(57)【要約】複数の実施形態によると、インスリン産生細胞（IPTs）を作成する方法は、出生後の膵臓に由来する、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）とを用意すること、NEECsを培養すること、インビトロでVECsを培養すること、及び、インビトロでNEECsとVECsとからなる組織複合体を生成させることを含み、VECsの培養は、少なくとも部分的に、NEECsの培養とは別個に行われる。別の実施形態によると、自然膵島が、別個に培養した血管内皮細胞（VECs）の細胞単層上に播種される。さらに他の実施形態によると、NEECsを富化する方法が、容器または基材に接着したNEECsを培養すること、組織解離酵素で剥離して容器または基材に依然として接着している残存細胞（LOCs）を残すこと、及び、このLOCsの存在下、またはLOCsにより調整された培地中でNEECsを培養することを含む。
2013521797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
出生後の膵臓から分離したか、または由来する、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）とを用意すること、
インビトロで非内分泌上皮細胞（NEECs）を培養すること、
インビトロで血管内皮細胞（VECs）を培養すること、及び、
インビトロで非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）とからなる組織複合体を生成させることを含み、
血管内皮細胞（VECs）の培養は、少なくとも部分的に、非内分泌上皮細胞（NEECs）の培養とは別個に行われることを特徴とする、インスリン産生細胞（IPTs）を作成する方法。
【請求項２】
(1) 前記の用意する段階にて、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）とは、膵臓から膵島を分離した後に残された残存組織である膵廃棄組織から分離されること、及び
(2) 前記血管内皮細胞（VECs）は、前記非内分泌上皮細胞（NEECs）が分離されたかまたは由来するのと同一のドナー組織に由来するか、または、前記インスリン産生細胞（IPTs）が移植されるレシピエントからの組織に由来すること、
の少なくとも一方であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の非内分泌上皮細胞（NEECs）の培養には、
前記膵廃棄組織を、コラーゲンまたはその他の細胞接着性材料でコーティングした培養容器または培養基材に、血清含有培地中にて播種し、これに続いて培養系を静置し、そして最後に浮遊組織片を培養系から除去することにより、非内分泌上皮細胞（NEECs）を捕集すること、
前記捕集の進行中に初期培養を行うこと、及び、
径が10〜30μmの範囲内である非内分泌上皮細胞（NEECs）のクローン性コロニーが出現するまで、第2の無血清培地中で培養することにより、初期コロニー増殖を行うことが含まれることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第2の無血清培地が、ヒトKGF（ケラチノサイト増殖因子）を含むか、または、ヒトKGFと、インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウムのサプリメントまたは他の増殖因子のサプリメントとを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記捕集での血清含有培地について、FGF-2または他の線維芽細胞増殖因子、並びに、インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウムのサプリメント、またはその他の増殖因子サプリメントを含有する第1の無血清培地に交換し、この第1の無血清培地中にて引き続き培養を行うことにより、前記初期コロニー増殖の前で、前記捕集の後に、非内分泌上皮細胞（NEECs）のコロニーを誘起すること、及び
前記初期コロニー増殖の開始時に、第1の無血清培地を、第2の無血清培地に交換すること
をさらに含むことを特徴とする請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記の非内分泌上皮細胞（NEECs）を培養する段階は、これら細胞を選択的に増殖するための継代培養を含み、この継代培養には、
組織解離酵素溶液で処理して、培養容器または培養基材から非内分泌上皮細胞（NEECs）を剥離するようにし、また、濾過及び遠心分離の少なくも一方によって、第2の無血清培地から非内分泌上皮細胞（NEECs）を剥離することにより、前記初期コロニー増殖の際、またはこの後に、培養容器または培養基材から、そして、次いで第2の無血清培地から、非内分泌上皮細胞（NEECs）を剥離すること、及び、
この剥離の後に、非内分泌上皮細胞（NEECs）を培養することが含まれ、
この培養の段階において、
非内分泌上皮細胞（NEECs）が、コラーゲンまたはその他の細胞接着性材料でコーティングした培養容器または培養基材に播種され、
非内分泌上皮細胞（NEECs）が第3の無血清培地中にて培養される
ことを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記剥離の後に非内分泌上皮細胞（NEECs）を培養するための、コラーゲンまたはその他の細胞接着性材料が、KGF、または、KGF及び抗Notch1抗体を含むか、または、rock（Rho結合コイルドコイル含有蛋白質キナーゼ）阻害剤、または、rock阻害剤及びEGF（上皮増殖因子）及びHGF（肝細胞増殖因子）並びにBMP（骨形成蛋白質）を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第3の無血清培地に、アトルバスタチン、シンバスタチンまたはその他のスタチンが添加されることを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記の非内分泌上皮細胞（NEECs）を剥離する段階の後に、培養容器または培養基材上に残っている上皮細胞としての残存細胞（LOCs）を、剥離された非内分泌上皮細胞（NEECs）とは別々に培養すること、及び
前記の剥離する段階により得られた非内分泌上皮細胞（NEECs）について、残存細胞（LOCs）により調整された培地中にて、または、残存細胞（LOCs）存在下の培地中にて、培養すること
をさらに含むことを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記の非内分泌上皮細胞（NEECs）を剥離する段階の後に、プロティナーゼ、またはその他の解離酵素を用いて、培養容器または培養基材上に残っている上皮細胞としての残存細胞（LOCs）を剥離すること、及び
前記の剥離する段階により得られた非内分泌上皮細胞（NEECs）について、残存細胞（LOCs）により調整された培地中にて、または、残存細胞（LOCs）存在下の培地中にて、培養すること
をさらに含むことを特徴とする請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記の血管内皮細胞（VECs）を培養する段階は、
前記膵廃棄組織そのもの、または、前記の非内分泌上皮細胞（NEECs）を捕集する段階により剥離された浮遊組織片を、第2の血清含有培地中にて、コラーゲンまたはその他の細胞接着性材料でコーティングした培養容器または培養基材に播種すること、
この播種する段階に続いて、血管内皮細胞（VECs）を増殖させること、
培地の交換を行い、この際には、前記の増殖させる段階の後で非接着性の細胞または組織を剥離して、新鮮な血清含有培地と交換すること、及び、
抗体を用いて血管内皮細胞（VECs）を純化し、また、前記の播種する段階、及び、前記の培地の交換を行う段階を繰り返すことにより、純化された血管内皮細胞（VECs）を増殖させること
を含むことを特徴とする請求項３〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記組織複合体を生成させる段階には、
組織解離酵素溶液で処理して非内分泌上皮細胞（NEECs）及び血管内皮細胞（VECs）を培養容器または培養基材から剥離し、次いで、遠心分離により、非内分泌上皮細胞（NEECs）及び血管内皮細胞（VECs）を培地から剥離することにより、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）とを別々に培養するのが完了した際、またはこの後に、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）とを、培養容器または培養基材から剥離し、次いで培地から剥離すること、
この剥離する段階により得られた非内分泌上皮細胞（NEECs）及び血管内皮細胞（VECs）を、血清含有分化培地が入れられた低接着性培養容器中に入れること、
組織複合体の初期形成が行われるまで、低接着性培養容器に非水平回転運動を加えること、及び、
低接着性培養容器を水平に静置して、前記血清含有分化培地、または同種の培地を交換することにより、前記の組織複合体の初期形成の後における前記インスリン産生細胞（IPTs）を熟成させること
が含まれることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記血清含有分化培地が、アクチビン、他の増殖因子、骨形成蛋白質及びCaCl2を含み、
非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）との混合比は、これら細胞の合計数に対する血管内皮細胞（VECs）の数の比率が、3%〜25%であり、
前記熟成させる段階において、前記血清含有分化培地から、CaCl2が省かれる
ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
出生後の膵臓から分離したか、または由来する、血管内皮細胞（VECs）と自然膵島とを用意すること、
細胞単層が形成されるように、インビトロで血管内皮細胞（VECs）を培養すること、及び、
自然膵島を、前記細胞単層上に播種して、この細胞単層上で増殖させること
を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞（IPTs）を作成する方法。
【請求項１５】
コラーゲンまたはその他の細胞接着性材料でコーティングした培養容器または培養基材に、血管内皮細胞（VECs）を播種して、ここで増殖させること、
血管内皮細胞（VECs）を培養容器または培養基材から剥離すること、及び、
前記細胞単層を形成するための前記の培養する段階の前に、抗体を用いて血管内皮細胞（VECs）を純化すること
をさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
出生後の膵臓から分離したか、または由来する、非内分泌上皮細胞（NEECs）を用意すすること、
インビトロで非内分泌上皮細胞（NEECs）を、培養容器または培養基材に接着した状態で培養すること、
組織解離酵素溶液で処理することで、培養容器または培養基材から非内分泌上皮細胞（NEECs）を剥離し、これにより、培養容器または培養基材に依然として接着している残存細胞（LOCs）を残すこと、
剥離された非内分泌上皮細胞（NEECs）と、残存細胞（LOCs）とを互いに別々に培養すること、及び、
非内分泌上皮細胞（NEECs）について、残存細胞（LOCs）により調整された培地中にて、または、残存細胞（LOCs）存在下の培地中にて、培養することで細胞クラスターを形成させること、
を含むことを特徴とする、インスリン産生細胞（IPTs）を作成する方法。
【請求項１７】
解離酵素を用いて培養容器または培養基材から残存細胞（LOCs）を剥離すること、及び、
細胞クラスターを形成させる培養を行う際、またはその前に、剥離した残存細胞（LOCs）について、非内分泌上皮細胞（NEECs）の培地と連通する培地に入れるか、部分的に非内分泌上皮細胞（NEECs）の培地へと運ばれる培地に入れるか、または、その他の方式により、非内分泌上皮細胞（NEECs）のための、調整培地を生成するための培地に入れること
をさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
非内分泌上皮細胞（NEECs）が浸漬された培地中に少なくとも部分的に浸漬された、培養容器または培養基材上に、剥離した残存細胞（LOCs）を配置するか、または、
培地に浸漬した多孔性容器中に、剥離した残存細胞（LOCs）を入れ、残存細胞（LOCs）が入ったこの容器を、さらに別の細胞容器または細胞基材上に配置し、この際、非内分泌上皮細胞（NEECs）を、多孔性容器中の培地と連通及び／または連続している培地中にて増殖させる
ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン産生組織（IPTs）を生成するための培養法に関する。特には、いずれも膵臓から分離したものである、膵由来非内分泌上皮細胞（NEECs）及び／または血管内皮細胞（VECs）（すなわち、これらうちの少なくともいずれか）を培養することによる上記の培養法、または、自然膵島細胞の増殖を促進させるべく血管内皮細胞（VECs）を用いることによる上記の培養法に関する。本発明は、また、インスリン産生組織（IPTs）へと分化可能な細胞を富化する方法に関する。ここでの、細胞を富化する方法には、膵由来非内分泌上皮細胞（NEECs）を含有する、膵細胞の初代培養から分離された残存細胞（LOCs）の存在下にて膵由来非内分泌上皮細胞（NEECs）を培養する方法が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
膵島の移植は、I型糖尿病の有効な治療法として認められている。しかし、この処置は、目下のところ、レシピエントにおける20%未満までのインスリン非依存性を実現するものであり、2人以上のドナーからの膵島を必要とする。複数のドナーから膵島移植を受けたレシピエントであっても、最近の研究が示すのは、膵島のほんの一部のみ生着しているということである。また、言うまでもなく、使用可能なドナーの組織は、常に不足している。
移植可能な膵島の不足を埋め合わせる1つの方策は、生体外での培養法で、充分な量の内分泌組織を、ドナーの膵臓に存在しうる膵島前駆細胞から生成することである。数々の方法が提案されたものの、生体外で生成された膵島様組織は、次の２者のうち少なくとも一方となる傾向にある。すなわち、自然膵島が生産するインスリンの量に比べて貧弱な量、往々にして１％未満の量のインスリンを生産するか、または、適切なレベルのグルコース応答性を有しないかの、少なくも一方である。グルコース応答性が適切なレベルでないということは、グルコース濃度の増加に対応して、より多くのインスリンを分泌することができないということである。
いくつかの研究は次のことを示している。すなわち、出生後の膵臓中に膵島前駆細胞が存在すること、及び、外的ストレスにより生体中にて内分泌細胞が再生することを示している。例えば、アロキサンやストレプトゾシンといった毒を投与することにより、膵臓に膵切除といった外科的処置を行うことにより、または、管結さつと呼ばれる膵管の結び止めを行うことにより、生体中にて内分泌細胞が再生することを示している。近年、膵管結さつが、膵臓の広範な炎症と、細胞アポトーシスとを引き起こすことについて知られた（Xu et al., 2008, Cell 132:197-207）。膵臓組織中における前駆細胞の精確な組織部位は、未だ明らかにされていないが、数多くの研究は、前駆細胞が、膵臓における膵管または腺房中心の領域に存在するという証拠を見つけ出した。また、いくつかの他の研究により、膵島中にも存在することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開WO2008/063640
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】XIA Bら、BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. vol. 383, no. 4, 2009, p383-385
【非特許文献２】TODOROV I.ら、PANCREAS vol.32, no.2, 2006, p130-138
【非特許文献３】金宗 潤（KANAMUNE J.）ら、REGENERATIVE MEDICINE vol. 8, no. 31, 2009, p154
【非特許文献４】MURRAY H.E.ら、DIAVETOLOGIA vol.52, no.3, 2009, p477-485
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前駆細胞の精確な性質は明らかになっていないが、前駆細胞を分離するための種々の方法が試された。それらのうちの１つの方法は、特定の組み合わせの細胞表面マーカーを用いるソーターによる分離である。この方法の欠点は、収集された細胞の量が、往々にして、増殖培養に充分でない。これは、分離ステップにより引き起こされた損傷、及び、細胞表面マーカーから起こり得る偏りのためである。他の一つの方法は、膵廃棄組織（膵島分離後の残り）をまるごと培養することによる目標細胞の選択的な増殖である。膵廃棄組織は、適切な媒体及び増殖因子を入れた培養容器に播種され、前駆細胞になる見込みのものの増殖を促進するようにする。この方法を採用する際の課題は、どの細胞について、また、どの段階にある細胞について、所定の培養プロトコルによって増殖させる必要があるかを予測することである。
【０００６】
