(57)【要約】  本発明の主題は、ａ）患者由来の試料を準備する工程、ｂ）前記試料中で、グルコース消費障害の指標となる少なくとも１つのマーカーのレベル（level）及び／又は活性（activity）を測定する工程、ｃ）前記レベル（level）及び／又は活性（activity）を既知の標準と比較する工程、並びにｄ）前記患者が筋萎縮性側索硬化症に罹患しているかどうか又は該疾患への罹患感受性が高い（susceptible）かどうか、を推定する工程、を含む、筋萎縮性側索硬化症の診断方法である。【選択図】なし
2013528802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）患者由来の試料を準備する工程、
ｂ）前記試料中で、グルコース消費障害の指標となる少なくとも１つのマーカーのレベル及び／又は活性を測定する工程、
ｃ）前記レベル及び／又は活性を既知の標準と比較する工程、並びに
ｄ）前記患者が筋萎縮性側索硬化症に罹患しているか又は該疾患への罹患感受性が高い（susceptible）か、を推定する工程、
を含む、筋萎縮性側索硬化症の診断方法。
【請求項２】
前記グルコース消費障害が、ケトン尿症、好適にはケトアシドーシスである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マーカーが代謝マーカーである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿又は血液、若しくはこれらの試料のうちのいずれかの画分である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が脳脊髄液（ＣＳＦ）であり、前記グルコース消費障害がケトン尿症、好適にはケトアシドーシスである、及び／又は、
前記試料が尿であり、前記グルコース消費障害がフェニルケトン尿症である、及び／又は、
前記試料が血液であり、前記グルコース消費障害が乳酸アシドーシスである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つ、好適には少なくとも２つ又は少なくとも３つのマーカーが、ケトン体、ペプチドではないフェニル化合物、アルケナール、カテコールアミン、好適には、アドレナリン及びノルアドレナリン、ピルビン酸塩、グルコース、乳酸塩、クエン酸塩、クレアチン、ホスホクレアチン、インスリン、コルチゾール、並びにグルタチオンからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が脳脊髄液（ＣＳＦ）であり、かつ前記マーカーが、ケトン体、好適にはアセトン又はアセチルアセトン、及び、シクロプロパンからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、尿又は血液であり、かつ前記マーカーが、ペプチドではないフェニル化合物、好適には、酢酸フェニル、ピルビン酸フェニル、又は、乳酸フェニル、アルケナール、及び、ピルビン酸塩からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が、血液又は尿であり、かつ前記マーカーが、カテコールアミン、好適には、アドレナリン及びノルアドレナリン、ペプチドではないフェニル化合物、好適にはフェニルアラニン、グルコース、乳酸塩、クエン酸塩、クレアチン、ホスホクレアチン、インスリン、コルチゾール、並びにグルタチオンからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｄ）において、前記マーカーのレベル及び／又は活性が、前記既知の標準から少なくとも１０％、好適には少なくとも２０％逸脱するときに、前記患者は、筋萎縮性側索硬化症に罹患する、又は該疾患への罹患感受性が高い（susceptible）と推定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料中で、少なくとも１つのタンパク質、及び／又は、細胞のレベル及び／又は活性、並びに／又は、ｐＨを測定することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ１）において、酵素又は細胞が、ＡＮＡ、ＣＫ−Ｎａｃ、ＣＤ３／Ｔ−細胞、ＬＤＬ、ＨＤＬ、白血球、好中球、単球、赤血球、及びアミロイドＡからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）において、前記代謝マーカーのレベルが、１Ｈ−ＮＭＲスペクトロスコピーによって測定される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）患者由来の試料を準備する工程、
ｂ）試料中で、グルコース消費障害の指標となる少なくとも１つのマーカーのレベル及び／又は活性を測定する工程、
ｃ）そのレベル及び／又は活性を既知の標準と比較する工程、並びに
ｄ）該患者が、筋萎縮性側索硬化症に罹患しているか又は該疾患への罹患感受性が高い（susceptible）か、を推定する工程、
を含み、
ここで、前記少なくとも１つのマーカー、好適には少なくとも２つ又は少なくとも３つのマーカーが、アセトン、アセトアセトン、ペプチドではないフェニル化合物、アルケナール、ピルビン酸塩、カテコールアミン、好適には、アドレナリン及びノルアドレナリン、グルコース、乳酸塩、クエン酸塩、クレアチン、ホスホクレアチン、インスリン、コルチゾール、並びにグルタチオンからなる群から選択される、筋萎縮性側索硬化症の診断方法。
【請求項１５】
患者のＡＬＳの進行状態をモニタリングするための、及び／又は、患者のＡＬＳの治療効果をモニタリングするための請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の診断方法である。
【背景技術】
【０００２】
技術の現状：
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルーゲーリック病とも呼ばれる）は、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）の一形態である。ＡＬＳは、運動ニューロンという随意筋運動を制御する中枢神経系の細胞の変性によって引き起こされる、進行性・致死性の神経変性疾患である。
