(57)【要約】  原位置生成物抽出を用いてブタノールなどの発酵生成物アルコールを効率的に生成する方法およびシステムが提供される。所与の原料を液化して、原料を生成した後で、かつ、例えば遠心分離による発酵の前に、非溶解固体を分離することによって、効率性が得られる。非溶解固体の除去により、原位置生成抽出の際に存在する非溶解固体を有することに関連する問題が回避され、それによって、アルコール生成の効率性が高められる。
2013528400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵性炭素源、非溶解固体、および水を含むバイオマス原料スラリーを提供する工程と；
前記非溶解固体の少なくとも一部を前記スラリーから分離する工程であって、それによって、（ｉ）発酵性炭素源を含む水溶液および（ｉｉ）固体を含むウェットケーキ副産物が生成される工程と；
発酵槽中の組み換え微生物を含む発酵ブロスに前記水溶液を加え、それによって、発酵生成物が生成される工程とを含む方法であって；
前記バイオマスの処理生産性が改良される方法。
【請求項２】
前記改良されたバイオマスの処理生産性が、非溶解固体の存在下で生成される発酵生成物と比べて向上した発酵生成物および副産物回収性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記改良されたバイオマスの処理生産性が、向上したプロセス流再利用性、向上した発酵装置体積効率、および向上したバイオマス原料負荷供給のうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記発酵ブロスを抽出剤と接触させる工程をさらに含み、前記抽出剤が、非溶解固体を含む発酵ブロスと比べて向上した抽出効率を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
向上した抽出効率が、前記抽出剤の安定化した分配係数、前記発酵ブロスからの前記抽出剤の向上した相分離、向上した液液物質移動係数、向上した抽出剤の回収および再利用性、ならびに回収および再利用のために保存される抽出剤のうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抽出剤が有機抽出剤である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記抽出剤が、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される１種またはそれ以上の不混和性有機抽出剤を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抽出剤が、トウモロコシ油に由来するＣ１２〜Ｃ２２の脂肪酸を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記非溶解固体が、デカンターボウル遠心分離、トリカンター遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せによって、原料スラリーから分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
原料を液化して、バイオマス原料スラリーを生成する工程をさらに含み；前記原料が、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、トウモロコシ、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、干し草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記原料がトウモロコシである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記原料が、分画されるかまたは分画されない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記原料が、湿式粉砕または乾式粉砕される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
液化の際の反応温度を上昇させる工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記原料スラリーが、前記原料に由来する油を含み、前記油が、前記スラリーから分離される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウェットケーキが原料油を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウェットケーキが、前記ウェットケーキ中に存在するオリゴ糖を回収するために水で洗浄される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記回収されたオリゴ糖が、前記発酵槽に加えられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウェットケーキが、向上した副産物を得るためにさらに処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記副産物が、動物飼料製品を形成するためにさらに処理される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウェットケーキが、前記ウェットケーキ中に存在する油を回収するために溶媒で洗浄される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶媒が、ヘキサン、ブタノール、イソブタノール、イソヘキサン、エタノール、および石油蒸留物から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記発酵生成物が、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、およびそれらの異性体からなる群から選択される生成物アルコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記組み換え微生物が、改変されたブタノール生合成経路を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記発酵ブロスおよび生成物および場合によりＣＯ２を少なくとも部分的に蒸発させる工程をさらに含み、ここで、蒸気流が生成され、前記蒸気流から前記生成物を回収する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記蒸気流を吸収液相と接触させる工程をさらに含み、ここで、前記蒸気流の少なくとも一部が、前記吸収液相中に吸収され；
前記吸収液相中への前記蒸気流の吸収の開始の温度が、前記吸収液相がない場合の前記蒸気流の凝縮の開始の温度より高い、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記蒸発および接触工程が、真空条件下で行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記非溶解固体の大部分を前記スラリーから分離する前記工程により、非溶解固体を含む発酵ブロスと比べて前記発酵ブロスのより高い蒸気圧が得られる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記より高い蒸気圧により、より効率的な蒸発生成物回収が得られる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記より効率的な蒸発生成物回収が、より少ない資源投入、より少ない蒸発、吸収、圧縮、および冷蔵設備、向上した物質移動速度、蒸発のためのより少ないエネルギー、およびより低い吸収剤流量のうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ブタノールを生成するための方法であって：
原料を提供する工程と；
前記原料を液化して、オリゴ糖、油、および非溶解固体を含む原料スラリーを生成する工程と；
非溶解固体を前記原料スラリーから分離して、（ｉ）オリゴ糖を含む水溶液、（ｉｉ）非溶解固体を含むウェットケーキ、および（ｉｉｉ）油相を生成する工程と；
前記水溶液を、発酵装置中の発酵ブロスと接触させる工程と；
前記発酵装置中の前記オリゴ糖を発酵させて、ブタノールを生成する工程と；
前記ブタノールが生成されるにつれて、前記発酵ブロスからの前記ブタノールの原位置除去を行う工程とを含み、
前記原料スラリーからの前記非溶解固体の除去により、前記ブタノール生成の効率が高められる方法。
【請求項３２】
前記原料がトウモロコシであり、前記油がトウモロコシ油である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記非溶解固体が、胚芽、繊維、およびグルテンを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記原料を乾式粉砕する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記トウモロコシが分画されない、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記非溶解固体が、デカンターボウル遠心分離、トリカンター遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せによって分離される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
非溶解固体を前記原料スラリーから分離する前記工程が、前記原料スラリーを遠心分離する工程を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記原料スラリーを遠心分離する工程が、前記原料を、前記水溶液を含む第１の液相と、前記ウェットケーキを含む固相と、前記油を含む第２の液相とに分離する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ウェットケーキが、前記ウェットケーキ中に存在するオリゴ糖を回収するために水で洗浄される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記原位置除去が液液抽出を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
前記液液抽出のための抽出剤が有機抽出剤である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記水溶液中の前記オリゴ糖の糖化が、前記発酵装置中の前記オリゴ糖の発酵と同時に行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
液化の際の反応温度を上昇させる工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
前記発酵装置中の前記オリゴ糖を発酵させる前に、前記オリゴ糖を糖化する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
非溶解固体を前記原料スラリーから除去する前記工程が、前記原料スラリーを遠心分離する工程を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記原料スラリーを遠心分離する工程が、前記糖を糖化する前に行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記発酵ブロスが、ブタノール生合成経路を含む組み換え微生物を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４８】
前記ブタノールがイソブタノールである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４９】
非溶解固体を前記原料スラリーから除去する前記工程が、前記発酵ブロスから前記抽出剤への前記ブタノールの液液物質移動係数を高めることによって、前記ブタノール生成の効率を高め；抽出剤により前記ブタノールの抽出効率を高めることによって、前記ブタノール生成の効率を高め；前記発酵ブロスと抽出剤との間の相分離の速度を上げることによって、前記ブタノール生成の効率を高め；抽出剤の回収および再利用を増加させることによって、前記ブタノール生成の効率を高め；または抽出剤の流量を減少させることによって、前記ブタノール生成の効率を高める、請求項３１に記載の方法。
【請求項５０】
原料を液化して、原料スラリーを生成するように構成される液化槽であって：
前記原料を受け入れるための入口；および
糖および非溶解固体を含む原料スラリーを排出するための出口
を含む液化槽と；
前記非溶解固体を前記原料スラリーから除去して、（ｉ）前記糖を含む水溶液および（ｉｉ）前記非溶解固体の部分を含むウェットケーキを生成するように構成される遠心分離機であって：
前記原料スラリーを受け入れるための入口；
前記水溶液を排出するための第１の出口；および
前記ウェットケーキを排出するための第２の出口
を含む遠心分離機と；
前記水溶液を発酵させて、ブタノールを生成するように構成される発酵装置であって：
前記水溶液を受け入れるための第１の入口；
抽出剤を受け入れるための第２の入口；
ブタノールに富んだ前記抽出剤を排出するための第１の出口；および
発酵ブロスを排出するための第２の出口
を含む発酵装置と
を含む、ブタノールを生成するためのシステム。
【請求項５１】
前記遠心分離機が、前記非溶解固体を前記原料スラリーから除去しながら、生成される油を排出するための第３の出口をさらに含む、請求項５０に記載のシステム。
【請求項５２】
前記原料スラリー中の前記糖を糖化するように構成される糖化槽であって：
前記原料スラリーを受け入れるための入口；および
前記原料スラリーを排出するための出口を含む糖化槽をさらに含む、請求項５０に記載のシステム。
【請求項５３】
前記水溶液中の前記糖を糖化するように構成される糖化槽であって：
前記水溶液を受け入れるための入口；および
前記水溶液を排出するための出口を含む糖化槽をさらに含む、請求項５２に記載のシステム。
【請求項５４】
前記原料を磨砕するように構成される乾式粉砕機であって：
前記原料を受け入れるための入口；および
磨砕された原料を排出するための出口を含む乾式粉砕機をさらに含む、請求項５０に記載のシステム。
【請求項５５】
２０〜３５質量％の粗タンパク質、
１〜２０質量％の粗脂肪、
０〜５質量％のトリグリセリド、
４〜１０質量％の脂肪酸、および
２〜６質量％の脂肪酸イソブチルエステル
を含む組成物。
【請求項５６】
２５〜３１質量％の粗タンパク質、
６〜１０質量％の粗脂肪、
４〜８質量％のトリグリセリド、
０〜２質量％の脂肪酸、および
１〜３質量％の脂肪酸イソブチルエステル
を含む組成物。
【請求項５７】
２０〜３５質量％の粗タンパク質、
１〜２０質量％の粗脂肪、
０〜５質量％のトリグリセリド、
４〜１０質量％の脂肪酸、および
２〜６質量％の脂肪酸イソブチルエステル
を含む組成物。
【請求項５８】
２６〜３４質量％の粗タンパク質、
１５〜２５質量％の粗脂肪、
１２〜２０質量％のトリグリセリド、
１〜２質量％の脂肪酸、
２〜４質量％の脂肪酸イソブチルエステル，
１〜２質量％のリジン、
１１〜２３質量％のＮＤＦ、および
５〜１１質量％のＡＤＦ
を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，２９０号；２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４５１号；２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４３６号、２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４４４号；２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４２９号；２０１０年９月２日に出願された米国仮特許出願第６１／３７９，５４６号；および２０１１年２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／４４０，０３４号；２０１１年６月１５日に出願された米国特許出願第１３／１６０，７６６号の利益を主張するものであり；これらの内容全体が全て、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本出願に関連する配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子書式で提出され、全体が参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本発明は、ブタノールなどの発酵アルコールの生成において発酵装置原料流から非溶解固体を除去するための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００４】
ブタノールは、燃料添加剤として、プラスチック産業における原料化学物質として、ならびに食品および香料産業における食品グレードの抽出剤としての使用を含む様々な用途を有する重要な産業用化学物質である。したがって、ブタノール、ならびに効率的でかつ環境に優しい生成方法に対する高い需要がある。
【０００５】
微生物による発酵を用いたブタノールの生成は、１つのこのような環境に優しい生成方法である。高収率でブタノールを生成するいくつかの微生物は、低いブタノール毒性閾値も有するため、ブタノールは、生成されるにつれて発酵装置から除去される必要がある。原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）を用いて、ブタノールが生成されるにつれて発酵装置からブタノールを除去し、それによって、微生物が高収率でブタノールを生成することが可能になり得る。当該技術分野で説明されているＩＳＰＲのための１つの方法は、液液抽出（特許文献１）である。技術的および経済的に実行可能であるために、液液抽出は、効率的な物質移動のための抽出剤と発酵ブロスとの接触；発酵ブロスからの抽出剤の相分離（発酵中および発酵後）；および／または溶媒の効率的な回収および再利用および長期間の運転にわたる抽出剤の劣化および／または汚染が最小限であることを必要とする。
【０００６】
発酵装置に入る水流が、原料からの非溶解固体を含有するとき、非溶解固体は、資本コストおよび運転コストを増加させることによって、液液抽出が技術的および経済的に実行可能であるための上述した要件の妨げとなる。特に、抽出発酵中の非溶解固体の存在は、発酵装置の内部の物質移動係数を低下させ、発酵装置中の相分離を妨げることがあり、抽出剤中の非溶解固体からの油（例えば、トウモロコシ油）の蓄積を生じ、時間の経過とともに抽出効率の低下を招くことがあり、可溶物含有乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）として最終的に除去される固体に溶媒が捕捉されるため、溶媒の損失を増加することがあり、発酵ブロスからの抽出剤液滴の離脱を遅くすることがあり、および／または発酵装置体積効率を低下させることがある。したがって、抽出発酵によるブタノールなどの生成物アルコールを生成するためのより効率的な方法およびシステムを開発することが引き続き必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の必要性を満たし、発酵装置に供給される非溶解固体の量を減少させることによって、ブタノールなどの生成物アルコールを生成するための方法およびシステムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ブタノールなどの発酵アルコールの生成において発酵装置原料流から非溶解固体を除去するための方法およびシステムに関する。
【００１０】
本発明は、発酵性炭素源、非溶解固体、および水を含むバイオマス原料スラリーを提供する工程と；非溶解固体の少なくとも一部を前記スラリーから分離する工程であって、それによって、（ｉ）発酵性炭素源を含む水溶液および（ｉｉ）固体を含むウェットケーキ副産物が生成される工程と；発酵槽中の組み換え微生物を含む発酵ブロスに水溶液を加え、それによって、発酵生成物が生成される工程とを含む方法であって；バイオマスの処理生産性が改良される方法に関する。ある実施形態において、改良されたバイオマスの処理生産性は、非溶解固体の存在下で生成される発酵生成物と比べて向上した発酵生成物および副産物回収性（ｒｅｃｏｖｅｒａｂｉｌｉｔｙ）を含む。ある実施形態において、改良されたバイオマスの処理生産性は、向上したプロセス流再利用性、向上した発酵装置体積効率、および向上したバイオマス原料負荷供給のうちの１つ以上を含む。ある実施形態において、本方法は、発酵ブロスを抽出剤と接触させる工程をさらに含み、抽出剤は、非溶解固体を含む発酵ブロスと比べて向上した抽出効率を有する。ある実施形態において、向上した抽出効率は、抽出剤の安定化した分配係数、発酵ブロスからの抽出剤の向上した相分離、向上した液液物質移動係数、向上した抽出剤の回収および再利用性、ならびに回収および再利用のために保存される抽出剤のうちの１つ以上を含む。ある実施形態において、抽出剤は有機抽出剤である。ある実施形態において、抽出剤は、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される１種以上の不混和性有機抽出剤を含む。ある実施形態において、抽出剤は、トウモロコシ油に由来するＣ１２〜Ｃ２２の脂肪酸を含む。ある実施形態において、非溶解固体は、デカンターボウル遠心分離、トリカンター（ｔｒｉｃａｎｔｅｒ）遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子（ｇｒａｔｉｎｇ）、多孔質格子、浮遊法（ｆｌｏｔａｔｉｏｎ）、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器（ｖｏｒｔｅｘ  ｓｅｐａｒａｔｏｒ）、またはそれらの組合せによって、原料スラリーから分離される。ある実施形態において、本方法は、原料を液化して、バイオマス原料スラリーを生成する工程をさらに含み；原料は、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、トウモロコシ、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、干し草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物から選択される。ある実施形態において、原料はトウモロコシである。ある実施形態において、原料は、分画されるかまたは分画されない。ある実施形態におい���、原料は、湿式粉砕または乾式粉砕される。ある実施形態において、本方法は、液化の際の反応温度を上昇させる工程をさらに含む。ある実施形態において、原料スラリーは、上記の原料に由来する油を含み、前記油は、スラリーから分離される。ある実施形態において、ウェットケーキは原料油を含む。ある実施形態において、ウェットケーキは、ウェットケーキ中に存在するオリゴ糖を回収するために水で洗浄される。ある実施形態において、回収されたオリゴ糖は、発酵槽に加えられる。ある実施形態において、ウェットケーキは、向上した副産物を得るためにさらに処理される。ある実施形態において、副産物は、動物飼料製品を形成するためにさらに処理される。ある実施形態において、ウェットケーキは、ウェットケーキ中に存在する油を回収するために溶媒で洗浄される。ある実施形態において、溶媒は、ヘキサン、ブタノール、イソブタノール、イソヘキサン、エタノール、および石油蒸留物から選択される。ある実施形態において、発酵生成物は、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、およびそれらの異性体からなる群から選択される生成物アルコールである。ある実施形態において、組み換え微生物は、改変された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ブタノール生合成経路を含む。ある実施形態において、本方法は、発酵ブロスおよび生成物および任意にＣＯ２を少なくとも部分的に蒸発させる工程をさらに含み、ここで、蒸気流が生成され、蒸気流から生成物を回収する。ある実施形態において、本方法は、蒸気流を吸収液相と接触させる工程をさらに含み、ここで、蒸気流の少なくとも一部が、吸収液相中に吸収され；吸収液相中への蒸気流の吸収の開始の温度は、吸収液相がない場合の蒸気流の凝縮の開始の温度より高い。ある実施形態において、蒸発および接触工程は、真空条件下で行われる。ある実施形態において、非溶解固体の大部分を前記スラリーから分離する工程により、非溶解固体を含む発酵ブロスと比べて発酵ブロスのより高い蒸気圧が得られる。ある実施形態において、より高い蒸気圧により、より効率的な蒸発生成物回収が得られる。ある実施形態において、より効率的な蒸発生成物回収は、より少ない資本投資、より少ない蒸発、吸収、圧縮、および冷蔵設備、向上した物質移動速度、蒸発のためのより少ないエネルギー、およびより低い吸収剤流量のうちの１つ以上を含む。
【００１１】
本発明は、ブタノールを生成するための方法にも関し、本方法は、原料を提供する工程と；原料を液化して、オリゴ糖、油、および非溶解固体を含む原料スラリーを生成する工程と；非溶解固体を原料スラリーから分離して、（ｉ）オリゴ糖を含む水溶液、（ｉｉ）非溶解固体を含むウェットケーキ、および（ｉｉｉ）油相を生成する工程と；水溶液を、発酵装置中の発酵ブロスと接触させる工程と；発酵装置中のオリゴ糖を発酵させて、ブタノールを生成する工程と；ブタノールが生成されるにつれて、発酵ブロスからのブタノールの原位置除去を行う工程とを含み、原料スラリーからの非溶解固体の除去により、ブタノール生成の効率が高められる。ある実施形態において、原料はトウモロコシであり、油はトウモロコシ油である。ある実施形態において、非溶解固体は、胚芽、繊維、およびグルテンを含む。ある実施形態において、本方法は、原料を乾式粉砕する工程をさらに含む。ある実施形態において、トウモロコシは分画されない。ある実施形態において、非溶解固体は、デカンターボウル遠心分離、トリカンター遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せによって分離される。ある実施形態において、非溶解固体を原料スラリーから分離する工程は、原料スラリーを遠心分離する工程を含む。ある実施形態において、原料スラリーを遠心分離する工程は、原料を、水溶液を含む第１の液相と、ウェットケーキを含む固相と、油を含む第２の液相とに分離する。ある実施形態において、ウェットケーキは、ウェットケーキ中に存在するオリゴ糖を回収するために水で洗浄される。ある実施形態において、原位置除去は液液抽出を含む。ある実施形態において、液液抽出のための抽出剤が有機抽出剤である。ある実施形態において、水溶液中のオリゴ糖の糖化が、発酵装置中のオリゴ糖の発酵と同時に行われる。ある実施形態において、本方法は、液化の際の反応温度を上昇させる工程をさらに含む。ある実施形態において、本方法は、発酵装置中のオリゴ糖を発酵させる前に、オリゴ糖を糖化する工程をさらに含む。ある実施形態において、非溶解固体を原料スラリーから除去する工程は、原料スラリーを遠心分離する工程を含む。ある実施形態において、原料スラリーを遠心分離する工程は、糖を糖化する前に行われる。ある実施形態において、発酵ブロスは、ブタノール生合成経路を含む組み換え微生物を含む。ある実施形態において、ブタノールはイソブタノールである。ある実施形態において、非溶解固体を原料スラリーから除去する工程は、発酵ブロスから抽出剤へのブタノールの液液物質移動係数を高めることによって、ブタノール生成の効率を高め；抽出剤によりブタノールの抽出効率を高めることによって、ブタノール生成の効率を高め；発酵ブロスと抽出剤との間の相分離の速度を上げることによって、ブタノール生成の効率を高め；抽出剤の回収および再利用を増加させることによって、ブタノール生成の効率を高め；または抽出剤の流量を減少させることによって、ブタノール生成の効率を高める。本発明は、原料を液化して、原料スラリーを生成するように構成される液化槽であって：原料を受け入れるための入口；および糖および非溶解固体を含む原料スラリーを排出するための出口を含む液化槽と；非溶解固体を原料スラリーから除去して、（ｉ）糖を含む水溶液および（ｉｉ）非溶解固体の部分を含むウェットケーキを生成するように構成される遠心分離機であって：原料スラリーを受け入れるための入口；水溶液を排出するための第１の出口；およびウェットケーキを排出するための第２の出口を含む遠心分離機と；水溶液を発酵させて、ブタノールを生成するように構成される発酵装置であって：水溶液を受け入れるための第１の入口；抽出剤を受け入れるための第２の入口；ブタノールに富んだ抽出剤を排出するための第１の出口；および発酵ブロスを排出するための第２の出口を含む発酵装置とを含む、ブタノールを生成するためのシステムにも関する。ある実施形態において、遠心分離機は、非溶解固体を原料スラリーから除去しながら、生成される油を排出するための第３の出口をさらに含む。ある実施形態において、本装置は、原料スラリー中の糖を糖化するように構成される糖化槽であって：原料スラリーを受け入れるための入口；および原料スラリーを排出するための出口を含む糖化槽をさらに含む。ある実施形態において、本装置は、水溶液中の糖を糖化するように構成される糖化槽であって：水溶液を受け入れるための入口；および水溶液を排出するための出口を含む糖化槽をさらに含む。ある実施形態において、本装置は、原料を磨砕するように構成される乾式粉砕機であって：原料を受け入れるための入口；および磨砕された原料を排出するための出口を含む乾式粉砕機をさらに含む。
【００１２】
本発明は、２０〜３５重量％の粗タンパク質、１〜２０重量％の粗脂肪、０〜５重量％のトリグリセリド、４〜１０重量％の脂肪酸、および２〜６重量％の脂肪酸イソブチルエステルを含む組成物にも関する。本発明は、２５〜３１重量％の粗タンパク質、６〜１０重量％の粗脂肪、４〜８重量％のトリグリセリド、０〜２重量％の脂肪酸、および１〜３重量％の脂肪酸イソブチルエステルを含む組成物にも関する。本発明は、２０〜３５重量％の粗タンパク質、１〜２０重量％の粗脂肪、０〜５重量％のトリグリセリド、４〜１０重量％の脂肪酸、および２〜６重量％の脂肪酸イソブチルエステルを含む組成物にも関する。本発明は、２６〜３４重量％の粗タンパク質、１５〜２５重量％の粗脂肪、１２〜２０重量％のトリグリセリド、１〜２重量％の脂肪酸、２〜４重量％の脂肪酸イソブチルエステル、１〜２重量％のリジン、１１〜２３重量％のＮＤＦ、および５〜１１重量％のＡＤＦを含む組成物にも関する。
【００１３】
ある実施形態において、（ａ）前記バイオマスおよび水から発酵性炭素および非溶解固体を含む原料スラリーを提供する工程と；（ｂ）非溶解固体の大部分を前記スラリーから分離し、それによって、（ｉ）発酵性炭素を含む水溶液および（ｉｉ）固体を含むウェットケーキ副産物が生成される工程と；（ｃ）発酵槽中の組み換え微生物を含む発酵ブロスに水溶液を加え、それによって、発酵生成物が生成される工程とを含む方法であって；バイオマスの処理生産性が改良される方法。ある実施形態において、改良されたバイオマスの処理生産性は、非溶解固体の存在下で生成される発酵生成物と比べて向上した発酵生成物および副産物回収性を含む。ある実施形態において、改良されたバイオマスの処理生産性は、向上したプロセス流再利用性、向上した発酵装置体積効率および向上したトウモロコシ負荷供給のうちの１つ以上を含む。ある実施形態において、向上したプロセス流再利用性は、発酵性組み換え微生物の再利用、水の再利用、およびエネルギー効率のうちの１つ以上を含む。
【００１４】
ある実施形態において、本方法は、（ｄ）（ｃ）の発酵ブロスを抽出剤と接触させる工程も含み得、抽出剤は、非溶解固体を含む発酵ブロスと比べて向上した抽出効率を有する。ある実施形態において、向上した抽出効率は、安定化した分配係数、向上した相分離、向上した物質移動係数、および向上したプロセス流再利用性のうちの１つ以上を含む。ある実施形態において、向上した抽出効率は、抽出剤の安定化した分配係数、発酵ブロスからの抽出剤の向上した相分離、向上した液液物質移動係数、ならびに向上した抽出剤の回収および再利用性のうちの１つ以上を含む。ある実施形態において、向上した抽出効率は、再利用のために保存される抽出剤を含む。
【００１５】
ある実施形態において、水溶液は、約２０ｃｐｓ未満の粘度を有する。ある実施形態において、水溶液は、約２０ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコースを含有する。
【００１６】
ある実施形態において、向上した生成物回収性は、生成物に対する向上した組み換え微生物耐性を提供する。ある実施形態において、向上した耐性は、非溶解固体を含む阻害剤の除去または向上した液液物質移動係数のうちの１つ以上によって提供される。ある実施形態において、向上した抽出剤効率は、向上した組み換え微生物耐性を提供する。ある実施形態において、向上した組み換え微生物耐性は、阻害剤、副生成物、および代謝産物の抽出によって提供される。
【００１７】
ある実施形態において、原料スラリーは、上記の原料に由来する油を含み、前記油は、工程（ｂ）のスラリーから分離される。ある実施形態において、ウェットケーキは、ウェットケーキの乾燥固形分の約２０％未満の量で原料油を含む。
【００１８】
ある実施形態において、工程（ｂ）で原料スラリーから分離される非溶解固体の大部分は、非溶解固体の少なくとも約７５重量％である。ある実施形態において、工程（ｂ）で原料スラリーから分離される非溶解固体の大部分は、非溶解固体の少なくとも約９０重量％である。ある実施形態において、工程（ｂ）で原料スラリーから分離される非溶解固体の大部分は、非溶解固体の少なくとも約９５重量％である。ある実施形態において、工程（ｂ）は、原料スラリーを遠心分離する工程を含む。ある実施形態において、原料スラリーを遠心分離する工程は、原料を、水溶液を含む第１の液相とウェットケーキを含む固相とに分離する。ある実施形態において、ウェットケーキは、ウェットケーキ中に存在する糖または糖源を回収するために水で洗浄される。ある実施形態において、水溶液を含む液相は、２回以上遠心分離される。
【００１９】
ある実施形態において、抽出剤は有機抽出剤である。ある実施形態において、抽出剤は、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される１種以上の不混和性有機抽出剤を含む。
【００２０】
ある実施形態において、発酵性組み換え微生物は、細菌または酵母細胞である。
【００２１】
ある実施形態において、生成物は、ブタノールおよびその異性体からなる群から選択される生成物アルコールである。
【００２２】
ある実施形態において、本方法は、（ｄ）発酵ブロスおよび（ｃ）の生成物および任意にＣＯ２を少なくとも部分的に蒸発させる工程も含み、ここで、蒸気流が生成され、蒸気流から生成物を回収する。ある実施形態において、本方法は、蒸気流を吸収液相と接触させる工程も含み、ここで、蒸気流の少なくとも一部が、吸収液相中に吸収され、吸収液相中への蒸気流の吸収の開始の温度は、吸収液相がない場合の蒸気流の凝縮の開始の温度より高い。ある実施形態において、蒸発および接触工程は、真空条件下で行われる。ある実施形態において、非溶解固体の大部分を前記スラリーから分離する工程により、非溶解固体を含む発酵ブロスと比べて発酵ブロスのより高い蒸気圧が得られる。ある実施形態において、より高い蒸気圧により、より効率的な蒸発生成物回収が得られる。ある実施形態において、より効率的な蒸発生成物回収は、より少ない資本投資、より少ない蒸発、吸収、圧縮、および冷蔵設備、向上した物質移動速度、蒸発のためのより少ないエネルギー、およびより低い吸収剤流量のうちの１つ以上を含む。
【００２３】
ある実施形態において、非溶解固体の大部分を分離する工程は、非溶解固体に対するでんぷんの損失が最小限に抑えられるように行われる。ある実施形態において、でんぷんの損失は、温度制御、酵素濃度、ｐＨ、磨砕トウモロコシの粒度、および液化の際の反応時間；遠心分離運転条件；およびウェットケーキ洗浄条件を含む１つ以上の最適化作業を行うことによって最小限に抑えられる。
【００２４】
ある実施形態において、ウェットケーキは、向上した副産物を得るためにさらに処理される。ある実施形態において、副産物は、ＤＤＧＳにさらに処理される。ある実施形態において、ＤＤＧＳは、非溶解固体の存在下で生成されるＤＤＧＳと比べて少ない原料油を含む向上した生成物プロファイルを有する。ある実施形態において、ＤＤＧＳは、ＤＤＧＳが、発酵ブロス、組み換え微生物、発酵生成物、および抽出剤との最小限の汚染接触で生成されるように向上した生成物プロファイルを有する。ある実施形態において、上記の方法によって生成されるＤＤＧＳは、有機動物飼料のための食品表示要件を満たす。
【００２５】
ある実施形態において、発酵ブロスは、発酵生成物部分およびトウモロコシ油部分を、重量基準で少なくとも約４：１の比率で含み、前記ブロスは、非溶解固体を実質的に含まない。ある実施形態において、トウモロコシ油部分は、少なくとも約１５重量％の遊離脂肪酸を含有する。ある実施形態において、発酵ブロスは、約１５重量％以下の非溶解固体を含有する。ある実施形態において、発酵ブロスは、約１０重量％以下の非溶解固体を含有する。ある実施形態において、発酵ブロスは、約５重量％以下の非溶解固体を含有する。
【００２６】
ある実施形態において、遠心分離生成物プロファイルは、非溶解固体の層と、トウモロコシ油層と、発酵性糖を含む上清層とを含み、非溶解固体層中の非溶解固体に対する上清層中の発酵性糖の重量基準による比率は、約２：１〜約５：１の範囲であり；トウモロコシ油層中のトウモロコシ油に対する上清層中の発酵性糖の重量基準による比率は、約１０：１〜約５０：１の範囲であり；トウモロコシ油層中のトウモロコシ油に対する非溶解固体層中の非溶解固体の重量基準による比率は、約２：１〜約２５：１の範囲である。
【００２７】
ある実施形態において、ブタノールを生成するための方法は、（ａ）トウモロコシ原料を提供する工程と；（ｂ）トウモロコシ原料を液化して、糖、トウモロコシ油、および非溶解固体を含む原料スラリーを生成する工程と；（ｃ）非溶解固体を原料スラリーから除去して、（ｉ）糖を含む水溶液、（ｉｉ）非溶解固体を含むウェットケーキ、および（ｉｉｉ）フリートウモロコシ油（ｆｒｅｅ  ｃｏｒｎ  ｏｉｌ）相を生成する工程と；（ｄ）水溶液を、発酵装置中のブロスと接触させる工程と；（ｅ）発酵装置中の糖を発酵させて、ブタノールを生成する工程と；（ｆ）ブタノールが生成されるにつれて、ブロスからのブタノールの原位置除去を行う工程とを含み、原料スラリーからの非溶解固体の除去により、ブタノール生成の効率が高められる。ある実施形態において、非溶解固体は、胚芽、繊維、およびグルテンを含む。ある実施形態において、本方法は、トウモロコシ原料を乾式粉砕する工程も含む。ある実施形態において、トウモロコシは分画されない。
【００２８】
