(57)【要約】  本発明は、試料を分類するための不連続状態及びサインの使用について記載する。
2013526863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、
ａ．腎細胞癌を患うと疑われているヒト又は動物個体の試料を用意するステップと、
ｂ．表１０の少なくとも６遺伝子の発現を決定することにより、不連続腎細胞癌特異的状態を示すサインに関して前記試料を検査するステップと、
ｃ．ステップｂ．において決定されたサインに基づき、前記試料に不連続腎細胞癌特異的状態を割り当てるステップと
を含む、腎細胞癌疾患に罹患している疑いがある少なくとも１体のヒト又は動物患者における腎細胞癌を診断、予後、層別化及び／又はスクリーニングする方法。
【請求項２】
少なくとも、
ａ．薬学的に有効な薬剤が投与される前に、腎細胞癌を患うと疑われているヒト又は動物個体の試料を用意するステップと、
ｂ．表１０の少なくとも６遺伝子の発現を決定することにより、不連続腎細胞癌特異的状態を示すサインに関して前記試料を検査するステップと、
ｃ．ステップｂ．において決定されたサインに基づき、前記試料に不連続腎細胞癌特異的状態を割り当てるステップと、
ｄ．前記個体における疾患症状における薬学的に有効な薬剤の効果を決定するステップと、
ｅ．疾患症状及び／又は不連続腎細胞癌特異的状態における効果と、試料の初期不連続腎細胞癌特異的状態との間の相関を同定するステップと
を含む、腎細胞癌に罹患している疑いがある少なくとも１体のヒト又は動物個体の薬学的に有効な薬剤に対する応答性を決定する方法。
【請求項３】
少なくとも、
ａ．請求項２に記載の方法を用いることにより、薬学的に有効な薬剤の投与の結果、疾患症状及び／又は不連続腎細胞癌特異的状態における効果と、初期不連続腎細胞癌特異的状態との間に相関が存在するか決定するステップと、
ｂ．表１０ａサインの少なくとも６遺伝子の発現を決定することにより、腎細胞癌に罹患している疑いがあるヒト又は動物個体患者の試料を、不連続腎細胞癌特異的状態を示すサインに関して検査するステップと、
ｃ．ステップｃ．において決定されたサインに基づき、不連続及び不連続腎細胞癌特異的状態特異的状態を前記試料に割り当てるステップと、
ｄ．ステップｃ．における試料の不連続及び不連続腎細胞癌特異的状態特異的状態と、ステップａ．において相関が決定された不連続及び不連続腎細胞癌特異的状態特異的状態とを比較するステップと、
ｅ．前記患者の疾患症状における薬学的に有効な化合物の効果を予見するステップと
を含む、腎細胞癌に罹患している疑いがある少なくとも１体の患者の、薬学的に有効な薬剤に対する応答性を予見する方法。
【請求項４】
少なくとも、
ａ．薬学的に有効な薬剤が適用される前に、腎細胞癌を患う疑いがあるヒト又は動物個体の試料を用意するステップと、
ｂ．表１０の少なくとも６遺伝子の発現を決定することにより、不連続腎細胞癌特異的状態を示すサインに関して前記試料を検査するステップと、
ｃ．ステップｂ．において決定されたサインに基づき、不連続腎細胞癌特異的状態を前記試料に割り当てるステップと、
ｄ．薬学的に有効な薬剤が適用された後に、腎細胞癌を患う疑いがある前述のヒト又は動物個体の試料を用意するステップと、
ｅ．表１０の少なくとも６遺伝子の発現を決定することにより、不連続腎細胞癌特異的状態を示すサインに関して前記試料を検査するステップと、
ｆ．ステップｅ．において決定されたサインに基づき、不連続腎細胞癌特異的状態を前記試料に割り当てるステップと、
ｇ．ステップｃ．及びｆ．において同定された不連続腎細胞癌特異的状態を比較するステップと
を含む、腎細胞癌の治療のための潜在的な薬学的に有効な化合物の効果を決定する方法。
【請求項５】
表１０の遺伝子１〜２８６が過剰発現され、表１０の遺伝子２８７〜４５４が過小発現される、表１０の少なくとも１０遺伝子の発現パターンによってサインが特徴付けられる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
表１０の遺伝子１〜２８６が過小発現され、表１０の遺伝子２８７〜４５４が過剰発現される、表１０の少なくとも１０遺伝子の発現パターンによってサインが特徴付けられる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
表１１の少なくとも６遺伝子の発現を決定することにより、サインを更に細分できる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
表１１の遺伝子１〜１９が過剰発現され、表１１の遺伝子２０〜１９５が過小発現される、表１１の少なくとも１０遺伝子の発現パターンによってサインが特徴付けられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
表１１の遺伝子１〜１９が過小発現され、表１１の遺伝子２０〜１９５が過剰発現される、表１１の少なくとも１０遺伝子の発現パターンによってサインが特徴付けられる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト又は動物個体における腎細胞がんの診断、予後、層別化及び／又はスクリーニングにおける使用のための、表１０の少なくとも６遺伝子の発現パターンによって定義されるサイン。
【請求項１１】
腎細胞がんの治療のための少なくとも１種類の薬学的に有効な化合物を開発、同定及び／又はスクリーニングするための標的の読み出し情報としての使用のための、表１０の少なくとも６遺伝子の発現パターンによって定義されるサイン。
【請求項１２】
表１０の遺伝子１〜２８６が過剰発現され、表１０の遺伝子２８７〜４５４が過小発現される、表１０の少なくとも６遺伝子の発現パターンによって定義される、請求項１０又は１１に記載の使用のためのサイン。
【請求項１３】
表１０の遺伝子１〜２８６が過小発現され、表１０の遺伝子２８７〜４５４が過剰発現される、表１０の少なくとも６遺伝子の発現パターンによって定義され、表１１の少なくとも６遺伝子の発現パターンによって更に定義される、請求項１０又は１１に記載の使用のためのサイン。
【請求項１４】
表１１の遺伝子１〜１９が過剰発現され、表１１の遺伝子２０〜１９５が過小発現される、請求項１３に記載の使用のためのサイン。
【請求項１５】
表１１の遺伝子１〜１９が過小発現され、表１１の遺伝子２０〜１９５が過剰発現される、請求項１３に記載の使用のためのサイン。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
分子生物学及び分子医学が出現するまでは、疾患の多くは、その表現型の特徴に基づいて分類されてきた。これは当然ながら、表現型の特徴が明らかになったときに初めて疾患を診断できることを意味し、そのときには疾患発症のかなり後期になっている可能性がある。更に近年、類似の表現型が、異なる分子機構に起因し得ることが理解されている。したがって、採用された治療アプローチが正しい原因機構に対処しない場合、厳密に表現型に基づく治療法は、役に立たない可能性がある。
【０００２】
一例として、乳がんは、腫瘍形成に関して同一の外観をもたらす異なる分子機構によって発生し得る。このような機構のあるものは、Ｈｅｒ２の上方制御に関与し、一方、他の機構はこれに関与しないであろう。したがって、Ｈｅｒ２の過剰発現に対処する抗体ハーセプチン（Herceptin）（登録商標）による治療法は、それに対応する機構により罹患した患者にしか役に立たない。疾患の根底にある分子機構を少なくともある程度まで理解しないと、選ばれた治療法は、効果を表さない可能性がある。
【０００３】
したがって、分子生物学及び分子医学は、疾患発症の分子基盤の解読を目的とする。疾患の分子基盤をより良く理解することは、切迫した又は進行中の疾患発症の早い段階での発見に役立ち、医療従事者による早い段階での治療法の調整又は代替的な治療アプローチの開発を可能にするであろう。例えば、ハーセプチン（登録商標）が特定の群の患者にしか効果がないことを知っていれば、これらの患者を予め選択して、それに従って治療することができる。更に、異なる疾患が、少なくともある程度まで同一機構に起因することが分かっていれば、ある疾患のみのために本来開発された薬物を他の疾患の治療用に検討することもできる。当然ながら、このためには、問題の疾患に特徴的であり、適切な治療選択のための関連する機構、関連する臨床エンドポイント及び関連する判断基準に関する、多くの場合バイオマーカーと呼ばれる分子マーカーが手近にあることが必要とされる。このようなマーカーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質レベルにおいて見出され得る。
【０００４】
単一遺伝子（monogenetic）疾患の場合、疾患がある確率で発生するか否か予見するためにＤＮＡレベルの異常を用いることができるため、分子マーカーの診断ツールとしての使用は、比較的単純明快である。例えば、ＤＮＡレベルにおける三塩基配列伸長（tri-nucleotide expansion）は、個体がハンチントン舞踏病を発症するか予見するために用いることができる。同様に、生存運動ニューロン（Survival of Motor Neuron）遺伝子における変異は、個体が脊髄性筋萎縮症を発症するか予見するために用いることができる。
【０００５】
腫瘍疾患の分子理解の当初から、腫瘍発生、悪性度、進行、転移形成、治療応答性、生存時間並びに臨床医にとって及び効率的な治療法の開発にとって重要な他の機能特性に関連する分子マーカーを定義することが望まれてきた。多くの有用なマーカー、第一に組織切片（大切片、細針生検）、体液、スメア（smear）（血液、糞便、痰、尿）由来又は毛髪試料等、試料の検査のための病理学的マーカーが同定されてきた。炎症又は進行中のアポトーシスのマーカー、代謝特性のマーカー、或いはＲａｓ、Ｍｙｃ、ＣＤＫ等、癌遺伝子と、ｐ１６、ｐ２７又はｐ５３等、腫瘍抑制遺伝子との間のバランスの調節解除により誘導された腫瘍誘導の機構の理解から得られた分子マーカー等、多くのマーカーが、同定された（例えば、「The Hallmarks of cancer」（2000）におけるHanahan & Weinbergを参照）。
【０００６】
血管外漏出、浸潤及び免疫応答回避等、制御されない細胞増殖、老化及びアポトーシス回避等、腫瘍発生機構の具体的な理解は、腫瘍抑制遺伝子仮説を更に強調した。
【０００７】
しかし、がんを含む過剰増殖性（hyper-proliferative）疾患等、大多数の疾患は、単一遺伝子原因に起因せず、異常で複合的な分子相互作用によるものである。
【０００８】
例えば、がんは、複合的分子ネットワークの調節解除（軽微なものから重大なものまで）によって生じる多因子疾患の典型例であると考えられる。多くの場合、この疾患は、単一遺伝子の変異からは発症せず、寧ろ様々な遺伝子における変異の蓄積に起因する。単一の変異それぞれは、それ自体では疾患発症の開始に十分ではない可能性がある。それどころか、変異の経時的な蓄積は、細胞内の複合的分子シグナル伝達ネットワークをますます調節解除すると思われる。したがって通常、このような場合、疾患発症は、重要事象によって特徴付けることのできない緩やかで連続的な過程であると考えられてきた。その結果、このような疾患は、単一のバイオマーカーでは診断又は分類できないが、疾患の根底にある複合的分子機構を理想的には単純化された様式で反映するマーカー群によって診断又は分類できると一般に仮定される。
【０００９】
多くのヒトがんから大量の分子情報を利用できるにもかかわらず、現在のがん研究は、依然として主に、血管新生増強等、薬物標的となる可能性がある腫瘍型特異的バイオマーカー候補を理想的には有する、単一の、高頻度で変化した染色体上の座位に焦点を置いており、これは、Ｈｅｒ受容体ファミリー並びにそのリガンド及び関連する変異体の腫瘍促進的な役割の理解をもたらしている。このような試みの一部は、実際に、腫瘍治療法選択のための特定の有用なマーカーをもたらした（Ｈｅｒ−２受容体が増幅した患者のためのハーセプチン（登録商標）治療）。
【００１０】
これらの結果は全て、主に最高の専門家知識から得られた。一般及び通常の仮定として、腫瘍は、上述の標的発現のために正常組織とは異なっている筈である。したがって、多くの場合病理学的パラメータ（腫瘍サブタイプ、グレード又はステージ分類等）と関連付けられる大部分の研究は、単一の標的の調査に集中的に取り組む。特定の経路におけるその役割及びその結合パートナーは、適切な細胞株又はマウスモデルにおいて明らかになるとしても、ネットワーク全体の一部としてのその特定の役割は、依然として不明のままである。
【００１１】
ヒトゲノムプロジェクトは、疾患に罹患した個体間又は個別の細胞間の個々のゲノム変種の解析、それぞれのトランスクリプトーム、プロテオーム等の解析等、そのあらゆるスピンオフ（spin-off）プロジェクトと共に、多種多様な有用バイオマーカーを直接もたらすと想定されてきた。興味深いことに、これらのアプローチの多くにおいて、異なる分子経路を有する疾患に観察された表現型の差異を関連付ける試みが再度なされた。
【００１２】
例えば、肺がん又は前立腺がん等、例えば臓器レベルで、或いは例えば細胞型レベルで数種の明確に弁別可能なマーカーと明らかに関連する多くの疾患の種類及びサブタイプが存在する。バイオマーカーを同定するための一般的な概念は、このような表現型をバイオマーカーの別個の組合せと関連付け、これによりそれぞれの表現型を示す特定の疾患サブタイプの診断を可能にすることである。例えば、このようなアプローチは、健常個体に対する罹患した患者の小細胞肺がん組織又は非小細胞肺がん組織における異なるプロテオーム発現パターンの同定を試み、続いて、このような発現パターンを将来的な患者の診断に用いる。興味深いことに、これらのアプローチは、多くの場合、生存時間等、臨床的に関連するパラメータと、マーカーとの関連付けに着目しない。しかし、データの豊富さ及び複雑さは、このようなパターンの明快な同定をある程度妨げてきた。
【００１３】
よって、分子レベルにおける疾患の分類と、例えば診断目的に用いることのできるバイオマーカーの提供とを可能にするツールが引き続き必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の一目的は、好ましくは、臨床上又は薬理学的に関連するエンドポイントとの明らかな相関による、疾患の分類に適切且つ特異的な新しいタイプのマーカーを提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、好ましくは、臨床上又は薬理学的に関連するエンドポイントとの明らかな相関による、疾患の分類に適切且つ有効なマーカーを検出するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
後に続く説明から明らかになる上述及び他の目的は、独立請求項の内容により達成される。従属請求項は、本発明の好適な実施形態の一部に関する。
【００１７】
本発明は、基本的にあらゆる種類の腫瘍に対する、また、潜在的には非腫瘍疾患に対する臨床的関連性の網羅的且つ機能的なバイオマーカーのための戦略的且つ直接的なアプローチを提供する。不連続安定又は準安定（meta-stable）状態に関連する腫瘍に関する本知見により、あらゆる種類の腫瘍に対するこのような不連続状態の存在の同定及び証明だけでなく、このような状態と関連する記述子（descriptor）及びサイン（signature）によるこのような状態の割り当てを当業者に行わせる方法を定義できるようになった。更に、本技術は、所定の腫瘍細胞試料における別の状態からこのような不連続状態のそれぞれを疑いの余地なく同定及び識別する、最小限の記述子の同定を可能にする。
【００１８】
このような状態の理解は、定量的測定値及び実験アクセスの容易さのために大きなダイナミックレンジを有する記述子の同定も可能にする。
【００１９】
よって、本発明は、根底にある分子機構を反映する不連続状態によって疾患が特徴付けられ得るとの驚くべき知見に基づく。興味深いことに、このような不連続状態同士は互いに別個のものであり、これにより疾患発症は、連続的な過程によって特徴付けられているとは思われない。そうではなく、不連続状態は、別の不連続状態への切換えが為される特定の閾値レベルに達するまで維持されているように思われる。更に、不連続状態は、臨床上及び薬理学的に重要なパラメータと関連付けできるように思われる。しかし、必ずしも標準組織学的分類スキームと一致すると思われる必要はない。
【００２０】
各不連続状態は、異なるサインによって説明することができる。サインは、少なくとも１種類の記述子の定性的及び／又は定量的出現を反映するパターンである。好ましくは、サインは、複数の記述子の定性的及び／又は定量的出現を反映するパターンである。記述子は、原則として、試験できるいかなる分子、機能、サイズ、形態又は細胞に関連付けることのできる他のパラメータであってもよい。よって、記述子は、例えば、遺伝子又はタンパク質やＲＮＡ等の遺伝子関連分子となることができる。このような分子の発現パターンは、サインを定義することができる。
【００２１】
本発明のこれらの知見は、様々な診断、予後及び治療目的に用いることができる。これらの知見は、過剰増殖性疾患等、疾患の新しい治療の研究及び開発に用いることもできる。
【００２２】
よって、本発明は、その一態様において、過剰増殖性疾患等、疾患に罹患している疑いがある患者から得られた試料の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるための少なくとも１種類の不連続疾患特異的状態に関する。本発明は、過剰増殖性疾患等、疾患の細胞株の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるための少なくとも１種類の不連続疾患特異的状態に更に関する。本発明は、また、薬学的に有効な化合物を開発、同定及び／又はスクリーニングするための標的として用いるための少なくとも１種類の不連続疾患特異的状態に関する。
【００２３】
不連続疾患特異的状態は、サインによって決定することができるため、本発明は、その一実施形態において、過剰増殖性疾患等、疾患の罹患が疑われる患者から得られた試料の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるための少なくとも１種類のサインに関する。本発明は、また、過剰増殖性疾患等、疾患の細胞株の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるための少なくとも１種類のサインに関する。本発明は、薬学的に有効な化合物を開発、同定及び／又はスクリーニングするための標的の読み出し情報（read out）として用いるための少なくとも１種類のサインに更に関する。
【００２４】
一部の実施形態において、本発明は、サイン及び不連続疾患特異的状態を利用することにより、過剰増殖性疾患等、疾患を診断する方法に関する。
【００２５】
本発明は、また、サイン及び不連続疾患特異的状態を利用することにより、過剰増殖性疾患等、疾患を患う試験集団の、薬学的に有効な薬剤に対する応答性を決定する方法に関する。
【００２６】
更に、本発明は、サイン及び不連続疾患特異的状態を利用することにより、臨床治験において過剰増殖性疾患等、疾患を患う患者の、薬学的に有効な薬剤に対する応答性を予見する方法に関する。
【００２７】
本発明は、また、サイン及び不連続疾患特異的状態を利用することにより、潜在的な薬学的に有効な化合物の効果を決定する方法に関する。
【００２８】
不連続疾患特異的状態及びサインの特定の使用に加えて、本発明は、また、患者に由来しても、例えば細胞株に由来してもよい試料におけるサイン及び不連続疾患特異的状態を同定するための方法に関する。
【００２９】
本発明のこれらの実施形態は全て、がん等、過剰増殖性疾患を含む疾患との関連、好ましくは、腎細胞癌との関連で用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】解析した症例のパーセンテージとして示した、ＲＣＣにおける領域的ゲノムＣＮＡを示す図である。第１〜第２２染色体（方向を示すために偶数の染色体番号が表示されている）における不均衡頻度が、−５０〜５０スケールのパーセンテージとして示されている。上パネル：４５例の試験症例における全ＣＮＡの描写であり、ゲノム増加はゼロ線より上に表され、ゲノム減少はゼロ線より下に表されている。下パネル：Ｐｒｏｇｅｎｅｔｉｘデータベース（４７２症例）を通じてアクセスできる、公表されている染色体及びアレイＣＧＨ  ＲＣＣデータ。ＣＮＶは、１００ｋｂサイズ限界の適用以外は、試験症例データにフィルターをかけていない。ゲノム増加はゼロ線より上に表され、ゲノム減少はゼロ線より下に表されている。
【図１Ｂ】ＰＡＮＴＨＥＲ分類のアウトプットにより、ＳＮＰにより以前に同定された５５７遺伝子が、７６種の上位の（superior）生物学的プロセスとマッチングされる。４種の優位な「ネットワーク」に番号が振られている。Ｙ軸は、ネットワークに関して発見された遺伝子数を０〜３８のスケールで表示する。注：マッチングの有効性を増加させるために、最初の７６９遺伝子のリストを「Ｐｕｂｍｅｄ」及び「Ｃｅｌｅｒａ」データバンクに対し同時に走査した。したがって、この棒グラフには多岐にわたるアウトプット数が示されている（ｅｘ．遺伝子／全遺伝子）。
【図２Ａ】本出願人らのＲＣＣ実験から得られた１４７種のマイクロアレイのセットに亘る、ＰＡＮＴＨＥＲによりアノテートされた血管新生由来の遺伝子を表す、ＨＧ−Ｕ１３３Ａマイクロアレイプローブセットの階層的クラスタリングを示す図である。遺伝子発現の相対的な、青：増加、白：減少。「経路」毎に、ＲＣＣ試料の全体分割を高度に表す最大４種のプローブセットクラスター（ボックス）が選択された。ＳＡＭソフトウェアによりクラスターを同定した。各列（row）は、各経路に対し解析された遺伝子を指定する。各行（line）は、解析された試料を表す。行の横と列の上にある濃度描写図（densogram）は、試料及び遺伝子のグループ化を表示する。
【図２Ｂ】本出願人らのＲＣＣ実験から得られた１４７種のマイクロアレイのセットに亘る、ＰＡＮＴＨＥＲによりアノテートされた炎症由来の遺伝子を表す、ＨＧ−Ｕ１３３Ａマイクロアレイプローブセットの階層的クラスタリングを示す図である。遺伝子発現の相対的な、青：増加、白：減少。「経路」毎に、ＲＣＣ試料の全体分割を高度に表す最大４種のプローブセットクラスター（ボックス）が選択された。ＳＡＭソフトウェアによりクラスターを同定した。各列（row）は、各経路に対し解析された遺伝子を指定する。各行（line）は、解析された試料を表す。行の横と列の上にある濃度描写図（densogram）は、試料及び遺伝子のグループ化を表示する。
【図２Ｃ】本出願人らのＲＣＣ実験から得られた１４７種のマイクロアレイのセットに亘る、ＰＡＮＴＨＥＲによりアノテートされたインテグリン由来の遺伝子を表す、ＨＧ−Ｕ１３３Ａマイクロアレイプローブセットの階層的クラスタリングを示す図である。遺伝子発現の相対的な、青：増加、白：減少。「経路」毎に、ＲＣＣ試料の全体分割を高度に表す最大４種のプローブセットクラスター（ボックス）が選択された。ＳＡＭソフトウェアによりクラスターを同定した。各列（row）は、各経路に対し解析された遺伝子を指定する。各行（line）は、解析された試料を表す。行の横と列の上にある濃度描写図（densogram）は、試料及び遺伝子のグループ化を表示する。
【図２Ｄ】本出願人らのＲＣＣ実験から得られた１４７種のマイクロアレイのセットに亘る、ＰＡＮＴＨＥＲによりアノテートされたＷｎｔ「経路」由来の遺伝子を表す、ＨＧ−Ｕ１３３Ａマイクロアレイプローブセットの階層的クラスタリングを示す図である。遺伝子発現の相対的な、青：増加、白：減少。「経路」毎に、ＲＣＣ試料の全体分割を高度に表す最大４種のプローブセットクラスター（ボックス）が選択された。ＳＡＭソフトウェアによりクラスターを同定した。各列（row）は、各経路に対し解析された遺伝子を指定する。各行（line）は、解析された試料を表す。行の横と列の上にある濃度描写図（densogram）は、試料及び遺伝子のグループ化を表示する。
【図３】ＲＣＣのＡ、Ｂ、Ｃ群及び細胞株の同定を示す図である。最も有意な生物学的プロセスのクラスタリングから構築された９２遺伝子に対する１４７種のＲＣＣ試料のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現マイクロアレイデータの二元配置（Two-way）階層的クラスタリング。遺伝子発現の相対的な、青：増加、白：減少。ＳＡＭソフトウェアによりクラスターを同定した。各列は、解析された遺伝子を指定する。各行は、解析された試料を表す。行の横と列の上にある濃度描写図は、試料及び遺伝子のグループ化を表示する。
