(57)【要約】  クロストリジウム神経毒によって筋肉組織に誘導された効果を測定する方法であって、（ａ）筋肉組織又は細胞培養物を、前記クロストリジウム神経毒を含むサンプルと接触させるステップ、（ｃ）前記クロストリジウム神経毒によって前記筋肉組織に誘導された効果を測定するステップを含み、ステップ（ｃ）を、前記サンプルの不存在下で実施する前記方法である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム神経毒によって細胞培養物に誘導された効果を測定する方法であって、
（ａ）細胞培養物を、前記クロストリジウム神経毒を含むサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）前記クロストリジウム神経毒によって前記細胞培養物に誘導された効果を測定するステップ
を含み、
ステップ（ｃ）を、前記サンプルの不存在下で実施し、
ステップ（ｃ）における前記測定の前であって、ステップ（ａ）における前記接触の後に、前記細胞培養物を、０．５〜１００時間、クロストリジウム毒素を含まない水性媒体と接触させる、前記方法。
【請求項２】
第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定する、請求項１に記載の方法であって、
（ａ）細胞培養物を前記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）前記神経毒によって前記細胞培養物に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、前記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された前記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）細胞培養物を前記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）前記細胞培養物に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｋ）前記第１及び前記第２の効果が同一である濃度を特定するステップ、
（ｌ）ステップ（ｋ）における前記濃度を前記未知濃度と見なすステップ
を含み、
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、前記第２及び／又は前記第１のサンプルの不存在下で実施し、
ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における前記測定の前であって、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における前記接触の後に、前記細胞培養物を、０．５〜１００時間、クロストリジウム毒素を含まない水性媒体と接触させる、前記方法。
【請求項３】
第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定する、請求項１に記載の方法であって、
（ａ）細胞培養物を前記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）前記神経毒によって前記細胞培養物に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、前記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された前記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）細胞培養物を前記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）前記細胞培養物に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｉ）ステップ（ｆ）〜（ｈ）を、前記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｊ）ステップ（ｉ）で測定された前記第１の効果を濃度に対して記録し、第１のデータセットを作成するステップ
を含み、
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、前記第２及び／又は前記第１のサンプルの不存在下で実施し、
ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における前記測定の前であって、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における前記接触の後に、前記細胞培養物を、０．５〜１００時間、クロストリジウム毒素を含まない水性媒体と接触させる、前記方法。
【請求項４】
ステップ（ｍ）及び（ｎ）：
（ｍ）前記様々な濃度を、前記第１及び前記第２のデータセットに最良適合する濃度範囲から選択するステップ、
（ｎ）下記サブステップ（α）〜（δ）:
（α）ステップ（ｅ）で得られた前記第２のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（β）ステップ（ｊ）で得られた前記第１のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（γ）前記適合曲線をそれぞれ線形化するサブステップ、
（δ）前記線形化した適合曲線を並列化するサブステップ
を含む統計的検定によって、前記最良適合を決定するステップ
をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記統計的検定が、Ｆ検定、又はχ2検定、又はｔ検定である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
サブステップ（α）〜（δ）のそれぞれに関する誤拒否確率（false-rejection probability）が≦５（％表示）である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ε）：
（ε）線形化及び並列化した適合曲線の互いに対するシフトから、前記第２のサンプルに対する前記第１のサンプルの相対的効能を計算するステップ
をさらに含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記効果が、ＳＮＡＲＥ複合体由来タンパク質の切断である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質が、ＳＮＡＰ２５である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における前記測定の前に、前記細胞培養物を、５〜４５時間、又は１５〜４０時間、又は２５〜３５時間、前記クロストリジウム毒素と接触させる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における前記測定の前であって、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における前記接触の後に、前記細胞培養物を、０．５〜１００時間、又は１〜９５時間、又は６〜９０時間、又は７〜８０時間、又は８〜７０時間、又は９〜６０時間、又は１０〜５０時間、又は１１〜５０時間、又は１２〜４０時間、又は１５〜４０時間、クロストリジウム毒素を含まない水性媒体と接触させる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における前記測定の前であって、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における前記接触の後に、前記細胞培養物を溶解する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定を、ウエスタンブロット分析又はＥＬＩＳＡによって実施する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞培養物が、神経細胞株又は初代神経細胞の細胞培養物から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記測定された第２の効果の記録を、前記第２の効果を濃度に対してプロットすることにより実施し、前記第２のデータセットの作成を、検量線を作成することにより実施する、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の効果を、１０以上のマウスＬＤ50単位／ｍＬで表される、少なくとも１つの濃度において決定する、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記濃度が、１０〜１０００、又は１０〜７０、又は１５〜６０、又は２０〜４５である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記濃度が、２０〜４００、又は１００〜８００である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記マウスＬＤ50単位が、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）単位である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記クロストリジウム神経毒が、ボツリヌス毒素である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項３〜２０のいずれか１項に記載の方法を実行するソフトウェア手段を含むコンピュータプログラムを含むコンピュータプログラム製品。
【請求項２２】
クロストリジウム神経毒を含むサンプルの効能をコントロールするための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２３】
前記サンプルが、保管サンプルである、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
前記サンプルが、凍結乾燥サンプルであるか、又は再構成サンプルである、請求項２２又は２３に記載の使用。
【請求項２５】
例えば、クロストリジウム神経毒の製造プロセスにおける品質管理の間に、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定するための、又は第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定するための、請求項１に記載の方法の使用。
【請求項２６】
クロストリジウム神経毒によって筋肉組織に誘導された効果を測定する方法であって、
（ａ）筋肉組織を、前記クロストリジウム神経毒を含むサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）前記クロストリジウム神経毒によって前記筋肉組織に誘導された効果を測定するステップ、
を含み、
ステップ（ｃ）を、前記サンプルの不存在下で実施する、前記方法。
【請求項２７】
第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定する、請求項２６に記載の方法であって、
（ａ）筋肉組織を前記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）前記神経毒によって前記筋肉組織に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、前記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された前記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）筋肉組織を前記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）前記筋肉組織に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｋ）前記第１及び前記第２の効果が同一である濃度を特定するステップ、
（ｌ）ステップ（ｋ）における前記濃度を前記未知濃度と見なすステップ
を含み、
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、前記第２及び／又は前記第１のサンプルの不存在下で実施する、前記方法。
【請求項２８】
第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定する、請求項２６に記載の方法であって、
（ａ）筋肉組織を前記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）前記神経毒によって前記筋肉組織に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、前記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された前記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）筋肉組織を前記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）前記筋肉組織に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｉ）ステップ（ｆ）〜（ｈ）を、前記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｊ）ステップ（ｉ）で測定された前記第１の効果を濃度に対して記録し、第１のデータセットを作成するステップ
を含み、
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、前記第２及び／又は前記第１のサンプルの不存在下で実施する、前記方法。
【請求項２９】
ステップ（ｍ）及び（ｎ）：
（ｍ）前記様々な濃度を、前記第１及び前記第２のデータセットに最良適合する濃度範囲から選択するステップ、
（ｎ）下記サブステップ（α）〜（δ）:
（α）ステップ（ｅ）で得られた前記第２のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（β）ステップ（ｊ）で得られた前記第１のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（γ）前記適合曲線をそれぞれ線形化するサブステップ、
（δ）前記線形化した適合曲線を並列化するサブステップ
を含む統計的検定によって、前記最良適合を決定するステップ
をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記統計的検定が、Ｆ検定、又はχ2検定、又はｔ検定である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
サブステップ（α）〜（δ）のそれぞれに関する誤拒否確率（false-rejection probability）が≦５（％表示）である、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ε）：
（ε）線形化及び並列化した適合曲線の互いに対するシフトから、前記第２のサンプルに対する前記第１のサンプルの相対的効能を計算するステップ
をさらに含む、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記筋肉組織を電気的に刺激する、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ａ）の後にステップ（ｂ）を含むか、又はステップ（ａ）の後にステップ（ｂ）を含み、ステップ（ｆ）の後にステップ（ｇ）を含む：
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記筋肉組織を電気的に刺激するステップ
（ｇ）ステップ（ｆ）で得られた前記筋肉組織を電気的に刺激するステップ
請求項２６〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｂ）又は（ｇ）を前記第２又は前記第１のサンプルの不存在下で実施するか、あるいは、ステップ（ｂ）及び（ｇ）を前記第２及び前記第１のサンプルの不存在下で実施する、請求項２６〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における前記測定の前に、前記筋肉組織を、５〜３０分間、前記クロストリジウム毒素に曝露する、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記測定された第２の効果の記録を、前記第２の効果を濃度に対してプロットすることにより実施し、前記第２のデータセットの作成を、検量線を作成することにより実施する、請求項２６〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の効果を、１０以上のマウスＬＤ50単位／ｍＬで表される、少なくとも１つの濃度において決定する、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記濃度が、１０〜１０００、又は１０〜７０、又は１５〜６０、又は２０〜４５である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記濃度が、２０〜４００、又は１００〜８００である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記マウスＬＤ50単位が、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）単位である、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１及び第２の効果が、前記筋肉組織の麻痺までの時間、前記筋肉組織の収縮速度の変化、前記筋肉組織の収縮距離の変化、前記筋肉組織の収縮力の変化、前記筋肉組織の終板電位又は微小終板電位の変化からなる群より選択される、請求項２６〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１及び第２の効果が、麻痺までの時間である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記筋肉組織が、肋間筋、後肢筋、後肢長趾伸筋、後足の足底筋、横隔膜神経−片側横隔膜、長耳挙筋（levator auris longus muscle）、カエルの神経筋接合部、ニワトリの頸二腹筋、肋骨筋、脳組織又はエイの発電器官から選択される、請求項２６〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記横隔膜神経−片側横隔膜が、ラット又はマウス由来である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記クロストリジウム神経毒が、ボツリヌス毒素である、請求項２６〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記電気的刺激を、消泡剤を含む緩衝液中で実施する、請求項２６〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
請求項２８〜４７のいずれか１項に記載の方法を実行するソフトウェア手段を含むコンピュータプログラムを含むコンピュータプログラム製品。
【請求項４９】
（Ａ）−クロストリジウム神経毒に曝露された筋肉組織を刺激して、前記神経毒によって前記筋肉組織に誘導された効果を選定するためのデバイス、
−前記効果を測定して記録するためのデバイス、並びに、
（Ｂ）請求項４８に記載のコンピュータプログラム製品
を含むキット。
【請求項５０】
クロストリジウム神経毒を含むサンプルの効能をコントロールするための、請求項２６〜４７のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項５１】
前記サンプルが、保管サンプルである、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
前記サンプルが、凍結乾燥サンプルであるか、又は再構成サンプルである、請求項５０又は５１に記載の使用。
【請求項５３】
第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定するための、又は第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定するための、請求項２６に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体外で（ex vivo）、参照サンプルに含まれるクロストリジウム毒素の既知濃度に基づいて、あるサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定する方法に関する。本発明の方法は、上記サンプルと接触させた筋肉組織を電気的に刺激するステップ、及び該筋肉組織に誘導されたそれぞれの効果を比較し、それにより、上記未知濃度を決定するステップを含むことができる。また、本発明の方法は、参照基準に基づいて、あるサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を推測するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
