(57)【要約】【課題】完全多能性を有する幹細胞において高発現するが、完全多能性を有しない幹細胞において、発現が著しく抑制又は沈黙されることを特徴とする細胞多能性を判定又は調整するための鍵遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、又はその組合を提供する。【解決手段】遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び他の非コードＲＮＡは、ネズミの第１２番の染色体の長腕のＤｌｋ１−Ｄｉｏ３と称する染色体刷り込みドメインに位置する遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び他の非コードＲＮＡ、並びに他の哺乳動物ゲノムシンテニー領域における、それと７０〜１００％相同性を有する相同遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び他の非コードＲＮＡである。更に、幹細胞多能性の判定又は細胞多能性の調整における、幹細胞型の分類における、細胞多能性の調整による細胞の多能性状態及びレベルの調節における、疾患の治療における、及び腫瘍の薬剤治療のターゲットの開発及び抗腫瘍薬物の研究開発における本発明に係る遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、又はその組合の用途を提供した。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞の多能性レベルの判定又は調整における、ネズミの第１２番の染色体の長腕のＤｌｋ１−Ｄｉｏ３と称する染色体刷り込みドメイン内に位置するｍｉｃｒｏＲＮＡ簇又はその中のいずれかのｍｉｃｒｏＲＮＡ又はｍｉｃｒｏＲＮＡ組合及び他の哺乳動物ゲノムシンテニー領域における、前記いずれかのｍｉｃｒｏＲＮＡと７０％〜１００％配列相同性を有する相同ｍｉｃｒｏＲＮＡの用途であって、前記ｍｉｃｒｏＲＮＡ簇は、完全多能性（full pluripotency）を有する胚性幹細胞（embryonic stem cell）と誘導性多能幹細胞（induced pluripotent stem cell）において、高発現するが、完全多能性を有しない胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞において、発現が著しく抑制又は沈黙されることを特徴とする胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞の多能性レベルの判定又は調整における、ネズミの第１２番の染色体の長腕のＤｌｋ１−Ｄｉｏ３と称する染色体刷り込みドメイン内に位置するｍｉｃｒｏＲＮＡ簇又はその中のいずれかのｍｉｃｒｏＲＮＡ又はｍｉｃｒｏＲＮＡ組合及び他の哺乳動物ゲノムシンテニー領域における、前記いずれかのｍｉｃｒｏＲＮＡと７０％〜１００％配列相同性を有する相同ｍｉｃｒｏＲＮＡの用途。
【請求項２】
前記ｍｉｃｒｏＲＮＡ簇の発現量が胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞の多能性レベルと正相関し、即ち、生殖系列キメラが形成できる胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞における発現量が生殖系列キメラが形成できない胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞における発現量より著しく高いことを特徴とする請求項１に記載の用途。
【請求項３】
前記ｍｉｃｒｏＲＮＡは、ＳＥＱＩＤ  １−７２がリストするいずれかのｍｉｃｒｏＲＮＡを含むことを特徴とする請求項１に記載の用途。
【請求項４】
前記ｍｉｃｒｏＲＮＡは、ＳＥＱＩＤ  １−７２がリストするいずれかのｍｉｃｒｏＲＮＡを含むことを特徴とする請求項２に記載の用途。
【請求項５】
胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞の分離、増幅及び分類における、及び胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞による疾患の治療における請求項１に記載のｍｉｃｒｏＲＮＡ簇又はその中のいずれかのｍｉｃｒｏＲＮＡ又はｍｉｃｒｏＲＮＡ組合及び他の哺乳動物ゲノムシンテニー領域における、前記いずれかのｍｉｃｒｏＲＮＡと７０％〜１００％配列相同性を有する相同遺伝子又はその組合の用途。
【請求項６】
胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞の分離、増幅及び分類における、及び胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞による疾患の治療における請求項２に記載のｍｉｃｒｏＲＮＡ簇又はその中のいずれかのｍｉｃｒｏＲＮＡ又はｍｉｃｒｏＲＮＡ組合及び他の哺乳動物ゲノムシンテニー領域における、前記いずれかのｍｉｃｒｏＲＮＡと７０％〜１００％配列相同性を有する相同遺伝子又はその組合の用途。
【請求項７】
胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞の分離、増幅及び分類における、及び胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞による疾患の治療における請求項３に記載のｍｉｃｒｏＲＮＡ簇又はその中のいずれかのｍｉｃｒｏＲＮＡ又はｍｉｃｒｏＲＮＡ組合及び他の哺乳動物ゲノムシンテニー領域における、前記いずれかのｍｉｃｒｏＲＮＡと７０％〜１００％配列相同性を有する相同遺伝子又はその組合の用途。
【請求項８】
胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞の多能性レベルの判定又は調整における、ネズミの第１２番の染色体の長腕のＤｌｋ１−Ｄｉｏ３と称する染色体刷り込みドメイン内に位置するＲｔｌ１、Ｍｅｇ３、Ｒｉａｎ、１１１０００６Ｅ１４Ｒｉｋ、Ｂ８３００１２Ｌ１４Ｒｉｋ、Ｍｉｒｇ遺伝子又はその組合及び他の哺乳動物ゲノムシンテニー領域における、前記遺伝子と７０％〜１００％相同性を有する相同遺伝子又はその組合の用途であって、
前記遺伝子は、完全多能性（full pluripotency）を有する胚性幹細胞（embryonic stem cell）と誘導性多能幹細胞（induced pluripotent stem cell）において、高発現するが、完全多能性を有しない胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞において、発現が著しく抑制又は沈黙されることを特徴とする胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞の多能性レベルの判定又は調整における、ネズミの第１２番の染色体の長腕のＤｌｋ１−Ｄｉｏ３と称する染色体刷り込みドメイン内に位置するＲｔｌ１、Ｍｅｇ３、Ｒｉａｎ、１１１０００６Ｅ１４Ｒｉｋ、Ｂ８３００１２Ｌ１４Ｒｉｋ、Ｍｉｒｇ遺伝子又はその組合及び他の哺乳動物ゲノムシンテニー領域における、前記遺伝子と７０％〜１００％相同性を有する相同遺伝子又はその組合の用途。
【請求項９】
前記遺伝子の発現量は胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞の多能性レベルと正相関し、即ち、生殖系列キメラが形成できる胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞における発現量は生殖系列キメラが形成できない胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞における発現量より著しく高いことを特徴とする請求項５に記載の用途。
【請求項１０】
胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞の分離、増幅及び分類における、及び胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞による疾患の治療における請求項８に記載の遺伝子又はその組合及び他の物種における前記遺伝子の相同遺伝子又はその組合の用途。
【請求項１１】
胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞の分離、増幅及び分類における、及び胚性幹細胞と誘導性多能幹細胞による疾患の治療における請求項９に記載の遺伝子又はその組合及び他の物種における前記遺伝子の相同遺伝子又はその組合の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞多能性を判定又は調整する鍵遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ又は他の非コードＲＮＡ又はその組合に関する。本発明は、更に、幹細胞多能性の判定及び幹細胞型の分類における、細胞多能性の調整、細胞の多能性状態及びレベルの調節における、疾患の治療における、腫瘍の薬剤治療のターゲットの発現又は抗腫瘍薬の研究開発における本発明の遺伝子及び非コード小ＲＮＡの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性細胞（pluripotent cells）とは、分裂、分化を経て人と動物個体の様々な組織と細胞を形成する、分化万能性を有する細胞である。現在、胚性幹細胞（embryonic stem cell、ＥＳＣ）は人に最も熟知される多能性細胞である。
【０００３】
胚性幹細胞は、哺乳類動物の胚胎発育早期の胞胚期内の細胞群細胞が分離された後、特定の条件で体外培養を経て、取得した特殊細胞系である。このような細胞が未分化状態と無限増殖を維持する能力を持つ。
【０００４】
現在、既に胚性幹細胞を体外でニューロン、肝細胞、内皮細胞、心筋細胞、膵臓β細胞及び造血細胞等のほとんどすべて種類の細胞へと成功に誘導・分化できた。幹細胞と再生医学の発展は、発育生物学と組織臓器移植、遺伝子治療、細胞治療及び薬物研究開発等の分野に対して重要な促進作用を果たし、人類が面する心臓血管や脳血管の疾患、糖尿病、神経系疾患等の医学難題を解決する見込みがあり、そして、これによる生命科学と生物技術の新突破及び発展は、人口健康と医薬分野の革命的な変化をもたらし、２１世紀の巨大な潜在力を有する新たなハイテク産業になり得ると考えられる。
【０００５】
伝統的な胚性幹細胞を再生医学に応用することには、２つの攻略しにくいボトルネックがある。まず、胚性幹細胞を取得する方法には初期胚の使用が必要となるので、倫理問題に関わる。そして、取得した胚性幹細胞を臨床に応用する場合に、患者が更に免疫学的拒絶問題に面する。
【０００６】
免疫学的拒絶の難題を克服するために、人々がまず面する問題が、どのようにして様々な方法で患者の体細胞を多能性細胞へと再プログラムして必要となるタイプの細胞に分化させ細胞治療及び臓器移植に用いることである。
１９９７年、クローン羊「ドリー」の誕生は、卵母細胞が、分化した哺乳動物の成体細胞を胚期全能性状態に再プログラムする能力を有し、多能性幹細胞を生じさせ新たな個体へ発育できることを証明した。
【０００７】
しかしながら、卵母細胞の不足及び胚使用に関する倫理問題はこの技術が再生医学分野での発展を制限した。２００６年に、Ｙａｍａｎａｋａが、４つの外生的転写因子の強引発現によって、体細胞を多能性幹細胞、即ち誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells）へと再プログラムできることを初めて証明した（Takahashi et al., 2007; Takahashi and Yamanaka, 2006; Yu et al. 2007）。
【０００８】
