(57)【要約】  電子的検出で使用する電子的流体インタフェースが提供される。前記電子的流体インタフェースは、流体試薬をセンサチップ表面に供する。前記電子的検出チップは通常は、データをパラレル様式で収集できる電子的センサのアレイを含む。前記電子的流体インタフェースは、例えば、前記チップを駆動し、前記チップからのデータを収集、記憶、分析及び表示するシステムの一部分として、及び製造後にチップを試験するためのシステムの一部分として使用され得る。前記電子的流体インタフェースは、例えば核酸配列決定応用に使用され得る。
2013537803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
装置であり、前記装置は、
ハウジングを含み、前記ハウジングは密閉部材を含む端部を含み、前記密閉部材は、電気的センサチップと前記ハウジングの端部との間に流体密閉を形成することができ、及び
前記ハウジング内に適合され及び１以上のチューブを持つプランジャを含み、
前記チューブは、前記プランジャが前記ハウジング内に設けられ、前記ハウジングがセンサチップに関連付けされる場合に、前記ハウジングの外部から前記電気的チップの表面へ流体を輸送することができ、
流体を保持することができるチャンバが、前記ハウジングが前記電気的センサチップと関連付けられ、かつ流体密閉が、前記電気的センサチップと前記ハウジングの端部の間に形成される場合に前記電気的センサチップの表面の近くに形成される、装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であり、さらに、基板に結合されるセンサチップを含むチップ基板に前記ハウジングを結合するための保持部材を含む、装置。
【請求項３】
請求項１に記載の装置であり、さらに、前記ハウジングの端部が適合し、かつ前記ハウジングを前記装置基板に保持することができる穴を持つ装置基板を含む、装置。
【請求項４】
請求項３に記載の装置であり、基板に結合される電気的センサチップを含むチップ基板が、前記装置基板に結合することができる、装置。
【請求項５】
請求項１に記載の装置であり、前記プランジャが、前記ハウジング内に取り外し可能に接続されている、装置。
【請求項６】
請求項１に記載の装置であり、前記プランジャアセンブリ及びハウジングが一体ユニットである、装置。
【請求項７】
請求項１に記載の装置であり、前記プランジャが２から２５のチューブを含む、装置。
【請求項８】
請求項１に記載の装置であり、前記ハウジングがさらに、前記ハウジングが前記電気的センサチップに関連付けられる場合に、前記電気的センサチップの表面の近くに形成されるチャンバ内の圧力が、前記チャンバ内で維持される、装置。
【請求項９】
請求項１に記載の装置であり、さらに、電気的センサチップを含み、前記密閉部材が、前記電気的センサチップの表面と前記ハウジングの端部の間に設けられ、前記電気的センサチップの表面と前記ハウジングの端部との間の密閉が形成される、装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の装置であり、前記電気的センサチップが、センサアレイを含み、戦記センサが、電界効果トランジスタ、拡張ゲート電界効果トランジスタ、電極及び光検出装置からなる群から選択される、装置。
【請求項１１】
請求項１に記載の装置であり、前記プランジャがさらに、前記ハウジングが前記センサチップに関連付けられる場合に前記電気的センサチップの表面の近くに形成される前記チャンバ内に位置する流体と接触が可能となるように、位置される電極を含む、装置。
【請求項１２】
請求項１に記載の装置であり、前記プランジャがさらに、前記ハウジングが前記センサチップに関連付けられる場合に前記電気的センサチップの表面の近くに形成される前記チャンバ内に、光を送ることができる光ファイバを含む装置。
【請求項１３】
請求項１に記載の装置であり、さらに、前記プランジャアセンブリのチューブへ流体を輸送することができる流体輸送システム、前記センサチップを駆動し、前記センサチップからデータを収集することができる電子回路、前記センサチップを駆動するために前記電子回路とインタフェースすることができ、及び前記センサチップからデータを収集し分析することでき、かつまた前記流体輸送システムの操作を指示し、前記センサチップからのデータを記憶することができるコンピュータを含む、装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載の装置であり、さらに、前記プランジャアセンブリの１以上のチューブから流体を除去することができる減圧源を含む、装置。
【請求項１５】
装置であり、前記装置は、
端部を持つハウジンを含み、前記端部は、電気的センサチップの表面に関連付けられる密閉部材へ接続されることができ、それにより前記電気的セサチップの表面と前記ハウジングの端部との間で流体密閉が形成され、及び
前記ハウジング内に適合され、及び前記プランジャ内に設けられる１以上のチューブを持つプランジャを含み、
前記チューブが、前記プランジャが前記ハウジング内部に位置され、前記ハウジングがセンサチップと関連付けされる場合に、前記ハウジングの外部から前記電気的チップの表面へ液体を輸送することができ、
液体を保持することができるチャンバが、前記ハウジングが前記電気的センサチップと関連付けされる場合に前記電気的センサチップの表面の近くに形成され、及び流体密閉が、前記電気的センサチップの表面と前記ハウジング端部の間に形成される、装置。
【請求項１６】
請求項１５に記載の装置であり、さらに、前記ハウジングに接続される保持部材を含み、ここにセンサチップを含む基板が接続される、装置。
【請求項１７】
請求項１５に記載の装置であり、さらに、それを通じて前記ハウジングの端部を適合させ、かつ前記ハウジングを前記装置基板に保持する部材を保持することができる穴を持つ装置基板を含む、装置。
【請求項１８】
請求項１７に記載の装置であり、電気的センサチップを含むチップ基板が前記装置基板に接続可能である、装置。
【請求項１９】
請求項１５に記載の装置であり、前記プランジャが、前記ハウジング内に取り外し可能に接続される、装置。
【請求項２０】
請求項１５に記載の装置であり、前記プランジャアセンブリ及びハウジングが、一体ユニットである、装置。
【請求項２１】
請求項１５に記載の装置であり、前記プランジャが２から２５のチューブを含む、装置。
【請求項２２】
請求項１５に記載の装置であり、さらに、電気的センサチップ及び密閉部材を含み、前記密閉部材が前記電気的センサチップの表面と前記ハウジングの端部の間に位置され、それにより前記電気的センサチップの本発明夢ンと前記ハウジングの端部との間で流体密閉が形成される、装置。
【請求項２３】
請求項２２に記載の装置であり、前記電気的センサチップがセンサアレイを含み、前記センサが、電界効果トランジスタ、拡張ゲート電界効果トランジスタ、電極及び光検出装置からなる群から選択される、装置。
【請求項２４】
請求項１５に記載の装置であり、前記プランジャがさらに、前記ハウジングが前記センサチップと関連付けされる場合に前記電気的センサチップの上に形成されるチャンバ内に保持される液体と接触するように位置される、装置。
【請求項２５】
請求項１５に記載の装置であり、さらに、さらに、前記プランジャアセンブリのチューブへ流体を輸送することができる流体輸送システム、前記センサチップを駆動し、前記センサチップからデータを収集することができる電子回路、前記センサチップを駆動するために前記電子回路とインタフェースすることができ、及び前記センサチップからデータを収集し分析することでき、かつまた前記流体輸送システムの操作を指示し、前記センサチップからのデータを記憶することができるコンピュータを含む、装置。
【請求項２６】
請求項１５に記載の装置であり、さらに、前記プランジャアセンブリの１以上のチューブから液体を除去することができる減圧源を含む、装置。
【請求項２７】
請求項１５に記載の装置であり、前記ハウジングがさらに、それを通じて圧力が、前記ハウジングが前記電気的センサチップと関連付けされる場合に前記電気的センサチップの表面の近くに形成されるチャンバ内に維持されることができる穴を含む、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施態様は、一般的に電子センサ、化学的及び生化学的検出のための電子センサ、電子センサのアレイ、生体分子検出及び核酸配列決定に関する。本出願は、米国特許出願第１１／２２６，６９６、発明の名称「Ｓｅｎｓｏｒ  Ａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（２００５年９月１３日出願、現在継続中、これは米国特許出願第１１／０７３，１６０、発明の名称「Ｓｅｎｓｏｒ  Ａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（２００５年３月４日出願）の一部継続出願の利益を主張する）に関連し、また米国特許出願第１１／９６７６００、発明の名称「Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」（２００７年１２月３１日出願、現在継続中）及び米国特許出願第１２／８２３９９５、発明の名称「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」（２０１０年６月２５日出願、現在継続中）に関連するものであり、これらの出願の内容は参照されて本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
