(57)【要約】  本発明は、配列が（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）nである非天然コラーゲン様タンパク質を提供し、うちＸとＹはそれぞれＣｙｓを除く天然のアミノ酸残基であり、ｎは２０〜３００である。当該非天然コラーゲン様タンパク質は薬物タンパク質と融合することで、より高い親水性とより長い半減期を備える融合タンパク質を生成可能である。これより、本発明は、当該融合タンパク質、その核酸、発現ベクター、宿主細胞、生成方法及び製薬への応用についても提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の体内半減期を延長するための組換えゼラチン様ユニットであって、
当該組換えゼラチン様ユニットは、（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n構造を持つポリペプチドであり、うち、Ｇｌｙはグリシン残基であり、ＸとＹはそれぞれ２０種類の天然アミノ酸のうちＣｙｓを除く任意のアミノ酸残基であり、ｎは２０〜３００であり、
且つ、上記組換えゼラチン様ユニットは、
（ａ）当該組換えゼラチン様ユニットのうち、親水性アミノ酸Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｈｙｐ、Ａｒｇのアミノ酸含有量パーセンテージの総和は、４０％〜２／３（６６．７％）であり、
（ｂ）前記組換えゼラチン様ユニットのうち、Ｐｒｏ数とＨｙｐ数の和とｎとの比は０．６以上であり、
（ｃ）Ｇｌｙ数の和とｎの比は１．１５以下であり、
付加条件として、前記ゼラチンユニットは天然のゼラチンタンパク質ではないことを特徴とする、組換えゼラチン様ユニット。
【請求項２】
前記組換えゼラチン様ユニットは、
（ｄ）等電点が３〜７であり、
（ｅ）コラスカー及びトンガオンカー法で算出した平均抗原指数が０．９８以下であり、
（ｆ）ＰｒｏｔＰａｒａｍ式で計算した場合、親水性を表すＧＲＡＶＹ値が−１．１より小さいことを特徴とする、請求項１に記載の組換えゼラチン様ユニット。
【請求項３】
前記組換えゼラチン様ユニットの分子量が１０〜１００ｋＤａであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えゼラチン様ユニット。
【請求項４】
組換え融合タンパク質であって、前記組換え融合タンパク質は生物活性ポリペプチド、及び請求項１に記載の組換えゼラチン様ユニットを融合してなることを特徴とする、組換え融合タンパク質。
【請求項５】
前記組換えゼラチンユニットを含有しない生物活性ポリペプチドに比べ、前記融合タンパク質の体内半減期は少なくとも２倍であることを特徴とする、請求項４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６】
前記組換えゼラチンユニットは前記融合タンパク質のアミノ末端、カルボキシル末端、両端、又は中間に位置することを特徴とする、請求項４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７】
前記組換え融合タンパク質は、下記化学式（１）に示す単量体又はその重合体であり、
｛ＧＬＫ｝ｐ−Ｒ−｛ＧＬＫ｝ｑ      式１
うち、ＧＬＫは請求項１に記載の組換えゼラチン様ユニットを表し、ｐとｑは各々が０又は１であり、且つｐとｑは同時に０とはならず、Ｒは前記ゼラチンユニットを含有しない、生物学的機能を持つタンパク質であり、且つ前記Ｒはゼラチンタンパク質ではなく、“−”はペプチド結合を表すことを特徴とする、請求項４記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８】
前記組換え融合タンパク質は重合体であり、且つ化学式（１）における各ＲとＧＬＫは同じであっても異なっていてもよいことを特徴とする、請求項７記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９】
請求項４に記載の組換え融合タンパク質をコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターを含むか、或いは染色体に請求項９に記載のポリヌクレオチドを組み込んでいることを特徴とする、組換え宿主細胞。
【請求項１２】
請求項４に記載の組換え融合タンパク質を生成する方法であって、
（１）請求項１１に記載の組換え宿主細胞を培養して、請求項４に記載の組換え融合タンパク質を発現するステップと、
（２）前記組換え融合タンパク質を分離するステップと、
を含むことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質分野に関し、更に具体的には、新型で且つ生物活性とより長い半減期を有する組換え融合タンパク質、及びその生成と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓、肝臓及び分解など複数の要因の作用により、臨床応用されている大部分の生物活性ポリペプチド／タンパク質は体内で急速に消失することが多く、通常、半減期はわずか数分から数時間である。よって、治療においては、多量且つ頻繁な注射を施すことで有効な薬物濃度を維持する必要があるが、このことは患者にとって苦痛であるだけでなく、薬物の血漿中濃度が変動することで治療効果が低減し、中毒性副作用を増加させる。
【０００３】
現在、これら生物活性ポリペプチド／タンパク質の体内での半減期を延長可能とする様々な方法が報告されている。例えば、水溶性高分子（例えば、ポリグリコール、グルコサン等）によって生物活性ポリペプチド／タンパク質を修飾する方法の応用に成功しており、ＰＥＧ−ＡＤＡやＰＥＧ−ＩＦＮα等はその一例である。修飾により、体内での半減期延長、安定性と溶解度の向上、免疫原性の低減等が実現される。しかし、あいにくこうした修飾手法にも多くの課題がある。まず、タンパク質／ポリペプチドを化学修飾すると、通常これら生体高分子の活性は著しく低下し、完全に消失することもある（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ＦＭ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２２：４０５−４１７，２００１）。次に、高分子化合物はいずれもタンパク質／ポリペプチド表面のアミノ基、メルカプト基、イミダゾール基といった基と反応し、共有結合によってタンパク質／ポリペプチド分子と結合する。しかし、タンパク質／ポリペプチドの分子量は膨大で構造が複雑なため、潜在的に活性ＰＥＧと反応可能な基の数もまた膨大となる。ＰＥＧとの結合位置によって、生成物の安定性や生物活性等の性質は異なる。更には、化学合成された大部分の高重合体、例えばＰＥＧ等は生体で分解されることがない。例えば、長期的に大量のＰＥＧ−インターフェロン（ＰＥＧ−ＩＦＮα２ａ）を注射した場合の腎臓への蓄積が発見されている（Ｃｏｎｏｖｅｒ  ＣＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎｓ．，２１：３６９−３７８，１９９７；Ｂｅｎｄｅｌｅ．Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ．，４２：１５２−１５７，１９９８）。薬物設計的には、こうした蓄積薬物がない方が安全なのは明らかである。一方で、ＰＥＧ修飾されたタンパク質はＰＥＧ抗体（多機能ハプテンと定義される。）を生じ、薬物の半減期に影響することが発見されている（Ｃａｌｉｃｅｔｉ  Ｐ  ＆  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ＦＭ，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．，５５：１２６１−１２７７，２００３）。
【０００４】
以上のような技術的課題のために、化学修飾の手法によってタンパク質／ポリペプチドの体内における薬物代謝特性を改善する技術が提案されて久しいにも拘わらず、真に臨床応用可能な製品は極めて少ない。
【０００５】
また、特定のキャリアタンパク質と融合することで生物活性ポリペプチド／タンパク質の体外安定性又は体内半減期を高める方法もある。例えば、米国特許第５８７６９６９号、同第５７６６８８号及び同第７１７６２７８号は、アルブミン、抗体Ｆｃ断片、トランスフェリン（トランスフェリンの突然変異体及びその断片）と融合することで、生物活性ポリペプチド／タンパク質の半減期が延長されると記載している。これらタンパク質と融合することで半減期が延長される主な理由としては、これらタンパク質がいずれもＦｃＲｎ受容体媒介の循環作用によって、それ自体の体内安定性を高めて半減期を延長するからである。融合タンパク質キャリアとして理想的なタンパク質は、（１）それ自体が体内において比較的長い半減期を持つこと、（２）免疫原性を持たないこと、（３）半減期の延長とは無関係の生体効果を一切持たないこと、（４）治療用タンパク質の生物活性に影響しないこと、という特徴を備えなければならない。しかし、現在開示されている技術方案では、これら全ての条件を満たすことはできない。中でも最大の課題は免疫原性の増加であり、例えば、Ｆｃ断片は構造自体が非保存的で複数の配列を有するため、免疫原性が生じやすい。また、これらキャリアタンパク質は、通常いくらかの生物学的効果をもたらす。例えば、抗体Ｆｃ断片は、補体と結合し、Ｆｃ受容体との結合によるアレルギー反応、食作用の調節、抗体による細胞殺傷作用といった幅広い生理機能を有するし、ＨＳＡはそれ自体が多くの正常な体内生理機能を有し、多数の物質の輸送や代謝に関与する。こうした生物学的特性は、融合タンパク質キャリアとしては不利である。更に、これらキャリアタンパク質はそれ自体が複雑な空間構造を有しており、活性タンパク質と融合すると、立体障害効果によって活性タンパク質の生物活性を著しく低減させてしまう（Ｂａｇｇｉｏ  ＬＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．，５３：２４９２−２５００，２００４；Ｈｕａｎｇ  ＹＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，６７：３０１−３０８，２００７）。
【０００６】
総括すると、活性タンパク質の体内半減期を改善する従来の方案には、（１）生成物が均一でなく、複雑な手順が要求される、（２）修飾物が生体に分解されずに体内に蓄積される、（３）免疫原性が増加する、（４）タンパク質の生物活性が著しく低下し、完全に消失することもある、（５）不要な生物活性機能をもたらすおそれがある、といった弊害があった。化学修飾、タンパク質融合の別に拘わらず、活性タンパク質の体内外での半減期を改善する方案は、いずれも上記の弊害を完全には回避できていない。
【０００７】
アルブミン、Ｆｃ断片等の天然キャリアタンパク質に存在する弊害を回避するために、キャリアタンパク質としてアミノ酸配列を人工的に構築する試みもなされており、例えば、ＧｌｙやＧｌｕを豊富に含有するアミノ酸重合体を構築し、これを融合キャリアとしてタンパク質の薬物半減期を延長する試みがある。Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｌｅｕｎｇらは、化学合成されたポリグルタミン酸を模倣し、人工的にポリグルタミン酸配列を合成して融合キャリアとし、タンパク質の薬物半減期を延長させている（ＵＳ２００８０１７６２８８）。或いは、人工的にポリグリシン配列を合成して融合キャリアとする試み（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．，２０：２７３−２８４，２００７）の他、完全な人工設計の試み、例えばＧｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ等の親水性アミノ酸を選択して人工的にアミノ酸重合体を構築し、これを融合キャリアタンパク質として薬物半減期を延長させるという試みもなされている。しかし、こうした完全に再設計されたアミノ酸重合体を融合キャリアとした場合には実際の効果を予測し難く、多くの課題が存在する。例えば、（１）人工設計の配列は、理論上は多くの親水性アミノ酸を含有するが、タンパク質構造と機能との関係の複雑さから、従来技術では完全な人工設計配列について空間構造（例えば、二次構造や三次構造等）を予測し難く、よって潜在的な生物学的機能や免疫原性は未知である。（２）人工的に設計された反復配列は自然進化に伴って生成されたタンパク質配列とは異なり、特に反復配列における極めて高頻度の断片については組換え発現が難しく、実際の発現量は極めて低くなることが多いため、実用的ではない。発明者は、Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｌｅｕｎｇらが提示する方法（ＵＳ２００８０１７６２８８）に基づき、ポリグルタミン酸を組換え発現して融合キャリアとしてタンパク質の薬物半減期延長を試みたが、実際には、当該方法が言うような配列は発現されなかった。
【０００８】
よって、当該分野では、タンパク質／ポリペプチドの体内外における安定性を効果的で簡便に改善し、且つ他の副作用が全く或いはほとんどない技術方案を開発することが急がれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、効果的且つ簡便にタンパク質／ポリペプチドの体内半減期を改善すると共に、従来技術よりも多くの利点を持つ方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、第１の観点として、タンパク質の体内半減期を延長するための組換えゼラチン様ユニットを提供するもので、当該組換えゼラチン様ユニットは（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n構造を持つポリペプチドであり、うち、Ｇｌｙはグリシン残基であり、ＸとＹはそれぞれ２０種類の天然アミノ酸のうちＣｙｓを除く任意のアミノ酸残基であり、ｎは２０〜３００であり、且つ、前記組換えゼラチン様ユニットは、（ａ）当該組換えゼラチン様ユニットのうち、親水性アミノ酸Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｈｙｐ、Ａｒｇのアミノ酸含有量パーセンテージの総和が４０％〜２／３（６６．７％）であり、（ｂ）前記組換えゼラチン様ユニットのうち、Ｐｒｏ数とＨｙｐ数の和とｎの比が０．６以上であり、（ｃ）Ｇｌｙ数の和とｎの比が１．１５以下（より好ましくは１．０５以下）であり、付加条件として、前記組換えゼラチンユニットは天然のゼラチンタンパク質ではないことを特徴とする。
【００１１】
また、別の好ましい実施例として、前記組換えゼラチン様ユニットは、（ｄ）等電点が３〜７（好ましくは３．２〜６であり、より好ましくは３．２〜５．５）であり、（ｅ）コラスカー及びトンガオンカー法で算出した平均抗原指数が０．９８以下であり、（ｆ）ＰｒｏｔＰａｒａｍ式で計算した場合、親水性を表すＧＲＡＶＹ値が−１．１に満たない（好ましくは−１．４より小さく、より好ましくは−１．５より小さい）。
