(57)【要約】本発明は、その必要な対象において、そして好ましくはヒト対象において、選択的にα４β１インテグリンヘテロ二量体に拮抗するための方法を提供する。本発明の方法は、生体適合性ポリマーに共有結合された２つ以上のα４β１低分子アンタゴニストを含むコンジュゲートを利用する。α４β１を選択的に阻害するこれらの方法は、少なくとも部分的にα４β１活性を通して媒介される正常なおよび病理学的な生物学的プロセスの両方を調節するために用いられ得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α４β７媒介性のトラフィッキングを実質的に保存しながらＣＮＳへのα４β１媒介性の白血球トラフィッキングによって媒介される疾患を治療するための、対象における式（Ｉ）の治療上有効な用量の使用。
【請求項２】
前記用量が約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記用量が、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記用量が約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記用量が約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
式（Ｉ）の前記化合物が前記対象に毎週投与される、請求項２、３、４または５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
式（Ｉ）の前記化合物が前記対象に毎月投与される、請求項２、３、４または５のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
式（Ｉ）の投与の前の前記対象の血流におけるｓＭＡｄＣＡＭレベルに比較して、前記対象の血流におけるｓＭＡｄＣＡＭレベルが投与後に７５％以上維持されるように式（Ｉ）の前記用量が選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
少なくとも部分的にα４β１活性を通じて媒介される生物学的プロセスを調節するための、対象における治療上有効量な用量のコンジュゲートの使用であって、ここで前記コンジュゲートが、生体適合性ポリマーに共有結合された２つ以上のα４β１低分子アンタゴニストを含み、かつここで前記コンジュゲートが、α４β７に対してよりもα４β１に対して２０〜１００倍大きい効力を有する、使用。
【請求項１０】
前記コンジュゲートが、α４β７に対してよりもα４β１に対して３０〜８０倍大きい効力を有する、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記コンジュゲートが式（Ｉ）の化合物を含む、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記コンジュゲートが、自己免疫疾患を有する対象に投与される、請求項９、１０または１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記コンジュゲートが、多発性硬化症を有する対象に投与される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記コンジュゲートが、炎症性疾患を有する対象に投与される、請求項９、１０または１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記コンジュゲートが、細胞増殖性障害を有する対象に投与される、請求項９、１０または１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
前記コンジュゲートが、移植片拒絶または移植片対宿主病を予防するために対象に投与される、請求項９、１０または１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
前記コンジュゲートが、傷害後の神経保護を促進するために対象に投与される、請求項９、１０または１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
前記コンジュゲートの投与の用量または間隔が、式（Ｉ）の投与の前の前記対象の血流中のｓＭＡｄＣＡＭレベルに比較して投与後に、前記対象の血流におけるｓＭＡｄＣＡＭのレベルを７５％以上維持するように選択される、請求項９、１０または１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
自己免疫疾患を有する対象の治療における、生体適合性ポリマーに対して共有結合された２つ以上のα４β１低分子アンタゴニストを含むコンジュゲートの治療上有効な用量の使用であって、前記コンジュゲートが、α４β７に対してよりもα４β１に対して２０〜１００倍大きい効力を有する、使用。
【請求項２０】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記用量が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
前記用量が、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記用量が、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記用量が、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２５】
前記コンジュゲートが、前記対象に毎週投与される、請求項１９、２０、２１、２２、２３または２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
式（Ｉ）の前記化合物が、前記対象に毎月投与される、請求項１９、２０、２１、２２、２３または２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
多発性硬化症を有する対象の治療における、生体適合性ポリマーに対して共有結合された２つ以上のα４β１低分子アンタゴニストを含むコンジュゲートの治療上有効な用量の使用であって、前記コンジュゲートが、α４β７に対してよりもα４β１に対して２０〜１００倍大きい効力を有する、使用。
【請求項２８】
前記用量が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記用量が、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記用量が、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記用量が、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３２】
式（Ｉ）の前記化合物が、前記対象に毎週投与される、請求項２７、２８、２９、３０または３１のいずれかに記載の使用。
【請求項３３】
前記コンジュゲートが、前記対象に毎月投与される、請求項２７、２８、２９、３０または３１のいずれかに記載の使用。
【請求項３４】
炎症性疾患を有する対象の治療における、生体適合性ポリマーに対して共有結合された２つ以上のα４β１低分子アンタゴニストを含むコンジュゲートの治療上有効な用量の使用であって、前記コンジュゲートが、α４β７に対してよりもα４β１に対して２０〜１００倍大きい効力を有する、使用。
【請求項３５】
前記用量が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記用量が、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇである、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記用量が、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇである、請求項３５に記載の使用。
【請求項３８】
前記用量が、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇである、請求項３５に記載の使用。
【請求項３９】
前記コンジュゲートが、前記対象に毎週投与される、請求項３４、３５、３６、３７または３８のいずれかに記載の使用。
【請求項４０】
前記コンジュゲートが、前記対象に毎月投与される、請求項３４、３５、３６、３７または３８のいずれかに記載の使用。
【請求項４１】
治療を必要とする患者の治療のための式（Ｉ）の使用であって、前記対象に対して、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇという式（Ｉ）の毎週用量または毎月用量を投与することを包含する、使用。
【請求項４２】
自己免疫疾患を有する患者の治療のための式（Ｉ）の使用であって、前記対象に対して、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇという式（Ｉ）の毎週用量または毎月用量を投与することを包含する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１０年４月３０日出願の米国特許仮出願第６１／３３０１２２号、２０１０年１０月１２日出願の米国特許仮出願第６１／３９２，２８８号、２０１１年４月８日出願の米国特許仮出願第６１／５１６，８４５号に対する優先権を主張し、その各々は全体として参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、インテグリンの選択的（選択性）阻害剤に、さらに具体的には、α４β１の選択的阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
以下の考察では、特定の物品および方法が、背景および導入の目的に関して記載される。本明細書には、先行技術の「承認」として解釈されるべきものは何も含まれていない。出願人は、本明細書に引用される物品および方法が、適用される法令の条項のもとで先行技術を構成しないということを必要に応じて実証する権利を明示的に保有する。
【０００４】
インテグリン受容体は、膜貫通性であり、１本のα鎖および１本のβ鎖からなる非共有結合したヘテロ二量体である。構造上の接着機能を果たすことに加えて、インテグリン受容体は、原形質膜を横切って細胞外シグナルを伝達する。インテグリン受容体α４β１（ＶＬＡ−４とも呼ばれる）は、以下の２つのタンパク質リガンドのいずれかとの結合によって細胞接着を媒介する：血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）（非特許文献１）、またはＩＩＩ型連結セグメント（ＣＳ−１）を含む、選択的にスプライシングされたフィブロネクチン改変体（非特許文献２）。プロトタイプのインテグリン受容体（それらのそれぞれのリガンドにおいてＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）トリペプチドを認識する）とは対照的に、α４β１は、ＶＣＡＭ−１におけるＧｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＱＩＤＳ）、およびフィブロネクチンにおけるＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（ＩＬＤＶ）を認識する。これらの配列は、保存されたＡｓｐ残基をＲＧＤと共有するが、それらは、それ以外は無関係である。
【０００５】
α４β１インテグリン受容体は、肥満細胞、単核白血球、好酸球、マクロファージおよび好塩基球の上で、高レベルで発現される（非特許文献３）。炎症の部位でのサイトカイン誘発性のＶＣＡＭ−１に対するα４β１の結合は、白血球／内皮細胞接着、続いて炎症組織への溢出を生じる（非特許文献４）。α４β１受容体のＶＣＡＭ−１との相互作用は、また骨髄間質細胞への幹細胞接着に重要な効果を発揮もする（非特許文献５）。
【０００６】
β１インテグリンを通じて媒介される細胞の接着および遊走は、細胞の動員プロセスの重要な構成要素である。インテグリンα４β１は、増殖因子およびサイトカインの産生、ならびにメディエーターの放出につながる、細胞活性化を支持する重要な共刺激性のシグナルをもたらす。細胞外マトリックスの認識を通じて、α４β１は、アポトーシスを阻害することによって活性化細胞の生存を増大する（非特許文献６）。
インテグリンは、種々のα成分およびβ成分を有し得るので、α４β１の一方または他方を攻撃する治療剤はまた、他のインテグリンの組み合わせも攻撃する。例えば、α４インテグリンサブユニットに選択的に結合する治療剤は、α４β１ヘテロ二量体およびα４β７ヘテロ二量体の両方に結合して調節する。多くの疾患状態に関して、ヘテロ二量体の組み合わせに選択的に結合する治療剤を有することが好ましい。なぜならこのような治療剤によれば、他のヘテロ二量体の結合から生じる有害事象の可能性なしに疾患状態とさらに適合した治療が得られるからである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｏｓｂｏｒｎ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ，１９８９，５９，１２０３
【非特許文献２】Ｗａｙｎｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９８９，１０９，１３２１
【非特許文献３】Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｐ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，３４，１７９