【図４Ａ】ＲＣＣ群及び異なるがん型特異的サインの色分け地図（Heatmap）を示す図である。黄又は赤（絶対値）は、遺伝子発現の相対的増加を表示し、青又は緑（腫瘍対正常組織の比）は、相対的減少を表示する。過剰発現が観察される領域は、矢印で表示されている。Ａ）Ａ、Ｂ及びＣ型腫瘍のサブセットに亘る、腫瘍型Ａ及びＣに対する腫瘍型Ｂの約５０種の最良の分類指標（classifier）の遺伝子発現（左の像）。ＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲによるこれら遺伝子の比較メタ解析は、同一発現サインを有する複数の他の腫瘍型を明らかにした（右の像）。列は試料を表示し、行は遺伝子を表示する。最初の３４行（上から下へ、左右の像）は、表１の順番の遺伝子に対応する。最後の１６行（上から下へ、左右の像）は、表２の順番の遺伝子に対応する。最初の１６列（左から右へ、左の像）は、その内７種が乳頭状ＲＣＣ、９種が明細胞ＲＣＣである試料に対応する。これら全て状態Ｂであった。次の２４列（左から右へ、左の像）は、その内７種が乳頭状ＲＣＣ、１７種が明細胞ＲＣＣである試料に対応する。これら全て状態Ａ又はＣのいずれかであった。次の２０列（左から右へ、右の像）は、その内４種が腎臓がん及びＲＣＣ、３種が乳がん、１種が多発性骨髄腫、１種が付属器漿液性癌（adnexal serous carcinoma）、４種が未分化大細胞リンパ腫、１種が口腔扁平上皮癌、１種が胃がん、１種が結腸直腸腺腫、４種が血管免疫芽球性Ｔ細胞性リンパ腫である試料に対応する。これらは、状態Ａ又はＣのいずれかであった。次の８列（左から右へ、右の像）は、その内１種が胃腫瘍、６種が卵巣腫瘍、１種がアルドステロン産生腺腫である試料に対応する。これら全て状態Ｂであった。左の像において、左上部分及び右下部分は、過剰発現を表示する。左下部分及び右上部分は、発現低下を表示する。破線は、左、右、上及び下部分を表示する。右の像において、左上部分及び右下部分は、発現低下を表示する。左下部分及び右上部分は、過剰発現を表示する。破線は、左、右、上及び下部分を表示する。
【図４Ｂ】Ｂ）Ａ及びＣ型腫瘍のサブセット（左の像）、並びにＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲにおいて同定された相関する他の腫瘍（右の像）に亘る、腫瘍型Ｃに対する腫瘍型Ａの２４種の最良の分類指標の遺伝子発現。全サインはがん特異的であり、対応する「正常」組織において検出不能である。列は試料を表示し、行は遺伝子を表示する。最初の５行（上から下へ、左右の像）は、表３の順番の遺伝子に対応する。最初の２行は、同一遺伝子（ＲＡＲＲＥＳ１）の異なるアイソフォームを表す。最後の１９行（上から下へ、左右の像）は、表４の順番の遺伝子に対応する。最初の９列（左から右へ、左の像）は、全て明細胞ＲＣＣである試料に対応する。これら全て状態Ａである。次の１５列（左から右へ、左の像）は、その内７種が乳頭状ＲＣＣ、８種が明細胞ＲＣＣである試料に対応する。これらは状態Ｃである。次の４列（左から右へ、右の像）は、その内２種が腎臓がん、２種が甲状腺がんである試料に対応する。これらは状態Ａである。次の１２列（左から右へ、右の像）は、その内２種が子宮頸部扁平上皮癌、１種が腺癌、１種が付属器漿液性癌、３種が膀胱がん、５種が乳がんである試料に対応する。これらは状態Ｃである。左の像において、左上部分及び右下部分は、発現低下を表示する。左下部分及び右上部分は、過剰発現を表示する。破線は、左、右、上及び下部分を表示する。右の像において、左上部分及び右下部分は、発現低下を表示する。左下部分及び右上部分は、過剰発現を表示する。破線は、左、右、上及び下部分を表示する。
【図４Ｃ】Ｃ）矢印で状態Ａ、Ｂ又はＣと表示される３群を同定する、ＨＧ−Ｕ１３３Ａアレイの全プローブセットに亘る４０種のＲＣＣ試料の階層的クラスタリング（左）。３種のＲＣＣ群を明らかにする、ＳＮＰアレイ解析から同定された７６９遺伝子のサブセットを表す６６２種のプローブセットから得られた発現シグナル値に基づく４０種の（色分けされている）ＲＣＣ試料の階層的クラスタリング（右）。濃度描写図は、４０種のＲＣＣ試料間の関係性を反映する。
【図４Ｄ】Ｄ）１７６名のＲＣＣ患者における腫瘍特異的生存率のカプラン−マイヤー解析。Ａ（高ＭＶＤ、ＤＥＫ及びＭＳＨ陽性）、Ｂ（ＭＳＨ６陰性）及びＣ（低ＭＶＤ、ＤＥＫ及びＭＳＨ陽性）にグループ化されている（対数順位検定：ｐ＜０．０００１）。ｙ軸は、生存者のパーセンテージを０％〜１００％スケールで表示する。ｘ軸は、平均生存時間を０〜１００カ月スケールで表示する。
【図５】マーカーＣＤ３４、ＤＥＫ及びＭＳＨ６の組合せの抗体染色によるＲＣＣ検査ＴＭＡを用いて、Ａ、Ｂ及びＣ群を定義した。拡大画像は、内皮微小血管（ＣＤ３４）及び腫瘍細胞の核（ＤＥＫ及びＭＳＨ６）の特異的染色を図示する。
【図６】異なる抗体によるＲＣＣ検査の解析を示す図である。
【図７】腎細胞がんの漸進的変化による（evolutionary driven）分子分類モデルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下に例示的に説明する本発明は、本明細書に特に開示されていない要素（単数又は複数）や制約（単数又は複数）なしで適宜実施することができる。
【００３２】
特定の実施形態に関し特定の図を参照しつつ本発明を説明するが、これは本発明を限定するものではなく、本発明は特許請求の範囲のみにより限定される。下文に記す用語は、一般に、他に断りがなければ常識的な範囲のものであると理解されたい。
【００３３】
本明細書及び特許請求の範囲において、用語「を含む（comprising）」が用いられている場合、この用語は他の要素を除外しない。本発明のため、用語「からなる（consisting of）」は、用語「で構成される（comprising of）」の好適な実施形態であると考慮される。下文において、ある群が、少なくともある一定数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれら実施形態のみからなる群も開示すると理解されたい。
【００３４】
単数名詞について述べるときに不定冠詞又は定冠詞（例えば、「ａ」、「ａｎ」又は「ｔｈｅ」）が用いられる場合、他に特に記されていなければ、これは該名詞の複数を包含する。
【００３５】
本発明の文脈において、用語「約」又は「およそ」は、問題の特色の技術的効果を依然として保証すると当業者が理解するであろう正確性の幅を意味する。この用語は、通常、表示されている数値の±１０％、好ましくは±５％の偏差を指す。
【００３６】
上述の通り、疾患特性評価のための診断ツール探索における以前の試みは、疾患発症が連続的な過程であると仮定し、例えば肺がん等のがんの異なる主に組織学的表現型を特異的な発現パターンに関連付けようとしたが、これは、異なる検出可能な表現型が、連続的で進行性の疾患発症を反映すると仮定したためである。
【００３７】
それに代わり、本発明は、過剰増殖性疾患の異なるサブタイプに確立された組織学的特性評価とは必ずしも相関しないが、生存時間等、臨床的に関連するパラメータと関連付けることのできる不連続疾患特異的状態の限定的なセットにより、過剰増殖性疾患等の疾患を包括的に説明できるであろうとの知見に基づく。特定の科学理論又は専門家の知識に縛られることは望まないが、疾患が、不連続疾患特異的状態へと切り換えることにより特徴付けられるとの仮説を立てる。この仮説は、細胞内における制御ネットワークの調節解除が、全体の不連続状態に影響を与えることなく一定の閾値レベルまで生じ得ることを示唆する。しかし、ひとたび閾値レベルを超えると、細胞は、別の特異的不連続状態に切り換わるものと思われる。したがってこれらの状態は、切り換わる前にある程度の変動が可能であるという点において安定的又は準安定的であると考慮することができる。本出願人らは、異なる制御ネットワーク間及びネットワーク内の相互作用の流れ及び範囲を反映する不連続状態を理解する。細胞は、異なる不連続状態へと切り換わると思われるため、このような切換えは、疾患の攻撃性の変化を生じ得る、また、異なる不連続状態を例えば異なる平均生存時間に関連付けることができる理由の説明にも役立ち得る、異なる制御ネットワーク間及びネットワーク内の相互作用の流れ及び範囲の主要な再編成を表示するものと思われる。
【００３８】
興味深いことに、腎細胞癌又は卵巣がん等、異なる種類の過剰増殖性疾患において見出すことのできる不連続状態が存在し、このことは、これら疾患の少なくとも一部の形態が、同等な分子機構に関与することを示し得る。更に、特定の過剰増殖性疾患においてのみ見出すことのできる不連続状態が存在し得る。
【００３９】
このような異なる制御ネットワーク間及びネットワーク内の相互作用の範囲及び流れは、例えば、このような制御ネットワーク内の例えばタンパク質の発現レベルによって検出可能となり得る。着目される分子構造物は、記述子と呼ぶことができる。記述子のセットに対し検出されるパターンは、サインとして考慮することができる。上述の具体例において、サインは、記述子として機能するタンパク質の発現パターンとなるであろう。当然ながら、異なる種類の記述子及び異なる種類のサインを選ぶことができる。よって、ＲＮＡレベルの遺伝子発現レベルに着目してもよい。ｍｉＲＮＡの制御に着目しても、いっそ特定の因子の細胞局在等、記述子の定性的分布又は細胞の形状に着目してもよい。サインを定義するために、同一種類の分子（例えば、ｍＲＮＡ）の記述子の所定のセットを用いても、異なる分子（ｍＲＮＡ、タンパク質及びｍｉＲＮＡ等）群である記述子の所定のセットを用いてもよく、異なるサインは、例えば異なる発現パターンを反映する。よって、本発明の論理に従い、不連続状態は、異なるサインと相関し得ることに留意することが重要である。しかし、単一のサインは、１種類の不連続状態のみを定義するであろう。
【００４０】
下文に記す通り、本発明により、異なるサインによって同一の不連続状態を特徴付けることができる。
【００４１】
腎細胞癌（ＲＣＣ）に関し下文に説明する通り、このような不連続疾患特異的状態は、平均生存時間等、医学的に重要なパラメータと関連付けることができる。しかし、興味深いことに、不連続疾患特異的状態は一般的な組織学的分類スキームと必ずしも相関せず、これは、例えば異なる患者の乳頭状ＲＣＣを異なる不連続分子状態によって特徴付けることができ、よって、患者のがんが組織学的標準により同等であると分類されたとしても、患者が異なる生存期待値を有する可能性があることを意味する。更に、ＲＣＣに存在する不連続分子状態の一部が、他のがん型においても検出できることが見いだされ、これは、通常無関係であると考えられる異なるがんが、実際には、不連続状態を定義する同一分子相互作用に少なくともある程度起因することを示唆する。
【００４２】
このように、腫瘍の分子的な新規分類を目標とする発癌の新しい解釈が示唆される。この新規分類は、不連続疾患特異的状態及びサインの同定を可能にする。サインは、現在の臨床病理学的（即ち、腫瘍ステージ、サブタイプ、分化グレード、腫瘍特異的生存）、遺伝学的（即ち、対立遺伝子増加（allelic gain）／「癌遺伝子」発現の増加、対立遺伝子欠失（allelic loss）／「腫瘍抑制遺伝子」発現の減少）及び生物学的（即ち、フォンヒッペル−リンダウタンパク質制御経路）な評価の先入観なく、最初にモデルとして腎細胞癌（ＲＣＣ）において精査された。
【００４３】
異なる種類の疾患において存在し得る異なる不連続疾患特異的状態により、過剰増殖性疾患等、疾患を特徴付けることができるとの知見は、重要な意味を持つ。
【００４４】
不連続疾患特異的状態（複数可）は、患者及びその試料を別個の群へと分類するために用いることができる。不連続疾患特異的状態は、生存時間又は別の薬物への応答性等、臨床上重要なパラメータと更に関連付けることができるため、治療計画の選択において有用となるであろう。このように、不連続分子状態（複数可）は、腫瘍を臨床的に関連するサブグループ、例えば、ＲＣＣ、卵巣がん、乳がん等のサブグループへと分類する新しい仕方を提供する診断及び／又はマーカーとして用いることができる。
【００４５】
新規医薬品の開発に向けた多くのプロジェクトは、既存の治療法との差別化が不十分であること、確実性を欠く統計データ又は第ＩＩ相若しくは第ＩＩＩ相の膨大な患者数を必要とすること（これは数百万ドルの投資と長大な時間を要求する）に苦しんでいる。しかし、薬物が、例えば肺がんのサブタイプを患い、相互作用する分子ネットワークの同一の不連続疾患特異的状態によって特徴付けられる選択された患者群のみに優先的に作用することが示され得るのであれば、この薬物は、異なる疾患を患うが、同一の不連続分子状態によって特徴付けられる他の患者において検査することができる。このような臨床治験は、より小さな患者群に対し統計的に信頼のおける結果をもたらすであろうと予想できる。実際に、大規模な臨床治験が、多くのノンレスポンダーによりいかなる統計的に有意義な結果解釈もできず結果を出すことができなくても、これにより治療が有効であることを示すことができる。
【００４６】
このように、不連続状態は、臨床治験のための患者のグループ化を可能にするため、薬理学的治療の検査のための層別化ツールを提供する。実質的に生存時間の重大なパラメータにプラスの影響を与えると予想又は期待される薬物候補が同定されたと仮定すると、ＦＤＡ認可を受けるために臨床治験によってこれを証明する必要がある。将来的な薬物は、機構的な治療介入に重点を置くことになるであろう。機構的に有効な薬剤は、臨床エンドポイントパラメータ「生存時間」に関して成功する場合、恐らく、パラメータ「生存時間」と関連付けられた機構と選択的に相互作用する。これらの機構的サブグループはまさに、例えば、本発明によって可能になった不連続分子状態によって定義されたサブグループである。よって、ほぼ確実に、ある患者サブグループが、別のサブグループとは異なる程度に陽性反応すると考えることができる。この患者コホート特異的不均衡の知識は、薬物認可を求めている業界にとって最大級に重要であり、これを知ることは、医師が最適の治療計画を選ぶために、また支払人（payor）が、治療成功の見込みを持って患者に最も効率的に金銭を使うために重要である。平均余命延長の観点において最大の相対効果で反応するサブグループの定義はいずれも、ＦＤＡ登録の可能性を高める。
【００４７】
不連続疾患特異的状態に関する知識は、医薬製品開発における標的としてのこれら状態の使用も可能にする。例えば、異なる不連続特異的疾患状態は、生存時間又は特定の薬物に対する奏効率等、臨床的に関連するパラメータと関連付けることができる。薬剤が、試料又は細胞株における不連続疾患特異的状態を、短い生存時間と関連付けられる状態から長い生存時間の状態へと切り換えることが示される場合、このような切換えは、薬剤が問題の疾患の治療において治療上有効となり得ることの指標として用いることができる。このように、不連続疾患特異的状態と、例えば関連する臨床パラメータとの間の相関を利用するアッセイを考案することができる。
【００４８】
更に、不連続疾患特異的状態それ自体が存在することを知っていると、新しい不連続疾患特異的状態の同定ができるようになる。例えば、本発明は、ＲＣＣを３種の異なる不連続疾患特異的状態によっておおまかに特徴付けできることを示す。このような不連続疾患特異的状態の一部は、例えば、卵巣がん等、ＲＣＣとは異なるがんにも更に存在することが示されている。しかし、全ての卵巣がんが、ＲＣＣに見いだされた不連続状態に関連付けられるという訳ではなく、これは、卵巣がんに対して異なる不連続疾患特異的状態を同定する必要があることを意味する。この文脈において、本発明はまた、不連続分子状態を同定するための、或いは実質的な患者サブセットの新規不連続疾患特異的状態を統計的に除外するための方法を提供する。例えば、本発明は、ＲＣＣの全症例が、３種の別個の不連続疾患特異的状態に起因し得ることを示す。
【００４９】
これらの方法の論理は、不連続状態下の不連続準状態（substate）と、不連続準状態下の更なる不連続準状態（命名法を分かり易くするため不連続レベルと呼ぶことができる）の定義に用いることもできる。この不連続準状態及び不連続レベルは、疾患の更により細かいレベルでの説明を可能にし得る。
【００５０】
よって、本明細書において同定された特異的不連続疾患特異的状態は、ＲＣＣを特徴付けるだけではなく、一般に他のがん又は疾患の特徴付けに用いることもできる。更に、これは、他の不連続疾患特異的状態が、これら他の疾患に存在するかの指針を提供することができる。
【００５１】
本発明は、このような不連続疾患特異的状態それ自体を同定するための方法と、不連続疾患特異的状態の検出に用いることのできる記述子のサインを同定するための方法とを更に提供する。ＲＣＣに関し、本発明は、その発現パターン（即ち、サイン）が、平均生存時間に応じたＲＣＣの分類を可能にする遺伝子記述子のリストを実際に提供する。
【００５２】
不連続疾患特異的状態が存在し、そのあらゆる面で疾患発症を推し進めることを知っていれば、記述子のサインを同定することができ、続く診断検査においてそれを用いて、異なる種類の過剰増殖性疾患等、疾患を分類することができる。このように、これら記述子のサインは、疾患又はそのサブタイプ分類のための読み出し情報として機能する。
【００５３】
次に、本発明及びその実施形態をより詳細に説明する。次の定義をより完全に理解するため、ＲＣＣに関連する知見の大まかな概略を記す。その次に、不連続疾患特異的状態の同定を可能にするデータを後に更に詳細に記す。
【００５４】
大多数のＲＣＣが、乳頭状、嫌色素性及び明細胞ＲＣＣとしてのその組織学的特性評価にかかわりなく、長い、中間的及び短い生存時間を示す３種の不連続疾患特異的状態に分類できることが見いだされた。このように、不連続疾患特異的状態は、腫瘍の攻撃性を反映するであろう。以下、Ａ、Ｂ及びＣと称するこれら３種の不連続分子状態の読み出し情報は、発現パターン、即ち限定的な記述子セット、即ち遺伝子のサインである。次に、同一のサイン、即ち同一遺伝子の発現パターンは、リンパ腫、骨髄腫、乳がん、結腸直腸がん又は卵巣がん等、他のがん型において少なくともある程度検出された。この結果は、異なる過剰増殖性疾患の発生が、少なくともある程度同一の分子機構に関与することを示唆する。更に、この知見は、異なる過剰増殖性疾患が、同一の不連続疾患特異的ステージにある程度分類できることを示唆する。そして、これらの状態は、これら異なる過剰増殖性疾患の生存時間の予後を可能にする。ＲＣＣのサイン、そして不連続疾患特異的状態を同定するため、これら異なるがん又は他の疾患における更に別の不連続疾患特異的状態の同定に適用できる発現データの階層的クラスタリングアプローチを用いた。このアプローチの主な特色は、少なくとも２種の異なる制御ネットワークに由来する記述子に着目することである。
【００５５】
次に、本出願人らは、本発明の理解に有用な定義を提示し、その後に本発明をより詳細に記す。
【００５６】
「状態」は、少なくとも２体の患者由来の少なくとも２種の生物学的試料において同定され、標準状態に対し参照される細胞又は分子レベルの単一の記述子又は複数の記述子によって説明することのできる、安定的又は準安定的な一群の細胞及び／又は細胞集団を意味する。下文に説明されている通り、このような状態は、少なくとも２種の制御ネットワークから得られた記述子を解析することにより同定することができる。下文に説明されている通り、このような状態は、少なくとも１種類又は様々なサイン又は代替サインによって特徴付けることができる。
【００５７】
「準状態」は、少なくとも２体の患者由来の少なくとも２種の生物学的試料において同定され、標準状態に対し参照される細胞又は分子レベルにおいて少なくとも２種の記述子により説明することができる状態下の安定的又は準安定的な一群の細胞を意味する。下文に説明されている通り、このような準状態は、少なくとも２種の制御ネットワークから得られた記述子を解析することにより同定することができる。下文に説明されている通り、このような準状態は、少なくとも１種類又は様々なサイン又は代替サインによって特徴付けることができる。
【００５８】
「レベル」は、少なくとも２体の患者由来の少なくとも２種の生物学的試料において同定され、標準状態に対し参照される細胞又は分子レベルの少なくとも３種の記述子によって説明することのできる準状態下の安定的又は準安定的な一群の細胞を意味する。下文に説明されている通り、このようなレベルは、少なくとも２種の制御ネットワークから得られた記述子を解析することにより同定することができる。下文に説明されている通り、このようなレベルは、少なくとも１種類又は様々なサイン又は代替サインによって特徴付けることができる。
【００５９】
定義によれば、異なる状態、準状態及びレベルは、異なる安定（stabile）、準安定した（metastabile）一群の細胞を指し、これは、これら一群が、細胞内で相互作用する少なくとも２種の制御ネットワークの分子の種類及び範囲の観点から互いに別個のものであることを意味する。異なる状態、準状態及びレベルは、異なるサインを生じる限定的な記述子セットによって特徴付けることができる。したがって、これらは、「不連続分子状態、準状態又はレベル」と称してもよい。
【００６０】
状態、準状態又はレベルが疾患を示す場合、これを「疾患特異的分子状態、準状態又はレベル」と呼んでもよい。場合によっては、疾患特異的状態、準状態又はレベルは、生存率、治療法、応答性その他等、臨床的に関連するパラメータと関連付けることができる。
【００６１】
健常なヒト又は動物対象において見出すことのできる状態、準状態又はレベルは、「健常状態、準状態又はレベル」と言ってもよい。
【００６２】
不連続疾患特異的状態、準状態又はレベルという用語は、好ましくは、不連続疾患特異的状態、準状態又はレベルによって特徴付けられたサブタイプを臨床上又は薬理学的に重要なパラメータに関連付ける新しい分類スキームに従った、異なるサブタイプの疾患の識別を可能にする。
【００６３】
用語「臨床又は薬理学的に関連するパラメータ」は、通常、臨床治験において解析されるため、好ましくは、有効性に関連するパラメータに関する。このように、これらは、疾患の組織学的外観の変化に必ずしも関係せず、寧ろ平均生存時間、無進行生存時間、特定の薬物に対する応答性、確立されたスケールシステムを利用した自覚的な患者又は医師の評価する改善、耐容性、有害事象等、重要な臨床エンドポイントに関係する。この用語は、治療に対する応答性も包含する。
【００６４】
「記述子」は、存在、構成、量、局在、共局在、化学的誘導体又は他の物理的特性（これらに限定されない）の観点から検出することができる、分子又は細胞レベルにおける測定可能なパラメータを意味する。このように、記述子は、メチル化パターン、ｍｉＲＮＡモチーフ、このようなｍｉＲＮＡモチーフの変種若しくは化学的誘導体、タンパク質若しくはペプチド、このようなタンパク質若しくはペプチドのプロセシング変種若しくは化学的誘導体又は前述の任意の組合せ等（これらに限定されない）、少なくとも１種類の特異的ｍＲＮＡ、少なくとも１種類の特異的ｍＲＮＡのプロセシング若しくは成熟化誘導体、特異的ＤＮＡモチーフ、このようなモチーフの変種若しくは化学的誘導体の存在、動態学的変動、クラスタリング、細胞局在又は共局在（これらに限定されない）の少なくとも１種類の定性的及び／又は定量的測定パラメータを報告する。
【００６５】
具体例において、記述子は、その過剰又は過小発現が、不連続疾患特異的状態、準状態又はレベル、対異なる不連続疾患特異的状態、準状態又はレベル、或いは、対不連続健常状態、準状態又はレベルの説明に用いることのできるタンパク質となることができる。異なるタンパク質、即ち異なる記述子が、その発現挙動に関して解析される場合、この記述子セットの過剰及び／又は過小発現の観察パターンは、サイン（後述を参照）と呼ぶことのできるパターンを生じる。同一の不連続状態、準状態及びレベルを説明するために異なる種類の記述子を用いてよいことを理解されたい。例えば、ある記述子セットは、第一セットのタンパク質の発現データ、第二セットのタンパク質の翻訳後修飾に関するデータ及びｍｉＲＮＡ群のデータを含むことができる。
【００６６】
好ましい記述子として、遺伝子及びｍＲＮＡ又はタンパク質等の遺伝子関連の分子が挙げられる。
【００６７】
記述子の「定性的」検出は、好ましくは、例えば細胞内における、例えばタンパク質、ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ等、記述子の局在の決定を意味する。これは、細胞のサイズ及び／又は形状も意味する。
【００６８】
記述子の「定量的」検出は、好ましくは、例えば所定の試料における記述子の存在、好ましくは量の決定を意味する。
【００６９】
好適な実施形態において、記述子の定量的測定は、遺伝子及びｍＲＮＡ又はタンパク質等の遺伝子関連の分子の量の検出に関する。
【００７０】
続いて、この記述子セットの組合せの解析によってもたらされるパターンは、サインとして考慮されることになる。
【００７１】
「サイン」は、不連続状態、準状態及び／又はレベルの特徴的な説明である、少なくとも２種の実験的に検出可能な及び／又は数量化できる記述子のセットのパターンを意味する。
【００７２】
「代替サイン」は、同一の不連続状態、準状態又はレベルの特徴付けに適したあらゆる種類の代替的なサイン候補を意味するものである。
【００７３】
シグナル伝達は、化学的又は物理的インプットシグナルに応答して化学的又は物理的アウトプットシグナルを生じるよう、外部及び／又は内部で相互作用する分子間の連絡を意味する。このように、この用語は本技術分野において一般的に用いられる。
【００７４】
本技術分野において一般に用いられる用語「シグナル伝達連鎖」は、互いに直線的に相互作用して、特異的な化学的又は物理的インプットシグナルのセットを、特異的な又は化学的アウトプットシグナルのセットへと変換する、十分な又は完全な一連の分子を意味する。よって、直線的シグナル伝達経路は、例えば、インテグリン等、特異的受容体から細胞核への段階的シグナル伝達を説明するよう定義されている。異なる直線的シグナル伝達連鎖は、互いに交差連絡（cross-communicate）し得る、或いはフィードバックループ等の制御機構を含み得ると理解される。
【００７５】
「制御ネットワーク」は、直線的に単純化されたシグナル伝達連鎖及びその相互作用の多次元的性質及び自動制御（kybernetics）を説明する。よって、この用語は、異なるシグナル伝達経路に属し得るが、その機能障害がそのあらゆる面で疾患の一因となり得る、炎症、血管新生等、生物学的プロセスに寄与し得る分子のセットを定義する。
【００７６】
制御ネットワークは、好ましくは、ＰＡＮＴＨＥＲソフトウェア（進化的関係性によるタンパク質解析（Protein Analysis Through Evolutionary Relationship）、例えば、http://www.pantherdb.org、Thomas et al、Genome Res., 13: 2129-2141（2003）、（２０、２１）を参照）によって提供される。ＰＡＮＴＨＥＲソフトウェアは、その標準パラメータで用いた場合、経路とも呼ばれる１６５種の制御ネットワークを含む。