【０００３】
ＡＬＳは、２０，０００人中、約１人に発症し、平均発症年齢は、５０〜５５歳である。ＡＬＳは、脳、脳幹、及び、脊髄における運動ニューロンの急速進行性変性を特徴とする。診断時からの患者の生存期間の中央値は、約５年である。この疾患の原因は不明であり、有効な治療はまだ見つかっていない。この疾患の少なくとも３つの個別のタイプが認められるので、治療及び原因の探索は困難である。散発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）、家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）、及び家族性ＳＯＤ１−ＡＬＳがある。さらに、これらのタイプの各々に、個々の特徴がある。
【０００４】
ＡＬＳの診断のための決定的なかつ信頼性のある生体分子パラメータは存在しない。
【０００５】
ＡＬＳは、今までのところ、遺伝子マーカーと明確には関連付けられていなかった。ＡＬＳにおけるＳＯＤ１遺伝子の突然変異はこの区分のうちの一つ（subcategory）に属することを許容するが、近年における研究成果は、これらの突然変異がヒトでのこの疾患の出現とは必ずしも関連しておらず、それらが正確には付随的な特徴であることを示唆する。最近、ＴＤＰ４３、スパスチン遺伝子の突然変異、トランスサイレチン、及び、シスタチンＣなどの他の遺伝子パラメータが検討された。今までのところ、診断の観点から、これらのパラメータは、正確にＡＬＳと結び付けることはできていない。従って、現在のところ、ハンチントン病などの他の神経変性疾患とは対照的に、ＡＬＳについての遺伝子相関は存在しない。
【０００６】
そこで、患者の体液中のバイオマーカーを決定するための多くの試みが行われている。Ｔｕｒｎｅｒら（２００９）は、バイオマーカーを基にしたＡＬＳの診断、特に、ＣＳＦ、血液、及び尿に基づくものに関する文献についての総説を提供する。この著者らは、最新の知見を次のようにまとめている：「ＡＬＳと類似の症状を呈する疾患は少なく、治療可能又は寛解型の類似疾患（mimics）はさらに少なく、ＡＬＳの診断学的検査は存在しない、そして、確定診断は、主に臨床的評価に基づいたものであり、手足及び／又は延髄領域における上位運動ニューロン（ＵＭＮ）と下位運動ニューロン（ＬＭＮ）の症状検出と症状進行の過程によっている。」（９４ページ、右列）。現在、筋電図検査などの臨床的方法により、診断の保証は、早ければ最初の兆候から１年以内に達成できる。
【０００７】
Ｔｕｒｎｅｒらが述べた通り、複数の論文において、血液由来のバイオマーカーをＡＬＳと関連させることが試みられた。対照と比較して延髄領域の病状がより進行した患者において顕著な、血清中のチロシン及び血漿中のグルタミン酸塩の濃度の上昇と、血漿中の多数の中性アミノ酸の濃度の低下という研究結果もある。候補となるサイトカインバイオマーカーに関し、インターロイキン６の濃度上昇が、ＡＬＳ患者の血清中において、検出感度７３％、特異度９１％でみられた。
【０００８】
Ｐａｔｔｅｎら（１９７８）は、アミノ酸レベルとＡＬＳとの関係を調べた。分岐鎖アミノ酸とバリンのレベルは、罹患期間が長くなるにつれて増加し、また、アスパラギン酸塩レベル及び酸性アミノ酸レベルの増加がみられた。ＡＬＳ患者血漿中におけるアミノ酸レベルの研究が、Ｉｌｚｅｃｋａ（２００３）によって発表されている。しかし、アミノ酸レベルに関する研究は理論水準であり、アミノ酸レベルに基づく信頼性のあるＡＬＳ診断が開示されることも、後に実用化されることもなかった。
【０００９】
他の研究において、脂質代謝がＡＬＳの進行及び生存に影響を及ぼすことが示唆された。高密度リポタンパク質に対し低密度リポタンパク質が高比率であることは、生存期間の延長と関連していた。
【００１０】
Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（２００９）は、ＡＬＳを他の神経生物学的疾患から識別できる可能性のあるものとして、脳脊髄液標本（ＣＳＦ、脳脊髄液（Ｌｉｑｕｏｒ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌｉｓ））由来の２７種類のバイオマーカーを調べた。この著者らは、試験した２７種類の物質のうち５種類が、他のニューロン疾患からＡＬＳを識別しうると結論付けた。これらは、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及び、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−単球コロニー刺激因子）である。しかしながら、これらは、本質的に炎症マーカーであり、神経生物学的以外の他の多くの疾患でも指標となりうる。
【００１１】
他にも、ＡＬＳ診断に適用できる可能性のあるバイオマーカーがＷＯ２００７／１００７８２号に開示されている。しかし、多数の候補マーカーは、その有意性及び独自性についての情報を伴わずに提供されている。
【００１２】
死後ＣＳＦ解析を含む比較研究では、診断されたばかりの患者由来のバイオマーカー（但し、対照なし）が、独立した他の患者の死後解析の場合と変化していないようにみえた（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ，２００９）。この研究結果は、疾患の進行に伴って変化するバイオマーカーを同定する必要性を明らかにする。
【００１３】
類似の症状を有する他の神経変性疾患からＡＬＳを識別するのは難しく、ＡＬＳの診断のための正確で信頼性の高いマーカーがないことは、極めて問題である。臨床的に、ＡＬＳの一般症状は、他の疾患、例えば、悪性新生物・タンパク異常血症・中毒・糖代謝障害などに付随する脊髄筋萎縮症の希少な症例などと極めて類似している。脊髄筋萎縮症は、例えば、複合型パーキンソン認知症・クロイツヘルトヤコブ病・フリードライヒ運動失調症・脊髄内隆起・起立性低血圧・その他の部分的症状でもある。運動性多発ニューロパチー又はポリオ小児麻痺に対するＡＬＳの鑑別診断は、髄液、ＥＭＧ、ＣＴ検査、筋生検の後に初めて可能となる。延髄の症候があるときは、偽性の延髄麻痺の構成要素である可能性がある。
