(57)【要約】  本発明は、タンパク質分離において使用されるような拡散性細孔を有する多孔質支持体の拡散性細孔を充填することなく且つ該細孔を介する拡散を制限することなく、前記多孔質支持体にポリマーエキステンダーをグラフト化する改善方法に関する。グラフト化条件及び／またはモノマー組成を変えることにより、生じたポリマーエキステンダーがグラフト化されている多孔質支持体は向上したタンパク質結合能力及び樹脂選択性を有し、これにより支持体のタンパク質分離有効性が高められる。グラフト化されているポリマーエキステンダーはより高い導電率でかなり大きい結合能力を有する支持体を与える。本発明は、拡散性細孔を有する多孔質樹脂支持体に対してポリマーエキステンダーを使用し、グラフト化するキット及び方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
拡散性細孔及び表面反応性不飽和官能基を有する多孔質支持体の修飾方法であって、前記方法は、
ａ）拡散性細孔及び支持体の表面に結合されている表面反応性不飽和官能基を有する多孔質支持体を用意し；
ｂ）グラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物を含む溶液、及び可溶性ラジカル重合開始剤を用意し；
ｃ）支持体を溶液と接触させ；
ｄ）溶液にフリーラジカル重合開始剤を導入することにより支持体の表面上の表面反応性不飽和官能基とグラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物の間でフリーラジカル重合を開始して、支持体にカップリングされているポリマー鎖を形成する
ことを含む前記方法。
【請求項２】
支持体は多孔質ポリマービーズ、多孔質アガロースビーズ及び多孔質セラミックビーズからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、ステップ（ｄ）の後に、
ｅ）支持体を洗浄して余分の未反応のグラフト化モノマー、グラフト化モノマーの混合物、または未結合のポリマー鎖を除去して、１００ｇ／Ｌを超えるタンパク質結合能力を有する多孔質支持体を得る
ことを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
更に、ステップ（ｅ）の後に、
ｆ）多孔質支持体表面に結合されているポリマー鎖にリガンドをカップリングさせる
ことを含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ラジカル重合開始剤を過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、アゾビス（４−シアノ吉草酸）、イルガキュア（登録商標）２９５９、２，２’−アゾビス（２−アミジノ−プロパン）塩酸塩及びその組合せからなる群から選択する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
不飽和官能基はアリル基からなる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アリル基は式Ｒ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２（式中、Ｒは多孔質支持体表面、または表面とアリル基間のリンカーである）からなる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
表面反応基の約２０〜約４００μｍｏｌ／ｍＬは式Ｒ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２（式中、Ｒは多孔質支持体表面、または表面とアリル基間のリンカーである）を有する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
グラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物をメタクリレート、アクリレート、アクリルアミド、アクリル酸、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド、２−アクリルアミド−グリコール酸、イタコン酸またはエチルビニルケトン、グリシジルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、アクリルアミド、ヒドロキシプロピルメタクリレート、Ｎ−フェニルアクリルアミド、ヒドロキシプロピルアクリルアミド及びその組合せからなる群から選択する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
多孔質支持体上の拡散性細孔は孔径が約１００Åから約１μの範囲である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
拡散性細孔を有する多孔質クロマトグラフィービーズを表面ポリマー鎖エキステンダーを用いて修飾する方法であって、その方法は、
ａ）拡散性細孔、表面及び該表面にカップリングされている表面反応性不飽和官能基を有する多孔質クロマトグラフィービーズを用意し；
ｂ）グラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物を含む溶液、及び可溶性ラジカル重合開始剤を用意し；
ｃ）クロマトグラフィービーズを溶液と接触させ；
ｄ）溶液にラジカル重合開始剤を導入することによりビーズ上の表面反応性不飽和官能基とグラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物の間でフリーラジカル重合を開始して、ビーズにカップリングされているポリマー鎖エキステンダーを形成し；
ｅ）ビーズを洗浄して余分の未反応のグラフト化モノマー、グラフト化モノマーの混合物、または未結合のポリマー鎖を除去して、１００ｇ／Ｌを超えるタンパク質結合能力を有する多孔質クロマトグラフィービーズを形成し；
ｆ）クロマトグラフィービーズ表面に結合されているポリマー鎖にリガンドをカップリングさせる；
ことを含む前記方法。
【請求項１２】
多孔質クロマトグラフィービーズをポリマービーズ、アガロースビーズ及びセラミックビーズからなる群から選択する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ラジカル重合開始剤を過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、アゾビス（４−シアノ吉草酸）、イルガキュア（登録商標）２９５９、２，２’−アゾビス（２−アミジノ−プロパン）塩酸塩及びその組合せからなる群から選択する請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
不飽和官能基はアリル基からなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
アリル基は式Ｒ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２（式中、Ｒは多孔質支持体表面、または表面とアリル基間のリンカーである）からなる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
表面反応基の約２０〜約４００μｍｏｌ／ｍＬは式Ｒ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２（式中、Ｒは多孔質クロマトグラフィービーズ、またはビーズの表面とアリル基間のリンカーである）を有している請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
グラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物をメタクリレート、アクリレート、アクリルアミド及びその組合せからなる群から選択する請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
多孔質クロマトグラフィービーズ上の拡散性細孔は孔径が約１００Åから約１μの範囲である請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
リガンドを強カチオン交換基、スルホプロピル、スルホン酸、アニオン交換基、トリメチルアンモニウムクロリド、弱カチオン交換基、カルボン酸、弱アニオン交換基、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、ＤＥＡＥ、疎水性相互作用基、フェニル基、ブチル基及びプロピル基、及びアフィニティー基、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ及びタンパク質Ｌからなる群から選択する請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
リンカーをメタクリレート、アミド、アクリルアミド、エポキシド、アミン、ブタンジオールジグリシジルエーテル、エピクロロヒドリン、ポリエチレンジオールジグリシジルエーテル、エチレンジオールジグリシジルエーテル、アリルクロロアセテート、アリルクロリド、アリル（クロロ）ジメチルシラン、アリルグリシジルエーテル、アリルブロミド、アリルメタクリレート及びその組合せからなる群から選択する請求項７、８、１５及び１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
リガンドを強カチオン交換基、スルホプロピル、スルホン酸、アニオン交換基、トリメチルアンモニウムクロリド、弱カチオン交換基、カルボン酸、弱アニオン交換基、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、ＤＥＡＥ、疎水性相互作用基、フェニル基、ブチル基及びプロピル基、及びアフィニティー基、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ及びタンパク質Ｌからなる群から選択する請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマーエキステンダーをグラフト化するための改善された方法に関する。本発明は、タンパク質分離において使用される多孔質支持体に対してポリマーエキステンダーをグラフト化して、改善されたタンパク質結合能力及び樹脂選択性を有する多孔質支持体を得る方法の改善、並びに前記支持体を製造し、使用するためのキット及び方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