【００７７】
用語「疾患」は、過剰増殖性疾患を包含するあらゆる種類の疾患に関する。この用語は、疾患のあらゆるステージ、例えば、初期段階等の疾患形成、疾患伝播等の疾患発達、顕性化段階、疾患維持、疾患監視等を反映する。
【００７８】
用語「過剰増殖性」疾患は、細胞の異常増殖（growth）又は増大化（multiplication）に関連するあらゆる疾患に関する。過剰増殖性疾患は、対象における病変として顕在化する疾患であってもよい。過剰増殖性疾患として、あらゆる種類の良性及び悪性腫瘍と共に、角質増殖及び乾癬等の疾患も挙げられる。
【００７９】
腫瘍性疾患として、肺がん（非小細胞肺がんを含む）、腎臓がん、腸がん、頭頸部がん、結腸（直腸）がん、神経膠芽腫、乳がん、前立腺がん、皮膚がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫その他等々、がんが挙げられる。
【００８０】
特に、検討されるがんは、腫瘍学分野における国際疾病分類（International Classification of Diseases）（http://en.wikipedia.org/wiki/carcinomaを参照）に従って定義されているがんである。このようながんとして、上皮性腫瘍等、上皮癌；扁平上皮癌等、扁平細胞腫瘍；基底細胞癌等、基底細胞性腫瘍；移行細胞乳頭腫及び細胞癌；腺腫、腺癌、形成性胃炎、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、ビポーマ、胆管細胞癌、肝細胞癌、腺様嚢胞癌、カルチノイド腫瘍、プロラクチノーマ、オンコサイトーマ、ハースル細胞腺腫、腎細胞癌、グラビッツ腫瘍、多発性内分泌腺腫、類内膜腺腫等、腺腫及び腺癌（腺）；皮膚付属器腫瘍；粘膜表皮性腫瘍；嚢胞腺腫、腹膜偽粘液腫等、嚢胞性、粘液性及び漿液性腫瘍；腺管、小葉及び髄様腫瘍；腺房細胞腫瘍；ワルチン（Warthin）腫瘍、胸腺腫等、複合型上皮性腫瘍；性索間質性腫瘍、莢膜細胞腫、顆粒膜細胞腫瘍、男化腫瘍、セルトリ−ライディッヒ細胞腫瘍等、固有性腺腫瘍（specialized gonadal neoplasm）；傍神経節腫、褐色細胞腫、グロムス腫瘍等、傍神経節腫及びグロムス腫瘍；色素性母斑、悪性メラノーマ、メラノーマ、結節性メラノーマ、異形成母斑、悪性黒子由来メラノーマ、肉腫及び間葉由来のがん、表在拡大型メラノーマ及び末端黒子型悪性メラノーマ等、母斑及びメラノーマが挙げられる。
【００８１】
用語「試料」は通常、例えば過剰増殖性疾患を患っていると疑われるヒト又は個体を意味する。このような個体は、患者と呼んでよい。よって、試料は、組織、細胞、唾液、血液、血清等となることができる。
【００８２】
用語「細胞株」は、患者の試料から開発された初代細胞株、或いは、通常ある特定の種類の過剰増殖性疾患の代表であると考えられる初代細胞株のいずれかの細胞株を言う。
【００８３】
本明細書に記載されているあらゆる方法及び使用は、その一実施形態において、少なくとも１ステップ、好ましくは全ステップがヒト又は動物の体外において実施できることを理解されたい。したがって、例えば「試料が得られる」と記述される場合、これは、試料が、好ましくはヒト又は動物の体外の形態で提供されることを意味する。
【００８４】
先ず、本発明に従ってサインを同定し得る方法について説明する。サインが、不連続疾患特異的状態を示すことを理解されたい。
【００８５】
原則として、サイン及び不連続疾患特異的状態は、過剰増殖性疾患の患者又は過剰増殖性疾患の細胞株のいずれかに由来する多数の試料に対し、少なくとも２種の異なる制御ネットワークから得られた記述子の質及び／又は量を解析することにより同定することができる。続いて、このデータは、（ｉ）記述子に亘り質及び／又は量に関してデータをグループ化すること、（ｉｉ）第二のステップにおいて、全記述子候補に亘り記述子の質及び／又は量の類似性に関して試料又は細胞株をグループ化することによって、特定のパターンに関し解析される。
【００８６】
よって、本発明は、その一実施形態において、少なくとも、
ａ．疾患を患う疑いがあるヒト若しくは動物個体に由来する疾患特異的試料又は前記疾患の細胞株における遺伝子又は遺伝子関連分子の記述子の質及び／又は量を検査するステップと、
ｂ．少なくとも、
ｉ．各記述子の結果をその質及び／又は量によって分別するステップと、
ｉｉ．全記述子に亘り、記述子の同等な質及び／又は量に関して疾患特異的試料又は細胞株を分別するステップと、
ｉｉｉ．共通の記述子セットの異なるパターンを同定するステップと、
ｉｖ．ステップａ．）ｉｉｉ．）において同定された各パターンにサインを割り当てるステップと、
ｖ．ステップｂ．）、ｉｖ．）において同定された各サインに不連続疾患特異的状態を必要に応じて割り当てるステップと
を含む、ステップａ．）において得られた結果をクラスタリングするステップと
を含む、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に関与するサイン及び必要に応じて少なくとも１種類の不連続疾患特異的状態を同定する方法に関する。
【００８７】
このような方法のため、ｍＲＮＡ又はタンパク質等の記述子の発現等、量を検出することが好ましくなり得る。しかし、ｍｉＲＮＡの局在及びプロセシング又はタンパク質の翻訳後修飾等、他の記述子の他の特性に着目することもできる。このように、例えば、記述子の局在、プロセシング、修飾、動態、発現等に着目することができる。明確にするため、ｍＲＮＡ又はタンパク質等、記述子の発現パターンに関して次の実施形態を記すが、その理由として、これらの記述子は、サインの単純明快な同定と、例えば診断及び／又は予後目的のためのその実行を可能にするからである。しかし、このような発現データへの注目は説明を目的としており、本発明を発現データに限定するものと解釈するべきではないことを理解されたい。
【００８８】
クラスタリングステップｂ．）は、様々なソフトウェアプログラムにおいて実行されるため、例えば階層的クラスタリング処理となることができる。適切なソフトウェアは、例えば、ユークリッド（Euclidian）距離及び平均連結法を用いたＴＩＧＲ  ＭｅＶソフトウェア（２３）となることができる。ソフトウェアは、そのデフォルトパラメータで用いられる。
【００８９】
クラスタリングステップは、好ましくは、例えば第一の遺伝子、即ち記述子がその発現強度によって分別され、続いて試料が全遺伝子、即ち全記述子に亘る同等な発現に関して分別される、「二元配置階層的」クラスタリングアプローチとなることができる。より詳細には、二元配置クラスタリングは、遺伝子発現強度及び腫瘍類似性に従ったソフトウェアによって実行することができる。その結果、全体的に類似の遺伝子発現プロファイルを有する腫瘍は、互いに隣接して存在する。ソフトウェアは、距離測定としてピアソン相関及び最適葉順序（Leaf Ordering）によるそのデフォルトパラメータで用いられる。
【００９０】
このアプローチが、例えば、十分な数の試料に亘り全ヒト遺伝子に対し行われる場合、所定の記述子セットの、原則としてサイン、即ち例えば発現データのパターンが出現する筈である。このようなサインの同定は、ＳＡＭ（１２）を用いて行うことができる。ソフトウェアは、そのデフォルトパラメータで用いられる。記述子セットのパターンが同定されている場合、ＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲ（１０、１１）等、代替的なソフトウェアを用いることによって精度を照合することができる。所定の記述子セットに対する異なるサインの出現は、このレベルの解像度の不連続疾患特異的状態の存在と同等であることを理解されたい。より詳細には、二元配置クラスタリングは、遺伝子発現強度及び腫瘍類似性に従ったソフトウェアによって実行することができる。その結果、全体的に類似の遺伝子発現プロファイルを有する腫瘍は、互いに隣接して存在する。ソフトウェアは、距離測定としてピアソン相関及び最適葉順序によるそのデフォルトパラメータで用いられる。
【００９１】
この一般アプローチは、例えば、利用できる試料の数又は必要な演算能力により、実用的な観点において制限され得る。
【００９２】
しかし、これらの制限を克服し、より高い精度及び速度によるサインの同定を可能にする手段が存在する。
【００９３】
したがって、好適な実施形態において、本発明は、少なくとも、
ａ．疾患を患うヒト又は動物個体に由来する疾患特異的試料、或いは前記疾患の細胞株における遺伝子又は遺伝子関連分子の記述子の質及び／又は量を検査するステップと、
ｂ．少なくとも、
ｉ．各記述子の結果をその質及び／又は量によって分別するステップと、
ｉｉ．全記述子に亘り、記述子の同等な質及び／又は量に関して疾患特異的試料又は細胞株を分別するステップと、
ｉｉｉ．前記疾患特異的試料又は細胞株に亘り異なって制御される異なる記述子群を同定するステップと
を含む、ステップａ．）において得られた結果をクラスタリングするステップと、
ｃ．ステップｂ．）ｉｉｉ．）において同定された記述子を組み合わせるステップであって、疾患特異的試料又は細胞株における前記記述子の質及び／又は量が、ステップａ．）により既に知られているステップと、
ｄ．少なくとも、
ｉ．ステップｃ．）の各記述子の結果をその質及び／又は量によって分別するステップと、
ｉｉ．全記述子に亘り、記述子の同等な質及び／又は量に関して疾患特異的試料又は細胞株を分別するステップと、
ｉｉｉ．ステップｃ．）において得られた記述子セットの異なるパターンを同定するステップと、
ｉｖ．ステップｄ．）ｉｉｉ．）において同定された各パターンにサインを割り当てるステップと、
ｖ．ステップｄ．）、ｉｖ．）において同定された各サインに不連続疾患特異的状態を必要に応じて割り当てるステップと
を含む、ステップｃ．）において得られた結果をクラスタリングするステップと
を含む、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に関与するサイン及び必要に応じて少なくとも１種類の不連続疾患特異的状態を同定する方法に関する。
【００９４】
このアプローチは、得られたデータが同じ分別原理に従って２回クラスター化されるという点において、上述の実施形態とは異なる。よって、１回目のクラスタリングにおいて、異なる腫瘍試料又は細胞株等、異なる試料において異なって制御される、おおまかに定義された遺伝子群を特徴付けることができる。この反復クラスタリングは、データ量を低下させ、シグナルノイズ比を改善し得る。
【００９５】
二元配置クラスタリング等、下文に記載するあらゆるクラスタリング処理の試みは、同一の発現プロファイル等、記述子プロファイルの腫瘍を近接させることである。その結果得られるデンドログラムは、ある「パターン」へと濃縮される条件を伝える。
【００９６】
どちらのステップにおけるクラスタリングも、ユークリッド距離及び平均連結法を用いたＴＩＧＲ  ＭｅＶソフトウェア（２３）によって実行することができる。ソフトウェアは、そのデフォルトパラメータで用いられる。第一のクラスタリングステップ後の群の同定と、続く第二のクラスタリングステップ後のサインの同定は、ＳＡＭ（１２）を用いて行うことができる。ソフトウェアは、そのデフォルトパラメータで用いられる。記述子セットのパターンが同定されている場合、ＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲ（１０、１１）等、代替的なソフトウェアを用いることによって精度を照合することができる。
【００９７】
続く２回目のクラスタリングにおいて解析が先鋭化されるため、この１回目においては、例えば目視検査により明確に定義されていない群が取り込めるよう選択は幾分おおまかでよい。
【００９８】
原則として、できるだけ多くの遺伝子及びできるだけ多くの試料が解析されることは、解析の精度にとって有益である。しかし、例えば演算能力が制約されている場合、約５０〜約４００試料、約７５〜約３００試料、約１００〜約２００試料、好ましくは約１００試料における、約２００〜約１０００遺伝子、約２００〜約８００遺伝子、約２００〜約６００遺伝子又は好ましくは約２００〜約４００遺伝子等、約１００〜約２０００遺伝子の発現を解析することができる。
【００９９】
次に、このデータは、１回目の、例えば階層的二元配置クラスタリングに付され、異なった制御の遺伝子群が得られる。続いてこれら遺伝子群は組み合わされ、２回目の階層的二元配置クラスタリングが為される。当然ながら、１回目のクラスタリングの前に最初に得られた発現データは、２回目のクラスタリングに用いることができる。
【０１００】
このアプローチは、サイン、したがって不連続疾患特異的状態のより単純明快な同定を可能にする。一例として、乳頭状、明細胞及び嫌色素性ＲＣＣ等、あらゆる種類のＲＣＣを均等に表すであろう、約１００種のＲＣＣ試料における約２００〜約４００遺伝子の発現データを得ることができる。１回目のクラスタリングにおいて、全１００遺伝子を含む２０群を同定することができる。例えば、群１は１０遺伝子を含むことができ、群２は２０遺伝子を含むことができ、群３は６遺伝子等を含むことができる。
【０１０１】
次に、これら１００遺伝子に２回目の階層的二元配置クラスタリングが為される。続いて、ソフトウェアは、４００種の記述子セットに対し３種の識別可能なパターン、即ち、３種のサインを生じる。あらゆる種類のＲＣＣに対し３種のサインのみが存在するため、このレベルの解像度において３種の不連続疾患特異的状態が存在することが分かる。更に別のステップにおいて、次に、その発現データが３種の異なる状態の間を最も確実に識別する遺伝子セットを同定することができる。続いて、これらのサインが、例えば生存率とどのように相関するか解析することもできる。
【０１０２】
異なって制御される遺伝子を有する群の同定と、したがってサイン及び不連続疾患特異的状態の同定をより迅速に行い、最終的に記述子セットのサイズを低下させ得る更に別のアプローチも存在する。
【０１０３】
このアプローチは、公知の制御ネットワークにおける記述子の質及び／又は量の解析を探求する。あるネットワークは、他のネットワークよりも強力に、例えば腫瘍発達に寄与し得るため、例えば単一ネットワーク内における異なって発現される遺伝子の群の同定は、より単純明快となり得る。この操作はデータ量を低下させ、したがってシグナルノイズ比を改善しつつ、特定のネットワークの選別を可能にする。
【０１０４】
よって、本発明は、その特に好適な実施形態において、少なくとも、
ａ．過剰増殖性疾患を患うヒト又は動物個体に由来する過剰増殖性疾患特異的試料、或いは過剰増殖性疾患の細胞株における少なくとも２種の制御ネットワークに関連する遺伝子又は遺伝子関連分子の記述子の質及び／又は量を検査するステップと、
ｂ．少なくとも、
ｉ．少なくとも１種類の制御ネットワーク内における各記述子の結果をその質及び／又は量によって分別するステップと、
ｉｉ．１種類の制御ネットワーク内の全記述子に亘り、記述子の同等な質及び／又は量に関して疾患特異的試料又は細胞株を分別するステップと、
ｉｉｉ．各制御ネットワーク内における前記疾患特異的試料又は細胞株に亘り異なって制御される異なる記述子群を同定するステップと
を含む、ステップａ．）において得られた結果をクラスタリングするステップと、
ｃ．ステップｂ．）ｉｉｉ．）において同定された記述子を組み合わせるステップであって、疾患特異的試料又は細胞株における前記記述子の質及び／又は量が、ステップａ．）により既に知られているステップと、
ｄ．少なくとも、
ｉ．ステップｃ．）の各記述子の結果をその質及び／又は量によって分別するステップと、
ｉｉ．全記述子に亘り、記述子の同等な質及び／又は量に関して疾患特異的試料又は細胞株を分別するステップと、
ｉｉｉ．ステップｃ．）において得られた記述子セットの異なるパターンを同定するステップと、
ｉｖ．ステップｄ．）ｉｉｉ．）において同定された各パターンにサインを割り当てるステップと、
ｖ．ステップｄ．）、ｉｖ．）において同定された各サインに不連続疾患特異的状態を必要に応じて割り当てるステップと
を含む、ステップｃ．）において得られた結果をクラスタリングするステップと
を含む、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に関与するサイン及び必要に応じて少なくとも１種類の不連続疾患特異的状態を同定する方法に関する。
【０１０５】
この場合も同様に、クラスタリングは、上述の階層的二元配置クラスタリングとなることができる。どちらのステップにおけるクラスタリングも、ユークリッド距離及び平均連結法を用いたＴＩＧＲ  ＭｅＶソフトウェア（２３）によって実行することができる。ソフトウェアは、そのデフォルトパラメータで用いられる。第一のクラスタリングステップの後の群の同定と、第二のクラスタリングステップの後のサインの同定は、ＳＡＭ（１２）を用いて実行することができる。ソフトウェアは、そのデフォルトパラメータで用いられる。記述子セットのパターンが同定されていれば、ＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲ（１０、１１）等、代替的なソフトウェアを用いることにより精度を照合することができる。
【０１０６】
よって、この実施形態において、例えばソフトウェア（後述を参照）によって、特異的制御ネットワークに割り当てられる全遺伝子に対し１回目のクラスタリングを行うことになる（ステップａ〜ｂ）ｉｉｉ．））。この回のクラスタリングは、異なる制御ネットワークに対し行われることになる。このように、限定的な遺伝子セットは、ネットワーク毎にクラスター化されるため、特異的パターンが出現し得る（図２を参照）。続いて、解析された全ネットワークのこれらのパターンの記述子、例えば遺伝子が組み合わされ（ステップｃ）、組み合わせたセットが第二のクラスタリングに付される（ステップｄ）ｉ．〜ｖ．）。
【０１０７】
このサイン及び状態同定法を更に合理化することもできる。
【０１０８】
記載されている通り、多くのネットワークは、ステップｂ．）ｉｉｉ．）において同定可能な群を生じないため、１回目のクラスタリング（ステップｂ）における制御ネットワークへの集中は、サインを同定する最も信頼のおける仕方となり得る。よって、第二のクラスタリングステップのために組み合わされる遺伝子等、記述子の数は、更に低下することになる。
【０１０９】
しかし、２回のクラスタリングによる前出の（afore-described）実施形態に関し、制御ネットワーク解析において同定された全記述子群の組合せリストである記述子セットが得られるであろう。次に２回目のクラスタリングにおいて、この記述子セットは、試料を別個の不連続疾患特異的状態にグループ化するためのパターン、即ちサインを生じるであろう。ＲＣＣの場合、このアプローチが採用され（図２、図３及び図４を参照）、３種の状態Ａ、Ｂ、Ｃを同定した。
【０１１０】
１回目のクラスタリングにおいて用いられたネットワークは、ＰＡＮＴＨＥＲソフトウェアにおいて記載されているネットワークとなることができる。原則として、ＰＡＮＴＨＥＲソフトウェアの全１６５種の制御ネットワークを用いることができる。しかし、最初の選択ステップを組み入れて、所定の試料セットに対し、試料において最も影響を受ける制御ネットワークを決定してもよい。この目的を達成するため、いずれのネットワークが最も高頻度の記述子を含むか解析することができる。次に、最大、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種の最も影響を受ける制御ネットワークを選択し、これらネットワークのみに対し最初のクラスタリングステップを実行することができる。ＲＣＣの例は、一般結果、即ち、不連続疾患特異的状態の数が、４種の最も影響を受ける経路を解析するか、或いは７６種の影響を受ける全経路を解析するかに応じて異ならないことを示す。当然ながら、数を減らした経路に着目すれば、２回目のクラスタリングに用いられる記述子、即ち記述子セットの数を減らすことができ、したがって、シグナルノイズ比を改善し、サイン同定を単純化することができる。
【０１１１】
解析は、疾患において影響を受ける可能性のある遺伝子等、記述子を最初に同定することにより更に単純化することができる。これは、例えば、疾患試料であることを示し得る一塩基多型（ＳＮＰ）を同定することによって行うことができる。例えば、また、実験の節に記載されている通り、組織学的解析により組織が疾患に罹患していることが確認されたある個体の疾患の影響を受けた組織に由来する試料と、組織学的解析により組織が疾患に罹患していないことが確認された同一個体の同一組織に由来する試料のＳＮＰの差異を解析することができる。次に、これらの候補遺伝子は、例えば、ＰＡＮＴＨＥＲソフトウェアを用いることにより、例えば制御ネットワークに割り当てることができる。続いて、例えばＳＮＰが同定された遺伝子の大部分を含むことから、最も高頻度に影響を受けていると思われる１、２、３、４、５種以上の制御ネットワークを同定する。その後の解析において、次に、これら最も高頻度に影響を受けるネットワークに属す全遺伝子の発現に関して疾患試料が解析されるが、なお、ＳＮＰ解析においてこれら遺伝子の全てが同定された訳ではない。次に、前述の方法においてこの発現データを用いる。
【０１１２】
メチル化、リン酸化等を同定する方法等、このような候補記述子を生じるいかなる初期選択方法を用いてもよい。
【０１１３】
原則として、僅か、例えば２種の制御ネットワークによる上述のアプローチを用いて、僅か２種の試料を解析すれば十分と思われる。通常、より多くの制御ネットワークを検討し、より多くの試料を検査すれば、解析の信頼性及び解像度は増加するであろう。十分な結果は、例えば約７５種、１００種、１５０種又は２００種等、少なくとも約５０種の試料を検査することにより得ることができる。制御ネットワークの観点から、例えば、発現データから明らかとなり得るように、最も影響を受けると思われる約３、４又は５種のネットワークの解析で十分となり得る。
【０１１４】
記述子セットは、必ずしも異なるサインを生じる必要がないことを理解されたい。よって、選ばれた記述子セットは、１種類のサインしか生じないことがある。これは、それによって、試験された疾患が１種類の不連続疾患特異的状態のみを有することを示すであろう。当然ながら、これは、解析が、明細胞、乳頭状及び嫌色素性ＲＣＣの試料等、あらゆる関連する種類の疾患を網羅する包括的な試料セットにより行われたことを想定する。当業者であれば、あらゆる関連する疾患サブタイプの大部分が解析のために網羅されていることを確信するために十分な数の試料を選択する仕方を理解しているであろう。
【０１１５】
当然ながら、所定の記述子セットは、２、３、４、５種以上のサイン等、複数のサインを生じてもよい。サインの数は、このレベルの疾患解像度において観察され得る不連続疾患特異的状態の数を示すであろう。例えば、小細胞肺がんの包括的な試料セットを解析し、例えば、３種のサインを同定する場合、これは、３種の不連続疾患特異的状態により小細胞肺がんを特徴付ける得ることを意味する。非小細胞肺がんを解析に含める場合、２種の追加的なサインを同定することができ、このことは、非小細胞及び小細胞肺がんのレベルにおいて、これらのがんを５種の不連続疾患特異的状態に分類できることを意味する。このように、試料の種類の選択は、いずれの疾患レベルにおいて不連続疾患特異的状態を観察できるかを定義する。
【０１１６】
所定のサインが、疑いの余地なく不連続疾患特異的状態に関係すると理解することが更に重要である。しかし、不連続疾患特異的状態は、いずれの種類及び組合せの記述子がサインの同定に用いられたかに応じて、複数のサインにより説明することができる。
【０１１７】
したがって、上述のアプローチは、サイン及び不連続疾患特異的状態を同定するための数多くの可能性のうちのほんの一部を提供する。例えば、バイクラスタリング（Biclustering）等、二元配置階層的クラスタリング以外のクラスタリング方法を用いてもよい。これらの方法は、一般に、例えば類似の形質を有する腫瘍の試料を一緒にまとめる。本発明の発見は、腫瘍群となることのできるこれら「整列された試料群」が、次に、疾患の特徴付けに用いることのできる不連続疾患特異的状態として考慮できることである。
【０１１８】
一般に、遺伝子又は遺伝子関連分子の完全なセット又はサブセットに亘り、記述子に起因し得るパラメータ（発現等）の類似性に応じて試料をグループ化することにより群を同定することができ、類似性は、好ましくは、ユークリッド距離、ピアソン相関、スピアマン相関又はマンハッタン距離等、統計的距離測定を用いて測定される。
【０１１９】
しかし、例えば二元配置階層的クラスタリングに頼る上述のアプローチは、容易にアクセスでき、大規模に試験できるパラメータ（例えば、ＲＮＡ又はタンパク質レベルにおける発現）を利用するため、所定の解像度の不連続疾患特異的状態の数を同定するため、また、これらの状態を説明するサインを同定するための重要なツールを提供する。
【０１２０】
前述の方法等により、記述子セットに対し多くのサインを同定すると、異なるサイン間の最も優れた識別に必要な記述子の数を更に減らすことができる。
【０１２１】
この目的を達成するため、異なる不連続疾患特異的状態の最も優れた差別化を可能にする記述子に関して、上述の解析により疾患特異的状態が分かる試料を解析することができる。これらの記述子は、必ずしも不連続疾患特異的ステージの同定を最初にもたらした記述子である必要はない。
【０１２２】