【００１２】
また、別の好ましい実施例として、前記組換えゼラチン様ユニットの配列はゼラチン由来又はゼラチンからの派生である。例えば、Ｘ，Ｙ位置を置換し、天然ゼラチンの一部又は全部の疎水性アミノ酸Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ等を親水性アミノ酸に突然変異させる。好ましくは、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｈｙｐ、Ａｒｇのいずれか１つ及び／又は複数に突然変異させ、ＧＲＡＶＹ値を−１．４より小さくする。
【００１３】
また、別の好ましい実施例として、前記組換えゼラチン様ユニットの分子量は１０〜１００ｋＤａである。
【００１４】
本発明は、第２の観点として、第１の観点の前記組換えゼラチン様ユニットをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
本発明は、第３の観点として組換え融合タンパク質を提供し、当該組換え融合タンパク質は、生物活性ポリペプチド、及び第１の観点のゼラチン様ユニットを融合してなる。
【００１６】
また、別の好ましい実施例として、前記組換えゼラチン様ユニットを含有しない生物活性ポリペプチドに比べ、前記組換え融合タンパク質の体内半減期は少なくとも２倍である。より好ましくは、半減期を少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍又は１０倍延長する。
【００１７】
また、別の好ましい実施例として、前記組換え融合タンパク質の見かけ分子量（分子篩測定法）と理論分子量の比は１．２５以上であり、より好ましくは１．５以上、最適には２以上である。
【００１８】
また、別の好ましい実施例として、生物活性ポリペプチドの分子量は０．５〜７０Ｋｄａであり、より好ましくは１〜６６Ｋｄａである。
【００１９】
また、別の好ましい実施例として、前記組換えゼラチンユニットは前記組換え融合タンパク質のアミノ末端、カルボキシル末端、両端、又は中間に位置することを特徴とする。
【００２０】
また、別の好ましい実施例として、前記組換え融合タンパク質は単量体又は重合体である。
【００２１】
また、別の好ましい実施例として、前記組換え融合タンパク質は、｛ＧＬＫ｝ｐ−Ｒ−｛ＧＬＫ｝ｑ（化学式Ｉ）が示す単量体又はその重合体であり、うち、ＧＬＫは本発明の第１の観点で述べた組換えゼラチンユニットを表し、ｐとｑは各々が０又は１であり、且つｐとｑは同時に０とはならず、Ｒは前記組換えゼラチンユニットを含有しない、生物学的機能を持つタンパク質であり、且つ前記Ｒはゼラチンタンパク質ではなく、“−”はペプチド結合を表す。
【００２２】
また、別の好ましい実施例として、前記組換え融合タンパク質内のすべての（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n領域に含まれるｎの総和は２０より大きく３００より小さい。
【００２３】
また、別の好ましい実施例として、前記組換え融合タンパク質の分子量は２０〜５００Ｋｄａである。
【００２４】
また、別の好ましい実施例として、前記組換え融合タンパク質は重合体であり、且つ化学式Ｉにおける各ＲとＧＬＫは同じであっても異なっていてもよい。
【００２５】
本発明は、第４の観点としてポリヌクレオチドを提供し、当該ポリヌクレオチドは、第３の観点で述べた組換え融合タンパク質をコードする。
【００２６】
本発明は、第５の観点として、第４の観点で述べたポリヌクレオチドの配列を含む発現ベクターを提供する。
【００２７】
本発明は、第６の観点として組換え宿主細胞を提供し、当該組換え宿主細胞は第５の観点で述べた発現ベクターを含むか、或いは染色体に第４の観点で述べたポリヌクレオチドを保有する。
【００２８】
本発明は第７の観点として、（１）第６の観点に記載の組換え宿主細胞を培養して、前記組換え融合タンパク質を発現するステップと、（２）前記組換え融合タンパク質を分離するステップを含む前記組換え融合タンパク質を生成する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、組換えゼラチン様融合タンパク質の代表的な基本構造を示す。
【図２】図２は、発現プラスミドｐＰＩＣ−ＧＬＫ１１６4の構築フローである。
【図３】図３は、発現プラスミドｐＰＩＣ−ＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの構築フローである。
【図４】図４は、ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦ精製過程におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（８％）分析の結果、精製による最終製品が一本鎖で、見かけの分子量が６６ＫＤ〜９７ＫＤであったことを示す。左より、レーン１：低分子量タンパク質マーカー、レーン２：発酵液の上澄み、レーン３：ＳＰカラム溶出ピーク、レーン４：Ｑカラム溶出ピークである。
【図５】図５は、精製したｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＳＥＣ−ＨＰＬＣにはＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ３０００  Ｓｗｘｌカラムを用い、緩衝液を５０ｍＭ  ＰＢ、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０とし、検出波長を２１４ｎｍ、流速を０．８ｍｌ／ｍｉｎとした。
【図６】図６は、精製したｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析を示す。ＲＰ−ＨＰＬＣにはＶＹＤＡＣ  ｐｒｏｔｅｉｎのＣ４  ＴＰ５４１５カラムを用い、移動相Ａを０．１％ＴＦＡ含有水溶液、移動相Ｂを０．１％ＴＦＡ含有アセニトリル水溶液（アセニトリル：水溶液＝９：１）とし、検出波長を２１４ｎｍ、流速を０．８ｍｌ／ｍｉｎとした。
【図７】図７は、ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの免疫ブロット分析結果を示す。一次抗体としては、抗マウスＧ−ＣＳＦポリクロナル抗体を用いた。
【図８】図８は、ｒｈＧ−ＣＳＦ依存性株ＮＳＦ６０を用いて測定した融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの体外における生物活性を示す。
【図９】図９は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣでｒｈＧ−ＣＳＦとｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの体外安定性を分析した研究結果を示す。
【図１０】図１０は、ｒＧＬＫ１１６4とｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦをマウスに連続注射後の血清抗体の測定結果である。ＡはＧ−ＣＳＦコーティング、ＢはｒＧＬＫ１１６4コーティングを示す。
【図１１】図１１は、ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦ融合タンパク質、ｒｈＧ−ＣＳＦ、ｒＨＳＡ／Ｇ−ＣＳＦ及びｒＧＬＫ１１６4の分量を変えた場合の正常な成年ＳＤラット体内における薬効研究結果を示す。
【図１２】図１２は、ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦ融合タンパク質、ｒｈＧ−ＣＳＦ及びｒＨＳＡ／Ｇ−ＣＳＦの分量を変えた場合の正常な成年ＳＤラット体内における薬物動態の研究結果を示す。
【図１３】図１３は、発現プラスミドｐＰＩＣ−ＧＬＫ１１６4／ＩＦＮαの構築フローである。
【図１４】図１４は、ｒＧＬＫ１１６4／ＩＦＮα精製過程におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（８％）分析の結果、精製による最終製品が一本鎖で、見かけ分子量が約８５ＫＤであったことを示す。左より、レーン１：低分子量タンパク質マーカー、レーン２：発酵液の上澄み、レーン３：Ｑカラム溶出ピークである。
【図１５】図１５は、ｒＧＬＫ１１６4／ＩＦＮαのアカゲザル体内における薬物動態の研究結果を示す。
【図１６】図１６は、発現プラスミドｐＰＩＣ−Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０４6及びｐＰＩＣ−Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０７6の構築フローである。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４はエクセナチドである。
【図１７】図１７は、ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０４6精製過程におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（１０％）分析の結果、見かけ分子量が６６ＫＤ〜９７ＫＤであったことを示す。左より、レーン１：低分子量タンパク質マーカー、レーン２：発酵液の上澄み、レーン３：ＳＰカラム溶出ピーク、レーン４：Ｑカラム溶出ピークである。
【図１８】図１８は、ＧＬＰ−１Ｒを安定導入されたＢＨＫ細胞を用いて、融合タンパク質ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０４6及びｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０７6の体外における生物活性を測定した図である。
【図１９】図１９は、ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０４6とｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０７6の正常な成年アカゲザル体内における薬物動態の研究結果を示す。
【図２０】図２０は、発現プラスミドｐＣＥＰ４−ＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4の構築フローである。
【図２１】図２１は、融合タンパク質ｒＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4とｒｈＥＰＯの分量を変えた場合の、正常なＢＡＬＢ／ｃマウス体内における薬効の研究結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本願発明者は、広範且つ詳細な研究と大量のスクリーニングの結果、組換えゼラチン様タンパク質（ｇｅｌａｔｉｎｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＬＫ）とその突然変異体が、融合タンパク質の融合キャリアとして非常に適していることを初めて発見した。本発明者が、ゼラチン様ユニットを融合キャリアとして活性タンパク質に融合させたところ、生物活性ポリペプチド／タンパク質の有機体内における半減期が大幅に延長された。これに基づき、本発明はなされた。
【００３１】
具体的には、試験の結果、生物活性を有するタンパク質にゼラチン様ユニットを融合発現して得られた組換えゼラチン様融合タンパク質が、生物活性タンパク質の体外における安定性を大きく改善することが分かった。また、より重要な点として、融合タンパク質の体内消失速度を大幅に降下させ、活性タンパク質の体内における薬物代謝分布を変化させることで、活性タンパク質の体内半減期を延長可能なことが明らかとなった。
【００３２】
本発明におけるタンパク質、ヌクレオチド配列及び各方法について述べる前に、本発明はこれら特定の方法、操作規定、細胞株、キャリア及び試薬に限定されるものではないと解釈される。なぜなら、これらは変動し得るからである。また、本願で用いる用語は特定の実施例を述べるためのものにすぎず、本発明の範囲を限定する意図はない。また、特に限定しない限り、本願における全ての技術及び使用される科学用語は、当業者の一般的理解と等しいものとする。本発明の記載は、好ましい方法、機器及び材料にすぎず、本発明の記載に類似又は相当する他の方法及び材料も、本発明の実践或いは測定に適用可能である。
【００３３】
ゼラチン様ユニット
本願で使用される「ゼラチン様ユニット」「ゼラチン様タンパク質」又は「ＧＬＫ（ｇｅｌａｔｉｎ−ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ）」の用語は、互いに言い換え可能である。
【００３４】
天然ゼラチンは、コラーゲン由来のタンパク質の一種であり、コラーゲンの変性によって得られる生成物である。基本構造としてＧｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返しを複数有し、構造式を（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）nとする。うち、ＸとＹはプロリンとヒドロキシプロリン残基であることが多く、且つプロリンとヒドロキシプロリン残基の含有量の割合はその構造と融点に影響する。Ｘ，Ｙ位置のアミノ酸組成の違いは、コラーゲンの親水性、等電点、二次構造、免疫原性等の特性に影響し得る。
【００３５】
ゼラチンは、動物の骨や毛皮を処理することによって抽出される。しかし、動物由来のゼラチンには侵襲性ウィルス（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｖｉｒｕｓ）が残存してしまうことが多い。また、動物由来のゼラチンを人に適用する場合、生体適合性も問題となる。
【００３６】
分子生物学技術の発展は、遺伝子組換技術によって、ヒト由来ゼラチンに基づいた、生理特性が安定し且つ均質性の高い組換えゼラチンの獲得を可能とした。現在、ヒト由来の組換えコラーゲン又はゼラチンの微生物、動物細胞或いは植物内における発現について、多くの報告がある（米国特許ＵＳ５５９３８５９、ＵＳ６，４２８９７８、ＵＳ６６１７４３１，Ｗｅｒｔｅｎ  ＭＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，１５:１０８７−１０９６，１９９９）。コラーゲン遺伝子における使用断片の違いによって、生物化学特性の異なる組換えゼラチンを獲得可能であり、多くの研究結果によれば、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現系は、由来の異なる独自の生物化学特性を備えた組換えゼラチン又はゼラチン類の生成に利用可能である（Ｏｌｓｅｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．，５５:１５４７−１５６７，２００３）。組換えゼラチンは、コラーゲンを加水分解して得られる天然ゼラチンと同様にタンパク質を安定させる作用を持ち、ワクチンの安定剤として用いられている（ＵＳ２００６／０２０４５１１Ａ１）。
