(57)【要約】  本発明は、グリコール酸、その誘導体または前駆体の発酵生産のための方法であって、炭素源を含んでなる適当な培養培地での大腸菌株の培養と培地中のグリコール酸の回収を含んでなり、前記大腸菌株がオロト酸からオロチジン５’−Ｐへの変換を改良するようい改変されている方法に関する。本発明はまた、オロト酸からオロチジン５’−Ｐへの変換の向上を示し、場合により、グリコール酸生産を向上させるようにさらに改変された、改変大腸菌株に関する。
2013537429.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコール酸、その誘導体または前駆体を発酵生産するための方法であって、炭素源を含んでなる適当な培養培地で大腸菌株を培養すること、および培地中のグリコール酸の回収することを含んでなり、前記株がオロト酸からオロチジン５’−リン酸への変換を向上させるように改変されている、方法。
【請求項２】
前記株が、増強されたオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ比活性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子ｐｙｒＥの発現が増強されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンにフレームシフト突然変異を有する大腸菌Ｋ１２株において遺伝子ｐｙｒＥの発現が復帰されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記株が、５−ホスホリボシル１−ピロリン酸（ＰＲＰＰ）の増強されたアベイラビリティーを示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ホスホリボシルピロリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｐｒｓＡの発現が増強されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記株が、グリコール酸の生産を高めるようにさらに改変されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記改変微生物が下記の改変：
−特に遺伝子ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌ、ｅｄａの減弱により得られる、グリオキシレートからグリコレート以外の産物への変換の低減、
−特に遺伝子ｇｌｃＤＥＦＧ、ａｌｄＡの減弱により得られる、グリコレートの実質的代謝不能、
−特に遺伝子ｉｃｄ、ａｃｅＫ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ｐｏｘＢ、ｉｃｌＲもしくはｆａｄＲの減弱により、かつ／または遺伝子ａｃｅＡの過剰発現により得られる、グリオキシル酸経路フラックスの増大、
−特に遺伝子ｙｃｄＷまたはｙｉａＥの過剰発現により得られる、グリオキシレートからグリコレートへの変換の増大、
−特に遺伝子ｐｇｉ、ｕｄｈＡ、ｅｄｄの減弱により得られる、ＮＡＤＰＨのアベイラビリティーの増大
のうち少なくとも１つを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記炭素源が下記の群：グルコース、スクロース、単糖類もしくはオリゴ糖類、デンプンもしくはその誘導体、またはグリセロール、およびにそれらの組合せの中から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
下記の工程：
ａ）グリコール酸を生産する微生物を発酵すること、
ｂ）細菌または培地においてグリコール酸を濃縮すること、および
ｃ）発酵液および／またはバイオマスからグリコール酸を単離すること（場合により、最終産物中に一部または全量（０〜１００％）が残ってもよい）
を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載されたグリコール酸を発酵製造するための方法。
【請求項１１】
グリコール酸が少なくともグリコレートダイマーへ重合する工程を介して単離され、グリコレートダイマー、オリゴマーおよび／またはポリマーからの脱重合により回収される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
オロト酸からオロチジン５’−リン酸への変換を向上させるように改変されている、大腸菌株。
【請求項１３】
増強されたオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ比活性を示す、請求項１２に記載の株。
【請求項１４】
オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子ｐｙｒＥの発現が増強されている、請求項１３に記載の株。
【請求項１５】
ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンにフレームシフト突然変異を有する大腸菌Ｋ１２株において遺伝子ｐｙｒＥの発現が復帰されている、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の株。
【請求項１６】
５−ホスホリボシル１−ピロリン酸（ＰＲＰＰ）の増強されたアベイラビリティーを示す、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の株。
【請求項１７】
ホスホリボシルピロリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｐｒｓＡの発現が増強されている、請求項１６に記載の株。
【請求項１８】
グリコール酸の生産を高めるようにさらに改変されている、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の株。
【請求項１９】
前記改変微生物が下記の改変：
−特に遺伝子ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌ、ｅｄａの減弱により得られる、グリオキシレートからグリコレート以外の産物への変換の低減、
−特に遺伝子ｇｌｃＤＥＦＧ、ａｌｄＡの減弱により得られる、グリコレートの実質的代謝不能、
−特に遺伝子ｉｃｄ、ａｃｅＫ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ｐｏｘＢ、ｉｃｌＲもしくはｆａｄＲの減弱により、かつ／または遺伝子ａｃｅＡの過剰発現により得られる、グリオキシル酸経路フラックスの増大、
−特に遺伝子ｙｃｄＷまたはｙｉａＥの過剰発現により得られる、グリオキシレートからグリコレートへの変換の増大、
−特に遺伝子ｐｇｉ、ｕｄｈＡ、ｅｄｄの減弱により得られる、ＮＡＤＰＨのアベイラビリティーの増大
のうち少なくとも１つを含んでなる、請求項１８に記載の株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースまたはその他の糖などの安価な炭素基質からグリコール酸を生物学的生産するための改良された方法に関する。本発明は、大腸菌Ｋ−１２ゲノムＤＮＡの改変に関し、その結果、前記微生物は、副産物オロト酸の生産の低減およびグリコール酸合成の最適化を目的として、増強されたオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性（ＯＰＲＴアーゼ）を含むようになる。
【背景技術】
【０００２】
グリコール酸（ＨＯＣＨ２ＣＯＯＨ）、またはグリコレートは、カルボン酸のα−ヒドロキシ酸ファミリーの最も単純なメンバーである。グリコール酸は、極めて小さい分子に、アルコール官能基とやや強酸性の官能基の両方を有し、二重機能性を備えている。グリコール酸はその特性により、井戸の復旧、皮革工業、石油ガス工業、クリーニングおよび繊維工業における使用を含む幅広い消費者および工業用途に、またパーソナルケア製品の成分として理想的なものとなる。
【０００３】
グリコール酸はまた、ポリグリコール酸を含んでなる熱可塑性樹脂をはじめとする多様なポリマー材料を製造するためにも使用することができる。ポリグリコール酸を含んでなる樹脂は優れた気体遮断性を有し、このような、ポリグリコール酸を含んでなる熱可塑性樹脂は、同じ特性を有する包装材料（例えば、飲料容器など）を作製するためにも使用し得る。ポリエステルポリマーは水性環境中で、制御可能な速度で徐々に加水分解する。ポリエステルポリマーはこの特性により、溶ける縫合糸などの生物医学用途や、ｐＨを下げるために酸の放出制御が必要とされる用途において有用なものとなる。現在、米国では、年間１５，０００トンを超えるグリコール酸が消費されている。
【０００４】
グリコール酸は、サトウキビ、ビーツ、ブドウおよび果物中に微量成分として天然に存在するが、主に合成により生産される。グリコール酸を生産するためのその他の技術は文献または特許出願において記載されている。例えば、Mitsui Chemicals, Inc.により、微生物を用いることによる、末端にヒドロキシル基を有する脂肪族多価アルコールからの該ヒドロキシカルボン酸の生産方法が記載されている（ＥＰ２０２５７５９Ａ１およびＥＰ２０２５７６０Ａ１）。この方法は、Michihiko Kataokaによって、エチレングリコール酸化微生物を用いたグリコール酸生産に関する研究論文において記載されたもののような生物変換である(Biosci. Biotechnol. Biochem., 2001)。グリコール酸はまた、ニトリラーゼ活性が改良された突然変異型ニトリラーゼを用いた、グリコロニトリルからの生物変換によっても生産され、その技術はDupont de Nemours and CoによってＷＯ２００６／０６９１１０において開示されている。他の細菌株を用いた再生可能な資源からの発酵によりグリコール酸を生産する方法が、Metabolic Explorer社からの特許出願（ＷＯ２００７／１４１３１６およびＵＳ６１／１６２，７１２および２００９年３月２４日に出願されたＥＰ０９１５５９７１．６）に開示されている。
