(57)【要約】本開示は、対象の末梢血に対してＶＬＡ−４陽性であるか、または組織に由来する幹細胞および／または前駆細胞を動員するための方法に関する。本方法は、ＶＬＡ−４に対する有効量のアンチセンス化合物を対象または組織に投与することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３４陽性でα４インテグリン陽性の多能性細胞および／または寡能性細胞をヒト対象の末梢血に動員するための方法であって、α４インテグリンに対する有効量のアンチセンス化合物を前記ヒト対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞が、骨髄から動員される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、造血幹細胞および／または前駆細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アンチセンス化合物が、
５’−ＭｅＣＭｅＵＧＡＧＴＭｅＣＴＧＴＴＴＭｅＵＭｅＣＭｅＣＡＭｅＵＭｅＵＭｅＣＭｅＵ−３’
［式中、
ａ）オリゴヌクレオチドの１９個のヌクレオチド間結合のそれぞれが、Ｏ，Ｏ−結合型ホスホロチオエートジエステルであり、
ｂ）５′末端から１〜３位のヌクレオチドが、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｃ）５′末端から４〜１２位のヌクレオチドが、２′−デオキシリボヌクレオシドであり、
ｄ）５′末端から１３〜２０位のヌクレオチドが、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｅ）すべてのシトシンが、５−メチルシトシン（ＭｅＣ）である］
のアンチセンス化合物またはその製薬上許容される塩である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ３４陽性でα４インテグリン陽性の多能性細胞および／または寡能性細胞をヒト対象の末梢血に動員するための方法であって、有効量のアンチセンス化合物が、
５’−ＭｅＣＭｅＵＧＡＧＴＭｅＣＴＧＴＴＴＭｅＵＭｅＣＭｅＣＡＭｅＵＭｅＵＭｅＣＭｅＵ−３’
［式中、
ａ）オリゴヌクレオチドの１９個のヌクレオチド間結合のそれぞれが、Ｏ，Ｏ−結合型ホスホロチオエートジエステルであり、
ｂ）５′末端から１〜３位のヌクレオチドが、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｃ）５′末端から４〜１２位のヌクレオチドが、２′−デオキシリボヌクレオシドであり、
ｄ）５′末端から１３〜２０位のヌクレオチドが、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｅ）すべてのシトシンが、５−メチルシトシン（ＭｅＣ）である］
のアンチセンス化合物またはその製薬上許容される塩を、前記ヒト対象に投与することを含む、方法。
【請求項６】
前記細胞が、骨髄から動員される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、造血幹細胞および／または前駆細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、間葉前駆細胞または内皮前駆細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
成長因子もしくはその類似体、またはＣＸＣＲ４阻害剤を投与することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記成長因子が、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＤＦ−１、またはＳＣＦである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記成長因子もしくはその類似体、または前記ＣＸＣＲ４阻害剤を、前記アンチセンス化合物の前、後、またはそれと同時に投与することをさらに含む、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
低用量の化学療法または追加のα４インテグリン拮抗薬を、前記アンチセンス化合物の前、後、またはそれと同時に投与することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記動員細胞を採取することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、前記アンチセンス化合物の投与から少なくとも４日後に採取される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞を採取する前に、末梢血中のＣＤ３４陽性の多能性細胞および／または寡能性細胞の数をモニターすることをさらに含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、コロニー形成単位またはフローサイトメトリーによってモニターされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、１つまたは複数の細胞表面抗原決定基の発現についてモニターされる、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記動員された細胞を採取する前に、末梢血中のＢ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、樹状細胞、血小板、好中球、好酸球、および／または好塩基球の数をモニターすることをさらに含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、好中球、好酸球、および／または好塩基球のうちの１つまたは複数の数の減少後に採取される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞を採取する前に、前記アンチセンス化合物の前記Ｃｍａｘおよび／またはＣｔｒｏｕｇｈ血漿中濃度をモニターすることをさらに含む、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｃｔｒｏｕｇｈが、２０〜４５ｎｇ／ｍＬである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
正常な血球産生および成熟の機能不全もしくは機能障害、造血器悪性腫瘍、自己免疫疾患、肝疾患、または免疫不全を治療するための方法であって、
必要とする対象に、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の動員後に採取された細胞を投与することを含む、方法。
【請求項２３】
前記細胞が同種細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が自己細胞である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、幹細胞および／または前駆細胞を動員（mobilize）するための方法を提供する。一つの例において、本開示は、骨髄から末梢血への造血幹細胞および／または前駆細胞を動員するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞は、自己複製し、血液中で骨髄、赤血球、巨核球、および白血球細胞系列を生じさせる前駆細胞に分化し、骨髄から出て循環血の中に動員して、プログラム細胞死（アポトーシス）を経ることがある。造血幹細胞は、血液または骨髄から単離され得る。
【０００３】
幹細胞は、一般に表面抗原決定基によって特徴付けられている。そのような細胞マーカーを使用して、造血幹細胞を同定し、血液または骨髄から単離することができる。そのように単離された細胞のグループには、いくつかの真の長期自己複製幹細胞である細胞、いくつかの短期前駆細胞、およびいくつかの非幹細胞が含まれる。
【０００４】
古典的な造血幹細胞の源は、骨髄である。骨髄中の１００００細胞毎に約１個は、長期造血幹細胞であり、存在する他の細胞は、間質細胞、間質幹細胞、血液前駆細胞、ならびに成熟および成熟中の白血球および赤血球を含む。
【０００５】
近年、自家（ドナーおよびレシピエントが同一の個体である）および同種（ドナーおよびレシピエントが異なる個体である）「骨髄」移植の大部分は、実際に、骨髄ではなく、末梢循環から得られた血球幹細胞および前駆細胞であった。造血幹細胞および前駆細胞は、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などのサイトカインをドナーに注入することによって、骨髄から血液に大量に移動することが知られている。ドナーは、典型的に、細胞採取の数日前にＧ−ＣＳＦを注入される。採取された細胞のうち、５〜２０％は、真の造血幹細胞である。
【０００６】
幹細胞および／または前駆細胞を骨髄から血液に動員し、その採取を容易にするための方法が必要である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、α４インテグリン発現および／またはＶＬＡ−４および／またはα４β７インテグリン発現を阻害するアンチセンス化合物を使用して、多能性細胞および／または寡能性細胞を末梢血に動員できることを意外にも発見した。多能性細胞および／または寡能性細胞の動員は、骨髄破壊的（骨髄機能廃絶）用量の放射線および化学療法を受ける患者において、後次の良好な生着、例えば、造血再構成に有利である。
【０００８】
したがって、本開示は、ＣＤ３４陽性で、α４インテグリン陽性の多能性細胞および／または寡能性細胞をヒト対象の末梢血に動員するための方法を提供し、本方法は、α４インテグリンに対する有効量のアンチセンス化合物を対象に投与することを含む。
【０００９】
一実施形態において、細胞は、骨髄から動員される。
【００１０】
さらなる実施形態において、細胞は、造血幹細胞および／または前駆細胞である。
【００１１】
別の実施形態において、細胞は、間葉または内皮幹細胞および／または前駆細胞である。
【００１２】
一実施形態において、アンチセンス化合物は、
５’−ＭｅＣＭｅＵＧＡＧＴＭｅＣＴＧＴＴＴＭｅＵＭｅＣＭｅＣＡＭｅＵＭｅＵＭｅＣＭｅＵ−３’
［式中、
ａ）オリゴヌクレオチドの１９個のヌクレオチド間結合のそれぞれは、Ｏ，Ｏ−結合型ホスホロチオエートジエステルであり、
ｂ）５′末端から１〜３位のヌクレオチドは、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｃ）５′末端から４〜１２位のヌクレオチドは、２′−デオキシリボヌクレオシドであり、
ｄ）５′末端から１３〜２０位のヌクレオチドは、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｅ）すべてのシトシンは、５−メチルシトシン（ＭｅＣ）である］
のアンチセンス化合物またはその製薬上許容される塩である。
【００１３】
本開示は、ＣＤ３４陽性で、α４インテグリン陽性の、多能性細胞および／または寡能性細胞を対象の末梢血に動員するための方法も提供し、本方法は、有効量のアンチセンス化合物、
５’−ＭｅＣＭｅＵＧＡＧＴＭｅＣＴＧＴＴＴＭｅＵＭｅＣＭｅＣＡＭｅＵＭｅＵＭｅＣＭｅＵ−３’
［式中、
ａ）オリゴヌクレオチドの１９個のヌクレオチド間結合のそれぞれは、Ｏ，Ｏ−結合型ホスホロチオエートジエステルであり、
ｂ）５′末端から１〜３位のヌクレオチドは、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｃ）５′末端から４〜１２位のヌクレオチドは、２′−デオキシリボヌクレオシドであり、
ｄ）５′末端から１３〜２０位のヌクレオチドは、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｅ）すべてのシトシンは、５−メチルシトシン（ＭｅＣ）である］
のアンチセンス化合物またはその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む。
【００１４】
一つの実施形態において、細胞は、骨髄から動員される。
【００１５】
さらなる実施形態において、細胞は、造血幹細胞および／または前駆細胞である。
【００１６】
別の実施形態において、細胞は、間葉または内皮幹細胞および／または前駆細胞である。
【００１７】
一つの実施形態において、開示の方法は、アンチセンス化合物を少なくとも週１回、少なくとも週２回、少なくとも週３回、または少なくとも週４回投与することを含む。
【００１８】
別の実施形態において、開示の方法は、１日１回、または２日、３日、もしくは４日に１回投与することを含む。
【００１９】
別の実施形態において、開示の方法は、体重１ｋｇ当たり２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、または３４００ｍｇのアンチセンス化合物を、治療の過程にわたって投与することを含む。
【００２０】
別の実施形態において、開示の方法は、体重１ｋｇ当たり５００〜１６００ｍｇのアンチセンス化合物を、治療の過程にわたって投与することを含む。
【００２１】
別の実施形態において、開示の方法は、アンチセンス化合物を皮下的に投与することを含む。
【００２２】
別の実施形態において、開示の方法は、体重１ｋｇ当たり６ｍｇのアンチセンス化合物を、単回皮下注射または２回皮下注射として投与することを含む。
【００２３】
一つの実施形態において、開示の方法は、成長因子もしくはその類似体、またはＣＸＣＲ４阻害剤を投与することをさらに含む。
【００２４】
一つの実施形態において、成長因子は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＤＦ−１、またはＳＣＦである。
【００２５】
一つの実施形態において、成長因子もしくはその類似体、またはＣＸＣＲ４阻害剤は、アンチセンス化合物の前、後、または同時に投与される。
【００２６】
一つの実施形態において、開示の方法は、成長因子およびＣＸＣＲ４阻害剤を、アンチセンス化合物の前、後、または同時に投与することをさらに含む。
【００２７】
一つの実施形態において、開示の方法は、低用量の化学療法または追加のα４インテグリン拮抗薬（例えば、抗α４インテグリン抗体）を、アンチセンス化合物の前、後、または同時に投与することをさらに含む。
【００２８】
一つの実施形態において、開示の方法は、動員された細胞を採取することをさらに含む。一実施例において、対象の末梢血は、アフェレーシスによって採取される。
【００２９】
一つの実施形態において、細胞は、アンチセンス化合物の投与から少なくとも４日後に採取される。
【００３０】
一つの実施形態において、開示の方法は、細胞を採取する前に、末梢血中のＣＤ３４陽性多能性および／または寡能性細胞の数をモニターすることをさらに含む。
【００３１】
一つの実施例において、細胞は、コロニー形成単位によってモニターされる。別の実施例において、細胞は、フローサイトメトリーによって、例えば、１つまたは複数の細胞表面抗原決定基の発現によってモニターされる。
【００３２】
一つの実施形態において、開示の方法は、動員された細胞を採取する前にモニターされる、末梢血中のＢ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、樹状細胞、血小板、好中球、好酸球、および／または好塩基球の数をモニターすることをさらに含む。
【００３３】
一つの実施例において、細胞は、Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、好中球、好酸球、および／または好塩基球のうちの１つまたは複数の数の減少後に採取される。
【００３４】
一つの実施形態において、開示の方法は、細胞を採取する前に、アンチセンス化合物のＣｍａｘおよび／またはＣｔｒｏｕｇｈ血漿中濃度をモニターすることをさらに含む。
【００３５】
一つの実施例において、Ｃｔｒｏｕｇｈは、２０〜４５ｎｇ／ｍＬである。
【００３６】
一つの実施形態において、対象は、哺乳類、好ましくはヒトである。
【００３７】
本開示は、正常な血球産生および成熟の機能不全または機能障害、造血器悪性腫瘍、自己免疫疾患、肝疾患、または免疫不全の治療のための方法も提供し、本方法は、それを必要とする対象に、開示の方法に従って動員後に採取された細胞を投与することを含む。
【００３８】
一つの実施形態において、細胞は同種である。
【００３９】
別の実施形態において、細胞は自家である。
【００４０】
本明細書における任意の実施形態は、他に具体的に記載されない限り、任意の他の実施形態について準用しなければならない。
【００４１】
本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態によってその範囲を制限されるものではなく、単に例証を目的とする。機能的に同等の産生物、組成物、および方法は、本明細書に記載のとおり、明らかに発明の範囲内にある。
【００４２】
以下、本発明を、非限定な例によって、添付の図面を参照しつつ説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】薬物動態データである。ヒトα４インテグリンアンチセンス化合物（ＡＴＬ１１０２）の中央値プロファイルは、１日目から８週目までの累積ピークまたは総プラズマ照射レベルの兆候を示さない。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
配列表の要点
・配列番号１  ヒトα４インテグリンアンチセンス化合物（ＡＴＬ１１０２）
・配列番号２  マウスα４インテグリンアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ３４８５７４）
一般的方法および選択された定義
他に具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝子学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および生物化学の）当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有しなければならない。
【００４５】
他に指定のない限り、本発明において利用される組み換えタンパク質、細胞培養、および免疫学的技法は、当業者によく知られた標準手順である。そのような技法は、以下などのソースにおいて、文献全体にわたって記載および説明されている。
Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４）、
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、
Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、
Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５  ａｎｄ  １９９６）、
Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までのすべての改訂を含む）、
Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）
Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（現在までのすべての改訂を含む）
用語「および／または」、例えば、「Ｘおよび／またはＹ」は、「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味するものと理解されるべきであり、両方の意味またはいずれかの意味に対して明示的な支持を提供するべきである。
【００４６】
本明細書で使用される、「約」または「およそ」は概して、所与の値または範囲の２０％以内、より好ましくは１０％以内、およびさらにより好ましくは５％以内を意味するものとする。
【００４７】
本明細書全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変型は、指定の要素、整数、もしくは工程、または要素、整数、もしくは工程の群の包含を暗示するが、任意の他の要素、整数、もしくは工程、または要素、整数、もしくは工程の群の除外を意味しないことが理解されるであろう。
【００４８】
本明細書全体にわたって、特に別段の指定がない限り、または文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単一の工程、物質の組成物、工程の群、または物質の組成物の群は、それらの工程、物質の組成物、工程の群、または物質の組成物の群のうちの１つおよび複数（すなわち、１つまたは複数）を包含するものとする。
【００４９】
本明細書で使用される、用語「幹細胞」は、自己複製する能力（すなわち、未分化状態を維持しながら多数の細胞分割周期を経る）、および特殊化した細胞種に分化する能力を有する細胞を指す。最も厳密な意味において、幹細胞は、分化全能性または多能性のいずれかであり得るが、多能性前駆細胞は、多くの場合、幹細胞と呼ばれ、寡能性、複能性、または単能性前駆細胞が幹細胞と称される場合もある。幹細胞の存在は、例えば、表面抗原決定基の分析（例えば、フローサイトメトリー分析）によって評価され得る。一実施例において、幹細胞は造血幹細胞である。
