(57)【要約】  天然のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）より改善された特性を有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分を含むポリペプチドであって、前記ＨＳＡ部分は、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合性断片を含み、かつ前記ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜１８のアミノ酸置換を含み、ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照ポリペプチドと比較してＦｃＲｎに対する親和性およびポリペプチドの血清半減期の一方または両方を向上させている、上記ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、前記対照ポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎに結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、前記対照ポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎに結合し、前記親和性は酸性ｐＨで測定される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表５に記載されたものから選択される、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡ（配列番号２）の位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のポリペプチド：残基３８１、残基３８３、残基３９１、残基４０１、残基４０２、残基４０７、残基４１１、残基４１３、残基４１４、残基４１５、残基４１６、残基４２４、残基４２６、残基４３４、残基４４２、残基４４５、残基４４７、残基４５０、残基４５４、残基４５５、残基４５６、残基４５７、残基４５９、残基４６３、残基５０６、残基５０８、残基５０９、残基５１１、残基５１２、残基５１５、残基５ｌ６、残基５１７、残基５１９、残基５２１、残基５２３、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２７、残基５３１、残基５３５、残基５３７、残基５３９、残基５４１、残基５５７、残基５６１、残基５６６、残基５６９。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対して番号付けされた、以下の群から選択される位置において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるアミノ酸置換を含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のポリペプチド：（ａ）残基３８３および４１３；（ｂ）残基４０１および５２３；（ｃ）残基４０７および４４７；（ｄ）残基４０７および４４７および５３９；（ｅ）残基４０７および５０９；（ｆ）残基４０７および５２６；（ｇ）残基４１１および５３５；（ｈ）残基４１４および４５６；（ｉ）残基４１５および５６９；（ｊ）残基４２６および５２６；（ｋ）残基４４２および４５０および４５９；（１）残基４６３および５０８；（ｍ）残基５０８および５１９および５２５；（ｎ）残基５０９および５２７；（ｏ）残基５２３および５３８；（ｐ）残基５２６および５５７；ならびに（ｑ）残基５４１および５６１。
【請求項７】
ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｋ４０２Ｇ、Ｋ４０２Ｉ、Ｋ４０２Ｌ、Ｋ４０２Ｖ、Ｌ４０７Ｆ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｑ、Ｌ４０７Ｗ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｙ４１ＩＮ、Ｋ４１３Ｃ、Ｋ４１３Ｓ、Ｋ４１３Ｔ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１４Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｖ４１５Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｑ４１６Ｈ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｄ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｖ４２６Ｐ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｐ４４７Ｓ、Ｐ４４７Ｔ、Ｅ４５０Ｄ、Ｅ４５０Ｅ、Ｓ４５４Ｃ、Ｓ４５４Ｍ、Ｓ４５４Ｔ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５５Ｑ、Ｖ４５６Ｎ、Ｖ４５６Ｑ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｑ４５９Ｋ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｃ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｌ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｖ、Ｆ５０９Ｗ、Ｆ５０９Ｙ、Ａ５１１Ｆ、Ａ５１１Ｗ、Ａ５１１Ｙ、Ｄ５１２Ｆ、Ｄ５１２Ｗ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｆ、Ｓ５１７Ｍ、Ｓ５１７Ｔ、Ｓ５１７Ｗ、Ｓ５１７Ｙ、Ｋ５１９Ａ、Ｋ５１９Ｇ、Ｋ５１９Ｉ、Ｋ５１９Ｌ、Ｋ５１９Ｖ、Ｒ５２１Ｆ、Ｒ５２１Ｗ、Ｒ５２１Ｙ、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｆ、Ｔ５２７Ｗ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、Ａ５３９Ｖ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５４１Ｗ、Ｋ５４１Ｙ、Ｋ５５７Ａ、Ｋ５５７Ｇ、Ｋ５５７Ｉ、Ｋ５５７Ｌ、Ｋ５５７Ｖ、Ａ５６１Ｆ、Ａ５６１Ｗ、Ａ５６１Ｙ、Ｔ５６６Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、Ｔ５６６Ｙ、Ａ５６９Ｈ、およびＡ５６９Ｐ。
【請求項８】
ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、請求項７のポリペプチド：Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇ。
【請求項９】
以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるアミノ酸置換を含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載のポリペプチド：（ａ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｂ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｄ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｅ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｆ）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｇ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｈ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｉ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｊ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；および（ｋ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ。
【請求項１０】
異種タンパク質を含み、該異種タンパク質の機能性活性を保持し、かつＦｃＲｎに結合する、請求項１乃至９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記異種タンパク質が抗体またはその抗原合断片を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記異種タンパク質が治療用タンパク質を含む、請求項１０または１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記異種タンパク質が、前記ＨＳＡ部分と化学的にまたは組換えによりコンジュゲートしている、請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
非タンパク質物質にコンジュゲートしている請求項１乃至９のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、その異種非タンパク質物質の機能性活性を保持し、かつＦｃＲｎに結合する、上記ポリペプチド。
【請求項１５】
前記異種タンパク質または前記非タンパク質物質が、前記ＨＳＡ部分のＮ末端アミノ酸、前記ＨＳＡ部分のＣ末端アミノ酸、または前記ＨＳＡ部分の内部アミノ酸のいずれかとコンジュゲートしている、請求項１０乃至１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ＨＳＡ部分が、ＨＳＡドメインＩの少なくとも一部、ＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部、あるいは、ＨＳＡドメインＩの少なくとも一部およびＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部、をさらに含む、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１乃至１６のいずれか１項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項１８】
処置を必要とする対象の処置方法であって、前記対象に対し、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１７に記載の組成物を投与するステップを含む、上記方法。
【請求項１９】
請求項１乃至１６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクト。
【請求項２０】
タンパク質のＦｃＲｎに対する結合親和性および血清半減期の一方または両方を向上させる方法であって、前記タンパク質を、請求項１乃至９および１６のいずれか１項に記載の前記ポリペプチドとコンジュゲートさせることを含む、上記方法。
【請求項２１】
非タンパク質物質のＦｃＲｎに対する結合親和性および血清半減期の一方または両方を向上させる方法であって、前記非タンパク質物質を、請求項１乃至９および１６のいずれか１項に記載の前記ポリペプチドとコンジュゲートさせることを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［１．関連出願の相互参照］
本出願は、２０１０年２月１６日に提出された米国仮特許出願第６１／３０４，９５４号および２０１０年７月１５日に提出された米国仮特許出願第６１／３６４，５０３号の優先権を主張する。両仮特許出願は、参照により全内容が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
［２．配列表の参照］
２０１０年２月１４日に作成された、「ＭＥＤ０５５４＿ＰＣＴ＿ＳＴ２５」というファイル名の３８．５キロバイトのサイズを有するテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して本出願とともに提出された配列表は、参照により本出願に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
［３．発明の背景］
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、ｐＨ依存的な機構によって、ＩｇＧとヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の寿命を延ばす。具体的には、エンドソームの酸性ｐＨで両方の分子に結合してそれらを細胞表面に再循環させ、もって両方の分子を通常のリソソーム分解経路から離脱させることによってそれらの寿命を延ばす。ＦｃＲｎ結合能力がアルブミンのドメインＩＩＩに固有であることが判明している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
［４．発明の概要］
本開示は、ＨＳＡ関連の組成物と使用の方法を提供する。本開示は、新生児ＦｃＲｎ結合性断片を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分、および異種ポリペプチドまたはその生理活性断片を含むキメラのポリペプチド、ならびに医薬用担体とともにキメラのポリペプチドを含んでいる組成物を提供する。そのようなキメラのポリペプチドを作り出すのに有用なコンストラクトも開示される。さらに、本開示は、キメラのポリペプチドとそれらをコードするコンストラクトの製造方法を教示する。本開示は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分を含むポリペプチドを提供し、前記ＨＳＡ部分は、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合性断片を含み、前記ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜１８のアミノ酸置換を含み、前記ポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性および血清半減期の一方または両方を、前記アミノ酸置換を含まない対照ポリペプチドと比較して向上させる。また本開示は、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合性断片を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分と、異種タンパク質とを含むキメラポリペプチドも提供し、前記キメラポリペプチドは、前記異種タンパク質の機能的な活性を保持し、ＦｃＲｎと結合することができ、前記ＨＳＡドメインＩＩＩは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性および血清半減期の一方または両方をＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照キメラポリペプチドと比較して向上させる。さらに、例えば、タンパク質の血清半減期を延ばすべくキメラポリペプチドを使用する方法がここに開示される。多様なポリペプチドの大きな集団のスクリーニングに役立つアデノウイルスライブラリーの生成に有用な方法およびベクターも開示される。そのような方法は、ＦｃＲｎへの親和性および血清半減期の一方または両方を向上させるＨＳＡドメインＩＩＩのアミノ酸置換のスクリーニングと特定に有用である。
【０００５】
特定の実施形態において、キメラのポリペプチドは、ＨＳＡ部分を含まない対照ポリペプチドと比較して増加したＦｃＲｎへの親和性および長くなった血清半減期の一方または両方を有する。特定の実施形態において、キメラポリペプチドは、長くなった血清半減期を有する。特定の実施形態において、キメラポリペプチドは、大きくなったＦｃＲｎに対する親和性と長くなった血清半減期の両方を有する。特定の実施形態において、キメラのポリペプチドは、酸性ｐＨ（例えば、およそｐＨ５．５）でのＦｃＲｎに対する親和性が高くなっている。他の実施形態において、キメラポリペプチドは、酸性ｐＨ（例えば、およそｐＨ５．５）でＦｃＲｎを高め、中性のｐＨ（例えば、およそｐＨ７．４）でのキメラのポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性が実質的に変化しない。
【０００６】
本開示は、いかなる前述の態様および実施形態のあらゆる組合せをも、ならびに以下の詳細の説明および実施例に記載されるいかなる実施形態の組合せをも想定している。
【０００７】
［５．図面の簡単な説明］
本発明を例示する目的で、本発明の特定の実施形態は図面中で示される。しかし、本発明は、図面中で表される実施形態の正確な構成および手段要素に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】ヒトＦｃＲｎのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のドメインＩＩＩにに対する結合の動態および平衡分析を提供する図である。ヒトＦｃＲｎのｐＨ５．５で固定されたドメインＩＩＩへの結合についての、ＳＰＲに誘導された会合、分離の動態および平衡結合定数をここに提示する。図１Ａはクーマシー染色したＰＡＧＥジェルであって、ピキア・パストリスからＨＳＡのドメインＩＩＩの成功した発現と精製（矢印で示される）を実証するものを示す。図１Ｂは、ＣＭ５チップ上に固定されたドメインＩＩＩの上に、種々のｃＲｎ濃度を射出することによって生成された結合センサーグラムを示す。図１Ｃは、定常状態親和性モデルに整合する、ＦｃＲｎ濃度に対する平衡結合応答のグラフを表す。
【図１Ｂ】ヒトＦｃＲｎのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のドメインＩＩＩにに対する結合の動態および平衡分析を提供する図である。ヒトＦｃＲｎのｐＨ５．５で固定されたドメインＩＩＩへの結合についての、ＳＰＲに誘導された会合、分離の動態および平衡結合定数をここに提示する。図１Ａはクーマシー染色したＰＡＧＥジェルであって、ピキア・パストリスからＨＳＡのドメインＩＩＩの成功した発現と精製（矢印で示される）を実証するものを示す。図１Ｂは、ＣＭ５チップ上に固定されたドメインＩＩＩの上に、種々のｃＲｎ濃度を射出することによって生成された結合センサーグラムを示す。図１Ｃは、定常状態親和性モデルに整合する、ＦｃＲｎ濃度に対する平衡結合応答のグラフを表す。
【図１Ｃ】ヒトＦｃＲｎのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のドメインＩＩＩにに対する結合の動態および平衡分析を提供する図である。ヒトＦｃＲｎのｐＨ５．５で固定されたドメインＩＩＩへの結合についての、ＳＰＲに誘導された会合、分離の動態および平衡結合定数をここに提示する。図１Ａはクーマシー染色したＰＡＧＥジェルであって、ピキア・パストリスからＨＳＡのドメインＩＩＩの成功した発現と精製（矢印で示される）を実証するものを示す。図１Ｂは、ＣＭ５チップ上に固定されたドメインＩＩＩの上に、種々のｃＲｎ濃度を射出することによって生成された結合センサーグラムを示す。図１Ｃは、定常状態親和性モデルに整合する、ＦｃＲｎ濃度に対する平衡結合応答のグラフを表す。
【図２Ａ】各種コンストラクトの設計の概略の表示、ならびにＨＳＡに融合したＩｇＧおよびドメインＩＩＩに融合したＩｇＧの精製と特性化に関する情報を提供する図である。図２Ａは、組換え型ＩｇＧ−ＨＳＡまたはＩｇＧ−ドメインＩＩＩ融合タンパク質の重鎖のＤＮＡコンストラクト、ならびにＹＴＥ変異形を表示する。図２Ｂは、還元条件または非還元条件状況の下での精製された融合タンパク（５μｇ／レーン）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。図２Ｃは、精製されたＩｇＧ−融合タンパクの分析的サイズ排除クロマトグラフィーを表示する。
【図２Ｂ】各種コンストラクトの設計の概略の表示、ならびにＨＳＡに融合したＩｇＧおよびドメインＩＩＩに融合したＩｇＧの精製と特性化に関する情報を提供する図である。図２Ａは、組換え型ＩｇＧ−ＨＳＡまたはＩｇＧ−ドメインＩＩＩ融合タンパク質の重鎖のＤＮＡコンストラクト、ならびにＹＴＥ変異形を表示する。図２Ｂは、還元条件または非還元条件状況の下での精製された融合タンパク（５μｇ／レーン）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。図２Ｃは、精製されたＩｇＧ−融合タンパクの分析的サイズ排除クロマトグラフィーを表示する。
【図２Ｃ】各種コンストラクトの設計の概略の表示、ならびにＨＳＡに融合したＩｇＧおよびドメインＩＩＩに融合したＩｇＧの精製と特性化に関する情報を提供する図である。図２Ａは、組換え型ＩｇＧ−ＨＳＡまたはＩｇＧ−ドメインＩＩＩ融合タンパク質の重鎖のＤＮＡコンストラクト、ならびにＹＴＥ変異形を表示する。図２Ｂは、還元条件または非還元条件状況の下での精製された融合タンパク（５μｇ／レーン）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。図２Ｃは、精製されたＩｇＧ−融合タンパクの分析的サイズ排除クロマトグラフィーを表示する。
【図３Ａ】ヒトＦｃＲｎのＨＳＡに融合したＩｇＧおよびドメインＩＩＩに融合したＩｇＧへの結合についてのＳＰＲに誘導された平衡定数を提供する図である。各ＦｃＲｎ注入に対応する平衡におけるのＲＵ（Ｒｅｑ）を、ヒトＦｃＲｎ濃度に対してプロットし、データを、固定されたＩｇＧ（パネルＡ）、ＨＳＡに融合されたＩｇＧ（パネルＢ）、およびドメインＩＩＩに融合したＩｇＧ（パネルＣ）に対するＫＤを計算するために定常状態親和性モデルに当てはめた。挿入図のセンサーグラムは、Ｙ軸上にブランク差し引き後の固定されたリガンドに結合されたＦｃＲｎの質量（共鳴単位）を、Ｘ軸上の時間に対して示す。
【図３Ｂ】ヒトＦｃＲｎのＨＳＡに融合したＩｇＧおよびドメインＩＩＩに融合したＩｇＧへの結合についてのＳＰＲに誘導された平衡定数を提供する図である。各ＦｃＲｎ注入に対応する平衡におけるのＲＵ（Ｒｅｑ）を、ヒトＦｃＲｎ濃度に対してプロットし、データを、固定されたＩｇＧ（パネルＡ）、ＨＳＡに融合されたＩｇＧ（パネルＢ）、およびドメインＩＩＩに融合したＩｇＧ（パネルＣ）に対するＫＤを計算するために定常状態親和性モデルに当てはめた。挿入図のセンサーグラムは、Ｙ軸上にブランク差し引き後の固定されたリガンドに結合されたＦｃＲｎの質量（共鳴単位）を、Ｘ軸上の時間に対して示す。
【図３Ｃ】ヒトＦｃＲｎのＨＳＡに融合したＩｇＧおよびドメインＩＩＩに融合したＩｇＧへの結合についてのＳＰＲに誘導された平衡定数を提供する図である。各ＦｃＲｎ注入に対応する平衡におけるのＲＵ（Ｒｅｑ）を、ヒトＦｃＲｎ濃度に対してプロットし、データを、固定されたＩｇＧ（パネルＡ）、ＨＳＡに融合されたＩｇＧ（パネルＢ）、およびドメインＩＩＩに融合したＩｇＧ（パネルＣ）に対するＫＤを計算するために定常状態親和性モデルに当てはめた。挿入図のセンサーグラムは、Ｙ軸上にブランク差し引き後の固定されたリガンドに結合されたＦｃＲｎの質量（共鳴単位）を、Ｘ軸上の時間に対して示す。
【図４】ＦｃＲｎに対するＨＳＡ上のエピトープが、立体構造エピトープであることを示している証拠を提供する図である。３種の異なる方法で処理されたセファロース−（Ｓ）ＨＳＡ、Ｓ−ＩｇＧまたはＳ−トリスを、ｐＨ５．５でヒトＦｃＲｎとともにインキューベートした。結合したＦｃＲｎを溶離し、抗β２ミクログロブリン抗体による免疫ブロット法によって定量化した。分子量マーカー（Ｍ、単位ｋＤ）の位置が示される。レーン１は２０μｇヒトＦｃＲｎを含み、それが各吸着性サンプルに加えられた量である。
【図５Ａ】酵母菌（Ｓ．セレビシエ）の表面に表示されるＨＳＡとドメインＩＩＩがＦｃＲｎ結合能を保持することを示す図である。図５Ａは、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＨＳＡ抗体を用いてガラクトース誘導性ｐＹＤｌ細胞表面表示プラスミドで形質転換されたＳ．セレビシエ細胞上でのＨＳＡまたはドメインＩＩＩのフローサイトメトリー検出を示す。表示された時間に細胞をガラクトースで誘導した。パネルＢは、４８時間誘導され、フローサイトメトリーを用いた抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化されたＳ．セレビシエ細胞上に表示されたＨＳＡまたはドメインＩＩＩへのビオチン化されたヒトＦｃＲｎの結合を表す。ｓｃｆｖで形質転換された酵母細胞を、ＦＩＴＣならびにフィコエリトリンに対するバックグラウンドの蛍光を調べるために対照として用いた。実験結果は、細胞の数に対する蛍光強度のヒストグラム（対数スケール）として表現される。
【図５Ｂ】酵母菌（Ｓ．セレビシエ）の表面に表示されるＨＳＡとドメインＩＩＩがＦｃＲｎ結合能を保持することを示す図である。図５Ａは、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＨＳＡ抗体を用いてガラクトース誘導性ｐＹＤｌ細胞表面表示プラスミドで形質転換されたＳ．セレビシエ細胞上でのＨＳＡまたはドメインＩＩＩのフローサイトメトリー検出を示す。表示された時間に細胞をガラクトースで誘導した。パネルＢは、４８時間誘導され、フローサイトメトリーを用いた抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化されたＳ．セレビシエ細胞上に表示されたＨＳＡまたはドメインＩＩＩへのビオチン化されたヒトＦｃＲｎの結合を表す。ｓｃｆｖで形質転換された酵母細胞を、ＦＩＴＣならびにフィコエリトリンに対するバックグラウンドの蛍光を調べるために対照として用いた。実験結果は、細胞の数に対する蛍光強度のヒストグラム（対数スケール）として表現される。
【図６Ａ】異なる種（ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ）由来のドメインＩＩＩのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。パネルＡ−Ｄのアライメントはニワトリを含み、パネルＥ−Ｈはニワトリを除外している。異なる種の間で保存されるアミノ酸残基は実線で印が付され、保存されたシステイン残基は点線で印が付される。シェードのついたアミノ酸残基は、種の間で保存されない。、図６中のアミノ酸の番号付けが、完全長の成熟ＨＳＡに対するドメインＩＩＩの番号付けに関してではなく、ヒトのドメインＩＩＩに関してのみなされたものであることに注意されたい。
【図６Ｂ】異なる種（ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ）由来のドメインＩＩＩのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。パネルＡ−Ｄのアライメントはニワトリを含み、パネルＥ−Ｈはニワトリを除外している。異なる種の間で保存されるアミノ酸残基は実線で印が付され、保存されたシステイン残基は点線で印が付される。シェードのついたアミノ酸残基は、種の間で保存されない。、図６中のアミノ酸の番号付けが、完全長の成熟ＨＳＡに対するドメインＩＩＩの番号付けに関してではなく、ヒトのドメインＩＩＩに関してのみなされたものであることに注意されたい。
【図６Ｃ】異なる種（ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ）由来のドメインＩＩＩのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。パネルＡ−Ｄのアライメントはニワトリを含み、パネルＥ−Ｈはニワトリを除外している。異なる種の間で保存されるアミノ酸残基は実線で印が付され、保存されたシステイン残基は点線で印が付される。シェードのついたアミノ酸残基は、種の間で保存されない。、図６中のアミノ酸の番号付けが、完全長の成熟ＨＳＡに対するドメインＩＩＩの番号付けに関してではなく、ヒトのドメインＩＩＩに関してのみなされたものであることに注意されたい。
【図６Ｄ】異なる種（ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ）由来のドメインＩＩＩのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。パネルＡ−Ｄのアライメントはニワトリを含み、パネルＥ−Ｈはニワトリを除外している。異なる種の間で保存されるアミノ酸残基は実線で印が付され、保存されたシステイン残基は点線で印が付される。シェードのついたアミノ酸残基は、種の間で保存されない。、図６中のアミノ酸の番号付けが、完全長の成熟ＨＳＡに対するドメインＩＩＩの番号付けに関してではなく、ヒトのドメインＩＩＩに関してのみなされたものであることに注意されたい。
【図６Ｅ】異なる種（ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ）由来のドメインＩＩＩのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。パネルＡ−Ｄのアライメントはニワトリを含み、パネルＥ−Ｈはニワトリを除外している。異なる種の間で保存されるアミノ酸残基は実線で印が付され、保存されたシステイン残基は点線で印が付される。シェードのついたアミノ酸残基は、種の間で保存されない。、図６中のアミノ酸の番号付けが、完全長の成熟ＨＳＡに対するドメインＩＩＩの番号付けに関してではなく、ヒトのドメインＩＩＩに関してのみなされたものであることに注意されたい。
【図６Ｆ】異なる種（ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ）由来のドメインＩＩＩのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。パネルＡ−Ｄのアライメントはニワトリを含み、パネルＥ−Ｈはニワトリを除外している。異なる種の間で保存されるアミノ酸残基は実線で印が付され、保存されたシステイン残基は点線で印が付される。シェードのついたアミノ酸残基は、種の間で保存されない。、図６中のアミノ酸の番号付けが、完全長の成熟ＨＳＡに対するドメインＩＩＩの番号付けに関してではなく、ヒトのドメインＩＩＩに関してのみなされたものであることに注意されたい。
【図６Ｇ】異なる種（ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ）由来のドメインＩＩＩのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。パネルＡ−Ｄのアライメントはニワトリを含み、パネルＥ−Ｈはニワトリを除外している。異なる種の間で保存されるアミノ酸残基は実線で印が付され、保存されたシステイン残基は点線で印が付される。シェードのついたアミノ酸残基は、種の間で保存されない。、図６中のアミノ酸の番号付けが、完全長の成熟ＨＳＡに対するドメインＩＩＩの番号付けに関してではなく、ヒトのドメインＩＩＩに関してのみなされたものであることに注意されたい。
【図６Ｈ】異なる種（ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ）由来のドメインＩＩＩのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。パネルＡ−Ｄのアライメントはニワトリを含み、パネルＥ−Ｈはニワトリを除外している。異なる種の間で保存されるアミノ酸残基は実線で印が付され、保存されたシステイン残基は点線で印が付される。シェードのついたアミノ酸残基は、種の間で保存されない。、図６中のアミノ酸の番号付けが、完全長の成熟ＨＳＡに対するドメインＩＩＩの番号付けに関してではなく、ヒトのドメインＩＩＩに関してのみなされたものであることに注意されたい。
【図７】野生型を有するＩｇＧへのＨＳＡの融合が、ＩｇＧ−ＹＴＥ変異形についてみられるのと同程度のレベルに血清中残留性を増加させることを示す図である。血清中に残存する注射されたサンプルの％が、時間（１〜２４０時間）に対してプロットされている。
【図８Ａ】ｓｃＦｖ−Ｆｃ細胞表面表示ライブラリー侵入ベクターのプラスミド地図を示す図である。パネルＡは、プロモーター（ここではＣＭＶプロモーター）に作用可能に結合されたｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＧＰＩ−アンカーカセットを含み、ｐｏｌｙＡ配列（ここではＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ配列）を終端に有するｐＥＮＤｉｓｐｌａｙベクターのプラスミド地図を示す。ｓｃＦｖ部分には、多種多様なｓｃＦｖ配列のクローン化を容易にするべくＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位が隣接している。ａｔｔＬｌとａｔｔＬ２部位は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＧＰＩ−アンカー発現カセットに隣接する。パネルＢは、パネルＡに示されるベクターに基づくが、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＧＰＩ−アンカーカセットのｐｏｌｙＡ末尾の後にＯｒｉＰベクターを組み込むｐＥＮＤｉｓｐｌａｙ−ＯｒｉＰベクターのプラスミド地図を示す。
【図８Ｂ】ｓｃＦｖ−Ｆｃ細胞表面表示ライブラリー侵入ベクターのプラスミド地図を示す図である。パネルＡは、プロモーター（ここではＣＭＶプロモーター）に作用可能に結合されたｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＧＰＩ−アンカーカセットを含み、ｐｏｌｙＡ配列（ここではＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ配列）を終端に有するｐＥＮＤｉｓｐｌａｙベクターのプラスミド地図を示す。ｓｃＦｖ部分には、多種多様なｓｃＦｖ配列のクローン化を容易にするべくＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位が隣接している。ａｔｔＬｌとａｔｔＬ２部位は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＧＰＩ−アンカー発現カセットに隣接する。パネルＢは、パネルＡに示されるベクターに基づくが、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＧＰＩ−アンカーカセットのｐｏｌｙＡ末尾の後にＯｒｉＰベクターを組み込むｐＥＮＤｉｓｐｌａｙ−ＯｒｉＰベクターのプラスミド地図を示す。
【図９Ａ】ＥＢＮＡ−１とＯｒｉＰの典型を提示する図である。ＥＢＮＡ−１のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれパネルＡおよびＢに示される。ＯｒｉＰの配列は、パネルＣに示される。
【図９Ｂ】ＥＢＮＡ−１とＯｒｉＰの典型を提示する図である。ＥＢＮＡ−１のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれパネルＡおよびＢに示される。ＯｒｉＰの配列は、パネルＣに示される。
【図９Ｃ】ＥＢＮＡ−１とＯｒｉＰの典型を提示する図である。ＥＢＮＡ−１のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれパネルＡおよびＢに示される。ＯｒｉＰの配列は、パネルＣに示される。
【図１０】関心対象のタンパク質の発現のための代表的な汎用アデノウイルス発現ベクターの概略を示す図である。ここに示すベクターは、関心対象の１以上のタンパク質をコードする関心対象のＤＮＡの塩基配列；およびＯｒｉＰ配列および選択に応じて含められるＥＢＮＡ−１コード領域を含む。これらの構成要素には、随意で、ベクターの作製のために使用されてきたものであり得るａｔｔ組換え部位が隣接して位置している。これらの構成要素には、１つの側にアデノウイルスゲノムが隣接しているが、この場合、Ｅｌおよび／またはＥ３遺伝子の除去がされており、ＩＴＲ配列が隣接している。３’と５’のＩＴＲ配列が示されている。また該ベクターは、作製、増殖、および選択容易性のために、細菌細胞において複製（例えば大腸菌起源）および抗生物質選択（例えば抗アンピシリン性）のための配列も提供し、これらの構成要素は、救済されたアデノウイルスに組み入れられることがないように配置される。
【図１１Ａ】哺乳類細胞（２９３Ｆ細胞）の表面に表示されるＨＳＡがＦｃＲｎ結合能を保持することを示す図である。パネルＡは、ＣＭＶプロモーター（太線）、シグナル配列（太い点線）、Ｎ末端Ｆｌａｇタグ（細い点線）、ＨＳＡ部分（ハッチングを付された囲み）およびＤＡＦ−ＧＰＩ配列とにはされまれた（Ｇ４Ｓ）３リンカー（細い実線）とを含む、ｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩと称される哺乳動物の発現コンストラクトを示す。パネルＢは、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＨＳＡ抗体（パネルＡ）を用いて、１６時間後および２４時間後にｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩから生成されたアデノウイルス、または対照ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする対照プラスミドを感染させた表面２９３−Ｆ細胞上のＨＳＡのフローサイトメトリー検出を示す。パネルＣおよびＤは、フローサイトメトリーを用いて抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化された２９３Ｆ細胞上に表示されるＨＳＡへのビオチン化されたヒトＦｃＲｎ（それぞれ２５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌ）の結合を示す。実験結果は、細胞の数に対する蛍光強度のヒストグラム（対数スケール）として表現される。
【図１１Ｂ】哺乳類細胞（２９３Ｆ細胞）の表面に表示されるＨＳＡがＦｃＲｎ結合能を保持することを示す図である。パネルＡは、ＣＭＶプロモーター（太線）、シグナル配列（太い点線）、Ｎ末端Ｆｌａｇタグ（細い点線）、ＨＳＡ部分（ハッチングを付された囲み）およびＤＡＦ−ＧＰＩ配列とにはされまれた（Ｇ４Ｓ）３リンカー（細い実線）とを含む、ｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩと称される哺乳動物の発現コンストラクトを示す。パネルＢは、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＨＳＡ抗体（パネルＡ）を用いて、１６時間後および２４時間後にｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩから生成されたアデノウイルス、または対照ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする対照プラスミドを感染させた表面２９３−Ｆ細胞上のＨＳＡのフローサイトメトリー検出を示す。パネルＣおよびＤは、フローサイトメトリーを用いて抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化された２９３Ｆ細胞上に表示されるＨＳＡへのビオチン化されたヒトＦｃＲｎ（それぞれ２５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌ）の結合を示す。実験結果は、細胞の数に対する蛍光強度のヒストグラム（対数スケール）として表現される。
【図１１Ｃ】哺乳類細胞（２９３Ｆ細胞）の表面に表示されるＨＳＡがＦｃＲｎ結合能を保持することを示す図である。パネルＡは、ＣＭＶプロモーター（太線）、シグナル配列（太い点線）、Ｎ末端Ｆｌａｇタグ（細い点線）、ＨＳＡ部分（ハッチングを付された囲み）およびＤＡＦ−ＧＰＩ配列とにはされまれた（Ｇ４Ｓ）３リンカー（細い実線）とを含む、ｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩと称される哺乳動物の発現コンストラクトを示す。パネルＢは、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＨＳＡ抗体（パネルＡ）を用いて、１６時間後および２４時間後にｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩから生成されたアデノウイルス、または対照ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする対照プラスミドを感染させた表面２９３−Ｆ細胞上のＨＳＡのフローサイトメトリー検出を示す。パネルＣおよびＤは、フローサイトメトリーを用いて抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化された２９３Ｆ細胞上に表示されるＨＳＡへのビオチン化されたヒトＦｃＲｎ（それぞれ２５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌ）の結合を示す。実験結果は、細胞の数に対する蛍光強度のヒストグラム（対数スケール）として表現される。
【図１１Ｄ】哺乳類細胞（２９３Ｆ細胞）の表面に表示されるＨＳＡがＦｃＲｎ結合能を保持することを示す図である。パネルＡは、ＣＭＶプロモーター（太線）、シグナル配列（太い点線）、Ｎ末端Ｆｌａｇタグ（細い点線）、ＨＳＡ部分（ハッチングを付された囲み）およびＤＡＦ−ＧＰＩ配列とにはされまれた（Ｇ４Ｓ）３リンカー（細い実線）とを含む、ｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩと称される哺乳動物の発現コンストラクトを示す。パネルＢは、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＨＳＡ抗体（パネルＡ）を用いて、１６時間後および２４時間後にｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩから生成されたアデノウイルス、または対照ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする対照プラスミドを感染させた表面２９３−Ｆ細胞上のＨＳＡのフローサイトメトリー検出を示す。パネルＣおよびＤは、フローサイトメトリーを用いて抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化された２９３Ｆ細胞上に表示されるＨＳＡへのビオチン化されたヒトＦｃＲｎ（それぞれ２５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌ）の結合を示す。実験結果は、細胞の数に対する蛍光強度のヒストグラム（対数スケール）として表現される。
【図１２】２９３Ｆ細胞に表示される野生型ＨＳＡ（ＨＳＡ−ｗｔ）および２つのＨＳＡ変異体ライブラリー（ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂｌおよびＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ２）への、ビオチン化されたヒトＦｃＲｎの結合プロファイルの変化を表す図である。パネルＡは、野生型および変異体ＨＳＡ−ＤＩＩＩライブラリーを感染させた２９３Ｆ細胞の表面におけるＨＳＡのフローサイトメトリー検出を示す。パネルＢは、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化された細胞表面上での、ビオチン化されたヒトＦｃＲｎに結合したＨＳＡのフローサイトメトリー検出を示す。実験結果は、細胞の数に対する蛍光強度のヒストグラム（対数スケール）として表現される。
【図１３Ａ】野生型ＨＳＡ（ＨＳＡ−ｗｔ、パネルＡ）、２つのＨＳＡ変異体ライブラリー（ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂｌおよびＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ２、それぞれパネルＢおよびＣ）、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンで検出される染色されたビオチン化ヒトＦｃＲｎ（１０μｇ／ｍｌ）のＦＡＣソーティングプロファイルを示す図である。
【図１３Ｂ】野生型ＨＳＡ（ＨＳＡ−ｗｔ、パネルＡ）、２つのＨＳＡ変異体ライブラリー（ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂｌおよびＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ２、それぞれパネルＢおよびＣ）、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンで検出される染色されたビオチン化ヒトＦｃＲｎ（１０μｇ／ｍｌ）のＦＡＣソーティングプロファイルを示す図である。
【図１３Ｃ】野生型ＨＳＡ（ＨＳＡ−ｗｔ、パネルＡ）、２つのＨＳＡ変異体ライブラリー（ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂｌおよびＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ２、それぞれパネルＢおよびＣ）、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンで検出される染色されたビオチン化ヒトＦｃＲｎ（１０μｇ／ｍｌ）のＦＡＣソーティングプロファイルを示す図である。
【図１４Ａ】ソーティングの前、および第１および第２ラウンドのソーティングの後での、細胞表面上に野生型ＨＳＡ（ＨＳＡ−ｗｔ）、ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂｌ変異体ライブラリーを発現する２９３Ｆ細胞に対するビオチン化ヒトＦｃＲｎの結合プロファイルの変化を示す図である。パネルＡは、ソーティングの前、および第１および第２ラウンドのソーティングの後での、野生型、ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂｌを発現する２９３Ｆ細胞の表面上でのＨＳＡのフローサイトメトリー検出を示す。パネルＢおよびＣは、フローサイトメトリーを用いて、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化された細胞の同じ組に対するビオチン化ヒトＦｃＲｎ（それぞれ１μｇ／ｍｌと０．１μｇ／ｍｌ）の結合を示す。実験結果は、細胞の数に対する蛍光強度のヒストグラム（対数スケール）として表現される。
【図１４Ｂ】ソーティングの前、および第１および第２ラウンドのソーティングの後での、細胞表面上に野生型ＨＳＡ（ＨＳＡ−ｗｔ）、ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂｌ変異体ライブラリーを発現する２９３Ｆ細胞に対するビオチン化ヒトＦｃＲｎの結合プロファイルの変化を示す図である。パネルＡは、ソーティングの前、および第１および第２ラウンドのソーティングの後での、野生型、ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂｌを発現する２９３Ｆ細胞の表面上でのＨＳＡのフローサイトメトリー検出を示す。パネルＢおよびＣは、フローサイトメトリーを用いて、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化された細胞の同じ組に対するビオチン化ヒトＦｃＲｎ（それぞれ１μｇ／ｍｌと０．１μｇ／ｍｌ）の結合を示す。実験結果は、細胞の数に対する蛍光強度のヒストグラム（対数スケール）として表現される。
【図１４Ｃ】ソーティングの前、および第１および第２ラウンドのソーティングの後での、細胞表面上に野生型ＨＳＡ（ＨＳＡ−ｗｔ）、ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂｌ変異体ライブラリーを発現する２９３Ｆ細胞に対するビオチン化ヒトＦｃＲｎの結合プロファイルの変化を示す図である。パネルＡは、ソーティングの前、および第１および第２ラウンドのソーティングの後での、野生型、ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂｌを発現する２９３Ｆ細胞の表面上でのＨＳＡのフローサイトメトリー検出を示す。パネルＢおよびＣは、フローサイトメトリーを用いて、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化された細胞の同じ組に対するビオチン化ヒトＦｃＲｎ（それぞれ１μｇ／ｍｌと０．１μｇ／ｍｌ）の結合を示す。実験結果は、細胞の数に対する蛍光強度のヒストグラム（対数スケール）として表現される。
【図１５】細胞表面に表示される変異体ＨＳＡへのＦｃＲｎの結合がｐＨ依存であることを示す図である。パネルＡおよびＢは、ｐＨ５．５（０．１μｇ／ｍｌ  ＦｃＲｎ、パネルＡ）およびｐＨ７．２（１０μｇ／ｍｌ、パネルＢ）で、対照ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、野生型ＨＡＳ、および３種の代表的な変異体（表５参照）を発現する２９３Ｆ細胞の表面上で抗ストレプトアビジンフィコエリトリンで検出されるビオチン化ヒトＦｃＲｎのフローサイトメトリー検出を示す。パネルＣは、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＨＳＡ抗体を用いたこれらの細胞の表面上でのＨＳＡのフローサイトメトリー検出を示す。
【図１６】大部分の単離したＨＳＡ変異体が、フローサイトメトリーで測定して、ＦｃＲｎに対してより高い親和性を有することを示す図である。野生型ＨＳＡおよび選択された変異体のパネルを、フローサイトメトリーによって異なる濃度でのビオチン化ヒトＦｃＲｎへの結合について解析した。データは、ＦｃＲｎ濃度に対するＭＦＩとしてプロットされている。
【図１７】ＨＳＡ（ＰＤＢ登録番号１ＢＭ０）の解明された構造についてのいくつかの変異形の位置を示す図である。スティックで表現され矢印で示された残基Ｌ４６３、Ｅ４９５、Ｔ５０８、Ｉ５２３、およびＫ５３４を有するリボン図として大部分の構造が示されている。残基４９２〜５３６を包含するループ６と７、およびらせん構造７と８が円で囲まれている。大部分のホットスポットおよび好ましいスポットはこの領域に見出される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［６．発明の詳細な説明］
［６．１  序論］
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、ｐＨ依存的な機構によって、ＩｇＧとヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の寿命を延ばす。具体的には、エンドソームの酸性ｐＨで両方の分子に結合してそれらを細胞表面に再循環させ、もって両方の分子を通常のリソソーム分解経路から離脱させることによってそれらの寿命を延ばす。ＦｃＲｎ結合能力がアルブミンのドメインＩＩＩに固有であることが判明している。本明細書で具体的に示されるように、ＨＳＡのＦｃＲｎ結合性断片の追加を、タンパク質の血清半減期や治療用物質（例えば抗体、抗体代替物、タンパク質、タンパク質骨格およびペプチド）のＦｃＲｎ結合親和性を高めるために用いることができる。特に、本明細書に示されるように、酸性ｐＨ（例えばおよそ５．５のｐＨ）でのＦｃＲｎ結合親和性は増加するが、中性のｐＨ（例えば、およそ７．４のｐＨ）での親和性はほとんど変わらない。本開示のＦｃＲｎ結合ドメイン変異形を含んでいるキメラのポリペプチドは、野生型ＦｃＲｎ結合ドメインよりさらに、タンパク質の血清半減期を延ばし、またはＦｃＲｎ結合親和性を高め得る。本発明のＨＳＡ変異形ポリペプチドは、治療上の標的に対する結合のための骨格の役割をしたり、または治療薬に結合させることができる。
【００１０】
本開示は、ドメインIIIの変異形を提供する。そのようなドメインＩＩＩの変異形は単独で、あるいは追加のＨＳＡ配列と関連して、異種タンパク質および／または非タンパク質薬剤の血清半減期の長期化および／またはＦｃＲｎ結合親和性の増加のために使用することができる。
【００１１】
ここに開示されるキメラのポリペプチドおよびＨＳＡ変異形には、多数の用途がある。タンパク質および他の分子は、ヒトまたは動物の体から比較的短時間で消失することがあることは理解されよう。速いクリアランス速度は、動物モデルにおいてタンパク質および他の分子を試験する能力を損なう損なうことがあり、治療上の目的のために効果的にそれらを利用する能力を損なうこともある。ある場合には、タンパク質は、短時間で消失するために治療効果が得られない。他の場合では、タンパク質が、頻繁な投与が必要となるほどの速度で消失するる。頻繁な投与は治療に伴う費用を増し、そのうえ治療レジメンでの服薬不履行のリスクを増加させる。ある場合には、タンパク質は、より多くの用量を投与することを必要とする速度で消失する。活性薬剤のより用量の増加は、副作用（免疫応答を含む）のリスクを増加させ得る。
【００１２】
本開示のキメラポリペプチドと変異形ＨＳＡポリペプチドは、ＦｃＲｎの血清半減期の長期化および／またはＦｃＲｎ結合親和性の増加によって短時間または比較的短時間のタンパク質クリアランスに伴う問題に対処するのを助ける。同様に、ＦｃＲｎの血清半減期の長期化および／またはＦｃＲｎ結合親和性の増加のために、非タンパク質薬剤と本発明の変異形ＨＳＡポリペプチドとのコンジュゲートを形成することができる。
【００１３】
［６．２  用語］
本発明についてさらに詳細に説明を続ける前に、本発明が特定の組成物または処理工程に限定されないことを理解されたい。それは、そのような組成物や処理過程は変化し得るからである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、前後関係から他の意味であることが明確に表現されていない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」（ある、１つの）、「ｔｈｅ」（その、該）は複数の指示物も包含するものとする。
【００１４】
別段の定めがされない限り、明細書中で使用されるすべての技術的科学的な用語は、本発明が関連する技術の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味をもつ。例えば、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＴｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，は、当業者にとって、本出願で使用される多くの用語を記載した辞書である。
【００１５】
本明細書においてアミノ酸は、一般的に知られた３文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される１文字記号によって表記される。ヌクレオチドも同様に、当業者に一般に認められた１文字記号によって表記される。本明細書中で使用されるとき「アミノ酸置換」は、元のポリペプチド配列の特定の位置におけるアミノ酸を、別の１つのアミノ酸で置換することを意味する。例えば、置換体Ｌ４６３Ｎは、４６３番目の位置のロイシンがアスパラギンと置換された変異形ポリペプチドを指す。
【００１６】
