを工程(a)の溶液に加え、十分混合し、均質溶液を得る。
【００６２】
(c) ２０ｍＬ〜５０ｍＬの模擬肺液(simulated lung fluid）（ＳＬＦ）を工程(b)の溶液に加える。
【００６３】
(d) 溶媒を蒸発させる。
【００６４】
(e) 工程(d)で得た量をＳＬＦで３０ｍＬにし、１５０００Ｇ〜３５０００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、ペレットを得る。
【００６５】
(f) 工程(e)で得たペレットをＳＬＦ中に再懸濁し、濃度０．５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの懸濁液を得る。
【００６６】
(g) 工程(f)で得た懸濁液を０．５μｍ〜５μｍのポリカーボネートフィルターを通してろ過し、形成された微粒子の粒径を均一にする。
【００６７】
本明細書において用いられる上記「溶媒蒸発法」は、米国特許第４８７７５６１号において報告されている方法の変形例である。
【００６８】
本発明の実施形態において、上記微粒子製剤の調製のためのプロセスの工程(a)において、式Ｉの化合物およびＤＰＰＣを１：２０の比で溶解する。
【００６９】
本発明の他の実施形態において、上記微粒子製剤の調製のためのプロセスの工程(a)において、式Ｉの化合物およびＤＰＰＣを５〜１０ｍＬのクロロホルムに溶解し溶液を得る。
【００７０】
本発明の実施形態において、上記微粒子製剤の調製のためのプロセスの工程(b)において、３０〜４０ｍＬのメタノールを加える。
【００７１】
本発明の他の実施形態において、上記微粒子製剤の調製のためのプロセスの工程(c)において、２５〜３５ｍＬのＳＬＦを加える。本発明の他の実施形態において、上記微粒子製剤の調製のためのプロセスの工程(e)において、遠心分離を２００００〜３００００Ｇで行う。
【００７２】
本発明の他の実施形態において、上記微粒子製剤の調製のためのプロセスの工程(f)において、ペレットをＳＬＦ中に再懸濁し、濃度１〜５ｍｇ／ｍＬの懸濁液を得る。
【００７３】
本発明の他の実施形態において、上記微粒子製剤の調製のためのプロセスの工程(g)において、工程(f)で得られた懸濁液を、２μｍ〜５μｍポリカーボネートフィルターを通してろ過する。
【００７４】
本発明の他の局面において、上記製剤の調製のためのプロセスは、以下の工程を含む「無溶媒脂質自己組織化法（Solvent free lipid self assembly method）」である。
【００７５】
(i)   ２０ｍＬ〜４５ｍＬのＳＬＦを、式Ｉの化合物とＤＰＰＣとの混合物（１：１５〜１：２５の比）に加える。
【００７６】
(ii)  工程(i)の混合物を、４２℃〜４５℃で１時間、１００ｒｐｍ〜２００ｒｐｍで回転させ、懸濁液を得る。
【００７７】
(iii) 工程(ii)で得た懸濁液を、１５０００Ｇ〜３５０００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、ペレットを得る。
【００７８】
(iv)  工程(iii)で得たペレットをＳＬＦ中に再懸濁し、濃度０．５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの懸濁液を得る。
【００７９】
(v)   工程(iv)で得た懸濁液を０．５μｍ〜５μｍのポリカーボネートフィルターを通してろ過し、形成された微粒子の粒径を均一にする。
【００８０】
本発明の実施形態において、上記微粒子製剤の調製のためのプロセスの工程(i)において、３０ｍＬ〜４０ｍＬのＳＬＦを、式Ｉの化合物とＤＰＰＣとの混合物に加える。
【００８１】
本発明の他の実施形態において、上記微粒子製剤の調製のためのプロセスの工程(i)において、式Ｉの化合物およびＤＰＰＣを１：２０の比で溶解する。
【００８２】
本発明の実施形態において、上記微粒子製剤の調製のためのプロセスの工程(iii)において、工程(ii)で得られた懸濁液を、２００００Ｇ〜３５０００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離しペレットを得る。
【００８３】
本発明の他の実施形態において、上記微粒子製剤の調製のためのプロセスの工程(iv)において、工程(iii)で得たペレットをＳＬＦ中に再懸濁し、濃度１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの懸濁液を得る。
【００８４】
本発明の他の実施形態において、上記微粒子製剤の調製のためのプロセスの工程(v)において、工程(iv)で得られた懸濁液を、２μｍ〜５μｍポリカーボネートフィルターを通してろ過する。
【００８５】
本発明はさらに、治療上効果的な量の製剤をそれを必要とする哺乳類に投与することによる、肺結核、ＭＤＲＴＢ、ＭＲＳＡ肺炎およびＭＳＳＡ肺炎の治療法における製剤の使用に関する。
【００８６】
本発明はさらに、肺結核、ＭＤＲＴＢ、ＭＲＳＡ肺炎およびＭＳＳＡ肺炎の治療のための薬剤の製造のための、式Ｉの化合物と薬物送達用生分解性脂質とを含み、脂質に対する薬物（式Ｉの化合物）の比が１：１５〜１：２５である微粒子製剤の使用に関する。
【００８７】
本発明の１つの局面において、上記治療法は、結核菌ならびにメチシリン耐性黄色ブドウ球菌およびメチシリン感受性黄色ブドウ球菌を宿すことができる肺胞マクロファージを標的とする。
【００８８】
本発明はまた、微粒子製剤をそれを必要とする哺乳類に送達する方法であって、上記製剤は肺送達のために吸入または気管内注入によって投与される送達方法に関する。
【００８９】
本発明の１つの局面において、上記微粒子製剤の送達方法は吸入による。
【００９０】
本発明の他の局面において、吸入方法は、式Ｉの化合物を上記微粒子中に封入した噴霧である。
【００９１】
本発明の微粒子製剤については、吸入によって投与された際、製剤に含まれた式Ｉの化合物のかなりの濃度がマウスの肺において検出されるということが観察されている。しかしながら、未製剤の式Ｉの化合物（unformulated compound of formula I）を投与したマウスの肺では、式Ｉの化合物はほとんど検出されない。これは、上記微粒子製剤における式Ｉの化合物の高生物学的利用能を示している。さらに、本発明の微粒子製剤が吸入によって投与された際、上記薬物（式Ｉの化合物）は、２４時間を超えて肺に保持されるということが観察されている。
【００９２】
本発明の他の局面において、封入された式Ｉの化合物の保持率は、３０％以上である。特に、封入された式Ｉの化合物の保持率は、３０％〜７０％の範囲である。
【００９３】
吸入のための式Ｉの化合物の投与量は、０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。
【００９４】
本発明の他の局面において、上記微粒子製剤の送達方法は、呼吸補助システムに依存している患者における気管内注入である。
【００９５】
本発明の他の局面において、噴霧による投与は、肺結核、ＭＤＲＴＢ、ＭＲＳＡ肺炎およびＭＳＳＡ肺炎の治療に必要とされる式Ｉの化合物量を減らすのに役立つ。
【００９６】
本発明のさらに他の局面において、上記方法は、式Ｉの化合物が肺に到達するのを助ける。
【００９７】
上記微粒子製剤の有効性は、次の実施例において詳細に記載される生物学的試験によって確立されている。これらの実施例は、本明細書において例示されているにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
以下の用語／略語／化学式は実施例において用いられる：
ＮａＣｌ          :塩化ナトリウム
ＣａＣｌ2         :塩化カルシウム
ＮａＯＨ          :水酸化ナトリウム
ＳＬＦ            :模擬肺液
ＨＰＬＣ          :高速液体クロマトグラフィー
ＤＰＰＣ          :１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン
