(57)【要約】本発明は、単量体に結合特異性のある結合体が反復して連結している反復鎖を作製し、それを用いて反復鎖と多くの単量体からなる反復鎖−複数の単量体複合体を作り、複合体内で単量体間の架橋結合の形成を容易にすることで、多数の単量体が架橋結合で連結された多量体の生産方法に関するものである。より詳細には、本発明はタンパク質単量体に結合特異性を有する結合タンパク質が反復して連結している反復鎖組換えタンパク質を作製してそれを用いて反復鎖と多くの単量体による反復鎖−複数の単量体複合体を作り、複合体内で単量体間の架橋結合の形成を容易にすることで、多数の単量体が架橋結合で連結された多量体の生産方法に関するものである。より詳細には、本発明はタンパク質単量体に結合特異性を有する結合タンパク質が反復して連結している反復鎖組換えタンパク質を作製してそれを用いて反復鎖と多くの単量体による反復鎖−複数の単量体複合体を作って、複合体内で単量体間のジスルフィド結合架橋の形成を容易にすることで、多数の単量体がジスルフィド結合架橋で連結された多量体の生産方法に関するものである。より詳細には、連鎖球菌タンパク質ＧのドメインＩＩＩ（Ｆａｂ結合ドメイン）が反復して連結する組換え反復鎖タンパク質を骨格に用いて抗体タンパク質の単量体から反復鎖とその複数の単量体複合体を作り、複合体内で単量体間のジスルフィド結合架橋の形成を容易にすることで、多数の単量体がジスルフィド結合架橋で連結された二量体及び多量体を生産する方法に関するものである。本発明の方法は、既知のリフォールディング（refolding）方法に比べてジスルフィド結合架橋二量体の収率を最大２００倍向上させることから、ジスルフィド結合架橋二量体を大量生産するのに有用に使用することができる。
2013513656.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）単量体に特異的に結合する結合体の反復鎖を製造する工程、
２）前記工程１）の反復鎖及び単量体を混合して、前記反復鎖と単量体の反復鎖−複数の単量体複合体を製造する工程、及び
３）前記工程２）の反復鎖−複数の単量体複合体内の単量体間の架橋結合を形成した多量体を分離する工程を含む、架橋結合を用いた多量体の生産方法。
【請求項２】
単量体に結合特異性のある結合体が反復して連結されている反復鎖と、複数の単量体が結合して形成された単量体間に架橋結合が形成されてなる多量体を分離する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単量体がタンパク質の場合、該単量体に結合特異性のある結合タンパク質が反復して連結されている反復鎖組換えタンパク質と単量体とを混合して、前記反復鎖と複数の単量体が結合して形成された反復鎖−複数の単量体複合体内の単量体間に架橋結合が形成されてなる多量体を分離する工程を含むことを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
反復鎖が、タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインであるドメインＩＩＩが反復して連結されているドメインＩＩＩの反復鎖組換えタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
単量体が、抗体、リガンド、受容体もしくはそれらの切片、またはそれらの組換え体、またはそれらの誘導体、またはそれらと生化学官能基の融合体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
単量体が、Ｆａｂ断片であること、またはＦａｂ断片を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
生化学官能基が、酵素、毒素官能基タンパク質、ウイルスなどの生体、化合物、薬物活性のための薬物化合物、リポソーム、バイオセンサー、プロドラッグのような官能基であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
多量体が、二量体以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単量体から二量体及び多量体を高い収率で生産する方法に関するものである。そのために、結合特異性がある結合体の反復鎖を用いて反復鎖−複数の単量体複合体を生産して、複合体内の単量体間の架橋結合形成が容易であることを利用して多量体を生産するものである。これは結合体の反復鎖を骨格に用いて反復鎖−複数の単量体複合体の形成を最大化して形成された反復鎖−複数の単量体複合体からジスルフィド結合架橋の生成を高めて、二量体及び多量体を大量生産する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗体−毒素（Antibody-toxin）は、癌細胞に特異的に結合する抗体に毒素を結合させることで合成される（非特許文献１）。
【０００３】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｂ３は、大腸癌、胃癌、卵巣癌、乳癌及び肺癌などの表面で過発現される炭水化物抗原（ＬｅＹ）に結合する（非特許文献２、３）。ＰＥ３８は、シュードモナス外毒素（ＰＥ）の誘導体の一つである（非特許文献４、５）。
【０００４】
抗体の抗原結合部位を含む断片としてＦａｂは、Ｆｄ鎖（ＶＨ及びＣＨ１）ならびに軽鎖（ＶＬ及びＣＬ）を含む。Ｆａｂ抗体−毒素は、Ｆｄ鎖（ＶＨ及びＣＨ１）ならびに軽鎖（ＶＬ及びＣＬ）を含む。Ｆａｂ−毒素は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）−毒素に比べて二つの利点を有する。第一に、Ｆａｂ−毒素の収率がｓｃＦｖ−毒素に比べて１０倍高い（非特許文献６、７）。第二に、マウス血漿でＦａｂ−毒素の安定性が改善する（非特許文献８）。
【０００５】
ジスルフィド結合された二価のＦａｂ−毒素二量体は、一価のｓｃＦｖ−毒素に比べて高い細胞毒性を有することが報告されている（非特許文献９、１０、１１）。ジスルフィド結合された二量体は、単量体であるＦａｂ−毒素のＦａｂドメインとＰＥ３８との間に位置するシステイン（Ｃｙｓ）残基のジスルフィド結合を通じて製造される。
【０００６】
二量体の抗体−毒素は、単量体の抗体−毒素に比べて様々な利点を有することが期待される。例えば、二量体の二つの抗原結合ドメインは、結合を増加させて高い複合度（avidity）を有するようにする。また、二価の二量体抗体−毒素は、標的細胞に同時に二つの毒素ドメインを運搬して、一価の単量体抗体−毒素に比べて高い細胞毒性によって標的細胞を死滅させることが可能である。同時に、Ｆａｂ−毒素は、組換え抗体−毒素の生産のために度々利用されるｓｃＦｖ−毒素に比べて高い安定性を有する（非特許文献１２）。
【０００７】
Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８がジスルフィド結合した二量体の［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２は、モノクローナル抗体Ｂ３のＦａｂドメインをシュードモナス外毒素Ａ（Pseudomonas Aexotoxin A）誘導体であるＰＥ３８を結合させて製造することができ（特許文献１）、［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２は、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８に比べて胃癌細胞株であるＣＲＬ−１７３９細胞株に対して約１１倍高い細胞毒性を有することが報告されている（非特許文献１０）。
【０００８】
従来は、ジスルフィド結合された二量体をリフォールディング後に精製した（非特許文献９、１０、１１）。従来報告された、ジスルフィド結合された二量体のリフォールディング工程（refolding process）は、０．０１４％〜０．２５％収率を増加させた。前記リフォールディング工程の間、ジスルフィド結合された二量体は２個の単量体の抗体−毒素のＦａｂドメインとＰＥ３８との間の部位に位置するシステイン残基の無作為的接近によって形成された。前記リフォールディング工程がジスルフィド結合された二量体の収率を増加させるにもかかわらず、リフォールディング反応の主要産物である単量体のＦａｂ−毒素の収率が約１０％に達する点に鑑みると、二量体の収率は非常に低かった。単量体である抗体−毒素が自らの間で自己結合親和性（self-binding-affinity）がないことから、架橋結合二量体はリフォールディング反応で単量体抗体−毒素のシステイン残基相互間の無作為的な衝突によって生成されるものである。ゆえに、リフォールディング過程中に生成される二量体の非常に低い収率は、システイン残基相互間の衝突頻度（collision frequency）が非常に低く、前記リフォールディング工程で単量体内のシステイン間の接近によるジスルフィド結合架橋の形成が容易でないことに起因する。
【０００９】
したがって、今まで本発明者らは還元及び酸化、及び化学的架橋剤（chemical cross-linker）を使用して単量体である抗体−毒素からジスルフィド結合された二量体の生産を含む、ジスルフィド結合された二量体の多様な生産方法を試みたが、単純に還元、酸化、及び化学的架橋剤の方法を用いて二量体収率を向上させることはできなかった。
【００１０】
そこで、本発明者らは単量体Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８がジスルフィド結合された二量体［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２をより多く生産するための方法を模索していたところ、連鎖球菌タンパク質Ｇ（Streptococcal protein G）のＦａｂ結合ドメインが２回以上反復される反復鎖組換えタンパク質を作製して、これを骨格（scaffold）として用いて複数の単量体抗体−毒素が同時に結合する複合体を作製した。タンパク質Ｇの三番目のドメイン（ドメインＩＩＩ）は、ＩｇＧのＦａｂ断片に結合することができ、Ｆａｂ断片のＣＨ１ドメインはタンパク質Ｇのドメインに高い親和度で結合することができることが報告されている（非特許文献１３）。前記リフォールディング工程に比べて本発明の前記反復鎖は、下記の利点を有している。前記反復鎖を構成するドメインは、単量体抗体−毒素に対して高い親和度で結合する。反復鎖を用いて生成された反復鎖−複数の単量体複合体内の単量体抗体−毒素の局所濃度（local concentration）を高めることができた。これは、単量体抗体−毒素のシステイン残基の接近頻度を高めて単量体間のジスルフィド結合を促進させることができ、その結果、ジスルフィド結合架橋二量体の大量生産を可能にした。このような効果の代表的な例としては、酵素反応速度論で説明する接近効果（proximity effect）により酵素反応の速度が顕著に増加することがある（非特許文献１４）。したがって、前記反復鎖を単量体抗体−毒素と単純に混合することで複合体を手軽に製造することができ、前記複合体内単量体抗体−毒素のシステイン残基を還元及び酸化させることで、ＦａｂドメインとＰＥ３８間システイン残基のジスルフィド結合を促進して［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２を大量生産することができることを確認して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０５６６０９１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｐａｓｔａｎ  Ｉ．ら，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．２００７年，第５８巻，ｐ．２２１−２３７
【非特許文献２】Ｌ．Ｈ．Ｐａｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９１年，第８８巻，ｐ．３３５８−３３６２
【非特許文献３】Ｉ．Ｐａｓｔａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９１年，第５１巻，ｐ．３７８１−３７８７
【非特許文献４】Ｊ．Ｈｗａｎｇら，Ｃｅｌｌ．１９８７年，第４８巻，ｐ．１２９−１３６
【非特許文献５】Ｖ．Ｋ．Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９０年，第２６５巻，ｐ．１６３０６−１６３１０
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｕｃｈｎｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）．１９９１年，第９巻，ｐ．１５７−１６２
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｕｃｈｎｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２年，第１０巻，ｐ．６８２−６８５
【非特許文献８】Ｍ．Ｃｈｏｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９４年，第５４巻，ｐ．３４６０−３４６７
【非特許文献９】Ｓ．Ｈ．Ｃｈｏｉら，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１年，第２２巻，ｐ．１３６１−１３６５
【非特許文献１０】Ｊ．Ｈ．Ｐａｒｋら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ，２００１年，第１２巻，ｐ．３９８−４０２
【非特許文献１１】Ｍ．Ｈ．Ｙｏｏら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６年，第１６巻，ｐ．１０９７−１１０３
【非特許文献１２】Ｄ．Ｒｏｔｈｌｉｓｂｅｒｇｅｒら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００５年，第３４７巻，ｐ．７７３−７８９
【非特許文献１３】Ｊ．Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２年，第３５９巻，ｐ．７５２−７５４