抗体の可変ドメイン、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸の番号付けは、特に明記しない限り、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，（１９９１）ＭＤに記載するカバット式定義に従う。この付番方式を用いて、実際の直鎖形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの欠失や挿入に対応して増減したアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の５２番目の残基の後への１個のアミノ酸の挿入（カバットに従えば残基５２ａ）、および重鎖の８２番目のＦＲ残基の後に挿入された残基（例えば、カバットに従えば残基８２ａ、８２ｂ、８２ｃ等）を含み得る。残基のカバット付番は所与の抗体について、その抗体の相同領域における、「標準の」カバット付番された配列とのアラインメントにより決定することができる。フレームワーク残基のアライメントを最大化するために、Ｆｖ領域のために使われる付番方式において「スペーサー」残基の挿入が必要となることが多い。そのうえ、あらゆる所定カバット部位番号の特定の各残基についても、種間または対立遺伝子の相違のために、異なる抗体鎖の間で異なるものとなり得る。
【００１７】
本明細書中で使用されるとき、「抗体」および「抗体群」（別名免疫グロブリン）という用語は、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合性断片から形成される多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、シングルドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、望ましい生物活性を示す抗体フラグメント（例えば抗原結合性部分）、ジスルフィド結合されたＦｖｓ（ｄｓＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗−ＩＤ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、細胞内抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合性断片を含む。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の断片（すなわち、少なくとも１つの抗原結合性部位を含む分子）を含む。免疫グロブリン分子は、いかなるアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、サブアイソタイプ（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌとＩｇＡ２）、またはアロタイプ（例えば、Ｇｍ、例えば、Ｇｌｍ（ｆ、ｚ、ａまたはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、またはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、およびＫｍ（１、２または３））のものであってもよい。抗体は、いかなる哺乳動物に由来するものでもよく、以下に限定しないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、または鳥類（例えばニワトリ）のような他の動物に由来するものであり得る。
【００１８】
本明細書中で使用されるとき「完全長ＨＳＡ」という用語は、成熟した完全長ヒト血清アルブミンタンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸配列を指す。完全長ＨＳＡタンパク質は、およそ５８５個のアミノ酸（Ｎ末端プロ−およびプリプロ−配列除去後）である。成熟した完全長ＨＳＡ（または、完全長成熟ＨＳＡとも称する）タンパク質は、配列番号２に記載されている。特定の実施形態において、完全長ＨＡＳとは、プロ配列のないＨＳＡの成熟した完全長の形態を指す。プレプロＨＳＡ（Ｎ末端プロおよびプレプロ配列の除去前）の配列は、６０９個のアミノ酸からなり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ０００４６８に記載されている。加えて、対立遺伝子の相違のために、特定の個々の残基が、配列番号２に提示される配列のものとは異なることがある。ＨＳＡのドメインＩＩＩで生ずる対立遺伝子の変化としては、残基４１０のＲ→Ｃ；残基４６６のＫ→Ｅ；残基４７９のＥ→Ｋ；残基４９４のＤ→Ｎ；残基５０１のＥ→Ｋ；残基５０５のＥ→Ｋ；残基５３３のＶ→Ｍ；残基５３６のＫ→Ｅ；残基５４１のＫ→Ｅ；残基５５０のＤ→ＡまたはＤ→Ｇ；残基５６０のＫ→Ｅ；残基５６３のＤ→Ｎ；残基５６５のＥ→Ｋ；残基５７０のＥ→Ｋ；残基５７３のＫ→Ｅ；残基５７４のＫ→Ｅ；残基５７２−５８５のＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ→ＰＴＭＲＩＲＥＲＫ；および残基５７５−５８５のＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ→ＴＣＣＣＫＳＳＣＬＲＬＩＴＳＨＬＫＡＳＱＰＴＭＲＩＲＥＲＫなどが挙げられ、ここで残基の番号は、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく。
【００１９】
本明細書中で使用されるとき、「ＨＳＡのドメインＩＩＩ」という用語は、完全長成熟ＨＡＳの３８１番目−５８５番目のアミノ酸にわたる、およそ２０５個のアミノ酸であるＨＳＡの従来のドメインＩＩＩ、およびそのようなタンパク質をコードする核酸配列を指す。ＨＳＡのドメインＩＩＩは、本明細書においてドメインＩＩＩまたは単にＤＨＬとも略称される。ドメインＩＩＩポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１に記載される。上記のように、特定の個々の残基が、対立遺伝子の相違のために配列番号１に記載するものとは異なることがある。
【００２０】
本明細書中で使用されるとき、「キメラポリペプチド」という用語は、相互に異種ではない少なくとも２つの部分を含んでいるポリペプチドを指す。例えば、キメラポリペプチド（融合ポリペプチドまたは融合タンパク質とも称する）は、少なくとも異種タンパク質部分に結合されたＨＳＡ部分をも含む。例えば、ＨＳＡ部分と異種タンパク質部分はそれら自身がＦｃまたは他の部分への融合物であり得る。ＨＳＡ部分と異種タンパク質部分とは、共有結合または非共有結合性の相互作用を介して結合され得る。例として、ＨＳＡ部分と異種タンパク質部分とは、互いに化学的にコンジュゲートを形成されるか、組換えによって融合（例えば、インフレーム翻訳融合）され得る。
【００２１】
本明細書中で使用されるとき「異種タンパク質」という用語は、ＨＳＡでないタンパク質の全体または一部を指す。総称「異種タンパク質」が本明細書中で使用されるが、この用語は、長さの異なる生物活性ペプチド、ならびに抗体および抗体フラグメントを含む完全長または実質的に完全長の長さタンパク質を含むものとする。好ましい異種タンパク質は、治療上の目的で使用または試験され得る。典型的な異種タンパク質のクラスは、酵素、サイトカイン、および成長因子を含むが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書中で使用されるとき、ＨＳＡポリペプチドは、各種生物活性断片および変異形、融合タンパク質、および野生型ＨＳＡポリペプチドの改変形を含む。そのような生物活性断片または変異形、融合タンパク質、およびＨＳＡポリペプチドの改変形は、天然ＨＳＡタンパク質と実質的に同一なアミノ酸配列の少なくとも一部分を有し、少なくとも天然ＨＳＡタンパク質のＦｃＲｎ結合活性を保持している。特定の実施形態において、ＨＡＳポリペプチドの生物活性断片、変異形、または融合タンパクは、ＨＳＡポリペプチドとの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書中で使用されるとき、「断片」は、ＦｃＲｎ結合活性を示す生物活性断片または生物活性変異形を含むと理解されるものとする。適当な生物活性断片はキメラポリペプチドを作るのに用いることができ、そのようなキメラポリペプチドは、本明細書中に記載するあらゆる方法で使用することができる。
【００２３】
本明細書中で使用されるとき、「変異した」、「変異体」などの用語は、部位特異的突然変異誘発または他のいずれかの既存の方法のための既知の技術を使用して、１箇所以上のアミノ酸の欠失、付加、または置換が施された分子、特にＨＳＡポリペプチドを指す。
【００２４】
［６．３  ＨＳＡドメインＩＩＩ］
特定の態様では、本発明は、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）変異形ポリペプチドを提供し、前記変異形ポリペプチドはＦｃＲｎに結合することができ、前記ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜１８個のアミノ酸置換を含み、それによって前記アミノ酸置換を欠いている対照ＨＳＡポリペプチドと比較して血清半減期を延ばすか、またはＦｃＲｎに対する前記変異形ポリペプチドの親和性を増加させる。
【００２５】
特定の実施形態において、１〜１８個のアミノ酸置換は、ＨＳＡ変異形ポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性を増加させる。特定の実施形態において、１〜１８個のアミノ酸置換は、ＨＳＡ変異形ポリペプチドの血清半減期を延ばす。特定の実施形態において、１〜１８個のアミノ酸置換は、ＨＳＡ変異形ポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性を増加させ、かつＨＳＡ変異形ポリペプチドの血清半減期を延ばす。特定の実施形態において、１〜１８個のアミノ酸置換は酸性ｐＨ（例えば、およそ５．５のｐＨ）で、ＨＳＡ変異形ポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性を増加させる。特定の実施形態において、１〜１８個のアミノ酸置換は酸性ｐＨ（例えば、およそ５．５のｐＨ）でＨＳＡ変異形ポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性を増加させるが、中性のｐＨ（例えば、およそ７．４のｐＨ）でＨＳＡ変異形ポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性を実質的に変えない。
【００２６】
特定の実施形態において、ＨＳＡ変異形はＦｃＲｎと結合し、前記対照ＨＳＡポリペプチドのそれと異なるオフレートまたはオンレートを有する。例えば、特定の実施形態において、ＨＳＡ変異形はＦｃＲｎと結合し、より速いオンレートおよび／またはより遅いオフレートを有する。他の実施形態においては、オンレートはより遅く、および／またはオフレートはより速い。
【００２７】
特定の実施形態において、本出願発明は、ドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合性部分を含むＨＳＡ部分および異種タンパク質を含むキメラポリペプチドを提供し、キメラポリペプチドは、異種タンパク質の機能的な活性を保持している。特定の実施形態において、ＨＳＡ部分は、全ＨＳＡポリペプチド、またはＨＳＡドメインＩＩＩまたはその新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合断片を含む生物活性断片を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡ部分は、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはその新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合性断片、およびＨＳＡの別のドメインの少なくとも一部（例えば、ＨＳＡドメインＩの少なくとも一部、またはＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部、またはＨＳＡドメインＩおよびＩＩの少なくとも一部）を含む。本明細書中で使用されるとき、ＨＳＡドメインＩは、残基１〜１９７を含み；ＨＳＡドメインＩＩは、残基１８９〜３８５を含み；ＨＳＡドメインＩＩＩは残基３８１〜５８５を含み、ここで残基の番号は、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく。
【００２８】
特定の実施形態において、キメラのポリペプチドは、ＨＳＡ部分を含まない対照ポリペプチドと比較して増加したＦｃＲｎへの親和性および長くなった血清半減期の一方または両方を有する。特定の実施形態において、キメラポリペプチドは、増加したＦｃＲｎへの親和性を有する。特定の実施形態において、キメラポリペプチドは、長くなった血清半減期を有する。特定の実施形態において、キメラポリペプチドは、大きくなったＦｃＲｎに対する親和性と長くなった血清半減期の両方を有する。特定の実施形態において、キメラのポリペプチドは、酸性ｐＨ（例えば、およそｐＨ５．５）においてＦｃＲｎに対する親和性が高くなっている。他の実施形態において、キメラポリペプチドは、酸性ｐＨ（例えば、およそｐＨ５．５）でＦｃＲｎを高め、中性のｐＨ（例えば、およそｐＨ７．４）ではキメラのポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性が実質的に変化しない。
【００２９】
さらに、本明細書に記載するように、特定の実施形態において、ポリペプチド（例えば、ＨＳＡ変異形またはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、１〜１８個のアミノ酸置換を含み、ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照ポリペプチドと比較してキメラポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性および血清半減期の一方または両方を向上させている。特定の実施形態において、前記１〜１８個のアミノ酸置換は、キメラポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性を増大させる。特定の実施形態において、前記１〜１８個のアミノ酸置換は、キメラポリペプチドの血清半減期を長期化させる。特定の実施形態において、前記１〜１８個のアミノ酸置換は、キメラポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性を増大させ、かつ血清半減期を長期化させる。
【００３０】
特定の実施形態において、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変異形ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または、１８個のアミノ酸置換を含む。同様に、ドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合部分を含むＨＳＡ変異形ポリペプチドに関して、ドメインＩＩＩは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または、１８個のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、該アミノ酸置換は、単なる対立遺伝子の変異形に存在する他の残基への単一のアミノ酸置換ではない。
【００３１】
特定の実施形態において、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変異形ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づいた次の位置のいずれかにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：残基３８１、残基３８３、残基３９１、残基４０１、残基４０２、残基４０７、残基４１１、残基４１３、残基４１４、残基４１５、残基４１６、残基４２４、残基４２６、残基４３４、残基４４２、残基４４５、残基４４７、残基４５０、残基４５４、残基４５５、残基４５６、残基４５７、残基４５９、残基４６３、残基４９５、残基５０６、残基５０８、残基５０９、残基５１１、残基５１２、残基５１５、残基５１６、残基５１７、残基５１９、残基５２１、残基５２３、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２７、残基５３１、残基５３５、残基５３８、残基５３９、残基５４１、残基５５７、残基５６１、残基５６６、および残基５６９。
【００３２】
特定の実施形態において、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変異形ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づいた次の複数の位置のいずれかにおいてアミノ酸置換群を含む：（ａ）残基３８３および４１３；（ｂ）残基４０１および５２３；（ｃ）残基４０７および４４７；（ｄ）残基４０７および４４７および５３９；（ｅ）残基４０７および５０９；（ｆ）残基４０７および５２６；（ｇ）残基４１１および５３５；（ｈ）残基４１４および４５６；（ｉ）残基４１５および５６９；（ｊ）残基４２６および５２６；（ｋ）残基４４２および４５０および４５９；（１）残基４６３および５０８；（ｍ）残基５０８および５１９および５２５；（ｎ）残基５０９および５２７；（ｏ）残基５２３および５３８；（ｐ）残基５２６および５５７；ならびに（ｑ）残基５４１および５６１。
【００３３】
特定の実施形態において、ＦｃＲｎに対する親和性の増加および／または血清半減期の長期化は、異なる対照に対して評価される。例えば、キメラポリペプチドの特性は、ＨＳＡ部分がない場合の異種タンパク質の特性に対して評価されるか、あるいはアミノ酸置換がない場合および／または異種タンパク質がない場合の同一または類似のＨＳＡ部分の特性に対して評価され得る。同様に、ＨＳＡ変異形ポリペプチドは、ＨＳＡ分子のポリペプチドがアミノ酸置換がない場合に対して評価され得る。
【００３４】
特定の実施形態において、キメラポリペプチド／ＨＳＡ変異形ポリペプチドは、前記対照ポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎと結合する。特定の実施形態において、１〜１８個のアミノ酸置換は、酸性ｐＨ（例えば、およそ５．５のｐＨ）で、キメラポリペプチド／ＨＳＡ変異形ポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性を増加させる。特定の実施形態において、１〜１８個のアミノ酸置換は酸性ｐＨ（例えば、およそ５．５のｐＨ）でキメラポリペプチド／ＨＳＡ変異形ポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性を増加させるが、中性のｐＨ（例えば、およそ７．４のｐＨ）ではキメラポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性を実質的に変えない。特定の実施形態において、キメラポリペプチドは、酸性ｐＨでより高い親和性でＦｃＲｎと結合し、かつ長期化した血清半減期を有する。
【００３５】
特定の実施形態において、キメラポリペプチド／ＨＳＡ変異形ポリペプチドはＦｃＲｎと結合し、前記対照ＨＳＡポリペプチドとは異なるオフレートまたはオンレートを有する。例えば、特定の実施形態において、キメラポリペプチド／ＨＳＡ変異形ポリペプチドはＦｃＲｎと結合し、より速いオンレートおよび／またはより遅いオフレートを有する。他の実施形態においては、オンレートはより遅く、および／またはオフレートはより速い。
【００３６】
特定の実施形態において、ポリペプチド（例えば、ＨＳＡ変異形またはＨＳＡ部分を有するキメラポリペプチド）のＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜１０個のアミノ酸置換を含み、ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照ポリペプチドと比較してキメラポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性の増大および／または血清半減期の長期化を達成している。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１個のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、少なくとも１個のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、少なくとも１０個のアミノ酸置換を含む。
【００３７】
典型的なアミノ酸置換は、（ｉ）アラニンによる置換；（ｉｉ）保存的アミノ酸置換；（ｉｉｉ）非保存的アミノ酸置換を含む。本開示は、所与のポリペプチドのドメインＩＩＩにおけるアミノ酸置換の全てが、これらの置換カテゴリの１つに属するものであり得ることを想定しており、また所定のポリペプチド（例えば、ＨＳＡ変異形およびＨＳＡ部分を有するキメラポリペプチド）のドメインＩＩＩにおける各アミノ酸置換が、これらのカテゴリから個々に独立して選択されたものであることを想定している。
【００３８】
特定の実施形態において、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩの置換）は、ＨＳＡにおけるある残基からアラニンへの置換である。特定の実施形態において、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩの置換）は、ＨＳＡにおける所定の天然のアミノ酸残基から別の天然のアミノ酸残基への置換である。特定の実施形態において、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩの置換）は、ＨＳＡにおける所与の酸性アミノ酸残基から別の酸性アミノ酸残基への置換である。特定の実施形態において、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などＨＳＡドメインＩＩＩの置換）は、ＨＳＡにおける所与の塩基性アミノ酸残基から別の塩基性アミノ酸残基への置換である。本開示は、各置換が前述の置換クラスのなかから独立して選択されたものである実施形態を想定している。前述の置換のカテゴリの任意の組合せを含むポリペプチド（例えば、ＨＳＡ変異形およびＨＳＡ部分を有するキメラポリペプチド）が、特定的に企図される。
【００３９】
特定の実施形態において、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩの置換）は、１つのアミノ酸から、次の群、すなわちリシン（Ｋ；Ｌｙｓ）、アルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）；およびヒスチジン（Ｈ；Ｈｉｓ）のうちの別のアミノ酸への置換である。特定の実施形態において、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩの置換）は、１つのアミノ酸から、次の群、すなわちアスパラギン酸（Ｄ；Ａｓｐ；アスパラギン酸）、およびグルタミン酸（Ｅ；Ｇｌｕ；グルタミン酸）のうちの別のアミノ酸への置換である。特定の実施形態において、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩの置換）は、１つのアミノ酸から、次の群、すなわちアスパラギン（Ｎ；Ａｓｎ）、グルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）、セリン（Ｓ；Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）、およびチロシン（Ｙ；Ｔｙｒ）のうちの別のアミノ酸への置換である。特定の実施形態において、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩの置換）は、１つのアミノ酸から、次の群、すなわちアラニン（Ａ；Ａｌａ）、バリン（Ｖ；Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉ；Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ；Ｌｅｕ）、プロリン（Ｐ；Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｆ；Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｗ；Ｔｒｐ）、メチオニン（Ｍ；Ｍｅｔ）、システイン（Ｃ；Ｃｙｓ）、およびグリシン（Ｇ；Ｇｌｙ）のうちの別のアミノ酸への置換である。特定の実施形態において、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩの置換）は、１つのアミノ酸から、次の群、すなわちフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンのうちの別のアミノ酸への置換である。特定の実施形態において、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩの置換）は、１つのアミノ酸から、次の群、すなわちシステイン、セリン、およびスレオニンのうちの別のアミノ酸への置換である。特定の実施形態において、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩの置換）は、１つのアミノ酸から、次の群、すなわちアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸のうちの別のアミノ酸への置換である。特定の実施形態において、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩの置換）は、１つのアミノ酸から、次の群、すなわちグリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンのうちの別のアミノ酸への置換である。本開示は、各置換が上述の置換のカテゴリのなかから独立して選択されたものである実施形態を想定している。前述の置換のクラスの任意の組合せを含むポリペプチド（例えば、ＨＳＡ変異形およびＨＳＡ部分を有するキメラポリペプチド）は、特に想定の範囲内である。
【００４０】
特定の実施形態において、増大したＦｃＲｎに対する親和性および／または長期化した血清半減期を有するポリペプチド（例えばＨＳＡ変異形ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｋ４０２Ｇ、Ｋ４０２Ｉ、Ｋ４０２Ｌ、Ｋ４０２Ｖ、Ｌ４０７Ｆ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｑ、Ｌ４０７Ｗ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｙ４１ＩＮ、Ｋ４１３Ｃ、Ｋ４１３Ｓ、Ｋ４１３Ｔ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１４Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｖ４１５Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｑ４１６Ｈ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｄ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｖ４２６Ｐ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｐ４４７Ｓ、Ｐ４４７Ｔ、Ｅ４５０Ｄ、Ｅ４５０Ｅ、Ｓ４５４Ｃ、Ｓ４５４Ｍ、Ｓ４５４Ｔ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５５Ｑ、Ｖ４５６Ｎ、Ｖ４５６Ｑ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｑ４５９Ｋ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｃ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｌ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｖ、Ｆ５０９Ｗ、Ｆ５０９Ｙ、Ａ５１１Ｆ、Ａ５１１Ｗ、Ａ５１１Ｙ、Ｄ５１２Ｆ、Ｄ５１２Ｗ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｆ、Ｓ５１７Ｍ、Ｓ５１７Ｔ、Ｓ５１７Ｗ、Ｓ５１７Ｙ、Ｋ５１９Ａ、Ｋ５１９Ｇ、Ｋ５１９Ｉ、Ｋ５１９Ｌ、Ｋ５１９Ｖ、Ｒ５２１Ｆ、Ｒ５２１Ｗ、Ｒ５２１Ｙ、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｆ、Ｔ５２７Ｗ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、Ａ５３９Ｖ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５４１Ｗ、Ｋ５４１Ｙ、Ｋ５５７Ａ、Ｋ５５７Ｇ、Ｋ５５７Ｉ、Ｋ５５７Ｌ、Ｋ５５７Ｖ、Ａ５６１Ｆ、Ａ５６１Ｗ、Ａ５６１Ｙ、Ｔ５６６Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、Ｔ５６６Ｙ、Ａ５６９Ｈ、およびＡ５６９Ｐからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。特定の実施形態においては、ドメインＩＩＩにおける２以上のアミノ酸置換（例えば、２、３、４、５・・・）またはドメインＩＩＩのアミノ酸置換の全部までもが、上述の置換から選択されたものである。
【００４１】
他の特定の実施形態において、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変異形ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ｇ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１３Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｇ４３４Ｃ、Ｅ４４２Ｋ、Ｒ４４５Ｗ、Ｐ４４７Ｓ、Ｅ４５０Ｄ、Ｓ４５４Ｃ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４５７Ｆ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｗ、Ｋ５１９Ｉ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ｉ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５５７Ｇ、Ａ５６１Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、およびＡ５６９Ｐからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。特定の実施形態においては、ドメインＩＩＩにおける２以上のアミノ酸置換（例えば、２、３、４、５・・・）またはドメインＩＩＩのアミノ酸置換の全部までもが、上述の置換から選択されたものである。
【００４２】
他の特定の実施形態において、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変異形ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。特定の実施形態においては、ドメインＩＩＩにおける２以上のアミノ酸置換（例えば、２、３、４、５・・・）またはドメインＩＩＩのアミノ酸置換の全部までもが、上述の置換から選択されたものである。
【００４３】
他の特定の実施形態において、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変異形ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｓ５１７Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。特定の実施形態においては、ドメインＩＩＩにおける２以上のアミノ酸置換（例えば、２、３、４、５・・・）またはドメインＩＩＩのアミノ酸置換の全部までもが、上述の置換から選択されたものである。
【００４４】
特定の実施形態において、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変異形ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて、（ａ）Ｅ３８３Ｇ／Ｋ４１３Ｓ；（ｂ）Ｙ４０１Ｅ／Ｉ５２３Ｇ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｄ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｅ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｆ）Ｌ４０７Ｙ／Ｑ５２６Ｔ；（ｇ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｈ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｉ）Ｖ４１５Ｔ／Ａ５６９Ｐ；（０）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｋ）Ｅ４４２Ｋ／Ｅ４５０Ｄ／Ｑ４５９Ｒ；（ｌ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｍ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５１９Ｉ／Ｋ５２５Ｖ；（ｎ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｏ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｐ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；および（ｑ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態においては、ドメインＩＩＩにおける２以上のアミノ酸置換（例えば、２、３、４、５・・・）またはドメインＩＩＩのアミノ酸置換の全部までもが、上述の置換から選択されたものである。
【００４５】
特定の実施形態において、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変異形ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて、（ａ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｂ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｄ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｅ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｆ）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｇ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｈ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｉ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｊ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；および（ｋ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。
【００４６】
さらに、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学などの当分野で既知の技術を用いて、断片または変異形を化学的に合成できる。断片または変異形を、（組換えによってまたは化学合成によって）作製し、試験して、機能し得る断片または変異形、または例えば天然のＨＳＡタンパク質に実質的に類似する断片または変異形を特定することができる。
【００４７】
特定の実施形態において、本発明は、治療的もしくは予防的な有効性または安定性（例えば、血清半減期、生体外貯蔵寿命、および生体内でのタンパク分解に対する抵抗性）を強化するなどの目的のためにＨＳＡポリペプチドの構造を改変することを想定している。そのような改変型ＨＳＡポリペプチドは、自然に発生する（すなわち、天然のまたは野生型の）ＨＳＡポリペプチドと同一または実質的に同一な生物活性を有する。改変型ＨＳＡポリペプチドは、本明細書に記載するように、他の治療的な分子（例えば、タンパク質および非タンパク薬剤）とコンジュゲートを形成したものであり得る。改変型ポリペプチドは、例えばアミノ酸置換、除去、または付加によって作り出すことができる。イソロイシンまたはバリンによるロイシンの単独の置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、セリンによるスレオニンの置換、またはあるアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸による同様の置換（例えば、保存的アミノ酸置換）は、結果として生じる分子の生物活性には大きな影響を及ぼさないと予想することは理にかなっている。保存的置換は、その側鎖において関連するアミノ酸のファミリ−内で起こるものである。
【００４８】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、複数の種全体で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、複数の種全体で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒトまで高度に保存される種（例えば類人猿およびサル）由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、非哺乳動物由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒトまで高度に保存される種（例えば類人猿およびサル）由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、非哺乳動物由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマの大多数に由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択された少なくとも２つの種に由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択された少なくとも３つの種に由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択された少なくとも４つの種に由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択された少なくとも５つの種に由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択された２〜５の種に由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマの大多数に由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択された少なくとも２つの種に由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択された少なくとも３つの種に由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択された少なくとも４つの種に由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択された少なくとも５つの種に由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択された２〜５の種に由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである。前述のアミノ酸置換のカテゴリの任意の組合せを含むポリペプチド（例えば、ＨＳＡ変異形およびキメラポリペプチド）も、想定の範囲内である。
【００４９】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのアミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのアミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基４１７、残基４４２、残基４９９、および残基５０２。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのアミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基３９２、残基３９９、残基４０３、残基４１１、残基４１２、残基４１４、残基４１６、残基４１８、残基４２０、残基４２３、残基４３４、残基４３７、残基４３８、残基４４５、残基４４８、残基４５０、残基４５３、残基４６１、残基４７６、残基４７７、残基４８４、残基４８５、残基４８７、残基４８８、残基４９４、残基４９７、残基５０７、残基５０９、残基５１４、残基５２９、残基５３４、残基５３７、残基５４０、残基５５１、残基５５８、残基５５９、残基５６７、残基５６８、および残基５７２。特定の実施形態においては、ドメインＩＩＩにおける２以上のアミノ酸置換（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８）またはドメインＩＩＩのアミノ酸置換の全部までもが、上述の残基の位置のものである。前述の残基のいずれか１以上におけるアミノ酸置換のあらゆる組合せを含むポリペプチド（例えば、ＨＳＡ変異形およびキメラポリペプチド）が、特に想定の範囲内である。
【００５０】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのアミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡドメインＩＩＩの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基３８３、残基３９１、残基４１１、残基４１４、残基４１６、残基４３４、残基４４２、残基４４５、残基４５０、および残基５０９。
【００５１】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４１１Ｑ、Ｙ４１１Ｎ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１４Ｔ、Ｑ４１６Ｈ、Ｑ４１６Ｐ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｅ４５０Ｄ、Ｅ４５０Ｅ、Ｆ５０９Ｃ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｌ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｖ、Ｆ５０９Ｗ、およびＦ５０９Ｙからなる群から選択されたものである。特定の実施形態においては、ドメインＩＩＩにおける２以上のアミノ酸置換（例えば、２、３、４、５・・・）またはドメインＩＩＩのアミノ酸置換の全部までもが、上述の置換から選択されたものである。
【００５２】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡドメインＩＩＩの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８７、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６６、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基５００、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３５、残基５３９、残基５４４、残基５４７、残基５７６。特定の実施形態においては、ドメインＩＩＩにおける２以上のアミノ酸置換（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８）またはドメインＩＩＩのアミノ酸置換の全部までもが、上述の残基の位置のものである。前述の残基のいずれか１以上におけるアミノ酸置換のあらゆる組合せを含むポリペプチド（例えば、ＨＳＡ変異形およびキメラポリペプチド）が、特に想定の範囲内である。
【００５３】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡドメインＩＩＩの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基３８１、残基４０１、残基４２４、残基４５７、残基４６３、残基４９５、残基５０８、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５３１、残基５３５、および残基５３９。
【００５４】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｖ２４２Ａ、Ｖ２４２Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２４Ｖ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、およびＡ５３９Ｖからなる群から選択されたものである。特定の実施形態においては、ドメインＩＩＩにおける２以上のアミノ酸置換（例えば、２、３、４、５・・・）またはドメインＩＩＩのアミノ酸置換の全部までもが、上述の置換から選択されたものである。
【００５５】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、複数の種全体で保存されない残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、複数の種全体で保存されない残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ネズミ、イヌ、ウサギ、およびウシ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存されない残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ネズミ、イヌ、ウサギ、およびウシ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存されない残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ネズミ、イヌ、ウサギ、およびウシ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存されない残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ネズミ、イヌ、ウサギ、およびウシ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存されない残基のものである。前述のアミノ酸置換のカテゴリの任意の組合せを含むポリペプチド（例えば、ＨＳＡ変異形およびＨＳＡ部分を有するキメラポリペプチド）も、想定の範囲内である。
【００５６】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのアミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基３８２、残基３８５、残基３９０、残基３９７、残基４００、残基４０２、残基４１５、残基４２９、残基４３２、残基４３５、残基４３９、残基４４０、残基４４３、残基４４４、残基４４６、残基４４７、残基４５９、残基４７１、残基４７２、残基４７８、残基４７９、残基４８３、残基４９０、残基４９２、残基４９３、残基５０３、残基５１１、残基５１７、残基５１８、残基５１９、残基５２１、残基５３８、残基５４１、残基５４２、残基５４６、残基５４９、残基５５０、残基５５２、残基５５４、残基５５６、残基５６０、残基５６２、残基５６３、残基５６５、および残基５６６。特定の実施形態においては、ドメインＩＩＩにおける２以上のアミノ酸置換（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８）またはドメインＩＩＩのアミノ酸置換の全部までもが、上述の残基の位置のものである。前述の残基のいずれか１以上におけるアミノ酸置換のあらゆる組合せを含むポリペプチド（例えば、ＨＳＡ変異形およびＨＳＡ部分を有するキメラポリペプチド）が、特に想定の範囲内である。
【００５７】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのアミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基４０２、残基４１５、残基４４７、残基４５９、残基５１１、残基５１７、残基５１９、残基５２１、残基５３８、残基５４１、および残基５６６。
【００５８】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｋ４０２Ａ、Ｋ４０２Ｇ、Ｋ４０２Ｉ、Ｋ４０２Ｌ、Ｋ４０２Ｖ、Ｖ４１５Ｃ、Ｖ４１５Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｐ４４７Ｓ、Ｐ４４７Ｔ、Ｑ４５９Ｋ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ａ５１１Ｆ、Ａ５１１Ｗ、Ａ５１１Ｙ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｆ、Ｓ５１７Ｍ、Ｓ５１７Ｔ、Ｓ５１７Ｗ、Ｓ５１７Ｙ、Ｋ５１９Ａ、Ｋ５１９Ｇ、Ｋ５１９Ｉ、Ｋ５１９Ｌ、Ｋ５１９Ｖ、Ｒ５２１Ｆ、Ｒ５２１Ｗ、Ｒ５２１Ｙ、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５４１Ｗ、Ｋ５４１Ｙ、Ｔ５６６Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、およびＴ５６６Ｙからなる群から選択されたものである。特定の実施形態においては、ドメインＩＩＩにおける２以上のアミノ酸置換（例えば、２、３、４、５・・・）またはドメインＩＩＩのアミノ酸置換の全部までもが、上述の置換から選択されたものである。
【００５９】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表面接触可能残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、表面接触可能残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表面接触可能で、かつ複数の種全体で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、表面接触可能で、かつ複数の種全体で保存される残基のものである。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのアミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのアミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基４１７、残基４４２、残基４９９、および残基５０２。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのアミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基３８３、残基３９１、および残基４４２。特定の実施形態においては、ドメインＩＩＩにおける２以上のアミノ酸置換（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８）またはドメインＩＩＩのアミノ酸置換の全部までもが、上述の残基の位置のものである。前述のアミノ酸置換のカテゴリのあらゆる組合せを含むポリペプチド（例えば、ＨＳＡ変異形およびキメラポリペプチド）は、特に想定の範囲内である。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｅ４４２Ｋ、およびＥ４４２Ｒからなる群から選択されたものである。特定の実施形態においては、ドメインＩＩＩにおける２以上のアミノ酸置換（例えば、２、３、４、５・・・）またはドメインＩＩＩのアミノ酸置換の全部までもが、上述の置換から選択されたものである。
【００６０】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのアミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｒ４１０Ｃ；Ｋ４６６Ｅ；Ｅ４７９Ｋ；Ｄ４９４Ｎ；Ｅ５０１Ｋ；Ｅ５０５Ｋ；Ｖ５３３Ｍ；Ｋ５３６Ｅ５３６；Ｋ５４１Ｅ；Ｄ５５０ＡまたはＤ５５０Ｇ；Ｋ５６０Ｅ；Ｄ５６３Ｎ；Ｅ５６５Ｋ；Ｅ５７０Ｋ；Ｋ５７３Ｅ；またはＫ５７４Ｅの置換単独ではない。
【００６１】
特定の実施形態において、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変異形ポリペプチドまたはＨＳＡ部分を有するキメラポリペプチド）は、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＳＡドメインＩＩＩを含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡ部分は、配列番号２の対応部分と少なくとも８０％、８５％、または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡ部分は、配列番号２の対応部分と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡ部分は、配列番号２の対応部分と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６２】
特定の実施形態において、本開示は、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける１以上のアミノ酸置換に加えて、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変異形ポリペプチドまたはＨＳＡ部分を有するキメラポリペプチド）が、ドメインＩＩＩ外のＨＳＡ部分において１以上のアミノ酸置換も含み得ることを想定している。
【００６３】
