(57)【要約】ＸＹドナー細胞と適切な宿主胚から、表現型的に雌の繁殖可能動物を作製するための方法および組成物を記述する。培養においてＸＹドナー細胞（これは、宿主胚への導入および適切な宿主における懐胎後に、繁殖可能なＸＹ雌動物をもたらすこととなる）を維持するための培地および方法を提供する。ドナーＸＹ細胞と宿主胚からＦ０世代における繁殖可能な雌動物を作製するための方法および組成物を記述し、ヘテロ接合性のＦ０繁殖可能な雄とヘテロ接合性のＦ０繁殖可能な雌の同胞から、改変についてホモ接合性であるＦ１後代を作製するための方法も記述する。
2013528062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆ０世代における繁殖可能な雌のＸＹマウスを作製するための方法であって、
（ａ）培地内にドナーＸＹマウスＥＳ細胞を維持する工程であって、該培地は、
（ｉ）基本培地と、
（ｉｉ）マウスＥＳ細胞を培養中に維持するのに適したサプリメント
とを含み、ここで、該基本培地は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇから３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満の重量オスモル濃度、約１１〜１３ｍＳ／ｃｍの導電率、約５０〜１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属およびハロゲン化物の塩、約１７〜３０ｍＭの炭酸塩濃度、約８５〜１３０ｍＭの全アルカリ金属ハロゲン化物塩濃度および炭酸塩濃度、ならびにこれらの任意の２つ以上の組み合わせ、からなる群から選択される特性を呈する、工程と；
（ｂ）該ドナーＸＹマウスＥＳ細胞を宿主胚に導入する工程と；
（ｃ）該宿主胚を懐胎させる工程と；
（ｄ）ＸＹ雌マウス後代を得る工程であって、性的成熟に達した時点で該ＸＹ雌マウスは繁殖可能である、工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記ドナーＸＹマウスＥＳ細胞が、遺伝子改変を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子改変が、１つまたは複数の内在性核酸配列、１つまたは複数の核酸の置換、内在性核酸配列の異種性核酸配列との置き換え、ノックアウト、およびノックインを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子改変が、ＳＴＥＡＰ２遺伝子のノックアウトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記基本培地が、５０±５ｍＭ  ＮａＣｌ、２６±５ｍＭ炭酸塩、および２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇを呈する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記基本培地が、約３ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム、および２１８ｍＯｓｍ／ｋｇを呈する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記基本培地が、８７±５ｍＭ  ＮａＣｌ、１８±５ｍＭ炭酸塩、および２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇを呈する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記基本培地が、約５．１ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム、および２６１ｍＯｓｍ／ｋｇを呈する、請求項１〜４、および請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記基本培地が、１１０±５ｍＭ  ＮａＣｌ、１８±５ｍＭ炭酸塩、および２９４±２９ｍＯｓｍ／ｋｇを呈する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記基本培地が、約６．４ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム、および２９４ｍＯｓｍ／ｋｇを呈する、請求項１〜４、および請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記基本培地が、８７±５ｍＭ  ＮａＣｌ、２６±５ｍＭ炭酸塩、および２７０±２７ｍＯｓｍ／ｋｇを呈する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記基本培地が、約５．１ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム、および２７０ｍＯｓｍ／ｋｇを呈する、請求項１〜４、および請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記基本培地が、８７±５ｍＭ  ＮａＣｌ、２６±５ｍＭ炭酸塩、８６±５ｍＭグルコース、および３２２±３２ｍＯｓｍ／ｋｇを呈する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記基本培地が、約５．１ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム、１５．５ｍｇ／ｍＬグルコース、および３２２ｍＯｓｍ／ｋｇを呈する、請求項１〜４、および請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子改変についてホモ接合であるＦ１世代におけるトランスジェニックマウスを生成する方法であって、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＦ０  ＸＹ繁殖可能雌マウスを同齢集団Ｆ０  ＸＹ雄マウスと交雑させる工程であって、ここで、該Ｆ０  ＸＹ繁殖可能雌マウスと該Ｆ０  ＸＹ雄マウスはそれぞれ、該遺伝子改変についてヘテロ接合性である、工程と、
該遺伝子改変についてヘテロ接合性であるＦ１後代マウスを得る工程と
を含む方法。
【請求項１６】
前記遺伝子改変が、１つまたは複数の内在性核酸配列、１つまたは複数の核酸の置換、内在性核酸配列の異種性核酸配列との置き換え、ノックアウト、およびノックインを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｆ０  ＸＹ繁殖可能雌マウスが、請求項６に従って作製される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか一項に従って生成される、遺伝子改変についてホモ接合であるトランスジェニックマウス。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか一項に従って生成される繁殖可能な雌のＸＹマウス。
【請求項２０】
前記基本培地が、５０±５ｍＭ  ＮａＣｌ、２６±５ｍＭ炭酸塩、および２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇを呈する、請求項１９に記載の繁殖可能な雌のＸＹマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、ＸＹ胚性幹（「ＥＳ」）細胞から得られ、ＸＹ核型を有する、繁殖可能な雌動物の生産に関する。特定の実施形態では、ＸＹドナーマウスのＥＳ細胞から繁殖可能なＸＹ雌マウスを作製するための方法および組成物を記述する。表現型的雌の形成に有利に働く体外受精方法も記述する。
【背景技術】
【０００２】
背景
遺伝子改変されたマウスを作製するためにほぼ全ての一般的に用いられるＥＳ細胞株は、遺伝子型的雄の（ＸＹ）ＥＳ細胞株である。結果として、Ｆ０世代では、すべてのＸＹ動物は、雄である。大抵の遺伝子改変は、２つの存在する対立遺伝子のうちの１つの改変をもたらすようにＸＹ  ＥＳ細胞をターゲティングすることによって実施される、すなわち、ドナーマウスＥＳ細胞は、その遺伝子改変についてヘテロ接合性である。しかし、その遺伝子改変についてホモ接合性であるマウスを得ることが、しばしば望ましい。本質的に十分にはＥＳ細胞由来でない雌マウスが、改変を含むＦ０世代において生まれるので、Ｆ０雄は通常、少なくとも１匹の雌（Ｆ１雌）が該遺伝子改変についてヘテロ接合性であり得るような同腹仔を産生するように、雌（例えば、対応する近交系の雌）と交配させる。次いで、ヘテロ接合性のＦ１雌を、Ｆ１ヘテロ接合性の雄と交雑させて、ホモ接合性の後代を得る。こうした交配に必要なのは、高費用かつ時間がかかるステップである。Ｆ０世代における交配対を産生すること、または、大部分または十分にドナー（ＸＹ雄）ＥＳ細胞由来であるＦ０雌を少なくとも産生することが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ドナー雄（ＸＹ）ドナーＥＳ細胞と宿主胚から、Ｆ０世代における繁殖可能な雌動物を作製するための方法および組成物の必要性が、当技術分野で存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
一実施態様では、ＸＹドナー細胞からヒトでない繁殖可能な雌の動物を作製するための方法であって、以下を含む方法が提供される：（ａ）ヒトでないＸＹドナー細胞をヒトでない宿主胚に導入してキメラ胚を形成する工程；および（ｂ）このキメラ胚を懐胎させてヒトでない雌動物を形成する工程。ここで、ヒトでない雌動物は、ＸＹであり、性的成熟に達した時点で繁殖可能である。
【０００５】
一実施形態では、ヒトでない動物は、マウスである。
【０００６】
