(57)【要約】  本発明は、治療活性を有する大環状化合物、ならびに、骨プロセスを調節する方法、ならびに骨関連疾患、障害、およびその症状を治療する方法などの障害を治療する方法について説明する。【選択図】図１
2013526587.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉによる化合物、
【化１】
2013526587.tif 000010
（式中、
各Ｒは、独立して、Ｈまたは任意で置換されたアルキルであり、
各Ｒ１は、独立して、Ｈまたは任意で置換されたアルキルであり、
各Ｒ２は、独立して、Ｈ、任意で置換されたアルキル、またはＣ（Ｏ）Ｒであり、
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、任意で置換されたアルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、またはＣ（Ｏ）ＮＲＲであり、
各Ｒ４は、独立して、Ｈ、任意で置換されたアルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、またはＣ（Ｏ）ＮＲＲである）
および、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、または水和物。
【請求項２】
Ｒ３およびＲ４が、Ｈである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が、イソプロピルである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が、表Ａにおける化合物１〜８のうちのいずれかである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が、ラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２が、アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ２が、アルキルＣ（Ｏ）−である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
請求項１に記載の前記化合物、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項１記載の前記化合物が、化合物１〜８のうちのいずれかであり、および薬学的に許容可能な担体である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
さらなる治療剤をさらに含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記さらなる治療剤が、抗骨粗鬆症剤である、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
骨障害を患う、または影響を受けやすい対象に前記化合物を投与するための説明書とともに、単位剤形の、請求項１に記載の化合物の有効量を含むキット。
【請求項１３】
対象において破骨細胞活性の活性を調節する方法であって、前記対象において破骨細胞の活性を調節するのに十分な量および条件下で、請求項１に記載の化合物または請求項８に記載の医薬組成物と前記対象を接触させることを含む方法。
【請求項１４】
対象において骨芽細胞活性の活性を調節する方法であって、前記対象において骨芽細胞の活性を調節するのに十分な量および条件下で、請求項１に記載の化合物または請求項８に記載の医薬組成物と前記対象を接触させることを含む方法。
【請求項１５】
前記化合物が、アナボリック活性および抗骨吸収活性を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記調節が、阻害である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
骨障害もしくは疾患を患う、または影響を受けやすい対象を治療する方法であって、前記対象が、骨障害または疾患の治療を必要とするとして認定され、前記対象が前記障害の治療がされるよう、それを必要とする前記対象に請求項１に記載の化合物または請求項８に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の前記化合物が、化合物１〜８のうちの１つである、請求項１３または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記障害が、骨粗鬆症である、請求項１３または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記障害が、骨組織の再生である、請求項１３または１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記障害が、骨組織の設計である、請求項１３または１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が、哺乳類である、請求項１３または１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が、霊長類またはヒトである、請求項１３または１７に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の前記化合物の有効量が、約０．００５μｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲である、請求項１３または１７に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の前記化合物の前記有効量が、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の前記化合物の前記有効量が、約１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の前記化合物の有効量が、約１．０ｐＭ〜約５００ｎＭの範囲である、請求項１３または１７に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の前記化合物が、静脈内、筋肉内、皮下、脳室内、経口的、または局所的に投与される、請求項１３または１７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の前記化合物が、単独で、または１つまたはそれ以上のその他の治療薬と組み合わせて投与される、請求項１３または１７に記載の方法。
【請求項３０】
さらなる前記治療剤が、抗骨粗鬆症剤である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
対象における骨疾患を治療する方法であって、それを必要とする前記対象に、化合物１〜８のうちのいずれか、およびその薬学的に許容されるその塩の有効量を投与することを含む方法。
【請求項３２】
対象における骨形成、骨修復、または骨再生を誘導する方法であって、それを必要とする前記対象に、請求項１に記載の化合物の有効量を投与し、それによって前記骨形成、骨修復、または骨再生が、対象において発生することを含む方法。
【請求項３３】
対象における骨形成を刺激する、および骨吸収を抑制する方法であって、それを必要とする前記対象に、請求項１に記載の化合物の有効量を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１０年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／３４７、１０９号、および、２０１０年１０月２５日に提出された米国仮特許出願第６１／４０６、４１３号に対する利益および優先権を主張するものであり、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の下で行われた発明に対する権利の陳述
この研究は、ＮＯＡＡ、シーグラントオフィス、米国商務省認可番号ＮＡ０６ＯＡＲ４１７００１４によって部分的に支援された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する
【背景技術】
【０００３】
新しいファーマコフォアの同定は、最優先で生物医学的に重要であり、天然物は、近年この試みで注目を取り戻してきた１。この再興は、おそらく化学多様性２が付随する比類のない多様性他に類を見ない生物多様性を庇護する海洋環境の利用の成功と密接に結びついている。特に、海洋シアノバクテリアは、生物活性二次代謝産物を多産生産者であり３、その多くは、ドラスタチン１０４、キュラシンＡ５、アプラトキシン６などの、抗腫瘍活性の見込みのある修飾されたペプチドまたはペプチド−ポリケチド混成形である。フロリダ州のシアノバクテリアから導かれる新薬を同定するための継続的な調査の結果として、我々は、新規の化学骨格およびナノモル抗増殖活性を有する海洋シアノバクテリアの代謝物の構造決定および予備的な生物学的特性をここで報告する。これらの知見は、増殖性疾患および障害の治療において満たされていないニーズに対応するための新たな選択肢を提供する。本明細書中の化合物はまた、骨疾患／障害のプロセス（例えば、破骨細胞、骨芽細胞形成など）を媒介することが判明し、そのため、そのようなプロセスによって媒介される疾患、障害、またはその症状を治療するために有用である。これらの所見は、骨疾患および障害の治療における満たされていないニーズに対応するための新たな選択肢を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、大環状化合物、ならびに、本明細書中の化合物および組成物を使用することにより、破骨細胞または骨芽細胞形成の疾患および障害を含む、骨疾患および障害を治療する方法に関する。
【０００５】
本発明は、大環状化合物、骨を調節するプロセスにおける方法、ならびに、それらの骨関連疾患、障害、およびその症状の治療方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態において、本発明は、式Ｉ