近年、ボツリヌス神経毒は、限局性筋失調症及び痙攣性麻痺症状（spastic indication）の標準的治療薬となっている。医薬製剤は、例えば、Ｉｐｓｅｎ  Ｌｔｄ．（Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標））又はＡｌｌｅｒｇａｎ  Ｉｎｃ．（Ｂｏｔｏｘ（登録商標））から市販されている。その他のクロストリジウムタンパク質を含まない高純度神経毒は、例えば、Ｍｅｒｚ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標））から市販されている。許認可された別の製剤には、Ｓｏｌｓｔｉｃｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｙｏｂｌｏｃ（登録商標））がある。許認可されたさらに別の製剤には、Ｍｅｎｔｏｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＰｕｒＴｏｘ（登録商標））がある。これらの製剤は、使用されるボツリヌス毒素の種類又は生物学的有効性又は効能の点で異なる。
【０００３】
患者の治療では、一般的に、神経毒を罹患筋肉組織へ注入し、神経筋終板の近傍、すなわち、罹患筋肉をコントロールする神経細胞への神経毒の取り込みを媒介する細胞受容体の近傍に薬剤を導入する。様々な程度の神経毒の拡散（spread）が観察される。この拡散は、注入された神経毒の注入量及び製剤化の種類と相関すると考えられている。拡散の結果、アセチルコリン放出阻害に起因する系統的（systematic）副作用が、筋肉組織の近傍で観察される場合がある。治療に必要なレベルまで注入量を減少させることにより、目的としない未治療筋肉の麻痺の大部分を回避することができる。注入された神経毒が中和抗体の形成を引き起こす場合があるので、過剰投与が患者の免疫系にとって問題となる場合がある。この場合、神経毒が不活性化され、不随意筋活性を緩和することができない。
【０００４】
市販品又は製造プロセス間に産生されたバッチ等の調製物の所定の効能における投与当量又は変化量の不一致は、副作用及び免疫促進の可能性を通じた患者のリスク増加をもたらす。したがって、上記市販品又は製造バッチに含有されるクロストリジウム神経毒の濃度を、信頼性をもって（すなわち、有意な変動なしに）、できるだけ正確に決定し、患者の利益のために上記毒素濃度を信頼性のある効果的投与量に調節することが非常に重要である。これは、製造業者が、様々な治療目的における生物学的活性（すなわち効能）の最適な発揮を可能とする調製物を提供する誘因としても役立つ。
【０００５】
ＥＰ１５９７５８４Ｂ１は、生体外で（ex vivo）、サンプル（例えば、ボツリヌス神経毒を含むサンプル）中のシナプス前神経筋遮断物質の量を決定する方法を提案する。この方法は、シナプス前神経筋遮断物質を含むサンプルの存在下で、筋肉組織（好ましくは、マウスの肋骨筋）を電気的に刺激するステップ、並びに、該サンプルによって誘導された効果を、参照物質によって誘導された効果と比較し、該サンプル中のシナプス前神経筋遮断物質の量を決定するステップを含む。
【０００６】
ＧＢ２４１６８４９Ａ及びＧＢ２３９８６３６Ａは、生体外で（ex vivo）、サンプル（例えば、ボツリヌス神経毒を含むサンプル）中のシナプス前神経筋遮断物質の量を決定する方法を提案する。この方法は、シナプス前神経筋遮断物質を含むサンプルの存在下で、平滑筋組織（好ましくは、マウス又はラットの肋骨筋）を電気的に刺激するステップ、並びに、該サンプルによって誘導された効果を、参照物質によって誘導された効果と比較し、該サンプル中のシナプス前神経筋遮断物質の量を決定するステップを含む。
【０００７】
ＵＳ２００３／００３２８９１Ａ１は、生体内で（in vivo）、物質（例えば、クロストリジウム毒素）の効能を測定する方法であって、該物質を哺乳動物に投与し、該哺乳動物に刺激を与え、該刺激に対する該哺乳動物の耳介反射応答をモニターリングする方法を提案する。
【０００８】
ＥＰ２０１５０６５Ａ１は、神経毒（例えば、クロストリジウム神経毒）の効能を定量化する方法であって、該神経毒を非ヒト哺乳動物の後肢に投与し、該非ヒト哺乳動物に電気的刺激を与え、該後肢の収縮を測定し、その他の後肢の収縮と比較する方法を提案する。
【０００９】
Ｐｅａｒｃｅ等（Toxicon, Vol. 35, No. 9, pp. 1373-1412, 1997）は、ボツリヌス神経毒結合性に関するラット／マウス横隔膜神経−片側横隔膜の適合性を開示する。
【００１０】
Ｗｏｈｌｆａｈｒｔ等（Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 355, 335-340 (1997)）は、マウスの横隔膜を使用した用量依存的反応曲線によって、市販の２種類のボツリヌス毒素Ａ調製物の効能を比較する。
【００１１】
Ｃｈａｎｇ等（Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 282, 129-142 (1974)）は、単離された神経筋調製物（例えば、マウス及びラットの横隔膜）に対するＡ型ボツリヌス毒素及びβ−ブンガロトキシンのシナプス前作用を比較する。
【００１２】
Ｓｈｅｒｉｄａｎ等（J. Appl. Toxicol. 19, S29-S33 (1999)）は、毒素濃度の伝統的なバイオアッセイに基づくボツリヌスアンタゴニストの効能の決定を記載する。
【００１３】
Ｊａｍｅｓ等（Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 285, G291- G297 (2003)）は、幽門洞平滑筋に対するボツリヌス毒素の阻害効果を記載する。
【００１４】
Ｇｏｓｃｈｅｌ等（Exp. Neurol., vol. 147, 1, 1997）は、既知量の毒素を含むサンプルの効能と比較して、あるサンプル中のボツリヌス毒素の相対的効能を決定するための濃度反応曲線を記載する。異なるボツリヌス毒素調製物がマウスの片側横隔膜で試験されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、上記に参照した従来の定量方法は、規制当局による認証に必要な精度を欠いている。したがって、それらの方法は、規制の目的に使用することができず、その代わりに、依然としてマウスを犠牲にする昔ながらのアッセイを実施しなければならない。
【００１６】
本発明の１つの目的は、従来の方法を改良すること、並びに、サンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能又は濃度を決定するための、信頼性のある正確な方法を開発することにあり、該方法は、規制の目的に使用することができる。このような改良された方法は、安全で効果的な投与の必要性を満足するためにも役立つであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一態様において、本発明は、クロストリジウム神経毒によって筋肉組織に誘導された効果を測定する方法であって、
（ａ）筋肉組織を、上記クロストリジウム神経毒を含むサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）上記クロストリジウム神経毒によって上記筋肉組織に誘導された効果を測定するステップ
を含み、
ステップ（ｃ）を、上記サンプルの不存在下で実施する、上記方法に関する。
【００１８】
一実施形態では、上記筋肉組織を電気的に刺激する。
【００１９】
一実施形態において、上記方法は、ステップ（ａ）の後にステップ（ｂ）：
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ
を含む。
【００２０】
別の実施形態では、ステップ（ｂ）を、上記サンプルの不存在下で実施する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定する方法であって、
（ａ）筋肉組織を上記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）上記神経毒によって上記筋肉組織に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された上記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）筋肉組織を上記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）上記筋肉組織に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｋ）上記第１及び上記第２の効果が同一である濃度を特定するステップ、
（ｌ）ステップ（ｋ）における上記濃度を上記未知濃度と見なすステップ
を含み、
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施する、上記方法に関する。
【００２２】
一実施形態では、上記筋肉組織を電気的に刺激する。
【００２３】
一実施形態において、上記方法は、ステップ（ａ）の後にステップ（ｂ）を含み、ステップ（ｆ）の後にステップ（ｇ）を含む。
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ
（ｇ）ステップ（ｆ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ
【００２４】
別の態様において、本発明は、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定する方法であって、
（ａ）筋肉組織を上記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）上記神経毒によって上記筋肉組織に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された上記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）筋肉組織を上記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）上記筋肉組織に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｉ）ステップ（ｆ）〜（ｈ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｊ）ステップ（ｉ）で測定された上記第１の効果を濃度に対して記録し、第１のデータセットを作成するステップ
を含み、
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施する、上記方法に関する。
【００２５】
一実施形態では、上記筋肉組織を電気的に刺激する。
【００２６】
一実施形態において、上記方法は、ステップ（ａ）の後にステップ（ｂ）を含み、ステップ（ｆ）の後にステップ（ｇ）を含む。
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ
（ｇ）ステップ（ｆ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ
【００２７】
一実施形態において、上記方法は、ステップ（ｍ）及び（ｎ）:
（ｍ）上記様々な濃度を、上記第１及び上記第２のデータセットに最良適合する濃度範囲から選択するステップ、
（ｎ）下記サブステップ（α）〜（δ）:
（α）ステップ（ｅ）で得られた上記第２のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（β）ステップ（ｊ）で得られた上記第１のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（γ）上記適合曲線をそれぞれ線形化するサブステップ、
（δ）上記線形化した適合曲線を並列化するサブステップ
を含む統計的検定によって、上記最良適合を決定するステップ
をさらに含む。
【００２８】
一実施形態において、上記統計的検定は、Ｆ検定、又はχ2検定、又はｔ検定である。
【００２９】
一実施形態において、サブステップ（α）〜（δ）のそれぞれに関する誤拒否確率（false-rejection probability）は≦５（％表示）である。
【００３０】
一実施形態において、上記方法は、ステップ（ε）：
（ε）線形化及び並列化した適合曲線の互いに対するシフトから、上記第２のサンプルに対する上記第１のサンプルの相対的効能を計算するステップ
をさらに含む。
【００３１】
本発明の第２及び第３の態様に係る方法の一実施形態では、ステップ（ｂ）又は（ｇ）を第２又は第１のサンプルの不存在下で実施するか、あるいはステップ（ｂ）及び（ｇ）を第２及び第１のサンプルの不存在下で実施する。
【００３２】
本発明の３つの態様に係る方法のいずれか１つの一実施形態において、上記クロストリジウム神経毒に対する筋肉組織の曝露時間、すなわち、上記サンプル（第１又は第２のサンプル）の不存在下で、ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における上記効果の測定の前に、ステップ（ａ）において、筋肉組織を、サンプル（クロストリジウム神経毒を含む第１又は第２のサンプル）と接触させる時間は、１〜６０分間である。
【００３３】
本発明の３つの態様に係る方法のいずれか１つの一実施形態において、ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における上記測定の前に、上記筋肉組織を、５〜３０分間、上記クロストリジウム毒素に曝露する。
【００３４】
本発明の３つの態様に係る方法のいずれか１つの別の実施形態において、上記神経毒に対する上記筋肉組織の曝露時間は、約１５分間である。
【００３５】
本発明の３つの態様に係る方法のいずれか１つの一実施形態において、上記筋肉組織は、ステップ（ａ）及び／又はステップ（ｆ）の前に既に電気的に刺激されている。
【００３６】
別の実施形態において、上記筋肉組織は、ステップ（ａ）及び／又はステップ（ｆ）の間に既に電気的に刺激されている。
【００３７】
別の実施形態において、上記筋肉組織は、ステップ（ａ）の前及びステップ（ａ）の間に、並びに／又はステップ（ｆ）の前及びステップ（ｆ）の間に、既に電気的に刺激されている。
【００３８】
一実施形態において、上記測定された第２の効果の記録は、上記第２の効果を濃度に対してプロットすることにより実施され、上記第２のデータセットの作成は、検量線を作成することにより実施される。
【００３９】
一実施形態では、上記第２の効果を、１０以上のマウスＬＤ50単位／ｍＬで表される、少なくとも１つの濃度で測定する。
【００４０】
別の実施形態において、上記濃度は、１０〜１０００、又は１０〜７０、又は１５〜６０、又は２０〜４５である。
【００４１】
別の実施形態において、上記濃度は、２０〜４００であるか、又は１００〜８００である。
【００４２】
一実施形態において、上記マウスＬＤ50単位は、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）単位である。
【００４３】
一実施形態において、上記効果（上記第１及び第２の各効果）は、上記筋肉組織の麻痺までの時間、上記筋肉組織の収縮速度の変化、上記筋肉組織の収縮距離の変化、上記筋肉組織の収縮力の変化、上記筋肉組織の終板電位又は微小終板電位の変化からなる群より選択される。
【００４４】
一実施形態において、上記効果（上記第１及び第２の各効果）は、麻痺までの時間である。
【００４５】
一実施形態において、上記筋肉組織は、肋間筋、後肢筋、後肢長趾伸筋、後足の足底筋、横隔膜神経−片側横隔膜、長耳挙筋（levator auris longus muscle）、カエルの神経筋接合部、ニワトリの頸二腹筋、肋骨筋、脳組織又はエイの発電器官から選択される。
【００４６】
一実施形態において、上記横隔膜神経−片側横隔膜は、ラット又はマウス由来である。
【００４７】
一実施形態において、上記クロストリジウム神経毒は、ボツリヌス毒素である。
【００４８】
別の実施形態において、上記ボツリヌス神経毒は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧからなる群より選択される血清型であるか、又はＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧからなる群より選択される血清型のボツリヌス神経毒の化学的又は遺伝子工学的に修飾された誘導体である。
【００４９】
一実施形態において、上記神経毒は、タンパク質と複合体形成していない。
【００５０】
別の実施形態において、上記神経毒は、血清型Ａ又はＢである。
【００５１】
一実施形態において、上記電気的刺激は、消泡剤を含む緩衝液中で実施される。
【００５２】
一実施形態において、上記消泡剤は、シリコン含有化合物から選択される。
【００５３】
一実施形態において、上記緩衝液は、酸素でパージされている。
【００５４】
別の態様において、本発明は、本発明の方法を実行するソフトウェア手段を含むコンピュータプログラムを含むコンピュータプログラム製品に関する。
【００５５】
別の態様において、本発明は、
（Ａ）−クロストリジウム神経毒に曝露された筋肉組織を刺激して、上記神経毒によって上記筋肉組織に誘導された効果を選定するためのデバイス、
−上記効果を測定して記録するためのデバイス、並びに、
（Ｂ）本発明の方法を実行するソフトウェア手段を含むコンピュータプログラムを含むコンピュータプログラム製品
を含むキットに関する。
【００５６】
別の態様において、本発明は、本発明の方法のいずれか１つにおける筋肉組織の使用に関する。
【００５７】
別の態様において、本発明は、クロストリジウム神経毒を含むサンプルの効能をコントロールするための、本発明の３つの態様のいずれか１つに係る方法の使用に関する。
【００５８】
一実施形態において、上記サンプルは、保管サンプルである。
【００５９】
一実施形態において、上記サンプルは、凍結乾燥サンプルであるか、又は再構成サンプルである。
【００６０】
一態様において、本発明は、例えば、クロストリジウム神経毒の製造プロセスにおける品質管理の間に、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定するための、又は第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定するための、本発明の第１の態様に係る方法の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、器官槽（organ bath）に適用されたボツリヌス神経毒ＮＴの濃度（マウスＬＤ50単位で表示）に対する、麻痺までの時間（片側横隔膜の初期収縮力の中間点に達するのに必要な時間）（分で表示）のプロットを示す（半対数目盛り）。図中の■（黒い正方形）は、誘導された効果が神経毒の存在下で測定されたサンプルを表し、図中の◆（黒い菱形）は、組織を、１５分間、神経毒を含有するサンプルに曝露したサンプルを表す。その後、筋肉組織を器官槽から取り出し、サンプルを、神経毒不含成分で置換した。電気的刺激を実施した後、誘導された効果を測定した。曲線は、本発明の方法に従って決定された適合線を表す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本明細書に開示した方法を適用することにより、従来の定量方法で観察される有意なバラツキ（variability）を、有意でない程度まで低減させることができることが見出された。
【００６３】
第１の態様において、本発明は、クロストリジウム神経毒によって筋肉組織に誘導された効果を測定する方法であって、
（ａ）筋肉組織を、上記クロストリジウム神経毒を含むサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）上記神経毒によって上記筋肉組織に誘導された効果を測定するステップ
を含み、ステップ（ｃ）を上記サンプルの不存在下で実施する、上記方法に関する。
【００６４】
「筋肉組織を上記サンプル（本発明の別の態様に係る方法では、第１又は第２のサンプルであり得る）と接触させる」という表現は、上記サンプルの神経毒の少なくとも一部分が、上記接触の間に、上記筋肉組織に取り込まれること、すなわち、上記サンプルに含まれる神経毒の少なくとも一部分が、上記筋肉組織に含まれる適当な受容体に結合することを意味する。
【００６５】
「サンプルの不存在」という表現は、ステップ（ｃ）における効果の測定が、サンプルの含有量（別の言い方をすれば、サンプルの神経毒の含有量）が１０重量％未満である（例えば、ゼロである）媒体（典型的には適当な緩衝液）中で実施されることを意味する。
【００６６】
一実施形態において、上記筋肉組織は、クロストリジウム神経毒を含むサンプル（本発明の別の態様に係る方法では、第１又は第２のサンプルであり得る）に連続的に曝露されず、一時的にのみ曝露される。
【００６７】
これは、上記筋肉組織の曝露に対する応答を生じさせるために、上記筋肉組織を上記神経毒に対して、所定時間、曝露した後（すなわち、ステップ（ａ）における接触の後）、対応する効果（本発明の別の態様に係る方法では、第１又は第２の効果）の測定（測定において、例えば、上記筋肉組織は電気的に刺激される）が、下記方法を利用して、上記サンプル（本発明の別の態様に係る方法では、上記第１又は第２のサンプルであり得る）の不存在下で実施されることを意味する。
【００６８】
一実施形態において、上記測定の前に、上記筋肉組織は、例えば、下記のように、上記サンプルを含む器官槽（organ bath）から取り出され、神経毒不含成分を含む器官槽に移される。次いで、電気的刺激及び効果（サンプルが第１又は第２のサンプルであるとき、第１又は第２の効果であり得る）の程度の測定が実施される。これは、電気的刺激及び該刺激に対する応答が、神経毒が取り込まれた筋肉組織を使用して実施されることを意味する。
【００６９】