例えば、例えば遺伝子の発現データを利用する上述の方法により、腫瘍試料等、疾患特異的試料の不連続特異的状態を同定すると、全部でおよそ２４．０００遺伝子に亘る発現の不連続疾患特異的状態が分かる試料を解析することができる。次に、異なる不連続疾患特異的状態の試料間で最も異なって制御される遺伝子を選択することができ、これらの発現パターンをサインとして用いることができる。この種の解析は、マイクロアレイ発現解析によって行うことができる。
【０１２３】
例えば、この例において、９２遺伝子、即ち記述子の発現データは、ＲＣＣの３種のサイン、したがって３種の不連続疾患特異的状態Ａ、Ｂ及びＣの同定を可能にする（図３を参照）。更なる解析において、不連続疾患特異的状態Ａ、Ｂ又はＣいずれのものであるか分かるようになった試料を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップを用いておよそ２０．０００遺伝子の発現に関して解析した。次に、ソフトウェアを用いて、不連続疾患特異的状態Ａ、Ｂ又はＣの試料間で最も異なって制御される遺伝子を同定した。特定の遺伝子リスト（後述を参照）に着目することにより、試料を不連続ＲＣＣ特異的状態Ｂ並びにＡ及びＣを表すＡＣへと最初に最も良く割り当てることができることが判明した。続いて、追加的な遺伝子に着目することにより、状態ＡＣは、Ａ及びＣへと更に識別することができる。
【０１２４】
このアプローチを用いて、約５０遺伝子のセットを同定した。これらの遺伝子（表１）のうち約３４種の過剰発現と、これら遺伝子のうち約１６種の過小発現は、状態Ｂ対Ａ及びＣの間の最適な区別を可能にする。別の解析は、約４（表３）遺伝子の群の過剰発現及び約１９遺伝子（表４）の群の過小発現が、状態Ａ及びＣの識別に良く適していることを明らかにした。これらの遺伝子は、必ずしも不連続疾患特異的状態を本来同定した約９２遺伝子と同一である必要はない。
【０１２５】
表１、２、３及び４との関連における用語「遺伝子」が、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップにおけるプローブを意味することを理解されたい。表１、２、３及び４は全て、明瞭な同定を為すプローブ識別子（identifier）を命名する。プローブ識別子のＤＮＡ又はアミノ酸配列が分かっていればそれが表示されている。表１、２、３及び４に関する下文のあらゆる記述は、好ましくは、ＤＮＡ及び／又はアミノ酸配列が公知の遺伝子のみを包含する。
【０１２６】
約５０％以上の信頼性で状態Ｂを同定するためには、例えば、それぞれ表１又は２の少なくとも１遺伝子の過剰又は過小発現を検査すれば十分である。約８０％以上の信頼性で状態Ｂを同定するためには、それぞれ表１又は２の少なくとも２遺伝子の過剰又は過小発現を検査すれば十分となり得る。約９０％以上の信頼性で状態Ｂを同定するためには、それぞれ表１又は２の少なくとも３遺伝子の過剰又は過小発現を検査すれば十分となり得る。約９５％以上の信頼性で状態Ｂを同定するためには、それぞれ表１又は２の少なくとも５遺伝子の過剰又は過小発現を検査すれば十分となり得る。約９９％以上の信頼性で状態Ｂを同定するためには、それぞれ表１又は２の少なくとも６遺伝子の過剰又は過小発現を検査すれば十分となり得る。
【０１２７】
約５０％以上の信頼性で状態Ａ対Ｃを同定するためには、例えば、それぞれ表３又は４の少なくとも２遺伝子の過剰又は過小発現を検査すれば十分である。約７０％以上の信頼性で状態Ａ対Ｃを同定するためには、それぞれ表３又は４の少なくとも３遺伝子の過剰又は過小発現を検査すれば十分となり得る。約８０％以上の信頼性で状態Ａ対Ｃを同定するためには、それぞれ表３又は４の少なくとも４遺伝子の過剰又は過小発現を検査すれば十分となり得る。約９０％以上の信頼性で状態Ａ対Ｃを同定するためには、それぞれ表３又は４の少なくとも５遺伝子の過剰又は過小発現を検査すれば十分となり得る。約９５％以上の信頼性で状態Ａ対Ｃを同定するためには、それぞれ表３又は４の少なくとも６遺伝子の過剰又は過小発現を検査すれば十分となり得る。約９９％以上の信頼性で状態Ａ対Ｃを同定するためには、それぞれ表３又は４の少なくとも７遺伝子の過剰又は過小発現を検査すれば十分となり得る。
【０１２８】
異なるサインと、したがって不連続状態を最も良く識別できる記述子セットを同定するために、ＳＡＭソフトウェア（１２）を用いて、発現レベルの少なくとも２倍の変化を選択パラメータとして設定することができる。サインの精密性を高めると同時に、異なるサイン間の区別に用いられる記述子の数を減らしたければ、３、４、５以上等、閾値を高くすることができる。
【０１２９】
本発明は、不連続疾患特異的状態、サイン等を同定する方法について記述する際は常に、記述子の質及び／又は量を検査する必要があると考えていることに留意されたい。この検査は、例えば、遺伝子発現を決定するためのマイクロアレイの使用等、技術手段を包含することができる。本発明が、記述子の質及び／又は量を示すデータであって、技術手段を用いた決定後に例えばデータベースに寄託されたデータに依存し、これを使用することによるこのような方法の適用を検討する場合、これらの方法は、コンピュータ等、技術機器において実施されるであろう。したがって、不連続疾患特異的状態、サイン等を同定するための、本明細書に記載されているあらゆる方法は、コンピュータ実行様式で行うことができる。
【０１３０】
実施例から明らかになる通り、ＲＣＣに関し同定された不連続疾患特異的状態は、他の過剰増殖性疾患においてもある程度見られる可能性がある。
【０１３１】
よって、上述の方法は、過剰増殖性疾患の患者試料又は過剰増殖性疾患の細胞株等、試料セット内における包括的なセットのサインと、したがって不連続疾患特異的状態の同定に適している。次に、サイン及び状態は、平均生存時間等、臨床的に関連するパラメータと相関し得るため、発現データ等、容易にアクセスできるパラメータにより、疾患の臨床上重要な特性評価をもたらすことができる。しかし、このようなサインが、それぞれの疾患の表現型上の組織学的特性評価と必ずしも相関せず、寧ろ、疾患発症を特徴付ける例えば分子レベルにおける不連続状態を説明するように見えることは新しい。
【０１３２】
上に指摘されている通り、これらの不連続疾患特異的状態は、閾値レベルに達して、別の不連続疾患特異的状態への切換えが起こるまでのある変化（例えば、変異、調節解除等）を明らかに考慮に入れている。
【０１３３】
現在、例えばＲＣＣの３種の状態が、第一の状態Ａが起こり、次に状態Ｂ、続いて状態Ｃへと切り換わるような連続した状態を表すのか、或いはこれらの状態が並行して起こるのか、連続且つ並行した発生の組合せであるのかは明らかではない。しかし、重要な側面は、例えば、ＲＣＣ等、過剰増殖性疾患が、生存時間等、臨床的に関連するパラメータと関連付けることのできる不連続状態で起こることである。例えば、化学的化合物が、短い生存時間と相関した状態から長い生存時間と相関した状態へと細胞を切り換え得るかについて検査することができる。これについては、下でより詳細に説明する。
【０１３４】
更に、疾患を特徴付けることが判明したサイン及び状態を用いて、他の疾患を特徴付けることができる。このことは、例えば、異なる疾患を同一の状態により特徴付けることができれば、異なる疾患に対する薬学的に有効な化合物の有効性の予見を可能にする。
【０１３５】
次に、本出願人らは、サイン及び不連続疾患特異的状態を診断、予後、分析及び治療目的に使用できることを詳細に説明する。これらの態様において、不連続疾患特異的状態及びサインは、これらの用語が互換的であるかの如く並列に記される。しかし、不連続疾患特異的状態は、選ばれた記述子の種類及び組合せに応じた様々なサインによって説明され得ることに注意されたい。以下にサインという用語が用いられる場合、したがってこれは、単一の不連続疾患特異的状態の説明に用いることのできるあらゆるサインを組み入れていることを意味する。更に、サインに関して記述するあらゆる実施形態は、不連続疾患特異的状態にも等しく適用される。
【０１３６】
記述されている通り、本発明は、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患している疑いがある患者由来の試料の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるための不連続疾患特異的状態に関する。本発明は、また、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患の細胞株の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるための不連続疾患特異的状態に関する。本発明は、更に、薬学的に有効な化合物開発の標的として用いるための不連続疾患特異的状態に関する。
【０１３７】
本発明は、また、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患している疑いがある患者由来の試料の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるためのサインであって、少なくとも１種類の記述子の定性的及び／又は定量的パターンを含み、不連続疾患特異的状態を示すサインに関する。状態に関して、本発明は、また、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患の細胞株の分類における、診断及び／又は予後マーカーとして用いるためのサインであって、少なくとも１種類の記述子の定性的及び／又は定量的パターンを含み、不連続疾患特異的状態を示すサインに関する。更に、本発明は、薬学的に有効な化合物の開発、同定及び／又は適用における標的の読み出し情報として用いるためのサインであって、少なくとも１種類の記述子の定性的及び／又は定量的パターンを含み、不連続疾患特異的状態を示すサインに関する。標的は、サインによって反映される不連続疾患特異的状態となることができる。
【０１３８】
上述の通り、不連続疾患特異的状態は、少なくとも２体の患者に由来する試料又は細胞株における少なくとも２種の制御ネットワークを比較することにより同定された、少なくとも２種の記述子を含む１又は複数のサインによって説明することができる。
【０１３９】
不連続疾患特異的状態及びそれに関するサインは、診断目的に用いることができる。よって、過剰増殖性疾患等、疾患を患う患者の試料をその不連続疾患特異的状態に関して解析し、それに従って分類することができる。試料の分類と、したがって患者の診断における不連続疾患特異的状態の重要性は、ＲＣＣの実験から明瞭となる。
【０１４０】
これらの例は、ＲＣＣをその不連続疾患特異的状態に基づき区別する方が、乳頭状、明細胞及び嫌色素性ＲＣＣ等、その表現型上の分類よりも情報価値が高くなり得ることを示す。実際に、実験は、異なる患者に由来する乳頭状ＲＣＣ試料は、その不連続疾患特異的状態が異なる可能性があることを示す。その一方で、異なる乳頭状及び明細胞ＲＣＣを同一の不連続疾患特異的状態により特徴付けることができる。
【０１４１】
このように、腫瘍は、組織学的レベルで同等のように見えていても、根底にある分子機構の観点で異なっている可能性がある。逆に、腫瘍は、異なる組織学的特性を示していてもなお、不連続疾患特異的状態の観点から同一の根底にある分子機構を共有し得る。ＲＣＣに関して同定され得る３種の不連続疾患特異的状態が、平均生存時間と明確に相関することを考慮すると、例えばその組織学的特性ではなくその不連続疾患特異的分子状態による試料の分類は、新しい重要な分類スキームを提供する。更に、不連続疾患特異的状態に関する知識は、組織学的変化又は他の表現型上の特性が未だ識別不能な時点の早い段階で患者から得られた試料における、進行中の疾患発症の診断に有用となり得る。
【０１４２】
よって、本発明は、その一態様において、少なくとも、
ａ．疾患に罹患している疑いがあるヒト又は動物個体の試料を用意するステップと、
ｂ．前記試料をサインに関して検査するステップと、
ｃ．ステップｂ．）において決定されたサインに基づき、前記試料に不連続疾患特異的状態を割り当てるステップと
を含む、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患している疑いがある少なくとも１体の患者における、或いは疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患の少なくとも１種類の細胞株における疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患を診断、層別化及び／又はスクリーニングする方法に関する。
【０１４３】
試料は、腫瘍試料となることができる。
【０１４４】
サインを検査する様々な仕方が存在し得る。サインが未だ知られていない場合、上述の通りこれを同定することができる。サインが既に知られている場合、サインの同定に用いられた記述子の質及び／又は量を解析することにより、これを検査することができる。異なる状態間の最も優れた差別化を可能にする最適化されたサインを用いることもできる。例えば、サインが、所定の遺伝子又はＲＮＡ若しくはタンパク質等、遺伝子関連分子のセットの発現データに基づく場合、この分子セットの発現パターンを単純に決定することによりサインを検査することができる。これは、マイクロアレイ発現解析等、標準方法により行うことができる。
【０１４５】
サインを同定すれば、このサインと相関する不連続疾患特異的状態も分かる。よって、このような方法を用いて、同一の不連続疾患特異的分子状態をもたらす一般的な分子機構により、患者試料を分類することができる。このような不連続疾患特異的状態が、表現型上の変化が明らかとなる前に生じる場合、したがって、早い段階でのＲＣＣ等、過剰増殖性疾患の診断が可能となる。
【０１４６】
好ましくは、「不連続疾患特異的状態、準状態又はレベル」は、これなしでは一般レベルで診断されてしまう疾患をカテゴリー化するための新しい層別化ツールとして用いられる。
【０１４７】
よって、本発明は、その一実施形態において、好ましくは、過剰増殖性疾患等、疾患を不連続疾患特異的状態、準状態及びレベルを示すサインに関して解析することによる、上述の不連続疾患特異的状態、準状態、レベル等の同定に関する。この解析は、例えば、ＲＣＣ、肺がん、乳がん等、特定の種類の過剰増殖性疾患に関して行われるであろう。このように、疾患は、罹患した臓器等、一般的な選択判断基準により同定することができる。しかし、例えば組織学的分類スキームに基づくこれら過剰増殖性疾患の細分類に最初から注意することはない。例えば、ＲＣＣ等の疾患の異なる不連続疾患特異的状態を同定すれば、表現型上の変化が認識不能な時点で早くも、進行中の疾患発症に関して上述の通り試料を検査することができる。したがって、不連続疾患特異的状態は通常、問題の疾患のいずれのサブタイプが発症しているか直接的に予見させる（例えば、ＲＣＣの状態Ａ、Ｂ又はＣ）。これらのサブタイプは、例えば、生存時間等、臨床的に関連するパラメータと相関する。このように、不連続疾患特異的状態、準状態又はレベルという用語は、好ましくは、サブタイプを臨床上又は薬理学的に重要なパラメータと関連付ける新しい分類スキームに従った、疾患の異なるサブタイプの識別を可能にする。よって、不連続疾患特異的状態が疾患に存在し、必ずしもその組織学的特性によってではなく、臨床上又は薬理学的に関連するパラメータによって特徴付けられるサブタイプと相関し得るとの本発明の知見は、不連続疾患特異的状態、準状態及びレベルに基づく新しいコードによる疾患の解読を可能にする。
【０１４８】
不連続疾患特異的状態が、例えばＲＣＣその他の過剰増殖性疾患に存在するという知識を用いて、ＲＣＣ又は他の過剰増殖性疾患の新しい治療のための臨床治験を受けている患者コホートを層別化することもできる。本明細書において言及されている通り、特定の薬学的に有効な薬剤は、特定の不連続疾患特異的状態においてのみ作用し得る。このような有効な薬剤による臨床治験を受ける患者コホートが、他の不連続疾患特異的状態の個体から主になる場合、特定の不連続疾患特異的状態において薬学的に有効な薬剤のいかなる効果も識別不能となり得る。しかし、このような効果は、患者コホートが不連続疾患特異的状態に従って群分けされていれば、統計的に有意となり得る。よって、不連続疾患特異的状態の存在に関する知識を用いて、その不連続疾患特異的状態に従い、臨床治験を受けている試験集団を層別化することができる。
【０１４９】
更に、不連続疾患特異的状態が分かれば、その存在に関する知識を用いて、異なる過剰増殖性疾患におけるサブタイプとしても同様に生じるか検査することができる。よって、不連続疾患特異的状態、準状態及びレベル並びにそれらに関するサインを用いて、これらサブタイプの存在に関して異なる疾患をスクリーニングすることができる。
【０１５０】
このように、それぞれのサインの同定による試料のその不連続疾患特異的状態に関する分類は、過剰増殖性疾患等、疾患の診断に用いることができる。しかし、過剰増殖性疾患等、疾患の患者のものであれ、細胞株のものであれ、試料のその不連続疾患特異的状態に関する分類は、更なる意味合いを持つ。
【０１５１】
不連続疾患特異的状態が、根底にある分子的疾患機構の決定的なステージを反映すると思われることを考慮すると、状態は、平均生存時間又は薬物に対する応答性等、関連する臨床及び薬理学的パラメータと関連付けることができる。このことは、患者試料のそのそれぞれの不連続疾患特異的分子状態に関する解析が、初期時点における疾患の種類の診断を可能にするだけではなく、疾患の将来的な経過についての予後を可能にすることを意味する。よって、患者が例えばＲＣＣを患っているか、また、このＲＣＣが高悪性度又は比較的中程度の形態となるかについて早く知ることができる。次に、この予後は、薬物療法、理学療法（physical treatment）又は手術の種類について決断するときの治療目的に用いることができる。
【０１５２】
更に、試料に不連続疾患特異的状態を割り当てる可能性は、特定の薬物による治療の有効性の解析を可能にする。例えば、過剰増殖性疾患を患う患者又は患者集団を、（ｉ）薬学的に有効な薬剤による治療に対するその反応と、（ｉｉ）その不連続疾患特異的分子状態に関し検査することができる。治療に対する反応は、例えば、臨床改善の質及び量によって測定することができる。次に、治療に対するこのようなレスポンダーを不連続疾患特異的状態と相関させるよう試みることができる。特定の不連続疾患特異的状態により疾患が特徴付けられた患者が、治療に対しより順調に反応することが判明した場合、これらの患者は、治療に対しより高度な応答性を示す。
【０１５３】
よって、本発明は、一態様において、少なくとも、
ａ．薬学的に有効な薬剤が投与される前に、疾患に罹患している疑いがある少なくとも１体のヒト又は動物個体の試料を用意するステップと、
ｂ．サインに関して前記試料を検査するステップと、
ｃ．決定されたサインに基づき、不連続疾患特異的状態を前記試料に割り当てるステップと、
ｄ．前記個体における疾患症状及び／又は不連続疾患特異的状態における薬学的に有効な化合物の効果を決定するステップと、
ｅ．疾患症状及び／又は不連続疾患特異的状態における効果と、試料の初期不連続疾患特異的状態との間の相関を同定するステップと
を含む、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患している疑いがある少なくとも１体のヒト又は動物個体の薬学的に有効な薬剤に対する応答性を決定する方法に関する。
【０１５４】
サインは、上述に関して検査することができる。試料は、腫瘍試料となることができる。
【０１５５】
例えば不連続疾患特異的状態の患者の治療に対する応答性を予見できると、多くの面で有用である。例えば、このような応答性が知られている場合、治療のための患者を予め選択することができる。このように、サイン及び不連続疾患特異的状態の同定は、効果的な治療のために患者を予め選択できるコンパニオン（companion）診断法として機能する。特定の治療に応答するであろう患者を同定するためのツールは、高価な治療費を償還するためにこのような検査を必要とする公衆衛生システムにとってますます重要となっている。その不連続疾患特異的状態によって特徴付けられる特定の患者群が、特定の薬学的に有効な薬剤に対し順調に反応するか予見できることも、他の分野にとって重要である。例えば、多くの薬物は、特定の適応症に対してのみＦＤＡ等、監督官庁からその最初の販売承認を受ける。多くの場合、その次に、このような薬物が他の疾患の治療に対しても有効であるかの検査を試みる。しかし、このような臨床治験は極めて費用がかかる。
【０１５６】
特定の不連続疾患特異的状態の患者のみが、特定の薬物に対し陽性に反応したことを前もって知っており、その上でこの薬物を他の疾患に関して検査すれば、異なる疾患であっても同一状態の患者を検査する際に、陽性応答を示した不連続疾患特異的プロファイルの患者のみを選択することにより、有意により小さな患者群によりこのような臨床治験を行うことができるであろう。これらの臨床治験は、試験集団がより小さくなることを考慮するとより安価となるだけでなく、治療の効果がより顕著となるため前向きな成績をもたらす可能性もあり、したがってシグナルノイズ比が改善されるためより容易に統計方法により識別可能となり得る。
【０１５７】
治療の応答性を予見できることは、また、本発明の予後的態様の一部を形成する。
【０１５８】
本発明は、その一実施形態において、少なくとも、
ａ．上述の薬学的に有効な薬剤の投与の結果、疾患症状及び／又は不連続疾患特異的状態における効果と、初期不連続疾患特異的状態との間に相関が存在するか決定するステップと、
ｂ．疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患している疑いがあるヒト又は動物個体の試料をサインに関して検査するステップと、
ｃ．決定されたサインに基づき、不連続疾患特異的状態を前記試料に割り当てるステップと、
ｄ．ステップｃ．における試料の不連続疾患特異的状態と、ステップａ．）において相関が決定された不連続疾患特異的状態とを比較するステップと、
ｅ．前記患者における疾患症状における薬学的に有効な化合物の効果を予見するステップと
を含む、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患している疑いがある少なくとも１体の患者の、薬学的に有効な薬剤に対する応答性を予見する方法に関する。
【０１５９】
試料は、腫瘍試料となることができる。
【０１６０】
過剰増殖性疾患等、疾患が、不連続疾患特異的状態によって特徴付けられるとの発見はまた、新しい治療法上有効な薬剤の開発及び／又は同定のための新しいアプローチも提供する。
【０１６１】
上述の通り、患者由来の試料は、その不連続疾患特異的状態に応じて特徴付けることができる。更に、疾患の細胞株も、このような不連続疾患特異的状態を示し得る。不連続疾患特異的状態の患者が応答性となる薬学的に有効な薬剤は、場合により、別の不連続疾患特異的状態（sate）への切換えを誘導することができると仮定される。このような他の不連続疾患特異的状態は、全く新しい不連続疾患特異的状態か、或いは他の患者に見られた不連続疾患特異的状態となることができる。例えば、薬学的に有効な薬剤は、低い平均生存時間と相関した不連続疾患特異的状態から、より長い平均生存時間と相関した不連続疾患特異的状態への切換えを誘導することができる。不連続疾患特異的状態及びそれに関するサインは、上述の通り同定することができる。
【０１６２】
実際に、薬学的に有効な薬剤が、不連続疾患特異的状態の切換えを誘導できるのであれば、不連続疾患特異的状態及びそれに関するサインを、薬学的に有効な薬剤の潜在的な有効性の読み出し情報パラメータとして用いることができる。よって、薬学的に有効な薬剤が作用する標的は、不連続疾患特異的状態である。よって、不連続疾患特異的状態は、薬学的に有効な薬剤の標的であると考慮される。
【０１６３】
したがって、本発明は、その一実施形態において、少なくとも、
ａ．薬学的に有効な薬剤が投与される前に、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患している疑いがある少なくとも１体のヒト又は動物個体又は疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患の細胞株の試料を用意するステップと、
ｂ．前記試料又は細胞株をサインに関して検査するステップと、
ｃ．決定されたサインに基づき、不連続疾患特異的状態を前記試料又は細胞株に割り当てるステップと、
ｄ．薬学的に有効な薬剤が投与された後に、前記試料又は細胞株をサインに関して検査するステップと、
ｅ．決定されたサインに基づき、不連続疾患特異的状態を前記試料又は細胞株に割り当てるステップと、
ｆ．ステップｃ．）及びｅ．）において同定された不連続疾患特異的状態を比較するステップと
を含む、薬学的に有効な化合物の効果を決定する方法に関する。
【０１６４】
試料は、腫瘍試料となることができる。
【０１６５】
例えば、生存時間の増加等、より有利な臨床パラメータと相関した不連続疾患特異的状態への切換えが観察される場合、この方法によって決定された効果は、例えば、疾患においてプラスの影響を持ち得る化合物の同定を可能にし得る。しかし、化合物が、生存時間の減少等、より不利な臨床パラメータと相関した不連続疾患特異的状態への切換えを誘導する場合、この方法は、有毒化合物の同定も可能にし得る。よって、これらの方法は、例えば、過剰増殖性疾患等、疾患における薬学的に有効な化合物の潜在的な有効性を決定するための、潜在的な薬学的に有効な化合物の開発、同定及び／又はスクリーニングにおけるアッセイとして用いることができる。これらのアッセイは、薬学的に有効な化合物の毒性を決定するために用いることもできる。
【０１６６】