一実施形態では、ヒトでないＸＹ雌動物は、Ｆ０世代で形成される。一実施形態では、Ｆ０世代におけるヒトでない雌のＸＹ動物は、マウスであり、１００％、ドナー細胞由来の毛色を有する。一実施形態では、Ｆ０世代において形成されるヒトでない雌のＸＹ動物は、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、または９９．８％、ＸＹドナー細胞由来である。一実施形態では、Ｆ０世代におけるヒトでない雌のＸＹ動物は、約１００％、ドナー細胞由来である。一実施形態では、宿主胚細胞の、Ｆ０世代におけるヒトでない雌のＸＹ動物に対する寄与は、２０００細胞中の１細胞（０．０５％）を検出することが可能な定量分析によって求められ、雌のＸＹ動物の組織は、宿主胚細胞寄与に関して少しもプラスではない。
【０００７】
一実施形態では、ドナー細胞は、遺伝子改変を含む。一実施形態では、遺伝子改変は、内在性核酸配列の完全なまたは部分的な欠失；１つまたは複数の核酸の置換；内在性核酸配列、例えば遺伝子の、異種性核酸配列との完全なまたは部分的な置き換え；ノックアウト；および／またはノックインを含む。
【０００８】
一実施形態では、該方法は、遺伝子改変についてヘテロ接合性のＦ０世代ＸＹ雄を、遺伝子改変についてヘテロ接合性のＦ０世代ＸＹ雌（例えば同胞）と交配する工程と、前記交配から遺伝子改変についてホモ接合性のＦ１世代動物を得る工程とをさらに含む。
【０００９】
一実施形態では、宿主胚への導入前のＸＹドナー細胞は、基本培地とサプリメントとを含む培地内に維持される。ここで、基本培地は、以下からなる群から選択される特性を呈する：（ａ）約２５０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度；（ｂ）約１１〜１３ｍＳ／ｃｍの導電率；（ｃ）約６０〜１０５ｍＭの濃度のアルカリ金属およびハロゲン化物塩；（ｄ）約２０〜３０ｍＭの炭酸塩濃度；（ｅ）多くとも約８５〜１３０ｍＭの総アルカリ金属ハロゲン化物塩および炭酸塩濃度；ならびに（ｆ）これらの組み合わせ。
【００１０】
一実施形態では、サプリメントは、培養中にＥＳ細胞を維持するための成分を含む。一実施形態では、サプリメントは、１種または複数のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミン、抗生物質（１種または複数）、ピルビン酸、可欠アミノ酸、２−メルカプトエタノール、およびＬＩＦを含む。
【００１１】
一実施形態では、基本培地は、低塩のＤＭＥＭである。具体的実施形態では、低塩のＤＭＥＭのＮａＣｌ濃度は、８５〜１３０ｍＭである。一実施形態では、基本培地は、低い重量オスモル濃度のＤＭＥＭである。具体的実施形態では、低い重量オスモル濃度のＤＭＥＭの重量オスモル濃度は、２５０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇである。一実施形態では、基本培地は、低導電率のＤＭＥＭである。具体的実施形態では、低導電率のＤＭＥＭの導電率は、１１〜１３ｍＳ／ｃｍである。
【００１２】
一実施形態では、ドナー細胞は、宿主胚への導入前に、約１、２、３、４、５、６日、１週間、８、９、１１０、１１、または１２日、２週間、３週間、または４週間またはそれ以上の間、サプリメントを加えた列挙した基本培地内に維持される。具体的実施形態では、ドナー細胞は、宿主胚への導入前に少なくとも１週間、サプリメントを加えた基本培地内に維持される。具体的実施形態では、ドナー細胞は、宿主胚への導入前に、２〜４週間、サプリメントを加えた基本培地内に維持される。
【００１３】
一実施形態では、宿主胚は、２細胞期、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、３２細胞期、または６４細胞期の胚である。別の実施形態では、宿主胚は、胚盤胞である。一実施形態では、胚は、桑実期前段階、桑実期、緊密化していない桑実期、および緊密化した桑実期から選択される段階にあるものである。一実施形態では、胚の段階は、Ｔｈｅｉｌｅｒ（１９８９）「Ｔｈｅ  Ｈｏｕｓｅ  Ｍｏｕｓｅ：Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されているＴｈｅｉｌｅｒ段階に準拠して、Ｔｈｅｉｌｅｒ段階１（ＴＳ１）、ＴＳ２、ＴＳ３、ＴＳ４、ＴＳ５、およびＴＳ６から選択される。具体的実施形態では、Ｔｈｅｉｌｅｒ段階は、ＴＳ１、ＴＳ２、ＴＳ３、およびＴＳ４から選択される。一実施形態では、胚は、透明帯を含み、ドナー細胞は、透明帯における孔を通して胚に導入されたＥＳ細胞である。
【００１４】
一実施形態では、胚は、胚盤胞前駆胚を含む。一実施形態では、胚は、桑実期胚である。具体的実施形態では、桑実期胚は、密な状態である。一実施形態では、胚は、透明帯の無い胚である。
【００１５】
一実施形態では、ＸＹドナー細胞は、ＥＳ細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、多能性細胞、および全能性細胞から選択される。具体的実施形態では、ＸＹドナー細胞は、マウスＥＳ細胞であり、宿主胚は、マウス胚である。
【００１６】
一実施形態では、ＸＹドナー細胞は、マウス近交系由来のＥＳ細胞である。一実施形態では、ＸＹドナー細胞は、ハイブリッドまたはマウス非近交系由来のＥＳ細胞である。
【００１７】
一実施形態では、宿主胚は、マウス宿主胚である。一実施形態では、マウス宿主胚は、近交系由来、別の実施形態では、ハイブリッドまたは非近交系由来である。一実施形態では、ドナー細胞は、マウスドナー細胞である。一実施形態では、宿主胚とドナー細胞が、両方ともマウスであり、それぞれが、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９とＣ５７ＢＬ／６の混合、ＢＡＬＢ／ｃ系統、またはＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ系統であるマウスから独立に選択される。具体的実施形態では、マウスは、５０％  １２９と５０％  Ｃ５７ＢＬ／６である。一実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇら（１９９９）Ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  １２９  ｍｉｃｅ、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６を参照のこと）。一実施形態では、マウスは、Ｃ５７ＢＬ系統であり、具体的実施形態では、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、Ｃ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択される。具体的実施形態では、マウスは、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統の混合である。別の具体的実施形態では、マウスは、前述の１２９系統の混合、または前述のＢＬ／６系統の混合である。具体的実施形態では、混合の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。
【００１８】
一実施形態では、ＸＹ雌マウスは、その生存期間に、１、２、３、４、５、６、７、８、または９匹の同腹の生存マウスを生じる。一実施形態では、ＸＹ雌マウスは、同腹につき少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０匹の仔を生じる。一実施形態では、ＸＹ雌マウスは、同腹につき約４〜６匹の仔を生じる。一実施形態では、ＸＹ雌マウスは、２〜６匹の同腹仔を生じ、ここで、各同腹仔は、少なくとも２、３、４、５、または６匹の仔を含む。一実施形態では、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％の仔が、ＸＹの雌の仔である。具体的実施形態では、約１５％〜２５％が、ＸＹの雌の仔である。
【００１９】
一実施態様では、遺伝子改変についてヘテロ接合性であるＸＹ  ＥＳ細胞を用いる、遺伝子改変についてホモ接合性であるマウスを作製するための方法が提供される。一実施形態では、この方法は、ＸＹドナーＥＳ細胞を遺伝子改変してヘテロ接合性のＸＹドナーＥＳ細胞を形成する工程と、該ヘテロ接合性ＸＹドナーＥＳ細胞を低塩および／または低い重量オスモル濃度または低導電率の培地内に維持する工程と、該ヘテロ接合性ＸＹドナーＥＳ細胞を桑実期前の宿主胚に導入する工程と、該宿主胚を懐胎させる工程と、ヘテロ接合性の改変を含み、かつ少なくとも一部分はドナーＥＳ細胞由来である、繁殖可能なＦ０世代の雌ＸＹマウスを、懐胎後に得る工程と、ヘテロ接合性の改変を含み、かつ少なくとも一部分はドナーＥＳ細胞由来である、繁殖可能なＦ０世代の雄ＸＹマウスを、懐胎後に得ることと、該Ｆ０雄とＦ０雌を交配して、ホモ接合性の改変を含むＦ１後代を得る工程とを含む。
【００２０】
一実施形態では、Ｆ０世代の雌ＸＹマウスおよび／またはＦ０世代の雄ＸＹマウスは、少なくとも２０％以上、ドナーＥＳ細胞由来である。一実施形態では、Ｆ０雌ＸＹマウスは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％、ドナーＥＳ細胞由来である。
【００２１】
一実施形態では、Ｆ０世代の雌ＸＹマウスおよび／または雄ＸＹマウスは、少なくとも９０％、ドナーＥＳ細胞由来である。一実施形態では、Ｆ０世代の雌ＸＹマウスは、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、または９９．８％、ドナーＥＳ細胞由来である。一実施形態では、Ｆ０の雌ＸＹマウスおよび／またはＦ０の雄ＸＹマウスは、１００％、ＥＳ細胞由来の毛色を有する。
【００２２】
一実施形態では、Ｆ０世代マウスは、ＸＹ卵母細胞を含む。
【００２３】
一実施形態では、Ｆ１世代の後代マウスは、完全にドナーＥＳ細胞由来のゲノムを含む。
【００２４】
一実施形態では、ＥＳ細胞由来のマウスを十分に生じさせる、Ｆ０世代の雄とＦ０世代の雌マウスとの交雑の頻度は、１００％である。
【００２５】
