(57)【要約】  調節領域へ作動可能なように連結された核酸を含み、該核酸がＣｐｎ２１の発現を撹乱する植物。核酸は、典型的にはアンチセンスＣｐｎ２１であり、かつ、調節領域は誘導性調節領域、組織特異的調節領域、または発生調節領域である。
2013511262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節領域へ作動可能なように連結された核酸を含み、該核酸がＣｐｎ２１の発現を撹乱する、斑入り植物。
【請求項２】
核酸がアンチセンスＣｐｎ２１、またはアンチセンスＣｐｎ２１の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸である、請求項１に記載の斑入り植物。
【請求項３】
調節領域が誘導性調節領域、組織特異的調節領域、発生調節領域、または構成的調節領域である、請求項１に記載の斑入り植物。
【請求項４】
誘導性調節領域がアルコール誘導性プロモーターである、請求項３に記載の斑入り植物。
【請求項５】
組織特異的調節領域がＲｕＢｉｓＣＯプロモーターである、請求項３に記載の斑入り植物。
【請求項６】
核酸がＲＮＡｉである、請求項１に記載の斑入り植物。
【請求項７】
ＲＮＡｉが配列番号：１の断片を含む、請求項６に記載の斑入り植物。
【請求項８】
ＲＮＡｉが配列番号：５、またはその断片もしくはその一部の断片を含む、請求項６に記載の斑入り植物。
【請求項９】
斑入り植物を生産する方法であって、
ｉ）調節領域へ作動可能なように連結された核酸であって、Ｃｐｎ２１の発現を撹乱する核酸を含む植物を提供すること、および
ｉｉ）核酸の発現を引き起こす条件下で植物を生育させ、そのことによって斑入り植物を生産すること、
を含む方法。
【請求項１０】
核酸がアンチセンスＣｐｎ２１、またはアンチセンスＣｐｎ２１の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
調節領域が誘導性調節領域、組織特異的調節領域、発生調節領域、または構成的調節領域である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ｉ）第一の調節領域へ作動可能なように連結された第一の核酸、ならびに対象のタンパク質をコードし第二の調節領域へ作動可能なように連結された第二の核酸を含む植物を提供すること、ここに該第一の核酸はＣｐｎ２１の発現を撹乱するものである、
ｉｉ）第一および第二の核酸の発現を引き起こす条件下で植物を生育すること、および
ｉｉｉ）斑入りの表現型を示し、対象の核酸を発現する植物を選択すること、
を含む、対象の遺伝子を含む植物を選択する方法。
【請求項１３】
核酸がアンチセンスＣｐｎ２１、またはアンチセンスＣｐｎ２１の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
調節領域が誘導性調節領域、組織特異的調節領域、発生調節領域、または構成的調節領域である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
誘導性調節領域がアルコール誘導性である、請求項１４に記載の斑入り植物。
【請求項１６】
第一の調節領域がＡｌｃＲ配列を含み、第二の調節領域がＡｌｃＡプロモーターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
調節領域がＲｕＢｉｓＣＯプロモーターを含む、請求項９に記載の斑入り植物。
【請求項１８】
調節領域がＡｌｃＲ配列およびＡｌｃＡプロモーターを含む、請求項９に記載の斑入り植物。
【請求項１９】
調節領域が葉脈特異的プロモーターを含む、請求項９に記載の斑入り植物。
【請求項２０】
調節領域へ作動可能なように連結された核酸であって、Ｃｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログの発現を直接的または間接的に撹乱する配列を含む核酸を含む、キメラ構築体。
【請求項２１】
構築体がさらに、対象のタンパク質をコードし第二の調節領域へ作動可能なように連結された第二の核酸を含む、請求項２０に記載のキメラ構築体。
【請求項２２】
請求項２１に記載のキメラ構築体を含むヌクレオチド配列で植物を形質転換すること、第一および第二の核酸の発現を引き起こす条件下で植物を生育すること、ならびに斑入りの表現型を示し、対象の核酸を発現する植物を選択すること、を含む、対象の遺伝子を含む植物を選択する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物における斑入り、およびこの特徴に基づく植物を選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物における斑入りは、斑点または縞模様の形状である、白色、クリーム色、黄色また時に他の色によって置き換えられた、植物の葉の通常緑色の部分と定義される。斑入りは葉の端（覆輪）または葉の中央（中斑）に起こり得る。斑入り植物の装飾的な性質から、これらの植物は園芸家によって望まれている。
【０００３】
斑入りは、転位因子（例えば、Ｉｔｏｈら、２００２、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４３（５）：５７８−８）、核内に位置するバリエゲイテッドアンドディストーテッドリーフ（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｏｒｔｅｄ  ｌｅａｆ）（ｖｄｌ）遺伝子による植物形質転換（Ｗａｎｇら、２０００、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．  １２（１１）：２１２９−４２）、激しい植物被害を引き起こすＧＳＡ−ＡＴの部分的もしくは完全な抑制を備える、クロロフィル合成を阻害するアンチセンスグルタメート１−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼ形質転換（Ｈｏｆｇｅｎら、１９９４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、９１：１７２６−１７３０）、または、オルガネラタンパク質あるいはオルガネラ遺伝子における変異を制御する核遺伝子における自然突然変異（Ａｌｕｒｕら、２００６、Ｊ．  ＥｘｐＢｏｔ．  ５７：１８７１−１８８１における総説）の使用を含む様々な方法によって植物において誘導されてきた。Ａｐｕｙａらは（２００１、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２６、７１７−７３０）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のシャペロニン−６０α遺伝子（Ｃｐｎ６０）におけるＴ−ＤＮＡ変異が、ハート型段階の前に成長遅滞を引き起こす、胚発生における欠陥をもたらすことを報告する。
【０００４】
葉の脱色は、センス配向およびアンチセンス配向（ｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）において構成的にシロイヌナズナのＣｐｎ６０β転写産物を発現する遺伝子組換えタバコ植物において、成長不全、開花遅延、減少した根の発達などの他の異常な表現型と一緒に観察されている（Ｚａｂａｌｅｔａ，  Ｅ，ら、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  Ｖｏｌ．  ６、ｐｐ．４２５−４３２）。
【０００５】
シャペロニンは、細菌、ミトコンドリアおよび色素体において見られるマルチサブユニットの二重リングオリゴマータンパク質である。シャペロニンは、熱ショック、マクロファージの細菌感染および変性タンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の細胞内含有量の増加などのストレスの後に量が増加する、豊富な構成タンパク質である。
【０００６】
高等植物の葉緑体は２１ｋＤａのタンパク質、シャペロニン２１（Ｃｐｎ２１）を含有する（Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ  Ｔ．ら、  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９９９  １４２９（２）：５１２−５）。葉緑体Ｃｐｎ２１ポリペプチドは共にタンデムに融合した２つのＣｐｎ１０様ドメインから成る。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＣｐｎ２１（ＡｔＣｐｎ２１）前駆体タンパク質のｃＤＮＡ配列は知られており、２５３アミノ酸長であるＡｔＣｐｎ２１前駆体タンパク質の推定アミノ酸配列は、ほうれん草Ｃｐｎ２１タンパク質と６１％の同一性を示す。ＡｔＣｐｎ２１前駆体タンパク質は、そのアミノ末端に５１アミノ酸の典型的な葉緑体輸送ペプチドを含有し、４６％の配列同一性を示す２つのドメインである２つのＣｐｎ１０様ドメインを含有する。予測されるＡｔＣｐｎ２１の成熟ポリペプチドを可溶性の２１ｋＤａのタンパク質として大腸菌内で発現させた。ゲル濾過および化学的架橋（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）解析から、組換え成熟ＡｔＣｐｎ２１タンパク質は３つまたは４つのポリペプチドから構成される安定なホモオリゴマーを形成することが示された。
【０００７】
Ｈａｎａｎｉａら、２００７（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  １６：５１５−５２５）は、Ｃｐｎ２１が種有りブドウおよび種無しブドウにおいて異なって発現されること、およびいくつかの植物における種子の発育不全において役割を有するかもしれないことを開示した。
【０００８】
Ｓｊｏｇｒｅｎら（２００４、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１３６：  ４１１４−４１２６）は、ストロマ分子シャペロン（ＣｌｐＣ）の含有量を平均で６５％欠如しているシロイヌナズナｃｌｐＣ１のＴ−ＤＮＡ挿入変異体を開示する。変異体は、全ての発育段階を通して、成長遅滞の表現型である均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）萎黄病の外観を備える葉を示す。光合成能はノックアウト系列において損なわれ、相対的により少ない光化学系Ｉおよび光化学系ＩＩ複合体を有するがＡＴＰアーゼおよびＲｕＢｉｓＣＯの含有量においては変化が無かった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は植物における斑入り、およびこの特徴に基づく植物を選択する方法に関する。
【００１０】
改良された斑入り植物を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明により、調節領域へ作動可能なように連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）核酸を含み、該核酸がシャペロニンの発現を撹乱する、斑入り植物が提供される。シャペロニンはシャペロニン２１（Ｃｐｎ２１）であってもよい。核酸は、Ｃｐｎ２１のアンチセンス配列、インビトロでアンチセンスＣｐｎ２１の相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸、またはＣｐｎ２１の発現を撹乱するＲＮＡｉであってもよい。さらに、調節領域は誘導性調節領域、組織特異的調節領域、発生調節領域、または構成的調節領域であり得る。
【００１２】
本発明は、第一の調節領域へ作動可能なように連結された第一の核酸であって、Ｃｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログの発現を直接的または間接的に撹乱する配列を含む第一の核酸、および、対象のタンパク質をコードし第二の調節領域へ作動可能なように連結された第二の核酸を含む、キメラ構築体を提供する。
【００１３】
本発明はまた、
ｉ）調節領域へ作動可能なように連結された核酸を含む植物を提供すること、ここに該核酸はＣｐｎ２１の発現を撹乱するものである、および
ｉｉ）核酸の発現を引き起こす条件下で植物を生育させ、そのことによって斑入り植物を生産すること、
を含む、斑入り植物を生産する方法（Ａ）を提供する。
【００１４】
好ましくは、提供の工程における核酸はアンチセンスＣｐｎ２１、インビトロでアンチセンスＣｐｎ２１の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸、またはＣｐｎ２１の発現を撹乱するＲＮＡｉである。さらに、調節領域は誘導性調節領域、組織特異的調節領域、発生調節領域、または構成的調節領域であってもよい。組織特異的調節領域はＲｕＢｉｓＣＯプロモーターであってもよく、あるいは葉脈特異的プロモーターであってもよい。構成的調節領域はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ  ３５Ｓまたは３５Ｓ）プロモーター配列を含むことができる。誘導性調節領域はＡｌｃＲ配列およびＡｌｃＡプロモーターを含むことができる。
【００１５】
本発明はまた、
ｉ）第一の調節領域へ作動可能なように連結された第一の核酸、ならびに対象のタンパク質をコードし第二の調節領域へ作動可能なように連結された第二の核酸を含む植物を提供すること、ここに該第一の核酸はＣｐｎ２１の発現を撹乱するものである、
ｉｉ）第一および第二の核酸の発現を引き起こす条件下で植物を生育すること、および
ｉｉｉ）斑入りの表現型を示す植物を選択すること、
を含む、対象の核酸を含む植物を選択する方法（Ｂ）に関する。
【００１６】
提供の工程における核酸はアンチセンスＣｐｎ２１、インビトロでアンチセンスＣｐｎ２１の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸、またはＣｐｎ２１の発現を撹乱するＲＮＡｉであってもよい。さらに、調節領域は誘導性調節領域、組織特異的調節領域、発生調節領域、または構成的調節領域であってもよい。組織特異的調節領域はＲｕＢｉｓＣＯプロモーターであってもよく、あるいは葉脈特異的プロモーターであってもよい。構成的調節領域はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ  ３５Ｓまたは３５Ｓ）プロモーター配列を含み得る。誘導性調節領域はＡｌｃＲ配列およびＡｌｃＡプロモーターを含むことができる。
【００１７】
本発明はまた、
ｉ）調節領域へ作動可能なように連結された核酸であって、Ｃｐｎ２１の発現を撹乱する核酸を含むヌクレオチド配列で植物を形質転換すること、および
ｉｉ）核酸の発現を引き起こす条件下で植物を生育させ、そのことによって斑入り植物を生産すること、
を含む、斑入り植物を生産する方法（Ｃ）を提供する。
【００１８】
本発明はまた、
ｉ）第一の調節領域へ作動可能なように連結された第一の核酸、ならびに対象のタンパク質をコードし第二の調節領域へ作動可能なように連結された第二の核酸を含むヌクレオチド配列で植物を形質転換すること、ここに該第一の核酸はＣｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログの発現を撹乱するものである、