【００５０】
「造血幹細胞」は、自己複製および分化して、骨髄（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞）、赤芽球（赤血球）、巨核球（血小板）、およびリンパ球系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む、あらゆる血球種を生じさせることができる。分化の間に、造血幹細胞は、成熟エフェクター細胞になる過程で段階的に、最初にその自己複製能力を喪失し、次に系列能を喪失する。典型的に、Ｌｉｎ−、ｃ−Ｋｉｔ＋、ＳＣＡ−１＋、Ｆｌｋ２−、ＣＤ３４−、Ｓｌａｍｆｌ＋マウス細胞は、造血幹細胞である。そのような細胞は、典型的に８週齢のマウスにおいて検出可能である。典型的に、Ｌｉｎ−、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ−ヒト細胞は、造血幹細胞である。造血幹細胞は、複能性または多能性幹細胞および／または前駆細胞と称される場合がある。一実施形態において、ＣＤ３４の発現を使用して、ヒトドナーから単離された末梢血中の造血幹細胞を同定する。このマーカーは、造血前駆細胞上にも存在する。そのように単離された細胞群は、真の長期自己複製幹細胞であるいくつかの細胞、いくつかの短期前駆細胞、および汚染物質により末期に近い／末期の血球も含む。
【００５１】
本明細書で使用される、用語「前駆細胞」は、多能性、寡能性、複能性、または単能性細胞を指し、造血、間葉、および内皮前駆細胞を含む。リンパ球共通前駆細胞（ＣＬＰ）および骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）は、リンパ球および骨髄コンパートメントの前駆細胞である。これらは、進行性の制限分化能を有する、方向付けされた前駆細胞のコホートに成熟し、最終的に主要な造血系列の非複製後期前駆細胞および末期細胞になる。ＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞は、ＣＭＰ細胞に由来する。ＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞は、リンパ球を除くすべての血球を生じさせる能力を有する。ＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞は、ＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅ細胞を生じさせる。ＣＦＵ−ＧＥＭＭは、ＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅ細胞と比較して、高い増殖能力を有する。しかしながら、ＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅ細胞がより一般的である。ＣＬＰ細胞は、ＴおよびＢならびに他のリンパ球を生じさせる。
【００５２】
前駆細胞の存在は、例えば、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ（コロニー形成単位、多能性／寡能性顆粒球、赤血球、巨核球、単球）、ＣＦＵ−ＧＭ（コロニー形成単位、複能性顆粒球、マクロファージ）、ＢＦＵ−Ｅ（バースト形成単位、単能性赤芽球）、ＨＰＰ−ＣＦＣ（高増殖能コロニー形成細胞）などを含む、様々な種のコロニー形成単位を形成する、試料中の細胞の能力によって評価され得る。インビトロクローン形成法の開発は、制限分化能力を有すると考えられる、骨髄細胞系列の前駆細胞のサブセットを画定した。前記細胞のクローン成長および成熟によって、造血細胞（赤血球、顆粒球、マクロファージ、血小板などを含む）および非造血細胞（例えば、間葉細胞）の形態学的に異なるコロニーのインビトロ形成を支持する条件が開発された。アッセイ培地内の異なる成長因子および他の栄養素の特異的な形成は、どの種の前駆細胞コロニーが培養系内で成長するかを決定する。
【００５３】
前駆細胞（ＣＬＰ集団を含む）の存在は、表面抗原決定基の他の分析（例えば、フローサイトメトリー分析）によって評価することができる（表Ｉ）。ＣＭＰおよびＣＬＰ細胞は、以下に寡能性として分類され得る抗原決定基プロファイルを有するが、文献において多能性と称される場合が多い。ＣＦＵ−ＧＥＭＭ前駆細胞も同様に、抗原的に寡能性であると紹介されるが、文献において多能性と称される場合が多い。
【００５４】
【表１】
2013541520.tif 000002
【００５５】
一実施形態において、非幹細胞ＣＦＵ前駆細胞の総数は、幹細胞回復、および血小板または好中球回復の予測因子である。
【００５６】
本明細書で使用される、用語「分化全能性細胞」（全能性としても知られる）は、胚細胞種および胚体外細胞種に分化し得る細胞を指す。そのような細胞は、完全な生有機体を構成することができる。これらの細胞は、卵子および精子細胞の融合から産生される。受精卵の最初の数回の分裂によって産生された細胞も全能である。
【００５７】
本明細書で使用される、用語「複能性細胞」は、全能性細胞の子孫であり、ほぼすべての細胞（すなわち、３つの胚葉のいずれかに由来する細胞）に分化し得る細胞を指す。
【００５８】
本明細書で使用される、用語「多能性細胞」は、多数の細胞に分化し得るが、密接に関連する細胞族の細胞のみを指し、造血幹細胞を含む。
【００５９】
本明細書で使用される、用語「寡能性細胞」は、たった数個の細胞に分化し得る細胞を指し、リンパ球または赤血球前駆細胞、例えば、ＣＭＰ、ＣＬＰ、およびＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞を含む。
【００６０】
本明細書で使用される、用語「複能性細胞」は、たった２つの細胞種、例えば、ＣＦＵ−ＧＭ細胞に分化し得る細胞を指す。
【００６１】
用語「単能性細胞」は、たった１つの細胞種、それら自体に分化し得るが、非幹細胞／前駆細胞と区別する自己複製特性を有する細胞、例えば、ＢＦＵ−Ｅ細胞を指す。
【００６２】
細胞個体発生の文脈において、形容詞「分化した」は相対語である。「分化した細胞」は、それが比較される細胞よりも発生経路をさらに下方に進行した細胞である。
【００６３】
本明細書で使用される、用語「動員」は、任意の組織源、例えば、骨髄から末梢血への幹細胞および／または前駆細胞の動員を指し、末梢血中の幹細胞および／または前駆細胞の集団または細胞の特定の亜集団の増加をもたらす。
【００６４】
本明細書で使用される、用語「アンチセンス化合物」は、幹細胞および／または前駆細胞の動員に影響するＶＬＡ−４および／またはα４β７インテグリンのα４インテグリン鎖をコードする、核酸分子にハイブリダイズするオリゴマー化合物を指す。ヒトのα４インテグリン鎖は、ＣＤ４９ｄである。アンチセンス化合物は、ＣＤ４９ｄ、β１インテグリン、および／またはβ７インテグリンの発現に干渉し得る。
【００６５】
本明細書で使用される、用語「α４インテグリンをコードする核酸分子」は、「標的核酸」と相互利用可能であり、ＶＬＡ−４またはα４β７インテグリンのα４インテグリン鎖をコードするＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（前ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡまたはその部分）、さらにそのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡを包含する。
【００６６】
本明細書で使用される、用語「ＶＬＡ−４」は、α４インテグリンおよびβ１インテグリンのヘテロ二量体を指す。ＶＬＡ−４は、正常な末梢血ＢおよびＴ細胞、胸腺細胞、単球、および他の細胞上、ならびに造血幹細胞および前駆細胞上に相当レベルで発現される。ＶＬＡ−４は、間葉および内皮前駆細胞ならびに間葉幹細胞および潜在的に内皮幹細胞上でも発現される。ＶＬＡ−４のリガンドは、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）およびＣＳ−１、フィブロネクチンのＨｅｐ  ＩＩ領域内で交互にスプライスしたドメインを含む。
【００６７】
本明細書で使用される、用語「α４β７インテグリン」は、α４インテグリンおよびβ７インテグリンのヘテロ二量体を指す。α４β７インテグリンは、腸管指向性を有するメモリＴ細胞のサブセットを同定する。α４β７インテグリンは、マスト、リンパ球、およびＮＫ前駆細胞のサブセット上でも発現される。α４β７インテグリンは、いくつかの幹細胞および前駆細胞上で発現される。α４β７インテグリンのリガンドは、ＭＡｄＣａｍ−１およびＶＣＡＭ−１を含む。
【００６８】
本明細書で使用される、用語「Ｇ−ＣＳＦポリペプチド」または「Ｇ−ＣＳＦ」は、自然発生するヒトおよび異種Ｇ−ＣＳＦ、組み換えによって産生されたＧ−ＣＳＦ、１７４または１７７アミノ酸のいずれかから成る発現産生物、もしくはその断片、類似体、変異体、または誘導体を指し、例えば、Ｋｕｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、米国特許第４，８１０，６４３号、同第４，９０４，５８４号、同第５，１０４，６５１号、同第５，２１４，１３２号、同第５，２１８，０９２号、同第５，３６２，８５３号、同第５，６０６，０２４号、同第５，８２４，７７８号、同第５，８２４，７８４号、同第６，０１７，８７６号、同第６，１６６，１８３号、同第６，２６１，５５０号、第２００３／００６４９２２号、欧州特許第０３３５４２３号、同第０２７２７０３号、同第０４５９６３０号、同第０２５６８４３号、同第０２４３１５３号、国際特許第ＷＯ９１０２８７４号、ＡＵ−Ａ−１０９４８／９２号およびＡＵ−Ａ−７６３８０／９１号に報告される。化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦが含まれ、例えば、第ＷＯ９０１２８７４号、第ＥＰ０４０１３８４号、および第ＥＰ０３３５４２３号に報告されるものを参照されたい。第ＷＯ０３００６５０１号、第ＷＯ０３０３０８２１号、第ＷＯ０１５１５１０号、第ＷＯ９６１１９５３号、第ＷＯ９５２１６２９号、第ＷＯ９４２００６９号、第ＷＯ９３１５２１１号、第ＷＯ９３０５１６９号、第ＪＰ０４１６４０９８号、第ＷＯ９２０６１１６号、第ＷＯ９２０４４５５号、第ＥＰ０４７３２６８号、第ＥＰ０４５６２００号、第ＷＯ９１１１５２０号、第ＷＯ９１０５７９８号、第ＷＯ９００６９５２号、第ＷＯ８９１０９３２号、第ＷＯ８９０５８２４号、第ＷＯ９１１８９１１号、および第ＥＰ０３７０２０５号も参照されたい。Ｇ−ＣＳＦの全形態、例えば、Ａｌｂｕｇｒａｎｉｎ（登録商標）、Ｎｅｕｕｌａｓｔａ（登録商標）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、およびＧｒａｎｏｃｙｔｅ（登録商標）も本明細書に包含される。
【００６９】
α４インテグリンに対するアンチセンス化合物
本開示の方法は、幹細胞および／または前駆細胞の動員のためのα４インテグリンに対するアンチセンス化合物の使用に依存する。そのようなアンチセンス化合物は、ＶＬＡ−４またはα４β７のα４インテグリン鎖をコードする核酸を標的とする。好ましくは、アンチセンス化合物は、オリゴヌクレオチドである。しかしながら、オリゴヌクレオチド模倣体を含むが、これに限定されない他のオリゴマーアンチセンス化合物が考えられる。
【００７０】
その標的核酸を有するアンチセンス化合物のハイブリダイゼーションは、概して、「アンチセンス」と称される。その標的核酸を有するアンチセンス化合物のハイブリダイゼーションは、標的核酸の機能を阻害する。そのような「アンチセンス阻害」は、典型的に、標的核酸に対するアンチセンス化合物の水素結合性ハイブリダイゼーションに基づき、標的核酸が、開裂、分解されるか、または他の方法で動作不可能になるようにする。干渉される標的ＤＮＡの機能は、複製および転写を含み得る。複製および転写は、例えば、内因性細胞テンプレート、ベクター、プラスミド構成体、またはその他に由来し得る。干渉されるＲＮＡの機能は、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの転移、ＲＮＡ合成部位から離れた細胞内部位へのＲＮＡの転移、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つまたは複数のＲＮＡ種を産出するためのＲＮＡのスプライシング、ＲＮＡと係合され得るか、またはＲＮＡによって促進され得る、ＲＮＡを伴う触媒活性または複合体形成などの機能を含み得る。
【００７１】
本明細書で使用される、「ハイブリダイゼーション」は、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸の相補的塩基の対合を意味する。塩基の対合は、典型的に、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）間に水素結合を伴い、ワトソン−クリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合であり得る。グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）は、３つの水素結合の形成を通じて対合する、相補的核酸塩基の例である。アデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）は、２つの水素結合の形成を通じて対合する、相補的核酸塩基の例である。ハイブリダイゼーションは、様々な環境下で起こり得る。
【００７２】
「ヌクレオシド」は、塩基−糖結合である。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基である。そのような複素環塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリン類およびピリミジン類である。「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシド類である。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシド類の場合、リン酸基は、糖の２′、３′、または５′ヒドロキシル部分のいずれかに結合され得る。
【００７３】
「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的」は、アンチセンス化合物と標的核酸との間で安定した特異的結合を引き起こすために十分な相補性の程度を示すように使用される用語である。アンチセンス化合物は、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸配列に対して１００％相補的である必要がないと理解される。標的核酸に対するアンチセンス化合物の結合が、標的分子の正常な機能を干渉して活性の喪失をもたらすとき、アンチセンス化合物は、特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が所望される条件下、例えば、治療的処置の場合の生理的条件下で、非標的配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性がある。
【００７４】
本明細書で使用される、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」は、アンチセンス化合物が、その標的配列に対してハイブリダイズするが、他の配列には最小数である条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存であり、状況によって異なる。アンチセンス化合物が標的配列に対してハイブリダイズするストリンジェントな条件は、アンチセンス化合物の性質および組成物、ならびにそれが調査されるアッセイによって決定される。
【００７５】
本明細書で使用される、「相補性」は、アンチセンス化合物の核酸塩基と標的核酸との間の正確な対合のための能力を指す。例えば、アンチセンス化合物の所定位置における核酸塩基が、標的核酸の所定位置における核酸塩基と水素結合できる場合、次にアンチセンス化合物と標的核酸との間の水素結合の位置は、相補的位置であると考えられる。アンチセンス化合物は、介在するか、または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、１つまたは複数のセグメントにわたってハイブリダイズする場合がある（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。一実施形態において、アンチセンス化合物は、標的核酸内の標的領域に対して少なくとも７０％の配列相補性を含む。例えば、２０核酸塩基のうちの１８個が、標的核酸内の標的領域に対して相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズする、アンチセンス化合物は、９０％の相補性を表す。この例において、残りの非相補的核酸塩基は、相補的核酸塩基と集合または散在されてもよく、互いに、または相補的核酸塩基に隣接する必要はない。そのように、標的核酸と完全に相補的である２つの領域が両側に位置する、４個の非相補的核酸塩基を有する、１８核酸塩基長のアンチセンス化合物は、標的核酸と全体で７７．８％の相補性を有し、したがって、本開示の範囲内にある。標的核酸の領域とのアンチセンスの相補性パーセントは、当該技術分野において既知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所配列検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを使用して日常的に決定され得る（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，１９９７）。
【００７６】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本開示は、α４インテグリン、および／またはＶＬＡ−４および／またはα４β７インテグリンの発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド類を提供する。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチド類は、ＶＬＡ−４および／またはα４β７のα４インテグリンをコードする核酸を標的とする。
【００７７】
本明細書で使用される、用語「阻害する」は、ＶＬＡ−４またはα４β７インテグリンの発現を任意の測定可能な減少（例えば、１０％、２０％、５０％、９０％、または１００％）を意味する。
【００７８】
本明細書で使用される、用語「オリゴヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡのオリゴマーまたはポリマー、またはその模倣体、キメラ、類似体、および相同体を指す。この用語は、自然発生する核酸塩基類、糖類、および共有インターヌクレオシド（骨格）結合で構成されるオリゴヌクレオチド類、ならびに同様に機能する非自然発生部分を有するオリゴヌクレオチド類を含む。そのような修飾または置換オリゴヌクレオチド類は、所望の特性、例えば、増強された細胞性取り込み、標的核酸に対して増強された親和性、およびヌクレアーゼ存在下での増加した安定性などに起因して、しばしば天然型よりも望ましい。
【００７９】
オリゴヌクレオチド類を形成する際に、リン酸基は、互いに隣接するヌクレオシド類を共有結合して、線形ポリマー化合物を形成する。順に、この線形ポリマー化合物のそれぞれの末端をさらに接合して、環状化合物を形成することができるが、一般に線形化合物が好ましい。さらに、線形化合物は、内部の核酸塩基相補性を有してよく、したがって、完全または部分的に二本鎖の化合物を産生するような方法で折り畳んでもよい。オリゴヌクレオチド類に関して、リン酸基は、一般にオリゴヌクレオチドのインターヌクレオシド骨格を形成するものと称される。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常な結合または骨格は、３′〜５′ホスホジエステル結合である。
【００８０】
開示のアンチセンスオリゴヌクレオチド類には、例えば、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド類、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも一部分をハイブリダイズする他のオリゴヌクレオチド類が挙げられる。
【００８１】
開示のアンチセンスオリゴヌクレオチド類は、一本鎖、二本鎖、環状、またはヘアピンの形態で投与されてよく、内部もしくは末端バルジまたはループなどの構造要素を含有し得る。一旦投与されると、アンチセンスオリゴヌクレオチド類は、標的核酸の修飾影響する、１つまたは複数の酵素または構造タンパク質の作用を引き出し得る。
【００８２】
