(57)【要約】  ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ及びそれらの使用が開示される。特に、式（Ｉ）：ＰＥＧ−Ｍ−Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ、又はその薬学的に許容される塩、並びに式（ＩＩ）：［Ａａｐ］Ｅｘｅｎｄｉｎ−４で示されるエキセンディン−４アナログが開示される（式中、各記号は本明細書で定義される意味を有する）。さらに、ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの調製方法、ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの使用、ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを含む組成物、及びＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの調製におけるエキセンディン−４アナログの使用が開示される。ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログにおいては、ポリエチレングリコールによる修飾がエキセンディン−４のペプチド鎖で部位特異的に生じている。ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログは、ＧＬＰ−１受容体の活性低下に関連する疾患及び／又は症状（例えばＩＩ型糖尿病）の予防及び／又は治療のために使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
ＰＥＧ−Ｍ−Ｘ−（Ｅｘ−４）  （Ｉ）
［式中、
ＰＥＧはＲＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−を表し、ＲはＨ又はＣＨ３であり、ｎは２５〜２５００の整数であり、
Ｍは、
【化１】
2013537879.tif 000026
【化２】
2013537879.tif 000027
又は
【化３】
2013537879.tif 000028
を表し、一方の側では各々の窒素原子又は硫黄原子によってＰＥＧ部分に結合しており、他方の側ではＸ部分のヒドロスルフリルに結合しており、
Ｘ−（Ｅｘ−４）は、構造：
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａａ２１−Ａａ２２−Ａａ２３−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａａ２７−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａａ３１−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａａ３６−Ａａ３７−Ａａ３８−Ｓｅｒ−ＮＨ２（ここで、Ａａ２１、Ａａ２２、Ａａ２３、Ａａ２７、Ａａ３１、Ａａ３６、Ａａ３７及びＡａ３８は各々独立に、アミノ酸：Ｃｙｓ、Ｔｈｐ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌから選択され、Ａａ２１、Ａａ２２、Ａａ２３、Ａａ２７、Ａａ３１、Ａａ３６、Ａａ３７及びＡａ３８のうちの１つはＣｙｓ又はＴｈｐである。）
を有するエキセンディン−４アナログを表し、
Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるエキセンディン−４アナログにおける２１、２２、２３、２７、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、システイン又は４−チオプロリン（Ｔｈｐ、
【化４】
2013537879.tif 000029
）であるアミノ酸（該アミノ酸のヒドロスルフリルはＭ基に結合している。）を表す。］
で示されるＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
式（Ｉ）：
ＰＥＧ−Ｍ−Ｘ−（Ｅｘ−４）  （Ｉ）
［式中、
ＰＥＧは、分子量１，０００〜１００，０００のポリエチレングリコールを表し、
Ｍは、
【化５】
2013537879.tif 000030
【化６】
2013537879.tif 000031
又は
【化７】
2013537879.tif 000032
を表し、一方の側では各々の窒素原子又は硫黄原子によってＰＥＧ部分に結合しており、他方の側ではＸ部分のヒドロスルフリルに結合しており、
Ｘ−（Ｅｘ−４）は、アミノ酸３９個のペプチドであって、
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ２１−Ｐｈｅ２２−Ｉｌｅ２３−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ２７−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ３１−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ３６−Ｐｒｏ３７−Ｐｒｏ３８−Ｓｅｒ−ＮＨ２
において２１、２２、２３、２７、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸がシステイン又は４−チオプロリン（Ｔｈｐ、
【化８】
2013537879.tif 000033
）に置換されたペプチドを表し、
Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるアミノ酸３９個のペプチドにおける２１、２２、２３、２７、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、システイン又は４−チオプロリン（Ｔｈｐ、
【化９】
2013537879.tif 000034
）であるアミノ酸（該アミノ酸のヒドロスルフリルはＭ基に結合している。）を表す。］
で示されるＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
ｎは５０〜２０００の整数、５０〜１５００の整数、５０〜１０００の整数、７５〜１５００の整数、７５〜１０００の整数、７５〜５００の整数、又は１００〜５００の整数である、請求項１に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ。
【請求項４】
ＰＥＧは、分子量１，０００〜１００，０００、２，０００〜８０，０００、３，０００〜６０，０００、４，０００〜６０，０００、５，０００〜６０，０００、３，０００〜５０，０００、４，０００〜４０，０００、４，０００〜３０，０００、又は５，０００〜２０，０００のポリエチレングリコールを表す、請求項１又は２に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ。
【請求項５】
Ｘ−（Ｅｘ−４）は、構造：
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａａ２１−Ａａ２２−Ａａ２３−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａａ２７−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａａ３１−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａａ３６−Ａａ３７−Ａａ３８−Ｓｅｒ−ＮＨ２（ここで、Ａａ２１、Ａａ２２、Ａａ２３、Ａａ２７、Ａａ３１、Ａａ３６、Ａａ３７及びＡａ３８は各々独立に、アミノ酸：Ｃｙｓ、Ｔｈｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏから選択され、Ａａ２１、Ａａ２２、Ａａ２３、Ａａ２７、Ａａ３１、Ａａ３６、Ａａ３７及びＡａ３８のうちの１つはＣｙｓ又はＴｈｐである。）
を有するエキセンディン−４アナログを表す、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ。
【請求項６】
Ａａ２１はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＬｅｕからなる群から選択され、Ａａ２２はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｈｅからなる群から選択され、Ａａ２３はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＩｌｅからなる群から選択され、Ａａ２７はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＬｙｓからなる群から選択され、Ａａ３１はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｒｏからなる群から選択され、Ａａ３６はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｒｏからなる群から選択され、Ａａ３７はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｒｏからなる群から選択され、Ａａ３８はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｒｏからなる群から選択され、Ａａ２１、Ａａ２２、Ａａ２３、Ａａ２７、Ａａ３１、Ａａ３６、Ａａ３７及びＡａ３８のうちの１つはＣｙｓ又はＴｈｐである、請求項５に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ。
【請求項７】
Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるエキセンディン−４アナログにおける２１、２２、２３、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、システイン又は４−チオプロリンであるアミノ酸を表す、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ。
【請求項８】
Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるエキセンディン−４アナログにおける２１、２２、２３、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、システインであるアミノ酸を表す、請求項７に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ。
【請求項９】
Ｘが、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるエキセンディン−４アナログにおける３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、４−チオプロリンであるアミノ酸を表す、請求項７に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ。
【請求項１０】
部位特異的ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ又はその薬学的に許容される塩である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ。
【請求項１１】
部位特異的ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ又はその薬学的に許容される塩であり、ＰＥＧ修飾はモノＰＥＧ修飾である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ。
【請求項１２】