【非特許文献４】Ｃｈｕｌｕｙａｎ，Ｈ．Ｅ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１９９５，１６，３９１
【非特許文献５】Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ，１９９２，８０，３８８
【非特許文献６】Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５６，１８３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、α４β１インテグリンに選択的に結合し、α４β７を通じたシグナル伝達および／またはα４β７媒介性の関連の経路を利用するプロセスに対してほとんど影響がない化合物を用いる組成物、および治療の方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
この要旨は、詳細な説明において下にさらに記載される、選択された概念を簡略化された形式で導入するために提供される。この要旨は、特許請求される本発明の主題の重要または必須の特徴を特定するものではなく、特許請求される本発明の主題の範囲を限定するために用いるように意図されるものでもない。特許請求される本発明の主題の他の特徴、詳細、有用性および利点は、添付の図面に図示され、添付の特許請求の範囲に規定される態様を含む以下の書面による詳細な説明から明らかとなろう。
【００１０】
本発明は、必要としている対象、好ましくはヒト対象において、選択的にα４β１インテグリンヘテロ二量体に拮抗するための方法を提供する。本発明の方法は、生体適合性ポリマーに共有結合された２つ以上のα４β１低分子アンタゴニストを含むコンジュゲートを利用する。α４β１を選択的に阻害するこれらの方法は、少なくとも部分的にα４β１活性を通じて媒介される正常な生物学的プロセスおよび病理学的な生物学的プロセスの両方を調節するために用いられ得る。
【００１１】
従って、本発明は、対象における疾患の治療のためにα４β１ヘテロ二量体を選択的に阻害する化合物の使用に関する。このような疾患としては、限定するものではないが、炎症性疾患、自己免疫性疾患および細胞増殖性障害が挙げられる。本発明における使用のためのこのようなコンジュゲートの治療上有効な量は、種々の投与経路を通じて対象に提供されてもよく、かつ必要に応じて、薬学的に許容される担体とともに提供されてもよい。
【００１２】
特定の態様では、本発明は、以下の式（Ｉ）に示されるような化合物：
【化１】
2013525435.tif 000002
【００１３】
を含むコンジュゲート、ならびにこのような化合物の関連する薬学的に許容される塩、ラセミ混合物、ジアステレオマーおよびエナンチオマーを含むコンジュゲートの使用に関する。式（Ｉ）に示されるアルキレンオキシド
［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ］−  
反復ユニットの数が変化し、約１００〜１００，０００；好ましくは約２０，０００〜６０，０００（また約２０〜約６０キロダルトン（ｋＤａ）とも表わされる）；さらに好ましくは約３０，０００〜約５０，０００（すなわち約３０〜約５０ｋＤａ）の、コンジュゲート中の単一または複数のポリマー部分から生じるポリマーの総量の平均分子量を提供する。この種の合成有機ポリマーは多分散系であることが当業者には明白である。多分散系とは、本明細書に意図される長さのポリマー分子が、同じ種類のものでさえ、異なるサイズ（直鎖またはマルチアームのポリマーについての鎖の長さ）になるという事実を指す。従って、平均分子量は、平均する方法次第である。多分散性指数（ＰＤＩ）は分子量の変動の一般的な指標であり、数平均分子量に対する重量平均分子量の比である。ＰＤＩは、所与のポリマーサンプル中の分子量の分布の指標である。計算されたＰＤＩは、重量平均分子量を数平均分子量で割ったものである。これは、ポリマーのバッチにおける個々の分子量の分布を示す。本発明のコンジュゲートについて、ＰＤＩは、１より大きい値を有するが、ポリマー鎖が均一な鎖長に近づくと、ＰＤＩは、均一（１）に近づく。これは、ポリマーのバッチにおける個々の分子量の分布を示す。数平均分子量とは、ポリマーの分子量を決定する一つの方法である。数平均分子量は、個々のポリマーの分子量の一般的平均である。数平均分子量は、ｎ個のポリマー分子の分子量を測定すること、重量を合計すること、およびｎで割ることによって決定される。ポリマーの平均分子量は、浸透圧法、末端基滴定および束一性によって決定され得る。
【００１４】
重量平均分子量は、光散乱、小角中性子散乱（ＳＡＮＳ）、Ｘ線散乱、および沈降速度によって決定され得る。数平均に対する重量平均の比は、多分散性指数と呼ばれる。多分散性を有さないポリマーの理論的な試料は、１という多分散性指数を有するであろう。本発明の多分散性指数の好ましい範囲は、約１．１０〜約１．０５である。さらに好ましくは、約１．０５から市販の実現可能な合成の上限までの範囲であり、これは今まで約１．０２である。式Ｉのコンジュゲートはまた、米国特許出願公開第２００６００１３７９９号にも記載されており、その全体は参照によって援用される。
【００１５】
本発明における使用のためにさらに想定される他のコンジュゲート組成物としては、米国特許出願公開第２００６００１３７９９号に個々に記載されるような、２つ以上のα４β１特異的な低分子アンタゴニストおよび生体適合性ポリマーを含む特異的なα４β１選択性コンジュゲートが挙げられる。
【００１６】
一態様では、本発明は、ＣＮＳへのα４β１媒介性の白血球トラフィッキングを阻害し、一方ではα４β７媒介性のトラフィッキングを実質的に保持する式（Ｉ）の治療上有効な用量の使用を提供する。一態様では、式（Ｉ）の上記用量は、典型的には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇである。別の態様では、上記用量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇである。特定の態様では、上記用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇである。上記用量は好ましくは、毎週または毎月投与される。
【００１７】
本発明の別の態様では、生体適合性ポリマーに共有結合された２つ以上のα４β１低分子を含むコンジュゲートの治療上有効な用量の使用を提供し、ここでこのコンジュゲートが、少なくとも部分的にα４β１活性を通じて媒介される生物学的プロセスの調節において、α４β７に対してよりもα４β１に対して２０〜１００倍大きい効力を有する。好ましくは、このコンジュゲートは、式（Ｉ）の化合物のように、α４β７に対してよりもα４β１に対して３０〜８０倍大きい効力を有する。
【００１８】
本発明における使用のためのコンジュゲートおよび化合物は、限定するものではないが、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）、炎症性疾患、および細胞増殖性障害を含む、疾患および障害を含む、種々のα４β１媒介性の生物学的プロセスの調節のために利用され得る。
【００１９】
従って、本発明の１つの特定の態様では、本発明は、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、喘息、乾癬、炎症性腸疾患などの治療のための本発明のコンジュゲートおよび化合物の使用を提供する。
【００２０】
本発明の別の特定の態様では、本発明は、炎症性疾患、例えば、再狭窄およびアテローム性動脈硬化症の治療のための本発明のコンジュゲートおよび化合物の使用を提供する。
【００２１】
他の特定の態様では、本発明は、造血系列の細胞に関与する異常な増殖である、造血系の新生物、および特にＢ細胞悪性腫瘍のような細胞増殖性障害の治療のための本発明のコンジュゲートおよび化合物の使用を提供する。
【００２２】
本発明のさらに別の特定の態様では、本発明は、例えば、移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するためなどの、免疫抑制を促進するための本発明のコンジュゲートおよび化合物の使用を提供する。
【００２３】
さらに他の特定の態様では、本発明は、脊髄損傷のような損傷後の神経保護を誘導するための本発明のコンジュゲートおよび化合物の使用を提供する。
【００２４】
いくつかの態様では、本発明は、生体適合性ポリマーに共有結合された２つ以上のα４β１低分子アンタゴニストを含むコンジュゲートの治療上有効な用量の使用であってを提供し、このコンジュゲートは、自己免疫疾患を有する患者の治療において、α４β７に対してよりもα４β１に対して２０〜１００倍大きい効力を有する、使用が提供される。
【００２５】
他の態様では、本発明は、必要とする患者の治療のための式（Ｉ）の使用であって、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇという式（Ｉ）の毎週用量または毎月用量を患者に投与することを包含する、使用を提供する。
【００２６】
さらに他の態様では、本発明は、自己免疫疾患を有する患者の治療のための式（Ｉ）の使用であって、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇという式（Ｉ）の毎週用量または毎月用量を患者に投与することを包含する、使用を提供する。
【００２７】
本発明のこれらおよび他の態様および使用は、書面の詳細な説明にさらに詳細に、そして添付の図面に図示されるとおり記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】多価のα４β１リガンドと比較した、式（Ｉ）の化合物の競合的結合を図示する折れ線グラフである。
【図２】式（Ｉ）の化合物の、ｒｓ−ｈｕ−ＶＣＡＭ−１に対するα４β１依存性のＪｕｒｋａｔ（商標）の接着を撹乱する能力を示す折れ線グラフである。
【図３】式（Ｉ）の、ヒトリンパ球細胞（Ｊｕｒｋａｔ（商標）細胞株）のフィブロネクチン（ＦＮ）に対するα４β１依存性接着を阻害する能力を示す折れ線グラフである。
【図４】式（Ｉ）の、Ｊｕｒｋａｔ（商標）細胞上の活性化されたα４β１に対するヒト血清ＦＮの結合を阻害する能力を示す折れ線グラフである。
【図５】種々の用量のコンジュゲートを投与されているヒト対象における式（Ｉ）の血漿濃度を示す折れ線グラフである。
【図６】ヒト対象に対する種々の用量の式（Ｉ）投与後のリンパ球に対するα４β１およびα４β７の飽和レベルを示す折れ線グラフである。
【図７】ヒト対象のコホートに対する式（Ｉ）の０．５ｍｇ／ｋｇの用量の投与後の受容体の平均下方制御を示す棒グラフである。
【図８】ヒト対象に対する０．５ｍｇ／ｋｇの用量の式（Ｉ）投与後の個々の受容体の下方制御を示す棒グラフである。
【図９】種々の用量の式（Ｉ）での患者のリンパ球カウントを示す棒グラフである。
【図１０】患者における式（Ｉ）血漿濃度と相対的リンパ球カウントとの間の関係を図示する折れ線グラフである。
【図１１】種々の用量の式（Ｉ）でのα４β１およびα４β７の受容体占有率を図示する一連の折れ線グラフである。
【図１２】０．５ｍｇ／ｋｇの用量の式（Ｉ）でのα４β１およびα４β７の受容体飽和を図示する折れ線グラフである。
【図１３】０．５ｍｇ／ｋｇの用量の式（Ｉ）でのα４β１およびα４β７の正規化された受容体発現を図示する折れ線グラフである。
【図１４】１．０ｍｇ／ｋｇの用量の式（Ｉ）でのα４β１およびα４β７の受容体飽和度を図示する折れ線グラフである。
【図１５】図１５Ａおよび図１５Ｂは、式（Ｉ）の化合物およびＥＬＮ４７６０６３の両方についてα４β１およびα４β７の阻害レベルを図示する２つの折れ線グラフである。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｆは、式（Ｉ）が、可溶性のＶＣＡＭ−１（ｓＶＣＡＭ−１）および可溶性のＭａｄＣＡＭ−１（ｓＭａｄＣＡＭ−１）を示差的に下方制御することを示す一連の折れ線グラフである。
【図１７】図１７Ａおよび図１７Ｂは、血漿化合物レベルと、血漿ｓＶＣＡＭ−１およびｓＭＡｄＣＡＭ−１とが相関する棒グラフである。
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは、式（Ｉ）およびＥＬＮ４７６０６３によるｓＶＣＡＭ−１およびｓＭＡｄＣＡＭ−１の示差的な調節を図示する折れ線グラフである。
【図１９】円によって、および四角によって示した、種々のマウス組織における式（Ｉ）の化合物（四角）およびＥＬＮ４７６０６３（円）の放射能測定値をプロットする折れ線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
本明細書に用いられる用語は、当業者によって理解されるとおりの平易でかつ通常の意味を有するものとする。以下の定義は、本発明を理解するのに読者の助けとなるものであるが、特に示さない限りこのような用語の意味を変更もそうでなければ制限もするものではない。
【００３０】
「投与すること」という用語は、本明細書において用いる場合、本発明のコンジュゲートを含んでいる組成物による、記述される種々の障害の治療を包含する。「投与すること」という用語はまた、治療の経過の間異なる時点で複数の用量が提供される単一の用量および投薬計画を包含する。投薬計画の単一用量または複数用量のいずれかが他の活性剤と組み合わせた形態で投与されてもよい。
【００３１】
本明細書において用いる場合、「α４β１選択性（選択的）」という用語は、他のインテグリンヘテロ二量体よりも、特にα４β７よりもα４β１ヘテロ二量体に優先的に結合して調節する化合物を指す。本発明の方法における使用のためのα４β１選択性分子は、α４β７に対してよりもα４β１に対して、少なくとも２０〜１００倍大きい効力、さらに詳細には、α４β７に対してよりもα４β１に対して３０〜８０倍大きい効力によって特徴付けられる。
【００３２】