ＤＭＳＯ          :ジメチルスルホキシド
ＲＢフラスコ      :丸底フラスコ
ｒｐｍ            :毎分回転数
ＤＳＣ            :示差走査熱量計
ＴＳＩ            :ツインステージインピンジャー
ＭＳＳＡ          :メチシリン感受性黄色ブドウ球菌
ＭＲＳＡ          :メチシリン耐性黄色ブドウ球菌
ＶＲＥ            :バンコマイシン耐性腸球菌
ＴＳＡ            :トリプトースソイ寒天
ＣＦＵ            :コロニー形成単位
ＨＢＳＳ          :ハンクス緩衝塩溶液
ＭＴＳ            :（３−（４，５−ジメチルシアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）
ＧＣ−ＨＳ        :ヘッドスペースアッタチメントでのガスクロマトグラフ
ＣＰＣＳＥＡ      :動物実験管理監督委員会（Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experiments on Animals）
ＩＡＥＣ          :動物倫理委員会（Institutional Animal Ethics Committee）
ＡＰＩ            :医薬有効成分
実施例１
南極圏から採取した土壌からの培養物番号ＰＭ０６２６２７１の分離
ａ）分離培地の組成：
改変人工海水寒天：ペプトン１．５ｇ、酵母エキス０．５ｇ、塩化第二鉄０．００７ｇ、水１．０Ｌ（７５０ｍＬの人工海水 ＋ ２５０ｍＬの脱塩水）、寒天末１５．０ｇ、最終ｐＨ（２５℃で）７．４〜７．８．
人工海水の組成：塩化ナトリウム２４．６ｇ、塩化カリウム０．６７ｇ、塩化カルシウム２水和物１．３６ｇ、硫酸マグネシウム７水和物６．２９ｇ、塩化マグネシウム６水和物４．６６ｇ、重炭酸ナトリウム０．１８ｇ、脱塩水１．０Ｌ、最終ｐＨ（２５℃で）７．８〜８．２．
ｂ）手順：
南極圏のシルマッハーオアシスから、表層土壌を採取し、ピラマル・ライフ・サイエンス・リミテッド（Piramal Life Sciences Limited）、ゴレガオン（Goregaon）、ムンバイ、インドへの旅程の間、−２０℃で保管した。試料を−２０℃〜２２℃で保管し、後に微生物の分離のために室温（２５℃±２℃）に解凍した。土壌試料（〜１ｇ）を、１００ｍＬの殺菌されたフラスコ中で無菌１％ペプトン水２５ｍＬに懸濁した。フラスコを３０秒間ボルテックスした。１０-5までの段階希釈物を無菌１％ペプトン水で調製した。１０-5希釈物の１００μＬを、改変人工海水寒天の表面に塗布した。プレートを、コロニーが観察されるまで室温（２５±２℃）で培養した。１か月半の培養後、この培地に現れたコロニーを、７５％人工海水［Ａｃｃｕｍｉｘ（商標）］（ＡＳ−ＡＩＡ）中に調製された放線菌アイソレーション寒天［高濃度培地］を含むシャーレ上に画線した。分離株を精製し、培養物ＩＤ番号ＰＭ０６２６２７１とした。培養物番号ＰＭ０６２６２７１をこのようにして、増殖中の微生物の中から単一の分離株として分離した
実施例２
培養物番号ＰＭ０６２６２７１の精製
ａ）精製培地（放線菌アイソレーション寒天、１．５％寒天により寒天化）の組成：
グリセロール５．０ｍＬ、カゼインナトリウム２．０ｇ、Ｌ−アスパラギン０．１ｇ、プロピオン酸ナトリウム４．０ｇ、リン酸二カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム０．１ｇ、硫酸第一鉄０．００１ｇ、１．０Ｌの水（７５０ｍＬの人工海水 ＋ ２５０ｍＬの脱塩水）、寒天末１５．０ｇ、最終ｐＨ（２５℃で）７．４〜７．８．
人工海水の組成：塩化ナトリウム２４．６ｇ、塩化カリウム０・６７ｇ、塩化カルシウム２水和物１．３６ｇ、硫酸マグネシウム７水和物６．２９ｇ、塩化マグネシウム６水和物４．６６ｇ、重炭酸ナトリウム０．１８ｇ、脱塩水１．０Ｌ、最終ｐＨ（２５℃で）７．８〜８．２．
ｂ）手順：
培養物番号ＰＭ０６２６２７１を、（７５％人工海水塩を含む）放線菌アイソレーション寒天シャーレ上に画線した。シャーレを２５℃で１０日間培養した。シャーレから分離されたコロニーのうち１つのコロニーを、７５％人工海水で調製された放線菌アイソレーション寒天の新しい斜面培地に移した。斜面培地を２５℃で１０日間培養した。
実施例３
産生株−培養物番号ＰＭ０６２６２７１の維持
ａ）培地（放線菌アイソレーション寒天）の組成：
グリセロール５．０ｍＬ、カゼインナトリウム２．０ｇ、Ｌ−アスパラギン０．１ｇ、プロピオン酸ナトリウム４．０ｇ、リン酸二カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム０．１ｇ、硫酸第一鉄０．００１ｇ、１．０Ｌの水（７５０ｍＬの人工海水 ＋ ２５０ｍＬの脱塩水）、寒天末１５．０ｇ、最終ｐＨ（２５℃で）７．４〜７．８。
【００９８】
人工海水の組成：塩化ナトリウム２４．６ｇ、塩化カリウム０．６７ｇ、塩化カルシウム２水和物１．３６ｇ、硫酸マグネシウム７水和物６．２９ｇ、塩化マグネシウム６水和物４．６６ｇ、重炭酸ナトリウム０．１８ｇ、脱塩水１．０Ｌ、最終ｐＨ（２５℃で）７．８〜８．２．
ｂ）加熱により材料をよく溶かした後、得られた溶液を試験管に分配し、１２１℃で３０分間殺菌した。試験管を冷却し、斜位にて凝固した。寒天斜面培地を、培養物番号ＰＭ０６２６２７１の増殖物でワイヤループにより画線し、良好な増殖物が観察されるまで２７℃〜２９℃で培養した。十分増殖した培養物を、４℃〜８℃で冷蔵庫に保管した。
実施例４
振とうフラスコ中の培養物番号ＰＭ０６２６２７１の発酵
ａ）種培地［ＡＳ−２７４（１）］の組成：
グルコース１５ｇ、コーンスティープリカー５ｇ、ペプトン７．５ｇ、酵母エキス７．５ｇ、炭酸カルシウム２．０ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、７５０ｍＬの人工海水と２５０ｍＬの脱塩水とからなる量。
ｂ）上記の培地を５００ｍＬ容量のエルレンマイヤーフラスコに４０ｍＬの分量で分配し、１２１℃で３０分間加圧滅菌した。フラスコを室温（２５℃ ± ２℃）に冷却され、斜面培地上に十分増殖した産生性株（培養物番号ＰＭ０６２６２７１）の１白金耳量を各フラスコに播種し、７２時間、２３０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、３０℃ ± ℃で振とうし、種培養物を得た。
ｃ）産生培地［ＡＳ ３６Ｐ（１）］の組成：
可溶性デンプン２０ｇ、グルコース１５ｇ、酵母エキス２ｇ、ペプトン３ｇ、炭酸カルシウム２ｇ、硫酸アンモニウム０．５ｇ、コーンスティープリカー２ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、リン酸マグネシウム５ｇ、１ｇ／Ｌの貯蔵液から塩化コバルト１ｍＬ／Ｌ、微量塩溶液１ｍＬ／Ｌ、７５％人工海水と２５％脱塩水を使い、量を１Ｌに調製した。
ｄ）５００ｍＬ容量のエルレンマイヤーフラスコ中の産生培地４０ｍＬを１２１℃で３０分間加圧滅菌し、２９℃〜３０℃に冷却し、実施例４ｂで記載された種培養物を５％（ｖ／ｖ）で播種した。
ｅ）発酵パラメーター：
産生フラスコを、２９℃、２２０ｒｐｍで９６時間、振とう機で培養した。産生フラスコを集菌し、各培地フラスコから収集した全液体培地を２９℃で１時間、振とう条件化で同量のメタノールで抽出し、３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を活性の監視のために抗菌寒天ウェル拡散アッセイに用いた。
実施例５
発酵用振とうフラスコでの種培養物の調製
ａ）培地［ＡＳ−２７４（１）］の組成：
グルコース１５ｇ、コーンスティープリカー５ｇ、ペプトン７．５ｇ、酵母エキス７．５ｇ、炭酸カルシウム２．０ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、７５０ｍＬの人工海水と２５０ｍＬの脱塩水とからなる量。