この発見により、体細胞の再プログラム研究が遺伝子層までに具体的に至って、それとともに、再プログラム研究の方向が拡張された。技術的角度によれば、ｉＰＳ細胞が体細胞からのものであり、胚からのものではないので、人類胚性幹細胞が面する倫理争議を避けることができ、よって、応用に明るい将来性がある。
【０００９】
ここ何年も、胚性幹細胞の多能性の判定が動物キメラ実験に依存するが、人のキメラ実験が法律限制及び倫理問題によって実施できなく、そのため、人の胚性幹細胞の多能性判定には本当に有力な標準が欠ける。人々がずっと適切なマーカーを探して幹細胞の発育潜在力を区分するように努力してきたが、今まで成功していない。
【００１０】
完全再プログラムのｉＰＳ細胞が本当な多能性を有し、すべて種類の体細胞へ分化でき、且つ四倍体胚補完の方法によって正常繁殖能力を有するネズミ（Zhao et al.,2009）を生むことができる。しかしながら、完全再プログラムしたｉＰＳ細胞を四倍体胚補完の方式により選別することには高い技術的要求があり、且つ成功率が非常に低いので、ｉＰＳ技術の発展と応用が酷く遅延された。
【００１１】
倫理道徳の制限のため、四倍体胚補完の方式で人のｉＰＳ細胞の多能性を検証してはいかないので、ｉＰＳ細胞が最終に臨床に応用することは、重大な障害を面する。これで、本当な多能性を有するｉＰＳ細胞を選択するために、新たなｉＰＳ細胞の格付け標準が必要となる。
【００１２】
上記問題に対して、本発明は、まず、伝統的な幹細胞多能性を検証する方法を用いて、異なるｉＰＳ細胞を、四倍体胚補完の方法で動物を取得できるもの（以下、４Ｎ  ｉＰＳ細胞と称する）と二倍体キメラの方法のみで動物を取得できるもの（以下、２Ｎ  ｉＰＳ細胞と称する）との２種類に分ける。
【００１３】
遺伝子チップ及び小ＲＮＡシークエンシングによりこの２種類のｉＰＳ細胞の遺伝子及び非コードＲＮＡの発現の差異を比較したところ、４Ｎ  ｉＰＳ細胞において発現が高いが、２Ｎ  ｉＰＳ細胞において発現がなく又は発現が非常に低い１グループの遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ簇及び他の非コードＲＮＡを発見した。
【００１４】
この簇の遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ簇及び他の非コードＲＮＡは、ネズミの第１２番の染色体の１つの刷り込みドメイン内に位置し、また、コード遺伝子を５つ、非コード遺伝子を３つ、Ｃ／Ｄ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡ遺伝子簇を１つ、複数の非常に保守するｍｉｃｒｏＲＮＡを含むｍｉｃｒｏＲＮＡ簇を１つ、及び幾つかの非コードＲＮＡを含む。且つ、この領域が細胞の多能性状態を示したばかりじゃなく、細胞の発育潜在力を決めたことを証明した。
【００１５】
この結果が既に多種の異なる出所の細胞系で検証された。この領域の非コード小ＲＮＡに対して設計したチップ或いは他の手段は、多能性細胞の発育潜在力を検証する判定標準として用いられることができる。伝統的な四倍体補完方式に比べて、本発明は、技術的要求が低く、操作周期が短く、且つ道徳倫理要素に関わらなく、ｉＰＳ分野で幅広い応用前景がある。
【００１６】
これら遺伝子及び非コード小ＲＮＡが哺乳動物で非常に保守するので、この簇の遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び他の非コードＲＮＡは、人類の胚性幹細胞及び他の哺乳動物にも同様に重要な機能を有する可能性がある。この成果が多能性細胞を判定する有効な分子マーカーを初めて明確に提出した。
且つ、この成果によって、この簇の遺伝子に対して調整することにより、細胞の多能性状態及びレベルを調整し、幹細胞及びｉＰＳ技術を革命的に変化させ、国際幹細胞研究の構成を変えたり、腫瘍等の疾患の発病機序の研究において新たな突破を獲得したり、腫瘍の薬剤治療の潜在ターゲットを発見して新たな抗腫瘍薬を開発したりする可能性がある。
且つ、本発明では、ネズミの染色体における他の位置から細胞多能性状態を著しく区分できる他の遺伝子簇或いは非コードＲＮＡを選出できなっかたから、この刷り込みドメイン内でコードされる遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ簇及び他の非コードＲＮＡは、細胞多能性状態を決める唯一な鍵マーカーである可能性が高く、このため、意味が非常に重大である。
【発明の概要】
【００１７】
国際でｉＰＳ細胞が全能性を有することを初めて証明した後、発明者は、ネズミのＥＳまたはｉＰＳ細胞の多能性を決める鍵遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ簇及び他の非コードＲＮＡを初めて発見し、且つ明らかに実証した。これらの遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ簇及び他の非コードＲＮＡがネズミゲノムの第１２番の染色体に位置し、非常に保守するｍｉｃｒｏＲＮＡ集合区である。この領域内の遺伝子及び非コードＲＮＡが高発現するＥＳまたはｉＰＳ細胞が完全な分化潜在力を示すが、一部の分化全能性を有する細胞にはこの領域の発現が著しく抑制又は沈黙される。
【００１８】
この領域が、ＥＳまたはｉＰＳ細胞の多能性状態を示すばかりじゃなく、ＥＳまたはｉＰＳ細胞の発育潜在力も決める。この領域でコードされるｍｉｃｒｏＲＮＡ簇が哺乳動物のゲノムにのみ存在し、且つ非常に保守するので、この簇のｍｉｃｒｏＲＮＡは、人類の胚性幹細胞を含む哺乳動物にも同様に重要な機能を有する可能性がある。
この成果が多能性細胞を判定する有効な分子マーカーを初めて明確に提出した。且つ、この成果によって、この簇の遺伝子に対して調整することにより、細胞の多能性状態及びレベルを調整できる。
【００１９】