「自己免疫性疾患」という用語は、本明細書において用いる場合、内因性ペプチドに対して自己反応性である宿主組織または免疫エフェクター細胞と反応する抗体の産生によって特徴付けられる疾患および障害を指す。
【００３３】
「細胞増殖性障害」という用語は、本明細書において用いる場合、限定するものではないが、細胞の脱分化または制御されない細胞分裂を含む、異常な細胞増殖または細胞活性に関連する任意の疾患または障害を指す。
【００３４】
「免疫抑制」という用語は、本明細書において用いる場合、例えば、移植片もしくは移植物の拒絶を妨げるため、または自己免疫性疾患を制御するための、免疫応答の抑制を指す。
【００３５】
「炎症性障害」という用語は、本明細書において用いる場合、種々の細胞学的および化学的反応によって生じる組織の損傷または破壊によって特徴付けられる病理学的プロセスによって特徴付けられる任意の疾患または障害を指す。
【００３６】
「対象」という用語は、本明細書において用いる場合、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
【００３７】
「治療上有効な量」という用語は、本明細書において用いる場合、所望の生物学的応答または医学的応答を惹起するような本発明のコンジュゲートの量を意味する。
【００３８】
「処置する、治療する（ｔｒｅａｔ）」、「処置、治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置すること、治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの用語は、所望の病理学的な効果および／または生理学的な効果を得ることを指す。「治療」とは、本明細書において用いる場合、哺乳動物、具体的にはヒトにおいて所望の効果を達成するための任意の処置を包含し、そして以下を包含する：（ａ）疾患または生理学的影響を受け易い場合があるが、まだそれとは診断されていない対象でその疾患または生理学的影響が生じることを妨げること；（ｂ）疾患または生理学的影響を阻害すること、すなわち、その発生を止めること；ならびに（ｃ）疾患または生理学的影響を和らげること、例えば、退縮を生じること（例えば、疾患または生理学的影響の症状を完全にまたは部分的に除去するため）。治療の効果は、疾患、生理学的影響またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという観点から、または組織拒絶のような有害反応を妨げる生理学的状態を維持するのにおいて、予防的であり得る。この効果はまた、疾患もしくは生理学的な影響、および／またはこの疾患もしくは生理学的影響に起因する有害な影響に対する応答のために部分的もしくは完全な治癒という観点で治療的でもあり得る。
【００３９】
発明の詳細な説明
本明細書に記載される技術の実施は、別段示さない限り、当該分野の当業者の技術の範囲内である、有機化学、製薬化学、ポリマー技術、細胞生物学、生化学の従来の技術および説明を使用し得る。本発明の組成物を含む薬学的調製物の調製のための技術を含む、適切な技術の詳細な例示説明は、本明細書の詳細な説明および実施例を参照してなされ得る。しかし、当然ながら、他の等価な従来の手順もまた用いられてもよい。このような従来の技術および説明は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第３版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；およびＢｅｒｇら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．のような標準的な実験マニュアルで見出され得る。薬学的組成物を製剤する方法は、多くの刊行物、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，第２版，改訂増補版、第１−３巻，編集Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，第１−２巻、編集Ａｖｉｓら；ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，第１−２巻，編集Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら；発行Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．に記載されている。薬学的に許容される担体の説明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎが発行した「Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ．」に見出され得る。これらの刊行物の各々は、本発明における使用のためにその全体が参照によって援用される。
【００４０】
本明細書において、および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「１つの、ある（ａ、ａｎ：不定冠詞）」および「この、その（ｔｈｅ：定冠詞）」とは、文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の言及を含むことに注意のこと。従って、例えば、「ある賦形剤（ａｎ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」という言及は、１つ以上の賦形剤を指し、「この投与計画（ｔｈｅ  ｄｏｓａｇｅ  ｒｅｇｉｍｅ）」という言及は、当業者に公知の等価な工程および方法の言及を包含するなどである。
【００４１】
別段定義しない限り、本明細書に用いられる全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に言及される全ての刊行物は、現在記載される本発明と関連して用いられ得る機器、処方物および方法を記載および開示する目的のために、参照によって援用される。
【００４２】
ある範囲の値が示される場合、その範囲の上限と下限との間の各々の介在する値、およびその言及される範囲の任意の他の言及される値もしくは介在する値が、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、より小さい範囲に包含されてもよく、また言及される範囲における任意の特に排除された限界に依拠して本発明内に包含されてもよい。言及される範囲が、限界のうち１つまたは両方を包含する場合、それらの包含された限界の両方のいずれかを除外する範囲もまた本発明に包含される。
【００４３】
以下の説明では、多数の具体的な詳細が示されて、本発明のさらに充実した理解が得られる。しかし、本発明は、これらの具体的な詳細の１つ以上がなくても行われ得ることが当業者には明白である。他の場合、当業者に周知の特徴および手順は、本発明をあいまいにしないために、記載していない。
【００４４】
本発明の方法は、米国特許出願公開第２００６００１３７９９号に開示される特定のα４β１選択性アンタゴニストのようなα４β１選択性阻害剤の治療上有効な量を対象に投与することを包含する、その必要な対象におけるα４β１媒介性の障害の治療を提供する。本発明の好ましい態様は、式（Ｉ）の化合物の治療上有効な量を対象に投与することを包含する、その必要な対象においてα４β１媒介性の障害を治療するための方法である。
【００４５】
特定の態様では、この化合物の治療上有効な量とは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約３０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００４６】
α４β１選択性コンジュゲートを含む本発明の組成物は、限定するものではないが、経口、経鼻、肺、舌下、眼、経皮、直腸、膣および非経口（すなわち、皮下、筋肉内、皮内、静脈内など）を含む任意の従来の投与経路によって投与され得る。皮下、筋肉内または皮内という投与経路が好ましい。
【００４７】
経口、局所および非経口投与のための液体剤形における本発明の組成物の調製では、任意の通常の薬学的な媒体または賦形剤を使用してもよい。従って、液体の投与剤形、例えば、懸濁液（すなわち、コロイド、エマルジョンおよび分散物）および溶液のためには、適切な担体および添加物としては、限定するものではないが、薬学的に許容され得る湿潤剤、分散剤、凝集剤、増粘剤、ｐＨ調節剤（すなわち、緩衝液）浸透物質、着色剤、香料、芳香剤、防腐剤（すなわち、微生物増殖などを制御するため）が挙げられ、液体ビヒクルが使用されてもよい。非経口の処方物の場合は、無菌の非発熱性の液体ビヒクルが好ましい。全てではないが上記で列挙される成分が、各々の液体剤形に必要である。
【００４８】
例えば、再構成または吸入のための乾燥粉末、顆粒、カプセル、カプレット、ジェルキャップ、丸剤および錠剤（各々が、中間放出、時限放出および徐放性の処方物を含む）のような固体の経口調製物においては、適切な担体および添加物としては、限定するものではないが、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、流動促進剤、崩壊剤などが挙げられる。それらの投与が容易であるおかげで、錠剤およびカプセルは、最も有利な経口の単位剤形であり、この場合、固体の薬学的な担体が、明らかに使用される。必要に応じて、錠剤は、標準的な技術によって、糖コーティング、ゼラチンコーティング、フィルムコーティングまたは腸溶性コーティングされてもよい。
【００４９】
α４β１選択性コンジュゲートを含む組成物は、１単位剤形、例えば、錠剤、カプセル、粉末、注射液、茶さじ一杯などあたりに、本明細書に記載されるような有効用量を送達するのに必要な量のコンジュゲートを含む。
【００５０】
本明細書の薬学的組成物は、１単位剤形、例えば、錠剤、カプセル、粉末、注射用の滅菌溶液または懸濁液、坐剤などあたりに、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ（好ましくは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ；およびより好ましくは、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇ）を含み、そして所定の時間にわたって８０％を超えるα４β１受容体飽和を提供する用量で与えられ得る。投与量は、投与の間の時間間隔に依存する。
【００５１】
好ましくは、α４β１コンジュゲートを用いる、本発明に記載されるα４β１インテグリン媒介性の障害の治療のための方法は、週または月単位で行われ、式（Ｉ）の化合物の約０．０１ｍｇ／ｋｇ／週〜約１ｍｇ／ｋｇ／週；そして、より好ましくは、約０．２ｍｇ／ｋｇ／週〜約０．５ｍｇ／ｋｇ／週のコンジュゲート、または約０．５ｍｇ／ｋｇ／月〜約３ｍｇ／ｋｇ／月、それよりさらに好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ／月〜約２ｍｇ／ｋｇ／月のコンジュゲートを含んでいる、薬学的に許容される担体を含む剤形を用い、そして選択された投与方式に適切な任意の形態に構成されてもよい。しかし、この投薬量は、対象の要件、治療されている状態の重篤度、および特定の投薬計画に必要な時間の長さおよび滴定のスケジュールに依存して変化し得る。例えば、自己免疫疾患のような慢性疾患のため、または移植のための免疫抑制における使用のため、この投薬計画は、急性投与であっても、もしくは慢性投与であっても、または両方であってもよく、薬学的組成物は、このような長期投与に合った用量および薬学的賦形剤を用いて処方される。
【００５２】
有利には、本発明の方法における使用のための組成物は、単位剤形、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、再構成もしくは吸入のための乾燥粉末、顆粒、トローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）、非経口溶液または懸濁液のプレフィルドシリンジ、定量エアロゾルまたは液体スプレー、点滴、アンプル、自動注入装置または坐剤であって、経口、経鼻、舌下、眼内、経皮、非経口、直腸、膣、乾燥粉末インヘイラーまたは他の吸入もしくはガス注入手段による投与のためのものである。非経口溶液はまた、バルクのアンプルまたはバイアルで提供されてもよく、ここでは所望の量の薬物が、所望の間隔で投薬のために抜き取られてもよい。あるいは、この組成物は、低頻度の投与；例えば、２週毎の間隔（隔週）で、または１月に１回、または６週間の間隔に適切な形態で与えられてもよく、処方物（製剤）は、筋肉内注射のための皮下注射またはデポ調製物を得るように適合されてもよい。
【００５３】