【化１】
2013526587.tif 000003
に記載の化合物
（式中、
各Ｒは、独立して、Ｈまたは任意で置換されたアルキルであり、
各Ｒ１は、独立して、Ｈまたは任意で置換されたアルキルであり、
各Ｒ２は、独立して、Ｈ、任意で置換されたアルキル、またはＣ（Ｏ）Ｒであり、
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、任意で置換されたアルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＲまたは、Ｃ（Ｏ）ＮＲＲであり、
各Ｒ４は、独立して、Ｈ、任意で置換されたアルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＲまたは、Ｃ（Ｏ）ＮＲＲである）
および、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、または水和物を提供する。
【０００７】
さらに別の態様は、式Ｉａ（および、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、または水和物）の化合物（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は式Ｉで定義されている通りである）である。
【化２】
2013526587.tif 000004
【０００８】
その他の実施形態において、明細書中の任意の式の化合物を含む（式中、Ｒ３およびＲ４はＨである、Ｒ１はイソプロピルである、Ｒ２はアルキルである、Ｒ２はアルキルＣ（Ｏ）−である、Ｒ２はＨである、化合物は表Ａ中の化合物１−８のいずれかである、または、化合物はラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）である）。
【０００９】
特定の例において、本発明の化合物は、下記の構造を有する式（Ｉ）（式Ｉａを含む）から選択される。
【表１】
2013526587.tif 000005
【００１０】
別の態様において、本発明は、式Ｉの化合物および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
その他の態様において、本発明は、本明細書中の任意の式（例えば、式Ｉ、式Ｉａ）における化合物を対象に投与することを含む、対象における骨疾患、障害、またはその症状を治療する方法を提供する。別の態様において、化合物は、対象における骨疾患、障害、またはその症状を改善するのに十分な量および条件下で投与される。
【００１２】
その他の態様において、本発明は、破骨細胞形成の活性を調節するのに十分な量および条件下で、本明細書中の任意の式（例えば、式Ｉ、式Ｉａ）における化合物を被験に接触させることを含む、対象における破骨細胞形成の活性を調節する方法を提供する。別の態様において、調節は阻害である。
【００１３】
その他の態様において、本発明は、骨芽細胞形成の活性を調節するのに十分な量および条件下で、式Ｉの化合物と対象を接触させることを含む、対象において骨芽細胞形成の活性を調節する方法を提供する。
【００１４】
その他の態様において、本発明は、対象に式Ｉの化合物または医薬組成物の有効量を投与することを含む、骨関連障害もしくは疾患を患う、または影響を受けやすい対象を治療する方法を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、対象が破骨細胞関連障害または疾患の治療を必要とするとして認定され、前述の対象が前述の障害が治療されるよう、それを必要とする前述の対象に式Ｉの化合物または医薬組成物の有効量を投与することを含む、破骨細胞関連障害もしくは疾患を患う、または影響を受けやすい対象を治療する方法を提供する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、対象が破骨細胞関連障害または疾患の治療を必要とするとして特定され、前述の対象における細胞増殖が調節（例えば、下方制御）されるよう、それを必要とする前述の対象に式Ｉの化合物または医薬組成物の有効量を投与することを含む、破骨細胞関連障害もしくは疾患を患う、または影響を受けやすい対象を治療する方法を提供する。
【００１７】
特定の態様において、本発明は、骨粗しょう症、骨形成、骨吸収、骨再生、骨組織設計、骨折、歯周病、骨の成長障害を治療する方法を提供する。
【００１８】
従って、本明細書中の特定の化合物は、破骨細胞形成を阻害するのに有用である。別の態様において、本明細書中の特定のものは、特定の骨芽細胞形成を促進するのに有用である。別の態様において、本明細書中の特定の化合物は、それらの二重の活性（例えば、同化作用活性および骨吸収抑制活性）に対し有用である。
【００１９】
別の態様において、本明細書中の特定の化合物は、骨形成を刺激し、骨吸収を阻害するそれらの二重の活性に対し有用である。
【００２０】
別の態様において、本発明は、本明細書に示される化合物（例えば、式Ｉ）および薬学的に許容されるその塩の有効量を、前述の対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患、障害、または症状を治療する方法を提供する。上記方法は、本明細書に記載される骨関連障害の治療に有用である。
【００２１】
本明細書に示される方法は、対象が特定の記載された治療を必要とするとして認定される者を含む。上記治療を必要とする対象の認定は、対象または医療専門家の判断においてなされ得、および、主観的（例えば意見など）または客観的（例えば試験または診断法により測定可能など）であり得る。
【００２２】
本発明は、以下の非限定的な実施例の参照とともに、および、以下の図の参照とともに、以下にてさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】骨芽細胞の分化に対する化合物１（ＬＡ−１）および化合物８（ＬＡ−３）における活性を示す。図１Ａでは、骨芽細胞の分化に対する試験化合物（最大５００ｎＭ）の効果をＡＬＰ染色により評価した。図１Ｂでは、骨芽細胞の分化に対する試験化合物（最大５０ｎＭ）の効果を、ＡＬＰ染色により評価した。ＭＳ−２７５はポジティブコントロールとして用いた。図１Ｃでは細胞の生存率に対する試験化合物の効果を、図１ＤではＲＵＮＸ２活性に対する試験化合物の効果を、それぞれＣＣＫ−８アッセイおよび６ｘＯＳＥ２−ルシフェラーゼ活性アッセイにより評価した。
【図２】破骨細胞形成に対する化合物１（ＬＡ−１）および化合物８（ＬＡ−３）における活性を示す。図２Ａは、ＲＡＮＫＬ誘導性ＴＲＡＰ活性に対する試験化合物の効果である。図２Ｂは、ＲＡＮＫＬ誘導性ＴＲＡＰ陽性多核破骨細胞の形成に対する試験化合物の効果である。破骨細胞の分化に対する試験化合物の効果は、ＲＡＷ２６４．７細胞において評価した。ＲＡＷ２６４．７細胞を、１×１０３の密度で９６ウェルプレートに播種し、その後、連続的に希釈したＬＡの化合物を処理し、多核破骨細胞が顕微鏡下で観察されるまでインキュベートした。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
本発明がより容易に理解されるよう、まず特定の用語を便宜のためにここで定義する。
【００２５】
本明細書で使用されるように、障害を「治療する」という用語は、障害、および／または障害を引き起こし得る状態を予防、改善、軽減、および／または管理することを含む。用語「治療する」および「治療」は、疾患および／またはそれに付随する症状を緩和するまたは和らげる方法を指す。本発明による場合、「治療する」は、障害における影響を予防する、防止する、抑制する、弱める、防御する、調節する、逆戻りさせる、および、例えば、障害における有害な影響などの発生を低減させることを含む。
【００２６】
本明細書において用いられる場合、「抑制する」は、進行の予防、低減および停止含む。
【００２７】
用語「調節する」は、本発明の化合物への曝露に応答して、細胞の活性が増加するまたは減少することを指す。
【００２８】
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋」は、その本来の状態で見られる場合に通常それに付随する成分から実質的または本質的に自由である物質を指す。純度および均質性は、一般的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて同定される。特に、実施形態において、化合物は、少なくとも純度８５％、より好ましくは少なくとも純度９０％、より好ましくは少なくとも純度９５％、および、最も好ましくは少なくとも９９％純度である。
【００２９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すよう本明細書中にて互換的に使用される。用語は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、天然に存在するアミノ酸のポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸のポリマーだけでなく、天然に存在するアミノ酸対応する人工的な化学擬態である、アミノ酸のポリマーにも適用される。
【００３０】
「ペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸の配列である。ペプチドは、タンパク質を含む、長いアミノ酸配列だけでなく、短いものからもなることができる。
【００３１】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸、および合成アミノ酸、さらに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物も指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるものだけでなく、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンなどの、後に修飾されるアミノ酸ものもある。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合している炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどと同じ基本的な化学構造を有する化合物を指す。上記類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【００３２】