生存生物から産生される治療用タンパク質は現代のヘルスケアにおいてますます重要な役割を発揮している。これらのタンパク質は、従来の医薬品に比して疾患標的に対して高い特異性及び効力を含めた多くの利点を与える。哺乳動物免疫系は、疾患前兆をコントロールし、除くために広範囲のタンパク質ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを使用している。遺伝子及びタンパク質工学の出現により、多くの「設計された」、すなわち組換えタンパク質治療薬が開発できた。これらの治療薬は１つのタンパク質、化学修飾したタンパク質、タンパク質断片またはタンパク質コンジュゲートに基づき得る。これらの治療用タンパク質の１つの亜群であるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）がヘルスケア及び診断において広範囲に使用されることが知見された。これらのバイオ医薬品の製造においてクロマトグラフィー分離が広く使用されている。産業が成熟するにつれて、分離を強化するための新規の／進歩したテクノロジー及び方法の実施によりバイオ治療薬の製造業者に対してこれらの医薬品をより多くの患者に対してより低コストで提供する能力が与えられる。
【０００３】
タンパク質を精製するために使用されている一般的なクロマトグラフィー方法には、特にアフィニティー、バイオアフィニティー、イオン交換、逆相、疎水性相互作用、親水性相互作用、サイズ排除及び混合モード（上記したカテゴリーの組合せ）が含まれる。これらのタイプのクロマトグラフィー手順の各々の適用及び効率は、溶質分子と各々が移動液体相と相互作用するクロマトグラフィー系の固定相（クロマトグラフィーの媒介）間の表面−表面相互作用の選択性に依存している。多種多様な固定相クロマトグラフィー支持体材料が市販されている。
【０００４】
多くの場合、産物を不純物からうまく分離するための鍵は、固定相、ベースマトリックス及びリガンド特性（リガンドタイプ、リガンド密度、細孔構造、リガンド分布、材料組成）、並びに移動相または溶液特性（緩衝液タイプ、ｐＨ及び導電率）を正しく組み合わせることに依存している。ベースマトリックス及びリガンドの特殊な設計により、タンパク質結合能力またはスループット、選択性、ベッド透過性及び化学的安定性を含めた幾つかの重要な属性により特徴づけられ得るクロマトグラフィーの媒介が得られる。精製方法には、主に産物に結合すること（結合し、溶離させる）、主に不純物に結合すること（流動させる）、及びこれらの組合せ（所謂弱い分配等）が含まれる。これらのテクノロジーの設計において精製したタンパク質産物を得るロバストな分離を可能にし、確実にするために上に教示したクロマトグラフィーの媒介の特性をコントロールすることが重要である。
【０００５】
タンパク質分離はさまざまな多孔質支持体またはベースマトリックスを用いて達成され得る。樹脂またはビーズ構造に対する一般的材料には、多糖（アガロース、セルロース）、合成ポリマー（ポリスチレン、ポリメタクリレート及びポリアクリルアミド）及び例えば、シリカ、ジルコニア及び多孔性ガラスのような、セラミックスが含まれる。これらの材料は、典型的には約＞５μｍである「対流性細孔」よりもかなり小さく、典型的には約２００Å〜３，０００Åである「拡散性細孔」を介してタンパク質を吸着する。拡散性細孔はベッド透過性をコントロールし、充填ベッド中のベッド内空間により形成される。
【０００６】
膜及びモノリス材料もクロマトグラフィー、特に流動用途のために一般的に使用されている。典型的な膜組成物には、合成ポリマー（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリエーテルスルホン、ナイロン）及び多糖（例えば、セルロース）が含まれる。
【０００７】
モノリスはポリスチレン、多糖及び多くの他の合成ポリマーから開発されてきた。膜及びモノリスクロマトグラフィーは、これらの材料が膜及びモノリス材料の透過性をコントロールする同じ「対流性細孔」中にタンパク質を吸着する点でビーズとは異なる。典型的な膜及びモノリスの対流性孔径は約０．６μｍ〜約１０μｍの範囲である。これらの支持体へのリガンドの付加はさまざまな、十分に開発された技術を用いて達成され得る。
【０００８】
タンパク質結合能力を改善し、樹脂選択性を修飾するためにリガンド「テンタクルス」または「エキステンダー」を使用することは、ベースマトリックスに例えばグラフト化によりカップリングされているポリマー鎖上にリガンドを配置し、ベースマトリックス表面から離れて延長させることを含む。リガンドエキステンダーは典型的には、標的分子結合が表面上での単層吸着を上回るリガンド利用性を増加させるためにより高い結合能力を生ずる。例えば、イオン交換材として使用するための表面修飾した多孔性シリカ材料の製造は、開示内容を参照により本明細書に組み入れるＪａｎｓｅｎら，“Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  Ｐｏｒｏｕｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−Ｐｏｒｏｕｓ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）  ａｎｄ  Ｔｅｎｔａｃｌｅ−Ｔｙｐｅ  Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ”（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．５２２，１９９０，７７−９３）に教示されている。
【０００９】
タンパク質分離等のためにクロマトグラフィーにおいて使用されているような多孔質支持体上に表面エキステンダーを形成するために、ポリマーエキステンダーをグラフト化するための２つの標準方法、すなわち１）表面ラジカルを介して支持体からモノマーをグラフト化する（「からモノマーをグラフト化する」）及び２）活性化基を介して支持体に対して予形成したポリマーをグラフト化する（「に対してポリマーをグラフト化する」）が開発された。
【００１０】
樹脂に対してエキステンダーをカップリングさせるための１つの初期の方法は、モノマー重合を金属／酸化生成したラジカルで開始した後ベースマトリックス表面からポリマー鎖をグラフト化して、典型的にはタンパク質結合能力を５０％以上増加させることであった（例えば、ＭｕｌｌｅｒのＵＳ特許Ｎｏ．５，４５３，１８６を参照されたい）。ベースマトリックス表面にデキストランをグラフト化する（例えば、Ｂｅｒｇの米国特許Ｎｏ．６，４２８，７０７を参照されたい）；高分岐状ポリマーをグラフト化する（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＷＯ  ２００４／００３５４２を参照されたい）；疎水性ポリマーをグラフト化する（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ＳｃｉｅｎｃｅｓのＷＯ  ２００５／０９８４１５を参照されたい）；を含めた幾つかの他の方法も開発された。これらの米国特許及び公開された国際特許出願の各々の開示内容は参照により本明細書に含まれる。
【００１１】
例えば、ＷＯ  ０５／０９８４１５に教示されているようにベース樹脂に疎水性ポリマーをグラフト化すると、単純な表面結合リガンドと比較して樹脂のタンパク質選択性が修飾される。これらの修飾の各々は、表面「からモノマーをグラフト化する」（ラジカル重合の開始）または表面「に対してポリマーをグラフト化する」（予形成したポリマーの結合）のいずれかによりポリマー鎖をベースマトリックス表面に対して付加する。
【００１２】
ラジカル重合反応を用いる多孔質材料からのモノマーのグラフト化は十分に開発されたテクノロジーである。通常、反応は多孔質表面材料から、または溶液中の開始剤から開始し得る。
【００１３】
ラジカル重合の表面からの開始は、放射、金属酸化及び吸着させた開始種のような反応性環境に曝すことにより表面でラジカルを生成させることにより達成され得る（例えば、“Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ”，Ｆａｂｉｏ  Ｇａｒｂａｓｓｉ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８を参照されたい）。しかしながら、これらの「からのモノマーのグラフト化」方法はかなりコントロールされた溶液条件及び／または特殊な装置を必要とし、その実施は複雑で、時間がかかる。
【００１４】
反応を溶液から開始する場合、新しく形成されたポリマーと多孔質材料の表面間の永久的連結を可能にするためにはグラフト化前に表面に表面反応基を結合しなければならない。典型的には、表面反応基は溶液中のモノマー（例えば、形成性アクリレートポリマーを固定する結合アクリレートのような類似タイプのモノマー）と更に重合し得る。しかながら、退化的連鎖移動のために、ラジカル重合は限定的であり、アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）のようなアリルモノマーを使用しないことが好ましい（例えば、開示内容を参照により本明細書に組み入れる“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｏｄｉａｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい）。
【００１５】
しかしながら、アリル官能基を表面反応基として使用することは公知である。例えば、アリル表面反応基は、孔径＞１ｍｍを有し、効率的対流（＞２００ｍＬ／分）を与える多孔質構造（所謂「ジェリーロール」）を形成するために使用され得るセルロース繊維またはシリカを修飾するために使用され得る（例えば、それぞれＨｏｕの米国特許Ｎｏｓ．４，６６３，１６３及び４，７２４，２０７を参照されたい）。これらの米国特許の各々の開示内容は参照により本明細書に組み入れる。
【００１６】
或いは、アクリルアミドを重合し、アガロースマトリックス（例えば、１５％ｗｔ  アガロース）に結合し得、これにより重合アクリルアミドが結合されているアガロースマトリックスがＨＰＬＣ用途（ＨＰＬＣ用途はアナライト分割を最大とするために非孔質ビーズを使用する）のために有用であるようにマトリックスへのタンパク質の拡散が効果的に抑えられる（例えば、開示内容を参照により本明細書に組み入れるＨｊｅｒｔｅｎの米国特許Ｎｏ．５，１３５，６５０を参照されたい）。
【００１７】
しかしながら、ＨｏｕもＨｊｅｒｔｅｎも、拡散性細孔を有する多孔質クロマトグラフィー支持体の表面にカップリングされているアクリルアミドまたはモノマーを重合すると、多孔質支持体材料がその所望のタンパク質吸着特性を維持していることを教示も示唆もしていない。
【００１８】
感熱性ポリマーをグラフト化する場合、ＬＣＳＴ（下限臨界溶解温度）含有ポリマーのグラフト化収率を改善するために残留メタクリレート基に追加のビニルまたはアリル基が補充され得る（例えば、開示内容を参照により本明細書に組み入れるＰｅｔｅｒｓの米国特許Ｎｏ．５，９２９，２１４を参照されたい）。しかしながら、これらの修飾は対流性細孔（＞１μｍ）を有する支持体に対してなされ、その目的は温度変化及びグラフト化ＬＣＳＴポリマーに応じて対流を「開門する」ことであった。μｍサイズの細孔中の流れを抑えるためには、グラフト化鎖はこのサイズの細孔を「充填」または「閉塞」するのに十分な長さ及び密度を有していなければならない。Ｈｊｅｒｔｅｎの米国特許Ｎｏ．５，１３５，６５０（開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に教示されているように、このグラフト法は本質的に細孔を充填または閉塞させる。ＬＣＳＴポリマーは疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のために使用されており、ＬＣＳＴポリマーは結合挙動に対して強い温度依存性を示すので、多孔質クロマトグラフィーにおけるその全体的実際的応用は限定される。