本発明は、細胞多能性を判定又は調整するための鍵遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ又はその組合が、完全多能性（ｆｕｌｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞において高発現し、完全多能性を有しない幹細胞において発現が著しく抑制又は沈黙されることを発見した。
【００２０】
本発明に係る遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、又はその組合は、生殖系列キメラができる多能性幹細胞における発現量が生殖系列キメラができない多能性幹細胞における発現量より高い。
【００２１】
本発明に係る遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、又はその組合は、ネズミの第１２番の染色体の長腕のＤｌｋ１−Ｄｉｏ３刷り込みドメイン（Ｄｌｋ１とＤｉｏ３遺伝子及びこの領域から上流のＢｅｇａｉｎ遺伝子と下流のＰｐｐ２ｒ５ｃ遺伝子までの遺伝子中間帯を含む）に位置するすべての遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び他の非コードＲＮＡ、及び他の哺乳動物ゲノムシンテニー領域における、ポリヌクレオチド配列がそれと７０％〜１００％相同性を有する相同遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び他の非コードＲＮＡを含むことを特徴とする。Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３染色体の刷り込みドメインがおおよそ１３８０ｋｂである。
【００２２】
本発明に係る遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び他の非コードＲＮＡ又はその組合は、そのｍｉｃｒｏＲＮＡがＳＥＱ  ＩＤ  １−７２がリストするすべてのｍｉｃｒｏＲＮＡであることを特徴とする。
本発明は、他の哺乳動物ゲノムシンテニー領域における前記領域の相同遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び他の非コードＲＮＡを含む。
【００２３】
本発明に係るゲノム領域は、Ｄｌｋ１、Ｒｔｌ１、１１１０００６Ｅ１４Ｒｉｋ、Ｂ８３００１２Ｌ１４Ｒｉｋ及びＤｉｏ３という５つの遺伝子、Ｍｅｇ３、Ｒｉａｎ及びＭｉｒｇという３つの非コード遺伝子、１つのＣ/Ｄ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡ遺伝子簇、１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ簇及び複数の他の非コードＲＮＡを含む。
【００２４】
本発明は、更に、幹細胞多能性の判定又は細胞多能性の調整における、細胞多能性の調整による細胞の多能性状態及びレベルの調節における、幹細胞型の分類における、疾患の治療における、及び腫瘍の薬剤治療のターゲットの開発における本発明に係る遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、又はその組合の用途に関する。
【００２５】
本発明に係るｍｉｃｒｏＲＮＡ簇が哺乳動物において非常に保守する。人類とネズミでは、この領域の刷り込み遺伝子の発現が異常すると、胚と胎盤の発育の異常を若干起こす。これは、哺乳動物では、この簇のｍｉｃｒｏＲＮＡの機能が保守であることを示す。  そのため、発明者は、この簇のｍｉｃｒｏＲＮＡが人類の胚性幹細胞でも同様に重要な機能を有することを推測する。
【００２６】
今まで、人の誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）の多能性が制限されること及び分化能力が強くないことが面する深刻な問題（Hu et al.）であり、且つ人の胚性幹細胞の多能性が依然として検出できなく、また、発育潜在力が異なるｉＰＳ及び胚性幹細胞を区分する有効な手段が欠ける。
【００２７】
この領域のｍｉｃｒｏＲＮＡ簇の発現が胚発育に対して重要な影響を与えるので、この領域のｍｉｃｒｏＲＮＡの発現情況を検出することによって、人の胚性幹細胞の多能性を区分し、そして、この領域のｍｉｃｒｏＲＮＡが高発現の、つまり、多能性が強い、最高の発育潜在力レベルを有する多能性細胞を選択して細胞治療等に応用できる。これだけでなく、哺乳動物においてこの領域のｍｉｃｒｏＲＮＡ簇が高度に保守するので、他の大動物の多能性細胞の判定もこれらｍｉｃｒｏＲＮＡの発現を検出することによって完成でき、これで多能性幹細胞の検証動作が大幅に簡素化される。
【００２８】
発明者は、この領域のｍｉｃｒｏＲＮＡの発現を検出することによって、ネズミ、ラット、人及び他の大動物の胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の多能性を判定できる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明に係るｍｉｃｒｏＲＮＡ簇が完全と不完全多能性を有するネズミ幹細胞系に発現差異が存在することを示す。図１のＡは、１０個の多能性幹細胞のｍｉｃｒｏＲＮＡのシークエンシング結果のクラスター分析を示す。図１のＢは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）と四倍体誘導多能性幹細胞（４Ｎ−ｉＰＳ細胞）においてｍｉｃｒｏＲＮＡの発現情況が著しい差異がないことを示す。図１のＣは、本発明に係るｍｉｃｒｏＲＮＡ簇がＥＳ細胞と二倍体誘導多能性幹細胞（  ２Ｎ−ｉＰＳ細胞）に著しい発現差異が存在する（赤色の円により示される）ことを示す。図１のＤは、本発明に係るｍｉｃｒｏＲＮＡ簇が４Ｎ−ｉＰＳ細胞と２Ｎ−ｉＰＳ細胞に著しい発現差異が存在する（赤色の円により示される）ことを示す。その中、ＥＳ、４Ｎ−ｉＰＳ及び２Ｎ−ｉＰＳという３つのグループの細胞系に対して、グループ内でｍｉｃｒｏＲＮＡの原始クローン回数を一意化した後、平均値を取り、そして２を底とする対数値に転換して図をプロットする。