移植可能な膵島の不足を埋め合わせる他の方策は、自然膵島細胞を生体外にて増殖させることである。膵島細胞、中でもベータ細胞は、分化を終了した性質を持つと考えられており、そのため、インビトロで増殖を促進するのは、困難であり、このための効率的な方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様によるインスリン産生組織を作成する方法は、インビトロにて、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）とからなる組織複合体を生成することを含む。ここで、非内分泌上皮細胞（NEECs）及び血管内皮細胞（VECs）は、いずれも、出生後の膵臓から分離したか、または由来したものである。
【０００８】
本発明の第２の態様によるインスリン産生組織を作成する方法は、以下の(1)〜(3)を含む。すなわち、(1)出生後の膵臓から分離したか、または由来したものである血管内皮細胞（VECs）及び自然膵島細胞を用意すること、(2)インビトロで血管内皮細胞（VECs）について、細胞単層を形成するように培養すること、及び、(3)この自然膵島細胞を前記血管内皮細胞（VECs）単層上に播種して増殖させることを含む。
【０００９】
本発明の第２の態様によるインスリン産生細胞（IPTs）を作成する方法は、以下の(1)〜(5)を含む。すなわち、(1)出生後の膵臓から分離したか、または由来したものである非内分泌上皮細胞（NEECs）を用意すること、(2)インビトロで非内分泌上皮細胞（NEECs）について、培養容器の表面または培養基材（「培養基材」の語は、これ以降、あらゆる形態の足場材料を含むものとする）に接着した状態で培養すること、(3)組織解離酵素で処理することにより、培養容器の表面または培養基材から非内分泌上皮細胞（NEECs）を剥離し、培養容器の表面または培養基材に依然として接着している残存細胞（LOCs）を残すこと、(4)剥離した非内分泌上皮細胞（NEECs）と、残存細胞（LOCs）とを其々に別々に培養すること、及び(5)非内分泌上皮細胞（NEECs）について、残存細胞（LOCs）が培養された調整培地中にて、または、この残存細胞（LOCs）の存在下にて培養を行って、細胞クラスターを形成することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄは、非内分泌上皮細胞（NEECs）の経時的増殖状態を示す顕微鏡写真である。図１Ａは、細胞捕集ステップにて、コラーゲンIでコーティングした培養皿の表面に接着した状態の細胞を示す（実施例２）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、20ng/ml FGF-2及び1400U/ml LIFを含む無血清培地中にて、増殖するよう誘起された細胞コロニーを示す（実施例３）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、10mMニコチンアミド, 0.02μＭ(10-6M) 2-メルカプトエタノール及び10ng/ml KGFを含む無血清培地中にて、さらに、２日間増殖させた細胞コロニーを示す（実施例４）。
【図１Ｄ】図１Ｄは、同一の無血清培地中にて７日間培養した後の、大部分が上皮細胞である稠密な細胞単層の形成を示す（実施例４）。
【図２Ａ】図2Ａ〜２Ｃは、非内分泌上皮細胞（NEECs）の種々のコロニー中における細胞分布密度を示すグラフである。図2Ａは、コラーゲンIでコーティングして抗体で処理した培養皿に、アキュターゼ処理した膵臓の組織を播種した後、血清含有培地にて18時間及び36時間培養した場合の、非内分泌上皮細胞（NEECs）のコロニー中の密度について示す。
【図２Ｂ】図2Ｂは、培地を無血清培地に交換した際に、FGF-2による刺激の後に、膵管組織、または、まるごとの膵臓を消化酵素処理した組織から出現した非内分泌上皮細胞（NEECs）を示す。
【図２Ｃ】図2Ｃは、ブロモデオキシウリジン（Brdu）を加えた非内分泌上皮細胞（NEECs）について、抗Notch１抗体で処理したコラーゲンIコーティング済みの培養容器（抗Notch１）で継代培養した場合、及び、抗体処理しなかったコラーゲンIコーティング済みの培養容器（未処理）で継代培養した場合を示す。
【図３−１】図３−１Ａは、培養容器のコーティング済みの表面上にある非内分泌上皮細胞（NEECs）を示す顕微鏡写真であり、コラーゲンIでコーティングされた培養容器にて、10ng/mlのEGF、10ng/mlのHGF、20 ngのBMP7及び4μＭのrock阻害剤を添加した無血清培地中で培養後のものを示す。ここで、培養容器には、残存細胞（LOCs）を入れたトランスウェルインサートを装着しておいた。矢印は、大きさが増加した非内分泌上皮細胞塊（NEECs）であって、培地中、図３−１Ｂに示すトランスウェルインサート中の残存細胞（LOCs）のクラスターと、ほぼ一致する位置に現れるものを示す。図3−１Ｂは、トランスウェルインサート中の残存細胞（LOCs）について、コーティング済み培養容器上の非内分泌上皮細胞（NEECs）と共培養した後のものを示す。ここで、矢印は残存細胞（LOCs）のクラスターを示す。図3−１Cは、1週間後の非内分泌上皮細胞（NEECs）のクラスターであって、より成熟した三次元構造を有するものを示す。
【図３−２】図3−２は、トランスウェルインサート中に、残存細胞（LOCs）が存在する状態で培養したものと、非存在下で培養したものとの、細胞クラスター数の差を示すグラフである。
【図３−３】図3−３は、残存細胞（LOCs）と、非内分泌上皮細胞（NEECs）についてインサート中に残存細胞（LOCs）を入れて培養したもの、及び入れずに培養したものと、自然膵島とにおける、Pdx-1及びIns1のmRNA発現を示す。
【図４Ａ】図4Ａは、非内分泌上皮細胞（NEECs）を抗インスリンプライマリ及びCy3結合二次抗体、並びにDAPI（4',6-ジアミノ-2-フェニルインドール）で染色したものの蛍光顕微鏡写真である。アトルバスタチンの存在下に培養したものについて「ATS-treated」として右側に示し、非存在下に培養したものについて「Control」として左側に示す。なお、上方側の区画の画像には、インスリン免疫染色した細胞を示し、下方側の区画の画像には、DAPIで染色した対応する細胞核を示す。左上の区画のサイズ・バーは、全ての画層についての100マイクロメートルを表す。
【図４Ｂ】図4Bは、これらの画像から得られるインスリン陽性細胞の割合を示す。
【図５Ａ】図5Aは、非内分泌上皮細胞（NEECs）の細胞核でのNgn3の発現を示す一組の蛍光顕微鏡画像である。これら細胞は、オールトランス型レチノイン酸（RA）及びシクロパミンKAAD（CYCL-K）のいずれかで24時間処理したもの（左側の画像）、または、処理しないままのもの（右側の画像）である。なお、上方の区画は、細胞核をDAPIで染色してNgn3の細胞核での偏在を確かめたものである。右下の区画のサイズ・バーは、全ての区画における５マイクロメートルを表す。
【図５Ｂ】図5Bは、非内分泌上皮細胞（NEECs）中におけるNgn3陽性細胞の割合を示すグラフである。
【図６Ａ】図6Ａ〜6Ｂは、非内分泌上皮細胞（NEECs）についての、半定量RT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）に基づく、Ngn3, Pdx1, NeuroD, Ptf1a（図6A中）及びNotch1, Hes1, HNF6及びNkx6.1（図6B中）の遺伝子の相対発現を示す。「１」は膵廃棄組織、「２」は無血清培地で5日間培養後の非内分泌上皮細胞（NEECs）、「３」は、この後、オールトランス型レチノイン酸とシクロパミンKAADを含む培地中にて24時間培養した非内分泌上皮細胞（NEECs）、「４」は、「３」の培養系のコントロールである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、上述のようなNotch1、Hes1、HNF6及びNkx6.1の遺伝子の相対的な表現を示す。
【図７−１】図７−１は、インスリン産生細胞（IPTs）を生成するのに用いた細胞の画像（区画「Ａ」及び「Ｂ」）、及び、生成されたインスリン産生細胞（IPTs）の画像（区画「Ｃ」及び「Ｄ」）である。ここで、区画「Ａ」は、膵廃棄片から増殖させ、磁気ミクロビーズ及び抗CD31抗体を用いて分離されて増殖させたものを示す。区画「Ｂ」は、80％の非内分泌上皮細胞（NEECs）と20％の血管内皮細胞（VECs）とから構成される混合細胞浮遊液を示す。区画「Ｃ」は、この混合細胞浮遊液について、非水平回転運動を加えつつ２４時間インキュベートした後の、球状の組織複合体を示す。区画「Ｄ」は、成熟したインスリン産生細胞（IPTs）を示す。
【図７−２】図７−２は、非内分泌上皮細胞（NEECs）単独により、または非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）との組織複合体により生成されたインスリン産生組織（IPTs）（100〜200マイクロメートルの直径）の数を示すグラフである。
【図８−１】図8−1は、非内分泌上皮細胞（NEECs）から生成され、20日間熟成されたインスリン産生組織（IPTs）の画像を示す。すなわち、非内分泌上皮細胞（NEECs）単独により生成したもの（A）、及び、80％のNEECsと20％のVECsとの複合組織により生成したもの（B）の画像を示す。サイズバーは30マイクロメートルを表す。
【図８−２】図８−２は、インスリン産生組織（IPTs）におけるインスリン産生細胞の割合を示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、半定量的PCRにより増幅したインスリンmRNA発現の画像及びグラフを示す。図９Ａ中、MはDNAサイズマーカーを示す。
【図９Ｂ】図9Bは、Insulin1発現のグラフである。
【図９Ｃ】図9Bは、Insulin2発現のグラフである。
【図１０】クレブス緩衝培地（20mM）中にて低グルコース濃度（5mM）及び高グルコース濃度の刺激をインスリン産生組織（IPTs）に加えた際の、C-ペプチドの分泌（図10A）及びインスリンの分泌（図10B）について示す。
【図１１−１】図１１−１には、チャンバースライド上にて血管内皮細胞（VECs）の細胞単層の上に増殖させた膵島細胞の画像を示す。
【図１１−２】図１１−2には、チャンバースライド上の血管内皮細胞（VECs）の細胞単層の上に播種した膵島細胞（A、B及びC）、及び、チャンバースライド上のコーティングされた表面に播種した膵島細胞（D、E、およびF）についての一連の免疫細胞化学的な画像を示す。
【図１１−３】図１１−３は、血管内皮細胞（VECs）の細胞単層の上、及びマトリゲル上にて増殖させた膵島細胞においてのブロモデオキシウリジン陽性細胞（％Brdu+細胞）の割合を示すグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、糖尿病マウスの血糖値の変化を示す。ここで、この糖尿病マウスは、同系統のドナーマウスの膵臓組織から生成された、700膵島イクイヴァレンツのインスリン産生組織（IPTs）を腎臓カプセルで包んだ状態で移植したものである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、指示された期間だけ血糖値を測定した後に摘出された、腎臓の被膜下におけるインスリン陽性細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、インスリン産生組織（IPTs）の形成と内分泌機能を増進させることができる培養法を提供する。特には、膵臓由来の非内分泌上皮細胞（NEECs）を、同じく膵臓から分離された血管内皮細胞（VECs）とともに培養することで、インスリン産生組織（IPTs）の形成を増進させる培養法を提供する。本発明は、また、血管内皮細胞（VECs）について、自然膵島の増殖を促進させるという別の用途を提供する。したがって、次のようなことを可能にする具体的な細胞の分離及び培養の方法を提供する。すなわち、非内分泌上皮細胞（NEECs）のコロニーを増殖させて、膵島様性質が付与されたインスリン産生組織（IPTs）を生成することを可能にし、また、I型（自己免疫性）及びII型（インスリン抵抗性）の糖尿病を治療するための自然膵島の増殖を促進させることを可能にする具体的な細胞の分離及び培養の方法を提供する。
【００１２】
第１の好ましい実施形態において、前記の非内分泌上皮細胞（NEECs）は、膵島を分離した後の廃棄組織から培養されるものであり、細胞群が、下記の（１）及び（３）を含む方法により、好ましくはさらに下記の（２）をも含む方法により、イニシエートされる。
【００１３】
（１）細胞の捕集：前記の膵廃棄組織を、血清含有培地に播種する。ここで、この血清含有培地に接する培養容器または培養基材は、コラーゲンといった細胞接着材料でコーティングされており、好ましくは、抗c-Met（HGF受容体）抗体及び／または抗E-カドヘリン抗体でコーティングされたものである。播種後、培養系を静置する。例えば、8〜56時間、約37℃にて二酸化炭素富化環境下に静置する。一実施例において、細胞の捕集は、次のように行われる。すなわち、次のようにコーティングした培養容器内にて10体積%のウシ胎児血清を含むRPMI1640培地中にて行われる。培養容器は、0.2mg/mlのラット尾由来コラーゲンIでコーティングされたものであり、さらには、抗E-カドヘリン抗体、及び／または、抗c-Met（HGF受容体）抗体で、1:100と1:1000との間の範囲の濃度にてコーティングされたものである。この組織は、約37℃で5%CO2にて24〜6時間培養される。
【００１４】
（２）コロニーの誘起：上記の細胞の捕集での血清含有培地について、以下を含有する第1の無血清培地に交換する。すなわち、FGF-2または他の線維芽細胞増殖因子、並びに、インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウムのサプリメント、またはその他の増殖因子サプリメントを含有し、好ましくはさらにLIF（白血病阻害因子）を含む第1の無血清培地に交換する。そして、この無血清倍地中にて培養を続ける。例えば、少なくとも8時間、約37℃の二酸化炭素富化環境内にて行う。好ましくは、第1の無血清培地が、線維芽細胞増殖因子を2〜40ng/ml、より好ましくは5〜30ng/mlの範囲で含有するか、LIFを100〜15000U/ml、より好ましくは300-5000U/ml含有するかの、いずれか、または両方である。一実施例において、第1の無血清培地が、1g/リットルのITS（インスリン-トランスフェリン-セレンのサプリメント。例えば、インスリンが5μg/ml、トランスフェリンが5μg/ml、亜セレン酸ナトリウムが5ng/ml）、0.2％のウシ血清アルブミン（BSA）、20ng/mlの組換えヒトFGF-2及び1400U/mlの組換えヒトLIF（白血病抑制因子）を、10mMのD-グルコースを含有するDMEM/Ham's F-12中に含み、培養が少なくとも24時間行われる。このステップは省略可能であり、細胞捕集ステップ（1）の後に、直接続けて、下記に示す初期のコロニー増殖のステップ（3）が行われるのであっても良い。
【００１５】
（3）初期のコロニー増殖：コロニー誘起（2）での第1の無血清培地について、ヒトKGF（ケラチノサイト増殖因子）を含む第2の無血清培地、または、ヒトKGF（ケラチノサイト増殖因子）と、インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウムのサプリメントまたは他の増殖因子のサプリメントとを含む第2の無血清培地に交換する。そして、クローン性の非内分泌上皮細胞（NEECs）であって、細胞の寸法が、直径で10〜30μmの範囲内であるものが出現するまで、培養を行う。好ましくは、第2の無血清培地は、1〜100ng/mlの範囲内のKGF、より好ましくは3〜30ng/mlの範囲内のKGFを含む。第2の無血清培地は、好ましくは0.1〜10g/Lの範囲の増殖因子のサプリメントを含む。
例えば、第2の無血清培地は、1g/LのITS（インスリンが5μg/ml、トランスフェリンが5μg/ml、亜セレン酸ナトリウムが5ng/ml）、0.2％のウシ血清アルブミン（BSA）、10mMのニコチンアミド、及び10ng/mlの組換えヒトKGF（ケラチノサイト増殖因子）を、7mMのD-グルコースを含有するDMEM/Ham's F-12中に含むものである。そして、培養は、例えば、少なくとも２〜７日間、約37℃の二酸化炭素富化環境内で行われる。線維芽細胞様細胞の増殖を軽減させるためには、必要ならば0.02μMの2-メルカプトエタノールを培地に添加することができる。マイコプラズマの感染を防止するためには、マイコプラズマ除去剤を培地に添加することができる。好ましくは、培地交換を、2〜3日ごとに行い、寸法が10〜30μmである非内分泌上皮細胞（NEECs）のクローン性コロニーが、相当な数だけ現れるまで行う。
【００１６】
第2の好ましい実施形態において、前記の非内分泌上皮細胞（NEECs）は、下記の（４）〜（６）の技法による選択的増殖へと、継代される。
【００１７】
（４）第1の細胞剥離：第1の好ましい実施形態の初期コロニー増殖（３）での非内分泌上皮細胞（NEECs）を、組織解離酵素溶液で処理することにより、培養容器から剥離する。また、濾過及び／または遠心分離によって、第2の無血清培地から非内分泌上皮細胞（NEECs）を捕集することにより、細胞剥離を行う。例えば、アキュターゼが剥離に用いられ、剥離された細胞は、40μmのメッシュを通して濾過し、4分未満の間160×G以下で遠心分離する。
【００１８】
（５）第2の細胞剥離または細胞剥離：第1の細胞剥離（４）における強固に接着された上皮細胞である残存細胞（LOCs）を、強力な細胞解離剤、または、例えばトリプシン-EDTA（エチレンジアミン四酢酸）といった部分的な蛋白質分解を行う分解剤を添加することにより、培養容器から剥離する。例えば、残存細胞（LOCs）を約37℃にて1〜15分間処理する。詳細な一実施例においては、残存細胞（LOCs）の剥離が、0.05％トリプシン-EDTAを用いて37℃で3〜5分間行われる。これらの細胞は、無血清培地にて洗浄された後、トランスウェルインサートに移され、後で用いる培地中にて培養される。