ある実施形態において、工程（ｃ）は、原料スラリーを遠心分離する工程を含む。ある実施形態において、原料スラリーを遠心分離する工程は、原料スラリーを、水溶液を含む第１の液相と、ウェットケーキを含む固相と、フリートウモロコシ油を含む第２の液相とに分離する。ある実施形態において、ウェットケーキは、ウェットケーキ中に存在する糖を回収するために水で洗浄される。ある実施形態において、水溶液を含む液相は、２回以上遠心分離される。ある実施形態において、非溶解固体の少なくとも約７５重量％が、工程（ｃ）で原料スラリーから除去される。ある実施形態において、非溶解固体の少なくとも約９０重量％が、工程（ｃ）で原料スラリーから除去される。ある実施形態において、非溶解固体の少なくとも約９５重量％が、工程（ｃ）で原料スラリーから除去される。
【００２９】
ある実施形態において、原位置除去は液液抽出を含む。ある実施形態において、液液抽出のための抽出剤が有機抽出剤である。ある実施形態において、有機抽出剤はオレイルアルコールを含む。
【００３０】
ある実施形態において、ブロスは微生物を含む。ある実施形態において、微生物は、細菌または酵母細胞である。
【００３１】
ある実施形態において、ブロスの一部が、発酵装置を出て、本方法は、ブロスの一部に存在する酵母をブロスから分離する工程と、分離された酵母を発酵装置に戻す工程とをさらに含む。ある実施形態において、ブロスの一部は、原料スラリー中に存在する約２５重量％以下の非溶解固体を含む。ある実施形態において、ブロスの一部は、原料スラリー中に存在する約１０重量％以下の非溶解固体を含む。ある実施形態において、ブロスの一部は、原料スラリー中に存在する約５重量％以下の非溶解固体を含む。
【００３２】
ある実施形態において、水溶液中の糖の糖化は、発酵装置中の糖の発酵と同時に行われる。ある実施形態において、本方法は、発酵装置中の糖の発酵の前に、糖を糖化する工程も含む。ある実施形態において、工程（ｃ）は、原料スラリーを遠心分離する工程を含む。ある実施形態において、原料スラリーを遠心分離する工程は、糖を糖化する前に行われる。ある実施形態において、原料スラリーを遠心分離する工程は、糖を糖化する工程の後に行われる。
【００３３】
ある実施形態において、ブタノールはイソブタノールである。ある実施形態において、工程（ｃ）は、ブロスから抽出剤へのブタノールの液液物質移動係数を高めることによって、ブタノール生成の効率を高める。ある実施形態において、工程（ｃ）は、抽出剤によりブタノールの抽出効率を高めることによって、ブタノール生成の効率を高める。ある実施形態において、工程（ｃ）は、ブロスと抽出剤との間の相分離の速度を上げることによって、ブタノール生成の効率を高める。ある実施形態において、工程（ｃ）は、抽出剤の回収および再利用を増加させることによって、ブタノール生成の効率を高める。ある実施形態において、工程（ｃ）は、抽出剤の流量を減少させることによって、ブタノール生成の効率を高める。
【００３４】
ある実施形態において、工程（ｃ）は、抽出剤の安定化した分配係数、向上した発酵装置体積頻度（ｖｏｌｕｍｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、向上したトウモロコシ負荷供給、向上した発酵性組み換え微生物再利用、向上した水の再利用、向上したエネルギー効率、ブタノールに対する向上した組み換え微生物耐性、より低い水相力価（ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ  ｔｉｔｅｒ）、およびＤＤＧＳの向上した値のうちの１つ以上を含む。
【００３５】
ある実施形態において、ブタノールを生成するためのシステムは、（ａ）原料を液化して、原料スラリーを生成するように構成される液化槽であって、原料を受け入れるための入口、糖および非溶解固体を含む原料スラリーを排出するための出口を含む液化槽と；（ｂ）非溶解固体を原料スラリーから除去して、（ｉ）糖を含む水溶液および（ｉｉ）非溶解固体の部分を含むウェットケーキを生成するように構成される遠心分離機であって、原料スラリーを受け入れるための入口、水溶液を排出するための第１の出口、およびウェットケーキを排出するための第２の出口を含む遠心分離機と；（ｃ）発酵装置中の水溶液を発酵させて、ブタノールを生成するための発酵装置であって、水溶液を受け入れるための第１の入口、抽出剤を受け入れるための第２の入口、およびブタノールに富んだ抽出剤を排出するための第１の出口および発酵ブロスを排出するための第２の出口を含む発酵装置とを含む。ある実施形態において、遠心分離機は、非溶解固体を原料スラリーから除去しながら、生成される油を排出するための第３の出口をさらに含む。ある実施形態において、本システムは、原料スラリー中の糖を糖化するように構成される糖化槽であって、原料スラリーを受け入れるための入口および原料スラリーを排出するための出口を含む糖化槽も含む。ある実施形態において、本システムは、水溶液中の糖を糖化するように構成される糖化槽であって、水溶液を受け入れるための入口および水溶液を排出するための出口を含む糖化槽も含む。ある実施形態において、本システムは、原料を磨砕するように構成される乾式粉砕機であって、原料を受け入れるための入口および磨砕された原料を排出するための出口を含む乾式粉砕機も含む。
【００３６】
ある実施形態において、非溶解固体を含む、遠心分離機においてトウモロコシマッシュスラリーから形成されるウェットケーキは、トウモロコシマッシュスラリー中に存在する少なくとも約７５重量％の非溶解固体を含む。ある実施形態において、ウェットケーキは、トウモロコシマッシュスラリー中に存在する少なくとも約９０重量％の非溶解固体を含む。ある実施形態において、ウェットケーキは、トウモロコシマッシュスラリー中に存在する少なくとも約９５重量％の非溶解固体を含む。
【００３７】
ある実施形態において、非溶解固体を含む、遠心分離機においてトウモロコシマッシュスラリーから形成される水溶液は、トウモロコシマッシュスラリー中に存在する約２５重量％以下の非溶解固体を含む。ある実施形態において、水溶液は、トウモロコシマッシュスラリー中に存在する約１０重量％以下の非溶解固体を含む。ある実施形態において、水溶液は、トウモロコシマッシュスラリー中に存在する約５重量％以下の非溶解固体を含む。
【００３８】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を成す添付の図面は、本発明を例示し、さらに、本明細書とともに、本発明の原理を説明し、関連技術分野の当業者が本発明を行い、使用できるようにする働きを果たす。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】液化の後かつ発酵の前に、非溶解固体が遠心分離機において除去される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図２】原料が粉砕される、本発明の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図３】遠心分離機が油流を排出する、本発明の別の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図４】糖化槽が、遠心分離機と発酵装置との間に配置される、本発明の別の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図５】糖化槽が、液化槽と遠心分離機との間に配置される、本発明の別の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図６】非溶解固体を除去するために、２つの遠心分離機が連続して用いられる、本発明の別の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図７】液化されたトウモロコシでんぷん（すなわち、オリゴ糖）の水溶液から、２．０３ｍｍの内径を有するノズルを用いてオレイルアルコールを分配するときに気泡塔を通って上方に流れるオレイルアルコール液滴の分散体へのｉ−ＢｕＯＨの移動についての全体積物質移動係数、ｋＬａに対する非溶解トウモロコシマッシュ固体の存在の影響を示す。
【図８】液化されたトウモロコシでんぷん（すなわち、オリゴ糖）の水溶液から、０．７６ｍｍの内径を有するノズルを用いてオレイルアルコールを分配するときに気泡塔を通って上方に流れるオレイルアルコール液滴の分散体へのｉ−ＢｕＯＨの移動についての全体積物質移動係数、ｋＬａに対する非溶解トウモロコシマッシュ固体の存在の影響を示す。
【図９】（重力）沈降時間に応じた、発酵試料管における液液界面の位置を示す。実行時間：５．３時間、２９．３時間、５３．３時間、および７０．３時間の実行時間について示される相分離データ。固体がマッシュ原料から除去され、ＯＡが溶媒であった場合の抽出−発酵からの試料データ（２０１０Ｙ０３５）。
【図１０】（重力）沈降時間に応じた、最終的な発酵ブロスの液液界面の位置を示す。固体がマッシュ原料から除去され、ＯＡが溶媒であった場合の抽出−発酵からのデータ（２０１０Ｙ０３５）。
【図１１】バッチ１およびバッチ２についての、時間に応じたスラリーの水相中のグルコースの濃度を示す。
【図１２】バッチ３およびバッチ４についての、時間に応じたスラリーの水相中のグルコースの濃度を示す。
【図１３】でんぷんの転化に対する、酵素充填および＋／−高温段階が液化中のある時点で適用されたか否かの影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、定義を含めて本出願が優先するものとする。また、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書に記載される全ての刊行物、特許、および他の参照文献は、あらゆる目的のために、全体が参照により本明細書に援用される。
【００４１】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が、本明細書において提供される。
【００４２】
本明細書において使用される際の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはそれらの任意の他の活用形は、記載される整数または整数の群を包含するが、任意の他の整数または整数の群を除外しないことを意味することが理解されよう。例えば、要素の列挙を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるわけではなく、明示的に列挙されていないかあるいはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素を含み得る。さらに、相反する明示的な記載がない限り、「または」は、排他的な「または」ではなく包括的な「または」を指す。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のうちの１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在する）かつＢが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在しない）かつＢが真である（または存在する）、ＡおよびＢの両方とも真である（または存在する）。
【００４３】
また、本発明の要素または構成要素の前にある不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、事例の数、すなわち、要素または構成要素の出現の数に関して限定されないことが意図される。したがって、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと読まれるべきであり、要素または構成要素の単数語形は、数値が単数であることを明白に意味しない限り、複数も含む。
【００４４】
本明細書において使用される際の「発明」または「本発明」の用語は、非限定的な用語であり、特定の発明の任意の１つの実施形態を指すことは意図されず、本出願に記載される考えられる全ての実施形態を包含する。
【００４５】
本明細書において使用される際の、用いられる本発明の成分または反応剤の量を修飾する「約」という用語は、例えば、現実の世界で濃縮物または溶液を作製するのに使用される典型的な測定および液体処理手順によって；これらの手順における不注意による誤りによって；組成物を作製するかまたは方法を行うのに用いられる成分の製造、供給源、または純度の差などによって起こり得る数量の変動を指す。「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物のための平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されているか否かにかかわらず、特許請求の範囲は、量に対する均等物を含む。一実施形態において、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、あるいは報告される数値の５％以内を意味する。
【００４６】
本明細書において使用される際の「バイオマス」は、トウモロコシ、サトウキビ、小麦、セルロース系またはリグノセルロース系材料ならびにセルロース、ヘミセルロース、リグニン、でんぷん、オリゴ糖、二糖類および／または単糖類、およびそれらの混合物を含む材料などの天然資源に由来する任意の糖類およびでんぷんを含む発酵性糖を提供する加水分解性多糖類を含有する天然産物を指す。バイオマスは、タンパク質および／または脂質などのさらなる成分も含み得る。バイオマスは、１つの供給源に由来してもよく、またはバイオマスは、２つ以上の供給源に由来する混合物を含み得る。例えば、バイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシの茎葉との混合物、または草と葉との混合物を含み得る。バイオマスとしては、以下に限定はされないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙からの汚泥、庭ごみ、木くずおよび林業廃棄物が挙げられる。バイオマスの例としては、以下に限定はされないが、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物が挙げられる。例えば、マッシュ、絞り汁、糖蜜、または加水分解物が、粉砕、処理、および／または液化などによる発酵のためのバイオマスを処理するための当該技術分野において公知の任意の処理によって、バイオマスから形成され得、発酵性糖を含み、水を含み得る。例えば、セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスは、当業者に公知の任意の方法によって発酵性糖を含有する加水分解物を得るように処理され得る。低アンモニア前処理が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書に開示されている。セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスの酵素的糖化は、通常、セルロースおよびヘミセルロースを分解して、グルコース、キシロース、およびアラビノースを含む糖類を含有する加水分解物を生成するために酵素群（ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）を利用する。（セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスに適した糖化酵素は、Ｌｙｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６６：５０６−５７７，２００２）に概説されている。
【００４７】
本明細書において使用される際の可溶物含有乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）は、原料またはバイオマスの発酵（例えば、生成物アルコールを生成する穀類または穀類混合物の発酵）からの副産物または副生成物を指す。ある実施形態において、ＤＤＧＳは、生成物アルコール（例えば、ブタノール、イソブタノールなど）を作製する方法から生成される動物飼料も指す。
【００４８】
本明細書において使用される際の「発酵性炭素源」または「発酵性炭素基質」は、微生物によって代謝されることが可能な炭素源を意味する。好適な発酵性炭素源としては、以下に限定はされないが、グルコースまたはフルクトースなどの単糖類；ラクトースまたはスクロースなどの二糖類；オリゴ糖；でんぷんまたはセルロースなどの多糖類；１つの炭素基質；およびそれらの混合物が挙げられる。
【００４９】
本明細書において使用される際の「発酵性糖」は、発酵アルコールを生成するための、本明細書に開示される微生物によって代謝されることが可能な１種以上の糖類を指す。
【００５０】
本明細書において使用される際の「原料」は、発酵プロセスにおける原料であって、非溶解固体を含むかまたは含まずに発酵性炭素源を含有し、該当する場合、発酵性炭素源がでんぷんから遊離されたかあるいは液化、糖化、または他のプロセスなどによるさらなる処理によって複合糖類を分解することから得られる前または後に発酵性炭素源を含有する原料を意味する。原料は、バイオマスを含むかまたはバイオマスに由来する。好適な原料としては、以下に限定はされないが、ライ麦、小麦、トウモロコシ、トウモロコシマッシュ、サトウキビ、サトウキビマッシュ、大麦、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、またはそれらの混合物が挙げられる。「原料油」に言及される場合、この用語が、所与の原料から生成される油を包含することが理解されよう。
【００５１】
本明細書において使用される際の「発酵ブロス」は、水と、糖類（発酵性炭素源）と、溶解固体と、任意にアルコールを生成する微生物と、生成物アルコールと、存在する微生物による、アルコール、水、および二酸化炭素（ＣＯ２）への糖類の反応によって生成物アルコールが作製される発酵槽中に保持される材料の全ての他の成分との混合物を意味する。場合により、本明細書において使用される際の「発酵培地」および「発酵された混合物」という用語は、「発酵ブロス」と同義に使用することができる。
【００５２】
本明細書において使用される際の「発酵槽」は、発酵反応が行われ、それによって、ブタノールなどの生成物アルコールが糖類から作製される槽を意味する。「発酵装置」という用語は、「発酵槽」と同義に使用することができる。
【００５３】
本明細書において使用される際の「糖化槽」は、糖化（すなわち、オリゴ糖の単糖類への分解）が行われる槽を意味する。発酵および糖化が同時に行われる場合、糖化槽および発酵槽は、同じ槽であってもよい。
【００５４】
本明細書において使用される際の「糖化酵素」は、多糖類および／またはオリゴ糖、例えば、グリコーゲン、またはでんぷんのα−１，４−グルコシド結合を加水分解することが可能な１種以上の酵素を意味する。糖化酵素は、セルロース系またはリグノセルロース系材料を加水分解することが可能な酵素も含み得る。
【００５５】
本明細書において使用される際の「液化槽」は、液化が行われる槽を意味する。液化は、オリゴ糖が原料から遊離されるプロセスである。原料がトウモロコシである実施形態において、オリゴ糖は、液化中にトウモロコシでんぷん含有物から遊離される。
【００５６】
本明細書において使用される際の「糖」は、オリゴ糖、二糖類、単糖類、および／またはそれらの混合物を指す。「糖」という用語は、でんぷん、デキストラン、グリコーゲン、セルロース、ペントサン、ならびに糖類を含む炭水化物も含む。
【００５７】
本明細書において使用される際の「非溶解固体」は、液相に溶解されない原料の非発酵性部分、例えば、胚芽、繊維、およびグルテンを意味する。例えば、原料の非発酵性部分は、原料の固体として残る部分を含み、発酵ブロスから液体を吸収し得る。
【００５８】
本明細書において使用される際の「抽出剤」は、任意のブタノール異性体を抽出するのに使用される有機溶媒を意味する。
【００５９】
本明細書において使用される際の「原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）」は、生成物が生成される際に、生物学的プロセスにおける生成物濃度を制御するために、発酵などの生物学的プロセスから特定の発酵生成物を選択的に除去することを意味する。
【００６０】
本明細書において使用される際の「生成物アルコール」は、発酵性炭素基質の供給源としてバイオマスを用いる発酵プロセスにおいて微生物によって生成され得る任意のアルコールを指す。生成物アルコールとしては、以下に限定はされないが、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールが挙げられる。ある実施形態において、生成物アルコールはＣ２〜Ｃ８のアルキルアルコールである。他の実施形態において、生成物アルコールはＣ２〜Ｃ５のアルキルアルコールである。Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールとしては、以下に限定はされないが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、およびペンタノールが挙げられることが理解されよう。同様に、Ｃ２〜Ｃ８のアルキルアルコールとしては、以下に限定はされないが、エタノール、プロパノール、ブタノール、およびペンタノールが挙げられる。「アルコール」はまた、生成物アルコールに関連して本明細書において使用される。
【００６１】
本明細書において使用される際の「ブタノール」は、特に、ブタノール異性体１−ブタノール（１−ＢｕＯＨ）、２−ブタノール（２−ＢｕＯＨ）、第３級−ブタノール（ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ）、および／またはイソブタノール（ｉＢｕＯＨ、ｉ−ＢｕＯＨ、またはＩ−ＢＵＯＨ）を、個々にまたはそれらの混合物として指す。
【００６２】
本明細書において使用される際の「プロパノール」は、プロパノール異性体イソプロパノールまたは１−プロパノールを指す。
【００６３】
本明細書において使用される際の「ペンタノール」は、ペンタノール異性体１−ペンタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、３−ペンタノール、２−ペンタノール、３−メチル−２−ブタノール、または２−メチル−２−ブタノールを指す。
【００６４】
本明細書において使用される際の「水相力価」という用語は、発酵ブロス中の特定のアルコール（例えば、ブタノール）の濃度を指す。
【００６５】
本明細書において使用される際の「有効力価」という用語は、発酵によって生成される特定のアルコール（例えば、ブタノール）または発酵培地のリットル当たりの、アルコールエステル化によって生成されるアルコールエステルのアルコール同等物の総量を指す。
【００６６】
「水不混和性」または「不溶性」という用語は、１つの液相を形成するように、発酵ブロスなどの水溶液と混合することができない抽出剤または溶媒などの化学成分を指す。
【００６７】
本明細書において使用される際の「水相」という用語は、発酵ブロスを水不混和性有機抽出剤と接触させることによって得られる二相混合物の水相を指す。発酵抽出を含む本明細書に記載されるプロセスの一実施形態において、「発酵ブロス」という用語は、この場合、二相性発酵抽出における水相を特に指す。
【００６８】
本明細書において使用される際の「有機相」という用語は、発酵ブロスを水不混和性有機抽出剤と接触させることによって得られる二相混合物の非水相を指す。
【００６９】
本発明は、バイオマスの処理生産性および費用対効果を高めつつ、発酵によって生成物アルコールなどの発酵生成物を生成するためのシステムおよび方法を提供する。ある実施形態において、生成物アルコールはブタノールである。原料は、液化されて、原料スラリーを生成することができ、ここで、原料スラリーは、可溶性糖および非溶解固体を含む。原料スラリーが、発酵装置に直接供給される場合、非溶解固体は、発酵装置からの、ブタノールなどの生成物アルコールの効率的な除去および回収を妨げ得る。特に、液液抽出が、発酵ブロスからブタノールを抽出するのに用いられる場合、非溶解粒子の存在は、抽出剤と発酵ブロスとの接触を妨げることによって、抽出剤へのブタノールの物質移動速度を低下させること；発酵装置中でエマルジョンを生成し、それによって、抽出剤および発酵ブロスの良好な相分離を妨げること；抽出剤およびブタノールの少なくとも一部が、可溶物含有乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）として最終的に除去される固体に「捕捉される」ため、抽出剤を回収し、再利用する効率を低下させること；発酵装置中の体積を占める固体があるため、また、発酵ブロスからの抽出剤の離脱がより遅いため、発酵装置体積効率がより低いこと；およびトウモロコシ油による汚染によって抽出剤の寿命が短縮されることを含むがこれらに限定されないシステムの非効率を招き得る。これらの影響は全て、資本コストおよび運転コストを増加させる。さらに、ＤＤＧＳに「捕捉される」抽出剤は、ＤＤＧＳ値および動物飼料として販売するための必要条件から外れ得る。したがって、これらの問題を回避し、および／または最小限に抑えるために、非溶解粒子（または固体）の少なくとも一部が、原料スラリー中に存在する糖を発酵装置に加える前に原料スラリーから除去される。ブタノール生成の抽出活性および効率が、非溶解粒子が除去されていない水溶液を含有する発酵ブロスにおいて行われる抽出と比べて、非溶解粒子が除去された水溶液を含有する発酵ブロスにおいて抽出が行われる場合に高められる。
【００７０】
本発明のシステムおよび方法が、図面を参照して説明される。ある実施形態において、例えば、図１に示されるように、システムは、原料を液化して、原料スラリーを生成するように構成される液化槽１０を含む。
【００７１】
特に、原料１２は、液化槽１０の入口に導入され得る。原料１２は、でんぷんなどの発酵性炭素源を含有する、ライ麦、小麦、サトウキビ、またはトウモロコシを含むがこれらに限定されない当業界で公知の任意の好適なバイオマス材料であり得る。
【００７２】
原料１２を液化するプロセスは、原料１２中のでんぷんを加水分解して水溶性糖にすることを含み、従来のプロセスである。酸プロセス、酸−酵素プロセス、または酵素プロセスを含むがこれらに限定されない、当業界で通常用いられる、任意の公知の液化プロセス、ならびに対応する液化槽が使用され得る。このようなプロセスは、単独でまたは組み合わせて使用され得る。ある実施形態において、酵素プロセスを用いることができ、適切な酵素１４、例えば、α−アミラーゼが、液化槽１０の入口に導入される。水も液化槽１０に導入され得る。
【００７３】
原料１２を液化するプロセスは、原料またはバイオマスに由来する糖（例えば、発酵性炭素）および非溶解固体を含む原料スラリー１６を生成する。非溶解固体は、原料１２の非発酵性部分である。ある実施形態において、原料１２は、乾式粉砕された、分画されていないトウモロコシの実などのトウモロコシであり得、非溶解粒子は、胚芽、繊維、およびグルテンを含み得る。原料スラリー１６は、液化槽１０の出口から排出され得る。ある実施形態において、原料１２は、トウモロコシまたはトウモロコシの実であり、原料スラリー１６は、トウモロコシマッシュスラリーである。
【００７４】
非溶解固体を原料スラリー１６から除去するように構成される遠心分離機２０は、原料スラリー１６を受け入れるための入口を有する。遠心分離機２０は、原料スラリー１６を撹拌し、または回転させて、液相または水溶液２２および固相またはウェットケーキ２４を生成する。
【００７５】
水溶液２２は、例えば、オリゴ糖の形態の糖、および水を含み得る。水溶液は、少なくとも約１０重量％のオリゴ糖、少なくとも約２０重量％のオリゴ糖、または少なくとも約３０重量％のオリゴ糖を含み得る。水溶液２２は、遠心分離機２０の上部の近くに位置する出口から排出され得る。水溶液は、約２０センチポアズ未満の粘度を有し得る。水溶液は、約２０ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコース、より好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満、または約５ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコースを含み得る。モノマーグルコースの量を決定するための好適な方法は、当該技術分野において周知である。当該技術分野において公知のこのような好適な方法は、ＨＰＬＣを含む。
【００７６】
ウェットケーキ２４は、非溶解固体を含み得る。ウェットケーキ２４は、遠心分離機２０の底部の近くに位置する出口から排出され得る。ウェットケーキ２４は、糖および水の一部も含み得る。水溶液２２が遠心分離機２０から排出されてから、ウェットケーキ２４は、遠心分離機２０においてさらなる水で洗浄され得る。あるいは、ウェットケーキ２４は、別個の遠心分離機においてさらなる水で洗浄され得る。ウェットケーキ２４の洗浄により、ウェットケーキ中に存在する糖または糖源（例えば、オリゴ糖）を回収し、回収された糖および水は、液化槽１０に再利用され得る。洗浄後、ウェットケーキ２４は、任意の好適な公知の方法によって、乾燥されて、可溶物含有乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）が形成され得る。遠心分離機２０において形成されるウェットケーキ２４からのＤＤＧＳの形成にはいくつかの利点がある。非溶解固体が発酵装置に送られないため、抽出剤および／またはブタノールがＤＤＧＳに捕捉されず、ＤＤＧＳが発酵装置の条件に供されず、ＤＤＧＳが、発酵装置中に存在する微生物と接触しない。全てのこれらの影響が、例えば動物飼料としてのＤＤＧＳの後の処理および販売に利点を与える。
【００７７】
遠心分離機２０は、例えば、デカンターボウル遠心分離機、トリカンター遠心分離機、ディスクスタック遠心分離機、ろ過遠心分離機、またはデカンター遠心分離機を含む、当業界で用いられる任意の従来の遠心分離機であり得る。ある実施形態において、原料スラリー１６からの非溶解固体の除去は、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、火格子（ｇｒａｔｅ）または格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、または液体から固体を分離するのに使用され得る任意の方法によって行うことができる。一実施形態において、非溶解固体が、トウモロコシマッシュから除去されて、２種の生成物流、例えば、トウモロコシマッシュと比較してより低い濃度の固体を含有するオリゴ糖の水溶液およびトウモロコシマッシュと比較してより高い濃度の固体を含有するウェットケーキが形成され得る。さらに、トリカンター遠心分離機が、トウモロコシマッシュからの固体の除去に用いられる場合、トウモロコシ油を含有する第３の流れが生成され得る。したがって、いくつかの生成物流が、様々な分離技術またはそれらの組合せを用いて生成され得る。
【００７８】
ある実施形態において、ウェットケーキ２４は、遠心分離機２０において、原料スラリー１６、例えば、トウモロコシマッシュスラリーから形成される組成物であり、ここで、ウェットケーキ２４は、原料スラリー中に存在する少なくとも約５０重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約５５重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約６０重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約６５重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約７０重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約７５重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約８０重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約８５重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約９０重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約９５重量％の非溶解粒子、または原料スラリー中に存在する約９９重量％の非溶解粒子を含む。
【００７９】
ある実施形態において、遠心分離機２０において、原料スラリー１６、例えば、トウモロコシマッシュスラリーから形成される水溶液２２は、原料スラリー中に存在する約５０重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約４５重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約４０重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約３５重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約３０重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約２５重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約２０重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約１５重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約１０重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約５重量％以下の非溶解粒子、または原料スラリー中に存在する約１重量％の非溶解粒子を含む。
【００８０】
水溶液２２を発酵させて、ブタノールを生成するように構成される発酵装置３０は、水溶液２２を受け入れるための入口を有する。発酵装置３０は、発酵ブロスを含み得る。細菌、シアノバクテリア、糸状菌、および酵母からなる群から選択される微生物３２が、発酵ブロスに含まれるべく発酵装置３０に導入される。ある実施形態において、微生物３２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌であり得る。ある実施形態において、微生物３２は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり得る。微生物３２は、水溶液２２中の糖を消費し、ブタノールを生成する。微生物による発酵を用いたブタノールの生成、ならびに高収率のブタノールを生成する微生物は公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書に開示されており、その開示内容の全体が、本明細書に援用される。ある実施形態において、微生物３２は、発酵性組み換え微生物であり得る。
【００８１】
ある実施形態において、微生物３２は、生合成経路を含むように改変される。ある実施形態において、生合成経路は、ブタノール生合成経路である。ある実施形態において、生合成経路は、ピルビン酸塩を発酵生成物に転化する。ある実施形態において、生合成経路は、生合成経路の基質−生成物転化を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種のポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、生合成経路の各基質−生成物転化は、異種のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドによって触媒される。
【００８２】
ブタノールが微生物によって生成されるにつれて、原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）を用いて、例えば、液液抽出によって、発酵装置３０からブタノールを除去することができる。液液抽出は、以下に簡単に記載され、開示内容の全体が、本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書に記載される方法にしたがって行われ得る。
【００８３】
発酵装置３０は、抽出剤３４を受け入れるための入口を有する。抽出剤３４は、飽和、単不飽和、多価不飽和（およびそれらの混合物）Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される有
機抽出剤であり得る。抽出剤はまた、飽和、単不飽和、多価不飽和（およびそれらの混合物）Ｃ４〜Ｃ２２の脂肪アルコール、Ｃ４〜Ｃ２８の脂肪酸、Ｃ４〜Ｃ２８の脂肪酸のエステル、Ｃ４〜Ｃ２２の脂肪アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得る。抽出剤３４は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、１−ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリンアルデヒド、２０−メチルウンデカナール、およびそれらの混合物などの有機抽出剤であり得る。抽出剤３４は、発酵ブロスと接触し、発酵ブロス中に存在するブタノールが、抽出剤３４に移される。ブタノールに富んだ抽出剤の流れ３６が、発酵装置３０の出口を通って排出される。その後、ブタノールは、従来の技術を用いて、流れ３６中の抽出剤から分離される。原料流が、発酵装置３０に加えられ得る。発酵装置３０は、当該技術分野において公知の任意の好適な発酵装置であり得る。
【００８４】
ある実施形態において、発酵装置３０の内部で同時に糖化および発酵が行われ得る。酸プロセス、酸−酵素プロセス、または酵素プロセスを含むがこれらに限定されない、当業界で通常用いられる、任意の公知の糖化プロセスが使用され得る。ある実施形態において、グルコアミラーゼなどの酵素３８が、水溶液２２中に存在するオリゴ糖の形態の糖類を分解して単糖類にするために、発酵装置３０の入口に導入され得る。
【００８５】
ある実施形態において、発酵ブロス４０が、発酵装置３０の出口から排出され得る。排出される発酵ブロス４０は、酵母などの微生物３２を含み得る。微生物３２は、例えば、遠心分離機（図示せず）において、発酵ブロス４０から容易に分離され得る。その後、微生物３２は、発酵装置３０に再利用することができ、発酵装置３０は、時間の経過とともにブタノールの生成速度を上げ、それによって、ブタノール生成の効率を高めることができる。
【００８６】
発酵ブロス４０の一部が発酵装置３０を出るとき、発酵ブロス４０は、原料スラリー中に存在する約５０重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約４５重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約４０重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約３５重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約３０重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約２５重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約２０重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約１５重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約１０重量％以下の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する約５重量％以下の非溶解粒子、または原料スラリー中に存在する約１重量％以下の非溶解粒子を含む。
