(57)【要約】ＧＣリッチ鋳型のメチル化状態を決定するための方法が提供される。その方法は、メチル化状態とＣＧＧリピート長との同時の特徴づけを可能にするＧＣ参照標準の使用を含む。その方法は、脆弱Ｘ症候群を含むＧＣリッチリピートに関連する遺伝子型を検出するために有用である。本方法は、ＤＮＡサンプル中のＦＭＲ遺伝子座を特徴づけることに関し、ａ）サンプルの第１部分をメチル化感受性ＤＮａｓｅと接触させる工程；ｂ）サンプルにＧＣ参照標準を加える工程（参照標準は、少なくとも７５％のＧＣ含量を有する）；ｃ）サンプルの第１および第２部分（各々がＧＣ参照標準を含む）をＤＮＡ増幅反応に供する工程（各部分において増幅されたＤＮＡは、異なる標識で標識される）；およびｄ）サンプルの第１および第２部分からの増幅されたＤＮＡを分析することにより、ＦＭＲ遺伝子座のメチル化状態を特徴づける工程を包含する。
2013540452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡサンプル中のＦＭＲ遺伝子座を特徴づける方法であって：
ａ）該サンプルの第１部分をメチル化感受性ＤＮａｓｅと接触させる工程；
ｂ）該サンプルにＧＣ参照標準を加える工程であって、該参照標準は、少なくとも７５％のＧＣ含量を有する、工程；
ｃ）該サンプルの該第１部分および第２部分であって、各々が該ＧＣ参照標準を含む、該第１部分および第２部分を、ＤＮＡ増幅反応に供する工程であって、各部分において増幅されたＤＮＡは、異なる標識で標識される、工程；および
ｄ）該サンプルの該第１部分および該第２部分からの該増幅されたＤＮＡを分析することにより、該ＦＭＲ遺伝子座のメチル化状態を特徴づける工程
を包含する、方法。
【請求項２】
工程（ｄ）が、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＧＣ参照標準が、前記メチル化感受性ＤＮａｓｅについての認識部位を欠いている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１部分および前記第２部分からの前記増幅されたＤＮＡが、単回のＣＥランにおいて分析される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＧＣ参照標準が、天然に存在するＦＭＲ対立遺伝子と重複しないＣＥ移動時間を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＣ参照標準が、約２０未満、約２４〜２７または約３２超のＣＧＧリピートの相対保持時間を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＧＣ参照標準が、約３未満のＣＧＧリピートの相対保持時間を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＣ参照標準が、約１７５〜約２２５のＣＧＧリピートの相対保持時間を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記メチル化感受性ＤＮａｓｅが、ＨｐａＩＩ、ＥａｇＩまたはＮｒｕＩから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅反応が、少なくとも２００のＣＧＧリピートを増幅することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅反応が、１を超えるＧＣ／ＡＴ比を有するｄＮＴＰ混合物を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＧＣ／ＡＴ比が、約２．５〜約１０である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＦＭＲ遺伝子座が、ＦＭＲ１遺伝子座である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＧＣ参照標準が、前記第１部分を前記ＤＮａｓｅと接触させた後に前記サンプルに加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＣ参照標準が、前記第１部分を前記ＤＮａｓｅと接触させる前に前記サンプルに加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルの前記第２部分をコントロール酵素と接触させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記コントロール酵素が、ＥｃｏＲＩおよびＳａｕ３Ａ１から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＧＣ参照標準が、前記第１部分を前記ＤＮａｓｅと接触させる前に前記サンプルに加えられ、前記コントロール酵素が、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ、ＥｃｏＲＩ、ＤｐｎＩおよびＮａｅＩから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルの前記第１部分を前記メチル化感受性ＤＮａｓｅと接触させる前に、該サンプルに消化コントロールを加える工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記消化コントロールが、約３未満のＣＧＧリピートの相対保持時間を有し、前記ＧＣ参照標準が、約３未満のＣＧＧリピートの相対保持時間を有し、該消化コントロールの増幅産物および該参照標準の相対保持時間が、約４またはそれを超えるＣＧＧリピートによって異なる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ヒトＤＮＡサンプルを分析する方法であって：
ａ）該サンプルの第１部分をメチル化感受性ＤＮａｓｅと接触させる工程；
ｂ）該サンプルにＧＣ参照標準を加える工程であって、該参照標準は、少なくとも７５％のＧＣ含量を有する、工程；
ｃ）該サンプルの該第１部分および第２部分をＤＮＡ増幅反応に供する工程であって、各部分において増幅されたＤＮＡは、異なる標識で標識される、工程；および
ｄ）該サンプルの該第１部分および該第２部分からの該増幅されたＤＮＡを分析することにより、脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ関連振戦運動失調症候群および／または脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全に関連する遺伝子型を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
以下の式の核酸配列：
５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’
を含むＧＣ参照標準であって、ここで、
Ａは、配列番号４０の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む配列であり、ここで、Ａは、ゲノムＦＭＲ１の５’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズすることができ；
Ｃは、配列番号４１の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む配列であり、ここで、Ｃは、ゲノムＦＭＲ１の５’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズすることができ；
Ｂは、少なくとも７５％のＧＣ含量を有する配列であり、かつＸ−３００ヌクレオチド長〜Ｘ＋１０ヌクレオチド長であり、ここで、Ｘは、
ａ）Ａの３’末端〜配列番号４０の最後のヌクレオチドのヌクレオチド数；および
ｂ）配列番号４１の最初のヌクレオチドからＣの５’末端までのヌクレオチド数
の合計である、ＧＣ参照標準。
【請求項２３】
Ｂが、１５０ヌクレオチド長〜２００ヌクレオチド長である、請求項２２に記載のＧＣ参照標準。
【請求項２４】
Ｂが、少なくとも９０％のＧＣ含量を有する、請求項２３に記載のＧＣ参照標準。
【請求項２５】
Ｂが、少なくとも９４％のＧＣ含量を有する、請求項２３に記載のＧＣ参照標準。
【請求項２６】
Ａが、
【化１３】
2013540452.tif 000037
を含む、請求項２２に記載のＧＣ参照標準。
【請求項２７】
Ｃが、
【化１４】
2013540452.tif 000038
を含む、請求項２２に記載のＧＣ参照標準。
【請求項２８】
Ｂが、配列番号４８の少なくとも１００ヌクレオチドまたは配列番号４９の少なくとも１００ヌクレオチドを含む、請求項２２に記載のＧＣ参照標準。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年１０月２９日に出願された米国仮出願第６１／４０８，３６７号の利益を主張し、上記米国仮出願は、その全容が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
本出願に記載された成果は、ユニス・ケネディ・シュライバー国立小児保健・人間発達研究所からのＧｒａｎｔ  Ｎｏ．  Ｒ４３ＨＤ０６０４５０およびＲ４４ＨＤ０６０４５０の下で、連邦政府によって、一部資金提供を受けたものである。したがって、連邦政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
本発明は、核酸分析、特に、ＧＣリッチな鋳型および産物のメチル化状態を決定するための方法に関する核酸分析の分野におけるものである。さらに、本発明は、本明細書中に記載される方法に従って使用され得るＧＣ参照標準（ＧＣ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ）に関する。
【背景技術】
【０００４】
ある特定の実施形態において、本明細書中に記載される方法は、ＧＣリッチな遺伝子座のメチル化状態を決定するために使用される。いくつかの状況では、ＧＣリッチ領域の伸長は、様々な疾患状態に関連する。ＣＧＧリピートの伸長に関連する遺伝子座の例は、Ｘ染色体上のＦｒａｇｉｌｅ  Ｘ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ−１遺伝子（ＦＭＲ１）の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）である。この領域が２００を超えるＣＧＧリピートに伸長することは、ＦＭＲ１遺伝子の過剰メチル化に関連し、「完全変異」対立遺伝子と呼ばれる。これらの対立遺伝子は、ＦＭＲ１タンパク質が産生されなくなること、および障害である脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）に関連する。ＦＸＳには、精神遅滞、自閉症、早発性卵巣機能不全ならびに他の認知性および行動性の状態が含まれ得る（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｄｉａｇ．１０（６）：４９６−５０１（２００８））。
【０００５】
ＧＣリッチ鋳型およびＦＭＲ１のメチル化状態を決定するための方法は、サザンブロット（ＳＢ）分析およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ストラテジーを含む。ＳＢ分析は、トリプレットリピート領域のサイズの大まかな程度およびメチル化の評価を提供する。メチル化された対立遺伝子とメチル化されていない対立遺伝子とを区別するために、メチル化部位を切断しないメチル化感受性酵素が使用され得る。しかしながら、ＳＢ分析によるメチル化状態の決定は、ゲル電気泳動によって十分に分離される対立遺伝子に限定される。ＳＢ分析は、必要とされるゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）材料の量によっても制限され、ハイスループット手順に適合しない面倒なワークフローである（Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．７（８）：５８４−５８７（２００５））。
【０００６】
ＰＣＲストラテジーは、トリプレットリピート領域のサイズを決定する際により高い精度を提供し得る。しかしながら、ＦＭＲ１  ５’ＵＴＲの完全変異対立遺伝子を含む長いＧＣリッチ配列の増幅における制約のせいで、リピート領域の定量化は制限される。例えば、ＦＭＲ１のＰＣＲに対する最適化が試みられており、それには、従来のＰＣＲアッセイ条件に対する改変が含まれる（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６（７）：６３３−８，（１９９６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．８：５４４−５５０，（２００６）；およびＡｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ．５１（４）：５２７−３４，（１９９４）を参照のこと）。より最近では、２００を超えるＣＧＧリピートの信頼性の高い増幅を可能にするＰＣＲ法が開発された。特許文献１（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。しかしながら、ＰＣＲだけでは、ＧＣリッチ鋳型のメチル化状態の特徴づけは不可能である。
【０００７】
いくつかのストラテジーが、メチル化を評価するための他の方法とＰＣＲとを組み合わせている。それらの方法の大部分が、メチル化状態を明らかにするために、亜硫酸水素塩変換に対する５−メチルシトシンの耐性を利用している。しかしながら、ＦＭＲ１の場合、例えば、亜硫酸水素塩に基づくメチル化ＰＣＲ法は、実際のところ、女性サンプルの解釈を混乱させる混合型のメチル化状態が原因で、男性サンプルの評価だけに限定されており、そして／またはそれらの方法は、伸長された対立遺伝子に対して限定的な有用性しか示していない（Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  １４：７１−７９，（１９９９）；Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５２：１４９２−１５００，（２００６）；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４１：１−８，（２００４）；およびＨｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０８：４５０−４５８，（２００１）を参照のこと）。メチル化感受性制限酵素の使用などの亜硫酸水素塩処理に対する代替法が報告されているが、女性サンプルの分析は、問題を抱えたままである（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｄｉａｇ．１０（６）：４９６−５０１，（２００８））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０２０９９７０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在までに、ＳＢ以外の単一のアプローチで、男性と女性の両方のサンプルにおいて、伸長された対立遺伝子に対して正確なメチル化の評価を示したものはない。ゆえに、ＧＣリッチな遺伝子座のメチル化およびリピート状態を特徴づけるために使用できる簡便なワークフローの迅速かつ正確なアッセイが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書中に記載される方法は、男性と女性の両方のサンプルにおけるＧＣリッチリピート長の範囲にわたってメチル化状態を検出および解明し得るＰＣＲベースの技術に関する。その全体的なワークフローは、日常的な試験およびハイスループットスクリーニングの用途に適用可能であり、ＳＢ分析を必要としない広範なＦＭＲ１分析の基礎を提供する。
