(57)【要約】  本発明は、細胞中の特定の染色体配列を編集するための方法およびキットを提供する。具体的には、標的化エンドヌクレアーゼおよび一本鎖核酸を使用して、前記染色体配列が編集される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中の少なくとも１つの内因性染色体配列を編集する方法であって、
ａ）前記細胞内に、（ｉ）少なくとも１つの標的化エンドヌクレアーゼであって、前記染色体配列中の標的切断部位に二本鎖切断を導入することができる、標的化エンドヌクレアーゼ、または前記標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｉｉ）前記標的切断部位の少なくとも１つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第１の部分を含む少なくとも１つの一本鎖核酸を導入すること；ならびに
ｂ）前記標的化エンドヌクレアーゼによって導入される前記二本鎖切断が、前記染色体配列が前記一本鎖核酸の配列と交換され、それによって前記染色体配列を編集する相同性指向プロセスによって修復される条件下に、前記細胞を維持すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記一本鎖核酸が、前記標的切断部位の他方の側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第２の領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一本鎖核酸が、前記染色体配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドの変化をさらに含み、その結果、前記編集された染色体配列が、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記一本鎖核酸が、前記第１の領域および前記第２の領域と隣接する外因性配列をさらに含み、その結果、前記編集された染色体配列が、組込まれた外因性配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記一本鎖核酸が、前記標的切断部位の上流または下流に位置する遠位染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第２の領域を含み、その結果、前記編集された染色体配列が欠失を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記一本鎖核酸が、前記第１の領域および前記第２の領域と隣接する外因性配列をさらに含み、その結果、前記編集された染色体配列が、組込まれた外因性配列をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記一本鎖核酸が、直鎖状または環状である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記一本鎖核酸が、約２０ヌクレオチド〜約１００，０００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記一本鎖核酸が、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、リボヌクレオチド模倣体、修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸、ペプチド核酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記一本鎖核酸が、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホラミダイト結合、ホスホロジアミデート結合、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記一本鎖核酸が、センスまたはアンチセンス鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記一本鎖核酸が、前記標的切断部位の少なくとも１つの側の少なくとも１０ヌクレオチドに対する少なくとも約９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的化エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、部位特異的ヌクレアーゼ、または人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞内に少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
１つの標的化エンドヌクレアーゼ、前記標的切断部位の上流側に対する実質的な配列同一性を有する第１の部分を含む第１の一本鎖核酸、前記標的切断部位の下流側に対する実質的な配列同一性を有する第１の部分を含む第２の一本鎖核酸、および１つのドナーポリヌクレオチドが前記細胞内に導入され、前記ドナーポリヌクレオチドは、前記第１の一本鎖核酸の第２の部分に対する実質的な配列同一性を有する第１の配列、および前記第２の一本鎖核酸の第２の部分に対する実質的な配列同一性を有する第２の配列を含み、前記ドナーポリヌクレオチドの前記第１の配列および第２の配列は、前記染色体配列内への挿入のための配列に隣接する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第１の標的化エンドヌクレアーゼ、前記第１の標的化エンドヌクレアーゼの前記標的切断部位の上流側に対する実質的な配列同一性を有する第１の部分を含む第１の一本鎖核酸、第２の標的化エンドヌクレアーゼ、前記第２の標的化エンドヌクレアーゼの前記標的切断部位の下流側に対する実質的な配列同一性を有する第１の部分を含む第２の一本鎖核酸、および１つのドナーポリヌクレオチドが前記細胞内に導入され、前記ドナーポリヌクレオチドは、前記第１の一本鎖核酸の第２の部分に対する実質的な配列同一性を有する第１の配列、および前記第２の一本鎖核酸の第２の部分に対する実質的な配列同一性を有する第２の配列を含み、前記ドナーポリヌクレオチドの前記第１の配列および第２の配列は、前記染色体配列内への挿入のための配列に隣接する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、培養細胞、初代細胞、不死細胞、幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）、または１細胞胚である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、ヒト細胞、哺乳動物細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、または単細胞真核生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的化エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼであり、前記一本鎖核酸が、少なくとも３０ヌクレオチドを含むデオキシリボ核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
細胞中の内因性染色体配列を編集するためのキットであって、
ａ）少なくとも１つの標的化エンドヌクレアーゼであって、前記染色体配列中の標的切断部位に二本鎖切断を導入することができる、標的化エンドヌクレアーゼ、または前記標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；および
ｂ）前記標的切断部位の少なくとも１つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第１の部分を含む少なくとも１つの一本鎖核酸
を含む、キット。
【請求項２１】
前記一本鎖核酸が、前記標的切断部位の他方の側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第２の領域を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記一本鎖核酸が、前記染色体配列に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変化をさらに含み、その結果、前記編集された染色体配列が、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記一本鎖核酸が、前記第１の領域および前記第２の領域と隣接する外因性配列をさらに含み、その結果、前記編集された染色体配列が、組込まれた外因性配列を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記一本鎖核酸が、前記標的切断部位の上流または下流に位置する遠位染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第２の領域を含み、その結果、前記編集された染色体配列が欠失を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２５】
前記一本鎖核酸が、前記第１の領域および前記第２の領域と隣接する外因性配列をさらに含み、その結果、前記編集された染色体配列が、組込まれた外因性配列をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記一本鎖核酸が、直鎖状または環状である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２７】
前記一本鎖核酸が、約２０ヌクレオチド〜約１００，０００ヌクレオチドの長さを有する、請求項２０に記載のキット。
【請求項２８】
前記一本鎖核酸が、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、リボヌクレオチド模倣体、修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸、ペプチド核酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２９】
前記一本鎖核酸が、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホラミダイト結合、ホスホロジアミデート結合、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項３０】
前記一本鎖核酸が、センスまたはアンチセンス鎖である、請求項２０に記載のキット。
【請求項３１】
前記一本鎖核酸が、前記標的切断部位の少なくとも１つの側の少なくとも１０ヌクレオチドに対する少なくとも約９０％の配列同一性を有する、請求項２０に記載のキット。
【請求項３２】
前記標的化エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、部位特異的ヌクレアーゼ、または人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤である、請求項２０に記載のキット。
【請求項３３】
前記キットが、前記標的切断部位の上流側に対する実質的な配列同一性を有する第１の部分を含む第１の一本鎖核酸、および前記標的切断部位の下流側に対する実質的な配列同一性を有する第１の部分を含む第２の一本鎖核酸を含み、ドナーポリヌクレオチドであって、前記第１の一本鎖核酸の第２の部分に対する実質的な配列同一性を有する第１の配列、および前記第２の一本鎖核酸の第２の部分に対する実質的な配列同一性を有する第２の配列を含むドナーポリヌクレオチドをさらに含み、前記ドナーポリヌクレオチドの前記第１の配列および第２の配列は、前記染色体配列内への挿入のための配列に隣接する、請求項２０に記載のキット。
【請求項３４】
少なくとも１つのＰＣＲのためのプライマーをさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項３５】
緩衝剤、希釈剤、および培養培地から選択される少なくとも１つの試薬をさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項３６】
前記標的化エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼであり、前記一本鎖核酸が、少なくとも３０ヌクレオチドを含むデオキシリボ核酸である、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１０年１１月４日出願の米国特許仮出願第６１／４１０，１２４号、２０１０年９月１５日出願の米国特許仮出願第６１／３８２，９６５号、および２０１０年７月２３日出願の米国特許仮出願第６１／３６７，０２２号の優先権を主張するものであり、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、概して、特定の染色体配列を編集するための標的化エンドヌクレアーゼおよび一本鎖核酸の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
合理的ゲノム操作は、基礎研究、創薬、および細胞に基づく薬物の全般にわたって、莫大な可能性を有する。標的遺伝子のノックアウト、突然変異誘発、または組込みのための多くの既存の方法は、相同的組換えに依存する。しかしながら、多くの細胞における低速の自発的組換え、ならびに標的事象を単離するために要求される多大なスクリーニングの取り組みおよび時間は、この分野における進歩を阻んできた。したがって、高速、高効率、および高精度で、標的ゲノム編集を迅速に達成することができる技術に対する強い必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示の種々の態様には、細胞中の少なくとも１つの内因性染色体配列を編集するための方法の提供が含まれる。本方法は、細胞内に、（ｉ）少なくとも１つの標的化エンドヌクレアーゼであって、前記染色体配列中の標的切断部位に二本鎖切断を導入することができる、標的化エンドヌクレアーゼ、または前記標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｉｉ）前記標的切断部位の少なくとも１つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第１の部分を含む少なくとも１つの一本鎖核酸を導入することを含む。本方法は、前記標的化エンドヌクレアーゼによって導入される前記二本鎖切断が、前記染色体配列が前記一本鎖核酸の配列と交換され、それによって前記染色体配列を編集する相同性指向プロセスによって修復される条件下に、前記細胞を維持することをさらに含む。
【０００５】
さらなる態様は、細胞中の染色体配列を編集するためのキットを提供する。このキットは、（ａ）少なくとも１つの標的化エンドヌクレアーゼであって、前記染色体配列中の標的切断部位に二本鎖切断を導入することができる、標的化エンドヌクレアーゼ、または前記標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｂ）前記標的切断部位の少なくとも１つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第１の部分を含む少なくとも１つの一本鎖核酸、を含む。
【０００６】
本開示の他の態様および特長は、下記でより詳しく説明する。
【０００７】
カラー図面の参照
本願は、カラーで制作された少なくとも１つの写真を含む。カラー写真を含む本特許出願公開の複製は、請求および必要手数料の支払い時に、特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＲＳＫ２キナーゼ遺伝子座を修飾するために使用されるオリゴヌクレオチドの設計を提示する。ＲＳＫ２キナーゼ野生型ゲノム配列が上部に提示され、ＺＦＮ結合部位が示される。特異的突然変異を包含するオリゴヌクレオチドの配列が下部に提示される。
