(57)【要約】  本発明は、胃癌のリンパ節転移治療のためのPDGF-R抑制剤の利用、および胃癌を患うヒトを含む哺乳動物の治療方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃癌のリンパ節転移治療のためのPDGF-R抑制剤またはその薬学的に許容可能な塩類。
【請求項２】
前記PDGF-R抑制剤が４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド、４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］−Ｎ−［５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル］ベンズアミド、アキシチニブおよびスニチニブ、ならびにこれらの薬学的に許容可能な塩類からそれぞれ選択されることを特徴とする、請求項１に記載のPDGF-R抑制剤またはその薬学的に許容可能な塩類。
【請求項３】
前記PDGF-R抑制剤が４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたはその薬学的に許容可能な塩類であることを特徴とする、請求項１に記載のPDGF-R抑制剤またはその薬学的に許容可能な塩類。
【請求項４】
前記PDGF-R抑制剤が４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド・メシレートであることを特徴とする、請求項１に記載のPDGF-R抑制剤またはその薬学的に許容可能な塩類。
【請求項５】
前記PDGF-R抑制剤が４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］−Ｎ−［５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル］ベンズアミドまたはその薬学的に許容可能な塩類であることを特徴とする、請求項１に記載のPDGF-R抑制剤またはその薬学的に許容可能な塩類。
【請求項６】
前記PDGF-R抑制剤が４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］−Ｎ−［５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル］ベンズアミド・ハイドロクロライド・モノハイドレートであることを特徴とする、請求項１に記載のPDGF-R抑制剤またはその薬学的に許容可能な塩類。
【請求項７】
前記PDGF-R抑制剤がアキシチニブおよびスニチニブ、ならびにこれらの薬学的に許容可能な塩類からそれぞれ選択されることを特徴とする、請求項１に記載のPDGF-R抑制剤またはその薬学的に許容可能な塩類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌のリンパ節転移治療のためのPDGF-R抑制剤の利用、および胃癌を患うヒトを含む哺乳動物の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ節転移は、ヒトにおける多くの癌で共通して臨床上に見られるものであり、疾患の悪性度および予後不良因子の両方においても関連している。胃癌は世界において多く見られる悪性腫瘍のうちの１つである。主とする死亡原因は転移であり、当該転移は血管およびリンパ管新生が関与している（Fidler IJ. Nat Rev Cancer 2003; 3: 453-8）。腫瘍血管新生は、数十またはそれ以上の腫瘍由来の増殖因子の相互作用が関与する複雑な過程であることが知られているが（Carmeliet P, Jain RK. Nature 2000; 407: 249-57）、腫瘍がどのようにリンパ管新生を誘導するのかは、ほとんど解明されていない。公知のリンパ管新生因子において、最も重要な増殖因子は血管内皮増殖因子VEGF-CおよびVEGF-Dである。腫瘍細胞、内皮細胞および間質細胞により産生される血管新生因子には、VEGF-A、ならびに、肝細胞増殖因子（HGF）およびアンジオポイエチン（Ang）ファミリーが含まれる（Gale NW, et al., Dev Cell 2002; 3: 411-23; Kajiya K, et al. Embo J 2005; 24: 2885-95; Hirakawa S, et al., J Exp Med 2005; 201: 1089-99）。
【０００３】
