(57)【要約】本明細書に記載される態様は、基質または目的の経路の生成物について競合する酵素を、標的酵素が部位特異的プロテアーゼに対して感受性となるように改変することにより、生体触媒として用いることができる細胞および細胞を調製する方法に関し、前記プロテアーゼは、細胞において発現されるが、インタクトな細胞において標的酵素と接触しない位置へ再配置される。細胞溶解によりプロテアーゼは標的酵素に接触し、これは次いでプロテアーゼ切断により不活化される。
2013537802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
再配置配列を含む部位特異的プロテアーゼコード配列；および
目的の経路に関与する酵素と競合する少なくとも１の標的酵素についてのコード配列、ここで、該標的酵素のコード配列は、部位特異的プロテアーゼ認識部位を含む、
を含むように遺伝子改変された細胞。
【請求項２】
再配置配列が、周辺質を標的とする配列である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
周辺質を標的とする配列が、以下：
【化１】
2013537802.tif 000009
からなる群より選択される、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
部位特異的プロテアーゼコード配列が、TEV NIa、HRV 3C、エンテロキナーゼ、Ｘａ因子およびトロンビンからなる群より選択される部位特異的プロテアーゼをコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
標的酵素コード配列が、部位特異的プロテアーゼ認識部位を含むように遺伝子改変されている、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
部位特異的プロテアーゼコード配列が、誘導性プロモーターに作動的に連結している、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
標的酵素が、前駆体が目的の経路に供給される速度を増大させる酵素と競合する、請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
標的酵素が、重要な経路の入口酵素と競合する、請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
標的酵素のネイティブなカウンターパートをコードする遺伝子が、標的酵素をコードする遺伝子により置き換えられている、請求項１に記載の細胞。
【請求項１０】
ネイティブなカウンターパート酵素をコードする遺伝子がノックアウトされている、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
標的酵素が、細胞内で過剰発現されている、請求項１に記載の細胞。
【請求項１２】
標的酵素が、エピソームベクターまたは染色体のいずれかに存在する、請求項１に記載の細胞。
【請求項１３】
目的の経路が、
ａ）抗生物質；
ｂ）生物系界面活性剤；
ｃ）アミノ酸；
ｄ）有機酸；
ｅ）脂肪酸；
ｆ）アルコールもしくはポリオール；
ｇ）フレーバーもしくはフレグランス；
ｈ）ヌクレオチド；
ｉ）ビタミン；
ｊ）色素；
ｋ）糖もしくは多糖；
ｌ）バイオポリマーもしくはプラスチック；
ｍ）E. coli代謝物；
ｎ）シキミ酸および／もしくはシキメート；
ｏ）イソプレノイドもしくはテルペン；
ｐ）ポリ−３−ヒドロキシ酪酸；または
ｑ）イソブタノールおよび／もしくはｌ−ブタノール
の合成である、請求項１に記載の細胞。
【請求項１４】
目的の経路が、シキミ酸および／もしくはシキメート；イソプレノイドもしくはテルペン；ポリ−３−ヒドロキシ酪酸；またはイソブタノールおよび／もしくはｌ−ブタノールの合成である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
細胞増殖培地が、標的酵素の活性を増大または保持する因子の添加または増強により改変されている、請求項１に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項１に記載の細胞の細胞ライセート。
【請求項１７】
目的の経路の生成物を生成するためのシステムであって、請求項１に記載の細胞のライセート；ならびに任意に１または２以上の基質、酵素、栄養素、補助因子、緩衝化剤、還元剤およびＡＴＰ生成システムを含む、前記システム。
【請求項１８】
１または２以上のさらなる細胞ライセートをさらに含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
目的の経路の生成物を生成する方法であって、
請求項１に記載の細胞を所望の細胞密度まで増殖させること；
前記細胞の少なくとも一部を溶解すること；および
任意に、ライセートを、１または２以上の基質、酵素、栄養素、補助因子、緩衝化剤、還元剤またはＡＴＰ生成システムと組み合わせること
を含み、
ここで、目的の経路における酵素が生成物の生成を触媒し、部位特異的プロテアーゼが標的酵素を切断する、前記方法。
【請求項２０】
ライセートを１または２以上のさらなる細胞ライセートと組み合わせることをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、2010年8月31日に出願された米国仮出願U.S.S.N. 61/378,828の35 U. S. C.§119(e)に基づく優先権を主張し、該仮出願は、本明細書に参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
微生物宿主において、合成酵素の経路を介して化学物質を生産することは、イソプレノイド、ポリケチド、非リボソーム性のペプチド、バイオプラスチック、および化学的構成要素を含む多くの重要なクラスの分子に有用であることが証明されている。合成生物学は、生物情報に固有のモジュール性により、微生物で生産した化合物のこのリストをさらにもっと広げる可能性を多いに有する。とはいえ、宿主細胞の代謝ネットワークに新規生化学的経路を埋め込むことによって、細胞が何千年にもわたって徐々に進化させてきた繊細な調節機構が破壊される可能性もある。操作された細胞の代謝への悪影響は、細胞内で起こる複雑な相互作用についての理解が限られているため予測することが難しく、実際に化合物の最終的な収率はしばしば制限されてしまう。細胞内資源の制御されない消費、異種タンパク質生産による代謝負担、および宿主に対して抑制性または毒性である経路中間体／産物の蓄積はすべて、全体の収率を制限し得る大きな問題である。
【０００３】
所望の目標を達成するための様々な実験技術を採用することによる代謝ネットワークおよび細胞内ネットワークの意図的な改変として定義することができる代謝工学の概念が、この目的を達成するために浮上してきた。代謝工学を遺伝子工学および菌株改良から区別するものは、それが、操作すべき標的を同定するために、代謝ネットワークおよび他の細胞内ネットワークを全体として考慮することである。この意味において、代謝のフラックス（flux）は、代謝工学の実施に際し、本質的な概念となる。遺伝子発現レベルと、細胞におけるタンパク質および代謝産物の濃度とが、代謝ネットワークの状態に対する手がかりを与え得るが、それらは、これら細胞内成分どうしの相互関係についての情報が欠如していることにより、細胞の表現型を十分に説明するのには固有の限界がある。代謝のフラックスは、代謝経路の反応速度を表し、数学的枠組みによりこれら因子を統合するのに役立つものである。よって、代謝のフラックスは、様々な細胞成分間の相互作用の結果として、細胞の表現型を表す１つの観点と見なすことができ、観察される代謝のフラックスのプロフィールは、相互接続した転写、翻訳、および複雑な調節を包含する酵素反応の結果を反映するものである。
【０００４】
セルフリー（cell-free）合成は、in vivoでの生成方法に対して利点を提供する。重要なこととして、in vitroにおける細胞壁の欠如は、合成環境の直接的な制御を可能にする。細胞増殖または細胞バイアビリティーについての必要性が存在しないため、酸化還元電位、ｐＨまたはイオン強度を、直接的に、およびより広い非生理学的な範囲にわたり、改変することができる。さらに、生成物の直接的な回収もまた、より容易に達成することができる。セルフリーシステムは、細胞の代謝源の全てではないが殆どを、１つの経路からの排他的な生成に向かわせることができる。本発明の組成物および方法は、これらの問題に対処するものである。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要旨
目的の経路に関与する酵素と競合する標的酵素の改変を介して代謝経路フラックスを制御するための、システム、組成物および方法が提供され、これは、細胞増殖期の間の標的酵素の細胞濃度を維持または変化させる改変と、その後の、目的の経路の生成物が生成される生成期の間の標的酵素の濃度を低下させる操作とを含む。細胞増殖期は、必然的に完全な（intact）細胞を伴うが、生成期は、かかる細胞のライセートにより行ってもよい。
【０００６】
本明細書において提供されるシステム、組成物および方法において、標的酵素（例えば、目的の経路における酵素の基質について競合する酵素）は、部位特異的プロテアーゼによる切断の標的となる。かかる標的酵素は、代謝経路の生成期の間は望ましくない。標的酵素は、部位特異的プロテアーゼのための少なくとも１つの切断部位（本明細書においてまた部位特異的プロテアーゼ認識部位として言及される）を含むように遺伝子改変しても、天然に存在する切断部位を有していてもよい。切断部位は、代表的には、ネイティブな酵素活性が受ける影響が最小限となるように、および、標的酵素が切断される場合にそれが不活化されるように、配置される。
【０００７】
対応する部位特異的プロテアーゼ、すなわち、標的酵素における切断部位を認識するプロテアーゼは、天然に存在する区画とは異なる細胞のまたは細胞外の区画への部位特異的プロテアーゼの再配置（relocation）を提供するペプチド配列を組み込むように、遺伝子改変される。部位特異的プロテアーゼが、細胞周期の細胞増殖期の間に再配置される場合、それは、標的酵素とは接触しておらず、したがってこれを切断することはできない。細胞が、代謝物生成期の前に溶解される場合、部位特異的プロテアーゼは、標的酵素と接触させられてこれを切断し、それにより標的酵素を不活化する。
【０００８】
一部の態様において、部位特異的プロテアーゼは、周辺質に隔離される。他の態様において、部位特異的プロテアーゼは、増殖培地中に分泌される。
【０００９】
部位特異的プロテアーゼは、細胞に対して内因性であってもよく、または、部位特異的プロテアーゼのコード配列を発現のために細胞内に導入してもよい。
【００１０】
一側面において、ここで提供されるのは、（ｉ）再配置配列を含む部位特異的プロテアーゼコード配列；および（ｉｉ）目的の経路に関与する酵素と競合する少なくとも１の標的酵素についてのコード配列を含むように遺伝子改変された細胞であり、ここで、前記標的酵素のコード配列は、部位特異的プロテアーゼ認識部位を含む。一部の態様において、部位特異的プロテアーゼコード配列は、誘導性プロモーターに作動的に連結されている。
【００１１】
一部の態様において、再配置配列は、周辺質を標的とする配列である。一部の態様において、周辺質を標的とする配列は、以下：
【化１】
2013537802.tif 000003
からなる群より選択される。
【００１２】
一部の態様において、部位特異的プロテアーゼコード配列は、TEV NIa、HRV 3C、エンテロキナーゼ、Ｘａ因子およびトロンビンからなる群より選択される部位特異的プロテアーゼをコードする。
【００１３】
ある態様において、標的酵素コード配列は、部位特異的プロテアーゼ認識部位を含むように遺伝子改変される。
【００１４】
一部の態様において、標的酵素は、目的の経路に前駆体が供給される速度を増大させる酵素と競合する。一部の態様において、標的酵素は、重要な経路の入口酵素と競合する。
【００１５】
ある態様において、ネイティブなカウンターパート酵素をコードする遺伝子を、標的酵素をコードするＤＮＡで置き換える。ある態様において、ネイティブなカウンターパート酵素をコードする遺伝子を、ノックアウトする（例えば、不活化するか、または不活性なＤＮＡ分子により置き換える）。一部の態様において、標的酵素を細胞内で過剰発現させる。
【００１６】
特定の態様において、部位特異的プロテアーゼまたは標的酵素は、エピソームベクターまたは染色体のいずれかに存在する。
【００１７】
ある態様において、目的の経路は、ａ）抗生物質；ｂ）生物系界面活性剤； ｃ）アミノ酸；ｄ）有機酸；ｅ）脂肪酸；ｆ）アルコールもしくはポリオール；ｇ）フレーバーもしくはフレグランス；ｈ）ヌクレオチド；ｉ）ビタミン；ｊ）色素；ｋ）糖もしくは多糖；ｌ）バイオポリマーもしくはプラスチック；ｍ）E. coli代謝物；ｎ）シキミ酸および／もしくはシキメート；ｏ）イソプレノイドもしくはテルペン；ｐ）ポリ−３−ヒドロキシ酪酸；または、ｑ）イソブタノールおよび／もしくはｌ−ブタノールの合成である。
【００１８】
一部の態様において、目的の経路は、シキミ酸および／またはシキメート、イソプレノイドまたはテルペン、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸、イソブタノールおよび／またはｌ−ブタノールの合成である。
【００１９】
一部の態様において、細胞増殖培地は、標的酵素の活性を増大または保持する因子の添加または増強により改変されている。
【００２０】
一側面において、ここで提供されるのは、本明細書に記載される細胞のいずれかの細胞ライセートである。
【００２１】
別の側面において、ここで提供されるのは、目的の経路の生成物を生成するためのシステムであって、該システムは、本明細書に記載される細胞のいずれかの１または２以上のライセート、および任意に１または２以上の基質、酵素、栄養素、補助因子（co-factor）、緩衝化剤（buffer）、還元剤およびＡＴＰ生成システムを含む。
【００２２】
さらに別の側面において、本明細書において提供されるのは、目的の経路の生成物を生成する方法であって、該方法は、本明細書に記載される細胞のいずれか１つを、所望の細胞密度まで増殖させること、前記細胞の少なくとも一部を溶解すること、および任意に、ライセートを、１または２以上の基質、酵素、栄養素、補助因子、緩衝化剤、還元剤および／またはＡＴＰ生成システムと組み合わせることを含み、ここで、目的の経路における酵素が生成物の生成を触媒し、部位特異的プロテアーゼが標的酵素を切断する。一部の態様において、方法は、ライセートを１または２以上のさらなる細胞ライセートと組み合わせることを、さらに含む。
【００２３】
なお別の側面において、本明細書において提供されるのは、再配置配列を含む部位特異的プロテアーゼコード配列を含むベクターであって、ここで任意に、コード配列は、誘導性プロモーターに作動的に連結されている。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、対照培養物から得られた、ならびに、部位特異的プロテアーゼの発現の誘導を行った、およびこれを行わない部位特異的プロテアーゼ発現培養物から得られた細胞抽出物を用いた切断インキュベーションの後で取得された試料の、クーマシー染色されたポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）のゲルの画像を示す。
【００２５】
【図２】図２は、対照培養物から、周辺質に標的化された部位特異的エンテロキナーゼ培養物から、ならびに精製された組換えエンテロキナーゼから得られた細胞抽出物を用いた切断インキュベーションの後で取得された試料の、イムノブロットの画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
態様の詳細な説明
本明細書に記載されるシステム、組成物および方法は、目的の経路に関与する酵素と競合する標的酵素の遺伝子改変を介して代謝経路のフラックスを制御するために、遺伝子改変された細胞を操作することができるという概念に基づいており、これは、細胞増殖期の間の標的酵素の細胞濃度を維持または改変する遺伝子改変と、その後の、目的の経路の生成物が生成される生成期の間の活性な標的酵素の濃度を低下させる操作とを含む。生成期の間に、部位特異的プロテアーゼによる酵素の切断の結果として、標的酵素の不活化がもたらされる。部位特異的プロテアーゼは、内因性プロテアーゼであっても外因性プロテアーゼであってもよい。ある態様において、標的酵素は、部位特異的プロテアーゼにより切断されるモチーフ（例えば部位特異的プロテアーゼ認識部位）を含むように遺伝子改変される。
【００２７】
一部の態様において、部位特異的プロテアーゼの発現は誘導性である。ある態様において、部位特異的プロテアーゼは、部位特異的プロテアーゼが天然には存在しない細胞のまたは細胞外の区画（例えば細胞のまたは細胞外の区画）に再配置され、そのように再配置された場合には部位特異的プロテアーゼが標的酵素を不活化しないように、遺伝子改変される。ある態様において、部位特異的プロテアーゼは、プロテアーゼの周辺質への標的化、すなわち、プロテアーゼが細胞の周辺質に隔離される状態をもたらすペプチド配列を含むように、遺伝子改変される。
【００２８】
ある態様において、標的酵素は、目的の経路に関与する酵素と競合するものである。一部の態様において、標的酵素は、経路の入口酵素と競合する。ある態様において、標的酵素は、律速酵素と競合する。ある態様において、標的酵素は、目的の経路に前駆体が供給される速度を増大する酵素、または別の要求される基質もしくは補助因子を供給する酵素と競合する。
【００２９】