【０００９】
【図２】ＲＳＫ２キナーゼ遺伝子座へのＢａｍＨＩ部位の組込みを示す。細胞のプールがＢａｍＨＩにより消化され、その断片がゲル電気泳動によって分解された。
【００１０】
【図３】ＲＳＫ２キナーゼ遺伝子座にＢａｍＨＩ部位を包含する単一の単離細胞クローンを示している。個々のクローン中のＲＳＫ２遺伝子座がＰＣＲ増幅され、ＢａｍＨＩにより消化された。
【００１１】
【図４】ＡＡＶＳ１遺伝子座を修飾するために使用されるオリゴヌクレオチドの設計を示す。ＡＡＶＳ１野生型ゲノム配列が上部に提示され、ＺＦＮ結合部位が示される。部位を含むセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が下部に示される。
【００１２】
【図５】ＡＡＶＳ１遺伝子座へのＨｉｎｄＩＩＩ部位の組込みを示す。上部パネルは、ＺＦＮおよびオリゴヌクレオチドと接触させた細胞を示し、下部パネルは、オリゴヌクレオチドのみと接触させた細胞を示す。細胞のプールがＨｉｎｄＩＩＩによって消化され、その断片がゲル電気泳動によって分解された。
【００１３】
【図６】ＡＡＶＳ１遺伝子座にＨｉｎｄＩＩＩ部位を包含する単一の単離細胞クローンを示している。個々のクローン中のＡＡＶＳ１遺伝子座がＰＣＲ増幅され、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化された。
【００１４】
【図７】異なる長さのセンスオリゴヌクレオチドを用いた、ＡＡＶＳ１遺伝子座へのＨｉｎｄＩＩＩ部位の組込みを示す。細胞のプールからのゲノムＤＮＡがＰＣＲ増幅され、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化された。上部に沿った数字は、各オリゴヌクレオチドのヌクレオチド長を示す。Ｍはマーカーを表し、ＧはＧＦＰ（すなわち、ＺＦＮ対照なし）を表し、ＺはＺＦＮを表す。
【００１５】
【図８】異なる長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた、ＡＡＶＳ１遺伝子座へのＨｉｎｄＩＩＩ部位の組込みを示す。細胞のプールからのゲノムＤＮＡがＰＣＲ増幅され、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化された。上部に沿った数字は、各オリゴヌクレオチドのヌクレオチド長を示す。Ｍはマーカーを表し、ＧはＧＦＰ（すなわち、ＺＦＮ対照なし）を表し、ＺはＺＦＮを表す。
【００１６】
【図９】ＺＦＮが、異なる長さのオリゴヌクレオチドと組み合わせて、ｍＲＮＡまたはＤＮＡとして送達された場合のＡＡＶＳ１遺伝子座へのＨｉｎｄＩＩＩ部位の組込みを示す。細胞のプールからのゲノムＤＮＡがＰＣＲ増幅され、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化された。上部に沿った数字は、各オリゴヌクレオチドのヌクレオチド長を示す。ＲはＲＮＡを表し、ＤはＤＮＡを表し、Ｍはマーカーを表し、ＧはＧＦＰ（すなわち、ＺＦＮ対照なし）を表し、ＺはＺＦＮを表す。
【００１７】
【図１０】ＡＡＶＳ１遺伝子座にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む細胞のＣｅｌ−１アッセイを示している。上部に沿った数字は、各オリゴヌクレオチドのヌクレオチド長を示す。Ｍはマーカーを表し、ＧはＧＦＰ（すなわち、ＺＦＮ対照なし）を表し、ＺはＺＦＮを表す。
【００１８】
【図１１】ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＨｉｎｄＩＩＩ部位の組込みのための、相同オリゴヌクレオチドと非相同オリゴヌクレオチドの使用の比較を示している。１、８＝センス、一本鎖；２、９＝アンチセンス、一本鎖；３、１０＝センス＋アンチセンス；４＝センス、一本鎖（２ｘ）；５、１１＝二本鎖（事前アニール）；６、１２＝オリゴヌクレオチドのみ（ＺＦＮなし）、および７＝野生型。
【００１９】
【図１２】一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）およびＺＦＮによる、特定の遺伝子座における０．１〜１００ｋｂゲノムＤＮＡの標的欠失を示している。図１２Ａは、ＺＦＮ切断部位の５’側の欠失を示す。図１２Ｂは、ＺＦＮ切断部位の３’側の欠失を示す。染色体配列中の遠位の欠失終止点領域はＩと表され、標的切断部位近傍のＺＦＮ結合部位は、ＩＩと表される。ｓｓＯＤＮドナーは、遠位の欠失終止点領域に対する配列同一性を有する領域（Ｉ’と表される）、および標的切断部位近傍のＺＦＮ結合部位に対する配列同一性を有する領域（ＩＩと表される）を含む。
【００２０】
【図１３】一本鎖オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮによる、Ｋ５６２中のＡＡＶＳ１遺伝子座における標的ゲノムＤＮＡ欠失のＰＣＲ確認を示している。「１」と記されたレーンは、オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮの双方に暴露したＫ５６２細胞を使用し、したがってＰＣＲ断片は欠失対立遺伝子に由来した。「２」と記されたレーンは、オリゴヌクレオチドのみに暴露され、ＺＦＮには暴露されていないＫ５６２細胞を使用し、得られるＰＣＲ断片は野生型対立遺伝子（欠失なし）である。「３」と記されたレーンは、ＺＦＮのみに暴露したＫ５６２細胞を使用し、したがってＰＣＲ産物は、野生型対立遺伝子の断片も示した。野生型対立遺伝子のＰＣＲ断片および欠失対立遺伝子のＰＣＲ断片の予想サイズが、図１３の各レーン群の上部に提示され、一本鎖オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮを用いた約０．１ｋｂ、０．５ｋｂ、１．０ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３．０ｋｂ、３．５ｋｂ、４．０ｋｂ、４．５ｋｂ、５．０ｋｂ、１０．０ｋｂ、１０．２ｋｂ、２０．０ｋｂ、２０．２ｋｂ、５０ｋｂ、および１００ｋｂの標的ゲノムＤＮＡ欠失が提示および検証された。レーン群には、ＺＦＮ切断部位から３’側の欠失を示す星印「＊」付きの群、ＺＦＮ切断部位から５’側の欠失を示す星印「＊」が付いていない群、ＺＦＮ切断部位から３’側および５’側の両欠失を示す２個の星印「＊＊」付きの１群が含まれる。「Ｍ」は、ＤＮＡマーカーを表す。
【００２１】
【図１４】一本鎖オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮによる、異なる細胞型のＡＡＶＳ１遺伝子座における標的５ｋｂ  ゲノムＤＮＡ欠失のＰＣＲ確認を提示する。Ｋ５６２細胞、ＨＣＴ１１６細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、およびＭＣＦ７細胞を含む全ての細胞試料における欠失対立遺伝子のＰＣＲ断片は、予想サイズが３０３ｂｐである。「１」は、「オリゴヌクレオチド＋ＺＦＮ」を表し；「２」は、「オリゴヌクレオチドのみ」を表し；「３」は、「ＺＦＮのみ」を表し；「Ｍ」は、ＤＮＡマーカーを表す。予想される野生型対立遺伝子のＰＣＲ断片は５３０３ｂｐであり、予想される欠失対立遺伝子のＰＣＲ断片は３０３ｂｐである。
【００２２】
【図１５】一本鎖オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮによる、Ｋ５６２中のＩＲＫ４遺伝子座、ＲＳＫ２遺伝子座、およびＲＳＫ４遺伝子座における標的ゲノムＤＮＡ欠失のＰＣＲ確認を示している。全ての細胞試料における欠失対立遺伝子のＰＣＲ断片は、予想サイズがそれぞれ、ＩＲＡＫ４遺伝子座で３３４ｂｐ、ＲＳＫ２遺伝子座で２８１ｂｐ、ＲＳＫ４遺伝子座で１９０ｂｐである。「１」は、「オリゴヌクレオチド＋ＺＦＮ」を表し；「２」は、「オリゴヌクレオチドのみ」を表し；「３」は、「ＺＦＮのみ」を表し；「Ｍ」は、ＤＮＡマーカーを表す。
【００２３】
【図１６】ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびＺＦＮにより、細胞中で同時標的ゲノム欠失および挿入を達成するための例示的な概略図を示す。遠位の欠失終点領域は、Ｉと表され、標的切断部位近傍のＺＦＮ結合部位は、ＩＩと表される。ｓｓＯＤＮドナーは、遠位の欠失終止点領域に対する配列同一性を有する領域（Ｉ’と表される）、標的切断部位近傍のＺＦＮ結合部位に対する配列同一性を有する領域（ＩＩと表される）、およびｌｏｘＰ配列（ＩＩＩと表される）を含む。フォワードプライマー（Ａ）およびリバースプライマー（Ｂ）は、領域ＩおよびＩＩに隣接し、標的欠失を検証するために使用することができる。プライマーＣは、ＺＦＮの右側結合アームの接合部位のヌクレオチドおよび周辺ゲノムＤＮＡを含み、それによりフォワードプライマー（Ａ）およびリバースプライマーＣを用いて、標的挿入を検証することができる。
【００２４】
【図１７】図１６に示されるプライマーＡおよびＢを用いて、欠失対立遺伝子（レーン６：ＡＡＶＳ１−ＺＦＮおよびＡＡＶＳ１−５ｋｂ  ｓｓＯＤＮ）から予想される３０３ｂｐのＰＣＲ断片を生じた５ｋｂゲノム配列の標的欠失のＰＣＲ検証を示す。ｌｏｘＰ部位の標的挿入のＰＣＲ検証は、プライマーＡおよびＣを用いた、レーン１０の予想サイズを有するＰＣＲ断片によって示された。レーン１および２は、ＤＮＡマーカーを表し；レーン３は、ＧＦＰを表し；レーン４は、ＡＡＶＳ１  ＺＦＮ（ｍＲＮＡ）のみを表し；レーン５は、オリゴヌクレオチドドナーのみを表し；レーン６は、ＡＡＶＳ１  ＺＦＮ＋オリゴヌクレオチドドナーを表し；レーン７は、ＧＦＰを表し；レーン８は、ＡＡＶＳ１  ＺＦＮ（ｍＲＮＡ）を表し；レーン９は、オリゴヌクレオチドドナーのみを表し；レーン１０は、ＡＡＶＳ１  ＺＦＮ＋オリゴヌクレオチドドナーを表す。
【００２５】
【図１８】５’結合配列（配列番号２９）および５’接合部におけるドナー配列の組込みを確認する配列解析を提示する。緑でハイライトした配列は、ＰＣＲ増幅に使用したプライマーを表し（小文字は、配列決定の結果によるものではない）、黒字の配列は、オリゴヌクレオチドドナー中ではないマウスＲｏｓａ２６プラスミド配列を表し、青字の配列は、オリゴヌクレオチドドナー中のマウスＲｏｓａ２６プラスミド配列を表し、赤字の配列は、オリゴヌクレオチドドナー中のＡＡＶＳ１配列を表し、ピンク字の配列は、オリゴヌクレオチドドナー中のＡＡＶＳ１配列を表す。
【００２６】
【図１９】３’結合配列（配列番号３０）および３’接合部におけるドナー配列の組込みを確認する配列解析を提示する。緑でハイライトした配列は、ＰＣＲ増幅に使用したプライマーを表し（小文字は、配列決定の結果によるものではない）、黒字の配列は、オリゴヌクレオチドドナー中ではないマウスＲｏｓａ２６プラスミド配列を表し、青字の配列は、オリゴヌクレオチドドナー中のマウスＲｏｓａ２６プラスミド配列を表し、赤字の配列は、オリゴヌクレオチドドナー中のＡＡＶＳ１配列を表し、ピンク字の配列は、オリゴヌクレオチドドナー中のＡＡＶＳ１配列を表す。
【００２７】
【図２０】２つのＺＦＮ（Ｚ）、２つのオリゴヌクレオチドドナー（Ｏ）、およびプラスミドドナー（Ｄ）に暴露したクローン（Ｚ＋Ｏ＋Ｄ）のみが、サイズ３９０ｂｐを有する５’接合部位のＰＣＲ断片（図２０Ａ）と、サイズ３０９ｂｐを有する３’接合部位のＰＣＲ断片（図２０Ｂ）とを含み、ドナー配列組込みを示唆したことを示している。
【００２８】
【図２１】オリゴヌクレオチド配列同一性（標的配列に対する）と、１０ｋｂのゲノム配列のオリゴ媒介標的欠失の効率との関係を示している。１０ｋｂ欠失の効率は、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲによって測定した。１＝１００％同一性、２＝９８％同一性、３＝９０％同一性、４＝５０％同一性、５＝陰性対照。
【００２９】
【図２２】ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびＺＦＮによる、普遍的プラスミド挿入方法の概略図を提示する。ＺＦＮは、二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製する。２つのオリゴヌクレオチドドナーは、次いでＺＦＮ切断部位に相補的な部分を用いてＤＳＢ端に結合する。２つのオリゴヌクレオチドドナーの５’端における、所望のプラスミド配列のいずれかの末端のプラスミド骨格配列（普遍的またはそうでない）に対する相同性は、プラスミドドナー内への侵入をもたらす。ドナープラスミドを用いてＤＳＢが分解されると、ドナープラスミドからの所望の配列が、ＺＦＮ切断部位に導入および挿入される。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本開示は、標的化エンドヌクレアーゼおよび一本鎖核酸を用いて、内因性染色体配列を編集するための方法を提供する。具体的には、標的化エンドヌクレアーゼは、染色体配列中の標的部位に二本鎖切断を導入することができ、一本鎖核酸は、標的切断部位の少なくとも１つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する領域を含む。標的化エンドヌクレアーゼによって導入される二本鎖切断は、染色体配列が一本鎖核酸の配列と交換され、それによって染色体配列を編集する、一本鎖核酸を用いた相同性指向修復プロセスによって修復される。編集された染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。また、本明細書で開示される方法を用いて染色体配列を編集するための適切な試薬を含むキットも本明細書において提供される。
【００３１】
（Ｉ）染色体配列を編集するための方法
本開示の一態様は、細胞中の少なくとも１つの内因性染色体配列を編集するための方法を提供する。本方法は、細胞内に、（ａ）少なくとも１つの標的化エンドヌクレアーゼであって、前記染色体配列中の標的切断部位に二本鎖切断を導入することができる、標的化エンドヌクレアーゼ、または前記標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｂ）前記標的切断部位の少なくとも１つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する配列を含む少なくとも１つの一本鎖核酸を導入することを含む。本方法は、前記標的化エンドヌクレアーゼによって導入される前記二本鎖切断が、前記染色体配列が前記一本鎖核酸のうちの少なくとも１つの配列と交換され、それによって前記染色体配列を編集する相同性指向修復プロセスによって修復される条件下に、前記細胞を維持することをさらに含む。本方法の要素は以下に詳述する。
【００３２】
（ａ）  標的化エンドヌクレアーゼ
本方法は、細胞内に、少なくとも１つの標的化エンドヌクレアーゼまたは標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸を導入することを含む。標的化エンドヌクレアーゼは、特定の二本鎖染色体ＤＮＡ配列を認識して結合し、染色体配列の標的切断部位に二本鎖切断を導入する実体である。標的化エンドヌクレアーゼは、天然タンパク質または人工タンパク質であってもよい。あるいは、標的化エンドヌクレアーゼは、タンパク質を含まなくてもよい（例えば、人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤）。
【００３３】
標的化エンドヌクレアーゼのタイプは異なり得、また異なるであろう。一部の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼであってもよい。他の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼであってもよい。さらに他の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）−ヌクレアーゼであってもよい。さらなる実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、部位特異的ヌクレアーゼであってもよい。さらに他の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤であってもよい。
【００３４】
（ｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ
一実施形態において、細胞内に導入される標的化エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であってもよい。通常は、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含むが、これらについては下記で説明する。
【００３５】
ジンクフィンガー結合ドメイン。ジンクフィンガー結合ドメインは、選択される任意の核酸配列を認識し、それに結合するように操作されてもよい。例として、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３８５０−３３８６０、Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０２−７０８、およびＳａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：５８０９−５８１４を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然のジンクフィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有し得る。操作方法は、合理的設計および種々のタイプの選択を含むが、それらに限定されない。合理的設計は、例えば、ダブレット、トリプレット、および／またはカドラプレットヌクレオチド配列、ならびに個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを用いることを含み、ここでダブレット、トリプレット、またはカドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはカドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列に関連する。例として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい。例として、米国特許第６，４５３，２４２号に記載されるアルゴリズムを使用して、事前選択された配列を標的とするためのジンクフィンガー結合ドメインを設計してもよい。また、非縮重認識コード表を用いる合理的設計等の代替的方法を使用して、特定の配列を標的とするためのジンクフィンガー結合ドメインを設計してもよい（Ｓｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：７０７４−７０８１）。ＤＮＡ配列内の潜在的標的部位を同定し、ジンクフィンガー結合ドメインを設計するための公的に入手可能なウェブベースのツールは、それぞれｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｔｏｏｌｓ．ｏｒｇおよびｈｔｔｐ：／／ｂｉｎｄｒ．ｇｄｃｂ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ＺｉＦｉＴ／に見出すことができる（Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３４：Ｗ５１６−Ｗ５２３、Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３５：Ｗ５９９−Ｗ６０５）。
【００３６】
ジンクフィンガー結合ドメインは、約３ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチド長、または好ましくは約９〜約１８ヌクレオチド長の範囲のＤＮＡ配列を認識して結合するように設計されてもよい。概して、本明細書に開示されるジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガー結合ドメインは、少なくとも３つのジンクフィンガー認識領域（すなわち、ジンクフィンガー）を含む。一実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、４つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、５つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。さらに別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、６つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の好適な標的ＤＮＡ配列に結合するように設計されてもよい。例として、米国特許第６，６０７，８８２号、第６，５３４，２６１号、および第６，４５３，２４２号を参照されたく、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３７】
ジンクフィンガー認識領域を選択する例示的方法は、ファージディスプレイおよびツー・ハイブリッドシステムを含んでもよく、それらは米国特許第５，７８９，５３８号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，４１０，２４８号、第６，１４０，４６６号、第６，２００，７５９号、および第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、国際公開第ＷＯ９８／５３０５７号、国際公開第ＷＯ００／２７８７８号、国際公開第ＷＯ０１／８８１９７号、および英国特許第２，３３８，２３７号に開示され、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、国際公開第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。
【００３８】
ジンクフィンガー結合ドメイン、ならびに融合タンパク質（およびそれらをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に既知であり、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号に詳述され、これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ジンクフィンガー認識領域および／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、５つ以上のアミノ酸長のリンカーを含む、好適なリンカー配列を用いてともに結合されてもよい。６つ以上のアミノ酸長のリンカー配列の非限定的例については、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号、および第７，１５３，９４９号を参照されたく、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるジンクフィンガー結合ドメインは、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間の好適なリンカーの組み合わせを含んでもよい。
【００３９】
一部の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、核局在シグナルまたは配列（ＮＬＳ）をさらに含んでもよい。ＮＬＳは、染色体の標的配列における二本鎖切断を導入するために、核内へのジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質の標的化を促進するアミノ酸配列である。核局在シグナルは、当技術分野で既知である。例えば、Ｍａｋｋｅｒｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：１０２５−１０２７を参照されたい。
【００４０】
切断ドメイン。ジンクフィンガーヌクレアーゼはまた、切断ドメインも含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的例としては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、それらに限定されない。例えば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．、およびＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８またはｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍを参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素は既知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ、ミクロコッカルヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。また、Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい。これらの酵素のうちの１つ以上（またはそれらの機能的断片）は、切断ドメインの源として使用されてもよい。
【００４１】
また、切断ドメインは、上述の通り、切断活性のための二量体化を必要とする酵素またはその部分に由来してもよい。各ヌクレアーゼは、活性酵素二量体の単量体を含むため、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼが切断に必要とされ得る。あるいは、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼは、活性酵素二量体を作り出すために両方の単量体を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、「活性酵素二量体」は、核酸分子を切断することができる酵素二量体である。２つの切断単量体は、同じエンドヌクレアーゼ（またはそれらの機能的断片）に由来してもよく、または各単量体は、異なるエンドヌクレアーゼ（またはそれらの機能的断片）に由来してもよい。
【００４２】
２つの切断単量体を使用して活性酵素二量体が形成される場合、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼのための認識部位は、好ましくは、それぞれの認識部位への２つのジンクフィンガーヌクレアーゼの結合が、例えば、二量体化によって、切断単量体が活性酵素二量体を形成することを可能にする相互の空間的配向で切断単量体を配置するように、配置される。結果として、認識部位の近端は、約５〜約１８ヌクレオチド分、隔てられてもよい。例えば、近端は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチド分、隔てられてもよい。しかしながら、ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の任意の整数が、２つの認識部位（例えば、約２〜約５０ヌクレオチド対以上）の間に介入してもよいことは理解されよう。例えば、本明細書に詳述される近端等の、ジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位の近端は、６ヌクレオチド分、隔てられてもよい。概して、切断の部位は、認識部位の間にある。
【００４３】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種において存在し、ＤＮＡ（認識部位における）に配列特異的に結合し、結合の部位における、またはその近くのＤＮＡを切断することができる。ある種の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から移動した部位におけるＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド、および他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドにおいて、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、第５，４３６，１５０号、および第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの切断ドメインおよび１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含んでもよく、それらは操作されても、されなくてもよい。例示的ＩＩＳ型制限酵素は、例えば、国際公開第ＷＯ０７／０１４，２７５号に記載され、この公開の開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらなる制限酵素もまた、分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これらもまた、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。
【００４４】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能な、例示的ＩＩＳ型制限酵素には、ＦｏｋＩがある。この特定の酵素は、二量体として活性である（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５）。したがって、本開示の目的で、ジンクフィンガーヌクレアーゼに使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断単量体と見なされる。したがって、ＦｏｋＩ切断ドメインを用いる標的二本鎖切断のために、各々がＦｏｋＩ切断単量体を含む、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、活性酵素二量体を再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断単量体を含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。
【００４５】
特定の実施形態において、切断ドメインは、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号、第２００６０１８８９８７号、および第２００８０１３１９６２号に記載される通り、ホモ二量体化を最小化または防止する、１つまたは複数の操作された切断単量体を含んでもよく、これらの文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非限定的な例として、ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、および５３８位のアミノ酸残基は全て、ＦｏｋＩ切断ハーフ−ドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。絶対的ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの、例示的な操作された切断単量体としては、第１の切断単量体がＦｏｋＩのアミノ酸残基４９０位および５３８位における変異を含み、第２の切断単量体がアミノ酸残基４８６位および４９９位における変異を含む対が挙げられる。
【００４６】