活性及び／又は有毒薬物候補のためのこのような不連続状態に関係するアッセイ系は、新しい医薬品の同定に大いに役立つ。腫瘍の特定の不連続状態が、過剰増殖細胞である状況を単に暗示するだけではなく、例えば腫瘍の攻撃性又は患者の生存時間に関係するとの合理的な仮定により、サインの切換えによってモニターされる状態の切換えは、腫瘍状態を変化させるための一般的な「読み出し情報」として興味深いスクリーニングシステムを特徴付ける。そこで、「読み出し情報」は、腫瘍機能と必ずしも関係しない特定の分子標的を遮断するのではなく、機能的有効性に関連する。このようなスクリーニングシステムは、相互作用の分子標的にかかわりなく状態を切り換える任意の化合物を単純に取り上げるであろう。このようなスクリーニングは、逆転写酵素等、特定のウイルス酵素の阻害剤のスクリーニングよりも、細胞培養物におけるウイルス増殖に干渉するアッセイに酷似する。
【０１６７】
一方、このようなアッセイは、健常細胞に特徴的な状態を過剰増殖性細胞の状態に特徴的な状態に変化させる、化合物の腫瘍形成能（tumorgenicity）を暗示し得る。
【０１６８】
例えば、ＨＳ２９４Ｔ細胞の発現解析が行われた。５ｍＭアセチルシステインの投与の６時間後、発現解析により、ＲＣＣの状態Ｂに対応する不連続疾患特異的状態の存在が明らかになった。この状態は、投与前には検出できなかった。この結果は、アセチルシステインが、ＨＳ２９４Ｔ細胞においてこの状態Ｂへの切換えを誘導できることを示す。
【０１６９】
同様に、ヒト悪性末梢神経鞘腫瘍（９０−８）細胞の発現解析が行われた。これらの細胞を、ＩＣＰ３４．５欠失腫瘍退縮性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）であるＧ２０７に感染させた。感染後、発現解析により、ＲＣＣの状態Ｂに対応する不連続疾患特異的状態の存在が明らかになった。この状態は、感染前には検出できなかった。これは、ｏＨＳＶが、９０−８細胞におけるこの状態Ｂへの切換えを誘導できることを示す。
【０１７０】
メバロン酸、ＵＯ１２６、ＭＫ８８６、デフェロキサミン、パクリタキセル等、化合物は、類似の効果を持ち得る。
【０１７１】
よって、疾患の特徴としての不連続疾患特異的状態の知見は、様々な診断、予後、治療、スクリーニング及び開発のためのアプローチを可能にする。これらアプローチの多くにおいて、不連続疾患特異的状態の存在の読み出し情報パラメータとしてサインが用いられる。当然ながら、容易に且つ確実に決定できるサインの使用を目標とする。
【０１７２】
したがって、好ましくは、遺伝子又はＲＮＡ及びタンパク質等の遺伝子関連分子が記述子として用いられ、その発現パターンがサインとして機能するサインを用いることができる。このアプローチの利点は、サインを同定するために通常のマイクロアレイ発現プロファイリングに依存することである。更に、上述の同定方法を利用することにより関連するサイン及び状態を同定するために、マイクロアレイ解析から得られた既存の発現データを用いることができる。
【０１７３】
下文に記す通り、ＲＣＣにおいて３種の異なる不連続疾患特異的状態が同定された。更に、これらの状態は、卵巣癌等、他の過剰増殖性疾患において少なくともある程度まで見出された。これらの状態は、発現データに基づくサインにより説明することができる。
【０１７４】
このデータは、信頼のおける単純明快な読み出し情報を提供するため、本発明は、その一実施形態において、過剰増殖性疾患等、疾患、好ましくはがん、より好ましくは腎細胞癌の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるため、或いは薬学的に有効な化合物を開発、同定及び／又はスクリーニングするための標的の読み出し情報として用いるためのサインであって、
ａ．表１の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表２の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられるサインに関する。
【０１７５】
このサインの存在は、約５０％等、約４５〜約５５％の患者が６０カ月後に生存すると予想できる中間的平均生存時間を示す少なくともＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示すであろう。好ましくは、このサインの存在は、約４５％等、約４０〜約５０％の患者が９０カ月後に生存すると予想できる中間的平均生存時間を示す少なくともＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示すであろう。
【０１７６】
このようなサインは、
ａ．表１の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表２の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられ、それぞれ表１及び表２の少なくとも１遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定は、不連続疾患特異的状態を尤度≧５０％で割り当てる。
【０１７７】
このようなサインは、
ａ．表１の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表２の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられ、それぞれ表１及び表２の少なくとも２遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定は、不連続疾患特異的状態を尤度≧８０％で割り当てる。
【０１７８】
このようなサインは、
ａ．表１の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表２の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられ、それぞれ表１及び表２の少なくとも３遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定は、不連続疾患特異的状態を尤度≧９０％で割り当てる。
【０１７９】
このようなサインは、
ａ．表１の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表２の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられ、それぞれ表１及び表２の少なくとも４遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定は、不連続疾患特異的状態を尤度≧９５％で割り当てる。
【０１８０】
このようなサインは、
ａ．表１の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表２の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられ、それぞれ表１及び表２の少なくとも５遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定は、不連続疾患特異的状態を尤度≧９９％で割り当てる。
【０１８１】
不連続疾患特異的状態の割り当てのために、表１又は表２の単一遺伝子の解析で十分であったとしても、より多くの遺伝子が解析されれば、正確な割り当ての尤度が増加するであろうことを理解されたい。よって、サインは、表１の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３若しくは３４遺伝子の過剰発現及び／又は表２の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５若しくは１６遺伝子の過小発現の解析も包含する。表１及び／又は表２の全遺伝子の発現データに着目すれば、最も単純明快となり得る。ただ１種類よりも多い記述子について考慮することは、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の尤度で、サインと、したがって不連続疾患の決定を可能にし得る。好ましくは、サインは、表１及び／又は表２の２、３、４、５、６、７、８、９又は１０遺伝子を解析することにより決定される。
【０１８２】
本発明は、その一実施形態において、がん等、過剰増殖性疾患、好ましくは腎細胞癌の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるための、或いは薬学的に有効な化合物の開発の標的として用いるための、サインであって、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過小発現
により特徴付けられるサインに関する。
【０１８３】
このサインの存在は、例えば、約４０％等、約３０％〜約４５％の患者が６０カ月後に生存すると予想できる低い平均生存時間を示す少なくともＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示すであろう。好ましくは、このサインの存在は、約１０％〜２０％等、約５〜約３０％の患者が９０カ月後に生存すると予想できる中間的平均生存時間を示す少なくともＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示すであろう。
【０１８４】
このようなサインは、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられ、それぞれ表３及び表４の少なくとも２遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定は、不連続疾患特異的状態を尤度≧５０％で割り当てる。
【０１８５】
このようなサインは、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられ、それぞれ表３及び表４の少なくとも３遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定は、不連続疾患特異的状態を尤度≧７０％で割り当てる。
【０１８６】
このようなサインは、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられ、それぞれ表３及び表４の少なくとも４遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定は、不連続疾患特異的状態を尤度≧８０％で割り当てる。
【０１８７】
このようなサインは、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられ、それぞれ表３及び表４の少なくとも５遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定は、不連続疾患特異的状態を尤度≧９０％で割り当てる。
【０１８８】
このようなサインは、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられ、それぞれ表３及び表４の少なくとも６遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定は、不連続疾患特異的状態を尤度≧９５％で割り当てる。
【０１８９】
このようなサインは、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられ、それぞれ表３及び表４の少なくとも７遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定は、不連続疾患特異的状態を尤度≧９９％で割り当てる。
【０１９０】
不連続疾患特異的状態の割り当てのために、表３又は表４の単一遺伝子の解析で十分であったとしても、より多くの遺伝子が解析されれば、正確な割り当ての尤度が増加するであろうことを理解されたい。よって、サインは、表３の少なくとも２、３若しくは４遺伝子の過剰発現及び／又は表４の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８若しくは１９遺伝子の過小発現の解析も包含する。表３及び／又は表４の全遺伝子の発現データに着目すれば、最も単純明快となり得る。ただ１種類よりも多い記述子について考慮することは、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の尤度で、サインと、したがって不連続疾患の決定を可能にし得る。好ましくは、サインは、表３及び／又は表４の２、３、４、５、６、７、８、９又は１０遺伝子を解析することにより決定される。
【０１９１】
本発明は、その一実施形態において、がん等、過剰増殖性疾患、好ましくは腎細胞癌の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるための、或いは薬学的に有効な化合物の開発の標的として用いるための、サインであって、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過小発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過剰発現
により特徴付けられるサインに関する。
【０１９２】
このサインの存在は、約８０％等、約７０〜約９０％の患者が６０カ月後に生存すると予想できる高い平均生存時間を示す少なくともＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示すであろう。好ましくは、このサインの存在は、約７０％等、約６０〜約８０％の患者が９０カ月後に生存すると予想できる中間的平均生存時間を示す少なくともＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示すであろう。
【０１９３】
このようなサインは、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過小発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過剰発現
により特徴付けられ、それぞれ表３及び表４の少なくとも２遺伝子の過小及び／又は過剰発現の決定は、尤度≧５０％で不連続疾患特異的状態を割り当てる。
【０１９４】
このようなサインは、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過小発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過剰発現
により特徴付けられ、それぞれ表３及び表４の少なくとも３遺伝子の過小及び／又は過剰発現の決定は、尤度≧７０％で不連続疾患特異的状態を割り当てる。
【０１９５】
このようなサインは、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過小発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過剰発現
により特徴付けられ、それぞれ表３及び表４の少なくとも４遺伝子の過小及び／又は過剰発現の決定は、尤度≧８０％で不連続疾患特異的状態を割り当てる。
【０１９６】
このようなサインは、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過小発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過剰発現
により特徴付けられ、それぞれ表３及び表４の少なくとも５遺伝子の過小及び／又は過剰発現の決定は、尤度≧９０％で不連続疾患特異的状態を割り当てる。
【０１９７】
このようなサインは、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過小発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過剰発現
により特徴付けられ、それぞれ表３及び表４の少なくとも６遺伝子の過小及び／又は過剰発現の決定は、尤度≧９５％で不連続疾患特異的状態を割り当てる。
【０１９８】
このようなサインは、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過小発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過剰発現
により特徴付けられ、それぞれ表３及び表４の少なくとも７遺伝子の過小及び／又は過剰発現の決定は、尤度≧９９％で不連続疾患特異的状態を割り当てる。
【０１９９】
不連続疾患特異的状態の割り当てのために、表３又は表４の単一遺伝子の解析で十分であったとしても、より多くの遺伝子が解析されれば、正確な割り当ての尤度が増加するであろうことを理解されたい。よって、サインは、表３の少なくとも２、３若しくは４遺伝子の過小発現及び／又は表４の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８若しくは１９遺伝子の過剰発現の解析も包含する。表３及び／又は表４の全遺伝子の発現データに着目すれば、最も単純明快となり得る。ただ１種類よりも多い記述子について考慮することは、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の尤度で、サインと、したがって不連続疾患の決定を可能にし得る。好ましくは、サインは、表３及び／又は表４の２、３、４、５、６、７、８、９又は１０遺伝子を解析することにより決定される。
【０２００】
これらのサイン及びそれに関する不連続疾患特異的状態は、好ましくは、ＲＣＣとの関連において上述の診断、治療及び予後目的に用いることができる。しかし、これらのサイン及び状態は、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、骨髄腫、結腸直腸がん、大細胞リンパ腫、口腔扁平上皮癌、子宮頸部扁平上皮癌、甲状腺がん、腺癌においても同定されたため、これらのがん型との関連において上述の目的に用いることもできる。
【０２０１】
上述の通り、ＣＤ３４（配列番号７８０（ＤＮＡ配列）、７８１（アミノ酸配列））、ＤＥＫ（配列番号７８２（ＤＮＡ配列）、７８３（アミノ酸配列））及びＭＳＨ６（配列番号７８４（ＤＮＡ配列）、７８５（アミノ酸配列））遺伝子の発現を解析することにより、ＲＣＣと先述のがんの高い、中間的及び低い生存時間のサイン（例えば、９０カ月後に約８０％）を決定することができる。
【０２０２】
高い生存時間の不連続状態は、ＣＤ３４の高発現、ＤＥＫの低〜高発現及びＭＳＨ６の低〜高発現により同定することができる。中間的生存時間の不連続状態は、ＣＤ３４の低〜高発現、ＤＥＫの発現なし及びＭＳＨ６の発現なしにより同定することができる。低い生存時間の不連続状態は、ＣＤ３４の低発現、ＤＥＫの低〜高発現及びＭＳＨ６の低〜高発現により同定することができる。これらのサインは、本明細書に記載されているあらゆる実施形態において用いることができる。
【０２０３】
既に上で述べた通り、本発明は、腎細胞癌等、過剰増殖性疾患が、異なる不連続疾患特異的状態において存在すると思われるとの知見に依存する。３種のこのような不連続疾患特異的状態は、元々、２回の二元配置階層的クラスタリングアプローチを用いて腎細胞癌（ＲＣＣ）に対して同定された。第一のステップにおいて、別個の腫瘍コホート内における、しかし該コホートの全部ではなく一部の腫瘍に対し共通して調節解除された、異なって発現された遺伝子を同定した（図２Ａ〜２Ｄを参照）。第二のステップにおいて、腫瘍サブグループ間の差別化を可能にするこれらの遺伝子を選び、同一腫瘍コホートに対する第二の二元配置階層的クラスタリングステップのマトリクスへと組み合わせた。ＲＣＣの場合、これは、Ａ、Ｂ及びＣ８と表示される３種の不連続疾患特異的状態を明らかにした（図３を参照）。これらの状態の一部は、他の腫瘍において同定された（図４を参照）。ＲＣＣのため、特定の遺伝子が適切な記述子であると同定された（上述及び例えば表１〜４を参照）。これら遺伝子の発現プロファイルは、３種の上述の状態を示す異なるサインを生じる。
【０２０４】
この手持ちの知識に基づき、コンピュータにより実行される、アルゴリズムに基づくアプローチに取り組み、その３種の不連続疾患特異的状態によりＲＣＣの特性評価をもたらす更に別の遺伝子セットを同定した。
【０２０５】
これらのコンピュータにより実行される、アルゴリズムに基づくアプローチを次に説明するが、これは、その発現パターンを用いて不連続ＲＣＣ特異的状態Ｂ対ＡＣ間を識別できる、表１０に表されるおよそ４５４遺伝子の同定をもたらした。表１１に表される別のセットのおよそ１９５遺伝子の発現パターンを用いて、不連続ＲＣＣ特異的状態Ａ対Ｃ間を識別することができる。次に、これらの結果の意味を説明する。次に、コンピュータにより実行される、アルゴリズムに基づくアプローチを更に詳細に説明する。
【０２０６】
記載の通り、表１０に列挙されている約４５４遺伝子の発現パターンを用いて、本明細書における命名法のためにＢと命名された、３種の不連続ＲＣＣ特異的状態のうち１種を明確に同定することができる。より正確には、ヒト又は動物個体の試料において、表１０の遺伝子１〜２８６が過剰発現されていると判明し、表１０の遺伝子２８７〜４５４が過小発現されていると判明する場合、個体は、不連続ＲＣＣ特異的状態Ｂを有すると特徴付けられるであろう。先に記述した通り、この状態は、約５０％等、約４５〜約５５％の患者が６０カ月後に生存すると予想できる、中間的平均生存時間を示す。好ましくは、このサインの存在は、約４５％等、約４０〜約５０％の患者が９０カ月後に生存すると予想できる、中間的平均生存時間を示す、ＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示すであろう。
【０２０７】
しかし、表１０の遺伝子１〜２８６が過小発現され、表１０の遺伝子２８７〜４５４が過剰発現されていることが判明する場合、この個体は、残りの２種の不連続ＲＣＣ特異的状態のうち一方、即ちＡ又はＣを示すと診断することができる。
【０２０８】
このような個体が、状態ＡかＣを示すか決定するため、表１１に列挙されている遺伝子の発現パターンを試験することができる。表１１の遺伝子１〜１９が過剰発現され、表１１の遺伝子２０〜１９５が過小発現されている場合、この個体は、例えば、約４０％等、約３０％〜約４５％の患者が６０カ月後に生存すると予想できる、低い平均生存時間を示す状態Ｃを示すであろう。好ましくは、このサインの存在は、約１０％〜２０％等、約５〜約３０％の患者が９０カ月後に生存すると予想できる中間的平均生存時間を示す、ＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示すであろう。
【０２０９】
しかし、表１１の遺伝子１〜１９が過小発現され、表１１の遺伝子２０〜１９５が過剰発現される場合、この個体は、約８０％等、約７０〜約９０％の患者が６０カ月後に生存すると予想できる、高い平均生存時間を示す状態Ａを示すであろう。好ましくは、このサインの存在は、約７０％等、約６０〜約８０％の患者が９０カ月後に生存すると予想できる中間的平均生存時間を示す、ＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示すであろう。
【０２１０】
発現レベルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップＨＧ−Ｕ１３３Ａ、ＨＧ−Ｕ１３３Ｂ、ＨＧ−Ｕ１３３＿Ｐｌｕｓ＿２等を用いて決定することができる。特異的試料における特定の遺伝子が過剰又は過小発現されているかに関する決定は、対照との比較において行われるであろう。この対照は、ソフトウェアにおいて実行されても、測定に亘って全体の中央値又は他の算術平均がなされてもよい。多数の試料を暗示することにより、各遺伝子それぞれの中央値及び／又は平均値を計算することも考え得る。これらの結果に関連して、それぞれの遺伝子発現値が上方又は下方制御としてモニターされる。
【０２１１】
表１０及び１１の遺伝子の発現パターンにより定義されるＲＣＣサインが、複数の試料に亘る統計解析の成績を反映することを理解されたい。
【０２１２】
本明細書に記載されている診断、予後、層別化、応答性決定等の方法のため、通常、個体から得られた試料を検査することになる。個体レベルでは、表１０及び／又は１１の単一遺伝子の発現レベルでは、個体が例えば該単一遺伝子を過剰発現しないとして不連続ＲＣＣ特異的状態を明確に割り当てるのに必ずしも十分ではない。したがって、通常、表１０及び１１の２以上の遺伝子の発現パターンを解析することになる。
【０２１３】
通常、表１０の少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９又は少なくとも約２０遺伝子の発現パターンを解析して、本明細書においてＢと表示されている不連続ＲＣＣ特異的状態が存在するか否かを決定することになる。表１０の少なくとも６遺伝子の発現パターンの解析は、状態Ｂ又は状態Ａ若しくはＣが、約６０％以上の信頼性で存在することの決定を可能にするであろう。この信頼性は、より多くの遺伝子が解析されれば増加するであろう。よって、表１０の少なくとも１０遺伝子の発現パターンの解析は、状態Ｂ又は状態Ａ若しくはＣが、約８０％以上の信頼性で存在することの決定を可能にするであろう。表１０の少なくとも１５遺伝子の発現パターンの解析は、状態Ｂ又は状態Ａ若しくはＣが、約９０％以上の信頼性で存在することの決定を可能にし、表１０の少なくとも２０遺伝子の発現パターンの解析は、状態Ｂ又は状態Ａ若しくはＣが約９９％以上の信頼性で存在することの決定を可能にするであろう。このように、表１０の約４５４遺伝子のセットは、状態Ｂの明確な特性評価の貯蔵所（reservoir）として機能する。例えば、この貯蔵所のおよそ１０遺伝子の発現挙動を解析することにより、（ｉ）患者がＲＣＣを患っているか、及び（ｉｉ）がん患者が状態Ｂであるか、又は他の２種の状態Ａ若しくはＣいずれかであるかに関して少なくとも８０％の信頼性で決定できるようになり、平均生存時間に関する予後をなし得る。状態ＡとＣとを区別するため、次に、表１１の遺伝子の発現パターンを解析する必要がある。