【０００５】
グリコール酸を生産するためにより良い株を構築するという目標において、本発明の発明者らは数種の特定の大腸菌株に着目してきた。
【０００６】
大腸菌(Escherichia coli)は、工業的バイオテクノロジーにおいて最初の、そして最も慣用されている生産微生物の１つである。大腸菌Ｋ−１２株の個々のクローンは、この株が長年研究されているために、組換えＤＮＡの操作およびバルクケミカルの生産の特に注目される宿主である。今日、研究および商業の双方のために用いられる大腸菌Ｋ−１２株は、この株の最初の研究において、Ｘ線照射とその後のＵＶ照射によりランダム突然変異を誘発することによって作出され単離されたクローンの誘導体である(Bachmann, B.J. 1987. Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E. coli K-12, p. 1191-1219. In J. L. Ingraham, K. B. Low, B. Magasanik, M. Schaechter, and H. E. Humbarger (編), Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology)。突然変異体または誘導体のいくつかは意図的な選抜によって進化され、よく特性化された突然変異を有する。しかしながら、現在の誘導体の多くは未検出の、および／または、これまでには特性化されていない対立遺伝子の相違を含む。よって、大腸菌Ｋ−１２株のメンバーは、１または多数の遺伝子における点突然変異によって互いに異なっている。
【０００７】
多くの大腸菌Ｋ−１２株は、ｒｐｈ遺伝子にフレームシフト突然変異を有する(Jensen K. F. 1993, J. Bacteriol. 175:3401-3707)。この点突然変異は最後の１５のコドンについての翻訳のフレームシフトをもたらし、ｒｐｈ遺伝子産物をアミノ酸残基１０個だけ小さくする。この末端切断型タンパク質はリボヌクレアーゼＰＨ活性を欠き、このｒｐｈシストロンにおける早すぎる翻訳停止が、大腸菌Ｋ−１２のオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼが低レベルであることを説明するが、これは転写と翻訳の間の密接な結びつきが、シストロン間ｐｙｒＥ減弱因子を過ぎて最適な転写レベルを維持する必要があるためである。
【０００８】
この点突然変異は、オロト酸(orotic acid)からオロチジン５’−リン酸への変換を触媒するオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＲＰＴアーゼ）をコードする下流ｐｙｒＥ遺伝子の発現に影響を及ぼすことが示されている(Poulsen P et al. 1984, EMBO 3: 1783-1790)。ｐｙｒＥ遺伝子の発現が低減されれば、ＯＲＰＴアーゼレベルが低減され、その結果、細胞内および細胞増殖中の増殖培地中に基質であるオロト酸が蓄積される(Womack J. E. and O' Donavan G. A. 1978, J. Bacteriol, 136:825-827)。
【０００９】
さらに、米国特許第５９３２４３号には、フレームシフト突然変異を含む大腸菌Ｋ−１２株における野生型ｒｐｈ遺伝子の復帰がそのような株において産生される異種タンパク質の量を増大させることが記載されている。
【００１０】
オロト酸(Orotate)は、バイオマスまたはグリコール酸を生成するために使用できたはずの炭素の消費を示すので望ましくない。さらに、オロト酸は、グリコール酸の精製中に除去するのが困難なため精製コストを引き上げる副産物である。さらに、オロト酸の痕跡により最終産物に色が出る場合もある。
【発明の開示】
【００１１】
本発明により解決される課題は、グルコースまたはその他の糖などの安価な炭素基質からグリコール酸を生物学的生産する際にオロト酸の蓄積を低減することである。グリコール酸生産の特性が改良されることから、相当なコストの削減が図れる。
【００１２】
発明の概要
本発明は、オロト酸からオロチジン５’−リン酸への変換を向上させるように改変されている大腸菌株によりグリコール酸の発酵生産を改良するための方法に関する。この変換を増大させることはグリコール酸の生産に効果を有し、すなわち、改良される。グリコール酸、その誘導体または前駆体の発酵生産のための本方法は、炭素源を含んでなる適当な培養培地での大腸菌株の培養と培地中のグリコール酸の回収を含んでなり、前記株はオロト酸からオロチジン５’−リン酸への変換を向上させるように改変されている。
【００１３】
本発明の第１の実施形態では、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴアーゼ）比活性が改変株において増強されている。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、前記大腸菌株は、オロト酸をオロチジン５’−リン酸へ変換する反応の必須補因子であるホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）の生産を高めるように改変されている。
【００１５】
ＯＰＲＴアーゼ活性の増強とＰＲＰＰ生産の増大の両改変とも、同じ大腸菌株に導入することができる。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、前記株はさらに、グリコール酸生産を高めるように遺伝的に操作されている。
【００１７】
本発明はまた、本発明による微生物が炭素源を含んでなる適当な増殖培地で増殖され、グリコール酸が回収される、グリコール酸の生産方法に関する。
【００１８】
本発明はまた、上記のものなどの改変を示す改変大腸菌株に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】酵素ＰｙｒＥ（オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）およびＰｒｓＡ（ＰＲＰＰシンテターゼ）を含むピリミジン生合成およびペントースリン酸経路。
【図２】３つの異なる生合成経路：グリコール酸経路、ペントースリン酸経路およびピリミジン経路の接点部分を示す概略図。
【図３】プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＰＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ＴＴｓのマップ。
【図４】プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＰＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ｐｒｓＡ−ＴＴｓのマップ。
【００２０】
発明の詳細
本発明は、グリコール酸、その誘導体または前駆体の発酵生産のための新規な方法であって、炭素源を含んでなる適当な培養培地での大腸菌株の培養と培地中のグリコール酸の回収を含んでなり、前記大腸菌株がオロト酸からオロチジン５’−リン酸への変換を向上させるように改変されている方法に関する。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、このグリコール酸の生産はまた、オロト酸からオロチジン５’−リン酸への変換を向上させるように改変されている大腸菌株において改変されている。
【００２２】
本発明では、「グリコレート(glycolate)」と「グリコール酸(glycolic acid)」は、互換的に用いられる。
【００２３】
「グリコール酸、その誘導体または前駆体」とは、グリコール酸の形成および分解の代謝経路におけるあらゆる中間体化合物を表す。グリコール酸の前駆体は、特に、クエン酸、イソクエン酸、グリオキシル酸、一般には、グリオキシル酸回路のあらゆる化合物である。グリコール酸の誘導体は、特に、グリコール酸エステル（エチルグリコール酸エステル、メチルグリコール酸エステルなど）およびグリコレート含有ポリマー（ポリグリコール酸など）である。
【００２４】
本発明によれば「発酵生産」、「発酵」または「培養」は、炭素源を含んでなる適当な増殖培養培地での細菌の増殖を表して互換的に用いられ、なお、この炭素源は、株の増殖と目的産物であるグリコール酸の生産の両方同時の目的で用いられる。
【００２５】
「適当な培養培地」とは、微生物の培養および増殖に適当な培地である。このような培地は、微生物の発酵の分野で周知であり、培養される微生物によって異なる。適当な培養培地は、炭素源を含んでなり、この「炭素源」とは、微生物によって代謝され得る任意の炭素源を意味する。
【００２６】
本発明に関して「代謝される」とは、微生物の増殖または少なくとも生命の維持を可能とするエネルギーおよび物質の変換というその一般的意味において理解される。
【００２７】
本発明の発酵プロセスでは、炭素源は、
・バイオマス生産−とりわけ培地の炭素源を変換することによる微生物の増殖、および
・グリコール酸生産−同じ炭素源から同じバイオマスによるグリコール酸への変換
のために用いられる。
【００２８】