ｉｉ）第一および第二の核酸の発現を引き起こす条件下で植物を生育すること、および
ｉｉｉ）対象の核酸を発現し、斑入りの表現型を示す植物を選択すること、
を含む、対象の核酸を含む植物を選択する方法（Ｄ）を提供する。
【００１９】
提供または形質転換の工程における第一の核酸は、アンチセンスＣｐｎ２１、インビトロでアンチセンスＣｐｎ２１の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸、またはＣｐｎ２１の発現を撹乱するＲＮＡｉであってもよい。さらに、調節領域は誘導性調節領域、組織特異的調節領域、発生調節領域、または構成的調節領域であってもよい。
【００２０】
対象のタンパク質をコードする第二の核酸配列は、例えば、任意の核酸、例えば薬学活性タンパク質をコードする核酸配列、例えば成長因子、成長調節物質、抗体、抗原、予防接種もしくはワクチン接種にとって有益であるそれらの誘導体等、インターロイキン、インスリン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦまたはそれらの組合せ、インターフェロン類、例えばインターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、血液凝固因子、例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子もしくはｔＰＡまたはそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。第二の核酸配列はまた、工業用酵素、タンパク質補助食品（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、栄養補助食品、または飼料、食品、あるいは飼料使用および食品使用のための付加価値製品をコードし得る。そのようなタンパク質の例は、タンパク質分解酵素、酸化酵素、フィターゼ、チキナーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、脂質生合成に関与する酵素等を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
上記に定義された方法を使用して生産された植物は斑入りの葉を示した。本明細書において記載される方法は、観賞目的のための斑入りの葉を備える植物を生産するために使用することができ、また、葉の斑入りは植物の形質転換が起こったことを示す選択マーカーとして使用される特徴であって、葉の斑入りの発生は植物の選択において支援する（ａｓｓｉｓｔ）ために使用することができる。本発明の方法は、作物、観賞植物、飼料植物等、例えば、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、キャノーラ、亜麻、麻（Ｈｅｍｐ）、ヤマカモジグサ属（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、セイヨウアブラナ、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｓｐｐ．）、シクラメン属（Ｃｙｃｌａｍｅｎ  ｓｐｐ）、ベゴニア属（Ｂｅｇｏｎｉａ  ｓｐｐ．）、ツツジ属（Ａｚａｌｅａ  ｓｐｐ）、およびスパティフィラム属（Ｓｐａｔｉｆｉｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｓｐｐ．）、ポプラ（Ｐｏｐｌａｒ）、バラ属（Ｒｏｓａ  ｓｐｐ．）、バラ、バショウ属（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）（例えばバナナ）、コーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ  Ａｒａｂｉｃａ）、トウモロコシ（Ｍａｉｚｅ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｐｐ．）（例えば大豆）等を含むが、これらに限定されない任意の植物内で使用することができる。
【００２２】
本発明はさらに、調節領域へ作動可能なように連結された核酸を含む核酸構築体を提供する。ここで該核酸はＣｐｎ２１の発現を撹乱するものである。該核酸はアンチセンスＣｐｎ２１、インビトロでアンチセンスＣｐｎ２１の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸、またはＣｐｎ２１の発現を撹乱するＲＮＡｉであってもよい。調節領域は誘導性調節領域、組織特異的調節領域、発生調節領域、または構成的調節領域であってもよい。
【００２３】
本発明はまた、第一の調節領域へ作動可能なように連結された第一の核酸、ならびに対象のタンパク質をコードする第二の核酸を含む核酸構築体を提供する。ここで該第一の核酸がＣｐｎ２１の発現を撹乱するものである。第一の核酸はアンチセンスＣｐｎ２１、インビトロでアンチセンスＣｐｎ２１の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸、またはＣｐｎ２１の発現を撹乱するＲＮＡｉであり得る。調節領域は誘導性調節領域、組織特異的調節領域、発生調節領域、または構成的調節領域であり得る。第一の調節領域はＡｌｃＲ配列を含むことができ、第二の調節領域はＡｌｃＡプロモーターを含むことができる。
【００２４】
本発明はまた、本発明の核酸構築体を含むベクターを含む。
【発明の効果】
【００２５】
アンチセンスシャペロニン２１を発現する遺伝的に形質転換された植物は、葉および花の斑入りへの強い傾向を示す。そのような系の利点は、形質転換された植物およびそれらの子孫は異種の核酸がないことである。本明細書において記載される植物および方法は、観賞市場内での使用のための作物を含む、商業用途のための斑入り植物の生産のために使用することができる。さらに、本明細書において記載された方法を使用して植物において得られた斑入りの表現型は、選択マーカーとして使用することができる。例えば斑入りの葉は、対象のタンパク質をコードする植物の選択のための視覚的な基準を提供することができる。
【００２６】
対象の核酸へ視覚的なマーカーを結合することもまた、同定および分離、または、工芸作物あるいはこの特徴を発現する他の遺伝的に改変された作物の同一性保持（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）のため、有益となり得る。組織特異的な斑入り（葉脈、葉頂、茎等）は、同じ植物種において異なる模様を作成するために、マーカーが植物の所望の部分において発現され、それゆえ同定し、かつ、その植物における異なる遺伝的に改変された特徴を識別するように使用することができる。
【００２７】
本発明のこの概要は必ずしも発明のすべての特徴について記載するとは限らない。本発明の他の実施態様および特徴は、本発明の具体的な実施形態の以下の記載を検討することにより、技術分野における当業者へ明らかにされるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
これらおよび本発明の他の特徴は、添付図面について申し述べる以下の記載からより明らかとなる。
【００２９】
【図１】図１は、Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ３５Ｓで形質転換されたタバコ植物由来の斑入りの葉の模様を示す。ＷＰ−（形質転換されていない）野生型の植物−は、一番上の列の中央である。
【００３０】
【図２】図２Ａ−Ｅは、Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５Ｓ構築体を発現するＴ１タバコ植物を示す。斑入り模様の範囲および色彩強度は植物において示される。対照植物は図２Ｂの右隣に示される。
【００３１】
【図３】図３は、ＡｌｃＲＣｐｎ２１ＲＮＡｉで形質転換されたタバコの葉における斑入りを示す。ＡｌｃＡプロモーターは２％エタノール溶液を吹きかけることによって誘導された。
【００３２】
【図４】図４は、Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５Ｓでの形質転換後の選択培地上でのキャノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）の再生個体を示す。
【００３３】
【図５】図５は、Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ３５Ｓで形質転換されたキャノーラにおける斑入りの模様を示す（ＷＰ−形質転換されていない対照は左下の葉）。
【００３４】
【図６】図６は、Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５Ｓで形質転換された遺伝子組換えイネ（右側の鉢）を示し；左の鉢は対照（形質転換されていない植物）である。
【００３５】
【図７】図７は、Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ３５Ｓで形質転換された遺伝子組換えヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）を示し；右の鉢は対照（形質転換されていない植物）である。
【００３６】
【図８】図８Ａ：配列番号：１−シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ｃｐｎ２１をコードする配列；図８Ｂ：配列番号：４−Ｃｐｎ２１アンチセンス３５Ｓ；図８Ｃ：配列番号：５−イントロンを備えるＣｐｎ２１ＲＮＡｉ断片；図８Ｄ：配列番号：６−Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉＲＢＣ；図８Ｅ：配列番号：７−Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉＲＢＣ；図８Ｆ：配列番号：８−ＡｌｃＲＣｐｎ２１ＲＮＡｉ配列；図８Ｇ：配列番号：９−３５Ｓプロモーター；図８Ｈ：配列番号：１０−最小限のＡｌｃＡプロモーター（ヌクレオチド１−２３２）；図８Ｉ：配列番号：１１−タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）ＲｕＢｉｓＣＯ（ＲＢＣ）プロモーター配列；図８Ｊ：配列番号：１２−最小限の３５Ｓプロモーターを備えるＡｌｃＲ断片；図８Ｋ：配列番号：２３−Ｃｐｎ２１アンチセンス；図８Ｌ：ＰＣＲ−シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｐｎ２１の増幅断片（配列番号：２）；図８Ｍ：配列番号：２８−ｐＧｒｅｅｎ００２９−ＲＢＣ構築体；図８Ｎ：配列番号：２９−ｐＵＣ５７−ＲＢＣ構築体。配列番号：４−Ａｃｐｎ２１アンチセンス配列を含むヌクレオチド１０３−８６６；ＮＯＳ末端配列を含むヌクレオチド９０４−１１５６；３５Ｓプロモーター配列を含むヌクレオチド１０２３２−１０６４８。配列番号：５−ＡＣｐｎＲＮＡｉ断片１を含むヌクレオチド１−４２７；ＡＣｐｎＲＮＡｉ構築体のイントロンを含むヌクレオチド９３８−２０１７；ＡＣｐｎＲＮＡｉ断片２を含むヌクレオチド２１５６−２６２７。配列番号：６−３５Ｓプロモーター配列を含むヌクレオチド８１４０−９１７５；ＡＣｐｎＲＮＡｉ断片１を含むヌクレオチド９３２４−９７９５；ＡＣｐｎＲＮＡｉ構築体のイントロンを含むヌクレオチド９９３４−１１０１３；ＡＣｐｎＲＮＡｉ断片２を含むヌクレオチド１１４７９−１１９４８。配列番号：７−ヌクレオチド２−１０２６、ＲＢＣプロモーター；ＡＣｐｎＲＮＡｉ断片１を含むヌクレオチド１２８０−１７４７；ＡＣｐｎＲＮＡｉ構築体のイントロンを含むヌクレオチド１８３９−３１９３；ＡＣｐｎＲＮＡｉ断片２を含むヌクレオチド３３４９−３８１６。配列番号：８−３５Ｓプロモーター配列を含むヌクレオチド７１７−１５０２；ＡｌｃＲ配列を含むヌクレオチド１５２９−４１２３；ＮＯＳ末端配列を含むヌクレオチド４１３０−４３８８；ＡｌｃＡプロモーター配列を含むヌクレオチド４３８９−４４０６；ＡＣｐｎＲＮＡｉ断片１を含むヌクレオチド５０５８−５５２５；ＡＣｐｎＲＮＡｉ構築体のイントロンを含むヌクレオチド５６１７−６９７１；ＡＣｐｎＲＮＡｉ断片２を含むヌクレオチド７１２７−７５９４。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
（詳細な説明）
本発明は植物における斑入り、およびこの特徴に基づく植物を選択する方法に関する。
【００３８】
本発明は、調節領域へ作動可能なように連結された核酸を含む斑入り植物を提供する。ここで該核酸はシャペロニン２１（Ｃｐｎ２１）もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログ、例えばＣｐｎ１０の発現を撹乱するものである。Ｃｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログの発現を撹乱する核酸は、Ｃｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログのアンチセンス配列、インビトロでＣｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログのアンチセンスの相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸、またはＣｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログの発現を撹乱するＲＮＡｉを含むが、これらに限定されない。調節領域は誘導性調節領域、組織特異的調節領域、発生調節領域、または構成的調節領域であってもよい。
【００３９】