別の実施形態において、神経毒含有成分、すなわち、サンプル（第１又は第２のサンプルであり得る）は、神経毒不含成分で置換される。置換の後、効果（サンプルが第１又は第２のサンプルであるとき、第１又は第２の効果であり得る）の程度の測定が実施される。
【００７０】
「クロストリジウム神経毒（又はクロストリジウム毒素）」という用語は、クロストリジウム毒素複合体及び高純度神経毒（すなわち、その他のクロストリジウムタンパク質を含まない神経毒調製物）を包含する。
【００７１】
一実施形態において、上記クロストリジウム神経毒は、ボツリヌス神経毒である。
【００７２】
別の実施形態において、上記ボツリヌス神経毒は、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ及びＧからなる群より選択された血清型である。
【００７３】
「ボツリヌス毒素複合体」という用語は、少なくとも別の非毒性タンパク質が複合したボツリヌス毒素を包含する。例えば、ここで使用されるボツリヌス毒素複合体という用語には、例えばＣ．ボツリヌスの培養物から取得し得る、４５０ｋＤａ及び９００ｋＤａボツリヌス毒素複合体が含まれる。Ａ型ボツリヌス毒素複合体をベースとした調製物は、例えば、Ｉｐｓｅｎ  Ｌｔｄ．（Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標））又はＡｌｌｅｒｇａｎ  Ｉｎｃ．（Ｂｏｔｏｘ（登録商標））から市販されている。Ｂ型ボツリヌス毒素複合体をベースとした別の調製物は、Ｓｏｌｓｔｉｃｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｙｏｂｌｏｃ（登録商標））から市販されている。その他のクロストリジウムタンパク質を含まないＡ型高純度神経毒は、Ｍｅｒｚ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標））から市販されている。それは、数種類の形態の限局性筋失調症を改善するための選択薬である。
【００７４】
別の実施形態において、上記ボツリヌス神経毒は、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ及びＧからなる群より選択された血清型の化学的又は遺伝子工学的に修飾された誘導体である。
【００７５】
上記神経毒の化学的に修飾された誘導体は、例えば、ピルビン酸化（pyruvation）、リン酸化、硫酸化（sulfatation）、脂質化及び／又はグリコシル化によって修飾されたものである。
【００７６】
上記神経毒の遺伝子工学的に修飾された誘導体は、上記血清型のタンパク質に含まれる１又は２以上のアミノ酸の欠失、付加又は置換によって修飾されたものである。
【００７７】
そのような修飾毒素は、好ましくは、生物学的に活性である。
【００７８】
生物学的に活性な毒素は、細胞に取り込まれ、ＳＮＡＲＥ複合体に含まれる１又は２以上のポリペプチドをタンパク分解的に切断し得る毒素である。
【００７９】
一実施形態では、上記筋肉組織を電気的に刺激する。
【００８０】
一実施形態において、本発明の方法は、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ
をさらに含む。
【００８１】
一実施形態では、ステップ（ｂ）を、上記サンプルの不存在下で実施する。
【００８２】
驚くべきことに、上記筋肉組織を上記神経毒に曝露した後、電気的に刺激し、上記サンプルの不存在下において上記効果を測定することにより、それぞれの用量反応曲線がシフトし、本発明の方法の感度が有意に増加することが見出された。感度は、マウスＬＤ50単位／ｍＬで表される、上記サンプル中の上記クロストリジウム神経毒の濃度が低濃度である場合に、特に増加する。
【００８３】
例えば、効果（又は応答）として、麻痺までの時間が測定される場合、上記麻痺までの時間は、上記効果がサンプルの存在下で測定される方法と比較して増加する。この結果、特に低濃度の神経毒に適用される場合に、本発明の方法の感度の有利な増加が生じる。効能が低濃度で測定される場合、神経毒は、一般的に、最も大きな変化を示し得る。これに対して、比較的高い濃度の場合、効能は互いに近づく。
【００８４】
この感度の増加によって、それぞれの用量反応曲線に関するより正確で、より信頼性のある解析が可能となる。そして、これにより、本発明の方法のいずれか１つを実施するために犠牲にしなければならなかったはずの実験動物（例えば、マウス）の数を大幅に減少させることが可能となる。したがって、本発明のこの実施形態によれば、技術的側面の向上だけでなく、倫理的側面の向上も図られる。
【００８５】
ここで使用される「感度」という用語は、生理学で一般的に使用される意味、すなわち、外部刺激に応答する筋肉組織の能力を意味する。ここで、外部刺激は、筋肉組織をクロストリジウム神経毒と接触させることにより実施される。本発明の範囲内には、一定の濃度範囲を選択することが包含され、例えば、上記感度が増加する比較的低い濃度のクロストリジウム神経毒の濃度範囲を選択することができる、すなわち、別の方法では決定できない応答又は許容できない偏差でしか決定できない応答を決定することができる。
【００８６】
第２の態様において、本発明は、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定する方法であって、
（ａ）筋肉組織を上記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）上記神経毒によって上記筋肉組織に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された上記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）筋肉組織を上記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）上記筋肉組織に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｋ）上記第１及び上記第２の効果が同一である濃度を特定するステップ、
（ｌ）ステップ（ｋ）における上記濃度を上記未知濃度と見なすステップ
を含み、ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施する、上記方法に関する。
【００８７】
一実施形態では、上記筋肉組織を電気的に刺激する。
【００８８】
一実施形態において、上記方法は、ステップ（ａ）の後にステップ（ｂ）を含むか、又はステップ（ａ）の後にステップ（ｂ）を含み、ステップ（ｆ）の後にステップ（ｇ）を含む。
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ
（ｇ）ステップ（ｆ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ
【００８９】
別の実施形態では、ステップ（ｂ）又は（ｇ）を、第２又は第１のサンプルの不存在下で実施するか、あるいは、ステップ（ｂ）及び（ｇ）を、第２及び第１のサンプルの不存在下で実施する。
【００９０】
したがって、一実施形態では、上記第２及び／又は上記第１の効果の測定を、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施する。
【００９１】
別の実施形態では、上記筋肉組織の電気的刺激を、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施する。これは、ステップ（ａ）の後であってステップ（ｂ）の前に、及び／又はステップ（ｆ）の後であってステップ（ｇ）の前に、上記筋肉組織が、上記のように、上記第２及び／又は上記第１のサンプルから取り出されることを意味する。
【００９２】
「上記第１及び上記第２の効果が同一である濃度を特定する」（ステップ（ｋ）及び（ｌ））という表現は、上記第１及び上記第２の効果が定性的及び定量的に同一であること、すなわち、誘導された効果（例えば、麻痺までの時間）が、同一の測定値を有することを意味する。
【００９３】
一実施形態において、信頼性をもって比較し得る結果を得るために、上記第２又は上記第１のサンプルに含まれる上記神経毒に対する上記筋肉組織の曝露時間は、同程度にすべきである。
【００９４】
一実施形態において、上記曝露時間は同一である。
【００９５】
一実施形態において、ステップ（ｅ）で測定された上記第２の効果の記録は、上記第２の効果を、上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて測定し、上記測定された第２の効果を濃度に対してプロットし、これにより検量線を作成することにより実施される。
【００９６】
上記第２のサンプルによって上記筋肉組織に誘導された効果がマウスＬＤ50単位／ｍＬで表される様々な濃度に基づいて決定される場合、検量線は、上記のようにして得ることができる。
【００９７】
例えば、所定濃度範囲内にある１０種のＬＤ50単位／ｍＬ又は５種のＬＤ50単位／ｍＬにおいて誘導された上記効果を決定することができる。
【００９８】
したがって、ステップ（ｅ）で作成された第２のデータセットにより、検量線がプロットされ、それを使用して、上記第１のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒の未知濃度が、ステップ（ｋ）及びそれに続くステップ（ｌ）に従って特定される。
【００９９】
一実施形態において、作成された検量線はプロットされ、ステップ（ｋ）〜（ｌ）における特定するステップ及び見なすステップは、グラフ分析により実施される。
【０１００】
上記第１のサンプルの未知濃度は、検量線から、上記第１及び上記第２の効果が同一の値（例えば、麻痺までの同一時間）を有する濃度を特定し、ステップ（ｌ）で上記濃度を上記未知濃度と見なすことにより決定することができる。
【０１０１】
上記決定の必要条件は、第１のサンプルに含まれる未知濃度のクロストリジウム毒素が筋肉組織に対して効果を発揮することであり、それは、上記検量線によって定量化することができる。当業者は、第２のサンプルとの比較が可能となる濃度範囲を実現するために、すなわち、第１及び第２の効果が同一となり得るように、必要に応じて、未知濃度の第１のサンプルを、１回又は数回、希釈又は濃縮することが必要な場合があることを容易に理解するであろう。そして、希釈又は濃度因子に基づいて、未希釈又は未濃縮の第１のサンプルに最初に存在していた神経毒の濃度を、計算により決定することができる。
【０１０２】
別の実施形態において、上記特定する及び見なすステップは、ステップ（ｈ）及びそれに続くステップ（ｋ）及び（ｌ）における１つの濃度のみでの一点測定によっては実施されず、多数の様々な濃度での測定により実施される。これは、規制上の要件の点から特に重要である。
【０１０３】
本発明の別の態様において、上記第２及び第１のサンプルの信頼性のある比較が可能である濃度範囲を最適化することが望ましい。これは、公知の市販クロストリジウム神経毒製剤の生物学的有効性に関する比較可能性だけでなく、将来開発され得る又は既に開発段階にある製剤に関しても適用される。
【０１０４】
一実施形態において、上記第２及び第１のサンプルの信頼性のある比較が可能である、マウスＬＤ50単位／ｍＬで表される濃度範囲を最適化するために、ステップ（ｅ）及び／又はステップ（ｈ）で作成された検量線の標準偏差を初めに決定することが望ましい。適当な段階的重回帰分析を使用することにより、用量反応曲線に基づいて未知毒素サンプルの効能を予測するための回帰モデルを作製することができる。
【０１０５】
このような方法を使用することにより、２つの異なるデータ群を表す第１及び第２のサンプルに関して、用量反応曲線間の相関が最大に達する（すなわち、最良適合が決定される）濃度範囲を特定することができる。
【０１０６】
一実施形態において、上記検定は、所定の回帰モデルに従って、上記第１及び上記第２のサンプルの対応するデータセットの値域を、適合曲線又は線形化及び並列化した所定の信頼区間内の上記適合曲線で表すことにより、さらに精度を向上させることができる。
【０１０７】
したがって、第３の態様において、本発明は、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定する方法であって、
（ａ）筋肉組織を上記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ、
（ｃ）上記神経毒によって上記筋肉組織に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された上記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）筋肉組織を上記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）で得られた上記筋肉組織に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｉ）ステップ（ｆ）〜（ｈ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｊ）ステップ（ｉ）で測定された上記第１の効果を濃度に対して記録し、第１のデータセットを作成するステップ
を含み、ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施する、上記方法に関する。
【０１０８】
一実施形態において、上記方法は、ステップ（ｍ）及び（ｎ）：
（ｍ）上記様々な濃度を、上記第１及び上記第２のデータセットに最良適合する濃度範囲から選択するステップ、
（ｎ）下記サブステップ（α）〜（δ）：
（α）ステップ（ｅ）で得られた上記第２のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（β）ステップ（ｊ）で得られた上記第１のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（γ）適合曲線をそれぞれ線形化するサブステップ、
（δ）線形化した適合曲線を並列化するサブステップ
を含む統計的検定によって、上記最良適合を決定するステップ
をさらに含む。
【０１０９】
一実施形態では、上記筋肉組織を電気的に刺激する。
【０１１０】
一実施形態において、上記方法は、ステップ（ａ）の後にステップ（ｂ）を含み、ステップ（ｆ）の後にステップ（ｇ）を含む。
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ
（ｇ）ステップ（ｆ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ
【０１１１】
一実施形態では、ステップ（ｂ）又は（ｇ）を上記第２又は上記第１のサンプルの不存在下で実施するか、あるいは、ステップ（ｂ）及び（ｇ）を上記第２及び上記第１のサンプルの不存在下で実施する。
【０１１２】
したがって、一実施形態では、上記第２及び／又は上記第１の効果の決定を、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施する。
【０１１３】
別の実施形態において、上記筋肉組織の電気的刺激を、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施する。これは、ステップ（ａ）の後であってステップ（ｂ）の前に、及び／又はステップ（ｆ）の後であってステップ（ｇ）の前に、上記筋肉組織が、上記のように、上記第２及び／又は上記第１のサンプルから取り出されることを意味する。
【０１１４】
上記手順（sequence）を実施するのに適した統計的検定は周知である（例えば、蓋然性指数検定（likelihood-quotient-tests））。そのような蓋然性指数検定の具体例は、公知のＦ検定である。χ2検定（カイ二乗検定又はχ2分布検定）又はｔ検定等の検定も使用することができる。上記検定も当業者に公知である。
【０１１５】
一実施形態において、上記統計的検定はＦ検定である。
【０１１６】
上記検定により、所定の信頼区間において、異なる２つの群から採取した２つの無作為サンプルが分散の点で本質的に異なるか否かを決定することができる。したがって、このような検定は、２つの統計的サンプル（ここでは、第２及び第１のサンプル）の差の検定に役立つ。
【０１１７】
一実施形態において、信頼性のある結果を得るために、信頼区間は広くすべきである、すなわち、誤拒否確率は比較的低くすべきである。
【０１１８】
一実施形態において、誤拒否確率は≦５（％表示；（すなわち０．０５））であるか、又は信頼区間は≧９５（％表示；（すなわち０．９５））である。
【０１１９】
一実施形態において、各サブステップ（α）〜（δ）に関する誤拒否確率は≦５（％表示）である。
【０１２０】
一実施形態において、ステップ（γ）における線形化は、対応するデータセットを最良適合直線で表すことにより実施される。
【０１２１】
一実施形態において、ステップ（δ）における並列化は、最良適合直線の共通の傾きを決定することにより実施される。
【０１２２】
ステップ（δ）の後に、線形化及び並列化した適合曲線の互いに対するシフトから、第２のサンプルに対する第１のサンプルの相対的効能が決定される。
【０１２３】
したがって、一実施形態において、上記方法は、ステップ（δ）の後に、ステップ（ε）：
（ε）線形化及び並列化した適合曲線の互いに対するシフトから、第２のサンプルに対する第１のサンプルの相対的効能を計算するステップ
をさらに含む。
【０１２４】
一実施形態において、「相対的効能」という用語は、第２のサンプルに対する第１のサンプルの効能が、線形化及び並列化したそれぞれの適合曲線に基づいて、同一濃度（１又は複数）において決定されることを意味する。
【０１２５】
一実施形態において、第２のサンプルの効能は１００％と見なされ、第１のサンプルの相対的効能は％で表される。例えば、第１のサンプルに関して、第２のサンプルに対する１１０％、９０％等の効能が得られる。１１０％〜１００％の効能を有する第１のサンプルをそれぞれ希釈することにより、三の法則（the rule of three）が適用され、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒が、従来知られていなかった効果的濃度となる。そこでの測定単位は相対的効能であり、その値は参照標準（第２のサンプル）の活性（効能）に基づいて定義された活性（効能）単位として表される。
【０１２６】
別の実施形態において、上記相対的効能は、上記第１及び上記第２のサンプルの効能の比として表される。
【０１２７】
一実施形態において、上記モデルは、適用された神経毒量の対数値を予測するために使用される。
【０１２８】
別の実施形態において、誘導された効果量及びサンプル中の神経毒量の両方が、対数尺度で記録される。
【０１２９】
一実施形態において、上記第２の効果又は上記第１の効果は、上記第２のサンプル又は上記第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の少なくとも３つの異なる濃度において測定される。
【０１３０】
一実施形態において、上記データセットの作成又は上記検量線（１又は複数）の作成は、片対数プロットの様式で実施される。
【０１３１】
別の実施形態において、両対数プロットが実施される。
【０１３２】
相対的効能を決定する方法は、ヨーロッパ薬局方に記載されている。
【０１３３】
一実施形態において、例えば１０マウスＬＤ50単位／ｍＬという濃度で開始する場合、上記相対的効能を決定する方法は、データセットの全範囲にわたって適用される。次いで、１０を上回る値のマウスＬＤ50単位／ｍＬ（例えば、１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７マウスＬＤ50単位／ｍＬ）が、開始ポイントとして使用される。上記繰り返しは、適用されたモデルによって目的とする必要な精度が実現されるまで実施される。
【０１３４】
一実施形態において、最良適合及び濃度範囲が統計的検定によって特定されると、未知濃度（効果的濃度）のクロストリジウム神経毒を含む第１のサンプルを、本発明の方法によって特定された上記濃度範囲内において、第２のサンプルに含まれる既知濃度の上記クロストリジウム神経毒と比較することができる。
【０１３５】
一実施形態において、上記測定された第２の効果の記録は、上記第２の効果を濃度に対してプロットすることにより実施され、上記第２のデータセットの作成は、検量線を作成することにより実施される。
【０１３６】
アッセイにおいて、相対的効能の推量を使用すること、及び参照標準（第２のサンプル）を包含させることにより、より正確で、より再現性のある推定が可能となり、これにより、動物の使用低減の実現が可能となる。
【０１３７】
本発明の３つの態様に係る方法のいずれか１つの一実施形態において、ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における上記測定の前に、上記筋肉組織を、５〜３０分間、上記クロストリジウム毒素に曝露する。
【０１３８】
本発明の３つの態様に係る方法のいずれか１つの一実施形態において、上記筋肉組織は、ステップ（ａ）及び／又はステップ（ｆ）の前に既に電気的に刺激されている。
【０１３９】
別の実施形態において、上記筋肉組織は、ステップ（ａ）及び／又はステップ（ｆ）の間に、既に電気的に刺激されている。
【０１４０】
別の実施形態において、上記筋肉組織は、ステップ（ａ）の前及びステップ（ａ）の間に、並びに／又はステップ（ｆ）の前及びステップ（ｆ）の間に、既に電気的に刺激されている。
【０１４１】
統計的検定は、通常、適当なコンピュータプログラム及び適当なコンピュータを使用して実施される。
【０１４２】
一実施形態において、上記統計的検定は、上記統計的検定を実行する適当なソフトウェア手段を含む適当なコンピュータプログラムを使用して実施される。
【０１４３】
したがって、一実施形態において、本発明は、本発明の方法を実行するソフトウェア手段を含むコンピュータプログラムを含むコンピュータプログラム製品に関する。