【００１１】
１つの実施形態において、本方法は、ＤＮＡサンプル中のＦＭＲ遺伝子座を特徴づけることに関し、その方法は：
ａ）そのサンプルの第１部分をメチル化感受性ＤＮａｓｅと接触させる工程；
ｂ）そのサンプルにＧＣ参照標準を加える工程（ここで、その参照標準は、少なくとも７５％のＧＣ含量（ＧＣ−ｒｉｃｈｎｅｓｓ）を有する）；
ｃ）そのサンプルの第１部分および第２部分（各々がＧＣ参照標準を含む）をＤＮＡ増幅反応に供する工程（ここで、各部分において増幅されたＤＮＡは、異なる標識で標識される）；および
ｄ）そのサンプルの第１および第２部分からの増幅されたＤＮＡを分析することにより、そのＦＭＲ遺伝子座のメチル化状態を特徴づける工程
を包含する。
【００１２】
ある特定の実施形態において、工程（ｄ）は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を含む。さらなる実施形態において、第１および第２部分からの増幅されたＤＮＡは、単回のＣＥランにおいて分析される。いくつかの方法において、ＧＣ参照標準は、メチル化感受性ＤＮａｓｅについての認識部位を欠いている。ある特定の方法において、ＧＣ参照標準は、天然に存在するＦＭＲ対立遺伝子と重複しないＣＥ移動時間を有する。例えば、ＧＣ参照標準は、約２０未満、約２４〜２７または約３２超のＣＧＧリピートの相対保持時間を有し得る。さらなる例では、ＧＣ参照標準は、約１７５〜約２２５のＣＧＧリピートの相対保持時間を有する。いくつかの実施形態において、ＧＣ参照標準は、第１部分をＤＮａｓｅと接触させた後にサンプルに加えられる。
【００１３】
他の実施形態において、増幅反応は、少なくとも２００のＣＧＧリピートを増幅することができる。ある特定の増幅反応物は、約２．５〜約１０などの１を超えるＧＣ／ＡＴ比を有するｄＮＴＰ混合物を含む。ある特定の方法において、ＦＭＲ遺伝子座は、ＦＭＲ１である。いくつかの方法において、メチル化感受性ＤＮａｓｅは、ＨｐａＩＩ、ＥａｇＩまたはＮｒｕＩから選択される。
【００１４】
さらなる実施形態において、サンプルの第２部分は、コントロール酵素と接触させられる。いくつかの場合において、コントロール酵素は、ＥｃｏＲＩおよびＳａｕ３Ａ１から選択される。他の場合において、コントロール酵素は、ＥｃｏＲＩ、ＤｐｎＩ、ＮａｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦから選択される。
【００１５】
本明細書中に記載されるある特定の実施形態は、ヒトＤＮＡサンプルを分析する方法に関し、その方法は：
ａ）そのサンプルの第１部分をメチル化感受性ＤＮａｓｅと接触させる工程；
ｂ）そのサンプルにＧＣ参照標準を加える工程（ここで、その参照標準は、少なくとも７５％のＧＣ含量を有する）；
ｃ）そのサンプルの第１部分および第２部分をＤＮＡ増幅反応に供する工程（ここで、各部分において増幅されたＤＮＡは、異なる標識で標識される）；および
ｄ）そのサンプルの第１および第２部分からの増幅されたＤＮＡを分析することにより、ＦＸＳ、脆弱Ｘ関連振戦運動失調症候群および／または脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全に関連する遺伝子型を検出する工程
を包含する。
【００１６】
本明細書中に記載されるある特定の実施形態は、式：５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’の核酸配列を含むＧＣ参照標準に関し、ここで、Ａは、配列番号４０の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む配列であり、Ａは、ゲノムＦＭＲ１の５’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズすることができ；Ｃは、配列番号４１の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む配列であり、Ｃは、ゲノムＦＭＲ１の５’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズすることができ；Ｂは、少なくとも７５％のＧＣ含量を有する配列であり、Ｘ−３００ヌクレオチド長〜Ｘ＋１０ヌクレオチド長の長さである。Ｘは、ａ）Ａの３’末端〜配列番号４０の最後のヌクレオチドのヌクレオチド数；とｂ）配列番号４１の最初のヌクレオチドからＣの５’末端までのヌクレオチド数との合計である。
【００１７】
ある特定の実施形態において、Ｂは、１５０〜２００ヌクレオチド長である。さらなる実施形態において、Ｂは、少なくとも９０％のＧＣ含量を有する。さらなる実施形態において、Ｂは、少なくとも９４％のＧＣ含量を有する。１つの実施形態において、Ａは、ＧＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＧＴＴＴＣＧＧＴ（配列番号１７）を含む。追加の実施形態において、Ｃは、ＡＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＣＧ（配列番号３９）を含む。
【００１８】
前述の全般的な説明と以下の詳細な説明との両方が、単に例示的かつ説明的なものであって、特許請求されるような本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、メチル化感受性ＤＮａｓｅとしてＨｐａＩＩを使用する、ＧＣリッチ対立遺伝子のメチル化状態を決定するための手順のワークフローの例を提供している。
【図２】図２は、天然に存在するＦＭＲ１のＧＣリッチな遺伝子座と重複しない相対保持時間で移動するようにデザインされた、ＧＣ参照標準の例を示している。
【図３】図３Ａは、既知の割合のＦＭＲ１メチル化を有するメチル化されたＤＮＡ標準の電気泳動図を示している。各トレースは、細胞株ＤＮＡからの完全変異対立遺伝子（約６４５ＣＧＧ）のバックグラウンドにおけるＤＮＡ標準のプロファイルを含む。図３Ｂは、投入された既知のメチル化ＤＮＡ標準に対する、検出されたメチル化パーセントの線形の当てはめのプロットを示している。バックグラウンドの完全にメチル化された６４５ＣＧＧ対立遺伝子の定量化が重ね合わされている（平均値＝１０４±５％）。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｄは、該当するＳＢデータとともに、ｍＰＣＲに供された４つの細胞株サンプルのキャピラリー電気泳動図を示している。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｄは、該当するＳＢデータとともに、ｍＰＣＲに供された４つの細胞株サンプルのキャピラリー電気泳動図を示している。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｄは、該当するＳＢデータとともに、ｍＰＣＲに供された４つの細胞株サンプルのキャピラリー電気泳動図を示している。
【図４Ｄ】図４Ａ〜Ｄは、該当するＳＢデータとともに、ｍＰＣＲに供された４つの細胞株サンプルのキャピラリー電気泳動図を示している。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｄは、該当するＳＢデータとともに、完全変異対立遺伝子を有する４つの代表的な臨床サンプルのキャピラリー電気泳動図を示している。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｄは、該当するＳＢデータとともに、完全変異対立遺伝子を有する４つの代表的な臨床サンプルのキャピラリー電気泳動図を示している。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｄは、該当するＳＢデータとともに、完全変異対立遺伝子を有する４つの代表的な臨床サンプルのキャピラリー電気泳動図を示している。
【図５Ｄ】図５Ａ〜Ｄは、該当するＳＢデータとともに、完全変異対立遺伝子を有する４つの代表的な臨床サンプルのキャピラリー電気泳動図を示している。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｄは、該当するＳＢデータとともに、４つの代表的な女性の前変異（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）臨床サンプルのキャピラリー電気泳動図を示している。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｄは、該当するＳＢデータとともに、４つの代表的な女性の前変異（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）臨床サンプルのキャピラリー電気泳動図を示している。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｄは、該当するＳＢデータとともに、４つの代表的な女性の前変異（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）臨床サンプルのキャピラリー電気泳動図を示している。
【図６Ｄ】図６Ａ〜Ｄは、該当するＳＢデータとともに、４つの代表的な女性の前変異（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）臨床サンプルのキャピラリー電気泳動図を示している。
【図７】図７は、ＨＥＸとＦＡＭの両方のチャネルにおける、正常な３１ＣＧＧ対立遺伝子のバックグラウンドにおける１％質量分率の臨床上の完全変異対立遺伝子の検出（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を示している。
【図８】図８は、９０％質量分率の完全にメチル化されていない完全変異サンプル（♯１２５）のバックグラウンドにおける、１０％質量分率の完全にメチル化された完全変異サンプル（♯０８）の検出を示している。
【図９】図９は、ＥａｇＩまたはＨｐａＩＩを用いて分析された臨床サンプルの比較を示している。
【図１０】図１０は、ＧＣリッチな対立遺伝子のメチル化状態を決定するための代替手順のワークフローを示しており、消化コントロールおよびＣＧＧ  ＤＮＡコントロール（ＣＧＧ参照標準）をサンプルに加えた後にそのサンプルを２つの部分に分けて消化反応を行い、そのうちの１つにおいて、ＨｐａＩＩがメチル化感受性ＤＮａｓｅとして使用されている。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｄは、平行して行われたサザンブロット分析の比較データとともに、図１０の代替ワークフローに従ってｍＰＣＲアッセイに供された４つの細胞株ＤＮＡサンプルの代表的なキャピラリー電気泳動図を示している。ピークの下の四角には、生の保持時間（１行目）、ピーク同定（ｐｅａｋ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）（２行目）およびピーク強度（３行目）が提供されている。ピーク強度は、任意蛍光単位における最大蛍光（ピーク高さ）として表されている。ピーク同定の省略形は、以下のとおりである：ＤＩＧ．Ｃ＝消化コントロール；ＲＥＦ＝ＧＣ参照標準；ＦＭ＝完全変異対立遺伝子；ＰＭ＝前変異対立遺伝子；ＮＯＲ＝正常対立遺伝子。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｄは、平行して行われたサザンブロット分析の比較データとともに、図１０の代替ワークフローに従ってｍＰＣＲアッセイに供された４つの細胞株ＤＮＡサンプルの代表的なキャピラリー電気泳動図を示している。ピークの下の四角には、生の保持時間（１行目）、ピーク同定（ｐｅａｋ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）（２行目）およびピーク強度（３行目）が提供されている。ピーク強度は、任意蛍光単位における最大蛍光（ピーク高さ）として表されている。ピーク同定の省略形は、以下のとおりである：ＤＩＧ．Ｃ＝消化コントロール；ＲＥＦ＝ＧＣ参照標準；ＦＭ＝完全変異対立遺伝子；ＰＭ＝前変異対立遺伝子；ＮＯＲ＝正常対立遺伝子。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｄは、平行して行われたサザンブロット分析の比較データとともに、図１０の代替ワークフローに従ってｍＰＣＲアッセイに供された４つの細胞株ＤＮＡサンプルの代表的なキャピラリー電気泳動図を示している。ピークの下の四角には、生の保持時間（１行目）、ピーク同定（ｐｅａｋ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）（２行目）およびピーク強度（３行目）が提供されている。ピーク強度は、任意蛍光単位における最大蛍光（ピーク高さ）として表されている。ピーク同定の省略形は、以下のとおりである：ＤＩＧ．Ｃ＝消化コントロール；ＲＥＦ＝ＧＣ参照標準；ＦＭ＝完全変異対立遺伝子；ＰＭ＝前変異対立遺伝子；ＮＯＲ＝正常対立遺伝子。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜Ｄは、平行して行われたサザンブロット分析の比較データとともに、図１０の代替ワークフローに従ってｍＰＣＲアッセイに供された４つの細胞株ＤＮＡサンプルの代表的なキャピラリー電気泳動図を示している。ピークの下の四角には、生の保持時間（１行目）、ピーク同定（ｐｅａｋ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）（２行目）およびピーク強度（３行目）が提供されている。ピーク強度は、任意蛍光単位における最大蛍光（ピーク高さ）として表されている。ピーク同定の省略形は、以下のとおりである：ＤＩＧ．Ｃ＝消化コントロール；ＲＥＦ＝ＧＣ参照標準；ＦＭ＝完全変異対立遺伝子；ＰＭ＝前変異対立遺伝子；ＮＯＲ＝正常対立遺伝子。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｇは、平行して行われたサザンブロット分析の比較データとともに、図１０の代替ワークフローに従ってｍＰＣＲアッセイに供された７つの臨床検体の代表的なキャピラリー電気泳動図を示している。ピークの下の四角は、図１１Ａ〜Ｄにおけるような情報を提供している。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜Ｇは、平行して行われたサザンブロット分析の比較データとともに、図１０の代替ワークフローに従ってｍＰＣＲアッセイに供された７つの臨床検体の代表的なキャピラリー電気泳動図を示している。ピークの下の四角は、図１１Ａ〜Ｄにおけるような情報を提供している。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜Ｇは、平行して行われたサザンブロット分析の比較データとともに、図１０の代替ワークフローに従ってｍＰＣＲアッセイに供された７つの臨床検体の代表的なキャピラリー電気泳動図を示している。ピークの下の四角は、図１１Ａ〜Ｄにおけるような情報を提供している。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜Ｇは、平行して行われたサザンブロット分析の比較データとともに、図１０の代替ワークフローに従ってｍＰＣＲアッセイに供された７つの臨床検体の代表的なキャピラリー電気泳動図を示している。ピークの下の四角は、図１１Ａ〜Ｄにおけるような情報を提供している。