【００１９】
エキステンダー鎖長を最短とすることにより表面修飾を生じさせるために、退化的連鎖移動を容易に受ける表面反応基及びモノマーを用いる戦術が使用されてきた。このアリル表面反応基及びアリルモノマーの組合せはエキステンダー鎖長を最短とするために有利である。
【００２０】
多孔質材料表面に対してポリマーエキステンダーを付加すると、改善されたタンパク質結合能力及び樹脂選択性の所望の電位変化が得られる。しかしながら、タンパク質分離がより要求されるようになるので、新規なポリマー構造を作成するための新しいテクノロジー及び方法を開発することがより重要になる。従って、改善されたタンパク質結合能力を開発し、タンパク質分離において使用されている多孔質支持体の樹脂選択性を修飾することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許第５，４５３，１８６号明細書
【特許文献２】米国特許第６，４２８，７０７号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４／００３５４２号
【特許文献４】国際公開第２００５／０９８４１５号
【特許文献５】米国特許第４，６６３，１６３号明細書
【特許文献６】米国特許第４，７２４，２０７号明細書
【特許文献７】米国特許第５，１３５，６５０号明細書
【特許文献８】米国特許第５，９２９，２１４号明細書
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．５２２，１９９０，７７−９３
【非特許文献２】“Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ”，Ｆａｂｉｏ  Ｇａｒｂａｓｓｉ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８
【非特許文献３】“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｏｄｉａｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
タンパク質分離のために有用であり、改善されたタンパク質結合能力及び樹脂選択性を有する新しい多孔質支持体に対する上記要求及び拡散性細孔を有する多孔質支持体に対するポリマーエキステンダーのグラフト化に関連する問題に応答して、拡散性細孔を有する多孔質支持体に対してポリマーエキステンダーをグラフト化するための新しい方法が開発された。
【００２４】
よって、本発明によれば、拡散性細孔を有する多孔質支持体の拡散性細孔を充填も閉塞させることなく前記多孔質支持体に対してポリマーエキステンダーをカップリングさせるための新しいグラフト法が開発され、その結果改善されたタンパク質結合能力及び／または結合選択性を有する支持体が得られる。
【００２５】
本発明は、少なくとも部分的に、容易に退化的連鎖移動を受ける表面反応基に対するラジカルグラフト化を含めた拡散性細孔及び多孔質支持体の表面にカップリングされている表面反応性不飽和基を有する多孔質支持体に対してポリマーエキステンダーをグラフト化するための新しい方法を提供する。
【００２６】
別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも部分的に、拡散性細孔を有し、タンパク質分離等において使用されている多孔質ビーズに対してポリマーエキステンダをグラフト化して、改善されたタンパク質結合能力及び所望の樹脂選択性を有するビーズを得るための新しい方法に基づいている。
【００２７】
さらに他の実施形態では、本発明は、少なくとも部分的に、多孔質ポリマークロマトグラフィービーズ、多孔質アガロースクロマトグラフィービーズ及び多孔質セラミッククロマトグラフィービーズに対するポリマーエキステンダーのグラフト化に基づいている。
【００２８】
別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも部分的に、孔径が約１００Åから約１μの範囲である拡散性細孔を有する多孔質支持体に対するポリマーエキステンダーのグラフト化に基づいている。
【００２９】
別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも部分的に、拡散性細孔及び表面反応性官能基を有する多孔質支持体に対してポリマーエキステンダーをグラフト化するための新しい方法に基づいており、その方法は、
ａ）拡散性細孔及びビーズにカップリングされている表面反応性官能基を有する多孔質クロマトグラフィービーズを用意するステップ；
ｂ）グラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物を含む溶液、及び可溶性ラジカル重合開始剤を用意するステップ；
ｃ）クロマトグラフィービーズを溶液と接触させるステップ；
ｄ）溶液中にラジカル重合開始剤を導入することによりビーズ上の表面反応性官能基とグラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物の間でフリーラジカル重合を開始して、ビーズにカップリングされているポリマー鎖エキステンダーを形成するステップ；
ｅ）ビーズを洗浄して余分の未反応のグラフト化モノマー、グラフト化モノマーの混合物、または未結合のポリマー鎖を除去して、１００ｇ／Ｌを超えるタンパク質結合能力を有する多孔質支持体を得るステップ；
ｆ）クロマトグラフィービーズ表面に結合されているポリマー鎖にリガンドをカップリングさせるステップ；
ことを含む。
【００３０】
追加の実施形態によれば、本発明は、少なくとも部分的に、拡散性細孔を有する多孔質支持体に対してポリマーエキステンダーをグラフト化するための新しい方法に基づき、前記グラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物には、メタクリレート、アクリレート、アクリルアミド、アクリル酸、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド、２−アクリルアミド−グリコール酸、イタコン酸またはエチルビニルケトン、グリシジルメタクリレート、Ν，Ν−ジメチルアクリルアミド、アクリルアミド、ヒドロキシプロピルメタクリレート、Ｎ−フェニルアクリルアミド、ヒドロキシプロピルアクリルアミド及びその組合せが含まれる。
【００３１】
別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも部分的に、多孔質支持体に対してポリマーエキステンダーをグラフト化するための新しい方法に基づき、前記ポリマー鎖エキステンダーにカップリングさせるリガンドには、強カチオン交換基、スルホプロピル基、スルホン酸基、アニオン交換基、トリメチルアンモニウムクロリド基、弱カチオン交換基、カルボン酸基、弱アニオン交換基、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ基、ＤＥＡＥ基、疎水性相互作用基、フェニル基、ブチル基及びプロピル基、及びアフィニティー基、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ及びタンパク質Ｌ、並びにその組合せが含まれる。
【００３２】
特定の他の実施形態では、本発明は、少なくとも部分的に、多孔質支持体に対してポリマーエキステンダーをグラフト化するための新しい方法に基づき、前記した多孔質支持体表面に対して表面反応性官能基をカップリングさせるリンカーには、メタクリレート、アミド、アクリルアミド、エポキシド、アミン、ブタンジオールジグリシジルエーテル、エピクロロヒドリン、ポリエチレンジオールジグリシジルエーテル、エチレンジオールジグリシジルエーテル、アリルクロロアセテート、アリルクロリド、アリル（クロロ）ジメチルシラン、アリルグリシジルエーテル、アリルブロミド、アリルメタクリレート及びその組合せが含まれる。
【００３３】
追加の実施形態によれば、本発明は、少なくとも部分的に、拡散性細孔及び表面反応性不飽和官能基を有する多孔質支持体に対してポリマーエキステンダーをグラフト化するための新しい方法に基づき、前記不飽和官能基はアリル基である。
【００３４】
もっと他の実施形態では、本発明は、少なくとも部分的に、多孔質支持体に対してラジカル重合開始剤を用いてポリマーエキステンダーをグラフト化するための新しい方法に基づき、前記ラジカル重合開始剤には過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、アゾビス（４−シアノ吉草酸）、イルガキュア（登録商標）２９５９、２，２’−アゾビス（２−アミジノ−プロパン）塩酸塩及びその組合せが含まれる。
【００３５】
本発明の別の目的は、タンパク質分離において使用されている拡散性細孔を有する多孔質支持体に対してポリマーエキステンダーをグラフト化して、改善されたタンパク質結合能力及び所望の樹脂選択性を得るための新しい方法の使用及び利用に関するキット及び方法を提供することである。
【００３６】
本発明の更なる要件及び作用効果は以下の詳細説明及び特許請求の範囲に記載されている。当業者に自明のように、本発明の多くの修飾及び改変はその趣旨及び範囲を逸脱することなく行える。先の概略的説明及び以下の詳細説明、特許請求の範囲及び添付の図面は例示及び説明のみであり、本発明の教示の各種実施形態の説明を与えると意図されていると理解されたい。本明細書中に教示されている具体的実施形態は単なる例として提示されており、決して限定すると解されない。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲の目的で、別段の指示がない限り、成分の量、材料のパーセンテージまたは割合、反応条件、及び明細書及び特許請求の範囲中で使用されている他の数値を表示するすべての数は全例で用語「約」により修飾されると理解されたい。
【００３８】
従って、反対の指示がない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲中に記載されている数値パラメーターは、本発明により得ようとする所望の特性に応じて異なり得る概算である。せめて、特許請求の範囲に対する均等論の適用を限定する試みとしてではなく、それぞれの数値パラメーターは少なくとも報告されている有効数字の数にてらして、通常の丸め技法を適用することにより解釈されるべきである。
【００３９】