【０１４４】
一実施形態において、第２のサンプルは、市販の許認可されたボツリヌス毒素調製物から選択される。これらの製品は、医薬品又は薬剤として許認可されており、明確に規定された量又は濃度のボツリヌス毒素を含む。
【０１４５】
別の実施形態において、標準的な条件の下で製造された、いかなるボツリヌス毒素を使用してもよい。
【０１４６】
一実施形態では、上記した市販の調製物を、第２のサンプルとして使用してもよい。したがって、第２のサンプルは、例えば、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）、Ｂｏｔｏｘ（登録商標）、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）、Ｍｙｏｂｌｏｃ（登録商標）又はＰｕｒＴｏｘ（登録商標）である。これらの調製物は、使用されるボツリヌス毒素の種類の点、又は生物学的有効性／活性（すなわち効能）の点、例えば、ボツリヌス神経毒の濃度の点、又はそこに含まれるボツリヌスの種類の点で、異なる。
【０１４７】
マウスＬＤ50で表されるマウス単位は、サンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の濃度を規定するために一般的に採用される単位である。ＬＤ50値は、マウス集団に適用された場合に該マウス集団の５０％が死亡する致死量を規定する。その値を決定するための方法は、当業者に公知である。そのような方法は、ヨーロッパ薬局方に記載されている。
【０１４８】
公知のように、ボツリヌス神経毒の製品のラベリングにおけるＬＤ50単位は、製品特異的又は製造者特異的である場合もあるし、標準がないために互換性がない場合もある。
【０１４９】
一実施形態において、ここで使用されるＬＤ50単位は、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）の特性及びラベリングで決定された単位であり、例えば、第２のサンプルはＸｅｏｍｉｎ（登録商標）である。したがって、ある効能に関する単位は、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）単位である。したがって、本発明のアッセイ系は、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）に基づいて、クロストリジウム神経毒を含むサンプルの効能を比較評価するために使用することができる。上記方法により、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）単位に基づいて、クロストリジウム神経毒（未知濃度）を含む第１のサンプルを直接比較することが可能となる。
【０１５０】
Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）及びＢｏｔｏｘ（登録商標）は、ほぼ同程度の有効性又は効能を示す。Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）及びＢｏｔｏｘ（登録商標）と同じ有効性又は効能を得るためには、約２．５倍量のＤｙｓｐｏｒｔ（登録商標）又は約１０倍量のＭｙｏｂｌｏｃ（登録商標）が適用される必要がある。
【０１５１】
一実施形態において、これらの市販の調製物を、それに含まれるボツリヌス神経毒が所定濃度となるように希釈又は濃縮し、上記第２の効果を、上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて測定する。上記測定された効果を、ボツリヌス毒素の濃度に対してプロットし、それにより、検量線を作成する。上記第２のデータセット又は上記検量線により、第１のサンプルに含まれるボツリヌス神経毒の未知濃度を決定することができる。
【０１５２】
サンプル（例えば、第１又は第２のサンプル）に含まれるクロストリジウム神経毒の濃度が、１０以上のマウスＬＤ50単位／ｍＬで表される場合、本発明の方法を有利に適用できることが見出された。但し、本発明における濃度は全てマウスＬＤ50単位／ｍＬである。
【０１５３】
一実施形態において、上記濃度は少なくとも１５である。
【０１５４】
別の実施形態において、上記濃度は少なくとも２０である。
【０１５５】
別の実施形態において、上記濃度は１０〜１０００である。
【０１５６】
一実施形態において、上記濃度は１０〜７０である。
【０１５７】
別の実施形態において、上記濃度は１５〜６０である。
【０１５８】
さらに別の実施形態において、上記濃度は２０〜４５である。
【０１５９】
一実施形態において、上記第２のサンプルはＸｅｏｍｉｎ（登録商標）である。
【０１６０】
一実施形態において、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）が第２のサンプルとして使用される場合、第２の効果が１０〜７０の少なくとも１つの濃度で決定されると、特に信頼性の高い結果が得られることが見出された。別の実施形態において、上記濃度は１５〜６０である。さらに別の実施形態において、上記濃度は２５〜４５である。
【０１６１】
一実施形態において、Ｂｏｔｏｘ（登録商標）が第２のサンプルとして使用される場合、第２の効果が１０〜７０の少なくとも１つの濃度で決定されると、信頼性のある結果が得られることが見出された。別の実施形態において、上記濃度は１５〜６０である。さらに別の実施形態において、上記濃度は２５〜４５である。
【０１６２】
第２のサンプルがステップ（ｅ）に従って検量線を決定するために使用される場合、神経毒の濃度が高い、すなわち、ＬＤ50単位／ｍＬの値が大きいＸｅｏｍｉｎ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）よりも濃度が低い又は有効性若しくは効能が低いボツリヌス神経毒を含む第２のサンプルが、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）によって誘導される効果と比較可能な第２の効果の強度を実現するために、必要となる。
【０１６３】
第２のサンプルにおけるボツリヌス神経毒の濃度又は効能がＸｅｏｍｉｎ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）よりも低い一実施形態において、第２の効果は、２０〜４００又は１００〜８００の少なくとも１つの濃度で決定される。
【０１６４】
第２のサンプルがＤｙｓｐｏｒｔ（登録商標）である一実施形態において、第２の効果は、２０〜４００、又は２５〜３００、又は３０〜２５０の少なくとも１つの濃度で決定される。
【０１６５】
第２のサンプルがＭｙｏｂｌｏｃ（登録商標）である別の実施形態において、第２の効果は、１００〜８００、又は１５０〜７００、又は２００〜６００の少なくとも１つの濃度で決定される。
【０１６６】
別の実施形態において、上記濃度は、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）と比較される上記第２のサンプルに含まれる上記神経毒の有効性又は効能の濃度に基づいて、３０〜６００、又は３０〜４００、又は３０〜２００、又は３０〜１００、又は３０〜８０、又は４０〜５００、又は４０〜４００、又は４０〜３００、又は４０〜２００、又は４０〜１００、又は４０〜９０、又は５０〜３００、又は５０〜２００、又は５０〜１００、又は６０〜１００の範囲をとることができる。
【０１６７】
一実施形態において、ＬＤ50単位は、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）単位である。
【０１６８】
本発明の第１の変更例において、上記未知濃度の決定に使用される効果は、筋肉組織の麻痺までの時間である。時間は、例えば、秒又は分として測定される。別の変更例において、麻痺までの時間は、筋肉収縮距離（収縮距離が０になった時点で麻痺が達成される）又は筋攣縮頻度（筋攣縮頻度が０になった時点で麻痺が達成される）に基づいて決定することができる。収縮距離は、例えば、センチメートル又はミリメートルとして測定される。
【０１６９】
「麻痺までの時間」は、最大攣縮の半値を達するまでに経過した時間として定義することができる。これは、毒素濃度に完全に依存する。
【０１７０】
本発明の別の変更例において、上記誘導された効果は、筋肉組織の収縮速度の変化であるか、又は筋肉組織の収縮の変化であるか、又は筋肉組織の収縮力の変化であるか、又は筋肉組織の終板電位若しくは微小終板電位の変化である。これらの方法は当業者に公知であり、例えば、ＥＰ１５９７５８４Ｂ１に記載されている。
【０１７１】
一実施形態において、上記効果、すなわち誘導された上記第１及び上記第２の効果は、筋肉組織の麻痺までの時間である。
【０１７２】
本発明の方法では、基本的に、神経筋の性質を示すいかなる筋肉組織、すなわち、電気的刺激に応答するいかなる筋肉組織を選択してもよい。筋肉組織は、電気的に刺激可能な、１又は複数の神経細胞又はそれに付着する神経を有する１又は複数の筋繊維を含む調製物を意味する。平滑筋及び横紋筋の両方の筋肉組織が使用可能である。
【０１７３】
本発明の教示に従うと、筋肉組織には、肋間筋、後肢筋及び後肢長趾伸筋（例えば、マウス及びラット由来のもの）、後足の足底筋（例えば、マウス又はラット由来のもの）、横隔膜神経−片側横隔膜（例えば、マウス又はラット由来のもの）、長耳挙筋（levator auris longus muscle）（例えば、マウス及びラット由来のもの）、カエルの神経筋接合部、ニワトリの頸二腹筋が含まれる。例えば、肋骨筋又は脳組織（マウス及びラット由来のもの）あるいはエイの発電器官を使用することもできる。
【０１７４】
さらに、一実施形態において、マウスの横隔膜神経−片側横隔膜の使用がクロストリジウム毒性の測定に有用なツールであることが実験により示された。したがって、それを、クロストリジウム毒性を測定するためのアッセイに使用することができる。
【０１７５】
一実施形態において、上記マウス片側横隔膜アッセイの信頼性により、規制当局の許認可条件を満たすことができるとともに、ボツリヌス毒素（例えば、血清型Ａ又は血清型Ｂ）の安全で効果的な投与の必要性を満たすことができる。
【０１７６】
一実施形態において、上記片側横隔膜は、齧歯動物（例えば、ラット又はマウス）の片側横隔膜である。
【０１７７】
一実施形態において、上記片側横隔膜は、マウスの片側横隔膜である。
【０１７８】
「マウス又はラットの片側横隔膜」という用語は、ラット又はマウスの横隔膜神経−片側横隔膜を意味する。
【０１７９】
さらに別の実施形態において、上記第１のサンプルに含まれる上記クロストリジウム毒素及び上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム毒素は、同一のクロストリジウム毒素である。
【０１８０】
さらに別の実施形態において、第１のサンプルに含まれる上記クロストリジウム毒素又は神経毒及び上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム毒素又は神経毒は、互いに異なる。
【０１８１】
上記方法の実験的実現のために、典型的には、運動ニューロンが付着した筋肉組織を動物（例えば、マウス又はラット）から取り出し、緩衝液（例えば、生理的緩衝液）を含有する器官又は組織槽（organ or tissue bath）に設置し、この際、該器官又は組織槽において、イオン組成、グルコース、温度、ｐＨ及び酸素供給等の条件をコントロールして組織生存能力及び機能を最適化する。電気的刺激後の筋肉収縮力の測定は、筋肉を力変換器に取り付けて実施することができ、これにより、神経筋機能に対する毒素の効果を直接測定することができる。
【０１８２】
一実施形態において、上記緩衝液の温度は、３５〜３９℃、又は３６〜３８℃である。別の実施形態において、上記温度は、３６．５〜３７．５℃である。
【０１８３】
さらに別の実施形態において、上記温度は、３７℃又は約３７℃である。
【０１８４】
一実施形態において、上記緩衝液のｐＨは７〜８又は７．２〜７．８である。一実施形態において、上記ｐＨは７．５又は約７．５である。
【０１８５】
一実施形態において、酸素供給は、酸素を含むガス混合物を使用して実施される。一実施形態において、酸素供給は、二酸化炭素及び酸素の混合物を使用して実施される。一実施形態において、９５部の酸素（容積基準）及び５部の二酸化炭素（容積基準）からなるガス混合物が使用される。carbogeneとして知られる市販の混合物を使用することができる。
【０１８６】
効果、すなわち第２及び第１の各効果を測定するための電気的刺激を実施するために、基本的に、参照した従来法を使用することができる。
【０１８７】
一実施形態において、本発明の方法は、ステップ（ｂ）又は（ｇ）における電気的刺激が少なくとも過最大電圧（supra-maximal voltage）に等しい電圧で実施されるように、実施される。過最大電圧は、筋肉組織の最大攣縮反応（maximum twitch response）が得られる最小電圧として理解される。一般的に、そのような実験は数回繰り返され、信頼性のある結果を得るために、得られた結果は平均化される。
【０１８８】
電気的刺激は、上記組織の過最大電圧に少なくとも等しい電圧で、一定間隔のパルス刺激により刺激されるように、実施することができる。パルス刺激は、刺激が実施されない所定間隔で分断される、所定時間継続される刺激を意味する。このアプローチは、例えば、Goschel等, Exp. Neurol., vol. 147, 1, 1997, Wohlfahrt等, Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol (1997) 355:335-340に記載されている。
【０１８９】
また、電気的刺激は、パルス列（train pulse）刺激であってもよい。そのような方法は、ＥＰ１５９７５８４Ｂ１に記載されている。
【０１９０】
パルス刺激の一実施形態において、刺激期間は、１０μｓ〜１ｍｓの範囲をとることができる。刺激が実施されない期間は、０．１〜１０ｓの範囲をとることができる。過最大電圧は、例えば、１ｍＶ〜１５Ｖの範囲をとることができる。筋肉組織は、例えば、周波数が例えば１Ｈｚのパルスを使用して、２つの電極を介して、連続的に電気的に刺激される。
【０１９１】
微小電極は、神経筋接合部又はその近傍に設置することができ、自発的な誘発膜電位の細胞内記録法を実施することができる。これらの膜電位は、アセチルコリンによるイオンチャネル内蔵型受容体の活性化によって生じ、毒素の影響を受ける。終板電位の分析は、アセチルコリンの量子的放出に対する毒素の効果に関する情報を得るために使用することができる。
【０１９２】
具体的には、適当な筋肉組織（例えば、左側の横隔膜神経−片側横隔膜（横隔神経））を例えば雄又は雌のマウスから切除し、器官槽に設置することができる。一実施形態において、この器官槽は、クレブス−リンガー溶液又はアール平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）又は生理的食塩水を含有する溶液槽である。上記溶液は当業者に公知である。筋肉組織は、次いで、公知の方法に従って、第１又は第２のサンプルの存在下、横隔神経を介して刺激される。誘導された効果は記録され、公知の方法（例えば、参照した従来法）を使用して評価される。
【０１９３】
筋肉組織は、緩衝液（例えば、生理的緩衝液）中に浸漬することができる。緩衝液は、エネルギー源を含むことができる。エネルギー源は、ＡＴＰエネルギー源、例えば、ＡＴＰ、糖（例えば、グルコース）、クレアチン、脂肪酸、アミノ酸、グリコーゲン、界面活性剤及びピルビン酸の１種又は２種以上であってよい。
【０１９４】
緩衝液には、酸素供給してもよく、これは、特に、長時間のアッセイの場合に適する。好ましくは、酸素及びグルコース（又はその他のＡＴＰ源）を、上記筋肉組織の生存期間を延長させるために、器官槽に加えることができる。界面活性剤の添加は、特に、本発明の方法に不利な影響を与える場合がある泡を低減させるために有用である。
【０１９５】
一実施形態において、上記界面活性剤は消泡剤である。
【０１９６】
「消泡剤」という用語は、液体中に含まれる気泡の表面張力に作用するあらゆる薬剤を包含する。
【０１９７】
ある種の消泡剤は、液体中に含まれる気泡の表面張力を低下させ、それにより気泡を破壊する。
【０１９８】
しかしながら、消泡剤は、気泡の表面張力を増加させることもでき、これにより、気泡を融合させ、小さな気泡よりも容易に液体から抜け出す大きな気泡とする効果が発揮される。
【０１９９】
表面張力の作用は、当業者に公知の方法（例えば、接触角及びぬれ角の測定）によって測定することができる。
【０２００】
したがって、消泡剤は、泡の形成を阻害する又は既に形成された泡を破壊する薬剤である。
【０２０１】
一般的に使用される消泡剤には、不溶性オイル、ジメチルポリシロキサン及びその他のシリコーン、アルコール、ステアレート並びにグリコールがある。
【０２０２】
一実施形態において、上記消泡剤は、少なくとも１種のシリコン含有化合物から選択される。
【０２０３】
別の実施形態において、少なくとも１種のシリコン含有化合物はシロキサンである。
【０２０４】
「シロキサン」という用語は、オリゴシロキサン及びポリシロキサンを包含する。一実施形態において、上記シロキサンは、アルキル基及び／又はアリール基で置換される。このようなシロキサンは当業者に周知である。シリコン含有化合物は、単一の化合物として又は２種以上のシリコン含有化合物の混合物として使用することができる。
【０２０５】
好適なシリコン化合物又は好適なシロキサンの具体例としては、これらに限定されるわけではないが、α−（トリメチルシリル）−ω−メチルポリ［オキシ（ジメチルシリレン）］及びポリジメチルシロキサンが挙げられる。これらの化合物は、シメチコン（simethicone）及びジメチコン（dimethicone）の名前で市販されており、医薬の成分として又は医薬として使用される。
【０２０６】
当業者は、シメチコン及びジメチコンと同様の活性を有する他の化合物を本発明の方法に適用可能であることを容易に理解するであろう。
【０２０７】
別の態様において、本発明は、クロストリジウム神経毒に曝露された筋肉組織が刺激され、（例えば上記のように）該刺激の効果が測定される器官槽（organ bath）と、統計的検定を実施し、信頼性のある結果を得るために、神経毒によって生じた効果が測定される濃度範囲を最適化するコンピュータプログラム製品とを含むキットに関する。
【０２０８】
したがって、一態様において、本発明は、
（Ａ）−クロストリジウム神経毒に曝露された筋肉組織を刺激して、上記神経毒によって上記筋肉組織に誘導された効果を選定するためのデバイス、
−上記効果を測定して記録するためのデバイス、並びに、
（Ｂ）本発明の方法を実行するソフトウェア手段を含むコンピュータプログラムを含むコンピュータプログラム製品
を含むキットに関する。
【０２０９】
第４の態様において、本発明は、クロストリジウム神経毒を含む第２のサンプルに基づいて、クロストリジウム神経毒を含む第１のサンプルの効能を、所定の信頼区間又は誤拒否確率で決定することができる濃度範囲を特定する、改良された方法を提供する。
【０２１０】
一実施形態において、クロストリジウム神経毒を含む第２のサンプルに基づいて、クロストリジウム神経毒を含む第１のサンプルの効能を決定することができる濃度範囲の特定方法は、下記ステップ：
（ａ）筋肉組織を上記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ、
（ｃ）上記神経毒によって上記筋肉組織に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された上記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）筋肉組織を上記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ、
（ｈ）上記神経毒によって上記筋肉組織に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｉ）ステップ（ｆ）〜（ｈ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｊ）ステップ（ｉ）で測定された上記第１の効果を濃度に対して記録し、第１のデータセットを作成するステップ
を含み、
上記濃度が、上記第１及び上記第２のデータセットに最良適合する濃度範囲から選択され、
上記最良適合が、下記サブステップ（α）〜（δ）：
（α）ステップ（ｅ）で得られた上記第２のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（β）ステップ（ｊ）で得られた上記第１のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（γ）上記適合曲線をそれぞれ線形化するサブステップ、
（δ）上記線形化した適合曲線を並列化するサブステップ
を含む統計的検定によって、決定される。
【０２１１】
上記実施形態において、上記第２及び上記第１の効果は、定性的に同一である。上記方法を改良するために、上記方法を本発明の第３の態様に係る方法と組み合わせて使用することができる。
【０２１２】
本発明の別の態様において、本発明の方法は、クロストリジウム神経毒を含むサンプルの質、すなわち、該サンプルの効能を、製造プロセスで要求されるような参照標準に基づいてコントロールするために、有利に使用することができる。
【０２１３】
したがって、上記態様において、本発明は、クロストリジウム神経毒を含むサンプルの質、すなわち、該サンプルの効能をコントロールするための、本発明の方法の使用に関する。
【０２１４】
一実施形態において、保管されていたサンプルの効能が決定される。一実施形態において、上記サンプルは、少なくとも１時間又は少なくとも１日間保管されていたサンプルである。