【００８７】
ある実施形態において、例えば、図２に示されるように、本発明のシステムおよび方法は、原料５２を乾式粉砕するように構成される粉砕機５０を含み得る。原料５２は、図１の原料１２と同じであり得、入口を通って粉砕機５０に入り得る。粉砕機５０は、原料５２を粉砕または磨砕し得る。ある実施形態において、原料５２は、分画されなくてもよい。ある実施形態において、原料５２は、分画されていないトウモロコシの実であり得る。粉砕機５０は、任意の好適な公知の粉砕機、例えば、ハンマーミルであり得る。乾式粉砕された原料５４は、出口を通して粉砕機５０から排出され、液化槽１０に入る。図２の残りの部分は図１と同一であるため、再度説明しない。他の実施形態において、原料は、分画されないか、および／または乾式粉砕される代わりに、当業界で公知のように分画および／または湿式粉砕され得る。
【００８８】
湿式粉砕は、各副産物から別々に価値を得るために、バイオマス（例えば、トウモロコシ）をその主要な構成要素（胚芽、種皮繊維、でんぷん、およびグルテン）に分離する多工程プロセスである。このプロセスにより、精製されたでんぷん流が得られるが；このプロセスはコストがかかり、バイオマスを、発酵アルコール生成に不要なその非でんぷん構成要素に分離することを含む。分画により、磨砕された全粒トウモロコシ中に存在する脂質の大部分を含有する繊維および胚芽が除去され、より高いでんぷん（胚乳）含量を有する分画されたトウモロコシが得られる。乾式分画は、繊維から胚芽を分離しないため、湿式粉砕よりコストが低い。しかしながら、分画は、繊維または胚芽の全体を除去せず、固体を完全に除去しない。さらに、分画の際にでんぷんをいくらか損失する。トウモロコシの湿式粉砕は、乾式分画よりさらにコストが高いが、乾式分画は、分画されていないトウモロコシの乾式磨砕よりコストが高い。
【００８９】
ある実施形態において、例えば、図３に示されるように、本発明のシステムおよび方法は、遠心分離機２０の出口からの油２６の排出を含み得る。図３は、油流２６が遠心分離機２０を出ることを除いて図１と同一であるため、再度詳細に説明しない。
【００９０】
原料スラリー１６は、第１の液相または発酵性糖を含有する水溶液２２と、固相または非溶解固体を含有するウェットケーキ２４と、遠心分離機２０を出ることができる油２６を含有する第２の液相とに分離される。ある実施形態において、原料１２はトウモロコシであり、油２６は、フリートウモロコシ油である。本明細書において使用される際のフリートウモロコシ油という用語は、トウモロコシの胚芽を含まないトウモロコシ油を意味する。例えば、トリカンター遠心分離機といった任意の好適な従来の遠心分離機を用いて、水溶液２２、ウェットケーキ２４、および油２６を排出することができる。ある実施形態において、原料がトウモロコシである場合、トウモロコシ油などの原料１２からの油の一部が、ウェットケーキ２４中に残る。このような場合、ウェットケーキ２４は、ウェットケーキ２４の乾燥固形分の約２０重量％未満の量のトウモロコシ油を含む。
【００９１】
ある実施形態において、原料１２（例えば、トウモロコシ）およびトウモロコシ油２６が、遠心分離機２０から除去されるとき、発酵装置３０中の発酵ブロスは、減少された量のトウモロコシ油を含む。例えば、非溶解固体を実質的に含まない発酵ブロスは、生成物アルコール部分（例えば、ブタノール）および油部分（例えば、トウモロコシ油）を、重量基準で少なくとも約４：１の比率で含み得る。トウモロコシ油は、少なくとも１５重量％の遊離脂肪酸、例えば、１６．７重量％の遊離脂肪酸を含有し得る。ある実施形態において、発酵ブロスは、約２５重量％以下の非溶解固体を有し、発酵ブロスは、約１５重量％以下の非溶解固体を有し、発酵ブロスは、約１０重量％以下の非溶解固体を有し、発酵ブロスは、約５重量％以下の非溶解固体を有し、発酵ブロスは、約１重量％以下の非溶解固体を有し、または発酵ブロスは、約０．５重量％以下の非溶解固体を有する。
【００９２】
ある実施形態において、遠心分離機２０は、非溶解固体の層、油（例えば、トウモロコシ油）の層、および発酵性糖を含む上清層を含む生成物プロファイルを生成する。重量基準における非溶解固体層中の非溶解固体に対する上清層中の発酵性糖の比率は、約２：１〜約５：１の範囲であり得；重量基準におけるトウモロコシ油層中のトウモロコシ油に対する上清層中の発酵性糖の比率は、約１０：１〜約５０：１の範囲であり得；および／または重量基準におけるトウモロコシ油層中のトウモロコシ油に対する非溶解固体層中の非溶解固体の比率は、約２：１〜約２５：１の範囲であり得る。
【００９３】
ある実施形態において、図２のシステムおよび方法は、図３のシステムおよび方法に関連して上述した遠心分離機２０からの油流の排出を含むように変更され得る。
【００９４】
油２６が、別々に排出されない場合、ウェットケーキ２４とともに除去され得る。ウェットケーキ２４が、遠心分離機２０を介して除去されるとき、ある実施形態において、原料がトウモロコシである場合、トウモロコシ油などの原料１２からの油の一部が、ウェットケーキ２４中に残る。水溶液２２が遠心分離機２０から排出されてから、ウェットケーキ２４は、遠心分離機においてさらなる水で洗浄され得る。ウェットケーキ２４の洗浄により、ウェットケーキ中に存在する糖（例えば、オリゴ糖）を回収し、回収された糖および水は、液化槽１０に再利用され得る。洗浄後、ウェットケーキ２４は、任意の好適な公知の方法によって、可溶物と組み合わされ、次に、乾燥されて、可溶物含有乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）が形成され得る。遠心分離機２０において形成されるウェットケーキ２４からのＤＤＧＳの形成にはいくつかの利点がある。非溶解固体が発酵槽に送られないため、ＤＤＧＳは、抽出剤および／またはブタノールなどの生成物アルコールを捕捉せず、ＤＤＧＳは、発酵槽の条件に供されず、発酵槽中に存在する微生物と接触しない。全てのこれらの利点が、例えば、動物飼料としてのＤＤＧＳの処理および販売をより容易にする。ある実施形態において、油２６は、ウェットケーキ２４から別々に排出されず、油２６は、ウェットケーキ２４の一部として含まれ、最終的にＤＤＧＳ中に存在する。このような場合、油は、ＤＤＧＳから分離され、同じかまたは異なるアルコール発酵プロセスにおいてその後の使用のためにＩＳＰＲ抽出剤に転化され得る。
【００９５】
油２６は、例えば、溶媒抽出プロセスを含む任意の好適な公知の方法を用いてＤＤＧＳから分離され得る。本発明の一実施形態において、ＤＤＧＳは、抽出槽に充填され、ヘキサンなどの溶媒で洗浄されて、油２６が除去される。用いられ得る他の溶媒としては、例えば、イソブタノール、イソヘキサン、エタノール、石油エーテルなどの石油蒸留物、またはそれらの混合物が挙げられる。油２６の抽出の後、ＤＤＧＳは、一切の残留溶媒を除去するように処理され得る。例えば、ＤＤＧＳは、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて、一切の残留溶媒を蒸発させるように加熱され得る。溶媒を除去した後、ＤＤＧＳは、一切の残留水を除去するように乾式処理に供され得る。処理されたＤＤＧＳは、家禽、家畜、およびペットなどの動物用の補足飼料として使用され得る。
【００９６】
ＤＤＧＳからの抽出の後、得られる油２６および溶媒混合物は、溶媒から油２６を分離するために収集され得る。一実施形態において、油２６／溶媒混合物は、蒸発によって処理されてもよく、それによって、溶媒は蒸発され、収集され、再利用され得る。回収された油は、同じかまたは異なるアルコール発酵プロセスにおいてその後の使用のためにＩＳＰＲ抽出剤に転化され得る。
【００９７】
発酵装置中に存在する油が脂肪酸およびグリセリンに分解し得るため、原料の油成分の除去はブタノール生成にとって有利である。グリセリンは、水中に蓄積し、システム全体にわたって再利用のために利用可能な水の量を減少させ得る。したがって、原料の油成分の除去は、システムを通して再利用され得る水の量を増加させることによって、生成物アルコール生成の効率を高める。
【００９８】
ある実施形態において、例えば、図４および５に示されるように、糖化は、遠心分離機２０と発酵装置３０と間（図４）または液化槽１０と遠心分離機２０との間（図５）に位置する別個の糖化槽６０において行われ得る。図４および５は、別個の糖化槽６０を含むことおよび発酵装置３０が酵素３８を受け入れないことを除いて、図１と同一である。
【００９９】
上述したように、酸プロセス、酸−酵素プロセス、または酵素プロセスを含むがこれらに限定されない、当業界で通常用いられる任意の公知の糖化プロセスが使用され得る。糖化槽６０が、任意の好適な公知の糖化槽であり得る。ある実施形態において、グルコアミラーゼなどの酵素３８が、オリゴ糖の形態の糖類を単糖類に分解するために、糖化槽６０の入口に導入され得る。例えば、図４において、遠心分離機２０から排出され、入口を通して糖化槽６０に受け入れられる、水流２２中に存在するオリゴ糖が、単糖類に分解される。したがって、単糖類を含有する水溶液６２が、出口を通して糖化槽６０から排出され、発酵装置３０に受け入れられる。あるいは、図５に示されるように、液化槽１０から排出され、入口を通して糖化槽６０に受け入れられる、原料スラリー１６中に存在するオリゴ糖が、単糖類に分解される。したがって、単糖類を含有する原料スラリー６４が、出口を通して糖化槽６０から排出され、遠心分離機２０に受け入れられる。
【０１００】
ある実施形態において、図２および３のシステムおよび方法は、図４および５のシステムおよび方法に関連して上述したように別個の糖化槽６０を含むように変更され得る。
【０１０１】
ある実施形態において、例えば、図６に示されるように、本発明のシステムおよび方法は、一連の２つ以上の遠心分離機を含み得る。図６は、第２の遠心分離機２０’が追加されたことを除いて図１と同一であるため、再度詳細に説明しない。
【０１０２】
遠心分離機２０から排出される水溶液２２は、遠心分離機２０’の入口に受け入れられ得る。遠心分離機２０’は遠心分離機２０と同一であり得、同じように運転され得る。遠心分離機２０’は、遠心分離機２０において水溶液２２から分離されない非溶解固体を除去して、（ｉ）水流２２と比較して減少された量の非溶解固体を含有する以外は水流２２と同様の水流２２’および（ｉｉ）ウェットケーキ２４と同様のウェットケーキ２４’を生成し得る。次に、水流２２’は、発酵装置３０に導入され得る。ある実施形態において、遠心分離機２０’の後に１つ以上のさらなる遠心分離機が存在し得る。
【０１０３】
ある実施形態において、図２〜６のシステムおよび方法は、図６のシステムおよび方法に関連して上述したように非溶解固体を除去するためのさらなる遠心分離機を含むように変更され得る。
【０１０４】
ある実施形態において、発酵ブロス４０は、発酵装置３０の出口から排出され得る。発酵ブロス４０とともに発酵装置３０を出る非溶解固体がないかまたは最小限であることには、いくつかのさらなる利点がある。例えば、ビール塔（ｂｅｅｒ  ｃｏｌｕｍｎ）または蒸留塔などの、例えば、下流の処理におけるユニットおよび作業の必要性をなくし、それによって、生成物アルコール生成の効率を高めることができる。また、発酵装置を出る最終的なブロス中の非溶解固体がより少ないことの結果として、全蒸留廃液（ｗｈｏｌｅ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）の遠心分離機の一部または全てを省略することができる。
【０１０５】
図１〜６に開示されるプロセスおよびシステムは、非溶解固体を原料スラリー１６から除去する工程を含み、結果として、バイオマスの処理生産性および費用対効果を向上する。向上した生産性は、発酵の前に非溶解固体を除去しないプロセスおよびシステムと比べて、ブタノール生成の向上した効率および／または向上した抽出活性を有することを含み得る。
【０１０６】
上述したように、非溶解固体は、ＤＤＧＳまたは脂肪酸エステルなどの他の副生成物を生成するようにさらに処理され得る。例えば、脂肪酸エステルは、炭水化物の、生成物アルコール（例えば、ブタノール）への収率を高めるために回収され得る。これは、溶媒を用いて、例えば、いくつかの副生成物流を組み合わせて混合し、組み合わせて混合する工程の生成物を乾燥させることによって形成される副生成物から脂肪酸エステルを抽出することによって行われ得る。ＤＤＧＳからトウモロコシ油トリグリセリドを回収するためのこのような溶媒系の抽出システムは、米国特許出願公開第２０１０／００９２６０３号明細書に記載されており、その教示内容が、参照により本明細書に援用される。
【０１０７】
脂肪酸エステルの溶媒抽出の一実施形態において、固体が、全蒸留廃液から分離され得る（「分離された固体」）が、これは、その流れが、組み合わされない副生成物流中の脂肪酸エステルの最も多い割合を含有し得るためである。次に、これらの分離された固体は、抽出器に供給され、溶媒で洗浄され得る。一実施形態において、分離された固体の全ての側が溶媒で確実に洗浄されるように、分離された固体は、少なくとも１回、回転される。洗浄後、ミセラとして知られている、脂質と溶媒との得られる混合物が、溶媒からの抽出される脂質の分離のために収集される。例えば、脂質と溶媒との得られる混合物は、さらなる処理のために分離器に堆積され得る。抽出プロセスの際、溶媒が分離された固体を洗浄するにつれて、溶媒は、脂質を溶液に入れるだけでなく、固体微粒子も収集する。これらの「微粒子」は、一般に、ミセラ中の望ましくない不純物であり、一実施形態において、ミセラは、ミセラから微粒子を分離するかまたは洗い落とす（ｓｃｒｕｂ）装置によって、抽出器または分離器から排出され得る。
【０１０８】
ミセラ中に含まれる脂質および溶媒を分離するために、ミセラは、蒸留工程に供され得る。この工程において、ミセラは、例えば、蒸発器によって処理することができ、蒸発器は、溶媒を蒸発させるのに十分に高いが、抽出される脂質に悪影響を与えるかまたは蒸発させるほど十分高くはない温度にミセラを加熱する。溶媒が蒸発するにつれて、溶媒は、例えば、凝縮器に収集され、将来の使用のために再利用され得る。ミセラからの溶媒の分離により、粗脂質の蓄積が得られ、これは、水、脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸イソブチルエステル）、脂肪酸、およびトリグリセリドを分離するようにさらに処理され得る。
【０１０９】
脂質の抽出の後、固体は、抽出器の外に送られ、残留溶媒を除去するストリッピングプロセスに供され得る。残留溶媒の回収は、プロセス経済性にとって重要である。一実施形態において、湿潤固体は、溶媒が脱溶媒器（ｄｅｓｏｌｖｅｎｔｉｚｅｒ）に送られる際に湿潤固体から一時的に蒸発する溶媒を貯蔵し、収集するための気密（ｖａｐｏｒ  ｔｉｇｈｔ）環境に送られ得る。固体が脱溶媒器に入る際、固体は加熱されて、残留溶媒が蒸発され、除去され得る。固体を加熱するために、脱溶媒器は、固体を１つ以上のトレイに分配するための機構を含んでいてもよく、固体は、加熱された空気または蒸気との直接接触などによって、直接加熱されるか、あるいは食事を運ぶトレイを加熱することなどによって間接的に加熱され得る。１つのトレイから別のトレイへの固体の移動を容易にするために、固体を運ぶトレイは、固体を１つのトレイから次のトレイへと送らせる開口部を含み得る。脱溶媒器から、固体は、任意に、混合器に送られてもよく、ここで、固体は、乾燥器に送られる前に、他の副生成物と混合される。この例では、固体は、脱溶媒器に供給され、ここで、固体は、蒸気によって接触される。一実施形態において、脱溶媒器中の蒸気および固体の流れは、逆行していてもよい。次に、固体は、脱溶媒器を出て、乾燥器または任意に混合器に供給されてもよく、ここで、様々な副生成物が混合され得る。脱溶媒器を出る蒸気は凝縮され、任意にミセラと混合され、次にデカンターに供給され得る。デカンターを出る水富化相は、蒸留塔に供給されてもよく、ここで、ヘキサンが、水富化流から除去される。一実施形態において、ヘキサン減損水富化流は、蒸留塔の塔底を出て、発酵プロセスに戻って再利用されてもよく、例えば、それは、磨砕されたトウモロコシ固体をスラリー化するために使用され得る。別の実施形態において、塔頂および塔底生成物は、発酵プロセスに再利用され得る。例えば、脂質富化塔底物は、加水分解装置の原料に加えられ得る。塔頂物は、例えば、凝縮され、デカンターに供給され得る。このデカンターを出るヘキサン富化流は、抽出器への溶媒原料の一部として任意に使用され得る。このデカンターを出る水富化相は、ヘキサンを水から取り除く塔に供給され得る。当業者が理解することができるように、本発明の方法は、ブタノールなどの生成物アルコールの生成のための発酵プロセスを最適化するために様々な方法で変更され得る。
【０１１０】
さらなる実施形態において、副生成物（または副産物）が、発酵プロセスに使用されるマッシュから得られる。例えば、トウモロコシ油は、マッシュから分離され得、このトウモロコシ油は、トリグリセリド、遊離脂肪酸、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質（例えば、実施例２０を参照）を含有し得る。トウモロコシ油は、様々な率で、他の副生成物（または副産物）に任意に加えられてもよく、したがって、例えば、得られる副生成物中のトリグリセリドの量を変化させる能力を生み出す。このように、得られる副生成物の脂肪含量は、例えば、高脂肪製品と比較して乳牛の必要性によく適合するであろうより低脂肪で高タンパク質の動物飼料が得られるように制御され得る。
【０１１１】
一実施形態において、マッシュから分離された粗トウモロコシ油は、消費者用途向けの食用油へとさらに処理されてもよく、またはその高いトリグリセリド含量により代謝エネルギーの優れた供給源となり得るため、動物飼料の成分としても使用され得る。別の実施形態において、この粗トウモロコシ油は、バイオディーゼルまたは再生可能ディーゼルの原料としても使用され得る。
【０１１２】
一実施形態において、抽出剤副生成物は、動物飼料副生成物の成分として、全てまたは部分的に使用されてもよく、またはバイオディーゼルまたは再生可能ディーゼルの原料として使用され得る。
【０１１３】
さらなる実施形態において、固体は、マッシュから分離されてもよく、トリグリセリドおよび遊離脂肪酸を含み得る。これらの固体（または流れ）は、動物飼料として使用されてもよく、遠心分離からの排出としてまたは乾燥後のいずれかで回収される。固体（またはウェットケーキ）は、利用可能なリジンおよびバイパスまたは第一胃非分解性タンパク質の含量が高いため、反すう動物（例えば、乳牛）の飼料として特に適し得る。例えば、これらの固体は、高タンパク質、低脂肪の飼料に特に有用であり得る。別の実施形態において、これらの固体は、基剤として使用されてもよく、すなわち、シロップなどの他の副生成物が、動物飼料として使用され得る生成物を形成するためにこの固体に加えられてもよい。別の実施形態において、様々な量の他の副生成物が、得られる生成物の特性が特定の動物種の必要性を満たすように調整するために固体に加えられてもよい。
【０１１４】
実施例２１に記載される全蒸留廃液から分離される固体の組成物は、例えば、粗タンパク質、脂肪酸、および脂肪酸イソブチルエステルを含み得る。一実施形態において、この組成物（または副生成物）は、動物飼料として湿潤または乾燥した状態で使用されてもよく、その場合、例えば、高タンパク質（例えば、高リジン）、低脂肪、および高い繊維含量が所望される。別の実施形態において、より高脂肪、低繊維の動物飼料が所望される場合、例えば、別の副生成物流から、脂肪がこの組成物に加えられてもよい。一実施形態において、このより高脂肪、低繊維の動物飼料は、ブタまたは家禽に使用され得る。さらなる実施形態において、凝縮蒸留可溶物（Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｓｏｌｕｂｌｅ）（ＣＤＳ）（例えば、実施例２１を参照）の非水性組成物は、例えば、タンパク質、脂肪酸、および脂肪酸イソブチルエステルならびに塩および炭水化物などの他の溶解および懸濁固体を含み得る。このＣＤＳ組成物は、例えば、動物飼料として湿潤または乾燥した状態で使用されてもよく、その場合、高タンパク質、低脂肪、高無機塩の飼料成分が所望される。一実施形態において、この組成物は、乳牛の飼料の成分として使用されてもよい。
【０１１５】
別の実施形態において、発酵プロセスからの油が、蒸発によって回収され得る。この非水性組成物は、脂肪酸イソブチルエステルおよび脂肪酸（例えば、実施例２０を参照）を含んでいてもよく、この組成物（または流れ）は、イソブタノールおよび脂肪酸を回収するために加水分解装置に供給され得る。さらなる実施形態において、この流れは、バイオディーゼル生成の原料として使用され得る。
【０１１６】
発酵プロセスによるアルコール（例えば、ブタノール）の生成によって生成される様々な流れは、いくつかの副産物を生成するために多くの方法で組み合わされ得る。例えば、マッシュからの粗トウモロコシを用いて、抽出剤として用いられる脂肪酸を生成し、脂質が、他の目的のために蒸発器によって抽出される場合、残りの流れが、組み合わされ、粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、および脂肪酸イソブチルエステルを含む副産物組成物を生成するように処理され得る。一実施形態において、この組成物は、少なくとも約２０〜３５重量％の粗タンパク質、少なくとも約１〜２０重量％の粗脂肪、少なくとも約０〜５重量％のトリグリセリド、少なくとも約４〜１０重量％の脂肪酸、および少なくとも約２〜６重量％の脂肪酸イソブチルエステルを含み得る。特定の一実施形態において、副産物組成物は、約２５重量％の粗タンパク質、約１０重量％の粗脂肪、約０．５重量％のトリグリセリド、約６重量％の脂肪酸、および約４重量％の脂肪酸イソブチルエステルを含み得る。
【０１１７】
別の実施形態において、脂質は、蒸発器によって抽出され、脂肪酸は、他の目的のために使用され、マッシュからの粗トウモロコシの約５０重量％および残りの流れが、組み合わされ、処理され、得られる副産物組成物は、タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、および脂肪酸イソブチルエステルを含み得る。一実施形態において、この組成物は、少なくとも約２５〜３１重量％の粗タンパク質、少なくとも約６〜１０重量％の粗脂肪、少なくとも約４〜８重量％のトリグリセリド、少なくとも約０〜２重量％の脂肪酸、および少なくとも約１〜３重量％の脂肪酸イソブチルエステルを含み得る。特定の一実施形態において、副産物組成物は、約２８重量％の粗タンパク質、約８重量％の粗脂肪、約６重量％のトリグリセリド、約０．７重量％の脂肪酸、および約１重量％の脂肪酸イソブチルエステルを含み得る。
【０１１８】
別の実施形態において、全蒸留廃液から分離される固体およびマッシュから抽出されるトウモロコシ油の５０重量％が、組み合わされ、得られる副産物組成物は、粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸イソブチルエステル、リジン、中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、および酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）を含み得る。一実施形態において、この組成物は、少なくとも約２６〜３４重量％の粗タンパク質、少なくとも約１５〜２５重量％の粗脂肪、少なくとも約１２〜２０重量％のトリグリセリド、少なくとも約１〜２重量％の脂肪酸、少なくとも約２〜４重量％の脂肪酸イソブチルエステル、少なくとも約１〜２重量％のリジン、少なくとも約１１〜２３重量％のＮＤＦ、および少なくとも約５〜１１重量％のＡＤＦを含み得る。特定の一実施形態において、副産物組成物は、約２９重量％の粗タンパク質、約２１重量％の粗脂肪、約１６重量％のトリグリセリド、約１重量％の脂肪酸、約３重量％の脂肪酸イソブチルエステル、約１重量％のリジン、約１７重量％のＮＤＦ、および約８重量％のＡＤＦを含み得る。この副産物組成物の高脂肪、高トリグリセリド、および高リジン含量およびより低い繊維含量は、ブタおよび家禽の飼料として望ましいことがある。
【０１１９】
上述したように、発酵プロセスによるアルコール（例えば、ブタノール）の生成によって生成される様々な流れは、粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、および脂肪酸イソブチルエステルを含む副産物組成物を生成するために多くの方法で組み合わされ得る。例えば、少なくとも約６％の粗脂肪および少なくとも約２８％の粗タンパク質を含む組成物が、乳畜の動物飼料製品として用いられ得る。少なくとも約６％の粗脂肪および少なくとも約２６％の粗タンパク質を含む組成物が、フィードロット牛の動物飼料製品として用いられ得る一方、少なくとも約１％の粗脂肪および少なくとも約２７％の粗タンパク質を含む組成物が、越冬牛の動物飼料製品として用いられ得る。少なくとも約１３％の粗脂肪および少なくとも約２７％の粗タンパク質を含む組成物が、家禽の動物飼料製品として用いられ得る。少なくとも約１８％の粗脂肪および少なくとも約２２％の粗タンパク質を含む組成物が、単胃動物の動物飼料製品として用いられ得る。したがって、様々な流れは、特定の動物種向けに飼料製品をカスタマイズするように組み合わされ得る。
【０１２０】
上述したように、発酵プロセスによるアルコール（例えば、ブタノール）の生成によって生成される様々な流れは、粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、および脂肪酸イソブチルエステルを含む副産物組成物を生成するために多くの方法で組み合わせられ得る。例えば、少なくとも約６％の粗脂肪および少なくとも約２８％の粗タンパク質を含む組成物が、乳畜の動物飼料製品として用いられ得る。少なくとも約６％の粗脂肪および少なくとも約２６％の粗タンパク質を含む組成物が、フィードロット牛の動物飼料製品として用いられ得る一方、少なくとも約１％の粗脂肪および少なくとも約２７％の粗タンパク質を含む組成物が、越冬牛の動物飼料製品として用いられ得る。少なくとも約１３％の粗脂肪および少なくとも約２７％の粗タンパク質を含む組成物が、家禽の動物飼料製品として用いられ得る。少なくとも約１８％の粗脂肪および少なくとも約２２％の粗タンパク質を含む組成物が、単胃動物の動物飼料製品として用いられ得る。したがって、様々な流れは、特定の動物種向けに飼料製品をカスタマイズするように組み合わせられ得る。
【０１２１】
一実施形態において、発酵プロセスによるアルコール（例えば、ブタノール）の生成によって生成される１つ以上の流れが、バイオディーゼルなどの燃料源として使用され得る少なくとも約９０％のＣＯＦＡを含む組成物を生成するために多くの方法で組み合わされ得る。
【０１２２】
本発明の方法の一実施形態の例として、粉砕された穀類（例えば、ハンマーミルによって処理されたトウモロコシ）および１種以上の酵素が組み合わされて、スラリー化された穀類が生成される。このスラリー化された穀類は、調理され、液化され、フラッシュ蒸気でフラッシュされて、調理されたマッシュが得られる。次に、調理されたマッシュはろ過されて、懸濁固体が除去され、ウェットケーキおよびろ液が生成される。ろ過は、遠心分離、ふるい分け、または真空ろ過などのいくつかの方法によって行うことができ、このろ過工程は、少なくとも約８０％〜少なくとも約９９％の懸濁固体をマッシュから除去し得る。
【０１２３】
ウェットケーキは、水を用いて再スラリー化され、再ろ過されて、さらなるでんぷんが除去され、洗浄されたろ過ケーキが生成される。再スラリー化プロセスは、何回か、例えば、１〜５回繰り返され得る。ウェットケーキを再スラリー化するのに使用される水は、発酵プロセス中に生成される再利用水であってもよい。再スラリー化／再ろ過プロセスによって生成されるろ液は、最初の混合工程に戻されて、粉砕された穀類とともにスラリーが形成され得る。ろ液は、混合工程の前に加熱または冷却され得る。
【０１２４】
洗浄されたろ過ケーキは、生成プロセスの際にいくつかの段階でビールを用いて再スラリー化され得る。例えば、洗浄されたろ過ケーキは、発酵装置の後、プレフラッシュ塔（ｐｒｅｆｌａｓｈ  ｃｏｌｕｍｎ）の前、または蒸留器の穀類乾燥器への供給点において、ビールを用いて再スラリー化され得る。洗浄されたろ過ケーキは、他の副生成物と別々に乾燥されてもよく、またはＤＤＧＳの生成のためのウェットケーキとして直接使用されてもよい。
【０１２５】
最初の混合工程の結果として生成されるろ液は、本明細書に記載されるようにさらに処理され得る。例えば、ろ液は、蒸気またはプロセス間熱交換（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｏ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｈｅａｔ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）を用いて加熱され得る。糖化酵素が、ろ液に加えられてもよく、ろ液の溶解されたでんぷんは、部分的にまたは完全に糖化され得る。糖化されたろ液は、プロセス間交換、冷却水による交換、または冷水による交換などのいくつかの手段によって冷却され得る。
【０１２６】
次に、冷却されたろ液は、発酵装置ならびにアルコール生成に適した微生物、例えば、ブタノールを生成することが可能な組み換え酵母に加えられ得る。さらに、アンモニアおよび再利用流も、発酵装置に加えられ得る。このプロセスは、少なくとも１つの発酵装置、少なくとも２つの発酵装置、少なくとも３つの発酵装置、または少なくとも４つの発酵装置を含み得る。大気放出（例えば、ブタノール大気放出）を減少させ、生成物の収率を高めるために、発酵中に生成される二酸化炭素がスクラバーに排気され得る。
【０１２７】
溶媒が、再利用ループを介して発酵装置に加えられてもよく、または発酵装置に直接加えられてもよい。溶媒は、アルコール（例えば、ブタノール）を溶解させるかまたはそれと反応することができ、かつ水への限られた溶解性を有し得る１種以上の有機化合物であり得る。溶媒は、１つの液相としてまたは２つの液相材料として連続して発酵装置から取り出されてもよく、または溶媒は、１つまたは２つの液相材料としてバッチ式に引き抜かれ得る。
【０１２８】
ビールが脱気され得る。ビールは、例えば、高温マッシュによるプロセス間交換またはプレフラッシュ塔の塔頂物によるプロセス間交換によって、脱気の前に加熱され得る。蒸気が、凝縮器、次に、スクラバーに排気されてもよい。脱気されたビールは、例えば、蒸留領域中の他の流れによるプロセス間熱交換によってさらに加熱され得る。
【０１２９】
予め加熱されたビールおよび溶媒は、従来の乾式磨砕燃料エタノールプラントのビール塔から改造され得るプレフラッシュ塔に入り得る。この塔は、大気圧より低い圧力で運転され、一連の蒸発器からまたはマッシュ調理工程から取り出された水蒸気によって駆動され得る。プレフラッシュ塔の塔頂物は、冷却水と、プレフラッシュ塔原料による熱交換を含むプロセス間熱交換とのいくつかの組み合わせによる熱交換によって凝縮され得る。液体凝縮物は、アルコール／水デカンター（例えば、ブタノール／水デカンター）に送られ得る。
【０１３０】
プレフラッシュ塔の塔底物は、溶媒デカンターに進められ得る。プレフラッシュ塔の塔底物は、遊離アルコール（例えば、ブタノール）を実質的に取り除かれ得る。デカンターは、スティルウェル（ｓｔｉｌ  ｗｅｌｌ）、遠心分離機、またはハイドロクロンであり得る。水が、このデカンター中の溶媒相から実質的に分離され、水相が生成される。懸濁され、溶解された固体を含む水相は、遠心分離されて、ウェットケーキおよび希薄な蒸留廃液（ｔｈｉｎ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）が生成され得る。ウェットケーキは、他の流れと組み合わされ、乾燥されて、ＤＤＧＳが形成され得、それは、ＤＤＧＳを生成する他の流れと別個に、乾燥され、販売され得るか、またはそれはウェットケーキとして販売され得る。水相は、上記のろ過ケーキを再スラリー化するために部分的に使用される逆流（ｂａｃｋｓｅｔ）を提供するために分割され得る。分割は、希薄な蒸留廃液も提供し、これは、さらなる処理のために蒸発器に注入され得る。
【０１３１】
溶媒デカンター中で生成される有機相は、アルコール（例えば、ブタノール）のエステルであり得る。溶媒は、加水分解されて、反応性溶媒が再生され、さらなるアルコール（例えば、ブタノール）が回収され得る。あるいは、有機相は、ろ過され、製品として販売され得る。加水分解は、熱によって推進され、均一触媒によるか、または不均一触媒により得る。このプロセスへの熱注入は、加熱炉、高温油、電気的熱注入、または高圧蒸気であり得る。加水分解を推進するために加えられる水は、再利用された水流、新鮮な水、または蒸気に由来し得る。
【０１３２】
冷却され、加水分解された溶媒は、大気圧より低い圧力の溶媒塔に注入されてもよく、ここで、溶媒は、蒸気によってアルコール（例えば、ブタノール）を実質的に取り除かれ得る。この蒸気は、蒸発器からの水蒸気であってもよく、マッシュプロセスのフラッシュ工程からの蒸気であってもよく、またはボイラーからの蒸気であってもよい（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０１７１１２９号明細書を参照）。従来の乾式磨砕エタノールプラントからの整流塔が、溶媒塔として適し得る。整流塔は、溶媒塔として働くように改造され得る。溶媒塔の塔底物は、例えば、冷却水またはプロセス間熱交換によって冷却され得る。冷却された塔底物は、残留水を除去するためにデカントされてもよく、この水は、このプロセスを含む他の工程に再利用されてもよく、またはマッシュ工程に再利用されてもよい。
【０１３３】
溶媒塔の塔頂物は、冷却水による交換によってまたはプロセス間熱交換によって冷却されてもよく、凝縮物が、プレフラッシュ塔の塔頂物と共用され得る排気されたアルコール／水デカンター（例えば、ブタノール／水デカンター）に送られ得る。スクラバー塔底物および脱気工程からの凝縮物を含む、他の混合される水およびアルコール（例えば、ブタノール）流が、このデカンターに加えられてもよい。二酸化炭素を含む排気が、水スクラバーに送られてもよい。このデカンターの水層はまた、溶媒塔に供給されてもよく、または小型の専用の蒸留塔中でアルコール（例えば、ブタノール）を取り除かれ得る。水層は、プレフラッシュ塔の塔頂物、溶媒塔の塔頂物、または溶媒塔の塔底物によるプロセス間交換によって予め加熱され得る。この専用の塔は、従来の乾式磨砕燃料エタノールプロセスのサイドストリッパーから改造され得る。
【０１３４】
アルコール／水デカンター（例えば、ブタノール／水デカンター）の有機層は、アルコール（例えば、ブタノール）塔に注入され得る。この塔は、過圧（ｓｕｐｅｒ−ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ）塔であってもよく、リボイラー内の蒸気凝縮によって駆動され得る。塔を運転するためのエネルギー需要を減少させるために、塔への原料がプロセス間熱交換によって加熱され得る。このプロセス間熱交換器は、プレフラッシュ塔の分縮器、溶媒塔の分縮器、加水分解装置の生成物、蒸発器からの水蒸気、またはブタノール塔の塔底物を含み得る。アルコール（例えば、ブタノール）塔の蒸気の凝縮物は、冷却されてもよく、アルコール／水デカンター（例えば、ブタノール／水デカンター）に戻されてもよい。アルコール（例えば、ブタノール）塔の塔底物は、アルコール（例えば、ブタノール）塔原料による交換を含むプロセス間熱交換によって冷却されてもよく、冷却水によってさらに冷却され、ろ過され、生成物アルコール（例えば、ブタノール）として販売され得る。
【０１３５】
上述されるプレフラッシュ塔の塔底物から生成される希薄な蒸留廃液は、多重効用蒸発器に送られ得る。この蒸発器は、２つ、３つ、またはそれ以上の段階を有し得る。蒸発器は、燃料エタノールプラントの従来の設計と同様の２つの効用部による４つの本体の構成を有してもよく、３つの効用部による３つの本体を有してもよく、または他の構成を有してもよい。希薄な蒸留廃液は、複数の効用部のいずれかに入り得る。第１の効用部本体の少なくとも１つが、過圧アルコール（例えば、ブタノール）塔からの蒸気によって加熱され得る。蒸気は、最も圧力の低い効用部から取り出されて、水蒸気の形態の熱が、大気圧より低い圧力のプレフラッシュ塔および溶媒塔に与えられ得る。蒸発器からのシロップが、蒸留器の穀類乾燥器に加えられてもよい。
【０１３６】
発酵装置、脱気装置（ｄｅｇａｓｓｅｒ）、アルコール／水デカンター（例えば、ブタノール／水デカンター）および他の供給源からの二酸化炭素放出は、水スクラバーに送られ得る。このスクラバーの上部に供給される水は、新鮮な補給水であってもよく、または再利用水であってもよい。再利用水は、揮発性有機化合物を除去するために処理（例えば、生物学的に消化）され、急冷され得る。スクラバーの塔底物は、アルコール／水デカンター（例えば、ブタノール／水デカンター）、溶媒塔に送られてもよく、または他の再利用水とともに使用されて、上記のウェットケーキが再スラリー化されてもよい。蒸発器からの凝縮物は、嫌気性の生物学的消化または他のプロセスによって処理されて、ろ過ケーキを再スラリー化するために再利用する前に水が精製され得る。
【０１３７】
トウモロコシが、粉砕された穀類の供給源として使用される場合、トウモロコシ油は、いくつかの点のいずれかにおいてプロセス流から分離され得る。例えば、遠心分離機が、調理されたマッシュのろ過の後にトウモロコシ油流を生成するように運転されてもよく、またはプレフラッシュ塔水相遠心分離機が、トウモロコシ油流を生成するように運転されてもよい。中間の濃縮シロップまたは最終的なシロップが遠心分離されて、トウモロコシ油流が生成され得る。
【０１３８】
本発明の方法の一実施形態の別の例において、発酵装置から排出される材料は、遠心分離機、沈降機、ハイドロサイクロンなど、およびそれらの組合せなどの装置を含む分離システムにおいて処理されて、直接またはいくらかの再調整の後に次の発酵バッチにおける再度の使用のために再利用され得る濃縮された形態の生酵母が回収され得る。この分離システムは、発酵から生成される脂肪酸エステル（例えばイソブチル脂肪酸エステル）およびアルコール（例えば、ブタノール）を含む有機流ならびにわずかな微量レベルの不混和性有機物を含む水流も生成し得る。この水流は、液化されたマッシュから分離され、洗浄された低でんぷん固体を再パルプ化し、注入するために、アルコール（例えば、ブタノール）含有物を取り除く前または後に使用され得る。これには、本来であれば、液化領域から穀類乾燥およびシロップ混合領域へとこれらの固体を移動するための長いベルトで駆動される搬送システムであり得るものを回避するという利点がある。さらに、アルコール（例えば、ブタノール）が取り除かれた後に得られるこの全蒸留廃液は、既存のまたは新規な分離装置を用いて、希薄な蒸留廃液とウェットケーキ画分とに分離される必要があり、この希薄な蒸留廃液は、発酵性マッシュの新しいバッチを調製するために調理水と組み合わせるために戻る逆流を部分的に形成することになる。この実施形態の別の利点は、液化されたマッシュから分離される固体の水分中に保持された任意の残留溶解でんぷんの一部が捕捉され、この逆流を通して回収され得ることである。あるいは、固体流に含まれる酵母は、生育不能とみなされ、水流に再分配され得、この組み合わされた流れは、発酵から残っているあらゆるアルコール（例えば、ブタノール）含有物を蒸留によって取り除かれる。生育不能の有機物は、繁殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）プロセスにおける栄養として使用するためにさらに分離され得る。