特定の実施形態において、本発明は、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変異形ポリペプチドまたはＨＳＡ部分を有するキメラポリペプチド）が、ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて１以上のアミノ酸置換に加えて、ドメインＩＩＩにおける１以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８）のアミノ酸欠失および／または挿入も含み得ることを想定している。ＨＳＡ部分が１以上のアミノ酸欠失および／または挿入を含むとき、そのような挿入されたまたは除去された残基は、天然のＨＳＡの残基に対する残基への番号付けを中断させないように文字を用いて表示され得ることに注意されたい。例えば、アミノ酸残基が残基４１４と４１５との間に挿入される場合、そのような残基を４１４ａとして表示することができる。特定の実施形態において、挿入されたアミノ酸残基は、表面接触可能ループに挿入され、そのようなループのサイズを増加させている。特定の実施形態において、挿入されたアミノ酸残基は、らせん構造に挿入されて、そのようならせん構造のサイズを増加および／または構造を改変させている。
【００６４】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜５個（１、２、３、４、５個）のアミノ酸置換を含み、前記１〜５個のアミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ２において１〜５個（１、２、３、４、または５個）のアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ２ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜５個（１、２、３、４、５個）のアミノ酸置換を含み、前記１〜５個のアミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ３において１〜５個（１、２、３、４、または５個）のアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ３ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜１８個（１、２、３、４、５、６個など）のアミノ酸置換を含み、前記１〜１８個のアミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ６において１〜１８個（１、２、３、４、５、または６個など）のアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ６ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜６個（１、２、３、４、５、または６個）のアミノ酸置換を含み、前記１〜６個のアミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるらせん構造７において１〜６個（１、２、３、４、５、または６個）のアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるらせん構造７ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜３個（１、２、または３個）のアミノ酸置換を含み、前記１〜３個のアミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ７において１〜３個（１、２、または３個）のアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ７ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜１８個（１、２、３、４、５、６個など）のアミノ酸置換を含み、前記１〜１８個のアミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるらせん構造８において１〜６個（１、２、３、４、５、６個など）のアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるらせん構造８ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜５個（１、２、３、４、５個）のアミノ酸置換を含み、前記１〜５個のアミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ８において１〜５個（１、２、３、４、または５個）のアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ８ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜４個（１、２、３、４個）のアミノ酸置換を含み、前記１〜４個のアミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ８において１〜５個（１、２、３、４個）のアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ９ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。以前に詳述したように、可能なアミノ酸置換は、各位置で独立して、以前に詳述した置換のクラス（例えば、アラニン、保存的置換など）のいずれかから選択されたものである。前述のアミノ酸置換のカテゴリの任意の組合せを含むポリペプチド（例えば、ＨＳＡ変異形およびキメラポリペプチド）が、想定の範囲内である。
【００６５】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２にはない。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３にはない。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６にはない。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７にはない。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７にはない。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８にはない。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８にはない。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９にはない。
【００６６】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩの少なくとも２つのループにはない。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９からなる群から選択され、ＨＳＡドメインＩＩＩの少なくとも３つのループにはない。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩの少なくとも４つのループにはない。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換は、らせん構造７または８にはない。
【００６７】
特定の実施形態において、ドメインＩＩＩは少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９、ならびにらせん構造７および８からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩの少なくとも２つのループおよび／またはらせん構造にある。特定の実施形態において、ドメインＩＩＩは少なくとも３つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９、ならびにらせん構造７および８からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩの少なくとも３つのループおよび／またはらせん構造にある。特定の実施形態において、ドメインＩＩＩは少なくとも４つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９、ならびにらせん構造７および８からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩの少なくとも４つのループおよび／またはらせん構造にある。特定の実施形態において、ドメインＩＩＩは少なくとも５つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９、ならびにらせん構造７および８からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩの少なくとも５つのループおよび／またはらせん構造にある。特定の実施形態において、ドメインＩＩＩは少なくとも６つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９、ならびにらせん構造７および８からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩの少なくとも６つのループおよび／またはらせん構造にある。特定の実施形態において、ドメインＩＩＩは少なくとも５つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２、３、６、７、８、および９のそれぞれにある。特定の実施形態において、ドメインＩＩＩは少なくとも６つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２、３、６、７、８、および９のそれぞれにある。特定の実施形態において、ドメインＩＩＩは少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７および８のそれぞれにある。
【００６８】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つはループ２にあり、残基４１５、残基４１６、残基４１７、残基４１８、および残基４１９から選択される。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の２以上（２、３、４、５）はループ２にあり、残基４１５、残基４１６、残基４１７、残基４１８、および残基４１９から選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２における前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｖ４１５Ｃ、Ｖ４１５Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｑ４１６Ｈ、およびＱ４１６Ｐから選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つはループ３にあり、残基４３９、残基４４０、残基４４１、残基４４２、および残基４４３から選択される。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の２以上（２、３、４、５）はループ３にあり、残基４３９、残基４４０、残基４４１、残基４４２、および残基４４３から選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３における前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｅ４４２ＫおよびＥ４４２Ｒから選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つはループ６にあり、残基４９２、残基４９３、残基４９４、残基４９５、残基４９６、残基４９７、残基４９８、残基４９９、残基５００、残基５０１、残基５０２、残基５０３、残基５０４、残基５０５、残基５０６、残基５０７、残基５０８、および残基５０９から選択される。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の２以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）はループ６にあり、残基４９２、残基４９３、残基４９４、残基４９５、残基４９６、残基４９７、残基４９８、残基４９９、残基５００、残基５０１、残基５０２、残基５０３、残基５０４、残基５０５、残基５０６、残基５０７、残基５０８、および残基５０９から選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６における前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｃ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｌ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｖ、Ｆ５０９Ｗ、およびＦ５０９Ｙから選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つはらせん構造７にあり、残基５１０、残基５１１、残基５１２、残基５１３、残基５１４、および残基５１５から選択される。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の２以上（２、３、４、５、６）はらせん構造７にあり、残基５１０、残基５１１、残基５１２、残基５１３、残基５１４、および残基５１５から選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７における前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ａ５１１Ｆ、Ａ５１１Ｗ、Ａ５１１Ｙ、Ｄ５１２Ｆ、Ｄ５１２Ｗ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、およびＴ５１５Ｓから選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つはループ７にあり、残基５１６、残基５１７、および残基５１８から選択される。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の２以上（２、３）はループ７にあり、残基５１６、残基５１７、および残基５１８から選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７における前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｆ、Ｓ５１７Ｍ、Ｓ５１７Ｔ、Ｓ５１７Ｗ、およびＳ５１７Ｙから選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つはらせん構造８にあり、残基５１９、残基５１８、残基５１９、残基５２０、残基５２１、残基５２２、残基５２３、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２７、残基５２８、残基５２９、残基５３０、残基５３１、残基５３２、残基５３３、残基５３４、残基５３５、および残基５３６から選択される。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の２以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）はらせん構造８にあり、残基５１９、残基５１８、残基５１９、残基５２０、残基５２１、残基５２２、残基５２３、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２７、残基５２８、残基５２９、残基５３０、残基５３１、残基５３２、残基５３３、残基５３４、残基５３５、および残基５３６から選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８における前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｋ５１９Ａ、Ｋ５１９Ｇ、Ｋ５１９Ｉ、Ｋ５１９Ｌ、Ｋ５１９Ｖ、Ｒ５２１Ｆ、Ｒ５２１Ｗ、Ｒ５２１Ｙ、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｆ、Ｔ５２７Ｗ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、およびＨ５３５Ｐから選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つはループ８にあり、残基５３７、残基５３８、残基５３９、残基５４０、および残基５４１から選択される。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の２以上（２、３、４、５）はループ８にあり、残基５３７、残基５３８、残基５３９、残基５４０、および残基５４１から選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つはループ９にあり、残基５６１、残基５６２、残基５６３、および残基５６４から選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８における前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、Ａ５３９Ｖ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５４１Ｗ、およびＫ５４１Ｙから選択される。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の２以上（２、３、４）はループ９にあり、残基５６１、残基５６２、残基５６３、および残基５６４から選択される。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９における前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ａ５６１Ｆ、Ａ５６１Ｗ、およびＡ５６１Ｙから選択される。
【００６９】
さらに、例えばＨＳＡドメインＩＩＩループの長さを増減させるドメインＩＩＩにおける挿入または欠失が想定されている。特定の実施形態において、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける挿入または欠失は、ループ２の長さを変える。特定の実施形態において、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける挿入または欠失は、ループ３の長さを変える。特定の実施形態において、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける挿入または欠失は、ループ６の長さを変える。特定の実施形態において、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける挿入または欠失は、らせん構造７の長さを変える。特定の実施形態において、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける挿入または欠失は、ループ７の長さを変える。特定の実施形態において、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける挿入または欠失は、らせん構造８の長さを変える。特定の実施形態において、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける挿入または欠失は、ループ８の長さを変える。特定の実施形態において、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける挿入または欠失は、ループ９の長さを変える。特定の実施形態において、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける挿入または欠失は、ループ２、３、６、７、８、および９ならびにらせん構造７および８からなる群から選択される、少なくとも２つのループおよび／またはらせん構造の長さを変える。特定の実施形態において、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける挿入または欠失は、ループ２、３、６、７、８、および９ならびにらせん構造７および８からなる群から選択される、少なくとも３つのループおよび／またはらせん構造の長さを変える。特定の実施形態において、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける挿入または欠失は、ループ２、３、６、７、８、および９ならびにらせん構造７および８からなる群から選択される、少なくとも４つのループおよび／またはらせん構造の長さを変える。特定の実施形態において、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける挿入または欠失は、ループ２、３、６、７、８、および９ならびにらせん構造７および８からなる群から選択される、少なくとも５つのループおよび／またはらせん構造の長さを変える。特定の実施形態において、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける挿入または欠失は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２、３、６、７、８、および９のそれぞれの長さを変える。複数のループおよび／またはらせん構造が改変されるとき、本開示は、それらのループおよび／またはらせん構造がそれぞれ独立して改変され、１以上のループおよび／またはらせん構造は挿入によって長さが延ばされ、１以上のループおよび／またはらせん構造は欠失により長さが短縮される場合もあり得ることを想定している。
【００７０】
ドメインＩＩＩがアミノ酸の挿入または欠失を含む実施形態について、本開示は、１個のアミノ酸の挿入または欠失を想定している。また、２個以上（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）のアミノ酸の挿入または欠失も想定されている。特定の実施形態において、本開示は、１０個以上のアミノ酸残基（例えば１０〜２０、２０〜４０、４０〜５０、５０〜１００個のアミノ酸）の挿入も想定している。本発明のキメラポリペプチドおよびＨＳＡ変異形ポリペプチドと同じように、挿入または除去を含む組成物は、それらがＦｃＲｎ結合活性を保持していることを確認するべく試験される。好ましい組成物は、対照と比較してＦｃＲｎ結合性や血清半減期を提供する組成物である。
【００７１】
明確性のために述べると、本開示は、上記または下記の複数の態様や実施形態の任意の組合せを特に想定の範囲内としている。ＨＳＡ部分を含んでいるキメラのポリペプチドに関して述べるとき、ならびにＨＳＡ部分を含んでいる変異形ＨＳＡポリペプチドに関して述べるとき、そのようなＨＳＡ部分は、ドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合性部分を含むものである。さらに、本明細書に記載するように、ＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、１〜１８個のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個のアミノ酸置換を含む。典型的なアミノ酸置換としては次のものが含まれる：（ｉ）アラニンによる置換；（ｉｉ）保存的アミノ酸置換；（ｉｉｉ）非保存的アミノ酸置換。本開示は、所与のポリペプチドのドメインＩＩＩのアミノ酸置換の全部が、これらのアミノ酸置換のカテゴリのなかの１つに属し得ることを想定するとともに、所与のポリペプチドのドメインＩＩＩのアミノ酸置換のそれぞれが、これらのアミノ酸置換のカテゴリのなかから個々に独立して選択されたものであり得ることも想定している。特定の実施形態において、ドメインＩＩＩの天然のシステイン残基は、維持されて置換されない。特定の実施形態において、ドメインＩＩＩの天然のプロリン残基は、維持されて置換されない。特定の実施形態において、ドメインＩＩＩの天然のシステイン残基および天然のプロリン残基は、維持されて置換されない。特定の実施形態において、システイン残基は置換されない（例えば、システインは天然の残基の置換に使用されない）。特定の実施形態において、プロリン残基は置換されない（例えば、プロリンは天然の残基の置換に使用されない）。他の実施形態においては、２０種のアミノ酸のいずれか一つが、所与の天然の残基を置換するために使用される。
【００７２】
前述のアミノ酸置換のクラスの任意の組合せを含むＨＳＡ変異形およびキメラポリペプチドも想定されている。
【００７３】
本発明は、本明細書に記載するアミノ酸配列と実質的に同一の配列にあるアミノ酸群を含むＨＳＡ部分を有するキメラポリペプチドおよび変異体を包含する。本明細書に記載するアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換ならびにアミノ酸の欠失および／または挿入を含む配列を包含する。保存的アミノ酸置換とは、第１のアミノ酸が、該第１のアミノ酸のものに類似した化学的および／または物理的特性（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第２のアミノ酸で置換されることを指す。保存的アミノ酸置換は、次の群、すなわち、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、およびヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、およびＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、およびグリシン（Ｇ）；Ｆ、Ｗ、およびＹ；Ｃ、Ｓ、およびＴのなかでのあるアミノ酸から別のアミノ酸への置換を包含する。
【００７４】
特定の実施形態において、前記ＨＳＡ変異形ポリペプチドは実質的に精製される。特定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは実質的に精製される。特定の態様では、本開示は、ここに開示されるＨＳＡ変異形またはキメラポリペプチドと、医薬的に許容される担体とを含む組成物を提供する。特定の実施形態において、該組成物は無菌の組成物である。特定の実施形態において、該組成物は非発熱性である。
【００７５】
［６．４  組合せドメインＩＩＩ変異体］
本発明は、ドメインＩＩＩを含むＨＳＡ部分の組合せ変異体の組、ならびに切断型変異体を生成することをさらに想定しており、これは生物活性変異形配列を特定するのに特に有用である。自然発生ＨＳＡポリペプチドと比較して選択的効力を有する組合せに由来する変異形を作り出すことができる。同様に、突然変異誘発によって、対応する野生型ＨＳＡポリペプチドと劇的に異なる細胞内半減期を有する変異形を生成することができる。例えば、改変されたタンパク質を、タンパク質分解か、あるいは目的のタンパク質の破壊そうでなければ不活化をもたらす他の細胞プロセスに対して安定度が高いか、または低いものとすることができる。そのような変異形を用いて、ＨＳＡポリペプチドのレベルを、それらの半減期を調節することによって改変することができる。可能性のあるＨＳＡ変異形配列のライブラリーを、例えば縮重オリヌクレオチド配列から作製する多くの方法が存在する。自動ＤＮＡ合成機において縮重配列の化学合成を行い、次に合成遺伝子を結合して発現のために適切な遺伝子にすることができる。縮重遺伝子の組を用いる目的は、１つの混合物において、目的の可能性のあるポリペプチド配列の組をコードするすべての配列を提供することにある。縮重オリゴヌクレオチドの合成については公知である。（例えば、ａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｅｄ．ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい。）そのような技術は、他のタンパク質の指向進化において用いられている。（例えば、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号、および同第５，０９６，８１５号を参照されたい。）
あるいは、他の形態の突然変異生成を用いて、組合せライブラリーを作り出すことができる。例えば、ＨＳＡポリペプチド変異形を生成し、例えばアラニンスキャニング突然変異生成（Ｒｕｆ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ，（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）、リンカースキャニング突然変異生成（Ｇｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ，（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３１６）、飽和突然変異生成（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：６１３）、ＰＣＲ突然変異生成（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １：１１−１９）、または化学的突然変異生成を含むランダム突然変異生成（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７：３２−３４）などを用いたスクリーニングによってライブラリーから単離することができる。特に組合せのセットの作製におけるリンカースキャニング突然変異生成は、ＨＳＡポリペプチドの切断型（生物活性）形態を特定するためには魅力的な方法である。ＨＳＡポリペプチド変異形のライブラリーを生成し単離する別の方法も、本明細書において提示される。例えば「実施例」と題する第８項を参照されたい。特に、組合せＨＳＡドメインＩＩＩ変異体ライブラリーの生成とスクリーニングに有用な特定の方法についての８．１０および８．１１の項を参照されたい。
【００７６】
本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸置換についての上述の実施形態のいずれをも、ペプチドのライブラリーの作製のために使用し得る。特定の実施形態において、組合せに由来する変異形を、ＨＳＡドメインＩＩＩの残基において生成する。特定の実施形態において、（ｉ）変異形ドメインＩＩＩコンストラクト；（ｉｉ）完全長ＨＳＡに関して提示された変異形ドメインＩＩＩコンストラクト；または（ｉｉｉ）少なくともドメインＩＩＩを含むキメラポリペプチドまたは切断型ＨＳＡに関するもののなかの１以上に関して、ドメインＩＩＩ変異が導入され、スクリーニングされる。特定の実施形態において、開始ポリペプチドと比較して増加したＦｃＲｎに対する親和性および長期化した血清半減期のいずれか一方または両方を有する変異形についてペプチドのライブラリーをスクリーニングする。特定の実施形態において、本出願に記載する標準試験管内アッセイ（例えばフローサイトメトリー）を用いて変異形を評価する。特定の実施形態において、改善されたＦｃＲｎｎｉ対する親和性を示す変異形を特定する。他の実施形態においては、改善されたＦｃＲｎに対する親和性が、酸性ｐＨ（例えばおよそ５．５のｐＨ）でのみ生じるが、中性ｐＨ（例えばおよそ７．４のｐＨ）では生じないか否かを決定するべく変異形をスクリーニングする。
【００７７】
特定の実施形態においては、組合せによって生成された変異形が、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づいた次の位置のいずれかにおいて少なくとも２つのアミノ酸置換を含む：残基４０７、残基４１５、残基４６３、残基４９５、残基５０８、残基５０９、残基５１１、残基５１２、残基５１５、残基５１６、残基５１７、残基５２１、残基５２３、残基５２４、残基５２６、残基５２７、および残基５５７。
【００７８】
特定の実施形態において、組合せによって生成された変異形が、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｆ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ｆ５０９Ｉ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｄ５１２Ｍ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ａ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｙ、およびＴ５５７Ｇからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。
【００７９】
特定の実施形態において、組合せによって生成された変異形は、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づいた（ａ）残基３８３および４１３；（ｂ）残基４０１および５２３；（ｃ）残基４０７および４４７；（ｄ）残基４０７および４４７および５３９；（ｅ）残基４０７および５０９；（ｆ）残基４０７および５２６；（ｇ）残基４１１および５３５；（ｈ）残基４１４および４５６；（ｉ）残基４１５および５６９；（ｊ）残基４２６および５２６；（ｋ）残基４４２および４５０および４５９；（１）残基４６３および５０８；（ｍ）残基５０８および５１９および５２５；（ｎ）残基５０９および５２７；（ｏ）残基５２３および５３８；（ｐ）残基５２６および５５７；および（ｑ）残基５４１および５６１からなる群から選択される位置において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるアミノ酸置換を含む。
【００８０】
特定の実施形態において、組合せによって生成された変異形は、複数の種全体で保存される残基において生ずる。特定の実施形態において、組合せによって生成された変異形は、表面接触可能残基において生ずる。特定の実施形態において、組合せによって生成された変異形は、表面接触可能残基であり、かつ複数種全体で保存される残基で発生する。特定の実施形態において、組合せによって生成された変異形は、複数種全体で保存されるが、ニワトリＨＳＡでは保存されない残基で発生する。
【００８１】
特定の態様において、本開示は、複数のポリペプチドを含むライブラリーを提供し、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合断片を含み、かつ前記複数のポリペプチドのそれぞれが独立して、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマに由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される、残基のアミノ酸置換を少なくとも１つ含む。
【００８２】
特定の態様では、本開示は、複数のポリペプチドを含むライブラリーを提供し、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合断片を含み、かつ前記複数のポリペプチドのそれぞれが独立して、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマに由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存されるが、ニワトリ由来の血清アルブミンでは保存されない、残基のアミノ酸置換を少なくとも１つ含む。
【００８３】
特定の態様では、本開示は、複数のポリペプチドを含むライブラリーを提供し、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合断片を含み、かつ前記複数のポリペプチドのそれぞれが独立して、ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて、表面接触可能残基である、前記残基のアミノ酸置換を少なくとも１つ含む。
【００８４】
特定の態様では、本開示は、複数のポリペプチドを含むライブラリーを提供し、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合断片を含み、かつ前記複数のポリペプチドのそれぞれが独立して、前記ＨＳＡとメインＩＩＩにおいて、（ｉ）表面接触可能残基であり、かつ（ｉｉ）ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマに由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される、残基のアミノ酸置換を少なくとも１つ含む。
【００８５】
特定の実施形態において、前記表面接触可能残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２にある。特定の実施形態において、前記表面接触可能残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３にある。特定の実施形態において、前記表面接触可能残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６にある。特定の実施形態において、前記表面接触可能残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７にある。特定の実施形態において、前記表面接触可能残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７にある。特定の実施形態において、前記表面接触可能残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８にある。特定の実施形態において、前記表面接触可能残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８にある。特定の実施形態において、前記表面接触可能残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９にある。
【００８６】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基４１７、残基４４２、残基４９９、および残基５０２。
【００８７】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基３９２、残基３９９、残基４０３、残基４１１、残基４１２、残基４１４、残基４１６、残基４１８、残基４２０、残基４２３、残基４３４、残基４３７、残基４３８、残基４４５、残基４４８、残基４５０、残基４５３、残基４６１、残基４７６、残基４７７、残基４８４、残基４８５、残基４８７、残基４８８、残基４９４、残基４９７、残基５０７、残基５０９、残基５１４、残基５２９、残基５３４、残基５３７、残基５４０、残基５５１、残基５５８、残基５５９、残基５６７、残基５６８、および残基５７２。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるアミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡドメインＩＩＩの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８７、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６６、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基５００、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３５、残基５３９、残基５４４、残基５４７、残基５７６。
【００８８】
特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ２に少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ２ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ３において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ３ではないところに１以上の追加の置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ６において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ６ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるらせん構造７において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるらせん構造７ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ７において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ７ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるらせん構造８において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるらせん構造８ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ８において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ８ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９にある。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ８において少なくとも１つののアミノ酸置換を含み、さらにＨＳＡドメインＩＩＩにおけるループ９ではないところに１以上の追加のアミノ酸置換を含む。
【００８９】
上記の特定の実施形態または下記の態様または実施形態のいずれかにおいて、アミノ酸置換は、ある残基のアラニンへの変化であり得る。上記の特定の実施形態または下記の側面または実施形態のいずれかにおいて、アミノ酸置換は、ある残基が類似の電荷または他の特性を有する別の残基に置換される保存的アミノ酸置換であり得る。上記の特定の実施形態または下記の態様または実施形態のいずれかにおいて、アミノ酸置換は、ある残基が類似の電荷または他の特性を有していない別の残基に置換される非保存的アミノ酸置換であり得る。上記の特定の実施形態または下記の態様または実施形態のいずれかにおいて、アミノ酸置換は、ある残基の別の残基への変化であり得る。ＨＳＡ部分が２以上のアミノ酸置換を含むとき、その置換は、上述のアミノ酸置換カテゴリーのいずれか１つまたはそれらの組合せに当てはまるものであり得ることが想定されている。例えば、前記置換の全部が、アラニンへの変化、または保存的アミノ酸置換、または非保存的アミノ酸置換であり得る。あるいは、そのアミノ酸置換が、例えば１つのアラニンへの変化、１つの保存的アミノ酸置換、および１つの非保存的アミノ酸置換などの任意の組合せを含み得る。
【００９０】
点突然変異と切り詰めによって構築される組合せライブラリーの遺伝子産物のスクリーニングのため、およびそのための、特定の特性を有する遺伝子産物についてのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための広範囲にわたる技術が公知である。そのような技術は、通常は、ＨＳＡポリペプチドの組合せ突然変異生成によって作製される遺伝子ライブラリーの高速スクリーニングに適用できる。大きい遺伝子ライブラリーのスクリーニングのために最も広く使われている技術には、遺伝子ライブラリーの複製可能な発現ベクターへのクローニング、得られたベクターのライブラリーでの適切な細胞の形質転換、所望の活性の検出により、およびその産物が検出される遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を容易にする条件の下での組合せ遺伝子を発現が含まれる。以下に記す典型的なアッセイのそれぞれは、組合せ突然変異生成技術によって生成された、多数の縮重配列をスクリーニングするために必要な高スループット分析に適する。
【００９１】
特定の実施形態において、ＨＳＡポリペプチドは、ポリペプチドおよびペプチド模倣薬を含み得る。本明細書中で使用されるとき、「ペプチド模倣薬」という用語は、非天然に存在するアミノ酸、ペプトイドなどを含む化学的に改質したペプチドおよびペプチド様分子を含む。ペプチド模倣薬は、対象に投与されるときの強化された安定性などの、ペプチドにまさる種々の利点を提供する。ペプチド模倣薬を特定する方法は当技術分野で知られており、可能性のあるペプチド模倣薬のライブラリーを含むデータベースをスクリーニングすることを含む。例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅは、既知の結晶構造を有する３０万を超える化合物の集合を含む（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ，３５：２３３１（１９７９））。目標分子の結晶構造が利用できない場合、例えばプログラムＣＯＮＣＯＲＤを使って構造を生成することができる（Ｒｕｓｉｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．２９：２５１（１９８９））。別のデータベースであるＡｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ  Ｃａｌｉｆ）は、市販のおよそ１０万の化合物を含み、ＨＳＡポリペプチドの可能性のあるペプチド模倣薬を特定するべくこれを検索することもできる。
【００９２】
特定の実施形態において、ＨＳＡポリペプチドは、翻訳後修飾をさらに含み得る。典型的な翻訳後のタンパク質の修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰリボシル化、ユビキチン結合、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化、あるいはポリペプチド側鎖の付加または疎水基の付加が含まれる。その結果、修飾ＨＳＡポリペプチドは、非アミノ酸要素（例えば脂質、多糖または単糖、およびリン酸塩）を含み得る。そのような非アミノ酸要素のＨＳＡポリペプチドの機能性に対する効果は、その生物活性、例えばそのＦｃＲｎに結合する能力などについて試験し得る。天然のＨＳＡポリペプチドをグリコシル化し得るとすると、特定の実施形態において、本発明によるキメラポリペプチドで使用されるＨＳＡポリペプチドはグリコシル化されている。特定の実施形態において、グリコシル化のレベルとパターンは、天然のＨＳＡポリペプチドのそれと同一または実質的に同一である。他の実施形態において、グリコシル化のレベルおよび／またはパターンは、天然のＨＳＡポリペプチドのそれとは異なる（例えば、過小グリコシル化、過剰グリコシル化、非グリコシル化）。
【００９３】
本発明の特定の実施形態において、ＨＳＡ部分を含んでいるポリペプチド（例えば、ＨＳＡ変異形またはキメラポリペプチド）は、非タンパク薬剤とコンジュゲートを形成し得る。そのような非タンパク製剤としては、以下に限定されないが、核酸分子、化学物質、有機分子などが挙げられ、それぞれ天然の源に由来するもの（例えば、天然物スクリーニング）、または化学的に合成されたものであり得る。特定の実施形態において、ＨＳＡ部分は、非タンパク薬剤に化学的コンジュゲートを形成し得る。
【００９４】
本発明のある特定の実施形態において、ＨＳＡポリペプチドは、非タンパク質・ポリマーで修飾されてもよい。１つの特定の実施形態において、前記ポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号；同４，４９６，６８９号；同４，４９６，６８９号；同４，３０１，１４４号；同４，３０１，１４４号；同４，６７０，４１７号；同４，６７０，４１７号；同４，７９１，１９２号；または同４，１７９，３３７号に記載の方法による、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンである。ＰＥＧは、市販のものであるか、当分野において周知のエチレングリコールの開環重合によって調製することができる周知の水溶性ポリマーである（Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒａ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ１３８−１６１）。
【００９５】
特定の実施形態において、ＨＳＡポリペプチドの断片または変異形は、望ましくは、天然のＨＳＡポリペプチドに伴う生物活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を保持するものである。特定の実施形態において、ＨＳＡポリペプチドの断片または変異形は、天然タンパク質の半減期と比較して長期化された半減期（ｔ１／２）を有する。半減期が長期化される実施形態について、そのＨＳＡ断片または変異形の半減期は、天然のＨＳＡタンパク質の半減期と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％または５００％だけ長期化され、または１０００％までも長期化される。いくつかの実施形態において、タンパク質半減期は、例えば緩衝生理食塩水または血清中において試験管内で決定される。他の実施形態において、該タンパク質半減期は、生体内での半減期（例えば血清または動物の他の体液中のタンパク質の半減期）である。
【００９６】
特定の態様では、ＨＳＡ部分を含んでいるポリペプチドは、１以上の融合ドメインをさらに含む融合タンパク質であり得る。そのような融合ドメインの周知の例としては、以下に限定されないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、Ｇタンパク質、および免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などが挙げられ、これらは特にアフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパクの単離に役立つ。アフィニティ精製の目的で、アフィニティークロマトグラフィーのための適切なマトリックス（例えばグルタチオン−、アミラーゼ−、ニッケル−、またはコバルト−コンジュゲート樹脂など）が使用される。融合ドメインは、特異的抗体が利用できる通常は短いペプチド配列である「エピトープタグ」も含む。特定のモノクローナル抗体が容易に利用できる周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス・ヘムアグルチニン（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグなどがある。場合によっては、融合ドメインは、プロテアーゼ切断部位（例えばＸａ因子またはトロンビンに対する切断部位）を有し、これらによって適切なプロテアーゼが融合タンパクを部分的に消化し、それによって、組換え型タンパク質を切り離すことが可能となる。その切り離されたタンパク質は、その後のクロマトグラフィー分離によって融合ドメインから分離することができる。特定の実施形態において、ＨＳＡポリペプチドは、ポリペプチドを安定化できる１以上の修飾を含み得る。例えば、そのような修飾は、ポリペプチドの試験管内の半減期を長期化し、ポリペプチドの循環半減期を長期化し、またはポリペプチドのタンパク質分解による分解を低減させる。同様にキメラポリペプチドに関連して、前述のタイプの修飾は、キメラポリペプチドの異種タンパク質部分に追加的または代替的に付加され得る。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ＨＳＡ部分を含んでいるポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域の全体または一部との融合タンパクであり得る。特定の実施形態において、融合タンパクはＩｇＧのＦｃＲｎ結合性ドメインまたはその断片を含む。同様に、特定の実施形態において、免疫グロブリンのＦｃ領域の全体または一部を、ＨＳＡ部分を異種タンパク質に結合するリンカーとして使用することができる。知られているように、各免疫グロブリン重鎖定常領域は、４または５のドメインを含む。そのドメインは、順に以下の通りに命名されている：ＣＨ１−ヒンジ部−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）。重鎖ドメインのＤＮＡ配列は、免疫グロブリンクラスの間で交雑相同性を有し、例えば、ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＩｇＡとＩｇＤのＣＨ２ドメイン、およびＩｇＭとＩｇＥのＣＨ３ドメインに相同である。本明細書中で使用されるとき、「免疫グロブリンＦｃ領域」という用語は、免疫グロブリン鎖定常領域のＣ末端部分、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域またはその部分を意味するものと理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン、およびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、または５）２以上のドメインの組合せならびに免疫グロブリンヒンジ領域を含み得る。好ましい実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含み、望ましくは、ＣＨ１ドメインを有していない。一実施形態において、重鎖定常領域の由来する免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３または４）である。免疫グロブリンの他のクラスであるＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）、およびＩｇＭ（Ｉｇμ）が用いられてもよい。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同５，７２６，０４４号に詳細に記載されている。特定の結果を達成する特定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当分野の技術レベルの範囲内であると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードしているＤＮＡコンストラクトの部分は、少なくともヒンジドメインの一部、望ましくはＦｃγのＣＨ３ドメインの少なくとも一部、またはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのいずれかの相同ドメインを含むのが好ましい。さらにまた、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸置換または欠失が発明の実施に役立つものであり得ることも想定される。一例を挙げると、上側ＣＨ２領域にアミノ酸置換を導入して、Ｆｃレセプターへの親和性が低下したＦｃ変異形を作製することがある（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１５９：３６１３）。当業者であれば、周知の分子生物学技術を使用してそのようなコンストラクトを調製できる。同様にキメラポリペプチドに関連して、前述のタイプの修飾は、キメラポリペプチドの異種タンパク質部分に追加的または代替的に付加され得る。
【００９８】
