(57)【要約】  本発明は、少なくとも３０重量％、好ましくは３５重量％〜８０重量％のアミロース含量を有するデンプンから作られ、７％〜１０％、好ましくは８％〜９％のグリコシド結合α−１，６含量と、５０，０００〜１５０，０００ダルトンのＭｗとを有する分岐した可溶性グルコースポリマーに関し、この分岐した可溶性グルコースポリマーは、上記ポリマーが試験「Ｂ」に基づいて２５％〜３５％の還元糖含量および６，０００〜１２，０００ダルトンの放出生成物のＭｗとして表される膵臓α−アミラーゼに対して抵抗性のあることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３０重量％、好ましくは３５から８０重量％の間のアミロース含量を有するデンプンから調製され、７から１０％、好ましくは８から９％の間のα−１，６グルコシド結合の含量と、５０，０００から１５０，０００ダルトンの間のＭｗとを有する分岐した可溶性グルコースポリマーであって、試験「Ｂ」に基づいて
・２５から３５％の間の還元糖含量、および
・６０００から１２，０００ダルトンの間の放出生成物のＭｗ
によって表される膵臓α−アミラーゼに対する抵抗性を示すことを特徴とする、ポリマー。
【請求項２】
試験Ａに基づいて測定される１００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満の値を有する浸透圧重量モル濃度を有し、前記試験Ａが、Ｆｉｓｋｅ（登録商標）Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから入手できるＭａｒｋ  ３浸透圧計を用いて、１ｋｇの水に溶かした１００ｇ（乾燥）の前記分岐グルコースポリマーを含有する溶液の浸透圧重量モル濃度を測定することにあることを特徴とする、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
４から１２の間の平均ＤＰで
−ＤＰ＜１０が２５〜８０％、
−ＤＰ＞３０が２〜１０％
からなる分岐鎖長分布プロフィールを有することを特徴とする、請求項１または２のいずれか一項に記載のポリマー。
【請求項４】
試験「Ｂ」に基づいて
−２５％以上かつ３０％未満の還元糖含量、および
−９５００以上かつ１２，０００ダルトン未満の放出生成物のＭｗ
によって表される膵臓α−アミラーゼに対する抵抗性を示すことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリマー。
【請求項５】
試験「Ａ」に基づいて測定される１０から２０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の値を有する浸透圧重量モル濃度を有することを特徴とする、請求項４に記載のポリマー。
【請求項６】
１０から１２の間の平均ＤＰで
−ＤＰ＜１０が２５〜４０％、
−ＤＰ＞３０が５〜１０％
からなる分岐鎖長分布プロフィールを有することを特徴とする、請求項４または５のいずれか一項に記載のポリマー。
【請求項７】
試験「Ｂ」に基づいて
−３０％以上かつ３５％未満の還元糖含量、および
−６０００ダルトン以上かつ９５００ダルトン未満の放出生成物のＭｗ
によって表される膵臓α−アミラーゼに対する抵抗性を示すことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリマー。
【請求項８】
試験「Ａ」に基づいて測定される５０から１００ｍＯｓｍ／ｋｇの間の値を有する浸透圧重量モル濃度を有する、請求項７に記載のポリマー。
【請求項９】
４から６の間の平均ＤＰで
−ＤＰ＜１０が６５〜８０％、
−ＤＰ＞３０が２〜５％
からなる分岐鎖長分布プロフィールを有することを特徴とする、請求項７または８のいずれか一項に記載のポリマー。
【請求項１０】
１）少なくとも３０重量％、好ましくは３５から８０重量％の間のアミロース含量と、５から２５％の間の乾物含量とを有するデンプンの乳状液のバーストおよび可溶化のステップ、
２）好熱性微生物から抽出された２５，０００Ｕ／ｍｌから６０，０００Ｕ／ｍｌの間の活性度を有するグリコーゲン分岐酵素を、デンプン１ｇ（乾燥）当たり８００から２５００Ｕの間の用量で、６０℃から８０℃の間の温度で１２〜１８時間のあいだ連続的に加えるステップ、
３）任意選択で、１００から１５０ＫＮＵ／ｍｌの間の活性度を有するα−アミラーゼ型のデンプン液化酵素で、９５℃の温度、５から８の間のｐＨで３０〜６０分間、好ましくは４５分間処理するステップ、
４）得られた分岐した可溶性グルコースポリマーを
−活性炭および／または粒状ブラックカーボンによる少なくとも１回の処理のステップ、
−少なくとも１回の滅菌濾過のステップ、および
−任意選択で、少なくとも１回の熱処理のステップ
によって精製するステップ、
５）得られた精製済み分岐した可溶性グルコースポリマーを回収するステップ
の一連のステップを含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分岐した可溶性グルコースポリマーの調製方法。
【請求項１１】
前記精製のステップ４）が、
ｉ）前記分岐した可溶性グルコースポリマーを含有する水溶液のｐＨを、４から５の間の値、好ましくは４．５の値にするステップ、
ｉｉ）前記得られた溶液に対して活性炭および／または粒状ブラックカーボンによる２回の連続する処理ステップを行うステップ、
ｉｉｉ）１０μｍの細孔径を有するフィルター上で、次いで１μｍの細孔径を有するフィルター上で濾過するステップ、
ｉｖ）分岐した可溶性グルコースポリマーの前記溶液を蒸発、濃縮、脱塩するステップ、
ｖ）活性炭および／または粒状ブラックカーボンによる第三の処理ステップを行うステップ、
ｖｉ）１０μｍの細孔径を有するフィルター上で、次いで１．２μｍの細孔径を有するフィルター上で濾過するステップ、
ｖｉｉ）０．４５μｍ、次いで０．２２μｍの細孔径の２回の膜濾過からなる滅菌濾過を実施するステップ
の一連のステップを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載されている、または請求項１０および１１に記載の方法によって得ることができる、前記分岐グルコースポリマーを含有することを特徴とする、食品および医薬用途においてヒトおよび動物に使用することを意図する組成物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載されている少なくとも１種類の分岐した可溶性グルコースポリマーを浸透圧剤として含むことを特徴とする腹膜透析液。
【請求項１４】
ソルビトール、マンニトール、マルチトール、キシリトール、エリトリトール、および水素添加デンプン加水分解物からなる群から選択される多価アルコールもまた含むことを特徴とする、請求項１３に記載の腹膜透析液。
【請求項１５】
乳酸塩、酢酸塩、およびグルコン酸塩などの緩衝剤もまた含むことを特徴とする、請求項１３に記載の腹膜透析液。
【請求項１６】
グルコース、マルトース、および／またはグルコースポリマーもまた含むことを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の腹膜透析液。
【請求項１７】
アミノ酸およびグルコースもまた含むことを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の腹膜透析液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５０，０００から１５０，０００ダルトンの間の狭い重量平均分子量（Ｍｗ）分布に対して７から１０％の間、好ましくは８まで９％の間のα−１，６グルコシド結合の含量を有する分岐した可溶性グルコースポリマーに関する。
【０００２】
これらの分岐した可溶性グルコースポリマーはまた、α−アミラーゼに対する或る一定の抵抗性と、１００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満の低い浸透圧重量モル濃度とを有する。
【０００３】
本発明の目的では「α−アミラーゼに対する或る一定の抵抗性」という表現は、これらの分岐した可溶性グルコースポリマーが、比較的非グリセミックであることに関して有する能力、具体的にはα−アミラーゼを含有する培地中でのそれらの浸透能の持続時間を長くすることに関して有する能力（腹膜内産物の加水分解をシミュレートする）、したがって長く続く治療の間、具体的には腹膜透析用途においてそれらの使用を可能にすることに関して有する能力を意味することを意図している。