【００３７】
本発明において、ゼラチン様ユニットとは、配列が天然ゼラチン由来又は天然ゼラチンから誘導され、且つ組換えにより発現されたポリペプチド断片であると共に、天然ゼラチンの構造的特徴（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）nを備えた突然変異によるゼラチン様配列を含むものである。
【００３８】
本発明では、ゼラチン様ユニットの長さ又は分子量は特に制限されない。長さについては、各ゼラチンユニットは通常６０〜１５００のアミノ酸残基を含み、好ましくは２００〜１０００のアミノ酸残基を含む。分子量については、各ゼラチンユニットは通常６〜１５０ＫＤａであり、より好ましくは２０〜８０ＫＤａである。
【００３９】
組換えゼラチン様融合タンパク質
本発明は、新型の組換えゼラチン様融合タンパク質に関し、当該組換えゼラチン様融合タンパク質は、１つ／複数の天然由来或いは人工で且つ生物学的機能を有したタンパク質及びゼラチン様ユニットから構成され、診断／治療／ターゲッティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）機能を備える。組換えゼラチン様融合タンパク質の基本構造は、｛ＧＬＫ｝ｐ−Ｒ−｛ＧＬＫ｝ｑ構造を有する単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）又は重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）である。うち、ＧＬＫはゼラチン様ユニットを表し、ｐとｑは０又は１であり、且つｐとｑは同時に０とはならず、Ｒは前記ゼラチンユニットを含有しない、生物学的機能を持つタンパク質であり、且つ前記Ｐはゼラチンタンパク質ではない。組換えゼラチン様融合タンパク質は、重合体の場合には、｛ＧＬＫ１｝ｐ−Ｒ1−｛ＧＬＫ２｝ｑ−｛ＧＬＫ３｝ｐ−Ｒ2、｛ＧＬＫ１｝ｐ−Ｒ1−｛ＧＬＫ２｝ｑ−｛ＧＬＫ３｝ｐ−Ｒ2−｛ＧＬＫ４｝ｑ、｛ＧＬＫ１｝ｐ−Ｒ1−｛ＧＬＫ２｝ｑ−｛ＧＬＫ３｝ｐ−Ｒ2−｛ＧＬＫ４｝ｑ−｛ＧＬＫ５｝ｐ−Ｒ1−｛ＧＬＫ６｝ｑ等の構造となり、うち、Ｒ1〜4は同じでも異なっていてもよく、ＧＬＫ１〜ＧＬＫ６は同じでも異なっていてもよいが、少なくとも１のＧＬＫ構造と１の生物活性機能を有するタンパク質／ポリペプチドユニット（例えばＲ1又はＲ2）を含有する。図１は、代表的な組換えゼラチン様融合タンパク質の構造を表す。
【００４０】
本発明は、１又は複数の生物活性タンパク質及びその断片を、一定分子量を有する１又は複数のセグメントのゼラチン様タンパク質ＧＬＫ（ｇｅｌａｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と融合発現することで実現される。融合発現用のＧＬＫは免疫原性を持たず、生理的条件下において極めて良好な水溶性を備える。本発明で生成する組換えゼラチン様融合タンパク質は、より良好な体外安定性と体内半減期を実現するだけでなく、従来のタンパク質修飾又は融合技術に比べて構造が均一であり、予想外に高い生物活性を備える。更に、融合キャリアとしてのＧＬＫ部分は生体適合性があり、免疫原性を持たず、生分解可能で体内に蓄積されない等の利点がある。
【００４１】
ここで、「組換えゼラチン様融合タンパク質」とは、基本構造｛ＧＬＫ｝ｐ−Ｒ−｛ＧＬＫ｝ｑを有する融合タンパク質であり、タンパク質／ポリペプチドＲと（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）nはペプチド結合によって直接連結されている。更に、ＲとＧＬＫはスペーサーによって連結されてもよい。「スペーサー」の用語は１又は複数の分子を示し、例えばアミノ酸、核酸又は化学分子、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であって、即ち１又は複数の成分ドメインを挿入可能である。スペーサーは、操作の便宜上、必要成分間の標的位置の提供や、活性タンパク質の空間構造の維持、或いは活性タンパク質と標的分子（Ｔａｒｇｅｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の相互作用に用いられる。本発明のスペーサーとしては、短リンカーペプチド、例えばＧｌｙやＳｅｒを豊富に含有する短リンカーペプチドや、ｎが１〜１０の間である（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎが最適である。また、リンカーペプチドとして、現在汎用されている他のリンカーペプチド、例えばＤａｍｉｎｇ  Ｓｈａｎが提示するペプチド断片（Ｓｈａｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＩ  ｍｍｕｎｏｌ．，１６２:６５８９-６５９５，１９９９）を用いてもよい。なお、ＧＬＫ自体を１つのセグメントのリンカーペプチドとして使用してもよいことは言うまでもない。また、タンパク質／ポリペプチド部分は繰り返し現れてもよく、これによりスペーサーの作用を果たして、例えばＲ1−Ｒ1−ＧＬＫ、Ｒ1−Ｒ1−ＧＬＫ−Ｒ2、ＧＬＫ−Ｒ1−Ｒ1、Ｒ1−ＧＬＫ−Ｒ2−Ｒ2、Ｒ1−Ｒ1−ＧＬＫ−Ｒ2−Ｒ2等の構造が形成されることは容易に理解される。図１に示されるのは組換えゼラチン様融合タンパク質の代表的な構造にすぎず、本発明の精神に基づけば、図１の構造のみに限定されない。
【００４２】
組換えゼラチン様融合タンパク質に含有されるＧＬＫは、ゼラチン構造の特徴（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）nを有する高度反復のタンパク質配列であって、その配列は全部或いは一部が天然ゼラチン由来であっても、天然ゼラチンの一部配列断片の単純反復であっても、最適化されたＧｌｙ−Ｘ−Ｙ特徴を持つ人工配列であってもよい。ゼラチン配列は種が異なっても相同性の差が小さいため、ＧＬＫの配列は、Ｄａｖｉｄ  Ｏｌｓｅｎ（Ｏｌｓｅｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．，５５:１５４７−１５６７，２００３）が提示するα１（Ｉ）コラーゲン配列の領域のように、非ヒト由来のゼラチン配列であってもヒト由来ゼラチン配列であってもよい。ＧＬＫ配列は、完全に天然の配列と同じであってもよいし、天然配列を一部選択して単純反復させることで本発明に必要な大きさを得てもよい。選択可能なＧＬＫ配列源は極めて広範囲に渡り、天然由来の配列か人工合成で、特徴として（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）nを有するゼラチン様配列かは問わず、例えばＵＳ５８０１０４５、ＵＳ６１５００８１、ＵＳ６４２８９７８、ＷＯ０１／３４６４６Ａ２等に記載のゼラチン領域を選択してもよい。免疫原性さえなければ、４０℃未満の水に溶解可能な配列はいずれも組換えゼラチン様融合タンパク質の生成に使用可能である。
【００４３】
更に、本発明の効果をより良好に得るために、発明者らは以下の原則に基づき、天然ゼラチンにおけるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ反復ユニットを元に新たな組み換えゼラチン様配列を設計した。
（１）天然ゼラチン配列のうち出現頻度の高いＧｌｙ−Ｘ−Ｙ反復ユニット、例えばＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ等をできるだけ選択し、新たに組み合わせた。
（２）親水性アミノ酸を豊富に含むＧｌｙ−Ｘ−Ｙ反復ユニットをできるだけ選択し、新たに組み合わせた。好ましくは、Ｘ、Ｙは親水性アミノ酸であり、より好ましくはＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｈｙｐ、Ａｒｇのいずれか１つ及び／又は複数とした。
（３）新たに設計したＧＬＫ配列には、免疫原性を持つ既知の配列はできるだけ含まないようにした。従来開示されている技術文書は、免疫原性を持つ位置をすでに明らかにしており、例えばＨ．Ｈｏｒｉらは、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを報告している（Ｈｏｒｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１０:６５２−６５７，２００２）。
（４）新たに設計されたＧＬＫ配列には、既知のプロテアーゼ作用点、例えばシグナルペプチダーゼＫＥＸ−２の位置など既知のプロテアーゼ作用点をできるだけ含まないようにした。
（５）新たに設計された組換えゼラチン様配列は、コラスカー及びトンガオンカー（Ｋｏｌａｓｋａｒ−Ｔｏｎｇａｏｎｋａｒ）法で算出した平均抗原指数（Ａｖｅｒａｇｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ）が０．９８以下であった。
【００４４】
構造組み換え後の人工配列は親水性アミノ酸を豊富に含み、代表的な配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２，１９，２１等を含むが、これに限定されるわけではない。
【００４５】
組換えゼラチン様融合タンパク質｛ＧＬＫ｝ｐ−Ｒ−｛ＧＬＫ｝ｑのうち、ＧＬＫの基本構造であるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ反復ユニットの数（ｎ）、即ちＧＬＫの分子量範囲は可変である。本発明の目的を達成するためには、まず、組換えゼラチン様融合タンパク質が腎臓でのろ過により除去されないよう適切な分子量を有する必要がある。組換えゼラチン様融合タンパク質の分子量は、タンパク質／ポリペプチド部分Ｒ及びＧＬＫの双方によって決定されるが、特定の活性組換えゼラチン様融合タンパク質については、活性タンパク質Ｒの分子量が確定しており、更に数も確定している場合は、組換えゼラチン様融合タンパク質の分子量はＧＬＫの大きさ及び数により決定される。タンパク質／ポリペプチドＲ部分の分子量が少ない場合（例えば、２０ＫＤ未満の場合）、組換えゼラチン様融合タンパク質が腎臓糸球体（ｇｌｏｍｅｒｕｌｕｓ）にろ過されるのを防ぐために、ＧＬＫの分子量は少なくとも１５〜７０ＫＤとすべきである。但し、分子量が多いほど組換えゼラチン様融合タンパク質の有機体内における半減期延長が有利になるとは限らず、逆に組換発現に不利となる上、プロテアーゼにより分解されやすくなり、予想外に免疫原性の制御も困難となる。よって、適切なＧＬＫ分子量は６〜１５０ＫＤであり、より好ましくは２０〜８０ＫＤである。Ｒ部分が元々大きい場合、或いは二量体又は重合体を形成可能な場合には、ＧＬＫ分子量の範囲は更に拡大してもよく、１ｋＤａ〜１５０ＫＤａの範囲内、例えば約１０００〜２０００Ｄａ、約２〜２０ｋＤａ、約２０〜５０ｋＤａ、約５０〜１００ｋＤａ、約１００〜１５０ｋＤａ、約１５０〜２００ｋＤａとしてもよい。
【００４６】
組換えゼラチン様融合タンパク質の分子量は特に限定されず、通常は２０〜５００ＫＤａ、好ましくは２５〜３００ＫＤａである。
【００４７】
生物活性タンパク質／ポリペプチド
「生物活性タンパク質／ポリペプチド」とは、タンパク質、抗体、ポリペプチド及びその断片と変異体をいい、１又は複数の薬理活性及び／又は生物活性、或いは標的ガイダンス（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｕｉｄａｎｃｅ）、重合等の機能を備える。これらは自然界に存在するものであっても、人工的に構築したものでもよい。「生物活性タンパク質／ポリペプチド」は、酵素、酵素抑制剤、抗原、抗体、ホルモン、血液凝固因子、インターフェロン、サイトカイン、成長因子、分化因子、骨組織の成長関連因子、骨質因子の吸収関連因子、化学走化性因子（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ）、細胞運動因子（ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒｓ）、移動因子（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）、細胞静止因子（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ）、殺菌因子、抗真菌因子、血漿接着分子、細胞間質接着分子、細胞外基質、及び受容体リガンドとその断片等を含む。
【００４８】
本発明における生物活性タンパク質／ポリペプチド、特に「治療活性」を奏するタンパク質／ポリペプチド、又は「治療上活性を有する」タンパク質／ポリペプチドといったタンパク質／ポリペプチドは、１以上の既知の生物活性及び／又は治療活性を有する。これら活性は、１以上の本願に記載又はその他の既知の治療用タンパク質に関連する。限定を意図しない例として、「治療用タンパク質」は疾病や状況又は機能の乱れの治療、予防又は改善に有用なタンパク質である。また、限定を意図しない例として、「治療用タンパク質」とは、特定タイプの細胞（正常（例えばリンパ細胞）或いは異常（例えば癌細胞））と特異的に結合し、化合物（薬物或いは細胞傷害性薬剤）を当該タイプの細胞に対し特異的に位置付けるためのタンパク質である。
【００４９】
また、限定を意図しない別の例として、「治療用タンパク質」は生物活性を有するタンパク質であって、特に疾病の治療、予防及び改善に有用な生物活性タンパク質を指す。限定を意図しない例としての治療用タンパク質は、例えば、血管新生の増進、血管新生の抑制、造血機能の調整、神経発育の促進、免疫反応の向上、免疫反応の抑制といった生物活性を有するタンパク質を含む。
【００５０】
上述したように、「治療活性」又は「活性」とは、ヒト、非ヒト哺乳動物又は他の生体において理想的な治療結果と一致するような効果を得られる活性といえる。治療活性は、体内又は体外で測定可能である。
【００５１】