したがって、一実施形態では、アミノ酸４９０位における変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、アミノ酸５３８位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、アミノ酸４８６位における変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換し、４９９位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する。具体的には、操作された切断単量体は、１つの切断単量体におけるＥ〜Ｋの４９０位およびＩ〜Ｋの５３８位を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と命名される操作された切断単量体を産生することによって、ならびに別の切断単量体におけるＱ〜Ｅの４８６位およびＩ〜Ｌの４９９位を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と命名される操作された切断単量体を産生することによって、調製されてもよい。上述の操作された切断単量体は、異常な切断が最小化されるか、または無効にされる、絶対的ヘテロ二量体変異体である。操作された切断単量体は、好適な方法を用いて、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号に記載される野生型切断単量体（ＦｏｋＩ）の部位特異的突然変異誘発によって調製することができる。
【００４７】
（ｉｉ）他の標的化エンドヌクレアーゼ
別の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼであってもよい。メガヌクレアーゼは、大きい認識部位を特徴とする、すなわち、認識部位が、一般に約１２塩基対〜約４０塩基対の範囲である、エンドデオキシリボヌクレアーゼである。この要件により、認識部位は、一般に、任意の所定のゲノム中に１度のみ生じる。メガヌクレアーゼの中で、ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーは、ゲノムの研究およびゲノム操作のための重要な手段となっている。メガヌクレアーゼは、当業者に公知の技法を用いて特定の染色体配列の認識配列を修飾することにより、それらの特定の染色体配列を標的とすることができる。
【００４８】
さらなる実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼであってもよい。ＴＡＬＥは、新しいＤＮＡ標的に結合するように容易に操作できる植物病原菌キサントモナス由来の転写因子である。ＴＡＬＥまたはそのトランケート型をＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに結合して、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮと称される標的化エンドヌクレアーゼを作製してもよい。
【００４９】
さらに別の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、部位特異的ヌクレアーゼであってもよい。具体的には、部位特異的ヌクレアーゼは、その認識部位がゲノム中にまれに生じる、「レアカッター」エンドヌクレアーゼであってもよい。好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼの認識配列は、ゲノム中に１度のみ生じる。
【００５０】
また別の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤（人工制限ＤＮＡカッターとも称される）であってもよい。例えば、人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤は、ＤＮＡを切断する金属／キレート剤錯体と、標的切断部位に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとを含んでもよい。したがって、人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤は、いかなるタンパク質も含有しない。金属／キレート剤錯体の金属は、セリウム、カドミウム、コバルト、クロム、銅、鉄、マグネシウム、マンガン、亜鉛等であってもよい。金属／キレート剤錯体のキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ等であってもよい。好ましい実施形態において、金属／キレート剤錯体は、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＧＴＡであってもよい。別の好ましい実施形態において、人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤は、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＧＴＡの錯体と、疑似相補性ペプチド核酸（ＰＮＡ）の二本鎖とを含んでもよい（Ｋａｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１１，１１（１）：３８−４５）。
【００５１】
（ｉｉｉ）標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸
一部の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、核酸として細胞内に導入してもよく、この細胞は次いで標的化エンドヌクレアーゼを発現および産生する。標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡであってもよく、ｍＲＮＡは、５’キャップされていても、ポリアデニル化されていても、またはその両方であってもよい。概して、標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、プロモーター調節領域に操作可能に結合されることになる。調節領域は、構成的または誘導的であってもよい。標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸（およびその結合調節領域）は、プラスミドなどのベクター等として細胞内に導入してもよい。あるいは、標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸（およびその結合調節領域）は、直鎖状分子として細胞内に導入してもよい。
【００５２】
（ｂ）一本鎖核酸
（ｉ）一般的特性
本方法は、細胞内に、標的切断部位の少なくとも１つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する領域を含む少なくとも１つの一本鎖核酸を導入することをさらに含む。一部の実施形態において、１つの一本鎖核酸が細胞内に導入される。他の実施形態において、２つの一本鎖核酸が細胞内に導入される。さらなる実施形態において、３つ以上の一本鎖核酸が細胞内に導入される。
【００５３】
「実質的な配列同一性」という表現は、オリゴヌクレオチドが、標的染色体配列に対する少なくとも約７５％の配列同一性有することを意味する。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的染色体配列に対する約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有してもよい。さらに、一本鎖核酸は、一般に、標的切断部位の少なくとも１つの側の少なくとも約１０ヌクレオチドに対して実質的な配列同一性を有する。一部の実施形態において、一本鎖核酸は、標的切断部位の少なくとも１つの側の約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、または１００を超えるヌクレオチドに対して、実質的な配列同一性を有してもよい。
【００５４】
細胞内に導入される一本鎖核酸の長さは異なり得、また異なるであろう。例えば、一本鎖核酸は、約２０ヌクレオチド長から約２００，０００ヌクレオチド長までの範囲であってもよい。種々の実施形態において、一本鎖核酸は、約２０ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド長〜約１０００ヌクレオチド長、約１０００ヌクレオチド長〜約１０，０００ヌクレオチド長、約１０，０００ヌクレオチド長〜約１００，０００ヌクレオチド長、または約１００，０００ヌクレオチド長〜約２００，０００ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
【００５５】
一部の実施形態において、一本鎖核酸は直鎖状であってもよい。他の実施形態において、一本鎖核酸は、環状であってもよい（例えば、当業者に既知のファージ法によって調製される）。一本鎖核酸は、対象染色体配列に対してセンスまたはアンチセンス鎖であってもよい。
【００５６】
一本鎖核酸の組成は異なり得、また異なるであろう。核酸のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせであってもよい。ヌクレオチドは、標準ヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）、またはヌクレオチド類似体であってもよい。ヌクレオチド類似体とは、修飾されたプリン塩基もしくはピリミジン塩基、または修飾リボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、天然ヌクレオチド（例えば、イノシン）、または非天然ヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖部分または塩基部分の修飾の非限定的な例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、ならびに塩基の炭素原子および窒素原子の他の原子との置換（例えば、７−デアザプリン）がある。またヌクレオチド類似体には、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノも含まれる。一本鎖核酸のヌクレオチドは、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホラミダイト結合、ホスホロジアミデート結合、またはそれらの組み合わせによって結合されていてもよい。
【００５７】
好ましい実施形態において、一本鎖核酸は、デオキシリボヌクレオチドを含む。
【００５８】
（ｉｉ）好ましい一本鎖核酸
一実施形態において、一本鎖核酸は、標的切断部位の上流側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第１の領域、および標的切断部位の下流側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第２の領域を含んでもよい（例えば、図１および図４を参照）。本実施形態の種々の反復法において、一本鎖核酸は、染色体配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチドの変化をさらに含んでもよい。例えば、一本鎖核酸は、一般に、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、またはそれらの組み合わせを含むであろう。種々の反復法において、一本鎖核酸は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のヌクレオチド変化を含んでもよい。これらのヌクレオチド変化の結果として、編集された染色体配列が改変配列または小変異を含み、修飾された遺伝子産物が産生される、遺伝子産物が産生されない等であってもよい。
【００５９】
代替的実施形態において、一本鎖核酸は、標的切断部位のいずれかの側に対する実質的な配列同一性を有する第１の領域および第２の領域と隣接する、外因性配列を含んでもよい（上述の通り）。その結果、編集された染色体配列は、組込まれた外因性核酸配列を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、用語「外因性の」とは、通常はその染色体位置に位置しない任意の配列を指す。例えば、外因性配列は、別の生物由来の「遺伝子」、同じ生物由来の「遺伝子」のさらなるコピー、人工配列、レポーター分子をコードする配列等であってもよい。
【００６０】
別の実施形態において、一本鎖核酸は、標的切断部位の一つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第１の領域、および標的切断部位の遠位の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第２の領域を含んでもよい（図１２を参照）。遠位染色体配列は、標的切断部位の上流または下流であってよく、遠位染色体配列は、標的切断部位から約２０塩基対〜約１，０００，０００塩基対離れて位置していてもよい。例えば、遠位染色体配列は、標的切断部位の約０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００、または１，０００キロ塩基対（上流または下流）であってもよい。結果として、編集された染色体配列は、最大約１，０００，０００塩基対の欠失を含んでもよい。本実施形態の１つの反復法において、一本鎖核酸は、標的切断部位の下流側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第１の領域、および標的切断部位の上流に位置する遠位染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第２の領域を含んでもよく、編集された染色体配列は、標的切断部位に対して上流（または５’）の欠失を含んでもよい。本実施形態の別の反復法において、一本鎖核酸は、標的切断部位の上流側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第１の領域、および標的切断部位の下流に位置する遠位染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第２の領域を含んでもよく、編集された染色体配列は、標的切断部位に対して下流（または３’）の欠失を含んでもよい。
【００６１】
また別の実施形態において、一本鎖核酸は、標的切断部位の一つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第１の領域および標的切断部位の遠位の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第２の領域と隣接する、外因性配列を含んでもよい（上記に詳述した通り）。本実施形態において、編集された染色体配列は、欠失、および標的切断部位における外因性配列の組込みを含んでもよい（図１６を参照）。外因性配列の同一性は異なり得、また異なるであろう。例えば、外因性配列は、別の生物由来の「遺伝子」、同じ生物由来の「遺伝子」のさらなるコピー、レポーター分子等であってもよい。
【００６２】
（ｃ）任意のドナーポリヌクレオチド
特定の実施形態において、方法は、細胞内に、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。ドナーポリヌクレオチドは、標的切断部位の染色体配列内への組込みのための配列を含み、この組込みのための配列は第１の配列および第２の配列と隣接し、第１の配列および第２の配列は、それぞれ一本鎖核酸の部分に対する実質的な配列同一性を有する。したがって、ドナーポリヌクレオチドは、第１の一本鎖核酸および第２の一本鎖核酸（ならびに少なくとも１つの標的化エンドヌクレアーゼ）とともに導入される。第１の一本鎖核酸は、標的切断部位の上流側に対する実質的な配列同一性を有する第１の部分、およびドナーポリヌクレオチド中の第１の配列に対する実質的な配列同一性を有する第２の部分を含む。第２の一本鎖核酸は、標的切断部位の下流側に対する実質的な配列同一性を有する第１の部分、およびドナーポリヌクレオチド中の第２の配列に対する実質的な配列同一性を有する第２の部分を含む。