錠剤のような本発明の方法で用いるための固体の薬学的組成物を調製するため、主要な活性成分を、薬学的な担体、例えば、従来の錠剤成分、例えば、希釈剤、結合剤、接着剤、崩壊剤、滑沢剤、抗接着剤および流動促進剤と混合する。適切な希釈剤としては限定するものではないが、デンプン（すなわち、加水分解され得る、コーンスターチ、コムギデンプンまたはジャガイモデンプン）、ラクトース（顆粒化、噴霧乾燥された、または無水）、スクロース、スクロースベースの希釈剤、デキストロース、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、微結晶性セルロース（すなわち、ＡＶＩＣＥＬ（商標）微結晶性セルロース、ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ））、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム二水塩、乳酸カルシウム三水和物などが挙げられる。適切な結合剤および接着剤としては、限定するものではないが、アカシアガム（ａｃａｃｉａ  ｇｕｍ）、グアーガム（ｇｕａｒ  ｇｕｍ）、ガムトラガカント（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ  ｇｕｍ）、スクロース、ゼラチン、グルコース、デンプン、およびセルロース誘導体類（すなわち、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなど）、水溶性または分散性の結合剤（例えば、アルギン酸およびその塩、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、ＴＹＬＯＳＥ（商標），Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｃｅｌａｎｅｓｅ，Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）、ポリエチレングリコール、多糖体酸類、ベントナイト類、ポリメタクリレート類およびアルファ化デンプン）などが挙げられる。適切な崩壊剤としては、限定するものではないが、デンプン（コーンスターチ、ジャガイモデンプンなど）、デンプングリコール酸ナトリウム、アルファ化デンプン、粘土（ケイ酸アルミニウムマグネシウム）、セルロース（例えば、架橋カルボキシルメチルセルロースナトリウムおよび微結晶性セルロース）、アルギン酸塩、アルファ化デンプン（すなわち、コーンスターチなど）、ガム（すなわち、寒天、グアーガム、イナゴマメ、カラヤゴム、ペクチン、およびガムトラガカント）、架橋ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００５４】
適切な滑沢剤および抗接着剤としては限定するものではないが、ステアリン酸塩（マグネシウム、カルシウムおよびナトリウムの塩）、ステアリン酸、タルク、ワックス、ステアロウエット（ｓｔｅａｒｏｗｅｔ）、ホウ酸、塩化ナトリウム、ＤＬ−ロイシン、カーボワックス（ｃａｒｂｏｗａｘ）４０００、カーボワックス（ｃａｒｂｏｗａｘ）６０００、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムなどが挙げられる。
【００５５】
適切な流動促進剤としては限定するものではないが、滑石（タルク）、コーンスターチ、シリカ（すなわち、ＣＡＢＯ−ＳＩＬ（商標）シリカ（Ｃａｂｏｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）ＳＹＬＯＩＤ（商標）シリカ（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ／Ｄａｖｉｓｏｎ）、およびＡＥＲＯＳＩＬ（商標）Ｄｅｇｕｓｓａ）などが挙げられる。甘味料および香味料を、歯で噛める固体剤形に添加して、経口剤形のおいしさを改善してもよい。さらに、着色剤およびコーティングを、薬物の特定を容易にするため、または審美的な目的のためにこの固体剤形に添加しても、塗布してもよい。これらの担体を、薬学的な活性剤と処方して、治療的な放出プロフィールを有する薬学的に活性な正確な適切な用量を得る。
【００５６】
一般に、これらの担体を、コンジュゲートと混合して、本発明における使用のためのコンジュゲートの均一な混合物を含む固体の予備処方組成物を形成する。一般には、予備処方は、以下の３つの共通の方法のうちの１つによって形成される：（ａ）湿式造粒法、（ｂ）乾式造粒法、および（ｃ）乾式混合法。これらの予備処方組成物を均一という場合、活性成分がその組成物全体にわたって均一に分散され、その結果この組成物が、錠剤、丸剤およびカプセルのような等しく有効な剤形に容易に小分割され得ることを意味する。次に、この固体予備処方組成物を、本発明の活性成分の約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを含む上記の種類の単位剤形に小分割する。新規な組成物を含有する錠剤または丸剤をまた、多層の錠剤または丸剤に処方して、徐放性製品を得てもまたは二重放出の製品を得てもよい。例えば、二重放出の錠剤または丸剤は、内側投薬成分および外側投薬成分を含んでもよく、その外側投薬成分は、内側投薬成分よりも外皮の形態である。この２つの成分は、胃での分解に抵抗することを助け、かつ内側成分が丸ごと十二指腸に通過するか、または放出が遅れることを可能にする、腸溶性層によって隔てられてもよい。種々の物質がこのような腸溶性の層またはコーティングのために用いられてもよく、このような物質としては、多数のポリマー物質、例えば、セラック、酢酸セルロース（すなわち、酢酸フタル酸セルロース、トリメリト酸酢酸セルロース）、ポリ酢酸ビニルフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸塩、およびアクリル酸エチルコポリマー類、メタクリル酸塩、およびメタクリル酸メチルコポリマー類などが挙げられる。徐放性の錠剤はまた、溶液（湿式造粒では結合剤として働く）中でわずかに溶解性もしくは不溶性の物質または低融点固体溶融型（湿式造粒では、活性成分を組み込み得る）を用いるフィルムコーティングまたは湿式造粒法によって作製されてもよい。これらの物質としては、活性成分を顆粒化するか、コーティングするか、封入するか、そうでなければ溶解度を制限して、放出の長いかまたは徐放性の製品を得るために用いられ得る、天然および合成のポリマー、ワックス、水素化油、脂肪酸およびアルコール（すなわち、蜜ろう、セチルアルコール、セチルステアリルアルコールなど）、脂肪酸のエステル、金属せっけん、および他の許容される物質が挙げられる。
【００５７】
本発明における使用のためのα４β１選択性コンジュゲートを含む液体型は、経口的にまたは注入による投与のために組み込まれ得る。これらの剤形としては、限定するものではないが、水溶液、適切に風味付けされたシロップ、水性もしくは油性の懸濁液、および綿実油、ゴマ油、ヤシ油またはピーナツ油のような食用油で風味付けされたエマルジョン、ならびにエリキシルおよび同様の薬学的ビヒクルが挙げられる。水性懸濁液のための適切な懸濁剤としては、合成および天然のガム、例えば、アカシアゴム、寒天、アルギン酸（すなわち、アルギン酸プロピレン、アルギン酸ナトリウムなど）、グアーガム、カラヤゴム、ローカストビーンガム、ペクチン、トラガカントガムおよびキサンタンガム、セルロース誘導体類、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、ならびにそれらの組み合わせ、合成ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、カルボマー（すなわち、カルボキシポリメチレン）、およびポリエチレングリコール；粘土、例えば、ベントナイト、ヘクトライト、アタパルジャイトまたはセピオライト；ならびに他の薬学的に許容される懸濁剤、例えば、レシチン、ゼラチンなどが挙げられる。適切な界面活性剤としては限定するものではないが、ドキュセートナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート、オクトキシノール−９、ノノキシノール−１０、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポリオキサマー１８８、ポリオキサマー２３５およびそれらの組み合わせが挙げられる。適切な解膠剤または分散剤としては、製剤等級のレシチン類が挙げられる。適切な凝集剤としては限定するものではないが、単純な中性の電解液（すなわち、塩化ナトリウム、カリウム、塩化物など）、高度に荷電された不溶性ポリマー類および多価電解質種、水溶性の二価または三価のイオン（すなわち、カルシウム塩、ミョウバンまたは硫酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩（ｐＨ緩衝液および凝集剤として処方物中で一緒に用いられ得る）が挙げられる。適切な防腐剤としては限定するものではないがパラベン（すなわち、メチル、エチル、ｎ−プロピルおよびｎ−ブチル）、ソルビン酸、チメロサール、四級アンモニウム塩、ベンジルアルコール、安息香酸、グルコン酸クロルヘキシジン、フェニルエタノールなどが挙げられる。液体の薬剤の剤形で用いられ得る多くの液体ビヒクルがあるが、特定の剤形で用いられる液体ビヒクルは、懸濁剤（単数または複数）と適合されなければならない。例えば、非極性の液体ビヒクル、例えば、脂肪酸エステルおよびオイル液体ビヒクルは、ＨＬＢ（親水性・親油性バランス）の低い界面活性剤、ステアラルコニウムヘクトライト、水不溶性樹脂、水不溶性フィルム形成ポリマーなどのような懸濁剤とともに用いるのが最も良い。逆に、極性の液体、例えば、水、アルコール、ポリオールおよびグリコールは、よりＨＬＢの高い界面活性剤、ケイ酸白土、ガム、水溶性セルロース誘導体類、水溶性ポリマーなどのような懸濁剤とともに用いるのが��も良い。非経口投与のためには、滅菌懸濁液および溶液が所望される。非経口投与のために有用な液体型としては、無菌の溶液、エマルジョンおよび懸濁液が挙げられる。静脈内投与が所望される場合、適切な防腐剤を一般には含む等張性調製物が使用される。適切な非経口の防腐剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、フェノキシエタノール、メチルパラベンまたはポリパラベンおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００５８】
一般には、式（Ｉ）の化合物は、必要に応じて適切な防腐剤を含んでいる、薬物溶液が注射されるかまたは注入される、組織または液体と適合性である生理学的に受容可能なｐＨで、無菌生理食塩水または緩衝化無菌生理食塩水中に溶解されてもよい。
【００５９】
α４β１選択性コンジュゲートはまた、小型の単層性小胞、大型の単層性の小胞、多層性の小胞などのようなリポソーム送達系の形態で投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、ホスファチジルコリンなどのような種々のリン脂質から形成され得る。
【００６０】
治療上有効な量のコンジュゲート薬物は通常、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇという投薬レベルで提供される。好ましくは、この範囲は、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ；そして最も好ましくは、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇである。有利には、本発明の化合物は、週に１回、隔週（ｂｉ−ｗｅｅｋｌｙ）または毎月の用量で投与されてもよく、または１日総投与量は、１日に２回、３回または４回の分割用量で投与されてもよい。
【００６１】
投与されるべき最適の投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして用いられる特定の化合物、投与方式、調製の強度、および疾患状態の進行によって変化する。さらに、対象の年齢、体重、食事および投与時間を含む、治療されている特定の対象に関連する要因によって、用量を適切な治療レベルに調節する必要性が生じる。
【００６２】
一般的な合成方法
本発明の方法における使用のためのα４β１選択性のコンジュゲートを、一般的な合成方法に従い、かつ実施例１にさらに詳細に図示されるように合成してもよい。このような実施例は、単に例示説明であって、本発明における使用のためのα４β１コンジュゲートの産生のための方法は、化学的反応および記載される条件によって限定されるべきではない。
【００６３】
α４β１選択性のコンジュゲートの成分は、薬学的に許容される塩の形態で提供され得る。医薬における使用のために、化合物の塩は、参照文献Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１９８６，３３，２０１〜２１７、およびＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９７（１月），６６，１，１）に開示される塩のような「薬学的に許容される塩」である。しかし、他の塩が、本発明のコンジュゲートにおいて用いられる化合物の調製に使用されてもよい。
【００６４】
本発明の化合物を用いる治療に適する疾患
本発明の方法は、α４β１インテグリンシグナル伝達を少なくとも部分的に介して媒介される種々の疾患、障害および生理学的効果の治療に有用である。
【００６５】
特定の態様では、本発明の方法は、自己免疫性障害を治療するために用いられる。集団の実質的にわずかが、自己免疫性疾患に罹患しており、この疾患は、慢性、消耗（衰弱）性および生命に危険がある場合が多い。自己免疫性疾患は、最大６５歳までの全ての年齢群の女性のうちで死亡の１０番目の主要な原因であると推定されている。参照によって本明細書に援用される、Ｎｏｅｌ  Ｒ．ＲｏｓｅおよびＩａｎ  Ｒ．ＭａｃＫａｙ，「Ｔｈｅ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」第４版の記載によれば、自己免疫によって生じる８０を超える疾患がある。このような疾患状態としては、例として、喘息、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、ＡＩＤＳ認知症、糖尿病（急性若年発症糖尿病を含む）、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病）、多発性硬化症、リウマチ関節炎、組織移植、腫瘍転移、髄膜炎、脳炎、脳卒中および他の脳外傷、腎炎、網膜炎、シェーグレン病、アトピー性皮膚炎、乾癬、心筋虚血および急性白血球媒介性肺損傷、例えば、成人呼吸窮迫症候群で生じるものが挙げられる。
【００６６】