この２つの段階は並行し、微生物による炭素源の増殖への変換は培地へのグリコール酸の分泌をもたらす（その微生物がそのような変換を可能とする代謝経路を含んでいるため）。
【００２９】
炭素源は、グルコース、スクロース、単糖類（フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノースなど）、オリゴ糖類（ガラクトース、セロビオースなど）、多糖類（セルロースなど）、デンプンまたはその誘導体、グリセロールおよび単一炭素基質からなる群の中から選択される。特に好ましい炭素源はグルコースである。もう１つの好ましい炭素源はスクロースである。
【００３０】
「向上された」、「増強された」、「増強する」または「向上させる」とは、オロト酸からオロチジン５’−リン酸への変換の量が、非改変微生物に比べて改変微生物で高いことを意味する。この変換は、種々の手段によって、特には、
−最初の基質（オロト酸）の量の増大、
−補因子（ＰＲＰＰ）のアベイラビリティーの増大、
−反応を触媒する酵素（オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）の活性の増強
によって向上させることができる。
【００３１】
本発明の特定の態様では、前記株は増強されたオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ比活性を有する。オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼまたは「ＯＰＲＴアーゼ」は、オロト酸からオロチジン５’−リン酸（ＯＭＰ）への変換を触媒する酵素である。
【００３２】
特に、前記株は、約３０単位、好ましくは、少なくとも５０単位、最も好ましくは少なくとも７０単位の増強されたオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ比活性を示す。
【００３３】
本発明の好ましい態様において、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子ｐｙｒＥの発現が増強されている。
【００３４】
「発現」とは、遺伝子から、その遺伝子の産物であるタンパク質への転写および翻訳を意味する。
【００３５】
遺伝子発現は、
−株に導入されたプラスミド上の異種遺伝子の発現、
−内因性プロモーターをより強力なプロモーターに置換することによるか、または染色体上の遺伝子のコピー数を増やすことによって得られる、内因性遺伝子の過剰発現、
−その染色体上の別の一遺伝子座または他の複数の遺伝子座における人工プロモーターからのその遺伝子の発現
などの種々の手段によって増強することができる。
【００３６】
本発明のさらに好ましい態様では、ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンにフレームシフト突然変異を有する大腸菌Ｋ１２株において遺伝子ｐｙｒＥの発現が復帰されている。
【００３７】
フレームシフト突然変異を含むｒｐｈ遺伝子のヌクレオチド配列は、Jensen, K. F. (1993)により示されている。さらに、野生型ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータバンクから受託番号Ｘ００７８１およびＸ０１７１３として入手可能であり、シストロン間ｒｐｈ−ｐｙｒＥセグメントの配列およびそのフランキング領域は、ＥＭＢＬデータバンクから受託番号Ｘ７２９２０として入手可能である。また、当業者には、野生型ｒｐｈおよびｐｙｒＥ  ＤＮＡ配列に関して、このような配列は、公開または寄託されているものと機能的に等価な天然および合成配列も含むことが理解される。
【００３８】
「大腸菌Ｋ−１２株」とは、スタンフォード大学細菌学研究室のコレクションの培養大腸菌、および大腸菌Ｋ−１２原株からＵＶ光、Ｘ線により処理および／または他の化学的もしくは遺伝学的処理の後に生じたレーダーバーグ株Ｗ１４８５の総ての誘導体を含むと理解される(Bachmann, B. J. 1987. Derivations and genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p.1191-1219. In J. L. Ingraham, K. B. Low, B. Magasanik, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (編), Escherichia coli and Salmonella typhinurium: cellular and molecular biology. American Society for Microbiology, Washington, D.C)。
【００３９】
「ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンにフレームシフト突然変異を有する大腸菌Ｋ１２株」とは、ｒｐｈ遺伝子に既知の点突然変異を有するレーダーバーグ株Ｗ１４８５の大腸菌株誘導体を意味する。ｒｐｈ停止コドンの４３〜４７塩基対上流に見られる５「ＧＣ」のブロックから１つの「ＧＣ」塩基対を欠く大腸菌株は、突然変異の無い野生型ｒｐｈ遺伝子を有する株に対して、突然変異株であるとみなされる(Jensen K, 1993, J. Bacteriol. 175:3401-3407)。
【００４０】
大腸菌Ｋ−１２株のｒｐｈ遺伝子におけるフレームシフト突然変異は、通常の「オペロン」において、ｒｐｈの下流に位置するｐｙｒＥ遺伝子の発現に対して中枢的機能を有することがこれまでに示されている。従って、このｒｐｈ遺伝子における突然変異の結果、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは低レベルとなり、結果として、オロト酸が蓄積される。
【００４１】
突然変異型のｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンを有する大腸菌Ｋ−１２株が、約５〜２０単位の比活性でオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（ＰｙｒＥ）を産生するのに対して、野生型ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンを有する、言い換えれば野生型ｐｙｒＥを発現する他方の大腸菌株は、約３０〜９０単位のＯＰＲＴアーゼ比活性レベルを示す。
【００４２】
ｒｐｈにフレームシフト突然変異を有する株におけるオロト酸の蓄積は、グリコレートの生産、単離および精製を妨げ得る。よって、野生型ＯＰＲＴ活性（少なくとも３０単位の比活性）を示す大腸菌Ｋ−１２においてこのオロト酸の蓄積を有意に減らすことによって、グリコール酸の生産を有意に改良することができる。
【００４３】
「復帰」とは、野生型ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンを再生するために用いられる、当業者に公知の特定の遺伝子変更または操作を意味する。
【００４４】
この特定の場合において、ｐｙｒＥの転写を増強する１つの可能性が、ｐｙｒＥの不十分な転写の原因であるｒｐｈにおける点突然変異を補正することにより、ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンの野生型配列を復帰させることである。
【００４５】
野生型オペロンを有する大腸菌Ｋ−１２株は、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性のレベルを測定することにより、かつ／またはそこに含まれるｒｐｈ−ｐｙｒＥ領域の配列決定を行うことにより、同定することができる。
【００４６】
化学化合物の「収量」、「レベル」または「量」という場合、これらの用語は本質的に純粋な産物の定量的量を意味すると理解される。ＧＣＭＳ、ＨＰＬＣ、分光度測定技術および酵素活性などの従来の化学的検出法が使用可能である。
【００４７】
本発明では、酵素はそれらの比活性により同定される。よって、この定義は、他の生物、より詳しくは、他の微生物にも存在する、定義された比活性を有する総てのポリペプチドを含む。同等の活性を有する酵素は、ＰＦＡＭまたはＣＯＧとして定義される特定のファミリーとの相同性によって同定することができる。
【００４８】
ＰＦＡＭ（アラインメントのタンパク質ファミリーデータベースおよび隠れマルコフモデル(protein families database of alignments and hidden Markov models); http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列アラインメントの大きなコレクションである。各ＰＦＡＭにより、複数のアライメントを表示し、タンパク質ドメインを視認し、生物間で分布を評価し、他のデータベースにアクセスし、既知のタンパク質構造を表示することができる。
【００４９】
ＣＯＧ（タンパク質のオーソロガス群のクラスター(clusters of orthologous groups of proteins)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）は、３０の主要な系統発生系に相当する、完全に配列決定された４３のゲノムからのタンパク質配列を比較することによって得られる。各ＣＯＧは、少なくとも３つの系から定義され、これにより、以前から保存されているドメインを同定することができる。
【００５０】