【０１３９】
別の実施形態において、多相材料が、プレフラッシュ塔の塔底を出て、上述したように分離システムにおいて処理され得る。濃縮された固体は、水流に再分配され得、この組み合わされた流れは、液化されたマッシュから分離され、洗浄された低でんぷん固体を再パルプ化し、注入するのに使用され得る。
【０１４０】
上記のプロセスならびに本明細書に記載される他のプロセスは、Ａｓｐｅｎモデル化などの計算機モデル化を用いて実証され得る（例えば、米国特許第７，６６６，２８２号明細書を参照）。例えば、市販のモデル化ソフトウェアＡｓｐｅｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）（Ａｓｐｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）は、統合されたブタノール発酵、精製、および水管理プロセスのためのＡｓｐｅｎモデルを作り出すために、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から入手可能なＤＩＰＰＲ（Ｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）などの物理的特性データベースとともに使用され得る。このプロセスモデル化は、多くの基礎工学的計算、例えば、物質収支およびエネルギー収支、気／液平衡、および反応速度計算を行うことができる。Ａｓｐｅｎモデルを生成するために、情報入力は、例えば、実験データ、含水量および原料の組成、マッシュの調理およびフラッシュのための温度、糖化条件（例えば、酵素原料、でんぷん転化率、温度、圧力）、発酵条件（例えば、微生物原料、グルコース転化率、温度、圧力）、脱気条件、溶媒塔、プレフラッシュ塔、凝縮器、蒸発器、遠心分離機などを含み得る。
【０１４１】
上記の方法およびシステムは、非溶解固体の除去の結果として、生成物アルコール生成における向上した抽出活性および／または効率をもたらし得る。例えば、非溶解固体の存在のない抽出発酵は、発酵ブロスから抽出剤への生成物アルコールのより高い物質移動速度、発酵装置の内部または外部の発酵からの抽出剤のより良好な相分離、およびより高い抽出剤液滴上昇速度の結果としての抽出剤のより低い保持（ｈｏｌｄ  ｕｐ）をもたらし得る。また、例えば、発酵の際に発酵ブロス中に保持される抽出剤液滴は、発酵ブロスからより速く、より完全に離脱し、それによって、発酵ブロス中の遊離抽出剤が少なくなり、プロセス中に喪失される抽出剤の量を減少させることができる。さらに、例えば、微生物は再利用することができ、例えば、ビール塔および／または全蒸留廃液遠心分離機の一部または全てなどの、下流の処理におけるさらなる設備を省略することができる。さらに、例えば、抽出剤がＤＤＧＳ中で喪失される可能性がなくなる。また、例えば、微生物を再利用する能力は、生成物アルコール生成の全体速度を上げ、全力価要件を低下させ、および／または水性力価要件を低下させ、それによって、より健康な微生物およびより高い生成速度をもたらすことができる。さらに、例えば、資本コストを削減するために発酵装置における撹拌器を省略し；保持される抽出剤が最小限に抑えられ、非溶解固体が存在しないために体積がより効率的に使用されるため、発酵装置の生産性を向上し；および／または未建設のプラントにおいて連続発酵またはより小型の発酵装置を使用することが可能であり得る。
【０１４２】
向上した抽出効率の例としては、例えば、安定化した分配係数、向上した（例えば、より速いまたはより完全な）相分離、向上した液液物質移動係数、より低い力価での運転、向上したプロセス流再利用性、向上した発酵体積効率、向上した原料（例えば、トウモロコシ）負荷供給、微生物（例えば、組み換え微生物）の向上したブタノール力価耐性、水の再利用、エネルギーの減少、抽出剤の増加した再利用、および／または微生物の再利用が挙げられる。
【０１４３】
例えば、発酵装置中で固体が占める体積が減少される。したがって、発酵に利用可能な発酵装置の有効体積が増加され得る。ある実施形態において、発酵に利用可能な発酵装置の体積は、少なくとも約１０％だけ増加される。
【０１４４】
例えば、分配係数の安定化があり得る。発酵装置中のトウモロコシ油が、発酵の前に原料スラリーから固体を除去することによって減少され得るため、抽出剤は、より少ないトウモロコシ油に曝される。トウモロコシ油は、抽出剤と組み合わされて、十分な量で存在する場合に分配係数を低下させ得る。したがって、発酵装置に導入されるトウモロコシ油の減少により、発酵装置における抽出剤相の分配係数がより安定する。ある実施形態において、分配係数は、１０回の発酵サイクルにわたって約１０％未満だけ減少される。
【０１４５】
例えば、発酵ブロスから抽出剤への生成物アルコールのより高い物質移動速度（例えば、より高い物質移動係数の形態における）があり、それによって、生成物アルコール生成の向上した効率が得られるため、抽出剤によるブタノールの抽出効率の向上があり得る。ある実施形態において、物質移動係数は、少なくとも２倍増加される（実施例４および５を参照）。
【０１４６】
さらに、発酵ブロスと抽出剤との間の相分離の向上があり得、これは、放出物の形成の可能性を減少させ、それによって、生成物アルコール生成の向上した効率が得られる。例えば、相分離は、より速く行うことができ、またはより完全であり得る。ある実施形態において、感知できる相分離が２４時間予め観察されなかった場合に相分離が行われ得る。ある実施形態において、相分離は、固体が除去されなかった場合の相分離と比較して、少なくとも約２倍速く、少なくとも約５倍速く、または少なくとも約１０倍速く行われる（実施例６および７を参照）。
【０１４７】
さらに、抽出剤の回収および再利用の増加があり得る。抽出剤は、ＤＤＧＳとして最終的に除去され得る固体中に「捕捉」されず、それによって、生成物アルコール生成の向上した効率が得られる（実施例８および９を参照）。また、トウモロコシ油による抽出剤の希釈が少なくなり、抽出剤の劣化が少なくなり得る（実施例１０を参照）。
【０１４８】
また、抽出剤の流量が減少され得るため、運転コストが低下し、それによって、生成物アルコール生成の向上した効率が得られる。
【０１４９】
さらにまた、抽出剤の保持が、抽出剤液滴がより高い速度で上昇する結果として減少され、それによって、生成物アルコール生成の向上した効率が得られる。発酵装置中の非溶解固体の量の減少は、生成物アルコール生成の向上した効率ももたらす。
【０１５０】
さらに、非溶解固体を懸濁させる必要がもはやないため、撹拌器を、発酵装置から除去することができ、それによって、資本コストおよびエネルギーを減少させ、生成物アルコール生成の効率を高める。
【０１５１】
ある実施形態において、発酵ブロス４０が、発酵装置３０の出口から排出され得る。発酵ブロス４０とともに発酵装置３０を出る非溶解固体がないかまたは最小限であることには、いくつかのさらなる利点がある。例えば、ビール塔または蒸留塔などの、例えば、下流の処理におけるユニットおよび作業の必要性をなくし、それによって、生成物アルコール生成の効率を高めることができる。さらに、非溶解固体が、発酵装置３０を出る発酵ブロス４０中に存在しないため、「捕捉される」抽出剤とともに形成されるＤＤＧＳがない。また、発酵装置を出る最終的なブロス中の非溶解固体がより少ないことの結果として、全蒸留廃液の遠心分離機の一部または全てを省略することができる。
【０１５２】
上述したように、本発明の方法は、ブタノールなどの生成物アルコールの向上した生産性（例えば、バッチまたは連続）をもたらし得るいくつかの利点を提供する。例えば、物質移動の改善は、より低い水性力価における運転を可能にし、微生物が「より健康」になる。より良好な相分離は、向上した発酵装置体積効率ならびにビール塔、蒸留塔などを通るより少ない反応器含有物の処理の可能性につながり得る。さらに、固体を介した溶媒損失がより少なく、細胞の再利用の可能性がある。本発明の方法は、ＤＤＧＳの高い品質も提供し得る。
【０１５３】
さらに、本明細書に記載される方法は、発酵前の油（例えば、トウモロコシ油）の除去を提供し、これにより、発酵への油の制御された添加が可能になり得る。さらに、発酵前の油の除去は、ＤＤＧＳ中に存在する油の量にいくらかの柔軟性をもたせ得る。すなわち、油は、様々な量でＤＤＧＳに加えられてもよく、特定の動物種の栄養必要量に応じて様々な脂肪含量を有するＤＤＧＳが生成される。
【０１５４】
組み換え微生物およびブタノール生合成経路
理論によって制約されるのを望むものではないが、本明細書に記載される方法は、任意のアルコール生成微生物、特に、それらの耐性レベルを超える力価でアルコールを生成する組み換え微生物に関連して有用であると考えられる。
【０１５５】
アルコール生成微生物は、当該技術分野において公知である。例えば、メタン資化性細菌（例えば、メチロサイナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ））によるメタンの発酵酸化により、メタノールが生成され、メタノール（Ｃ１アルキルアルコール）を、カルボン酸およびメタノールとともにカルボン酸をエステル化することが可能な触媒と接触させることにより、カルボン酸のメタノールエステルが形成される。酵母菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＣＢＳ  ８３４０、ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａａｌ  Ｂｕｒｏ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅ；ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏ．２６：７０６−７１４，２０００）により、エタノールが生成され得、エタノールを、カルボン酸およびエタノールとともにカルボン酸をエステル化することが可能な触媒と接触させることにより、エチルエステルが形成される（例えば、実施例３６を参照）。
【０１５６】
アルコールを生成する組み換え微生物も、当該技術分野において公知である（例えば、Ｏｈｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：８９３−９００，１９９１；Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１−１０８１，２００２；Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉａｏ，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．１０：３１２−３２０，２００８；Ｈａｈｎａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３：７８１４−７８１８，２００７；米国特許第５，５１４，５８３号明細書；米国特許第５，７１２，１３３号明細書；ＰＣＴ出願公開番号国際公開第１９９５／０２８４７６号パンフレット；Ｆｅｌｄｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：３５４−３６１，１９９２；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３，１９９５；米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書；米国特許第７，２２３，５７５号明細書；米国特許第７，７４１，１１９号明細書；米国特許第７，８５１，１８８号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２０３０９９Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２４６８４６Ａ１号明細書；およびＰＣＴ出願公開番号国際公開第２０１０／０７５２４１号パンフレット、これらは全て参照により本明細書に援用される）。
【０１５７】
ブタノールを生成することが可能な好適な組み換え微生物は、当該技術分野において公知であり、ブタノールを生成することが可能な特定の好適な微生物が本明細書に記載される。生合成経路を介してブタノールを生成する組み換え微生物としては、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウイニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、またはサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーが挙げられる。一実施形態において、組み換え微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択され得る。一実施形態において、組み換え微生物は酵母である。一実施形態において、組み換え微生物は、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）のいくつかの種から選択されるクラブトリー陽性酵母である。クラブトリー陽性酵母種としては、以下に限定はされないが、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロマイセス・バイアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・ミカタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｋａ���ａｅ）、サッカロマイセス・パラドキサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、ジゴサッカロマイセス・ルーキシィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、およびカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）が挙げられる。
【０１５８】
ある実施形態において、宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母が、当該技術分野において公知であり、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ、Ｆｅｒｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍａｒｔｒｅｘ、およびＬａｌｌｅｍａｎｄを含むがこれらに限定されない様々な供給元から入手可能である。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）としては、以下に限定はされないが、ＢＹ４７４１、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）酵母、Ｆｅｒｍ  Ｐｒｏ（商標）酵母、Ｂｉｏ−Ｆｅｒｍ（登録商標）ＸＲ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ  Ｂａｔｃｈ  Ｔｕｒｂｏアルコール酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｔｕｒｂｏ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｒｅｅｎ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｏｌｄ酵母、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）酵母、ＢＧ−１、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、およびＣＢＳ７９６１が挙げられる。
【０１５９】
微生物による発酵を用いたブタノールの生成、ならびにブタノールを生成する微生物は、例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書に開示されている。ある実施形態において、微生物は、ブタノール生合成経路を含む。ある実施形態において、経路の基質−生成物転化を触媒する少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのポリペプチドが、微生物中の異種のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態において、経路の基質−生成物転化を触媒する全てのポリペプチドが、微生物中の異種のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態において、微生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を実質的に含まない微生物が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書に記載されている。ＧＰＤ２などのＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を実質的に含まない微生物も、この文献に記載されている。
【０１６０】
ブタノールの生成に適した生合成経路は、当該技術分野において公知であり、特定の好適な経路が本明細書に記載される。ある実施形態において、ブタノール生合成経路は、宿主細胞に対して異種の少なくとも１つの遺伝子を含む。ある実施形態において、ブタノール生合成経路は、宿主細胞に対して異種の２つ以上の遺伝子を含む。ある実施形態において、ブタノール生合成経路は、生合成経路のあらゆる工程に対応するポリペプチドをコードする異種遺伝子を含む。
【０１６１】
指定の基質−生成物転化を触媒する能力を有する特定の好適なタンパク質が本明細書に記載され、他の好適なタンパク質が、当該技術分野において提供される。例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００８／０２６１２３０号明細書、同第２００９／０１６３３７６号明細書、および同第２０１０／０１９７５１９号明細書は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼを記載しており；参照により援用される米国特許出願公開第２０１０／００８１１５４号明細書は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを記載しており；アルコールデヒドロゲナーゼが、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書に記載されている。
【０１６２】
多くのレベルの配列同一性が、他の種からポリペプチドを同定するのに有用であり、このようなポリペプチドが、同じかまたは同様の機能または活性を有し、本明細書に記載される組み換え微生物に使用するのに適していることが、当業者によってよく理解される。パーセント同一性の有用な例としては、以下に限定はされないが、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挙げられ、あるいは７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの、７５％〜１００％の任意の整数パーセンテージが、本発明を説明する際に有用であり得る。
【０１６３】
好適な株としては、本明細書に引用され、参照により本明細書に援用される特定の出願ならびに２０１０年９月７日に出願された米国仮特許出願第６１／３８０，５６３号明細書に記載されるものが挙げられる。実施例に使用されるものを含む特定の好適な株の構造が、本明細書に提供される。
【０１６４】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＰ１０８３（「ＮＧＣＩ−０７０」；ＰＮＹ１５０４）の作成
株ＢＰ１０６４は、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ（ＣＢＳ  ８３４０；Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得られ、以下の遺伝子の欠失を含む：ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびＧＰＤ２。ＢＰ１０６４を、プラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１、米国仮特許出願第６１／２４６，８４４号明細書に記載される）およびｐＬＨ４６８（配列番号２）で形質転換して、株ＮＧＣＩ−０７０（ＢＰ１０８３、ＰＮＹ１５０４）を生成した。
【０１６５】
標的遺伝子および形質転換体の選択のためのＧ４１８耐性マーカーまたはＵＲＡ３遺伝子のいずれかの上流および下流の相同領域を含むＰＣＲ断片による相同的組み換えによって、全コード配列を完全に除去した欠失を作り出した。ｌｏｘＰ部位が側面にあるＧ４１８耐性マーカーを、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて除去した。ＵＲＡ３遺伝子を相同的組み換えによって除去して、無瘢痕（ｓｃａｒｌｅｓｓ）欠失を作り出し、またはｌｏｘＰ部位が側面にある場合、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて除去した。
【０１６６】
無瘢痕欠失の手順を、Ａｋａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｙｅａｓｔ  ２３：３９９−４０５，２００６）から適応させた。一般に、各無瘢痕欠失のためのＰＣＲカセットを、ＰＣＲを重複させることによって、４つの断片、Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを組み合わせることによって作製した。ＰＣＲカセットは、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の上流の２５０ｂｐ）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の下流の１５０ｂｐ）とともに、天然ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＵＲＡ３遺伝子からなる、選択可能な／対抗選択可能な（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）マーカー、ＵＲＡ３（断片Ｕ）を含有していた。それぞれ長さ５００ｂｐの断片ＡおよびＣは、標的遺伝子のすぐ上流の５００ｂｐ（断片Ａ）および標的遺伝子の３’５００ｂｐ（断片Ｃ）に対応していた。断片ＡおよびＣを、相同的組み換えによる、染色体へのカセットの組み込みに使用した。断片Ｂに対応する配列の直接の繰り返しが、染色体へのカセットの組み込みの際に生成された際、断片Ｂ（長さ５００ｂｐ）は、標的遺伝子のすぐ下流の５００ｂｐに対応し、それを、相同的組み換えによる、染色体からのＵＲＡ３マーカーおよび断片Ｃの切除に使用した。ＰＣＲ産物ＡＢＵＣカセットを用いて、ＵＲＡ３マーカーを、相同的組み換えによって、まず染色体に組み込み、次に染色体から切除した。最初の組み込みにより、３’５００ｂｐを除いて、遺伝子を欠失させた。切除の際、遺伝子の３’５００ｂｐ領域も欠失させた。この方法を用いた遺伝子の組み込みでは、組み込まれる遺伝子が、断片ＡとＢとの間のＰＣＲカセットに含まれていた。
【０１６７】
ＵＲＡ３の欠失
内因性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるために、ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを、ｐＬＡ５４鋳型ＤＮＡ（配列番号３）からＰＣＲで増幅した。ｐＬＡ５４は、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターおよびｋａｎＭＸマーカーを含有し、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組み換えおよびマーカーの除去を可能にするｌｏｘＰ部位が側面にある。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマーＢＫ５０５およびＢＫ５０６（配列番号４および５）を用いて、ＰＣＲを行った。ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰマーカーの組み込みが、ＵＲＡ３コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのＵＲＡ３部分を、ＵＲＡ３プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得た。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄへと形質転換し、３０℃でＧ４１８（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＹＰＤにおいて形質転換体を選択した。プライマーＬＡ４６８およびＬＡ４９２（配列番号６および７）ならびに指定されるＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸを用いたＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正確な組み込みを確認した。
【０１６８】
ＨＩＳ３の欠失
無瘢痕ＨＩＳ３欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ、キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ａを、ＨＩＳ３断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）およびプライマーｏＢＰ４５３（配列番号１５）を用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂを、ＨＩＳ３断片Ａの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５４（配列番号１６）、およびＨＩＳ３断片Ｕの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５５（配列番号１７）を用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ｕを、ＨＩＳ３断片Ｂの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５６（配列番号１８）、およびＨＩＳ３断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５７（配列番号１９）を用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ｃを、ＨＩＳ３断片Ｕの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５８（配列番号２０）、およびプライマーｏＢＰ４５９（配列番号２１）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＨＩＳ３断片ＡおよびＨＩＳ３断片Ｂを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）およびｏＢＰ４５５（配列番号１７）を用いて増幅することによって、ＨＩＳ３断片ＡＢを生成した。ＨＩＳ３断片ＵおよびＨＩＳ３断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号１８）およびｏＢＰ４５９（配列番号２１）を用いて増幅することによって、ＨＩＳ３断片ＵＣを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いてＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。ＨＩＳ３断片ＡＢおよびＨＩＳ３断片ＵＣを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）およびｏＢＰ４５９（配列番号２１）を用いて増幅することによって、ＨＩＳ３  ＡＢＵＣカセットを生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１６９】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸのコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＨＩＳ３  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養（ｐｌａｔｅ）した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４６０（配列番号２２）およびｏＢＰ４６１（配列番号２３）によるＰＣＲによって、ｈｉｓ３ノックアウトを有する形質転換体をスクリーニングした。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸ  Δｈｉｓ３：：ＵＲＡ３として選択した。
【０１７０】
Δｕｒａ３部位からのＫａｎＭＸマーカー除去およびΔｈｉｓ３部位からのＵＲＡ３マーカー除去
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号６６、米国仮特許出願第６１／２９０，６３９号明細書に記載される）でＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸ  Δｈｉｓ３：：ＵＲＡ３を形質転換し、３０℃で２％のグルコースが補充されたヒスチジンおよびウラシル欠損合成完全培地において平板培養することによって、ＫａｎＭＸマーカーを除去した。形質転換体を、３０℃で約６時間にわたって１％のガラクトースが補充されたＹＰ中で増殖させて、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＫａｎＭＸマーカー切除を誘発し、回収のために３０℃でＹＰＤ（２％のグルコース）プレートに平板培養した。分離株を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（５−ＦＯＡ、０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。５−ＦＯＡ耐性分離株を、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドを除去するために、ＹＰＤにおいて増殖させ、平板培養した。ＹＰＤ＋Ｇ４１８プレート、ウラシル欠損合成完全培地のプレート、およびヒスチジン欠損合成完全培地のプレートにおける増殖をアッセイすることによって、ＫａｎＭＸマーカー、ＵＲＡ３マーカー、およびｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの損失について分離株を調べた。Ｇ４１８に対して感受性であり、かつウラシルおよびヒスチジンに対して栄養要求性であった正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３として選択し、ＢＰ８５７として表した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、Δｕｒａ３についてはプライマーｏＢＰ４５０（配列番号２４）およびｏＢＰ４５１（配列番号２５）、およびΔｈｉｓ３についてはプライマーｏＢＰ４６０（配列番号２２）およびｏＢＰ４６１（配列番号２３）によるＰＣＲおよび配列決定によって、欠失およびマーカー除去を確認した。
【０１７１】
ＰＤＣ６の欠失
無瘢痕ＰＤＣ６欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ａを、ＰＤＣ６断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）およびプライマーｏＢＰ４４１（配列番号２７）を用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ｂを、ＰＤＣ６断片Ａの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４２（配列番号２８）、およびＰＤＣ６断片Ｕの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４３（配列番号２９）を用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ｕを、ＰＤＣ６断片Ｂの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４４（配列番号３０）、およびＰＤＣ６断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４５（配列番号３１）を用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ｃを、ＰＤＣ６断片Ｕ３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４６（配列番号３２）、およびプライマーｏＢＰ４４７（配列番号３３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＤＣ６断片ＡおよびＰＤＣ６断片Ｂを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）およびｏＢＰ４４３（配列番号２９）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ６断片ＡＢを生成した。ＰＤＣ６断片ＵおよびＰＤＣ６断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４４４（配列番号３０）およびｏＢＰ４４７（配列番号３３）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ６断片ＵＣを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いてＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。ＰＤＣ６断片ＡＢおよびＰＤＣ６断片ＵＣを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）およびｏＢＰ４４７（配列番号３３）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ６  ＡＢＵＣカセットを生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１７２】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＰＤＣ６  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。ｐｄｃ６ノックアウトを有する形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号３４）およびＢＰ４４９（配列番号３５）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３として選択した。
【０１７３】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号３４）およびｏＢＰ４４９（配列番号３５）によるＰＣＲおよび配列決定によって、欠失およびマーカー除去を確認した。ＰＤＣ６、ｏＢＰ５５４（配列番号３６）およびｏＢＰ５５５（配列番号３７）のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性ＰＣＲ結果によって、分離株からのＰＤＣ６遺伝子がないことを実証した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６として選択し、ＢＰ８９１として表した。
【０１７４】
ＰＤＣ１欠失ｉｌｖＤＳｍ組み込み
