(57)【要約】  本発明は、ＨＢＶ遺伝子の発現および／または活性のモジュレーションに対して応答する、および／またはＨＢＶ遺伝子発現経路をモジュレートする化合物、組成物および方法であって、形質、疾患および病状の試験、診断および処置のための化合物、組成物および方法に関する。詳しくは、本発明は、ＨＢＶ遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る、または該ＲＮＡ干渉を媒介する二本鎖核酸分子、例えば、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などの低分子量核酸分子に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ−００８３８０６４８−０００Ｅ、Ｒ−００８３８０７８３−０００Ｒ、Ｒ−００８３８０６６５−０００Ｎ、Ｒ−００８３８０６４５−０００Ｄ、Ｒ−００８３８０４０８−０００Ｒ、Ｒ−００８３８０６３３−０００Ｕ、Ｒ−００８３８０７６７−０００Ｒ、Ｒ−００８３８０７３０−０００Ｃ、Ｒ−００８３８０７７７−０００Ｈ、Ｒ−００８３８０７４０−０００Ｖ、Ｒ−００８３８０５５８−０００Ｍ、Ｒ−００８３８０４０６−０００Ｙ、Ｒ−００８３８０７６４−０００Ｐ、Ｒ−００８３８０７７２−０００Ｐ、Ｒ−００８３８０３８９−０００Ｄ、Ｒ−００８３８０３６２−０００Ｈ、Ｒ−００８３８０３６３−０００Ｓ、Ｒ−００８３８０３４０−０００Ｆ、Ｒ−００８３８０６８９−０００Ｈ、Ｒ−００８３８０７５６−０００Ｐ、Ｒ−００８３８０７３６−０００Ｅ、Ｒ−００８３８０７５７−０００Ｙ、Ｒ−００８３８０７５３−０００Ｎ、Ｒ−００８３８０７３７−０００Ｎ、Ｒ−００８３８０７３４−０００Ｍ、またはＲ−００８３８０７９１−０００Ｒのいずれかを含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
【請求項２】
請求項１に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）および薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含む組成物。
【請求項３】
（ａ）請求項１に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）；
（ｂ）カチオン性脂質；
（ｃ）コレステロール；
（ｄ）ＤＳＰＣ；および
（ｅ）ＰＥＧ−ＤＭＧ
を含む組成物。
【請求項４】
（ａ）請求項１に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）；
（ｂ）（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン；
（ｃ）コレステロール；
（ｄ）ＤＳＰＣ；および
（ｅ）ＰＥＧ−ＤＭＧ
を含む組成物。
【請求項５】
（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ−ＤＭＧが、それぞれ５０：３０：１０：２のモル比を有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物および薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含む組成物。
【請求項７】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の作用または該作用の喪失によって媒介される病状に苦しんでいるヒト被検体を処置する方法であって、前記被検体に、有効量の請求項１に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を投与することを含む方法。
【請求項８】
該病状がＨＢＶ感染である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
該病状が肝細胞癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
３７  ＣＦＲ  §１．５２（ｅ）（５）に従ってＥＦＳによって提出した配列表は、引用により本明細書に組み込まれる。ＥＦＳによって提出した配列表のテキストファイルは、２０１０年８月１７日に作成した４５５，４９５バイトのサイズのファイル「ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＩＦＤ１ＵＳＰＳＰ」を含む。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされる肝臓の感染性疾患である。この病気は急性であり、肝臓の炎症、嘔吐、黄疸が引き起こされ、稀に場合によっては重度の激症疾患、死亡が引き起こされることがあり得る。ほとんどの感染では慢性の病気がもたらされ、これは無症候性であるか、または肝臓の慢性炎症がもたらされて肝硬変に至り、肝細胞癌（ＨＣＣ）の発生率が増大するかのいずれかであり得る。
【０００３】
ＨＢＶ感染は世界規模で問題であり、世界中でおよそ３億５０００万人を超える人が慢性的に感染しており、６００，０００人が毎年ＨＢＶ関連肝臓疾患またはＨＣＣで死亡している。アジアおよびアフリカでは、この疾患による流行病が引き起こされたことがあり、中国では風土病である。ＨＢＶの伝播は血液または体液を介した感染によるものである。現在、ＨＢＶ感染の予防のためのワクチンが存在している。しかしながら、ワクチンは予防的であり、既に感染した患者を処置するために使用することはできない。
【０００４】
ＨＢＶポリメラーゼの作用をブロックすることによりＨＢＶの複製を妨げる慢性Ｂ型肝炎のための承認済の化学療法処置薬がいくつか存在している（ラミブジン、アデホビル、エンタカビル（ｅｎｔａｃａｖｉｒ）およびテルビブジン）。このような処置薬は、いずれも該ウイルスの完全なクリアランスをもたらすものではなく、長期間処置すると薬物耐性ＨＢＶバリアントの発生がもたらされる。また、Ｂ型肝炎は、ペグ化インターフェロン−α２ａで処置することもできるが、この処置は重度の副作用を伴い、すべての患者に有効というわけではない。
【０００５】
ＨＢＶは、ヘパドナウイルス科の構成員であり、抗原エピトープに基づいて４つの主な血清型（ｓｅｒｏｔｙｏｅ）（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、ａｙｗ）に分けられる。また、このウイルスは、ゲノム配列に基づいて８つの遺伝子型（ｇｅｎｏｙｐｅ）Ａ〜Ｈに分類される。遺伝子型Ａは、アメリカ、アフリカ、インドおよび西欧に一般的に見られる。遺伝子型ＢとＣはアジアと米国に見られる。遺伝子型Ｄは南欧とインドに最もよく見られる。遺伝子型Ｅは西アフリカと南アフリカに見られる。遺伝子型ＦとＨは、中央アメリカと南アメリカに一般的に見られる。遺伝子型Ｇは欧州と米国に一般的に見られる。
【０００６】
ＨＢＶゲノムは、一部が二本鎖である環状のＤＮＡ鎖からなる。このゲノムは約３．３Ｋｂ長である。これには４つの既知遺伝子（Ｃ、Ｘ、ＰおよびＳ）がコードされている。ＨＢＶは、複製プロセスに逆転写酵素が使用される数少ないＤＮＡウイルスのうちの１つである。ＨＢＶの複製は、ウイルスゲノムの核への進入、脱殻および輸送などの数多くの工程を伴う。まず、ＨＢＶゲノムの複製はＲＮＡ中間体の生成を伴い、次いで、これが逆転写され、ＤＮＡウイルスゲノムが生成される。
【０００７】
現在使用されている治療薬は、その非有効性、重篤な副作用のため、または薬物耐性バリアントの発生のため限定的であることから、ＨＢＶ感染を処置するための新しい治療薬を開発する臨床的必要性が存在している。
【０００８】
ＲＮＡ干渉（以下、本明細書において「ＲＮＡｉ」）によるウイルス遺伝子発現、特にＨＢＶ遺伝子発現の改変は、この必要性を満たすアプローチの１つである。ＲＮＡｉは、低分子一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）または二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子によって誘導される。低分子ｄｓＲＮＡ分子は、「低分子干渉核酸（「ｓｉＮＡ」）」または「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ阻害薬」と称され、該ｓｉＮＡとの配列相同性を共有するメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）の発現のサイレンシングを行なう。これは、一般的にＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称されるｓｉＮＡ含有エンドヌクレアーゼ複合体によって媒介される該ｍＲＮＡの切断によって行なわれ得る。標的ＲＮＡの切断は、典型的には、ｓｉＮＡ二本鎖のガイド配列に相補的な領域の中央部に行なわれる（非特許文献１）。また、ＲＮＡ干渉は、低分子ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）媒介性遺伝子サイレンシングを伴うものであり得、これは、おそらく、翻訳が阻害されるか、またはクロマチン構造が調節され、それにより標的遺伝子配列の転写が抑制されるかのいずれかである細胞機構によるものである（例えば、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５参照）。
【０００９】
いくつかの研究で、ＨＢＶの処置に対するＲＮＡｉの使用が試みられており、このアプローチは、非特許文献６に包括的に概説されている。だが、上記の参考文献に記載のように、単独のｓｉＲＮＡのトランスフェクションでは、多くの場合、充分な遺伝子サイレンシングをもたらすことができない（同上）。したがって、ＲＮＡｉに分野における相当な進歩にもかかわらず、依然として、ＨＢＶ遺伝子発現を有効に阻害することができる薬剤、ならびに肝臓疾患およびがんなどのＨＢＶ発現と関連している疾患を処置することができる薬剤の必要性が存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：１８８
【非特許文献２】Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７：１８１８−１８１９；
【非特許文献３】Ｖｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７：１８３３−１８３７
【非特許文献４】Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７：２２１５−２２１８
【非特許文献５】Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７：２２３２−２２３７
【非特許文献６】ＲＮＡＩ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８  Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１，ｐｇｓ  ７２−８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＨＢＶ発現をモジュレートする新規な低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を用いてＨＢＶ遺伝子発現のモジュレーションに応答する疾患を処置する課題に対する解決策を提供する。
【００１２】
本発明は、ＨＢＶ遺伝子の発現のモジュレーションに有用な、ならびに低分子量核酸分子を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるＢ型肝炎およびＢ型肝炎感染に起因する病状の処置に有用な化合物、組成物および方法を提供する。
【００１３】
特に、本発明は、低分子量核酸分子、すなわち、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、例えば限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および環状ＲＮＡ分子、ならびにＨＢＶ遺伝子および／またはＨＢＶ遺伝子の発現および／または活性の経路に関与している他の遺伝子の発現をモジュレートするために使用される方法を特色とする。本発明者らは、既知のすべてのＨＢＶの完全ゲノムの保存領域から標的部位を選択すると、高効力かつ高効率の配列が得られることを見い出した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一態様において、本発明は、細胞または哺乳動物においてＨＢＶ遺伝子の発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供し、ここで、該二本鎖ｓｉＮＡはセンス鎖（ｓｔａｎｄ）とアンチセンス鎖を含むものである。アンチセンス鎖は、ＨＢＶ遺伝子の発現と関連しているＲＮＡの少なくとも一部分に相補的な配列を含むものである。センス鎖は、アンチセンス鎖に相補的な配列を含むものである。種々の実施形態において、少なくとも一方の鎖は、配列番号：１〜５０２からなる配列の群から選択される少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むものである。一部の特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、表１ａに示した標的配列に対して配列相補性を有する少なくとも１５個のヌクレオチドを含むものである。他の実施形態および／または同じ実施形態において、該アンチセンス鎖は、表１ｂに示したアンチセンス配列のうちの１つの少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むものである。一部の実施形態において、センス鎖は、表１ｂに示したセンス鎖配列の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むものである。
【００１５】
本発明のこの態様の一部の特定の実施形態において、アンチセンス鎖が、本発明の標的配列に対して配列相補性を有する表１ｃに示した修飾配列を含むものである二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。また、一部の実施形態では、センス鎖が、表１ｃに示した修飾配列を含むものである。
【００１６】
一部の特定の実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含むものであり；各鎖が、独立して１５〜３０ヌクレオチド長であり；該アンチセンス鎖が：
５’−ＵＣＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡ−３’（配列番号：１）；
５’−ＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡＡＵ−３’（配列番号：２）；
５’−ＧＣＣＧＡＵＣＣＡＵＡＣＵＧＣＧＧＡＡ−３’（配列番号：３）；または
５’−ＣＣＧＡＵＣＣＡＵＡＣＵＧＣＧＧＡＡＣ−３’（配列番号：４）
のいずれかに相補的な配列を有する少なくとも１５個のヌクレオチドを含むものである、ＨＢＶの発現をモジュレートする二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
【００１７】
本発明の一部の実施形態において、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は：
５’−ＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣＧＡ−３’（配列番号：４５２）；
５’−ＡＵＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号：４５３）；
５’−ＵＵＣＣＧＣＡＧＵＡＵＧＧＡＵＣＧＧＣ−３’（配列番号：４５４）；または
５’−ＧＵＵＣＣＧＣＡＧＵＡＵＧＧＡＵＣＧＧ−３’（配列番号：４５５）
の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むものである。
【００１８】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖は：
５’−ＵＣＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡ−３’（配列番号：１）；
５’−ＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡＡＵ−３’（配列番号：２）；
５’−ＧＣＣＧＡＵＣＣＡＵＡＣＵＧＣＧＧＡＡ−３’（配列番号：３）；または
５’−ＣＣＧＡＵＣＣＡＵＡＣＵＧＣＧＧＡＡＣ−３’（配列番号：４）
の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むものである。
【００１９】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は：
５’−ＵＣＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡ−３’（配列番号：１）と５’−ＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣＧＡ−３’（配列番号：４５２）；または
５’−ＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡＡＵ−３’（配列番号：２）と５’−ＡＵＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号：４５３）；または
５’−ＧＣＣＧＡＵＣＣＡＵＡＣＵＧＣＧＧＡＡ−３’（配列番号：３）と５’−ＵＵＣＣＧＣＡＧＵＡＵＧＧＡＵＣＧＧＣ−３’（配列番号：４５４）；または
５’−ＣＣＧＡＵＣＣＡＵＡＣＵＧＣＧＧＡＡＣ−３’（配列番号：４）と５’−ＧＵＵＣＣＧＣＡＧＵＡＵＧＧＡＵＣＧＧ−３’（配列番号：４５５）
のいずれかを含むものである。
【００２０】
一部の実施形態において、本発明は、二本鎖Ｒ−００８３８０６４８−０００Ｅ、Ｒ−００８３８０７８３−０００Ｒ、Ｒ−００８３８０６６５−０００Ｎ、Ｒ−００８３８０６４５−０００Ｄ、Ｒ−００８３８０４０８−０００Ｒ、Ｒ−００８３８０６３３−０００Ｕ、Ｒ−００８３８０７６７−０００Ｒ、Ｒ−００８３８０７３０−０００Ｃ、Ｒ−００８３８０７７７−０００Ｈ、Ｒ−００８３８０７４０−０００Ｖ、Ｒ−００８３８０５５８−０００Ｍ、Ｒ−００８３８０４０６−０００Ｙ、Ｒ−００８３８０７６４−０００Ｐ、Ｒ−００８３８０７７２−０００Ｐ、Ｒ−００８３８０３８９−０００Ｄ、Ｒ−００８３８０３６２−０００Ｈ、Ｒ−００８３８０３６３−０００Ｓ、Ｒ−００８３８０３４０−０００Ｆ、Ｒ−００８３８０６８９−０００Ｈ、Ｒ−００８３８０７５６−０００Ｐ、Ｒ−００８３８０７３６−０００Ｅ、Ｒ−００８３８０７５７−０００Ｙ、Ｒ−００８３８０７５３−０００Ｎ、Ｒ−００８３８０７３７−０００Ｎ、Ｒ−００８３８０７３４−０００Ｍ、またはＲ−００８３８０７９１−０００Ｒのいずれかを含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特色とする。
【００２１】
一部の実施形態において、本発明は、
（ａ）本発明の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）；
（ｂ）化合物番号１〜４６のいずれかまたはその任意の組合せを有するカチオン性脂質化合物（ｃｏｍｐｏｎｄ）；
（ｃ）コレステロール；
（ｄ）ＤＳＰＣ；および
（ｅ）ＰＥＧ−ＤＭＧ
を含む組成物を特色とする。
【００２２】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、化合物番号１〜４６のいずれかを、以下のモル比：
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ５６．６／３８／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６７．３／２９／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ４９．３／４７／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ５０．３／４４．３／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０；および
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ５８／３０／２／１０
で有する任意のカチオン性脂質を含むものである。
【００２３】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ−ＤＭＧを、それぞれ、５０：３０：１０：２のモル比で含むものである。
【００２４】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、さらに抗凍結剤を含むものである。一部の実施形態において、抗凍結剤は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキロース、ベルバスコース、マンニトール、グルコース、ラクトース、マルトース、マルトリオース−ヘプタオース、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、インスリン、ソルビトール、グリセロール、アルギニン、ヒスチジン、リシン、プロリン、ジメチルスルホキシドまたはその任意の組合せである。一部の実施形態では、抗凍結剤はスクロースである。一部の実施形態では、抗凍結剤はトレハロースである。一部の実施形態では、抗凍結剤はスクロースとトレハロースの組合せである。
【００２５】
本発明の一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡのヌクレオチドはすべて非修飾である。他の実施形態では、ｓｉＮＡ分子のいずれか一方または両方の鎖の独立した１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個）のヌクレオチド位置が修飾されている。修飾としては、核酸の糖鎖修飾、塩基修飾、主鎖（ヌクレオチド間結合）修飾、非ヌクレオチド修飾、および／またはその任意の組合せが挙げられる。一部の特定の場合では、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチドは異なるように修飾されている。例えば、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチドには、糖鎖の２’位において異なる修飾がなされ得る（すなわち、同じ鎖または異なる鎖の糖鎖の２’位において、少なくとも１個のプリンは少なくとも１個のピリミジンと異なる修飾を有する）。一部の特定の場合では、プリンは、一方または両方の鎖において非修飾であるが、一方または両方の鎖のピリミジンは修飾されている。一部の特定の他の場合では、ピリミジンは、一方または両方の鎖において非修飾であるが、一方または両方の鎖のプリンは修飾されている。一部の場合では、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、または２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドである。一部の場合では、一方または両方の鎖のピリミジンヌクレオチドの少なくとも５個またはそれ以上が、すべて２’−デオキシ−２’−フルオロまたはすべて２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドのいずれかである。一部の場合では、一方または両方の鎖のプリンヌクレオチドの少なくとも５個またはそれ以上が、すべて２’−デオキシ−２’−フルオロまたはすべて２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドのいずれかである。一部の特定の場合では、ｓｉＮＡ分子が本明細書に記載の１つ以上の修飾を含むものである場合、ガイド（アンチセンス）鎖の５’末端の１、２および３位のヌクレオチドが非修飾である。
【００２６】
一部の特定の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、一方または両方の鎖に１、２、３または４個のヌクレオチドの３’突出端を有する。他の実施形態では、ｓｉＮＡ分子には突出端がない（すなわち、平滑端を有する）。好ましくは、ｓｉＮＡ分子は、センス鎖とアンチセンス鎖の両方に２個のヌクレオチドの３’突出端を有するものである。突出端は修飾されていても非修飾であってもよい。突出端の修飾ヌクレオチドの例としては、限定されないが、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、または２’−デオキシヌクレオチドが挙げられる。アンチセンス鎖の突出端ヌクレオチドは、ＨＢＶ標的配列内のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含むものであり得る。同様に、センス鎖の突出端は、ＨＢＶ標的配列内に存在するヌクレオチドを含むものであり得る。一部の特定の場合では、本発明のｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖に２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチドである２つの３’突出端ヌクレオチドと、センス鎖に２’−デオキシヌクレオチドである２つの３’突出端ヌクレオチドを有するものである。他の場合では、本発明のｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方に２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチドである２つの３’突出端ヌクレオチドを有するものである。一部の特定の実施形態では、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルウリジンヌクレオチドである。また、一部の特定の場合では、突出端は、突出端のヌクレオチド間に１つ以上のホスホロチオエート結合を含むものである。