PDGF（血小板由来増殖因子）ファミリーに属する増殖因子は、多くの悪性組織において、過剰に発現している。PDGFファミリーは、-AA、-AB、-BB、-CCおよび-DDの５つのアイソフォームにて構成されている。これらの生理活性は、２つの遺伝子産物PDGF-RαおよびPDGF-Rβによりコードされているチロシンキナーゼ受容体の３つの形状により媒介される。PDGF-RαはPDGF-DDを除くPDGFの全てのアイソフォームに結合することができる。一方で、PDGF-RβはPDGF-BBに優先的に結合する。また、これらPDGFについては、腫瘍細胞の増殖、血管新生の促進、血管周皮細胞の集積、さらに腫瘍間質における組織間質圧を制御し、パラクリン作用における化学療法剤の血管輸送に影響を与えるということが解っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
驚くべき事に、PDGF-R抑制剤が胃癌のリンパ節転移の治療のために利用できるということを発見した。
【０００５】
広義には、本発明は、PDGFのシグナル経路を阻害する組成物を、必要とする患者に投与することによる、胃癌の治療方法を提供する。
【０００６】
ヒトの胃癌におけるPDGF-BおよびPDGF-RβのmRNA発現量。PDGF-BおよびPDGF-RβのmRNA発現量は、実施例において記載されているように、定量的リアルタイムPCRによって調べられた。PDGF-BおよびPDGF-Rβの相対的発現量（T/N比）は、図１Ａにおけるリンパ節転移の状態によって示されている。リンパ節転移陽性（Node-positive）の患者では、PDGF-BおよびPDGF-Rβの発現量が、リンパ節転移陰性（Node-negative）の患者よりも有意に高いことが見つかった（それぞれp=0.03、p<0.001）。ここで、びまん型胃癌は、豊富な間質を有しリンパ節転移の頻度が高いことが知られているため、発明者らはPDGF-BおよびPDGF-RβのmRNA発現量とヒト胃癌の組織型との関連性も調べた。PDGF-BおよびPDGF-Rβの発現量は、びまん型胃癌（Diffuse-type）の患者において、腸型胃癌（Intestinal-type）の患者よりも有意に高かった（それぞれ、p=0.02、p=0.01）（図１Ｂ）。さらに、リンパ節転移陽性の患者では、リンパ節転移陰性の患者よりも有意に高いPDGF-BおよびPDGF-Rβの発現量を示した。
【０００７】
ヒト胃癌細胞株の培養におけるPDGF-BおよびPDGF-Rβの発現量の増加。異なる組織型に由来する４つのヒト胃癌細胞株において、PDGF-BおよびPDGF-Rβの発現量を実施例に記載されているよう調べた。MG63細胞がPDGF-R発現量のポジティブコントロールとして使用された。リアルタイムPCRおよびウエスタンブロッティングの結果が、図２に示されている。培養条件下では、異なる量ではあるものの、全ての胃癌細胞株において、PDGF-BのmRNAの発現が確認された。しかし、PDGF-Rβは培養された胃癌細胞株では発現していなかった。
【０００８】
マウスの胃におけるヒト胃癌の治療。TMK-1ヒト胃癌細胞のヌードマウスの胃壁への移植から、腫瘍増大に対するPDGF-Rβチロシンリン酸化阻害剤であるイマチニブの効果が、実施例にて記載されているように判明した。イマチニブ・メシレートを投与した腫瘍では、コントロールの腫瘍と比較して、リンパ管の面積が減少した（p<0.05）（図５）。
【０００９】
腫瘍血管は、正常粘膜の血管とは形態学的に異なることが明らかにされている。内皮細胞は構造的および機能的に異常なものとなっており、腫瘍での微小環境においては染色体異常を示す場合もある。腫瘍リンパ管には、構造的な組織破壊、蛇行および漏出性がみられる（Cao R, et al. Cancer Cell 2004; 6: 333-45）。このような漏出性の腫瘍リンパ管は、リンパ系機構への腫瘍細胞の浸潤のため、易損性の構造基板となりうる。腫瘍血管内皮細胞のように、腫瘍関連リンパ管内皮細胞には、他と異なる遺伝子が発現していることが最近になり明らかにされた。Clasperらは、高転移性線維肉腫と真皮組織から精製したリンパ管内皮細胞の遺伝子発現量を比較した（Cancer Res 2008; 68: 7293-303）。彼らは、内皮機能、内皮下マトリックスおよび脈管の成長／パターンに関する成分を含む様々なタンパク質をコードするおよそ７９２の遺伝子の発現量の違いを発見した。実施例において使用された胃癌同所移植モデルにおいて、Lyve-1-陽性リンパ管にはPDGF-Rβが発現していることが示されたが、全てのリンパ管がPDGF-Rβを発現しているわけではなかった。PDGF-Rβは、リンパ管内皮細胞、特に、腫瘍巣にすぐ近接した場所に位置する拡大し蛇行したリンパ管において局所的に発現していた。一方、正常な組織におけるリンパ管または腫瘍内の小さなリンパ管にはPDGF-Rβは発現していなかった。一般的に、腫瘍細胞は生物学的に不均一であり、これらの表現型は臓器の微小環境により変化しうる（Fidler IJ, Poste G., Semin Oncol 1985; 12: 207-21）。発明者らのデータにより、腫瘍に関してリンパ管が生物学的に異質なものとなることと、リンパ管と腫瘍細胞との相互作用は、公に知られているものよりも内皮表現型において、より著しい影響を有するということが証明された。