特定の態様では、ＨＳＡポリペプチドは足場であり得る。特定の実施形態においては、あるタンパク質を用いて、特に標的と結合できるタンパク質フレームワークを選択または設計する。足場からタンパク質を設計する場合、フレームワークの好ましい特性にとって重要であるアミノ酸残基は保持されるが、他の残基が変化してもよい。特定の実施形態において、足場は、異なる特性を有するタンパク質誘導体の間で異なるアミノ酸残基を５０％以下の割合で有し得、そのような誘導体の間で無変化の残基を５０％以上の割合で有し得る。特定の実施形態において、足場は、異なる特性を有するタンパク質誘導体の間で異なるアミノ酸残基を４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以下の割合で有し得、そのような誘導体の間で無変化の残基を５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上の割合で有し得る。特定の実施形態において、足場は、異なる特性を有するタンパク質誘導体の間で異なるアミノ酸残基を５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上の割合で有し得、そのような誘導体の間で無変化の残基を４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以下の割合で有し得る。特定の実施形態において、これらの無変化の残基はすべての変異形ドメインに対し、それらの特性に関係なく、同じ全体的な３次元折り畳みを与える。特定の実施形態において、本発明の他の側面と実施形態で論じられているように、ＨＳＡポリペプチドの足場は修飾されても、置換されてもよい。特定の実施形態において、ＨＳＡポリペプチドの足場は、治療的なものであり得る。特定の実施形態において、ＨＳＡポリペプチドの足場は、標的に対してアゴニストとして作用するものでもよい。特定の実施形態において、ＨＳＡポリペプチドの足場は、標的に対してアンタゴニストとして作用するものでもよい。
【００９９】
［６．５  キメラポリペプチド］
本発明のＨＳＡ部分（ＨＳＡ変異形ポリペプチドを含む）を含んでいるポリペプチドは、任意の異種タンパク質とのコンジュゲートを形成し得る。特定の実施形態において、異種タンパク質は治療的な物質である。特定の実施形態において、治療的な物質は抗体またはペプチドである。特定の実施形態において、キメラポリペプチドの異種タンパク質部分は、抗体またはその抗原結合性断片を含む。特定の実施形態において、キメラポリペプチドは、ＩｇＧ免疫グロブリンの定常領域を更に含む。特定の実施形態において、前記異種タンパク質は非抗体治療的タンパク質を含む。特定の実施形態において、キメラポリペプチドの異種タンパク質部分は、成長因子またはサイトカインを含む。特定の実施形態において、キメラポリペプチドはエピトープ、例えば検出や精製に役立つエピトープ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグなど）を更に含む。
【０１００】
特定の実施形態において、ＨＳＡ部分は、化学的に異種タンパク質とのコンジュゲートを形成する。特定の実施形態において、ＨＳＡ部分は、組換えによって異種タンパク質とのコンジュゲートを形成する。特定の実施形態においては、ＨＳＡ部分と異種タンパク質の両方をコードしている組み換え型ベクターを用いてキメラポリペプチドを作製する。
【０１０１】
特定の実施形態において、ＨＳＡ変異形は、原核生物または真核生物の細胞で産生される。特定の実施形態において、キメラポリペプチドは、原核生物または真核生物の細胞で産生される。特定の実施形態において、該真核細胞は、酵母菌の細胞、鳥類の細胞、昆虫の細胞または哺乳動物の細胞から選択されたものである。
【０１０２】
本発明のキメラポリペプチドは、いろいろな方法で作製することができる。特定の実施形態において、ＨＳＡ部分のＣ末端を、異種タンパク質（例えば、抗体または治療的なペプチド）のＮ末端に結びつけることができる。あるいは、異種タンパク質（例えば、抗体または治療的なペプチド）のＣ末端を、ＨＳＡ部分のＮ末端に結びつけることができる。特定の実施形態において、ＨＳＡ部分は、異種タンパク質の内部のアミノ酸とのコンジュゲートを形成する。特定の実施形態において、可能な構成は、結合されたＨＳＡ部分および／または結合された異種タンパク質の機能的な完全性を維持するための必要に応じて抗体の重鎖および軽鎖配列の切断された部分の使用を含む。特定の他の実施形態において、ＨＳＡ部分は、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片、ならびにＨＳＡドメインＩ、またはＨＳＡドメインＩＩ、またはＨＳＡドメインＩおよびＩＩの少なくとも一部を含む。さらに、異種タンパク質を、ＨＳＡ部分またはその変異形の露出した内部の（非末端）残基に結びつけることができる。更に別の実施形態において、１：１より大きいＨＳＡ：異種タンパク質比率（例えば、１つの異種タンパク質への２つのＨＳＡ分子の結合）となる、ＨＳＡ−異種タンパク質構成のあらゆる組合せを使用することができる。
【０１０３】
ＨＳＡ部分と異種タンパク質とは、互いに直接接合され得る。あるいは両者が、各々のドメインがその二次および三次構造に適切に折り畳まれることを確実とするのに十分な距離だけＨＳＡ部分と異種タンパク質とを分離するリンカー配列を介して互いに結合され得る。特定の実施形態において、リンカーは切断可能リンカーである。好ましいリンカーは、（１）柔軟な延ばされた立体構造を採用しているもので、（２）ＨＳＡポリペプチドまたは異種タンパク質の機能的なドメインと相互作用し得るように適合された二次構造をなすような傾向を示さないもので、かつ（３）機能的なタンパク質ドメインとの相互作用を促進し得る、疎水性または荷電特性が最小限のものであるべきである。
【０１０４】
特定の実施形態において、前記リンカーの長さは、少なくとも８０オングストローム（Å）、または少なくとも１００Å、または少なくとも１２０Å、または少なくとも１４０Å、または少なくとも１６０Å、または少なくとも１８０Å、または少なくとも２００Åである。特定の実施形態において、前記リンカーの長さは、約８０Åから約２００Åの間、または約１００Åから約１８０Åの間、または約１２０Åから約１６０Åの間である。
【０１０５】
特定の実施形態において、前記リンカーはペプチドリンカーである。特定の実施形態において、前記リンカーはペプチドリンカーであり、ペプチドリンカーは次の特徴のうちの１以上を有する：ａ）異種タンパク質配列とＨＳＡ部分とを相対的に回転可能とすること、ｂ）プロテアーゼによる消化に対して抵抗性を有すること、およびｃ）異種タンパク質配列またはＨＳＡ部分と相互作用しないこと。柔軟なタンパク質領域中の典型的な表面のアミノ酸には、Ｇｌｙ、ＡｓｎとＳｅｒが含まれる。Ｇｌｙ、ＡｓｎとＳｅｒを含むアミノ酸配列は、リンカー配列に対して上記の基準を満たすことが予想される。他の概ね中性のアミノ酸（例えばＴｈｒとＡｌａ）も、リンカー配列に使用できる。特定の実施形態において、ペプチドリンカーのアミノ酸の各々は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、ＴｈｒおよびＡｌａからなる群から選択されたものである。特定の実施形態において、ペプチドリンカーはＧｌｙ−Ｓｅｒ要素を含む。特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの反復を１以上含む。特定の実施形態において、リンカーは１、２、３、４、５、６または７個のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ反復を含む。特定の実施形態において、およそ２０アミノ酸の長さのリンカー配列を、機能的なタンパク質ドメインの適切な分離を与えるために用いることができるが、より長いか短いリンカー配列を用いてもよい。ＨＳＡポリペプチドと異種タンパク質を分離しているリンカー配列の長さは、５〜５００アミノ酸の長さ、またはより好ましくは５〜１００アミノ酸の長さであり得る。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、およそ５〜６０アミノ酸の長さ、またはおよそ５〜３０アミノ酸の長さである。ある実施形態において、リンカー配列は、およそ５〜およそ２０アミノ酸の長さであり、有利にはおよそ１０〜およそ３０アミノ酸の長さである。他の実施形態において、ＨＳＡ部分を異種タンパク質に結びつけているリンカーは、抗体の定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ領域の全体または一部）であり得る。特定の実施形態において、リンカーは切断可能リンカーである。
【０１０６】
特定の実施形態において、本発明のキメラポリペプチドは、周知の架橋試薬とプロトコルを使って生成することができる。例えば、当業者に知られている、異種タンパク質（例えば、抗体）にＨＳＡポリペプチドを架橋させることに役立つ多数の化学的架橋剤が存在する。例えば、架橋剤はヘテロ二官能性架橋剤であり、これは段階的方法で分子を結合するのに用いることができる。ヘテロ二官能性架橋剤は、タンパク質とコンジュゲート形成し、それによって、ホモタンパク質ポリマーのような不必要な副反応の発生を減らす、具体的な結合方法を設計する能力を提供する。多種多様なヘテロ二官能性架橋剤が当分野で既知であり、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル（ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸塩（ＳＭＰＢ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸］ヘキサン酸塩（ＬＣ−ＳＰＤＰ）などを含む。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分を有する架橋剤は、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド類似物として得られ、それは一般的により大きい水溶性を有する。さらに、結合鎖内においてジスルフィド架橋を有する架橋剤は、生体内リンカー切断の量を減らすべく、代わりにアルキル誘導体として合成することもできる。ヘテロ二官能性架橋剤に加えて、ホモ二官能性性で光反応性架橋剤を含むいくつかの他の架橋剤が存在する。スベリン酸ジスクシニミジル（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）および；ジメチルピリミダート二塩酸塩（ＢＭＨ）は有用なホモ二官能性性架橋剤の例であり、ビス［Ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］二硫化物（ＢＡＳＥＤ）およびＮ−スクシンイミジル−６（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は、本発明で使用できる光反応性架橋剤の例である。タンパク質結合技術に関する最近の文献としては、引用により本明細書に組み入れられる、Ｍｅａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１：２−１２を参照されたい。
【０１０７】
上記のものに含まれるヘテロ二官能性架橋剤の特に有用なクラスの１つは、一級アミン反応性基のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、またはその水溶性アナログであるＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を含む。アルカリ性ｐＨでの一級アミン（リジンε群）は、非プロトン化されて、ＮＨＳまたはスルホＮＨＳエステルの上での求核攻撃によって反応する。この反応は、結果としてアミド結合形成と副産物としてのＮＨＳまたはスルホＮＨＳの放出を生じる。ヘテロ二官能性架橋剤の一部として有用な別の反応性基は、チオール反応性基である。一般のチオール反応性基は、マレイミド、ハロゲン、およびピリジル二硫化物を含む。マレイミドは、わずかに酸性から中性（ｐＨ６．５−７．５）の条件下で、数分間で遊離スルフヒドリル（システイン残基）と特定的に反応する。ハロゲン（ヨードアセチル官能基）は、生理的ｐＨでＳＨ基と反応する。これらの反応性基の両方とも、結果として安定したチオエーテル結合を形成する。ヘテロ二官能性架橋剤の第３の成分は、スペーサアームすなわちブリッジである。ブリッジは、２つの反応端をつなぐ構造である。ブリッジの最も顕著な特質は、立体障害に対するその影響である。いくつかの事例では、より長いブリッジが、２つの複雑な生体分子を結ぶのに必要な距離をより簡単に掛け渡すことができる。
【０１０８】
ヘテロ二官能性試薬を用いたタンパクコンジュゲートの形成は、アミン反応とスルフヒドリル反応を含む２ステップ法である。第１ステップ（アミン反応）のために、選択されるタンパク質は、一級アミンを含まなければならない。これは、大部分のタンパク質のＮ末端に見出されるリジンεアミンすなわち１次αアミンであり得る。タンパク質は、遊離スルフヒドリル基を含んではならない。コンジュゲート形成される両方のタンパク質が遊離スルフヒドリル基を含む場合、ある１つのタンパク質を、そのすべてのスルフヒドリル基が例えばＮ−エチルマレイミドを用いてブロックされるように修飾することができる（参照により本明細書に組み入れられる、Ｐａｒｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｐｒｏ．Ｃｈｅｍ．２：２６３を参照されたい）。エルマン試薬を特定のタンパク質でのスルフヒドリル基の量を計算するのに用いることができる（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９５８）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７４：４４３およびＲｉｄｄｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：７５）。
【０１０９】
特定の実施形態において、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ  （１９９３）およびＧｒａｎｔ  Ｇ．Ａ．（ｅｄ．），Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９２）に記載される標準的なタンパク質化学反応を用いて、本発明のポリペプチドを作り出すことができる。さらに、自動化したペピチド合成機（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００）が市販されている。異種タンパク質へのＨＳＡの化学的コンジュゲート形成のための前述の架橋方法のいずれにおいても、切断可能ドメインまたは切断可能リンカーを用いることができる。切断によって、異種タンパク質とＨＳＡポリペプチドとを分離できる。例えば、キメラポリペプチドによる細胞への侵入の後に切断可能リンカーを切断すると、異種タンパク質からＨＳＡが分離される。
【０１１０】
特定の実施形態において、本発明のキメラポリペプチドは、１つの隣接するポリペプチド鎖として発現されるＨＳＡ部分と異種タンパク質（例えば、抗体または治療的なペプチド）とを含む融合タンパク質として作り出すことができる。そのようなキメラポリペプチドは、本明細書において、組換えによるコンジュゲートと称する。そのような融合タンパクを調製する際、ＨＳＡ部分と異種タンパク質とをコードする核酸、および選択に応じて、ＨＳＡ部分と異種タンパク質とにわたるペプチドリンカー配列を含む融合遺伝子が作製される。翻訳の産物が望ましい融合タンパクとなる融合遺伝子をつくる組換えＤＮＡ技術の使用は、周知の技術である。タンパク質産物の機能的特性、産生されるタンパク質の量、またはタンパク質を産生する細胞の種類を変えるために、遺伝子のコード配列とその制御領域の両方を再設計することができる。例えば、融合タンパク質をコードする新しいハイブリッド遺伝子を生成するために異なる遺伝子のコード配列にそれの部分と融合することによって、遺伝子のコード配列を大幅に改変することができる。融合タンパクを生成する方法の例は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０２９６８、ＰＣＴ／ＵＳ８９／０３５８７、およびＰＣＴ／ＵＳ９０／０７３３５、ならびにＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。基本的に、異なるポリペプチド配列をコードする種々ＤＮＡ断片の結合は、ライゲーションのための平滑末端または互い違いの末端の使用、適切な末端をつくる制限酵素による消化、必要に応じた粘着末端の適切なフィルイン、望ましくない接合を避けるためのアルカリホスファターゼ処置、および酵素によるライゲーションなどの従来の技術に従って行う。あるいは、融合遺伝子は自動化したＤＮＡ合成機を用いる従来の技術によって合成することができる。別の方法では、後にキメラ遺伝子配列を作り出すべくアニールされ得る２つの連続した遺伝子断片の間で互いに相補的な突出を生成するアンカープライマーを用いて、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照）。融合遺伝子によってコードされるキメラポリペプチドは、周知の技術である（下記も参照）、各種発現系を用いて組換えによって生成され得る。
【０１１１】
組換えによってコンジュゲートにされるキメラポリペプチドは、ＨＳＡ部分が異種タンパク質のＮ末端と、またはＣ末端とのコンジュゲートを形成した実施形態を含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、米国特許出願公開第2003/0166877号に記載のように、キメラポリペプチドの接合部領域内において候補Ｔ細胞エピトープを特定し、その接合部領域内のアミノ酸を変更することによって、キメラポリペプチドの免疫原性を低下させ得る。
【０１１３】
キメラタンパク質という用語は、ＨＳＡ部分（例えばＨＳＡ変異形ポリペプチド）と異種タンパク質とを含んでいるタンパク質を指し、これらの部分がどのように相互接続されているか（例えば、化学的にコンジュゲートされているか、組換えによってコンジュゲートされているか、など）とは無関係に、該タンパク質を指すものとして用いられる。よって、キメラタンパク質、融合タンパク、および複合タンパク質という用語は、交換可能な同義のものとして用いられる。
【０１１４】
異種タンパク質の典型的なカテゴリは、酵素、成長因子、およびサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、異種タンパク質は抗体である。
【０１１５】
ＨＳＡ部分を含んでいるキメラポリペプチドに用いられる異種タンパク質は、治療的なタンパク質またはその断片（例えば成長因子、酵素、骨形成タンパク質、および溶解性受容体断片）であり得る。典型的な異種ポリペプチドとしては、成長因子（例えば肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ；成長因子のＥＧＦファミリーのメンバー）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ；成長因子のＦＧＦファミリーのメンバー）、トランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ；例えば、ＶＥＧＦ−２）、インターフェロン（例えば、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２）、サイトカイン、およびインシュリン）などが挙げられる。他の典型的な異種タンパク質には、酵素が含まれる。他の典型的な異種ポリペプチドには、骨形成タンパク質（ＢＭＰ；タンパク質のＢＭＰファミリーのメンバー）、ＥＰＯ（ＥＰＯ）、ミオスタチン、および腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−ａ）などが含まれる。他の典型的な異種ポリペプチドには、膜貫通レセプタの細胞外ドメイン（細胞レセプタのあらゆる自然に生じる細胞外ドメイン、ならびにその変異体、断片、およびペプチド模倣薬の形態を含むあらゆる変異形が含まれる。
【０１１６】
ＨＳＡ部分を含んでいるキメラポリペプチドに用いられる異種タンパク質は、治療的なタンパク質またはその断片であり得、抗体またはその抗原結合性部分が含まれ得る。典型的な抗体および抗体断片には、以下に限定されないが、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、ＴｈｅｒａＣｌＭ（登録商標）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）、Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）、Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）などが含まれる。
【０１１７】
［６．６  ＨＳＡ関連核酸および発現］
特定の態様では、本開示は、本発明のポリペプチド（例えば、ＨＳＡ変異形およびＨＳＡ部分を含むキメラポリペプチド）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを提供する。さらに、本発明は、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチド（例えば、ＨＳＡ部分−生物活性断片、変異形、およびそれらの融合を含む）を生成するためにそのような核酸を利用する。特定の実施形態において、該核酸は、本発明の組換えキメラタンパク質を作るために、異種タンパク質（例えば、抗体または治療的なペプチド）をコードするＤＮＡを更に含み得る。これらのすべての核酸は、包括的にＨＳＡ核酸と称する。
【０１１８】
特定の態様において、本開示は、核酸コンストラクトを提供し、該核酸コンストラクトは（ｉ）ヒト結成アルブミン（ＨＳＡ）部分をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＨＳＡ部分は、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合断片を含み、かつ前記ＨＳＡドメインＩＩＩは、（ｉｉ）異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能にリンクされた１〜１８のアミノ酸置換を含み、前記核酸コンストラクトは、異種タンパク質の機能活性を保持しているキメラポリペプチドをコードし、かつＦｃＲｎに結合でき、前記キメラポリペプチドは、ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照キメラポリペプチドと比較して長期化された血清半減期および／またはＦｃＲｎに対する増大した親和性を有している。
【０１１９】
特定の実施形態において、核酸コンストラクトによってコードされるキメラポリペプチドは、前記対照キメラポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎと結合する。特定の実施形態において、核酸コンストラクトによってコードされるキメラポリペプチドは、前記対照キメラポリペプチドと比較して長期化された血清半減期を有する。特定の実施形態においては、核作コンストラクトによってコードされるキメラポリペプチドは、これらの特性の両方を有する。
【０１２０】
特定の実施形態においては、（ｉ）は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分をコードする核酸配列を含み、そのＨＳＡ部分はＨＳＡドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合断片を含み、そのＨＳＡ部分ＩＩＩは、１〜１８（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個）のアミノ酸置換を含む。
【０１２１】
特定の実施形態において、核酸コンストラクトによってコード化されるＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、複数の種全体で保存される残基である。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全てが、複数の種全体で保存される残基である。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマに由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基である。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマに由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基である。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表面接触可能残基である。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、表面接触可能残基である。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表面接触可能でかつ複数の種全体で保存される残基である。特定の実施形態において、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、表面接触可能でかつ複数の種全体で保存される残基である。
【０１２２】
特定の実施形態において、（ｉ）は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するＨＳＡドメインＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、（ｉ）は、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するＨＳＡドメインＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、（ｉ）は、配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有するＨＳＡドメインＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１２３】
特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２にある。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３にある。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６にある。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７にある。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７にある。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８にある。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８にある。特定の実施形態において、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９にある。
【０１２４】
特定の実施形態において、（ｉｉ）は異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その異種タンパク質は抗体またはその抗原結合性断片を含む。特定の実施形態において、（ｉｉ）は異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その異種タンパク質は治療的なタンパク質を含む。
【０１２５】
特定の実施形態において、該ヌクレオチド配列はさらに、ＩｇＧ免疫グロブリンの定常領域をコードする。
【０１２６】
特定の実施形態において、（ｉｉ）は異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その異種タンパク質は成長因子またはサイトカインを含む。特定の実施形態において、核酸コンストラクトは、リンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１２７】
該核酸は、一本鎖でも二本鎖でもよいＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。特定の実施形態において、本発明は、ＨＳＡ配列（例えば、配列番号１および２）の同じ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＨＳＡ部分をコードする、単離された、または組み換え型の核酸一次構造に関する。さらに別の実施形態において、ＨＳＡ核酸配列は、単離された、組み換え型の、および／または異種ヌクレオチド配列と融合した、またはＤＮＡライブラリーに含められたものであり得る。
【０１２８】
特定の実施形態において、ＨＳＡ核酸は、前記天然のＨＳＡヌクレオチド配列のいずれか、またはその相補配列に非常にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変化し得ることを当業者は容易に理解されよう。例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイゼーションを行った後、５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することができる。例えば、洗浄ステップの塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低いストリンジェンシーから５０℃で約０．２×ＳＳＣの高いストリンジェンシーまでの間から選択することができる。さらに洗浄ステップの温度は、約２２℃の室温での低いストリンジェンシーから約６５℃での高いストリンジェンシーまで高めることができる。温度と塩は変えてもよいし、あるいは、他の変数を変え温度または塩濃度は一定に保ってもよい。一実施形態において、本発明は、室温での６×ＳＳＣの低いストリンジェンシー条件でハイブリダイズした後、室温で２×ＳＳＣで洗浄される核酸を提供する。
【０１２９】
遺伝暗号の縮重のために天然のＨＳＡ核酸と異なっている単離された核酸も、発明の範囲内である。たとえば、多数のアミノ酸が２種以上のトリプレット暗号によって示される。同種のアミノ酸を指定するコドンすなわちシノニム（たとえば、ＣＡＵとＣＡＣはヒスチジンのシノニムである）は、結果としてタンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異体になり得る。しかし、対象のタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列多型が哺乳動物の細胞の間に存在することが予想される。当業者であれば、特定のタンパク質をコードしている核酸の１以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３〜５％まで）のこれらの変化が、自然の対立遺伝子の変化を原因として所定の種の個体間で存在し得るものであることを理解されよう。あらゆるそのようなヌクレオチドの変化および結果として生じるアミノ酸多型は、この発明の範囲内である。
【０１３０】
特定の実施形態において、組み換え型ＨＳＡ核酸は、発現用コンストラクトにおいて１以上の調節ヌクレオチド配列に機能可能にリンクされ得る。調節ヌクレオチド配列は、通常は、発現のために使用される宿主細胞に適切なものである。種々の宿主細胞にための多数の種類の適切な発現ベクターと適当な制御配列が当分野で既知である。一般的に、前記１以上の調節ヌクレオチド配列には、以下に限定されないが、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボゾーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、およびエンハンサーまたはアクチベーターの配列が含まれ得る。等分野で知られる構成型または誘導型プロモーターが本発明で想定されている。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたは２以上のプロモーターの要素を結合するハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現用コンストラクトがエピソーム（例えばプラスミド）上で細胞中に存在する場合や、あるいは発現用コンストラクトが染色体に挿入されている場合もある。好ましい実施形態において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能とする選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は周知の技術で、使用される宿主細胞によって異なる。特定の態様では、本発明は、ＨＳＡポリペプチドをコードする、少なくとも１つの制御配列に機能可能にリンクしたヌクレオチド配列から含む発現ベクターに関するものである。制御配列は当分野で認識されており、コードされたポリペプチドの発現を誘導するべく選択される。したがって、制御配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節領域を含むものとする。典型的な制御配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現が所望されるタンパク質の種類などの要因に依存する。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、およびベクターによってコードされる他のいずれかのタンパク質（例えば抗生物質マーカー）の発現も考慮されなければならない。
【０１３１】
本発明は、本発明のＨＳＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする組み換え遺伝子で形質転換した宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核生物または真核細胞のいずれかであり得る。例えば、ＨＳＡポリペプチドまたはキメラのポリペプチドは、細菌細胞（例えば大腸菌）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用）、酵母菌、または哺乳動物の細胞で発現され得る。他の適当な宿主細胞も当業者において既知である。
【０１３２】
本発明はさらに、本発明のＨＳＡポリペプチド、異種タンパク質および／またはキメラポリペプチドを製造する方法に関する。例えば、ＨＳＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、ポリペプチドの発現が生するのを可能とする適切な条件下で培養することができる。該ポリペプチドは、そのポリペプチドを含んでいる細胞と培地との混合物から分泌され、かつ単離され得る。あるいは、該ポリペプチドは細胞質中または膜画分中に保持され得、細胞を回収し溶解して、タンパク質を単離し得る。細胞培養物は、宿主細胞、培地、および他の副産物を含む。細胞培養物のための適当な培地は周知の技術である。該ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、および該ポリペプチドの特定のエピトープ（例えばＨＳＡポリペプチド）に特異的な抗体を用いたイムノアフィニティ精製などの、タンパク質を精製するための既知の技術を用いて、細胞培地、宿主細胞、またはその両方から単離することができる。好ましい実施形態において、該ポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含む融合タンパク質である。
【０１３３】
組み換え型ＨＳＡ核酸は、原核細胞、真核細胞（酵母菌、トリ、昆虫類、または哺乳類）のいずれか一方または両方での発現に適したベクターに、クローン化された遺伝子またはその部分をリゲートすることによって作製することができる。組み換え型ポリペプチドの産生のための発現ビヒクルには、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、適当なベクターには、次のタイプのプラスミド、即ち原核細胞（例えば大腸菌）の発現のためのｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、およびｐＵＣ由来プラスミドなどが挙げられる。好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌でのベクターの増殖を容易にする原核生物配列と、真核細胞で発現される１以上の真核性転写単位の両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆr、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、およびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物発現ベクターの例である。原核生物および真核生物の両方の細胞での複製と薬剤耐性選択を容易にするために、これらのベクターの一部は細菌性プラスミド（例えばｐＢＲ３２２）からの配列で修飾される。あるいは、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ−１）またはＥＢウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ−由来およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体を、真核細胞でのタンパク質の一時的発現のために使用することができる。プラスミドの作製と宿主生物の形質転換において使用される種々の方法は周知の技術である。原核生物および真核生物の両細胞のための、ならびに一般的な組み換え型の手順のための他の適当な発現系については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）第１６および１７章を参照されたい。いくつかの事例では、バキュロウイルス発現系を用いて組み換え型ポリペプチドを発現するのが望ましい場合がある。そのようなバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ由来のベクター（例えばｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えばｐＡｃＵＷｌ）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えばｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩを含んでいるβ−ｇａｌ）が含まれる。
【０１３４】
融合遺伝子を作製する技術はよく知られている。基本的に、異なるポリペプチド配列をコードする各種ＤＮＡ断片の結合は、ライゲーションのための平滑末端または互い違いの末端の使用、適切な末端を形成するための制限酵素消化の利用、必要に応じた粘着末端のフィルインの利用、不要な結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理の利用、および酵素によるライゲーションの利用などの従来の技術によって行われる。他の実施態様では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成することができる。あるいは、キメラの遺伝子配列を創り出すべく後にアニールされ得る２つの連続した遺伝子断片の間での相補的な突出部を形成するアンカープライマーを用いて、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２参照）。
【０１３５】
［６．７  治療方法］
特定の実施形態において、本発明は、本発明のキメラ融合異種タンパク質を用いて治療できる病状を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、対象におけるタンパク質の血清半減期を長期化させ、および／またはＦｃＲｎに対する結合親和性の増加させる方法を提供し、その方法はＨＳＡ部分を前記タンパク質とコンジュゲート形成させるステップを含み、前記ＨＳＡ部分は、ドメインＩＩＩまたはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片を含む。特定の実施形態において、前記ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜１８個のアミノ酸置換を含み、それによって結果的に対照ＨＳＡポリペプチドと比較して血清半減期またはＦｃＲｎに対する前記変異形ポリペプチドの親和性の一方または両方を向上させている。これらの方法は、治療の必要がある個体に対して、前述のキメラのまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドの治療上有効な量を投与することを含む。特定の実施形態において、前記方法は、（ａ）ＨＳＡ部分またはその生物活性断片と、（ｂ）異種タンパク質とを含んでいるキメラポリペプチドを投与することを含む。これらの方法は、動物、特にヒトの治療的および予防的処置を特に目的とする。
【０１３６】
治療できる特定の疾病や状態は、キメラタンパク質の異種タンパク質部分によって決まることに注目されたい。さらに、特定の疾病または状態を治療するために適切な異種タンパク質を含むキメラポリペプチドを、治療レジメンの一部として、特定の疾病または状態を治療するのに適した１種以上の他の化合物または他の治療法と併用して投与することを本開示は想定している。さらに本開示は、患者の年齢、体重、健康状態、疾患の重篤度などに応じた医学的に適切な処置に合わせてキメラポリペプチドを投与することを想定している。
【０１３７】
例として、異種タンパク質がヒュミラである場合、キメラポリペプチドを、例えば関節リウマチ、乾癬、若年性関節炎、およびクローン病の治療において使用し得る。異種タンパク質がインシュリンである場合は、キメラのポリペプチドを、例えばインシュリン処置において使用し得る。
【０１３８】
「治療」「処置」などの用語は、本明細書においては、一般的に望ましい薬理学的および／または生理的影響を得ることを意味するものとする。その効果は、疾病または状態、またはその症状を完全にまたは部分的に予防する点で予防的であり得、および／または疾病または状態の部分的または完全に治癒する点で治療的であり得、および／またはそれらに起因する副作用であり得る。本明細書で用いられる「治療」は、哺乳動物、特にヒトの疾病または状態のあらゆる治療を網羅し、（ａ）疾病または状態の罹患する傾向を有し得るが、また罹患したと診断されていない対象において疾病または状態が発生するのを予防すること；（ｂ）疾病または状態を抑制する（例えば、その発生を抑える）こと；または（ｃ）疾病または状態を軽減すること（例えば、疾病または状態の後退を生じさせること、１以上の症状の改善すること）を含むものとする。状態のいかなる改善も、当分野で既知の標準的な方法と技術によって容易に評価できる。その疾病の方法によって処置される対象の集団は、望ましくない状態または疾病に罹患する対象、ならびにその状態または疾病の発症の危険がある対象を含む。
【０１３９】
「治療的に有効な用量」または「有効量」という用語は、その投与について望まれる効果を奏する用量を意味する。正確な用量は治療の目的に応じて決まり、当業者であれば既知の技術を用いて確認可能である（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。
【０１４０】
本発明の特定の実施形態において、１種以上のキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドを、一緒に（同時に）、または異なる時間に（逐次）投与することができる。加えて、本発明のキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドは、同じ疾病または症状を治療するための１以上の追加の化合物または治療法と併用して投与することができる。例えば、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドの１以上を、１種以上の治療的な化合物と同時投与することができる。併用療法には、同時投与または交代投与が含まれ得る。さらに、併用両方には、一時的投与または長期的な投与が含まれる。選択に応じて、本発明のキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドと追加の化合物とは、疾病または症状を治療するために相加的または相乗的に作用する。併用療法で使用される追加の化合物には、小分子、ポリペプチド、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ分子が含まれるが、これに限定されない。さらに、併用療法には、他の非薬物療法と本明細書に開示される方法の組合せも含まれる。併用療法の性質に応じて、本発明のキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドの投与は継続され得、他の療法はその継続中に施される、および／またはその後に施される。キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドの投与は、単回投与で、または複数回投与でなされ得る。ある場合には、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドの投与が、他の療法の施される少なくとも数日前に開始され、他の場合には、投与は他の療法の施される直前または同時のいずれかに開始される。
【０１４１】
［投与の方法］
特定の実施形態において、前記対象への投与は、ＨＳＡ変異形またはキメラポリペプチドを全身投与することを含む。特定の実施形態において、前記対象への投与は、ＨＳＡ変異形またはキメラポリペプチドを経口投与することを含む。特定の実施形態において、前記対象への投与は、ＨＳＡ変異形またはキメラポリペプチドを静脈内投与することを含む。
【０１４２】
特定の態様では、本開示は、本開示のＨＳＡ変異形またはキメラのポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。特定の実施形態において、該組成物は無菌の組成物である。特定の実施形態において、該組成物は非発熱性である。
【０１４３】
各種送達系が知られており、本開示のＨＳＡ変異形またはキメラポリペプチドを投与するために使用することができ、例えば、リポソームカプセル化、微小粒子、マイクロカプセル、化合物を発現できる組換え型細胞、受容体媒介エンドサイトーシスなどが挙げられる（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照）。導入方法は、腸内または腸管外導入であり得、以下に限定されないが、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、肺内、鼻腔内、眼内、硬膜外、局所、経口の各投与経路が含まれる。特定の実施形態において、腸管外導入には、筋肉内投与、皮下投与、静脈投与、血管内投与、心膜内投与が含まれる。
【０１４４】
キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドは、任意の都合の良い投与経路によって、例えば、注射または大量瞬時注射によって、上皮または皮膚内部粘膜（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通しての吸収によって投与可能であり、他の生物活性物質と共に投与してもよい。投与は全身投与または局所投与であり得る。肺内投与も、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を有する製剤を使用することによって利用し得る。
【０１４５】
特定の実施形態において、本発明のキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドを、治療が必要な領域（例えば筋肉）に局所的に投与することが望ましいことがあり得る。このような投与は、例えば以下に限定されないが、手術中の局所注入によって、局所適用（例えば、注射、カテーテル、またはインプラントによる）によって達成することが可能であり、ここでインプラントは、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の材料（シラスティック製の膜、繊維、または市販の皮膚代替物などの膜を含む）からなるものである。
【０１４６】
他の実施形態において、本発明のキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドを、ベシクル、特にリポソームに含めて送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３を参照）。さらに別の実施形態において、開示のキメラのまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドを、徐放システムで送達することができる。別の実施形態においては、ポンプを使用し得る（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，前述）。別の実施形態においては、高分子物質を用いることができる（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５参照）。特定の実施形態において、本発明のキメラポリペプチドまたは変異形ポリペプチドは、静脈内送達することができる。
【０１４７】
特定の実施形態において、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドは、静脈内への点滴によって投与される。特定の実施形態において、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドは、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、または少なくとも３０分間にわたって点滴注入される。他の実施形態において、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドは、少なくとも６０分間、少なくとも９０分間、または少なくとも１２０分間にわたって点滴注入される。注入期間とは無関係に、各注入処置が、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドが規則的スケジュール（例えば、週１回、月１回など）通りに投与される全治療計画の一部であることを本発明は想定している。
【０１４８】
［６．９  評価方法］
本開示のキメラポリペプチドは、（ｉ）異種タンパク質の機能を実質的に保持していること、および（ｉｉ）非修飾ＨＳＡ部分にコンジュゲート形成したキメラポリペプチドと比較して、または他の適当な対照と比較して増加したＦｃＲｎに対する親和性および／または長期化した血清半減期を有することに基づいて特徴付けられる。本発明のＨＳＡ変異形ポリペプチドは、天然のＨＳＡ部分と比較して、または他の適当な対照と比較して増加したＦｃＲｎに対する親和性および／または長期化した血清半減期を有することに基づいて特徴付けられる。キメラのポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドの特性は、試験管内または生体内での１以上の適当なアッセイで評価され得る。
【０１４９】
例として、例えば実施例に記載するアッセイまたは他の結合アッセイの１つ以上を用いて、ＦｃＲｎに対する親和性（Ｋａおよび／またはＫｄ）を、試験管内で評価し得る。同様に、例えば実施例に記載するアッセイまたは他の結合アッセイの１以上を用いて、ｋｏｆｆおよび／またはｋｏｎを、試験管内で評価し得る。
【０１５０】
抗原と抗体の間の親和性定数と結合の特異性の測定が、抗ＨＳＡ抗体を用いる治療、診断、および研究方法の有効性の決定における中心要素である。「結合性親和性」とは、一般に、ある分子（例えば抗体、ＨＳＡ部分）の１つの結合部とその結合パートナー（例えば抗原、ＦｃＲｎ）との非共有結合性相互作用の総強度を指す。特に明記しない限り、本明細書中で使用される「結合親和性」は、結合ペア（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は通常、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される、平衡解離定数（ＫｄまたはＫＤ）によって表わされる。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５−８８１を参照されたい。親和性は、本明細書中に記載され例示されるもの（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）を含む、当分野で既知の一般的な方法で測定することができる。低度親和性抗体は、通常ゆっくり抗原に結合し、かつ容易に解離する傾向があり、一方高親和性抗体は通常比較的速く抗原に結合し、かつより長時間結合した状態を維持する傾向がある。結合性親和性を測定する種々の方法は当分野で既知であり、そのいずれをも本発明のために使用できる。
【０１５１】
特定の実施形態において、キメラポリペプチドまたは変異形ＨＳＡポリペプチドは、対照のそれと比較して、およそ１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍または５倍向上したＦｃＲｎに対する親和性を有する。特定の実施形態において、キメラポリペプチドは、対照のそれと比較して、およそ５倍超、１０倍超までもの向上したＦｃＲｎに対する親和性を有する。特定の実施形態において、キメラポリペプチドまたは変異形ＨＳＡポリペプチドは、対照のそれと比較して、およそ２０倍、２５倍、４０倍、または５０倍超向上した親和性を有する。特定の実施形態において、キメラポリペプチドは、対照のそれと比較して、およそ５〜１０倍、およそ１０〜２０倍、およそ２５〜４０倍、およそ４０〜５０倍、およそ５０〜７５倍、またはおよそ７５〜１００倍向上した親和性を有する。親和性がＫａを計算することによって評価されるとき、親和性の向上は、Ｋａの増加（例えば、前に概説したように、２倍、５倍、１０倍など）に置き換えられる。親和性がＫｄを計算することによって評価されるとき、親和性の向上は、Ｋｄの減少（例えば、前に概説したように、２倍、５倍、１０倍など）に置き換えられる。
【０１５２】
特定の実施形態において、低いｐＨ（例えば、ｐＨ約５．５）でのＦｃＲｎに対する親和性が向上する。他の特定の実施形態において、低いｐＨでのＦｃＲｎに対する親和性は向上するが、中性のｐＨ（例えば、ｐＨ約７．２）での親和性は不変である。
【０１５３】
さらなる例として、血清半減期は、ヒトまたは動物モデルで測定され得る。いずれかの動物モデル（限定しないが、ヒトＦｃＲｎを有するトランスジェニック動物を含む）における血清半減期の長期化は、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドを、対照と比較して血清半減期の長期化を有するものとして特徴付けるのに十分である。
【０１５４】