電子センサなどの、極小化され大量生産される分子検出用プラットフォームは、これまで可能ではなかった場所及び条件下での妥当な価格での疾患検出を提供することを可能にしている。妥当な価格の分子診断装置が利用できることは、社会で利用可能な健康管理のコストを低減し品質を改善するものである。妥当な価格及び可搬分子検出装置はまた、安全性及び危険物検出などの応用を持ち、可能性のある生物的、生化学的及び化学的危険に対して迅速な適切に応答する可能性を提供する。
【０００３】
電子的生化学及び化学センサは、分子診断、物質検出及び同定の応用を持ち、及びＤＮＡ検出及び配列決定の応用を持つ。電子的生物／化学センサは、半導体製造技術を用いて製造される。センサは、シリコンウェハの表面上に組み立てられ、それを切断して個々のチップにする。生物／化学的応用のための電子センサは、種々の形を持ち得るものであり、例えばセンサは、電極、ナノギャップ電極、ＦＥＴ（電界効果トランジスタ）、拡張ゲートＦＥＴ、カーボンナノチューブトランジスタ及び光子検出装置などであり得る。
【０００４】
植物又は動物の疾患検出の１つの方法は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸分子についての配列情報の分析を含む。ヒトゲノムはＤＮＡを配列の約３０億のヌクレオチド及び、推定２００００から２５０００遺伝子を含む。ＤＮＡを配列情報は、多くの共通疾患、例えば癌、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血などの存在及び感染性と同様に個人の複数の特徴を決定する。ヒトゲニムの配列決定は完了するまで何年もかかった。核酸配列情報は、また、研究、環境保護、食品安全、生物防衛及び臨床応用で要求され、例えば病原体検出、即ち病原の存在又は不存在の検出又はそれらの変異体の検出などである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の実施態様は、一般的に電子センサ、化学的及び生化学的検出のための電子センサ、電子センサのアレイ、生体分子検出及び核酸配列決定に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、電子的検出で使用する電子的流体インタフェースを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａは、１つの電子的流体インタフェースを記載する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１つの電子的流体インタフェースを記載する。
【図２Ａ】図２Ａは、１つの電子センサチップ組立物を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、１つの電子センサチップ組立物を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、センサチップのための電子的及び流体的インタフェースの両方を与える、電子センサチップアセンブリ及び流体インタフェースを構成する１つの装置を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、センサチップのための電子的及び流体的インタフェースの両方を与える、電子センサチップアセンブリ及び流体インタフェースを構成する１つの装置を示す。
【図４】図４は、核酸配列決定反応のために検出装置として作用する電子的センサの単純化されたアレイを示す。
【図５】図５は、１つの電界効果トランジスタ検出装置を示す。
【図６】図６は、検出要素として電極を適用した１つの電子的センサを示す。
【図７】図７は、一般的な核酸配列決定方法のアウトラインを示し、電子的センサチップ及び電子的流体インタフェースが有用である。
【図８】図８は、センサのアレイを用いる電子的検出を実施するためのシステムのダイヤグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
電子的生化学及び化学的検出において、一方で同時に前記センサチップに電気的接続を形成しつつ、前記センサに流体を輸送する必要がある。生物／化学的応用で使用される流体は、前記流体が前記チップが格納されている前記チップ及び装置の電子部品と接触する場合には、チップが故障する可能性がある。前記電子装置の故障は、流体中に含まれる塩によりさらに悪化される。例えばここで説明したような核酸配列応用は、チップの検出領域に又はそこから流体を繰り返し輸送し除去することが必要である。流体が電子的センサチップと関連する電子部品と不適合性であることは、再現性の点で丈夫な方法でチップへ流体の輸送及び除去を繰り返すことが可能となり、又はチップを前記装置から除去又は配置することを可能にする丈夫なインタフェースを設計することを難しくしている。
【０００９】
有利には、本発明の実施態様では、流体はセンサに又はセンサから迅速に交換され得る。実施態様では、流体は全てのセンサに一時に適用される。さらに、前記センサで実施され及び又は検出されるそれぞれの反応のために前記チップの検出領域に適用される流体の量が最小化され、従って高価な試薬を節約する利点を提供する。加えて、本発明の実施態様は、前記センサチップの表面領域中の流体の乱流混合を提供する。溶液添加の際に、乱流混合は、望ましくない試薬及び生成物を前記センサ表面から洗浄し、及び前記検出チップの検出領域に添加される試薬に溶液を混合するために重要である。
【００１０】
半導体産業でのチップとはまた、マイクロチップ、集積回路（ＩＣ）チップ又はダイとして知られている。検出領域は、前記チップの表面に位置され、電子的にその他の部品と接続されている。他の電子部品は場合により前記チップの内部又は表面に設けられ、不活性な絶縁材料で封止されている。通常は、回路は、前記センサが個々にアドレスされ得る。場合により、前記センサを駆動し、前記センサの表面での事象を測定し増幅する機能のいくつか又は全てを実行するための電子回路がチップに含まれている。測定後、前記検出チップは場合により、前記チップがある装置により提供される操作環境を考慮するようにパッケージ化される。一般的に、チップのパッケージは、チップが損傷を受けることを防止し、前記チップと電源及びその他の電子部品（例えばインプット／アウトプットを実行する）であってチップのある装置を作り上げている部品と接続するための電子的接続を提供する。前記パッケージは、さらに、パッケージ内システム（ＳｉＣ）を作る選択的な別の部品とのスタック又はフリップフロップ構造において多数のダイを含み得る。又は前記センサチップはパッケージ化されていない。操作では、チップ内の回路は電子的に追加の装置と接続され、例えば増幅装置及びシグナル記録装置、データ収集及び分析装置、さらに電源などである。
【００１１】
図１Ａ及び１Ｂは、生物／化学的センサチップの電子的及び流体インタフェースを示す。図１Ａでは、断面図が、チップを駆動するために使用される電子部品と整合するセンサチップへの流体インタフェースを示す。ハウジング１０５は検出チップ１１０の表面に密接に関連付けされ、流体シールが、前記ハウジング１０５と検出チップ１１０の間に、前記検出チップとハウジング１０５の間に設けられる密閉部材１１５により形成されている。前記密閉部材１１５は、通常は、テフロン（登録商標）、テフロン（登録商標）コーティングゴム、バイトン（剛性ゴムフッ化エラストマー）、ニトリル、シリコーン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＲＦＥ）、ネオプレン（ポリクロロプレン）及び天然ゴムなどの変形可能なポリマーからなる。この実施態様で、ハウジング１０５は円筒形状であり、前記密閉部材１１５はＯリングである。前記密閉部材１１５は、いかなる形状であって、前記チップとハウジング１０５の間を密閉することができるものであればよい。前記流体密閉は、前記装置の操作の際に、外部圧力／真空源に接続されるラインを通じて負荷されるあらゆる圧力での、前記密閉部材を超えて液体が移動することを防止することができる。他の形状には、例えば楕円形、正方形、長方形及び多面体が含まれる。ハウジング１０５は場合により、１以上の孔１２０を含み、これは操作の際に、前記チャンバ１２５が、選択された圧力（例えば大気圧）を維持又は圧力に置かれることを可能にする。操作では、チャンバ１２５は、チューブ１４０を通じて輸送される流体を含む。プランジャアセンブリ１３０がハウジング１０５の中に配置される。前記ハウジング及びプランジャアセンブリは、例えばセラミックス、サファイア、合金（ステンレス鋼、チタン、青銅、銅、金）又はエンジニアリングプラスチック（テフロン（登録商標）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレンなどから製造される。ある実施態様では、プランジャアセンブリ１３０はハウジング１０５内に可動に設置されている。場合により、前記プランジャアセンブリ１３０は、ハウジング０５にねじ込まれ、ネジ山１３５がハウジング１０５の内側及びプランジャアセンブリ１３０内に設けられる（図示されていない）。他の設置機構も可能であり、例えば保持リング又はクリップである。設置機構は、前記アセンブリに圧力を与えて前記チップ１１０とプランジャ１３０との間に密閉を形成する。