相同配列およびそれらの相同性パーセンテージを同定する手段は当業者に周知であり、特にＢＬＡＳＴプログラムが含まれ、このプログラムはウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から、そのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに使用することができる。得られた配列は次に、例えば、プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)またはＭＵＬＴＡＬＩＮ(http /prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)をそのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いて利用する（例えばアラインする）ことができる。
【００５１】
当業者ならば、ＧｅｎＢａｎｋに示されている既知の遺伝子に関する参照番号を用いて他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物などにおける等価な遺伝子を決定することができる。この常法は、有利には、他の微生物由来の遺伝子との配列アラインメントを行い、縮重プローブを設計して、他の生物における対応する遺伝子をクローニングすることにより決定することができるコンセンサス配列を使用して行われる。これらの分子生物学の常法は当業者に周知であり、例えば、Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 第2版 Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York)に記載されている。
【００５２】
本発明の特定の実施形態では、前記株は、５−ホスホリボシル１−ピロリン酸（ＰＲＰＰ）の増大したアベイラビリティーを示す。
【００５３】
「ホスホリボシルピロリン酸」、「５−ホスホリボース１−ピロリン酸」および「ＰＲＰＰ」は互換的に用いられる。ＰＲＰＰは、リボース５−リン酸と１個のＡＴＰ（図１参照）から、遺伝子ｐｒｓＡによりコードされる酵素ホスホリボシルピロリン酸シンテターゼによって形成されるペントースリン酸である。
【００５４】
ホスホリボシルピロリン酸シンテターゼは、プリン、ピリミジンおよびニコチンアミドヌクレオチドの生合成の第一段階、ならびにヒスチジンおよびトリプトファンの生合成に関与している（味の素社のＥＰ１５２９８３９Ａ１およびＥＰ１７００９１０Ａ２）。
【００５５】
ＰＲＰＰ分子はまた、酵素ＯＰＲＴアーゼにより触媒される反応の必須補因子でもある（上記参照）。実際に、この反応はＰＲＰＰのペントースリン酸部分を用いる。
【００５６】
「増大したアベイラビリティー」とは、ＰＲＰＰが非改変株に比べて高い量で存在することを意味し、ＰＲＰＰの生産が増大しているか、その消費が低減されているかのいずれかである。
【００５７】
本発明の特定の態様では、非改変株に比べてホスホリボシルピロリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｐｒｓＡの発現が増強されており、従って、ＰＲＰＰの生産が増大している。
【００５８】
遺伝子の発現を増強するための種々の方法が有用であり、それらの方法：
−プラスミドＤＮＡからのその遺伝子の発現、
−その染色体上で直接、その遺伝子の天然プロモーターを強力なプロモーターに置換
−その染色体上の別の一遺伝子座または他の複数の遺伝子座における人工プロモーターからのその遺伝子の発現
は当業者に公知である。
【００５９】
本発明の別の実施形態では、前記株はグリコール酸の生産を高めるようにさらに改変されている。
【００６０】
特に、改変微生物は、下記の改変：
−特に遺伝子ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌ、ｅｄａの減弱により得られる、グリオキシレートからグリコレート以外の産物への変換の低減、
−特に遺伝子ｇｌｃＤＥＦＧ、ａｌｄＡの減弱により得られる、グリコレートの実質的代謝不能、
−特に遺伝子ｉｃｄ、ａｃｅＫ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ｐｏｘＢ、ｉｃｌＲまたはｆａｄＲの減弱により、かつ／または遺伝子ａｃｅＡの過剰発現により得られる、グリオキシル酸経路フラックスの増大、
−特に遺伝子ｙｃｄＷまたはｙｉａＥの過剰発現により得られる、グリオキシレートからグリコレートへの変換の増大、
−特に遺伝子ｐｇｉ、ｕｄｈＡ、ｅｄｄの減弱により得られる、ＮＡＤＰＨのアベイラビリティーの増大
のうち少なくとも１つを含んでなり得る。
【００６１】
特に、前記微生物は、グリコレートを生産する以外の、グリコレートの重要な前駆体であるグリオキシレートを消費する酵素をコードする遺伝子：
−マレイン酸シンターゼをコードするａｃｅＢおよびｇｃｌＢ遺伝子、
−グリオキシル酸カルボリガーゼをコードするｇｃｌ、および
−２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼをコードするｅｄａ
の発現の減弱による、グリオキシル酸変換能が低くなるように変換されている。
【００６２】
種々の方法：
・その遺伝子への、この遺伝子の発現レベルを低減する突然変異の導入、
・その遺伝子の天然プロモーターをより弱いプロモーターに置換することによる発現の低減、
・発現が必要とされない場合には、その遺伝子の欠失
が遺伝子発現の減弱に有用である。
【００６３】
本発明のさらなる実施形態では、大腸菌Ｋ１２株は、実質的にグリコレートを代謝できないように改変されている。このような結果は、グリコレートを消費する酵素をコードす遺伝子：
−グリコール酸オキシダーゼをコードするｇｌｃＤＥＦ、および
−グリコアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｌｄＡ
のうち少なくとも１つの減弱により達成することができる。
【００６４】
遺伝子の減弱は、天然プロモーターを低強度プロモーターに置換することによるか、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化する要素によって行うことができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列を欠失させることによって遺伝子の完全な減弱も達成することができる。
【００６５】
別の実施形態では、本発明による大腸菌Ｋ１２株は、グリオキシル酸経路フラックスを増大するように変換されている。
【００６６】
グリオキシル酸経路のフラックスは、種々の手段、特に：
ｉ）ｉｃｄ遺伝子によりコードされる酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性を低減すること、
ｉｉ）下記の酵素：
・ｐｔａ遺伝子によりコードされるホスホトランスアセチラーゼ、
・ａｃｋ遺伝子によりコードされる酢酸キナーゼ、
・ｐｏｘＢ遺伝子よりコードされるピルビン酸オキシダーゼ、
・ａｃｅＫ遺伝子よりコードされるＩｃｄキナーゼホスファターゼ
のうち少なくとも１つの活性を低減すること、
ｉｉｉ）ａｃｅＡ遺伝子によりコードされる酵素イソクエン酸リアーゼの活性を増強すること
によって増大させることができる。
【００６７】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼのレベルの低減は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードするｉｃｄ遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することによるか、またはｉｃｄ遺伝子にそのタンパク質の酵素活性を低減する突然変異を導入することによって達成することができる。
【００６８】
タンパク質Ｉｅｄの活性はリン酸化により低減されるので、この活性は野生型ＡｃｅＫ酵素に比べてキナーゼ活性が増強され、ホスファターゼ活性が低減された突然変異型ａｃｅＫ遺伝子を導入することによって制御することもできる。
【００６９】
イソクエン酸リアーゼの活性の増強は、グリオキシル酸経路レプレッサーをコードするｉｃｌＲもしくはｆａｄＲ遺伝子のレベルを減弱することによるか、またはａｃｅＡ遺伝子の発現を刺激するか（例えば、その遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入するか、もしくはａｃｅＡ遺伝子に、コードされているタンパク質の活性を増強する突然変異を導入することによる）のいずれかによって達成することができる。
【００７０】
本発明の別の実施形態では、大腸菌Ｋ１２株は、グリオキシレートからグリコレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。好ましい様式では、前記遺伝子の発現が増強される。
【００７１】
特に、このポリペプチドは、毒性グリオキシル酸中間体からグリコレートへ変換するＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸レダクターゼ酵素である。
【００７２】