【００６３】
ドナーポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体等を含んでもよい。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、環状または直鎖状であってもよい。通常は、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡであろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター等であってもよい。ドナーポリヌクレオチドは、複製起点、選択マーカー、マルチクローニングサイト等をさらに含んでもよい。ドナーポリヌクレオチドのサイズは異なり得、また異なるであろう。例えば、ドナーヌクレオチドは、約１キロ塩基（ｋｂ）〜約２００ｋｂの範囲であってもよい。一実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、対象タンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列の約１００ｋｂのエキソン配列およびイントロン配列を含んでもよい。
【００６４】
（ｄ）細胞
本方法は、上記に記載の標的化エンドヌクレアーゼ分子（複数可）および核酸（複数可）を細胞内に導入することを含む。様々な細胞が、本方法における使用に適している。概して、細胞は、真核細胞または単細胞真核生物であろう。一部の例において、細胞は、培養細胞、初代細胞、または不死細胞であってもよい。好適な細胞には、菌類または酵母、例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、昆虫細胞、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のＳＦ９細胞またはキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のＳ２細胞、および動物細胞、例えば、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞がある。例示的細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、初代細胞であってもよい。概して、二本鎖切断に感受性であるいかなる初代細胞も使用することができる。細胞は、様々な細胞型を有してもよく、例えば、線維芽細胞、筋芽細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞、マクロファージ、上皮細胞等である。
【００６５】
哺乳動物細胞株を使用する場合、その細胞株は、まだ記載されていないいかなる樹立細胞株または初代細胞株であってもよい。細胞株は、接着性または非接着性であってよく、あるいは細胞株は、当業者に既知の標準技術を用いて、接着性、非接着性、または器官型の成長を促進する条件下で成長させてもよい。好適な哺乳動物細胞株の非限定的な例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶＩ株（ＣＯＳ７）、ヒト胚性腎臓株２９３、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、サル腎臓細胞（ＣＶＩ−７６）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ）、ラットヘパトーマ細胞（ＨＴＣ）、ＨＩＨ／３Ｔ３細胞、ヒトＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＫ５６２細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ヒトＨＣＴ１１６細胞、ヒトＭＣＦ−７細胞、およびＴＲＩ細胞がある。哺乳動物細胞株の広範な一覧について、当業者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｃａｔａｌｏｇ（ＡＴＣＣ（登録商標），Ｍａｍａｓｓａｓ，ＶＡ）を参照することができる。
【００６６】
さらに他の実施形態において、細胞は幹細胞であってもよい。好適な幹細胞には、胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎生幹細胞、成人幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、および単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
さらなる実施形態において、細胞は１細胞胚であってもよい。胚は、脊椎動物の胚または非脊椎動物の胚であってもよい。好適な脊椎動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類が含まれる。好適な哺乳動物の例には、齧歯動物、伴侶動物、家畜動物、および非霊長類が含まれるが、これらに限定されない。齧歯動物の非限定的な例には、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、およびモルモットがある。好適な伴侶動物には、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミ、およびフェレットが含まれるが、これらに限定されない。家畜の非限定的な例には、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラマ、アルパカが含まれる。好適な非霊長類には、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザル、およびサバンナモンキーが含まれるが、これらに限定されない。鳥類の非限定的な例には、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびガチョウが含まれる。あるいは、動物は、無脊椎動物、例えば昆虫、線虫等であってもよい。昆虫の非限定的な例には、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）および蚊が含まれる。
【００６８】
（ｅ）細胞への送達
上記に記載の標的化エンドヌクレアーゼ分子（複数可）および核酸（複数可）は、様々な手段で細胞内に導入することができる。好適な送達手段には、微量注入、エレクトロポレーション、ソノポレーション、遺伝子銃、リン酸カルシウム媒介型トランスフェクション、陽イオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション、光学トランスフェクション、専有の薬剤増強型の核酸取り込み、およびリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、または人工ビリオンを介する送達が含まれる。一実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼ分子（複数可）および核酸（複数可）は、ヌクレオフェクションによって細胞内に導入することができる。別の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼ分子（複数可）および核酸（複数可）は、微量注入によって細胞（例えば、１細胞胚）中に導入することができる。標的化エンドヌクレアーゼ分子（複数可）および核酸（複数可）は、細胞核または細胞質中に微量注入してもよい。
【００６９】
１つより多くの標的化エンドヌクレアーゼ分子および１つより多くの一本鎖核酸が細胞内に導入される実施形態において、それらの分子は、同時または順次に導入することができる。例えば、それぞれ標的切断部位に対して特異的な標的化エンドヌクレアーゼ分子、および対応する一本鎖核酸（複数可）は、同時に導入してもよい。あるいは、各標的化エンドヌクレアーゼ分子、および対応する一本鎖核酸（複数可）は、順次導入してもよい。任意のドナーポリヌクレオチドも同様に導入してよい。
【００７０】
標的化エンドヌクレアーゼ分子（複数可）の一本鎖核酸（複数可）に対する比率は、異なり得、また異なるであろう。概して、標的化エンドヌクレアーゼ分子（複数可）の核酸（複数可）に対する比率は、約１：１０〜約１０：１の範囲であってもよい。種々の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼ分子（複数可）の核酸（複数可）に対する比率は、約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１であってもよい。一実施形態において、この比率は約１：１であってもよい。
【００７１】
（ｆ）細胞の培養
本方法は、標的化エンドヌクレアーゼによって導入される二本鎖切断が、一本鎖核酸（複数可）を用いた相同性指向プロセスによって修復されて、染色体配列が編集され得る適切な条件下に、細胞を維持することをさらに含む。標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸（複数可）が細胞内に導入される実施形態において、本方法は、細胞が標的化エンドヌクレアーゼを発現する適切な条件下に、細胞を維持することを含む。
【００７２】
概して、細胞は、細胞にとって適切な条件下で維持されるであろう。好適な細胞培養条件は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  ＰＮＡＳ  １０５：５８０９−５８１４、Ｍｏｅｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  ＰＮＡＳ  １０４：３０５５−３０６０、Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：６４６−６５１、およびＬｏｍｂａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ（２００７）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：１２９８−１３０６に記載されている。当業者は、細胞を培養するための方法が、当技術分野において既知であり、細胞型に応じて異なり得、また異なるであろうことを理解する。あらゆる場合において、日常的な最適化を使用して、個々の細胞型にとって最良の技術を決定することができる。
【００７３】
細胞が１細胞胚である実施形態では、胚は、インビトロ（例えば、細胞培養物中）で培養してもよい。通常は、胚は、適切な温度および適切な培地で、二本鎖切断の修復を可能にし、胚の発達を可能にするために必要なＯ２／ＣＯ２比で培養する。好適な培地の非限定な例には、Ｍ２培地、Ｍ１６培地、ＫＳＯＭ培地、ＢＭＯＣ培地、およびＨＴＦ培地が含まれる。当業者は、培養条件が胚の種に応じて異なり得、また異なるであろうことを理解するであろう。あらゆる場合において、日常的な最適化を使用して、個々の胚の種にとって最良の培養条件を決定することができる。一部の例において、胚は、胚をメス宿主の子宮中に移すことによって、インビボで培養してもよい。概して言えば、メス宿主は、その胚と同じ種または類似した種に由来する。好ましくは、メス宿主は、偽妊娠している。偽妊娠したメス宿主を準備する方法は、当技術分野で既知である。さらに、胚をメス宿主中に移す方法も既知である。胚をインビボで培養することは、胚の発達を可能にし、その胚に由来する動物の出生をもたらし得る。
【００７４】
本プロセスのこのステップにおいて、標的化エンドヌクレアーゼ（一部の例では、導入された標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸から発現される）は、染色体配列中の標的切断部位を認識し、結合し、そこで二本鎖切断を作製する。染色体配列中の二本鎖切断は、核酸配列が染色体配列と交換される、一本鎖核酸を用いた相同的組み換えによって修復される。核酸配列は、物理的に組込んでもよく、あるいは核酸配列を切断の修復のためのテンプレートとして使用して、染色体配列の編集をもたらしてもよい。
【００７５】
染色体配列の標的編集の頻度は、様々な要因に応じて異なり得、また異なるであろう。一部の実施形態において、編集の頻度は、約０．０１％、０．０３％、０．１％、０．３％、１％、３％、１０％、または３０％を超えてもよい。編集された染色体配列を含む単細胞クローンは、当技術分野において周知の技術を用いて単離することができる。当業者は、編集された染色体配列のホモ接合型の細胞を生成するための方法に精通している。つまり、細胞は、編集された染色体配列のヘテロ接合型またはホモ接合型であってもよい。
【００７６】
編集された染色体配列は、１つまたは複数の点変異（すなわち、１つのヌクレオチドが、別のヌクレオチドに置換される）、１つまたは複数の欠失、および／または１つまたは複数の挿入を含んでもよい。点変異は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、またはサイレント突然変異であってもよい。欠失は、約１塩基対〜約５００キロ塩基対の範囲であってよく、挿入は、約１塩基対〜約２００キロ塩基対の範囲であってもよい。
【００７７】
したがって、編集された染色体配列は、修飾遺伝子産物（すなわち、タンパク質または非コードＲＮＡ）を生じてもよい。例えば、編集された染色体配列がタンパク質コード領域内に位置する実施形態では、得られるタンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸変化を含んでもよい。他の実施形態において、修飾染色体配列は、修飾非コードＲＮＡを生じてもよく、または修飾染色体配列は、変更された制御機能を有してもよい。
【００７８】
あるいは、編集された染色体配列は、機能性遺伝子産物が産生されない（または制御領域の機能が排除される）ように不活性化してもよい。例えば、編集された染色体配列がタンパク質コード領域内に位置する実施形態において、点変異（複数可）、欠失（複数可）、および／または挿入（複数可）が、未成熟終止コドン、スプライス部位突然変異、および／またはフレームシフト突然変異を導入して、機能性タンパク質が産生されないようにしてもよい。
【００７９】
編集された染色体配列が挿入を含む実施形態において、挿入される配列は、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、タンパク質断片、タンパク質サブユニット、タンパク質タグ等をコードしてもよい。あるいは、挿入される配列は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでも、非コードＲＮＡをコードしても、マイクロＲＮＡ結合部位を含んでも、または転写調節因子として機能してもよい。
【００８０】
（ＩＩ）少なくとも１つの編集された染色体配列を含む細胞
本開示の別の態様は、少なくとも１つの編集された染色体配列であって、上記の第（Ｉ）章に記載した方法で編集された染色体配列を含む細胞を提供する。好適な細胞は、上記の第（Ｉ）（ｄ）章に詳述される。
【００８１】
（ＩＩＩ）キット
さらなる態様は、細胞中の染色体配列を編集するためのキットを包含する。本キットは、（ａ）少なくとも１つの標的化エンドヌクレアーゼであって、前記染色体配列中の標的切断部位に二本鎖切断を導入することができる、標的化エンドヌクレアーゼ、または前記標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｂ）前記標的切断部位の少なくとも１つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第１の部分を含む少なくとも１つの一本鎖核酸、を含む。したがって、本キットは、上記の第（Ｉ）章に詳述した方法を用いて染色体配列を編集するための手段を提供する。
【００８２】