［Ｃｙｓ２１（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ２２（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ２３（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３１（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３６（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３７（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３８（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｔｈｐ３１（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｔｈｐ３６（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｔｈｐ３７（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｔｈｐ３８（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、及び
［Ｃｙｓ３１（ｍＰＥＧ２００００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、又は
それらの薬学的に許容される塩
からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ。
【請求項１３】
式（ＩＩ）：
［Ａａｐ］Ｅｘｅｎｄｉｎ−４  （ＩＩ）
［式中、
Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、アミノ酸３９個のペプチド：
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ２１−Ｐｈｅ２２−Ｉｌｅ２３−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ２７−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ３１−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ３６−Ｐｒｏ３７−Ｐｒｏ３８−Ｓｅｒ−ＮＨ２
を表し、
Ａａｐは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４で示されるアミノ酸３９個のペプチドのｐ位のアミノ酸を置換しているアミノ酸であって、システイン（Ｃｙｓ）又は４−チオプロリン（Ｔｈｐ、
【化１０】
2013537879.tif 000035
）から選択されるアミノ酸を表し、
ｐは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４で示されるアミノ酸３９個のペプチドの２１、２２、２３、２７、３１、３６、３７又は３８位を表す。］
で示されるエキセンディン−４アナログ。
【請求項１４】
Ａａｐは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４で示されるアミノ酸３９個のペプチドのｐ位のアミノ酸を置換しているシステインを表し、
ｐは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４で示されるアミノ酸３９個のペプチドの２１、２２、２３、３１、３６、３７又は３８位を表す、
請求項１３に記載のエキセンディン−４アナログ。
【請求項１５】
Ａａｐは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４で示されるアミノ酸３９個のペプチドのｐ位のアミノ酸を置換している４−チオプロリンを表し、
ｐは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４で示されるアミノ酸３９個のペプチドの３１、３６、３７又は３８位を表す、
請求項１３に記載のエキセンディン−４アナログ。
【請求項１６】
［Ｃｙｓ２１］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ２２］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ２３］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３１］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３６］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３７］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３８］エキセンディン−４、
［Ｔｈｐ３１］エキセンディン−４、
［Ｔｈｐ３６］エキセンディン−４、
［Ｔｈｐ３７］エキセンディン−４、及び
［Ｔｈｐ３８］エキセンディン−４
からなる群から選択される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のエキセンディン−４アナログ。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを調製するための方法であって、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のエキセンディン−４アナログをＰＥＧ−Ｍ（Ｍは請求項１での定義と同義である。）と反応させるステップを含む方法。
【請求項１８】
ＧＬＰ−１受容体アゴニストとしての薬剤の調製、
ＧＬＰ−１受容体の低活性に伴う疾患及び／又は症状の予防及び／又は治療のための薬剤の調製、
グリセリドの調節、インスリン分泌の促進、循環グルカゴンの低減、膵β細胞の質の向上、胃内容排出の抑制、栄養摂取の低減、及びインスリン感受性の改善のための薬剤の調製、
グルコース代謝に関連する疾患及び／又は症状の予防及び／又は治療のための薬剤の調製、
グルコース代謝疾患（例えば、ＩＩ型糖尿病、肥満及び／又は体脂肪蓄積、β細胞の機能低下）の予防及び／又は治療のための薬剤の調製、及び／又は
ＩＩ型糖尿病患者の血糖コントロールのための薬剤の調製
における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの使用。
【請求項１９】
予防及び／又は治療有効量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを含み、さらに任意選択で薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの調製における、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のエキセンディン−４アナログの使用。
【請求項２１】
ＧＬＰ−１受容体の活性化によって疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療するための方法であって、それを必要とする個体に予防及び／又は治療有効量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを投与するステップを含み、前記疾患及び／又は症状の予防及び／又は治療は、
ＧＬＰ−１受容体の低活性に伴う疾患及び／又は症状の予防及び／又は治療、
グリセリドの調節、インスリン分泌の促進、循環グルカゴンの低減、膵β細胞の質の向上、胃内容排出の抑制、栄養摂取の低減、及びインスリン感受性の改善、
グルコース代謝に関連する疾患及び／又は症状の予防及び／又は治療、
グルコース代謝疾患（例えば、ＩＩ型糖尿病、肥満及び／又は体脂肪蓄積、β細胞の機能低下）の予防及び／又は治療、及び／又は
ＩＩ型糖尿病患者の血糖コントロール
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、部位特異的ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ、該アナログの調製方法、該アナログを含む医薬組成物、該アナログの前駆体、及び疾患（例えばＩＩ型糖尿病）の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エキセンディン−４は、アメリカドクトカゲ（ヘロデルマ・ススペクトゥム（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ））の唾液から分離され、同定された天然物である。エキセンディン−４は、配列：
Ｈｉｓ１−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ５−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ１０−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ１５−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ２０−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ２５−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ３０−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ３５−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ３９−ＮＨ２
を有する、アミノ酸３９個のペプチドである。エキセンディン−４は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）のアナログである。エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１受容体を活性化できるＧＬＰ−１受容体アゴニストであり、種々の生物学的活性（例えば、グリセリドの調節、インスリンの分泌促進、循環グルカゴンの低減、膵β細胞の質の向上、胃内容排出の抑制、栄養摂取の低減、インスリン感受性の改善）を有する。エキセンディン−４は、ｉｎ  ｖｉｖｏで自然に分泌されたホルモンを模倣でき、それ故人体内での血糖値の調節に役立つ。さらに、エキセンディン−４は、患者に必要でない場合には機能を停止する。エキセンディン−４の別の特徴は、インスリン分泌を行うβ細胞の分泌の第１相の回復にある。分泌の第１相は、食物摂取によって誘導されるインスリン分泌を指す。しかし、ＩＩ型糖尿病患者は、疾患の経過の初期にそのような反応を行う能力を失う。エキセンディン−４は血糖を低下させるだけではなく、失われた細胞機能を増強させることもでき、それ故ＩＩ型糖尿病の治療にとっての大きな進展である。
【０００３】
エキセンディン−４は、ジメチルジグアニド薬及びスルホニル尿素薬の使用による血糖コントロールが理想的でない場合にＩＩ型糖尿病患者の血糖コントロールを改善することを目的として、米国ＦＤＡによって２００５年４月に承認されている。エキセンディン−４は、糖尿病の治療に関して著しい治療効果及び軽度の副作用を有することが臨床試験で示されているが、１日２回の皮下投与が必要なため患者には不便である。
【０００４】
エキセンディン−４は、その有効性及び独特な血中グルコース依存性機構により、徐放性製剤の調製により適している。Ａｌｋｅｎｎｅｓ  Ｃｏ．との協力でＡｍｙｌｉｎ  Ｃｏ．によって２０００年５月に開発された製品である徐放性注射剤のエキセンディン−４ＬＡＲが第ＩＩ相臨床試験を終了している。その結果は、１５週間経っても薬剤は２つの用量レベルの各々で良好な忍容性を示し、エキセンディン−４の血中濃度はいずれも予想された治療範囲に達したことを示している。そして、エキセンディン−４はＩＩ型糖尿病の治療機構の観点から大きな優位性を有するので、長時間作用性のエキセンディン−４アナログの開発は世界の多くの製薬会社でも研究開発のホットスポットとなっている。
【０００５】