一部の態様において、ネイティブなカウンターパート酵素をコードする遺伝子は、標的酵素をコードするＤＮＡ配列により置き換えられる。ある態様において、ネイティブなカウンターパート酵素をコードする遺伝子は、ノックアウトされる（例えば、不活化されるか、または人工ＤＮＡにより置き換えられる）。ある態様において、標的酵素は、細胞内で過剰発現される（例えば、酵素発現が生理学的に正常な酵素の発現レベルを超えて増大させられる）。
【００３０】
ある態様において、標的酵素および／または部位特異的プロテアーゼは、エピソームベクターまたは染色体のいずれかに存在する。
【００３１】
ある態様において、細胞増殖培地は、標的酵素の活性を増大または保持する因子（例えば、栄養素、補助因子、還元剤）の添加または増強により改変されている。
【００３２】
一側面において提供されるのは、遺伝子改変された細胞であり、これは、再配置配列、例えば周辺質を標的とする配列を含むように改変された部位特異的プロテアーゼを含む。細胞は、切断により標的酵素を不活化する部位特異的プロテアーゼのための認識部位を導入するように遺伝子改変されている標的酵素をさらに含んでもよい。
【００３３】
別の側面において、このように遺伝子改変された細胞のライセートが提供される。目的の生成物を生成するためのセルフリーシステムを作製するために、ライセートを、基質、栄養素、補助因子、緩衝化剤、還元剤、ＡＴＰ生成システム、および／または他の剤の１または２以上と組み合わせてもよい。
【００３４】
別の側面において提供されるのは、目的の生成物を生成するための方法であって、該方法は、その再配置をもたらすペプチド配列を組み込むように遺伝子改変された部位特異的プロテアーゼを発現する細胞を増殖させること（ここで、部位特異的プロテアーゼのための認識配列を含む標的酵素を、前記細胞の細胞質において発現させる）、前記細胞を溶解して部位特異的プロテアーゼを標的酵素と接触させること、および、ライセートを含むセルフリーシステムにおいて経路の生成物を生成すること、を含む。さらなる基質、栄養素、補助因子、緩衝化剤、還元剤、ＡＴＰ生成システムおよび／または他の剤を、セルフリーシステムに添加してもよい。一態様において、目的の生成物は、高いフラックス速度で生成される。
【００３５】
さらに別の側面において提供されるのは、目的の生成物を生成するための方法であって、該方法は、少なくとも１の周辺質に標的化された部位特異的プロテアーゼを過剰発現するように遺伝子改変された細胞を増殖させること、前記細胞を溶解すること、およびライセートを含むセルフリーシステムにおいて目的の経路の生成物を生成することを含む。さらなる基質、栄養素、補助因子、緩衝化剤、還元剤、ＡＴＰ生成システムおよび／または他の剤をセルフリーシステムに添加してもよい。
【００３６】
生成方法
目的の生成物の高収率生成は、目的の経路を含む細胞質酵素が、例えば生理学的に正常なレベルで、または生理学的に正常なレベルよりも高く発現される細胞を提供することにより達成され、ここで、前記経路に関与する少なくとも１の標的酵素は、（ａ）正常なレベルで発現され、および（ｂ）部位特異的プロテアーゼのための不活化認識物を含む。一部の態様において、部位特異的プロテアーゼは、細胞において発現されるが、それが標的酵素と接触しない部位へ再配置される。
【００３７】
細胞培養の間に、周辺質に隔離されたプロテアーゼの活性に影響を及ぼす条件への暴露、例えば金属などへの暴露を避けるために、細胞の増殖培地の成分を制御することが望ましい場合がある。例えば、シキミ酸経路におけるDAHPシンターゼは、銅触媒酸化を介して不活化され得、したがって、利用可能な銅との競争に勝つために、増殖培地中のマンガンまたはマグネシウム金属などの補助因子の濃度を増大させることにより培養条件を改変することが望ましいことが見出されている（例えば、各々が本明細書に参照により組み込まれる、Bauerleら、J. Bacteriol. (1999) 181:1636-1642；およびStadtmanら、J. Biol. Chem. (1991) 266:2005-2008を参照）。したがって、ある態様において、周辺質または他の再配置された酵素の位置において酵素活性を増強するために、増殖培地において補助因子を提供するかまたは補助因子の濃度を改変する。
【００３８】
生成を目的として、細胞のライセートを利用し、ここで、周辺質に隔離された部位特異的プロテアーゼを、細胞質において発現された目的の経路の酵素と作動的に接触させる。細胞を、当該分野において既知であるように、酵素活性を実質的に維持する任意の簡便な方法、例えば超音波処理、フレンチプレスなどにより溶解する。ライセートは、分画しても、微粒子状物質を遠心分離により除去しても、またはさらなる処理工程なしに用いてもよい。細胞ライセートは、酵素活性のための必要に応じて、１または２以上の基質、酵素、栄養素、補助因子、緩衝化剤、還元剤および／またはＡＴＰ生成システムとさらに組み合わせてもよい。かかるシステムは、ある態様において、本明細書において「セルフリーシステム」、例えば、所与の順序において（例えば酵素経路において）、および既定の基質に対する所与の割合において作用する場合に、目的の化合物である生成物の有利な生成をもたらす酵素のまたは酵素のカスケードを合成するように特に操作された細胞のライセートまたは抽出物を含む単離された系として言及される場合がある。目的の化合物は、化学物質（例えば有機低分子）であってもよく、これは、医薬品有効成分（active pharmaceutical ingredient：API）、化学物質前駆体または中間体として用いることができる。
【００３９】
本明細書において用いられる場合、「基質」は、目的の化合物を合成するために必要とされる必要要素を提供することができる化合物または化合物の混合物である。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、「有機低分子」または「低分子」とは、８００ｇ／ｍｏｌ未満（例えば、７００ｇ／ｍｏｌ未満、６００ｇ／ｍｏｌ未満、５００ｇ／ｍｏｌ未満、４００ｇ／ｍｏｌ未満、３００ｇ／ｍｏｌ未満、２００ｇ／ｍｏｌ未満、１００ｇ／ｍｏｌ未満、５０ｇ／ｍｏｌ以上８００ｇ／ｍｏｌ以下、１００ｇ／ｍｏｌ以上８００ｇ／ｍｏｌ以下、または１００ｇ／ｍｏｌ以上５００ｇ／ｍｏｌ以下）の分子量を有する有機分子を指す。ある態様において、有機低分子は、薬物などの治療活性剤（例えば、連邦規制基準（ＣＦＲ）において提供されるもののような、米国食品医薬品局により承認された有機低分子）である。有機低分子はまた、金属を含んでもよい。この場合、有機低分子はまた、「有機金属低分子」として言及される。
【００４１】
本明細書において用いられる場合、「還元当量（reducing equivalent）」または「還元剤」は、酸化還元反応において１電子の当量を移動する化学種である。還元当量の例は、孤立電子（例えば、金属イオンを伴う反応において）、水素原子（陽子および電子からなる）、ならびに２個の電子を運搬する水素化物イオン（：Ｈ−）（例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を伴う反応において）である。「還元当量アクセプター」は、酸化還元反応において１電子の当量を受容する化学種である。
【００４２】
本明細書において用いられる場合、「アデノシン三リン酸再生システム」または「ＡＴＰ再生システム」は、アデノシン、ＡＭＰおよびＡＤＰをＡＴＰへ転換する化学または生化学システムである。ＡＴＰ再生システムの例として、ブドウ糖代謝、グルタミン酸代謝および光合成を伴うものが挙げられる。
【００４３】
異なる遺伝的背景（例えば先に改変または遺伝子操作されているもの）もしくは種の細胞のライセート、または異なる戦略により調製されたものを、混合して、細胞ライセートを用いるプロセスにおいて同時にまたは連続して用いてもよい。ライセートは、遊離であっても固定されていてもよく、当該プロセスの各々の段階において再使用されても廃棄されてもよい。例えば、ある態様において、細胞ライセートは、目的の経路における１または２以上の酵素を過剰発現するように操作されたE. coli生物のライセートである。ある態様において、細胞ライセートは、異なる細胞ライセートの組み合わせ、例えば、各々目的の経路における１または２以上の酵素を過剰発現するように操作された２、３、４、５、６、７、８、９または１０の異なるE. coli生物から得られた２、３、４、５、６、７、８、９または１０の異なる細胞ライセートの組み合わせである。
【００４４】
本明細書に記載される方法は、高収率の所望の生成物を提供し、この収率は、ネイティブな微生物宿主を用いて達成することができる収率よりも高い。生産性（すなわち、容積またはバイオマスの単位当たりの生成の速度）もまた、増大し得る。一態様において、生成物の収率は、基底速度の少なくとも約２倍、基底速度の少なくとも約５倍、基底速度の少なくとも約１０倍、基底速度の少なくとも約２５倍、基底速度の少なくとも約５０倍またはそれより高く、例えば基底速度の約２倍〜約１００倍高い。ある態様において、本発明の方法を用いた生成物の収率の速度は、約０．１〜２０グラムの生成物／Ｌ／ｈである。
【００４５】
多様な接種菌液を、多様な条件に対して適応させてもよく（例えば、２つの異なる炭素源に依存して増殖させた２つのバッチ）、または、多様な接種菌液が多様な遺伝子型を有していて、プロセスを実行するために（例えば、炭素源の混合物を同時に消費させるため、または２つの別々の細胞のバッチに分割される経路を介しての代謝物の連続処理のために）混合されてもよい。プロセスはまた、１セットの反応を１つの容器中で進行させて、次いで上清を第２の容器に移すことにより、逐次的に行ってもよい。
【００４６】
反応は、ラージスケールの反応器を利用しても、スモールスケールを利用しても、または複数の同時合成を行うために多重化してもよい。連続反応は、試薬のフローを導入するために、フィード機構を用いる場合があり、最終生成物をプロセスの一部として単離することができる。活発な合成のための期間を延長するためにさらなる試薬を経時的に導入することができるバッチシステムもまた興味深い。反応器は、バッチ、拡大バッチ（extended batch）、セミバッチ（semi-batch）、半連続的、フェドバッチ（fed-batch）、および連続などの任意のモードで運転することができ、これは、適用の目的に従って選択される。
【００４７】
反応は、任意の容積のものであってよく、小規模であっても（例えば、通常は少なくとも約１ｍｌであり約１５ｍｌ以下である）、またはスケールアップされた反応であってもよい（例えば反応容積が少なくとも約１５ｍｌ、通常は少なくとも約５０ｍｌ、より通常には少なくとも約１００ｍｌであり、５００ｍｌ、１０００ｍｌ、または数千リットルの容積まで大きくてもよい）。反応は、任意のスケールで行うことができる。
【００４８】
多様な塩および緩衝化剤が含まれていてもよく、ここで、イオン種は、生成物の生成に関して最適化されていてもよい。反応培地の特定の成分の濃度を変化させる場合、別の成分がそれに従って変化してもよい。また、反応器中の成分の濃度レベルは、経時的に変化してもよい。チオール／ジスルフィド酸化／還元電位の調整剤（adjuster）は、ジチオトレイトール、アスコルビン酸、グルタチオンおよび／またはこれらの酸化形態であってもよい。一般的な酸化還元電位の他の調整剤もまた用いることができる。
【００４９】
半連続操作モードにおいて、反応器は、透析、透析濾過（diafiltration）バッチまたはフェドバッチモードで運転してもよい。フィード溶液は、同じ膜または別々の注入ユニットを介して反応器に供給することができる。合成された生成物は、反応器中に蓄積され、次いで、システム運転の完了の後で、精製のための通常の方法に従って単離および精製される。あるいは、生成物は、連続または不連続モードのいずれかにおけるプロセスの間に取り除かれ、任意に、残りの化合物の一部または全てを反応器に戻す。
【００５０】
試薬のフローがある場合、液体のフローの方向は、膜に対して垂直および／または接線方向であってよい。接線方向のフローは、ＡＴＰをリサイクルするために、および膜が塞がれるのを防ぐために有効であり、垂直のフローに重なってもよい。膜に対して垂直のフローは、陽圧ポンプまたは真空吸引ポンプにより、または当該分野において既知の他の方法を用いて膜を貫通する圧力を適用することにより、生じさせるかまたは達成することができる。膜の外側表面と接触する溶液は、周期的に変化させてもよく、膜に対して一定の接線方向のフローであってもよい。反応器を、内部または外部から撹拌してもよい。
【００５１】
反応において生成される生成物の量は、多様な方法において、例えば、発色または蛍光の生成物を生成する酵素アッセイにより、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により、測定することができる。ある態様において、生成されている特定の生成物の活性または濃度を測定するアッセイを利用して、生成物を測定する。
【００５２】
目的の経路
本明細書において用いられる場合、用語「酵素経路」または「目的の経路」とは、基質を目的の生成物へと転換するための細胞または無細胞（セルフリー）のシステムを指し、ここで、該システムは、複数の酵素を含み、さらに、酵素の１または２以上により作用される基質、酵素触媒反応の生成物、酵素により利用される補助因子などを含んでもよい。システムは、完全な細胞において存在しても、細胞のライセート中に存在してもよい。微生物システムにおける多くの代謝経路が既知であって、記載されており、公共のデータベースにおいてアクセス可能である：例えば、Smolke編、The Metabolic 経路 Engineering Handbook: Tools and Applications, CRC Press, New York (2009)；Stephanopoulos、NielsenおよびAristidou編、Metabolic Engineering: Principles and Methodology, Academic Press, New York (1998)；Greenberg, Metabolic Pathways: Energetics, Tricarboxylic Acid Cycle, and Carbohydrates, Academic Press, New York (1967)；ならびにD.M. Greenbergの複数巻のシリーズである表題Metabolic Pathways、第１〜７巻を参照：これらの各々は本明細書に参照により組み込まれる。
【００５３】
目的の経路としては、炭水化物、アミノ酸、核酸、ステロイド、脂肪酸および天然生成物の生合成に関与する経路を含み、以下を含むがこれらに限定されない多様な化学化合物および材料の合成を包含する：
ａ）抗生物質；例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、リファマイシン、クロラムフェニコール、カルバペネム、テトラサイクリン、リンコマイシン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、サイクロセリン、バシトラシン、ペニシリン、セファロスポリン、バンコマイシン、ポリミキシンおよびグラミシジン；
ｂ）生物系界面活性剤；例えば、ラムノリピド（rhamnolipid）、ソホロリピド（sophorolipid）、糖脂質およびリポペプチド；
ｃ）生物燃料；例えば、バイオエタノール、バイオディーゼルおよびバイオブタノール；
ｄ）アミノ酸；例えば、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プロリン（ヒドロキシプロリン）、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−チロシンおよびＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン；
ｅ）有機酸；例えば、クエン酸、乳酸、グルコン酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、フマル酸およびイタコン酸；
ｆ）脂肪酸；例えば、アラキドン酸、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＢＡ）およびα−リノール酸；
ｇ）アルコールおよびポリオール；例えば、グリセロール、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸、イソブタノールおよびｌ−ブタノール；
ｈ）フレーバーおよびフレグランス；例えば、バニリン、ベンズアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、４−（Ｒ）−デカノリドおよび２−アセチル−１−ピロリン；
ｉ）ヌクレオチド；例えば、５’−グアニル酸および５’−イノシン酸；
ｊ）ビタミン；例えば、ビタミンＣ、ビタミンＦ、ビタミンＢ２、プロビタミンＤ２、ビタミンＢ１２、葉酸、ニコチンアミド、ビオチン、２−ケト−Ｌ−グロン酸およびプロビタミンＱ１０；
ｋ）色素；例えば、アスタキサンチン、β−カロテン、ロイコペン（leucopene）、モナスコルビン（monascorubrin）およびルブロプンクタチン（rubropunctatin）；
ｌ）糖および多糖；例えば、リボース、ソルボース、キサンタン、ジェランおよびデキストラン；ならびに
ｍ）バイオポリマーおよびプラスチック；例えば、ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ）、ポリ−γ−グルタミン酸および１，３−プロパンジオール。
【００５４】