【０００４】
本発明はまた、全く特有の分岐鎖長分布プロフィールを有する可溶性分岐グルコースポリマーに関する。
【０００５】
本発明の目的では用語「分岐鎖長分布プロフィール」とは、α−１，６分岐点を介して他のα−１，４線状グルコシド鎖と結合しているα−１，４線状グルコシド鎖の、重合度（すなわちＤＰ）として表されるサイズ分布を意味することを意図している。
【０００６】
本発明はまた、非常に多くの産業用途において、具体的には医薬産業において、より具体的には腹膜透析において使用することができるような分岐した可溶性グルコースポリマーを含む組成物に関する。
【０００７】
最後に、本発明は、前記分岐した可溶性グルコースポリマーの生産方法、またより具体的には腹膜透析液の生産を意図するように前記ポリマーを精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００８】
従来、工業的に生産されるグルコースポリマーは、天然またはハイブリッドデンプン、およびそれらの誘導体の加水分解によって調製されている。
【０００９】
したがって、これらのデンプン加水分解物は、穀類または塊茎植物由来のデンプンの酸加水分解または酵素加水分解によって生産される。それらは、実際にはグルコースと、きわめて多様な分子量のグルコースポリマーとの混合物である。
【００１０】
工業的に生産される（或る一定の平均重合度すなわちＤＰを有する）これらのデンプン加水分解物（デキストリン、マルトデキストリンなど）は、線状構造（α−１，４グルコシド結合）と分岐構造（α−１，６グルコシド結合）の両方を含有する広い分布の糖を含む。
【００１１】
これらのデンプン加水分解物、具体的にはマルトデキストリンは、輸送体または充填剤として、賦形剤（ｔｅｘｔｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として、噴霧乾燥担体として、代用脂肪として、被膜形成剤として、凍結調整剤として、抗結晶化剤として、または栄養源として広く使用される。
【００１２】
マルトデキストリンの糖組成が、それらの物理学的特性および生物学的特性の両方を決定することは当業者に知られている。
【００１３】
したがって、それらの吸湿性、それらの発酵性、それらの粘度、それらの甘味性、それらの安定性、それらのゲル化性、およびそれらの浸透圧重量モル濃度は、それらが使用される様々な分野に応じて従来から評価され選択されている基準である。
【００１４】
したがってこれらの糖の物理化学的挙動の基本的知識が、例えばそれらを腹膜透析液に組み込むことにつながる。
【００１５】
腹膜透析は、透析液を腹膜腔中にカテーテルによって導入することにある。
【００１６】
一定の時間の後、血液と透析物の間で溶質の交換が行われる。
【００１７】
適切な浸透圧剤の使用は、過剰な水を血液から透析物へ排出し、こうして腎臓不全を克服することを可能にする。
【００１８】
体から過剰な水（限外濾過）および溶質を除去するための腹膜透析の従来の方法は、透析液を腹膜腔中に注入することにあり、これは浸透圧剤としてのグルコースの添加により血液に関して高張性にする。
【００１９】
理想的な半透膜を通過する流量は、溶液中に存在する溶質粒子の総数（浸透圧重量モル濃度）によって主に決まり、それらのサイズには関係ない。
【００２０】
一方、腹膜などの生体膜の場合にはその流量は、その膜を通過しないか、またはやや通過する溶質のみに左右され、したがって溶液の総浸透圧重量モル濃度には必ずしもリンクしない。
【００２１】
これに加えて溶質がこの膜を通過する能力はまた、それら分子の形状、それらのイオン電荷、かつまたそれらのサイズにも左右される。
【００２２】
理想的な浸透圧剤の選択は注意を要する。前記薬剤は、浸透勾配が腹膜を通して水および有毒物質を血液から透析液へ移動させることを可能にしなければならない。
【００２３】
それはまた、非毒性かつ生物学的に不活性でなければならず、一方で同時に体内で代謝可能で、その一部は血液中で同化されなければならない。
【００２４】
それはまた、長時間にわたる限外濾過勾配を維持するように、かつ血液中の望ましくない非分解性物質が蓄積されないように、あまり速く腹膜を通過してはならない。
【００２５】
したがって、欧州特許第２０７  ６７６号明細書は、連続的な、また携行用の腹膜透析に使用するには、５０００〜１００，０００ダルトンのＭｗおよび低い多分散性指数すなわちＰＩを有する、水に溶かして１０％の透明かつ無色の溶液を形成するデンプン加水分解物が好ましいはずであるということを教示している。
【００２６】
これは、３以下のＤＰを有するグルコースまたはオリゴ糖を全くまたはほんの少ししか含有しない、また１００，０００ダルトンを超えるＭｗを有するグルコースポリマーを全くまたはほんの少ししか含有しない、主に５０００から５０，０００ダルトンの間の高分子量グルコースポリマーを含有する組成物ということになる。
【００２７】
実際には、この用途の場合、腹壁を速やかに通過する低分子量のモノマーまたはポリマーは、長時間にわたる浸透圧勾配を作り出すための対象にならず、またさらに１００，０００ダルトンを超え、浸透能を欠く非常に高分子量のポリマーは、それらが体の中で劣化し、また沈殿する危険があるので避けるべきであり、また禁止されるべきでさえある。
【００２８】
本出願人の会社は、その欧州特許第６６７  ３５６号明細書において、水に完全に可溶であり、２．８未満の低い多分散性指数を有し、Ｍｗが８０００から２２，５００ダルトンの間にあるデンプン加水分解物を、もち性デンプンから生成する方法を提案している。
【００２９】
この方法は、アミロペクチンのみからなるデンプンの乳状液を酸加水分解にかけ、次いでこの酸加水分解物を細菌α−アミラーゼを用いる酵素加水分解によってさらに加水分解し、その加水分解物をアルカリ金属またはアルカリ土類金属形態のマクロポーラス強力カチオン樹脂上でクロマトグラフにかけることにある。
【００３０】
イコデキストリンとも呼ばれるこの特定のデンプン加水分解物は、本明細書中で後述するように光散乱によって求められる２１，０００〜２２，０００ダルトンのＭｗを有する。
【００３１】
イコデキストリンのグルコース分子の大部分は、小分率のα−１，６分岐状α−１，４鎖（１０％未満）を有するα−１，４結合の線状鎖（９０％を超える）である。
【００３２】
イコデキストリンは、透析液で浸透圧剤としてこれまで使用されていたグルコースの日々の吸収の顕著な減少を可能にし、こうしてカロリー含量が重大な要因である糖尿病および／または肥満患者の治療に実質的な利点をもたらす。
【００３３】
浸透圧剤としてイコデキストリンを含有する腹膜透析液（具体的には、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．により商品名Ｅｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）で販売されている）は、長くかかる毎日の交換（携行式連続腹膜透析においては夜間、また自動腹膜透析においては昼間）用に一般に使用されている。
【００３４】
しかしながら、より少ない血糖およびより長続きする浸透能を生じさせる浸透圧剤が存在するならば、このイコデキストリンをさらに改良することができ、これは透析治療処置の著しい簡素化につながる。
【００３５】
実際に、透析物の収率が向上することになるので、透析バッグを替える頻度がより少なくなり、これにより患者の生活の質が確実に改善されることになる。
【００３６】
したがって腹膜透析において理想的な炭水化物は、
−水溶性であり、
−低粘度を有し、
−老化せず、
−全身循環において低いグルコース出現動態を生じさせ、
−ゆっくり加水分解されるが、その加水分解の終わりに体の酵素によって完全に分解され、かつ
−長続きする浸透圧を働かせる
べきである。
【００３７】
実際に、最後の２点に関して腎不全を患っている患者の腹腔中に溶液の状態で投与された浸透圧剤の結果は、腹腔液中でのそれらの安定性、それらの全身循環中の吸収度、およびアミラーゼによるそれらの加水分解速度によって決まる。
実のところ従来技術のすべての浸透圧剤は、急速に加水分解されるという欠点を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３８】
【特許文献１】欧州特許第２０７  ６７６号明細書
【特許文献２】欧州特許第６６７  ３５６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３９】