【００１４】
要約すると、ＡＬＳの診断、及び、他の疾患との識別は極めて困難である。例えば、筋生検のように、患者にとって負担の大きい大規模な検査を必要とする。
【非特許文献１】Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ＣＳＦ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  Ｔｈａｔ  Ｅａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  Ｍａｙ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ．ＰＬＯＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００６，３，１４２０−１４２８．
【非特許文献２】Ｉｌｚｅｃｋａ  Ｊ，Ｓｔｅｌｍａｓｉａｋ  Ｚ，Ｓｏｌｓｋｉ  Ｊ，Ｗａｗｒｚｙｃｋｉ  Ｓ，Ｓｚｐｅｔｎａｒ  Ｍ．Ｐｌａｓｍａ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ  ｉｎ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  ２００３；２４：２９３−９５．
【非特許文献３】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｒ．Ｍ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｗ．Ｍ．，Ｒａｎｄａｚｚｏ，Ｗ．Ｔ．，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｈ．Ｅ．，Ｂｅａｒｄ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｚ．，Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｒ．Ａ  ＣＳＦ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｐａｎｅｌ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００９；７２；１４−１９．
【非特許文献４】Ｐａｔｔｅｎ  ＢＭ，Ｈａｒａｔｉ  Ｙ，Ａｃｏｓｔａ  Ｌ，Ｊｕｎｇ  ＳＳ，Ｆｅｌｍｕｓ  ＭＴ．Ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  １９７８；３：３０５−０９．
【非特許文献５】Ｐｅｔｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ，Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９８６，４７，１２７０−１２７６．
【非特許文献６】Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ  Ｓ，Ｎｉｃｈｏｌｌ  ＧＣ，Ｈｅｎｒｙ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉ  ｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌ  ｕｉｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ  ｍｏｒｔｅｍ  ＡＬＳ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒ  ２００７；８：３７３−７９．
【非特許文献７】Ｔｕｒｎｅｒ，Ｍ．Ｒ．，Ｋｉｅｒｎａｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｌｅｉｇｈ，Ｐ．Ｎ．，Ｔａｌｂｏｔ，Ｋ．，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００９；８：９４−１０９．
【非特許文献８】Ｗｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  １Ｈ−ＮＭＲ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１，７４４−７５１．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の基礎になる課題：
本発明の基礎になる課題は、ＡＬＳの診断方法を提供することである。本方法は、上述の課題を解決する。本法は、信頼性が高く明確なものとなる。
【００１６】
本発明の基礎になる具体的課題は、比較的簡易に実施することができるＡＬＳの診断方法を提供することである。本法は、簡易に入手可能な試料で適用できる。本法は、少ないプロセス工程しか必要としないものとなる。
【００１７】
さらに、本発明は、患者に便利なＡＬＳの診断方法を提供する。それは、筋生検など、痛みを伴い患者にとって負担の大きい検査を行う必要のないものとなる。
【００１８】
他の神経変性疾患からＡＬＳを識別することが可能なＡＬＳの診断方法を提供することが、本発明のさらなる課題である。本法は、ＡＬＳと類似の臨床症状を有する他の疾患からＡＬＳを識別するものとなる。本法は、ＡＬＳの進行をモニタリングしたり、ＡＬＳ治療をモニタリングしたりする上で有用なものとなる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の開示：
驚くべきことに、本発明の基礎になる課題は、特許請求の範囲による方法によって解決される。本発明の主題は、
ａ）患者由来の試料を準備する工程、
ｂ）試料中で、グルコース消費障害の指標となる少なくとも１つのマーカーのレベル及び／又は活性を測定する工程、
ｃ）そのレベル及び／又は活性を既知の標準と比較する工程、並びに
ｄ）該患者が、筋萎縮性側索硬化症に罹患しているか又は該疾患への罹患感受性が高い（susceptible）か、を推定する工程、