他の実施態様では、前記プランジャアセンブリ及びハウジングは、例えば一体型とされる、というのはそれらが機械的に１体として設けられ成形されるからであり、又はそれらが同じ基材から加工されるからである。
【００１２】
前記プランジャアセンブリは少なくとも１つのチューブ１４０を含み、これは流体がチャンバ１２５へ又はから輸送されることを可能にする。チューブ１４０の数は、一部分、前記検出チップ１１０の機能に、前記センサに輸送される流体の数に、チューブのサイズに、及び前記プランジャアセンブリ１３０のサイズに依存する。ある実施態様では、チューブ１４０の数は、１から２５チューブの間である。他の実施態様では、チューブ１４０の数は、２から１０の間で使用される。さらなる実施態様では、少なくとも１２つのチューブ１４０が存在する。別々のチューブ１４０は、場合により、流体の輸送及び除去のために使用される。１以上のチューブ１４０は場合により、またチャンバ１２５を選択された圧力に維持するために使用される。チューブ１４０は場合により、固体プランジャ本体に形成（又はマイクロマシンされた）された孔である。又は、前記プランジャ本体は、チューブが設けられる孔を含む。操作では、１以上のチューブ１４０が流体的に流体容器に接続され、前記流体容器は、検出チップ１１０の検出領域へ輸送される試薬及び他の物質を含む流体を保持し、及び１以上のチューブ１４０は、前記チューブ１４０と接続されるチューブ系（図示されていない）を通じて真空源と接続されている。
【００１３】
ある実施態様では、前記プランジャアセンブリ１３０は、電極１４５が設けられ、前記電極は、対向及び又は参照電極として機能し得るものであり、電気的にプランジャ１５０の外部へ接続され、前記チップの駆動に関連する電子回路（図示されていない）へ電気的に接続されている。前記電極１４５は、導電性材料であって、前記装置の操作のために選択された反応条件下では不活性であり、例えば、白金（Ｐｔ），金（Ａｕ），パラジウム（Ｐｄ），ニッケル（Ｎｉ），銅（Ｃｕ），イリジウム（Ｉｒ），チタン（Ｔｉ），ロジウム（Ｒｈ），同様に金属合金，導電性カーボン例えばグラッシーカーボン，ガラス状カーボン，基底面グラファイト，エッジ面グラファイト，グラファイト，導電性ポリマー，金属ドープ導電性ポリマー，導電性セラミックス及び導電性粘土などから選択される。前記参照電極は、例えば、銀（Ａｇ），銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ），白金（Ｐｔ），飽和カロメル（水銀−塩化物），又はその他の材料であり、及び場合により、流体が半浸透し得るガラス又はポリマーに封止され得る。
【００１４】
場合により、装置（図示されていない）がプランジャアセンブリ１３０又はチップ１１０の一部分として供給され、前記チャンバ１２５内の圧力を測定することができる。同様に、装置（図示されていない）がプランジャアセンブリ１３０又はチップ１１０の一部分として供給され、チャンバ１２５の内部の温度を測定することができる。実施態様では、プランジャアセンブリ１３０が、加熱及び又は冷却要素（図示されていない）と共に設けられる。
【００１５】
さらに場合により、１以上の光学ファイバがプランジャアセンブリ１３０に設けられチャンバ１２５の内部を照明する。光検出装置のアレイが、前記検出チップ１１０表面に設けられ、光学的性質が測定される。例えば発光測定が実施される。
【００１６】
保持部材１５５が前記プランジャアセンブリ１３５を、チップ１１０を格納する基板（図示されていない）に設置し、前記密閉部材１１５が、流体を保持し得るチャンバ１２５を形成する流体密閉を形成する。本実施態様では、前記密閉部材１１５は、検出チップ１１０に密接接触している。他の実施態様では、前記密閉部材１１５は、検出チップ１１０が設けられている検出チップ１１０回りのパッケージ基材（図示されていない）と接触する。前記検出チップ１１０は、前記検出要素を暴露させたままにするか、又はパッケージ化させないかのいずれかの方法でパッケージ化される。
【００１７】
一般的に、前記チャンバ１２５は、十分な大きさを持ち、前記チャンバ１２５内に乱流混合を可能にする。大気圧を維持することは、流体が流れる際に生じ得る前記センサの圧力応答ゆらぎの効果を緩和する。図１Ａに示されるチャンバは、通常１００μｍから１０ｃｍ、１ｍｍから８ｃｍ及び１ｃｍから５ｃｍの間の直径を持つ。直径選択は、部分的に前記検出チップのサイズに関数である。チャンバ１２５の高さ（図１Ａでは符号「ｈ」）は、１００μｍから１０ｃｍの範囲である。高さの選択は、部分的に、チャンバ１２５に加えられる流体の数、及び前記チャンバ１２５内に注入される流体の速度に依存する。一般的に、前記チャンバ１２５は、１００ｎＬから１ｍＬの範囲の流体容積を保持する。図１Ａの前記グレイ領域は、チャンバ１２５内の流体の位置を示す。前記グレイ領域は、どの程度の流体が前記検出チップの操作の際に、又は前記検出チップ表面の洗浄の際に存在するかの大体の指示を与えるものであるが、これよりも大い又は少ないこともあり得る。
【００１８】
図１Ｂは図１Ａに示される装置のライン２−２に沿っての平面図である。図１Ｂでは、ハウジング１０５は、密閉部材１１５を囲んでいる。図１Ｂの平面図から、検出チップ１１０が、前記プランジャアセンブリ１３０とハウジング１０５の間の空間を通して見える。プランジャアセンブリ１３０は、チューブ１４０及び場合により、電極１４５を格納する。８チューブ１４０が示されているが、他の数のチューブ１４０もまた可能であり、前記の通り例えば１から２５チューブであり得る。保持部材１５５は、図１Ｂの断面図では正方形輪郭を持つように見えるが、他の形状も可能であり、例えば下にある電子回路を装置の操作の際にプランジャアセンブリ１３５へ輸送される流体から保護するように作用する、より大きい、より複雑及びより細長い形状であってよい。一般的に、保持部材１５５は、プランジャアセンブリ１３０を保持するように適合される一部分である。保持部材１５５の他の構造も可能である。
【００１９】
図２Ａは、チップアセンブリ２５０を示し、これは図１Ａ及び１Ｂの電気的及び流体インタフェースと組み合わせで有用である。
図２Ａ及びで、検出チップ２１０はソケット２１５上に設けられ電気的に接触しており、前記ソケットはチップ２１０と、前記検出チップ２１０を駆動し、測定し、チップ２１０からの情報を記録する外部電子回路（図示されていない）との電気的インタフェース（図示されていない）を与える。この実施態様では、チューブ２１０は、ソケット２１５に結合されたフリップチップ（又はワイヤ）であり、前記電気的インタフェースは、エポキシ、ポリイミド又は他のポリマーなどの保護的耐流体材料で封止されている。チップ２１０は、一般的に、接続を形成するより大きい導線（リード）を持つ基板び結合され得る（プリント回路基板（ＰＣＢ）など）。チップの電気的接続のための他の構成が可能であり、例えば前記センサチップが電気的接続を与えるパッケージ基材に接続され得る。前記ソケット２１５は、例えば、機械加工可能なポリマーからなり、かつ金属ピンを持ち、これにより前記チップ上のパッドと接続を形成し、外部電子回路とのインタフェースを形成することを可能にする。前記ソケット２１５は前記チップ２１０を保持し、前記チップの適合させるように設計される固定電気導線を与える。実施態様では、前記チップ２１０は、前記ソケット２１５に恒久的に設けられるものではなく、ソケット２１５はチップを固定する物理的支持を与えるものではない。ＰＣＢを使用するなどの他の構成では、物理的支持がチップ２１５に与えられ、これによりその位置をある位置に案内し保持することを可能にする。チップ（又はパッケージ化されていないチップ自体）を含むパッケージ基材は、その後チップアセンブリから取り外され、新たな又は異なるパッケージ化又はパッケージ化されていないチップがチップアセンブリ内に配置され得る。パッケージ化されたセンサチップの場合には、前記センサチップは電気的に前記パッケージ基材に接続されており、これはその後場合により、電気的に電気的インタフェースに接続され、前記インタフェースは、前記センサチップに電力を供給し、前記センサチップを駆動し及び又は測定かつ前記チップからの情報を記録し分析する電子回路との間をインタフェースする。
【００２０】
又は前記チップは、前記チップの周辺上の接続点と共に設けられ、前記チップからの接続点は、前記ソケットの前記電気的接続点に設置される。さらなる実施態様では、前記チップは、前記チップの周辺上に位置する外部電気的接続点を持ち、これは前記ソケットの導線にワイヤ結合されている。さらに、前記チップはまた、前記チップの表面に位置するセンサ及び前記チップの対抗する表面に位置する外部電気的接続点を持ち得る。この場合、前記チップの底部の全領域は電気的接続のために使用でき、ボールグリッドアレイなどの技術が使用され得る。または、多数ダイを一緒のパッケージ化して、例えばスタック又はフリップチップ構造のいずれかで完全なシステムパッケージ（ＳｉＣ）を製造することができる。