特定の態様では、本発明の方法は、多発性硬化症を治療するために用いられる。「多発性硬化症」という用語は、本明細書において用いる場合、一次進行性多発性硬化症（ＰＰＭＳ）、二次進行性多発性硬化症（ＳＰＭＳ）および再発型多発性硬化症（ＲＦＭＳ）（再発寛解型多発性硬化症およびこの疾患の全ての他の再発型を包含する）を含むがこれらに限定されない、疾患の全ての状態を包含する。
【００６７】
他の態様では、本発明の方法は、炎症性疾患を治療するために用いられる。炎症性疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症および再狭窄（両方とも動脈血管に影響する）は、動脈の壁における慢性の炎症性応答から生じる。アテローム性動脈硬化症は、心血管系疾患の主要な原因であり、白血球の蓄積および連続的動員は、血栓症、心筋梗塞または発作をもたらす、破裂し易い「脆弱な」アテローム斑の発達と関連する。プラークマクロファージは、プラーク中のほとんどの白血球を占め、α４β１媒介性の相互作用を介して循環血液から動員された単球から分化されると考えられる。Ｗｏｏｌｌａｒｄ  ＫＪおよびＧｅｉｓｓｍａｎｎ  Ｆ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１０  Ｆｅｂ；７（２）：７７〜８６．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｊａｎ  １２。再狭窄、すなわち血管形成術のような介入後の炎症性応答は、冠動脈の再狭窄化を生じる。これは典型的には、血管形成術を行った患者の４０〜５０％で３〜６カ月内に生じて、心筋梗塞および虚血を含む、重大な病理をもたらす。
【００６８】
自己免疫性疾患および炎症性疾患の両方とも、ヒトの適応免疫系または生来の免疫系の異常な反応を通じて生じる。自己免疫では、患者の免疫系は、身体自体の細胞および／またはタンパク質に対して活性化される。炎症性疾患では、病理学は、免疫系の過剰反応およびその引き続く下流のシグナル伝達に起因する。これらのプロセスは、少なくとも部分的にα４β１シグナル伝達を通じて媒介され、従って、α４β１の選択的な阻害は、治療の介入において膨大な適用を有する。
【００６９】
本発明のコンジュゲートおよび組成物を用いて治療され得る、他の例示的な自己免疫性疾患および／または炎症性疾患状態としては、限定するものではないが、炎症性状態、例えば、結節性紅斑、アレルギー性結膜炎、視神経炎、ぶどう膜炎、アレルギー性鼻炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、脈管炎、ライター症候群、全身性エリテマトーデス、全身性進行性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、ウェーグナー肉芽腫症、大動脈炎、サルコイドーシス、リンパ球減少症、側頭動脈炎、心膜炎、心筋炎、うっ血性心不全、結節性多発動脈炎、過敏症候群、アレルギー、好酸球増加症候群、チャーグ・ストラウス症候群、慢性閉塞性肺疾患、過敏性肺炎、慢性活動性肝炎、間質性膀胱炎、自己免疫性内分泌腺不全、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性再生不良性貧血、慢性持続性肝炎および甲状腺炎が挙げられる。
【００７０】
他の態様では、本発明の方法が、細胞増殖性障害を治療するために用いられる。α４β１インテグリンは、能動的に治癒する血管および腫瘍関連血管の両方で見出されるＡ４Ｂ１およびフィブロネクチンに対する造血前駆細胞のホーミングを促進することが示されている。これらの前駆細胞は、腫瘍血管におけるα４β１の存在に起因して、腫瘍における能動的な血管形成の部位には向かうが正常な組織には向かわない。本発明の方法による組成物によるα４β１の遮断は、前駆細胞が血管へ固着すること、新規に形成された血管へ遊走すること、および異なる細胞種へ変化することを妨げ得る。従って、α４β１媒介性のホーミングプロセスを撹乱することは、腫瘍において新規な血管形成を抑制することにおいて有用である。
【００７１】
血液学的障害、および具体的には、白血病および多発性硬化症もまた、本発明の方法を用いる治療に適している。さらに具体的には、細胞増殖性障害とは、例えば、急性リンパ球芽性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である。
【００７２】
本発明の他の態様では、侵襲性白血球活性に関与する損傷によって生じる損傷のレベルを軽減するための方法が提供される。例えば、脊髄損傷（ＳＣＩ）によって生じる身体障害の程度は、最初の損傷後に好中球および単球／マクロファージのα４β１媒介性の髄腔内流入から部分的に生じる二次組織破壊に関連する。このような好中球および単球／マクロファージの流入を妨げる方法は、損傷された脊髄の酸化的活性を有意に低減し、生き延びたミエリン含有白質に関連する機能的回復を改善し得る。Ｆｌｅｍｉｎｇ  ＪＣら，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００８  Ｄｅｃ；２１４（２）：１４７−５９．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｍａｙ  １。損傷後の本発明の組成物でのα４β１の阻害および特に早期介入の方法は、神経保護的なストラテジーとして神経学的に重要であり得る。
【実施例】
【００７３】
以下の実施例は、本発明を実施および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するように示され、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定する意図ではなく、下の実験が行われた全ての実験または唯一の実験であることを示すもことを意図することでも、または意味するものでもない。多数の変形および／または改変が、広範に記載される本発明の趣旨もしくは範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示される本発明に対して行われ得るということが当業者には理解されるであろう。従って、本開示はあらゆる点において例示説明であって、限定ではないと解釈されるべきである。
【００７４】
用いられる数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証する労力を払ったが、ある程度の実験誤差および逸脱は、考慮されるべきである。他に示さない限り、部分は、重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、かつ圧力は大気圧または大気圧付近である。
実施例１
【００７５】
式（Ｉ）のコンジュゲートの生成
本発明の好ましい方法で用いられる式（Ｉ）の化合物は、以下の成分を用いて合成した：
【００７６】
４０ｋＤａの３−アームＰＥＧアルコール（０．２５ｇ、０．００６２５ｍｍｏｌ、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．Ｊａｐａｎ）および低分子阻害剤２−（３，３−ジメチル−１−（ピリジン−３−イルスルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）−３−（４−（２−オキソ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３（２Ｈ）−イル）フェニル）プロパン酸（０．０４ｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）と：一緒にトリフェニルホスフィン（０．０２５ｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）と。これらの成分を、トルエン（５ｍＬ）から共沸蒸留によって乾燥した。半分の容積を蒸留して（２．５ｍＬ）、その混合物を室温まで冷却した。ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）を添加して反応物を均一にした。ジエチルアゾジカルボキシレート（０．０１５ｍＬ、０．０９４ｍｍｏｌ）を滴下して、反応物を４８時間攪拌した。ＨＰＬＣ法Ｃによって、出発のＰＥＧアルコールの完全な消失が示された。反応物を真空中で濃縮して、ｔ−ブチルエステルを白色固体として得た。この得られたｔ−ブチルエステルは式（Ｉ）である。
【００７７】
ＥＬＮ４７６０６３と同様に、汎α４β１およびαβ７阻害剤のコンジュゲートは、低分子阻害剤をコンジュゲートすることによって作製され、２−（２−（ジエチルアミノ）−５−（１−オキソ−１−（ピロリジン−１−イル）ブタン−２−イル）ピリミジン−４−イルアミノ）−３−（４−（２−オキソ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３（２Ｈ）−イル）フェニル）プロパン酸を、上記の式（Ｉ）の化合物について記載されるような光延条件下でカップリングした。
【００７８】
低分子阻害剤を作製する詳細な方法は、米国特許出願公開第２００７００３７８０４号に示される。式（Ｉ）およびＥＬＮ４７６０６３などを含む薬物分子とのコンジュゲートを作製する詳細な方法は、その全てが、その全体として参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７００２１５５５号および同第２００８００３１８４８号に開示される。
実施例２
【００７９】
インビトロ効力の研究
式（Ｉ）の化合物の効力を、α４−依存性リガンド相互作用を独立して測定するいくつかのアッセイを用いて決定した、詳細には：１）式（Ｉ）の化合物がα４β１特異的な多価のリガンドの結合と競合する能力、２）ヒトＶＣＡＮ−１に対するヒトリンパ球細胞（Ｊｕｒｋａｔ（商標）細胞株）のα４β１依存性の接着の阻害；３）フィブロネクチンに対するヒトリンパ球細胞（Ｊｕｒｋａｔ（商標）ＴＭ細胞株）のα４β１依存性の接着の阻害；および４）Ｊｕｒｋａｔ（商標）細胞上の活性化されたα４β１に対するヒト血清ＦＮの結合の阻害。これらのアッセイの各々によって、α４β１結合に基づいて式（Ｉ）の効力が確認された。
【００８０】
多価の競合アッセイ
式（Ｉ）の効力を、α４β１特異的な多価のリガンドを用いてリンパ球結合競合アッセイで評価した。このリガンドは、α４β１に高い親和性を有するいくつかの低分子のための担体として機能する非特異的な抗体から構成される。この多価のリガンドは以下のとおり調製した。
【００８１】
非特異的な抗体を、非求核性の緩衝液中に溶解して、ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳで処理し、それによって、抗体の表面上でアスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩側鎖を活性化した。その後、α４β１インテグリンに対する結合について重要でない分子の領域における一次アミノ基を保有する、α４β１インテグリンの低分子阻害剤を、混合物に添加した。適切な期間にわたってコンジュゲーションの反応を進行させた後、その反応混合物を２−ヒドロキシエチルアミンの添加によってクエンチした。次いで、非特異的な抗体（現この段階で、低分子α４β１阻害剤の複数のコピーを提示している）を、透析によって低分子量の混入物から分離した。多価のリガンドは、Ｊｕｒｋａｔ（商標）細胞（α４β１インテグリンを提示する）に対して高い結合力を示し、この相互作用の競合は、極めて強力なα４β１阻害性の化合物の効力を識別するための手段である。従って、このアッセイは、式（Ｉ）分子の効力を特徴付けるために用いられる極めてストリンジェントなアッセイである。α４β１に対する式（Ｉ）の結合は、式（Ｉ）がヒトリンパ球上の多価のリガンドに置き換わる能力を示す競合結合アッセイによって実証された。
【００８２】
Ｊｕｒｋａｔ（商標）細胞を、室温で３０分間、１：４００に希釈した多価のリガンドの存在下で式（Ｉ）の滴定によってアッセイ緩衝液中でインキュベートした。次に、未結合の試薬をいくつかの洗浄工程によって除去し、この洗浄工程では、細胞をベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）卓上遠心分離機で、３００×ｇで５分間ペレットにし、次いで新鮮な緩衝液中に再懸濁した。残りの結合した抗体多価リガンドを、細胞とＧｏａｔ  Ｆ（ａｂ）’２抗−マウスＩｇＧ（Ｆｃ）−フィコエリトリン（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ  ＣＡ）と３０分間、４℃でインキュベートすること、続いて、洗浄およびＦＡＣＳ分析によって検出した。
【００８３】
式（Ｉ）の化合物は、多価のリガンドの結合の有意な置換を示した。この阻害は、再現性であって、試験されたロット間で一致し（図１を参照のこと）、ここで分子は１８．８ｎＭおよび１７．７ｎＭのＩＣ５０を示した。式（Ｉ）の効力は、異なる種からの１００％の血清の存在下で変わらず、このことは、式（Ｉ）が血清タンパク質に結合しなかったことを示す（データ示さず）。
【００８４】
α４β１依存性の接着：ｒｓ−ｈｕ−ＶＣＡＭ−１に対するＪｕｒｋａｔ（商標）の接着
Ｊｕｒｋａｔ（商標）リンパ腫Ｔ細胞は、高レベルのα４β１インテグリンを発現し、かつＶＣＡＭ−１に対してα４インテグリン−依存性の方式で強力に接着する。この接着の阻害を評価するためのアッセイをまた用いて、式（Ｉ）の分子の効力を決定した。式（Ｉ）が接着を妨げる能力を、式（ＩＩＩ）（式（Ｉ）の単一の低分子成分）、および抗−α４抗体である２１／６での阻害と比較した。
【００８５】