そのような酵素の一非限定例は、ＲＮＡｓｅＨであり、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する、細胞エンドヌクレアーゼである。「ＤＮＡ様」の一本鎖アンチセンス化合物が、ＲＮＡｓｅＨを引き出すことは、当該技術分野において既知である。したがって、ＲＮＡｓｅＨの活性化は、ＲＮＡ標的の開裂をもたらし、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチドを介する阻害の効率を大幅に強化する。ＲＮａｓｅＩＩＩおよび酵素のリボヌクレアーゼＬ族に含まれるものなどの他のリボヌクレアーゼ類についても同様の役割が仮定される。
【００８３】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子の導入は、遺伝子またはその関連遺伝子産生物の機能の潜在的且つ特異的なアンチセンスを介する減少を誘発することが示された。この現象は、植物および動物の両方で起こり、ウイルスに対する防御およびトランスポゾンサイレンシングとの進化的接続を有すると考えられる。
【００８４】
ｄｓＲＮＡが動物において遺伝子サイレンシングをもたらすという最初の証拠は、１９９５年に線虫シノラブディスエレガンスの研究から得られた（Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｋｅｍｐｈｅｕｓ，１９９５）。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら（１９９８）は、ｄｓＲＮＡの一次干渉効果が転写後であることを示した。以降、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）への暴露に起因する、シノラブディスエレガンスにおいて画定された転写後アンチセンス機序は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と指定されている。この用語は一般化されて、内因性標的ｍＲＮＡレベルの配列特異的減少をもたらす、ｄｓＲＮＡの導入を伴うアンチセンスによる遺伝子サイレンシングを意味する（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。近年、それが実際に、ＲＮＡｉの潜在的誘導物質である、ｄｓＲＮＡのアンチセンス極性の一本鎖ＲＮＡオリゴマーであることが示された（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００８５】
当該技術分野において通常の技術を有する者であれば、過度の実験なしに、本開示の方法に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド類を同定することができる。
【００８６】
修飾インターヌクレオシド結合（骨格）
本開示のアンチセンス化合物は、修飾骨格または非天然インターヌクレオシド結合を有するオリゴヌクレオチド類を含む。修飾骨格を有するオリゴヌクレオチド類は、骨格にリン原子を保持するもの、および骨格にリン原子を有しないものを含む。
【００８７】
リン原子をその中に含む修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート類、キラルホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエステル類、アミノアルキルホスホトリエシテル類、メチルおよび他のアルキルホスホン酸塩類（３′−アルキレンホスホン酸塩類、５′−アルキレンホスホン酸塩類、およびキラルホスホン酸塩類を含む）、ホスフィン酸塩類、ホスホロアミド酸類（３′−アミノホスホロアミド酸およびアミノアルキルホスホロアミド酸類を含む）、チオノホスホロアミド酸類、チオノアルキルホスホン酸塩類、チオノアルキルホスホトリエステル類、セレノホスホン酸塩類、および正常な３′−５′結合を有するボラノホスホン酸塩類、これらの２′−５′結合類似体、ならびに逆位極性を有するもの（１つまたは複数のヌクレオチド間結合が、３′−３′、５′−５′、または２′−２′結合である）を含む。
【００８８】
逆位極性を有するオリゴヌクレオチド類は、３′−先端ヌクレオチド間結合での単３′−３′結合、すなわち脱塩基（核酸塩基が欠損、またはその場所にヒドロキシル基を有する）であり得る単逆位ヌクレオシド残基を含む。様々な塩類、混合塩類、および遊離酸形態も含まれる。
【００８９】
上記リン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，１９４，５９９号、第５，５６５，５５５号、第５，５２７，８９９号、第５，７２１，２１８号、第５，６７２，６９７号、第５，６２５，０５０号が挙げられる。
【００９０】
リン原子をその中に含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルインターヌクレオシド結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルインターヌクレオシド結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環インターヌクレオシド結合によって形成された骨格が挙げられる。これらは、モルホリノ結合を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から一部が形成された）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸塩およびスルホンアミド骨格、アミド骨格、および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２成分部分を有する他のものを含む。
【００９１】
上記オリゴヌクレオチド類の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、第５，７９２，６０８号、第５，６４６，２６９号、第５，６７７，４３９号が挙げられる。
【００９２】
修飾糖およびインターヌクレオシド結合
本開示のアンチセンス化合物は、ヌクレオチド単位の糖およびインターヌクレオシド結合（すなわち、骨格）の両方が、新規の基と置き換えられる、オリゴヌクレオチド模倣体を含む。核酸塩基単位は、標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。
【００９３】
優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置き換えられる。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号が挙げられる。ＰＮＡ化合物に関するさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１において見出すことができる。
【００９４】
本開示のアンチセンス化合物は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド類、およびヘテロ原子骨格、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および米国特許第５，４８９，６７７号の−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［天然ホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、および米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有するオリゴヌクレオチド類も含む。
【００９５】
本開示のアンチセンス化合物は、米国特許第５，０３４，５０６号を有するオリゴヌクレオチド類も含む。
【００９６】
修飾糖
本開示のアンチセンス化合物は、１つまたは複数の置換糖部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００９７】
例としては、以下のＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルうちの１つを２′位に含むオリゴヌクレオチド類が挙げられ、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルもしくはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。
【００９８】
一つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２のうちの１つを２′位に含み、ｎおよびｍは１〜約１０である。
【００９９】
修飾オリゴヌクレオチド類のさらなる例としては、以下のＣ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上させるための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させるための基、および同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを２′位に含むオリゴヌクレオチド類が挙げられる。
【０１００】
一実施形態において、修飾は、２′−メトキシエトキシ（２′−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２′−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらなる実施形態において、修飾は、２′−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２′−ＤＭＡＯＥとしても知られる）、または２′−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２′−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２′−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２′−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【０１０１】
他の修飾は、２′−メトキシ（２′−Ｏ−ＣＨ３）、２′−アミノプロポキシ（２′−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２′−アリル（２′−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２′−Ｏ−アリル（２′−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２′−フルオロ（２′−Ｆ）を含む。２′−修飾は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位であってよい。一実施形態において、２′−アラビノ修飾は２′−Ｆである。
【０１０２】
同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位、特に３′末端ヌクレオチド上または２′−５′結合オリゴヌクレオチド内の糖の３′位、および５′末端ヌクレオチドの５′位において行われてもよい。
【０１０３】
オリゴヌクレオチド類は、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。
【０１０４】
そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号、および第５，７００，９２０号が挙げられる。
【０１０５】
糖のさらなる修飾は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）を含み、２′−ヒドロキシル基が、糖環の３′または４′炭素原子に結合され、それによって二環系糖部分を形成する。一実施形態において、結合は、２′酸素原子および４′炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、ｎは１または２である。ＬＮＡおよびその調製は、国際公開第ＷＯ９８／３９３５２号および同第ＷＯ９９／１４２２６号に説明されている。
【０１０６】
天然および修飾核酸塩基
本開示のアンチセンス化合物は、核酸修飾または置換を有するオリゴヌクレオチド類を含む。本明細書で使用される、「非修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。
【０１０７】
修飾核酸塩基には、他の合成および天然核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ハイポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（疑似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニン類およびグアニン類、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシル類およびシトシン類、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。
【０１０８】
さらなる修飾核酸塩基には、三環系ピリミジン類、例えば、フェノキサジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３′，２′：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。
【０１０９】
修飾核酸塩基類は、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環と置き換えられたもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンを含んでもよい。さらなる核酸塩基類は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９０）に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）によって開示されるもの、およびＹ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものを含む。
【０１１０】
これらの核酸塩基類のうちのある種は、特にオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるための有用である。これらには、５−置換ピリミジン類、６−アザピリミジン類、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン類が挙げられ、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシンの置換は、０．６〜１．２℃で核酸二本鎖の安定性を増加させることが示された。一実施形態において、これらの核酸塩基置換は、２′−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と併用される。
【０１１１】
上記ある種の修飾核酸塩基類ならびに他の修飾核酸塩基類の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、第３，６８７，８０８号、第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第６，００５，０９６号、第５，６８１，９４１号、および第５，７５０，６９２号が挙げられる。
【０１１２】
複合体
本開示のアンチセンス化合物は、１つまたは複数の部分または基に共役され、アンチセンス化合物の活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する。
【０１１３】
これらの部分または基は、一級もしくは二級ヒドロキシル基等の官能基に共有結合されてもよい。
【０１１４】
例示的な部分または基には、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン類、ポリアミド類、ポリエチレングリコール類、ポリエーテル類、オリゴマー類の薬力学的特性を増強する基、およびオリゴマー類の薬物動態特性を増強する基が挙げられる。典型的な複合基には、コレステロール類、脂質類、リン脂質類、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、および染料類が挙げられる。
【０１１５】
薬力学的特性を増強する部分または基には、取り込みを向上させ、分解への抵抗力を増強し、および／または標的核酸との配列特異的なハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。
【０１１６】
薬物動態特性を増強する部分または基は、本開示の化合物の取り込み、分布、代謝、または分泌を向上させる基を含む。
【０１１７】
代表的な部分または基は、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６および米国特許第６，２８７，８６０号に開示される。
【０１１８】
部分または基には、これらに限定されるものではないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられる。
【０１１９】
本開示のアンチセンス化合物は、活性原薬に共役されてもよい。
【０１２０】
オリゴヌクレオチド薬複合体およびそれらの調製は、米国公開第０９／３３４，１３０号に説明されている。
【０１２１】
そのような複合体の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、および第５，６８８，９４１号が挙げられる。
【０１２２】
キメラ化合物
当業者によって理解されるように、指定化合物のすべての位置が、均一に修飾される必要はなく、実際に、前述の修飾のうちの複数が単一のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込まれてもよい。
【０１２３】
開示のアンチセンス化合物は、キメラオリゴヌクレオチド類を含む。「キメラオリゴヌクレオチド類」は、２つ以上の化学的に異なる領域を含み、オリゴヌクレオチド化合物の場合、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位、すなわちヌクレオチドで形成される。これらのオリゴヌクレオチド類は、典型的に、増加したヌクレアーゼ分解への抵抗力、増加した細胞性取り込み、増加した安定性および／または標的核酸に対する増加した結合親和性をオリゴヌクレオチドに付与するように、オリゴヌクレオチドが修飾される、少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドの追加領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂することができる酵素の基質として機能し得る。例として、ＲＮＡｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅ  Ｈの活性は、ＲＮＡ標的の開裂をもたらし、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチドを介する阻害の効率を著しく増強させる。ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの開裂は、同様の様式で、細胞性およびウイルス性ＲＮＡの両方を開裂するＲＮＡｓｅＬなどのエンドリボヌクレアーゼ類の作用によって達成され得る。ＲＮＡ標的の開裂は、ゲル電気泳動および必要に応じて、当該技術分野において既知の関連核酸ハイブリダイゼーション技法によって日常的に検出され得る。
【０１２４】
開示のキメラアンチセンス化合物は、２つ以上のオリゴヌクレオチド類、修飾オリゴヌクレオチド類、および／またはオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成されてもよい。そのような化合物は、当該技術分野において、ハイブリッドまたはギャップマーとも称されている。
【０１２５】
そのようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、第５，０１３，８３０号、第５，１４９，７９７号、第５，２２０，００７号、第５，２５６，７７５号、第５，３６６，８７８号、第５，４０３，７１１号、第５，４９１，１３３号、第５，５６５，３５０号、第５，６２３，０６５号、第５，６５２，３５５号、第５，６５２，３５６号、および第５，７００，９２２号が挙げられる。
【０１２６】
例示的オリゴヌクレオチド
一実施形態において、アンチセンス化合物は、ＶＬＡ−４ｍＲＮＡの３′−未翻訳領域にハイブリダイズするように設計された第２世代のホスホロチオエート骨格２′−ＭＯＥ−修飾キメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。オリゴヌクレオチドは、ＶＬＡ−４およびα４β７インテグリンのα４インテグリンサブユニットである、ＣＤ４９をコードするＲＮＡにハイブリダイズすることによって、一次ヒト細胞およびいくつかのヒト細胞株の両方において、ＶＬＡ−４発現を選択的に阻害する。
【０１２７】