ポリペプチド薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって修飾された後でも依然として優れた生物活性を維持でき、そのような修飾は、生物においてｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有意に延長できることが研究により示されている。エキセンディン−４のＰＥＧ修飾に関する報告があるが、そこではそれぞれ、Ｈｉｓ１、Ｌｙｓ１２及びＬｙｓ２７のアミノ基でＰＥＧ修飾されたものが開示されている。ラットにおける代謝研究において、その代謝半減期はエキセンディン−４よりもはるかに長いことが判明している（Ｊｉｎ  Ｚｈｏｕら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，２００９，７２：４１２〜４１７）。さらに、エキセンディン−４が、Ｌｙｓ１２及びＬｙｓ２７のε−アミノ基で脂肪酸、リトコール酸又はヒアルロン酸によって修飾された場合、それぞれ、単一修飾及び二重修飾された化合物が得られたとの報告がなされている（Ｓｕ  Ｙｏｕｎｇ  Ｃｈａｅら，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１０，  １４４（１）：１０〜１６；Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅａｌｅａｓｅ，２０１０，  １４２：２０６〜２１３；Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１０，  ３１：４１２１〜４１２８）。
【０００６】
しかしながら、当業者に理解されているように、エキセンディン−４がＰＥＧによって修飾されていても、脂肪酸、リトコール酸又はヒアルロン酸によって修飾されていても、修飾部位に対する特異性の低さに関する問題がある。したがって、修飾による生成物は、種々の単一部位で修飾された種々の化合物の混合物である可能性があり、医薬への適用において非常に不利となる。
【０００７】
このように、当業界では、依然として、エキセンディン−４の生物学的活性を維持しながらエキセンディン−４の部位特異的修飾を行う方法を提供し、エキセンディン−４の修飾（例えばＰＥＧ修飾）に対する特異性の低さに関する問題を克服するために、修飾エキセンディン−４（例えばＰＥＧ修飾エキセンディン−４）を提供することが求められている。
【発明の内容】
【０００８】
本発明によって解決されるべき技術的な課題は、エキセンディン−４の修飾（例えばＰＥＧ修飾）の低い特異性という欠点を克服すること、エキセンディン−４及び修飾エキセンディン−４（例えばＰＥＧ修飾エキセンディン−４）の生物学的活性を維持しながらエキセンディン−４の部位特異的修飾を行う方法を提供することである。驚くべきことに、本発明者らは、エキセンディン−４のアミノ酸を別のアミノ酸に置換して得られるエキセンディン−４アナログがＰＥＧ化学修飾の際に良好な反応特異性を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、本発明によるエキセンディン−４アナログのＰＥＧ修飾によって得られるＰＥＧ修飾生成物がＧＬＰ−１受容体のアゴニスト活性を有することを見出した。本発明は、上記発見に基づいてなされたものである。
【０００９】
［発明の概要］
第１の態様において、本発明は、式（Ｉ）：
ＰＥＧ−Ｍ−Ｘ−（Ｅｘ−４）  （Ｉ）
［式中、各記号は本明細書で定義される意味を有する。］
で示されるＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、式（ＩＩ）：
［Ａａｐ］Ｅｘｅｎｄｉｎ−４  （ＩＩ）
［式中、各記号は本明細書で定義される意味を有する。］
で示されるエキセンディン−４アナログを提供する。
【００１１】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを調製するための方法を提供する。
【００１２】
第４の態様において、本発明は、本発明の第２の態様のエキセンディン−４アナログを調製するための方法を提供する。
【００１３】
第５の態様において、本発明は、薬剤の調製における、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの使用を提供する。
【００１４】
第６の態様において、本発明は、予防及び／又は治療有効量の本発明の第１の態様のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを含み、さらに任意選択で薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００１５】
第７の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの調製における、本発明の第２の態様のエキセンディン−４アナログの使用を提供する。
【００１６】
第８の態様において、本発明は、ＧＬＰ−１受容体を活性化するための方法、及びそれを必要とする個体において関連疾患又は症状を治療するための方法を提供する。
【００１７】
第９の態様において、本発明は、ＧＬＰ−１受容体アゴニストとして又は疾患又は症状の予防及び／又は治療剤として使用するための、本発明の第１の態様のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを提供する。
【００１８】
第１０の態様において、本発明は、それを必要とする個体においてＧＬＰ−１受容体を活性化するため、又はＧＬＰ−１受容体の低活性に伴う疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療するための組成物であって、本発明の第１の態様のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを含む組成物を提供する。
【００１９】
［発明の詳細な説明］
第１の態様において、本発明は、式（Ｉ）：
ＰＥＧ−Ｍ−Ｘ−（Ｅｘ−４）  （Ｉ）
［式中、
ＰＥＧはＲＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−を表し、ＲはＨ又はＣＨ３であり、ｎは２５〜２５００の整数であり、
Ｍは、
【化１】
2013537879.tif 000002
【化２】
2013537879.tif 000003
又は
【化３】
2013537879.tif 000004
を表し、一方の側では各々の窒素原子又は硫黄原子によってＰＥＧ部分に結合しており、他方の側ではＸ部分のヒドロスルフリルに結合しており、
Ｘ−（Ｅｘ−４）は、構造：
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａａ２１−Ａａ２２−Ａａ２３−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａａ２７−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａａ３１−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａａ３６−Ａａ３７−Ａａ３８−Ｓｅｒ−ＮＨ２（ここで、Ａａ２１、Ａａ２２、Ａａ２３、Ａａ２７、Ａａ３１、Ａａ３６、Ａａ３７及びＡａ３８は各々独立に、アミノ酸：Ｃｙｓ、Ｔｈｐ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌから選択され、Ａａ２１、Ａａ２２、Ａａ２３、Ａａ２７、Ａａ３１、Ａａ３６、Ａａ３７及びＡａ３８のうちの１つはＣｙｓ又はＴｈｐである。）
を有するエキセンディン−４アナログを表し、
Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるエキセンディン−４アナログにおける２１、２２、２３、２７、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、システイン又は４−チオプロリン（Ｔｈｐ、
【化４】
2013537879.tif 000005
）であるアミノ酸（該アミノ酸のヒドロスルフリルはＭ部分に結合している。）を表す。］
で示されるＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【００２０】
さらに、第１の態様において、本発明は、式（Ｉ）：
ＰＥＧ−Ｍ−Ｘ−（Ｅｘ−４）  （Ｉ）
［式中、
ＰＥＧは、分子量１，０００〜１００，０００のポリエチレングリコールを表し、
Ｍは、
【化５】
2013537879.tif 000006
【化６】
2013537879.tif 000007
又は
【化７】
2013537879.tif 000008
を表し、一方の側では各々の窒素原子又は硫黄原子によってＰＥＧ部分に結合しており、他方の側ではＸ部分のヒドロスルフリルに結合しており、
Ｘ−（Ｅｘ−４）は、アミノ酸３９個のペプチドであって、
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ２１−Ｐｈｅ２２−Ｉｌｅ２３−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ２７−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ３１−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ３６−Ｐｒｏ３７−Ｐｒｏ３８−Ｓｅｒ−ＮＨ２
において２１、２２、２３、２７、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸がシステイン又は４−チオプロリン（Ｔｈｐ、
【化８】
2013537879.tif 000009
）に置換されたペプチドを表し、
Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるアミノ酸３９個のペプチドにおける２１、２２、２３、２７、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、システイン又は４−チオプロリン（Ｔｈｐ、
【化９】
2013537879.tif 000010
）であるアミノ酸（該アミノ酸のヒドロスルフリルはＭ部分に結合している。）を表す。］
で示されるＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【００２１】
好ましくは、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログにおいて、ＰＥＧはＲＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−を表し、式中、ＲはＨ又はＣＨ３であり、ｎは５０〜２０００の整数である。一実施形態において、ＲはＨである。一実施形態において、ＲはＣＨ３である。一実施形態において、ｎは５０〜１５００の整数である。一実施形態において、ｎは５０〜１０００の整数である。一実施形態において、ｎは７５〜１５００の整数である。一実施形態において、ｎは７５〜１０００の整数である。一実施形態において、ｎは７５〜５００の整数である。一実施形態において、ｎは１００〜５００の整数である。
【００２２】
好ましくは、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログにおいて、ＰＥＧは分子量１，０００〜１００，０００のポリエチレングリコールを表す。一実施形態において、ＰＥＧは分子量２，０００〜８０，０００のポリエチレングリコールを表す。一実施形態において、ＰＥＧは分子量３，０００〜６０，０００のポリエチレングリコールを表す。一実施形態において、ＰＥＧは分子量４，０００〜６０，０００のポリエチレングリコールを表す。一実施形態において、ＰＥＧは分子量５，０００〜６０，０００のポリエチレングリコールを表す。一実施形態において、ＰＥＧは分子量３，０００〜５０，０００のポリエチレングリコールを表す。一実施形態において、ＰＥＧは分子量４，０００〜４０，０００のポリエチレングリコールを表す。一実施形態において、ＰＥＧは分子量４，０００〜３０，０００のポリエチレングリコールを表す。一実施形態において、ＰＥＧは分子量５，０００〜２０，０００のポリエチレングリコールを表す。
【００２３】
好ましくは、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログにおいて、Ｍは、
【化１０】
2013537879.tif 000011
（本発明において場合によりＭＡＬで表す。）
【化１１】
2013537879.tif 000012
又は
【化１２】
2013537879.tif 000013
を表し、一方の側では各々の窒素原子又は硫黄原子によってＰＥＧ部分に結合しており、他方の側ではＸ部分のヒドロスルフリルに結合している。例えば、それらはそれぞれ、
【化１３】
2013537879.tif 000014
【化１４】
2013537879.tif 000015
又は
【化１５】
2013537879.tif 000016
［各式中、Ｐｅｇは本明細書で定義されるポリエチレングリコールを表す。］
を形成する。一実施形態において、Ｍは
【化１６】