【図２】本発明に係るゲノムＤｌｋ１−Ｄｉｏ３領域及びその上下流の近接する遺伝子の発現及び保守情況を示す。図２のＡは、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３領域及びその近接する領域における完全多能性細胞（ＥＳと２Ｎ−ｉＰＳ）と一部多能性細胞（４Ｎ−ｉＰＳ）の発現差異を示す。その中、不完全多能性細胞に比べて、完全多能性細胞において高発現する遺伝子が緑の長方形（即ちモノクロ図における刷り込み領域内の灰色の長方形）により示され、発現が相当する遺伝子が灰色の長方形により示され、検出には含まない遺伝子が白色の長方形により示される。ヘアピン型パターンがｍｉｃｒｏＲＮＡを示し、五角形が他の短い非コードＲＮＡを示し、ヘアピン型パターンと五角形のライン及び充填色の濃さが発現量と正相関する。図２のＢは、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３領域及びその上下流の近接する遺伝子の保守情況を示す。その中、赤色の小ダイヤモンドが保守のｍｉｃｒｏＲＮＡを示し、ピンク色の小ダイヤモンドが不保守のｍｉｃｒｏＲＮＡを示し、緑のフレームが他の遺伝子を示す。ｍｉｃｒｏＲＮＡ簇が哺乳動物にのみ存在し、且つ高度に保守する。
【図３】ゲノムのＤｌｋ１−Ｄｉｏ３セクターのｍｉｃｒｏＲＮＡｓ（Ａ）、他の非コード小ＲＮＡｓ（Ｂ）及びタンパク質コード遺伝子（Ｃ）の発現情況のクラスター分析を示す。Ｃ板には、更にＤｌｋ１−Ｄｉｏ３コアセクターの周りの隣接する遺伝子の発現情況を示す。発現値は、ＳＯＬＥＸＡシークエンシング及び発現スペクトルチップの最初の信号値を２を底とする対数値に転換されたものを用いる。集合図がＲにおけるｈｃｌｕｓｔ  ｐａｃｋａｇｅを用いて描く。
【図４】Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３コアセクターのｍｉｃｒｏＲＮＡｓの発現量が生殖系列キメラ能力を有する２Ｎ−ｉＰＳ細胞系と非生殖系列キメラの２Ｎ−ｉＰＳ細胞系との間に差異が存在することを示す。生殖系列キメラ能力を有する２Ｎ−ｉＰＳ細胞系ＩＰ２０Ｄ−３におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現情況が青色の柱により示され、非生殖系列キメラの２Ｎ−ｉＰＳ細胞系ＩＰ３６Ｄ−３におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現情況が赤色の柱により示される。
【図５】Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３セクターのｍｉｃｒｏＲＮＡがＰＲＣ２複合体を調整する機制の模式モデルを示す。図５のＡは、ＰＲＣ２複合体がトリメチル化ヒストンＨ３Ｋ２７サイトを介して遺伝子及びｍｉｃｒｏＲＮＡの発現を抑制することを示す。図５のＢは、完全多能性幹細胞で、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３セクターのｍｉｃｒｏＲＮＡが発現し、そして、ＰＲＣ２複合体における３つの蛋白を抑制することによってＰＲＣ２複合体の形成を阻止し、これでｍｉｃｒｏＲＮＡ及びＤｌｋ１−Ｄｉｏ３セクターにおける他の遺伝子の発現を促進する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明者の研究は、厳格な動物実験に基づき、異なる発育潜在力を有する胚性幹細胞及び多能性幹細胞を判定して分類し、且つ大規模のＳｏｌｅｘａシークエンシング及び遺伝子チップデータにより、これら多能性幹細胞の間の差異を遡る。
【００３１】
これによって、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３セクターに位置する遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び他の非コードＲＮＡが、発育潜在力が最高の完全多能性細胞において、高発現するが、発育潜在力が低い不完全多能性幹細胞において、著しく抑制又は沈黙されることが分かった。まずこの簇の遺伝子及び非コード小ＲＮＡを検出して、そして多能性を検証する方法で取得した結果は、この結論に合致する。そのため、ネズミでは、この簇の遺伝子の発現が幹細胞多能性の重要の一つのマーカーである。
【００３２】
ＭｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とは、前駆体がヘアピン型の二級構造を有し、対応する標的伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列と相補することによって転写後の発現レベルで遺伝子沈黙を調整できる、長さが２２個のヌクレオチドである短鎖ｓｍａｌｌ  ＲＮＡである。
【００３３】
＜材料と方法：＞
［１．ｉＰＳ細胞系及び多能性判定］
現在、ネズミの多能性幹細胞の発育潜在力を評価する標準は、（１）例えばｐｏｕ５ｆｌ、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘｌ等の多能性マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）の発現、（２）３つの胚層へ分化できることを証明する胚様体（ＥＢ）及び奇形腫の形成、（３）体外で指向的に誘導することによって、例えば、ニューロン、心筋細胞、膵島細胞等の多種の細胞タイプへの分化、（４）キメラ体動物（２Ｎ）の取得、（５）生殖系列キメラのキメラ体動物が獲得される、即ち、生殖細胞系に入って、精子又は卵子（ＧＬＴ）に発育できること、（６）四倍体補完動物（４Ｎ）が健全に誕生されることがある。その中、前記項目「（６）」が最も厳格な標準（黄金標準）であるが、倫理問題のため、前の三項のみが人類多能性幹細胞の評価に適用する。発明者は、四、五、六という３種レベルのネズミ幹細胞を選択して実験を行った。