【００２７】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、キャップ（本明細書では「末端キャップ」とも称する）を有する。キャップは、５’末端に存在させても（５’−キャップ）３’末端に存在させてもよく（３’−キャップ）、両末端に存在させてもよい（ｓｉＮＡのセンス鎖の５’末端と３’末端など）。
【００２８】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖の５’末端がリン酸化されている。リン酸基は、ホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートであり得る。
【００２９】
本発明のｓｉＮＡ分子は、二本鎖である場合は、対称であっても非対称であってもよい。このような二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は、独立して、３〜３０個のヌクレオチドのヌクレオチド長の範囲であり得る。一般的に、本発明のｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５〜３０（すなわち、約１９、２０、２１、２２、２３または２４）ヌクレオチド長である。
【００３０】
二本鎖であるか、または二本鎖構造を有するものである本発明のｓｉＮＡ分子は、独立して、約３〜約３０（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）個の塩基対を含むものである。一般的に、本発明のｓｉＮＡの二本鎖構造は、１５〜３０、より一般的には１８〜２５、なおより一般的には１９〜２４、最も一般的には１９〜２１塩基対長である。
【００３１】
一部の特定の実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖を有し、式（Ａ）：
【００３２】
【化１】
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を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供し、
式中、上側の鎖は該二本鎖核酸分子のセンス鎖であり、下側の鎖はアンチセンス鎖であり；該アンチセンス鎖は、配列番号：４５２、配列番号：４５３、配列番号：４５４、または配列番号：４５５の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むものであり、該センス鎖は、該アンチセンス鎖に対して相補性を有する配列を含むものであり；
各Ｎは、独立して非修飾もしくは化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドであり；
各Ｂは、存在する、または存在しない末端キャップであり；
（Ｎ）は、突出端ヌクレオチド（各々、独立して非修飾または化学修飾）を表し；
［Ｎ］は、リボヌクレオチドであるヌクレオチドを表し；
Ｘ１およびＸ２は、独立して、０〜４の整数であり；
Ｘ３は、１５〜３０の整数であり；
Ｘ４は、９〜３０の整数であり；
Ｘ５は、０〜６の整数であるが、Ｘ４とＸ５の和は１５〜３０であるものとする。
【００３３】
一実施形態において、本発明は、
（ａ）ＮＸ４位の１個以上のピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せである；
（ｂ）ＮＸ４位の１個以上のプリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せである；
（ｃ）ＮＸ３位の１個以上のピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せである；および
（ｄ）ＮＸ３位の１個以上のプリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、である、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特色とする。
【００３４】
さらに、本発明は、本明細書に記載の二本鎖核酸分子を含み、薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含んでいてもよい組成物を提供する。
【００３５】
該組成物の投与は、核酸が所望の標的細胞内にインビトロまたはインビボで導入される既知の方法によって行なわれ得る。
【００３６】
細胞、組織および生物体への本発明の核酸分子の導入に一般的に使用される手法としては、種々の担体系、試薬およびベクターの使用が挙げられる。本発明における使用に適したかかる担体系の非限定的な例としては、コンジュゲート、核酸−脂質粒子、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、リポプレックス、ミセル、ビロソーム、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、核酸複合体、およびその混合物が挙げられる。
【００３７】
本発明の組成物は、エアロゾル剤、分散剤、液剤（例えば、注射用液剤）、クリーム剤、軟膏、錠剤、散剤、懸濁剤などの形態であり得る。このような組成物は、任意の適当な様式で、例えば、経口、舌下、口腔内、非経口、経鼻または経表面的に投与され得る。一部の実施形態において、該組成物はエアロゾル化され、吸入によって送達される。
【００３８】
本発明の分子および組成物は、広範な治療適用用途において有用性を有する。したがって、本発明の別の態様は、被検体の処置における本発明の化合物および組成物の使用に関する。したがって、本発明は、ＨＢＶの作用によって媒介される病状に苦しんでいる被検体（ヒトなど）の処置方法であって、該被検体に有効量の本発明の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を投与することを含む方法を提供する。したがって、本発明のｓｉＮＡ分子によりＢ型肝炎感染および／またはそれに起因する病状が処置される。一部の特定の実施形態において、該病状は肝臓疾患である。一部の特定の実施形態では、該病状はがんである。
【００３９】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細説明および添付の図面を参照すると明らかとなろう。さらに、本明細書に記載の任意の方法または組成物は、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に関して行なわれ得ること、および異なる実施形態を組み合わせてもよいことが考慮される。
【００４０】
さらに、本発明の種々の態様を説明し、より詳しく示すために本明細書を通して特許、特許出願、および他の文献を挙げている。本明細書において挙げたこれらの参考文献は各々、引用によりその全体（図面を含む）が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の提案される非限定的な機構の図を示す。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって外来一本鎖ＲＮＡ（例えば、ウイルス、トランスポゾンまたは他の外因性のＲＮＡ）から生成された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がＤＩＣＥＲ酵素を活性化し、次にＤＩＣＥＲ酵素がｓｉＮＡ二本鎖を生成する。あるいはまた、合成または発現ｓｉＮＡを、直接細胞内に適切な手段によって導入してもよい。活性なｓｉＮＡ複合体が形成され、これが標的ＲＮＡを認識し、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体による標的ＲＮＡの分解をもたらすか、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によるさらなるＲＮＡの合成をもたらし、これによりＤＩＣＥＲが活性化され、さらなるｓｉＮＡ分子がもたらされ、それにより、ＲＮＡｉ応答が増幅され得る。
【図２】代表的なｓｉＮＡ二本鎖の一般化構造を使用した、本発明の化学修飾ｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示す。図示した具体的な修飾は、本発明のいずれかのｓｉＮＡ分子に関して本明細書に記載した他の修飾および特徴に加えて、単独で、または図の他の修飾と組み合わせて用いることができる。図において、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、本明細書に記載の非ヌクレオチドであってもよい。Ｂ−ＮＸ３−（Ｎ）Ｘ２Ｂ−３’を有する上側の鎖は、ｓｉＮＡのセンス（またはパッセンジャー）鎖であり、Ｂ（Ｎ）Ｘ１−ＮＸ４−［Ｎ］Ｘ５−５’を有する下側の鎖は、ｓｉＮＡのアンチセンス（またはガイド）鎖である。センス鎖の内部部分のヌクレオチド（または非ヌクレオチドであってもよい）をＮＸ３と表示し、アンチセンス鎖の内部部分のヌクレオチド（または非ヌクレオチドであってもよい）をＮＸ４と表示している。内部部分のヌクレオチド（または非ヌクレオチドであってもよい）は一般的には、２つの鎖間で塩基対合しているが、一部の実施形態では塩基対合していなくてもよい（例えば、ミスマッチまたはギャップを有する）。突出端領域ヌクレオチド（または非ヌクレオチドであってもよい）を括弧で表示している（Ｎ）。アンチセンス鎖の５’末端部分のヌクレオチドは［Ｎ］と表示している。末端キャップは、センス鎖の５’および／または３’末端に存在していてもよく、さらに、アンチセンス鎖の３’末端に存在していてもよい。一般的に、各鎖は独立して約１５〜約３０ヌクレオチド長の範囲であり得るが、突出端ヌクレオチド（あれば）の存在に応じて種々であり得る。一部の特定の実施形態において、Ｘ１およびＸ２は、独立して、０〜４の整数であり；Ｘ３は、１５〜３０の整数であり；Ｘ４は、９〜３０の整数であり；Ｘ５は、０〜６の整数であるが、Ｘ４とＸ５の和は１５〜３０であるものとする。ｓｉＮＡ構築物のセンス鎖とアンチセンス鎖のヌクレオチドに対する種々の修飾を示す。（Ｎ）突出端ヌクレオチド位置は、本明細書に記載のように化学修飾されていてもよく（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ、ＬＮＡ、ユニバーサル塩基など）、対応する標的核酸配列に由来するものまたはそうでないもののいずれであってもよい。また、図示した構築物は、本明細書に記載のホスホロチオエート結合を含むものであってもよい。例えば、ホスホロチオエート結合は、任意のＮ、（Ｎ）および／または［Ｎ］の位置間に存在し得る。かかるホスホロチオエートの組込みは、プリン「Ｒ」とピリミジン「Ｙ」の位置間に、または一般にピリミジン結合の安定化のために使用され得る。さらに、図に示していないが、図示した構築物は、センス鎖の５’末端から９番目の位置またはガイド鎖の５’末端に対して１１番目の位置（ガイド鎖の５’末端から内側に数えて１１個目のヌクレオチド位置）にリボヌクレオチドを含むものであってもよい。同様に、アンチセンス鎖は、５’末端から１４番目の位置にリボヌクレオチドを含むものであってもよく、あるいはまた、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルプリン）がこの位置に存在しないように選択または設計してもよい。さらに、図に示していないが、アンチセンスの５’末端位置鎖は、本明細書に記載の末端リン酸基を含むものであってもよい。アンチセンス鎖は、一般的に、本発明の任意の標的核酸配列（本明細書の表１ａに示したものなど）に相補的な配列を含むものである。
【図３】図２に示した代表的なｓｉＮＡ二本鎖に適用される修飾の特定の組合せの非限定的な例を示す。代表的な構造の下側に示した表は、（Ν）Ｘ１、（Ν）Ｘ２、ΝＸ３、ΝＸ４、および／または［Ｎ］Ｘ５ヌクレオチド（および非ヌクレオチドであってもよい）位置の具体的な組合せを示す。例えば、５個以上（例えば、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上）のΝＸ３と５個以上（例えば、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上）のΝＸ４のピリミジン「Ｙ」とプリン「Ｒ」のヌクレオチドの組合せを明示しており、これらの各々は、独立して、存在していてもよいホスホロチオエート置換に加えて特定の（Ｎ）Ｘ１および／または（Ν）Ｘ２、図に示した置換を有するものであってもよい。５’末端アンチセンス鎖の［Ｎ］ヌクレオチドは、一般的にはリボヌクレオチドであるが、プリン「Ｒ」ヌクレオチドであるかピリミジン「Ｙ」ヌクレオチドであるかに応じて修飾型であっても非修飾型であってもよい。
【図４Ａ】本発明の種々のｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示す。図２と３に示した代表的な構造の基準は、図４Ａ〜Ｃに示した任意の構造に適用され得る。  図４Ａに示した実施例（構築物１、２および３）は、１９個の代表的な塩基対を有する；しかしながら、本発明の種々の実施形態は、本明細書に記載の任意の数の塩基対を含む。括弧内の領域は、例えば、約１、２、３または４ヌクレオチド長、好ましくは約２個のヌクレオチドを含むヌクレオチド突出端を表す。構築物１および２は、独立してＲＮＡｉ活性に使用され得る。構築物２は、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーを含むものであってもよく、該リンカーは生分解性リンカーとして設計してもよい。一実施形態において、構築物２に示したループ構造は、インビボおよび／またはインビトロで構築物１の形成をもたらす生分解性リンカーを含むものであり得る。別の例では、同じ原理で構築物２を作製するために構築物３が使用され得、この場合、活性なｓｉＮＡ構築物２をインビボおよび／またはインビトロで生成させるためにリンカーが使用され、活性なｓｉＮＡ構築物１をインビボおよび／またはインビトロで生成させるために別の生分解性リンカーを使用してもよい。そのため、ｓｉＮＡ構築物の安定性および／または活性は、インビボまたはインビトロおよび／またはインビトロで使用するためのｓｉＮＡ構築物の設計に基づいてモジュレートされ得る。
【図４Ｂ】本発明の種々のｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示す。図２と３に示した代表的な構造の基準は、図４Ａ〜Ｃに示した任意の構造に適用され得る。  図４Ｂに示した例は、一部相補性に起因する突出端、隆起部、ループ、および幹部−ループを含むものであり得る本発明の異なる型の二本鎖核酸分子（マイクロＲＮＡなど）を表す。隆起部、ループ、および幹部−ループを有するかかるモチーフは、一般的に、ｍｉＲＮＡの特徴である。隆起部、ループ、および幹部−ループは、一部相補性の任意の度合い（本発明の二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖内の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のヌクレオチドのミスマッチまたは隆起部など）に起因するものであり得る。
【図４Ｃ】本発明の種々のｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示す。図２と３に示した代表的な構造の基準は、図４Ａ〜Ｃに示した任意の構造に適用され得る。  図４Ｃに示した例は、２個のヌクレオチドの３’−突出端を有する２１個のヌクレオチドの２つの配列のうち１９個の塩基対の二本鎖を含む本発明のモデル二本鎖核酸分子を表す。上側の鎖（１）はセンス鎖（パッセンジャー鎖）を表し、真ん中の鎖（２）はアンチセンス（ガイド鎖）を表し、下側の鎖（３）は標的ポリヌクレオチド配列を表す。２個のヌクレオチドの突出端（ＮＮ）は、標的ポリヌクレオチドに由来する配列を含むものであり得る。例えば、ガイド鎖の３’−（ＮＮ）配列は、標的ポリヌクレオチドの５’−［ＮＮ］配列に相補的であり得る。また、パッセンジャー鎖の５’−（ＮＮ）配列は、標的ポリヌクレオチド配列の５’−［ＮＮ］配列と同じ配列を含むものであり得る。他の実施形態では、突出端（ＮＮ）は、標的ポリヌクレオチド配列に由来するものでなく、例えば、ガイド鎖の３’−（ＮＮ）配列は標的ポリヌクレオチドの５’−［ＮＮ］配列に相補的でなく、パッセンジャー鎖の５’−（ＮＮ）配列は標的ポリヌクレオチド配列の５’−［ＮＮ］配列と異なる配列を含むものであり得る。さらなる実施形態では、（ＮＮ）ヌクレオチド（あれが）は化学修飾されたもの、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、および／または本明細書における他の修飾体である。さらに、パッセンジャー鎖は、パッセンジャー鎖のＮ位にリボヌクレオチドを含むものであってもよい。図示した代表的な１９塩基対合２１量体二本鎖では、Ｎ位はパッセンジャー鎖の３’末端から内側に９個のヌクレオチドであり得る。しかしながら、異なる長さの二本鎖では、Ｎ位は、ガイド鎖の５’末端を基準にしてガイド鎖の５’末端から内側に１１個のヌクレオチド位置を数え、パッセンジャー鎖の対応する塩基対合ヌクレオチドを選出することにより決定される。Ａｇｏ２による切断は、矢印で示した１０位と１１位の間で起こる。さらなる実施形態では、ガイド鎖の５’末端を基準にしてガイド鎖の５’末端から内側に１０および１１のヌクレオチド位置を数え、パッセンジャー鎖内の対応する塩基対合ヌクレオチドを選出することにより、２個のリボヌクレオチドＮＮが１０位と１１位に存在する。
【図５】例えば本発明のｓｉＮＡ配列の５’および／または３’末端を安定化させるため使用され得る種々の安定化化学構造（１〜１０）の非限定的な例、例えば、（１）［３−３’］−逆位デオキシリボース；（２）デオキシリボヌクレオチド；（３）［５’−３’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（４）［５’−３’］−リボヌクレオチド；（５）［５’−３’］−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；（６）３’−グリセリル；（７）［３’−５’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（８）［３’−３’］−デオキシリボヌクレオチド；（９）［５’−２’］−デオキシリボヌクレオチド；および（１０）［５−３’］−ジデオキシリボヌクレオチド（Ｘ＝Ｏの場合）を示す。図に示した修飾型および非修飾型の主鎖化学構造に加え、このような化学構造は、本明細書に記載の種々の糖鎖および塩基ヌクレオチドの修飾と組み合わせることができる。
【図６】ヌクレアーゼ抵抗性であるがＲＮＡｉ活性を媒介する能力は保持している本発明の化学修飾ｓｉＮＡ構築物を同定するために使用されるストラテジーの非限定的な一例を示す。化学修飾は、ｓｉＮＡ構築物に、知識に基づいた設計パラメータに基づいて導入される（例えば、２’−修飾、塩基修飾、主鎖修飾、末端キャップ修飾などが導入される）。修飾型構築物は、適切な系（例えば、ヌクレアーゼ抵抗性についてはヒト血清（表示）、またはＰＫ／送達パラメータについては動物モデル）において試験される。並行して、ｓｉＮＡ構築物はＲＮＡｉ活性について、例えば、細胞培養系において（ルシフェラーゼレポーターアッセイ）および／または内因性ｍＲＮＡに対して試験される。次いで、特定の特徴を有するがＲＮＡｉ活性は保持しているリードｓｉＮＡ構築物が特定され、さらに修飾し、もう一度アッセイしてもよい。この同じアプローチを使用し、薬物動態学的プロフィール、送達およびＲＮＡｉ活性が改善されたｓｉＮＡ−コンジュゲート分子が同定され得る。
【図７】線状の二本鎖構築物ならびにその非対称誘導体を含む、本発明のリン酸化ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。
【図８】本発明の化学修飾末端リン酸基の非限定的な例を示す。
【図９】本発明のコレステロールコンジュゲート型ｓｉＮＡ分子を合成するために使用され得るコレステロール連結ホスホルアミダイトの非限定的な例を示す。コレステロール部分がｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端に連結された一例を示す。
【図１０】核酸鎖に連結された５’および３’逆位無塩基キャップが一実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
Ａ．用語および定義
本出願書類で用いる場合、以下の専門用語および定義を適用する。
【００４３】
用語「無塩基の」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、糖鎖部分の１’位の核酸塩基が欠失しているか、または核酸塩基の代わりに水素原子（Ｈ）もしくは他の非核酸塩基化学基を有する糖鎖部分をいい、例えば、Ａｄａｍｉｃら，米国特許第５，９９８，２０３号を参照のこと。一実施形態において、本発明の無塩基部分は、リボース、デオキシリボース、またはジデオキシリボース糖鎖である。
【００４４】
用語「非環式ヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、非環式リボース糖鎖を有する任意のヌクレオチド、例えば、リボースの炭素／炭素結合または炭素／酸素結合（あれば）が独立して、または組合せでヌクレオチドに存在しないものをいう。
【００４５】
用語「アルキル」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、飽和または不飽和の炭化水素、例えば、直鎖、分枝鎖のアルケニル、アルキニル基および環式基をいうが、芳香族基は除外される。前述のことにかかわらず、アルキルはまた、非芳香族の複素環式基も指す。好ましくは、アルキル基は１〜１２個の炭素を有するものである。より好ましくは、炭素数が１〜７、より好ましくは炭素数が１〜４の低級アルキルである。アルキル基は、置換型であっても非置換型であってもよい。置換型である場合、置換基（１つまたは複数）は、好ましくは、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、＝０、＝Ｓ、ＮＯ２、ＳＨ、ＮＨ２、またはＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＨもしくはＣ１〜Ｃ４アルキルである）である。
【００４６】
語句「細胞周期のチェックポイントに干渉する薬剤」は、細胞周期のチェックポイントのシグナルを伝達するプロテインキナーゼを阻害し、それによりがん細胞をＤＮＡ損傷剤に対して感作させる化合物をいう。
【００４７】
語句「受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に干渉する薬剤」は、ＲＴＫを阻害し、したがって発がんおよび腫瘍進行に関与している機構を阻害する化合物をいう。
【００４８】
語句「アンドロゲン受容体モジュレータ」は、機構に関係なくアンドロゲンのその受容体に対する結合を妨げる、または該結合を阻害する化合物をいう。
【００４９】
語句「血管新生阻害薬」は、機構に関係なく新たな血管の形成を阻害する化合物をいう。
【００５０】
用語「アリール」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、共役π電子系を有する少なくとも１つの環を有する芳香族基をいい、炭素環式アリール、複素環式アリールおよびビアリール基（これらはすべて、置換されていてもよい）を包含する。アリール基の好ましい置換基（１つまたは複数）は、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、ＯＨ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４アルキニル、ＮＨ２、ならびにＮＲ１Ｒ２基（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＨもしくはＣ１〜Ｃ４アルキルである）である。
【００５１】
用語「アルキルアリール」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、アリール基（上記のもの）に共有結合により連接されたアルキル基（上記のもの）をいう。炭素環式アリール基は、芳香族環の環内原子がすべて炭素原子である基である。該炭素原子は置換されていてもよい。複素環式アリール基は、芳香族環に環内原子として１〜３個のヘテロ原子を有し、残りの環内原子が炭素原子である基である。好適なヘテロ原子としては酸素、イオウおよび窒素が挙げられ、かかるヘテロ原子を有する複素環式アリール基の例としては、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリルなど（すべて、置換されていてもよい）が挙げられる。好ましくは、該アルキル基はＣ１〜Ｃ４アルキル基である。
【００５２】
用語「アミド」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒをいい、式中、Ｒは、アルキル、アリール、アルキルアリールまたは水素のいずれかである。
【００５３】
語句「アンチセンス領域」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。本発明の例示的な核酸分子に関して、該用語は、標的核酸配列に対して相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列をいう。また、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、該ｓｉＮＡ分子のセンス領域に対して相補性を有する核酸配列を含むものであってもよい。一実施形態では、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域をアンチセンス鎖またはガイド鎖と称する。
【００５４】