を含む、筋萎縮性側索硬化症の診断方法である。
【００２０】
本発明によれば、筋萎縮性側索硬化症の診断は、グルコース消費障害の症候の測定と相関する。グルコース消費障害では、グルコースの代謝的消費が妨げられる。ヒトでは、グルコースの代謝的消費は、解糖時のピルビン酸塩への変換と、その後のクエン酸回路におけるピルビン酸塩の分解とを含む。グルコース消費がヒト体内で損なわれるか又は妨げられるとき、体液、特に、血液中のグルコースレベルは、しばしば、増大又は減少し、又は不規則な変動を示す。
【００２１】
グルコースのレベル、及び、グルコース消費に関連するマーカーのレベルは、各種疾患の診断時において患者の血液・尿を検査する際に、通常、測定される。しかし、本発明は、初めて、ＡＬＳ診断を、グルコース消費障害の症候と関係付けるものである。本発明は、ＡＬＳが、グルコース消費障害の症候と一致するという予想外の発見に基づいている。本発明者らの知る限り、患者がＡＬＳに罹患しているか否かを、グルコース消費障害の症候から系統的にかつ原因として推定することは当該技術分野では知られていなかった。従って、本発明に係る独創的な方法は、いずれの先行技術の開示とも区別されるものであり、ＡＬＳに対する診断的効果を認識しないまま、グルコース又は他の代謝産物のレベルの変化を観察しただけであるという先行技術や、グルコース又は他の代謝産物のレベルの変化がＡＬＳ患者の副次的病状に起因するにすぎないという先行技術とは区別されるものである。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様として、グルコース消費障害は、ケトン尿症、好適にはケトアシドーシスである。
【００２３】
ケトン尿症は、体液中でケトンレベルが増加する病態である。即ち、ケトン尿症は、尿・血液・ＣＳＦなど、体液中のケトン体量が増加又は少なくとも変化することと関連している。ケトン体は、水溶性代謝産物であり、エネルギー産生のために脂肪酸が代謝分解されるときの副産物である。主要な３つのケトン体は、アセトン、アセトアセテート、β−ヒドロキシ酪酸である。β−ヒドロキシ酪酸は、ケトンではなく、カルボン酸である。ケトン尿症は、高頻度でＩ型糖尿病と関連している。ケトン尿症でのケトン体産生は、グルコース欠乏に対する典型的な応答であり、その場合、脂肪酸が代替エネルギー源として消費される。健常個体では、ケトンは、肝臓で形成され、完全に代謝され、その結果、尿、血液、又はＣＳＦなどの体液中には、ごくわずかな量しか出現しない。
【００２４】
ケトアシドーシスは、高濃度ケトン体と関連する代謝性アシドーシスの一種である。ケトアシドーシスでは、脂肪酸からのケトン体の産生は、ｐＨの低下を伴う。一般に、ケトアシドーシスは、Ｉ型糖尿病で最も一般的である。
【００２５】
乳酸アルカローシスは、通常、血液及び／又は尿中で検出可能である。この生理的状態は、高レベルの乳酸塩を伴う高い血中ｐＨ（アルカローシス）を特徴とする。例えば、血清ｐＨは、７．４又は７．５を超えるものであることができ、乳酸塩レベルは、４ｍｍｏｌ／Ｌを超えるものであることができる。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様として、試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）・尿・血液などの体液、若しくはこれらの試料のいずれかの画分である。
【００２７】
体液は簡易に入手可能であるため、ＡＬＳ診断に体液を使用することは最も好適である。その検査は、患者には簡易で利便性が高い。特に、ＡＬＳの場合、体液検査は、筋生検など、侵襲的な診断方法より簡便である。
【００２８】
先行技術では、血液・尿・ＣＳＦ由来の各バイオマーカーが、ＡＬＳ診断における重要候補として研究されている。しかし、グルコース消費障害、特に、ケトン尿症又はケトアシドーシスとは、まだ直接関連付けられていない。本発明では、ＡＬＳが疑われる患者について、ケトン尿症・ケトアシドーシス・乳酸アルカローシスなど、グルコース消費障害の典型的な症状が見られるかどうかを系統的に判定することにより、特異性が高く、極めて信頼性のあるＡＬＳ診断を行なうことができることが分かった。特に、ＡＬＳと他の神経変性疾患との識別が可能であることが分かった。さらに、ＡＬＳを類似の臨床症状を有する他の疾患と分子レベルで識別できる。
【００２９】
好ましい実施態様では、試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）である。この実施態様では、障害が、脳の機能障害、特に、運動ニューロンの機能障害と関連していることが好ましい。
【００３０】
先行技術で研究されていた血中バイオマーカーは、ＡＬＳ患者の臨床診断と比べて、検出感度と特異性の向上を提供しない。本発明の診断方法は、ＡＬＳ診断を特定の生理学的経路の変化と関連付けることができ、有効である。つまり、本発明は、患者がＡＬＳに罹患した際、特定の生理学的経路が影響を受けるという研究結果に基づいている。この視点から、特定の患者について、どのマーカーで検査するか、いくつのマーカーで検査するかについては、当業者によって判断される。本発明方法は、有意性がわかっていない単離されたマーカーが同定されたことなど、その技術分野で知られた方法と比較して、より確実性の高いＡＬＳの診断を提供するものである。
【００３１】
本発明方法は、ある患者がＡＬＳに罹患しているかどうか、又は、罹患しやすいかどうかの診断を可能にする。本発明方法は、ある患者のＡＬＳの進行状態をモニタリングするために用いることができる。本発明方法は、ＡＬＳ患者の治療効果をモニタリングするために用いることもできる。本発明方法は、ＡＬＳを、他の神経変性疾患又はＡＬＳと類似した臨床症状を有する他の疾患と鑑別するために用いることもできる。
【００３２】
試料は、体液のある画分であってもよい。例えば、試料は、血清、血漿、又は、それらのある画分であることができる。ＣＳＦは、既知の方法、例えば、腰椎穿刺によって取得できる。
【００３３】
試料は、体液又はその画分であってもよい。例えば、血液・ＣＳＦなどの体液は、タンパク質を予め分離したものを供してもよい。
【００３４】