本発明の広い範囲を記載する数値範囲及びパラメーターは概算であるにもかかわらず、具体的実施例に記載されている数値はできるだけ正確に報告されている。しかしながら、数値は本質的にそれぞれの試験測定で見られる標準偏差から必然的に生ずるある誤差を含んでいる。更に、本明細書中で教示されている範囲はすべてその中に含まれるすべての部分範囲を包含すると理解されるべきである。例えば、「１〜１０」の範囲には（１と１０を含めた）１の最小値と１０の最大値の間のすべての部分範囲、すなわち１以上の最小値及び１０以下の最大値を有するすべての部分範囲、例えば５．５〜１０を含む。
【００４０】
本発明を更に詳細に説明する前に、複数の用語を定義する。これらの用語の使用は本発明の範囲を限定せず、本発明の説明を助けるのに役立つにすぎない。
【００４１】
本明細書中で使用されている単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は文脈から判断してそうでない限り複数形を含む。
【００４２】
生長ラジカルは非常に反応性であるが、モノマーとの連鎖移動生成物は反応性でない（安定なラジカルを形成する）場合に「退化的連鎖移動」は、起こる（開示内容が参照により本明細書に組み入れる“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｏｄｉａｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい）。この連鎖移動により、重合速度及びポリマー分子量が大きく低下する。これは、低分子量表面修飾を望むときにはグラフト化において有利である（例えば、各々がＩｈｒｅの米国特許Ｎｏｓ．７，０４８，８５８及び７，０６０，１８７を参照されたい）。しかしながら、より反応性のモノマーを使用するときには、表面反応基はより長いエキステンダーに対する連鎖停止アンカーとなり、またはポリマーをその場で形成するときには「に対してポリマーをグラフト化する」方法を探る。これらの現場生成されるエキステンダーは改善された結合能力及び修飾された選択性を与える。広範囲のモノマー（例えば、アクリレート、アクリルアミド、メタクリレート）及び広範囲の支持体またはベースマトリックス（例えば、ポリマービーズ、アガロースビーズ及びセラミックビーズ）で使用され得るので、この方法は有利である。
【００４３】
本発明で使用され得る他の「多孔質支持体」または「ベースマトリックス」には、拡散性細孔及びアリル表面反応基を有する材料が含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用され得る多孔質支持体またはベースマトリックスに対する好ましい材料には、アリルメタクリレート等を含有する多糖、合成ポリマー、アガロース、セルロース、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、並びに前記のハイブリッドまたは組合せが含まれる。最も好ましい材料には、アリル表面反応基で修飾されているアガロース、アリル表面反応基を含有するポリメチルアクリレート材料、アリル表面反応基で修飾されているポリメチルアクリレート材料、及びアリルメチルメタクリレートを含むポリメタクリレート材料が含まれる。
【００４４】
本発明で使用され得る「官能基」の例には、イオン交換基、バイオアフィニティー基、疎水性基、硫黄親和性相互作用基、キレートまたはキレート化基、標的化合物と所謂π−π相互作用を有する基、水素結合基及び親水性基が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明で使用され得る「リガンド」の例には、イオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、硫黄親和性相互作用基、金属アフィニティー基、アフィニティー基、バイオアフィニティー基及び混合モード基（前記の組合せ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用され得る幾つかの好ましいリガンドには、強カチオン交換基、例えばスルホプロピル、スルホン酸；強アニオン交換基、例えばトリメチルアンモニウムクロリド；弱カチオン交換基、例えばカルボン酸；弱アニオン交換基、例えばＮ，Ｎ−ジエチルアミノまたはＤＥＡＥ；疎水性相互作用基、例えばフェニル、ブチル、プロピル、ヘキシル；及びアフィニティー基、例えばタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ及びタンパク質Ｌが含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明で使用され得る「ラジカル重合開始剤」の例には、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、アゾビス（４−シアノ吉草酸）、イルガキュア（登録商標）２９５９（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ，ニューヨーク州ホーソン）、２，２’−アゾビス（２−アミジノ−プロパン）塩酸塩等が含まれるが、これらに限定されない。反応物に対するグラフト化は当業界で公知の方法、好ましくは熱開始（加熱）またはＵＶ照射により開始され得る。
【００４７】
本発明で使用され得る「表面反応性不飽和基または官能基」の例には、アリル基が含まれるが、これに限定されない。好ましい表面反応性不飽和官能基には、式Ｒ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２（式中、Ｒは多孔質支持体表面、または表面とアリル基間のリンカーである）を有するアリル基が含まれる。
【００４８】
本発明で使用され得る「リンカー」の例には、ラジカル重合中高レベルの退化的連鎖移動を受ける基を含有している分子が含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用され得るリンカーには、苛性アルカリ溶液に対してかなりの安定性を有する分子または官能基、例えばエーテル結合、メタクリレート、アミド、アクリルアミド、エポキシド、アミド等を有する化合物も含まれる。ブタンジオールジグリシジルエーテル、エピクロロヒドリン、ポリエチレンジオールジグリシジルエーテル、エチレンジオールジグリシジルエーテルのような好ましいリンカーを更に当業界で公知の方法を用いてアリル含有基（例えば、アリルグリシジルエーテル）で修飾してもよい。好ましいリンカーには、アリルクロロアセテート、アリルクロリド、アリル（クロロ）ジメチルシラン、アリルグリシジルエーテル、アリルブロミド及びアリルメタクリレートが含まれる。最も好ましいリンカーには、アリルグリシジルエーテル、アリルブロミド及びアリルメタクリレートが含まれる。
【００４９】
本発明で使用され得る「グラフト化モノマー」または「グラフト化モノマーの混合物」の例には、メタクリレート、アクリレート及びアクリルアミドが含まれるが、これらに限定されない。最も好ましいグラフト化モノマーには、アクリル酸、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド、２−アクリルアミド−グリコール酸、イタコン酸またはエチルビニルケトン、グリシジルメタクリレート、Ν，Ν−ジメチルアクリルアミド、アクリルアミド、ヒドロキシプロピルメタクリレート、Ｎ−フェニルアクリルアミド、ヒドロキシプロピルアクリルアミド及びその組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
典型的なグラフト法では、残留不飽和が更なる重合に対する反応性を維持するか、または表面開始が注意深くコントロールされた条件を必要とする。例えば、表面に対してアクリレート官能基を結合すると、成長しているポリマー鎖は表面と反応し、その後成長し続けることができ、よってエキステンダーが表面に対して本質的にランダムに結合する場所を作る。例えば、重合鎖はその鎖が成長している間表面基と反応し、成長し続け得、よって表面反応基をエキステンダーに沿ってランダムにとり込む。ヒドロキシル基の金属酸化のような表面開始の場合、溶液条件は金属の活性酸化状態を維持し、表面活性化反応のクエンチを避けるためにコントロールされなければならない。
【００５１】
本明細書中で教示されているグラフト法では、これら２つの欠陥が解消される。ポリマーエキステンダーの重合は制限の弱い条件下で溶液中で開始し、多孔質支持体の表面への結合は表面反応基の退化的連鎖移動はかなり阻害剤らしく作用するので、末端である可能性が高くなり、ポリマー鎖の成長が終わる（開示内容を参照により本明細書に組み入れる“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｏｎ”，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｏｄｉａｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい）。
【００５２】
退化的連鎖移動を受けるアリル表面反応基に対するグラフト化はモノリス、セルロース繊維及びシリカ粒子の場合公知である。しかしながら、モノリス、セルロース繊維及びシリカ粒子に対する公知の修飾はビーズをベースとするテクノロジーで見られる拡散性細孔よりもかなり大きい対流性細孔（＞１μｍ）に対してなされた。セルロース及びシリカ粒子は修飾され、その後大きい対流性細孔を有する多孔質構造に形成された。
【００５３】
内部構造の表面／表面域（ここでは、リガンドが標的分子と相互作用し得る）にのみエキステンダーが存在することが望ましいので、多孔質構造を形成する前に材料をエキステンダーで修飾することは有利でなく、ビーズをベースとするテクノロジーに対して容易に適用され得ない。これらの修飾粒子から多孔質構造を形成することにより粒子（例えば、セルロース及びシリカ）を修飾すると、対流性細孔が閉塞し、エキステンダーがランダムに分布し、よって限定されているが非常に少ないリガンドしか標的分子相互作用に対して与えられない。
【００５４】
加えて、グラフト化エキステンダーをバルク多孔質構造に取り込む（すなわち、ビーズ形成前にエキステンダーをグラフト化する）と、材料の機械的特性及び細孔形態が損なわれたり、変化したりする恐れがある。モノリス修飾により、μｍの大きさの細孔が制限される（流れが減少する）。こうして観察された細孔の制限から、より小さい拡散性モノリス細孔を完全に充填または閉塞するポリマーエキステンダー修飾を有するモノリスが得られることが示唆される。
【００５５】
先に挙げたＨｊｅｒｔｅｎは、細孔中のタンパク質拡散を解消して、分析用ＨＰＬＣのような非孔質ビーズの用途に対して材料を使用することができるように重合ポリアクリレートをグラフト化することにより完全に閉塞された細孔を有するアガロースマトリックスを教示している。本明細書中で教示されている本発明の方法では、結合能力を改善する表面反応基密度、開始剤濃度及びモノマー濃度の組合せにより選択性を変化させ、新規な分離樹脂を作成することができる。
【実施例】
【００５６】
実施例１Ａ：多糖樹脂の表面反応基及びカチオン交換エキステンダーでの修飾