オリゴヌクレオチドは、７２３０ダルトンの分子量を有する３−９−８ＭＯＥとも称される、３′→５′ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド２０ｍｅｒの１９ナトリウム塩であり、５′末端から１〜３位のヌクレオチドは、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２′ＭＯＥ）修飾リボヌクレオシド類（２′−Ｏ−（２−メトキシエチルリボース）であり、５′末端から４〜１２位のヌクレオチド類は、すべてのシトシン類が５−メチルシトシン類である、２′−デオキシリボヌクレオシドであり、５′末端から１３〜２０位のヌクレオチドは、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾リボヌクレオシド類である。
【０１２８】
オリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＭｅＣＭｅＵＧＡＧＴＭｅＣＴＧＴＴＴＭｅＵＭｅＣＭｅＣＡＭｅＵＭｅＵＭｅＣＭｅＵ−３’である。
【０１２９】
オリゴヌクレオチドの実験式は、Ｃ２３３Ｈ３２７Ｎ６０Ｏ１２９Ｐ１９Ｓ１９Ｎａ１９である。
【０１３０】
すべてのウラシル類は、５−メチルウラシル類（ＭｅＵ）である。典型的に、オリゴヌクレオチドは、５−メチルウラシル類ではなく、２−メトキシエチル修飾チミジン類を使用して合成される。
【０１３１】
すべてのピリミジン類は、Ｃ５メチル化される（すなわち、Ｕ、Ｔ、ＣはＣ５メチル化される）。
【０１３２】
オリゴヌクレオチドの配列は、許容されるオリゴヌクレオチド命名法によって命名されてもよく、それぞれＯ−Ｏ結合型ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を示す。
【０１３３】
２′−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−２′−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−２′−Ｏ−メトキシエチルグアノシリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−２′−Ｏ−デオキシアデノシリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−２′−Ｏ−デオキシグアノシリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−チミジリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−２′−デオキシ−５−メチルシチジリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−チミジリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−２′−デオキシグアノシリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−チミジリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−チミジリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−チミジリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−２′−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−２′−メトキシエチル−５−メチルシチジリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−２′−メトキシエチル−５−メチルシチジリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−２′−Ｏ−メトキシエチル−５−アデノシリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−２′−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−２′−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジリル−（３′→５′Ｏ，Ｏ−ホスホロチオイル）−２′−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシトシン（３′→５′Ο，Ｏ−ホスホロチオイル）−２′−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジリル−１９ナトリウム塩。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドは、固相合成および下流処理の２つの異なる操作に分割され得る、多工程プロセスによって合成されてもよい。第１の操作において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、コンピュータ制御固相合成器によって組み立てられる。後次の下流処理は、脱保護工程、調製逆相クロマトグラフ精製、単離および乾燥を含み、オリゴヌクレオチド原薬を産生する。オリゴヌクレオチドの化学合成は、ホスホルアミダイト結合化学に続いて酸化硫化を利用し、伸長オリゴマーへの活性化したモノマーの連続結合を伴い、その３′−末端は、固相担体に共有結合される。
【０１３５】
脱トリチル反応（反応ａ）
固相合成のそれぞれの周期は、担体結合したオリゴヌクレオチドの５′末端ヌクレオシドの酸に不安定な５′−Ｏ−４ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基の除去から始まる。これは、酸溶液による処置によって達成される（例えば、トルエン中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ））。脱トリチル反応に続いて、次の反応の準備において、アセトニトリルで洗浄することによって、過剰な試薬が担体から除去される。
【０１３６】
結合（反応ｂ）
鎖の伸長は、活性化因子（例えば、１Ｈ−テトラゾール）の存在下で、担体結合したオリゴヌクレオチドの５′−ヒドロキシル基と、特定の塩基位置（例えば、塩基２の場合：ＭＯＥ−ＭｅＣアミダイト）に対応するホスホルアミダイトの溶液との反応によって達成される。これは、流入するヌクレオチドシントンと担体結合したオリゴヌクレオチド鎖との間に亜リン酸トリエステルの形成をもたらす。結合反応後、次の反応の準備において、アセトニトリルで洗浄することによって、過剰な試薬が担体から除去される。
【０１３７】
硫化（反応ｃ）
新たに形成された亜リン酸トリエステル結合は、硫酸転移試薬（例えば、フェニルアセチルジスルフィド）の溶液で処理することによって、対応する（Ｏ，Ｏ，Ｏ）−トリアルキルホスホロチオエートトリエステルに変換される。硫化に続いて、次の反応の準備において、アセトニトリルで洗浄することによって、過剰な試薬が担体から除去される。
【０１３８】
キャッピング（反応ｄ）
任意の指定周期において使用可能な５′−ヒドロキシ基の一部は伸長できない。後次周期のいずれかにおけるこれらの基の結合は、所望の産生物から分離することが困難である、処理関連不純物（「ＤＭＴ−ｏｎ（ｎ−１）−ｍｅｒ」の形成をもたらす。これらの不純物の形成を回避し、精製を促進するために、「キャッピング試薬」（例えば、無水酢酸およびＮ−メチルイミダゾール／アセトニトリル／ピリジン）は、反応容器の中に導入されて、キャップド配列を生じる。得られた失敗配列（「ＤＭＴ−オフショートマー」）は、逆相ＨＰＬＣ精製によって所望の産生物から分離される。キャッピング反応後、次の反応の準備において、アセトニトリルで洗浄することによって、過剰な試薬が担体から除去される。
【０１３９】
適切な保護ヌクレオシドホスホルアミダイトを使用するこの基本的な４工程周期の繰り返しによって、全体保護オリゴヌクレオチド配列のアセンブリを可能にする。
【０１４０】
骨格脱保護（反応ｅ）
プロセスのアセンブリ部分の完了に続いて、（Ｏ，Ｏ，Ｏ）−トリアルキルホスホロチオエートトリエステルヌクレオチド間結合を保護するシアノエチル基は、アセトニトリル中のトリエチルアミン（ＴＥＡ）溶液で処理することによって除去される。この工程中に生成された試薬およびアクリロニトリルは、カラムをアセトニトリルで洗浄することによって除去される。
【０１４１】
担体およびからの開裂および塩基脱保護（反応ｆ）
環外アミノ基の脱保護および担体からの粗産生物の開裂は、含水水酸化アンモニウムで培養することによって達成される（反応ｆ）。５′−Ｏ−ＤＭＴ保護された粗産生物の精製は、逆相ＨＰＬＣによって達成される。逆相ＨＰＬＣ工程は、ＤＭＴ−オフ失敗配列を除去する。溶出プロファイルは、ＵＶ吸収分光法によってモニターされる。ＤＭＴ−オンオリゴヌクレオチド産生物を含む画分が、回収され分析される。
【０１４２】
酸性脱保護（反応ｇ）
５′−Ｏ−ＤＭＴ保護されたオリゴヌクレオチドを含有する逆相ＨＰＬＣ画分はプールされ、沈殿タンクに移される。いくつかの合成の精製から得られる産生物は、プロセスのこの段階で複合される。精製されたＤＭＴ−オンオリゴヌクレオチドは、酸（例えば、酢酸）で処理され、５′末端に結合されたＤＭＴ基を除去する。定めた時間の酸暴露および中和後に、オリゴヌクレオチド原薬は単離され乾燥される。
【０１４３】
最終の酸性脱保護工程に続いて、溶液は、水酸化ナトリウム水溶液の添加によって中和され、オリゴヌクレオチド原薬は、エタノールを添加することによって溶液から沈殿される。沈殿した物質を反応溶液の底に沈殿させ、エタノール上澄みを静かに移す。沈殿した物質を精製水に再溶解し、溶液のｐＨをｐＨ７．２〜７．３の間に調整する。沈殿工程を繰り返す。沈殿した物質を水に溶解し、０．４５ミクロンフィルターを通して溶液を濾過して、使い捨てのポリプロピレンのトレイに移した後、凍結乾燥機の中に置く。溶液を−５０℃に冷却する。一次乾燥を２５℃で３７時間行う。温度を３００℃まで高め、二次乾燥工程を５．５時間行う。凍結乾燥プロセスの完了に続いて、原薬を高密度ポリエチレンのボトルに移し、−２００℃で保管した。
【０１４４】
標的核酸
特定の核酸に対するアンチセンス化合物の「標的」は、多工程プロセスであり得る。プロセスは、通常、その機能が変調される標的核酸の同定から始まる。本開示において、標的核酸は、ＶＬＡ−４またはα４β７インテグリンのα４インテグリン鎖をコードする。
【０１４５】
標的プロセスは、通常、アンチセンス相互作用が起こるように、標的核酸内の少なくとも１つの標的領域、セグメント、または部位の特定も含み、所望の効果、例えば、発現の阻害が生じるようにする。本明細書で使用される、用語「領域」は、少なくとも１つの同定可能な構造、機能、または特徴を有する標的核酸の一部分として定義される。標的核酸の領域内にセグメントがある。「セグメント」は、標的核酸内の領域のより小さい部分、または副部分として定義される。本明細書で使用される「部位」は、標的核酸内の位置を意味する。
【０１４６】
「翻訳開始コドン」は、典型的に、５′−ＡＵＧ（転写ｍＲＮＡ分子において、対応するＤＮＡ分子では５′−ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンは、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」、または「ＡＵＧ開始コドン」とも称される。少数の遺伝子が、ＲＮＡ配列５′−ＧＵＧ、５′−ＵＵＧ、または５′−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、５′−ＡＵＡ、５′−ＡＣＧ、および５′−ＣＵＧは、インビボで機能することを示した。したがって、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は、それぞれの例における開始アミノ酸が、典型的にメチオニン（真核細胞において）またはホルミルメチオニン（原核細胞において）であるとしても、多くのコドン配列を包含し得る。真核細胞および原核細胞遺伝子は、２つ以上の選択的開始コドンを有し得ることも当該技術分野において既知であり、それらのいずれか１つが、特定の細胞種または組織において、または特定の条件下で、翻訳開始に選好的に利用され得る。本明細書で使用される、用語「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、そのようなコドンの配列（複数可）に関わらず、例えば、ＶＬＡ−４またはα４β７インテグリンのα４インテグリンをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡの翻訳を開始するようにインビボで使用される、１つまたは複数のコドンを指す。
【０１４７】
「停止コドン」とも称される「翻訳終了コドン」は、３つのＲＮＡ配列：５′−ＵＡＡ、５′−ＵＡＧ、および５′−ＵＧＡのうちの１つを有し得る（対応するＤＮＡ分子において、それぞれ５′−ＴＡＡ、５′−ＴＡＧ、および５′−ＴＧＡ）。本明細書で使用される、用語「翻訳終了コドン」および「停止コドン」は、そのようなコドンの配列（複数可）に関わらず、ＶＬＡ−４またはα４β７インテグリンのα４インテグリンをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を終了するようにインビボで使用される、１つまたは複数のコドンを指す。
【０１４８】
用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５′または３′）に約２５〜約５０個の連続ヌクレオチドを包含する、ｍＲＮＡまたは遺伝子の一部分を指す。同様に、用語「停止コドン領域」および「翻訳終了コドン領域」は、翻訳終了コドンからいずれかの方向（すなわち、５′または３′）に約２５〜約５０個の連続ヌクレオチドを包含する、ｍＲＮＡまたは遺伝子の一部分を指す。結果として、「開始コドン領域」または「翻訳開始コドン領域」および「停止コドン領域」または「翻訳終了コドン領域」は、本開示のアンチセンス化合物によって有効に標的され得る、すべての領域である。
【０１４９】
翻訳開始コドンと翻訳終了コドンとの間の領域を指すことが当該技術分野において既知である、「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）または「コーディング領域」もまた、有効に標的され得る領域である。一実施形態において、遺伝子のＯＲＦの翻訳開始または終了コドンを包含する遺伝子内領域が標的される。
【０１５０】
他の標的領域は、翻訳開始コドンから５′方向のｍＲＮＡの部分を指すことが当該技術分野において知られている、５′未翻訳領域（５′ＵＴＲ）（したがって、ｍＲＮＡの５′キャップ部位と翻訳開始コドンとの間にヌクレオチド類（または遺伝子上で対応するヌクレオチド類）を含む）、および翻訳終了コドンから３′方向のｍＲＮＡの部分を指すことが当該技術分野において知られている、３′未翻訳領域（３′ＵＴＲ）（したがって、翻訳終了コドンとｍＲＮＡの３′末端との間にヌクレオチド類（または遺伝子上で対応するヌクレオチド類）を含む）を含む。ｍＲＮＡの５′キャップ部位は、５′−５′三リン酸結合を介してｍＲＮＡの５′−先端残基に接合されたＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５′キャップ領域は、５′キャップ構造自体、ならびにキャップ部位に隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むと考えられる。一実施形態において、５′キャップ領域が標的される。
【０１５１】
いくつかの真核ｍＲＮＡ転写産物は、直接翻訳されるが、多くは「イントロン」として知られる１つまたは複数の領域を含み、それが翻訳される前に転写産物から削除される。残りの（およびしたがって翻訳された）領域は、「エクソン」として知られ、一緒にスプライスされて、連続ｍＲＮＡ配列を形成する。異なる遺伝子源から２つ（以上）のｍＲＮＡをスプライシングするプロセスを介して産生されるｍＲＮＡ転写産物は、「融合転写産物」として知られる。一実施形態において、イントロン、またはスプライス部位、すなわちイントロン−エクソン接合もしくはエクソン−イントロン接合、または再配列もしくは削除に起因する異常な融合接合が標的される。
【０１５２】
選択的ＲＮＡ転写は、ＤＮＡの同一のゲノム領域から産生され得る。これらの選択的転写は、一般に「変異型」として知られる。
【０１５３】
「ｍＲＮＡ前駆体変異型」は、それらの開始または停止位置のいずれかにおいて、同一のゲノムＤＮＡから産生される他の転写産物とは異なる、同一のゲノムＤＮＡから産生された転写産物であり、イントロンおよびエクソン配列の両方を含む。スプライシング中に１つまたは複数のエクソンもしくはイントロン領域、またはその部分を削除するとき、ｍＲＮＡ前駆体変異型は、より小さい「ｍＲＮＡ変異型」を産生する。結果として、ｍＲＮＡ変異型は、処理されたｍＲＮＡ前駆体変異型であり、それぞれ固有のｍＲＮＡ前駆体変異型は、スプライシングの結果として、固有のｍＲＮＡ変異型を常に産生しなければならない。これらのｍＲＮＡ変異型は、「選択的スプライス変異型」としても知られている。ｍＲＮＡ前駆体変異型のスプライシングが起こらない場合、次にｍＲＮＡ前駆体変異型は、ｍＲＮＡ変異型と同一である。
【０１５４】
変異型は、転写を開始または停止させる選択的シグナルの使用によって、すなわち、選択的開始コドンまたは停止コドンの使用によって産生され得る。選択的開始コドンを使用するｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡ起源の変異型は、そのｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡの「選択的開始変異型」として知られる。選択的停止コドンを使用するそれらの転写産物は、そのｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡの「選択的停止変異型」として知られる。選択的停止変異型の特定の一種は、産生された複数の転写産物が、転写機構によって「ポリＡ停止シグナル」の１つの代替選択から生じ、それによって固有のポリＡ部位で終了する転写産物を産生する、「ポリＡ変異型」である。一実施形態において、ＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡ変異型が標的される。
【０１５５】
アンチセンス化合物がハイブリダイズされる標的核酸上の位置は、「標的セグメント」と称される。本明細書で使用される、用語「標的セグメント」は、アンチセンス化合物が標的される標的領域の少なくとも８核酸塩基部分として定義される。理論に縛られるものではないが、現在、これらの標的セグメントは、ハイブリダイゼーションのためにアクセス可能な標的核酸の部分を表すと考えられている。
【０１５６】
１つまたは複数の標的領域、セグメント、または部位が同定されると、標的セグメントに対して十分に相補的なアンチセンス化合物、すなわち所望の効果を得るために十分に良好にハイブリダイズし、十分な特異性を有するアンチセンス化合物が選択される。
【０１５７】
さらなる実施形態において、本明細書で同定される標的セグメントは、α４インテグリン遺伝子の発現（およびしたがって、α４インテグリン、ＶＬＡ−４および／またはα４β７インテグリン）を調節する追加の化合物のスクリーニングに用いられてもよい。「調節因子」は、ＶＬＡ−４またはα４β７インテグリンのα４インテグリン鎖をコードする核酸分子の発現を減少または増加させ、好適な標的セグメントに対して相補的である少なくとも８核酸塩基部分を含む、化合物である。
【０１５８】
スクリーニング方法は、ＶＬＡ−４またはα４β７インテグリンのα４インテグリン鎖をコードする核酸の標的セグメントを、１つまたは複数の候補調節因子と接触させるステップと、ＶＬＡ−４またはα４β７インテグリンのα４インテグリン鎖をコードする核酸の発現を減少または増加させる１つまたは複数の候補調節因子を選択するステップと、を含む。１つまたは複数の候補調節因子が、ＶＬＡ−４またはα４β７インテグリンのα４インテグリン鎖をコードする核酸の発現を調節（例えば、減少または増加のいずれか）できることが示されると、次に調節因子は、ＶＬＡ−４またはα４β７インテグリンの機能に関するさらなる調査研究、または研究、診断、もしくは治療薬として使用するために用いられてもよい。
【０１５９】
標的セグメントは、安定した二本鎖（二重鎖）オリゴヌクレオチド類を形成するように、そのそれぞれの相補的アンチセンス化合物と複合されてもよい。
【０１６０】
そのような二重鎖オリゴヌクレオチド部分は、当該技術分野において、標的発現を調節し、翻訳ならびにアンチセンス機序を介してＲＮＡ処理を規制することが示された。さらに、二本鎖部分は、化学修飾に供され得る（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｔｉｍｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅ，１９９８、Ｔｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｔａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ｂ）。例えば、そのような二本鎖部分は、標的に対する二本鎖のアンチセンス鎖の古典的なハイブリダイゼーションによって、標的を阻害し、それによって標的の酵素分解を誘起することが示された（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０１６１】