【００１９】
（６）第1の細胞剥離で得られた非内分泌上皮細胞（NEECs）は、第2の細胞剥離で得られた残存細胞（LOCs）が培養された調整培地中にて培養される。好ましい実施例において、第1の細胞剥離（4）で得られた剥離細胞は、第1の好ましい実施形態の細胞捕集ステップ（1）におけると同様に、新たな培養容器に播種されるか、または他の培養容器に播種される。そして、このような培養容器には、第2の細胞剥離で得られた残存細胞（LOCs）が入れられたトランスウェルインサート（例えばミリポア社）が装填される。トランスウェルインサートにおける穴の開いた底部を通じて、トランスウェルインサート内の培地は、非内分泌上皮細胞（NEECs）の培地と同一か、または連通している。好ましくは、第1の細胞剥離（4）で得られた非内分泌上皮細胞（NEECs）が、KGFを含むコラーゲン、または、KGF及び抗Notch1抗体を含むコラーゲンでコーティングされている培養容器または培養基材に播種される。そして、非内分泌上皮細胞（NEECs）は、アトルバスタチンを添加した第3の無血清培地中にて培養される。ここで、KGF、または、KGF及び抗Notch1抗体は、rock（Rho結合コイルドコイル含有蛋白質キナーゼ）阻害剤、または、rock阻害剤、EGF（上皮増殖因子）及びHGF（肝細胞増殖因子）並びにBMP-4またはBMP-7の混合物で置き換えることができる。
【００２０】
例えば、培養容器にコーティングするコラーゲン溶液は、10ng/mlのKGFを含むように調整され、コーティングされた表面は、さらに、抗Notch1抗体にて、最終濃度が1:100〜1:1000となるように処理される。上記に代えて、コラーゲンコーティングがKGFを含まず、抗Notch1抗体によっても処理されず、代わりに、第1の細胞剥離ステップ（１）の培地中のKGFが、以下によって置き換えられるのであってもよい。すなわち、10ng/ml, 15ng/mlまたは20ng/mlより多く30ng/mlまたは20ng/mlより少ない（例えば20ng/mlの）HGF（肝細胞増殖因子）と、10ng/ml, 15ng/ml, 20ng/mlまたは30ng/mlより多く50ng/mlまたは50ng/mlより少ない（例えば40ng/mlの）EGF（上皮増殖因子）と、2μM, 4μM, 8μMまたは14μMより多く25μM, 20μM, 14μMまたは8μM少ない（例えば4μMの）rock（Rho結合コイルドコイル含有蛋白質キナーゼ）阻害剤とによって置き換えられるのであっても良い。細胞剥離（4）で得られた、剥離された非内分泌上皮細胞（NEECs）が、培養容器に播種され、場合により、残存細胞（LOCs）が入れられたトランスウェルインサートが装填されてから、好ましくは、培地に、アトルバスタチンが、0.01〜1.0μM、より好ましくは0.03〜0.3μM、例えば0.1μM添加される。また、この培地には、さらに、10ng/mlまたは15ng/mlより多く40ng/mlまたは30ng/mlより少ないBMP7が添加することができる。このようにして、後の分化の際に、内分泌細胞になろうとする傾向を持つ非内分泌上皮細胞（NEECs）を富化することができる。培地交換は、2〜3日ごとに、40％調整培地で、非内分泌上皮細胞（NEECs）のクローン性コロニーが、相当な数だけ現れるまで行う。非内分泌上皮細胞（NEECs）のクローン性コロニーは、自然に、細胞クラスターを形成するのであり、この細胞クラスターは、分化時における上記の組織複合体を形成する傾向をさらに増大させる、さらなる富化のために、継代培養に供することができるものである。
【００２１】
第3の好ましい実施形態において、前記の非内分泌上皮細胞（NEECs）は、増殖培養または継代時に次のような細胞を含む。すなわち、Hes1、Notchシグナリングの下流ターゲットを示し、かつ、全トランスレチノイン酸およびシクロパミンKAAD（3-ケト-N-(アミノエチル-アミノカプロイル-ジヒドロシナモイル)シクロパミン）による処理でNgn3陽性細胞として同定され、これにより、インスリン産生細胞を生成する能力を備えた前駆細胞の特性を示す細胞を含む。
【００２２】
第4の好ましい実施形態において、前記の血管内皮細胞（VECs）は、膵島を除去した後の廃棄組織から培養され、細胞群のイニシエーションが、下記の（7）及び（8）の技法により行われる。
【００２３】
（7）播種：第1の実施の形態の細胞捕集ステップ（1）で除去された前記廃棄組織そのもの、または浮遊組織を、第2の血清含有培地中、コラーゲンまたはその他の細胞接着材料がコーティングされている培養容器または培養基材に播種する。そして、第2の血清含有培地中にて、培養を行う。好ましくは、この培養には、以下が含まれる。すなわち、前記播種に引き続いて血管内皮細胞（VECs）を増殖させることと、培地交換することと、抗体及び磁気ビーズを用いて血管内皮細胞（VECs）を純化することが含まれる。培地交換は、次のように行われる。すなわち、上記の増殖の後で非接着の細胞及び組織片を除去し、例えば、リン酸塩緩衝液といった生理溶液でざっと洗浄してから、新鮮な無血清培地を補充することにより行われる。より好ましくは、新鮮な無血清培地が、ファンギゾン（商品名、インビトロジェン社）といった抗真菌剤を含む。
【００２４】
第2の血清含有培地は、例えば、1.8mg/mlのラット尾由来コラーゲンIをコーティングした培養容器中にあって、65.5℃にて60〜70分間の熱不活化が施された胎児ウシ血清（FCS）20体積％と、70〜100μg/mlのECGS（内皮細胞増殖サプリメント）とを含むRPMI1640培地である。例えば、非接着組織片を18時間の培養後に除去し、接着している細胞及び組織を、素早くリン酸塩緩衝液にて洗浄してから、0.1体積％のファンギゾンを含む新鮮な培地を補充する。
【００２５】
（8）血管内皮細胞（VECs）の純化：抗体と磁気ビーズによって血管内皮細胞（VECs）を純化する。好ましくは、抗体結合マイクロビーズといった抗体結合基材であって、抗CD31抗体を有するものなどを用いる。好ましくは、（7）に記載した、前記の播種及び前記の培地交換を繰り返すことで、純化した血管内皮細胞（VECs）をさらに増殖させる。
【００２６】
第5の好ましい実施形態においては、前記の血管内皮細胞（VECs）が培養容器に播種され、第4の好ましい実施形態にて具体的に記載された培地中で、ほぼコンフルエントな細胞単層を作り出す。すると、分離され純化された自然膵島から解離された細胞または細胞クラスターが、血管内皮細胞（VECs）の細胞単層に播種され、膵島の細胞または細胞クラスターの増殖を促す。好ましくは、血管内皮細胞（VECs）について、第4の好ましい実施形態における播種及び培養（7）及び／または純化（8）を行い、この後に、血管内皮細胞（VECs）の細胞単層が形成される。
【００２７】
第1、第4または第5の好ましい実施形態にしたがう実施形態において、前記血管内皮細胞（VECs）は、非内分泌上皮細胞（NEECs）が分離されたと同一のドナー組織に由来するか、または、インスリン産生細胞（IPTs）または自然膵島が移植されるレシピエントの組織に由来する。
【００２８】
前述のいずれかの実施形態にしたがう実施形態において、前記のインスリン産生細胞（IPTs）は、下記の（9）〜（11）による培養方法を用いて、前記の非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）との組織複合体を形成することにより生成される。
【００２９】
（9）剥離：第2の好ましい実施形態での第1の細胞の剥離（4）におけると同様にして、前記の非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）を剥離し、低接着性培養容器中にて、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）との組織複合体を生成する。
【００３０】
（10）組織複合体の生成：前記剥離（9）で得られた前記の非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）との前記組織複合体を、血清含有分化培養液を備える低接着性培養容器中に入れ、この低接着性培養容器に非水平回転運動を、組織複合体の初期形成が行われるまで行う。これら2種類の細胞の混合比は、好ましくは97/3〜70/30、より好ましくは97/3〜25/75または95/5〜70/30、さらに好ましくは95/10〜70/30または95/5〜75/25、一層好ましくは95/10〜75/25である。
【００３１】
好ましくは、血清含有分化培地が、アクチビン、他の増殖因子、及びCaCl2を含む。より好ましくは、血清含有分化培養培地が、例えば、BMP-7またはBMP-4などの骨形成タンパク質を含む。さらに好ましくは、血清含有分化培地が、ベータセルリン及び/またはエキセンディン-4を含む。好ましい実施例において、アクチビン、ベータセルリン、HGF（肝細胞増殖因子）、ガストリン、IGF（インスリン様増殖因子）-1、KGF、VEGF（血管内皮細胞増殖因子）、BMP7、エキセンディン-4、アスコルビン酸及びCaCl2を含む。具体的な実施例において、培地は、DMEM/Ham's F-12及び20mMのD-グルコースを含み、2体積％の胎児ウシ血清（FCS）、2ng/mlのアクチビンA、5ng/mlのベータセルリン、20ng/mlのHGF、20ng/mlのガストリン、20ng/mlのBMP7、20ng/mlのIGF-1、5ng/mlのKGF、20ng/mlのVEGF、20ng/mlのエキセンディン-4、10mMのニコチンアミド、0.1mMのアスコルビン酸、及び、1mMのCaCl2が添加されている。培養容器についての非水平回転運動を、インスリン産生細胞（IPTs）の球状クラスターがこの培地中に出現するまで行う。好ましくは、10、15または20rpmより小さいスピードで行う。例えば、37℃で5％CO2にて18〜24時間行う。
【００３２】
（11）インスリン産生細胞（IPTs）の熟成：以下の点を除き前記の生成（10）におけると同じ手順によりインスリン産生細胞（IPTs）を熟成する。すなわち、培養容器が水平に、運動することなく配置され、培地が全くCaCl2を含んでいない点を除くと同じ手順で熟成する。好ましい実施例において、培地は、約20日間の全成熟期間中、1〜2日ごとに交換される。
【００３３】
上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、培地に添加される抗生物質は、50〜100U/mlのペニシリンと、50〜100μg/mlのストレプトマイシンであるが、このストレプトマイシンは50〜100U/mlのゲンタマイシンに置き換えてもよい。
【００３４】
上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、培地に添加されるITS（インスリン-トランスフェリン-セレン酸ナトリウムサプリメント）の原液は、約5μg/mlのインスリンと、約5μg/mlのトランスフェリンとを含み、亜セレン酸ナトリウムを、好ましくは0.5〜5ng/ml、より好ましくは0.75〜2.5ng/ml、例えば1.25ng/ml含む。
【００３５】
上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、前記のインスリン産生組織（IPTs）は、これら実施形態に示される方法によらずに形成される組織に比べて、インスリン産生細胞の割合が、より大きい組織を、より大きい分量で含む。
【００３６】
上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、インスリン産生組織（IPTs）は、これら実施形態に示される方法によらずに形成される組織に比べて、より多くのインスリンを産生する細胞を含む。
【００３７】
上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、インスリン産生組織（IPTs）の機能には、同種の自然膵島により生成するインスリンの5％、10％、40％、60％、80％または100％より少ない分泌が含まれる。
【００３８】
上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、インスリン産生組織（IPTs）の機能には、これら実施形態に示される方法によらずに形成される組織に比べて、インスリン分泌における、より大きいグルコース応答性が含まれる。
【００３９】
上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、インスリン産生組織（IPTs）の機能には、インスリン産生組織（IPTs）を糖尿病患者のレシピエントに移植した際に、レシピエントのグルコース制御機能を正常化することが含まれる。
【００４０】
上述のいずれかの実施形態にしたがう一実施形態において、これら実施形態に示される方法によらずに形成される組織に比べて、自然膵島の増殖が促進する度合いが大きい。
【００４１】
これ以降、次のことを可能にするインビトロ培養法に関するさらに具体的な実施形態について述べる。すなわち、出生後の膵臓から得られた非内分泌上皮細胞（NEECs）によるインスリン産生組織（IPTs）の生成を可能にする培養法に関するものであり、ここで、このインスリン産生組織（IPTs）は、自然膵島の10％以下のインスリンを分泌する内分泌細胞を含み、また、適切なレベルのグルコース応答性を有するものである。
【００４２】
本発明の第一および第三の態様において、以下の、相異なる３つの細胞グループのうち少なくとも2つを用いる培養法を採用する。一つは、膵臓から分離された非内分泌上皮細胞（NEECs）である。この細胞は、膵管の内部または近傍に存在するか、または、中心腺房細胞として存在する、上皮細胞特性の前駆細胞と定義することができる。最近、これらの細胞は、前駆細胞におけるアルデヒド脱水素酵素の高い酵素活性を利用してAldefluor染色でラベリングされた(Rovira et al., 2010, PNAS 107:75-80)。以前に考えられていたよりも多量にあるものと推測される。
【００４３】
膵島の除去後の膵廃棄組織は、例えばコラゲナーゼ処理などの後、コラーゲンI等でコーティングした培養容器または培養基材に、10％FCSを含むRPMI1640培地といった、血清含有培地とともに播種される。初期のインキュベーションは、接着性の細胞や組織が、コーティングされた表面に接着することを可能にし、これにより細胞の捕集を可能にする。捕集される細胞は、大半が非内分泌上皮細胞（NEECs）である。このような捕集のためには、培養系を、好ましくは8〜56時間、より好ましくは12〜48時間放置する。好ましくは、約37℃で富化CO2濃度にて放置する。このような捕集が進行する際に、非内分泌上皮細胞（NEECs）の初期のインキュベーションまたは培養が行われる。捕集が行われたなら、血清含有培地は、FGF-2または類似の増殖因子を含む第1の無血清培地に交換され、好ましくは8〜48時間、より好ましくは12〜36時間、例えば24時間、増殖を刺激する。この期間の後、培地は、さらに、他の無血清培地、すなわち、第2の無血清培地に交換される。この第2の無血清培地は、好ましくは、KGFまたは類似の増殖因子、及び/または、線維芽細胞様細胞のための何らかの増殖阻害剤を含む。例えば、この無血清培地は、0.1nMの2-メルカプトエタノール、0.2％のウシ血清アルブミン（BSA）、1g/LのITS、10mMのニコチンアミド及び10ng/mlのKGFを含む。好ましくは、培養環境が約37℃で富化CO2濃度とする。2-メルカプトエタノールは、上皮細胞の増殖を妨害する傾向がある線維芽細胞様細胞の増殖を阻害する。無血清培地に添加されるITSの原液は、好ましくは、5μg/mlのインスリンと、5μg/mlのトランスフェリンと、0.5ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、または、より好ましくは1.25ng/mlの亜セレン酸ナトリウムを含む。
【００４４】
非内分泌上皮細胞（NEECs）のクローン性コロニーは、典型的には、7〜10日の培養の間、大きさが増加していく。そのため、第2の無血清培地での培養は、好ましくは2〜3日で培地交換しつつ、好ましくは3〜20日間、より好ましくは5〜15日間、好ましくは約37℃で富化CO2濃度にて行われる。このような初期のコロニー増殖によって、直径10〜30μmの大きさを有するNEECsのクローン性コロニーが出現する。上述の、培養に用いる血清含有または無血清のいずれの培地においても、マイコプラズマの感染を防止すべく、必要ならば、マイコプラズマ除去剤を添加することができる。
【００４５】
次に、無血清培地には、インスリン産生細胞の自然に生成されるのを防止するために、同じ培地ではあるが、7mM以下のD-グルコース濃度といった、より低い糖濃度の培地が、好ましくは2〜3日ごとに交換される。
【００４６】
好ましい実施形態において、細胞周期をスウィッチオンする重要な信号トランスデューサーとして機能するNotch受容体のマルチレベルの刺激を用いる。充分な数の細胞単層細胞が、コンフルエントの70％を超えて増殖した際、これらの細胞を、アキュターゼで培養容器から引き離し、40マイクロメートルのナイロンメッシュを通して濾過し、培養容器に播種する。この培養容器は、KGFを溶解したコラーゲンIでコーティングし、さらに抗Notch I抗体で処理しておいたものである。
【００４７】