本キットは、標的化エンドヌクレアーゼおよび一本鎖核酸を用いたゲノム編集のための開示される方法を実施するのに有用な、１つまたは複数のさらなる試薬をさらに含んでもよい。キットは、一般に、１つまたは複数の別個の組成物として、または試薬の適合性が許容する場合には任意により混合物として試薬を保持する１つまたは複数の容器を有するパッケージを含む。本キットは、使用者の立場から望ましいであろう他の材料（複数可）、例えば緩衝剤（複数可）、希釈剤（複数可）、培養培地（複数可）、標準物質（複数可）、および／または加工時、またはゲノム編集方法の任意のステップを実施する際に有用な任意の他の材料も含んでよい。
【００８３】
本明細書において提供されるキットは、好ましくは、上記の第（Ｉ）章に詳述したように染色体配列を編集するための使用説明を含む。本キットに含まれる使用説明は、パッケージ材料に書き添えられていても、添付文書として含まれていてもよい。使用説明は、通常は記載物または印刷物であるが、そのようなものに限定されない。そのような使用説明を保存し、それらを最終使用者に伝達することができるいかなる媒体も本開示により想定されている。そのような媒体には、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）等を含むが、それらに限定されない。本明細書で使用されるとき、用語「使用説明」は、その使用説明を提供するインターネットサイトのアドレスを含みうる。
【００８４】
（ＩＶ）用途
本明細書に開示される染色体配列を編集するための方法は、様々な用途を有しうる。一部の実施形態において、本方法を研究目的で使用して、修飾タンパク質の機能を検査することができるように、対象タンパク質中に標的突然変異を導入することができる。また、本方法を使用して、タンパク質が産生されないようにタンパク質コード配列を不活性化してもよく、このとき細胞または細胞を含む生物の表現型を検査することができる。さらに、本方法を使用して、ＲＮＡコード領域または転写調節領域を研究目的で修飾または不活性化することができる。さらに他の実施形態において、本方法を使用して、染色体配列および／または組込み外因性核酸配列の大きい領域を欠失させることができる。
【００８５】
他の実施形態において、本明細書に開示される方法は、臨床目的または治療目的で使用することができる。つまり、本方法を用いて、病原遺伝子または染色体配列を修復または修正することができる。一例として、鎌状赤血球病は、単一ヌクレオチド変化によって生じ得る（すなわち、β−グロビン遺伝子におけるＡからＴへの変化は、β−グロビンタンパク質におけるグルタミン酸のバリンへの変化をもたらす）。したがって、本開示の方法を使用して、鎌状赤血球形質または鎌状赤血球病を有する個人の細胞内のβ−グロビン遺伝子において、ＳＮＰを修正することができる。同様に、本方法を使用して、特定の疾患または疾患状態に関与する他の遺伝子または染色体配列における、スプライス部位の突然変異、欠失、挿入等を修正することができる。
【００８６】
定義
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に本発明において使用される用語の多くの一般的定義を提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）、Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）、Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用されるとき、以下の用語は、別途指示されない限り、それらに帰された意味を有する。
【００８７】
本開示の要素またはそれら好ましい実施形態（複数可）を紹介するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、１つ以上の要素が存在することを意味することが意図される。「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であることが意図され、列挙された要素以外の付加的な要素が存在し得ることを意味する。
【００８８】
「編集」または「ゲノム編集」とは、特定の染色体配列を変化させるプロセスを指す。編集された染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、および／または少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含んでもよい。編集された修飾染色体配列は、修飾遺伝子産物（例えば、変更されたアミノ酸配列を有するタンパク質、変更されたヌクレオチド配列を有する非コードＲＮＡ等）をコードしても、修飾された機能（例えば、変更されたプロモーター機能、変更されたエンハンサー機能等）を提供しても、遺伝子産物をもたらさなくても（すなわち、配列が転写されない、および／または機能性産物が生成されない）、制御機能を提供しなくても、外因性配列をコードしなくても、または新しい機能（すなわち、制御可能なプロモーター、誘導可能なプロモーター、マイクロＲＮＡ結合部位等として）を提供しなくてもよい。
【００８９】
本明細書で使用されるとき、用語「内因性の」とは、その細胞の天然の染色体配列を指す。
【００９０】
本明細書で使用されるとき、用語「外因性の」とは、通常は特定の染色体位置に位置しない核酸配列を指す。外因性配列は、別の生物に由来してもよく、人工的であってもよく、または別の染色体位置に存在する核酸配列の重複コピーであってもよい。
【００９１】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エクソンおよびイントロンを含む）、ならびに遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域を指し、かかる制御配列がコード配列および／または転写配列に隣接するか否かを問わない。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等の転写制御配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、ならびに遺伝子座調節領域を含むが、必ずしもそれらに限定されない。
【００９２】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、直鎖状または環状立体配座のデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的で、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であるものとして解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分、および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含し得る。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対形成する。
【００９３】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互換的に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。
【００９４】
本明細書で使用されるとき、「標的部位」または「標的配列」という用語は、編集対象の染色体配列の一部分を規定し、結合に十分な条件が存在することを条件として、ジンクフィンガーヌクレアーゼが認識し、結合するように操作される核酸配列を指す。
【００９５】
「上流」および「下流」という用語は、定位置に対する核酸配列中の位置を指す。上流は、その位置の５’側（すなわち、鎖の５’末端近傍）の領域を指し、下流は、その位置の３’側（すなわち、鎖の３’末端近傍）の領域を指す。
【００９６】
核酸およびアミノ酸の配列同一性を決定するための技術は、当技術分野において既知である。通常は、そのような技術には、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することが含まれる。ゲノム配列もこれと同様に決定し、比較することができる。概して、同一性は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のそれぞれヌクレオチドとヌクレオチド、またはアミノ酸とアミノ酸の正確な一致を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性百分率を決定することによって比較することができる。２つの配列の同一性百分率は、核酸であるかアミノ酸配列であるかを問わず、２つのアラインメントされた配列間の正確なマッチの数を短い方の配列の長さで除し、１００を乗じたものである。核酸配列の近似アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって正規化されたスコアリング行列を用いることによって、アミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性百分率を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実現形態は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）により、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーテリティアプリケーションにおいて提供される。配列間の同一性百分率または類似性を算出するために好適な他のプログラムは、概して当該技術分野で既知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用することができる：遺伝コード（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ）＝標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）；フィルター（ｆｉｌｔｅｒ）＝なし（ｎｏｎｅ）；鎖（ｓｔｒａｎｄ）＝両方（ｂｏｔｈ）；カットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）＝６０；期待数（ｅｘｐｅｃｔ）＝１０；行列（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；表示（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；分類方法（ｓｏｒｔ  ｂｙ）＝高スコア（ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ）；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅｓ）＝非重複（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋウェブサイト上に見出すことができる。本明細書に記載される配列に関して、望ましい配列同一性の程度���範囲は、約８０％〜１００％およびその間の任意の整数値である。通常は、配列間の同一性百分率は、少なくとも７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、より一層好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。
【００９７】
あるいは、安定な二重鎖の形成が、ある程度の配列同一性を共有する領域間で起こり得るような条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）により消化し、消化された断片のサイズ決定を行うことによって、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度を決定することができる。２つの核酸配列、または２つのポリペプチド配列は、それらの配列が、上記の方法を用いて決定したときに、その分子の規定の長さにわたって、少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、より好ましくは８５％〜９０％、さらにより好ましくは９２％、より一層好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を示す場合、互いに実質的に類似している。本明細書で使用されるとき、実質的に類似はまた、指定したＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列も指す。実質的に類似したＤＮＡ配列は、例えば、その特定の系に対して定義されるストリンジェントな条件下で行われる、サザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定めることは、当該分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。
【００９８】
２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、以下の通りに決定することができる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、かかる分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強さに影響を及ぼす。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当技術分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイを用いて評価することができる（例えばサザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーション等、Ｓａｍｂｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。かかるアッセイは、様々な程度の選択性を用いて、例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまでの様々な条件を用いて行うことができる。低ストリンジェンシー条件を用いる場合、非特異的結合の不在は、ある程度でも配列同一性を欠いた二次プローブ（例えば、標的分子との約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いて、非特異的結合事象の不在下ではその二次プローブが標的にハイブリダイズしないようにすることにより、評価することができる。
【００９９】
ハイブリダイゼーションに基づく検出系を利用する場合は、参照核酸配列に相補的な核酸プローブを選択し、次いで適切な条件を選択することによって、プローブと参照配列とが互いに選択的にハイブリダイズ、または結合して、二重鎖分子を形成する。中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は、通常は、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にするような条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、通常は、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％を超える配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブおよび参照配列が特定の配列同一性の程度を有する場合、プローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当分野で既知である通りに決定することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。ハイブリダイゼーションの条件は当業者に周知である。