目的の経路の他の例は、多様なE. coli代謝物の合成を含む。「代謝物」は、代謝の間に用いられるかまたは生成される任意の物質である（例えば、酵素、基質または生成物）。本明細書において、代謝物は、常にではないがしばしば目的の経路における酵素の生成物である。例示的なE. coli代謝物として、限定されないが、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２−ケトグルタル酸、３−ホスホグリセリン酸、４−ヒドロキシベンゾアート、６−ホスホグルコン酸、アセトアセチル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ、アセチルリン酸、アデニン、アデノシン、ホスホ硫酸アデノシン、ＡＤＰ、ＡＤＰ−グルコース、アラニン、ＡＭＰ、アントラニル酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、ＡＴＰ、アスパラギン酸カルバモイル（carbamylaspartate）、シス−アコニット酸、クエン酸、シトルリン、ＣＭＰ、コエンザイムＡ、ＣＴＰ、サイクリックＡＭＰ、シチジン、シトシン、ｄＡＭＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシリボース−５−Ｐ、ｄＧＭＰ、ジヒドロオロチン酸、硫酸ジヒドロキシアセトン、ｄＴＤＰ、ｄＴＴＰ、エリスロース−４−リン酸、ＦＡＤ、フラビンモノヌクレオチド、フルクトース−１，６−二リン酸、フルクトース−６−リン酸、フマル酸、ＧＤＰ、グルコン酸、グルコノラクトン、グルコサミン−６−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルコース−１−リン酸、グルタミン酸、グルタミン、グルタチオン、グルタチオンジスルフィド、グリセルアルデヒド−３−リン酸、グリセリン酸、グリセロール−３−リン酸、ＧＭＰ、ＧＴＰ、グアニン、グアノシン、ヒスチジン、ヒスチジノール、ホモシステイン、イノシン二リン酸、イノシン一リン酸、イノシン三リン酸、イソロイシン、リジン、リンゴ酸、マロニル−ＣｏＡ、メチオニン、ミオイノシトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン−１Ｐ、Ｎ−アセチル−オルニチン、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、オルニチン、オキサロ酢酸、フェニルアラニン、フェニルピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸、プロリン、プロピオニル−ＣｏＡ、ＰＲＰＰ、ピルビン酸、キノリン酸、リボフラビン、リボース−５−リン酸、リブロース−５−リン酸、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、セリン、シキミ酸、シキメート、コハク酸、スクシニル−ＣｏＡ、スレオニン、トリプトファン、チロシン、ＵＤＰ、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ウリジン、ＵＴＰ、バリン、およびキシルロース−５−リン酸が挙げられる。
【００５５】
ある態様において、目的の経路は、シキミ酸および／またはシキメート（シキメート（shikimate）は、シキミ酸（shikimic acid）のアニオン形態である）の合成、およびその合成中間体、イソプレノイドまたはテルペン（例えば、アモルファジエン（amorphadiene）、ファルネセン、リコピン、アスタキサンチン、ビタミンＡ、メントール、ベータ−カロテン）、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸、イソブタノールおよびｌ−ブタノールをもたらす。
【００５６】
多数の反応が、目的の経路における酵素により触媒され得る。括弧内に提供される酵素分類番号により同定することができる広範なクラスの酵素として、限定されないが、以下が挙げられる：
（ＥＣ１）酸化還元酵素；例えば、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、酸化還元酵素、シンターゼ、オキシゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、エポキシダーゼ、ヒドロキシラーゼ、デメチラーゼ、デサチュラーゼ、ジスムターゼ、ヒドロキシルトランスフェラーゼ、デハロゲナーゼおよびデヨードナーゼ；
（ＥＣ２）トランスフェラーゼ；例えば、トランスアミナーゼ、キナーゼ、ジキナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼ、ホルムイミノトランスフェラーゼ、カルボキシトランスフェラーゼ、カルバモイルトランスフェラーゼ、アミジノトランスフェラーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、パルミトイルトランスフェラーゼ、スクシニルトランスフェラーゼ、マロニルトランスフェラーゼ、ガロイルトランスフェラーゼ、シナポイルトランスフェラーゼ、チグロイルトランスフェラーゼ、テトラデカノイルトランスフェラーゼ、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、フェルロイルトランスフェラーゼ、ミコリル（mycolyl）トランスフェラーゼ、ベンゾリルトランスフェラーゼ、ピペロイルトランスフェラーゼ、トリメチルトリデカノイルトランスフェラーゼ、ミリストイルトランスフェラーゼ、クマロイルトランスフェラーゼ、チオラーゼ、アミノアシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ヘキソシルトランスフェラーゼ、ペントシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、ピリジニラーゼ、ジホスホリラーゼ、シクロトランスフェラーゼ、スルフリラーゼ、アデノシルトランスフェラーゼ、カルボキシビニルトランスフェラーゼ、イソペンテニルトランスフェラーゼ、アミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼ、ジメチルアリルトランスフェラーゼ、ファルネシルトランストランスフェラーゼ、ヘキサプレニルトランストランスフェラーゼ、デカプレニルシストランスフェラーゼ、ペンタプレニルトランストランスフェラーゼ、ノナプレニルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、アミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼ、オキシイミノトランスフェラーゼ、プリントランスフェラーゼ、ホスホジスムターゼ、ホスホトランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、コリンホスホトランスフェラーゼ、ホスホリルムターゼ、スルファートランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼおよびＣｏＡ−トランスフェラーゼ；
（ＥＣ３）ヒドロラーゼ；例えば、リパーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、ヒドロラーゼ、ラクトナーゼ、デアシラーゼ、デアセチラーゼ、フェオホルビダーゼ（pheophorbidase）、デポリメラーゼ、チオールエステラーゼ、ホスファターゼ、ジホスファターゼ、トリホスファターゼ、ヌクレオチダーゼ、フィターゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、スルファターゼ、シクラーゼ、オリゴヌクレオチダーゼ、リボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、ヌクレオシダーゼ、グリコシラーゼ、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、オメガ−ペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、スレオニンエンドペプチダーゼ、アミナーゼ、アミダーゼ、デスクシニラーゼ、デホルミラーゼ、アシラーゼ、デイミナーゼ、デアミナーゼ、ジヒドロラーゼ、シクロヒドロラーゼ、ニトリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、ＧＴＰアーゼ、ハリダーゼ（halidase）、デハロゲナーゼおよびスルホヒドロラーゼ；
（ＥＣ４）リアーゼ；例えば、デカルボキシラーゼ、カルボキシラーゼ、カルボキシキナーゼ、アルドラーゼ、エポキシリアーゼ（epoxylyase）、オキソ酸リアーゼ、炭素−炭素リアーゼ、デヒドラターゼ、ヒドラターゼ、シンターゼ、エンドリアーゼ、エキソリアーゼ、アンモニアリアーゼ、アミジンリアーゼ、アミンリアーゼ、炭素−硫黄リアーゼ、炭素−ハライドリアーゼ、リン−酸素リアーゼおよびデヒドロクロリナーゼ（dehydrochlorinase）；
（ＥＣ５）イソメラーゼ；例えば、イソメラーゼ、ラセマーゼ、ムターゼ、トートメラーゼ、ホスホムターゼ、ホスホグルコムターゼ、アミノムターゼ、シクロイソメラーゼ、シクラーゼ、トポイソメラーゼ；ならびに
（ＥＣ６）リガーゼ；例えば、シンテターゼ、ｔＮＲＡ−リガーゼ、酸−チオールリガーゼ、アミドシンターゼ、ペプチドシンターゼ、シクロリガーゼ、カルボキシラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼおよびシクラーゼ。
【００５７】
より具体的なクラスの酵素として、限定されないが、以下に提供するような酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼのサブクラスが挙げられる。
【００５８】
例示的な酸化還元酵素として、限定されないが、以下が挙げられる：
（ＥＣ１．１）ドナーのＣＨ−ＯＨ基およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．２）ドナーのアルデヒドまたはオキソ基およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．３）ドナーのＣＨ−ＣＨ基およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．４）ドナーのＣＨ−ＮＨ２基およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．５）ドナーのＣＨ−ＮＨ基およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．６）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨおよびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．７）ドナーとしての他の窒素含有化合物およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．８）ドナーの硫黄基およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．９）ドナーのヘム基およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．１）ドナーとしてのジフェノールおよび関連する物質およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．１１）アクセプターとしてのぺルオキシドに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．１２）ドナーとしての水素およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．１３）１または２個の酸素原子を組み込む分子酸素の組み込みを伴う単独ドナーに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．１４）分子酸素の組み込みまたは還元を伴い、ドナーが２−オキソグルタル酸、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、還元フラビン、フラボタンパク質、プテリジン、鉄−硫黄タンパク質、アスコルビン酸である、対のドナーに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．１５）アクセプターとしてのスーパーオキシドラジカルに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．１６）金属イオンおよびアクセプターを酸化する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．１７）ＣＨまたはＣＨ２基、およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．１８）ドナーとしての鉄−硫黄タンパク質およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．１９）ドナーとしての還元フラボドキシンおよびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；
（ＥＣ１．２）ドナー中のリンまたはヒ素およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；ならびに
（ＥＣ１．２１）Ｘ−Ｙ結合を形成するＸ−ＨおよびＹ−Ｈ、およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素；ここで、各々のドナー分類についてのアクセプターとして、限定されないが、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ヘムタンパク質、酸素、ジスルフィド、キノン、鉄−硫黄タンパク質、フラビン、窒素含有基、チトクロム、二窒素、およびＨ＋が挙げられ得る。
【００５９】
例示的なトランスフェラーゼとして、限定されないが、以下が挙げられる：
（ＥＣ２．１）１炭素基を転移するトランスフェラーゼ；
（ＥＣ２．２）アルデヒドまたはケトン基を転移するトランスフェラーゼ；
（ＥＣ２．３）アシルトランスフェラーゼ；
（ＥＣ２．４）グリコシルトランスフェラーゼ；
（ＥＣ２．５）メチル基以外のアルキルまたはアリール基を転移するトランスフェラーゼ；
（ＥＣ２．６）窒素含有基を転移するトランスフェラーゼ；
（ＥＣ２．７）リン含有基を転移するトランスフェラーゼ；
（ＥＣ２．８）硫黄含有基を転移するトランスフェラーゼ；ならびに
（ＥＣ２．９）セレン含有基を転移するトランスフェラーゼ。
【００６０】
例示的なヒドロラーゼとして、限定されないが、以下が挙げられる：
（ＥＣ３．１）エステル結合に対して作用するヒドロラーゼ；
（ＥＣ３．２）グリコシラーゼ；
（ＥＣ３．３）エーテル結合に対して作用するヒドロラーゼ；
（ＥＣ３．４）ペプチド結合に対して作用するヒドロラーゼ（ペプチダーゼ）；
（ＥＣ３．５）ペプチド結合以外の炭素−窒素結合に対して作用するヒドロラーゼ；
（ＥＣ３．６）酸無水物に対して作用するヒドロラーゼ；
（ＥＣ３．７）炭素−炭素結合に対して作用するヒドロラーゼ；
（ＥＣ３．８）ハライド結合に対して作用するヒドロラーゼ；
（ＥＣ３．９）ゼリン−窒素結合に対して作用するヒドロラー；
（ＥＣ３．１）硫黄−窒素結合に対して作用するヒドロラーゼ；
（ＥＣ３．１１）炭素−リン結合に対して作用するヒドロラーゼ；
（ＥＣ３．１２）硫黄−硫黄結合に対して作用するヒドロラーゼ；ならびに
（ＥＣ３．１３）炭素−硫黄結合に対して作用するヒドロラーゼ。
【００６１】
例示的なリアーゼとして、限定されないが、以下が挙げられる：
（ＥＣ４．１）炭素−炭素リアーゼ；
（ＥＣ４．２）炭素−酸素リアーゼ；
（ＥＣ４．３）炭素−窒素リアーゼ；
（ＥＣ４．４）炭素−硫黄リアーゼ；
（ＥＣ４．５）炭素−ハライドリアーゼ；ならびに
（ＥＣ４．６）リン−酸素リアーゼ。
【００６２】
例示的なイソメラーゼとして、限定されないが、以下が挙げられる：
（ＥＣ５．１）ラセマーゼおよびエピマラーゼ；
（ＥＣ５．２）シス−トランス−イソメラーゼ；
（ＥＣ５．３）分子内イソメラーゼ；
（ＥＣ５．４）分子内トランスフェラーゼ（ムターゼ）；ならびに
（ＥＣ５．５）分子内リアーゼ。
【００６３】
例示的なリガーゼとして、限定されないが、以下が挙げられる：
（ＥＣ６．１）炭素−酸素結合を形成するリガーゼ；
（ＥＣ６．２）炭素−硫黄結合を形成するリガーゼ；
（ＥＣ６．３）炭素−窒素結合を形成するリガーゼ；
（ＥＣ６．４）炭素−炭素結合を形成するリガーゼ；
（ＥＣ６．５）リン酸エステル結合を形成するリガーゼ；ならびに
（ＥＣ６．６）窒素−金属結合を形成するリガーゼ。
【００６４】
アイソザイム（イソ酵素としても知られる）は、アミノ酸配列が異なるが、同じ化学反応を触媒する酵素である。目的の経路における幾つかの点において、２または３以上のアイソザイムが存在してもよい。アイソザイムは、異なる動力学的パラメーター、および／または異なる調節特性を示してもよい。
【００６５】
目的の経路または関連する経路に関与する酵素はまた、酵素の役割に従って分類することができる。細胞または細胞ライセートにおける直接関与酵素（クラス１）は、経路における反応を触媒する。これは、かかる直接的酵素が鎖の一つであり、第１の酵素の生成物が第２の酵素の基質であり、第２の酵素の生成物が第３の酵素の基質であり、以下同様であり、これが最終的に目的の生成物を生じる経路に典型的である。細胞または細胞ライセートにおける間接関与酵素（クラス２）は、関連する経路において、通常は目的の経路において用いられる基質の生成において、反応する。
【００６６】
経路内において、酵素は、ターンオーバー速度および生成物が生成される効率において異なる。結果として、経路におけるある酵素が律速となる。経路における律速酵素の濃度を増大させる（非律速酵素と比較して）ことにより、目的の経路全体のフラックスを増大させることが可能になる（例えば、本明細書に参照により組み込まれるZamboniら、Nature Protocols (2009) 4:878-892を参照）。しばしば、律速酵素は、過剰に精製された場合に毒性を伴い、したがって、かかる酵素の利用可能な濃度は、望ましくは調節される。例えば、本明細書に参照により組み込まれるＰＣＴ公開番号WO 2010/077806を参照。