本発明の継代方法は、２つのNotch活性化刺激を用いる。1つは、上記のような抗Notch1抗体または類似のNotch活性化抗体による、Notch受容体の細胞外刺激を用いるものである。他の１つは、アトルバスタチン、または、Notch経路活性化特性を有する、類似のスタチンによる細胞内刺激を用いるものである。スタチンは、HMG-CoA還元酵素阻害剤であり、これらには、特に、アトルバスタチン及びシンバスタチンが含まれる。アトルバスタチンは、潜在的な内分泌前駆細胞の正の誘導因子であるプレセニリン1の発現を促進することが知られている。改変無血清培地におけるアトルバスタチン、シンバスタチン、または他のスタチンの濃度は、好ましくは0.01〜1.0μMであり、より好ましくは、0.03〜0.3μM、例えば0.1μMである。
【００４８】
上記に代えて、次のとおりとすることができる。コラーゲンコーティングが、KGFを用いて調製されず、抗Notch1抗体で処理したものでもない。その代わりに、初期のコロニー増殖ステップ（3）の培養液におけるKGFが、10、15、20及び30ng/mlのHGF、より好ましくは20ng/mlのHGFと、10、15、20、30、40または50ng/mlのEGF、、より好ましくは40ng/mlのEGFと、2、4、6、8または10μMのrock阻害剤、より好ましくは4μMのrock阻害剤とにより置きかえられる。培地には、さらに、アトルバスタチンと、10、15、20、または30ng/mlのBMP4またはBMP7、より好ましくは20ng/mlのBMP4またはBMP7が添加されて、非内分泌上皮細胞（NEECs）について、後の分化時に内分泌細胞になる傾向を強めることができる。
【００４９】
培養に用いられる別のグループの細胞は、強く付着しあって細胞塊を形成する上皮細胞である。これらの細胞は、これまで記載した培養条件にて急速に増殖するのであり、腺房細胞の前駆細胞、及び/または、脱分化して、膵管様、または膵管前駆細胞様の表現型を有するのものである。初期の無血清培地の培養系は、かなりの量の、このような上皮細胞塊を含んでおり、この上皮細胞塊が、非内分泌上皮細胞（NEECs）の増殖を増進させている。この増進は、おそらく、何らかの未同定のパラクリン因子を分泌することによる。この細胞は、アキュターゼ処理といった組織解離酵素を用いた処理によって非内分泌上皮細胞（NEECs）を分離した後、培養容器に接着したまま残される。そのため、「残存細胞（LOCs）」と呼ぶ。この細胞は、プロティナーゼなどの、より強い解離酵素により、培養容器から剥離される。例えば、0.05％トリプシン-EDTAを用い、37℃で3〜5分間処理し、無血清培地で洗浄した後、トランスウェルインサートに移す。そして、非内分泌上皮細胞（NEECs）の増殖を促進させるべく、培地中に配置される。
【００５０】
培養に用いられる第3のグループの細胞は、血管内皮細胞（VECs）であり、非内分泌上皮細胞（NEECs）を捕集する際に収集される組織片から培養することができるものである。血管内皮細胞（VECs）は、前述の、接着している細胞や組織を捕集する際の培養液中にある浮遊組織片から、好ましくは6〜54時間後、より好ましくは9〜36時間後に、収集される。培養された血管内皮細胞（VECs）は、抗CD31抗体が結合した磁気ビーズを用いて純化される。
【００５１】
本発明の一実施形態は、低接着性培養容器中で、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）とから組織複合体を生成する方法を提供する。これら2種類の細胞の混合比は、好ましくは97/3〜75/25、より好ましくは95/5〜70/30である。すなわち、非内分泌上皮細胞（NEECs）の数と血管内皮細胞（VECs）の数との合計に対する非内分泌上皮細胞（NEECs）の数の比率で見た場合、混合比は、好ましくは3％〜25％、より好ましくは5％〜30％の比率である。組織複合体は、低接着性培養容器に非水平回転運動を、好ましくは6〜72時間、より好ましくは9〜48時間、さらに好ましくは18〜24時間、好ましくは約37℃で富化CO2濃度にて、加えることにより生成される。ここで使用される培地は、好ましくは、アクチビン、ベータセルリン、HGF、ガストリン、IGF1、KGF、VEGF、BMP7、エキセンディン4、アスコルビン酸及びCaCl2を含む。
【００５２】
好ましい実施形態において、前記インスリン産生組織（IPTs）の熟成は、培養容器が水平に静置され培地にCaCl2が含まれないことを除くと、上述と同じ方法が用いられる。培地交換は、約20日間の熟成期間の全期間にわたって、1〜2日ごとに行われる。
【００５３】
本発明は、いずれも生後の膵臓から得られる非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）との組織複合体をインビトロで生成することにより、インスリン産生組織（IPTs）の形成及び機能を増進させる新たな方法について記載する。血管内皮細胞（VECs）が分離される組織源と、血管内皮細胞（VECs）そのものの生理状態とのいずれもが、本発明において重要である。血管内皮細胞（VECs）の表現形質の特性は、これら細胞が存在する臓器、組織及び細胞の種類に部分的に依存して、不均一となっている（Crivellato et al., 2007, J. Anat. 211:415-427）。このことから、血管内皮細胞（VECs）の組織特異性または臓器特異性は、非内分泌上皮細胞（NEECs）がインスリン産生組織（IPTs）及び／または膵島へと分化するのを増進させる上で、決定的な因子であるようである。また、非内分泌上皮細胞（NEECs）とともに組織複合体を生成してからインスリン産生組織（IPTs）を生成するのに用いられる血管内皮細胞（VECs）は、膵島中の血管内皮細胞（VECs）にて通常見られるのと同様に、表現形質において、好ましくは開窓状態となっている。したがって、本発明で用いられる分化培地は、血管内皮細胞（VECs）について開窓を形成するように刺激することが知られているVEGFを含む。
【００５４】
インスリン産生組織（IPTs）の形成及び機能を増進させる方法は、2つのステップからなるものとして考案されている。一方のステップは、2種の細胞（NEECs及びVECs）を分離し増殖させるステップである。もう一方のステップは、これら2種の細胞からの組織複合体の生成である。これら２つのステップは、本願において、実施例の見出しを付けた各セクション、及び/または、各請求項中に、詳細に説明されている。
【００５５】
膵島前駆細胞が含みうる細胞集団を分離するためには、種々の表面マーカーを用いて、サイトメトリーにより、細胞を選り分けることができる。この方法の欠点は、選別された細胞の量が、往々にして前駆細胞の培養増殖にとり不充分であることである。この前駆細胞は、通常、際限なく増殖するのでなく、選り分けのステップで引き起こされる損傷を受ける。もう一つの欠点は、使用される表面マーカーのセットが、個々の細胞のサンプル間のバラツキに起因する選別の偏りを引き起こしうるということである。したがって、得られた細胞が目的とする前駆細胞であるかについては、機能性の分泌細胞を生成した際にはじめて、より厳密に評価することが可能である。
【００５６】
この目的のために、本件発明者らは、目的とする前駆細胞の選択的増殖を可能にする細胞培養アプローチを採用する。前駆細胞となる見込みの細胞の増殖を促すとともに、目的としない細胞の増殖をうながさないようにするための、適切な培地及び増殖因子を備えた培養容器に、膵島を除去した後の膵廃棄組織を播種する。従前の研究では、インスリン産生細胞を生成するかもしれない前駆細胞を選択的に増殖させる数多くの方法が考え出すための試みがなされた。例えば、Todorovら（2006, Pancreas 32:130-138）は、コラーゲンIでコーティングしたフラスコ中、血清含有培地で、ヒトの膵廃棄組織を用いて、Pdx1-発現性の上皮細胞を増殖させた。この方法が、本発明のベースとなっており、培地及び増殖因子の選択において、種々の改変がなされた。本件発明者らは、Bonner-Weirら(2000, PNAS 97:7999-8004)及びKatdareら(2004, J. Endocrinology 182:105-112)が選択的増殖に用いたのと同様に、熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）を10%添加したRPMI1640を用いることで、コラーゲンIでコーティングされた表面への選択的な細胞接着を促すようにした。Bonner-WeirやKatdareの研究では、培地が、インスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）と、5〜10 Mmのニコチンアミドと、10ng/mlのKGF（FGF-7）を含む無血清培地に切り替えられた。ニコチンアミドは、上皮細胞の増殖を促進すると言われている。Katdareら（2004）は、また、線維芽細胞様細胞の増殖を抑えるために2-メルカプトエタノールを用いた。本件発明者らは、Bonner-WeirやKatdareの方法に対して、クローン性コロニーを誘発する他の中間のステップを追加するという改変を行った。ここで、FGF-2及びLIFを添加することで、24時間、接着した細胞の増殖を無差別に促進するようにした。この後、培地について、2-メルカプトエタノール、ニコチンアミド及びKGFを添加した他の無血清培地に変更した。この培地は、さらなる細胞増殖を可能にするものである。引き続く2〜7日の期間内に、直径が10から30マイクロメートルの範囲のサイズを有する上皮細胞のクローン性コロニーが、かなりの数、出現した。これらの細胞が、少なくとも初期増殖段階においては、密接に隣接し合った上皮シートを形成せず、緩やかに隣接しあった単一細胞のクラスターのままとなっている。本件発明者らは、このような細胞を「非内分泌上皮細胞（NEECs）」と命名した。これは、未だ内分泌機能を達成していない前駆細胞を含む、上皮細胞の大きいカテゴリ内における、不均一な細胞のグループであることを示す。内分泌細胞が未熟な状態で生成するのを防止すべく、無血清培地中のグルコース濃度は、非内分泌上皮細胞（NEECs）を培養する残りの期間全体にわたって7mM以下に維持される。この初期培養ステップでは、接着している上皮細胞を非内分泌上皮細胞（NEECs）とともに増殖させる。この理由は、接着している上皮細胞が、非内分泌上皮細胞（NEECs）の増殖を促進する未同定の増殖因子を分泌している可能性があるからである。本件発明者らは、このように接着している上皮細胞を「残存細胞（LOC）」と命名した。この残存細胞（LOC）は、上述のアキュターゼ処理によって非内分泌上皮細胞（NEECs）を剥離した後に、培養容器に接着したままとなっている。残存細胞（LOC）は、後にトリプシン処理により剥離される。
【００５７】
コラーゲンでコーティングした培養容器、ウェルプレートまたは培養皿について、非内分泌上皮細胞（NEECs）の接着性を高めるべく、表面特性を改変した。この改変は、コラーゲンでコーティングした容器について、抗Eカドヘリン抗体及び抗CMET抗体のリン酸塩緩衝液（PBS）であって濃度が1:100と1:1000との間の範囲にあるものを用いて、1時間室温（25℃付近）で処理することにより行った。この抗体処理は、上皮細胞が他の種類の細胞に接着する確率を増大させる。上皮細胞は、他の種類の細胞の間にあって、E-カドヘリンを発現する。E-カドヘリンは、細胞間接着分子であって、膵内分泌前駆細胞によっても発現される。そのため、上皮細胞は、抗Eカドヘリン抗体でコーティングした表面に接着すると予測される。c-Metと同義であるHGF受容体は、膵島内分泌細胞になる能力を有する細胞が含まれた前駆細胞を特徴づける細胞表面分子の一つである(Suzuki et al., 2004, Diabetes 53:2143-2152)。実際、抗体処理は、コーティングされた表面あたりの上皮細胞（図2A）の収率を増大させた。興味深いことに、上記の２つの抗体を組み合わせた場合、一方だけの場合より、細胞の収率が少し低くなった。
【００５８】
成人の膵臓から分離した前駆細胞の細胞集団は、継代培養時に、多分に増殖を停止する可能性がある（Seaberg et al., 2004, Nature Biotechnology 22:1115-1124）。TAら（2006, Stem Cells 24:1738-1749）は、BMP-4でもって上皮間葉移行（EMT）を誘起することにより、この増殖停滞を克服した。TAらの研究によると、上皮間葉移行後の線維状の細胞が急速に増殖した。そして、培養系が充分な量の細胞を生み出した際に、膵島様組織を生成する前に、逆のプロセス、すなわち間葉上皮移行（MET）により、上皮細胞の特性を回復させた。このような移行培養方法の1つの欠点は、結果として得られる膵島様組織が分泌するインスリンの量が貧弱であるということであった。このことは、移行培養方法が、得られた組織により機能的に成果を出すことを妨げているという可能性を示唆する。これとは対照的に、Bonner-Weirら（2000）やKatdareら（2004）によるもののような、上皮細胞から生成した膵島様組織は、より多くのインスリンを産生した。Bonner-Weirら（2000）やKatdareら（2004）の研究は、継代培養について具体的な方法を示すものでないが、本件発明者は、これらの研究の基本的な培養技術のいくつかについて、継代時における上皮細胞の均一性を向上させるべく、上皮間葉移行（EMT）を誘起することなくシミュレートした。
【００５９】
継代後における非内分泌上皮細胞（NEECs）の増殖を促進させるべく、本件発明者らは、細胞周期をスウィッチオンする重要な信号トランスデューサーである、Notchシグナリングの２つの方法の刺激を用いた。一つの方法は、抗Notch1抗体を用いたNotch受容体の細胞外の刺激によるものであり、他の方法は、アトルバスタチンを用いた細胞内の刺激によるものである。初代培養で充分な数の細胞単層細胞が増殖して50％、60％、70％、80％、90％より大きいコンフルエンス、または100％のコンフルエンスとなった際、より好ましくは70％のコンフルエンスとなった際、非内分泌上皮細胞（NEECs）は、アキュターゼにより、個々ばらばらの細胞または小さな細胞塊として剥離される。特には残存細胞（LOCs）といった、より大きな細胞塊の除外は、ナイロンメッシュなどの濾布またはその他のフィルター材を通して細胞浮遊液を濾過することにより保証されている。フィルター材の目開きの寸法は、およそ、10、20、30、40、50、70または100μm、より好ましくは40μmである。KGFを埋め込んだコラーゲンIでコーティングした上に抗Notch1抗体にて1:1000（ミリポア社）の希釈率で処理した培養容器に、濾過後の非内分泌上皮細胞（NEECs）を、本来の細胞密度の、およそ、2/3, 3/4または4/5の細胞密度、より好ましくは3/4の細胞密度で播種する。特定のグループの抗Notch1抗体が、筋肉細胞の再生におけるNotch受容体の活性化を誘起することが知られている(Conboy et al., 2003, Science 302:1575-1577)。
【００６０】
この後、非内分泌上皮細胞（NEECs）を、0.1μMのアトルバスタチンを添加した改変無血清培地中にて増殖させた。この培地は、積極的に潜在的な内分泌前駆細胞を選択することが知られている。CRAS-Meneurら（2009, Genes & Development 23:2088-2101）は、トランスジェニックマウスモデルを用いて次のことを示した。すなわち、γ-セクレターゼの触媒コアにおけるプレセニリン1及び2が、Notchシグナリングと、Ngn3陽性前駆細胞による内分泌特性の獲得とに必須であることを示した。プレセニリン1は、脳卒中後の神経細胞の再生中に、アトルバスタチンによりアップレギュレートされることが知られている（Chen et al., 2008, Stroke 39:220-226）。したがって、本件発明者らは、内分泌前駆細胞を増加させるのに、上皮細胞のプール内にて、アトルバスタチンを用いた。但し、他のスタチンが同様の効果を生み出す可能性がある。非内分泌上皮細胞（NEECs）の培養にあたり、上記の無血清培地は、さらに、KGFについて、次の(1)〜(3)のいずれか、または任意の組み合わせにより置き代えることができる。すなわち、(1) 10、15、20及び/または30ng/mlを含む濃度範囲のHGF、より好ましくは20ng/mlのHGF、(2) 15、20、30、40及び/または50ng/mlを含む濃度範囲のEGF、より好ましくは40ng/mlのEGF、及び/または、(3) 2、4、6、8及び/または10μMのrock阻害剤、より好ましくは4μMのrock阻害剤、により置き代えることができる。非内分泌上皮細胞（NEECs）の培養にあたり、上記の無血清培地には、さらに、次の(1)及び(2)の少なくとも一方を添加するで、非内分泌上皮細胞（NEECs）について、後の分化時に内分泌細胞になる傾向を高めることができる。すなわち、(1) 0.01〜1.0μM、より好ましくは0.03〜0.3μM、例えば0.1μMのアトルバスタチン、及び/または、(2) 10、15、20及び/または30 g/mlのBMP、より好ましくは約20ng/mlのBMP4またはBMP7を添加することで内分泌細胞になる傾向を高めることができる。解離した非内分泌上皮細胞（NEECs）を新たな培養容器に播種した後、残存細胞（LOCs）が入れられたトランスウェルインサートを、この培養容器の上方に配置することで、残存細胞（LOCs）から分泌される増殖促進性のパラクリン因子により、非内分泌上皮細胞（NEECs）の増殖が促進する。これらの培養系のいずれにおいても、培地は、非内分泌上皮細胞（NEECs）クローン性コロニーがかなりの数に増殖するまで、2〜3日ごとに、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％または約60％の調整培地で交換される。より好ましくは約40％の調整培地で交換される。これらのクローンのコロニーが形成する細胞塊は、さらに富化を行うべく、採取して継代培養することができるものであり、このようにして、分化の際に組織複合体を生成する傾向を強めることができる。