2013537879.tif 000017
を表す。
【００２４】
好ましくは、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログにおいて、Ｘ−（Ｅｘ−４）は、構造：
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａａ２１−Ａａ２２−Ａａ２３−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａａ２７−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａａ３１−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａａ３６−Ａａ３７−Ａａ３８−Ｓｅｒ−ＮＨ２（ここで、Ａａ２１、Ａａ２２、Ａａ２３、Ａａ２７、Ａａ３１、Ａａ３６、Ａａ３７及びＡａ３８は各々独立に、アミノ酸：Ｃｙｓ、Ｔｈｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏから選択され、Ａａ２１、Ａａ２２、Ａａ２３、Ａａ２７、Ａａ３１、Ａａ３６、Ａａ３７及びＡａ３８のうちの１つはＣｙｓ又はＴｈｐである。）
を有するエキセンディン−４アナログを表す。一実施形態において、Ａａ２１はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＬｅｕからなる群から選択され、Ａａ２２はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｈｅからなる群から選択され、Ａａ２３はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＩｌｅからなる群から選択され、Ａａ２７はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＬｙｓからなる群から選択され、Ａａ３１はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｒｏからなる群から選択され、Ａａ３６はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｒｏからなる群から選択され、Ａａ３７はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｒｏからなる群から選択され、Ａａ３８はＣｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｒｏからなる群から選択され、Ａａ２１、Ａａ２２、Ａａ２３、Ａａ２７、Ａａ３１、Ａａ３６、Ａａ３７及びＡａ３８のうちの１つはＣｙｓ又はＴｈｐである。
【００２５】
好ましくは、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログにおいて、Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるエキセンディン−４アナログにおける２１、２２、２３、２７、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、システイン又は４−チオプロリンであるアミノ酸（該アミノ酸のヒドロスルフリルはＭ基に結合している。）を表す。一実施形態において、Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるエキセンディン−４アナログにおける２１、２２、２３、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、システイン又は４−チオプロリンであるアミノ酸を表す。一実施形態において、Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるエキセンディン−４アナログにおける２１、２２、２３、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、システインであるアミノ酸を表す。一実施形態において、Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるエキセンディン−４アナログにおける３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、４−チオプロリンであるアミノ酸を表す。
【００２６】
好ましくは、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログにおいて、Ｘ−（Ｅｘ−４）は、アミノ酸３９個のペプチドであって、
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ２１−Ｐｈｅ２２−Ｉｌｅ２３−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ２７−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ３１−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ３６−Ｐｒｏ３７−Ｐｒｏ３８−Ｓｅｒ−ＮＨ２
において２１、２２、２３、２７、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸がシステイン（Ｃｙｓ）又は４−チオプロリン（Ｔｈｐ、
【化１７】
2013537879.tif 000018
）に置換されたペプチドを表す。一実施形態において、Ａａ２１はＣｙｓ及びＴｈｐからなる群から選択される。一実施形態において、Ａａ２２はＣｙｓ及びＴｈｐからなる群から選択される。一実施形態において、Ａａ２３はＣｙｓ及びＴｈｐからなる群から選択される。一実施形態において、Ａａ２７はＣｙｓ及びＴｈｐからなる群から選択される。一実施形態において、Ａａ３１はＣｙｓ及びＴｈｐからなる群から選択される。一実施形態において、Ａａ３６はＣｙｓ及びＴｈｐからなる群から選択される。一実施形態において、Ａａ３７はＣｙｓ及びＴｈｐからなる群から選択される。一実施形態において、Ａａ３８はＣｙｓ及びＴｈｐからなる群から選択される。
【００２７】
好ましくは、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログにおいて、Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるアミノ酸３９個のペプチドにおける２１、２２、２３、２７、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、システイン又は４−チオプロリンであるアミノ酸（該アミノ酸のヒドロスルフリルはＭ基に結合している。）を表す。一実施形態において、Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるアミノ酸３９個のペプチドにおける２１、２２、２３、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、システイン又は４−チオプロリンであるアミノ酸を表す。一実施形態において、Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるアミノ酸３９個のペプチドにおける２１、２２、２３、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、システインであるアミノ酸を表す。一実施形態において、Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）Ｘで示されるアミノ酸３９個のペプチドにおける３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、４−チオプロリンであるアミノ酸を表す。
【００２８】
好ましくは、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログは、部位特異的ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ又はその薬学的に許容される塩である。好ましくは、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログは、部位特異的ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログ又はその薬学的に許容される塩であり、ＰＥＧ修飾はモノＰＥＧ修飾である。
【００２９】
好ましくは、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログは、
［Ｃｙｓ２１（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ２２（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ２３（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３１（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３６（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３７（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３８（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｔｈｐ３１（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｔｈｐ３６（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｔｈｐ３７（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、
［Ｔｈｐ３８（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、及び
［Ｃｙｓ３１（ｍＰＥＧ２００００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４、又は
それらの薬学的に許容される塩
から選択される。
【００３０】
上記式で示される化合物において、例えば、［Ｃｙｓ２１（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］Ｅｘｅｎｄｉｎ−４で示される化合物の場合、Ｃｙｓ２１は、エキセンディン−４の２１位のアミノ酸ＬｅｕがＣｙｓに置換されていることを意味する。すなわち、ここで、アミノ酸３９個のペプチドは、２１位のアミノ酸がＣｙｓであるエキセンディン−４アナログである。ｍＰＥＧ５０００は、端部にメチル（ｍで表される。）を有する分子量約５０００のポリエチレングリコールを表す。ＭＡＬは、
【化１８】
2013537879.tif 000019
を表す。すなわち、［Ｃｙｓ２１（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、２１位のアミノ酸がＣｙｓに置換されているエキセンディン−４アナログがＭＡＬを経由して分子量約５０００のポリエチレングリコールに結合している（ここで、ＭＡＬは、一方の側では窒素原子によってＰＥＧ部分に結合しており、他方の側ではＣｙｓのヒドロスルフリルに結合している。）ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを表す。他の式も同様の意味を有する。
【００３１】
第２の態様において、本発明は、式（ＩＩ）：
［Ａａｐ］Ｅｘｅｎｄｉｎ−４  （ＩＩ）
［式中、
Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、アミノ酸３９個のペプチド：
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ２１−Ｐｈｅ２２−Ｉｌｅ２３−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ２７−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ３１−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ３６−Ｐｒｏ３７−Ｐｒｏ３８−Ｓｅｒ−ＮＨ２