語句「非対称ヘアピン型」は、アンチセンス領域と、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むものであり得るループ部分と、センス領域とを含み、センス領域が、アンチセンス領域と塩基対合してループを有する二本鎖を形成するのに充分な相補ヌクレオチドを有する範囲でアンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む線形ｓｉＮＡ分子をいう。例えば、本発明の非対称ヘアピン型ｓｉＮＡ分子は、細胞内またはインビトロ系においてＲＮＡｉを媒介するのに充分な長さ（例えば、約１５〜約３０個、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個のヌクレオチド）を有するアンチセンス領域と、約４〜約１２（例えば、約４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２）個のヌクレオチドを含むループ領域と、アンチセンス領域に相補的な約３〜約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５）個のヌクレオチドを有するセンス領域とを含むものであり得る。また、非対称ヘアピン型ｓｉＮＡ分子は、５’末端リン酸基（化学修飾されていてもよい）を含むものであってもよい。非対称ヘアピン型ｓｉＮＡ分子のループ部分は、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子またはコンジュゲート分子（本明細書に記載）を含むものであってもよい。
【００５５】
用語「生分解性の」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、生物学的系内における分解、例えば、酵素的分解または化学的分解をいう。
【００５６】
用語「生分解性リンカー」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。本発明の例示的な核酸分子に関して、該用語は、ある分子を別の分子に連結させるために設計され、生物学的系内における分解を受け易いリンカー分子をいう。該リンカーは、核酸系リンカーであっても非核酸系リンカーであってもよい。例えば、生分解性リンカーは、リガンドまたは生物学的に活性な分子を本発明のｓｉＮＡ分子に結合させるために使用され得る。あるいはまた、生分解性リンカーは、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖を連結するために使用され得る。生分解性リンカーは、その安定性が具体的な目的（特定の組織または細胞型への送達など）のためにモジュレートされ得るように設計される。核酸系の生分解性リンカー分子の安定性は、種々の化学物質、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ならびに化学修飾されたヌクレオチド（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、および他の２’修飾または塩基修飾ヌクレオチドなど）の組合せを使用することによりモジュレートされ得る。生分解性核酸リンカー分子は、二量体、三量体、四量体またはそれより長鎖の核酸分子（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド）であってもよく、リン系結合（例えば、ホスホロアミダートまたはホスホジエステル結合）を有する単一ヌクレオチドを含むものであってもよい。また、生分解性核酸リンカー分子は、核酸主鎖、核酸糖鎖、または核酸塩基の修飾を含むものであってもよい。
【００５７】
語句「生物学的に活性な分子」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。本発明の例示的な核酸分子に関して、該用語は、系内の生物学的応答を誘起もしくは改良し得る、および／または他の生物学的に活性な分子の薬物動態特性および／または薬力学的特性をモジュレートし得る化合物または分子をいう。生物学的に活性な分子の例としては、単独、または他の分子（例えば限定されないが、治療上活性な分子、例えば、抗体、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス薬、ペプチド、タンパク質、化学療法薬、小分子、ビタミン類、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素性核酸、アンチセンス核酸、オリゴヌクレオチドを形成する三重鎖、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、他のポリエーテル、２−５Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、デコイおよびその類似体など）と併用されるｓｉＮＡ分子が挙げられる。
【００５８】
語句「生物学的系」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、生物学的供給源、例えば限定されないがヒトまたは動物に由来する精製形態または未精製形態の物質をいい、該系には、ＲＮＡｉ活性に必要とされる成分が含まれている。したがって、この語句は、例えば、細胞、組織、被検体もしくは生物体またはその抽出物を包含する。また、該用語は、生物学的供給源に由来する再構成物質も包含する。
【００５９】
語句「平滑端」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。本発明の例示的な核酸分子に関して、該用語は、突出端ヌクレオチドを有しない二本鎖ｓｉＮＡ分子の末端をいう。例えば、平滑端を有する二本鎖ｓｉＮＡ分子の２つの鎖は、末端に突出端ヌクレオチドがなく、互いに一直線に並んで塩基対がマッチしている。本発明のｓｉＮＡ二本鎖分子は平滑端を、該二本鎖の一方または両方の末端（例えば、アンチセンス鎖の５’末端、センス鎖の５’末端に位置する末端または該二本鎖の両末端）に含むものであってもよい。
【００６０】
用語「キャップ」（本明細書において「末端キャップ」とも称する）は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。本発明の例示的な核酸分子に関して、該用語は、本発明の１種類以上の核酸分子の１つ以上の末端に組み込まれ得る化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドであり得る部分をいう。このような末端修飾により、核酸分子がエキソヌクレアーゼ分解から保護され、細胞内における送達および／または局在化が補助され得る。キャップは、５’末端（５’−キャップ）または３’末端（３’−キャップ）に存在させてもよく、本発明の任意の核酸分子の両末端に存在させてもよい。キャップは、本発明の核酸分子のセンス鎖の５’末端、３末端および／または５’末端と３’末端に存在させてもよい。さらに、キャップは、本発明の核酸分子のアンチセンス鎖の３’末端に存在させてもよい。非限定的な例において、５’−キャップとしては、限定されないが、ＬＮＡ；グリセリル；逆位デオキシ無塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド；３’−３’−逆位ヌクレオチド部分；３’−３’−逆位無塩基部分；３’−２’−逆位ヌクレオチド部分；３’−２’−逆位無塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホロアミダート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または橋状結合性もしくは非橋状結合性メチルホスホネート部分が挙げられる。３’−キャップの非限定的な例としては、限定されないが、ＬＮＡ；グリセリル；逆位デオキシ無塩基残基（部分）；４’、５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート；３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド部分；５’−５’−逆位無塩基部分；５’−ホスホロアミダート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；橋状結合性および／または非橋状結合性５’−ホスホロアミダート；ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート；橋状結合性または非橋状結合性メチルホスホネート；ならびに���’−メルカプト部分（さらなる詳細については、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９，１９２５を参照のこと；引用により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。図５は、種々のキャップの非限定的な例を示す。
【００６１】
用語「細胞」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。本発明の例示的な核酸分子に関して、該用語は、その通常の生物学的意味で用いており、完全な多細胞生物体を指すのではない（例えば、具体的には、人間を指すのではない）。細胞は、生物体、例えば、鳥類、植物および哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、およびネコに存在するものであり得る。細胞は、原核生物系（例えば、細菌細胞）であっても真核生物系（例えば、哺乳動物または植物の細胞）であってもよい。細胞は、体細胞起源または生殖細胞系起源、全能性または多能性、分裂性または非分裂性であり得る。また、細胞は、生殖体もしくは胚、幹細胞または完全に分化した細胞に由来するものであってもよく、これらを構成するものであってもよい。
【００６２】
語句「化学修飾」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。本発明の例示的な核酸分子に関して、該用語は、一般的な天然ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチドと異なるヌクレオチド化学構造の任意の修飾をいう。用語「化学修飾」は、本明細書に記載の、あるいは当該技術分野で知られているような、糖鎖、塩基またはヌクレオチド間結合における天然のｓｉＲＮＡまたはＲＮＡの付加、置換または修飾を包含する。一部の特定の実施形態において、用語「化学修飾」は、特定の生物学的系内に天然に存在しているＲＮＡの特定の形態（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾またはイノシン修飾）をいう場合があり得る。
【００６３】
用語「相補性」または「相補的な」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。本発明の例示的な核酸分子に関して、該用語は、一般的に、ある核酸配列と別の核酸配列間での、従来のワトソン−クリック型または本明細書に記載の他の非従来型の結合のいずれかによる水素結合（１つまたは複数）の形成または存在をいう。本発明の核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）分子に関連して、核酸分子のその相補配列との結合自由エネルギーは、該核酸の該当する機能（例えば、ＲＮＡｉ活性）が進行することを可能にするのに充分なものである。核酸分子の結合自由エネルギーの測定は当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒら，１９８７，ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ  ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒら，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照のこと）。完璧に相補的とは、核酸配列の連続している残基のすべてが、第２の核酸配列内の同じ数の連続している残基と水素結合することを意味する。一部相補性は、種々のミスマッチまたは非塩基対合ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくはそれ以上のミスマッチ、非ヌクレオチドリンカーまたは非塩基対合ヌクレオチド）を核酸分子内に含むものであり得、これにより、核酸分子のセンス鎖もしくはセンス領域とアンチセンス鎖もしくはアンチセンス領域間、または核酸分子と対応する標的核酸分子のアンチセンス鎖間もしくはアンチセンス領域間に生成される隆起部、ループまたは突出端がもたらされ得る。かかる一部相補性は相補性％で表すことができ、非塩基対合ヌクレオチドの数、すなわち、関与しているヌクレオチドの総数に応じて約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％などと求められる。かかる一部相補性は、核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）がその機能（例えば、配列特異的ＲＮＡｉを媒介する能力）維持している範囲で許容される。
【００６４】
用語「組成物」または「製剤」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。これらの用語は、一般的に、細胞または被検体（例えば、ヒトなど）への投与（例えば、全身性または局所投与）に適した形態の、例えば、薬学的に許容され得る担体または希釈剤との組成物または製剤をいう。好適な形態は、一部において、用途または進入経路（例えば、経口、経皮、吸入もしくは注射）に依存する。かかる形態は、該組成物または製剤が標的細胞（すなわち、負電荷を有する核酸が送達に望ましい細胞）に到達するのを妨げないものであるのがよい。例えば、血流中に注射される組成物は、可溶性であるのがよい。他の要素は、当該技術分野で知られており、毒性および該組成物または製剤の奏功を妨げる形態などの考慮事項が挙げられる。本明細書で用いる場合、医薬製剤は、ヒト使用および獣医学的使用のための製剤を包含する。本発明の核酸分子を用いた製剤に適した薬剤の非限定的な例としては：脂質ナノ粒子（例えば、Ｓｅｍｐｌｅら，２０１０，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｆｅｂ；２８（２）：１７２−６参照）；Ｐ−糖タンパク質阻害薬（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５など）；生分解性ポリマー（徐放送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフィアなど（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦら，１９９９，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８））；および負荷ナノ粒子（ポリブチルシアノアクリレートで作製されたもの）が挙げられる。本発明の核酸分子のための送達ストラテジーの他の非限定的な例としては、Ｂｏａｄｏら，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７，１３０８−１３１５；Ｔｙｌｅｒら，１９９９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２１，２８０−２８４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，１９９５，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．，９２，５５９２−５５９６；Ｂｏａｄｏ，１９９５，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１５，７３−１０７；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａら，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６，４９１０−４９１６；およびＴｙｌｅｒら，１９９９，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．，９６，７０５３−７０５８に記載された物質が挙げられる。「薬学的に許容され得る組成物」または「薬学的に許容され得る製剤」は、その所望の活性に最も適した身体位置での本発明の核酸分子の有効な分布を可能にする組成物または製剤をいうものであり得る。
【００６５】
語句「細胞傷害剤／細胞増殖抑制薬」は、主に細胞の機能発揮を直接妨げることにより、細胞死を引き起こすか、または細胞増殖を抑止する化合物、あるいは細胞の有糸分裂（ｍｙｔｏｓｉｓ）を阻害するか、または妨げる化合物をいい、アルキル化剤、腫瘍壊死因子、インターカレータ、低酸素活性化性化合物、微小管阻害薬／微小管安定化剤、有糸分裂キネシンの阻害薬、ヒストンデアセチラーゼの阻害薬、有糸分裂の進行に関与しているキナーゼの阻害薬、代謝拮抗薬；生物学的応答の改良薬；ホルモン／抗ホルモン療法剤、造血系増殖因子、モノクローナル抗体ターゲテッド治療用薬剤、トポイソメラーゼ阻害薬、プロテアソーム阻害薬およびユビキチンリガーゼ阻害薬が挙げられる。
【００６６】
語句「エストロゲン受容体モジュレータ」は、機構に関係なくエストロゲンのその受容体に対する結合を妨げる、または該結合を阻害する化合物をいう。
【００６７】
用語「遺伝子」または「標的遺伝子」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、ポリペプチドの生成に必要な一部分の長さまたは全長のコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列をいう。また、標的遺伝子は、その核酸配列のＵＴＲまたは非コード領域を含むものであってもよい。また、遺伝子または標的遺伝子は、機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）または非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えば、小分子一本鎖（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ）ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびその前駆体ＲＮＡをコードするものであってもよい。かかる非コードＲＮＡは、機能性または調節性の細胞プロセスに関与しているｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性のモジュレーションにおけるｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡ干渉の標的核酸分子の機能を果たすものであり得る。したがって、疾患をもたらす異常なｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性は、本発明のｓｉＮＡ分子によってモジュレートされ得る。また、ｆＲＮＡおよびｎｃＲＮＡを標的化するｓｉＮＡ分子は、遺伝子（ｇｅｎｅｔｉｃ）インプリンティング、転写、翻訳、または核酸プロセッシング（例えば、アミノ基転移、メチル化など）などの細胞プロセスに介在することにより、被検体、生物体または細胞の遺伝子型または表現型を操作または改変するために使用され得る。標的遺伝子は、細胞に由来する遺伝子、内因性遺伝子、導入遺伝子、または外因性遺伝子（感染後の細胞内に存在する病原体（例えば、ウイルス）の遺伝子など）であり得る。標的遺伝子を含む細胞は、任意の生物体、例えば、植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌または真菌に由来するもの、またはこれらに含有されているものであり得る。植物の非限定的な例としては、単子葉植物、双子葉植物、または裸子植物が挙げられる。動物の非限定的な例としては、脊椎動物または非脊椎動物が挙げられる。真菌の非限定的な例としては、カビまたは酵母が挙げられる。概説については、例えば、ＳｎｙｄｅｒおよびＧｅｒｓｔｅｉｎ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００，２５８−２６０を参照のこと。
【００６８】
語句「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬」は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼの阻害薬をいう。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬という用語は、本明細書で用いる場合、あらゆる薬学的に許容され得るラクトンおよび開環型の酸形態（すなわち、ラクトン環が開環してその遊離酸が形成されている場合）ならびにＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害活性を有する化合物の塩およびエステルの形態を包含し、したがって、かかる塩、エステル、開環型の酸およびラクトン形態の使用は本発明の範囲に含まれる。
【００６９】
用語「ＨＢＶ」はＢ型肝炎ウイルスを指し、これは、ＨＢＶタンパク質、ＨＢＶペプチド、ＨＢＶポリペプチド、ＨＢＶ調節ポリヌクレオチド（例えば、ＨＢＶ  ｍｉＲＮＡおよびｓｉＮＡ）をコードしている遺伝子、変異型ＨＢＶ遺伝子、およびＨＢＶ遺伝子のスプライスバリアント、ならびに遺伝子発現および／または活性のＨＢＶ経路に関与している他の遺伝子である。したがって、用語「ＨＢＶ」に関する本明細書に記載の各実施形態は、用語「ＨＢＶ」（該用語は本明細書において定義している）に包含されるタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、および／またはポリヌクレオチド分子のすべてに適用可能である。包括的に、かかる遺伝子標的は、本明細書において一般的に「標的」配列（例えば、表１ａに示した標的配列）とも呼ばれる。
【００７０】
語句「高度に保存された配列領域」は、ある世代とその他の世代で、またはある生物学的系とその他の生物学的系で有意に変化していない標的遺伝子内の１つ以上の領域のヌクレオチド配列をいう。
【００７１】
語句「相同配列」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、１種類以上のポリヌクレオチド配列、例えば、遺伝子、遺伝子転写物および／または非コードポリヌクレオチドなどによって共有されたヌクレオチド配列をいう。例えば、相同配列は、関連しているが異なるタンパク質（遺伝子ファミリーの異なる構成員、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォームなど）をコードしている２種類以上の遺伝子または完全に相違する遺伝子によって共有されたヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、２種類以上の非コードポリヌクレオチド、例えば、非コードＤＮＡまたはＲＮＡ、調節配列、イントロン、および転写の制御部位または調節部位などによって共有されたヌクレオチド配列であってもよい。また、相同配列は、１つより多くのポリヌクレオチド配列によって共有された配列領域を含むものであり得る。相同性は、完璧に同一（１００％）である必要はなく、一部相同配列も、本発明の範囲で考慮され、本発明の範囲内で考慮される（例えば、少なくとも９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％など）。相同性パーセントは、２つの配列間でマッチしているヌクレオチドの数を比較対象の全長で除算して１００を乗算したものである。
【００７２】
語句「改善されたＲＮＡｉ活性」は、インビトロおよび／またはインビボで測定されたＲＮＡｉ活性の増大をいい、該ＲＮＡｉ活性は、ｓｉＮＡがＲＮＡｉを媒介する能力および本発明のｓｉＮＡの安定性の両方の反映である。本発明において、このような活性の成果は、全ＲＮＡ  ｓｉＮＡまたは複数のリボヌクレオチドを含有するｓｉＮＡと比べて、インビトロおよび／またはインビボでの増大したものであり得る。一部の場合では、ｓｉＮＡ分子の活性または安定性が低下している（すなわち、１０倍未満である）ものがあり得るが、ｓｉＮＡ分子の全体的な活性はインビトロおよび／またはインビボで向上している。
【００７３】
用語「阻害する」、「下方調節する」、または「低減させる」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。本発明の例示的な核酸分子に関して、該用語（ｈｅ  ｔｅｒｍ）は、一般的に、遺伝子の発現、または１種類以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードしているＲＮＡ分子もしくは同等ＲＮＡ分子のレベル、または１種類以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性を、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）の非存在下で観察されるものよりも低下させることをいう。また、下方調節は、転写後サイレンシング（ＲＮＡｉ媒介性切断など、またはＤＮＡのメチル化パターンもしくはＤＮＡのクロマチン構造の改変により）と関連しているものであり得る。ｓｉＮＡ分子による阻害、下方調節または低減は、不活性な分子、弱毒化分子、スクランブル配列を有するｓｉＮＡ分子、またはミスマッチを有するｓｉＮＡ分子に関するものであってもよく、あるいはまた、核酸が存在しない系に関するものであってもよい
語句「細胞の増殖および生存のシグナル伝達経路の阻害薬」は、細胞表面受容体および該表面受容体の下流のシグナル伝達カスケードを阻害する医薬用薬剤をいう。
【００７４】
用語「インテグリン遮断薬」は、生理学的リガンドがαωβ３インテグリンに結合することを選択的に拮抗、阻害または反作用する化合物、生理学的リガンドがαωβ５インテグリンに結合することを選択的に拮抗、阻害または反作用する化合物、生理学的リガンドがαωβ３インテグリンとαωβ５インテグリンの両方に結合することを拮抗、阻害または反作用する化合物、および毛管内皮細胞で発現される特定のインテグリン（１種類または複数種）の活性を拮抗、阻害または反作用する化合物をいう。また、該用語は、αωβ．６、αωβ．８、α１β．１、α２β．１、α５β．１、α６β１、およびα６β４インテグリンの拮抗薬も指す。また、該用語は、αωβ３、αωβ５、αωβ．６、αωβ．８、α１β．１、α２β．１、α５β．１、α６β１、およびα６β４インテグリンの任意の組合せの拮抗薬も指す。