ｂ）上記の培地を１０００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに２００ｍＬの分量で分配し、１２１℃で３０分間加圧滅菌した。フラスコを室温（２５℃ ± ２℃）に冷却し、斜面培地上に十分増殖した産生性株（培養物番号ＰＭ０６２６２７１）の１白金耳量を各フラスコに播種し、７０時間〜７４時間、２３０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、２９℃〜３０℃で振とうし、種培養物を得た。
実施例６
発酵槽での培養物番号ＰＭ０６２６２７１の培養
ａ）産生培地の組成：
人工海水（人工海水塩２８．３２ｇ）（７５％）、可溶性デンプン２０ｇ、グルコース１５ｇ、酵母エキス２ｇ、ペプトン３ｇ、炭酸カルシウム２ｇ、硫酸アンモニウム０．０５ｇ、コーンスティープリカー２ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、リン酸マグネシウム５ｇ、塩化コバルト（塩化コバルト１ｇ、脱塩水１．０Ｌ）１ｍＬ／Ｌ、微量塩溶液（硫酸銅７ｇ、硫酸第一鉄１ｇ、塩化マンガン８ｇ、硫酸亜鉛２ｇ、脱塩水１．０Ｌ）１ｍＬ／Ｌ、脱塩水１．０Ｌ、ｐＨ６．５〜７．５（殺菌前）。
ｂ）１５０Ｌの発酵槽中で産生培地１００Ｌを消泡剤としてのデスモフェン３０ｍＬとともに３０分間１２１℃でその場で殺菌し、２９℃〜３０℃に冷却し、上記実施例５で得られた種培養物２．５Ｌ〜３．５Ｌを播種した。
ｃ）発酵パラメーター：発酵を温度２９℃〜３０℃、攪拌１００ｒｐｍ、通気６０ｌｐｍで行い、７０時間〜７４時間で集菌した。発酵液体培地における式Ｉの化合物の産生を、寒天ウェル拡散法を用いて黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｅ７１０（ＭＲＳＡ株）および／またはエンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）Ｒ２（ＶＲＥ）に対する生物活性を試験することにより定性的に検出した。培養液の集菌ｐＨは７．５〜８．０であった。集菌後、全液体培地を溶媒抽出した。
実施例７
化合物の分離および精製
全液体培地（１０Ｌのバッチ量）を酢酸エチルを用い（１：１）抽出した。有機層と水層を分離した。溶媒を蒸発させるよう有機層を処理し、粗酢酸エチル抽出物を得た（１．５ｇ）。粗抽出物をフラッシュクロマトグラフィーによりさらに処理した（シリカゲル３０ｇ、溶媒：メタノール／クロロホルム 段階勾配、流量：１５ｍＬ／分）。活性化合物はクロロホルム中１％〜５％のメタノールで溶出し、溶出物を濃縮し半純粋化合物（２５０ｍｇ）を得た。その後の精製は順相分取ＨＰＬＣを繰り返して行った。
分取ＨＰＬＣ条件：
カラム            :Ｅｕｒｏｓｐｈｅｒシリカ（１０μ、２０×２５０ｍｍ）
溶離液            :メタノール:クロロホルム（５：９５）
流速              :２０ｍＬ／分
検出（ＵＶ）      :２４５ｎｍ
保持時間          :（５〜６分）
画分の純度をエンテロコッカスフェシウム（E. faecium）Ｒ２および／または黄色ブドウ球菌（S. aureus）３０６６に対するバイオアッセイならびに／あるいは分析ＨＰＬＣにより調べた。溶出物を貯留し減圧下で濃縮して溶媒を取り除き、化合物を得た。
分析ＨＰＬＣ条件：
カラム            :Ｅｕｒｏｓｐｈｅｒ ＲＰ−１８（３μ、４．６×１２５ｍｍ）
溶媒系            :勾配（１５分間で水に対して０％〜１００％のアセトニトリル、その後５分間１００％のアセトニトリル）
流速              :１ｍＬ／分
検出（ＵＶ）      :２４５ｎｍ
保持時間          :式Ｉの化合物（１２〜１３分）
式Ｉの化合物の物理特性および分光特性：
外観                  :白色粉末
融点                  :２４０℃（分解）
溶解度                :クロロホルム、酢酸エチル、メタノールに可溶かつ水に不溶
ＨＲ−ＥＳＩ          :１６５０．４８５８（Ｍ＋Ｈ）
分子量（ＥＳＩ）      :１６５０．５（Ｍ＋Ｈ）
分子式                :Ｃ71Ｈ83Ｎ19Ｏ18Ｓ5
ＩＲ（ＫＢｒ          :３３８６、２９２７、１６４８、１５０７、１２０６、７５６、６６６ｃｍ-1
1Ｈ ＮＭＲ            :表１参照
13Ｃ ＮＭＲ           :表２参照
【００９９】
【表１】
2013532722.tif 000003
【０１００】
【表２】
2013532722.tif 000004
【０１０１】
実施例８
ＳＬＦ（ｐＨ７．４）中における式Ｉの化合物の溶解度の測定
用いた物質：
ＮａＣｌ        :ＲＦＣＬ社、インド
ＣａＣｌ2       :ＲＦＣＬ社、インド
ＮａＯＨ        :ＲＦＣＬ社、インド
手順：
ＳＬＦを「呼吸生理学＆神経生物学（Respiratory Physiology & Neurobiology）」、２００８年、１６２、ｐ．７３−７９に基づく方法によって調製した。
ＳＬＦの調製
塩化ナトリウム９ｇ、塩化カルシウム０．２２０ｇおよびラクトース６．５ｇを水１０００ｍＬに溶解した。得られた溶液のｐＨを７．４に調整した。ＳＬＦ中における式Ｉの化合物の溶解度を２つの温度、４５℃および６０℃で測定した。このために、式Ｉの化合物１ｍｇをＳＬＦ３ｍＬ（２つ）に加え、数秒ボルテックスした後に必要とされる温度に設定された水浴で培養した。溶解度を３時間にわたって１時間間隔で測定した。溶液を０．２２μｍフィルターを通してろ過し、ろ液をＨＰＬＣに注入した。溶解度を適切な較正曲線について計算した。
【０１０２】
得られた結果を表３に示す。
【０１０３】
【表３】
2013532722.tif 000005
【０１０４】
結論：
式Ｉの化合物は４５℃および６０℃でＳＬＦ中において難溶性を示す。溶解度はまた時間に依存しない。式Ｉの化合物は水不溶性化合物であり、したがって溶解度は緩衝ＳＬＦにおいて測定した。
実施例９
式Ｉの化合物の微粒子製剤の調製
用いた物質：
ＤＰＰＣ                            :アバンティポーラーリピッド、カナダ
メタノール                          :ＲＦＣＬ社、インド
クロロホルム                        :ＲＦＣＬ社、インド
ＤＭＳＯ                            :ＲＦＣＬ社、インド
ＮａＣｌ                            :ＲＦＣＬ社、インド
ＣａＣｌ2                           :ＲＦＣＬ社、インド
ＮａＯＨ                            :ＲＦＣＬ社、インド
ラクトース１水和物                 :シグネット化学（Signet Chemical Corporation Private Ltd.）、米国
ガラス器具                          :メルク、インド
ガラスビーズ                        :Ｎ．Ｍ．エンタープライズ、インド
ポリカーボネート膜フィルター        :ＩＳＯＰＯＲＥ（商標）、ミリポア、米国
ポリポロピレンフィルターホルダー    :ＳＷＩＮＮＥＸ（登録商標）、ミリポア、米国
金属ルアーロック式気密ガラス注射器  :ハミルトン社、米国
ｐＨメーター                        :ユーテック社（Eutech instruments）、米国
手順：
方法Ａ
溶媒蒸発法
アッセイを文献ＵＳ４８７７５６１に基づいて行った。
【０１０５】
