(57)【要約】本発明は、ヒトVLA4に結合する新規の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドおよびその結合体を提供する。本発明はまた、関連するポリヌクレオチド、組成物、ベクター、宿主細胞、および方法も提供する。2013528374.tif 000026
2013528374.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
0〜8個のアミノ酸位置においてSEQ ID NO: 18と異なり、かつSEQ ID NO: 18に関して34位のフェニルアラニンまたはチロシン(F34またはF34Y); SEQ ID NO: 18に関して37位のプロリン(P37); SEQ ID NO: 18に関して39位のロイシン(L39);およびSEQ ID NO: 18に関して74位のアルギニン(R74)からなる群より選択される少なくとも2個のアミノ酸残基を含む、配列
を含む組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドであって、
ヒトVLA4(インテグリンα4β1)タンパク質に対するQ38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 10)の結合親和性よりも大きい該ヒトVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項２】
前記配列が、SEQ ID NO: 18に関して37位のプロリン(P37)および/またはSEQ ID NO: 18に関して39位のロイシン(L39)を含む、請求項1記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項３】
前記配列が、SEQ ID NO: 18に関して37位のプロリン(P37)およびSEQ ID NO: 18に関して39位のロイシン(L39)を含む、請求項2記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項４】
前記配列が、SEQ ID NO: 18に関して34位のフェニルアラニン(F34)を含む、請求項1記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項５】
前記配列が、SEQ ID NO: 18に関して34位のチロシン(F34Y)を含む、請求項1記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項６】
前記配列が、SEQ ID NO: 18に関して34位のフェニルアラニンまたはチロシン(F34またはF34Y); SEQ ID NO: 18に関して37位のプロリン(P37); SEQ ID NO: 18に関して39位のロイシン(L39);およびSEQ ID NO: 18に関して74位のアルギニン(R74)からなる群より選択される少なくとも3個のアミノ酸残基を含む、請求項1記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項７】
前記配列が、SEQ ID NO: 18に関して34位のフェニルアラニン(F34);SEQ ID NO: 18に関して37位のプロリン(P37);SEQ ID NO: 18に関して39位のロイシン(L39);およびSEQ ID NO: 18に関して74位のアルギニン(R74)を含む、請求項1記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項８】
前記配列が、SEQ ID NO: 18に関して32位のロイシン(L32)をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項９】
前記配列が、SEQ ID NO: 18に関して38位のロイシン(L38)をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項１０】
前記配列が、SEQ ID NO: 18に関して79位のセリン(S79)をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項１１】
前記配列が、0〜5個のアミノ酸位置においてSEQ ID NO: 18と異なる、請求項1〜10のいずれか一項記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項１２】
前記配列が、0〜3個のアミノ酸位置においてSEQ ID NO: 18と異なる、請求項1〜10のいずれか一項記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項１３】
実施例10のアッセイ法においてヒトVLA4タンパク質に対するQ38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 10)の結合親和性よりも少なくとも4倍大きいヒトVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、前記請求項のいずれか一項記載の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項１４】
1より大きいVLA4/LPAM-1結合親和性比率を示す、前記請求項のいずれか一項記載の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項１５】
SEQ ID NO: 18の配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項１６】
変異体が、実施例21のアッセイ法において不活性VLA4と比べて活性化VLA4に対してより強い結合を示す、前記請求項のいずれか一項記載の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項１７】
変異体が、実施例21のアッセイ法において、活性化VLA4に対するQ38L-2D-VCAM-1変異体(SEQ ID NO: 10)の結合と比べて活性化VLA4に対してより強い結合を示す、前記請求項のいずれか一項記載の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項１８】
実施例19のアッセイ法を用いて未処置の対照哺乳動物と比べると、哺乳動物に投与された場合に末梢血中のCD49d+ B細胞およびCD29+ B細胞ならびにCD49d+ T細胞およびCD29+ T細胞の百分率における減少を誘導しない、前記請求項のいずれか一項記載の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
【請求項１９】
前記請求項のいずれか一項記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドである第1のポリペプチドと、該2D-VCAM-1変異体のN末端またはC末端に融合されている第2のポリペプチドまたはペプチドとを含む、タンパク質融合物。
【請求項２０】
請求項1〜18のいずれか一項記載の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドと該ポリペプチドに共有結合している少なくとも1つの結合成分とを含む2D-VCAM-1変異体結合体であって、該結合成分が、非ポリペプチドポリマー成分、糖成分、および非ポリペプチド親油性成分より選択される、2D-VCAM-1変異体結合体。
【請求項２１】
前記少なくとも1つの結合成分が非ポリペプチドポリマー成分である、請求項20記載の2D-VCAM-1変異体結合体。
【請求項２２】
前記非ポリペプチドポリマー成分がポリエチレングリコール(PEG)である、請求項21記載の結合体。
【請求項２３】
前記PEGが分子量約20〜80kdalの分枝PEGである、請求項22記載の結合体。
【請求項２４】
前記PEGが前記ポリペプチドのリジンまたはN末端に共有結合している、請求項23記載の結合体。
【請求項２５】
前記PEGが前記ポリペプチドのN末端に共有結合している、請求項24記載の結合体。
【請求項２６】
1つの二官能性PEGに共有結合している2つの請求項1〜18のいずれか一項記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを含む、請求項21〜25のいずれか一項記載の結合体。
【請求項２７】
請求項1〜19のいずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項20〜26のいずれか一項記載の結合体と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、組成物。
【請求項２８】
請求項1〜10のいずれか一項記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組換えポリヌクレオチド。
【請求項２９】
プロモーターに機能的に連結された請求項28記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項３０】
請求項29記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項３１】
(a)組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項29記載のベクターで形質転換された宿主細胞を培養する段階;および
(b)培地からまたは該宿主細胞から、該ポリペプチドを回収する段階
を含む、該組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを作製する方法。
【請求項３２】
(a)封入体としての組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項29記載のベクターで形質転換された宿主細胞を培養する段階;
(b)該ポリペプチドを含む該封入体を回収する段階;
(c)該封入体を可溶化して、可溶化されたポリペプチドを得る段階;
(d)該可溶化されたポリペプチドがリフォールディングするのに適した条件下で尿素および還元型/酸化型グルタチオンの溶液中において該可溶化されたポリペプチドをインキュベートして、リフォールディングされたポリペプチドを得る段階;
(e)該リフォールディングされたポリペプチドを精製する段階;ならびに
(f)段階(e)に由来する該ポリペプチドを回収する段階
を含む、該組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを作製する方法。
【請求項３３】
段階(e)が、前記リフォールディングされたポリペプチドを精製することを含む、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
請求項1〜18のいずれか一項記載の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを提供する段階;および
回収された該ポリペプチドに少なくとも1つのポリエチレングリコール(PEG)成分を共有結合させる段階
を含む、2D-VCAM-1変異体結合体を作製する方法。
【請求項３５】
前記ポリペプチドに少なくとも1つの結合成分を共有結合させる前記段階が、該ポリペプチドのN末端アミノ基にPEG-アルデヒドを結合させるのに有効な条件下で分子量20〜80kdalの分枝PEG-アルデヒドと共に該ポリペプチドをインキュベートし、それによって、該ポリペプチドのN末端に共有結合している分枝PEG成分を含む2D-VCAM-1結合体を作製することを含む、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
請求項27記載の薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、該対象の炎症性疾患または炎症性障害の治療的または予防的な処置のための方法。
【請求項３７】
前記炎症性疾患が多発性硬化症である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
炎症性疾患または炎症性障害の治療的または予防的な処置用の医薬を製造するための、請求項1〜19のいずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項20〜26のいずれか一項記載の結合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、35U.S.C.§119(e)に従って、その全体が参照により組み入れられる2010年5月10日に出願された米国特許仮出願第61/333,210号の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、VLA4(インテグリンα4β1)とVCAM-1の相互作用の新規のポリペプチド阻害剤およびそれらをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０００３】
配列表の参照
37C.F.R.§1.821に従い、EFS-Webを介してファイル名0376US_ST25_shifted.txtとしてコンピューターで読み取り可能な形態(CRF)で本明細書と共に同時に電子的に提出される「配列表」は、参照により本明細書に組み入れられる。配列表の電子コピーは、2011年5月10日に作成され、ディスク上での0サイズは364キロバイトである。
【背景技術】
【０００４】
背景
炎症プロセスは、外傷性傷害、感染性傷害、虚血後傷害、中毒性傷害、または自己免疫性傷害に対する応答として組織において起こり得る、可溶性因子と細胞との複雑な一連の相互作用から成る。正常な状況においては、炎症は、感染からの回復および最終的な治癒を促進する。しかしながら、持続的な炎症は、白血球、リンパ球、またはコラーゲンによる組織損傷をもたらす場合があり、最終的には、悪性形質転換を促進するのに十分なほどひどくDNAを酸化することがある(Nathan C., Nature 420:846-852 (2002))。
【０００５】
一次的病原性役割または重要な二次的病原性役割のいずれかを炎症が有するとみなされているいくつかの疾患がある。例えば、炎症は、アルツハイマー病、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、痛風、橋本甲状腺炎、虚血-再灌流障害、多発性硬化症、変形性関節症、天疱瘡、周期熱症候群、乾癬、関節リウマチ、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、1型糖尿病、潰瘍性大腸炎、脈管炎(ウェゲナー症候群、グッドパスチャー症候群、巨細胞性動脈炎、結節性多発動脈炎など)、および異種移植拒絶の病理において重要な役割を果たすと考えられている(Nathan、前記)。同様に、炎症は、細菌性赤痢、シャーガス病、嚢胞性線維症、間質性肺炎、ビラリアシス(bilariasis)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)胃炎、C型肝炎、インフルエンザウイルス性肺炎、ハンセン病(類結核型)、ナイセリア髄膜炎または肺炎球菌髄膜炎、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、敗血症症候群、および結核などの感染症の病理において微生物毒性と同じくらい重要であると考えられている。したがって、炎症は、いくつかの様々な障害において主要な治療標的の内の1つとなっている(Nathan、前記)。
【０００６】
内皮への白血球粘着の増加は、急性炎症応答の特徴である(Harlan J.M., Blood 65(3):513-525(1985))。炎症部位において、白血球接着受容体活性は調節され、細胞は、脈管構造の管腔表面において発現されるリガンドと相互作用できるようになる(Newham P. et al., J. Biol. Chem. 272(31):19429-19440(1997))。急性炎症応答での白血球-内皮相互作用における基本的事象は、初期の粘着、付着の維持、血管外遊出、および血管外遊走である(Harlan、前記; Mayrovitz H. et al., Thromb. Haemost. 38:823-830(1997))。白血球インテグリン受容体および内皮免疫グロブリンスーパーファミリー細胞接着分子(IgCAM)は、組織中への白血球遊出を促進する事象に寄与すると考えられている(Newham et al., 前記; Butcher E.C., Adv. Exp. Med. Biol. 323:181-194(1992); Springer T.A., Cell 76:301-314(1994))。
【０００７】
インテグリンは、それぞれ120〜180kDaおよび90〜120kDAの共有結合していない2つのサブユニットαおよびβからなる膜貫通型タンパク質の大きなファミリーを構成する(Ghosh S., Ann. Rhem. Dis. 62(Suppl II):ii70-ii72 (2003))。共有結合していないαサブユニットおよびβサブユニットは、広範囲に渡る構造的相同性を有する、α鎖およびβ鎖が様々に組み合わせられたαβヘテロダイマーとして存在する(Pepinsky R.B. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 312(2):742-750 (2005))。インテグリン最後期抗原4(VLA4、CD49d/CD29またはインテグリンα4β1とも呼ばれる)、すなわちα4サブユニットおよびβ1サブユニットのヘテロダイマーは、単核細胞および好酸球など造血系に属する細胞において優勢に発現される。VLA4は、炎症に応答した白血球の血管外遊出の調節において重要な役割を果たしていると考えられている(Hemler M.E. et al., Immun. Rev. 114:45-65 (1990))。インテグリンα4β1はまた、黒色腫および他のいくつかの腫瘍細胞型によっても発現される。RiceおよびBevilacqua(Rice G.E. and Bevilacqua M.P., Science 246:1303-1306 (1989))は、VLA4およびその共受容体VCAM-1が、これらの細胞の血行性転移拡散を媒介することを提唱した。
【０００８】
VLA4は、神経堤細胞、リンパ球、単球、好酸球、筋芽細胞において発現され、多形核細胞において低レベルで発現される(Newham P. et al., J. Immunol. 160:4508-4517 (1998))。VLA4は、損傷組織中への白血球遊走を調節することが報告されている(Pepinsky et al., 前記)。これは、フィブロネクチンに対しておよび細胞表面Igスーパーファミリーのメンバーである血管細胞接着分子-1(VCAM-1)に対して鍵となる受容体である。VLA4はまた、粘膜血管アドレシン細胞接着分子(MADCAM-1; Pepinsky et al.、前記)にもある程度結合する。
【０００９】
VLA4の主要な共受容体であるVCAM-1は、6個または7個いずれかの細胞外ドメインを含む形態で、サイトカイン刺激に応答して内皮表面で発現される(Hession C. et al., J. Biol. Chem. 266:6682-6685 (1991))。サイトカインに刺激された内皮上で優勢な形態は、7ドメイン型である。ドメイン1〜3を含む領域とドメイン4〜6を含む領域のアライメントにおいて配列同一性は63％であるのに対し、VCAM-1ドメインの他のペアワイズ比較の配列同一性は平均で24％であることが報告されている(Dudgeon T.J. et al., Eur. J. Biochem. 226:517-523 (1994))。VCAM-1の最初の6個のドメインは、3つのドメインからなる構成単位の直列型の反復物(duplication)から生じたと考えられている (Dudgeon et al.、前記)。
【００１０】
VCAM-1中にはVLA4に対する2つの結合部位があり、VCAM-1のドメイン1およびドメイン4中に位置している。ドメイン4部位は、6ドメイン型のVCAM-1には存在しない。VLA4結合を媒介する残基は、VCAM-1のドメイン1およびドメイン4中の保存モチーフGln-Ile-Asp-Ser-Proにマッピングされた(Osborn L. et al., J. Cell. Biol. 124:601-608 (1994); Vonderheide R.H. et al., J. Cell. Biol. 125:215-222 (1994); Renz M.E. et al., J. Cell. Biol. 125:1395-1306 (1994); Clements J.M. et al., J. Cell. Sci. 107:2127-2135 (1994))。Newham et al., J. Biol. Chem. 272(31):19429-19440 (1997)では、VCAM-1/MAdCAM-1キメラおよび予測されるインテグリン接着面内にアミノ酸置換を含む変異体VCAM-1構築物を説明しており、インテグリンα4β1およびインテグリンα4β7に対するそれらの結合が特徴決定された。他に行われた観察の内の1つで、著者らは、グリシンまたはロイシンのいずれかに変異したGln38は、α4β1結合に関して極めて接着性の高い表現型を示すことを報告した。
【００１１】
α4インテグリンのアンタゴニストは、炎症性疾患の様々な実験モデルを抑制するにあたって有効であることが報告されている。Leoneおよび共同研究者ら(Leone D.R. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 305:1150-1156 (2003))は、2種類のタイプのα4β1阻害剤、すなわち抗ラットα4モノクローナル抗体TA-2および低分子阻害剤BIO5192が、ラットの実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)に関連した麻痺を遅延させる際に有効であったことを報告している。EAEは、多発性硬化症との類似性がある、中枢神経系の炎症状態である(Yednock T.A. et al., Nature 356:63-66 (1992))。EAEおよび多発性硬化症の両方において、循環血中の白血球は、血液脳関門に侵入し、ミエリンを損傷して、その結果、神経伝導の障害および麻痺をもたらす。Yednockら(前記)は、抗α4インテグリン抗体が、中枢神経系における白血球の蓄積および実験動物におけるEAEの発症を予防する際に有効であったと報告している。
【００１２】
別のインテグリンであるα4β7(リンパ球パイエル板接着分子またはLPAM-1)は、大半の固有層T細胞およびIgA分泌B細胞上に存在している。α4β7の主な共受容体は、粘膜血管アドレシン細胞接着分子(「MADCAM-1」)である。α4β7に対する他のリガンドには、フィブロネクチン、VCAM-1、およびα4インテグリンそれ自体が含まれる(Rice and Bevilacqua、前記)。VLA4およびLPAM-1、ならびに他のインテグリン受容体は、低親和性の立体構造状態(または不活性状態)および高親和性状態(または活性化状態)の両方で存在して、細胞がそれらのインテグリン受容体の結合親和性を調節することが可能になっている(Dustin, M.L. and Springer, T.A., Nature, 34:619-624 (1989))。低親和性状態から高親和性状態への移行は、リガンド、すなわちVCAM-1およびMADCAM-1に対するVLA4およびLPAM-1の親和性をそれぞれ増大させるマグネシウム(Mg2+)およびマンガン(Mn2+)などの二価陽イオンの結合に次いで起こる、インテグリン受容体の立体構造変化に起因する(Dransfield, I., et al., J. Cell Biol. 116:219-226 (1992); Mould, A.P. et al., J. Biol. Chem. 277:19800-19806 (2002))。炎症性接着メカニズムの進行中、活性化されたインテグリンは、ローリング(rolling)白血球を停止させ、それらを血管内皮にしっかりと付着させる。
【００１３】
組換えモノクローナル抗α4抗体ナタリズマブ(タイサブリ(TYSABRI)(登録商標))は、インテグリンα4β1(VLA4)およびインテグリンα4β7(LPAM-1)がそれらの個々の内皮共受容体VCAM-1およびMADCAM-1に結合する能力を妨害する。ナタリズマブは、2004年11月に食品医薬品局(Food and Drug Administration)(FDA)によって再発型多発性硬化症の治療用に認可された。ナタリズマブは、クローン病および関節リウマチの治療について調査されている(Yousry T.A. et al., New Engl. J. Med. 354(9):924-933 (2006))。Millerおよび共同研究者ら(Miller D.H. et al., New Engl. J. Med. 348(1):15-23 (2003))は、プラセボ対照試験において、ナタリズマブを用いた治療により、再発性多発性硬化症の患者における炎症性脳病変が減少し、6ヶ月の期間中の再発が減少したことを報告している。ナタリズマブを用いた治療は、臨床的寛解および臨床反応の比率を高め、C反応性タンパク質レベルを上昇させることが示され、かつ、活動性クローン病患者において許容性が高かった(Ghosh S. et al., New Engl. J. Med. 348(1):24-32 (2003))。
【００１４】
ナタリズマブは、多発性硬化症(MS)およびクローン病の治療において有望な治療物質であると思われたが、Yousryら(前記)、より最近ではWenningら(N. Eng. J. Med. 361:1075-1080 (2009))およびLindaら(N. Eng. J. Med. 361:1081-1087 (2009))が、進行性多巣性白質脳症(PML)、すなわちJCウイルスによって引き起こされる中枢神経系の脱髄疾患が、ナタリズマブで治療された一部の患者において発症したことを報告している。MS患者における研究により、ナタリズマブの薬力学的効果は、その血清半減期よりも著しく長持ちし、いくつかの免疫抑制効果は最終薬物投与後、最長6ヶ月まで続くことが示された(Stuve, O., et al., Ann. Neurol. 59:743-747 (2006))。このモノクローナル抗体治療物質の長い薬物動態学的半減期および薬力学的半減期の結果として、血漿交換処置によってナタリズマブのクリアランスを加速させることにより、ナタリズマブで治療された患者でPMLを発症する患者の臨床転帰が改善し得ることが示唆されている(Khatri B.O. et al. Neurology 72:402-409 (2009))。血漿交換処置は、ナタリズマブレベルを低下させるにあたってある程度しか有効ではないが、それでもなお、患者は数週間にも渡って週に3回、2〜3時間続く侵襲的な処置を受ける必要がある(Khatri et al.、前記)。
【００１５】
ナタリズマブは、ヒト化IgG4モノクローナル抗体である。IgG4抗体は、インビボで他のIgG4抗体との半抗体交換(half-antibody exchange)(または鎖交換(chain swapping))を自然に経る。このプロセスにより、Fabアームがランダム化され、鎖交換されたIgG4 集団は、その本来の抗原に対して本質的に一価となる(Aalberse R.C. and Schuurman J., Immunology 105:9-19 (2002); Van der Neut Kolfschoten, M. et al., Science. 317: 1554-1557 (2007))。IgG4鎖交換は、IgG4ヒンジ配列の還元によって媒介される(Bloom, J.W. et al., Protein Sci. 6:407-415 (1997); Schuurman, J., et al., Mol. Immunol. 38:1-8 (2001))。いくつかの証拠により、ナタリズマブもまたインビボでIgG4鎖交換を経るという概念が裏付けられている。第1に、ナタリズマブをヒトIgG4モノクローナル抗体と同時注射したラットでの研究により、血清中で検出されたナタリズマブの内の13％のみが、24時間後に未変化であることが実証された(Shapiro, R.I. et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 55(1):168-175 (2011))。第2に、Fabアーム交換されたナタリズマブ(ナタリズマブと内因性 IgG4の軽鎖の差異に基づく)が、多発性硬化症(MS)患者へのナタリズマブ投与後数時間以内に検出された(Labrijn A.F. et al., Nat. Biotechnol. 27(8):767-771 (2009))。人におけるナタリズマブ鎖交換の程度は、人によってかなり異なり得る内因性IgG4レベルに依存する(Aucouturier, P. et al., J. lmmunol. Methods, 74:151-162 (1984))。ナタリズマブの第3相臨床試験により、ナタリズマブ300mgを4週毎に投与した場合、α4インテグリン受容体の70％以上が飽和していることが実証された(Rudick R.A. and Sandrock A. Expert Rev Neurotherapeutics. 4:571-580 (2004); Biogen Idec 保管資料(Data on File))。内因性IgG4レベルに関わらずあらゆるMS患者に適用可能である共通のナタリズマブ投薬計画は、内因性IgG4レベルの高い患者における過少量投与および有効性の低下ならびに内因性IgG4レベルの低い人における安全性の問題(過度の免疫抑制に起因する)を招く可能性がある。
【００１６】
ナタリズマブと他の抗α4モノクローナル抗体の結合は、リンパ球の細胞表面におけるVLA4の量を下方調節することが報告されているのに対し、VLA4の低分子阻害剤であるBIO5192は、VLA4受容体の内在化に影響を及ぼさないことが実証された(Putzki, N. et al. Eur. Neurology 63:311-317 (2010); Leone, D. R. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 305:1150-1162 (2003))。さらに、Wipflerら(Mult. Scler.17:16-23 (2011))およびHarrerら(J. Neuroimmunol. (2011))は、ナタリズマブが患者の他の細胞接着分子に対する二次的効果を有して、T細胞上の白血球機能抗原-1(LFA-1)ならびにT細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、およびナチュラルキラーT細胞上のβ1インテグリンの細胞表面下方調節をそれぞれもたらすことを最近報告した。LFA-1は、白血球のトラフィッキングおよび活性化において重要であり、EAEの発症において重要な役割を果たす(Dugger, K. J. et al. J. Neuroimmunol. 206:22-27 (2009))。β1インテグリンは、少なくとも12個の様々なサブユニットと共に、ヘテロダイマーインテグリン接着受容体を形成する (Byron, A., et al. J. Cell Sci. 122:4007-4011 (2009))。LFA-1およびβ1を含むインテグリン接着分子に対するナタリズマブの二次的効果は、モノクローナル抗体の長い薬力学的効果と共に、細胞遊走、免疫ホメオスタシス、および免疫監視の著しい欠陥、ならびにJCウイルスによって引き起こされるものなどの日和見性感染症のリスク増大を招く可能性がある。
【００１７】
したがって、副作用の可能性が低い、多発性硬化症およびクローン病などの炎症を伴う障害を治療するための有効な代替療法が依然として強く望まれていることが明らかである。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、VLA4(インテグリンα4β1)に結合し、VLA4とVCAM-1の相互作用を阻害する、新規の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを提供する。特定の態様において、本発明は、0〜8個のアミノ酸位置においてSEQ ID NO: 18と異なり、かつSEQ ID NO: 18に関して34位のフェニルアラニンまたはチロシン(F34またはF34Y); SEQ ID NO: 18に関して37位のプロリン(P37); SEQ ID NO: 18に関して39位のロイシン(L39);およびSEQ ID NO: 18に関して74位のアルギニン(R74)からなる群より選択される少なくとも2個のアミノ酸残基を含む配列を含む組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドであって、ヒトVLA4(インテグリンα4β1)タンパク質に対するQ38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO:10)の結合親和性よりも大きい該ヒトVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを提供する。本発明は、不活性VLA4と比べて、活性化VLA4に対してより強い結合を示す、組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドをさらに提供する。別の態様において、本発明は、Q38L-2D-VCAM-1変異体(SEQ ID NO:10)と比べて、活性化VLA4に対してより強い結合を示す、組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを提供する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドである第1のポリペプチドと2D-VCAM-1変異体のN末端またはC末端に融合されている(共有結合されている)第2のポリペプチドまたはペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。さらなる態様において、本発明は、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドである第1のポリペプチドと、該2D-VCAM変異体ポリペプチドのN末端に融合されている第2のポリペプチドまたはペプチドと、該2D-VCAM変異体ポリペプチドのC末端に融合されている第3のポリペプチドまたはペプチドとを含む融合タンパク質であって、該第2のポリペプチドまたはペプチドおよび該第3のポリペプチドまたはペプチドが同一であるかまたは異なっていてよい、融合タンパク質を提供する。例示的な第2および第3のポリペプチド/ペプチドには、例えば、ポリヒスチジンタグおよびその変異体、免疫グロブリンのFc領域の全体または一部分、およびヒト血清アルブミンなどが含まれる。
【００２０】
本発明はまた、VLA4結合活性を示す2D-VCAM-1変異体結合体も提供する。結合体は、1つまたは複数の非ポリペプチド結合成分に共有結合的に連結された本発明の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはその融合タンパク質を含み、この結合成分は、非ポリペプチドポリマー成分、糖成分、または非ポリペプチド親油性成分である。場合によっては、非ポリペプチドポリマー成分は、ポリエチレングリコール(PEG)成分である。別の局面において、本発明は、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドおよび別のポリペプチドを含むポリペプチド融合物、例えば、VLA4結合活性を示す2D-VCAM-1変異体-Fc融合ポリペプチドを提供する。
【００２１】
本発明はまた、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたは2D-VCAM-1変異体結合体もしくは2D-VCAM-1変異体融合ポリペプチドに加えて、薬学的に許容される賦形剤または担体などの賦形剤または担体を含む、組成物も含む。
【００２２】
別の局面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養する段階および発現されたポリペプチドを回収する段階を含む、本発明の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを作製する方法を含む。本発明はまた、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに結合成分(例えばPEG)を結合させる段階を含む、本発明の2D-VCAM-1変異体結合体を作製する方法も含む。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはその結合体もしくは薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象の炎症性疾患を治療する方法を含む。
【００２４】
本発明のその他の局面を、以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】ヒトVCAM-1の最初の2つのドメイン(すなわち、ヒト2D-VCAM-1)をコードするポリヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 1)を示す。
【図１Ｂ】図1Aのポリヌクレオチド配列にコードされるアミノアミノ酸配列(SEQ ID NO: 2)を示し、ヒトVCAM-1の最初の2つのドメイン(すなわち、ヒト2D-VCAM-1)に相当する。
【図２Ａ】ヒト2D-VCAM-1のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 2)および単一の置換Q38Lを有するヒト2D-VCAM-1変異体のアミノ酸配列(Q38L-2D-VCAM-1、SEQ ID NO: 10)と比較した、例示的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２Ｂ】ヒト2D-VCAM-1のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 2)および単一の置換Q38Lを有するヒト2D-VCAM-1変異体のアミノ酸配列(Q38L-2D-VCAM-1、SEQ ID NO: 10)と比較した、例示的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２Ｃ】ヒト2D-VCAM-1のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 2)および単一の置換Q38Lを有するヒト2D-VCAM-1変異体のアミノ酸配列(Q38L-2D-VCAM-1、SEQ ID NO: 10)と比較した、例示的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２Ｄ】ヒト2D-VCAM-1のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 2)および単一の置換Q38Lを有するヒト2D-VCAM-1変異体のアミノ酸配列(Q38L-2D-VCAM-1、SEQ ID NO: 10)と比較した、例示的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２Ｅ】ヒト2D-VCAM-1のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 2)および単一の置換Q38Lを有するヒト2D-VCAM-1変異体のアミノ酸配列(Q38L-2D-VCAM-1、SEQ ID NO: 10)と比較した、例示的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２Ｆ】ヒト2D-VCAM-1のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 2)および単一の置換Q38Lを有するヒト2D-VCAM-1変異体のアミノ酸配列(Q38L-2D-VCAM-1、SEQ ID NO: 10)と比較した、例示的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図３】Q38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 10)およびヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)と比較した、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドであるクローン146(SEQ ID NO: 18)の結合のBIACORE解析によって得られたセンサーグラム図を示す。対応する実験は、実施例12で説明する。
【図４】実施例12で説明する通り、矢印で示した時点より前の時点の曲線によって表される、2D-VCAM-1分析物およびVLA4-Fc リガンドの結合を反映する結合相(association phase)、ならびに矢印で示した時点より後の時点の曲線によって表される解離相(dissociation phase)を示す。本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドであるクローン146(SEQ ID NO: 18)についての結果を、Q38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 10)およびヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)と比較して示す。
【図５】実施例13で説明する通り、抗VLA4抗体および様々な可溶性2D-VCAM-1ポリペプチドによる、固定された7D-VCAM-1に対するU937細胞接着の阻害を示す。抗VLA-4抗体(陽性対照)、希釈緩衝液のみ(「処置なし」)、2D-VCAM-1変異体クローン46(SEQ ID NO: 12)、Q38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 10)、およびヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)についての結果を示す。
【図６】実施例13で説明する通り、様々な濃度の変異体クローン46(SEQ ID NO: 12)、変異体クローン146(SEQ ID NO: 18)、およびQ38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 10)の存在下での、固定された7D-VCAM-1に対するU937細胞接着の滴定曲線を示す。
【図７Ａ】不完全フロイントアジュバントに溶かした1000μg/ml PLPおよび2mg/ml結核菌(Mycobacterium tuberculosis)による雌SJLマウスの免疫化後の日数に対する麻痺スコアのプロットである。7日目から開始して15日目まで、マウスを未処置で放置するか、またはラット抗マウスα4インテグリンモノクローナル抗体PS/2を毎日(対照)、2D-VCAM-1変異体クローン59(SEQ ID NO: 16)を毎日、もしくは2D-VCAM-1変異体クローン146(SEQ ID NO: 18)を毎日、マウスに静脈内注射した。結果から、実施例14で説明する通り、本発明の2D-VCAM-1変異体が、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウスモデルにおいて麻痺の発生を遅らせ、疾患症状の重症度を緩和するにあたって、インビボで有効であることが実証される。
【図７Ｂ】不完全フロイントアジュバントに溶かした1000μg/ml PLPおよび2mg/ml結核菌による雌SJLマウスの免疫化後の日数に対する麻痺スコアのプロットである。PLP投与後6日目、8日目、10日目、および13日目に、3mg/kgのラット抗マウスα4インテグリンモノクローナル抗体PS/2または50Kの分枝PEG-アルデヒド試薬でN末端をPEG化した2D-VCAM-1変異体クローン146(SEQ ID NO: 18)(「PEG50-146」)のいずれかでマウスを処置した。結果から、実施例16で説明する通り、PEG化された本発明の2D-VCAM-1変異体が、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウスモデルにおいて麻痺の発生を遅らせ、疾患症状の重症度を緩和するにあたって、インビボで有効であることが実証される。
【図８】完全フロイントアジュバントに溶かしたモルモット脳全体のホモジネートおよび結核菌による雌ハートレイ系モルモットの免疫化後の日数に対する臨床スコアのプロットである。13日目から、モルモットを未処置で放置するか、または50Kの分枝PEG-アルデヒド試薬でN末端をPEG化した2D-VCAM-1変異体クローン146(SEQ ID NO: 18)(「PEG50-146」)もしくは80Kの分枝PEG-アルデヒド試薬でN末端をPEG化した2D-VCAM-1変異体クローン146(「PEG80-146」)を13日目、15日目、および17日目にモルモットに皮下注射した。ヒト化抗α4インテグリンモノクローナル抗体ナタリズマブを13日目に投与した(対照)。結果から、実施例17で説明する通り、PEG化された本発明の2D-VCAM-1変異体が、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モルモットモデルにおいて麻痺の発生を遅らせるにあたって、インビボで有効であることが実証される。
【図９Ａ】PEG50-146を0.3mg/kgまたは3mg/kgいずれかの用量で皮下注射した後の、時間(時)に対する薬物血清中濃度(ng/ml)のプロットである。このプロットは、実施例18で説明する通り、ポリペプチドの皮下投与後のカニクイザル血清における本発明の2D-VCAM-1変異体の濃度を示す。
【図９Ｂ】ナタリズマブを3mg/kgの用量で皮下注射した後の、時間(時)に対する薬物血清中濃度(ng/ml)のプロットである。このプロットは、実施例18で説明する通り、ポリペプチドの1回の皮下投与後のカニクイザル血清におけるナタリズマブの濃度を示す。
【図１０】CD49+(α4インテグリン)である末梢B細胞の比率(％)を日数に対してプロットした図である。0日目に、PEG50-146、ラット抗マウスα4インテグリンモノクローナル抗体PS/2、またはPBSのいずれかを0日目、2日目、および4日目に雌Balb/cマウスに皮下注射した。結果から、実施例19Aで説明する通り、本発明の2D-VCAM-1変異体は、マウスの末梢血中のCD49d+(α4インテグリン)/B220+ B細胞の百分率を減少させないことが実証される。
【図１１Ａ】CD49d+(α4インテグリン)である末梢B細胞の比率(％)を日数に対してプロットした図であり、PEG50-146またはヒト化抗α4インテグリンモノクローナル抗体ナタリズマブ(対照)を1日目に雄カニクイザルに皮下注射した。結果から、実施例19Bで説明する通り、2D-VCAM-1変異体は、サルの末梢血中のCD49+(α4インテグリン)/CD20+ B細胞の比率もCD49+(α4インテグリン)/CD3+ T細胞の百分率も有意に減少させないことが実証される。
【図１１Ｂ】CD49d+(α4インテグリン)である末梢T細胞の比率(％)を日数に対してプロットした図であり、PEG50-146またはヒト化抗α4インテグリンモノクローナル抗体ナタリズマブ(対照)を1日目に雄カニクイザルに皮下注射した。結果から、実施例19Bで説明する通り、2D-VCAM-1変異体は、サルの末梢血中のCD49+(α4インテグリン)/CD20+ B細胞の比率もCD49+(α4インテグリン)/CD3+ T細胞の百分率も有意に減少させないことが実証される。
【図１２Ａ】CD29+(β1インテグリン)である末梢B細胞の比率(％)を日数に対してプットした図であり、PEG50-146またはヒト化抗α4インテグリンモノクローナル抗体ナタリズマブ(対照)を1日目に雄カニクイザルに皮下注射した。結果から、実施例19Bで説明する通り、本発明の2D-VCAM-1変異体は、マウスの末梢血中のCD29+(β1インテグリン)/CD20+ B細胞の百分率を有意に減少させないことが実証される。
【図１２Ｂ】CD29+(β1インテグリン)である末梢T細胞の比率(％)を日数に対してプロットした図であり、PEG50-146またはヒト化抗α4インテグリンモノクローナル抗体ナタリズマブ(対照)を1日目に雄カニクイザルに皮下注射した。結果から、実施例19Bで説明する通り、本発明の2D-VCAM-1変異体は、マウスの末梢血中のCD29+(β1インテグリン)/CD20+ B細胞の百分率を有意に減少させないことが実証される。
【図１３】クローン146(SEQ ID NO: 18)の配列最適化された変異体のVLA4結合特性を示す棒グラフである。この実験の説明は、実施例20で提供する。
【図１４】実施例21で説明する通り、1mM MnCl2をアッセイ緩衝液に添加することによりVLA4の活性化型への変換を誘導したモルモット脾臓細胞上の高親和性(または活性化)インテグリンに対する2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの優先的結合を示す棒グラフである。
【図１５】実施例21で説明する通り、インテグリン受容体の様々な活性化状態におけるヒトVLA4-Fc分子への2D-VCAM-1クローン146(SEQ ID NO: 18)の結合をBIACORE解析することによって得られたセンサーグラム図を示す。
【図１６Ａ】実施例23で説明するモルモットにおけるPEG50-146の薬物動態と薬力学の関連を示す。
【図１６Ｂ】実施例23で説明するカニクイザルにおけるPEG50-146の薬物動態と薬力学の関連を示す。
【図１７Ａ】実施例23で説明する通り、クローン146のFc融合タンパク質(146-Fc;パネルA)およびクローン046のFc融合タンパク質(046-Fc;パネルB)のヒトVLA4への結合をBIACORE解析することによって得られたセンサーグラム図を示す。