を表し、
Ａａｐは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４で示されるアミノ酸３９個のペプチドのｐ位のアミノ酸を置換しているアミノ酸であって、システイン（Ｃｙｓ）又は４−チオプロリン（Ｔｈｐ、
【化１９】
2013537879.tif 000020
）から選択されるアミノ酸を表し、
ｐは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４で示されるアミノ酸３９個のペプチドの２１、２２、２３、２７、３１、３６、３７又は３８位を表す。］
で示されるエキセンディン−４アナログを提供する。
【００３２】
好ましくは、本発明の第２の態様のいずれかのエキセンディン−４アナログにおいて、
Ａａｐは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４で示されるアミノ酸３９個のペプチドのｐ位のアミノ酸を置換しているシステインを表し、
ｐは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４で示されるアミノ酸３９個のペプチドの２１、２２、２３、３１、３６、３７又は３８位を表す。
【００３３】
好ましくは、本発明の第２の態様のいずれかのエキセンディン−４アナログにおいて、
Ａａｐは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４で示されるアミノ酸３９個のペプチドのｐ位のアミノ酸を置換している４−チオプロリンを表し、
ｐは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４で示されるアミノ酸３９個のペプチドの３１、３６、３７又は３８位を表す。
【００３４】
好ましくは、本発明の第２の態様のいずれかのエキセンディン−４アナログは、
［Ｃｙｓ２１］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ２２］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ２３］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３１］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３６］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３７］エキセンディン−４、
［Ｃｙｓ３８］エキセンディン−４、
［Ｔｈｐ３１］エキセンディン−４、
［Ｔｈｐ３６］エキセンディン−４、
［Ｔｈｐ３７］エキセンディン−４、及び
［Ｔｈｐ３８］エキセンディン−４
からなる群から選択される。
【００３５】
上記式で示される化合物において、例えば、［Ｃｙｓ２１］エキセンディン−４で示される化合物の場合、Ｃｙｓ２１は、エキセンディン−４の２１位のアミノ酸ＬｅｕがＣｙｓに置換されていることを意味する。すなわち、ここで、エキセンディン−４で示されるアミノ酸３９個のペプチドは、２１位にＣｙｓを有するエキセンディン−４アナログである。すなわち、［Ｃｙｓ２１］エキセンディン−４は、２１位のアミノ酸がＣｙｓに置換されているエキセンディン−４を表す。他の式も同様の意味を有する。
【００３６】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを調製するための方法であって、本発明の第２の態様のいずれかのエキセンディン−４アナログをＰＥＧ−Ｍと反応させるステップを含む方法を提供する。一実施形態において、反応はリン酸塩緩衝液中で行われる。一実施形態において、反応は１０〜４０℃の温度（例えば、１５〜３５℃、室温）で行われる。一実施形態において、ＰＥＧ−ＭはＰＥＧ−ＭＡＬである。
【００３７】
本発明の第３の態様のいずれかの方法の一実施形態において、エキセンディン−４アナログは次のステップを通じて調製される。（１）標準的なＦｍｏｃ固相合成法により、エキセンディン−４アナログのアミノ酸配列に基づいてペプチド樹脂を合成するステップであって、Ｒｉｎｋアミド樹脂が固相担体として使用され、ＨＢＴＵ−ＨＯＢｔが縮合剤として使用され、対応するＦｍｏｃで保護されているアミノ酸が原料として使用されるステップ；（２）ペプチドの保護基を除去し、０〜４０℃でペプチドを樹脂から切断する（例えば、約０℃で約３０分間反応させ、次いで室温で９０分間反応させる）ステップであって、トリフルオロ酢酸、チオアニソール、メタクレゾール、ジチオグリコール及び水（体積比は、例えば、８．２５：０．５：０．５：０．２５：０．５）の混合溶液が切断溶液として使用されるステップ；及び（３）任意選択の精製ステップ。
【００３８】
すなわち、第４の態様において、本発明は、本発明の第２の態様のいずれかのエキセンディン−４アナログを調製するための方法であって、次のステップを含む方法を提供する。（１）標準的なＦｍｏｃ固相合成法により、エキセンディン−４アナログのアミノ酸配列に基づいてペプチド樹脂を合成するステップであって、Ｒｉｎｋアミド樹脂が固相担体として使用され、ＨＢＴＵ−ＨＯＢｔが縮合剤として使用され、対応するＦｍｏｃで保護されているアミノ酸が原料として使用されるステップ；（２）ペプチドの保護基を除去し、０〜４０℃でペプチドを樹脂から切断する（例えば、約０℃で約３０分間反応させ、次いで室温で９０分間反応させる）ステップであって、トリフルオロ酢酸、チオアニソール、メタクレゾール、ジチオグリコール及び水（体積比は、例えば、８．２５：０．５：０．５：０．２５：０．５）の混合溶液が切断溶液として使用されるステップ；及び（３）任意選択の精製ステップ。
【００３９】
第５の態様において、本発明は、ＧＬＰ−１受容体アゴニストとしての薬剤の調製における、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの使用を提供する。
【００４０】
第５の態様において、本発明は、ＧＬＰ−１受容体の低活性に伴う疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療するための薬剤の調製における、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの使用を提供する。一実施形態において、ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログは、グリセリドの調節、インスリン分泌の促進、循環グルカゴンの低減、膵β細胞の質の向上、胃内容排出の抑制、栄養摂取の低減、及びインスリン感受性の改善を行って、ＧＬＰ−１受容体の低活性に伴う疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療するのに有用である。
【００４１】
第５の態様において、本発明は、グルコース代謝に関連する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療するための薬剤の調製における、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの使用を提供する。一実施形態において、グルコース代謝に関連する疾患及び／又は症状は、ＩＩ型糖尿病、肥満及び／又は体脂肪蓄積、及びβ細胞の機能低下からなる群から選択される。
【００４２】
第５の態様において、本発明は、ＩＩ型糖尿病患者におけるｉｎ  ｖｉｖｏ血糖コントロールのための薬剤の調製における、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの使用も提供する。
【００４３】
第６の態様において、本発明は、予防及び／又は治療有効量の本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを含み、さらに任意選択で薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００４４】
第７の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの調製における、本発明の第２の態様のいずれかのエキセンディン−４アナログの使用を提供する。
【００４５】
第８の態様において、本発明は、それを必要とする個体においてＧＬＰ−１受容体を活性化するための方法であって、予防及び／又は治療有効量の本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを個体に投与することを含む方法を提供する。
【００４６】
第８の態様において、本発明は、それを必要とする個体においてＧＬＰ−１受容体の低活性に伴う疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療するための方法であって、予防及び／又は治療有効量の本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを個体に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本発明は、それを必要とする個体におけるグリセリドの調節、インスリン分泌の促進、循環グルカゴンの低減、膵β細胞の質の向上、胃内容排出の抑制、栄養摂取の低減、及び／又はインスリン感受性の改善のための方法であって、予防及び／又は治療有効量の本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを個体に投与することを含む方法を提供する。本発明の方法は、ＧＬＰ−１受容体の低活性に伴う疾患及び／又は症状の予防及び／又は治療に有用である。
【００４７】
第８の態様において、本発明は、それを必要とする個体においてグルコース代謝に関連する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療するための方法であって、予防及び／又は治療有効量の本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを個体に投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、グルコース代謝に関連する疾患及び／又は症状は、ＩＩ型糖尿病、肥満及び／又は体脂肪蓄積、及びβ細胞の機能低下からなる群から選択される。
【００４８】
第８の態様において、本発明は、それを必要とする個体における血糖コントロール法であって、予防及び／又は治療有効量の本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを個体に投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、個体はＩＩ型糖尿病に罹患している。
【００４９】
第９の態様において、本発明は、ＧＬＰ−１受容体アゴニストとして使用するための、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを提供する。
【００５０】
第９の態様において、本発明は、ＧＬＰ−１受容体の低活性に伴う疾患及び／又は症状の予防及び／又は治療に使用するための、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを提供する。一実施形態において、本発明は、グリセリドの調節、インスリン分泌の促進、循環グルカゴンの低減、膵β細胞の質の向上、胃内容排出の抑制、栄養摂取の低減、及び／又はインスリン感受性の改善に使用するための、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを提供する。
【００５１】
第９の態様において、本発明は、グルコース代謝に関連する疾患及び／又は症状の予防及び／又は治療に使用するための、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを提供する。一実施形態において、グルコース代謝に関連する疾患及び／又は症状は、ＩＩ型糖尿病、肥満及び／又は体脂肪蓄積、及びβ細胞の機能低下からなる群から選択される。
【００５２】
第９の態様において、本発明は、ＩＩ型糖尿病患者の血糖コントロールに使用するための、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを提供する。
【００５３】