【００２１】
ソケット２１５は基板２２０に格納されており、基板はチップ２２５を含み、これはチップアセンブリを、前記流体インタフェースを格納する前記装置に設置する。一般的に、他の構成が可能であり、これにより前記センサチップを前記流体インタフェースに対して可動にし、例えば前記チップを含むホルダーを装置からスライドさせて取り出し、新しい又は異なるチップを前記装置内に配置することを可能にする。チップが装置内に置かれると、流体密閉が、前記流体インタフェースと電気的センサを含むチップの表面との間に形成される。他の実施態様では、前記チップは、ＰＣＢ内に可動に配置され、これにより前記ダイ上のパッドに配列された電気的接続が、前記ダイとＰＣＢが面と面を合わせることが可能になり、かつ前記ＰＣＢが前記ダイ上のセンサを含む領域を暴露するように切断できるようになる。
【００２２】
図２Ｂは、また密閉部材２３０を含む図２Ａのチップアセンブリを示す。他の実施態様では、前記密閉部材２３０が、前記プランジャハウジングに配置されるよりはむしろ前記チップアセンブリと共に設けられる。この実施態様では、密閉部材２３０は正方形輪郭及び切断内部円形として示されているが、他の形状も可能であり、例えば内部又は外部形状のいずれかが、リング状、楕円状、正方形状、長方形状及び多角形状（３以上の片）であり得る。密閉部材２３０として選択された形状は、前記ハウジングとセンサチップの表面との間の流体密閉を与えることが可能となる。
【００２３】
図３Ａは、流体インタフェースに関して図２Ａ及び２Ｂの流体インタフェースなどのチップアセンブリを示す。図３Ａでは、チップアセンブリ３５０は基板３５５の表面に可動に設けられている。センサチップ（図３Ａにには図示されていない）は基板３５５内の孔に面している。前記基板は、例えばシリコン、石英、ガラス、ポリマー、ＰＣＢ（多塩素化ビフェノール）材料からなる。前記センサチップの流体インタフェースは、基板３５５の反対側に設けられ、基板３５５の孔を通じて前記センサチップと流体流通する。前記流体インタフェースは、保持部材３６０を持ち、これはハウジング３６５及びプランジャアセンブリ３７０を保持し、プランジャアセンブリは前記ハウジング３６５内に配置されている。場合により、前記保持部材３６０とハウジング３６５は一体型であり、又は保持部材３６０は機械的に前記ハウジング３６５に設置され流体密閉を形成して、望ましくない流体が、電子回路を格納し得る基板３５５、又は近くにある電気部品に到達しないように防止する。ハウジング３６５は前記基板３５５の孔を通じて前記センサチップと流体的に関連し、前記センサチップ表面とハウジング３６５との間の流体密閉が存在する。複数のチューブ３７５がプランジャアセンブリ３７０を流体容器（図示されていない）と接続し、及び真空供給源（図示されていない）と接続する。場合により、チューブ３７５は、操作の際に、例えば前記チャンバが流体で満たされている時、及び前記チャンバが流体で満たされた間に、装置内の望ましい圧力、例えば大気圧に維持するため使用される。チューブ３７５の数は部分的には望ましいチップの機能に依存する。前記チューブ３７５は、プランジャアセンブリ３７０を通じてあらゆる方向に伸び、又はプランジャ亜鉛３７０の内部の孔（図示されていない）へ接続される。
【００２４】
図３Ｂは、図３Ａのライン２−２に沿っての断面を示す。図３Ｂでは、チップアセンブリ３５０は基板３５５上に可動に設けられる。前記センサチップ３７２は基板３５５の孔に面する。前記センサチップ３７２の流体インタフェースは、基板３５５の反対側に設けられ、基板３５５の孔を通じて前記センサチップと流体流通する。前記流体インタフェースは、保持部材３６０を含み、これはハウジング３６５とハウジング３６５内に位置するプランジャアセンブリ３７０を保持する。プランジャアセンブリ３７０は、場合により、ネジ穴又は保持クリップなどの機械的手段によりハウジング３６５内部に可動に設置される。除去可能な設置により、プランジャアセンブリ３７０はクリーニングのために取り外され得る。プランジャアセンブリ３７０は１以上の穴３７１を持ち、これを通じて流体が移動すること可能となる（又はチューブ系を配置する）。場合により、チューブ３７５は穴３７１を通じて伸びるか、又は穴３７１へ（又はその中に）設置される。前記流体インタフェースと前記チップアセンブリ３５０を基板３５５に設置することで、基板３５５の穴はチャンバ３８０となる。密閉部材３８５は前記ハウジング３６５を前記センサチップ３７２の表面へ流体的に密閉する。場合により、前記密閉部材３８５はハウジング３６５に設けられ、前記チップアセンブリ３５０が取り出される際にその位置に保持される。場合により、前記チャンバ３８０に面し、対向電極として作用する電極（図示されていない）が前記プランジャアセンブリ３７０内に存在する。電気的接続が、前記電極からハウジング又はプランジャアセンブリ外部へ接続され、前記電極が外部電子回路と接続される。場合により、ハウジング３６５は穴（図示されていない）を持ち、これにより前記チャンバ３８０が大気圧を維持することができる（又は他の圧力）。さらに場合により、光学ファイバがプランジャアセンブリ３７０に設けられて前記チャンバ３８０の内部を照明する。画像センサ（光検出装置）のアレイが、前記検出チップ表面上に設けられ、光学的性質が測定される。例えば発光スペクトルが実施される。
【００２５】
具体的な実施態様は、電気的流体インタフェースがＤＮＡ配列決定応用で使用される場合に提供される。前記提供される電気的流体インタフェースはしかしながら、一般的に、流体インタフェースが電気的検出チップと共に形成される応用で有用である。電気的検出チップは前記流体の内容物の分析を実施することが可能である。
【００２６】
図４は、核酸配列決定として機能する電気的センサのアレイを示す。
図４では、反応及び検出領域４１０及び固定化ＤＮＡ分子を持つ電気的センサ４００のアレイが示される。前記電気的センサ４００は、例えば電解効果トランジスタ（ＦＥＴ）、拡張ゲートＦＥＴ及び又は電極である。この例では、検出領域４１０は、前記センサ４００の表面近くにあり、そこでセンサ４００は、前記センサと接触する溶液中の変化を検出することが可能である。配列決定されるべき１つのＤＮＡ分子が、この実施態様では検出領域４１０ごとに固定化されているが、場合により、１以上のＤＮＡ分子（同じ分子の複製）がまた、前記センサ領域に固定化されてよい。場合により、前記検出領域４１０は、基板表面での凹部又はウェルとして形成される。本発明の実施態様では、１つのＤＮＡ分子が検出領域４１０に固定化されている。本発明の他の実施態様では、複数の分子が固定化される。ＤＮＡのサンプルの配列決定の前に、重複したＤＮＡ断片が、ランダムに基板表面上に固定化され、それにより統計的に１つのＤＮＡ分子４２０が、前記反応及び検出領域４１０を占めることとなる。
【００２７】
ＤＮＡサンプルは、場合により、より小さい重合分子に、例えば制限酵素又は機械的力（シェア）により断片化される。前記固定化核酸は、ヌクレアーゼ耐性塩基で末端基化されるプライマー４２５とプライミングし、核酸合成及び分解反応を実行して、増幅された合成反応の化学生成物４３０を前記検出領域４１０内で作り出す。反応生成物の検出は、次の相補的ヌクレオシドの識別を示す。前記識別された塩基位置は次に、マッチングする知られたヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドポリリン酸（場合により、ヌクレオシドのさらなる付加を防止し得る可逆的ブロックヌクレオシド）で満たされ、前記反応は、ＤＮＡ鎖４２０の次に使用可能な位置についてマッチングする塩基を決定することを繰り返す。前記方法（塩基位置の識別及び前記位置を、前記識別反応で決定されたマッチングヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性ブロック体で満たす）のこれらの要素は、表面に付けられたＤＮＡ鎖４２０について配列決定情報を決定するために繰り返される。前記反応が繰り返される数は、部分的に配列決定されるＤＮＡの塩基数に依存する。
【００２８】
図４では、増幅された化学生成物４３０が電気的に検出され、固定化ＤＮＡについての配列データが集められる。例えばＦＥＴのゲートなどの反応及び検出領域４１０で増幅された化学生成物は、前記ＥＦＴのソース及びドレイン間の電流及び容量を変化させ、これにより前記核酸合成反応の化学的に増幅された生成物の電気的検出を可能にする。検出される反応生成物及び対応するアレイでの位置は、コンピュータ及び分析プログラム又は前記チップに埋め込まれたファームウェアを用いて記録され、分析される。前記センサ内での化学的変化の検出は、酵素生成物の濃度の増加又は反応の終点まで、リアルタイムで実行される。固定化されていない核酸サンプル又は複数の固定化サンプルを持つ領域からにデータは区別される。さらに、コンピュータが場合により、前記アレイの反応領域へのアクセス及びモニタを指示するだけでなく、電気的流体インタフェースを通じて流体的に接続される流体容器から前記アレイに試薬を与えるために使用される。さらに、コンピュータは、データを分析し、配列情報をまとめる。前記センサ内の化学的変化の検出は、酵素反応生成物の濃度に応じて又は反応終了までリアルタイムで実施される。