【図１７Ｂ】クローン146のFc融合タンパク質(146-Fc)のヒトVLA4-Fcへの結合をBIACORE解析することによって得られたセンサーグラム図を示す。その際、146-Fcをチップ上に固定し、様々な濃度のVLA4-Fcを注入した。ヒトVLA4-Fcに対する146-Fc結合の解離曲線は、逆方向のBiacoreアッセイ法におけるヒトVLA4-Fcに対するFcを含まないタイプのクローン146のもの(差し込み図)と質的に類似している。この実験の説明は、実施例23で提供する。図17Bは、クローン046のFc融合タンパク質(046-Fc)のヒトVLA4-Fcへの結合をBIACORE解析することによって得られたセンサーグラム図を示す。その際、046-Fcをチップ上に固定し、様々な濃度のヒトVLA4-Fcを注入した。ヒトVLA4-Fcに対する046-Fc結合の解離曲線は、逆方向のBiacoreアッセイ法におけるヒトVLA4-Fcに対するFcを含まないタイプのクローン046のもの(差し込み図)と質的に類似している。この実験の説明は、実施例23で提供する。
【図１８】実施例24で説明する通り、二官能的にPEG化された2D-VCAM-1クローン146(SEQ ID NO: 18)および単量体の非PEG化2D-VCAM-1クローン146(SEQ ID NO: 18)のヒトVLA4への結合をBIACORE解析することによって得られたセンサーグラム図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
定義
本明細書または明細書の残りの部分において他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「ヒト2D-VCAM-1」(または単に「2D-VCAM-1」)という用語は、6ドメイン型または7ドメイン型の天然ヒトVCAM-1の最初の2つのドメインからなる人工構築物を意味する。この2ドメイン型のVCAM-1は、実際には自然に発生しない(言い換えれば、非天然である)。SEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2(それぞれ図1および図2)は、ヒト2D-VCAM-1の核酸配列およびアミノ酸配列をそれぞれ提供する。SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基1〜88および96〜199は、ヒト2D-VCAM-1のドメイン-1およびドメイン-2の配列にそれぞれ相当し、SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基89〜95は、ドメイン-1およびドメイン-2を連結するリンカーペプチドの配列に相当する。ヒト2D-VCAM-1配列は、成熟した6ドメイン型のヒトVCAM-1(「6D-VCAM-1」、SEQ ID NO: 4;核酸配列SEQ ID NO: 3にコードされる)のアミノ酸残基1〜199ならびに成熟した7ドメイン型のヒトVCAM-1(「7D-VCAM-1」、SEQ ID NO: 6;核酸配列SEQ ID NO: 5にコードされる)の残基1〜199に相当し、これらは両方とも自然に発生する(すなわち、天然である)。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「2D-VCAM-1変異体ポリペプチド」(または「2D-VCAM-1変異体」)という用語は、ヒト2D-VCAM-1のドメイン1配列およびドメイン2配列(それぞれ、SEQ ID NO: 2のアミノ酸1〜88および96〜199)を含む配列を含み、かつVLA4結合活性を示すポリペプチドを意味し、その際、変異体配列は、1つまたは複数のアミノ酸位置において、ヒト2D-VCAM-1のドメイン1配列および/またはドメイン2配列と異なる。
【００２９】
「ポリペプチド」とは、文脈によって、天然のアミノ酸もしくは人工のアミノ酸類似体を含むアミノ酸ポリマー、またはアミノ酸ポリマーを表す文字列である。遺伝コードの縮重を前提として、特定のポリペプチド配列をコードする1つもしくは複数の核酸、またはその相補的核酸を、そのポリペプチド配列から決定することができる。
【００３０】
「ポリヌクレオチド」(または「核酸」)は、文脈によって、ヌクレオチドA、C、T、U、Gもしくは他の天然のヌクレオチドまたは人工のヌクレオチド類似体を含むヌクレオチドポリマー、または核酸を表す文字列である。任意の指定されたポリヌクレオチド配列から、所与の核酸または相補的核酸のいずれかを決定することができる。
【００３１】
任意の所与のポリマー構成要素(例えば、同様に総称的に「残基」と呼ばれるアミノ酸、ヌクレオチド)の位置が、所与のポリマーにおけるその構成要素の実際の数値的位置に基づくのではなく、選択されたアミノ酸ポリマーまたは核酸ポリマーにおける同じ位置または等価な位置を参照することにより呼ばれる場合、所与のアミノ酸ポリマーまたは核酸ポリマーの番号付けは、選択されたアミノ酸ポリマーまたは核酸ポリマーの番号付け「に対応する」か、または「に関する」。したがって、例えば、所与のポリペプチド配列における所与のアミノ酸位置の番号付けは、参照配列として使用される選択されたポリペプチド配列における同じまたは等価なアミノ酸位置に対応する。
【００３２】
「等価な位置」(例えば、「等価なアミノ酸位置」もしくは「等価な核酸位置」または「等価な残基位置」)とは、本明細書において説明するアライメントアルゴリズムを用いて最適に整列させられた場合、参照ポリペプチド(または参照ポリヌクレオチド)配列の対応する位置と並ぶ、試験ポリペプチド(または試験ポリヌクレオチド)配列の位置(例えば、アミノ酸位置もしくは核酸位置または残基位置)であると本明細書において定義される。試験ポリペプチドの等価なアミノ酸位置は、参照ポリペプチドの対応する位置と同じ数値的位置番号を有さなくてもよい;同様に、試験ポリヌクレオチドの等価な核酸位置は、参照ポリヌクレオチドの対応する位置と同じ数値的位置番号を有さなくてもよい。
【００３３】
2つのポリペプチド配列は、その配列ペアにとって可能な最大の類似性スコアに達するように、所定のパラメーター、すなわち、所定のアミノ酸置換マトリクス、ギャップ存在ペナルティ(ギャップオープンペナルティとも呼ばれる)、およびギャップ伸長ペナルティを用いてそれらを整列させた場合、「最適に整列される」。BLOSUM62マトリックス(Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(22):10915-10919)は、ポリペプチド配列アラインメントアルゴリズム(例えばBLASTP)において、初期設定のスコアリング置換マトリクスとしてしばしば使用される。ギャップ存在ペナルティは、整列された配列の内の1つに単一のアミノ酸ギャップを導入するために課され、ギャップ伸長ペナルティは、ギャップ中の各残基位置に課される。別段の定めが無い限り、本明細書において使用されるアライメントパラメーターは、BLOSUM62スコアリングマトリックス、ギャップ存在ペナルティ=11、およびギャップ伸長ペナルティ=1である。アライメントスコアは、アライメントが開始および終了する各配列のアミノ酸位置(例えば、アライメントウィンドウ)によって、任意で、可能な最大の類似性スコアに達するように一方または両方の配列中に1つのギャップまたは複数のギャップを挿入することによって定められる。
【００３４】
アミノ酸位置およびアミノ酸置換を特定するのに使用される用語は、次のように示される。T37は、SEQ ID NO: 2などの参照アミノ酸配列において、位置番号37がトレオニン(Thr)残基によって占められていることを示す。T37Pは、37位のトレオニン残基がプロリン(Pro)残基で置換されていることを示す。二者択一の置換は、「/」を用いて示され、例えば、T37M/Pは、37位のトレオニン残基がメチオニン(Met)残基またはプロリン(Pro)残基で置換されているアミノ酸配列を意味する。複数の置換は、「+」を用いて示される場合が時々あり、例えば、T37M/P+I39Lは、メチオニン残基またはプロリン残基による37位のトレオニン残基の置換、およびロイシン残基による39位のイソロイシン残基の置換を含むアミノ酸配列を示す。欠失は、アスタリスクによって示される。例えば、S100*は、100位のセリン残基が欠失していることを示す。2個またはそれ以上の連続したアミノ酸の欠失は、次のように示される場合がある。例えば、P95*-S100*は、残基P95〜S100(P95およびS100を含む)の欠失を示す(すなわち、残基95、96、97、98、99、および100が欠失している)。挿入は、次のように示される。95位に位置するプロリン残基の後ろへの付加的なセリン残基の挿入は、P95PSと示される。置換および挿入の組合せは、次のように示される。セリン残基による95位のプロリン残基の置換および95位のアミノ酸残基の後ろへのアラニン残基の挿入は、P95SAと示される。
【００３５】
別段の定めが無い限り、本明細書において説明する2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのアミノ酸残基の位置番号付けは、アミノ酸配列SEQ ID NO: 2、すなわちヒト2D-VCAM-1の配列に関する。親ポリペプチドの例および親ポリペプチドに対する改変は、配列SEQ ID NO: 2に関して(または別の指定配列に関して)本明細書において提供され得るものの、これらの例は本発明の他のポリペプチドに関係し、本明細書において説明する改変は、本明細書において説明する他のポリペプチドのいずれかの等価なアミノ酸位置(前述した通り)に加えられ得ることを理解すべきである。したがって、例として、SEQ ID NO: 2に関する置換Q38Lは、SEQ ID NO: 18におけるアミノ酸位置L38に対応すると理解される。別の例として、SEQ ID NO: 2に関する置換F32Lは、SEQ ID NO:20に関する置換S32Lに対応し、かつSEQ ID NO: 18におけるアミノ酸位置L32に対応する。
【００３６】
VLA4は、インテグリンサブユニットα4およびβ1の非共有結合性ヘテロダイマーとして自然界に存在する。本明細書において定義される場合、「VLA4タンパク質」は、天然の形態および非天然の形態のインテグリンα4β1を含むと意図される。本明細書の実施例3において、1種のこのようなVLA4タンパク質である、Fcドメインにそれぞれ融合されたヒトインテグリンα4サブユニットおよびβ1サブユニットを含む可溶性融合タンパク質(本明細書において「ヒトVLA4-Fc」または単に「VLA4-Fc」と呼ぶ)の組換え発現および精製を説明する。この可溶性融合タンパク質を、例えば実施例10のアッセイ法において使用して、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのVLA4結合活性を測定することができる。
【００３７】
同様に、LPAM-1も、インテグリンサブユニットα4およびβ7の非共有結合性ヘテロダイマーとして自然界に存在する。本明細書において定義される場合、「LPAM-1タンパク質」は、例えば、実施例4および実施例11で説明する通り、Fcドメインにそれぞれ融合されたヒトインテグリンα4サブユニットおよびβ7サブユニットを含む可溶性融合タンパク質(本明細書において「ヒトLPAM-1-Fc」または単に「LPAM-1-Fc」と呼ぶ)などの天然の形態および非天然の形態のインテグリンα4β7を含むと意図される。
【００３８】
「VLA4結合活性を示している(exhibiting)(または、例えば、示す(exhibits)、有している(having)、もしくは有する(has))」という用語は、本発明のポリペプチドまたは結合体がVLA4タンパク質に対して測定可能な結合活性を有することを示すと意図される。VLA4タンパク質は、例えば、ヒトU937細胞などの細胞の表面で発現される場合があり、その場合、細胞表面のVLA4タンパク質(この場合、ヒトVLA4タンパク質)への結合は、本明細書の実施例13で説明する細胞接着アッセイ法などの細胞接着アッセイ法を用いて測定することができる。あるいは、例えば、本明細書の実施例3で説明するヒトVLA4-Fc融合タンパク質などの融合タンパク質として、可溶型のVLA4タンパク質を作製してもよく、例えば、実施例10で説明する通りのELISAアッセイ法または実施例12で説明する通りの表面プラズモン共鳴(BIACORE)アッセイ法を用いて、VLA4-Fcへの結合を測定してもよい。非ヒト(例えば、マウス、げっ歯動物、非ヒト霊長類)VLA4タンパク質に対する本発明のポリペプチドおよび結合体の結合活性を含むVLA4結合活性を測定する他のアッセイ法は、当技術分野において公知であり、かつ/または実施例において説明する。
【００３９】
当業者は、「測定可能な結合活性」を構成するものは、行われるアッセイ法の性質にある程度依存することを認識しているが、一般的指針として、測定可能な活性とは、試験化合物(例えば、本発明のポリペプチド)の存在下で生じるアッセイシグナルが、試験化合物の非存在下で生じるアッセイシグナルと異なり、その差が定量可能であるものである。場合によって、(例えば、EC50、粘着指数、または活性に関係する他の値によって証明される)本発明のポリペプチドまたは結合体によって示される活性は、参照2D-VCAM-1ポリペプチド(例えば、ヒト2D-VCAM-1ポリペプチド、SEQ ID NO: 2)によって示される特定の活性のものとほぼ等しいか、それより小さいか、またはそれより大きくてよい。
【００４０】
「変異体」とは、(例えば、置換、欠失、または挿入によって)親ポリペプチド配列のものと1つまたは複数のアミノ酸位置において異なる配列を含むポリペプチドである。変異体は、残基の最大8％など親ポリペプチド配列の総残基数の最大10％において、例えば、親ポリペプチド配列の総残基数の最大6％、5％、4％、3％、2％、または1％において親ポリペプチド配列と異なる配列を含んでよい。例えば、アミノ酸199個のポリペプチド配列SEQ ID NO: 2の変異体は、親ポリペプチド配列の総残基数の最大10％において、すなわち、アミノ酸199個のポリペプチド配列SEQ ID NO: 2内の最高19個のアミノ酸位置において(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、または19個のアミノ酸位置において)、例えば、SEQ ID NO: 2内の1〜19個のアミノ酸位置において、1〜18個のアミノ酸位置において、1〜17個のアミノ酸位置において、1〜16個のアミノ酸位置において、1〜15個のアミノ酸位置において、1〜14個のアミノ酸位置において、1〜13個のアミノ酸位置において、1〜12個のアミノ酸位置において、1〜11個のアミノ酸位置において、1〜10個のアミノ酸位置において、1〜9個のアミノ酸位置において、1〜8個のアミノ酸位置において、1〜7個のアミノ酸位置において、1〜6個のアミノ酸位置において、1〜5個のアミノ酸位置において、1〜4個のアミノ酸位置において、1〜3個のアミノ酸位置において、または1〜2個のアミノ酸位置において異なる配列を含む。
【００４１】
「親ポリペプチド」という用語は、本発明に従って改変するためのポリペプチド配列を示すと意図される。例えば、親ポリペプチド配列は、本明細書においてSEQ ID NO: 2として特定するヒト2D-VCAM-1ポリペプチドまたは本明細書においてSEQ ID NO: 10として特定するQ38L-2D-VCAM-1ポリペプチドの配列でよい。あるいは、親ポリペプチド配列は、例えば、SEQ ID NO: 12、14、16、18、20、22、または24の内の1つなどの本明細書において開示する2D-VCAM-1変異体の配列でもよい。
【００４２】
物体に対して使用される場合、「天然の」とは、その物体が、人によって人工的に作製されるのとは違って、自然界で見出すことができることを意味する。例えば、生物(ウイルス、細菌、原生動物、昆虫、植物、または哺乳動物組織を含む)中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、かつ研究室で人によって意図的に改変されていないポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然である。物体に対して使用される場合、「非天然の」(または「合成」もしくは「人工」とも称される)とは、その物体が天然に存在しないこと、すなわち、その物体が、人によって人工的に作製されるのとは違って自然界で見出すことができないことを意味する。
【００４３】
「断片」または「部分配列」とは、配列全体までだが配列全体を含まない、配列全体の任意の部分である。したがって、断片または部分配列とは、アミノ酸の長い配列(例えばポリペプチド)または核酸の長い配列(例えばポリヌクレオチド)の一部分を含む、アミノ酸または核酸の配列を意味する。
【００４４】
2つの分子間、例えば、リガンドおよび受容体の「特異的結合親和性」とは、分子の混合物における一方の分子の別の分子に対する優先的結合を意味する。典型的には、結合親和性が、約1×104M-1〜約1×109M-1またはそれ以上(すなわち、KDが約10-4M〜10-9Mまたはそれ未満)である場合、それらの分子の結合は特異的とみなされる。リガンドおよび受容体の結合親和性は、当業者に公知の標準的技術によって測定することができる。結合親和性を測定するための周知の技術の非限定的な例には、Biacore(登録商標)技術(Biacore AB, Sweden)、等温滴定マイクロカロリメトリー(MicroCal LLC, Northampton, MA USA)、ELISA、およびフローサイトメトリー(例えばFACS)が含まれる。例えば、フローサイトメトリー法を用いて、関連する結合対メンバー(例えば受容体)に特異的に結合する分子集団(例えば、細胞表面に提示されたリガンドなど)を選択することができる。リガンド-受容体複合体は、(例えば、複合体と複合体を認識する蛍光性抗体とを反応させることによるか、またはビオチン標識リガンドを含む複合体とストレプトアビジン結合蛍光プローブとを反応させることによって)、蛍光に基づいて検出し選別することができる。関連する結合対メンバー(例えば受容体)に結合する関心対象の分子を集め、低濃度の受容体の存在下で再選別する。漸減濃度の受容体(例示的な濃度範囲は、リガンド-受容体相互作用の性質によって、10-6M程度から10-9Mまで、すなわち、1マイクロモル濃度(μM)から1ナノモル濃度(nM)またはそれ以下まで)の存在下で細胞選別を複数回実施することによって、その受容体に対して特異的結合親和性を示す分子が濃縮された集団を得ることができる。
【００４５】
ポリペプチド、核酸、または他の構成要素は、通常それが伴っている構成要素(他のペプチド、ポリペプチド、タンパク質(複合体、例えば、天然配列に付随する場合があるポリメラーゼおよびリボソームを含む)、核酸、細胞、合成試薬、細胞混入物、細胞構成要素など)から、例えば、もともとの由来元である細胞において通常伴っている他の構成要素から、部分的にまたは完全に分離されている場合、「単離されて」いる。ポリペプチド、核酸、または他の構成要素は、その自然環境の他の構成要素から部分的または完全に回収または分離され、その結果、それが、構成要素の組成物、混合物、または集合物中に存在する優勢な種である(すなわち、モルに基づいて、組成物中の他の任意の個々の化学種よりもそれが豊富である)場合、単離されている。場合によっては、調製物は、約60％超、70％超、もしくは75％超、典型的には約80％超、または好ましくは約90％超の単離された種からなる。
【００４６】
「実質的に純粋な」または「単離された」核酸(例えば、RNAもしくはDNA)、ポリペプチド、タンパク質、または組成物はまた、対象の種(例えば、核酸またはポリペプチド)が、存在する全高分子種の少なくとも約50重量％、60重量％、または70重量％(モルベース)を構成する場合も意味する。実質的に純粋な組成物または単離された組成物はまた、組成物中に存在する全高分子種の少なくとも約80重量％、90重量％、または95重量％を構成してもよい。また、単離された対象の種は、組成物が単一の高分子種の誘導体から本質的になる、本質的に均質な状態(組成物中の混入種を従来の検出方法によって検出することができない)に精製することもできる。「精製された」という用語は、核酸、ポリペプチド、またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを一般に意味する。これは、典型的には、核酸、ポリペプチド、またはタンパク質が、少なくとも約50％純粋、60％純粋、70％純粋、75％純粋、より好ましくは少なくとも約85％純粋、および最も好ましくは少なくとも約99％純粋であることを意味する。
【００４７】
「単離された核酸」という用語は、本発明の核酸の由来元である生物の天然のゲノムにおいてはそれのすぐ横に連続しているコード配列の両方(すなわち、5'末端側の1つおよび3'末端側の1つ)のすぐ横に連続していない核酸(例えば、DNAまたはRNA)を意味することができる。したがって、この用語は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または制限エンドヌクレアーゼ処理によって作製されたcDNAまたはゲノムDNA断片を含み、このようなcDNAまたはゲノムDNA断片が、ベクター中に組み入れられているか、そのもともとの由来元である生物(例えばウイルスを含む)と同じ種もしくは異なる種のゲノム中に組み込まれているか、キメラポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子を形成させるための付加的なコード配列に連結されているか、または他の任意のDNA配列から独立しているかを問わない。DNAは、二本鎖でも一本鎖でもよく、センスでもアンチセンスでもよい。
【００４８】
「組換えポリヌクレオチド」または「組換えポリペプチド」は、複数の供給源ポリヌクレオチドまたは供給源ポリペプチドにそれぞれ由来する核酸配列またはアミノ酸配列を含んでよい非天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり、この供給源ポリヌクレオチドまたは供給源ポリペプチドは、天然のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドでもよく、またはそれ自体が変異誘発もしくは他のタイプの改変に供されたものでもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それが合成もしくは人工もしくは操作されているか、または合成もしくは人工もしくは操作されているポリペプチドもしくは核酸に由来する場合、「組換え」とみなしてよい。組換えポリヌクレオチド(例えば、DNAまたはRNA)は、典型的には一緒に含まれてないか、典型的には互いに結合していないか、またはさもなければ、典型的には互いから分離されている、配列の少なくとも2個のセグメントの組合せ(例えば、人工的組合せ)によって作製することができる。組換えポリヌクレオチドは、異なる供給源に由来するポリヌクレオチドセグメントを一緒にして結合するかもしくは組み合わせることによって形成させた、かつ/または人工的に合成した核酸分子を含んでよい。「組換えポリペプチド」は、クローニングされたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドの結果として生じるポリペプチドをしばしば意味する。
【００４９】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、ポリヌクレオチド、ベクター、またはポリペプチドに関して使用される場合、典型的には、その細胞、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくはポリペプチドが、異種(すなわち、天然ではない、外来の)核酸の導入もしくは天然核酸の変更によって改変されていること、またはタンパク質もしくはポリペプチドが、異種アミノ酸の導入によって改変されていること、またはそのように改変された細胞に細胞が由来することを示す。組換え細胞は、その細胞の天然(非組換え)形態には存在しない核酸配列を発現するか、または別の状況では異常に発現されるか、過少発現されるか、もしくは全く発現されないであろう天然核酸配列を発現する。「組換え」という用語は、細胞に関して使用される場合、その細胞が異種核酸を複製するか、または異種核酸にコードされたポリペプチドを発現することを示す。組換え細胞は、天然(非組換え)形態の細胞の内部には存在しないコード配列を含むことができる。また、組換え細胞は、人工的手段によって改変され細胞に再導入される、天然形態の細胞中に存在するコード配列を含んでもよい。この用語はまた、細胞から核酸を除去することなく改変された、細胞に内在する核酸を含む細胞も包含する。このような改変には、遺伝子置換、部位特異的変異、組換え、および関連した技術によって得られるものが含まれる。
【００５０】
「ベクター」とは、選択された核酸による細胞への形質導入もしくはトランスフェクション、または細胞におけるその核酸の発現を容易にする構成要素または構成物である。ベクターには、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、YACなどが含まれる。「発現ベクター」とは、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを含む、組換えまたは合成によって作製された核酸構築物または核酸配列である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部分でよい。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに機能的に連結された、転写されるべき核酸を含む。転写されるべき核酸は、典型的には、プロモーターの指示下または制御下にある。
【００５１】
「イムノアッセイ法」という用語は、抗原に結合または特異的に結合させるために抗体または免疫原を使用するアッセイ法を含む。典型的には、イムノアッセイ法は、抗原を単離し、標的とし、かつ/または定量するために特定の抗体の特異的結合特性を使用することを特徴とする。
【００５２】
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、生物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、オランウータン、サル)、マウス、ブタ、雌ウシ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジを含む哺乳動物または他の非ヒト哺乳動物;例えば、トリ(例えば、ニワトリもしくはアヒル)または魚など哺乳動物ではない脊椎動物および哺乳動物ではない無脊椎動物を含む非哺乳動物を含むが、それらに限定されるわけではない。
【００５３】
「薬学的組成物」という用語は、動物またはヒトを含む対象における薬学的使用に適している組成物を意味する。薬学的組成物は、一般に、有効量の活性作用物質と、例えば薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、賦形剤または担体とを含む。
【００５４】
「有効量」という用語は、所望の結果をもたらすのに十分な投薬量または量を意味する。所望の結果は、その投薬量または量の受容者における客観的改善または主観的改善を含んでよい。
【００５５】
「予防的処置」とは、疾患、病状、もしくは医学的障害の徴候も症状も示していないか、または疾患、病状、もしくは障害の初期の徴候もしくは症状を示しているにすぎない対象に対して施される処置であり、その際、処置は、疾患、病状、または医学的障害を発生するリスクを減少、防止、または低下させる目的で施される。予防的処置は、疾患または障害に対する防止的な処置として機能する。「予防的活性」とは、病状、疾患、もしくは障害の徴候も症状も示していないか、または病状、疾患、もしくは障害の初期の徴候もしくは症状を示しているにすぎない対象に投与された場合に、病状、疾患、または障害を対象が持つようになるリスクを減少、防止、または低下させる、核酸、ベクター、遺伝子、ポリペプチド、タンパク質、物質、またはそれらの組成物などの作用物質の活性である。「予防的に有用な」作用物質または化合物(例えば、核酸またはポリペプチド)とは、病状、疾患、または障害の発生を減少、防止、処置、または低下させる際に有用である作用物質または化合物を意味する。
【００５６】
「治療的処置」とは、病状、疾患、または障害の症状または徴候を示している対象に対して施される処置であり、その際、処置は、病状、疾患、または障害の徴候または症状を減少または消失させる目的で対象に施される。「治療的活性」とは、病状、疾患、または障害の徴候または症状を、そのような徴候または症状に苦しんでいる対象に投与された場合に消失または減少させる、核酸、ベクター、遺伝子、ポリペプチド、タンパク質、物質、またはそれらの組成物などの作用物質の活性である。「治療的に有用な」作用物質または化合物(例えば、核酸またはポリペプチド)とは、作用物質または化合物が、病状、疾患、または障害のそのような徴候または症状を減少、治療、または消失させる際に有用であることを示す。
【００５７】
一般に、以下で使用する学名および下記に説明する細胞培養、分子遺伝学、分子生物学、核酸化学、およびタンパク質化学における実験手順は、当業者に周知であり、一般に使用されるものである。標準的技術、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3nd Ed.), Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2001 (以下、「Sambrook」)およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, John Wiley & Sons, Inc. (2010年に改訂)(以下、「Ausubel」)で説明されているものが、組換え核酸法、核酸合成、細胞培養法、および導入遺伝子組込み、例えば、エレクトロポレーション、インジェクション、遺伝子銃、皮膚を介した導入(impressing through the skin)、およびリポフェクションのために使用される。一般に、オリゴヌクレオチドの合成工程および精製工程は規格に従って実施される。一般に、それらの技術および手順は、当技術分野および本文書の全体を通して提供される様々な一般的参考文献における従来の方法に従って実施される。その中の手順は、当業者に周知であると考えられており、読者の利便性のために提供される。
【００５８】
一般に、「スクリーニング」という用語は、本発明の最適な分子、例えば、本発明のポリペプチドなど、およびそのような分子をコードする核酸を同定するプロセスを説明する。これらの各分子のいくつかの特性を、スクリーニングにおいて使用することができる。例えば、試験システムまたはインビトロ適用、エクスビボ適用、もしくはインビボ適用において、分子がリガンドまたは受容体に結合する能力、細胞増殖を阻害する能力、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製を阻害する能力、細胞サイトカイン産生を誘導または阻害する能力、免疫応答を変化させる(例えば、所望の免疫応答を誘導または阻害する)能力である。抗原の場合、抗原の発現、フォールディング、安定性、免疫原性、およびいくつかの関連抗原に由来するエピトープの存在を含む、抗原のいくつかの特性を選択およびスクリーニングにおいて使用することができる。
【００５９】
「選択」とは、同定および物理的分離が同時に実現される、スクリーニングの一形態である。選択の1つの様式は、遺伝的選択であり、これは、例えば、選択マーカーの発現によって遂行することができる。選択マーカーにより、一部の状況において、他の細胞は死滅するが、そのマーカーを発現する細胞が生き残ることが可能になる(または逆の場合も同じ)。選択マーカーには、薬物耐性遺伝子および毒素耐性遺伝子などが含まれる。スクリーニングマーカーには、例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、および緑色蛍光タンパク質などが含まれる。別の様式の選択は、受容体へのリガンドの結合、基質と酵素の反応、または直接的に(例えば、発色性/蛍光発生性の基質もしくはリガンドを利用することによって)もしくは間接的に(例えば、発色性/蛍光発生性の二次抗体もしくは発色性/蛍光発生性のリガンドと反応させることによって)検出可能なシグナルを生じることができる他の任意の物理的プロセスなど、検出可能な事象に基づいた物理的選別を伴う。
【００６０】
物理的選別による選択は、例えば、全細胞形式または微小滴形式のフローサイトメトリーなどの様々な方法によって遂行することができる。例えば、ライブラリーを表面提示ベクター中にサブクローニングして、細胞表面でのポリペプチドの発現を可能にすることができる。次いで、表面で発現されたポリペプチドのライブラリーから、フローサイトメトリーを用いて、受容体に結合するポリペプチドを予め濃縮することができる。例えば、受容体に結合した場合に受容体と表面に提示されたポリペプチドとの相互作用の寄与により細胞を間接的に標識する、蛍光標識された抗受容体抗体を用いて、受容体に結合するポリペプチドを提示する細胞を検出することができる。次いで、受容体に結合する発現されフォールディングされたポリペプチドをコードするメンバーをライブラリーから予め濃縮するフローサイトメトリーによって、この様式で蛍光標識された細胞を選別することができる。次いで、受容体結合物を予め濃縮したライブラリーを、参照ポリペプチドと比べて受容体に強固に結合し、かつ/または受容体からの解離速度が遅いポリペプチドをコードするメンバーをさらに濃縮するための競合アッセイ法を用いた選択に供することができる。このアプローチにおいて、受容体は、細胞表面でポリペプチドを発現する細胞集団に添加される。これらの細胞は洗浄され、次いで、参照ポリペプチドが添加される。参照ポリペプチドの存在下で、徐々に長くなる期間に渡って受容体に結合したままである表面提示ポリペプチドを選択するために、様々な期間の後にフローサイトメトリーによって細胞集団を選別する。この様式で選択される細胞集団は、同族受容体への結合がより強固であるポリペプチドをコードするライブラリーメンバーが濃縮されていることが予想され、強固な受容体結合に関連した活性を有するポリペプチドの単離および同定が可能になる。
【００６１】
本明細書および特許請求の範囲において、例えば、非ポリペプチド成分、アミノ酸残基、置換、緩衝液などの文脈において、「1つの(a)」構成要素への任意の言及は、別段の記載が無い限り、またはそうではないことが特定の文脈から明らかである場合を除いて、1つまたは複数のそのような構成要素に言及すると意図される。例えば、「A、B、およびCより選択される構成要素」という表現は、A、B、およびCのあらゆる組合せ、例えば、A、B、C、A+B、A+C、B+C、またはA+B+Cを含むと意図される。
【００６２】
その他の様々な用語は、本明細書において定義されるか、またはそうでなければ特徴決定される。
【００６３】
本発明の分子および方法
本発明は、VLA4結合活性を示す組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドならびにその融合タンパク質および結合体を提供する。このような2D-VCAM-1変異体ポリペプチドならびにその融合タンパク質および結合体は、VLA4への天然VCAM-1の結合を阻害する(に拮抗する)際に有用であり得る。
【００６４】
本発明は、特定の理論の根本的メカニズムによって限定されるものではないが、本明細書においてより詳細に説明するものなどの代理アッセイシステムにおけるVLA4結合活性は、例えば、対象において天然VCAM-1への天然VLA4の結合を阻害する際の、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドならびにその融合タンパク質および結合体(ひとまとめにして「本発明の分子」とも呼ばれる)の有効性の予測に役立ち得ることが提唱されている。本発明の分子はVCAM-1:VLA4相互作用に拮抗する能力を有するため、VCAM-1へのVLA4の結合に関連した障害、疾患、または症状を予防または治療する際に有用となっている。このようなアンタゴニストは、細胞の活性化、遊走、増殖、および分化を含む細胞接着プロセスを阻害し得る。
【００６５】
2D-VCAM-1変異体ポリペプチド
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、例えば、実施例13の細胞ベースのアッセイ法において実証される通り、VLA4およびVCAM-1の結合を阻害する。VLA4は、炎症応答の鍵となる介在物質として関係付けられているため、VLA4:VCAM-1結合相互作用の阻害剤(「VLA4アンタゴニスト」とも呼ばれる)は、炎症の治療(すなわち、治療的処置または予防的処置)ならびに炎症性の疾患および障害に関連した病態の治療(すなわち、治療的処置または予防的処置)に有用な可能性がある。
【００６６】
1つの態様において、本発明は、0〜8個のアミノ酸位置においてSEQ ID NO: 18と異なり、かつSEQ ID NO: 18に関して34位のフェニルアラニンまたはチロシン(F34またはF34Y);SEQ ID NO: 18に関して37位のプロリン(P37);SEQ ID NO: 18に関して39位のロイシン(L39);およびSEQ ID NO: 18に関して74位のアルギニン(R74)からなる群より選択される少なくとも2個のアミノ酸残基を含む配列を含む組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドであって、ヒトVLA4(インテグリンα4β1)タンパク質に対するQ38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO:10)の結合親和性よりも大きい該ヒトVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを提供する。
【００６７】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、SEQ ID NO: 18に関する番号付けを用いて前述したアミノ酸残基の内の任意の2個、3個、または4個の組合せを有してよい。例示的な組合せには、P37+L39;P37+R74;F34+P37;F34+R74;P37+L39+R74;F34+L39+R74;F34+P37+L39;S34+P37+R74;S34+L39+R74;Y34+P37+L39;ならびに前述したアミノ酸残基の内の4個の組合せ、すなわち、F34+P37+L39+R74およびY34+P37+L39+R74が含まれ、アミノ酸位置の番号付けは、SEQ ID NO: 18に関する。
【００６８】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのポリペプチド配列は、SEQ ID NO: 18に関して34位のフェニルアラニン(F34)またはSEQ ID NO: 18に関して34位のチロシン(Y34)をしばしば含み、通常、SEQ ID NO: 18に関して34位のフェニルアラニン(F34)を含む。前述の配列特徴に加えて、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドはまた、SEQ ID NO: 18に関して32位のロイシン(L32)および/もしくはSEQ ID NO: 18に関して38位のロイシン(L38)ならびに/またはSEQ ID NO: 18に関して79位のセリン(S79)もしばしば含む。
【００６９】
前述の態様において、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、SEQ ID NO: 18に関して0〜7個、0〜6個、0〜5個、0〜4個、0〜3個、0〜2個、または0〜1個の位置において異なるアミノ酸配列を含んでよい。適切な置換には、L32F、F34S、L38Q、S41A、R74A/I/L/M/F/W/Y/V、S79K/R、L141F、D145A、およびR146Wが含まれる。
【００７０】
特定の態様において、組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、0〜8個のアミノ酸位置においてSEQ ID NO: 18と異なり、かつSEQ ID NO: 18に関して37位のアミノ酸プロリン(P37)および/または39位のアミノ酸ロイシン(L39)を含む配列を含む。典型的には、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、P37およびL39の両方を含む。一部のこのような2D-VCAM-1変異体ポリペプチドはまた、SEQ ID NO: 18に関して38位のロイシン(L38)も含む。本発明のこの局面によるいくつかの2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、SEQ ID NO: 18に関してL32F/S、F34S/Y、L38Q、S41A、R74T/A、S79K/R、L141F/W、D145A、およびR146Wより選択される1つまたは複数の置換を含む。
【００７１】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、0〜8個のアミノ酸位置においてSEQ ID NO: 12と異なり、かつSEQ ID NO: 12に関して37位のアミノ酸プロリン(P37)および39位のアミノ酸ロイシン(L39)を含む配列を含む、組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを含む。この態様において、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、SEQ ID NO:12に関して0〜7個、0〜6個、0〜5個、0〜4個、0〜3個、0〜2個、または0〜1個の位置において異なるアミノ酸配列を含んでよい。一部のこのような2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、SEQ ID NO:12に関して41位のアラニン(A41)も含む。本発明のこの局面によるいくつかの2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、SEQ ID NO:12に関してF32L/S、S34F/Y、Q38L、A41S、T74R/A、K79S/R、L141F/W、D145A、およびR146Wより選択される1つまたは複数の置換を含む。
【００７２】
SEQ ID NO: 12およびSEQ ID NO: 18に関して列挙した前述の具体的な置換に加えて、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、保存的置換をさらに含んでもよい。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸(アルギニン、リシン、およびヒスチジン)、酸性アミノ酸(グルタミン酸およびアスパラギン酸)、極性アミノ酸(グルタミンおよびアスパラギン)、疎水性アミノ酸(ロイシン、イソロイシン、およびバリン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン)、ならびに小型アミノ酸(グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、プロリン、システイン、およびメチオニン)のグループ内のものである。最も一般的に起こる交換は、Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、およびLeu/Val、ならびにこれらの逆である。
【００７３】
別の局面において、本発明は、ペプチド結合によって直接的に、またはリンカー(例えばリンカーペプチドなど)を介して間接的に連結されている第1のドメイン配列および第2のドメイン配列(それぞれ、本明細書において「ドメイン-1」および「ドメイン-2」とも呼ばれる)を有する組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを含む。ドメイン-1配列は、ヒト2D-VCAM-1のドメイン-1アミノ酸配列(SEQ ID NO: 2のアミノ酸1〜88)と2〜8個のアミノ酸位置において異なり(すなわち、2個の位置において、3個の位置において、4個の位置において、5個の位置において、6個の位置において、7個の位置において、または8個の位置において異なり)、SEQ ID NO: 2に関して置換T37PおよびI39Lを含む。変異体のドメイン-1配列は、SEQ ID NO: 2に関してF32L/S、S34F/Y、Q38L、S41A、T74R/A、およびK79S/Rより選択される、1つまたは複数のドメイン-1置換をさらに含んでもよい。変異体のドメイン-2配列は、ヒト2D-VCAM-1のドメイン-2アミノ酸配列(SEQ ID NO: 2のアミノ酸96〜199)と0〜3個のアミノ酸位置において異なり(すなわち、同じであるか、または1個の位置において、2個の位置において、もしくは3個の位置において異なり)、SEQ ID NO: 2に関してL141F、D145A、およびR146Wより選択される1つまたは複数のドメイン-2置換を任意で含む。本発明のこの局面によるいくつかのこのような2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、ドメイン-1配列およびドメイン-2配列を間接的に連結する、SEQ ID NO: 2のアミノ酸89〜95に対応するリンカーペプチドなどのリンカーペプチドを含む。
【００７４】
前述の1つまたは複数のドメイン-1置換に加えて、いくつかの本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、ヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)に関して、次の1つまたは複数のアミノ酸残基を含んでよい。36位のアルギニン(R36)、40位のアスパラギン酸(D40)、および42位のプロリン(P42)(アミノ酸位置は、SEQ ID NO: 2との最適アライメントに基づいて決定される)。一部のこのような本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、40位に少なくともアミノ酸残基アスパラギン酸(D40)を含む。例えば、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、D40ならびにR36およびP42の一方または両方と組み合わせて、上記に特定したドメイン-1置換の内の任意の1つまたは複数を含んでよい。例えば、いくつかの本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、SEQ ID NO: 2に関して残基R36、D40、およびP42ならびに置換T37PおよびI39Lを含み、かつSEQ ID NO: 2に関してドメイン-1置換F32L/S、S34F/Y、Q38L、S41A、T74R/A、およびK79S/Rの内の1つまたは複数をさらに含んでよい。
【００７５】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、VLA4タンパク質(インテグリンα4β1)、例えば、本明細書の実施例3で説明するヒトVLA4-Fc融合物などのヒトVLA4タンパク質に結合する。言い換えると、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、「VLA4結合活性を示す」。場合によっては、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、VLA4タンパク質に対するヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)の結合親和性よりも大きい、ヒトVLA4タンパク質、例えば、本明細書の実施例3で説明するヒトVLA4-Fc融合物などのVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する。いくつかのこのような本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、VLA4タンパク質に対するQ38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 10)の結合親和性よりも大きい、VLA4タンパク質に対する結合親和性を有する。
【００７６】
いくつかの本発明の2D-VCAM-1変異体配列は、次のモチーフの内の1つを含んでよい:RPQLDAP(SEQ ID NO: 7)またはRPLLDSP(SEQ ID NO: 8)。一般に、これらのモチーフ配列は、ヒト2D-VCAM-1配列(SEQ ID NO: 2)に関して、アミノ酸位置36〜42に、またはその付近に位置する。したがって、本発明はまた、最大10個のアミノ酸位置においてSEQ ID NO: 2と異なり、かつRPQLDAP(SEQ ID NO: 7)およびRPLLDSP(SEQ ID NO: 8)より選択されるモチーフを含む変異体配列を有する組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドも提供する。典型的には、上記のモチーフの内の1つを含むこのような2D-VCAM-1変異体ポリペプチド配列は、最大8個、最大6個、または最大4個のアミノ酸位置においてSEQ ID NO: 2と異なり、VLA4タンパク質に対するその結合親和性は、VLA4タンパク質に対するヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)の結合親和性よりも大きいか、または場合によっては、VLA4タンパク質に対するQ38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO:10)の結合親和性よりも大きい。
【００７７】
例示的な本発明の2D-VCAM-1変異体は、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 125、SEQ NO:127、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 161、およびSEQ ID NO: 163として本明細書において提供される。