式Ｉの化合物およびＤＰＰＣを、１：１、１：１０および１：２０ｗ／ｗの比でガラスビーカー中の５ｍＬのクロロホルムに溶解した。３０ｍＬのメタノールを加え、混合物を２５０ｍＬの丸底フラスコに移した。ＳＬＦ３０ｍＬを混合物にゆっくりと注いだ。溶媒をロータリーエバポレーター（ビュッヒ（Buchi）社、スイス）を用いて蒸発させた。水浴を４５℃に設定し、１００ｒｐｍに設定して回転させた。真空制御器を４００ｍＢａｒの圧力に設定した。蒸発した溶媒をガラス製の溶媒回収器に回収した。ＲＢフラスコに残っている溶液はリポソームの形成を示す乳白色になった。ＲＢフラスコからの懸濁液の量をＳＬＦで３０ｍＬに調整し、２５０００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。得られたペレットをＳＬＦに再懸濁、ボルテックスし、１．２μｍのポリカーボネートフィルターでのろ過を１１回行い、確実に均一粒径にした。微粒子製剤を光学顕微鏡検査および電子顕微鏡検査によって分析した。
方法Ｂ
無溶媒脂質自己組織化法
目的は製剤のための無溶媒製造プロセスを開発することである。
【０１０６】
式Ｉの化合物２０ｍｇおよびＤＰＰＣ２０ｍｇ（１：２０ｗ／ｗ）を２０〜３０のガラスビーズおよびＳＬＦ３０ｍＬを含むＲＢフラスコに加えた。混合物を４５℃の温度で１時間、１００ｒｐｍで回転させた。得られた製剤を方法Ａに記載のように遠心分離しろ過した。 製剤を光学顕微鏡検査によって分析した。
観察：
方法Ａによって調製された製剤における微粒子では、
(i)   光学顕微鏡で観察した際、１：１ｗ／ｗの比および１：１０ｗ／ｗの比で式Ｉの化合物およびＤＰＰＣを含む微粒子の製剤は不均一で不安定な懸濁液を示し薬物凝集体が存在した。微粒子は試験管の底に沈降した。
【０１０７】
(ii)  光学顕微鏡で観察した際、１：２０ｗ／ｗの比で式Ｉの化合物およびＤＰＰＣを含む微粒子の製剤は均一な懸濁液を示し薬物凝集体が存在しなかった。微粒子は試験管に沈降しなかった。
【０１０８】
(iii) 電子顕微鏡で観察した際、１：２０ｗ／ｗの比で式Ｉの化合物およびＤＰＰＣを含む微粒子の製剤はサイズ２μｍ〜３μｍの微粒子を示した。
結果：
式Ｉの化合物およびＤＰＰＣを含む微粒子の製剤は、薬物：脂質比１：２０ｗ／ｗを用いると最適に形成された。
実施例１０
実施例９方法Ａの製剤および実施例９方法Ｂの製剤における式Ｉの化合物の封入効率およびマスバランスの測定。
用いた物質：
メタノール      :ＲＦＣＬ社、インド
ＤＭＳＯ        :ＲＦＣＬ社、インド
ガラス器具      :メルク、インド
自動ピペット    :エッペンドルフ、ドイツ
手順：
実施例９方法Ａおよび実施例９方法Ｂの製剤における式Ｉの化合物の封入効率は、ＨＰＬＣ（アジレント、米国）によって分析された。ＨＰＬＣ条件は以下のとおりである。
カラム          :Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）１００、ＲＰ−１８ｅ、１５０×４．６ｍｍ、５μｍ
移動相          :（ａ）１０００ｍＬの水に０．０１Ｍの酢酸アンモニウム＋０．５％のトリエチルアミン、氷酢酸でｐＨを６．５に調整
（ｂ）アセトニトリル
組成            :（ａ）：（ｂ）：：５０：５０
実行時間        :５分
カラム温度      :２５℃
注入量          :２０μＬ
保持時間        :〜３．５分
溶媒            :メタノール中に２０％のＤＭＳＯ
式Ｉの化合物を２０％ＤＭＳＯに溶解し、２００μｇ／ｍＬの濃縮物を得て参照標準物質として用いた。実施例９方法Ａの製剤１００μＬおよび実施例９方法Ｂの製剤１００μＬを２ｍＬの遠心管に別々にピペットで移し、２０％のＤＭＳＯ９００μＬを各遠心管に加えた。各遠心管はボルテックスされ、微粒子マトリックスが破裂しマトリックスに封入された式Ｉの化合物の全内容物が放出した。ＨＰＬＣに別々に注入された試料は、参照標準物質、実施例９方法Ａの製剤（微粒子マトリックスの破裂後）および実施例９方法Ｂの製剤（微粒子マトリックスの破裂後）である。ピーク面積の平均値を加味して計算した。
【０１０９】
封入効率を、下記の式により求めた。
【０１１０】
％封入＝（Ｗ／ｗ）×１００
（Ｗ＝微粒子内に結合／封入された薬物（式Ｉの化合物）量、ｗ＝式Ｉの化合物の初期量とする）
マスバランス計算のため、式Ｉの化合物をガラス器具、フィルターおよび製剤調製プロセス（実施例９方法Ａおよび実施例９方法Ｂ）において用いた他の全ての実験器具から回収し、その量を測定した。ポリカーボネートフィルター（実施例９方法Ａおよび実施例９方法Ｂ）をメタノール中の２０％のＤＭＳＯ５ｍＬで洗浄した。この試料を「膜残渣」としてＨＰＬＣに注入した。
【０１１１】
製剤を調製するために用いたＲＢフラスコをメタノール中の２０％のＤＭＳＯ１０ｍＬで洗浄した。この試料を「フラスコ残渣」としてＨＰＬＣに注入した。
【０１１２】
参照標準物質をＨＰＬＣに６回注入し、ピーク面積を記した。標準物質の６回の注入の相対標準偏差は２．０％未満であった。試料をＨＰＬＣに２回注入し、ピーク面積の平均値を加味して計算した。
【０１１３】
得られた結果を表４に示す。
【０１１４】
【表４】
2013532722.tif 000006
【０１１５】
結論：
製剤の封入効率は、実施例９の方法Ｂで調製したときよりも実施例９の方法Ａで調製した方が比較的良好である。
実施例１１
実施例９方法Ａの製剤の微粒子の粒径の測定
手順：
実施例９方法Ａの製剤の微粒子の流体力学的径およびサイズ分布を光子相関分光法（ＤＥＬＳＡ Ｎａｎｏ、ベックマンコールター、米国）を用いて測定した。製剤１ｍＬをＳＬＦ１０ｍＬで希釈した。この溶液１ｍＬを粒径測定に用いた。
結果：
実施例９方法Ａの製剤の微粒子の平均粒径は２μｍ〜３μｍである。それぞれの個体集団に関して、平均値からの粒径の分散度は約０．４５〜０．４７である。
【０１１６】
表５に３つのカットオフ直径を示す。Ｄ10、Ｄ50およびＤ90はそれぞれ粒子集団の１０％、５０％および９０％の平均直径を示す。
【０１１７】
【表５】
2013532722.tif 000007
【０１１８】
結論：
式Ｉの化合物脂質系微粒子を得るための溶媒蒸発法（実施例９方法Ａ）により１μｍ〜１０μｍ（表５に示されるように）の範囲のミクロンサイズ粒子が生成され、９９％を超える粒子の粒径は１０μｍ未満であった（表６に示す）。
【０１１９】
【表６】
2013532722.tif 000008
【０１２０】
実施例１２
実施例９方法Ａの製剤のｐＨの測定
手順：
ｐＨメーター（ユーテック、米国）を、ｐＨ４、７および９の標準ｐＨ緩衝液に対して電子的に標準化した。実施例９方法Ａの製剤のｐＨを同じｐＨメーターを用いて測定した。
結果：
実施例９方法Ａの製剤のｐＨは６．１４である。
結論：
実施例９方法Ａの製剤のｐＨは、１度の噴霧または気管内注入による３０分以内の短期間の薬物（式Ｉの化合物）の投与と生理的に適合する。
実施例１３
実施例９方法Ａの製剤の重量モル浸透圧濃度の測定
物質：
標準溶液    :ウィーコン社（Wheecon Instruments Privates Limited）
浸透圧計    :ウィーコン社
手順：
実施例９方法Ａの製剤の重量モル浸透圧濃度を浸透圧計を用いて測定した。浸透圧計を２９０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの標準溶液を用いて標準化した。
結果：
実施例９方法Ａの製剤の重量モル浸透圧濃度は３４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。
結論：
体液の生理的重量モル浸透圧濃度は、３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。この重量モル浸透圧濃度における著しい変化は病理学的意味を持つ。高張溶液（非常に高い重量モル浸透圧濃度）または低張溶液（非常に低い重量モル浸透圧濃度）の大量投与は、液体の過剰損失／獲得のいずれかを引き起こし、肺水腫および組織浮腫あるいは脱水につながる。通常の重量モル浸透圧濃度のエアロゾル形態で液体を少量投与することは前述の症状の発生を防ぐ。実施例９方法Ａの製剤は、重量モル浸透圧濃度３４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであり、したがって安全限度内である。