ＰＤＣ１遺伝子を欠失させ、ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７００６１０に由来するｉｌｖＤコード領域で置換した。Ａ断片、続いて、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みのためのＰＣＲカセットのミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）に由来するｉｌｖＤコード領域を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＮＹＬＡ８３ゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＮＹＬＡ８３は、米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みを有する株（全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１０１２４０６０号明細書に記載される作成）である。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ（配列番号６９）を、ＰＤＣ１断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）およびプライマーｏＢＰ５１５（配列番号３９）を用いて増殖した。ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みのためのＰＣＲカセットのＢ、Ｕ、およびＣ断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＰＤＣ１断片Ｂを、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１６（配列番号４０）、およびＰＤＣ１断片Ｕの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１７（配列番号４１）を用いて増幅した。ＰＤＣ１断片Ｕを、ＰＤＣ１断片Ｂの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１８（配列番号４２）、およびＰＤＣ１断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１９（配列番号４３）を用いて増幅した。ＰＤＣ１断片Ｃを、ＰＤＣ１断片Ｕの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５２０（配列番号４４）、およびプライマーｏＢＰ５２１（配列番号４５）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍおよびＰＤＣ１断片Ｂを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）およびｏＢＰ５１７（配列番号４１）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−Ｂを生成した。ＰＤＣ１断片ＵおよびＰＤＣ１断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５１���（配列番号４２）およびｏＢＰ５２１（配列番号４５）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ１断片ＵＣを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いて、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢおよびＰＤＣ１断片ＵＣを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）およびｏＢＰ５２１（配列番号４５）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ１  Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣカセット（配列番号７０）を生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１７５】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＰＤＣ１  Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。ｐｄｃ１ノックアウトｉｌｖＤＳｍ組み込みを有する形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号４６）およびｏＢＰ５１２（配列番号４７）によるＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＤＣ１、ｏＢＰ５５０（配列番号４８）およびｏＢＰ５５１（配列番号４９）のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性ＰＣＲ結果によって、分離株からのＰＤＣ１遺伝子がないことを実証した。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３として選択した。
【０１７６】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。ＰＤＣ１の欠失、ｉｌｖＤＳｍの組み込み、およびマーカー除去を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号４６）およびｏＢＰ５１２（配列番号４７）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍとして選択し、ＢＰ９０７として表した。
【０１７７】
ＰＤＣ５欠失ｓａｄＢ組み込み
ＰＤＣ５遺伝子を欠失させ、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に由来するｓａｄＢコード領域で置換した。ＰＤＣ５欠失−ｓａｄＢ組み込みのためのＰＣＲカセットのセグメントを、まずプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローニングした。
【０１７８】
ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳは、ｐＵＣ１９をベースとしており、多重クローニング部位（ＭＣＳ）に位置するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するＵＲＡ３遺伝子の配列を含む。ｐＵＣ１９は、ｐＭＢ１レプリコンおよび大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における複製および選択のためのβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含む。ＵＲＡ３のためのコード配列に加えて、この遺伝子の上流および下流の配列が、酵母におけるＵＲＡ３遺伝子の発現のために含まれていた。ベクターを、クローニングプロセスに使用することができ、酵母組み込みベクターとして使用することができる。
【０１７９】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡに由来するＵＲＡ３コード領域の上流の２５０ｂｐおよび下流の１５０ｂｐとともにＵＲＡ３コード領域を含むＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて、ＢａｍＨＩ、ＡｓｃＩ、ＰｍｅＩ、およびＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ４３８（配列番号１２）、およびＸｂａＩ、ＰａｃＩ、およびＮｏｔＩ制限部位を含有するｏＢＰ４３９（配列番号１３）を用いて増幅した。ゲノムＤＮＡを、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製した。ＰＣＲ産物およびｐＵＣ１９（配列番号７１）を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる消化の後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートして、ベクターｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳを生成した。プライマーｏＢＰ２６４（配列番号１０）およびｏＢＰ２６５（配列番号１１）によるＰＣＲおよび配列決定によって、ベクターを確認した。
【０１８０】
ｓａｄＢおよびＰＤＣ５断片Ｂのコード配列を、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローニングして、ＰＤＣ５  Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットのｓａｄＢ−ＢＵ部分を生成した。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３０（配列番号５０）、およびＰＤＣ５断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５３１（配列番号５１）とともに、鋳型としてｐＬＨ４６８−ｓａｄＢ（配列番号６７）を用いて、ｓａｄＢのコード配列を増幅した。ＰＤＣ５断片Ｂを、ｓａｄＢの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５３２（配列番号５２）、およびＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３３（配列番号５３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ｓａｄＢおよびＰＤＣ５断片Ｂ  ＰＣＲ産物を混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５３０（配列番号５０）およびｏＢＰ５３３（配列番号５３）を用いて増幅することによって、ｓａｄＢ−ＰＤＣ５断片Ｂを生成した。得られたＰＣＲ産物を、ＡｓｃＩおよびＰｍｅＩによって消化させ、適切な酵素による消化の後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。得られたプラスミドを、ＰＤＣ５断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５３６（配列番号５４）およびｏＢＰ５４６（配列番号５５）を用いて、ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの増幅のための鋳型として使用した。ＰＤＣ５断片Ｃを、ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５４７（配列番号５６）、およびプライマーｏＢＰ５３９（配列番号５７）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片ＵおよびＰＤＣ５断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５３６（配列番号５４）およびｏＢＰ５３９（配列番号５７）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いて、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。天然のＰＤＣ５コード配列のすぐ上流の５０ヌクレオチドに対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５４２（配列番号５８）、およびｏＢＰ５３９（配列番号５７）を用いてＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを増幅することによって、ＰＤＣ５  Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣカセット（配列番号７２）を生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１８１】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍのコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＰＤＣ５  Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で１％のエタノール（グルコースではない）が補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。ｐｄｃ５ノックアウトｓａｄＢ組み込みを有する形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号５９）およびｏＢＰ５４１（配列番号６０）によるＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＤＣ５、ｏＢＰ５５２（配列番号６１）およびｏＢＰ５５３（配列番号６２）のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性ＰＣＲ結果によって、分離株からのＰＤＣ５遺伝子がないことを実証した。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３として選択した。
【０１８２】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３を、ＹＰＥ（１％のエタノール）中で一晩増殖させ、エタノール（グルコースではない）が補充され、かつ３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。ＰＤＣ５の欠失、ｓａｄＢの組み込み、およびマーカー除去を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号５９）およびｏＢＰ５４１（配列番号６０）によるＰＣＲによって確認した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢとして選択し、ＢＰ９１３として表した。
【０１８３】
ＧＰＤ２の欠失
内因性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるために、ｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセット（配列番号７３）を、鋳型ＤＮＡとしてｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ（配列番号６８）を用いて、ＰＣＲで増幅した。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰは、ｌｏｘＰリコンビナーゼ部位が側面にある（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７７１０７）に由来するＵＲＡ３マーカーを含有する。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマーＬＡ５１２およびＬＡ５１３（配列番号８および９）を用いて、ＰＣＲを行った。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰマーカーの組み込みが、ＧＰＤ２コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのＧＰＤ２部分を、ＧＰＤ２コード領域の上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得た。ＰＣＲ産物をＢＰ９１３に形質転換し、形質転換体を、１％のエタノール（グルコースではない）が補充されたウラシル欠損合成完全培地において選択した。プライマーｏＢＰ５８２およびＡＡ２７０（配列番号６３および６４）を用いたＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正確な組み込みを確認した。
【０１８４】
ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号６６）を用いた形質転換、および３０℃で１％のエタノールが補充されたヒスチジン欠損合成完全培地における平板培養によって、ＵＲＡ３マーカーを再利用した。形質転換体を、１％のエタノールが補充され、かつ５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地においてストリークし（ｓｔｒｅａｋ）、３０℃で培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。５−ＦＯＡ耐性分離株を、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの除去のためにＹＰＥ（１％のエタノール）中で増殖させた。欠失およびマーカー除去を、プライマーｏＢＰ５８２（配列番号６３）およびｏＢＰ５９１（配列番号６５）によるＰＣＲによって確認した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ  Δｇｐｄ２：：ｌｏｘＰとして選択し、ＰＮＹ１５０３（ＢＰ１０６４）として表した。
【０１８５】
ＢＰ１０６４を、プラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１）およびｐＬＨ４６８（配列番号２）で形質転換して、株ＮＧＣＩ−０７０（ＢＰ１０８３；ＰＮＹ１５０４）を生成した。
【０１８６】
さらに、本発明の様々な実施形態を上に説明してきたが、それらは例として示されたに過ぎず、限定するものではないことを理解されたい。本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本発明の形態および細部の様々な変更を行うことができることが、関連技術の当業者に明らかであろう。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上述した例示的実施形態のいずれによって限定されるものでもなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物のみにしたがって規定されるものである。
【０１８７】
本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関する技術分野の当業者の技能のレベルを示し、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により援用されることが具体的にかつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【０１８８】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに例示する。以下の実施例が原料としてトウモロコシを含む一方、本発明から逸脱せずに、他のバイオマス源が原料に使用され得ることを理解されたい。
【０１８９】
本明細書において使用される際、使用される略語の意味は以下のとおりであった：「ｇ」はグラムを意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ／Ｌ」はミリリットル／リットルを意味し、「ｍＬ／分」はミリリットル／分を意味し、「ＤＩ」は脱イオン化されていることを意味し、「ｕＭ」はマイクロメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｗ／ｖ」は重量／体積を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎＭの波長における光学密度を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥菌体重量を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「℃」は摂氏温度を意味し、「℃／分」は摂氏温度／分を意味し、「ｓｌｐｍ」は標準リットル／分を意味し、「ｐｐｍ」は百万分率を意味し、「ｐｄｃ」はピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素を意味し、後ろに酵素番号が付く。
【０１９０】
実施例１
トウモロコシマッシュの調製
約１００ｋｇの液化されたトウモロコシマッシュを、３０Ｌのガラスの被覆された樹脂ケトルを用いて、３つの等しいバッチで調製した。ケトルは、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。全ての３つのバッチに使用されるプロトコルは以下のとおりであった：（ａ）磨砕トウモロコシを水道水と混合し（乾燥量基準で３０重量％のトウモロコシ）、（ｂ）スラリーを、撹拌しながら５５℃まで加熱し、（ｃ）スラリーのｐＨを、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかを用いて５．８に調整し、（ｄ）α−アミラーゼ（乾燥トウモロコシ基準で０．０２重量％）を加え、（ｅ）スラリーを８５℃まで加熱し、（ｆ）ｐＨを５．８に調整し、（ｇ）スラリーを、ｐＨを５．８に保ちながら８５℃で２時間保持し、（ｈ）スラリーを２５℃に冷却した。
【０１９１】
使用されるトウモロコシは、Ｐｉｏｎｅｅｒ製の全粒イエローコーン（３３３５）であった。トウモロコシを、１ｍｍのふるいを用いて、ハンマーミルで磨砕した。磨砕トウモロコシの水分含量は１２重量％であり、磨砕トウモロコシのでんぷん含量は、乾燥トウモロコシ基準で７１．４重量％であった。α−アミラーゼ酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）から入手可能なＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。全ての３つのバッチを合わせて使用される成分の総量は：３３．９ｋｇの磨砕トウモロコシ（１２％の水分）、６５．４ｋｇの水道水、および０．００６ｋｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。合計で０．２９７ｋｇのＮａＯＨ（１７重量％）を、ｐＨを制御するために加えた。Ｈ２ＳＯ４は不要であった。３つの３０Ｌのバッチから回収された、液化されたトウモロコシマッシュの総量は９９．４ｋｇであった。
【０１９２】
実施例２
固体除去
６つの１Ｌのボトルを含む大容量（ｌａｒｇｅ  ｆｌｏｏｒ）遠心分離機における遠心分離によって、実施例１で生成されたマッシュから固体を除去した。７３．４ｋｇのマッシュを、２５℃で２０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離したところ、４４．４ｋｇの遠心分離液および２６．９ｋｇのウェットケーキが得られた。遠心分離液が１重量％未満の懸濁固体を含有し、ウェットケーキが約１８重量％の懸濁固体を含有していたことが分かった。これは、元の液化されたマッシュが、約７重量％の懸濁固体を含有していたことを示唆している。これは、でんぷんの大部分が液化されたと仮定した場合、トウモロコシ充填量および使用されるトウモロコシのでんぷん含量と一致する。でんぷんの全てが液化された場合、遠心分離機から直接回収される４４．４ｋｇの遠心分離液は、約２３重量％の溶解されたオリゴ糖（液化でんぷん）を含有していたであろう。約０．６ｋｇのｉ−ＢｕＯＨを３５．４ｋｇの遠心分離液に加えて、それを保存した。１．６重量％のｉ−ＢｕＯＨを含有する得られた３６．０ｋｇの遠心分離液を、原液として使用した。
【０１９３】
実施例３
物質移動の速度に対する非溶解固体の影響
ＳＳＦバッチ用の液相の平均的な組成を模倣するために、ＳＳＦ（同時糖化発酵）発酵のほぼ中間段階（すなわち、オリゴ糖の約５０％の転化率）の、トウモロコシマッシュから得られる発酵ブロスの組成をシミュレートする水相からのｉ−ＢｕＯＨの物質移動の速度に対する非溶解固体の影響を測定するために以下の実験を行った。実施例２からの遠心分離液は、ＳＳＦの開始時の液相の組成を模倣している。したがって、その一部を、質量基準で等量のＨ２Ｏで希釈して、約５０％の転化率におけるＳＳＦを模倣する遠心分離液を生成した。さらなるｉ−ＢｕＯＨを加えて、希釈された遠心分離液中のｉ−ＢｕＯＨの最終濃度を３．０重量％（約３０ｇ／Ｌ）にした。
【０１９４】
希釈された遠心分離液を以下のように調製した：１．６重量％のｉ−ＢｕＯＨを含有する実施例２からの１８ｋｇの遠心分離液原液を、１８ｋｇの水道水と混合し、０．８２ｋｇのｉ−ＢｕＯＨを加えた。希釈された遠心分離液の得られた３６．８ｋｇの溶液は、約１１重量％のオリゴ糖および約３０ｇ／Ｌのｉ−ＢｕＯＨからなっていた。この溶液は、オリゴ糖の約５０％の転化率におけるトウモロコシマッシュ発酵（ＳＳＦ）の液相および３０ｇ／Ｌのｉ−ＢｕＯＨの水性力価を模倣している。
【０１９５】
実施例４
物質移動に対する非溶解固体の除去の影響
非溶解固体の大部分が除去された後、液化されたトウモロコシマッシュから得られるブロスにおける物質移動性能を模倣する水相として、実施例３において得られた溶液を用いて、物質移動試験を行った。物質移動試験の目的は、液化されたトウモロコシマッシュから得られる、シミュレートされるブロスから、シミュレートされるブロスを通って上昇する溶媒（抽出剤）液滴の分散体へのｉ−ＢｕＯＨの移動の全体積物質移動係数（ｋＬａ）に対する非溶解固体の影響を測定することであった。運転パラメータの主な設計とのｋＬａの相関は、物質移動運転の規模を拡大するのに使用され得る。規模を拡大するのに有用な、より小さい規模のデータからのｋＬａの相関を生成するためにできる限り一定に保持されるべきパラメータの例は、液滴サイズを決定する相および設計パラメータの両方の物理的特性（例えば、ノズル直径、ノズルを通して分散される相の速度）である。
【０１９６】
６インチの直径、７フィートの高さのガラスの被覆されたカラムを用いて、懸濁されたマッシュ固体を含むかまたは含まない、（液化されたトウモロコシマッシュから得られる）オリゴ糖の水溶液から、シミュレートされるブロスを通って上昇するオレイルアルコール（ＯＡ）液滴の分散体へのｉ−ＢｕＯＨの移動のｋＬａを測定した。ｉ−ＢｕＯＨを水相に加えたところ、約３０ｇ／Ｌの、ｉ−ＢｕＯＨの初期濃度が得られた。約１１重量％のオリゴ糖および約３０ｇ／Ｌのｉ−ＢｕＯＨを含有する所定の量の水相（通常、約３５ｋｇ）を、カラムに投入し、ジャケットを通して温かいＨ２Ｏを流すことによってカラムを３０℃まで加熱した。試験中、カラムに出入りする水相の流れは存在しなかった。
【０１９７】
新鮮なオレイルアルコール（Ｃｏｇｎｉｓ製の８０／８５％グレード）を、１つのノズルを通してカラムの塔底に散布して、水相を通って上方に流れる抽出剤液滴の分散体を生成した。水相の上部に達した後、抽出剤液滴により別個の有機相が形成され、これはその後、カラムの上部から溢れ、受け器に収集された。通常、１つの試験につき３〜５ガロンのＯＡが、カラムを通って流れた。
【０１９８】
水相の試料を、試験全体を通して数回カラムから引き抜き、溢流から収集された全「富化」ＯＡの複合試料を試験の最後に引き抜いた。全ての試料を、ＨＰ−６８９０  ＧＣを用いてｉ−ＢｕＯＨについて分析した。水相中のｉ−ＢｕＯＨの濃度プロファイル（すなわち、時間に対するｉ−ＢｕＯＨ濃度）を用いて、所与の運転条件におけるｋＬａを計算した。試験中に収集される全「富化」ＯＡの最終的な複合試料を用いて、ｉ−ＢｕＯＨの物質収支を調べた。
【０１９９】
ノズルサイズおよびノズル速度（供給ノズルを通るＯＡの平均速度）を様々に変化させて、ｋＬａに対するそれらの影響を観察した。マッシュ固体が除去されたオリゴ糖の水溶液（液化されたトウモロコシマッシュから得られる希釈された遠心分離液）を用いて、一連の試験を行った。ＳＳＦの途中で液化されたトウモロコシマッシュ（非溶解固体を含む）をシミュレートするためにマッシュ固体を戻し加えた後、オリゴ糖の同じ水溶液を用いて、同様の一連の試験を行った。ある運転条件（例えば、より高いＯＡ流量）下で、カラムの上部において不十分な相分離が得られ、試験中に収集される全「富化」ＯＡの典型的な複合試料を得るのが困難になることが留意される。ある運転条件下で、水相の試料がかなりの量の有機相を含有していたことも留意される。特殊な試料処理および調製技術を用いて、試料が引き抜かれたときにカラム中の水相のできる限り典型的な水相の試料を得た。
【０２００】
ｉ−ＢｕＯＨの濃度が所与の時点でカラムの長さに沿ってそれほど変化しなかったため、カラム中の水相があらゆる実用的な目的のために「よく混合された」ことが分かった。溶媒液滴相もよく混合されたと仮定すると、カラム中の水相から溶媒相へのｉ−ＢｕＯＨの全物質移動を、以下の式によって概算することができる：
【数１】
2013528400.tif 000003
式中、
ｒＢ＝水相の単位体積当たりの単位時間当たりの水相から溶媒相へと移動されるｉ−ＢｕＯＨの全質量（ｉ−ＢｕＯＨのグラム／水相のリットル／時またはｇ／Ｌ／時）である。
ｋＬａ＝水相から溶媒相へのｉ−ＢｕＯＨの物質移動を表す全体積物質移動係数（毎時）である。
ＣＢ，ブロス＝シミュレートされるブロス（水）相中のｉ−ＢｕＯＨの平均濃度（ｉ−ＢｕＯＨのグラム／水相のリットルまたはｇ／Ｌ）である。
ＣＢ，溶媒＝試験全体にわたる溶媒相中のｉ−ＢｕＯＨの平均濃度（ｉ−ＢｕＯＨのグラム／溶媒相のリットルまたはｇ／Ｌ）である。
ＫＢ＝溶媒と水相との間のｉ−ＢｕＯＨの平均平衡分配係数（（ｉ−ＢｕＯＨのグラム／溶媒相のリットル）／（ｉ−ＢｕＯＨのグラム／水相のリットル））である。
【０２０１】
パラメータｒＢ、ＣＢ，ブロス、およびＣＢ，溶媒を、水相および溶媒相の試料から得
られる濃度データから各試験について計算した。液化されたトウモロコシマッシュからの水性遠心分離液、ＯＡ、およびｉ−ＢｕＯＨを混合し、２つの液相が平衡状態になるまで系を激しく混合することによって、パラメータＫＢを独立して測定した。ｉ−ＢｕＯＨの濃度を両方の相において測定して、ＫＢを決定した。ｒＢ、ＣＢ，ブロス、ＣＢ，溶媒、およびＫＢを所与の試験について決定した後、式（１）の配列を変更することによってｋＬａを計算することができた：
【数２】
2013528400.tif 000004
【０２０２】
水相として希釈された遠心分離液（固体を除去したもの）を用いて５フィート／秒〜２１フィート／秒の範囲のノズル速度で２つの異なるサイズのノズルを用いて、物質移動試験を行った。０．７６ｍｍの内径（ＩＤ）を有するノズルを用いて３つの試験を行い、２．０３ｍｍの内径を有するノズルを用いて３つの試験を行った。溶媒としてＯＡを用いて上記の６インチの直径のカラム中で３０℃で全ての試験を行った。ＯＡと、固体を除去することによって液化されたトウモロコシマッシュから得られた希釈された遠心分離液との間のｉ−ＢｕＯＨの平衡分配係数は、約５であった。希釈された遠心分離液（固体を除去したもの）を用いた物質移動試験の結果を表１に示す。
【０２０３】
【表１】
2013528400.tif 000005
【０２０４】
実施例５
物質移動に対する非溶解固体の影響
ＳＳＦの途中の段階の（非溶解固体を含有する）液化されたトウモロコシマッシュからの発酵ブロスをシミュレートする水相を、実施例２からのウェットケーキ（液化されたトウモロコシマッシュから固体を除去することによって最初に得られた）の一部を、希釈された遠心分離液（実施例４において上述した物質移動試験に使用した）に加えることによって合成した。ウェットケーキ中に保持される液相を希釈するためにいくらかの水も加えた。この液体は濃縮された遠心分離液と同じ組成を有するためである。１７．８ｋｇの希釈された上清、１３．０ｋｇのウェットケーキ（約１８重量％の非溶解マッシュ固体を含有する）、５．０ｋｇのＨ２Ｏ、および０．８３ｋｇのｉ−ＢｕＯＨを一緒に混合したところ、約６．３重量％の非溶解固体と、約１３重量％の液化でんぷんおよび約２．４重量％のｉ−ＢｕＯＨ（残りはＨ２Ｏ）からなる液相とを含有する３６．６ｋｇのスラリーが得られた。このスラリーは、約３０％のトウモロコシ充填量におけるｉ−ＢｕＯＨへの、トウモロコシのＳＳＦの途中の段階の発酵ブロスの組成を模倣している。こうしたタイプのブロスに見られる非溶解固体およびオリゴ糖のレベルが、それぞれ約６〜８重量％および１０〜１２重量％であるためである。
【０２０５】
水相として希釈された遠心分離液および非溶解マッシュ固体のスラリーを用いて、５フィート／秒〜２２フィート／秒の範囲のノズル速度で２つの異なるサイズのノズルを用いて、物質移動試験を行った。３つの試験を、０．７６ｍｍの内径を有するノズルを用いて行い、３つの試験を、２．０３ｍｍの内径を有するノズルを用いて行った。溶媒としてＯＡを用いて上記の６インチの直径のカラム中で３０℃で全ての試験を行った。希釈された遠心分離液および非溶解マッシュ固体のスラリーを用いた物質移動試験の結果を表２に示す。
【０２０６】
【表２】
2013528400.tif 000006
【０２０７】
図７は、液化トウモロコシでんぷん（すなわち、オリゴ糖）の水溶液から、気泡塔を通って上方に流れるオレイルアルコール液滴の分散体へのｉ−ＢｕＯＨの移動の全体積物質移動係数、ｋＬａに対する非溶解トウモロコシマッシュ固体の存在の影響を示す。ＯＡを、内径２．０３ｍｍのノズルを通してカラムに供給した。固体が除去されていない系のｋＬａに対する固体が除去された系のｋＬａの比率が、２．０３ｍｍのノズルのノズル速度に応じて２〜５であることが発見された。
【０２０８】
図８は、液化トウモロコシでんぷん（すなわち、オリゴ糖）の水溶液から、気泡塔を通って上方に流れるオレイルアルコール液滴の分散体へのｉ−ＢｕＯＨの移動の全体積物質移動係数、ｋＬａに対する非溶解トウモロコシマッシュ固体の存在の影響を示す。ＯＡを、内径０．７６ｍｍのノズルを通してカラムに供給した。固体が除去されていない系のｋＬａに対する固体が除去された系のｋＬａの比率が、０．７６ｍｍのノズルのノズル速度に応じて２〜４であることが発見された。
【０２０９】
実施例６
水相と溶媒相との間の相分離に対する非溶解固体の除去の影響
この実施例は、非溶解固体が除去されていない液化されたトウモロコシマッシュから得られるオリゴ糖の水溶液および同じ溶媒と比較した、非溶解固体が除去された液化されたトウモロコシマッシュから得られるオリゴ糖の水溶液と溶媒相との間の向上した相分離を示す。両方の系がｉ−ＢｕＯＨを含有していた。水相からの溶媒相の十分な分離は、液液抽出が原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）を実施するための実行可能な分離方法であるために重要である。
【０２１０】
約９００ｇの液化されたトウモロコシマッシュを、１Ｌのガラスの被覆された樹脂ケトル中で調製した。ケトルは、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。以下のプロトコルを使用した：磨砕トウモロコシを水道水と混合し（乾燥量基準で２６重量％のトウモロコシ）、スラリーを、撹拌しながら５５℃まで加熱し、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかを用いてｐＨを５．８に調整し、α−アミラーゼ（乾燥トウモロコシ基準で０．０２重量％）を加え、８５℃まで加熱し続け、ｐＨを５．８に調整し、ｐＨを５．８に保ちながら８５℃で２時間保持し、２５℃に冷却した。使用されるトウモロコシは、Ｐｉｏｎｅｅｒ製の全粒イエローコーン（３３３５）であった。トウモロコシを、１ｍｍのふるいを用いて、ハンマーミルで磨砕した。磨砕トウモロコシの水分含量は１２重量％であり、磨砕トウモロコシのでんぷん含量は、乾燥トウモロコシ基準で７１．４重量％であった。α−アミラーゼ酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）製のＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。使用される成分の総量は：２６５．９ｇの磨砕トウモロコシ（１２％の水分）、６３４．３ｇの水道水、および０．０５６ｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。回収された、液化されたトウモロコシマッシュの総量は８８３．５ｇであった。
【０２１１】
液化されたトウモロコシマッシュの一部を、非溶解固体を除去せずにそのまま用いて、固体を含む、相分離試験用の水相を調製した。液化されたトウモロコシマッシュの一部を遠心分離して、非溶解固体の大部分を除去し、それを用いて、固体を含まない、相分離試験用の水相を調製した。
【０２１２】
固体を、大容量遠心分離機における遠心分離によってマッシュから除去した。５８３．５ｇのマッシュを、３５℃で２０分間、５０００ｒｐｍで遠心分離したところ、３９４．４ｇの遠心分離液および１８９．０ｇのウェットケーキが得られた。遠心分離液が約０．５重量％の懸濁固体を含有し、ウェットケーキが約２０重量％の懸濁固体を含有していたことが分かった。これは、元の液化されたマッシュが、約７重量％の懸濁固体を含有していたことを示唆している。これは、でんぷんの大部分が液化されたと仮定した場合、トウモロコシ充填量および使用されるトウモロコシのでんぷん含量と一致する。でんぷんの全てが液化された場合、遠心分離機から直接回収された遠心分離液は、固体を含まない場合、約２０重量％の溶解されたオリゴ糖（液化でんぷん）を含有していたであろう。
【０２１３】
相分離試験の目的は、液化されたトウモロコシマッシュから得られるブロスをシミュレートする溶媒相と水相との間の相分離の程度に対する非溶解固体の影響を測定することであった。全ての試験において、水性液相は、約２０重量％のオリゴ糖を含有し、有機相は、オレイルアルコール（ＯＡ）を含有していた。さらに、ｉ−ＢｕＯＨを全ての試験に加えたところ、相が平衡状態になったときに水相中約２５ｇ／Ｌが得られた。２つの振とう試験を行った。第１の試験の水相（固体を含むもの）を、６０．０ｇの液化されたトウモロコシマッシュを３．５ｇのｉ−ＢｕＯＨと混合することによって調製した。第２の試験の水相（固体を除去したもの）を、固体を除去することによって液化されたトウモロコシマッシュから得られた６０．０ｇの遠心分離液を、３．５ｇのｉ−ＢｕＯＨと混合することによって調製した。１５．０ｇのオレイルアルコール（Ｃｏｇｎｉｓ製の８０／８５％グレード）を、振とう試験ボトルのそれぞれに加えた。ＯＡは、両方のボトル中の水相の上部に別個の液相を形成し、相の質量比、すなわち水相／溶媒相が約１／４になった。両方のボトルを２分間激しく振とうして、水相と有機相とを密着させ、ｉ−ＢｕＯＨが二相間で平衡に達するようにした。ボトルを１時間静置（ｓｅｔ）しておいた。写真を様々な時間（０分、１５分、３０分、および６０分）で撮影して、液化されたトウモロコシマッシュから得られる水相、ＯＡを含有する溶媒相、およびｉ−ＢｕＯＨを含有する系における相分離に対する非溶解固体の影響を観察した。時間ゼロ（０）は、振とう期間が完了した２分直後の時間に対応する。
【０２１４】
固体（液化されたトウモロコシマッシュに由来する）を含む系および固体を除去した系（液化されたトウモロコシマッシュからの液体遠心分離液）についての、時間に応じた有機（溶媒）相と水相との間の分離の程度は、任意の時点で両方の系においてほぼ同じであるようであった。固体を含む場合、有機相は、わずかに暗色で濁っており、界面が少し曖昧であった（界面の周りの「ラグ（ｒａｇ）」層がより厚い）。しかしながら、溶媒が連続して操作される抽出発酵では、有機相の上部の組成は、次の工程が蒸留である抽出発酵の下流のプロセスに関与する。
【０２１５】
微生物は、蒸留塔において熱的に不活性化されるため、有機相の上部における微生物の量を最小限に抑えることが有利であり得る。微生物は、蒸留塔を詰まらせ、リボイラーを汚染し、カラムの基部に位置する溶媒／水デカンターにおける不十分な相分離の原因となり得、または上述した問題の任意の組合せであり得るため、有機相の上部における非溶解溶媒の量を最小限に抑えることが有利であり得る。有機相の上部における相の水の量を最小限に抑えることが有利であり得る。相の水は、別個の水相として存在する水である。さらなる量の水相は、蒸留塔における負荷およびエネルギー要件を増大させる。１０ミリリットルの試料を、「固体を含む」および「固体を除去した」ボトルからの有機層の上部から除去し、両方の試料を遠心分離して、６０分間の沈降時間の後、「固体を含む」および「固体を除去した」ボトルにおける有機相の組成を明らかにし、比較した。結果は、両方の振とう試験の最後の時点での「有機相」が、いくらかの望ましくない相を含有していた（両方の有機相が濁っている）ことを示す。しかしながら、結果は、固体が除去された、遠心分離液を含む相分離試験からの上層が、非溶解固体を実質的に含有していなかったことも示す。一方、非溶解固体は、マッシュを含む試験の有機相の上部から引き抜かれた１０ｍＬの試料の底部においてはっきりと見られる。有機層の上部から引き抜かれた試料の３％がマッシュ固体を洗浄することが推定された。抽出発酵プロセスの発酵装置を出る富化溶媒相が、３％の非溶解固体を含有していた場合、以下の問題の１つ以上が起こり得る：かなりの量の微生物の損失、溶媒塔リボイラーの汚染、溶媒塔の閉塞。結果は、遠心分離液を含む相分離試験からの上層がより少ない相の水を含有していたことも示す。表３は、６０分間の沈降時間の後の両方の振とう試験ボトルにおける上側「有機」層にわたって分散された相の相対量の推定値を示す。
【０２１６】
【表３】
2013528400.tif 000007
【０２１７】