【０２１５】
一実施形態において、上記サンプルは、凍結乾燥サンプルであるか、又は再構成サンプルである。
【０２１６】
別の態様において、本発明は、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定するための、あるいは、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定するための、本発明の第１の態様に係る方法の使用に関する。
【０２１７】
別の態様において、本発明は、本発明の方法のいずれか１つにおいてクロストリジウム活性を決定するための、あるいは、本発明のキットを使用してクロストリジウム活性を決定するための、筋肉組織の使用、特にマウス又はラットの片側横隔膜の使用に関する。
【０２１８】
以下の実施形態も、本発明の範囲に包含され、上記実施形態が同様に下記方法に適用されると理解されるべきである。
【０２１９】
すなわち、本発明は、生体外で（ex vivo）、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定する方法であって、
（ａ）筋肉組織を上記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ、
（ｃ）上記神経毒によって上記筋肉組織に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された上記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）筋肉組織を上記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）で得られた上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）で得られた上記筋肉組織に誘導された第１の効果を測定するステップ
を含み、
上記第２の効果が、１０以上のマウスＬＤ50単位／ｍＬで表される、少なくとも１つの濃度で決定される、上記方法にも関する。
【０２２０】
一実施形態において、上記第１及び上記第２の効果が同一である濃度が特定され、上記第１のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒の未知濃度と見なされる。
【０２２１】
したがって、一実施形態において、本発明の方法は、ステップ（ｋ）及び（ｌ）：
（ｋ）上記第１及び上記第２の効果が同一である濃度を特定するステップ、
（ｌ）ステップ（ｋ）における上記濃度を上記未知濃度と見なすステップ
をさらに含む。
【０２２２】
一実施形態において、上記筋肉組織は、ステップ（ａ）及び／又はステップ（ｆ）の前に既に電気的に刺激されている。
【０２２３】
別の実施形態において、上記筋肉組織は、ステップ（ａ）及び／又はステップ（ｆ）の間に既に電気的に刺激されている。
【０２２４】
別の実施形態において、上記筋肉組織は、ステップ（ａ）の前及びステップ（ａ）の間に、並びに／又はステップ（ｆ）の前及びステップ（ｆ）の間に、既に電気的に刺激されている。
【０２２５】
上記筋肉組織が上記第２及び／又は上記第１のサンプルに存在する上記クロストリジウム神経毒に曝露された場合には、上記筋肉組織の上記電気的刺激は、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下又は存在下で実施することができる。
【０２２６】
一実施形態において、本発明は、生体外で（ex vivo）、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定する方法であって、
（ｉ）上記第２のサンプルの存在下で筋肉組織を電気的に刺激し、上記第２のサンプルによって上記筋肉組織に誘導された第２の効果を選択するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）における上記第２の効果を、上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて測定し、測定された上記第２の効果を濃度に対してプロットし、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｉｉｉ）上記第１のサンプルの存在下で上記筋肉組織を電気的に刺激するステップ、
（ｉｖ）上記第１のサンプルによって上記筋肉組織に誘導された第１の効果を選択するステップ、
（ｖ）上記第１及び上記第２の効果が同一である濃度を特定するステップ、並びに、
（ｖｉ）ステップ（ｖ）における上記濃度を上記未知濃度と見なすステップ
を含み、
上記第２の効果が、１０以上のマウスＬＤ50単位／ｍＬで表される、少なくとも１つの濃度で決定される、上記方法に関する。
【０２２７】
一実施形態において、ステップ（ｅ）又はステップ（ｉｉ）で測定された上記第２の効果の上記記録は、上記第２の効果を、上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて測定し、測定された上記第２の効果を濃度に対してプロットし、検量線を作成することにより実施される。
【０２２８】
したがって、ステップ（ｅ）又は（ｉｉ）で作成される第２のデータセットにより、検量線がプロットされ、それにより、ステップ（ｋ）及びそれに続くステップ（ｌ）、又はステップ（ｖ）及びそれに続くステップ（ｖｉ）において、上記第１のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒の未知濃度が特定される。
【０２２９】
一実施形態において、作成される検量線はプロットされ、ステップ（ｋ）〜（ｌ）、又はステップ（ｖ）及びそれに続くステップ（ｖｉ）における特定するステップ及び見なすステップは、グラフ分析によって実施される。
【０２３０】
一実施形態において、上記濃度は、少なくとも１５であるか、又は少なくとも２０である。
【０２３１】
別の実施形態において、上記濃度は、１０〜１０００である。
【０２３２】
一実施形態において、上記第２のサンプルの濃度は、１０〜７０である。
【０２３３】
別の実施形態において、上記第２のサンプルの濃度は、１５〜６０である。
【０２３４】
さらに別の実施形態において、上記濃度は、２０〜４５である。
【０２３５】
一実施形態において、上記した市販の調製物を、上記第２のサンプルとして使用することができる。したがって、第２のサンプルは、例えば、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）、Ｂｏｔｏｘ（登録商標）、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）、Ｍｙｏｂｌｏｃ（登録商標）又はＰｕｒＴｏｘ（登録商標）である。
【０２３６】
一実施形態において、使用される単位は、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）単位である。
【０２３７】
一実施形態において、これらの市販の調製物は、それに含有されるボツリヌス神経毒が所定濃度となるように希釈又は濃縮され、上記第２の効果は、上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて測定される。測定された上記効果は、ボツリヌス毒素の濃度に対してプロットされ、検量線が作成される。上記第２のデータセット又は上記検量線により、第１のサンプルに含まれるボツリヌス神経毒の未知濃度が決定される。
【０２３８】
一実施形態において、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）が上記第２のサンプルとして使用される場合、上記第２の効果が１０〜７０の範囲の少なくとも１つの濃度で測定されると、特に信頼性のある結果が得られることが見出された。別の実施形態において、上記濃度は１５〜６０である。さらに別の実施形態において、上記濃度は２５〜４５である。
【０２３９】
一実施形態において、Ｂｏｔｏｘ（登録商標）が上記第２のサンプルとして使用される場合、上記第２の効果が１０〜７０の範囲の少なくとも１つの濃度で決定されると、信頼性のある結果が得られることが見出された。別の実施形態において、上記濃度は１５〜６０である。さらに別の実施形態において、上記濃度は２５〜４５である。
【０２４０】
第２のサンプルが、ステップ（ｉｉ）に従って検量線を決定するために使用される場合、ボツリヌス神経毒の濃度が高い、すなわち、ＬＤ50単位／ｍＬの値が大きいＸｅｏｍｉｎ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）よりも濃度が低い又は有効性若しくは効能が低いボツリヌス神経毒を含む第２のサンプルが、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）によって誘導される効果と比較可能な第２の効果の強度を実現するために、必要となる。
【０２４１】
第２のサンプルが、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）よりも濃度又は効能が低いボツリヌス神経毒を含む一実施形態において、第２の効果は、２０〜４００又は１００〜８００の範囲の少なくとも１つの濃度で決定される。
【０２４２】
第２のサンプルがＤｙｓｐｏｒｔ（登録商標）である一実施形態において、第２の効果は、２０〜４００又は２５〜３００又は３０〜２５０の範囲の少なくとも１つの濃度で決定される。
【０２４３】
第２のサンプルがＭｙｏｂｌｏｃ（登録商標）である別の実施形態において、第２の効果は、１００〜８００又は１５０〜７００又は２００〜６００の範囲の少なくとも１つの濃度で決定される。
【０２４４】
別の実施形態において、上記濃度は、上記第２のサンプルの有効性又は効能がＸｅｏｍｉｎ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）と比較可能である濃度に応じて、３０〜６００、又は３０〜４００、又は３０〜２００、又は３０〜１００、又は３０〜８０、又は４０〜５００、又は４０〜４００、又は４０〜３００、又は４０〜２００、又は４０〜１００、又は４０〜９０、又は５０〜３００、又は５０〜２００、又は５０〜１００、又は６０〜１００の範囲をとることができる。
【０２４５】
上記第２のサンプルによって上記筋肉組織に誘導された効果が、マウスＬＤ50単位／ｍＬで表される様々な濃度に基づいて決定される場合、検量線は、上記のように得ることができる。
【０２４６】
例えば、所定濃度範囲内にある１０種のＬＤ50単位／ｍＬ又は５種のＬＤ50単位／ｍＬにおいて誘導された上記効果を決定することができる。
【０２４７】
第１のサンプルの上記未知濃度は、上記第１及び上記第２の効果が同一の値（例えば、麻痺までの同一時間）である濃度を検量線から特定し、ステップ（ｌ）に従って上記濃度を上記未知濃度と見なすことにより、決定することができる。
【０２４８】
上記決定の必要条件は、第１のサンプルに含まれる未知濃度のクロストリジウム毒素が、上記検量線によって定量化可能な、筋肉組織に対する効果を発揮することである。当業者は、第２のサンプルとの比較が可能な濃度範囲を達成するために、すなわち、第１及び第２の効果が同一となるように、必要に応じて、未知濃度の第１のサンプルを１回又は数回希釈又は濃縮する必要があるかもしれないことを容易に理解するであろう。その後、希釈又は濃度因子が判明すれば、未希釈又は未濃縮サンプルに最初に存在する神経毒の濃度を計算により決定することができる。
【０２４９】
一実施形態において、本発明の方法は、ステップ（ｂ）又は（ｇ）、あるいはステップ（ｉ）及び（ｉｉｉ）における電気的刺激が、上記した従来の方法を使用して、過最大電圧と少なくとも等しい電圧で実施されるように、実施される。
【０２５０】
一実施形態において、上記筋肉組織はマウスの横隔膜である。
【０２５１】
したがって、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定する方法は、
（ｉ）マウス片側横隔膜を、上記第２のサンプルの存在下で電気的に刺激し、上記第２のサンプルによって上記マウス片側横隔膜に誘導された第２の効果を選択するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）における上記第２の効果を、上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて測定し、測定された上記第２の効果を濃度に対してプロットし、検量線を作成するステップ、
（ｉｉｉ）上記筋肉組織を、上記第１のサンプルの存在下で電気的に刺激するステップ、
（ｉｖ）上記第１のサンプルによって上記筋肉組織に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｖ）上記第１及び上記第２の効果が同一である濃度を特定するステップ、並びに、
（ｖｉ）ステップ（ｖ）における上記濃度を上記未知濃度と見なすステップ
を含み、
上記第２の効果は、１０以上のマウスＬＤ50単位／ｍＬで表される、少なくとも１つの濃度で決定される。
【０２５２】
一実施形態において、上記筋肉組織はラット又はマウスの横隔膜神経−片側横隔膜であり、誘導された効果は麻痺までの時間であり、上記クロストリジウムボツリヌスは、血清型Ａのボツリヌス神経毒である。
【０２５３】
本発明の特定の実施形態において、本発明の方法は、第２のサンプルに含まれる血清型Ａのボツリヌス神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれる血清型Ａのボツリヌス神経毒の未知濃度を決定する方法であって、
（ｉ）マウス片側横隔膜を、上記第２のサンプルの存在下で電気的に刺激し、上記第２のサンプルによって上記マウス片側横隔膜に誘導された麻痺までの第２の時間を選択するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）における上記第２の効果を、上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて測定し、測定された上記第２の効果を濃度に対してプロットし、検量線を作成するステップ、
（ｉｉｉ）上記筋肉組織を、上記第１のサンプルの存在下で電気的に刺激するステップ、
（ｉｖ）上記第１のサンプルによって上記筋肉組織に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｖ）上記第１及び上記第２の効果が同一である濃度を特定するステップ、並びに、
（ｖｉ）ステップ（ｖ）における上記濃度を上記未知濃度と見なすステップ
を含み、
上記麻痺までの第２の時間が、１０〜７０、又は１５〜６０、又は２０〜４５の範囲のマウスＬＤ50単位／ｍＬで表される、少なくとも１つの濃度で決定され、第２のサンプルがＸｅｏｍｉｎ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）である、上記方法を包含する。
【０２５４】
一実施形態において、上記濃度は、１６．６マウスＬＤ50単位／ｍＬ〜５６．３マウスＬＤ50単位／ｍＬの範囲にある。
【０２５５】
別の実施形態において、上記濃度は、２０マウスＬＤ50単位／ｍＬ〜５５マウスＬＤ50単位／ｍＬの範囲にある。
【０２５６】
さらに別の実施形態において、上記濃度は、２５マウスＬＤ50単位／ｍＬ〜５０マウスＬＤ50単位／ｍＬの範囲にある。
【０２５７】
本発明の別の特定の実施形態において、本発明の方法は、第２のサンプルに含まれるボツリヌスＡ毒素の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれる血清型Ａのボツリヌス毒素の未知濃度を決定する方法であって、
（ｉ）マウス片側横隔膜を、上記第２のサンプルの存在下で電気的に刺激し、上記第２のサンプルによって上記マウス片側横隔膜に誘導された麻痺までの第２の時間を選択するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）における上記第２の効果を、上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて測定し、測定された上記第２の効果を濃度に対してプロットし、検量線を作成するステップ、
（ｉｉｉ）上記筋肉組織を、上記第１のサンプルの存在下で電気的に刺激するステップ、
（ｉｖ）上記第１のサンプルによって上記筋肉組織に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｖ）上記第１及び上記第２の効果が同一である濃度を特定するステップ、並びに、
（ｖｉ）ステップ（ｖ）における上記濃度を上記未知濃度と見なすステップ
を含み、
上記麻痺までの第２の時間が、２０〜４００、又は２５〜３００、又は３０〜２５０の範囲のマウスＬＤ50単位／ｍＬで表される、少なくとも１つの濃度で測定され、上記第２のサンプルがＤｙｓｐｏｒｔ（登録商標）である、上記方法を包含する。
【０２５８】
本発明の別の特定の実施形態において、本発明の方法は、第２のサンプルに含まれるボツリヌスＢ毒素又はボツリヌスＡ毒素の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれる血清型Ｂのボツリヌス神経毒の未知濃度を決定する方法であって、
（ｉ）マウス片側横隔膜を、上記第２のサンプルの存在下で電気的に刺激し、上記第２のサンプルによって上記マウス片側横隔膜に誘導された麻痺までの第２の時間を選択するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）における上記第２の効果を、上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて測定し、測定された上記第２の効果を濃度に対してプロットし、検量線を作成するステップ、
（ｉｉｉ）上記筋肉組織を、上記第１のサンプルの存在下で電気的に刺激するステップ、
（ｉｖ）上記第１のサンプルによって上記筋肉組織に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｖ）上記第１及び上記第２の効果が同一である濃度を特定するステップ、並びに、
（ｖｉ）ステップ（ｖ）における上記濃度を上記未知濃度と見なすステップ
を含み、
上記麻痺までの第２の時間が、１００〜８００、又は１５０〜７００、又は２００〜６００の範囲のマウスＬＤ50単位／ｍＬで表される、少なくとも１つの濃度で決定され、上記第２のサンプルがＭｙｏｂｌｏｃ（登録商標）である、上記方法を包含する。
【０２５９】
但し、神経毒の濃度又は効能を決定するアッセイでは、上記のような組織だけでなく、細胞培養物も利用することができる。
【０２６０】
別の態様において、本発明は、参照サンプルに含まれるクロストリジウム毒素の既知濃度に基づいて、あるサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定するために、細胞培養物を使用してクロストリジウム神経毒の活性を決定するアッセイに関する。上記方法は、クロストリジウムボツリヌス神経毒に感受性のある細胞培養物を上記神経毒に曝露したときにＳＮＡＲＥ複合体の切断によって生じるＳＮＡＰ２５等のタンパク質の定量化を利用する。上記方法はまた、参照基準に基づいて、あるサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を推定するために使用することができる。
【０２６１】
Ｐｅｌｌｅｔ，Ｓ．等（Comparison of the primary rat spinal cord cell (RSC) assay and the mouse bioassay for botulinum neurotoxin type A determination, Journal of Pharmacological and Toxicological Methods (2010), doi: 10.1016/j.vascn.2010.01.003）は、マウスバイオアッセイに代わるものとして、精製された血清型Ａボツリヌス神経毒の効能決定のための細胞系アッセイを提案する。
【０２６２】
Ｋｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．等（Persistence of botulinum neurotoxin action in cultured spinal cord cells, FEBS Letters 456 (1999) 137-142）は、ボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）及びボツリヌス神経毒Ｅ（ＢｏＮＴ／Ｅ）活性の持続性の相違の原因となるメカニズムを開示する。
【０２６３】
本発明の別の目的は、これら従来の方法を改良すること、並びに、サンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能又は該効能を生じる濃度を決定するための、信頼性のある正確な方法を開発することにあり、該方法は、規制の目的で使用することができる。このような改良された方法は、安全で効果的な投与の必要性を満たすためにも役立つであろう。
【０２６４】
この目的は、細胞培養物を、クロストリジウム神経毒を含むサンプルに曝露する又は接触させる方法であって、上記クロストリジウム神経毒によって上記細胞培養物の細胞に誘導される効果を測定する前に、上記サンプルを、あるクロストリジウム神経毒又は上記クロストリジウム神経毒を含まない水性媒体（例えば、緩衝液、又は中性緩衝液）と置換し、上記細胞培養物を、所定期間、例えば、１時間以上、又は２時間以上、又は３時間以上、又は４時間以上、又は５時間以上、上記水性媒体に曝露する方法によって達成される。測定の前に、上記細胞培養物を、最大１００時間又はそれ以上、上記水性媒体と接触させてもよい。
【０２６５】