【００２９】
電気的センサは、個々に、又はグループでモニタされる。前記センサアレイは、例えば、多くの固定化ＤＮＡ分子を、個々の反応領域をモニタすることで同時に配列決定することが可能である。前記固定化ＤＮＡを分子は、配列決定されるべきサンプルであるか、又は知られる配列のキャプチャーＤＮＡプローブであって、最初に固定化しその後配列決定されるサンプルを前記固定化プローブとハイブリダイズさせるかのいずれかである。前記キャプチャープローブは、前記サンプルＤＮＡの相補的部分にハイブリダイズするように設計された配列を持つ。ある実施態様では、固定化されるＤＮＡ分子は希釈され、統計的にそれぞれのセンサが１つの固定化ＤＮＡを分子を含む。核酸配列決定は、核酸の長い重合体を含むサンプルで実施される場合がある。前記サンプルはその長い重合体をより小さい重合体、長さで５０以下のヌクレオチドに切断することで調製される。長いＤＮＡを切断することは、例えば制限酵素を用いるか又は機械的力（シェア）を用いることでなされる。より小さい一本鎖核酸重合体はその後電気的センサのキャビティ内に固定化される。不明確な結果を示す電気的センサからの情報は廃棄される。個々のＤＮＡ分子からの配列情報は、繋ぎあわせて、より小さい重合体に切断されたより長い重合体ＤＮＡの配列を作成する。
【００３０】
さらなる実施態様では、同じ配列の複数の分子が１つのセンサで使用される。同じ配列を持つ多くのＤＮＡ分子１つのセンサ領域に付けることは、例えば、同じ配列の多くのＤＮＡ分子を含む担体を、例えば乳化重合技術を用いてセンサ領域に付けることで達成できる。乳化重合は、油で囲まれる水滴内のＤＮＡの分子を増幅する。水滴は単一のプライマーコーティングビーズ及び前記ビーズに結合し、水滴中で酵素により増幅される単一の開始ＤＮＡの分子を含む。前記ビーズは、ＤＮＡの増幅配列の担体となる。前記配列決定されるＤＮＡ分子はまた、前記センサ領域へ付けられた後インシチュで増幅され得る。さらに、前記ＤＮＡ分子は、同じ配列の多くの繰り返しを持つ１つの長い分子を形成するローリングサークル増幅を用いて増幅され得る。
【００３１】
図４では、４つのセンサを含むアレイが簡単にするために示される。半導体プロセス技術を用いて製造された電気的センサのアレイは、検出チップごとに多くのより個々にアドレス可能な領域を含むことができる。検出ユニットの数の選択はコスト、要求される精度（例えば、より正確な検出のための冗長センサー領域が設けられる）、及び検出されるべき分子の異なるタイプの数に依存する。しかし１つの検出領域を持つ検出チップもまた可能である。一般的に、センサのアレイは、あるパターン又は規則的デザイン又は構成で形成されるが、又ランダムにセンサを配置することもできる。ある実施態様では、規則的パターンのセンサが使用されて、前記センサはＸ−Ｙ座標面上にアドレスされる。アレイのサイズは、アレイに使用目的に依存する。センサアレイは、多くの反応サイトを同時にモニタすることを可能にする。約２から数百万の異なる別々のセンサからなるアレイが作成され得る。非常に高密度、高密度、中程度の密度、低密度又は非常に低密度アレイが作成される。非常に高密度のある領域は、アレイごとに約１０００００００００から約１０００００００００のセンサからなる。高密度アレイは、約１００００００から約１００００００００センサの範囲である。中程度の密度アレイは、約１００００から約１０００００センサの範囲である。低密度アレイは、通常は１００００センサ未満である。非常に低密度アレイは１０００センサ未満である。
【００３２】
標準のシリコン及び半導体プロセス方法は、非常に集積されたセンサアレイを作成することを可能にする。例えば、１ｃｍ２シリコンウェハチップは、１ｘ１０８個のセンサ領域を保持し、１領域が約１μｍ２を持ち、及び２．５ｘ５ｃｍ２のシリコンウェハチップは５ｘ１０９個のセンサを含み、これは１領域で約０．５ｘ０．５μｍ２を占める。
【００３３】
本発明の実施態様では、電気的センサは個々にアドレス可能なセンサのアレイである。アレイは、種々の寸法及び電気的センサ領域の数を持って作成される。センサの数の選択は、例えば、検出されるべき分析物のタイプ、検出領域のサイズ及びアレイ製造にかかるコストなどのファクタで決められる。例えば、センサのアレイは、１０ｘ１０、１００ｘ１００、１０００ｘ１０００、１０５ｘ１０５及び１０６ｘ１０６などである。
【００３４】
電気的センサは、例えばＦＥＴ（電界効果トランジスタ）装置、拡張ゲートＦＥＴ、インピーダンス検出用電極及び又は酸化還元電極、酸化還元サイクル検出用デジタル化又は近接した電極配置、及びその電気的性質が対象となる化学物質で変調される物質などの装置、及び光検出装置を含む。電極に適用される電気的センサは、インピーダンス、抵抗、容量及び又は電極上又はその近くに位置する物質の酸化還元電池を測定することができる。光検出装置に適用される電気的センサは、発光スペクトルを用いて発光性タグ化分子の消光寿命を測定することができる。
【００３５】
図５は、基本的なＦＥＴ（電界効果トランジスタ）系装置５０５を示し、選択的な装置ウェル５１０内に設けられている、分析されるべき溶液中の変化（図示されていない）を検出することができる（又は測定されるべき表面結合物質を持つセンサについて近くの分子の変化）。核酸合成反応からの前記ウェル５１０内で生成された増幅化学シグナルは、前記電気的センサ５０５によって電気シグナルに変換される。前記センサ５０５は、ｐ−タイプＦＥＴ、ｎ−タイプＦＥＴ、カーボンナノチューブトランジスタ又はグラファイトトランジスタであってよい。実施態様では、前記センサ５０５は、ナノサイズ化された反応ウェル５１０、及び絶縁層で分離された半導体トランジスタを持つ。前記ＦＥＴ系装置５０５は、基板５１５、ソース５２０、ドレイン５２５、導電性電極５３０（金、銅、銀、白金、ニッケル、鉄、タングステン、アルミニウム又はチタン金属などの金属からなる））及び検出領域５３５を含む。前記検出領域５３５（又は「チャンネル」）は通常、絶縁材料（例えばシリコン酸化物、シリコン窒化物、アルミニウム窒化物及びシリコン酸化窒化物など）の薄層でコーティングされているドープ半導体材料からなる。前記半導体トランジスタのチャンネル５３５は、例えば、ｐ−又はｎ−タイプの半導体からなり、これは当該技術分野では知られており、例えばホウ素、ヒ素、リン又はアンチモンでドープされたシリコン又はゲルマニウムなどである。場合により、前記ウェル５１０は、約１００ｎｍ未満、約１μｍ未満又は約１０μｍ未満の寸法である。一般的に、ＦＥＴでは、前記検出領域５３５の近くに位置する材料、例えばウェル５１０中の溶液又は前記絶縁材料５４０上に直接付けられている材料により形成される電場は、前記検出チャンネル５３５の導電性を変化させる。前記検出チャンネル５３５の導電性の変化の測定は、変化が、反応溶液などの検出チャンネル５３５の近くの材料に生じたことを示す。場合により、前記バイオセンサは、例えばシリコン酸化物からなる取り囲む不活性側部５５０により形成されるウェル５１０を含み、この中に試薬及び又は生成物が含まれる。他の実施態様では、センサ及びセンサアレイは、前記検出領域としてウェル又は凹部の代わりに平坦表面を含む。また場合により、分析されるべき核酸５５５又は他の分子は前記検出領域５３５上に結合される。他の実施態様では、分析されるべき核酸又は他の分子は、例えば前記検出領域５３５の上に位置する表面、又は前記ウェルの側壁上に結合される。有利には、前記検出領域近くで検出されるべき分子を集めるように設計されたセンサは、溶液中に存在する分子を検出するセンサ上で検出感度において大きな増加を与える。例は、表面結合特異的結合分子、対象となる目標分子に特異的に結合する分子、例えばピロリン酸塩又はリン酸塩イオンを特異的に認識し結合し得るピロリン酸塩又はリン酸塩結合分子などである。
【００３６】
さらに、前記センサは、金属からなるミクロ製造金属電極であり、前記電極金属がＦＥＴのチャンネル領域の丈夫に堆積されるものである。この例では、前記金属電極は、ＦＥＴ装置の拡張ゲートとなる。前記拡張ゲートの金属は、生化学（配列決定）反応が生じる領域に機能的に接続される表面領域を持つ。拡張ゲートＦＥＴは、例えばＣＭＯＳプロセスで製造されるＦＥＴ装置に機能的に接続される金属を持つ。前記金属性拡張ゲートは、ＦＥＴセンサが位置されるシリコン基板の上部に相互接続を構築するために使用されるプロセスに類似するプロセスで構築され得る。前記拡張ゲートの暴露表面は、電気化学的に安定な、Ａｕ、Ｐｔ又はＰｄなどの貴金属から作られる。
【００３７】