【非特許文献１４】Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｃ．ＰｒｉｃｅおよびＬｅｗｉｓ  Ｓｔｅｖｅｎｓ．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、単量体間に架橋結合を用いて単量体から多量体を大量生産することによって、単量体に対して結合特異性を有する結合体の反復鎖を骨格（scaffold）として用いて、単量体と結合させて、前記単量体の反復鎖−複数の単量体複合体を大量生産して生産された反復鎖−複数の単量体複合体を構成する単量体間に架橋結合を形成して、既存の架橋結合多量体生産方法に比べて単量体の鎖内相手がいないシステイン残基の接近頻度を高めることによって、架橋結合の形成を促進して前記単量体の多量体の生産を最大化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために本発明は、
１）単量体に特異的に結合する結合体の反復鎖を製造する工程、
２）前記工程１）の反復鎖及び単量体を混合して、前記反復鎖と単量体との反復鎖−複数の単量体複合体を製造する工程、及び
３）前記工程２）の反復鎖−複数の単量体複合体内の単量体間に架橋結合を形成した多量体を分離する工程を含む、
架橋結合多量体の生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の生産方法を用いた例として、抗体−毒素をジスルフィド結合架橋で連結した二量体を生産した時、既存の報告されたリフォールディング（refolding）方法に比べて単量体抗体−毒素のジスルフィド結合架橋二量体の収率を約２０８倍増加させることで、二量体の生産量を最大化させることができた。本発明によって生産された二量体は、既に報告された単量体抗体−毒素に比べて高い抗原結合力、毒性及び安定性を有し、特に胃癌細胞株に対して約１１倍高い細胞毒性を有することが知られており、これを大量生産することによって抗癌治療剤の開発に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の架橋結合を用いた多量体生産方法の概要を示した図である。
【図２】図２は、本発明で精製されたタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで確認した結果を示した図である。  図２Ａは、タンパク質Ｇの反復鎖組換えタンパク質を還元ＳＤＳ−試料緩衝溶液と混合した後、還元１６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで確認した結果であり、１番から７番はそれぞれＴＲ１〜ＴＲ７タンパク質である。そして図２Ｂは、本発明で生産した抗体−毒素であるＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８（Ｍ）及び［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２（Ｄ）を非還元８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで確認した結果であり、矢印は上からそれぞれ［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８及びＢ３（Ｆｄ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８を示す（Ｈ６−Ｂ３（Ｌ）は、小分子量（約２５ｋＤａ）を有するので図面に表示されなかった）。
【図３】図３は、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８とＴＲ１〜ＴＲ７タンパク質との複合体から［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の形成をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで確認した結果を示した図である。  図３Ａは、タンパク質試料（各１０ｇ）を金属キレートアガロースビーズに結合させて（１）４０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールで３０分間室温で還元した後（２）、タンパク質複合体をＧＳＳＧから酸化された５ｍＭグルタチオンで２時間３７℃で酸化した後（３）、各試料の１／２を非還元８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを使用して分離した結果である（矢印は、上からそれぞれ［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８及びＢ３（Ｆｄ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８を示す）。そして、図３Ｂは、各試料の残り１／２を還元１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを使用して分離した結果である（矢印は、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８に結合したＴＲタンパク質を示し、ＴＲ１タンパク質（分子量８ｋＤａ）は分離するにあたりサイズが小さすぎるため図面に表示されなかった）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、架橋結合によって形成された多量体の大量生産を目的とし、単量体に対して結合特異性を有する結合体の反復鎖を骨格（scaffold）として用いて、単量体と反復鎖との複合体を作製すると、複合体を構成する単量体の局所濃度（local concentration）を高めることによって単量体間の衝突頻度を高め、これにより架橋結合の生成を促進させて、架橋結合多量体の収率を向上させる方法を提供する。
【００１９】
多数の単量体を架橋結合で連結させて多量体を作る過程は、架橋結合の形成がどの程度効率的であるかによって多量体の生産量が決定される。生体内で用いようとする物質の場合、多量体を形成する架橋結合は共有結合であれば生体内で単量体に分解されないで多量体の安定性を維持することができる。このような共有結合性架橋結合を形成するためには、共有結合を形成することができる化学的官能基間の接触がなければならないが、タンパク質のような巨大分子においてこのような化学的官能基は、タンパク質分子全体の大きさに比べて非常に小さな大きさである。したがって、巨大タンパク質分子が反応溶液において自由に動いている場合、非常に小さな部分である化学的官能基が互いに接触する確率は非常に小さく、かかる官能基が接触する確率を画期的に高める方法なしには効率的な多量体の生産が難しい。
【００２０】
本発明は、このような生成効率が低い単量体間の架橋結合の形成を画期的に高めるために単量体に結合性がある結合体の反復鎖を作り、そこに単量体を結合させて単量体間の距離を数ナノメートル〜数十または数百ナノメートルサイズの分子サイズの水準になるようにすることで、単量体が溶液で自由に運動しながら接触するのとは異なり、限定された空間に固定されて分子サイズ程度の空間で動いて相互に接触するようにする。このような条件で、多数の単量体が付いている単一の反復鎖では、単量体の局地的濃度が非常に高い状態になり、一緒に付いている単量体間の接触頻度は非常に高くなって、それによって架橋結合を形成することができる化学的官能基間の接触も増加して、多量体の形成を画期的に増加させることができる。
【００２１】
本発明が適用され得る対象は、単にタンパク質単量体とジスルフィド共有結合性架橋結合にのみ限られないで、有機化合物、生物分子、タンパク質などの単量体とアミド結合、エステル結合、グリコシド結合、エーテル結合などの共有結合にも適用されることは明白である。共有結合性架橋結合は、多量体の安定性を最も高める架橋結合であるが、この架橋結合は必ずしも共有結合に限られるものではない。すなわち、イオン結合などの架橋結合で多量体を形成する場合にも、本発明の思想が適用され得る。また、単量体間の架橋を形成するために、架橋鎖を入れて単量体−架橋鎖−単量体の形態で多量体を形成する場合にも、その多量体の形成効率を増加させるために本発明の思想を適用することができる（Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques. Academic Press, Inc.,1995年、 Wong S.S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking.CRC Press,Inc.,1991年）。
【００２２】
具体的に、本発明による方法は、下記の工程を含む方法で行なわれることが好ましいが、これに限定されない：
１）単量体に特異的に結合する結合体の反復鎖を製造する工程、
２）前記工程１）の反復鎖及び単量体を混合して、前記反復鎖と単量体との反復鎖−複数の単量体複合体を製造する工程、及び
３）前記工程２）の反復鎖−複数の単量体複合体内の単量体間に架橋結合を形成した多量体を分離する工程。
【００２３】
前記方法において、工程１）の単量体と単量体に特異的に結合する結合体はタンパク質から由来したものが好ましいが、これに限定されない。すなわち、前記単量体と結合体には、それら相互間に結合特異性を有するすべての分子を用いることができる。例えば、タンパク質とそれに特異的に結合する小さな有機化合物は、それぞれ単量体及びそれに対する結合特異性結合体として本発明の方法によって使用することができる。
【００２４】
前記方法において、工程１）の結合特異性結合体の反復鎖を作製するにあたり、互いに異なる結合特異性結合体を有する反復鎖の作製が可能である。これを通じてそれぞれの結合体に特異的に結合する互いに異なる単量体間の異種二量体(heterodimer)及び異種多量体(heteromultimer)の作製が可能である。
【００２５】
前記方法において、工程１）のタンパク質単量体及びその結合特異性タンパク質は、タンパク質の生来型（native form)に由来したものが好ましいが、これに限定されない。すなわち、組換え型の単量体も結合特異性を有する相手があれば本発明の方法によって架橋結合多量体生産に使用することができる。前記のタンパク質の遺伝情報をコードするＤＮＡ断片は、そのタンパク質を発現する生物体の染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡから順方向及び逆方向プライマー対を用いてＰＣＲを通じてクローニングして製造することがより好ましいが、これに限定されない。
【００２６】
前記方法において、工程３）の架橋結合はタンパク質単量体とジスルフィド共有結合性架橋結合だけでなく、有機化合物、生物分子またはタンパク質の単量体とアミド結合、エステル結合、グリコシド結合またはエーテル結合の共有結合も含まれる。共有結合性架橋結合が多量体の安定性を最も高める架橋結合であるが、前記架橋結合は共有結合にのみ限定されるのではなく、イオン結合によっても多量体が形成され得る。
【００２７】
前記方法において、工程１）の反復鎖は、下記の工程を含む製造方法で製造することが好ましいが、これに限定されない。
１）結合特異性結合体タンパク質及びその間を連結するリンカーをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターに反復してクローニングし、結合体タンパク質が反復するコンストラクトを製造する工程、
２）前記工程１）のコンストラクトを宿主細胞に形質転換させて形質転換体を製造する工程、及び
３）前記工程２）の形質転換体を培養した後、発現した反復鎖をクロマトグラフィーで分離及び精製する工程。
【００２８】
前記コンストラクトは、反復鎖内の結合体タンパク質が３回以上反復された構造を有することが好ましいが、これに限定されない。
【００２９】
前記コンストラクトは、結合体タンパク質がリンカー（linker）を通じて連結されていて、前記Ｇ４Ｓリンカーとしては、ＧＧＧＧＳを使用することができるが、これに限定されず、前記リンカーはさらに延長されてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであり得るが、これに限定されない。前記Ｇ４Ｓリンカーは、非常に柔軟性を有する構造である（R.Araiら,Protein Eng,2001年,第14巻,p.529-532）。
【００３０】
本発明では、結合体タンパク質及びリンカーをコードするＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断した後、前記のような酵素で切断したｐＣＷ１のベクター部位にクローニングしてプラスミド（plasmid）ｐＴＲ１を製造した。また、結合体タンパク質及びＧ４ＳをコードするＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＢｓｐＥＩで切断して、前記結合体タンパク質ＤＮＡ断片、及び前記ドメイン間のリンカーとして一つのＧ４Ｓをコードする２２６ｂｐのポリヌクレオチド断片を作製して、それを、ｐＴＲ１をＮｄｅＩとＡｇｅＩで切断して得られたプラスミドの部位にクローニングして、プラスミドｐＴＲ２を製造した。前記のようなクローニング方法を７回まで反復して結合体タンパク質が７回反復するコンストラクトを有するプラスミドｐＴＲ７を製造した（表１参照）。前記プラスミドをE.coli BL21（ＤＥ３）に形質転換して過発現させた後、キレート化セファロース・ファスト・フロー・クロマトグラフィー（chelating sepharose fast flow chromatography）及びサイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）を用いて分離及び精製した。
【００３１】
前記方法において、工程２）の単量体は前記の結合体タンパク質に特異的に結合する部位（結合ドメイン（Ｂ）（binding sequence））を有する。
【００３２】
前記方法において、工程２）の反復鎖−複数の単量体複合体の形成において、互いに異なる結合特異性結合体の反復鎖を用いれば、それぞれの結合体に特異的に結合する互いに異なる単量体間の異種二量体（heterodimer）及び異種多量体（heteromultimer）の作製が可能である。
【００３３】