【図１２Ｅ】図１２Ａ〜Ｇは、平行して行われたサザンブロット分析の比較データとともに、図１０の代替ワークフローに従ってｍＰＣＲアッセイに供された７つの臨床検体の代表的なキャピラリー電気泳動図を示している。ピークの下の四角は、図１１Ａ〜Ｄにおけるような情報を提供している。
【図１２Ｆ】図１２Ａ〜Ｇは、平行して行われたサザンブロット分析の比較データとともに、図１０の代替ワークフローに従ってｍＰＣＲアッセイに供された７つの臨床検体の代表的なキャピラリー電気泳動図を示している。ピークの下の四角は、図１１Ａ〜Ｄにおけるような情報を提供している。
【図１２Ｇ】図１２Ａ〜Ｇは、平行して行われたサザンブロット分析の比較データとともに、図１０の代替ワークフローに従ってｍＰＣＲアッセイに供された７つの臨床検体の代表的なキャピラリー電気泳動図を示している。ピークの下の四角は、図１１Ａ〜Ｄにおけるような情報を提供している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
例示的な実施形態
ある特定の態様において、本発明は、ＧＣリッチな核酸鋳型のメチル化状態を特徴づけるための方法を提供する。例示的な実施形態において、その方法は、ＧＣ参照標準の存在下におけるＰＣＲと組み合わせたメチル化感受性ＤＮａｓｅによる処理を含む。本明細書中に記載される方法は、「ｍＰＣＲ」法と呼ばれることがある。
【００２１】
本発明の理解を助けるために、まず、ある特定の用語を定義する。追加の定義は、本願全体を通して提供される。
【００２２】
「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」との語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において用語「含む」とともに使用されるとき、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」および「１つまたは１つより多い」の意味とも一致する。
【００２３】
「ＧＣ／ＡＴ比」は、所与の溶液または混合物における、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびそれらのすべてのヌクレオチドアナログの合計の濃度対、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰおよびそれらのすべてのヌクレオチドアナログの合計の濃度の比のことを意味する。
【００２４】
「ｄＮＴＰ」は、デオキシヌクレオチド三リン酸を表し、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰおよびそれらのアナログのことを指す。
【００２５】
「ヌクレオチドアナログ」は、天然の塩基であるアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）以外の塩基部分、デオキシリボースと同一もしくは類似の糖部分、および少なくとも１つのリン酸もしくは複数のリン酸（例えば、二リン酸または三リン酸）部分を含む、分子またはイオンである。ヌクレオチドアナログは、三リン酸および糖部分（その両方の構造および配置が、ポリメラーゼによって核酸の二重らせんに組み込まれるのに適している）、ならびに塩基（核酸の二重らせんにおけるその塩基対形成特性、および核酸の二重らせんにおけるＤＮＡポリメラーゼによって組み込まれる遺伝子座におけるその塩基対形成特性が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰのうちの１つに最も類似している）を含むとき、ｄＴＴＰのアナログが一般にｄＵＴＰのアナログでもあり、その逆もまた同じであることを除いて、特定のヌクレオチド、特に、先に列挙された５つのヌクレオチドのアナログである。
【００２６】
「ＧＣ含量」は、ある核酸中の、グアニン残基、シトシン残基またはそれらのアナログである全核酸塩基残基の割合またはパーセンテージである。例えば、厳密に３０個のシトシン、厳密に３０個のグアニン、厳密に１つのシトシンアナログおよび厳密に１つのグアニンアナログを含む１００ｎｔ核酸は、６２％というＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態において、ＧＣリッチ鋳型は、少なくとも５１、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％のグアニン残基、シトシン残基またはそれらのアナログを含み得る。
【００２７】
Ｉ．メチル化状態を特徴づける方法
ある特定の実施形態において、本発明は、ＧＣリッチな核酸鋳型のメチル化状態を特徴づける方法に関する。概して、その方法は、サンプルの第１部分をメチル化感受性ＤＮａｓｅと接触させる工程、そのサンプルにＧＣ参照標準を加える工程、そのサンプルの第１部分および第２部分を核酸増幅反応に供する工程、ならびにそのサンプルの第１および第２部分からの増幅された核酸を分析する工程を包含する。いくつかの実施形態において、第１部分および第２部分は、異なって標識される。
【００２８】
さらなる実施形態において、第２部分は、増幅前にコントロール酵素と接触させられる（ここで、そのコントロール酵素は、増幅された配列を切断しない）。そのコントロール酵素は、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＤｐｎＩ、ＮａｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦから選択され得る。さらに可能性のあるものとしては、Ｓａｕ３Ａ、ＮｈｅＩ、ＴｆｉＩ、ＡｐａＬＩ、ＭｌｕＣＩ、ＮｃｏＩ、ＳｃａＩ、ＳｔｕＩ、ＸｍｎＩおよびＨｐｙ１６６１１が挙げられる。いくつかの実施形態において、コントロール酵素は、ＤＮＡ増幅反応によって増幅される領域内に存在しない認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼから選択される。いくつかの実施形態において、コントロール酵素は、ＤＮＡ増幅反応によって増幅される領域内の非標的部位において、非特異的切断（スター活性）を（たとえあったとしても）ほとんど示さない酵素から選択される（例えば、ＤＮＡ増幅反応によって増幅される領域内において、２０％、１５％、１０％、５％、３％または１％未満の非標的部位の切断）。切断の程度は、ＤＮＡ増幅反応によって増幅される領域内で少なくとも１つの切断事象を起こす分子の割合について表される。
【００２９】
さらなる実施形態において、第１および第２部分の分析は、単一のアッセイで行われる。
【００３０】
図１および１０は、本発明の方法に従った例示的なアッセイの概略を表している図を示している。
【００３１】
ある特定の実施形態において、本明細書中に記載される方法は、ＦＸＳ、脆弱Ｘ関連振戦運動失調症候群および脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全に関連する遺伝子型を検出するために使用され得る。これらの状態に関連する遺伝子座は、当該分野で公知であり、それらとしては、ＦＭＲ１、ＦＭＲ２、ＦＭＲ１の５’ＵＴＲ、ＦＭＲ２の５’ＵＴＲ、ＦＭＲ１の５’ＵＴＲ内のＣＧＧリピートおよびＦＭＲ２の５’ＵＴＲ内のＣＣＧリピートが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用されるとき、用語「ＦＭＲ遺伝子座」とは、ＦＭＲ１遺伝子座またはＦＭＲ２遺伝子座のことを指す。追加の実施形態において、本方法は、ＧＣリッチトリヌクレオチドリピート障害（例えば、ＦＸＳ、脆弱Ｘ関連振戦運動失調症候群および脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全、筋緊張性ジストロフィ、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症ならびに／または脊髄小脳失調）に関連する遺伝子型を検出するために使用され得る。これらの状態に関連する遺伝子座は、当該分野で公知であり、それらとしては、ＦＭＲ１、ＦＭＲ２、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＨＴＴ、ＡＲ、ＡＴＮ１、ＡＴＸＮ１−３、ＡＴＸＮ７、ＡＴＸＮ１０、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＳＣＡ８、ＰＰＰ２Ｒ２ＢおよびＴＢＰが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９６  Ｍａｙ；１３（１）：１０５−８；Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９６  Ｍａｙ；１３（１）：１０９−１３を参照のこと。これらの遺伝子座におけるＧＣリッチ領域の過剰伸長（Ｈｙｐｅｒｅｘｐａｎｓｉｏｎ）および／または過剰メチル化は、それらの疾患に関連している。
【００３２】
Ａ．ＧＣ参照標準
いくつかの態様において、本発明は、本明細書中に記載される方法に従って使用され得るＧＣ参照標準に関する。本明細書中に記載される方法のＧＣ参照標準は、外部参照標準であり、ＦＭＲ遺伝子座と共に増幅されるようにデザインされる。いくつかの実施形態において、ＧＣ参照標準は、ＦＭＲ１遺伝子付近に存在するＧＣリッチな遺伝子座などの遺伝子座に存在するＣＧＧリピートの数を評価するために使用され得る。例示的な実施形態において、ＧＣ参照標準は、ＣＥによる所望の相対保持時間を有するようにデザインされる。
【００３３】
本明細書中で使用されるとき、用語「相対保持時間」とは、所与の長さおよび／またはＧＣ含量の他の増幅産物の移動時間と比較したときの、ＧＣ参照標準から増幅された産物がＣＥにおいてキャピラリーを通って移動するのに要する時間の長さのことを指す。ある特定の実施形態において、ＧＣ参照標準の相対保持時間は、既知の数のＣＧＧリピートを含む配列と比較される。いくつかの場合において、ＧＣ参照標準は、ヒト被験体のＦＭＲ１遺伝子座におけるＣＧＧリピートの数を決定するために使用される。ある特定の実施形態において、ＧＣ参照標準の相対保持時間は、増幅のために同じプライマーを用いる遺伝子座と比較される。いくつかの実施形態において、ＧＣ参照標準は、ＣＥアッセイにおいて、天然に存在するＦＭＲ１対立遺伝子と重複しないような相対保持時間を有する。例えば、ＦＭＲ１遺伝子座におけるＣＧＧリピートのメチル化状態および数を決定するアッセイにおいて、ＣＧＧリピートを含む天然に存在するゲノム対立遺伝子と比較される、０のＣＧＧリピートの相対保持時間を有するＧＣ参照標準が、含められ得る。別の実施形態は、約４０のＣＧＧリピートの相対保持時間を有するＧＣ参照標準を含む。さらなる実施形態において、ＧＣ参照標準は、ゲノムサンプルと比較される、約２０未満、約２４〜約２７または約３２超のＣＧＧリピートの相対保持時間を有する。
【００３４】
例示的なＧＣ参照標準は、以下の式：
５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’
を有する配列を含み、
ここで、ＡおよびＣは、順方向および逆方向ＰＣＲプライマーによって認識される配列であり、Ｂは、ＧＣリッチ配列である。一般に、ＧＣ参照標準は、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９パーセントのＧＣ含量を有する。配列Ａは、ＧＣリッチ領域またはＣＧＧリピート領域の上流のゲノム配列から選択され得、配列Ｃは、そのような領域の下流のゲノム配列から選択され得る。増幅反応中、これらの配列またはその相補体は、プライマー認識部位として使用され得、参照標準は、標的配列と同じプライマーを用いて増幅される。
【００３５】
ある特定の実施形態において、配列ＡおよびＣは、それぞれＧＣリッチ領域の上流および下流のＦＭＲ１  ５’−ＵＴＲから選択される。ＡおよびＣまたはそれらの相補体の配列は、増幅反応用のプライマーとして使用され得る。配列Ａの例としては：
【００３６】
【化１】
2013540452.tif 000003
【００３７】
が挙げられる。
【００３８】
配列Ｃの例としては：
【００３９】
【化２】
2013540452.tif 000004
【００４０】
が挙げられる。
【００４１】
配列番号４０および４１は、ＣＧＧリピート領域の上流および下流のＦＭＲ１配列を示している。ある特定の実施形態において、配列Ａは、配列番号４０の少なくとも１０個のヌクレオチドを含み、配列Ｃは、配列番号４１の少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。
【００４２】