本発明の好ましい実施態様では、マーカーは、代謝マーカー（代謝産物）である。代謝産物は、代謝の中間体又は最終産物である。通常、代謝産物は小分子である。例えば、代謝産物は、２，０００ダルトン未満又は１，０００ダルトン未満の分子量であってもよい。好適には、代謝産物は、機能タンパク質でない。
【００３５】
本発明では、工程ｂ）において、少なくとも１つのマーカーのレベル及び／又は活性が測定される。特に、代謝マーカーの場合、活性よりもマーカーのレベルを決定することがより簡易であることが多い。「レベル」を決定することは、２つのマーカーの比を測定することにも関連する。
【００３６】
本発明では、２以上のマーカーのレベルを決定することが好ましい。好適には、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は、少なくとも６つのマーカーのレベル及び／又は活性が測定される。好適な実施態様では、２〜２０個のマーカー、３〜１５個のマーカー、又は、４〜１０個のマーカーのレベル及び／又は活性測定される。一般に、当業者は、重要度の高い数個のマーカーの組合せによって、ＡＬＳとの強い相関が可能になることを理解している。
【００３７】
本発明の好ましい実施態様では、試料は脳脊髄液（ＣＳＦ）であり、グルコース消費障害はケトアシドーシスである、及び／又は、試料は尿であり、グルコース消費障害はフェニルケトン尿症である、及び／又は、試料は血液であり、グルコース消費障害は乳酸アルカローシスである。
【００３８】
本発明の好ましい実施態様では、少なくとも１つ、好適には、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は、少なくとも４つのマーカーは、アセトン、アセトアセトン、ペプチドではないフェニル化合物、アルケナール、ピルビン酸塩、カテコールアミン、好適にはアドレナリン・ノルアドレナリン、グルコース、乳酸塩、クエン酸塩、クレアチン、ホスホクレアチン、インスリン、コルチゾール、並びにグルタチオンからなる群から選択される。好適には、ケトン体は、アセトン又はアセトアセトンである。これらのマーカーは、特にＣＳＦ中で有意に増加することが分かった。好適には、フェニル化合物は、低分子量化合物、好適には酢酸フェニル、ピルビン酸フェニル、又は乳酸フェニルである。特定の実施態様では、フェニル化合物は、フェニルアラニンを含まない。
【００３９】
本発明の好ましい実施態様では、試料は脳脊髄液（ＣＳＦ）であり、マーカーは、ケトン体、特に、アセトン、アセチルアセトン、及び、シクロプロパンからなる群から選択される、少なくとも１つ、好適には２つ又は３つである。ＣＳＦに関するこれらの実施態様では、グルコース消費障害は、ケトアシドーシスであることが好ましい。本発明によれば、特に、ＣＳＦ中のアセトン及びアセチルアセトンのレベルが有意に増加することが分かった。少なくともアセトンもしくはアセトアセトン、若しくはアセトンとアセトアセトンの両方のレベルを決定することが極めて好ましい。第三のケトン体は、β−ヒドロキシ酪酸であるが、これも有意に変化することが分かった。しかしながら、そのレベルは、ＡＬＳ患者のＣＳＦ中で減少する。
【００４０】
Ｉ型糖尿病などの一般的なグルコース消費障害は、多くの場合、血液又は尿中の代謝マーカーによって検出可能であることが当技術分野で知られている。特に、Ｉ型糖尿病の場合、ケトン尿症又はケトアシドーシスの症状は、血液又は尿中で観察される。しかし、Ｉ型糖尿病を有する患者は、ＣＳＦにおいてケトン尿症又はケトアシドーシスの症状を有さない。従って、本発明の方法をＣＳＦを用いて実施する場合、患者が、Ｉ型糖尿病などの異なるグルコース消費障害を有するために、偽陽性の結果が得られるということを排除することができる。したがって、本発明の診断方法におけるＣＳＦ試料の使用は、診断を特異性の高いものにする。したがって、本発明の方法は、特に、ＡＬＳをＩ型糖尿病と鑑別するのにも有用である。
【００４１】
グルコース消費障害の症候、特に、ケトン尿症又はケトアシドーシスをＣＳＦで測定することが本発明の有利性であるが、これらの障害に対する本発明方法において、血液又はその画分、若しくは尿で検査することもできる。アセトン・アセトアセトンなどのマーカーは、血液又は尿中であまり顕著ではないが、それでも適切なレベルで検出可能であることが分かった。
【００４２】
本発明の別の好ましい実施態様では、試料が尿であり、かつ少なくとも１つのマーカー又は少なくとも２つもしくは少なくとも３つのマーカーが、フェニル化合物、好適には、酢酸フェニル、ピルビン酸フェニル、又は、乳酸フェニル、アルケナール、及び、ピルビン酸塩からなる群から選択されることが好ましい。これらの実施態様では、グルコース消費障害は、フェニルケトン尿症であることが好ましい。アルケナールは、２−ノネナールなどの一般的な代謝物質、又は、ヒドロキシノネナールなどのアルケナール誘導体であってもよい。特に、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は、少なくとも３つのフェニル化合物のレベルを測定することが好ましい。尿の検査がこれらの実施態様に好ましいが、本方法は、血液又はその画分に関しても適用可能である。
【００４３】
本発明の好ましい実施態様では、試料が血液又はその画分であり、かつ少なくとも１つのマーカー、好適には少なくとも２つ又は少なくとも３つのマーカーがカテコールアミン、好適にはアドレナリン及びノルアドレナリン、フェニル化合物、好適には、フェニルアラニン、グルコース、乳酸塩、クエン酸塩、クレアチン、ホスホクレアチン、インスリン、コルチゾール、並びにグルタチオンからなる群から選択される。これらの実施態様では、グルコース消費障害は、乳酸アルカローシスであることが好ましい。血液又はその画分の検査がこれらの実施態様に好ましいが、本方法は、尿に関しても適用可能である。
【００４４】