前記方法において、工程２）の単量体複合体から架橋結合多量体の作製のために鎖内マッチレスシステイン（matchless-cysteine）を含むことが好ましいが、これに限定しない。すなわち、単量体間の架橋結合に使用し得る方法としては、前記の鎖内マッチレスシステイン間のジスルフィド結合架橋以外の汎用に使用される多様な種類の化学的架橋剤（chemical cross-linker）を使用することができる。単量体がシステインを含む場合、一つの鎖内マッチレスシステインを含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００３４】
前記方法において、工程２）の単量体は、前記の単量体と機能性タンパク質が延長鎖（extension sequence, Ext）によって連結されて新しい単量体として使用することができる。
【００３５】
前記方法において、機能性タンパク質は、酵素、毒素官能基タンパク質、ウイルスなどの生体、化合物、薬物活性のための薬物化合物、リポソーム、バイオセンサー、プロドラッグなどのような官能基（functional group)がすべて可能である。
【００３６】
前記延長鎖（Ｅｘｔ）は、単量体から延長されて機能性タンパク質につながって、単量体と機能性タンパク質を融合させて、前記延長鎖（Ｅｘｔ）には鎖内マッチレスシステインが含まれ得、二つの単量体間の鎖内マッチレスシステインの酸化によってジスルフィド結合架橋が形成されることで二量体が成り立ち、またこの延長鎖（Ｅｘｔ）にはジスルフィド結合架橋で二量体を成すようにする鎖内マッチレスシステイン中の最後のシステインと異種官能基（Ｆ）間の柔軟なアミノ酸配列（Flx, flexible sequence）が含まれ、この柔軟鎖（Ｆｌｘ）はバルキー（bulky）ではないアミノ酸であるＧＡＳＱＥＮＤ（グリシン、アルラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸）を含む柔軟なアミノ酸配列からなることが好ましいが、これに限定されない。
【００３７】
前記方法において、工程２）の混合は、前記単量体とを混合した後、３〜５℃で一晩中培養した後、３５〜４０℃で１〜２時間培養することが好ましく、４℃で一晩中培養した後、３７℃で１時間培養することがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００３８】
前記方法において、工程３）の固定は前記単量体が骨格である反復鎖に結合したタンパク質複合体を金属キレート化セファロースビーズ（metal chelating sepharose bead）に固定させることが好ましいが、これに限定されない。ビーズに固定する場合、１０℃で１時間固定することが好ましいが、これに限定されない。
【００３９】
前記方法において、工程３）の架橋結合の形成において互いに異なる結合特異性を有する結合体の反復鎖によって形成された異種複数の単量体複合体内の互いに異なる単量体間の架橋結合を形成させることで、架橋結合異種多量体の作製が可能である。
【００４０】
前記方法において、工程３）の架橋結合の形成は、既存に存在する多様な方法によって可能である（Greg T. Hermanson,Bioconjugate Techniques. Academic Press, Inc., 1995; Wong S.S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking. CRC Press, Inc., 1991.）。ジスルフィド結合架橋を使用する場合、鎖内マッチレスシステインの官能基はまず還元されなければならないが、ここで還元は前記タンパク質複合体を２−メルカプトエタノールを含む還元緩衝溶液に添加して行なうことが好ましいが、これに限定されない。すなわち、前記還元において、単量体のシステイン残基の完全な還元のための２−メルカプトエタノールの添加量が、２０〜４０ｍＭであることが好ましいが、これに限定されない。
【００４１】
前記方法において、工程３）の架橋結合の形成においてジスルフィド結合架橋を用いる場合、各単量体の還元されたシステイン残基の酸化によってジスルフィド結合架橋による多量体が生産される。単量体間の酸化は、還元されたタンパク質複合体をグルタチオン酸化形態（ＧＳＳＧ）を含む酸化緩衝溶液に添加して行なうことが好ましいが、これに限定されない。
【００４２】
本発明では、タンパク質複合体を室温で２−メルカプトエタノールを添加したＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２）を添加して還元させることが好ましいが、これに限定されない。前記還元されたタンパク質複合体をＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）が含まれた洗浄緩衝溶液で１回洗浄することが好ましいが、これに限定されない。ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２）で３回さらに洗浄した後、ＧＳＳＧ及びＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２）を含んだ酸化緩衝溶液を添加して酸化反応させた後、３７℃で２時間培養した。前記方法において培養温度と時間は、３７℃と２時間が好ましいが、これに限定されない。
【００４３】
前記方法において、工程３）の架橋結合多量体の分離は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて行なうことが好ましいが、これに限定されず、一般的なタンパク質の分離及び精製のために使用される方法はすべて使用可能である。
【００４４】
前記方法において、工程３）の多量体は単量体のジスルフィド結合二量体であることが好ましいが、これに限定されない。融合タンパク質分子形態の単量体は、「結合ドメイン−延長鎖（Ｅｘｔ）−機能性タンパク質」の形態で作られたもので、前記の延長鎖は、鎖内マッチレスシステインを含む場合に結合ドメイン−延長鎖（Ｅｘｔ）−機能性タンパク質構造の鎖内マッチレスシステインによって二つの分子の結合ドメイン−延長鎖（Ｅｘｔ）−機能性タンパク質間にジスルフィド結合架橋が作られることによって、［結合ドメイン−延長鎖（Ｅｘｔ）−機能性タンパク質］２の形態で成り立ったものである。
【００４５】
本発明者らは、発明を完成するために、単量体の結合ドメインとして抗体のタンパク質断片のＦａｂを有する抗体−毒素、および結合特異性結合体タンパク質として連鎖球菌（Streptococcus）タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインを使用した。単量体としては、抗体−毒素の形態以外に抗体の断片であるＦａｂを含む抗体分子（抗体分子単量体）が、すべて使用可能である。単量体間のジスルフィド結合架橋二量体（［抗体分子単量体］２）の生産量を最大にするため、連鎖球菌タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインが２回以上反復する反復鎖組換えタンパク質をそれぞれ製造し、それを［抗体分子単量体］２を製造するための骨格に使用した。具体的には、前記反復鎖に抗体分子単量体タンパク質を混合して一つの組換えタンパク質にいくつかの抗体分子単量体が非共有結合された反復鎖−抗体分子単量体複合体を製造した後、抗体分子単量体内システイン残基を還元及び酸化してＦａｂ断片と毒素との間にシステイン残基のジスルフィド結合を形成させることによって［抗体分子単量体］２を製造した。
【００４６】
本発明者らは、前記方法による［抗体分子単量体］２の生産水準を既存のリフォールディング方法による生産水準と比較するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、密度分析を通じて［抗体分子単量体］２の収率を分析した結果、本発明の方法による［抗体分子単量体］２の収率が、既存に報告されたリフォールディングによる収率に比べて顕著に高かった。すなわち、［抗体分子単量体］２の収率は、連鎖球菌タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインが２回以上反復する組換えタンパク質に結合された総抗体分子単量体の約３６〜５２％の範囲であり、これは既に報告されたリフォールディング収率に比べて約１４４〜２０８倍高い数値であることが分かった。
【００４７】
結論としては、タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインの反復鎖を使用して結合された抗体分子単量体のジスルフィド結合架橋二量体を形成することができ、前記反復鎖の使用を通じて［抗体分子単量体］２の生産を顕著に増加させることが分かる。タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインの反復鎖及び抗体分子単量体の結合特異性を用いれば、簡単に還元及び酸化によって［抗体分子単量体］２を効率的に大量生産することができることが分かる。
【００４８】
また、本発明は、結合特異性がある結合タンパク質反復鎖組換えタンパク質の発現をコードする遺伝子コンストラクトを提供する。
【００４９】
本発明では、タンパク質ＧのドメインＩＩＩ（Ｆａｂ結合ドメイン）が反復された組換えタンパク質をコードする遺伝子コンストラクトを製造した。
【００５０】
前記組換えタンパク質は、２個のＦａｂ結合ドメイン間に１つのリンカーであるＧ４Ｓ（ＧＧＧＧＳ）を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００５１】
前記組換えタンパク質は、タンパク質ＧのドメインＩＩＩ（Ｆａｂ結合ドメイン）が３〜７回反復された構造であることが好ましいが、これに限定されない。
【００５２】
また、本発明は、前記本発明による遺伝子コンストラクトを含む発現ベクターを提供する。
【００５３】
前記発現ベクターは、所望する遺伝子にその遺伝子のｍＲＮＡへの転写及びタンパク質に翻訳に対する調節情報を有している特定の核酸配列が所望するタンパク質の遺伝子が良く発現してタンパク質の生産が可能になるように、所望の遺伝子に連結されているように有していることが好ましい。
【００５４】
同時に、本発明は、前記本発明による発現ベクターを宿主細胞に形質転換させた形質転換体を提供する。
【００５５】
前記発現ベクターの宿主細胞への導入は、形質転換（transformation）、トランスフェクション、コンジュゲーション、原形質体融合（protoplast fusion）、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、直接顕微注射（direct microinjection）などのいろいろな適切な方法の一つによって適切な宿主細胞内に導入することができる。
【００５６】
前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。好ましいのは、真核細胞、例えば、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞であり、正確な部位で正確なフォールディングまたはグリコシレーションを含むタンパク質分子に対するタンパク質生成後の変形を提供する細胞であることが好ましいが、これに限定されない。
【００５７】
本発明では、連鎖球菌タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインが３〜７回反復される組換えタンパク質を骨格に用いて、抗体分子単量体から［抗体分子単量体］２を大量生産することができることを確認した。
【００５８】
したがって、本発明の結合特異性結合体の反復鎖は、単量体間の二量体の生産を顕著に増加させるために用いることができ、これをコードする遺伝子コンストラクト、前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを形質転換させた形質転換体は、抗体分子単量体間の架橋結合多量体の大量生産のために有用に使用することができる。
【００５９】
［参考文献］
1. Pastan I.ら, Annu Rev Med. 2007年, 第58巻, p.221-237
2. L.H.Paiら, Proc Natl Acad Sci USA, 1991年, 第88巻, p.3358-3362
3. I. Pastanら, Cancer Res. 1991年, 第51巻, p.3781-3787
4. J. Hwangら, Cell. 1987年, 第48巻, p.129-136 
5. V. K. Chaudharyら, J Biol Chem, 1990年, 第265巻, p.16306-16310
6. J. Buchnerら, Biotechnology (NY). 1991年, 第9巻, p.157-162
7. J. Buchnerら, Biotechnology, 1992年, 第10巻, p.682-685
8. M. Choeら, Cancer Res. 1994年, 第54巻, p.3460-3467
9. S. H. Choiら, Bull. Kor. Chem. Soc. 2001年, 第22巻, p.1361-1365
10. J. H. Parkら, Mol Cells, 2001年, 第12巻, p.398-402
11. M. H. Yooら, J. Microbiol. Biotechnol. 2006年, 第16巻, p.1097-1103
12. D. Rothlisbergerら, J Mol Biol, 2005年, 第347巻, p.773-789
13. 韓国登録特許第10-0566091号
14. Nicholas C. Price およびLewis Stevens. Fundamentals of Enzymology, 3rd Ed. Oxford University Press
15. R. Araiら, Protein Eng, 2001年, 第14巻, p.529-532
16. Wong S. S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking. CRC Press, Inc., 1991年
17. Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques.Academic Press, Inc., 1995年 