配列Ｂは、ＧＣリッチ配列であり、ＣＥ分析において参照標準が特定の相対保持時間を有するような長さを有し得る。その保持時間は、規定の長さおよびＧＣ特徴を有する既知の標準に対して測定され得る。例えば、配列Ｂの長さは、参照標準が、ゲノムサンプルと比較される、約２０未満、約２４〜約２７または約３２超のＣＧＧリピートの相対保持時間を有するように選択され得る。配列Ｂの長さは、参照標準が、０未満または約０のＣＧＧの相対保持時間を有するように選択され得る。ある特定の例において、参照標準は、約−１００、−９０、−８０、−７０、−６０、−５０、−４０、−３０、−２０、−１０または０のＣＧＧリピートの相対保持時間を有する。いくつかの実施形態において、ＧＣ参照標準は、３、２、１、０、−１、−２、−３、−４、−５、−１０、−１５または−２０以下のＣＧＧリピートの相対保持時間を有する。参照標準の相対保持時間は、プライマーのピークまたは天然に存在するＦＭＲ１対立遺伝子と重複しないように選択され得る。ＧＣ参照標準の相対保持時間はまた、消化コントロール（下記で論じられる）が使用されるとき、その消化コントロールと重複しないようにも選択され得る。
【００４３】
ＧＣ参照標準は、例えば、その参照標準が、ゲノムサンプルから増幅された産物よりも短いＧＣリッチ領域周辺の隣接配列を有するとき、負の相対保持時間を有し得る。したがって、ＧＣ参照標準は、実際には、正の数のＣＧＧリピートを含むが、隣接配列の含有量の差に起因して、負の数のＣＧＧリピートを有する仮定上のゲノムサンプルと等価な保持時間を有し得る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、Ｂの長さは、Ｘ−３００からＸ＋１０のヌクレオチド長であり、ここで、Ｘは：
ａ）配列Ａの３’末端とＧＣリッチ領域の始まりとの間のヌクレオチド数；と
ｂ）ＧＣリッチ領域の終わりと配列Ｃの５’末端との間のヌクレオチド数
との合計である。
【００４５】
いくつかの実施形態において、Ｂは、配列
【００４６】
【化３】
2013540452.tif 000005
【００４７】
を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、Ｂは、配列番号４８の少なくとも５０、７５、１００または１２５ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｂは、配列
【００４８】
【化４】
2013540452.tif 000006
【００４９】
を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、Ｂは、配列番号４９の少なくとも５０、７５、１００または１２５ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｂは、ストリンジェントな条件下において配列番号４８または配列番号４９とハイブリダイズする配列を含むかまたはそれからなる。
【００５０】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウムである）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃におけるハイブリダイゼーションに続く、０．１×ＳＳＣを含む溶液中での６５℃における洗浄である。
【００５１】
図２は、ＦＭＲ１のＧＣリッチな遺伝子座の天然に存在する配列と重複しない相対保持時間を有するＧＣ参照標準の例を示している。
【００５２】
ある特定の実施形態において、ＧＣ参照標準は、プラスミド内または他のベクター内に含まれている。そのプラスミドまたは他のベクターは、例えば、制限酵素を用いた消化によって、線形化されてもよいし、インタクトなままであってもよい。１つの実施形態において、プラスミドは、ｐＢＲ３２２である。ＧＣ参照標準が、プラスミドなどのより長いＤＮＡ分子の一部としてサンプルまたはサンプルの一部に加えられるとき、増幅反応は、必ずしもそのより大きなＤＮＡ分子のすべての部分を増幅せず（例えば、増幅されない可能性のある配列としては、プラスミド複製起点、抗生物質耐性マーカー、介在する非コード配列などが挙げられ得る）、本開示の場合、ＧＣ参照標準を含む分子内のそのような増幅されない配列は、ＧＣ参照標準の相対保持時間またはＧＣ含量を決定する際に考慮されない。
【００５３】
ＧＣ参照標準は、メチル化感受性ＤＮａｓｅによる処理の前または後に核酸サンプルに加えられ得る。メチル化感受性ＤＮａｓｅによる処理の前にＧＣ参照を加えることは、そうでなければＧＣ参照標準をサンプルの２つの部分（そのうちの１つは、メチル化感受性ＤＮａｓｅで処理され、もう１つは処理されない）にピペットで加えることに起因し得る誤差を減少させ得る。つまり、ＧＣ参照が、メチル化感受性ＤＮａｓｅで処理する前にサンプルに加えられるとき、そのＧＣ参照は、サンプルを２つの部分に分ける前にサンプルに加えられ得る。ＧＣ参照標準がメチル化感受性ＤＮａｓｅまたはコントロール酵素の前にサンプルに加えられる実施形態において、そのＧＣ参照標準は、そのＤＮａｓｅによって切断されず、例えば、そのＧＣ参照標準は、そのＤＮａｓｅについての認識部位を欠いている可能性があり、かつ／またはメチル化感受性ＤＮａｓｅによる切断に耐性であるようにメチル化されている可能性がある。ＧＣ参照標準が、メチル化感受性ＤＮａｓｅでサンプルの部分を処理した後にそのサンプルに加えられるとき、そのＧＣ参照標準は、そのサンプルの第１および第２部分に加えられる。サンプルに加えられるＧＣ参照標準の量は、増幅反応のタイプおよび増幅の程度（例えば、サイクル数または等温インキュベーションの長さ）に応じて変動し得る。例えば、増幅反応としてＰＣＲを用いるいくつかの実施形態において、約７５０〜約１２，０００コピーのＧＣ参照標準が、各ＰＣＲ反応のために加えられ得る。
【００５４】
Ｂ．消化コントロール
本明細書中に記載される方法は、消化コントロールの使用を含み得る。その消化コントロールは、サンプルＤＮＡ中の、ＦＭＲ遺伝子座などの領域と共に増幅されるようにデザインされる。その消化コントロールは、メチル化されておらず、メチル化感受性ＤＮａｓｅに対する少なくとも１つの認識部位を含み、ゆえに、そのメチル化感受性ＤＮａｓｅで処理されると切断される。結果として、このコントロール鋳型は、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化の有効性を報告する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、消化コントロールは、ＣＥ分析において特定の相対保持時間を有するような構造および長さを有する。増幅反応がＰＣＲを含む実施形態では、ゲノム標的遺伝子座および消化コントロールを増幅するために、同じプライマーが使用され得る。メチル化感受性ＤＮａｓｅによる消化から生じる消化コントロールのフラグメントは、消化コントロールの増幅を支持しない。いくつかの実施形態において、消化コントロールは、ゲノムサンプルと比較される、約２０未満、約２４〜約２７または約３２超のＣＧＧリピートの相対保持時間を有する。ある特定の例において、消化コントロールは、約−１００、−９０、−８０、−７０、−６０、−５０、−４０、−３０、−２０、−１０または０のＣＧＧリピートの相対保持時間を有する。いくつかの実施形態において、消化コントロールは、３、２、１、０、−１、−２、−３、−４、−５、−１０、−１５または−２０以下のＣＧＧリピートの相対保持時間を有する。消化コントロールの相対保持時間は、プライマーのピークまたは天然に存在するＦＭＲ１対立遺伝子と重複しないように選択され得る。消化コントロールの相対保持時間はまた、ＧＣ参照標準と重複しないようにも選択され得る。
【００５６】
ある特定の実施形態において、消化コントロールは、プラスミド内または他のベクター内に含まれている。そのプラスミドまたは他のベクターは、例えば、制限酵素を用いた消化によって、線形化されてもよいし、インタクトなままであってもよい。１つの実施形態において、プラスミドは、ｐＢＲ３２２である。消化コントロールが、プラスミドなどのより長いＤＮＡ分子の一部としてサンプルまたはサンプルの一部に加えられるとき、増幅反応は、必ずしもそのより大きなＤＮＡ分子のすべての部分を増幅せず（例えば、増幅されない可能性のある配列としては、プラスミド複製起点、抗生物質耐性マーカー、介在する非コード配列などが挙げられ得る）、本開示の場合、消化コントロールを含む分子内のそのような増幅されない配列は、消化コントロールの相対保持時間またはＧＣ含量を決定する際に考慮されない。
【００５７】
いくつかの実施形態において、消化コントロールは、配列
【００５８】
【化５】
2013540452.tif 000007
【００５９】
を含むかまたはそれからなる。下線の部分は、得られるアンプリコンのサイズを改変するために調整され得る隣接配列の例である。いくつかの実施形態において、消化コントロールは、配列番号５０の少なくとも１００、１５０、１７５、２００または２２０ヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、消化コントロールは、ストリンジェントな条件下において配列番号５０にハイブリダイズする配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、消化コントロールは、消化コントロールが上で論じられたような相対保持時間を有するように、より多いかまたは少ない数のＣＧＧリピートを有する点で改変された配列番号５０のバージョンである配列を含むかまたはそれからなる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、消化コントロールおよび参照標準の相対保持時間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のＣＧＧリピート相当分だけ異なる。ＧＣリッチな増幅反応では、鋳型またはプライマーのスリッピング（ｓｌｉｐｐｉｎｇ）が生じ得、元の標的と約１〜３個のＣＧＧリピートだけ長さが異なる産物がもたらされ得る。したがって、特定の実施形態において、消化コントロールおよび参照標準の相対保持時間は、シグナルの重複を最小にするために４またはそれ以上のＣＧＧリピート相当分だけ異なる。いくつかの実施形態において、消化コントロールと参照標準の両方が、３、２、１、０、−１、−２、−３、−４、−５、−１０または−１５以下のＣＧＧリピートの相対保持時間を有する。いくつかの実施形態において、消化コントロールは、上に記載されたようなＡ、ＢおよびＣ配列を含む、ＧＣ参照標準のいくつかの実施形態について上記のＩ．Ａの項に記載された一般的な１次構造を有する。消化コントロールとＧＣ参照標準の両方が、上に記載されたようなＡ、ＢおよびＣ配列を含むとき、その消化コントロールにおけるＡ、ＢまたはＣセグメントの少なくとも１つは、ＧＣ参照標準中のその対応物と長さが異なり得、その消化コントロールは、参照標準の長さと少なくとも１、２、３、４、５またはそれ以上のＣＧＧリピートの相当分だけ異なる長さである。消化コントロールは、なおも、メチル化感受性ヌクレアーゼによる消化に対して適切なメチル化状態（その状態は、参照標準のメチル化状態の反対であり得る）を有する。
【００６１】
サンプルに加えられる消化コントロールの量は、増幅反応のタイプおよび増幅の程度（例えば、サイクル数または等温インキュベーションの長さ）に応じて変動し得る。例えば、増幅反応としてＰＣＲを用いるいくつかの実施形態において、約７５０〜約１２，０００コピーの消化コントロールが、各ＰＣＲ反応のために加えられ得る。
【００６２】
Ｃ．メチル化感受性ヌクレアーゼ
本明細書中に記載される方法は、メチル化感受性ヌクレアーゼの使用を含み得る。いくつかの場合において、そのヌクレアーゼは、制限酵素などのＤＮａｓｅである。本明細書中に提供される方法のメチル化感受性ヌクレアーゼは、そのメチル化状態に基づいて、増幅されたＦＭＲ遺伝子座の一部を異なって切断する。コントロールヌクレアーゼは、その部分を切断しない。
【００６３】
メチル化感受性ＤＮａｓｅとしては、
【００６４】
【化６】
2013540452.tif 000008
【００６５】
が挙げられる。
【００６６】
ある特定の実施形態において、メチル化感受性ＤＮａｓｅは、ＨｐａＩ、ＮｒｕＩ、ＥａｇＩ、ＢｓｓＨＩＩおよびＨｈａＩから選択される。ある特定の実施形態において、メチル化感受性ＤＮａｓｅは、ＨｐａＩＩである。
【００６７】
選択されるメチル化感受性ＤＮａｓｅについての認識部位を下記に示す：
【００６８】
【数１−１】
2013540452.tif 000009
【００６９】
【数１−２】
2013540452.tif 000010
【００７０】
【数１−３】
2013540452.tif 000011
【００７１】
【数１−４】
2013540452.tif 000012
【００７２】
【数１−５】
2013540452.tif 000013
【００７３】
ある特定の実施形態において、サンプルの第１部分は、メチル化感受性ヌクレアーゼで処理され、一方、第２部分は、コントロールヌクレアーゼで処理される。そのコントロールヌクレアーゼは、増幅された遺伝子座を切断しない制限酵素であり得る。そのコントロールヌクレアーゼは、非メチル化感受性ヌクレアーゼであり得る。多くの制限酵素およびそれらの特異性は、当該分野で周知である。記載される方法において使用され得るコントロールヌクレアーゼの例としては、とりわけ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ、ＤｐｎＩ、ＮａｅＩ、ＥｃｏＲＩまたはＳａｕ３Ａ１が挙げられる。コントロールヌクレアーゼは、上記のＩの項の最初の部分で詳細に論じられている。
【００７４】
Ｄ．増幅方法
本発明の方法は、核酸増幅も含む。核酸配列を増幅するための方法は数多く存在し、それらとしては、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応、多重連結可能（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｌｉｇａｔａｂｌｅ）プローブ増幅、インベーダー技術（ｉｎｖａｄｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ）、ローリングサークル増幅、インビトロ転写、鎖置換増幅、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ＲＮＡ（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）増幅、ループ媒介性等温増幅および当業者に公知の他の方法が挙げられる。いくつかの実施形態において、それらの方法は、下流の分析のために非連結状の増幅産物を提供するために、ローリングサークル増幅またはループ媒介性等温増幅などの増幅反応によって生成された連結状の増幅産物を、例えば、増幅鋳型または組み込まれるプライマーに存在する認識部位のエンドヌクレアーゼ的切断によって、プロセシングする工程をさらに包含する。