この実施例は、液化されたトウモロコシマッシュから非溶解固体の大部分を除去すると、マッシュから得られる液体、水相がオレイルアルコールなどの溶媒と接触された後、向上した相分離が得られることを示す。この実施例は、マッシュの液体部分を有機溶媒と接触させる前に固体がまず除去される場合、相分離後に得られる上側相が大幅に少ない非溶解固体を含有することを示す。これは、抽出発酵のための相分離の上側（「有機」）層におけるマッシュの非溶解固体含量を最小限に抑えることの利点を示す。
【０２１８】
実施例７
水相と溶媒相との間の相分離に対する非溶解固体の除去の影響
実施例６と同様に、この実施例は、非溶解固体が除去されていない液化されたトウモロコシマッシュから得られるオリゴ糖の水溶液および同じ溶媒と比較して、非溶解固体が除去された液化されたトウモロコシマッシュから得られるオリゴ糖の水溶液と、溶媒相との間の向上した相分離を示す。両方の系がｉ−ＢｕＯＨを含有していた。水相からの溶媒相の十分な分離は、液液抽出が原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）を実施するための実行可能な分離方法であるために重要である。
【０２１９】
実施例６のために調製される同じ混合物をこの実施例に使用した。唯一の相違は、この実施例に記載される相分離振とう試験を繰り返す前に、実施例６に記載される試料調製の完了後に試料を数日間静置しておいたことであった。「固体を含む」と表示される試料は、液化されたトウモロコシマッシュ、ｉ−ＢｕＯＨ、およびオレイルアルコールからなっていた。「固体を除去した」と表示される試料は、液化されたトウモロコシマッシュから非溶解固体の大部分を除去することによって生成された遠心分離液、ｉ−ＢｕＯＨ、およびオレイルアルコールからなっていた。液化されたマッシュは、約７重量％の懸濁固体を含有し、マッシュから生成される遠心分離液は、約０．５重量％の懸濁固体を含有していた。磨砕トウモロコシ中のでんぷんの全てが液化された場合、液化されたマッシュ中の液相およびマッシュから生成される遠心分離液は、固体を含まない場合、約２０重量％の溶解されたオリゴ糖（液化でんぷん）を含有していた。両方の試料は、相の質量比、すなわち溶媒相／水相が約１／４である量でオレイルアルコールを含有していた。さらに、ｉ−ＢｕＯＨを全ての試験に加えたところ、相が平衡状態になったときに水相中約２５ｇ／Ｌが得られた。
【０２２０】
相分離試験の目的は、抽出発酵全体にわたって系の特性の潜在的変化を模倣するために、多相混合物を室温で数日間エージングさせた後に、溶媒相（ＯＡを含有する）と、液化されたトウモロコシマッシュから得られる水相（固体を含むものおよび含まないもの）との間の相分離の程度に対する非溶解固体の影響を測定することであった。２つの振とう試験を行った。両方のボトルを２分間激しく振とうして、水相と有機相とを密着させた。ボトルを１時間静置しておいた。写真を様々な時間（０分、２分、５分、１０分、２０分、および６０分）で撮影して、数日間エージングしたこれらの系における相分離に対する非溶解固体の影響を観察した。時間ゼロ（０）は、ボトルをベンチに置いた直後の時間に対応する。
【０２２１】
固体が２分後に除去された試料において相分離が起こり始めた。有機相が二相混合物の全体積の約２５％を占めていたことに基づいて、固体がわずか５〜１０分後に除去された場合、ほぼ完全な相分離が試料において起こったと考えられる。有機相が全体積の約２０％を占めていた場合、それが相の初期の比率に対応するため、完全な分離が示され得ることが予測され得る。１時間後でさえ、固体が除去されなかった試料では明らかな相分離は起こっていなかった。
【０２２２】
両方の試料の上側相の組成も比較した。上側相の組成は、次の工程が蒸留である抽出発酵の下流のプロセスのための意味を有する。微生物は蒸留塔において熱的に不活性化されるため、有機相の上部における微生物の量を最小限に抑えることが有利である。固体は、蒸留塔を詰まらせ、リボイラーを汚染し、カラムの基部に位置する溶媒／水デカンターにおける不十分な相分離の原因となり得、または上述した問題の任意の組合せであり得るため、有機相の上部において最小限に抑えるべき別の構成要素は、非溶解固体の量である。さらに、有機相の上部において最小限に抑えるべき別の構成要素は、別個の水相として存在する水である相の水の量であり、その理由は、このさらなる量の水相は、その後の蒸留塔における負荷およびエネルギー要件を増大させるためである。
【０２２３】
１０ミリリットルの試料を、「固体を含む」および「固体を除去した」ボトルからの有機層の上部から除去し、両方の試料を遠心分離して、６０分間の沈降時間の後、「固体を含む」および「固体を除去した」ボトルにおける有機相の組成を明らかにし、比較した。「固体を含む」試料の上部から引き抜かれた試料の組成は、６０分以内に当該試料において相分離が実質的に全く起こらなかったことを確認している。特に、「固体を含む」振とう試験ボトルの上部から引き抜かれた試料中の全水相（水性液体＋懸濁固体）に対する溶媒相の比率は、約１／４ｗ／ｗであり、これは、試験の前に試料を調製するのに使用されるのと同じ比率である。また、「固体を含む」振とう試験ボトルの上部から引き抜かれた試料中の非溶解固体の量は、液化されたトウモロコシマッシュにおいて見られる量とほぼ同じであり、これは、６０分以内にこの振とう試験ボトルにおいて固体が実質的に全く沈降しなかったことを示す。一方、固体を除去した遠心分離液（「固体を除去した」）を含む相分離試験からの上層は、非溶解固体を実質的に含有していなかった。結果は、遠心分離液を含む相分離試験からの上層が相の水を含有していたことも示す。これは、試料ボトルにおける水相に対する溶媒相の比率が約１／１ｗ／ｗであることによって示され、これは、固体を除去した場合の試験において有機相が溶媒（ＯＡ）で富化されたことを示す。表４は、６０分間の沈降時間の後の両方の振とう試験ボトルにおける上側「有機」層にわたって分散された相の相対量の推定値を示す。
【０２２４】
【表４】
2013528400.tif 000008
【０２２５】
この実施例は、ｉ−ＢｕＯＨを含有する液化されたトウモロコシマッシュから非溶解固体を除去し、それを溶媒相と接触させ、それを数日間静置させ、相を再度混合すると、非溶解固体を液化されたマッシュから除去しなかった試料と比較して、向上した相分離が得られることを示す。実際に、この実施例は、非溶解固体を除去しなかった試料において、６０分後でさえ相分離が実質的に全く起こらないことを示す。この実施例は、マッシュの液体部分を有機溶媒と接触させる前に固体がまず除去される場合、相分離後に得られる上側相が大幅に少ない非溶解固体を含有することを示す。抽出発酵のための相分離の上側（「有機」）層において最小限に抑えられるべき最も重要な種の２つが、微生物のレベルおよびマッシュからの非溶解固体のレベルであるため、これは重要である。前の実施例は、液化されたトウモロコシマッシュから固体を除去すると、水相を溶媒相と接触させた直後に向上した相分離が得られることを示した。これにより、抽出発酵が、発酵のより早い時点で実行可能になり得る。この実施例は、液化されたトウモロコシマッシュから固体を除去すると、溶媒相と接触させた水相（固体を除去したオリゴ糖溶液）を含有するエージングした試料において向上した相分離が得られることも示す。また、これにより、抽出発酵が発酵のより遅い時点で実行可能になり得る。
【０２２６】
実施例８
ＩＳＰＲ抽出溶媒の損失に対する非溶解固体の除去の影響−ディスクスタック遠心分離機
この実施例は、半連続的なディスク−スタック遠心分離機を用いて、発酵前にトウモロコシマッシュから非溶解固体を除去することによって、抽出発酵プロセスによって生成されるＤＤＧＳを介した溶媒の損失を減少させる可能性を示す。
【０２２７】
約２１６ｋｇの液化されたトウモロコシマッシュを、被覆されたステンレス鋼反応器中で調製した。反応器は、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。使用されるプロトコルは以下のとおりであった：磨砕トウモロコシを水道水と混合し（乾燥量基準で２５重量％のトウモロコシ）、スラリーを、４００ｒｐｍで撹拌しながら５５℃まで加熱し、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかを用いてｐＨを５．８に調整し、α−アミラーゼ（乾燥トウモロコシ基準で０．０２重量％）を加え、８５℃まで加熱し続け、ｐＨを５．８に調整し、ｐＨを５．８に保ちながら８５℃で３０分間保持し、生蒸気噴射を用いて１２１℃まで加熱し、ジェットクッカーをシミュレートするために１２１℃で３０分間保持し、８５℃に冷却し、ｐＨを５．８に調整し、α−アミラーゼ（乾燥トウモロコシ基準で０．０２重量％）の第２の投入を加え、ｐＨを５．８に保ちながら８５℃で６０分間保持して、液化を完了させた。次に、マッシュを６０℃に冷却し、遠心分離機の供給タンクに移した。
【０２２８】
使用されるトウモロコシは、Ｐｉｏｎｅｅｒ製の全粒イエローコーン（３３３５）であった。トウモロコシを、１ｍｍのふるいを用いて、ハンマーミルで磨砕した。磨砕トウモロコシの水分含量は１２重量％であり、磨砕トウモロコシのでんぷん含量は、乾燥トウモロコシ基準で７１．４重量％であった。α−アミラーゼ酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）製のＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。使用される成分の量は：６１．８ｋｇの磨砕トウモロコシ（１２％の水分）、１４７．３ｋｇの水道水、第１のα−アミラーゼ投入のための１ｋｇの水中の０．０１０９ｋｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳの溶液、第２のα−アミラーゼ投入（調理段階後）のための１ｋｇの水中の０．０１０９ｋｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳの別の溶液であった。約５ｋｇのＨ２Ｏを、調理段階中に蒸気凝縮液を介してバッチに加えた。合計で０．２５ｋｇのＮａＯＨ（１２．５重量％）および０．１２ｋｇのＨ２ＳＯ４（１２．５重量％）を、ｐＨを制御するために実験全体にわたって加えた。回収される液化されたトウモロコシマッシュの総量は２１６ｋｇであった。
【０２２９】
最終的な液化されたトウモロコシマッシュスラリーの組成は、約７重量％の非溶解固体および９３重量％の液体であると推定された。液相は、約１９重量％（１９０ｇ／Ｌ）の液化でんぷん（可溶性オリゴ糖）を含有していた。マッシュのレオロジーは、スラリーをその成分に分離する能力に関して重要である。マッシュ中の液相は、３０℃で約５．５ｃＰの粘度を有するニュートン流体であることが分かった。マッシュスラリーは、せん断速度に応じて、８５℃で約１０〜７０ｃＰの体積粘度を有するずり薄化（ｓｈｅａｒ−ｔｈｉｎｎｉｎｇ）流体であることが分かった。
【０２３０】
２０９ｋｇ（１９０Ｌ）の液化されたマッシュを、Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌディスク−スタック分離ボウル（ｓｐｌｉｔ−ｂｏｗｌ）遠心分離機を用いて遠心分離した。遠心分離機を、連続した供給、連続した遠心分離液排出、およびウェットケーキのバッチ排出を含むセミバッチモードで運転した。液化されたトウモロコシマッシュを、１Ｌ／分の速度で連続して供給し、浄化された遠心分離液を連続して除去し、ウェットケーキを４分ごとに定期的に排出した。ディスクスタックからの固体の適切な排出間隔を決定するために、ディスクスタックに供給されるマッシュの試料を、高速の実験用遠心分離機で遠心分離した。マッシュ（４８．５ｇ）を、室温で約１０分間、１１，０００ｒｐｍ（約２１，０００ｇ’ｓ）で回転させた。浄化された遠心分離液（３６．１ｇ）および１２．４ｇのペレット（ウェットケーキ）を回収した。浄化された遠心分離液は、約０．３重量％の非溶解固体を含有し、ペレット（ウェットケーキ）は、約２７重量％の非溶解固体を含有していたことが分かった。このデータに基づいて、４分間の排出間隔を、ディスクスタック遠心分離機の運転のために選択した。
【０２３１】
ディスクスタック遠心分離機を、１Ｌ／分の液化されたトウモロコシマッシュ供給速度および約６０℃で、９０００ｒｐｍ（６１００ｇ’ｓ）で運転した。マッシュ（２０９ｋｇ）を、１５５ｋｇの浄化された遠心分離液と、５５ｋｇのウェットケーキとに分離した。半連続ディスクスタックによって得られる、（遠心分離液の量）／（供給されるマッシュの量）として定義されるスプリット（ｓｐｌｉｔ）は、バッチ式遠心分離機において得られるスプリットと同様であった。６１００ｇ’ｓ、１Ｌ／分の供給速度、および４分間の排出間隔で運転されるディスクスタックセミバッチ式遠心分離機のスプリットは、（１５５ｋｇ／２０９ｋｇ）＝７４％であり、２１，０００ｇ’ｓで１０分間運転される実験用のバッチ式遠心分離機のスプリットは、（３６．１ｇ／４８．５ｇ）＝７４％であった。
【０２３２】
ディスクスタック遠心分離から回収される浄化された遠心分離液の４５ｍＬの試料を、実験用遠心分離機において２１，０００ｇ’ｓで１０分間回転させて、遠心分離液中の懸濁固体のレベルを推定した。約０．１５〜０．３ｇの非溶解固体を、４５ｍＬの遠心分離液から回収した。これは、遠心分離液中の０．３〜０．７重量％の非溶解固体に相当し、これは、遠心分離機に供給されるマッシュからの非溶解固体の約１０倍の減少である。発酵前にトウモロコシマッシュから懸濁固体を除去するために、抽出発酵の際に存在する非溶解固体のレベルが、いくつかの固／液分離デバイスまたはデバイスの組合せを用いて、１桁減少される場合、ＤＤＧＳを介したＩＳＰＲ抽出溶媒損失が、約１桁減少され得ると仮定することが妥当である。ＤＤＧＳを介した溶媒損失を最小限に抑えることは、抽出発酵プロセスの経済性およびＤＤＧＳ品質の重要な要因である。
【０２３３】
実施例９
ＩＳＰＲ抽出溶媒の損失に対する非溶解固体の除去の影響−ボトル回転試験
この実施例は、遠心分離機を用いて、発酵前にトウモロコシマッシュから非溶解固体を除去することによって、抽出発酵プロセスによって生成されるＤＤＧＳを介した溶媒の損失を減少させる可能性を示す。
【０２３４】
実験室規模のボトル回転試験を、液化されたトウモロコシマッシュを用いて行った。試験は、商業的なエタノール（ＥｔＯＨ）プラント中の全蒸留廃液から非溶解固体を除去するのに使用される典型的なデカンター遠心分離機の運転条件をシミュレートするものである。商業的なＥｔＯＨプラントにおけるデカンター遠心分離機は、通常、約３０００ｇ’ｓの相対遠心力（ＲＣＦ）および約３０秒間の全蒸留廃液滞留時間で運転される。これらの遠心分離機は、通常、約５％〜６％の懸濁固体（ビール塔の後）を含有する全蒸留廃液中の懸濁固体の約９０％を除去し、約０．５％の懸濁固体を含有する希薄な蒸留廃液が得られる。
【０２３５】
液化されたトウモロコシマッシュを、実施例６に記載されるプロトコルにしたがって作製した。約１０ｍＬのマッシュを遠心分離機管に入れた。試料を、合計１分間、約３０００ｇ’ｓのＲＣＦ（４４００ｒｐｍのローター速度）で遠心分離した。試料を、遠心分離機の加速および減速により、３０００ｇ’ｓで約３０〜４０秒間および３０００ｇ’ｓ未満の速度で合計２０〜３０秒間経過させた。試料温度は約６０℃であった。
【０２３６】
約７重量％の懸濁固体を含有する１０ｍＬのマッシュを、約６．２５ｍＬの浄化された遠心分離液と、３．７５ｍＬのウェットケーキ（遠心分離機管の底部におけるペレット）とに分離した。ボトル回転試験によって得られる、（遠心分離液の量）／（投入される元のマッシュの量）として定義されるスプリットは、約６２％であった。浄化された遠心分離液は、約０．５重量％の懸濁固体を含有し、これは、元のマッシュ中の懸濁固体のレベルと比較して懸濁固体中では１０倍を超える減少であることが分かった。浄化されたペレットは、約１８重量％の懸濁固体を含有していたことも分かった。
【０２３７】
表５は、商業的なＥｔＯＨプロセスにおいて全蒸留廃液を希薄な蒸留廃液に転化するデカンター遠心分離機の運転の典型的な条件でのボトル回転試験の懸濁（非溶解）固体の物質収支をまとめたものである。表５に示される全ての値は概算値である。
【０２３８】
【表５】
2013528400.tif 000009
【０２３９】
遠心分離液は、約１９０ｇ／Ｌの溶解されたオリゴ糖（液化でんぷん）を含有していたことも分かった。これは、使用されるトウモロコシ充填量（乾燥トウモロコシ基準で約２６重量％）および液化されたマッシュ（乾燥トウモロコシ基準で約７１．４重量％のでんぷん）を生成するのに使用されるトウモロコシにおけるでんぷん含量に基づいて、磨砕トウモロコシ中のでんぷんの大部分が液化プロセスにおいて液化された（すなわち、可溶性オリゴ糖に加水分解された）という仮定と一致する。２６％の乾燥トウモロコシ充填量における磨砕トウモロコシ中のでんぷんの大部分を加水分解すると、ボトル回転試験に使用される遠心分離機に投入される液化されたトウモロコシマッシュ中の約７重量％の懸濁（非溶解）固体が得られる。
【０２４０】
浄化された遠心分離液が、わずか約０．５重量％の非溶解固体を含有していたことは、ボトル回転試験に使用される条件が、投入されるマッシュからの非溶解固体の１０倍を超える減少をもたらしたことを示す。この同じ固体除去性能が発酵前に連続デカンター遠心分離機によって得られる場合、ＤＤＧＳ中のＩＳＰＲ抽出溶媒損失が、約１桁減少され得ると仮定することが妥当である。ＤＤＧＳを介した溶媒損失を最小限に抑えることは、抽出発酵プロセスの経済性およびＤＤＧＳ品質の重要な要因である。
【０２４１】
実施例１０
非溶解固体を除去することによるトウモロコシ油の除去
この実施例は、発酵前に非溶解固体を除去することによって、トウモロコシマッシュからトウモロコシ油を除去および回収する可能性を示す。抽出溶媒の有効性は、トウモロコシ油が、非溶解固体の除去によって除去される場合に向上され得る。さらに、非溶解固体の除去によるトウモロコシ油の除去により、溶媒分配係数の減少を最小限に抑えることができ、向上した抽出発酵プロセスが得られる可能性もある。
【０２４２】
約１０００ｇの液化されたトウモロコシマッシュを、１Ｌのガラスの被覆された樹脂ケトル中で調製した。ケトルは、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。以下のプロトコルを使用した：磨砕トウモロコシを水道水と混合し（乾燥量基準で２６重量％のトウモロコシ）、スラリーを、撹拌しながら５５℃まで加熱し、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかを用いてｐＨを５．８に調整し、α−アミラーゼ（乾燥トウモロコシ基準で０．０２重量％）を加え、８５℃まで加熱し続け、ｐＨを５．８に調整し、ｐＨを５．８に保ちながら８５℃で２時間保持し、２５℃に冷却した。使用されるトウモロコシは、Ｐｉｏｎｅｅｒ製の全粒イエローコーン（３３３５）であった。トウモロコシを、１ｍｍのふるいを用いて、ハンマーミルで磨砕した。磨砕トウモロコシの水分含量は約１１．７重量％であり、磨砕トウモロコシのでんぷん含量は、乾燥トウモロコシ基準で約７１．４重量％であった。α−アミラーゼ酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）製のＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。使用される成分の総量は：２９４．５ｇの磨砕トウモロコシ（１１．７％の水分）、７０５．５ｇの水道水、および０．０５９ｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。酵素を希釈するために水（４．３ｇ）を加え、ｐＨを制御するために合計２．３ｇの２０％のＮａＯＨ溶液を加えた。約９５２ｇのマッシュを回収した。
【０２４３】
液化されたトウモロコシマッシュを、４０℃で３０分間、５０００ｒｐｍ（７２６０ｇ’ｓ）で遠心分離して、オリゴ糖の水溶液から非溶解固体を除去した。遠心分離によって固体を除去すると、水相の上部の別個の有機液体層としてフリートウモロコシ油も除去される。約１．５ｇのトウモロコシ油を、水相の上部に浮遊する有機層から回収した。液化されたマッシュを生成するのに使用される磨砕トウモロコシは、乾燥トウモロコシ基準で約３．５重量％のトウモロコシ油を含有していたことが、ヘキサン抽出によって分かった。これは、磨砕トウモロコシを含む、液化プロセスに供給される約９ｇのトウモロコシ油に相当する。
【０２４４】
トウモロコシ油を液化されたマッシュから回収した後、オリゴ糖の水溶液をデカントして、ウェットケーキから取り除いた。約６１７ｇの液化でんぷん溶液を回収したところ、約３３４ｇのウェットケーキが残った。ウェットケーキは、液化されたマッシュ中にあった非溶解固体の大部分を含有していた。液化でんぷん溶液は、約０．２重量％の非溶解固体を含有していた。ウェットケーキは、約２１重量％の非溶解固体を含有していた。ウェットケーキを１０００ｇの水道水で洗浄して、ケーキ中に残っているオリゴ糖を除去した。ケーキを水と混合して、スラリーを形成することによって、これを行った。次に、洗浄された固体を回収するために、元のマッシュを遠心分離するのに使用されるのと同じ条件下でスラリーを遠心分離した。洗浄スラリーを遠心分離することによって洗浄された固体を除去すると、液化されたマッシュから生成される元のウェットケーキとともに残っているはずのいくらかのさらなるフリートウモロコシ油も除去された。このさらなるトウモロコシ油は、遠心分離された洗浄混合物の水相の上部における別個の薄い有機液体層として観察された。約１ｇのさらなるトウモロコシ油を洗浄プロセスから回収した。
【０２４５】
湿潤固体を、毎回１０００ｇの水道水を用いてさらに２回洗浄して、液化でんぷんの実質的に全てを除去した。目視可能なさらなるトウモロコシ油は、マッシュ固体の２回目および３回目の水洗浄から除去されなかった。最終的な洗浄固体を、真空オーブン中で一晩、８０℃および約２０水銀柱インチの真空下で乾燥させた。乾燥固体中に残っている（おそらく胚芽中に残っている）トウモロコシ油の量を、ヘキサン抽出によって測定した。比較的乾燥した固体（約２重量％の水分）の３．６０ｇの試料が、０．２２ｇのトウモロコシ油を含有していたことが測定された。この結果は、乾燥固体のｇ当たり０．０６２４ｇのトウモロコシ油に相当する。これは、湿潤固体中に残留オリゴ糖がないことを意味する洗浄された固体の場合であった。液化されたトウモロコシマッシュを遠心分離して、フリートウモロコシ油の層およびオリゴ糖の水溶液をウェットケーキから分離した後、約２１重量％の非溶解固体を含有する約３３４ｇのウェットケーキが残っていたことが分かった。これは、約７０．１ｇの非溶解固体を含むウェットケーキに相当する。乾燥固体のｇ当たり０．０６２４ｇのトウモロコシ油において、ウェットケーキ中の固体は、約４．４ｇのトウモロコシ油を含有するはずである。
【０２４６】
要約すると、液化されたマッシュを遠心分離することによって、約１．５ｇのフリートウモロコシ油を回収した。マッシュから生成される元のウェットケーキを洗浄するために生成された第１の（水）洗浄スラリーを遠心分離することによって、さらなる１ｇのフリートウモロコシ油を回収した。最終的に、洗浄された固体が、約４．４ｇのトウモロコシ油を依然として含有していたことが分かった。液化に投入されたトウモロコシが、約９ｇのトウモロコシ油を含有していたことも分かった。したがって、合計６．９ｇのトウモロコシ油を以下のプロセス工程から回収した：液化、液化されたマッシュからの固体の除去、マッシュからの固体の洗浄、および最終的な洗浄された固体。その結果、液化に供給されるトウモロコシ中の全トウモロコシ油の約７６％を、本明細書に記載される液化および固体除去プロセス中に回収した。
【０２４７】
実施例１１
糖源としてマッシュおよび遠心分離液を用いた抽出発酵
この実施例は、糖源としてトウモロコシマッシュおよびトウモロコシマッシュ遠心分離液を用いて行われる抽出発酵を説明する。発酵前にトウモロコシマッシュから非溶解固体を除去することによって、トウモロコシマッシュ遠心分離液を生成した。４つの抽出発酵を、並行して行い、２つは、液化されたトウモロコシマッシュを糖源（固体を除去したもの）として用い、２つは、非溶解固体の大部分を液化されたトウモロコシマッシュから除去することによって得られる液化されたマッシュ遠心分離液（オリゴ糖の水溶液）を用いた。オレイルアルコール（ＯＡ）を発酵の２つ（１つは固体を含み、１つは固体を除去したもの）に加えて、生成物が形成されるにつれて生成物（ｉ−ＢｕＯＨ）をブロスから抽出した。トウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）の混合物を、発酵の他の２つ（１つは固体を含み、１つは固体を除去したもの）に加えて、生成物が形成されるにつれて生成物をブロスから抽出した。トウモロコシ油を加水分解することによってＣＯＦＡを作製した。これらの発酵の目的は、溶媒とブロスとの間の相分離に対する固体の除去の影響を試験すること（実施例１１を参照）および固体を除去したまたは除去しなかった発酵ブロスから回収される非溶解固体に捕捉される残留溶媒の量を測定すること（実施例１２を参照）であった。
【０２４８】
液化されたトウモロコシマッシュの調製
約３１ｋｇの液化されたトウモロコシマッシュを、３０Ｌの被覆されたガラス樹脂ケトル中で調製した。反応器は、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。使用されるプロトコルは以下のとおりであった：磨砕トウモロコシを水道水と混合し（乾燥量基準で４０重量％のトウモロコシ）、スラリーを、２５０ｒｐｍで撹拌しながら５５℃まで加熱し、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかを用いてｐＨを５．８に調整し、α−アミラーゼの希薄水溶液（乾燥トウモロコシ基準で０．１６重量％）を加え、５５℃で６０分間保持し、９５℃まで加熱し、ｐＨを５．８に調整し、ｐＨを５．８に保ちながら９５℃で１２０分間保持して、液化を完了させた。汚染を防止するために、マッシュを滅菌した遠心分離機ボトルに移した。
【０２４９】
使用されるトウモロコシは、Ｐｉｏｎｅｅｒ製の全粒イエローコーンであった。トウモロコシを、１ｍｍのふるいを用いて、パイロット規模のハンマーミルで磨砕した。磨砕トウモロコシの水分含量は約１２重量％であり、磨砕トウモロコシのでんぷん含量は、乾燥トウモロコシ基準で約７１．４重量％であった。使用されるα−アミラーゼ酵素は、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｒｅｄ−Ｌ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（登録商標），Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）であった。使用される成分の量は：１４．１ｋｇの磨砕トウモロコシ（１２％の水分）、１６．９ｋｇの水道水、２．０ｋｇの水中の１９．５ｇのＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｒｅｄ−Ｌからなるα−アミラーゼの溶液であった。α−アミラーゼを滅菌ろ過した。ｐＨを制御するために、合計０．２１ｋｇのＮａＯＨ（１７重量％）を実験全体にわたって加えた。
【０２５０】
液化されたトウモロコシマッシュは、全てのでんぷんが液化中に加水分解されたと仮定して、使用されるトウモロコシ充填量、トウモロコシのでんぷん含量を基準にして、約２８重量％（約２８０ｇ／Ｌ）の液化でんぷんを含有していたことが推定された。マッシュを、発酵に必要とされるより高濃度のオリゴ糖を用いて調製して、栄養、接種材料、グルコアミラーゼ、および基剤を初期の発酵ブロスに加えるときに希釈を可能にした。栄養、接種材料、グルコアミラーゼ、および基剤の添加によって希釈した後、マッシュ（固体を除去していないもの）中の予測される全初期可溶性糖は約２５０ｇ／Ｌであった。
【０２５１】
約１３．９ｋｇの液化されたマッシュを、６つの１Ｌのボトルを含むボトル遠心分離機を用いて遠心分離した。遠心分離機を、室温で２０分間、５０００ｒｐｍ（７２６０ＲＣＦ）で運転した。マッシュを、約５．５ｋｇの浄化された遠心分離液と、約８．４ｋｇのウェットケーキ（遠心分離機ボトルの底部におけるペレット）とに分離した。（遠心分離液の量）／（供給されるマッシュの量）として定義されるスプリットは、約（５．５ｋｇ／１３．９ｋｇ）＝４０％であった。
【０２５２】
後述される２０１０Ｙ０３４および２０１０Ｙ０３６発酵に投入されるマッシュから固体を除去しなかった。発酵２０１０Ｙ０３３および２０１０Ｙ０３５（後述もされている）に投入される遠心分離液を、上記のプロトコルにしたがって懸濁固体の大部分をマッシュから（遠心分離によって）除去することによって生成した。
【０２５３】
発酵の一般的な方法
シードフラスコ増殖（Ｓｅｅｄ  Ｆｌａｓｋ  Ｇｒｏｗｔｈ）
ｐｄｃ１が欠損した、ｐｄｃ５が欠損した、およびｐｄｃ６が欠損した、炭水化物源からイソブタノールを生成するように改変されたサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を、凍結された培地からのシードフラスコ中で０．５５〜１．１ｇ／Ｌ  ｄｃｗ（ＯＤ６００  １．３〜２．６−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｅｌｉｏｓ  α  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）まで増殖させた。培地を、３００ｒｐｍで回転する培養器中、２６℃で増殖させた。凍結した培地を−８０℃で予め貯蔵した。第１のシードフラスコ培地の組成は以下のとおりであった：
３．０ｇ／Ｌのデキストロース
３．０ｇ／Ｌの無水エタノール
３．７ｇ／ＬのＦｏｒＭｅｄｉｕｍ（商標）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（Ｋａｉｓｅｒ）Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ：ＨＩＳなし、ＵＲＡなし（参照番号ＤＳＣＫ１６２ＣＫ）
アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（番号２９１９２０）。
【０２５４】
第１のシードフラスコ培地からの１２ミリリットルを、２Ｌのフラスコに移し、３００ｒｐｍで回転する培養器中、３０℃で増殖させた。第２のシードフラスコは、２２０ｍＬの以下の培地を有する：
３０．０ｇ／Ｌのデキストロース
５．０ｇ／Ｌの無水エタノール
３．７ｇ／ＬのＦｏｒＭｅｄｉｕｍ（商標）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（Ｋａｉｓｅｒ）Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ：ＨＩＳなし、ＵＲＡなし（参照番号ＤＳＣＫ１６２ＣＫ）
アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（番号２９１９２０）
ｐＨ５．５〜６．０に滴定された０．２ＭのＭＥＳ緩衝液。
【０２５５】
培地を、０．５５〜１．１ｇ／Ｌ  ｄｃｗ（ＯＤ６００  １．３〜２．６）で増殖させた。２００ｇ／Ｌのペプトンおよび１００ｇ／Ｌの酵母抽出物を含有するさらなる３０ｍＬの溶液を、この細胞濃縮物に加えた。次に、さらなる３００ｍＬの０．２ｕＭのろ過滅菌されたＣｏｇｎｉｓ、９０〜９５％のオレイルアルコールをフラスコに加えた。４ｇ／Ｌ  ｄｃｗ超（ＯＤ６００＞１０）まで培地を増殖させ続けてから、採取し、発酵に加えた。
【０２５６】
発酵調製
初期の発酵装置調製
ガラスの被覆された２Ｌの発酵装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、固体を含むかまたは固体を含まない液化されたマッシュ（遠心分離液）を投入した。ｐＨプローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｅａｓｙｆｅｒｍ  Ｐｌｕｓ  Ｋ８、部品番号：２３８６２７、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｂｏｎａｄｕｚ  ＡＧ，Ｂｏｎａｄｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＤＣＵ−３  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔｏｗｅｒ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎメニューによって較正した。ｐＨ＝７でゼロ較正を行った。ｐＨ＝４でスパン較正を行った。次に、プローブを、ステンレス鋼のヘッドプレートを通して発酵装置に入れた。溶解された酸素プローブ（ｐＯ２プローブ）も、ヘッドプレートを通して発酵装置に入れた。栄養、シード培地、抽出溶媒、および基剤を送達するのに使用される管をヘッドプレートに取り付け、端部に箔を被せた（ｆｏｉｌ）。発酵装置全体をＳｔｅｒｉｓ（Ｓｔｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｎｔｏｒ，Ｏｈｉｏ）オートクレーブに入れ、液体サイクル中で３０分間滅菌した。
【０２５７】
発酵装置をオートクレーブから取り出し、ロードセル上に設置した。ジャケット水供給および戻り管路を、それぞれ家庭用水および排水管（ｈｏｕｓｅ  ｗａｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｌｅａｎ  ｄｒａｉｎ）に連結した。流入水および流出水の配管を冷却する凝縮器を、７℃で運転される６Ｌの再循環温度浴に連結した。発酵装置からのガスを移送する通気管路を、Ｔｈｅｒｍｏ質量分析計（Ｐｒｉｍａ  ｄＢ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に連結された移送管路に連結した。スパージャ管路をガス供給管路に連結した。栄養、抽出溶媒、シード培地、および基剤を加えるための管を、ポンプを通して配管し（ｐｌｕｍｂ）、しっかりと固定した。オートクレーブ材料、０．９％  ｗ／ｖのＮａＣｌを、液化されたマッシュを加える前に排出した。
【０２５８】
液化後のリパーゼ処理
液化サイクルが完了した後（液化）、発酵装置温度を３０℃の代わりに５５℃に設定した。必要に応じて酸または塩基のボーラス添加を行うことによって、ｐＨをｐＨ＝５．８に手作業で制御した。リパーゼ酵素原液を、最終的なリパーゼ濃度が１０ｐｐｍになるように発酵装置に加えた。発酵装置を、５５℃、３００ｒｐｍ、および０．３ｓｌｐｍのＮ２重層（ｏｖｅｒｌａｙ）で６時間超にわたって保持した。リパーゼ処理が完了した後、発酵装置温度を３０℃に設定した。
【０２５９】
接種の前の栄養添加
接種の直前に７．０ｍＬ／Ｌ（接種後の体積）のエタノール（２００プルーフ、無水）を加えた。接種の直前に２０ｍｇ／Ｌの最終濃度になるようにチアミンを加えた。接種の直前に１００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を加えた。
【０２６０】
発酵装置の接種
Ｎ２を発酵装置に加えながら、発酵装置ｐＯ２プローブをゼロに較正した。発酵装置ｐＯ２プローブを、３００ｒｐｍにおける滅菌空気スパージを用いてそのスパンに較正した。第２のシードフラスコが４ｇ／Ｌ  ｄｃｗ超になった後、発酵装置に接種した。振とうフラスコを培養器／振とう器から５分間取り出して、オレイルアルコール相と水相との相分離を可能にした。５５ｍＬの水相を滅菌した接種ボトルに移した。接種材料を、蠕動ポンプを通して発酵装置に注入した。
【０２６１】
接種後のオレイルアルコールまたはトウモロコシ油脂肪酸の添加
接種の直後に１Ｌ／Ｌ（接種後の体積）のオレイルアルコールまたはトウモロコシ油脂肪酸を加えた。
【０２６２】
発酵装置の運転条件
発酵装置を、増殖および生成段階全体について３０℃で運転した。ｐＨを、酸を全く加えずに５．７〜５．９のｐＨから５．２の制御設定点まで低下させた。増殖および生成段階の残りでは、水酸化アンモニウムを用いて、ｐＨをｐＨ＝５．２に制御した。増殖および生成段階の残りでは、無菌の空気を、スパージャを介して、０．３ｓｌｐｍで発酵装置に加えた。ＤＣＵ−３  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｏｘ  ＰＩＤ制御ループによって、撹拌制御のみを用いて、撹拌器を最小で３００ｒｐｍに設定し、最大で２０００ｒｐｍに設定して、ｐＯ２を、３．０％に制御されるように設定した。a−アミラーゼ（グルコアミラーゼ）を加えることによって、液化トウモロコシマッシュの同時糖化発酵によってグルコースを供給した。でんぷんが糖化に利用できる限り、グルコースを過剰（１〜５０ｇ／Ｌ）に保った。
【０２６３】
分析
ガスの分析
処理空気を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｒｉｍａ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）質量分析計で分析した。これは、滅菌してから各発酵装置に加えたのと同じ処理空気であった。各発酵装置のオフガスを、同じ質量分析計で分析した。このＴｈｅｒｍｏ  Ｐｒｉｍａ  ｄＢは、毎週月曜の午前６：００に較正チェックを実行する機能を有する。較正チェックを、質量分析器に関連するＧａｓ  Ｗｏｒｋｓ  ｖ１．０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）ソフトウェアによってスケジューリングした。較正されるガスは以下のとおりであった：
【０２６４】
【表６】
2013528400.tif 000010
【０２６５】
二酸化炭素を、他の公知のボトル入りのガスを用いて、較正サイクル中５％および１５％でチェックした。酸素を、他の公知のボトル入りのガスを用いて１５％でチェックした。各発酵装置のオフガスの分析に基づいて、ストリッピングされたイソブタノール、消費された酸素、およびオフガスに吸入された二酸化炭素の量を、質量分析計のモル分率分析および発酵装置に入るガス流量（質量流制御装置）を用いて測定した。１時間当たりのガス速度を計算し、次に、発酵の間のその速度を積分した。
【０２６６】
バイオマスの測定
０．０８％のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ溶液を、１×ＰＢＳによる、ＮａＣｌ（ＶＷＲ  ＢＤＨ８７２１−０）中の０．４％のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅの１：５の希釈液から調製した。１．０ｍＬの試料を、発酵装置から引き抜き、１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機管に入れ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，５４１５において、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離の後、上部の溶媒層を、２０〜２００μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を有するｍ２００  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ＢｉｏＨｉｔピペットを用いて除去した。溶媒と水層との間の層を除去しないように注意した。溶媒層を除去してから、試料を、２７００ｒｐｍに設定されたＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ（登録商標）を用いて再懸濁した。