18. T. Brodyら, Anal Biochem, 1997年, 第247巻, p.247-256
19. Nienhaus, G. Ulrich. Protein-ligand interactions: methods and applications. Humana Press, 2005年
20. Farah, R. A. ら, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1998年, 第8巻, p.321-356 
21. Trail, P.A.ら, Science, 1993年, 第261巻, p.212-215
22. Hinman, L.M.ら, Cancer Res. 1993年, 第53巻, p.3336-3342
23. Pastan, I. Biochim. Biophys. Acta, 1997年, 第1333巻, p.C1-C6
24. Kreitman, P.J.ら, J. Clin. Oncol. 2000 1622-1636
25. Zalutsky, M.R. & Vaidyanathan, G. Curr. Pharm. Des. 2000年, 第6巻, p.1433-1455
26. Goldenberg, D.M. in Clinical Uses of Antibodies(eds Baum, R.P.ら) 1-13 (Kluwer academic, The Netherlands, 1991年)
27. Lode, H.N. & Reisfeld, R.A. Immunol. Res. 2000年, 第21巻, p.279-2880
28. Penichet, M.L. & Morrison, S.L. J. Immmunol. Methods, 2001年, 第248巻, p.91-101
29. Lasic, D.D. & Papahadjopoulos, D. Science, 1995年, 第267巻, p.1275-1276
30. Park. J.W.ら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1995年, 第92巻, p.1327-1331
31. Niculescu-Davaz, I.ら, Anticancer Drug Des. 1999年, 第14巻, p.517-538
32. SToldt, H.S.ら, Eur. J. Cancer, 1997年, 第33巻, p.186-192
33. Zachariou M., Affinity Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press; 2nd edition.
【００６０】
発明の実施のための形態
【００６１】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
【００６２】
但し、下記の実施例は本発明を具体的に例示するものであり、本発明の内容が実施例によって限定されるのではない。
【００６３】
＜実施例１＞
連鎖球菌タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインの反復鎖コンストラクトの製造
本発明者らは、タンパク質ＧのドメインＩＩＩを韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Korean Collection for Type Cultures, KCTC）から分譲された連鎖球菌（ＫＣＴＣ３０９８）の染色体ＤＮＡからＰ１［５’−ＧＧＧＣＡＴＡＴＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＣＣＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＡＣＡＡ−３’（配列番号１）］とＰ２［５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＣＧＧＡＣＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＴＡＣＣＧＴＡＡＡ−３’（配列番号２）］プライマーを用いて、ＰＣＲを通じて直接的にクローニングした。前記ＰＣＲ産物（２４３ｂｐ）をＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断した後、前記のような酵素で切断したｐＣＷ１のベクター部分にクローニングした。その後、前記ドメインＩＩＩのコード配列をジデオキシＤＮＡ配列化によって確認した。各ドメインＩＩＩ間のＧ４Ｓリンカーは、スペーサーで添加した。前記結果物であるプラスミドｐＴＲ１を再びＮｄｅＩとＢｓｐＥＩで切断した。その後、ドメインＩＩＩ及び一つのＧ４Ｓをコードする２２５ｂｐ断片を、ＮｄｅＩとＡｇｅＩで切断した同一なプラスミドの大きな断片に付けた。前記結果物であるプラスミドであるｐＴＲ２をＮｄｅＩとＡｇｅＩで切断した後、前記切断された大きな断片を２２６ｂｐ断片と付けて、それを「ｐＴＲ３」とした。前記のようなクローニング方法を使用して、タンパク質ＧのドメインＩＩＩを（ｐＴＲ１０）１０回まで反復して製造した（表１）。以前に報告された方法を用いて、Ｈ６−Ｂ３（Ｌ）をコードするｐＭＣ７５Ｈを製造した（韓国登録特許第１０−０５６６０９１号参照）。
【００６４】
【表１】
2013513656.tif 000003
【００６５】
ａＳＫＰＳＩＳＴ：野生型ヒンジ配列（hinge sequence）の変形された配列（ＣＫＰＣＩＣＴ）、
ｅｘｔ，ＫＡＳＧ４Ｃ（Ｇ４Ｓ）２：システイン残基（Cys residue）を有する延長ペプチド鎖、
Ｇ４：ＧＧＧＧのアミノ酸配列、
ＰＥ３８：３８ｋＤの切断したシュードモナス外毒素（truncated Pseudomonas Exotoxin）、
ｂ（Ｈｉｓ）６：６個のヒスチジンタグ（Histidine tag）、及び
ｃＤＩＩＩ：連鎖球菌（Streptococcal）タンパク質ＧのドメインＩＩＩ。
【００６６】
以前に報告された方法を用いて、前記反復鎖コンストラクトを過発現させた（J.H.Parkら,Mol Cells,2001年,第12巻,p.398-402）。
【００６７】
純粋な溶解物をキレート化セファロース・ファスト・フロー・クロマトグラフィー（Amersham Bioscience, Sweden）で分離した後、Ｈｉｌｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５ｐｇまたはＨｉｌｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（２６／６０）（Amersham Bioscience, Sweden）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーで分離した。すべてのコンストラクトは、純度９５％以上になるように精製した（図２のＡ）。
【００６８】
＜実施例２＞
Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８及び［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の製造
本発明者らは、Ｂ３（Ｆｄ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８及びＨ６−Ｂ３（Ｌ）の封入体の過発現、製造及びリフォールディングは以前に報告された方法にしたがって行なった（J.H.Parkら, Mol Cells, 2001年, 第12巻,p.398-402)。前記リフォールドされたタンパク質をＱ−セファロースＦＦ、Ｈｉｔｒａｐタンパク質Ｇ  ＨＰ（Hitrap protein G HP）、及びＨｉｌｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（２６／６０）（Amersham Bioscience, Sweden）クロマトグラフィーを用いて精製した。
【００６９】
具体的には、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８は、Ｂ３（Ｆｄ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８及びＨ６−Ｂ３（Ｌ）間内部鎖ジスルフィド結合によって製造した。内部鎖ジスルフィド結合に関連した二つのシステイン残基は、Ｂ３（Ｆｄ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８のＣＨ１ドメイン及びＨ６−Ｂ３（Ｌ）のＣＬドメインに位置した。また、［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２は、リフォールディング過程の間Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８内のｅｘｔに位置する２個のシステイン残基間の内部鎖ジスルフィド結合によって製造した。サイズ排除クロマトグラフィー後、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８及び［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の精製は、非還元のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの密度分析を用いて９５％以上に決定した（図２のＢ）。［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２のリフォールディング収率は、約０．０６％と示された。
【００７０】
＜実施例３＞
タンパク質Ｇの反復鎖コンストラクト及びＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８の結合
本発明者らは、精製されたタンパク質Ｇの反復鎖コンストラクトとＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８間の結合反応を誘導するため、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８（７１５μｇ）とＴＲタンパク質（各２８μｇ）を混合して４℃で一晩中培養した後、３７℃で１時間培養した。その後、前記反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＴＭＨＲ）で分離した。溶出したタンパク質複合体をＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８単独（Ｋａｖ＝０．３３）または、［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２単独（Ｋａｖ＝０．２０）を対照群に用いて比較した。溶出したタンパク質ピークのＫａｖ値を［数式１］を用いて計算した。
【００７１】
【数１】
2013513656.tif 000004
【００７２】
ここで、Ｖｅはピークの溶出体積で、Ｖｏはカラムの空いた空間体積（void volume）で、これはブルーデキストラン２０００の溶出体積で；Ｖｔは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムの総容積（bed volume）である。
【００７３】
ＴＲ３に結合されたＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８（Ｋａｖ＝０．２２）が、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の溶離体積に近接した。また、ＴＲ２を除くすべての複合体は、同時に少なくとも二つ以上のＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８分子に結合した。ＴＲ３〜ＴＲ６までの複合体は二量体で示され、ＴＲ７〜１０の複合体は三量体で示された。
【００７４】
＜実施例４＞
タンパク質Ｇの反復鎖組換えタンパク質とＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８が結合した複合体から［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の製造
本発明者らは、前記精製されたＴＲ１〜１０タンパク質及びそれに結合したＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８を用いて［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２を生産するため、グルタチオン酸化形態（ＧＳＳＧ）で酸化させた後、固定された分子を非還元（図２Ａ）及び還元（図２Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。
【００７５】
具体的には、タンパク質複合体を金属キレート化セファロースビーズに１０℃で１時間固定させた。１０μｌの金属キレート化セファロースビーズ［１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２）に５０％懸濁］をそれぞれの反応混合物に添加した後、固定されたタンパク質複合体を室温で４０ｍＭの２−メルカプトエタノールを添加した１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２）を添加して還元した。Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８のシステイン残基を還元させるために必要な２−メルカプトエタノールの濃度を決定するために行なった予備実験で、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８のシステイン残基の完全な還元は、２０〜４０ｍＭの２−メルカプトエタノールの添加によって行われた。その後、還元されたタンパク質複合体を１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）を含んだ洗浄緩衝溶液で１回洗浄した後、１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２）で３回さらに洗浄した。前記洗浄工程後、タンパク質複合体を５ｍＭのＧＳＳＧ及び１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２）を含んだ酸化緩衝溶液に添加して酸化反応させた後、３７℃で２時間培養した。前記酸化反応後、２Ｘ  ＳＤＳ試料緩衝溶液を添加した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色で分析した後に、濃度計測機を用いて密度分析を通じて［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の収率を分析した。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で、［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２のバンドの強度を［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２及びＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８の強度の合計である総バンド強度で割った値を用いて［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の収率を算出した（表２）。Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８単独及びＴＲ１に結合されたＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８を陰性対照群に使用した。
【００７６】
【表２】
2013513656.tif 000005
【００７７】