第１０の態様において、本発明は、それを必要とする個体においてＧＬＰ−１受容体を活性化するための組成物であって、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを含む組成物を提供する。
【００５４】
第１０の態様において、本発明は、ＧＬＰ−１受容体の低活性に伴う疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療するための組成物であって、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを含む組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、グリセリドの調節、インスリンの分泌促進、循環グルカゴンの低減、膵β細胞の質の向上、胃内容排出の抑制、栄養摂取の低減、及び／又はインスリン感受性の改善のための組成物であって、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを含む組成物を提供する。
【００５５】
第１０の態様において、本発明は、それを必要とする個体においてグルコース代謝に関連する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療するための組成物であって、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを含む組成物を提供する。一実施形態において、グルコース代謝に関連する疾患及び／又は症状は、ＩＩ型糖尿病、肥満及び／又は体脂肪蓄積、及びβ細胞の機能低下からなる群から選択される。
【００５６】
第１０の態様において、本発明は、それを必要とする個体における血糖コントロールのための組成物であって、本発明の第１の態様のいずれかのＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを含む組成物を提供する。一実施形態において、個体はＩＩ型糖尿病に罹患している。
【００５７】
本発明のいずれの態様又はそのいずれのアイテムによって保有される特徴も、互いに相反することがない限り、他の任意の態様又はアイテムに適用される。もちろん、一態様又はそのいずれかのアイテムの特徴を他の態様又はそのいずれかのアイテムに適用する場合は、必要に応じて該特徴を適宜改変してもよい。本発明において、例えば「本発明の第１の態様のいずれか（のアイテム）」という場合、「いずれか（のアイテム）」とは本発明の第１の態様の任意の下位態様を指す。他の態様についても同様である。
【００５８】
本発明の種々の態様及び特徴は以下でさらに説明される通りである。
【００５９】
本発明で引用される文献は、参照されることによりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの文献において表現される意味が本発明の意味と異なる場合、本発明の表現により統制される。さらに、本発明で使用されている種々の用語及び語句は、当業者によって認識される一般的な意味を有する。そうはいっても、本発明ではこれらの用語及び語句をより詳しく説明することが意図されている。本明細書で言及されている用語及び語句が一般的な意味と異なる意味を有する場合、本発明で表現される意味が優先される。
【００６０】
本明細書において、「約」という用語は、例えば、生成物の収率を記述するのに使用される場合、一般的には当業界で許容できる誤差範囲（例えば、±１０％、±５％、±２％）を指す。
【００６１】
本明細書において、「有効量」という用語は、個体において、本発明における疾患又は障害が治療、予防、軽減及び／又は緩和され得る用量を指す。
【００６２】
本明細書において、「医薬組成物」という用語は、個体において、本発明における疾患、障害及び症状の治療、予防、軽減及び／又は緩和に有用な物質を指す。
【００６３】
本明細書において、「個体」又は「患者」は、本発明における疾患を治療、予防、軽減及び／又は緩和するために本発明の組成物又は抽出物の投与を受ける動物、特に哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、サル、ウシ、ウマ）を指す。
【００６４】
本明細書において、「疾患又は症状」という用語は、本発明における疾患又は症状に関連する、個体の身体状態を指す。
【００６５】
本明細書において、「％」は、特に断らない限り、物全体が固体である場合は重量／重量の百分率を指し、物全体が液体である場合は重量／体積の百分率を指す。もちろん、物全体が液体であり、溶質が液体である場合は、液体の溶質の百分率は体積／体積の百分率で特徴づけられる。
【００６６】
本明細書において、「エキセンディン−４」という用語は、配列：
Ｈｉｓ１−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ５−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ１０−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ１５−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ２０−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ２５−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ３０−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ３５−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ３９−ＮＨ２
を有する、アミノ酸３９個のペプチドを指す。「エキセンディン−４アナログ」という用語は、任意の位置（好ましくは２１、２２、２３、２７、３１、３６、３７又は３８位）の１つ又は複数のアミノ酸（好ましくは１つのアミノ酸）が他の１つ又は複数のアミノ酸（好ましくはシステイン又は４−チオプロリン）に置換されている、エキセンディン−４のアミノ酸３９個のペプチドを指す。
【００６７】
本明細書において、「ＰＥＧ」という用語はポリエチレングリコールを指す。そのサイズは重合度によって表される（本明細書において、ＰＥＧは、例えばＲＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−（ｎは２５〜２５００の整数）で表される）か、又は分子量によって表される（本明細書において、ＰＥＧは例えば分子量１，０００〜１００，０００のポリエチレングリコールとして表される）。これら２つの異なる表現法は当業者に周知のものであり、互いに相反するものではない。
【００６８】
本発明において、アミノ酸は特に断らない限りＬ−アミノ酸である。
【００６９】
本明細書において、「ＧＬＰ−１受容体に関連する疾患及び／又は症状」という用語は、ＧＬＰ−１受容体を刺激することにより予防及び／又は治療される関連疾患を指し、主としてグルコース代謝疾患（例えば、ＩＩ型糖尿病、肥満及び／又は体脂肪蓄積、β細胞の機能低下）を指す。
【００７０】
本発明の目的は、ＩＩ型糖尿病を治療するための長時間作用性薬剤の開発に役立つＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを提供することである。本発明者らは、反応特異性を有する官能基を含有するアミノ酸残基を導入すると、ＰＥＧに対するエキセンディン−４の反応特異性が上昇し、それにより、正確に部位特異的モノＰＥＧ修飾された化合物を得ることが可能となることを見出した。さらに、ＰＥＧの性質（例えば、ポリペプチド薬の作用時間の延長、バイオアベイラビリティーの向上）により、エキセンディン−４のｉｎ  ｖｉｖｏ挙動の改善が可能となる。
【００７１】
本発明の目的の１つは部位特異的ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの提供である。該アナログの構造は、部位特異的ＰＥＧ修飾がアミノ基、カルボキシル基又はヒドロスルフリル基でなされるように、エキセンディン−４のアミノ酸配列のいくつかのアミノ酸残基が改変されて側鎖に１つのアミノ基、カルボキシル基又はヒドロスルフリル基のみを有することを特徴とする。本発明のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログに関しては、本明細書に記載の式（Ｉ）の構造及びその定義を参照されたい。
【００７２】
本発明の別の目的は、ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを調製するための方法を提供することである。
【００７３】
本発明はまた、少なくとも１種のＰＥＧ化エキセンディン−４アナログ若しくは立体異性体又はその塩と、薬学的に許容される担体又は賦形剤と、を含む医薬組成物に関する。
【００７４】
本発明はまた、糖尿病の治療及び予防のための薬剤の調製における本発明の化合物の使用に関する。
【００７５】
本発明はまた、糖尿病及びグルコース代謝に関連する疾患又は症状の治療及び予防における本発明の化合物の使用に関する。
【００７６】
一態様において、本発明は、式（Ｉ）：
ＰＥＧ−Ｍ−Ｘ−（Ｅｘ−４）  （１）
［式中、
ＰＥＧはＲＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｒ＝Ｈ又はＣＨ３であり、ｎ＝２５〜２５００であり、
Ｍ＝
【化２０】
2013537879.tif 000021
又は
【化２１】
2013537879.tif 000022
又は
【化２２】
2013537879.tif 000023
であり、
Ｘ−（Ｅｘ−４）は、構造：
Ｈｉｓ１−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ５−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ１０−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ１５−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ２０−Ａａ２１−Ａａ２２−Ａａ２３−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ２５−Ｌｅｕ−Ａａ２７−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ３０−Ａａ３１−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ３５−Ａａ３６−Ａａ３７−Ａａ３８−Ｓｅｒ３９−ＮＨ２（ここで、Ａａ２１、Ａａ２２、Ａａ２３、Ａａ２７、Ａａ３１、Ａａ３６、Ａａ３７及びＡａ３８は各々独立に、Ｃｙｓ、Ｔｈｐ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選択される。但し、Ａａ２１、Ａａ２２、Ａａ２３、Ａａ２７、Ａａ３１、Ａａ３６、Ａａ３７及びＡａ３８のうちの１つのみがＣｙｓ又はＴｈｐである。）
を有するエキセンディン−４アナログであり、
Ｘは、Ｘ−（Ｅｘ−４）で示されるエキセンディン−４アナログにおける２１、２２、２３、２７、３１、３６、３７又は３８位のアミノ酸であって、システイン又は４−チオプロリン（Ｔｈｐ、
【化２３】
2013537879.tif 000024
）であるアミノ酸（これは、ヒドロスルフリルを経由してＭ基に結合している。）を表す。
特に断らない限り、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。］
で示されるＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログを提供する。
【００７７】
本発明のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの好ましい一実施形態において、式（Ｉ）のＸ−（Ｅｘ−４）部分は下記構造的特徴を有する。
Ａａ２１は、Ｃｙｓ、Ｔｈｐ及びＬｅｕからなる群から選択することができる。
Ａａ２２は、Ｃｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｈｅからなる群から選択することができる。
Ａａ２３は、Ｃｙｓ、Ｔｈｐ及びＩｌｅからなる群から選択することができる。
Ａａ２７は、Ｃｙｓ、Ｔｈｐ及びＬｙｓからなる群から選択することができる。