さらに、PDGF-Rチロシンリン酸化阻害剤イマチニブの経口投与によるPDGF-Rβシグナリングの阻害は、使用された胃癌の同所性移植マウスモデルにおいて、リンパ管面積を著しく減少させた。相まって、これらの見解は、正常組織における活動していないリンパ管ではなく、活性化し増殖しているリンパ管内皮のみに特異的に、PDGF-Rβが発現するということを示している。標的とされるPDGF-Rβ方策の潜在的な治療における利用のための重要な関連性としての見解ともなる。結論としては、PDGF-Bは腫瘍細胞から分泌されており、PDGF-Rβは胃癌におけるリンパ節転移に関連するリンパ管内皮細胞を含む間質細胞によって発現するということが発見された。このように、PDGFに誘導されるリンパ管新生の抑制または妨害は、リンパ節転移の防止および治療への道理に合ったアプローチである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒト胃癌検体のPDGF-BおよびPDGF-RβのmRNA発現量における、定量的リアルタイムPCRの結果。（A）局所的なリンパ節の状態に関連するPDGF-BおよびPDGF-RβのmRNA発現量。（B）ヒト胃癌の組織型に関連するPDGF-BおよびPDGF-RβのmRNA発現量。びまん型胃癌の患者は、腸型胃癌の患者よりも、有意に高いPDGF-BおよびPDGF-Rβの発現量を示した。全ての値はGAPDHに対し標準化し、また、正常な領域におけるこれらのRNAの各々の量に対し標準化した。胃癌組織（T）とそれに対応する正常粘膜（N）との間のmRNA率を算出し、T/N比（ratio）として示した。示されている値は標準誤差*p<0.05、**p<0.01にて表されている。
【図２】胃癌細胞株におけるPDGF-BおよびPDGF-Rβの発現。（A）胃癌細胞株は、様々な量でPDGF-BmRNAを構成的に発現していた。（B）PDGF-Rβは培養した胃癌細胞株では発現していなかった。
【図３】TMK-1の同所性での胃癌におけるイマチニブ（Imatinib）投与の有無での、Lyve-1による免疫組織化学染色。イマチニブの投与によりリンパ管の面積は著しく減少した。*p<0.05; bars, SE.（標準誤差）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
そこで、本発明の１つの観点においては、胃癌のリンパ節転移治療のためのPDGF-R抑制剤の利用に関する。
【００１２】
ここにおいて使用されている、“PDGF-R抑制剤”との表現は、限定はされないが、特に、４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド（“イマチニブ”としても知られている）、４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］−Ｎ−［５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−３（トリフルオロメチル）フェニル］ベンズアミド（“ニロチニブ”としても知られている）、アキシチニブ（AG013736）、および、スニチニブ（SUTENT登録商標）、または、それぞれの薬学的に許容可能な塩類を含む。
【００１３】
本発明の目的のために好ましい１つの実施の形態として、イマチニブ・メシレート、および、ニロチニブ・モノハイドロクロライド・モノハイドレートが挙げられる。同時に本発明のさらなる実施の形態の好ましいものとして、アキシチニブおよびスニチニブ（SUTENT（登録商標））、または、それぞれの薬学的に許容可能な塩類が挙げられる。
【００１４】
“治療”または“処方”という文言は、ここに記載されている病気の予防的な、または好ましくは治療的な（限定されないが、苦痛を緩和すること、治すこと、症状を軽くすること、症状を減少させることを含む）処置を示す。特には、リンパ節転移の進行を遅らせる、または抑止することを意味する。
【００１５】
特に、抗腫瘍剤としてのイマチニブの調製およびその使用は、欧州特許出願公開第0564409号明細書のExample 21および米国特許第5,521,184号明細書に記載されており、その両方を当該言及により組み込む。
【００１６】