【００７５】
用語「断続的」または「断続的に」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、規則的間隔または不規則的間隔のいずれかで定期的に停止および開始させることをいう。
【００７６】
用語「ヌクレオシド間結合」または「ヌクレオシド間リンカー」または「ヌクレオチド間結合」または「ヌクレオチド間リンカー」は、本明細書において互換的に用いており、当該技術分野で知られた任意のリンカーまたは２つのヌクレオシド単位間の結合をいい、例えば限定されないが、ホスフェート、ホスフェート類似体、ホスホネート、グアニジウム、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシルヒドラジニル、アミド、カルバメート、アルキル、および置換アルキル結合が挙げられる。ヌクレオシド間結合は核酸分子の主鎖を構成している。
【００７７】
用語「哺乳動物の」または「哺乳動物」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、任意の温血脊椎動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜動物などをいう。
【００７８】
語句「定量吸入器」またはＭＤＩは、缶、該缶に蓋をするねじ込み式キャップおよび該キャップに配設された製剤を計量する弁を備えたユニットをいう。ＭＤＩシステムとしては、適当なチャネル付（ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ）デバイスが挙げられる。好適なチャネル付デバイスは、例えば、弁作動器と、柱状路または円錐様路（これを介して、医薬が充填キャニスターから計量弁によって患者の鼻または口に送達され得る）とを備えたものである（マウスピース型作動器）。
【００７９】
用語「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、標的メッセンジャーＲＮＡの発現を、ｍＲＮＡの切断、翻訳の抑制／阻害または異質染色質サイレンシングのいずれかによって調節する低分子二本鎖ＲＮＡをいう（例えば、Ａｍｂｒｏｓ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３１，３５０−３５５；Ｂａｒｔｅｌ，２００４，Ｃｅｌｌ，１１６，２８１−２９７；Ｃｕｌｌｅｎ，２００４，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，１０２，３−９；Ｈｅら，２００４，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，５，５２２−５３１；Ｙｉｎｇら，２００４，Ｇｅｎｅ，３４２、２５−２８；およびＳｅｔｈｕｐａｔｈｙら，２００６、ＲＮＡ、１２：１９２−１９７を参照のこと）。
【００８０】
用語「モジュレートする」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。本発明の例示的な核酸分子に関して、該用語は、遺伝子の発現、または１種類以上のＲＮＡ分子（コードもしくは非コード）のレベル、または１種類以上のＲＮＡ分子もしくはタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性を、該発現、レベルまたは活性が、モジュレーションをもたらす分子の非存在下で観察されるものよりも大きくなる、または小さくなるように上方調節または下方調節する場合をいう。例えば、用語「モジュレートする」は、一部の実施形態では、例えば遺伝子発現の阻害を指すものであり得、他の実施形態では、その増強または上方調節を指すものであり得る。
【００８１】
語句「修飾ヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、当該技術分野で一般的に知られた非修飾（または天然）ヌクレオチドの塩基、糖鎖および／またはリン酸基の化学構造内に修飾を含むヌクレオチドをいう。修飾ヌクレオチドの非限定的な例は、本明細書および米国特許出願第１２／０６４，０１４号に記載されている。
【００８２】
語句「選択的ＣＯＸ−２阻害薬であるＮＳＡＩＤ」は、本明細書における解釈上、細胞アッセイまたはミクロソームアッセイによって評価されるＣＯＸ−１の場合のＩＣ５０に対するＣＯＸ−２の場合のＩＣ５０の比率によって測定したとき、ＣＯＸ−１よりもＣＯＸ−２の阻害に対して少なくとも１００倍の特異性を有するＮＳＡＩＤをいう。
【００８３】
語句「非塩基対合」は、二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間でヌクレオチドが塩基対合されていないことをいい；例えば限定されないが、ミスマッチ、突出端、一本鎖ループなどが包含され得る。
【００８４】
用語「非ヌクレオチド」は、核酸鎖内の１つ以上のヌクレオチド単位の代わりに組み込まれ得る任意の基または化合物（例えば限定されないが、無塩基部分またはアルキル鎖）をいう。該基または化合物は、一般的に認識されているヌクレオチド塩基（アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなど）を含有しておらず、したがって、１’位に核酸塩基がないという点で「無塩基」である。
【００８５】
用語「ヌクレオチド」は、当該技術分野で一般的に認知されているとおりに用いている。ヌクレオチドは、一般的に、核酸塩基、糖鎖およびヌクレオシド間結合（例えば、ホスフェート）を含む。塩基は、天然塩基（標準）であっても修飾塩基であっても塩基類似体であってもよく、これらは、当該技術分野でよく知られている。かかる塩基は、一般的に、ヌクレオチドの糖鎖部分の１’位に存在している。さらに、ヌクレオチドは非修飾であってもよく、糖鎖、ヌクレオシド間結合、および／または塩基部分が修飾されていてもよい（互換的にヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどとも称される；例えば、米国特許出願第１２／０６４，０１４号を参照のこと）。
【００８６】
用語「突出端」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。例示的な二本鎖核酸分子に関して、該用語は、一般的に、二本鎖核酸分子の２つの鎖が塩基対合されていない末端ヌクレオチド配列部分をいう（例えば、図４を参照のこと）。突出端は、存在している場合、典型的には、ｓｉＮＡ二本鎖の一方または両方の鎖の３’末端に存在している。
【００８７】
用語「非経口」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、消化管経由以外の様式で分子、薬物、薬剤または化合物を投与する方法または手法をいい、皮膚上、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、または髄腔内注射または注入手法などが挙げられる。
【００８８】
語句「経路標的」は、遺伝子の発現または活性の経路に関与している任意の標的をいう。例えば、任意の所与の標的は、生物学的経路内に関連経路標的を有し得、関連経路標的としては、上流遺伝子、下流遺伝子または変更遺伝子が挙げられ得る。このような経路標的遺伝子により、本明細書における疾患、病状および形質の処置において相加的または相乗的効果がもたらされ得る。
【００８９】
用語「ホスホロチオエート」は、酸素原子の代わりに１個以上のイオウ原子を含むヌクレオチド間リン酸結合をいう。したがって、ホスホロチオエートという用語は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合およびホスホロジチオエートヌクレオチド間結合のどちらも指す。
【００９０】
「プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害薬」は、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ酵素、例えば、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ（ＦＰＴａｓｅ）、ゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼＩ型（ＧＧＰＴａｓｅ−Ｉ）、およびゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼＩＩ型（ＧＧＰＴａｓｅ−ＩＩ，Ｒａｂ  ＧＧＰＴａｓｅとも称される）の任意の１種類または任意の組合せを阻害する化合物をいう。
【００９１】
語句「レチノイド受容体モジュレータ」は、機構に関係なくレチノイドのその受容体に対する結合を妨げる、または該結合を阻害する化合物をいう。
【００９２】
用語「リボヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドをいう。
【００９３】
用語「ＲＮＡ」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められた意味を示す。一般的に、ＲＮＡという用語は、少なくとも１つのリボフラノシド部分を含む分子をいう。該用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば、一部精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え作製されたＲＮＡ、ならびに天然に存在するＲＮＡと１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって異なる改変ＲＮＡが包含され得る。かかる改変としては、ｓｉＮＡの末端（１つまたは複数）または内部などの例えば該ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質の付加が挙げられ得る。また、本発明のＲＮＡ分子内のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドを含むものであってもよい。このような改変ＲＮＡは、類似体または天然ＲＮＡの類似体と称されることがあり得る。
【００９４】
語句「ＲＮＡ干渉」または用語「ＲＮＡｉ」は、細胞内での遺伝子発現を阻害または下方調節する生物学的プロセスをいい、これは、当該技術分野で一般的に知られており、低分子干渉核酸分子によって媒介される。例えば、ＺａｍｏｒｅおよびＨａｌｅｙ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５１９−１５２４；ＶａｕｇｈｎおよびＭａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２５−１５２６；Ｚａｍｏｒｅら，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；ならびにＫｒｅｕｔｚｅｒら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ００／４４８９５；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ０１／３６６４６；Ｆｉｒｅ，ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ９９／３２６１９；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ００／０１８４６；ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅ，ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ０１／２９０５８；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ９９／０７４０９；およびＬｉら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ００／４４９１４；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；ならびにＨａｌｌら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７；ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓら，２００２，ＲＮＡ，８、８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔら，２００２，Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；ならびにＲｅｉｎｈａｒｔ  ＆  Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１）を参照のこと。さらに、ＲＮＡｉという用語は、配列特異的ＲＮＡ干渉を示すために用いている他の用語、例えば、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、または後成的などと等価であることを意図する。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は、転写後レベルまたは転写前レベルのいずれかで、後成的遺伝子サイレンシングを行なうために使用され得る。非限定的な例において、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の後成的モジュレーションは、遺伝子発現を改変するためのクロマチン構造またはメチル化パターンのｓｉＮＡ媒介性改良の結果、起こるものであり得る（例えば、Ｖｅｒｄｅｌら，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６７２−６７６；Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａら，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６６９−６７２；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照のこと）。別の非限定的な例では、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のモジュレーションは、ＲＩＳＣ���しくは翻訳阻害によるＲＮＡ（コードＲＮＡもしくは非コードＲＮＡのいずれか）のｓｉＮＡ媒介性切断の結果、起こるものであり得るか（当該技術分野で知られている）、またはモジュレーションは、転写阻害の結果、起こるものであり得る（例えば、Ｊａｎｏｗｓｋｉら，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，２１６−２２２を参照のこと）。
【００９５】
語句「ＲＮＡｉ阻害薬」は、細胞または生物体においてＲＮＡ干渉性の機能または活性を下方調節、低減または阻害し得る任意の分子をいう。ＲＮＡｉ阻害薬は、ＲＮＡｉ（例えば、標的ポリヌクレオチドのＲＮＡｉ媒介性切断、翻訳阻害、もしくは転写サイレンシング）を、ＲＮＡｉ経路の任意の成分（例えば、ＲＩＳＣなどのタンパク質成分、またはｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡなどの核酸成分）の機能と相互作用すること、または該機能を妨げることによって下方調節、低減または阻害し得るものである。ＲＮＡｉ阻害薬は、ｓｉＮＡ分子、アンチセンス分子、アプタマー、またはＲＩＳＣの機能と相互作用する、もしくは該機能を妨げる小分子、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡまたは細胞もしくは生物体のＲＮＡｉ経路の任意の他の成分であり得る。ＲＮＡｉ（例えば、標的ポリヌクレオチドのＲＮＡｉ媒介性切断、翻訳阻害、または転写サイレンシング）を阻害することにより、本発明のＲＮＡｉ阻害薬は、標的遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、上方調節または下方調節する）ために使用され得る。
【００９６】
語句「センス領域」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。本発明の例示的な核酸分子に関して、該用語は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対して相補性を有する該ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列をいう。また、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性または配列同一性を有する核酸配列を含むものであり得る。一実施形態において、ｓｉＮＡ分子のセンス領域はセンス鎖またはパッセンジャー鎖とも称される。
【００９７】
語句「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」、または「化学修飾された低分子干渉核酸分子」は、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」または遺伝子サイレンシングを配列特異的様式で媒介することにより、遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方調節し得る任意の核酸分子をいう。これらの用語は、個々の核酸分子、複数のかかる核酸分子、またはかかる核酸分子のプールのいずれも示し得る。ｓｉＮＡは、自己相補性のセンス鎖とアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子であり得、この場合、アンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むものであり、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を含むものである。ｓｉＮＡは、二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピン型または非対称ヘアピン型二次構造を有し、自己相補性のセンス領域とアンチセンス領域を有するポリヌクレオチドであってもよく、この場合、アンチセンス領域は、別々の標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むものであり、センス領域は、標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を含むものである。ｓｉＮＡは、２つ以上のループ構造と、自己相補性のセンス領域およびアンチセンス領域を含む幹部とを有する環状の一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、この場合、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むものであり、センス領域は、標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を含むものであり、該環状ポリヌクレオチドがインビボまたはインビトロのいずれかでプロセッシングされると、ＲＮＡｉを媒介し得る活性なｓｉＮＡ分子が生成され得る。また、ｓｉＮＡは、標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含むものであってもよく（例えば、かかるｓｉＮＡ分子が、該ｓｉＮＡ分子内に標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列の存在を必要としない場合）、この場合、該一本鎖ポリヌクレオチドは、さらに末端リン酸基、例えば、５’−リン酸基（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら，２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，５６３−５７４およびＳｃｈｗａｒｚら，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，１０，５３７−５６８を参照のこと）、または５’，３’−二リン酸基などを含んでいてもよい。
【００９８】
用語「被検体」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、本発明の核酸分子が投与され得る生物体をいう。被検体は、哺乳動物または哺乳動物細胞（例えば、ヒトまたはヒト細胞）であり得る。また、該用語は生物体をいい、これは、採取された細胞のドナーもしくはレシピエントまたは細胞それ自体である。
【００９９】
語句「全身投与」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、血流中の薬物のインビボでの全身性の吸収または蓄積、続いて全身への分布をいう。
【０１００】
用語「標的」は、ＨＢＶに言及している場合、任意のＨＢＶ標的タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド（表７に示したＧｅｎｂａｎｋ受託番号にコードされているものなど）をいう。また、該用語は、任意の標的タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド（表７に示したＧｅｎｂａｎｋ受託番号を有する配列にコードされているタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドなど）をコードしている核酸配列または標的ポリヌクレオチド配列も指す。対象の標的としては、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡなどの標的ポリヌクレオチド配列が挙げられ得る。また、用語「標的」は、種々のアイソフォーム、変異型標的遺伝子、標的ポリヌクレオチドのスプライスバリアント、標的多型、および非コード配列（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓＲＮＡ）または本明細書に記載の他の調節ポリヌクレオチド配列などの他の配列も包含することを意図する。
【０１０１】
語句「標的部位」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、例えばｓｉＮＡ構築物（そのアンチセンス領域内に標的配列に相補的な配列を含む）によって媒介される切断のために「標的化される」標的核酸分子（例えば、ＲＮＡ）内の配列をいう。
【０１０２】
語句「治療有効量」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、細胞、組織、系、動物またはヒトに生物学的または医学的応答が誘起される化合物または組成物の量であって、研究者、獣医、医師または他の臨床家によって模索される量をいう。例えば、所与の臨床処置を、疾患または障害と関連している測定可能なパラメータに少なくとも２５％の低減が見られたとき有効であるとみなす場合、該疾患または障害の処置のための薬物の治療有効量は、該パラメータに少なくとも２５％の低減がもたらされるのに必要な量である。
【０１０３】
語句「ユニバーサル塩基」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。ユニバーサル塩基という用語は、一般的に、天然のＤＮＡ／ＲＮＡの各塩基と、ほとんどまたは全く区別なく塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体をいう。ユニバーサル塩基の非限定的な例としては、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチルおよび他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびにニトロアゾール誘導体（３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、および６−ニトロインドールなど）が挙げられ、当該技術分野で知られている（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７を参照のこと）。
【０１０４】
用語「上方調節する」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。本発明の例示的な核酸分子に関して、該用語は、遺伝子の発現、または１種類以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードしているＲＮＡ分子もしくは同等ＲＮＡ分子のレベル、または１種類以上のＲＮＡ、タンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性を、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）の非存在下で観察されるものよりも上に増大させることをいう。一部の特定の場合では、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の上方調節または促進は、不活性分子または減弱分子の存在下で観察されるレベルより上になるものである。他の場合では、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の上方調節または促進は、例えば、スクランブル配列またはミスマッチを有するｓｉＮＡ分子の存在下で観察されるレベルより上になるものである。さらに他の場合では、本発明の核酸分子による遺伝子発現の上方調節または促進は、該核酸分子の存在下の方が非存在下よりも大きくなるものである。一部の場合では、遺伝子発現の上方調節または促進は、ＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングの阻害（上方調節対象の遺伝子の発現を下方調節、阻害またはサイレンシングするコードＲＮＡ標的または非コードＲＮＡ標的のＲＮＡｉ媒介性の切断またはサイレンシングなど）と関連するものである。遺伝子発現の下方調節は、例えば、コードＲＮＡまたはそのコードタンパク質によって、例えば、負のフィードバック効果またはアンタゴニスト効果などによって誘導され得る。遺伝子発現の下方調節は、例えば、対象遺伝子に対して調節的制御を有する非コードＲＮＡによって、例えば、翻訳阻害、クロマチン構造、メチル化、ＲＩＳＣ媒介性ＲＮＡ切断または翻訳阻害による該遺伝子の発現のサイレンシングによって誘導され得る。そのため、対象遺伝子を下方調節、抑制またはサイレンシングする標的の阻害または下方調節は、治療的使用のために対象遺伝子の発現を上方調節するために使用され得る。