実施例１４
実施例９方法Ａの製剤における式Ｉの化合物の賦形剤相溶性の評価
物質：
Ｏ−リング付気密容器    :パーキンエルマーインドリミテッド（Perkin Elmer India Limited）
ＤＳＣ                   :パーキンエルマー、米国
手順：
実施例９方法Ａの製剤５０μＬをＤＳＣ容器にピペットで移す。試料および空の標準容器（参照標準）を密閉し、高速ＤＳＣに設置し温度プログラムを以下のように実行した。
温度プログラム    :０℃〜５０℃
加熱速度          :５℃／分
パージガス        :窒素
流速              :３０ｍＬ／分
結果：
式Ｉの化合物なしで調製されたリポソームは４１．１℃になると吸熱した。この吸熱はリップルゲルから液体結晶相への転移に起因し得る。微粒子製剤はおよそ４２．５℃で吸熱した。吸熱が始まる温度におけるこのズレは、ＤＰＰＣリポソームと式Ｉの化合物の物理的相互作用によるかもしれない。この主な転移におけるズレは、立体障害が大きくよく組織化された炭化水素鎖が詰め込まれた状態から一部のアシル鎖がねじれの存在を示す状態へのリン脂質二重層の転移を示す。
結論：
結果は式Ｉの化合物およびＤＰＰＣ間の薬物−賦形剤相溶性を示す。吸熱発生温度において過剰なズレはなく、ピークの消滅もない。
実施例１５
実施例９方法Ａの製剤における溶媒含有量の測定
物質：
メタノール（ＨＰＬＣグレード）      :ＲＦＣＬ社、インド
クロロホルム（ＨＰＬＣグレード）    :ＲＦＣＬ社、インド
ＤＭＳＯ（ＨＰＬＣグレード）        :ＲＦＣＬ社、インド
ガラスＧＣ−ＨＳバイアル          :パーキンエルマーインドリミテッド （Perkin Elmer India Limited）
ガラス器具                          :メルク、インド
手順：
ＧＣ−ＨＳを用いて実施例９方法Ａの製剤における残留溶媒含有量を試験するために実験を行った。この実験は、実施例９方法Ａの製剤の大規模な商業生産に用いられる溶媒蒸発法（実施例９方法Ａ）を用いることの実現可能性を評価する。
ブランクの調製：ＤＭＳＯ５ｍＬを２０ｍＬのＧＣ−ＨＳガラスバイアルに加えた。バイアルをテフロン（登録商標）ストッパーおよびアルミキャップでかしめた。２つのそのようなバイアルをブランク注入のために調製した。
標準物質の調製：クロロホルム１０ｍｇおよびメタノール１００ｍｇを１００ｍＬの標準メスフラスコで正確に秤量した。溶媒を溶かし、量をＤＭＳＯで１００ｍＬにした。貯蔵液５ｍＬを２０ｍＬのＧＣ−ＨＳガラスバイアルにピペットで移した。バイアルをテフロン（登録商標）ストッパーおよびアルミキャップでかしめた。６つのそのようなバイアルを標準物質注入のために調製した。
試料の調製：ＤＭＳＯ５ｍＬを２０ｍＬＧＣ−ＨＳガラスバイアルに加えた。バイアルを電子秤にのせ、その重量を風袋引きした。実施例９方法Ａの製剤５００μＬをガラスバイアルに加え、その重量を正確に記した。バイアルをテフロン（登録商標）ストッパーおよびアルミキャップでかしめた。３つのそのようなバイアルを試料注入のために調製した。
【０１２１】
表７はクロマトグラフィーの条件および実施例９方法Ａの製剤における溶媒含有量の測定方法である。
【０１２２】
【表７】
2013532722.tif 000009
【０１２３】
結果：
表８は実施例９方法Ａの製剤の溶媒含有量および封入効率への蒸発時間の影響を別々に示す。
【０１２４】
【表８】
2013532722.tif 000010
【０１２５】
観察：
２時間の蒸発時間により実施例９方法Ａの製剤の溶媒含有量は低下し、望ましい封入効率およびマスバランス特性が得られることが観察された。また、ＧＣ−ＨＳにより検出されたような残留溶媒含有量は、ＡＰＩ溶媒含有量の各溶媒の許容限度（クロロホルムの１日あたりの許容濃度は６０ｐｐｍで、メタノールの１日あたりの許容濃度は３０００ｐｐｍ（「ＩＣＨ品質ガイドライン、不純物：残留溶媒のガイドライン」（ICH Quality Guidelines, Impurities: Guidelines for Residual Solvents）、Ｑ３Ｃ（Ｒ５）、２０１１年２月）および医薬品の１日当たりの許容濃度を下まわる。
結論：
溶媒蒸発法（実施例９方法Ａ）はこの製剤を開発するのに適した方法として考えることができる。
実施例１６
実施例９方法Ａの製剤の噴霧
物質：
ツインステージインピンジャー  :コプリーサイエンティフィック（Copley Scientific）、英国
ネブライザー                  : DeVILBISS（登録商標）、サンライズメディカル、米国
メタノール                    :ＲＦＣＬ社、インド
ＤＭＳＯ                      :ＲＦＣＬ社、インド
ＨＰＬＣ                      :アジレント、米国
電子秤                        :デンバー社（Denver Instruments）、米国
手順：
ＴＳＩユニットをこの試験のために用い、取扱説明書に従って組み立てた。ＴＳＩはヒト肺気道のインビトロガラスモデルであり、インビトロ肺薬物沈着能を定量化するために用いる。
【０１２６】
ＴＳＩの真空ポンプのスイッチをいれ、系の流量を正確に調べるために流量計を用いた。正確な流量指定条件（２８．３Ｌ／分）を確保するために真空ポンプの流量バルブを調整した。気流の較正後、全ユニットを解体した。メタノール７ｍＬを上部インピンジャーに加え、メタノール２０ｍＬを下部インピンジャーに加えた。取り扱い説明書に従ってＴＳＩユニットを再び組み立てた。
【０１２７】
実施例９方法Ａの製剤５ｍＬをネブライザーの薬剤カップに加えた。ネブライザーのマウスピースをＴＳＩの口部に取り付けた。真空ではなくなることを防ぐために全部品を確実に密着させた。
【０１２８】
ＴＳＩの真空ポンプを起動し、均一な気流を確保した。３０秒後、ネブライザーを起動し、開始時間を記した。正確に５分後、ネブライザーを止めた。ポンプをさらに３０秒動かし、その後ポンプのスイッチを止めた。上部インピンジメントチャンバは咽頭および上気道を模し、下部インピンジメントチャンバは肺胞を模している。
【０１２９】
メタノールを洗浄溶媒として用い、上部および下部インピンジメントチャンバの内容物を適切な標準メスフラスコに回収した。２０％のＤＭＳＯを加え、式Ｉの化合物を確実に溶解した。メスフラスコの最終容積をメタノールによって調整した。上記実験を６つの製剤バッチおよび２つの未製剤の式Ｉの化合物バッチで繰り返した。
【０１３０】
試料を下記のいくつかの濃度で評価した。
実施例９方法Ａの製剤５ｍＬ中に式Ｉの化合物０．５ｍｇ−試料１、
実施例９方法Ａの製剤５ｍＬ中に式Ｉの化合物１ｍｇ−試料２、
実施例９方法Ａの製剤５ｍＬ中に式Ｉの化合物２．５ｍｇ−試料３、
実施例９方法Ａの製剤５ｍＬ中に式Ｉの化合物５ｍｇ−試料４、
未製剤の式Ｉの化合物１００μｇ／ｍＬ（式Ｉの化合物のみ）−試料５。
【０１３１】
インビトロ薬物沈着への濃度の影響を知るためにこの試験を行った。この試験をさらに続け、噴霧プロセスで失われ、したがってネブライザーカップに残った薬物（式Ｉの化合物）の量を測定した。
【０１３２】
ＴＳＩの上部および下部インピンジメントチャンバに沈着した式Ｉの化合物を、勾配ポンプおよび自動サンプラー付ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＣＬ分析に用いられたクロマトグラフィーの条件を表９に示す。
【０１３３】
【表９】
2013532722.tif 000011
【０１３４】
式Ｉの化合物１００μｇ／ｍＬ（式Ｉの化合物２．５ｍｇをメタノール中２０％のＤＭＳＯに溶解した）を参照標準物質として用いた。
【０１３５】