【００６７】
細胞または細胞ライセートにおける第３のクラスの酵素は、競合酵素（クラス３）であり、これは、目的の経路の基質または生成物を利用する。競合酵素の特徴は、基質の転換の動力学が、当該酵素の存在が、目的の経路により触媒される所望の最終生成物の全体的な収率および／または生成の速度を低下させるのに十分高いことである。正常な細胞は、競合酵素の発現を必要とする場合があり、したがって、競合酵素の発現を完全にノックアウトするよりも、むしろ、本明細書に記載される方法により活性な酵素の濃度を選択的に低下させることが望ましい。
【００６８】
命名の利便性のために、経路における酵素を、第１の経路入口酵素（pathway entry enzyme）、または続く下流の酵素として分類することができる。利便性のために、経路入口酵素を、本明細書においてＥ１として言及し、下流の酵素を、続けてＥ２、Ｅ３、...Ｅｎとナンバリングすることができる。本明細書に記載される方法において用いられるための目的の経路は、通常は、少なくとも１の酵素、少なくとも２の酵素、少なくとも３の酵素、少なくとも４の酵素、またはそれより多く、例えば、１以上５０以下の酵素、１以上４０以下の酵素、１以上３０以下の酵素、１以上２０以下の酵素、１以上１０以下の酵素、１以上５以下の酵素、１以上２以下の酵素、２以上５０以下の酵素、２以上４０以下の酵素、２以上３０以下の酵素、２以上２０以下の酵素、２以上１０以下の酵素、２以上５以下の酵素、２以上４以下の酵素、５以上５０以下の酵素、５以上４０以下の酵素、５以上３０以下の酵素、５以上２０以下の酵素、５以上１０以下の酵素、５以上８以下の酵素、１０以上５０以下の酵素、１０以上４０以下の酵素、１０以上３０以下の酵素、または１０以上２０以下の酵素を含む。
【００６９】
経路における酵素は、天然に存在するものであっても、特定の目的の特徴、例えば、基質特異性、反応動力学、可溶性、および／またはフィードバック阻害に対する非感受性を最適化するように改変されていてもよい。さらに、一部の場合において、酵素を発現する遺伝子を、宿主再細胞内でのコドン使用のために最適化する。一部の態様において、完全な経路は、単一の生物からの酵素を含むが、これは必須ではなく、複数の生物からの酵素を組み合わせることもまた企図される。幾つかの目的のために、経路は、宿主細胞にとって内因性であってよいが、これもまた必須ではなく、完全な経路または経路の成分を、宿主細胞内に導入してもよい。システムが完全な細胞において提供される場合、目的の経路の酵素の完全なセットが、細胞内に存在することができる。セルフリー生成を目的として、経路を完成させるために、１または２以上の酵素をライセートに添加しても、あるいは、これらをライセートにより生成させてもよい。酵素は、単離および／または精製されていてもよい。
【００７０】
経路のシステムにおいて、第１の基質（Ｓ１）は、経路入口酵素により作用され、第１の生成物に転換されるが、１つの酵素が、１つより多くの基質に対して同時に作用し得、１つより多くの生成物を生成し得ること、およびその結果として２または３以上の経路が単一の酵素において相互接続し得ることが、当業者により理解されるであろう。第１の生成物は、下流の酵素Ｅ２のための基質（Ｓ２）であり、Ｅ２により第２の生成物に転換される。経路の複雑性に依存して、第２の生成物は、最終生成物（ＰＦ）である場合もあり、第３の下流の酵素（Ｅ３）のための基質であり、Ｅ３により第２の生成物に転換され、これが第４の酵素のための基質（Ｓ４）となる場合もある。経路における最終の酵素は、例えばＥ２、Ｅ３またはＥ４であり得、目的の生成物（ＰＦ）を生成する。酵素の生成物が次の酵素のための基質であることは、酵素経路の特徴である。
【００７１】
生成物は、安定である場合も、相対的に不安定である場合もあるが、一部の場合において、最終生成物は、細胞、細胞ライセートまたは反応混合物から単離することができるために十分に安定である。競合酵素は、目的の経路の基質または生成物を利用し、これは、ＰＦ、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３および／またはＳ４のいずれか一つを含み得、競合酵素（ＥＣ）として言及される場合がある。
【００７２】
一部の態様において、初めの基質Ｓ１は、中心的な代謝物、または細胞の「日用品（commodity）」である。代謝の中心的経路は、解糖およびクエン酸回路を含む。かかるＳ１化合物は、目的の経路に対して特異的でなくともよく、多様な細胞において広範に見出される化合物であり、複数の酵素および経路のための基質である。日用品的基質の例として、限定することなく、ブドウ糖、ＡＴＰ、ピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸などが挙げられる。経路入口酵素Ｅ１は、日用品的基質を、１つまたは比較的少数の酵素のための選択的基質である生成物へと転換する。一部の態様において、Ｓ１化合物または細胞の日用品を、細胞ライセートに添加する。
【００７３】
一部の態様において、重要な入口酵素は、目的の生成物への経路における第１の関連工程を行うものとして定義される。この工程は、目的の生成物の経路に対する化合物の生化学的関与を伴い得る。重要な入口酵素の例として、限定されないが、表１において記載されるものが挙げられる。
【表１】
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【００７４】
説明を目的として提供される特定の経路の非限定的な例は、シキミ酸の合成のための経路である。この経路において、例えば、細胞の日用品的化合物であるホスホエノールピルビン酸（Ｓ１Ａ）とエリスロース−４−リン酸（Ｓ１Ｂ）との反応は、酵素ＤＡＨＰシンターゼ（Ｅ１）により触媒されて３−デオキシ−Ｄ−アラビノースヘプツロン酸−７−リン酸（ＤＡＨＰ）を生成する。ＤＡＨＰ（Ｓ２）は、経路における第２の酵素であるＤＨＱシンターゼ（Ｅ２）により、３−デヒドロキナ酸（３−ＤＨＱ）に転換される。３−ＤＨＱ（Ｓ３）は、経路における第３の酵素である３−ＤＨＱデヒドラターゼ（Ｅ３）により、３−デヒドロシキメートに脱水される。３−デヒドロシキメート（Ｓ４）は、経路における第４の酵素であるシキミ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ４）により、補助因子としてＮＡＤＰＨを用いて、シキミ酸（ＰＦ）に還元される。当該経路の酵素は、当該分野において既知であり、例えばE. coliを含む多数の生物において特徴づけられており、ここで、酵素は、以下の遺伝子座によりコードされる：ＤＡＨＰシンターゼ（aroG、aroF、aroH）；ＤＨＱシンターゼ（aroB）；３−ＤＨＱデヒドラターゼ（aroD)；シキミ酸デヒドロゲナーゼ（aroE）；例えば、本明細書に参照により組み込まれるＰＣＴ公開番号WO2010/074760を参照。
【００７５】
代謝フラックス
「フラックス」または「代謝フラックス」とは、分子が目的の経路または反応を通過する速度を指す。フラックスを制御する因子の中には、経路における酵素の触媒の速度、基質のアベイラビリティー、細胞における酵素の濃度、および／または経路における酵素の近接度がある。
【００７６】
目的の経路全体における高速のフラックスが望ましい一方で、同時にこれは、通常では細胞において高レベルで蓄積しない生成物が、正常な条件下において生じるものと比較して高速で生成される場合に、毒性の問題を生じ得る。高速のフラックスは、経路特異的であり、経路の生成物の経時的な濃度、例えば、約０．１グラム（ｇ）〜約２０ｇの生成物／Ｌ／ｈの速度での生成物の生成を指すことが理解される。一部の態様において、生成物生成の速度は、約０．５、約１、約２、約５、約１０または約１５グラムの生成物／Ｌ／ｈである。
【００７７】
フラックス速度を決定する方法は、当該分野において既知であり用いられている：例えば、Wiechertら、Metab. Eng. (2001) 3:265-283；Wiechertら、Metab. Eng. (2001)3:195-206；ならびにLeeおよびPapoutsakis編、Metabolic Engineering, Marcel Dekker, Inc. New York (1999)；Stephanopoulos、NielsenおよびAristidou編、Metabolic Engineering: Principles and Methodology, Academic Press, New York (1998)；ならびにNielsenおよびEggeling編、Metabolic Engineering, Springer, London (2001)などの代謝工学のテキストを参照：これらの各々は、本明細書に参照により組み込まれる。フラックスは、例えばアイソトープ標識された基質の転換速度の直接測定による、代謝フラックス分析（ＭＦＡ）などの技術を用いて、測定可能な量から計算することができる。
【００７８】
部位特異的プロテアーゼ
本明細書において用いられる場合、当該用語は、特異的なアミノ酸モチーフで選択的に切断するプロテアーゼ、例えばエンドプロテアーゼを指す。一部の態様において、アミノ酸モチーフは、バックグラウンドのタンパク質切断を低減するために、少なくとも４アミノ酸残基のモチーフであり、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸またはそれより多いアミノ酸のモチーフであってよい。かかるプロテアーゼは、当業者に既知であり、限定することなく、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ（ＥＮＬＹＦＱＧ／Ｓ）；黄熱病ウイルスプロテアーゼ（ＧＡＲＲＧ／Ｓ）；トロンビン（ＬＶＰＲＧＳ）；ならびにＸａ因子（ＩＥ／ＤＧＲ）を含む。
【００７９】
ある態様において、本明細書に記載されるのは、周辺質に再配置される配列を有する部位特異的プロテアーゼを生成する方法である。各々の部位特異的プロテアーゼをコードする遺伝子の合成により、E. coli細胞における発現のためのコドンの最適化が可能となる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当業者が精通する他の方法を、周辺質再配置配列の付加のために用いることができる。遺伝子を、制御された発現を可能にするベクター（例えば、pETシリーズからのベクターなどの、T7誘導系を用いて制御される発現を可能にするベクター）中にサブクローニングする。
【表２】
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【００８０】
ある態様において、部位特異的プロテアーゼコード配列を、微生物細胞内に導入する。部位特異的プロテアーゼコード配列は、構成的プロモーターまたは調節可能プロモーター、例えば誘導性プロモーターに作動的に連結されていてもよく、これは、本明細書において部位特異的プロテアーゼ発現コンストラクトとして言及される場合がある。部位特異的プロテアーゼ発現コンストラクトは、当該分野において既知であるように、エピソームベクター、例えばプラスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣまたはウイルスベクターにおいて提供される。あるいは、部位特異的プロテアーゼ発現コンストラクトは、微生物宿主細胞の染色体中に組み込まれてもよい。
【００８１】
一部の態様において、部位特異的プロテアーゼの発現速度は、細胞の外へまたは細胞の周辺質中へのプロテアーゼの搬出の効率を最適化するために、実験的に調整される。少ない輸送は、不十分な搬出機構の能力から生じ得る。発現速度の調整のための方法として、限定することなく、周辺質へ搬出されるべき部位特異的プロテアーゼをコードする遺伝子を運搬するプラスミドのコピー数の改変が挙げられる。当該分野において既知であり用いられるレプリコンとして、P15A（１０コピー／細胞）、ColA（３０コピー／細胞）、ColE1（４０コピー／細胞）およびRSF1030（＞１００コピー／細胞）が挙げられる。周辺質に搬出されるべき部位特異的プロテアーゼをコードする遺伝子の５’ＵＴＲにおけるリボソーム結合部位を改変してもよく、ここで、様々な強度を有するリボソーム結合部位のライブラリーを作製して、本明細書に記載される態様における使用のために試験することができる。各々が本明細書に具体的に参照により組み込まれるNature Biotechnology 27: 946-950, 2009；Nature Biotechnology 14:629, 1996を参照。タンパク質、例えば搬出されるべき部位特異的プロテアーゼをコードする遺伝子の上流のプロモーター領域を、転写の速度を調整するために改変してもよく、ここで、様々な強度を有するプロモーター領域のライブラリーを作製して、本明細書に記載される態様における使用のために試験することができる。各々が本明細書に具体的に参照により組み込まれるPNAS 102:12678-12683, 2005；BMC Biotechnology 7:34, 2007を参照。
【００８２】
プロテアーゼ切断部位
上記のように、部位特異的プロテアーゼは、配列特異的な様式で、例えばＥＮＬＹＦＱＧ／Ｓ、ＧＡＲＲＧ／Ｓ、ＬＶＰＲＧＳまたはＩＥ／ＤＧＲで、標的酵素を切断する。本明細書に記載される方法は、部分的に、部位特異的プロテアーゼ消化および結果としての不活化に対して不安定な標的酵素を作製するために、標的となる遺伝子配列の改変を利用する。さらに、部位特異的プロテアーゼは、目的の経路の酵素がプロテアーゼにより切断されないように選択してもよい。
【００８３】
部位特異的プロテアーゼ切断の標的となる酵素は、目的の経路における酵素と競合する酵素、例えば、経路の基質または生成物を利用し、それにより経路全体のフラックスを低下させるかまたは所望の生成物の生成を減少させる酵素であってもよい。標的酵素は、部位特異的プロテアーゼ切断部位を作製するために、例えば保存的なアミノ酸の変更によるかまたはアミノ酸の変更なしの中性置換により、アミノ酸の挿入または置換により改変してもよい。「中性置換」により、モチーフ（例えば、部位特異的プロテアーゼ認識部位）内のある位置におけるアミノ酸を標的酵素の活性を維持するアミノ酸により置換することが意図される。かかるアミノ酸配列は、「プロテアーゼ不安定配列」として言及される場合がある。ある態様において、切断のための部位は、切断の後で標的酵素の活性が破壊されるように選択される。一部の態様において、酵素の活性は、完全（例えば、１００％不活性であるかまたは１００％低下する）には破壊されず、９９％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％または約５０％低下する。一部の態様において、標的酵素は、酵素活性のレベルが、標的酵素が目的の経路における酵素と競合することができないレベルである場合、不活性であるとみなされる。
【００８４】
標的酵素は、目的の生成物からフラックスを迂回／減速させる酵素、または目的の生成物からフラックスを流用する副反応を触媒する酵素を同定するための経路分析により、選択してもよい。第１に、これらの酵素活性を、細胞増殖に有害な影響を及ぼすことなく宿主株から取り除くこと（例えばゲノムノックアウトを介して）ができるか否かを決定することができる。酵素活性の完全な除去が、宿主の代謝の健康に実質的に有害であるかまたは他に負の影響を及ぼす場合、この活性を担っている酵素は、再配置される部位特異的プロテアーゼによる分解の標的となる。この方法において、目的の生成物に対するフラックスは増大し得る。
【００８５】
一部の態様において、様々な位置に挿入されたプロテアーゼ切断部位を有する標的酵素の配列のライブラリーを、初めに作製して、最適な部位特異的認識部位および／または部位の配置を決定する。標的酵素の構造（例えば三次構造）に基づいて、例えば部位特異的認識部位を表面に露出したループ領域中に挿入することにより、位置を選択することができる。標的酵素についての構造的情報が利用可能でない場合、認識部位の配置は、標的酵素の相同体のアミノ酸配列を比較して、配列および長さの可変性が高い親水性領域を同定することにより、決定することができる。親水性残基は、一般に、酵素の表面に露出し、配列および長さの可変性が高いことは、当該領域が酵素の機能のために決定的ではなく、配列の改変を許容し得ることを示し得る。例えば、本明細書に参照により組み込まれるJournal of Virology 78:5079, 2004；米国特許7223390を参照。これは、制限されたタンパク質分解消化とその後のクロマトグラフィーによる共分画およびＮ末端ポリペプチドのシークエンシング／質量分析とを用いて、プロテアーゼ消化に対してアクセス可能であり、完全な酵素／タンパク質構造を形成するために不可欠ではない候補部位を決定することができることを教示する。
【００８６】
部位特異的認識部位を導入するための標的酵素のアミノ酸配列の改変は、当該分野において既知の遺伝子操作の方法により、例えば、ＰＣＲに基づく、およびライゲーションに基づく方法を用いて、または当業者に既知のゲノム改変の方法により、達成することができる。例えば、各々が本明細書に具体的に参照により組み込まれるPhusion部位特異的（Site-Directed）変異誘発キット（New England Biolabs）；Journal of Virological Methods 149:85, 2008；Nucleic Acids Research 32:e174, 2004；Journal of Bacteriology 180: 2063, 1998；Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97:6640, 2000を参照。
【００８７】
周辺質への隔離