一実施形態において、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドは、１０日より長い、好ましくは１４日より長い血中半減期を有し、最も好ましくは天然の血清アルブミンタンパク質またはそのホモログの半減期の５０％より長い血中半減期を有する。別の実施形態において、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドの半減期は、対照ポリペプチドのそれと比較しておよそ１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、またはおよそ５倍増加する。特定の実施形態において、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドの半減期は、対照ポリペプチドのそれと比較して、およそ５倍超、場合によっては１０倍超長期化する。特定の実施形態において、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドの半減期は、対照ポリペプチドのそれと比較して、２０倍、２５倍、４０倍超、または５０倍超長期化する。特定の実施形態において、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドの半減期は、対照ポリペプチドのそれと比較して、およそ５〜１０倍、およそ１０〜２０倍、およそ２５〜４０倍、およそ４０〜５０倍、およそ５０〜７５倍、またはおよそ７５〜１００倍長期化する。
【０１５５】
キメラポリペプチドが異種タンパク質の機能を実質的に保持しているか否かを評価するための適切なアッセイは、異種タンパク質とその天然の機能によって決まる。しかし、その機能は、任意の適切な試験管内または生体内アッセイ（動物モデルにおけるアッセイを含む）で評価し得る。典型的な機能として、以下に限定されないが、（ｉ）特定の受容体と結合する能力；（ｉｉ）特定のシグナル伝達経路を介したシグナル伝達を誘導または阻害する能力；（ｉｉｉ）アポトーシスを誘導または阻害する能力；（ｉｖ）血管形成を誘導または阻害する能力；（ｖ）細胞増殖を促進または阻害する能力；（ｖｉ）細胞分化を促進または阻害する能力；（ｖｉｉ）細胞の生存を促進する能力；および（ｖｉｉｉ）別のタンパク質因子の分泌を促進または阻害する能力が挙げられる。
【０１５６】
特定の実施形態において、例えば、生物活性異種タンパク質を含んでいる本発明のキメラポリペプチドは、例えばＨＳＡ部分に融合していない生物活性異種タンパク質自体より強力である。例えば、キメラポリペプチドは、生物学的に活性なタンパク質配列単独より２倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍活性度が高く、１０００倍活性度が高い場合さえあり、つまり１桁分、２桁分、ときには３桁分活性度が高いものであり得る。したがって、生物学的に活性なペプチド配列が生物活性を阻害する実施形態では、キメラポリペプチドのＩＣ５０は、生物活性タンパク質だけのＩＣ５０より、１０分の１、１００分の１低濃度であり、ときには１０００分の１の低濃度の場合さえあり得、生物学的に活性なペプチド配列が生物活性を誘導または促進する実施形態では、キメラポリペプチドのＥＣ５０は、生物活性タンパク質だけのＥＣ５０より、１０分の１、１００分の１の低濃度であり、ときには１０００分の１の低濃度の場合さえあり得る。生物学的に活性なタンパク質配列が生体分子（例えば核酸、ペプチド、または炭水化物）と結合する実施形態では、キメラポリペプチドとそれが結合する生体分子との解離定数Ｋｄは、生体分子および生物学的に活性なタンパク質単体のＫｄより、１０分の１、１００分の１の小ささ、ときには１０００分の１の小ささである場合さえあり得、例えば、２つの物質の結合が両者の解離を一層上回るようになり得る。
【０１５７】
［６．１０  医薬組成物］
特定の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドは、薬理学的に許容される担体とともに製剤される。１以上のキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドを、単独でまたは製剤（組成物）の構成成分として投与することができる。該キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドは、ヒトおよび獣医学的な薬剤での使用のためのあらゆる方式での投与用に製剤することができる。湿潤剤、乳化剤、および滑沢剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど）、ならびに色素、離型剤、コーティング剤、甘味料、芳香剤、保存料、および抗酸化剤が、組成物に存在することもあり得る。
【０１５８】
本発明のキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドの製剤は、経口投与、鼻腔内投与、局所投与、腸管外投与、直腸内投与および／または腟内投与に適した製剤を含む。製剤は、単位剤形として使用しやすく提供され得、薬学分野で周知のいかなる方法によっても調合されてもよい。ある１つの剤形を作り出すべく担体材料と結合され得る主成分の量は、処置対象のホストと特定の投与方法によって異なるものとなる。ある１つの剤形を作り出すべく担体材料と結合され得る主成分の量は、通常は、治療効果を奏する当該化合物の量である。
【０１５９】
特定の実施形態において、これらの製剤または組成物を調製する方法は、別種の治療薬と、担体と、選択に応じて１種以上の補助的成分とを結合することを含む。一般に、製剤は、液体担体、微粉固体担体のいずれかまたは両方とともに調製され得、その後、必要に応じて製品を成形する。
【０１６０】
経口投与用の製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、トローチ剤（風味付けした基材、通常ショ糖、アカシア、またはトラガカンタを使用したもの）、粉剤、顆粒剤の形態、または水性または非水性の液体への溶液または懸濁液として、または水中油型または油中水型液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤またはシロップとして、またはトローチ剤（不活性の基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアカシアを使用したもの）として、および／または洗口剤などとしての形態で、それぞれ主成分として本発明のポリペプチド治療薬を所定量含むものであり得る。懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁化剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル（微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、およびトラガカンタ、およびそれらの混合物）を含み得る。
【０１６１】
経口投与用の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣剤、粉剤、顆粒剤など）において、１種以上の本発明のポリペプチド治療薬を、一種以上の薬理学的に許容される担体と混合し得、当該担体としては、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または、次のものいずれか：（１）充填剤または増量剤（例えばでんぷん、ラクトース、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール、および／または珪酸）；（２）結合剤（例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、および／またはアラビアゴム）；（３）湿潤剤（例えばグリセロール）；（４）崩壊剤（例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカでんぷん、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）；（５）溶解遅延剤（例えばパラフィン）；（６）吸収促進剤（例えば第４アンモニウム化合物）；（７）湿潤剤（例えばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート）；（８）吸収剤（例えばカオリンおよびベントナイト粘土）；（９）滑沢剤（例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物）；および（１０）着色料が挙げられる。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、医薬組成物は、緩衝剤も含み得る。類似のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いて、ソフトまたはハードなゼラチン充填カプセルにおける充填剤として使用することもできる。経口投与用の液体製剤には、医薬的に許容される乳濁液、微細乳濁液、液剤、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤などがある。主成分に加えて、液体の剤形は、当分野で一般的に用いられる不活性の希釈液、例えば水または他の溶媒、溶解剤、および乳化剤など（例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸ジエチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実、落花生類、コーン、細菌、オリーブ、ひまし油、およびごま油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物など）を含み得る。不活性希釈液に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤、ならびに甘味料、着香料、着色料、香料、および防腐剤などのアジュバントを含むことができる。
【０１６２】
非経口的適用に適した医薬組成物は、１以上のキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドを、１種以上の医薬上許容される無菌の等張性水溶液または非水性溶液、分散液、懸濁液、またはエマルジョン、または使用前に無菌の注射可能な溶液または分散液に再構成し得、抗酸化剤、緩衝液、細菌発育阻止因子、製剤を予定レシピエントの血液と等張にする溶質または懸濁剤または増粘剤を含み得る無菌の粉体とともに含み得る。本発明の医薬品組成物で使用され得る適当な水性で非水性の担体の例としては、水、エチルアルコール、ポリオール（例えばグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適当な混合物、植物油（例えばオリーブ油）、および注射可能な有機酸エステル（例えばオレイン酸エチル）などが挙げられる。適当な流動性は、例えばコーティング物質（例えばレシチン）を用いることによって、分散剤の場合必要な粒径の維持によって、おおよび界面活性剤を使用することによって、維持することができる。
【０１６３】
これらの組成物は、アジュバント（例えば防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤）を含んでいてもよい。微生物の作用の防止は、各種抗細菌性因子および抗真菌性因子（たとえば、パラベン、クロロブタノール、石炭酸ソルビン酸など）を含めることによって確実となり得る。組成物に等張剤、例えば砂糖、塩化ナトリウムなどを含めることも望ましいことであり得る。加えて、吸収を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウムとゼラチン）を含めることによって、注射可能の薬剤の吸収の長期化がもたらされ得る。
【０１６４】
特定の実施形態において、医薬品組成物を含む本開示の組成物は、非発熱性である。言い換えると、特定の実施形態において該組成物は実質的に発熱因子を含まない。一実施形態において、本発明の製剤は、エンドトキシンおよび／または関連する発熱物質を実質的に含まない発熱因子無しの製剤である。エンドトキシンは、微生物内に制限されて、微生物が分解されるか死ぬ時にのみ放出される毒素を含む。発熱物質はまた、細菌と他の微生物の外膜からの、熱を誘導する熱安定性物質（グリコプロテイン）を含む。これらの物質の両方とも、人間に投与されると、熱、低血圧、およびショックを引き起こすことがあり得る。その潜在的悪影響のために、少量のエンドトキシンさえ、静注で投与される薬液から取り除かれなければならない。食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静注薬適用について、１時間、体重１キログラムの用量につき５エンドトキシン単位（ＥＵ）を上限として設定している（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００））。治療的なタンパク質が、抗体の場合にあり得るように、体重１キログラムにつき数１００または１０００ミリグラムの量で投与されるとき、ごく微量の有害で危険なエンドトキシンさえ除去しなければならない。特定の実施形態により、組成物中のエンドトキシンおよび発熱因子レベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【０１６５】
ポリ乳酸−ポリグリコール糖などの生分解性ポリマーにおける１以上のポリペプチド治療薬のマイクロカプセル基質を形成することによって注射可能なデポー製剤が作られる。ポリマーに対する薬物比、および使用される特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度は制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。身体組織に対し適合性を有するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を捕捉することによっても注射可能デポー製剤は調製される。
【０１６６】
特定の実施形態において、本発明のキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドは、ヒトへの静脈内投与に適合する医薬組成物として通常の手順に従って作製される。必要な場合、該組成物は、溶解剤と、注射部位での痛みを和らげるためにリドカインのような局所麻酔剤とを含み得る。組成物を点滴によって投与する場合は、薬品グレードの無菌の水または食塩水を含む点滴ボトルにより投薬される。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、注射用無菌水または食塩水のアンプルが提供され得る。
【０１６７】
組織関連の状態または疾病の治療に効果的な本発明のキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドの量は、標準的な臨床技術によって測定し得る。加えて、最適投薬量範囲を確認するのを助けるべく、試験管内アッセイを選択に応じて使用し得る。製剤において使用される正確な用量は、投与経路および病状の重篤度によって変わり、医師の判断と各々の対象の状況に応じて決定されるべきである。しかし、静脈内投与のための適当な投薬量範囲は、通常、体重１キログラムにつき活性のキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドがおよそ２０〜５０００マイクログラムの範囲である。鼻腔内投与のための適当な投薬量範囲は、通常、およそ０．０１ｐｇ／ｋｇ（体重）乃至１ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲である。有効量は、試験管内または動物モデル試験システムから導出された用量−反応曲線から推定され得る。
【０１６８】
［６．１１  製品およびキット］
特定の実施形態において、本発明はまた、本発明の少なくとも１つのキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドで満たされた１以上の容器を含む薬剤パッケージまたはキットを提供する。特定の実施形態において、本発明の製剤は、以下に限定されないが、異種タンパク質、異種ポリペプチド、非相同ペプチド、大型の分子、小分子、マーカー配列、診断用または検出可能な薬剤、治療的な部分、薬物部分、放射性金属イオン、第二抗体、および固体担体などの別の部分と組換えによって融合されているか、または化学的にコンジュゲート形成したキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、本発明の製剤は、無菌の液体として単回投与バイアルで処方される。本発明の製剤は、１．２ｍＬの目標体積で３ｃｃのＵＳＰ  Ｔｙｐｅ  Ｉホウケイ酸塩琥珀色バイアル（Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｉｃｅｓ−Ｐａｒｔ  Ｎｏ．６８００−０６７５）で供給され得る。典型的な容器としては、バイアル、ボトル、予め充填された注射器、ＩＶバッグ、ブリスターパック（１以上の丸剤を含む）などが挙げられるが、これらに限定されない。選択に応じて、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を管理している政府機関によって定められた形の通知を、そのような容器に付与しておくことができ、該通知は、ヒトの診断および／または投与のための製造、使用、または販売についての該機関による承認を反映するものである。
【０１６９】
特定の実施形態において、例えば、血清半減期の長期化または治療薬のＦｃＲｎ結合親和性の増大など、各種目的に有用なキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドを含むキットも提供される。試薬の単離と精製のため、該キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合されたポリペプチドを含み得る。試験管内での（例えばＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットでの）標的の検出と定量化のためにポリペプチドを含むキットも提供され得る。製品と同様、キットも容器とともに、容器上でまたはそれに添付されたラベルまたは添付文書を含む。容器は、本発明の少なくとも１つのキメラポリペプチドまたはＨＳＡ変異形ポリペプチドを含む組成物を保持するものである。例えば、希釈液と緩衝液、対照診断用試薬などを含む追加の容器も含められ得る。ラベルまたは添付文書は、組成物の説明ならびに意図された試験管内または診断の用途のための使用説明を提供し得る。
【０１７０】
［６．１２  アデノウイルスベクターおよび方法］
宿主細胞からの組み換え型アデノウイルス粒子の生成に役立つＤＮＡベクターは周知の技術であり、市販試薬は容易に入手できる（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のカタログ番号Ｖ４９３−２０およびＶ４９４−２０など）。本発明は、アデノウイルス粒子の生成に役立つＤＮＡベクターにＯｒｉＰ配列を取り込むことによって組み換え型アデノウイルスの生成を強化する方法を提供する（これを本明細書中でアデノウイルスベクターと称する）。ＯｒｉＰを含んでいるアデノウイルスベクターはＥＢＮＡ−１タンパク質の発現のために配列を更に含んでいてもよく、あるいは、ＥＢＮＡ−１タンパク質を発現する宿主細胞が組み換え型アデノウイルス粒子の生成のために使用される。ＯｒｉＰを含むアデノウイルスベクターは、特に組み換え型アデノウイルスの集団（対象のＤＮＡ配列（例えばＨＳＡドメインＩＩＩ変異形をコードするＤＮＡ配列など）の多様／複雑なライブラリーを含む）の生成に役立つ。
【０１７１】
ＯｒｉＰ配列は、当分野で知られている多数の技術を用いてあらゆる既知のアデノウイルスベクターにでも容易に組み入れることができる。例えば、ゲートウェイ組換え系が利用される場合は、ＯｒｉＰ配列はエントリベクターまたはアデノウイルスデスティネーションベクターのａｔｔ組換え部位の間に位置しなければならない。配列をアデノウイルスベクターに加えるときは、アデノウイルスＤＮＡの複製または組立てに干渉する部位にそれを挿入しないように注意を払わなければならない。代替として、または選択に応じて、ＯｒｉＰ配列を含んでいるアデノウイルスベクターを、ＥＢＮＡ−１タンパク質も発現するように組換えてもよい（図１０参照）。アデノウイルスベクターから直接ＥＢＮＡ−１タンパク質を発現させることによって、宿主細胞がＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する必要がなくなる。
【０１７２】
本発明のアデノウイルスベクターは、ＯｒｉＰ配列およびアデノウイルスゲノム配列を含む。本発明のアデノウイルスベクターは、以下の要素の１つ以上を更に含み得る：
（ｉ）別のベクターによる組換えクローニングのための組換え部位（例えば、ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２）。当該部位は、当該ベクターから生成された組換えアデノウイルスにおける発現のための対象のＤＮＡ配列のクローニングを施すのに有用である；
（ｉｉ）選択および／または対抗選択に有用な、抗生物質／薬物（例えばクロラムフェニコール）抵抗性遺伝子および／または毒素発現遺伝子（例えばｃｃｄＢ遺伝子）；
（ｉｉｉ）対象のＤＮＡ塩基配列をサブクローニングすることに有用なクローニング部位（マルチクローニング部位であり得る）；
（ｉｖ）１以上の対象のタンパク質をコードする１以上の対象の遺伝子を含み得る対象のＤＮＡ；
（ｖ）広範囲にわたる哺乳動物細胞における対象の遺伝子の発現のためのプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時プロモーター）。このプロモーターは構成的であるか、または誘導的であり得る；
（ｖｉ）対象のタンパク質の検出および／または精製のためのエピトープタグ（例えばＨｉｓ６Ｘエピトープ）。エピトープタグは対象の組換えタンパク質の５’または３’末端のいずれかに存在し得る；
（ｖｉｉ）効果的な転写終了およびｍＲＮＡのポリアデニル化のためのポリアデニル化（ポリＡ）配列（例えば、サル４０ウイルスポリＡ配列）；
（ｖｉｉｉ）大腸菌における高コピー複製及びプラスミドの維持のための複製起点；
（ｉｘ）大腸菌における選択のための抗生物質抵抗性遺伝子；
（ｘ）ベクターを一本鎖状にするための制限酵素部位（例えばＰａｄ）。制限酵素部位は、要素（ｖｉｉｉ）および（ｉｘ）に隣接して位置し得る；および
（ｘｉ）ＥＢＮＡ−１タンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【０１７３】
プラスミドＤＮＡのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点、ｏｒｉＰは、各種高等真核細胞でのＤＮＡ合成を効果的に支援する。代表的なＯｒｉＰ配列を図９Ｃに示す。この複製起点は１種類のウイルスタンパク質（ＥＢＮＡ−１）のみを用い、他のすべての他の因子は細胞によって提供される。特定の実施形態において、ＥＢＮＡ−１タンパク質は宿主細胞（例えば、２９３Ｅ細胞）によって提供される。他の実施形態において、発明のアデノウイルスベクターは、ＥＢＮＡ−１タンパク質をコードしている要素（ｘｉ）ＤＮＡ塩基配列をさらに含む。代表的なＥＢＮＡ−１タンパク質とＤＮＡ塩基配列を、それぞれ図９Ａおよび図９Ｂに示す。
【０１７４】
アデノウイルスゲノム配列（例えば、ヒトアデノウイルス５型配列）は、アデノウイルスの適切なパッケージングと産生に必要な遺伝子および他の要素（例えば、左右の逆位末端配列（ＩＴＲ）、カプシド形成シグナル配列、後期遺伝子）をコードするものである、ことが想定されている（Ｈｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．６１−８６；Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１，２５７３−２６０４）。アデノウイルスゲノム配列は、完全なアデノウイルスゲノムをコードするものであり得る。あるいは、アデノウイルスゲノム配列は、複製不能アデノウイルスを作りだすべく、１以上のタンパク質および／または調節要素（トランス形態で提供される）を除き、すべてのタンパク質と他の調節要素をコードしたものであり得る。例えば、Ｅ１タンパク質（Ｅ１ａとＥ１ｂ）をコードしているＥ１領域は、本発明のアデノウイルスベクターから除外され得る（Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１，２５７３−２６０４）。欠失したタンパク質および／または他の要素は、そこで通常はアデノウイルスを産生するために用いられる宿主によって、トランスの形態で提供され得る。例えば、２９３細胞株は、Ｅ１領域のゲノムのコピーを含む。特定の実施形態において、アデノウイルスゲノム配列は、野生型配列１〜４５８番と３５１３〜３５９３５番と一致するヒトアデノウイルス５型配列を含んでいるか、基本的にその配列からなるものである。
【０１７５】
特定の要素が、他の要素を組み合わせておよび／または組み入れた形で提供されること、例えば要素（ｉｖ）が要素（ｖ）〜（ｖｉｉ）を組み入れたものであり得ることは当業者には理解されよう。特定の要素が他の５’末端および／または３’に提供され、例えば、要素（ｘ）はアデノウイルスベクターの一本鎖化のために有用であり得るが、要素（ｘ）は、一本鎖化のために組み入れられるときは、５’ＩＴＲの５’末端および／または３’ＩＲＴの３’末端に提供されるべきであることも理解されよう。同様に、要素（ｖｉｉｉ）および（ｉｘ）は、それらが存在する場合には、通常それらはレスキューされたアデノウイルスに組み入れられることがないように配置され、例えば、これらの要素は、５’ＩＴＲの５’末端および／または３’ＩＲＴの３末端に配置され得る。ＯｒｉＰおよび要素（ｉ）乃至（ｖｉｉ）は、存在する場合には、３’末端ＩＴＲを含むアデノウイルスゲノム配列の一方の側に隣接するか、他方の側の５’末端ＩＴＲ配列に隣接する（例えば、図１０参照）。
【０１７６】
要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉｉｉ）−（ｘ）、および選択に応じて（ｘｉ）を組み入れた代表的な本発明のアデノウイルスベクターが、図１０に提示されている。
【０１７７】
［７  実施形態］
１．
（ａ）ＨＳＡドメインＩＩＩまたはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合性断片を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分、および
（ｂ）異種タンパク質とを含むキメラポリペプチドであり、
前記キメラポリペプチドは、前記異種タンパク質の機能的な活性を保持し、ＦｃＲｎと結合することができ、かつ前記ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜１８個のアミノ酸置換を含み、それによりＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照キメラポリペプチドと比較してポリペプチドのＦｃＲｎに対する親和性および血清半減期の一方または両方を向上させている。
【０１７８】
２．前記キメラポリペプチドは、前記対照キメラポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎに結合する、実施形態１のキメラポリペプチド。
【０１７９】
３．前記キメラポリペプチドは、前記対照キメラポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎに結合し、前記親和性は酸性ｐＨで測定される、実施形態１または２のキメラポリペプチド。
【０１８０】
４．前記酸性ｐＨは５．０〜６．０の範囲である、実施形態３に記載のキメラポリペプチド。
【０１８１】
５．前記酸性ｐＨは５．５±０．２である、実施形態４に記載のキメラポリペプチド。
【０１８２】
６．前記キメラポリペプチドは、酸性ｐＨで前記対照ポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎに結合するが、中性ｐＨでは前記対照ポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎに結合しない、実施形態１乃至３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【０１８３】
７．前記中性ｐＨは６．９〜７．９の範囲である、実施形態６のキメラポリペプチド。
【０１８４】
８．前記中性ｐＨは７．４±０．２である、実施形態７のキメラポリペプチド。
【０１８５】
９．前記キメラポリペプチドはＦｃＲｎに結合し、前記対照ポリペプチドのものとは異なるオフレートまたはオンレートを有する、実施形態１乃至６のいずれかのキメラポリペプチド。
【０１８６】
１０．前記キメラポリペプチドはＦｃＲｎに結合し、前記対照ポリペプチドと比較して、増加したオンレートおよび／または減少したオフレートを有する、実施形態９のキメラポリペプチド。
【０１８７】
１１．前記キメラポリペプチドはＦｃＲｎに結合し、前記対照ポリペプチドと比較して、増加したオフレートを有する、該キメラポリペプチド実施形態９のキメラポリペプチド。
【０１８８】
１２．前記ＨＳＡドメインＩＩＩが１乃至１０個のアミノ酸置換を有し、それにより前記ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照キメラポリペプチドと比較して前記キメラポリペプチドの血清半減期が長期化している、実施形態１乃至１１のいずれかのキメラポリペプチド。
【０１８９】
１３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、複数種全体で保存される残基のものである、実施形態１乃至１２のいずれかのキメラポリペプチド。
【０１９０】
１４．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、複数種全体で保存される残基のものである、実施形態１３のキメラポリペプチド。
【０１９１】
１５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである、実施形態１乃至１３のいずれかのキメラポリペプチド。
【０１９２】
１６．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである、実施形態１５のキメラポリペプチド。
【０１９３】
１７．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、表５に記載されたものから選択される、実施形態１乃至１５のいずれかのキメラポリペプチド。
【０１９４】
１８．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡ（配列番号２）の位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある、実施形態１乃至１５のいずれかのキメラポリペプチド：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８７、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６６、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基５００、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３５、残基５３９、残基５４４、残基５４７、残基５７６。
【０１９５】
１９．前記キメラポリペプチドは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づいた、以下からなる群から選択される位置において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるアミノ酸置換を含む、実施形態１乃至１５のいずれかのキメラポリペプチド：（ａ）残基３８３および４１３；（ｂ）残基４０１および５２３；（ｃ）残基４０７および４４７；（ｄ）残基４０７および４４７および５３９；（ｅ）残基４０７および５０９；（ｆ）残基４０７および５２６；（ｇ）残基４１１および５３５；（ｈ）残基４１４および４５６；（ｉ）残基４１５および５６９；（ｊ）残基４２６および５２６；（ｋ）残基４４２および４５０および４５９；（１）残基４６３および５０８；（ｍ）残基５０８および５１９および５２５；（ｎ）残基５０９および５２７；（ｏ）残基５２３および５３８；（ｐ）残基５２６および５５７；および（ｑ）残基５４１および５６１。
【０１９６】
２０．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態１乃至１５または１８のいずれかのキメラポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｋ４０２Ｇ、Ｋ４０２Ｉ、Ｋ４０２Ｌ、Ｋ４０２Ｖ、Ｌ４０７Ｆ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｑ、Ｌ４０７Ｗ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｙ４１ＩＮ、Ｋ４１３Ｃ、Ｋ４１３Ｓ、Ｋ４１３Ｔ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１４Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｖ４１５Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｑ４１６Ｈ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｄ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｖ４２６Ｐ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｐ４４７Ｓ、Ｐ４４７Ｔ、Ｅ４５０Ｄ、Ｅ４５０Ｅ、Ｓ４５４Ｃ、Ｓ４５４Ｍ、Ｓ４５４Ｔ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５５Ｑ、Ｖ４５６Ｎ、Ｖ４５６Ｑ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｑ４５９Ｋ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｃ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｌ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｖ、Ｆ５０９Ｗ、Ｆ５０９Ｙ、Ａ５１１Ｆ、Ａ５１１Ｗ、Ａ５１１Ｙ、Ｄ５１２Ｆ、Ｄ５１２Ｗ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｆ、Ｓ５１７Ｍ、Ｓ５１７Ｔ、Ｓ５１７Ｗ、Ｓ５１７Ｙ、Ｋ５１９Ａ、Ｋ５１９Ｇ、Ｋ５１９Ｉ、Ｋ５１９Ｌ、Ｋ５１９Ｖ、Ｒ５２１Ｆ、Ｒ５２１Ｗ、Ｒ５２１Ｙ、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｆ、Ｔ５２７Ｗ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、Ａ５３９Ｖ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５４１Ｗ、Ｋ５４１Ｙ、Ｋ５５７Ａ、Ｋ５５７Ｇ、Ｋ５５７Ｉ、Ｋ５５７Ｌ、Ｋ５５７Ｖ、Ａ５６１Ｆ、Ａ５６１Ｗ、Ａ５６１Ｙ、Ｔ５６６Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、Ｔ５６６Ｙ、Ａ５６９Ｈ、およびＡ５６９Ｐ。
【０１９７】
２１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態１乃至１５、１８、または２０のいずれかのキメラポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ｇ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１３Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｇ４３４Ｃ、Ｅ４４２Ｋ、Ｒ４４５Ｗ、Ｐ４４７Ｓ、Ｅ４５０Ｄ、Ｓ４５４Ｃ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４５７Ｆ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｗ、Ｋ５１９Ｉ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ｉ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５５７Ｇ、Ａ５６１Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、およびＡ５６９Ｐ。  
２２．ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて以下からなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む、実施形態１乃至１５、または１８のいずれかのキメラポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ｇ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１３Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｇ４３４Ｃ、Ｅ４４２Ｋ、Ｒ４４５Ｗ、Ｐ４４７Ｓ、Ｅ４５０Ｄ、Ｓ４５４Ｃ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４５７Ｆ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｗ、Ｋ５１９Ｉ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ｉ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５５７Ｇ、Ａ５６１Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、およびＡ５６９Ｐ。
【０１９８】
２３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態２１のキメラポリペプチド：Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇ。  
２４．ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて以下からなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む、実施形態２２のキメラポリペプチド：Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇ。
【０１９９】
２５．前記キメラポリペプチドは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて以下からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、実施形態１乃至１４または１８のいずれかのキメラポリペプチド：（ａ）Ｅ３８３Ｇ／Ｋ４１３Ｓ；（ｂ）Ｙ４０１Ｅ／Ｉ５２３Ｇ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｄ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｅ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｆ）Ｌ４０７Ｙ／Ｑ５２６Ｔ；（ｇ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｈ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｉ）Ｖ４１５Ｔ／Ａ５６９Ｐ；（０）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｋ）Ｅ４４２Ｋ／Ｅ４５０Ｄ／Ｑ４５９Ｒ；（ｌ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｍ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５１９Ｉ／Ｋ５２５Ｖ；（ｎ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｏ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｐ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；および（ｑ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ。
【０２００】
２６．前記キメラポリペプチドは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて以下からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、、実施形態２５のキメラポリペプチド：、（ａ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｂ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｄ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｅ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｆ）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｇ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｈ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｉ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｊ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；および（ｋ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ。
【０２０１】
２７．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものであるが、ニワトリ血清アルブミンにおいては保存されない、実施形態１乃至１５のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２０２】
２８．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものであるが、ニワトリ血清アルブミンにおいては保存されない、実施形態２７のキメラポリペプチド。
【０２０３】
２９．ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡ（配列番号２）の位置に対する番号付けに基づいた次の位置のいずれかにある、実施形態１５のキメラポリペプチド：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。
【０２０４】
３０．ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡ（配列番号２）の位置に対する番号付けに基づいた次の位置のいずれかにある、実施形態２９のキメラポリペプチド：残基３８３、残基３９１、残基４３４、残基４４２、残基４４５、および残基４５０。
【０２０５】
３１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態３０のキメラポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｅ４５０Ｄ、およびＥ４５０Ｅ。
【０２０６】
３２．ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡ（配列番号２）の位置に対する番号付けに基づいた次の位置のいずれかにある、実施形態２９のキメラポリペプチド：残基４１７、残基４４２、残基４９９、および残基５０２。
【０２０７】
３３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある、実施形態２７のキメラポリペプチド：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８７、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６６、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基５００、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３５、残基５３９、残基５４４、残基５４７、および残基５７６。
【０２０８】
３４．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある、実施形態３３のキメラポリペプチド：残基３８１、残基４０１、残基４２４、残基４５７、残基４６３、残基４９５、残基５０８、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５３１、残基５３５、および残基５３９。
【０２０９】
３５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態３４のキメラポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、およびＡ５３９Ｖ。
【０２１０】
３６．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群のメンバーのなかから選択されたものである、実施形態２９のキメラポリペプチド：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。
【０２１１】
３７．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群のメンバーのなかから選択されたものである、実施形態３３のキメラポリペプチド：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８７、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６６、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基５００、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３５、残基５３９、残基５４４、残基５４７、および残基５７６。
【０２１２】
３８．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群のメンバーのなかから選択されたものである、実施形態３３のキメラポリペプチド：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８３、残基３８７、残基３８９、残基３９１、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１０、残基４１７、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２５、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４４２、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６５、残基４６６、残基４６７、残基４６８、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８６、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基４９９、残基５００、残基５０２、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２０、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３２、残基５３５、残基５３６、残基５３９、残基５４３、残基５４４、残基５４７、残基５７１、および残基５７６。
【０２１３】
３９．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群のメンバーのなかから選択されたものである、実施形態３８のキメラポリペプチド：残基３８１、残基３８３、残基３９１、残基４０１、残基４２４、残基４４２、残基４６３、残基４９５、残基５０６、残基５０８、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５３１、残基５３５、および残基５３９。
【０２１４】
４０．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態３９のキメラポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ，Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、およびＡ５３９Ｖ。
【０２１５】
４１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表面接触可能残基のものである、実施形態１乃至４０のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２１６】
４２．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、表面接触可能残基のものである、実施形態４１のキメラポリペプチド。
【０２１７】
４３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表面接触可能で、かつ複数の種全体で保存される残基のものである、実施形態１乃至１２のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２１８】
４４．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、表面接触可能で、かつ複数の種全体で保存される残基のものである、実施形態４３のキメラポリペプチド。
【０２１９】
４５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づいた次の位置のいずれかにある、実施形態４３または４４のキメラポリペプチド：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。
【０２２０】
４６．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づいた次の位置のいずれかにある、実施形態４５のキメラポリペプチド：残基３８３、残基３９１、および残基４４２。
【０２２１】
４７．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、からなる群からから選択されたものである、実施形態４５のキメラポリペプチド：Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｅ４４２Ｋ、およびＥ４４２Ｒ。
【０２２２】
４８．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づいた次の位置のいずれかにある、実施形態４５のキメラポリペプチド：残基４１７、残基４４２、残基４９９、および残基５０２。
【０２２３】
４９．前記ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１乃至４８のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２２４】
５０．前記ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４９のキメラポリペプチド。
【０２２５】
５１．前記ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４９のキメラポリペプチド。
【０２２６】
５２．前記ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１乃至４８のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２２７】
５３．前記ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５２のキメラポリペプチド。
【０２２８】
５４．前記ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５２のキメラポリペプチド。
【０２２９】
５５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２に存在する、実施形態１乃至５４のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２３０】
５６．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２に存在する、実施形態１乃至２２、２７乃至２９、３２、３３、３６乃至３８、４１乃至４５、または４８乃至５５のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２３１】
５７．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の１〜５個が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２に存在する、実施形態５５または５６のキメラポリペプチド。
【０２３２】
５８．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３に存在する、実施形態１乃至５５のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２３３】
５９．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３に存在する、実施形態１乃至２２、２７乃至３３、３６乃至５４、または５８のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２３４】
６０．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の１〜５個が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３に存在する、実施形態５８または５９のキメラポリペプチド。
【０２３５】
６１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６に存在する、実施形態１乃至５５または５８のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２３６】
６２．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６に存在する、実施形態１乃至２２、２７乃至２９、３２、３３乃至４５、４８乃至５４、または６１のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２３７】