イマチニブの薬学的に許容可能な塩類とは、薬学的に許容可能な酸付加塩である。例えば、塩酸、硫酸またはリン酸のような無機酸が付加したものが挙げられる。また、例えば、適当な有機カルボン酸またはスルホン酸が付加したものが挙げられる。これには、例えば、トリフルオロ酢酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、こはく酸、マレイン酸、フマル酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸またはシュウ酸のような脂肪族モノ−またはジカルボン酸が付加したものが挙げられる。アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸が付加したものも挙げられる。安息香酸、２−フェニル安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、マンデル酸もしくはケイ皮酸のような芳香族の脂肪族カルボン酸、ニコチン酸もしくはイソニコチン酸のようなヘテロ芳香族カルボン酸、メタン−、エタン−もしくは２−ヒドロキシエタンスルホン酸のような脂肪族スルホン酸、または、ベンゼン−、p−トルエン−もしくはナフタレン−２−スルホン酸のような芳香族スルホン酸が付加したものも挙げられる。
【００１７】
イマチニブのモノメタンスルホン酸付加塩（“イマチニブ・メシレート”としても知られている）およびその好まれる結晶構造（例えば、β型結晶構造）は、国際公開第99/03854号において記載されている。投与は、種、年齢、個々の状況、投与の形態および当の病像に合わせ、効果的な服用量、例えばイマチニブの１日の経口投与にて約100-1000mg、好ましくは200-600mg、特には400mgを、約70kgの体重の恒温動物に投与する。大人の患者にとっては、主成分として形成されるイマチニブ400mgと対応する毎日の開始投与量が、経口投与として推奨され得る。
【００１８】
イマチニブの有効量、またはその薬学的に許容可能な塩類を含む、適宜可能な調薬方法についても国際公開第99/03854号において記載されている。
【００１９】
イマチニブ（メシレート塩としての、Glivec（登録商標）／Gleevec（登録商標））は、Bcr-Abl腫瘍性タンパク質および細胞膜貫通チロシンキナーゼ受容体c-Kitの活性を抑制する。Glivec（登録商標）は、慢性骨髄白血病（CML）および消化管間質腫瘍（GIST）における治療を含むいくつかの適応に対して認可されている。
【００２０】
ニロチニブおよびその製造工程は、国際公開第04/005281号において開示されており、これは、当該言及を以てここに組み込まれる。
【００２１】
ニロチニブの薬学的に許容可能な塩類は、特に国際公開第2007/015871号において記載されている。１つの好ましいニロチニブの実施の形態では、その塩酸塩一水和物の形状にて使用される。国際公開第2007/015870号には、本発明にとって適しているニロチニブの特定の多形およびそれらの薬学的に許容可能な塩類が開示されている。
【００２２】
ニロチニブおよびその薬学的に許容可能な塩類は、経口的な、または、非経口的な（例えば、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、直腸もしくは経腸的）ものを含む、任意の経路により投与され得る。好ましくは、ニロチニブおよびその薬学的に許容可能な塩類は経口的に投与され、好ましくは、１日に100-2000mgが服用される。経口での１日のニロチニブの好ましい服用量は200-1200mg、例えば800mgであり、１回で又は１日２回のように複数回に分けて投与される。
【００２３】
通常、最初は少ない服用量が投与され、治療を受ける患者にとっての最適の服用量が決まるまで服用量を徐々に増加させていく。服用量の上限は、副作用により設定され、治療を受けている患者での試行により決定され得る。
【００２４】
ニロチニブ（Tasigna（登録商標））は、第２世代のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（PTKI）であり、イマチニブを含め事前の治療に対し、抵抗力がある、または耐性がある慢性期および加速期フィラデルフィア染色体陽性（Ph+）CMLの成人患者の治療に対して２００７年に認可された。当該組成物は、GISTの患者の治療のためにも研究されている。
【００２５】
コードナンバー、非専売薬または商品によりここに確定されるその他の活性剤の構成は、標準大要の現行版"The Merck Index"から、または例えば国際特許のデータベース（例えば、IMS World Publication）から、見つけることができる。当該言及により、これらの内容等に対応するものをここに組み込む。
【００２６】
さらなる観点においては、本発明は胃癌のリンパ節転移の治療の薬剤製造のための、PDGF-R抑制剤、またはこれらの薬学的に許容可能な塩類のそれぞれの利用に関する。
【００２７】
本発明は、胃癌を有する哺乳動物、特にヒトの患者に、PDGF-R抑制剤の薬学的な有効量またはこれらの薬学的に許容可能な塩類を、それぞれその必要において当該哺乳動物に投与する方法にも関する。
【００２８】
関連分野における技術者であれば、前述および後述にて示される治療上の適用および有益な効果を証明するために、適切な試験モデルを選択することは当然可能である。薬理的な活性は、例えば確立されているin vitroおよびin vivoでの試験方法にて証明される。