好ましくは、前記遺伝子は、大腸菌ＭＧ１６５５のゲノム由来のｙｃｄＷまたはｙｉａＥ遺伝子の中から選択される。必要であれば、高レベルのＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸レダクターゼ活性は、染色体にコードされている遺伝子から、当業者に公知の組換え方法によって導入可能な、ゲノム上の１コピーまたは数個ピーを用いて得ることができる。染色体外遺伝子の場合、複製起点が異なる、従って、細胞内でのコピー数が異なる、異なるタイプのプラスミドを使用することができる。それらは、厳格な複製の低コピー数プラスミド（ｐＳＣ１０１、ＲＫ２）、低コピー数プラスミド（ｐＡＣＹＣ、ｐＲＳＦ１０１０）または高コピー数プラスミド（ｐＳＫ  ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）に相当する１〜５コピー、およそ２０コピーまたは最大５００コピーとして提供することができる。ｙｃｄＷまたはｙｉａＥ遺伝子は、インデューサー分子によって誘導する必要がある、または必要のない、種々の強度のプロモーターを用いて発現させることができる。例としては、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、Ｐｌａｃ、λプロモーターｃＩまたは当業者に公知のその他のプロモーターがある。これらの遺伝子の発現はまた、対応するメッセンジャーＲＮＡ(Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64)またはタンパク質（例えば、ＧＳＴタグ、Amersham Biosciences）を安定化する要素によって増強することもできる。
【００７３】
前記ポリペプチドをコードする遺伝子は外因性または内因性のいずれであってもよく、染色体により、または染色体外で発現させることができる。
【００７４】
本発明の別の実施形態では、大腸菌Ｋ１２株は、ＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸レダクターゼの、増大したＮＡＤＰＨアベイラビリティーを示し、より良いグリコール酸生産収量を提供する。微生物のこの改変は、
−グルコース−６−リン酸イソメラーゼをコードするｐｇｉ、
−可溶性トランスヒドロゲナーゼをコードするｕｄｈＡ、および
−６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性をコードするｅｄｄ
の中から選択される少なくとも１つの遺伝子の減弱によって得ることができる。
【００７５】
このような遺伝子改変をもってすれば、総てのグルコース−６−リン酸がペントースリン酸経路を介して解糖系に入り、代謝されるグルコース−６−リン酸当たり２つのＮＡＤＰＨが生成される。
【００７６】
本発明の好ましい実施形態では、改変微生物は、遺伝子ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌ、ｅｄａ、ｇｌｃＤＥＦＧ、ａｌｄＡ、ｉｃｄ、ａｃｅＫ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ｐｏｘＢ、ｉｃｌＲの減弱、ならびに遺伝子ａｃｅＡおよびｙｃｄＷの過剰発現を含んでなる。場合により、改変微生物はまた、遺伝子ｐｇｉ、ｕｄｈＡおよびｅｄｄの減弱を含んでなってもよい。
【００７７】
本発明の一実施形態では、炭素源は下記の群：グルコース、スクロース、単糖類もしくはオリゴ糖類、デンプンもしくはその誘導体、またはグリセロール、ならびにそれらの組合せの中から選択される。
【００７８】
従前に記載した本発明はまた、下記の工程：
ａ）グリコール酸を生産する微生物を発酵すること、
ｂ）細菌または培地においてグリコール酸を濃縮すること、および
ｃ）発酵液および／またはバイオマスからグリコール酸を単離すること（場合により、最終産物中に一部または全量（０〜１００％）が残ってもよい）
を含んでなる、グリコール酸の発酵製造のための方法に関する。
【００７９】
特定の実施形態では、グリコール酸は、少なくともグリコレートダイマーへ重合する工程を介して単離され、グリコレートダイマー、オリゴマーおよび／またはポリマーからの脱重合により回収される。
【００８０】
当業者ならば、本発明による微生物の培養条件を定義することができる。特に、大腸菌Ｋ１２株は３０℃〜３７℃の間の温度で発酵される。
【００８１】
発酵は一般に、少なくとも１つの単純炭素源および必要であれば代謝産物の生産に必要な補助基質を含有する、使用する微生物に適合した既知の定義された組成の無機培養培地の入った発酵槽で行われる。
【００８２】
本発明はまた、オロト酸からオロチジン５’−リン酸への変換が高められた大腸菌Ｋ−１２株に関する。
【００８３】
特に、前記株は増強されたオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ比活性を示す。
【００８４】
本発明の好ましい態様では、前記株において、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子ｐｙｒＥの発現が増強されている。
【００８５】
本発明の特定の態様では、前記株は、ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンにフレームシフト突然変異を有する大腸菌Ｋ１２株において遺伝子ｐｙｒＥの発現を復帰させるように改変されている。
【００８６】
本発明の別の態様では、前記株は、５−ホスホリボシル１−ピロリン酸（ＰＲＰＰ）の増強されたアベイラビリティーを示す。
【００８７】
特に、本発明は、遺伝子ｐｙｒＥの発現とＰＲＰＰの生産の双方が増強されている大腸菌株に関する。
【００８８】
より具体的には、本発明は、上記のようなホスホリボシルピロリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｐｒｓＡが過剰発現される大腸菌株に関する。
【００８９】
本発明の別の実施形態では、前記の改変大腸菌株は、グリコール酸を高収量で生産するようにさらに改変されている。特に、前記大腸菌株は下記の改変：
−特に遺伝子ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌ、ｅｄａの減弱により得られる、グリオキシレートからグリコレート以外の産物への変換の低減、
−特に遺伝子ｇｌｃＤＥＦＧ、ａｌｄＡの減弱により得られる、グリコレートの実質的代謝不能、
−特に遺伝子ｉｃｄ、ａｃｅＫ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ｐｏｘＢ、ｉｃｌＲまたはｆａｄＲの減弱により、かつ／または遺伝子ａｃｅＡの過剰発現により得られる、グリオキシル酸経路フラックスの増大、
−特に遺伝子ｙｃｄＷまたはｙｉａＥの過剰発現により得られる、グリオキシレートからグリコレートへの変換の増大、
−特に遺伝子ｐｇｉ、ｕｄｈＡ、ｅｄｄの減弱により得られる、ＮＡＤＰＨのアベイラビリティーの増大
のうち少なくとも１つを含んでなる。
【００９０】
この微生物は、優先的には、まず少なくとも野生型ＯＰＲＴ活性を含むように補正し、次に、特にグリオキシレートからグリコレート以外の産物への変換を回避するように遺伝的に操作された、ｒｐｈフレームシフト突然変異を有する大腸菌Ｋ−１２株である［Machida, H. and Kuninaka, A. (1969) and "Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology 1987参照］。
【００９１】
このような株は、本明細書すでに記載されている種々の方法により、ＯＰＲＴ活性を測定することによるか、ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンのＤＮＡ配列分析によるか、かつ／またはオロト酸蓄積のレベルを確認することによって同定することができる。
【実施例】
【００９２】
いくつかのプロトコールを用いて、以下の実施例に記載するグリコール酸生産株を構築した。これらのプロトコールを以下に詳細に示す。
【００９３】
プロトコール１：組換えのためのＰＣＲ産物の導入および組換え体の選択（Ｃｒｅ−ＬＯＸ系）
遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択し、表１に示したオリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰ(Gene Bridges)由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドｌｏｘＰ−ＰＧＫ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ｌｏｘＰ(Gene Bridges)由来のネオマイシン耐性カセットのいずれかを増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションによって、プラスミドｐＫＤ４６（発現されるλ  Ｒｅｄ系（γ、β、ｅｘｏ）が相同組換えに極めて好都合である）を担持するレシピエント株に導入した。次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、表２に示す適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【００９４】
プロトコール２：ファージＰ１を用いた遺伝子欠失の導入
ファージＰ１を用いた形質導入法により、ある大腸菌株から別の大腸菌株へのＤＮＡ移入を行った。このプロトコールは、（ｉ）単一改変遺伝子を含むドナー株でのファージ溶解液の調製と、（ｉｉ）このファージ溶解液によるレシピエント株の形質導入、の２工程で行った。
【００９５】
ファージ溶解液の調製
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｃｍ  ３０μｇ／ｍｌ／Ｋｍ  ５０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２  ５ｍＭ中、単一改変遺伝子を有するＭＧ１６５５株の一晩培養物１００μｌを植菌する。