本発明において、組換えゼラチン様融合タンパク質の治療性タンパク質部分に対応する治療性タンパク質は、ＶＥＧＦ受容体、ＴＮＦ受容体、ＨＥＲ−２／神経膜受容体、ヒトＥｒｂＢ３受容体分泌形態異性体、トランスフォーミング成長因子ｂIII型受容体細胞外ドメイン、トランスフォーミング成長因子ｂII型受容体細胞外ドメイン、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−４受容体、ウロキナーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、アルギニンデイミナーゼ、アルギナーゼ（ａｒｇｉｎａｓｅ）、ハースタチン（ｈｅｒｓｔａｔｉｎ）、上皮成長因子、ＦＧＦ−１、線維芽細胞成長因子−２、普通繊維細胞成長因子、神経成長因子、血小板由来成長因子、ＶＥＧＦ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２４、ＩＬ−１ＲＡ、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＯＰＧ、ＬＥＰＴＩＮ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンΩ、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−３、ＴＮＦα、心房性ナトリウム利尿ペプチド、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、性腺刺激ホルモン、ヒト黄体化ホルモン（ｈｕｍａｎ  ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、卵胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、ヒト成長ホルモン、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＶＥＧＦ、ＥＰＯミミックペプチド、ＴＰＯミミックペプチド、ＦＬＴ３リガンド、Ａｐｏ２リガンド、骨細胞阻害因子、及びＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＧＬＰ−１とその類似物、Ｅｘｅｎｄｉｎ−３、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、インシュリン及びその類似物、ＧＩＰ、グルカゴン、エンドスタチン、プラスミノゲンクリングル１ドメイン、プラスミノゲンクリングル５ドメイン、アンギオスタチン等を含むが、これらに限定はされない。治療性タンパク質は、単鎖抗体ｓｃＦｖ等の抗体及びその断片であってもよい。これらタンパク質及びこれらタンパク質をコードする核酸配列はいずれも周知であり、ＣＡＳ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）データベース（例えばＣＡＳレジストリ）、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）、ＧｅｎＳｅｑといった公共のデータベースから検索可能である。当業者にとって、本発明の精神に基づき、従来発見されているほとんどの生物活性タンパク質を本発明に適用可能であることは容易に理解される。なお、本発明以降に新たに発見される生物活性を備えたタンパク質／ポリペプチドについても、同様に本発明に適用可能であると解釈すべきことは言うまでもない。
【００５２】
本発明における組換えゼラチン様融合タンパク質の生物活性タンパク質は、非グリコシル化及びグリコシル化のいずれであってもよく、例えば一部のサイトカイン、細胞表面タンパク質及び分泌性タンパク質は、１又は複数のオリゴ糖基と結合されて修飾されることが多い。グリコシル化には、一般的に主なタイプとして、結合位置がセリン又はスレオニン残基である０−結合型オリゴ糖グリコシル化と、結合位置がＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列のアスパラギン酸残基であるＮ−結合型オリゴ糖グリコシル化の二種類があり、うちＸはプロリン以外であればどのアミノ酸であってもよい。
【００５３】
グリコシル化異性体は、グリコシル化部位を除去又は導入することによって得られる。例えば、アスパラギン酸をグルタミン酸に置き換えるように、アミノ酸残基を置換又は除去したり、或いは、グリコシル化タンパク質を発生させない宿主細胞、例えば大腸菌又はグリコシル化欠損酵母において、非グリコシル化組換えタンパク質を発現させたりする。
【００５４】
作用メカニズム
ポリペプチド／タンパク質が体内において急速に除去されるメカニズムは多岐に渡り、腎臓糸球体のろ過、受容体依存性エンドサイトーシス、プロテアーゼの作用、リンパ系による除去、肝臓による除去等複数のメカニズムを含む。活性タンパク質がＩｇＧのＦｃ断片又はアルブミンと融合した後に比較的長い半減期を維持できるのは、体内に特殊なＦｃＲｎ介在性の循環作用が護られているからである。
【００５５】
ゼラチン配列と活性タンパク質を融合発現した後に活性タンパク質の半減期が延長される確かなメカニズムについては、まだ明らかとなっていない。現在のところ、類似の受容体が機能することは発見されていない。また、ＧＬＫ配列自体は、ＦｃＲｎと結合しない。本発明の発明者らは、ヒト血清をエライサ（ＥＬＩＳＡ）プレートにコーティングし、融合タンパク質ＧＬＫ／Ｇ−ＣＳＦを加えて（なお、Ｇ−ＣＳＦを陰性対照とした）、保温・培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）・洗浄の後にビオチン標識Ｇ−ＣＳＦ（Ａｂｃａｍ  ｐｌｃ．）抗体を結合させ、ＨＲＰ発色によってＧＬＫ融合タンパク質が血清中のどの成分とも結合しないことを証明した。これにより、「ＧＬＫ融合タンパク質が血清中の何らかの成分と結合し合う」という可能性が排除された。なお、単純に融合後の分子量が増加したことで半減期が延長されたのでないことは確かである。従来研究では、単純に融合タンパク質の分子量を増加させても、体内での半減期を延長できるとは限らないことが発見されている。例えば、Ｃａｒｌｏｓ  Ａ．（Ｂｕｓｃａｇｌｉａ  ＣＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．，９３:２０２５−２０３２，１９９９）の研究では、分子量の多いＴＳａｃタンパク質（７６ＫＤ）の体内半減期（約数時間）は、これより分子量の少ないＧＳＴ−Ａｇ３６（６０ＫＤ）（約３０時間）よりも遥かに短いことが発見されている。実施例７のデータも、同様の活性ポリペプチドが、配列は異なるが分子量は近いゼラチン様ユニットを融合キャリアとして用いた場合に、最終的に得られた融合タンパク質の半減期が異なったことを示している。
【００５６】
なお、本発明が保護する範囲は作用メカニズムの制限を受けないと解釈されるべきである。発明者らが以下のようなメカニズムを提示したのは、本発明について一層の理解を促すためである。融合された組換えゼラチン様融合タンパク質が活性タンパク質の体内外における安定性及び半減期を増進可能な理由としては、以下が考えられる。
（１）ＧＬＫのＧｌｙ−Ｘ−Ｙ構造におけるＹ位置のＰｒｏ（Ｈｙｐ）が大量に存在することで、生理的環境下で緩やかな構造が維持されるようになり、結果として、活性タンパク質が体内のプロテアーゼに分解されないよう保護する障壁が形成された。
（２）ＧＬＫ構造は親水性アミノ酸を豊富に含むため、水和分子半径が大きくなり、腎臓でのろ過・排出が防止された。理論分子量約５５ＫＤの融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦを分子篩で分析すると、見かけ分子量は約１５４ＫＤ（見かけ分子量：理論分子量＝２．８）であった。
（３）融合タンパク質におけるＧＬＫに特有の帯電性によって、組換えゼラチン様融合タンパク質は体内に更に長時間留まることになった。本発明のＧＬＫはやや低い等電点を有し、通常の生理的条件下では負の電荷を持つ。血漿タンパク質の多くは負の電荷を持つと共に輸送機能を備えているため、負の電荷を持つ組換えゼラチン様融合タンパク質はこれら血漿タンパク質と結合し合う可能性が低くなり、血漿中により長時間留まることが可能となった。
（４）血管壁の内皮細胞表面を覆う多糖類−タンパク質複合物（グリコカリックス）の存在により、組換えゼラチン様融合タンパク質の除去率が低下した。血管壁の多糖類−タンパク質は、血管内と周辺基質間との物質輸送を制御する（Ｓｉｍｉｏｎｅｓｃｕ  Ｍ，Ｓｉｍｉｏｎｅｓｃｕ  Ｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４８:２７９−２９３，１９８６）。多糖類−タンパク質複合物は、通常の生理状態下では負の電荷を有するのに対し、組換えゼラチン様融合タンパク質もまた負の電荷を有する。このため、同電荷間の排斥によって、組換えゼラチン様融合タンパク質とグリコカリックスの相互作用が減少し、結果として組換えゼラチン様融合タンパク質の血管から組織への浸透が減少した。
【００５７】
組換えゼラチン様融合タンパク質の生成
本発明の融合タンパク質は、固相法でペプチドを直接合成することによって生成してもよいし、本発明におけるタンパク質の各断片をそれぞれ化学合成してから、化学的手法で結合することで分子の全長を生成してもよい。好ましくは、本発明の融合タンパク質は組換え法で生成される。
【００５８】
組換え法によるゼラチン融合タンパク質の生成は、原核宿主、真核宿主、植物又は動物において、組換え目的ゼラチン融合タンパク質をコーディングするヌクレオチドを発現し、及び組換えゼラチン様融合タンパク質を獲得する過程を含む。原核、真核、トランスジェニック動植物系を含む全ての組換えタンパク質発現系は、本発明に適用可能である。例えば、米国特許ＵＳ６５４８６５３に記載される融合タンパク質を発現するための方法は、全て本願発明に適用される。
【００５９】
より詳細には、組換え法によって目的の組換えゼラチン様融合タンパク質を得るには、まずコーディングに要する組換えゼラチン様融合タンパク質のヌクレオチドを取得する必要がある。うち、コーディング用の目的のヌクレオチド配列は複数の一般的な方法を用いて生成すればよい。また、上記配列から誘導又は変異した配列を得るためには、例えば遺伝子工学技術を用いてヌクレオチド配列を修飾し又は変化させればよい。
【００６０】
より好ましくは、本発明の過程において、ヌクレオチド配列は転写開始領域（プロモーター配列）の発現カセット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）の一部を含み、宿主細胞においてこの転写開始領域がヌクレオチド配列の発現を制御すると共に、本発明のポリペプチドをコードする。当該領域は、使用される宿主細菌のうち高度に発現される構造遺伝子又は調節遺伝子のプロモーター領域であってもよい。例えば酵母においては、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）及び類似の遺伝子のプロモーターであってもよい。発現カセットは、使用される宿主細菌のうち機能を有する転写終了領域を含んでもよく、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流に緊密に結合されてもよい。
【００６１】
より好ましくは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の前にシグナルペプチド配列を持ち、新たに生成されるポリペプチドをその宿主における分泌ルートに導く。
【００６２】
発現カセットの他、１又は複数の組換え宿主細菌をスクリーニングする標識（Ｔａｇ）、例えば出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵＲＡ３遺伝子、ピキア（ｐｉｃｈｉａ）酵母のＧ４１８耐性遺伝子、又はその他あらゆる選択可能な標識を挿入してもよい。発現カセット及びスクリーニング標識からなるユニットは、宿主細胞に直接導入されてもよいし、或いは機能的に自己複製する発現ベクターに予め挿入されてもよい。使用可能な発現ベクター源は極めて広範囲に渡り、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）酵母に常用される発現プラスミドｐＫＤ１、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母に望ましい２μプラスミド、ピキア（ｐｉｃｈｉａ）属に常用されるｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺα発現プラスミド等を含むが、これに限定されない。
【００６３】
上記の組換え発現プラスミドを構築した後、一般的な分子生物学文献、例えば『分子クローニング実験指南』第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＤＷ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．”３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｋｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）や企業により提供される一般的な技術に基づき、組換えプラスミドを選択した宿主細胞に導入し、組換えプラスミドをうまく組み込んだ宿主細菌細胞をスクリーニングすればよい。また、外来ＤＮＡを細胞に導入するための一般的な方法、例えば形質転換、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）等、あらゆる方法が実用可能である。原核、真核、トランスジェニック動植物系を含む全ての組換えタンパク質発現系が、本発明に適用可能である。
【００６４】
形質転換細胞をスクリーニングした後、上記融合タンパク質を発現した細菌又は細胞が接種培養される。融合タンパク質は、連続培養過程における細胞の成長段階で取得されるが、成長後期の培養段階で取得されてもよく、宿主細胞の発現特性によって決定すればよい。融合タンパク質は例えば大部分の原核発現系に対し宿主細菌内部において発現してもよいし、培地に分泌してもよい。例えば、酵母や動物細胞の発現系に対し、融合タンパク質は通常は細胞外に分泌される。そして、遠心分離、細菌破壊、限外ろ過、沈殿、クロマトグラフィー等複数の方法を適切に組み合わせることで、高度に精製された組換えゼラチン様タンパク質又は組換えゼラチン様タンパク質と活性タンパク質との融合タンパク質が得られる。精製された融合タンパク質は、構造評価、体内外における生物活性の測定、又は薬物代謝動力学等に用いられる。
【００６５】
発現ベクターと宿主細菌の違いから、真核系によっては、発現される組換えゼラチン様タンパク質構造におけるＰｒｏの一部又は全てがＨｙｐに形質転換されることがあるが、このような変化は本発明の実施効果に影響しない。通常、酵母にはプロリル‐４‐ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ，ｐｒｏｌｙｌ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）は存在しないが、特殊な手段を利用すると、酵母系でも一部又は全てのＰｒｏ部分がＨｙｐに形質転換し得る。例えば、Ｖｕｏｒｅｌａ（Ｖｕｏｒｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６:６７０２−６７１２，１９９７）とＶａｕｇｈａｎ（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１７:５１１−５１８，１９９８）の研究では、出芽酵母又はピキア酵母においてゼラチン及びプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）遺伝子を同時発現することで、ヒドロキシル化ゼラチンを得られるとしている。
【００６６】
組換えゼラチン様融合タンパク質の性質
（ａ）物理化学特性