したがって上記全体から考えると、これまで満たされていない、具体的には安定性および可溶性に関して卓越した特性を示す、また同様に、それらグルコースポリマーを含有する製品に、特に腹膜透析分野においてそれらを使用することを可能にする、より長寿命と制御された消化性とを付与するグルコースポリマーを獲得する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
多大な研究費用を費やして、少なくとも３０重量％、好ましくは３５から８０重量％の間のアミロース含量を有するデンプンから調製される新規な分岐した可溶性グルコースポリマーを構想し、開発することによって、今まで調和させることが困難であると考えられたこれらのすべての目的を調和させたことは本出願人の会社の功績である。
【００４１】
本明細書中で後に例証するように本出願人の会社は、アミロースを多く含むデンプンを出発物質として使用しさえすれば、具体的には安定性、より長寿命、および制御された消化性に関して卓越した特性を有するグルコースポリマーの生産を達成することができることを見出した。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明による分岐グルコースポリマーは、本出願人の会社がそれ自身の先行する特許出願においてすでに提案し、記述した他の高度に分岐した可溶性グルコースポリマーを含めた従来技術のものときわめて異なるという意味で可溶性グルコースポリマーの新規な系列を構成する。
【００４３】
したがって本出願人の会社は、国際公開第２００４／０２２６０２号パンフレット中で強く主張されているように、腹膜透析に使用することができるデンプン系製品は、優先的に１１から１８％の間のα−１，６分岐度と、１０，０００から２００，０００の間の分子量とを有しなければならないということに基づく第一の技術的先入観を克服した。
【００４４】
本出願人の会社はまた、高度に分岐した可溶性グルコースポリマー（１０％を超える分岐度）のみが腹膜透析に使用することができると考え、
−その欧州特許第１  ３６９  ４３２号明細書ではそのポリマーは、１０％を超える、好ましくは１２から３０％の間のα−１，６結合の含量と、３０，０００〜２００，０００ダルトンのＭｗとを有する高度に分岐した可溶性グルコースポリマーであり、
−その欧州特許出願第１  ５４８  ０３３号明細書ではそのポリマーは、１３から１７％の間のα−１，６結合の含量と、９０，０００〜１５０，０００ダルトンのＭｗとを有する高度に分岐した可溶性グルコースポリマーであり、また
−その欧州特許出願第１  ９９４  ０６１号明細書ではそのポリマーは、２０から３０％の間のα−１，６結合の含量と、２０，０００〜３０，０００ダルトンのＭｗとを有する高度に分岐した可溶性グルコースポリマーであった。
【００４５】
実のところ、本発明による少なくとも３０重量％、好ましくは３５から８０％の間のアミロース含量を有するデンプンから調製される分岐した可溶性グルコースポリマーは、７から１０％の間、好ましくは８から９％の間のα−１，６グルコシド結合の含量と、５０，０００から１５０，０００ダルトンの間のＭｗとを有する。
【００４６】
これらのポリマーは、それらのα−アミラーゼに対する卓越した抵抗性を特徴とし、その抵抗性は、本発明による分岐ポリマーの水溶液を調製し、それを膵臓由来のアミラーゼと接触させて腹膜中での製品の加水分解をシミュレートすることにある試験によって求められる。
【００４７】
本出願人の会社は、過去にその欧州特許出願第１  １７７  ２１６号明細書において、２．５から１０％の間のα−１，６グルコシド結合と、１０，０００から１０８ダルトンの間のＭｗとを有する分岐した可溶性グルコースポリマーについて述べた。
【００４８】
大部分が標準的なデンプン、特にもち性コーンスターチから調製されるそれらの化合物のいずれも、本明細書中で後に例証するように膵臓α−アミラーゼに対する抵抗性に関してこのような卓越した特性を示さなかった。
【００４９】
最後に、これらのポリマーは、試験「Ａ」に基づいて測定される１００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満の値を有する浸透圧重量モル濃度を有する。
【００５０】
本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーは、７から１０％の間、好ましくは８から９％の間のα−１，６グルコシド結合の含量を有する。
【００５１】
前記含量は、プロトンＮＭＲ分析によって求められる。
【００５２】
次いで分岐度は、前記可溶性グルコースポリマーのグルコース残基のすべてのＣ１が担持するグルコシドプロトン由来のシグナル全体に１００の値を与えたとき、α−１，６結合を介して別のアンヒドログルコース単位を結び付けるアンヒドログルコース単位のＣ１が担持するプロトン由来のシグナルの量に対応する比率として表される。
【００５３】
これらの条件下で、本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーは、７から１０％の間、好ましくは８から９％の間のα−１，６グルコシド結合の含量を有する。
【００５４】
α−１，６グルコシド結合のこの含量は、本発明による分岐グルコースポリマーに、そのポリマーがそれから誘導されるデンプンに関する分岐度の点で特別の構造を付与する。
【００５５】
このα−１，６グルコシド結合の含量は、本発明による分岐グルコースポリマーを消化し難くし、これは緩やかな消化が望ましいすべての用途にそれらを使用できることに寄与する。
【００５６】
本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーの分子量は、その重量平均分子量（Ｍｗ）を測定することによって求められる。
【００５７】
この値は、直列に取り付けられ、光散乱検出器に連結されたＰＳＳ  ＳＵＰＲＥＭＡ  １００カラムおよびＰＳＳ  ５  ＳＵＰＲＥＭＡ  １０００カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーによって得られる。
【００５８】
その場合、本発明による分岐グルコースポリマーは、５０，０００から１５０，０００ダルトンの間のＭｗ値を有する。
【００５９】
本発明によるこのポリマーは、それらのα−アミラーゼに対する卓越した抵抗性を特徴とし、前記抵抗性は本出願人の会社によって開発された試験に基づいて求められる。
【００６０】
試験「Ｂ」と呼ばれるこの試験は、具体的には透析液用の浸透圧剤の選択における必須の判定基準である、ポリマーのアミラーゼ加水分解に対する抵抗性を評価することを可能にする。
【００６１】
試験「Ｂ」によればアミラーゼ消化のための操作条件は、
−０．６ｇの試験生成物を正確に量り分け、
−１５０ｍｌのマレイン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７）を０．１モル／ｌで加え、
−生成物が溶解するまで撹拌し、
−溶液の温度が３７℃になるように、そのフラスコをサーモスタットで３７℃に調温した水槽中に１５分間置き、
−０分時に１．５ｍｌの試料（試料ＳＩ）を採取し、
−８ＵＳＰの活性当量を有するブタのパンクレアチン（動物由来のα−アミラーゼ）０．１５ｇを加え、
−サーモスタットで調温した槽中で撹拌（ＴＨＰ  １５  Ｖａｒｉｏｍａｇ撹拌機の撹拌能力の４分の３で）しながら３７℃で３００分間インキュベートし、
−１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００分時に１．５ｍｌの試料を採取し、
−試料を１００℃の乾燥槽中に１０分間置くことによって酵素反応を停止し、
−加水分解速度を調べるために試料上の還元糖を検定し、
−こうして放出されるアミラーゼ加水分解生成物の平均モル質量を求める。
【００６２】
還元糖を検定するために用いる方法はＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法であり、これは、
−２００μｌの試料を栓付き試験管中に導入し、前記試料に２００μｌの使用液（酒石酸ナトリウム試薬および硫酸銅試薬）を加え、
−沸騰させ、冷却後にアルセノモリブデン酸試薬、次いで水を加える、
ことにある。
【００６３】
得られた溶液をマイクロプレート上に付着させ、次いで吸光度をマイクロプレートリーダー上で５２０ｎｍの波長で読み取る。
【００６４】
試験「Ｂ」により還元糖を判定するための基準値は、３００分で測定された値である。