用語「タンパク質」は、隣接する残基のα−アミノ基およびカルボキシ基間のペプチド結合によって一方が他方に接続されたアミノ酸残基の一つながりを指す。
【００３３】
アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する、一般的に知られているそれらの３文字の記号、または、１文字記号のいずれかによって、本明細書中で指すことができる。
【００３４】
アミノ酸配列としては、当業者には、エンコードされた配列における単一アミノ酸または小さな割合のアミノ酸を、改変、追加、または削除する、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、「保存的に修飾された変異体」であることが理解されるであろう。ここで、改変は、化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす。機能的に類似のアミノ酸を提供する同類置換表は、当該分野において周知である。
【００３５】
ポリペプチド構造などの巨大分子構造は、組織の様々なレベルの観点から記載することができる。この組織における一般的な議論については、例えば、Alberts et al.、 Molecular Biology of the
Cell(3rd ed., 1994)、ならびに、Cantorn and Schimmel、 Biophysical Chemistry Part I. The Conformation of Biological
Macromolecules(1980)を参照されたい。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」は、ポリペプチド内で局所的に順序付けられた、三次元構造を指す。これらの構造は、一般的にドメインとして知られている。ドメインは、ポリペプチドの密なユニットを形成するポリペプチドの一部であり、一般的には５０〜３５０の長さのアミノ酸である。一般的なドメインは、βシートとαヘリックスによる一続きなどのより少ない組織の区分で構成される。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」は、独立した三次元ユニットの非共有結合によって形成される三次元構造を指す。異方性の観点からもエネルギー項として知られている。
【００３６】
用語「投与」または「投与する」は、それらの意図された機能を実行するために、被験体に化合物を導入する経路を含む。使用できる投与経路の例としては、注射（皮下、静脈内、経口、腹腔内、髄腔内）、局所、経口、吸入、直腸、および経皮が含まれる。
【００３７】
用語「有効量」は、必要な用量および期間で、所望の結果を達成するために有効な量を含む。化合物の有効量は、対象の疾患の状態、年齢、および体重、ならびに対象において所望の応答を誘発する化合物能などの要因によって異なり得る。投薬レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整することができる。有効量はまた、エラスターゼ阻害剤化合物の任意の毒性または有害な効果（例えば、副作用）より、治療上有益な効果が上回るものである。
【００３８】
本明細書で使用されるように、語句「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」、および「末梢に投与される」は、それが患者の身体に入り、それにより、代謝およびその他のプロセスのようなものに従うような、化合物（複数可）、薬物、または他の物質の投与を意味する。
【００３９】
用語「治療有効量」は、治療される状態または障害による症状の１つまたはそれ以上を、ある程度まで進行を予防するまたは軽減するために十分な投与される化合物の量を指す。
【００４０】
化合物の治療有効量（すなわち、有効投与量）は、体重に対して約０．００５μｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇとすることができ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇとすることができる。他の実施形態において、治療有効量は、約１．０ｐＭ〜約５００ｎＭとすることができる。当業者には、疾患または障害の重症度、以前の治療、被験体の一般的な健康および／または年齢、およびその他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の要因が、効果的に対象を治療するのに必要な投与量に影響を及ぼすことが理解されるであろう。さらに、化合物の治療有効量による対象の処置は、単一の治療を含むことができ、または、好ましくは、一連の治療を含むことができる。一例では、対象は、体重に対して約０．００５μｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲における化合物により、週に１回を約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、より一層好ましくは約４、５、または６週間治療される。治療に使用される化合物の有効投与量は、特定の一連の治療より増加するまたは減少し得ることがまた、理解されるであろう。
【００４１】
用語「キラル」は、鏡像相手に非重ね合わせである特性を有する分子を指し、一方、用語「アキラル」は、それらの鏡像相手に重ねることができる分子を指す。
【００４２】
用語「ジアステレオマー」は、２つまたはそれ以上の非対称の中心を備え、その分子が互いの鏡像ではない立体異性体を指す。
【００４３】
用語「エナンチオマー」は、互いに重ね合わせることができない鏡像である化合物の２つの立体異性体を指す。２つの鏡像異性体の等モル混合物は、「ラセミ混合物」または「ラセミ体」と呼ばれる。
【００４４】
用語「異性体」または「立体異性体」は、同一の化学的構成を有するが、空間中の原子または基の配置に関して異なる化合物を指す。
【００４５】
用語「プロドラッグ」は、ｉｎ  ｖｉｖｏで代謝することができる部分を有する化合物を含む。一般的に、プロドラッグは、薬物を活性させるため、エステラーゼにより、またはその他のメカニズムにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで代謝される。プロドラッグおよびその使用方法の例は、当技術分野においては周知である（例えば、Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci.
66:1-19を参照）。プロドラッグは、化合物の最終的な単離および精製中に、または、その遊離酸の形態での精製化合物もしくは水酸基を適切なエステル化剤と個別に反応させることによって、原位置において、調製することができる。水酸基は、カルボン酸による処理を介してエステルへと変換することができる。プロドラッグ部分の例としては、置換ならびに非置換の、分岐鎖または非分枝鎖の、低級アルキルエステル部分（例えば、プロピオン酸エステル）、低級アルケニルエステル、ジ低級アルキルアミノ低級アルキルエステル（例えば、ジメチルアミノエチルエステル）、アシルアミノ低級アルキルエステル（例えば、アセチルオキシメチルエステル）、アシルオキシ低級アルキルエステル（例えば、ピバロイルオキシメチルエステル）、アリールエステル（フェニルエステル）、アリール低級アルキルエステル（例えば、ベンジルエステル）、（例えば、メチル、ハロ、またはメトキシ置換基による）置換、アリールおよびアリール低級アルキルエステル、アミド、低級アルキルアミド、ジ低級アルキルアミド、ならびにヒドロキシアミドがあげられる。好ましいプロドラッグ部分は、プロピオン酸エステルおよびアシルエステルである。ｉｎ  ｖｉｖｏでのその他のメカニズムを介して活性型に変換されるプロドラッグも含まれる。態様において、本発明の化合物は、本明細書中の任意の式のプロドラッグである。
【００４６】
用語「対象」は、これらに限定されないが、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含む、哺乳動物などの動物を指す。特定の実施形態において、対象はヒトである。
【００４７】
さらに、本発明の化合物は、以下のいずれかの形状を有するオレフィン類を含み、「Ｚ」は「シス」（同じ側）の立体配座と呼ばれるものを指し、一方「Ｅ」は「トランス」（反対側）の立体配座と呼ばれるものを指す。キラル中心における学名に関して、用語「ｄ」および「ｌ」の構成は、ＩＵＰＡＣ勧告によって定義されている。用語ジアステレオマー、ラセミ体、エピマー、および鏡像異性体の使用に関して、これらは、調製物の立体化学を記述するため、通常の文脈において使用される。
【００４８】
本明細書において用いられる場合、用語「アルキル」は、１〜１２個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖炭化水素基を指す。用語「低級アルキル」は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル鎖を指す。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル基、およびｎ−ペンチル基が挙げられる。アルキル基は、任意で１つまたはそれ以上の置換基で置換することができる。
【００４９】
用語「アルケニル」は、２〜１２個の炭素原子および少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む、直鎖または分枝鎖であり得る不飽和炭化水素鎖を指す。アルケニル基は、任意で１つまたはそれ以上の置換基で置換されてもよい。
【００５０】