６３．ＨＳＡドメインＩＩＩに１〜１８個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の１〜１８個が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６に存在する、実施形態６１または６２のキメラポリペプチド。
【０２３８】
６４．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７に存在する、実施形態１乃至５５、５８、または６１のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２３９】
６５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７に存在する、実施形態１乃至２２、２７乃至２９、３２、３３乃至４５、４８乃至５４、または６４のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２４０】
６６．ＨＳＡドメインＩＩＩに１〜３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の１〜６個は、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７に存在する、実施形態６７または６８のキメラポリペプチド。
【０２４１】
６７．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７に存在する、実施形態１乃至５５、５８、６１、または６４のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２４２】
６８．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７に存在する、実施形態１乃至２２、２７乃至２９、３２、３３乃至４５、４８乃至５４、または６７のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２４３】
６９．ＨＳＡドメインＩＩＩに１〜３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の１〜３個は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７に存在する、実施形態６７または６８のキメラポリペプチド。
【０２４４】
７０．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８に存在する、実施形態１乃至５５、５８、６１、６４、または６７のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２４５】
７１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８に存在する、実施形態１乃至２２、２７乃至２８、３７、３８、４１乃至４４、４９乃至５４、または７０のいずれかのキメラポリペプチド
７２．ＨＳＡドメインＩＩＩに１〜５個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の１〜１８個は、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８に存在する、実施形態７０または７１のキメラポリペプチド。
【０２４６】
７３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８に存在する、実施形態１乃至５５、５８、６１、６４、６７、または７０のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２４７】
７４．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８に存在する、実施形態１乃至２２、２７乃至２８、３７、３８、４１乃至４４、４９乃至５４、または７３のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２４８】
７５．ＨＳＡドメインＩＩＩに１〜５個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の１〜５個は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８に存在する、実施形態７３または７４のキメラポリペプチド。
【０２４９】
７６．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９に存在する、実施形態１乃至５５、５８、６１、６４、６７、７０、または７３のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２５０】
７７．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９に存在する、実施形態１乃至２２、２７乃至２８、４１乃至４４、４９乃至５４、または７６のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２５１】
７８．ＨＳＡドメインＩＩＩに１〜４個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の１〜４個は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９に存在する、実施形態７６または７７のキメラポリペプチド。
【０２５２】
７９．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、あるアミノ酸のアラニンによる置換を含む、実施形態１乃至７８のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２５３】
８０．実施前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、保存的アミノ酸置換を含む、形態１乃至７９のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２５４】
８１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸による置換を含む、実施形態１乃至８０のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２５５】
８２．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸による置換を含む、実施形態１乃至８１のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２５６】
８３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、中性アミノ酸の別の中性アミノ酸による置換を含む、実施形態１乃至８３のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２５７】
８４．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１乃至８３のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２５８】
８５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１乃至８４のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２５９】
８６．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１乃至８５のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２６０】
８７．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、アラニン、バリン、プロリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、およびグリシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１乃至８６のいずれかのキメラポリペプチドで。
【０２６１】
８８．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１乃至８７のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２６２】
８９．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、システイン、セリン、およびスレオニンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１乃至８８のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２６３】
９０．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１乃至８９のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２６４】
９１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１乃至９０のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２６５】
９２．実施前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、非保存的アミノ酸置換を含む、形態１乃至９１のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２６６】
９３．前記アミノ酸置換の全部が、あるアミノ酸のアラニンによる置換を含む、実施形態７９のキメラポリペプチド。
【０２６７】
９４．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、保存的なアミノ酸置換を含む、実施形態８０のキメラポリペプチド。
【０２６８】
９５．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸による置換を含む、実施形態８１のキメラポリペプチド。
【０２６９】
９６．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸による置換を含む、実施形態８３のキメラポリペプチド。
【０２７０】
９７．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、中性アミノ酸の別の中性アミノ酸による置換を含む、実施形態８３のキメラポリペプチド。
【０２７１】
９８．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態８４のキメラポリペプチド。
【０２７２】
９９．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態８５のキメラポリペプチド。
【０２７３】
１００．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態８６のキメラポリペプチド。
【０２７４】
１０１．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、アラニン、バリン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、およびグリシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態８７のキメラポリペプチド。
【０２７５】
１０２．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態８８のキメラポリペプチド。
【０２７６】
１０３．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、システイン、セリン、およびスレオニンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態８９のキメラポリペプチド。
【０２７７】
１０４．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態９０のキメラポリペプチド。
【０２７８】
１０５．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態９１のキメラポリペプチド。
【０２７９】
１０６．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、非保存的なアミノ酸置換を含む、実施形態９２のキメラポリペプチド。
【０２８０】
１０７．前記異種タンパク質が抗体またはその抗原結合断片を含む、実施形態１乃至１０６のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２８１】
１０８．前記異種タンパク質が治療用タンパク質を含む、実施形態１乃至１０７のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２８２】
１０９．ＩｇＧ免疫グロブリンの定常領域をさらに含む、実施形態１乃至１０８のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２８３】
１１０．前記ＨＳＡ部分が、前記異種タンパク質と化学的にコンジュゲート形成している、実施形態１乃至１０９のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２８４】
１１１．前記ＨＳＡ部分が、前記異種タンパク質と組換えによりコンジュゲート形成している、実施形態１乃至１０９のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２８５】
１１２．前記キメラポリペプチドが、ＨＳＡ部分及び異種タンパク質の両方をコードする組換えベクターを用いて生成されたものである、実施形態１１１のキメラポリペプチド。
【０２８６】
１１３．前記キメラポリペプチドが、原核細胞または真核細胞において生成されたものである、実施形態１１１または１１２のキメラポリペプチド。
【０２８７】
１１４．前記真核細胞は、酵母菌の細胞、鳥類の細胞、昆虫の細胞または哺乳動物の細胞から選択さえれたものである、実施形態１１３のキメラポリペプチド。
【０２８８】
１１５．前記ＨＳＡ部分と前記異種タンパク質とが、相互に直接コンジュゲート形成している、実施形態１１０乃至１１４のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２８９】
１１６．前記ＨＳＡ部分と前記異種タンパク質とが、リンカーを介してコンジュゲート形成している、実施形態１１０乃至１１４のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２９０】
１１７．前記リンカーはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの反復を１以上含む、実施形態１１６のキメラポリペプチド。
【０２９１】
１１８．前記ＨＳＡ部分が、前記異種タンパク質のＮ末端アミノ酸とコンジュゲート形成している、実施形態１乃至１１７のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２９２】
１１９．前記ＨＳＡ部分が、前記異種タンパク質のＣ末端アミノ酸とコンジュゲート形成している、実施形態１乃至１１７のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２９３】
１２０．前記ＨＳＡ部分が、前記異種タンパク質の内部のアミノ酸とコンジュゲート形成している、実施形態１乃至１１７のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２９４】
１２１．前記ＨＳＡ部分が、ＨＳＡドメインＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩの少なくとも一部およびＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部をさらに含む、実施形態１乃至１２０のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２９５】
１２２．前記キメラポリペプチドが実質的に精製されている、実施形態１乃至１２１のいずれかのキメラポリペプチド。
【０２９６】
１２３．実施形態１乃至１２２のいずれかのキメラポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【０２９７】
１２４．前記組成物が無菌の組成物である、実施形態１２３の組成物。
【０２９８】
１２５．前記組成物が非発熱性である、実施形態１２３または１２４の組成物。
【０２９９】
１２６．処置を必要とする対象の処置方法であって、前記対象に対し、実施形態１乃至１２２のいずれかのキメラポリペプチドまたは実施形態１２３乃至１２５のいずれかの組成物を投与することを含む、該方法。
【０３００】
１２７．処置を必要とする対象におけるタンパク質の血清半減期を長期化させる方法であって、前記対象に対し、実施形態１乃至１２２のいずれかのキメラポリペプチドを投与することを含む、該方法。
【０３０１】
１２８．前記対象に対し投与することが、前記キメラポリペプチドを全身投与することを含む、実施形態１２６または１２７の方法。
【０３０２】
１２９．前記対象に対し投与することが、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、血管内、心膜内、皮下、肺内、鼻腔内、眼内、硬膜外、局所、経口の各投与経路からなる群から選択された投与経路による前記キメラポリペプチドを投与することを含む、実施形態１２６または１２７の方法。
【０３０３】
１３０．前記対象に対し投与することが、前記キメラポリペプチドを静脈内投与することを含む、実施形態１２６または１２７の方法。
【０３０４】
１３１．実施形態１乃至１２１のいずれかのキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクト。
【０３０５】
１３２．ＨＳＡドメインＩＩＩまたはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）変異形ポリペプチドであって、前記変異形ポリペプチドはＦｃＲｎに結合することができ、前記ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜１８個のアミノ酸置換を含み、それによって前記アミノ酸置換を欠いている対照ＨＳＡポリペプチドと比較してＦｃＲｎに対する前記変異形ポリペプチドの親和性を増加させる、該ＨＳＡ変異形ポリペプチド。
【０３０６】
１３３．前記変異形ポリペプチドは、前記対照ポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎに結合し、前記親和性は酸性ｐＨで測定される、実施形態１３２の変異形ポリペプチド。
【０３０７】
１３４．前記酸性ｐＨは５．０〜６．０の範囲である、実施形態１３２または１３３に記載の変異形ポリペプチド。
【０３０８】
１３５．前記酸性ｐＨは５．５±０．２である、実施形態１３４に記載の変異形ポリペプチド。
【０３０９】
１３６．前記変異形ポリペプチドは、酸性ｐＨで前記対照ポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎに結合するが、中性ｐＨでは前記対照ポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎに結合しない、実施形態１３２に記載の変異形ポリペプチド。
【０３１０】
１３７．前記中性ｐＨは６．９〜７．９の範囲である、実施形態１３６の変異形ポリペプチド。
【０３１１】
１３８．前記中性ｐＨは７．４±０．２である、実施形態１３７の変異形ポリペプチド。
【０３１２】
１３９．前記変異形ポリペプチドが、前記対照ＨＳＡポリペプチドと比較して長い血清半減期を有する、実施形態１３２の変異形ポリペプチド。
【０３１３】
１４０．前記ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜１０個のアミノ酸置換を含む、実施形態１３２乃至１３９のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３１４】
１４１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、複数種全体で保存される残基のものである、実施形態１３２乃至１４０のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３１５】
１４２．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、複数種全体で保存される残基のものである、実施形態１４１の変異形ポリペプチド。
【０３１６】
１４３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである、実施形態１３２乃至１４０のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３１７】
１４４．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである、実施形態１４３の変異形ポリペプチド。
【０３１８】
１４５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表５に記載されたものから選択される、実施形態１３２乃至１４３のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３１９】
１４６．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある実施形態１３２乃至１４３のいずれかの変異形ポリペプチド：残基３８１、残基３８３、残基３９１、残基４０１、残基４０２、残基４０７、残基４１１、残基４１３、残基４１４、残基４１５、残基４１６、残基４２４、残基４２６、残基４３４、残基４４２、残基４４５、残基４４７、残基４５０、残基４５４、残基４５５、残基４５６、残基４５７、残基４５９、残基４６３、残基４９５、残基５０６、残基５０８、残基５０９、残基５１１、残基５１２、残基５１５、残基５１６、残基５１７、残基５１９、残基５２１、残基５２３、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２７、残基５３１、残基５３５、残基５３８、残基５３９、残基５４１、残基５５７、残基５６１、残基５６６、残基５６９。
【０３２０】
１４７．前記キメラポリペプチドは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づいた、以下からなる群から選択される位置において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるアミノ酸置換を含む、実施形態１３２乃至１４３のいずれかの変異形ポリペプチド：ａ）残基３８３および４１３；（ｂ）残基４０１および５２３；（ｃ）残基４０７および４４７；（ｄ）残基４０７および４４７および５３９；（ｅ）残基４０７および５０９；（ｆ）残基４０７および５２６；（ｇ）残基４１１および５３５；（ｈ）残基４１４および４５６；（ｉ）残基４１５および５６９；（ｊ）残基４２６および５２６；（ｋ）残基４４２および４５０および４５９；（１）残基４６３および５０８；（ｍ）残基５０８および５１９および５２５；（ｎ）残基５０９および５２７；（ｏ）残基５２３および５３８；（ｐ）残基５２６および５５７；および（ｑ）残基５４１および５６１。
【０３２１】
１４８．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態１３２乃至１４３または１４６のいずれかの変異形ポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｋ４０２Ｇ、Ｋ４０２Ｉ、Ｋ４０２Ｌ、Ｋ４０２Ｖ、Ｌ４０７Ｆ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｑ、Ｌ４０７Ｗ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｙ４１ＩＮ、Ｋ４１３Ｃ、Ｋ４１３Ｓ、Ｋ４１３Ｔ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１４Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｖ４１５Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｑ４１６Ｈ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｄ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｖ４２６Ｐ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｐ４４７Ｓ、Ｐ４４７Ｔ、Ｅ４５０Ｄ、Ｅ４５０Ｅ、Ｓ４５４Ｃ、Ｓ４５４Ｍ、Ｓ４５４Ｔ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５５Ｑ、Ｖ４５６Ｎ、Ｖ４５６Ｑ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｑ４５９Ｋ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｃ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｌ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｖ、Ｆ５０９Ｗ、Ｆ５０９Ｙ、Ａ５１１Ｆ、Ａ５１１Ｗ、Ａ５１１Ｙ、Ｄ５１２Ｆ、Ｄ５１２Ｗ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｍ、Ｓ５１７Ｔ、Ｓ５１７Ｗ、Ｓ５１７Ｙ、Ｋ５１９Ａ、Ｋ５１９Ｇ、Ｋ５１９Ｉ、Ｋ５１９Ｌ、Ｋ５１９Ｖ、Ｒ５２１Ｆ、Ｒ５２１Ｗ、Ｒ５２１Ｙ、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｆ、Ｔ５２７Ｗ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、Ａ５３９Ｖ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５４１Ｗ、Ｋ５４１Ｙ、Ｋ５５７Ａ、Ｋ５５７Ｇ、Ｋ５５７Ｉ、Ｋ５５７Ｌ、Ｋ５５７Ｖ、Ａ５６１Ｆ、Ａ５６１Ｗ、Ａ５６１Ｙ、Ｔ５６６Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、Ｔ５６６Ｙ、Ａ５６９Ｈ、およびＡ５６９Ｐ。
【０３２２】
１４９．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態１３２乃至１４３、１４６、または１４８のいずれかの変異形ポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ｇ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１３Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｇ４３４Ｃ、Ｅ４４２Ｋ、Ｒ４４５Ｗ、Ｐ４４７Ｓ、Ｅ４５０Ｄ、Ｓ４５４Ｃ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４５７Ｆ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｗ、Ｋ５１９Ｉ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ｉ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５５７Ｇ、Ａ５６１Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、およびＡ５６９Ｐ。
【０３２３】
１５０．前記変異形ポリペプチドは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて以下からなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む、実施形態１３２乃至１４３、または１４６のいずれかの変異形ポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ｇ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１３Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｇ４３４Ｃ、Ｅ４４２Ｋ、Ｒ４４５Ｗ、Ｐ４４７Ｓ、Ｅ４５０Ｄ、Ｓ４５４Ｃ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４５７Ｆ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｗ、Ｋ５１９Ｉ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ｉ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５５７Ｇ、Ａ５６１Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、およびＡ５６９Ｐ。
【０３２４】
１５１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態１４９の変異形ポリペプチド：Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇ。
【０３２５】
１５２．前記変異形ポリペプチドは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて以下からなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む、実施形態１５０の変異形ポリペプチド：Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇ。
【０３２６】
１５３．前記変異形ポリペプチドは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて以下からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、実施形態１３２乃至１４３、または１４６のいずれかの変異形ポリペプチド：（ａ）Ｅ３８３Ｇ／Ｋ４１３Ｓ；（ｂ）Ｙ４０１Ｅ／Ｉ５２３Ｇ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｄ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｅ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｆ）Ｌ４０７Ｙ／Ｑ５２６Ｔ；（ｇ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｈ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｉ）Ｖ４１５Ｔ／Ａ５６９Ｐ；（０）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｋ）Ｅ４４２Ｋ／Ｅ４５０Ｄ／Ｑ４５９Ｒ；（ｌ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｍ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５１９Ｉ／Ｋ５２５Ｖ；（ｎ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｏ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｐ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；および（ｑ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ。
【０３２７】
１５４．前記変異形ポリペプチドは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて以下からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、実施形態１３２乃至１４３または１４６のいずれかの変異形ポリペプチド：（ａ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｂ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｄ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｅ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｆ）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｇ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｈ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｉ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｊ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；および（ｋ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ。
【０３２８】
１５５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものであるが、ニワトリ血清アルブミンにおいては保存されない、実施形態１３２乃至１４３のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３２９】
１５６．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものであるが、ニワトリ血清アルブミンにおいては保存されない、実施形態１５５の変異形ポリペプチド。
【０３３０】
１５７．ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡ（配列番号２）の位置に対する番号付けに基づいた次の位置のいずれかにある、実施形態１４３の変異形ポリペプチド：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。
【０３３１】
１５８．ＨＳＡドメインＩＩＩにおける前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づいた次の位置のいずれかにある、実施形態１５７の変異形ポリペプチド：残基３８３、残基３９１、残基４３４、残基４４２、残基４４５、および残基４５０。
【０３３２】
１５９．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態１５８の変異形ポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｅ４５０Ｄ、およびＥ４５０Ｅ。
【０３３３】
１６０．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づいた次の位置のいずれかにある、実施形態１５７の変異形ポリペプチド：残基４１７、残基４４２、残基４９９、および残基５０２。
【０３３４】
１６１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある、実施形態１５５の変異形ポリペプチド：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８７、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６６、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基５００、残基５０８、残基５１０、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２８、残基５３１、残基５３５、残基５３９、残基５４４、残基５４７、残基５７６。
【０３３５】
１６２．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある、実施形態１６１の変異形ポリペプチド：残基３８１、残基４０１、残基４２４、残基４５７、残基４６３、残基４９５、残基５０８、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５３１、残基５３５、および残基５３９。
【０３３６】
１６３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態１６２の変異形ポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、およびＡ５３９Ｖ。
【０３３７】
１６４．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群のメンバーのなかから選択されたものである、実施形態１５７の変異形ポリペプチド：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。
【０３３８】
１６５．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群のメンバーのなかから選択されたものである、実施形態１６１の変異形ポリペプチド：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８７、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６６、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基５００、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３５、残基５３９、残基５４４、残基５４７、および残基５７６。
【０３３９】
１６６．前記アミノ酸置換の全部が、からなる群のメンバーのなかから選択されたものである、実施形態１５７または１６１の変異形ポリペプチド：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８３、残基３８７、残基３８９、残基３９１、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１０、残基４１７、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２５、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４４２、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６５、残基４６６、残基４６７、残基４６８、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８６、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基４９９、残基５００、残基５０２、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２０、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３２、残基５３５、残基５３６、残基５３９、残基５４３、残基５４４、残基５４７、残基５７１、および残基５７６。
【０３４０】
１６７．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群のメンバーのなかから選択されたものである、実施形態１６６の変異形ポリペプチド：残基３８１、残基３８３、残基３９１、残基４０１、残基４２４、残基４４２、残基４６３、残基４９５、残基５０８、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５３１、残基５３５、および残基５３９。
【０３４１】
１６８．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態１６７の変異形ポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ，Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、およびＡ５３９Ｖ。
【０３４２】
１６９．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表面接触可能残基のものである、実施形態１３２乃至１６６のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３４３】
１７０．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、表面接触可能残基のものである、実施形態１６９の変異形ポリペプチド。
【０３４４】
１７１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表面接触可能で、かつ複数の種全体で保存される残基のものである、実施形態１３２乃至１６６のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３４５】
１７２．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、表面接触可能で、かつ複数の種全体で保存される残基のものである、実施形態１７１のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３４６】
１７３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づいた次の位置のいずれかにある、実施形態１７１または１７２の変異形ポリペプチド：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。
【０３４７】
１７４．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づいた次の位置のいずれかにある、実施形態１７３の変異形ポリペプチド：残基３８３、残基３９１、および残基４４２。
【０３４８】
１７５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群からから選択されたものである、実施形態１７４の変異形ポリペプチド：Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｅ４４２Ｋ、およびＥ４４２Ｒ。
【０３４９】
１７６．前記ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１３２乃至１７２いずれかの変異形ポリペプチド。
【０３５０】
１７７．前記ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１７６の変異形ポリペプチド。
【０３５１】
１７８．前記ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１６９１７７の変異形ポリペプチド。
【０３５２】
１７９．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２に存在する、実施形態１３２乃至１７８のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３５３】
１８０．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２に存在する、実施形態１３２乃至１５０、１５５乃至１５７、１６１、１６４乃至１６６、１６９乃至１７３、または１７６乃至１７９のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３５４】
１８１．１〜５個のアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩに含み、前記アミノ酸置換の１〜５個は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２に存在する、実施形態１７９または１８０の変異形ポリペプチド。
【０３５５】
１８２．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３に存在する、実施形態１３２乃至１７９のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３５６】
１８３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３に存在する、実施形態１３２乃至１５０、１５５乃至１６１、１６４乃至１６６乃至１７８、または１８２のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３５７】
１８４．１〜５個のアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩに含み、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の１〜５個は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３に存在する、実施形態１８２または１８３の変異形ポリペプチド。
【０３５８】
１８５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６に存在する、実施形態１３２乃至１７３または１８２のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３５９】
１８６．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６に存在する、実施形態１３２乃至１５０、１５５乃至１５７、１６０乃至１７３、１７６乃至１７８、または１８５のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３６０】
１８７．１〜５個のアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩに含み、ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の１〜５個は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６に存在する、実施形態１８５または１８６の変異形ポリペプチド。
【０３６１】
１８８．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７に存在する、実施形態１３２乃至１７３、１８２、または１８５のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３６２】
１８９．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ7に存在する、実施形態１３２乃至１５０、１５５乃至１５７、１６０乃至１７３、１７６乃至１７８、または１８８のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３６３】
１９０．ＨＳＡドメインＩＩＩに１〜３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の１〜６個は、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７に存在する、実施形態１８８または１９２の変異形ポリペプチド。
【０３６４】
１９１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７に存在する、実施形態１３２乃至１７３、１８２、１８５、または１８８のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３６５】
１９２．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７に存在する、実施形態１３２乃至１５０、１５５乃至１５７、１６０乃至１７３、１７６乃至１７８、または１９１のいずれかの変異形ポリペプチド
１９３．ＨＳＡドメインＩＩＩに１〜３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の１〜３個は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７に存在する、実施形態１９１または１９２の変異形ポリペプチド。
【０３６６】
１９４．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８に存在する、実施形態１３２乃至１７３、１８２、１８５、１８８、または１９１のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３６７】
１９５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８に存在する、実施形態１３２乃至１５０、１５５乃至１５７、１６５乃至１６６、１６９乃至１７３、１７６乃至１７８、または１９４のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３６８】
１９６．ＨＳＡドメインＩＩＩに１〜５個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の１〜１８個は、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８に存在する、実施形態１９４または１９５の変異形ポリペプチド。
【０３６９】
１９７．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８に存在する、実施形態１３２乃至１７３、１８２、１８５、１８８、１９１、または１９４のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３７０】
１９８．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８に存在する、実施形態１３２乃至１５０、１５５乃至１５７、１６５乃至１６６、１６９乃至１７３、１７６乃至１７８、または１９７のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３７１】
１９９．ＨＳＡドメインＩＩＩに１〜５個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の１〜５個は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８に存在する、実施形態１９７または１９８の変異形ポリペプチド。
【０３７２】
２００．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造９に存在する、実施形態１３２乃至１７３、１８２、１８５、または１９７のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３７３】
２０１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９に存在する、実施形態１３２乃至１５０、１５５、１５６、１６９乃至１７２、１７６乃至１７８、または２００のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３７４】
２０２．ＨＳＡドメインＩＩＩに１〜４個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の１〜４個は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９に存在する、実施形態２００または２０１の変異形ポリペプチド。
【０３７５】
２０３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、あるアミノ酸のアラニンによる置換を含む、実施形態１３２乃至２０２いずれかの変異形ポリペプチド。
【０３７６】
２０４．前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、保存的アミノ酸置換を含む、実施形態１３２乃至２０３のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３７７】
２０５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸による置換を含む、実施形態１３２乃至２０４のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３７８】
２０６．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸による置換を含む、実施形態１３２乃至２０５のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３７９】
２０７．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、中性アミノ酸の別の中性アミノ酸による置換を含む、実施形態１３２乃至２０６のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３８０】
２０８．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１３２乃至２０７のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３８１】
２０９．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１３２乃至２０８のいずれかの変異形ポリペプチド
２１０．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１３２乃至２０９のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３８２】