９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９０）を、ＰＢＳ＋＋（ＰＢＳ＋１ｍＭのＣａＣｌ２＋１ｍＭのＭｇＣｌ２）中で０．２５μｌ／ウェルで用いてｒｓ−ｈｕ−ＶＣＡＭ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）でコーティングして、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，１４０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＣａＣｌ２，１ｍＭのＭｇＣｌ２および０．３％のＢＳＡ）を用いて３０分間室温でブロックし、アッセイ緩衝液を用いて３回洗浄した。蛍光的に標識したＪｕｒｋａｔ（商標）細胞（カルセインフルオレセイン色素，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、９６ウェルのＦｌｅｘｉＰｌａｔｅ（Ｆａｌｃｏｎ３５３９１１）のウェルに対して、アッセイ緩衝液中で１０５細胞／ウェル（最終容積：１００μｌ／ウェル）で添加した。種々の濃度のコンジュゲート、化合物または抗体の添加後、細胞を３０分間室温でインキュベートした。次いで細胞を、ｒｓ−ｈｕ−ＶＣＡＭ−１コーティングしたプレートに移して、３０分間室温で結合させた。このプレートを、アッセイ緩衝液を用いて３回洗浄して、蛍光を読んだ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  ｓｅｒｉｅｓ  ４０００，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
【００８６】
式（Ｉ）は、０．５ｎＭというＥＣ５０値でヒトＶＣＡＭ−１に対するＪｕｒｋａｔ（商標）細胞のα４β１依存性の接着を強力に阻害した（図２）。興味深いことに、式（Ｉ）の化合物について３つのα４β１アンタゴニスト低分子が存在するが、式（Ｉ）は、式（ＩＩＩ）よりも２３倍強力であるようであった（それぞれ、０．５ｎＭ対１１．６ｎＭというＥＣ５０）。
【００８７】
α４β１依存性接着：ヒトフィブロネクチンに対するＪｕｒｋａｔ（商標）細胞の接着
Ｊｕｒｋａｔ（商標）細胞は、μ４β１−依存性の方式でフィブロネクチン（ＦＮ）に接着する。式（Ｉ）、式（ＩＩＩ）および抗−α４抗体である２１／６を用いるこの接着の阻害をまた用いて、式（Ｉ）の分子の効力を決定した。
【００８８】
９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５９０）を、フィブロネクチン（ＦＮ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を０．６μｇ／ウェルでＰＢＳ＋＋（ＰＢＳ＋１ｍＭのＣａＣｌ２＋１ｍＭのＭｇＣｌ２）中で用いて一晩４℃でコーィングした。次いで、このプレートを、アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．３％のＢＳＡ）を用いて３０分間室温でブロックして、アッセイ緩衝液を用いて３回洗浄した。蛍光的に標識したＪｕｒｋａｔ（商標）細胞（カルセイン蛍光色素，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃ−１４３０（製造手順に従って用いた））を、９６ウェルのＦｌｅｘｉＰｌａｔｅ（Ｆａｌｃｏｎ  ３５３９１１）のウェルに１０５細胞／ウェル（最終容積：１００μＬ／ウェル）のアッセイ緩衝液および１０μｇ／ｍＬのＴＳ２／１６抗体（α４β１を活性化するβ１インテグリンに対する）に添加した。α５インテグリンに対する５μｇ／ｍＬの阻害性抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を、緩衝液に添加して、ＦＮに対するα５−依存性の接着を妨げる。種々の濃度での化合物または抗−α４抗体（２１／６，ＧＧ５／３，またはＨＰ２／１）の添加後、その細胞を通常の氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、ＦＮでコーティングしたプレートに移して、３５分間室温で結合させた。そのプレートを、アッセイ緩衝液を用いて３回洗浄し、蛍光を読み取った（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４０００）。
【００８９】
ＦＮおよびα４β１の相互作用は、ＶＣＡＭ−１アッセイにおける９．７ｎＭからＦＮアッセイにおける１．１ｎＭまでの２１／６のＥＣ５０のシフトによって示されるようにＶＣＡＭ−１相互作用よりもストリンジェントではない（図３を参照のこと）。式（Ｉ）は、その低分子成分（０．１ｎＭ）と同様に０．２ｎＭというＥＣ５０でＦＮの接着を阻害した。式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の２つの化合物は、極めて強力な化合物であり、従ってアッセイの感度に達し、効力の相違は、もはや測定できない。
【００９０】
ヒト血清におけるα４β１ＦＮ捕捉アッセイ
Ｊｕｒｋａｔ（商標）細胞の表面上のα４β１受容体は、溶液中で、血清中に存在する内因性のＦＮを捕捉し得る。この一価の相互作用の阻害もまた、式（Ｉ）の効力の評価として用いた。
【００９１】
対数期のＪｕｒｋａｔ（商標）細胞を、以下の条件下で９６ウェルのＦｌｅｘｉＰｌａｔｅ中でインキュベートした：５０％のヒト血清、２×（２０μｇ／ｍｌ）のα５インテグリンに対する阻害性抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）および２×の化合物または抗体をある範囲の濃度で含有する、アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．３％のＢＳＡ）の中で、１０５個の細胞／５０μｌ／ウェルにおいて、室温で３０分間。５０％のヒト血清、抗体１５／７（２×、２０μｇ／ｍｌ）およびＭｎＣｌ２（２×、３ｍＭ）を含有する等体積のアッセイ緩衝液を次に各々のウェルに添加した。これらの試薬は、α４インテグリン活性化剤として働き、受容体が血清からＦＮを捕捉することを可能にする。次いで、このプレートを室温でさらに３０分間インキュベートした。次いで細胞を冷たいアッセイ緩衝液で２回洗浄し、ニワトリ抗−ヒトＦＮ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐａｌｏｓ  Ｖｅｒｄｅ，ＣＡ）を１５μｇ／ｍＬとともに冷たいアッセイ緩衝液中で、３０分間氷上で、暗所でインキュベートした。次いで細胞を１回洗浄して、ＦＡＣＳ分析のために３００μｌの冷アッセイ緩衝液中に再懸濁した（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）。
【００９２】
式（Ｉ）は、０．０５ｎＭというＥＣ５０で５０％のヒト血清中でＦＮ捕捉を阻害した（図４）。このアッセイでは、式（ＩＩＩ）は、式（Ｉ）よりも依然として強度が劣るがわずか２．６倍の差であった（ＶＣＡＭ−１の接着アッセイで観察される２３倍の相違とは異なる）。式（Ｉ）は、抗−α４抗体２１／６よりも約６倍強力であった（ＥＣ５０＝０．３２ｎＭ）。このアッセイは、受容体と一価の可溶性リガンドとの相互作用を測定しており、多価の相互作用に関与するＶＣＡＭ−１接着アッセイよりもストリンジェンシーが低い。
実施例３
【００９３】
インビトロの選択性の研究
式（Ｉ）を、その特異性を特徴づけるために、α４β１以外のインテグリンに依存性であるいくつかの細胞接着アッセイにおいて、およびα９β１（α４β１に最も密接に関連するインテグリン）での多価のリガンドアッセイにおいて試験した。式（Ｉ）の特異性を、４つの非−α４β１インテグリン−依存性アッセイにおいてその活性を検査することによって評価した：１）Α４β７に対するα４β７−依存性の接着；２）ＩＣＡＭ−１に対するαＬβ２（ＬＦＡ−１）−依存性の接着；３）ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）に対するα５β１−依存性の接着；および４）α９β１細胞上の多価の競合。これらを下のように各々簡略に記載する。
【００９４】
α４β７−依存性の接着：Α４β７−Ｆｃに対する８８６６細胞の接着
９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５９０）のウェルを、ヒトＦｃに対するマウス抗体（Ｓｉｇｍａ．Ｉ−６２６０）を用いて、それらを、Ｈ／Ｓ＋＋（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，１４０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＣａＣｌ２，１ｍＭのＭｇＣｌ２）に含有される１：３００希釈の抗体とともに室温で１時間インキュベートすることによってコーティングした。このプレートを、アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，１４０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＣａＣｌ２，１ｍＭのＭｇＣｌ２および０．３％のＢＳＡ）を用いて室温で１時間ブロックし、次いで同じ緩衝液で３回洗浄した。次に、アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，１４０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＣａＣｌ２，１ｍＭのＭｇＣｌ２および０．３％のＢＳＡ）中に含まれる組み換えヒトΑ４β７−Ｆｃをこのウェルに３０ｎｇ／ウェルで添加して、４℃で一晩インキュベートした。次いでそのプレートを、アッセイ緩衝液中で３回洗浄した。蛍光的に標識した８８６６細胞（カルセイン蛍光色素，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ．Ｃ−１４３０（製造業者の手順に従って用いた））を、アッセイ緩衝液中で１０５細胞／ウェル（最終容積：１００μｌ／ウェル）で９６ウェルのＦｌｅｘｉＰｌａｔｅ（Ｆａｌｃｏｎ３５３９１１）のウェルに添加した。種々の濃度の化合物または抗−α４抗体（２１／６，ＧＧ５／３またはＨＰ２／１）の添加後、細胞を室温で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をΑ４β７−Ｆｃでコーティングしたプレートに移して、室温で３０分間結合させた。このプレートを、アッセイ緩衝液を用いて３回洗浄して、蛍光を読み取った（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  ｓｅｒｉｅｓ  ４０００，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
【００９５】
αＬβ２依存性接着：ＩＣＡＭ−１−Ｆｃに対する８８６６細胞の接着
９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５９０）を、マウス腹水抗−ＨｕＦｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて１：３００で、Ｈ／Ｓ＋＋中で、室温で１時間コーティングした。このプレートを、アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２および０．３％のＢＳＡ）を用いて室温で１時間ブロックして、同じ緩衝液で３回洗浄し（ｒヒト−ＩＣＡＭ−１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，７２０−ＩＣ）、次いでアッセイ緩衝液中で４０ｎｇ／ウェルで、４℃で一晩捕捉して、このプレートをアッセイ緩衝液中で再度３回洗浄した。カルセインで標識した８８６６細胞（アッセイ緩衝液（最終容積：１００μｌ／ウェル）中で１０５個の細胞／ウェル）を、５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡとともに、およびある濃度範囲の化合物とともに、９６ウェルＦｌｅｘｉＰｌａｔｅ中で、室温で３０分間、予備インキュベートした。抗−αＬβ２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５５３８１）を１０μｇ／ｍＬでまた、正の対照として用いて、αＬβ２−依存性結合を阻害した。次いで、細胞をＩＣＡＭ−１−Ｆｃでコーティングしたプレートに移して、３７℃で３５分間５％のＣＯ２（インキュベーター）結合させた。このプレートを、アッセイ緩衝液を用いて３回洗浄して、蛍光を読み取った（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  ｓｅｒｉｅｓ  ４０００）。
【００９６】
α５β１依存性接着：ヒトＦＮに対するＴＨＰ−１細胞の接着
９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５９０）を、ＰＢＳ＋＋（ＰＢＳ＋１ｍＭのＣａＣｌ２＋１ｍＭのＭｇＣｌ２）中に含まれる、ＦＮ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を０．６μｌ／ウェルで用いて４℃で一晩コーティングした。次いで、このプレートを、アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．３％のＢＳＡ）を用いて室温で３０分間ブロックし、アッセイ緩衝液を用いて３回洗浄した。カルセイン標識したＴＨＰ−１細胞（アッセイ緩衝液中で１０５細胞／ウェル（最終容積：１００μＬ／ウェル））を、９６ウェルのＦｌｅｘｉＰｌａｔｅ中で、１０μｇ／ｍＬ（２１／６）、１０μｇ／ｍｌ（ＴＳ２／１６）中で、およびある濃度範囲の化合物とともに、室温で３０分間、予備インキュベートした。抗−α５抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）も５μｇ／ｍＬで、正の対照として用いてα５β１依存性の結合を阻害した。次いで、細胞をＦＮコーティングしたプレートに移して、室温で３０分間結合させた。このプレートを、アッセイ緩衝液を用いて３回洗浄して蛍光を読み取った（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  ｓｅｒｉｅｓ  ４０００）。