用語「アルキニル」は、２〜１２個の炭素原子および少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含む、直鎖または分枝鎖であり得る不飽和炭化水素鎖を指す。アルキニル基は、任意で１つまたはそれ以上の置換基で置換されてもよい。
【００５１】
アルケニル基およびアルキニル基のｓｐ２またはｓｐ炭素は、それぞれ、任意でアルケニル基またはアルキニル基の結合点であり得る。
【００５２】
用語「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル基を指す。
【００５３】
本明細書で使用されるように、用語「ハロゲン」、「ｈａｌ」、または「ｈａｌｏ」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉを意味する。
【００５４】
用語「シクロアルキル」は、３〜８員環の単環系、または少なくとも１つの飽和環もしくは少なくとも一つの非芳香環を有する７〜１４員環の二環系炭化水素を指し、非芳香環は、不飽和をある程度有することができる。シクロアルキル基は、任意で１つまたはそれ以上の置換基で置換することができる。一実施形態において、シクロアルキル基の各環の０、１、２、３、または４個の原子は、置換基により置換することができる。シクロアルキル基の代表例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロブチル、シクロヘプチル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、などが挙げられる。
【００５５】
用語「アリール」は、単環、二環または三環系芳香族炭化水素を指す。アリール基は、任意で１つまたはそれ以上の置換基で置換することができる。一実施形態において、アリール基の各環の０、１、２、３、４、５、または６個の原子は、置換基により置換することができる。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フルオレニル、インデニル、アズレニル、などが挙げられる。
【００５６】
用語「ヘテロアリール」は、単環の場合１〜４環のヘテロ原子を、二環の場合１〜６環のヘテロ原子を、三環の場合１〜９環のヘテロ原子を有し、前述のヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され、剰余環の原子が（特に断らない限り、適切な水素原子を有する）炭素である、５〜８員環の単環系、８〜１２員環の二環系、または１１〜１４員環の三環系芳香族を指す。ヘテロアリール基は、任意で１つまたはそれ以上の置換基で置換することができる。一実施形態において、ヘテロアリール基の各環の０、１、２、３、または４個の原子は、置換基により置換することができる。ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、フラニル、チエニル、ピロリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、キノリニル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、イソキノリニル、インダゾリル、などが挙げられる。
【００５７】
用語「ヘテロシクロアルキル」は、単環の場合１〜３環のヘテロ原子を、二環の場合１〜６環のヘテロ原子を、三環の場合１〜９環のヘテロ原子を含み、前述のヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｂ、Ｐ、またはＳｉから選択され、非芳香族環系は完全に飽和している、３〜８員環の単環系、７〜１２員環の二環系、または１０〜１４員環の三環系非芳香族を指す。ヘテロシクロアルキル基は、任意で１つまたはそれ以上の置換基で置換することができる。一実施形態において、ヘテロシクロアルキル基の各環の０、１、２、３、または４個の原子は、置換基で置換することができる。代表的なヘテロシクロアルキル基は、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、チイレニル（ｔｈｉｉｒｅｎｙｌ）、などが挙げられる。
【００５８】
用語「アルキルアミノ」は、１つまたは２つのアルキル基でさらに置換されたアミノ置換基を指す。用語「アミノアルキル」は、１つまたはそれ以上のアミノ基でさらに置換されたアルキル置換基を指す。用語「ヒドロキシアルキル」または「ヒドロキシルアルキル」は、１つまたはそれ以上のヒドロキシル基でさらに置換されたアルキル置換基を指す。アルキルアミノ、アミノアルキル、メルカプトアルキル、ヒドロキシアルキル、メルカプトアルコキシ、スルホニルアルキル、スルホニルアリール、アルキルカルボニル、およびアルキルカルボニルアルキルのアルキルまたはアリール部分は、任意で１つまたはそれ以上の置換基により置換することができる。
【００５９】
本明細書中の方法において有用な酸および塩基は、当技術分野で既知である。酸触媒は、天然において無機（例えば、塩酸、硫酸、硝酸、塩化アルミニウム）、または有機（例えば、カンファースルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、イッテルビウムトリフレート）であり得る、任意の酸性の化学物質である。酸は、化学反応を促進するため、触媒または化学量論量のいずれにおいても有用である。塩基は、天然において無機（例えば、重炭酸ナトリウム、水酸化カリウム）、または有機（例えば、トリエチルアミン、ピリジン）であり得る、任意の塩基性の化学物質である。塩基は、化学反応を促進する触媒または化学量論量のいずれにおいても有用である。
【００６０】
アルキル化剤としては、問題となる官能基（例えば、アルコールの酸素原子、アミノ基の窒素原子）のアルキル化をもたらすことが可能な任意の試薬である。アルキル化剤は、本明細書に引用した文献を含む、当該技術分野において既知であり、ハロゲン化アルキル（例えば、ヨウ化メチル、臭化ベンジル、または塩化ベンジル）、アルキル硫酸塩（例えば、硫酸メチル）、または当該技術分野において既知のその他のアルキル基の脱離基の組み合わせを含む。脱離基は、反応（例えば、脱離反応、置換反応）中に分子から切り離すことができ、本明細書に引用した文献を含む、当該技術分野において既知である、任意の安定した種類のものであり、ハロゲン化物（例えば、Ｉ−、Ｃｌ、Ｂｒ−、Ｆ−）、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、−ＯＭｅ、−Ｏ−ｔ−Ｂｕ）、アシルオキシアニオン（例えば、−ＯＡｃ、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３）、スルホン酸塩（例えば、メシル、トシル）、アセトアミド（例えば、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｍｅ）で、カルバメート（例えば、Ｎ（Ｍｅ）Ｃ（Ｏ）Ｏｔ−Ｂｕ）、ホスホン酸塩（例えば、−ＯＰ（０）（ＯＥｔ）２）、水またはアルコール（プロトン性の状態）などがあげられる。
【００６１】
特定の実施形態において、（例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール基、ヘテロアラルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基などの）任意の基上の置換基は、その基の任意の原子であり得、（例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール基、ヘテロアラルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基などの）置換することができる任意の基は、それぞれ水素原子を置換する、（同一または異なっていてもよい）１つまたはそれ以上の置換基で、任意で置換することができる。適切な置換基の例としては、これらに限定されるものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ハロアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、アリール、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、オキソ（すなわち、カルボニル）、カルボキシル、ホルミル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールオキシカルボニル、チオ、メルカプト、メルカプトアルキル、アリールスルホニル、アミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アルキルアミノカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アルキルカルボニル、またはアリールアミノで置換されたアリール、アリールアルキルアミノ、アラルキルアミノカルボニル、アミド、アルキルアミノ、スルホニル、アリールアミノスルホニル、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、イミノ、カルバミド、カルバミル、チオウレイド、チオシアナート、スルホアミド、スルホニルアリール、またはメルカプトアルコキシ、などがあげられる。
【００６２】
本発明の化合物
本発明の化合物は、有機合成の分野において既知の手段により作成することができる。必要に応じて副産物の競合を最小限に抑え、反応条件を最適化するための方法は、当該技術分野で既知である。反応の最適化およびスケールアップは、有利には、高速パラレル合成装置およびコンピュータ制御マイクロリアクターを利用することができる（例えば、Design And Optimization in Organic Synthesis, 2nd Edition, Carlson
R, Ed, 2005; Elsevier Science Ltd.; Jahnisch, K et al, Angew. Chem. Int. Ed.