【０１０５】
用語「ベクター」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。ベクターという用語は、一般的に、１種類以上の核酸分子を送達するために使用される任意の核酸系および／またはウイルス系の発現系または手法をいう。
Ｂ．本発明のｓｉＮＡ分子
本発明は、ＨＢＶに標的化されるｓｉＮＡを含む組成物および方法であって、ＨＢＶ発現と関連している疾患、例えば、肝臓疾患または悪性疾患および／またはがん、あるいはＢ型肝炎感染に起因する他の病状を処置するために使用され得る組成物および方法を提供する。本発明の特定の態様および実施形態において、本発明の核酸分子は、表１ａおよび表１ｂに示された配列の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むものである。該ｓｉＮＡはいくつかの形態で提供され得る。例えば、該ｓｉＮＡは、１種類以上のｓｉＮＡ化合物として単離されたものであってもよく、ＤＮＡプラスミド内の転写カセットの形態であってもよい。また、該ｓｉＮＡは化学合成されたものであってもよく、例えば限定されないが、表１ｃおよび表８に示したような修飾を含むものであってもよい。したがって、種々の実施形態において、本発明の核酸の少なくとも一方の鎖または１つの領域は、配列番号：１〜５０２からなる配列の群から選択される少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むものである。該ｓｉＮＡは、単独で投与してもよく、他のｓｉＮＡ分子またはＨＢＶ関連の疾患もしくは病状を処置するための慣用的な薬剤と共投与してもよい。
【０１０６】
本発明のｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡ転写物との相互作用によって、あるいはまた、特定の遺伝子配列との相互作用によって（この場合、かかる相互作用により、転写レベルもしくは転写後レベルのいずれかで遺伝子サイレンシングのモジュレーション（例えば限定されないが、ＲＮＡｉなど）がもたらされる）、または標的のクロマチン構造またはメチル化パターンをモジュレートし、標的のヌクレオチド配列を有する標的遺伝子の転写を抑制し、それによりサイレンシングが媒介される細胞プロセスによって、遺伝子サイレンシング（具体的にはＨＢＶ）を媒介するために使用され得る。より具体的には、標的は、ＨＢＶ  ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｍＲＮＡのいずれかである。
【０１０７】
一態様において、本発明は、細胞または哺乳動物においてＨＢＶ遺伝子の発現を阻害するための低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。該ｓｉＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、該ｓｉＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含むものである。アンチセンス鎖は、ＨＢＶ遺伝子の発現で形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部分に相補的である。センス鎖は、アンチセンス鎖に相補領域を含むものである。具体的な実施形態において、アンチセンス鎖は、表１ｂに示したアンチセンス配列の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むものである。一般的に、二本鎖ｓｉＮＡは、表１ｂのセンス鎖の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列と、表１ｂのアンチセンス鎖の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むものである。本発明のｓｉＮＡのヌクレオチドの１個以上が修飾されていてもよい。修飾を有するさらなる実施形態において、本発明の一部のｓｉＮＡは、表１ｃに示した配列の群から選択される少なくとも１個のヌクレオチド配列を含むものである。他の実施形態において、該ｓｉＮＡは、表１ｃに示した配列の群から選択される少なくとも２つの配列を含むものであり、該少なくとも２つの配列のうち１つは、該少なくとも２つの配列のうちの別の配列に相補的であり、該少なくとも２つの配列のうち１つは、ＨＢＶ遺伝子の発現で生成されるｍＲＮＡの配列に相補的である。本発明の特定の修飾ｓｉＮＡの例を表１ｃに示す。
【０１０８】
本発明の二本鎖ＲＮＡ分子は、対称であっても非対称であってもよい相補的な２つの相違する別々の鎖、すなわち２本の一本鎖ＲＮＡ分子を含むものであってもよく、２つの相補的な部分（例えば、センス領域とアンチセンス領域）が、塩基対合しており、かつ１つ以上の一本鎖「ヘアピン型」領域（すなわち、ループ）によって共有結合されており、例えば、一本鎖低分子ヘアピン型ポリヌクレオチドまたは環状の一本鎖ポリヌクレオチドになっている１つの一本鎖分子を含むものであってもよい。
【０１０９】
リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーであってもよく、非ヌクレオチドリンカーであってもよい。一部の実施形態において、リンカーは非ヌクレオチドリンカーである。一部の実施形態において、本発明のヘアピン型または環状のｓｉＮＡ分子には１つ以上のループモチーフが含まれており、該ｓｉＮＡ分子のループ部分の少なくとも１つは生分解性である。例えば、本発明の一本鎖ヘアピン型ｓｉＮＡ分子は、該ｓｉＮＡ分子のループ部分のインビボでの分解によって、１、２、３または４個のヌクレオチドを含む３’末端突出端（３’末端ヌクレオチド突出端など）を有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生成され得るように設計される。あるいはまた、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のループ部分のインビボでの分解によって、約２個のヌクレオチドを含む３’末端突出端（３’末端ヌクレオチド突出端など）を有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生成され得るように設計される。
【０１１０】
本発明の対称ｓｉＮＡ分子において、センス（パッセンジャー）鎖およびアンチセンス（ガイド）鎖の各鎖は、独立して、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）ヌクレオチド長である。一般的に、本発明の対称ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１９〜２４（例えば、約１９、２０、２１、２２、２３または２４）ヌクレオチド長である。
【０１１１】
非対称ｓｉＮＡ分子において、該分子のアンチセンス領域（または鎖）は、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）ヌクレオチド長であり、そのセンス領域は約３〜約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５）ヌクレオチド長である。一般的に、本発明の非対称ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１９〜２４（例えば、約１９、２０、２１、２２、２３または２４）ヌクレオチド長である。
【０１１２】
また他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は一本鎖ヘアピン型ｓｉＮＡ分子を含むものであり、該ｓｉＮＡ分子は、約２５〜約７０（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７０）ヌクレオチド長である。
【０１１３】
さらに他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は一本鎖の環状ｓｉＮＡ分子を含むものであり、該ｓｉＮＡ分子は、約３８〜約７０（例えば、約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７０）ヌクレオチド長である。
【０１１４】
さらに他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は一本鎖の非環状ｓｉＮＡ分子を含むものであり、該ｓｉＮＡ分子は、独立して約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）ヌクレオチド長である。
【０１１５】
種々の対称実施形態において、本発明のｓｉＮＡ二本鎖は、独立して、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）個の塩基対を含むものである。一般的に、本発明のｓｉＮＡの二本鎖構造は、１５〜３０、より一般的には１８〜２５、なおより一般的には１９〜２４、最も一般的には１９〜２１塩基対長である。
【０１１６】
また他の実施形態において、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子が非対称である場合、該ｓｉＮＡ分子は、約３〜２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５）個の塩基対を含むものである。一般的に、本発明のｓｉＮＡの二本鎖構造は、１５〜２５、より一般的には１８〜２５、なおより一般的には１９〜２４、最も一般的には１９〜２１塩基対長である。
【０１１７】
さらに他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子がヘアピン型または環状構造である場合、該ｓｉＮＡ分子は、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）個の塩基対を含むものである。
【０１１８】
本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖、またはセンス領域とアンチセンス領域は相補的であり得る。また、アンチセンス鎖またはアンチセンス領域は、ＨＢＶ標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分に相補的であり得る。該ｓｉＮＡのセンス鎖またはセンス領域は、ＨＢＶ遺伝子またはその一部分のヌクレオチド配列を含むものであり得る。一部の特定の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス領域またはセンス鎖は、該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域またはアンチセンス鎖のＨＢＶ標的ポリヌクレオチド配列（例えば限定されないが、表７に示すＧＥＮＢＡＮＫ受託番号に代表される配列など）に相補的である部分に相補的である。
【０１１９】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、該ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域間に完璧な相補性を有するものである。他の実施形態または同じ実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、対応する標的核酸分子に完璧に相補的である。
【０１２０】
また他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、該ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域間、あるいは該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と、対応する標的核酸分子間に、一部相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有するものである。したがって、一部の実施形態において、本発明の二本鎖核酸分子は、一方の鎖に、他方の鎖のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）個有するものである。他の実施形態において、該分子は、二本鎖核酸分子のセンス領域に、アンチセンス領域のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）個有するものである。一部の特定の実施形態において、本発明の二本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖に、その対応する標的核酸分子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）個を有するものである。
【０１２１】
他の実施形態において、該ｓｉＮＡ分子に１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加が含有されていてもよい；しかしながら、該ｓｉＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡｉを媒介するその活性を維持しているものとする。非限定的な例において、該欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加は、ループまたは隆起部、あるいはまた、ウォッブル（ｗｏｂｂｌｅ）または他の択一的な（非ワトソン−クリック）塩基対をもたらすものであり得る。したがって、一部の実施形態において、例えば、本発明の二本鎖核酸分子は、一方の鎖または領域に、他方の鎖または領域とミスマッチであるか、または塩基対合していないヌクレオチドを１個以上（例えば、１、２、３、４、５、または６個）有するものである。他の実施形態において、本発明の二本鎖核酸分子は、各鎖または各領域内に、他方の鎖または領域とミスマッチであるか、または塩基対合していないヌクレオチドを１個以上（例えば、１、２、３、４、５、または６個）有するものである。好ましい実施形態において、本発明のｓｉＮＡに含有されるミスマッチは３つ以下である。該ｓｉＮＡのアンチセンス鎖に標的配列に対するミスマッチが含有されている場合、ミスマッチ領域は相補性領域の中心に存在していないことが好ましい。
【０１２２】
他の実施形態において、該ｓｉＮＡ分子は、表１ｂに示した配列に対して１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加が含有されていてもよいが、該ｓｉＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡｉを媒介するその活性を維持しているものとする。非限定的な例において、該欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加は、ループまたは隆起部、あるいはまた、ウォッブルまたは他の択一的な（非ワトソン−クリック）塩基対をもたらすものであり得る。
【０１２３】
また、本発明は、第１鎖と第２鎖が互いに相補的であり、少なくとも一方の鎖が表１ｂの配列のポリヌクレオチド配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能であり、その任意のヌクレオチドは非修飾であるか、または化学修飾されている以外は本明細書において上記のとおりである二本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含むものである。
【０１２４】
ハイブリダイゼーション手法は当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）参照のこと）。好ましいストリンジェントハイブリダイゼーション条件としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％硫酸デキストラン、および２０マイクログラム／ｍｌの剪断処理した変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩のインキュベーション；続いて、０．１×ＳＳＣ中、約６５℃でのフィルターの洗浄が挙げられる。
【０１２５】
具体的な一実施形態において、第１鎖は、他方の鎖のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを約１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個有し、少なくとも一方の鎖が表１ｂのポリヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能である。より好ましい実施形態において、第１鎖は、他方の鎖のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを約１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個有し、少なくとも一方の鎖が配列番号：１、配列番号：１２１０、配列番号：２、配列番号：１２１１、配列番号：３、配列番号：１２１２、配列番号：４、または配列番号：１２１３に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能であり、その任意のヌクレオチドは非修飾であるか、または化学修飾されている。
【０１２６】
一部の特定の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１〜約４（例えば、約１、２、３または４）個のヌクレオチドの突出端を含むものである。突出端のヌクレオチド同じヌクレオチドであっても異なるヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態において、突出端は二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖の３’末端に存在している。例えば、本発明の二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖／領域の３’末端、センス鎖／領域の３’末端、またはアンチセンス鎖／領域とセンス鎖／領域の両方にヌクレオチド突出端または非ヌクレオチド突出端を含むものであり得る。
【０１２７】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子の突出端部分を構成するヌクレオチドは、ＨＢＶ標的ポリヌクレオチド配列を主体とした配列を含むものであり、ここで、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖／領域の突出端部分を構成するヌクレオチドは、ＨＢＶ標的ポリヌクレオチド配列内のヌクレオチドに相補的であり得る、および／または本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖／領域の突出端部分を構成するヌクレオチドは、ＨＢＶ標的ポリヌクレオチド配列内のヌクレオチドを含むものであり得る。したがって、一部の実施形態において、突出端は、ＨＢＶ標的ポリヌクレオチド配列の一部分に相補的な２個のヌクレオチドの突出端を構成している。しかしながら、他の実施形態では、突出端は、ＨＢＶ標的ポリヌクレオチド配列の一部分に相補的でない２個のヌクレオチドの突出端を構成している。一部の特定の実施形態において、突出端は、ＨＢＶ標的ポリヌクレオチド配列の一部分に相補的でない３’−ＵＵ突出端を構成している。他の実施形態では、突出端は、アンチセンス鎖の３’末端ではＵＵ突出端を構成しており、センス鎖の３’末端ではＴＴ突出端を構成している。他の実施形態では、突出端は、本明細書の実施例、表および図に記載のヌクレオチドを含むものである。
【０１２８】
本明細書に記載のｓｉＮＡ分子が３’末端ヌクレオチド突出端を有する任意の実施形態において、突出端は、１つ以上の核酸の糖鎖位置、塩基位置または主鎖位置が化学修飾されていてもよい。本発明の二本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子の突出端部分の修飾ヌクレオチドの代表的だが限定されない例としては：２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ）、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、ユニバーサル塩基、非環式、または５−Ｃ−メチルヌクレオチドが挙げられる。より好ましい実施形態において、突出端ヌクレオチドは各々、独立して、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ（ｄｅｘｏｙ）−２−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシリボヌクレオチドである。一部の場合では、突出端ヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエート結合によって連結されている。
【０１２９】
また他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、平滑端を有する（すなわち、ヌクレオチド突出端なし）二本鎖核酸分子を含むものであり、この場合、両方の末端が平滑であるか、あるいはまた一方の末端が平滑である。一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端が全く突出端ヌクレオチドを有しない場合１つの平滑端を含むものであり得る。別の例では、該ｓｉＮＡ分子は、例えば、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端が全く突出端ヌクレオチドを有しない１つの平滑端を含むものである。他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端ならびにアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端が全く突出端ヌクレオチドを有しない２つの平滑端を含むものである。
【０１３０】
本発明のｓｉＮＡ分子の任意の実施形態または態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、さらに、キャップ（本明細書に記載のもの、または当該技術分野で知られたものなど）を、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に有するものであり得る。あるいは、ヘアピン型ｓｉＮＡ分子の場合のように、キャップは、該ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドのいずれか一方に存在していても両方に存在していてもよい。一部の実施形態において、キャップは、二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の末端の一方または両方に存在している。他の実施形態では、キャップは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端に存在している。好ましい実施形態では、キャップは、センス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端に存在している。
【０１３１】
かかる末端キャップの代表的だが非限定的な例としては、逆位無塩基ヌクレオチド、逆位デオキシ無塩基ヌクレオチド、逆位ヌクレオチド部分、図５に示した基、グリセリル修飾、アルキルもしくはシクロアルキル基、複素環、または当該技術分野で一般的に知られた任意の他のキャップが挙げられる。
【０１３２】
本発明のｓｉＮＡ分子の実施形態はいずれも、５’リン酸末端基を有するものであってもよい。一部の実施形態では、該ｓｉＮＡ分子に末端リン酸基がない。
【０１３３】
本発明のｓｉＮＡ分子または構築物はいずれも、１つ以上の化学修飾を含むものであってもよい。修飾は、インビトロまたはインビボでの特性、例えば、安定性、活性、毒性、免疫応答（例えば、インターフェロン応答、炎症性もしくは炎症促進性のサイトカイン応答、あるいはＴｏｌｌ様受容体（ＴｌＦ）応答の刺激の抑制）および／またはバイオアベイラビリティなどを改善するために使用され得る。
【０１３４】
本出願人は、本明細書において、対応する非修飾型ｓｉＮＡ分子と比べてＲＮＡｉの活性および／または安定性が改善された化学修飾ｓｉＮＡ分子を説明する。本明細書において開示する種々の化学修飾ｓｉＮＡモチーフにより、非修飾型または修飾が最小限の活性なｓｉＲＮＡと実質的に同様のＲＮＡｉ活性を維持する能力がもたらされる（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０：６８７７−６８８８を参照のこと）と同時に、治療適用用途における使用に適したヌクレアーゼ抵抗性および薬物動態特性がもたらされる。
【０１３５】