【００７８】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、参照(または親)ポリペプチド配列、例えば、SEQ ID NO: 2または本明細書において提供される例示的な2D-VCAM-1変異体配列の内の1つ、例えばSEQ ID NO: 12もしくはSEQ ID NO: 18に関して、アミノ酸残基のさらなるアミノ酸置換、欠失、および/または挿入を含んでよい。このような2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、例えば、VLA4への結合を測定するための実施例10のELISAアッセイ法および/または実施例12のBIACOREアッセイ法と共に、変異誘発法および変異体ライブラリーを作製するための当技術分野において公知の他の方法を用いて、容易に同定することができる。
【００７９】
置換、欠失、および/または挿入に適した他の位置は、2D-VCAMのドメイン1およびドメイン2の間の天然リンカー中に位置する場合がある。SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基89〜95は、ヒト2D-VCAM-1のドメイン1およびドメイン2の間の天然リンカーペプチドを形成する。いくつかの本発明の2D-VCAM-1変異体は、変異体ポリペプチドのドメイン-1配列およびドメイン-2配列を間接的に連結するこのリンカー(SEQ ID NO: 2の残基89〜95に対応する)を含む。本発明はまた、ドメイン-1およびドメイン-2を結合させるため、ならびに2D-VCAM-1変異体-Fc融合ポリペプチドにおいて2D-VCAM-1変異体ポリペプチドをFc領域と結合させるための、このリンカーおよび他の適切なリンカーの使用も企図する。他の適切なリンカーには、20種の天然のアミノ酸(すなわち、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、およびVal)のいずれか、または当技術分野において公知の非天然のアミノ酸、ならびにそれらの組合せから構成されるリンカーが含まれる。ポリペプチドを連結して新規の融合ポリペプチドにするための、天然のアミノ酸残基または非天然のアミノ酸残基のいずれかから構成されたリンカーの使用は、当技術分野において周知であり、参照によりそれぞれ本明細書に組み入れられる次の参考文献において報告されている:Hallewell, et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:5260-5268; Alfthan, et al. (1995) Protein Eng. 8:725-731; Robinson and Suer (1996) Biochemistry 35:109-116; Khandekar, et al. (1997) J. Biol. Chem., 272:32190-32197; Fares, et al. (1998) Endocrinology 139:2459-2464; Smallshaw et al. (1999) Protein Eng. 12:623-630; および米国特許第5,856,456号。また、リンカーペプチドの使用は、軽鎖(VL)および重鎖(VH)の可変領域がリンカーペプチドを介して連結されている単鎖抗体の作製においても実証されている。広く使用されているリンカーペプチドは、Gly-Gly-Gly-Gly-Serアミノ酸配列の繰り返し3回からなる15量体である((Gly4Ser)3; SEQ ID NO:25)。適切なリンカー配列を多様化し選択するために、ファージ提示技術が使用されている(両方とも参照により本明細書に組み入れられる、Tang, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:15682-15686; Hennecke, et al. (1998) Protein Eng. 11:405-410)。
【００８０】
いくつかの態様において、ドメイン-1配列およびドメイン-2配列を間接的に連結するリンカーペプチドは、少なくとも50％のグリシン残基、場合によっては、少なくとも75％のグリシン残基を含んでよい。リンカーペプチドはまた、グリシン残基のみから構成されてもよい。例えば、リンカーは、1〜20個のグリシン残基、2〜16個のグリシン残基、3〜15個のグリシン残基、4〜12個のグリシン残基、または5〜10個のグリシン残基を含んでよい。グリシン残基のほかに、リンカーは、他の残基、特にSer、Ala、およびThrからなる群より選択される残基を含んでもよい。本発明の2D-VCAM-1変異体において使用されるリンカーペプチドは、その配列中にグリシン残基およびセリン残基のみを含んでもよい。例えば、リンカーペプチドは、(Gly3Ser)nの形態(nは1〜5(両端の数値を含む)または1〜3(両端の数値を含む)である)であってよい。グリシン残基およびセリン残基のみを有する他の適切なリンカーペプチドは、(Gly4Ser)nの形態(nは1〜4(両端の数値を含む)または1〜3(両端の数値を含む)である)であってよい。
【００８１】
他の適切なリンカーペプチドには、アミノ酸配列Glyx-Xaa-Glyy-Xaa-Glyz(各Xaaは、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、およびGluからなる群より独立に選択され、x、y、およびzは、それぞれ、1〜5(両端の数値を含む)の整数である)を有するものが含まれる。いくつかの態様において、各Xaaは、Ser、Ala、およびThrからなる群より独立に選択される。より具体的には、リンカーペプチドは、アミノ酸配列Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:26) を有し、各Xaaは、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp 、およびGluからなる群より独立に選択される。いくつかの態様において、各Xaaは、Ser、Ala、およびThrからなる群より独立に選択される。典型的には、XaaはSerである。
【００８２】
適切なリンカーペプチドには、リンカーペプチドのアミノ酸配列中に少なくとも1つのプロリン残基を含むものが含まれる。本発明の2D-VCAM-1変異体において使用するためのリンカーペプチドはまた、少なくとも1つのシステイン残基および/または少なくとも1つのリジン残基も含んでよい。したがって、本発明のいくつかの態様において、リンカーペプチドは、Gly、Ser、Ala、Thr、Cys、Lys、およびProからなる群より選択されるアミノ酸残基を含む。
【００８３】
インビボで投与された場合の2D-VCAM-1変異体に特徴的な血清半減期を変化させるために、他の配列改変を加えてもよい。例えば、グリコシル化部位またはPEG化部位を導入または除去するための配列改変を、本発明の2D-VCAM-1変異体に加えることができる。以下に、より詳細にこれを説明する。1つの態様において、本発明はまた、非ポリペプチド結合成分が共有結合し得るアミノ酸の置換、挿入、または欠失を伴う2D-VCAM-1変異体ポリペプチド配列も提供する。除去または導入するための具体的なアミノ酸は、除去または導入するための非ポリペプチド結合成分の性質に基づいて選択される。例えば、非ポリペプチド結合成分が、非ポリペプチドポリマー、例えば、適切な反応性官能基を用いて活性化されたポリエチレングリコール(PEG)などのポリアルキレンオキシド誘導体である場合、結合基は、システイン、リジン、N末端アミノ酸残基(すなわち、末端αアミノ基を介する)、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、もしくはアルギニン、またはそれらの2種もしくはそれ以上の任意の組合せでよい。リジンおよびシステインは、非ポリペプチド結合成分に結合させるための結合部位を付加または除去するという状況において導入または除去される典型的な結合基である。
【００８４】
本明細書において使用される場合、「非ポリペプチド結合成分」という用語は、非ポリペプチドポリマー成分、糖成分、または非ポリマー親油性成分を意味する。例示的な非ポリペプチド結合成分を、下記により詳細に説明する。非ポリペプチド結合成分が共有結合するアミノ酸残基は、本明細書において「結合基」と呼ばれる。非ポリペプチド結合成分は、結合基上の特定の結合部位と反応する。「結合部位」という用語は、結合反応に関与する特定の官能基を意味する。
【００８５】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの配列中にリジン反応性結合部位を導入するための(SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 12、またはSEQ ID NO: 18のいずれかに関する)例示的な置換には、R10K、R36K、R78K、R123K、R146K、R172K、R187K、ならびにそれらの任意の2種またはそれ以上の組合せが含まれる。本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド配列からリジン反応性結合部位を除去するための(特に言及される場合を除いて、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 12、またはSEQ ID NO: 18のいずれかに関する)例示的な置換には、K2R/Q、K46R/Q、K79R/Q(79位はSEQ ID NO: 18においてリジン反応性結合部位ではないことに留意されたい)、K82R/Q、K93R/Q、K107R/Q、K112R/Q、K130R/Q、K136R/Q、K147R/Q、K152R/Q、K167R/Q、ならびにそれらの任意の2種またはそれ以上の組合せが含まれる。例示的な非ポリペプチド結合成分を、下記により詳細に説明する。
【００８６】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、典型的には、長さが約190〜約230アミノ酸残基、より典型的には、長さが約185〜約210アミノ酸残基、例えば、長さが約190〜約205アミノ酸残基、一般に、長さが約195〜約200アミノ酸残基、しばしば、長さが約199アミノ酸残基である。
【００８７】
別の態様において、本発明は、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドである第1のポリペプチドと、2D-VCAM変異体ポリペプチドのN末端またはC末端のいずれかに融合されている第2のポリペプチドまたはペプチドとを含む、融合タンパク質を提供する。別の態様において、本発明は、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドである第1のポリペプチドと、該2D-VCAM変異体ポリペプチドのN末端に融合されている第2のポリペプチドまたはペプチドと、該2D-VCAM変異体ポリペプチドのC末端に融合されている第3のポリペプチドまたはペプチドとを含む融合タンパク質であって、該第2のポリペプチドまたはペプチドおよび該第3のポリペプチドまたはペプチドが同一であるかまたは異なっていてよい、融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質において使用するのに適したポリペプチドおよびペプチドには、例えば、延長された半減期およびターゲティングまたは精製のために望ましい場合があるVLA4以外の分子実体への結合などの望ましい特徴を2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに与えるものが含まれる。例示的な第2のポリペプチド/ペプチドおよび第3のポリペプチド/ペプチドには、例えば、ポリヒスチジンタグおよびその変異体、免疫グロブリンのFc領域の全体または一部分、ならびにヒト血清アルブミンなどが含まれる。
【００８８】
例えば、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、例えば、1〜5個もしくは1〜10個または1〜20個もしくは1〜30個のアミノ酸残基からなるタグペプチドまたはリンカーペプチドを含む融合タンパク質として発現されてよい。タグペプチドまたはリンカーペプチドは、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのN末端またはC末端に結合(すなわち、融合)されてよい。タグペプチドまたはリンカーペプチドは、例えば、ポリペプチドの精製を容易にするように設計することができ、または非ポリペプチドポリマー成分への結合を容易にすることができる(下記により詳細に説明する)。いくつかの適切なタグが、例えば、Unizyme Laboratories(Denmark)から市販されている。例示的なタグには、以下が含まれる。
2013528374.tif 000003
;参照により本明細書に組み入れられるEvan, G.I. et al., Mol. Cell. Biol. 5:3610-16 (1985)によって説明されているC末端タグ)。その他の適切なリンカーペプチドは、ランダム変異誘発などの周知の変異誘発技術を用いて、本明細書または文献において説明されるリンカーペプチドを最適化することによって得ることができる。
【００８９】
別の例において、融合タンパク質は、免疫グロブリン(Ig)のFc領域の一部分または全体に直接的にまたはリンカーを介して間接的に連結されている本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを含む、2D-VCAM-1変異体-Fc融合ポリペプチドでもよい。本発明の実践において使用するのに適したFc領域には、抗体アイソタイプIgG、IgA、もしくはIgDの重鎖の第2定常ドメインおよび第3定常ドメイン(すなわちCH2およびCH3)、またはIgMもしくはIgEの重鎖の第2、第3、および/もしくは第4定常ドメイン(すなわちCH2、CH3、およびCH4)の一部分もしくは全部が含まれる。適切なリンカーには、下記により詳細に説明するものが含まれる。実施例22は、本発明の2D-VCAM-1変異体-Fc融合ポリペプチドの構築を例示する。
【００９０】
2D-VCAM-1変異体の特性
いくつかの本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、実施例10のELISAアッセイ法によって測定されるように、VLA4タンパク質に対するヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)の結合親和性と比べて、VLA4タンパク質(例えばヒトVLA4-Fc)に対する結合親和性が大きい(すなわち、EC50値が小さい)。実施例10のアッセイ法において、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、典型的には、ヒトVLA4-Fcに対するヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)の親和性と比べて、少なくとも5倍、例えば、少なくとも10倍大きい親和性をヒトVLA4-Fcに対して示す。いくつかのこのような本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、実施例10のアッセイ法において、ヒトVLA4-Fcに対するヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)の親和性と比べて、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍、少なくとも300倍、最高で500倍大きい親和性をヒトVLA4-Fcに対して示す。
【００９１】
いくつかの本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドはまた、実施例10のELISAアッセイ法および/または実施例12のBIACOREアッセイ法のいずれかによって測定されるように、VLA4タンパク質に対するQ38L-2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 10)の結合親和性と比べて、VLA4タンパク質に対する結合親和性が少なくとも同等であるか、または典型的には大きい。実施例10のアッセイ法において、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、典型的には、ヒトVLA4-Fcに対するQ38L-2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 10)の親和性と比べて、少なくとも2倍大きい親和性をヒトVLA4-Fcに対して示す。より典型的には、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、実施例10のアッセイ法において、Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 10)の親和性と比べて、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、最高で50倍大きい親和性をヒトVLA4-Fcに対して示す。
【００９２】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、より大きいまたはより小さい結合親和性をLPAM-1タンパク質(インテグリンα4β7)に対して示す。すなわち、VLA4/LPAM-1結合親和性比率が、それぞれ1より大きいか、または1未満である。本発明のある種の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、実施例11のELISAアッセイ法で測定されるように、ヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)の結合親和性またはQ38L-2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 10)の結合親和性と比べて、より大きいまたはより小さい結合親和性をLPAM-1タンパク質(インテグリンα4β7)に対して示す。組換えモノクローナル抗体ナタリズマブ(タイサブリ(登録商標))および野生型ヒトVCAM-1と同様に、いくつかの本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、ヒトVLA4(α4β1)およびLPAM-1(α4β7)の両方に対して結合活性を示す。
【００９３】
したがって、いくつかの本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチドと比べて、より大きい結合親和性をLPAM-1タンパク質に対して示す。典型的には、このような変異体は、実施例11のアッセイ法において、Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 10)の親和性と比べて、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、最高で50倍大きい親和性をLPAM-1タンパク質に対して示す。
【００９４】
さらに、いくつかの本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、ヒト2D-VCAM-1ポリペプチドまたはQ38L-2D-VCAM-1ポリペプチドの結合親和性と比べて、同等または小さい結合親和性をLPAM-1タンパク質に対して示す。典型的には、このような変異体は、実施例11のアッセイ法において、Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 10)の結合改善と比べて、2倍未満の結合改善をLPAM-1-Fcに対して示す。より典型的には、このような2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、実施例11のアッセイ法において、Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 10)の結合改善と比べて、1.5倍未満、1倍未満、0.5倍未満、0.2倍未満、0.1倍までの結合改善をLPAM-1-Fcに対して示す。
【００９５】
いくつかの本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのVLA4タンパク質(例えばヒトVLA4-Fc)に対する平衡解離定数(KD)は、ヒト2D-VCAM-1の平衡解離定数よりも小さい。言い換えると、いくつかの2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、例えば、実施例12の動態学的結合アッセイ法によって測定されるように、ヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)の結合親和性よりも大きい、VLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、。実施例12のアッセイ法において、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、典型的には、ヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)より少なくとも5倍大きい親和性をVLA4-Fcに対して示す。より典型的には、それらは、実施例12のアッセイ法において、ヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)の結合親和性と比べて、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍、少なくとも300倍、少なくとも400倍、最高で500倍大きい結合親和性をVLA4-Fcに対して示す。
【００９６】
いくつかの本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、VLA4タンパク質、例えばVLA4-Fcに対する結合親和性が、Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 10)の結合親和性とほぼ等しいか、または典型的にはそれより大きい。いくつかのこのような本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、実施例12のアッセイ法において、Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 10)の結合親和性より、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも30倍、少なくとも35倍、少なくとも40倍、最高で50倍大きい結合親和性をVLA4-Fcに対して示す。
【００９７】
本発明のある種の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、野生型2D-VCAM-1の結合親和性よりも大きい結合親和性をLPAM-1タンパク質(α4β7)、例えばLPAM-1-Fcに対して示す。このような変異体は、典型的には、実施例12のアッセイ法において、ヒト2D-VCAM-1 (SEQ ID NO: 2)よりも、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍、少なくとも300倍、少なくとも400倍、最高で500倍大きい結合親和性をLPAM-1-Fcに対して示す。
【００９８】
本発明の他の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、野生型2D-VCAM-1またはQ38L-2D-VCAM-1の結合親和性と比べて、ほぼ等しい結合親和性または小さい結合親和性をLPAM-1タンパク質(α4β7)、例えばLPAM-1-Fcに対して示す。典型的には、このような変異体は、実施例12のアッセイ法において、Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチドの結合親和性と比べて2倍未満の大きさの結合親和性をLPAM-1-Fc に対して示す。より典型的には、このような2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、実施例12のアッセイ法において、Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 10)の結合親和性と比べて、約1.5倍未満、約1倍未満、約0.5倍未満、約0.2倍未満、約0.1倍までの大きさの結合親和性をLPAM-1-Fcに対して示す。
【００９９】
さらに、実施例12で示した通り、いくつかの本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、ヒト2D-VCAM-1またはQ38L-2D-VCAM-1によって示されるVLA4/LPAM-1結合親和性比率のものよりも大きい、VLA4/LPAM-1結合親和性比率を示す。言い換えると、いくつかの本発明の変異体は、ヒト2D-VCAM-1またはQ38L-2D-VCAM-1のいずれかのVLA4対LPAM-1の相対的結合親和性と比べた場合、LPAM-1(α4β7)タンパク質に対する結合親和性よりもVLA4(α4β1)タンパク質に対する結合親和性においてより大きい改善を示す。ヒト2D-VCAM-1またはQ38L-2D-VCAM-1の結合親和性比率と比べて高いVLA4/LPAM-1結合親和性比率を有する2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、LPAM-1結合が望ましくない場合、例えば、LPAM-1結合が、進行性多巣性白質脳症(PML)などの有害な副作用と相関している場合、特に有利であり得る。
【０１００】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、図14および図15に示す通り、不活性VLA4と比べた場合、活性化VLA4に対して優先的な結合を示すことが実証されている。対応する実験は、下記の実施例21で説明する。背景技術のセクションで説明した通り、他のインテグリン受容体と同様に、VLA4は、低親和性の立体構造状態(または不活性状態)および高親和性の立体構造状態(または活性化状態)の両方で存在する。低親和性状態から高親和性状態への移行は、リガンドに対するVLA4およびLPAM-1の親和性を増大させる、マグネシウム(Mg2+)およびマンガン(Mn2+)などの二価陽イオンの結合に次いで起こるインテグリン受容体の立体構造変化に起因する。図14に示す通り、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド(SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、およびSEQ ID NO: 18によって示される)は、不活性VLA4と比べた場合、活性化VLA4に対してより強い結合を示す。また、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、野生型2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)および/またはQ38L-2D-VCAM-1変異体(SEQ ID NO: 10)と比べて、活性化VLA4に対してより強い結合を示す。
【０１０１】
図15は、VLA4活性化状態がクローン146(SEQ ID NO: 18)の結合に与える影響を示す。この図から、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは活性化VLA4に結合するが、活性化されていないVLA4には強固に結合しないことが裏付けられる。このように2D-VCAM-1ポリペプチドが活性化VLA4を優先するため、疾患に関連する活性化受容体を選択的にブロックすることができ、無関係なインテグリン受容体に結合する潜在的なポリペプチドプールを減少させることができる。また、関連するVLA4受容体を選択的にターゲティングすることによって、免疫を過剰に抑制することなく疾患を予防することを可能にする2D-VCAM-1変異体ポリペプチド最適用量レベルを与えることができる。したがって、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、活性化VLA4および非活性化VLA4に同様に良く結合するナタリズマブなどの他のα4β1アンタゴニストと比べて、例えばJCウイルスによる日和見性感染症およびそのような感染症によって引き起こされる疾患、例えばPMLのリスク低減を実現する際に有益であり得る。
【０１０２】
実施例19Aおよび19Bで実証される通り、哺乳動物に投与される場合、本発明の変異体ポリペプチドは、末梢血リンパ球上のα4インテグリンおよびβ1インテグリンの表面発現を下方調節しないと思われる。実施例19Aにおいて、ペグ化型のクローン146(SEQ NO:18)(「PEG50-146」)、ラット抗マウスα4インテグリンモノクローナル抗体PS/2、またはリン酸緩衝液溶液(PBS)のいずれかを雌Balb/cマウスに皮下注射した。マウスから採取した全血を、B220+細胞上のα4インテグリンレベルおよびβ1インテグリンレベルについて解析した。これらの結果を図10に示す。PS/2処置マウスにおいてa4インテグリンの細胞表面レベルの上昇が観察されたのとは対照的に、PEG50-146処置マウスにおいては□4インテグリンの細胞表面レベルは、不変のようであった。同様の結果が、b1インテグリンレベルに関しても得られた(表12)。実施例19Bにおいて、PEG50-146またはヒト化抗α4インテグリンモノクローナル抗体ナタリズマブのいずれかを雄カニクイザルに皮下注射した。サルから採取した全血を、CD20+末梢B細胞およびCD3+末梢T細胞上のα4インテグリン細胞表面レベルおよびβ1インテグリン細胞表面レベルについて解析した。図11Aに示す通り、PEG50-146変異体と比べて、ナタリズマブで処置したサルにおいて、CD49d+B細胞の百分率が有意に減少していた。図11Bに示す通り、PEG50-146変異体で処置したサルと比べて、ナタリズマブで処置したサルにおいて、CD49d+であるT細胞の同様の減少が観察された。図12Aおよび図12Bに示す通り、PEG50-146変異体と比べて、ナタリズマブで処置したサルにおいて、CD29+B細胞およびCD29+T細胞の百分率もまた、それぞれ有意に減少していた。
【０１０３】
したがって、さらなる態様において、本発明は、実施例19におけるアッセイ法を用いて未処置の対照哺乳動物と比べると、哺乳動物(ヒトまたは非ヒト哺乳動物)に投与された場合に末梢血中のCD49d+ B細胞およびCD29+ B細胞ならびにCD49d+ T細胞およびCD29+ T細胞の百分率における減少を誘導しない2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを提供する。理論に拘束されることを望むものではないが、インビボで投与された場合に末梢血リンパ球上のα4インテグリンおよびβ1インテグリンの表面発現の減少を誘導しない変異体の特性は、これらの接着分子に依存した免疫学的活性に対して強い影響を示し得ると考えられている。これらの活性には、免疫監視および炎症部位への免疫細胞の遊走が含まれる。このように接着細胞の表面発現に対する影響力を欠く結果、免疫監視、免疫細胞トラフィッキング、免疫ホメオスタシス、およびJCウイルスによって引き起こされる感染症などの日和見性感染症のリスクに対する影響が小さくなって、細胞接着分子の細胞表面発現に影響を及ぼす他のVLA4アンタゴニストと比べてPMLの全体的リスクが低くなり得る。
【０１０４】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを含むタンパク質融合物および結合体もまた、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに対して前述の特性を示すと考えられている。上記および下記の実施例で説明する本発明の分子に関して観察される特性を考慮して、本発明の分子は、他のVLA4アンタゴニストに関連付けられているPMLのリスクの低下を伴う、炎症性疾患または炎症性障害の治療的または予防的な処置として有益であり得ると考えられている。
【０１０５】
具体的には説明しない、本明細書において説明する特性を有する2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、下記の「本発明のポリペプチド」という題のセクションおよび実施例において説明するアッセイ法において説明される通り、変異誘発を加味した本明細書において先に提供された鍵となるアミノ酸残基の情報に基づいて容易に同定することができる。
【０１０６】
本発明のポリヌクレオチド
本発明は、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドおよび前述のそのタンパク質融合物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明の例示的なポリヌクレオチドには、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 160、およびSEQ ID NO: 162が含まれる。これらのポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 161、およびSEQ ID NO: 163にそれぞれ対応する本発明の例示的なポリペプチドをコードする。
【０１０７】
当業者は、遺伝コードの縮重のために、本発明の2D-VCAM-1変異体をコードする多数のポリヌクレオチド配列が存在することを容易に理解するであろう。表1は、各アミノ酸の同義コドンを提供するコドン表である。例えば、コドンAGA、AGG、CGA、CGC、CGG、およびCGUはすべて、アミノ酸アルギニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定されている本発明のポリヌクレオチド中のすべての位置において、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変更することなく、前述の対応するコドンのいずれかに変更することができる。RNA配列中のUはDNA配列中のTに対応することが理解される。
【０１０８】
（表１）コドン表
2013528374.tif 000004
【０１０９】
このような「サイレント変種(variation)」は、「保存的」変種の一種である。当業者は、ポリヌクレオチド配列中の各コドン(通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるUGG以外)を、標準的な技術によって、機能的に同一なポリペプチドをコードするように改変できることを認識するであろう。したがって、あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの各サイレント変種は、説明した任意の配列に潜在的に含まれる。本発明は、可能なコドン選択に基づいて組合せを選択することによって作製できる、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の存在し得る各変種およびすべての変種を企図し、提供する。これらの組合せは、本発明のポリヌクレオチド配列に適用される際、標準的なトリプレット遺伝コード(表1に説明した)に従って作られる。
【０１１０】
同じ環境で翻訳された場合に同じアミノ酸をいずれもコードする2種またはそれ以上の異なるコドンのグループは、本明細書において「同義コドン」と呼ばれる。本発明の2D-VCAM-1変異体は、所望の宿主生物の最適コドン使用に従うようにポリヌクレオチドを改変することによって、特定の宿主生物における発現のためにコドン最適化することができる。当業者は、多様な生物についての優先情報を提供する表および他の参考文献が容易に入手可能であることを認識するであろう。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Henaut and Danchin, "Escherichia coli and Salmonella," Neidhardt, et al. Eds., ASM Press, Washington D.C. (1996), pp. 2047-2066を参照されたい。特定の宿主生物による発現用に最適化されたポリヌクレオチドの例はSEQ ID NO: 55であり、これは、大腸菌(E. coli)用に最適化したヒト2D-VCAM-1ポリヌクレオチド配列である。ヒト2D-VCAM-1ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 1として提供される。
【０１１１】
「保存的に改変された変種」および「保存的変種」という用語は本明細書において同義的に使用され、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを意味するか、またはポリヌクレオチドがコード配列でない状況において、この用語は、同一であるポリヌクレオチドを意味する。コードされる配列中の単一のアミノ酸またはわずかな百分率のアミノ酸を変化させるか、付加するか、または欠失させる個々の置換、欠失、または付加は、その変化が次の内の1つまたは複数をもたらす場合、保存的に改変された変種とみなされることを当業者は認識する:アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換。複数のアミノ酸が影響を受ける場合、その百分率は、典型的には、コードされる配列の長さ全体のアミノ酸残基の5％未満、およびより典型的には2％未満である。互いに保存的置換であるとみなされるアミノ酸を提供する参考文献は、当技術分野において周知である。
【０１１２】
本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法を用いて調製することができる。典型的には、最長約50〜120塩基のオリゴヌクレオチドを個々に合成し、次いで、(例えば、酵素的連結方法もしくは化学的連結方法、またはポリメラーゼを媒介とした方法によって)連結して、本質的に任意の所望の連続的配列を形成させる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、Beaucage, et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-69によって説明されている古典的なホスホラミダイト法、またはMatthes, et al. (1984) EMBO J. 3:801-05によって説明されている方法(文献は両方とも参照により本明細書に組み入れられる)を用いて化学合成によって調製することができる。ホスホラミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドは合成され、精製され、アニールされ、連結され、適切なベクター中にクローニングされる。さらに、本質的に任意のオリゴヌクレオチドは、例えば、The Midland Certified Reagent Company(Midland, TX)、The Great American Gene Company(Ramona, CA)、ExpressGen Inc.(Chicago, IL)、および他社など様々な商業的供給業者のいずれかによって受注製作され得る。
【０１１３】
ポリヌクレオチドはまた、例えば、両方とも参照により本明細書に組み入れられるCarruthers, et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 47:411-418 (1982)およびAdams, et al., J. Am. Chem. Soc. 105:661 (1983)において説明されている周知の技術によっても合成され得る。その場合、相補鎖を合成し、適切な条件下でそれらの鎖を一緒にアニールすることによるか、または適切なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応において相補鎖を作製することによって、二本鎖DNA断片を得ることができる。
【０１１４】
本明細書において具体的に説明しない2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、変異体ライブラリーを作製するための公知の方法を用い、続いて、例えば、実施例6または実施例7のアッセイ方法を用いてVLA4結合活性を検出するためのスクリーニングを行うことによって、容易に同定することができる。変異体ライブラリーを作製するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、変異誘発法および定向進化法をポリヌクレオチド(例えば、本明細書において説明する、ヒト2D-VCAM-1をコードするポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO: 1)または本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかなど)に容易に適用して、本明細書において説明する方法を用いて発現させ、スクリーニングし、かつ分析できる変異体ライブラリーを作製することができる。変異誘発法および定向進化法は、当技術分野において周知である。例えば、Ling, et al., "Approaches to DNA mutagenesis: an overview," Anal. Biochem., 254(2):157-78 (1997); Dale, et al., "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method," Methods Mol. Biol., 57:369-74 (1996); Smith, "In vitro mutagenesis," Ann. Rev. Genet., 19:423-462 (1985); Botstein, et al., "Strategies and applications of in vitro mutagenesis," Science, 229:1193-1201 (1985); Carter, "Site-directed mutagenesis," Biochem. J., 237:1-7 (1986); Kramer, et al., "Point Mismatch Repair," Cell, 38:879-887 (1984); Wells, et al., "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites," Gene, 34:315-323 (1985); Minshull, et al., "Protein evolution by molecular breeding," Current Opinion in Chemical Biology, 3:284-290 (1999); Christians, et al., "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling," Nature Biotechnology, 17:259-264 (1999); Crameri, et al., "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution," Nature, 391:288-291; Crameri, et al., "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling," Nature Biotechnology, 15:436-438 (1997); Zhang, et al., "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening," Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 94:45-4-4509; Crameri, et al., "Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling," Nature Biotechnology, 14:315-319 (1996); Stemmer, "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling," Nature, 370:389-391 (1994); Stemmer, "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution," Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 91:10747-10751 (1994); WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651;およびWO 01/75767を参照されたい。これらの文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１５】
ベクターの使用、プロモーター、および他の多くの関連する題目を含む、本明細書において有用な分子生物学的技術を説明する一般的教科書には、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA ("Berger"); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2001 (「Sambrook」)、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., Eds., Current Protocols, John Wiley & Sons, Inc. (2010年に補遺が加えられた)(「Ausubel」)が含まれ、これらの文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Qβ-レプリカーゼ増幅、およびRNAポリメラーゼを介した他の技術(例えばNASBA)を含むインビトロの増幅法を通じて当業者に指導するのに十分なプロトコールの例は、Berger、Sambrook、およびAusubel、ならびにMullis, et al. (1987) 米国特許第4,683,202号; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al., eds.) Academic Press Inc., San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim and Levinson ( October 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal of NIH Research (1991) 3:81-94; Kwoh, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173; Guatelli, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874; Lomell, et al. (1989) J. Clin. Chem. 35:1826; Landegren, et al. (1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt (1990) i 8:291-294; Wu and Wallace (1989) Gene 4:560; Barringer, et al. (1990) Gene 89:117、およびSooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13:563-564において見出され、これらの文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。インビトロで増幅された核酸をクローニングするための改良された方法は、参照により本明細書に組み入れられるWallace, et al., 米国特許第5,426,039号において説明されている。PCRによって大型核酸を増幅するための改良された方法は、参照により本明細書に組み入れられるCheng, et al. (1994) Nature 369:684-685において要約されている。当業者は、参照により本明細書に組み入れられるAusubel、Sambrook、およびBergerの前記文献において説明されている通りに逆転写酵素およびポリメラーゼを用いることにより、本質的に任意のRNAを、制限消化、PCR伸張、および配列決定に適した二重鎖DNAに変換できることを容易に理解するであろう。
【０１１６】
ベクター、プロモーター、および発現システム
本発明はまた、前述の本発明の2D-VCAM-1変異体をコードするポリヌクレオチドの内の1つまたは複数を含む組換え構築物も含む。「構築物」または「核酸構築物」という用語は、本明細書において、天然の遺伝子から単離されているか、または改変しなければ自然には存在しないと思われる様式で核酸のセグメントを含むように改変された、一重鎖または二重鎖いずれかの核酸を意味する。「核酸構築物」という用語は、核酸構築物が、本発明のポリヌクレオチド配列の発現に必要とされる制御配列を含む場合、「発現カセット」という用語と同義である。
【０１１７】
特定の態様において、本発明はまた、プロモーターに機能的に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。「発現ベクター」という用語は、本明細書において、転写を実現する付加的なセグメントに機能的に連結された本発明のポリペプチドをコードするセグメントを含む、直線状または環状のDNA分子を意味する。本明細書において使用される場合、「発現」という用語は、限定されるわけではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含む、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。
【０１１８】