参照標準物質をＨＰＬＣに６回注入し、ピーク面積を記した。標準物質の６回の注入の相対標準偏差は２．０％未満であった。試料をＨＰＬＣに２回注入し、ピーク面積の平均値を加味して計算した。
結果：
ＴＳＩの上部および下部インピンジャーにさまざまな試料（試料１〜６）によって沈着した式Ｉの化合物の％を表１０に示す。
【０１３６】
【表１０】
2013532722.tif 000012
【０１３７】
（Ｂ）噴霧カップ中の失われた（噴霧プロセス中）式Ｉの化合物量（μｇ）を表１１に示す。
【０１３８】
【表１１】
2013532722.tif 000013
【０１３９】
観察：
１ｍｇ／ｍＬの濃度および２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で噴霧された際の製剤は、噴霧カップに投入された式Ｉの化合物の初期量の約１６％および１０％が沈着した。式Ｉの化合物の最小抑制濃度は０．１２５μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬの範囲である（国際公開ＷＯ２０１１−０２７２９０号公報）。沈着した式Ｉの化合物量は、インビトロモデルにおいて十分であり上記最小抑制濃度より多い。この結果は、１ｍｇ／ｍＬおよび２．５ｍｇ／ｍＬの式Ｉの化合物製剤の濃度がインビボ試験において評価に必要とされる濃度であり得るということを示唆する。１ｍｇ／ｍＬ未満の濃度では、沈着した式Ｉの化合物のパーセントは高くなるがその量は十分ではない。一方、５ｍｇ／ｍＬの濃度では、式Ｉの化合物の十分な量がネブライザーカップに保持され、式Ｉの化合物が無駄になる。
結論：
結果は、実施例９方法Ａの製剤は、ＴＳＩインビトロ肺モデルにおいて十分な量の式Ｉの化合物を沈着させることが可能だが、未製剤の式Ｉの化合物はＴＳＩに噴霧では沈着しない。従って、実施例９方法Ａの製剤を式Ｉの化合物の吸入送達のために用いることができる。
〔微粒子製剤の生物学的評価〕
インビトロアッセイ
実施例１７
微生物アッセイ
アッセイを文献（ネーサン（Nathan P.）他、１９７８年、「感染した熱傷を治療する局所抗菌剤選択のための実験方法」（Laboratory Methods for Selection of Topical antimicrobial Agents to treat infected Burn Wounds）、バーンズ４：ｐ．１７７−１８７）に基づいて行った。
（Ａ）本アッセイに用いた細菌供試モデル：
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）２０９Ｐ（ＭＳＳＡ）
黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ３３５９１（ＭＲＳＡ）
エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）Ｒ−２（ＶＲＥ）
（Ｂ）接種物の調製
クライオバイアルから培養物をＴＳＡ斜面培地に画線し、３７℃で１８〜２４時間培養した。斜面培地上の増殖物を用い、懸濁液を調製し、５６０ｎｍでの光学濃度を０．３ユニット（〜１０8ＣＦＵ／ｍＬ）に調整した。
（Ｃ）試料の調製
アッセイで検査された試料は下記である。
試料１：実施例９方法Ｂの製剤の未ろ過懸濁液。
試料２：実施例９方法Ｂの製剤のろ過懸濁液（０．２２μｍフィルターでろ過後）。
試料３：メタノール崩壊法によって調整された試料。試料２を同量のメタノールと混ぜ、１時間培養した。この溶液の希釈物をメタノールで調製し、放出した式Ｉの化合物の有効性を評価するために用いた。
試料４：未製剤の式Ｉの化合物（１：８０（メタノール：クロロホルム）の比に溶かした式Ｉの化合物）。
【０１４０】
本アッセイで評価された試料１、２、３および４の濃度は、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６、０．７８、０．３９および０．１９５μｇ／ｍＬである。
（Ｄ）アッセイ手順：
（Ｂ）から得た供試培養物の接種物懸濁液４０μＬを、１００ｍＬ容量の無菌三角フラスコ内の４０ｍＬの解けたＴＳＡ残片（３８℃〜３９℃に維持）のそれぞれに注入し、均一に混ぜるために回転させた。播種された残片をシャーレ（１５０ｍｍの外径）に注ぎ、約３０分間固化させた。完全に固化させるためシャーレを４℃〜８℃に保った。ウェル（直径６ｍｍ）の必要数を固化した培地から打ち抜いた。試料１、試料２および試料３を５０μＬずつシャーレの対応するウェルに加えた。シャーレを低温（２℃〜８℃）で約３０分間プレインキュベートし、拡散させた。そしてシャーレを３７℃で１８〜２４時間培養した。２０μｇ／ｍＬのバンコマイシンを標準抗生物質として用いた。さまざまな試料の活性結果は阻止円のサイズ（ｍｍ）で解釈した。
結果：
試料３は１００μｇ／ｍＬ〜０．７８μｇ／ｍＬで透明帯を示したが、試料４は１００μｇ／ｍＬ〜０．３９μｇ／ｍＬで透明帯を示した。
【０１４１】
試料２は１２．５μｇ／ｍＬで透明な阻止円を示したが、試料１は２５μｇ／ｍＬで透明帯を示したので、試料２の活性（円サイズに関して）は試料１よりもよい。
【０１４２】
試料３の場合、式Ｉの化合物の円サイズは未製剤の式Ｉの化合物（試料４）よりも小さい。これは脂質製剤からの式Ｉの化合物の遅放性によるのかもしれない。
結論：
実施例９方法Ｂの製剤（試料３）から放出された式Ｉの化合物の活性は、未製剤の式Ｉの化合物（試料４）に匹敵するので、インビボ試験および評価を進めることができる。
実施例１８
インビトロ細胞適合性アッセイ
文献「医用材料研究の学術雑誌」（Journal of Biomedical Materials Research、２００９年、８９Ａ、ｐ．２８１−２９２）に基づいてアッセイを行った。
【０１４３】
規制当局により指定された関連細胞株および標準細胞を用いて実施例９方法Ａの製剤の細胞適合性を評価するためにこのアッセイを行った。
評価した細胞株：
ＭＲＣ５（肺線維芽細胞株）
Ａ５４９（悪性腫瘍から分離したタイプＩＩ肺胞細胞株）
Ｌ９２９（マウス線維芽細胞株、ＡＳＴＭ規格）
実験の詳細：
細胞濃度：ＭＲＣ５およびＬ２９２には１００００／ウェル、Ａ５４９には３０００／ウェル
時点：２４時間および４８時間
評価した濃度：
実施例９方法Ｂの製剤の微粒子に対して、１、０．７、０．３、０．１ｍｇ／ｍＬ−試料１
式Ｉの化合物およびＤＰＰＣなしの微粒子に対して、０．３、０．１ｍｇ／ｍＬ−試料２
式Ｉの化合物のみに対して、０．１、０．０１ｍｇ／ｍＬ―試料３。
手順：
毒性評価をプロメガのセルタイター９６エイクイアス・ワンソルーション・アッセイ（The CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay）（カタログ番号：Ｇ３５８２）を用いて行った。アッセイは細胞増殖アッセイまたは細胞毒性アッセイにおける生存細胞数を測定するための標準比色法である。本アッセイに用いられるＭＴＳは細胞培養培地において可溶性の着色ホルマザン生成物に細胞によって生物学的に還元される。４９０ｎｍ吸光度量で測定されたようにホルマザン生成物量は培養物における生細胞数に正比例する。
【０１４４】
手短に言えば、細胞株を３つの９６ウェルプレートに蒔いて培養し、２４時間付着および増殖させた。細胞付着後２４時間して、化合物を加えた。４８時間のポスト細胞プレーティングし、１００μＬの新しい培地で培地を取り替えることによりアッセイを終え、セルタイター９６エイクイアス・ワンソルーション（プロメガ、カタログ番号：Ｇ３５８２）２０μＬを加えた。また、培養培地１００μＬおよび「ワンソルーション」２０μＬを含む「無細胞」コントロールを３つセットアップし、それらを本アッセイにおけるコントロールとして維持した。プレート３０分〜４時間培養し、発色させた。そして、エサイザ（ELISA）９６ウェルプレートを９６ウェルプレートリーダを用い４９０ｎｍ（４５０〜５４０ｎｍ）で吸光度測定した。「無細胞」コントロールからの平均４９０ｎｍ吸光度を全てのほかの吸光度値から引き、修正した吸光度をさらなる計算のために利用した。（「無細胞」コントロールからの背景吸光度は典型的に培養４時間後の０．２〜０．３吸光度ユニットである）。