【００６５】
こうして放出されるアミラーゼ加水分解生成物の平均モル質量を求めるために使用する方法については、Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨ  ｐａｋ−ＳＢ８０２カラム−ＳＢ８０３カラム−ＳＢ８０５カラム上でのＨＰＳＥＣクロマトグラフィー法である。
【００６６】
溶離溶媒は、０．１Ｍ硝酸ナトリウム＋０．０２％アジ化ナトリウムの溶液である。流量は０．５ｍｌ／分である。カラムは、３０℃の温度に維持される。
【００６７】
屈折計を検出モジュールとして使用し、またカラムを既知のモル質量のプルランで較正する。
【００６８】
試験「Ｂ」に基づいて平均モル質量を求めるための基準値もまた、３００分で測定された値である。
【００６９】
その場合、本発明の分岐した可溶性グルコースポリマーは、試験「Ｂ」に基づいて、
−２５から３５％の間の還元糖含量、および
−６０００から１２，０００ダルトンの間の放出生成物のＭｗ
で表される膵臓α−アミラーゼに対する抵抗性を示す。
【００７０】
本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーの第一のサブファミリーは、試験「Ｂ」に基づいて、
−２５％以上、３０％未満の還元糖含量、および
−９５００ダルトン以上、１２，０００ダルトン未満の放出生成物のＭｗ
で表される膵臓α−アミラーゼに対する抵抗性を示す。
【００７１】
本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーの第二のサブファミリーは、試験「Ｂ」に基づいて、
−３０％以上、３５％未満の還元糖含量、および
−６０００ダルトン以上、９５００ダルトン未満の放出生成物のＭｗ
で表される膵臓α−アミラーゼに対する抵抗性を示す。
【００７２】
本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーはまた、特定の浸透圧重量モル濃度を有する。
【００７３】
溶液の浸透圧重量モル濃度は、水１ｋｇに溶解する物質のモル量として定義される。
【００７４】
本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーの浸透圧重量モル濃度は、欧州特許出願第１  ３６９  ４３２号明細書に記載されているものと同じ試験「Ａ」に基づいて測定され、これは水１ｋｇに溶かした本発明による分岐グルコースポリマー１００ｇ（乾燥）を含有する溶液の浸透圧重量モル濃度を求めることにある。
【００７５】
この溶液の浸透圧重量モル濃度は、Ｆｉｓｋｅ  ＴＭ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから入手したＭａｒｋ  ３浸透圧計上で作製業者の仕様書に従って測定され、１００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満の浸透圧重量モル濃度値が得られる。
【００７６】
この値は、腹膜透析用である化合物の期待すべき値に従う（高過ぎる値は前記化合物の水との強い結合を意味し、それらが腹膜の半透膜を通過するのを損なう）。
【００７７】
血液の浸透圧重量モル濃度（３００ｍＯｓｍ／ｋｇ）よりも著しく低い浸透圧重量モル濃度値が推奨される。
【００７８】
その場合、本明細書中で上記に示した、本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーの第一のサブファミリーは、１０から２０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の著しく低い浸透圧重量モル濃度を有する。
【００７９】
一方、本明細書中で上記に示した、本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーの第二のサブファミリーは、５０から１００ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧重量モル濃度を有する。
【００８０】
最後に、本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーは、それらの鎖長分布プロフィールを特徴とする。
【００８１】
本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーの分岐鎖の長さの決定は、２段階で行われる。
【００８２】
第一段階は、細菌イソアミラーゼを用いて前記生成物を脱分岐（α−１，６結合の特異的加水分解）することにあり、続いて第二段階でその放出されたオリゴ糖の重合度をサイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）によって既知のサイズのプルランと比較して特定する。
【００８３】
この手法は、分析される生成物５０ｍｇを量り分け、それに水３．７５ｍｌを加えることにある。この混合物を撹拌した後、０．５ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、その混合物を撹拌しながら３０分間煮沸させる。
【００８４】
次いで温度を４５℃まで下げ、０．２５ｍｌの１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（前もって酢酸でｐＨ３．５にした）を加える。
【００８５】
次いで、Ｈａｙａｓｈｉｂａｒａ社によって販売されている、シュードモナス・アミロデラモサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）から抽出されたイソアミラーゼを加え（５９，０００Ｕ／ｍｇの割合）、４５℃で２０分間放置して作用させる。
【００８６】
この添加を２０回繰り返し、次いで３分間煮沸することによって反応を停止させる。
【００８７】
次いでこの溶液を、Ｆｌｕｋａ社およびＳｉｇｍａ社からそれぞれ販売されているＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ２００樹脂およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−６７樹脂を用いて脱塩する。
【００８８】
次いでこの溶液を、細孔径０．４５μｍを有するナイロンフィルターを通して濾過してからＨＰＳＥＣカラムに注入する。
【００８９】
ＨＰＳＥＣクロマトグラフィーのパラメータ（ＴＳＫによって販売されているＰＷＸＬオリゴカラムおよびＳｈｏｄｅｘによって販売されているＳＢ８０２カラム＋８０３カラム＋８０４カラム＋８０５カラム上での）を
−注入量：２００ｌ、
−流量：０．５ｍｌ／分、
−カラム温度：４０℃、
−溶離液：０．２Ｍ硝酸ナトリウム＋０．０２％アジ化Ｎａ、
−溶離時間：１８０分
のように決める。
【００９０】
放出されたオリゴ糖のサイズを、それらの溶離時間を既知のサイズのプルランの溶離時間と比較することによって決める。
【００９１】
その場合、本発明による分岐グルコースポリマーは、
−ＤＰ＜１０が２５〜８０％、
−ＤＰ＞３０が２〜１０％
であり、平均ＤＰが４から１２の間にある
ことを特徴とする分岐鎖長分布プロフィールを有する。
【００９２】
本明細書中で上記に示した、本発明による第一系統の分岐グルコースポリマーは、
−ＤＰ＜１０が２５〜４０％、
−ＤＰ＞３０が５〜１０％
であり、平均ＤＰが１０から１２の間にある
ことを特徴とする分岐鎖長分布プロフィールを有する。
【００９３】
本明細書中で上記に示した、本発明による第二系統の分岐グルコースポリマーは、
−ＤＰ＜１０が６５〜８０％、
−ＤＰ＞３０が２〜５％
であり、平均ＤＰが４から６の間にある
ことを特徴とする分岐鎖長分布プロフィールを有する。
【００９４】
これと比較してイコデキストリンは、
−ＤＰ＜１０が２２％、
−ＤＰ＞３０が１６％
であり、平均ＤＰが１３である
ことを特徴とする分岐鎖長分布プロフィールを有する。
【００９５】
したがって本発明による分岐グルコースポリマーは、特にイソデキストリンと比較した場合、はっきりと識別できる鎖長分布（より低いＤＰ＞３０含量に対して著しく高いＤＰ＜１０含量）を有することを特徴とする。
【００９６】
したがってこの分岐鎖長分布は、本発明による分岐グルコースポリマーに、分岐短鎖で作られる全く特殊な構造を付与する。
【００９７】
本発明はまた、浸透圧剤として、デンプンの酵素処理によって得られる
−７から１０％の間、好ましくは８から９％のα−１，６グルコシド結合の含量、および