本発明の融合タンパク質における前記ゼラチン様ユニット（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）nは、以下の物理化学特性の一部又は全部を備える。
（１）親水性アミノ酸Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｈｙｐ、Ａｒｇのアミノ酸含有量パーセンテージが高く、合計で４０％〜２／３（６６．７％）である。
（２）Ｐｒｏ数とＨｙｐ数との和とｎの比が０．６以上である。
（３）Ｇｌｙ数の和とｎの比が１．１５以下（より好ましくは１．０５以下）である。
（４）等電点が３〜７（好ましくは３．２〜６であり、より好ましくは３．２〜５．５）である。
（５）コラスカー及びトンガオンカー法（Ｋｏｌａｓｋａｒ−Ｔｏｎｇａｏｎｋａｒ  ｍｅｔｈｏｄ）で算出した平均抗原指数が０．９８以下である。
（６）ＰｒｏｔＰａｒａｍ式で計算した場合、親水性を表すＧＲＡＶＹ値が−１．１より小さい（好ましくは−１．４より小さく、より好ましくは−１．５より小さい）。
【００６７】
【表１】
2013511263.tif 000002
ａ．ＧＲＡＶＹ値：ポリペプチド又はタンパク質における全てのアミノ酸の親水性値の平均値（親水性値の総和：アミノ酸数の総和）（Ｋｙｔｅ  Ｊ，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ＲＦ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，１５７:１０５−１３２，１９８２）。
ｂ．ＳGly／ｎ：ＧＬＫ配列におけるＧｌｙの総数とｎの比。
ｃ．Ｓ(Pro+Hyp)／ｎ：ＧＬＫ配列におけるＰｒｏとＨｙｐの総数とｎの比。
ｄ．各アミノ酸が既知のエピトープの一部に露出する確率に基づき算出。最少予測残基数は８である。報告によると、予測の正確さは約７５%である（Ｋｏｌａｓｋａｒ  ＡＳ，Ｔｏｎｇａｏｎｋａｒ  ＰＣ報告の方法で算出（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２７６:１７２−１７４，１９９０））。
【００６８】
（ｂ）生物活性
従来、融合発現によって活性タンパク質の体外における安定性を高める技術案は、活性タンパク質の生物活性を犠牲にするものが多かった。これは、融合キャリアとなるタンパク質、例えばアルブミンやＦｃ断片が、往々にして分子量が多く、立体障害が大きいために、融合後に生物活性タンパク質と反応リガンド（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｌｉｇａｎｄ）との結合を妨げるからである。例えば、Ｈｕａｎｇ  ＹＳら（Ｈｕａｎｇ  ＹＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，６７:３０１‐３０８，２００７）が生成した融合タンパク質ＨＳＡ／ＩＦＮαでは、ＩＦＮαが従来備えていた活性のわずか１．７％しか保持できなかった（モル比換算）。しかし、本発明の組換えゼラチン様融合タンパク質では、予想外に高い生物活性が保持された。例えば実施例３で述べるように、融合発現された融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの体外活性は、未融合であるＧ−ＣＳＦの約１４６％に達した。また、本発明の融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／ＩＦＮαの体外活性は、従来の“アルブミン−ＩＦＮα”融合タンパク質の体外における活性の７倍以上であった。
【００６９】
良好な体外活性は、臨床においてより少ない投薬量で済み、コスト・治療効果の両面で改善が得られることを意味する。組換えゼラチン様融合タンパク質が体外においてより高い活性を保持できるメカニズムについてはまだ研究されていないが、ＧＬＫ配列が生理的状態下で高次構造を形成せずに緩やかな構造を維持し、立体障害が小さくなることと関係すると考えられる。
【００７０】
（ｃ）体外安定性
本発明の組換えゼラチン様融合タンパク質は、体内での半減期を改善する以外にも、発現融合後に生物活性タンパク質の体外での安定性を高めることが予想外に発見された。実施例３で述べるように、未融合であるｒｈＧ−ＣＳＦと融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの溶液を、いずれも４０℃で４８時間振動させ、分子篩で分析したところ、ｒｈＧ−ＣＳＦサンプルには大量の重合体が出現し、更にタンパク質の含有総量が著しく低下したのに対し、融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦについてはこれら指標に大きな変化はなく、ＧＬＫとの融合後に生物活性タンパク質の体外における安定性が大きく向上することが分かった。
【００７１】
組換えゼラチン様融合タンパク質が生物活性タンパク質の体外での安定性を高める作用メカニズムとしては、ゼラチン配列が、部分的に折り畳みタンパク質を除去した露出部分と互いに作用することで、折り畳まれていない生物活性タンパク質の集中が避けられるためと考えられる。融合後に体外での安定性が高まり、生成及び保存期間におけるタンパク質重合体の形成が減少することで治療用タンパク質薬物の免疫原性が低減することは、臨床的に極めて意義がある。
【００７２】
ゼラチンと融合された活性タンパク質は体外での安定性が大幅に向上し、製剤にあたってＨＳＡ等の安定剤を添加する必要がなくなるため、ＨＳＡ添加による抗体の発生や中和といったリスクが減少する。
【００７３】
（ｄ）免疫原性
半減期を延長するための融合タンパク質のキャリアタンパク質は、免疫原性を持たないことが必須であり、そうでない場合は、キャリアタンパク質の抗体に対して抗体‐融合タンパク質免疫複合体が生じ、融合タンパク質の体内消失が加速すると共に、その他の望ましくない反応が引き起こされる。ゼラチンが製剤補助材料として既に広く用いられていることは、ゼラチンに免疫原性がないことを証明している。実施例４でも、組換えゼラチンそのものかゼラチン融合タンパク質かに拘わらず、有機体において抗体の発生を誘発しないことが証明されている。更なる利点としては、ゼラチン配列自体に種差の問題がないため、従来の融合発現法よりも、各種動物モデルにおける治療効果や安全性の評価に便利である。
【００７４】
（ｆ）体内での生物活性と半減期
本発明で生成される組換えゼラチン様融合タンパク質によれば、体内での半減期を大きく改善可能である。実施例５では、ｒｈＧ−ＣＳＦ、ｒＨＳＡ／Ｇ−ＣＳＦ、ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦという３種類のタンパク質のＳＤラット体内における薬物代謝及び薬効を比較した。異なる分量のｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦをそれぞれ一回皮下注射したところ、白血球の増加を急進させる効果があった他、体内半減期がｒｈＧ−ＣＳＦを大きく上回った。ｒＨＳＡ／Ｇ−ＣＳＦもほぼ同様であった。実施例１０でも、コラーゲンと融合したＥｘｅｎｄｉｎ−４がアカゲザル体内において半減期を大きく延長させることがわかった。
【００７５】
組換えゼラチン様融合タンパク質の用途
融合タンパク質のゼラチン部分自体には生物活性又は薬理活性がないため、本発明で生成される組換えゼラチン様融合タンパク質の用途は融合タンパク質中の非コラーゲン部分により決定される。即ち、組換えゼラチン様融合タンパク質｛ＧＬＫ｝ｐ−Ｒ−｛ＧＬＫ｝ｑの生物学的機能はＲ部分により決定され、ＧＬＫ部分の導入は、体外安定性と体内消失速度とを変化させるだけである。生物活性タンパク質／ポリペプチドＲの性質は、組換えゼラチン様融合タンパク質の用途、用法及び用量を決定する。例えば、造血因子ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１１、Ｍ−ＣＳＦをそれぞれ赤血球、好中球、血小板及び乾細胞の増殖に用いる場合、ＧＬＫと融合して生成されたＥＰＯ／ＧＬＫ、ＧＬＫ／Ｇ−ＣＳＦ、ＧＬＫ／ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＬＫ／Ｍ−ＣＳＦは、同様にそれらの効果を有する。これらは当業者にとって自明である。
【００７６】
薬用組成物
本発明の組換えゼラチン様融合タンパク質は、それ自体に良好な安定性が備わってはいるが、保存、運搬及び臨床への応用の便宜を考慮し、本発明では上記組換えゼラチン様融合タンパク質と薬学的に受け入れ可能なキャリアとを含む薬用組成物についても開示する。なお、薬用組成物は一般的な添加剤を更に含有してもよく、例えば希釈剤、保護剤、防腐剤を含有して得られる薬用組成物は、有機体、特に人体における疾病又は望ましくない症状の治療、予防、緩和或いは診断に用いられる。薬効を上げるため、本発明の融合タンパク質は、より良好な治療効果を得られるように他の薬物と共に使用してもよい。
【００７７】
本発明は、主に以下のような利点を有する。
１．高分子（例えばＰＥＧ）による修飾法とは異なり、組換え発現によって生成されるゼラチン融合タンパク質は構造が均一で製造方法も簡単であり、且つ有機体で分解可能なため体内に蓄積されることがない。
２．キャリアタンパク質（例えばＦｃ又はアルブミン）による融合法とは異なり、本発明のゼラチン様ユニットは親水性を高め、等電点を下げ、免疫原性が全く又はほぼなく、且つ余分な生物活性を持たない。
３．ＧＬＫは、複雑な構造ではなく線状高分子（例えばＰＥＧ等）と類似した線状構造を持ち、融合後の立体障害が小さいので、従来の融合法と比較して、組換えゼラチン様融合タンパク質の方が活性タンパク質の生物活性保持に有利である。
【００７８】
本発明の技術方案は、高分子化合物による修飾とタンパク質融合技術双方の利点を備えながらも双方の欠点を回避するものであって、組換えタンパク質薬物の体内半減期を変化させる一層優れた方法である。
【００７９】
次に、具体的な実施例と合わせて、更に本発明について詳述する。なお、以下の実施例は本発明を説明するためのもので、本発明の範囲を制限するものではないと解釈すべきである。特に記載がない限り、本発明は、分子生物学、微生物学、ＤＮＡ組み換え及び免疫学において当業者に周知の一般的な技術を用いて実施される。これら技術は、例えば、『分子クローニング実験指南』第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．”３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｋｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）や、『タンパク質精製：原理と実践』第３版（Ｓｃｏｐｅｓ  ＲＫ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４）等の文献に詳述されており、或いは試薬メーカーが提供する説明書に基づき実施可能である。メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の操作に関しては、特に指示がない場合には、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製のピキア発現キット（Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｎｉｔ）やピキア酵母発酵ガイドの操作説明に基づき実施される。また、以下の全ての配列においては、特に説明がない限り、下線部分は全て酵素切断識別点、イタリック部分はシグナルペプチド配列を表す。
【実施例１】
【００８０】
タンパク質ｒＧＬＫ１１６4の発現と精製
１．ＧＬＫ１１６4遺伝子のクローンニング
本発明のＧＬＫ１１６4遺伝子は、４つの同じ単量体（配列についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を参照）を直列して構成された。うち、単量体はＧＬＫ１１６1と称され、１１６のアミノ酸（配列についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２を参照）をコードしたもので、上海英駿生物技術有限公司（インビトロジェン社）により合成された。合成時には、５'末端に酵母ＧＳ１１５のα因子シグナルペプチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１の１〜２４位がＸｈｏＩ部位を有する）を挿入し、直後を制限酵素ＤｒａＩＩＩの認識部位とし、３'末端にＶａｎ９１ＩとＥｃｏＲＩ認識部位を備えてクローニングベクターｐＭＤ１８−Ｔ（タカラ社製）に連結し、プラスミドｐＧＬＫ１１６１−Ｔを構成した。
【００８１】
ＧＬＫ１１６2二量体を獲得するため、まずプラスミドｐＧＬＫ１１６1−ＴをＶａｎ９１Ｉ／ＤｒａＩＩＩでダブルダイジェスト（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した。そして、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、約３３０ｂｐの大きさの断片（即ち、ＧＬＫ１１６1）を切り出し回収し、カラム遠心分離式少量ゲル回収キットを用いて精製して（上海華舜生物工程有限公司）、−２０℃で保存し使用に備えた。同時に、プラスミドｐＧＬＫ１１６1−ＴをＶａｎ９１Ｉで切断した。切断したプラスミドは前述のように切り出し回収し、３０μｌのＴＥ溶液に溶解させた。続いて、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＢＡＰ，タカラ社製）を用いて処理した。
【００８２】
リン酸化処理したｐＧＬＫ１１６1−Ｔと、Ｖａｎ９１Ｉ／ＤｒａＩＩＩでダブルダイジェストして回収したＧＬＫ１１６1断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてモル比１：１０で連結した。そして、連結した生成物をＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α形質転換受容性細胞に形質転換した。
【００８３】
形質転換プレート（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｌａｔｅ）からモノクローンをピック-アップし、アンピシリン耐性のＬＢ液体培地にいれて培養し、一般的な方法によってプラスミドを抽出し、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩを用いてダブルダイジェスト評価を行った。ＤＮＡ塩基配列決定法（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いて陽性クローンを確認した。
【００８４】
上記と同様に、ＧＬＫ１１６2をｐＧＬＫ１１６2−Ｔに連結したところ、４つの単量体ＧＬＫ１１６1を含有する目的遺伝子ＧＬＫ１１６4（配列についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３を参照）が構築された。
【００８５】