一部の態様において、部位特異的プロテアーゼの再配置は、細胞の周辺質空間へのものである。かかる側面において、本明細書に記載されるのは、細胞を作製する方法、ライセート、およびそれらの使用であり、それにより、プロテアーゼは、プロテアーゼの周辺質への標的化をもたらすペプチド再配置配列を組み込むように、遺伝子改変される。周辺質再配置配列（また、本明細書において、標的化ペプチド配列、標的化シグナル、シグナルペプチドまたはシグナル配列としても言及される）は、一部の態様において、細菌の分泌タンパク質のＮ末端に見出される。それらの長さは、約１５〜約７０アミノ酸で変化する。アミノ酸の一次配列もまた変化するが、以下の部分を含む共通の全体構造を有していてもよい：（ｉ）可変性の長さを有し、例えば正味の負の電荷を帯びるＮ末端；（ｉｉ）約６〜約１５アミノ酸の中心の疎水性コア；ならびに（ｉｉｉ）シグナルペプチダーゼのための切断部位を規定する約４〜約６アミノ酸。
【００８８】
本明細書における使用のために好適な周辺質再配置配列は、グラム陰性細菌において分泌されるタンパク質から誘導してもよい。分泌されるタンパク質は、細菌により、または細菌に感染するバクテリオファージによりコードされていてもよい。分泌タンパク質の好適なグラム陰性細菌ソースの例として、限定されないが、属Escherichia、Pseudomonas、Klebsiella、Salmonella、Caulobacter、Methylomonas、Acetobacter、Achromobacter、Acinetobacter、Aeromonas、Agrobacterium、Alcaligenes、Azotobacter、Burkholderia、Citrobacter、Comamonas、Enterobacter、Erwinia、Rhizobium、VibrioおよびXanthomonasのメンバーが挙げられる。
【００８９】
細胞膜を超えるタンパク質の輸送のための３つの経路が存在する：（ｉ）SecB依存性のもの、（ｉｉ）シグナル認識粒子（ＳＲＰ）、および（ｉｉｉ）双アルギニン輸送（ＴＡＴ）経路。SecB依存性およびシグナル認識粒子の経路は、いずれも、SecYEGトランスロコンを使用する。双アルギニン輸送経路は、TatABCE複合体を使用する。SecB依存性の輸送が最も一般的に用いられるが、この経路は、折りたたまれたタンパク質を輸送することができない。迅速な細胞質での折りたたみは、ＴＡＴ経路の使用を必要とする場合がある。細菌により分泌される周辺質再配置配列を有するタンパク質の例として、限定されないが、以下の遺伝子によりコードされるタンパク質が挙げられる：ompA、geneIII、E. coli アルカリホスファターゼ、lamB、malE、secE、secYおよびprlA-4。当業者は、これらのタンパク質および他の細菌により分泌されるタンパク質の各々のＮ末端に配置された、周辺質再配置配列を同定することができる。また、当業者により、周辺質再配置配列において、周辺質への標的化機能を保持させたまま、幾つかのアミノ酸の置換、付加および／または欠失を行い得ることが知られている。したがって、本明細書に記載される機能的な周辺質再配置配列は、完全に天然の配列であっても改変された配列であってもよい。
【００９０】
一部の態様において、部位特異的プロテアーゼは、細胞質外の位置に再配置される。細菌細胞における分泌のためのシグナルは、当該分野において既知であり、例えば、B. subtilisにおけるsecおよびTatトランスロコンである（概説については、各々が本明細書に具体的に参照により組み込まれるBuistら（2006年）Microbiology 152(Pt 10):2867-74；およびTjalsmaら（2004年）Microbiol Mol Biol Rev. 68(2):207-33を参照）。細菌細胞からのClyA搬出もまた当該分野において既知であり、例えば、本明細書に参照により組み込まれるLudwigら（2010年）J Bacteriol. 192(15):4001-11を参照する。
【００９１】
他の態様において、部位特異的プロテアーゼは、核の区画へ再配置される。核への再配置のためのペプチドシグナルは、当該分野において既知であり、例えば、SV40ラージＴ細胞抗原ペプチド：ＰＫＫＫＲＫＶ（Kalderonら（1984年）Cell 39 (3 Pt 2): 499-509を参照）；およびヌクレオプラスミンペプチドＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（Dingwallら（1988年）J Cell Biol. 107 (3): 841-9を参照）。他の態様において、局在は、チラコイド膜に対して行われてもよく、例えば、各々が本明細書に具体的に参照により組み込まれるSchnell（1998年）Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology Vol. 49: 97-126；KoおよびCashmore（1989年）EMBO J. 8(11): 3187-3194；de Boerら（1991年）EMBO J. 10(10): 2765-2772；ならびに MackleおよびZilinskas（1994年）J. Bacteriol. 176(7):1857-1864を参照のこと。
【００９２】
本明細書に記載される融合タンパク質は、周辺質再配置配列および／または部位特異的プロテアーゼを含んでもよい。ある態様において、部位特異的プロテアーゼのために最適な周辺質再配置配列は、かかる配列の選択肢から経験的に決定される。部位特異的プロテアーゼの分泌の効率は、再配置配列、再配置されるプロテアーゼ、用いられる宿主細胞株、プロテアーゼ発現レベルおよび他のパラメーターを含む多様なパラメーターに依存し得る。例えば、様々な５’領域を有する異なる周辺質再配置配列をコードする改変された遺伝子のライブラリーを、ＰＣＲまたは当業者に既知の他の方法を用いて作製することができる。このライブラリーを、制御発現を可能にするベクター（例えば、pETシリーズからのベクターなどの、Ｔ７誘導システムを用いる制御発現を可能にするベクター）中にサブクローニングし、搬出の効率ならびにタンパク質活性について試験する（各々が本明細書に具体的に参照により組み込まれるJ. Biol. Chem. 267:4882, 1992；J. Biol. Chem. 267:12375, 1992；US2007/0111283 A1およびBiotechnology Advances 23:177, 2005を参照）。
【００９３】
周辺質再配置配列の例として、限定されることなく、以下が挙げられる：
【表３】
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【００９４】
切断部位は、任意に、分離を可能にするために、再配置配列と部位特異的プロテアーゼとの間に配置される。切断部位は、再配置配列と部位特異的プロテアーゼコード配列とを分離する上で用いることができる任意の部位であってよい。タンパク質切断のための任意の方法を利用する任意の切断部位を用いることができる。E. coliからの周辺質再配置配列は、そのシグナル配列内に、シグナル配列のプロセッシングおよび切断のための、リーダーペプチダーゼLepにより認識されるモチーフを含んでもよい。首尾よく用いられてきた当業者に周知の他の方法として、プロテアーゼ切断方法、例えば、トロンビン、Ｘａ因子プロテアーゼ、およびトリプシンなどの他のエンドペプチダーゼが挙げられる。融合タンパク質をコードする遺伝子は、再配置配列とプロテアーゼ配列との間にこれらのプロテアーゼのいずれかのための切断部位を含むように合成してもよい。融合および切断のための別のシステムは、インテイン／キチン結合ドメインシステム（S. Chongら、Gene, Vol. 192, 271-281（1997））である。このシステムは、インテインタンパク質の自己切断特性を利用する。
【００９５】
核酸、ポリペプチドおよび細胞
本明細書に記載されるように使用される核酸は、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ（ＲＮＡｉとしてもまた知られる）、アンチセンス核酸、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、人工染色体、ウイルス、またはこれらのハイブリッドのいずれであっても、多様なソースから単離し、遺伝子操作し、増幅し、および／または組換えにより発現／生成することができる。本明細書に記載される態様に関連する標的酵素または部位特異的プロテアーゼのいずれかをコードする核酸分子を、当該分野において既知の方法および技術を用いて細胞内に導入することができる。例えば、化学的形質転換（chemical transformation）およびエレクトロポレーションを含む形質転換、形質導入ならびに微粒子銃などの標準的なプロトコルにより、核酸分子を細胞に導入することができる。標的酵素または部位特異的プロテアーゼをコードする核酸分子の発現はまた、細胞のゲノム中へ核酸分子を組み込むことによっても達成することができる。核酸分子は、当該分野において既知の標準的な技術を用いて、細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込むことができる。これらの核酸から生成される組換えポリペプチドは、個々に単離またはクローニングして、所望の活性について試験することができる。「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において用いられる場合、標的酵素および部位特異的プロテアーゼを包含する。細菌、哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞発現系を含むがこれらに限定されない、任意の組換え発現系を用いてよい。本明細書に記載されるように用いられる核酸は、例えば、Adamsら、J. Am. Chem. Soc. (1983) 105:661；Belousovら、Nucleic Acids Res. (1997)  25:3440-3444；Frenkelら、Free Radic. Biol. Med. (1995) 19:373-380；Blommersら、Biochemistry (1994) 33:7886-7896；Narangら、Meth. Enzymol. (1979) 68:90；Brownら、Meth. Enzymol. (1979) 68:109；Beaucageら、Tetrahedron Letters (1981) 22:1859；ならびに米国特許4,458,066（これらの各々は、本明細書に参照により組み込まれる）において記載されるような周知の化学合成技術によりin vitroで合成してもよい。
【００９６】
経路の操作のための宿主細胞は、細菌、真菌および原虫を含むがこれらに限定されない広範な従属栄養および独立栄養微生物を含む。ある態様において、宿主細胞は、それについて、ポリペプチドを細胞の区画または細胞外の区画に方向付けすることができる手段が知られているものを含む。一部の態様において、細胞は、組換えにより本明細書に記載される核酸のいずれか１つまたは２つ以上（例えば、部位特異的プロテアーゼまたは標的酵素をコードする配列）を発現する、任意の型の細胞である。かかる細胞として、原核細胞および真核細胞が挙げられる。一部の態様において、細胞は、Escherichia spp.、Streptomyces spp.、Zymonas spp.、Acetobacter spp.、Citrobacter spp.、Synechocystis spp.、Rhizobium spp.、Clostridium spp.、Corynebacterium spp.、Streptococcus spp.、Xanthomonas spp.、Lactobacillus spp.、Lactococcus spp.、Bacillus spp.、Alcaligenes spp.、Pseudomonas spp.、Aeromonas spp.、Azotobacter spp.、Comamonas spp.、Mycobacterium spp.、Rhodococcus spp.、Gluconobacter spp.、Ralstonia spp.、Acidithiobacillus spp.、Microlunatus spp.、Geobacter spp.、Geobacillus spp.、Arthrobacter spp.、Flavobacterium spp.、Serratia spp.、Saccharopolyspora spp.、Thermus spp.、Stenotrophomonas spp.、Chromobacterium spp.、Sinorhizobium spp.、Saccharopolyspora spp.、Agrobacterium spp.およびPantoea spp.などの細菌細胞である。細菌細胞は、Escherichia coli（E. coli）細胞などのグラム陰性細胞であっても、Bacillus属の種などのグラム陽性細胞であってもよい。他の態様において、細胞は、酵母細胞、例えばSaccharomyces spp.、Schizosaccharomyces spp.、Pichia spp.、Paffia spp.、Kluyveromyces spp.、Candida spp.、Talaromyces spp.、Brettanomyces spp.、Pachysolen spp.、Debaryomyces spp.、Yarrowia spp.および工業的な倍数体酵母株などの真菌細胞であってもよい。真菌の他の非限定的な例として、Aspergillus spp.、Pennicilium spp.、Fusarium spp.、Rhizopus spp.、Acremonium spp.、Neurospora spp.、Sordaria spp.、Magnaporthe spp.、Allomyces spp.、Ustilago spp.、Botrytis spp.およびTrichoderma sppが挙げられる。他の態様において、細胞は、藻類細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である。本明細書に記載される態様に適合する幾つかの細胞は、本明細書に記載される遺伝子の１または２以上の内因性のコピーならびに組換えコピーを発現してもよい。目的の種として、限定することなく、S. cerevisiae、E. coli、Pseudomonasの種、Klebsiellaの種およびSynechocystisの種が挙げられる。再配置された部位特異的プロテアーゼの望まない変性を避けるために、宿主株を、多様な区画のプロテアーゼ（例えば周辺質プロテアーゼ）を取り除くように、および／または、タンパク質の折りたたみを補助するシャペロンおよびマチュラーゼなどのタンパク質を増強するために、改変してもよい。かかる改変および増強は、当業者に既知の方法を使用する。例えば、米国特許4,946,783および6,921,659、ならびにChenら、Biotechnology and Bioengineering (2004) 85: 463-474（これらの各々は本明細書に参照により組み込まれる）を参照。
【００９７】
一部の態様において、本明細書に記載される１または２以上の遺伝子は、細菌細胞において組換え発現される。本明細書に記載される細菌細胞は、任意の型（リッチまたは最少）および任意の組成の培地中で培養することができる。一部の態様において、細胞を最少培地中で培養する。当業者により理解されることであるが、慣用的な最適化により、多様な型の培地の使用が可能となる。選択される培地に、多様な追加成分を追加してもよい。追加の成分の幾つかの非限定的な例として、ブドウ糖、抗生物質、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、遺伝子誘導のためのテトラサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリン（aTc）、およびＡＴＣＣ微量ミネラルサプリメントが挙げられる。同様に、培地の他の側面、および本明細書に記載される態様の細胞の増殖条件を、慣用的な実験を介して最適化することができる。ｐＨおよび温度は、最適化することができる要因の非限定的な例である。一部の態様において、追加成分の濃度および量を最適化することができる。一部の態様においては、培地に１または２以上の追加成分を追加する頻度、および培地が培養される時間の量を最適化する。
【００９８】
核酸の操作のための技術、例えばサブクローニング、プローブ標識（例えばKlenowポリメラーゼを用いるランダムプライマー標識、ニック翻訳、増幅）、シークエンシング、ハイブリダイゼーションなどは、科学文献および特許文献によく記載されており、例えば、Sambrook編、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第２版）１〜３巻、Cold Spring Harbor Laboratory（1989年）；Ausubel編、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York（1997年）；ならびにTijssen編、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, N.Y. (1993)（これらの各々は本明細書に参照により組み込まれる）を参照されたい。
【００９９】