その結果、［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２は、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８単独、ＴＲ１、及びＴＲ２複合体の３個の試料では検出されなかった。ＴＲ３〜ＴＲ７複合体の相互作用は、ジスルフィド結合された二量体の相当な生産を示した。ＴＲ３〜ＴＲ７複合体の試料で［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の収率は、それぞれ４７％、４４％、４８％、３６％及び５２％を示した。［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の生産は、酸化剤添加後２時間以内になされ、追加的な培養に対して有意的な増加が示されなかった。これは、ＴＲタンパク質に結合するＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８分子のｅｘｔ内のシステイン残基は、反復鎖を通じて近くに近接して一緒に結合したことが分かった。［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２に相応するバンドが非還元性ゲルで淡いバンドを示した。前記淡いバンドは、Ｂ３（Ｆｄ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８が還元性ゲルで有意な分解が起きず、Ｂ３（Ｆｄ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８及びＨ６−Ｂ３（Ｌ）間のジスルフィド結合が完璧に形成されない［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２のまた他の形態であることが分かった。これは、既に報告された精製された抗体の還元性切断の観察によって分かることだった（T.Brodyら, Anal Biochem, 1997年, 第247巻, p.247-256）。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、架橋結合多量体を生産する方法として単量体と親和度を通じて特異的に結合する結合体の反復鎖を用いることによって、反復鎖−複数の単量体複合体の形成を促進させることができ、さらには生成された反復鎖−複数の単量体複合体を架橋結合多量体の形態で作製することができるというものである。これは、既存の架橋結合多量体生産方法と比較して顕著に高い生産率を示し、架橋結合二量体を大量生産することができるので、産業的に有用に用いることができる。
【００７９】
単量体は、多くの種類の物質から作ることができ、それに対する例としては、リガンド、またはそのリガンドの結合性を有する一部切片、例えば、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＴＮＦ、ＧＭＳＣＦ等々、また各種リガンド受容体またはその受容体の結合性を有する一部切片、例えば、ＴＢＰ１、ＴＢＰ２、ＩＦＮαまたはβ受容体、ゴナドトロピン受容体などの各種受容体が単量体を作るのに用いることができる（Nienhaus, G. Ulrich. Protein-ligand interactions: methods and applications. Humana Press, 2005年）。薬物前駆体変換、物質検出、物質分解、物質生成などの作用をする各種酵素、細胞殺傷効果を有する毒素官能基などを含むタンパク質、遺伝子治療のためのウイルスなどの生体、ＤＮＡ伝達のためのカチオンテール組成物（tail-composition）、薬物活性のための薬物化合物などの化合物、薬物伝達のために作った化学工学的産物であるリポソーム、標的分子のリアルタイム検出のためのバイオセンサー、またはプロドラッグなどのような官能基（Ｆ）などを、単量体を作るのに用いることができる。［参照：(20. Farah, R.A.ら, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr.1998年, 第8巻, p.321-356) (Trail, P.A.ら, Science, 1993年, 第261巻, p.212-215) (Hinman, L.M.ら, Cancer Res. 1993年, 第53巻, p.3336-3342) (Pastan, I. Biochim. Biophys. Acta, 1997年, 第1333巻, p.C1-C6) (Kreitman, P.J.ら, J. Clin. Oncol. 2000 1622-1636) (Zalutsky ,M.R. &  Vaidyanathan, G. Curr. Pharm. Des. 2000年, 第6巻, p.1433-1455) (Goldenberg, D.M. in Clinical Uses of Antibodies (eds Baum,R.P.ら) 1-13 (Kluwer academic, The Netherlands, 1991年)) (Lode,H.N.& Reisfeld, R.A. Immunol. Res. 2000年, 第21巻, p.279-2880) (Penichet, M.L. & Morrison, S.L. J. Immmunol. Methods, 2001年, 第248巻, p.91-101) (Lasic, D.D. & Papahadjopoulos, D. Science, 1995年, 第267巻, p.1275-1276) (Park. J.W.ら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1995年, 第92巻, p.1327-1331) (Niculescu-Davaz, I.ら, Anticancer Drug Des. 1999年, 第14巻, p.517-538) (SToldt, H.S.ら, Eur. J. Cancer, 1997年, 第33巻, p.186-192)]。
【００８０】
前記のように自然界には、リガンドと受容体、抗体と抗原、及び同種二量体または異種二量体、さらには多量体を形成するタンパク質など、報告された結合親和関係を有する物質の種類が非常に多様である。このような場合、相互結合親和性を有する物質を、それぞれ単量体と結合体として用いて、本出願の方法によって単量体から架橋結合多量体を大量に製造することができる。
【００８１】
本発明の方法によって作製された結合特異性反復鎖は、反復鎖−複数の単量体複合体を形成する特性があるので、この反復鎖を樹脂に固定化させることによって前記のバイオ産業及び医療産業分野における有用なタンパク質分子の純粋分離精製のための高効率の親和性精製（affinity purification）が可能であろう（Zachariou M., Affinity Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press; 2nd edition）。
【図１】
2013513656.tif 000006
【図２】
2013513656.tif 000007
【図３】
2013513656.tif 000008
【配列表】
2013513656000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年10月14日(2011.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単量体から二量体及び多量体を高い収率で生産する方法に関するものである。そのために、結合特異性がある結合体の反復鎖を用いて反復鎖−複数の単量体複合体形態の多量体を生産して、複合体内の単量体間の架橋結合形成が容易であることを利用して架橋結合で連結された多量体を生産するものである。これは結合体の反復鎖を結合マトリックス（binding matrix）に用いて反復鎖−複数の単量体複合体形態の多量体の形成を最大化して形成された反復鎖−複数の単量体複合体からジスルフィド結合架橋の生成効率を高めて、二量体及び多量体を大量生産する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗体−毒素（Antibody-toxin）は、癌細胞に特異的に結合する抗体に毒素を結合させることで合成される（非特許文献１）。
【０００３】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｂ３は、大腸癌、胃癌、卵巣癌、乳癌及び肺癌などの表面で過発現される炭水化物抗原（ＬｅＹ）に結合する（非特許文献２、３）抗体−ＰＥ３８形態の融合タンパク質に使用されたＰＥ３８は、シュードモナス外毒素（ＰＥ）の誘導体の一つで、ＰＥのＮ−末端を切断した分子量が３８ｋｄのタンパク質毒素である（非特許文献４、５）。
【０００４】
抗体の抗原結合部位を含む断片としてＦａｂは、Ｆｄ鎖（ＶＨ及びＣＨ１）ならびに軽鎖（ＶＬ及びＣＬ）を含む。Ｆａｂ抗体−毒素形態の融合タンパク質に使用されたＦａｂは、Ｆｄ鎖（ＶＨ及びＣＨ１）ならびに軽鎖（ＶＬ及びＣＬ）を含む。Ｆａｂ−毒素は、一本鎖Ｆｖ（single chain Ｆｖ，ｓｃＦｖ；ＶＨとＶＬをリンカーで連結して一本鎖形態に作ったＦｖ，ＣＨ１とＣＬがない）を利用したｓｃＦｖ−毒素に比べて二つの利点を有する。第一に、Ｆａｂ−毒素の収率がｓｃＦｖ−毒素に比べて１０倍高い（非特許文献６、７）。第二に、マウス血漿でＦａｂ−毒素の安定性が改善する（非特許文献８）。
【０００５】
二つのＦａｂ−毒素がジスルフィド架橋結合で連結された二価のＦａｂ−毒素二量体（［Ｆａｂ−毒素］２）は、一価のｓｃＦｖ−毒素に比べて高い細胞毒性を有することが報告されている（非特許文献９、１０、１１）。ジスルフィド結合で架橋結合して生成された二量体は、単量体であるＦａｂ−毒素のＦａｂドメインと毒素との間に位置するシステイン（Ｃｙｓ）残基によるジスルフィド結合が二つのＦａｂ−毒素間で起きることによって二量体［Ｆａｂ−毒素］２が製造される。
【０００６】
多量体の最も単純な形態である二量体の抗体−毒素は、単量体の抗体−毒素に比べて様々な利点を有することが期待される。例えば、二量体は二つの抗原結合ドメインを有する二価であるので、単量体の各ドメインの親和度（affinity）よりも強い結合力を持つようにして、二量体が高い複合度（avidity）を有することによってより強く結合するようにする。また、二価の二量体抗体−毒素は、標的細胞に同時に二つの毒素ドメイン（生物学的または化学的官能基）を運搬して、一価の単量体抗体−毒素に比べて高い細胞毒性によって標的細胞を死滅させることが可能である。同時に、Ｆａｂ−毒素は、組換え抗体−毒素の生産のために度々利用されるｓｃＦｖ−毒素に比べて高い安定性を有する（非特許文献１２）。
【０００７】
二つのＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８がジスルフィド結合で架橋結合された二量体の［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２は、モノクローナル抗体Ｂ３のＦａｂドメインをシュードモナス外毒素Ａ（Pseudomonas Aexotoxin A）誘導体であるＰＥ３８を結合させて製造することができ（特許文献１）、［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２は、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８に比べて胃癌細胞株であるＣＲＬ−１７３９細胞株に対して約１１倍高い細胞毒性を有することが報告されている（非特許文献１０）。
【０００８】
従来は、ジスルフィド結合で架橋結合された二量体をリフォールディング後に精製した（非特許文献９、１０、１１）。従来報告されたジスルフィド結合された二量体のリフォールディング工程（refolding process）の発展を通じ、二量体の収率が、０．０１４％〜０．２５％に増加した。前記リフォールディング工程の間、ジスルフィド結合された二量体は二つの抗体−毒素（Ｆａｂ−ＰＥ３８）単量体のＦａｂドメインとＰＥ３８との間に位置するシステイン残基の無作為的接近によって形成された。リフォールディング反応の大部分の生成物は、Ｆａｂ−毒素単量体で、その収率が約１０％に達する点に鑑みると、前記リフォールディング工程がジスルフィド結合された二量体の収率を増加させるにもかかわらず、二量体の収率は単量体に比べて非常に低い。単量体である抗体−毒素（Ｆａｂ−毒素）は、自らの間で自己結合親和性（self-binding-affinity）がないことから、ジスルフィド架橋結合で連結されてなる二量体は、リフォールディング反応で二つの抗体−毒素単量体のシステイン残基相互間の無作為的な衝突によるジスルフィド架橋結合の形成により生成されるものである。前記リフォールディング工程のリフォールディング緩衝溶液に溶解している単量体で二つの単量体のシステイン残基相互間の衝突頻度（collision frequency）が非常に低く、そのためにシステイン間の酸化反応によるジスルフィド架橋結合の形成が容易でないことに起因して、リフォールディング過程中に生成される二量体の収率が非常に低い。
【０００９】
したがって、今まで本発明者らは還元及び酸化、及び化学的架橋剤（chemical cross-linker）を使用して抗体−毒素単量体からジスルフィド結合された二量体の生産を含むジスルフィド結合された二量体の多様な生産方法を試みたが、単純に還元、酸化、及び化学的架橋剤の方法を用いて二量体収率を大きく向上させることはできなかった。
【００１０】
そこで、本発明者らは単量体Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８がジスルフィド結合された二量体［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２をより多く生産するための方法を模索していたところ、連鎖球菌タンパク質Ｇ（Streptococcal protein G）のＦａｂ結合ドメインが２回以上反復される反復鎖組換えタンパク質を作製して、これを結合マトリックス（binding matrix）に用いて複数の単量体がこの反復鎖に同時に結合した複合体形態の多量体を作製した。タンパク質Ｇの三番目のドメイン（ドメインＩＩＩ）は、ＩｇＧのＦａｂ断片に結合することができ、Ｆａｂ断片のＣＨ１ドメインはタンパク質Ｇのドメインに高い親和度で結合することができることが報告されている（非特許文献１３）。前記リフォールディング工程に比べて本発明の前記反復鎖は、下記の利点を有している。前記反復鎖を構成するドメインは、抗体−毒素単量体に対して高い親和度で結合する。反復鎖に多数の単量体を結合させて生成された反復鎖−複数の単量体複合体での単量体間の濃度は、多くの単量体が反復鎖に結合されて固定された状態なので単量体が自由に動くことができる空間が非常に制限されるようになって単量体の局所濃度（local concentration）が非常に高い状態になる。これは、各抗体−毒素単量体のシステイン残基の衝突頻度を高めて単量体間のジスルフィド結合を促進させることができ、その結果、ジスルフィド結合架橋二量体の大量生産を可能にした。このようなメカニズムの代表的な例としては、酵素反応速度論で酵素反応の速度が顕著に増加することを説明する接近効果（proximity effect）がある（非特許文献１４）。したがって、前記反復鎖を単量体抗体−毒素と単純に混合することで複合体を手軽に製造することができ、このように生成された多量体内の単量体間の結合を共有結合性結合に変えて、より安定した多量体分子を作るため、前記複合体内単量体抗体−毒素のシステイン残基を還元及び酸化させることで、ＦａｂドメインとＰＥ３８間システイン残基のジスルフィド結合の生成を二つの単量体間で促進して［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２を大量生産することができることを確認して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０５６６０９１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｐａｓｔａｎ  Ｉ．ら，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．２００７年，第５８巻，ｐ．２２１−２３７
【非特許文献２】Ｌ．Ｈ．Ｐａｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９１年，第８８巻，ｐ．３３５８−３３６２
【非特許文献３】Ｉ．Ｐａｓｔａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９１年，第５１巻，ｐ．３７８１−３７８７
【非特許文献４】Ｊ．Ｈｗａｎｇら，Ｃｅｌｌ．１９８７年，第４８巻，ｐ．１２９−１３６
【非特許文献５】Ｖ．Ｋ．Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９０年，第２６５巻，ｐ．１６３０６−１６３１０
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｕｃｈｎｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）．１９９１年，第９巻，ｐ．１５７−１６２