組成物
開示のアンチセンス化合物は、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合、被包、共役、または他の方法で関連付けられ、例えば、取り込み、分布、および／または吸収を支援するためのリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所、または他の製剤を生じ得る。
【０１６２】
そのような取り込み、分布、および／または吸収を支援する製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、第５，１０８，９２１号、第５，３５４，８４４号、第５，４１６，０１６号、第５，４５９，１２７号、第５，５２１，２９１号、第５，５４３，１５８号、第５，５４７，９３２号、第５，５８３，０２０号、第５，５９１，７２１号、第４，４２６，３３０号、第４，５３４，８９９号、第５，０１３，５５６号、第５，１０８，９２１号、第５，２１３，８０４号、第５，２２７，１７０号、第５，２６４，２２１号、第５，３５６，６３３号、第５，３９５，６１９号、第５，４１６，０１６号、第５，４１７，９７８号、第５，４６２，８５４号、第５，４６９，８５４号、第５，５１２，２９５号、第５，５２７，５２８号、第５，５３４，２５９号、第５，５４３，１５２号、第５，５５６，９４８号、第５，５８０，５７５号、および第５，５９５，７５６号が挙げられる。
【０１６３】
開示のアンチセンス化合物は、製薬上許容される担体中で投与され得る。用語「製薬上許容される担体」は、対象、特に哺乳類、およびより具体的にはヒトに投与されると、アレルギー反応、毒性反応、または他の有害反応を生じない分子実体を指す。製薬上許容される担体は、固体または液体であり得る。製薬上許容される担体の有用な例には、これらに限定されるものではないが、開示の活性剤の活性に影響しない希釈剤、溶媒、界面活性剤、賦形剤、懸濁剤、緩衝剤、潤滑剤、アジュバント、媒体、乳化剤、吸収剤、分散媒質、コーティング、安定剤、保護コロイド、接着剤、増粘剤、チキソトロピー剤、浸透剤、封鎖剤、等張剤、および吸収遅延剤が挙げられる。
【０１６４】
開示のアンチセンス化合物は、製薬上許容される塩、エステル類、もしくはエステル類の塩、または投与時に生物活性代謝物を（直接または間接的に）提供することができる、任意の他の化合物であり得る。
【０１６５】
本明細書で使用される用語「製薬上許容される塩」は、投与時に親化合物の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒物学的効果を付与しない、アンチセンス化合物の生理学上および製薬上許容される塩を指す。製薬上許容される塩の好適な例は、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに説明される。
【０１６６】
開示のアンチセンス化合物は、プロドラッグもしくはプロドラッグの製薬上許容される塩、または他の生物学的同等物であり得る。
【０１６７】
本明細書で使用される、用語「プロドラッグ」は、内因性酵素または他の化学物質および／または条件の作用によって、投与時に活性形態（すなわち、薬物）に変換される、不活性形態で調製された治療薬を指す。特に、開示のアンチセンス化合物のプロドラッグ形態は、国際公開第ＷＯ９３／２４５１０号、同第ＷＯ９４／２６７６４号、および米国特許第５，７７０，７１３号に開示される方法に従って、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）リン酸塩］誘導体として調製される。
【０１６８】
投与
開示のアンチセンス化合物は、全身投与される。本明細書で使用される、「全身投与」は、腸内または非経口のいずれかの投与経路である。
【０１６９】
本明細書で使用される、「腸内」は、胃腸管の任意の部分を伴い、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの錠剤、カプセル、またはドロップ形態での経口投与、経胃栄養管、経十二指腸栄養管、または胃瘻造設、および例えば、アンチセンス化合物の坐薬または注腸形態での直腸投与を含む、任意の投与形態を指す。
【０１７０】
本明細書で使用される、「非経口」は、注射または注入による投与を含む。例としては、静脈内（静脈の中）、動脈内（動脈の中）、筋肉内（筋肉内）、心臓内（心臓の中）、皮下（皮膚の下）、骨内注射（骨髄の中）、皮内（皮膚自体の中）、髄腔内（脊柱管の中）、腹腔内（腹腔の中に注入または注射）、膀胱内（膀胱の中に注射）、経皮（正常な皮膚を通じて拡散）、経粘膜（粘膜を通じて拡散）、吸入が挙げられる。
【０１７１】
アンチセンス化合物は、期間ベースで、例えば、１日１回、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日に１回、週１回、週２回、週３回、または２週間に１回、単回投与または反復投与として投与されてもよい。
【０１７２】
投与の量および頻度は、担当医師によって決定され得る。例えば、用量５０〜３４００ｍｇ、より好ましくは５０〜１６００ｍｇのアンチセンス化合物が対象に投与され得る。用量１５０〜３００ｍｇ、例えば、用量２００ｍｇは、特にヒトに対して考慮される。用量２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／Ｋｇも特に考慮される。５ｍｇ／Ｋｇを超える用量は、好ましくは少なくとも週に３回投与される。１回の単一皮下注射の頻度は、最大５ｍｇ／Ｋｇの用量が好ましい。５ｍｇ／Ｋｇを超える用量の皮下注射の場合、薬物は２つの同時注射として投与されることが好ましい。一実施形態において、Ｇ−ＣＳＦおよび任意にＭｏｚｏｂｉｌ（登録商標）は、同時に添加される。
【０１７３】
一実施形態において、アンチセンス化合物は、１日当たり４ｍｇ／Ｋｇの用量で、４、５、６、または７日間にわたって、計４、５、６、もしくは７回、または最大許容用量で投与される。
【０１７４】
代替の実施形態において、アンチセンス化合物は、１日当たり４または６ｍｇ／Ｋｇの用量で、１日おき（１、３、５日目）に計３用量、または最大許容用量で投与される。
【０１７５】
本明細書で使用される、用語「有効量」は、投与条件下で、幹細胞および／または前駆細胞動員を生じるために十分なアンチセンス化合物の任意の用量を指す。
【０１７６】
一実施形態において、投与経過中のヒト対象の平均血小板数は、血液１μＬ当たり血小板５０，０００個を超える。理論に制限されるものではないが、ＣＤ３４＋前駆細胞の動員は、血小板の急速な回復を可能にし、採取後に必要とされる血球輸血の数を減少させることが可能である。
【０１７７】
別の実施形態において、投与は、２８９０ｎｇ／ｍＬ以上、好ましくは１０，０００〜１１，０００ｎｇ／ｍＬのヒト対象の血漿中オリゴヌクレオチドのＣｍａｘを提供するために有効である。
【０１７８】
別の実施形態において、投与は、少なくとも２．５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも２０ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは少なくとも４５ｎｇ／ｍＬのヒト対象の血漿中オリゴヌクレオチドのＣｍｉｎまたはＣｔｒｏｕｇｈを提供するために有効である。
【０１７９】
本明細書で使用される、用語「Ｃｍａｘ」は、その投与後に観察される薬物の最大またはピーク濃度を指す。本明細書で使用される、用語「Ｃｍｉｎ」は、最小またはトラフ濃度を指す（すなわち、その投与後および後次用量の投与直前に観察される薬物のＣｔｒｏｕｇｈ）。
【０１８０】
複合療法
発明のアンチセンス化合物は、１つまたは複数の他の動員化合物／治療と併せて投与されてもよい。
【０１８１】
例示的な動員治療には、低用量の化学量法とともに、例えば、シクロホスファミドまたはメルファラン、フィルグラストリム（Ｇ−ＣＳＦ類似体、作動薬；Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ）；Ｇｒａｎｕｌｏｋｉｎｅ（登録商標）（東欧ではＨＬＲ））、ペグフィルグラスチム（Ｇ−ＣＳＦ類似体、作動薬；Ｎｅｕｌａｓｔｒａ（登録商標））、レノグラスチム（Ｇ−ＣＳＦ類似体、作動薬；Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ（登録商標）（Ｃｈｕｇａｉ，Ｌｉｇａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ類似体、作動薬；Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ−Ｂａｒｌｅｘ））、プレリキサフォル（ＣＸＣＲ４拮抗薬、ＳＤＦ−１に対する部分作動薬；Ｍｏｚｏｂｉｌ（登録商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ））、アンセスチム（幹細胞因子（ＳＣＦ）；Ｓｔｅｍｇｅｎ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ））の投与が挙げられる。
【０１８２】
１つまたは複数の成長因子との複合療法
一実施形態において、本開示の方法は、幹細胞および／または前駆細胞の動員において、α４インテグリンに対するアンチセンス化合物と併用して、成長因子の使用を利用する。成長因子は、例えば、Ｇ―ＣＳＦ、ＥＰＯ、Ｍ−ＧＤＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＳＤＦ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、または他の様々なインターロイキン、ＩＧＦ−１、ＬＩＦ、インターフェロン（例えば、α、β、γ、またはコンセンサス）、神経栄養因子（例えば、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＣＴＮＦ、またはＮｏｇｇｉｎ）、他の多能性成長因子（例えば、これらがそのような多能性成長因子、ｆｌｔ−３／ｆｌｋ−２リガンド、幹細胞増殖因子、および全能性幹細胞因子であることが証明される程度）、線維芽細胞成長因子（例えば、ＦＧＦ）、ヒト成長ホルモンおよび類似体、融合分子、および上記の他の誘導体であり得る。
【０１８３】
複合療法組成物は、幹細胞および／または前駆細胞を動員するために有効な併用量で対象に投与される。このプロセスは、細胞を成長因子およびα４インテグリンに対するアンチセンス化合物と同時に接触させることを伴ってもよい。これは、両方の薬剤を含む単一の組成物もしくは医薬製剤を投与することによって、または２つの異なる組成物もしくは製剤を同時に投与することによって達成されてもよく、成長因子を含む組成物もあれば、α４インテグリンに対するアンチセンス化合物を含むものもある。
【０１８４】
成長因子治療は、数分から１または２週間にわたる間隔で、α４インテグリンに対するアンチセンス化合物による治療に先行または後続し得る。α４インテグリンに対するアンチセンス化合物の投与は、数分から数週間だけ成長因子に先行し得る。α４インテグリンに対するアンチセンス化合物および成長因子が個別に投与される実施形態において、一般に、それぞれの送達時間の間に著しい期間が経過しないことを保証し、α４インテグリンに対するアンチセンス化合物および成長因子が、依然として有益な併用効果を及ぼすことができるようにする。そのような例において、成長因子およびアンチセンス化合物の両方を、互いに約数分、４〜６時間、６〜１２時間、１２〜２４時間以内、または約３〜４日以内、最も好ましくは約４〜６時間の遅延時間で、二番目に投与されるアンチセンス化合物薬とともに投与することが考えられる。場合によっては、治療期間を著しく延長することが望ましい場合があるが、数日（２、３、４、５、６、または７）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）が、それぞれの投与間に経過し、例えば、場合によっては、アンチセンス化合物が最初に投与される。
【０１８５】
Ｇ−ＣＳＦ
一実施形態において、本開示の方法は、幹細胞および／または前駆細胞の動員において、α４インテグリンに対するアンチセンス化合物と併用して、Ｇ−ＣＳＦの使用を利用する。一実施形態において、α４インテグリンに対するアンチセンス化合物と併用してＧ−ＣＳＦを使用することは、ＣＤ３４＋多能性および／または寡能性細胞の動員をもたらす。
【０１８６】
Ｇ−ＣＳＦは、血中への造血幹細胞の放出の増加をもたらし、骨髄前駆細胞の増殖、分化、および生存において役割を果たす（Ｔａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。Ｇ−ＣＳＦおよび他の造血成長因子（ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＳＣＦを含む）は、すべて骨髄における顆粒球形成（顆粒球の産生）の正の調節因子であることが報告されている（Ｔａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦと併用してα４インテグリンに対するアンチセンス化合物を投与することが、ＣＦＵ−ＧＥＭＭおよびＣＤ３４＋細胞の放出を増加させることを示した。これらの細胞の単離および移植は、例えば、顆粒球を必要とする患者を治療するために使用され得る。
【０１８７】
Ｇ−ＣＳＦは、神経栄養前駆細胞の成熟好中球への増殖および分化を特異的に刺激することも示され（Ｆｕｋｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、好中球減少状態の治療におけるその有用性がよく知られている（Ｗｅｌｔｅ，１９８５、Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６、Ｇａｂｒｉｌｏｖｅ，１９８９）。Ｇ−ＣＳＦは、循環顆粒球の数を増加させ、敗血症モデルにおいて感染を軽減することが報告された。Ｇ−ＣＳＦ投与は、敗血症および拒絶反応中の組織損傷に重要なサイトカインである、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の放出も阻害する（Ｗｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【０１８８】
したがって、Ｇ−ＣＳＦは、好中球の増加が利益をもたらす病態の治療に有用であることがわかった。例えば、癌患者の場合、Ｇ−ＣＳＦは、化学療法または放射線治療に起因する造血欠損を補償するための選択的刺激神経栄養産生の手段として有益である。他の適応には、様々な感染疾患および関連病態、例えば典型的に細菌の代謝によって引き起こされる敗血症の治療を含む。Ｇ−ＣＳＦはまた、培養中の細胞の成長または増殖に対して（例えば、骨髄移植または生体外増殖に対して）単独で有用であるか、または他の化合物、例えば他のサイトカインとの併用も有用である。Ｇ−ＣＳＦは、感染治療または好中球減少の治療に対する補助として、移植患者に投与された（Ｄｉｆｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｌａｃｈａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｃｏｌｑｕｅｈｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
【０１８９】
一実施形態において、α４インテグリンに対するアンチセンス化合物の投与は、好中球増加をもたらさず、好中球減少を生じる場合さえある。アンチセンス化合物とＧ−ＣＳＦの併用は、Ｇ−ＣＳＦと、例えば、Ｍｏｚｏｂｉｌ（登録商標）の併用を超える予想外の利益を提供し、Ｇ−ＣＳＦを超える追加の好中球増加をもたらす場合があり、モニターを必要とする。
【０１９０】
Ｇ−ＣＳＦは、線維芽細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、トロホブラスト、内皮細胞、および上皮細胞によって産生され、第１７染色体上に位置する４個のエクソンおよび５個のイントロンで構成された単一コピー遺伝子の発現産生物である。ヒトにおいて、内因性Ｇ−ＣＳＦは、血漿中で検出可能である（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。Ｇ−ＣＳＦは、交差反応種であり、ヒトＧ−ＣＳＦが別の哺乳類、例えば、マウス、イヌ、またはサルに投与されると、持続的な好中球増加が誘発される（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。
【０１９１】
Ｇ−ＣＳＦは、多数の源から取得および精製され得る。Ｇ−ＣＳＦは、培養された腫瘍細胞株の上澄みから単離され得る。組み換えＤＮＡ技術の進歩によって、真核宿主細胞発現の産生物として、グリコシル化形態のＧ−ＣＳＦ、および原核宿主細胞発現の産生物として、非グリコシル化形態のＧ−ＣＳＦの商業規模量の産生が可能になった。
【０１９２】
Ｇ−ＣＳＦ組成物または製剤は、投与経路に基づいて選択されてもよく、リポソームおよびミセル製剤ならびに古典的な医薬製剤を含み得る。
【０１９３】
好適な実施形態において、Ｇ−ＣＳＦタンパク質に基づく治療は、連続または断続的静脈内投与を介してもたらされる。「有効量」とは、Ｇ−ＣＳＦの１つまたは複数の生物活性のレベルにおける観察可能な変化を支持するために十分なＧ−ＣＳＦポリペプチドの量を意味する。変化は、Ｇ−ＣＳＦ活性のレベルの増加であってもよい。好ましくは、変化は、骨髄幹細胞動員の増加である。
【０１９４】
Ｇ−ＣＳＦタンパク質製剤の特異的活性は、約１００単位／ｍｇタンパク質〜約５００単位／ｍｇタンパク質の範囲内であり得ると考えられる。したがって、ヒトＧ−ＣＳＦタンパク質の所与の製剤は、約１００単位／ｍｇタンパク質、約１２５単位／ｍｇタンパク質、約１５０単位／ｍｇタンパク質、約１７５単位／ｍｇタンパク質、約２００単位／ｍｇタンパク質、約２２５単位／ｍｇタンパク質、約２５０単位／ｍｇタンパク質、約２７５単位／ｍｇタンパク質、約３００単位／ｍｇタンパク質、約３２５単位／ｍｇタンパク質、約３５０単位／ｍｇタンパク質、約３７５単位／ｍｇタンパク質、約４００単位／ｍｇタンパク質、約４２５単位／ｍｇタンパク質、約４５０単位／ｍｇタンパク質、約４７５単位／ｍｇタンパク質、約５００単位／ｍｇタンパク質を含み得る。特に好ましい範囲は、約１００単位／ｍｇタンパク質〜約２００単位／ｍｇタンパク質である。より好ましい範囲は、約１５０単位／ｍｇタンパク質〜約２００単位／ｍｇタンパク質である。好ましくは、タンパク質組成物は、実質的に汚染因子を含まず、汚染レベルは０．０２％（ｗ／ｗ）未満である。患者への注射に適したＧ−ＣＳＦ組成物は、例えば、精製されたＧ−ＣＳＦおよび安定化塩を含む凍結乾燥試料の製薬上許容される希釈剤を用いて再構成することによって調製され得る。
【０１９５】
組成物の投与は、全身または局所であり得、有効量のＧ−ＣＳＦタンパク質組成物の単一部位注入を含んでもよい。Ｇ−ＣＳＦの投与のための当業者に知られている任意の経路が考えられ、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、または長期投与のためのカテーテルを含む。あるいは、Ｇ−ＣＳＦは、複数部位において対象に送達されてもよいと考えられる。複数投与は、同時に行われ得るか、または数時間の期間にわたって投与されてもよい。場合によっては、組成物の連続フローを提供することが有益であり得る。追加の治療は、期間ベース、例えば、毎日、毎週、または毎月投与されてもよい。
【０１９６】
一実施形態において、Ｇ−ＣＳＦは、４、５、６、もしくは７日間、または製造者によって推奨されるように投与される。Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）は、典型的に、５日目、および十分な幹細胞および／または前駆細胞が放出されていない場合は、５、６、および７日目、最初のアフェレーシス手順の前に１０μｇ／ｋｇ／日を毎日４日にわたって皮下注射する。
【０１９７】
Ｇ−ＣＳＦの誘導体も本明細書に含まれる。そのような誘導体は、１つまたは複数の水溶性ポリマー分子（例えば、ポリエチレングリコール）によって、または融合タンパク質を含むポリアミノ酸の添加によって、修飾された分子を含む（当該技術分野においてよく知られている手順）。そのような誘導体化は、Ｎ末端またはＣ末端において単独で発生し得るか、または複数の誘導体化部位が存在し得る。１つまたは複数のアミノ酸をリシンと置換することによって、誘導体化のための追加部位を提供し得る（米国特許第５，８２４，７８４号および同第５，８２４，７７８号）。
【０１９８】
末梢血からの幹細胞および前駆細胞の採取