電極は、そこに暴露される溶液のインピーダンス（ＡＣ電流）、抵抗、及び容量を測定するために使用される。場合により、電極電流が、前記電極−溶液界面で適用されるＤＣ電圧の関数として測定される。通常は、インピーダンス測定は、前記電極−溶液界面で、ＡＣ安定状態及び一定ＤＣバイアスの条件下で、電気的インピーダンスを測定することを含む。図６は、電極が検出要素を与える例示的バイオセンサを示す。図６では、基板６０５は第１の電極６１０を格納し、これは作用電極として作用し、及び第２の電極６１５を格納し、これは対向電極として作用する。さらに、第３の電極（図示されていない）が格納され、これは場合により使用される参照電極として作用する。反応液６２５は、作用電極６１０と対向電極６１５の間を電気的に接続する。分析されるべき分子（図示されていない）は、前記基板６０５、作用電極６１０、又は作動センサ装置の部分を形成する他の構造であって分析されるべき分子が溶液中にありかつ前記電極の近くに存在する他の構造（例えば電極を囲むウェルの壁又はミクロ流体チャンネルなど）に結合される。場合により、検出されるべき分子（特異的結合分子、対象となる目標分子に特異的に結合する分子、例えばピロリン酸塩又はリン酸塩イオンを特異的に認識し結合し得るピロリン酸塩又はリン酸塩結合分子などである特異的結合分子）の層６２０が前記作用電極６１０の上に位置される。破線矢印６３０は、電極６１０と６１５の間の電流又は荷電の動きを示す。電気回路６３５が、インピーダンス、容量及び又は抵抗を測定する。通常は、種々の条件下で電流が検出される。前記回路６３５から検出された出力シグナルは、前記回路６３５へ与えられる入力シグナルとは異なる。前記入力シグナルは、第一に周波数及び波形の点で異なる。インピーダンス、容量及び抵抗は、所与の電圧（Ｖ）と周波数で検出電流（Ｉ）に基づき計算される。計算値は使用された回路モデルに依存する。例えば、Ｄａｎｉｅｌｓ，  Ｊ．Ｓ．，  Ｐｏｕｒｍａｎｄ，  Ｎ．の「  Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｙｌｓｉｓ，  １９，  １２３９−１２５７  （２００７）」、Ｃａｒｒａｒａ，  Ｓ．らの「Ｓｅｎｓｏｒｓ  ＆Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ８８，  ３１−３９  （２００８）」、Ｃａｒｒａｒａ，  Ｓ．らの「Ｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ７６，  ９６９−９７７  （２００７）」及びＷａｎｇ，  Ｊ．  Ｃａｒｍｏｎ，  Ｋ．Ｓ．，  Ｌｕｃｋ，  Ｌ．Ａ．，  Ｓｕｎｉの「Ｉ．Ｉ．，  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．  ８，  Ｈ６１−Ｈ６４  （２００５）」を参照のこと。場合により、回路６３５は集積回路である。入力及び出力制御を与える電子回路（図示されていない）が、場合により、例えば集積回路チップなどで前記基板に格納されるか、及び又は前記基板の外部にある回路を介して提供される。
【００３８】
電気的検出応用で使用される電極は、導電性材料を含み、これは反応条件下で不活性であり、例えば金又は白金である。さらなる実施態様では、前記電極は、金属、金属の組合せ又は他の導電性材料から作られる。例えば、電極は、白金，パラジウム，ニッケル，銅，イリジウム，アルミニウム、チタン，タングステン、ロジウム，同様に金属合金，導電性カーボン例えばグラッシーカーボン，ガラス状カーボン，基底面グラファイト，エッジ面グラファイト，グラファイト，導電性ポリマー，金属ドープ導電性ポリマー，導電性セラミックス及び導電性粘土などから作られる。電極表面は場合により変性されており、例えば前記センサの表面へ分子（分析物）を結合することを容易にする機構として前記表面のシラン化による変性などである。
【００３９】
電気的センサは、例えばチップ製造のために使用される集積回路（ＩＣ）製造プロセス（例えば、ＣＭＯＳ，バイポーラ又はＢＩＣＭＯＳプロセス）を用いて製造される。チップ製造の基本的技術は、基板上に材料の薄膜を堆積し、フォトリソグラフィー画像化又は他の知られるリソグラフィ方法を用いて前記膜上にパターン化マスクを適用し、及び前記膜を選択的にエッチングする、ことである。薄膜は、数ナノメートルから１００ミクロンの範囲の厚さを持つ。使用される堆積技術は、化学蒸着（ＣＶＤ）などの化学的方法、電極堆積、エピタキシャル及び熱酸化及び物理蒸着（ＰＶＤ）などの物理的方法及びキャスティングなどを含む。前記ミクロ機械的部品は、適合性のあるマイクロ加工方法を用いて製造され、これはシリコンウェハの部分を選択的にエッチングで取り除き、新たな構造層を加えて機械的及び／又は電気機械的部品を形成することである。電気的センサは、信頼を持ってＣＭＯＳ（相補的金属酸化物半導体）適合性方法で製造され、高密度集積センサユニット（及び場合により、駆動電子回路）を単一のプラットフォーム上、例えば通常集積回路製造応用で使用されるチップ又はシリコンウェハに形成できる。前記電気的センサが非常に小型であり、高い感度を持つものであることから、これらは、超低濃度の分子及び生体分子の検出可能性を提供する。
【００４０】
かかるチップで使用するための知られた材料が、開示された装置で使用でき、これには、シリコン、二酸化ケイ素、シリコン窒化物、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、プラスチック、ガラス及び石英を含む。
【００４１】
場合により、検出及び電極駆動及びデータ記録のための電子回路のいくらか又は全てが集積回路とされ、これは電気的センサのアレイを格納する基板の位置部分をなす。入力及び出力を与える電子回路が、場合により、例えば集積回路チップとして基板に格納され、又は基板の外部の回路を通じて提供される。検出電極のアレイは、場合により、個々の電極にアドレスし、電極に選択された電圧を駆動するための回路、電極特性測定のためのメモリとマイクロプロセッサ、差動増幅装置、電流検知回路（ＣＭＯＳ画像センサで使用される回路の変更型）及び又は電界効果トランジスタ（直接又は浮動ゲート）を有する。前記チップはまた場合により、チップ機能を管理するソフトウェアが埋め込まれている（ファームウェア）。検出機能の１以上が、外部装置又は接続されたコンピュータシステムで実施され得る。
【００４２】
場合により、前記センサ装置はさらに、加熱及び又は冷却要素を持ち、前記検出領域の温度を制御することを可能にする。場合により、センサ装置は、シグナル検出及び熱制御のための電子回路と組み合わされる。熱要素は場合により、前記検出装置内、前記検出装置のハウジング内又は前記電気的流体インタフェース内に設けられる。、センサ装置の温度を制御する例示的方法は、抵抗ヒーターとしてＡｕ，Ａｇ又はＰｔの薄金属膜の使用、及び前記制御回路へ温度フィードバックする温度センサとしての別の金属膜（Ｐｔ又はＡｕ）の使用を含む。電子回路は、前記検出装置と組み合わされ、要素が、制御ソフトウェアを実行することを可能にし、センサ、シグナル検出及び熱制御のための駆動電力入力を提供する。
【００４３】
センサの分子結合サイトは、表面に付けられた化学的機能基又は分子であり、これはモノマー、リンカー、核酸、タンパク質又はその他の分子を基板表面へ付加することを可能にする。前記分子結合サイトは、実施態様では、分子が付加又は結合することができる反応性機能性基を含む。前記分子結合サイトは保護又は保護されていなくてよい。センサ表面は、例えば、アミン、アルデヒド、エポキシ及び又はチオール基の１又は組合せで官能基化されており、及び、結合される分子は、アミン（これは表面上のカルボキシ、エポキシ及びアルデヒド官能基のため）及びカルボキシル（これは表面上のアミン基のため）、チオール（これは表面上の金のため）で官能基化され、分子結合サイトを形成する。種々の共役化学が官能基を結合させるために利用できる。基板表面の分子の濃度は、種々の方法で制御でき、例えば：表面官能基の濃度を制限剃る方法又は結合される分子の量を制限することなどである。ある実施態様では、分子結合サイトは、ビオチン分子であり、前記結合される分子はアビジン分子（又はストレプトアビジン分子）である。
【００４４】
核酸結合サイトは、基板表面のサイトでありそこには、官能基、核酸、親和性分子又は他の核酸を基板表面へ結合させる反応が可能な分子が存在する。ＤＮＡ分子は、基板又はセンサ表面に標準方法で固定化され、例えばビオチン−アビジン又は抗体−抗原結合などである。ビオチン、アビジン、抗体又は抗原は、例えば、シリコン酸化物からなる絶縁層に結合されるが、この絶縁層であるシリカ表面は、例えば（３−アミノプロピル）トリエトキシシランで処理されて分子結合のためにアミノ基が存在するように表面が調製されている。分子は、水溶性カルボジイミドカップリング剤、例えばＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（これはカルボン酸官能基をアミン基と結合させる）を用いることで結合される。対応するカップリング基を持つＤＮＡ分子がその後前記表面に、例えばビオチン−アビジン又は抗体−抗原相互作用により結合される。さらに、アクリダイト変性ＤＮＡ断片を、例えばチオール基で変性させた表面に結合させ、アミン変性ＤＮＡ断片を、例えばエポキシ又はアルデヒド変性表面に結合させる。前記核酸結合サイトはまた、表面に結合されるべき核酸にハイブリダイズし得る核酸であり得る。
【００４５】
金属、金属酸化物及びＳｉＯ２などの多くの材料及び電極材料は、表面結合性−ＯＨ基を持ち、これはさらに反応及び分子結合に利用できる。さらに、分子結合のための−ＯＨ基を持つ表面は、場合により、基板上に、例えば金属上の薄金属酸化膜形成（化学的又はプラズマエッチングなどにより）又は前記表面上にＳｉＯ２の薄層を堆積させることで形成される。基板表面がＳｉＯ２、前記表面がＳｉＯ２でコーティングされたものか、又は前記表面は利用可能な−ＯＨ基を持つ金属である場合には、分子は、場合により、前記センサ表面へシランリンカー剤（有機シラン化合物）を用いて結合させ得る。ニッケル，パラジウム，白金，二酸化チタン，アルミニウム酸化物，インジウムスズ酸化物，銅，イリジウム，アルミニウム，チタン，タングステン，ロジウムなどの金属表面又は他の利用可能なヒドロキシ基又は他の類似の表面基を持つ表面などが、分子をさらに結合させるためにシラン化され得る。