アガロースビーズ（セファロース４Ｂ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）は、開示内容を参照により本明細書に組み入れるＰｏｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｆｏｒｎｓｔｅｄｔ，“Ｇｒｏｕｐ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ”（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．５１，１９７０，ｐ．４７９−４８９）の教示に従ってエピクロロヒドリンを用いて架橋された。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）で修飾した：ジャーにおいて８Ｍ  ＮａＯＨ（１８ｇ）、ＡＧＥ（４ｇ）、Ｎａ２ＳＯ４（３ｇ）にビーズ（１０ｍＬ）を添加した後、５０℃で一晩撹拌した。次いで、ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキ（１０ｍＬ）をプラスチックバッグ中の２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（２．４ｇ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（１７．３ｇ）、Ν，Ν−ジメチルアクリルアミド（０．２ｇ）及びイルガキュア（登録商標）２９５９（ＣＩＢＡ）（０．１２ｇ）を含有している２０ｍＬ溶液に添加した。プラスチックバッグを２枚のポリエチレンシートの間に挟んだ。次いで、ポリエチレンサンドイッチを輸送ユニットにテープで貼り付け、このユニットは“Ｈ”バルブがあるフュージョン・システムズＵＶ露光ラボユニットを介してアセンブリを運ぶ。露光時間はアセンブリをどれだけ速くＵＶユニット中を移動させるかによりコントロールされる。この例では、アセンブリを１５フィート／分でＵＶチャンバー中を移動させる。アセンブリを５分間静置させた後、バッグを取り出し、ビーズを濾過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄する。実施例６の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表１に示す。
【００５７】
実施例１Ｂ：多糖樹脂の表面反応基及びカチオン交換エキステンダーなしでの修飾
アガロースビーズ（セファロース４Ｂ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）をＰｏｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｆｏｒｎｓｔｅｄｔ，“Ｇｒｏｕｐ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ”（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．５１，１９７０，ｐ．４７９−４８９）の教示に従ってエピクロロヒドリンを用いて架橋した。
【００５８】
次いで、ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキ（１０ｍＬ）をプラスチックバッグ中の２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（２．４ｇ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（１７．３ｇ）、Ν，Ν−ジメチルアクリルアミド（０．２ｇ）及びイルガキュア（登録商標）２９５９（ＣＩＢＡ）（０．１２ｇ）を含有している２０ｍＬ溶液に添加した。プラスチックバッグを２枚のポリエチレンシートの間に挟んだ。次いで、ポリエチレンサンドイッチを輸送ユニットにテープで貼り付け、このユニットは“Ｈ”バルブがあるフュージョン・システムズＵＶ露光ラボユニットを介してアセンブリを運ぶ。露光時間はアセンブリをどれだけ速くＵＶユニット中を移動させるかによりコントロールされる。この例では、アセンブリを１５フィート／分でＵＶチャンバー中を移動させる。アセンブリを５分間静置させた後、バッグを取り出し、ビーズを濾過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄する。実施例６の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表１に示す。
【００５９】
実施例１Ｃ：多糖樹脂の表面反応基及びアニオン交換エキステンダーでの修飾
アガロースビーズ（セファロース４Ｂ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）をＰｏｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｆｏｒｎｓｔｅｄｔ，“Ｇｒｏｕｐ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ”（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．５１，１９７０，ｐ．４７９−４８９）の教示に従ってエピクロロヒドリンを用いて架橋した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）で修飾した：ジャーにおいて１Ｍ  ＮａＯＨ（１８ｇ）、ＡＧＥ（１２ｇ）、Ｎａ２ＳＯ４（３ｇ）にビーズ（１０ｍＬ）を添加した後、５０℃で一晩撹拌した。次いで、ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキを７５％（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド溶液（６ｇ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（１３．６ｇ）及び過硫酸アンモニウム（０．２ｇ）を含有する溶液に添加した。混合物を６５℃で１７時間撹拌した。次いで、ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄した。実施例６の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表１に示す。
【００６０】
実施例１Ｄ：低イオン強度で最適の結合を有する多糖樹脂の表面反応基及びカチオン交換エキステンダーでの修飾
アガロースビーズ（セファロース４Ｂ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）を開示内容を参照により本明細書に組み入れるＰｏｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｆｏｒｎｓｔｅｄｔ，“Ｇｒｏｕｐ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ”（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．５１，１９７０，ｐ．４７９−４８９）の教示に従ってエピクロロヒドリンを用いて架橋した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）で修飾した：ジャーにおいて１Ｍ  ＮａＯＨ（１８ｇ）、ＡＧＥ（２．４ｇ）、Ｎａ２ＳＯ４（３ｇ）にビーズ（１０ｍＬ）を添加した後、５０℃で一晩撹拌した。次いで、ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキをジャー中の２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（１ｇ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（１８．８ｇ）、Ν，Ν−ジメチルアクリルアミド（０．１５ｇ）及び過硫酸アンモニウム（０．０８ｇ）を含有している２０ｍＬ溶液に添加した。ジャーを撹拌し、６５℃に１時間加熱した。ビーズを濾過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄した。実施例６の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表１に示す。
【００６１】
実施例１Ｅ：高いイオン強度で最適の結合を有する多糖樹脂の表面反応基及びカチオン交換エキステンダーでの修飾
アガロースビーズ（セファロース４Ｂ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）を開示内容を参照により本明細書に組み入れるＰｏｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｆｏｒｎｓｔｅｄｔ，“Ｇｒｏｕｐ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ”（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．５１，１９７０，ｐ．４７９−４８９）の教示に従ってエピクロロヒドリンを用いて架橋した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）で修飾した：ジャーにおいて１Ｍ  ＮａＯＨ（１８ｇ）、ＡＧＥ（２．４ｇ）、Ｎａ２ＳＯ４（３ｇ）にビーズ（１０ｍＬ）を添加した後、５０℃で一晩撹拌した。次いで、ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキをジャー中の２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（２ｇ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（１７．８ｇ）、Ν，Ν−ジメチルアクリルアミド（０．２ｇ）及び過硫酸アンモニウム（０．０８ｇ）を含有している２０ｍＬ溶液に添加した。ジャーを撹拌し、６５℃に１時間加熱した。ビーズを濾過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄した。実施例６の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表１に示す。
【００６２】
【表１】
2013532829.tif 000002
【００６３】
実施例２Ａ：低イオン強度で最適に結合する合成ポリマー樹脂の表面反応基及びカチオン交換エキステンダーでの修飾