【００７５】
代表的なＰＣＲ反応は、標的核酸種を選択的に増幅する複数の増幅工程またはサイクルを含む。代表的なＰＣＲ反応は、３つの工程：標的核酸を変性する変性工程；ＰＣＲプライマーのセット（順方向および逆方向プライマー）が相補ＤＮＡ鎖にアニールするアニーリング工程；および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長する伸長工程を含む。これらの工程を複数回繰り返すことによって、ＤＮＡフラグメントが増幅されて、標的ＤＮＡ配列に対応するアンプリコンが生成される。代表的なＰＣＲ反応は、変性、アニーリングおよび伸長の２０以上のサイクルを含む。サイクルが２工程だけを含む多くの場合において、アニーリング工程および伸長工程は、同時に行われ得る。
【００７６】
ある特定の方法において、プライマーのセットは、各標的配列に対して使用される。いくつかの実施形態において、単一のプライマーセットが、ＧＣ参照標準と標的核酸の両方を増幅し得る。ある特定の実施形態において、プライマーの長さは、多くの因子に左右され、その因子としては、プライマー間の所望のハイブリダイゼーション温度、標的核酸配列、および増幅される種々の標的核酸配列の複雑さが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態において、プライマーは、約１５〜約３５ヌクレオチド長である。他の実施形態において、プライマーは、１５、２０、２５、３０または３５ヌクレオチド長以下である。さらなる実施形態において、プライマーは、３５ヌクレオチド長より長い。いくつかの実施形態において、プライマーセットは、配列番号４０にハイブリダイズする１つのプライマー、および配列番号４１にハイブリダイズする第２のプライマーを含む。プライマーは、配列番号４０に示されている少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含み得るか、またはプライマーは、配列番号４１の示されている鎖に対して相補的な少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含み得る。
【００７７】
ある特定の実施形態において、本方法は、少なくとも１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００またはそれ以上のＣＧＧリピートを増幅することができるＰＣＲ反応を含む。大きなＧＣリッチ鋳型を増幅することができる例示的な方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２０９９７０号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００７８】
ＰＣＲ反応は、１より大きいＧＣ／ＡＴ比で、かつＧＣリッチ鋳型を用いてＤＮＡの合成をもたらす全ｄＮＴＰ濃度で、ｄＮＴＰを提供する工程を包含し得る。そのＧＣ／ＡＴ比は、約１．１、１．２、１．４、１．６、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５またはそれ以上であり得る。そのＧＣ／ＡＴ比は、１．１〜２０、１．１〜１５、１．１〜１０、１．１〜８、１．１〜７、１．１〜６、１．１〜５、１．２〜２５、１．４〜２５、１．６〜２５、２〜２５、３〜２５、４〜２５、５〜２５、２〜１５、２．５〜１０または４〜１０であり得る。全ｄＮＴＰ濃度は、約０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．２、１．５、２または３ｍＭであり得る。ｄＮＴＰ濃度は、０．４〜３ｍＭ、０．５〜３ｍＭ、０．６〜３ｍＭ、０．７〜３ｍＭ、０．８〜３ｍＭ、０．９〜３ｍＭ、１〜３ｍＭ、０．４〜２ｍＭ、０．４〜１．５ｍＭ、０．４〜１．２ｍＭ、０．４〜１ｍＭ、０．４〜０．９ｍＭ、０．４〜０．８ｍＭ、０．４〜０．７ｍＭ、０．５〜２ｍＭ、０．５〜１ｍＭまたは０．６〜０．９ｍＭであり得る。
【００７９】
ＰＣＲ反応において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、野生型のもの、改変されたもの、好熱性のもの、キメラのもの、操作されたもの、および／または２つ以上のポリメラーゼの混合物を含み得る。そのＤＮＡポリメラーゼは、
【００８０】
【化７】
2013540452.tif 000014
【００８１】
【化８】
2013540452.tif 000015
【００８２】
【化９】
2013540452.tif 000016
【００８３】
由来の天然に存在するＤＮＡポリメラーゼを含み得る。
【００８４】
例示的な実施形態において、増幅される核酸は、増幅反応中に標識される。ある特定の場合において、メチル化感受性ＤＮａｓｅで処理されたサンプルの部分が、第１の標識で標識され、そのサンプルのコントロール部分が、第２の標識で標識される。いくつかの実施形態において、各標識は、ＣＥによって検出可能である。
【００８５】
標識としては：検出可能な蛍光、化学発光または生物発光シグナルを発生するかまたはクエンチする、発光性、光散乱性および光吸収性の化合物が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９２）およびＧａｒｍａｎ  Ａ．，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照のこと）。標識として有用な蛍光レポーター色素としては、フルオレセイン（例えば、米国特許第５，１８８，９３４号、同第６，００８，３７９号および同第６，０２０，４８１号を参照のこと）、ローダミン（例えば、米国特許第５，３６６，８６０号、同第５，８４７，１６２号、同第５，９３６，０８７号、同第６，０５１，７１９号および同第６，１９１，２７８号を参照のこと）、ベンゾフェノキサジン（例えば、米国特許第６，１４０，５００号を参照のこと）、ドナーおよびアクセプターの対を含むエネルギー移動蛍光色素（例えば、米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；および同第５，９４５，５２６号を参照のこと）、およびシアニン（例えば、ＷＯ９７４５５３９を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。フルオレセイン色素の例としては、６−カルボキシフルオレセイン；２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン；および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセインが挙げられるが、これらに限定されない。シアニン色素の例としては、ＷｅｌｌＲｅｄ（登録商標）赤外色素Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３またはＤ４が挙げられる。追加の標識は、リサミン、フィコエリトリン、
【００８６】
【化１０】
2013540452.tif 000017
【００８７】
ならびに別の標識とは異なる検出可能な色素シグナルを発生することができる他の任意の蛍光部分から得てもよい。フルオレセイン色素の例としては、６−カルボキシフルオレセイン；２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン；および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセインが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の態様において、蛍光標識は、ＣＥ分析と適合性である、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ、６−カルボキシフルオレセイン（「ＦＡＭ」）、ＴＥＴ、ＮＥＤ、ＲＯＸ、ＶＩＣ（商標）またはＪＯＥから選択される。例えば、ある特定の実施形態において、標識は、スペクトル的に分解可能な異なる波長で発光することができる種々のフルオロフォア（例えば、４つの異なる色のフルオロフォア）であり；ある特定のそのように標識されたプローブは、当該分野で公知であり、上記および米国特許第６，１４０，０５４号に記載されている。レポーターフルオロフォアおよびクエンチャーフルオロフォアを含む二重標識された蛍光プローブが、いくつかの実施形態において使用される。他の例としては、一般的な色素に対する商業的に入手可能な代用物であるＦｒｅｅｄｏｍ（登録商標）色素が挙げられ得る。容易に区別され得るように、異なる発光スペクトルを有するフルオロフォアの対が選択されることが認識されるだろう。
【００８８】
なおもさらなる態様において、標識は、二重鎖のハイブリダイゼーションを増強するか、安定化するかまたはそれに影響するように働くハイブリダイゼーション安定化部分、例えば、インターカレーターおよびインターカレート色素（エチジウムブロマイドおよびＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎを含むがこれらに限定されない）、副溝結合剤および架橋官能基である（例えば、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら編“ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）を参照のこと）。
【００８９】
単一アッセイにおいて２つ以上の標識を用いる状況では、異なる発光スペクトルを有する標識が容易に区別され得るように選択されることが認識されるだろう。いくつかの例では、ＦＡＭおよびＨＥＸ標識が、サンプルの第１部分および第２部分を標識するために使用され得る。さらなる実施形態において、ＦＡＭまたはＨＥＸは、本明細書中に記載される方法において、とりわけＮＥＤまたはＲＯＸ標識とともに使用され得る。
【００９０】
Ｅ．分析方法
いくつかの実施形態において、増幅された核酸は、メチル化状態を決定するために分析される。例示的な実施形態において、その分析方法は、当業者によく知られた装置（例えば、ＡＢＩ３１００、３１３０、３７３０または３５００モデル）を用いるキャピラリー電気泳動（ＣＥ）である。他の実行には、ＤＮＡの電気泳動によるサイジングおよび多色分解が可能な任意の装置が含まれる。例えば、ＷｅｌｌＲｅｄ赤外色素（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４）の検出用のＢｅｃｋｍａｎ  ＶｉｄｉｅｒａもしくはＳＥＱ６０００キャピラリー電気泳動システム、またはＩＲＤｙｅｓを組み込んでいるＬｉ−Ｃｏｒ装置も使用され得る。使用され得る他の方法としては、マイクロ流体ＣＥシステム（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよび同様のプラットフォーム）、質量分析、アガロースゲル電気泳動に続くスキャンデンシトメトリー、およびｐｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒまたはオートラジオグラフのスキャンデンシトメトリーを用いた放射標識産物の分析が挙げられる。さらなる実施形態において、サンプルの第１および第２部分からの増幅された核酸は、単一のＣＥアッセイにおいて分析される。
【００９１】
ＣＥなどのある特定の分析方法は、鋳型に存在するメチル化状態とＣＧＧリピート数の同時の特徴づけを可能にする。ある特定の実施形態において、ＣＥ分析は、３６または５０ｃｍカラムとともにＰＯＰ−４、５、６または７液体ポリマーを用いて行われる。１つの実施形態において、その液体ポリマーは、ＰＯＰ−７である。
【００９２】
ある特定の実施形態において、メチル化のパーセンテージが計算され得る。ＣＥ電気泳動図、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒスキャン、デンシトメトリースキャン、質量スペクトルまたは他の形態のデータにおいて観察されるピークの強度は、当該分野で公知の好適な方法、例えば、ピーク高さ、曲線下面積（積分）またはカーブフィッティングなどの方法に従って決定され得る。次いで、コントロールとして処理されたサンプルの一部およびメチル化感受性ＤＮａｓｅによる消化に供されたサンプルの一部からの対応するピークのピーク強度の値が、比較され得；それらのピーク強度は、ＧＣ参照標準を用いて正規化され得る。例えば、正規化は、観察された各ピーク強度を、同じサンプルの一部においてＧＣ参照標準に対して観察されたピーク強度に対する比として表現することによって、行われ得る。
【００９３】
他の実施形態において、メチル化状態は、メチル化されていないかまたはメチル化されたと特徴づけられ得る。なおもさらなる実施形態において、メチル化状態は、メチル化されていない、部分的にメチル化された、または完全にメチル化されたと分類され得る。
【００９４】
ＩＩ．サンプル
本明細書中に提供される方法は、サンプル中の核酸鋳型のメチル化状態の特徴づけに関する。ある特定の実施形態において、核酸サンプルは、ヒトから得られる。例えば、サンプルは、患者サンプルであり得る。「患者サンプル」は、患者由来の任意の生物学的検体である。その用語には、生体液（例えば、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ液、透析液、洗浄液、精液および他の液体サンプル）ならびに生物学的起源の細胞および組織が含まれるがこれらに限定されない。細胞および組織には、頬側の細胞、口腔洗浄液の収集物または皮膚細胞（毛嚢を含む）が含まれ得る。上記用語には、ヒトから単離された細胞またはそれに由来する細胞（培養中の細胞、細胞上清および細胞溶解産物を含む）も含まれる。さらにそれには、器官または組織の培養物に由来する流体、組織生検サンプル、腫瘍生検サンプル、糞便サンプルおよび生理学的組織から抽出された流体、ならびに固形組織から分離された細胞、組織切片および細胞溶解産物が含まれる。それには、脳由来のサンプルなどの死後の固形組織サンプルも含まれ得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、約８０、１００、１５０、２００、５００または１，０００ｎｇ未満のＤＮＡを含む。
【００９５】
いくつかの場合において、サンプルは、ゲノムＤＮＡを含む。そのＤＮＡは、本発明の方法に供される前に、サンプルの他の非ＤＮＡ成分から分離され得る。ＤＮＡの分離および精製の多くの方法が、当該分野で公知である。
【００９６】