【００４６】
基板表面に結合される分子の濃度は、場合により、ブロック基を設けることで制御されるが、ここでブロック基とは、例えばウシ血清アルブミンタンパク質又は非官能基化シラン分子（二酸化ケイ素表面をシラン化することができるが、さらなる分子を結合させるための官能基を持たない分子）などの他の分子結合する分子と共には、分子結合のための前記表面上に、分子を付着又は結合することができなくする基である。ＤＮＡ結合のための表面をコーティングするために使用する溶液中のブロック又は非ブロック分子の濃度を制御することで、統計的に１ＤＮＡの分子が検出のための検出領域に結合される。前記ＤＮＡが、ビオチン−アビジン相互作用により前記表面に結合される場合、前記ビオチンラベル化ＤＮＡは、最終的に統計的に１ＤＮＡ分子が１キャビティとなる濃度で遊離のビオチンを含む溶液中で結合のための表面上に存在することができる。
【００４７】
図７は、核酸配列決定反応のための増幅された化学シグナルと配列データを提供する方法を示す。図７に示される方法は、電気的検出装置のアレイ及び電気的流体インタフェースを用いてＤＮＡ分子の断片を配列決定するために有用である。図７では、配列決定されるＤＮＡ７０５がプライマー７１０でプライマー化され、前記プライマーはエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドで末端化され、この例ではチミンである（図７ではヌクレアーゼ抵抗性を「＾」で表している）。相補的ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチドトリリン酸を表し、例えばｄＡＴＰ（デオキシアデノシントリリン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジントリリン酸）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシントリリン酸）、又はｄＴＴＰ（デオキシチミジントリリン酸）など）又はｄＮＴＰ類似体であって、配列決定される核酸鎖７０５の塩基と相補的である塩基から得られる化学生成物は、前記プライマー配列７１０への次の相補的ヌクレオチドの付加及び切断が繰り返されることで増幅される。実施態様では、個々の試験反応は、４つのｄＮＴＰのいずれかを用いて実施され、配列決定される核酸の次の相補的ヌクレオチドに関して判定がなされる。一般的に、試験反応は、ポリメラーゼ、エキソヌレアーゼ及びデオキシヌクレオシドトリリン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ又はｄＧＴＰなど）、４から５のリン酸基を含むヌクレオシドオリゴリン酸、又はラベル化ヌクレオシド類似体（４から５個のリン酸基を含むラベル化ヌクレオシドトリ又はオリゴリン酸）を含む。ラベル化剤は酸化還元ラベル化剤を含み、これは酸化還元活性性物であり、例えばアミノフェニール、ヒドロキシフェノール又はナフチル基がヌクレオシドトリ又はオリゴリン酸の末端に結合され、リン酸基が除去された後酸化還元活性となる。一般的に、酸化還元性ラベル化剤は、核酸内にラベル化ヌクレオシオドが挿入されてポリリン酸ヌクレオシドから除去された後、酸化還元活性となり、電極で検出可能となる。前記酸化還元性ラベル化剤は、酸化還元活性になる前に、さらにヌクレオシドポリリン酸から挿入−関連開裂後のさらなる反応、例えばリン酸基又はポリリン酸基の除去などの反応を行う。酸化還元ラベル化ヌクレオシドポリリン酸の挿入後、リン酸基がホスファターゼ酵素を用いて前記ラベル化剤から除去される。放出された酸化還元性ラベル化剤は、電気化学的に検出され、及び又は酸化還元サイクル技術を用いて検出される。
【００４８】
図７では、相補的ヌクレオシドが成長するＤＮＡ分子（プライマー鎖）７１０に挿入され、そこからポリメラーゼ酵素の作用で切り出される。通常の有用なポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡをポリメラーゼであり、例えばＥＣｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ及び市販の９Ｎ及びその変性誘導体、例えばＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡから入手可能）である。配列決定される鎖７０５上に例えばシトシンが存在する場合、グアニンが挿入されるが、チミンが存在する場合、アデノシンが挿入され、逆もまたそうである。前記ヌクレオシドトリリン酸が、前記試験反応で成長する鎖７１０内に挿入される場合には、その後ピロリン酸イオン（即ち、ピロリン酸ＰＰｉ、又はＰ２Ｏ７−４）、ポリリン酸又はラベル化ポリ又はピロリン酸が放出される。増幅反応において、エキソヌレアーゼは、挿入されたヌクレオシドモノリン酸（ｄＮＭＰ−２）を除去するために使用され、他の相補的ヌクレオシドトリリン酸が挿入され、さらにＰＰｉが放出されることが可能となる。この添加及び切断反応の繰り返しが、核酸合成の反応生成物を増幅させる。従って、陽性試験反応（即ち、化学的に増幅された生成物の検出）は、配列決定されるべきテンプレートＤＮＡ鎖７１０でのプライマー７１０鎖のプライム塩基（３’塩基）直後の塩基が、試験塩基（合成及び分解反応で使用された４つのｄＮＴＰの１つ）相補的である、ということを示す。追加及び切断のこれらの要素は、検出可能なシグナルが認められるまで繰り返される。場合により、前記反応手順は、ｄＮＴＰの挿入を示す陽性結果が得られる場合は、残る塩基の挿入を試験することなく（相補性）停止され得る。
【００４９】
図７は、前記テンプレート上の次の塩基を配列決定するために、前記プライマー鎖７１０の最初に識別された塩基が充填され又は識別されたヌクレアーゼ耐性ブロックヌクレオチド（３’ブロックは、図７では「°」で示される）であってこれは次に脱ブロック後に次の試験反応のためのプライマ塩基となると塩基と交換される。一般的に、ブロックヌクレオチドは、核酸を前記核酸分子の端部に付加することを可逆的にブロックすることで、さらなる核酸合成を抑制する。挿入されるべきヌクレオシドのブロック機能は選択的である。ヌクレアーゼ耐性ブロックヌクレオシドは、例えば、３’位で、アジドメチル、アリール又はＯ−ニトロベンジル基で変性されたリボヌクレオチド又はヌクレオシドである。リボヌクレオチド又は変性ヌクレオシドをＤＮＡに挿入することができる種々のポリメラーゼが利用可能であり、例えば、市販されているＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，  ＭＡ）が挙げられる。また、例えば、ＤｅＬｕｃｉａ，  Ａ．Ｍ．，  Ｇｒｉｎｄｌｅｙ，  Ｎ．Ｄ．Ｆ．，  Ｊｏｙｃｅ，  ＣＭ．の「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ３１：１４，  ４１２９−４１３７  （２００３）」；及びＧａｏ，  Ｇ．，  Ｏｒｌｏｖａ，  Ｍ．，  Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ，  Ｍ．Ｍ．，  Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，  Ｗ．Ａ．，  Ｇｏｆｆ，  Ｓ．Ｐ．の「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．  ９４，  ４０７−４１１  （１９９７）」を参照すること。ヌクレアーゼ抵抗性塩基の例は、異なるキラリティを持つアルファフォスフォロチオエートヌクレオシドを含み、前記フォスフォロチオエート結合の特異的キラル異性体を消化できない例示的ヌクレアーゼは、Ｔ４又はＴ７ポリメラーゼ（フォスフォロチオエート結合のＳキラル構造を消化できない）のエキソヌクレアーゼ活性などのエキソヌクレアーゼに関連するポリメラーゼを含む。あるポリメラーゼは、本来的にエキソヌクレアーゼ活性を持ち、従って、追加及び削除のための２つの異なる酵素を必ず持つ必要はない。有意な量の生成物が検出されない反応は、前記試験反応が、配列決定される核酸の次の塩基と相補的ではなかったということを示す。次の知られた相補的ヌクレオチドを前記プライマー７１０へ付加した後、前記プライマー７１０は、３’ブロック基の除去により脱ブロックされ、次の相補的ヌクレオチドの識別が、上で説明したように試験反応を繰り返すことでなされる。
【００５０】