【０２６７】
細胞を血球計計数のための理想的な濃度にするために、一連の希釈が必要とされた。ＯＤが１０であった場合、理想的な量（２０〜３０）の細胞が平方当たり係数されるようにし得る０．５のＯＤを得るために、１：２０の希釈を行い得る。トウモロコシの固体による、希釈の不正確性を低下させるために、カットされた１００〜１０００μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を用いた複数回の希釈が必要とされた。先端が詰まるのを防いで開口を広げるために、約１ｃｍを先端からカットした。１：２０の最終的な希釈の場合、発酵試料および０．９％のＮａＣｌ溶液の初期の１：１の希釈を行った。次に、前の溶液および０．９％のＮａＣｌ溶液の１：１の希釈、次に、最終的に、前の溶液およびＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ溶液による１：５の希釈。試料を各希釈の間にボルテックスし、カットされた先端を０．９％のＮａＣｌおよびＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ溶液に入れてすすいだ。
【０２６８】
カバースリップを、Ｈａｕｓｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｂｒｉｇｈｔ−Ｌｉｎｅ
１４９２、血球計の上部に注意深く入れた。２〜２０μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を有するｍ２０  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ＢｉｏＨｉｔピペットを用いて、１０ｕＬを、最終的なＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ希釈液から抜き取り、血球計に注入した。血球計を４０倍の倍率のＺｅｉｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ４０顕微鏡に設置した。中央の４分の１（ｃｅｎｔｅｒ  ｑｕａｄｒａｎｔ）を２５個の方形に分割し、両方のチャンバーにおける４隅および中央の方形（ｃｅｎｔｅｒ  ｓｑｕａｒｅ）を計数し、記録した。両方のチャンバーを計数した後、平均値を取り、希釈係数（２０）を乗算し、次に血球計における中央の４分の１における方形の数の２５を乗算し、次に計数された４分の１の体積である０．０００１ｍＬで除算した。この計算の合計は、ｍＬ当たりの細胞の数である。
【０２６９】
水相中の発酵生成物のＬＣ分析
試料を処理の準備ができるまで冷蔵した。試料を、１時間冷蔵から取り出して、室温にした。約３００ｕＬの試料を、１００〜１０００μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を有するｍ１０００  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ＢｉｏＨｉｔピペットを用いて、０．２ｕｍの遠心分離機フィルター（Ｎａｎｏｓｅｐ  ＭＦの改造されたナイロン遠心分離機フィルター）に移し、次にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１５Ｃを用いて、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。約２００ｕＬのろ過された試料を、ポリマーフィート（ｆｅｅｔ）とともに２５０ｕＬのガラス容器挿入部（ｉｎｓｅｒｔ）を備えた１．８オートサンプラー容器に移した。ＰＴＦＥ隔壁を備えたねじ蓋を用いて容器に蓋をしてから、２７００ｒｐｍに設定されたＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ（登録商標）を用いて試料をボルテックスした。
【０２７０】
次に、試料を、バイナリアイソクラティックポンプ、真空脱気装置、加熱されたカラム区画、サンプラー冷却システム、ＵＶ  ＤＡＤ検出器およびＲＩ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＬＣで実験した。使用されたカラムは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｈリフィル、３０Ｘ４．６ガードカラムを備えたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ，３００  Ｘ  ７．８であった。カラム温度は、０．０１Ｎの硫酸の移動相を用いて、０．６ｍＬ／分の流量で４０分間、４０℃であった。結果を表６に示す。
【０２７１】
【表７】
2013528400.tif 000011
【０２７２】
溶媒相中の発酵生成物のＧＣ分析
試料を処理の準備ができるまで冷蔵した。試料を、１時間冷蔵から取り出して、室温にした。約１５０ｕＬの試料を、１００〜１０００μＬのＢｉｏＨｉｔピペット先端を有するｍ１０００  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ＢｉｏＨｉｔピペットを用いて、ポリマーフィートとともに２５０ｕＬのガラス容器挿入部を備えた１．８オートサンプラー容器に移した。ＰＴＦＥ隔壁を備えたねじ蓋を用いて容器に蓋をした。
【０２７３】
次に、試料を、７６８３Ｂ注入器およびＧ２６１４Ａオートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ７８９０Ａ  ＧＣで実験した。カラムは、ＨＰ−ＩｎｎｏＷａｘカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍの内径、０．２５μｍのフィルム）であった。キャリアガスは、一定の上部圧力を用いて４５℃で測定される１．５ｍＬ／分の流量でヘリウムであり；注入器スプリットは、２２５℃で１：５０であり；オーブン温度は、１．５分間４５℃、１０℃／分で０分間、４５℃〜１６０℃、次に２９分間の実行時間について、３５℃／分で１４分間、２３０℃であった。炎イオン化検出を、４０ｍＬ／分のヘリウムメイクアップガスを用いて２６０℃で使用した。結果を表７に示す。
【０２７４】
【表８】
2013528400.tif 000012
【０２７５】
脂肪酸ブチルエステルについて分析される試料を、７６８３Ｂ注入器およびＧ２６１４Ａオートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ＧＣで実験した。カラムは、ＨＰ−ＤＢ−ＦＦＡＰカラム（１５メートル×０．５３ｍｍの内径（Ｍｅｇａｂｏｒｅ）、１−ミクロンのフィルム厚さのカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍの内径、０．２５μｍのフィルム）であった。キャリアガスは、一定の上部圧力を用いて４５℃で測定される３．７ｍＬ／分の流量でヘリウムであり；注入器スプリットは、２２５℃で１：５０であり；オーブン温度は、２．０分間１００℃、１０℃／分で１００℃〜２５０℃、次に、２６分間の実行時間について、９分間２５０℃であった。炎イオン化検出を、４０ｍＬ／分のヘリウムメイクアップガスを用いて３００℃で使用した。以下のＧＣ標準（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ；Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を用いて、脂肪酸イソブチルエステル生成物：パルミチン酸イソ−ブチル、ステアリン酸イソ−ブチル、オレイン酸イソ−ブチル、リノール酸イソ−ブチル、リノレン酸イソ−ブチル、アラキドン酸イソ−ブチルの属性を確認した。
【０２７６】
実施例１１Ａ
実験識別子２０１０Ｙ０３３は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、固体を除外したトウモロコシマッシュを用いた初期の発酵装置の調製方法、液化後のリパーゼ処理、接種方法の前の栄養添加、発酵装置の接種方法、発酵装置の運転条件方法、および分析方法の全て。トウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェン（ｂｕｔａｎｏｌｏｇｅｎ）は、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ  Δｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ／ｐＹＺ０９０＋ｐＬＨ４６８（ＮＧＣＩ−０７０）であった。
【０２７７】
実施例１１Ｂ
実験識別子２０１０Ｙ０３４は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、固体を含むトウモロコシマッシュを用いた初期の発酵装置の調製方法、液化後のリパーゼ処理、接種方法の前の栄養添加、発酵装置の接種方法、発酵装置の運転条件方法、および分析方法の全て。トウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンは、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ  Δｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ／ｐＹＺ０９０＋ｐＬＨ４６８（ＮＧＣＩ−０７０）であった。
【０２７８】
実施例１１Ｃ
実験識別子２０１０Ｙ０３５は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、固体を除外したトウモロコシマッシュを用いた初期の発酵装置の調製方法、接種方法の前の栄養添加、発酵装置の接種方法、発酵装置の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンは、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ  Δｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ／ｐＹＺ０９０＋ｐＬＨ４６８（ＮＧＣＩ−０７０）であった。
【０２７９】
実施例１１Ｄ
実験識別子２０１０Ｙ０３６は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、固体を含むトウモロコシマッシュを用いた初期の発酵装置の調製方法、接種方法の前の栄養添加、発酵装置の接種方法、発酵装置の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンは、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ  Δｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ／ｐＹＺ０９０＋ｐＬＨ４６８（ＮＧＣＩ−０７０）であった。
【０２８０】
実施例１１Ａ〜１１Ｄの結果を表８に示す。
【０２８１】
【表９】
2013528400.tif 000013
【０２８２】
実施例１２
発酵装置体積効率の向上に対する発酵装置原料からの非溶解固体の除去の影響
この実施例は、発酵装置体積効率に対する、発酵前のマッシュからの非溶解固体の除去の影響を示す。トウモロコシマッシュ中の非溶解固体は、トウモロコシ充填量およびでんぷん含量に応じて、マッシュ体積の少なくとも５％を占める。発酵前の固体の除去により、少なくとも５％多くの糖を発酵装置に投入することができ、したがってバッチの生産性を高める。
【０２８３】
実施例１０で生成された液化されたトウモロコシマッシュは、全てのでんぷんが液化中に可溶性オリゴ糖に加水分解されたと仮定して、使用されるトウモロコシ充填量（乾燥トウモロコシ基準で４０％）、トウモロコシのでんぷん含量（乾燥トウモロコシ基準で７１．４％）を基準にして、約２８重量％（２８０ｇ／Ｌ）の液化でんぷんを含有していたことが推定された。マッシュを、実施例１１に記載されるように発酵に必要とされるより高濃度のオリゴ糖を用いて調製して、栄養、接種材料、グルコアミラーゼ、および基剤を初期の発酵ブロスに加えるときに希釈を可能にした。これらの成分を加えた後、マッシュを約１０％だけ希釈した。したがって、発酵２０１０Ｙ０３４および２０１０Ｙ０３６の開始時におけるマッシュ（固体を含む）中の液化でんぷんの予測される濃度は約２５０ｇ／Ｌであった。２０１０Ｙ０３４および２０１０Ｙ０３６発酵に投入される実際のグルコース当量は、それぞれ２３９ｇ／ｋｇおよび２４１ｇ／ｋｇであった（表８を参照）。比較して、２０１０Ｙ０３３および２０１０Ｙ０３５発酵に投入されるグルコース当量は、それぞれ２５７ｇ／ｋｇおよび２６３ｇ／ｋｇであった。これらの発酵の原料は、遠心分離液（固体の大部分を除去したマッシュ）であったことに留意されたい。約１．２Ｌの糖源（マッシュまたは遠心分離液）を、各発酵に投入した。したがって、このデータに基づいて、マッシュ（２０１０Ｙ０３４および２０１０Ｙ０３６）と比較して約８．３％多くの糖を、遠心分離液（２０１０Ｙ０３３および２０１０Ｙ０３５）を使用する発酵装置に投入した。これらの結果は、発酵前のトウモロコシマッシュからの非溶解固体の除去により、単位体積当たりに投入される糖がかなり増加し得ることを示す。これは、固体が存在する場合、それが貴重な発酵装置体積を占めることを示唆している。固体が原料から除去される場合、非溶解固体が存在しないために、より多くの糖が、発酵装置に加えられ得る（「適する」）。この実施例は、発酵装置体積効率が、発酵前にマッシュから非溶解固体を除去することによって、かなり向上され得ることを示す。
【０２８４】
実施例１３
抽出溶媒とブロスとの間の相分離に対する非溶解固体の除去の影響−抽出発酵
この実施例は、発酵前にトウモロコシマッシュから非溶解固体を除去することによる、抽出発酵プロセスの際およびその後の溶媒相とブロス相との間の向上した分離を示す。２つの抽出発酵を、並行して行い、１つは、液化されたトウモロコシマッシュを糖源（固体を除去したもの）として用い、１つは、非溶解固体の大部分を液化されたトウモロコシマッシュから除去することによって生成された遠心分離液（オリゴ糖の水溶液）を用いた。オレイルアルコール（ＯＡ）を両方の発酵に加えて、生成物が形成されるにつれて生成物（ｉ−ＢｕＯＨ）をブロスから抽出した。固体が原料（トウモロコシマッシュを使用した）から除去されなかった場合の、この実施例において言及される発酵ブロスは、実施例１０に記載される２０１０Ｙ０３６であった。固体が原料（トウモロコシマッシュから生成される遠心分離液を使用した）から除去された場合の、この実施例において言及される発酵ブロスは、実施例１０に記載される２０１０Ｙ０３５であった。オレイルアルコールが、両方の発酵に使用される抽出溶媒であった。最終的な発酵ブロスについてだけではなく発酵全体にわたって、相分離の速度および程度を測定し、比較した。抽出発酵プロセス中の十分な相分離は、微生物の最小限の損失および最小限の溶媒損失ならびに下流の処理のより低い資本コストおよび運転コストにつながり得る。
【０２８５】
発酵中の溶媒相とブロス相との間の相分離
約１０ｍＬの試料を、５．３時間、２９．３時間、５３．３時間、および７０．３時間の時点で各発酵装置から引き抜き、試料から固体を除去した場合の発酵（２０１０Ｙ０３５）および固体を除去しなかった場合の発酵（２０１０Ｙ０３６）からの試料について相分離を比較した。試料を約２時間静置させ、液液界面の位置を追跡することによって、全ての実行時間からの全ての試料について、相分離を観察し、比較した。固体を除去しなかった場合の発酵から引き抜かれた試料のいずれについても相分離が実質的に全く観察されなかった。発酵前に液化されたトウモロコシマッシュから固体を除去した場合の発酵からの全ての試料について相分離が観察された。全ての発酵時間について固体を除去した場合の実験から試料を引き抜いた約１０〜１５分以内に分離が起こり始め、２時間の期間にわたって向上し続けた。約７分間の沈降時間の後、遠心分離液発酵（固体を除去したもの）から、５．３時間の発酵実行時間の時点で引き抜かれた試料において相分離が起こり始めた。約１７分間の沈降時間の後、遠心分離液発酵（固体を除去したもの）から５３．３時間の時点で引き抜かれた試料において相分離が起こり始めた。
【０２８６】
図９は、（重力）沈降時間に応じた発酵試料管中の液液界面の位置のプロットである。データは、遠心分離液が糖源として供給された（固体がトウモロコシマッシュから除去されたもの）場合の抽出発酵から引き抜かれた試料についてのものであり、ＯＡは、ＩＳＰＲ抽出溶媒（実施例１０の実験２０１０Ｙ０３５）であった。このプロットにおける相分離データは、５．３時間、２９．３時間、５３．３時間、および７０．３時間の実行時間の時点で発酵２０１０Ｙ０３５から引き抜かれた試料についてのものである。界面位置が、試料管中の全ブロス高さにおけるパーセンテージとして報告される。例えば、５．３時間の実行時間の時点で２０１０Ｙ０３５発酵（遠心分離液／ＯＡ）から引き抜かれた試料の界面位置は、１２０分間の沈降時間の後、試料管の底部（分離なし）から３．５ｍＬに増加した。その特定の試料管中には約１０ｍＬの全ブロスが存在していた。したがって、その試料の界面位置は、図９において３５％として報告された。同様に、５３．３時間の実行時間の時点で２０１０Ｙ０３５発酵（遠心分離液／ＯＡ）から引き抜かれた試料の界面位置は、１２５分間の沈降時間の後、試料管の底部（分離なし）から約３．９ｍＬに増加した。その特定の試料管中には約１０ｍＬの全ブロスが存在していた。したがって、その試料の界面位置は、図９において３９％として報告された。
【０２８７】
発酵を完了した後の溶媒相とブロス相との間の相分離
７０時間の実行時間の後、発酵を停止し、ＯＡ抽出発酵からの２つのブロスを、別個の２Ｌのガラス製メスシリンダーに移した。溶媒相とブロス相との分離を観察し、比較した。発酵前に固体を除去しなかった場合のブロス（実験２０１０Ｙ０３６）については、約３時間後に相分離がほとんど観察されなかった。発酵前に液化されたトウモロコシマッシュから固体を除去した場合のブロス（実験２０１０Ｙ０３５）については、相分離が観察された。約１５分間の沈降時間の後に分離が起こり始め、３時間の期間にわたって向上し続けた。１５分後、液液界面が、二相混合物の全高さの約１０％のレベルで確立された。これは、水相がまず分散体から分割され、混合物の底部において蓄積され始めたことを示す。時間が経過するにつれて、より多くの水相が混合物の底部に蓄積され、界面の位置を上昇させた。約３時間の沈降時間の後、界面は、二相混合物の全高さの約４０％のレベルに増加した。これは、最初に発酵に投入した遠心分離液およびＯＡの量に基づいて、固体を除去した場合の最終的な二相のブロスについて、ほぼ完全な相分離が、約３時間の（重力）沈降時間の後に起こったことを示す。ほぼ等しい体積の初期の遠心分離液および溶媒を、両方の発酵に投入した。約１．２Ｌの液化されたトウモロコシマッシュおよび約１．１ＬのＯＡを、発酵２０１０Ｙ０３６に投入した。マッシュの同じバッチから生成された約１．２Ｌの遠心分離液、および約１．１ＬのＯＡを、発酵２０１０Ｙ０３５に投入した。水相中の約１００ｇ／ｋｇの初期の糖が消費されたことおよび生成されるｉ−ＢｕＯＨの約７５％が溶媒相中にあったことを把握した後、完全な分離が起こった場合、最終的な水相および有機相の相対体積が約１：１であろうことが予測され得る。図１０は、固体を除去した場合の抽出発酵（２０１０Ｙ０３５）からの最終的な二相のブロスについての（重力）沈降時間に応じた液液界面位置のプロットである。界面位置は、最終的なブロスの相分離を観察するために使用される２Ｌのメスシリンダー中の全ブロス高さにおけるパーセンテージとして報告される。２０１０Ｙ０３５発酵からの最終的なブロスの界面位置は、１７５分間の沈降時間の後、メスシリンダーの底部（分離なし）から二相混合物の全高さの約４０％のレベルに増加した。したがって、最終的なブロス中の二相のほぼ完全な分離が、３時間の沈降時間の後に起こった。約５０％の界面位置が、完全な分離に相当し得る。
【０２８８】
１０ｍＬの試料を、固体を除去した場合の発酵からの最終的なブロス（約３時間沈降させた）の有機相の上部から引き抜いた。試料を、高速の実験用遠心分離機において回転させて、ブロスを３時間沈降させた後に有機相中に存在する水相の量を測定した。結果は、最終的なブロスの上層の約９０％が溶媒相であったことを示した。比較的少量の非溶解固体を含む、最終的なブロスの上層の約１０％が水相であった。いくらかの固体が水相の底部（水相より濃い）に位置し、また、少量の固体が液液界面に蓄積されていた。
【０２８９】
１０ｍＬの試料を、固体を除去した場合の発酵からの最終的なブロス（約３時間沈降させた）の底相からも引き抜いた。試料を、高速の実験用遠心分離機において回転させて、ブロスを３時間沈降させた後に水相中に存在する有機相の量を測定した。ブロスを３時間沈降させた後、固体を除去した発酵からの最終的なブロスの底（水）相中に有機相が実質的に存在しなかったことが分かった。これらの結果は、固体を除去した場合の発酵からの最終的なブロスについては、ほぼ完全な相分離が起こったことを確認する。固体を除去しなかった場合の発酵からの最終的なブロスについては、相分離がほとんど見られなかった。このデータは、抽出発酵前の液化されたトウモロコシマッシュからの固体の除去により、発酵中および発酵後の相分離のかなりの向上が可能になり得、下流の処理への微生物、非溶解固体、および水の損失が減少され得ることを示唆する。
【０２９０】
１０ｍＬの試料を、ブロスを約３時間静置させた後に固体を除去しなかった発酵からの最終的なブロスの上部から引き抜いた。試料を、高速の実験用遠心分離機において回転させて、最終的なブロスの上部における溶媒相および水相の相対量を測定した。このブロスは、液化されたトウモロコシマッシュ固体からの全ての固体を含有していた。試料の約半分が水相であり、約半分が有機相であった。水相は、固体を除去した場合のブロスからの上層の試料と比較して、かなり多くの非溶解固体（液化されたマッシュに由来する）を含有していた。この試料中の水相および溶媒相の量はほぼ同じであり、これは、（３時間の沈降時間の後でさえ）固体を除去しなかった場合の最終的なブロスにおいて相分離が実質的に起こらなかったことを示す。このデータは、固体が、抽出発酵前に液化されたトウモロコシマッシュから除去されない場合、発酵中および発酵後に相分離がほとんどないし全く起こらない可能性が高いことを示唆する。これは、下流の処理への微生物、非溶解固体、および水のかなりの損失をもたらし得る。
【０２９１】
実施例１４
ＩＳＰＲ抽出溶媒の損失に対する非溶解固体の除去の影響−抽出発酵
この実施例は、発酵前にトウモロコシマッシュから非溶解固体を除去することによって、抽出発酵プロセスの最終段階から出るＤＤＧＳについての溶媒損失を減少させる可能性を示す。実施例１０は、並行して行われる２つの抽出発酵を説明し、１つは、糖源として液化されたトウモロコシマッシュ（２０１０Ｙ０３６−固体を除去しないもの）を用い、１つは、非溶解固体の大部分を液化されたトウモロコシマッシュから除去することによって得られる液化されたマッシュ遠心分離液（２０１０Ｙ０３５−オリゴ糖の水溶液）を用いた。オレイルアルコール（ＯＡ）を両方の発酵に加えて、生成物が形成されるにつれて生成物イソブタノール（ｉ−ＢｕＯＨ）をブロスから抽出した。最終的な発酵ブロスから回収される非溶解固体に捕捉される残留溶媒の量を測定し、比較した。
【０２９２】
実施例１０に記載される発酵２０１０Ｙ０３５および２０１０Ｙ０３６が完了した後、ブロスを採取し、実施例１１に記載される相分離試験を行うのに使用した。次に、非溶解固体（発酵前に除去されなかったトウモロコシマッシュからの微粒子）を、各ブロスから回収し、全抽出可能油について分析した。固体の各ロットから回収される油を、ＯＡおよびトウモロコシ油について分析した。両方のブロスについて以下のプロトコルにしたがった：
・ブロスを遠心分離して、有機相と、水相と、固相とに分離した。
・有機相および水相を、固体からデカントして、遠心分離機ボトルの底部にウェットケーキを残した。
・ウェットケーキを水で十分に洗浄して、残留オリゴ糖、グルコース、塩、酵素などの、ケーキ中に保持される溶解固体の実質的に全てを除去した。
・洗浄されたウェットケーキを、一晩、真空オーブン（８０℃で家庭用の真空）中で乾燥させて、ケーキ中の水の実質的に全てを除去した。
・乾燥固体の一部を、Ｓｏｘｈｌｅｔ抽出器中でヘキサンと十分に接触させて、固体から油を除去した。
・固体から回収される油をＧＣによって分析して、固体から回収される油中に存在するＯＡおよびトウモロコシ油の相対量を測定した。
・両方の発酵ブロスから回収される固体についての粒度分布（ＰＳＤ）を測定した。
【０２９３】
両方の発酵ブロスからの非溶解固体の回収およびヘキサン抽出についてのデータを表８に示す。データは、（固体の単位質量当たり）ほぼ同じ量の油が、両方の発酵において固体によって吸収されたことを示す。
【０２９４】
【表１０】
2013528400.tif 000014
【０２９５】
実施例１５
ウェットケーキを水で洗浄することによる、液化されたトウモロコシマッシュからの固体の除去から生成されるウェットケーキからの可溶性でんぷんの回収−２段階プロセス
この実施例は、ケーキを水で２回洗浄することによる、ウェットケーキからの可溶性でんぷんの回収を示し、ここで、ケーキは、液化されたマッシュを遠心分離することによって生成された。液化されたトウモロコシマッシュを、連続デカンター遠心分離機に供給して、遠心分離液流（Ｃ−１）およびウェットケーキ（ＷＣ−１）を生成した。遠心分離液は、比較的固体を含まない、可溶性でんぷんの水溶液であり、原料マッシュと比較して、ウェットケーキを固体に濃縮した。ウェットケーキの一部を、高温水と混合して、スラリー（Ｓ−ｌ）を形成した。スラリーをデカンター遠心分離機に再び注入して、洗浄水遠心分離液（Ｃ−２）および洗浄されたウェットケーキ（ＷＣ−２）を生成した。Ｃ−２は、比較的固体を含まない、可溶性でんぷんの希薄水溶液であった。Ｃ−２中の可溶性でんぷんの濃度は、マッシュの分離から生成される遠心分離液中の可溶性でんぷんの濃度より低かった。ＷＣ−２中に保持される液相は、マッシュの分離から生成されるウェットケーキ中の液体より、でんぷんが希薄であった。洗浄されたウェットケーキ（ＷＣ−２）を、高温水と混合して、スラリー（Ｓ−２）を形成した。投入されるウェットケーキ中の可溶性でんぷんの量に対する投入される水の比率は、両方の洗浄工程において同じであった。第２の洗浄スラリーを、デカンター遠心分離機に再び注入して、２回洗浄した、第２の洗浄水遠心分離液（Ｃ−３）およびウェットケーキ（ＷＣ−３）を生成した。Ｃ−３は、比較的固体を含まない、可溶性でんぷんの希薄水溶液であった。Ｃ−３中の可溶性でんぷんの濃度は、第１の洗浄段階（Ｃ−２）において生成される遠心分離液中の可溶性でんぷんの濃度より低く、したがって、ＷＣ−３（第２の洗浄されたウェットケーキ）中に保持される液相は、ＷＣ−２（第１の洗浄されたウェットケーキ）中のでんぷんより希薄であった。２つの洗浄遠心分離液（Ｃ−２およびＣ−３）中の全可溶性でんぷんは、回収され、液化に再利用され得るでんぷんである。最終的な洗浄されたウェットケーキ中に保持される液体中の可溶性でんぷんは、マッシュの元の分離において生成されるウェットケーキ中よりはるかに少ない。
【０２９６】
液化されたトウモロコシマッシュの生成
約１０００ガロンの液化されたトウモロコシマッシュを、ハンマーミル、スラリー混合器、スラリータンク、および液化タンクからなる連続乾式磨砕液化システムにおいて生成した。磨砕トウモロコシ、水、およびα−アミラーゼを連続して供給した。反応器は、アンモニアまたは硫酸のいずれかを用いて、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。反応条件は以下のとおりであった：
・ハンマーミルのふるいサイズ：７／６４インチ
・スラリー混合器への供給速度
−磨砕トウモロコシ：５６０質量ポンド／時（１４．１重量％の水分）
−処理水：１６．６質量ポンド／分（２００Ｆ）
−α−アミラーゼ：６１ｇ／時（Ｇｅｎｅｃｏｒ：Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）Α）
・スラリータンク条件：
−温度：１８５°Ｆ（８５℃）
−ｐＨ：５．８
−滞留時間：０．５時間
−乾燥トウモロコシ充填量：３１重量％
−酵素充填量：０．０２８重量％（乾燥トウモロコシ基準）
・液化タンク条件：
−温度：１８５°Ｆ（８５℃）
−ｐＨ：５．８
−滞留時間：約３時間
−さらなる酵素添加なし。
【０２９７】
液化されたトウモロコシマッシュの生成速度は約３ガロン／分（ｇｐｍ）であった。磨砕トウモロコシのでんぷん含量は、乾燥トウモロコシ基準で約７０重量％であった。液化されたマッシュの全固形分（ＴＳ）は約３１重量％であり、全懸濁固体（ＴＳＳ）は約７重量％であった。液相は、ＨＰＬＣによって測定した際に約２３〜２４重量％の液化でんぷん（可溶性オリゴ糖）を含有していた。
【０２９８】
液化されたマッシュを、連続デカンター遠心分離機において以下の条件で遠心分離した：
・ボウル速度：５０００ｒｐｍ（約３６００ｇ’ｓ）
・差速：１５ｒｐｍ
・せきの直径：１８５ｍｍ（せき板を取り外した場合）
・供給速度：５〜２０ガロン／分で変動。
【０２９９】
約８５０ガロンの遠心分離液および約１４００質量ポンドのウェットケーキを、マッシュを遠心分離することによって生成した。ウェットケーキ中の全固形分は、水分収支によって測定したところ、約４６．３％（懸濁固体＋溶解固体）であった。液相が約２３重量％の可溶性でんぷんを含有していたことが分かり、ウェットケーキ中の全懸濁固体が約２８重量％であったことが推定された。ウェットケーキが、遠心分離機運転の前に液化されたマッシュ中に存在する約１２％の可溶性でんぷんを含有していたことが推定された。
【０３００】
固体を水で洗浄することによるウェットケーキからの可溶性でんぷんの回収−１回目の洗浄
液化されたマッシュの分離から回収される約７０７質量ポンドのウェットケーキを、３００ガロンのステンレス鋼容器中で、１６５ガロンの高温（９１℃）の水と混合した。得られたスラリーを、約３０分間混合した。スラリーをデカンター遠心分離機に連続して供給して、洗浄された固体をスラリーから除去した。洗浄スラリーを分離するのに使用される遠心分離機は、上記の液化されたマッシュから固体を除去するのに使用されるのと同じものであり、スラリーを供給する前に、それを新鮮な水ですすいだ。遠心分離機を以下の条件で運転して、洗浄スラリーから固体を除去した：
・ボウル速度：５０００ｒｐｍ（約３６００ｇ’ｓ）
・差速：５ｒｐｍ
・せきの直径：１８５ｍｍ（せき板を取り外した場合）
・供給速度：５ガロン／分。
【０３０１】
約６００質量ポンドの洗浄されたウェットケーキを遠心分離機によって生成したが、材料の損失のためにわずか４００質量ポンドが回収されたに過ぎなかった。ウェットケーキ中の全固形分は、水分収支によって測定したところ、約３６．７％（懸濁固体＋溶解固体）であった。スラリーの液相中および洗浄水遠心分離液（スラリーから得られる）中の全可溶性でんぷん（グルコース、ＤＰ２、ＤＰ３、およびＤＰ４＋の合計）をＨＰＬＣによって測定したところ、それぞれ約６．７重量％および６．９重量％であった。ＤＰ２は、２つのグルコース単位（グルコース二量体）を含有するデキストロースポリマーを指す。ＤＰ３は、３つのグルコース単位（グルコース三量体）を含有するデキストロースポリマーを指す。ＤＰ４＋は、４つ以上のグルコース単位（グルコース四量体およびより高次の多量体）を含有するデキストロースポリマーを指す。これにより、よく混合された希釈洗浄段階が行われたことを確認した。したがって、洗浄されたウェットケーキ中に保持される液相中の可溶性でんぷんの濃度は、この希釈洗浄について約６．８重量％（物質収支によって）であったはずである。全固形分および溶解されたオリゴ糖のデータに基づいて、洗浄されたウェットケーキ中の全懸濁固体は約３２重量％であったことが推定された。遠心分離機によって生成されるケーキの全ての６００質量ポンドを洗浄することができた場合、洗浄されたウェットケーキは、元の液化されたマッシュ中に存在する約２．６％の可溶性でんぷんを含有していたことが推定された。これは、洗浄前のマッシュウェットケーキと比較して、洗浄されたウェットケーキ中の可溶性でんぷんの約７８％の減少を表す。液化されたマッシュの分離から生成されるウェットケーキを洗浄しなかった場合、マッシュ中の全でんぷんの約１２％が、可溶性（液化）でんぷんとして喪失されるであろう。マッシュの分離から生成されるウェットケーキを、この実施例に示される条件で水で洗浄する場合、マッシュからの全でんぷんの２．６％が、可溶性（液化）でんぷんとして喪失されるであろう。
【０３０２】
液化されたマッシュウェットケーキの第１の再スラリー洗浄から回収される約４００質量ポンドの洗浄されたウェットケーキを、３００ガロンのステンレス鋼容器中で１１０ガロンの高温（９０℃）水と混合した。得られたスラリーを約３０分間混合した。スラリーをデカンター遠心分離機に連続して供給して、洗浄された固体をスラリーから除去した。第２の洗浄スラリーを分離するのに使用される遠心分離機は、上記の第１の洗浄に使用されるのと同じであり、第２の洗浄スラリーを供給する前に、それを新鮮な水ですすいだ。遠心分離機を以下の条件で運転して、洗浄スラリーから固体を除去した：
・ボウル速度：５０００ｒｐｍ（約３６００ｇ’ｓ）
・差速：５ｒｐｍ
・せきの直径：１８５ｍｍ（せき板を取り外した場合）
・供給速度：４ガロン／分。
【０３０３】
約３２２質量ポンドの洗浄されたウェットケーキを、遠心分離機によって生成した。第２の洗浄からのウェットケーキ中の全固形分は、水分収支によって測定したところ、約３７．４％（懸濁固体＋溶解固体）であった。スラリーの液相中および洗浄水遠心分離液（スラリーから得られる）中の全可溶性でんぷん（グルコース、ＤＰ２、ＤＰ３、およびＤＰ４＋の合計）をＨＰＬＣによって測定したところ、それぞれ約１．６重量％および１．６重量％であった。これにより、よく混合された希釈洗浄段階が第２の洗浄において行われたことを確認した。したがって、洗浄されたウェットケーキ中に保持される液相中の可溶性でんぷんの濃度は、この希釈洗浄について約１．６重量％（物質収支によって）であったはずである。全固形分および溶解されたオリゴ糖のデータに基づいて、洗浄されたウェットケーキ中の全懸濁固体は約３６重量％であったことが推定された。第１の洗浄段階において生成されるケーキの全ての６００質量ポンドを洗浄することができた場合、洗浄されたウェットケーキは、元の液化されたマッシュ中に存在する約０．５％の可溶性でんぷんを含有していたことが推定された。これは、約９６％の洗浄の前のマッシュウェットケーキと比較して、２回洗浄されたウェットケーキ中の可溶性でんぷんの全減少を表す。液化されたマッシュの分離から生成されるウェットケーキを除去しなかった場合、マッシュ中の全でんぷんの約１２％が可溶性（液化）でんぷんとして喪失されるであろう。マッシュの分離から生成されるウェットケーキを、この実施例に示される条件で水で２回洗浄する場合、マッシュからの全でんぷんの０．５％が、可溶性（液化）でんぷんとして喪失されるであろう。
【０３０４】
実施例１６
トウモロコシ固体中のでんぷんの、可溶性（液化）でんぷんへの転化率に対する液化中の高温段階の影響
この実施例は、反応の途中のある時点における高温（または「調理」）段階による液化の操作が、トウモロコシ固体中のでんぷんの、可溶性（液化）でんぷんへのより高い転化率につながり得ることを示す。この実施例に示される「調理」段階は、液化が開始した後のある時点で液化温度を上昇させる工程と、より高温である期間保持する工程と、次に、温度を再び元の値まで低下させて、液化を完了させる工程とを含む。
【０３０５】
Ａ．液化後に固体中に残っている非加水分解でんぷんを測定する手順
液化されたトウモロコシマッシュを、実施例１（中間の高温段階はない）のプロトコルにしたがって１回の実行で調製した。液化されたトウモロコシマッシュを、中間の高温段階を追加した以外は第１の実行と同じ条件における別の実行で調製した。両方の実行からのマッシュを、以下の工程にしたがって後処理（ｗｏｒｋ  ｕｐ）した。それを遠心分離して、液化でんぷんの水溶液を非溶解固体から分離した。液化でんぷんの水溶液をデカントして取り除いて、ウェットケーキを回収した。ウェットケーキは、マッシュからの非溶解固体の大部分を含有していたが、固体は、液化でんぷん溶液でまだ湿っていた。ウェットケーキを水で十分に洗浄し、得られたスラリーを遠心分離して、水層を非溶解固体から分離した。ケーキを、十分な水で、合計５回洗浄して、液化から回収される元のウェットケーキ中に保持された可溶性でんぷんのほぼ全てを除去した。その結果、最終的な洗浄されたウェットケーキ中に保持される液相は、可溶性でんぷんを実質的に含有しない水からなっていた。
【０３０６】
最終的な洗浄されたウェットケーキを、水中で再スラリー化し、非常に過剰なα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの両方を加えた。温度およびｐＨを制御しながら、スラリーを少なくとも２４時間混合して、α−アミラーゼが、非溶解固体中に残っている実質的に全ての非加水分解でんぷんを可溶性オリゴ糖に転化するのを可能にした。その後、残留でんぷん（対象とする条件における液化中に加水分解されなかった）から生成される可溶性オリゴ糖を、存在するグルコアミラーゼによってグルコースに転化した。グルコース濃度を、ＨＰＬＣによって時間とともに追跡して、残留でんぷんから生成される全てのオリゴ糖がグルコースに転化されたことおよびグルコース濃度がもはや時間とともに増加しないことを確認した。
【０３０７】
Ｂ．液化されたトウモロコシマッシュの生成
２つのバッチの液化されたトウモロコシマッシュを、Ｌｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）製のα−アミラーゼ）を用いて、８５℃で（それぞれ約１Ｌ）調製した。両方のバッチを、８５℃で２時間余り運転した。ただし、「調理」期間を、第２のバッチ（「バッチ２」）の途中で追加した。バッチ２の温度分布は、８５℃で約３０分間、温度を８５℃から１０１℃まで上昇させ、１０１℃で約３０分間保持し、８５℃に冷却し、さらに１２０分間液化を続けた。両方のバッチに使用される磨砕トウモロコシは、実施例１と同じであった。２６重量％（乾燥トウモロコシ基準）のトウモロコシ充填量を両方のバッチに使用した。両方の実行に使用される酵素の総量は、０．０８重量％（乾燥トウモロコシ基準）に相当していた。両方の液化実行中、ｐＨを５．８に制御した。液化を、ガラスの被覆された樹脂ケトル中で行った。ケトルは、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。
【０３０８】
以下のプロトコルにしたがって、バッチ１の液化されたトウモロコシマッシュを調製した：
・α−アミラーゼを水道水で希釈した（２０．８０２ｇの水中の０．４１８ｇの酵素）。
・７０４．５ｇの水道水をケトルに投入した。
・撹拌器のスイッチを入れた。
・磨砕トウモロコシ（１９８ｇ）の第１の投入を行った。
・撹拌しながら５５℃まで加熱した。
・Ｈ２ＳＯ４またはＮａＯＨを用いて、ｐＨを５．８に調整した。
・α−アミラーゼ溶液（７．１１１ｇ）の第１の投入を行った。
・８５℃まで加熱した
・８５℃で３０分間保持した。