本発明の核酸構築物は、典型的には、プロモーターなどの制御配列を含む。「制御配列」という用語は、本明細書において、本発明の2D-VCAM-1変異体の発現のために必要または有利である構成要素すべてを意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に固有のものまたは外来のものでよい。このような制御配列には、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれるが、それらに限定されるわけではない。最低でも、制御配列には、プロモーターならびに転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルが含まれる。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード配列との連結を容易にする、特異的制限部位を導入する付加的な配列と共に提供されてよい。
【０１１９】
「機能的に連結される」という用語は、本明細書において、制御配列がポリペプチドの発現を指示するように、制御配列がDNA配列のコード配列に関連する位置に適切に配置されている立体配置を意味する。
【０１２０】
本明細書において使用される場合、「コード配列」という用語は、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接的に指定するポリヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は、一般に、ATG開始コドンで通常始まるオープンリーディングフレームによって決定される。コード配列は、典型的には、DNA配列、cDNA配列、および/または組換えポリヌクレオチド配列を含む。
【０１２１】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において周知である様々な発現ベクターのいずれか1つに組み込むことができる。
【０１２２】
当技術分野において公知である原核細胞発現ベクターなどの、原核宿主細胞に適合する発現ベクターが使用され得る。これらには、例えば、BLUESCRIPTベクター(Stratagene)、T7発現ベクター(Invitrogen)、pETベクター(Novagen)、ならびにクローニングおよび発現用の多機能性大腸菌ベクターなどが含まれる。
【０１２３】
あるいは、当技術分野において公知である真核生物発現ベクターなどの、真核宿主細胞に適合する発現ベクターが使用され得る。これらには、例えば、pCMVベクター(例えばInvtrogen)、pIRESベクター(Clontech)、pSG5ベクター(Stratagene)、pCDNA3.1(Invitrogen Life Technologies)、pCDNA3(Invitrogen Life Technologies)、および遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE(商標))発現ベクター(Millipore)などが含まれる。
【０１２４】
適切なベクターには、染色体配列、非染色体配列、および合成DNA配列が含まれる。例示的なベクターには、細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、例えば細菌プラスミドまたは酵母プラスミドなどのプラスミド、コスミド、ファージ、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスなどのウイルスDNA由来のベクター、ならびにプラスミドとファージDNAの組合せに由来するベクターが含まれる。遺伝物質を細胞中に伝達し、かつ複製が望ましい場合には、関連する宿主において複製可能かつ生存可能である任意のベクターを使用することができる。
【０１２５】
発現ベクター中に組み込まれる場合、本発明のポリヌクレオチドは、例えばT5プロモーターなどの、mRNA合成を指示するための適切な転写制御配列(プロモーター)に機能的に連結される。原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが公知であり、かつ本発明のいくつかの態様において使用できる他のプロモーターには、SV40プロモーター、大腸菌lacプロモーターまたはtrpプロモーター、ファージλPLプロモーター、tacプロモーター、およびT7プロモーターなどが含まれる。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位およびPin IIなどの転写ターミネーターを任意で含む。また、ベクターは、例えばエンハンサーなどの発現を増幅するための適切な配列も任意で含む。
【０１２６】
さらに、本発明の発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型形質を提供するために1種または複数種の選択マーカー遺伝子を任意で含む。適切なマーカー遺伝子には、抗生物質スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンに対する耐性をコードするもの(例えばaada遺伝子)、ストレプトマイシン耐性をコードするストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ(SPT)遺伝子、カナマイシン耐性またはジェネテシン耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NPTII)遺伝子、ハイグロマイシン耐性をコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HPT)遺伝子が含まれる。その他の選択マーカー遺伝子には、真核細胞培養の場合のジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、および大腸菌の場合のテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性が含まれる。
【０１２７】
本発明のベクターを使用して、適切な宿主を形質転換して、本明細書において説明する2D-VCAM-1変異体を宿主が発現するのを可能にすることができる。適切な発現宿主の例には、「発現宿主」という題のセクションにおいて下記に説明するものが含まれる。
【０１２８】
本発明の2D-VCAM-1変異体をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、細胞の所望の細胞区画、膜、もしくは細胞小器官にポリペプチド発現を導くため、またはポリペプチド分泌を細胞周辺腔もしくは細胞培養培地中へと方向付けるために、分泌配列/局在化配列をコードする核酸にインフレームで融合させることもできる。このような配列は当業者に公知であり、分泌リーダーペプチド、細胞小器官標的配列(例えば、核局在化配列、小胞体(ER)保留シグナル、ミトコンドリア移行配列、葉緑体移行配列)、および膜局在化/アンカー配列(例えば、移動停止配列、GPIアンカー配列)などが含まれる。
【０１２９】
発現宿主
本発明はまた、本発明のベクターまたは構築物を用いて形質導入(形質転換またはトランスフェクト)される操作された宿主細胞、ならびに組換え技術によって本発明のポリペプチドを作製する方法も提供する。本明細書において使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の核酸構築物による形質転換を受け入れることができる任意の細胞型を意味する。したがって、本発明は、本明細書において前述した本発明の任意のポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞を含む。典型的には、ポリヌクレオチドは、宿主細胞のポリヌクレオチドの発現を実現する1つまたは複数のプロモーターおよび/またはエンハンサーに機能的に連結されている。
【０１３０】
単離された宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、もしくは植物細胞などの真核細胞(例えばCHO細胞)でよく、または宿主細胞は、細菌細胞(例えば、大腸菌、バチルス属種(Bacillus sp.)、およびストレプトマイセス属(Streptomyces)など)などの原核細胞でもよい。宿主細胞中への核酸構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストランを介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃もしくはワクチン銃、インジェクション、または他の一般的な技術によって実施することができる(例えば、インビボ、エクスビボ、またはインビトロの方法について、参照により本明細書に組み入れられるDavis, L., Dibner, M., and Battey, I. (1986) Basic Methods in Molecular Biologyを参照されたい)。
【０１３１】
宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する能力、または発現されたタンパク質を所望の様式でプロセシングする能力について任意で選択される。タンパク質のこのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、それらに限定されるわけではない。タンパク質の「プレ」型または「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングもまた、正確な挿入、フォールディング、および/または機能のために重要である場合がある。大腸菌細胞、バチルス属種細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞など異なる宿主細胞、例えば、CHO、HeLa、BHK、MDCK、HEK293、およびWI38などは、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、導入された外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。
【０１３２】
組換えタンパク質の長期的な高収率の作製のために、安定な発現を使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドを安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質導入される。ベクターの導入後、細胞は、選択培地に移す前に、強化培地中で1〜2日間、増殖させてよい。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、その存在により、導入された配列を成功裡に発現する細胞の増殖および回収が可能になる。例えば、安定に形質転換された細胞の耐性集団を、細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【０１３３】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養物からコードされるタンパク質を発現および回収するのに適した条件下で任意で培養される。組換え細胞によって産生されたポリペプチドは、使用される配列および/またはベクターに応じて、分泌されるか、膜に結合するか、または細胞内に含まれ得る。当業者には理解される通り、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜もしくは真核細胞膜を通って成熟ポリペプチドが分泌されるように指示するシグナル配列を含むように設計することができる。
【０１３４】
2D-VCAM-1変異体の作製および回収
別の態様において、本発明は、本発明の2D-VCAM-1変異体を作製する方法を提供し、この方法は、コードされるポリペプチドの発現に適した条件下で、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を培養する段階;および培地から、または形質転換され培養された宿主細胞から、ポリペプチドを回収する段階を含む。2D-VCAM-1変異体の作製および回収に使用される宿主細胞は、典型的には、植物または動物などの高等生物と比べて、単離された宿主細胞である。
【０１３５】
適切な宿主株に形質導入し、適切な細胞密度まで宿主株を増殖させた後、選択されたプロモーターを、例えば温度変化または化学的誘導などの適切な手段によって誘導し、細胞をさらに一定期間培養する。典型的には、細胞は遠心分離によって採取され、物理的手段または化学的手段によって破壊され、得られた粗製の抽出物が、さらなる精製のために確保される。タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用、または当業者に周知である他の方法を含む任意の簡便な方法によって破壊することができる。
【０１３６】
上述した通り、細菌、植物、動物(特に哺乳動物)、および古細菌(archebacterial)由来の細胞を含む多種類の細胞の培養および作製について、多くの参考文献が入手可能である。これらの参考文献には、Sambrook、Ausubel、およびBerger(前記)、ならびにFreshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York (およびその中で引用されている参考文献); Doyle and Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential Techniques John Wiley and Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, fourth edition, W.H. Freeman and Company;およびRicciardelli, et al. (1989) In vitro Cell Dev. Biol. 25:1016-1024が含まれ、これらはすべて、参照により本明細書に組み入れられる。植物細胞の培養および再生を説明する参考文献には、Payne, et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (Eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg, New York); Jones, Ed. (1984) Plant Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey、およびPlant Molecular Biology (1993) R.R.D. Croy, Ed. Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6が含まれ、これらはすべて、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３７】
一般的な細胞培養用培地は、参照により本明細書に組み入れられるAtlas and Parks (Eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FLにおいて説明されている。細胞培養についてのその他の情報は、両方とも参照により本明細書に組み入れられる、Sigma-Adrich, Inc. (St. Louis, MO)によるLife Science Research Cell Culture Catalogue (1998)ならびにSigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)によるThe Plant Culture Catalogueおよび補遺(1997)などの入手可能な商用文献において見出される。
【０１３８】
本発明の2D-VCAM-1変異体は、例えば、硫安沈殿または溶媒沈殿(例えば、エタノールおよびアセトンなどに似た溶媒を用いることによる)、酸抽出、イオン(陰イオンまたは陽イオン)交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーなどの当技術分野において周知であるいくつかの方法のいずれかによって、組換え細胞培養物から回収/単離し、任意で精製してよい。適切なタンパク質精製方法は、Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition,Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook, Humana Press, NJ; Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition, Wiley-VCH, NY;およびWalker (1998) Protein Protocols on CD-ROM, Humana Press, NJにおいて説明されており、これらはすべて、参照により本明細書に組み入れられる。典型的には、精製段階は、アルギニンを含む溶離液混合物を用いたクロマトグラフィー法による精製を含む。
【０１３９】
細菌に産生させた2D-VCAM-1変異体は、封入体(IB)を形成する場合があり、これは活性ポリペプチドを生成するためにさらなる加工段階を必要とする。このさらなる加工は、封入体の単離および可溶化、ポリペプチドのアンフォールディング、次いで、生物学的に活性である正しい三次構造へのポリペプチドのリフォールディングを伴う場合がある。本発明は、本発明のポリペプチドを作製する方法を提供し、該方法は、封入体としてのポリペプチドの発現に適した条件下で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を培養する段階;形質転換され培養された宿主細胞から、コードされるポリペプチドを含む封入体を回収する段階;ポリペプチドを含む回収された封入体を、可溶化剤を用いて可溶化する(変性させる)段階;可溶化されたポリペプチドを精製する段階;ポリペプチドをリフォールディングさせる段階;およびリフォールディングされたポリペプチドを精製する段階を含む。
【０１４０】
封入体は、典型的には、尿素などの溶媒中で可溶化される。リフォールディングは、例えば、希釈した尿素およびグルタチオンの溶液中で、可溶化されたポリペプチドをインキュベートすることによって達成することができる。
【０１４１】
ポリペプチド変異体結合体
本発明は、少なくとも1つの非ポリペプチド結合成分に共有結合している本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはその融合タンパク質を含む、ポリペプチド変異体結合体を提供する。典型的には、ポリペプチド変異体結合体は、1つまたは複数の非ポリペプチド結合成分に共有結合している本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを含む。
【０１４２】
本明細書において使用される場合、「非ポリペプチド結合成分」という用語は、非ポリペプチドポリマー、糖成分、または非ポリマー親油性成分を意味する。「非ポリペプチドポリマー」という用語は、本明細書において、ペプチドでもポリペプチドでもタンパク質でもない、天然ポリマーまたは合成ポリマー(ホモポリマー、コポリマー、およびターポリマーなど)でよい水溶性ポリマーを意味する。本明細書において使用される場合、「糖成分」という用語は、Nグリコシル化プロセスまたはOグリコシル化プロセスなどのインビボまたはインビトロのグリコシル化プロセスによって結合される炭水化物分子を意味する。
【０１４３】
典型的には、非ポリペプチド結合成分は、例えば、インビボでの血清半減期またはインビボでの機能的半減期、安定性、および免疫原性など2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの固有の特性を変化させるために選択される。本明細書において使用される場合、「インビボでの血清半減期」という用語は、関心対象の化合物の50％が、ラット、マウス、ウサギ、またはサルなどの非ヒト哺乳動物の血流中を循環するようになるまでの時間を意味する。「血清」という用語は、本明細書において、通常の意味、すなわち、フィブリノーゲンおよび他の凝固因子を含まない血漿を意味するために使用される。「インビボでの機能的半減期」という用語は、本明細書において、関心対象の化合物の生物活性の50％が体内もしくは標的器官において依然として存在する時間、または関心対象の化合物の活性が初期値の50％となるまでの時間を意味する。インビボでの機能的半減期は、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、またはサルなどの非ヒト哺乳動物において測定してもよい。インビボでの血清半減期およびインビボでの機能的半減期の両方を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはその結合体を非ヒト哺乳動物に投与し、既定の時間間隔で血液試料を採取してよい。例えば、抗VCAM-1抗体を用いたELISAアッセイ法によって、または可溶性VLA4タンパク質もしくは不溶性VLA4タンパク質の調製物を用いて分析すること(例えば、可溶性VLA4-Fcもしくは膜結合型VLA4への結合および複合体の存在の検出)によって、血液試料を2D-VCAM-1変異体レベルについて解析することができる。半減期は、時間に対する2D-VCAM-1変異体濃度のプロットから決定することができる。
【０１４４】
典型的には、本発明の2D-VCAM-1変異体結合体は、対応する非結合型2D-VCAM-1変異体ポリペプチドと比べて、より長いインビボでの機能的半減期および/またはより長い血清半減期を示す。これらの2D-VCAM-1変異体結合体は、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに結合された非ポリペプチドポリマーまたは糖成分を通常有する。例えば、各非ポリペプチドポリマーおよび/または糖成分は、直接的にまたはリンカーを介して間接的に2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに結合されてよい。典型的には、非ポリペプチド結合成分は、直接的にまたはリンカーを介して間接的に2D-VCAM-1変異体ポリペプチド中の結合基に結合されている。
【０１４５】
「より長い」という用語は、インビボでの機能的半減期または血清半減期に関連して使用される場合、2D-VCAM-1変異体結合体の関連する半減期が、類似条件下で測定された場合に、対応する非結合型2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはその構成要素などの参照分子と比べて統計学的に有意に長いことを示すために本明細書において使用される。したがって、2D-VCAM-1変異体結合体には、インビボでの機能的半減期または血清半減期が、対応する非結合型2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの半減期よりも長いものが含まれる。
【０１４６】
2D-VCAM-1変異体結合体には、結合体のインビボでの機能的半減期(または血清半減期)と対応する非結合型2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの半減期との比が、少なくとも1.25、少なくとも1.5、少なくとも1.75、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、または少なくとも8であるものが含まれる。
【０１４７】
さらなる局面において、2D-VCAM-1変異体結合体は、対応する非結合型2D-VCAM-1変異体ポリペプチドよりも大きい生物学的利用能を示す場合がある。生物学的利用能の指標は、「皮下投与された場合の曲線下面積」パラメーターまたは「AUCsc」によって提供される。「AUCsc」または「皮下投与された場合の曲線下面積」という用語は、通常の意味で使用されて、2D-VCAM-1変異体が実験動物に皮下投与された場合、血清中活性対時間曲線下の面積を意味する。実験の活性時点を決定した後、AUCscは、GraphPad Prism 3.01(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA)などのコンピュータープログラムによって簡便に計算することができる。AUCscに関連して使用される場合の「より大きい」という用語は、皮下投与された場合の2D-VCAM-1変異体結合体の曲線下面積が、類似条件下で測定された場合に、対応する非結合型2D-VCAM-1変異体ポリペプチドと比べて統計学的に有意に大きいことを示すために使用される。異なる分子を直接比較するために、典型的には、AUCsc値は正規化されるべきであり、例えば、AUCsc/投与用量として表される。
【０１４８】
例示的な2D-VCAM-1変異体結合体には、結合体のAUCscと対応する非結合型2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのAUCscの比が、同じ種の実験動物(例えば、ラットおよびサルなど)に類似条件下で投与された場合、少なくとも1.25、少なくとも、1.5、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、または少なくとも20であるものが含まれる。
【０１４９】
本発明のある種の2D-VCAM-1変異体結合体は、対応する非結合型2D-VCAM-1変異体ポリペプチドよりも、投与後のより長い期間後に、より大きい活性を示す。これらの2D-VCAM-1変異体結合体は、対応する非結合型2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのTmaxよりも大きいTmaxを示す。本明細書において使用される場合、「Tmax」という用語は、血清中活性対時間曲線において、最も高い血清中活性が観察される時点を意味する。このような2D-VCAM-1変異体結合体のTmaxと対応する非結合型2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのTmaxとの比は、皮下投与された場合、特に、ラットまたはサルなどの実験動物において皮下投与された場合、少なくとも1.2、少なくとも1.4、少なくとも1.6、少なくとも1.8、少なくとも2、少なくとも2.5、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10である。
【０１５０】
結合成分は、直接的にまたはリンカーを介して間接的にポリペプチドに共有結合されてよい。適切なリンカー成分には、ペプチド、非ペプチド性の非ポリマー脂肪族成分、およびオリゴヌクレオチドなどが含まれる。適切なリンカーには、「2D-VCAM-1変異体ポリペプチド」という題のセクションで本明細書において前述したものが含まれる。いくつかの態様において、リンカーペプチドが、2D-VCAM-1変異体のN末端に共有結合され、非ポリペプチド結合成分が、結合されたリンカーペプチドのN末端に共有結合される。いくつかの態様において、リンカーペプチドが、2D-VCAM-1変異体のN末端またはC末端に結合され、非ポリペプチド結合成分が、リンカーペプチド中の結合基(Cys残基またはLys残基など)に共有結合される。より詳細に下記でも考察するグリコシル化部位もまた、リンカーペプチド配列中に組み入れられてよい。非ポリペプチド結合成分を結合するための例示的な結合基を表2に後述する。
【０１５１】
（表２）有用な結合基および対応する非ポリペプチド結合成分の例
2013528374.tif 000005
2013528374.tif 000006
2013528374.tif 000007
*各刊行物は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５２】
本発明の実践において使用するのに適したポリマーは、分枝状(すなわち、リンカー基によって相互に連結された2つもしくはそれ以上の直鎖状ポリマー鎖を有する)または直鎖状でよく、典型的には、約300〜約100,000ダルトンの範囲、典型的には、約1,000ダルトン〜約80,000ダルトン、または約2,000〜約60,000もしくは50,000もしくは40,000もしくは30,000もしくは20,000、もしくは10,000ダルトン、およびいくつかの態様において、約1,000ダルトン〜約5,000ダルトンの平均分子量を有する。より具体的には、ポリマー分子は、約2,000ダルトン、5,000ダルトン、10,000ダルトン、12,000ダルトン、15,000ダルトン、20,000ダルトン、30,000ダルトン、40,000ダルトン、50,000ダルトン、60,000ダルトン、または80,000ダルトンの平均分子量を典型的に有する。
【０１５３】
ポリマーの分子量を説明する文脈において使用される場合、「約」という用語は、概算の平均分子量を示し、所与のポリマー調製物にはある程度の分子量分布が通常あると考えられることを示す。
【０１５４】
本発明の結合体で使用するのに適した例示的なポリマーには、ポリアルキレンオキシド(PAO)、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシポリエチレングリコール(mPEG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、リンカー基(例えば、リジンおよびグリセロールなどのリンカー)によって相互に連結された2つまたはそれ以上のポリエチレングリコール鎖を有する分枝状ポリエチレングリコールなどでよいポリアルキレングリコール(PAG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボキシラート、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリエチレン-co-マレイン酸無水物、デキストラン(例えばカルボキシメチルデキストランなど)、および他の同様のポリマーが含まれる。
【０１５５】
ポリアルキレングリコールに由来するポリマーは、一般に生体適合性、非毒性、非抗原性、非免疫原性、水溶性であり、生物から容易に排泄されるため、本発明の結合体において典型的に使用される。特にポリエチレングリコール(PEG)は、多糖類(例えばデキストラン)などの他の化合物に架橋できる反応性基がごく小数であるため、好都合である。例えばモノメトキシポリエチレングリコール(mPEG)などの単官能性PEGは、本発明の結合体において使用するための適切なポリマーの一例である。
【０１５６】
ポリエチレングリコールなどのヒドロキシル化ポリマーの2D-VCAM-1変異体ポリペプチドへの共有結合をもたらすために、ポリマー分子の少なくとも1つの末端ヒドロキシル基は、典型的には、活性化型で提供される、すなわち、2D-VCAM-1変異体ポリペプチド中の標的結合基と反応する官能基で誘導体化されている。例示的な反応性官能基には、第一級アミノ基、ヒドラジド(HZ)、チオール、スクシナート(SUC)、スクシンイミジルスクシナート(SS)、スクシンイミジルスクシンアミド(SSA)、スクシンイミジルプロプリオナート(proprionate)(SPA)、スクシンイミジルカルボキシメチラート(SCM)、ベンゾトリアゾールカルボナート(BTC)、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、アルデヒド、ニトロフェニルカルボナート(NPC)、マレイミド(MAL)、およびトレシラート(TRES)が含まれる。本発明の2D-VCAM-1結合体は、1つの二官能性PEGに共有結合している2つの本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを含んでよい。本明細書において使用される場合、「二官能性peg」という用語は、2D-VCAM-1変異体ポリペプチド中の標的結合基と反応する官能基2つで誘導体化されているポリエチレングリコール成分を意味する。
【０１５７】
適切に活性化されたポリマー分子が、例えば、Nektar Therapeutics, Inc., San Francisco, CA、NOF Corporation, Japan、およびDowPharma, Midland, MIから市販されている。あるいは、参照により本明細書に組み入れられるWO 90/13540において開示されているものなどの当技術分野において公知である従来の方法によって、ポリマー分子を活性化することもできる。本発明の2D-VCAM-1変異体結合体において使用するのに適している、活性化された直線状および分枝状の単官能性および二官能性のポリマー分子の具体的な例は、Nektar 2005-2006 Advanced Pegylation CatalogueおよびNOF DDS Catalogue Ver. 12において説明されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み入れられる。これらの活性化ポリエチレングリコールポリマーの具体的な例には、(参照により本明細書に組み入れられる) Nektar 2005-2006 "Advanced Pegylation" Catalogueにおいて開示されている、次の直線状PEG:NHS-PEG (例えば、SPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PET、SG-PEG、およびSCM-PET)、およびNOR-PEG)、BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、IODO-PEG、およびMAL-PEG、二官能性PEG、例えば、MAL-PEG-MAL、NHS-PEG-NHS、およびSS-PEG-SSなど、ならびにmPEG2-NHSなどの分枝PEG、ならびにNOF DDS Catalogue Ver. 12、米国特許第5,932,462号および同第5,643,575号(すべて、参照により本明細書に組み入れられる)において開示されているものが含まれる。
【０１５８】
本発明の2D-VCAM-1変異体結合体において使用するのに適している、活性化された直線状および分枝状のポリマー分子の他の例は、NOF Corp. 2005 Catalogue: "PEG Derivatives, Phospholipids and Drug Delivery Materials for Pharmaceutical Products and Formulations" およびNOF Corp. Catalogue Ver. 12 DDSにおいて説明されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み入れられる。活性化ポリエチレングリコールポリマーのその他の例には、(参照により本明細書に組み入れられる)NOF Corp. 2005 Catalogue: "PEG Derivatives, Phospholipids and Drug Delivery Materials for Pharmaceutical Products and Formulations"においてすべて開示されている、次のPEG: NHS-PEG(例えばSUNBRIGHT ME-020(-050、-100、-200)-CS (CH3O(CH2CHO)n-CO-CH2CH2-COO-NHS); SUNBRIGHT MEGC-20(-50)-HSおよびSUNBRIGHT MEGC-10(-20、-30)-TS(CH3O(CH2CH2O)n-CO-CH2CH2CH2-COO-NHS); SUNBRIGHT ME-020(-050)-AS(CH3O(CH2CH2O)n-CH2-COO-NHS); SUNBRIGHT ME-050HS (CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)5-COO-NHS)); アルデヒドPEG(例えばSUNBRIGHT ME-050(-100、-200、-300)-AL (CH3O(CH2CH2O)n-CH2CH2CHO)); マレイミド-PEG(例えばSUNBRIGHT ME-020(-050、-120、-200、-200)-MA (CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)3NHCO(CH2)2-(C4H2NO2)); 分枝PEGマレイミド(例えばSUNBRIGHT GL2-200(-400)-MA); 分枝PEG NHS-グルタリル(例えばSUNBRIGHT GL2-200(-400)-GS2);分枝PEG NHS-カルボキシメチル(例えばSUNBRIGHT GL2-200(-400)-HS); 分枝PEGアルデヒド(例えばSUNBRIGHT GL3-200(-400)AL2)、ならびにNOF Corp. Catalogue Ver. 12 DDS、米国特許第6,875,841号ならびに米国特許出願公開第2005/0058620号および同第2005/0288490号(すべて、参照により本明細書に組み入れられる)において開示されているものが含まれる。
【０１５９】
以下の公報は、本発明の2D-VCAM-1変異体結合体に関連して使用するのに適しているその他の有用なポリマーおよび/またはPEG化化学的部分(chemistry)を開示している:米国特許第5,824,778号、米国特許第5,476,653号、米国特許第6,875,841号、米国特許第5,872,191号、米国特許第5,767,284号、EP 0 839 850、WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、米国特許第4,902,502号、米国特許第5,281,698号、米国特許第5,122,614号、米国特許第5,219,564号、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439 508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921 131、米国特許第5,736,625号、WO 98/05363、EP 809 996、米国特許第5,629,384号、WO 96/41813、WO 96/07670、米国特許第5,473,034号、米国特許第5,516,673号、EP 605 963、US 5,382,657、EP 510 356、EP 400 472、EP 183 503、およびEP 154 316(すべて、参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１６０】
システイン残基への結合のために特に好ましい活性化PEGポリマーの具体的な例には、次の直線状PEG:ビニルスルホン-PEG(VS-PEG)、好ましくはビニルスルホン-mPEG 9VS-mPEG);マレイミド-PEG(MAL-PEG、ならびに本明細書において説明する他のマレイミドPEG)、好ましくはマレイミド-mPEG(MAL-mPEG、ならびに本明細書において説明する他のマレイミドmPEG)、およびオルトピリジルジスルフィド-PEG(OPSS-PEG)、好ましくはオルトピリジル-ジスルフィド-mPEG(OPSS-mPEG)が含まれる。
【０１６１】
2D-VCAM-1変異体ポリペプチドと活性化ポリマー分子の結合は、例えば、次の参考文献(ポリマー分子の活性化のための適切な方法も説明する)において説明されている任意の従来の方法に従って行われる: Harris and Zalipsky, eds., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; R.F. Taylor, (1991), "Protein Immobilisation: Fundamentals and Applications", Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G.T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.(すべて、参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１６２】
活性化ポリエチレングリコールを2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに結合するプロセスは、本明細書において「PEG化」と呼ばれる。2D-VCAM-1変異体ポリペプチドへのポリエチレングリコール成分の共有結合は、適切な活性化ポリエチレングリコールおよび反応条件を選択することによって、特定の結合部位を標的とすることができる。これらは当技術分野において周知であり、下記により詳細に説明する。さらに、結合は、参照により本明細書に組み入れられるWO 99/55377において説明されているものなどの公知の方法を用いて、一段階で、または段階的様式で達成することができる。
【０１６３】
システイン残基のPEG化の場合、ポリペプチドは通常、PEG化の前にジチオトレイトール(DTT)などの還元剤で処理される。その後、還元剤は、脱塩などの任意の従来の方法によって除去される。典型的には、システイン残基へのPEGの結合は、最長で約16時間の期間中に、4℃〜25℃の様々な温度で、pH6〜9の適切な緩衝液中で起こる。
【０１６４】
リジンのPEG化は、活性エステルで活性化されたPEG成分(例えば、本明細書において説明する他の活性化PEG NHSエステルを含む、N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)エステル(例えばmPEG-N-ヒドロキシルスクシンイミド(例えば、mPEG-NHSまたはmPEG2-NHS)およびPEGスクシンイミジルプロピオナート(例えばmPEG-SPA)またはPEGスクシンイミジルブタノアート(例えばmPEG-SBA)などのエステルなどをしばしば使用する。ほぼ等モル量のPEGおよびタンパク質が混合された場合、室温、pH8〜9.5において、1つまたは複数のPEG成分が30分以内にタンパク質に結合され得る。通常、PEGとタンパク質アミノ基のモル比は1:1〜5:1で十分である。pHを上昇させると反応速度が速くなるのに対し、pHを低下させると反応速度が遅くなる。これらの反応性が高い活性エステルは、生理学的pHで結合することができるが、反応性が劣る誘導体は、より高いpHを典型的には必要とする。また、不安定なタンパク質が使用されている場合、低温を使用してもよい。低温条件下では、より長い反応時間が使用され得る。
【０１６５】
2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのN末端アミノ基へのPEG成分の共有結合は、本明細書において「N末端PEG化」と呼ばれる。N末端PEG化は、N末端アミノ酸のαアミノ基のpKa値(約7.6〜8.0)とリジンのεアミノ基のpKa値(約10)の差によって促進される。N末端アミノ基のPEG化は、アミンに対する選択性がより高く、したがって、ヒスチジンのイミダゾール基と反応する可能性がより低いPEG-アルデヒドをしばしば使用し;さらに、(例えば、上記の通りの)リジン結合のために使用されるPEG試薬もまた、N末端アミンの結合のために使用され得る。N末端アミノ基へのPEG-アルデヒドの結合は、典型的には、約4℃〜25℃の様々な温度で、一晩の間に、pH約5.0の適切な緩衝液(例えば、20mMシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えた100mM酢酸ナトリウム緩衝液または100mMナトリウム二リン酸緩衝液)中で起こる。有用なN末端PEG化の方法および化学的性質は、両方とも参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,985,265号および米国特許第6,077,939号でも説明されている。
【０１６６】
場合によっては、N末端をPEG化された本発明の2D-VCAM-1変異体結合体は、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのN末端アミノ酸のαアミノ基に直接結合されたPEGを有する。場合によっては、PEGは、ポリペプチドのN末端にリンカーペプチドを介して間接的に結合される。すなわち、リンカーペプチドが2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのN末端に結合(融合)され、次いで、PEGが、リンカーペプチドのN末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合される。適切なリンカーペプチドは、前述の通りである。PEGは、直鎖状または分枝状でよく、典型的には、約20kdal〜約80kdal、例えば約30kdal〜約60kdal、例えば約50kdalの平均分子量を有する。
【０１６７】
2D-VCAM-1変異体結合体は、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド中のリジン残基に結合された1つまたは複数のポリエチレングリコール成分を有してよい。場合によっては、少なくとも1つまたは複数のPEG成分が、次のリジン結合基(特に言及された場合を除いて、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 12、またはSEQ ID NO: 18のものに対応するアミノ酸位置番号を参照する)の内の1つまたは複数の位置で2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに結合される:K2、K46、K79(79位は、SEQ ID NO: 18においてリジン反応性結合部位ではないことに留意されたい)、K82、K93、K107、K112、K130、K136、K147、K152、K167、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのN末端アミノ酸残基のαアミノ基、およびそれらの2つまたはそれ以上の任意の組合せ。また、PEG成分は、置換によって導入される次の結合基の内の1つまたは複数の位置で2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに結合されてもよい:R10K、R36K、R78K、R123K、R146K、R172K、R187K(SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 12、またはSEQ ID NO: 18のものに対応するアミノ酸位置番号を参照する)、ならびにそれらの任意の2種またはそれ以上の任意の組合せ。
【０１６８】
システインペグ化方法が利用される場合、本発明の2D-VCAM-1変異体結合体は、例えば、C23、C28、C71、C75、C113、C171(SEQ ID NO: 2のものに対応するアミノ酸位置番号を参照する)およびそれらの2種またはそれ以上の任意の組合せなどのシステイン結合基の位置において2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに結合されたPEG成分を含んでよい。PEG成分は、前述の結合基の任意の組合せ、ならびに本明細書において説明する任意の導入された結合基に結合されてよい。
【０１６９】
場合によっては、利用可能なポリマー結合基の内のできるだけ多数をポリマーと結合させることが望ましい場合がある。これは、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに対してモル過剰のポリマーを使用することによって実現することができる。このようなモル過剰は、約100:1または200:1〜約1000:1までの活性化ポリマー対2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのモル比を用いることによって実現することができる。場合によっては、モル比は、約50:1、10:1、または5:1までなど、いくらか低くてもよい。等モル比の活性化ポリマーおよび2D-VCAM-1変異体ポリペプチドもまた、使用してよい。
【０１７０】
前述した通り、本発明の2D-VCAM-1変異体結合体には、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに結合された1つまたは複数の糖成分(すなわち、炭水化物分子)を有する結合体も含まれる。これらの結合体は、本明細書において「グリコシル化」2D-VCAM-1変異体ポリペプチドとも呼ばれる。2D-VCAM-1変異体ポリペプチド上のグリコシル化部位は、典型的には、N-グリコシル化部位またはO-グリコシル化部位のいずれかである。本明細書において使用される場合、「N-グリコシル化部位」という用語は、配列N-X-S/T/C''を意味し、式中、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、Nはアスパラギンであり、S/T/Cは、セリン、トレオニン、またはシステインのいずれか、好ましくはセリンまたはトレオニン、および最も好ましくはトレオニンである。「O-グリコシル化部位」は、本明細書において、セリン残基またはトレオニン残基の-OH基を意味する。
【０１７１】
2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、インビトロのプロセスまたはインビボのプロセスのいずれかによってグリコシル化されてよい。使用される結合方法に応じて、炭水化物は、次の結合基に結合され得る:(a)参照により本明細書に組み入れられるLundblad and Noyes, "Chemical Reagents for Protein Modification", CRC Press Inc. Boca Raton, FLにおいて説明されている通り、アルギニンおよびヒスチジン、(b)(例えば、C末端アミノ酸残基、アスパラギン、もしくはグルタミンの)遊離カルボキシル基、(c)システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、(d)セリン、トレオニン、チロシン、もしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、(e)フェニルアラニンもしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または(f)グルタミンのアミド基。このような基は、本発明のポリペプチドにおいて導入および/または除去され得る。インビトロ結合の適切な方法は、いずれも参照により本明細書に組み入れられるWO 87/05330およびAplin et al.,"CRC Crit Rev. Biochem." pp. 259-306, 1981において説明されている。また、タンパク質が結合したGln残基およびペプチドが結合したGln残基への糖成分のインビトロ結合は、例えば、いずれも参照により本明細書に組み入れられるSato et al., 1996 Biochemistry 35:13072-13080およびEP 725145によって説明されている通り、グルタミン転移酵素(TGase)を用いて実施することもできる。