サンプルは、ＤＮＡ鋳型を含み得る。本明細書中に記載されるある特定の方法において、ＤＮＡ鋳型は、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応における合成の標的であり得る。そのＤＮＡ鋳型のＧＣ含量は、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％以上のＣおよびＧ残基であり得る。ＤＮＡ鋳型は、ＣおよびＧ残基を含むジ、トリまたはテトラヌクレオチドリピートを含み得る。ＤＮＡ鋳型は、疾患に関連する遺伝子座内またはその遺伝子座付近の配列を含み得る。ＤＮＡ鋳型は、ＦＭＲ１またはＦＭＲ２遺伝子の５’ＵＴＲの少なくとも一部を含み得る。ＤＮＡ鋳型は、ＦＭＲ１の５’ＵＴＲのＣＧＧリピートまたはＦＭＲ２遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＣＣＧリピートを含み得る。ＤＮＡ鋳型のサイズは、約５０、１００、２００、３００、５００もしくは７００ｂｐ、または１、１．５、２、２．５、３、４、５、７もしくは１０ｋｂであり得る。ＤＮＡ鋳型のサイズは、５０ｂｐ〜１０ｋｂ、１００ｂｐ〜１０ｋｂ、２００ｂｐ〜１０ｋｂ、３００ｂｐ〜１０ｋｂ、５００ｂｐ〜１０ｋｂ、７００ｂｐ〜１０ｋｂ、１ｋｂ〜１０ｋｂ、１．５ｂｐ〜１０ｋｂ、２ｂｐ〜１０ｋｂ、３ｂｐ〜１０ｋｂ、５０ｂｐ〜７ｋｂ、５０ｂｐ〜５ｋｂ、５０ｂｐ〜４ｋｂ、５０ｂｐ〜３ｋｂ、５０ｂｐ〜２ｋｂ、５０ｂｐ〜１．５ｋｂ、１００ｂｐ〜７ｋｂ、２００ｂｐ〜５ｋｂまたは３００ｂｐ〜４ｋｂであり得る。
【実施例】
【００９７】
ＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例証するものであり、本発明の範囲を限定すると意図されていない。
【００９８】
実施例１．メチル化状態を特徴づけるためのワークフロー
図１は、本明細書中に記載されるｍＰＣＲ法の例を示している。メチル化されていない鋳型を分解するがメチル化された対立遺伝子を保持する、ＨｐａＩＩ  ｉなどのメチル化感受性ＤＮａｓｅを含む反応混合物、またはメチル化感受性酵素を含まないコントロール混合物でサンプルＤＮＡが処理される。サンプルＤＮＡの各部分は、ＧＣ外部参照標準の存在下においてＰＣＲに供される。そのＰＣＲはさらに、２００を超えるＣＧＧリピートを有する対立遺伝子を増幅することができる。ＨｐａＩＩ部分およびコントロール部分についてのプライマーは、異なる標識（例えば、ＦＡＭおよびＨＥＸ）を有する。次いで、ＰＣＲ産物が、プールされ、キャピラリー電気泳動によって分析される。ＣＥにおけるアンプリコンのシグナルの喪失は、ＨｐａＩＩ部位において消化されたこと、およびメチル化されていなかったことを示すのに対し、シグナルの保持は、対応する対立遺伝子がメチル化されていたことを示す。対立遺伝子ごとのメチル化の割合は、ＨｐａＩＩで消化された所与の対立遺伝子についてのアンプリコンの収量と、対応する消化されていない対立遺伝子についてのアンプリコンの収量との比から決定される。この比は、ＧＣ外部参照標準のシグナルに対して正規化される。
【００９９】
実施例２．実験の手順
Ａ．臨床上のおよび細胞株のＤＮＡサンプル
血液サンプル由来のｇＤＮＡは、Ｍ．Ｉ．Ｎ．Ｄ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｌｉｎｉｃで診察された被験体から、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄの承認後に得た（Ｆｉｌｉｐｏｖｉｃ−Ｓａｄｉｃら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０１０；５６：３９９−４０８）。細胞株ＤＮＡサンプルは、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（ＣＣＲ，Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）から入手した。臨床上のおよび細胞株のＤＮＡサンプルを、ＰＣＲの前に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．８中に２０ｎｇ／μＬに希釈した。
【０１００】
Ｂ．ＦＭＲ１メチル化ＰＣＲ
各サンプルからの４０ｎｇのｇＤＮＡの２つのアリコートを、メチル化評価のために、ＡｍｐｌｉｄｅＸ（商標）  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ＰＣＲ試薬（Ａｓｕｒａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）を用いて調製する。制限酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製である。一方のＤＮＡアリコートを、消化緩衝液およびメチル化感受性酵素（別段述べられない限り、ＨｐａＩＩ）と混合し、第２のアリコートを、消化緩衝液およびＳａｕ３ＡＩまたはＥｃｏＲＩなどのコントロール酵素と混合する。これらの制限酵素は、０．１５Ｕ／μｌという最終濃度で反応混合物中に存在する。各反応物中の緩衝液の成分の最終濃度の例を表１に示す（酵素貯蔵緩衝液からの試薬の寄与は含まない）。
【０１０１】
【表１】
2013540452.tif 000018
【０１０２】
ＨｐａＩＩ反応物およびコントロール反応物を、シールされた９６ウェルプレートにおいて３７℃で２時間インキュベートする。ＨｐａＩＩ処理産物（ＦＡＭプライマー）または非ＨｐａＩＩコントロール産物（ＨＥＸプライマー）に対して、メチル化ＰＣＲ試薬の別個のＰＣＲマスターミックスを調製し、制限酵素消化混合物中またはコントロール消化混合物中に直接分注する。各マスターミックスは、ｍＰＣＲ  ＡＭＰ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｓｕｒａｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１４５１５２）、ＧＣ−ｒｉｃｈ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ａｓｕｒａｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１４５１５３）、脱イオン水およびｍＰＣＲプライマー
【０１０３】
【化１１】
2013540452.tif 000019
【０１０４】
を含む。各マスターミックスは、ＧＣ外部参照標準（ＰＣＲサイクル数に応じて、約３０００〜１２，０００コピー／ＰＣＲ反応）も含む。
【０１０５】
最終的なＰＣＲ緩衝液／試薬の条件は、消化緩衝液から持ち越される、追加の０．６７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．６６ｍＭビス−Ｔｒｉｓ−プロパン，ｐＨ７．０および０．２６６ｍＭ  ＤＴＴ（消化混合物Ａサンプルの場合）；追加の１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７．５および２０ｍＭ  ＮａＣｌ（消化混合物Ｂサンプルの場合）；または追加の２．６６ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７．５および２６．６μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（消化混合物Ｃサンプルの場合）を除いて、ＡｍｐｌｉｄｅＸ（商標）  ＦＭＲ１キット（Ａｓｕｒａｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．４９４０２；米国特許出願公開第２０１０／０２０９９７０号）におけるものと同じである。
【０１０６】
ある特定の反応は、３０ヌクレオチドの非ヒトＤＮＡ配列を、３０個のＣＧＧリピートを含むプラスミドに挿入することによって構築された４０ＣＧＧ（配列番号４４；「４０−ＣＧＧ−Ｃｏｎｔｒｏｌ」）の相対保持時間を有するＧＣ参照標準を使用し得る。ＰＣＲ工程中に、その参照標準は、そのプラスミドから増幅される。追加の例としては、やはりプラスミド内に含まれる０ＣＧＧ（Ａｓｕｒａｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．４９４４１；配列番号４５；「０−ＣＧＧ−Ｃｏｎｔｒｏｌ」）の相対保持時間を有する参照標準が挙げられる。記載の通り、代わりの移動時間を有する非プラスミドコントロールも使用される。
【０１０７】
上記サンプルは、９５℃５分間の最初の熱変性工程に続く、９７℃３５秒間、６２℃３５秒間および７２℃４分間の２５サイクル、ならびに７２℃１０分間を用いてＰＣＲ増幅される。アンプリコンは、ＣＥ分析のために調製されるか、または−１５〜−３０℃で保管される。
【０１０８】
プロービングされる２つのＨｐａＩＩ部位の指摘とともに、ＦＭＲ１アンプリコンの配列が、以下のとおり示される：
５’−Ｘ−（ＣＧＧリピート領域）−Ｙ−３’
【０１０９】
【化１２】
2013540452.tif 000020
【０１１０】
である。
【０１１１】
配列番号４６および４７において、下線の領域は、順方向および逆方向プライマーによって結合される配列を指し示しており、イタリック体かつ下線のＣＣＧＧ配列は、２つのＨｐａＩＩ部位を指摘している。
【０１１２】
Ｃ．キャピラリー電気泳動（ＣＥ）
断りのない限り、３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）がこの実験のために使用される。合計２μＬの未精製ＰＣＲ産物（ＨＥＸ標識産物およびＦＡＭ標識産物からの各々１μＬ）を、１１μＬのＨＩ−ＤＩ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（登録商標）（ＡＢＩ）および２μＬのＲＯＸ  １０００  Ｓｉｚｅ  Ｌａｄｄｅｒ（Ａｓｕｒａｇｅｎ）と混合し、９５℃で２分間熱変性し、分析のためにＣＥシステムに移す。断りのない限り、注入は、２．５ｋＶでの２０秒間の注入および１５ｋＶでの４０分間のランを用いる標準的なフラグメントサイジング条件（３６ｃｍ，ＰＯＰ７）に従う。断りのある場合、ＡＢＩ３５００ｘＬ  ＣＥ（５０ｃｍ，ＰＯＰ７）を使用する。ＰＯＰ７ポリマーの分解能の限界のために、＞２５０のＣＧＧリピートを有するすべてのＦＭＲ１アンプリコンが、ＣＥにおいて同様の移動度を有する。
【０１１３】
Ｄ．データ分析
Ｇｅｎｅ  Ｍａｐｐｅｒ  ４．０（３５００ｘＬデータの場合は４．１）またはＰｅａｋＳｃａｎｎｅｒ  Ｖ１．０ソフトウェア（ＡＢＩ）を用いて、電気泳動図を分析する。塩基対サイズからＣＧＧリピート数への変換は、２０、２９、３１、５４および１１９個のＣＧＧリピートを有する鋳型から生成されたコントロールアンプリコンに対する線形回帰によって決定される（Ｆｉｌｉｐｏｖｉｃ−Ｓａｄｉｃ，２０１０）。各ピークに対するピークサイズは、（Ｓｉｚｅｉ−２３０．３／２．９７５）を用いてＣＧＧリピート長に変換される。
【０１１４】
検出された各対立遺伝子に対するＣＧＧリピート長およびメチル化パーセントの結果を、ＭＳ  Ｅｘｃｅｌで表にまとめる。メチル化パーセントである％Ｍｉは、等式１に示されるように、ＧＣ参照標準のアンプリコンのピーク高さ（ＣＴＲＬＨＥＸまたはＣＴＲＬＦＡＭ）に対して正規化された、消化されたサンプル（Ｐｅａｋｉ，ＦＡＭ）と消化されていないサンプル（Ｐｅａｋｉ，ＨＥＸ）とのピーク高さの比として計算される：
【０１１５】
【数２】
2013540452.tif 000021
【０１１６】
約１００％であるかまたは名目上１００％を超えるメチル化の値が、完全にメチル化されたとスコア付けされる。そのような値は、概して、下記で述べられるように十分に表されている対立遺伝子についてはアッセイの変動の範囲内に観察されたが、ＣＥ装置の検出の下側範囲付近に対立遺伝子特異的シグナルが存在するがゆえにＧＣ参照標準のピークのシグナルに対して定量的な信頼性が低いとき、少量の対立遺伝子（例えば、臨床上の完全変異サンプルのわずか１％の質量分率の投入）のメチル化の評価では、時折、過大になる（例えば、１２０〜１３７％）。
【０１１７】
Ｅ．サザンブロット分析
８０個の臨床サンプルのＳＢ分析が、Ｔａｓｓｏｎｅら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  ２００８；１０：４３−９に記載されているように行われる。細胞株ＤＮＡは、ＥｃｏＲＩおよびＥａｇＩ（ＮＥＢ）を用いてＳＢのために調製される。ＳＢイメージは、分類によって（ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌｌｙ）評価され（メチル化されていない対立遺伝子、部分的にメチル化された対立遺伝子、および完全にメチル化された対立遺伝子）、各サンプルにおけるメチル化のパーセントは、Ｔａｓｓｏｎｅ，２００８に記載されているように決定される。
【０１１８】
実施例３．メチル化されたＤＮＡ標準およびサンプルを用いたｍＰＣＲの精度および再現性
２色ｍＰＣＲワークフローの精度を評価するために、３０個のＣＧＧリピートおよび既知のメチル化割合を含む規定の８つの分析標準のセットを開発した。メチル化されたおよびメチル化されていないＤＮＡコントロールを、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に従ってｐＢＲ３２２にクローニングされた３０ＣＧＧリピート対立遺伝子のＰＣＲ産物から調製した。その３０ＣＧＧ標準を、ＨｐａＩＩメチルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）でメチル化し、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）で線形化した。
【０１１９】
様々な比率のメチル化されたかまたはメチル化されていない３０ＣＧＧ標準を、０〜１００％で混合し、２０ｎｇ／μＬの６４５ＣＧＧ細胞株ＤＮＡ（ＮＡ０４０２５，ＣＣＲ）において１．５×１０４コピー／μＬに希釈した。細胞株ＤＮＡサンプルをＣｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（ＣＣＲ，Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）から入手した。各サンプルを、消化混合物ＡにおけるＨｐａＩＩ消化（コントロール反応物の場合は消化混合物ＡにおけるＳａｕ３Ａ１）、４０−ＣＧＧ−Ｃｏｎｔｒｏｌの存在下における２５サイクルのＰＣＲ、および実施例２に記載したようなＣＥに供した。
【０１２０】