一実施態様では、マウス仔の同腹仔を産生するための方法であって、本発明に従って調製されたＸＹドナーＥＳ細胞を宿主マウス胚に導入する工程と、この胚を適切なマウスにおいて懐胎させる工程と、性的成熟に到達した時点で繁殖可能なＸＹ雌マウスである少なくとも１匹のＸＹ雌マウス仔を含むマウス仔の同腹仔を得る工程とを含む方法が提供される。
【００２６】
一実施形態では、性的成熟に到達した時点で繁殖可能である、生まれるＸＹ雌マウス仔の割合は、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％である。具体的実施形態では、該割合は、約１５〜２５％である。
【００２７】
一実施態様では、培養中にＸＹ  ＥＳ細胞を維持するための方法が提供され、ここで、ＸＹ  ＥＳ細胞は、ＸＹ  ＥＳ細胞の宿主胚への導入後に、また適切な雌マウスにおける懐胎後に雌のＸＹマウスの発生を促進するまたは該発生に有利に働く条件下で維持される。この方法は、基本培地とサプリメントとを含む適切な培地内に雄のＥＳ細胞を維持することを含む。ここで、基本培地は、約２４０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度、約１０〜１４ｍＳ／ｃｍの導電率、約５０〜１０５ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩濃度、１０〜４０ｍＭの炭酸濃度の塩、および／または約８０〜１４０ｍＭのアルカリ金属塩と炭酸塩の合計濃度を呈する。一実施形態では、ＸＹ  ＥＳ細胞は、宿主胚への導入前に１、２、３、４、５、または６日、または１週間、８、９、１１０、１１、または１２日、２週間、３週間、または４週間の間、培地（ＥＳ細胞を維持するためのサプリメントを含む）内に維持される。具体的実施形態では、ＥＳ細胞は、宿主胚への導入前に、約２〜４週間、培地（ＥＳ細胞を維持するためのサプリメントを含む低塩の基本培地）内に維持される。
【００２８】
一実施形態では、基本培地は、多くとも約３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、または２４０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する。一実施形態では、基本培地は、多くとも約２４０〜３２０、２５０〜３１０、または２６０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する。具体的実施形態では、基本培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する。
【００２９】
一実施形態では、基本培地は、多くとも約１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、または１４．０ｍＳ／ｃｍの導電率を呈する。一実施形態では、基本培地は、多くとも約１０〜１４ｍＳ／ｃｍまたは１１〜１３ｍＳ／ｃｍの導電率を呈する。具体的実施形態では、基本培地は、約１２〜１３ｍＳ／ｃｍの導電率を呈する。
【００３０】
具体的実施形態では、基本培地は、約１２〜１３ｍＳ／ｃｍの導電率および約２６０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する。さらなる具体的実施形態では、基本培地は、約９０ｍＭ  ＮａＣｌの濃度の塩化ナトリウムを含む。さらなる具体的実施形態では、塩化ナトリウムの濃度は、約７０〜９５ｍＭである。さらなる具体的実施形態では、基本培地は、約３５ｍＭよりも低い濃度の炭酸水素ナトリウムを含む。さらなる具体的実施形態では、炭酸水素ナトリウムの濃度は、約２０〜３０ｍＭである。
【００３１】
一実施形態では、基本培地は、多くとも約１００ｍＭのアルカリ金属およびハロゲン化物の塩の濃度を呈する。一実施形態では、アルカリ金属およびハロゲン化物の塩は、ＮａＣｌである。一実施形態では、アルカリ金属塩およびハロゲン化物の濃度は、高くとも９０、８０、７０、６０、または５０ｍＭである。一実施形態では、基本培地中のアルカリ金属およびハロゲン化物の塩の濃度は、約６０〜１０５、７０〜９５、または８０〜９０ｍＭである。具体的実施形態では、該濃度は、約８５ｍＭである。
【００３２】
一実施形態では、基本培地は、炭酸の塩の濃度を呈する。一実施形態では、炭酸の塩は、ナトリウム塩である。一実施形態では、ナトリウム塩は、炭酸水素ナトリウムである。一実施形態では、基本培地中の炭酸塩の濃度は、高くとも４０、３５、３０、２５、または２０ｍＭである。一実施形態では、基本培地中の炭酸塩の濃度は、約１０〜４０、別の実施形態では、約２０〜３０ｍＭである。具体的実施形態では、該濃度は、約２５または２６ｍＭである。
【００３３】
一実施形態では、基本培地中のアルカリ金属およびハロゲン化物の塩と、炭酸の塩との濃度の合計は、多くとも１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、または８０ｍＭである。一実施形態では、基本培地中のアルカリ金属およびハロゲン化物の塩と、炭酸の塩との濃度の合計は、約８０〜１４０、８５〜１３０、９０〜１２０、９５〜１２０、または１００〜１２０ｍＭである。具体的実施形態では、基本培地中のアルカリ金属およびハロゲン化物の塩と、炭酸の塩との濃度の合計は、約１１５ｍＭである。
【００３４】
一実施形態では、アルカリ金属およびハロゲン化物の塩と、炭酸の塩とのモル比は、２．５よりも大きい。一実施形態では、この比は、約２．６〜４．０、２．８〜３．８、３〜３．６、または３．２〜３．４である。一実施形態では、この比は、３．３〜３．５である。具体的実施形態では、この比は、３．４である。
【００３５】
一実施形態では、基本培地は、約２５０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度および約６０〜１０５ｍＭのアルカリ金属およびハロゲン化物の塩の濃度を呈する。さらなる実施形態では、基本培地は、約２０〜３０ｍＭの炭酸の塩の濃度を有する。さらなる実施形態では、アルカリ金属およびハロゲン化物の塩と、炭酸の塩との濃度の合計は、約８０〜１４０ｍＭである。さらなる実施形態では、基本培地の導電率は、約１２〜１３ｍＳ／ｃｍである。
【００３６】
一実施態様では、本明細書に記述する条件下で、培養中にドナーＸＹ  ＥＳ細胞を維持するための方法が提供される。ここで、キメラ胚を形成するためのドナーＸＹ  ＥＳ細胞の宿主胚への導入後に、また適切な動物における懐胎後に、キメラ胚は、少なくとも９０％、ＸＹであり、かつ性的成熟に達した時点で繁殖可能である雌であるマウス仔に発育する。
【００３７】
一実施形態では、マウス仔は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、または９９．８％、ＸＹである。
【００３８】
一実施態様では、繁殖可能なＸＹ雌動物を作製するための方法であって、ＸＹドナー細胞を、該ドナー細胞の宿主胚への導入の前に、低塩の基本培地を含む培地内に維持する工程と、ドナー細胞を宿主胚に導入する工程と、該宿主胚を予定日まで適切な動物において懐胎させる工程と、懐胎後にそこからＸＹ雌動物を得る工程とを含む方法が提供される。ここで、性的成熟に到達した時点で、該ＸＹ雌動物は繁殖可能である。
【００３９】
一実施形態では、ＸＹドナー細胞は、マウスＥＳ細胞であり、宿主胚は、ＸＸ雌マウス由来の胚である。
【００４０】
一実施形態では、ドナー細胞が維持される培養は、本明細書に記述する通りの基本培地と、培養中にマウスＥＳ細胞を維持するのに適した１種または複数のサプリメントとを含む。具体的実施形態では、培養中にマウスＥＳ細胞を維持するのに適した１種または複数のサプリメントは、ＦＢＳ（９０ｍＬ  ＦＢＳ／０．５Ｌ基本培地）、グルタミン（２．４ミリモル／０．５Ｌ基本培地）、ピルビン酸ナトリウム（０．６ミリモル／０．５Ｌ基本培地）、可欠アミノ酸（＜０．１ミリモル／０．５Ｌ基本培地）、２−メルカプトエタノール、ＬＩＦ、および１種または複数の抗生物質である。
【００４１】
一実施形態では、ドナー細胞は、ドナー細胞を宿主胚に導入する前に、少なくとも１、２、３、４、５、または６日、または１週間、８、９、１１０、１１、または１２日、２週間、３週間、または４週間の間、低塩の基本培地を含む培地内に維持される。具体的実施形態では、ドナー細胞は、ドナー細胞を宿主胚に導入する前に、少なくとも２〜４週間の間、低塩の基本培地を含む培地内に維持される。
【００４２】
一実施形態では、ドナー細胞は、低塩の基本培地を含む培地内に維持（例えば凍結）され、このドナー細胞は、低塩の基本培地を含むこの培地内で解凍され、ドナー細胞を宿主胚に導入する前に少なくとも１、２、３、または４日間、またはそれ以上の間、該培地内に維持される。具体的実施形態では、ドナー細胞は、低塩の基本培地を含む培地内で少なくとも１回継代され、この細胞は、低塩の基本培地を含むこの培地内で凍結され、この細胞は、低塩の基本培地を含む培地内で解凍され、宿主胚への導入の前に、１、２、３、４、５、または６日以上、または１週間、８、９、１１０、１１、または１２日、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上の間成長させられる。
【００４３】
一実施形態では、ドナー細胞は、宿主胚への導入の前に、１、２、３、または４日の間、維持される。一実施形態では、ドナー細胞は、列挙した基本培地を含む培地内に３日間維持される。
【００４４】
一実施態様では、同じＦ０世代における、各々が十分にドナーＥＳ細胞由来である繁殖可能なマウスの交配対を作製するための方法であって、以下を含む方法が提供される：基本培地と本明細書に記述した通りのサプリメントを含む培養中にドナー雄マウスＸＹ  ＥＳ細胞を維持する（ここで、ＥＳ細胞は、基本培地およびサプリメント内に、少なくとも１日の間、維持される）工程と；該ＥＳ細胞を宿主胚（例えば、ＸＸマウス由来）に導入してキメラ胚を形成する工程と；該キメラ胚を適切なマウス中で予定日まで懐胎させる工程と；該適切なマウスから、十分にドナーＥＳ細胞由来であるＦ０世代の繁殖可能な雄ＸＹマウスと十分にドナーＥＳ細胞由来であるＦ０世代の繁殖可能な雌ＸＹマウスを含む、マウス仔の同腹仔を得ること。