・振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
・ドナー株ＭＧ１６５５で調製したＰ１ファージ溶解液１００μｌ（およそ１×１０９ファージ／ｍｌ）を加える。
・３７℃で３時間、総ての細胞が溶解するまで振盪する。
・２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・４５００ｇで１０分間遠心分離して細胞残渣を除去する。
・上清を滅菌試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを加える。
・溶解液を４℃で保存する。
【００９６】
形質導入
・ＬＢ培地中の大腸菌レシピエント株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
・２．５ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５ｍＭ  ＣａＣｌ２に細胞ペレットを懸濁させる。
・対照試験管：１００μｌの細胞
１００μｌの、単一遺伝子欠失を有するＭＧ１６５５株のＰ１ファージ。
・供試試験管：１００μｌの細胞＋１００μｌの、単一改変遺伝子を有するＭＧ１６５５株のＰ１ファージ。
・振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートする。
・各試験管に１００μｌの１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍＬのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
・試験管を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、ＬＢ＋Ｃｍ  ３０μｇ／ｍｌ／Ｋｍ  ５０μｇ／ｍｌのディッシュ上に播種する。
・３７℃で一晩インキュベートする。
【００９７】
その後、抗生物質耐性形質導入体を選択し、欠失の挿入を、表２に示す適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【００９８】
【表１】
2013537429.tif 000003
【００９９】
【表２】
2013537429.tif 000004
【０１００】
実施例１
発酵によりグリコール酸を生産する大腸菌Ｋ−１２株におけるｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンの遺伝子再構築：ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ｒｐｈ＋ｐｙｒＥｒｃ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）
大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株を特許出願ＥＰ２０２７２７７および非公開出願ＥＰ０９１５５９７１の記載に従って構築した。
【０１０１】
大腸菌野生型ＭＧ１６５５株はｒｐｈ遺伝子にフレームシフト突然変異を有する。細胞のオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性レベルを復帰させるために、機能的ｒｐｈ遺伝子を数段階で大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株に導入して大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  Δｒｐｈ＋ｐｙｒＥ：：Ｎｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴＯ１）を得た。
【０１０２】
略号：
Ｒｐｈ−ｐｙｒＥｒｃは、「ｒｐｈの野生型コピーを用いたｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンの再構築」を表す。このような場合にはｐｙｒＥの発現が増強される。
【０１０３】
Δｒｐｈ＋ｐｙｒＥ：：Ｎｍは、「オペロンの欠失」を表す。
【０１０４】
遺伝子型が記載されていない場合は、そのオペロンはＭＧ１６５５大腸菌Ｋ−１２株のものと同じであり、すなわち、ｒｐｈ遺伝子に突然変異を有している。
【０１０５】
１．ＭＧ１６５５  Δｒｐｈ＋ｐｙｒＥ：：Ｎｍ株の構築
大腸菌ＭＧ１６５５株においてｒｐｈ＋ｐｙｒＥ領域を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。構築は、プロトコール１に記載されている技術に従い、表１に示されている各オリゴヌクレオチドＯａｇ  ０１１９−ＤｐｙｒＥ−ｌｏｘＰ  ＲおよびＯａｇ  ０１４３＿Ｄｒｐｈ−ｌｏｘＰ  Ｆ（配列番号１および２）を用いて行った。
【０１０６】
Ｏａｇ  ０１１９＿ＤｐｙｒＥ−ｌｏｘＰ  Ｒ（配列番号１）
【化１】
2013537429.tif 000005
この配列は以下の領域を有する
・領域ｐｙｒＥの配列（３８１３１５５−３８１３２３４）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（大文字）、
・ネオマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（太字の大文字）（参照配列Gene Bridges）。
Ｏａｇ  ０１４３＿Ｄｒｐｈ−ｌｏｘＰ  Ｆ（配列番号２）
【化２】
2013537429.tif 000006
【０１０７】
この配列は以下の領域を有する
・領域ｒｐｈの配列（３８１４５４３−３８１４４６２）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（大文字）、
・ネオマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（太字の大文字）（参照配列Gene Bridges）。
得られたＰＣＲ産物を、エレクトロポレーションにより、ＭＧ１６５５株に導入した（ｐＫＤ４６）。次に、ネオマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、表２に定義されるオリゴヌクレオチドＯａｇ  ０１４４＿ｒｐｈ−ｌｏｘＰ  ＦおよびＯａｇ  ０１２２＿ＤｐｙｒＥ  Ｒ（配列番号７および８）を用いたＰＣＲ分析により確認した。得られた株をＭＧ１６５５  Δｒｐｈ＋ｐｙｒＥ：：Ｎｍと呼称した。
【０１０８】
２．大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ｒｐｈ＋ｐｙｒＥｒｃ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株の構築
まず、大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  Δｒｐｈ＋ｐｙｒＥ：：Ｎｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ株を、プロトコール１に記載のＰ１ファージを用いた形質導入法により構築した。ドナー株は、上記のＭＧ１６５５  Δｒｐｈ＋ｐｙｒＥ：：Ｎｍ株であった。受容株大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａは上述した従前の特許出願に記載されている。ネオマイシンおよびクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、Δｒｐｈ＋ｐｙｒＥ：：Ｎｍ領域の挿入を、オリゴヌクレオチドＯａｇ  ０１４４＿ｒｐｈ−ｌｏｘＰ  ＦおよびＯａｇ  ０１２２＿ＤｐｙｒＥ  Ｒを用いたＰＣＲ分析により確認した。得られた株をＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  Δｒｐｈ＋ｐｙｒＥ：：Ｎｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａと呼称した。
【０１０９】
機能的ｒｐｈ遺伝子を復帰させるために、大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ｒｐｈ＋ｐｙｒＥｒｃ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ株を、プロトコール１に記載のＰ１ファージを用いた形質導入法により構築した。ドナー株は、野生型ｒｐｈ遺伝子（ここでは、ｒｐｈ＋ｐｙｒＥｒｃと記載）を有するＣＧＳＣ  ＃５０７３株（「E. coli Genetic Stock Center」から入手可能、保存株番号５０７３、Yale University, New Haven, Conn.）である。次に、クロラムフェニコール耐性形質転換体をピリミジン原栄養性に関して選択し、ｒｐｈ＋ｐｙｒＥ領域の挿入を、上記で定義されたオリゴヌクレオチドＯａｇ  ０１４４＿ｒｐｈ−ｌｏｘＰ  ＦおよびＯａｇ  ０１２２＿ＤｐｙｒＥ  Ｒを用いたＰＣＲ分析により確認した。得られた株を配列決定より確認した。保持した株をＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ｒｐｈ＋ｐｙｒＥｒｃ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａと呼称した。
【０１１０】