【００３４】
本実験は上記の方法で多能性遺伝子の発現及び核型の分析を行う。そして、ＥＢ形成、奇形腫形成、及びキメラ体形成と四倍体胚補完を含む体内及び体外実験で検出を行う。多能性の幹細胞をＣＤ−１二倍体ネズミの胚に注射してキメラ体ネズミを取得する。
【００３５】
これらネズミが生長した後、ＣＤ−１ネズミと交尾させて新生ネズミを産み、そして、生殖系列キメラのネズミが誕生したかどうかを毛色によって決定する。四倍体胚補完は幹細胞多能性を検出する最も厳格な標準である。多能性幹細胞を四倍体胚に注射することによって全部ＥＳ又はｉＰＳ由来のネズミを取得する。
【００３６】
そして、（１）生殖系列キメラができ、且つ四倍体補完できる２つのＥＳ細胞系及び６つのｉＰＳ細胞系（４Ｎ）、（２）生殖系列キメラのみができる１つのｉＰＳ細胞系（ＧＬＴ）、（３）生殖系列キメラができないが、キメラ体動物を取得できる１つのｉＰＳ細胞系（２Ｎ）という細胞系を選択して総ＲＮＡを抽出し、シークエンシングを行う。
【００３７】
［２．細胞の総ＲＮＡの抽出及びＲＮＡの完備性検出］
ｔｒｉｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞の総ＲＮＡを抽出し、抽出した総ＲＮＡに対してＡｇｉｌｅｎｔ２１００によってその完備性を検出し、合格のＲＮＡがＲＩＮ値≧８．０、且つ２８ｓ：１８ｓ≧１を満たす必要がある。
【００３８】
［３．小ＲＮＡの高スループットシークエンシング］
３．１ 非コード小ＲＮＡの分離
検出に合格した総ＲＮＡをｌ０ｕｇ取り、１５％ポリアクリルアミド（７Ｍ尿素）の変性ＰＡＧＥゲルで分離を行い、ゲルを切って１８−３０ｎｔの小ＲＮＡを回収する。
【００３９】
３．２  ５’端コネクタの接続
回収後の非コード小ＲＮＡに５’端コネクタが接続され、接続産物が１５％ポリアクリルアミド（７Ｍ尿素）の変性ＰＡＧＥゲルで分離を行い、ゲル切って４０−６０ｎｔの接続産物を回収する。
【００４０】
３．３  ３’端コネクタの接続
回収後の接続産物に３’端コネクタを接続し、接続産物が１０％ポリアクリルアミド（７Ｍ尿素）の変性ＰＡＧＥゲルで分離を行い、ゲル切って７０−９０ｎｔの接続産物を回収する。
【００４１】
３．４  ＲＴ−ＰＣＲ
回収後の接続産物が特異的なプライマーを用いて逆転写を経てｃＤＮＡを取得し、このｃＤＮＡに対して１５回のＰＣＲ増幅を行い、増幅して得た産物が１０％ポリアクリルアミドの非変性ＰＡＧＥゲルで分離を行い、ゲル切って９０ｂｐの特異ストリップを回収する。
【００４２】
３．５ スループットシークエンシング
回収したＰＣＲ産物がｉｌｌｕｍｉｎａ社の高スループットシークエンシング機器によりシークエンシングを行う。
【００４３】
［４．データの分析］
会社から戻した原始データを取得し、生物情報手段で初期処理を行い、シークエンシング品質が標準に合致しないシークエンシング結果を削除し、高品質の非冗長配列及びその発現値を取得した。配列比較により配列をゲノムに位置づける。
【００４４】
そして、異なる多能性標準（四倍体補完動物を取得できるかを標準とする）の多能性幹細胞の間で、ゲノムにおける位置によってセクターを分けて比較を行い、そこで、特異の非コード小ＲＮＡ簇を選別する。これによって、胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞が四倍体補完という最高の多能性標準に符合することを指示できる特性を取得する。
【００４５】
［５．遺伝子発現スペクトルチップ及び差異発現に対する遺伝子分析］
Ｒ言語環境における生物チップデータ及びゲノムデータ分析ソフトウェアパッケージＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒを用いてすべての細胞系の発現スペクトルチップ結果に対して処理を行う。チップの最初のハイブリダイゼーション信号値がＲＭＡ方法により一意化した後、２を底とする対数値に転換する。
ＦＤＲ補正に合わせて、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて２つのグループの細胞系の間に発現差異が存在する遺伝子（Ｐ＜０．０５）を選別する。Ｒにおけるｈｅａｔｍａｐ．２  ｐａｃｋａｇｅソフトウェアパッケージを用いて研究した刷り込みセクターの遺伝子及び非コード小ＲＮＡ発現のヒートマップを描く。
【００４６】
＜結果：＞
本研究は、哺乳動物において特異的に発現する一簇の遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び他の非コードＲＮＡが、ネズミの胚性幹細胞の多能性に対して重要な影響を有することを発見した。
【００４７】
ネズミの第１２番の染色体セクターのＤｌｋ１−Ｄｉｏ３刷り込みドメイン（Ｄｌｋ１とＤｉｏ３遺伝子及びこの領域から上流のＢｅｇａｉｎ遺伝子と下流のＰｐｐ２ｒ５ｃ遺伝子までの遺伝子中間帯を含む）のすべての遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び他の非コードＲＮＡは、四倍体補完動物を取得できる完全多能性幹細胞において、高発現するが、四倍体補完動物を取得できない一部多能性幹細胞において、抑制又は沈黙される。これら遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び他の非コードＲＮＡが哺乳動物ゲノムで非常に保守する。
【００４８】
＜ｉＰＳ細胞系及び多能性判定＞
本実験のシークエンシングに用いるｉＰＳ及びＥＳに対して、多能性遺伝子の発現、核型分析、ＥＢの形成、奇形腫の形成及び二倍体キメラ能力と四倍体胚補完について、検出を行い、検出結果が表１に示す。
【００４９】
【表１】
2013528358.tif 000003
【００５０】
非コード小ＲＮＡの大規模シークエンシングにより、異なる発育潜在力を有する幹細胞に発現が異なる一簇のｍｉｃｒｏＲＮＡが発見された。