【０１００】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチヌクレオチドを含むハイブリッドの形成を疎外する程度を指し、ストリンジェンシーの高さはミスマッチハイブリッドに対する許容度の低さと相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす因子は当業者に周知であり、これには温度、ｐＨ、イオン強度、および有機溶媒、例えばホルムアミドおよびジメチルスルホキシドの濃度が含まれるが、これらに限定されない。当業者には既知の通り、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、高温、低イオン強度、および低溶媒濃度によって増大する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、例えば、配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液構成成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、デキストラン硫酸およびポリエチレングリコール）の存否、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメータなどの因子を変更することによって、ならびに洗浄条件を変更することによって、数多くの相当条件を用いて特定のストリンジェンシーを確立できることは、当技術分野で周知である。特定の一連のハイブリダイゼーション条件は、当技術分野における次の標準方法に従って選択することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
【実施例】
【０１０１】
本発明を説明するために以下の実施例が含まれる。
【実施例１】
【０１０２】
ＲＳＫ２キナーゼの修飾
以下の実施例は、ＲＳＫ２キナーゼ遺伝子座の修飾について詳述する。ＲＳＫ２キナーゼ染色体配列内に３つの異なる変異を組込むように、オリゴヌクレオチド（１２５ｎｔ）を設計した。このオリゴヌクレオチドは、（１）後続する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を防止するためのＺＦＮ結合部位中の２つの点変異、（２）ＣｙｓをＶａｌに変換するためのＴＧＣからＧＴＴへの変化、および（３）クローンスクリーニングのための固有ＢａｍＨＩ部位を作製するためのＣからＡへのサイレント変化を含んだ（図１）。オリゴヌクレオチドは、標準合成手順（例えば、化学修飾なし）を用いて作製し、ＰＡＧＥ精製した。ＲＳＫ２キナーゼ遺伝子座を標的とするように、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を設計した。一方のＺＦＮは、配列５’−ＧＴＡＴＡＣＡＴＡＡＡＧＣＴＡ−３’（配列番号６、図１に示される左結合部位）に結合するように設計し、他方のＺＦＮは、５’−ＧＧＡＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＡ−３’（配列番号７、図１に示される右結合部位）に結合するように設計した。
【０１０３】
ヒトＫ５６２細胞に、ＺＦＮをコードするｍＲＮＡ８μｇと、オリゴヌクレオチド０．３ｎｍｏｌをヌクレオフェクトした。２日間のインキュベーション後、ＢａｍＨ１部位の存在について細胞のプールを解析した。図２に示すように、オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮの双方に暴露した細胞はＢａｍＨ１部位を包含したが、オリゴヌクレオチドのみの導入は効果を示さなかった。組込み率は、約２０〜３０％の範囲であった。
【０１０４】
単細胞クローンを単離し、ｑＰＣＲアッセイを用いてスクリーニングして、ＢａｍＨ１部位を包含するものを同定した（図３を参照）。およそ７５０個のクローンをスクリーニングし、約４０個の陽性クローンを同定した。続いて陽性クローンを標的染色体位置周囲でＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩで消化して、ＲＳＫ２キナーゼ染色体遺伝子座の編集を確認した。配列決定データは、ＢａｍＨＩ陽性クローンが、望ましいＣｙｓからＶａｌへのコドン変化に対しても陽性であることを明らかにした。
【実施例２】
【０１０５】
ＡＡＶＳ１遺伝子座の修飾
以下の実施例は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位をＡＡＶＳ１遺伝子座に導入するためのオリゴヌクレオチドの使用について詳述している。図４は、ＡＡＶＳ１遺伝子座の野生型配列、ならびにＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列（１０８ｎｔ）を示している。これらのオリゴヌクレオチドは、標準手順（例えば、化学修飾なしで）を用いて作製し、ＰＡＧＥ精製した。
【０１０６】
ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするように、一対のＺＦＮを設計した。一方のＺＦＮは、配列５’−ＡＣＣＣＣＡＣＡＧＴＧＧ−３’（配列番号８、図４に示される左結合部位）に結合するように設計し、他方のＺＦＮは、５’−ＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ−３’（配列番号９、図４に示される右結合部位）に結合するように設計した。キャップされ、ポリアデニル化されたＺＦＮをコードするｍＲＮＡを、標準手順を用いて調製した。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むＺＦＮ  ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドをＫ５６２細胞、ＨＣＴ１１６細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、またはＭＳＦ７細胞内にヌクレオフェクトした。インキュベーション期間後、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の存在について細胞のプールを解析した。オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮの双方に暴露した細胞はＨｉｎｄＩＩＩ  断片を含んだが、オリゴヌクレオチドのみで処理したものは、ＨｉｎｄＩＩＩ断片を有さなかった（図５）。
【０１０７】
単細胞Ａ５４９クローンを単離し、ｑＰＣＲアッセイを用いてスクリーニングして、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を包含するものを同定した（図６）。およそ９３３個のクローンをスクリーニングし、３０８個を陽性と同定した。したがって、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の送達率は、約３３％であった。続いて陽性クローンを標的染色体位置周囲でＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、オリゴヌクレオチド配列の挿入を確認した。親ＰＣＲ産物の位置に薄いバンドを示すクローンの配列を決定し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むことを確認した（図６を参照）。親ＰＣＲ産物の周囲に複数の強いバンドを示すクローンは、小さいＮＨＥＪ由来の挿入を含むと仮定される。
【実施例３】
【０１０８】
ＡＡＶＳＩ遺伝子座の修飾−オリゴヌクレオチドの長さ
より短いオリゴヌクレオチドを用いてＨｉｎｄＩＩＩ部位をＡＡＶＳ１遺伝子座に送達することができるかどうかを判断するために、３６〜１０６ｎｔの範囲の長さのオリゴヌクレオチドを調製した。例えば、１０６ｎｔのオリゴヌクレオチドは、ＺＦＮ切断部位のいずれかの側の５０ｎｔに対する配列同一性を有し（すなわち、５０ｎｔの相同アームを有し）、相同アーム間にＨｉｎｄＩＩＩ部位（６ｎｔ）を有する。オリゴヌクレオチドの配列を下記の表１に示す。
【表１】
2013537410.tif 000002
【０１０９】
Ｋ５６２細胞に、それぞれのＡＡＶＳ１指向型ＺＦＮをコードするプラスミドＤＮＡ２．５μｇ（合計５μｇ）と、１００μΜオリゴヌクレオチド原料（センスまたはアンチセンスのいずれか）３μＬとをヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション２日後に細胞を採取した。ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。図７は、様々な長さのセンス鎖ＡＡＶＳ１−ＨｉｎｄＩＩＩオリゴヌクレオチドの組込みを示す。ＺＦＮおよびこれらのオリゴヌクレオチドのいずれの送達も組込みをもたらした。しかしながら、４０ｎｔ以上を含むオリゴヌクレオチドが、より良好な組込みをもたらしたと思われる。様々な長さのアンチセンス鎖ＡＡＶＳ１−ＨｉｎｄＩＩＩオリゴヌクレオチドの組込みを図８に示す。上記の通り、これらのオリゴヌクレオチドおよびＺＦＮのいずれへの暴露も組込みをもたらした。これらのデータは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかを使用してもよいこと、また３０ｎｔの短いオリゴヌクレオチドでも組込まれることを明らかにした。
【０１１０】
ＺＦＮをコードする核酸の種類が、挿入速度に影響を与えるかどうかを判断するために、Ｋ５６２細胞に、ＺＦＮをコードする２．５μｇのＤＮＡまたは２．０μｇのｍＲＮＡ（それぞれ合計５μｇまたは４μｇ）と、１００μΜのＡＡＶＳ１−ΗｉｎｄＩＩＩオリゴヌクレオチド（すなわち、５０ｎｔ、６０ｎｔ、または１００ｎｔ）の３μｌとをヌクレオフェクトした。細胞をヌクレオフェクション２日後に採取した。ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。図９に示すように、ＲＮＡとしてのＺＦＮの送達は、異なる長さを有するオリゴヌクレオチドのより良好な組込みをもたらした。
【０１１１】
推定ＮＨＥＪ断片を検出するために、ＺＦＮ／オリゴヌクレオチド処理細胞にＣｅｌ−１アッセイを実施した。Ｃｅｌ−１アッセイは、ＺＦＮ誘導性ＤＮＡ二本鎖切断のＮＨＥＪ媒介性不完全修復および／または付加ヌクレオチドの挿入の結果として、野生型から逸脱した標的遺伝子座の対立遺伝子を検出する。ＺＦＮ処理細胞のプールからの標的領域のＰＣＲ増幅は、ＷＴおよび変異アンプリコンの混合物を生成する。この混合物の溶融および再アニーリングは、ＷＴのヘテロ二重鎖と変異対立遺伝子との間ミスマッチの形成をもたらす。ミスマッチの部位で形成されるＤＮＡ「バブル」を、サーベイヤーヌクレアーゼＣｅｌ−１で切断し、切断産物をゲル電気泳動により分離することができる。親のバンドと比較した切断産物の相対強度は、ヘテロ二重鎖のＣｅｌ−１切断のレベルの尺度である。この目的で、ＺＦＮ／オリゴヌクレオチド処理細胞のプールをＰＣＲ増幅し、２つの試料に分割した。一方の試料は未処理のままとし、他方の試料はＣｅｌ−１酵素１μＬおよびエンハンサー１μＬにより、４２°Ｃで３０分間処理した。この結果は図１０に示す。Ｃｅｌ−１断片および推定ＮＨＥＪ誘導性ミスマッチ断片が、Ｃｅｌ−１処理細胞中に検出された。
【実施例４】
【０１１２】
相同性がオリゴヌクレオチド媒介性組込みに要求される
Ａ５４９細胞に、４μｇのＡＡＶＳ１標的ＺＦＮをコードするｍＲＮＡ、およびＡＡＶＳ１−ＨｉｎｄＩＩＩオリゴヌクレオチドまたはＣＮＲ１−ＨｉｎｄＩＩＩオリゴヌクレオチドのいずれかをヌクレオフェクトした。オリゴヌクレオチドの各種類について、以下の形態を試験した：ａ）センス一本鎖、ｂ）アンチセンス一本鎖、ｃ）センス＋アンチセンス、ｄ）センス一本鎖（２Ｘ）、ｅ）二本鎖（事前アニール）。インキュベーション２日後、細胞を採取し、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、その後ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。図１１に示すように、相同ＡＡＶＳ１−ＨｉｎｄＩＩＩオリゴヌクレオチドに暴露した細胞のみが、ＡＡＶＳ１遺伝子座にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有した。
【実施例５】
【０１１３】
ｓｓＤＮＡオリゴおよびＺＦＮによる細胞における標的ゲノム欠失
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド）を使用して、Ｋ５６２細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座で０．１ｋｂ〜１００ｋｂの標的ゲノム配列を欠失させることができるかどうかを判断するために、多数のｓｓＯＤＮを調製した。５ｋｂ、１０ｋｂ、および１００ｋｂの標的ＡＡＶＳ１ゲノム配列を欠失させるように設計したｓｓＯＤＮｓを表２に示す。各オリゴヌクレオチドは、ＺＦＮ切断部位から特定の距離に位置するゲノム領域（すなわち、遠位欠失境界または欠失終点領域）に対する配列同一性を有する領域（図１２においてＩ’と指定）と、ＺＦＮ切断部位近傍の適切なＺＦＮ結合部位に対応する領域（図１２においてＩＩと指定）とを含んだ。標準合成手順（例えば、化学修飾なし）を用いてオリゴヌクレオチドを作製し、ＰＡＧＥ精製した。
【表２】
2013537410.tif 000003
【０１１４】
上記の表２に示す例示的ｓｓＯＤＮ配列において、下線が付いたものはＺＦＮ結合部位（図１２ＡにおいてＩＩと指定される領域）を含む遺伝子座の核酸である。下線付きかつ太字の核酸は、ＡＡＶＳ１  ＺＦＮの右結合部位の認識ヌクレオチドである。太字斜体であるが下線が付いていない核酸は、遠位欠失終点（図１２ＡにおいてＩと指定される領域）に相補的である。図１２Ａは、ＺＦＮ切断部位の５’側の欠失を示す。図１２Ｂは、ＺＦＮ切断部位の３’側の欠失を示す。
【０１１５】
一本鎖オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮによる、Ｋ５６２におけるＡＡＶＳ１遺伝子座での異なるサイズの標的ゲノムＤＮＡ欠失。Ｋ５６２細胞に、４μｇのＡＡＶＳ１指向型ＺＦＮをコードするｍＲＮＡ（合計８μｇ）と、３μＬの１００μΜ  ｓｓＯＤＮドナー：ＡＡＶＳ１−０．１ｋｂ、ＡＡＶＳ１−０．５ｋｂ、ＡＡＶＳ１−１ｋｂ、ＡＡＶＳ１−１．５ｋｂ、ＡＡＶＳ１−２ｋｂ、ＡＡＶＳ１−２．５ｋｂ、ＡＡＶＳ１−３ｋｂ、ＡＡＶＳ１−３．５ｋｂ、ＡＡＶＳ１−４ｋｂ、ＡＡＶＳ１−４．５ｋｂ、ＡＡＶＳ１−５ｋｂ、ＡＡＶＳ１−１０ｋｂ、ＡＡＶＳ１−１０．２ｋｂ、ＡＡＶＳ１−１９．９ｋｂ、ＡＡＶＳ１−２０ｋｂ、ＡＡＶＳ１−５０ｋｂ、ＡＡＶＳ１−１００ｋｂをヌクレオフェクトした。ｓｓＯＤＮのみまたはＺＦＮのみをヌクレオフェクトしたＫ５６２細胞を対照として使用した。Ｋ５６２細胞をヌクレオフェクション２日後に採取した。遠位欠失終点の５’末端上流のフォワードプライマー、およびＺＦＮの右結合部位の３’末端下流のリバースプライマーにより、図１２Ａに示すように、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅した。同様に、図１２ＢのＺＦＮ切断部位からの３’欠失の概略図の参照点としてＺＦＮ切断部位を使用すると、フォワードプライマーは、ＺＦＮの結合部位の５’末端上流にあり、リバースプライマーは、遠位欠失終点の３’末端下流にある。
【０１１６】