【００６１】
膵島内分泌細胞の成体前駆細胞の正確な分化系列については争いがある（Dor et al., 2004, Nature 429:41-46; Inada et al., 2008, PNAS105:19915-19919; Xu et al., 2008, Cell 132:197-207）。本件発明者らは、本発明に記載された培養条件のような一定のストレス状況下にて膵島内分泌細胞を生成することができる、成体前駆細胞が存在するとの見解を有している。いくつかの研究は、出生後の膵臓中における膵島前駆細胞と、外部ストレスを加えることによる生体中での内分泌細胞の再生とを示している。例えば、アロキサンまたはストレプトゾトシンなどの毒を投与したり、膵切除などの外科的処置を膵臓に施したり、膵管結さつ（結紮）と呼ばれる膵管を縛って止めることを行ったり、という外部ストレスを加える。最近、管結さつが、強力な膵臓の炎症及び細胞のアポトーシスを引き起こし、これに続いて、膵島前駆細胞集団の増殖が行われることが知られた（Xu et al., 2008）。成体の膵臓中における前駆細胞の正確な組織位置の特定について、未だ解明がなされていないが、多くの研究は、前駆細胞細胞、膵管中及び／または腺房中心細胞中に存在する証拠を見出している。また、いくつかの他の研究は、前駆細胞が膵島中にも存在することを示している。最近、このような前駆細胞の特定のグループが、アルデヒドデヒドロゲナーゼの高い酵素活性を用いたaldefluor（Stem Cell Technologies）によりラベリングされ(Rovira et al., 2010, PNAS 107:75-80)、従前に考えられていたよりも多量にあることが知られた。
【００６２】
インスリン産生組織（IPTs）の生成に用いる他のグループの細胞は、血管内皮細胞（VECs）であり、これは、通常、膵島と膵臓の間葉組織との両方を、分岐する枝のように貫いている。この血管内皮細胞（VECs）も、接着性の細胞または組織を捕集するために膵廃棄組織を12〜48時間浮遊培養した後に、収集した膵廃棄組織から分離することができる。血管内皮細胞（VECs）を含む細胞を短期間だけ増殖させた後、血管内皮細胞（VECs）を培養容器から剥離し、抗CD31抗体が結合した磁気ビーズ（Mylteny Biolgy, Inc.）を用いて純化する。純化した血管内皮細胞（VECs）について、内皮細胞増殖サプリメント（ECGS、シグマアルドリッチ社）を添加した血清含有培地中で、さらに増殖を行う。このような分離と培養の手法は、様々な組織や臓器の供給源からの血管内皮細胞（VECs）の培養を可能にする技術分野にて知られている。
【００６３】
非内分泌上皮細胞（NEECs）及び血管内皮細胞（VECs）は、まず、インビトロで相異なる培地中にて別々に増殖させてから、球状組織の生成を促すカルシウムイオン（1mM）の存在下に非水平回転運動を加えて混ぜ合わせる。過剰量の細胞外カルシウムイオンは、隣接する細胞間の表面における、E-カドヘリン分子のホモタイプな結合を誘起し、これにより、球状の組織を形成することが知られている。
【００６４】
カドヘリンといった細胞表面分子によるホモタイプな結合のみならず、ヘテロタイプな細胞間相互作用も、膵島の器官形成に決定的な役割を果たすことが知られている。非内分泌上皮細胞（NEECs）の役割、特には、膵島の初期の発生段階における役割について、注目すべきである（Yoshitomi & Zaret, 2004, Development 131:807-817; Lammert et al., 2001, Science 294:564-567）。血管内皮細胞（VECs）が、隣接する細胞との相互作用に関連して果たす役割は、実に多面的であり、他の種類の細胞のためのニッチ（専門用語では「血管ニッチ」）を形成する（Nikolova et al., 2007, Trends in Cell Biology 17:19-25）。血管内皮細胞（VECs）は、接着、増殖及び諸機能を含む、隣接する細胞の生態作用についてサポートするための、細胞外マトリクスを分泌する。実際のところ、膵島の形態形成の期間中、膵内分泌前駆細胞は、特定の組み合わせのインテグリンによって、細胞外マトリクスに接着して移動する（Cirulli et al., 2000, Journal of Cell Biology 150:1445-1458）。β細胞が、成熟時にも自らの細胞外マトリクスを有しないため、複数のβ細胞の物理的な一体性は、隣接する血管内皮細胞（VECs）から分泌される細胞外マトリックスに依存していると推測される。膵島内分泌細胞は、成熟後、血管内皮細胞（VECs）と相互作用を行うが、この機構は、ガス及び／または栄養の交換以外のものであり得る。例えば、Johanssonら（2006, Endocrinology, 147:2315-2324）は、次のことを見出した。成熟した膵島細胞と、隣接する血管内皮細胞（VECs）とが、相互に増進作用を及ぼしあうのであり、血管内皮細胞（VECs）がHGFを分泌してベータ細胞の増殖と維持を促し、ベータ細胞がVEGFを分泌して血管内皮細胞（VECs）をサポートする。これらの研究は、いずれも、異なるタイプの細胞間における相互作用の重要性を示すものの、膵臓組織から分離した血管内皮細胞（VECs）が、成体膵前駆細胞についてインビトロでインスリン産生細胞へと分化するのを促進することは示していない。
【００６５】
血管内皮細胞（VECs）が分泌する細胞外マトリクスに関連して、血管内皮細胞（VECs）とベータ細胞との間の細胞間相互作用が果たす役割を記載した研究報告が多数あり、いくつかの研究は、そのような細胞間相互作用が、膵島細胞の機能を向上させるのに用いうることを見出した。例えば、Powersら（2005年、US20050048040A1）は、一度解離した血管内皮細胞（VECs）を膵島と再結合させることで血管新生を増進させ、成熟したヒト膵島細胞の機能を増進させようと試みた。増殖因子及び細胞外マトリクスによる、成熟膵島細胞の機能の増進は、しばしば文献に記載されているが、成体膵前駆細胞がインスリン産生細胞にインビトロで分化するのを増進させることにつき、血管内皮細胞（VECs）との細胞間相互作用と関連して示されたことはない。
【００６６】
本発明においてインスリン産生組織（IPTs）をインビトロで生成させるにあたり、いくつかの他の研究において用いられていた浮遊培養方法を用いた（Ogata et al., 2004, Endocrine Journal 51:381-386; Todorov et al., 2006）。そして、得られた膵島様組織は、周囲の培地へと、より多量のインスリンを分泌した。また、本発明は、非水平回転運動培養法を用いて、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）との直接の接触を促進することで、効率的にインスリン産生組織（IPTs）を生成すべく、ホモタイプのみならずヘテロタイプの細胞間相互作用を増進させる。
【００６７】
増殖または継代培養された非内分泌上皮細胞（NEECs）は、まず、培養容器から、細胞剥離酵素の1つであるアキュターゼ（Innovative Cell Technologies, Inc.）で処理することで剥離される。アキュターゼは、哺乳類の細胞に対する損傷が最小限であるものとして知られているものである。細胞を、リン酸塩緩衝液（PBS）で洗浄し、アキュターゼでオーバーフローさせ、室温で3-10分間インキュベートし、培地で希釈し、穏やかにピペッティングし、4分未満の間160ラGで遠心分離することで沈渣を得た。上澄みが除去され、細胞沈渣は、集められて、再度、インスリン産生組織（IPTs）を培養する培地に浮遊される。この培地は、20mM D-グルコースを含むDMEM/Ham's F-12に、2体積％のウシ胎児血清（FCS）と、10mMのニコチンアミドと、0.1mMのアスコルビン酸と、表1に挙げられている成長因子及び増殖因子が添加されている。
【００６８】
一方、血管内皮細胞（VECs）が、同様の方法により培養容器から剥離されるが、10〜15分間インキュベートされ、5分間300ラGで遠心分離される。この後、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）とが、浮遊状態で混ぜ合わされる。これらの割合は、それぞれ、95, 90, 80または70%と、5, 10, 20または30%であり、より好ましくは70％と30％である。浮遊液中の典型的な細胞密度は、0.1X105, 0.5X105, 1.0X105, 5.0X105及び10.0X105細胞/mlのうちの任意の２つの値の間であり、より好ましくは5.0X105細胞/mlである。超低接着性の６ウェルプレート（Corning, Inc.）の各ウェルには、およそ0.5, 0.75, 1.0または1.5mlの上記浮遊液、特に好ましくは1.0mlの上記浮遊液が仕込まれる。細胞混合液が入れられたプレートには、さらに、1mMのCaCl2が添加される。そして、オービタルシェーカーに設置されて、10, 15, 20または25回転／分より小さい回転スピードの非水平回転運動、好ましくは20回転／分の非水平回転運動が、37OC及び5%CO2にて、18〜24時間加えられる。この非水平回転運動によるインキュベーション期間の経過後、上記の細胞は、典型的には、直径100〜200μmの球状組織を形成する。球状組織を形成したなら、CaCl2を含まない培地に完全に交換して、水平に静置する。培地は、約20日間の熟成期間の全期間にわたって、1〜2日ごとに交換される。このような最後のインキュベーションステップの間に、このような球状の組織、すなわちインスリン産生組織（IPTs）のあるものは、融合してより大きな組織塊となり、これらの組織塊から、より小さな半透明の組織の芽が出てくる。このように形成された球状組織は、非内分泌上皮細胞（NEECs）のみより作られた球状組織に比べて、相当に、より平滑な表面テクスチャーを有し、また、組織の外側の膜が、より明確な境界を有している。非内分泌上皮細胞（NEECs）のみの培地は、球状組織から解離したと思われる小さな細胞塊によって汚染されやすい傾向にある。そのため、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）とから作られた組織複合体は、物理的な一体性を維持しやすいが、非内分泌上皮細胞（NEECs）のみから作られた組織複合体は、より壊れやすい。これは、血管内皮細胞（VECs）、及び／または、これより分泌される細胞マトリクスが、組織複合体の物理的一体性を向上させているようである。
【００６９】
非内分泌上皮細胞（NEECs）及び血管内皮細胞（VECs）のキャラクタリゼーションは、次のような方法で、ルーチン的に行われる。すなわち、RT-PCR、免疫細胞化学的もしくは免疫組織化学的検査、及び、インビトロでのインスリン分泌の能力に関して、インスリンもしくはC-ペプチドELISA、などの方法によって行われる。C-ペプチドの評価は、用いた培地がインスリンを基質として含み、このインスリンにより新しく分泌されたインスリンの定量化が難しい場合に行われる。理論的には、一つのインスリン産生細胞から、等モル量のC-ペプチドとインスリンとが生成されるのであるが、ELISAによる定量化によると、必ずしも、これら二つのタンパク質についての推定量は対応するものとならない。
【００７０】
RT-PCRによる遺伝子発現解析が、以下の方法で行われる。非内分泌上皮細胞（NEECs）及び血管内皮細胞（VECs）を培地から剥離してリン酸塩緩衝液（PBS）で洗浄し、回収した細胞または組織を、細胞溶解緩衝液中にて、1秒間に3〜4回のパルスによって超音波処理する。全RNAは、RNeasy Mini Kit（Qiagen, Inc.）により抽出し、さらに、RNaseフリーのDNase Iセット（Qiagen, Inc.）により精製して、存在しうるDNAのコンタミネーションを除去する。20ngの精製したRNAをテンプレートとして用いて、SuperScript III（Invitrogen, Inc.）及びランダムヘキサマー（Invitrogen, Inc.）を用いたcDNAの合成を行う。得られたcDNAは、RNase Hで処理することで、存在しうるRNAのコンタミネーションを除去する。半定量的PCRを、HotStartTaq PCR反応混合物（Ambion, Inc.）と、20ngのcDNAを用い、表2に示すプライマー、アニーリング温度、及びサイクル数にて行った。PCR生成物は、内部コントロールに対する指定生成物の分子サイズに関連した、DNAバンドの強度により定量する。
【００７１】
免疫細胞化学的検査は、以下の方法で実行される。非内分泌上皮細胞（NEECs）は、各段の培地を用いて、コラーゲンIでコーティングしたスライドチャンバー上にて継代培養される。コラーゲンIでコーティングしたスライドチャンバーは、使用する前に、成長因子または抗体で前処理されている。細胞は、適切な密度に増殖すると、リン酸塩緩衝液（PBS）で3回洗浄し、冷メタノール中10分間の固定処理、または70％エタノール中室温で30分間の固定処理を行い、空気乾燥させ、リン酸塩緩衝液（PBS）で洗浄し、ブロッキング溶液（Dako, Inc.）でブロッキングした。この細胞を、一次抗体で染色し、0.1％BSA、0.1％Tween20及びリン酸塩緩衝液（PBS）を含む洗浄バッファーで洗浄し、二次抗体とともにインキュベートした。この後、ブロッキング溶液でDAPI染色し、VectraShieldを用いてマウントし、倒立蛍光顕微鏡で観察した。Ngn3を検出するための免疫細胞化学的検査のためには、培養した細胞を、4％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液中、室温10分間で固定処理し、固定処理を0.1％グリシン溶液でクエンチする。0.2％トリプシン溶液で細胞を処理することにより免疫学的エピトープを腑活化し、さらに、ブロッキング溶液と抗Ngn3抗体で処理する。
【００７２】
生成されたインスリン産生組織（IPTs）のグルコース反応をテストするための静的なインキュベーションを行うには、約20膵島当量のインスリン産生組織（IPTs）または膵島（１膵島イクイヴァレンツは、200μmの直径のインスリン産生組織）を、U字型の底96ウェルプレートの各ウェルに、5mMグルコース入りのクレブス緩衝液200μLと共に仕込む。緩衝液を注意深くピペッティングにより新たなものに交換し、1時間、37℃、5％CO2でキュベーション（プレインキュベーション）を行う。次いで、インスリン産生組織（IPTs）を、同様に、5mMグルコース入りのクレブス緩衝液200μLで洗浄し、2時間のインキュベーション（低グルコースインキュベーション）を行う。このインキュベーションの後、20mMグルコース入りの同様の緩衝液で数回洗浄し、2時間のインキュベーション（高グルコースインキュベーション）を行う。このインキュベーションの後、クレブス緩衝液を集め、分析までの間、-30℃で保存する。ELISAは、メーカーのプロトコルに従って行われる。20日間の熟成後に、生成したインスリン産生組織（IPTs）は、典型的には、自然膵島により産生させるインスリンの10%までのインスリンを分泌し、また、適切な程度のグルコース反応性を有する。
【００７３】
上記のような本発明の対象、及びその他の対象は、後述の実施形態の1つまたは複数により与えられる。
【００７４】
本発明の一実施形態は、インビトロで非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）とからなる組織複合体を生成することにより、インスリン産生組織（IPTs）の生成及び内分泌機能を増進させる方法を提供する。この方法は、所与の細胞源から、より多い量のインスリン産生組織（IPTs）を得ることを可能にするとともに、インスリン分泌に関する内分泌機能を増大させることを可能にする。
【００７５】
インスリン産生組織（IPTs）の生成及び内分泌機能を増進させる他の一実施形態において、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）とは、同一の、哺乳類の出生後の膵臓から分離したものでありうる。また、血管内皮細胞（VECs）は、他の体細胞種のものでありうる。
【００７６】
非内分泌上皮細胞（NEECs）は、膵管及び/または中心腺房細胞に属するが、インスリンその他の内分泌ホルモンを分泌しない細胞である。
【００７７】
インスリン産生組織（IPTs）の生成及び内分泌機能を増進させる他の一実施形態において、非内分泌上皮細胞（NEECs）を、膵廃棄組織から、すなわち、膵臓を酵素的に分解してから膵島を取り出した残りの組織から得ることができる。
【００７８】
本発明の一実施形態は、前記非内分泌上皮細胞（NEECs）をインビトロで培養する方法を与えるものであり、この方法には、0.2mg/mlのラット尾由来コラーゲンIでコーティングし、1:100と1:1000との間の範囲の濃度の抗E-カドヘリン抗体及び抗c-Met（HGF受容体）抗体でコーティングした培養容器に、前記膵廃棄組織を、10体積％のウシ胎児血清（FCS）が含まれるRPMI1640中にて、播種する細胞捕集ステップが含まれる。この膵廃棄組織は、好ましくは、24〜36時間、約37℃で約5％CO2にて培養される。
【００７９】
本発明の他の一実施形態は、前記非内分泌上皮細胞（NEECs）をインビトロで培養する方法を与えるものであり、この方法には、細胞捕集ステップでの培地について、以下のような無血清培地に交換して培養を行う、コロニー誘起ステップが含まれる。すなわち、1g/LのITS（5μg/mlのインスリン、5μg/mlのトランスフェリン、5ng/mlの亜セレン酸ナトリウム）と、20ng/mlの組換えヒトFGF-2と、1400U/mlの組換えヒトLIFとを、7mMのD-グルコース入りのDMEM/Ham's F-12中に含む無血清培地に交換して、少なくとも24時間培養を行う。