次に、プラスミドｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１を、エレクトロポレーションにより、ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ｒｐｈ＋ｐｙｒＥｒｃ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａに導入した。得られたＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ｒｐｈ＋ｐｙｒＥｒｃ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株をＡＧ０８４３と呼称した。
【０１１１】
実施例２
プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ＴＴｓの構築
プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ＴＴｓは、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（M. E. Kovach, (1995), Gene 166: 175-176)およびｐＰＰ１(P. Poulsen, (1984), The EMBO Journal 3: 1783-1790)から構築した。遺伝子ｐｙｒＥは、プラスミドｐＰＰ１から、オリゴヌクレオチドＰｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ  Ｆおよびその配列にＰｔｒｃ０４プロモーターとＲＢＳ０１＊５を含むｐｙｒＥ  Ｒ（表１、配列番号３および４）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶで消化したＰＣＲ断片をＫｐｎＩ／ＳｍａＩで切断したプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５にクローニングし、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ（図３）を得た。この組換えプラスミドの配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１１２】
実施例３
プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ｐｒｓＡ−ＴＴｓの構築
プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳＳ−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ｐｒｓＡ−ＴＴｓは、上記のプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ＴＴｓから構築した。遺伝子ｐｒｓＡを、表１に示されるオリゴヌクレオチドＯａｇ  ０３７１−ｐｒｓＡ  Ｆ  ＫｐｎＩおよびＯａｇ  ０３７２−ｐｒｓＡ  Ｒ  ＳｍａＩ（配列番号５および６）を用いたＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡ上のＰＣＲにより増幅した。ＳｍａＩ／ＫｐｎＩで消化したＰＣＲ断片を、ＳｐｈＩ／Ｋｌｅｎｏｗ／ＫｐｎＩにより切断したプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ＴＴｓにクローニングし、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ｐｒｓＡ−ＴＴｓ（図４）を得た。この組換えプラスミドの配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１１３】
実施例４
グリコール酸を生産し、かつ、ｐｒｓＡとともにまたは伴わずにｐｙｒＥを過剰発現するＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ＴＴｓ）株およびＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ｐｒｓＡ−ＴＴｓ）株の構築
大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）を、特許出願ＥＰ１０３０５６３５．４の記載に従って構築した。
【０１１４】
プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ＴＴｓおよびｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ｐｒｓＡ−ＴＴｓ（上記の実施例２および３に記載）をそれぞれＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株に導入した。得られたＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ＴＴｓ）株およびＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ｐｒｓＡ−ＴＴｓ）株をそれぞれＡＧ１６２９およびＡＧ１６３０と呼称した。
【０１１５】
実施例５
グリコール酸を生産し、かつ、ｐｒｓＡとともにまたは伴わずにｐｙｒＥを過剰発現するＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ／ｃＩ８５７／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔａｃｅＫ：：Ｃｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ＴＴｓ）株およびＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ／ｃＩ８５７／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔａｃｅＫ：：Ｃｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ｐｒｓＡ−ＴＴｓ）株の構築
大腸菌ＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ／ｃＩ８５７／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔａｃｅＫ：：Ｃｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株は、特許出願ＥＰ１０３０５６３５．４の記載に従って構築した。
【０１１６】
プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ＴＴｓおよびｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ｐｒｓＡ−ＴＴｓをそれぞれＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ／ｃＩ８５７／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔａｃｅＫ：：Ｃｍ（ｐＭＥ１０１−ｊｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株に導入した。得られたＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ／ｃＩ８５７／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔａｃｅＫ：：Ｃｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ＴＴｓ）株およびＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ／ｃＩ８５７／ＰＲ０１／ＫＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔａｃｅＫ：：Ｃｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ｐｒｓＡ−ＴＴｓ）をそれぞれＡＧ１８６９およびＡＧ１８７１と呼称した。
【０１１７】
実施例６
副産物としてオロト酸を生産しない株を用いた発酵によるグリコール酸生産
ＡＧ１３８５株：  ＭＧ１６５５  ＤｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ＣＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳ０５／ＴＴＧ−ｉｃｄ  ＤａｃｅＢ  Ｄｇｃｌ  ＤｇｌｃＤＥＦＧＢ  ＤａｌｄＡ  ＤｉｃｌＲ  Ｄｅｄｄ＋ｅｄａ  ＤｐｏｘＢ  ＤａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ＊（Ｍ）−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）。
ＡＧ１６２９株：  ＭＧ１６５５  ＤｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ＣＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳ０５／ＴＴＧ−ｉｃｄ  ＤａｃｅＢ  Ｄｇｃｌ  ＤｇｌｃＤＥＦＧＢ  ＤａｌｄＡ  ＤｉｃｌＲ  Ｄｅｄｄ＋ｅｄａ  ＤｐｏｘＢ  ＤａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ＊（Ｍ）−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ＴＴｓ）。