本発明の好ましい実施態様では、工程（ｄ）において、マーカーのレベル及び／又は活性が、既知の標準から少なくとも１０％逸脱するときに、患者が筋萎縮性側索硬化症を罹患している、又は、罹患感受性が高い（susceptible）と推定される。好適には、マーカーのレベルは、既知の標準から少なくとも１０％、より好適には、少なくとも２０％、少なくとも３０％、若しくは少なくとも５０％逸脱する。本発明では、「既知の標準」は、多くの健常者の既知の平均値であることができる。そのような標準は当技術分野で公知である。さらに、既知の標準は、一人の人からの基準であってもよい。別の実施態様では、既知の標準は、以前に決定された、同じ患者の値である。例えば、同じ人の値を比較する場合、ＡＬＳの進行を経時的にモニタリングすることができる。本発明の別の実施態様では、既知の標準は、ＡＬＳを罹患していることが判明した人、又は、ＡＬＳを罹患していることが判明した人の集団の基準値である。
【００４５】
本発明の好ましい実施態様では、本方法は、試料中で、少なくとも１つのタンパク質及び／又は細胞のレベル、及び／又は、活性、並びに／又は、ｐＨをさらに測定することを含む。
【００４６】
特に、本発明方法において、ＣＳＦのｐＨが、例えば、７．５未満、好適には、７．３未満又は７．２未満の値に低下しているかどうかが測定される。特に、血液のｐＨが、例えば、７．４を超える、好ましくは、７．５を超える値に増加しているかどうかが測定される。
【００４７】
本発明の好ましい実施態様では、酵素及び／又は細胞は、ＡＮＡ、ＣＫ−Ｎａｃ、ＣＤ３／Ｔ−細胞、ＬＤＬ、ＨＤＬ、白血球、好中球、単球、赤血球、及び、アミロイドＡからなる群から選択される。好適には、これらのマーカーのうちの少なくとも２つ又は少なくとも３つが検査される。本発明にＡＬＳと何らかの相関を有する追加的なマーカーを用いて、本発明の診断アッセイを補完してもよい。
【００４８】
本発明の別の主題は、
ａ）患者由来の試料を準備する工程、
ｂ）試料中で、少なくとも１つの代謝マーカーのレベル及び／又は活性を測定する工程、
ｃ）このレベル及び／又は活性を既知の標準と比較する工程、並びに
ｄ）該患者が、罹患しているか又は該疾患への罹患感受性が高い（susceptible）か、を推定する工程、
を含み、
ここで、この少なくとも１つのマーカー、好適には少なくとも２つ又は少なくとも３つのマーカーが、アセトン、アセトアセトン、ペプチドではないフェニル化合物、アルケナール、ピルビン酸塩、カテコールアミン、好適には、アドレナリン及びノルアドレナリン、グルコース、乳酸塩、クエン酸塩、クレアチン、ホスホクレアチン、インスリン、コルチゾール、並びにグルタチオンからなる群から選択される、筋萎縮性側索硬化症の診断方法である。好適には、ケトン体は、アセトン又はアセトアセトンである。好適には、フェニル化合物は、低分子量化合物、好適には、酢酸フェニル、ピルビン酸フェニル、又は、乳酸フェニルである。本発明方法では、体液、マーカー、試料、マーカーレベルなどは、上述の通り選択される。
【００４９】
好適には、試料が脳脊髄液（ＣＳＦ）であり、マーカーが、ケトン体、特に、アセトン又はアセチルアセトン、及び、シクロプロパンから選択される。好適には、試料が、尿又は血液であり、ここで、マーカーが、フェニル化合物、好適には、酢酸フェニル、ピルビン酸フェニル、又は、乳酸フェニル、アルケナール、及び、ピルビン酸塩からなる群から選択される。好適には、試料が、血液又は尿であり、マーカーが、カテコールアミン、好適には、アドレナリン及びノルアドレナリン、ペプチドではないフェニル化合物、好適には、フェニルアラニン、グルコース、乳酸塩、クエン酸塩、クレアチン、ホスホクレアチン、インスリン、コルチゾール、並びにグルタチオンからなる群から選択される。
【００５０】
以下では、本発明に従って好ましいマーカー及びそのマーカーの適切なレベルが詳細に記載されている。さらなる情報は、下記の実施例で提供されている。ＣＳＦ、尿、及び血液中において、以下のマーカーの観察が好ましい（「＋」は既知の標準と比べた増加を示し、「−」は、既知の標準と比べた減少を示す。
【表１】
2013528802.tif 000003
【表２】
2013528802.tif 000004
【表３】
2013528802.tif 000005
【００５１】
クエン酸塩／クレアチン、クレアチニン、ホスホクレアチン比：１：１
ｐＨ値  血液：＞７．５２
ｐＨ値  ＣＳＦ：＜７．２４
【００５２】
理論に拘束されるものではないが、ＣＳＦ、尿、及び血液中のマーカーレベルの全体的なパターンは、次のように説明できると推測される。ＡＬＳの主要な要因は、少なくとも主に、脳に位置するグルコース消費障害であるように思われる。おそらく、この障害の端緒は、運動皮質の機能不全である。結果として、脳内での増大した脂肪酸酸化の代替エネルギー産生経路が活性化される。結果として、アセトン及びアセトアセトンがＣＳＦ中に蓄積する。これらとその他の代謝産物が、グルコース産生が障害されているというシグナルを伝達する。そして、身体は、既知の手段、例えば、カテコールアミン及び異常なインスリンの産生増加によってグルコース産生を増加させようとする。この反応は、一過性に高いグルコースレベルを提供するために、身体が高いレベルでアドレナリンを産生するときのストレス反応と類似する。しかし、ＡＬＳでは、脳機能障害はこれらの応答では覆されず、異常なパターンが維持される。グルコースレベルとインスリンレベルの大きい揺らぎは、補助的な経路が、通常のグルコースバランスによらずに、活性化及び不活化されることを示すように思われる。さらに、異常なインスリンレベルは、グルコース代謝障害の結果であるように思われる。乳酸塩のレベルの増加は、身体の特定の領域、この場合はおそらく、運動ニューロン及び前角細胞が、正常のグルコースベースのエネルギー産生の代わりに、乳酸塩からのエネルギー産生に切り換えたことを示すように思われる。
【００５３】