Ｃｐｎ２１配列は配列番号：１またはＣｐｎ２１活性を示す配列番号：１の断片を含み得る。配列番号：１はシロイヌナズナシャペロニン２１（ｃｐｎ２１、Ａｃｐｎ２１）配列（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号ＡＦ４２８３６６．１    ｇｉ：１６２２６９１０  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴ５ｇ２０７２０／Ｔ１Ｍ１５＿１２０  ｍＲＮＡ）に対応する。配列番号：１の断片は配列番号：１のヌクレオチド７７−８４２を含むことができる。しかしながら、シャペロニン配列はまた、例えばブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）ｃｐｎ２１（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号ＡＹ６８０６９９）、ほうれん草Ｃｐｎ２１（Ｂａｎｅｙｚら  １９９５、ＪＢＣ  ２７０：１０６９５−１０７０２）を含むことができる。さらに、Ｃｐｎ２１ポリペプチドは共にタンデムに融合した２つのＣｐｎ１０様ドメインから成り、Ｃｐｎ２１はＣｐｎ１０の機能的ホモログと考えられており（登録番号：ＡＦ０５９０３７；  Ｂｅｒｔｓｃｈ  Ｕ．，ら、１９９２、ＰＮＡＳ  ８９：８６９６−８７００；  Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ  Ｔ．，ら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４２９：５１２−５１５）、それゆえ本発明のシャペロニン配列はまた、ほうれん草シャペロニンｃｐｎ１０、Ｈｅｌｉｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ｅｘ  Ｓｉｍｕｌｉｕｍ  ｊｏｎｅｓｉｉのｃｐｎ１０（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号ＡＹ５９６４９４）もしくはＲｂｃＸ（Ｅｍｌｙｎ−Ｊｏｎｅｓら、２００６  Ｐｌａｎｔ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ４７：１６３０−１６４０）、またはＣｐｎ２１の他の機能的なアナログを含むことができる。原核生物および(植物を含む)真核生物の両方に由来するシャペロニンの他の例は、ｃｐｎｄｂ−シャペロニンデータベース（例えば、ＵＲＬ：ｃｐｎｄｂ．ｃｂｒ．ｎｒｃ．ｃａ／  ；  Ｈｉｌｌら  ２００４．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：１６６９−１６５７、出典明示により本明細書に組み込まれる）において見出される。シャペロニン２１は略語「ｃｐｎ２１」または「Ｃｐｎ２１」によって示すことができる。
【００４０】
本明細書において記載される方法は、Ｃｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログ、例えばＣｐｎ１０の発現を撹乱、減少または除去する核酸配列の使用を含む。これは、例えば、以下に記載されるようなサイレンシング核酸を使用することによって達成することができるが、これらに限定されない。サイレンシング核酸の例は、アンチセンスＣｐｎ２１配列もしくはアンチセンスＣｐｎ２１機能的ホモログ配列、インビトロでアンチセンスＣｐｎ２１配列もしくはアンチセンスＣｐｎ２１機能的ホモログ配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸、またはＣｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログの発現を撹乱するＲＮＡｉを含むが、これらに限定されない。
【００４１】
サイレンシング核酸の例は、配列番号：１、２もしくはそれらの断片の逆相補配列、配列番号：４もしくはそれらの断片、配列番号：５もしくはそれらの断片、配列番号：２３もしくはそれらの断片、配列番号：５のヌクレオチド２０７８−２５１８、または配列番号：２のヌクレオチド２２３−６６３の逆相補配列：に応じた配列を含む核酸を含有する。Ｃｐｎ１０をコードする配列は、ｃｐｎ２１の断片と見なされ得るＣｐｎ１０として使用することができる（Ｂｅｒｔｓｃｈ  Ｕ．，ら、１９９２、ＰＮＡＳ  ８９：８６９６−８７００；  Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ  Ｔ．，ら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４２９：５１２−５１５）。
【００４２】
上記の方法および構築体において使用される調節領域は、構成的調節領域、誘導性調節領域、組織特異的調節領域、または発生調節領域であってもよい。
【００４３】
本発明はそれゆえ、
ｉ）サイレンシングヌクレオチド配列に作動可能なように連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌy  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）調節領域を含む核酸配列を植物へ導入すること、ここに該サイレンシングヌクレオチド配列の発現はＣｐｎ２１の発現を減少または除去するものである、および
ｉｉ）植物内または植物内の組織内で該サイレンシングヌクレオチド配列を発現させることを含む、植物または植物の組織におけるＣｐｎ２１のレベルを減少させるための方法を提供する。Ｃｐｎ２１の量は、植物または植物の組織におけるＣｐｎ２１発現のレベルと、サイレンシング核酸配列を発現しない第二の植物または第二の植物からの組織におけるＣｐｎ２１発現のレベルを比較することによって決定される。Ｃｐｎ２１の量はノーザン解析、ウェスタン解析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等を含む標準的な技術を使用して決定される。
【００４４】
本発明はさらに、
ｉ）サイレンシング核酸配列に作動可能なように連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌy  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）調節領域を含むサイレンシング核酸配列を植物へ導入すること、および
ｉｉ）植物を成長させること、
を含む、斑入り植物を生産するための方法を提供する。該サイレンシング核酸配列は、配列番号：１もしくは２の逆相補配列、配列番号：１の逆相補配列の断片、配列番号：１もしくは２のアンチセンスの相補配列とハイブリダイズする配列、または配列番号：１のアンチセンスの相補配列の断片とハイブリダイズする配列を含んでもよい。
【００４５】
配列番号：４、５もしくは２３またはそれらの断片、配列番号：５のヌクレオチド２０７８−２５１８、または配列番号：２のヌクレオチド２２３−６６３の逆相補配列を含む他のサイレンシング核酸が上記の方法において使用することができる。Ｃｐｎ１０をコードする配列もまた使用することができる。
【００４６】
該調節領域は、構成的調節領域、誘導性調節領域、組織特異的調節領域、または発生調節領域であり得る。誘導性調節領域が使用される場合、該方法はさらに、調節領域を誘導しサイレンシング核酸の発現を引き起こす化学薬品または環境条件に植物を供する工程を含む。
【００４７】
シャペロニン発現が撹乱される実施形態において、サイレンシングヌクレオチド配列を発現しない第二の植物から得られたシャペロニン発現のレベルと比較した際に、シャペロニン発現は、約１０％から約１００％またはそれらの間の任意の量、減少させられ得る。例えば、Ｃｐｎ２１発現は、約１０％から約６０％もしくはそれらの間の任意の量、約１０％から約５０％もしくはそれらの間の任意の量、約１０％から約４０％もしくはそれらの間の任意の量、または、約１０％から約３０％もしくはそれらの間の任意の量、約１０％から約２０％もしくはそれらの間の任意の量、減少させられ得る。
【００４８】
用語「発現」によって、核酸分子からの機能的なＲＮＡ、タンパク質またはそれらの両方の産生が意味される。
【００４９】
「サイレンシングヌクレオチド配列」または「サイレンシング核酸配列」は、転写された際に標的配列の発現を撹乱、減少または除去することを引き起こす配列をいう。サイレンシングヌクレオチド配列は、例えば、アンチセンスヌクレオチド、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡをコードし得るが、これらに限定されない。
【００５０】
「遺伝子発現の減少」もしくは「発現の減少」「発現の撹乱」もしくは「発現の除去」によって、核酸配列によってコードされるｍＲＮＡ、タンパク質またはｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルの減少が意味される。発現は、約１０％から約１００％またはそれらの間の任意の量、例えば、約１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８および１００％またはそれらの間の任意の量、減少させられ得る。発現の減少は、全長ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、の産生欠如の結果として、あるいはサイレンシング核酸配列の発現を通して起こり得、例えばリボザイム（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ  ７４  Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｐ．Ｃ．  Ｔｕｒｎｅｒ，版、１９９７、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照）、ｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｍ．  Ｓｏｈａｉｌ版、２００５、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓを参照）でのｍＲＮＡの切断を、また別の面では、アンチセンス（例えばＡｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃ．  ＬｉｃｈｔｅｎｓｔｉｅｎおよびＷ．  Ｎｅｌｌｅｎ版、１９９７、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）、リボザイム、ｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉ技術または技術分野において知られている他の関連する方法を使用して、ＲＮＡの半減期を減少させることを引き起こす。
【００５１】
アンチセンス核酸分子はヌクレオチド配列の相補鎖と相互作用し、存在する時、標的核酸の発現を改変する。アンチセンス核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡであってもよく、組成物として送達され、または、インビボもしくはインサイチュで鋳型核酸、ベクターもしくは人工染色体などの他の構築体または宿主細胞もしくは宿主生物のゲノムへ導入された遺伝子組換え配列から転写されてもよい。アンチセンス核酸は２０−３０ヌクレオチドから数百ヌクレオチドの様々な長さであり、一以上のｍＲＮＡと相互作用するアンチセンス配列を含むことができる。
【００５２】
アンチセンス核酸は、ヘアピンループ構造を形成するために自己アニール（ｓｅｌｆ  ａｎｎｅａｌ）する一本鎖ＲＮＡとして、鋳型核酸、プラスミドまたは他の遺伝子構築体（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）から転写されることができる。転写されたＲＮＡ鎖は、ループまたはＲＮＡの非対合部分によって分離された、二本鎖を形成するためにアニールすることができる２つのパリンドローム配列を有する。該二本鎖領域は約１５塩基対から数百塩基対の長さまたはそれらの間の任意の長さを形成することができ、例えば、植物において存在するＤＩＣＥＲまたはＲＩＳＣ様酵素によってプロセシングされる際、短い二本鎖断片（ｓｉＲＮＡ）の形成を引き起こすことができる。短い二本鎖断片は、例えば、技術分野において一般的に知られているような、１９塩基の二本鎖部分および３’末端に２塩基の突出を有する２１塩基長であるが、これらに限定されない。
【００５３】
配列番号：１のアンチセンス配列の例は、配列番号：２３もしくはその断片、配列番号：５のヌクレオチド２０７８−２５１８もしくはその断片、または配列番号：２のヌクレオチド２２３−６６３の逆相補配列もしくはその断片、配列番号：１の逆相補配列もしくはその断片を含む。
【００５４】
「作動可能なように連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」によって、特定の配列が、遺伝子発現の仲介（ｍｅｄｉａｔｉｏｎ）または調節などの意図される機能を実行するために、直接的または間接的のいずれかで相互作用することが意味される。作動可能なように連結された配列の相互作用は、例えば、作動可能なように連結された配列と相互作用するタンパク質によって仲介（ｍｅｄｉａｔｉｏｎ）されてもよい。対象のコード領域はまた、キメラ構築体を生産するために、典型的には異種の、他の配列を伴ってベクター内に導入されることができる。転写調節領域によって仲介（ｍｅｄｉａｔｉｏｎ）または調節される対象の配列の転写を可能にするために、配列が機能的に結合される際、転写調節領域および対象の配列は「作動可能なように連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」。
【００５５】
以下に記載するように、モデル系として、本明細書に記載される方法を使用して、タバコＳＲ１（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｃｖ．ＳＲ１）、シロイヌナズナランズバーグ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｃｖ  Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ）、セイヨウアブラナＤＨ１２０７５（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ｃｖ．ＤＨ１２０７５）  イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）およびミナトカモジグサダブロンブルースカイプランツ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ  ｃｖ．Ｄｏｕｂｌｏｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｋｙ  ｐｌａｎｔｓ）を用いて斑入り植物が生産された。しかしながら、作物、観賞植物、飼料植物等、例えば、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、キャノーラ、亜麻、麻（Ｈｅｍｐ）、ヤマカモジグサ属（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、セイヨウアブラナ、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｓｐｐ．）、シクラメン属（Ｃｙｃｌａｍｅｎ  ｓｐｐ）、ベゴニア属（Ｂｅｇｏｎｉａ  ｓｐｐ．）、ツツジ属（Ａｚａｌｅａ  ｓｐｐ）、およびスパティフィラム属（Ｓｐａｔｉｆｉｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、アルファルファ、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、大麦、米、タバコ、シロイヌナズナ、キャノーラ、亜麻、麻（Ｈｅｍｐ）、例えば、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ）、じゃがいもを含む他の植物もまた、本明細書に記載される方法を使用して改変することができるが、これらに限定されない。