分子レベルで多能性幹細胞が四倍体補完できるかを評価する鍵指標を見つけるために、本発明は、２つのＥＳ細胞系、６つの４Ｎ−ｉＰＳ細胞系及び２つの２Ｎ−ｉＰＳ細胞系から了１８ｎｔ〜３０ｎｔの非コード小ＲＮＡを収集し、且つシークエンシングを行った。
【００５１】
クラスター分析方法は、ＥＳ細胞であってもｉＰＳ細胞であっても、四倍体補完ができる多能性幹細胞が２Ｎ−ｉＰＳ細胞に比べて差異が極めて大きく、しかし、４Ｎ−ＥＳ細胞と４Ｎ−ｉＰＳ細胞との間が著しい差異がない（図１に示すよう）ことを証明した。更に研究したところ、７５つのｍｉｃｒｏＲＮＡが２Ｎと４Ｎとの間での変化倍数が２倍を超えることが分かった。その中、６２つのｍｉｃｒｏＲＮＡが２Ｎ−ｉＰＳ細胞系で通常低発現又は不発現であり、これらｍｉｃｒｏＲＮＡが４Ｎ−ＥＳ  /４Ｎ−ｉＰＳ細胞系で通常高発現である。
刷り込みセクターＤｌｋ１−Ｄｉｏ３の高活性は全能性を示す重要な表徴である。
【００５２】
図２は、ネズミの第１２番の染色体のＤｌｋ１−Ｄｉｏ３刷り込みドメイン（Ｄｌｋ１とＤｉｏ３遺伝子及びこの領域から上流のＢｅｇａｉｎ遺伝子と下流のＰｐｐ２ｒ５ｃ遺伝子までの遺伝子中間帯を含む）のすべての遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び他の非コードＲＮＡを示す。２Ｎ−ｉＰＳ細胞と４Ｎ−ＥＳ/ｉＰＳにおいて、このセクターにおける遺伝子の発現に差異がある。緑の矩形で４Ｎ−ＥＳ/ｉＰＳ細胞において発現が向上した遺伝子及び他の非コードＲＮＡを示し、変化しない遺伝子が刷り込みドメイン外の灰色の矩形により示され、空のフレームが検出しない遺伝子を示す。
【００５３】
ヘアピン構造がこの領域で大量ｍｉｃｒｏＲＮＡが生じたことを示し、色が濃いほどこのｍｉｃｒｏＲＮＡが４Ｎ−ＥＳ/ｉＰＳ細胞での発現量が高いことを示す。五角形が他の非コード小ＲＮＡｓを表し、色の濃さとその発現量の変化の勢いが前記ｍｉｃｒｏＲＮＡと一致する。Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３刷り込みセクターのすべての遺伝子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及び他の非コードＲＮＡｓが４Ｎ−ＥＳ/ｉＰＳ細胞においていずれも活化状態にある。
【００５４】
注意すべきなのは、ｍｉＲＮＡの差異発現が多く検出された、２Ｎ−ｉＰＳで低発現するｍｉｃｒｏＲＮＡｓは、いずれもネズミの第１２番の染色体の長腕のＤｌｋ１−Ｄｉｏ３刷り込みドメインに位置づける。この領域は、おおよそ１３８０ｋｂであり、そして、Ｄｌｋ１、Ｒｔｌ１、１１１０００６Ｅ１４Ｒｉｋ、Ｂ８３００１２Ｌ１４Ｒｉｋ、Ｄｉｏ３という５つの遺伝子、Ｍｅｇ３、Ｒｉａｎ及びＭｉｒｇという３つの非コード遺伝子、１つのＣ/Ｄ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡ遺伝子簇、７２つのｍｉｃｒｏＲＮＡｓ及び複数の他の非コード小ＲＮＡ（図２に示す）を含む。早期の研究によれば、このセクターの遺伝子及びｍｉｃｒｏＲＮＡｓの発現がネズミの胚と成年ネズミの脳のみに存在するが、具体的な機能がまだわかっていない。
上記５つの遺伝子及び３つの非コード遺伝子が表２に示す如く。
【００５５】
【表２】
2013528358.tif 000004
【００５６】
【表３】
2013528358.tif 000005
2013528358.tif 000006
【００５７】
上文に記載のＤｌｋ１−Ｄｉｏ３セクターのｍｉｃｒｏＲＮＡが２Ｎ−ｉＰＳ細胞系で通常低発現であるが、２Ｎ−ｉＰＳに対して、ｍｉｃｒｏＲＮＡｓが４Ｎ−ＥＳ／ｉＰＳ細胞系で通常高発現である。隣接する領域の他の２つのｍｉｒ−３４２とｍｉｒ−３４５も類似の勢い（図３Ａに示す）がある。
【００５８】
注意すべきなのは、このセクターの大勢の内生のｓｉＲＮＡも同一な発現情況（図３Ｂに示す）を有する。その他に、発現スペクトルチップを用いて転写情況を分析したところ、Ｂ８３００１２Ｌ１４Ｒｉｋの外に、この位置のすべての遺伝子は、４Ｎ−ＥＳ／ｉＰＳ細胞系で通常高発現であるが、２Ｎ−ｉＰＳで発現が抑制される（図３Ｃに示す）ことが分かった。
【００５９】
これにより、発明者は、刷り込みセクターＤｌｋ１−Ｄｉｏ３の高活性が本当な正多能性を示す重要な表徴である結論を得た。
【００６０】
＜一部再プログラム後、生殖系列キメラ能力を有する又は有しない細胞系の微小の発現差異＞
本研究における２つの２Ｎ  ｉＰＳ細胞系も多能性に差異があり、ＩＰ２０Ｄ−３が生殖系列キメラ能力を有し、ＩＰ３６Ｄ−３がこの能力を有しない。発明者が推測したのように、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３領域でコードされるｍｉｃｒｏＲＮＡが、この２種の２Ｎ  ｉＰＳにおいて、発現量が極めて低く又は発現しないが、これら有限の発現では、ＩＰ２０Ｄ−３の発現量が通常ＩＰ３６Ｄ−３（図４に示す）より高い。
【００６１】
ＩＰ２０Ｄ−３の生殖系列キメラ能力に対応するが、この刷り込みドメインからのｍｉｃｒｏＲＮＡの量が高いからこそ、この細胞系は、一層高い発育潜在力が賦与されたのである可能性が高い。
【００６２】
アクティブにしたｍｉｃｒｏＲＮＡ簇がＰＲＣ２複合物を正帰還によって調節し、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３領域を脱メチル化させる。
２Ｎ誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）と胚性幹細胞（ＥＳ）及び４Ｎ  ｉＰＳ細胞系の発現スペクトルチップデータによれば、１６３８個の遺伝子がＥＳ及び４Ｎ  ｉＰＳで２Ｎ  ｉＰＳより発現が向上したが、３４６７個の遺伝子が発現が低下した。
【００６３】