ポリメタクリレートビーズ（ＨＷ−６５，４５ｕｍ，ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（５０ｍＬ）を１Ｍ  ＮａＯＨ中に２５℃で２時間浸漬した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（登録商標）（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）で修飾した：ジャー中にビーズ（１５ｍＬ）、１Ｍ  ＮａＯＨ（１８ｇ）、ＡＧＥ（２．４ｇ）、Ｎａ２ＳＯ４（３ｇ）を添加し、５０℃で一晩撹拌した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）（５００ｍＬ）で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。次いで、湿ったケーキ（１０ｍＬ）をジャー中の２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（１．２ｇ）、過硫酸アンモニウム（０．０８ｇ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（１８．５ｇ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（０．２４ｇ）を含有する溶液に添加した。ジャーを撹拌し、６５℃に１時間加熱した。ビーズを濾過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄した。実施例６の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表２に示す。
【００６４】
実施例２Ｂ：高いイオン強度で最適に結合する合成ポリマー樹脂の表面反応基及びカチオン交換エキステンダーでの修飾
ポリメタクリレートビーズ（ＨＷ−６５，４５ｕｍ，ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（５０ｍＬ）を１Ｍ  ＮａＯＨ中に２５℃で２時間浸漬した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（登録商標）（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）で修飾した：ジャー中にビーズ（１５ｍＬ）、１Ｍ  ＮａＯＨ（１８ｇ）、ＡＧＥ（２．４ｇ）、Ｎａ２ＳＯ４（３ｇ）を添加し、５０℃で一晩撹拌した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）（５００ｍＬ）で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。次いで、湿ったケーキ（１０ｍＬ）をジャー中の２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（２．８ｇ）、過硫酸アンモニウム（０．０８ｇ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（１７ｇ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（０．１２ｇ）を含有する溶液に添加した。ジャーを撹拌し、６５℃に１時間加熱した。ビーズを濾過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄した。実施例６の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表２に示す。
【００６５】
実施例２Ｃ：合成ポリマー樹脂のカチオン交換エキステンダーなしでの修飾
ポリメタクリレートビーズ（ＨＷ−６５，４５ｕｍ，ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（５０ｍＬ）を１Ｍ  ＮａＯＨ中に２５℃で２時間浸漬した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（登録商標）（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）で修飾した：ジャー中にビーズ（１５ｍＬ）、１Ｍ  ＮａＯＨ（１８ｇ）、ＡＧＥ（２．４ｇ）、Ｎａ２ＳＯ４（３ｇ）を添加し、５０℃で一晩撹拌した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）（５００ｍＬ）で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。表面反応基を次の方法により標準のカチオン交換官能基に変換した：ジャー中にビーズ（６ｇ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（４．７ｍＬ）、５０％ｗｔ  ＮａＯＨ（０．８ｇ）及びメタ亜硫酸水素ナトリウム（２．３ｇ）を添加し、室温で一晩撹拌した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）クオリティー水（３×５００ｍＬ）で洗浄した。この手順により、樹脂の表面へのタンパク質結合は可能であるが、エキステンダー、すなわちグラフト化鎖を利用しないエキステンダーなしの対照樹脂が生じた。実施例６の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表２に示す。
【００６６】
実施例２Ｄ：合成ポリマー樹脂の表面反応基及びアニオン交換エキステンダーでの修飾
ポリメタクリレートビーズ（ＨＷ−６５，４５ｕｍ，ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（２０ｍＬ）を１Ｍ  ＮａＯＨ中に２５℃で２時間浸漬した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（登録商標）（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）で修飾した：ジャー中にビーズ（１５ｍＬ）、１Ｍ  ＮａＯＨ（１８ｇ）、ＡＧＥ（２．４ｇ）、Ｎａ２ＳＯ４（３ｇ）を添加し、５０℃で一晩撹拌した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）（５００ｍＬ）で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。次いで、湿ったケーキ（１０ｍＬ）をジャー中の７５％（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド溶液（６ｇ）、過硫酸アンモニウム（０．１２ｇ）及びＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（１３．６ｇ）を含有する溶液に添加した。ジャーを撹拌し、６５℃に１時間加熱した。ビーズを濾過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄した。実施例６の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表２に示す。
【００６７】
実施例２Ｅ：標準アニオン交換樹脂を作成するための合成ポリマー樹脂の表面反応基及びエキステンダーなしでの修飾
ポリメタクリレートビーズ（ＨＷ−６５，４５ｕｍ，ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（５０ｍＬ）を１Ｍ  ＮａＯＨ中に２５℃で２時間浸漬した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（登録商標）（５００ｍＬ）で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキをジャー中の７５％（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド溶液（６ｇ）、過硫酸アンモニウム（０．１２ｇ）及びＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（１３．６ｇ）を含有する溶液に添加した。ジャーを撹拌し、６５℃に１時間加熱した。次いで、ビーズを濾過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄した。この手順により、樹脂の表面へのタンパク質結合は可能であるが、エキステンダー、すなわちグラフト化鎖を利用しないエキステンダーなしの対照樹脂が生じた。実施例６の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表２に示す。
【００６８】
【表２】
2013532829.tif 000003
【００６９】
実施例２Ａ〜２Ｄから、方法が２つ以上のタイプのベースマトリックス（ここでは、実施例１のアガロースに対してポリメタクリレート）に対して能力の同様の改善で適用され得ることが示される。カチオン及びアニオン交換エキステンダーのいずれの場合も、エキステンダーのアリル表面反応基に対するグラフト化で２〜３倍高い能力が観察された。加えて、実施例１Ｄ及び１Ｅの場合の能力は「従来技術」のエキステンダー修飾樹脂Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）Ｓより高い。このことは、ＩｇＧのような大きなタンパク質の拡散がこの方法によりグラフト化エキステンダーを用いて可能であり、実際能力は従来技術に比して改善されることを示している。
【００７０】
実施例２Ｆ：合成ポリマー樹脂の表面反応基及び疎水性相互作用エキステンダーでの修飾
ポリメタクリレートビーズ（ＨＷ−６５，４５ｕｍ，ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（５０ｍＬ）を１Ｍ  ＮａＯＨ中に２５℃で２時間浸漬した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（登録商標）（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）で修飾した：ジャー中にビーズ（１０ｇ）、２Ｍ  ＮａＯＨ（１８ｇ）、ＡＧＥ（１２ｇ）、Ｎａ２ＳＯ４（３ｇ）を添加し、５０℃で一晩撹拌した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）（５００ｍＬ）で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキ（５ｇ）をジャー中のＮ−フェニルアクリルアミド（０．２ｇ）、過硫酸アンモニウム（０．０８ｇ）、Ν，Ν−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）（３．４ｇ）、ヘキシレングリコール（３．４ｇ）及びＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（３ｇ）を含有する溶液に添加した。ジャーを撹拌し、８０℃に１７時間加熱した。ビーズを濾過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄した。実施例６の方法に従って測定した平衡タンパク質結合（ＩｇＧ）能力は３３ｇ／Ｌであると判明した。
【００７１】
実施例２Ｇ：合成ポリマー樹脂の表面反応基及び疎水性相互作用エキステンダーでの修飾