【００４５】
一実施形態では、ドナーＥＳ細胞は、遺伝子改変を含む。一実施形態では、ドナーＥＳ細胞は、ヘテロ接合性である遺伝子改変を含む。一実施形態では、ドナーＥＳ細胞は、ヘテロ接合性の遺伝子改変を含み、Ｆ０世代の繁殖可能な雄マウスとＦ０世代の繁殖可能な雌ＸＹマウスは、該遺伝子改変についてそれぞれヘテロ接合性であり、該Ｆ０世代の繁殖可能な雄と該Ｆ０世代の繁殖可能な雌は、互いに交配されて、該遺伝子改変についてホモ接合性のＦ１世代マウスである後代を生じる。
【００４６】
一実施形態では、ＥＳ細胞は、２日、３日、または４日、またはそれ以上の間、維持される。
【００４７】
一実施態様では、Ｆ０世代における繁殖可能な雌のＸＹマウスを作製するための方法であって、（ａ）ドナーＸＹマウスＥＳ細胞を、基本培地と、培養中にマウスＥＳ細胞を維持するのに適したサプリメントとを含む培地内に維持する工程と、（ｂ）該ドナーＸＹマウスＥＳ細胞を宿主胚に導入する工程と、（ｃ）該宿主胚を懐胎させる工程と、（ｄ）ＸＹ雌マウス後代を得る（ここで、性的成熟に達した時点で、該ＸＹ雌マウスは繁殖可能である）工程とを含む方法が提供される。この実施態様による基本培地は、（１）２００ｍＯｓｍ／ｋｇから３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満までの重量オスモル濃度、（２）約１１〜１３ｍＳ／ｃｍの導電率、（３）約５０〜１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属およびハロゲン化物の塩、（４）約１７〜３０ｍＭの炭酸塩濃度、および（５）約８５〜１３０ｍＭの総アルカリ金属ハロゲン化物塩および炭酸塩濃度、から選択される１つまたは複数の特性を呈する。
【００４８】
一実施形態では、ドナーＸＹマウスＥＳ細胞は、遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、１つまたは複数の内在性核酸配列、１つまたは複数の核酸の置換、内在性核酸配列の異種性核酸配列との置き換え、ノックアウト、およびノックインを含む。ある特定の実施形態では、遺伝子改変は、ＳＴＥＡＰ２遺伝子のノックアウトである。
【００４９】
一実施形態では、基本培地は、５０±５ｍＭ  ＮａＣｌおよび２６±５ｍＭ炭酸塩を特に含有し（を呈し）、重量オスモル濃度は２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇである。具体的実施形態では、基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌおよび２．２ｍｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム、それに伴い約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する。
【００５０】
別の実施形態では、基本培地は、８７±５ｍＭ  ＮａＣｌおよび１８±５ｍＭ、それに伴い２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する。具体的実施形態では、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌおよび１．５ｍｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム、それに伴い約２６１ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する。
【００５１】
別の実施形態では、基本培地は、１１０±５ｍＭ  ＮａＣｌおよび１８±５ｍＭ炭酸塩を呈し、重量オスモル濃度は、２９４±２９ｍＯｓｍ／ｋｇである。具体的実施形態では、基本培地は、約６．４ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌおよび１．５ｍｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム、それに伴い約２９４ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する。
【００５２】
別の実施形態では、基本培地は、８７±５ｍＭ  ＮａＣｌおよび２６±５ｍＭ炭酸塩、それに伴い約２７０±２７ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する。具体的実施形態では、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌおよび２．２ｍｇ／ｍＬ  炭酸水素ナトリウム、それに伴い約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する。
【００５３】
別の実施形態では、基本培地は、８７±５ｍＭ  ＮａＣｌ、２６±５ｍＭ炭酸塩、および８６±５ｍＭグルコース、それに伴い３２２±３２ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する。具体的実施形態では、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム、および約１５．５ｍｇ／ｍＬグルコース、それに伴い約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する。
【００５４】
一実施態様では、Ｆ１世代における、遺伝子改変についてホモ接合性のトランスジェニックマウスを生じる方法であって、（ａ）前述の方法に従って生成されるＦ０  ＸＹ繁殖可能雌マウスを同齢集団Ｆ０  ＸＹ雄マウスと交雑させる工程と、（ｂ）該遺伝子改変についてヘテロ接合性であるＦ１後代マウスを得る工程とを含む方法が提供される。この実施態様によれば、Ｆ０  ＸＹ繁殖可能雌マウスとＦ０  ＸＹ雄マウスはそれぞれ、該遺伝子改変についてヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、１つまたは複数の内在性核酸配列、１つまたは複数の核酸の置換、内在性核酸配列の異種性核酸配列との置き換え、ノックアウト、およびノックインを含む。
【００５５】
ある具体的実施形態では、Ｆ０  ＸＹ繁殖可能雌マウスは、基本培地が５０±５ｍＭ  ＮａＣｌおよび２６±５ｍＭ炭酸塩、それに伴い２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈するような前述の方法に従って作製される。特定の実施形態では、基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌおよび２．２ｍｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム、それに伴い約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する。
【００５６】
一実施態様では、前述の方法に従って生成される、遺伝子改変についてホモ接合性のトランスジェニックマウスが提供される。
【００５７】
一実施態様では、前述の方法のいずれかに従って生成される、繁殖可能な雌のＸＹマウスが提供される。一実施形態では、ＥＳ細胞（該細胞からＸＹ雌マウスが得られる）が、５０±５ｍＭ  ＮａＣｌおよび２６±５ｍＭ炭酸塩、それに伴い２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する基本培地内に維持された。具体的実施形態では、基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌおよび２．２ｍｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム、それに伴い約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を呈する。
【００５８】
特段の記述がある、または文脈から明らかであるのではない限り、本明細書に記述するいかなる実施態様または実施形態も、互いに組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、様々なＸＹ  ＥＳ細胞クローンから作製されるＦ０世代の雌ＸＹマウスを使用する交配の結果を示す。
【図２】図２は、低塩のＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ、またはＦＳ（Ｗｎｔ−３ａ−調整培地、すなわち、Ｗｎｔ−３ａ−発現構築物を形質移入されたマウスＬ細胞によって調整された培地）、ＮａＣｌ、およびＮａＨＣＯ３を補足した低塩のＤＭＥＭと共にインキュベートされるＥＳ細胞からのＸＹ雌マウスの産生を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
詳細な説明
この開示に引用されるすべての刊行物を、参照により本明細書に組み込む。
【００６１】