本明細書に記載される態様に関連する標的酵素および部位特異的プロテアーゼをコードする遺伝子は、多様なソースから得ることができることが理解されるべきである。当業者は、これらの標的酵素および部位特異的プロテアーゼのための相同遺伝子が、多くの種に存在し、例えばNCBIのインターネットサイト（ncbi.nlm.nih.gov）において利用可能なタンパク質のBLAST検索を介した相同性検索により同定することができることを知っている。これらの標的酵素および部位特異的プロテアーゼをコードする遺伝子は、所与の標的酵素および部位特異的プロテアーゼを含む任意のソースからのＤＮＡから、ＰＣＲにより、例えば縮重プライマーを用いて増幅することができ、このことは、当業者によって理解されるであろう。一部の態様において、所与の標的酵素および部位特異的プロテアーゼをコードする遺伝子は、合成（人工）のもの、例えば、糖、窒素ベースの化合物、リン酸およびＤＮＡ合成のために必要とされる他の化合物／試薬から合成されたＤＮＡであってもよい。ここで議論される標的酵素および部位特異的プロテアーゼをコードする遺伝子を得る任意の手段は、本明細書に記載される態様の側面に適合する。
【０１００】
本明細書に記載される態様はまた、単離された、核酸によりコードされるポリペプチドおよびタンパク質（例えば、標的酵素および部位特異的プロテアーゼ）を提供する。かかるポリペプチドは、例えば単独でまたは融合タンパク質として有用である。本明細書に記載される細胞、細胞ライセートおよび方法に関連するポリペプチドは、組織または細胞のホモジェネートを含む生物学的試料から単離しても、また、多様な原核および真核生物発現系において、当該発現系に適切な発現ベクターを構築して、該発現ベクターを発現系に導入し、組換発現されたポリペプチドまたはタンパク質、例えば標的酵素または部位特異的プロテアーゼを単離することにより、組換え発現させてもよい。ポリペプチドはまた、よく確立されたペプチド合成の方法を用いて化学的に合成してもよい。一部の態様において、単離された酵素および／またはプロテアーゼを、代謝物の生成の生成期の間に、細胞ライセートに直接添加してもよい。
【０１０１】
当業者に周知の多様な方法論を利用して、本明細書に記載される態様に関連する単離されたポリペプチドを得ることができる。ポリペプチドは、クロマトグラフィー的手段または免疫学的認識により細胞から精製してもよい。あるいは、発現ベクターを細胞内に導入して、ポリペプチドの生成を引き起こしてもよい。別の方法において、ｍＲＮＡ転写物を、細胞内にマイクロインジェクションするか他の方法で導入して、コードされたポリペプチドの生成を引き起こしてもよい。網状赤血球ライセート系などのセルフリー抽出物中でのｍＲＮＡの翻訳もまた、ポリペプチドを生成するために用いることができる。当業者はまた、ポリペプチドを単離するための既知の方法を容易に理解することができる。これらとして、限定されないが、免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫アフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【０１０２】
本明細書に記載される標的酵素および部位特異的プロテアーゼなどの分子の発現は、当業者に既知の慣用的な方法を用いて決定することができる。これらの方法として、限定されないが、以下が挙げられる：直接的なＲＮＡ増幅、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ｃＤＮＡの増幅、ハイブリダイゼーション、ならびに、限定されないが、免疫組織化学、抗体サンドウィッチ捕捉アッセイ、ＥＬＩＳＡおよび酵素免疫スポットアッセイ（EliSpotアッセイ）を含む免疫学に基づくアッセイ方法。例えば、細胞における核酸のレベルの存在の決定は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む任意の標準的な核酸決定アッセイを介して、または標識されたハイブリダイゼーションプローブによりアッセイすることにより、行うことができる。かかるハイブリダイゼーション方法として、限定されないが、マイクロアレイ技術が挙げられる。
【０１０３】
本明細書に記載される態様は、このように、一側面において、標的酵素および部位特異的プロテアーゼ、これらの酵素およびプロテアーゼをコードする遺伝子、前述のものの機能的改変体およびバリアント、ならびにこれらに関連する使用を含む。
【０１０４】
本明細書に記載される態様はまた、ネイティブな材料において存在するものに対して代替的なコドンを含む縮重コード配列を含む。例えば、セリン残基は、コドンＴＣＡ、ＡＧＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴおよびＡＧＣによりコードされる。６つのコドンの各々は、セリン残基をコードする目的について等価である。したがって、伸長中のポリペプチド中にセリン残基を組み込むようin vivoまたはin vivoでのタンパク質合成装置を指揮するために、セリンをコードするヌクレオチドトリプレットのいずれを用いてもよいことは、当業者には明らかである。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットとして、限定されないが、以下が挙げられる：ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧおよびＣＣＴ（プロリンコドン）；ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧおよびＡＣＴ（スレオニンコドン）；ＡＡＣおよびＡＡＴ（アスパラギンコドン）；ならびにＡＴＡ、ＡＴＣおよびＡＴＴ（イソロイシンコドン）。他のアミノ酸残基は、同様に、複数のヌクレオチド配列によりコードされ得る。したがって、本明細書に記載される態様は、遺伝子コードの縮重に起因してコドン配列において生物学的に単離された核酸と異なる、縮重核酸を包含する。態様はまた、宿主細胞、例えばE. coliまたは他の細菌細胞の最適なコドン利用に適合させるためのコドンの最適化を包含する。
【０１０５】
本明細書に記載される態様はまた、１または２以上のヌクレオチドの付加、置換および欠失を含む改変された核酸分子を提供する。一部の態様において、これらの改変された核酸分子および／またはそれらがコードするポリペプチドは、改変されていない核酸分子および／またはそれらがコードするポリペプチドの少なくとも１つの活性または機能、例えば酵素（例えばプロテアーゼ）活性を保持する。ある態様において、改変された核酸分子は、改変されたポリペプチド、例えば本明細書において他の場所で記載されるような保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。改変された核酸分子は、改変されていない核酸分子に構造的に関連し、一部の態様においては、改変された核酸分子と改変されていない核酸分子とが、当業者に既知のストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするために十分に構造的に関連している。
【０１０６】
例えば、単一のアミノ酸の変更を有するポリペプチドをコードする改変された核酸分子を調製してもよい。これらの核酸分子の各々は、本明細書に記載される遺伝子コードの縮重に対応するヌクレオチドの変更を除く、２または３ヌクレオチドの置換を有していてもよい。同様に、２アミノ酸の変更を有するポリペプチドをコードする、改変された核酸分子を調製してもよく、これは、例えば２〜６ヌクレオチドの変更を有する。これらのような多数の改変された核酸分子は、当業者により容易に想起され、例えば、アミノ酸をコードするコドンにおけるヌクレオチド２および３、２および４、２および５、２および６などの置換を含む。前述の例において、２つのアミノ酸の各々の組み合わせは、改変された核酸分子のセット、ならびにアミノ酸置換をコードする全てのヌクレオチド置換に含まれる。さらなる置換（例えば３またはそれより多い）、付加または欠失（例えば停止コドンまたは１または２以上のスプライス部位の導入によるもの）を有するポリペプチドをコードするさらなる核酸分子もまた、当業者により容易に想起されるように、調製することができる。前述の核酸またはポリペプチドのいずれかを、慣用的な実験により、本明細書において開示される核酸および／またはポリペプチドに対する構造的関係性または活性、例えば酵素活性の保持について、試験することができる。
【０１０７】
ある態様において、本明細書に記載される標的酵素および部位特異的プロテアーゼのバリアントが企図される。本明細書において用いられる場合、標的酵素または部位特異的プロテアーゼの「バリアント」は、標的酵素または部位特異的プロテアーゼの一次アミノ酸配列に対する１または２以上の改変を含むタンパク質である。例えば、部位特異的プロテアーゼの存在下において標的酵素の活性を低下させるかもしくは除去するために、または、部位特異的プロテアーゼの細胞分布を改変するために、標的酵素または部位特異的プロテアーゼに対してバリアントを作り出す改変を行ってもよい。
【０１０８】
標的酵素または部位特異的プロテアーゼに対する改変を、当該タンパク質をコードする核酸に対して行ってもよく、これは、欠失、点変異、トランケーション、アミノ酸置換、およびアミノ酸または非アミノ酸部分の付加を含んでもよい。あるいは、ポリペプチドまたはタンパク質に対して、切断、リンカー分子の付加、ビオチンなどの検出可能部分の付加、脂肪酸の付加などにより、直接的に改変を行ってもよい。改変はまた、融合タンパク質を包含する。当業者は、タンパク質の立体配置に対するアミノ酸配列の変化の効果を予測するための方法を知り、したがって、それらの既知の方法に従って、標的酵素または部位特異的プロテアーゼのバリアントを「設計」することができる。かかる方法の一例は、DahiyatおよびMayoにより、Science 278:82 87（1997年）において記載され、これにより、タンパク質を新規に設計することができる。方法は、既知のタンパク質に対して、そのタンパク質配列の一部のみを変化させるために適用することができる。DahiyatおよびMayoのコンピューターによる方法を適用することにより、タンパク質の特定のバリアントを提案させて、当該バリアントが所望の立体配置を保持するか否かを決定するために試験することができる。
【０１０９】
一部の態様において、バリアントは、その所望の生理学的活性に無関係なタンパク質の特徴を特異的に変更するように改変された、標的酵素および部位特異的プロテアーゼを含む。例えば、望ましくないジスルフィド架橋を防ぐために、システイン残基を、置換または欠失させることができる。同様に、発現系におけるプロテアーゼによるタンパク質分解を取り除くことによりタンパク質の発現を増強するために、特定のアミノ酸を変更することができる（例えば、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母発現系における二塩基性アミノ酸残基）。
【０１１０】
標的酵素または部位特異的プロテアーゼをコードする核酸の変異は、コード配列のアミノ酸リーディングフレームを保持することができ、一部の例においては、バリアントタンパク質の発現にとって有害であり得る、ヘアピンまたはループなどの、ハイブリダイズして二次構造を形成する可能性がある領域を核酸中に作り出さない。
【０１１１】
変異は、アミノ酸置換を選択することにより、または標的酵素または部位特異的プロテアーゼをコードする核酸における選択された部位のランダム変異誘発により、行うことができる。次いで、バリアントタンパク質を発現させて、１または２以上の活性について試験し、いずれの変異が所望の特性（例えば部位特異的プロテアーゼ切断）を有するバリアント酵素またはプロテアーゼを提供するかを決定する。タンパク質のアミノ酸配列に関してサイレントであるが、特定の宿主における効率的な翻訳のためのコドンを提供するバリアントに対して（または非バリアントタンパク質に対して）さらなる変異を行うことができる。例えばE. coliにおける効率的な核酸の翻訳のためのコドンの例は、当業者に周知である。なお、タンパク質の発現を増強するために、遺伝子またはｃＤＮＡクローンの非コード配列に対して、他の変異を行ってもよい。バリアントタンパク質をコードする遺伝子を細菌または哺乳動物発現ベクター中にクローニングして、当該ベクターを適切な宿主細胞内に導入し、バリアントタンパク質を発現させて、本明細書において開示されるようなタンパク質の機能的能力について試験することにより、タンパク質のバリアントの活性を試験することができる。
【０１１２】
当業者はまた、前述の標的酵素および部位特異的プロテアーゼの機能的に等価なバリアント、すなわちタンパク質の機能的能力を保持するバリアントを提供するために、タンパク質において保存的アミノ酸置換を行ってもよいことを知っている。本明細書において用いられる場合、「保存的アミノ酸置換」とは、そのアミノ酸置換が行われたタンパク質の相対的な電荷またはサイズの特徴を変化させないアミノ酸置換を指す。当業者に既知のタンパク質配列についての方法を集めた参考文献、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual（J. Sambrookら、編、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989年）またはCurrent Protocols in Molecular Biology（F.M. Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc.、New York）に見出されるような方法に従って、バリアントを調製してもよい。例示的な機能的に等価なタンパク質のバリアントとして、本明細書において開示される酵素およびプロテアーゼのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換が挙げられる。アミノ酸の保存的置換は、以下の群内のアミノ酸の間で行われる置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【０１１３】
ある態様において、酵素およびプロテアーゼのバリアントを調製する場合に、全てよりも少ないアミノ酸を変更することができる。特定のアミノ酸残基が機能を付与し、機能が必要とされる場合、かかるアミノ酸は、置き換えないか、あるいは保存的アミノ酸置換により置き換える。一部の態様において、バリアントタンパク質を調製する場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０残基を変更する。一部の態様において、最少の数の置換を行う。したがって、酵素またはプロテアーゼのバリアントを作製するための一方法は、特定の単一のアミノ酸を全ての他のアミノ酸で置換して、次いでバリアントの活性を決定し、次いで最良の活性を有する酵素またはタンパク質の１または２以上によりこのプロセスを繰り返すことである。
【０１１４】
タンパク質の機能的に等価なバリアントを生成するためのタンパク質のアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、標的酵素または部位特異的プロテアーゼをコードする核酸の変更により行うこともできる。かかる置換は、当業者に既知の多様な方法により行うことができる。例えば、アミノ酸置換は、ＰＣＲによる変異（PCT-directed mutation）、Kunkelの方法（Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1985) 82: 488-492）に従う部位特異的変異誘発により、またはタンパク質をコードする遺伝子の化学合成により行うことができる。例えば、一部の態様においては、標的酵素をコードする核酸を、部位特異的プロテアーゼ切断部位を含むように改変し、発現される酵素バリアントは、改変されていない酵素の機能的活性をなお保持する。
【０１１５】
ベクターおよび発現コンストラクト
標的酵素および／または部位特異的プロテアーゼをコードする単離されたＤＮＡフラグメントの好適な宿主細胞（例えばE. coli細胞）内への形質転換のために有用なベクターは、当該分野において既知である。本明細書において用いられる場合、「ベクター」は、異なる遺伝子環境間における輸送のため、または宿主細胞における発現のために、制限酵素切断およびライゲーションにより所望の配列（例えば標的酵素または部位特異的プロテアーゼをコードする配列）を挿入することができる、多数の核酸のうちのいずれかであってよい。ベクターは、代表的にはＤＮＡからなるが、ＲＮＡベクターもまた利用可能である。ベクターとして、限定されないが、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノムおよび人工染色体が挙げられる。ベクターは、関連する遺伝子の転写および翻訳を指揮する配列、選択マーカー、および自己複製または染色体への組み込みを可能にする配列を含んでもよい。好適なベクターは、転写開始の制御を保有する遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡフラグメントの３’領域を含む。融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子の宿主細胞のゲノム中への組み込みを促進するベクターもまた、用いることができる。かかるベクターは、ランダムな組み込み、部位特異的な組み込み、または相同組み換えのためのものである。ベクターは、単一交差または二重交差型の相同組み換えを可能にする特徴を有していてもよい。１つまたは複数のコピーを、宿主細胞（例えば細菌または酵母細胞）のゲノム中に組み込んでもよい。
【０１１６】
クローニングベクターは、自己複製することができるか、または宿主細胞におけるゲノム中に組み込まれることができる。クローニングベクターはさらに、１または２以上のエンドヌクレアーゼ制限部位により特徴づけられ、そこでベクターを決定可能な様式において切断（例えば酵素消化を介して）することができ、その中に所望のＤＮＡ配列をライゲーションすることができる。この方法において、新たな組換えベクターは、宿主細胞において複製するその能力を保持する。プラスミドベクターを用いる場合、所望の配列の複製は、宿主内でプラスミドがコピー数を増大するにつれて多数回、または宿主が有糸分裂により複製する前に宿主１つあたり１回のみ起こり得る。ファージベクターを用いる場合、複製は、溶菌期の間に能動的に、または溶原期の間に受動的に起こり得る。