ポリメタクリレートビーズ（ＨＷ−６５，４５ｕｍ，ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（５０ｍＬ）を１Ｍ  ＮａＯＨ中に２５℃で２時間浸漬した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（登録商標）（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）で修飾した：ジャー中にビーズ（１０ｇ）、８Ｍ  ＮａＯＨ（１８ｇ）、ＡＧＥ（１２ｇ）、Ｎａ２ＳＯ４（３ｇ）を添加し、５０℃で一晩撹拌した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）（５００ｍＬ）で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキ（５ｇ）をジャー中のＮ−フェニルアクリルアミド（０．２ｇ）、過硫酸アンモニウム（０．０８ｇ）、Ν，Ν−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）（３．４ｇ）、ヘキシレングリコール（３．４ｇ）及びＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（３ｇ）を含有する溶液に添加した。ジャーを撹拌し、８０℃に１７時間加熱した。ビーズを濾過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄した。実施例６の方法に従って測定した平衡タンパク質結合（ＩｇＧ）能力は４０ｇ／Ｌであると判明した。
【００７２】
実施例３Ａ：ユニークな化学的環境及び２つの異なる孔径領域を有する非対称アガロースビーズ
内部構造の作成：
非対称アガロースビーズを米国特許出願公開Ｎｏ．２００７／０２１２５４０に教示されている方法に従って作成した：１５％  アガロース溶液（Ｈｉｓｐａｎａｇａｒ製Ｄ−５アガロース）（１，０００ｍｌ）を第１の油浴において８０℃で絶えず撹拌しながらＳｐａｎ  ８０乳化剤（１２０ｍｌ）を含有している鉱油（２，０００ｍｌ）に添加して、油相が連続しているエマルジョンを得た。次いで、エマルジョンを直径０．５インチ（１２．７ｍｍ）、長さ６インチ（１５２．４ｍｍ）のＫｅｎｉｃｓスタティックミキサー（ＫＭＲ−ＳＡＮ−１２）を用いて３Ｌ／分の流速で５℃の鉱油の第２の油浴に圧送した。最大粒径が２００ｕｍの球状均質アガロースビーズを得た。このビーズを沈降させ、水、エタノール、次いで水で洗浄し、篩い分けして、ビーズサイズを７５〜１２５μｍの範囲とした。次いで、ビーズを開示内容を参照により本明細書に組み入れるＰｏｒａｔｈら，“Ａｇａｒ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｇｅｌ  ｂｏｕｎｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｄｅｓｕｌｐｈａｔｅｄ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ａｇａｒ  ａｎｄ  ａｇａｒｏｓｅ  ｉｎ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｂｅａｄ  ｆｏｒｍ”（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．６０，１９７１，ｐ．１６７−１７７）に教示されている方法に従って架橋した。次いで、ビーズをアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）で修飾した。ジャー中にビーズ（１２０ｇ）、８Ｍ  ＮａＯＨ（１５０ｍＬ）、硫酸ナトリウム（３０ｇ）及びＡＧＥ（１００ｇ）を添加し、４５℃で一晩撹拌した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）クオリティー水（３×５００ｍＬ）で洗浄した。選択性試験結果を表３に示す。
【００７３】
実施例３Ｂ：ユニークな化学的環境及び２つの異なる孔径領域を有する非対称アガロースビーズ：標準カチオン交換官能基を有する内部構造
実施例３Ａで作成したビーズの一部を修飾して、標準のカチオン交換材料を作成した。ビーズをメタ重亜硫酸ナトリウムで修飾した。ジャー中にビーズ（６０ｇ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（４７ｍＬ）、５０％ｗｔ  ＮａＯＨ（７．９ｇ）及びメタ重亜硫酸ナトリウム（２３．４ｇ）を添加し、室温で一晩撹拌した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）クオリティー水（３×５００ｍＬ）で洗浄した。
【００７４】
次いで、ビーズを次の方法に従って６％  アガロースで被覆した：ビーズ（５０ｍＬ）を６％  アガロース溶液（Ｈｉｓｐａｎａｇａｒ製Ｄ−５アガロース）（３００ｍＬ）中に混合して、スラリーを得た。アガロース−ビーズ混合物を９０℃で絶えず撹拌しながら鉱油（１０００ｍｌ）に添加して、油相が連続であるエマルジョンを得た。次いで、エマルジョンを直径０．５インチ（１２．７ｍｍ）、長さ６インチ（１５２．４ｍｍ）のＫｅｎｉｃｓスタティックミキサー（ＫＭＲ−ＳＡＮ−１２）を用いて３Ｌ／分の流速で５℃の鉱油に圧送した。生じたアガロースビーズは１０ｕｍの推定外層厚さを有しており、ビーズ集団は主に（＞５０％）シングルコアであった。ビーズを沈降させ、水、エタノール、次いで水で洗浄し、篩い分けして、ビーズサイズを７５〜１２５μｍの範囲とした。ビーズを開示内容を参照により本明細書に組み入れるＰｏｒａｔｈら，“Ａｇａｒ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｇｅｌ  ｂｏｕｎｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｄｅｓｕｌｐｈａｔｅｄ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ａｇａｒ  ａｎｄ  ａｇａｒｏｓｅ  ｉｎ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｂｅａｄ  ｆｏｒｍ”（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．６０，１９７１，ｐ．１６７−１７７）に教示されている方法に従って架橋した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）クオリティー水（３×５００ｍＬ）で洗浄した。
【００７５】
次いで、ビーズをブロモプロパンスルホン酸（ＢＰＳＡ）で修飾した。ジャー中にビーズ（１０ｇ）、５Ｍ  ＮａＯＨ（３０ｍＬ）、ＢＰＳＡ（７．２ｇ）を添加し、５０℃で一晩撹拌した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）クオリティー水（５００ｍＬ）で洗浄した後、２０％  エタノール中に保存した。選択性試験結果を表３に示す。
【００７６】
実施例３Ｃ：ユニークな化学的環境及び２つの異なる孔径領域を有する非対称アガロースビーズ：本発明の方法による内部構造；改善された結合強度／選択性を有するカチオン交換エキステンダー
実施例３Ａで作成したビーズの一部を修飾して、改善された結合強度／選択性を有するカチオン交換エキステンダーを作成した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキ（１０ｍＬ）をプラスチックバッグ中の２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（２．４ｇ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（１７．３ｇ）、Ν，Ν−ジメチルアクリルアミド（０．２ｇ）及びイルガキュア（登録商標）２９５９（ＣＩＢＡ）（０．１２ｇ）を含有している２０ｍＬ溶液に添加した。プラスチックバッグを２枚のポリエチレンシートの間に挟んだ。次いで、ポリエチレンサンドイッチを輸送ユニットにテープで貼り付け、このユニットは“Ｈ”バルブがあるフュージョン・システムズＵＶ露光ラボユニットを介してアセンブリを運ぶ。露光時間はアセンブリをどれだけ速くＵＶユニット中を移動させるかによりコントロールされる。この例では、アセンブリを５フィート／分でＵＶチャンバー中を移動させる。アセンブリを５分間静置させた後、バッグを取り出し、ビーズを濾過し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（５００ｍＬ）で洗浄する。
【００７７】
次いで、ビーズを次の方法に従って６％  アガロースで被覆した：ビーズ（５０ｍＬ）を６％  アガロース溶液（Ｈｉｓｐａｎａｇａｒ製Ｄ−５アガロース）（３００ｍＬ）中に混合して、スラリーを得た。アガロース−ビーズ混合物を９０℃で絶えず撹拌しながら鉱油（１０００ｍｌ）に添加して、油相が連続であるエマルジョンを得た。次いで、エマルジョンを直径０．５インチ（１２．７ｍｍ）、長さ６インチ（１５２．４ｍｍ）のＫｅｎｉｃｓスタティックミキサー（ＫＭＲ−ＳＡＮ−１２）を用いて３Ｌ／分の流速で５℃の鉱油に圧送した。生じたアガロースビーズは１０ｕｍの推定外層厚さを有しており、ビーズ集団は主に（＞５０％）シングルコアであった。ビーズを沈降させ、水、エタノール、次いで水で洗浄し、篩い分けして、ビーズサイズを７５〜１２５μｍの範囲とした。ビーズを開示内容を参照により本明細書に組み入れるＰｏｒａｔｈら，“Ａｇａｒ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｇｅｌ  ｂｏｕｎｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｄｅｓｕｌｐｈａｔｅｄ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ａｇａｒ  ａｎｄ  ａｇａｒｏｓｅ  ｉｎ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｂｅａｄ  ｆｏｒｍ”（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．６０，１９７１，ｐ．１６７−１７７）に教示されている方法に従って架橋した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）クオリティー水（３×５００ｍＬ）で洗浄した。
【００７８】
次いで、ビーズをブロモプロパンスルホン酸（ＢＰＳＡ）で修飾した。ジャー中にビーズ（１０ｇ）、５Ｍ  ＮａＯＨ（３０ｍＬ）、ＢＰＳＡ（７．２ｇ）を添加し、５０℃で一晩撹拌した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）クオリティー水（５００ｍＬ）で洗浄した後、２０％  エタノール中に保存した。選択性試験結果を表３に示す。
【００７９】