驚くべきことに、クロストリジウムボツリヌス神経毒を含むサンプルに曝露又は接触させた後、上記クロストリジウムボツリヌス神経毒を含まない水性媒体との接触に続いて上記サンプルの不存在下で上記効果を測定すると、それぞれの用量反応曲線がシフトし、本発明の方法の感度が有意に増加することが見出された。マウスＬＤ50単位／ｍＬで表される、上記サンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒の濃度が低濃度であると、感度は特に増加する。
【０２６６】
したがって、第１の態様において、本発明は、クロストリジウム神経毒によって細胞培養物に誘導された効果を測定する方法であって、
（ａ）細胞培養物を、上記クロストリジウム神経毒を含むサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）上記クロストリジウム神経毒によって上記細胞培養物に誘導された上記効果を測定するステップ
を含み、
ステップ（ｃ）を、上記サンプルの不存在下で実施し、
ステップ（ｃ）における上記測定の前であって、ステップ（ａ）における上記接触の後に、上記細胞培養物を、０．５〜１００時間、クロストリジウム毒素を含まない水性媒体と接触させる、上記方法に関する。
【０２６７】
第２の態様において、本発明は、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定する方法であって、
（ａ）細胞培養物を上記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）上記神経毒によって上記細胞培養物に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された上記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）細胞培養物を上記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）上記細胞培養物に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｋ）上記第１及び上記第２の効果が同一である濃度を特定するステップ、
（ｌ）ステップ（ｋ）における上記濃度を上記未知濃度と見なすステップ
を含み、
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施し、
ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における上記測定の前であって、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における上記接触の後に、上記細胞培養物を、０．５〜１００時間、クロストリジウム毒素を含まない水性媒体と接触させる、上記方法に関する。
【０２６８】
第３の態様において、本発明は、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定する方法であって、
（ａ）細胞培養物を上記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）上記神経毒によって上記細胞培養物に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された上記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）細胞培養物を上記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）上記細胞培養物に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｉ）ステップ（ｆ）〜（ｈ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｊ）ステップ（ｉ）で測定された上記第１の効果を濃度に対して記録し、第１のデータセットを作成するステップ
を含み、
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施し、
ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における上記測定の前であって、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における上記接触の後に、上記細胞培養物を、０．５〜１００時間、クロストリジウム毒素を含まない水性媒体と接触させる、上記方法に関する。
【０２６９】
一実施形態において、上記方法は、ステップ（ｍ）及び（ｎ）：
（ｍ）上記第１及び上記第２のデータセットに最良適合する濃度範囲から、上記様々な濃度を選択するステップ、
（ｎ）下記サブステップ（α）〜（δ）:
（α）ステップ（ｅ）で得られた上記第２のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（β）ステップ（ｊ）で得られた上記第１のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（γ）上記適合曲線をそれぞれ線形化するサブステップ、
（δ）上記線形化した適合曲線を並列化するサブステップ
を含む統計的検定によって、上記最良適合を決定するステップ
をさらに含む。
【０２７０】
一実施形態において、上記統計的検定は、Ｆ検定、又はχ2検定、又はｔ検定である。
【０２７１】
一実施形態において、サブステップ（α）〜（δ）のそれぞれに関する誤拒否確率は、≦５（％表示）である。
【０２７２】
一実施形態において、上記方法は、ステップ（ε）：
（ε）線形化及び並列化した適合曲線の互いに対するシフトから、第２のサンプルに対する第１のサンプルの相対的効能を計算するステップ
をさらに含む。
【０２７３】
一実施形態において、上記効果（第１及び／又は第２の効果を含む）は、ＳＮＡＲＥ複合体由来タンパク質の切断である。
【０２７４】
一実施形態において、上記タンパク質はＳＮＡＰ２５である。
【０２７５】
一実施形態において、ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における上記測定の前に、上記細胞培養物を、５〜４５時間又は１５〜４０時間又は２５〜３５時間、上記クロストリジウム毒素と接触させる。
【０２７６】
一実施形態において、ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における上記測定の前であって、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における上記接触の後に、上記細胞培養物を、０．５〜１００時間、又は１〜９５時間、又は６〜９０時間、又は７〜８０時間、又は８〜７０時間、又は９〜６０時間、又は１０〜５０時間、又は１１〜５０時間、又は１２〜４０時間、又は１５〜４０時間、クロストリジウム毒素を含まない水性媒体と接触させる。
【０２７７】
一実施形態において、ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における上記測定の前であって、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における上記接触の後に、上記細胞培養物を溶解させる。
【０２７８】
別の実施形態において、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における上記接触の前に、細胞培養物を溶解させる。
【０２７９】
一実施形態において、上記測定は、ウエスタンブロット分析又はＥＬＩＳＡによって実施される。
【０２８０】
一実施形態において、上記細胞培養物は、神経細胞株又は初代神経細胞の細胞培養物から選択される。
【０２８１】
一実施形態において、上記測定された第２の効果の記録は、上記第２の効果を濃度に対してプロットすることにより実施され、上記第２のデータセットの作成は、検量線を作成することにより実施される。
【０２８２】
一実施形態において、上記第２の効果は、１０以上のマウスＬＤ50単位／ｍＬで表される、少なくとも１つの濃度で決定される。
【０２８３】
別の実施形態において、上記濃度は、１０〜１０００、又は１０〜７０、又は１５〜６０、又は２０〜４５の範囲である。
【０２８４】
別の実施形態において、上記濃度は、２０〜４００の範囲であるか、又は１００〜８００の範囲である。
【０２８５】
一実施形態において、上記マウスＬＤ50単位は、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）単位である。
【０２８６】
一実施形態において、上記クロストリジウム神経毒は、ボツリヌス毒素である。
【０２８７】
別の実施形態において、上記ボツリヌス神経毒は、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ及びＧからなる群より選択された血清型であるか、あるいは、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ及びＧからなる群より選択された血清型のボツリヌス神経毒の、化学的又は遺伝子工学的に修飾された誘導体である。
【０２８８】
別の実施形態において、上記神経毒は、血清型Ａ又はＣ又はＥである。
【０２８９】
一実施形態において、上記神経毒は、複合体形成するタンパク質を含まない。
【０２９０】
別の態様において、本発明は、本発明の方法を実行するソフトウェア手段を含むコンピュータプログラムを含むコンピュータプログラム製品に関する。
【０２９１】
別の態様において、本発明は、本発明の方法のいずれか１つにおける、細胞培養物の使用に関する。
【０２９２】
別の態様において、本発明は、クロストリジウム神経毒を含むサンプルの効能をコントロールするための、本発明の第１、第２及び第３の態様のいずれか１つに係る方法の使用に関する。
【０２９３】
一実施形態において、上記サンプルは、保管サンプルである。
【０２９４】
一実施形態において、上記サンプルは、凍結乾燥サンプル又は再構成サンプルである。
【０２９５】
別の態様において、本発明は、例えばクロストリジウム神経毒の製造プロセスにおける品質管理の間に、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定するための、あるいは、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定するための、本発明の第１の態様に係る方法の使用に関する。
【０２９６】
細胞培養物を使用する当業者に公知の方法と比較すると、本発明の方法によって、クロストリジウムボツリヌス神経毒の生物学的活性の定量に関する正確性及び精密性の有意な改善を可能となる。本発明の方法は、規制上の要件を満足する。
【０２９７】
本明細書に開示された方法を適用することにより、細胞培養物を使用する従来の定量法で観察される有意なバラツキ（variability）を、有意でない程度まで顕著に低減させることができることをが見出された。
【０２９８】
一実施形態において、本発明は、クロストリジウム神経毒によって細胞培養物に誘導された効果を測定する方法であって、
（ａ）細胞培養物を、クロストリジウム神経毒を含むサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）上記神経毒によって上記細胞培養物に誘導された効果を測定するステップ
を含み、
ステップ（ｃ）を、上記サンプルの不存在下で実施する、上記方法に関する。
【０２９９】
「細胞培養物をサンプル（本発明の別の態様では、第１又は第２のサンプルであり得る）と接触させる」という表現は、サンプルの神経毒の少なくとも一部が接触の間に細胞培養物に取り込まれる、すなわち、サンプルに含まれる神経毒の少なくとも一部が細胞培養物の細胞に含まれる適当な受容体に結合することを意味する。
【０３００】
「サンプルの不存在」という表現は、ステップ（ｃ）における効果の測定が、サンプルの含有量（別の言い方をすれば、サンプルの神経毒の含有量）が１０重量％未満である（例えば、ゼロである）媒体、典型的には適当な緩衝液中で実施されることを意味する。
【０３０１】
一実施形態において、上記細胞培養物は、クロストリジウム神経毒を含むサンプル（本発明の別の態様に係る方法では、第１又は第２のサンプルであり得る）に連続的に曝露（接触）されず、一時的にのみ曝露される。
【０３０２】
これは、上記細胞培養物の曝露に対する応答を生じさせるために、上記細胞培養物を神経毒に対して、所定時間、曝露させた後（すなわち、ステップ（ａ）における接触の後）、対応する効果（本発明の別の態様に係る方法では、第１又は第２の効果）の測定は、上記サンプル（本発明の別の態様に係る方法では、上記第１又は上記第２のサンプルであり得る）の不存在下で実施されることを意味し、その際、下記方法が利用される。
【０３０３】
一実施形態において、上記測定の前に、上記細胞培養物は、例えば、下記のように、上記サンプルを含む容器（bath）から取り出され、神経毒不含成分を含む容器に移される。次いで、効果（サンプルが第１又は第２のサンプルであるとき、第１又は第２の効果であり得る）の程度の測定が実施される、すなわち、効果が定量化される。これは、上記刺激に対する応答が、神経毒を取り込んだ細胞培養物を使用して実施されることを意味する。
【０３０４】
別の実施形態において、神経毒含有成分、すなわちサンプル（例えば、第１又は第２のサンプル）は、神経毒不含成分によって置換される。一実施形態において、サンプルは、例えばデカンテーションにより、細胞培養物から取り除かれ、下記のような神経毒不含成分によって置換される。置換の後、効果（サンプルが第１又は第２のサンプルである場合、第１又は第２の効果であり得る）の程度の測定が実施される。
【０３０５】
「クロストリジウム神経毒（又はクロストリジウム毒素）」という用語は、クロストリジウム毒素複合体及び高純度神経毒（すなわち、その他のクロストリジウムタンパク質を含まない神経毒調製物）を包含する。
【０３０６】
一実施形態において、上記クロストリジウム神経毒はボツリヌス神経毒である。
【０３０７】
別の実施形態において、上記ボツリヌス神経毒は、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ及びＧからなる群より選択される血清型である。
【０３０８】
「ボツリヌス毒素複合体」という用語は、少なくとも別の非毒性タンパク質と複合化したボツリヌス毒素を包含する。例えば、ここで使用されるボツリヌス毒素複合体という用語には、例えばＣ．ボツリヌスの培養物から得られる、４５０ｋＤａ及び９００ｋＤａボツリヌス毒素複合体が含まれる。そのような調製物のうち、Ａ型ボツリヌス毒素複合体をベースとしたものは、例えば、Ｉｐｓｅｎ  Ｌｔｄ．（Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標））又はＡｌｌｅｒｇａｎ  Ｉｎｃ．（Ｂｏｔｏｘ（登録商標））から市販されている。Ｂ型ボツリヌス複合体をベースとした別の調製物は、Ｓｏｌｓｔｉｃｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｙｏｂｌｏｃ（登録商標））から市販されている。その他のクロストリジウムタンパク質を含まないＡ型高純度神経毒は、Ｍｅｒｚ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標））から市販されている。それは、数種のタイプの限局性筋失調症を改善するための選択薬である。
【０３０９】
別の実施形態において、上記ボツリヌス神経毒は、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ及びＧからなる群より選択される血清型の、化学的又は遺伝子工学的に修飾された誘導体である。
【０３１０】
上記神経毒の化学的に修飾された誘導体は、例えば、ピルビン酸化（pyruvation）、リン酸化、硫酸化（sulfatation）、脂質化及び／又はグリコシル化によって修飾されたものである。
【０３１１】
上記神経毒の遺伝子工学的に修飾された誘導体は、上記血清型のタンパク質に含まれる１個又は２個以上のアミノ酸の欠失、付加又は置換によって修飾されたものである。
【０３１２】
そのような修飾された毒素は、好ましくは、生物学的に活性である。
【０３１３】
生物学的に活性な毒素は、細胞内に取り込まれ、１個又は２個以上のポリペプチド（例えば、ＳＮＡＲＥ複合体と関連するＳＮＡＰ２５）をタンパク分解的に切断することができる毒素である。タンパク分解的に切断されたポリペプチド（例えば、ＳＮＡＰ２５）の濃度が測定及び定量化されると、使用された毒素の濃度又は効能が計算され得る。
【０３１４】
本発明の３つの態様のいずれか１つに係る方法の一実施形態において、ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における上記測定の前に、上記細胞培養物を、５．０〜４５時間又は１５〜４０時間又は２５〜３５時間、上記クロストリジウム毒素に曝露（接触）させる。
【０３１５】
別の実施形態において、ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における上記測定の前であって、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における上記接触の後に、上記細胞培養物を、０．５〜１００時間、又は１〜９５時間、又は６〜９０時間、又は７〜８０時間、又は８〜７０時間、又は９〜６０時間、又は１０〜５０時間、又は１１〜５０時間、又は１２〜４０時間、又は１５〜４０時間、クロストリジウム毒素を含まない水性媒体と接触させる。
【０３１６】
「水性媒体」という用語は、水を含む液体又は流体を意味する。
【０３１７】
一実施形態において、上記水性媒体は緩衝液である。
【０３１８】
一実施形態において、上記緩衝液は、中性緩衝液である。「中性」という用語は、６〜８、又は６．５〜７．５、又は約７のｐＨ範囲を包含する。
【０３１９】
一実施形態において、上記緩衝液はリン酸緩衝液である。
【０３２０】
一実施形態において、上記水性媒体の温度は、２０〜４０℃、又は２５〜４０℃、又は３０〜４０℃である。一実施形態において、上記温度は約３７℃である。
【０３２１】
一実施形態において、ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における上記測定の前であって、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における上記接触の後に、上記細胞培養物を溶解させる。
【０３２２】
「溶解」という用語は、例えば細胞の完全性を破壊するウイルス、酵素又は浸透圧の作用による、細胞の破壊を意味する。溶解細胞の内容物を含む流体は、「溶解物」と呼ばれる。例えば、溶解は、特定のタンパク質、脂質及び核酸のそれぞれの組成又はそれらの複合体の組成を分析するために、ウエスタン及びサザンブロッティングにおいて使用することができる。溶解に関しては、一般的に知られている溶解バッファーを使用することができる。
【０３２３】
別の実施形態において、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における上記接触の前に、上記細胞培養物を溶解する。
【０３２４】
驚くべきことに、上記細胞培養物をクロストリジウムボツリヌス神経毒に曝露又は接触させた後、上記クロストリジウムボツリヌス神経毒を含まない水性媒体との接触に続いて上記サンプルの不存在下で上記効果を測定することにより、それぞれの用量反応曲線がシフトし、本発明の方法の感度が有意に増加することが見出された。感度は、マウスＬＤ50単位／ｍＬで表される、上記サンプル中の上記クロストリジウム神経毒の濃度が低濃度である場合に、特に増加する。
【０３２５】
例えば、効果（又は応答）として、ＳＮＡＲＥ複合体由来ＳＮＡＰ２５等のタンパク質の切断が測定される場合、上記方法は、上記方法の感度の有利な増加を生じ、これは、特に神経毒の濃度が低い場合に当てはまる。上記効能が低濃度で測定される場合、神経毒は、一般的に、最も大きな変化を示し得る。これに対して、比較的高い濃度の場合、効能は互いに近づく。
【０３２６】
この感度の増加によって、それぞれの用量反応曲線に関するより正確で、より信頼性のある解析が可能となる。そして、これにより、本発明の方法のいずれか１つを実施するために犠牲にしなければならなかったはずの実験動物（例えば、マウス）の数を大幅に減少させることが可能となる。したがって、本発明のこの実施形態によれば、技術的側面の向上だけでなく、倫理的側面の向上も図られる。
【０３２７】
ここで使用される「感度」という用語は、生理学で一般的に使用される意味、すなわち、外部刺激に応答する細胞培養物の能力を意味する。ここで、外部刺激は、細胞培養物をクロストリジウム神経毒と接触させることにより実施される。本発明の範囲内には、一定の濃度範囲を選択することが包含され、例えば、上記感度が増加する比較的低い濃度のクロストリジウム神経毒の濃度範囲を選択することができる、すなわち、別の方法では決定できない応答又は許容できない偏差でしか決定できない応答を決定することができる。
【０３２８】
別の実施形態において、本発明は、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定する方法であって、
（ａ）細胞培養物を上記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）上記神経毒によって上記細胞培養物に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された上記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）細胞培養物を上記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）上記細胞培養物に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｋ）上記第１及び上記第２の効果が同一である濃度を特定するステップ、