２．発現プラスミドｐＰＩＣ−ＧＬＫ１１６4の構築
図２を参照する。ｐＰＩＣ９（インビトロジェン社製）を発現プラスミドとして用い、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで切断した後に、１％アガロースゲル電気泳動を行い、断片を回収した。ｐＧＬＫ１１６4−ＴをＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、約１２００ｂｐのＧＬＫ１１６4の目的断片を回収した。ＧＬＫ１１６4とｐＰＩＣ９の切断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させた。そして、結合した生成物をＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α形質転換受容性細胞に形質転換し、評価した。
【００８６】
３．タンパク質ｒＧＬＫ１１６4を発現する酵母の構築
メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒ）ＧＳ１１５（Ｈｉｓ‐）を発現宿主細菌とし、電気的形質転換（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によって、線形化プラスミドｐＰＩＣ−ＧＬＫ１１６4をＧＳ１１５に形質転換した。そして、シングルコロニーが現れるまで３０℃で３日間培養した。
【００８７】
４．ｒＧＬＫ１１６4タンパク質の発現スクリーニング
上記のように形質転換した組換え酵母のシングルコロニーを１０ｍｌのＢＭＧＹ液体培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養してから一晩放置し、上澄みを捨て、１％メチルアルコールを含有した１０ｍｌのＢＭＭＹ液体培地に加え、３０℃、２５０ｒｐｍで発現を誘導した。そして、発現が相対的に良好な菌株を発現株とした。
【００８８】
５．タンパク質ｒＧＬＫ１１６4の発酵と精製
ステップ４で得た発現株を液体ＹＰＤ培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍ振動で、ＯＤ600が約２０となるまで一晩培養し、これを発酵槽へ放置する種培養液体とした。培養した液体はビー・ブラウン社製の発酵槽ＢＩＯＳＴＡＴＣ−１０に入れ、培地はインビトロジェン社製のピキア酵母発酵ガイドに基づき配置した。接種量を１０％とし、発酵温度３０℃、ｐＨ５．０に設定し、グリセリンが消耗されてからメチルアルコールの追加を開始し、発現を誘導した。発現段階では発酵温度を２５℃に制御し、発酵槽に７２時間放置して誘導した。
【００８９】
高速遠心分離で菌体を取り除き、発酵上澄みを１リットル取り、予め氷で冷やしたアセトンを４℃下で最終濃度４０％になるまで加え、３０分攪拌し、遠心分離を行い、沈殿物を廃棄した。上澄み中に、予め氷で冷やしたアセトンを最終濃度８０％になるまで再度添加し、３０分攪拌し、遠心分離を行って沈殿物を収集した。得られた組換えゼラチン様融合タンパク質の沈殿物を１００ミリリットルの純水中に再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｄ）させて、２０ｍＭ  ＰＢ、ｐＨ７．０、４℃で一晩透析した。
【００９０】
透析したゼラチン融合タンパク質溶液を、予め緩衝液Ａ（２０ｍ  ＭＰＢ、ｐＨ７．０）で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア社製ＸＫ２６／２０、カラム体積５０ｍｌ）に装填し、その後カラム体積２倍の緩衝液Ａで未結合のタンパク質を溶出し、続いて線状勾配、１０カラム体積、０〜１００％緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＰＢ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で溶出した。
【００９１】
溶出したｒＧＬＫ１１６4を、タンパク質濃度約１０ｍｇ／ｍｌまで限外ろ過濃縮し（ミリポア社製ＭＷＣＯ１０ＫＤ使用）、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（ＧＥヘルスケア社製ＸＫ２６／２０使用。カラム体積５０ｍｌ）で脱塩した。緩衝液は１０ｍＭ  ＰＢ、ｐＨ７．０で、凍結乾燥した。
【００９２】
タンパク質濃度の測定にはブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いた。測定の結果、発酵もろみ液１リットルにつき約４０ｍｇのｒＧＬＫ１１６4が生成された。精製収率は約２０％で、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によると純度は９８％であった。
【実施例２】
【００９３】
融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの発現、精製及び評価
１．ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の合成
ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子（配列についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４を参照）は上海沢衡生物技術有限公司（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｚｅｈｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）により合成され、ｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローニングされて、プラスミドｐＧ−ＣＳＦ−Ｔを構築した。Ｇ−ＣＳＦの５'末端はＤｒａＩＩＩの認識部位、３'末端はＥｃｏＲＩの認識部位とした。
【００９４】
２．発現プラスミドｐＰＩＣ−ＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの構築
基本的には実施例１と同様である。発現プラスミドの構築フローは図３に示した。ＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦのＤＮＡコード配列、及び融合タンパク質ＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの成熟アミノ酸配列については、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６の通りである。
【００９５】
３．融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦを発現する酵母の構築
ｐＰＩＣ−ＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦのメタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒ）ＧＳ１１５（Ｈｉｓ‐）の形質転換、プラスミドの線形化処理、ＧＳ１１５形質転換受容性細胞の生成、及び電気的形質転換の方法については、実施例１と同様である。
【００９６】
４．融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの発現
形質転換した組換え酵母シングルコロニーを１０ｍｌのＢＭＧＹ液体培地へ接種し、発現を誘導する過程は実施例１と同様である。
【００９７】
５．融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの精製
実施例１を参照して発酵を行い、発酵液を遠心分離によって菌体除去し、遠心分離後に１リットルの上澄みを取り、０．４５μｍのフィルタでろ過除菌した。除菌後の上澄みをｐＨ３．０に調節し、注射用水でコンダクタンス５ｍｓ／ｃｍ未満まで希釈した。そして、このように処理した上澄みを予め緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ３．０）で平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア社製ＸＫ２６／２０。カラム体積５０ｍｌ）に装填し、装填後にカラム体積２倍の緩衝液Ａで未結合のタンパク質を溶出し、続いて緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＮａＡｃ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で溶出して、溶出ピークを収集した。
【００９８】
溶出したｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５（ＧＥヘルスケア社製ＸＫ５０／３０、カラム体積６００ｍｌ）で脱塩した。緩衝液は２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５を用いた。脱塩後のＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦ溶液を、予め緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５）で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア社製ＸＫ１６／２０、カラム体積２０ｍｌ）に装填し、装填後にカラム体積２倍の緩衝液Ｃで未結合のタンパク質を溶出してから、線状勾配、１０カラム体積、０〜１００％緩衝液Ｄ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）でＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦを溶出した。
【００９９】
溶出したＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦを、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌまで限外ろ過濃縮し（ミリポア社製ＭＷＣＯ１０ＫＤ使用）、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（ＧＥヘルスケア社製ＸＫ２６／２０使用。カラム体積５０ｍｌ）で脱塩した。緩衝液は１０ｍＭ  ＰＢ、ｐＨ７．０で、凍結乾燥した。
【０１００】
タンパク質濃度の測定にはブラッドフォード法を用い、発酵上澄み１リットルにつき３０ｍｇのＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦが生成された。精製収率は約２８％であった。分析結果は表４に示す。
【実施例３】
【０１０１】
ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの分析・同定
１．ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で、得られたｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの純度を分析したところ、見かけ分子量が６６ＫＤ〜９７ＫＤの一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｂａｎｄ）（図４参照）であることがわかった。
【０１０２】
２．分子ふるいクロマトグラフィー―高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
ＳＥＣ−ＨＰＬＣにはＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ３０００  Ｓｗｘｌカラムを用い、緩衝液を５０ｍＭ  ＰＢ、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０とした。結果を図５に示す。見かけ分子量は、約１５４ＫＤ（見かけ分子量：理論分子量＝２．８）であった。
【０１０３】
３．逆相クロマトグラフィー―高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
ＲＰ−ＨＰＬＣにはＶＹＤＡＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４  ＴＰ５４１５カラムを用い、移動相Ａを０．１％ＴＦＡ含有水溶液、移動相Ｂを０．１％ＴＦＡ含有アセニトリル水溶液（アセニトリル：水溶液＝９：１）とした。図６に結果を示す。
【０１０４】
４．ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）分析
Ｇ−ＣＳＦを比較対象とし、使用する一次抗体を抗マウスＧ−ＣＳＦポリクロナル抗体（ＡＮＴＩＧＥＮＩＸ）として、得られたＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦに対し免疫ブロット分析を行った。実験結果（図７）より、９０ＫＤ付近に陽性バンド（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｎｄ）があった。
【０１０５】
５．体外活性測定
ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦの体外活性測定にはＧ−ＣＳＦ依存性細胞株ＮＦＳ６０を用い、ＭＴＴ法により生物活性を測定した（『中華人民共和国薬典』，２００５版，３部）。
【０１０６】
うち、代表的な活性測定結果を図８に示した。
【０１０７】
ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦ活性は約３．３×１０7ＩＵ／ｍｇであり、モル比換算でＧ−ＣＳＦ生物活性の約１４６％に相当した。
【０１０８】
６．体外安定性
ｒｈＧ−ＣＳＦ標準品とｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦを、２０ｍＭ  ＰＢ、ｐＨ６．０の溶液に、タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌになるまで溶解した。無菌ろ過を行って無菌ペニシリン瓶に充填し、４０℃で４８時間振動させた後、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ法で重合体と含有量を分析した。その結果（表２及び図９参照）、ｒｈＧ−ＣＳＦサンプルについては大量の重合体が現れ、タンパク質の総含有量も著しく低下したが、融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦについてはこれら指標の変化はわずかであった。これは、ＧＬＫと融合後に生物活性タンパク質の体外での安定性が大幅に高まったことを示している。
【０１０９】
【表２】
2013511263.tif 000003
【実施例４】
【０１１０】