語句「基本培地」には、培養中にＥＳ細胞を成長または維持する際の使用に適した、（サプリメントが追加された）当技術分野で知られた基本培地（例えばＤＭＥＭ）が含まれる。繁殖可能なＸＹ雌を作製するのに適した基本培地（すなわち「低塩のＤＭＥＭ」）は、培養中にＥＳ細胞を維持するために一般的に使用される基本培地とは異なる。概して基本培地について論じる目的で、繁殖可能なＸＹ雌を作製するのに適していない基本培地を、このセクションでは、また、以下の表中では、「ＤＭＥＭ」として記述する（例えば典型的なＤＭＥＭ培地）。繁殖可能なＸＹ雌を作製するのに適した基本培地について論じる目的で、語句「低塩のＤＭＥＭ」が使用される。培養中にＥＳ細胞を維持するために一般的に使用される基本培地（例えばＤＭＥＭ）と、繁殖可能なＸＹ雌を作製するのに適した基本培地（例えば「低塩のＤＭＥＭ」）との違いは、本明細書に明確に述べる。語句「低塩のＤＭＥＭ」は、便宜のために使用され；繁殖可能なＸＹ雌を作製するのに適したＤＭＥＭは、「低塩」に限定されない、本明細書に記述する特性も含まれる特性を呈する。例えば、本明細書で提供される通りに、塩化ナトリウムおよび／または炭酸水素ナトリウム濃度を変えることによって（これは、表１に示されるＤＭＥＭと比較した場合に異なる重量オスモル濃度および異なる導電率ももたらすことになる）、繁殖可能なＸＹ雌を作製するのに適した、表１に示されるＤＭＥＭを作製することができる。基本培地の例は、様々な型のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤＭＥＭ、カタログ番号１１９７１−０２５）である（表１）。適切な低塩のＤＭＥＭは、ＫＯ−ＤＭＥＭＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０８２９−０１８）として市販されている。基本培地は、一般的に、ドナー細胞として使用するための細胞を培養において維持するために使用される場合、当技術分野で知られたいくつかのサプリメントが補足される。この開示では、こうしたサプリメントは、「サプリメント」または「＋サプリメント」として示される。
【００６２】
【表１−１】
2013528062.tif 000003
【００６３】
【表１−２】
2013528062.tif 000004
用語「サプリメント」または語句「＋サプリメント」としては、培養中にドナー細胞を成長または維持するために、例えば培養中にドナー細胞の多能性または全能性を維持するために、基本培地に添加される要素が挙げられる。例えば、培養中に非ヒトＥＳ細胞を成長または維持するのに適した培地サプリメントとしては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミン、ペニシリンとストレプトマイシン（例えばペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ））、ピルビン酸塩（例えばピルビン酸ナトリウム）、可欠アミノ酸（例えばＭＥＭ  ＮＥＡＡ）、２−メルカプトエタノール、およびＬＩＦが挙げられる。
【００６４】
培養中に非ヒトドナー細胞を維持するための培地の種々の実施形態では、約５００ｍＬの基本培地に、以下のサプリメントが添加される：約９０ｍＬ  ＦＢＳ（例えばＨｙｌｃｏｎｅ  ＦＢＳカタログ番号ＳＨ３００７０．０３）、約２．４ミリモルのグルタミン（例えば約１２ｍＬの２００ｍＭグルタミン溶液、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号２５０３０−０８１）、ペニシリン：ストレプトマイシン（例えば６０，０００単位のペニシリンＧナトリウムと６０ｍｇの硫酸ストレプトマイシン（約５１ｍｇのＮａＣｌを含む）；例えば約６ｍＬのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎペンストレップ（ｐｅｎｎｓｔｒｅｐ）、カタログ番号１５１４０−１２２）、約０．６ミリモルのピルビン酸ナトリウム（例えば６ｍＬの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１３６０−０７０）、約０．０６ミリモルの可欠アミノ酸（例えば約６ｍＬのＭＥＭ  ＮＥＡＡ、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１１４０−０５０のＭＥＭ  ＮＥＡＡ）、約１．２ｍＬ  ２−メルカプトエタノール、および約１．２マイクログラムのＬＩＦ（例えば約１２０マイクロリットルの１０６単位／ｍＬ  ＬＩＦ調製物；例えば、約１２０マイクロリットルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＥＳＧＲＯＴＭ−ＬＩＦ、カタログ番号ＥＳＧ１１０７）。繁殖可能なＸＹ雌を作製するために、ＸＹ  ＥＳ細胞を維持するための基本培地を構成する場合、一般的に、同じサプリメントがほぼ同じ量で用いられるが、基本培地の組成は（ＤＭＥＭとは、例えば、上の表に記述した培地とは）異なることとなり、その違い（１つまたは複数）は、本明細書で教示する違い（１つまたは複数）に相当する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、サプリメントとしては、Ｗｎｔ−調整培地、例えば、Ｗｎｔ−３ａ−調整培地が挙げられる。
【００６６】
ドナー細胞および／または宿主胚に関する用語「動物」としては、哺乳類、魚類、および鳥類が挙げられる。哺乳類としては、例えば、ヒト、ヒトでない霊長類、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、家畜（例えば、ウシ種、例えば、雌牛、去勢牛、など；ヒツジ種、例えば、ヒツジ、ヤギ、など；ならびにブタ種、例えば、ブタおよびイノシシ）が挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒル、などが挙げられる。ドナー細胞および／または宿主胚に関する語句「ヒトでない動物」は、ヒトを除外する。
【００６７】
種々の実施形態では、ドナー細胞および／または宿主胚は、１つまたは複数の以下のもの由来ではない：Ａｋｏｄｏｎ種、Ｍｙｏｐｕｓ種、Ｍｉｃｒｏｔｕｓ種、Ｔａｌｐａ種。種々の実施形態では、ドナー細胞および／または宿主胚は、通常の野生型特性がＸＹ雌繁殖性であるような、いかなる種由来でもない。種々の実施形態では、ドナー細胞または宿主胚に遺伝子改変が存在する場合、その遺伝子改変は、ＸＹＹまたはＸＸＹ、Ｔｄｙネガティブの性転換、Ｔｄｙポジティブの性転換、Ｘ０改変、異数性、ＳＲＹ転座または改変、ｆｇｆ９−／−遺伝子型、あるいはＳＯＸ９改変ではない。
【００６８】
（概要）
ドナーＥＳ細胞と宿主胚から、ヒトでない動物、例えばマウスを作製するための方法は、当技術分野で知られている。ドナーＥＳ細胞は、細胞が宿主胚に住み着く能力を高め、また、このようにしてドナーＥＳ細胞と宿主胚によって形成される動物に、ある程度または実質的にある程度寄与するような、ある種の特性について選択される。形成される動物は、ＥＳ細胞の遺伝子型（例えば、ＸＹまたはＸＸ）に主に基づくと、雄または雌であり得る。
【００６９】
マウスを作製するための大部分のＥＳ細胞株は、雄のＸＹ遺伝子型を有する。哺乳類の性別決定においては、Ｙ染色体が優性であるので、ＸＹ  ＥＳ細胞が宿主胚に導入されて懐胎される場合、第１世代（Ｆ０）では、ほとんどいつも、キメラである、すなわち雄のドナーＥＳ細胞（ＸＹ）由来である細胞と、雄の（ＸＹ）または雌（ＸＸ）であり得る宿主胚由来である細胞とを含有する、表現型的に雄の動物がもたらされる。Ｆ０世代において表現型的な雌が認められる限りは、これらは一般的に、ＸＹ  ＥＳ細胞の雌のＸＸ胚への導入に起因し、そのＥＳ細胞の寄与が、胚の生殖隆起を雄性化するのに不十分であるようなキメラがもたらされる。大抵の場合、こうした雌のキメラは、ＸＹ  ＥＳ細胞由来である卵母細胞を生じないので、ＥＳ細胞ゲノムを次世代に伝達する能力がない。稀に、雌のキメラは、ＸＹ  ＥＳ細胞由来である卵母細胞を生成せず；こうした雌は、ＥＳ細胞ゲノムを次世代に伝達することができる（例えば、Ｂｒｏｎｓｏｎら（１９９５）Ｈｉｇｈ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ＸＸＹ  ａｎｄ  ＸＹＹ  ｍａｌｅｓ  ａｍｏｎｇ  ｔｈｅ  ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ  ｏｆ  ｆｅｍａｌｅ  ｃｈｉｍｅｒａｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：３１２０〜３１２３を参照のこと）。
【００７０】
ＸＹ遺伝子型をもつ表現型的に雌のマウスは、特定の突然変異の結果として生じ得る。例えば、Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅら（１９９０）ＸＹ  ｆｅｍａｌｅ  ｍｉｃｅ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｅｓｔｉｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ、Ｔｄｙ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０９：６３５〜６４６を参照のこと；また、Ｃｏｌｖｉｎら（２００１）Ｍａｌｅ−ｔｏ−Ｆｅｍａｌｅ  Ｓｅｘ  Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  Ｌａｃｋｉｎｇ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ９、Ｃｅｌｌ  １０４（６）：８７５〜８８９（Ｆｇｆ−／−ＸＹ  ｆｅｍａｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｅ  ａｔ  ｂｉｒｔｈ  ｆｒｏｍ  ｌｕｎｇ  ｈｙｐｏｐｌａｓｉａ）も参照のこと。南アメリカのＡｋａｄｏｎ種のげっ歯類は、ＸＹ雌を含む（Ｈｏｅｋｓｔｒａら（２０００）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ＸＹ  ｆｅｍａｌｅ  ｍｉｃｅ（ｇｅｎｕｓ  Ａｋｏｄｏｎ）：ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ  ２６７：１８２５〜１８３１を参照のこと）が、こうしたマウス由来のＥＳ細胞株は、一般的に入手できず、仮に存在したとしても、広範には使用されない。
【００７１】