Engl. 2004 43: 406;および本明細書中の参考文献）。さらなる反応スキームおよびプロトコルを、市販の構造検索データベースソフトウェア、例えば、ＳｃｉＦｉｎｄｅｒ（登録商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＳｏｃｉｅｔｙのＣＡＳの部門）、およびＣｒｏｓｓＦｉｒｅ  Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ（登録商標）（エルゼビアＭＤＬ）の使用による熟練した掘り抜き（ａｒｔｅｓｉａｎ）により、または例えばＧｏｏｇｌｅ（登録商標）などのインターネット検索エンジン、もしくは米国特許商標庁テキストデータベースなどのキーワードデータベースを使用して適切なキーワード検索により、決定することができる。
【００６３】
本明細書中の化合物はまた、結合（例えば、炭素−炭素結合）を含むことができ、結合の回転は、例えば、環または二重結合の存在に由来する制限などの、その特定の結合などについて制限される。従って、全てのシス／トランスおよびＥ／Ｚ異性体は、明らかに本発明に含まれる。本明細書中の化合物はまた、複数の互変異性型で表すことができ、そのような例において、単一の互変異性型のみが表されていても、本発明は、本明細書に記載される化合物のすべての互変異性型を明らかに含むといえる。本明細書中のそのような化合物の全てのこのような異性体形態は、明らかに本発明に含まれる。本明細書中に記載される化合物のすべての結晶形および多形は、明らかに本発明に含まれる。また、本発明の化合物を含む抽出物および画分が具現化される。異性体という用語は、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、位置異性体、構造異性体、回転異性体、互変異性体などが挙げられることを意図する。１つまたはそれ以上の立体中心、例えば、キラル化合物を含む化合物について、本発明の方法は、鏡像異性的に富む化合物、ラセミ体、またはジアステレオマーの混合物を用いて行うことができる。
【００６４】
好ましい鏡像異性的に富む化合物が５０％以上の鏡像体過剰率を有し、より好ましくは、化合物は、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％以上の鏡像体過剰率を有する。好ましい実施形態において、本発明のキラル化合物の一方のエナンチオマーまたはジアステレオマーのみが、細胞または対象に投与される。
【００６５】
治療方法
本発明は、大環状化合物、ならびに本明細書中に記載されるそれらの化合物または組成物を用いた疾患および障害を治療する方法に関する。
【００６６】
その他の態様において、本発明は、対象が骨障害または疾患の治療を必要とするとして認定されており、前述の対象が前述の障害を治療するように、それを必要とする前述の対象に、式Ｉの化合物または医薬組成物の有効量を投与することを含む、骨障害もしくは疾患を患う、または影響を受けやすい対象を治療する方法を提供する。このような治療を必要とする被験体を認定することは、対象または医療専門家の判断ですることができ、主観的（例えば、意見）または客観的（例えば、試験または診断法により測定可能など）であり得る。
【００６７】
一態様において、本発明は、破骨細胞活性を調節するために十分な量および条件下で、式Ｉの化合物を対象に接触させることを含む、破骨細胞活性を調節する方法を提供する。
【００６８】
一実施形態において、調節は阻害である。
【００６９】
別の態様において、本発明は、式Ｉの化合物または医薬組成物の有効量を被験体に投与することを含む、または破骨細胞関連障害もしくは疾患を患う、もしくは影響を受けやすい対象を治療する方法を提供する。
【００７０】
その他の態様において、本発明は、対象が破骨細胞媒介障害または疾患の治療が必要として認定され、前述の対象が前述の障害を治療するように、それを必要とする前述の対象に、式Ｉの化合物または医薬組成物の有効量を投与することを含む、破骨細胞媒介障害もしくは疾患を患う、または影響を受けやすい対象を治療する方法を提供する。
【００７１】
その他の態様において、本発明は、対象が骨芽細胞媒介障害または疾患の治療が必要として認定され、前述の対象が前述の障害を治療するように、それを必要とする前述の対象に、式Ｉの化合物または医薬組成物の有効量を投与することを含む、骨芽細胞媒介障害もしくは疾患を患う、または影響を受けやすい対象を治療する方法を提供する。
【００７２】
特定の実施形態において、本発明は、式Ｉの化合物がラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）である、上記に記載されるような方法を提供する。
【００７３】
特定の実施形態において、本発明は、障害が骨粗しょう症、骨組織工学、骨組織再生、または他の骨障害である、障害を治療する方法を提供する。本明細書中の化合物および方法は、対象の骨形成、骨の修復、および骨再生に有用である。
【００７４】
特定の実施形態において、対象は哺乳動物、好ましくは霊長類またはヒトである。
【００７５】
別の実施形態において、本発明は、上記に記載される方法を提供し、式Ｉの化合物の有効量は、約０．００５μｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。特定の実施態様において、式Ｉの化合物の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。さらなる実施形態において、式Ｉの化合物の有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【００７６】
その他の実施形態において、本発明は、上記に記載される方法を提供し、式Ｉの化合物の有効量は、約１．０ｐＭ〜約５００ｎＭの範囲である。特定の実施態様において、有効量は、約１０．０ｐＭ〜約１０００ｐＭの範囲である。別の実施形態において、有効量は、約１．０ｎＭ〜約１０ｎＭの範囲である。
【００７７】
別の実施形態において、本発明は、上記に記載される方法を提供し、式Ｉの化合物は、静脈内、筋肉内、皮下、脳室内、経口的、または局所的に投与される。
【００７８】
その他の実施形態において、本発明は、上記に記載される方法を提供し、式Ｉの化合物は、単独で、または１つまたはそれ以上のその他の治療薬と組み合わせて投与される。さらなる実施形態において、さらなる治療薬は、抗骨粗鬆症剤、骨吸収に関連する疾患の治療剤、骨折治癒剤、骨形成剤である。
【００７９】
本発明の別の目的は、骨障害または疾患の治療における使用のための薬剤の製造において、本明細書中に記載される（例えば、本明細書中の任意の式の）化合物を使用することである。本発明の別の目的は、骨障害または疾患の治療に使用するための、本明細書に記載される（例えば、明細書中の任意の式の）化合物の使用である。
【００８０】
医薬組成物
一態様において、本発明は、式Ｉの化合物および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【００８１】
一態様において、本発明は、式Ｉの化合物がラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）である医薬組成物、および薬学的に許容される担体を提供する。
【００８２】
別の実施形態において、本発明は、さらなる治療剤をさらに含む医薬組成物を提供する。さらなる実施形態において、さらなる治療剤は、抗骨粗鬆症剤である。
【００８３】
一態様において、本発明は、破骨細胞媒介性障害、または骨芽細胞媒介性障害を含む、骨疾患もしくは障害を患う、または影響を受けやすい対象に化合物を投与するための説明書とともに、単位剤形で、式Ｉの化合物の有効量を含むキットを提供する。
【００８４】
一態様において、本発明は、破骨細胞媒介性障害、または骨芽細胞媒介性障害を含む、骨疾患もしくは障害を患う、または影響を受けやすい対象に化合物を投与するための説明書とともに、単位剤形で、式Ｉの化合物の有効量を含むキットを提供する。
【００８５】