Ａａ３１は、Ｃｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｒｏからなる群から選択することができる。
Ａａ３６は、Ｃｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｒｏからなる群から選択することができる。
Ａａ３７は、Ｃｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｒｏからなる群から選択することができる。
Ａａ３８は、Ｃｙｓ、Ｔｈｐ及びＰｒｏからなる群から選択することができる。
Ａａ２１、Ａａ２２、Ａａ２３、Ａａ２７、Ａａ３１、Ａａ３６、Ａａ３７及びＡａ３８のうちの１つのみがＣｙｓ又はＴｈｐである。
特に断らない限り、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。
【００７８】
好ましくは、本発明のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログは、下記１２種のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログからなる群から選択される。
１．［Ｃｙｓ２１（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４
２．［Ｃｙｓ２２（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４
３．［Ｃｙｓ２３（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４
４．［Ｃｙｓ３１（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４
５．［Ｃｙｓ３６（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４
６．［Ｃｙｓ３７（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４
７．［Ｃｙｓ３８（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４
８．［Ｔｈｐ３１（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４
９．［Ｔｈｐ３６（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４
１０．［Ｔｈｐ３７（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４
１１．［Ｔｈｐ３８（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４
１２．［Ｃｙｓ３１（ｍＰＥＧ２００００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４
【００７９】
本発明の化合物は、従来のペプチド合成法（例えば、固相ペプチド合成法、液相ペプチド合成法、固相液相ペプチド合成法）によって調製される。アミノ酸は、Ｆｍｏｃ−／ｔＢｕ−又はＢｏｃ−／Ｂｚｌ−ストラテジーを用いて保護される。アミノ酸はＮ末端からＣ末端へ連結されるか、あるいはまずフラグメントが形成され、次いで該フラグメントが連結される。固相合成においては、アミド末端を形成できる限り種々の樹脂（例えば、ＭＢＨＡ、ＰＡＬ、Ｒｉｎｋアミド樹脂）が担体として使用可能である。種々の一般的な縮合剤（例えば、ＤＣＣ／ＨＯＢＴ、ＢＯＰ／ＤＩＥＡ、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＴＢＴＵ）が縮合反応に使用可能である。反応終了後、トリフルオロ酢酸又は無水ＨＦによってペプチドは樹脂から切断される。ＰＥＧ修飾剤へのペプチドの結合は、水溶液中又はリン酸緩衝液中で行われる。反応溶液のｐＨ値は適切に調節される。修飾生成物のモニター、単離及び精製はＲＰ−ＨＰＬＣによって行われる。最終生成物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって同定される。
【００８０】
本発明によれば、好ましい化合物の一部は、細胞レベルでＧＬＰ−１受容体を刺激することができる。
【００８１】
本発明はまた、少なくとも１種の修飾ペプチド及び／又は立体異性体又はその生理学的に無毒の塩を有効成分として含み、さらに医薬賦形剤又は補助剤を含む医薬組成物に関する。本明細書において、「医薬賦形剤又は補助剤」としては、例えば、溶媒、分散媒、被覆、抗菌若しくは抗真菌剤、等張剤、徐放剤、及び同様の生理学的に適合性のある物質が挙げられるが、静脈注射、筋肉内注射、皮下注射又は他の非経口投与に適したものが好ましい。投与法に応じて、有効成分を被覆して酸又は他の自然条件による不活性化から保護してもよい。
【００８２】
本発明において、「生理学的に無毒の塩」という用語は、いかなる予想外の副作用も引き起こすことなく親化合物（又はそれを含む組成物）の予想される生理学的活性を維持可能な塩を指す。例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、安息香酸塩、パモ酸塩、アルギン酸塩、メシル酸、ナフタレンスルホン酸塩が挙げられる。塩に含まれる陽イオンに基づいて、塩を無機塩（例えば、カリウム塩、リチウム塩、亜鉛塩、銅塩、バリウム塩、ビスマス塩、カルシウム塩）及び有機塩（例えばトリアルキルアンモニウム塩）に分類できる。
【００８３】
本発明の修飾ペプチド及びその立体異性体、又はそれを含む医薬組成物は、既知のいかなる経路（例えば、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、経鼻投与）で投与してもよい。投与剤形としては、例えば、錠剤、カプセル、バッカル錠、チュアブル錠、エリキシル剤、懸濁液、経皮剤、マイクロカプセル化剤、インプラント、シロップが挙げられる。本発明の修飾ペプチド及びその立体異性体、又はそれを含む医薬組成物は、通常の製剤、徐放性製剤、制御放出製剤、及び種々の微粒子薬物送達システムに製剤化してもよい。単位用量を錠剤に製剤化するために、当業界で既知の種々の生分解性又は生体適合性担体を広く使用できる。そのような担体としては、例えば、食塩水ベースの水溶液及び緩衝液、エタノール又は他のポリオール、リポソーム、ポリ乳酸、ビニル酢酸、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルが挙げられる。
【００８４】
本発明の修飾ペプチドの用量は、予防又は治療対象疾患の性質・重症度、患者又は動物の性、年齢、体重、感受性及び応答性、使用される具体的な化合物、投与経路、投与時間、要求される治療効果といった多くの因子に依存する。単回投与又は複数回（例えば、２回、３回、４回）投与の単位で上記用量を投与できる。当業者は、既知のエキセンディン−４の用量をアッセイから得られた研究結果と組み合わせて参照することによって、本発明のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログの具体的な用量を容易に決定できる。
【００８５】
本発明で使用されるいくつかの略号の意味は下記の通りである。
Ｅｘ−４はエキセンディン−４を表す。
ＰＥＧはポリエチレングリコールを表す。
Ａａはアミノ酸を表す。
Ａｌａはアラニンを表す。Ａｒｇはアルギニンを表す。
Ａｓｎはアスパラギンを表す。Ａｓｐはアスパラギン酸を表す。
Ｃｙｓはシステインを表す。Ｇｌｎはグルタミンを表す。
Ｇｌｕはグルタミン酸を表す。Ｇｌｙはグリシンを表す。
Ｈｉｓはヒスチジンを表す。Ｈｙｐはヒドロキシプロリンを表す。
Ｉｌｅはイソロイシンを表す。Ｌｅｕはロイシンを表す。
Ｌｙｓはリシンを表す。Ｍｅｔはメチオニンを表す。
Ｐｈｅはフェニルアラニンを表す。Ｐｒｏはプロリンを表す。
Ｓｅｒはセリンを表す。Ｔｈｒはスレオニンを表す。
Ｔｈｐはチオプロリンを表す。Ｔｒｐはトリプトファンを表す。
Ｔｙｒはチロシンを表す。Ｖａｌはバリンを表す。
Ｆｍｏｃはフルオレニルメチルオキシカルボニルを表す。
ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを表す。
ＤＣＣはＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドを表す。
ＨＯＢｔは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを表す。
ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を表す。
ＥＤＴはメルカプトエタノールを表す。
ＨＢＴＵは２−（１Ｈ−ヒドロキシベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩を表す。
ＲＰ−ＨＰＬＣは逆相高速液体クロマトグラフィーを表す。
他の略号は、当業界で認識されている意味を有する。
【実施例】
【００８６】
本発明はさらに、以下の実施例によって説明される。しかし、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく種々の改変及び変更を本発明に行うことができることは理解されよう。本明細書では、実験で使用された材料及び実験法の一般的及び／又は具体的な説明が行われる。本発明の目的を達成するために使用される材料及び操作の多くはよく知られているが、本明細書ではできるだけ詳細にそれらが説明される。
【００８７】
本実施例で使用された固相合成のための担体、Ｒｉｎｋアミド樹脂は、ＴＩＡＮＪＩＮ  ＮＡＮＫＡＩ  ＧＵＡＲＤ  ＣＯ．，ＬＴＤ．製のものである。ＨＯＢＴ、ＨＢＴＵ、ＤＩＥＡ及びＦｍｏｃ−保護天然アミノ酸は、ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｌｔｄ．から購入した。式（Ｉ）において「ＰＥＧ−Ｍ」で表されるＰＥＧ修飾部分（例えば、本実施例で使用されたｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）は、Ｋａｉｚｈｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．Ｃｏ．製のものである。
【００８８】
実施例１（［Ｃｙｓ２１（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４（化合物１）の合成）：
ステップ１（［Ｃｙｓ２１］エキセンディン−４の固相合成）：
化合物１のアミノ酸配列に基づいて、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成法によってペプチド樹脂を合成した。Ｒｉｎｋアミド樹脂６７０ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）を固相担体として使用した。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨを原料として使用した。ＨＢＴＵ−ＨＯＢｔを縮合剤として使用した。ペプチドを脱保護し、トリフルオロ酢酸、チオアニソール、メタクレゾール、ジチオグリコール及び水（体積比は、８．２５：０．５：０．５：０．２５：０．５）の混合溶液２５ｍｌを切断溶液として用いて樹脂から切断し、０℃で３０分間、次いで室温で９０分間放置した。粗ペプチドを２０％酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥して白色粉末（７１９ｍｇ）を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣによる粗ペプチドの精製後、バイオマス分光測定法により、分子量が４１７６、保持時間が１０．３６５分と決定した。ＨＰＬＣ条件は下記の通りであった。
Ａ相：０．０５％ＴＦＡ／水
Ｂ相：０．０５％ＴＦＡ／７０％ＡＣＮ／水
クロマトグラフィーカラム：ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ｊｕｐｉｌｅｒ  ５ｕ  Ｃ４  ３００Ａ  ４．６×２５０ｍｍ
グラジエント：０〜１７分  Ｂ％  ３５〜８５；１７〜２１分  Ｂ％  ８５〜３５；２５分で終了
流量：１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃
【００８９】
ステップ２（ＰＥＧ修飾部分を有するポリペプチドの反応）：
ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した［Ｃｙｓ２１］エキセンディン−４をリン酸塩緩衝液に溶解し、適量のｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬを加え、室温で反応を行った。ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて反応をモニターし、生成物を単離した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、生成物がＭｎ＝９１３５、２つの隣接ピーク間における約４４の分子量差、及びポリエチレングリコールの典型的な構造的特徴を有することを示した。ＲＰ−ＨＰＬＣの保持時間は１２．９２５分であった。
【００９０】
実施例２（［Ｃｙｓ２２（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４（化合物２）の合成）：
合成法に関しては実施例１を参照されたい。
［Ｃｙｓ２２］エキセンディン−４は、分子量４１４２、保持時間１０．８６分を有した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、ＰＥＧ修飾生成物がＭｎ＝９１４６、２つの隣接ピーク間における約４４の分子量差、ポリエチレングリコールの典型的な構造的特徴、及び１０．４３８分のＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間を有することを示した。
【００９１】
実施例３（［Ｃｙｓ２３（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４（化合物３）の合成）：
合成法に関しては実施例１を参照されたい。
［Ｃｙｓ２３］エキセンディン−４は、分子量４１７６、保持時間１０．８７５分を有した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、ＰＥＧ修飾生成物がＭｎ＝９１８０、２つの隣接ピーク間における約４４の分子量差、ポリエチレングリコールの典型的な構造的特徴、及び１１．５２分のＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間を有することを示した。
【００９２】
実施例４（［Ｃｙｓ３１（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４（化合物４）の合成）：
合成法に関しては実施例１を参照されたい。
［Ｃｙｓ３１］エキセンディン−４は、分子量４１９２、保持時間１１．１５分を有した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、ＰＥＧ修飾生成物がＭｎ＝９１５０、２つの隣接ピーク間における約４４の分子量差、ポリエチレングリコールの典型的な構造的特徴、及び１１．７２分のＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間を有することを示した。
【００９３】
実施例５（［Ｃｙｓ３６（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４（化合物５）の合成）：
合成法に関しては実施例１を参照されたい。
［Ｃｙｓ３６］エキセンディン−４は、分子量４１９２、保持時間１１．２１分を有した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、ＰＥＧ修飾生成物がＭｎ＝９１５１、２つの隣接ピーク間における約４４の分子量差、ポリエチレングリコールの典型的な構造的特徴、及び１１．８８分のＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間を有することを示した。
【００９４】
実施例６（［Ｃｙｓ３７（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４（化合物６）の合成）：
合成法に関しては実施例１を参照されたい。
［Ｃｙｓ３７］エキセンディン−４は、分子量４１９２、保持時間１０．９２分を有した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、ＰＥＧ修飾生成物がＭｎ＝９１５０、２つの隣接ピーク間における約４４の分子量差、ポリエチレングリコールの典型的な構造的特徴、及び１１．８２分のＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間を有することを示した。
【００９５】
実施例７（［Ｃｙｓ３８（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４（化合物７）の合成）：
合成法に関しては実施例１を参照されたい。
［Ｃｙｓ３８］エキセンディン−４は、分子量４１９２、保持時間１１．２４分を有した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、ＰＥＧ修飾生成物がＭｎ＝９１５３、２つの隣接ピーク間における約４４の分子量差、ポリエチレングリコールの典型的な構造的特徴、及び１１．９０分のＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間を有することを示した。
【００９６】
実施例８（［Ｔｈｐ３１（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４（化合物８）の合成）：
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｐ（Ｔｒｔ）−ＯＨをアミノ酸Ｔｈｐの原料として使用した。合成法に関しては実施例１を参照されたい。
［Ｔｈｐ３１］エキセンディン−４は、分子量４２１８、保持時間１１．０２分を有した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、ＰＥＧ修飾生成物がＭｎ＝９２２１、２つの隣接ピーク間における約４４の分子量差、ポリエチレングリコールの典型的な構造的特徴、及び１１．４５分のＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間を有することを示した。
【００９７】
実施例９（［Ｔｈｐ３６（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４（化合物９）の合成）：
合成法に関しては実施例８を参照されたい。
［Ｔｈｐ３６］エキセンディン−４は、分子量４２１８、保持時間１０．９５分を有した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、ＰＥＧ修飾生成物がＭｎ＝９２２２、２つの隣接ピーク間における約４４の分子量差、ポリエチレングリコールの典型的な構造的特徴、及び１１．６２分のＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間を有することを示した。
【００９８】
実施例１０（［Ｔｈｐ３７（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４（化合物１０）の合成）：
合成法に関しては実施例８を参照されたい。
［Ｔｈｐ３７］エキセンディン−４は、分子量４２１８、保持時間１０．８２分を有した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、ＰＥＧ修飾生成物がＭｎ＝９２２２、２つの隣接ピーク間における約４４の分子量差、ポリエチレングリコールの典型的な構造的特徴、及び１１．４３分のＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間を有することを示した。
【００９９】
実施例１１（［Ｔｈｐ３８（ｍＰＥＧ５０００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４（化合物１１）の合成）：
合成法に関しては実施例８を参照されたい。
［Ｔｈｐ３８］エキセンディン−４は、分子量４２１８、保持時間１０．９１分を有した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、ＰＥＧ修飾生成物がＭｎ＝９２２１を有し、２つの隣接ピーク間における約４４の分子量差を有し、ポリエチレングリコールの典型的な構造的特徴、及び１１．７４分のＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間を有することを示した。
【０１００】
実施例１２（［Ｃｙｓ３１（ｍＰＥＧ２００００−ＭＡＬ）］エキセンディン−４（化合物１２）の合成）：
合成法に関しては実施例１を参照されたい。［Ｃｙｓ３１］エキセンディン−４ペプチドアナログを以下の分光測定条件下で分析した。
［Ｃｙｓ３１］エキセンディン−４ペプチドアナログは、分子量４１９２、保持時間８．８３８分を有した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、ＰＥＧ修飾生成物がＭｎ＝２５６８２、２つの隣接ピーク間における約４４の分子量差、ポリエチレングリコールの典型的な構造的特徴、及び９．７０分のＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間を有することを示した。ＨＰＬＣ条件は下記の通りであった。
Ａ相：０．０５％ＴＦＡ／水
Ｂ相：０．０５％ＴＦＡ／７０％ＡＮＣ／水
クロマトグラフィーカラム：Ａｇｌｉｅｎｔ  ｚｏｒｂａｘ  ５ｕ  Ｃ１８  ３００Ａ  ４．６×１５０ｍｍ
グラジエント：０〜１５分  Ｂ％  ３５〜８５；１５〜１７分  Ｂ％  ８５〜３５；２０分で終了
流量：１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃
【０１０１】
上記合成及び分析の結果から、本発明においてモノＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログが得られたことが分かる。エキセンディン−４アナログのペプチド鎖における活性ヒドロスルフリルの高反応性により、ＰＥＧはエキセンディン−４アナログに部位特異的に結合する可能性がある。
【０１０２】
アッセイ１（ＧＬＰ−１受容体に対するアゴニスト活性の評価）：
ＧＬＰ−１受容体はＧｓ共役ＧＰＣＲである。ＣＲＥ−ルシフェラーゼレポーター系は、評価に使用されるヒト胚腎臓上皮細胞株ＨＥＫ２９３中で安定に発現した。したがって、受容体が活性化されると、Ｇｓシグナル経路を介した二次メッセンジャーｃＡＭＰの細胞内濃度の上昇により、レポーター系におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現が開始されたはずである。試験化合物のＧＬＰ−１受容体を刺激活性化する能力は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の検出された発現レベルに反映されている。
【０１０３】
文献（Ｙｉｎ  Ｆｅｉら，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００７，  ４２（１）：２４）に記載の方法を参照して、ＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログのＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を細胞レベルで決定した。エキセンディン−４は１．９３ｎＭのＥＣ５０を有していた。結果を表１に示す。
【０１０４】
【表１】
2013537879.tif 000025
【０１０５】
表１から、本発明のＰＥＧ修飾エキセンディン−４アナログはすべて有効なＧＬＰ−１アゴニスト活性を有していたことが分かる。
【手続補正書】
【提出日】平成25年5月16日(2013.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013537879000001.app
【国際調査報告】
2013537879.tif 000036
2013537879.tif 000037
2013537879.tif 000038
2013537879.tif 000039
2013537879.tif 000040
2013537879.tif 000041
2013537879.tif 000042
2013537879.tif 000043