【００２９】
次の実施例は前述した発明を例証するものであるが、多少なりとも発明の範囲を限定するつもりはない。
【実施例】
【００３０】
実施例１：ヒト胃癌におけるPDGF-BおよびPDGF-Rβの発現分析
【００３１】
材料および方法
【００３２】
患者および腫瘍検体。後に広島大学病院において外科切除を受けた胃癌を有する３８の患者からの、胃の組織の内視鏡下生検検体（腫瘍および対応する正常の粘膜）を、液体窒素にてさっと凍結させ、その後、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）のためのRNA抽出まで−８０℃で保管した。ヘルシンキ宣言加盟の見解にしたがい、治験への関与について、全ての患者から同意を得た。病理組織学的報告および臨床歴を、外科的手術の時期における正確な病期の分類のために調査した。病期分類および病理組織分類の基準は、Japanese Research Society for Gastric Cancer（Japanese Research Society for Gastric Cancer. Japanese classification of gastric carcinoma. Tokyo: Kanehara; 1999）のものによって行った。リンパ節の状態は、通常の外科的検体を伴う病理上の実験により決めた。病理組織型および浸潤の深さを、患者を２つのグループに分けて密接に比較した。２つのグループは、リンパ節転移を有するもの（リンパ節転移陽性グループ、n=21）と、有さないもの（リンパ節転移陰性グループ、n=17）である。患者のグループは３４名の男性と４名の女性とで構成されており、年齢の中央値は６６．５歳であった。全ての患者が、腫瘍の浸潤が粘膜下組織を越えている浸潤性胃癌を有していた。
【００３３】
細胞培養。ヒト胃癌から樹立した４つの細胞株およびヒト骨肉腫細胞株MG63を、１０％ウシ胎児血清（FBS; MA BioProducts, Baltimore, MD, USA）を含むRPMI 1640（Nissui Co., Tokyo, Japan）中で保存した。TMK-1細胞株（低分化腺癌）は、広島大学のDr. E. Taharaから提供された。KKLS細胞株（未分化癌）は、日本国千葉県の千葉大学のDr. Y. Takahashiから提供された。MG63と２つのその他の細胞株（腺扁平上皮癌のMKN-1、および低分化腺癌腫のMKN-45）は、日本国大阪府のHealth Science Research Resources Bankから得た。
【００３４】
定量リアルタイムRT-PCR分析。RNeasy Kit（Qiagen, Valencia, CA, USA）を用い、当該取り扱い説明書に従って、胃癌細胞株および生検材料からトータルRNAを抽出した。cDNAは、第一鎖のcDNA合成キット（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA）を用い、1μｇのトータルRNAから合成した。RNAからcDNAへの逆転写の後、LightCycler-FastStart DNA Master SYBR-Green I Kit（Roche Diagnostis, Basel, Switzerland）を用い、その取り扱いで推奨されたプロトコールに従って、定量的RT-PCRを行った。PCR反応は３回のサイクルにおいて行った。RNAの品質および定量のいずれについてもサンプル間の差異を校正するため、値はそれらのβ−アクチンに対して標準化した。その後、胃癌組織（T）および対応する正常粘膜（N）のmRNA率を算出し、T/N比として表した。PCRのプライマーは、特定のプライマー分析ソフトウェア（Primer Designer, Scientific and Educational Software, Durham, NC, USA）を用いて設計し、配列の特定はFASTA（EMBL Database）によって確立させた。それぞれのプライマーの配列、アニーリング温度、およびPCRサイクルは次のとおりである。PDGF-BフォワードCGAGTTGGACCTGAACATGA、PDGF-BリバースGTCACCGTGGCCTTCTTAAA（PDGF-B PCR産物，339bp；58℃；35サイクル）。PDGF-RβフォワードAGCTACCCCTCAAGGAATCATAG、PDGF-RβリバースCTCTGGTGGATGGATTAAGACTG（PDGF-RβPCR産物，376bp；58℃；35サイクル）。GAPDHフォワードATCATCCCTGCCTCTACTGG、GAPDHリバースCCCTCCGACGCCTGCTTCAC（GAPDH PCR産物，188bp；55℃；28サイクル）。
【００３５】