【０１７２】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、1つまたは複数のN-グリコシル化部位またはO-グリコシル化部位を有する2D-VCAM-1変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをグリコシル化用真核性発現宿主細胞(glycosylating eukaryotic expression host cell)中に導入することによって、インビボでグリコシル化することができる。グリコシル化用真核性発現宿主細胞は、真菌細胞(例えば、糸状菌細胞もしくは酵母細胞)、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または当技術分野において公知である他の任意のグリコシル化用真核性発現宿主細胞より選択することができる。
【０１７３】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドへの結合のために適した非ポリペプチド親油性成分には、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸、脂肪酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミン、カロテノイドまたはステロイド、リン脂質などの天然化合物、あるいは、直鎖状または分枝状の脂肪族、アリール、アルカリル酸(例えば、カルボン酸およびスルホン酸など)、アルコール、およびアミンなどの合成化合物が含まれる。非ポリペプチド親油性成分への結合は、次の例示的な結合部位のいずれか1つの位置で起こり得る:2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのN末端もしくはC末端、アミノ酸残基Ser、Thr、もしくはTyrのヒドロキシル基、Lysのεアミノ基、CysのSH基、またはAspおよびGluのカルボキシル基。2D-VCAM-1変異体ポリペプチドおよび非ポリペプチド親油性成分は、いずれも参照により本明細書に組み入れられるBodanszky, "Peptide Synthesis", John Wiley, New York (1976)およびWO 96/12505において説明されているものなどの当技術分野において公知の方法に従って、直接的にまたはリンカーを介して間接的に互いに結合させることができる。
【０１７４】
非ポリペプチド結合成分は、直接的にまたはリンカー成分を介して間接的に本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに結合され得る。例えば、非ポリペプチドポリマーは、いずれも参照により本明細書に組み入れられるAbuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581およびUS 4,179,337において説明されている通りに塩化シアヌルリンカーを介して2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに結合され得る。他の適切なリンカーは当技術分野において周知である。
【０１７５】
薬学的組成物
本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤などの担体または賦形剤と共に、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたは本明細書において前述したそのタンパク質融合物もしくは結合体を含む組成物を提供する。
【０１７６】
薬学的に許容される適切な賦形剤には、加工剤(processing agent)ならびに薬物送達の調整剤および促進剤、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、単糖類、二糖類、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、デキストロース、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、ポリビニルピロリドン、低融点ワックス、およびイオン交換樹脂など、ならびにそれらの任意の2種またはそれ以上の組合せが含まれる。薬学的に許容される他の適切な賦形剤は、"Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Pub. Co. New Jersey (1991)、"Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor and Francis (2000)、および"Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)において説明されており、これらの文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７７】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはそのタンパク質融合物もしくは結合体を含む薬学的組成物は、例えば、液剤、懸濁剤、または乳剤を含む、意図された投与方法に適した任意の形態で存在してよい。本発明の実践において使用するために企図される液体担体には、例えば、水、生理食塩水、薬学的に許容される有機溶媒、ならびに薬学的に許容される油および脂肪など、ならびにそれらの任意の2種またはそれ以上の混合物が含まれる。液体担体は、可溶化剤、乳化剤、栄養素、緩衝剤、保存剤、懸濁化剤、増粘剤、粘度調節剤、および安定化剤など薬学的に許容される他の適切な添加剤を含んでよい。適切な有機溶媒には、例えば、エタノールなどの一価アルコール、およびグリコールなどの多価アルコールが含まれる。適切な油には、例えば、ダイズ油、ヤシ油、オリーブ油、サフラワー油、および綿実油などが含まれる。非経口投与の場合、担体は、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油状エステルでもよい。本発明の組成物はまた、微粒子、マイクロカプセル、およびリポソーム封入物など、ならびにそれらの任意の2種またはそれ以上の組合せの形態で存在してよい。
【０１７８】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドならびにそのタンパク質融合物および結合体は、従来の薬学的に許容される無毒性の担体、補助剤、およびビヒクルを所望に応じて含む単位用量製剤として、経口的に、非経口的に、舌下に、吸入スプレーによって、直腸に、または局所的に投与され得る。また、局所的投与は、経皮貼付剤またはイオン導入装置などの経皮投与の使用を伴ってもよい。「非経口」という用語は、本明細書において使用される場合、皮下注射、静脈内投与、筋肉内投与、胸骨内注射、経皮もしくは経粘膜投与、または輸注技術を含む。
【０１７９】
注射可能な製剤(例えば、無菌の注射可能な水性懸濁剤または油性懸濁剤など)は、標準的な方法および当技術分野において公知の材料、例えば、適切な分散剤、湿潤剤、および懸濁化剤などを用いて調製することができる。また、無菌注射製剤は、溶媒、例えば、1,3-プロパンジオールに溶かした液剤として存在してもよい。使用され得る許容されるビヒクルおよび溶媒の例は、水、リンガー溶液、および等張性の塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発性油も、溶媒または懸濁媒体として従来使用される。この目的には、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も注射製剤中で使用される。
【０１８０】
経口投与用の固形剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が含まれ得る。このような固形剤形において、活性化合物は、スクロース、ラクトース、またはデンプンなど少なくとも1種の不活性な希釈剤と混合されてよい。このような剤形はまた、不活性な希釈剤以外のその他の物質、例えば、滑沢剤(例えばステアリン酸マグネシウム)なども含んでよい。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、これらの剤形はまた、緩衝剤も含んでよい。錠剤および丸剤は、さらに腸溶コーティングを用いて調製することができる。
【０１８１】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはそのタンパク質融合物もしくは結合体はまた、リポソームの形態で投与されてもよい。当技術分野において公知である通り、リポソームは一般に、リン脂質または他の脂質物質に由来する。リポソームは、水性媒体中に分散されている一重膜または多重膜の水和された液晶によって形成されている。リポソームを形成できる任意の非毒性で生理学的に許容され、かつ代謝可能な脂質を使用することができる。脂質型の本発明の組成物は、本発明の化合物のほかに、安定化剤、保存剤、および賦形剤などを含んでよい。典型的な脂質は、天然および合成の両方のリン脂質およびホスファチジルコリン(レシチン)である。リポソームを形成させる方法は当技術分野において公知であり、参照により本明細書に組み入れられるPrescott, Ed., "Methods in Cell Biology", Volume XIV, Academic Press, New York, N.W., p. 33 et seq. (1976)において説明されている。
【０１８２】
2D-VCAM-1変異体ポリペプチド、その結合体および組成物を使用する方法
本発明は、炎症のメカニズムに関係があるとされているVLA4(α4β1インテグリン)とVCAM-1の相互作用を阻害するために、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドならびにその結合体および薬学的組成物を使用する方法を提供する。より具体的には、本発明は、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはその結合体もしくは薬学的組成物の治療的有効量を対象(ヒトまたは非ヒト哺乳動物)に投与する段階を含む、対象の炎症性疾患を治療する方法を提供する。治療は、本明細書において説明するものを含む炎症性疾患の治療的処置または予防的処置のいずれかでよい。別の態様において、本発明は、炎症性疾患の治療(治療的または予防的)用の医薬を製造するための、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは結合体の使用を提供する。
【０１８３】
α4インテグリンに対するアンタゴニストは、炎症部位へのリンパ球および単球の動員を阻害するため、炎症性疾患および自己免疫の多種多様の実験モデルを抑制する際に有効であることが報告されている(いずれも参照により本明細書に組み入れられるFeral, C.C. et al., J. Clin. Invest., 116(3): 715-723 (2006); Ransohoff, R. M. et al., Nat. Rev. Immunol., 3:569-581 (2003); Smolen, J.S., et al., Nat. Rev. Drug Discov., 2:473-488 (2003); James, W.G., et al., J. Immunol. 170:520-527 (2003); von Andrian, U.H., et al. N. Engl. J. Med. 348:68-72 (2003)を参照されたい)。本明細書において使用される場合、「炎症性疾患」という用語は、例えば、自己免疫疾患または自己免疫障害を含む、炎症が重要な病理学的役割を果たす疾患または障害を意味する。これらには、アルツハイマー病、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、痛風、橋本甲状腺炎、虚血-再灌流障害、多発性硬化症、変形性関節症、天疱瘡、周期熱症候群、乾癬、関節リウマチ、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、1型糖尿病、潰瘍性大腸炎、脈管炎(ウェゲナー症候群、グッドパスチャー症候群、巨細胞性動脈炎、結節性多発動脈炎)、および異種移植拒絶、細菌性赤痢、シャーガス病、嚢胞性線維症、間質性肺炎、ビラリアシス、ヘリコバクター・ピロリ胃炎、C型肝炎、インフルエンザウイルス性肺炎、ハンセン病(類結核型)、ナイセリア髄膜炎または肺炎球菌髄膜炎、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、敗血症症候群、および結核などの疾患が含まれる。Nathan, Nature, 420:846 (2002)。特に、本発明は、VLA4経路よって媒介される疾患または障害を治療、予防、軽減、または抑制するための方法を提供する。本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドならびにそのタンパク質融合物および結合体は、炎症性疾患または炎症性障害の治療的または予防的な処置用の医薬を製造するために使用され得る。このような疾患および障害には、例えば、喘息、多発性硬化症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、炎症性肺疾患、関節リウマチ、敗血症性関節炎、I型糖尿病、臓器移植拒絶、炎症性腸疾患、および接着分子によって媒介される他の疾患、例えば、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、エイズ認知症、および腫瘍転移が含まれる。
【０１８４】
急性炎症の特徴は、内皮への白血球粘着の増加である(Harlan, Blood, 65(3):5130525 (1985))。本発明は、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはその結合体もしくは組成物の治療的有効量をヒト対象または非ヒト哺乳動物対象に投与する段階を含む、内皮細胞への白血球の接着を阻害する方法を提供する。本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、下記の実施例19に示す通り、VLA4の定常状態発現または接着分子を含む-4インテグリンもしくはβ1インテグリンの細胞表面レベルにほとんど影響を与えないことが示されている。したがって、1つの態様において、本発明は、α4β1(VLA4)、α4β7(LPAM-1)、α1β1(VLA1)、α2β1(VLA2)、α3β1(VLA3)、α5β1(VLA5)、α6β1(VLA6)、α7β1、α8β1、およびα9β1などのα4またはβ1を含む細胞接着分子の細胞表面発現に最小限の影響しか与えずに、内皮細胞への白血球の接着を阻害する方法を提供する。
【０１８５】
本明細書のこれまでの部分および実施例において説明する2D-VCAM-1分子の特性を考慮して、本発明の分子は、他のVLA4アンタゴニストに関連付けられているPMLリスクを低下させるにあたって、治療的および予防的な利点を提供し得ると考えられている。
【０１８６】
任意の特定の対象または患者に対する具体的な用量レベルは、使用される個々の化合物の活性、年齢、体重、全体的健康状態、投与経路、障害の重症度、および排泄速度などを含む様々な因子に依存し得ることを当業者は理解するであろう。所与の状況に対する治療的有効量は、常用的な実験法によって容易に決定することができ、通常の臨床家の技能および判断の範囲内である。
【０１８７】
本発明の目的において、治療的有効用量は、一般に、約0.1μg/kg/日〜約100mg/kg/日の本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたは結合体、時には、約10μg/kg/日〜約500μg/kg/日、および時には、約10μg/kg/日〜約100μg/kd/日であり、1つの用量でまたは複数用量で投与されてよい。
【０１８８】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドならびにその結合体および薬学的組成物は、推奨される最大臨床投薬量またはそれよりも少ない投薬量で投与することができる。本発明の組成物中の活性化合物および活性結合体の投薬量レベルは、投与経路、疾患の重症度、および患者の応答などに応じて、所望の治療応答が得られるように変更してよい。
【０１８９】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドおよび結合体は、単独の活性な薬学的作用物質として投与することができるが、1種または複数種の他の作用物質と組み合わせて使用してもよい。組合せは、個別の組成物として、または両方の作用物質を含む単一の剤形として投与することができる。組合せとして投与される場合、治療作用物質は、同時もしくは異なる時点に与えられる個別の組成物として調製されてよく、または治療作用物質は単一の組成物として与えられてもよい。
【０１９０】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドおよび結合体はまた、VLA4を有する細胞の存在を検出するのに有用である。脳中にこのような細胞が存在する場合、治療的処置を開始する必要性が指摘される可能性がある。2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはその結合体は、蛍光性標識、放射性同位体、および常磁性同位体などの検出可能な標識で標識されてよい。標識された2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはその結合体は、インビトロ(対象から抜き取られた試料)またはインビボで細胞と接触させられる。対象細胞に結合する標識された2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはその結合体が検出および定量される。対象におけるVLA4レベルの変化は、望ましくない炎症応答の証拠となり得る。したがって、本発明は、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはその結合体をヒト対象または非ヒト哺乳動物対象に由来する組織試料と接触させる段階;および該2D-VCAM-1変異体ポリペプチドまたはその結合体と組織試料中のVLA4との特異的結合によって形成される複合体を検出する段階を含む、該VLA4を検出するための方法を提供する。
【０１９１】
本発明の態様には、以下が含まれる。
1.  0〜8個のアミノ酸位置においてSEQ ID NO:12と異なり、かつSEQ ID NO:12に関して37位のプロリン(P37)および39位のロイシン(L39)を含む、配列
を含む組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドであって、
ヒトVLA4(インテグリンα4β1)タンパク質に対するQ38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO:10)の結合親和性よりも大きい該ヒトVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
2.  前記配列が、SEQ ID NO:12に関して41位のアラニン(A41)を含む、態様1の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
3.  前記配列が、SEQ ID NO: 12に関してF32L/S、S34F/Y、Q38L、A41S、T74R/A、K79S/R、L141F/W、D145A、およびR146Wより選択される1つまたは複数の置換を含む、態様1の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
4.  前記配列が、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、およびSEQ ID NO: 24より選択される、態様1の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
5.  前記配列が、0〜5個のアミノ酸位置においてSEQ ID NO:12と異なる、態様1の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
6.  前記配列が、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 22、およびSEQ ID NO: 24より選択される、請求項5記載の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
7.  前記配列が、SEQ ID NO: 12に関して38位のロイシン(L38)を含む、態様1の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
8.  0〜8個のアミノ酸位置においてSEQ ID NO: 18と異なり、かつSEQ ID NO: 18に関して37位のプロリン(P37)および39位のロイシン(L39)を含む、配列
を含む組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドであって、
ヒトVLA4(インテグリンα4β1)タンパク質に対するQ38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO:10)の結合親和性よりも大きい該ヒトVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
9.  前記配列が、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、およびSEQ ID NO: 24より選択される、態様8の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
10.  前記変異体配列が、SEQ ID NO: 18に関してL32F/S、F34S/Y、L38Q、S41A、R74T/A、S79K/R、L141F/W、D145A、およびR146Wより選択される1つまたは複数の置換を含む、態様8の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
11.  前記配列が、0〜5個のアミノ酸位置においてSEQ ID NO: 18と異なる、態様8の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
12.  前記配列が、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 20、およびSEQ ID NO: 22より選択される、態様11の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
13.  前記配列が、SEQ ID NO: 12またはSEQ ID NO: 18のアミノ酸96〜199に対応する天然ヒトVCAM-1ドメイン-2配列を含む、態様1または態様8の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
14.  前記配列が191〜199アミノ酸長である、態様1または態様8の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
15.  前記配列が、RPQLDAP(SEQ ID NO: 7)およびRPLLDSP(SEQ ID NO: 8)より選択されるモチーフを含む、態様1または態様8の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
16.  実施例10のアッセイ法において、ヒトVLA4タンパク質に対するQ38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 10)の結合親和性よりも少なくとも4倍大きいヒトVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、態様1または態様8の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
17.  実施例11のアッセイ法において、ヒトLPAM-1タンパク質(インテグリンα4β7)に対するQ38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 10)の結合親和性よりも小さいヒトLPAM-1タンパク質に対する結合親和性を有する、態様1または態様8の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
18.  実施例11のアッセイ法において、ヒトLPAM-1タンパク質に対するQ38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 10)の結合親和性よりも大きいヒトLPAM-1タンパク質に対する結合親和性を有する、態様1または態様8の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
19.  実施例12のアッセイ法において、Q38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 10)のVLA4/LPAM-1結合親和性比率と比べて、少なくとも2のVLA4/LPAM-1結合親和性比率を示す、態様1または態様8の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
20.  前記配列が、SEQ ID NO: 12またはSEQ ID NO: 18のアミノ酸89〜95に対応するヒト2D-VCAM-1リンカー配列を含む、態様1または態様8の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
21.  N末端またはC末端に融合されたタグペプチドをさらに含む、態様1または態様8の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチド。
22.  前記タグペプチドが、配列SEQ ID NO: 25を有するポリヒスチジンタグである、態様21の組換えVLA4結合ポリペプチド。
23.  態様1または態様9の組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドと該ポリペプチドに共有結合している少なくとも1つの結合成分とを含む2D-VCAM-1変異体結合体であって、該結合成分が、非ポリペプチドポリマー成分、糖成分、および非ポリペプチド親油性成分より選択される、2D-VCAM-1変異体結合体。
24.  前記非ポリペプチドポリマー成分がポリエチレングリコール(PEG)である、態様23の結合体。
25.  前記PEGが分子量約20〜80kdalの分枝PEGである、態様24の結合体。
26.  前記PEGが前記ポリペプチドのリジンまたはN末端に共有結合している、態様24の結合体。
27.  前記ポリペプチドに共有結合している2つまたはそれ以上のPEGを含む、態様24の結合体。
28.  前記PEGが、直接的にまたはリンカーペプチドもしくはタグペプチドを介して間接的に、前記ポリペプチドのN末端に結合している、態様24の結合体。
29.  前記PEGが分枝PEGである、態様24の結合体。
30.  配列SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、またはSEQ ID NO: 18を含む、態様24の結合体。
31.  態様1もしくは態様8のポリペプチドまたは態様23の結合体と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、組成物。
32．  態様1または態様8の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。
33.  プロモーターに機能的に連結された態様32のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
34.  態様33のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
35.  (a)組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの発現に適した条件下で、態様33のベクターで形質転換された宿主細胞を培養する段階;および
(b)培地からまたは該宿主細胞から、該ポリペプチドを回収する段階
を含む、該組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを作製する方法。
36.  (a)封入体としての組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの発現に適した条件下で、態様33のベクターで形質転換された宿主細胞を培養する段階;
(b)該ポリペプチドを含む封入体を回収する段階;
(c)該封入体を可溶化して、可溶化されたポリペプチドを得る段階;
(d)該可溶化されたポリペプチドがリフォールディングするのに適した条件下で尿素および還元型/酸化型グルタチオンの溶液中において該可溶化されたポリペプチドをインキュベートして、リフォールディングされたポリペプチドを得る段階;
(e)該リフォールディングされたポリペプチドを精製する段階;ならびに
(f)段階(e)に由来するポリペプチドを回収する段階
を含む、該組換え2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを作製する方法。
37.  段階(e)が、セラミックヒドロキシアパタイト(CHT)カラムに通すクロマトグラフィーによって、前記リフォールディングされたポリペプチドを精製することを含む、態様36の方法。
38.  回収された前記ポリペプチドに少なくとも1つの結合成分を共有結合させる段階をさらに含む、態様35、36、または37の方法。
39.  前記ポリペプチドに少なくとも1つの結合成分を共有結合させる段階が、該ポリペプチドのN末端アミノ基にPEG-アルデヒドを結合させるのに有効な条件下で分子量20〜80kdalの分枝PEG-アルデヒドと共に該ポリペプチドをインキュベートし、それによって、該ポリペプチドのN末端に共有結合している分枝PEG成分を含む2D-VCAM-1結合体を作製する段階を含む、態様38の方法。
40.  態様1もしくは態様8のポリペプチド、態様23の結合体、または態様31の組成物を、ヒトまたは非ヒト哺乳動物対象においてVCAM-1およびVLA4の結合を阻害するのに有効な量で、該対象に投与する段階を含む、該対象においてVCAM-1およびVLA4の結合を阻害する方法。
【０１９２】
本発明の前述の局面および他の局面は、以下の非限定的な実施例と併せると、より良く理解することができる。
【実施例】
【０１９３】
実施例1
2D-VCAM-1プラスミドの構築、2D-VCAM-1をCHOの細胞表面に提示するための細胞トランスフェクション、および細胞表面に提示された2D-VCAM-1の検出
CHO K1細胞の細胞表面に2D-VCAM-1を提示するために、ヒトVCAM-1の最初の2つのドメインおよびその変異体をコードするポリヌクレオチド(例えば、ヒト2D-VCAM-1、SEQ ID NO: 1;Q38L-2D-VCAM-1、SEQ ID NO: 9;および本発明の例示的な2D-VCAM-1変異体、SEQ ID NO: 11、13、15、17、19、21、および23)を、ヒトIgGκ軽鎖定常領域をコードするポリヌクレオチド(「Cκ」;SEQ ID NO: 32;アミノ酸配列はSEQ ID NO: 33として提供される)、パラミクソウイルスSV5に由来するV5エピトープをコードするポリヌクレオチド(Southern, J.A. et al., J. Gen. Virol. 72:1551-1557 (1991); SEQ ID NO: 34;アミノ酸配列はSEQ ID NO: 35として提供される); およびグリコシル-ホスファチジルイノシトール(GPI)膜アンカーをコードするポリヌクレオチド(SEQ ID NO: 36;アミノ酸配はSEQ ID NO: 37として提供される)に翻訳によって融合させた。Cκとの融合物を使用する論理的根拠は、適切なフォールディングを促進し、2D-VCAM-1変異体を分泌経路に導くことであった。V5エピトープは、細胞表面に提示された組換えタンパク質の発現レベルをモニターするために好都合なエピトープタグを提供するために使用した。
【０１９４】
ヒト2D-VCAM-1プラスミドを構築するために、オリゴヌクレオチドTBO380(SEQ ID NO: 38)およびTBO381(SEQ ID NO: 39)を用いるPCRによって、鋳型としての白血球cDNAライブラリー(Human Leukocyte Quick-Clone cDNA, Clontechカタログ番号637240)から、シグナルペプチドおよびヒトVCAM-1の最初の2つのドメインを増幅した。得られた680塩基対(bp)のアンプリコンを精製し、以下のようにその後のクローニングのための制限部位を導入することおよび内在するBamHI制限部位を破壊することを狙いとする2回のPCR反応のための鋳型として使用した。オリゴヌクレオチドTBO388(SEQ ID NO: 40)およびTBO383(SEQ ID NO: 41)を用いて、PCR産物TBO380-TBO381を再増幅して、その後のクローニングのためのBamHI制限部位、シグナルペプチド、およびVCAM-1由来の303塩基、ならびにヒトVCAM-1遺伝子中に存在する元の内在するBamHI制限部位を破壊するためのVCAM-1のAsp94におけるサイレント変異(オリゴヌクレオチドTBO383中に含まれる)を含む、394bpアンプリコンを生じさせた。オリゴヌクレオチドTBO382(SEQ ID NO: 42)およびTBO385(SEQ ID NO: 43)を用いてPCR産物TBO380-TBO381を再増幅して、PCR産物TBO388-TBO383のものと一致し、かつその後のクローニングのためのBsrGI制限部位を作り出すためのVCAM-1のVal195におけるサイレント変異(オリゴヌクレオチドTBO385中に含まれる)を含む、46bpのオーバーラップした5'末端を作製した。これらの2つのPCR産物を精製し、続いて、オリゴヌクレオチドTBO388およびTBO385を用いたPCR反応によって組み立てた。得られた688bpアンプリコンを、オリゴヌクレオチドTBO388およびTBO392(SEQ ID NO: 44)を用いる新たなPCR反応において鋳型として使用して、Cκに由来する最初の17個のヌクレオチドを含む705bpアンプリコンを生じさせた。
【０１９５】
オリゴヌクレオチドTBO389(SEQ ID NO: 45)およびTBO390(SEQ ID NO: 46)を用いて、鋳型としての白血球cDNAライブラリー(Human Leukocyte Quick-Clone cDNA, Clontechカタログ番号637240)から、PCRによりヒトCκ配列を増幅した。得られた271bp アンプリコンを精製し、オリゴヌクレオチドTBO391(SEQ ID NO: 47)およびTBO393(SEQ ID NO: 48)を用いた新たなPCR反応において鋳型として使用して、PCR産物TBO388-TBO392のものと一致する36ヌクレオチドのオーバーラップした5'末端、ヒトCκ配列、UGA停止コドン、およびSbfI制限部位を含む354bpアンプリコンを生じさせた。これらの2つのPCR産物TBO388-TBO392およびTBO391-TBO393を精製し、オリゴヌクレオチドTBO388およびTBO393を用いたPCRによって組み立てた。得られた1023bp アンプリコンを制限酵素BamHIおよびSbfIで消化し、ベクターpB183中の対応する部位にサブクローニングしてpVM009を得た。pVM009プラスミドは、ヒト2D-VCAM-1とCκとの翻訳融合物の発現を可能にする2D-VCAM-1-Cκ-UGA-V5-GPI構築物(SEQ ID NO: 49、アミノ酸配列はSEQ ID NO: 50として提供される)を含み、この翻訳融合物の細胞内局在(分泌されるか、またはGPIアンカーを介して膜に結合されるか)は、調節リードスルー(Regulated Readthrough)技術によって制御される。調節リードスルーベクターにより、高発現体(high expressor)トランスフェクタントを得るために活用され得る同じベクターから、膜結合型組換えタンパク質および可溶型組換えタンパク質を選択的に作製することが可能になる。高い表面発現を示す個々のトランスフェクタント細胞を選択し、増幅して、高レベルの可溶性タンパク質の作製のために次いで使用できるクローン細胞株を得る。調節リードスルーベクターを作製および使用するための方法は、参照により本明細書に組み入れられる国際出願公開WO 2005/073375およびBouquin T. et al., J. Biotechnol.125:516-528 (2006)において説明されている。
【０１９６】
プラスミドpVM009を鋳型として用いてプラスミドpVM025を作製した。プラスミドpVM025は、Cκ配列とV5配列の間にUGA停止コドンを含まないことを除いては、pVM009と同一であった。オリゴヌクレオチドTBO394(SEQ ID NO: 51)およびTBO014(SEQ ID NO: 52)を用いたPCR反応においてプラスミドpVM009を鋳型として使用して、得られた274bpアンプリコンを制限酵素BstEIIおよびPmeIで消化し、pVM009中の対応する部位にサブクローニングして、pVM025を得た。プラスミドpVM025は、2D-VCAM-1、Cκ、およびV5エピトープの翻訳融合物(SEQ ID NO: 53、アミノ酸配列はSEQ ID NO: 54として提供される)をCHO K1細胞の形質膜にターゲティングするのを可能にする。
【０１９７】
レトロウイルス型のプラスミドpVM009およびpVM025を次のようにして構築した。レトロウイルス型のpVM009を生じさせるために、プラスミドを制限酵素BamHIおよびPmeIで消化して2D-VCAM-1-Cκ-UGA-V5-GPIカセットを遊離させ、このカセットを精製し、続いて、レンチウイルスベクターpC100中の対応する部位にサブクローニングした(Bouquin T. et al., J. Biotechnol. 125:516-528 (2006))。得られたpVM010プラスミドにより、調節リードスルー技術を用いてレトロウイルス哺乳動物細胞株において2D-VCAM-1-Cκタンパク質融合物を選択的に分泌または膜固定(anchorage)することが可能になった。
【０１９８】
レトロウイルス型のプラスミドpVM025を生じさせるために、PCR産物TBO394-TBO014を制限酵素BstEIIおよびPmeIで消化し、pVM010の対応する部位にサブクローニングした。得られたpVM011プラスミド(2D-VCAM-1-Cκ-V5-GPIカセットを含み、Cκ配列とV5配列の間にUGA停止コドンを含まない)を用いて、2D-VCAM-1、Cκ、およびV5エピトープの翻訳融合物を細胞表面に提示するレトロウイルスCHO K1細胞株を生じさせた。
【０１９９】
本発明者らはまた、2D-VCAM-1配列が大腸菌発現用に最適化されている、pVM011由来の派生プラスミド(pVM036と呼ばれる)も構築した。部位特異的変異誘発を用いて、次の残基の位置のコドンを大腸菌発現にとってより有利であるもので置換した:成熟ヒトVCAM-1中のArg10、Arg36、Ile39、Arg78、Arg123、Arg126、Arg146、Arg172、Pro184、Arg187、Ile197、およびCys199。大腸菌用に最適化されたヒト2D-VCAM-1核酸配列は、SEQ ID NO: 55として提供される。大腸菌用に最適化された2D-VCAM-1構築物および元の構築物は、CHO K1細胞において同程度の発現を示したことから、コドン最適化はCHO K1細胞における発現に悪影響を与えないことが示された。
【０２００】
5％CO2の37℃インキュベーターにおいて、100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン(Bio Whittaker、DE17-602E)および10％熱失活ウシ胎児血清(Gibco、カタログ番号BRL 10091-148)を添加したD-MEM Nut Mix F-12(HAM)培地(Gibco、カタログ番号BRL 31330-038)中で、CHO K1ベースの粘着性細胞株すべてを増殖させた。製造業者の推奨に従って細胞解離溶液(Sigma、カタログ番号C5914)を用いて、細胞を回収した。レトロウイルスベースのベクターまたはレトロウイルスをベースとしないベクターを以下のように用いて、トランスジェニック細胞株を生じさせた。
【０２０１】
関心対象のプラスミドをトランスフェクション剤LIPOFECTAMINE(商標)2000(Invitrogen、カタログ番号11668-019)の存在下で用い、製造業者の推奨に従ってトランスフェクションを行うことによって、非レトロウイルスベクターを内部に持つトランスジェニック細胞を作製した。トランスフェクション後、2日間または3日間細胞を増殖させてから、選択用の抗生物質ハイグロマイシン(360μg/mL;Invitrogen、カタログ番号10687-010)またはブラストサイジン(5mg/L;Invitrogen、カタログ番号R210-01)をそれぞれ添加した。安定な細胞プールが生じるまで(7〜12日目まで)、2〜3日毎に選択培地を補充した。
【０２０２】
pLenti6/V5-D-TOPO(登録商標)に由来するレトロウイルスベクター(pVM010、pVM011、pVM036、および2D-VCAM-1ライブラリー)の場合、VIRAPOWER(商標)レンチウイルスキット(Invitrogen、カタログ番号K4950-00)に含まれる推奨に従って、293FT細胞 (Invitrogen)中でレトロウイルスを作製した。簡単に説明すると、pLenti6/V5-D-TOPO(登録商標)ベースのベクターおよびパッケージングプラスミド(VIRAPOWER(商標)レンチウイルスキットに含まれる)を293FT細胞に同時トランスフェクトして、レトロウイルス粒子を作製した。48時間後、レトロウイルス粒子を含む上清を回収し、フィルター滅菌して細胞片を除去し、続いて、CHO-K1細胞を感染させるために使用した。CHO K1細胞をウイルス希釈系列に感染させ、製造業者の推奨に従うことによって、レトロウイルス力価を評価した。5mg/Lブラストサイジン(Invitrogen、カタログ番号R210-01)を用いた選択を感染後3日目に開始し、安定な細胞プールが生じるまで(12日目まで)、2〜3日毎に選択培地を補充した。
【０２０３】
二重生物発現(dual organism expression)用にコドン最適化されたヒト2D-VCAM-1核酸配列(SEQ ID NO: 55)を、CHO K1細胞における膜提示を介したタンパク質発現について、天然ヒト2D-VCAM-1核酸配列(SEQ ID NO: 1)と比較した。pVM011(天然ヒト2D-VCAM-1)レトロウイルスベクターおよびpVM036(コドン最適化されたヒト2D-VCAM-1)レトロウイルスベクターの両方を、VIRAPOWER(商標)レンチウイルスキット(Invitrogenカタログ番号K4950-00)を用いて293FT細胞においてレトロウイルスを作製するのに使用した。pVM011-R0およびpVM036-R0とそれぞれ名付けられるCHO K1安定細胞株が生じた後、488mnのアルゴンレーザーを装備しているFACSCalibur(商標)Flow Cytometer(BD Biosciences)を用いた蛍光活性化細胞選別(FACS)解析およびCellQuest(商標)Proソフトウェア、ver 5.1.1 (BD Biosciences)を用いたデータ解析によって、組換えタンパク質の膜提示について細胞を分析した。膜に提示された組換えタンパク質は、ヒト2D-VCAM-1、ヒトIgGκ鎖、V5エピトープ、およびGPIアンカーの翻訳融合物であるため、組換えタンパク質の異なるエピトープを標的とする複合抗体(conjugated antibodies)を用いて二重染色を実施することが可能であった。この目的のために、FITC結合抗V5 mAb(Invitrogen、カタログ番号46-0308;1:500で希釈)およびPECy5結合抗ヒトVCAM-1 mAB(Becton Dickinson、カタログ番号551148;1:10で希釈)を用いて、pVM011-R0トランスジェニック細胞プールおよびpVM036-R0トランスジェニック細胞プールを染色した。2つの細胞株の蛍光プロファイルは、極めて類似していた。より具体的には、V5染色および2D-VCAM-1染色の両方が陽性である細胞の百分率は、pVM011-R0トランスジェニック細胞プールおよびpVM036-R0トランスジェニック細胞プールのそれぞれ84％および72％であった。P1(FITC)チャネルの平均蛍光シグナルは、p011-R0トランスジェニック細胞プールおよびpVM036-R0トランスジェニック細胞プールにおいて、それぞれ113および112であった。同様に、P3(PECy5)チャネルの平均蛍光シグナルは、pVM011-R0トランスジェニック細胞プールおよびpVM036-R0トランスジェニック細胞プールにおいて、それぞれ590および503であった。この結果から、コドン最適化された2D-VCAM-1を含む組換えmRNAは、CHO K1細胞において元のヒト2D-VCAM-1を含む組換えmRNAと同じくらい効率的に翻訳されることが示される。さらに、この結果から、コドン最適化された2D-VCAM-1に基づく変異体を提示するCHO K1細胞における機能的ライブラリースクリーニングと、それに続く、大腸菌におけるその後のサブクローニングおよび2D-VCAM-1変異体の作製を実施することが可能であることが示される。
【０２０４】
実施例2
2D-VCAM-1ファージミドの構築、2D-VCAM-1を提示するファージの作製、およびファージに提示された2D-VCAM-1の検出
一価ファージ提示ベクタープラスミドpS0124を用いて、糸状ファージの表面に2D-VCAM-1を提示させた。プラスミドpS0124は、大腸菌における複製のためのcolE1起点、M13起点およびパッケージングシグナル、大腸菌におけるアンピシリン耐性選択のためのβラクタマーゼ遺伝子、ならびにSTII分泌シグナル、提示されるべきポリペプチド(例えばヒト2D-VCAM-1)、6Hisタグ、抑制可能なアンバー停止コドン、およびM13遺伝子III C末端ドメインの翻訳融合物の発現を推進するアラビノース(araBAD)オペロンを含むファージミド大腸菌ベクターである。ヒト2D-VCAM-1との例示的な翻訳融合の核酸配列は、SEQ ID NO: 56として提供される。STII分泌シグナル配列とHisタグの間の独特なSfiI部位およびNotI部位によって、提示されるべきポリペプチドをコードするDNA配列をクローニングしてインフレーム融合物を生じさせることが可能になる。araBADプロモーター(pBAD)は、遺伝子が同じくプラスミド中に含まれるaraC活性化タンパク質と相互作用するアラビノースによって活性化され得る。プラスミドが、TG1(Stratagene)またはTOP10(Invitrogen)などのアンバーサプレッサー株中に形質転換される場合、araBADプロモーターからの基底発現が、提示されるべきポリペプチド、Hisタグ、およびM13タンパク質IIIのC末端ドメインからなる成熟融合タンパク質の発現およびプロセシングを推進する。
【０２０５】
2D-VCAM-1をコードするDNAをプライマーを用いて増幅して、隣接するSfiI部位およびNotI部位を導入し、続いてこれらの部位を用いてpS0124中にサブクローニングして、プラスミドpS0124-2DVCAM1を作製した。このプラスミドを大腸菌TG1細胞(Stratagene、カタログ番号200123)中に形質転換し、後述する通りにこの形質転換体をファージ作製のために使用した。
【０２０６】
2D-VCAM-1またはその変異体を提示するファージを調製するために、ファージミドクローンを2×YT+Carb50(50ug/mLのカルベニシリン)3ml中に播種し、続いて、対数増殖期中期(mid-log phase)になるまで2×YT+Carb50 50ml中で継代培養し、対数増殖期中期になった時点でM13K07ヘルパーファージ1mL(約1E+10cfu/mL)を添加し、37℃、250rpmで一晩、培養物を増殖させた。一晩培養物を6000rpmで20分間遠心分離し、上清を採取し、4分の1の体積量の5×PEG/NaCl(20％ポリエチレングリコール8000、2.5M NaCl)溶液と混合し、氷上で30分間インキュベートした。4℃、10,000rpmで30分間の遠心分離によってファージDNAを回収し、トリス緩衝生理食塩水(TBS;25mM Tris、pH7.5、150mM NaCl)+1％ウシ血清アルブミン(BSA)1〜2ml中に再懸濁した。微量遠心管に入れ、最大速度で5分間の遠心分離によって再懸濁物を清澄化し、上清を4℃で最長1週間保存した。
【０２０７】
TBS+1％BSAに溶かしたファージの10倍段階希釈系列を作製し、各希釈物1ulを対数期TG1培養物100ulに添加し、37℃で20分間、TG1細胞をファージに感染させることによって、ファージの力価を測定した。次いで、感染した培養物を、50ug/mlカルベニシリンを含むLB寒天プレート上に塗り広げた。37℃で一晩インキュベートした後に得られたファージミドトランスフェクタントコロニーを計数し、ファージ力価を算出するのに使用した。典型的には、力価は、1012〜1013cfu/mlの範囲であった。