ＡＧ１６３０株：  ＭＧ１６５５  ＤｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ＣＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳ０５／ＴＴＧ−ｉｃｄ  ＤａｃｅＢ  Ｄｇｃｌ  ＤｇｌｃＤＥＦＧＢ  ＤａｌｄＡ  ＤｉｃｌＲ  Ｄｅｄｄ＋ｅｄａ  ＤｐｏｘＢ  ＤａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ＊（Ｍ）−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ｐｒｓＡ−ＴＴｓ）。
ＡＧ１４１３株：  ＭＧ１６５５  ＤＰｉｃｄ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）／ＲＢＳ０１−ｉｃｄ：：Ｋｍ  ＤａｃｅＢ  Ｄｇｃｌ  ＤｇｌｃＤＥＦＧＢ  ＤａｌｄＡ  ＤｉｃｌＲ  Ｄｅｄｄ＋ｅｄａ  ＤｐｏｘＢ  ＤａｃｋＡ＋ｐｔａ  ＤａｃｅＫ：：Ｃｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ＊（Ｍ）−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）。
ＡＧ１８６９株：  ＭＧ１６５５  ＤＰｉｃｄ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）／ＲＢＳ０１−ｉｃｄ：：Ｋｍ  ＤａｃｅＢ  Ｄｇｃｌ  ＤｇｌｃＤＥＦＧＢ  ＤａｌｄＡ  ＤｉｃｌＲ  Ｄｅｄｄ＋ｅｄａ  ＤｐｏｘＢ  ＤａｃｋＡ＋ｐｔａ  ＤａｃｅＫ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ＊（Ｍ）−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ＴＴｓ）。
ＡＧ１８７１株：  ＭＧ１６５５  ＤＰｉｃｄ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）／ＲＢＳ０１−ｉｃｄ：：Ｋｍ  ＤａｃｅＢ  Ｄｇｃｌ  ＤｇｌｃＤＥＦＧＢ  ＤａｌｄＡ  ＤｉｃｌＲ  Ｄｅｄｄ＋ｅｄａ  ＤｐｏｘＢ  ＤａｃｋＡ＋ｐｔａ  ＤａｃｅＫ：：Ｃｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ＊（Ｍ）−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０４／ＲＢＳ０１＊５−ｐｙｒＥ−ｐｒｓＡ−ＴＴｓ）。
【０１１８】
発酵プロセス
これらの株に用いたプロトコールは、特許出願ＵＳ６１／２４５，７１６およびＥＰ１０３０５６３５．４に記載されている。
【０１１９】
前培養は、４０ｇ／ｌのＭＯＰＳおよび１０ｇ／ｌのグルコースを添加した５５ｍｌの合成培地ＭＭＬ８ＡＧ１＿１００（表３の組成）を充填した３本の５００ｍｌバッフル付きエルレンマイヤーフラスコにて、３７℃で２日間行った（最終光学濃度は７〜１０の間）。この前培養物２０ｍＬを継代培養の植菌に用いた。
【０１２０】
【表３】
2013537429.tif 000007
【０１２１】
継代培養物は、Multifors Multiple Fermentor System (Infors)上に取り付けた有効用量７００ｍＬの容器で増殖させた。各容器には、２０ｇ／ｌのグルコース、５０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを添加した２００ｍｌの合成培地ＭＭＬ１１ＡＧ１＿１００（表３の組成）を充填し、初期光学濃度が約１となるように植菌した。
【０１２２】
【表４】
2013537429.tif 000008
【０１２３】
培養は３０℃にて０．２ｌｐｍで曝気しながら行い、溶存酸素は振盪（最初は３００ｒｐｍ、最大１２００ｒｐｍ）と酸素供給（０〜４０ｍｌ／分）を制御することによって３０％を越える飽和を維持した。ｐＨを、塩基（ＮＨ４０Ｈ  ７．５％ｗ／ｗとＮａＯＨ  ２．５％ｗ／ｗの混合物）を添加することによってｐＨ６．８±０．１に調整した。発酵は、７００ｇ／ｌのグルコース（下表５の組成）の供給原料溶液を用いて不連続流加様式で行った。
【０１２４】
【表５】
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【０１２５】
グルコースが培養培地中に流れ出た際には、供給パルスは２０ｇ／ｌのグルコース濃度に回復させた。
【０１２６】
５回目の供給パルスの後（１００ｇ／Ｌのグルコースが消費）、培養を終了するまでｐＨをｐＨ７．４に調整した。ｐＨのシフトは約２時間以内に行った。
【０１２７】
これらの条件下で増殖させたＡＧ１３８５、ＡＧ１６２９、ＡＧ１６３０、ＡＧ１４１３、ＡＧ１８６９およびＡＧ１８７１株のグリコール酸生産の性能およびオロト酸の蓄積を下表６に示す。
【０１２８】
【表６】
2013537429.tif 000010
【０１２９】
表６で見て取れるように、ＡＧ１６２９、ＡＧ１６３０、ＡＧ１８６９およびＡＧ１８７１株におけるｐｙｒＥ遺伝子の過剰発現は、オロト酸の蓄積を抑制した。
【０１３０】
ＡＧ１８６９およびＡＧ１８７１株においては、またグリコール酸生産収量を高めることができた。ｐｙｒＥ遺伝子の過剰生産をｐｒｓＡの過剰発現と組み合わせると性能が良くなる。
【０１３１】
実施例７
オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴ）活性の測定
オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴ）活性の測定のため、フラスコ培養の細胞（乾重２５ｍｇ）をリン酸カリウムバッファーに懸濁させ、ガラスビーズの入った試験管に移し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（６５００ｒｐｍで３０秒、Bertin Technologies）を用いて溶解させた。１２０００ｇ（４℃）で３０分間遠心分離を行うことにより、細胞残渣を除去した。ブラッドフォードタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を測定した。粗抽出液中に存在するオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴ）活性を、２９５ｎｍでの分光光度測定(Jasco)により検出した。このＯＰＲＴにより触媒される反応は、ＡＭＰの存在下でのオロト酸からオロチジン一リン酸（ＯＭＰ）とＰＰｉへの変換からなる。このアッセイは、オロト酸消費の２９５ｎｍでの測定に基づく。８０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．８）、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３２ｍＭのオロト酸および０．１〜０．５μｇ／μＬの粗抽出液を含有する反応混合物（１ｍＬ）を３７℃で１０分間インキュベートした。その後、０．８ｍＭの５−ホスホ−Ｄ−リボシル−１−二リン酸（ＰＲＰＰ）を添加して反応を開始させた。活性は、オロト酸の２９５ｎｍでの吸光係数３．６７Ｍ−１．ｃｍ−１を用いて計算した。
【０１３２】
ホスホリボシルピロリン酸シンテターゼ（ＰＲＳＡ）活性の測定
ＰＲＳＡ活性の測定のために、フラスコ培養の細胞（乾重２５ｍｇ）をリン酸カリウムバッファーに懸濁させ、ガラスビーズの入った試験管に移し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（６５００ｒｐｍで３０秒、Bertin Technologies）を用いて溶解させた。１２０００ｇ（４℃）で３０分間遠心分離を行うことにより、細胞残渣を除去した。ブラッドフォードタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を測定した。リボース−５−リン酸に対するＰＲＳＡ（ＰＲＰＰシンテターゼ）活性を、ＩＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＤＩＯＮＥＸ／ＡＰＩ２０００）とその後のＰＲＰＰの生産によって検出した。５０ｍＭのＴＥＡ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭのＡＴＰおよび２ｍＭのリボース−５−リン酸を含有する反応混合物（１ｍＬ）を３７℃で１０分間インキュベートした。その後、５０ｎｇの粗抽出液を添加して反応を開始させた。３０分後、限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ  １０Ｋ）により反応を停止させ、生産されたＰＲＰＰの量を定量した。
【０１３３】
【表７】
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参照文献
2013537429.tif 000012
【図１】
2013537429.tif 000013
【図２】
2013537429.tif 000014
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2013537429.tif 000017
2013537429.tif 000018
2013537429.tif 000019
2013537429.tif 000020
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