試薬。イマチニブ・メシレートは経口投与のために滅菌水で希釈した。一次抗体は次のところから購入した。ポリクローナルウサギ抗PDGF-Rβ抗体およびポリクローナルウサギ抗PDGF-Bサブユニット抗体はSanta Cruz Biotechnology（Santa Cruz, USA）から、ラット抗マウスLyve-1抗体はR&D Systems（Minneapolis, MN, USA）から購入した。
【００３６】
ウェスタンブロット分析。1mmol/Lのオルトバナジウム酸ナトリウムを含有する冷却したリン酸緩衝塩類溶液（PBS）で３回洗浄した後、細胞を溶解させた。タンパク質（全タンパク質20μｇ）はSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロースメンブレン（Whatman GmbH, Germany）にて移動させた。免疫複合体は、ECL Plus Kit（GE Healthcare, Buckinghamshire, UK）を用い、亢進させた化学発光により可視化させた。
【００３７】
動物および腫瘍細胞の同所性移植。雄の無胸腺BALB/cヌードマウス（Charles River Japan, Tokyo）を特定の病原体フリーの環境下で管理し、５週齢で使用した。移植のために使用するサブコンフルエントの胃癌細胞（TMK-1細胞またはKKLS細胞）を、０．２５％トリプシンおよび０．０２％エチレンジアミンテトラ酢酸を用いた簡単な処理により収集し、その後、再度懸濁して最終濃度2.0×107cells/mLのハンクス溶液とした。1mLシリンジに附属の３０規格針を使用し、ズーム実体顕微鏡で観察しながら、細胞（50μl中1×106cells）をヌードマウスの胃壁中に移植した。４週間後、マウスを殺し、当該腫瘍を研究のため切除した。腫瘍をOCTコンパウンド（Miles, Elkhart, IN, USA）に埋め込み、すぐに液体窒素に入れて凍結させ、−８０℃で保存した。
【００３８】
PDGF-BおよびPDGF-Rβについての蛍光免疫染色、ならびにPDGF-RβおよびLyve-1についての二重染色。ヌードマウス胃壁に生着したヒト胃癌細胞だけでなく、ヒト胃癌組織の新鮮な凍結検体を8μm区分にカットし、正に荷電させたスライド上に固定し、−８０℃にて保存した。その後、組織切片を冷却アセトン中に１０分間保持した後、PBSで３回（１回につき３分間）洗浄した。スライドを加湿チャンバー内に置き、タンパク質ブロッキング溶液（PBS内に５％ウマ正常血清および１％ヤギ正常血清を含有）を用いて２０分間室温にてインキュベートした。その後、PDGF-BまたはPDGF-Rβの一次抗体を用い、スライドを４℃にて一晩インキュベートし、PBSで３回すすぎ、タンパク質ブロッキング溶液中に１０分間インキュベートし、次いで、Cy3が複合したヤギ抗ウサギ二次抗体を用い室温で１時間インキュベートした。ここまでの前述の様子からわかるよう、当該スライドは光から保護されている。その後、サンプルをPBSで３回すすいだ。リンパ管内皮細胞を確認するため、Lyve-1に対する抗体を用い、スライドを４℃で一晩インキュベートした。切片をPBSで３回すすぎ、タンパク質ブロッキング溶液中にて１０分間インキュベートした。スライドは、その後、対応するCy5が複合した二次抗体を用い、室温にて１時間インキュベートされ、当該サンプルはPBSで３回すすがれた。次いで、１０分間、DAPI核対比染色を適用した。その後、サンプルをPBSで３回すすぎ、それぞれのサンプル上に封鎖剤を配置し、ガラスカバースリップにて覆った。なお、封鎖剤としてFluoromount/Plus（Diagnostic BioSystem, Pleasanton, USA）を使用した。
【００３９】
共焦点顕微鏡。共焦点蛍光画像は、motorised Axioplan microscope、アルゴンレーザー（458/477/488/514 nm, 30 mW）、HeNeレーザー（543 nm, 1 mW; 633 nm, 5 mW）、LSM 510制御および画像取得ソフトウェア、ならびに適合するフィルタ（Chroma Technology Corp., Brattleboro, VT, USA）を備えたZeiss LSM 510 laser scanning microscopy system（Carl Zeiss, Thornwood, NY）を用い、×２０３または×４０３の拡大率で得た。PDGFおよびPDGF-Rは赤色蛍光により確認される一方、リンパ管内皮細胞は緑色蛍光により確認される。
【００４０】