ある場合、例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（例えば、米国特許第７，６５９，４４２号、第７，５７６，２５９号、第７，２９４，７５４号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７）Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１〜９９（各々を参照により本明細書に組み込む）を参照のこと）を使用する場合、十分にドナーＥＳ細胞由来であるＦ０世代マウスを得ることが可能である。普通の状況および標準の実験条件下では、ＸＹドナーＥＳ細胞は、十分にＥＳ細胞由来の表現型的に雄のマウスしか生じないのに対し、ＸＸまたはＸであるＥＳ細胞（Ｙ染色体を失っているＸＹ  ＥＳ細胞）は、十分にＥＳ細胞由来の表現型的に雌のマウスしか生じない。雄および雌の十分にＥＳ細胞由来のマウスから、標的とされるホモ接合性の突然変異を有するマウスを生じるには、交雑させた場合に、Ｆ２世代におけるホモ接合性の後代を生じる潜在的可能性を有するようなＦ１世代のヘテロ接合性の雄および雌を第一に生じるために、それに続く２世代の交配が必要である。
【００７２】
本発明者らは、ＸＹドナー細胞（例えば、表現型的に雄のマウス由来であるＸＹドナー細胞）と適切な宿主胚から、表現型的に雌の繁殖可能なＸＹマウスを作製するための方法を考案した。この方法は、Ｆ０世代における交配対（雄のＦ０と雌のＦ０）を形成することが可能な、Ｆ０世代におけるこうしたマウスを作製することを含む。これは、ドナー細胞がヘテロ接合性の遺伝子改変を含み、かつホモ接合性のマウスが所望される場合に特に有用である。この開示は、ドナーマウスＸＹ  ＥＳ細胞から表現型的に雌の繁殖可能なＸＹマウスを作製するという趣旨で、本発明を例示するが、本明細書に記述する方法および組成物は、任意の適切なヒトでない細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、または多能性細胞）および任意の適切なヒトでない胚から、表現型的に雌のＸＹの繁殖可能なヒトでない動物を作製するために適用することができる。
【００７３】
ドナー細胞を宿主胚に導入することによって動物を産生するためにドナー細胞が使用される場合に、このようにして産生された動物が表現型的に雌の繁殖可能なＸＹ動物を含むようにドナー細胞を維持するための条件を含めた、方法および組成物を記述する。表現型的に雌の繁殖可能なＸＹ動物としては、排卵し、かつ該動物における排卵によって生成された卵の受精後に胚を懐胎する（胚を予定日まで懐胎し、生きて生まれる動物を出産することを含めて）のに十分な、表現型的に雌の特性を呈する動物が挙げられる。
【００７４】
本発明者らは、種々の実施形態において、少なくとも約１０％、１５％、２０％、または２５％以上の確率で、ＸＹマウスＥＳ細胞から繁殖可能な雌のＸＹマウスの出生をもたらす方法を考案した。
【００７５】
動物管理
一実施態様では、精細胞と卵細胞から雌動物を産生するための方法であって、低塩の基本培地を含む培地内に、精細胞および／または卵細胞を、受精の前に１、２、３、または４日、またはそれ以上の間、維持する工程と、精細胞と卵細胞とを、受精を可能にして受精卵を形成させるような条件下で接触させる工程と、懐胎のために適切な宿主に受精卵を移植する工程と、宿主において懐胎させる工程と、雌動物を含む同腹仔を得る工程とを含む方法が提供される。
【００７６】
一実施形態では、受精卵は、低塩の基本培地を含む培地内に、適切な宿主への移植の前に、１、２、３、または４日、またはそれ以上の間、さらに維持される。
【００７７】
一実施態様では、受精卵または胚からの雌動物の産生に有利に働く方法であって、低塩の基本培地を含む培地内に、適切な宿主への移植の前に、１、２、３、または４日、またはそれ以上の間、受精卵または胚を維持する工程と、受精卵または胚を懐胎のために適切な宿主に移植する工程と、該受精卵または胚を宿主において懐胎させる工程と、雌動物を含む同腹仔を得る工程とを含む方法が提供される。
【００７８】
一実施態様では、雌の愛玩動物、雌の家畜、科学研究対象としての雌動物、または絶滅危惧種の動物を作製するために、本発明の方法および組成物が用いられる。一実施形態では、動物は、マウス、ラット、ハムスター、サル、類人猿、ネコ、イヌ、雌牛、ウマ、雄牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、およびバイソンである。
【実施例】
【００７９】
実施例１：ドナーＸＹ  ＥＳ細胞および宿主胚
ドナー細胞および宿主胚。ドナーＥＳ細胞は、１２９Ｓ６Ｃ５７ＢＩ６／Ｆ１ハイブリッドＥＳ細胞であった。ドナーＥＳ細胞は、１０％  ＤＭＳＯを含有する凍結培地内で、使用まで凍結した。解凍後、ドナーＥＳ細胞を、基本培地および以下に記述するサプリメント内に維持した。宿主胚は、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ（ＳＷ）マウス由来であり、ＫＳＯＭ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）内に、使用まで維持した。従来記載されている通りに、８細胞胚を得た（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１〜９９；米国特許第７，６５９，４４２号、第７．５７６，２５９号、および第７，２９４，７５４号）。
【００８０】
ＤＭＥＭ  ＥＳ細胞：ＤＭＥＭ内で調製および凍結したＥＳ細胞を、ＤＭＥＭ内で解凍し、３日間成長させ、ＤＭＥＭ内で宿主胚にマイクロインジェクションした。
【００８１】
低塩ＤＭＥＭ  ＥＳ細胞：低塩のＤＭＥＭ内で調製および凍結したＥＳ細胞を、低塩のＤＭＥＭ（ＫＯ−ＤＭＥＭ）内で解凍し、３日間成長させ、ＤＭＥＭ内で宿主胚にマイクロインジェクションした。
【００８２】
ＦＳ低塩ＤＭＥＭ：低塩のＤＭＥＭ内で調製および凍結したＥＳ細胞を、低塩のＤＭＥＭ（４４０ｍＬ）＋１０％  Ｗｎｔ−３ａ−調整培地（ＦＳ）（６０ｍＬ）内で解凍および維持し、ＤＭＥＭ内で宿主胚にマイクロインジェクションした。
【００８３】
低塩のＤＭＥＭ＋ＮａＣｌ＋ＮａＨＣＯ３：ＮａＣｌ（１，３００ｍｇ／Ｌ）およびＮａＨＣＯ３（１，５００ｍｇ／Ｌ）を添加した低塩のＤＭＥＭ内で調製および凍結したＥＳ細胞を、ＤＭＥＭ内で宿主胚にマイクロインジェクションした。
【００８４】
１０％  Ｗｎｔ−３ａ−調整培地（ＦＳ）：Ｗｎｔ−３ａ−調整培地を、Ｗｎｔ−３ａ発現ベクター（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６４７）で形質転換させたマウスＬ細胞の培養から作製した。（ＤＭＥＭの代わりにＫＯ−ＤＭＥＭＴＭが使用されること以外は）ＡＴＣＣ指示書に従って、ＦｉｂｒａＳｔａｇｅＴＭ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）システム内で、Ｌ細胞を成長させる。
【００８５】
実施例２：ドナーＥＳ細胞由来であるＦ０世代マウスの作製
Ｆ０世代マウスの産生。マウスＥＳ細胞が、本明細書に記述する通りのサプリメントを加えた基本培地内に維持されること以外は、従来記載されている通りに（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１〜９９；米国特許第７，６５９，４４２号、第７．５７６，２５９号、および第７，２９４，７５４号）、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を使用して、８細胞期の桑実期前の宿主胚にドナーＥＳ細胞を導入した。マイクロインジェクションについては、ＥＳ細胞を成長させて胚にマイクロインジェクションし、この胚を、代理母への移植の前に、ＫＳＯＭまたはＤＭＥＭ培地内で、終夜培養した。
【００８６】
実施例３：ドナーＸＹ  ＥＳ細胞由来のＦ０世代繁殖可能雌マウス
典型的なプロトコルでは、ＥＳ細胞は、ＫＯ−ＤＭＥＭＴＭの存在下で解凍され、１代継代される（約５日）。次いで、継代した細胞を、遺伝子ターゲティングベクターで電気穿孔し、次いで、ＫＯ−ＤＭＥＭＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号１０８２９−０１８）を含む培地内で、１０日間、選択下におく。薬物抵抗性の細胞を、ＫＯ−ＤＭＥＭＴＭを含む培地内で、採取および展開し、次いで凍結する。マイクロインジェクションについては、ＫＯ−ＤＭＥＭＴＭ内で細胞を解凍し、ＫＯ−ＤＭＥＭＴＭ内で３日間成長させ、次いで、ＤＭＥＭ中の胚にマイクロインジェクションする。次いで、この胚を懐胎のために代理母に導入する。
【００８７】
交配対を選択するために、マウス仔を、外性器の外見に基づいて、最初に雄または雌と特徴付けた。図１は、Ｆ０  ＸＹ雌が、高い繁殖率を呈することを示す。３３匹のＦ０  ＸＹ雌のうちの２１匹が、同腹仔を生じた。
【００８８】
実施例４：ＤＭＥＭの低塩のＤＭＥＭとの比較
重量オスモル濃度は、Ａｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）Ｍｏｄｅｌ  ３２５０  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒで測定した。導電率は、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＧｍｂＨ  ＳｅｖｅｎＭｕｌｔｉＴＭＥＣＮ  ＃１５０５５導電率計で測定した。
【００８９】