【０２１４】
同様に、表１１の少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９又は少なくとも約２０遺伝子の発現パターンを解析して、本明細書においてＡ又はＣと表示されている不連続ＲＣＣ特異的状態が存在するかどうかを決定することになる。表１１の少なくとも５遺伝子の発現パターンの解析は、状態Ａ若しくはＣが、約６０％以上の信頼性で存在することの決定を可能にするであろう。この信頼性は、より多くの遺伝子が解析されれば増加するであろう。よって、表１１の少なくとも１０遺伝子の発現パターンの解析は、状態Ａ若しくはＣが、約８０％以上の信頼性で存在することの決定を可能にするであろう。表１１の少なくとも１５遺伝子の発現パターンの解析は状態Ａ若しくはＣが、約９０％以上の信頼性で存在することの決定を可能にし、表１１の少なくとも２０遺伝子の発現パターンの解析は、状態Ａ若しくはＣが約９９％以上の信頼性で存在することの決定を可能にするであろう。
【０２１５】
よって、本発明は、表１０の少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９又は少なくとも約２０遺伝子の発現パターンに由来し得るサインに関する。このサインは、３種の不連続ＲＣＣ特異的状態のうち１種、即ち状態Ｂが存在するかの明確な決定を可能にするであろう。このサインは、表１０の遺伝子１〜２８６の過剰発現及び遺伝子２８７〜４５４の過小発現によって定義される。表１０の遺伝子１〜２８６の過小発現及び遺伝子２８７〜４５４の過剰発現によって定義されるサインは、ＲＣＣの他の２種の状態、即ちＡ又はＣを示す。
【０２１６】
本発明はまた、表１１の少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９又は少なくとも約２０遺伝子の発現パターンに由来し得るサインに関する。このサインは、残りの２種の不連続ＲＣＣ特異的状態、即ち状態Ａ又はＣのいずれが存在するかの明確な決定を可能にするであろう。表１１の遺伝子１〜１９の過剰発現及び遺伝子２０〜１９５の過小発現によって定義されるサインは、状態Ｃを示す。表１１の遺伝子１〜１９の過小発現及び遺伝子２０〜１９５の過剰発現によって定義されるサインは、状態Ａを示す。
【０２１７】
本発明はまた、ＲＣＣとの関連で診断及び／又は予後マーカーとして用いるための上述のサインに関する。サインが存在するか決定することにより、患者が、ＲＣＣそれ自体を患う及び／又は将来的にＲＣＣそれ自体を発症する可能性が高いかに関して決定することができる。更に、ＲＣＣ発症の攻撃性の間を識別し、それに従って治療法を調整することができる。更に、本発明は、ＲＣＣ治療の臨床治験のための試験集団の層別化において用いるための上述のサインに関する。
【０２１８】
更に、本発明は、上述の通りＲＣＣとの関連で少なくとも１種類の薬学的に有効な化合物を開発、同定及び／又はスクリーニングするための標的の読み出し情報として用いるための上述のサインに関する。
【０２１９】
本発明はまた、進行中又は切迫したＲＣＣ発症を患うと疑われるヒト又は動物個体の層別化において用いるための上述のサインに関する。層別化は、これらの不連続ＲＣＣ特異的状態によるこれら個体のグループ化を可能にする。よって、ＲＣＣ治療において有効であると仮定される潜在的な薬学的に有効な化合物は、このような予め選択された患者群において解析することができる。
【０２２０】
本発明は、また、その一実施形態において、少なくとも、
ａ．腎細胞癌を患うと疑われているヒト又は動物個体の試料を用意するステップと、
ｂ．表１０の少なくとも６、好ましくは少なくとも１０遺伝子の発現を決定することにより、不連続腎細胞癌特異的状態を示すサインに関して前記試料を検査するステップと、
ｃ．ステップｂ．）において決定されたサインに基づき、前記試料に不連続腎細胞癌特異的状態を割り当てるステップと
を含む、腎細胞癌疾患に罹患している疑いがある少なくとも１体のヒト又は動物患者における腎細胞癌を診断、予後、層別化及び／又はスクリーニングする方法に関する。
【０２２１】
更に、本発明は、その一実施形態において、少なくとも、
ａ．薬学的に有効な薬剤が投与される前に、腎細胞癌を患うと疑われているヒト又は動物個体の試料を用意するステップと、
ｂ．表１０の少なくとも６、好ましくは少なくとも１０遺伝子の発現を決定することにより、不連続腎細胞癌特異的状態を示すサインに関して前記試料を検査するステップと、
ｃ．ステップｂ．）において決定されたサインに基づき、前記試料に不連続腎細胞癌特異的状態を割り当てるステップと、
ｄ．前記個体における疾患症状及び／又は不連続腎細胞癌特異的状態における薬学的に有効な薬剤の効果を決定するステップと、
ｅ．疾患症状及び／又は連続腎細胞癌特異的状態における効果と、ステップｃ）において決定された試料の初期不連続腎細胞癌特異的状態との間の相関を同定するステップと
を含む、腎細胞癌に罹患している疑いがある少なくとも１体のヒト又は動物個体の薬学的に有効な薬剤に対する応答性を決定する方法に関する。
【０２２２】
さらに別の実施形態において、本発明は、少なくとも、
ａ．上記の方法を用いることにより、薬学的に有効な薬剤の投与の結果、疾患症状及び／又は不連続腎細胞癌特異的状態における効果と、初期不連続腎細胞癌特異的状態との間に相関が存在するか決定するステップと、
ｂ．表１０の少なくとも６、好ましくは少なくとも１０遺伝子の発現を決定することにより、腎細胞癌に罹患している疑いがあるヒト又は動物個体患者の試料を、不連続腎細胞癌特異的状態を示すサインに関して検査するステップと、
ｃ．ステップｃ．）において決定されたサインに基づき、不連続疾患特異的状態を前記試料に割り当てるステップと、
ｄ．ステップｃ．における試料の不連続腎細胞癌特異的状態と、ステップａ．）において相関が決定された不連続腎細胞癌特異的状態とを比較するステップと、
ｅ．前記患者の疾患症状における薬学的に有効な化合物の効果を予見するステップと
を含む、腎細胞癌に罹患している疑いがある少なくとも１体の患者の、薬学的に有効な薬剤に対する応答性を予見する方法に関する。
【０２２３】
本発明の一実施形態は、少なくとも、
ａ．薬学的に有効な薬剤が投与される前に、腎細胞癌を患う疑いがあるヒト又は動物個体の試料を用意するステップと、
ｂ．表１０の少なくとも６、好ましくは少なくとも１０遺伝子の発現を決定することにより、不連続腎細胞癌特異的状態を示すサインに関して前記試料を検査するステップと、
ｃ．ステップｂ．）において決定されたサインに基づき、不連続腎細胞癌特異的状態を前記試料に割り当てるステップと、
ｄ．薬学的に有効な薬剤が投与された後に、腎細胞癌を患う疑いがあるヒト又は動物個体の試料を用意するステップと、
ｅ．表１０の少なくとも６、好ましくは少なくとも１０遺伝子の発現を決定することにより、不連続腎細胞癌特異的状態を示すサインに関して前記試料を検査するステップと、
ｆ．ステップｅ．）において決定されたサインに基づき、不連続腎細胞癌特異的状態を前記試料に割り当てるステップと、
ｇ．ステップｃ．）及びｆ．）において同定された不連続腎細胞癌特異的状態を比較するステップと
を含む、腎細胞癌の治療のための薬学的に有効な薬剤候補の効果を決定する方法に関する。
【０２２４】
これらの方法において、表１０の遺伝子１〜２８６が過剰発現され、表１０の遺伝子２８７〜４５４が過小発現される、表１０の少なくとも６、７、８又は９、好ましくは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０遺伝子の発現パターンによって、１種類のサインが特徴付けられる。このサインは、不連続ＲＣＣ特異的状態Ｂを示す。よって、サインは、約５０％等、約４５〜約５５％の患者が６０カ月後に生存すると予想できる、中間的平均生存時間のＲＣＣ型を示す。好ましくは、このサインの存在は、約４５％等、約４０〜約５０％の患者が９０カ月後に生存すると予想できる中間的平均生存時間を示す、ＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示すであろう。
【０２２５】
これらの方法において、表１０の遺伝子１〜２８６が過小発現され、表１０の遺伝子２８７〜４５４が過剰発現される、表１０の少なくとも６、７、８又は９、好ましくは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０遺伝子の発現パターンによって１種類のサインが特徴付けられる。このサインは、不連続ＲＣＣ特異的状態Ａ又はＣを示す。明確な差別化のため、表１１の遺伝子の発現プロファイルに基づくサインに依存することができる。
【０２２６】
このようなサインは、表１１の遺伝子１〜１９が過剰発現され、表１１の遺伝子２０〜１９５が過小発現される、表１１の少なくとも６、７、８又は９、好ましくは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０遺伝子の発現パターンによって特徴付けることができる。このサインは、不連続特異的ＲＣＣ状態Ｃを示す。よって、これは、例えば、約４０％等、約３０％〜約４５％の患者が６０カ月後に生存すると予想できる、低い平均生存時間のＲＣＣ型を表示する。好ましくは、このサインの存在は、約１０％〜２０％等、約５〜約３０％の患者が９０カ月後に生存すると予想できる、中間的平均生存時間を示すＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示すであろう。
【０２２７】
別のサインは、表１１の遺伝子１〜１９が過小発現され、表１１の遺伝子２０〜１９５が過剰発現される、表１１の少なくとも６、７、８又は９、好ましくは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０遺伝子の発現パターンによって特徴付けることができる。このサインは、不連続特異的ＲＣＣ状態Ａを示す。よって、これは、約８０％等、約７０〜約９０％の患者が６０カ月後に生存すると予想できる、高い平均生存時間のＲＣＣ型を表示する。好ましくは、このサインの存在は、約７０％等、約６０〜約８０％の患者が９０カ月後に生存すると予想できる中間的平均生存時間を示す、ＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示すであろう。
【０２２８】
上述の通り、ＲＣＣの症例に存在する３種の不連続疾患特異的状態を示した後、コンピュータにより実行される、アルゴリズムに基づくアプローチにより表１０及び１１における遺伝子のセットを同定した。この手持ちの知識に基づき、コンピュータにより実行される、アルゴリズムに基づくアプローチを用いて、既存の発現データにおけるこのようなパターンを同定できることが推測された。このようなアプローチは、「３．ＲＣＣ特異的遺伝子セットの同定」の実施例の節に記載されている。
【０２２９】
よって、本発明は、その一部の実施形態において、次の項目に関する。
【０２３０】
１．疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患している疑いがある少なくとも１体の患者に由来する試料の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるための不連続疾患特異的状態。
【０２３１】
２．疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患の最小１種類の細胞株の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるための不連続疾患特異的状態。
【０２３２】
３．少なくとも１種類の薬学的に有効な化合物を開発、同定及び／又はスクリーニングするための標的として用いるための不連続疾患特異的状態。
【０２３３】
４．少なくとも１種類の記述子のサインによって説明することのできる、１〜３のいずれかに記載の不連続疾患特異的状態。
【０２３４】
５．前記状態が、少なくとも２体の患者に由来する試料又は細胞株における少なくとも２種類の制御ネットワークの比較によって同定された少なくとも２種類の記述子を含むサインによって記載できる、４に記載の不連続疾患特異的状態。
【０２３５】
６．少なくとも１種類の記述子の定性的及び／又は定量的パターンを含み、不連続疾患特異的状態を示すサインであって、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患していると疑われる少なくとも１体の患者に由来する少なくとも試料の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるためのサイン。
【０２３６】
７．少なくとも１種類の記述子の定性的及び／又は定量的パターンを含み、不連続疾患特異的状態を示すサインであって、少なくとも１種類の疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患の少なくとも１種類の細胞株の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるためのサイン。
【０２３７】
８．少なくとも１種類の記述子の定性的及び／又は定量的パターンを含み、不連続疾患特異的状態を示すサインであって、少なくとも１種類の薬学的に有効な化合物を開発、同定及び／又はスクリーニングするための標的の読み出し情報として用いるためのサイン。
【０２３８】
９．少なくとも２体の患者に由来する試料又は少なくとも２種の異なる細胞株における少なくとも２種の異なる制御ネットワークに由来する複数の記述子の解析により同定することのできる、６〜８のいずれかに記載のサイン。
【０２３９】
１０．およそ１００体の患者に由来する試料又はおよそ２０種の細胞株におけるおよそ７６種の制御経路に由来するおよそ２００〜４００種の記述子の解析により同定することのできる、９に記載のサイン。
【０２４０】
１１．およそ１００体の患者に由来する試料又はおよそ２０種の細胞株におけるおよそ１６５種の制御経路に由来するおよそ２００〜４００種の記述子の解析により同定される、９に記載のサイン。
【０２４１】
１２．記述子の局在、プロセシング、修飾、動態及び／又は発現パターンが、サインとして機能する、６〜１１のいずれかに記載のサイン。
【０２４２】
１３．遺伝子又は遺伝子関連分子が記述子として用いられ、その発現パターンがサインとして機能する、６〜１２のいずれかに記載のサイン。
【０２４３】
１４．発現が、ＲＮＡ又はタンパク質レベルで検査される、１３に記載のサイン。
【０２４４】
１５．・表１の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
・表２の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられるサインであって、
少なくとも１種類の疾患、必要に応じて少なくとも１種類の過剰増殖性疾患、好ましくは腎細胞癌の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるための、或いは少なくとも１種類の薬学的に有効な化合物を開発、同定及び／又はスクリーニングするための標的の読み出し情報として用いるための、６〜１４のいずれかに記載のサイン。
【０２４５】
１６．それぞれ表１及び表２の少なくとも１遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定が、不連続疾患特異的状態の尤度５０％を超える割り当てを可能にする、
ａ．表１の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表２の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられる、１５に記載のサイン。
【０２４６】
１７．それぞれ表１及び表２の少なくとも４遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定が、不連続疾患特異的状態の尤度≧９５％での割り当てを可能にする、
ａ．表１の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表２の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられる、１６に記載のサイン。
【０２４７】
１８．約４５〜約５５％の患者が６０カ月後に生存すると予想できる中間的平均生存時間を示す少なくともＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示す、１５〜１７のいずれかに記載のサイン。
【０２４８】
１９．ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられるサインであって、
少なくとも１種類の疾患、必要に応じて少なくとも１種類の過剰増殖性疾患、好ましくは腎細胞癌の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるための、或いは少なくとも１種類の薬学的に有効な化合物を開発、同定及び／又はスクリーニングするための標的の読み出し情報として用いるための、７〜１４のいずれかに記載のサイン。
【０２４９】
２０．それぞれ表３及び表４の少なくとも１遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定が、不連続疾患特異的状態の尤度≧５０％での割り当てを可能にする、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられる、１９に記載のサイン。
【０２５０】
２１．それぞれ表３及び表４の少なくとも６遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定が、不連続疾患特異的状態の尤度≧９５％での割り当てを可能にする、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられる、２０に記載のサイン。
【０２５１】
２２．約３５〜約４５％の患者が６０カ月後に生存すると予想できる低い平均生存時間を示す少なくともＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示す、１９〜２１のいずれかに記載のサイン。
【０２５２】
２３．ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過小発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過剰発現
によって特徴付けられるサインであって、
少なくとも１種類の疾患、必要に応じて少なくとも１種類の過剰増殖性疾患、好ましくは腎細胞癌の分類における診断及び／又は予後マーカーとして用いるための、或いは少なくとも１種類の薬学的に有効な化合物を開発、同定及び／又はスクリーニングするための標的の読み出し情報として用いるための、７〜１４のいずれかに記載のサイン。
【０２５３】
２４．それぞれ表３及び表４の少なくとも１遺伝子の過小及び／又は過剰発現の決定が、不連続疾患特異的状態の尤度≧５０％での割り当てを可能にする、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過小発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過剰発現
によって特徴付けられる、２３に記載のサイン。
【０２５４】
２５．それぞれ表３及び表４の少なくとも６遺伝子の過小及び／又は過剰発現の決定が、不連続疾患特異的状態の尤度≧９５％での割り当てを可能にする、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過小発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過剰発現
によって特徴付けられる、２４に記載のサイン。
【０２５５】
２６．約７０〜約９０％が６０カ月後に生存すると予想できる高い平均生存時間を示す少なくともＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示す、２３〜２５のいずれかに記載のサイン。
【０２５６】
２７．生存時間等、機能的臨床パラメータを示す不連続疾患特異的状態を示す、７〜２６のいずれかに記載のサイン。
【０２５７】
２８．少なくとも、
ａ．疾患を患うヒト若しくは動物個体に由来する疾患特異的試料又は前記疾患の細胞株における遺伝子又は遺伝子関連分子の記述子の質及び／又は量を検査するステップと、
ｂ．少なくとも、
ｉ．各記述子の結果をその質及び／又は量によって分別するステップと、
ｉｉ．全記述子に亘り、記述子の同等な質及び／又は量に関して疾患特異的試料又は細胞株を分別するステップと、
ｉｉｉ．共通の記述子セットの異なるパターンを同定するステップと、
ｉｖ．ステップｂ．）ｉｉｉ．）において同定された各パターンにサインを割り当てるステップと、
ｖ．ステップｂ．）、ｉｖ．）において同定された各サインに不連続疾患特異的状態を必要に応じて割り当てるステップと
を含む、ステップａ．）において得られた結果をクラスタリングするステップと
を含む、少なくとも１種類の疾患、必要に応じて少なくとも１種類の過剰増殖性疾患に関与するサイン及び必要に応じて少なくとも１種類の不連続疾患特異的状態を同定する方法。
【０２５８】
２９．少なくとも、
ａ．疾患を患うヒト又は動物個体に由来する疾患特異的試料、或いは前記疾患の細胞株における遺伝子又は遺伝子関連分子の記述子の質及び／又は量を検査するステップと、
ｂ．少なくとも、
ｉ．各記述子の結果をその質及び／又は量によって分別するステップと、
ｉｉ．全記述子に亘り、記述子の同等な質及び／又は量に関して疾患特異的試料又は細胞株を分別するステップと、
ｉｉｉ．前記疾患特異的試料又は細胞株に亘り異なって制御される異なる記述子群を同定するステップと
を含む、ステップａ．）において得られた結果をクラスタリングするステップと、
ｃ．ステップｂ．）ｉｉｉ．）において同定された記述子を組み合わせるステップであって、疾患特異的試料又は細胞株における前記記述子の質及び／又は量が、ステップａ．）により既に知られているステップと、
ｄ．少なくとも、
ｉ．ステップｃ．）の各記述子の結果をその質及び／又は量によって分別するステップと、
ｉｉ．全記述子に亘り、記述子の同等な質及び／又は量に関して疾患特異的試料又は細胞株を分別するステップと、
ｉｉｉ．ステップｃ．）において得られた記述子セットの異なるパターンを同定するステップと、
ｉｖ．ステップｄ．）ｉｉｉ．）において同定された各パターンにサインを割り当てるステップと、
ｖ．ステップｄ．）、ｉｖ．）において同定された各サインに不連続疾患特異的状態を必要に応じて割り当てるステップと
を含む、ステップｃ．）において得られた結果をクラスタリングするステップと
を含む、２８に記載の方法。
【０２５９】
３０．少なくとも、
ａ．疾患を患うヒト又は動物個体に由来する疾患特異的試料、或いは前記疾患の細胞株における少なくとも２種の制御ネットワークに関連する遺伝子又は遺伝子関連分子の記述子の質及び／又は量を検査するステップと、
ｂ．少なくとも、
ｉ．少なくとも１種類の制御ネットワーク内における各記述子の結果をその質及び／又は量によって分別するステップと、
ｉｉ．１種類の制御ネットワーク内の全記述子に亘り、記述子の同等な質及び／又は量に関して疾患特異的試料又は細胞株を分別するステップと、
ｉｉｉ．少なくとも１種類の制御ネットワーク内における前記疾患特異的試料又は細胞株に亘り異なって制御される異なる記述子群を同定するステップと
を含む、ステップａ．）において得られた結果をクラスタリングするステップと、
ｃ．ステップｂ．）ｉｉｉ．）において同定された記述子を組み合わせるステップであって、疾患特異的試料又は細胞株における前記記述子の質及び／又は量が、ステップａ．）により既に知られているステップと、
ｄ．少なくとも、
ｉ．ステップｃ．）の各記述子の結果をその質及び／又は量によって分別するステップと、
ｉｉ．全記述子に亘り、記述子の同等な質及び／又は量に関して疾患特異的試料又は細胞株を分別するステップと、
ｉｉｉ．ステップｃ．）において得られた記述子セットの異なるパターンを同定するステップと、
ｉｖ．ステップｄ．）ｉｉｉ．）において同定された各パターンにサインを割り当てるステップと、
ｖ．ステップｄ．）、ｉｖ．）において同定された各サインに不連続疾患特異的状態を必要に応じて割り当てるステップと
を含む、ステップｃ．）において得られた結果をクラスタリングするステップと
を含む、２８又は２９に記載の方法。
【０２６０】
３１．およそ１００体の患者に由来する試料又はおよそ２０種の細胞株におけるおよそ７６種の制御経路に由来するおよそ２００〜４００種の記述子が解析される、３０に記載の方法。
【０２６１】
３２．およそ１００体の患者に由来する試料又はおよそ２０種の細胞株におけるおよそ１６５種の制御経路に由来するおよそ２００〜４００種の記述子が解析される、３１に記載の方法。
【０２６２】
３３．記述子の局在、プロセシング、修飾、動態及び／又は発現パターンが、サインとして機能する、２８〜３２のいずれかに記載の方法。
【０２６３】
３４．遺伝子又は遺伝子関連分子が記述子として用いられ、その発現パターンがサインとして機能する、２８〜３３のいずれかに記載の方法。
【０２６４】
３５．発現が、ＲＮＡ又はタンパク質レベルで検査される、３４に記載の方法。
【０２６５】