植物の他の例は、カシューナットノキ属（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ）、ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ）、アスパラガス属（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）、ベラドンナ属（Ａｔｒｏｐａ）、カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ヤマカモジグサ属（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）、ココヤシ属（Ｃｏｃｏｓ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、ワスレグサ属（Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、アマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、ハウチワマメ属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、キャッサバ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、マヨナラ属（Ｍａｊｏｒａｎａ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、オリーブ属（Ｏｌｅａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｅｕｍ）、チカラシバ属（Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ）、ワニナシ属（Ｐｅｒｓｅａ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、カイノキ属（Ｐｉｓｔａｃｈｉａ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、トウゴマ属（Ｒｉｃｉｎ��ｓ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、コオン属（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、シロガラシ属（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、カカオノキ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍｕｓ）、レイリョウコウ属（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）、ササゲ属（Ｖｉｇｎａ）、およびトウモロコシ属（Ｚｅａ）由来の種を含む。
【００５６】
植物の形質転換のために使用された構築体は表４に提示され、かつ：
Ｃｐｎ２１ＡＳ（構成的な、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの転写制御下のアンチセンス配向におけるＣｐｎ２１をコードする核酸配列）、
Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５Ｓ（３５Ｓプロモーターの転写制御下のＣｐｎ２１ＲＮＡｉヘアピンループ）、
Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉＲＢＣ（組織特異的な、ＲｕＢｉｓＣＯ（ＲＢＣ）プロモーターの転写制御下のＣｐｎ２１ＲＮＡｉヘアピンループ）、
Ｃｐｎ２１ＡＳＲＢＣ（ＲＢＣプロモーターの転写制御下のアンチセンス配向にけるＣｐｎ２１をコードする核酸配列）、
ＡｌｃＲＣｐｎ２１ＲＮＡｉ（アルコール誘導性プロモーターの転写制御下のＣｐｎ２１ＲＮＡｉヘアピンループ）、
を含むが、これらに限定されない。
【００５７】
様々なレベルの葉の斑入りを備えるタバコ植物は、３５Ｓプロモーターの制御下のＣｐｎ２１のアンチセンス発現を使用して生産された。斑入りタバコ植物は、非選択培地上と同様にカナマイシン選択培地上またはハイグロマイシン選択培地上を使用して、産生された。斑入りのシロイヌナズナ、キャノーラ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）およびミナトカモジグサ（Ｂ．ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）植物が、アンチセンス配向におけるＣｐｎ２１遺伝子またはＲＮＡｉを用いた形質転換に続いてカナマイシン無しの選択培地上で同定された。
【００５８】
本明細書において記載される方法は、観賞目的のための斑入りの葉を備える植物を生産するために使用することができ、また、葉の斑入りは植物の形質転換が起こったことを示す選択マーカーとして使用される特徴であって、葉の斑入りの発生は植物の選択において支援する（ａｓｓｉｓｔ）ために使用することができる。
【００５９】
それゆえ、本発明は、植物において、調節領域へ作動可能なように連結された核酸であって、Ｃｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログの発現を直接的または間接的に撹乱する配列を含む核酸を含む、キメラ構築体を提供する。本発明はまた、今述べた構築体で植物を形質転換すること、および、核酸の発現を引き起こす条件下で植物を生育させ、そのことによって斑入り植物を生産することを含む、斑入り植物を生産する方法を提供する。
【００６０】
該核酸は、アンチセンスＣｐｎ２１もしくはアンチセンスＣｐｎ２１機能的ホモログ、インビトロでアンチセンスＣｐｎ２１の相補配列もしくはアンチセンスＣｐｎ２１機能的ホモログの相補配列と厳密な条件下インビトロでハイブリダイズする核酸、またはＣｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログの発現を撹乱するＲＮＡｉであってもよい。さらに、調節領域は誘導性調節領域、組織特異的調節領域、発生調節領域、または構成的調節領域であってもよい。
【００６１】
本発明はさらに、第一の調節領域へ作動可能なように連結された第一の核酸であって、Ｃｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログの発現を直接的または間接的に撹乱する第一の核酸、および対象のタンパク質をコードし第二の調節領域へ作動可能なように連結された第二の核酸を含む、キメラ構築体を提供する。
【００６２】
本発明はまた、
ｉ）第一の調節領域へ作動可能なように連結された第一の核酸、ならびに対象のタンパク質をコードし第二の調節領域へ作動可能なように連結された第二の核酸を含むヌクレオチド配列で植物を形質転換すること、ここに該第一の核酸はＣｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログの発現を撹乱するものである、
ｉｉ）第一および第二の核酸の発現を引き起こす条件下で植物を生育すること、および
ｉｉｉ）対象の核酸を発現し、斑入りの表現型を示す植物を選択すること、
を含む、対象の核酸を含む植物を選択する方法を提供する。
【００６３】
本発明はまた、
ｉ）第一の調節領域へ作動可能なように連結された第一の核酸、ならびに対象のタンパク質をコードし第二の調節領域へ作動可能なように連結された第二の核酸を含む植物を提供すること、ここに該第一の核酸はＣｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログの発現を撹乱するものである、
ｉｉ）第一および第二の核酸の発現を引き起こす条件下で植物を生育すること、および
ｉｉｉ）対象の核酸を発現し、斑入りの表現型を示す植物を選択すること、
を含む、対象の核酸を含む植物を選択する方法を提供する。
【００６４】
（提供または形質転換の工程における）第一の核酸はアンチセンスＣｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログのアンチセンス、インビトロでアンチセンスＣｐｎ２１の相補配列もしくはアンチセンスＣｐｎ２１機能的ホモログの相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸、またはＣｐｎ２１もしくはＣｐｎ２１の機能的ホモログの発現を撹乱するＲＮＡｉであり得る。さらに、調節領域は誘導性調節領域、組織特異的調節領域、発生調節領域、または構成的調節領域であり得る。
【００６５】
対象のタンパク質をコードする第二の核酸配列は、任意の核酸、例えば、薬学活性タンパク質をコードする核酸配列、例えば成長因子、成長調節物質、抗体、抗原、予防接種もしくはワクチン接種にとって有益であるそれらの誘導体等、インターロイキン、インスリン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦもしくはそれらの組合せ、インターフェロン類、例えばインターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、血液凝固因子、例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子もしくはｔＰＡまたはそれらの組合せ、を含み得るが、これらに限定されない。第二の核酸配列はまた、工業用酵素、タンパク質補助食品（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、栄養補助食品、または飼料、食品、あるいは飼料使用および食品使用のための付加価値製品をコードし得る。そのようなタンパク質の例は、タンパク質分解酵素、酸化酵素、フィターゼ、チキナーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、脂質生合成に関与する酵素等、を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明は、配列番号：１とハイブリダイズする、または厳密なハイブリダイゼーション条件下でアンチセンスＣｐｎ２１の相補配列とハイブリダイズする、アンチセンスｃｐｎ２１活性を有するヌクレオチド配列を含む（Ｍａｎｉａｔｉｓら、  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８２）  ｐ．  ３８７−３８９；  Ａｕｓｕｂｅｌら  （ｅｄｓ）、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．  １、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．，およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ａｔ  ｐ．  ２．１０．３を参照；  両者とも出典明示により本明細書に組み込まれる）。厳密なハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、４×ＳＳＣ中６５℃で８−１６時間のハイブリダイゼーションに続いて０．１×ＳＳＣ中６５℃で１時間の洗浄、または、５×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド中４２℃で８−１６時間のハイブリダイゼーションに続いて約０．５×ＳＳＣから約０．２×ＳＳＣ中６５℃で１時間の洗浄、を含む。しかしながら、ハイブリダイゼーション条件は対象の配列に依存して公知の方法に従って改変することができる（Ｔｉｊｓｓｅｎ、１９９３、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  −−  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照；  出典明示により本明細書に組み込まれる）。一般的に、限定されることは望まないが、厳密なハイブリダイゼーション条件は、確定したイオン強度およびｐＨでの具体的な配列に対する熱融解点（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）より約５℃低く選択される。
【００６７】
当業者によって理解されるように、配列番号：１または配列番号：１の相補配列とハイブリダイズする様々な長さのヌクレオチド配列は、インビボで転写される際、ｃｐｎ２１発現を減少する特性を示す。そのようなヌクレオチド配列は約１５−約９００ヌクレオチドの長さまたはそれらの間の任意の長さであり得る。（そのような配列の断片を含む）そのような配列の非限定的な例は：ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号ＡＦ０５９０３７（ｃｐｎ１０）、ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号ＮＭ＿１８０７１４（ｃｐｎ２０）、ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号ＡＦ５１０５６５．１（ｈｄａ２）、および配列番号：４を含む。
【００６８】
本発明はまた、Ｃｐｎ２１に対するＲＮＡｉ活性を有するヌクレオチド配列を含む。例えば、配列番号：５はイントロンによって分離された４４０ヌクレオチド配列（配列番号：２のヌクレオチド２２３−６６３）および配列番号：２のヌクレオチド２２３−６６３の逆相補ヌクレオチド配列を含む。配列番号：５の配列を有する核酸が転写される時、ＲＮＡはヘアピンループ構造を形成する（イントロンがループであり、配列番号：２に対応するヌクレオチドが対合領域を形成する）。当業者によって理解されるように、二本鎖領域はＣｐｎ２１に対して特異的なより短い二本鎖ＲＮＡｉ分子へと切断される。
【００６９】
本明細書において定義されたアンチセンスＣｐｎ２１配列と約７５−約１００％の配列同一性または約８０−約１００％の配列同一性を有する配列もまた、該配列がアンチセンスｃｐｎ２１活性を有するという条件で、含まれる。同一性の決定は、オリゴヌクレオチド配列比較（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）アルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら  １９９０．  Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−４１０；  出典明示により本明細書に組み込まれる）を使用して行われるが、これに限定されない。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＵＲＬ：  ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ／）を通して入手可能である。規定のパラメーターは：Ｐｒｏｇｒａｍ：ｂｌａｓｔｎ；Ｄａｔａｂａｓｅ：ｎｒ；Ｅｘｐｅｃｔ  １０；ｆｉｌｔｅｒ：ｄｅｆａｕｌｔ；Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ：ｐａｉｒｗｉｓｅ；Ｑｕｅｒｙ  ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅｓ：Ｓｔａｎｄａｒｄ（１））を含む。配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するための好適なアルゴリズムの別の例はＦＡＳＴＡである（Ｐｅａｒｓｏｎら  １９８８．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：２４４４−８）。