３０ＣＧＧ標準に対するＦＡＭチャネルにおけるシグナルの比例変化を強調している一連の電気泳動図を図３Ａに示す。メチル化パーセントが上昇するにつれて、３０ＣＧＧ標準に対するシグナルは、４０−ＣＧＧ−ｃｏｎｔｒｏｌおよび混合された６４５ＣＧＧ完全変異対立遺伝子に対するピークと比べて増加した。そのピーク高さの変化を、４０−ＣＧＧ−Ｃｏｎｔｒｏｌのピーク高さに対して正規化し、ＨＥＸチャネルにおける正規化された比と比較した（等式１）。３つの異なるランの日にわたって２人の技師によって行われたとき（図３Ｂ）、既知のメチル化の割合とｍＰＣＲ後に実験的に得られた割合との間に直線関係（Ｒ２＝０．９９８）が観察された（投入されたメチル化がｘ軸上に示され、測定されたメチル化がｙ軸上に示されている）。６４５ＣＧＧ対立遺伝子のメチル化が、評価された各標準に対して定量的（１０４±５％）であると決定された（図３Ｂ）。
【０１２１】
２つのＣＥ装置プラットフォーム（ＡＢＩ３１３０ｘｌおよび３５００ｘＬ）における、２つの正常対立遺伝子（女性の臨床サンプル由来の３０および３２ＣＧＧ）および２つの完全変異対立遺伝子（５５０ＣＧＧおよび９４０ＣＧＧ）の８つの複製物にわたって、ｍＰＣＲの再現性をさらに評価した。メチル化割合、標準偏差、変動係数（ＣＶ）および９５％信頼区間（ＣＩ）を表２に示す。
【０１２２】
【表２】
2013540452.tif 000022
【０１２３】
計算されたｍＰＣＲメチル化割合から、２つの異なるプラットフォームにおいて、正常対立遺伝子に対してはＣＶ＝７〜８％、および完全変異対立遺伝子に対してはＣＶ＝８〜１６％が得られた。さらに、４つの完全変異サンプルを含む８つの細胞株サンプルを用いたとき、ｍＰＣＲの結果は、２人の異なる技師において再現性があった（ＣＶ＝７％）。時折１００％を超えるメチル化パーセントの測定値は、本方法の所定の変動の結果であり、そのようなサンプルは、ＳＢ分析との比較目的のために、完全にメチル化されたものとして表に記載した。下記の実施例で証明されるように、ｍＰＣＲ法は、臨床サンプルに対して、少なくともＳＢ分析と同程度に良好な結果をもたらした。
【０１２４】
実施例４：細胞株ＤＮＡのｍＰＣＲ評価およびＳＢ分析との比較
男性と女性の両方のサンプル由来の、正常、前変異および完全変異の対立遺伝子を含む８つの商業的に入手可能な細胞株ＤＮＡ鋳型を用いて、ｍＰＣＲを評価した。サンプルを、消化混合物ＡにおけるＨｐａＩＩ消化（コントロール反応物の場合は消化混合物ＡにおけるＳａｕ３Ａ１）、４０−ＣＧＧ−Ｃｏｎｔｒｏｌの存在下における２５サイクルのＰＣＲ、および実施例２に記載したようなＣＥに供した。対立遺伝子のサイズおよびメチル化状態についてのｍＰＣＲおよびＳＢ分析の結果を表３に要約する。
【０１２５】
【表３】
2013540452.tif 000023
【０１２６】
４つのサンプルの電気泳動図を、該当するＳＢデータとともに図４Ａ〜Ｄに示す。各図において、上のパネルは、ＨｐａＩＩで処理されていないサンプルの部分を示しており、下のパネルは、消化されたサンプルを示している。表３のサンプルＩＤをリピート長とともに各図に示している。図４におけるリピート長は、＞２５０ＣＧＧに対してはＣｏｒｉｅｌｌの指摘を用いて、および＜２５０ＣＧＧのときはＰＣＲの結果を用いて表示されている。各図は、ｍＰＣＲによって決定されたメチル化パーセンテージも含んでいる。「Ｃｔｒｌ」と表示されたピークは、４０−ＣＧＧ−ｃｏｎｔｒｏｌを示している。
【０１２７】
いずれの場合においても、ｍＰＣＲの結果は、対応するＳＢデータと定性的に一致した。例えば、図４Ａに示されるように、男性の前変異対立遺伝子（ＮＡ０６８９２，９０ＣＧＧ）は、ｍＰＣＲによって２％のメチル化を示し、これは、ＳＢのメチル化されていない領域のみで検出される産物の存在と一致した。完全にメチル化された完全変異対立遺伝子を伴う女性の正常対立遺伝子（ＮＡ０７５３７，図４Ｃ）の偏ったＸ不活性化（８％メチル化）もまた、ＳＢ分析および以前に公開されたデータ（Ｚｈｏｕら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５２：１４９２−１５００（２００６））と一致した。
【０１２８】
ｍＰＣＲは、約２５０までのＣＧＧ長の複雑なサンプルにおける対立遺伝子特異的メチル化状態のより詳細な解釈を提供した。例えば、モザイク女性サンプル（ＮＡ０６８９６，ＣＣＲによるところの「２３／９５−１４０」）は、２３、１１２、１３６ＣＧＧの主要なピーク、ならびに１５３、１７５、１９６および２１９ＣＧＧの４つの追加の少量のピークによって検出された（図４Ｄ）。２３ＣＧＧおよび１１２ＣＧＧのピークは、部分的にメチル化されており、１３６ＣＧＧピークは、完全にメチル化されており、１５３〜２１９のピークは、完全にメチル化されていなかった。
【０１２９】
これらの結果は、ＳＢ分析の結果と定性的に類似していた。ＳＢから、ほとんどメチル化されていない２３ＣＧＧ対立遺伝子、伸長していてメチル化されていない対立遺伝子の広範なセット（＜５．２ｋｂ）、および伸長していてメチル化された対立遺伝子のより明確なセットが明らかになった。重要なことには、ｍＰＣＲデータは、ＳＢにおけるメチル化されていないスメアのパターンに対する、個々のサイズのモザイクの寄与を明らかにした。例えば、ＳＢイメージは、ｍＰＣＲによって報告されたような、部分的にメチル化された１１２ＣＧＧおよび１５３〜２１９ＣＧＧのメチル化されていないより高リピートの対立遺伝子と一致した。
【０１３０】
実施例５．臨床ＤＮＡサンプルを用いたときのメチル化ＰＣＲアッセイの性能
臨床的に関連する対立遺伝子のサイズおよびメチル化状態の全範囲を表しており、対立遺伝子のサイズについて以前に評価されたものと同じセット（Ｆｉｌｉｐｏｖｉｃ−Ｓａｄｉｃ，２０１０）から選択される、８０個の臨床検体のセットを用いて、ＦＭＲ１  ｍＰＣＲアッセイを評価した。実験は、実施例４に記載したように行った。メチル化状態は、ＳＢ（Ｔａｓｓｏｎｅ，２００８）によっても決定した。ＣＧＧリピート長、メチル化パーセントおよびＳＢデータとの比較を、各臨床サンプルについて表にまとめ（表４）、要約した（表５）。表４において、ｍＰＣＲを用いて検出された対立遺伝子は、ＳＢの分解能の限界とマッチするようにグループ化された。完全変異対立遺伝子を有するサンプルは、灰色で影を付けられ、太字のものは、図５および６に示されている。各図において、「Ｃｔｒｌ」と表示されているピークは、４０−ＣＧＧ−Ｃｏｎｔｒｏｌを示している。
【０１３１】
Ｘ活性化（Ｒｏｕｓｓｅａｕら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ２８：８３０−６（１９９１））は、正常サンプルおよび完全変異サンプルにおいて、女性の正常対立遺伝子についてのメチル化パーセントと相反する。Ｘ活性化の平均は、女性の正常対立遺伝子（ｎ＝８）については０．５１、および女性の完全変異（ｎ＝１２）サンプルの正常対立遺伝子については０．６７であり、ｄｅ  Ｖｒｉｅｓらによって報告された値（それぞれ０．５０および０．７１）（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ５８：１０２５−３２（１９９６））と一致した。
【０１３２】
【表４−１】
2013540452.tif 000024
【０１３３】
【表４−２】
2013540452.tif 000025
【０１３４】
【表４−３】
2013540452.tif 000026
【０１３５】
【表４−４】
2013540452.tif 000027
【０１３６】
【表４−５】
2013540452.tif 000028
【０１３７】
【表４−６】
2013540452.tif 000029
【０１３８】
ａＲｏｕｓｓｅａｕらおよびｄｅ  Ｖｒｉｅｓら；ある特定のサンプルだけに対して入手可能なデータ。
ｂ完全＝＜５．４ｋｂのバンドの証拠なし、部分的＝ブロットの両方の領域にバンドの証拠、なし＝＞５．４ｋｂのバンドの証拠なし。
ｃメチル化された分離バンドとメチル化されていない分離バンドとの間のバンド強度のパーセント推定値として得た
ｄ電気泳動図およびＳＢイメージは図６に示される。
ｅ電気泳動図およびＳＢイメージは図５に示される。
ｆ少量の対立遺伝子が１６０ＣＧＧに検出された（６０％メチル化）
【０１３９】
【表５】
2013540452.tif 000030
【０１４０】
ｍＰＣＲの結果は、ＳＢ分析と一致していたが、しかしながら、ｍＰＣＲでは、ＳＢと比べて、種々のメチル化状態の検出および解釈が単純化され、改善された。ＣＥのより高い分解能のために、ｍＰＣＲによって容易に区別されたいくつかの対立遺伝子は、ＳＢでは分解されなかった（例えば、類似サイズの２つの前変異）。これらの場合において、ＳＢ分析の分解能の限界にマッチするように対立遺伝子をグループ化した。
【０１４１】
２つの異なる実験を通して、ｍＰＣＲの感度に焦点をあてた。第１の実験では、正常な３１ＣＧＧ対立遺伝子のバックグラウンドにおける１％もの低い質量分率の臨床上の完全変異対立遺伝子の検出が、ＨＥＸとＦＡＭの両方のチャネルにおいて検出可能だった（図７）。第２の実験では、１０％質量分率の完全にメチル化された完全変異サンプル（♯０８）を、９０％質量分率の完全にメチル化されていない完全変異サンプル（♯１２５）のバックグラウンドにおいて同定することができた（図８）。両方のサンプルのメチル化状態を、表４に示されるようにＳＢ分析によって確かめた。したがって、図３と一致して、臨床サンプルを用いたとき、１０％のメチル化モザイクでさえも検出できた。
【０１４２】
Ａ．完全変異対立遺伝子のメチル化状態の同定および分解
代表的な完全変異サンプルに対する電気泳動図および該当するＳＢイメージを図５に示す。以前に記載されたように（Ｆｉｌｉｐｏｖｉｃ−Ｓａｄｉｃ，２０１０）、これらの実験において使用されたＣＥの設定では、アンプリコンの差次的な分解は＜２５０ＣＧＧを有するものに限定され、ゆえに、より大きなリピート伸長の増幅産物は、共に移動するが、広範なカテゴリーの完全変異に対する全体的なメチル化のパーセンテージは、下記のデータによって支持されるように正確に評価された。例えば、男性の完全変異サンプル♯８８（図５Ａ）において、伸長した対立遺伝子が、ＳＢのメチル化された領域において主に検出され、メチル化されていない領域では微弱な生成物（約１０〜２０％シグナル）が検出された。ｍＰＣＲは、ＳＢの結果と一致して、このサンプルに対して８２％のメチル化を明らかにした。さらに、女性の完全変異サンプル♯１１７に対してＳＢを用いたとき、正常対立遺伝子に対する部分的なメチル化および伸長した対立遺伝子に対する完全なメチル化が観察された（図５Ｂ）。そのｍＰＣＲの結果はまた、３０ＣＧＧ対立遺伝子の部分的な（４４％）メチル化および伸長された対立遺伝子の完全な（１０４％）メチル化を示唆した。
【０１４３】
ｍＰＣＲは、ＳＢにとっては問題となり得るより複雑なサンプルにおける、メチル化状態の同定を単純化した。男性の完全変異サンプル♯１２５（図５Ｃ）は、メチル化されていない領域（３〜＞５ｋｂの範囲）にわたって低強度のスメアを示した。ｍＰＣＲを用いたとき、完全変異のピークは、ＨＥＸでは明らかに検出されたが、ＦＡＭチャネルでは４０−ＣＧＧ−Ｃｏｎｔｒｏｌの増幅にもかかわらず検出されなかった。したがって、完全変異対立遺伝子は、メチル化されていなかった。別の実施例（図５Ｄ）では、サイズおよびメチル化のモザイク現象の稀なパターンが解明された。ＳＢ分析によって、完全変異対立遺伝子は、部分的にメチル化されたと見られたのに対し、ｍＰＣＲは、偏ったメチル化を有する２つの異なる対立遺伝子サイズを明らかにした。顕著な完全変異シグナルが、メチル化されていない長い鋳型において観察されたのに対し、約２００ＣＧＧにおけるより少量の鋳型は、完全にメチル化されていた。したがって、サイズのモザイク現象は、ｍＰＣＲによってより明らかに解明され、メチル化パターンは、ＳＢによって示されたものよりも複雑だった。
【０１４４】
Ｂ．ＳＢ分析によって隠された女性の前変異対立遺伝子における新規の偏ったパターンの同定
４つの代表的な女性の前変異サンプルに対する電気泳動図および該当するＳＢイメージを図６に示す。各サンプルの特徴的な特徴は、より長い対立遺伝子、すなわち５３および５４〜５６ＣＧＧ、７０および７１〜７５ＣＧＧ、９０および９２〜１０１ＣＧＧならびに１０７および１０９〜１２５ＣＧＧについての２つの群のリピートサイズの検出だった（それぞれ図６Ａ〜Ｄ）。消化およびＦＡＭ標識プライマーを用いた増幅の後、各モザイクサンプル内のより短いＣＧＧリピート長だけが検出された。そのサイズのモザイク現象は、特徴的な女性サンプルのＨｐａＩＩで処理されたＦＡＭチャネルで観察されず、対応するリピート長の試験された１１個のいずれの男性前変異対立遺伝子のＰＣＲの後でも観察されなかったなかったので、このパターンは、ポリメラーゼの「スタッタリング（ｓｔｕｔｔｅｒｉｎｇ）」のアーチファクトではなかったとみられる。各場合において、前変異対立遺伝子のより伸長したＣＧＧリピートは、完全にメチル化されていなかった。この前述のモザイク現象および偏ったメチル化パターンは、試験されたコホート内の８４％（１９個のうちの１６個）の女性前変異サンプルにおいて同定された。対照的に、ＳＢの分解能の限界のために、ただ１つの検出可能な前変異バンドしか得られなかったので、このレベルの生物学的詳細については不明瞭だった。さらに、観察された偏ったモザイク現象は、メチル化されたＨｐａＩＩ部位の分析に特異的というわけではなかった。具体的には、ＨｐａＩＩではなくＥａｇＩを用いてもｍＰＣＲ分析を行った。コントロール反応のために、消化混合物ＢにおいてＥｃｏＲＩを使用した。ＥａｇＩ分析では、約−１２．８ＣＧＧリピートの相対保持時間で移動するＣＧＧコントロールを使用し、そのコントロールは、プラスミドベースの４０−ＣＧＧ−Ｃｏｎｔｒｏｌの代わりにＰＣＲアンプリコンから得た。さらに、ＥａｇＩ認識部位がアンプリコン内に存在するようにＰＣＲプライマーを選択した。鋳型をＨｐａＩＩではなくＥａｇＩで処理し、ＥａｇＩメチル化部位の評価を可能にするｍＰＣＲ法の変法を用いて分析したとき、同じパターンが観察された（図９；「Ｒｅｆ」とは、ＨｐａＩＩサンプルでは４０−ＣＧＧ−Ｃｏｎｔｒｏｌ、およびＥａｇＩサンプルでは−１２．８ＧＣＣコントロールのことを指す）。
【０１４５】