一実施形態において、幹細胞および／または前駆細胞は、末梢血の中に動員される。幹細胞および／または前駆細胞は、対象の末梢血から単離され得る。末梢血は、全身麻酔を使用せずに採取することができ、手順は通常、外来扱いで行われ、採取中または採取後にほとんどまたは全く不快感を伴わない。
【０１９９】
幹細胞および／または前駆細胞は、好ましくは、アフェレーシスとして知られるプロセスによって、対象の末梢血から単離される。幹細胞および／または前駆細胞は、蛍光活性化細胞分類または密度勾配遠心分離を使用してさらに精製されてもよい。例えば、ＣＤ３４を発現する細胞は、蛍光活性化細胞分類によってアフェレーシス試料から精製され得る。幹細胞および／または前駆細胞は、生体外で拡張および／または分化され、将来の使用のために保管されるか、または患者に注射され得る。患者は、その血液を採取した対象またはＨＬＡ適合した対象であり得る。
【０２００】
一実施形態において、最初のアフェレーシスは、５日目に行われ、フォローアップアフェレーシスが６日目および７日目に行われ、十分な幹細胞／前駆細胞が採取されない場合は、１４日目まで毎日アフェレーシスを行ってもよい。
【０２０１】
典型的に、ヒト移植では、２×１０６ＣＤ３４＋細胞／ＫＧより多くが単離および使用される。一実施例において、非ホジキンリンパ腫では、５×１０６ＣＤ３４＋細胞／Ｋｇが移植用に単離され、多発性骨髄腫では、６×１０６ＣＤ３４＋細胞／Ｋｇが移植用に単離される。好ましくは、５×１０６ＣＤ３４＋細胞／Ｋｇが、非ホジキンリンパ腫における移植用に最大４回のアフェレーシスで単離され、多発性骨髄腫では、６×１０６ＣＤ３４＋細胞／Ｋｇが、最大２回のアフェレーシスで単離される。典型的に、Ｇ−ＣＳＦ単独またはＧ−ＣＳＦとＭｏｚｏｂｉｌ（登録商標）などの他の動員剤による動員を使用して、ＣＤ３４＋細胞を末梢に放出する。Ｇ−ＣＳＦ  Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）は、それぞれ多発性骨髄腫患者および非ホジキンリンパ腫患者の約３０％および４０％において、この数の細胞／Ｋｇを達成する際に有効である。Ｍｏｚｏｂｉｌ（登録商標）とＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）の併用は、それぞれ多発性骨髄腫患者および非ホジキンリンパ腫患者のさらに４０％および３０％において有効である。したがって、治療の約３分の２および３分の１は、それぞれ既存の単剤療法および複合治療によって最適以下である。本開示のアンチセンス化合物は、新規の機序を標的とし、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）およびＭｏｚｏｂｉｌ（登録商標）と比較して、放出を向上させ、アフェレーシスの回数を減少させる。
【０２０２】
既存の治療は、汚染エフェクターＴ細胞も放出する場合があり、同種移植において移植片対宿主病を引き起こすか、または自家移植の場合に過剰な好中球または汚染腫瘍細胞をもたらす。本開示のアンチセンス化合物は、異なる標的に対するものであり、実施例４および５に示されるように、細胞によって選択的に取り込まれ、好中球を放出しないため、既存の治療をより潜在的な安全性の向上を提供する。
【０２０３】
開示の方法に従って採取された幹細胞および前駆細胞の使用
開示の方法に従って採取された幹細胞および／または前駆細胞は、幹細胞および／または前駆（もしくはエフェクター）細胞移植を必要とする、疾患および病態の治療において使用することができる。例えば、幹細胞および／または前駆細胞は、正常な血球産生および成熟の機能不全または機能障害、造血器悪性腫瘍、自己免疫疾患、肝疾患、または免疫不全の治療において（例えば、放射線治療、化学療法、または病原体の感染の理由で）使用することができる。
【０２０４】
移植は、典型的に、真の長期自己複製幹細胞であるいくつかの細胞、いくつかの短期前駆細胞、およびいくつかの非幹細胞を含む。
【０２０５】
幹細胞および／または前駆細胞は、患者に投与する前に、生体外で拡張または分化されてもよい。例えば、幹細胞および／または前駆細胞は、エフェクター肝細胞に分化し、肝疾患を患う患者に移植されてもよい。
【０２０６】
本明細書で使用される、用語「治療」は、疾患もしくは病態の進行の抑止、阻害、遅延、もしくは逆転、または疾患もしくは病態の臨床症状の軽減もしくは予防を含む。
【０２０７】
白血病およびリンパ腫
開示の方法に従って採取された幹細胞および前駆細胞は、白血球および前駆細胞の未制御増殖から生じる血液の癌（白血病およびリンパ腫）の治療において使用することができる。一実施形態において、患者自身の癌性造血細胞は、放射線治療または化学療法を介して破壊され、適合する（自家）ドナーの末梢血から採取した幹細胞および前駆細胞の移植によって置き換えられる。別の実施形態において、患者自身の造血幹細胞および前駆細胞は、放射線治療または化学療法の前に採取され、後次に戻される。血液の癌には、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、および非ホジキンリンパ腫が挙げられる。
【０２０８】
遺伝性血液障害
開示の方法に従って採取された自家幹細胞および前駆細胞の別の使用は、遺伝性血液障害、例えば、異なる種の遺伝性貧血（血球の産生障害）および先天性代謝異常（必須体成分の産生または化学副産物の分解に必要な主要酵素の欠損を特徴とする遺伝性疾患）の治療においてである。血液障害は、再生不良性貧血、β−サラセミア、ブラックファン−ダイアモンド症候群、球様細胞白質萎縮症、鎌状赤血球貧血、重度の複合免疫不全、Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群、およびウィスコット−アルドリッヒ症候群が挙げられる。骨髄移植によって治療され得る先天性代謝異常には、ハンター症候群、ハーラー症候群、レッシュナイハン症候群、および大理石骨病が挙げられる。
【０２０９】
癌化学療法における造血幹細胞レスキュー
癌細胞を急速に分割することを目的とした化学療法は、必然的に造血細胞の急速な分割を目標とする。開示の方法に従って採取された自家幹細胞および前駆細胞を使用して、化学療法によって破壊された細胞を置き換えることができる。患者は自身の細胞を移植されるため、免疫不適合または移植片対宿主病の可能性はない。
【０２１０】
癌の移植片対腫瘍治療
開示の方法に従って採取された幹細胞および前駆細胞を使用して、他の方法では治療不可能な腫瘍、特に、標準治療に抵抗する固体腫瘍（肺、前立腺、卵巣、乳房、大腸、食道、肝臓、および膵臓の癌を含む）を治療してもよい。
【０２１１】
この治療は、自家幹細胞または前駆細胞の移植に依存する。対象自身の免疫系は抑制されるが、完全には破壊されない。ドナーの細胞を患者に輸注し、例えば、ＤＮＡ指紋法を使用して、患者の免疫細胞を注意深くモニターし、ドナー細胞の生着および患者自身の血球の再増殖を追跡する。患者の免疫系は、それらのＴ細胞が移植片を攻撃するのを阻止し、移植片対宿主病を低減するように、さらに抑制される必要があり得る。
【０２１２】
他の用途
開示の方法に従って採取された幹細胞および前駆細胞を使用して、自己免疫疾患、例えば、１型糖尿病、関節リウマチ、および全身性紅斑性狼瘡を治療してもよい。
【０２１３】
開示の方法に従って採取された幹細胞および前駆細胞は、損傷した細胞を修復するように遺伝子を送達する手段として使用されてもよい（すなわち、遺伝子治療用）。
【実施例】
【０２１４】
実施例１：マウスの薬理学的動員試験
本試験では、インビボマウスモデルにおいて、マウスＶＬＡ−４をＧ−ＣＳＦと併用して、骨髄性前駆細胞の動員を評価する。
【０２１５】
動物
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス３０匹をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、ブリティッシュコロンビア癌研究所（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｃｙ（ＢＣＣＡ），バンクーバー，ブリティッシュコロンビア州，カナダ）にて収容および処置した。
【０２１６】
化合物
ＩＳＩＳ３４８５７４（ＡＴＡＴＴＴＴＴＣＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＣ：配列番号：２）、マウスおよびラットα４インテグリン（マウスおよびラットＣＤ４９ｄ）に対して完全に相補的なすべてのＣについて、ホスホロチオエート骨格および５−メチルシストシンを有する５−１０−５  ＭＯＥギャップマーをこれらの試験で使用した。ＩＳＩＳ３４８５７４は、７１３８．２３ＤａのＭＷおよび１８０．０ｍＭのＥＸＴ  Ｃｏｅｆｆを有する。マウスＶＬＡ−４を標的とするこのオリゴヌクレオチドの分析は、国際公開第ＷＯ２００６／０８６８２１号に説明されるとおりである。
【０２１７】
【表２】
2013541520.tif 000003
【０２１８】
動物処置スケジュール
６群のマウス（１群当たりマウス５匹）を生理食塩水の対照または試験化合物Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）、Ｇ−ＣＳＦの臨床等級ペグ化形態、もしくはＩＳＩＳ３４８５７４、マウスＶＬＡ−４（ｍＶＬＡ−４）に対するアンチセンス化合物によって、表３に要約されるスケジュールに従って処置した。
【０２１９】
マウスの体重に基づいて、ｍＶＬＡ−４アンチセンス化合物（６ｍｇ／ｍＬで０．８ｍＬアリコート）を注入し、最終アンチセンス用量３０ｍｇ／Ｋｇを得た。ｍＶＬＡ−４アンチセンス化合物は、４、７、１０、または１４日間、計２、３、５、または７回の投与で注入した。採取の３日前に、すべてのアンチセンス処置群およびＧ−ＣＳＦ単独処置群に、５０μｇ用量のＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標）を１回注入した。対照群は、生理食塩水媒体の投与を１４日間受け、Ｇ−ＣＳＦの注入はなかった。
【０２２０】
【表３】
2013541520.tif 000004
【０２２１】
試験の開始から１４日後、カナダ動物管理協会ガイドライン（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）に従って、すべてのマウスを屠殺した。末梢血試料を心穿刺によってＥＤＴＡ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ管に採取し、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）およびフローサイトメトリー分析のために処理した。
【０２２２】
細胞処理
各試料の体積を記録し、３％酢酸およびＮｅｕｂａｕｅｒ血球計算盤を使用して、有核細胞の計数を行った。これらから、各個のマウスについて、末梢血１ｍＬ当たりの有核細胞の総数を計算した。赤血球細胞（ＲＢＣ）を氷上で１０分間、血液ｖ／ｖの９倍の塩酸アンモニウム緩衝液で溶解し、試料をＩｓｃｏｖｅ修飾ダルベッコ媒体（ＩＭＤＭ）＋２％ウシ血清（ＦＢＳ）中に１回洗浄した。次に細胞ペレットを既知の体積のＩＭＤＭ＋２％ＦＢＳ中で再懸濁し、有核細胞数を評価して、細胞濃度を明らかにした。この細胞ストックから、２×１０６細胞／ｍＬの希釈液を調製して、造血前駆細胞数を評価し、残りの細胞をフローサイトメトリー分析に使用した。
【０２２３】
フローサイトメトリー
マウスＳｃａｌ（Ｌｙ−６Ａ／Ｅ）マーカーの発現を評価するために、細胞をＳｃａ−１ＰＥ共役抗体（クローンＥ１３−１６１．７，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ロット２９２８６、有効期限２０１１−０５−３１）および一連のＦＩＴＣ共役系統マーカー（ＣＤ５、ＣＤ４５Ｒ、Ｇｒ−１、ＣＤ１１ｂ、Ｔｅｒ１１９）を用いて培養した。抗体カクテルを１００μＬ中約１×１０６個の細胞に添加し、４℃で３０分間培養した。次に細胞をＡＣＫ溶解緩衝液で短期間培養し、任意の残りの赤血球を溶解した。細胞ならびに非関連ＦＩＴＣおよびＰＥ標識抗体を含む管を調整して、適切な蛍光染色体の補償を確立した。血球計算器調整のための管をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄し、試料管を、１μｇ／ｍＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳ含有ヨウ化プロピジウムで洗浄して、死細胞を標識した。最大１００，０００事象の採取後に、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して、生細胞のみのフローサイトメトリー分析を行った。選択的前駆細胞マーカーに関するさらなる情報を得るために、細胞を４℃で一晩保管し、翌日ＥＰＣＲ  ＰＥ（クローンＲＭＥＰＣＲ１５６０、ＳＴＩ）、ｃ−キットＡＰＣ（クローン２Ｂ８、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ロット２７１０８、有効期限２００８−０４−３０）およびＦＩＴＣ共役系統マーカーを用いて、前述の手順に従って染色した。
【０２２４】
クローン形成アッセイ
赤芽球（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球−単球（ＣＦＵ−ＧＭ）、および多能性／寡能性（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）系統のクローン形成前駆細胞を、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｍ幹細胞因子、１０ｎｇ／ｍＬ  ｒｍインターロイキン３、１０ｎｇ／ｍＬ  ｒｈインターロイキン６、および３Ｕ／ｍＬ  ｒｈエリトロポエチンを含有するメチルセルロース系培地ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（登録商標）Ｍ３４３４において評価した。各マウスから得た末梢血細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（登録商標）Ｍ３４３４に添加し、ボルテックスして、２×１０５細胞／培養皿を３部で蒔いた。培養物を１０日間、３７℃、加湿した培養器中５％のＣＯ２で培養した。
【０２２５】
統計解析
各群のデータセットについて、および各マウスのクローン形成アッセイの３部培養物について、平均＋／−１標準偏差を計算した。標準ｔ検定を行い、対照と処置した培養物との間で、生成された細胞またはコロニーの数に差があるか否かを評価した。コロニー係数の潜在的な主観性に起因して、０．０１未満のｐ値を有意とみなす。
【０２２６】
マウス試験コロニー形成細胞
コロニー形成前駆細胞アッセイを使用して、ｍＶＬＡ−４アンチセンス化合物およびＧ−ＣＳＦの様々な投与レジメンでマウスを処置した後の骨髄から末梢血への骨髄前駆細胞の動員を明らかにした。
【０２２７】
顆粒球、赤血球、単球、巨核球多能性／寡能性前駆細胞）ＧＥＭＭ、ＣＤ３４＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ１３＋、ＨＬＡＤＲ＋）の割合は、Ｇ−ＣＳＦ単独での処置と比較して、ｍＶＬＡ−４アンチセンス化合物およびＧ−ＣＳＦによる処置後７日目および１０日目に７０％以上、１４日目に８５％以上であった。
【０２２８】
増殖能の低いＧＥＭＭ由来の顆粒球、マクロファージ前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ；ＣＤ３４＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ１３＋、ＨＬＡＤＲ＋）の割合は、Ｇ−ＣＳＦ単独での処置と比較して、ｍＶＬＡ−４アンチセンス化合物およびＧ−ＣＳＦによる処置後１０日目および１４日目までに約１８％上昇した。
【０２２９】
増殖能の低いＧＥＭＭ由来の最早赤芽球前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）の割合は、Ｇ−ＣＳＦ単独での処置と比較して、ｍＶＬＡ−４アンチセンス化合物およびＧ−ＣＳＦによる処置後に変化しなかった。
【０２３０】
ＣＦＵ−ＧＭとして約２０％増加した総コロニー形成コロニーは、最も一般的なコロニー形成単位である。
【０２３１】
ｍＶＬＡ−４アンチセンス化合物およびＧ−ＣＳＦによる処置は、意外にも、Ｇ−ＣＳＦ単独と比較して（生理食塩水対照と比較して、ＧＥＭＭ細胞を７倍多く動員した）、骨髄前駆ＧＥＭＭ細胞を１２倍多く動員した（ｐ＜０．０１）。さらに、意外にも、ｍＶＬＡ−４アンチセンス化合物およびＧ−ＣＳＦによる処置後、末梢血中のＣＦＵ−ＧＭ細胞の増加は限られており、ＢＦＵ−Ｅは検出されなかった。
【０２３２】
Ｇ−ＣＳＦ単独での処置は、ＧＥＭＭに影響を及ぼし（ｐ＝０．０５〜０．０７）、ＣＦＵ−ＧＭ（１２倍）およびＢＦＵ−Ｅ（２．５倍）に対して影響すると考えられる。
【０２３３】
ｍＶＬＡ−４アンチセンス化合物は、４日間でＧＥＭＭ放出作用を有し始め、７〜１０日以内にＧＥＭＭ細胞（多能性／寡能性前駆細胞）を（Ｇ−ＣＳＦとともに）１２倍多く放出すると考えられ、すべての顆粒球、赤血球、単球、巨核球を再配置させることができる。
【０２３４】
マウス試験細胞のフローサイトメトリー分析
フローサイトメトリーを使用して、ｍＶＬＡ−４アンチセンス化合物およびＧ−ＣＳＦの様々な投与レジメンによるマウスの処置後の、骨髄から末梢血への前駆細胞および幹細胞の動員を明らかにした。
【０２３５】
ｍＶＬＡ−４アンチセンス化合物およびＧ−ＣＳＦによる処置は、生理食塩水と比較した場合ではなく、Ｇ−ＣＳＦ単独での処置と比較して、ｍＶＬＡ−４アンチセンス化合物およびＧ−ＣＳＦによる処置の１０日後に、ＥＰＣＲ＋細胞を５５％増加させた。これらの試験の最後の３日間に添加された長期作用性Ｇ−ＣＳＦは、生理食塩水に対して、ＥＰＣＲ＋細胞％を減少させたと考えられる。
【０２３６】
ＥＰＣＲは、ＣＣＤ４１またはＣＤ２０１としても知られる、内皮タンパク質Ｃ受容体である。ＥＰＣＲタンパク質は、マウス骨髄細胞の〜１．５％上に検出される。精製されたＥＰＣＲ＋細胞は、造血幹細胞活性のために高度に濃縮されると報告されている。ＥＰＣＲ＋＋細胞の割合は、恐らく試験におけるマウス造血幹細胞の最適なマーカーである。高ＥＰＣＲ発現細胞は、移植されると骨髄を再構成できると考えられる。マウスのＥＰＣＲ＋＋細胞は、最早ヒト造血幹細胞の同等物であり得る。
【０２３７】
ｍＶＬＡ−４アンチセンス化合物およびＧ−ＣＳＦによる処置は、白血球減少を引き起こした。Ｇ−ＣＳＦ処置単独では、通常、マウスの血液中の主要な白血球集団である、好中球を増加させ、ｍＶＬＡ−４アンチセンス化合物が白血球の減少を引き起こす可能性がある。ＡＴＬ１１０２（ｈＶＬＡ−４）もまた、ヒト試験においていくらかの血球を減少させるが、実施例８において以下に記載されるＶＬＡ−４に対する抗体によって生じるものではない。
【０２３８】
実施例２：ヒト薬理学的ＣＤ３４動員試験
この試験では、インビボヒト試験においてヒトＶＬＡ−４に対するアンチセンスを使用して、ＣＤ３４細胞動員を評価した。ＣＤ３４のＲＮＡレベルは、全血中ＲＮＡのＰＣＲを介して検出された。
【０２３９】
化合物
ＩＳＩＳ１０７２４８（ＣＴＧＡＧＴＣＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣＴ：配列番号：１）、ヒトα４インテグリン（ＣＤ４９ｄ）に対して完全に相補的なすべてのＣについて、ホスホロチオエート骨格および５−メチルシストシンを有する３−９−８  ＭＯＥギャップマーをこれらの試験で使用した。ＡＴＬ１１０２（ｈＶＬＡ−４アンチセンスオリゴヌクレオチド）としても知られるこのオリゴヌクレオチドおよび他の標的ヒトＶＬＡ−４のインビトロ分析は、国際公開第ＷＯ２０００／２０６３５号および米国特許第６，２５８，７９０号に記載のとおりである。
【０２４０】
注入用の皮下溶液は、化合中に酸または塩基によってｐＨ７．４に調整された注入用水中にＡＴＬ１１０２のみを含んだ。溶液は、透明な明黄色であった。Ｉ型フリントグラスバイアル瓶に入れ、テフロン（登録商標）コーティングを有する臭化ブチルゴム栓で塞ぎ、アルミニウムフリップオフオーバーシールで密閉した。
【０２４１】
多発性硬化症患者の治療
二重盲検プラセボ対照試験において、多発性硬化症患者にＡＴＬ１１０２を投与し、磁気共鳴撮像によって脳の病変数に対する薬物の影響を明らかにした。再発寛解型多発性硬化症患者（ＲＲＭＳ）における治療の詳細および損傷数の減少に関するこのオリゴヌクレオチドの分析は、国際公開第２０１０／００８４７４号に記載のとおりである。
【０２４２】
インビボヒトモデルにおけるＣＤ３４動員試験
数人のＭＳ患者から調製した全血中のＲＮＡを、ＣＤ３４＋（造血）幹細胞および前駆細胞動員について評価した。ＣＤ３４＋細胞動員は、皮下注射によってＡＴＬ１１０２（ｈＶＬＡ−４アンチセンスオリゴヌクレオチド）を受けている、ＲＲＭＳと診断された１１例の対象（治療８週目の全血中のＲＮＡおよびベースラインが入手可能であった）において試験した。
【０２４３】
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ調製は、以下の実施例３に記載のとおりである。
【０２４４】
ＣＤ３４のＴａｑＭａｎ実時間定量的ＰＣＲ
Ｏｐｐｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ２００５  ９０（７）：８７５−８８０に前述されるように、ＣＤ３４について、実時間定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０２４５】
ＣＤ３４  ＲＮＡ転写分析
ＡＴＬ１１０２治療は、赤血球を含む、全血中のすべての細胞において発現したＰＢＧＤハウスキーピング遺伝子と比較して、１１例の適合ＲＲＭＳ患者において、ベースラインと比較すると、８週目に全血中ＲＮＡにおけるＣＤ３４転写を１．５倍（Ｐ＜０．０２７）増加させた（表４）。
【０２４６】
【表４】
2013541520.tif 000005
【０２４７】
実施例３：ヒトＶＬＡ−４ＲＮＡの薬力学的試験
本試験では、実施例２の上記インビボヒト多発性硬化症試験において、ｈＶＬＡ−４アンチセンスを使用して、ＶＬＡ  ＲＮＡの作用を評価した。ＣＤ４９ｄ  ＲＮＡレベルは、全血ＲＮＡまたは分画ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球ＲＮＡにおいて、ＰＣＲを介して検出された。
【０２４８】
ＲＮＡ単離
東欧センターからの試料に対して、Ｐａｘｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡシステム管（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）を使用した。全血の２．５ｍＬを直接Ｐａｘｇｅｎｅ（登録商標）管に採取し、製造者の指示に示されるとおり処置した。この方法によって、細胞内ＲＮＡは必要になるまで安定化した。ＲＮＡ単離は、製造者の指示に従って、Ｐａｘｇｅｎｅ（登録商標）キットを使用して行った。
【０２４９】
ドイツセンターから得た試料に対して、ＲＮＡ単離は以下のように行った。２４ｍＬのＥＤＴＡ血の採取から２〜８時間後、Ｆｉｃｏｌｌに基づく分離溶液ＬＳＭ１０７７（ＰＡＡ）を使用して、リンパ球の事前濃縮を行った。細胞を数え、製造者の手引きに従ってＣＤ４およびＣＤ８陽性の単離キット（Ｄｙｎａｌ）を使用する、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の光磁気免疫単離に即時使用した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋単離細胞の純度を、フローサイトメトリーによってランダムにチェックした。ＲＮＡ単離は、製造者の指示に従って、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）を使用して行った。さらに、ＥＤＴＡ血２．５ｍＬを直接Ｐａｘｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡシステム管（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）に採取し、製造者の指示に従って、Ｐａｘｇｅｎｅ（登録商標）キットを使用してＲＮＡ単離を行った。
【０２５０】
ｃＤＮＡ調製
ｃＤＮＡは、ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ  ＱＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）テンプレートとして産生した。反応混合物は、総ＲＮＡ６μＬ、ランダムプライマー３μＬ（０．１μｇ／μＬ）、第１鎖マスターミックス（２×）１０μＬおよびＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ／ＲＮａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ酵素混合物１μＬを含んだ。反応液を２５℃で５分間、４２℃で１５分間、９５℃で５分間培養した。
【０２５１】
ヒトＶＬＡ−４の増殖のための実時間ＰＣＲ
ＰＣＲは、７５００実時間ＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で行った。ｈＩＴＧＡ４（ＶＬＡ−４）の増殖の場合、反応混合液は、ｃＤＮＡ５ｎｇ、ＴａｑＭａｎ発現アッセイ（２０ｘ、Ｈｓ００１６８４３３_ｍｌ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）１．２５μＬ、および１２．５μＬのＴａｑＭａｎ発現マスターミックス（２ｘ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を総容量２５μＬに含んだ。ハウスキーピング遺伝子ｈＴＢＰ（ヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質）の増殖の場合、反応混合液は、ｃＤＮＡ５ｎｇの、ＴａｑＭａｎ発現アッセイ（２０ｘ、Ｈｓ００４２７６２０_ｍｌ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）１．２５μＬ、およびＴａｑＭａｎ発現マスターミックス（２ｘ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）１２．５μＬを総容量２５μＬに含んだ。
【０２５２】
ｈＩＴＧＡ４およびｈＴＡＴＡのＰＣＲは、別個のウェルで行われ、実行ごとに複製する。各試料について、ＰＣＲを２回行った。各反応は以下のように行った。５０℃で２分間初期培養し、９５℃で１０分間酵素活性化した後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間のサイクルを４０回行った。データ収集は、６０℃の培養工程で行った。
【０２５３】
ヒトＶＬＡ−４の相対定量
各試料におけるｈＩＴＧＡ４  ｍＲＮＡの発現レベルは、ＳＤＳ  ｖｌ．２ソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析した。原則およびワークフローは、以前に説明されている（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．２（Ｐ／Ｎ  ４３０３８５９）；Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１）。
【０２５４】
相対定量は、較正試料（比較結果の基礎として使用される試料）における同一配列に対する、試験試料における核酸配列（標的）の発現の変化を明らかにする。内因性対照遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）の目的は、逆転写反応に対して添加されたＲＮＡの量について、ＰＣＲを正規化することである。比較ＣＴ法（ΔΔＣＴ法）は、演算式を使用して、相対定量の結果を得る。この方法の場合、標的と内因性対照との間のＰＣＲ効率が比較的等しい限り、標準曲線を使用する必要がない。
【０２５５】
内因性基準に対して正規化された（Ｃｔ標的遺伝子−Ｃｔ内因性対照＝ΔＣＴ）および較正器に相対する（ΔＣＴ試料−ΔＣＴ較正器＝ΔΔＣＴ）標的の量は、２−ΔΔＣＴ；ＣＴ＝閾値サイクルによって得られる。
【０２５６】
この実験において、健常な未治療の試験対象のＲＮＡは、較正器試料として使用され、標的−およびハウスキーピング遺伝子−ＰＣＲの効率が同等であることが検証された（Δ効率≦０．０２）。サイクル３〜１５のＣＴ閾値０．２００００００およびベースラインが選択された。
【０２５７】
結果
全血または分画ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球において検出された１マイクログラム当たりのＣＤ４９ｄ  ＲＮＡレベルに変化はなかった。全血中のＣＤ４９ｄ  ＲＮＡ分析は、好中球の減少によって影響される場合があり、細胞がヒト血液中に大量発生し、大部分がＶＬＡ−４  ＲＮＡ陰性である。ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球におけるＣＤ４９ｄ  ＲＮＡ減少の不在は、ＡＴＬ１１０２が選択数の血中Ｔ細胞のみにおいてＶＬＡ−４  ＲＮＡを減少させることを示し、全血中の減少の不在は、ＡＴＬ１１０２が選択数の他の血球のみにおいてＶＬＡ−４  ＲＮＡを減少させることを示し得る。これは、実施例４および５の観察と一致する。
【０２５８】
実施例４：ヒトＶＬＡ−４細胞性薬力学的試験
細胞表面上のＶＬＡ−４レベルを評価するために、実施例試験２におけるＲＲＭＳ患者から、訪問２回目（ベースライン）、６回目（８週目）、７回目（１２週目）、および８回目（１６週目）に血液試料を得た。リンパ球に関するＶＬＡ−４アッセイには、３６ｍＬの全血が必要であった。
【０２５９】
細胞表面抗原決定基
ＶＬＡ−４の細胞表面発現および白血球副集団のマーカーについて、患者の血液試料の多チャネルフローサイトメトリー分析を行った。試験は、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、およびＣＤ１４＋単球上で行い、ＶＬＡ−４共染色は、ＶＬＡ−４  ＭＦＩとして、または指定の細胞集団内のＶＬＡ−４＋細胞の割合として分析した。
【０２６０】
ＶＬＡ−４細胞表面発現の測定
ＶＬＡ−４膜発現について、フローサイトメトリーによって、モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役抗ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−４、Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｉｄｄｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、全血単核細胞を分析した。つまり、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に、ＶＬＡ−４  ＭｏＡｂを１０μＬ添加した。Ｂ細胞を同定するために、１０μＬのフィコエリトリン（ＰＥ）共役抗ＣＤ１９  ＭｏＡｂを添加した。単球を同定するために、２μＬのアロフィコシアニン（ＡＰＣ）共役抗ＣＤ１４  ＭｏＡｂを添加した。Ｔ細胞ならびにそれらのＣＤ４＋およびＣＤ８＋副集団を同定するために、１０μＬのペリニジンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）共役抗ＣＤ３  ＭｏＡｂ、１０μＬのＰＥ共役抗ＣＤ４  ＭｏＡｂ、および２μＬのＡＰＣ共役抗ＣＤ８  ＭｏＡｂを添加した。１００μＬのＥＤＴＡ血液を添加した後、試料を暗所に１５分間培養した。赤血球を溶解液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ハイデルベルグ，ドイツ）で溶解した後、ＰＢＳで洗浄した。染色された細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定し、ＶＬＡ−４発現を細胞の割合ならびに平均チャネル蛍光強度（ＭＦＩ）として記録した。ＭｏＡＢは、Ｂ細胞に対して配向され、Ｔリンパ球および単球は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入した。
【０２６１】
プラセボの統計解析およびベースライン比較は、２つの方法によって、フローサイトメトリーデータについて行った。第１の方法は、未変換およびログ変換したデータの共分散検定の分析を伴い、以下に報告されるログ変換したデータを用いて、減少率％を明らかにし、対応するベースライン値がない場合は、データを除外した。第２の方法は、未変換のデータに関するスチューデントＴ検定の使用を伴い、すべてのデータが含まれた。
【０２６２】
結果
Ｂ細胞表面ＶＬＡ−４の影響
ＡＴＬ１１０２処置は、検出可能なＶＬＡ−４を発現するＣＤ１９＋Ｂリンパ球の割合を減少させた。これは、プラセボ群およびベースラインの両方と比較して、８週目に観察された。
【０２６３】
プラセボ比較において、第１の分析方法によって、１１％の減少（ｐ＜０．０５）が観察された。ＶＬＡ−４＋／ＣＤ１９＋Ｂ細胞数データの第２の分析方法によって、８．３％の減少（ｐ＜０．０１３）が観察された。
【０２６４】
ベースライン比較において、ＶＬＡ−４＋／ＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合に同様の減少が観察された。第１の分析方法によって、１１％の減少（ｐ＜０．０５）が観察され、ＶＬＡ−４＋／ＣＤ１９＋Ｂ細胞数データの第２の分析方法によって、７．１％の減少（ｐ＜０．０３２）が観察された。
【０２６５】
他の分析において、ＶＬＡ−４  ＭＦＩの減少は、１６週目にＢ細胞においてのみ観察された（＜１０％＞減少）。
【０２６６】
Ｔ細胞表面ＶＬＡ−４の影響
ＡＴＬ１１０２処置は、ＶＬＡ−４の検出可能なレベルを発現するＣＤ３＋およびＣＤ４＋細胞の割合を減少させた。ベースラインと比較して、１２週目のデータを分析すると、第２の分析方法は、ＶＬＡ−４＋でもある、ＣＤ３＋Ｔリンパ球の割合の減少（８．２％減少、ｐ＜０．０３７）およびＶＬＡ−４＋でもある、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の割合の減少（１２％減少、ｐ＜０．０４７）を示した。
【０２６７】
結論
ＡＴＬ１１０２は、選択数の血中Ｂ細胞およびＴ細胞上のＶＬＡ−４を減少させる。
【０２６８】
実施例５：ヒト血球薬力学的試験
血球変化を評価するために、実施例試験２において、訪問２、６、７、および８回目にＲＲＭＳ患者から血液試料を得た。実施例４のように多チャネルフローサイトメトリーを使用して、血液学によって細胞変化を評価した。
【０２６９】
ＣＤ８＋／ＣＤ４＋測定：
ＣＤ８＋／ＣＤ４＋細胞数を評価するために、ＶＬＡ−４アッセイのために得られた３６ｍＬの血液試料を使用して、訪問２、６、７、および８回目に、フローサイトメトリーによって血液試料を分析した。ＣＤ４：８の比は、これらの試験において変化しなかった。
【０２７０】
細胞数：白血球
訪問２、６、７、および８回目に、血液学および多チャネルフローサイトメトリーによって血液試料を分析した。ＡＴＬ１１０２による処置の８週目に、プラセボに対して以下の減少が観察された（第１の分析方法を使用）。
・総白血球：３７％（ｐ＜０．０００５）
・顆粒球：４３％（ｐ＜０．０００５）
・リンパ球：２５％（ｐ＜０．０５）
・Ｂ細胞：５３％（ｐ＜０．０００５）
・ＨＬＡ−ＤＲ＋Ｂ細胞：４１％（ｐ＜０．０５）
・ＣＤ４＋Ｔ細胞：２６％（ｐ＜０．０５）
・ＣＤ８＋Ｔ細胞：２３％（ｐ＜０．０５）
ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｐ<０．０５）およびＣＤ８＋ＨＬＡ−ＤＲ＋Ｔ細胞（ｐ＜０．００５）の比率の増加の可能性も見られたが、これらの細胞は少数であった。
【０２７１】
結論
ＡＴＬ１１０２は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および顆粒球（好中球、好塩基球、および好酸球を含む）の数を減少させる（データ図示せず）。ＡＴＬ１１０２は、単球またはＮＫリンパ球の数を減少させない。ＶＬＡ−４に対する抗体が、通常、血液中のこれらの細胞数を増加させることを考えると、このデータは意外である（実施例８を参照）。
【０２７２】
ＶＬＡ−４は、ＢおよびＴ細胞の成熟、アポトーシス、活性、接着、および転移において役割を有することが知られており（Ａｒｒｏｙｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｃａｒｒａｓｃｏ  ａｎｄ  Ｂａｔｉｓｔａ，２００６、Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ，２００３、Ａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００３  Ｔｃｈｉｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７、Ｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２００６）、それらのうちの１つまたは複数は、ＡＴＬ１１０２相ＩＩ試験において、細胞性薬力学的観察に寄与し得る。ＶＬＡ−４は、好中球前駆細胞、好酸球、および好塩基球に対しても役割を有する。
【０２７３】
ＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞由来のＡＴＬ１１０２は、自己免疫疾患を引き起こす汚染血球をほとんど有しない場合があり、患者自身のＣＤ３４＋細胞を放射線治療後の自己免疫疾患の自家治療において使用可能にする。加えて、開示の方法に従って採取されたＡＴＬ１１０２幹細胞および前駆細胞は、移植片対宿主病に関与する汚染細胞をほとんど含まない場合があり、白血病のより良好な同種治療を可能にする。移植片において影響を受けないナチュラルキラー細胞および樹状（単球）細胞は、無病の生存を向上させる。ＡＴＬ１１０２は、選択数の血中Ｂ細胞およびＴ細胞上のＶＬＡ−４を減少させ、患者の腫瘍細胞を放出する能力を減少させる。
【０２７４】
実施例６：ヒトＡＴＬ１１０２薬物動態試験
オリゴヌクレオチド１血漿濃度を評価するために、訪問２、５、６、および８回目に、血液試料（７ｍＬ）を得た。訪問２、５、および６回目に、オリゴヌクレオチド１／プラセボの注射から１、２、３、４、および６時間前にこれを行った。訪問８回目に、単一試料を得た。採取後、血液試料を１０分間、１，６００ｇで４℃の温度で遠心分離した。上澄みをピペットによってラベル付きのポリプロピレン管（試料当たり管２本）に移し、さらに−２０℃（許容範囲＋５℃）以下の温度で保管するために、大型冷蔵庫に移した。
【０２７５】
薬物動態データ
ＡＴＬ１１０２の中央値プロファイルは、１日目〜８週目の蓄積ピークまたは総血漿暴露レベルの兆候を示さない（図１および表５）。
【０２７６】
治療段階中のＣｍｉｎ濃度の増加は、オリゴヌクレオチド１が、複数回投与によって組織内に蓄積することを示唆する。フォローアップ段階のＣｍｉｎ濃度の減少は、ｔ１／２の消滅が約３週間であることを示唆する。
【０２７７】
【表５】
2013541520.tif 000006
【０２７８】
ＡＴＬ１１０２の中央値血漿濃度は、１日目、４週目および８週目の連続測定で明らかにした。皮下投与後、ＡＴＬ１１０２は、第１の投与後時点（投与後１時間）で見られる測定可能な濃度で急速に吸収されるように思われた。続いて、すべての中央値プロファイルは、１〜２時間に明らかな増加を示した。１日目の中央値プロファイルは、さらに投与から２〜３時間に顕著に増加した。これは、４週目および８週目の中央値プロファイルには当てはまらなかった。中央値プロファイルのＡＴＬ１１０２ピーク血漿濃度は、注射から２〜４時間後に得られ、その後減少し、すべての中央値プロファイルについて、６時間の値は、４時間の値よりも明らかに低い。４週目および８週目の投与前ＡＴＬ１１０２濃度中央値は、それぞれ１日目および４週目の投与後６時間の中央値濃度よりも約１００倍低かった。
【０２７９】
一般に、１週目にはＡＴＬ１１０２を３回皮下投与し、２〜８週目には週２回皮下投与したところ、１日目〜８週目の蓄積ピーク（Ｃｍａｘ）または総（ＡＵＣ）血漿暴露レベルは認められなかった。しかしながら、トラフ（投与前）濃度は、４週目〜８週目に明らかに増加した。トラフ中央値は、４週目および８週目にそれぞれ３８ｎｇ／ｍＬおよび８８ｎｇ／ｍＬであった。８週目に、３２例の患者全員が、４週目のトラフレベルを超えるトラフレベルを有した。８週目に計画された治療の中断後、ＡＴＬ１１０２血漿濃度中央値は、１２週目に３２ｎｇ／ｍＬ（投与後４週間）、および１６週目に１１ｎｇ／ｍＬ（投与後８週間）であった。
【０２８０】
薬物動態パラメータは、個別の血漿濃度プロファイルから計算した。計１００個のプロファイルを評価し、１日目および４週目にそれぞれ３４プロファイル、８週目に３２プロファイルを評価した。
【０２８１】
Ｃｍａｘ（ピーク暴露）値は、２８８９ｎｇ／ｍＬ〜２４１１８ｎｇ／ｍＬの範囲にあった。中央値は、１日目に９７７３ｎｇ／ｍＬ、４週目に１０５０５ｎｇ／ｍＬ、８週目に９４６２ｎｇ／ｍＬ、および全体で９８４８ｎｇ／ｍＬであった。
【０２８２】
ＡＴＬ１１０２の最大濃度は、投与後平均３．３時間（１日目）、投与後２．７時間（４週目）、および投与後３．２時間（８週目）に観察された。１００個の血漿濃度プロファイルをすべて考慮すると、最大濃度は、２８プロファイルにおいて２時間、４１プロファイルにおいて３時間、および２７プロファイルでは４時間に観察された。中央値ｔｍａｘは、ＡＴＬ１１０２の投与後約３時間であった。
【０２８３】
個別のＡＵＣｌａｓｔ値（総暴露）は、１３３７４ｈ×ｎｇ／ｍＬ〜１１０９０９ｈ×ｎｇ／ｍＬの範囲にあった。ＡＵＣｌａｓｔ値は、１日目〜８週目の蓄積効果を示さなかった。中央値は、１日目に４５８４７ｈ×ｎｇ／ｍＬ、４週目に４６０７４ｈ×ｎｇ／ｍＬ、８週目に４５３４４ｈ×ｎｇ／ｍＬ、および全体で４５９７６ｈ×ｎｇ／ｍＬであった。
【０２８４】
計１８例の患者は、１２週目および１６週目の両方において、ＡＴＬ１１０２血漿濃度を測定し、これによって最終の排泄の半減期ｔ１／２の概算を可能にした。計算された排泄の半減期は、１．８〜２０週間であり、中央値は３．０週間、幾何平均は３．２週間、および変動係数は１０６％であった。ログ変換された半減期は、標準偏差０．５６４であった。