実施例３Ｄ：ユニークな化学的環境及び２つの異なる孔径領域を有する非対称アガロースビーズ：本発明の方法による内部構造；改善された結合強度／選択性を有するカチオン交換エキステンダー
実施例３Ａからのビーズを実施例３Ｃと同様に、次のような追加の最終修飾ステップを加えて修飾した：ビーズをブロモプロパンスルホン酸（ＢＰＳＡ）で修飾した。ジャー中にビーズ（１０ｇ）、５Ｍ  ＮａＯＨ（３０ｍＬ）、ＢＰＳＡ（７．２ｇ）を添加し、５０℃で一晩撹拌した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）クオリティー水（５００ｍＬ）で洗浄した後、２０％  エタノール中に保存した。選択性試験結果を表３に示す。
【００８０】
実施例３Ｅ：ユニークな化学的環境及び２つの異なる孔径領域を有する非対称アガロースビーズ：本発明の方法による内部構造；改善された結合強度／選択性を有するカチオン交換エキステンダー
実施例３Ａからのビーズを実施例３Ｃと同様に、次のような２つの追加の最終修飾ステップを加えて修飾した：ビーズをブロモプロパンスルホン酸（ＢＰＳＡ）で修飾した。ジャー中にビーズ（１０ｇ）、５Ｍ  ＮａＯＨ（３０ｍＬ）、ＢＰＳＡ（７．２ｇ）を添加し、５０℃で一晩撹拌した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）クオリティー水（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで、ビーズをブロモプロパンスルホン酸（ＢＰＳＡ）で修飾した。ジャー中にビーズ（１０ｇ）、５Ｍ  ＮａＯＨ（３０ｍＬ）、ＢＰＳＡ（７．２ｇ）を添加し、５０℃で一晩撹拌した。ビーズをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）クオリティー水（５００ｍＬ）で洗浄した後、２０％  エタノール中に保存した。選択性試験結果を表３に示す。
【００８１】
【表３】
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【００８２】
実施例３Ｃ〜３Ｅは、内部ビーズ構造が本発明の方法に従って修飾されており、外部構造が一連の標準カチオン交換方法により修飾されている非対称アガロースビーズを教示している。比較として、実施例３Ｂは内部及び外部構造が標準カチオン交換方法により修飾されている非対称アガロースビーズを教示している。
【００８３】
表３は、塩化ナトリウム勾配溶離中タンパク質を溶離させるのに必要なカラム容積（ＣＶ）に換算してＩｇＧとリゾチームの分離を示している。実施例３Ｂ及び市販のアガロース樹脂であるＳＰ−セファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗが２つのタンパク質を同様に分離することは明白である。
【００８４】
しかしながら、本発明方法を含む内部構造を有する実施例３Ｃ〜３Ｅは非常に改善された２つのタンパク質の分離を与える。
【００８５】
実施例４：選択性試験方法
異なる実効電荷及び分子量を有する２つのタンパク質を使用して、典型的なカチオン交換（ＣＥＸ）条件下で選択性または分離係数を試験した。ｐＨ４．５で１０ｍＳの導電率を与えるべくＮａＣｌを含む５０ｍＭ  酢酸緩衝液中に０．５ｍｇ／ｍｌ  ポリクローナルＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）及び０．５ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を含有するタンパク質の混合物を担体に充填した正味タンパク質が１０ｍｇ／ｍＬであるように各サンプルカラム（７ｃｍのベッド高，０．６６ｃｍの直径）に２００ｃｍ／時で適用した。次いで、タンパク質混合物を、１０ｍＳで始め、８０ｍＳで終わる３０ＣＶ  ＮａＣｌ勾配を用いて２００ｃｍ／時で溶離させた。各タンパク質のピークを溶離勾配の開始からのカラム容積（ＣＶ）に換算して記録した（ボイド容積を補正した）。
【００８６】
実施例５：表面反応基濃度の測定
表面反応基のアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を付加した後、上に教示した例示的修飾の代表的サンプルを洗浄し、以下のように水性臭素を用いて滴定した：１０％  ＮａＯＢｒ（２０ｍＬ）及び５０ｍＭ  酢酸ナトリウム（８０ｍＬ，ｐＨ４．５）の混合物を調製した。水中ＡＧＥ（１００ｕＬ）を滴定することにより溶液中の臭素濃度を較正した。ＡＧＥ表面基が完全に反応したことを示す臭素の色が持続するまで表面修飾したビーズの１０ｍＬサンプルを臭素溶液で滴定した。
【００８７】
実施例６：平衡タンパク質結合能力の測定
上の実施例に教示されている生成物及び市販のベンチマークの各々についての静的、すなわち平衡能力を以下の方法を用いて測定した：
１．ビーズ懸濁液（１０％  ビーズ）を適切な平衡緩衝液（ＥＱ緩衝液，表４を参照されたい）中の各サンプルから作成した；
２．ビーズ懸濁液を撹拌し、１００μｌサンプルを３つの１５ｍＬプラスチック製コニカルチューブにピペットで移した；
３．ＥＱ緩衝液中の適切なタンパク質溶液（供給物，タンパク質はすべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製ポリクローナルであった，表２を参照されたい）を各チューブに添加した（１０ｍＬ）；
４．チューブに蓋を被せ、Ｌａｂｑｕａｋｅローター／シェーカーを用いてゆっくり（＜１０ｒｐｍ）回転させた；
５．１６時間後、ビーズを沈降させ、結合後溶液からＵＶ測定値を得た；
６．ＵＶ吸光度を供給物タンパク質に対する適切な吸光係数を用いてタンパク質濃度に換算し、物質収支を用いて飽和能力を調べた。
【００８８】
【表４】
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【００８９】
本明細書中に教示されている方法のタンパク質結合特性は、幾つかの異なる結合条件及びタンパク質分離に対する全タンパク質能力について試験した。比較例１Ａ／１Ｂ、２Ａ／２Ｃ及び２Ｄ／２Ｅから、アリル表面反応基を付加すると、タンパク質能力が表面反応基なし及び／またはエキステンダーなしに比して有意に改善するようにグラフト化ポリマーエキステンダーの密度を改善することが明らかとなる。実施例１Ａ／１Ｂでは、ＩｇＧに対するアガロースビーズ能力は、表面反応性アリル基に対するグラフト化の場合約１０倍以上、すなわち１００ｇ／Ｌ対１１／Ｌである。
【００９０】
本明細書中に教示されている方法は、実施例１Ｄ／１Ｅ及び２Ａ／２ＢのＩｇＧ能力より示されるように樹脂の結合強度も修飾する。
【００９１】
加えて、実施例１Ｄ及び２ＡはｐＨ５、８ｍＳの導電率でＩｇＧを結合するように設計されている。ベースマトリックス、アガロースまたは別の合成ポリマーに関係なく、エキステンダー化学は特定の結合条件に適合され得る。特定のタンパク質精製プロセスの場合、幾つかのイオン交換樹脂にとって問題であり得る高い塩濃度で所望の結合条件が生ずる。
【００９２】
例えば、対照樹脂（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）Ｓ）は、塩化ナトリウムで導電率を８ｍＳから１６ｍＳに上昇させるとＩｇＧに対する結合能力を低下させる。これは、多分樹脂のＩｇＧに対する結合強度が低下するためであろう。
【００９３】
本明細書中に教示されているグラフト法を用いると、実施例１Ｅ及び２Ｂに示されているように導電率を８ｍＳから１６ｍＳに上昇させると低下しているＩｇＧに対する樹脂の結合能力が改善され得る。樹脂の結合特性をベースマトリックスに関係なく再び適合させると、１６ｍＳの導電率で高い能力が生じ、これらの条件下で結合能力を＞５０％増加させることができる。こうすると、より高い導電率でＩｇＧを効果的に充填することができ、当業者が当該タンパク質を不純物から分離するために使用し得る緩衝液条件を拡大する。
【００９４】
本発明は任意のサンプル調製方法と一緒に使用され得、その方法にはクロマトグラフィー；調製用タンパク質クロマトグラフィー電気泳動；ゲル濾過；サンプル遠心；オンラインサンプル調製；診断キット試験；診断テスト；化学物質の輸送；生体分子の輸送；ハイスループット・スクリーニング；アフィニティー結合アッセイ；液体サンプルの精製；流体サンプルの成分のサイズに基づく分離；流体サンプルの成分の物性に基づく分離；流体サンプルの成分の化学特性に基づく分離；流体サンプルの成分の生物学的特性に基づく分離；流体サンプルの成分の静電的特性に基づく分離；及びその組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
本発明は、拡散性細孔を充填または閉塞することなく且つタンパク質分離中タンパク質等の拡散を制限することなく、表面にポリマーエキステンダーを付加することにより、拡散性細孔を有する多孔質構造の結合能力を向上させるために使用され得るキットも提供する。多孔質構造の表面に付加されたポリマーエキステンダーはより高い導電率でかなり大きい結合能力を与える。
【００９６】
用語「キット」は、例えば１つのパッケージ中に組み合わせた構成部品の各々、個々に包装されており、一緒に販売される構成部品の各々、或いはカタログ（例えば、同一のページ、またはカタログの見開き広告）に一緒に挙げられている構成部品の各々を含む。
【００９７】
本明細書中に教示されている本発明のグラフト法は、拡散性細孔を充填することなく且つ拡散を制限することなく表面に対してエキステンダーを付加することにより拡散性細孔を有する多孔質構造の結合能力を向上させ得る。本明細書中に教示されている本発明のグラフト法は、効果的なタンパク質分離のために必要な２つの重要な樹脂特性である樹脂の結合強度及び選択性を変化させることもできる。本明細書中に教示されているように、これは使用するグラフト化条件またはモノマー組成を変えることにより容易に達成し得る。最後に、本明細書中に教示されている本発明のグラフト法はより高い導電率でかなり大きい結合能力を有するエキステンダーを製造することもできる。
【００９８】
先に挙げた開示内容は独立の有用性を有する複数の別々の発明を包含し得る。これらの発明の各々はその好ましい形態で開示されているが、本明細書中に開示されており、説明されている具体的実施形態は、複数の変更が可能であるので限定的な意味で解釈されるべきではない。本発明の主題は、本明細書中に教示されている各種の要件、特徴、機能及び／または特性のすべての新規で自明でない組合せ及び部分的組合せを包含する。以下の特許請求の範囲は、特に新規で自明でないと見なされる特定の組合せ及び部分的組合せを示している。特徴、機能、要件及び／または特性の他の組合せ及び部分的組合せで具体化される発明は、本出願または関連出願を優先権主張している出願において特許請求され得る。別の発明または同一発明に関していようとなかろうと、及び元の発明よりも広い、狭い、等しいまたは異なっていようとなかろうと、特許請求の範囲は本明細書の本発明の主題の範囲に含まれるとも見なされる。
【国際調査報告】
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