−光散乱によって求められる５０，０００から１５０，０００ダルトンの間の重量平均分子量（Ｍｗ）
を有する少なくとも１種類の分岐した可溶性グルコースポリマーを含むことを特徴とする腹膜透析液に関する。
【００９８】
本発明による腹膜透析液はまた、電解質の血清から腹膜への移行による損失を避けるために、生理学的に許容できる電解質、例えば、具体的にはナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、または塩素を含むことができる。
【００９９】
本発明による分岐ポリマーを水に溶解することによって溶液を得る場合、それは透明かつ無色であるべきである。
【０１００】
それは、エンドトキシン、ペプチドグリカン、およびβ−グルカンを含まず、かつ原料由来のまたはその生成に使用される酵素製剤由来の汚染物質も含まない。
【０１０１】
この趣旨で、前記溶液に使用される高分岐ポリマーは、本明細書中で後に例証するように、タンパク質、細菌、細菌毒素、繊維、金属の痕跡などのいずれの着色または望ましくない汚染物質も除去するために、好ましくは精製されることになる。
【０１０２】
本発明による透析液はまた、緩衝剤（具体的には、乳酸塩、酢酸塩、グルコン酸塩）および他の添加剤、例えばアミノ酸、インスリン、多価アルコール、例えばソルビトール、エリトリトール、マンニトール、マルチトール、またはキシリトールなど、あるいは水素添加デンプン加水分解物を含んでもよい。
【０１０３】
組成物への多価アルコールの添加、好ましくは前述の不純物（具体的にはエンドトキシン、および細菌由来の他の残渣）を含まない非発熱性多価アルコールの添加は、それらのより大きな浸透能により、またそれらが減少しないためにグルコースまたはマルトースの場合よりも溶液の浸透圧重量モル濃度を増すことを可能にするのでより有利である。
【０１０４】
最後に、グルコース、マルトース、および／またはグルコースポリマーを用いて本発明の高度に分岐した可溶性グルコースポリマーを含有する透析液を完成させることもまた可能である。
【０１０５】
アミノ酸系腹膜透析液は、たとえそれらの注意を要する酸分解の調節のコストおよび危険性がその単独のまた連続的な処方を制限するとしても、グルコースおよびその誘導体に関連した腹膜の加速老化の防止には一定の価値がある。
【０１０６】
したがって同一の腹膜透析液において様々な分子、すなわちグルコース、本発明による高度に分岐した可溶性グルコースポリマー、およびアミノ酸の混合物を作り出すことを構想することが可能である。
【０１０７】
したがって具体的には、腹膜の安定性に対する有害な影響の原因であるグルコース分解生成物（ＧＤＰ）またはグルコースと前記アミノ酸の結合により生ずる生成物（すなわちＡＧＥ）の発生を避けるために、これらの様々な成分を別々に滅菌すること（区分された袋の使用）が好ましい。
【０１０８】
さらに本発明による透析液は、含有する浸透圧剤が長時間にわたる浸透圧を与え、かつ緩やかなグルコース出現動態を生じさせ、一方で同時に老化に対して安定であることを可能にし、こうして上記で定義した主要な基準を満たすので、従来技術の製品と比較して有利である。
【０１０９】
本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーを調製するために、
１）少なくとも３０重量％、好ましくは３５から８０重量％の間のアミロース含量と、５から２５％の間の乾物含量とを有するデンプンの乳状液のバーストおよび可溶化のステップ、
２）好熱性微生物から抽出された２５，０００Ｕ／ｍｌから６０，０００Ｕ／ｍｌの間の活性度を有するグリコーゲン分岐酵素を、デンプン１ｇ（乾燥）当たり８００から２５００Ｕの間の用量で、６０℃から８０℃の間の温度で連続的に１２〜１８時間加えるステップ、
３）任意選択で、１００から１５０ＫＮＵ／ｍｌの間の活性度を有するα−アミラーゼ型のデンプン液化酵素で９５℃の温度、５から８の間のｐＨで３０〜６０分間、好ましくは４５分間処理するステップ、
４）得られた分岐した可溶性グルコースポリマーを
−活性炭および／または粒状ブラックカーボンによる少なくとも１回の処理ステップ、
−少なくとも１回の滅菌濾過ステップ、および
−任意選択で、少なくとも１回の熱処理ステップ
によって精製するステップ、
５）得られた精製済み分岐した可溶性グルコースポリマーを回収するステップ
の一連のステップを含む方法を行うことができる。
【０１１０】
アミロースを多く含むデンプンを分岐酵素で変性する方法は、部分的または完全に糊化された形態になるようにデンプンをまず蒸解することにある。
【０１１１】
本発明による方法のこの第一ステップは、アミロースを多く含むデンプンの乳状液のバーストおよび可溶化に対応しており、このデンプンの可溶化は分岐酵素による処理を可能にすることを意図している。
【０１１２】
本発明の目的では用語「アミロースを多く含むデンプン」とは、少なくとも３０重量％、好ましくは３５から８０重量％の間のアミロース含量を有するデンプンを意味することを意図している。
【０１１３】
本発明によるこの方法の一実施形態では、５から２５％の間の乾物含量を有するエンドウデンプンの乳状液を調製し、当業者には一層よく知られている任意の手法によってデンプンの糊化温度以上の、優先的には１００から２００℃の間、より優先的には１４０から１６０℃の間の温度で、４〜５バールの圧力で３〜５分間加熱する。
【０１１４】
本発明の目的では用語「分岐酵素」とは、幾種類かのグリコーゲン分岐酵素からなる群から選択される分岐酵素を意味することを意図している。
【０１１５】
より具体的にはこれらの分岐酵素は、好熱性の生物および／または微生物から抽出される。
【０１１６】
デンプンの全体的または部分的可溶化のこのステップの後、分子間複合体の形成を制限する条件下で分岐酵素を反応培地中に連続的に導入する。
【０１１７】
より具体的には分岐酵素を反応培地中に導入するための条件は、デンプンの老化、また構造化されたアミロース−脂質結合体の老化の結果として生ずる不溶性物質の形成を制限するように時間および温度に関して調節される。
【０１１８】
したがって、こうして部分的または全体的に糊化されたデンプンペーストを、その選択した分岐酵素の最適温度にするために冷却する。
【０１１９】
例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）など）の好熱性微生物から抽出された熱安定グリコーゲン分岐酵素を選択する場合、デンプンペーストをこの酵素の最適作用温度、すなわち６０から８０℃の間の温度にすることが必要である。
【０１２０】
部分的または全体的に糊化されたデンプンペーストを、その１４０から１６０℃の間の初期温度から６０〜８０℃の温度まで１５分間未満で急速に冷却するように選択するのが有利であり、それによりデンプンの老化および構造化されたアミロース−脂質結合体の形成を避けるような分岐酵素の迅速な添加が可能になる。
【０１２１】
次いで溶液のｐＨを調整して、前記酵素の作用モードに応じた値にする。
【０１２２】
本明細書中で後に例証するように、反応培地の温度を分岐酵素の最適作用温度まで急速に下げるステップの後、２５，０００Ｕ／ｍｌから６０，０００Ｕ／ｍｌの間の活性度の前記分岐酵素を、エンドウデンプン１ｇ（乾燥）当たり８００から２５００Ｕの間の用量で、６０℃から８０℃の間の温度で１２〜１８時間使用することが選択される。
【０１２３】
反応の終わりに、酵素は最終的に９０℃〜９５℃の温度で熱失活することができる。
【０１２４】
こうして分岐した可溶性グルコースポリマーが水溶液の状態で得られる。
【０１２５】
本発明によるこの方法の任意選択の第三ステップは、デンプン液化酵素、例えばα−アミラーゼに作用するようにさせることにある。
【０１２６】
反応条件（温度およびｐＨ）は、０．１０〜０．３０ｍｌのα−アミラーゼ、例えば９５℃の温度で１００から１５０ＫＮＵ／ｍｌの間の活性度を有するＮｏｖｏｚｙｍｅｓから入手できるＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）１２０Ｌ型のα−アミラーゼ、５から８の間のｐＨ、３０〜６０分間、好ましくは４５分間である。
【０１２７】
次いでこのα−アミラーゼを、例えば１０％ＨＣｌを用いてｐＨを３．５まで下げることによって失活させる。
【０１２８】
この処理の終わりに、本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーが、それらの酵素分解生成物を含む混合物として水溶液の状態で得られる。