【００８０】
本発明のさらなる一実施形態、前記非内分泌上皮細胞（NEECs）をインビトロで培養する方法を与えるものであり、この方法には、コロニー誘起ステップでの培地について、以下のような別の無血清培地に交換して培養を行う、コロニー増殖ステップが含まれる。すなわち、1g/LのITSと、0.2％ウシ血清アルブミン（BSA）と、10mMのニコチンアミドと、10ng/mlの組換えヒトKGFとを、7mMのD-グルコース入りのDMEM/Ham's F-12中に含む無血清培地に交換して、少なくとも5〜7日間培養を行う。この培地には、好ましくは、培養の後の段階で、非内分泌上皮細胞（NEECs）の増殖を阻害しうる線維芽細胞の増殖を防ぐための0.02μMの2-メルカプトエタノールと、起こりうるマイコプラズマ感染を防ぐためのマイコプラズマ除去剤とを含む。培地は、直径10〜30マイクロメートルの範囲のサイズを有するNEECsのクローン性コロニーが、かなりの数出現するまで2〜3日ごとに交換される。
【００８１】
本発明の一実施形態は、非内分泌上皮細胞（NEECs）について選択的増殖を行うべく継代培養する方法を与えるものであり、この方法には、組織消化酵素であるアキュターゼで処理することにより、培養容器から非内分泌上皮細胞（NEECs）を剥離する細胞剥離ステップが含まれる。剥離された細胞について、160×G以下にて、4分未満の間、遠心分離を行う。
【００８２】
本発明の他の一実施形態は、非内分泌上皮細胞（NEECs）について選択的増殖を行うべく継代培養する方法を与えるものであり、この方法には、先のステップにて剥離された細胞を、下記のような培養容器及び培地に播種して培養する培養ステップが含まれる。すなわち、1:100〜1:1000の最終濃度の抗Notch1抗体で前処理した他は先のステップと同一である培養容器に、0.1μMのアトルバスタチンを含む他は先のステップと同一である倍地中にて播種し、培養を行う。培地は、かなりの数の、非内分泌上皮細胞（NEECs）のクローン性コロニーが増殖するまで交換される。
【００８３】
他の一実施形態においては、上記に代えて、コラーゲンコーティングがKGFまたは抗Notch1抗体を含まずに調製され、初期のコロニー増殖ステップ（3）の培地中のKGFが、10、15、20及び30ng/mlのHGF、より好ましくは20ng/mlのHGFと、10、15、20、30、40及び50ng/mlのEGF、より好ましくは40ng/mlのEGFと、2、4、8、14、20及び25μMのrock阻害剤、より好ましくは4μMのrock阻害剤とにより置きかえられる。0.01〜1.0μM、より好ましくは0.03〜0.3μM、例えば、0.1μMのアトルバスタチンと、10、15、20及び30ng/ml、より好ましくは20ng/mlのBMP4またはBMP7とにより、非内分泌上皮細胞（NEECs）が、後の分化時に内分泌細胞になる傾向が高められている。
【００８４】
本発明のさらなる一実施形態において、アキュターゼ処理により非内分泌上皮細胞（NEECs）が剥離された後に、培養容器に接着して残っている上皮細胞塊は、このことから残存細胞（LOCs）と呼ぶが、培養容器から、0.05％トリプシン-EDTAを用いた37℃5分間の処理で剥離され、無血清培地で洗浄され、トランスウェルに移され、そして、非内分泌上皮細胞（NEECs）の増殖をさせるために、培地に入れられる。
【００８５】
本発明のさらなる一実施形態において、トランスウェル内の残存細胞（LOCs）と共に培養された非内分泌上皮細胞（NEECs）が、細胞クラスターを形成する。この細胞クラスターは、さらなる富化のために継代培養を行って、分化の際に組織複合体を形成する傾向を高めることができる。
【００８６】
本発明の一実施形態において、培養された非内分泌上皮細胞（NEECs）は、次のような細胞により特徴付けられる。すなわち、オールトランス型レチノイン酸及びシクロパミンKAADで処理した際に、転写因子であるHes1と、Notchシグナルの下流ターゲットと、Ngn3とを発現し、これによって、インスリン産生細胞を生成可能な前駆細胞としての特長を示す細胞により特徴付けられる。
【００８７】
血管内皮細胞（VECs）を分離して培養する方法の一実施形態は、血管内皮細胞（VECs）を、膵廃棄組織から分離するか、または、膵廃棄組織の培養系から収集した浮遊組織片から分離するステップを含む。この方法は、膵廃棄組織または浮遊組織片を、次のような培地及び培養容器に播種するものである。すなわち、65.5℃で60〜70分間の熱不活化を行った20体積%のウシ胎児血清（FCS）と70〜100μg/mlのECGS（内皮細胞増殖サプリメント）とを含むRPMI1640中、1.8mg/mlのラット尾由来コラーゲンIでコーティングした培養容器に播種するものである。非接着性の細胞及び組織を含む、この培地は、18時間の培養後に、新鮮な培地で交換される。
【００８８】
血管内皮細胞（VECs）を分離して培養する方法の一実施形態において、血管内皮細胞（VECs）は、抗体結合マイクロビーズと、抗CD31抗体とを用いて純化することができ、その後、先のステップについて説明した手順により増殖させることができる。
【００８９】
血管内皮細胞（VECs）を分離して培養する方法のさらなる一実施形態において、管内皮細胞（VECs）は、起こりうる免疫拒絶を減弱させる目的で、前記インスリン産生組織（IPTs）の移植を受けるレシピエントの組織に由来するか、または、非内分泌上皮細胞（NEECs）を分離したのと同一のドナー組織に由来する。
【００９０】
本発明の一実施形態は、低接着性培養容器内にて、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）との組織複合体を生成する方法を提供する。ここで、これら2種類の細胞の混合比は、細胞数でそれぞれ、好ましくは、95、90、80または70％と、5、10、20または30％とになっている。組織複合体は、培養容器にゆっくりとした非水平回転運動を加えることで生成する。好ましくは、10、15、20、または25rpmより少ない回転数で、約37℃で、5%CO2などといったCO2富化条件下に、18〜24時間、非水平回転運動を加えることで生成する。
【００９１】
本発明の他の一実施形態は、次のような培地中で組織複合体を生成する方法を提供する。すなわち、DMEM/Ham's F-12及び20mMのD-グルコースを含む培地であって、2体積％の胎児ウシ血清（FCS）、2ng/mlのアクチビンA、5ng/mlのベータセルリン、20ng/mlのHGF、20ng/mlのガストリン、20ng/mlのIGF-1、5ng/mlのKGF、20ng/mlのVEGF、20ng/mlのBMP7、20ng/mlのエキセンディン-4、10mMのニコチンアミド、0.1mMのアスコルビン酸、及び、1mMのCaCl2が添加されている培地中にて、組織複合体を生成させるのであり、培養容器についての非水平回転運動を行う間に、インスリン産生細胞（IPTs）の球状クラスターが、この培地中に出現するまで、組織複合体を生成させる。
【００９２】
本発明のさらなる一実施形態は、下記の点を除き同一の方法で組織複合体を熟成させる方法を提供する。すなわち、培養容器が水平に、運動することなく配置され、培地がCaCl2を含んでいない点を除くと同一の方法で熟成する。培地は、約20日間の全成熟期間中、1〜2日ごとに交換される。
【００９３】
本発明のさらなる一実施形態は、次の(1)及び(2)を含む方法を提供する。(1)血管内皮細胞（VECs）が、培養容器に播種され、第4の好ましい実施形態に記載された培地中、ほぼコンフルエントな細胞単層を生成する。(2)次いで、分離され純化された自然膵島から解離された細胞または細胞クラスターが、血管内皮細胞（VECs）の細胞単層の上に播種されて、膵島の細胞または細胞クラスターが増殖するのを促進させる。
【００９４】
インスリン産生細胞（IPTs）を生成する方法についての本発明の一実施形態において、このようにして生成されたインスリン産生組織（IPTs）は、この方法を用いない場合よりも、より多数の組織を含む。
【００９５】
インスリン産生細胞（IPTs）を生成する方法についての本発明の他の一実施形態において、このようにして生成されたインスリン産生組織（IPTs）は、この方法を用いない場合よりも、より多くのインスリンを産生する細胞を含む。
【００９６】
インスリン産生細胞（IPTs）を生成する方法についての本発明の他の一実施形態において、このようにして生成されたインスリン産生組織（IPTs）の機能は、同種の自然膵島により産生されるインスリンの、5％、10％、40％、60％、80％または100％より少なく、例えば約10％を分泌することを含む。
【００９７】
インスリン産生細胞（IPTs）を生成する方法についての本発明の他の一実施形態において、このようにして生成されたインスリン産生組織（IPTs）の機能は、この方法を用いない場合よりも、インスリン分泌における、より高いグルコース応答性を含む。
【００９８】
本発明のさらなる一実施形態において、分離されて純化された自然膵島から解離され、血管内皮細胞（VECs）の細胞単層の上に播種された細胞または細胞クラスターは、血管内皮細胞（VECs）を有しない基材に播種された場合に比べて、増殖が促進される。
【００９９】
本発明のさらなる一実施形態において、培地に添加される抗生物質は、50〜100U/mlのペニシリン及び50〜100μg/mlのストレプトマイシンである。または、ストレプトマイシンを、50〜100U/mlのゲンタマイシンで置き換えてもよい。
【０１００】
【表１】
2013521797.tif 000003
【０１０１】
【表２】
2013521797.tif 000004
【０１０２】
＜定義＞
「膵臓」または「膵」の用語は、本技術分野において、哺乳類生物の腹腔内における脾臓と十二指腸の間に位置して内分泌及び外分泌の両方の器官として認識され、またそのような器官を指す。
【０１０３】
本願で用いられているように、「膵島」は、膵臓にある小さな組織塊であって、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド及びグレリンといった内分泌ホルモンを分泌するものを指す。
【０１０４】
本願で用いられているように、「膵廃棄組織」は、膵臓から膵島を除去した後に残った膵臓の組織を指す。臨床的な膵島移植において、膵島を収集すべく、ドナーの膵臓組織が、コラゲナーゼ分解、及び、これに続く一連の純化ステップによって処理され、膨大な量の膵廃棄組織が副産物として生み出される。この膵廃棄組織中に存在する膵島前駆細胞が糖尿病を治療するための細胞療法に用いうるのではないかということが、言われており、また試されている。
【０１０５】
本願で用いられているように、「非内分泌上皮細胞（NEECs）」は、出生後の哺乳動物の膵臓から分離された細胞であって、未だ内分泌機能を獲得していない前駆細胞を含む上皮細胞の大きなカテゴリ内の異種の細胞から構成されているものを指す。そのため、非内分泌上皮細胞（NEECs）は、インビトロでインスリン産生組織（IPT）を増殖させて生成することが可能な細胞を含む。非内分泌上皮細胞（NEECs）は、次の(1)及び(2)の少なくともいずれかである。(1)膵臓の膵管に存在する可能性がある、かつ／または、(2)Aldefluor陽性細胞として同定される中心腺房細胞と同義でありうる。
【０１０６】
本願で用いられているように、「残存細胞（LOCs）」は、しっかりと接着し合った細胞クラスターを形成する上皮細胞であって、非内分泌上皮細胞（NEECs）を継代培養のために培養容器から最初に剥離した後も残存する細胞のことをいう。これらの細胞は、本願記載の培養条件下で急速に増殖する。また、これらの細胞は、次の(1)〜(3)の少なくともいずれかである。すなわち、(1)中心腺房細胞の前駆細胞である、(2)膵管細胞の前駆細胞である、かつ／または、(3)脱分化して、膵管様、または膵管前駆細胞様の表現形質を有する。これらの細胞が、おそらくは何らかの未同定のパラクリン因子を分泌することによって、非内分泌上皮細胞（NEECs）の増殖を促進する。
【０１０７】
本願で用いられているように、「血管内皮細胞（VECs）」は、出生後の哺乳動物の膵臓から単離された血管内皮細胞を指す。血管内皮細胞（VECs）は、また、骨髄細胞または末梢血のいずれかから分離することができる。血管内皮細胞（VECs）は、非内分泌上皮細胞（NEECs）が分離されるのと同じドナーに由来するか、または、より好ましくはインスリン産生組織（IPTs）が移植される予定のレシピエントに由来する。
【０１０８】
本願で用いられているように、「インスリン産生組織（IPTs）」は、球状の組織複合体を形成する一群の細胞群であって、インビトロで生成可能な組織であり、インスリンを分泌可能であってその他の内分泌ホルモンも分泌可能でありうる内分泌組織として熟成することができるものを指す。
【０１０９】
本願で用いられているように、「生成」または「生成する」は、非内分泌上皮細胞（NEECs）として分類されうる細胞が、インスリン産生組織（IPTs）の定義を満たすことができる組織複合体となる変化であるところの組織形成プロセスを指す。
【０１１０】
本願で用いられているように、「前駆細胞」は、本願に記載の条件下に、膵廃棄組織から選択的に培養されて、増殖及び継代培養を可能にしたものであり、膵内分泌細胞になる能力を有するものとして特徴づけられるとともに、オールトランス型レチノイン酸及びシクロパミンKAADでの処理により、Ngn3陽性細胞として同定しうるものを指す。
【０１１１】
本願で用いられているように、「培養」は、細胞、細胞のクラスター、組織複合体または自然膵島について、細胞の増殖または機能性組織の生成を可能にする環境条件にてインキュベーションを行うことにより、増殖または生育させることを指す。培養には、適切な増殖因子、マイトジェン、及び/または分化因子を含む培地が必要である。これらは、培養を行う、細胞、細胞のクラスター、組織複合体または自然膵島について、一般に、増殖及び/または熟成を向上させる。
【０１１２】
本願で用いられているように、「組織複合体」は、インスリン産生組織（IPTs）を生成する目的で得られた2つのグループの細胞の配合体である。組織複合体は、これら2つのグループの細胞を、所与の混合比で低接着性培養容器中に入れて、ゆっくりとした非水平回転運動を加えることで、形成される。組織複合体は、1mMのCaCl2を添加した本願記載の無血清培地中にて、インキュベーションを行うことができる。培地中のカルシウムイオンは、隣接する細胞間でカドヘリン分子を活性化し、これにより細胞間接着を促し、このようにして組織複合体を形成する。
【０１１３】
本発明の実際的な応用には、特にことわらない限り、当業者の技能の範囲内における、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学及び組換えDNAについての従来の技術を用いる。これらの技術は、文献に記載されており、例えば、以下に記載されている。Basic Manuals for Molecular Biology, Book 3 "Truly-Amplifying PCR" (Yodo Publishing, Inc., 2004)、 Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immunocytochemical Methods and Protocols, Vol. 115 in Methods in Molecular Biology (Lorette C. Javois, eds., Humana Press, Totowa, NJ, 1994)、The ELISA Guidebook (Methods in Molecular Biology) by Crowther (Humana Press, 2000)、Methods in Cell Biology, Vol. 41, Flow Cytometry, 2nd Ed., ed. By Darzynkiewicz, Robinson and Crissman (Academic Press: 1994)
【０１１４】
＜実施例＞
以下の分析の結果を得るのに用いた実験手順の詳細は、対応する実施例に記載されている。グラフに示されているエラーバーは、下記の図の標準偏差を表す。図面の各写真画像は、カラー画像をグレースケール画像に変換したもの、またはRGB色を分離し、赤、緑、青のいずれかの色分解画像としたものである。
【実施例１】
【０１１５】
＜膵廃棄組織の収集＞
マウスの膵臓（C57Bl/6）の摘出を、膵管内へと、2.0〜2.5ml、0.1%のコラゲナーゼS-1（新田ゼラチン社）のHBSS(Sigma-Aldrich Co.)溶液を投与した直後に行った。これらの膵臓について、HBSS中にて37℃で20分間のインキュベーションを行い、氷上で冷却し、添加物を加えることなくRPMI1640（インビトロジェン社）10mlを加えて20秒間激しく振盪した。コラゲナーゼで分解した膵臓組織を、1.0 mmのスチールメッシュに通すことで、大部分が脂肪と結合組織である、大きな廃棄組織塊を除去した。この除去の後、膵臓の溶出液は、50mlのRPMI1640を用い、4℃で2分間250×Gで遠心することにより、3回洗浄した。得られた約1mlの沈殿組織について、M-Kyoto液（大塚製薬株式会社）とOptiprep（Axis-Shield, PoC AS, Oslo, Norway）との、密度を1.1g/mlに調製した混合液15mlにより、50mlコニカルチューブ中にて再浮遊した。次いで、この浮遊液の上に、密度を1.077 g/mlに調製した別の混合液15 mlを静かに注いで層をなすようにし、さらに、5 mlのRPMI1640を静かに注いで層をなすようにした。複数の層をなす浮遊液を、4℃で20分間、400×Gで遠心分離した。大部分の膵島を含む中間の不透明な浮遊層を、慎重なピペット操作により除去し、実施例14における自然膵島細胞の増殖試験に用いた。残りの浮遊する細胞及び組織と、底部の組織片とについて、まとめて、「膵廃棄組織」と捉えて、細胞捕集ステップに供した。