３６．制御ネットワークが、Ｐａｎｔｈｅｒソフトウェアにより同定可能である、３０〜３５のいずれかに記載の方法。
【０２６６】
３７．請求項２８〜３０のステップｂ．又はｄ．におけるクラスタリングプロセスが、ＴＩＧＲ  ＭｅＶソフトウェアによる二元配置階層的クラスタリングである、２８〜３６のいずれかに記載の方法。
【０２６７】
３８．請求項２８〜３０のステップｂ．又はｄ．における群及びサインの同定プロセスが、ＳＡＭソフトウェアによりなされる、２８〜３７のいずれかに記載の方法。
【０２６８】
３９．疾患特異的試料が腎細胞癌細胞株である、２８〜３８のいずれかに記載の方法。
【０２６９】
４０．細胞株が、初代又は永久腎細胞癌細胞株である、２８〜３８のいずれかに記載の方法。
【０２７０】
４１．不連続疾患特異的状態及びそれを説明するサインが、生存時間等、機能的臨床パラメータに関連付けられる、２８〜４０のいずれかに記載の方法。
【０２７１】
４２．２８〜４１のいずれかの方法により得られる記述子セット。
【０２７２】
４３．２８〜４１のいずれかの方法により得られるサイン。
【０２７３】
４４．２８〜４１のいずれかの方法により得られる不連続疾患特異的状態。
【０２７４】
４５．少なくとも１種類の疾患、必要に応じて少なくとも１種類の過剰増殖性疾患のための診断又は予後マーカーとして、或いは標的の読み出し情報として、或いは少なくとも１種類の薬学的に有効な化合物の開発及び／又は適用の標的としての、４２に記載の記述子セット、４３に記載のサイン及び／又は４４に記載の不連続疾患特異的試料の使用。
【０２７５】
４６．少なくとも、
ａ．疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患を患うと疑われるヒト又は動物個体、或いは疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患の少なくとも１種類の細胞株の試料を用意するステップと、
ｂ．サイン、必要に応じて４３に記載のサインに関して前記試料を検査するステップと、
ｃ．ステップｂ．）において決定されたサインに基づき、不連続疾患特異的状態を前記試料又は細胞株に割り当てるステップと
を含む、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患している疑いがある少なくとも１体の患者における、或いは疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患の少なくとも１種類の細胞株における疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患を診断、層別化及び／又はスクリーニングする方法。
【０２７６】
４７．少なくとも、
ａ．薬学的に有効な薬剤が投与される前に、疾患に罹患している疑いがある少なくとも１体のヒト又は動物個体の試料を用意するステップと、
ｂ．サイン、必要に応じて４３に記載のサインに関して前記試料を検査するステップと、
ｃ．決定されたサインに基づき、不連続疾患特異的状態を前記試料に割り当てるステップと、
ｄ．前記個体における疾患症状及び／又は不連続疾患特異的状態における薬学的に有効な化合物の効果を決定するステップと、
ｅ．疾患症状及び／又は不連続疾患特異的状態における効果と、試料の不連続疾患特異的状態との間の相関を同定するステップと
を含む、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患している疑いがある少なくとも１体のヒト又は動物個体の薬学的に有効な薬剤に対する応答性を決定する方法。
【０２７７】
４８．疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患している疑いがある少なくとも１体の患者の薬学的に有効な薬剤に対する応答性を予見する方法であって、少なくとも、
ａ．４６に記載の方法を用いることにより、薬学的に有効な薬剤の投与の結果としての疾患症状における効果と、不連続疾患特異的状態との間に相関が存在するか決定するステップと、
ｂ．サイン、必要に応じて４３に記載のサインに関して、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患している疑いがあるヒト又は動物個体の試料を検査するステップと、
ｃ．決定されたサインに基づき、不連続疾患特異的状態を前記試料に割り当てるステップと、
ｄ．ステップｃ．における試料の不連続疾患特異的状態対、ステップａ．）において相関が決定された不連続疾患特異的状態を比較するステップと、
ｅ．前記患者における疾患症状における薬学的に有効な化合物の効果を予見するステップと
を含む、方法。
【０２７８】
４９．少なくとも、
ａ．薬学的に有効な薬剤が投与される前に、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患している疑いがある少なくとも１体のヒト又は動物個体、或いは疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患の細胞株の試料を用意するステップと、
ｂ．サイン、必要に応じて４３に記載のサインに関して前記試料又は細胞株を検査するステップと、
ｃ．決定されたサインに基づき、不連続疾患特異的状態を前記試料又は細胞株に割り当てるステップと、
ｄ．薬学的に有効な薬剤が投与された後に、疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患に罹患している疑いがある少なくとも１体のヒト又は動物個体、或いは疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患の細胞株の試料を用意するステップと、
ｅ．サイン、必要に応じて４３に記載のサインに関して前記試料又は細胞株を検査するステップと、
ｆ．決定されたサインに基づき、不連続疾患特異的状態を前記試料又は細胞株に割り当てるステップと、
ｇ．ステップｃ．）及びｆ．）において同定された不連続疾患特異的状態を比較するステップと
を含む、潜在的な薬学的に有効な化合物の効果を決定する方法。
【０２７９】
５０．前記不連続疾患特異的状態が、腎細胞癌を患っている疑いがある患者の試料、或いは腎細胞癌細胞株に対して決定される、４６〜４９のいずれかに記載の方法。
【０２８０】
５１．疾患、必要に応じて過剰増殖性疾患、好ましくは腎細胞癌の不連続疾患特異的状態が、
ａ．表１の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表２の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられるサインによって割り当てられる、４６〜５０のいずれかに記載の方法。
【０２８１】
５２．それぞれ表１及び表２の少なくとも１遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定が、不連続疾患特異的状態の尤度≧５０％での割り当てを可能にする、サインが
ａ．表１の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表２の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられる、５１に記載の方法。
【０２８２】
５３．それぞれ表１及び表２の少なくとも４遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定が、不連続疾患特異的状態の尤度≧９０％での割り当てを可能にする、サインが
ａ．表１の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表２の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられる、５２に記載の方法。
【０２８３】
５４．サインが、約４５〜約５５％の患者が６０カ月後に生存すると予想できる中間的平均生存時間を示す少なくともＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示す、５１〜５３のいずれかに記載の方法。
【０２８４】
５５．腎細胞癌の不連続疾患特異的状態が、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられるサインによって割り当てられる、４６〜５０のいずれかに記載の方法。
【０２８５】
５６．それぞれ表３及び表４の少なくとも１遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定が、不連続疾患特異的状態の尤度≧５０％での割り当てを可能にする、サインが
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられる、５５に記載の方法。
【０２８６】
５７．それぞれ表３及び表４の少なくとも６遺伝子の過剰及び／又は過小発現の決定が、不連続疾患特異的状態の尤度≧９５％での割り当てを可能にする、サインが
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過剰発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過小発現
によって特徴付けられる、５６に記載の方法。
【０２８７】
５８．サインが、約３５〜約４５％の患者が６０カ月後に生存すると予想できる低い平均生存時間を示す少なくともＲＣＣにおける不連続疾患特異的状態を示す、５５〜５７のいずれかに記載の方法。
【０２８８】
５９．腎細胞癌の不連続疾患特異的状態が、
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過小発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過剰発現
によって特徴付けられるサインによって割り当てられる、４６〜５０のいずれかに記載の方法。
【０２８９】
６０．それぞれ表３及び表４の少なくとも１遺伝子の過小及び／又は過剰発現の決定が、不連続疾患特異的状態の尤度≧５０％での割り当てを可能にする、サインが
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過小発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過剰発現
によって特徴付けられる、５９に記載の方法。
【０２９０】
６１．それぞれ表３及び表４の少なくとも６遺伝子の過小及び／又は過剰発現の決定が、不連続疾患特異的状態の尤度≧９５％での割り当てを可能にする、サインが
ａ．表３の少なくとも１遺伝子の過小発現、及び／又は
ｂ．表４の少なくとも１遺伝子の過剰発現
によって特徴付けられる、６０に記載の方法。
【０２９１】
６２．約７０〜約９０％の患者が６０カ月後に生存すると予想できる高い平均生存時間を示す少なくともＲＣＣにおけるサインが不連続疾患特異的状態を示す、６０〜６２のいずれかに記載の方法。
【０２９２】
６３．サインが、生存時間等、機能的臨床パラメータを示す不連続疾患特異的状態を示す、４６〜６２のいずれかに記載の方法。
【０２９３】
次に、本発明を特定の実験に関して説明する。しかし、これらの実験を限定的なものと解釈するべきではない。
【０２９４】
実験
１．材料と方法
組織標本、細胞株、核酸抽出
凍結初代腎細胞癌（ＲＣＣ）及びＲＣＣ転移由来の組織をチューリッヒ大学病院（University Hospital Zurich）の組織バイオバンクから得た。本研究は、地域倫理委員会（local commission of ethics）による承認を受けた（参照番号ＳｔＶ３８−２００５）。全腫瘍は、尿路病理学（uropathology）を専門にする病理学者により点検し、３段階評点方式（3-tiered grading system）（１４）に従ってグレード分けし、世界保健機関（World Health Organisation）分類（１５）に従って組織学的に分類した。組織学的に検証された少なくとも８０％の腫瘍細胞の存在により、全腫瘍組織を選択した。５６種のｃｃＲＣＣ、１３種のｐＲＣＣ及び６９種の対応する正常腎組織から、血液組織キット（Blood and Tissue Kit）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出した。７４種のｃｃＲＣＣ、２２種のｐＲＣＣ、２種の嫌色素性ＲＣＣ、１５種のｃｃＲＣＣ転移から、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出した。４６種のｃｃＲＣＣ及び１０種のｐＲＣＣから得られたＤＮＡ及びＲＮＡを、ＳＮＰアレイ及びマイクロアレイ実験の両方に用いた。２４種のＲＣＣ細胞株、ＲＣＣ転移由来の６種の細胞株及び対照として４種の前立腺がん細胞株から得られたＲＮＡにより、発現解析を更に行った。ＳＮＰ及び発現アレイ実験に用いたあらゆる腫瘍及び細胞株を表６に列挙する。
【０２９５】
ＳＮＰアレイ解析及び分類
メーカーの説明書（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に従い、全ゲノムヒトＳＮＰ６．０アレイによりＳＮＰアレイ解析を行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐスキャナー３０００  ７Ｇを用いてアレイをスキャンした。
【０２９６】
ａｒｏｍａ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロジェクト（１６）（http://groups.google.com/group/aroma-affymetrix/）から入手したアレイ解析パッケージを用いて、Ｒ統計ソフトウェアフレームワーク（http://www.cran.org）により未加工のプローブデータＣＥＬファイルを処理した。総コピー数の評価は、対立遺伝子クロストークキャリブレーション、プローブ配列効果の正規化及びＰＣＲ断片長効果の正規化を含むＣＲＭＡｖ２方法（１７）を用いて行った。Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ方法（１８）を用いてコピー数の分節化を行い、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒプロジェクト（http://www.bioconductor.org）から入手できるＤＮＡコピーパッケージにて実行した。分節化結果、癌遺伝子マップ位置及びゲノム変種データベース（Database of Genomic Variants）（ＤＧＶ、http://projects.tcag.ca/variation/;（１９））において報告された公知のコピー数変動を含む正規化データのプロットを、Ｐｒｏｇｅｎｅｔｉｘプロジェクト（２）（http://www.progenetix.net）のために開発されたソフトウェアパッケージにより作成した。２００６年３月のヒト参照配列（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ３６．１）に基づき、ＵＣＳＣゲノムアセンブリｈｇ１８に関してマップ位置を参照した。コピー数不均衡の評価へと進む前に、正規化後に顕著なプローブレベルノイズのあるアレイのデータを除外した。全体として、１１４種のＳＮＰ６．０アレイ（４５種の腫瘍、６９種の正常組織試料）を最終データ処理に用いた。
【０２９７】
癌ゲノム（oncogenomic）不均衡は、多くの場合、数百個の可能な標的遺伝子を有する広大なゲノム領域に広がるため、コピー数分節化データにおいて動的閾値化アプローチを用いた。癌遺伝子標的を含有する集中的ゲノム不均衡の決定のため、コピー数ベースラインから高偏差のサイズ制限領域をその遺伝子含量に対し評価した。対応する完全重複ＣＮＶがＤＧＶに報告されていなければ、コピー数不均衡領域から第一の候補遺伝子を選択した。全体的ゲノム不均衡プロファイルの作成のため、確率的閾値０．１３／−０．１３をそれぞれゲノム増加及び減少に用いた。反復的に出現する候補は列挙され、更なる解析に１回だけ検討される。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（http://www.ingenuity.com）、ＫＥＧＧ（京都遺伝子ゲノム百科事典（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）−http://www.genome.jp/kegg/）及びＰＡＮＴＨＥＲ（進化的関係性によるタンパク質解析）分類システム（２０、２１）（http://www.pantherdb.org）により、機能的遺伝子分類を行った。ＰｕｂＭｅｄ及びＣｅｌｅｒａ両データセットを検討しつつＰＡＮＴＨＥＲにより、遺伝子／タンパク質リストの作成及び解析を行った。
【０２９８】
マイクロアレイ及び発現解析
メーカーの説明書（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）に従ってＲＮＡをハイブリダイズさせた。ＨＴスキャナーを用いてアレイをスキャンした。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（２２）のＭＡＳ５を用いてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐデータを正規化し、ｌｏｇ２スケーリングした。ユークリッド距離及び平均連結法を用いたＴＩＧＲ  ＭｅＶ（２３）により階層的クラスタリングを行った。ＳＡＭ（１２）を用いて腫瘍型特異的バイオマーカーの同定を行った。最も重要な遺伝子をＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲ（１０、１１）にて照合して、全試料に亘り信号（call）なしのプローブセットを取り除いた。
【０２９９】
ＰＡＮＴＨＥＲ（血管新生１９５種、炎症２７１種、インテグリン１９６種及びＷｎｔ２６３種のプローブセット）から抽出された４種の経路由来の遺伝子の少なくとも半分のプローブセットを同定することができた。経路毎に、プローブセット対発現アレイの完全なセット（１４７アレイ）の二元配置階層的クラスタリングを適用した。本出願人らは、各経路における全体的アレイクラスタリングを最も良く表す最大４種のクラスターを選択した（図２、表８）。最後に、これらクラスターから得られた全プローブセットのジョイントクラスタリングは、記載されているグループ化をもたらした（図３、表５）。
【０３００】
マイクロアレイ及びＳＮＰデータは、ＧＳＥ１９９４９（暫定公開：３０．０６．２０１０）としてＧＥＯに寄託されている。総説リンク（Reviewer link）：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=zronrguasyacefq&acc=GSE19949
【０３０１】
試料毎にＨＧ−Ｕ１３３Ａ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップをそれぞれ用いることにより、未加工のマイクロアレイ発現データを作成した。更なる解析のため、オンラインの高品質の手作業で精選した発現データベース及びメタ解析システムＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲ（www.genevestigator.com）にこれらの生データをアップロードした。次に、記載の通り、二元配置階層的クラスタリングを行った。遺伝子発現対試料セット全体をクラスター化した。この第一のクラスタリングに用いた遺伝子リストをＰＡＮＴＨＥＲ分類システム（www.pantherdb.org）により提示し、１経路に属す遺伝子全体を網羅させた（図２及び図３を参照）。このようなクラスタリングの結果は、入力した全プローブセットに亘って観察される同一の発現プロファイルを有する腫瘍が、近接して存在することである。異なる腫瘍試料における反復性の異なって制御される遺伝子の存在に依存して、腫瘍コホート全体に亘り別個のクラスターが形成される。第二のステップにおいて、これら形成されたクラスターを表すプローブセットを取り上げ、別のクラスタリングマトリクスへと組み合わせた。その後、同一の試料コホートに対し、同一の二元配置階層的クラスタリング条件を実行した。この解析により、腫瘍群が出現した（図３）。
【０３０２】
更に別のステップにおいて、別個の群の間の明瞭な差別化を可能にする最良の遺伝子候補が既に図３に取り上げられているかとの疑問が生じた。この疑問に回答するため、図３から異なる群に由来する４０種の腫瘍試料（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ、生データ）を最良の識別子検出のために任意に取り上げた。ＧＥＮＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲを統計プログラムＳＡＭ（マイクロアレイの有意性分析）と組み合わせて用いることにより、それぞれの群のための最良の識別子を計算した（図４）。このように、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａマイクロアレイに存在する全２２．０００種のプローブセットの発現に関して、これら４０種の任意に選ばれた試料を統計的に解析した。図３及び図４における作成されたデータは、絶対発現値である。
【０３０３】
本出願人らは、その結果生じたこのサイン（図４）を、続くメタ解析のための「マーカーサイン」として用いた。この目的のため、ＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲデータベースにおける全ＨＧ＿Ｕ１３３Ａマイクロアレイから入手できる、異なる腫瘍研究に亘るこれら遺伝子の発現特徴を確証した。本明細書に示されている値は、相対値である（図４Ａ及び４Ｂの右の像）。本明細書において、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ腫瘍チップ毎に、対応する対照が存在する。サインは、腫瘍試料に出現するが、対照には出現しない。更に、示されている値は平均値である。別個の腫瘍型を表す１種類の実験手順の数種の発現アレイチップはオーバーレイされている。
【０３０４】
ＴＭＡ構築及び免疫組織化学
本出願人らは、それぞれ２７種由来の腫瘍組織及び２５４種のＲＣＣ関連の腎摘除術標本による、２種の組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を用いた。チューリッヒ大学病院（スイス、チューリッヒ）外科病理学研究所（Institute for Surgical Pathology）の１９９３年〜２００７年の間のアーカイブから試料を回収した。以前に記載された通りにＴＭＡを構築した（２４）。腫瘍不均一性に十分に対処するため、本出願人らは、２７種の腫瘍試料によるＴＭＡの構築のために腫瘍当たり３回パンチ採取した（２５）。腫瘍当たり１種類の生検シリンダーが、２５４種の腫瘍によるＴＭＡ構築に十分であると考えた。スライドグラス上のＴＭＡ切片（２．５μｍ）を、Ｖｅｎｔａｎａ（米国アリゾナ州ツーソン）自動プロトコールに従った免疫組織化学的解析に付した。ＣＤ３４（Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｌｔｄ．−クローンＱＢＥＮＤ−１０、１：８００希釈）、ＭＳＨ６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−クローン４４、１：５００希釈）及びＤＥＫ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−クローン２、１：４００希釈）染色を行い、Ｌｅｉｔｚ  Ａｒｉｓｔｏｐｌａｎ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ドイツ、ウェッツラー）下で解析した。１％を超える腫瘍細胞が明解な核発現を示した場合、腫瘍がＭＳＨ６又はＤＥＫ陽性であると考慮した。以前に記載された通りにＭＶＤを決定した（２６）。Ｓｔａｔｖｉｅｗ５．０（ＳＡＳ、米国）及びＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ＳＰＳＳ１７．０（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、イリノイ州シカゴ）により統計を行った。
【０３０５】
２．結果
先ず、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰアレイを用いて、４５種のＲＣＣ及び対応する正常組織のゲノムプロファイルを解析した。例示するため、本出願人らは、ｐｒｏｇｅｎｅｔｉｘウェブサイト（http://www.progenetix.net）を用いてゲノム不均衡の全体的概略を抽出し、これを４７２種のＲＣＣの利用できる全データセットと比較した（図１Ａ）。以前のＣＧＨデータ（８）と一致して、本出願人らの結果は、ＲＣＣにおけるＣＧＨプロファイルの全体的複合物を確証した。
【０３０６】
次に、本出願人らは、ＣＧＨにより得られる染色体減少及び増加の解像限界である５Ｍｂを下回る腫瘍特異的ゲノム変化に焦点を合わせた（９）。本出願人らは、０．５ｋｂ〜５Ｍｂの間を変動し、６１種の対立遺伝子増加及び６５種の対立遺伝子欠失を包含する、本出願人らのコホートにおける１２６種の異なる領域を同定した。アレル不均衡及び遺伝子機能の種類にかかわりなく、本出願人らは、同一の関連性を、これが「影響を受けた」と考えることにより、各同定領域及び遺伝子に割り当てた。合計すると、７６９遺伝子のコード領域が部分的又は全体的に関与し、５遺伝子（ＡＵＴＳ２、ＥＴＳ１、ＦＧＤ４、ＰＲＫＣＨ、ＦＴＯ）のみが最大５種の腫瘍のみにおいて反復的に影響を受けることが判明した。