ｍｉｃｒｏＲＮＡが通常にその標的遺伝子に対してマイナス調整の作用を果たすため、ＥＳと４Ｎ  ｉＰＳにおいて発現が低下した遺伝子は、発明者が判定して取得したｍｉｃｒｏＲＮＡ簇の標的遺伝子を含むはずだ。発明者は、ｍＲＮＡのうち、３’ＵＴＲ領域が、ｍｉｃｒｏＲＮＡの５’端末の２つ乃至８つの核酸シード領域と相補的に結合できるサイトとして少なくとも２つ有するものを分析したところ、２８つの中等又は高発現のｍｉｃｒｏＲＮＡに存在する潜在の標的遺伝子のうち、７１７つが、ＥＳ及び４Ｎ  ｉＰＳ系で発現が低下したことが分かった。
【００６４】
遺伝子本体（Gene ontrogy、ＧＯ）分析によれば、存在度が高いｍｉｃｒｏＲＮＡから推測された標的遺伝子が生長、分化・代謝及び発育過程における調整等の複数の表現型に関わり、完全多能性細胞において高発現のｍｉｃｒｏＲＮＡ簇は、発育に関わる遺伝子を抑制することにより機能を発揮する可能性があることが分かった。
【００６５】
信号通路分析によれば、ＨＤＡＣ２、ＲＢＡＰ４８及びＥＥＤという３つのコア蛋白複合体（polycomb repressive complex 2、ＰＲＣ２）の構成素子が、予測したｍｉｃｒｏＲＮＡの標的遺伝子であることが分かった。ＰＲＣ２は、ヒストン３リジン２７位のトリメチル化を引き起こして、遺伝子を沈黙させることができる。ＰＲＣ２によってメチル化を引き起こす前に、まず、ヒストン脱アセチル化酵素ＨＤＡＣ２をアクティブにしてヒストン３のアセチル化修飾を取り除く必要がある。
【００６６】
我々の研究結果によれば、ＥＳ及び４Ｎ  ｉＰＳ細胞の場合、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３領域でコードされるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現がＨＤＡＣ２、ＲＢＡＰ４８及びＥＥＤの発現を抑制し、よって、ＰＲＣ２の形成が低減され、ゲノムが脱メチル化されることが分かった。ＥＳ及びｉＰＳ細胞において、ＰＲＣ２形成の低減がＤｌｋ１−Ｄｉｏ３領域の脱メチル化を引き起こすが、それが、遺伝子及びｍｉｃｒｏＲＮＡの発現の増加という我々の研究結果に合致する。（図５に示す）ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現は、更にｈｄａｃ２、ｒｂａｐ４８及びｅｅｄの転写を狙ってＰＲＣ２の形成を抑制し、これにより、最終に１つの正帰還調整信号通路を形成する。
【００６７】
図５は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３セクターのｍｉｃｒｏＲＮＡがＰＲＣ２複合体を調整する機制の模式モデルを示す。図５のＡは、ＰＲＣ２複合体がトリメチル化ヒストンのＨ３Ｋ２７サイトを介して遺伝子及ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現を抑制することを示す。図５のＢは、一部多能性幹細胞において、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３セクターのｍｉｃｒｏＲＮＡの発現が、ＰＲＣ２複合体仲介のヒストンＨ３ｋ２７のメチル化によって抑制されることを示す。
【００６８】
完全多能性幹細胞では、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３セクターのｍｉｃｒｏＲＮＡがアクティブ状態にある。このため、ＨＤＡＣ２、ＲＢＡＰ４８及びＥＥＤという３つの蛋白の合成を指導するｍＲＮＡが正常に機能を果たすことができなくなって、細胞がＰＲＣ２複合体を構成でず、よって、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３セクターの脱メチル化が引き起こされ、更にＤｌｋ１−Ｄｉｏ３セクターのｍｉｃｒｏＲＮＡの発現が促進され、正帰還調整通路が形成される。
【００６９】
＜機能検証の実験結果：＞
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑＰＣＲとＮｏｒｔｈｅｒｎの方法で６つの４Ｎ−ＥＳ細胞系、７つの４Ｎ−ｉＰＳ細胞系、４つのＧＬＴ  ｉＰＳ細胞系、１つの２Ｎ−ｉＰＳ細胞及び１つの２Ｎ−ＥＳ細胞においてＤｌｋ１−Ｄｉｏ３領域の遺伝子とｍｉｃｒｏＲＮＡの発現を検出した。
【００７０】
Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３領域の遺伝子とｍｉｃｒｏＲＮＡが、６つの４Ｎ−ＥＳ細胞系、７つの４Ｎ−ｉＰＳ細胞系で高発現し、４つのＧＬＴ  ｉＰＳ細胞系で一定程度発現するが、発現量が高くなく、２Ｎ−ｉＰＳ細胞及び２Ｎ−ＥＳ細胞で発現しなく又は低発現するという結果が分かった。Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３領域の遺伝子及びｍｉｃｒｏＲＮＡが細胞の多能性を調整することを証明した。この領域の遺伝子及びｍｉｃｒｏＲＮＡが高発現すると、細胞が更によい発育潜在力を有する。
【００７１】
＜参照文献：＞
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【図１】
2013528358.tif 000007
【図２Ａ】
2013528358.tif 000008
【図２Ｂ】
2013528358.tif 000009
【図３Ａ】
2013528358.tif 000010
【図３Ｂ】
2013528358.tif 000011
【図３Ｃ】
2013528358.tif 000012
【図４】
2013528358.tif 000013
【図５Ａ】
2013528358.tif 000014
【図５Ｂ】
2013528358.tif 000015
【国際調査報告】
2013528358.tif 000016
2013528358.tif 000017
2013528358.tif 000018
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