【０２８５】
ＡＴＬ１１０２血漿濃度は、女性患者のほうが男性患者よりも約１．６倍高いように思われる。ＡＵＣｌａｓｔおよびＣｍａｘ値の幾何平均は、女性患者のほうが男性患者よりも１．５〜１．８倍高い。暴露におけるこの明らかな性差を確認するために、今後より多くの患者を対象とした試験が必要である。
【０２８６】
結論
最大血漿ＡＴＬ１１０２濃度は、投与から約３時間後に到達し、２８８９ｎｇ／ｍＬ〜２４１１８ｎｇ／ｍＬの範囲にあった（中央値９８４８ｎｇ／ｍＬ）。投与後６時間までの血漿濃度時間曲線下の面積は、１３３７４ｈ×ｎｇ／ｍＬ〜１１０９０９ｈ×ｎｇ／ｍＬの範囲にあった（中央値４５９７６ｈ×ｎｇ／ｍＬ）。１日目〜８週目に蓄積ピーク（Ｃｍａｘ）または総（ＡＵＣ）血漿暴露レベルは認められなかった。４週目および８週目の投与前濃度中央値は、それぞれ１日目および４週目の投与後６時間の濃度中央値よりも約１００倍低かった。４週目（中央値３８ｎｇ／ｍＬ）〜８週目（中央値８８ｎｇ／ｍＬ）に投与前濃度に増加が見られ、複数回投与時の組織におけるＡＴＬ１１０２の蓄積を示唆する。たった２つの時点（最終投与後４週間および８週間）から推定される最終の排泄の半減期の中央値は、３週間であった。
【０２８７】
実施例７：ラットにおけるＡＴＬ１１０２薬物動態試験
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、３Ｈ−ＡＴＬ１１０２（ＩＳＩＳ１０７２４８）の静脈内ボーラス注射を単回行った。血漿、血液、および組織中の放射能の平均濃度は、液体シンチレーション計数を使用して、雄ラットの平均用量５ｍｇ／Ｋｇで決定した。以下の表６は、ＡＴＬ１１０２血液／血漿および組織濃度の測定値に関する要約情報を分（ｍｉｎ）および時間（ｈｒ）または日（ｄ）で示す。血液および血漿は、１ｍＬ当たりのマイクログラム等量であり、組織濃度は、組織１ｇ当たりのマイクログラム等量である。
【０２８８】
ＡＴＬ１１０２は、４時間以内に血液および血漿から器官（例えば、腎臓、肝臓、ならびに一次および二次免疫器官（骨髄（ＢＭ）およびリンパ節（ＬＮ）を含む）など）に速やかに除去される。大腿骨を除くＢＭ（ＢＭ  ｅｘｆ）において、半減期は約１４日であった。ＢＭ大腿骨において、半減期はより長かった。
【０２８９】
【表６】
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【０２９０】
雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、３Ｈ−ＡＴＬ１１０２（ＩＳＩＳ１０７２４８）の１９．３ｍｇ／Ｋｇ静脈内ボーラス注射を単回投与し、雌ラットには、１９．７ｍｇ／Ｋｇを単回投与した。４時間および２４時間の血漿、血液、ならびに骨髄、腎臓、および肝臓における放射能の平均濃度は、表７において以下に示される。ＡＴＬ１１０２は、４時間の器官よりも血漿においてより低く、２４時間までに大部分が腎臓、肝臓、および骨髄に出現する。異なる部位から分析された様々な骨髄試料において、薬物濃度は、雄および雌の両方において、組織１グラム当たりのマイクログラム等量で肝臓とほぼ同一である。
【０２９１】
【表７】
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【０２９２】
実施例８：ＶＬＡ−４に対する拮抗薬と比較したＶＬＡ−４に対するアンチセンスの比較ヒト成熟血球薬力学および薬物動態
異なる薬力学および薬物動態を含むＶＬＡ−４アンチセンス薬物の新規の機序は、特にＶＬＡ−４拮抗薬小分子および抗体の潜在的使用と比較されるとき、単独および動員剤Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＭｏｚｏｂｉｌ（登録商標）と併用して使用されて、幹細胞／前駆細胞動員において利益を提供する。
【０２９３】
Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）は、インターフェロンβまたはｃｏｐａｘｏｎｅ不良などの他の治療が失敗したときに、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を治療するための市販のＶＬＡ−４標的に対するモノクローナル抗体である。ボランティアおよびＲＲＭＳにおけるＴｙｓａｂｒｉ（登録商標）治療は、血中のすべてのＶＬＡ−４＋白血球に作用して、免疫細胞の末梢隔離に至る。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびナチュラルキラー細胞を含む、循環リンパ球（１．５倍）、ならびにＢ細胞（２．８倍）を他のリンパ球よりも増加させる。Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）は、単球を増加させ、顆粒球は好酸球および好塩基球を増加させ、ヒトにおいて事実上すべてＶＬＡ−４陰性である、好中球を増加させない（Ｋｒｕｍｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ，２００８、Ｐｏｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００６、Ｐｕｔｚｋｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１０、Ｋｉｖｉｓａａｋ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）は、長い血中半減期を有し、１ヶ月より長い持続性作用を有する。これは、ＪＣウイルス活性および進行性の多発性白質脳炎（ＰＭＬ）を引き起こす能力を有する、強力な免疫抑制薬である。
【０２９４】
対照的に、ＶＬＡ−４に対するアンチセンス薬であるＡＴＬ１１０２は、循環Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、および顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球を含む）を減少させ、血中の単球およびナチュラルキラー細胞の数に影響しない。ＡＴＬ１１０２は、血漿中で非常に短い半減期を有し、数時間以内に急速に器官に除去され、循環白血球の薬物への暴露を制限する。これらの薬物動態、所定の成熟血球に対する選択的作用、さらに実施例４に概説される治療の選択的なＶＬＡ−４薬力学的作用は、大部分の血球において、ＶＬＡ−４を介する接着および免疫監視能力を保存する。
【０２９５】
実施例９：ＡＴＬ１１０２第Ｉ相試験
本試験の主な目的は、用量増量レジメンで付与され、健常なボランティアに皮下（ＳＣ）注射される、ＡＴＬ１１０２の単回投与および複数回投与の安全性および耐性を評価することである。雄および雌の両方を試験に組み入れた。
【０２９６】
投与レジメン
用量増量試験において雄における単回皮下注射用量は、０．１ｍｇ／Ｋｇ、０．５ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇ、２．０ｍｇ／Ｋｇ、４．０ｍｇ／Ｋｇ、および６．０ｍｇ／Ｋｇであった。雄において、２．０ｍｇ／Ｋｇの単回の静脈内注射用量は、６０分かけて投与される。雌における複数回の皮下注射用量は、１、３、および５日目に４．０ｍｇ／Ｋｇ、１、３、および５日目に６．０ｍｇ／Ｋｇが投与された。
【０２９７】
対象は、盲検において活性薬物またはプラセボを受けるように無作為抽出した。対象は、他に単会の試験期間のユニットに参加した。単回投与の増量スケジュールの場合、対象は、投与前の午後に入院し（１日目）、調査者の裁量で、投与完了後約２４時間で退院した。複数回の投与スケジュールの対象は、３回目の投与から２４時間後に退院した。次に、対象は、多数の外来に戻る（薬物動態のための血液試料を採取するために最大５９週）。
【０２９８】
ＡＴＬ１１０２用量は、医師または看護師によって、０．９％  ＮａＣｌ（生理食塩水）とともに最大１００ｍＬの皮下注射として、または静脈内注射として６０分間にわたって投与された（グループ７）。対象は、注射中は横臥位または半横臥位であった。
【０２９９】
対象は、投与の時間から少なくとも４時間は横臥位／半横臥位を維持するように求められた。各投与の実際の開始時間（およびグループ７のみ終了時間）がＣＲＦに記録された。
【０３００】
試験以降の日
すべての対象は、４、８、１５、２２、および２９日目に、ＡＴＬ１１０２用の血液採取のために再訪し、２ｍｇ／Ｋｇ以上を投与された対象もまた、ＡＴＬ１１０２薬物動態試料のために５９日目までの日に再訪した。４、８、および１５日目に、すべてのグループからバイタルサイン（血圧および脈拍）を得た。安全性研究所試験のための血液採取は、投与２４時間後に行った（４、８、１５日目およびフォローアップ）。
【０３０１】
フォローアップ
血圧、体温、および脈拍数、１２誘導ＥＣＧおよび研究所安全性試験（血液学、臨床化学、および尿検査）を含む身体検査。
【０３０２】
ＡＴＬ１１０２用の血液採取は、最大１ｍｇ／Ｋｇを受ける対象の場合、２９日目の対象の訪問で行い、次に２ｍｇ／Ｋｇ以上を受ける対象の場合、５９日目に行った。同様の評価を複数回投与試験の対象に行った。有害事象はこの訪問時に評価した。
【０３０３】
薬物動態／薬力学的試料採取
約１．６ｍＬの血漿を提供するために、ＡＴＬ１１０２アッセイ用の血液試料（３ｍＬ）を採取する必要があった。グループ１〜３の場合、試料は、ラベンダートップ４．５ｍＬ  ＥＤＴＡ管内に、投与前（ベースライン）および投与後３０、６０、および９０分、２、２．５、３、４、６、１２、２４時間、および４、８、１５、２２、および２９日後に採取した。
【０３０４】
２ｍｇ／Ｋｇ〜６ｍｇ／Ｋｇ単回皮下投与を受ける対象の場合、試料は、４３日目および５９日目にも採取した。
【０３０５】
２ｍｇ／Ｋｇ静脈内投与を受ける対象の場合、試料は、投与前、注入開始後３０、６０、７０、および９０分後、投与後２、３、４、６、８、および２４時間後、ならびに２、４、８、１５、２２、２９、４３、および５９日目にも採取した。
【０３０６】
複数回皮下投与を受ける対象の場合、血液試料は、２４時間薬物濃度プロファイリングの場合、いつも１日目（第１回投与後）および５日目（第３回投与後）に採取され、次に異なる時点、少なくとも投与後最大５９日目に採取された。
【０３０７】
研究所試験
血液学：Ｈｂ、Ｈｃｔ、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、ＲＢＣ、ＷＢＣおよび百分率、血小板、ＰＴ、ＡＰＴＴ、ＴＴ。
【０３０８】
生化学：Ｎａ、Ｋ、クレアチニン、空腹時血糖、ＡＰ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＧＧＴ総タンパク質、アルブミン、ビリルビン、尿素、相補体。
【０３０９】
尿：比重、ｐＨ、タンパク質、糖、血液、ケトン類（１０ｓｇマルチスティックを使用する）。異常な試験紙結果が生じた場合は、尿を顕微鏡および培養検査に送った。
【０３１０】
結果
短期ＡＴＬ１１０２第Ｉ相試験において、４ｍｇ／Ｋｇおよび６ｍｇ／Ｋｇの複数回投与であっても、白血球のレベルの増加および赤血球または血小板に対する影響は見られなかった。
【０３１１】
実施例１０：健常なボランティア、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）患者、および多発性骨髄腫（ＭＭ）患者における幹細胞／前駆細胞動員
ＡＴＬ１１０２は、幹細胞／前駆細胞を放出するように、健常なボランティア、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）患者、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者に投与される。優れた動員を提供するために、単独で、Ｇ−ＣＳＦ作動薬と一緒に、Ｍｏｚｏｂｉｌ（登録商標）と一緒に、またはＧ−ＣＳＦ＋Ｍｏｚｏｂｉｌ（登録商標）もしくは他の動員治療と一緒に投与されてもよい。
【０３１２】
ＡＴＬ１１０２およびＧ−ＣＳＦ類似体Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）を使用して、幹細胞および／または前駆細胞を放出するための方法が以下に記載される。試験は、ＡＴＬ１１０２＋Ｇ−ＣＳＦが、ＣＤ３４＋造血幹細胞および／または前駆細胞の放出において、Ｇ−ＣＳＦ単独での動員よりも優れていることを示すように、対照とともに設計される。毎日Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（フィルガストリム）を投与する代わりに、ペグフィルグラスチム（ペグ化Ｇ−ＣＳＦ類似体、Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））長時間作用するＧ−ＣＳＦ−ペグを単回投与する。
【０３１３】
主な目的
ＡＴＬ１１０２＋Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）造血前駆細胞動員が、安全、効果的、かつＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）単独での動員よりも優れていることを示す。
【０３１４】
投与レジメン１：ＡＴＬ１１０２およびＧ−ＣＳＦ治療スケジュール
２つの対象群（１群当たり１０人）は、４、５、６、または７日間、または製造者によって推奨されるように、フィルグラストリム（Ｇ−ＣＳＦ類似体、作動薬Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））を毎日注射することにより治療される。Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）は、典型的に、５日目、および任意に、十分な幹細胞／前駆細胞が放出されない場合は、５、６、および７日目の最初のアフェレーシス手順前に、１０μｇ／ｋｇ／日を４日間毎日皮下注射される。
【０３１５】
ある群は、ＡＴＬ１１０２、ｈＶＬＡ−４アンチセンス化合物で追加治療される一方で、他の群は、生理食塩水を注射される。ｈＶＬＡ−４アンチセンス化合物は、１日当たり４ｍｇ／ｋＫｇの最終アンチセンス用量を得るように注射される。ｈＶＬＡ−４アンチセンス化合物は、計４、５、６、もしくは７回投与または最大許容用量で、４、５、６、もしくは７日間にわたって毎日注射される。最初のアフェレーシス手順は５日目であり、十分な幹細胞／前駆細胞が放出されない場合は、６日目および７日目にフォローアップアフェレーシスを行うが、アフェレーシスは、１４日目まで毎日行われてもよい。
【０３１６】
試験は、ＡＴＬ１１０２を含むＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）レジメンにおいて、１ｋｇ当たりの動員されたＣＤ３４＋幹細胞／前駆細胞の数、幹細胞／前駆細胞の目標数を回収するために必要なアフェレーシスの回数、生着に要する時間、および安全性を測定するように設計される。
【０３１７】
投与レジメン２：ＡＴＬ１１０２およびＧ−ＣＳＦ治療スケジュール
２つの対象群（１群当たり１０人）は、４、５、６、または７日間、または製造者によって推奨されるように、フィルグラストリム（Ｇ−ＣＳＦ類似体、作動薬Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））を毎日注射することにより治療される。Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）は、典型的に、５日目、および任意に、十分な幹細胞／前駆細胞が放出されない場合は、５、６、および７日目の最初のアフェレーシス手順前に、１０μｇ／ｋｇ／日を４日間毎日皮下注射される。
【０３１８】
ある群は、ＡＴＬ１１０２、ｈＶＬＡ−４アンチセンス化合物で追加治療される一方で、他の群は、生理食塩水を注射される。ｈＶＬＡ−４アンチセンス化合物は、１日当たり４または６ｍｇ／Ｋｇの最終アンチセンス用量を得るように注射される。ｈＶＬＡ−４アンチセンス化合物は、計３回の投与または最大許容用量で、１日おき（１、３、５日目）に注射される。最初のアフェレーシス手順は５日目であり、十分な幹細胞／前駆細胞が放出されない場合は、６日目および７日目にフォローアップアフェレーシスを行うが、アフェレーシスは、１４日目まで毎日行われてもよい。
【０３１９】
試験は、ＡＴＬ１１０２を含むＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）レジメンにおいて、１ｋｇ当たりの動員されたＣＤ３４＋幹細胞／前駆細胞の数、幹細胞／前駆細胞の目標数を回収するために必要なアフェレーシスの回数、生着に要する時間、および安全性を測定するように設計される。
【０３２０】
研究所試験
以下の試験を行うことができる。
・放出されるＣＤ３４＋幹細胞／前駆細胞の数および種に関する情報を得るために、様々な幹細胞／前駆細胞表面マーカーを用いて生細胞のフローサイトメトリー分析を行ってもよく、また他の表面マーカーを使用して、血中の白血球集団を評価してもよい。
・クローン形成分析を行って、多能性／寡能性ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、赤芽球（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球−単球（ＣＦＵ−ＧＭ）、および巨核球（ＣＦＵ−Ｍｋ）を含むクローン形成前駆細胞を明らかにする。末梢血細胞は、培養物上で決定される様々な因子およびコロニー形成単位とともに置かれる。
・マウスへの幹細胞生着：動員および回収されたヒト末梢血幹細胞／前駆細胞の生着能は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ／２ｍ−／−マウスモデルにおいて明らかにされ得る。
・ヒトへの幹細胞生着：動員および回収されたヒト末梢血幹細胞／前駆細胞の生着能は、高用量化学療法後の患者において明らかにされる。血小板回復および好中球回復の速度ならびに長期グラフト能が調査される。
・血液学を行って、血中の白血球、血小板、および赤血球集団を評価してもよい。
・Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）と併用されるＡＴＬ１１０２治療の安全性を評価して、深刻な有害事象に関連する任意の薬物が存在するか否かを明らかにする。
【０３２１】
結果
・有用性変数：２×１０６ＣＤ３４＋細胞／Ｋｇを達成したボランティアまたは患者の割合。例えば、ＮＨＬにおける４回以下のアフェレーシスにおいて、体重１Ｋｇ当たり５×１０６のＣＤ３４＋細胞を超える者の割合、および例えば、ＭＭにおける２回以下のアフェレーシスにおいて、体重１Ｋｇ当たり６×１０６のＣＤ３４＋細胞を超える者の割合。生着が促進され、耐久性があるか否かを評価する。
・安全性変数：リンパ腫動員を評価し、主要な毒性が検討される。
【０３２２】
上記試験は、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）単独と比較して、ＡＴＬ１１０２＋Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）を付与されるボランティアおよび患者が、移植に使用できる幹細胞および／または前駆細胞をより多く有することを示すことが期待される。
【０３２３】
上記試験は、移植に必要な幹細胞および／または前駆細胞の目標数を得るために必要なアフェレーシス回収の数を明らかにすることが期待される。
【０３２４】
これらの試験はまた、幹細胞および／または前駆細胞が、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）単独と比較して、ＡＴＬ１１０２＋Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）によって動員される患者において、再生着に要する日数も評価する。
【０３２５】
当業者であれば、広義に説明されるように、発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるように、多くの変型および／または修正を発明に行ってもよいことを理解するであろう。したがって、本実施形態は、あらゆる観点において、例示的であると見なされ、制限的ではない。
【０３２６】
本明細書で論考および／または参照されるすべての出版物は、それら全体が本明細書に組み込まれる。
【０３２７】
本明細書に含まれる文書、行為、物質、装置、物品、または同様物に関する任意の論考は、単に本発明に文脈を提供する目的である。これらの事項のいずれかまたはすべては、本出願の各請求項の優先日前に存在したために、先行技術の一部を形成することの承認として、または本発明に関連する分野における共通の一般的知識であるかのように見なされるものではない。
【０３２８】
【表８−１】
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【０３２９】
【表８−２】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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