本発明の傾向は、特に空腹又はストレス時の、脂肪酸分解の一過性の増加と関連する既知のプロセスと一部類似性を有する。しかし、本方法は、試料を採取する際、患者をストレス又は空腹にさらさなかったことを勘案すれば、これらのものからＡＬＳを容易に区別できる。さらに、本明細書に記載の異常値は、一時的にではなく、長時間にわたって観察される。従って本発明の好ましい実施態様では、異なる時点で、例えば、６又は２４時間以内、又は、１週間又は１カ月以内に採取された、同じ患者から少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、又は、少なくとも４つのプローブが検査される。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様では、工程（ｂ）において、マーカー、好ましくは代謝マーカーのレベルは、ＮＭＲスペクトロスコピー、特に１Ｈ−ＮＭＲスペクトロスコピーで決定される。好ましくは、１Ｈ−ＮＭＲスペクトロスコピーは一次元のものである。しかしながら、２−Ｄ  ＮＭＲを用いることも可能である。好ましくは、高分解能ＮＭＲが用いられる。例えば、一次元１Ｈ−スペクトルは、２５℃で、５００又は３６０ＭＨｚで取得できる。一般に、ＮＭＲによる分析が好ましいが、それは、この方法が、試料の前処理をほとんど又は全く必要としないからである。さらに、多数の代謝産物を１つのプローブだけで可視化することができる。高分解能ＮＭＲは、統合失調症などの他の疾患の進行及び転帰をモニタリングするのに用いられている（Ｈｏｌｍｅｓら、２００６）。ＮＭＲ診断では、試料を既知の方法、例えば、Ｄ２Ｏとのインキュベーションで前処理してもよい。試料中のマーカーの量は、ピーク面積から推測可能である。ＮＭＲスペクトロスコピーによるＣＳＦなどの体液の検査が当技術分野で記載されている。例えば、Ｐｅｔｒｏｆｆら（１９８６）は、高分解能ＮＭＲによってＣＳＦ成分を研究する方法及び装置の概要を提供している。高分解能ＮＭＲによるＣＳＦの別の研究は、Ｗｅｖｅｒｓら（１９９５）によって開示されている。これらの刊行物では、多数の代謝産物の基準値が開示されている。本発明の特定の実施態様では、これらの文書のうちの１つに開示されているように、試料を調製し、分析する。
【００５５】
本発明は、高分解能ＮＭＲスペクトロスコピーを用いたＡＬＳ患者の髄液、血液、及び尿試料の研究に基づいている。理論に拘束されるものではないが、全体的な研究結果は、脳、特に、運動皮質におけるグルコース消費障害を示している。運動皮質におけるグルコース消費障害は、運動ニューロン１及び２の能力欠損と関連している。これは、ＰＥＴ−ＣＴ（陽電子放出断層撮影法）によって確認され、これにより、これらの脳領域でのグルコース代謝回転の減少が示される。結果として、これらのニューロン領域では、脂肪酸の分裂によって提供された細胞へのエネルギー供給を介して、代替経路が活性化された。次に、アセトアセテート−Ｓ−補酵素Ａは、脳に入り、アセテート−Ｓ−補酵素Ａへの変換により、ニューロン細胞のエネルギー供給に貢献する。この代替エネルギー供給経路は、絶食時又はグルコースレベルが長時間にわたって強く低下したときに、健常個体で観察される。
【００５６】
本発明方法では、乳酸アルカローシスが血液及び／又は尿中に存在するかどうかを測定することが好ましい。本発明によれば、乳酸塩のレベルが血液及び尿中で異常に高いことが分かった。さらに、血液のｐＨが異常に高いことが分かった。従って、患者は、乳酸アルカローシスの症状を有する。他の疾患では、血液中の乳酸塩レベルの増加は、ｐＨの減少を伴うことが多い。そのような生理的状態を乳酸アシドーシスと呼ぶ。
【００５７】
上記のようないくつかの現象は、糖尿病（糖尿病性多発神経障害）で観察される現象と類似する。糖尿病の進行中、ケトン体形成及びインスリンシグナル経路の障害によって、本明細書に記載の症状と類似の症状が生じる。しかし、今回の血液又は尿の解析では、Ｉ型糖尿病の兆候は見られなかった。従って、理論に拘束されるものではないが、体内のグルコース調節はほぼ無傷のようであると考えられる。予備的機能不全は、運動神経系に、また、本明細書では特に、運動皮質の錐体細胞に位置するように思われる。少なくとも、これは、ＣＳＦ中に見られる多数のケトン体を考慮して可能性が高いように思われ、これにより、髄液における低いｐＨ（約７．２３）が生じる。結果として、高い乳酸塩値が、血液及び尿中で観察された。血液では、ｐＨの増加（約７．５２〜７．６）は、不自然な手の位置など、ＡＬＳの症候を誘発する代謝性アルカローシスを示すように思われる。
【００５８】
以上の通り、運動ニューロンの能力低下を引き起こす以下のプロセスが適合すると考える：  過剰のアセトアセテート−ＳＣｏＡは、アセタール−ＳＣｏＡに変換され、その後のエネルギー産生に利用されるだけでなく、ケトン体にも変換され、ｐＨ低下とその後の代謝効率の減少が誘導される。さらに、ケトン体は、細胞タンパク質と相互作用し、その正常な機能を障害する。代謝の減少は、リポキシゲナーゼの活性の増大を引き起こし、これにより、脂肪酸がエネルギー消費に変換される。アルケナール、さらなるケトン体、及び、ＲＯＳが産生され、これにより、代謝がさらに悪化する。リポキシゲナーゼがミトコンドリア脂肪酸に影響を及ぼすと、アポトーシスプロセスを誘導し得る、さらなる後続反応が起こる場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル比較：ＡＬＳ患者の髄液（上の曲線）及び健常個体の髄液（下の曲線）、ピルビン酸塩標準（下から二番目の線、約２．３７５で単一のピークを有する）、アセトン標準（上から二番目の線、約２．２３０で単一のシグナル）、アセトアセテート標準（上の線、約２．２８５で単一のシグナル）。
【図２】１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル比較：ＡＬＳ患者の髄液（上の曲線）及び健常個体の髄液（下の曲線）、２−ヒドロキシ酪酸（下から四番目の線、約０．９０で三重線シグナル及び約１．６０〜１．８０で多重線シグナル）、浸漬溶液由来のエタノールアーティファクト（上から三番目の線、約１．２０で三重線シグナル）。
【図３】健常ドナーの対照とともに、２００８年５月に記録された患者１の１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル（尿）（ＨＭ−ＵＲ１６０５−ｄ２０  １１／１  Ｆ：ｗ  ＨＭ  ｄ２０（１）３００／３００）。
【図４】２００９年８月に記録された患者２の１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル（尿）（ＳＶ−ＵＲ１４１００９−ｄ２ｏ）、最初の部分；ＳＶ−ＵＲ１８０８０９−ｄ２０  １１  １＼Ｂｒｕｋｅｒ＼Ｔｏｐｓｐｉｎ  Ｓｔｅｆｆａｎ。