２１１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、アラニン、バリン、プロリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、およびグリシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１３２乃至２１０のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３８３】
２１２．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１３２乃至２１１のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３８４】
２１３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、システイン、セリン、およびスレオニンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１３２乃至２１２のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３８５】
２１４．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１３２乃至２１３のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３８６】
２１５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態１３２乃至２１４のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３８７】
２１６．前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、非保存的アミノ酸置換を含む、実施形態１３２乃至２１５のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０３８８】
２１７．前記アミノ酸置換の全部が、あるアミノ酸のアラニンによる置換を含む、実施形態２０３の変異形ポリペプチド。
【０３８９】
２１８．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、保存的なアミノ酸置換を含む、実施形態２０４の変異形ポリペプチド。
【０３９０】
２１９．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸による置換を含む、実施形態２０５の変異形ポリペプチド。
【０３９１】
２２０．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸による置換を含む、実施形態２０６の変異形ポリペプチド。
【０３９２】
２２１．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、中性アミノ酸の別の中性アミノ酸による置換を含む、実施形態２０７の変異形ポリペプチド。
【０３９３】
２２２．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態２０８の変異形ポリペプチド。
【０３９４】
２２３．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態２０９の変異形ポリペプチド。
【０３９５】
２２４．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態２１０の変異形ポリペプチド。
【０３９６】
２２５．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、アラニン、バリン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、およびグリシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態２１１の変異形ポリペプチド。
【０３９７】
２２６．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態２１２の変異形ポリペプチド。
【０３９８】
２２７．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、システイン、セリン、およびスレオニンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態２１３の変異形ポリペプチド。
【０３９９】
２２８．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態２１４の変異形ポリペプチド。
【０４００】
２２９．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群のなかの、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む、実施形態２１５の変異形ポリペプチド。
【０４０１】
２３０．前記アミノ酸置換の全部が、各位置において独立して、非保存的なアミノ酸置換を含む、実施形態２１６の変異形ポリペプチド。
【０４０２】
２３１．前記ＨＳＡ部分が、ＨＳＡドメインＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩの少なくとも一部およびＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部をさらに含む、実施形態１３２乃至２３０のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０４０３】
２３２．前記変異形ポリペプチドが実質的に精製されている、実施形態１３２乃至２３１のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０４０４】
２３３．前記変異形ポリペプチドが、標的のエピトープに対する結合部位をさらに含む、実施形態１３２乃至２３２のいずれかの変異形ポリペプチド。
【０４０５】
２３４．前記結合部位は、前記標的に対して拮抗因子として働くする、実施形態２３３に記載の変異形ポリペプチド。
【０４０６】
２３５．前記結合部位は、前記標的に対して作用因子として働く、実施形態２３３に記載の変異形ポリペプチド。
【０４０７】
２３６．実施形態１３２乃至２３５のいずれかの変異形ポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【０４０８】
２３７．無菌の組成物である実施形態２３６の組成物。
【０４０９】
２３８．非発熱性である、実施形態２３６または２３７の組成物。
【０４１０】
２３９．タンパク質の血清半減期を長期化させる方法であって、前記タンパク質を、実施形態１３２乃至２３５のいずれかの変異形ポリペプチドとコンジュゲート形成させることを含む、該方法。
【０４１１】
２４０．処置を必要とする対象の処置方法であって、前記対象に対し、実施形態２３３乃至２３５のいずれかの変異形ポリペプチドを投与することを含む、該方法。
【０４１２】
２４１．実施形態１３２乃至２３１のいずれかの変異形ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクト。
【０４１３】
２４２．核酸コンストラクトであって、（ａ）ヒト結成アルブミン（ＨＳＡ）部分をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＨＳＡ部分は、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合断片を含み、かつ前記ＨＳＡドメインＩＩＩは、（ｂ）異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能にリンクされた１〜１８のアミノ酸置換を含み、前記核酸コンストラクトは、異種タンパク質の機能活性を保持し、かつＦｃＲｎに結合できるキメラポリペプチドをコードし、前記キメラポリペプチドは、ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照キメラポリペプチドと比較して長期化された血清半減期および／またはＦｃＲｎに対する増大した親和性を有している、該核酸コンストラクト。
【０４１４】
２４３．前記キメラポリペプチドは、前記対照キメラポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎに結合する、実施形態２４２の核酸コンストラクト。
【０４１５】
２４４．前記キメラポリペプチドは、前記対照キメラポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎに結合し、前記親和性は酸性ｐＨで測定される、実施形態２４２または２４３の核酸コンストラクト。
【０４１６】
２４５．前記酸性ｐＨは５．０〜６．０の範囲である、実施形態２４４に記載の核酸コンストラクト。
【０４１７】
２４６．前記酸性ｐＨは５．５±０．２である、実施形態２４５に記載の核酸コンストラクト。
【０４１８】
２４７．前記キメラポリペプチドは、酸性ｐＨで前記対照ポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎに結合するが、中性ｐＨでは前記対照ポリペプチドより高い親和性をもってＦｃＲｎに結合しない、実施形態２４２乃至２４７のいずれかに記載の核酸コンストラクト。
【０４１９】
２４８．前記中性ｐＨは６．９〜７．９の範囲である、実施形態２４７に記載の核酸コンストラクト。
【０４２０】
２４９．前記中性ｐＨは７．４±０．２である、実施形態２４８に記載の核酸コンストラクト。
【０４２１】
２５０．（ｉ）ヒト結成アルブミン（ＨＳＡ）部分をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＨＳＡ部分は、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合断片を含み、かつ前記ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜１０個のアミノ酸置換を含む、実施形態２４２に記載の核酸コンストラクト。
【０４２２】
２５１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、複数種全体で保存される残基のものである、実施形態２４２乃至２５０のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４２３】
２５２．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、複数種全体で保存される残基のものである、実施形態２５１の核酸コンストラクト。
【０４２４】
２５３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである、実施形態２４２乃至２５０のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４２５】
２５４．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ由来の血清アルブミンタンパク質の間で保存される残基のものである、実施形態２５３の核酸コンストラクト。
【０４２６】
２５５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表５に記載されたものから選択される、実施形態２４２乃至２５４のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４２７】
２５６．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づく次の位置のいずれかにある、実施形態２４２乃至２５４のいずれかの核酸コンストラクト：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８７、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６６、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基５００、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３５、残基５３９、残基５４４、残基５４７、残基５７６。
【０４２８】
２５７．前記核酸コンストラクトは、完全長成熟ＨＳＡの位置に対する番号付けに基づいた、以下からなる群から選択される位置において、ＨＳＡドメインＩＩＩにおけるアミノ酸置換を含む、実施形態２４２乃至２５４のいずれかの核酸コンストラクト：（ａ）残基３８３および４１３；（ｂ）残基４０１および５２３；（ｃ）残基４０７および４４７；（ｄ）残基４０７および４４７および５３９；（ｅ）残基４０７および５０９；（ｆ）残基４０７および５２６；（ｇ）残基４１１および５３５；（ｈ）残基４１４および４５６；（ｉ）残基４１５および５６９；（ｊ）残基４２６および５２６；（ｋ）残基４４２および４５０および４５９；（１）残基４６３および５０８；（ｍ）残基５０８および５１９および５２５；（ｎ）残基５０９および５２７；（ｏ）残基５２３および５３８；（ｐ）残基５２６および５５７；および（ｑ）残基５４１および５６１。
【０４２９】
２５８．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態２４２乃至２５４または２５６のいずれかの核酸コンストラクト：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｋ４０２Ｇ、Ｋ４０２Ｉ、Ｋ４０２Ｌ、Ｋ４０２Ｖ、Ｌ４０７Ｆ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｑ、Ｌ４０７Ｗ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｙ４１ＩＮ、Ｋ４１３Ｃ、Ｋ４１３Ｓ、Ｋ４１３Ｔ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１４Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｖ４１５Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｑ４１６Ｈ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｄ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｖ４２６Ｐ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｐ４４７Ｓ、Ｐ４４７Ｔ、Ｅ４５０Ｄ、Ｅ４５０Ｅ、Ｓ４５４Ｃ、Ｓ４５４Ｍ、Ｓ４５４Ｔ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５５Ｑ、Ｖ４５６Ｎ、Ｖ４５６Ｑ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｑ４５９Ｋ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｃ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｌ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｖ、Ｆ５０９Ｗ、Ｆ５０９Ｙ、Ａ５１１Ｆ、Ａ５１１Ｗ、Ａ５１１Ｙ、Ｄ５１２Ｆ、Ｄ５１２Ｗ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｆ、Ｓ５１７Ｍ、Ｓ５１７Ｔ、Ｓ５１７Ｗ、Ｓ５１７Ｙ、Ｋ５１９Ａ、Ｋ５１９Ｇ、Ｋ５１９Ｉ、Ｋ５１９Ｌ、Ｋ５１９Ｖ、Ｒ５２１Ｆ、Ｒ５２１Ｗ、Ｒ５２１Ｙ、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｆ、Ｔ５２７Ｗ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、Ａ５３９Ｖ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５４１Ｗ、Ｋ５４１Ｙ、Ｋ５５７Ａ、Ｋ５５７Ｇ、Ｋ５５７Ｉ、Ｋ５５７Ｌ、Ｋ５５７Ｖ、Ａ５６１Ｆ、Ａ５６１Ｗ、Ａ５６１Ｙ、Ｔ５６６Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、Ｔ５６６Ｙ、Ａ５６９Ｈ、およびＡ５６９Ｐ。
【０４３０】
２５９．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態２４２乃至２５４、または２５６のいずれかの核酸コンストラクトＶ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ｇ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１３Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｇ４３４Ｃ、Ｅ４４２Ｋ、Ｒ４４５Ｗ、Ｐ４４７Ｓ、Ｅ４５０Ｄ、Ｓ４５４Ｃ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４５７Ｆ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｗ、Ｋ５１９Ｉ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ｉ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５５７Ｇ、Ａ５６１Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、およびＡ５６９Ｐ。
【０４３１】
２６０．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される、実施形態２５９の核酸コンストラクト：Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇ。
【０４３２】
２６１．前記キメラポリペプチドは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて、以下からなる群から選択されたアミノ酸置換を含む、実施形態２４２乃至２５４たは２５６のいずれかの核酸コンストラクト：（ａ）Ｅ３８３Ｇ／Ｋ４１３Ｓ；（ｂ）Ｙ４０１Ｅ／Ｉ５２３Ｇ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｄ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｅ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｆ）Ｌ４０７Ｙ／Ｑ５２６Ｔ；（ｇ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｈ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｉ）Ｖ４１５Ｔ／Ａ５６９Ｐ；（０）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｋ）Ｅ４４２Ｋ／Ｅ４５０Ｄ／Ｑ４５９Ｒ；（ｌ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｍ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５１９Ｉ／Ｋ５２５Ｖ；（ｎ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｏ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｐ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；および（ｑ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ。
【０４３３】
２６２．前記キメラポリペプチドは、ＨＳＡドメインＩＩＩにおいて、以下からなる群から選択されたアミノ酸置換を含む、実施形態２６１の核酸コンストラクト：（ａ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｂ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｄ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｅ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｆ）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｇ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｈ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｉ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｊ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；および（ｋ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ。
【０４３４】
２６３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表面接触可能残基のものである、実施形態２４２乃至２５４のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４３５】
２６４．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、表面接触可能残基のものである、実施形態２６３の核酸コンストラクト。
【０４３６】
２６５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表面接触可能で、かつ複数の種全体で保存される残基のものである、実施形態２４２乃至２５０のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４３７】
２６６．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の全部が、表面接触可能で、かつ複数の種全体で保存される残基のものである、実施形態２６５のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４３８】
２６７．（ｉ）配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する、ＨＳＡドメインＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態２４２乃至２６６のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４３９】
２６８．（ｉ）配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する、ＨＳＡドメインＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態２６７の核酸コンストラクト。
【０４４０】
２６９．（ｉ）配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有する、ＨＳＡドメインＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態２６８の核酸コンストラクト。
【０４４１】
２７０．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２に存在する、実施形態２４２乃至２６９のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４４２】
２７１．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３に存在する、実施形態２４２乃至２７０のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４４３】
２７２．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６に存在する、実施形態２４２乃至２７１のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４４４】
２７３．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのヘリックス７に存在する、実施形態２４２乃至２７２のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４４５】
２７４．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７に存在する、実施形態２４２乃至２７３のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４４６】
２７５．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８に存在する、実施形態２４２乃至２７４のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４４７】
２７６．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８に存在する、実施形態２４２乃至２７５のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４４８】
２７７．ＨＳＡドメインＩＩＩの前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９に存在する、実施形態２４２乃至２７６のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４４９】
２７８．（ｉｉ）異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その異種タンパク質は抗体またはその抗原結合性断片を含む、実施形態２４２乃至２７７のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４５０】
２７９．リンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態２４２乃至２７８のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４５１】
２８０．リンカーをコードするヌクレオチド配列はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの反復を１つ以上含む、実施形態２７９の核酸コンストラクト。
【０４５２】
２８１．前記ＨＳＡ部分が、ＨＳＡドメインＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩの少なくとも一部およびＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部をさらに含む、実施形態２４２乃至２８０のいずれかの核酸コンストラクト。
【０４５３】
２８２．複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合断片を含み、かつ前記複数のポリペプチドのそれぞれが独立して、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマに由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける残基のアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、該ライブラリー。
【０４５４】
２８３．複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合断片を含み、かつ前記複数のポリペプチドのそれぞれが独立して、ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマに由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存されるが、ニワトリ由来の血清アルブミンでは保存されない、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける残基のアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、該ライブラリー。
【０４５５】
２８４．複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合断片を含み、かつ前記複数のポリペプチドのそれぞれが独立して、表面接触可能残基である、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける残基のアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、該ライブラリー。
【０４５６】
２８５．前記表面接触可能残基が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２に存在する、実施形態２８４のライブラリー。
【０４５７】
２８６．前記表面接触可能残基が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３に存在する、実施形態２８４または２８５のライブラリー。
【０４５８】
２８７．前記表面接触可能残基が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６に存在する、実施形態２８４乃至２８６のいずれかのライブラリー。
【０４５９】
２８８．前記表面接触可能残基が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７に存在する、実施形態２８４乃至２７３のいずれかのライブラリー。
【０４６０】
２８９．前記表面接触可能残基が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８に存在する、実施形態２８４乃至２８８のいずれかのライブラリー。
【０４６１】
２９０．前記表面接触可能残基が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９に存在する、実施形態２８４乃至２８９のいずれかのライブラリー。
【０４６２】
２９１．複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合断片を含み、かつ前記複数のポリペプチドのそれぞれが独立して、（ｉ）表面接触可能残基であり、かつ（ｉｉ）ヒト、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマに由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存される、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける残基のアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、該ライブラリー。
【０４６３】
２９２．複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩＩＩまたはそのＦｃＲｎ結合断片を含み、かつ前記複数のポリペプチドのそれぞれが独立して、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマから選択された、ヒトではない２種以上に由来する血清アルブミンタンパク質の間で保存されるアミノ酸への、前記ＨＳＡドメインＩＩＩにおける残基のアミノ酸置換を少なくとも１つ含む、該ライブラリー。
【０４６４】
２９３．前記少なくとも１つのアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ２に存在する、実施形態２９１または２９２のライブラリー。
【０４６５】
２９４．前記少なくとも１つのアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ３に存在する、実施形態２９１乃至２９３のいずれかのライブラリー。
【０４６６】
２９５．前記少なくとも１つのアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ６に存在する、実施形態２９１乃至２９４のいずれかのライブラリー。
【０４６７】
２９６．前記少なくとも１つのアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造７に存在する、実施形態２９１乃至２９５のいずれかのライブラリー。
【０４６８】
２９７．前記少なくとも１つのアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ７に存在する、実施形態２９１乃至２９６のいずれかのライブラリー。
【０４６９】
２９８．前記少なくとも１つのアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのらせん構造８に存在する、実施形態２９１乃至２９７のいずれかのライブラリー。
【０４７０】
２９９．前記少なくとも１つのアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ８に存在する、実施形態２９１乃至２９８のいずれかのライブラリー。
【０４７１】
３００．前記少なくとも１つのアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ９に存在する、実施形態２９１乃至２９９のいずれかのライブラリー。
【０４７２】
３０１．前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩの少なくとも一部およびＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部をさらに含む、実施形態２８２乃至３００のいずれかのライブラリー。
【０４７３】
３０２．ディスプレイライブラリーである、実施形態２８２乃至３０１のいずれかのライブラリー。
【０４７４】
３０３．ディスプレイライブラリーの種類が、酵母、ファージ、および哺乳動物からなる群から選択されたものである、実施形態３０２のライブラリー。
【０４７５】
３０４．実施形態２８２乃至３０３のいずれかのライブラリーのスクリーニング方法であって、（ａ）スクリーニングする複数のポリペプチドを選択すること、（ｂ）ＦｃＲｎに対する親和性の増加または血清半減期の長期化についてポリペプチド群をスクリーニングすること、および（ｃ）ＦｃＲｎに対する親和性が増加した、または血清半減期が長期化したポリペプチドの配列を決定することを含む、該方法。
【０４７６】
［８  実施例］
本明細書で本発明について概説したが、本発明は以下の実施例の参照することによりより容易に理解されよう。当該実施例は、本発明の特定の態様および実施形態を単に例示する目的で本明細書に含められたものであり、本発明の限定することを意図しない。例えば、本明細書に開示される特定のコンストラクトと実験計画は、適切な機能を確認するための典型的なツールと方法を表すものである。よって、開示された特定のコンストラクトと実験の実施計画のいずれも本出願発明の範囲内で置き換え可能であることは容易に明らかになろう。さらに、使用される特定の器材、試薬、サイズ、メーカーなどの具体的なリストまたは説明は、特に断りがない限り本発明を限定するものとみなされないことは理解されよう。同様に機能する他の機材や試薬に置き換えが可能であることも理解されよう。
【０４７７】
［８．１  実施例１：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のドメインＩＩＩへのヒトＦｃＲｎの結合の動態と親和性の解析］
この実施例では、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、ヒトＦｃＲｎに対するＨＳＡのドメインＩＩＩの会合定数、解離定数、および平衡親和性定数を測定する。ドメインＩＩＩ（「ＤＩＩＩ」とも略される）は、ヒト血清アルブミンタンパク質のアミノ酸残基３８１−５８５にわたる断片である。ドメインＩＩＩのアミノ酸配列は、配列番号１に記載されている。完全長成熟ＨＳＡのアミノ酸配列は、配列番号２に記載されている。これらの実験で使用するために、ドメインＩＩＩをピキアパストリスから発現させ精製した。
【０４７８】
［８．１．１  組換えタンパク質の発現と精製］
ドメインＩＩＩ遺伝子をコードしている組換えプラスミドを、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙより入手した。ドメインＩＩＩ遺伝子を、業者から提供されたベクターから制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔｌを用いて切除し、ｐＰＩＣＺ−ａｌｐｈａ−Ａピキア発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ｖ１９５−２０）にクローン化した。メーカーの説明書で概説された方法で、組換え型ドメインＩＩＩタンパク質を発現させた。組換え型ドメインＩＩＩタンパク質を培地に分泌させて、、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｃａｔａｌｏｇ，ｎｏ．１７  ５１９７  ０１）製のＨｉ  Ｔｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム上で、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製した。簡単に説明すると、培地の塩分とｐＨは、１．５Ｍ硫酸アンモニウムと５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に最初に調節した。培地をろ過し、ブチルセファロースカラム上に通し、結合したドメインＩＩＩを、低塩ｐＨ７．０リン酸ナトリウム緩衝液を用いて溶離した。精製されたタンパク質の画分を、５０℃に維持された循環水ジャケットを備えたＨｙｄｒｏｘｙａｌｏｘｙｐｓｏｐｙｌ  Ｄｅｘｔｒａｎ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．Ｈ６２５８）カラムに通すことによって脱脂した。クーマシー青染色（図１Ａ）による４−１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって視覚化したとき、脱脂形態とと非脱脂形態のそれぞれの純度は９９％であった。タンパク質濃度は、Ａ２８０で測定した。精製されたドメインＩＩＩの適当な折畳みは、以前に発表された測定（例えば、Ｇｉａｎｃｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０（１９９７）１９３−２０４）と強く相関してる近ＵＶ−ＣＤと遠ＵＶ−ＣＤ測定によって確認した。
【０４７９】
［８．１．２  動態の測定］
平衡定数、会合定数、および解離定数を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００測定器（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で２５℃で測定し、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００評価用ソフトウェアｖ１．１（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてデータを解析した。ドメインＩＩＩの非脱脂形態と脱脂形態の両方は、標準的なアミン結合（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２００２）によって、ＣＭ４（カタログ番号ＢＲ−１００５−３９）またはＣＭ５（カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）チップの上に、それぞれ結合密度１０１６ＲＵおよび１８４ＲＵで共有結合で固定された。フローセルの１つは、ブランク対照となるタンパク質なしの同一の固定化プロトコルを使用して模擬固定化された。注入物はすべてｐＨ５．５、５０ｍＭリン酸塩および１５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液で作られ、チップ表面はｐＨ７．４リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で注入と注入の間に再生させた。一回の実験で会合定数（ｋｏｎ）、解離定数（ｋ０ｆｆ）と平衡解離定数（ＫＤ）を測定するために、漸増濃度のヒトＦｃＲｎ（３９ｎＭ−４０μＭ）を、固定化されたドメインＩＩＩタンパク質上に５０μＬ／分で注入した（図１Ｂ左パネル）。結合が平衡に達するようにし、曲線の会合フェーズ（４分）および解離フェーズ（１分）の両方を１：１のラングミュアモデルに同時にフィッティングすることによって動態定数ＫｏｎおよびＫｏｆｆを導出した。ＫＤを平衡での検体濃度に対する結合応答のプロットを、非線形回帰分析を用いて、定常状態親和性モデルに当てはめることにより導出した。ドメインＩＩＩの非脱脂形態と脱脂形態の両方は、類似した結合センサーグラムおよびＲｅｑ−リガンド濃度のプロットを示した。
【０４８０】
ドメインＩＩＩとＦｃＲｎとの相互作用は、急速な会合（ｋｏｎ≒７ｅ３）と解離（ｋ０ｆｆ≒４ｅ−２）の動態を示す（表１）。ドメインＩＩＩに対するＦｃＲｎのＫＤ値は５−８μＭであって、これは完全長ＨＳＡのそれよりおよそ７倍大きい（例えば、解離定数がより大きい）（表１参照）。このＫＤの差は、ＨＳＡと比較してドメインＩＩＩに対するｋｏｆｆがより大きく、両分子に対するｋｏｎは同程度であることに主に起因している。ｋｏｎおよびｋｏｆｆに由来するＫＤは、実験的に得られた値に概ね一致しており、これは動態測定の確実さの根拠となる。さらに、可変カルボキシ部分を有する２種類の異なるセンサーチップ（ＣＭ４およびＣＭ５）から類似の親和性が得られた。動態の定数および平衡定数は、ドメインＩＩＩの脱脂形態と非脱脂形態の間で同程度であるが、このことは、脂質分子がＦｃＲｎがドメインIIIに結合するのを媒介もしくは促進しないことを示唆している。
【０４８１】
表１：この表は、ＳＰＲで導出されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のドメインＩＩＩに対するヒトＦｃＲｎの結合の動態および平衡定数と、公表されている完全長ＨＳＡの動態の定数との比較（下段パネル）とを示す。
【表１】
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【０４８２】
［８．２  実施例２：完全長ＨＳＡまたはドメインＩＩＩのみがヒトＩｇＧのＦｃＲｎに対する親和性を増加させる］
この実験は、治療用タンパク質または抗体またはその変異形にＨＳＡのドメインＩＩＩを融合させることにより、相互作用のｐＨ依存性に影響を与えることなく、酸性ｐＨでのＦｃＲｎに対する治療用タンパク質／抗体の親和性が高められたことを立証した。ｐＨ５．５におけるこのＦｃＲｎに対する親和性の増加は、血清半減期の長期化（例えば、生体内での、または適当なモデル系での寿命の長期化）に移行する傾向がある。治療用タンパク質に融合されたドメインＩＩＩを含むＨＳＡ部分の薬動力学的半減期測定を、例えば、ヒトＦｃＲｎ遺伝子（ただし、ネズミＦｃＲｎを含まない）の単一コピーを発現するトランスジェニックマウスで実行し、野生型または変異形ドメインＩＩＩを含む部分との融合の半減期に対する効果を評価し得る。
【０４８３】
［８．２．１  コンストラクトの設計］
代表的なタンパク質として、ヒトＩｇＧ１を用いて、ＩｇＧ単独とＨＳＡまたはドメインＩＩＩと融合したＩｇＧとの間でのＦｃＲｎ親和性を比較した。ＨＳＡまたはドメインＩＩＩは、反復単位Ｇｌｙ−  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを４つ含むリンカーを介してヒトＩｇＧ１重鎖のＣ末端に融合させた（図２Ａ）。両リガンドがそれぞれの結合部位を同時に結合可能となる、ＦｃＲｎ上でのＩｇＧ結合部位とＨＳＡ結合部位との間の距離に基づいて、リンカーの長さを設計した。ＨＳＡおよびドメインＩＩＩと融合した、天然ＩｇＧと比較して１０倍高いＦｃＲｎに対する親和性を示す以前に発表された高親和性ＩｇＧ変異形（ＩｇＧ−ＹＴＥ、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：５１７１−５１８０参照）も、同様の方式で作製した。従って、以下のコンストラクトを作製し使用した：
ＩｇＧ
ＩｇＧ（ＹＴＥ）
ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）４−ＨＳＡ
ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）４−ドメインＩＩＩ
ＩｇＧ（ＹＴＥ）−（Ｇ４Ｓ）４−ＨＳＡ
ＩｇＧ（ＹＴＥ）−（Ｇ４Ｓ）４−ドメインＩＩＩ。
【０４８４】
［８．２．２  精製と特性化］
概略を説明すると、全部で６つのコンストラクトを発現ベクターにクローン化し、２９３Ｆ細胞（ＧＩＢＣＯ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ７９００７）における一時的発現によってタンパク質を精製した。ＩｇＧ１と培地に分泌された融合タンパク質を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＨｉＴｒａｐ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティーカラム（ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．１７−０４０３−０３）を使用して精製した。精製されたタンパク質を、還元条件および非還元条件の両方でＳＤＳ  ＰＡＧＥによって解析し、クーマシー染色で可視化したとき９９％の純度を得た（図２Ｂ）。
【０４８５】
ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）４−ＨＳＡ融合タンパク質の推定分子量は２８４キロダルトン（ｋＤａ）であり、ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）４−ドメインＩＩＩのそれは１９６ＫＤａである。測定された分子量は、これらの推定値と非常によい相関を示した。これらの融合タンパクが、その大きいサイズのため、または改変された生理化学的性質のために凝集体を形成するか否かを評価するため、その融合タンパク質を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２００シリーズＳＥＣ用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって解析した（図２Ｃ）。ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）４−ＨＳＡおよびＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）４−ドメインＩＩＩの両方は、Ａ２８０−持続時間（分）図上でモノマーに対応する１つのピークを示し、このことは、融合タンパク質が、測定可能な範囲で凝集体形成をしないことを示している。ＩｇＧ−ＹＴＥ変異形に対する融合タンパク質のＳＥＣプロファイルは、ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）４−ＨＳＡまたはＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）４−ＨＳＡキメラタンパク質と区別がつかなかった。
【０４８６】
［８．２．３  平衡結合定数（ＫＤ）の測定］
融合タンパク質に対するヒトＦｃＲｎの親和性（ＫＤ）を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００器具（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で測定した。概説すると、ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）４−ドメインＩＩＩ、ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）４−ＨＳＡ、ＩｇＧ−ＹＴＥ、ＩｇＧ−ＹＴＥ−（Ｇ４Ｓ）４−ドメインＩＩＩ、およびＩｇＧ−ＹＴＥ−（Ｇ４Ｓ）４−ＨＳＡを、２つのＳｅｒｉｅｓ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の別々のフローセルの上に、メーカーの説明書に概説された標準なアミノカップリング化学反応を用いて高密度で固定化した。最終的な表面ＩｇＧ密度は、それぞれ５１１６ＲＵ、５２５８ＲＵ、６０９７ＲＵ、５２５６ＲＵ、５５６１ＲＵ、および５５３１ＲＵであった。同一の固定化プロトコルを用いてタンパクのない基準フローセルも各センサーチップ上に準備した。ｐＨ５．５の、５０ｍＭのＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中の５．８６ｎＭ〜３０００ｎＭにわたるＦｃＲｎの二倍段階希釈系列を、結合されたタンパク質および基準細胞表面の両方の上に５μＬ／分で注入した。結合データを５０分間収集し、その後ｐＨ７．４の、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝食塩水の６０秒注入を複数回行うことにより再生した。各注入に対する平衡（Ｒｅｑ）時の結合反応を濃度に対してプロットし、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００評価用祖父とｖ１．１（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて定常状態親和性モデルに当てはめ、平衡結合定数ＫＤを導出した。ＩｇＧ−ＹＴＥ変異形および対応する融合タンパク質のＫＤ値も同様の方法で算出した（データは示さず）。
【０４８７】
ＩｇＧ単独のＫＤが１．５１μＭであるのに対して、ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）４−ＨＳＡのＫＤは１８３ｎＭであり、ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）４−ドメインＩＩＩのそれは３０５ｎＭであり、このことは、ＩｇＧにＨＳＡまたはドメインＩＩＩを融合するとＦｃＲｎ親和性がそれぞれ１０倍および５倍増加することを意味する（表２）。ＹＴＥ変異形についても同様に顕著さは低いが類似した傾向が観察され、ＩｇＧ−ＹＴＥと比較して、ＩｇＧ−ＹＴＥ−（Ｇ４Ｓ）４−ＨＳＡが３．８倍（４２．５ｎＭ）の親和性の改善を示し、ＩｇＧ−ＹＴＥ−（Ｇ４Ｓ）４−ドメインＩＩＩは２．５倍（６５．１ｎＭ）の親和性の改善を示している（表２）。
【０４８８】
表２：この表は、ＳＰＲで導出された、ｐＨ５．５での、ＨＳＡに融合されたＩｇＧまたはドメインＩＩＩに融合されたＩｇＧ、およびそれらのＹＥＴ変異形アナログに対するヒトＦｃＲｎの結合の平衡定数を示す。
【表２】
2013519392.tif 000003
【０４８９】
しかし、ｐＨ５．５での親和性の改善は、中性ｐＨでのＦｃＲｎの結合に影響しない。このことは、同じ固定化表面の上にｐＨ７．２で１μＭのＦｃＲｎを注入することによって試験した。融合タンパク質結合表面のいずれと結合しているＦｃＲｎにおいてもＩｇＧ／ＩｇＧ−ＹＴＥ対照比較した測定可能な相違は検出されなかった（データは示さず）。
【０４９０】
酸性ｐＨ（約５．５〜６．０）でのＨＳＡ融合物のＦｃＲｎへの結合、および中性ｐＨ（約７．４）での解離は、そのような特性が生体内結合を模したものであるので生体内での有効性と相関する。したがって、好ましいＨＳＡ変異形は、（ｉ）天然のＨＳＡと比較した向上した親和性を有する変異形または天然ＨＳＡを含むコンジュゲート、および（ｉｉ）酸性ｐＨにおいて向上した親和性が観察される変異形である。さらに、中性ｐＨでのＦｃＲｎに対する増加した結合親和性を有する変異形は有効性を損ない、酸性ｐＨでの向上した親和性の有益な効果が低下させ得る。
【０４９１】
［８．３  実施例３：完全長ＨＳＡとの融合は、ヒトＩｇＧの血清中持続性を向上させる］
この実験は、抗体とのＨＳＡの融合が抗体の血清半減期を長期化させることを証明した。図７に示すように、実施例１に記載したＩｇＧ−ＨＳＡ融合体の血清中持続性は、ＩｇＧ単独と比較して増加した。血清半減期の長期化は、ＩｇＧ−ＹＴＥ変異形にみられた程度に匹敵するものであった。しかしこの実験では、ＨＳＡのＩｇＧ−ＹＴＥ変異形への付加により、ＹＴＥ単体と比較した有意な長期化がみられなかった。
【０４９２】
ＰＫ試験を、マウス新生児Ｆｃ受容体（ｎｉＦｃＲｎ）をヒトＦｃＲｎ（ＨｕＦｃＲｎ）の単一コピーと置換した４−５ヶ月のヒトＦｃＲｎＣ５７ＢＬ／６トランスジェニックマウス（ＪＡＸ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて行った。このマウスに、ｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水で希釈した適切なタンパク質を１５ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈を通して注射する。すべての動物は、注射の１時間後に眼窩後網状組織から採血し、血清（７５μｌ）を回収して、血中に実際に注射された量を決定する。次に注射の２４、７２、１６８と２４０時間後に血清試料を回収し、−８０℃で保存する。血清中に残存するタンパク質の量をＥＬＩＳＡで解析する。概説すると、抗ＨＳＡコーティングされたプレートを用いて、各種ＩｇＧ融合コンストラクトを捕捉し、抗κ検出抗体を用いて検出する。ＩｇＧとＹＴＥコンストラクトについては、抗原コートプレートを用いてＩｇＧを捕捉し、抗重鎖検出抗体を用いて検出する。血清中に残存するタンパク質の％を、注射量（１時間のサンプル中）に対する割合として時間に対してプロットする。
【０４９３】
［８．４  実施例４：ＨＳＡ上のＦｃＲｎに対するエピトープは立体構造である］
抗β２マイクログロブリン抗体を用いた免疫ブロッティングによって可視化したとき、ヒトＦｃＲｎは天然ＨＳＡに対し、濃度依存的によく結合することが観察された。しかし、変性ＨＳＡを用いて類似した実験条件の下で試験しても、類似の結果が得られなかった。
【０４９４】