【０１２９】
前述の特許出願、具体的には欧州特許第１  ３６９  ４３２号明細書および第１  ５４８  ０３３号明細書の教示に反して、高分子量画分を回収するために、また低分子量画分を除くために、例えば膜分離法およびクロマトグラフィーの群から選択される手法を用いた分別をここでは必ずしも行わない。
【０１３０】
したがって分岐酵素のみを用いた処理の直接生成物と、分岐酵素、次いでα−アミラーゼを用いた処理の直接生成物とが、上述の分岐した可溶性グルコースポリマーの２つの系統、すなわち
−分岐酵素による処理のみによって得られた本発明によるグルコースポリマーに対応する第一系統、および
−分岐酵素およびα−アミラーゼによる複合処理によって得られた本発明によるグルコースポリマーに対応する第二系統
を構成する。
【０１３１】
したがって、例えば膜分離法およびクロマトグラフィーの群から選択される手法を用いた、本明細書中で上述した第二系統の生成物の分別は、本発明による第三系統の分岐した可溶性グルコースポリマーを結果として生じさせることになる。
【０１３２】
本発明によるこの方法の第四ステップは、得られた分岐した可溶性グルコースポリマーを
−活性炭および／または粒状ブラックカーボンによる少なくとも１回の処理のステップ、
−少なくとも１回の滅菌濾過のステップ、
−任意選択で、少なくとも１回の熱処理のステップ
によって精製することにある。
【０１３３】
こうして、これらの活性炭および／または粒状ブラックカーボンによる処理のステップ、濾過のステップ、または熱処理のステップを特定の配列で組み合わせることによって、本出願人の会社は、汚染、具体的にはエンドトキシン、β−グルカン、およびペプチドグリカンが「実質上存在しない」ことを保証することに明らかに成功する。
【０１３４】
したがって、このような方法の安全性が、前記方法の終りでの細菌の防除を、ペプチドグリカンを検出するための単独の試験（例えば、本出願人の会社によって開発され、検証された高検出感度の試験−これについては本明細書中で後述する）に、またエンドトキシンを検出するための従来の試験（ＬＡＬ試験＝グラム陰性菌の主要成分である細菌エンドトキシンを検出するための試験）に限定することを可能にする。
【０１３５】
本発明の目的では用語「実質上存在しない」とは、薬局方試験に記載のものをはるかに下回る閾値での数量的把握を意味することを意図している。すなわち、
−Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ−Ｅｎｄｏｓａｆｅによって生産された試薬（感度０．０１５ＥＵ／ｍｌのＬＡＬライセート（ＯＲ１５０１５参照）および１瓶当たりＣＳＥエンドトキシン５００ｎｇまたは１０ｎｇ（Ｅ１１０またはＥ１２０参照））を用いたＬＡＬ試験（ゲル−クロットエンドポイント法）によるエンドトキシン（およびβ−グルカン）については、０．６ＥＵ／ｇ、また
−本出願人の会社によって開発された高感度試験によるペプチドグリカン（およびβ−グルカン）については、グルコースポリマー１ｇ当たり＜８ｎｇ（したがってペプチドグリカンについて欧州特許第１  ７２０  ９９９号明細書に記載の参考閾値をはるかに下回る）。
【０１３６】
「本出願人の会社によって開発され、検証された高感度試験」という表現は、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．社によって生産され、販売されているＳＬＰ−ＨＳシングルセットキット（２９３−５８３０１参照）を適合させることによって本出願人の会社により開発され、検証された試験を意味することを意図している。
【０１３７】
この試験は、「ＳＬＰ−ＨＳ」（カイコ幼虫血漿高感度）試薬を加えることにある。前記試薬は、カイコ幼虫血漿から調製され、
−水（例えばＬＡＬ試験用の特殊な水）に溶かして５％に調製されたグルコースポリマーの溶液中に含まれるペプチドグリカンおよびβ−グルカンと反応させ、
−セリン−プロテアーゼカスケード反応を引き起こし、
−Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．社によって製造され、販売されているＴｏｘｉｎｏｍｅｔｅｒチューブリーダーによって、前記ペプチドグリカンおよびβ−グルカンをきわめて低い閾値、すなわち、
・閾値約０．０５ｎｇ／ｍｌ（すなわち、グルコースポリマー１ｇ当たり１ｎｇ）の検出限界（ＬＤ）、および
・閾値約０．１５ｎｇ／ｍｌ（すなわち、グルコースポリマー１ｇ当たり３ｎｇ）の定量限界（ＬＱ）
（試験されるこのグルコースポリマー製品の確定されたＬＤおよびＬＱ）で検出および／または定量することができる。
【０１３８】
より具体的にはＳＬＰ−ＨＰ試験は、
−適切な品質の水（例えばＬＡＬ試験用の特殊な水）に溶かした５％溶液の状態の試験用グルコースポリマーを調製し、
−直線検量線（対数目盛線形回帰曲線Ｔａ＝ｆ（ＰＧ含量））を設定するためのＳＬＰ−ＨＳシングルセットキットのペプチドグリカン基準（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）から抽出された）を用いて、０．０４〜２．５ｎｇ／ｍｌ（標的値）の適用範囲にわたって水中でのペプチドグリカンの較正範囲を作成し、
−この調製した試験溶液１００μｌを、希釈液（前述のキット中で与えられる）１００μｌを加えることにより再構成した後のＨＳ−ＳＬＰチューブ中に導入し、
−このＳＬＰ−ＨＳチューブを、サーモスタットで３０℃に調温され、製造業者が推奨する条件に従ってパラメータが決められるＴｏｘｉｎｏｍｅｔｅｒチューブリーダー（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｔｄ．）のインキュベーションウェル中に差し込む
ことにある。
【０１３９】
この試験溶液のＰＧ含量は、設定した直線検量線によって計算される。
【０１４０】
結果は、試験される５％溶液１ｍｌ当たりのｎｇ、次いでグルコースポリマー１ｇ当たりのｎｇで表される。
【０１４１】
最後には、本発明によるこの方法によって得られるグルコースポリマー中のこれらのペプチドグリカン／β−グルカンの量が、グルコースポリマー１ｇ当たり８ｎｇをはるかに下回ることを保証されることは注目に値する。
【０１４２】
上述のように、腹膜透析を意図する分岐した可溶性グルコースポリマーを精製するためのステップにおいてこの精製の第一ステップは、特定の配置で活性炭および／または粒状ブラックカーボンを使用することにある。
【０１４３】
本出願人の会社は、下記の３つの変形形態の少なくとも１つでこの手段を実施することを推奨する。
−本発明による方法の第一の変形形態では、すなわち粒状ブラックカーボンを使用する場合には、この配置は向流モードでの作用に基づく。
【０１４４】
カラム中の滞留時間は約３時間である。パーコレーションは、細菌汚染を避けるために約８０℃の温度で約２ｍ／時間の速度で行われる。
【０１４５】
精製される本発明によるグルコースポリマーと粒状ブラックカーボンの接触は、グルコースポリマー溶液がカラムの底部でまず最初に飽和した粒状ブラックカーボンと接触するという意味で向流モードで行われる。
【０１４６】
したがって精製済みグルコースポリマーは、粒状ブラックカーボンのカラムの上部、すなわち精製された粒状ブラックカーボンが向流モードで加えられる場所で回収される。
【０１４７】
このようにカラムの上部の粒状ブラックカーボンの最後の層が「安全バリア」として働く。
【０１４８】
この配置は、粒状ブラックカーボンの「追跡」作業を行うことによって制御することができる。カラムを停止し、その底部で飽和した粒状ブラックカーボンを取り出し、上部で再生粒状ブラックカーボンと入れ替える。
【０１４９】
飽和した粒状ブラックカーボンは、脱糖してから炉床炉中で熱処理することによって再生される。
【０１５０】
始動時に、また安全のために、低乾物含量を有する分岐した可溶性グルコースポリマーの最初の１ｍ３を格下げする。
【０１５１】
汚染物質（エンドトキシン、ペプチドグリカン、およびβ−グルカン）レベルの低下の監視は、カラムの底部から上部まで一定数の試料（例えば５個）を採取して分析することによって行うことができる。
−本発明による方法の第二の変形形態では、すなわち活性炭を使用する場合には、この配置は活性炭による「二重」の処理に基づく。
【０１５２】
入って来る分岐した可溶性グルコースポリマーを、活性炭（処理される乾物に対して０．５％から５％の間、好ましくは０．５％から１．５％の間の）と、７０から７５℃の間の温度で１時間混合する。
【０１５３】