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｕｃｈｎｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２年，第１０巻，ｐ．６８２−６８５
【非特許文献８】Ｍ．Ｃｈｏｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９４年，第５４巻，ｐ．３４６０−３４６７
【非特許文献９】Ｓ．Ｈ．Ｃｈｏｉら，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１年，第２２巻，ｐ．１３６１−１３６５
【非特許文献１０】Ｊ．Ｈ．Ｐａｒｋら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ，２００１年，第１２巻，ｐ．３９８−４０２
【非特許文献１１】Ｍ．Ｈ．Ｙｏｏら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６年，第１６巻，ｐ．１０９７−１１０３
【非特許文献１２】Ｄ．Ｒｏｔｈｌｉｓｂｅｒｇｅｒら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００５年，第３４７巻，ｐ．７７３−７８９
【非特許文献１３】Ｊ．Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２年，第３５９巻，ｐ．７５２−７５４
【非特許文献１４】Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｃ．ＰｒｉｃｅおよびＬｅｗｉｓ  Ｓｔｅｖｅｎｓ．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、単量体から多量体を大量生産することであって、単量体に対して結合特異性を有する結合体の反復鎖を結合マトリックスとして用いて、多数の単量体と結合させて、前記単量体の反復鎖−複数の単量体複合体を大量生産して、生産された反復鎖−複数の単量体複合体内で単量体間に単量体内のマッチレスシステイン残基の衝突頻度が高くなることを利用して、結合架橋の形成を促進して前記単量体の架橋結合多量体の生産を既存の生産方法に比べて最大化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために本発明は、
１）単量体に特異的に結合する結合体の反復鎖を製造する工程、及び
２）前記工程１）の反復鎖と単量体とを混合して、前記反復鎖と単量体との反復鎖−複数の単量体複合体を製造する工程を含むことを特徴とする多量体の製造方法を提供する。
また、本発明は、
１）単量体に特異的に結合する結合体の反復鎖を製造する工程、
２）前記工程１）の反復鎖と単量体とを混合して、前記反復鎖と単量体との反復鎖−複数の単量体複合体を製造する工程、及び
３）前記工程２）の反復鎖−複数の単量体複合体内の単量体間に架橋結合が形成された後、架橋結合が形成された反復鎖−複数の単量体複合体から反復鎖を分離する工程とを含む、多量体の製造方法を提供する。
【００１５】
［発明の効果］
本発明の生産方法を用いた例として、抗体−毒素をジスルフィド結合架橋で連結した二量体を生産した時、既存の報告されたリフォールディング（refolding）方法に比べて単量体抗体−毒素のジスルフィド結合架橋二量体の収率を約２００倍以上増加させることで、二量体の生産量を最大化させることができた。本発明によって生産された二量体は、既に報告された単量体抗体−毒素に比べて高い抗原結合力、毒性及び安定性を有し、特に胃癌細胞株に対して約１１倍高い細胞毒性を有することが知られており、これを大量生産することによって抗癌治療剤の開発に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の架橋結合を用いた多量体生産方法の概要を示した図である。
【図２】図２は、本発明で精製されたタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで確認した結果を示した図である。  図２Ａは、タンパク質Ｇの反復鎖組換えタンパク質を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝溶液と混合した後、還元１６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで確認した結果であり、１番から７番はそれぞれＴＲ１〜ＴＲ７タンパク質である。そして図２Ｂは、本発明で生産した抗体−毒素であるＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８（Ｍ）及び［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２（Ｄ）を非還元８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで確認した結果であり、矢印は上からそれぞれ［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８及びＢ３（Ｆｄ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８を示す（Ｈ６−Ｂ３（Ｌ）は、小分子量（約２５ｋＤａ）を有するので図面に表示されなかった）。
【図３】図３は、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８とＴＲ１〜ＴＲ７タンパク質との複合体から［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の形成をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで確認した結果を示した図である。  図３Ａは、タンパク質試料（各１０ｇ）を金属キレートアガロースビーズに結合させて（１）４０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールで３０分間室温で還元した後（２）、タンパク質複合体をＧＳＳＧから酸化された５ｍＭグルタチオンで２時間３７℃で酸化した後（３）、各試料の１／２を非還元８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを使用して分離した結果である（矢印は、上からそれぞれ［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８及びＢ３（Ｆｄ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８を示す）。そして、図３Ｂは、各試料の残り１／２を還元１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを使用して分離した結果である（矢印は、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８に結合したＴＲタンパク質を示し、ＴＲ１タンパク質（分子量８ｋＤａ）は分離するにあたりサイズが小さすぎるため図面に表示されなかった）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、架橋結合によって形成された多量体の大量生産を目的とし、単量体に対して結合特異性を有する結合体の反復鎖を結合マトリックスに用いて、単量体と反復鎖との複合体を作製すると、その複合体内で単量体の局所濃度（local concentration）が非常に高い状態となる結果になり、このような複合体の生産は複合体内の単量体間の衝突頻度を高め、これにより架橋結合の生成を促進させて、架橋結合多量体の収率を向上させる方法を提供する。
【００１９】
多数の単量体を架橋結合で連結させて多量体を作る過程は、架橋結合の形成がどの程度効率的であるかによって多量体の生産量が決定される。生体内で用いようとする物質の場合、多量体を形成する架橋結合は共有結合であれば生体内で単量体に分解されないで多量体の安定性を維持することができる。このような共有結合性架橋結合を形成するためには、共有結合を形成することができる化学的官能基間の接触がなければならないが、タンパク質のような巨大分子においてこのような化学的官能基は、タンパク質分子全体の大きさに比べて非常に小さな大きさである。したがって、巨大タンパク質分子が反応溶液において自由に動いている場合、非常に小さな部分である化学的官能基が互いに接触する確率は非常に小さく、かかる官能基が接触する確率を画期的に高める方法なしには効率的な架橋結合によって連結された多量体の生産が難しい。
【００２０】
本発明は、このような生成効率が低い単量体間の架橋結合の形成を画期的に高めるために単量体に結合性がある結合体の反復鎖を作り、そこに単量体を結合させて単量体間の距離を数ナノメートル〜数十または数百ナノメートルサイズの分子サイズの水準になるようにすることで、単量体が溶液で自由に運動しながら衝突するのとは異なり、限定された空間に固定されて分子自体のサイズ程度の空間で動いて相互に接触するようにする。このような条件で、多数の単量体が付いている単一の反復鎖では、単量体の局地的濃度が非常に高い状態になり、一緒に付いている単量体間の接触頻度は非常に高くなって、それによって架橋結合を形成することができる化学的官能基間の接触頻度も増加して、多量体の形成を画期的に増加させることができる。
【００２１】
本発明が適用され得る対象は、単にタンパク質単量体とジスルフィド共有結合性架橋結合にのみ限られないで、有機化合物、生物分子、タンパク質などの単量体とアミド結合、エステル結合、グリコシド結合、エーテル結合などの共有結合にも適用されることは明白である。共有結合性架橋結合は、多量体の安定性を最も高める架橋結合であるが、この架橋結合は必ずしも共有結合に限られるものではない。すなわち、イオン結合などの架橋結合で多量体を形成する場合にも、本発明の思想が適用され得る。また、単量体間の架橋を形成するために、架橋鎖を入れて単量体−架橋鎖−単量体の形態で多量体を形成する場合にも、その多量体の形成効率を増加させるために本発明の思想を適用することができる（Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques. Academic Press, Inc.,1995年、 Wong S.S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking.CRC Press,Inc.,1991年）。
【００２２】
具体的に、本発明による方法は、下記の１）および２）の工程を含む方法で行なわれることが好ましいが、これに限定されない：
１）単量体に特異的に結合する結合体の反復鎖を製造する工程、 及び
２）前記工程１）の反復鎖と単量体とを混合して、前記反復鎖と単量体との反復鎖−複数の単量体複合体を製造する工程。
また、前記方法に下記の３）の工程を追加的に含む方法で行なわれることが好ましいが、これに限定されない：
３）前記工程２）の反復鎖−複数の単量体複合体内の単量体間に架橋結合を形成された後、結合架橋が形成された反復鎖−複数の単量体複合体から反復鎖を分離する工程。
【００２３】
前記方法において、工程１）の単量体と単量体に特異的に結合する結合体はタンパク質から由来したものが好ましいが、これに限定されない。すなわち、前記単量体と結合体には、それら相互間に結合特異性を有するすべての分子を用いることができる。例えば、タンパク質とそれに特異的に結合する小さな有機化合物は、それぞれ単量体及びそれに対する結合特異性結合体として本発明の方法によって使用することができる。
【００２４】
前記方法において、工程１）の結合特異性結合体の反復鎖を作製するにあたり、互いに異なる単量体に対する結合特異性を有する互いに異なる結合体からなる反復鎖を作製して結合マトリックスに用いることが可能である。これを通じてそれぞれの結合体に特異的に結合する互いに異なる単量体間の異種二量体(heterodimer)及び異種多量体(heteromultimer)の作製が可能である。
【００２５】
前記方法において、工程１）のタンパク質単量体及びその結合特異性タンパク質は、タンパク質の生来型（native form)に由来したものが好ましいが、これに限定されない。すなわち、組換え型の単量体も結合特異性を有する相手があれば本発明の方法によって架橋結合多量体生産に使用することができる。前記のタンパク質の遺伝情報をコードするＤＮＡ断片は、そのタンパク質を発現する生物体の染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡから順方向及び逆方向プライマー対を用いてＰＣＲを通じてクローニングして製造することがより好ましいが、これに限定されない。
【００２６】
前記方法において、工程３）の架橋結合はタンパク質単量体とジスルフィド共有結合性架橋結合だけでなく、有機化合物、生物分子またはタンパク質の単量体とアミド結合、エステル結合、グリコシド結合またはエーテル結合の共有結合も含まれる。共有結合性架橋結合が多量体の安定性を最も高める架橋結合であるが、前記架橋結合は共有結合にのみ限定されるのではなく、イオン結合によっても多量体が形成され得る。
【００２７】
前記方法において、工程１）の反復鎖は、下記のａ）〜ｃ）の工程を含む製造方法で製造することが好ましいが、これに限定されない。
ａ）結合特異性結合体タンパク質及びその間を連結するリンカーをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターに反復してクローニングし、結合体タンパク質が反復するコンストラクトを製造する工程、
ｂ）前記工程ａ）のコンストラクトを宿主細胞に形質転換させて形質転換体を製造する工程、及び
ｃ）前記工程ｂ）の形質転換体を培養した後、発現した反復鎖をクロマトグラフィーで分離及び精製する工程。
【００２８】
前記コンストラクトは、反復鎖内の結合体タンパク質が３回以上反復された構造を有することが好ましいが、これに限定されない。
【００２９】
前記コンストラクトは、結合体タンパク質がリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を通じて連結されていて、前記Ｇ４Ｓリンカーとしては、ＧＧＧＧＳを使用することができるが、これに限定されず、前記リンカーはさらに延長されてＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであり得るが、これに限定されない。前記Ｇ４Ｓリンカーは、非常に柔軟性が高い構造である（R. Araiら, Protein Eng, 2001年, 第14巻, p.529-532）。
【００３０】
本発明では、結合体タンパク質及びリンカーをコードするＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断した後、前記のような酵素で切断したｐＣＷ１のベクター部位にクローニングしてプラスミド（plasmid）ｐＴＲ１を製造した。また、結合体タンパク質及びＧ４ＳをコードするＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＢｓｐＥＩで切断して、前記結合体タンパク質ＤＮＡ断片、及び前記ドメイン間のリンカーとして一つのＧ４Ｓをコードする２２６ｂｐのポリヌクレオチド断片を分離精製して、それを、ｐＴＲ１をＮｄｅＩとＡｇｅＩで切断して得られたプラスミドの部位にクローニングして、プラスミドｐＴＲ２を製造した。前記のようなクローニング方法を１０回まで反復して結合体タンパク質が１０回反復するコンストラクトを有するプラスミドを製造した（表１参照）。前記プラスミドをE.coli BL21（ＤＥ３）に形質転換して過発現させた後、キレート化セファロース・ファスト・フロー・クロマトグラフィー（chelating sepharose fast flow chromatography）及びサイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）を用いて分離及び精製した。
【００３１】
前記方法において、工程２）の単量体は前記の反復鎖結合マトリックスを構成している結合体タンパク質に対して特異的に結合する部位であるマトリックス結合ドメイン（ＭＢ）（matrix binding sequence）を有する。単量体が標的（target）を有している場合に、単量体は標的に対する標的結合ドメイン（ＴＢ）を有している。このような場合、単量体の標的物質を、反復鎖を作製するのに使用することもでき、これは単量体の標的結合ドメイン（ＴＢ）と結合マトリックス結合ドメイン（ＭＢ）のような場合である。また、単量体の標的結合ドメイン（ＴＢ）ではないドメインに結合する単量体の標的物質ではない物質で反復鎖を作製して結合マトリックスに使用する場合には、単量体の結合マトリックス結合ドメイン（ＭＢ）が標的物質に結合する標的結合ドメイン（ＴＢ）と異なるドメインになって、単量体が結合マトリックス結合ドメイン（ＭＢ）と標的に対する標的結合ドメイン（ＴＢ）を別に有するようになる。