【図５】２００９年８月に記録された患者２の１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル（尿）（ＳＶ−ＵＲ１４１００９−ｄ２ｏ）、次の部分；ＳＶ−ＵＲ１８０８０９−ｄ２０  １１  １＼Ｂｒｕｋｅｒ＼Ｔｏｐｓｐｉｎ  Ｓｔｅｆｆａｎ。
【実施例】
【００６０】
１．概要
標準的な基準ＩＣＤ−１０（世界保健機構）に準拠するＡＬＳ患者、少なくとも４人の患者の試料が、同じ年齢及び性別の健常個体由来の（定量的及び定性的）各マーカー基準値からの有意な変動を有するマーカー探索のために検査された。試料を高周波数ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ６００  ＮＭＲスペクトロメーター；Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｅｓｑｕｉｒｅ  Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）に供した。以下では、最も有意な変動を記載する。
【００６１】
２．血球数解析
４週間の血球数を以下の通り解析した。Ｓｅｐａｃｋクロマトグラフィーカラムを用いて、２５０μＬの血液又はＣＳＦ試料からタンパク質を分離した。一試料当たり３５０μＬのＤ２Ｏを添加した。低分子代謝産物に対するマススペクトロスコピーと組み合わせ、ＮＭＲで、試料を分析した。他の試料を、タンパク質分離なしで調製し、タンパク質及びペプチドマーカーを探索した。２５０μＬの尿試料を３５０μＬのＤ２Ｏと直接混合し、調べた。
【００６２】
グルコース：
そのレベルは、４８ｍｇ／ｄＬと１２０ｍｇ／ｄＬの間で変動ことがわかった。この変動は、健常個体における基準変動と比べてあまりにも大きい。しかし、グルコース負荷試験（１０：２６ａｍ、朝の節制状態のときに、グルコース７５ｇを含む３００ｍＬの水）は、比較的正常な進行を示す。例えば、以下の値が測定された：１０：２５ａｍ（節制状態）：９３ｍｇ／ｄＬ；１１：２５ａｍ：１１３ｍｇ／ｄＬ；１２：２５ａｍ：１０１ｍｇ／ｄＬ。
乳酸塩：
５〜１０．８ｍｍｏｌ／Ｌ（基準０．５〜２．２ｍｍｏｌ／Ｌ）。この値はあまりにも高く、（以下で詳述する通り）それぞれの合併症を伴う有意な乳酸アルカローシスを示す。乳酸塩の値、さらにクエン酸塩の値も尿中で非常に高かった。
ＧＳＨ／グルタチオン：
３．０μｍｏｌ／Ｌから１．８μｍｏｌ／Ｌに減少（基準２．４〜４．４μｍｏｌ／Ｌ）。
トリグリセリド：
この値は、２０８ｍｇ／ｄＬと３４７ｍｇ／ｄＬの間を変動した（基準３５〜１７５ｍｇ／ｄＬ）。
ＬＤＬ／ＨＤＬ−割合：
その値は、４．４から３．５へと徐々に下降した（基準＜４）。
ＩＧＦ−１：この値は、平均値の１３０ｎｇ／ｍＬの前後を行き来した（基準１５０〜３５０ｎｇ／ｍＬ）。
ＡＮＡ：
その値は、平均で１：３２０から１：１６０に減少したが、依然として非常に高かった（基準＜１：８０力価）。
ＣＫ−Ｎａｃ：
２９４Ｕ／Ｌから２１７Ｕ／Ｌに減少（基準＜１９０Ｕ／Ｌ）。
白血球：
１１．７×１０３／μＬから９．７×１０３／μＬに減少（基準４〜９．４×１０３／μＬ）。
好中球：
７７％から６３％に減少（基準４２〜７５％）。
単球：
２．０％から３．２％に増加（基準３．４〜１２％）。
赤血球：
４．４×１０６／μＬ前後での境界線変動（基準４．６〜６．２×１０６／μＬ）。
ＣＤ３／Ｔ−細胞：
３４０から３９４に増加（変動する）（基準４６７〜６３３ＦＩ平均）。
ＮＫ−細胞：
（基準５３６〜１０５６ＦＩ平均）３４０から３９４に増加。
ＣＤ１４／単球：
１０９０ＦＩ平均から１５０２ＦＩ平均に増加（基準１３７２〜１８８１ＦＩ平均）。
【００６３】
３．髄液解析
ＡＬＳ患者及び健常個体（参照プローブ）の髄液を採取し、前処理し、上記と同様に調べた。正常値と比較して、有意量のケトン体が患者の髄液中に検出された。さらに、グルコース対乳酸塩比の異常が認められた。同等の値を血液及び尿中で検出できる。結果を図１及び２に示す。これらの図では、２つの試料の結果を重ね合わせ、既知のマーカーとさらに組み合わせている。それらの結果は、ＡＬＳと参照プローブの有意な差を示している。標準により、有意なピークをマーカーと関連付けることができた。ＡＬＳ患者の髄液では、各々参照と比較して、アセトン及びアセトアセテートレベルの強い増加（図１）及びヒドロキシ酪酸のわずかな増加を示している。
【００６４】
４．尿分析
２人のＡＬＳ患者の尿を分析し、健常個体と比較した。患者１については、２００７年１２月にＡＬＳが診断された。試料を分析したとき、ＡＬＳＦ−Ｒスコアは約２０であった。患者２については、１９９９年頃にＡＬＳが診断された。試料を分析したとき、ＡＬＳＦ−Ｒスコアは約２であった。両方の患者の試料を採取し、ほぼ同時並行で調べた。
【００６５】
図３は、２００８年５月に記録された第一の１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル（尿）及び健常ドナーの対照を示す。一方では、少なくとも４つのアルケナール（ノネナールなど）のシグナルが患者１の血液及び尿中に１０ｐｐｍの範囲で検出され、また、対照と比較した代謝産物の異常な識別パターンが７〜９ｐｐｍの範囲で示された。フェニルアラニン及びそれと関連する代謝物質、並びにヒスチジンの関連シグナルも検出された。
【００６６】
図４は、２００９年８月に記録された患者２のＮＭＲ−スペクトル（尿）（ＳＶ−ＵＲ１４１００９−ｄ２ｏ）を示す。２００８年５月の第一の患者のスペクトル（図３）との著しい類似点が観察された。芳香族アミノ酸と複素環は同じレベルである。脂肪族部分では、クエン酸塩対クレアチンの比は、約１である（図５）。
【図１】
2013528802.tif 000006
【図２】
2013528802.tif 000007
【図３】
2013528802.tif 000008
【図４】
2013528802.tif 000009
【図５】
2013528802.tif 000010
【国際調査報告】
2013528802.tif 000011
2013528802.tif 000012
2013528802.tif 000013