【０２０８】
ファージELISAを用いて、ファージに提示された2D-VCAM-1の機能を試験した。TBS-M(TBS＋1mM MnCl2)に溶かした濃度5ug/mlのVLA4-Fc(実施例3を参照されたい)をウェル1つ当たり50ul加えて、NUNC MaxiSorp(商標)プレートを4℃で一晩コーティングした。TBS-MT(TBS＋1mM MnCl2および0.02％TWEEN-20)で洗浄した後、3％ミルク(無脂肪の乾燥粉乳;Sigma-Aldrich)を含むTBS-Mでプレートをブロッキングした。このブロックを洗浄し、コーティングされたプレートにファージ希釈物(TBS-MT＋1％ミルクに溶かした2倍タイトレーション(titration))を添加し、室温でインキュベートした。2時間のインキュベーション後、TBS-MTでプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)-抗M13抗体結合体(GE Healthcare)と共に30分間インキュベートし、TBS-MTで洗浄し、固定されたHRPをTMB-H2O2試薬(Pierce)によって検出することによって、結合されたファージを検出した。2M H2SO4を用いて発色させた後に反応を停止させ、分光光度計およびSoftMaxPro(商標)ソフトウェア(Molecular Devices, Sunnyvale CA)を用いて、プレートの450nMにおける吸光度を読み取った。ファージ希釈物に対して吸光度をプロットして、様々な変異体の結合を比較するための結合曲線を得た。
【０２０９】
実施例3
VLA4-Fcのクローニング、発現、精製、および特徴決定
A.  ヒトα4-Fcプラスミドの構築
ヒトα4インテグリンcDNAを、白血球cDNAライブラリー(Human Leukocyte Quick-Clone cDNA, Clontechカタログ番号637240)から3つの断片としてPCR増幅した。第1の断片は、成熟ヒトα4インテグリンの最初の317個のヌクレオチドを含み、プライマーTBO358およびTBO357(それぞれSEQ ID NO: 57およびSEQ ID NO: 58)を使用した。第2の断片は、プライマーTBO365およびTBO367(SEQ ID NO: 59およびSEQ ID NO: 60)を用いて作製した。プライマーTBO366およびTBO352(それぞれSEQ ID NO: 61およびSEQ ID NO:62)を用いた第3のPCR反応の結果、ヒトα4インテグリンの配列を含む1155bpのアンプリコンが得られた。標準手順を用いてこれら3種のPCR産物を精製し、次の変更を伴う完全なヒトα4-インテグリン細胞外ドメインをコードするDNAの作製を目標とするPCR反応のための鋳型とした:内因性シグナルの代わりにマウスκIgG軽鎖シグナルペプチド、内在するBamHI制限部位の除去、変異R558Lの導入(潜在的なプロテアーゼ切断部位を除去するため)、およびその後のサブクローニングのための制限部位の導入。
【０２１０】
プライマーTBO359およびTBO355(それぞれSEQ ID NO: 63およびSEQ ID NO: 64)を用いて、第1のPCR断片を再増幅させた。プライマーTBO359は、BamHI制限部位、続いて、マウスIgGκシグナルペプチド(SEQ ID NO: 65)をコードするコザックコンセンサス翻訳開始シグナル配列、および第1の断片の5'にハイブリダイズする配列を含んだ。TBO355は、第1の断片の3'末端の近くのBamHI部位を破壊するサイレント変異を含んだ。得られた産物は長さが412bpであり、BamHI部位、続いてコザック配列、および成熟ヒトα4-インテグリン遺伝子へのマウスIgGκシグナルの融合物をコードするDNAを含んだ。
【０２１１】
プライマーTBO354およびTBO369(それぞれSEQ ID NO: 66およびSEQ ID NO: 67)を用いて第2のPCR産物を増幅して、第1のPCR断片のものと一致し、かつヒトα4インテグリンにおける変異R558Lを含む、33bpのオーバーラップした5'末端を作製した。
【０２１２】
オリゴヌクレオチドTBO368およびTBO353(それぞれSEQ ID NO: 68およびSEQ ID NO: 69)を用いて第3のPCR産物を増幅して、第2のPCR産物のものと一致し、かつその後のサブクローニングのための制限部位SalIを含む、36bpのオーバーラップした5'末端を作製した。
【０２１３】
標準手順を用いてこれら3種のPCR産物を精製し、続いて、隣接プライマーTBO359およびTBO353を用いたPCRによって組み立て、増幅した。最終的なPCR断片は、マウスIgGκシグナルペプチドと変異R558Lを含むヒトα4インテグリンとの翻訳融合物をコードした。TOPO-TAクローニングキット(Invitrogen、カタログ番号45-0030)のpCR4-TOPOベクター中に2907bpアンプリコンをクローニングして、プラスミドpVM017を作り出した。
【０２１４】
ヒトα4インテグリン細胞外ドメインは、ヒトIgG1 Fcと融合させた。オリゴヌクレオチドTBO351およびTBO305(それぞれSEQ ID NO: 70およびSEQ ID NO: 71)を用いたPCRによって、ヒト白血球cDNAライブラリー(Human Leukocyte Quick-Clone cDNA、Clontech カタログ番号637240)から、ヒトIgG1 Fc核酸配列を増幅した。SOE(splicing by overlap extension)戦略(例えば、参照により本明細書に組み入れられるHorton, et al., "Gene Splicing by overlap extension:tailor-made genes using the polymerase chain reaction", Biotechniques, 8(5):528-35 (1990)を参照されたい)によって、IgG1 CH3ドメインの最初の部分に独特なXhoI制限部位を導入した。オリゴヌクレオチドの組合せTBO351(SEQ ID NO: 70)およびTBO377(SEQ ID NO: 72)(結果として、409bp断片が得られた)ならびにTBO376(SEQ ID NO: 73)およびTBO305(SEQ ID NO: 71)(326bp断片を生じた)を用いた2回の独立したPCR反応において、IgG1-Fc鋳型を増幅した。オリゴヌクレオチドTBO351およびTBO305を用いたPCRによって、これらの2種のPCR断片を組み立て、増幅した。
【０２１５】
得られたIgG1-Fc産物は、IgG1 Fcタンパク質のコード配列に変異Y407Tを導入するための鋳型として働いた。626bp断片を作製するためのオリゴヌクレオチドの組合せTBO361(SEQ ID NO: 74)およびTBO365(SEQ ID NO: 59)ならびに159bp断片を作製するためのオリゴヌクレオチドの組合せTBO364およびTBO360(それぞれSEQ ID NO: 75およびSEQ ID NO: 76)を用いて、2回のPCR反応を実施した。オリゴヌクレオチドTBO361およびTBO360を用いたPCRによって、これらの2種のPCR産物TBO361-TBO365およびTBO364-TBO360を組み立てて、Y407T変異を有するヒトIgG1 Fc配列ならびにサブクローニング目的で導入されたBamHI、SalI、XhoI、およびPmeI制限部位を含む753bpアンプリコンを生じさせた。TOPO-TAクローニングキット(Invitrogen、カタログ番号45-0030)のpCR4-TOPOベクター中にTBO361-TBO360 PCR産物をクローニングして、プラスミドpVM001を作製した。
【０２１６】
muIgG1κシグナルおよびα4インテグリンR558L配列を含むBamHI-SalI断片をpVM017から切り出し、pVM001の対応する部位にサブクローニングして、muIgG1κシグナル配列、α4インテグリンR558L変異体ECD配列、およびFcY407T配列の機能的融合物を含むプラスミドpVM003を作製した。BamHI酵素およびPmeI酵素を用いてこの融合物をpCDNA3.1 Hyg(Invitrogen)中にサブクローニングして、ハイグロマイシン耐性マーカーおよび可溶性ヒトα4インテグリン-FcY407T(本明細書において「α4-Fc」と呼ばれる。核酸配列は本明細書においてSEQ ID NO: 77として提供され、アミノ酸配列はSEQ ID NO: 78として提供される)の発現を推進するCMVプロモーターを含むプラスミドpVM004を得た。
【０２１７】
実現し得る最高レベルの可溶性α4-Fcを産生する細胞株を作製するために、プラスミドpVM004においてα4-Fc翻訳融合物の下流にUGA停止コドン、V5エピトープ、およびGPIアンカー(本明細書においてUGA-V5-GPIと呼ばれる)を導入することによって、調節リードスルー技術(参照により本明細書に組み入れられるWO 2005/073375において説明されている)に基づくプラスミドベクター pVM007を構築した。次のようにしてUGA-V5-GPIカセットを作製した。プラスミドpVM001が、オリゴヌクレオチドTBO376およびTBO379(SEQ ID NO: 79)を用いたPCR反応において鋳型として働いて、FcY407TのCH3領域、UGA停止コドン 、および V5 エピトープの上流部分を含む347bpアンプリコンをもたらした。鋳型としてのプラスミドpB183ならびにオリゴヌクレオチドTBO378およびTBO104(それぞれSEQ ID NO: 80およびSEQ ID NO: 81)を用いる第2のPCR反応を実施して、PCR産物TBO376-TBO379の3'末端との37bpオーバーラップ、残りのV5エピトープ、GPI配列、およびサブクローニングのための制限部位PmeIを含む235bpのアンプリコンを作製した。オリゴヌクレオチドTBO376およびTBO104を用いたPCRによって、2種のPCR産物TBO376-TBO379およびTBO378-TBO104を組み立て、増幅し、得られた545bpアンプリコンをXhoIおよびPmeIで消化し、pVM004中のXhoI-PmeI断片を置換するのに用いて、pVM007を作製した。プラスミドpVM007により、参照により本明細書に組み入れられるWO 2005/073375において説明されている調節リ―ドスルーアプローチによる可溶性α4-Fcまたは膜結合型α4-Fcの選択的作製が可能になった。
【０２１８】
遍在性クロマチンオープニングエレメント技術(UCOE)(Millipore, Inc.)を用いて、α4-Fc発現プラスミドおよびβ1-Fc発現プラスミドの第2のセットを作製した。CET1019AS-puroベクターおよびCET1019AS-hygroベクターは、ゲノムDNAにおけるプラスミド組込み後の発現を改善するために局所的クロマチン巻き戻しを誘導するDNAエレメントを含む。両方のベクターとも、プロモーターA(モルモットCMV由来)およびSV40 polyAターミネーターを有する。NheI制限部位およびPmeI制限部位を用いて、pVM007由来のα4-Fcを切り出し、NheI制限酵素およびSnaBI制限酵素で消化したCET1019AS-puro中にクローニングして、プラスミドpVM162を得た。NheI制限酵素およびPmeI制限酵素を用いて、pVM008由来のα1-Fc ORFを切り出し、同じ酵素で消化したCET1019AS-hygro中にクローニングして、プラスミドpVM168を得た。
【０２１９】
B.  ヒトβ1-Fcプラスミドの構築
鋳型としての白血球cDNAライブラリー(Human Leukocyte Quick-Clone cDNA、Clontechカタログ番号637240)ならびにオリゴヌクレオチドTBO370およびTBO371(それぞれSEQ ID NO: 82およびSEQ ID NO: 83)を用いたPCRによって、ヒトα1インテグリンをクローニングして、分泌シグナル配列および細胞外ドメインを含むヒトβ1インテグリン遺伝子の最初の2187個のヌクレオチドを含むPCR産物を得た。オリゴヌクレオチドTBO372およびTBO373(それぞれSEQ ID NO: 84およびSEQ ID NO: 85)を用いてPCR産物を再増幅して、隣接するBamHI制限部位およびPmeI制限部位を導入した。TOPO-TAクローニングキット(Invitrogen、カタログ番号45-0030)のpCR4-TOPOベクター中にこの断片をクローニングして、プラスミドpVM016を得た。
【０２２０】
次いで、ヒトβ1シグナル配列およびβ1インテグリンをヒトIgG1-Fc配列に融合した。第1に、PCR産物TBO351-TBO305中で得られるヒトIgG1-Fc配列を、2回のPCR反応によってT366Y変異を含むように変異させた:505bp断片を与える、オリゴヌクレオチドTBO361(SEQ ID NO: 74)およびTBO363(SEQ ID NO: 86)を用いた第1の反応ならびに277bp断片を与える、TBO362(SEQ ID NO: 87)およびTBO360を用いた第2の反応。オリゴヌクレオチドTBO361およびTBO360を用いたPCRによって、これらの2種のPCR産物TBO361-TBO363およびTBO362-TBO360を組み立て、増幅して、T366Y変異を有するヒトIgG1-Fc配列ならびにBamHI、SalI、XhoI、およびPmeI制限部位を含む753bpアンプリコンを生じさせた。次いで、組み立てられた産物をTOPO-TAクローニングキットのpCR4-TOPOベクター中にクローニングして、プラスミドpVM002を得た。酵素BamHIおよびSalIを用いて、プラスミドpVM016からヒトβ1インテグリン配列を切り出し、プラスミドpVM002の対応する部位にサブクローニングして、ヒトβ1インテグリンおよびヒトIgG1 FcT366Yの翻訳融合物(本明細書において「β-Fc」と呼ばれる。核酸配列はSEQ ID NO: 88として提供され、アミノ酸配列はSEQ ID NO: 89として提供される)を含むpVM005を得た。
【０２２１】
β1-Fc融合物を、pCDNA6-myc-His-A(Invitrogen、カタログ番号V22120)に由来する発現ベクター中にサブクローニングした。オリゴヌクレオチドTBO374およびTBO375(それぞれSEQ ID NO: 90およびSEQ ID NO: 91)を用いて、プラスミドpCDNA3.1-Hyg(pF377)(Invitrogen)から5'非翻訳領域(5'UTR)およびβ-グロビンイントロン配列をPCR増幅して、HindIII制限部位およびBamHI制限部位にはさまれた406bpアンプリコンを作製し、HindIIIおよびBamHIを用いてこれをpCDNA6-myc-His-A中にクローニングして、プラスミドpCDNA6-myc-His-A-イントロンを得た。酵素BamHIおよびPmeIを用いて、プラスミドpVM005からβ1-Fcカセットを切り出し、プラスミドpCDNA6-myc-His-A-イントロン中にサブクローニングして、プラスミドpVM006を得た。プラスミドpVM006は、ブラストサイジン耐性マーカー、および可溶性β1-Fcの発現を推進するCMVプロモーターを含んだ。
【０２２２】
実現し得る最高レベルの可溶性β1-Fcを産生する細胞株を作製するために、pVM006プラスミドのβ1-Fc翻訳融合物の下流にUGA停止コドン、V5エピトープ、およびGPIアンカー(本明細書においてUGA-V5-GPIと呼ばれる)を導入することによって、調節リードスルー技術に基づくプラスミドベクターpVM008を構築した。プラスミドpVM002は、オリゴヌクレオチドTBO376およびTBO379を用いたPCR反応において鋳型として働いて、Fcドメインの3'末端、UGA停止コドン、およびV5エピトープの上流部分を含む347bpアンプリコンを生じた。鋳型としてプラスミドpB183を用い、かつオリゴヌクレオチドTBO378およびTBO104を用いて、第2のPCR反応を実施した。得られた235bpアンプリコンは、PCR産物TBO376-TBO379の3'末端との37bpオーバーラップ、残りのV5エピトープ、GPI配列、およびサブクローニングのためのPmeI制限部位を含んだ。オリゴヌクレオチドTBO376およびTBO104を用いたPCRによって、これらの2種のPCR産物TBO376-TBO379およびTBO378-TBO104を組み立て、増幅して、545bpアンプリコンを得、これをXhoI制限酵素およびPmeI制限酵素で消化し、ベクターpVM006の対応する部位にクローニングして、プラスミドpVM008を作製した。プラスミドpVM008により、参照により本明細書に組み入れられるWO 2005/073375において説明されている調節リードスルーアプローチによる可溶性β1-Fcまたは膜結合型β1-Fcの選択的作製が可能になった。
【０２２３】
遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE)技術(Millipore, Inc.)を用いて、α-4-Fc発現プラスミドおよびβ1-Fc発現プラスミドの第2のセットを作製した。CET1019AS-puroベクターおよびCET1019AS-hygroベクターは、ゲノムDNAにおけるプラスミド組込み後の発現を改善するために局所的クロマチン巻き戻しを誘導するDNAエレメントを含む。両方のベクターとも、プロモーターA(モルモットCMV由来)およびSV40 polyAターミネーターを有する。NheI制限部位およびPmeI制限部位を用いて、pVM007由来のαf-Fcを切り出し、NheI酵素およびSnaBI酵素で消化したCET1019AS-puro中にクローニングして、プラスミドpVM162を得た。NheI制限酵素およびPmeI制限酵素を用いて、pVM008由来のβ1-Fc ORFを切り出し、同じ酵素で消化したCET1019AS-hygro中にクローニングして、プラスミドpVM168を得た。
【０２２４】
C.  α4-Fc/β1-Fcを産生する細胞株の構築:
調節リードスルー法によってα4-Fc/β1-Fc(本明細書において「VLA4-Fc」とも呼ばれる)細胞株を作製するために、本発明者らは、最初にα4-Fcベースのプラスミド(pVM007)をCHO-K1にトランスフェクトし、高レベルのα4-Fcを提示するクローンを作製および選択する逐次的アプローチを用いた。続いて、これらのクローンを、β1-Fcベースのプラスミド(pVM008)によるトランスフェクションのための受容細胞として使用した。サンドイッチELISA(下記の実施例9で説明する)を用いて、得られたトランスジェニック細胞株をヘテロダイマー分泌についてスクリーニングした。
【０２２５】
製造業者の推奨に従ってリポフェクタミン(商標)2000(Invitrogen)を用いて、pVM007プラスミドでCHO-K1細胞をトランスフェクトし、ハイグロマイシン耐性について選択した。安定な細胞プールが生じた後、GPI固定を介してヒトα4-Fcを提示するためにFACSに基づいた2回の濃縮にこれらの細胞を供した。各回の濃縮において、選別された細胞の百分率は、それぞれ0.8％および0.7％であった。FACSに基づいた異なる濃縮ラウンドの出来を評価するために、元のトランスジェニック細胞に対応する細胞プールの上清(ラウンドR0)または1回のFACSに供した細胞(ラウンドR1)もしくは2回のFACSに供した細胞(ラウンドR2)を、α4-Fc産生について分析した(下記の実施例9で説明する)。異なる濃縮ラウンド間でα4-Fc分泌に著しい改善が認められたことから、FACS工程は高発現体細胞を濃縮する上で大きい成功を収めたことが示された。実際、2回のFACSに供された細胞プール(pVM007-R2)中のα4-Fc分泌レベルは、元のトランスジェニック細胞プール(pVM007-R0)の分泌レベルの87倍であった。
【０２２６】
続いて、pVM007-R2細胞プールを、5個の96ウェル培養プレートにおける限界希釈クローニングに供した。2週間増殖させた後、約300個のクローンを目で見て確認し、ELISAを用いてα4-Fc産生について順位付けした(実施例9を参照されたい)。最も多いα4-Fc組換えタンパク質産生を示しているクローン24個を集め、増幅し、製造業者の推奨に従ってリポフェクタミン2000を用いてプラスミドpVM008でトランスフェクトした。抗生物質ブラストサイジンの存在下で約2週間増殖させた後、トランスジェニック細胞株を得た。pVM007およびpVM008を同時トランスフェクトされた細胞を、CHO-K1-007-008と呼んだ。各細胞プールを、5個の96ウェル培養プレートにおける限界希釈クローニングに供した。2週間増殖させた後、サンドイッチELISAを用いてα4-Fc産生およびβ1-Fc産生についてCHO-K1-007-008クローンを順位付けした(実施例9)。8個のCHO-K1-007-008クローンを選択し、さらに増殖させるためにTフラスコに移し、1週間後に、サンドイッチELISAを用いて、分泌されたヘテロダイマーのレベルを評価した。ローラーボトルにおいてさらに組換えタンパク質を産生させるために、1つのクローンを選択した。
【０２２７】
前述したものに類似した逐次的トランスフェクション工程により、プラスミドpVM162およびpVM168を用いて、第2のVLA4-Fc細胞株をCHO-S細胞から作製した。
【０２２８】
D.  VLA4-Fcの発現および精製
選択した細胞株をローラーボトルに移し、無血清培地に順応させた。上清を毎日採取し、-80℃で凍結した。一連の行動(campaign)の最後に、上清を解凍し、まとめ、溶出緩衝液としてグリシンpH3.2を用いるrプロテインA-セファロースカラム(GE Healthcare)を用いた標準的なプロテインAクロマトグラフィーによって精製した。溶出された画分を集め、還元条件下のSDS-PAGEゲル上で解析した。PVDF膜にエレクトロブロッティングした後、2つの主要バンドの配列を決定した。Mrが最も低いバンド(β1-Fc)の配列は得られなかった。別々に、かつ機能的細胞結合アッセイ法によって、画分を試験した(下記)。等価な活性を示している画分を集め、中和した溶出緩衝液中で-80℃で保存した。続いて、機能的ELISAアッセイ法用の標準物質としてこれを使用した(下記)。また、BIACOREを用いて、活性な画分を同定し、集めることもできる(下記)。
【０２２９】
E.  VLA4-Fcの特徴決定
1.  MALDI-TOF質量分析:
VLA4 Fc融合タンパク質に対してMALDI-TOF質量分析を実施した。結果から、融合タンパク質が約280kDaの不均一な質量を有することが示された。この不均質性は、α鎖およびβ鎖の両方の多数のN-グリコシル化部位にN-グリカンが結合することに起因する可能性が高かった。結合した炭水化物の質量は、約45kDaと推定された(各N-グリカンの平均質量を2500Daと想定し、約18個のN-グリカン)。
【０２３０】
2.  N末端配列決定:
上記のDの部分で説明したゲル解析において観察された2つの主要バンドのN末端アミノ酸配列決定を実施した。Mrが最も高いバンドについては、N末端アミノ酸配列Tyr-Asn-Val-Asp-Thr-Glu-Ser-Ala-Leu-Leu-Tyr-Gln-Gly-Pro-(SEQ ID NO: 92)が見出された。このアミノ酸配列は、α4鎖の予想されるN末端アミノ酸配列と同一である。Mrが最も低いバンドについては、N末端アミノ酸配列は見出されなかった。β1鎖中の予想されるN末端アミノ酸残基は、環化してN末端のアミノ酸配列決定をし難くする可能性が高いGln残基であるため、この結果は以外ではない。
【０２３１】
3.  機能的細胞結合アッセイ法:
精製された可溶性VLA4-Fc受容体の機能性を評価するために、2D-VCAM-1-Cκ-V5(野生型、Q38L、L80A、またはD40Aのいずれか)を提示するトランスジェニックCHO-K1細胞をVLA4-Fc希釈系列と共にインキュベートした。これらの細胞をPE結合抗ヒトIgG Fc鎖抗体と共にインキュベートすることによって、2D-VCAM-1への可溶性VLA4-Fc受容体の結合を検出した。これらの結果から、可溶性VLA4-Fcが、CHO-K1細胞表面に提示された2D-VCAM-1タンパク質に結合したことが示される。
【０２３２】
4.  機能的ELISAアッセイ法:
後期のVLA4-Fc精製バッチの機能性を標準バッチと比べるために、本発明者らは、実施例10において説明するELISAアッセイ法を使用した。TBS-Mに溶かした2ug/mlのVLA4-Fcタンパク質画分および標準VLA4-Fc調製物で同じELISAプレートをコーティングし、2種の異なる2D-VCAM-1変異体(その内の1つはQ38Lであった)を用いてELISAを実施した。両方の2D-VCAM-1変異体について標準バッチと同一である画分のみを許容範囲とみなし、集めて、VLA4-Fcタンパク質の新しいバッチを作製した。
【０２３３】
実施例4
LPAM-1-Fcのクローニング、発現、精製、および特徴決定
A.  ヒトβ7-Fcプラスミドの構築
鋳型としての白血球cDNAライブラリー(Human Leukocyte Quick-Clone cDNA、Clontech、カタログ番号637240)ならびにオリゴヌクレオチドTBO395およびTBO396(それぞれSEQ ID NO: 93およびSEQ ID NO: 94)を用いたPCRによって、ヒトβ7インテグリンをクローニングして、分泌シグナル配列および細胞外ドメインを含む、ヒトβ7インテグリン遺伝子の最初の2169個のヌクレオチドを含むPCR産物を得た。オリゴヌクレオチドTBO397およびTBO398(それぞれSEQ ID NO: 95およびSEQ ID NO: 96)を用いて、このPCR産物を再増幅して、隣接するBamHI制限部位およびSalI制限部位を導入した。BamHI部位およびSalI部位を用いて、β1断片の代わりにβ7断片をプラスミドpVM006にサブクローニングして、IgG1-FcT366Y配列に融合されたβ7シグナル配列および細胞外ドメインを含むプラスミドpVM012を得た。続いて、BamHI制限酵素およびPmeI制限酵素を用いて、この融合物をコードする配列を切り出し、プラスミドpCDNA6-myc-His-A(Invitrogen、カタログ番号V22120)の対応する部位の間にクローニングして、プラスミドpVM013を得た。プラスミドpVM013は、ブラストサイジン耐性マーカーおよび可溶性ヒトβ7インテグリン-FcT366Y(本明細書において「β7-Fc」と呼ばれる。核酸配列はSEQ ID NO: 97として提供され、アミノ酸配列はSEQ ID NO: 98として提供される)の発現を推進するCMVプロモーターを含んだ。
【０２３４】
またpVM013由来のNheI-PmeI断片を、同じ酵素で消化したCET1019AS-hygro中にサブクローニングすることによって、UCOE技術に基づいたβ7-Fcプラスミドを作製した。得られたプラスミドをpVM172と名付けた。
【０２３５】
B.  α4-Fc/β7-Fc CHO細胞株の構築
本質的にはα4-Fc/β1-Fc細胞株の作製について前述した通りの逐次的アプローチを用いて、α4-Fc/β7-Fc(本明細書において「LPAM-1-Fc」または「LPAM-1-Fc」とも呼ばれる)を発現する細胞株を作製した。前述した通り、最も多いα4-Fc組換えタンパク質産生を示しているクローン24個を集め、増幅し、製造業者の推奨に従ってリポフェクタミン2000を用いてプラスミドpVM013でトランスフェクトした。抗生物質ブラストサイジンの存在下で約2週間増殖させた後、トランスジェニック細胞株を得た。pVM007およびpVM013を同時トランスフェクトされた細胞を、CHO-K1-007-013と呼んだ。各細胞プールを、5個の96ウェル培養プレートにおける限界希釈クローニングに供した。2週間増殖させた後、実施例9で説明するサンドイッチELISAを用いてα4-Fc産生およびβ7-Fc産生についてCHO-K1-007-013クローンを順位付けした。8個のCHO-K1-007-013クローンを選択し、さらに増殖させるためにTフラスコに移し、1週間後に、サンドイッチELISAを用いて、分泌されたヘテロダイマーのレベルを評価した。ローラーボトルにおいてさらに組換えタンパク質を産生させるために、1つのクローンを選択した。
【０２３６】
前述したものに類似した逐次的トランスフェクション工程により、プラスミドpVM162およびpVM172を用いて、第2のLPAM-1-Fc発現細胞株をCHO-S細胞から作製した。
【０２３７】
C.  LPAM-1-Fcの発現および精製:
選択した細胞株をローラーボトルに移し、無血清培地に順応させた。上清を毎日採取し、-80℃で凍結した。一連の行動の最後に、上清を解凍し、まとめ、溶出緩衝液としてグリシンpH3.2を用いるrプロテインA-セファロースカラム(GE Healthcare)を用いた標準的なプロテインAクロマトグラフィーによって精製した。これらの画分を別々に試験し、機能的画分を集め、中和した溶出緩衝液中で-80℃で保存した。
【０２３８】
D.  LPAM-1-Fcの特徴決定:
機能的ELISAアッセイ法:
後期のLPAM-1-Fc精製バッチの機能性を標準バッチと比べるために、本発明者らは、実施例11において説明するELISAアッセイ法を使用した。TBS-Mに溶かした2ug/mlのLPAM-1-Fcタンパク質画分および標準LPAM-1-Fc調製物で同じELISAプレートをコーティングし、2種の異なる2D-VCAM-1変異体(その内の1つはQ38Lであった)を用いてELISAを実施した。両方の2D-VCAM-1変異体について標準バッチと同一である画分のみを許容範囲とみなし、集めて、LPAM-1-Fcタンパク質の新しいバッチを作製した。
【０２３９】
実施例5
CHO細胞表面提示ライブラリーおよびファージ提示ライブラリーの調製
入手可能なVCAM-1構造体をVLA4と相同なインテグリンの構造体に手動でドッキングすることに基づいて、VLA4への結合を担っている2D-VCAM-1中の領域を特定した(Newham, P. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:19429-19440; Jin, M. et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 5758-5763; Song, G. et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:5042-5049)。VLA4結合に直接関与していると予測されるこれらの領域の表面の残基をライブラリーに含めた。次の残基を変異誘発の標的とした:R36、T37、Q38、I39、S41、P42(ライブラリー1);F32、S34、T72、T74、K79、L80、E81(ライブラリー2);R123、L141、E142、D143、D145、R146、およびK147(ライブラリー3)。
【０２４０】
「ドープされた」または「スパイクされた」オリゴヌクレオチドとして公知の特別設計されたゆらぎの使用に基づくライブラリー設計戦略を使用した。これらのゆらぎは、変異体1個当たり変異2〜3個という平均変異頻度を与えるように最適化した。停止コドンの量を最小限に抑え、同時に、オリゴヌクレオチド合成のための異なるゆらぎの数を最小限に抑えつつ、システイン以外のアミノ酸すべてに備えるために、設計戦略を最適化した。
【０２４１】
CHO細胞表面提示ライブラリー1および3については、ベクターpVM036中の2D-VCAM-1をPCR変異誘発のための鋳型として使用した。標的とされる領域において変異誘発プライマーを用いて鋳型を増幅し、隣接領域は非変異誘発性プライマーを用いて増幅した。PCR断片を組み立て、BamHIクローニング部位およびPstIクローニング部位も導入する隣接プライマーを用いた最終PCR反応において増幅した。得られた変異体配列ライブラリーをBamHI酵素およびPstI酵素で消化し、ベクターpVM036中のヒト2D-VCAM-1挿入配列を置換するのに使用した。この連結を用いて、下記の実施例6で説明するレトロウイルスライブラリーを作製した。
【０２４２】
ライブラリー2の場合、ヒト野生型2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)を鋳型として使用した。VLA4結合に直接関与していると予測される2D-VCAM-1のドメイン-1の表面の残基にまたがる(spanning)変異誘発性プライマーを用いて、様々な位置に変異を組み入れた。これらのプライマーを用いていくつかのオーバーラップ断片を増幅し、PCRによって組み立てた。得られた2D-VCAM-1変異体配列ライブラリーを、挿入物の5'末端および3'末端にSfiIクローニング部位およびNotIクローニング部位をそれぞれ挿入するプライマーを用いて増幅した。ライブラリー産物をSfiI制限酵素およびNotI制限酵素で消化し、アガロースゲルを用いて精製し、pS0124ベクターの対応する部位に連結し、エレクトロポレーションによって大腸菌TOP10細胞(Invitrogen)に形質転換した。1時間回復させた後、50ug/mLカルベニシリンを含む2×YT培地中、37℃で一晩、形質転換体を増殖させた。大量調製キット(Quiagen)を用いてライブラリーDNAを作製するために、得られたライブラリー培養物を使用した。典型的なライブラリーは、約9×108個の独立した形質転換体を含んだ。
【０２４３】
実施例6
CHO細胞表面提示を用いた、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの発現およびスクリーニング
pLenti6/V5-D-TOPO(登録商標)に由来するレトロウイルスライブラリーを、ViraPower(商標)レンチウイルスキット(Invitrogen、カタログ番号K4950-00)に含まれる推奨に従って、293FT細胞中で作製した。簡単に説明すると、pLenti6/V5-D-TOPO(登録商標)ベースのライブラリーおよびパッケージングプラスミド(ViraPower(商標)レンチウイルスキットに含まれる)を293FT細胞に同時トランスフェクトして、レトロウイルス粒子を作製した。48時間後、レトロウイルス粒子を含む上清を回収し、フィルター滅菌して細胞片を除去し、続いて、CHO-K1細胞を感染させるために使用した。CHO K1細胞をウイルス希釈系列に感染させ、製造業者の推奨に従うことによって、レトロウイルス力価を評価した。ブラストサイジン選択(5mg/L)を感染後3日目に開始し、安定な細胞プールが生じるまで(12日)、2〜3日毎に選択培地を補充した。
【０２４４】
CHO細胞表面に提示された2D-VCAM-1変異体ライブラリーを、FACSに基づいた数回の濃縮に供した。第1のラウンドは、抗V5-FITC mAbで標識される検出可能レベルの2D-VCAM-1-Cκ-V5組換えタンパク質を提示する細胞を濃縮することを狙いとした。抗V5-FITC mAbが陽性である細胞を集め(母集団の22％)、細胞培養によって増幅(amplified)した。濃縮したライブラリー細胞を、可溶性VLA4-Fcに結合する2D-VCAM-1変異体を提示する細胞を選別することを狙いとする後続のFACSラウンドに供した。21℃で1時間、200nM VLA4-Fcと共に細胞をインキュベートし、抗IgG1-PEモノクローナル抗体を用いて、結合したVLA4-Fcを定量した。抗V5-FITCモノクローナル抗体で細胞を同時染色することによって、組換えタンパク質提示レベルを評価した。ヒト2DVCAM-1を提示する細胞と比べて強いVLA4-Fc/V5染色を示す細胞を選別し、細胞培養で増幅した。選別された集団は、後続のラウンドにおける全細胞の6％および14.5％に相当した。
【０２４５】
最後に、FACS解析の間に、解離速度に基づく2回の連続した競合にライブラリーを供した。抗IgG-PEモノクローナル抗体による染色の前に、5μM Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 10)の存在下で、2D-VCAM-1変異体ライブラリーを提示する細胞をVLA4-Fcに結合させた。したがって、Q38L-2D-VCAM-1変異体よりもVLA4-Fcに良く結合する2D-VCAM-1変異体を提示する細胞のみが、実質的なPEシグナルを保持すると予想された。2回の連続した解離速度競合において、細胞の約5％および14％が選別された。
【０２４６】
ラウンド4およびラウンド5の濃縮から得られた細胞を、限界希釈クローニングを用いて96ウェル培養プレートに単一細胞として播種し、増幅して、クローン細胞株を得た。これらの細胞株をVLA4-Fc結合およびV5結合についてのFACS染色に供し、ヒト2D-VCAM-1ポリペプチドまたはQ38L-2D-VCAM-1ポリペプチドのいずれかを発現する対照細胞と比較した。並行して、2D-VCAM-1挿入DNAをPCRによって細胞株から増幅し、配列決定に供した。配列データとFACS結合データの相互関係を明らかにして、VLA4-Fc結合が改善している2D-VCAM-1変異体を同定した。
【０２４７】
実施例7
ファージ提示を用いた2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの発現、パンニングおよびスクリーニング
エレクトロポレーションによってライブラリーDNAを大腸菌TG1細胞(Stratagene)に形質転換した。2D-VCAM-1変異体のライブラリーを提示するファージ粒子の産生(product)を援助するためのM13K07(約1E+10cfu/ml)ヘルパーファージを追加して、ライブラリー培養物を一晩増殖させた。一晩培養物を6,000rpmで10分間遠心分離し、4分の1の体積量の5×PEG/NaCl(20％w/vポリエチレングリコール(PEG)8000、2.5M NaCl)と共に氷上で30分間インキュベーションし、10,000rpmで40分間遠心分離することによって、上清中のライブラリーファージ粒子を沈降させた。ファージ沈殿物を1〜2mlのTBS+1％BSAに再懸濁し、微量遠心管に入れて最大速度で5分間遠心分離することによって清澄化し、使用するまで氷上で保存した。
【０２４８】
TBS-M(25mM Tris pH 7.5; 150mM NaCl; 1mM MnCl2)に溶かした2ug/mLのVLA4-Fcタンパク質1mLで、NUNC Maxisorb(商標)イムノチューブ(immunotube)を4℃で一晩コーティングした。別のチューブを対照としてBSA 1mLでコーティングした。イムノチューブをTBS-MT(TBS-M+0.05％TWEEN-20)中で洗浄し、TBS-MT中3％ミルクによって室温で1時間ブロッキングした。上記のライブラリーファージ調製物をイムノチューブに添加し、2時間結合させた。チューブをTBS-T(0.05％TWEEN-20を含むTBS)で入念に(rigorously)洗浄し、結合したファージ粒子を1/10体積量の1M Tris pH 9.0で中和した1％BSA中0.2Mグリシン、pH2.2を用いて溶出させた。この溶出物を用いて、ナイーブなTG1細胞を感染させた。VLA4でコーティングしたチューブおよびBSAでコーティングしたチューブの両方に由来する試料感染培養物を選択培地上に播種して、ファージ粒子の数を推定し、個別のコロニーを得た。VLA4でコーティングしたチューブに由来する残存培養物を用いて、前述のようにしてファージを調製した。パンニング工程を5回繰り返した。
【０２４９】
各ラウンドの濃縮後に得られた個々のファージミドクローンの試料を、ファージELISA形式を用いてVLA4-Fc結合についてスクリーニングした。2×YT+Carb50を含む96ウェルプレートに個々のファージミドクローンを播種し、以下のようにハイスループットな(HTP)ファージ調製物を作製するために使用した。最初に、96ウェルのディープウェルブロックに入れたウェル1個当たり1mlの2×YT+Carb50にこれらのクローンを播種し、M13KO7ヘルパーファージ(Invitrogen)の存在下で一晩増殖させた。これらのブロックを遠心分離し、上清を回収し、VLA4-Fcへの結合についてELISAアッセイ法によってスクリーニングした。TBS-M中5ug/ml VLA4-Fcで、NUNC MAXISORPプレートを4℃で一晩コーティングした。TBS-MTで洗浄した後、ファージ上清を1時間インキュベートし、洗浄し、抗M13-HRP抗体結合体(GE Health Care)の1:5000希釈物と共にインキュベートすることによって、結合されたファージを検出した。TBS-MTで洗浄した後、TMB-H2O2(Pierce)とのインキュベーションによって、結合された抗体シグナルを推定し、発色後に2M H2SO4で反応を停止させた。プレートの450nmでの吸光度を読み取った。また、ファージミドクローンを、QIAGENミニプレップキットを用いてファージミドDNAを調製するのにも使用し、配列決定した。配列データをELISAデータと合わせて、最も高頻度で出現し、かつ/または良好なVLA4-Fc結合を示すクローンを同定し、これらを実施例8で説明する通りにして精製した。
【０２５０】
実施例8
2-D VCAM-1変異体ポリペプチドの発現、リフォールディングおよび精製
A.  大腸菌における発現のための2D-VCAM-1配列のサブクローニング
発現させようとする2D-VCAM-1配列を細菌発現ベクターpVM-EcVec中にサブクローニングした。プラスミドpVM-EcVecは、プラスミドpQE81(Clontech)に由来し、大腸菌における増殖および選択のためのcolE1起点およびカナマイシン耐性マーカー、lacオペレーターおよびT5プロモーター配列からなり、標的遺伝子の発現を推進するIPTG誘導性プロモーター、ならびにその産生物が誘導性プロモーターを制御するlacIリプレッサー遺伝子を含む。2D-VCAM-1配列の5'末端にHisタグ配列および3'末端にHindIII制限部位を加えるプライマーを用いて、サブクローニングしようとする2D-VCAM-1遺伝子を供給源ベクター(ライブラリースクリーニングによって得たCHO表面提示ベクターまたはファージミドベクターのいずれか)からPCR増幅した。このPCR産物を再増幅して、2D-VCAM-1配列の5'末端にEcoRI制限部位、リボソーム結合部位、および開始ATGコドンを付加した。PCR産物をEcoRIおよびHindIIIで消化し、同じ酵素で消化したpVM-EcVec中にサブクローニングした。得られたプラスミドを配列決定して2D-VCAM-1配列を確認し、次いで、2D-VCAM-1ポリペプチドの発現および精製のためにW3110大腸菌株に形質転換した。
【０２５１】
タグ無し型の2D-VCAM-1変異体を発現させるためのプラスミドを次のようにして構築した。(前述した通りの)Hisタグ付き型の2D-VCAM-1変異体を含むプラスミドを、2D-VCAM-1変異体ORF(open-reading frame)の5'のすぐ近くにEcoRI制限部位、リボソーム結合部位、および開始ATGコドンを導入するフォワードプライマーならびに2D-VCAM-1 ORFの終止コドンの後ろにHindIII制限部位を導入するリバースプライマーを用いるPCR増幅のための鋳型として使用した。前述した通りにEcoRI制限酵素およびHindIII制限酵素を用いて、PCR産物をpVM-EcVec中にサブクローニングし、次いで、発現および精製のためにW3110大腸菌に形質転換した。
【０２５２】
B.  細菌培養物の調製:
2D-VCAM-1変異体ポリペプチドおよびHisタグペプチドの翻訳融合物を発現するトランスジェニック大腸菌株を、50μg/mLカナマイシンを添加した2×YT液体培地3ml中、37℃で4〜6時間、振盪インキュベーターにおいて増殖させた。4〜6時間後、50μg/mLカナマイシンおよび0.5％グルコースを添加した2×YT培地100mlを入れた500ml容振盪フラスコに培養物を移した。振盪インキュベーターにおいて37℃で一晩、培養物を増殖させた。翌日、50μg/mLカナマイシンを添加した2×YT液体培地250mlを入れた1L容振盪フラスコに培養物を移した。組換えタンパク質の発現を促進するために、培養フラスコに1.5mMになるまでIPTGを添加した。振盪インキュベーターにおいて37℃で4時間、培養物を誘導した。
【０２５３】
C.  大腸菌からの封入体の単離:
細菌培養物をIPTG処理した後、5000gで15分間の遠心分離によって大腸菌細胞を単離した。上清を廃棄した。さらに使用するまで、細菌沈殿物を-20℃で保存した。抽出する前に、細菌沈殿物を1時間解凍した。解凍した沈殿物を再懸濁し、製造業者の取扱い説明書に従ってBPER(Pierce、カタログ番号78248)を用いて溶解した。氷上に20分間置いた後、15,000gで15分間の遠心分離によって封入体を回収した。上清を廃棄した。次いで、沈殿物を精製のために処理した。
【０２５４】
D.  精製:
1.  Hisタグ付き2D-VCAM変異体の捕捉工程:
IMAC精製のために、大腸菌から単離された封入体を平衡緩衝液30ml中に溶解した。15,000gで15分間の遠心分離によって、大型の砕片を除去した。上清をデカントし、上清の総体積を40mlにするのに十分な量の平衡緩衝液を添加した。溶解物を0.22μmフィルターに通してろ過し、続いて、Ni-セファロースカラムに添加した。
【０２５５】
Ni-セファロースカラムを10カラム容量の50mM TRIS、200mM NaCl、6M尿素、5mM DTT pH8.0で平衡化した。溶解物を添加した後に、20カラム容量の平衡緩衝液でカラムを洗浄した。50mM TRIS、300mMイミダゾール、6M尿素、2mM DTT pH8.0中にタンパク質を溶出させた。
【０２５６】
2.  Hisタグ付き2D-VCAM-1変異体のリフォールディング:
1mM還元型グルタチオンおよび1mM酸化型グルタチオンを含む50mM TRIS、200mM NaCl pH8に加えて希釈することによって、リフォールディングを遂行した。リフォールディングされたものにおけるタンパク質濃度は0.1mg/mlまたはそれ以下に保った。尿素およびDTTの影響を打ち消すために、最小希釈率1/40を用いた。リフォールディングは、4℃で一晩実現した。
【０２５７】
3.  SEC精製:
Superdex 200カラムによって変異体をさらに精製するために、まず、Centricon Plus 70遠心ろ過装置を用いて、リフォールディングされたタンパク質を約1mlになるまで濃縮した。濃縮されたタンパク質のおよそ半分をSuperdex200サイズ排除カラムに添加した。50mM TRIS、200mM NaCl pH 8.0でカラムを溶出させた。濃縮されたタンパク質の残り半分を用いて精製を繰り返した。タンパク質をSDS-PAGEによって解析した。
【０２５８】
実施例9
α4-Fc、VLA4-FcおよびLPAM-1-Fcの発現についてのELISAアッセイ法
A.  α4-FcについてのELISAアッセイ法:
2μg/mL mAbを添加したPBS(Invitrogen、カタログ番号BE17-512F)100μLを用いて、Fcドメインに特異的なマウス抗ヒトIgG1 mAb(Serotec、カタログ番号MCA514G)を黒色のMaxySorb 96ウェルプレート(Nunc、カタログ番号43711)に吸着させた。4℃で約16時間インキュベーションした後、ウェルを洗浄緩衝液(PBS-T)200μLで2回洗浄し、続いて、25mg/mLカゼイン(Fluka、カタログ番号22080)を含む洗浄緩衝液200μLによって21℃で90分間、ブロッキングした。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、培地試料(100μL/ウェル)と共に2時間インキュベートし、洗浄緩衝液で3回洗浄した。2.5mg/mLカゼインおよび0.4μg/mLビオチン標識抗ヒトインテグリンα4(Serotec、カタログ番号MCA1949B)を添加した100μL/ウェルのPBSと共にプレートをインキュベートすることによって、α4-Fc組換えタンパク質の検出を実施した。21℃で90分間インキュベーションした後、プレートを3回洗浄し、2.5mg/mLカゼインを添加した洗浄緩衝液中で200倍希釈した100μL/ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ストレプトアビジン(R&D Systems、カタログ番号890803)と共に30分間インキュベートした。オービタルシェーカー上で100μL/ウェルのSuperSignal化学発光基質(Pierce、カタログ番号37069)と共にプレートを20分間インキュベートすることによって、HRPを検出した。発光シグナルをマイクロプレートシンチレーション(Microplate Scintillation)および発光カウンター(Luminescence Counter)(Packard TopCount(商標) Liquid Scintillation Counter LSC)によって測定した。
【０２５９】
B.  VLA4-Fc(α4-Fc/β1-Fc)を推定するためのサンドイッチELISA:
PBS中2ug/ml抗CD49d(すなわち抗α4)抗体で、NUNC MAXISORPプレートを4℃で一晩コーティングした。これらのプレートをPBS-Tで4回洗浄し、室温で1時間、PBS中3％ミルクでブロッキングした。洗浄後、上清試料を2倍希釈して滴定した。また、各プレートは、10ug/mlから始まる標準物質VLA4-Fcの2倍タイトレーション系列(titration series)も含んだ。PBS-T中1％ミルクの存在下で結合を行った。室温で1時間インキュベーションした後、これらのプレートをPBS-Tで4回洗浄し、室温で1時間、1％ミルクを含むPBS-Tに溶かした0.4ug/mlのビオチン標識抗CD29(すなわち抗β1)抗体をウェル1個当たり50ul加えて、インキュベートした。これらのプレートをPBS-Tで4回洗浄し、PBS-T中で1:2000希釈したストレプトアビジン-HRPと共にインキュベートし、もう一度、PBS-Tで4回洗浄した。50ul/ウェルのTMBPlus基質を添加し、発色するまで室温でインキュベートし、その後、2M H2SO4を用いて反応を停止させ、SoftMaxPlusソフトウェアを用いてプレートリーダーによってプレートを読み取ることによって、HRPを検出した。GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)によってデータを解析して検量線を得、これを用いて、上清試料中のヘテロダイマーの濃度を算出した。
【０２６０】
C.  LPAM-1-Fc(α4-Fc/β7-Fc)を推定するためのサンドイッチELISA