・α−アミラーゼ溶液（３．５０１ｇ）の第２の投入を行った。
・磨砕トウモロコシ（９７．５ｇ）の第２の投入を行った。
・８５℃でさらに１００分間、運転し続けた。
・液化が完了した後、６０℃に冷却した。
・反応器の中身を空け（ｄｕｍｐ）、９９８．５ｇの液化されたマッシュを回収した。
【０３０９】
以下のプロトコルにしたがって、バッチ２の液化トウモロコシマッシュを調製した：
・α−アミラーゼを水道水で希釈した（１６．６４２ｇの水中の０．３３６６ｇの酵素）。
・５６２．６ｇの水道水をケトルに投入した。
・撹拌器のスイッチを入れた。
・磨砕トウモロコシ（２３７．５ｇ）を投入した。
・撹拌しながら５５℃まで加熱した。
・希薄Ｈ２ＳＯ４またはＮａＯＨを用いて、ｐＨを５．８に調整した。
・α−アミラーゼ溶液（４．２５ｇ）の第１の投入を行った。
・８５℃まで加熱した。
・８５℃で３０分間保持した。
・１０１℃まで加熱した。
・１０１℃で３０分間保持した。
・マッシュの温度を再び８５℃に低下させた。
・希薄Ｈ２ＳＯ４またはＮａＯＨを用いて、ｐＨを５．８に調整した。
・α−アミラーゼ溶液（４．２４３９ｇ）の第２の投入を行った。
・８５℃でさらに１２０分間、運転し続けた。
・液化が完了した後、６０℃に冷却した。
【０３１０】
Ｃ．液化されたマッシュからの非溶解固体の除去および可溶性でんぷんを除去するための水によるウェットケーキの洗浄
バッチを室温で２０分間、５０００ｒｐｍで大容量遠心分離機において遠心分離することによって、液化されたマッシュの両方のバッチから固体の大部分を除去した。バッチ１からの５００ｇのマッシュの遠心分離により、３３４．１ｇの遠心分離液および１６５．９ｇのウェットケーキが得られた。バッチ２からの８７２ｇのマッシュの遠心分離により、６５４．７ｇの遠心分離液および２１７ｇのウェットケーキが得られた。液化されたマッシュの各バッチから回収されるウェットケーキを、水道水で５回洗浄して、ケーキ中に保持される可溶性でんぷんの実質的に全てを除去した。容器間でケーキが移るのを防ぐために、元のマッシュを遠心分離するのに使用されるのと同じボトルにおいて洗浄を行った。各洗浄段階では、ケーキを水と混合し、得られた洗浄スラリーを室温で（５０００ｒｐｍで２０分間）遠心分離した。マッシュの両方のバッチから回収されるウェットケーキにおいて行われる全ての５回の洗浄段階についてこれを行った。約１６５ｇの水を、バッチ１からのウェットケーキの５回の洗浄のそれぞれに使用し、これは、バッチ１からのウェットケーキを洗浄するのに使用される合計８２８．７ｇの水になった。約５００ｇの水を、バッチ２からのウェットケーキの５回の洗浄のそれぞれに使用し、これは、バッチ２からのウェットケーキを洗浄するのに使用される合計２５００ｇの水になった。バッチ１からのウェットケーキの全ての５回の水洗浄から回収される全洗浄遠心分離液は８９３．１ｇであった。バッチ２からのウェットケーキの全ての５回の水洗浄から回収される全洗浄遠心分離液は２５６６．３ｇであった。バッチ１から回収される最終的な洗浄されたウェットケーキは１０１．５ｇであり、バッチ２から回収される最終的な洗浄されたウェットケーキは１５１．０ｇであった。各バッチから得られる最終的な洗浄されたウェットケーキは、可溶性でんぷんを実質的に含有しておらず；したがって、各ケーキ中に保持される液体は主に水であった。ウェットケーキの全固形分（ＴＳ）を、水分収支を用いて測定した。バッチ１からのウェットケーキの全固形分は２１．６３重量％であり、バッチ２からのウェットケーキのＴＳは２３．６６重量％であった。
【０３１１】
Ｄ．液化後に非溶解固体中に残っている非加水分解でんぷんのレベルを測定するための、洗浄されたウェットケーキの液化／糖化
両方の洗浄されたウェットケーキ中に存在する固体中に残っている非加水分解でんぷんのレベルを、水中のケーキを再スラリー化し、過剰のα−アミラーゼおよび過剰のグルコアミラーゼを加えることによって測定した。α−アミラーゼは、固体中の残留非加水分解でんぷんを、スラリーの水相に溶解する可溶性オリゴ糖に転化する。その後、グルコアミラーゼが、α−アミラーゼによって生成される可溶性オリゴ糖をグルコースに転化する。反応を５５℃（グルコアミラーゼの推奨される最高温度）で少なくとも２４時間実行して、固体中の残留でんぷんの全てが可溶性オリゴ糖に転化され、全ての可溶性オリゴ糖がグルコースに転化されるのを確実にした。液化中に加水分解されなかったでんぷんである、固体中の残留非加水分解でんぷんは、この手順によって生成されるグルコースの量から計算することができる。
【０３１２】
以下のプロトコルに使用されるα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ酵素は、それぞれＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳおよびＳｐｉｒｉｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｕｅｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）であった。洗浄されたウェットケーキを処理するのに使用される容器は、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えた２５０ｍＬの被覆されたガラス樹脂ケトルであった。使用されるＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）の量は、「乾燥トウモロコシ基準」における０．０８重量％の酵素充填量に相当していた。使用されるＳｐｉｒｉｚｙｍｅ（登録商標）の量は、「乾燥トウモロコシ基準」における０．２重量％の酵素充填量に相当していた。この基準は、全てのでんぷんが可溶性オリゴ糖に加水分解されると仮定して、洗浄されたケーキ中に保持される非溶解固体の量を得るのに必要とされる磨砕トウモロコシの量として定義される。洗浄されたケーキ中に保持される非溶解固体はほとんど、トウモロコシのでんぷんでない非発酵性の部分であると考えられる。これらの酵素充填量は、２６％のトウモロコシ充填量で完全な液化および糖化を得るのに必要とされるより少なくとも４倍多い。酵素を非常に過剰に用いて、固体中の残留でんぷんの完全な加水分解およびグルコースへのオリゴ糖の完全な転化を確実にした。
【０３１３】
以下のプロトコルにしたがって、バッチ１のマッシュからの洗浄されたウェットケーキ中に存在する固体中の非加水分解でんぷんのレベルを測定した：
・α−アミラーゼを水道水で希釈した（１０．３６０７ｇの水中の０．１２９７ｇの酵素）。
・グルコアミラーゼを水道水で希釈した（１５．６０５４ｇの水中の０．３２１２ｇの酵素）。
・１３２ｇの水道水をケトルに投入した。
・撹拌器のスイッチを入れた。
・液化バッチ１から生成される６８ｇの洗浄されたウェットケーキ（ＴＳ＝２１．６３重量％）を投入した。
・撹拌しながら５５℃まで加熱した。
・希薄Ｈ２ＳＯ４またはＮａＯＨを用いて、ｐＨを５．５に調整した。
・α−アミラーゼ溶液（３．４９９２ｇ）を投入した。
・グルコアミラーゼ溶液（５．３１９ｇ）を投入した。
・ｐＨを５．５に制御しながら５５℃で２４時間運転し、グルコース用のスラリーを定期的に採取した。
【０３１４】
以下のプロトコルにしたがって、バッチ２からの洗浄されたウェットケーキ中に存在する固体中の非加水分解でんぷんのレベルを測定した。
・α−アミラーゼを水道水で希釈した（１１．７０９ｇの水中の０．２３８４ｇの酵素）。
・グルコアミラーゼを水道水で希釈した（１７．５５３８ｇの水中の０．３５０９ｇの酵素）。
・１５４．３ｇの水道水をケトルに投入した。
・撹拌器のスイッチを入れた。
・液化バッチ１から生成される７０．７ｇの洗浄されたウェットケーキ（ＴＳ＝２３．６６重量％）を投入した。
・撹拌しながら５５℃まで加熱した。
・希薄Ｈ２ＳＯ４またはＮａＯＨを用いて、ｐＨを５．５に調整した。
・α−アミラーゼ溶液（２．３９３ｇ）を投入した。
・グルコアミラーゼ溶液（５．９７０１ｇ）を投入した。
・ｐＨを５．５に制御しながら５５℃で２４時間運転し、グルコース用のスラリーを定期的に採取した。
【０３１５】
洗浄されたウェットケーキの液化／糖化の結果の比較
上述したように、バッチ１および２からの洗浄されたウェットケーキを、水中で再スラリー化し、固体中に残っている一切のでんぷんを加水分解し、それをグルコースに転化するために、非常に過剰なα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの両方をスラリーに加えた。図１１は、時間に応じたスラリーの水相中のグルコースの濃度を示す。
【０３１６】
グルコース濃度は、時間とともに増加し、両方の反応について約２４時間の時点で最大値で安定した。２４時間〜４８時間のグルコースのわずかな減少は、微生物汚染によるものであり得；したがって、各系において達するグルコースの最大レベルを用いて、洗浄されたウェットケーキの固体中にある残留非加水分解でんぷんのレベルを計算した。（α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの存在下で）バッチ１の液化から得られる洗浄されたウェットケーキを反応させることによって達するグルコースの最大レベルは４．４８ｇ／Ｌであった。比較して、（α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの存在下で）バッチ２の液化から得られる洗浄されたウェットケーキを反応させることによって達するグルコースの最大レベルは２．３９ｇ／Ｌであった。
【０３１７】
液化されたマッシュ中の非溶解固体中にある残留非加水分解でんぷん（液化中に加水分解されなかった）のレベルを、マッシュの対応するバッチから得られる洗浄されたウェットケーキから得られるグルコースのデータに基づいて計算した。
・液化バッチ１：固体中の残留非加水分解でんぷんは、液化に供給されるトウモロコシ中の全でんぷんの２．１％に相当する。これは、トウモロコシ中のでんぷんの２．１％が、バッチ１の液化条件で加水分解されなかったことを示唆する。液化バッチ１中、中間の高温（「調理」）段階を行わなかった。
・液化バッチ２：固体中の残留非加水分解でんぷんは、液化に供給されるトウモロコシ中の全でんぷんの１．１％に相当する。これは、トウモロコシ中のでんぷんの１．１％が、バッチ２の液化条件で加水分解されなかったことを示唆する。液化バッチ２中、高温（「調理」）段階を行った。
【０３１８】
この実施例は、液化中のある時点における高温「調理」段階の追加が、より高いでんぷん転化率をもたらし得ることを示す。これにより、液化されたトウモロコシマッシュ中の非溶解固体中に残っている残留非加水分解でんぷんが少なくなり、非溶解固体が液化の前にマッシュから除去される場合のプロセスにおけるでんぷんの損失が少なくなる。
【０３１９】
実施例１７
トウモロコシ固体中のでんぷんの、可溶性（液化）でんぷんへの転化率に対する液化中の高温段階の影響
液化されたトウモロコシマッシュの２つのバッチ（バッチ３およびバッチ４）を、Ｌｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）製のα−アミラーゼ）を用いて８５℃で調製した。両方のバッチを、８５℃で２時間余り運転した。ただし、「調理」期間を、バッチ４の途中で追加した。バッチ４の温度分布は、８５℃で約３０分間、温度を８５℃から１２１℃まで上昇させ、１２１℃で約３０分間保持し、８５℃に冷却し、さらに９０分間液化を続けた。両方のバッチに使用される磨砕トウモロコシは、実施例１と同じであった。２６重量％（乾燥トウモロコシ基準）のトウモロコシ充填量を両方のバッチに使用した。両方の実行に使用される酵素の総量は、０．０４重量％（乾燥トウモロコシ基準）に相当していた。両方の液化実行中、ｐＨを５．８に制御した。バッチ３の液化を、１Ｌのガラスの被覆された樹脂ケトル中で行い、バッチ４の液化を、２００Ｌのステンレス鋼発酵装置中で行った。両方の反応器は、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。
【０３２０】
この実施例の実験条件は、以下の相違点を除き、実施例１４について記載される実験条件と同様であった：
【０３２１】
バッチ３の液化されたトウモロコシマッシュの生成では：０．２１１ｇのα−アミラーゼを、１０．４０３ｇの水道水で希釈した。α−アミラーゼ溶液の第１の投入は３．５５６ｇであった。α−アミラーゼ溶液の第２の投入は１．７５５ｇであり、反応を、８５℃でさらに９０分間実行し続けた。
【０３２２】
バッチ４の液化されたトウモロコシマッシュの生成では：２２ｇのα−アミラーゼを、２ｋｇの水道水で希釈し、１４７．９ｋｇの水道水を発酵装置に投入し、６１．８ｋｇの磨砕トウモロコシを投入した。α−アミラーゼ溶液の第１の投入は１．０ｋｇであり、反応物を８５℃まで加熱し、８５℃で３０分間保持し、次に、反応物を１２１℃まで加熱し、１２１℃で３０分間保持した。α−アミラーゼ溶液の第２の投入は１ｋｇであり、反応を、８５℃でさらに９０分間実行し続けた。
【０３２３】
液化されたマッシュからの非溶解固体の除去および可溶性でんぷんを除去するための水によるウェットケーキの洗浄
バッチを室温で１５分間、５０００ｒｐｍで大容量遠心分離機において遠心分離することによって、液化されたマッシュの両方のバッチから固体の大部分を除去した。バッチ３からの５００．１ｇのマッシュの遠心分離により、３３７．２ｇの遠心分離液および１６２．９ｇのウェットケーキが得られた。バッチ４からの５０９．７ｇのマッシュの遠心分離により、３４６．３ｇの遠心分離液および１６３．４ｇのウェットケーキが得られた。液化されたマッシュの各バッチから回収されるウェットケーキを、水道水で５回洗浄して、ケーキ中に保持される可溶性でんぷんの実質的に全てを除去した。容器間でケーキが移るのを防ぐために、元のマッシュを遠心分離するのに使用されるのと同じボトルにおいて洗浄を行った。各洗浄段階では、ケーキを水と混合し、得られた洗浄スラリーを室温で（５０００ｒｐｍで１５分間）遠心分離した。マッシュの両方のバッチから回収されるウェットケーキにおいて行われる全ての５回の洗浄段階についてこれを行った。約１６４ｇの水を、バッチ３からのウェットケーキの５回の洗浄のそれぞれに使用し、これは、バッチ３からのウェットケーキを洗浄するのに使用される合計８１９．８ｇの水になった。約４００ｇの水を、バッチ４からのウェットケーキの５回の洗浄のそれぞれに使用し、これは、バッチ４からのウェットケーキを洗浄するのに使用される合計２０００ｇの水になった。バッチ３からのウェットケーキの全ての５回の水洗浄から回収される全洗浄遠心分離液は８７９．５ｇであった。バッチ４からのウェットケーキの全ての５回の水洗浄から回収される全洗浄遠心分離液は２０４８．８ｇであった。バッチ３から回収される最終的な洗浄されたウェットケーキは１０３．２ｇであり、バッチ４から回収される最終的な洗浄されたウェットケーキは１１４．６ｇであった。各バッチから得られる最終的な洗浄されたウェットケーキは、可溶性でんぷんを実質的に含有しておらず；したがって、各ケーキ中に保持される液体は主に水であった。ウェットケーキの全固形分（ＴＳ）を、水分収支を用いて測定した。バッチ３からのウェットケーキの全固形分は２１．８８重量％であり、バッチ４からのウェットケーキのＴＳは１８．１重量％であった。
【０３２４】
この実施例の実験条件は、以下の相違点を除き、実施例１４について記載される実験条件と同様であった：
【０３２５】
バッチ３についての、液化の後に非溶解固体中に残っている非加水分解でんぷんのレベルの測定するための洗浄されたウェットケーキの液化／糖化では：バッチ３の液化から生成される６８ｇの洗浄されたウェットケーキを投入した（ＴＳ＝２１．８８重量％）。３．４９８４ｇのα−アミラーゼ溶液および５．３０４２ｇのグルコアミラーゼを投入した。ｐＨを５．５に制御しながら５５℃で４７時間反応を実行し、グルコース用のスラリーを定期的に採取した。
【０３２６】
バッチ４についての、液化の後に非溶解固体中に残っている非加水分解でんぷんのレベルの測定するための洗浄されたウェットケーキの液化／糖化では：０．１６６３ｇのα−アミラーゼを、１３．８１３９ｇの水道水で希釈し、０．２１３ｇのグルコアミラーゼを、２０．８００２ｇの水道水で希釈した。１１７．８ｇの水道水をケトルに投入した。バッチ４の液化から生成される８２．２４ｇの洗浄されたウェットケーキを投入した（ＴＳ＝１８．１重量％）。３．４９５２ｇのα−アミラーゼ溶液および１０．５１０ｇのグルコアミラーゼを投入した。ｐＨを５．５に制御しながら５５℃で５０時間反応を実行し、グルコース用のスラリーを定期的に採取した。
【０３２７】
洗浄されたウェットケーキの液化／糖化の結果の比較
上述したように、バッチ３および４からの洗浄されたウェットケーキを、水中で再スラリー化し、固体中に残っている一切のでんぷんを加水分解し、それをグルコースに転化するために、非常に過剰なα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの両方をスラリーに加えた。図１２は、時間に応じたスラリーの水相中のグルコースの濃度を示す。
【０３２８】
グルコース濃度は、時間とともに増加し、バッチ３からの洗浄されたウェットケーキについて約２６時間の時点で最大値で安定した。バッチ４の洗浄されたウェットケーキでは、グルコース濃度は、２４時間〜４７時間でわずかに増加し続けた。バッチ４のウェットケーキについて４７時間の時点で測定したグルコース濃度が、最大値にほぼ等しいことが仮定される。（α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの存在下で）バッチ３の液化から得られる洗浄されたウェットケーキを反応させることによって達するグルコースの最大レベルは８．３３ｇ／Ｌであった。比較して、（α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの存在下で）バッチ４の液化から得られる洗浄されたウェットケーキを反応させることによって達するグルコースの最大レベルは４．９２ｇ／Ｌであった。
【０３２９】
液化されたマッシュ中の非溶解固体中にある残留非加水分解でんぷん（液化中に加水分解されなかった）のレベルを、（過剰のα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの存在下で）マッシュの対応するバッチから得られる洗浄されたウェットケーキを「加水分解」することによって得られるグルコースのデータに基づいて計算した。
・液化バッチ３：固体中の残留非加水分解でんぷんは、液化に供給されるトウモロコシ中の全でんぷんの３．８％に相当する。これは、トウモロコシ中のでんぷんの３．８％が、バッチ３の液化条件で加水分解されなかったことを示唆する。液化バッチ３中、中間の高温（「調理」）段階を行わなかった。
・液化バッチ４：固体中の残留非加水分解でんぷんは、液化に供給されるトウモロコシ中の全でんぷんの２．２％に相当する。これは、トウモロコシ中のでんぷんの２．２％が、バッチ４の液化条件で加水分解されなかったことを示唆する。液化バッチ４中、高温（「調理」）段階を行った。
【０３３０】
この実施例は、液化中のある時点における高温「調理」段階の追加が、より高いでんぷん転化率をもたらし得ることを示す。これにより、液化されたトウモロコシマッシュ中の非溶解固体中に残っている残留非加水分解でんぷんが少なくなり、非溶解固体が液化の前にマッシュから除去される場合のプロセスにおけるでんぷんの損失が少なくなる。
【０３３１】
実施例１６および１７の概要および比較
液化条件は、トウモロコシ固体中のでんぷんの、可溶性（液化）でんぷんへの転化率に影響を与え得る。磨砕トウモロコシ中のでんぷんの、可溶性でんぷんへの転化率に影響し得る考えられる液化条件は、温度、酵素（α−アミラーゼ）充填量、および＋／−高温（「調理」）段階が液化中のある時点で行われるか否かである。実施例１６および１７は、液化中のある時点における高温（「調理」）段階の実施により、トウモロコシ固体中のでんぷんの、可溶性（液化）でんぷんへのより高い転化率が得られることを示した。実施例１６および１７に記載される液化中の高温段階は、液化が開始した後のある時点で液化温度を上昇させる工程と、ある期間、より高い温度に保持する工程と、次に、温度を再び元の値まで低下させて、液化を完了させる工程とを含んでいた。
【０３３２】
実施例１６において比較される液化反応を、実施例１７において比較される反応と異なる酵素充填量で実行した。これらの実施例は、でんぷん転化率に対する２つの主な液化条件：（１）酵素充填量、および（２）＋／−高温段階が液化中のある時点で適用されるか否かの影響を示す。
【０３３３】
実施例１６および１７に記載される液化されたトウモロコシマッシュの４つのバッチを調製するのに使用される条件を、以下および表９にまとめる。
【０３３４】
全てのバッチに共通の条件：
・液化温度−８５℃
・液化温度における合計時間−約２時間
・トウモロコシを磨砕するのに使用されるふるいサイズ−１ｍｍ
・ｐＨ−５．８
・乾燥トウモロコシ充填量−２６％
・α−アミラーゼ−Ｌｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）。
【０３３５】
【表１１】
2013528400.tif 000015
【０３３６】
バッチ２および４の温度分布（全ての値は概算値である）は：８５℃で３０分間、３０分間の高温段階、８５℃で９０分間であった。最初の８５℃の期間の前に半分の酵素を加え、最後の８５℃の期間にわたる高温段階の後に半分を加えた。
【０３３７】
図１３は、でんぷん転化率に対する、酵素充填量および＋／−高温段階が液化中のある時点で適用されたか否かの影響を示す。固体中の残留非加水分解でんぷんのレベルは、対象とする液化条件で加水分解されなかったでんぷんである。図１３は、固体中の非加水分解でんぷんのレベルが、液化中のある時点における高温（「調理」）段階の適用によってほぼ半分だけ減少されたことを示す。これは、２つの異なる酵素充填量で示された。図１３のデータは、高温段階が液化中に適用されたか否かにかかわらず、酵素充填量を２倍にすると、固体中に残っている非加水分解でんぷんのレベルがほぼ半分になったことも示す。これらの実施例は、より高い酵素（α−アミラーゼ）充填量による液化の実行および／または反応中のある時点における高温（「調理」）段階の追加が、液化されたトウモロコシマッシュ中に存在する非溶解固体中の残留非加水分解でんぷんをかなり減少させ得、非溶解固体が液化の前にマッシュから除去される場合のプロセスにおけるでんぷんの損失を減少させ得ることを示す。液化の後の固体中の一切の残留でんぷんには、固体が発酵の前に除去される場合のプロセスにおいて発酵中に加水分解する機会がない。
【０３３８】
実施例１８
８５℃での酵素消化の後のでんぷんおよび不溶物のふるい分け分離
実施例１に記載される方法ごとに調製されるマッシュ（３０１グラム）を、調整が必要な場合にＮａＯＨ溶液の液滴を用いてｐＨ５．８に保ち、業者指定の用量の約０．０６４グラムのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）α−アミラーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）で処理し、８５℃で５時間保持した。生成物を冷蔵した。
【０３３９】
冷蔵された生成物を約５０℃に温め、４８ｇを、１００メッシュスクリーンを含むフィルターアセンブリに注ぎ、−１５水銀柱インチ（ｉｎ  Ｈｇ）〜−２０水銀柱インチで家庭用真空源に接続した。ふるい皿は、４４ｃｍ２の露出されたふるい表面積を有し、このふるい皿を、Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）によって提供されるプラスチックフィルターハウジング中に密閉した。スラリーをろ過したところ、ふるい上にウェットケーキが形成され、受け器ボトル中に４０．４ｇの黄色の濁ったろ液が形成された。ウェットケーキを所定の位置で水ですぐに洗浄してから、中断した一方、真空源は、最終的な洗浄されたケーキを通して遊離水分を引き続けた。フィルターの下側からの滴りが停止したとき、ろ過を停止した。さらなる２８．５ｇの洗浄ろ液を３段階にわたって収集し、ここで、最終段階のろ液が、最も少ない色および濁りを示した。７．６ｇの最終的なウェットケーキ質量を、室温で２４時間にわたって２．１ｇになるまで空気乾燥させた。２．１ｇは、加熱ランプを用いて乾燥させた後に７．７３％の水を含有することが分かった。この実験の真空ろ過により、合計２５％の乾燥固体を含有するウェットケーキが生成された。
【０３４０】
ろ液の試料を、室温でオレイルアルコールと組み合わせて、激しく混合し、沈降させた。界面を約１５分間回復させたが、濁ったラグ層が残った。
【０３４１】
１ｇの９９．９９％超（微量金属基準）のヨウ素、２ｇのＲｅａｇｅｎｔＰｌｕｓ（登録商標）グレード（９９％超）のヨウ化カリウム（両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製）、および１滴の量の１７ｇの家庭用脱イオン水からなるルゴール液（でんぷん指示薬）を、ろ液の試料、水中で再スラリー化された、乾燥されたケーキ固体および水の対照試料に加えた。ろ液が濃い青色または紫色に変化し、固体スラリーが非常に濃い青色に変化し、水の色が薄い琥珀色になった。琥珀色より濃い色は、１２単位長より長いオリゴ糖の存在を示す。
【０３４２】
この実験は、大部分の懸濁固体が、１００メッシュスクリーンにおいて、中程度の速度で、上述したように調製されるでんぷん溶液から分離され得ること、およびでんぷんがろ過ケーキ固体とともに残ることを示した。これは、加水分解されたでんぷんの一部が残るケーキの不完全な洗浄を示す。
【０３４３】
この実験を、直径６３ｍｍの１００メッシュスクリーン上で１５６グラムのマッシュを用いて繰り返した。最高温度は１０２℃であり、酵素はＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）であり、スラリーを、８５℃超で、３時間保持した。ふるい分け速度を測定し、決定したところ、ふるい面積の平方フィート当たり毎分０．００４ガロン以下であった。
【０３４４】
実施例１９
１１５℃での酵素消化の後のでんぷんおよび不溶物のふるい分け分離
家庭用脱イオン水（２００ｇ）を、空のＰａｒｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４６３５の１リットルの圧力容器（Ｍｏｌｉｎｅ，ＩＬ）に投入し、８５℃の温度まで加熱した。水を、磁気撹拌子を用いて撹拌した。実施例１に記載されるように調製される乾式磨砕トウモロコシ（９０ｇ）をスプーンで加えた。アンモニア水溶液の原液を用いて、ｐＨを５．２から約６．０に上げた。約０．０６４グラムのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）溶液を、小型の較正されたピペットで加えた。圧力容器の蓋を閉め、家庭用窒素を用いて容器を５０ｐｓｉｇに加圧した。撹拌された混合物を６分以内に１１０℃まで加熱し、１０６〜１１６℃で合計２０分間保持した。加熱を抑え、圧力を軽減し、容器を開放した。さらなる０．０６４ｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）を加え、温度をさらに１４２分間、６３〜７５℃で保持した。
【０３４５】
少量のスラリーを、Ｐａｒｒ容器から取り、１００、１４０、および１７０メッシュスクリーンのスタックを通して重力によりふるい分け（ｇｒａｖｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎ）した。１００メッシュスクリーン上のみに固体が留まった。
【０３４６】
スラリーの一部、約４０％を、直径７５ミリメートルの１００および２００メッシュ皿の２重ふるいアセンブリの上部に、高温のまま移した。いくらかの重力ろ過を行った。−１５〜−２０水銀柱インチの真空を、ろ液受け器に引き、一定のろ過を設定した。ろ液は黄色で濁っていたが、分散は安定していた。ケーキの表面を５分以内の間、露出させた。
ケーキを、脱イオン水の噴霧で２〜３分間洗浄し、ろ液の濁りが一定になるまで（合計５回の噴霧）、受け器を変えて繰り返した。ふるいを調べたところ、全ての固体が１００メッシュスクリーン上にあり、２００メッシュ上に固体がなかったという結論となった。ウェットケーキは厚さ５ｍｍであった。ウェットケーキの質量を測定したところ、１８．９ｇであり、ろ液の合計質量は１９２ｇであった。
【０３４７】
スラリーの残りの質量を、６５℃で所定の位置で１００メッシュスクリーンを備えたフィルターアセンブリに移し、５〜１０分間にわたってろ過した。ケーキを脱イオン水の噴霧で３〜４分間洗浄し、ろ液の濁りが一定になるまで（合計８回の噴霧）、受け器を変えて繰り返した。フィルターの下側から落ちる液滴が観察されなくなるまで真空をかけ続けた。ウェットケーキは、厚さ８ｍｍで、直径７５ｍｍであり、質量が３６．６ｇであった。ろ液の重量の合計は２６１ｇであった。
【０３４８】
３つの容器を、上記の方法ごとにでんぷんについて試験した。１つの容器は水を含有し、他の２つの容器は、脱イオン水中でスラリー化されたウェットケーキの試料を含有していた。全ての容器の色が黄色の琥珀色に変化した。これは、ろ過ケーキを洗浄してでんぷんのオリゴ糖を取り除いたことを意味するものと解釈される。これらの固体を、長期の液化およびその後の糖化を用いて正確に分析して、グルコース基準で、ウェットケーキが、元のトウモロコシ中にある全でんぷんの０．２％以下を含有していたことを確認した。
【０３４９】
ろ液の試料を、容器中でオレイルアルコールと組み合わせて、激しく混合し、沈降させた。透明の油層が迅速に得られ、界面にはほとんどラグ層がなく、明確に画定されていた。この実施例は、トウモロコシマッシュが約１１０℃で２０分間の調理という熱水条件まで加熱され、ろ過および洗浄される前に８５℃で２時間超さらに液化されるプロセスにおいて、全ろ液が、穀類に供給される実質的に全てのでんぷんを含有していたことを示した。さらに、ろ液に含まれるオレイルアルコールと不純物との間の干渉がそれほど観察されない。
【０３５０】
この実験を、直径７５ｍｍの８０メッシュスクリーンにおいて２４７グラムのマッシュを用いて繰り返した。最高調理温度は１１５℃であり、酵素はＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）であり、スラリーを８５℃以上で３時間保持した。ふるい分け速度を測定し、決定したところ、ふるい面積の平方フィート当たり毎分０．１ガロン超であった。
【０３５１】
実施例２０
脂質の分析
エステル交換によって、様々な脂肪酸含有化合物種を、脂肪酸メチルエステル（「ＦＡＭＥ」）に転化することによって、脂質の分析を行った。グリセリドおよびリン脂質を、メタノール中のナトリウムメトキシドを用いてエステル交換した。グリセリド、リン脂質、および遊離脂肪酸を、メタノール中の塩化アセチルを用いてエステル交換した。得られたＦＡＭＥを、トルエン／ヘキサン（２：３）中での希釈の後、３０−ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＯＭＥＧＡＷＡＸ（商標）（Ｓｕｐｅｌｃｏ，ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ７８９０  ＧＣを用いたガスクロマトグラフィーによって分析した。オーブン温度を、５℃／分で１６０℃から２００℃まで、次に１０℃／分で２００℃から２５０℃（１０分間保持した）まで上昇させた。ＧＣ分析によって記録されたＦＡＭＥピークを、公知のメチルエステル（ＭＥ）の保持時間と比較したときの、それらの保持時間によって特定し、ＦＡＭＥピーク面積を、公知の量の内部標準（Ｃ１５：０のトリグリセリド、試料によるエステル交換手順によって取られた）の面積と比較することによって定量化した。したがって、概算量（ｍｇ）の任意の脂肪酸ＦＡＭＥ（「ｍｇ  ＦＡＭＥ」）を、下式にしたがって計算する：（所定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピークの面積／１５：０のＦＡＭＥピークの面積）＊（内部標準Ｃ１５：０のＦＡＭＥのｍｇ）。次に、ＦＡＭＥの結果を、１．０５２の適切な分子量換算係数で除算することによって、対応する脂肪酸のｍｇに補正することができる。全ての内部標準および参照標準は、Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．から入手される。
【０３５２】
メタノール中のナトリウムメトキシドを用いてエステル交換された試料から得られる脂肪酸の結果を、１．０４５の分子量換算係数を乗算することによって、対応するトリグリセリドレベルに換算する。トリグリセリドは、一般に、この実施例について調べられた試料中のグリセリドの約８０〜９０％を占め、残りはジグリセリドである。モノグリセリドおよびリン脂質含量は一般にごくわずかである。メタノール中の塩化アセチルを用いてエステル交換された試料について得られる全脂肪酸の結果を、ナトリウムメトキシド手順を用いて同じ試料について決定された脂肪酸を減算することによって、グリセリド含量について補正する。結果は、試料の遊離脂肪酸含量である。
【０３５３】
グリセリド含量（モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、およびリン脂質）の分布を、薄層クロマトグラフィーを用いて決定した。６：１のクロロホルム／メタノールに溶解される油の溶液を、シリカゲルで予め被覆されたガラスプレートの底部の近くに垂らした。次に、そのスポット（ｓｐｏｔ）を、７０：３０：１のヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸溶媒系を用いて、クロマトグラフにかける。次に、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、およびリン脂質に対応する分離されたスポットを、ヨウ素蒸気でプレートを染色することによって検出する。次に、スポットをプレートから落とし、メタノール手順で塩化アセチルを用いてエステル交換し、ガスクロマトグラフィーによって分析する。全てのスポットの合計ピーク面積に対する各スポットの合計ピーク面積の比率が、様々なグリセリドの分布である。
【０３５４】
実施例２１
この実施例は、蒸留廃液からの固体の除去ならびに脂肪酸、エステル、およびトリグリセリドを固体から回収するための脱溶媒器による抽出を示した。発酵中、固体を全蒸留廃液から分離し、脱溶媒器に供給し、脱溶媒器において固体を１．１トン／時の蒸気と接触させる。全蒸留廃液のウェットケーキ（抽出器原料）、溶媒、抽出器のミセラ、および抽出器の排出固体の流量は、表１０に示されるとおりである。表の値の単位は、ショートトン／時である。
【０３５５】
【表１２】
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【０３５６】
脱溶媒器を出る固体を、乾燥器に供給する。脱溶媒器を出る蒸気は、０．５５トン／時のヘキサンおよび１．１０２トン／時の水を含有する。この流れを凝縮し、デカンターに供給する。デカンターを出る水富化相は、約３６０ｐｐｍのヘキサンを含有する。この流れを蒸留塔に供給し、蒸留塔において、ヘキサンを水富化流から除去する。蒸留塔の上部を出るヘキサン富化流を凝縮し、デカンターに供給する。デカンターを出る有機物富化流を蒸留塔に供給する。蒸気（１１．０２トン／時）を、蒸留塔の塔底に供給する。この塔の塔頂および塔底生成物の組成を表１１に示す。表の値の単位は、トン／時である。
【０３５７】
【表１３】
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【０３５８】
実施例２２
この実施例は、マッシュからの副生成物の回収を示す。トリカンター遠心分離機（Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  Ｚ２３−４ボウル直径、２３０ｍｍ、長さ対直径の比率４：１）をこれらの条件で使用したことを除いて、実施例１０に記載される条件下でトウモロコシ油をマッシュから分離する：
・ボウル速度：５０００ｒｐｍ
・差速：１０ｒｐｍ
・供給速度：３ガロン／分
・相分離機ディスク：１３８ｍｍ
・羽根車の設定：１４４ｍｍ。
【０３５９】
分離されたトウモロコシ油は、実施例１８に記載される方法および薄層クロマトグラフィーによって測定した際に、８１％のトリグリセリド、６％の遊離脂肪酸、４％のジグリセリド、および合計５％のリン脂質およびモノグリセリドを有していた。
【０３６０】
上記の条件下でマッシュから分離された固体は、乾燥時の重量損失によって測定した際に５８％の水分含量を有し、実施例１８に記載される方法によって測定した際に１．２％のトリグリセリドおよび０．２７％の遊離脂肪酸を有していた。
【０３６１】
表１４中の全蒸留廃液から分離された固体、蒸発器段階の間に抽出された油、副生成物抽出剤および凝縮蒸留可溶物（ＣＤＳ）の組成を、表１２に示される全蒸留廃液の組成を前提とし、表１３（トリカンター遠心分離機における分離）を前提として計算した。表１１の値を、Ａｓｐｅｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）モデル（Ａｓｐｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から得た。このモデルは、トウモロコシ油がマッシュから抽出されていないことを前提としている。細胞、溶解固体、および懸濁固体の乾燥量基準でのタンパク質含量が、それぞれ約５０％、２２％、および３５．５％であることが推定される。副生成物抽出剤の組成は、乾燥量基準で７０．７％の脂肪酸および２９．３％の脂肪酸イソブチルエステルであることが推定される。
【０３６２】
【表１４】
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【０３６３】
【表１５】
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【０３６４】
【表１６】
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【０３６５】
本発明の様々な実施形態を上に説明してきたが、それらは例として示されたに過ぎず、限定するものではないことを理解されたい。本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本発明の形態および細部の様々な変更を行うことができることが、関連技術の当業者に明らかであろう。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上述した例示的実施形態のいずれによって限定されるものでもなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物のみにしたがって規定されるものである。
【０３６６】
本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関する技術分野の当業者の技能のレベルを示し、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により援用されることが具体的にかつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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