用語「薬学的に許容される塩」または「薬学的に許容される担体」は、本明細書中に記載される化合物に見られる特定の置換基に応じて、比較的無毒の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含むことを意味する。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含む場合、塩基付加塩は、ニート、または適当な不活性溶媒中のいずれかで、十分な量の所望の塩基と上記化合物の中性形を接触させることによって得ることができる。薬学的に許容可能な塩基付加塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミノ塩、もしくはマグネシウム塩、または類似の塩が挙げられる。本発明の化合物が、比較的塩基的な官能基を含む場合、酸付加塩は、ニート、または適当な不活性溶媒中のいずれかで、十分な量の所望の酸と上記化合物の中性形を接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例としては、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フタル酸、乳酸、マンデル酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、などの比較的無毒の有機酸由来の塩に加え、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸一水素（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｃａｒｂｏｎｉｃ）、リン酸、リン酸一水素（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ）、リン酸二水素（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ）、硫酸、硫酸一水素（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｕｒｉｃ）、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などの無機酸から由来するものが挙げられる。また、アルギン酸などのアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸などのような有機酸の塩も含まれる（例えば、Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19 (1977)参照）。本発明のある特定の化合物は、化合物が塩基または酸付加塩のいずれかに変換することができるよう、塩基性および酸性の両方の官能基を含む。当業者に既知のその他の薬学的に許容可能な担体が、本発明に適する。
【００８６】
化合物の中性形は、塩基または酸と塩を接触させ、ならびに従来の方法で親化合物を単離することによって再生することができる。化合物の親の形態は、極性溶媒における溶解度などの特定の物理的特性において種々の塩の形態とは異なるが、それ以外の塩は、本発明の目的に対する化合物における親の形態と同等である。
【００８７】
塩の形態に加えて、本発明はプロドラッグの形態である化合物を提供する。本明細書に記載の化合物のプロドラッグは、本発明の化合物を提供することで、生理的条件下で化学変化を容易に受ける化合物である。さらに、プロドラッグは、ｅｘ  ｖｉｖｏ環境において化学的または生化学的方法によって、本発明の化合物に変換することができる。例えば、プロドラッグは、適切な酵素または化学試薬と共に経皮パッチリザーバーに入れることで、本発明の化合物へとゆっくりと変換することができる。
【００８８】
本発明の特定の化合物は、水和形態を含む、溶媒和形態だけでなく非溶媒和形態においても存在することができる。一般に、溶媒和形態は、非溶媒和形態と同等であり、本発明の範囲内に包含されることが意図される。本発明の特定の化合物は、複数の結晶または非晶質形態で存在することができる。一般に、すべての物理的形態は、本発明によって企図される用途対して同意義であり、本発明の範囲内であることを意図する。
【００８９】
本発明はまた、本明細書中に記載の化合物の有効量および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。実施形態において、化合物が、例えば、薬学的に許容される製剤が対象に投与された後、少なくとも１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、１週間、２週間、３週間、４週間、対象に化合物の持続的な配送を提供する薬学的に許容可能な製剤などの、薬学的に許容可能な製剤を用いて対象に投与される。
【００９０】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルおよび投与の時間経過は、患者への毒性（または許容できない毒性）なくして、特定の患者、組成、および投与方法に対する所望の治療応答を達成するために有効な活性成分量を得るために変化させることができる。
【００９１】
使用において、本発明による少なくとも１つの化合物は、静脈内、筋肉内、皮下、もしくは脳室内注射により、または、経口投与、もしくは局所適用により、医薬担体においてそれを必要とする対象に薬学的に有効な量で投与される。本発明によれば、本発明の化合物は、単独で、または第二の異なる治療薬と合わせて投与することができる。「と合わせる」ことによりとは、実質的に同時に、または連続して一緒であることを意味する。一実施形態において、本発明の化合物は、急性投与される。したがって、本発明の化合物は、約１日〜約１週間などの、短期の一連の治療に対して投与することができる。別の実施形態において、本発明の化合物は、治療すべき症状に応じて、例えば、約１週間〜数ヶ月間などの慢性疾患を改善するために、より長い期間にわたって投与することができる。
【００９２】
本明細書で使用される「薬学的有効量」によりとは、健全な医学的判断の範囲内で、治療すべき症状を非常に積極的に修正するのに十分に多いが重篤な副作用防ぐのに十分に少ない（合理的な利益／リスク比である）、本発明の化合物量を意味する。本発明の化合物の薬学的有効量は、達成すべき特定の目標、治療を受けている患者の年齢および体調、基礎疾患の重症度、治療期間、併用療法の性質、ならびに用いられる特定の有機亜鉛化合物により異なるであろう。例えば、子供や新生児に投与される本発明の化合物の治療有効量は、健全な医学的判断に従って比例して低減される。したがって、本発明の化合物の有効量は、所望の効果を提供する最小量であろう。
【００９３】
本発明の明らかに実用的な利点は、化合物が、クリームまたはゲルなどにおいて、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、口腔内、もしくは脳室注入経路により、または局所適用により、便利な方法で投与することができることである。投与経路に応じて、本発明の化合物を含む活性成分は、化合物を不活性化し得る、酵素、酸、およびその他の自然条件の作用から化合物を保護する物質で被覆することが必要となり得る。非経口投与以外により本発明の化合物を投与するために、化合物は、不活性化を防止する物質により被覆される、または共に投与することができる。
【００９４】
化合物は、非経口または腹腔内投与をすることができる。分散体はまた、例えば、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物などの油中で、調製することができる。
【００９５】
注射用に適した薬学的形態として、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための、電子滅菌水溶液（水溶性）または分散液、および滅菌粉末を含む。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動的でなければならない。それは、製造および貯蔵の状態下で安定でなければならない。担体としては、例えば、水、ＤＭＳＯ、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、維持することができる。多くの場合、例えば、糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長期吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を組成物中に使用することによってもたらすことができる。
【００９６】
滅菌注射用溶液は、濾過滅菌した後、必要に応じて、上記に列挙した様々なその他の成分と共に適切な溶媒中に必要な量の本発明の化合物を組み込むことによって調製される。一般的に、分散液は、塩基分散媒および上記に列挙したものから必要とされるその他の成分を含む滅菌ビヒクル中に種々の滅菌物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥し、その予め濾過滅菌した溶液からの任意のさらなる所望の成分を加えた活性成分の粉末を得る凍結乾燥技術である。
【００９７】