上清中のα4-Fc/β7-Fcヘテロダイマーを推定するために使用したサンドイッチELISAは、上記で使用した手順と同様であり、以下の変更点を伴った。2ug/mlのPBS中抗β7抗体でプレートをコーティングし、0.4ug/mlのビオチン標識抗α4抗体を用いてヘテロダイマーを検出した。検量線をプロットするために、標準LPAM1-Fcタイトレーションを各プレートに含めた。
【０２６１】
実施例10
2D-VCAM-1:VLA4-Fc結合についてのELISAアッセイ法
対照タンパク質(例えば、Q38L-2D-VCAM-1またはヒト2D-VCAM-1)と比べた、固定されたVLA4-Fc(α4-Fc/β1-Fc)ヘテロダイマーに対する様々な2D-VCAM-1変異体の相対的結合親和性を固相ELISAアッセイ法によって測定した。4℃で一晩、TBS-M(1mM MnCl2を含むTBS(25mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl))中2ug/mlのVLA4-Fcヘテロダイマー50ulでMAXISORP(商標)ELISAプレート(NUNC)をコーティングし、TBS-T(0.05％ TWEEN-20を含むTBS)で洗浄し、室温で1時間、TBS-M中3％ミルク200ulでブロッキングし、TBS-Tで再び洗浄した。分析しようとする精製2D-VCAM変異体の4倍希釈系列を、COSTAR U底プレートにおいてTBS-TMC(0.05％Tween-20、1mM MnCl2、および1％カゼインを含むTBS;Sigma)中に開始濃度8.2uM(200ug/ml)で溶かして作製した。希釈系列をELISAプレートに移し、このプレートを室温で2時間インキュベートし、続いてTBS-Tで洗浄した。TBS-TMC中0.5ug/mlビオチン標識抗ヒトVCAM抗体(R&D Systems、カタログ番号BAF809)と共に室温で1時間インキュベーションし、次いで、TBS-MT(TBS+1mM MnCl2および0.02％TWEEN-20)で洗浄し、その後、TBS-TMC中ストレプトアビジン-HRP(BD Biosciences、カタログ番号554066)の1:2000希釈物と共に室温で30分間インキュベーションすることによって、結合された2D-VCAMタンパク質を検出した。TBS-MTで最終的な洗浄を行った後、暗所で室温と同等の温度にした(equilibrated)TMBPlus基質(Kem Diagnostics、カタログ番号4390A)50ulを各ウェルに添加し、発色を目で見て追跡した。典型的な顕色時間は、5〜15分の範囲であった。2M H2SO4(EM、カタログ番号SX1244-75)50ulを添加することによって発色を停止させた。SpectraMax Softmax Pro分光光度計(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて、450nMにおける吸光度を迅速に測定し、GraphPad Prism(商標)ソフトウェア(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)を用いて、タンパク質濃度に対して吸光度をプロットすることによってEC50値を算出した。同じプレートで分析した対照タンパク質(例えば、Q38L-2D-VCAM-1またはヒト2D-VCAM-1)を基準とした結合の改善倍率を算出した。表3Aは、Q38L-2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 10)またはヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)のいずれかを基準とした、代表的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドによって示されるVLA4への結合の改善倍率を示す。
【０２６２】
（表３Ａ）ELISAアッセイ法におけるVLA4-Fcへの結合の改善倍率
2013528374.tif 000008
【０２６３】
表3Bは配列置換の表を提供する。
【０２６４】
（表３Ｂ）
2013528374.tif 000009
【０２６５】
実施例11
2D-VCAM-1:LPAM-1-Fc結合についてのELISAアッセイ法
対照タンパク質(例えば、Q38L-2D-VCAM-1またはヒト2D-VCAM-1)と比べた、固定されたLPAM-1-Fc(α4-Fc/β-7-Fc)ヘテロダイマーに対する様々な2D-VCAM変異体タンパク質の相対的結合親和性を固相ELISAアッセイ法によって測定した。4℃で一晩、LPAM-1-Fcヘテロダイマー(TBS-M中、つまりTBS(1mM MnCl2を含む25mM TRIS-HCl pH7.5、150mM NaCl)中2ug/ml)50ulでMAXISORP(商標)ELISAプレート(NUNC)をコーティングし、TBS-T (0.05％ Tween-20を含むTBS)で洗浄し、室温で1時間、TBS-M中3％ミルク200ulでブロッキングし、TBS-Tで再び洗浄した。分析しようとする精製2D-VCAM-1変異体の4倍希釈系列を、COSTAR U底プレートにおいてTBS-TMC(0.05％Tween-20、1mM MnCl2、および1％カゼインを含むTBS;Sigma)中に開始濃度8.2uM(200ug/ml)で溶かして作製した。希釈系列をELISAプレートに移し、このプレートを室温で2時間インキュベートし、続いてTBS-Tで洗浄した。TBS-TMC中0.5ug/mlビオチン標識抗ヒトVCAM抗体(R&D Systems、カタログ番号BAF809)と共に室温で1時間インキュベーションし、次いで、TBS-Tで洗浄し、その後、TBS-TMC中ストレプトアビジン-HRP(BD Biosciences、カタログ番号554066)の1:2000希釈物と共に室温で30分間インキュベーションすることによって、結合された2D-VCAM-1タンパク質を検出した。TBS-Tで最終的な洗浄を行った後、暗所で室温と同等の温度にしたTMBPlus基質(Kem Diagnostics、カタログ番号4390A)50ulを各ウェルに添加し、発色を目で見て追跡した。典型的な顕色時間は、5〜15分の範囲であった。2M H2SO4(EM、カタログ番号SX1244-75)50ulを添加することによって発色を停止させた。SpectraMax Softmax Pro分光光度計(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて、450nMにおける吸光度を迅速に測定し、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)を用いて、タンパク質濃度に対して吸光度をプロットすることによってEC50値を算出した。同じプレートで分析した対照タンパク質(Q38L-2D-VCAM-1)を基準とした結合の改善倍率を算出した。
【０２６６】
表4は、Q38L-2D-VCAM-1を基準とした、代表的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドによって示されるLPAM-1への結合の改善倍率を示す。
【０２６７】
（表４）ELISAアッセイ法におけるLPAM-1-Fcへの結合の改善倍率
2013528374.tif 000010
【０２６８】
実施例12
表面プラズモン共鳴(SPR;BIACORE解析)を用いた、VLA4-Fc融合タンパク質およびLPAM-1-Fc融合タンパク質に対する2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの結合親和性の測定
本実施例では、Biacore相互作用解析を用いて、VLA4-Fcリガンドおよび/またはLPAM-1-Fcリガンドに対する結合親和性の改善に基づいて2D-VCAM-1変異体ポリペプチドをスクリーニングするための手順を説明する。このタイプの解析を説明するのに使用される学術用語では、固定された結合相手が「リガンド」と呼ばれ、移動相中の結合相手が「分析物」と呼ばれる。典型的には、結合親和性の強さは、利用可能なリガンドの50％が平衡状態で結合される分析物のモル濃度を示す平衡解離定数(KD)の観点から説明される。
【０２６９】
このスクリーニング方法では、Biacoreセンサーチップを抗ヒトIgGで誘導体化した。これらの表面にVLA4-FcリガンドまたはLPAM-1-Fcリガンドを捕捉した後、緩衝液に溶かした2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに、リガンドでコーティングしたセンサーチップの上を流れさせた。2D-VCAM変異体ポリペプチドが特異的結合相手(すなわち、VLA4-FcまたはLPAM-1-Fc)に結合する能力を評価した。また、対照タンパク質(すなわち、ヒト2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 2)またはQ38L-2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 10))にも、リガンドでコーティングしたセンサーチップの上を流れさせ、これらの分子がVLA4-FcまたはLPAM-1-Fcに結合する能力を比較用に同様に評価した。Biacoreシステムを用いて、VLA4-FcリガンドまたはLPAM-1-Fcリガンドに結合する関心対象のタンパク質の結合速度定数(kon)および解離速度定数(koff)を評価し、平衡解離定数KDを算出するために使用することができる。ヒト2D-VCAM-1および/またはQ38L-2D-VCAM-1と比べてVLA4-Fcおよび/またはLPAM-1-Fcに対する結合親和性が高い変異2D-VCAM-1ポリペプチドを同定した。
【０２７０】
BIACORE解析はすべて、BIACORE 2000システムまたはBIACORE 3000システム(GE Healthcare)を用いて室温(RT、25℃)で実施した。特に指定した場合を除いて、1mM MnCl2を添加したHBS-P緩衝液(10mM Hepes(pH7.4)、150mM NaCl、0.005％サーファクタントP20)(HBS-P-Mn)をすべての実験用のフローバッファーとして使用した。
【０２７１】
A.  動態学的2D-VCAM-1結合アッセイ法
動態学的2D-VCAM-1アッセイ法では、センサーチップに塗られた二量体リガンド(例えば、VLA4-Fc融合タンパク質またはLPAM-1-Fc融合タンパク質)および単量体分析物(例えば2D-VCAM-1変異体ポリペプチド)の移動相における結合動態を測定する。製造業者のプロトコールに従って、ヤギ抗ヒトIgG抗体(Jackson ImmunoResearch、カタログ番号105-005-098)をCM-5センサーチップ(GE Healthcare、カタログ番号BR-1000-14)に固定した。固定化緩衝液(10mM酢酸ナトリウム、pH5.0(GE Healthcare、カタログ番号BR-1003-51))中で抗体を30μg/mlになるまで希釈した。流速5μl/分で、EDC/NHS混合物(等体積の11.5mg/ml EDCおよび75mg/ml NHSを混合することによって作製(GE Healthcare、カタログ番号BR1000-50))35μlを注入し、続いて希釈抗体35μlを注入して、センサーチップCM-5を活性化した。1Mエタノールアミン-HCl、pH8.5(GE Healthcare、カタログ番号BR-1000-50)35μlによって未反応部位の反応を停止させた。この手順により、典型的には15,000応答単位(RU)の結合抗体が得られた。実施例3および実施例4でそれぞれ説明した通りにして調製したVLA4-FcまたはLPAM-1-Fcを、リガンド溶液(HBS-P-Mn緩衝液に溶かした20μg/mlのタンパク質、流速10μl/分)20μlを注入することによって、抗体でコーティングしたセンサーチップに結合させた。リガンド捕捉レベルは典型的には200〜300RUであった。2D-VCAM-1変異体ポリペプチドをHBS-P-Mn中で希釈し、リガンドでコーティングしたセンサーチップの上に30μl/分で2分間流し、続いて、タンパク質を含まないHBS-P-Mnと共に同じ流速で5分間インキュベーションした。VLA4-FcまたはLPAM-1-Fcからの解離速度が非常に遅い2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの場合、より長い解離時間(例えば20分)も用いて動態学的アッセイ法を行った。2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのRmaxシグナルレベルは、約5〜25RUの範囲であった。50μl/分で10mMグリシン緩衝液(pH1.7)と共に200秒間インキュベーションすることによって、サイクル間の再生を実施した。実際の実験での使用に先立って、新しいチップを4〜5サイクルの捕捉/結合/再生に供した。ヤギ抗ヒトIgG捕捉抗体のみを含む参照セルからのデータを、補足されたVLA4-FcまたはLPAM-1-Fcを含むフローセルから得られたデータから差し引いた。典型的には、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの150nM〜0.069nMの範囲の希釈物8種をブランク参照(HBS-P-Mn緩衝液のみ)に対して解析した。各単量体融合タンパク質は、そのC末端がヒスチジンタグに共有結合的に融合されている、成熟2D-VCAM-1ポリペプチドまたは成熟した本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド(SEQ ID NO: 12、14、16、18、20、22、もしくは24など)を含む。
【０２７２】
典型的なBiacore解析のセンサーグラムトレースを図3に示す。この図は、VLA4-Fc融合タンパク質に対する次の2D-VCAM-1タンパク質の結合によって生じた応答(RU)の経時変化(単位:秒(s))を示す:(1)ヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2、対照としての機能を果たし、比較用となる);(2)Q38L-2D-VCAM-1(「Q38L」、SEQ ID NO: 10);および(3)クローン146と呼ばれる例示的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド(SEQ ID NO: 18)。
【０２７３】
結合相(association phase)は、関心対象の分析物と関心対象のリガンドとの結合を反映する。図3において、各分析物の結合相は、矢印を付けた時点より前の時点の曲線によって表され、VLA4-Fcリガンドへの分析物(すなわち、ヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)、Q38L-2D-VCAM-1(「Q38L」、SEQ ID NO: 10)、または2D-VCAM-1クローン146(SEQ ID NO: 18))の結合を特徴とする。分析物がVLA4-Fcリガンドと結合する速度は、曲線に反映されている。例えば、約620秒の時点で始まる応答単位の急激な上昇率を参照されたい。
【０２７４】
解析の解離相は、図3で矢印を付けた時点に始まる。解離相の間、分析物およびリガンドは、それらが結合した立体構造から解離する。図3において、分析物がVLA4-Fcリガンドから解離する速度は、応答単位の減少によって表される(ある期間における応答単位の減少率)。これらのデータに基づいて、相対的な解離速度定数(「オフ」レート、koff、またはkd)および結合速度定数(「オン」レート、kon、またはka)を決定することができる。相互作用の親和性の合計は、KD、すなわち(koff)/(kon)によって説明することができる。結合親和性の増大は、より遅い解離速度によってしばしば顕在化する。このより遅い解離速度が、等しいか、より速いか、またはわずかに遅い結合速度を伴い、その結果、計算される平衡解離定数KDが小さくなる場合には、親和性がより大きいと考えられる。この場合、VLA4-Fcリガンドに対する結合親和性が、同じリガンドに対する野生型2D-VCAM-1の結合親和性よりも大きい2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、野生型2D-VCAM-1よりもリガンドからの解離速度も遅いと考えられる。
【０２７５】
VLA4-Fcリガンドに対する結合親和性が、同じリガンドに対するQ38L-2D-VCAM-1ポリペプチドの結合親和性よりも大きい2D-VCAM-1変異体ポリペプチドはまた、Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチドよりも遅いリガンドからの解離速度を有する場合がある。
【０２７６】
図3は、VLA4-FcリガンドからのQ38L-2D-VCAM-1ポリペプチドの解離速度が、同じリガンドからの野生型2D-VCAM-1ポリペプチドの解離速度より有意に遅いことを示す。また、Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチドがVLA4-Fcリガンドに結合するための結合速度は、野生型 2D-VCAM-1において観察されるものに似ている。したがって、野生型2D-VCAM-1と比べて、Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチドの方がVLA4-Fcリガンドに対する親和性が高い。図3はまた、例示的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド(クローン 146; SEQ ID NO: 18)の方が、野生型2D-VCAM-1またはQ38L-2D-VCAM-1ポリペプチドのいずれかよりもVLA4-Fcリガンドからの解離速度が遅いことも示す。また、例示的な2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、VLA4-Fcリガンドに対する野生型2D-VCAM-1またはQ38L-2D-VCAM-1ポリペプチドのいずれかの結合速度と比べて、VLA4-Fcリガンドに結合するための結合速度が同様である。したがって、例示的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの方が、野生型2D-VCAM-1またはQ38L-2D-VCAM-1ポリペプチドのいずれかよりも、VLA4-Fcリガンドに対して高い結合親和性を示す。したがって、例示的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、ヒトなどの哺乳動物のローリング白血球においてインビボで発現される、例えば活性化VLA4を含む天然VLA4に、より高い結合親和性で結合すると予想される。この結論は、下記の実施例で考察する機能的な細胞ベースのアッセイ法によってさらに裏付けられる。
【０２７７】
本発明の他の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを用いて、前述した通りにしてBiacore解析を実施した。さらに、LPAM-1-Fcでコーティングしたセンサーチップおよび本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドを用いて、Biacore解析を実施した。図4は、LPAM-1-Fc融合タンパク質に対する次の2D-VCAM-1タンパク質の結合によって生じたある期間に渡る(RU)のセンサーグラムトレース(単位:秒(s))を示す:(1)ヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2、対照としての機能を果たし、比較用となる);(2)Q38L-2D-VCAM-1(「Q38L」、SEQ ID NO: 10);および(3)クローン146と呼ばれる例示的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド(SEQ ID NO: 18)。
【０２７８】
これらの2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの解離速度および結合親和性を測定し、野生型2D-VCAM-1およびQ38L-2D-VCAM-1ポリペプチドの解離速度および結合親和性と比較した。代表的な結果を下記の表5および表6に示す。
【０２７９】
B.  標準的なBIACOREデータ解析
センサーグラムの再生部分および捕捉部分を削除した後、試料注入の約10秒前のすべての曲線の5秒間の平均に曲線の0の位置を合わせた。各試験曲線からブランク曲線を差し引いた。「フィットカイネティクス、同時ka/kd(Fit kinetics, Simultaneous ka/kd)」機能を用いて、BIAevaluationソフトウェア(v4.1、GE Healthcareから入手可能)によってデータを解析した。注入開始時期は、すべての曲線が0に近い、結合相の前の時点と定義した。結合相についてのデータ選択は、注入開始時点から約10秒後に開始し、注入停止時点より約10秒前に終了した。注入停止時点は、解離相に関連する任意のシグナルスパイクが出現する前の時点と定義した。解離相は、注入停止時点から10秒後に開始するように選択し、5分の解離相の内の280〜295秒を含んだ。1:1ラングミュア(Langmuir)モデルは、反応A+B<=>ABを説明する。このモデルは、関心対象の単一のタンパク質(例えば受容体)に対する単一のリガンド結合を表す。BIAevaluationソフトウェアの1:1ラングミュアモデルを用いて、結合速度定数(ka)および解離速度定数(kd)を決定し、平衡解離定数KDを算出した。KD=kd/ka。KD=([A][B])/[AB]。平衡解離定数KDは、平衡結合定数KAの逆数に等しい。KD=1/KA。反応の速度式(分析物AにリガンドBを加えると複合体ABを生じる)は、次の通りである:d[B]/dt=-(ka[A][B]-kd[AB])およびd[AB]/dt=ka[A][B]-kd[AB](A=注入される分析物、B=遊離リガンド、およびt=時間)。[AB]を所与の時点のBiacore応答単位R(RU)で、[B]をRmax-Rで、および[A]をC(分析物濃度)で置き換えることにより、Biacore単位の正味の速度式は、dR/dt=kaC(Rmax-R)-kdR(t0でのR=0、B[0]=Rmax、およびAB[0]=0RU)となり、総応答=[AB]+RI)となる。バルクシフト(RI)を0に設定し、全曲線に対してRmax、ka、およびkdを全体的にフィットさせた。
【０２８０】
前述の標準的な動態学的アッセイ法およびデータ解析を、代表的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドならびにQ38L 2D-VCAM-1ポリペプチドおよびヒト2D-VCAM-1ポリペプチドの調製物に対して実施した。表5および表6は、代表的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドについての結合データを要約する。
【０２８１】
（表５Ａ）
2013528374.tif 000011
【０２８２】
表5Aは、前述の標準的なBIACOREアッセイ法によって測定した、VLA4-Fcに対する代表的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの結合親和性を示す。具体的には、表5Aは、本発明の各2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの呼称;2D-VCAM-1ポリペプチドまたはポリペプチド変異体のポリペプチド配列に対応する配列識別番号(SEQ ID NO);VLA4-Fcに対する2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの結合に基づいて決定された平衡解離定数(KD(モル濃度(M));およびVLA4-Fcに対する野生型2D-VCAM-1の結合親和性と比べた、VLA4-Fcに対する各2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの結合親和性を示す。(一番右の列に示す)この相対的結合親和性は、VLA4-Fcに対する野生型2D-VCAM-1ポリペプチドの結合親和性と比べた、VLA4-Fcに対する2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの結合親和性の改善倍率として示す。さらに、ヒト2D-VCAMのVLA4-Fc結合親和性と比べた、Q38L 2D-VCAM-1ポリペプチドのVLA4-Fc結合親和性の改善倍率も示す。
【０２８３】
表5Aに示した通り、代表的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのVLA4-Fc結合親和性は、(1)VLA4-Fcリガンドに対する野生型2D-VCAM-1の結合親和性と少なくともほぼ等しいか、もしくはそれより大きい;かつ/または(2)VLA4-Fcリガンドに対するQ38L 2D-VCAM-1ポリペプチドの結合親和性と少なくともほぼ等しいか、もしくはそれより大きい。VLA4-Fcに対する野生型 2D-VCAM-1の結合親和性を基準としたVLA4-Fcリガンドに対する結合親和性の改善倍率を、代表的な各2D-VCAM-1変異体について示す(表5Aの4番目の列を参照されたい)。
【０２８４】
本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの多くが、VLA4-Fcからの野生型2D-VCAM-1の解離速度よりも遅い、VLA4-Fc 融合タンパク質からの解離速度を有することが判明した。
【０２８５】
表5Aに示す代表的な2D-VCAM-1変異体ポリペプチドはすべて、野生型2D-VCAM-1のVLA4-Fc平衡解離定数より小さいVLA4-Fc平衡解離定数(KD)を有していた。さらに、表5Aに示す2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの大半が、Q38L 2D-VCAM-1ポリペプチドのVLA4-Fc平衡定数より小さいVLA4-Fc平衡解離定数を有していた。
【０２８６】
表5Aに示す代表的な2D-VCAM-1変異体ポリペプチドはすべて、ヒト野生型2D-VCAM-1のVLA4-Fc結合親和性より大きいVLA4-Fc結合親和性を有していた(野生型2D-VCAM-1を基準として算出したVLA4-Fc結合親和性の改善倍率を表5Aの4番目の列に示す)。さらに、表5Aに示す2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの多くは、Q38L 2D-VCAM-1ポリペプチドのVLA4-Fc結合親和性より大きいVLA4-Fc結合親和性を有していた(表5Aの3番目の列を参照されたい)。
【０２８７】
ヒト2D-VCAM-1またはQ38L 2D-VCAM-1ポリペプチドのVLA4-Fc結合親和性と比べてVLA4-Fcリガンドに対する結合親和性が大きい本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、ヒト2D-VCAM-1またはQ38L 2D-VCAM-1ポリペプチドとそれぞれ比べて、インビボで炎症を抑制する際の有効性が高くなっている可能性が高い。このような本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、炎症部位へのリンパ球および単球の動員を阻害する上で極めて有効であり、したがって、様々な炎症性疾患および自己免疫に関連した障害の有効な治療薬である可能性がある。
【０２８８】
表5Bは、新しいポリペプチド調製物および新しいVLA-Fcリガンドを用いて再試験し、前述の標準的なBIACOREアッセイ法によって測定した場合の、VLA4-Fcに対する代表的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの結合親和性を示す。対照のヒト2D-VCAM-1またはQ38L 2D-VCAM-1ポリペプチドは再分析しなかった。
【０２８９】
（表５Ｂ）
2013528374.tif 000012
【０２９０】
表6Aは、標準的なBIACOREアッセイ法によって測定した、LPAM-1-Fcに対する代表的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの結合親和性を示す。
【０２９１】
（表６Ａ）
2013528374.tif 000013
【０２９２】
具体的には、表6Aは、代表的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドそれぞれについて、LPAM-1-Fcリガンド結合に関する平衡解離定数(KD(モル濃度(M))および同じリガンドに対する野生型2D-VCAM-1融合タンパク質の結合親和性と比べた、LPAM-1-Fcに対する結合親和性を提供する。各2D-VCAM-1変異体ポリペプチドについて、LPAM-1-Fcリガンドに対する野生型2D-VCAM-1融合タンパク質の結合親和性と比べた、LPAM-1-Fcリガンドに対する結合親和性の改善倍率を示す(表6Aの4番目の列を参照されたい)。野生型ヒト2D-VCAM-1は基準となる。すなわち、LPAM-1-Fcへのその結合親和性を1に設定する。表6Aに示した通り、代表的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのLPAM-1-Fcリガンドに対する結合親和性は、(1)LPAM-1-Fcリガンドに対する野生型2D-VCAM-1の結合親和性と少なくともほぼ等しいか、もしくはそれより大きいか;かつ/または(2)LPAM-1-Fcリガンドに対するQ38L 2D-VCAM-1ポリペプチドの結合親和性と少なくともほぼ等しいか、もしくはそれより大きい。
【０２９３】
いくつかの2D-VCAM-1変異体ポリペプチドが、同じリガンドからの野生型2D-VCAM-1の解離速度とほぼ等しいか、またはそれより大きい、LPAM-1-Fcリガンドからの解離速度を有することが判明した。いくつかの2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、同じリガンドへの野生型2D-VCAM-1融合タンパク質の結合速度とほぼ等しいか、またはそれより大きい、LPAM-1-Fcへの結合速度を有することが判明した。
【０２９４】
表6に示す多くの代表的な2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、野生型2D-VCAM-1のLPAM-1-Fc平衡解離定数より小さいLPAM-1-Fc平衡解離定数(KD)を有していた。さらに、表6Aに示すいくつかの代表的な2D-VCAM-1変異体ポリペプチドが、Q38L 2D-VCAM-1ポリペプチドのLPAM-1-Fc平衡定数と少なくともほぼ等しいLPAM-1-Fc平衡解離定数を有していた。
【０２９５】
表6Aに示す多くの2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、同じリガンドに対するヒト野生型2D-VCAM-1の結合親和性より大きいLPAM-1-Fc結合親和性を有していた(野生型2D-VCAM-1を基準としたLPAM-1-Fc結合親和性の改善倍率を表6Aの4番目の列に示す)。さらに、表6Aに示すいくつかの2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、同じリガンドに対するQ38L-2D-VCAM-1ポリペプチドの結合親和性とほぼ等しいLPAM-1-Fc結合親和性を有していた。
【０２９６】
表6Bは、新しいポリペプチド調製物および新しいLPAM-1-Fcリガンドを用いて再試験し、前述の標準的なBIACOREアッセイ法によって測定した場合の、LPAM-1-Fcに対する代表的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの結合親和性を示す。対照のヒト2D-VCAM-1またはQ38L 2D-VCAM-1ポリペプチドは再分析しなかった。
【０２９７】
（表６Ｂ）
2013528374.tif 000014
【０２９８】
VLA4に対する結合親和性(表5A)とLPAM-1に対する結合親和性(表6A)を比較すると、例示的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの多くが、ヒト2D-VCAM-1またはQ38L-2D-VCAM-1のいずれかによって示されるVLA4/LPAM-1結合親和性の比率よりも大きい、VLA4/LPAM-1結合親和性の比率を示すことが明らかである。言い換えると、いくつかの本発明の2D-VCAM-1変異体は、VLA4およびLPAM-1に対するヒト2D-VCAM-1またはQ38L-2D-VCAM-1のいずれかの相対的親和性と比べると、LPAM-1(インテグリンα4β7)に対する結合親和性よりもVLA4(インテグリンα4β1)に対する結合親和性においてより大きい改善を示す。
【０２９９】
表7は、ヒト2D-VCAM-1の値を基準として、Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチドおよび代表的な本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドに対するVLA4-FcおよびLPAM-1-Fcの結合親和性比率を提供する。これらの比率は、対照および変異体の両方を分析した実験に基づく、表5Aおよび表6Aに示す実験データから導き出した。
【０３００】
（表７）
2013528374.tif 000015
【０３０１】
ヒト2D-VCAM-1またはQ38L-2D-VCAM-1の結合親和性比率と比べて高いVLA4/LPAM-1結合親和性比率を有する2D-VCAM-1変異体ポリペプチド(例えば、VLA4/LPAM-1結合親和性比率が2より大きく、例えば、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、または少なくとも10である)は、LPAM-1結合が望ましくない場合、例えば、LPAM-1結合が、進行性多巣性白質脳症(PML)などの有害な副作用と相関している場合、特に有利であり得る。
【０３０２】
実施例13
α4インテグリン妨害についての静的細胞接着アッセイ法
2D-VCAM-1変異体が細胞表面ヒトVLA4に結合するために、固定されたVCAM-1タンパク質と競合する能力を、U937-VCAM-1細胞接着アッセイ法を用いて定量した。細胞表面にVLA4を有するU937細胞(ATCC)を蛍光色素カルセインAM(Invitrogen)で標識し、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドおよび対照の存在下または非存在下で7D-VCAM-1に結合させた。粘着性細胞に関連した蛍光強度の低下は、VLA4を媒介とした細胞接着が2D-VCAM-1変異体ポリペプチドおよび対照によって競合的に阻害されていることを反映していた。
【０３０３】
最初に、これは、コーティング用緩衝液(HEPES CaMg緩衝液:50mM HEPES、150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、pH7.4)100μlに溶かした5μg/mlの組換えヒト7D-VCAM-1(SEQ ID NO: 6、7ドメイン型のVCAM-1、R&D Systems)で96ウェルプレート(MICROLON 600 High Binding; Greiner Bio-One)をコーティングすること、各プレートを密閉すること、およびプレートを37℃で2時間インキュベートさせることを伴った。逆さまにしてコーティング溶液をデカントし、ブロッキング緩衝液(2％BSAを添加したHEPES CaMg緩衝液)200μlを添加し、室温でさらに1時間インキュベートした。分析する直前に、VCAM-1でコーティングしたプレートを、手作業でまたは96ウェルプレート自動洗浄装置(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いることによってPBS中0.05％TWEEN-20で3回洗浄し、次いで、プレートを逆にし、ブロットした。
【０３０４】
10％FBS、1％ Pen/Strep(Invitrogen)を含むRPMI1640培地(フェノールレッドを含むRPMI培地1640、Invitrogen) 中でU937細胞を維持した。分析する前に、標識用緩衝液(フェノールレッドを含まないRPMI1640培地、10％FBS; Invitrogen)中にU937細胞を再懸濁し、次いで、ローテーターにおいて37℃で30分間、0.5μg/mlカルセイン-AMで標識した。続いて、標識用緩衝液で細胞を3回洗浄し、次いで、アッセイ緩衝液(HEPES CaMgMn緩衝液:50mM HEPES、150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM MnCl2 pH 7.4)中に5×106細胞/mlとなるように再懸濁した。
【０３０５】
試験化合物(すなわち2D-VCAM-1変異体ポリペプチド)を希釈緩衝液中に希釈し、VCAM-1でコーティングしたプレートに添加した。希釈緩衝液(上記のアッセイ緩衝液に0.1％BSAを添加したもの)100μlで満たしたVCAM-1でコーティングしたウェルを、固定されたVCAM-1に対する最大量の細胞粘着を示すための対照として使用した。10μg/ml抗VLA-4抗体(R&D Systems、クローン2B4)100μlを、細胞粘着の最大限の阻害を示す陽性対照として使用した。VCAMではないタンパク質でコーティングされた(すなわち、BSAでブロッキングされた)ウェルを「ブランク」として使用した。カルセイン-AMで標識した細胞100μlを各ウェルに添加した。室温で20分間、プレートをインキュベートし、静置式(static)細胞接着洗浄チャンバー(GlycoTech)においてアッセイ緩衝液で洗浄した。LJL Analyst HT 96.384(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて蛍光強度(励起=485nm、発光=530nm)を測定する前に、280×gで5分間、プレートを遠心沈殿させ、逆さまにしてアッセイ緩衝液をデカントした。
【０３０６】
図5は、抗VLA4抗体(細胞粘着の最大限の阻害を示す陽性対照として使用された)、希釈緩衝液のみ(「未処理」、固定されたVCAM-1への最大量の細胞粘着を示すための対照)、2D-VCAM-1変異体クローン46(SEQ ID NO: 12)、Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 10)、およびヒト2D-VCAM-1(SEQ ID NO: 2)の細胞接着指数を示すグラフである。細胞接着指数は、(VCAMでコーティングされたウェルの蛍光強度)/(VCAM-1でコーティングされていないウェルの蛍光強度)として算出した。VCAM-1でコーティングされていないウェル(「ブランク」)に細胞接着指数=1を与える。図5は、100μg/mlの2D-VCAM-1変異体クローン46が、抗VLA4抗体とほぼ同じくらいU937細胞接着を阻害したことを示す。これに対して、100μg/mlのQ38L-2D-VCAM-1は、U937細胞接着の部分的な阻害しか示さず、100μg/mlのヒト2D-VCAM-1はU937細胞接着の阻害を本質的に全く示さなかった。
【０３０７】
図6は、様々な濃度の可溶性2D-VCAM-1ポリペプチドの存在下での、固定されたVCAM-1に対するU937細胞接着の滴定曲線を示す。これらの曲線から、変異体クローン46(SEQ ID NO: 12)および変異体クローン146(SEQ ID NO: 18)のIC50はそれぞれ6.4nM(0.16mg/ml)および0.8nM(0.02mg/ml)であると推定された。Q38L-2D-VCAM-1ポリペプチド(SEQ ID NO: 10)は全面的な阻害を示さず、IC50は推定されなかった。図6に示す細胞結合の阻害曲線は、Graphpad Prismソフトウェアにおいて非線形回帰モデル(シグモイド型用量反応、可変勾配、共通の(shared)最大値および最小値、Y=最小値+(最大値-最小値)/(1+10^((LogIC50-X)×ヒル勾配(HillSlope)))を用いて作成して、IC50値を推定した。
【０３０８】
実施例14
2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウスモデルにおいて有効である
以下の実施例から、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドが、ヒト多発性硬化症(MS)の認識された動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウスモデルにおいて麻痺の発生を遅らせ、疾患症状の重症度を緩和するにあたって、インビボで有効であることが実証される。
【０３０９】
EAEは、急性又は慢性の、再発性、後天性、炎症性、かつ脱髄性の自己免疫疾患である。一般に、EAEは、神経細胞を取り囲む絶縁性の鞘であるミエリン中に存在するタンパク質、例えば、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)またはプロテオリピドタンパク質(PLP)を動物に注射することによって誘導される。あるいは、これらのタンパク質の公知のエピトープに対応する配列を有する合成ペプチドが注射される。注射されたタンパク質または免疫原性ペプチドは、動物において自己免疫応答を誘導し、その結果、動物の免疫系がそれ自身のミエリンに対して攻撃を開始する。動物は、ヒトのMSによく似ている疾患過程を経験する。
【０３１０】
6〜7週齢の雌SJLマウス(Charles River Labs)を計量し、不完全フロイントアジュバント(IFA; Sigma)に溶かした1000ug/ml PLP(PLP ペプチド139〜151 HSLGKWLGHPDKF(SEQ ID NO: 99)、Anaspec)および2mg/ml結核菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra(Fisher)の乳濁液合計100ulを側腹部に皮下注射した。1群当たり7〜8匹の動物からなる4群にマウスを分けた。7日目から開始して15日目まで、マウスを未処置で放置するか、またはラット抗マウスα4インテグリンモノクローナル抗体PS/2(AbDSerotec)を1日おき(対照群)、2D-VCAM-1変異体クローン59(SEQ ID NO: 16)を毎日、もしくは2D-VCAM-1変異体クローン146(SEQ ID NO: 18)を毎日、100ug(PBS 100ul中)を静脈内に注射するかした。免疫化後、マウスを毎日観察し、膿瘍などの注射部位の合併症を検査した。注射後10日目から開始して、1日おきに体重を測定し、動物を毎日視診し、疾患の進行をグレード分けした。以下の通りに、疾患進行の標準的なグレード分け方式を使用した。
【０３１１】
（表８）
2013528374.tif 000016
【０３１２】
4.0またはそれより高いスコアが動物に与えられた場合、人道的に安楽死させた。15日目を過ぎると、対照群の観察を中止した。
【０３１３】
図7に示した通り、2D-VCAM変異体ポリペプチドで処置した動物では、未処置動物と比べて、EAE症状の発生は遅れ、疾患の全般的重症度は低下した。2D-VCAM-1変異体クローン146は、クローン2D-VCAM-1変異体クローン59よりも有効であると思われた。これは、これら2種の分子のVLA-4インテグリン結合親和性の差と相関がある可能性がある。未処置群、クローン59処置群、およびクローン146処置群における疾患発症までの平均日数は、それぞれ9.6±0.8日、11.1±1.4日、および12.8±1.1日であった。これらは、統計学的に有意な改善である(クローン59についてはp=0.016、クローン146についてはp=0.0016)。マウスEAEモデルにおいて動物を疾患から保護する際のさらなる改善は、2D-VCAM-1変異体の投薬量レベルおよび投薬頻度を最適化し、PEG試薬で改変したものなどの半減期を長くした2D-VCAM-1変異体を用いることによって、実現することができる。
【０３１４】
これらの結果から、VLA-4インテグリン結合親和性を示す本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドがげっ歯動物EAE モデルにおいて有効であることが示され、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドが多発性硬化症および関連障害の治療において有効であることが示唆される。
【０３１５】
実施例15
「タグ無し」2-D VCAM-1変異体ポリペプチドのリフォールディング、PEG化および精製
以下の実施例は、ポリペプチドのN末端に融合されるヒスチジンタグを伴わずに発現される本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチド(言い換えると、「タグ無し」2D-VCAM-1変異体)をリフォールディング、PEG化、および精製するための例示的手順を提供する。この手順を用いて、タグ無しのクローン146(SEQ ID NO: 18)および本発明の他の変異体をリフォールディング、PEG化、および精製した。
【０３１６】
1.  捕捉段階:
大腸菌由来の封入体(IB)を25mM酢酸ナトリウム、25mM NaH2PO4、8M尿素、pH4(0.1g IB/ml)に調整した。この材料を室温で一晩インキュベートし、次いで、20,000RPMで1時間遠心分離して、不溶性構成要素を除去した。0.22μmフィルターを用いて上清をろ過し、次いで、素通りモードのSartobind Q Miniフィルターに添加して、DNAを除去した。可溶性タンパク質を添加する前に、25mM酢酸ナトリウム、25mM NaH2PO4、8M尿素、pH4でSartobind フィルターを平衡にした。25mM酢酸ナトリウム、25mM NaH2PO4、8M尿素、pH4で平衡にしたSPセファロースFFカラムに添加する前に、0.5M HClでSarobindQ素通り材料をpH4に再び調整した。平衡緩衝液で洗浄した後、25mM酢酸ナトリウム、25mM NaH2PO4、300mM NaCl、8M尿素、pH4中にタンパク質を溶出させた。
【０３１７】
2.  タグ無し2D-VCAM-1変異体のリフォールディング:
最終濃度が0.3Mになるまで尿素を補充した50mM Tris、2mM酸化型グルタチオン、1mM還元型グルタチオン、pH8に加えて希釈することによって、リフォールディングを遂行した。最小希釈率1/26.7を用いてリフォールディング物のタンパク質濃度を0.2mg/mlで維持して、尿素濃度が0.3Mを超えるのを防いだ。最低40時間かけて、4℃でリフォールディングを実現した。
【０３１８】
3.  QセファロースHP精製:
25mM Tris、pH6で平衡にしたQ HPカラムにリフォールディング物を添加することによって、リフォールディングされた材料の精製を実現した。平衡緩衝液で洗浄した後、勾配を用いて、25mM Tris、100mM NaCl、pH 6中にタンパク質を溶出させた。
【０３１９】
4.  PEG化のための予備処理:
下記の2つの方法の内の1つを用いて、PEG化のために2D-VCAM-1変異体を予備処理した。
(A)分子量カットオフ値(MWCO)3.5Kの透析カセットを用いて、100mM NaH2PO4にタンパク質を加えて透析し、次いで、3K MWCOの遠心濃縮装置を用いて1〜5mg/mlの間の濃度に濃縮した。または、
(B)50mM KH2PO4、0.01％Tween-80、pH4.8で平衡にしたSPセファロースFFカラムにタンパク質を添加した。平衡緩衝液でカラムを洗浄し、次いで、50mM KH2PO4、200mM KCl、0.01％Tween-80、pH5を用いて溶出させた。0.5M HClを用いて、溶出液をpH4に調整した。
【０３２０】
5.  タグ無し2D-VCAM-1変異体のN末端PEG化:
1〜4mg/mlのタンパク質を、タンパク質に対して2〜1倍モル過剰の(タンパク質濃度による)50K分枝PEG-アルデヒド(SUNBRIGHT GL3-400AL100U; NOF Corporation, Tokyo, Japan)および0.63mg/ml NaCNBH3と反応させた。反応物を室温で3時間インキュベートした。
【０３２１】
6.  SPセファロースHPによるモノPEG化2D-VCAM-1変異体の単離:
PEG化された材料を、導電率が8mS/cm未満になるように水で希釈し、各20mMのリンゴ酸、クエン酸、コハク酸、NaH2PO4、およびHEPES(MCSPH)、0.01％Tween-80、pH4で平衡にしたSPセファロースHPカラムに添加した。平衡緩衝液で洗浄した後、勾配を用いて、各20mMのMCSPH、100mM NaCl、0.01％Tween-80、pH5.5中にタンパク質を溶出させた。モノPEG化画分を集め、3K MWCOの遠心濃縮装置を用いて濃縮し、3.5K MWCO透析カセットを用いてバッファーをPBSに交換した。SDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を分析した。
【０３２２】
あるいは、上記の段階3および4を下記の段階3'で置き換えてもよい。
【０３２３】
3'.セラミックヒドロキシアパタイト(CHT)I 型精製:
リフォールディングされたタンパク質を1mM NaH2PO4、50mM MES、pH6に調整し、1mM NaH2PO4 、50mM MES、150mM NaCl、pH6で平衡にしたCHTカラムに添加した。平衡緩衝液、次いで、5mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH6でカラムを洗浄した。次いで、19mM NaH2PO4、243mM NaCl、pH6.5でタンパク質を溶出させた。0.5M HClを用いて、溶出液をpH4に調整した。
【０３２４】
段階3'はまた、Capto混合モードクロマトグラフィー(MMC)で置き換えてもよい。
【０３２５】
実施例16
N末端がPEG化された2D-VCAM-1変異体の延長された半減期およびインビボでの活性有効性
前述した通りにして、例示的な2D-VCAM-1変異体クローン146(SEQ ID NO: 18)を大腸菌中で作製し、50K分枝PEG-アルデヒド試薬を用いてN末端をPEG化した。PEG化されたクローン146分子(「PEG50-146」)は、PEG化されていないクローン146ポリペプチドよりも有意に長い半減期をマウス血清において示した(表9)。