次いでグルコースポリマーを濾過し、分析する。
【０１５４】
次いでこのグルコースポリマーに同じ性質の処理を受けさせる。この第二処理は「安全」処理である。
【０１５５】
本出願人の会社は、汚染物質のサイズのばらつきを考慮に入れるために、これらの二段階において異なる気孔率の活性炭を使用することを推奨する。
−本発明による方法の第三の変形形態では、粒状ブラックカーボンの段階と活性炭の段階を組み合わせることを選択する。
【０１５６】
その場合、本出願人の会社は、この組合せの先頭に粒状ブラックカーボンのカラムを置くことを推奨する。
【０１５７】
これらの二段階を実施するための条件は、本明細書中で上述したものに一致する。
【０１５８】
本発明による腹膜透析液の生産を意図するグルコースポリマーを精製するために実施されるこれら３つの手段の第二は、滅菌濾過を使用することにある。
【０１５９】
この滅菌濾過のステップは、基本的には細孔径０．１μｍの膜濾過からなり、必要に応じて細孔径０．２２μｍの予備膜濾過がそれに先行し、またそれ自体に細孔径０．４５μｍの膜濾過が先行する。
【０１６０】
このステップは、微生物によるあらゆる汚染、具体的にはサイズが濾過孔径よりも大きいアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）型の好酸性好熱菌を保存することを可能にする。
【０１６１】
この濾過は、シロップが向かう垂直のケーシングに挿入される数個のカートリッジを用いて行われる。
【０１６２】
これらのカートリッジフィルターは、例えばＰａｌｌまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅといった会社によって供給されている。これらカートリッジのサイズは、１０、２０、または３０インチであってもよく、取り付けられるカートリッジの数により、１から２０ｌ／分／ｍ２の間の生成物流量を通すのに十分な濾過表面積を得ることが可能になる。
【０１６３】
これらのカートリッジフィルターは、約７５℃の高温で連続的に働くための、また７００時間を超える時間のあいだ上記流量を通すための抵抗能力を有する。
【０１６４】
７５℃を超える温度での作業は、いかなる微生物の成長も、具体的には好熱菌叢の成長を制限することを可能にする。
【０１６５】
これらの耐熱性はまた、それらを使い始める前に滅菌を行うことを可能にする。この滅菌は、流れを２バールでケーシングの中を２０分間通過させることにある。この滅菌の後に、精製水（薬局方の意味における）による５分間のすすぎがある。
【０１６６】
これらのフィルターはまた、設備の清掃作業に使用される或る種の化学製品、具体的には５％の濃度の過酢酸に耐える能力を有する。
【０１６７】
例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社から入手した完全性試験を用いてこれらのカートリッジに対して完全性試験を行うことができる。この完全性試験は、その組み立てを点検するためにカートリッジを取り付ける時に行われる。その場合、この試験は設備の清掃のたびにその前に、また最後に分解の前に、生成段階の間の前記カートリッジの正しい機能を確認するために行われる。
【０１６８】
フィルターの完全性を保証するために、それらの作用圧力差（△Ｐ）は２バールを超えてはならない。超える場合はこれらのフィルターを新しいものと交換しなければならない。
【０１６９】
本発明による腹膜透析液の生産を意図する分岐した可溶性グルコースポリマーを精製するために実施される第三かつ最後の手段は、特定の熱処理の使用にあることができ、これは有利にはこれらの精製ステップの終わりに実施されることになる。
【０１７０】
本出願人の会社は、この処理が、本発明によるこの方法によって提供されるグルコースポリマーの高レベルの精製を保証するのに不可欠ではないが、安全のために実施し得ることに着目した。
【０１７１】
より具体的にはこの熱処理は、まだ前記グルコースポリマーを汚染する能力のある好熱性微生物の残留バイオバーデンを排除するように時間／温度の対を調節することにある。
【０１７２】
その場合、この熱処理のステップは、１００から１３０℃の間の温度、好ましくは１２０℃の温度で、１〜５分間、好ましくは２分間加熱することにある。
【０１７３】
この熱処理は、その中をグルコースポリマー溶液が循環する管形熱交換器によって行われ、前記管形熱交換器は、その中の温度を約１２０℃に調節するために２バールの蒸気を供給されるカレンダーによって囲まれている。
【０１７４】
例えばＡｃｔｉｎｉ社によって製造されているこの管形熱交換器は、数個の部品、すなわち
−生成された／ゾーンの入口と出口の間で生成されたエネルギーを回収する部分、
−２バールの蒸気で加熱する部分、
−一体化されており、所望の滞留時間に応じて調節することができる保持部分
からなる。
【０１７５】
この熱交換器の長さは、供給流量に応じた所望の滞留時間を保証するように計算される。例えば供給流量は、約１００〜１３０Ｌの保持部分の場合、３０００から４０００ｌ／時の間であることができる。
【０１７６】
本発明によるグルコースポリマーのためのこの精製処理を例示するために、好ましい方法の一つは、ステップ２）の最後のところで指定したように分岐酵素の不活化のステップの後に、または任意選択のステップ３）の最後のところで推奨したようにα−アミラーゼを抑制するステップの後に、
ｉ）分岐した可溶性グルコースポリマーを含有する水溶液のｐＨを４から５の間の値、好ましくは４．５の値にするステップ、
ｉｉ）前記の得られた溶液に対して活性炭および／または粒状ブラックカーボンによる２回の連続する処理ステップを行うステップ、
ｉｉｉ）１０μｍの細孔径を有するフィルター上で、次いで１μｍの細孔径を有するフィルター上で濾過するステップ、
ｉｖ）この分岐した可溶性グルコースポリマーの溶液を蒸発、濃縮、脱塩するステップ、
ｖ）活性炭および／または粒状ブラックカーボンによる第三の処理ステップを行うステップ、
ｖｉ）１０μｍの細孔径を有するフィルター上で、次いで１．２μｍの細孔径を有するフィルター上で濾過するステップ、
ｖｉｉ）細孔径が０．４５μｍ、次いで０．２２μｍの２回の膜濾過からなる滅菌濾過を実施するステップ
の一連のステップを行うことにある。
【０１７７】
本出願人の会社は、ステップ２）のレベルで、その次に使用される活性炭および／または粒状ブラックカーボンのカラムの目詰まりを避けるために、活性炭および／または粒状ブラックカーボンによる２回の連続する処理の間で、第一処理の結果として生ずる溶液の粒子および不純物（例えば、汚染性の炭素または粒状ブラックカーボンの粒子）を取り除くことを推奨している。
【０１７８】
鉱物性充填剤、あるいは有機充填剤のこの除去は、滅菌条件下で当業者には一層よく知られている任意の手段によって行うことができる。
【０１７９】
例えばこれは、本明細書中で後に例証するように、無菌ディスク遠心分離機、例えばＡｌｆａ  Ｌａｖａｌ社によって販売されているもの（ＢＴＵＸ型）を用いて、あるいは精密濾過モジュール、例えばＰａｌｌ社によって販売されており、Ｍｅｍｂｒａｌｏｘセラミック膜を備えたものを用いて、あるいは５０、２５、および１０μｍの一連の細孔径を有するＥａｔｏｎバグフィルターを用いて行うことができる。
【０１８０】
こうしてこの一連のステップにより、腹膜透析液の調製を意図するグルコースポリマーの生産の安全性を少しずつ増すことが可能になる。
【０１８１】
これらの分岐した可溶性グルコースポリマーは、それらの連産品が存在する場合でさえ、その意図する腹膜透析用途に完全に適しているので全く有利である。
【０１８２】
本発明の他の特徴および利点は、下記の非限定的な実施例を読むことにより明らかになるであろう。
【実施例】
【０１８３】
実施例１：分岐酵素のみによる本発明の分岐した可溶性グルコースポリマーの調製（本発明による第一系統のポリマー）
デンプンを多く含み（９５％を超える）、３６．７％のアミロース含量を有するエンドウデンプンから１１％の乾物を含有するデンプンの溶液を調製する。
【０１８４】
このために１１０ｇ（乾燥）のエンドウデンプンを、周囲温度で撹拌しながら８９０ｍｌの水に再度懸濁させる。
【０１８５】
４％水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整する。
【０１８６】
デンプンの総可溶化をＪｅｔ  Ｃｏｏｋｅｒ中で１５０℃において４〜５バールの圧力で４分間行い、続いて熱交換器中で再循環することによって７０℃まで大気中でフラッシュ冷却する。