経口治療投与の場合、化合物は、賦形剤に組み込むことができ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハーなどの形態で使用することができる。本発明に係る組成物または製剤は、経口投与単位形態は、被験体における生涯を治療するのに十分な化合物の濃度を含むように調製される。
【００９８】
医薬担体として機能することができる物質のいくつかの例は、例えば、ビタミンＣ、エストロゲン、およびエキナセアなどの医薬製剤に使用されるその他の非毒性適合性物だけでなく、乳糖、ブドウ糖、およびショ糖などの糖、トウモロコシデンプン、およびジャガイモデンプンなどのデンプン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースならびにその誘導体、粉末トラガント、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、およびカカオの油などの植物油、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール類、寒天、アルギン酸類、パイロジェンフリー水、生理食塩水等張、ならびにリン酸緩衝液、脱脂粉乳である。着色剤、香料、潤滑剤、賦形剤、錠剤化剤、安定剤、抗酸化剤、および防腐剤だけでなく、ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤および潤滑剤もまた存在することができる。
【００９９】
本明細書中の任意の変化するものの定義における化学基の一覧の列挙は、任意の単独の基または記載された基の組み合わせとして、その変化するものの定義を含む。本明細書中の変数に対する実施例の列挙は、任意の単独の実施形態として、またはそれらの任意のその他の実施形態または一部の組み合わせとして、その実施例を含む。
【０１００】
実施例
以下、本発明を、限定するものとして解釈されるべきではない特定の例を用いて実証する。
【０１０１】
一般的な実験手順
１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータを、それぞれ６００および１５０ＭＨｚで動作する５ｍｍのプローブによりＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ６００ＭＨｚ分光計で取得した。２Ｄ  ＮＭＲデータは、内部標準として残留溶媒シグナル（δＨ  ７．２６ｐｐｍ、δＣ  ７７．０ｐｐｍ）を使用して、低温プローブを超伝導させる高温１ｍｍ三重共鳴を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩ  ６００ＭＨｚ上で記録した。ＨＳＱＣ実験を１ＪＣＨ＝１４５Ｈｚに、ＨＭＢＣ実験をｎＪＣＨ＝７または３．５Ｈｚに最適化した。ＬＣ−ＭＳデータは、ＥＳＩ（ポジティブモード）によるＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００を使用して得た。ＨＲＭＳデータを、ＥＳＩ／ＡＰＣＩマルチモードイオン源検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ−ＴＯＦ質量分析計を使用して得た。
【０１０２】
実施例１：化合物１物理化学的データ
ラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）（１）：無色、アモルファス固体；［α］２０Ｄ＋２２（ｃ０．１、ＭｅＯＨ）；ＵＶ（ＭｅＯＨ）（ｌｏｇ  ｅ）２１０（４．０７）、２６０（ｓｈ）（３．６１）；ＩＲ（ｆｉｌｍ）ｖｍａｘ２９２４、２８５３、１７２５、１６９４、１６１１、１６５９、１６４１、１６３０、１５９６、１５１２、１２４９、１１１７、１０６７、１０３４、８９４ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲ、およびＨＭＢＣデータ、表を参照；ＨＲ−ＥＳＩ／ＡＰＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋６２３．２３９７（Ｃ２９Ｈ４３Ｎ４Ｏ５Ｓ３  ６２３．２３９６に対する計算値）
【表２】
2013526587.tif 000006
【０１０３】
実施例２：骨芽細胞の分化
試験化合物のアナボリック活性は、骨芽細胞分化のマーカーの１つであるＡＬＰ染色によって行った。図１ＡおよびＢに示すように、試験化合物の低用量は、ＢＭＰ−２の存在下でもＡＬＰの発現を誘導した。最大５０ｎＭまで、これらの化合物は、有意な細胞毒性は示されなかった（図１Ｃ）。興味深いことに、化合物１は、骨芽細胞における間葉系幹細胞のコミットメントにおいて重要な調節因子であるＲＵＮＸ２の活性を強力に誘導した（図１Ｄ）。最も重要なことには、化合物１は、ｉｎ  ｖｉｖｏの骨再生モデルでの活性を形成する骨同化作用を示した（図２）。化合物１および８は、破骨細胞形成を阻害する可能性を有する。
【０１０４】
実施例３：骨再生
すべてのウサギを、０．１ｍｌ／ｋｇ  Ｚｏｌｅｔｉｌ（ビルバック社、フランス）の筋肉内投与で麻酔にかける。頭の毛を剃り、皮膚の表面を実施前にポビドンヨード液で消毒する。頭蓋冠の骨を、長さ〜４ｃｍの皮膚切開により露出させる。４つの同様な円形のバイコーティカルな穴（３ｍｍ径）を、０．９％生理食塩水灌漑を適用して、低速電動ハンドピースにおけるトレパンを使用し、頭頂骨に作成する。穴を、１０ｍｇの骨補填材（５０μｌのＰＢＳまたはＬＡ−１に浸したＭＢＣＰ（Ｂｉｏｍａｔｌａｎｔｅ社、フランス））で充填する。骨膜および皮下組織の閉鎖を、ｌａｃｔｏｍｅｒ（Ｓｙｎｅｔｕｒｅ社）で行い、一方、皮膚を、ｎｙｌｏｎ：ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（Ｓｙｎｅｔｕｒｅ社）で再配置する。術後の抗生物質、例えばゲンタマイシンなどを投与する。ウサギを、手術後４週目に屠殺する。
【０１０５】
実施例４：破骨細胞／骨芽細胞分化
破骨細胞／骨芽細胞分化プロトコルは、当該技術分野で既知である。本明細書中の化合物を評価するのに適用可能な代表的な例として、Kim JM, Lee SU, Kim YS, Min YK, Kim SH. Baicalein stimulates
osteoblast differentiation via coordinating activation of MAP kinases and
transcription factors. J Cell Biochem. 2008 Aug 1;104(5): 1906-17、Kim MH, Ryu SY, Bae MA, Choi JS, Min YK, Kim SH. Baicalein inhibits
osteoclast differentiation and induces mature osteoclast apoptosis. Food Chem
Toxicol. 2008 Nov;46(l l):3375-82.が挙げられる。
【０１０６】
実施例５：アルカリホスファターゼ染色および活性アッセイ
Ｃ２Ｃ１２細胞を、９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルで播種し、１日インキュベートした後、５％ＦＢＳおよびラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）を含む培地を交換した。培地は３日ごとに交換し、分化６日目に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３０秒間１０％ホルマリンＰＢＳ中におき、脱イオン水ですすぎ、直接光からの保護の下でアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）キット（Ｓｉｇｍａ社）を使用して染色した。染色された細胞の画像は、ＤＰ７０デジタルカメラ（オリンパス光学工業、日本）を備えた顕微鏡下で取得した。ＡＬＰ活性を測定するために、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２の、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で超音波処理した。４℃で２０分間１０，０００×ｇで遠心分離した後、上清中のＡＬＰ活性を、ＬａｂＡｓｓａｙ  ＡＬＰキット（和光純薬工業）を使用して、三連で測定した。タンパク質濃度は、ＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定した。有意差は、スチューデントｔ−検定により決定し、Ｐ＜０．０５の場合、差が有意であるとみなした。
【０１０７】
実施例６：ｍＲＮＡ発現レベルの評価
プライマーは、オンラインプライマー設計プログラム（表１）を使用して設計した。（S.