【０１１７】
発現ベクターは、その中に、所望のＤＮＡ配列を、制限酵素切断およびライゲーションにより、それが調節配列に作動的に連結してＲＮＡ転写物として発現され得るように、挿入することができるものである。ベクターは、当該ベクターにより形質転換されている細胞または形質転換されていない細胞の同定において用いるために好適な１または２以上のマーカー配列を、さらに含んでもよい。マーカーとして、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増大または低下させるタンパク質をコードする遺伝子、当該分野において既知の標準的なアッセイによりその活性が検出可能である酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換された細胞もしくは形質転換されていない細胞、コロニーまたはプラークの表現型に可視的に影響を及ぼす遺伝子（例えば緑色蛍光タンパク質）が挙げられる。ベクターは、自己複製、およびそれらが作動的に連結したＤＮＡセグメント中に存在する構造遺伝子の生成物の発現ができるものを含む。
【０１１８】
本明細書において用いられる場合、コード配列と調節配列とは、それらが、コード配列の発現または転写を調節配列の影響または制御下におくように共有結合している場合に、「作動的に」連結されると言われる。コード配列が機能的なタンパク質へと翻訳されることが所望される場合、５’調節配列におけるプロモーターの導入がコード配列の転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさないか、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を指揮する能力に干渉しないか、または（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力に干渉しない場合に、２つのＤＮＡ配列は作動的に連結されると言われる。したがって、プロモーター領域がＤＮＡ配列の転写に対して、生じる転写物が、例えば所望の部位特異的プロテアーゼへと翻訳されることができるように、影響を及ぼすことができた場合に、プロモーター領域はコード配列に作動的に連結されている。
【０１１９】
本明細書に記載される標的酵素または部位特異的プロテアーゼのいずれかをコードする核酸分子が細胞において発現される場合、多様な転写制御配列（例えばプロモーター／エンハンサー配列）を、その発現を指揮するために用いることができる。プロモーターは、ネイティブなプロモーター、すなわち、その内因性の文脈（context）における遺伝子のプロモーターであってもよく、これは遺伝子の発現の正常な調節を提供する。一部の態様において、プロモーターは、構成的であってもよく、すなわち、プロモーターは制御されず、その関連する遺伝子の連続的な転写を可能にする。ある分子の存在または不在により制御されるプロモーターなどの、多様な条件的プロモーターもまた用いることができる。例えば、幾つかの誘導性プロモーターは、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）またはテトラサイクリン（Ｔｅｔ）などの化学物質により活性化される。
【０１２０】
遺伝子発現のために必要とされる調節配列の正確な性質は、種または細胞の型の間で変化し得、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列などの、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列を含む。特に、かかる５’非転写配列はプロモーター領域を含み、これは作動的に連結した遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含む。調節配列はまた、所望の場合、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を含んでもよい。ベクターは、任意に、５’リーダーまたはシグナル配列を含んでもよい。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。
【０１２１】
発現のための全ての必要なエレメントを含む発現ベクターは、市販されており、当業者に既知である。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版（Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年）を参照。細胞に異種ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を導入することにより、細胞を遺伝子操作する。この異種ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を、宿主細胞における異種ＤＮＡの発現を可能にするために、転写エレメントの作動的な制御下におく。一部の態様において、２または３以上の核酸を、同じ発現ベクターまたはプラスミド中にクローニングしてもよい。
【０１２２】
本明細書に記載される方法は、標的酵素および／または部位特異的プロテアーゼをコードする多様な核酸配列の、構成的なまたは制御された発現を利用することができる。発現は、多様なキュー、例えば、化学物質（例えばＩＰＴＧ）による誘導、増殖期の変化、栄養の枯渇、温度シフト（例えばヒートショックプロモーター）、および／または光により制御され得る。一部の態様において、誘導性プロモーターは、当該分野において知られるように、誘導剤、例えばラクトース、アラビノースまたはテトラサイクリンなどの化学物質の存在により制御される。「高レベル」発現が示される場合、細胞において発現されるタンパク質の濃度は、基底レベルの少なくとも約２倍高いか、基底レベルの少なくとも１０倍高いか、基底レベルの少なくとも２５倍高いか、基底レベルの少なくとも５０倍またはそれより高く、例えば基底レベルの約２倍〜約１００倍高い。
【０１２３】
細胞または細胞の区画が本明細書に記載される部位特異的プロテアーゼを搬出する効率を最適化するために、発現速度を実験的に調節することが望ましい場合がある。例えば細胞の周辺質への、少ない輸送は、搬送機構の不十分な能力から生じ得る。部位特異的プロテアーゼの発現速度の調節のための方法として、限定することなく、周辺質へ搬出されるべきプロテアーゼをコードする遺伝子を運搬するプラスミドのコピー数の改変が挙げられる。当該分野において既知であり用いられるレプリコンとして、P15A（１０コピー／細胞）、ColA（３０コピー／細胞）、ColE1（４０コピー／細胞）およびRSF1030（＞１００コピー／細胞）が挙げられる。周辺質へ搬出されるべきプロテアーゼをコードする遺伝子の５’ＵＴＲにおけるリボソーム結合部位を改変してもよく、ここで、様々な強度を有するリボソーム結合部位のライブラリーを作製して試験することができる。例えば、各々が本明細書に参照により組み込まれるSalisら、Nature Biotechnology (2009) 27: 946-950；およびSimmonsら、Nature Biotechnology (1996) 14:629-634を参照。転写の速度を調節するために、周辺質へ搬出されるべきプロテアーゼをコードする遺伝子の上流のプロモーター領域を改変してもよく、ここで、様々な強度を有するプロモーター領域のライブラリーを作製して試験することができる。例えば、その各々が本明細書に参照により組み込まれるAlperら、PNAS (2005) 102:12678-12683；およびDe Meyら、BMC Biotechnology (2007) 7:34を参照。
【０１２４】
誘導性発現
本明細書に記載される方法は、多様なコード配列の制御された発現を利用する。発現は、多様なキュー、例えば化学物質による誘導、増殖期の変化、栄養の枯渇、温度シフトおよび光により、制御され得る。一部の態様において、誘導性プロモーターは、当該分野において既知の誘導剤、例えばラクトース、アラビノースおよびテトラサイクリンなどの化学物質の存在により制御される。
【０１２５】
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、目的のコード配列に作動的に連結したプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（５’）に配置された非翻訳配列であって、それらが作動的に連結した特定の核酸配列の転写および翻訳を制御するものである。かかるプロモーターは、誘導性および構成的の、２つのクラスに分類することができる。誘導性プロモーターは、培養条件における何らかの変化、例えば栄養の存在もしくは不在、または温度の変化に応じて、それらの制御下におけるＤＮＡからの転写のレベルの増大を惹起するプロモーターである。この時点において、多様な潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが、周知である。ネイティブなプロモーターを用いてもよいが、一部の態様においては、それらが標的酵素または部位特異的プロテアーゼのより高い転写およびより高い収率を可能にするので、異種性プロモーターが用いられる。
【０１２６】
原核生物宿主による使用のために好適なプロモーターとして、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系、およびtacプロモーターなどの多数のハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかし、他の既知の細菌プロモーター、例えば、lacIプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、アラビノースプロモーター、gptプロモーター、ラムダＰＲプロモーター、ラムダＰＬプロモーター、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの解糖系酵素をコードするオペロンからのプロモーター、および酸ホスファターゼプロモーターもまた好適である。それらのヌクレオチド配列は公開されており、それにより、当業者は、リンカーまたはアダプターを用いてそれらを目的の配列に作動的にライゲーションすることができる。細菌系において用いるために好適なプロモーターもはまた、コード配列に作動的に連結したShine-Dalgarno（Ｓ．Ｄ．）配列を含む場合もある。ある場合において、また、宿主細胞は、培養中の全ての細胞が同等に誘導されるように代謝物またはインデューサートランスポータータンパク質の濃度を調節するために、遺伝子改変されてもよい。
【０１２７】
真核細胞、例えば酵母のために好適なプロモーターもまた、当該分野において既知である。実質的に全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に配置されたＡＴリッチな領域を有する。転写の開始点から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＸＣＡＡＴ領域であり、ここで、Ｘは任意のヌクレオチドであってよい。殆どの真核生物遺伝子の３’末端にあるのは、ＡＡＴＡＡＡ配列であり、これは、コード配列の３’末端へのポリＡテイルの付加のためのシグナルであり得る。これらの配列の全ては、真核生物発現ベクター中に好適に挿入される。酵母宿主により用いるために好適なプロモーター配列の例として、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、または、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他の解糖系酵素のためのプロモーターが挙げられる。
【０１２８】
増殖条件により制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用の原因である酵素のためのプロモーター領域である。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターにより有利に用いられる。
【０１２９】
例
以下の例は、当業者に、本明細書に記載される態様を作製および使用する方法の完全な開示および説明を提供するために記載され、本発明の範囲を限定すること、または以下の実験が、行われる全てもしくは唯一の実験であることを表わすことを意図しない。用いられる数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を期するために努力がなされたが、いくらかの実験的誤差および偏差が存在する。他に示されない限りにおいて、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏におけるものであり、圧力は大気圧またはその付近におけるものである。
【０１３０】
部位特異的プロテアーゼの隔離。プロテアーゼの隔離および標的酵素の操作のプロセスにおける工程は、（ｉ）不活化の標的となるべき酵素を同定するための経路を分析すること、（ｉｉ）標的酵素をコードするＤＮＡ配列を改変することにより、プロテアーゼ切断部位を操作すること、（ｉｉｉ）標的酵素の活性を検証すること、（ｉｖ）周辺質に隔離されたプロテアーゼを操作すること、（ｖ）周辺質で発現されたプロテアーゼの活性を検証すること、（ｖｉ）代謝的に健康な細胞増殖を実証すること、（ｖｉｉ）標的酵素の不活化、および溶解後の活性なセルフリー反応における目的の生成物に対するフラックスの増大を実証することを含む。
【０１３１】
例１．周辺質へのプロテアーゼの隔離
幾つかのプロテアーゼ遺伝子を、プロテアーゼ酵素を周辺質へ標的化する多様な周辺質シグナル配列とともに含む、プラスミドのライブラリーを構築する。例えば、５つの特定のプロテアーゼと６つの周辺質シグナル配列を組みわせて、３０メンバーのライブラリーを作製することができる。
【０１３２】
周辺質シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を介して、各々のプロテアーゼ遺伝子に付加する。あるいは、プロテアーゼ遺伝子を、周辺質リーダーシグナル配列を含むように合成する。完全な合成は、宿主株における効率的な発現のためのコドンの最適化を可能にする。好適なプロテアーゼおよび周辺質標的化／リーダー配列を、各々上記表２および３に記載する。
【０１３３】
周辺質を標的とするプロテアーゼ遺伝子のライブラリーを、pDuetベクター中に、または好適なベクター中に、誘導性発現のためにサブクローニングする。Ｔ７ポリメラーゼを発現するE.coli株BL21(DE3)または類似の株を、周辺質を標的とするプロテアーゼのライブラリーにより形質転換させる。発現の改変は、多様なレベルのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（各ベクターはLacIを発現し、Ｔ７プロモーターは、lacオペレーター部位を含む）の使用を介して、多様なプロモーターおよびリボソーム結合部位の使用を介して、ならびに、多様なpDuetベクターの間でのコピー数のバリエーションの使用を介して、達成する。当業者が精通する他のプラスミド、発現系または株もまた用いることができる。
【０１３４】
個々のライブラリーメンバーを保有する個別の培養物を、リッチなディファインド培地中で中間の光学密度（ＯＤ）まで増殖させて、その後、０．０２〜１ｍＭのＩＰＴＧで発現誘導する。周辺質におけるプロテアーゼの蓄積を可能にするために、数時間にわたり発現を誘導する。誘導後の増殖をモニタリングして、恐らくはネイティブなE. coli周辺質タンパク質のオフターゲット切断に起因して、細胞増殖を阻害するものがある場合は、いずれのライブラリーメンバーであるかを決定する。著しい増殖の阻害は、発現された活性なプロテアーゼが、重要なまたは必須のタンパク質を標的とすることを示し得る。これは、オフターゲットタンパク質を同定し、それらのアミノ酸配列を特異的な切断部位を取り除くように改変することにより緩和され得る。周辺質を標的とするプロテアーゼは、浸透圧ショックまたは当業者に既知の他の方法を用いて抽出する。全長タンパク質の発現の検証は、適切なサイズ標準とともに変性タンパク質をゲル電気泳動することにより決定する。より効率的な周辺質への搬出は、ＩＰＴＧレベルを変化させること、用いられるプラスミドにおけるプラスミド複製起点を変更すること、および／またはリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の改変の使用を介して発現を最適化することにより、達成することができる。
【０１３５】
周辺質を標的とするプロテアーゼの特異的活性は、周辺質抽出物において、切断部位を含み部位特異的プロテアーゼによる切断により測定可能なシグナルを生じる標的タンパク質を設計することにより、決定される。一例は、SarathおよびSchwartzbachによりCurrent Protocols in Protein Science (2001) 21.9.1 - 21.9.10において概説される。この方法は、ＮまたはＣ末端のいずれかにおいて精製タグを含む蛍光レポータータンパク質の使用を含む。切断部位は、精製タグと蛍光レポーターのオープンリーディングフレームとの間に挿入され、特異的プロテアーゼのための標的を作り出す。精製されたレポーター標的を、部位特異的プロテアーゼを含む周辺質抽出物に添加することができ、この混合物を、精製タグに結合するアフィニティー樹脂を用いて分離することができる。切断された未結合の蛍光レポーターが分離され、蛍光を測定してプロテアーゼ切断の程度を決定する。あるいは、操作された蛍光レポーターを、周辺質を標的とするプロテアーゼを発現する株の細胞質において発現させてもよい。未切断のレポーターは、ライセートから分離することができ、ライセート中の蛍光のレベルを用いて、プロテアーゼの標的切断の程度を決定することができる。
【０１３６】