種々の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は修飾を含むものであり、この場合、センスおよび／またはアンチセンス鎖に存在している任意（例えば、１つ以上または全部）のヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである（例えば、１個のヌクレオチドが修飾されている、いくつかのヌクレオチド（すなわち、複数もしくは１個より多く）が修飾されている、または全部のヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、化学修飾により一部修飾されたものである（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５または５９個のヌクレオチドが修飾されている）。一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、修飾ヌクレオチドである少なくとも約８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８または６０個のヌクレオチドを含むものである。他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、化学修飾により完全に修飾されたものである（例えば、１００％修飾されている）、すなわち、該ｓｉＮＡ分子にはリボヌクレオチドが全く含有されていない。一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖のヌクレオチドの１個以上が修飾されている。同じ実施形態または他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖のヌクレオチドの１個以上が修飾されている。
【０１３６】
単一のｓｉＮＡ分子内の化学修飾は同じであっても異なっていてもよい。一部の実施形態において、少なくとも一方の鎖が少なくとも１つの化学修飾を有する。他の実施形態において、各鎖は、同じであっても異なっていてもよい少なくとも１つの化学修飾（例えば、糖鎖、塩基、または主鎖（すなわち、ヌクレオチド間結合）の修飾）を有する。他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも２、３、４、５個またはそれ以上の異なる化学修飾を含むものである。
【０１３７】
本発明における使用に適した化学修飾の非限定的な例は、米国特許出願第１０／４４４，８５３号；同第１０／９８１，９６６号；同第１２／０６４，０１４号およびこれらに挙げられた参考文献に開示されており、糖鎖、塩基およびリン酸基、非ヌクレオチドの修飾、および／またはその任意の組合せが挙げられる。
【０１３８】
本発明の一部の特定の具体的な実施形態において、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチド、またはロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（当該技術分野で一般的に認知されている）である。
【０１３９】
本発明のまた他の実施形態において、少なくとも１個のヌクレオチドは、リボ様ＮｏｒｔｈｅｒｎまたはＡ型ヘリックス立体配置を有するものである（例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ編，１９８４参照）。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ立体配置を有するヌクレオチドの非限定的な例としては、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド；２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド；２’−アジドヌクレオチド；２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド；２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド；２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド；４’−チオヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。
【０１４０】
種々の実施形態において、二本鎖ｓｉＮＡ分子に存在しているピリミジンヌクレオチドの大部分（例えば、５０％より多く）は糖鎖修飾を含むものである。一部の同じおよび／または他の実施形態において、二本鎖ｓｉＮＡ分子に存在しているプリンヌクレオチド大部分（例えば、５０％より多く）は糖鎖修飾を含むものである。
【０１４１】
一部の実施形態において、アンチセンス鎖内のピリミジンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖内に存在しているプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオチドである。他の実施形態において、センス鎖内のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス鎖内に存在しているプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。
【０１４２】
本発明の一部の特定の実施形態において、センス鎖上の相補領域内のピリミジンヌクレオチドはすべて、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。一部の特定の実施形態において、アンチセンス鎖の相補領域内のピリミジンヌクレオチドはすべて、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。一部の特定の実施形態において、センス鎖上の相補領域内のプリンヌクレオチドはすべて、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。一部の特定の実施形態において、アンチセンス鎖上の相補領域内のプリンはすべて、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。一部の特定の実施形態において、センス鎖上の相補領域内のピリミジンヌクレオチドはすべて、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである；アンチセンス鎖の相補領域内のピリミジンヌクレオチドはすべて、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである；センス鎖上の相補領域内のプリンヌクレオチドはすべて、２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖上の相補領域内のプリンはすべて、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
【０１４３】
一部の実施形態において、一方または両方の鎖のピリミジンヌクレオチドの少なくとも５個またはそれ以上が２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。一部の実施形態において、一方または両方の鎖のピリミジンヌクレオチドの少なくとも５個またはそれ以上が２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。一部の実施形態において、一方または両方の鎖のプリンヌクレオチドの少なくとも５個またはそれ以上が２’−デオキシ−２’−フルオロプリンヌクレオチドである。一部の実施形態において、一方または両方の鎖のプリンヌクレオチドの少なくとも５個またはそれ以上が２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
【０１４４】
一部の特定の実施形態において、プリンとピリミジンは、糖鎖の２’位が異なるように修飾されている（すなわち、同じ鎖または異なる鎖の糖鎖の２’位において、少なくとも１個のプリンは少なくとも１個のピリミジンと異なる修飾を有する）。例えば、一部の場合では、一方または両方の鎖のピリミジンヌクレオチドの少なくとも５個またはそれ以上が２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、一方または両方の鎖の少なくとも５個またはそれ以上のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。他の場合では、一方または両方の鎖のピリミジンヌクレオチドの少なくとも５個またはそれ以上が２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドであり、一方または両方の鎖の少なくとも５個またはそれ以上のプリンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロプリンヌクレオチドである。
【０１４５】
種々の修飾および修飾パターンを有するかかるｓｉＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖のさらなる非限定的な例を図２と３に示す。
【０１４６】
上記のいずれかの修飾またはその組合せ（引用した参考文献のものを含む）が本発明の任意のｓｉＮＡ分子に適用され得る。
【０１４７】
本発明の修飾ｓｉＮＡ分子では、該ｓｉＮＡ分子内の種々の位置に修飾を含めることができる。一部の実施形態において、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は修飾ヌクレオチドを、該ｓｉＮＡ二本鎖内の内部塩基対合位置に含んでいる。他の実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は修飾ヌクレオチドを、該ｓｉＮＡ分子の非塩基対合領域または突出端領域に含んでいる。また他の実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は修飾ヌクレオチドを、該ｓｉＮＡ分子の末端位置に含んでいる。例えば、かかる末端領域としては、該ｓｉＮＡ分子のセンスおよび／またはアンチセンス鎖（または領域）の３’位および／または５’位が挙げられる。さらに、本発明の修飾ｓｉＮＡ分子はいずれも、修飾を、該ｓｉＮＡ二本鎖の一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖（例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖）内に有するものであり得る。さらに、本発明のｓｉＮＡ分子の化学修飾に関して、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は１つ以上の化学修飾を有していてもよく、その結果、各鎖は異なる化学修飾パターンを含むものになる。
【０１４８】
一部の特定の実施形態において、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、異なる化学修飾パターン、例えば、本明細書に記載のいずれかのＳｔａｂ修飾化学構造（表８参照）またはその任意の組合せ、すなわち、規定の安定化化学構造（Ｓｔａｂｉｌｚａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ｓｔａｂ）の異なる組合せのセンス鎖とアンチセンス鎖を含むものである。さらに、異なる修飾パターンが生じ得る修飾スキームの非限定的な例を表８に示す。表８にＳｔａｂと示した安定化化学構造は、センス／アンチセンス化学構造の任意の組合せで組み合わせることができる（Ｓｔａｂ７／８、Ｓｔａｂ７／１１、Ｓｔａｂ８／８、Ｓｔａｂ１８／８、Ｓｔａｂ１８／１１、Ｓｔａｂ１２／１３、Ｓｔａｂ７／１３、Ｓｔａｂ１８／１３、Ｓｔａｂ７／１９、Ｓｔａｂ８／１９、Ｓｔａｂ１８／１９、Ｓｔａｂ７／２０、Ｓｔａｂ８／２０、Ｓｔａｂ１８／２０、Ｓｔａｂ７／３２、Ｓｔａｂ８／３２、もしくはＳｔａｂ１８／３２など、または任意の他の安定化化学構造の組合せ）。
【０１４９】
本発明の任意のｓｉＮＡにおいて、該ｓｉＮＡ分子のガイド鎖またはガイド領域（アンチセンス鎖またはアンチセンス領域としても知られている）の５’末端の１個以上（例えば、１、２、３、４または５個）のヌクレオチドはリボヌクレオチドである。
【０１５０】
一部の特定の実施形態において、本発明は、ＨＢＶの発現をモジュレートする二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、該ｓｉＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含むものであり；各鎖が、独立して１５〜３０ヌクレオチド長であり；該アンチセンス鎖が：
５’−ＵＣＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡ−３’（配列番号：１）；
５’−ＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡＡＵ−３’（配列番号：２）；
５’−ＧＣＣＧＡＵＣＣＡＵＡＣＵＧＣＧＧＡＡ−３’（配列番号：３）；または
５’−ＣＣＧＡＵＣＣＡＵＡＣＵＧＣＧＧＡＡＣ−３’（配列番号：４）
のいずれかに相補的な配列を有する少なくとも１５個のヌクレオチドを含むものである、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
【０１５１】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は：
５’−ＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣＧＡ−３’（配列番号：４５２）；
５’−ＡＵＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号：４５３）；
５’−ＵＵＣＣＧＣＡＧＵＡＵＧＧＡＵＣＧＧＣ−３’（配列番号：４５４）；または
５’−ＧＵＵＣＣＧＣＡＧＵＡＵＧＧＡＵＣＧＧ−３’（配列番号：４５５）
の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むものである。
【０１５２】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖は：
５’−ＵＣＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡ−３’（配列番号：１）；
５’−ＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡＡＵ−３’（配列番号：２）；
５’−ＧＣＣＧＡＵＣＣＡＵＡＣＵＧＣＧＧＡＡ−３’（配列番号：３）；または
５’−ＣＣＧＡＵＣＣＡＵＡＣＵＧＣＧＧＡＡＣ−３’（配列番号：４）
の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むものである。
【０１５３】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は：
５’−ＵＣＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡ−３’（配列番号：１）と５’−ＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣＧＡ−３’（配列番号：４５２）；または
５’−ＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡＡＵ−３’（配列番号：２）と５’−ＡＵＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号：４５３）；または
５’−ＧＣＣＧＡＵＣＣＡＵＡＣＵＧＣＧＧＡＡ−３’（配列番号：３）と５’−ＵＵＣＣＧＣＡＧＵＡＵＧＧＡＵＣＧＧＣ−３’（配列番号：４５４）；または
５’−ＣＣＧＡＵＣＣＡＵＡＣＵＧＣＧＧＡＡＣ−３’（配列番号：４）と５’−ＧＵＵＣＣＧＣＡＧＵＡＵＧＧＡＵＣＧＧ−３’（配列番号：４５５）
のいずれかを含むものである。
【０１５４】
上記のいずれかの修飾またはその組合せ（引用した参考文献のものを含む）がこれらの任意の実施形態に適用され得る。
【０１５５】
一部の特定の実施形態において、配列番号：１、配列番号：４５２、配列番号：２、配列番号：４５３、配列番号：３、配列番号：４５４、配列番号：４、または配列番号：４５５の該少なくとも１５個のヌクレオチドの配列のヌクレオチドは、連続したヌクレオチド鎖を形成している。
【０１５６】
一部の実施形態において、該ｓｉＮＡ分子は、配列番号：１、配列番号：４５２、配列番号：２、配列番号：４５３、配列番号：３、配列番号：４５４、配列番号：４、または配列番号：４５５の少なくとも１５個のヌクレオチド配列に対して１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加が含有されていてもよい；しかしながら、該ｓｉＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡｉを媒介するその活性を維持しているものとする。非限定的な例において、該欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加は、ループまたは隆起部、あるいはまた、ウォッブルまたは他の択一的な（非ワトソン−クリック）塩基対をもたらすものであり得る。
【０１５７】
本発明の一部の特定の実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖を有し、下記式（Ａ）：
【０１５８】
【化２】
2013537423.tif 000004
を含む二本鎖ｓｉＮＡ分子を提供し、
式中、上側の鎖は該二本鎖核酸分子のセンス鎖であり、下側の鎖はアンチセンス鎖であり；該アンチセンス鎖は、配列番号：４５２、配列番号：４５３、配列番号：４５４、または配列番号：４５５の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むものであり、該センス鎖は、該アンチセンス鎖に対して相補性を有する配列を含むものであり；
各Ｎは、独立して非修飾もしくは化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドであり；
各Ｂは、存在する、または存在しない末端キャップであり；
（Ｎ）は、突出端ヌクレオチド（各々、独立して非修飾または化学修飾）を表し；
［Ｎ］は、リボヌクレオチドであるヌクレオチドを表し；
Ｘ１およびＸ２は、独立して、０〜４の整数であり；
Ｘ３は、１５〜３０の整数であり；
Ｘ４は、９〜３０の整数であり；
Ｘ５は、０〜６の整数であるが、Ｘ４とＸ５の和は１５〜３０であるものとする。
【０１５９】
一部の特定の実施形態において、配列番号：４５２、配列番号：４５３、配列番号：４５４、または配列番号：４５５の該少なくとも１５個のヌクレオチドの配列のヌクレオチドは、連続したヌクレオチド鎖を形成している。
【０１６０】
一部の実施形態において、式ＡのｓｉＮＡ分子は、配列番号：４５２、配列番号：４５３、配列番号：４５４、または配列番号：４５５の少なくとも１５個のヌクレオチド配列に対して１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加が含有されていてもよい；しかしながら、該ｓｉＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡｉを媒介するその活性を維持しているものとする。非限定的な例において、該欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加は、ループまたは隆起部、あるいはまた、ウォッブルまたは他の択一的な（非ワトソン−クリック）塩基対をもたらすものであり得る。
【０１６１】
一実施形態において、本発明は、
（ａ）ＮＸ４位の１個以上のピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せである；
（ｂ）ＮＸ４位の１個以上のプリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せである；
（ｃ）ＮＸ３位の１個以上のピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せである；および
（ｄ）ＮＸ３位の１個以上のプリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せである、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特色とする。
【０１６２】
一部の特定の実施形態において、本発明は、
（ａ）ＮＸ４位の１、２、３、４、５個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである；
（ｂ）ＮＸ４位の１、２、３、４、５個またはそれ以上のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドである；
（ｃ）ＮＸ３位の１、２、３、４、５個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである；および
（ｄ）ＮＸ３位１、２、３、４、５個またはそれ以上のプリンヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチドである、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特色とする。
【０１６３】
一部の特定の実施形態において、本発明は、
（ａ）ＮＸ４位の１、２、３、４、５個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドが２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドである；
（ｂ）ＮＸ４位の１、２、３、４、５個またはそれ以上のプリンヌクレオチドがリボヌクレオチドである；
（ｃ）ＮＸ３位の１、２、３、４、５個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドが２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドである；および
（ｄ）ＮＸ３位の１、２、３、４、５個またはそれ以上のプリンヌクレオチドがリボヌクレオチドである、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特色とする。
【０１６４】
一部の特定の実施形態において、本発明は、
（ａ）ＮＸ４位の１、２、３、４、５個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである；
（ｂ）ＮＸ４位の１、２、３、４、５個またはそれ以上のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドである；
（ｃ）ＮＸ３位の１、２、３、４、５個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドが２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドである；および
（ｄ）ＮＸ３位の１、２、３、４、５個またはそれ以上のプリンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特色とする。
【０１６５】
一部の特定の実施形態において、本発明は、さらに１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特色とする。
【０１６６】
一部の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、該核酸分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域の５’末端に末端リン酸基を含むものである。
【０１６７】
種々の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、Ｘ５＝０、１、２または３；各Ｘ１およびＸ２＝１または２；Ｘ３＝１８、１９、２０、２１、２２または２３、およびＸ４＝１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３を含むものである。
【０１６８】
一部の特定の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子はＸ５＝３を含むものである。他の実施形態では、式Ａを有するｓｉＮＡ分子はＸ５＝０を含むものである。
【０１６９】
一部の特定の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子はＸ１＝２およびＸ２＝２を含むものである。
【０１７０】
種々の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、Ｘ５＝０、Ｘ１＝２、およびＸ２＝２を含むものである。他の実施形態では、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、Ｘ５＝３、Ｘ１＝２、およびＸ２＝２を含むものである。
【０１７１】
具体的な一実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、Ｘ５＝３；各Ｘ１およびＸ２＝２；Ｘ３＝１９、およびＸ４＝１６を含むものである。
【０１７２】
別の具体的な実施形態では、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、Ｘ５＝０；各Ｘ１およびＸ２＝２；Ｘ３＝１９、およびＸ４＝１９を含むものである。
【０１７３】
一部の特定の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、センス鎖またはセンス領域の３’末端と５’末端にキャップ（Ｂ）を含むものである。
【０１７４】
一部の特定の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖またはアンチセンス領域の３’末端にキャップ（Ｂ）を含むものである。
【０１７５】
種々の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、センス鎖またはセンス領域の３’末端と５’末端にキャップ（Ｂ）およびアンチセンス鎖またはアンチセンス領域の３’末端にキャップ（Ｂ）を含むものである。
【０１７６】
また他の実施形態では、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、該二本鎖核酸分子のセンス（上側の）鎖の５’末端のみにキャップ（Ｂ）を含むものである。
【０１７７】