【０３２６】
（表９）
2013528374.tif 000017
【０３２７】
マウスにおいて、抗α4インテグリン抗体PS/2は、未成熟リンパ球上で発現されたVLA-4と骨髄細胞上で発現されたVCAM-1との相互作用を阻害し、したがって、末梢血白血球増加症と呼ばれるプロセスにおいて未成熟リンパ球が骨髄から末梢血へと出て行く原因となる。同様に、PEG50-146分子は、マウス(表10)およびカニクイザル(実施例22で説明)において末梢血白血球の増加を誘導し、その結果、2D-VCAM-1変異体結合体がインビボでVLA-4とVCAM-1の相互作用を阻害することが示唆された。また、PEG50-146分子は、PLP投与後6日目、8日目、10日目、および13日目に3mg/kgの量で投与された場合、未処置の対照と比べて、(実施例14において説明した通りに)雌SJLマウスにおけるEAE症状の発生を遅らせることにより、インビボの活性を示した(図7B)。
【０３２８】
（表１０）
2013528374.tif 000018
【０３２９】
実施例17
N末端をPEG化された2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モルモットモデルにおいて有効である
以下の実施例から、N末端をPEG化された本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドが、ヒト多発性硬化症(MS)の認識された動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モルモットモデルにおいて麻痺の発生を遅らせるにあたって、インビボで有効であることが実証される。
【０３３０】
完全フロイントアジュバントに溶かしたモルモット脳全体のホモジネートおよび結核菌を0日目に注射することによって、雌ハートレイ系モルモットを免疫化した。1群当たり9匹の動物からなる群にモルモットを分けた。13日目から、モルモットを未処置で放置するか、または50Kの分枝PEG-アルデヒド試薬でN末端をPEG化した2D-VCAM-1変異体クローン146(PEG50-146)(0.3mg/kg)もしくは80Kの分枝PEG-アルデヒド試薬でN末端をPEG化した2D-VCAM-1変異体クローン146(PEG80-146)(0.3mg/kg)を13日目、15日目、および17日目にモルモットに皮下注射した。ヒト化抗α4インテグリンモノクローナル抗体ナタリズマブ(Biogen Idec)3mg/kgを13日目に投与した(対照)。免疫化後、モルモットを毎日観察し、疾患の進行をグレード分けした。以下のように、疾患進行の標準的なグレード分け方式を使用した。
【０３３１】
（表１１）
2013528374.tif 000019
【０３３２】
図8に示した通り、未処置の対照と比べて、PEG50-146ポリペプチドおよびPEG80-146ポリペプチドで処置した動物においてEAE 症状の発生が遅れた。PEG50-146およびPEG80-146で処置した動物は、免疫化後約19日目および21日目まで、またはポリペプチドの最終投与後2日目および4日目まで、モルモットを疾患から保護した。ナタリズマブで処置した動物もまた、疾患から保護され、24日目または薬物の最終投与後11日目に疾患の症状を示し始めた。薬物の最終投与後に動物が疾患を発症するのにかかる時間の長さがこのように異なるのは、PEG化2D-VCAM-1変異体ポリペプチドと対照抗体とでVLA4受容体占有の薬物動態および/または持続期間が異なることを反映している可能性がある。
【０３３３】
これらの結果から、N末端をPEG化された本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドがVLA4インテグリン結合親和性を示し、EAEげっ歯動物モデルにおいて有効であることが示される。また、データから、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドが多発性硬化症および関連障害の治療において有効であることが示唆される。
【０３３４】
実施例18
カニクイザルにおいてPEG50-146の血清中濃度を検出するためのELISAアッセイ法
カニクイザルへのPEG50-146ポリペプチド皮下投与後の様々な時点における動物血清中の機能的PEG50-146の量を、固相ELISAアッセイ法を用いて測定した。4℃で一晩、TBS-KCl(TBSからKClを除いたもの;24.7mM Tris-HCl pH 7.4、137mM NaCl)中1ug/mlのVLA4-Fcヘテロダイマー50ulでMAXISORP(商標)ELISAプレート(NUNC)をコーティングし、TBS-T(0.05％ TWEEN-20を含むTBS)で洗浄し、室温で1時間、TBS-KCl中1％ウシ血清アルブミン(BSA)200ulでブロッキングした。5ug/mlから始まるPEG50-146の5倍希釈物からなる検量線を、カニクイザル血清(カニクイザル血清の最終濃度は20％であった)を含む1％BSA含有TBS-KClにおいて調製した。1％BSAおよび20％サル血清を含むTBS-KCL中で2倍系列希釈を調製することによって、実験的な未知試料を調製した。PEG50-146および実験的な未知試料の両方をELISAプレートに移し、このプレートを振盪しながら室温で1時間インキュベートし、続いてTBS-Tで洗浄した。1％BSA含有TBS-KCl中0.25ug/mlビオチン標識抗ヒトVCAM抗体(R&D Systems、カタログ番号BAF809)と共に振盪しながら室温で1時間インキュベーションし、次いで、洗浄し、その後、1％BSA含有TBS-KCl中ストレプトアビジン-HRP(BD Biosciences、カタログ番号554066)の1:100,000希釈物と共に室温で1時間インキュベーションすることによって、結合されたPEG50-146 タンパク質を検出した。TBS-Tで最終的な洗浄を行った後、暗所で室温と同等の温度にした(equilibrated)TMB Plus基質緩衝液(Kem Diagnostics、カタログ番号4390A)100ulを各ウェルに添加し、発色を目で見て追跡した。典型的な顕色時間は、15分±2分の範囲であった。停止溶液(R&D Systems、カタログ番号DY994)50ulを添加することによって発色を停止させた。450nMでの吸光度をSpectraMax Softmax Pro分光光度計(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて迅速に測定した。
【０３３５】
50Kの分枝PEG-アルデヒド試薬でN末端をPEG化した2D-VCAM-1変異体クローン146(PEG50-146)(0.3mg/kg)またはPEG50-146(3mg/kg)を、0日目(0時間)にカニクイザルに皮下注射した。投与後8時間目、24時間目、48時間目、72時間目、96時間目、120時間目、および144時間目に血清試料を採取した。1群当たりの動物は4匹であった。前述のELISA法によって、機能的PEG50-146ポリペプチドの量について血清試料を解析した。
【０３３６】
図9Aに示した通り、0.3mg/kgおよび3mg/kgのPEG50-146を皮下投与した後の血清中PEG50-146の量は、24時間目の時点でそれぞれ約300ng/mlおよび1300ng/mlである。次いで、血清中PEG50-146ポリペプチドの量は、20〜60時間の範囲のおおよその半減期で減少する。VLA4-Fcに結合できるPEG50-146の量は、低用量群(0.3mg/kg)において投与後144時間目の時点でアッセイ法の限界値を下回っている。
【０３３７】
実施例19
2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは末梢血リンパ球におけるα4インテグリンおよびβ1インテグリンの表面発現を減少させない
蛍光活性化細胞選別(FACS)アッセイ法を用いて、末梢血リンパ球におけるα4インテグリンおよびβ1インテグリンの表面発現に対する2D-VCAM-1ポリペプチド結合の影響をマウスおよびカニクイザルの両方において検査した。
【０３３８】
A.  マウス末梢血リンパ球におけるα4インテグリンおよびβ1インテグリンの細胞表面発現の評価
EDTA中に採取したマウス全血を1×溶解用緩衝液(BD Biosciences、カタログ番号555899)で1:10希釈し、穏やかにボルテックスし、室温で5分間インキュベートし、1％熱失活ウシ胎児血清(FBS)を加えたPBS中で洗浄した。次いで、細胞懸濁液をマウスFc Block(BD Biosciences、カタログ番号553142)と共に5分間インキュベートした(1×106細胞につき2ulのFc Block)。次いで、FITCに結合させたラット抗マウスB220抗体(クローンRA3-6B2、BD Sciences、カタログ番号553088)およびPEに結合させたノンブロッキングラット抗マウスCD49d(α4インテグリン)モノクローナル抗体(クローン9C10-PE;BD Sciences、カタログ番号557420)またはノンブロッキングハムスター抗マウスCD29(β1インテグリン)ビオチン標識抗体(クローン6A267、USBiological、カタログ番号C2381-10N))を用いて、末梢B細胞上のα4インテグリンまたはβ1インテグリンの細胞表面レベルに関して細胞を二重染色した。1:200希釈したストレプトアビジン-PE(SouthernBiotech、カタログ番号9190-09)を用いて、ビオチン標識抗マウスCD29を検出した。アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。2％FBSを加えたPBS中に、染色された細胞を再懸濁し、FACS Caliburによって分析した。フローサイトグラムを作成して、各細胞表面マーカーについて陽性である細胞の割合を明らかにした。ヨウ化プロピジウム(PI)(Roche、Ref. 11 348 639 001)の排除に基づいて、生存リンパ球を選択した。抗体陽性細胞の比率(％)を算出するための分母として使用するリンパ球を含めるために、前方散乱対側方散乱サイトグラム内に電気的ゲート(electronic gate)をかけた。
【０３３９】
0日目、2日目、および4日目に、0.4mg/kgのPEG50-146または3mg/kgのラット抗マウスα4インテグリンモノクローナル抗体PS/2(AbDSerotec)またはPBSを雌Balb/cマウスに皮下注射した。1群当たり5匹の動物からなる3群にマウスを分けた。1日目、2日目、4日目、5日目、6日目、7日目、および8日目に各群から全血を採取し、集め、前述のアッセイ法を用いてフローサイトメトリーによってB220+末梢B細胞上のα4インテグリンレベルおよびβ1インテグリンレベルを解析した。3日目には試料を採取しなかった。
【０３４０】
図10に示す通り、PBSで処置した対照と比べて、PEG50-146で処置したマウスでは、CD49d+(α4インテグリン)である末梢B細胞の百分率に変化はなかった。一方、PS/2の場合、処置後早くも1日目にCD49+ B細胞の百分率が減少した。PS/2処置によるCD49+ B細胞の百分率のこの減少は、7日目まで約55％で維持された。8日目に、CD49+ B細胞の百分率は正常化し始め、PS/2抗体の最終投与後4日目に90％陽性に達した。β1インテグリンの細胞表面レベルもまた、PEG50-146処置マウスにおいて不変であったのに対し、PS/2処置マウスでは1回の皮下投与後にβ1インテグリン陽性B細胞の減少が観察可能であった(表12)。
【０３４１】
（表１２）
2013528374.tif 000020
【０３４２】
表13に示す通り、ラット抗マウスα4インテグリンモノクローナル抗体R1-2(Biolegend、カタログ番号103610)によってマウスを処置した場合も、3mg/kgのR1-2で処置したBalb/cマウスの脾臓中のCD49d+ B細胞およびCD29+ B細胞の数が減少した。R1-2は、PS/2のエピトープと比べて異なるα4インテグリン上のエピトープに結合する。
【０３４３】
（表１３）
2013528374.tif 000021
【０３４４】
これらの結果から、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、抗α4モノクローナル抗体PS/2およびR1-2とは違って、末梢B細胞におけるα4インテグリンまたはβ1インテグリンの細胞表面発現を低減させないことが示される。また、これらの結果から、(末梢血または脾臓のいずれかに存在する)B細胞上のα4インテグリンおよびβ1インテグリンの減少が、細胞表面のα4インテグリンに二価で結合し架橋するモノクローナル抗体の一般的特性であり得ることが示唆される。
【０３４５】
A.  カニクイザル末梢血リンパ球におけるα4インテグリンおよびβ1インテグリンの細胞表面発現の評価
K3EDTAで処理したチューブ中に、フローサイトメトリー解析用の全血試料(約1.0mL)を集めた。溶解/洗浄方法を用いて、単離された白血球を、CD3に対する抗体(SP-34(2)-APC-Cy、BD Biosciences、カタログ番号557757)、CD20に対する抗体(2H7-PE-Cy7、BD Biosciences、カタログ番号560734)、CD29に対する抗体(MAR4-APC、BD Sciences、カタログ番号557332)、およびCD49dに対する抗体(9F10-PE、BD Sciences、カタログ番号556635)で染色した。FACSCanto II(Becton Dickinson BD)およびFACSDiva解析ソフトウェアを用いて、フローサイトメトリーのデータを捕獲した。FACSDiva解析ソフトウェアを用いて、取得データを解析した。フローサイトグラムを作成して、各細胞表面マーカーについて陽性である細胞の割合を明らかにした。抗体陽性細胞の比率(％)を算出するための分母として使用するリンパ球を含めるために、前方散乱対側方散乱サイトグラム内に電気的ゲートをかけた。個々のリンパ球部分集団の絶対計数は、リンパ球ゲートおよびAdvia 120 Hematology Analyzerによるリンパ球絶対計数から次の式に従って導き出された相対比率(％)から算出される:リンパ球絶対計数(×103/μL)=(リンパ球部分集団の相対比率(％)×全リンパ球絶対計数)/100。
【０３４６】
1日目に、0.3mg/kgのPEG50-146もしくは3mg/kgのPEG50-146または3mg/kgのヒト化抗α4インテグリンモノクローナル抗体ナタリズマブ(Biogen Idec)(対照)を雄カニクイザルに皮下注射した。これらの動物を、それぞれ4匹の動物からなる3群に分けた。投与の4日前、投与後2、3 4、および5日目に全血試料を採取し、前述のアッセイ法を用いてフローサイトメトリーによってCD20+末梢B細胞およびCD3+末梢T細胞上のα4インテグリン細胞表面レベルおよびβ1インテグリン細胞表面レベルを解析した。
【０３４７】
図11Aに示した通り、カニクイザルすべての末梢血中のCD49d+ B細胞のベースライン(4日前)の百分率は、4日前の3群の動物すべてにおいて約70〜80％であった。薬物投与後2〜5日目において、PEG50-146で処置したサルの末梢血中のCD49d+ B細胞の百分率は96〜97％であった。PEG50-146群において投与前(predose)(4日前)から投与後2日目までにCD49d+ B細胞の百分率が増加したのは、実施例16において説明する通りにVCAM-1とVLA4の相互作用の妨害の結果として生じる、血液中の末梢リンパ球の全体的増加(白血球増加)を反映している可能性が最も高い。ナタリズマブで処置した動物における白血球増加は、PEG50-146を単回投与した場合に観察された白血球増加と同程度〜上回る程度であったにもかかわらず(表14)、末梢におけるCD49d+ B細胞の百分率は、2日目および3日目の間、約68％のままであり、その後、93〜94％陽性まで増加した。2日目および3日目における、PEG50-146群と比べたナタリズマブで処置した動物におけるCD49d+ B細胞の百分率の差は、統計学的に有意であった(*p<0.001;ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ANOVA)。また、ナタリズマブで処置されたサルにおいてはCD49d+ T細胞百分率の同様の減少も観察されたが、どちらのPEG50-146処置群もCD49d+ T細胞百分率に影響を及ぼさなかった(図11B)(*p<0.001;ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ANOVA)。
【０３４８】
（表１４）
2013528374.tif 000022
【０３４９】
図12Aに示す通り、処置前試料(4日前)と比べて、いずれかの用量のPEG50-146で処置したサルにおいて、CD29+末梢B細胞の百分率に有意な変化はなかった。一方、ナタリズマブで処置されたサルにおけるCD29+ B細胞の百分率は、4日前と2日目とで約2分の1に(4日前の80％陽性から2日目の37％陽性に)減少した。ナタリズマブで処置されたサルにおけるCD29+ B細胞の百分率の減少は、2日目、3日目、4日目、および5日目のPEG50-146投与群での比率と比べて統計学的に有意であった(*p<0.001;ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ANOVA)。ナタリズマブで処置されたサルにおいてはCD29+ T細胞百分率の同様の減少が観察されたが、どちらのPEG50-146処置群もCD29+ T細胞百分率に影響を及ぼさなかった(図12B)(*p<0.001;ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ANOVA)。
【０３５０】
図11および図12の結果から、PEG50-146は、試験したいずれの用量によっても、カニクイザルの末梢B細胞または末梢T細胞におけるα4ヘテロダイマーインテグリン接着分子またはβ1ヘテロダイマーインテグリン接着分子の細胞表面発現を減少させないことが示される。これらの結果は、末梢リンパ球表面においてα4インテグリンレベルおよびβ1インテグリンレベルの両方が低下したナタリズマブ処置サルにおいて観察された結果とは対照的である。2日目〜3日目に認められた、ナタリズマブ処置によるα4レベルの一時的な下方調節(図11)は、内因性サルIgG4抗体との鎖交換(chain swapping)が原因で、これらの動物の血清中に存在する二価のインタクトなナタリズマブ抗体が、VLA4結合について本質的に一価であるナタリズマブに変換することを反映している可能性が最も高い。これは、二価の機能的ナタリズマブの大多数が薬物投与後3日目と4日目の間にサルから消失したことを示すELISAデータによって裏付けられた(図9B)。サル血清中の機能的ナタリズマブの濃度は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合させたヒトIgG4に対するマウスモノクローナル二次抗体(Abcam、カタログ番号ab99823)を用いて結合されたタイサブリを検出したことを除いては実施例18において説明したものと同様のELISAアッセイ法におけるヒトVLA4-Fcの結合に基づいて決定した。ナタリズマブと内因性ヒトIgG4とのIgG4鎖交換が、患者および動物において観察されている(Labrijn, A.F., et al., Nat. Biotechnol. 27(8):767-771 (2009); Shapiro, R.I. et al., J. PHarm. Biomed. Anal. 55(1):168-175 (2011))。マウス(図10)およびヒトにおいて抗4モノクローナル抗体について観察された通り、サルへのナタリズマブの複数回投与が、動物において定常状態レベルの二価ナタリズマブを維持し、末梢リンパ球上の細胞表面VLA4の下方調節を維持した可能性が最も高い(Putzki, N., et al., eur. Neurology, 63:311-317 (2010); Wipfler, et al., Mult. Schler. 17:16-23 (2011); Harrer, et al., J. Neuroimmunol. "Natalizumab therapy decreases surface expression of both VLA-heterodimer subunits on peripheral blood mononuclear cells," Epub (2011))。
【０３５１】
ナタリズマブの単回投与は、β1を含むインテグリン受容体に持続的な影響を与え、サルにおいて5日目まで受容体下方調節が観察された(図12)。β-1は少なくとも9個の異なる鎖と非共有結合的に結合するため、これは、VLA4およびLPAM-1以外の細胞接着分子に対するナタリズマブのより幅広い影響を反映している可能性がある。β-1を含む接着分子に対するナタリズマブのこの影響は、免疫監視および炎症部位への免疫細胞の遊走などこれらの接着分子に依存する免疫学的活性に対する多大な影響を有する可能性がある。PEG50-146は接着分子の細胞表面発現に影響を与えないため、α4モノクローナル抗体と比べて、免疫監視、免疫細胞トラフィッキング、免疫ホメオスタシス、およびJCウイルスなどの日和見性の感染症のリスクに対する影響が小さい可能性がある。
【０３５２】
実施例20
クローン146(SEQ ID NO: 18)の配列最適化
2D-VCAM-1変異体クローン146(SEQ ID NO: 18)の配列最適化された変異体12種(R1〜R12)からなる第1のセットをGeneArt(Invitrogen, Inc.)によって設計および合成した。配列最適化された変異体は、2D-VCAM-1変異体クローン146(SEQ ID NO: 18)中に存在する7種の変異の様々な組合せを含んだ(ヒト2D-VCAM-1、SEQ ID NO: 2に関してF32L S34F T37P Q38L I39L T74R K79S)が、変異荷重の合計が少ないものも含んだ(with lower total mutation loads)(表15)。各合成遺伝子は、5'NheI部位、コザック配列、変異体ORF(内因性VCAM-1シグナル配列、2D-VCAM-1変異体ORF、および3つの連続したスペーサー-FLAGタグ(GGGS-DYKDDDDK)からなる)、および終止コドンとそれに続く3'PmeI部位を含んだ。適切なコドン使用によって、独特な制限部位(HindIII、NotI、およびBamHI)をORFの様々な位置に人工的に作り出すことにより、第1のセットのクローン間で断片を交換することによって本発明者らが新しいクローンを作製することが可能になった。NheI制限部位およびPmeI制限部位を用いて、pCDNA3.1(+)(Invitrogen, Inc.)哺乳動物発現ベクター中に合成遺伝子をサブクローニングし、CHO-S細胞にプラスミドを一過的にトランスフェクトした。細胞培養上清を濃縮し、ろ過し、VLA4-Fcへの結合をBIACOREによって分析した。また、2D-VCAM-1変異体クローン146発現のためのプラスミドもこの様式で作製し、トランスフェクトし、分析して、対照データを得た。単一復帰変異体(single revertant)クローンの最初のセット(R1〜R7)から、wt-2D-VCAM-1と比べて、クローン146の活性改善に対するF32LおよびK79Sの貢献はたとえあるとしても少しであり、クローン146の活性改善に対するT37PおよびI39Lの貢献はあまり大きくなく、クローン146の活性改善に対するS34F、Q38L、およびT74Rの貢献が最も大きいことが示唆された。146R1〜146R12から得られた最初の結果に基づいて、配列最適化されたクローンの第2のセット(表15)を、ORF中の独特な制限部位を用いたサブクローニングによって、またはSOE(Splicing by Overlap Extension)技術によって、第1のセットから誘導した。前述した通りにして、プラスミドをトランスフェクトし、粗製の上清を分析した(表15)。表15は、配列最適化された各変異体中に存在する7種の変異の様々な組合せ、変異体中の変異の合計数(変異荷重)、およびBIACOREによって測定された、2D-VCAM-1変異体クローン146(146R0)を基準とした結合親和性の低下(=KD(変異体)/KD(146R0))を示す。
【０３５３】
（表１５）2D-VCAM-1変異体クローン146(「146R0」、SEQ ID NO: 18)の配列最適化された変異体
2013528374.tif 000023
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【０３５４】
粗製上清アッセイ法の結果に基づいて、配列最適化された変異体13種をさらなる研究のために精製タンパク質として選択した。これらの変異体は、SOE技術によるスプライシングの技法を用いて適切な変異を復帰させることにより、元のプラスミドpVM146(pVM-EcVec中のVCAM146)から誘導した。これらの変異体の配列情報を表16に提供する。プラスミドを作製用のW3110大腸菌株に形質転換し、精製し、実施例8および実施例12において前述した通りにVLA-4親和性およびLPAM-1親和性について分析した。
【０３５５】
（表１６）大腸菌発現システムにクローニングした、2D-VCAM-1変異体クローン146の配列最適化された変異体
2013528374.tif 000025
【０３５６】
Biacore測定の結果を図13に示す。またこの結果から、5個未満または5個の変異を有する二重復帰変異体の大半がVLA-4結合およびLPAM-1結合の低下を示すことが示唆される。配列最適化された変異体(表16)を大腸菌発現システムから発現させ、精製し、VLA-4結合およびLPAM-1結合についてBIACOREによって分析した。VLA-4のKD(単位pM)(黒いバー)およびLPAM-1のKD(単位nM)(灰色のバー)を示している。
【０３５７】
実施例21
2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは高い親和性(または活性化)状態のインテグリンに優先的に結合する
以下の実施例から、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドが、高い親和性または活性化状態のインテグリン受容体に優先的に結合することが実証される。この実験において、1mM MnCl2をアッセイ緩衝液に添加することによって、活性化型へのVLA4の変換を誘導した。
【０３５８】
A.  フローサイトメトリーアッセイ法を用いた活性化モルモットVLA4への2D-VCAM-1ポリペプチドの結合:
モルモット脾細胞をTBS(25mM TRIS-HCl pH 7.5、150mM NaCl)中に再懸濁し、最終濃度50ug/mlの精製2D-VCAM-1ポリペプチドと共に氷上で15分間インキュベートした。次いで、2％ウシ胎児血清(FBS)を加えたTBSでこれらの細胞を洗浄した。2通りの試料セットを調製し、ここで1mM MnCl2を含むTBS(TBS-M)中にモルモット脾細胞を再懸濁した後、氷上で15分間の2D-VCAM-1ポリペプチド添加および2％FBSを含むTBS-Mによる洗浄を行った。氷上で10分間、1％正常ヒツジ血清を含むTBS中で両方の試料セット(図14において「Mn2+有り」および「Mn2+無し」と呼ぶ)をブロッキングした。次いで、1％正常ヒツジ血清を含むTBSに溶かした1ug/mlのビオチン標識ヒツジポリクローナル抗ヒトVCAM-1/CD106抗体(R & D Systems、カタログ番号BAF809)を用いて、氷上で15分間、結合された2D-VCAM-1ポリペプチドを検出した。次いで、細胞を洗浄し、1:200希釈したストレプトアビジン-PE(SA-PE)(Southern Biotech、カタログ番号9190-09)と共に氷上で15分間インキュベートした。染色された細胞を洗浄し、2％FBSを加えたTBS中に再懸濁し、FACS Caliburによって分析した。リンパ球を含めるために、前方散乱対側方散乱サイトグラム内に電気的ゲートをかけた。染色されなかった細胞およびSA-PEのみで処理された細胞をアッセイ法の対照として使用した。SA-PEのみのバックグラウンド対照試料を引いて、2D-VCAM-1ポリペプチドに加えてビオチン標識抗VCAMおよびSA-PEと共にインキュベートした細胞の平均蛍光強度(MFI)の変化としてデータをプロットした。
【０３５９】
図14に示す通り、活性化VLA4状態に相当する1mM MnCl2を含む緩衝液(「Mn2+有り」)中の細胞と共にポリペプチドをインキュベートした場合、Q38L(SEQ ID NO: 10)、クローン046(SEQ ID NO: 12)、クローン047(SEQ ID NO: 14)、クローン059(SEQ ID NO: 16)、およびクローン146(SEQ ID NO: 18)2D-VCAM-1ポリペプチドの場合にモルモット脾細胞への結合が検出された。また、MnCl2の存在下で2量体のクローン046融合タンパク質(046-Fc)に対する結合も検出された。これらのポリペプチドすべてにおいて、モルモット脾細胞上の細胞表面インテグリンへの結合は、1mM MnCl2が存在しない場合よりも存在する場合の方が強かったことから、これらのタンパク質が高親和性または活性状態のインテグリンに優先的に結合することが示唆された。Mn2+の非存在下では、Q38Lの結合もクローン046-Fcの結合も観察されなかった。「Mn2+無し」試料には、アッセイ緩衝液中に導入された任意の二価陽イオンを除去するためにEDTAなどのキレート剤が添加されなかったため、「Mn2+無し」試料中のインテグリン受容体の一部分が活性化状態であった可能性があり、「Mn2+無し」試料中のポリペプチドの結合量が少なかったのは、残存する高親和性受容体に結合し、低親和性受容体には結合しないことに起因した可能性がある。Q38Lまたは2D-VCAM-1変異体と比較すると、1mM MnCl2の存在下でも非存在下でも、野生型2D-VCAM-1の有意な結合はこのアッセイ法において検出されなかった。これは、BIACOREによって実証されたように、精製VLA-4に対する野生型2D-VCAM-1の結合親和性が低いことに起因する可能性がある(実施例12)。このアッセイ法におけるモルモット脾細胞への野生型2D-VCAM-1ポリペプチドおよび変異体2D-VCAM-1ポリペプチドの結合は、ヒトVCAM-1に対するポリクローナル抗体を用いて間接的に検出したため、モルモット脾細胞への変異体ポリペプチドの様々な結合量は、精製VLA4に対する相対的親和性を反映しない可能性があり、むしろ、抗VCAMポリクローナル抗体に対する親和性を反映している可能性がある。抗VCAMポリクローナル抗体に対する野生型2D-VCAM-1ポリペプチドおよび変異体2D-VCAM-1ポリペプチドの結合親和性は測定しなかった。
【０３６０】
B.  BIACOREアッセイ法における活性化ヒトVLA4-Fcへの2D-VCAM-1クローン146の結合:
VLA4の活性化状態がクローン146(SEQ ID NO: 18)結合に与える影響を、いくつかの例外(後述)以外は実施例12で前述したのと同じ方法を用いてBIACOREによって測定した。ヤギ抗ヒトIgG抗体をCM5チップに固定し、実施例12で説明した通りにしてHBS-P中のヒトVLA4-Fcを捕捉した。各結合サイクルにおいて、常に150nMのクローン146を1回注入した。クローン146は、HBS-P緩衝液、1mM Mn2+を添加したHBS-P緩衝液、または1.5mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を添加したHBS-P緩衝液中で希釈した。流速30ul/分で90秒間、クローン146を注入した。解離を5分間モニターした。各緩衝液条件で2回試験した。クローン146の各注入後に、グリシン、pH1.7を3分注入してチップを再生した。
【０３６１】
Mn2+含有緩衝液中のクローン146がヒトVLA4-Fcに結合した(図15)ことから、2D-VCAM-1ポリペプチドが活性化VLA4に結合することを示す以前のデータが裏付けられた。EDTA含有緩衝液中のクローン146はVLA4に結合しなかったことから、クローン146は非活性化VLA4には強固に結合しないことが示された。EDTAもMn2+も添加されていないHBS-P中のクローン146の場合に観察される小さい結合シグナルは、HBS-P中のVLA4は活性化状態と非活性化状態の混合物であることを示す可能性が高い。有意な解離は観察されなかった。
【０３６２】
まとめると、図14および図15に示されるデ―タから、細胞ベースのフローサイトメトリーおよびインビトロのBIACOREアッセイ法の両方によって、本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドが、不活性状態または低親和性状態のVLA4よりも、活性化状態または高親和性状態のVLA4に対して高い結合親和性を示すことが実証される。したがって、2D-VCAM-1変異体ポリペプチドは、ヒトなどの哺乳動物のローリング白血球上で発現されるものなどのインビボの活性化VLA4に、不活性状態のVLA4に対してよりも高い結合親和性で、優先的に結合すると予想される。このように2D-VCAMポリペプチドが活性化VLA4を優先するため、疾患に関連する活性化受容体が選択的にブロックされ得、無関係なインテグリン受容体に結合する潜在的なポリペプチドプールが減少され得る。また、関連するVLA4受容体を選択的にターゲティングすることによって、免疫の過剰抑制を伴わない疾患予防を可能にする2D-VCAM-1変異体ポリペプチド最適用量レベルを与え、それによって、JCウイルスによって引き起こされるものなどの日和見性感染症のリスクを低減させることができる。
【０３６３】
実施例22
N末端をPEG化された2D-VCAM-1変異体の薬物動態はインビボでのリンパ球放出に密接に関係している
以下の実施例によって、N末端をPEG化された本発明の2D-VCAM-1変異体ポリペプチドの動物における薬物動態(PK)または血清中濃度が、リンパ球増加と呼ばれるプロセスである末梢血リンパ球の増加に密接に関係していることが実証される。リンパ球増加は、VCAM-1と末梢血リンパ球上のVLA4との相互作用の阻害(それによって、末梢コンパートメント中へのそれらの移行が妨害される)および/またはVCAM-1と骨髄中の未成熟リンパ球上のVLA4との相互作用の阻害(末梢血中への放出をもたらす)に起因する。どちらの場合も、ポリペプチドで処置した動物におけるリンパ球増加は、実施例16で説明した通りに2D-VCAM-1変異体結合体がインビボでVLA4とVCAM-1の相互作用を阻害するという証拠である。
【０３６４】
第2の実験において、50Kの分枝PEG-アルデヒド試薬でN末端をPEG化した2D-VCAM-1変異体クローン146(PEG50-146)(0.3mg/kg)を、0日目(0時間目)および8日目(168時間目)にカニクイザル4匹に皮下注射した。96時間前、1時間前、8時間目、24時間目、48時間目、72時間目、96時間目、120時間目、144時間目、192時間目、240時間目、および336時間目に血清試料を採取し、実施例18で説明したELISAアッセイ法を用いて、血清試料中のPEG50-146の量を測定した。96時間前、1時間前、24時間目、48時間目、72時間目、96時間目、120時間目、144時間目、192時間目、240時間目、および336時間目に全血試料を採取し、Bayer Advia 120自動分析装置を用いて、リンパ球絶対計数を得た。
【０３６５】
図16Bに示す通り、PEG50-146でカニクイザルを処置すると、末梢血リンパ球増加が誘導された。リンパ球増加は、最初の薬物投与後24時間目までに誘導され、投与後約24〜72時間の間、増加したままであり、投与後72〜144時間目に、ベースラインのリンパ球レベル(図16において点線で示す)に戻り始めた。168時間目の2回目のPEG50-146投与後、末梢血中のリンパ球計数は再び上昇し、240時間目にピークに達し、その後、336時間目にベースラインレベルに戻り始めた。図16Bで認められる通り、PEG50-146で処置したサルで観察されたリンパ球増加のパターンは、動物中のPEG50-146の血清中レベルを反映していた。言い換えると、薬物投与後にPEG50-146血清レベルが上昇するにつれ、リンパ球計数が増加し、薬物投与後にPEG50-146血清レベルが低下するにつれ、リンパ球計数が減少した。
【０３６６】
まとめると、PEG50-146で処置したモルモットおよびカニクイザルについてそれぞれ図16Aおよび図16Bに示す結果から、末梢血中のリンパ球計数の変化がインビボでのPEG50-146の薬物血清中濃度(またはPK)に関係していることが示唆される。リンパ球放出は、VLA4とVCAM-1の相互作用のインビボでの阻害についての薬力学的マーカーであるため、この実施例で示す結果から、カニクイザルとモルモットの両方においてPEG50-146のPK/PDの関連性が密であることが示唆される。PEG50-146の密なPK/PD関連性は、薬物血清レベルとインビボ活性との直接的関係、ならびにポリペプチドが自然にクリアランスされる際に患者において正常リンパ球機能が迅速に回復する潜在的可能性を与えるという点で、自己免疫疾患を治療するにあたって有益である可能性がある。この結果として、薬物動態が長く、PKとPDが不調和である他のVLA4アンタゴニストには必要とされる可能性がある、JCウイルスによって引き起こされるものなどの日和見性感染症の場合の患者におけるPLEXまたは免疫吸収の必要が回避され得る。
【０３６７】
実施例23
2D VCAM-1変異体ポリペプチドFc融合タンパク質の発現、精製、および活性の確認
A.  哺乳動物細胞において発現させるための2D-VCAM-1 Fc融合配列のサブクローニング:
SOE(Splicing by Overlap Extension)PCR技術を用いて、2D-VCAM-1クローン046(SEQ ID NO: 12)ポリペプチドおよびクローン146(SEQ ID NO: 18)ポリペプチドを、4つのシステインの内の3つがセリンに変異させられたヒトIgG2 Fcドメインまたはエフェクター機能を失うように変異させられたヒトIgG1 Fcドメインに融合させて、046および146のPIg17(IgG2 SSSC)、PIg18(IgG2 SSCS)、およびZIgをそれぞれ作製した。
【０３６８】
2D-VCAM-1クローン046遺伝子および2D-VCAM-1クローン146遺伝子は、ドメイン1領域と相補的な5'プライマーおよび改変されたIgG2 FcドメインまたはIgG1 Fcドメインとオーバーラップする伸長部分を含みドメイン2領域と相補的な3'プライマーを用いて、供給源ベクターpVM046およびCet1019-2DVCAM 146からそれぞれPCR増幅した。改変されたIgG2 Fc PIg17断片およびIgG2 Fc PIg18断片は、VCAMクローンとオーバーラップする伸長部分を含む5'プライマーおよび内部3'プライマーを用いて、これらのFcドメインを含む供給源ベクターからPCR増幅した。改変されたIgG1断片は、VCAMクローンとオーバーラップする伸長部分を含む5'プライマーおよびIgG1 Fcドメインの下流のポリA配列に相補的な3'プライマーを用いて、このFcドメインを含む供給源ベクターからPCR増幅した。内因性VCAMシグナルペプチド配列は、AgeI 部位を含む伸長部分を含むシグナル配列と相補的な5'プライマーおよびVCAM ドメイン1領域と相補的な3'プライマーを用いて、供給源ベクターpcDNA-2D-VCAM-146-IgG2FcSSからPCR増幅した。増幅されたシグナル配列、VCAM、およびPIg17 Fc産物、PIg18Fc産物、またはZIg Fc産物をSOEing反応のために混合し、シグナル配列 5'プライマーおよび各IgG Fc 3'プライマーを用いて増幅して、シグナル配列-VCAM-Fc産物を生じさせた。クローン046 Fc融合構築物の場合、PCR産物をAgeIおよびPmlIで消化(PIg17およびPIg18)またはAgeIおよびSalIで消化(ZIg)し、同じ酵素で消化したCETベクター中に挿入した。クローン046 PIg17構築物およびクローン046 PIg18構築物の場合、ベクターはPmlI部位の3'側にIgG2配列を含んだ。ZIg構築物の場合、空ベクターを使用した。クローン146 Fc融合構築物の場合、PCR産物をAgeIおよびSal1で消化し(PIg17、PIg18、およびZIg)、同じ酵素で消化したCETベクター中に挿入した。得られたプラスミドを配列決定して、シグナルペプチド配列、2D-VCAM-1配列、およびIgG Fc配列を確認した。
【０３６９】
B. 2D-VCAM-1 Fc融合タンパク質の精製
GenePulser(Bio-Rad)を用いたエレクトロポレーションによって、046-Fc融合タンパク質および146-Fc融合タンパク質をコードするDNAプラスミドを懸濁Opti-CHOK1細胞中にトランスフェクトした。細胞を48時間増殖させた後、9ug/mLのピューロマイシンを含む培地中でピューロマイシン耐性カセットを発現させるために細胞を選択した。選択後7〜8日間ぐらい、安定なプールを発達させた。これらのプールをT25フラスコから125mL容振盪フラスコに移して増殖させた。プロテインAアフィニティー高速液体クロマトグラフィー(ProA HPLC)を実施して、安定なプール中でのFc融合タンパク質の発現レベルをチェックした。発現力価に基づいて、細胞培養物を増殖させ、精製のために上清を回収した。GE Healthcareから購入したMabSelect Sureカラムを用い、溶出緩衝液として100mMグリシンpH3.7を用いた標準的なプロテインAクロマトグラフィーによって、タンパク質を精製した。溶出されたタンパク質をPBSに対して一晩透析した。これらのタンパク質を非還元条件下および還元条件下のSDS-PAGEゲル上で解析し、単量体内容物に対してはSEC解析によって解析した。
【０３７０】
C.  2D-VCAM-1 Fc融合タンパク質のBIACORE結合
次の例外はあるものの本質的には実施例12において説明した通りにして、ヒトVLA4-Fcに2D-VCAM-1 Fc融合物を結合させた。製造業者のプロトコールに従って、クローン146-Fcおよびクローン046-FcをセンサーCM-3チップに固定した。EDC/NHS混合物(等体積の11.5mg/ml EDCおよび75mg/ml NHSを混合することによって作製)(GE Healthcare、カタログ番号BR1000-50)35μlを流速5μl/分で注入して、センサーチップCM-3を活性化した。活性化された表面を、固定用緩衝液(10mM酢酸ナトリウム、pH5.0(GE Healthcare、カタログ番号BR-1003-51))に溶かして30ug/mlに希釈したクローン146-Fcまたはクローン046-Fcに3〜5分間曝露した。1Mエタノールアミン-HCl pH8.5(GE Healthcare、カタログ番号BR-1000-50)35μlで未反応部位の反応を停止させた。約1900RUのクローン146-Fcおよび2500 RUのクローン046-Fcを固定した。1mM Mn+2を加えたHBS-P緩衝液中で、濃度0.39nM、1.56nM、6.25nM、25nM、および100nMにVLA4-Fcを希釈した。30ul/分で4分間、これらをクローン146-Fcおよびクローン046-Fcの上に注入した。解離を30分間モニターした。各VLA4-Fc注入後、10mMグリシン、pH1.7を30秒間2回注入することによって、チップを再生した。クローン146-Fcおよびクローン046-Fcの解離を、Fcを含まないそれらの単量体親ポリペプチド(それぞれ、クローン146およびクローン046)のヒトVLA4-Fc結合の過去の(historical)解離曲線と定性的に比較した。その際、実施例12で説明した通りにしてヤギ抗ヒトIgGを用いてVLA4-Fcを固定し、1回のサイクルにおいて0.16nM、0.8nM、4.0nM、20nM、および100nMの2D-VCAMポリペプチドを注入した。過去のアッセイ法においてFcを含まないタンパク質をチップに固定するために使用された抗ヒトIgGは2D-VCAM-Fcタンパク質およびVLA4-Fcタンパク質の両方のFc領域と交差反応すると思われるため、ヒトVLA4-Fcに対する2D-VCAM-Fc融合タンパク質の結合親和性を評価するために異なるアッセイ形式を使用することが必要であった。VLA4に対する2D-VCAMの結合を測定するための2種の異なるアッセイ形式によって与えられるRU尺度は異なるが、解離曲線および対応するKDは、両方のアッセイ形式について比較可能である。
【０３７１】
図17Aに示す通り、クローン146-FcはヒトVLA4-Fcに強固に結合した。試験した5種類の濃度のヒトVLA4-Fcすべてに対して、形状が類似した解離曲線が得られ、100nMの場合に最も高いRUが認められた。このアッセイ法におけるヒトVLA4-Fcへのクローン 146-Fc結合の解離曲線は、Fcを含まないタイプのクローン146のものと質的に類似していた(図17Aの差し込み図)。同様に、図17Bのデータから、100nM VLA4-Fcの場合に最も高いRUが得られた、ヒトVLA-Fcへのクローン046-Fcの結合が実証される。ヒトVLA4-Fcに対する046-Fcの解離曲線は、Fcを含まないタイプのクローン046に対して得られたものと質的に類似していた(図17Bの差し込み図)。まとめると、図17Aおよび図17Bのデータから、Fc融合物が、2D-VCAM-1ポリペプチドの機能的な薬物形態であることが実証される。このアッセイ法は、ヒトVLA4に対する2D-VCAM-1 Fc融合タンパク質の1つのアームの単量体結合親和性を測定するために設計されたものであり、このアッセイ法は、結合活性の効果によって強化されたFc融合物の抗原結合を測定する。インビボにおいて、2D-VCAM-1 Fc融合物は、VLA4インテグリン受容体に対する結合活性の強化のため、結合親和性に関して単量体2D-VCAM-1ポリペプチドに勝る優位性を有し得る。
【０３７２】
実施例24
二官能的にPEG化された2D-VCAM-1変異体ポリペプチドのPEG化、単離、および活性の確認
A.  二官能的にPEG化された2D-VCAM-1クローン146(SEQ ID NO: 18)のPEG化
二官能性PEG(1つのPEG分子への2つのタンパク質分子の結合を可能にする)を用いたタグ無し2D-VCAM-1変異体のN末端PEG化:5 mg/mlタンパク質(実施例15で説明)を、タンパク質に対して0.25〜1倍モル過剰の60K二官能性PEG-アルデヒド(SUNBRIGHT DE-600AL2; NOF Corporation、Tokyo、Japan)および1.26mg/ml NaCNBH3と反応させた。反応物を室温で3時間インキュベートした。
【０３７３】
B.  SPセファロースHPにおける60Kの二官能的にPEG化された2D-VCAM-1変異体の単離
PEG化された材料を、導電率が6mS/cm未満になるように1部の水および2部の平衡緩衝液で希釈した。この材料を、30mMアルギニン、20mMリンゴ酸、500mMグリシン、0.01％Tween-80、pH4で平衡化したSPセファロースHPカラムに添加した。平衡緩衝液で洗浄した後、250mMアルギニン、20mMリンゴ酸、500mMグリシン、0.01％ Tween-80、pH4への勾配を用いて、タンパク質を溶出させた。二官能的にPEG化された画分を集め、3K MWCO遠心濃縮装置を用いて濃縮し、3.5K MWCO透析カセットを用いてバッファーをPBSに交換した。SDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を解析した。
【０３７４】
C.  二官能的にPEG化された2D-VCAM-1クローン146のBIACORE結合
クローン146と同様に、二価のPEG60クローン146が、捕捉されたヒトVLA4-Fcに結合することを示した。実施例12で前述した通りにして、ヤギ抗ヒトIgG抗体(Jackson ImmunoResearch、カタログ番号105-005-098)をCM-5センサーチップ(GE Healthcare、カタログ番号BR-1000-14)上に固定した。ヒトVLA4-FcをHBS-P中で20ug/mlに希釈し、15ul/分で3分間捕捉した。典型的には、捕捉は約600RUであった。1mM Mn+2を加えたHBS-P中でクローン146(SEQ ID NO: 18)を6nM、30nM、および150nMに希釈した。最も薄いものから始めて、各濃度について30ul/分で3分間、これらの濃度を順次注入した。二価PEG60クローン146を同じ緩衝液中で16nM、80nM、および400nMに希釈し、同様に注入した。解離を30分間モニターした。結合サイクル間に、10mMグリシン、pH1.7を10ul/分で用いて、チップを3分間再生した。クローン146の結合を2回測定して、アッセイ法の再現性を確認した。
【０３７５】
図18に示すデータから、二価PEG60クローン146がヒトVLA4-Fcに結合したことが示される。PEG化されていないクローン146ポリペプチドと比べて、チップ上のヒトVLA4-Fcを飽和させるのにいくらか高い濃度が必要であった。これは、PEG50-146およびPEG80-146などのすべてのPEG化2D-VCAM-1クローンの特徴を示している。実験中、解離は観察されなかったことから、クローン146および二価PEG60クローン146の両方による非常に強固な結合が示唆された。二価PEG60クローン146の方が、VLA4インテグリン受容体に対する結合活性の強化のため、単量体PEG化クローン146(PEG50-146またはPEG80-146など)よりもインビボでヒトVLA4に対して高い結合親和性を有することが予想される。このデータから、2つの同一の2D-VCAM-1ポリペプチドを単一のPEG成分と連結して二価分子を形成させることは、2D-VCAM-1ポリペプチドの機能的な薬物形態であることが実証される。
【０３７６】
本発明の好ましい態様を例示し説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、それらの態様において様々な変更がなされてもよいことが容易に理解されるであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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