ＸＹ  ＥＳ細胞からのＦ０世代ＸＹ雌の形成に対する、低塩のＤＭＥＭおよびＤＭＥＭ（それぞれサプリメントを含む）の効果を研究した。表２は、追加の塩および／またはサプリメントを含むおよび含まない基本培地の重量オスモル濃度および導電率の値を示す。表示「＋サプリメント」＝以下のものの（０．５Ｌの基本培地への）の添加：９０ｍＬ  Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＦＢＳ（カタログ番号ＳＨ３００７０．０３）、１２ｍＬのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎグルタミン溶液（カタログ番号２５０３０−０８１）、６ｍＬのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ（カタログ番号１５１４０−１２２）、６ｍＬのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎピルビン酸ナトリウム（カタログ番号１１３６０−０７０）、６ｍＬのＭＥＭ  ＮＥＡＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１１４０−０５０）、１．２ｍＬ  ２−メルカプトエタノール、および１２０マイクロリットルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＥＳＧＲＯＴＭ−ＬＩＦ（カタログ番号ＥＳＧ１１０７）。
【００９０】
図２は、宿主胚へのマイクロインジェクションの前に、異なる培地内で成長させた、ＸＹ  ＥＳ細胞の比較を示す。低塩のＤＭＥＭ内で成長および維持され、次いで胚に注入されたＸＹ  ＥＳ細胞は、ＸＹ雌を生じた。ＮａＣｌおよびＮａＨＣＯ３を補足した低塩のＤＭＥＭ内で成長および維持され、次いで胚に注入されたＸＹ  ＥＳ細胞は、ＸＹ雌を生じなかった。これは、ＸＹ  ＥＳ細胞が低塩のＤＭＥＭ内に維持された場合に、ＸＹ雌の生成が促進されることと、ＸＹ  ＥＳ細胞の性比を、基本培地の塩濃度を変えることによって操作することができることを実証する。低塩のＤＭＥＭにＷｎｔ−３ａ−調整培地（１０％  ＦＳ）を添加することは、Ｆ０  ＸＹ雌の生成の頻度を増大させた。
【００９１】
さらに、ＥＳ細胞が、低塩のＤＭＥＭ内に維持された場合、Ｆ０におけるＥＳ細胞由来のマウスを産生する効率は増大した。ＥＳ細胞由来の仔の、Ｆ０世代において産生された仔全体に対する比は、ＤＭＥＭ内に維持されたＥＳ細胞について約２３％から、低塩のＤＭＥＭ内に維持されたＥＳ細胞について６１％まで、１０％  Ｗｎｔ−３ａ−調整培地を補足した低塩のＤＭＥＭ内に維持されたＥＳ細胞について７２％まで増大した。図２を参照のこと。
【００９２】
【表２】
2013528062.tif 000005
実施例５：Ｆ０世代マウスの分析
毛色。マウスを、ドナーＸＹ  ＥＳ細胞（野ネズミ色）および宿主胚（白色）からの毛色寄与について分析した。Ｆ０世代マウスは一匹も、宿主胚からの毛色寄与を呈さなかった。
【００９３】
性別。Ｆ０世代仔を、外性器の外観検査によって雌または雄と特定した。Ｆ０仔には、性別が割り当てられ、外観検査に基づいて、交配のためにつがいにした。
【００９４】
遺伝子型判定。Ｘ染色体上の配列に特異的なＴＡＱＭＡＮＴＭＱＰＣＲ分析を使用して、Ｘ染色体の存在を検出した。Ｙ染色体上の配列に特異的なＴＡＱＭＡＮＴＭＱＰＣＲ分析を使用して、Ｙ染色体の存在を検出した。表現型的に雌のＦ０世代マウスの遺伝子型判定は、試験されたそれらの表現型的に雌のマウスにおけるＸ染色体の単一コピーとＹ染色体の単一コピーを示した。
【００９５】
核型分析。６匹のＦ０世代ＸＹ雌を、核型分析した。核型分析結果は、６匹すべてが、正常なＸおよび正常なＹ染色体を有することを示した。
【００９６】
ＸＹ雌の生殖解剖学。いくつかのＦ０世代ＸＹ雌を、内部生殖器について検査した。検査したすべてのＦ０  ＸＹ雌は、正常な雌の内部生殖器を有するように見えた。各生殖器（卵巣、卵管、子宮）からの組織サンプルを遺伝子判定し、その結果、これらの組織が、一様なＸＹ遺伝子型を有することが示された。
【００９７】
実施例６：ＥＳ細胞由来の仔およびＸＹ雌を産生する効率に対する重量オスモル濃度の効果の分析
低塩の低炭酸塩のＤＭＥＭ内に維持されたＸＹ  ＥＳ細胞からのＸＹ雌の産生に対する重量オスモル濃度の効果を判定するために、低塩の低炭酸塩のＤＭＥＭに、グルコースを加えて、重量オスモル濃度をＤＭＥＭの重量オスモル濃度の範囲内にした。Ａｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）Ｍｏｄｅｌ  ３２５０  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓａｍｐｌｅ  Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒで、重量オスモル濃度を測定した。
【００９８】
ドナーＸＹ  ＥＳ細胞を、特に５．１ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＣＯ３、および１５．５ｍｇ／ｍＬグルコースを含有し、重量オスモル濃度が３２２ｍＯｓｍ／ｋｇである、低塩、低炭酸塩、高グルコースのＤＭＥＭ（「ＤＭＥＭ−ＬＳ／ＬＣ／ＨＧ」）内に維持した。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（上記）によって、前記ＥＳ細胞を胚に移植すると、ＥＳ細胞由来の得られたすべてのＦ０後代の１５％は、表現型的に雌のＸＹマウスであった。Ｆ０世代における陰性対照として、ＤＭＥＭ（「ＤＭＥＭ」：６．４ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、３．７ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＣＯ３、および４．５ｍｇ／ｍＬグルコース；３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ）内に維持したＥＳ細胞から、表現型的に雌でないＸＹマウスを得た。この１５％  Ｆ０  ＸＹ雌の結果は、ＤＭＥＭ由来のＥＳ細胞（３２９ｍＯｓｍ／Ｌ）から得られる０％  Ｆ０  ＸＹ雌と、低塩の低炭酸塩のＤＭＥＭ（「ＤＭＥＭ−ＬＳ／ＬＣ」：５．１ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＣＯ３、および４．５ｍｇ／ｍＬグルコース；２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ）内に維持されたＥＳ細胞由来である２７．８％  Ｆ０  ＸＹ雌マウスとの間にある。したがって、一つの解釈は、重量オスモル濃度が、すべてではないが、いくらかの雌性化効果を提供するということである。別の説明は、低塩および／または低炭酸塩が、雌性化効果を提供し、高グルコースが、ＸＹ  ＥＳ細胞の雌性化をある程度妨げるということである。表３を参照のこと。
【００９９】
【表３】
2013528062.tif 000006
さらに、Ｆ０におけるＥＳ細胞由来のマウスを産生する効率（表３）は、ＥＳ細胞が、ＤＭＥＭ−ＬＳ／ＬＣ／ＨＧ内に維持された場合（すなわち約４０％）、ＤＭＥＭ内に維持されたＥＳ細胞の効率よりも高い（すなわち約２２％）が、ＤＭＥＭ−ＬＳ／ＬＣ内に維持されたＥＳ細胞の効率（すなわち約５１％）ほど高くはない。表３を参照のこと。
【０１００】
実施例７：ＥＳ細胞由来の仔およびＸＹ雌を産生する効率に対する塩濃度の効果の分析
ＸＹ  ＥＳ細胞からのＸＹ雌の産生に対する、塩濃度またはイオン強度の効果を判定するために、ＥＳ細胞を、非常に低い塩（ＤＭＥＭ−ＶＬＳ／ＬＣ：３．０ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＣＯ３、４．５ｍｇ／ｍＬグルコース、２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ）内に維持した。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（上記）によって、前記ＥＳ細胞を胚に移植すると、ＥＳ細胞由来の得られたすべてのＦ０後代の３４％は、表現型的に雌のＸＹマウスであり；ＤＭＥＭ−ＬＳ／ＬＣ対照の２７．８％というレベルに対するわずかな増大であった。興味深いことに、ＤＭＥＭ−ＶＬＳ／ＬＣ培地内に維持されたＥＳ細胞の移植から得られたＦ０仔の９１．４％が、ＥＳ細胞由来であったのに対し；ＤＭＥＭ−ＬＳ／ＬＣおよびＤＭＥＭ対照では、それぞれ５０．７％および２２．４％のみが、ＥＳ細胞由来であった。
【０１０１】
別の実験では、ＥＳ細胞を、高塩かつ低炭酸塩の培地（ＤＭＥＭ−ＨＳ／ＶＬＣ：６．４ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＣＯ３、４．５ｍｇ／ｍＬグルコース、２９４ｍＯｓｍ／ｋｇ）内に維持した。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（上記）によって、前記ＥＳ細胞を胚に移植すると、ＥＳ細胞由来の得られたすべてのＦ０後代の２８．６％は、表現型的に雌のＸＹマウスであり；ＤＭＥＭ−ＬＳ／ＬＣ対照の２７．８％というレベルに対するわずかな増大であった。興味深いことに、ＤＭＥＭ−ＨＳ／ＶＬＣ培地内に維持されたＥＳ細胞の移植から得られたＦ０仔の７２．１％が、ＥＳ細胞由来であったのに対し；ＤＭＥＭ−ＬＳ／ＬＣおよびＤＭＥＭ対照では、それぞれ５０．７％および２２．４％のみが、ＥＳ細胞由来であった。
【０１０２】
これらの結果は、低塩および／または低炭酸塩が、ＥＳ細胞由来のＦ０後代とＦ０  ＸＹ雌との両方の割合の増大に寄与することを立証する（表３を参照のこと）。
【０１０３】
実施例８：ＥＳ細胞由来の仔およびＸＹ雌を産生する効率に対する炭酸塩濃度の効果の分析
ＸＹ  ＥＳ細胞からのＸＹ雌の産生に対する、炭酸塩濃度の効果を判定するために、ＥＳ細胞を、低塩かつ非常に低い炭酸塩の培地（ＤＭＥＭ−ＬＳ／ＶＬＣ：５．１ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＣＯ３、４．５ｍｇ／ｍＬグルコース、２６１ｍＯｓｍ／ｋｇ）内に維持した。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（上記）によって、前記ＥＳ細胞を胚に移植すると、ＥＳ細胞由来の得られたすべてのＦ０後代の３４％は、表現型的に雌のＸＹマウスであり；ＤＭＥＭ−ＬＳ／ＬＣ対照の２７．８％というレベルに対するわずかな増大であった。興味深いことに、ＤＭＥＭ−ＬＳ／ＶＬＣ培地内に維持されたＥＳ細胞の移植から得られたＦ０仔の８７．７％が、ＥＳ細胞由来であったのに対し；ＤＭＥＭ−ＬＳ／ＬＣおよびＤＭＥＭ対照では、それぞれ５０．７％および２２．４％のみが、ＥＳ細胞由来であった。