マウス胃壁に定着し成長するヒト胃癌腫瘍の治療。TMK-1細胞の同所性移植から１４日後、マウス（それぞれのグループにおいて、n=10）をランダムに次の２つの治療のうちの１つを受けるよう割り当てた。当該治療は、毎日の水での経口投与（コントロールグループ）、または毎日のイマチニブ・メシレートでの経口投与（予め決めていた生物学的に最適な服用量である、50mg/kg（Hwang RF, et al. Clin Cancer Res 2003; 9: 6534-44））である。当該治療を２８日間続けた。全ての治療実験を２回行った。当該同所性腫瘍のマウスは２９日目にメトファンで安楽死させた。免疫組織化学のため、腫瘍組織をホルマリン固定し、パラフィン包理した。結果を図３において示す。
【００４１】
リンパ管の領域の免疫組織化学での確定。パラフィン包理された組織は、Lyve-1の免疫組織化学での確認のために使用した。切片を、まずPBS中にて脱パラフィンおよび再水和し、抗原を賦活させるため５分間水中にてマイクロウェーブ波を照射し、マウス抗Lyve-1抗体を用い４℃で一晩インキュベートし、ペルオキシダーゼが複合したラット抗マウス抗体を用い室温で１時間インキュベートした。その後、安定性のある３，３’−ジアミノベンジジンに５−１０分間曝すことにより、陽性反応が検出された。スライドはギルヘマトキシリンにて対比染色した。Lyve-1を免疫標識させたスライド上では、典型的な形態（内腔も含む）のリンパ管のみがリンパ管として数えられる。これは、線維芽細胞での偶発的に弱くなる抗体交差反応性のためである（Valencak J, et al., Eur J Cancer 2004; 40: 358-64）。リンパ管領域の定量のために、１００倍に拡大した１０個のランダムな領域をそれぞれの腫瘍にてとらえ、それぞれの内腔を含むリンパ管の輪郭をたどった。当該領域は、その後、NIH Image J software（http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html）を使用して算出した。
【００４２】
統計分析。結果は±SEの値として表されている。連続変数におけるグループでの差異を分析するために、Wilcoxon/Kruskal-Wallisの検定を使用した。少なくとも０．０５よりも小さいP値は統計学的に意味があるものとして考えた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年2月28日(2012.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃癌のリンパ節転移の進行を遅らせる又は抑止するためのPDGF-R抑制剤またはその薬学的に許容可能な塩類であり、前記PDGF-R抑制剤は、４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド、４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］−Ｎ−［５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル］ベンズアミド、アキシチニブおよびスニチニブにて構成される群から選択されることを特徴とするPDGF-R抑制剤またはその薬学的に許容可能な塩類。
【請求項２】
前記PDGF-R抑制剤が４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたはその薬学的に許容可能な塩類であることを特徴とする、請求項１に記載のPDGF-R抑制剤またはその薬学的に許容可能な塩類。
【請求項３】
前記PDGF-R抑制剤が４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド・メシレートであることを特徴とする、請求項１に記載のPDGF-R抑制剤またはその薬学的に許容可能な塩類。
【請求項４】
前記PDGF-R抑制剤が４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］−Ｎ−［５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル］ベンズアミドまたはその薬学的に許容可能な塩類であることを特徴とする、請求項１に記載のPDGF-R抑制剤またはその薬学的に許容可能な塩類。
【請求項５】
前記PDGF-R抑制剤が４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］−Ｎ−［５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル］ベンズアミド・ハイドロクロライド・モノハイドレートであることを特徴とする、請求項１に記載のPDGF-R抑制剤またはその薬学的に許容可能な塩類。
【請求項６】
前記PDGF-R抑制剤がアキシチニブおよびスニチニブ、ならびにこれらの薬学的に許容可能な塩類からそれぞれ選択されることを特徴とする、請求項１に記載のPDGF-R抑制剤またはその薬学的に許容可能な塩類。
【国際調査報告】
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