ｒＧＬＫ１１６4と融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦのマウス体内における免疫原性研究
動物免疫：４群のＢａｌｃ／Ｃマウスを用いた。各群は体重約２５ｇの３匹のマウスからなる。マウスの背の一点に、週１回４度の皮下注射を実施した。薬剤量は、融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦ、ｒＧＬＫ１１６4共に２．５ｎｍｏｌとした。なお、ブランク対照群については同体積の生理食塩水を注射した。免疫第４周及び第８回の免疫終了１週間後に採血し、血清を分離して-７０℃で保存した。
【０１１１】
投薬４回後の血清抗体価分析
タンパク質ｒＧＬＫ１１６4又はＧ−ＣＳＦを０．２Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに調製し、エライサプレートの各孔に１００μｌずつ充填した後、エライサプレートの各孔を４℃で一晩コーティングした。続いて、ＰＢＳＴで３回洗浄し（毎回につき、５分間続けた）、５％の脱脂粉乳を用いて１時間振動、密封した後、ＰＢＳＴで３回洗浄した（毎回につき、５分間続けた）。各群の血清を１：５０、１：２００、１：８００の比率で取り、３７℃で１時間インキュベートした後、二次抗体としてＨＲＰ標識（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギ抗マウス抗体を加えて１時間インキュベートし、脱水後にＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ−ＨＣＬで発色し、マイクロプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）を用いて４５０ｎｍ波長で測定を行った。同時に、２００ｎｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗体を陽性対照とした。
【０１１２】
結果を図１０に示す。Ｇ−ＣＳＦコーティング群は、融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦ投薬群と陽性対照群のみに高い吸収値がみられ、ｒＧＬＫ１１６4コーティング群は、全ての血清サンプルで吸収値が低く、投薬４週間後に生成された抗体はいずれも抗Ｇ−ＣＳＦであり、抗ｒＧＬＫ１１６4抗体は生成されなかった。このことは、本発明のゼラチン様ユニットに免疫原性がないことを示している。
【実施例５】
【０１１３】
融合タンパク質ｒＧＬＫ４／Ｇ−ＣＳＦの薬効学及び薬物動態学研究
ｒｈＧ−ＣＳＦ対象製品（米国アムジェン社製フィルグラスチム）、ｒＨＳＡ／Ｇ−ＣＳＦ（米国特許第５８７６９６９号に基づき作成）、ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦ及びｒＧＬＫ１１６4の４種類のタンパク質についてＳＤラット体内における薬物代謝及び薬効情況を比較した。
【０１１４】
中国科学院上海動物試験センターのＳＰＦ級成年ＳＤラット（約３００〜３５０グラム）を用い、表３のようにグループ分け、注射を行い、尾静脈から血液をサンプルリングし、白血球数をカウントした。そして、３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行って血清を分離し、−２０℃で保存した。
【０１１５】
薬物動態の測定においては、二重抗体サンドイッチエライサ法（ｄｏｕｂｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  ｍｅｔｈｏｄ）を用い、サンプル中のｒｈＧ−ＣＳＦ、ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦ及びｒＨＳＡ／Ｇ−ＣＳＦの血漿中濃度を測定した。具体的な操作については、Ｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦ  Ｄｕｏ  Ｓｅｔキット、Ｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＡＮＴＩＧＥＮＩＸ）の操作手順書を参照した。そして、Ｍｉｃｒｏ  Ｃａｌ  Ｏｒｉｇｉｎの４パラメーター論理曲線を用いて基準曲線を描写し、回帰方程式及び関連統計パラメーターを求めた。また、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３を用い、サンプルデータを基準曲線の回帰方程式に代入して関連数値を算出した。最後に、３Ｐ８７ソフトウェアで曲線あてはめ（ｃｕｒｖｅ  ｆｉｔｔｉｎｇ）を行い、主要な薬物動態学パラメーターを算出した。
【０１１６】
【表３】
2013511263.tif 000004
【０１１７】
薬効についての結果を図１１に示す。フィルグラスチム（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）を１回注射した群と比較すると、ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦ群とｒＨＳＡ／Ｇ−ＣＳＦ群は投薬４８時間後に白血球が明らかに増加し、且つその増加幅と持続時間はｒｈＧ−ＣＳＦ群を大きく上回った。投薬量の異なるｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦ群間では、投薬量の増加に伴って白血球の増え幅は明らかに増加し、白血球増加持続時間も長くなった。これに対し、投薬量を同じとしたｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦとｒＨＳＡ／Ｇ−ＣＳＦでは、白血球増加の効果及び持続時間に明らかな違いはなかった。
【０１１８】
薬物代謝についての結果を図１２に示した。血漿中濃度‐時間曲線のグラフから明らかなように、ｒｈＧ−ＣＳＦは皮下注射後に急速に代謝され、２４時間後には検出できなくなったが、ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦ群とｒＨＳＡ／Ｇ−ＣＳＦは７２時間経っても検出可能であった。皮下投薬したｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦのラット体内末端における半減期は１０時間程度であり、ｒＨＳＡ／Ｇ−ＣＳＦよりやや長かった。
【実施例６】
【０１１９】
タンパク質ＧＬＫ／Ｇ−ＣＳＦの構造別性質比較
同様の方法を用いて、構造の異なるタンパク質ＧＬＫ／Ｇ−ＣＳＦを構築し、その活性、半減期（ＳＤラット）等の関連データを比較した。
【０１２０】
【表４】
2013511263.tif 000005
【０１２１】
うち、ＧＬＫ420はヒト由来のＣＯＬ５Ａ１型コラーゲン配列のうち１１５０−１５６９位置から選択した。全配列については、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８の通りである。また、ＧＬＫ420／Ｇ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ及びアミノ酸配列については、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０の通りである。
【実施例７】
【０１２２】
融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／ＩＦＮαの発現と精製
１．インターフェロンα２b（ＩＦＮα）遺伝子の合成
ＩＦＮα遺伝子は上海沢衡生物有限公司により合成され（配列についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１参照）、ｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローニングされて、プラスミドｐＩＦＮα−Ｔを構築した。ＩＦＮαの５'末端はＤｒａＩＩＩ認識部位、３'末端はＥｃｏＲＩ認識部位とされた。
【０１２３】
２．発現プラスミドｐＰＩＣ−ＧＬＫ１１６4／ＩＦＮαの構築
構築フローを図１３に示す。完全なＧＬＫ１１６4／ＩＦＮαのＤＮＡ配列及び成熟融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／ＩＦＮαのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３の通りである。
【０１２４】
３．融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／ＩＦＮαを発現する酵母の構築及びスクリーニング
実施例１種類と同様の方法を用いた。
【０１２５】
４．融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／ＩＦＮαのメタノール資化酵母ＧＳ１１５における発現及び精製
発酵と精製の方法は実施例１と同様であり、精製した生成物には８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析を用いた。図１４にその結果を示す。
【０１２６】
５．体外活性測定
融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／ＩＦＮαの体外生物活性の測定には、通常の細胞変性抑制法（ＷＩＳＨ細胞）を用いた（『中華人民共和国薬典』，２００５版，３部）。
【０１２７】
細胞変性抑制法により測定した融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／ＩＦＮαの体外活性は、約２．２×１０7ＩＵ／ｍｇＩＦＮαであった。モル比換算すると未融合時の約１１％であり、「アルブミン−ＩＦＮα」融合タンパク質の体外活性（わずか１．４％）の７倍以上に達した。
【０１２８】
６．薬効学研究
研究はアカゲザルの体内で行われた。アカゲザルは全１５匹で、オス・メス半々とし（３〜４才、４．２〜４．８キログラム）、中国軍事医学研究院動物センターから購入した。各群を３匹とし、５群に分けて皮下注射を行った。サンプルはＰＢＳで希釈した。融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／ＩＦＮα３群の分量は、それぞれ０．３６ｐｍｏｌ／ｋｇ、１．０ｐｍｏｌ／ｋｇ、３．６ｐｍｏｌ／ｋｇとした。また、ＩＦＮα群の分量は０．３６ｐｍｏｌ／ｋｇ、ブランク対照群であるタンパク質ｒＧＬＫ１１６4の分量は０．３６ｐｍｏｌ／ｋｇであった。０時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１０時間、１４時間でそれぞれ血清を取り、２'，５'−ＯＡＳ放射性免疫検定キット（日本国東京栄研化学社製）を用いて血清中の２'，５'−ＯＡＳ活性を測定した。
【０１２９】
図１５に示すように、アカゲザル体内の２'，５'−ＯＡＳ濃度には明らかな分量依存性があった。２'，５'−ＯＡＳの体内活性は、２日後にピーク値に達した。融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／ＩＦＮα群は、体内において１４日後でも検出可能であったが、ＩＦＮα群は６日後にはブランク値に近くなり、同量のｒＧＬＫ１１６4／ＩＦＮαの２'，５'−ＯＡＳ活性はＩＦＮαよりも明らかに高かった。このことは、融合タンパク質の半減期が大幅に延長されたことを示している。
【０１３０】
性質の異なるＧＬＫ配列を用い、同様の方法で性質の異なるＧＬＫ／ＩＦＮα融合タンパク質を構築し、構造上の特徴、半減期（ＳＤラット）等の関連データを比較した結果は、表５に示す通りである。
【０１３１】
【表５】
2013511263.tif 000006
【０１３２】
表中の４本のＧＬＫ配列の長さは類似していたが、融合後の最終的な半減期は異なっていた。
ＧＬＫ１１６2Ｐ−とＧＬＫ１１６2を比較すると、元の配列における全てのＰｒｏとＨｙｐをＳｅｒに置換した後、親水性の変化は大きくなかったが、半減期は大きく低減した。
ＧＬＫ３０２配列はＰｒｏとＨｙｐを含まず、ＧＧＳＧＧＳ反復を基本配列とした。ＧＬＫ１１６2Ｐ−と比較すると、ＧＬＫ３０２配列はより多くのＧｌｙを含み（Ｇｌｙ総数とｎの比は２．０２）、両者の分子量と等電点は近似していたが、ＧＬＫ３０２の方が疎水性が強く（ＧＲＡＶＹ値が増加）、体内半減期もＧＬＫ１１６2Ｐ−より短かった。このことは、Ｇｌｙ総計とｎの比は１．５以下が適しており、好ましくは１．１５以下であり、より好ましくは１．０５以下であることを示している。
【０１３３】
ＧＬＫ１１６2Ｎ−とＧＬＫ１１６2を比較すると、元の配列の全てのＡｓｎをＧｌｕに置換した後、親水性の変化は大きくないが、等電点は明らかに低減し、体内半減期は大幅に延長された。
【０１３４】
ＧＬＫ１１６2／ＩＦＮα、ＧＬＫ１１６2Ｐ−／ＩＦＮα、ＧＬＫ３０２／ＩＦＮα、ＧＬＫ１１６2Ｎ−／ＩＦＮαの構築方法は実施例１及び実施例２と同様であり、成熟ペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４〜１７に示す通りである。
【実施例８】
【０１３５】
ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ｒＧＬＫの発現及び精製
ＧＬＫ１０４6遺伝子は６つの同じ単量体ＧＬＫ１０４1（単量体の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８を参照）を直列してなる。うち、単量体はＧＬＫ１０４1と称され、１０４のアミノ酸（配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９を参照）をコードする。ＧＬＫ１０７6遺伝子は６つの同じ単量体ＧＬＫ１０７1（単量体の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０を参照）を直列してなる。うち、単量体はＧＬＫ１０７1と称され、１０７のアミノ酸（配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１を参照）をコードするＤＮＡは上海英駿馬生物技術有限公司（インビトロジェン社）により合成された。構築方法は実施例１と同様であった。ＧＬＫ１０４2とＧＬＫ１０７2をそれぞれｐＧＬＫ１０４4−Ｔ、ｐＧＬＫ１０７4−Ｔに結合すると、６つの単量体ＧＬＫ１０４1、ＧＬＫ１０７1を含むプラスミドｐＧＬＫ１０４6−Ｔ、ｐＧＬＫ１０７4−Ｔが構築された。
【０１３６】
１．Ｅｘｅｎｄｉｎ−４遺伝子のクローン
Ｅｘｅｎｄｉｎ−４遺伝子は上海沢衡生物技術有限公司により合成された。そのＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２の通りである。
【０１３７】
合成後にｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローニングし、プラスミドｐＥｘｅｎｄｉｎ−４−Ｔを構築した。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４の５'末端はα因子シグナルペプチド配列（ＸｈｏI部位を含む）を持ち、３'末端はＤｒａＩＩＩ認識部位とされた。