一部の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、さらに、ヌクレオチド間に１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むものである。一部の特定の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、第１末端（Ｎ）と、該核酸分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の３’末端上の隣接ヌクレオチドとの間に１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むものである。例えば、該二本鎖核酸分子は、Ｘ１および／またはＸ２＝２を含み、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する突出端ヌクレオチド位置（例えば、（ＮｓＮ）（式中、「ｓ」はホスホロチオエートを示す）を有するものであり得る。
【０１７８】
一部の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチドの１個以上はユニバーサル塩基を有するものである。
【０１７９】
一部の特定の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位のヌクレオチドがプリンである場合、該１４位にリボヌクレオチドを有するものである。他の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位のヌクレオチドがピリミジンヌクレオチドである場合、該１４位にリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを有するものである。
【０１８０】
一部の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖（下側の鎖）内に、ＨＢＶ標的ポリヌクレオチド配列（これも、アンチセンス（下側の）鎖Ｎおよび［Ｎ］ヌクレオチドに対して相補性を有する）内のヌクレオチドに相補的な（Ｎ）ヌクレオチドを含むものである。
【０１８１】
本発明のｓｉＮＡに適用可能であると上記において論考した上記の任意の修飾またはその組合せ（引用した参考文献のものを含む）は、式Ａを有するｓｉＮＡ分子に対する任意の実施形態に適用可能である。
Ｃ．ｓｉＮＡ分子の作製／合成
本発明のｓｉＮＡは、当業者に知られたいくつかの手法を用いて得ることができる。例えば、該ｓｉＮＡは、化学合成され得るものであってもよく、プラスミドにコードされたものであってもよい（例えば、ヘアピン型ループを有する二本鎖に自動的にフォールディングする配列として転写される）。また、該ｓｉＮＡは、長鎖ｄｓＲＮＡ（例えば、約２５ヌクレオチド長より大きいｄｓＲＮＡ）を大腸菌ＲＮａｓｅ  ＩＩまたはダイサーによって切断することにより作製したものであってもよい。これらの酵素により、ｄｓＲＮＡはプロセッシングされて生物学的に活性なｓｉＮＡになる（例えば、Ｙａｎｇら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７（２００２）；Ｃａｌｅｇａｒｉら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９９：１４２３６（２００２）Ｂｙｒｏｎら，Ａｍｂｉｏｎ  Ｔｅｃｈ  Ｎｏｔｅｓ；１０（１）：４−６（２００９）；Ｋａｗａｓｋｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：９８１−９８７（２００３），ＫｎｉｇｈｔおよびＢａｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：２２６９−２２７１（２００１）ならびにＲｏｂｅｒｓｔｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２４３：８２（１９６９）を参照のこと。
【０１８２】
１．化学合成
好ましくは、本発明のｓｉＮＡは化学合成されたものである。オリゴヌクレオチド（例えば、一部の特定の修飾オリゴヌクレオチドまたはリボヌクレオチドがないオリゴヌクレオチドの一部分）は、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ９９／５４４５９、Ｗｉｎｃｏｔｔら，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４、Ｗｉｎｃｏｔｔら，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９、Ｂｒｅｎｎａｎら，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５、およびＢｒｅｎｎａｎ，米国特許第６，００１，３１１号に記載された、当該技術分野で知られたプロトコルを用いて合成される。オリゴヌクレオチドの合成では、一般的な核酸用保護基およびカップリング基（５’末端にジメトキシトリチル、および３’末端にホスホルアミダイトなど）が利用される。
【０１８３】
修飾のないｓｉＮＡ分子は、Ｕｓｍａｎら，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５４３３に記載の手順を用いて合成される。この合成では、一般的な核酸用保護基およびカップリング基が利用される（５’末端にジメトキシトリチル、および３’末端にホスホルアミダイトなど、これらは、本発明の一部の特定のｓｉＮＡ分子に使用され得る）。
【０１８４】
一部の特定の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、米国特許第６，９９５，２５９号、同第６，６８６，４６３号、同第６，６７３，９１８号、同第６，６４９，７５１号、同第６，９８９，４４２号、および米国特許出願第１０／１９０，３５９号に記載の方法に従って合成され、脱保護され、解析される。
【０１８５】
非限定的な合成の一例において、小規模合成は、３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製の合成装置にて、０．２μｍｏｌ規模プロトコルを使用し、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドでは２．５分間のカップリング工程を、２’−デオキシヌクレオチドまたは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドでは４５秒間のカップリング工程を用いて行なわれる。表９に、合成サイクルで使用した試薬の量および接触時間の概略を示す。
【０１８６】
あるいはまた、本発明のｓｉＮＡ分子は、別々に合成し、合成後に、例えば、ライゲーションによって（Ｍｏｏｒｅら，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｈａｂａｒｏｖａら，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１；Ｂｅｌｌｏｎら，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８，２０４）、あるいは合成および／または脱保護後にハイブリダイゼーションによって、一緒に連接してもよい。
【０１８７】
また、本発明の種々のｓｉＮＡ分子を、Ｓｃａｒｉｎｇｅら，米国特許第５，８８９，１３６号；同第６，００８，４００号；および同第６，１１１，０８６号の教示を用いて合成することもできる。
【０１８８】
２．ベクター発現
あるいはまた、標的ＨＢＶ分子をコードしている遺伝子と相互作用して下方調節する本発明のｓｉＮＡ分子を、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター内に挿入した転写単位（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅら，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照のこと）から発現させて送達してもよい。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。ｓｉＮＡ発現ウイルスベクターは、限定されないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスをベースにして構築され得る。
【０１８９】
一部の実施形態では、ｐｏｌ  ＩＩＩ系構築物を用いて本発明の核酸分子を発現させる。該ｓｉＮＡ分子配列の転写は、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のプロモーターにより駆動させることができる（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，米国特許第５，９０２，８８０号および同第６，１４６，８８６号を参照のこと）。（また、ＩｚａｎｔおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙおよびＬｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃら，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら，１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒら，１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，２２５９；Ｇｏｏｄら，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５も参照のこと。ｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターによる転写物は、あらゆる細胞において高レベルで発現される；所与の細胞型における所与のｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在している遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。また、原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターも使用されるが、原核生物のＲＮＡポリメラーゼ酵素は、適切な細胞において発現させるものとする（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ  １９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒら，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕら，１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。数名の研究者らにより、かかるプロモーターにより発現させた核酸分子は、哺乳動物の細胞において機能を果たし得ることが示されている（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら，１９９２，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１��９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ＆  Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より具体的には、Ｕ６核内低分子（ｓｎＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードしている遺伝子に由来するものなどの転写単位が、細胞内に高濃度の所望のＲＮＡ分子（ｓｉＮＡなど）を生成させるのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，上掲；ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，上掲；Ｎｏｏｎｂｅｒｇら，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇら，米国特許第５，６２４，８０３号；Ｇｏｏｄら，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４，４５；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ９６／１８７３６。上記のｓｉＮＡ転写単位は、哺乳動物の細胞内への導入のための多種多様なベクター内に、例えば限定されないが、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（アデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスベクターなど）、またはウイルスＲＮＡベクター（レトロウイルスもしくはアルファウイルスベクターなど）に組み込まれ得る（概説については、ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６（上掲）を参照のこと）。
【０１９０】
本発明のｓｉＮＡ分子を発現させるために使用されるベクターは、ｓｉＮＡ二本鎖の一方または両方の鎖をコードしているものであってもよく、自己ハイブリダイズしてｓｉＮＡ二本鎖になる単一の自己相補的鎖をコードしているものであってもよい。本発明のｓｉＮＡ分子をコードしている核酸配列は、該ｓｉＮＡ分子の発現を可能にする様式で作動可能に連結され得る（例えば、Ｐａｕｌら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５；ＭｉｙａｇｉｓｈｉおよびＴａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００；ならびにＮｏｖｉｎａら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，事前にオンライン公開されたｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５参照）。
Ｄ．担体／送達系
本発明のｓｉＮＡ分子は標的細胞または標的組織に直接添加するか、またはカチオン性脂質と複合体形成させてもよく、リポソーム内に封入してもよく、該ｓｉＮＡ分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、あるいは別の様式で送達してもよい。核酸分子の送達方法は、Ａｋｈｔａｒら，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２，１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ａｋｈｔａｒ編，１９９５，Ｍａｕｒｅｒら，１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６，１２９−１４０；ＨｏｆｌａｎｄおよびＨｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７，１６５−１９２；ならびにＬｅｅら，２０００，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２，１８４−１９２に記載されている。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらの米国特許第６，３９５，７１３号およびＳｕｌｌｉｖａｎらのＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５には、さらに、核酸分子の一般的な送達方法が記載されている。このようなプロトコルは、事実上いずれの核酸分子の送達にも使用することができる。核酸分子は細胞に、当業者に知られた多種多様な方法によって、例えば限定されないが、リポソーム内への封入、イオン導入、または他の媒体（生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚら，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４；Ｗａｎｇら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ０３／４７５１８およびＷＯ０３／４６１８５を参照のこと）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフィア（例えば、米国特許６，４４７，７９６および米国特許出願公開公報番号ＵＳ２００２１３０４３０を参照のこと）、生分解性ナノカプセル、ならびに生体接着性ミクロスフィアなど）への組込みによって、またはタンパク質性ベクター（Ｏ’ＨａｒｅおよびＮｏｒｍａｎｄ，ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ００／５３７２２）によって投与され得る。
【０１９１】
一態様において、本発明は、本明細書に記載のｓｉＮＡ分子を内包する担体系を提供する。一部の実施形態において、担体系は、脂質系の担体系、カチオン性脂質、もしくはリポソーム核酸複合体、リポソーム、ミセル、ビロソーム、脂質ナノ粒子またはその混合物である。他の実施形態では、担体系は、ポリマー系の担体系（カチオン性ポリマー−核酸複合体など）である。さらなる実施形態では、担体系は、シクロデキストリン系の担体系（シクロデキストリンポリマー−核酸複合体など）である。さらなる実施形態では、担体系は、タンパク質系の担体系（カチオン性ペプチド−核酸複合体など）である。好ましくは、担体系は脂質ナノ粒子（「ＬＮＰ」）製剤である。
【０１９２】
一部の特定の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、米国特許出願第１１／３５３，６３０号、同第１１／５８６，１０２号、同第６１／１８９，２９５号、同第６１／２０４，８７８号、同第６１／２３５，４７６号、同第６１／２４９，８０７号、同第６１／２９８，０２２号、同第６１／３５１３７３号、同第６１／３４７６４０号、同第６１／３４５７５４号、同第６１／３２２０５４号、同第１２／６４０３４２号、および同第１２／６１７０７９号、ならびにＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１０／０２００１３およびＰＣＴ／ＵＳ０９／０５３３３６に記載されているような脂質ナノ粒子組成物を用いて製剤化される。一部の特定の実施形態では、該ｓｉＮＡは、本明細書の実施例６に記載および例示した成分および比率を用いて製剤化される（表１０と１１も参照のこと）。
【０１９３】
種々の実施形態において、表１０に示した脂質ナノ粒子配合物は、本明細書に記載の任意のｓｉＮＡ分子またはｓｉＮＡ分子の組合せに適用される。一部の実施形態において、本発明は、カチオン性脂質化合物番号１〜４６のいずれかまたはその組合せを含む組成物として製剤化された本発明のｓｉＮＡ分子を含む組成物を特色とする。
【０１９４】
一部の特定の他の実施形態において、本発明は、米国特許出願第６１／１８９，２９５号、同第６１／２０４，８７８号、同第６１／２３５，４７６号、同第６１／２４９，８０７号、および同第６１／２９８，０２２号に記載のカチオン性脂質配合物のいずれかを用いて製剤化された本発明のｓｉＮＡ分子を含む組成物を特色とする。
【０１９５】
他の実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲートおよび／または複合体を特色とする。かかるコンジュゲートおよび／または複合体は、生物学的系内（細胞など）への該ｓｉＮＡ分子の送達を助長するために使用され得る。本発明によって提供されるコンジュゲートおよび複合体は、細胞膜を通過して治療用化合物を運搬すること、薬物動態特性を改変すること、および／または本発明の核酸分子の局在化をモジュレートすることにより、治療活性を付与し得るものである。かかるコンジュゲートの非限定的な例は、米国特許出願公開公報番号ＵＳ２００８／０１５２６６１Ａ１およびＵＳ２００４／０１６２２６０Ａ１（例えば、ＣＤＭ−ＬＢＡ、ＣＤＭ−Ｐｉｐ−ＬＢＡ、ＣＤＭ−ＰＥＧ、ＣＤＭ−ＮＡＧなど）ならびに米国特許出願第１０／４２７，１６０号  同第１０／２０１，３９４号、同第６１／３２２４２２号、および同第６１／３１５２２３号；ならびに米国特許第６，５２８，６３１号；同第６，３３５，４３４号；同第６，２３５，８８６号；同第６，１５３，７３７号；同第５，２１４，１３６号；および同第５，１３８，０４５号に記載されている。
【０１９６】
種々の実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が本発明のｓｉＮＡ化合物に共有結合され得る。結合されるＰＥＧは任意の分子量であり得る（好ましくは約１００〜約５０，０００ダルトン（Ｄａ））。
【０１９７】
また他の実施形態において、本発明は、ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ修飾型もしくは長時間循環性のリポソームまたはステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）リポソーム）と本発明のｓｉＮＡ分子とを内包している表面修飾されたリポソームを含む組成物または製剤を特色とする（例えば、ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ９６／１０３９２に開示されているようなもの）。
【０１９８】
また、一部の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、例えば、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体などを用いて製剤化または複合体形なされ得る。一実施形態において、本発明の核酸分子は、米国特許出願公開公報番号２００３００７７８２９に記載のようにして製剤化される。
【０１９９】
他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子を、膜破壊剤（米国特許出願公開公報第２００１０００７６６６号に記載のものなど）と複合体形成させる。また、さらに他の実施形態では、膜破壊剤（１種類または複数種）と該ｓｉＮＡ分子を、カチオン性脂質またはヘルパー脂質分子（米国特許第６，２３５，３１０号に記載の脂質など）と複合体形成させる。
【０２００】
一部の特定の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、米国特許出願公開公報第２００３０７７８２９号；同第２００５０２８７５５１号；同第２００５０１６４２２０号；同第２００５０１９１６２７号；同第２００５０１１８５９４号；同第２００５０１５３９１９号；同第２００５００８５４８６号；および同第２００３０１５８１３３号；ならびにＰＣＴ国際出願公開公報番号ＷＯ００／０３６８３およびＷＯ０２／０８７５４１に記載のような送達系と複合体形成させる。
【０２０１】
一部の実施形態において、本発明のリポソーム製剤は、米国特許第６，８５８，２２４号；同第６，５３４，４８４号；同第６，２８７，５９１号；同第６，８３５，３９５号；同第６，５８６，４１０号；同第６，８５８，２２５号；同第６，８１５，４３２号；同第６，５８６，００１号；同第６，１２０，７９８号；同第６，９７７，２２３号；同第６，９９８，１１５号；同第５，９８１，５０１号；同第５，９７６，５６７号；同第５，７０５，３８５号；ならびに米国特許出願公開公報第２００６／００１９９１２号；同第２００６／００１９２５８号；同第２００６／０００８９０９号；同第２００５／０２５５１５３号；同第２００５／００７９２１２号；同第２００５／０００８６８９号；同第２００３／００７７８２９号、同第２００５／００６４５９５号、同第２００５／０１７５６８２号、同第２００５／０１１８２５３号；同第２００４／００７１６５４号；同第２００５／０２４４５０４号；同第２００５／０２６５９６１および２００３／００７７８２９に記載された化合物および組成物と製剤化または複合体形成させた本発明のｓｉＮＡ分子（例えば、ｓｉＮＡ）を含む。
【０２０２】
あるいはまた、本発明のｓｉＮＡを発現する上記に論考したような組換えプラスミドおよびウイルスベクターを、本発明の分子の送達に使用してもよい。ｓｉＮＡ分子発現ベクターの送達は、全身性（静脈内もしくは筋肉内投与など）によるもの、被検体から取り出された標的細胞に投与した後、該被検体に再導入することによるもの、または所望の標的細胞への導入が可能であり得る任意の他の手段によるものであり得る（概説については、Ｃｏｕｔｕｒｅら，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照のこと）。また、かかる組換えプラスミドは、直接投与してもよく、適当な送達試薬とともに、例えば、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；ポリカチオン（例えば、ポリリジン）またはリポソーム脂質系の担体系、カチオン性脂質、もしくはリポソーム核酸複合体、ミセル、ビロソーム、脂質ナノ粒子などとともに投与してもよい。
Ｅ．キット
また、本発明は、核酸をキットの形態で提供する。キットには容器が含まれ得る。キットには、典型的には、本発明の核酸を、その投与のための使用説明書とともに含む。一部の特定の場合では、該核酸は、標的化部分が結合されたものであり得る。標的化部分（例えば、抗体、タンパク質）を結合させる方法は、当業者に知られている。一部の特定の場合では、該核酸は化学修飾されている。他の実施形態では、キットに、１種類より多くの本発明のｓｉＮＡ分子を含む。キットには、本発明のｓｉＮＡ分子を薬学的に許容され得る担体または希釈剤とともに含めてもよい。キットに、さらに賦形剤を含めてもよい。
Ｆ．治療的使用／医薬組成物
現在のＨＢＶの研究における一連の知見により、ＨＢＶ活性をアッセイするための方法の必要性、および研究、診断および治療での使用のためのＨＢＶ発現を調節することができる化合物の必要性が示されている。後述するように、本発明の核酸分子は、アッセイにおいて、ＨＢＶレベルと関連している疾患状態を診断するために使用され得る。また、該核酸分子および医薬組成物は、ＨＢＶ  ＲＮＡレベルと関連している疾患状態を処置するために使用され得る。