【０１８７】
バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から精製されたグリコーゲン分岐酵素を、４５，０００Ｕ／ｍｌの酵素の溶液で基質１００ｇ（乾燥）当たり３ｍｌの割合で連続的に加える。
【０１８８】
酵素反応を７０℃でｐＨ６．８で１５時間行い、次いで９０℃で１時間加熱することによって停止する。
【０１８９】
次いで反応培地を、温度７０℃、ｐＨ４．５に戻す。
【０１９０】
次いでそれを１％（ｄ／ｄ）の活性炭Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋上で１時間処理し、５０、２５、および１０μｍの一連の細孔径を有するＥａｔｏｎバグフィルター上で濾過する。
【０１９１】
得られた溶液を、１重量％（乾燥／乾燥（ｄ／ｄ））の活性炭Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋による７０℃で１時間のさらなる処理にかけ、次いで１１μｍの細孔径を有するＣｒｉｃｋｅｔフィルター、次いで１μｍのＥａｔｏｎフィルター上で濾過する。
【０１９２】
得られた生成物を、Ｎｉｒｏ流下膜式蒸発器上で約３０％の乾物含量まで濃縮する。
【０１９３】
混床上を４０℃未満の温度で３Ｖ／Ｖ／時の流量で通過させることによって脱塩を行う。
【０１９４】
脱塩された溶液を７０℃に加熱し、１％（ｄ／ｄ）の活性炭Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋による１時間の第三処理にかけ、次いで１１μｍの細孔径を有するＣｒｉｃｋｅｔフィルター、次いで１．２μｍの細孔径を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅカートリッジ上で濾過し、続いて０．４５μｍ、次いで０．２２μｍの細孔径を有する膜上で滅菌濾過する。
【０１９５】
次いで溶液を噴霧乾燥する。
【０１９６】
こうして精製されたグルコースポリマーは、１ｇ当たり＜０．３ＥＵのエンドトキシン含量および１ｇ当たり＜２０ｎｇのペプチドグリカン含量を有し、かつまた１ｇ当たり好気性微生物（酵母、カビ、および好熱性好酸性細菌）が存在しない。
【０１９７】
下記表Ｉは、こうして得られた本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーのイコデキストリンと比較した物理化学的特性の結果を示す。
【０１９８】
【表１】
2013518562.tif 000002
【０１９９】
本発明によるグルコースポリマーは、イコデキストリンによって生産されるものと比較して卓越した血糖能および浸透能を示す。
【０２００】
同等の浸透圧重量モル濃度の場合、本発明によるグルコースポリマーは、実際にイコデキストリンのものよりも大きな耐アミラーゼ性を呈する。
【０２０１】
本発明による分岐グルコースポリマーはまた、本出願人の会社が所有者である欧州特許第１  １７７  ２１６号の明細書の教示に従って調製したものとも異なることに注目されたい。
【０２０２】
この欧州特許第１  １７７  ２１６号明細書は、３７℃でのもち性（アミロペクチンを多く含む）デンプン誘導体またはデンプンの分岐酵素によるバッチ式処理が優先されることを教示した。
【０２０３】
したがって本出願人の会社は、この欧州特許第１  １７７  ２１６号明細書に従って得られるグルコースポリマーが、アミラーゼ抵抗性試験に関してあまり有利でない挙動を示し、これは、具体的にはＭｗ＜６０００ダルトン、好ましくは５０００から６０００ダルトンの間の放出生成物、すなわちこの実施例１に従って生成される生成物が放出する生成物のこの半分のサイズのＭｗの値が反映していることを見出した。
【０２０４】
したがって、これらの分岐した可溶性グルコースポリマーは、分子量、分岐構造、およびそれらの耐アミラーゼ性に関する挙動の点で最善の妥協を構成し、より具体的にはこれが、腹膜透析用としてそれらを特徴づけている。
【０２０５】
実施例２：α−アミラーゼと併用した分岐酵素による本発明の分岐した可溶性グルコースポリマーの調製（本発明による第二系統のポリマー）
デンプンを多く含み（９５％を超える）、３６．７％のアミロース含量を有するエンドウデンプンから、１１％の乾物を含有するデンプンの溶液を調製する。
【０２０６】
このために１１０ｇ（乾燥）のエンドウデンプンを周囲温度で撹拌しながら８９０ｍｌの水に再度懸濁させる。
【０２０７】
４％水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整する。
【０２０８】
デンプンの総可溶化をＪｅｔ  Ｃｏｏｋｅｒ中で１５０℃において４〜５バールの圧力で４分間行い、続いて熱交換器中で再循環させることによって大気中で７０℃までフラッシュ冷却する。
【０２０９】
バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から精製されたグリコーゲン分岐酵素を、４５，０００Ｕ／ｍｌの酵素の溶液で基質１００ｇ（乾燥）当たり２ｍｌの割合で連続的に加える。
【０２１０】
酵素反応を７０℃においてｐＨ６．８で１５時間行う。
【０２１１】
補足処理をα−アミラーゼにより下記条件下で行う。
【０２１２】
ＣａＣｌ２の形態の７０ｐｐｍ（乾燥／乾燥）のカルシウムイオンを加える。
【０２１３】
混合物を９５℃に加熱する。
【０２１４】
濃度１２０ＫＮＵ／ｇのＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）１２０Ｌを０．１５％（Ｖ／乾燥）加える。
【０２１５】
インキュベーションを４５分間行い、ｐＨを１０％ＨＣｌで３．５まで下げることによって反応を停止し、次いでその溶液をｐＨ３．５において温度９５℃で１５分間維持する。
【０２１６】
次いで反応培地を温度７０℃、ｐＨ４．５に戻し、次いでそれを、１％（ｄ／ｄ）の活性炭Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋上で１時間処理し、次いで５０、２５、および１０μｍの一連の細孔径を有するＥａｔｏｎバグフィルター上で濾過する。得られた溶液を、１％（ｄ／ｄ）の活性炭Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋による７０℃で１時間のさらなる処理にかけ、次いで１１μｍの細孔径を有するＣｒｉｃｋｅｔフィルター、次いで１μｍのＥａｔｏｎフィルター上で濾過する。
【０２１７】
得られた生成物を、Ｎｉｒｏ流下膜式蒸発器上で約３０％の乾物含量まで濃縮する。
【０２１８】
混床上を４０℃未満の温度で３Ｖ／Ｖ／時の流量で通過させることによって脱塩を行う。
【０２１９】
脱塩された溶液を７０℃に加熱し、１％（ｄ／ｄ）の活性炭Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ＋による１時間の第三処理にかけ、次いで１１μｍの細孔径を有するＣｒｉｃｋｅｔフィルター、次いで１．２μｍの細孔径を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅカートリッジ上で濾過し、続いて０．４５μｍ、次いで０．２２μｍの細孔径を有する膜上で滅菌濾過する。
【０２２０】
次いで溶液を噴霧乾燥する。
【０２２１】
こうして精製されたグルコースポリマーは、１ｇ当たり＜０．３ＥＵのエンドトキシン含量および１ｇ当たり＜２０ｎｇのペプチドグリカン含量を有し、かつまた１ｇ当たり好気性微生物（酵母、カビ、および好熱性好酸性細菌）が存在しない。
【０２２２】
下記表ＩＩは、こうして得られた本発明による分岐した可溶性グルコースポリマーのイコデキストリンと比較した物理化学的特性の結果を示す。
【０２２３】
【表２】
2013518562.tif 000003
【０２２４】
本発明による方法のこの変形形態によって得られるグルコースポリマー自体もまた、α−アミラーゼ抵抗性試験の見地から、具体的には放出された生成物のＭｗに関して全く卓越した挙動を示す。
【国際調査報告】
2013518562.tif 000004
2013518562.tif 000005
2013518562.tif 000006
2013518562.tif 000007
2013518562.tif 000008
2013518562.tif 000009
2013518562.tif 000010
2013518562.tif 000011
2013518562.tif 000012