【００３２】
前記方法において、工程２）の反復鎖−複数の単量体複合体の形成において、互いに異なる結合特異性結合体の反復鎖を用いれば、それぞれの結合体に特異的に結合する互いに異なる単量体間の異種二量体（heterodimer）及び異種多量体（heteromultimer）の作製が可能である。
【００３３】
前記方法において、工程２）の単量体複合体から架橋結合で連結した多量体の作製のために鎖内マッチレスシステイン（matchless-cysteine）を含むことが好ましいが、これに限定しない。すなわち、単量体間の架橋結合に使用し得る方法としては、前記の単量体内マッチレスシステイン間のジスルフィド結合架橋以外の汎用に使用される多様な種類の化学的結合と架橋剤（chemical cross-linker）を使用することができる。単量体がシステインを含む場合、一つの鎖内マッチレスシステインを含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００３４】
前記方法において、工程２）の単量体は、前記の単量体と機能性タンパク質（Ｆ）（functional）（官能基）が延長鎖（extension sequence, Ext）によって連結されて作られた新しい単量体を使用することができる。
【００３５】
前記機能性タンパク質（Ｆ）は、酵素、毒素官能基タンパク質、ウイルスなどの生体、化合物、薬物活性のための薬物化合物、リポソーム、バイオセンサー、プロドラッグなどのような官能基（functional group）（Ｆ）はすべて可能である。
【００３６】
前記延長鎖（Ｅｘｔ）は、単量体から延長されて官能基タンパク質（Ｆ）につながって、単量体と官能基タンパク質を融合させて、前記延長鎖（Ｅｘｔ）には単量体内マッチレスシステインが含まれることが好ましいが、これに限定されず、二つの単量体間の単量体内マッチレスシステインの酸化によってジスルフィド結合架橋が形成されることで二量体が成り立ち、またこの延長鎖（Ｅｘｔ）にはジスルフィド結合架橋で二量体を成すようにする単量体内マッチレスシステイン中の最後のシステインと官能基（Ｆ）間に柔軟なアミノ酸配列（Flx, flexible sequence）が含まれ、この柔軟鎖（Ｆｌｘ）はバルキー（bulky）ではないアミノ酸であるＧＡＳＱＥＮＤ（グリシン、アルラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸）を含む柔軟なアミノ酸配列からなることが好ましいが、これに限定されない。
【００３７】
前記方法において、工程２）の混合は、前記単量体と混合した後、３〜５℃で一晩中保温した後、３５〜４０℃で１〜２時間保温することが好ましく、４℃で一晩中保温した後、３７℃で１時間保温することがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００３８】
前記方法において、工程３）の架橋結合は、タンパク質単量体とジスルフィド共有結合性架橋結合のみならず、有機化合物、生物分子またはタンパク質の単量体とアミド結合、エステル結合、グリコシド結合またはエーテル結合などの共有結合も含まれる。共有結合性架橋結合が最も多量体の安全性を高める架橋結合であるが、前記架橋結合が共有結合にのみ限定されるのではなく、イオン結合などでも多量体が形成され得る。
【００３９】
前記方法において、工程３）の架橋結合の形成において互いに異なる結合特異性を有する結合体の反復鎖によって形成された異種複数の単量体複合体内の互いに異なる単量体間の架橋結合を形成させることで、架橋結合異種多量体の作製が可能である。
【００４０】
前記方法において、工程３）の架橋結合の形成は、既存に存在する多様な方法によって可能である（Greg T. Hermanson,Bioconjugate Techniques. Academic Press, Inc., 1995; Wong S.S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking. CRC Press, Inc., 1991.）。ジスルフィド結合架橋を使用する場合、単量体内マッチレスシステインのチオール基（−ＳＨ）がまず還元され、すべてが−ＳＨ形態でなければならないが、ここで還元は前記タンパク質複合体を２−メルカプトエタノールを含む還元緩衝溶液に添加して行なうことが好ましいが、これに限定されない。すなわち、前記還元において、単量体のシステイン残基の完全な還元のための２−メルカプトエタノールの添加量が、２０〜４０ｍＭであることが好ましいが、これに限定されない。
【００４１】
前記方法において、工程３）の架橋結合の形成においてジスルフィド結合架橋を用いる場合、各単量体の還元されたシステイン残基の酸化によってジスルフィド結合架橋による多量体が生産される。単量体間の酸化は、還元されたタンパク質複合体をグルタチオン酸化形態（ＧＳＳＧ）を含む酸化緩衝溶液に添加して行なうことが好ましいが、これに限定されない。
【００４２】
本発明では、タンパク質複合体を室温で２−メルカプトエタノールを添加したＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２）を添加して還元させることが好ましいが、これに限定されない。前記還元されたタンパク質複合体をＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）が含まれた洗浄緩衝溶液で１回洗浄することが好ましいが、これに限定されない。ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２）で３回さらに洗浄した後、ＧＳＳＧ及びＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２）を含んだ酸化緩衝溶液を添加して酸化反応させた後、３７℃で２時間保温した。前記方法において保温温度と時間は、３７℃と２時間が好ましいが、これに限定されない。
【００４３】
前記方法において、工程３）の架橋結合多量体の分離は、クロマトグラフィーを用いて行なうことが好ましいが、これに限定されず、一般的なタンパク質の分離及び精製のために使用される方法はすべて使用可能である。
【００４４】
前記方法において、工程３）の多量体は単量体のジスルフィド結合二量体であることが好ましいが、これに限定されない。本明細書の融合タンパク質分子形態の単量体は、「結合ドメイン−延長鎖（Ｅｘｔ）−機能性タンパク質」の形態で作られたもので、この結合ドメインには、単量体の標的結合ドメイン（ＴＢ）とそれとは異なる独立的な結合マトリックス結合ドメイン（ＭＢ）が一緒に入っていて前記の延長鎖が単量体内マッチレスシステインを含む場合に単量体内マッチレスシステインによって二つの分子の結合ドメイン−延長鎖（Ｅｘｔ）−機能性タンパク質間にジスルフィド結合架橋が作られることによって、［結合ドメイン−延長鎖（Ｅｘｔ）−機能性タンパク質］２の形態で二量体が成り立つのである。
【００４５】
本発明者らは、発明を完成するために、単量体として、抗体のタンパク質断片のＦａｂを有する抗体−毒素を使用し、結合特異性結合体タンパク質として、連鎖球菌（Streptococcus）タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインであるドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）を使用した。単量体としては、抗体−毒素の形態以外に抗体の断片であるＦａｂを含む抗体に由来した抗体分子（抗体分子単量体または抗体−官能基融合分子単量体）が、すべて使用可能である。単量体間のジスルフィド結合架橋二量体（［抗体分子単量体］２）の生産量を最大にするため、連鎖球菌タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインであるドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）が２回以上反復する反復鎖組換えタンパク質をそれぞれ製造し、それを［抗体分子単量体］２を製造するための結合マトリックスに使用した。具体的には、前記反復鎖に抗体分子単量体タンパク質を混合して一つの組換え反復鎖タンパク質にいくつかの抗体分子単量体が非共有結合された反復鎖−抗体分子単量体複合体形態の多量体を製造した後、抗体分子単量体内システイン残基を還元及び酸化してＦａｂ断片ととの間にシステイン残基のジスルフィド結合を形成させることによって［抗体分子単量体］２を製造した。
【００４６】
本発明者らは、前記方法による［抗体分子単量体］２の生産水準を既存のリフォールディング方法による生産水準と比較するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、密度分析を通じて［抗体分子単量体］２の収率を分析した結果、本発明の方法による［抗体分子単量体］２の収率が、既存に報告されたリフォールディングによる収率に比べて顕著に高かった。すなわち、［抗体分子単量体］２の収率は、連鎖球菌タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインであるドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）が２回以上反復する組換えタンパク質に結合された総抗体分子単量体の約３６〜５２％の範囲であり、これは既に報告されたリフォールディング収率に比べて２００倍以上顕著に高い数値であることが分かった。
【００４７】
結論としては、タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインであるドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）の反復鎖を使用して結合された抗体分子単量体のジスルフィド結合架橋二量体を形成することができ、前記反復鎖の使用を通じて［抗体分子単量体］２の生産を顕著に増加させることが分かる。タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインであるドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）の反復鎖及び抗体分子単量体の結合特異性を用いれば、簡単に還元及び酸化によって［抗体分子単量体］２を効率的に大量生産することができることが分かる。
本発明の方法によって作製された結合特異性反復鎖は、反復鎖−複数の単量体複合体内を形成する特性があるので、この反復鎖を樹脂に固定化させることで反復鎖−複数の単量体複合体内形態の多量体形成を通じて前記のバイオ産業及び医療産業分野における有用なタンパク質分子の純粋分離精製のための非常に高い分子回収率を有する高効率の抗体から誘導された単量体または特定反復鎖に親和度がある単量体の親和度純粋分離（affinity purification）が可能であろう（Zachariou M., Affinity Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press; 2nd edition）。
【００４８】
また、本発明は、結合特異性がある結合タンパク質反復鎖組換えタンパク質の発現をコードする遺伝子コンストラクトを提供する。
【００４９】
本発明では、タンパク質ＧのドメインＩＩＩ（Ｆａｂ結合ドメイン）が反復された組換えタンパク質をコードする遺伝子コンストラクトを製造した。
【００５０】
前記組換えタンパク質は、２個のＦａｂ結合ドメイン間に１つのリンカーであるＧ４Ｓ（ＧＧＧＧＳ）を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００５１】
前記組換えタンパク質は、タンパク質ＧのドメインＩＩＩ（Ｆａｂ結合ドメイン）が３〜１０回反復された構造であることが好ましいが、これに限定されない。
【００５２】
また、本発明は、前記本発明による遺伝子コンストラクトを含む発現ベクターを提供する。
【００５３】
前記発現ベクターは、所望する遺伝子にその遺伝子のｍＲＮＡへの転写及びタンパク質に翻訳に対する調節情報を有している特定の核酸配列が所望するタンパク質の遺伝子が良く発現してタンパク質の生産が可能になるように、所望の遺伝子に連結されているように有していることが好ましい。
【００５４】
同時に、本発明は、前記本発明による発現ベクターを宿主細胞に形質転換させた形質転換体を提供する。
【００５５】
前記発現ベクターの宿主細胞への導入は、形質転換（transformation）、トランスフェクション、コンジュゲーション、原形質体融合（protoplast fusion）、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、直接顕微注射（direct microinjection）などのいろいろな適切な方法の一つによって適切な宿主細胞内に導入することができる。
【００５６】
前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。好ましいのは、真核細胞、例えば、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞であり、正確な部位で正確なフォールディングまたはグリコシレーションを含むタンパク質分子に対するタンパク質生成後の変形を提供する細胞であることが好ましいが、これに限定されない。
【００５７】
本発明では、連鎖球菌タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインが３〜７回反復される組換えタンパク質を結合マトリックスに用いて、抗体分子単量体から［抗体分子単量体］２を大量生産することができることを確認した。
【００５８】
したがって、本発明の結合特異性結合体の反復鎖は、単量体間の二量体の生産を顕著に増加させるために用いることができ、これをコードする遺伝子コンストラクト、前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを形質転換させた形質転換体は、抗体分子単量体が架橋結合によって連結された多量体の大量生産のために有用に使用することができる。
【００５９】
［参考文献］
1. Pastan I.ら, Annu Rev Med. 2007年, 第58巻, p.221-237
2. L.H.Paiら, Proc Natl Acad Sci USA, 1991年, 第88巻, p.3358-3362
3. I. Pastanら, Cancer Res. 1991年, 第51巻, p.3781-3787
4. J. Hwangら, Cell. 1987年, 第48巻, p.129-136 
5. V. K. Chaudharyら, J Biol Chem, 1990年, 第265巻, p.16306-16310
6. J. Buchnerら, Biotechnology (NY). 1991年, 第9巻, p.157-162
7. J. Buchnerら, Biotechnology, 1992年, 第10巻, p.682-685
8. M. Choeら, Cancer Res. 1994年, 第54巻, p.3460-3467
9. S. H. Choiら, Bull. Kor. Chem. Soc. 2001年, 第22巻, p.1361-1365
10. J. H. Parkら, Mol Cells, 2001年, 第12巻, p.398-402
11. M. H. Yooら, J. Microbiol. Biotechnol. 2006年, 第16巻, p.1097-1103
12. D. Rothlisbergerら, J Mol Biol, 2005年, 第347巻, p.773-789
13. 韓国登録特許第10-0566091号
14. Nicholas C. Price およびLewis Stevens. Fundamentals of Enzymology, 3rd Ed. Oxford University Press
15. R. Araiら, Protein Eng, 2001年, 第14巻, p.529-532
16. Wong S. S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking. CRC Press, Inc., 1991年
17. Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques.Academic Press, Inc., 1995年 