【実施例２】
【０１１６】
＜非内分泌上皮細胞（NEECs）についての細胞捕集＞
膵廃棄組織について、50mlのRPMI1640を用い4℃で2分間、250×Gで遠心分離することにより、2回洗浄を行った。そして、各膵廃棄組織を次のように播種した。すなわち、10％の熱不活化ウシ胎児血清（FCS）（HyClone Laboratories, Inc.）とPenStrep (最終の溶液におけるペニシリン/ストレプトマイシン=50/50, 和光ケミカル（株）)とを含むRPMI1640中、6ウェルプレートまたは10cmディッシュ（Greiners Inc.）に播種した。上記に代わる手順では、膵廃棄組織の組織塊について、アキュターゼ（Innovative Cell Technologies, Inc.）を用いて室温にて10分間で、さらに解離させる。ほぼ１つの膵臓からの膵消化組織塊を、各プレートまたはディッシュに播種した。非内分泌上皮細胞（NEECs）を捕集するためには、プレートまたはディッシュについて、予め、0.2〜0.25mg/mlのラット尾由来コラーゲンI（BD Biosciences）を用いて室温で1時間コーティングしておき、さらに、(1)抗マウスE-カドヘリン抗体（Clone: 36/E-Cadherin, BD Biosciences）、及び／または、(2)抗c-Met (HGF受容体) 抗体 (Wako Chemicals, BAF527)を（すなわち、これら(1)及び(2)の少なくとも一方を）、1:100と1:1000との間の濃度範囲にて用い、室温で1時間コーティングを行った。組織の培養を、37℃で5％CO2にて、24〜36時間行った。培養期間中、浮遊組織片を一度、培地と共に除去し、新鮮な血清含有培地を加えた。図1Aに示す顕微鏡写真は、このように得られた細胞であって、コラーゲンIでコーティングされたディッシュ表面に接着したままとなっている細胞について示す。これは、抗c-Met抗体のみを、ディッシュ表面をコーティングする抗体として用いた場合のものである。図2Aは、このようにして得られた表面に接着している細胞の数についてのグラフである。これは、非内分泌上皮細胞（NEECs）の培養を、18〜36時間、E-カドヘリン（「Ecad」)）及び/または抗c-Metは（「cMet」）抗体の存在下、または、非存在下で行った場合のものである。二元配置分散分析（Two-way ANOVA）によると、抗体処理間の効果は、F=11.6, n=6/group, p=0.0003であり、18時間培養と36時間培養との間の効果は、F=87.7, n=6/group, p<0.0001であった。
【実施例３】
【０１１７】
＜非内分泌上皮細胞（NEECs）のコロニー誘起＞
細胞捕集ステップの後、培地は、コーティングされた表面から、いくぶん大きい細胞塊が脱落することを可能にする非水平回転運動をプレートに加えてから、除去した。非内分泌上皮細胞（NEECs）のコロニー増殖を誘起すべく、培養系には、次のような無血清培地を加えた。すなわち、1g/mlのITS（最終濃度：インスリンが5μg/ml、トランスフェリンが5μg/ml、亜セレン酸ナトリウムが5ng/ml）、0.2％のウシ血清アルブミン（BSA）（Sigma-Aldrich Co.）、20ng/mlの組換えヒトFGF-2、及び1400U/mlの組換えヒトLIF（白血病抑制因子）、10mMのD-グルコース（Wako Chemicals Co.）、PenStrep (50/50)及びサイクリンB1（Roche Pharmaceutical, Inc.）を含有するDMEM/Ham's F-12中に含まれる無血清培地を加えた。そして、組織の培養を、37℃で5％CO2にて、少なくとも24時間行った。図1Bは、このように誘起された細胞コロニーの顕微鏡画像を示す。比較のために、実施例1及び2と同様の処理手順、及び、上記誘起ステップを、同一の膵臓の膵管のみから得られた組織（「Ductal tissues」(膵管組織)）に対して行った。すなわち、比較のために、実施例1のように膵臓の全部分から得られた組織（「All tissues」(全組織)）を用いる代わりに、このように行った。また、誘起ステップにてヒトFGF-2を用いない他は同一である処理手順も行った。結果を図２Bに示す。二元配置分散分析（Two-way ANOVA）によると、FGF-2処理と非処理との間の効果は、F=75.9, n=6/group, p<0.0001であり、膵管組織(Ductal tissues)と全組織(All tissues)との間の効果は、F=338.0, n=6/group, p<0.0001であった。無血清培地を用いる、この誘起ステップにてFGF-2を含む培地を用いる場合は、FGF-2を含まない培地を用いる場合に比べて、より多くの非内分泌上皮細胞（NEECs）を産生した。また、膵廃棄組織の全体を用いる場合、播種前にピペット操作で選び取った膵管組織を用いる場合に比べて、より多くの非内分泌上皮細胞（NEECs）を産生した。
【実施例４】
【０１１８】
＜初期コロニー増殖＞
非内分泌上皮細胞（NEECs）のコロニーを増殖させるには、コロニーの誘起ステップ（実施例3）の後、無血清培地を、次のような別の無血清培地に置き換える。すなわち、1g/LのITS（インスリンが5μg/ml、トランスフェリンが5μg/ml、亜セレン酸ナトリウムが5ng/ml）、0.2％のウシ血清アルブミン（BSA）、10mMのニコチンアミド、及び10ng/mlの組換えヒトKGF（ケラチノサイト増殖因子）が、7mMのD-グルコース、PenStrep (50/50)、0.02μMの2-メルカプトエタノール及びサイクリンB1を含有するDMEM/Ham's F-12（1:1混合物）中に含まれる無血清培地に置き換え、2日間培養する（図1C）。次いで、培地には、サイクリンB1を含まず40％が調整培地である培地による交換を、非内分泌上皮細胞（NEECs）のクローン性コロニーであって10〜30μmの径範囲の大きさを有するものが、かなりの数だけ増殖するまで、２〜７日間行った（図1D）。
【実施例５】
【０１１９】
＜非内分泌上皮細胞（NEECs）の継代培養と選択的増殖＞
実施例4の初期増殖ステップの後の非内分泌上皮細胞（NEECs）を、リン酸塩緩衝液（PBS）で2回洗浄し、室温で5分間アキュターゼ処理することにより、プレートから剥離した。剥離した細胞は、40μmのナイロンメッシュを通して濾過し、160×G以下で4分未満の間、遠心分離した。プレートに残っている細胞クラスター、すなわち残存細胞（LOCs）については、別個の容器中にて同一の無血清培地でインキュベーションを続け、後に、実施例6におけるトランスウェルの培養系に用いた。細胞の沈殿について、0.1μMのアトルバスタチン（LKT Laboratories社）を添加した他は実施例4と同一である無血清培地を用いて再浮遊した。細胞及びこの浮遊培地を、実施例2と同様にラット尾由来コラーゲンIでコーティングされた、6ウェルプレート、10cmのディッシュ、または4ウェルのスライドチャンバー（Biocoat Cellware, BD Labware）に播種した。但し、プレートをコーティングするコーティング液は、10ng/mlのKGFを含み、コーティングされた表面について、抗マウスNotch1抗体（Clone: 8G10, Millipore）で1:100〜1:1000の最終濃度にて、さらに処理したのであった。培地交換は、2〜3日ごとに、40％調整培地で、非内分泌上皮細胞（NEECs）のクローン性コロニーが、相当な数だけ現れるまで行った。比較実験は、抗マウスNotch1抗体を省いた点を除き、実施例1から、この直前の箇所にまで記載したのと同じ処理手順により行った。図2C（独立t-検定： n=5/group、P<0.0001）は、抗Notch1抗体で処理したコラーゲンIコーティング済みの培養容器に継代培養した場合（「Anti-Notch1」(抗Notch1)）、及び、抗体処理していないコラーゲンIコーティング済みの培養容器に継代培養した場合（「Untreated」(未処理)）における、ブロモデオキシウリジン陽性（Brdu+）細胞の割合を示す。免疫細胞化学的検査を、実施例4と同じ方法により行った。図4に示すように、増殖を示すBrdu陽性細胞の割合は、「Anti-Notch1」(抗Notch1)で、「Untreated」(未処理)の約2倍となった。
【実施例６】
【０１２０】
＜改変無血清培地、及び、トランスウェルによる残存細胞（LOCs）を用いた非内分泌上皮細胞（NEECs）の培養＞
実施例5の選択的増殖の後の非内分泌上皮細胞（NEECs）を、コラーゲンIでコーティングした12ウェルトランスウェルプレート（Millipore社）へと、下記を含有する無血清培地中にて継代培養した。すなわち、10mMのD-グルコース（Wako Chemicals Co.）、PenStrep (50/50)及び0.02μMの2-メルカプトエタノールを含有するDMEM/Ham's F-12中に、1g/mlのITS（インスリンが5μg/ml、トランスフェリンが5μg/ml、亜セレン酸ナトリウムが1.25ng/ml）と、0.2％のウシ血清アルブミン（BSA）と、10mMのニコチンアミドと、20ng/mlのHGFと、40ng/mlのEGFと、20ng/mlのBMP7と、4μMのrock阻害剤(Y-27632 . 2HCl)とが含まれる無血清培地中にて、残存細胞（LOCs）の塊を配置したトランスウェルインサートを吊り下げた状態で、3日間のインキュベーションを行った。トランスウェルインサートは、多孔性の底部を有する一種の容器であり、この底部が、トランスウェルプレートの底部の培養系を覆い、かつ離間されるように配置されたものである。次いで、顕微鏡画像を取得した。図3-1Aには、培養容器のコーティングされた表面上、すなわち、トランスウェルプレートの底部上（「下側コンパートメント」）にある非内分泌上皮細胞（NEECs）の顕微鏡画像を示す。また、図3-1Bには、トランスウェルインサート中、すなわち、トランスウェルインサートの底部上（「上側コンパートメント」）にある残存細胞（LOCs）の顕微鏡画像を示す。このように増殖した非内分泌上皮細胞（NEECs）が往々にして細胞クラスター（図3-1A、矢印）を形成し、この細胞クラスターは、1週間の期間で増殖して大きさが増加した（図3-1C）。図3-1A及び図3-1B中に矢印で示すように、下側コンパートメント中にある非内分泌上皮細胞（NEECs）のクラスターの位置と、上側のトランスウェルインサート中にある残存細胞（LOCs）のクラスター位置とが、ほぼ一致している。このことは、残存細胞（LOCs）により分泌される何らかのパラクリン因子が、生理学的に、及び／または、細胞生物学的に、近傍にある非内分泌上皮細胞（NEECs）に影響を与えていることを示唆する。非内分泌上皮細胞（NEECs）を、このように残存細胞（LOCs）とともに増殖させると、残存細胞（LOCs）なしのコントロールに比べて、非内分泌上皮細胞（NEECs）クラスターの数が、顕著に増大した（（図3-2、独立t検定、n=3 groups/treatment, t=0.0021）。図3-3は、半定量的RT-PCRにより評価した、これらの細胞からの、Pdx-1及びIns1のmRNA発現を示す。残存細胞（LOCs）が、自然膵島よりも、さらに強度の大きい、Pdx-1の強いシグナルを示した。一方、非内分泌上皮細胞（NEECs）は、せいぜい中程度のシグナルを示した。これとは対照的に、分化の際、残存細胞（LOCs）は、非内分泌上皮細胞（NEECs）と異なり、Ins1のシグナルを示さなかった。なお、インサート中の残存細胞（LOCs）とともに培養した非内分泌上皮細胞（NEECs）「NEECs +LOC」は、残存細胞（LOCs）なしに培養した非内分泌上皮細胞（NEECs）「NEECs -LOC」に比べて、強度の大きいIns1のシグナル示した。
【実施例７】
【０１２１】
＜インスリン産生細胞に分化する前駆細胞について富化した非内分泌上皮細胞（NEECs）の培養＞
実施例5の選択的増殖の後の非内分泌上皮細胞（NEECs）は、コラーゲンIでコーティングしたスライドチャンバー（Biocoat Cellware, BD Labware）上へと継代培養し、0.1μMのアトルバスタチン（ATS）を含む他は実施例4と同一の無血清培地中にて、5日間インキュベーションを行った。「Control」（コントロール）では、アトルバスタチン（ATS）を省いたので、実施例4と全く同一の培地を用いた。次いで、これらの細胞は、次のような培地に交換することで、3日間、分化を誘起した。すなわち、DMEM/Ham's F-12 (1/1) に、20mMのD-グルコース、2体積%のウシ胎児血清（FCS）、2ng/mlのアクチビンA、5ng/mlのベータセルリン、20ng/mlのHGF、20ng/mlのガストリン、20ng/mlのIGF-1、 5 ng/mlのKGF、20ng/mlのBMP7、20ng/mlのVEGF、20ng/mlのエキセンディン-4、10 mM のニコチンアミド及び0.1mMアスコルビン酸を含む培地に交換して分化を誘起した。免疫細胞化学的検査のために、細胞を冷メタノールで固定し、室温で1時間ブロッキング溶液（Dako A/Sの「ペルオキシダーゼブロッキング試薬」、過酸化水素及び15mMアジ化ナトリウムを含む。）でブロッキングした。そして、抗インスリン抗体（Millipore International, Inc., Linco 4011-01F）（1:400）により室温で30分間処理し、ブロッキング溶液で洗浄し、Cy3結合二次抗体（抗モルモットIgG）（1:800）で処理した。核をDAPIで染色し、スライドをVectraShield（Vector Laboratoriesの退色防止剤溶液の商品名）を用いてマウントし、蛍光顕微鏡で観察した（図4A）。インスリン陽性細胞の割合は、所与の観測フィールド内にて、細胞のトータルの数を表すDAPI染色核の数を基準に算出した（図4B）。図4Bに示すように、インスリン陽性細胞の割合は、アトルバスタチン（ATS）で処理した細胞の場合に、処理しなかった場合よりも、著しく大きかった（独立t検定: n=7/group, p<0.0001）。
【実施例８】
【０１２２】
＜非内分泌上皮細胞（NEECs）についての、インスリン産生組織（IPTs）を生成可能な前駆細胞としての特定＞
実施例7の富化及び分化の後の非内分泌上皮細胞（NEECs）を、コラーゲンIでコーティングしたスライドチャンバー（Biocoat Cellware, BD Labware）中へと継代培養し、少なくとも24時間のインキュベーションを行った。この際、2μMのオールトランスレチノイン酸（和光ケミカル(株)）と0.25μMのシクロパミンKAAD（Merk Ltd.）とを培地中に含む条件、及び含まない条件にて行った。また、培地には、KGFもアトルバスタチンも含まない他は実施例４で用いたと同じ無血清培地を用いた。インキュベーション後、非内分泌上皮細胞（NEECs）を、免疫細胞化学的な分析に供した。非内分泌上皮細胞（NEECs）を、pH7.4のリン酸塩緩衝液（PBS）に溶かした4％パラホルムアルデヒド（和光ケミカル(株)）でもって、室温にて30分間で固定した。そして、固定剤を、リン酸塩緩衝液（PBS）に溶かした100mMグリシンでクエンチした。免疫エピトープは、0.05％のトリプシンを溶かした1％塩化カルシウム溶液にて、37℃で10分間処理することにより、明らかにした。スライド上の細胞を、ブロッキング溶液（Dako, Inc.の「ペルオキシダーゼブロッキング試薬」）と、抗Ngn3抗体（Millipore International, Inc., AB5684）（400:1）と、FITC（フルオレセイン・イソチオシアネート）標識二次抗体で処理した（800:1）。次いで、蛍光顕微鏡により観察した（図5A）。免疫細胞化学的画像は、Adobe Photoshop（バージョン6）での色変換により分析し、任意に選ばれた閾値レベルを超える色彩強度を示す細胞につきNgn3陽性であるとした。このようにして得られた、非内分泌上皮細胞（NEECs）中におけるNgn3陽性の細胞の割合を図5Bに示す。オールトランス型レチノイン酸及びシクロパミンKAAD（「Cycl-K+RA」）で処理された非内分泌上皮細胞（NEECs）は、これらによる処理を行わなかったもの（「Contrrol」(コントロール)）に比べて、Ngn3陽性細胞の割合が著しく高かった（n=3 (処理あたりの細胞サンプル数)、 p<0.0001; 独立t検定）。
【実施例９】
【０１２３】
＜遺伝子発現解析＞
C57Bl/6マウスから分離した自然膵島並びに膵島内分泌前駆細胞及びインスリン産生組織（IPTs）に関連したmRNA発現につきキャラクタリゼーションを行うべく、半定量的RT-PCRを行った（Ngn3, Pdx1, NeuroD, Ptf1a, Notch1, Hes1, HNF6, Nkx6.1, Ins1 及びIns2）。全RNAは、1.0×105個の細胞から、RNeasy Mini Kit（Qiagen, Inc.）により抽出した。存在しうるDNAコンタミネーションは、RNase-free DNase I Set (Qiagen, Inc.)により除去した。逆転写を、20ngのRNAでSuper Script III（Invitrogen, Inc.）及びランダムプライマー（Invitrogen, Inc.）を用いて行い、合成されたcDNAは、RNase H（Wako Chemicals Co.）で処理して、RNAコンタミネーションを除去した。PCRを、20ngのcDNAでHot Start Taq Master Mix (Promega Co.)を用い、表２に挙げた所定のプライマーのペア、アニーリング温度及びサイクル数にて行った。増幅したPCR生成物を、2％アガロースゲル及び0.001％エチジウムブロマイドを用いたゲル電気泳動により分析した（図6A、6B、9A-9C）。図6a〜6B中、1〜4の番号は、分析に用いた組織または細胞培養のサンプルを示す。「1」は、実施例1の膵廃棄組織である。「2」は、実施例7における、アトルバスタチン（ATS）で5日間、無血清培地で培養した後の非内分泌上皮細胞（NEECs）である。「3」は、この後、オールトランス型レチノイン酸及びシクロパミン実施例8におけるKAADを含む培地で24時間培養した、実施例８の非内分泌上皮細胞（NEECs）である（図5A〜5Bの「CYCL-K+RA」）。「4」は、「3」の培養系のコントロール、すなわち、実施例8及び図5A〜5Bの「Control」（コントロール）としての非内分泌上皮細胞（NEECs）である。図6A〜6B中の矢印は、Ngn3とHes1の発現が、見かけ上、同時となっていることを強調して示す。このことは、継代培養された細胞集団が、内分泌前駆細胞を生成するにあたり、わずかに異なる時間経過を取ることを示す。