【００９７】
α９β１に対する競合結合
対数期のＳＷ４８０−発現性α９β１細胞を、以下の条件下で９６ウェルのＦｌｅｘｉＰｌａｔｅ（Ｆａｌｃｏｎ  ３５３９１１）中でインキュベートした：アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２および０．３％のＢＳＡ）中で１０５細胞／１００μＬ／ウェル、および無関係のマウス抗体に対してコンジュゲートされたα９β１に対して選択的に結合する低分子。α９β１結合因子は、そのＥＣ９０濃度（１：４００希釈）で提供し、および式（Ｉ）は、ある範囲の濃度で提供した。インキュベーションは、室温で３０分間行った。次いで未結合の試薬をアッセイ緩衝液中で２回の洗浄によって除去した。残りの結合したα９β１結合性の分子を、アッセイ緩衝液中で、１：２００希釈で用いたヤギＦａｂ’２抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）−ＰＥ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）によって、３０分間、氷上で、暗野で検出した。次いで細胞を１回洗浄して、ＦＡＣＳ分析のために３００μｌの冷アッセイ緩衝液中に再懸濁した（Ｂｅｃｔｏｎ−  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）。
【００９８】
結果
式（Ｉ）は、αＬβ２（ＬＦＡ−１）およびα５β１インテグリンに対して測定可能な活性を有さず、α４β７およびα９β１に対しては測定可能な活性を有し、これはそれぞれ３８ｎＭおよび５１ｎＭというＥＣ５０であった。α９β１に対する式（Ｉ）の効力は、α４β１に関するその効力の３倍内であった（平均ＭＶ競合のＥＣ５０がα４β１＝１６．５ｎＭ、対、ＥＣ５０がα９β１＝５１ｎＭ）。結果を表１にまとめる。
【００９９】
式（Ｉ）によって、α４β７よりもα４β１の活性の７５倍優先的な阻害；α９β１に対して軽度の交差反応性（これは、α４とα９との間の相同性、および重複するリガンドに基づけば予想外ではない）；ならびにαＬβ２（ＬＦＡ−１）およびα５β１インテグリンに対する活性がないということが示された。表１は、特異性のデータをまとめる：
【０１００】
【表１】
2013525435.tif 000003
実施例４
【０１０１】
α４β１選択性コンジュゲートを用いるヒトの薬物動態
式（Ｉ）のα４β１選択性化合物の血漿の薬物動態挙動を評価した。
【０１０２】
１８〜４５歳の健康なヒト被験者を、この研究に登録した。３９人の健常な男性および女性（年齢１８〜４５歳）（包含）を、この研究に登録した。被験者を、６つのコホートに分けて、被験者にそれぞれ、式（Ｉ）の化合物を０．０５、０．１、０．２、０．５、１．０および２．０ｍｇ／ｋｇ投与した。末梢静脈血サンプルを、各々の被験者から直接の静脈穿刺によって採取試験管に採取した。４．０ｍｌの血液試料を、以下の時点で式（Ｉ）のコンジュゲートの血漿濃度の測定のためにヘパリンナトリウム中に各々の被験者から採取した：投与前、投与の２、４、８、１２、１６、２４、３０、３６、４８、７２、９６、１２０、１６８、２４０、３３６、５０４、６７２、１４４０、および２１６０時間後。液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）検出を用いて、コンジュゲートを投与された被験者での式（Ｉ）の血漿濃度を決定した。これらの結果のまとめを図５に示す。
【０１０３】
式（Ｉ）の定量下限（ｌｏｗｅｒ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）（ＬＬＯＱ）は、１０．０ｎｇ／ｍＬであって、検量線は、１０．０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲にわたって許容できた。非コンパートメントの薬物動態（ＰＫ）パラメーターは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ５．２ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて算出した。表２は、最初の５つのコホートについての予備的ＰＫパラメーター評価のまとめである。
【０１０４】
【表２】
2013525435.tif 000004
【０１０５】
コホート１（０．０５ｍｇ／ｋｇ）について全ての時点で、式（Ｉ）の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬというＬＬＯＱ未満で維持された。この群に関してＰＫパラメーター評価は行わなかった。式（Ｉ）の露出は、０．１、０．２、０．５、１．０および２．０ｍｇ／ｋｇの用量群について期待される様式よりも大きく増大した。排出半減期は、濃度対時間曲線の非線形の性質のため、評価が困難である。
【０１０６】
要約すると、式（Ｉ）の皮下（ＳＣ）投与後、ＡＵＣは、用量比例様式よりも大きく増大し、これは式（Ｉ）の排出半減期の用量関連性の延長から生じた。Ｃｍａｘはまた、予想される様式よりも大きく増大した。式（Ｉ）のＰＫ挙動は、用量の増大に伴う全身クリアランスおよび見かけの分布容積の減少によって特徴付けられた。最初の研究によって、１週あたり０．２〜０．５ｍｇ／ｋｇおよび１月あたり１．０〜２．０ｍｇ／ｋｇという式（Ｉ）についての好ましい投与範囲が支持される。
実施例５
【０１０７】
インテグリン受容体飽和アッセイ
末梢血リンパ球を、実施例４に記載されるヒト臨床試験の６つのコホートの血液サンプルから採取して、α４β１およびα４β７受容体の飽和パーセンテージならびに総α４受容体数について分析した。
【０１０８】
α４β１インテグリン飽和、α４β７インテグリン飽和、ならびに総α４受容体数を、採取した循環のリンパ球で決定した。２ｍｌの溶解緩衝液を各々の試験管に添加し、その試験管を２〜４秒間ボルテックスした。それらを再度２〜８℃で１３〜１７分間インキュベートして、光に対する暴露を低減するためにアルミニウムホイルでカバーした。このようなインキュベーションの終わりに、細胞をボルテックスして、２２００ｒｐｍで５分間、４〜１５℃で遠心分離した。上清を、吸引して廃棄し、そのペレットを０．５ｍｌのオルト固定溶液［ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）中の１％のホルムアミド（ｐＨ７．６）］に再懸濁し、式（Ｉ）の１３×溶液および１５／７または２Ｇ３の１３×溶液を、１×ＰＢＳ中にＦＢＳの５％（容積）を含むアッセイ培地中で提供した。
【０１０９】
α４β１インテグリン飽和アッセイを、式（Ｉ）がヘテロ二量体に結合するとき、インテグリンのβ鎖における高次構造変化を認識する、リガンド誘導性の結合部位抗体である１５／７を用いて行った。この立体構造変化によって、マウス抗ヒト抗体によって認識されるエピトープが明らかになった。フィコエリトリン標識したロバ抗マウスＩｇＧを、レポーターとして用いた。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメトリーを用いるフローサイトメトリー分析（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を行って、飽和パーセントを評価して、過剰の式（Ｉ）を血液サンプルの異なるアリコートに添加して、１００％の飽和を決定した。ｍＡｂ１３（β１インテグリン鎖に対する市販のラットモノクローナル抗−ヒト抗体）を、血液の異なるアリコートに添加して、０％の飽和を得た。ｍＡｂ１３ｍは、１５／７の結合を無効にして、これを用いて、α４β１アッセイのためのベースラインを確立した。
【０１１０】
α４β７インテグリン飽和アッセイを、インテグリンのβ７鎖に選択的に結合する抗体２Ｇ３を用いて行った。全血を、ヘパリンナトリウムの試験管に収集して、式（Ｉ）を、血液のアリコートに２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加して、飽和したサンプルを調製した。式（Ｉ）を、血液のアリコートに５μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加して、バックグラウンドのためのサンプルを調製した。次いで、式（Ｉ）を含まない試験アリコートを２Ｇ３で処理して、リンパ球に対する式Ｉの結合を、Ｆ（ａｂ’）２抗−マウスＩｇＧＰＥを用いて検出して、結合した２Ｇ３を検出した。阻害性モノクローナル抗体ＦＩＢ２７（β７インテグリン鎖に対する市販のモノクローナル抗−ヒト抗体）を、血液の異なるアリコートに添加して、０％の飽和を得た。ＦＩＢ２７は、２Ｇ３の結合を無効にし、これを用いてα４β７アッセイのためのベースラインを確立した。
【０１１１】
リンパ球のＰＥ蛍光を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーターを用いて分析して、平均の蛍光強度（ＭＦＩ）を、これらのアッセイの両方において、試験サンプルについて、バックグラウンドおよび飽和を決定した。
【０１１２】
α４β１およびα４β７の両方の飽和パーセントを、試験サンプル測定値から決定したバックグラウンド測定値を差引きすること、これを飽和レベル測定値からバックグラウンド測定値を引いたもので割ること、およびこの割った数に１００を掛けることによって算出した。
【０１１３】
全ての投薬において、β１受容体の７０〜１００％飽和が生じたが、コホート４〜６では、飽和は最大１４日間持続した（図６を参照のこと）。対応して、α４受容体の総数は、全ての投薬レベルで減少した（データ示さず）α４β７の飽和のパーセンテージは、コホート４（０．５ｍｇ／ｋｇ）で開始して検討した。この用量およびより高用量では、α４β７の飽和は、８０％以上であった。α４β１およびα４β７の受容体占有率は、２週以上の間０．５ｍｇ／ｋｇ以上の投薬で匹敵すると考えられる。α４β１飽和は、α４β７飽和よりも長く持続する（０．５ｍｇ／ｋｇで；より低用量は、α４β７飽和については試験しなかった）。
実施例６
【０１１４】
式（Ｉ）でのヒト対象の治療後のインテグリン受容体下方制御
末梢血液リンパ球を、実施例４に記載のように０．５ｍｇ／ｋｇを投与されているヒトコホートから収集した。１０μｌの９Ｆ１０−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）（ヒトα４インテグリンと交差反応するマウス抗α４インテグリン抗体）を、総抗α４下方制御の決定のために試験管に添加して、その試験管を約２秒間ボルテックスした。次いでこの試験管を２〜８℃で３０〜５０分間インキュベートした。
【０１１５】
２ｍｌの溶解緩衝液を、各々の試験管に添加して、その試験管を２〜４秒間ボルテックスした。それらを再度、２〜８℃で１３〜１７分間インキュベートして、アルミニウムホイルでカバーして、曝光を低減した。このようなインキュベーションの終わりに、細胞をボルテックスして、４〜１５℃で、２２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その上清を吸引して廃棄し、ペレットを０．５ｍｌのオルトの固定溶液（Ｏｒｔｈｏ’ｓ  ｆｉｘａｔｉｖｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）［ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）中に１％のホルムアルデヒド（ｐＨ７．６）］の中に再懸濁する。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、９Ｆ１０−ＰＥの結合について決定して、同じサンプルの０時点のＭＦＩ（ベースライン）に対して正規化して、受容体の下方制御％を算出した。α４β１およびα４β７についてのＭＦＩは、実施例４に記載の１５／７または２Ｇ３抗体アッセイからの正規化ＭＦＩを用いて決定した。
【０１１６】
式（Ｉ）の０．５ｍｇ／ｋｇの投薬量を投与されているヒト臨床試験コホートにおける受容体下方制御の結果を図７および８に示す。図７は、このコホート内の平均の下方制御を示し、図８は、この投薬量を投与されている個人からの結果を示す。総α４およびα４β１受容体の下方制御は相関した。有意なα４β７受容体下方制御は観察されなかった。
実施例７
【０１１７】
リンパ球カウントおよび受容体の占有に対する式（Ｉ）の投与量の影響
ヒト対象における種々の投与量の式（Ｉ）の生理学的影響を、従来のα４標的化治療剤Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ（Ｔｙｓａｂｒｉ（商標））の影響と比較した。ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）（Ｔｙｓａｂｒｉ（商標））は、α４β１およびα４β７の両方に結合して調節する抗−α４抗体である。
【０１１８】
末梢血液リンパ球を、実施例４に記載のように、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇまたは２．０ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与されている種々のヒトコホートから収集し、リンパ球カウントをベースラインの割合として、初回の投与後６日目に測定した。末梢静脈血サンプルは、各々の対象から直接静脈穿刺によって収集試験管中に吸引した。４．０ｍｌの血液サンプルを各々の対象から収集した。リンパ球のレベルは、標準的な臨床プロトコールによって測定した。
【０１１９】