ｍＰＣＲ研究の手順は、大量のサンプル分析を支援し得、技師１人あたり最大４８サンプルを処理するための全実施（ｈａｎｄｓ−ｏｎ）時間（その多くは自動化され得る）として１日、およびおよそ２時間しか必要としない。さらに、ｍＰＣＲは、たった８０ｎｇのＤＮＡの投入量しか必要としない（ＳＢと比べて１／５０〜１／１００に低減しており、亜硫酸水素塩（Ｐａｎａｇｏｐｏｕｌｏｓら、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  １４：７１−９（１９９９）；Ｚｈｏｕら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５２：１４９２−５００（２００６）；Ｄａｈｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５：ｅ１４４（２００７））または以前に報告されたＨｐａＩＩ媒介性ＰＣＲ法（Ｃａｒｒｅｌら、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ６４：２７−３０（１９９６）；Ｋｌｉｎｅら、Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  ８５：１４８８−９５（２００６）；Ａｌｌｅｎら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ５１：１２２９−３９（１９９２）と比べて１／１０に低減している）。結果として、外胚葉の細胞系列をニューロン細胞と分け合う、全血に対する代替サンプルタイプ（例えば、頬側の細胞または皮膚細胞）が、ＳＢに対して十分なＤＮＡ収量を提供しないとしても、ｍＰＣＲ分析に適用可能であり得る。
【０１４６】
本研究において評価されたｍＰＣＲ技術は、男性と女性の両方のサンプルにおけるＣＧＧリピート長の範囲にわたってメチル化状態を検出および解明するＰＣＲベースの方法である。その全体的なワークフローは、日常的な試験およびハイスループットスクリーニングの用途に適用可能である。それらの方法は、ＳＢ分析を必要としない広範なＦＭＲ１分析の基礎を提供する。
【０１４７】
実施例６：代替のメチル化感受性酵素を用いたｍＰＣＲ
ｍＰＣＲ法の汎用性を証明するために、選択された臨床サンプルを、ＥａｇＩおよびＮｒｕＩならびにＨｐａＩＩ酵素を用いて分析した。実験は、概して、実施例２に記載されているように行い、サンプルを、消化混合物ＢにおいてＥａｇＩまたはＮｒｕＩで２時間処理し、コントロールサンプルを、消化混合物ＢにおいてＥｃｏＲＩで２時間処理した。非プラスミド−１２．８ＣＧＧ標準をＥａｇＩ実験のために使用し、非プラスミド−４１ＣＧＧ標準をＮｒｕＩサンプルとともに使用した。ＥａｇＩおよびＮｒｕＩ実験用のＰＣＲプライマーを、アンプリコンが適切な酵素についての認識部位を含むように選択した。ＨｐａＩＩ実験は、実施例４に記載したように行った。表６は、これらの実験の結果を比較している。様々な酵素を用いたときの結果は、メチル化された対立遺伝子に対してメチル化されていない対立遺伝子を、ならびにメチル化されていない、部分的にメチル化されたおよび完全にメチル化された対立遺伝子を区別した。
【０１４８】
【表６】
2013540452.tif 000031
【０１４９】
実施例７．ＨｐａＩＩ部位におけるメチル化を評価するために、「０ＣＧＧ」参照標準を用いたメチル化ＰＣＲアッセイの成果
Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ由来の６つのサンプルのメチル化状態を、生物学的ＦＭＲ１対立遺伝子の検出範囲外の相対保持時間を有する０−ＣＧＧ−Ｃｏｎｔｒｏｌを用いて評価した。実施例２に記載したように、消化混合物Ｃ中のＨｐａＩＩまたはＳａｕ３Ａ１（コントロール）、および２７サイクルのＰＣＲを用いて実験を行った。表７に示されるように、参照標準の選択によって、２％メチル化から定量的にメチル化されたものまでのメチル化状態の範囲におけるメチル化データの解釈は変化しなかった。結果を、実施例４に記載したような４０−ＣＧＧ−Ｃｏｎｔｒｏｌを用いてもたらされた結果と比較した。
【０１５０】
【表７】
2013540452.tif 000032
【０１５１】
実施例８．コントロールヌクレアーゼ
本明細書中に記載される方法は、コントロール反応物中でのエンドヌクレアーゼの使用を含み得、これは、大きなゲノムＤＮＡをＦＭＲ１遺伝子座の増幅領域外で切断し、メチル化感受性消化反応におけるＤＮＡ鋳型と同等にＤＮＡ鋳型のサイズを減少させ、したがって、ＰＣＲ増幅にとって同等に好ましくなる。
【０１５２】
多くの制限酵素およびそれらの特異的な認識部位は、十分に特徴づけられている。Ｓａｕ３Ａ、ＥｃｏＲＩ、ＮａｅＩ、ＤｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ、ＮｈｅＩ、ＴｆｉＩ、ＡｐａＬＩ、ＭｌｕＣＩ、ＮｃｏＩ、ＳｃａＩ、ＳｔｕＩ、ＸｍｎＩおよびＨｐｙ１６６１１を含む合計１４個の商業的に入手可能な制限エンドヌクレアーゼを試験のために選択した。
【０１５３】
本方法において使用され得る制限酵素の例としては、Ｓａｕ３Ａ、ＥｃｏＲＩ、ＮａｅＩ、ＤｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦが挙げられる。Ｓａｕ３Ａは、鋳型上の非標的部位の切断に対して低い選択性を示した。鋳型内の非標的部位がほとんど〜まったく切断されないことが観察されたという点で（すなわち、配列番号４０および４１が境界となるＦＭＲ１遺伝子座の領域）、ＥｃｏＲＩ、ＮａｅＩ、ＤｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦは、高度の選択性を示した。
【０１５４】
【表８】
2013540452.tif 000033
【０１５５】
実施例９．メチル化状態を特徴づけるための代替のワークフロー
メチル化状態を特徴づけるための代替のワークフローを図１０に示す。このワークフローでは、ゲノムＤＮＡサンプルを、消化コントロールおよびＧＣ参照標準（この図ではＣＧＧ  ＤＮＡコントロールと呼ばれている）と予め混合する。ＤＮＡ混合物の各部分を、メチル化感受性ヌクレアーゼ（ＨｐａＩＩ）またはコントロールヌクレアーゼ（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ）による処理に供する。続いて、消化されたＤＮＡ混合物を、それぞれＦＡＭ標識プライマー（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ反応）またはＨＥＸ標識プライマー（ＨｐａＩＩ反応）を用いるＰＣＲ増幅に供する。次いで、ＰＣＲ産物をプールし、キャピラリー電気泳動によって分析する。
【０１５６】
消化コントロールとＧＣ参照標準の両方が、電気泳動図の早いウィンドウ（ｅａｒｌｙ  ｗｉｎｄｏｗ）に移動し、サンプル特異的プロファイルを干渉しない。ＨＥＸ標識ＰＣＲにおける消化コントロールからのアンプリコンの減少は、ＨｐａＩＩ消化の効率を示す。ＧＣ参照標準は、ＦＡＭ標識ＰＣＲ産物とＨＥＸ標識ＰＣＲ産物との間のシグナル強度を正規化するために使用される。制限酵素消化前のＧＣ参照標準の添加は、各反応物中のゲノムＤＮＡの量の変動を正規化するために使用される。ゆえに、各対立遺伝子によるメチル化のパーセンテージは、対応する反応物のＧＣ参照標準に対して正規化した後の、消化された反応物（ＨＥＸ）とコントロール反応物（ＦＡＭ）との間のピーク高さの比として決定される。
【０１５７】
実施例１０．代替のワークフローにおける細胞株ＤＮＡのｍＰＣＲ評価およびＳＢ分析との比較
実施例９の代替のワークフローに従ったｍＰＣＲを、男性と女性の両方のサンプル由来の正常、前変異および完全変異の対立遺伝子を含む商業的に入手可能な４つの細胞株ＤＮＡ鋳型（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて評価した。各サンプルを、配列番号５０およびＧＣ参照標準を含む消化コントロールと予め混合し、ここで、Ａ、ＢおよびＣ配列は、それぞれ配列番号１７、４８および３９を含んだ。消化コントロールおよびＧＣ参照標準を加えた後、サンプルを２つの部分に分けた。そのサンプルの一方をＨｐａＩＩ消化に供し、他方をコントロール反応物としてＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ消化に供した。次いで、実施例９におけるような標識プライマーを使用し、その２つの部分の各々を用いて、２５〜２７サイクルのＰＣＲ増幅を行い、産物をＣＥで分離した。同じ細胞株由来のＤＮＡを、ＳＢでも分析した。ｍＰＣＲおよびＳＢからの対立遺伝子のサイズおよびメチル化状態に対する結果を、表９に要約する。対応するＳＢデータとともに４つのサンプルの電気泳動図を図１１Ａ〜１１Ｄに示す。各図において、上のパネルは、コントロールとしてＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦで処理されたサンプルの部分を示しており、下のパネルは、ＨｐａＩＩで消化された同じサンプルを示している。各図は、ｍＰＣＲによって決定されたメチル化パーセンテージも含んでいる。
【０１５８】
各サンプルについて、ｍＰＣＲの結果は、一貫してＳＢデータと一致していた。例えば、２つの男性完全変異サンプル（ＮＡ０７８６２およびＮＡ０６８５２）は、ＳＢにおいて＞２００ＣＧＧの対立遺伝子についてのメチル化された領域だけに産物が存在することと一致して、ｍＰＣＲによって≧１００％メチル化を有すると測定された。
【０１５９】
さらに、ｍＰＣＲは、複雑なモザイク現象を有するサンプルにおいて、対立遺伝子特異的なメチル化状態に対してより詳細な情報を提供した。例えば、２つのモザイク女性サンプル（ＮＡ０６８９６，２３／９６−１４０およびＮＡ２０２４２，３０／７３）は、ＳＢでは主要なピークによって検出されたが、これらのサンプルは、ｍＰＣＲで分析されたとき、ＳＢでは可視化されない少量のピークも示した（図１１Ｃ〜１１Ｄ）。そのｍＰＣＲデータは、ＳＢにおけるメチル化パターンに対する各対立遺伝子の個別の寄与も明らかにした。例えば、ＮＡ０６８９６は、完全にメチル化された１１３ＣＧＧおよび１３８ＣＧＧ対立遺伝子、ならびに１４３〜＞２００ＣＧＧのメチル化されていないより大きな対立遺伝子によって検出され（図１１Ｃ）、これは、ＳＢにおいて報告された部分的にメチル化されたＦＭと一致する。
【０１６０】
【表９】
2013540452.tif 000034
【０１６１】
実施例１１．代替のワークフローにおいて臨床ＤＮＡ検体を用いたｍＰＣＲの評価
実施例９に係る代替のワークフローに従ったｍＰＣＲアッセイを、ある範囲の臨床的に関連する対立遺伝子のサイズおよびメチル化状態を表している１２個の臨床検体のセットを用いてさらに評価した。実施例１０に記載したように実験を行った。ｍＰＣＲからの対立遺伝子のサイズおよびメチル化状態に対する結果ならびにＳＢとの比較を表１０に要約する。表１０中の＊でマークされたサンプルの電気泳動図は、対応するＳＢデータとともに図１２Ａ〜１２Ｇに提供されている。
【０１６２】
ｍＰＣＲの結果は、ＳＢ分析と良好に一致していた。ｍＰＣＲは、より高い分解能を提供し、ＳＢよりも、種々のメチル化状態のより詳細な検出および解釈を可能にした。ＳＢによって分解されないいくつかの対立遺伝子が、ｍＰＣＲによって容易に区別された（例えば、類似サイズの２つの対立遺伝子）。例えば、サンプル♯７は、３０および３１ＣＧＧ対立遺伝子を含み、これらは、ＳＢによって区別できなかった。ｍＰＣＲでは、これらの２つの対立遺伝子は、メチル化された３０ＣＧＧおよびメチル化されていない３１ＣＧＧによって明確に検出された（図１２Ｆ）ので、ＳＢ分析によって検出可能でなかった対立遺伝子特異的メチル化が明らかになった。
【０１６３】
【表１０−１】
2013540452.tif 000035
【０１６４】
【表１０−２】
2013540452.tif 000036
【０１６５】
本明細書の検討および本明細書中に開示される本発明の実施から、本発明の他の実施形態が当業者には明らかであろう。本明細書および実施例が、単に例示として考えられるべきであることが意図されており、本発明の真の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲によって示される。ある方法における特定の順序での工程の列挙は、それとは反対の明示的な指摘がある場合、または１つの工程の結果が別の工程の存在にとって必要である場合を除き、それらの工程が、その順序で行われなければならないということを示しているとして解釈されるべきでない。例えば、「サンプルの第１部分をメチル化感受性ＤＮａｓｅと接触させる」工程および「そのサンプルにＧＣ参照標準を加える」工程は、いずれの工程も他方の結果を必要としないので、任意の順序で行ってよい。他方、「各々がＧＣ参照標準を含むサンプルの第１部分および第２部分をＤＮＡ増幅反応に供する工程」は、「そのサンプルにＧＣ参照標準を加える工程」の後で行われる。なぜならば、供する工程が、加える工程からもたらされるサンプルの部分においてＧＣ参照の存在を必要とするからである。
【０１６６】
本明細書中に引用されたすべての参考文献は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。参考として援用される刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる本発明と矛盾する範囲において、本明細書は、任意の矛盾する材料に取って代わることになる。
【図１】
2013540452.tif 000039
【図２】
2013540452.tif 000040
【図３】
2013540452.tif 000041
【図４Ａ】
2013540452.tif 000042
【図４Ｂ】
2013540452.tif 000043
【図４Ｃ】
2013540452.tif 000044
【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
2013540452.tif 000046
【図５Ｂ】
2013540452.tif 000047
【図５Ｃ】
2013540452.tif 000048
【図５Ｄ】
2013540452.tif 000049
【図６Ａ】
2013540452.tif 000050
【図６Ｂ】
2013540452.tif 000051
【図６Ｃ】
2013540452.tif 000052
【図６Ｄ】
2013540452.tif 000053
【図７】
2013540452.tif 000054
【図８】
2013540452.tif 000055
【図９】
2013540452.tif 000056
【図１０】
2013540452.tif 000057
【図１１Ａ】
2013540452.tif 000058
【図１１Ｂ】
2013540452.tif 000059
【図１１Ｃ】
2013540452.tif 000060
【図１１Ｄ】
2013540452.tif 000061
【図１２Ａ】
2013540452.tif 000062
【図１２Ｂ】
2013540452.tif 000063
【図１２Ｃ】
2013540452.tif 000064
【図１２Ｄ】
2013540452.tif 000065
【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【配列表】
2013540452000001.app
【国際調査報告】
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