【０３０７】
公開データにおけるＣＧＨにより一般に検出される大規模な染色体異常とは対照的に、＜５Ｍｂのゲノム変化は、形態学的に定義されたＲＣＣサブタイプと関連付けることができない。ＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲ（１０、１１）（http://www.genevestigator.com）ヒトマイクロアレイデータセットに対する７６９遺伝子の追加的な発現解析は、明らかなクラスタリングを示さなかった（データ図示せず）。
【０３０８】
本出願人らは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ、ＫＥＧＧ及びＰＡＮＴＨＥＲ等、分類システムに対し遺伝子リスト全体のランを実行した。ＰＡＮＴＨＥＲソフトウェアは、これらを上位の生物学的プロセスへと統合した。このデータベースは、７６９種のＩＤのうち５５７種をマッピングした（７３％）。ＰＡＮＴＨＥＲ棒グラフは、５５７遺伝子を合計１６５種の利用可能なシグナル伝達及び代謝「ネットワーク」のうち７６種へと割り当てた（図１Ｂ、表７）。これら４種のプロセスそれぞれの遺伝子の解析は、結果的に上位の生物学的プロセスと異なる「経路」に一般に関与する遺伝子による、多様性及び可塑性を明らかにした。一例として、当初は「炎症」と関連（affiliated）した（ＰＡＮＴＨＥＲ経路ＩＤ  Ｐ０００３１）「アクチン関連タンパク質２／３複合体」は、インテグリンシグナル伝達（ＰＡＮＴＨＥＲ経路ＩＤ  Ｐ０００３４）、ハンチントン病（ＰＡＮＴＨＥＲ経路ＩＤ  Ｐ０００２９）又はＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅによる細胞骨格制御（ＰＡＮＴＨＥＲ経路ＩＤ  Ｐ０００１６）にも関与する遺伝子ＡＲＰＣ５Ｌを含有する。
【０３０９】
次に、本出願人らは、ＰＡＮＴＨＥＲにより割り当てられた７６種のプロセスそれぞれの遺伝子リストを作成し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａアレイを用いた９８種の初代ＲＣＣ（ＳＮＰアレイ実験に用いた試料を含む）、１５種のＲＣＣ転移と３４種の細胞株における階層的クラスタリングにより、これら遺伝子リストのそれぞれをＲＮＡ発現レベルにおいて調査した（表６）。例えば、４種の優位な生物学的プロセス（図１Ｂ）「炎症」、「血管新生」、「インテグリン」及び「Ｗｎｔ」は、それぞれ４７６、３５４、３６５及び４９７遺伝子で構成された。これら４種の優位なプロセスのクラスタリング内において、本出願人らは、異なる、明確に識別可能な主要な群パターン（図２Ａ〜Ｄ、表５）を観察したが、これは、数種類の腫瘍群特異的遺伝子制御機構を示唆する。対照的に、残りの７２種の生物学的プロセス（アポトーシス、ＨＩＦ又はｐ５３シグナル伝達のプロセスを含む）の遺伝子の階層的クラスタリングでは、明瞭な異なった遺伝子発現パターンは得られなかった。
【０３１０】
次に、本出願人らは、試料の全体クラスタリング（図２Ａ〜Ｄ、赤ボックス、表８）の最も代表的な合計９２遺伝子により４種のマトリクスそれぞれから最大４種の遺伝子クラスターを選択し、それらを新たなマトリクスへと組み合わせた。このマトリクスのその後のクラスタリングは、４種の明確に別個の腫瘍群（「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」及び「細胞株」と称する）を生じた（図３、表５）。ＰＡＮＴＨＥＲにより提案された４種の「経路」のメンバーではあるが、９２遺伝子は、これら生物学的プロセスに関与する遺伝子は低いパーセンテージしか表さなかった。したがって、本出願人らは、腫瘍群を経路特異的であると考えるより、腫瘍群の「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」及び「細胞株」への細分化を好む。特に、９２種の選択されたクラスター関連遺伝子から選ばれた単一の（ＩＴＧＡＬ）は、本出願人らのＲＣＣセットの単一の腫瘍においてＣＮＡにより直接的に影響を受けるとしても、本出願人らのＳＮＰアレイ解析により検出されたゲノム変化から最終的に生じたと思われる群特異的発現サインを集合的に構成する。
【０３１１】
別の群を表す細胞株とは対照的に、ＲＣＣ転移及び初代ＲＣＣは、腫瘍サブタイプ、ステージ又は分化グレードにかかわりなく群Ａ、Ｂ又はＣに分かれる。明細胞ＲＣＣ（ｃｃＲＣＣ）、乳頭状ＲＣＣ（ｐＲＣＣ）及び嫌色素性ＲＣＣは、異なる形態学的表現型を有するが、異なるクラスターに亘る３種のサブタイプの出現組合せは、分子的類似性を示唆する。
【０３１２】
次に、本出願人らは、図３において以前に同定された３種の腫瘍群から任意に選ばれた４０種の初代ＲＣＣ試料に亘り遺伝子発現をプロファイルした。このアレイの全２２，０００種のプローブセットに亘るこれら試料の階層的クラスタリングは、Ｂ型が、Ａ及びＣとは明確に別個のものであること（図４Ｃ左）を示し、群Ａは、Ｃクラッド（clad）内の高度な（tight）クラスターとして現れる。ＳＡＭ（１２）を用いたところ、２，０００を超える遺伝子において発現レベルの少なくとも２倍の変化が観察され、そのうちＡ及びＣと比較してＢにおいて１，４５５遺伝子はより高発現、７１５遺伝子はより低発現であり、Ａ対Ｃにおいて２２１遺伝子は正に、１１遺伝子は負に制御された。これらの独立した知見は、ＳＮＰアレイの結果に由来する遺伝子に基づくＲＣＣの以前のグループ化を確証した。
【０３１３】
群Ｂ並びに群Ａ及びＣ間で最も異なって制御された遺伝子は、４８遺伝子によって表され、そのうち１６遺伝子はＢにおいて低発現だがＡ及びＣにおいて強く発現し（８．７〜５．７倍の変化）、３２遺伝子の転写産物はＢに豊富だがＡ及びＣでは減少した（１４．４〜５．２倍の変化）（図４Ａ左、表１及び２）。２３遺伝子は、群Ａ及びＣを明確に識別し、そのうち４遺伝子はＣにおいて高度に発現したがＡでは高度に発現せず（１４．３〜２．５倍の変化）、一方、１９遺伝子はＡにおいて高度に発現したがＣでは高度に発現しなかった（１６．０〜４．２倍の変化）（図４Ｂ左、表３及び４）。
【０３１４】
次に、本出願人らは、ＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲデータベースにおける全ＨＧ＿Ｕ１３３Ａマイクロアレイから入手できる、８０種の異なる腫瘍研究に亘るこれら遺伝子の発現特徴を比較した（「腫瘍」対「健常」の比較セット）。ＲＣＣ腫瘍Ｂ対ＲＣＣ腫瘍Ａ及びＣ間で異なって発現する遺伝子に関し、４種の独立した腎臓がん実験及び２４種の更に別の腫瘍セットは、非常に類似した二峰性（bimodal）発現サインを呈した。これらセットのうち１６セットは、ＲＣＣ型Ａ及びＣと類似のサインを有し、８セットはＢ型と類似していた。同様に、ＲＣＣ腫瘍Ａ型対Ｃ型間で最も有意に調節解除された遺伝子に関し、１６種の腫瘍セットは、ＧＥＮＥＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲにおいて類似の特徴を示した。腎臓がんに加えて甲状腺がんも、ＲＣＣ型Ａと類似していたが、乳癌、膀胱癌及び子宮頸部癌等、１２種の他のセットは、Ｃ型と高度に相関していた。データベースに存在する残りの３９種の腫瘍セットに関し、群Ａ、Ｂ又はＣ特異的遺伝子サインを有するものはなかった。これらの結果は、本出願人らのアプローチが、ＲＣＣだけでなく他の腫瘍型における発癌における３種の異なる一般分子サインの高度な再現性を立証し、多くの異なるヒトがんによって活用される分子戦略に適合すると主張するものとして確認した。
【０３１５】
次に、本出願人らは、３群それぞれから２７種のＲＣＣを無作為に選択し（図３）、それらを小組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）へと配置した。ヘマトキシリン／エオシン染色したＴＭＡ切片は、病理学者により盲検的に評価された。群Ａの腫瘍全９種を高い微小血管密度（ＭＶＤ）により特徴付けたが、群Ｂ及びＣの腫瘍において特異的な形態的特色は見られなかった。この知見を更に検証するため、本出願人らは、この２７種のＲＣＣにおける内皮細胞マーカーＣＤ３４を免疫組織化学的に染色した。
【０３１６】
表９及び図５に示す通り、結果は、群特異的血管新生形質を大部分確証した。群Ａにおいては全９種の腫瘍だが、群Ｂにおいては３種のみ、群Ｃにおいては１種のみが、アレイスポット（０．０３６ｍｍ２）当たり１００を超える微小血管を有したが、一方、それ以外は５０未満の微小血管を有していた。これに従い、高及び低ＭＶＤの腫瘍を分類した。群Ｂ及びＣに割り当てられた腫瘍において更に別の特異的な形態学的特色は観察されなかった。
【０３１７】
次に、本出願人らは、この３群において明瞭な有無が分かる発現プロファイルを有する遺伝子をＳＡＭにより探索した。これら遺伝子にコードされた数種のタンパク質候補の染色パターンを調べることにより、本出願人らは、最終的に、高ＭＶＤ且つＤＥＫ及びＭＳＨ６陽性の腫瘍を群Ａ、ＭＳＨ６陰性腫瘍を群Ｂ、低ＭＶＤだがＤＥＫ及びＭＳＨ６陽性の腫瘍を群Ｃに割り当てることができた。
【０３１８】
得られた群特異的タンパク質発現パターンを更に数多くの腫瘍において評価するため、本出願人らは、２５４種のＲＣＣによるＴＭＡをスクリーニングした。小検査ＴＭＡから得られた染色組合せを厳密に適用することにより、１８９種の腫瘍（７５％）を特定の群に明確に割り当てた。異なる腫瘍サブタイプ及び核分化グレードだが、これらの群において変動する頻度の臓器限局型転移性ＲＣＣが存在した（図６）。
【０３１９】
これらの群の臨床上の攻撃性を決定するため、本出願人らは、生存データが利用できるＴＭＡによる１８９種のＲＣＣ試料のうち１７６種における解析に集中した。カプラン−マイヤー解析は、群関連と全体的生存との高度に有意な相関（対数順位検定：ｐ＜０．０００１）を示し、それによると、患者成績は群Ａが最も良く、群Ｃが最も悪かった（図４Ｄ）。この結果は、腫瘍ステージ及び多変量解析におけるＴｈｏｅｎｅｓグレードとは独立的であった（図６）。この生存解析を行うことにより、本出願人らは、ＲＣＣの分子的再分類が、患者予後不良を伴う高い転移潜在力を有する初期腫瘍（ｐＴ１及びｐＴ２）の同定を可能にすることを立証する。その上、群Ａにおける後期非転移性ＲＣＣの知見は、その腫瘍がｐＴ３にカテゴリー化されたとしても相対的に予後良好となる患者の存在も示唆する。
【０３２０】
本報告に提示されているデータは、クラスターを形成する発見された群が、発癌の３種の共通様式を反映する遺伝子サインを表すことを示唆する。これらの遺伝子クラスターは、本出願人らのＲＣＣコホートにおいて検出された１２６種の腫瘍特異的ＣＮＡの全セットを適用することによってのみ決定することができる。したがって、ＣＮＡの頻度が単一の腫瘍において大きく異なり、なし及び１８種の変化したゲノム領域間で変動するとしても、群特異的遺伝子発現パターンのそれぞれは安定的なままであることに注目すべきである。結果的として、これらＲＣＣのそれぞれは、３種の腫瘍群のうち１群に到達するよう分子成分の制御を共に支持する、ＣＮＡとは別の個々に均衡を保つ機構（即ち、変異、メチル化、転写及び翻訳修飾）を発達させてきたに違いない（図７）。
【０３２１】
本出願人らのメタ解析は、多くの異なるヒトがん型によって追求された類似の戦略を示唆する。したがって、腫瘍型コホートにおける単一の腫瘍に存在する異なる種類の分子変化（即ち、変異、ＣＮＡ及びメチル化）全体か、特定の種類の分子変化（即ち、ＣＮＡのみ）全体のいずれかが、遺伝子発現プロファイリングにより可視化できる群特異的アウトプットを常にもたらすとの推測が導かれる。
【０３２２】
データは、各腫瘍が、試行錯誤により自身の分子ロードマップをプログラムし、最終的に３種の異なる「目的地」の１種に到達することを示す。本出願人らのメタ解析は、様々なヒトがん型におけるこれら群又は不連続状態の存在を立証したが、全てのヒトがん型ではないため、更に別の未知の群が存在し得る。
【０３２３】
３．ＲＣＣ特異的遺伝子セットの同定
発現データ作成
コンピュータで実行される、アルゴリズムに基づく解析に用いるデータは、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ製等のマイクロアレイチップを用いて作成した。試料中のｍＲＮＡは、ＰＣＲを用いて増幅する。マイクロアレイチップにおいて、各遺伝子は、遺伝子から得られた複数（通常１０〜２０種）の２５ヌクレオチド配列により表される。通常、各配列は、修正バージョンのチップ上に２回登場する。この修正バージョンをミスマッチと呼ぶ（正確なバージョンは完全マッチと呼ばれる）。これは、ｍＲＮＡの特定の配列への非特異的結合の評価に用いられる。この配列ペアをプローブペアと呼ぶ。１遺伝子の全プローブペアをプローブセットと呼ぶ。配列及びそのチップにおけるレイアウトは、マイクロアレイチップのベンダーにより定義及び記述されている。試料の各測定の後、遺伝子当たり最大５０個の値が得られ、これらは試料における遺伝子の発現レベル１個へと組み合わせる必要がある。
【０３２４】
正規化
発現レベルを決定するため、異なるアプローチを用いることもできる。顕著な一例は、モデルベースの正規化である（２７）。各プローブペアのモデルベースの正規化において、完全マッチ（ＰＭ）及びミスマッチ（ＭＭ）間の差異が計算される。次に、複数の試料又は測定から得られたある１プローブセット（即ち、ある１遺伝子）の結果を検討する。
【０３２５】
各プローブペアｐの感度ｓｐは様々であるが、このプローブペアに特異的であると仮定される。一方、ある１試料ｓにおける各遺伝子の発現ｅｓレベルは、全プローブペアで一定となる筈である。したがって、
ＰＭｓ，ｐ−ＭＭｓ，ｐ＝ｓｐｅｓ＋ｎｐ，ｓ      （１）
（式中、ｎｐ，ｓは、追加的なノイズであり、ｓｐ及びｅｓは、ここでは、ｎｐ，ｓの合計が最小となり、ｓｐ２の合計がプローブペア数に等しくなるよう最適化されている）
と仮定する。
【０３２６】
データを正規化する更に別の仕方は、カーネル回帰の使用に依存する。カーネル回帰正規化を用いることの根拠は、プローブペアシグナル及び／又は発現レベルが、異なる測定において異なるスケーリング及びオフセットを依然として提示し得ることである。例えば、ＰＣＲの期間及び有効性は、シグナルをこのようなやり方で改変し得る。更に、シグナル増幅は、非直線的な仕方において測定間で異なる可能性がある。測定を比較するために、これらの改変は補正される必要がある。この補正のための選択肢の１つは、カーネル回帰方法（３２）例えば、Ｌｏｗｅｓｓである。
【０３２７】
回帰を決定するため、遺伝子セット及び参照試料を定義する必要がある。参照試料は、異常値（outlier）の数が最も少ない最も平均な試料となるよう採用される。遺伝子セットは、全遺伝子を含んでいてもよいが、遺伝子のサブセット、例えば、マイクロアレイベンダー）によって供給される所定のハウスキーピング遺伝子セット又は不変セット方法（２８）により決定された遺伝子セットを用いてもよい。しかし、がん状態による遺伝子群の系統的増幅は、試料間に類似の非線形関係を生じ得る。したがって、カーネル回帰方法は、この文脈において慎重に用いるべきである。ソフトウェアｄＣｈｉｐ（２９）は、上述の正規化方法の大部分を実行する。
【０３２８】
スケーリング
正規化は通常、試料セットにおいて行われる。したがって、これらの試料は、スケール及びオフセットが同程度となる。しかし、異なる場所で測定及び正規化された試料は、やはりこの点において異なるであろう。したがって、
・極限のデータポイントにおける誤差
・オフセット及び
・線形スケーリング
に対して強いデータのスケーリングが必要とされる。
【０３２９】
更に、スケーリングは、この点において、他の試料から得られたいかなるデータにも依存するべきではない。これを達成するための可能性の１つは、次式の使用である。
ｅscaleｄ＝（ｆ（ｅ）−ｍ）／σ      （２）
・任意の関数ｆは、極値の影響を低下させるために発現レベルを変換することができる。例えば、これは、単位元（identity）又は対数となることができる。対数等の関数が用いられる場合、非有限値を回避するため、対数を評価する前に小さな定数εを加えることが必要となる場合がある。次に、εのサイズは、最小の測定された発現レベルの順となるべきである。
・任意の平均ｍは、１試料内の全体発現レベル（ｆによる変換後）から得られる。この平均の例として、算術平均又は中央値が挙げられる。
・任意の量σは、データのスケールを表す。本明細書における例として、１試料内の全体発現レベル（ｆによる変換後）から得られた標準偏差が挙げられる。２個の中央四分位点の考慮に入れる範囲を低下させることもできる。
【０３３０】
別の可能性として、発現レベルのハウスキーピング遺伝子セットに関して直線的なスケーリングが挙げられる。これらの遺伝子は、カーネル回帰に関して同様に選択するべきである。
【０３３１】
クラスター検索
状態は、ある腫瘍群を他の腫瘍群から遺伝子発現レベル及び医学パラメータの両方において分ける共通の特性と考えられる。これらの腫瘍群は、学習セットの腫瘍の遺伝子発現プロファイルに、教師なし学習（unsupervised learning）の異なる種類の方法（３３）（ニューラルガス（neural gases）（３１）及びクラスター検索、例えば、ｋ−最近傍検索（３５）等）を適用することによって確立することができる。アルゴリズムにより用いられる距離測定（メトリック（metric））の選択も重要である。単純ユークリッドノルムだけではなく、相関を選ぶこともできる。用いたスケーリングの種類もまた、メトリックと、したがってクラスター検索の結果に影響を及ぼす。
【０３３２】
したがって、状態を導くことができる包括的な図柄を得るには、異なるアルゴリズム、メトリック及びスケーリングを用いるのが賢明である。
【０３３３】
これらの状態は、２セットの状態が明確に分けられるが、それ自身が準状態に分かれる一種類の階層を形成することもできる。
【０３３４】
ＲＣＣの場合、Ａ、Ｂ、Ｃと表示されるがんの３状態が見出された。状態Ａ及びＣは、ＡＣと呼ぶことのできる、より一般的な状態の準状態である。
【０３３５】
遺伝子検索
状態が決定されると、今度は、所定の試料セットにおいてある状態を他の状態と区別する遺伝子を見つけなければならない。遺伝子は、あらゆる種類の系統的誤差に対し可能な限り強い仕方で選択するべきである。これは、スケーリング関数の良い選択と、選択判断基準の良い選択とを含む。可能な選択判断基準として、次のものが挙げられる。
・マイクロアレイインデックスの有意性分析（３０）。
・対象の状態の試料以外の全試料に対し０となる関数に対する、学習セットにおける全試料の発現レベルの相関。対象の状態の試料の場合、この関数は１となる。
・最適化された単一遺伝子モデル（例えば、次節を参照）を用いた遺伝子に基づく予見の正確さ。
【０３３６】
遺伝子選択の質を高めるため、これらの判断基準は、異なるスケーリング、例えば、（２）及び（４）又は異なる正規化、例えば、ｄＣｈｉｐデータ及び単にモデルベースの正規化データ並びにそれらの任意の組合せにおいて検定することができる。
【０３３７】
遺伝子検索は、あらゆる選択された判断基準に対し最小値、例えば、０．７を超える相関の絶対値又は０．８５を超える正確さを達成する遺伝子のみを含むべきである。
【０３３８】
モデル
各サブモデルは、対応する閾値θｇ及びサイド（sides）（（１）及び（−１））を有する遺伝子ｇのリスト並びに２セットの状態（セット「ｉｎ」及びセット「ｏｕｔ」）からなる。先ず、各遺伝子を個々に評価する。この遺伝子リストは、上述の遺伝子検索を用いて決定され、遺伝子の閾値は、正確さが最適となるように決定される。正の相関を有する遺伝子は「過剰発現」と考えられ、その他の遺伝子は「過小発現」と考えられる。
【０３３９】
サイドが「過剰発現」である場合、次の検定が行われる。
ｅｇ＞θｇ＋αであれば、Ｎｉｎを１増加させる      （３ａ）
ｅｇ＜θｇ−αであれば、Ｎｏｕｔを１増加させる      （３ｂ）
【０３４０】
サイドが「過小発現」である場合、次の検定が行われる。
ｅｇ＜θｇ−αであれば、Ｎｉｎを１増加させる      （３ｃ）
ｅｇ＞θｇ＋αであれば、Ｎｏｕｔを１増加させる      （３ｄ）
【０３４１】
因数α＞＝０は、遺伝子閾値θｇ前後の不確実性の範囲を定義する。スケールフリースケーリング（（２）等）を用いた場合、αの合理的な選択は１／３である。そうでなければ、スケールはαに含まれる必要がある。
【０３４２】
これらの検定は、サブモデルにおける全遺伝子に対し行われる。最終的に、２個の計算値Ｎｉｎ及びＮｏｕｔが得られる。続いて、これら２個の計算値を比較する。
・Ｎｉｎ＞βＮａｌｌ且つＮｉｎ＞γＮｏｕｔであれば、腫瘍は、「ｉｎ」状態の１種であると考えられる。
・Ｎｏｕｔ＞βＮａｌｌ且つＮｏｕｔ＞γＮｉｎであれば、腫瘍は、「ｏｕｔ」状態の１種であると考えられる。
【０３４３】
因数βは、（３）において決定されたと思われる遺伝子の最小画分を定義する。因数γは、検討されている状態セットがどの程度他の状態セットを上回る（beat）かにより定義する。合理的な選択は、β＝１／３、γ＝２である。
【０３４４】
縮小モデル
一部の適用のためには、遺伝子検索（遺伝子検索の節を参照）により作成された遺伝子リストは包括的に過ぎる。この場合、遺伝子検索の節に記されている判断基準のうち１又は複数によって選択された最良の遺伝子のみを用いてもよい。しかし、これは、用いられる所定数の遺伝子の最良の選択とはならない可能性がある。全遺伝子は個々に検定され、多数の正確な予見状態を生じるが、遺伝子がより大規模なリストから慎重に選択されない限り、同一試料を誤分類する可能性がある。要求されるサブセットのサイズが小さい程、より慎重に選択を行わなければならない。したがって、遺伝子をサブ選択（sub-select）するためのアルゴリズムが必要とされる。これは、最適化判断基準のセットにおける遺伝的アルゴリズム又は単純ランダム−ウォーク最適化等、任意の最適化アルゴリズムにより行うことができる。このような判断基準は、次のものを含むことができる。
・試料の学習セットにおける予見の正確さ。完全な遺伝子リストの結果は、試料の正確な状態であると仮定される。このように、縮小モデルは、完全モデルと一致する。
・試料の学習セットにおける予見の傾向の正確さ。上に定義するモデルから不確実性の範囲を完全に（α＝０、β＝０、γ＝１）、或いは部分的に（例えば、β＝０、γ＝１）取り除く場合、依然として状態を得ることができるが、その信頼性は低い。変化させていないモデルが状態を予見しない場合、これらの状態を予見の傾向と呼び、これを本明細書において用いることができる。更に、完全遺伝子リストを用いた予見及び傾向は、試料の正確な状態を表すと仮定される。このように、縮小モデルは、予見及び傾向の両方において完全モデルと一致する。
・検定セット試料の予見及び傾向における誤差。これらの検定セット試料は、オリジナルの学習セットには含まれていない。このようなデータは、遺伝子発現オムニバス（Gene Expression Omnibus）（３４）から得ることができる。
【０３４５】
追加的な制約（例えば、少なくとも２５％の過剰発現遺伝子）を選択アルゴリズムに適用してもよい。
【０３４６】
【表１】
2013526863.tif 000003
【０３４７】
【表２】
2013526863.tif 000004
【０３４８】
【表３】
2013526863.tif 000005
【０３４９】
【表４】
2013526863.tif 000006
【０３５０】
【表５】
2013526863.tif 000007
2013526863.tif 000008
【０３５１】
【表６】
2013526863.tif 000009
2013526863.tif 000010
2013526863.tif 000011
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【０３５２】
【表７】
2013526863.tif 000013
2013526863.tif 000014
2013526863.tif 000015
【０３５３】
【表８】
2013526863.tif 000016
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【０３５４】
【表９】
2013526863.tif 000018
【０３５５】
【表１０】
2013526863.tif 000019
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【０３５６】
【表１１】
2013526863.tif 000028
2013526863.tif 000029
2013526863.tif 000030
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2013526863.tif 000032
【０３５７】
次の刊行物が本発明の文脈内にあると考察された。
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【図１Ａ】
2013526863.tif 000033
【図１Ｂ】
2013526863.tif 000034
【図２Ａ】
2013526863.tif 000035
【図２Ｂ】
2013526863.tif 000036
【図２Ｃ】
2013526863.tif 000037
【図２Ｄ】
2013526863.tif 000038
【図３】
2013526863.tif 000039
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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