（ｌ）ステップ（ｋ）における濃度を上記未知濃度と見なすステップ
を含み、
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施する、上記方法に関する。
【０３２９】
したがって、一実施形態において、上記第２及び／又は上記第１の効果の決定は、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施される。これは、上記したように、ステップ（ａ）の後及び／又はステップ（ｆ）の後に、上記細胞培養物を、上記第２及び／又は上記第１のサンプルから取り出すか、あるいは、上記第２及び／又は上記第１のサンプルを上記細胞培養物から取り出すことを意味する。
【０３３０】
「上記第１及び上記第２の効果が同一である濃度を特定する」（ステップ（ｋ）及び（ｌ））という表現は、上記第１及び上記第２の効果が定性的及び定量的に同一であること、すなわち、誘導された効果（例えば、ＳＮＡＲＥ複合体由来ＳＮＡＰ２５等のタンパク質又はポリペプチドの切断）が、同一の測定値を有することを意味する。
【０３３１】
一実施形態において、信頼性のある比較が可能である結果を得るために、上記第２又は上記第１のサンプルに含まれる神経毒の細胞培養物に対する曝露時間は、同程度であるべきである。
【０３３２】
一実施形態において、上記曝露時間は同一である。
【０３３３】
一実施形態において、ステップ（ｅ）における上記測定された第２の効果の記録は、上記第２の効果を、上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて測定し、上記測定された第２の効果を濃度に対してプロットし、検量線を作成することにより実施される。
【０３３４】
上記第２のサンプルによって上記細胞培養物に誘導された効果が、マウスＬＤ50単位／ｍＬで表される様々な濃度に基づいて決定されると、上記のように、検量線を得ることができる。
【０３３５】
例えば、所定濃度範囲内にある１０種のＬＤ50単位／ｍＬ又は５種のＬＤ50単位／ｍＬにおいて誘導された上記効果を決定することができる。
【０３３６】
したがって、ステップ（ｅ）で記録された第２のデータセットを使用して、検量線がプロットされ、それにより、上記第１のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒の未知濃度がステップ（ｋ）及びそれに続くステップ（ｌ）に従って特定される。
【０３３７】
一実施形態において、作成された検量線はプロットされ、ステップ（ｋ）〜（ｌ）の特定するステップ及び見なすステップは、グラフ分析により実施される。
【０３３８】
上記第１のサンプルの未知濃度は、上記第１及び上記第２の効果が同一の値（例えば、産生されたＳＮＡＰ２５の同一濃度）を有する検量線から濃度を特定し、ステップ（ｌ）で上記濃度を上記未知濃度と見なすことにより決定することができる。
【０３３９】
上記決定の必要条件は、上記第１のサンプルに含まれる未知濃度のクロストリジウム毒素が細胞培養物に対して効果を発揮することであり、それは、上記検量線によって定量化することができる。当業者は、上記第２のサンプルとの比較が可能である濃度範囲を実現するために、すなわち、第１及び第２の効果が同一となるように、必要に応じて、未知濃度の第１のサンプルを１回又は数回希釈又は濃縮することが必要であり得ることを容易に理解するであろう。そして、希釈又は濃度因子に基づいて、未希釈又は未濃縮の第１のサンプルに最初に存在する神経毒の濃度を、計算により決定することができる。
【０３４０】
別の実施形態において、上記特定する及び見なすステップは、ステップ（ｈ）及びそれに続くステップ（ｋ）及び（ｌ）における１つの濃度のみでの一点測定によっては実施されず、多数の様々な濃度での測定により実施される。これは、規制上の要件の点から特に重要である。
【０３４１】
本発明の別の態様において、上記第２及び第１のサンプルの信頼性のある比較が可能である濃度範囲を最適化することが望ましい。これは、公知の市販クロストリジウム神経毒製剤の生物学的有効性に関する比較可能性だけでなく、将来開発され得る又は既に開発段階にある製剤に関しても適用される。
【０３４２】
一実施形態において、上記第２及び第１のサンプルの信頼性のある比較が可能である、マウスＬＤ50単位／ｍＬで表される濃度範囲を最適化するために、ステップ（ｅ）及び／又はステップ（ｈ）で作成された検量線の標準偏差を初めに決定することが望ましい。適当な段階的重回帰分析を使用することにより、用量反応曲線に基づいて未知毒素サンプルの効能を予測するための回帰モデルを作製することができる。
【０３４３】
このような方法を使用することにより、２つの異なるデータ群を表す第１及び第２のサンプルに関して、用量反応曲線間の相関が最大に達する（すなわち、最良適合が決定される）濃度範囲を特定することができる。
【０３４４】
一実施形態において、上記検定は、所定の回帰モデルに従って、上記第１及び上記第２のサンプルの対応するデータセットの値域を、適合曲線で表すことにより、又は線形化及び並列化した所定の信頼区間内の上記適合曲線で表すことにより、さらに精度を向上させることができる。
【０３４５】
したがって、第３の態様において、本発明は、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定する方法であって、
（ａ）細胞培養物を上記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）上記神経毒によって上記細胞培養物に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された上記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）細胞培養物を上記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）ステップ（ｇ）で得られた上記細胞培養物に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｉ）ステップ（ｆ）〜（ｈ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｊ）ステップ（ｉ）で測定された上記第１の効果を濃度に対して記録し、第１のデータセットを作成するステップ、
を含み、
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施する、上記方法に関する。
【０３４６】
一実施形態において、上記方法は、ステップ（ｍ）及び（ｎ）：
（ｍ）上記第１及び上記第２のデータセットに最良適合する濃度範囲から、上記様々な濃度を選択するステップ、
（ｎ）下記サブステップ（α）〜（δ）:
（α）ステップ（ｅ）で得られた上記第２のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（β）ステップ（ｊ）で得られた上記第１のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（γ）上記適合曲線をそれぞれ線形化するサブステップ、
（δ）上記線形化した適合曲線を並列化するサブステップ
を含む統計的検定によって、上記最良適合を決定するステップ
をさらに含む。
【０３４７】
一実施形態において、上記第２及び／又は上記第１の効果の測定は、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施される。
【０３４８】
別の実施形態において、上記効果の測定は、上記第２及び／又は上記第１のサンプルの不存在下で実施される。これは、ステップ（ａ）の後及び／又はステップ（ｆ）の後に、上記のように、上記培養物が上記第２及び／又は上記第１のサンプルから取り出されるか、あるいは、上記第２及び／又は上記第１のサンプルが細胞培養物から取り出されることを意味する。
【０３４９】
上記手順（sequence）を実施するのに適した統計的検定は周知である（例えば、蓋然性指数検定（likelihood-quotient-tests））。そのような蓋然性指数検定の具体例は、公知のＦ検定である。χ2検定（カイ二乗検定又はχ2分布検定）又はｔ検定等の検定も使用することができる。上記検定も当業者に公知である。
【０３５０】
一実施形態において、上記統計的検定は、Ｆ検定である。
【０３５１】
上記検定により、所定の信頼区間において、異なる２つの群から採取した２つの無作為サンプルが分散の点で本質的に異なるか否かを決定することができる。したがって、このような検定は、２つの統計的サンプル（ここでは、第２及び第１のサンプル）の差の検定に役立つ。
【０３５２】
一実施形態において、信頼性のある結果を得るために、信頼区間は広くすべきである、すなわち、誤拒否確率は比較的低くすべきである。
【０３５３】
一実施形態において、誤拒否確率は≦５（％表示；（又は０．０５））、すなわち信頼区間は≧９５（％表示；（又は０．９５））である。
【０３５４】
一実施形態において、各サブステップ（α）〜（δ）に関する誤拒否確率は≦５（％表示）である。
【０３５５】
一実施形態において、ステップ（γ）における線形化は、対応するデータセットを最良適合直線で表すことにより実施される。
【０３５６】
一実施形態において、ステップ（δ）における並列化は、最良適合直線の共通の傾きを決定することにより実施される。
【０３５７】
ステップ（δ）の後に、線形化及び並列化した適合曲線の互いに対するシフトから、第２のサンプルに対する第１のサンプルの相対的効能が決定される。
【０３５８】
したがって、一実施形態において、上記方法は、ステップ（δ）の後に、ステップ（ε）：
（ε）線形化及び並列化した適合曲線の互いに対するシフトから、第２のサンプルに対する第１のサンプルの相対的効能を計算するステップ
をさらに含む。
【０３５９】
一実施形態において、「相対的効能」という用語は、第２のサンプルに対する第１のサンプルの効能が、線形化及び並列化したそれぞれの適合曲線に基づいて、同一濃度（１又は複数）において決定されることを意味する。
【０３６０】
一実施形態において、第２のサンプルの効能は１００％と見なされ、第１のサンプルの相対的効能は％で表される。例えば、第１のサンプルに関して、第２のサンプルに対する１１０％、９０％等の効能が得られる。１１０％〜１００％の効能を有する第１のサンプルをそれぞれ希釈することにより、三の法則（the rule of three）が適用され、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒が、従来知られていなかった効果的濃度となる。そこでの測定単位は相対的効能であり、その値は参照標準（第２のサンプル）の活性（効能）に基づいて定義された活性（効能）単位として表される。
【０３６１】
別の実施形態において、上記相対的効能は、上記第１及び上記第２のサンプルの効能の比として表される。
【０３６２】
一実施形態において、上記モデルは、適用された神経毒量の対数値を予測するために使用される。
【０３６３】
別の実施形態において、誘導された効果量及びサンプル中の神経毒量の両方が、対数尺度で記録される。
【０３６４】
一実施形態において、第２の効果及び第１の効果は、それぞれ、第２のサンプル及び第１のサンプルに含まれる少なくとも３つの異なる濃度のクロストリジウム神経毒で測定される。
【０３６５】
一実施形態において、上記データセットの作成又は上記検量線（１又は複数の検量線）の作成は、片対数プロットの様式で実施される。
【０３６６】
別の実施形態において、両対数プロットが実施される。
【０３６７】
相対的効能を決定する方法は、ヨーロッパ薬局方に記載されている。
【０３６８】
一実施形態において、例えば１０マウスＬＤ50単位／ｍＬという濃度で開始する場合、上記相対的効能を決定する方法は、データセットの全範囲に適用される。次いで、１０マウスＬＤ50単位／ｍＬよりも大きい値（例えば、１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７マウスＬＤ50単位／ｍＬ）が、開始ポイントとして使用される。上記繰り返しは、適用されたモデルによって目的とする必要な精度が実現されるまで実施される。
【０３６９】
一実施形態において、最良適合及び濃度範囲が統計的検定によって特定されると、未知濃度（未知効果的濃度）のクロストリジウム神経毒を含む第１のサンプルが、本発明の方法によって特定された上記濃度範囲内において、第２のサンプルに含まれる既知濃度の上記クロストリジウム神経毒と比較され得る。
【０３７０】
一実施形態において、上記測定された第２の効果の記録は、上記第２の効果を濃度に対してプロットすることにより実施され、上記第２のデータセットの作成は、検量線を作成することにより実施される。
【０３７１】
アッセイにおいて、相対的効能の推量を使用すること、及び参照標準（第２のサンプル）を包含させることにより、より正確で、より再現性のある推定が可能となり、これにより、動物の使用低減の実現が可能となる。
【０３７２】
統計的検定は、通常、適当なコンピュータプログラム及び適当なコンピュータを使用して実施される。
【０３７３】
一実施形態において、上記統計的検定は、上記統計的検定を実行する適当なソフトウェア手段を含む適当なコンピュータプログラムを使用して実施される。
【０３７４】
したがって、一実施形態において、本発明は、本発明の方法を実行するソフトウェア手段を含むコンピュータプログラムを含むコンピュータプログラム製品に関する。
【０３７５】
一実施形態において、上記第２のサンプルは、許認可された市販のボツリヌス毒素調製物から選択される。これらの製品は、医薬品又は薬剤として許認可されており、明確に規定された量又は濃度のボツリヌス毒素を含む。
【０３７６】
別の実施形態において、標準的条件下で製造された、いかなるボツリヌス毒素調製物を使用してもよい。
【０３７７】
一実施形態において、上記した市販の調製物を、第２のサンプルとして使用することができる。したがって、第２のサンプルは、例えば、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）、Ｂｏｔｏｘ（登録商標）、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）、Ｍｙｏｂｌｏｃ（登録商標）又はＰｕｒＴｏｘ（登録商標）である。これらの調製物は、使用されるボツリヌス毒素の種類又は生物学的有効性／活性すなわち効能、例えば、含有されるボツリヌス神経毒の濃度又はボツリヌスの種類の点で、異なる。
【０３７８】
マウスＬＤ50で表されるマウス単位は、サンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の濃度を規定するために一般的に採用される単位である。ＬＤ50値は、マウス集団に適用された場合に該マウス集団の５０％が死亡する致死量を規定する。その値を決定するための方法は、当業者に公知である。そのような方法は、ヨーロッパ薬局方に記載されている。
【０３７９】
公知のように、ボツリヌス神経毒の製品のラベリングにおけるＬＤ50単位は、製品特異的又は製造者特異的である場合もあるし、標準がないために互換性がない場合もある。
【０３８０】
一実施形態において、ここで使用されるＬＤ50単位は、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）の特性及びラベリングで決定された単位であり、例えば、第２のサンプルはＸｅｏｍｉｎ（登録商標）である。したがって、ある効能に関する単位は、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）単位である。したがって、本発明のアッセイ系は、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）に基づいて、クロストリジウム神経毒を含むサンプルの効能を比較評価するために使用することができる。上記方法により、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）単位に基づいて、クロストリジウム神経毒（未知濃度）を含む第１のサンプルを直接比較することが可能となる。
【０３８１】
Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）及びＢｏｔｏｘ（登録商標）は、ほぼ同程度の有効性又は効能を示す。Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）及びＢｏｔｏｘ（登録商標）と同じ有効性又は効能を得るためには、約２．５倍量のＤｙｓｐｏｒｔ（登録商標）又は約１０倍量のＭｙｏｂｌｏｃ（登録商標）が適用される必要がある。
【０３８２】
一実施形態において、これらの市販の調製物を、それに含まれるボツリヌス神経毒が所定濃度となるように希釈又は濃縮し、上記第２の効果を、上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて測定する。上記測定された効果を、ボツリヌス毒素の濃度に対してプロットし、それにより、検量線を作成する。上記第２のデータセット又は上記検量線により、第１のサンプルに含まれるボツリヌス神経毒の未知濃度を決定することができる。
【０３８３】
サンプル（例えば、第１又は第２のサンプル）に含まれるクロストリジウム神経毒の濃度が、１０以上のマウスＬＤ50単位／ｍＬで表される場合、本発明の方法を有利に適用できることが見出された。但し、本発明における濃度は全てマウスＬＤ50単位／ｍＬである。
【０３８４】
一実施形態において、上記サンプルは、上記神経毒に加えて水を含む。一実施形態において、上記サンプルは上記神経毒の水溶液又は懸濁水を含む。
【０３８５】
一実施形態において、上記サンプルに含まれる上記神経毒の濃度は少なくとも１５である。
【０３８６】
別の実施形態において、上記濃度は少なくとも２０である。
【０３８７】
別の実施形態において、上記濃度は１０〜１０００である。
【０３８８】
一実施形態において、上記濃度は１０〜７０である。
【０３８９】
別の実施形態において、上記濃度は１５〜６０である。
【０３９０】
さらに別の実施形態において、上記濃度は２０〜４５である。
【０３９１】
一実施形態において、上記第２のサンプルはＸｅｏｍｉｎ（登録商標）である。
【０３９２】
一実施形態において、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）が第２のサンプルとして使用される場合、第２の効果が１０〜７０の少なくとも１つの濃度で決定されると、特に信頼性のある結果が得られることが見出された。別の実施形態において、上記濃度は１５〜６０である。さらに別の実施形態において、上記濃度は２５〜４５である。
【０３９３】
一実施形態において、Ｂｏｔｏｘ（登録商標）が第２のサンプルとして使用される場合、第２の効果が１０〜７０の少なくとも１つの濃度で決定されると、信頼性のある結果が得られることが見出された。別の実施形態において、上記濃度は１５〜６０である。さらに別の実施形態において、上記濃度は２５〜４５である。
【０３９４】
第２のサンプルが、ステップ（ｅ）に従って検量線を決定するために使用される場合、ボツリヌス神経毒の濃度が高い、すなわち、ＬＤ50単位／ｍＬの値が大きいＸｅｏｍｉｎ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）よりも濃度が低い又は有効性若しくは効能が低いボツリヌス神経毒を含む第２のサンプルが、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）によって誘導される効果と比較可能な第２の効果の強度を実現するために、必要となる。
【０３９５】
第２のサンプルが、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）よりも濃度又は効能が低いボツリヌス神経毒を含む一実施形態において、第２の効果は、２０〜４００又は１００〜８００の範囲の少なくとも１つの濃度で決定される。
【０３９６】
第２のサンプルがＤｙｓｐｏｒｔ（登録商標）である一実施形態において、第２の効果は、２０〜４００、又は２５〜３００、又は３０〜２５０のうち、少なくとも１つの濃度で決定される。
【０３９７】
第２のサンプルがＭｙｏｂｌｏｃ（登録商標）である別の実施形態において、第２の効果は、１００〜８００、又は１５０〜７００、又は２００〜６００のうち、少なくとも１つの濃度において決定される。
【０３９８】
別の実施形態において、上記濃度は、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）又はＢｏｔｏｘ（登録商標）と比較される上記第２のサンプルに含まれる上記神経毒の有効性又は効能の濃度に基づいて、３０〜６００、又は３０〜４００、又は３０〜２００、又は３０〜１００、又は３０〜８０、又は４０〜５００、又は４０〜４００、又は４０〜３００、又は４０〜２００、又は４０〜１００、又は４０〜９０、又は５０〜３００、又は５０〜２００、又は５０〜１００、又は６０〜１００の範囲をとることができる。
【０３９９】
一実施形態において、ＬＤ50単位は、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）単位である。
【０４００】
一実施形態において、上記細胞培養物アッセイの信頼性により、規制当局の許認可条件を満たすことができるとともに、ボツリヌス毒素（例えば、血清型Ａ又は血清型Ｃ又は血清型Ｅ）の安全で効果的な投与の必要性を満たすことができる。
【０４０１】