【００７０】
核酸の断片または部分は、核酸またはヌクレオチド配列の長さの約６０％から約１００％、またはそれらの間の任意の量を含む。例えば、核酸またはヌクレオチド配列の長さの約６０％から約１００％、約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、約９０％から約１００％、約９５％から約１００％、またはそれらの間の任意の量。あるいは断片または部分は、約１５０から約５００ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の量である。例えば、断片は約１５０から約５００ヌクレオチドまたはそれらの間の任意の量、約２００から約５００ヌクレオチドまたはそれらの間の任意の量、約２５０から約５００ヌクレオチドまたはそれらの間の任意の量、約３００から約５００ヌクレオチドまたはそれらの間の任意の量、約３５０から約５００ヌクレオチドまたはそれらの間の任意の量、約４００から約５００ヌクレオチドまたはそれらの間の任意の量、約４５０から約５００ヌクレオチドまたはそれらの間の任意の量である。例えば、約５、１０、２０、３０、４０もしくは５０ヌクレオチドまたはそれらの間の任意の量が、核酸またはヌクレオチド配列の５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方から除去され得る。
【００７１】
「調節領域」（あるいは調節エレメント）によって、調節領域に作動可能なように連結された配列の発現を制御する性質を有する核酸配列が意味される。そのような調節領域は、プロモーターあるいはエンハンサー領域、および技術分野における当業者によって認識される他の調節エレメントを含み得る。「プロモーター」によって、転写の開始のため、および転写速度の調節のために不可欠な全てのシグナルを含む、コード領域の５’末端のヌクレオチド配列またはその断片が意味される。
【００７２】
発生的に調節される、誘導性、組織特異的、または構成的等を含む何種類かの調節エレメントが存在する。発生的に調節される調節エレメントは、ある器官または器官のある組織内で、その器官または組織の発生の間の特定の時期に活性化され、かつ遺伝子の差示的発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を調節する。しかしながら、発生的に調節されるいくつかの調節エレメントは、ある器官または組織内で特定の発生段階で優先的に活性化されてもよく、また、発生的に調節される方法において、あるいは植物内の他の器官または組織における基礎レベルでなお活性であってもよい。そのような調節エレメントは、任意の組織、例えば、葉、根、茎、芽、果実、種子、花、塊茎、胚珠、胚等において見出されるが、これらに限定されない。
【００７３】
調節エレメントは、該調節エレメントが宿主植物において活性であることを条件に、任意の好適な資源（ｓｏｕｒｃｅ）に由来することができる。調節エレメントは、それが使用される植物または植物細胞と同一の種または型（ｔｙｐｅ）に由来することができ、あるいは異なる植物資源から獲得することができる。調節エレメントはまた、それが使用される宿主植物において該調節エレメントが活性であることを条件に、動物の核酸配列、細菌性核酸配列、ウイルス性核酸配列、原生動物の核酸配列、またはシアノバクテリア性核酸配列であってもよい。調節エレメントは、全体にまたは一部分に、自然においては発見されない合成核酸配列（合成調節エレメント）を含んでもよい。
【００７４】
組織特異的調節エレメントは、組織特異的な方法において一以上のヌクレオチド配列または遺伝子の転写を、直接的または間接的に活性化することができる調節エレメントである。そのような調節エレメントは、葉特異的、孔辺細胞特異的、茎特異的、根特異的、緑色組織特異的、オルガネラ特異的等であってもよい。孔辺細胞特異的調節エレメントの非限定的な例は、シロイヌナズナＴＧＧ１遺伝子のプロモーター配列を含む（Ｈｕｓｅｂｙｅら  ２００２．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２８：１１８０−１１８８；  Ｐｌｅｓｃｈら  ２０００  Ｇｅｎｅ  ２４９：８３−９；  ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ  ９３／０１８１６９；  出典明示により本明細書に組み込まれる）。オルガネラ特異的調節エレメントの非限定的な例は、エンドウのクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子ＡＢ８０のプロモーター配列を含む（Ｚａｂａｌｅｔａら  １９９４．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６：４２５−４３２；  出典明示により本明細書に組み込まれる）。葉特異的調節エレメントの非限定的な例は、ＰＣＴ特許公報ＷＯ  ０２／０７７２４８；  ＷＯ０２／０３６７８６；  ＷＯ  ９８／００５３３（出典明示により本明細書に組み込まれる）において記載される。根特異的または根活性型調節エレメントの非限定的な例は、ＰＣＴ特許公報ＷＯ  ０６／０６６１９３；  ＷＯ  ０５／０８５４４９（出典明示により本明細書に組み込まれる）において記載される。
【００７５】
誘導性調節エレメントは、誘導因子に応答して、一以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を、直接的または間接的に活性化することができる調節エレメントである。誘導因子が無い場合、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。典型的に、転写を活性化するために誘導性調節エレメントへ特異的に結合するタンパク質因子は、誘導因子によってその後活性型へと直接的または間接的に変換される不活性型で存在し得る。しかしながら、タンパク質因子は存在しなくてもよい。該誘導因子は、タンパク質、代謝物、成長調節物質、除草剤もしくはフェノール化合物などの化学薬品、または熱、低温、塩もしくは有毒物質によって直接的にあるいはウイルスなどの病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎ）もしくは病因物質（ｄｉｓｅａｓｅ  ａｇｅｎｔ）を介して間接的に課せられる（ｉｍｐｏｓｅｄ）生理学的ストレスであってもよい。誘導性調節エレメントを含む植物細胞は、噴射、散水、加熱あるいは同様の方法によってなど、細胞または植物への誘導因子の外部適用によって誘導因子へ暴露される。誘導性エレメントは植物または非植物遺伝子のいずれかに由来することができる。（例えば、Ｇａｔｚ，  Ｃ．およびＬｅｎｋ，  Ｉ．Ｒ．Ｐ．、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  ３，  ３５２−３５８；  出典明示により本明細書に組み込まれる）。潜在的誘導性プロモーターの例は、ステロイド誘導性プロモーター、例えばエストラジオールプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｇａｔｚ，  Ｃ．、１９９７、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８，  ８９−１０８；  出典明示により本明細書に組み込まれる）、ステロイド誘導性プロモーター（Ａｏｙａｍａ，  Ｔ．およびＣｈｕａ，  Ｎ．Ｈ．、１９９７、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２，  ３９７−４０４；  出典明示により本明細書に組み込まれる）、アルコールもしくはエタノール誘導性プロモーター（Ｓａｌｔｅｒ，  Ｍ．Ｇ．，ら、１９９８、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６，  １２７−１３２；  Ｃａｄｄｉｃｋ，  Ｍ．Ｘ．，ら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １６，  １７７−１８０、出典明示により本明細書に組み込まれる）、サイトカイニン誘導性ＩＢ６およびＣＫＩ１遺伝子（Ｂｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒ，  Ｉ．およびＫｉｅｂｅｒ，  Ｊ．Ｊ．、１９９８、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０，  １００９−１０１９；  Ｋａｋｉｍｏｔｏ，  Ｔ．、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，  ９８２−９８５；  出典明示により本明細書に組み込まれる）、オーキシン誘導性エレメント、ＤＲ５（Ｕｌｍａｓｏｖ，  Ｔ．，ら、１９９７、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９，  １９６３−１９７１；  出典明示により本明細書に組み込まれる）、およびデキサメタゾン誘導性プロモーター（Ｓａｂｌｏｗｓｋｉら、１９９８．  Ｃｅｌｌ  ９２：９３−１０３）を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
構成的調節エレメントは、植物の様々な部分の至る所で、かつ植物発生の間中、連続的に、遺伝子の発現を指示する。公知の構成的調節エレメントの例は、ＣａＭＶ  ３５Ｓ転写産物に付随するプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ，  ３１３：  ８１０−８１２）、オクトピン合成酵素プロモーター（Ｆｒｏｍｍら、１９８９．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：９７７−９８４）、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）プロモーター（Ｌａｍら、１９９０．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２６５：９９０９−９９１３）、イネアクチン１（Ｚｈａｎｇら、１９９１、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ３：  １１５５−１１６５）およびトリオースリン酸イソメラーゼ１（Ｘｕら、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０６：  ４５９−４６７）遺伝子、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）ユビキチン１遺伝子（Ｃｏｒｎｅｊｏら、１９９３、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９：  ６３７−６４６）、シロイヌナズナユビキチン１および６遺伝子（Ｈｏｌｔｏｒｆら、１９９５、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９：  ６３７−６４６）、タバコｔ−ＣＵＰプロモーター（ＷＯ／９９／６７３８９；  ＵＳ  ５，８２４，８７２）、ＨＰＬプロモーター（ＷＯ  ０２／５０２９１）および、タバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Ｍａｎｄｅｌら、１９９５  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９：  ９９５-１００４）、を含み、これらの全ては出典明示により本明細書に組み込まれる。用語「構成的」は本明細書において使用される場合、構成的調節エレメントの制御下において遺伝子が全ての細胞タイプにおいて同一のレベルで発現されることを必ずしも示さないが、たとえしばしば多量に変化が観察されても、広範囲の細胞タイプにおいて遺伝子が発現することを示す。
【００７７】
発生的に調節される、誘導性、組織特異的、または構成的な調節エレメントの他の非限定的な例は表１に示され、表１における参考文献は、全て出典明示により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
【表１】
2013511262.tif 000003
【００７９】
調節エレメントの他の非限定的な例は特定の配列または応答エレメントを含み得る。例えば、調節エレメントは、アブシジン酸応答エレメント、Ｓｐｈ／ＲＹエレメント、Ｍｙｂ認識エレメントまたはＭｙｃ認識エレメントなどの一以上のシス作用性モチーフを含むことができる。これらおよび／または他の調節エレメントは、非自然発生的なプロモーターを提供するために組み合わせることができ、発現されようとする所望の核酸（例えば、本明細書において記載されるアンチセンスｃｐｎ２１またはＲＮＡｉ）へシス、５’に挿入することができる。
【００８０】