【実施例１０】
【０１２４】
＜血管内皮細胞（VECs）＞
実施例2における膵廃棄組織の培養系から除去された浮遊組織片を、1.8mg/mlのラット尾由来コラーゲンIをコーティングした24ウェルプレートに、100μg/mlのECGS（内皮細胞増殖サプリメント）と、65.5℃にて60〜70分間の熱不活化が施された胎児ウシ血清（FCS）20体積％とを含むRPMI1640培地とともに、播種した。18時間培養後の非接着性の組織片を除去し、リン酸塩緩衝液（PBS）でざっと洗浄してから、0.1体積％のファンギゾン（Sigma-Aldrich Co.）を含む新鮮な培地で交換し、7〜10日間培養した。次いで、細胞をアキュターゼ処理によって剥離し、浮遊する細胞を、抗体結合磁性マイクロビーズ（Miltenyi Biotec, Inc.）及び抗CD31抗体（Pharmingen, Co.）により純化した。細胞溶出液は、細胞が直前に記載のごとく剥離したのと同一の培地にて、コラーゲンIをコーティングしたT25フラスコ（Corning, Inc.）中にて培養した。このように得られた細胞（VECs）の浮遊液の画像を図7-1Aに示す。
【実施例１１】
【０１２５】
＜組織複合体の生成＞
実施例7の富化及び分化の後の非内分泌上皮細胞（NEECs）と、実施例10の培養の後の血管内皮細胞（VECs）とを、それぞれの培養容器の表面からアキュターゼ処理によって剥離し、細胞数での比率が、それぞれ、95/5、90/10、80/20及び70/30となるように、混合した。図7-1B〜7-1D及び7-2は、混合比を80/20とした場合の結果を示す。この混合比は、組織複合体の機能を増大させるとともに、非内分泌上皮細胞（NEECs）の比率をあまり下げないという観点から、最適であるように思われる。細胞混合物浮遊液を、超低接着性6ウェルプレート（Costar 3471, Corning, Inc）に、組織生成培地とともに播種した（図7-1B）。この培地は、DMEM/Ham's F-12と、20 mMのD-グルコースと、2体積%のウシ胎児血清（FCS）と、2ng/mlのアクチビンAと、5ng/mlのベータセルリンと、20ng/mlのHGFと、20ng/mlのガストリンと、20ng/mlのIGF-1と、5ng/mlのKGFと、20ng/mlのBMP7と、20ng/mlのVEGFと、20ng/mlのエキセンディン-4と、10mMのニコチンアミドと、0.1mMアスコルビン酸と、1mMのCaCl2を含む。細胞混合物の浮遊液には、ゆっくりとした非水平回転運動が約20回転/分にて、37℃、5％CO2で、18〜24時間、インスリン産生組織（IPTs）の球状のクラスターが生成される（図7-1C）まで加えられた。インスリン産生組織（IPTs）の熟成を、培地にCaCl2が含まれず、培養容器を動かさずに水平に置く点を除き、上記球状クラスターの生成と同一の方法で行った。培地は、約20日間の熟成の全期間にわたって、1〜2日ごとに交換した（図7-1D）。図7-1の画像「Ｃ」及び「Ｄ」から知られるように、インスリン産生組織（IPTs）の熟成が進むにともない、一部のインスリン産生組織（IPTs）は融合して、より大きな組織塊を形成するとともに、より小さな組織部分が出芽している。比較のためには、実施例7の富化及び分化の後の非内分泌上皮細胞（NEECs）について、血管内皮細胞（VECs）と混合することなく、上記の培養に供した。非内分泌上皮細胞（NEECs）のみ、または、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）との組織複合体から生成した、100〜200μmの径のインスリン産生組織（IPTs）の数を計測し、図7-2に示す（独立t検定, n=3 (インキュベートした細胞群), p<0.0001）。図7-2から知られるように、組織複合体から生成したインスリン産生組織（IPTs）の数は、非内分泌上皮細胞（NEECs）のみから生成した場合の3倍より多かった。
【実施例１２】
【０１２６】
＜インスリン産生組織（IPTs）のキャラクタリゼーション＞
実施例11の熟成期間後のインスリン産生組織（IPTs）について、計数及び径の測定を行い、これにより膵島イクイヴァレンツ（IEQs）を算出することで、組織の生産性を評価した。１膵島イクイヴァレンツ（IEQ）は、約200μmの径の球状の組織（IPT）に相当する。この計算は、インスリン産生組織（IPTs）の体積に基づいており、この体積は、得られたインスリン産生組織（IPTs）の数を表す膵島イクイヴァレンツ（IEQs）に置き換えて捉えられる（図7-2）。組織の評価は、標準的な免疫組織化学的手法により、インスリン陽性細胞の相対的な比率についても行った。インスリン産生組織（IPTs）の固定を、リン酸緩衝液に溶かした4％パラホルムアルデヒド液により4℃で18時間行った。固定されたインスリン産生組織（IPTs）を、リン酸緩衝液中4℃で18時間洗浄し、2％アガロース中に埋め込み、一連のアルコール液で脱水し、キシレンで置換し、パラフィン中に埋め込んだ。4μmのパラフィン切片について、ガラススライド上にてワックス除去を行い、一連のアルコール液及びリン酸緩衝液で、再度含水状態とした。インスリン産生組織（IPTs）の切片について、ブロッキング溶液で室温にて1時間ブロッキングを行い、抗インスリン抗体（Millipore International, Inc., Linco 4011-01F）（1:400）で処理し、ブロッキング溶液で洗浄し、Cy3結合二次抗体（Anti-Guinea Pig IgG）（1:800）で処理した。核をDAPIで染色し、スライドをVectraShieldでマウントし、倒立蛍光顕微鏡で観察した（図8-1）。インスリン産生組織（IPTs）の4μmパラフィン切片を、抗インスリン抗体及びCy3標識二次抗体で染色した。図8-1のサイズバーは30μmを表す。インスリン陽性細胞の割合について、所与の観測領域でのトータルの細胞数を示す、DAPIで染色された核の数に対する割合として算出した（図8-2）。図8-2に示すように、組織複合体から生成したインスリン産生組織（IPTs）は、非内分泌上皮細胞（NEECs）のみから生成したものに比べて、より多くのインスリン陽性細胞を含んでいた（n=5 (各グループの代表的なインスリン産生組織), 独立t検定, p<0.001）。組織複合体から生成したインスリン産生組織（IPTs）と、非内分泌上皮細胞（NEECs）のみから生成したインスリン産生組織（IPTs）とをさらに比較するために、半定量的PCRにより増幅したインスリンmRNA発現について測定した。図9Aはこのようにして得られた画像を示す。この図で、MはDNAサイズマーカーを表し、自然膵島のパターンも示されている。図9Bは、Insulin1（Ins1）の相対発現強度を示す（ペアt-検定: Ins1, n=5 (標本ペア), p<0.0001）。また、図9Cは、Insulin2（Ins2）についての同様の相対発現強度を示す（ペアt-検定: Ins2, n=4 (標本ペア), p<0.0001）。図9B及び9Cから知られるように、組織複合体から生成したインスリン産生組織（IPTs）は、非内分泌上皮細胞（NEECs）のみから生成したものに比べて、insulin1（Ins1）及び insulin2（Ins2）のいずれについても、より大きい相対発現強度を示した。
【実施例１３】
【０１２７】
＜インスリン分泌機能の評価＞
インスリン分泌機能をグルコース刺激法で評価した。実施例11で得られた20日間の熟成後のインスリン産生組織（IPTs）における約20膵島イクイヴァレンツ（IEQs）を、次のようにプレインキュベートした。すなわち、0.1%のウシ血清アルブミン（BSA）、10mMのHepes、PenStrep (50/50)及び5mMのD-グルコースを添加した（低濃度グルコース溶液とした）200μLのクレブスリンゲル液を用い、U字形底の96ウェルプレート（Nalgene Nunc International K.K.）中にて、37℃で5％CO2にて2時間プレインキュベートした。20膵島イクイヴァレンツ（IEQs）の自然膵島（BALB/cマウス）についてもプレインキュベートしたが、実験条件に順応させるべく、グルコース刺激の前に一晩（18時間）プレインキュベート。クレブスリンゲル液を注意深く除去し、２〜３回洗浄し、同量の新鮮な溶液を仕込んでから、37℃で5％CO2にて2時間インキュベートした。インキュベーション後、150μLの低グルコース溶液をウェルから採取し、後の分析のために、-30℃で保存した。そして、インスリン産生組織（IPTs）について、２〜３回洗浄し、20mMのD-グルコースを含む点を除き上記のとおりの同量の新鮮なリンゲル液（高濃度グルコース溶液）を仕込み、37℃で5％CO2にて2時間インキュベートした。次いで、150μLの高濃度グルコース溶液をウェルから採取し、後の分析のために、-30℃で保存した。採取したリンゲル液を、解凍し、ざっと遠心分離することで各サンプルから50μLを取り、機器メーカーの指示にしたがい、ELISA (Shibayagi, Co.)によるCペプチドアッセイ（図10A）、または、ELISA (Mercodia AB, Uppsala, Sweden)によるインスリンアッセイ（図10B）を行った。この組織について、実施例9と同様にRT-PCRを行うことで、Ins1及びIns2の検査を行った。この検査は、自然膵島について、熟成及び機能の状態を評価するのにルーチン的に用いられるものである。図10Aに示すように、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）との組織複合体から生成したインスリン産生組織（IPTs）は、グルコース濃度が増大した際に、C-ペプチドの分泌において、より高いグルコース応答性を示した（二元配置分散分析(Two-way ANOVA)：効果=NEEC単独vs.NEECs+VECs, F=19.7, n=5 (グループ), p=0.0004。効果=低グルコース濃度vs.高グルコース濃度, F=5.7, n=5 (グループ), p=0.0295）。さらに、図10Bに示すように、非内分泌上皮細胞（NEECs）と血管内皮細胞（VECs）との組織複合体から生成したインスリン産生組織（IPTs）は、自然膵島（BALB/cマウス）が分泌するインスリン量の、1/10〜1/2のインスリンを分泌したが、少なくとも実験を行った条件において、グルコース応答性が、自然膵島よりも高かった（二元配置分散分析(Two-way ANOVA)：効果= IPTs vs.自然膵島, F=11797.8, n (IPTs)=4グループ, n (自然膵島)=3グループ, p<0.0001。効果= 低グルコース濃度vs.高グルコース濃度, F=1223.2, p<0.0001)。
【実施例１４】
【０１２８】
＜血管内皮細胞（VECs）の細胞単層上での膵島細胞の培養＞
実施例1に記載したようにC57Bl/6マウスから自然膵島を分離し、自然膵島を、アキュターゼ存在下に室温で10分間のインキュベーションを行うことにより、解離させた。これらの細胞を、(1) 0.2mg/mlの増殖因子低減マトリゲル（BD Biosciences）でコーティングしたスライドチャンバー、または、(2) 実施例10で得られた血管内皮細胞（VECs）が培養されて細胞単層が形成されたスライドチャンバーに播種した。膵島細胞を、10%のウシ胎児血清（FCS）及びPenStrep（50/50）を含むRPMI1640中にて2日間培養し（図11-1）、培養の最後の30分間には10μMのブロモデオキシウリジン（Brdu）で刺激を加えた。免疫細胞化学的検査のために、70％エタノールで室温にて30分間で固定処理を行った後、実施例７と同様のインスリン染色の操作手順を行った（図11-2）。リン酸塩緩衝液で洗浄した後、細胞の染色を、抗Brduの一次抗体（Clone:IIB5, Santa Cruz Biotechnology, Inc.）及び二次抗体（goat anti-mouse IgG-FITC, Santa Cruz Biotechnology, Inc.）を用いて、それぞれ1:200及び1:400の希釈率にて行った。実施例７におけると同様に蛍光画像を観察した（図11-2）。図11-2に示す一連の免疫細胞化学的画像は、チャンバースライド上の血管内皮細胞（VECs）膵島の細胞単層の上に播種した膵島（A、B及びC）、及び、チャンバースライドのコーティングされた表面の上に播種した膵島（D、E及びF）についてのものである。図11-2において、A及びDはDAPI、B及びEは抗インスリンCy3、C及びFは抗BrdU-FITCのものである。図11-3のグラフは、膵島を血管内皮細胞（VECs）上で増殖させた場合に、マトリゲルを用いた場合よりも、ブロモデオキシウリジン陽性細胞（％BrdU+細胞）が著しく多いことを示す（独立スチューデント検定：t=6.57, n=8/グループ, p<0.0001）。
【実施例１５】
【０１２９】
＜インスリン産生組織（IPTs）のインビボでの機能評価＞
生後9〜14週の同性で同一系統のマウスを、実施例11の熟成後のインスリン産生細胞（IPTs）を移植するレシピエントに用いた一晩絶食させたマウスに、ストレプトゾトシン（110〜150mg/kg体重）を腹腔内に注入することによって、糖尿病にさせ、血糖値の測定を、注射後4日目、及び、その後の2〜5日ごとに行った。血糖値が2日間連続で400 mg/dlを超えた場合に、糖尿病であると考えた。麻酔中の糖尿病マウスの腹側部腹膜を外科的に切開し、一方の腎被膜下に700〜1000膵島イクイヴァレンツ（IEQs）のインスリン産生細胞（IPTs）を移植した。もう一方の腎臓は、処置を行わず、そのままとした。切開口は、マウスの麻酔を解除する前に、二重閉鎖技法により閉鎖した。手術を行ったマウスについての経過の追跡を、Accu-Chek Active（Roche Diagnostics, Inc.）による血糖値の測定及び体重測定により50日間行った（図12A）。図12Aは、700膵島イクイヴァレンツ（IEQs）のインスリン産生細胞（IPTs）を移植した糖尿病マウスについて測定された血糖値の変化を示す。ここで、インスリン産生細胞（IPTs）は、同一系統のドナーマウスの膵組織から生成されたものであり、腎被膜下に移植した。日数「0」は移植の日を示す。400mg/dlを超える血糖値は高血糖性（糖尿病性）であり、200mg/dlより低い血糖値は正常血糖性（非糖尿病性であって正常）である。移植を受けたマウスは、最初の2週間で血糖値の低下を示した。インスリン産生細胞（IPTs）が移植された腎臓について、インスリン陽性細胞局在を免疫組織化学的に実施例12で検査したところ、インスリン陽性細胞クラスターが腎被膜下に明瞭に視認可能であった。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−Ｃ】
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【図１−Ｄ】
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【図３−１】
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【図４−Ａ】
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【図５−Ａ】
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【図５−Ｂ】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−Ａ】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図２−Ｃ】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−Ｂ】
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【図９−Ａ】
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【図９−Ｂ】
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【図９−Ｃ】
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【図１０−Ａ】
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【図１０−Ｂ】
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【図１１−３】
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【図１２−Ｂ】
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【国際調査報告】
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