さらに別の実施形態において、上記第１のサンプルに含まれる上記クロストリジウム毒素及び上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム毒素は、同じクロストリジウム毒素である。
【０４０２】
さらに別の実施形態において、上記第１のサンプルに含まれる上記クロストリジウム毒素又は神経毒及び上記第２のサンプルに含まれる上記クロストリジウム毒素又は神経毒は、互いに異なる。
【０４０３】
上記方法の実験的実現のために、典型的には、ボツリヌス毒素への曝露に応答する細胞培養物、すなわち、ボツリヌス毒素が効果（例えば、ＳＮＡＲＥ複合体中のタンパク質又はポリペプチドの切断）を発揮する細胞培養物が使用される。
【０４０４】
「細胞培養物」という用語は、制御された生体外の条件下で成長する細胞を包含する。
【０４０５】
一実施形態において、「細胞培養物」という用語は、多細胞真核生物（特に動物細胞）由来の細胞の培養物を意味する。しかしながら、この用語はまた、植物、菌類、及び微生物の細胞培養物、例えば、ウイルス、細菌及び原生生物の細胞培養物も包含する。
【０４０６】
細胞培養方法は、当業者に周知である。一実施形態において、細胞は、生体外（ex vivo）培養のために、組織から単離されてもよい。一実施形態において、組織片が培養培地に入れられ、成長する細胞が培養に利用され得る。別の実施形態において、細胞外マトリックスを破壊する酵素（例えば、コラゲナーゼ、トリプシン又はプロナーゼ等）を使用した酵素消化により、細胞が軟部組織から精製される。不死化細胞株が使用される場合、そのような細胞株は、通常、ランダム突然変異又は意図的な修飾を通じて無限に増殖する能力を有する。細胞は、懸濁液又は接着性培養プレート中で成長することができる。細胞の種類に応じて、細胞は、表面に付着することなく、懸濁液中で生存する場合がある。接着性細胞は、表面（例えば、組織培養プレート又はマイクロキャリア）を必要とし、表面は、接着性を増加させるために、並びに成長及び分化に必要なその他のシグナルを供給するために、細胞外マトリックス成分でコーティングされていてもよい。
【０４０７】
一実施形態において、本発明の方法の実験的実現のために、細胞を、細胞インキュベーターにおいて、適当な温度及び気体混合物（例えば、３７℃及び５％ＣＯ2）下に維持して成長させることができる。培養条件は、細胞の種類に応じて大きく変化する場合があり、特定の種類の細胞に関して、条件の変化が異なる表現型の発現を生じる場合がある。温度及び気体混合物以外に、培養系における最も一般的な変動因子は、成長培地である。成長培地の処方構成は、ｐＨ、グルコース濃度、成長因子及びその他の栄養素の存在等の点で変化し得る。当業者は、上記様々な種類の細胞培養に精通している。
【０４０８】
培養した細胞を、回収後、本発明の方法のいずれか１つにおいて使用することができる。
【０４０９】
一実施形態において、上記細胞は、神経細胞株又は初代神経細胞の細胞培養物から選択される。
【０４１０】
「細胞株」という用語は、無限に増殖する、ある種の細胞を包含する。
【０４１１】
「初代細胞」という用語は、組織から直接得られた非不死化細胞系を包含する。
【０４１２】
一実施形態において、上記細胞培養物の細胞は脊髄細胞を含む。
【０４１３】
一実施形態において、上記細胞培養物の細胞（例えば、脊髄細胞）は、齧歯動物から得られる。一実施形態において、上記細胞培養物の細胞は、マウス脊髄細胞又はラット脊髄細胞である。
【０４１４】
一実施形態において、従来技術で使用された細胞培養物（Pellet, S.等；Keller, J.E.等参照）を、本発明の目的に使用することができる。
【０４１５】
一態様において、本発明はまた、クロストリジウム神経毒を含む第２のサンプルに基づいて、クロストリジウム神経毒を含む第１のサンプルの効能を、所定の信頼区間又は誤拒否確率の範囲内で決定することができる濃度範囲を特定する、改良された方法を提供する。
【０４１６】
一実施形態において、クロストリジウム神経毒を含む第２のサンプルに基づいて、クロストリジウム神経毒を含む第１のサンプルの効能を決定することができる濃度範囲を特定する上記方法は、下記ステップ：
（ａ）細胞培養物を上記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）上記神経毒によって上記細胞培養物に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返す、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された上記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）細胞培養物を上記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）上記神経毒によって上記細胞培養物に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｉ）ステップ（ｆ）〜（ｈ）を、上記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｊ）ステップ（ｉ）で測定された上記第１の効果を濃度に対して記録し、第１のデータセットを作成するステップ
を含み、
上記濃度は、上記第１及び上記第２のデータセットに最良適合する濃度範囲から選択され、上記最良適合は、下記サブステップ（α）〜（δ）：
（α）ステップ（ｅ）で得られた上記第２のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（β）ステップ（ｊ）で得られた上記第１のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（γ）上記適合曲線をそれぞれ線形化するサブステップ、
（δ）上記線形化した適合曲線を並列化するサブステップ
を含む統計的検定によって決定される。
【０４１７】
上記実施形態において、上記第２及び上記第１の効果は、定性的に同一である。上記方法を改良するために、上記方法を、本発明の第３の態様に係る方法と組み合わせて使用することができる。
【０４１８】
本発明の別の態様において、製造プロセスで要求されるような参照標準に基づいて、クロストリジウム神経毒を含むサンプルの品質（すなわち効能）をコントロールするために、本発明の方法を有利に使用することができる。
【０４１９】
したがって、上記態様において、本発明は、クロストリジウム神経毒を含むサンプルの品質（すなわち効能）をコントロールするための、本発明の方法の使用に関する。
【０４２０】
一実施形態において、保管されていたサンプルの効能が決定される。一実施形態において、サンプルは、少なくとも１時間、又は少なくとも１日間、保管されていたものである。
【０４２１】
一実施形態において、サンプルは、凍結乾燥サンプルであるか、又は再構成サンプルである。
【０４２２】
別の態様において、本発明は、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定するための、あるいは、第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定するための、本発明の第１の態様に係る方法の使用に関する。
【０４２３】
別の態様において、本発明は、本発明の方法のいずれかに１つにおいてクロストリジウム活性を決定するための、細胞培養物、特に脊髄細胞（例えば、ラット又はマウス由来の細胞）を含む細胞培養物の使用に関する。
【実施例】
【０４２４】
下記実施形態も本発明に属し、上記実施形態は逆に下記方法に適用されると理解されるべきである。
実施例１
標準的な測定のために、マウスの片側横隔膜を調製し、アール緩衝塩類溶液（Earle's Balanced Salt Solution）を満たした器官槽（organ bath）に入れた。片側横隔膜の横隔神経を白金電極に取り付け、それにより神経を電気的に刺激し、片側横隔膜の収縮を生じさせた。片側横隔膜を器官槽に固定（clamp）した。固定の間、刺激のスイッチを切ったが、固定後直ちにスイッチを入れた。刺激のための電流強度は、片側横隔膜の収縮力が測定可能となるように選択した。一定の収縮力が測定可能となった後、媒体を、ボツリヌス神経毒を含有する媒体と交換した。収縮力が中間点に達するのに必要な時間（麻痺時間）を、各濃度（少なくとも濃度ごとの時間）について測定し、器官槽に適用したボツリヌス神経毒の濃度に対してプロットした。
【図１】
2013511264.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成24年7月18日(2012.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム神経毒によって細胞培養物に誘導された効果を測定する方法であって、
（ａ）細胞培養物を、前記クロストリジウム神経毒を含むサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）前記クロストリジウム神経毒によって前記細胞培養物に誘導された効果を測定するステップ
を含み、
ステップ（ｃ）を、前記サンプルの不存在下で実施し、
ステップ（ｃ）における前記測定の前であって、ステップ（ａ）における前記接触の後に、前記細胞培養物を、０．５〜１００時間、クロストリジウム毒素を含まない水性媒体と接触させる、前記方法。
【請求項２】
第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定する、請求項１に記載の方法であって、
（ａ）細胞培養物を前記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）前記神経毒によって前記細胞培養物に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、前記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された前記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）細胞培養物を前記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）前記細胞培養物に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｋ）前記第１及び前記第２の効果が同一である濃度を特定するステップ、
（ｌ）ステップ（ｋ）における前記濃度を前記未知濃度と見なすステップ
を含み、
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、前記第２及び／又は前記第１のサンプルの不存在下で実施し、
ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における前記測定の前であって、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における前記接触の後に、前記細胞培養物を、０．５〜１００時間、クロストリジウム毒素を含まない水性媒体と接触させる、前記方法。
【請求項３】
第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定する、請求項１に記載の方法であって、
（ａ）細胞培養物を前記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）前記神経毒によって前記細胞培養物に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、前記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された前記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）細胞培養物を前記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）前記細胞培養物に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｉ）ステップ（ｆ）〜（ｈ）を、前記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｊ）ステップ（ｉ）で測定された前記第１の効果を濃度に対して記録し、第１のデータセットを作成するステップ
を含み、
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、前記第２及び／又は前記第１のサンプルの不存在下で実施し、
ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における前記測定の前であって、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における前記接触の後に、前記細胞培養物を、０．５〜１００時間、クロストリジウム毒素を含まない水性媒体と接触させる、前記方法。
【請求項４】
クロストリジウム神経毒によって筋肉組織に誘導された効果を測定する方法であって、
（ａ）筋肉組織を、前記クロストリジウム神経毒を含むサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）前記クロストリジウム神経毒によって前記筋肉組織に誘導された前記効果を測定するステップ、
を含み、
ステップ（ｃ）を、前記サンプルの不存在下で実施する、前記方法。
【請求項５】
第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定する、請求項４に記載の方法であって、
（ａ）筋肉組織を前記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）前記神経毒によって前記筋肉組織に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、前記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された前記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）筋肉組織を前記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）前記筋肉組織に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｋ）前記第１及び前記第２の効果が同一である濃度を特定するステップ、
（ｌ）ステップ（ｋ）における前記濃度を前記未知濃度と見なすステップ
を含み、
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、前記第２及び／又は前記第１のサンプルの不存在下で実施する、前記方法。
【請求項６】
第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定する、請求項４に記載の方法であって、
（ａ）筋肉組織を前記第２のサンプルと接触させるステップ、
（ｃ）前記神経毒によって前記筋肉組織に誘導された第２の効果を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を、前記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定された前記第２の効果を濃度に対して記録し、第２のデータセットを作成するステップ、
（ｆ）筋肉組織を前記第１のサンプルと接触させるステップ、
（ｈ）前記筋肉組織に誘導された第１の効果を測定するステップ、
（ｉ）ステップ（ｆ）〜（ｈ）を、前記クロストリジウム神経毒を様々な濃度に変化させて繰り返すステップ、
（ｊ）ステップ（ｉ）で測定された前記第１の効果を濃度に対して記録し、第１のデータセットを作成するステップ
を含み、
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｈ）を、前記第２及び／又は前記第１のサンプルの不存在下で実施する、前記方法。
【請求項７】
ステップ（ｍ）及び（ｎ）：
（ｍ）前記様々な濃度を、前記第１及び前記第２のデータセットに最良適合する濃度範囲から選択するステップ、
（ｎ）下記サブステップ（α）〜（δ）:
（α）ステップ（ｅ）で得られた前記第２のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（β）ステップ（ｊ）で得られた前記第１のデータセットの値域を適合曲線で表すサブステップ、
（γ）前記適合曲線をそれぞれ線形化するサブステップ、
（δ）前記線形化した適合曲線を並列化するサブステップ
を含む統計的検定によって、前記最良適合を決定するステップ
をさらに含む、請求項３又は６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ε）：
（ε）線形化及び並列化した適合曲線の互いに対するシフトから、前記第２のサンプルに対する前記第１のサンプルの相対的効能を計算するステップ
をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記効果が、ＳＮＡＲＥ複合体由来タンパク質の切断である、請求項１〜３のいずれか１項、あるいは請求項１〜３のいずれか１項及び請求項７又は８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における前記測定の前に、前記細胞培養物を、５〜４５時間、又は１５〜４０時間、又は２５〜３５時間、前記クロストリジウム毒素と接触させるか、あるいは、
ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における前記測定の前に、前記細胞培養物を、５〜４５時間、又は１５〜４０時間、又は２５〜３５時間、前記クロストリジウム毒素と接触させ、ステップ（ｃ）若しくはステップ（ｈ）又はステップ（ｃ）及びステップ（ｈ）における前記測定の前であって、ステップ（ａ）若しくはステップ（ｆ）又はステップ（ａ）及びステップ（ｆ）における前記接触の後に、前記細胞培養物を、０．５〜１００時間、又は１〜９５時間、又は６〜９０時間、又は７〜８０時間、又は８〜７０時間、又は９〜６０時間、又は１０〜５０時間、又は１１〜５０時間、又は１２〜４０時間、又は１５〜４０時間、クロストリジウム毒素を含まない水性媒体と接触させる、請求項１〜３のいずれか１項、あるいは請求項１〜３のいずれか１項及び請求項７〜９のいずれ１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記筋肉組織を電気的に刺激するか、あるいは、
前記筋肉組織を電気的に刺激し、ステップ（ａ）の後に下記ステップ（ｂ）を含むか、又はステップ（ａ）の後に下記ステップ（ｂ）を含み、ステップ（ｆ）の後に下記ステップ（ｇ）を含む：
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記筋肉組織を電気的に刺激するステップ
（ｇ）ステップ（ｆ）で得られた前記筋肉組織を電気的に刺激するステップ
請求項４〜６のいずれか１項、あるいは請求項４〜６のいずれか１項及び請求項７又は８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）及び（ｇ）を前記第２又は前記第１のサンプルの不存在下で実施するか、あるいは、ステップ（ｂ）及び（ｇ）を前記第２及び前記第１のサンプルの不存在下で実施する、請求項４〜６のいずれか１項、あるいは請求項４〜６のいずれか１項及び請求項７又は８又は１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定された第２の効果の記録を、前記第２の効果を濃度に対してプロットすることにより実施し、前記第２のデータセットの作成を、検量線を作成することにより実施する、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１及び第２の効果が、前記筋肉組織の麻痺までの時間、前記筋肉組織の収縮速度の変化、前記筋肉組織の収縮距離の変化、前記筋肉組織の収縮力の変化、前記筋肉組織の終板電位又は微小終板電位の変化からなる群より選択される、請求項４〜６のいずれか１項、あるいは請求項４〜６のいずれか１項及び請求項７又は８又は１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記筋肉組織が、肋間筋、後肢筋、後肢長趾伸筋、後足の足底筋、横隔膜神経−片側横隔膜、長耳挙筋（levator auris longus muscle）、カエルの神経筋接合部、ニワトリの頸二腹筋、肋骨筋、脳組織又はエイの発電器官から選択される、請求項４〜６のいずれか１項、あるいは請求項４〜６のいずれか１項及び請求項７又は８又は１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項３又は請求項６〜１５のいずれか１項に記載の方法を実行するソフトウェア手段を含むコンピュータプログラムを含むコンピュータプログラム製品。
【請求項１７】
第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の既知濃度に基づいて、第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の未知濃度を決定するための、又は第２のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の効能に基づいて第１のサンプルに含まれるクロストリジウム神経毒の相対的効能を決定するための、請求項１又は４に記載の方法の使用。
【国際調査報告】
2013511264.tif 000004
2013511264.tif 000005
2013511264.tif 000006