本発明の核酸構築体は必要に応じて、飼料植物、食用作物、観賞植物、または他の植物を含む任意の所望の植物へ導入することができる。それゆえ、本発明の実施形態は、広範囲の植物への用途を有する。そのような植物の例は、アルファルファ、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、大麦、米、タバコ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、キャノーラ、小麦、カラスムギ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、麻（ｈｅｍｐ）、大豆、エンドウ豆、朝鮮人参、亜麻、麻（ｈｅｍｐ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、例えば、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ）、じゃがいも、および観賞植物、例えば、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｓｐｐ．）、シクラメン属（Ｃｙｃｌａｍｅｎ  ｓｐｐ）、ベゴニア属（Ｂｅｇｏｎｉａ  ｓｐｐ．）、ツツジ属（Ａｚａｌｅａ  ｓｐｐ）、およびスパティフィラム属（Ｓｐａｔｉｆｉｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）を含むが、これらに限定されない。他の例は、カシューナットノキ属（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ）、ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｅｓｉａ）、アスパラガス属（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）、ベラドンナ属（Ａｔｒｏｐａ）、カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ヤマカモジグサ属（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）、ココヤシ属（Ｃｏｃｏｓ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）（例えばＣ．ａｒａｂｉｃａ、Ｃ．ｒｏｂｕｓｔａ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、ワスレグサ属（Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、アマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、ハウチワマメ属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、キャッサバ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、マヨラナ属（Ｍａｊｏｒａｎａ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）（例えばバナナ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、オリーブ属（Ｏｌｅａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｅｕｍ）、チカラシバ属（Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ）、ワニナシ属（Ｐｅｒｓｅａ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、カイノキ属（Ｐｉｓｔａｃｈｉａ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、トウゴマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、バラ属（Ｒｏｓａ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、コオン属（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、シロガラシ属（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、カカオノキ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍｕｓ）、レイリョウコウ属（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）、ササゲ属（Ｖｉｇｎａ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ）等由来の種を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
以下に概説する実施例において、タバコ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、キャノーラ、イネまたはヤマカモジグサ属（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）が、本明細書において定義される構築体の発現のための試験生物として使用されたが、しかしながら、本発明の構築体は任意の植物において導入され発現され得ることが理解されるべきである。
【００８２】
本明細書において記載される構築体、ベクターまたは核酸を含む遺伝子組換え植物もまた本発明の一部と見なされる。
【００８３】
植物細胞から植物全体を再生する方法は技術分野において知られている。一般的に、形質転換された植物細胞は抗生物質などの選択剤を含有する適切な培地において培養され、選択マーカーが形質転換された植物細胞の同定を容易にするために使用される。一度カルスが形成すると、シュート形成は、公知の方法に従って適切な植物ホルモンを採用すること、および植物の再生のための発根培地へ移植させられたシュートによって促進され得る。植物はその後、種子からあるいは栄養繁殖技術を使用して、反復世代（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ）を確立するために使用される。
【００８４】
形質転換された植物細胞の同定において補助するために、この発明の構築体は植物選択マーカーを含有するようさらに操作されてもよい。選択マーカーは、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン等などの抗生物質への抵抗性を提供する酵素を含み得る。同様に、ＧＵＳ（ベータ−グルクロニダーゼ）などの色変化、ルシフェラーゼなどの発光、ホスホマンノースイソメラーゼなどの(非形質転換体の成長を阻害する)特定の炭素源の代謝による、識別可能な化合物の生産を提供する酵素が有用であるが、これらに限定されない。
【００８５】
核酸、アンチセンス分子、サイレンシングヌクレオチド配列、ベクターまたは他の遺伝的構築体（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）（まとめて「構築体」または「核酸構築体」と呼ぶ）は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、ダイレクトＤＮＡトランスフォーメーション、マイクロ−インジェクション、エレクトロポレーション、フローラルディップ、微粒子銃パーティクルガン等を使用して、植物細胞内へ導入することができる。そのような技術の検討のため、例えば、ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＶＩＩＩ，  ｐｐ．  ４２１-４６３  （１９８８）；  ＧｅｉｅｒｓｏｎおよびＣｏｒｅｙ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２ｄ  Ｅｄ．  （１９８８）；  および、ＭｉｋｉおよびＩｙｅｒ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ＤＴ．  Ｄｅｎｎｉｓ，ら、（編者）、Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙ，  Ｌａｎｇｍａｎｓ  Ｌｔｄ．  Ｌｏｎｄｏｎ，  ｐｐ．  ５６１-５７９  （１９９７）；  ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ、１９９８  （Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １６，  ７３５−７４３）を参照のこと。麻（Ｈｅｍｐ）、例えば、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）は、ＦｅｅｎｙおよびＰｕｎｊａ、２００６．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４４：  ３７３−３８２；  出典明示により本明細書に組み込まれる）によって記載されるように、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｉｆａｓｃｉｅｎｓ）を使用して形質転換することができるが、これに限定されない。
【００８６】
本発明はさらに核酸構築体を含む好適なベクターを含む。
【００８７】
本発明の核酸構築体を含有する遺伝子組換え植物およびそれらの子孫もまた本発明の一部と考えられる。植物細胞から植物全体を再生する方法は技術分野において知られており、形質転換され、かつ再生された植物を獲得する方法はこの発明にとって重要ではない。一般的に、形質転換された植物細胞は抗生物質などの選択剤を含有する適切な培地において培養され、選択マーカーが形質転換された植物細胞の同定を容易にするために使用される。一度カルスが形成すると、シュート形成は、公知の方法に従って適切な植物ホルモンを採用すること、植物の再生のための発根培地へ移植させられたシュートによって促進され得る。該植物はその後、種子からあるいは栄養繁殖技術を使用して、反復世代（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ）を確立するために使用される。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Ｅｖａｎｓら（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  ｐｐ．  １２４−１７６，  ＭａｃＭｉｌｌｉａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８３；  および、Ｂｉｎｄｉｎｇ，  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，  ｐｐ．  ２１−７３，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  １９８５；  出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載されている。再生は、植物カルス、外植片（ｅｘｐｌａｎｔ）、器官、またはそれらの一部分からも獲得することができる。そのような再生技術は、Ｋｌｅｅら１９８７（Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．  ３８：４６７−４８６；  出典明示により本明細書に組み込まれる）において一般的に記載されている。
【００８８】
本明細書において記載されるサイレンシングヌクレオチド配列または構築体は、第一の植物とサイレンシングヌクレオチド配列または構築体を含む第二の植物とを交配し、核酸の発現を選択することによって、植物へ導入することができる。
【００８９】
【表２】
2013511262.tif 000004
＊下線部の配列はＧａｔｅｗａｙ商標（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）伸長
【００９０】
本発明はさらに以下の実施例において説明される。しかしながら、これらの実施例は説明目的のためのみであると理解されるべきであり、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限するために使用されるべきではない。
実施例
方法
ベクター構築
【００９１】
シロイヌナズナシャペロニン２１配列（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号ＡＦ４２８３６６．１  ｇｉ：１６２２６９１０  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴ５ｇ２０７２０／Ｔ１Ｍ１５＿１２０  ｍＲＮＡ；配列番号：１）を使用して、クローニング目的のためのＰｍｌ１サイトおよびＳｐｅ１サイトを組み込むＰＣＲプライマーを設計した。
【００９２】
３５Ｓプロモーター下のＣｐｎ２１アンチセンス（ｃｐｎ２１ＡＳ）（配列番号：４）
ｃｐｎ２１をコードする配列は、プライマーＡＣｐｎ２１アンチセンスＦおよびプライマーＡＣｐｎ２１アンチセンスＲ（配列番号：２６および２７）を使用して、クローニング目的のため（５’末端で）Ｓｐｅ１および（３’末端で）Ｐｍｌ１制限酵素認識配列を組み込み、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）から増幅された。得られたＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔへライゲーションされ、シークエンシングによって確認された（得られた構築体Ａｃｐｎ２１アンチセンスｐＧＥＭ−Ｔ）。ＡＣｐｎ２１アンチセンスｐＧＥＭ−ＴはＰｍｌＩ／ＳｐｅＩで消化され、Ｃｐｎ２１を含有する得られた８００ｂｐの断片はＰｍｌＩ／ＳｐｅＩで切断されたｐＣａｍｂｉａ１３０２ベクターへライゲーションされ、シークエンシングによって確認された。
【００９３】
ｐＣａｍｂｉａベクター（ＣＡＭＢＩＡから入手可能）は、ｐＰＺＰ骨格（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら  １９９４．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：９８９−９９４；  ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＡＦ２３４３０１）に由来する。
【００９４】
「Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５Ｓ」（配列番号：６）構築体は３５Ｓプロモーター（配列番号：９）の制御下にＣｐｎ２１のＲＮＡｉ配列の発現をもたらす。Ｃｐｎ２１遺伝子の中央から５００ｂｐ断片をＧａｔｅｗａｙ商標（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ａｔｔＢ１（フォワード）５’伸長およびａｔｔＢ２（リバース）５’伸長を含むプライマー（ＡＣｐｎ２１  ＲＮＡｉ  ＦおよびＡＣｐｎ２１  ＲＮＡｉ  Ｒ、配列番号：２４および２５）を使用して、製造者の取扱説明書に従ってＰＣＲにより増幅し、Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ構築体を作製した。Ｇａｔｅｗａｙ商標ＢＰ組換え反応を使用して、Ｃｐｎ２１ＰＣＲ産物をｐＤＯＮＲ商標２２１ベクターへ挿入し、得られたＣｐｎ２１  ｐＤＯＮＲ構築体はシークエンシングによって確認された。Ｇａｔｅｗａｙ商標ＬＲ組換え反応を再度使用して、Ｃｐｎ２１  ｐＤＯＮＲからＣｐｎ２１配列をｐＫＧＷ１ＷＧ２ＩＩ（Ｋａｒｉｍｉら、２００２  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ７（５）：１９３−１９５）へＲＮＡフォーマットで挿入し（イントロンに隣接するセンスおよびアンチセンス配列；転写された際、核酸はヘアピンループ構造を形成する）（配列番号：５）、シークエンシングによって確認された。
【００９５】
「ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−ＲＢＣ」構築体はＲｕＢｉｓＣＯ（ＲＢＣ）プロモーター（配列番号：１１）の制御下にＣｐｎ２１のＲＮＡｉ配列の発現をもたらす。ｐＫＧＷ１ＷＧ２ＩＩからＲＮＡｉ配向におけるｃｐｎ２１挿入断片をＸｍｎＩで切り取り、ｐＧｒｅｅｎ００２９−ＲＢＣ（配列番号：２８）へライゲーションし、ＸｍｎＩ／ＳｍａＩで直線化して、ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−ＲＢＣ（配列番号：７）を作製した。ｐＧｒｅｅｎ００２９は、タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）のＲＢＣプロモーター（配列番号：２８のヌクレオチド６９９−１７４４）、マルチクローニングサイト（配列番号：２８のヌクレオチド１７４５−１８４１）、ＮＯＳターミネーターをコードする配列（配列番号：２８のヌクレオチド１８４２−２１２２）を含み、ＲＢＣプロモーターを含むｐＵＣ５７−ＲＢＣ（配列番号：２９）のＫｐｎＩ／ＡｐａＩ断片を切り取り、この断片をＫｐｎＩ／ＡｐａＩで直線化されたｐＧｒｅｅｎ００２９ベクターへライゲーションすることによって作製された。ｐＧｒｅｅｎプラスミドは、技術分野において知られており、例えば、Ｈｅｌｌｅｎｓら、２０００（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４２：８１９−８３２；  Ｈｅｌｌｅｎｓら、２０００  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ５：１０：４４６−４５１；  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号；Ｙ０９３７４）による参考文献において記載される。