【０１０４】
これらの結果は、低炭酸塩が、ＥＳ細胞由来のＦ０後代とＦ０  ＸＹ雌との両方の割合の増大に寄与することを立証する（表３を参照のこと）。
【０１０５】
実施例９：Ｆ０  ＸＹ雌マウスの表現型
Ｆ０  ＸＹの表現型的に雌のマウスは、同系統のＦ１  ＸＸの表現型的に雌のマウスと比較した場合に、比較的正常な表現型的特質を呈していた。しかし、ＸＹ雌マウスは、各身体的パラメータについて、より広範囲の値を確実に呈していた。成体ＸＹ雌の体重は、約１５グラムから約３０グラムの範囲であり、平均は約２１．５グラムであった。成体ＸＸ雌の体重は、約１６グラムから約１７グラムの範囲であり、平均は約１６．８グラムであった。肛門と生殖器の間の距離の比を、体重の比（肛門生殖器間距離（ｃｍ）／体重（ｇ））として測定および算出した。この比は、Ｆ０  ＸＹ雌については、約０．１１ｃｍ／ｇから約０．２４ｃｍ／ｇの範囲であり、平均は約０．１６ｃｍ／ｇであった。この比は、Ｆ１  ＸＸ雌については、約０．１７ｃｍ／ｇから約０．１９ｃｍ／ｇの範囲であり、平均は０．１８ｃｍ／ｇであった。
【０１０６】
ＸＹ雌マウスとＸＸ雌マウスについて、様々な臓器（例えば、肝臓、腎臓、心臓および肺、ならびに脾臓）の相対質量間に有意な差はなかった。相対質量は、臓器質量（ｍｇ）／体重（ｇ）として表される。Ｆ０  ＸＯ雌の肝臓の相対質量は、約３５ｍｇ／ｇから約５０ｍｇ／ｇの範囲であり、平均は約４２ｍｇ／ｇであった。Ｆ１  ＸＸ雌の肝臓の相対質量は、約３７．５ｍｇ／ｇから約４６．９ｍｇ／ｇの範囲であり、平均は約４２．５ｍｇ／ｇであった。Ｆ０  ＸＯ雌の腎臓の相対質量は、約１１．５ｍｇ／ｇから約１５ｍｇ／ｇの範囲であり、平均は約１３．４ｍｇ／ｇであった。Ｆ１  ＸＸ雌の腎臓の相対質量は、約１２．６ｍｇ／ｇから約１３．８ｍｇ／ｇの範囲であり、平均は約１３．７ｍｇ／ｇであった。Ｆ０  ＸＯ雌の心臓と肺の合計相対質量は、約１４．３ｍｇ／ｇから約１８．９ｍｇ／ｇの範囲であり、平均は約１６．１ｍｇ／ｇであった。Ｆ１  ＸＸ雌の心臓と肺の合計相対質量は、約１４．７ｍｇ／ｇから約１６．１ｍｇ／ｇの範囲であり、平均は約１５．９ｍｇ／ｇであった。Ｆ０  ＸＯ雌の脾臓の相対質量は、約２．７ｍｇ／ｇから約６．６ｍｇ／ｇの範囲であり、平均は約３．３ｍｇ／ｇであった。Ｆ１  ＸＸ雌の脾臓の相対質量は、約２．７ｍｇ／ｇから約４．０ｍｇ／ｇの範囲であり、平均は約３．８ｍｇ／ｇであった。
【０１０７】
Ｆ０  ＸＹ雌マウスは、同系のＦ１  ＸＸ雌と比較した場合に、比較的正常な血清濃度の電解質、酵素、グルコース、タンパク質、脂質、および他の徴候を有することが示された。しかし、ＸＹ雌マウスは、それぞれ測定された血清パラメータについて、より広範囲の値を確実に呈していた。成体ＸＹ雌の血清ナトリウム濃度が、約１５０ｍＥｑ／Ｌから約１５９ｍＥｑ／Ｌの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約１４８ｍＥｑ／Ｌから約１５５ｍＥｑ／Ｌの範囲であった。
【０１０８】
成体ＸＹ雌の血清カリウム濃度が、約０．７ｍＥｑ／Ｌから約７ｍＥｑ／Ｌの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約０．７ｍＥｑ／Ｌであった。
【０１０９】
成体ＸＹ雌の血清塩化物濃度が、約１１１ｍＥｑ／Ｌから約１２１ｍＥｑ／Ｌの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約１１３ｍＥｑ／Ｌから約１２０ｍＥｑ／Ｌであった。
【０１１０】
成体ＸＹ雌の血清カルシウム濃度が、約７ｍＥｑ／Ｌから約９ｍＥｑ／Ｌの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約７ｍＥｑ／Ｌであった。
【０１１１】
成体ＸＹ雌の血清アルカリホスファターゼ濃度が、約１２４Ｕ／Ｌから約２８５Ｕ／Ｌの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約１９１Ｕ／Ｌから約２３６Ｕ／Ｌの範囲であった。
【０１１２】
成体ＸＹ雌の血清アラニンアミノトランスフェラーゼ濃度が、約２１Ｕ／Ｌから約２８５Ｕ／Ｌであったのに対して、ＸＸ雌の該濃度は、約１３Ｕ／Ｌから約３４Ｕ／Ｌの範囲であった。
【０１１３】
成体ＸＹ雌の血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ濃度が、約４２Ｕ／Ｌから約１９０Ｕ／Ｌの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約４２Ｕ／Ｌから約２６９Ｕ／Ｌの範囲であった。
【０１１４】
成体ＸＹ雌の血清リパーゼ濃度が、約１６Ｕ／Ｌから約４９Ｕ／Ｌの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約２１Ｕ／Ｌから約２６Ｕ／Ｌの範囲であった。
【０１１５】
成体ＸＹ雌の血清グルコース濃度が、約２２７ｍｇ／ｄＬから約３１９ｍｇ／ｄＬの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約２５５ｍｇ／ｄＬから約２７０ｍｇ／ｄＬの範囲であった。
【０１１６】
成体ＸＹ雌の血清総タンパク質濃度が、約４．６ｍｇ／ｄＬから約５．２ｍｇ／ｄＬの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約４．６ｍｇ／ｄＬから約４．８ｍｇ／ｄＬの範囲であった。
【０１１７】
成体ＸＹ雌の血清アルブミン濃度が、約３ｍｇ／ｄＬから約３．５ｍｇ／ｄＬの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約３．１ｍｇ／ｄＬから約３．２ｍｇ／ｄＬの範囲であった。
【０１１８】
成体ＸＹ雌の血清コレステロール（総）濃度が、約５８ｍｇ／ｄＬから約１０８ｍｇ／ｄＬの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約６１ｍｇ／ｄＬから約８５ｍｇ／ｄＬの範囲であった。
【０１１９】
成体ＸＹ雌の血清トリグリセリド濃度が、約４２ｍｇ／ｄＬから約８９ｍｇ／ｄＬの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約３９ｍｇ／ｄＬから約４８ｍｇ／ｄＬの範囲であった。
【０１２０】
成体ＸＹ雌の血清ＨＤＬ濃度が、約２９ｍｇ／ｄＬから約５７ｍｇ／ｄＬの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約２３ｍｇ／ｄＬから約４２ｍｇ／ｄＬの範囲であった。
【０１２１】
成体ＸＹ雌の血清ＬＤＬ濃度が、約３．７ｍｇ／ｄＬから約１１ｍｇ／ｄＬの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約３．７ｍｇ／ｄＬから約１３ｍｇ／ｄＬであった。
【０１２２】
成体ＸＹ雌の血中尿素窒素（ＢＵＮ）濃度が、約１２ｍｇ／ｄＬから約２７ｍｇ／ｄＬの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約１８ｍｇ／ｄＬから約２１ｍｇ／ｄＬの範囲であった。
【０１２３】
成体ＸＹ雌の血清マグネシウム濃度が、約１．６ｍｇ／ｄＬから約３．２ｍｇ／ｄＬの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約２．１ｍｇ／ｄＬであった。
【０１２４】
成体ＸＹ雌の血清無機リン酸塩濃度が、約５．１ｍｇ／ｄＬから約１０ｍｇ／ｄＬの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約７．２ｍｇ／ｄＬから約８．４ｍｇ／ｄＬの範囲であった。
【０１２５】
成体ＸＹ雌の血清尿酸濃度が、約０．９ｍｇ／ｄＬから約３．５ｍｇ／ｄＬの範囲であったのに対して；ＸＸ雌の該濃度は、約０．７ｍｇ／ｄＬから約２．２ｍｇ／ｄＬの範囲であった。
【０１２６】
実施例１０：Ｆ１世代におけるホモ接合性の遺伝子改変されたマウスの生成
遺伝子改変についてホモ接合性のＦ１マウスが作製された可能性があるかどうかを判定するために、ＳＴＥＡＰ２遺伝子の、少なくとも１つのノックアウトされた対立遺伝子を含有するＦ０  ＸＹ雌マウスを、同じＳＴＥＡＰ２遺伝子ノックアウトを含有するＸＹ雄の同齢集団と交配した。このＳＴＥＡＰ２（前立腺の６回膜貫通上皮抗原２（Ｓｉｘ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２））遺伝子は、三価鉄還元酵素および銅還元酵素活性を有する推定上の６膜金属還元酵素（６  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｍｅｔａｌｌｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードし、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの鉄と銅両方の細胞取り込みを刺激することが示されている。細胞表面抗原として、ＳＴＥＡＰ２は、前立腺癌における診断または治療の潜在的な標的である。ＳＴＥＡＰ２は、未処置の原発性前立腺癌種とホルモン不応性前立腺癌腫との両方において良性前立腺肥大症よりも、有意に上昇し、これは、ＳＴＥＡＰ２が、前立腺癌の発生に関与することを示唆していた。ＳＴＥＡＰ２  ＫＯマウスは、報告されていない。Ｏｈｇａｍｉら、ＢＬＯＯＤ、ｖｏｌ．１０８（４）：１３８８〜１３９４、２００６を参照のこと。結果を、表４に示す。
【０１２７】
【表４】
2013528062.tif 000007
【図１】
2013528062.tif 000008
【図２】
2013528062.tif 000009
【国際調査報告】
2013528062.tif 000010
2013528062.tif 000011