３’位を変性された可逆的停止基、例えば３’−アジドメチル又は３’−アリールは、化学的に開裂してヌクレオチドを脱ブロックするために例えば、ＴＣＥＰ（トリカルボキシメチルホスフィン）で３’−アジドメイル基を、及び水溶性Ｐｄ−系触媒で３’−アリール基を除去し、及びＯ−ニロトベンジルブロック基は光化学的に開裂させる。ほとんど全ての天然核酸が配列決定され、これには、例えば染色体、ミトコンドリア又はクロロプラストＤＮＡ、又はリボソーム、転写、ヘテロ核又はメッセンジャＲＮＡが含まれる。ＲＮＡは、より安定なＤＮＡへ、逆転写酵素（逆トランスクリプターゼ）を用いて変換され得る。配列決定される核酸のタイプには、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はリボヌクレオチド（ＲＮＡ）及びそれらの類似体であって、リン酸ジエステル結合でリンクされている、ものが含まれる。ポリヌクレオチドは、ゲノム、遺伝子の断片又はそれらの部分、ｃＤＮＡ又は合成ポリデオキシリボ核酸配列であり得る。オリゴヌクレオチド（例えば、プローブ又はプライマー）を含むポリヌクレオチドは、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体、又はリン酸ジエステル結合以外のバックボーン結合を含むことができる。一般的に、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、天然に生じる、２’−デオキシリボースのリンクされたデオキシリボヌクレオチド、例えばアデニン、シトシン、グアニン又はチミン、又はリボースにリンクされたアデニン、シトシン、グアニン又はウラシルである。しかし、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオチド類似体を含み、天然由来ではない合成ヌクレオチドや変性天然由来のヌクレオチドが含まれ得る。
【００５１】
図８は、電気的センサのアレイを用いて自動的に化学物質及び生体物質を検出するために使用されるシステムを示す。図８のシステムは、場合により、持ち運び可能な装置として製造される。図８では、電気的流体インタフェース８１０は、電気的センサチップ（図示されていない）と流体的に組み合わされている。前記センサチップは、電気的に、ソケット（図示されていない）へ接続され、これは外部電子回路へ接続される電気的接続を提供する。前記ソケットは、チップアセンブリ８１５に格納され、場合により、電気的流体インタフェース８２０と除去可能に設けられている。前記電気的流体インタフェース基板８２０はまた、電気的流体インタフェース８１０に結合されている。前記電気的流体インタフェース８１０は、流体的に、前記チップの表面に、前記電気的流体インタフェース基板８２０の穴（図示されていない）を通じて密閉されている。前記検出チップ及び前記電気的流体インタフェースを、流体密閉が前記検出チップと前記流体インタフェース間に形成されるような位置に設けられるように保持される周辺構造のための他の構成もまた可能である。前記チップのソケットは、電気的に電子回路８３０と結合され、前記チッピ及び前記チップからの測定シグナルを駆動する。前記電子回路８３０のいくらかは、場合により、前記チップ自体内に含まれる。場合により、前記電子回路８３０はまた、前記チップのために温度制御を提供する。また場合により、前記センサチップ及びソケット又は前記センサチップアセンブリ８１５は、使い捨てユニットであり、試験が終了すると、追加の又は異なる分子を分析可能な新しいセンサ装置と交換され得る。
【００５２】
選択的な熱要素（図示されていない）が、チップアセンブリ基板８１５、ソケット、チップ及び又は電気的流体インタフェース基板８２０内に設けられる。センサ装置の温度を制御する例示的方法は、抵抗ヒーターとしてＡｕ，Ａｇ又はＰｔの薄金属膜、及び前記制御回路８３０へ温度をフィードバックするための温度センサとしての別の金属膜（Ｐｔ，又はＡｕ）を含む。さらなる実施態様では、周囲の温度制御が提供される。周囲温度制御は、前記センサ装置を、例えば、前記センサチップに直接結合される熱電対（ＴＥＣ）装置（図示されていない）による加熱又は冷却からなる。さらに場合により、前記電気的検出チップの表面と前記流体インタフェースとの間に形成されるチャンバとの流通を持ち、前記チャンバ内の圧力を測定し得る装置が提供される。さらに場合により、前記チャンネル内の選択された圧力を形成し維持するために制御機構が提供される。電子回路８３０は、前記検出チップを、計算要素８３５へ接続させ、前記計算要素は、制御プログラムを実行し、前記センサ、シグナル検出及び熱制御のための駆動電力入力を提供する。制御ソフトウェアは、ユーザ操作インタフェースを提供し、温度制御機能、流体試薬輸送操作、及びデータ収集、出力、分析、表示及びデータ記憶操作の制御を提供する。制御ソフトウェアは場合により、チップ自体に位置する。計算要素８３５は、前記センサの操作に関するデータを表示するためのソフトウェアと表示装置を含む。記憶装置８４０は、例えばソフトウェアコードを記憶し、ルーチンを実行し及び又はデータを収集する。電子回路８３０はまた、電気的流体インタフェース８１０に設けられる前記選択的な参照電極を前記計算要素に結合させる。電源８４５（又は複数の電源）は電力をシステムに与える。電源は、例えば、ＡＣ／ＤＣコンバーター及び電池を含む。
【００５３】
流体及び試薬輸送システム８５０は、試薬を流体インタフェース８１０へ提供する。前記流体輸送システム８５０は、前記流体インタフェース８１０を試薬を保持する容器と接続するチューブを含む。試薬輸送は、前記コンピュータソフトウェアにより自動化される。試薬輸送は、流体輸送システム、例えばポンプ、注入装置、流体を押すために加圧ガス又は流体を引くための真空装置などのシステムを用いて機械的に実施される。さらには、流体輸送システムは、場合により、試薬を前記検出チップ表面から除去するための真空源を含む。場合により、前記システムはまた、脱ガスシステムを含み、流体からガスを除去して気泡生成を防止し、試薬混合のための混合装置及び試薬の完全性を維持するために試薬のミクロ冷却装置から気泡を除去する。
【００５４】
操作では、例えば図７と関連して記載されたＤＮＡ配列決定反応を実行するために、複数の溶液が、それぞれの配列決定試験のために前記検出チップの表面に輸送されることが必要である。
【００５５】
例えば、核酸合成及び分解反応のための４つのヌクレオチドのそれぞれ１つを含む個々の溶液、同様にＤＮＡポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼの酵素溶液を含む溶液、及びエキソヌクレアーゼに抵抗性の変性ヌクレオチドを含む容器の第２のセットが必要とされる。実施態様では、前記センサは、前記センサにより検出される領域又はその近くに固定された検出用試薬と共に提供される。他の実施態様では、前記センサにより検出される領域は、分析されるべき分子又は検出され分析されるべき特異的結合する分子でインシチュで官能基化される。センサで検出される領域又はその近くでＤＮＡ又は他の分子を固定化することは、固定化表面のクリーニング、リンクさせる化学物質の導入、及び分析されるＤＮＡ（又は他の分子）を前記表面に結合させる、ことを含む。洗浄液は、新たな溶液を導入する前に前記検出領域から望ましくない試薬又は生成物を除去する。場合により、オイルなどの特定の流体が、全アセンブリを包埋するために使用される。
【００５６】
有利には、本発明の側面は、可搬式バイオセンサ装置に埋め込まれる。前記電気的流体インタフェースはまた、ウェハを試験するために使用される。ウェハ試験のために、複数の電気的流体インタフェースが、前記ウェハに含まれるセンサチップの全ての又は部分を試験するために適用されるか、又はラスターが、ウェハ中のそれぞれのチップを試験するための前記ウェハの表面にわたり前記インタフェースを動かすように使用される。又は、複数の電気的及び流体インタフェースが、センサチップを試験するために前記ウェハの表面にわたり動かされる。
【００５７】
前記電気的及び流体インタフェースの例示的使用がここで与えられたが、本発明の電気的及び流体インタフェースの使用は電気的検出の特定の形に限定されない。
【００５８】
当業者は、種々の変形例、変法例が、ここで示され説明された部品についての開示及び組合せ及び置換により可能であることを、理解する。明細書を通じて参照される、「ひとつの実施態様」又は「実施態様」は、前記実施態様に関連して説明された特定の構成、構造、材料又は特徴が、本発明の少なくとも１つの実施態様に含まれるということ、しかしそれらが全ての実施態様に存在することは必須ではないこと、を意味する。さらに、特定に構成、構造、材料又は特徴は、１以上の実施態様でいかようにも組み合わせることができる。種々のさらなる追加の構造が導入され得るものであり、記載された構成のいくつかが他の実施態様では省略することも可能である。
【図１Ａ】
2013537803.tif 000003
【図１Ｂ】
2013537803.tif 000004
【図２Ａ】
2013537803.tif 000005
【図２Ｂ】
2013537803.tif 000006
【図３Ａ】
2013537803.tif 000007
【図３Ｂ】
2013537803.tif 000008
【図４】
2013537803.tif 000009
【図５】
2013537803.tif 000010
【図６】
2013537803.tif 000011
【図７】
2013537803.tif 000012
【図８】
2013537803.tif 000013
【国際調査報告】
2013537803.tif 000014
2013537803.tif 000015