具体的な経路の非限定的例は、シキミ酸の合成のための経路である。この経路において、例えば、細胞の日用品的化合物であるホスホエノールピルビン酸（Ｓ１Ａ）とエリスロース−４−リン酸（Ｓ１Ｂ）との反応は、ＤＡＨＰシンターゼのイソ酵素、AroF、GまたはH（Ｅ１）により触媒され、３−デオキシ−Ｄ−アラビノースヘプツロン酸−７−リン酸（ＤＡＨＰ）を生成する。ＤＡＨＰ（Ｓ２）は、経路における第２の酵素であるＤＨＱシンターゼ、AroB（Ｅ２）により３−デヒドロキナ酸（３−ＤＨＱ）に転換される。３−ＤＨＱ（Ｓ３）は、経路における第３の酵素である３−ＤＨＱデヒドラターゼ、AroD（Ｅ３）により脱水されて３−デヒドロシキメートとなる。補助因子としてNADPHを用いて、経路における第４の酵素、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、AroE（Ｅ４）により、３−デヒドロシキメート（Ｓ４）は還元されてシキミ酸（ＰＦ）となる。経路の酵素は、当該分野において既知であり、例えばE. coliを含む多数の生物において特徴づけられており、ここで、酵素は、以下のような遺伝子座によりコードされる： ＤＡＨＰシンターゼ（aroG、FまたはH）；ＤＨＱシンターゼ（aroB）；３−ＤＨＱデヒドラターゼ（aroD）；シキミ酸デヒドロゲナーゼ（aroE）。
【０１３７】
シキミ酸経路において、aroE、aroFおよびtktAの過剰発現は、aroEおよびaroFにより直接的に、または基質分子であるエリスロース−４−リン酸の供給を増大させるtktAにより間接的に、シキミ酸の生成を増大させることが示されている。
【０１３８】
また、この経路に関連する競合酵素も存在し、これは、基質として所望の最終生成物を利用し、この酵素は、シキミ酸キナーゼ（AroK）およびシキミ酸キナーゼII（AroL）である。活性な競合酵素は、反応混合物中の所望の生成物の量を低下させるため、その存在は望ましくない場合がある。
【０１３９】
競合酵素であるシキミ酸キナーゼＩＩ（Genbankアクセッション番号NP_414922.1）をコードする配列を、組換えまたは多重ゲノム操作による特異的変異の誘導を介して標的タンパク質中にプロテアーゼ切断部位を導入することにより、部位特異的プロテアーゼによるタンパク質分解に対して感受性にする。プロテアーゼによる不活化のための部位を、酵素中の好適な部位に導入する。あるいは、シキミ酸キナーゼＩＩを、DatsenkoおよびWanner（2000年）に記載される方法により不活化し、シキミ酸キナーゼＩを、部位特異的プロテアーゼによるタンパク質分解に対して感受性にする。
【０１４０】
シキミ酸の生成において、ＤＡＨＰシンターゼおよび／またはシキミ酸への生化学的経路におけるさらなる酵素の発現が含まれてもよい。
【表４】
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【０１４１】
プロテアーゼ切断部位を生じるための最少のアミノ酸配列に対する改変が必要であるため、酵素の配列を、プロテアーゼ切断モチーフに最も近接するアミノ酸配列を同定するために分析する。理想的な部位は、酵素機能に対する影響を最少化するために、タンパク質の表面上である。表面付近の部位もまた、それが折りたたまれた場合にプロテアーゼに対してアクセス可能であることを確実にする。あるいは、同じ機能を行いプロテアーゼ切断部位を含む異なる生物からの酵素を、プロテアーゼに対して不安定でないネイティブな酵素の代わりに用いてもよい。
【０１４２】
切断のための好適な部位（スラッシュは、代替的アミノ酸を示す）は、配列ＥＮＬＹＦＱＧ／Ｓである（タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼにより切断される）。切断のための代替的な部位は、ＧＡＲＲＧ／Ｓである（黄熱病ウイルスプロテアーゼにより切断される）。切断のための代替的な部位は、ＬＶＰＲＧＳである（トロンビンにより切断される）。配列のプロテアーゼに対して不安定な形態に関連し得る遺伝子改変された配列は、染色体のコピーの同時不活化とともにプラスミドから発現させるか、または宿主生物の染色体配列を改変するために用いる。代替的態様において、AroLをコードする遺伝子を不活化し、AroKをタンパク質分解に対して感受性にする。
【０１４３】
配列の簡単なスキャンの後で、選択されたプロテアーゼが標的タンパク質を切断するがシキミ酸生合成のために必要な任意の他のタンパク質を切断しないことを確認するために、酵素アッセイを行う。これを達成するため、プロテアーゼに対して不安定な競合酵素により改変された細胞を、誘導性プロモーターの制御下において同種プロテアーゼを発現するように、さらに改変する。細胞を、炭素源としてブドウ糖を含む培地中で増殖させる。細胞におけるシキミ酸の生成を、Knopら（2001年）J. Am. Chem. Soc. 123:10173-10182またはvan Hessら（1999）Talanta、1999年1月5日、173〜17頁により記載されるように、核磁気共鳴（１ＨＮＭＲ）分光法もしくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、またはＧＣ−ＭＳなどの任意の他の分析化学技術を用いて測定する。
【０１４４】
あるいは、個々の酵素アッセイ、例えば、溶液中の酵素の基質の枯渇またはその生成物の蓄積を、精製された酵素タンパク質により測定するものを、行ってもよい。
【０１４５】
シキミ酸経路における競合酵素以外の任意のタンパク質が、タンパク質分解に対して感受性であることが見出された場合、部位特異的変異誘発により保存的アミノ酸交換を行うことにより、切断部位を取り除く。あるいは、同じ機能を行うがプロテアーゼ切断部位を含まない異なる生物からの酵素を、プロテアーゼに対して不安定なネイティブの酵素の代わりに用いてもよい。必要である場合、適切なプロテアーゼが見出されるまで、かかる分析を繰り返す。
【０１４６】
例２．周辺質を標的とするエンテロキナーゼの発現および活性
プラスミド、細胞増殖および発現。ウシエンテロキナーゼをコードする遺伝子（GenbankアクセッションL19663.1）を、E. coliにおける発現のために最適化されたコドン内容を有するように、および以下の周辺質シグナル配列を有するように、化学合成した。
【表５】
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【０１４７】
これらのコンストラクトを、pACYC-Duet（EMD Chemicals, Gibbstown, NJ）中にサブクローニングし、生じたプラスミドによりE.coli株BL21(DE3)を形質転換した。２５０ｍｌの培養物を、グリセロールストックから、６時間にわたり３７℃および３００ｒｐｍにて、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（cam）を含むＥＺリッチな培地中で、０．６〜０．８の光学密度（ＯＤ６００）まで増殖させた。空のpACYC-Duetベクターを保有する株を、対照として用いた。０．１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により発現を誘導し、培養物を、１６時間にわたり２５℃で増殖させた。誘導の後で、細胞を収集し、周辺質画分を抽出した。
【０１４８】
周辺質の抽出および活性アッセイ。細胞を、１２ｍｌの培養物から、３０００×ｇで３０分間、４℃における遠心分離により収集した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、２ｍｌの氷冷された１ｍＭのTris-HCl中で穏やかに再懸濁した。この懸濁液を、次いで、３０００×ｇで３０分間、４℃において遠心分離した。上清を周辺質画分として収集した。３．６μｇの周辺質画分を、４μｇの対照タンパク質（EMDにより提供されたエンテロキナーゼ切断可能タンパク質）とともに、５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのTris-HCl、２ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ７．４）を含む反応バッファー中でインキュベートすることにより、活性アッセイを行った。反応を、３０℃で２４時間インキュベートした。０．０４Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む１９．５μＬのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥランニングバッファーを添加することにより反応をクエンチし、９９℃において５分間沸騰させた。反応物を、NuPAGE（登録商標）の１２％のBis-Trisゲル上で、２００Ｖで５０分間流し、ゲルをクーマシー色素で染色した。エンテロキナーゼ（ＥＫ）による４８ｋＤａの対照タンパク質の切断は、３２および１６ｋＤａの２つのタンパク質分解フラグメントを生じる。図１において示すゲルを用いて、プロテアーゼ切断生成物を可視化し、周辺質に局在するエンテロキナーゼが標的タンパク質を切断する上で活性であることを示した。
【０１４９】
例３．周辺質を標的とするエンテロキナーゼの発現
ウシエンテロキナーゼについての遺伝子配列を、E. coliにおける発現のためにコドン最適化して、OmpA周辺質発現シグナル配列を付加し、発現ベクターpACYCDuet-1（Novagen）中にサブクローニングした。コンストラクトを、E.coli株BL21(DE3)中で形質転換させた。細胞を、０．６の光学密度（ＯＤ６００）まで増殖させ、０．８ｍＭのＩＰＴＧの添加により発現を誘導し、３７℃で３時間増殖を継続させた。培養物は、誘導の間に２．４倍になり、このことは、エンテロキナーゼの発現が増殖を阻害しなかったことを示す。細胞を、遠心分離により収集し、アッセイバッファー（２０ｍＭのTris HCl（ｐＨ７．４）；５０ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのＣａＣｌ２）中で再懸濁し、ホモジェナイザーを用いて溶解した。
【０１５０】
例４．ホールセルライセートにおけるエンテロキナーゼの活性
エンテロキナーゼ発現細胞からのホールセルライセートを、エンテロキナーゼ切断部位（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）を含む切断対照タンパク質とともにインキュベートして、組換えエンテロキナーゼの活性と比較することにより、プロテアーゼ活性について試験した。組換えエンテロキナーゼおよび切断対照タンパク質は、Novagenから入手した。４０μｌのライセートまたは４０μｌのアッセイバッファー（２０ｍＭのTris HCl（ｐＨ７．４）；５０ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのＣａＣｌ２）中の２単位の組換えエンテロキナーゼを、４μｇの切断対照タンパク質とともに室温でインキュベートした。エンテロキナーゼを発現しない株から同様に調製したライセートを、陰性対照として用いた。ゼロ時間または２時間の試料を、切断対照タンパク質上のアミノ末端のＳタグを認識するS proteinと西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とのコンジュゲートによるイムノブロットにより分析した。標的タンパク質は、組換えエンテロキナーゼ（レーン２）により、および周辺質を標的とするエンテロキナーゼを発現する株からのライセート（レーン４）により、特異的に切断されたが、エンテロキナーゼ発現を欠くライセート（レーン６）によっては特異的に切断されなかった。
【０１５１】
例５．周辺質からのプロテアーゼ放出による標的酵素の不活化
ウシエンテロキナーゼについての遺伝子配列を、E. coli細胞における発現のためにコドン最適化し、周辺質発現シグナル配列を付加して、誘導性プラスミド発現ベクター中にサブクローニングする。AroL酵素をコードする遺伝子を、エンテロキナーゼ特異的切断部位を含むように改変する。E. coli細胞を、周辺質において部位特異的プロテアーゼを発現し、細胞質において改変された標的酵素を発現するように、改変する。細胞を、０．６の光学密度（ＯＤ６００）まで増殖させ、エンテロキナーゼの発現を誘導し、３７℃で３時間、細胞に増殖を続けさせる。
【０１５２】
ホモジェナイザーを用いて細胞を溶解し、それにより部位特異的プロテアーゼおよび改変された酵素と接触させる。細胞ライセートを、経路の酵素の活性のための必要に応じて、１または２以上の基質、酵素、栄養素、補助因子、緩衝化剤、還元剤および／またはＡＴＰ生成システムと組み合わせ、セルフリーシステムを形成する。セルフリーシステムの酸化還元電位、ｐＨおよびイオン強度を最適化する。セルフリーシステムにおけるシキミ酸の生成を、１ＨＮＭＲ分光法またはＨＰＬＣを用いて測定する。
【０１５３】
例６．周辺質からのプロテアーゼ放出によるPurFの不活化
その各メンバーが、酵素のポリペプチド配列内の異なる位置にエンテロキナーゼ特異的切断部位を含むアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（E. coli PurF）をコードする、ライブラリーを作製する。切断部位の位置の選択は、Muchmoreら、Protein Science (1998) 7:39-51において報告されるような公開されたPurFの三次構造により補助される。例えば、Muchmoreらは、切断部位の組み込みのために好適である、可橈性の、溶媒に露出するループを含む領域を記載する。ライブラリーは、ＰＣＲ、遺伝子合成または他の標準的な分子生物学的方法により作製し、E. coli細胞における制御発現のためのベクターにおいて構築する。E. coli細胞を、改変された酵素ライブラリーを発現するベクターにより形質転換する。細胞を、０．６の光学密度（ＯＤ６００）まで増殖させ、ライブラリーの発現を誘導し、３７℃で３時間、細胞に増殖を継続させる。
【０１５４】
ホモジェナイザーを用いて細胞を溶解し、細胞ライセートを、精製された組換えエンテロキナーゼ（Novagen）により処置し、エンテロキナーゼにより媒介されるライブラリーメンバーの切断を検証する。PurFの切断を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニタリングする。組換えエンテロキナーゼにより切断されるライブラリーメンバーを、次いで活性について試験する。具体的には、これらのライブラリーメンバーを過剰発現する細胞からのライセートを、酵素活性のための必要性に応じてＰＲＰＰおよびグルタミン（各１０ｍＭ）と組み合わせ、それにより、セルフリーシステムを形成する。反応物の試料を、一連の時点において分析する。オルトフタルアルデヒドによるプレカラム誘導体化を用いるＨＰＬＣにより測定されるセルフリー反応中でのグルタミン酸の出現および同時のグルタミン酸の消失により、改変されたPurFの活性をモニタリングする。改変されたPurFの不活化は、上記のアッセイに組換えエンテロキナーゼを添加することにより試験する。
【０１５５】
エンテロキナーゼの不在において活性を示し、反応の経過においてエンテロキナーゼにより切断および不活化されるPurFライブラリーの最も活性なメンバーを、PurFの活性により阻害される目的の経路（例えば、ピリミジン誘導性化合物を生成する経路などの、ＰＲＰＰを必要とする経路）を含む細胞内への組み込みのために選択する。細胞は、さらに、周辺質で発現されるエンテロキナーゼ、および目的の経路のために必要とされる任意の酵素を含む。ライブラリーメンバーを、PurFの染色体遺伝子座中にノックインし、それにより内因性遺伝子を置き換える。遺伝子の置換により増殖が有害な影響を受けないことを検証する。
【０１５６】
ホモジェナイザーを用いて細胞を溶解し、それにより、部位特異的プロテアーゼおよび改変された酵素と接触させる。細胞ライセートを、経路の酵素の活性のための必要性に応じて、１または２以上の基質、酵素、栄養素、補助因子、緩衝化剤、還元剤および／またはＡＴＰ生成システムと組み合わせて、セルフリーシステムを形成する。セルフリーシステムの酸化還元電位、ｐＨおよびイオン強度を最適化する。セルフリーシステムにおける目的の生成物の生成を、適切な方法を用いて測定する。
【０１５７】
他の態様
他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において参照される全ての特許、特許出願（公開または未公開）、および他の刊行物は、その全体が参照により組み込まれる。本出願において記載される定義が、本明細書に参照により組み込まれる特許、出願、公開された出願および他の刊行物において記載される定義と矛盾するかまたは一致しない場合は、本出願において記載される定義が、本明細書に参照により組み込まれる定義に対して優先する。
【０１５８】
刊行物または書類の引用は、かかる刊行物または書類のいずれかが関連する先行技術であることを認めるものであることを意図されず、これらの刊行物または書類の内容または日付に関するいかなる承認も構成しない。
【０１５９】
本明細書において用いられる場合、「a」または「an」は、他に示されない限り、「少なくとも１」または「１または２以上」を意味する。
【０１６０】
本明細書において用いられる場合、用語「約（about）」および「約（approximately）」は、交換可能に用いられ、用語の意味は、本出願の明細書および請求の範囲において用いられる用語の文脈を考慮することにより、得ることができる。一部の態様において、「約（about）」特定の数値は、その値の３０％の範囲を包含する。他の態様において、「約（about）」特定の数値は、その値の２０％の範囲を包含する。さらに他の態様において、「約（about）」特定の数値は、その値の１０％の範囲を包含する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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