【００９６】
ｐＵＣ５７ベクターは既知でありＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．  １２０  Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ  Ａｖｅ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ．  カタログ＃  ＳＤ１１７６−５０ｕｇ）から入手可能である。ｐＵＣ５７−ＲＢＣは、タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）のＲＢＣプロモーター（配列番号：２９のヌクレオチド２１−１０６６）、マルチクローニングサイト（配列番号：２９のヌクレオチド１０６７−１１６３）、ＮＯＳターミネーターをコードする配列（配列番号：２９のヌクレオチド１１６４−１４４４）を含む。
【００９７】
得られたｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−ＲＢＣ構築体は挿入断片の存在を確認するためにＢａｍＨＩ／ＸｍｎＩで消化された。
【００９８】
「Ｃｐｎ２１ＡＳ−ＲＢＣ」構築体はＲＢＣプロモーターの制御下にＣｐｎ２１のセンス配向の発現をもたらす。ＲＢＣプロモーター（配列番号：１１）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩでの消化によってｐＵＣ５７ＲＢＣから取り除き、アンチセンス配向におけるＣｐｎ２１配列を含むｐＣａｍｂｉａ  １３０２  ＡＡＳ６（ＣＡＭＢＩＡから；ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩで切断）へと挿入して、Ｃｐｎ２１ＡＳ−ＲＢＣを作製した。得られた構築体は正しい挿入断片の大きさの確認をするためＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩで切断された。
【００９９】
Ａｌｃを含む誘導性の構築体もまた作製された。ＡｌｃレギュロンはＣａｄｄｉｃｋら  １９９８において記載されている。簡単には、最小レギュロンはａｌｃＲ配列およびＡｌｃＡプロモーターを含む。ＡｌｃＲポリペプチド（転写因子）は、植物がエタノールへ暴露された際、誘導因子分子（エタノール）へ反応する；ＡｌｃＡプロモーター配列へ作動可能なように連結しているオープンリーディングフレームの発現を刺激するＡｌｃＲポリペプチドはＡｌｃＡプロモーターへ結合する。
【０１００】
「ＡｌｃＲ  Ｃｐｎ２１  ＲＮＡｉ」構築体（配列番号：８）はアルコール誘導性プロモーター（ＡｌｃＡ）（ＡｌｃＡ−配列番号：１０）の制御下にＣｐｎ２１のＲＮＡフォーマットの発現をもたらす。ＰｓｐＯＭＩ／ＸｍｎＩで消化されたｐＫＧＷ１ＷＧ２ＩＩ  Ｃｐｎ２１  ＲＮＡｉからＲＮＡフォーマットで（イントロンに隣接するセンスおよびアンチセンス配列；転写された際、核酸はヘアピンループ構造を形成する）Ｃｐｎ２１を含む核酸配列を、ＳｗａＩ／ＮｏｔＩで切断されたＡＩＲ−ＡＩＡ  ｐＧｒｅｅｎ００２９由来ＡｌｃＡプロモーターを含有する骨格へ挿入し、ＡｌｃＲＣｐｎ２１ＲＮＡｉを作製した。構築体は正しいバンドパターンの確認をするためＢｇｌＩＩで消化された。ＡｌｃＲ−ＡｌｃＡ  ｐＧｒｅｅｎ００２９構築体はＧｅｎＳｃｒｉｐｔから得られる。Ａ１Ｒ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号ＸＭ＿６７７１５５）およびＡｌＡプロモーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号Ｍ１６１９６）は技術分野において既知である。
タバコ植物（タバコＳＲ１（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｃｖ．ＳＲ１））の形質転換
【０１０１】
インビトロで生育させたタバコ植物が上記の構築体（Ｃｐｎ２１ＡＳ、Ｃｐｎ２１  ＲＮＡｉ−ＲＢＣ、Ｃｐｎ２１ＡＳ−ＲＢＣ、ＡｌｃＲ  Ｃｐｎ２１  ＲＮＡｉ）でのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換のために利用された。対象の構築体を運ぶアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｉｆａｓｃｉｅｎｓ）を、抗生物質添加ＬＢ培地中で撹拌しながら（２８℃、２００ｒｐｍ）一晩、懸濁培養液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）（４００ｍｌ）で生育させた。菌液は遠心され５％スクロース中に再懸濁され、０．０２％（２００マイクロリットル（ｕＬ）／Ｌ）の濃度へとＳｉｌｗｅｔＬ−７７が添加された。インビトロで生育している植物由来の葉片は、再懸濁されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｉｆａｓｃｉｅｎｓ）へ３０分間浸され、固体ＣＴ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）上での２日間の共培養が続いた。共培養は、暗所において２２℃および湿度７０％で実行された。形質転換体は、形質転換において使用される構築体によって、選択剤（カナマイシンまたはハイグロマイシン）あるいは誘導剤（アルコール）の存在下または非存在下で、選択培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ−“ＭＳ”）を使用して選択された（培地、選択剤、誘導剤に関して表３、４参照）。斑入りを示す植物は発根し、土壌へ移植された。
【表３】
2013511262.tif 000005
【表４】
2013511262.tif 000006
【０１０２】
ハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびカナマイシン（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ）が選択剤として使用された。選択培地はまたチメンチン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）が添加された。２−４−Ｄ（Ｓｉｇｍａ）、ＢＡ（Ｓｉｇｍａ）、インドール−ｅ−酢酸（ＩＡＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびカイネチン（Ｓｉｇｍａ）がカルスおよび／またはシュート再生の誘導のために使用された。
シロイヌナズナの形質転換
【０１０３】
シロイヌナズナの形質転換は、ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ、１９９８の方法に従った。簡単には、シロイヌナズナは長日光条件（１６／８時間の光周期、湿度７０％、および２２℃）下で、培養土（ｐｏｔｓｏｉｌ）において、開花期まで生育させられた。対象の構築体（Ｃｐｎ２１ＡＳまたはＣｐｎ２１  ＲＮＡｉ  ＲＢＣ）を運ぶアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｉｆａｓｃｉｅｎｓ）を、抗生物質添加ＬＢ培地中で撹拌しながら一晩、懸濁培養液（４００ｍｌ）で生育させた。菌液は遠心され５％スクロース中に再懸濁され（ＯＤ６６０〜０．８）、０．０２％（２００マクロリットル（ｕＬ）／Ｌ）の濃度へとＳｉｌｗｅｔＬ−７７が添加された。開花している植物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｉｆａｓｃｉｅｎｓ）懸濁液へ２−３秒間浸され、２４時間プラスチックラップの下へ設置された（ｐｌａｃｅ）。乾燥成熟種子は回収され、滅菌され、かつ選択培地（５０ｍｇ／ｌ  ハイグロマイシン）または非選択培地（ハイグロマイシン無し）上で、インビトロで発芽させられた。
キャノーラの形質転換
【０１０４】
高再生効率によって特徴づけられるセイヨウアブラナＤＨ  １２０７５（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  ＤＨ  １２０７５）がシャペロニン−形質転換実験のために使用された。種子は１／２ＭＳ培地上で６日間、長日光条件（２２℃、１６／８時間の光周期、湿度７０％）下で発芽させられた。６日齢の外植片から葉柄を伴う子葉が形質転換実験のために使用された。
【０１０５】
対象の構築体（Ｃｐｎ２１ＡＳまたはＣｐｎ２１  ＲＮＡｉ−３５Ｓ）を運ぶアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｉｆａｓｃｉｅｎｓ）は、抗生物質添加ＬＢ培地中で撹拌しながら（２８℃、２００ｒｐｍ）一晩、懸濁培養液（４００ｍｌ）で生育させられた。菌は遠心によって回収され、ＣＴ培地でＯＤ６６０＝０．４で再懸濁された。子葉は葉柄部分と一緒に小植物体（ｐｌａｎｔｌｅｔ）から分離され、組織の切り口はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液へ浸された。
【０１０６】
外植片は、１００ｕｍ  アセトシリンゴン、１ｍｇ／ｌ  ２．４−Ｄおよび７５ｍｇ／ｌ  ＤＴＴが添加されたＣＴ寒天培地上で４８時間共培養された。外植片はそれから４．５ｍｇ／ｌ  ＢＡ、２００ｍｇ／ｌ  チメンチン、および５ｍｇ／ｌ  ハイグロマイシン有り無しで、および５０ｍｇ／ｌ  カナマイシン有り無し、のいずれかが補強されたＭＭＯ選択培地へ移植された。
【０１０７】
良好に成長したシュートは外植片から分離され、新鮮培地へ移植された。発根は、成長調節物質を欠き、２００ｍｇ／ｌ  チメンチン、ハイグロマイシン有り無しが添加されたＭＳ培地において実行された。良好に発根した植物は土壌で固められた（ｈａｒｄｅｎｅｄ）。植物は、１６／８時間の光周期で２３℃、アイソレーターにおいて開花期へと生育させられた。成熟した種子は収穫され、滅菌され、かつ１０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンまたは１００ｍｇ／ｌのカナマイシンが添加された選択培地上で、インビトロで発芽させられた。若芽はＰＣＲ解析のために収穫された。
【実施例１】
【０１０８】
Ｃｐｎ２１ＡＳでのタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）の形質転換
タバコＳＲ１（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｃｖ．ＳＲ１）植物は記載されるようにｃｐｎ２１で形質転換された。Ｃｐｎ２１アンチセンス配列は記載されるように、３５Ｓプロモーターの制御下で構成的に発現された。
【０１０９】
様々な斑入り模様を示す２００を超える植物が、アンチセンス配向またはＲＮＡｉにおける形質転換に続いて選択された。開花期でのＴ０植物は生育キャビネット内のアイソレーター下で生育させられた（日中２３℃／夜間１９℃；１６／８時間の光周期）。無作為に選択された１５の斑入り植物から種子が収穫され、滅菌され、かつ５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシン有りの１／２ＭＳ培地またはハイグロマイシン無しのＭＳ培地上で、インビトロで発芽させられた（表３および４）。発芽から３週間後、ＨｙｇＲおよびＨｙｇＳの苗の数が決定された。Ｔ０およびＴ１植物を、３５Ｓ−ＡＳＲおよび３５Ｓ−ＡＳＦプライマーでのＰＣＲを使用して試験し、Ｃｐｎ２１アンチセンス配列の存在を確認した。
【０１１０】
ハイグロマイシン選択培地上で生育したシュートは、さらなるシュート伸長のためにハイグロマイシンが添加されたＭＳ培地上へ継代培養された。シュート伸長段階では、いくつかの葉は端に濃緑色の組織の小さな部分を備えた薄緑色であった一方、その他は葉全体にわたって斑入りを示した。斑入りの植物はハイグロマイシン選択培地において発根を示した一方、退色した（ｂｌｅａｃｈｅｄ）葉を備える植物はより低い生存能力および減弱した生育を示した。退色した植物から種子は、産生されない、または産生された場合でも、インビトロでの栽培において発芽しない、のいずれかであった。部分的に斑入りの植物は遮光下（８００ルクス）において生育させられ、生育可能な種子を産生した。再生されたシュートの６７．４％がハイグロマイシン培地上に発根した。全てのハイグロマイシン耐性の発根した植物の１２．２％が明白に斑入りであった。
【０１１１】
斑入りのタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）植物はまたハイグロマイシン無しの培地（ＭＳ−ｈｙｇ）上でも同定された。一以上の葉の一以上の領域が差示的着色を示した場合、植物は斑入りとみなされた。形質転換の効率は、植物が選択圧無しで再生された際わずかに減少した−再生された植物の１１．３％が斑入りであり、４．４％が３週間後に発根した。これらの結果は、人工的な選択圧が無い場合、斑入り効果が形質転換された植物のマーカーとして使用され得ることを明示している。
【０１１２】
（Ｔ０植物の自家受粉によって産生された）Ｔ１植物はハイグロマイシン培地上で発芽した植物の〜２５％において斑入りを示した。
【０１１３】
非形質転換植物はハイグロマイシンを分解せず、選択培地（ハイグロマイシン含有）上で生存したシュートはアルビノであった。選択培地上で生育させられた形質転換された植物は緑色であるか、またはいくつかの緑色の組織を有していた。
【実施例２】
【０１１４】
ｃｐｎＲＮＡｉ−３５Ｓでのタバコの形質転換
記載されるようにｃｐｎＲＮＡｉ−３５Ｓでの葉組織の形質転換の後の３週間、シュートは斑入り、着色および発根を評価された。
【０１１５】
シュート再生（形成（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）および伸長）の段階の間、退色は選択条件下および非選択条件下の両方（＋／−カナマイシン再生培地）で、いくつかのシュートにおいて観察された。良好に生育しているシュートは、さらなる伸長および発根のためにＭＳ選択培地へ継代培養された。シュート伸長のこの段階で、葉の着色パターンは、葉全体におよぶ薄緑色の着色、斑入り模様または黄色端、を含んだ（図１）。斑入り植物を含む、再生されたシュートの６７．４％がカナマイシン培地上に発根した。退色した葉を備える植物はより弱く、減弱した生育を示した。全体としては、カナマイシン発根植物の４３．７％が斑入りを示した。