結果：
試料１の存在下で評価した全細胞株の生存率は９８％より高かった。その細胞株のモルフォロジーは変化せず、単層集密（monolayer confluence）が存在した。これは評価された濃度において、試料１は体細胞由来アッセイにおいて毒性を示さなかったことをあらわす。しかしながら、未製剤形態の式Ｉの化合物は評価された異なる細胞株全てにおいて細胞毒性を示した。したがって、製剤は式Ｉの化合物によって現れる毒性を制限するという別の利点を有する。その結果を表１２にまとめる。
【０１４５】
【表１２】
2013532722.tif 000014
【０１４６】
結論：
試料３はインビボで副作用および毒性に結びつくまたは発現する可能性を有する。しかしながら、ＤＰＰＣを含む試料１では、式Ｉの化合物の毒性が隠され、毒性がなく生物学的有効性が観察される。
実施例１９
インビトロマクロファージ取り込みアッセイ（uptake assay）
アッセイを文献「呼吸器研究」（Respiratory Research、２００９年、１０、ｐ.４４）に基づいて行った。
ラット肺胞マクロファージ分離および培養
ラットからの気管支肺胞洗浄洗液を適切な倫理承認後取った。無菌の温めた生理食塩水を肺に導入し、吸入により除去した。気管支肺胞洗浄液を積氷に移した（通常、ドナーあたり気管支肺胞洗浄液１００〜２００ｍＬが望ましい）。液体を２５０Ｇで１０分間遠心分離し、細胞を採取した。細胞を総量１０ｍＬのＨＢＳＳに再懸濁することにより細胞ペレットを貯留した。１００μＬのアリコットを取り、ライト・ギムザ染色により染色し示差的細胞計数（differential cell count）を行った。細胞計数は調整され、細胞をマクロファージ培養培地（ＨＡＭ Ｆ１２培地、Ａｍｉｍｅｄ、スイス）に蒔いた。細胞懸濁液０．５ｍＬをマクロファージ培養培地とともに各６ウェル組織培養プレートに加えた。細胞を２４時間３７℃、５％ＣＯ2で培養した。細胞付着および細胞増殖物を評価し、スルホローダミン染料でタグ付けされた実施例９方法Ａの製剤で処理した。ポスト処理において、細胞を蛍光評価した。この蛍光は肺胞マクロファージによる製剤の選択的取り込みを意味する。
結果：
実施例９方法Ａの製剤の微粒子は、肺胞マクロファージによって選択的に取り込まれ、取り込みは１時間のポスト処理から始まる。染料は３時間で強度のゆっくりとした飽和を示す。これは活発な取り込みおよびその取り込みの飽和点を示す。結核菌は肺胞マクロファージに住みおよび生存するので、薬物がマクロファージに確実に到達することが非常に重大な意味を持つ。実施例９方法Ａの設計された微粒子製剤により、式Ｉの化合物がマクロファージに到達するだけでなく、マクロファージによって活発に取り込まれるが、これはインビボで成功すべき療法のために望ましい。
【０１４７】
表１２における値から明白なように、実施例９方法Ａの製剤は活発に取り込まれ（化合物濃度においてゆっくりと増加する）、マクロファージによって代謝される（化合物濃度において減少する）。遊離薬物（式Ｉの化合物）は活発な取り込みを示さない（遊離薬物の飽和濃度から明白である）。
【０１４８】
【表１３】
2013532722.tif 000015
【０１４９】
結論：
脂質系微粒子製剤として開発された式Ｉの化合物は治療の標的である肺胞マクロファージによる活発に取り込まれる。この療法は活発に標的や関連する細胞に到達する可能性を有する。
インビボアッセイ
実験に用いられた動物はＣＰＣＳＥＡ,タミル・ナードゥ、インドによって出版されたガイドラインに従って収容され世話された。実験動物を用いる手順はピラマル・ライフ・サイエンス・リミテッド（Piramal Life Sciences Limited）、ゴレアゴン、ムンバイ、インドのＩＡＥＣによって承認された。
実施例２０
肺沈着試験
ＡＡＰＳ学術雑誌（The AAPS Journal）、２００５年、７（１）、Ｅ２０−Ｅ４１によって報告されたようにアッセイを行った。
【０１５０】
パイロットインビボ肺沈着試験（pilot in vivo lung deposition study）を上記文献に従って行った。モルモットを３つの群に分けた。群１には実施例９方法Ａの製剤を投与し、群２には未製剤の式Ｉの化合物を投与し、群３は処置しなかった（未処置群）。製剤１０ｍｇ／ｋｇをエアロゾル化し、上記動物を受動的に呼吸させた。実施例９方法Ａの製剤の投与に続いて、３０分の時点で動物を屠殺した。肺を採取し、ＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣ条件を表１３に示す。
【０１５１】
【表１４】
2013532722.tif 000016
【０１５２】
得られた結果を表１４にまとめる。
【０１５３】
【表１５】
2013532722.tif 000017
【０１５４】
観察：
噴霧では、未製剤の式Ｉの化合物は肺に到達することができない。実施例９方法Ａの製剤は受動呼吸において肺に到達できた。動物をさらに製剤に曝露すると、肺における式Ｉの化合物量が増加する。
結論：
実施例９方法Ａの製剤は肺に到達できる。
実施例２１
実施例９方法Ａの製剤の肺生物学的利用能の測定。
【０１５５】
ＡＡＰＳ学術雑誌（The AAPS Journal、２００５年、７（１）、Ｅ２０−Ｅ４１）によって報告されたようにアッセイを行った。
【０１５６】
鼻のみ曝露インビボ肺沈着試験（nose-only exposure in vivo lung deposition study）を上記文献に従って行った。モルモットを２つの群に分けた。群１には未製剤の式Ｉの化合物を投与し（３ｍｇ／ｋｇ）、群２には実施例９方法Ａの製剤を投与した（３ｍｇ／ｋｇ）。未製剤の式Ｉの化合物および実施例９方法Ａの製剤をエアロゾル化し、噴霧期間を１時間としてジェットネブライザーを用い鼻のみ曝露を行った。噴霧投与に続き、１時間、２時間、６時間、１２時間および２４時間のポスト噴霧曝露で動物を屠殺し、肺を採取して分析し、ＬＣ−ＭＳによって肺に沈着した式Ｉの化合物量（ｎｇ／ｇ）を定量化した。ＬＣ−ＭＳ条件を以下に明記する。
【０１５７】
【表１６】
2013532722.tif 000018
【０１５８】
【表１７】
2013532722.tif 000019
【０１５９】
【表１８】
2013532722.tif 000020
【０１６０】
得られた結果を表１８にまとめる。
【０１６１】
【表１９】
2013532722.tif 000021
【０１６２】
観察
噴霧では、未製剤の式Ｉの化合物は肺に到達することができない。実施例９方法Ａの製剤は肺に到達でき、２４時間保持された。
結論
実施例９方法Ａの製剤は、未製剤の式Ｉの化合物の生物学的利用能特性不良を克服することができた。さらに、実施例９方法Ａの製剤の肺保持特性は１日に一度の吸入に適している。
実施例２２
１時間／日の噴霧曝露を５日間１日に一度投与を行った後の実施例９方法Ａの製剤の累積蓄積物の評価
ＡＡＰＳ学術雑誌（The AAPS Journal、２００５年、７（１）、Ｅ２０−Ｅ４１）によって報告されたようにアッセイを行った。
【０１６３】
鼻のみ曝露インビボ肺沈着試験を上記文献に従って行った。モルモットを２つの群に分けた。群１には未製剤の式Ｉの化合物を投与し（３ｍｇ／ｋｇ）、群２には実施例９方法Ａの製剤を投与した（３ｍｇ／ｋｇ）。未製剤の式Ｉの化合物および実施例９方法Ａの製剤をエアロゾル化し、噴霧期間を連続した５日間毎日１時間としジェットネブライザーを用い鼻のみ曝露を行い、動物を６日目に屠殺した。肺を採取、分析し、ＬＣ−ＭＳによって肺中に沈着した式Ｉの化合物量（ｎｇ／ｇ）を定量化した。ＬＣ−ＭＳ条件は実施例２１の表１５、１６および１７に示したような条件である。
【０１６４】
得られた結果を表１９にまとめる。
【０１６５】
【表２０】
2013532722.tif 000022
【０１６６】
観察：