図９は、式（Ｉ）の種々の投薬量での患者リンパ球を示す棒グラフであり、図１０は、患者の式（Ｉ）の血漿濃度と相対リンパ球カウントとの間の関係を図示する折れ線グラフである。これらの投与量群の各々が、匹敵するレベルのナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）（Ｔｙｓａｂｒｉ（商標））を投与されている患者に比較して低レベルのリンパ球カウンがを示された。
実施例８
【０１２０】
受容体飽和に対する式（Ｉ）の投薬量の影響
α４β１およびα４β７受容体飽和、リンパ球での占有率および発現に対する式（Ｉ）の種々の用量の効果を、漸増性の用量研究で決定した。受容体飽和を決定するための方法は、実施例５に示したとおりであった。このレベルは、異なるコホートにおける最初の投与後９１日間続いた。
【０１２１】
０．１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇの間で、リンパ球上のα４β１受容体は、図１１に示されるとおり、少なくとも１週間完全に飽和された。対照的に、α４β７受容体飽和は、投与後１４日までにベースラインに戻った。特定のコホートでは、飽和のこの測定されたレベルは、発現レベルと独立していることが示され、このことは、選択性を実証したことが示される。例えば、コホート４では、図１２に示されるとおり、α４β１飽和のレベルは、投与後３６０で高く維持されたが、α４β７の飽和は、３０％より下に低下した。図１３に示されるとおり、α４β７の発現レベルは実際に、α４β１に示される発現レベルよりも高く残った。コホート５に与えられたより高い式（Ｉ）の用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）は、図１４に示されるように、α４β１およびα４β７の両方の飽和レベルがより高くなった。これによって、受容体の飽和のレベルが用量依存性であること、および適切な投薬量および投与計画によって制御され得ることが示される。
実施例９
【０１２２】
用量選択
式（Ｉ）の好ましい投薬量とは、α４β１のその調節を通じて有効性を示すが、α４β７によって媒介され得るなんらの有害事象をも最小化する投薬量である。約９０％のα４β１受容体飽和を生じることが既知の最小用量を見積もるため、α４β１受容体飽和の別個のレベルおよび期間をもたらす用量範囲および投与計画を決定する。この評価によって、α４β７飽和を低下しながら、許容できるα４β１受容体飽和を生じる可能性が高い最小用量を決定する。このような研究からの結果を表３にまとめる：
【０１２３】
【表３】
2013525435.tif 000005
実施例１０
【０１２４】
式（Ｉ）によるα４β１媒介性の細胞接着の選択的な阻害
式（Ｉ）の化合物による、それぞれ、α４β１およびα４β７に対するα４β１およびα４β７媒介性の細胞接着の阻害を、細胞ベースのＳＲＵ  ＢＩＮＤ（商標）細胞接着アッセイ（ＳＲＵ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を用いて試験した。式（Ｉ）の化合物を、ある範囲の濃度でα４β１およびＪｕｒｋａｔ細胞またはα４β７および８８６６細胞とともにインキュベートした。比較のためにＥＬＮ４７６０６３も試験した。この化合物−細胞混合物を、α４β１またはα４β７でコーティングしてあるＳＲＵ  ＢＩＮＤ（商標）アッセイプレートに添加して、細胞の結合をＰＶＷシフトで測定した。
【０１２５】
簡潔に述べると、ＴｉＯ２  ＳＲＵ  ＢＩＮＤ（商標）アッセイプレートを、抗−ヒトＦｃ抗体を用いて、続いてヒトＦｃ−α４β１またはＦｃ−α４β７でコーティングした。式（Ｉ）およびＥＬＮ４７６０６３（ペグ化した低分子α４−選択性インテグリン阻害剤）を、ある範囲の濃度で、α４β１およびＪｕｒｋａｔ細胞またはα４β７および８８６６細胞とともにインキュベートした。次いで、この化合物−細胞混合物を、ＳＲＵ  Ｂｉｎｄアッセイプレートに添加して、細胞の結合を開始して、これをＰＶＷシフトによって測定した。接着の１００％阻害を、抗−α４インテグリンブロッキング抗体の飽和性濃度で前処理した細胞で観察されるＰＷＶシフトとして規定して、０％の阻害（最大の細胞接着）は、それぞれ、α４β１またはα４β７プレート上でインキュベートした未処理のＪｕｒｋａｔ細胞または８８６６細胞で観察されるＰＷＶシフトとして規定した。
【０１２６】
式（Ｉ）の化合物は、それぞれ０．４ｎＭおよび６０ｎＭというＩＣ５０で、α４β７に対するα４β７＋細胞よりも約１５０倍強力に、ＶＣＡＭ−１に対するα４β１＋細胞の接着を阻害した（図１５Ａ）。対照的に、ＥＬＮ４７６０６３は、それぞれ、１．７および１．２ｎＭというＩＣ５０で、α４β１およびα４β７に対するα４β１およびα４β７媒介性の細胞接着の等効力のα４β７を示した（図１５Ｂ）。式（Ｉ）の化合物は、ＥＬＮ４７０６０３よりも４倍超強力にα４β１接着を阻害した。
【０１２７】
さらに、式（Ｉ）の化合物は、ＥＬＮ４７０６０３よりも４倍超強力にα４β１媒介性の接着を阻害し、このことは、式（Ｉ）の化合物が、α４β１媒介性の接着の強力かつ選択性の阻害剤であるが、α４β７媒介性の接着の阻害剤ではないことを示している。
実施例１１
【０１２８】
α４β７リガンドＭａｄＣＡＭ−１よりもα４β１リガンドＶＣＡＭ−１の可溶性型の選択的な下方制御
α４インテグリンの阻害は、それらのリガンド、ＶＣＡＭ−１およびＭＡｄＣＡＭ−１の可溶性の循環型の下方制御を生じることが示されている（Ｍｉｌｌｏｎｉｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｏｃｔ  ８；２２７（１〜２）：１９０〜４．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ａｕｇ  ２３（２０１０）。ｓＶＣＡＭ−１およびｓＭＡｄＣＡＭ−１のマウス血漿レベルを、式（Ｉ）の化合物およびＥＬＮ  ４７６０６３について３週間にわたってある範囲の濃度を用いて単回投与実験で測定した。式（Ｉ）の化合物またはＥＬＮ４７６０６３の単回皮下投与後のｓＶＣＡＭ−１およびｓＭＡｄＣＡＭ−１調節の動態を、２１日間にわたって計算した。
【０１２９】
未処置のＣ５７ＢＬ／６マウスを、単回の皮下注射のＰＢＳ（ビヒクル）、式（Ｉ）の化合物またはＥＬＮ４７６０６３（ＦＩＧ  ある範囲の用量で用いて治療した。４匹のマウスを各々のレベル／時点について投与した。これを、非選択性のコンジュゲートの効果に対して比較した。式（Ｉ）の化合物およびＥＬＮ４７６０６３の両方とも、ｓＶＣＡＭ−１およびｓＭＡｄＣＡＭ−１の急速な用量依存性の下方制御を生じ、これは薬物レベルが低下するにつれて回復した。
【０１３０】
マウスでの０．５ｍｇ／ｋｇの用量は、ヒトの０．２ｍｇ／ｋｇの用量と等価であると推定された（Ｃｍａｘに基づく）。ヒトでの０．２ｍｇ／ｋｇの用量は、マウスでの０．５ｍｇ／ｋｇの用量を用いてマウスで得られたＣｍａｘ値（０．８３μｇ／ｍＬ）に匹敵するであろうＣｍａｘ値（０．５７ｎｇ／ｍＬ）を生じることとなる。マウスでの０．５ｍｇ／ｋｇの用量は、急なＣＮＳ細胞トラフィッキングをブロックするのに十分に有効であった。同じ分析を用いて、０．５ｍｇ／ｋｇというヒト用量は、１ｍｇ／ｋｇ（５．５〜４．３ｕｇ／ｍＬ）というマウスの用量に匹敵する３．７μｇ／ｍＬというＣｍａｘ値を生じることとなる。０．５ｍｇ／ｋｇというヒト用量は、急なＣＮＳ細胞トラフィッキングを妨げるのにこれもやはり十分に有効である１．０ｍｇ／ｋｇ（Ｃｍａｘによる）というマウス用量にほぼ匹敵する。
【０１３１】
図１６Ａ〜１６Ｆは、ｓＶＣＡＭ−１（図１６Ａおよび図１６Ｂ）、ｓＭＡｄＣＡＭ−１（図１６Ｃおよび１６Ｄ）、および血漿薬物レベル（図１６Ｅおよび図１６Ｆ）を投与後４時間〜２１日にわたる種々の時点で示す。評価基準として、ビヒクル処理した動物における平均レベルに基づいた可溶性の接着分子の５０％下方制御を、図１６のグラフに破線で示す（これらの投薬量から生じるｓＶＣＡＭ−１およびｓＭＡｄＣＡＭ−１の急速な用量依存性の下方制御は、薬物レベル低下につれて回復される（（グラフＥおよびＦを参照のこと））。
【０１３２】
式（Ｉ）の化合物およびＥＬＮ  ４７６０６３の血漿薬物濃度、対ｓＶＣＡＭ−１またはｓＭＡｄＣＡＭ−１を、図１６にまとめた実験で用いた各々のマウスについてプロットした。可変勾配の非線形回帰を用いて曲線をあてはめた。インビトロ選択性データと一致して、式（Ｉ）の化合物は、ｓＶＣＡＭ−１をより強力に下方制御したが、ＥＬＮ  ４７６０６３に比較した場合、ｓＭＡｄＣＡＭ−１レベルに対する影響は最小限であった。ＶＣＡＭ−１の最大阻害が３ｎＭ程度の低い式（Ｉ）の化合物血漿濃度で見られたが、ｓＭＡｄＣＡＭ−１は、最高の血漿濃度でさえ十分下方制御されなかった（図１７Ａ）。対照的に、ｓＶＣＡＭ−１およびｓＭＡｄＣＡＭ−１は、ＥＬＮ  ４７６０６３の等価な血漿濃度で同様に下方制御される（図１７Ｂ）。
【０１３３】
α４β７リガンドＭＡｄＣＡＭ−１を上回るα４β１リガンドＶＣＡＭ−１の可溶型の選択的な下方制御によって、インビトロ選択性は、可溶性の接着分子の選択的調節を通じてインビボで維持され、ｓＭＡｄＣＡＭ−１よりもｓＶＣＡＭ−１の調節を介してインビボで反映されるとおり、α４β７よりもα４β１についての式（Ｉ）の化合物のインビトロ選択性および効力を示すということが示される。
実施例１２
【０１３４】
式（Ｉ）の投与による細胞トラフィッキングの選択的阻害
放射性標識した脾臓細胞およびリンパ節細胞を処理したＥＡＥマウスに養子移入して、種々の臓器での総放射性を定量した。簡潔に述べると、実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＣＦＡ中で乳化されたＭＯＧ３５−５５ペプチドの皮下注射、続いて、０日目および２日目に百日咳毒素の腹腔内注射を介して誘発した。誘発後１２日目に、臨床スコア２（後肢の足取りに影響）のマウスを、研究に登録して、ある範囲の用量でＰＢＳ、ＥＬＮ４７６０６３、または式（Ｉ）を皮下投与した。未処置のマウス由来の脾臓細胞および腸間膜リンパ節細胞を一晩培養して、インビトロにおいて１１１インジウムで標識し、導入１３日後に登録したＥＡＥマウスに養子移入した。細胞移入の約１６時間後、臓器を回収し、秤量して、放射能をガンマカウンターによって定量した。
【０１３５】
式（Ｉ）の化合物は、０．５〜３．０ｍｇ／ｋｇ、ただし０．１ｍｇ／ｋｇ以下ではない用量でＥＡＥマウスの脊髄および脳への放射性標識細胞のトラフィッキングを有意に阻害することができた（図１９Ｂ、図１９Ｃ、図１９Ｅおよび図１９Ｆ）。式（Ｉ）の化合物は、α４β７相互作用によって部分的に媒介される可能性が高い小腸のパイアー斑への細胞トラフィッキングに大きく影響しなかった（図１９Ａおよび１９Ｄ）。パイアー斑およびＣＮＳへのトラフィッキングの阻害が、１０および１．０ｍｇ／ｋｇの用量でＥＬＮ  ４７６０６３で観察された。
【０１３６】
ｓＶＣＡＭ−１は、ＣＮＳトラフィッキングをブロックする式（Ｉ）の化合物の用量で下方制御されるが、０．１ｍｇ／ｋｇでは下方制御されず（図１８Ａ）、これによってｓＶＣＡＭ−１は、薬物レベルだけでなく、薬物活性の可能性のあるマーカーであることが示される。ＣＮＳへの細胞トラフィッキングの有意な阻害が、ｓＭＡｄＣＡＭ−１レベルに大きく影響しなかった式（Ｉ）の化合物で示され、これによって、式（Ｉ）の化合物が、α４β７−依存性免疫細胞トラフィッキングを妨げることなくＣＮＳ炎症を調節したことが示される（図１８Ｂ)。実際、図１５Ｂに示されるとおり、血漿中のｓＭＡｄＣＡＭのレベル（血流中で見出されたレベルと相関する）は、最大３ｍｇ／ｋｇの用量でさえ、式（Ｉ）の投与後に少なくとも７５％の正常なレベルを保持している。従って、式（Ｉ）の投与は、ｓＶＣＡＭ−１レベルの統計学的に有意な下方制御を有することが示されるレベルにおいて、ｓＭＡｄＣＡＭを通じたシグナル伝達に影響しない。
【０１３７】
上記は単に本発明の原理を例示するものである。当業者は、本明細書に明確に記載されることも示されないが、本発明の原理を具現化し、かつその趣旨および範囲内に含まれる種々の構成を考案できることが理解される。さらに、本明細書に言及される全ての実施例および条件付きの表現は、主として、読者が本発明の原理および技術分野を進歩させるするように本発明者らが与える概念を理解するのを助けるものであって、このような詳細に言及される実施例および条件に対する制限はないと解釈されるべきである。さらに本発明の原理、態様および実施形態、ならびにその特定の実施例について述べている本明細書の全ての供述は、その構造的および機能的な等価物の両方を包含するものとする。
【図１】
2013525435.tif 000006
【図２】
2013525435.tif 000007
【図３】
2013525435.tif 000008
【図４】
2013525435.tif 000009
【図５】
2013525435.tif 000010
【図６】
2013525435.tif 000011
【図７】
2013525435.tif 000012
【図８】
2013525435.tif 000013
【図９】
2013525435.tif 000014
【図１０】
2013525435.tif 000015
【図１１】
2013525435.tif 000016
【図１２】
2013525435.tif 000017
【図１３】
2013525435.tif 000018
【図１４】
2013525435.tif 000019
【図１５】
2013525435.tif 000020
【図１６】
2013525435.tif 000021
【図１７】
2013525435.tif 000022
【図１８】
2013525435.tif 000023
【図１９】
2013525435.tif 000024
【国際調査報告】
2013525435.tif 000025
2013525435.tif 000026
2013525435.tif 000027