18. T. Brodyら, Anal Biochem, 1997年, 第247巻, p.247-256
19. Nienhaus, G. Ulrich. Protein-ligand interactions: methods and applications. Humana Press, 2005年
20. Farah, R. A. ら, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1998年, 第8巻, p.321-356 
21. Trail, P.A.ら, Science, 1993年, 第261巻, p.212-215
22. Hinman, L.M.ら, Cancer Res. 1993年, 第53巻, p.3336-3342
23. Pastan, I. Biochim. Biophys. Acta, 1997年, 第1333巻, p.C1-C6
24. Kreitman, P.J.ら, J. Clin. Oncol. 2000 1622-1636
25. Zalutsky, M.R. & Vaidyanathan, G. Curr. Pharm. Des. 2000年, 第6巻, p.1433-1455
26. Goldenberg, D.M. in Clinical Uses of Antibodies(eds Baum, R.P.ら) 1-13 (Kluwer academic, The Netherlands, 1991年)
27. Lode, H.N. & Reisfeld, R.A. Immunol. Res. 2000年, 第21巻, p.279-2880
28. Penichet, M.L. & Morrison, S.L. J. Immmunol. Methods, 2001年, 第248巻, p.91-101
29. Lasic, D.D. & Papahadjopoulos, D. Science, 1995年, 第267巻, p.1275-1276
30. Park. J.W.ら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1995年, 第92巻, p.1327-1331
31. Niculescu-Davaz, I.ら, Anticancer Drug Des. 1999年, 第14巻, p.517-538
32. SToldt, H.S.ら, Eur. J. Cancer, 1997年, 第33巻, p.186-192
33. Zachariou M., Affinity Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press; 2nd edition.
【００６０】
発明の実施のための形態
【００６１】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
【００６２】
但し、下記の実施例は本発明を具体的に例示するものであり、本発明の内容が実施例によって限定されるのではない。
【００６３】
連鎖球菌タンパク質ＧのＦａｂ結合ドメインの反復鎖コンストラクトの製造
本発明者らは、タンパク質ＧのドメインＩＩＩを韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Korean Collection for Type Cultures, KCTC）から分譲された連鎖球菌（ＫＣＴＣ３０９８）の染色体ＤＮＡからＰ１［５’−ＧＧＧＣＡＴＡＴＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＣＣＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＡＣＡＡ−３’（配列番号１）］とＰ２［５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＣＧＧＡＣＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＴＡＣＣＧＴＡＡＡ−３’（配列番号２）］プライマーを用いて、ＰＣＲを通じて直接的にクローニングした。前記ＰＣＲ産物（２４３ｂｐ）をＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断した後、前記のような酵素で切断したｐＣＷ１のベクター部分にクローニングした。その後、前記ドメインＩＩＩのコード配列をジデオキシＤＮＡ配列検査法によって確認した。各ドメインＩＩＩ間のＧ４Ｓリンカーは、スペーサーで添加した。前記結果物であるプラスミドｐＴＲ１を再びＮｄｅＩとＢｓｐＥＩで切断した。その後、ドメインＩＩＩ及び一つのＧ４Ｓをコードする２２５ｂｐ断片を、ＮｄｅＩとＡｇｅＩで切断した同一なプラスミドの大きな断片に付けた。前記結果物であるプラスミドであるｐＴＲ２をＮｄｅＩとＡｇｅＩで切断した後、前記切断された大きな断片を２２６ｂｐ断片と付けて、それを「ｐＴＲ３」とした。前記のようなクローニング方法を使用して、タンパク質ＧのドメインＩＩＩが１０回まで反復したプラスミド（ｐＴＲ１０）を製造した（表１）。以前に報告された方法を用いて、Ｈ６−Ｂ３（Ｌ）をコードするｐＭＣ７５Ｈを製造した（韓国登録特許第１０−０５６６０９１号参照）。
【００６４】
【表１】
2013513656.tif 000009
【００６５】
ａＳＫＰＳＩＳＴ：天然型ヒンジ配列（hinge sequence）の変異された配列（ＣＫＰＣＩＣＴ）、
ｅｘｔ，ＫＡＳＧ４Ｃ（Ｇ４Ｓ）２：システイン残基（Cys residue）を有する延長ペプチド鎖、
Ｇ４：ＧＧＧＧのアミノ酸配列、
ＰＥ３８：３８ｋｄの切断したシュードモナス外毒素（truncated Pseudomonas Exotoxin）、
ｂ（Ｈｉｓ）６：６個のヒスチジンタグ（Histidine tag）、及び
ｃＤＩＩＩ：連鎖球菌（Streptococcal）タンパク質ＧのドメインＩＩＩ。
【００６６】
以前に報告された方法を用いて、前記反復鎖コンストラクトを過発現させた（J. H. Parkら, Mol Cells, 2001年, 第12巻, p.398-402）。
【００６７】
純粋な溶解物をキレート化セファロース・ファスト・フロー・クロマトグラフィー（Amersham Bioscience, Sweden）で分離した後、Ｈｉｌｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５ｐｇまたはＨｉｌｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（２６／６０）（Amersham Bioscience, Sweden）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーで分離した。すべてのコンストラクトは、純度９５％以上になるように精製した（図２のＡ）。
【００６８】
＜実施例２＞
リフォールディング過程を通じたＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８及び［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の製造
本発明者らは、Ｂ３（Ｆｄ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８及びＨ６−Ｂ３（Ｌ）の封入体の過発現、製造及びリフォールディングは以前に報告された方法にしたがって行なった（J.H.Parkら, Mol Cells, 2001年, 第12巻,p.398-402)。前記リフォールドされたタンパク質をＱ−セファロースＦＦ、Ｈｉｔｒａｐタンパク質Ｇ  ＨＰ（Hitrap protein G HP）、及びＨｉｌｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（２６／６０）（Amersham Bioscience, Sweden）クロマトグラフィーを用いて精製した。
【００６９】
具体的には、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８は、Ｂ３（Ｆｄ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８及びＨ６−Ｂ３（Ｌ）間鎖間（ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ）ジスルフィド結合によって製造した。鎖間ジスルフィド結合に関連した二つのシステイン残基は、Ｂ３（Ｆｄ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８のＣＨ１ドメイン及びＨ６−Ｂ３（Ｌ）のＣＬドメインに位置した。また、［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２は、リフォールディング過程の間Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８内のｅｘｔに位置する単量体内マッチレスシステイン残基によって二つの単量体間の単量体間ジスルフィド結合によって生成されたりした。サイズ排除クロマトグラフィー後、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８及び［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の精製度は、非還元のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの密度分析を用いて測定した結果、純度９５％以上と示された（図２のＢ）。本実施例の従来の［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２のリフォールディング過程を通じた収率は、約０．０６％と示され、本発明の方法を用いれば従来の収率に比べて２００倍以上向上する。
【００７０】
＜実施例３＞
タンパク質Ｇの反復鎖コンストラクト及びＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８の結合
本発明者らは、精製されたタンパク質Ｇの反復鎖コンストラクトと単量体Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８間の結合反応を誘導するため、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８（７１５μｇ）とＴＲタンパク質（各２８μｇ）を混合して４℃で一晩中保温した後、３７℃で１時間保温した。その後、前記反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＴＭＨＲ）で分離した。溶出したタンパク質複合体をＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８単独（Ｋａｖ＝０．３３）または、［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２単独（Ｋａｖ＝０．２０）を対照群に用いて比較した。溶出したタンパク質ピークのＫａｖ値を［数式１］を用いて計算した。
【００７１】
【数１】
2013513656.tif 000010
【００７２】
ここで、Ｖｅはピークの溶出体積で、Ｖｏはカラムの空いた空間体積（void volume）で、これはブルーデキストラン２０００の溶出体積で；Ｖｔは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムの総容積（bed volume）である。
【００７３】
ＴＲ３に結合されたＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８（Ｋａｖ＝０．２２）が、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の溶離体積に近接した。また、ＴＲ２を除くすべての複合体は、同時に少なくとも二つ以上のＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８分子に結合していた。ＴＲ３〜ＴＲ６までの複合体は二量体で示され、ＴＲ７〜１０の複合体は三量体で示された。
【００７４】
＜実施例４＞
タンパク質ＧのドメインＩＩＩ反復鎖組換えタンパク質とＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８が結合した複合体から［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の製造
本発明者らは、前記精製されたＴＲ１〜 ＴＲ１０タンパク質及びそれに結合したＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８を用いて［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２を生産するため、２−メルカプトエタノールで還元させてグルタチオン酸化形態（ＧＳＳＧ）で酸化させた後、固定された分子を非還元（図２Ａ）及び還元（図２Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００７５】
具体的には、タンパク質複合体を金属キレート化セファロースビーズに１０℃で１時間固定させた。１０μｌの金属キレート化セファロースビーズ［１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２）に５０％懸濁］をそれぞれの反応混合物に添加した後、固定されたタンパク質複合体を室温で４０ｍＭの２−メルカプトエタノールを添加した１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２）を添加して還元した。Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８のシステイン残基を還元させるために必要な２−メルカプトエタノールの濃度を決定するために行なった予備実験で、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８のシステイン残基の完全な還元は、２０〜４０ｍＭの２−メルカプトエタノールの添加によって行われた。その後、還元されたタンパク質複合体を１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）を含んだ洗浄緩衝溶液で１回洗浄した後、１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２）で３回さらに洗浄した。前記洗浄工程後、タンパク質複合体を５ｍＭのＧＳＳＧ及び１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２）を含んだ酸化緩衝溶液に添加して酸化反応させた後、３７℃で２時間保温した。前記酸化反応後、２Ｘ  ＳＤＳ試料緩衝溶液を添加した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びクマシー染色で分析した後に、濃度計測機を用いて密度分析を通じて［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の生成率を分析した。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で、［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２のバンドの強度を［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２及びＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８の強度の合計である総バンド強度で割った値を用いて［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の総単量体投与に対する二量体の収率を算出した（表２）。Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８単独及びＴＲ１に結合されたＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８を陰性対照群に使用した。
【００７６】
【表２】
2013513656.tif 000011
【００７７】
その結果、［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２は、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８単独、ＴＲ１との複合体、及びＴＲ２との複合体の３種の試料では検出されなかった。ＴＲ３〜ＴＲ７複合体内での単量体間の高まった衝突相互作用は、ジスルフィド結合で架橋結合した二量体の、相当に増加した生産を示した。ＴＲ３〜ＴＲ７複合体の試料で［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の収率は、それぞれ４７％、４４％、４８％、３６％及び５２％を示した。［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の生産は、酸化剤添加後２時間以内になされ、追加的な保温によって有意的な増加が示されなかった。このようにして、ＴＲタンパク質に結合するＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８分子のｅｘｔ内のシステイン残基は、反復鎖を通じて容易に近くに近接して一緒に結合していることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、架橋結合多量体を生産する方法として単量体と親和度を通じて特異的に結合する結合体の反復鎖を用いることによって、反復鎖−複数の単量体複合体の形成を促進させることができ、さらには生成された反復鎖−複数の単量体複合体を架橋結合多量体の形態で作製することができるというものである。これは、既存の架橋結合多量体生産方法と比較して顕著に高い生産率を示し、架橋結合二量体を大量生産することができるので、産業的に有用に用いることができる。
【００７９】
単量体は、多くの種類の物質から作ることができ、それに対する例としては、リガンド、またはそのリガンドの結合性を有する一部切片、例えば、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＴＮＦ、ＧＭＳＣＦ等々、また各種リガンド受容体またはその受容体の結合性を有する一部切片、例えば、ＴＢＰ１、ＴＢＰ２、ＩＦＮαまたはβ受容体、ゴナドトロピン受容体などの各種受容体が単量体を作るのに用いることができる（Nienhaus, G. Ulrich. Protein-ligand interactions: methods and applications. Humana Press, 2005年）。薬物前駆体変換、物質検出、物質分解、物質生成などの作用をする各種酵素、細胞殺傷効果を有する毒素官能基などを含むタンパク質、遺伝子治療のためのウイルスなどの生体、ＤＮＡ伝達のためのカチオンテール組成物（tail-composition）、薬物活性のための薬物化合物などの化合物、薬物伝達のために作った化学工学的産物であるリポソーム、標的分子のリアルタイム検出のためのバイオセンサー、またはプロドラッグなどのような官能基（Ｆ）などを、単量体を作るのに用いることができる。［参照：(20. Farah, R.A.ら, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr.1998年, 第8巻, p.321-356) (Trail, P.A.ら, Science, 1993年, 第261巻, p.212-215) (Hinman, L.M.ら, Cancer Res. 1993年, 第53巻, p.3336-3342) (Pastan, I. Biochim. Biophys. Acta, 1997年, 第1333巻, p.C1-C6) (Kreitman, P.J.ら, J. Clin. Oncol. 2000 1622-1636) (Zalutsky ,M.R. &  Vaidyanathan, G. Curr. Pharm. Des. 2000年, 第6巻, p.1433-1455) (Goldenberg, D.M. in Clinical Uses of Antibodies (eds Baum,R.P.ら) 1-13 (Kluwer academic, The Netherlands, 1991年)) (Lode,H.N.& Reisfeld, R.A. Immunol. Res. 2000年, 第21巻, p.279-2880) (Penichet, M.L. & Morrison, S.L. J. Immmunol. Methods, 2001年, 第248巻, p.91-101) (Lasic, D.D. & Papahadjopoulos, D. Science, 1995年, 第267巻, p.1275-1276) (Park. J.W.ら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1995年, 第92巻, p.1327-1331) (Niculescu-Davaz, I.ら, Anticancer Drug Des. 1999年, 第14巻, p.517-538) (SToldt, H.S.ら, Eur. J. Cancer, 1997年, 第33巻, p.186-192)]。
【００８０】
前記のように自然界には、リガンドと受容体、抗体と抗原、及び同種二量体または異種二量体、さらには多量体を形成するタンパク質など、報告された結合親和関係を有する物質の種類が非常に多様である。このような場合、相互結合親和性を有する物質を、それぞれ単量体と結合体として用いて、本出願の方法によって単量体から架橋結合多量体を大量に製造することができる。
【００８１】
本発明の方法によって作製された結合特異性反復鎖は、反復鎖−複数の単量体複合体を形成する特性があるので、この反復鎖を樹脂に固定化させることによって前記のバイオ産業及び医療産業分野における有用なタンパク質分子の純粋分離精製のための高効率の親和性精製（affinity purification）が可能であろう（Zachariou M., Affinity Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press; 2nd edition）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）単量体に特異的に結合する結合体の反復鎖を製造する工程、及び
２）前記工程１）の反復鎖と単量体とを混合して、前記反復鎖と単量体の反復鎖−複数の単量体複合体を製造する工程を含むことを特徴とする多量体の製造方法。
【請求項２】
反復鎖−複数の単量体複合体内の単量体間に架橋結合が形成された後、架橋結合が形成された反復鎖−複数の単量体複合体から反復鎖を分離する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の多量体の製造方法。
【請求項３】
単量体がタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の多量体の製造方法。
【請求項４】
単量体が、抗体、リガンド、受容体もしくはそれらの切片、またはそれらの組換え体、またはそれらの誘導体、またはそれらと生化学官能基との融合体であることを特徴とする、請求項１に記載の多量体の製造方法。
【請求項５】
抗体が、抗体の切片、Ｆａｂ断片またはＦａｂ断片を含むことを特徴とする、請求項４に記載の多量体の製造方法。
【請求項６】
生化学官能基が、酵素、毒素官能基タンパク質、ウイルスなどの生体、化合物、薬物活性のための薬物化合物、リポソーム、バイオセンサー、プロドラッグを含む官能基（functional group）であることを特徴とする、請求項４に記載の多量体の製造方法。
【請求項７】
結合体が、タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の多量体の製造方法。
【請求項８】
結合体が、単量体に結合するタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
結合体が、抗体、抗体の切片、またはＦａｂ断片に結合するタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
結合体が、タンパク質Ｇ（protein G）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
結合体が、タンパク質Ｇの切片であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質Ｇの切片が、タンパク質Ｇの抗体結合ドメインであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質Ｇの抗体結合ドメインが、ドメインＩＩＩであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2013513656.tif 000012
【図２】
2013513656.tif 000013
【図３】
2013513656.tif 000014
【国際調査報告】
2013513656.tif 000015
2013513656.tif 000016
2013513656.tif 000017
2013513656.tif 000018
2013513656.tif 000019
2013513656.tif 000020
2013513656.tif 000021
2013513656.tif 000022
2013513656.tif 000023
2013513656.tif 000024