噴霧では、未製剤の式Ｉの化合物は肺に到達することができない。実施例９方法Ａの製剤は肺に到達でき２４時間保持され、また５日間の慢性的な毎日の曝露後に式Ｉの化合物を示した。
結論：
５日間製剤（実施例９方法Ａの製剤）として式Ｉの化合物を保持するための肺の能力を、治療レジメンとして５日間の噴霧として用いることができる。
実施例２３
実施例９方法Ａの製剤の投与量スケジュールを評価する。
【０１６７】
ＡＡＰＳ学術雑誌（The AAPS Journal、２００５年、７（１）、Ｅ２０−Ｅ４１）によって報告されたようにアッセイを行った。
【０１６８】
鼻のみ曝露インビボ肺沈着試験を上記文献に従って行った。モルモットを３つの群に分けた。群１には未製剤の式Ｉの化合物（３ｍｇ／ｋｇ）を投与し、群２には１日間１日に一度実施例９方法Ａの製剤（３ｍｇ／ｋｇ）を投与し、群３には１日間１日に二度実施例９方法Ａの製剤（３ｍｇ／ｍＬ）を投与した。未製剤の式Ｉの化合物および実施例９方法Ａの製剤をエアロゾル化し、ジェットネブライザーを用い鼻のみ曝露を行った。動物を屠殺し、肺を採取および分析し、ＬＣ−ＭＳによって肺中に沈着した式Ｉの化合物量（ｎｇ／ｇ）を定量化した。ＬＣ−ＭＳ条件は実施例２１の表１５、１６および１７に示したような条件である。
【０１６９】
得られた結果を表２０にまとめる。
【０１７０】
【表２１】
2013532722.tif 000023
【０１７１】
観察：
噴霧では、未製剤の式Ｉの化合物は肺に到達することができない。実施例９方法Ａの製剤は肺に到達でき、肺によって吸収された式Ｉの化合物量は投与量が１日に２倍になると増加する。
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月22日(2013.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物と、薬物送達用生分解性脂質とを含む微粒子製剤であって、脂質に対する該式Ｉの化合物の比が１：１５〜１：２５であり、生分解性であり吸入可能である微粒子製剤。
【化１】
2013532722.tif 000025
【請求項２】
式Ｉの化合物は、前記製剤の１％〜５％（ｗ／ｗ）を構成する、請求項１に記載の微粒子製剤。
【請求項３】
前記生分解性脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）である、請求項１または２に記載の微粒子製剤。
【請求項４】
前記微粒子の粒径は、０．５ミクロンと１０ミクロンとの間の範囲である、請求項１から３のいずれか１項に記載の微粒子製剤。
【請求項５】
前記微粒子の少なくとも９０％は、１０ミクロン未満の粒径である、請求項４に記載の微粒子製剤。
【請求項６】
前記製剤は水性リポソーム分散液である、請求項１から５のいずれか１項に記載の微粒子製剤。
【請求項７】
前記製剤は６から７の範囲であるｐＨを有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の微粒子製剤。
【請求項８】
前記製剤では、相転移温度は４１℃から４３℃の範囲である、請求項１から５のいずれか１項に記載の微粒子製剤。
【請求項９】
請求項１で定義されるような式Ｉの化合物とジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）とを含み、ＤＰＰＣに対する式Ｉの化合物の比が１：１５〜１：２５である微粒子製剤の調製のためのプロセスであって、
（ａ）  式Ｉの化合物およびＤＰＰＣを３ｍＬ〜１５ｍＬのクロロホルムに溶解し、溶液を得る工程と、
（ｂ）  ２０ｍＬ〜４５ｍＬのメタノールを工程（ａ）の溶液に加え、十分混合し、確実に均質性を得る工程と、
（ｃ）  ２０ｍＬ〜５０ｍＬの模擬肺液（ＳＬＦ）を工程（ｂ）の溶液に加える工程と、
（ｄ）  溶媒を蒸発させる工程と、
（ｅ）  工程（ｄ）で得た量をＳＬＦで３０ｍＬにし、１５０００Ｇ〜３５０００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離しペレットを得る工程と、
（ｆ）  工程（ｅ）で得たペレットをＳＬＦ中に再懸濁し、濃度０．５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの懸濁液を得る工程と、
（ｇ）  工程（ｆ）で得た懸濁液を０．５μｍ〜５μｍのポリカーボネートフィルターを通してろ過し、形成された微粒子の粒径を均一にする工程と、を含むプロセス。
【請求項１０】
前記微粒子の粒径は０．５ミクロンと１０ミクロンとの間の範囲である、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記微粒子の少なくとも９０％が１０ミクロン未満のサイズである、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
請求項１で定義されるような式Ｉの化合物とジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）とを含み、ＤＰＰＣに対する式Ｉの化合物の比が１：１５〜１：２５である微粒子製剤の調製のためのプロセスであって、
(ｉ)  ２０ｍＬ〜４５ｍＬの模擬肺液（ＳＬＦ）を、式Ｉの化合物とＤＰＰＣとの混合物に加える工程と、
(ｉｉ)  工程（ｉ）の混合物を、４２℃〜４５℃で１時間、１００ｒｐｍ〜２００ｒｐｍで回転させ、懸濁液を得る工程と、
(ｉｉｉ)  工程（ｉｉ）で得た懸濁液を、１５０００Ｇ〜３５０００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、ペレットを得る工程と、
(ｉｖ)  工程（ｉｉｉ）で得たペレットをＳＬＦ中に再懸濁し、濃度０．５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの懸濁液を得る工程と、
(ｖ)  工程（ｉｖ）で得た懸濁液を０．５μｍ〜５μｍのポリカーボネートフィルターを通してろ過し、形成された微粒子の粒径を均一にする工程と、を含むプロセス。
【請求項１３】
肺結核、多剤耐性結核、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌肺炎およびメチシリン感受性黄色ブドウ球菌肺炎の治療のための薬剤の製造のための、式Ｉの化合物と薬物送達用生分解性脂質とを含み、脂質に対する式Ｉの化合物の比が１：１５〜１：２５である微粒子製剤の使用。
【請求項１４】
前記薬剤の使用は肺胞マクロファージを標的とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
肺送達のために吸入または気管内注入によって哺乳類に送達される薬剤の製造のための、式Ｉの化合物と薬物送達用生分解性脂質とを含み、脂質に対する式Ｉの化合物の比が１：１５〜１：２５である微粒子製剤の使用。
【請求項１６】
前記薬剤は吸入によって送達される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記吸入による薬剤の送達は、前記薬剤に含まれる式Ｉの化合物を微粒子に封入した噴霧により行われる、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記吸入によって送達された薬剤に含まれる式Ｉの化合物は、２４時間を超えて肺に保持される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記封入された式Ｉの化合物の保持率は、３０％から７０％の範囲である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
吸入のための投与量は、０．０５と１０ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の範囲である、請求項１６に記載の使用。 
【国際調査報告】
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