Rozen, H. J. Skaletsky, Methods Mol. Biol. 2000, 132, 365-386.）総ＲＮＡを、メーカーのプロトコルに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＭＤ）を使用して単離した。総ＲＮＡの濃度と純度は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより算出した。第一鎖ｃＤＮＡは、２μｇの総ＲＮＡ、ならびに１μΜのオリゴｄＴ１８プライマーおよびＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州）を使用して合成した。ＳＹＢＲグリーンベースの定量ＰＣＲは、メーカーのプロトコルに従って、の１：５０に希釈されたプライマーの第一鎖ｃＤＮＡ３μｌ、およびプライマー２０ｐｍｏｌにより、ストラタＭｘ３０００ＰリアルタイムＰＣＲシステム、およびブリリアントのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州）を使用して行った。ＰＣＲ反応を、３つのセグメントで構成した。第一セグメント（１０分間、９５℃）では、ポリメラーゼを活性化し、第二セグメントでは、９４℃で４０秒間（変性）、６０℃で４０秒間（アニーリング）、および７２℃で１分間（伸長）の３ステップの繰り返し（４０サイクル）を含み、第三セグメントでは、９５℃で１分間、５５℃で３０秒間、９５℃で３０秒間、ＰＣＲ産物温度解離曲線（「融解曲線」）の生成を行った。全ての反応を三連で実行し、データを、２−ΔΔＣＴ法（K. J. Livak, T. D. Schmittgen, Methods 2001, 25, 402-408.）によって分析した。ＧＡＰＤＨを対照の遺伝子として使用した。有意差は、ＧＡＰＤＨ正規化２−△△ＣＴ値のスチューデントのｔ−検定によって決定した。Ｐ＜０．０５の場合、差が有意であるとみなした。
【０１０８】
ＢＭＰのｍＲＮＡ発現レベルでラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）の効果を評価した。予想されたように、ラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）は、ラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）の骨形成活性がＲｕｎｘ２およびＢＭＰの発現および／または活性の増加を介して媒介されることを確認し、ＢＭＰ−２、４、６、７、および９の発現を顕著に誘導した。したがって、ＢＭＰの発現またはＢＭＰ−シグナル伝達経路を刺激するラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）などの同化剤は、骨の形成または再生によって骨芽細胞関連疾患の治療のために有用であろう。したがって、ラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）の骨形成活性は、ＢＭＰの発現／活性を増加させるその可能性から（少なくとも部分的に）もたらされる可能性がある。
【表３】
2013526587.tif 000007
【表４】
2013526587.tif 000008
【０１０９】
実施例７：Ｒｕｎｘ２のルシフェラーゼレポーターアッセイ
Ｒｕｎｘ２の活性を測定するために、ｐ６×骨芽細胞特有シス作用性エレメント（ＯＳＥ）の２−ｌｕｃリポーターベクターを、前述(Kim et al., /. Cell Biochem. 2004, 9, 1239-1247)のように５×１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種したＣ２Ｃ１２細胞へと一過的にトランスフェクトした。２４時間後、培地を、タンシノンＩＩＡおよび／またはＢＭＰ−２の有無にかかわらず、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭと交換した。２４時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびワラックエンビジョンマイクロプレートリーダーを用いて測定した。
【０１１０】
Ｒｕｎｘ２は、骨形成において重要であり、ＡＬＰおよびＯＰＮなどの骨特異的遺伝子の発現を調節することが示されている[J. Cell Biochem. 2003, 88, 446-454]ため、我々は、ｐ６×骨芽細胞特異的シス作用性エレメントの２−ルシフェラーゼレポーター[J. Cell Biochem. 2004, 9, 1239-1247]およびリアルタイムＰＣＲを使用して、活性化およびＲｕｎｘ２のｍＲＮＡ発現のそれぞれにおけるラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）の効果を調べた。ＤＭＳＯ対照と比較して、ラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）５０ｎＭは、活性およびＲｕｎｘ２のｍＲＮＡレベルがそれぞれ２９倍および３倍へと大幅に増加した（詳細についてはサポートの情報を参照）。ＨＤＡＣ（複数可）は、Ｒｕｎｘ２の活性に影響を与える共リプレッサー（ｃｏ−ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）タンパク質として同定されているので[/. Cell Biochem. 2006, 98, 54-64]、これらの結果により、ラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）によるＨＤＡＣの阻害が、Ｒｕｎｘ２の活性を増加させ、骨芽細胞の分化を増強し、骨形成を増加させることが示唆された。
【０１１１】
実施例８：ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス頭蓋冠骨形成アッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏで、ラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）の骨形成活性を、前述したように凍結乾燥したコラーゲンスポンジを使用して評価した。(H. Ha, J. H. Lee, H. N. Kim, H. M. Kim, H. B. Kwak, S. Lee, H. H.
Kim, Z. H. Lee, . Immunol. 2006, 176, 111-117.)簡単に言うと、ビヒカルまたはラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）５μｌを装填したコラーゲンのスポンジを、マウス（各群ｎ＝５）の頭蓋冠骨上に移植した。三週間の薬剤注入後、頭蓋冠を、４％パラホルムアルデヒド中におき、ＥＤＴＡ１２％で脱灰し、パラフィンに包埋し、切片化した。セクションを、傾斜キシレンの洗浄を通して脱パラフィン化し、一連の段階的なエタノール洗浄で脱水し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０１１２】
マウス頭蓋冠骨形成アッセイにおいて、ラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）を浸したコラーゲンスポンジを頭蓋冠骨中に移植すると、ラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）は、頭蓋冠骨の骨膜上に織られた骨形成を誘導した。より低い濃度（５０μΜ）で織られた骨形成は、より高い濃度（１００μΜ）のものより有意であった。このデータは、ラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）がその他の骨形成化合物により観察されている二相性の効果を示す可能性が示唆された。
【０１１３】
実施例９：多核破骨細胞の誘導
ＲＡＷ２６４．７細胞をＡＴＣＣから購入し、３７℃で、空気中５％ＣＯ２の加湿大気下にて３日ごとの培地交換により、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ中で培養した。破骨細胞の分化については、ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％ＦＢＳおよび１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＭＮ）を添加した最小必須培地（α−ＭＥＭ）に懸濁し、１×１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞をラルガゾール（ｌａｒｇａｚｏｌｅ）で処理した後、さらに３日後、多核破骨細胞が観察された。
【０１１４】
実施例１０：酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色および活性
多核破骨細胞を、１０分間１０％ホルマリンで、および１分間エタノール／アセトン（１：１）中においた後、白血球酸性ホスファターゼキット３８７−Ａ（シグマ社、ミズーリ州）で染色した。ＴＲＡＰ陽性多核細胞の画像は、ＤＰコントローラ（オリンパス光学工業、日本）を用いて顕微鏡下で取得した。ＴＲＡＰ活性を測定するために、多核破骨細胞は、その後、１０分間１０％ホルマリン中に、および１分間９５％エタノール中に、さらにその後１０ｍＭの酒石酸ナトリウムを含むクエン酸塩緩衝液１００μｌ（５０ｍＭ、ｐＨ４．６）中におき、５ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ社）を乾燥させた細胞に添加した。１時間のインキュベートの後、ウェル中の酵素反応混合物を、ＮａＯＨ０．１Ｎ等量を含む新しいプレートに移した。吸光度を４１０ｎｍで測定し、ＴＲＡＰ活性を対照に対する％として示した。実験は三連で行った。
【０１１５】
参考文献
【表５】
2013526587.tif 000009
【０１１６】
参照による組み込み
本願の全体にわたって参照される（参考文献、発行された特許、公開特許出願、および同時係属特許出願を含む）すべての参考文献の内容は、ここでその全体が参照として本明細書中に明らかに組み込まれる。
【０１１７】
均等物
当業者には、通常の実験以上のものを使用していないこと、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態における多くの等価物が、理解される、または確認することができるであろう。上記同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されると意図される。
【図１】
2013526587.tif 000011
【図２】
2013526587.tif 000012
【国際調査報告】
2013526587.tif 000013
2013526587.tif 000014
2013526587.tif 000015