【０１１６】
斑入り植物はまたカナマイシン選択の無い培地上でも生育した。植物が選択圧無しで再生された際、形質転換効率はわずかに減少し、再生された少なくとも１つの斑入り植物を有する外植片の２３．３％であった。
【０１１７】
開花期でＴ０植物は生育され、種子が収穫された。退色した植物は種子を産生し損ねたか、発芽しない種子を産生したかのいずれかであった。部分的に斑入りの植物は遮光下（８００ルクス）において生育させられ、生育可能な種子を産生した。
【０１１８】
斑入り植物から収穫された種子は、Ｔ１子孫の産生のために、滅菌され、かつ適切な抗生物質（例えば５００ｍｇ／ｌのカナマイシン）を備える１／２ＭＳ培地または抗生物質無しのＭＳ培地上で、インビトロで発芽させられ、カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）およびカナマイシン感受性（ＫａｎＳ）の苗の数が３週間の生育にて集計された。Ｔ０再生個体の自家受粉は、３：１近くまたは２：１のいずれかのカナマイシン陽性／陰性植物の分離比、および３：１の斑入り陽性／斑入り陰性植物の比を生じた。斑入りのＴ１植物はカナマイシン陰性培地上で容易に同定され、かつ、退色または薄緑色の葉端、より暗い葉組織を備える、より暗い葉組織を備える明るい葉脈（ｖｅｉｎａｔｉｏｎ）、または葉全体に及ぶ多数の斑点状の（ｓｐｅｃｋｌｅｄ）／まだらの（ｓｐｏｔｔｅｄ）斑入りを含む、様々な斑入りのパターンが観察された。
【０１１９】
明白に斑入りのＴ１子孫からの組織に対しＰＣＲを使用して、ｃｐｎＲＮＡｉ−３５Ｓで形質転換された再生個体の形質転換状態を確認したが、Ｔ１種子において著しい不稔症率（ｒａｔｅ  ｏｆ  ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）が観察された。種子は選択無しのＭＳ基本栽培培地上で発芽させられ、種子の４２％が生育し、生育可能な植物を産生した。
【実施例３】
【０１２０】
Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−ＲＢＣでのタバコの形質転換
組織特異的プロモーター下のＣｐｎ２１ＲＮＡｉ−ＲＢＣで形質転換されたタバコ植物の形質転換効率は、Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５Ｓで形質転換されたものに類似していた。葉は一般的に対照（野生型）に比べてより明るく、後期生育段階で観察された形質転換された植物において斑入りを備えていた。茎の色、生存能力および形態は、形質転換された植物の栄養発生および開花期の間、非形質転換植物に類似し、種子は産生された。明白に斑入りのＴ１子孫からの組織に対してＰＣＲを使用して、再生個体の形質転換状態を確認した。
【実施例４】
【０１２１】
Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−ＡｌｃＲでのタバコの形質転換
Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−ＡｌｃＲで形質転換されたタバコ植物の形質転換効率は、Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５ＳまたはＣｐｎ２１ＲＮＡｉ−ＲＢＣで形質転換されたものに類似していた。再生された植物は通常の形態および種子生存能力を示した（Ｔ０世代に対して７８％発芽；野生型対照に対して８１％）。
【０１２２】
シュート伸長の段階の間、植物がエタノール誘導性プロモーター下のＣｐｎ２１で形質転換された場合、２％の濃度のエタノールが選択培地へ追加された。新たに生育した葉は斑入りの形態を示した（図３）。いくつかのより古い葉は新芽成長点領域において斑入りを示した。
【０１２３】
ＡｌｃＲプロモーターからの発現は、いくつかの方法のうちのいずれかによって誘導することができる：２％エタノールの栽培培地への添加；エタノール蒸気への再生個体の暴露（生育しているシュートと共に、マゼンタジャー（ｍａｇｅｎｔａ  ｊａｒ）内へ９９％エタノールを含有する小試験管を配置すること）；２％エタノールの葉への噴霧（インビトロまたはインビボ）。３つの方法全ては、葉および茎を含む、生育している組織において斑入りを誘導する。
【０１２４】
エタノール無しの培地において生育している植物の約２％もまた、斑入り模様を生じた。
【０１２５】
抗生物質無しの培地（シュート伸長の間エタノールを添加された）上で再生された発根した植物の３４．２％は明白に斑入りであった。再生された植物は土壌へ移植され、種子は産生され、収穫され、滅菌され、かつインビトロで発芽された。約３：１（発芽：不発芽）の発芽率が抗生物質選択（カナマイシン）培地上で観察された。エタノールが再生培地へ添加された際、植物の１２．８％が斑入りを示した。
【実施例５】
【０１２６】
Ｃｐｎ２１Ｓ、Ｃｐｎ２１ＡＳ、Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５Ｓでのシロイヌナズナの形質転換
シロイヌナズナはＣｐｎ２１ＡＳおよび記載されるように生育させられた遺伝子組換え子孫で形質転換された。
【０１２７】
１％未満（０．４％）の効率がｃｐｎ２１ＡＳまたはＣｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５Ｓ構築体で形質転換されたシロイヌナズナで観察され、０．２％のみが斑入りを示した。形質転換体の苗は退色を示し、かつ相当量の緑色着色を欠如した。
【０１２８】
Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５Ｓを含む形質転換体は、カナマイシン選択培地上で発根し、生育可能な種子がいくつかの斑入り植物によって生産された。カナマイシン耐性：感受性のＴ１分離比は約１：１であった；再生個体の６３．２％が斑入りであった。明白に斑入りのＴ１子孫からの組織に対してＰＣＲを使用して、Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５Ｓで形質転換された再生個体の形質転換状態を確認した。
【実施例６】
【０１２９】
Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５Ｓ、ｃｐｎ２１ＡＳでのキャノーラ（セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ））の形質転換
Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５Ｓでの形質転換効率は低く、わずかの斑入り植物がカナマイシン選択の無い培地において同定された。約３２の斑入りシュート（再生個体の総量の１．２％）がカナマイシン無しの培地において再生された。Ｔ０植物は根を発達させたが、生育は阻害された。種子発生は非形質転換植物と比較して遅延したが、しかしながら、生育可能な種子が産生され、発芽した種子は初期葉において斑入りを示し、非形質転換植物から識別可能であった（図４および５）。
【０１３０】
明白に斑入りのＴ１子孫植物からの組織に対しＰＣＲを使用して、再生個体の形質転換状態を確認した。
【実施例７】
【０１３１】
葉脈特異的プロモーターを含む構築体および遺伝子組換え植物
シャペロニン構築体の葉脈特異的発現のためのプロモーターは植物を形質転換するために使用され得る。Ｃｐｎ２１ＡＳ構築体は、標準方法に従って、３５Ｓプロモーターを取り除くために制限酵素で消化することができる。Ｉｍｌａｕら  １９９９（Ｃｅｌｌ  １１：３０９−３２２）において記載されるように増幅されたＡｔＳＵＣ２プロモーターは、切断されたベクターへライゲーションされ、構築体はシークエンシングによって確認された。簡単には、ＰＣＲ増幅はＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｍｌＩサイトを含むＨＰ−ＳＵＣ２Ｐプライマー（配列番号：１９）、およびＳａｃＩ、ＮｏｔＩおよびＮｃｏＩサイトを含むＳＮＮ−ＳＵＣ２Ｐプライマー（配列番号：２０）を使用して実行され得る。葉脈特異的プロモーターを含む得られたプラスミドは本明細書において例示された方法などの既知の方法を使用して、対象の植物組織へ形質転換され得る。
【実施例８】
【０１３２】
Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５Ｓでのイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（インディカ）の形質転換
胚培養は、２ｍｇ／ｌ  ２−４Ｄが添加された２×Ｎ６培地上で、成熟したインディカ米の種子（品種ニッポンバレ）から形成された（ｉｎｉｔｉａｔｅ）。胚培養は、３週間ごとに新鮮培地へ継代培養することによって維持された。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換のため、Ｋｕｍａｒら、２００５（Ｐｌａｎｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐ．  ２３２：  ６７-７３）の手順が使用された。再生されたシュートは、胚性カルス（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃａｌｌｕｓ）の再生培地（カナマイシン１００ｍｇ／ｌおよび２００ｍｇ／ｌチメンチンが添加された）への移植後４−６週で獲得された。伸長したシュートは選択培地上に発根した。良好に発根した植物は続いて、生育、成熟および種子の産生のために鉢へ移植された（図６）。自家受粉させられ、Ｔ１種子はカナマイシン（５００ｍｇ／ｌ）選択培地において発芽された。明白に斑入りのＴ１子孫植物からの組織に対しＰＣＲを使用して、再生個体の形質転換状態を確認した。
【実施例９】
【０１３３】
Ｃｐｎ２１ＲＮＡｉ−３５Ｓでのミナトカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）の形質転換
未成熟の胚が、Ｄｒａｐｅｒら、（２００１）．（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．    １２７：  １５３９-１５５５）の手順を使用して、胚培養のための初代外植片の資源（ｓｏｕｒｃｅ）として利用された。胚形成（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）は５ｍｇ／ｌ  ２−４Ｄが添加された培地（ＬＳ）（カルス誘導培地、ＣＩＭ）上であった。胚培養は、３週間ごとにＣＩＭ新鮮培地上へ継代培養することによって維持された。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換のためのため、Ｖｏｇｅｌら、２００６（Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ８４：  １９９-２１１）の手順が使用された。再生されたシュートは、胚性カルス（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃａｌｌｕｓ）の再生培地（０．２ｍｇ／ｌカイネチン、５０ｍｇ／ｌカナマイシンおよび１５０ｍｇ／ｌチメンチンが添加された）への移植後４−６週で獲得された。伸長したシュートは選択培地上に発根した。良好に発根した植物は続いて、生育、成熟および種子の産生のために鉢へ移植された（図７）。自家受粉させられたＴ１種子はカナマイシン（５００ｍｇ／ｌ）選択培地において発芽された。明白に斑入りのＴ１子孫植物からの組織に対しＰＣＲを使用して、再生個体の形質転換状態を確認した。
【０１３４】
それぞれ個々の参考文献が出典明示により本明細書中に組み込まれるために具体的かつ個々に示されるかのように、かつ、本明細書中に完全に説明されるかのように、全ての引用は出典明示により本明細書中に組み込まれる。本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であるという自白とみなされることもなく、そのように解釈されることもない。
【０１３５】
一以上の現在好ましい発明の実施形態は実施例として記載されている。上記のように、実施例および図に関連して、発明は全ての実施形態、改変および変種を実質的に含む。請求項において定義された本発明の範囲から逸脱することなく、多数の変種および改変が作製されることは、技術分野における当業者にとって明らかである。そのような改変の例は、実質的に同一の方法によって同一の結果を達成するための、本発明の任意の態様に対する既知の同等物との置換を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ１】
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【図８Ｂ２】
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【図８Ｂ３】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ１】
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【図８Ｄ２】
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【図８Ｄ３】
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【図８Ｄ４】
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【図８Ｅ１】
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【図８Ｅ２】
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【図８Ｅ３】
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【図８Ｆ１】
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【図８Ｆ２】
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【図８Ｆ３】
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【図８Ｆ４】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【図８Ｍ１】
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【図８Ｍ２】
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【図８Ｎ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年7月18日(2012.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2013511262000001.app
【国際調査報告】
2013511262.tif 000085
2013511262.tif 000086