図１３において、「２」と表示したレーンは、オリゴヌクレオチドのみに暴露し、ＰＣＲ増幅のテンプレートとしてＺＦＮを用いないＫ５６２細胞を使用した。したがって、ＰＣＲ断片は、野生型対立遺伝子（欠失を含まない）に由来することを示すサイズを有すると予想された。「３」と表示したレーンは、ＺＦＮのみに暴露したＫ５６２細胞を使用し、したがってＰＣＲ産物は、同様に野生型対立遺伝子に由来することを示す長さを有すると予想された（またはＮＨＥＪ産物）。「１」と表示したレーンは、オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮの双方に暴露したＫ５６２細胞を使用し、したがってＰＣＲ断片は、欠失対立遺伝子から増幅され、したがって欠失されるように設計された塩基対の数だけ野生型対立遺伝子よりサイズが小さいと予想された。細胞中の意図された欠失の長さに応じて、レーン１は、野生型対立遺伝子から増幅されたＰＣＲ断片も含み得る。野生型対立遺伝子のＰＣＲ断片および欠失対立遺伝子のＰＣＲ断片の予想サイズは、図１３において、各レーン群の上部に示す。ＰＣＲ断片は全て予想サイズを有し、一本鎖オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮを用いて、約０．１ｋｂ、０．５ｋｂ、１．０ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３．０ｋｂ、３．５ｋｂ、４．０ｋｂ、４．５ｋｂ、５．０ｋｂ、１０．０ｋｂ、１０．２ｋｂ、１９．９ｋｂ、２０ｋｂ、５０ｋｂ、および１００ｋｂの標的ゲノムＤＮＡ欠失が良好に実施されたこと示した。
【０１１７】
参照点としてＺＦＮ切断部位を使用して、標的ゲノム欠失領域に対する上流（３’欠失）および／または下流（５’欠失）のＺＦＮ切断部位（複数可）の選択に従って、アンチセンスおよび／またはセンス一本鎖オリゴヌクレオチドを使用して、特に上流ＺＦＮ切断部位の標的ゲノム欠失を媒介した。図１３において、レーン群には、ＺＦＮ切断部位から３’側の欠失を示す星印「＊」付きの群、ＺＦＮ切断部位から５’側の欠失を示す星印「＊」が付いていない群、ＺＦＮ切断部位から３’側および５’側の両欠失を示す２個の星印「＊＊」付きの１群が含まれる。図１３に示されるように、各タイプの群は、予想サイズのＰＣＲ産物を有することを示した。
【０１１８】
一本鎖オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮによる、異なる細胞型におけるＡＡＶＳ１遺伝子座での標的５ｋｂゲノムＤＮＡ欠失。異なる細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座での標的ゲノムＤＮＡ欠失を試験するために、Ｋ５６２、ＨＣＴ１１６、Ｕ２ＯＳ、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、およびＭＣＦ７の各細胞プールに、４μｇのＡＡＶＳ１指向型ＺＦＮをコードするｍＲＮＡ（合計８μｇ）と、３μＬの１００μΜ  ｓｓＯＤＮドナー：ＡＡＶＳ１−５ｋｂとをヌクレオフェクトした。ｓｓＯＤＮのみまたはＺＦＮのみをヌクレオフェクトした各細胞プールを対照として使用した。細胞をヌクレオフェクション２日後に採取した。標的欠失の５’末端上流のフォワードプライマー、および標的欠失の３’末端下流のリバースプライマーにより、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅した。「１」と表示したレーンは、ＰＣＲテンプレートとしてのオリゴヌクレオチドおよびＺＦＮの双方に暴露した細胞に由来するＤＮＡであり、ＰＣＲ断片は欠失対立遺伝子から増幅されたと予想され、野生型対立遺伝子ＰＣＲ断片（５３０３ｂｐ）よりも５ｋｂ小さいサイズを有した。図１４に示されるように、全ての細胞試料における欠失対立遺伝子のＰＣＲ断片は、予想サイズ３０３ｂｐを有した。
【０１１９】
一本鎖オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮによる、Ｋ５６２における異なる遺伝子座での標的ゲノムＤＮＡ欠失。Ｋ５６２細胞における異なる遺伝子座での標的ゲノムＤＮＡ欠失を試験するために、Ｋ５６２細胞に、（１）６ｋｂ欠失に対して、ＩＲＡＫ４指向型ＺＦＮをコードするｍＲＮＡ（合計８μｇ）と、ｓｓＯＤＮドナー（３μＬの１００μΜ）、（２））５．２ｋｂ欠失に対して、ＲＳＫ２指向型ＺＦＮをコードするｍＲＮＡ（合計８μｇ）と、ｓｓＯＤＮドナー（３μＬの１００μΜ）、および（３）５．０ｋｂ欠失に対して、ＲＳＫ４指向型ＺＦＮをコードするｍＲＮＡ（合計８μｇ）と、ｓｓＯＤＮドナー（３μＬの１００μΜ）とをヌクレオフェクトした。ｓｓＯＤＮのみまたはＺＦＮのみをヌクレオフェクトした各細胞プールを対照として使用した。細胞をヌクレオフェクション２日後に採取し、ゲノムＤＮＡを単離した。標的欠失の５’末端上流のフォワードプライマー、および標的欠失の３’末端下流のリバースプライマーにより、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅した。「１」と表示したレーンは、ＰＣＲテンプレートとしてのオリゴヌクレオチドおよびＺＦＮの双方に暴露した細胞に由来するＤＮＡを使用し、ＰＣＲ断片は欠失対立遺伝子から増幅されたと予想された。図１５に示されるように、全ての細胞試料における欠失対立遺伝子ＰＣＲ断片は、それぞれ、ＩＲＡＫ４遺伝子座に対して予想サイズ３３４ｂｐ、ＲＳＫ２遺伝子座に対して２８１ｂｐ、およびＲＳＫ４遺伝子座に対して１９０ｂｐを有した。
【０１２０】
一本鎖オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮによる、Ｋ５６２におけるＡＡＶＳ１遺伝子座での標的ゲノムＤＮＡ欠失の精度評価。ゲノムＤＮＡプールのクローンのＤＮＡ配列解析を行って、一本鎖オリゴヌクレオチドおよびＺＦＮによって媒介される標的欠失の精度のレベルを評価した。ゲノムＤＮＡプールは、ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＺＦＮ切断部位の５’側の標的１００ｂｐを欠失するように設計される、ＺＦＮおよび一本鎖オリゴヌクレオチドに暴露されるＫ５６２細胞から単離した。４０％をわずかに上回るクローンが、標的１００ｂｐの正確な欠失を有する対立遺伝子を有し、５５％をわずかに上回るクローンが、野生型対立遺伝子（欠失、切断、もしくは修復を含まない）、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の結果としての対立遺伝子を含み、不正確な欠失（すなわち、意図された５’欠失境界の追加の８１ｂｐ欠失）を有する対立遺伝子を有するクローンは、５％未満であった（データは示さず）。
【０１２１】
別の事象において、Ｋ５６２細胞がＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＺＦＮ切断部位の３’側の標的１００ｂｐを欠失するように設計されたＺＦＮおよび一本鎖オリゴヌクレオチドに暴露された後に単離されたゲノムＤＮＡプールのクローンを、ＤＮＡ配列解析に供した。５０％をわずかに上回るクローンが、標的１００ｂｐの正確な欠失を有する対立遺伝子を有し、５０％をわずかに下回るクローンが、野生型対立遺伝子（欠失、切断、もしくは修復を含まない）、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の結果としての対立遺伝子を含み、不正確な欠失を有する対立遺伝子を有するクローンは無かった（データは示さず）。
【０１２２】
なお別の事象において、Ｋ５６２細胞がＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＺＦＮ切断部位の５’および３’の双方の標的１００ｂｐを欠失するように設計される、欠失に対する標的領域にわたる一対のＺＦＮ、および２組の一本鎖オリゴヌクレオチドに暴露された後に単離されたゲノムＤＮＡプールのクローンを、ＤＮＡ配列解析に供した。２０％を上回るクローンが、ＺＦＮ切断部位の５’側の標的１００ｂｐの正確な欠失を有する対立遺伝子を有し、３０％をわずかに下回るクローンが、ＺＦＮ切断部位の３’側の標的１００ｂｐの正確な欠失を有する対立遺伝子を有し、５０％をわずかに下回るクローンが、野生型対立遺伝子（欠失、切断、もしくは修復を含まない）、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の結果としての対立遺伝子を含み、ＺＦＮ切断部位の５’もしくは３’欠失のいずれに対しても不正確な欠失を有する対立遺伝子を有するクローンは無かった（データは示さず）。
【０１２３】
標的ゲノムＤＮＡ欠失の単一細胞クローニング、およびＫ５６２におけるＡＡＶＳ１遺伝子座でのその解析。単離された単一細胞クローンを、ゲル分析を通じて遺伝子型決定して、標的ゲノムＤＮＡ欠失が行われた遺伝子座における対立遺伝子組成を決定した。単一細胞クローンは、Ｋ５６２細胞が、それぞれ５ｋｂ、１０ｋｂ、および１００ｋｂゲノム配列を欠失するように設計されるＺＦＮおよび一本鎖オリゴヌクレオチドに暴露される前に、単離した。ホモ接合型欠失クローンは、クローンにおいて、２つの欠失対立遺伝子に由来する１つのサイズのＰＣＲ断片を有することが予想された。ヘテロ接合型欠失クローンは、欠失対立遺伝子、および野生型非欠失対立遺伝子を有することが予想された。野生型非欠失対立遺伝子は、２つの欠失境界の各々に隣接するプライマー対によるジャンクションＰＣＲによって検出された。表３は、単一クローン遺伝子型決定の結果を要約する。
【表３】
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【実施例６】
【０１２４】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびＺＦＮによる、細胞における同時標的ゲノム欠失および挿入
図１６は、一本鎖ＤＮＡ  オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）およびＺＦＮにより、細胞における同時標的ゲノム欠失および挿入を達成するための例示的な概略図を示す。標的欠失および挿入に対するｓｓＯＤＮ配列は、３つの領域：遠位欠失終点に相補的なヌクレオチド配列を含む領域Ｉ’（図１６でＩと表される領域）；ＺＦＮ結合部位ヌクレオチド配列を含む領域ＩＩ（図１６でＩＩと表される領域）；および挿入されるべきヌクレオチド配列を含む領域ＩＩＩを有する。具体的に、オリゴヌクレオチドＳＭ２７１が、５ｋｂの同時標的欠失およびｌｏｘＰ部位の挿入のために設計された：
【化１】
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、ｌｏｘＰ部位は小文字のヌクレオチド配列によって表され、ＺＦＮ結合部位は下線が付され、ＺＦＮの右結合部位に対する認識ヌクレオチドは下線が付され、太字であり、遠位欠失終点に相補的な配列は太字斜体であるが、下線が付いていない。
【０１２５】
図１６に示されるように、領域ＩおよびＩＩに隣接するＰＣＲフォワードプライマーＡおよびリバースプライマーＢを使用して、標的欠失を検証し、ＰＣＲフォワードプライマーＡおよびリバースプライマーＣを使用して、標的挿入を検証し、プライマーＣは、ＺＦＮの右結合アームの接合部位のヌクレオチドおよび周辺ゲノムＤＮＡを含む。図１７は、プライマーＡおよびＢを使用して、欠失対立遺伝子（レーン６：ＡＡＶＳ１−ＺＦＮおよびＡＡＶＳ１−５ｋｂ  ｓｓＯＤＮ）から予想される３０３ｂｐ  ＰＣＲ断片を生じた５ｋｂ配列の標的欠失のＰＣＲ検証を示す。ｌｏｘＰ部位の標的挿入は、プライマーＡおよびＣを使用したＰＣＲ断片によって検証された（図１７、レーン１０を参照されたい）。
【実施例７】
【０１２６】
一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびＺＦＮによる、普遍的プラスミド挿入方法。
以下の実施例は、ドナープラスミドからの対象配列をＡＡＶＳ１遺伝子座に導入するためのオリゴヌクレオチドおよびＺＦＮの使用を詳述する。概して、１つまたは２つのＺＦＮ、２つのオリゴヌクレオチドドナー、およびプラスミドドナーが、このプロセスに関与する。ＺＦＮが、二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製する。２つのオリゴヌクレオチドドナーは、次いでＺＦＮ切断部位に相補的な部分を用いてＤＳＢ端に結合する。２つのオリゴヌクレオチドドナーの各５’端は、ドナープラスミド（普遍的またはそうでない）における領域に相同的である。オリゴヌクレオチドドナーの５’端における相同性は、プラスミドドナー内への侵入をもたらす。ドナープラスミドを用いてＤＳＢが分解されると、ドナープラスミドからの所望の配列が、ＺＦＮ切断部位に導入および挿入される（図２２）。
【０１２７】
スキームを確認するために、細胞を２つのＡＡＶＳ１  ＺＦＮ（Ｚ）、２つのオリゴヌクレオチドドナー（Ｏ）、およびマウスＲｏｓａ２６プラスミドドナー（Ｄ）（Ｚ＋Ｏ＋Ｄ）でトランスフェクトした。ＺＦＮのみ（Ｚ）、オリゴヌクレオチドドナーのみ（Ｏ）、プラスミドドナーのみ（Ｄ）、ＺＦＮおよびオリゴヌクレオチドドナーのみ（Ｚ＋Ｏ）、ＺＦＮおよびプラスミドドナーのみ（Ｚ＋Ｄ）、オリゴヌクレオチドドナーおよびプラスミドドナーのみ（Ｏ＋Ｄ）でトランスフェクトした細胞を、対照として使用した。次いで、トランスフェクトした細胞を培養し、採取し、個々の細胞クローンを解析した。ジャンクションＰＣＲを実施して、プラスミドドナーからのドナーＤＮＡがＡＡＶＳ１遺伝子座に組込まれたことを確認した。５’接合部に隣接するプライマーＡＡＶＳ１  Ｃｅｌ−Ｆ２（５’ＴＴＣＧＧＧＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＣ３’；配列番号２５）およびＳＭ３７３．Ｊｕｎｃ．Ｒ１（５’ＡＣＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡ３’；配列番号２６）を５’接合確認のために使用し、３’接合部に隣接するプライマーＳＭ３７３．Ｊｕｎｃ．Ｆ２（５’ＧＣＧＧＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧ３’；配列番号２７）およびＡＡＶＳ１  Ｃｅｌ−Ｒ２（５’ＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＴＡＡＧＣＡＡＡＣＣ３’；配列番号２８）を３’接合確認のために使用した。
【０１２８】
５’接合部および３’接合部における配列解析は、プラスミドドナーからのドナー配列が、細胞においてＡＡＶＳ１遺伝子座へ組込まれたことを確認した。５’接合部における確認された組込みは、図１８に提示される配列（配列番号２９）によって示される。３’接合部における確認された組込みは、図１９に提示される配列（配列番号３０）によって示される。図２０は、２つのＺＦＮ、２つのオリゴヌクレオチドドナー、およびプラスミドドナー（Ｚ＋Ｏ＋Ｄ）に暴露されたクローンが、ドナー配列組込みを示す、サイズ３９０ｂｐの５’接合部位ＰＣＲ断片（図２０Ａ）およびサイズ３０９ｂｐの３’接合部位ＰＣＲ断片（図２０Ｂ）を含んだことを示す。
【実施例８】
【０１２９】
標的１０ｋｂゲノムＤＮＡ欠失のオリゴ媒介ゲノム修飾における、オリゴヌクレオチド配列同一性の効果
ゲノム配列上の相同的部位に対するオリゴヌクレオチドＤＮＡの配列同一性が、標的ゲノム配列欠失の効率に影響するかどうかを調査するために、オリゴヌクレオチド配列を、ＡＡＶＳ１  ＺＦＮ切断部位から遠位欠失境界１０ｋｂに対応するセグメント上で改変し、１００％の同一性、９８％の配列同一性、９０％の配列同一性、５０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを調製した。次いで、１０ｋｂ欠失の効率をＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲによって測定した（図２１）。１００％の同一性と９８％の同一性との間のΔＣｔは０．４であり、１００％の同一性と９０％の同一性との間のΔＣｔは５であり、１００％の同一性と５０％の同一性との間のΔＣｔは７であった。欠失効率は、１００％の同一性を有するオリゴヌクレオチドと９８％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドとの間で同等であった。欠失の効率は、配列同一性が９０％まで低下した時に減少し、効率は、配列同一性が５０％以下の時にわずかに低下した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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