【０１３８】
２．発現プラスミドｐＰＩＣ−Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０４6とｐＰＩＣ−Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０７6の構築を図１６に示した
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３〜２６は、それぞれＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０４6とＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０７6のＤＮＡ配列及び成熟融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１３９】
３．融合タンパク質ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０４6、ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０７6を発現する酵母の構築及びスクリーニング
実施例１に同じである。
【０１４０】
４．融合タンパク質ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０４6、ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０７6の発酵と精製
発酵方法と精製方法は実施例１と同様であり、溶出、精製によって得たｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０４6とｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０７6は、それぞれタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌとなるまで限外ろ過濃縮され（ミリポア社製ＭＷＣＯ  １０ＫＤ使用）、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（ＧＥヘルスケア社製ＸＫ２６／２０使用。カラム体積５０ml）で脱塩した。緩衝液は１０ｍＭ  ＰＢ、ｐＨ７．０で、凍結乾燥した。電気泳動の分析結果は図１７に示した。
【実施例９】
【０１４１】
融合タンパク質ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０４6とｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０７6の生物活性
ＧＬＰ−１Ｒを安定導入されたＢＨＫ細胞（ｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ）は、ＧＬＰ−１及びアゴニストの信号刺激を受容して細胞内のｃＡＭＰ含有量を増加させることが可能である。よって、ｃＡＭＰの放出量を測定することは、間接的に融合タンパク質ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４の生物活性を反映することになる。ＢＨＫ−ＧＬＰ−１Ｒ細胞の培養方法は、前述のＬｉ  Ｙらの方法（Ｌｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７８:４７１−４７８，２００３）の通りである。
【０１４２】
結果として、ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫは、ＢＨＫ−ＧＬＰ−１Ｒにおいて分量依存的に細胞内のｃＡＭＰの発生を刺激可能であり、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４標準品と類似の体外受容体結合活性を備えることがわかった（図１８において、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４  ＥＣ50＝０．０１７ｎＭ、ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０４6 ＥＣ50＝０．０９５ｎＭ、ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０７6  ＥＣ50＝０．１１３ｎＭ）。
【実施例１０】
【０１４３】
ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０４6とｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０７6の薬物動態学
融合タンパク質の薬物動態学研究はアカゲザルの体内で行われた。アカゲザルは全６匹で、オス・メス各３匹とし（３〜４才、４．２〜４．８キログラム）、中国軍事医学研究院動物センターから購入した。動物は、実験動物に対する通常の方法で飼育した（浙江大学実験動物センター）。各群は３匹からなり、皮下注射を行った。サンプルは、ＰＢＳで４ｍｇ／ｋｇに希釈した。そして、０．５時間、１時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１９２時間、２４０時間、２８８時間、３３６時間でそれぞれ血液をサンプリングし、予めＥＤＴＡを充填した採取管に採集した。高感度Ｅｘ−４ＲＩＡキット（米国Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）を用い、血漿中の融合タンパク質の濃度を測定した。実験では、ブランク血漿を用いて希釈調整した。
【０１４４】
結果は図１９に示すように、ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０４6とｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／ＧＬＫ１０７6の皮下注射後、サル体内の末端半減期はそれぞれ７０．４時間及び４５．４時間であった。ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４／rＧＬＫ１０４6を皮下注射して４８時間後には最高濃度に達し、この時の濃度は３６,９８０ｎｇ／ｍｌであった。半減期は１５倍以上となった（注：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４の半減期はわずか２．４時間にとどまった）。
【実施例１１】
【０１４５】
ｒＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4融合タンパク質の発現と精製
１．ＥＰＯ遺伝子のクローンニング
ＥＰＯ遺伝子は上海沢衡生物技術有限公司により合成された。そのＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２７に示す通りである。
【０１４６】
合成後、ｐＭＤ１８−Ｔにクローニングし、プラスミドｐＥＰＯ−Ｔを構築した。ＥＰＯ５'末端はＮｈｅＩ認識部位とＫｏｚａｋ配列を持ち、３'末端はＤｒａＩＩＩ認識部位を持った。なお、イタリック部分はＥＰＯの天然シグナルペプチド配列である。
【０１４７】
２．ＧＬＫ１０７4遺伝子のクローンニング
ＧＬＫ１０７4遺伝子配列に基づき、プライマーＧＬＫ１０７4／Ｐ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８）、ＧＬＫ１０７4／Ｐ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２９）を合成した。プライマーＧＬＫ１０７4１はＤｒａＩＩＩ認識部位を持ち、プライマーＧＬＫ１０７4２はＮｏｔＩ認識部位を持った。ｐＧＬＫ１０７4−Ｔを鋳型とした。また、通常のＰＣＲを用いて増幅産物を得た。
【０１４８】
３．発現プラスミドｐＣＥＰ４−ＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4の構築
構築フローは図２０に示す通りである。ｒＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4のＤＮＡ配列と成熟融合タンパク質のアミノ酸配列とは、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３０とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３１に示す通りである。
【０１４９】
４．組換えタンパク質ｒＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4の発現細胞株の構築
ｐＣＥＰ４−ＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4プラスミドは、超高純度プラスミド抽出キット（Ｍａｒｌｉｇｅｎ社より購入）を用いて抽出した。中国キヌゲネズミの卵巣細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ，ＣＨＯ）を宿主細胞として、通常のリポフェクションを行った。その後、エライサ法でＥＰＯ活性を測定した。陽性クローンは、メトトレキサート加圧（ＭＴＸ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）によってスクリーニングされた。うち、陽性細胞を１株取り、ＣＤ  ＣＨＯ無血清培地（ＧＩＢＣＯ社から購入）で徐々に培養した（Ｄｅｂｅｌｊａｋ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５９:２１６-２２３，２００６）。
【０１５０】
５．組換えタンパク質ｒＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4の発現
ステップ４で得た発現細胞株を無血清培地で蘇生させると、細胞は、細胞培養用回転瓶１２５ｍｌ、５００ｍｌ、１０００ｍｌの順で増殖した。これをＢ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｒｔ培養槽に接種し、細胞密度が１．５×１０6／ｍｌを超えると、毎日１０％の１０倍濃縮培地を補充し、１５日程度培養した。そして、毎日サンプリングして細胞密度をカウントし、ローリー法（ｌｏｗｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ）で目的タンパク質の発現量を測定した。発酵培養終了後、組換え発現細胞を収集し、６０００ｒ／ｍｉｎで遠心分離を５分間行い、上澄みを収集した。そして、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析を行った。
【０１５１】
６．組換えタンパク質ｒＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4の精製
精製方法は実施例１と同様である。
【実施例１２】
【０１５２】
融合タンパク質ｒＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4の正常なマウス体内における赤血球生成増進作用
マウス体内において、融合タンパク質ｒＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4とｒＥＰＯ標準品（アムジェン社製ＥＰＯＧＥＮR）の赤血球生成増進活性を比較した。実験では、中国科学院上海動物試験センターからのＢＡＬＢ／ｃマウス（オス、６〜８週齢、１８〜２０ｇ／匹）を用いた。下表のようにグループ分け、注射、尾静脈血サンプリングを行った。比色法で、ヘモグロビン（Ｈｂ）含有量を分析した。
【０１５３】
【表６】
2013511263.tif 000007
【０１５４】
週１度の皮下投薬によって、ｒＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4の赤血球生成増進作用を研究した。結果は図２１に示すように、ｒＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4の分量を変えた群間で、分量の増加に応じてＨｂレベルも上がることが分かった。同様に、ｒＥＰＯも赤血球生成増進作用を示したが、モル数が近い条件下では、活性は明らかにｒＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4よりも低かった。即ち、ｒＥＰＯに比べて、ｒＥＰＯ／ＧＬＫ１０７4は投薬周期を延長可能なだけでなく、赤血球生成増進作用の強化も可能であった。
【実施例１３】
【０１５５】
薬用組成物
以下のように、融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦを含有する注射用水を生成した。
【０１５６】
タンパク質濃度が１５．５ｍｇ／ｍＬで且つ１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を含むｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦ融合タンパク質原液を２００ミリリットル採取した。次に、７．１３グラムのグリシンを原液中に完全に溶解させ、更にｐＨが６．５の０．５ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液を２．２ミリリットル加え、１０％Ｎａ０Ｈでｐｈ６．５まで調節した。最後に、適量の注射用水を３１０ミリリットルまで加え、均一になるまで混合した後、０．２２ミクロンのろ過膜を使って当該調合剤を無菌ろ過し、ペニシリン瓶に充填した。最終的な調合剤成分は、融合タンパク質ｒＧＬＫ１１６4／Ｇ−ＣＳＦ濃度１０ｍｇ／ｍＬ、リン酸緩衝液濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．５、グリシン含有量２．３％（重量比）となった。
【０１５７】
【表６】
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【０１５８】
本発明が提示した全ての文献は、各文献が単独で参考引用されるように、本願において参考のために引用した。なお、当業者は、本発明の上述の内容を読了後、本発明に各種の変更又は修正を加えてもよく、これら等価形態は同様に本願の特許請求の範囲が限定する範囲に含まれると解釈すべきである。
【図１】
2013511263.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2013511263.tif 000020
【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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