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．Ａ−８７６３）、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ；ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．１−４５０６）を、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）上に、１０ｍｇタンパク質／ｍｌセファロースで固定化した。ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂの反応性基を、０．１ＭＴｒｉｚｍａベース、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８を用いてブロックすることによってセファロース−トリスを作製する。ＨＳＡ、ｈＩｇＧ、またはトリスに結合したセファロースビーズ（２０μｌのビーズが約１８０μｇの結合されたタンパク質に相当）を、還元条件（１％２メルカプトエタノール）下、または非還元条件下、または未処理の状態で、ＳＤＳ含有サンプル緩衝液（６０ｍＭのトリス、ｐＨ６．８、２．３％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）の存在下で１０分間煮沸した。このように処理されたタンパク質またはトリス結合ビーズを、ｐＨ５．５で５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１％アイシングラスを含んだ１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ＢＩＯＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，カタログ番号ＰＦＧＰ−１０００−０１）で洗浄し、次に２００μｌの様々な濃度のヒトＦｃＲｎ（０〜２０μｇ）とともに、ｐＨ５．５緩衝液中で室温で２時間インキュベートした。ｐＨ５．５の緩衝液を用いて未結合タンパク質を洗い流した。結合したタンパク質を、１％の２メルカプトエタノールを含むＳＤＳ含有サンプル緩衝液とともに煮沸することによって溶出させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で、その後抗２マイクログロブリン抗体（Ａｂｅａｍ  ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．Ａｂ６６０８）で免疫ブロッティングを行って解析した。
【０４９５】
セファロース−ＨＳＡへのヒトＦｃＲｎの結合は、全てのＦｃＲｎ濃度範囲にわたって天然のＨＳＡに対して最大化した。しかし、ＨＳＡが変性したとき、還元条件および非還元条件の両方で結合は大幅に低減した。このことは、ＦｃＲｎに対するＨＳＡ上のエピトープは立体構造エピトープであることを示唆している（図４）。予想されるように、セファロース−ＩｇＧはヒトＦｃＲｎに結合し、トリスでブロックされたビーズはあらゆる条件下でＦｃＲｎ結合した。
【０４９６】
［８．５  実施例５：ＨＳＡおよびドメインＩＩＩは酵母細胞の表面にディスプレイされ得、該ディスプレイされたタンパク質はＦｃＲｎ結合能力を保持する］
この実施例は、ＨＳＡおよびドメインＩＩＩの両方が酵母細胞上でうまく発現され得ること、およびこれらのディスプレイされたタンパク質が、酸性ｐＨで行われる改変フローサイトメトリーで評価したときｐＨ依存的にＦｖＲｎに結合することを立証する。このように、酵母細胞上での発現は、ドメインＩＩＩに変異を含むコンストラクト（例えば、ドメインＩＩＩ単体、完全長ＨＳＡ、少なくともドメインＩＩＩを含む切断型ＨＳＡまたはキメラポリペプチド）をスクリーニングし、そのコンストラクトが（ｉ）ＦｃＲｎに結合する能力、（ｉｉ）例えば非変異形コンストラクトと比較して高い親和性をもってＦｃＲｎに結合する能力を評価するための一方法を提供する。
【０４９７】
［８．５．１  酵母細胞表面ディスプレイ］
ＨＳＡ、ドメインＩＩＩまたは一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃｆｖ）をｐＹＤＩ酵母ディスプレイベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号Ｖ８３５−０１）にクローン化し、酵母細胞表面上での提示のためにＳ．セレビシエに形質転換した。ｐＹＤＩは、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下で、Ｓ．セレビシエタンパク質Ａｇａ２ｐとのＣ末端融合物として対象のタンパク質をディスプレイする。すべての実験手順は、供給元のマニュアルに記載されているように行った。形質転換された細胞は、栄養要求性選択マーカー、ウラシルおよびトリプトファンを用いて選択し、適切な選択培地（Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．，Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．Ｃ８１４０）において培養した。培養物は、Ａｇａ２ｐ融合タンパク質の発現ができるように最大４８時間ガラクトースで誘導した。細胞は、０、２４、４８時間目に試料採取した。細胞試料を洗浄し、０．１％の魚ゼラチンを含んでいるＰＢＳ（ｐＨ７．２）でブロックし、ＦＩＴＣコンジュゲートウサギポリクローナル抗ＨＳＡ抗体（Ａｂｅａｍ  Ｉｎｃ．，Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．ＡＢ３４６６９）で染色し、フローサイトメトリーで解析した。
【０４９８】
ＨＳＡまたはドメインＩＩＩの細胞表面発現は、０時間目には観察されなかったが、２４時間目には酵母細胞上で量たんぱく質の発現が観察された。そのような発現は、インキュベーション後４８時間維持された。発現は、ポジティブＦＩＴＣ染色によって視覚化させた。図５Ａは、ＨＳＡおよびドメインＩＩＩ両方が酵母細胞の表面上にうまく発現させられ得ることを示す。ｓｃｆｖで形質転換された細胞は、予想通り抗ＨＳＡで染色しなかった（陰性であった）。このように、ｓｃｆｖで形質転換された細胞は、陰性対照として機能した。
【０４９９】
［８．５．２  表面に発現されたＨＳＡまたはドメインＩＩＩのＦｃＲｎ結合能力］
ＨＳＡ、ドメインＩＩＩまたはｓｃｆｖを発現し、ガラクトースで４８時間誘導された酵母細胞を、ｐＨ５．５、５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％魚ゼラチンを含む１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ＦＡＣＳ緩衝液とも称する）で１時間ブロックした。次にその細胞をビオチン化されたＦｃＲｎ（７０μＭ）とともにｐＨ５．５のリン酸緩衝液中でインキュベートし、結合されたＦｃＲｎをストレプトアビジンフィコエリトリン（ＰＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いて可視化した。そのように染色された細胞を、通常使用されるＰＢＳの代わりに１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を用いたフローサイトメトリーで解析した。
【０５００】
ｓｃｆｖの場合と比較したヒストグラムのシフト（図５Ｂ）から明らかなように、ＨＳＡおよびドメインＩＩＩを発現する細胞は両方ともＰＥ染色で陽性であったが、陰性対照ｓｃｆｖ発現細胞は陽性とならなかった。このことは、酵母細胞表面上に発現されるＨＳＡおよびドメインＩＩＩがＦｃＲｎ結合能力を保持しており、したがって機能的であることを示している。別の実験では、ＦｃＲｎとの結合性の有無について低ｐＨのフローサイトメトリーで細胞に同様の処置を施し、高スループットのサンプリング技術ＨｙｐｅｒＣｙｔ（登録商標）システム（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてアッセイし、同様の結果を得た。
【０５０１】
［８．６  実施例６：高多様性のライブラリーを作製するためのＯｒｉＰを含むアデノウイルス哺乳動物細胞表面ディスプレイベクター］
ｓｃＦｖ−Ｆｃタンパク質の表面ディスプレイのためのグリコシルホスチファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを用いた哺乳動物表面ディスプレイライブラリーを、ｐＥＮＤｉｓｐｌａｙと表記されるｓｃＦｖ−Ｆｃ発現カセットを含むように遺伝子組換えされたＧａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリベクターにおいて作製した（図８Ａ参照）。異なるｓｃＦｖ配列のライブラリーが、Ｓｆｉ／Ｎｏｔｌ部位に容易に挿入される。ｐＥＮＤｉｓｐｌａｙベクターにおけるライブラリーを、メーカーによりｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ４９４−２０）と組合せ、アデノウイルス発現ライブラリーを生成し、約５×１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）が得られた。アデノウイルスを生成するために、トランスにおいて組換えアデノウイルスを生成するのに必要なＥ１タンパク質（Ｅ１ａおよびＥ１ｂ）を供給するＥ１遺伝子の安定して統合されたコピーを含む、２９３Ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ７０５０７）に、左右の逆位末端配列（ＩＴＲ）を露出させるべく線形化されたアデノウイルス発現ライブラリーをトランスフェクトする。この線形化されたアデノウイルスライブラリで直接トランスフェクトした２９３Ａ細胞の少なくとも５０％がＦＡＣＳ解析により、それらの表面に抗体を表示したことが見出された。しかし、アデノウイルスの生産のために線形化されたアデノウイルスライブラリーを２９３Ａ細胞にトランスフェクトしたとき、１１０ｍｍ（直径）ディッシュあたり５０個未満のプラークしか得られなかった。アデノウイルスを１０日目に回収し、ウイルスＤＮＡを単離した。ＰＣＲを用いて、ｐＥＮＤｉｓｐｌａｙベクターに再クローン化されたｓｃＦｖコード領域を増幅し、９６コロニーを選択して配列決定した。解析された９６のクローンから１４個のみの独特なＶＨ配列が特定された。プラーク回収の効率が低いのは、線形化したアデノウイルスベクターの分解のためにであり得、このためにアデノウイルスライブラリーの複雑さの有意な減少が生じる。
【０５０２】
エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ−１）は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み、プラスミドなどの核酸を含むＯｒｉＰに結合する。ＥＢＮＡ−１タンパク質（図９Ａ参照）は、核酸を含むＯｒｉＰをＮＬＳを介して核に転位させ、エピソームメンテナンスを向上させるのを補助し得る。維持されたエピソームが、アデノウイルスレスキューに必要であるとは考えられていないが、ＯｒｉＰ配列（図９Ｃ参照）を、ｐＥＮＤｉｓｐｌａｙベクターのａｔｔＬ１配列とａｔｔＬ２配列の間のｓｃＦｖ−Ｆｃカセットの後に導入した。ｐＥＮＤｉｓｐｌａｙ−ＯｒｉＰと称される新しいベクターは、図８Ｂに示す。ｐＥＮＤｉｓｐｌａｙ−ＯｒｉＰにおけるライブラリーを、メーカーによりｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ４９４−２０）と組合せ、〜５×１０６ｃｆｕのアデノウイルス発現ライブラリーを生成した。ｐＥＮＤｉｓｐｌａｙ−ＯｒｉＰベクターから作製されたライブラリーを線形化し、２９３Ｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ６２０−０７）にトランスフェクトした。この細胞は、エスプタイン・バーウイルス核抗原（ＥＢＮＡ−１）およびアデノウイルスＥ１ａタンパク質を安定的に発現し、１１０ｍｍ（直径）のディッシュあたり１００００プラークを十分に超えるプラークが得られた。ウイルスを７日目に回収し、上述のように９６のクローンを解析した。ＯｒｉＰ部位なしの最初のライブラリーから単離された独特のクローンの数が少なかったのに対して、解析された９６のＶＨ配列はすべて独特であった。総じて、これらの結果から、アデノウイルス発現ライブラリーベクターへのＯｒｉＰ配列の付加は、ＥＢＮＡ−１を発現する細胞からのアデノウイルスのレスキューおよびアデノウイルスライブラリーの多様性の両方を大幅に向上させることが明らかとなった。
【０５０３】
ＯｒｉＰ配列（例えば図９Ｃ）のアデノウイルスベクターへの付加は、ＥＢＮＡ−１タンパク質の存在下での宿主細胞からの組み換えアデノウイルス粒子の生成の効率を向上させる。アデノウイルス発現ライブラリーを構築するとき、ウイルス生成の効率が向上することで、失われるクローン数が少なくなることによってライブラリーの多様性／複雑さが維持される。下記の実施例７は、基本的に上記されたようにアデノウイルス発現ベクターにＯｒｉＰ配列を組み入れたＨＳＡドメインＩＩＩ変異形を発現する哺乳動物表面ディスプレイライブラリーの作製とスクリーニングについて詳述している。
【０５０４】
図１０は、対象のタンパク質の発現のための代表的な汎用アデノウイルス発現ベクターの概略図を示す。この例では、Ｅ１および／またはＥ３部分が除去された変異体アデノウイルスゲノムが提供される。ウイルスレスキューのために使用される宿主細胞によって、除去されたウイルス遺伝子がトランスの形態で提供される。この除去により、対象のタンパク質の発現のために使用される宿主細胞でのアデノウイルスの複製が防止される。対象のＤＮＡは、以下に限定されないが、コード配列、、プロモーター配列、終止シグナル、ポリＡ配列などを含む、タンパク質の発現のために必要とされるすべての構成要素を含む。対象のタンパク質は可溶性であり得るか、またはタンパク質を細胞表面に固定する配列（例えば膜貫通領域またはＧＰＩ−アンカーシグナル）を含むものであり得る。ここに例示されるように、アデノウイルスベクターは変異形タンパク質のライブラリーを発現するべく遺伝子改変され得る。図１０に示すアデノウイルス発現ベクターは、その作製のためのＧａｔｅｗａｙ（商標）エントリ、および標的プラスミドから得られるａｔｔ組換え部位の位置を提供する。また、ＥＢＮＡ−１  ＤＮＡの塩基配列が存在する可能性のある位置を１つ示している。他の位置およびベクター構成要素の方向も想定されている。ベクター領域の方向および／または相対位置が様々に変化し得ることは当業者には理解されよう。
【０５０５】
［８．７  実施例７：ＨＳＡおよびドメインＩＩＩのための他のディスプレイプラットフォームの使用］
ファージディスプレイ技術および哺乳動物細胞表面ディスプレイ技術も、ＨＳＡおよびドメインＩＩＩのための潜在的ディスプレイプラットホームとして評価した。細菌細胞の表面においてファージディスプレイプラットホームは、ＨＳＡおよびドメインＩＩＩのいずれも発現しなかったが、これはおそらくこれらの分子の豊富なＳ‐Ｓ結合のためである（データは示さず）。しかし、崩壊促進因子（ＤＡＦ）（例えば、米国特許出願公開２００７／０１１１２６０号に記載の変異体ＤＡＦ）からのグリコシルホスチファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーシグナルを介した２９３Ｆ細胞における一過性表面発現を用いる哺乳動物細胞ディスプレイ系は、ＨＳＡおよびドメインＩＩＩのディスプレイに成功した。ディスプレイされたタンパク質は、ＦｃＲｎ結合能を保持していた（データは示さず）。
【０５０６】
ｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩと表記される別の哺乳動物の発現用コンストラクトも作製した。当該コンストラクトでは、エピトープタグ（例えばＦｌａｇタグ）をそれで二重染色のために付加され、融合タンパク質の柔軟性を高め、ＨＳＡのＦｃＲｎへの結合を促進するべくＨＳＡの５’末端および３’末端の両方にリンカーが付加されていた。このコンストラクトは、一時的なトランスフェクションのために直接使用されるか、またはｐＡｄ−ＨＳＡ−ＧＰＩと表記されるＯｒｉＰ配列も組み込んだアデノウイルスベクターを生成するために使用された。機能的なＨＳＡが、一時的トランスフェクションアッセイ（データは示さず）およびアデノウイルス発現系の利用の両方において、このコンストラクトから哺乳動物の細胞（例えば２９３Ｆ細胞）の表面で発現された。図１１は、抗ＨＳＡで染色された細胞（図１１Ｂ）、または２５μｇ／ｍｌと５μｌ／ｍｌのＦｃＲｎ（それぞれ図１１Ｃおよび図１１Ｄ）のヒストグラムに生ずる変動を示す。このように、ＨＳＡおよびドメインＩＩＩ変異形を発現するため、および（ｉ）ＦｃＲｎに対する結合について、（ｉｉ）例えば非変異形コンストラクトと比較して高い親和性をもってＦｃＲｎに結合する能力について、そのような変異形をスクリーニングためにいくつかの可能な系が存在している。
【０５０７】
ＨＳＡを細胞表面にディスプレイする２９３Ｆ細胞のトランスフェクション：１．５μｇのプラスミドおよび２．２５μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎを１００μｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に別々の試験管中で加え、室温で５分間インキュベートし、次に２つの成分を一緒にした。さらに２０分間の室温でのインキュベーションの後、混合物を、２４穴の深いウェルプレートにおいて１×１０６個細胞／ｍｌの密度で２ｍｌの２３６Ｆ細胞に加えた。トランスフェクトした細胞は、８％のＣＯ２の存在下、２５０ｒｐｍで２４時間増殖させた。
【０５０８】
アデノウイルスベクターの世代と使用：Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ標的ベクターにエントリベクター（ｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩ）におけるＨＳＡを組換えて、アデノウイルス発現ベクターを作製した。概説すると、１５０ｎｇのｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩベクター、３００ｎｇのｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌのＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＴＥ緩衝液を、総量１０μｌの反応混合物に加えた。２５℃で一晩インキュベートした後、２μｌの反応混合物を、メーカーのプロトコルに従って用いて、ワンショットＴｏｐ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。形質転換されたＴＯＰ１０細胞を、アンピシリンプレート上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。１つのコロニーを選択してＬＢ培地に移し、プラスミドを調製した。ＨＳＡ遺伝子を含んでいるアデノウイルス発現ベクターは、アデノウイルスを生成するためのトランスフェクションの前にＰａｃＩで線形化した。アデノウイルスを生成するために、２μｇの線形化したアデノウイルスベクターと６μｌのｌｉｐｏｆｅｃａｔｉｎｅ−２０００を用いて２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７日後に、凍結（−８０℃）と解凍（３７℃）を２−３回交互に繰り返すことによって、トランスフェクトした細胞からアデノウイルスを放出させた。細胞片を１０分間３０００ｒｐｍで遠心沈降することによって除去し、アデノウイルスを含有する上清を新しい試験管にアリコート化し、−８０℃で保存した。ウイルス力価は、Ａｄｅｎｏ−ＸＴＭ  ｒａｐｉｄ  ｔｉｔｅｒ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：ＰＴ３６５１−２）をメーカーの説明書に従って使用することによって決定した。そのアデノウイルスを、ＨＳＡコンストラクトの発現のため１のＭＯＩで使用した。
【０５０９】
［８．８  実施例８：ＦｃＲｎ結合エピトープの同定のためのＤＩＩＩ上の表面露出ループのアラニンスキャニング突然変異誘発］
この実施例は、ＨＳＡへのＦｃＲｎの結合を媒介する際にドメインＩＩＩ上の表面露出ループの果たす役割について記載する。
【０５１０】
ドメインＩＩＩは２０５個のアミノ酸残基からなり、９個のループによってリンクされた１０個のらせん構造をコードしており、６個のジスルフィド結合によって安定化されている（Ｓｕｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２：４３９−４６  ａｎｄ  ＰＤＢ：１ＢＭ０）。これらのループを含むアミノ酸残基の位置、ならびに各ループの長さを以下に記載する。アミノ酸残基の番号付けは、完全長成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号２）のこれらのループにおける位置に基づく。
【０５１１】
ループ１：残基３９８〜４００＝３アミノ酸
ループ２：残基４１５〜４１９＝５アミノ酸
ループ３：残基４３９〜４４３＝５アミノ酸
ループ４：残基４６８〜４７０＝３アミノ酸
ループ５：残基４８０〜４８２＝３アミノ酸
ループ６：残基４９２〜５０９＝１８アミノ酸
ループ７：残基５１６〜５１７＝２アミノ酸
ループ８：残基５３７〜５４１＝５アミノ酸
ループ９：残基５６１〜５６４＝４アミノ酸
ループ２、３、６、８、および９は、溶液が接触可能であり、分子表面に露出されている（Ｓｕｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．ｉｂｉｄ，ａｎｄ  ＰＤＢ：１ＢＭ０）。
【０５１２】
特定の実施形態において、各表面接触可能ループにおけるアミノ酸は１つおきにアラニンに変異され（変異されないプロリンおよびシステインを除く）、１つの組は奇数番目の残基が変異され、別の組では偶数番目の残基が変異される。実験計画に合わせてコンストラクトが１つだけしか必要とならないループ９を除き、各種ループにつきそのような２種の変異体の組が作製される。全部で９のそのようなコンストラクトを細胞表面ディスプレイのためのベクター（例えば、ｐＹＤＩ酵母ディスプレイベクター）に形成し、ＦｃＲｎ結合能力について評価する。変異形は、本明細書に記載する標準的な試験管内アッセイ（例えばフローサイトメトリー）を用いて評価し得る。ＦｃＲｎに対する向上した親和性を示す変異形を特定する。各変異形について、ＦｃＲｎに対する向上した親和性が酸性ｐＨにおいて生じ中性ｐＨにおいては生じないか、そうでないかを判定するべくスクリーニングしてもよい。酸性ｐＨにおいて生じ中性ｐＨでは生じないＦｃＲｎに対する向上した親和性は、（ｉ）変異形ドメインＩＩＩコンストラクト単独、（ｉｉ）完全長ＨＳＡのコンテキストで提示される変異形ドメインＩＩＩコンストラクト、または（ｉｉｉ）少なくともドメインＩＩＩを含む切断型ＨＳＡまたはキメラポリペプチドのコンテキストで提示される変異形ドメインＩＩＩコンストラクトに対して試験し得る。これらのものは、変異なしの野生型ドメインＩＩＩ、野生型完全長ＨＳＡ、またはキメラポリペプチドと比較される。
【０５１３】
特定の実施例において、上述のスクリーニングから得られた情報により、ＦｃＲｎ結合能力を維持（またはさらに向上）させつつ、変異を受ける表面接触可能ループにおける残基群が特定される。当該特定された位置が他の２０種類のアミノ酸のそれぞれに変異した一連の変異形の組を作製し、そのような変異形もスクリーニングする。その後、２箇所以上の位置での変位を含むさらなる変異形を作製し、スクリーニングする。
【０５１４】
特定の実施例においては、変異形のライブラリーを作成し、評価する。
【０５１５】
［８．９  実施例９：保存された、表面露出残基のアラニンスキャニング突然変異誘発］
１３種の異なる動物種の間で保存されるドメインＩＩＩ中の表面接触可能アミノ酸残基を、アミノ酸配列アライメントによって特定した。当該保存された残基を、ＦｃＲｎ結合におけるそれらの役割を決定するべく単独でアラニンに変異させる。
【０５１６】
ＨＳＡのドメインＩＩＩアミノ酸配列を、ネズミ、マウス、ウシ、イヌ、ウサギ、ブタ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコとウマを含む１２の異なる種に由来する血清アルブミンドメインＩＩＩと比較し、これらの全部の種の間に保存される残基を特定した（図６Ａ−図６Ｄ）。ニワトリのＨＳＡは哺乳動物のＨＳＡタンパク質とは明白に異なることから、哺乳動物種のみの第２のアライメント（図６Ｅ−図６Ｈ）が提供される。ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング、およびＳＰＲによって（データは示さず）、ブタ、ネズミ、マウス、イヌ、ヒツジ、ウサギ、およびウシに由来する血清アルブミンはヒトＦｃＲｎに結合することが既に分かっている。別の分析において、ドメインＩＩＩの表面露出残基を、インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｃｕｒｉｅ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ｇｅｔａｒｅａ．ｈｔｍｌ）で入手可能なＧＥＴ  ＡＲＥＡ１．０βソフトウェアを用いて特定した。このソフトウェアは個々の原子の接触可能表面積とそれらの勾配を計算し、各アミノ酸残基について、それぞれ接触不可能および接触可能を表す「ｉ」または「ｏ］として表される表面接触可能性の尤度を付与する（表３）。前記ソフトウェアで計算され、ＨＳＡ結晶構造のマニュアルの検査によって確認される、これらの全部の種の間で保存されかつ表面露出されるアミノ酸残基を特定した（表３でボックスで囲われた部分）。
【０５１７】
このように特定された全１８個のアミノ酸残基を単独でアラニンに変異させ、細胞表面ディスプレイ（例えば、ｐＹＤ１酵母ディスプレー系）を用いてＦｃＲｎへの結合性への影響について評価する。ドメインＩＩＩ変異を導入し、ドメインＩＩＩ単独、完全長ＨＳＡタンパク質、少なくともドメインＩＩＩを含む切断型ＨＳＡ、またはキメラポリペプチドのなかの１以上のコンテキストにおいてスクリーニングを行う。保存され、表面に露出されたシステインおよびプロリンは、この解析には含めない。
【０５１８】
別の実施例では、全１８個のアミノ酸残基（またはアラニン実験の結果、当該特定の位置は置換を許容できないことが判明した場合は、全１８個より少ない数の）を、単独で他の１９種のアミノ酸残基のそれぞれに変異させ、ｐＹＤ１酵母ディスプレイ系（または他のディスプレイ系）を用いてＦｃＲｎへの結合性への影響について評価する。
【０５１９】
別の実施例では、複数の変異の組合せを含む変異形を構築し、評価する。変異形は、本出願に記載する標準的な試験管内アッセイ（例えばフローサイトメトリー）を用いて評価し得る。ＦｃＲｎに対する向上した親和性を示す変異形を特定する。各変異形について、ＦｃＲｎに対する向上した親和性が酸性ｐＨにおいて生じ中性ｐＨにおいては生じないか、そうでないかを判定するべくスクリーニングしてもよい。酸性ｐＨにおいて生じ中性ｐＨでは生じないＦｃＲｎに対する向上した親和性は、（ｉ）変異形ドメインＩＩＩコンストラクト単独、（ｉｉ）完全長ＨＳＡのコンテキストで提示される変異形ドメインＩＩＩコンストラクト、または（ｉｉｉ）少なくともドメインＩＩＩを含む切断型ＨＳＡまたはキメラポリペプチドのコンテキストで提示される変異形ドメインコンストラクトに対して試験し得る。これらのものは、変異なしの野生型ドメインＩＩＩ、野生型完全長ＨＳＡ、またはキメラポリペプチドと比較される。
【０５２０】
表３：この表は、ドメインＩＩＩにおける全アミノ酸についての溶液接触可能性パラメータを表示する。図６Ａ−図６Ｄにおいてアライメントをとられた全ての種の間で保存される残基（配列番号２に示す成熟完全長ＨＳＡ配列での位置に基づいて番号付けされている）は太字で示され、かつ（＃＃）が付記され、アライメントをとられた全ての種の間で保存され、かつ表面接触可能な残基はボックスで囲まれている。ｈｔｔｐ：  ／／ｃｕｒｉｅ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ｇｅｔａｒｅａ．ｈｔｍｌ。さらに、図６Ｅ−図６Ｈにおいてアライメントをとられたニワトリを除く全ての種（の間で保存される残基は、（＠＠）が付記される。（ｉ）および（ｏ）が付記された残基は、それぞれ表面接触不可能および表面接触可能なものであることを示す。
【表３】
2013519392.tif 000004
2013519392.tif 000005
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【０５２１】
8.10 実施例10:ドメイン IIIの各残基を可能性のある全てのアミノ酸に変異させ単一アミノ酸変異体のライブラリーを作製する
システイン及びプロリンを除く、ドメイン IIIの全てのアミノ酸を20種のアミノ酸全てに変異させ (すなわち、野生型アミノ酸及び全19個の非野生型アミノ酸)、そして個々の変異体がそれぞれ一つの位置においてのみ単一突然変異を有するように、変異体のライブラリーを構築する。205個のアミノ酸の全長が、ライブラリーの構築に用いられる。したがって、184個の残基がそれぞれ変異して、全部で3496にもなるライブラリーの多様性を生じる。ドメイン III の変異は以下の一以上に即して導入及びスクリーニングされる：ドメイン III単独、完全長HASタンパク質、切断型HAS又は少なくともドメイン IIIを含むキメラタンパク質。標準的な変異導入法を用いて、ドメイン III変異体のライブラリーを作製することができる。任意に、又は代替的に、ドメイン III変異体のライブラリーは、Geneart AG, Germanyなどの商業施設によって作製される。変異体のライブラリーを、ディスプレイベクター（例えば、pYDl酵母ディスプレイベクターや上記哺乳動物ディスプレイベクターpEN-HSA-GPI（これは組換えアデノウイルスの生成を高めるためのOriP配列を含む（ OriPを含む一般的なエントリーベクターの概略図を示す図１０を参照のこと)）にクローニングして、そして本願に記載される標準的なin vitroアッセイ（例えば、フローサイトメトリー）を使用して、FcRn結合能についてスクリーニングする。FcRnに対する親和性が改善された変異体を同定する。また、各変異体を、FcRnに対する親和性が酸性pHにおいてのみ改善され、中和性pHにおいては改善されないかを判定するためにスクリーニングすることができる。FcRnに対する親和性が酸性pHにおいてのみ改善され、中和性pHにおいては改善されないことを、 (i) 変異型ドメイン IIIコンストラクト単独; (ii) 完全長HASのコンテキストで提示される変異型ドメイン IIIコンストラクト; 又は (iii)キメラポリペプチドとの関連において、試験する。上記のものを、野生型ドメイン III、野生型全長HAS、又は変異を有さないキメラポリペプチドと比較する。この実験計画によりFcRnに対する親和性を改善する変異と共に、結合エピトープを同定することができる。
【０５２２】
上述のごとく、６×１０ｅ４の形質転換体を有する合成ドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）ライブラリーが生成された。個々の変異体が単一位置のみでの単一変異をゆするようにライブラリーを設計したが、二重または場合によっては三重の変異体が多数生成された。合成ＤＩＩＩライブラリーをＰＣＲ増幅し、ＤＩおよびＤＩＩと組み合わせて、オーバーラップＰＣＲによって完全長ＨＳＡライブラリーを形成した。ＰＣＲ産物をＳｆｉＩおよびおＥｃｏＲＩで消化して、同様に消化されたベクターｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩ、すなわち上述のようにＯｒｉＰ配列を含む改善型哺乳動物ディスプレイベクターＧａｔｅｗａｙ（商標）エントリベクタークローン化した（例えば、図８Ｂおよび図１０参照）。ＤＩＩＩライブラリーを増幅するために使用されたプライマーは、Ｎ末端およびＣ末端に６個の野生型アミノ酸残基を有し、従ってドメインＩＩＩのこれらの１２個のアミノ酸における多様性が除去された。２種のライブラリーをｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩベクターに生成し、１２μｇのＰＡＣ  Ｉ線形化アデノウイルス発現ベクターをライブラリー生成に使用した点を除いて基本的に上述のように対応するアデノウイルスベクターを生成した。各ライブラリーのサイズは（表４）に示す。ｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩライブラリーの多様性を調べ、ライブラリー１では約５０％のクローンが野生型で、ライブラリー２では約３０％のクローンが野生型であった。
【０５２３】
表４：ＤＩＩＩライブラリーのサイズ
【表４】
2013519392.tif 000008
【０５２４】
野生型ＨＡＳ、ＨＳＡ−ＤＩＩＩライブラリー１またはＨＳＡ−ＤＩＩＩライブラリー２を発現するアデノウイルスで感染させた細胞を、基本的に実施例５に記載したように抗−ＨＳＡ−ＦＩＴＣ抗体およびＦｃＲｎビオチン（ＳＡ−ＰＥで検出されるもの）を用いて染色し、後述するようにＦＡＣＳによって解析／スクリーニングした。野生型ＨＳＡおよび２種のライブラリーの発現レベルは同程度であった（図１２Ａ）。１０μｇ／ｍｌのＦｃＲｎで染色したとき、ＨＳＡ−ＤＩＩＩライブラリーを発現する細胞集団のみが、ヒストグラムの変動を示した（図１２Ｂ）。図１３は、対応する二重染色ＦＡＣＳプロファイルを示す。ソーティングから濃縮された細胞集団を回収し、増幅し、ソーティングにより第２ラウンドの濃縮を施すか、または後述するように独立したクローンを単離するために使用した。図１４Ａのヒストグラムに見ることができるように、野生型ＨＡＳ、開始ライブラリー、およびソーティングされたライブラリーの発現レベルは同程度である。しかし、ＦｃＲｎで染色すると、ラウンド１および２のソーティングされたライブラリーは、低濃度、１μｇ／ｍｌおよび場合によっては０．１μｇ／ｍｌで存在するＦｃＲｎに結合し得るＨＳＡ−ＤＩＩＩ変異体を発現する細胞が濃縮されていたことが分かる（図１４Ｂおよび図１４Ｃ）。
【０５２５】
多数の独立したクローンを（下記のように）単離し、ｐＨ７．２で実験を行った点を除いて基本的に実施例２に記載で上述したようにｐＨ依存ＦｃＲｎ結合についてスクリーニングを行った。図１５は、ｐＨ５．５（パネルＡ）およびｐＨ７．２（パネルＢ）における、対照細胞、野生型ＨＳＡ，およびいくつかの代表的なクローンについ標本ヒストグラムを示す。これらのＨＳＡ変異体と野生型ＨＳＡの間の発現レベルは同程度である（図１５Ｃ）。図１６に示すように、ｐＨ依存性結合（すなわち低ｐＨで優先的に結合する）を保持すると特定されたクローンを配列決定し、いくつかのＦｃＲｎ濃度（例えば、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍのＦｃＲｎ−ビオチン）で、野生型ＨＳＡおよび対照細胞とともに追加のＦＡＣＳ解析を施して、ＦｃＲｎに対する変異体の相対的親和性を解析してもよい。濃縮集団からの追加の約１１００個のクローンを配列決定し、その後他の特性化を行った。表５は、ライブラリーから単離および／または配列決定されたクローンにおいて特定されたアミノ酸置換の概要を示す。太字の位置は、置換が約１〜５％のクローンの位置において見出されたことを表し、「選好スポット」と称することができる。太字で下線を付した位置は、置換が５％超のクローンの位置で見出されたことを表し、「ホットスポット」と称することができる。斜体字で列挙されるアミノ酸置換（置換されたＡＡの欄）は二重/３重変異のコンテキストのみで特定された。５以上のクローンで見出されたアミノ酸置換（置換されたアミノ酸（置換されたＡＡ）の欄）は太字で示されている。３以上のクローンで見出された組合せも、かっこ内に示す特定されたクローン数とともに太字で示されている。アミノ酸の番号は、配列番号２の成熟完全長ＨＳＡに基づくものである。同じ位置における同じアミノ酸置換および／または同じ位置における異なるアミノ酸置換を含む複数のクローンが単離されているが（表５参照）、このことはこれらの位置が変異ホットスポットであることを表し得る。
【０５２６】
ＨＳＡの解析された構造上のいくつかの選好スポットおよび／またはホットスポットの位置を図１７に示す。、アミノ酸４０７、４１５、および４６３を除き、ホットスポットおよび選好スポットの大部分は、ループ６および７（それぞれ、残基４９２−５０９および残基５１６−５１８を含む）、らせん構造７および（それぞれ、残基５１０−５１５および残基５１９−５３６を含む）に見出され、図１６において円で囲んで示されている。
【０５２７】
表５：特定されたＤＩＩＩ変異の概要
【表５】
2013519392.tif 000009
2013519392.tif 000010
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【０５２８】
2013519392.tif 000015
【０５２９】
このように特定されるいくつかの変異体を、さらなる分析のため、以下に記載するような部位特異的突然変異誘発によって可溶性タンパク質として作製し、精製した。結合親和性（ｐＨ５．５でのＫＤ）およびｐＨ依存性（７．２ｖｓ５．５）をＰｒｏｔｅＯｎ（後述）および／またはＢＩＡｃｏｒｅ（基本的に前述）によって決定した。表６は、結合試験の概要と、これらの試験のためのタンパク質密度を示す。表６において太字で示すＬ４０７Ｙ／Ｑ５２６Ｔ；Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；Ｉ５２３Ｇ；Ｖ４２４Ｑ；Ｌ８２Ｎ１２８Ｒ／Ｉ１４３Ｇ；およびＫ１４４を含む多数の変異体が、ｐＨ５．５で向上した結合性を有することが見出された。これらの試験されたもののうち、ｐＨ５．５で向上した結合性を示したもの全部が、ｐＨ依存結合性を維持していることも見出された（表６の最終欄参照）。いくつかのアッセイされた変異体は、ｐＨ５．５で不変であるか、場合によってはさらに増加するＫＤ（即ち不変であるかより悪い結合性）を有することが見出された。何故そのようなクローンが特定され得たのかについてははいくつかの理由があり得る。例えばこれらの変異体は、ディスプレイ系においてタンパク質発現または安定性を増強させ得るからである。変異体ＨＳＡが可溶性分子として発現されるとき複製されない、ディスプレイのために使用されるＧＰＩアンカーは、これらの変異体が補償し得る結合に対するいくらかの影響を有し得る。さらにまた、オフレートを捕えるべく最適化されたスクリーニング方法のデザインによって、全体の親和性改善に移行し得る、またはし得ない変異体を安定化させる。これらの変異は、１以上の他の変異と組合せられたときより増強を与えることも考えられる。多数の変異の組合せも見出された（表５参照）。
【０５３０】
表６：結合試験の概要
【表６】
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【０５３１】
ブランクの欄は試験されなかったことを示す；ｎｂは使用された条件下で結合が生じなかったことを示す。
【０５３２】
＊推定値−弱い親和性＋１０μＭでの最大濃度でＲｅｑ−濃度等温に対する限界曲率のみが結果的に得られた。
【０５３３】
＊＊推定値−強力な親和性−低い濃度曲線の結合は、「真の」定常状態に到達しなかった。
【０５３４】
細胞染色およびＦＡＣＳ解析およびソーティング：密度１×１０６／ｍｌの３０百万の２９３Ｆ細胞を、ＭＯＩ＝１でＨＳＡアデノウイルスライブラリーに感染させた。細胞は形質導入の１６時間後に遠心分離によって回収し、低温のＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、約１×１０７細胞／ｍｌに再懸濁した。ソーティングの第１ラウンドのために、ビオチン化されたＦｃＲｎを１０μｇ／ｍｌ（２１２ｎＭ）で加えた。４℃で６０分間のインキュベーションの後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１：５００の希釈でストレプトアビジン−ＰＥに再懸濁した。４℃で３０分間のインキュベーション、ＦＡＣＳ緩衝液での１回の洗浄、ＦｃＲｎ結合性についてのソーティングの後、これはｐＨ５．５でＦｃＲｎに結合する細胞を濃縮したものとなる。ソーティングされた細胞を、追加のスクリーニングのために増幅した。第２ラウンドのソーティングのため、濃縮した細胞集団を、更に高親和性ＨＳＡ変異体を濃縮するためにビオチン化されたＦｃＲｎを１μｇ／ｍｌ（２１．２ｎＭ）で用いた以外は、基本的に上述したようにソートした。濃縮されたライブラリーの更なる解析も、０．１μｇ／ｍｌ（２．１２ｎＭ）で行った。例えば図１４を参照のこと。いくつかのスクリーニングでは、第１または第２ラウンドに「除外」ステップを組み込み、そこでは、濃縮された細胞集団をソーティングして中性ｐＨ（ｐＨ７．４）でＦｎＲｃに結合したものを除去した。個々のクローンを特定するために、濃縮された細胞集団からウイルスＤＮＡを抽出し、ＤＩＩＩ−ＨＳＡ変異形を、２９３Ｆ細胞の一時的トランスフェクションのため哺乳動物発現ベクターにクローン化する。個々のクローンは、基本的に前述したようにｐＨ５．５およびｐＨ７．４でフローサイトメトリーによってｐＨ依存性結合についてスクリーニングする。
【０５３５】
ＨＳＡ−ＤＩＩＩ変異体の生成と発現：野生型ＨＡＳを変異させて、特定の変異原性プライマーを使用し、哺乳動物発現ベクターにおいて、標準的なプロトコル（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃａｔａｌｏｇ＃２００５２１）を用いていくつかのＤＩＩＩ変異体を作製する。変異体は、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ｓｋｕ１２３４７−０１９）を用いて、メーカーのプロトコルに従った一時的トランスフェクションによって２９３Ｆ細胞で発現され、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ａ２２２０）上で標準的な手順を用いて精製する。このように精製された全ての変異体を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで解析し、サイズ排除クロマトグラフィーで純度と集塊の有無を評価した。変異体の全てが、有意な集塊のない（９５％超が単一遺伝子性）（データ示さず）約９９％の純度であると判定された。
【０５３６】
ＰｒｏｔｅＯｎ解析：ＨＳＡ変異形に対するヒトＦｃＲｎの親和性（ＫＤ）を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）上で測定した。簡単に説明すると、メーカーの説明書の通りにＰｒｏｔｅＯｎ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔを使用し、ＨＳＡ変異形をＰｒｏｔｅＯｎ  ＧＬＭ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ上に高密度で固定化した。最終的な表面のＨＳＡ密度は、３７４０〜３９５０ＲＵであった。基準フロー面も、同一の固定化プロトコルを用いて、いずれかのタンパク質の無いものをチップ上に作製した。５０ｍＭのＰ０４、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）中に５．８６ｎＭ〜１００００ｎＭの範囲の濃度のヒトＦｃＲｂの２倍希釈系列を、流量２５Ｌ／分でタンパク質結合面および基準細胞面の両方の上に注入した。８分間結合データを収集し、その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）の６０秒間の注入を複数回行うことによって再生させた。各注入あたりの平衡時の結合応答（Ｒｅｑ）を濃度に対してプロットし、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて定常状態親和性モデルに当てはめ、平衡結合定数ＫＤを導出した。
【０５３７】
この解析に基づいて、確認された変異の組合せのさらなる解析を行い、個々の変異の活性について評価する。加えて、突然変異の異なる組合せ（例えば、スクリーニングで直接確認されなかった２以上の位置での変異を有するコンストラクト）がＦｃＲｎに対して向上した親和性を示すか否かを確認するための更なるスクリーニングを行う。
【０５３８】
［８．１１  実施例１１：ドメインＩＩＩ上の選択された残基の組合せ変異誘発］
実施例１０（上記）で特定されたもっとも発生頻度の高い変異の組合せを調べるため、残基：４０７；４１５；４６３；４９５；５０８；５０９；５１１；５１２；５１５；５１６；５１７；５２１；５２３；５２４；５２６；５２７；および５５７が表７に示す残基に変異して、個々の変異体のそれぞれが２４種の変異を有するような変異体のライブラリーを作成するように合成ドメインＩＩＩライブラリーを生成する。あるいは、列挙された残基のそれぞれが２０種のアミノ酸のすべて（即ち野生型のアミノ酸および全１９種の非野生型アミノ酸）に変異するようにライブラリーを作製し、より広範囲な組合せについて調べることもできる。
【０５３９】
ドメインＩＩＩ組合せ変異を導入し、ドメインＩＩＩ単独、完全長ＨＳＡタンパク質、少なくともドメインＩＩＩを含む切断型ＨＳＡ、またはキメラポリペプチドのなかの１以上のコンテキストにおいてスクリーニングを行う。標準的な突然変異誘発法を用いて、ドメインＩＩＩ変異体のライブラリーを作製することができる。選択に応じて、または代替的には、ドメインＩＩＩ変異体のライブラリーを、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙなどの民間の施設で作製してもらう。
【０５４０】
その組合せ変異体のライブラリーを、上述のｐＹＤ１酵母ディスプレイベクターまたは哺乳動物ディスプレイベクターｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩのようなディスプレイベクターにクローン化し、本明細書に記載する標準的な試験管内アッセイ（例えばフローサイトメトリー）を用いてＦｃＲｎ結合能力についてスクリーニングする。実施例１０に記載のもののような正および／または負の選択法を採用し得る。ＦｃＲｎに対する向上した親和性を示す組合せ変異形を特定する。各変異形について、ＦｃＲｎに対する向上した親和性が酸性ｐＨにおいて生じ中性ｐＨにおいては生じないか、そうでないかを判定するべくスクリーニングしてもよい。酸性ｐＨにおいて生じ中性ｐＨでは生じないＦｃＲｎに対する向上した親和性は、（ｉ）変異形ドメインＩＩＩコンストラクト単独、（ｉｉ）完全長ＨＳＡのコンテキストで提示される変異形ドメインＩＩＩコンストラクト、または（ｉｉｉ）キメラポリペプチドのコンテキストで提示される変異形ドメインＩＩＩコンストラクトに対して試験する。これらのものは、変異なしの野生型ドメインＩＩＩ、野生型完全長ＨＳＡ、またはキメラポリペプチドと比較される。選択に応じて、または代替的には、組合せ変異を、ドメインＩＩＩ、完全長ＨＳＡ，または各変異を単独で含むキメラポリペプチドと比較して、その組合せがＦｃＲｎに対する親和性および／または血清半減期をさらに増強または長期化するか否かを判定し得る。この実験計画で、ＦｃＲｎに対する親和性を向上させる、および／または血清半減期を長期化させる組合せ変異を特定することができる。
【０５４１】
表７：組合せライブラリーの変異
【表７】
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【０５４２】
［８．１２  実施例１２：改善されたＦｃＲｎ親和性についてスクリーニングされる単一アミノ酸変異体を作製するためのドメインＩＩＩ上の変異誘発］
本出願に記載する標準的な方法を用いて、１８の単一アミノ酸をドメインＩＩＩで保存されるアミノ酸のなかから選択し、単独で変異させてアラニンとし、各変異形が単一位置のみでの単独変異を有するようにする。１８種の変異形を導入し、完全長ＨＳＡタンパク質のコンテキストで、または代替として、少なくともドメインＩＩＩを含むキメラタンパク質または切断型ＨＳＡにおいてスクリーニングする。１８種の変異形を、本出願に記載する標準的な試験管内アッセイを用いて、ＦｃＲｎ結合能力についてスクリーニングする。ＦｃＲｎに対する向上した親和性を示す変異形を特定する。各変異形について、ＦｃＲｎに対する向上した親和性が酸性ｐＨにおいて生じ中性ｐＨにおいては生じないか、そうでないかを判定するスクリーニングも行う。酸性ｐＨにおいて生じ中性ｐＨでは生じないＦｃＲｎに対する向上した親和性は、（ｉ）変異形ドメインＩＩＩコンストラクト単独、（ｉｉ）完全長ＨＳＡのコンテキストで提示される変異形ドメインＩＩＩコンストラクト、またはキメラポリペプチドのコンテキストで提示される変異形ドメインＩＩＩコンストラクトに対して試験し得る。これらのものは、変異なしの野生型ドメインＩＩＩ、野生型完全長ＨＳＡ、またはキメラポリペプチドと比較される。
【０５４３】
この解析に基づいて、突然変異の組合せ（例えば、２以上の位置での変異を有するコンストラクト）がＦｃＲｎに対して向上した親和性を示すか否かを確認するための更なるスクリーニングを行う。
【０５４４】
［９  配列］
配列番号１−ヒトＨＳＡＤＩＩＩタンパク質配列
ＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣ  ＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶ  ＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤ  ＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
配列番号２−ヒト完全長ＨＳＡタンパク質配列
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤ  ＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫ  ＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣ  ＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰ  ＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
図６は、さまざまな種に由来する血清アルブミンタンパク質のドメインＩＩＩのアライメントを示す。
【０５４５】
ネズミ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、配列番号３として図６中に記載されている。マウス血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、配列番号４として図６中に記載されている。ウシ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、配列番号５として図６中に記載されている。ヒト血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、配列番号２として図６中に記載されている。イヌ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、配列番号６として図６中に記載されている。ウサギ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、配列番号７として図６中に記載されている。ブタ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、配列番号８として図６中に記載されている。ニワトリ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、配列番号９として図６中に記載されている。ロバ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、配列番号１０として図６中に記載されている。スナネズミ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、配列番号１１として図６中に記載されている。ヒツジ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、配列番号１２として図６中に記載されている。ネコ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、配列番号１３として図６中に記載されている。ウマ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、配列番号１４として図６中に記載されている。
【０５４６】
本明細書に記載するすべての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が個別に参照により本明細書中に組み入れられたごとく、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられるものとする。加えて、２０１０年２月１６日出願の米国仮出願第６１／３０４，９５４号および２０１０年７月１５日出願の米国仮出願第６１／３６４，５０３号は、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられるものとする。
【０５４７】
本発明の特定の実施形態について説明してきたが、上記の明細書の内容は例示にすぎず、発明を限定するものではない。本発明の多くの改変形態は、本明細書および特許請求の範囲の記載を考察すれば当業者には明らかとなろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲の記載範囲とその均等物の範囲、および本明細書の記載内容ならびにその改変形態の範囲によって定められるべきものである。
【図１Ａ】
2013519392.tif 000018
【図１Ｂ】
2013519392.tif 000019
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2013519392.tif 000021
【図２Ｂ】
2013519392.tif 000022
【図２Ｃ】
2013519392.tif 000023
【図３Ａ】
2013519392.tif 000024
【図３Ｂ】
2013519392.tif 000025
【図３Ｃ】
2013519392.tif 000026
【図４】
2013519392.tif 000027
【図５Ａ】
2013519392.tif 000028
【図５Ｂ】
2013519392.tif 000029
【図６Ａ】
2013519392.tif 000030
【図６Ｂ】
2013519392.tif 000031
【図６Ｃ】
2013519392.tif 000032
【図６Ｄ】
2013519392.tif 000033
【図６Ｅ】
2013519392.tif 000034
【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
2013519392.tif 000037
【図７】
2013519392.tif 000038
【図８Ａ】
2013519392.tif 000039
【図８Ｂ】
2013519392.tif 000040
【図９Ａ】
2013519392.tif 000041
【図９Ｂ】
2013519392.tif 000042
【図９Ｃ】
2013519392.tif 000043
【図１０】
2013519392.tif 000044
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
2013519392.tif 000050
【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
2013519392.tif 000052
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
2013519392.tif 000054
【図１４Ｃ】
2013519392.tif 000055
【図１５】
2013519392.tif 000056
【図１６】
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【図１７】
2013519392.tif 000058
【配列表】
2013519392000001.app
【国際調査報告】
2013519392.tif 000059
2013519392.tif 000060