【０２０３】
１．ＨＢＶと関連している疾患状態
ＨＢＶ発現のモジュレーションと関連したものであり得る具体的な疾患状態としては、肝臓疾患およびがんが挙げられる。かかる疾患の非限定的な例としては、肝硬変および肝細胞（ｈｅｐｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ）癌が挙げられる。
【０２０４】
本発明のｓｉＮＡ分子が標的ＨＢＶ  ｍＲＮＡを分解（したがって、上記の疾患を抑止）し得るものであることは理解されよう。疾患の抑止は、被検体において疾患の進行を直接測定することにより評価することができる。また、該疾患と関連している病状の変化または逆転を観察することにより推断してもよい。さらに、本発明のｓｉＮＡ分子を予防法として使用してもよい。したがって、本発明の核酸分子および医薬組成物の使用は、ＨＢＶ遺伝子発現の調節と関連しているこれらおよび他の疾患を改善、処置、予防および／または治癒するために使用され得る。
【０２０５】
２．医薬組成物
本発明のｓｉＮＡ分子により、多種多様な治療的、予防的、美容的、獣医学的、診断的、標的確認、ゲノム知得、遺伝子操作、および薬理ゲノミクス適用用途に有用な試薬および方法が提供される。
【０２０６】
ａ．製剤
したがって、本発明はまた、一態様において、記載のｓｉＮＡ分子の医薬組成物、すなわち、薬学的に許容され得る担体または希釈剤中の組成物を提供する。このような医薬組成物は、上記の化合物の塩、エステル、またはかかるエステルの塩、例えば、酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、酢酸およびベンゼンスルホン酸の塩を含むものである。他の塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、マンガン、アンモニウムおよびカルシウムの塩が挙げられる。このような医薬製剤または医薬組成物には、当該技術分野で一般的に知られた薬学的に許容され得る担体または希釈剤が含まれ得る。
【０２０７】
一実施形態において、本発明は、配列番号：１の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。別の実施形態では、本発明は、配列番号：４５２の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。また別の実施形態では、本発明は、配列番号：２の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号：４５３の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。別の実施形態では、本発明は、配列番号：３の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。別の実施形態では、本発明は、配列番号：４５４の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。別の実施形態では、本発明は、配列番号：４の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。また別の実施形態では、本発明は、配列番号：４５５の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。さらに別の実施形態では、本発明は、式（Ａ）を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。
【０２０８】
本発明のｓｉＮＡ分子は、好ましくは、被検体に投与する前に、当該技術分野で知られた手法に従って医薬組成物として製剤化される。本発明の医薬組成物は、少なくとも滅菌されており、パイロジェンフリーであることを特徴とする。本発明の医薬組成物の調製方法は、当該技術分野の技能の範囲内であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１７版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８５）に記載されている。
【０２０９】
一部の実施形態において、本発明の医薬組成物（例えば、ｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）は、さらに、慣用的な医薬用賦形剤および／または添加剤を含む。好適な医薬用賦形剤としては、保存料、フレーバー剤、安定剤、酸化防止剤、オスモル濃度調整剤、バッファー、およびｐＨ調整剤が挙げられる。好適な添加剤としては、生理学的に生体適合性のバッファー（例えば、塩酸トリメチルアミン）、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡもしくはＤＴＰＡ−ビスアミドなど）またはカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドなど）の添加が挙げられ、あるいは、カルシウムもしくはナトリウム塩（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムもしくは乳酸カルシウム）を添加してもよい。また、酸化防止剤および懸濁化剤を使用してもよい。
【０２１０】
局所投与のための製剤の種々の型の非限定的な例としては、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、フォーム剤、経皮パッチによる送達のための調製物、粉末剤、スプレー剤、エアロゾル剤、カプセル剤または吸入器もしくは吹送器での使用のためのカートリッジ剤または滴剤（例えば、点眼薬または点鼻薬）、噴霧化される液剤／懸濁剤、坐薬、膣坐薬、貯留注腸剤およびチュアブル錠もしくはサッカブル錠もしくはペレット剤（例えば、アフタ性潰瘍の処置用）またはリポソームもしくはマイクロカプセル封入調製物が挙げられる。
【０２１１】
軟膏、クリーム剤およびゲル剤は、例えば、水性または油性の基剤を用い、適当な増粘剤および／またはゲル化剤および／または溶媒の添加を伴って製剤化され得る。したがって、かかる基剤の非限定的な例としては、例えば、水および／または油類、例えば、液状パラフィンあるいは植物油（ラッカセイ油もしくはヒマシ油など）、または溶媒（ポリエチレングリコールなど）が挙げられ得る。基剤の性質に応じて、種々の増粘剤およびゲル化剤が使用され得る。かかる薬剤の非限定的な例としては、軟質パラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、ポリエチレングリコール、羊毛脂、蜜蝋、カルボキシポリメチレンおよびセルロース誘導体および／またはグリセリルモノステアレートおよび／または非イオン性乳化剤が挙げられる。
【０２１２】
一実施形態において、ローション剤は、水性または油性基剤を用いて製剤化され得、また、一般的に１種類以上の乳化剤、安定化剤、分散化剤、懸濁化剤または増粘剤が含まれる。
【０２１３】
一実施形態において、外用粉末剤は、任意の適当な粉末基剤、例えば、タルク、ラクトースまたはデンプンの補助を伴って形成され得る。滴剤は、水性または非水性の基剤を用いて製剤化され得、また、１種類以上の分散化剤、可溶化剤、懸濁化剤または保存料が含まれる。
【０２１４】
経口使用が意図される組成物は、医薬組成物の製造のための当該技術分野で知られた任意の方法に従って調製され得、かかる組成物に、医薬品として洗練された口当たりのよい調製物を得るために甘味剤、フレーバー剤、着色剤または保存剤などの１種類以上を含有させてもよい。錠剤は、活性成分を、錠剤の製造に適した無毒性の薬学的に許容され得る賦形剤と混合された状態で含む。このような賦形剤は、例えば、不活性な希釈剤；炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなど；造粒剤および崩壊剤、例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア；ならびに滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであり得る。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、既知の手法によってコーティングされていてもよい。一部の場合では、かかるコーティングは、胃腸管内での崩壊と吸収を遅延させ、それにより長期間にわたって持続作用をもたらすための既知の手法によって調製され得る。例えば、グリセリルモノステアレート（ｍｏｎｏｓｔｅｒａｔｅ）またはグリセリルジステアレートなどの時間遅延物質が使用され得る。
【０２１５】
また、経口使用のための製剤は、活性成分を不活性な固形希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合した硬質ゼラチンカプセル剤として、あるいは活性成分を水または油性媒体（例えば、ピーナッツ油、液状パラフィンもしくはオリーブ油と混合した軟質ゼラチンカプセル剤）として提示され得る。
【０２１６】
水性懸濁剤は、活性物質を、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤との混合物の状態で含む。かかる賦形剤は、懸濁化剤、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントゴムおよびアカシアゴムである；分散化剤または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えば、レシチン、あるいはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）；またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから得られる部分エステルとの縮合生成物（ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなど）、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られる部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。また、水性懸濁剤には、１種類以上の保存料（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｎ−プロピル）、１種類以上の着色剤、１種類以上のフレーバー剤、および１種類以上の甘味剤（スクロースまたはサッカリンなど）が含有され得る。
【０２１７】
油性懸濁剤は、活性成分を、植物油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナッツ油）、または鉱油（液状パラフィンなど）に懸濁させることにより製剤化され得る。油性懸濁剤には、増粘剤、例えば、蜜蝋、硬質パラフィンまたはセチルアルコールが含有され得る。甘味剤およびフレーバー剤は、口当たりのよい経口調製物を得るために添加され得る。このような組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加によって保存され得る。
【０２１８】
また、本発明の医薬組成物は水中油型の乳剤の形態であってもよい。油相は、植物油または鉱油またはこれらの混合物であり得る。好適な乳化剤は、天然に存在するゴム（例えば、アカシアゴムまたはトラガントゴム）、天然に存在するホスファチド、例えば、ダイズ、レシチン、および脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られるエステルまたは部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、ならびに前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。また、乳剤に甘味剤およびフレーバー剤を含有させてもよい。
【０２１９】
シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコースまたはスクロースを用いて製剤化され得る。また、かかる製剤には、粘滑剤、保存料およびフレーバー剤および着色剤も含有され得る。医薬組成物は、滅菌された注射用の水性または油性懸濁剤の形態であってもよい。この懸濁剤は、既知の技術に従い、上記に示した適当な分散化剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて製剤化され得る。また、滅菌された注射用調製物は、無毒性の非経口に（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）許容され得る希釈剤または溶媒中の滅菌された注射用の液剤または懸濁剤（例えば、１，３−ブタンジオール中の液剤）であり得る。中でも、使用可能な許容され得るビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液である。また、滅菌された固定油も、溶媒または懸濁媒体として慣用的に使用されている。この目的には、任意の無刺激性固定油（例えば、合成のモノ−またはジグリセリド）が使用され得る。また、オレイン酸などの脂肪酸は、注射用剤の調製に有用性が見い出されている。
【０２２０】
また、本発明の核酸分子は、例えば、薬物の経直腸投与のための坐薬の形態で投与され得る。このような組成物は、薬物を適当な非刺激性賦形剤と混合することにより調製され得、該賦形剤は、通常の温度では固体であるが直腸温度では液状となり、したがって、直腸内で融解して薬物を放出するものである。かかる物質としては、ココアバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２２１】
本発明の核酸分子は、滅菌された媒体にて非経口投与してもよい。薬物は、使用されるビヒクルおよび濃度に応じてビヒクル中に懸濁させるか、または溶解させるかのいずれかであり得る。好都合には、局所麻酔薬、保存料および緩衝剤などの佐剤をビヒクル中に溶解させるのがよい。
【０２２２】
他の実施形態において、肺経由送達における使用のための本明細書において提供するｓｉＮＡならびにＬＮＰ組成物および製剤は、さらに、１種類以上の界面活性剤を含む。本発明の組成物の取込みを向上させるための好適な界面活性剤または界面活性剤成分としては、とりわけ、合成および天然の、ならびに完全体および切断型の界面活性体プロテインＡ、界面活性体プロテインＢ、界面活性体プロテインＣ、界面活性体プロテインＤならびに界面活性体プロテインＥ、ジ−飽和ホスファチジルコリン（ジパルミトイル以外）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン；ホスファチジン酸、ユビキノン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、パルミトイル−リゾホスファチジルコリン、デヒドロエピアンドロステロン、ドリコール、スルファチジン（ｓｕｌｆａｔｉｄｉｃ）酸、グリセロール−３−ホスフェート、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール、グリセロ−３−ホスホコリン、ジヒドロキシアセトン、パルミテート、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）ジアシルグリセロール、ＣＤＰコリン、コリン、コリンリン酸；ならびに界面活性剤成分の天然担体ビヒクルである天然および人工の層状体、ω−３脂肪酸、ポリエン酸、ポリエノン酸、レシチン、パルミチン酸、エチレンまたはプロピレンオキシド、ポリオキシプロピレン、モノマー型およびポリマー型のポリオキシエチレン、モノマー型およびポリマー型のポリ（ビニルアミン）と、デキストランおよび／またはアルカノイル側鎖との非イオン性ブロックコポリマー、Ｂｒｉｊ  ３５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ならびに合成界面活性剤ＡＬＥＣ、Ｅｘｏｓｕｒｆ、ＳｕｒｖａｎおよびＡｔｏｖａｑｕｏｎｅが挙げられる。このような界面活性剤は、製剤中で単独で、もしくは多成分界面活性剤の一部として、本明細書の医薬組成物中の核酸成分の５’末端および／または３’末端に共有結合された付加物としてのいずれかで使用され得る。
【０２２３】
ｂ．併用
本発明によるｓｉＮＡおよび医薬製剤は、被検体に単独で投与してもよく、１種類以上の他の治療用薬剤（例えば、抗ウイルス剤または抗がん剤）と併用して使用してもよく、該他の治療用薬剤を含めてもよい。したがって、本開示の化合物と他の抗ウイルス剤または抗がん剤または化学療法剤との併用は本発明の範囲に含まれる。
【０２２４】
抗がん剤または化学療法剤の例は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｖ．Ｔ．Ｄｅｖｉｔａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈｅｌｌｍａｎ（編集者），第６版（２００１年２月１５日），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを見るとよい。当業者には、どの薬剤の組合せが有用であり得るかが、関与する具体的な薬物およびがんの特性に基づいて認識され得よう。かかる抗がん剤としては、限定されないが、以下のもの：エストロゲン受容体モジュレータ、アンドロゲン受容体モジュレータ、レチノイド受容体モジュレータ、細胞傷害剤／細胞増殖抑制薬、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害薬、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬および他の血管新生阻害薬、細胞の増殖および生存のシグナル伝達の阻害薬、アポトーシス誘導剤ならびに細胞周期のチェックポイントに干渉する薬剤が挙げられる。また、本発明のｓｉＮＡは、ＨＣＣの処置に使用される任意の治療用薬剤（例えば限定されないが、ソラフェニブ）との併用にも有用である。
【０２２５】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子（例えば限定されないが、配列番号：１、配列番号：１２１０、配列番号：２、配列番号：１２１１、配列番号：３、配列番号：１２１２、配列番号：４、もしくは配列番号：１２１３の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列；または式（Ａ）を含むｓｉＮＡ分子など）あるいはその薬学的に許容され得る塩、溶媒和物もしくは生理学的に機能性の誘導体を、１種類以上の抗ウイルス剤と一緒に含む併用を提供する。一部の実施形態では、抗ウイルス薬は別のＨＢＶ阻害薬である。
【０２２６】
一部の特定の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、既知のＨＢＶ抗ウイルス剤、例えば、以下のもの：ラミブジン（２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン、一般呼称３ＴＣ）、ペグインターフェロン−α２ａ、テノホビル、エンテカビル、テルビブジン、アデホビルとの併用において有用である。
【０２２７】
また、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子、例えば限定されないが、配列番号：１、配列番号：４５２、配列番号：２、配列番号：４５３、配列番号：３、配列番号：４５４、配列番号：４、もしくは配列番号：４５５の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列；または式（Ａ）を含むｓｉＮＡ分子あるいはその薬学的に許容され得る塩、溶媒和物もしくは生理学的に機能性の誘導体などを１種類以上の抗がん剤または化学療法剤と一緒に含む併用を提供する。
【０２２８】
一部の特定の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、既知の抗がん剤、例えば以下のもの：エストロゲン受容体モジュレータ、アンドロゲン受容体モジュレータ、レチノイド受容体モジュレータ、細胞傷害剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害薬、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、ＨＩＶプロテアーゼ阻害薬、逆転写酵素阻害薬、および他の血管新生阻害薬との併用にも有用である。
【０２２９】
本発明の化合物と併用して使用され得るエストロゲン受容体モジュレータの例としては、限定されないが、タモキシフェン、ラロキシフェン、イドキシフェン、ＬＹ３５３３８１、ＬＹ１１７０８１、トレミフェン、フルベストラント、４−［７−（２，２−ジメチル−１−オキソプロポキシ−４−メチル−２−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル］−フェニル−２，２−ジメチルプロパノエート、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン−２，４−ジニトロフェニル−ヒドラゾン、およびＳＨ６４６が挙げられる。
【０２３０】
本発明の化合物と併用して使用され得るアンドロゲン受容体モジュレータの例としては、限定されないが、フィナステリドおよび他の５α−レダクターゼ阻害薬、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、リアロゾール、および酢酸アビラテロンが挙げられる。
【０２３１】
本発明の化合物と併用して使用され得るかかるレチノイド受容体モジュレータの例としては、限定されないが、ベキサロテン、トレチノイン、１３−シス−レチノイン酸、９−シス−レチノイン酸、α−ジフルオロメチルオルニチン、ＩＬＸ２３−７５５３、トランス−Ｎ−（４’−ヒドロキシフェニル）レチンアミド、およびＮ−４−カルボキシフェニルレチンアミドが挙げられる。
【０２３２】
本発明の化合物と併用して使用され得る細胞傷害剤の例としては、限定されないが、セルテネフ、カケクチン、イホスファミド、タソネルミン、ロニダミン、カルボプラチン、アルトレタミン、プレドニムスチン、ジブロモダルシトール、ラニムスチン、ホテムスチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、テモゾロミド、ヘプタプラチン、エストラムスチン、トシル酸インプロスルファン、トロホスファミド、ニムスチン、塩化ジブロスピジウム、プミテパ、ロバプラチン、サトラプラチン、プロフィロマイシン、シスプラチン、イロフルベン、デキシホスファミド、シス−アミンジクロロ（２−メチル−ピリジン）白金、ベンジルグアニン、グルホスファミド、ＧＰＸ１００、（トランス，トランス，トランス）−ビス−μ−（ヘキサン−１，６−ジアミン）−μ−［ジアミン−白金（ＩＩ）］ビス［ジアミン（クロロ）白金（ＩＩ）］テトラクロリド、ジアリジジニルスペルミン、三酸化ヒ素、１−（１１−ドデシルアミノ−１０−ヒドロキシウンデシル）−３，７−ジメチルキサンチン、ゾルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ビサントレン、ミトザントロン、ピラルビシン、ピナフィド、バルルビシン、アムルビシン、アンチネオプラストン、３’−デアミノ−３’−モルホリノ−１３−デオキソ−１０−ヒドロキシカルミノマイシン、アンナマイシン、ガラルビシン、エリナフィド、ＭＥＮ１０７５５、および４−デメトキシ−３−デアミノ−３−アジリジニル−４−メチルスルホニル−ダウノルビシン（ＷＯ００／５００３２参照）が挙げられる。
【０２３３】
本発明の化合物と併用して使用され得る低酸素活性化性化合物の一例はチラパザミンである。
【０２３４】
本発明の化合物と併用して使用され得るプロテアソーム阻害薬の例としては、限定されないが、ラクタシスチンおよびボルテゾミブが挙げられる。
【０２３５】
本発明の化合物と併用して使用され得る微小管阻害薬／微小管安定化剤の例としては、限定されないが、パクリタキセル、硫酸ビンデシン、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキセル、リゾキシン、ドラスタチン、イセチオン酸ミボブリン、アウリスタチン、セマドチン、ＲＰＲ１０９８８１、ＢＭＳ１８４４７６、ビンフルニン、クリプトフィシン、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、アンヒドロビンブラスチン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、ＴＤＸ２５８、エポチロン（例えば、米国特許第６，２８４，７８１号および同第６，２８８，２３７号参照）ならびにＢＭＳ１８８７９７が挙げられる。
【０２３６】
本発明の化合物と併用して使用され得るトポイソメラーゼ阻害薬の一例としては、限定されないが、トポテカン、ヒカプトアミン（ｈｙｃａｐｔａｍｉｎｅ）、イリノテカン、ルビテカン、６−エトキシプロピオニル−３’，４’−Ｏ−エキソ（ｅｘｏ）−ベンジリデン−シャールトルーシン、９−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−ニトロピラゾロ［３，４，５−ｋｌ］アクリジン−２−（６Ｈ）プロパンアミン、１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［デ］ピラノ［３’，４’：ｂ，７］−インドリジノ［１，２ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）ジオン、ラルトテカン、７−［２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル］−（２０Ｓ）カンプトテシン、ＢＮＰ１３５０、ＢＮＰＩ１１００、ＢＮ８０９１５、ＢＮ８０９４２、リン酸エトポシド、テニポシド、ソブゾキサン、２’−ジメチルアミノ−２’−デオキシ−エトポシド、ＧＬ３３１、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−９−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−カルボキサミド、アスラクリン、（５ａ，５ａＢ，８ａａ，９ｂ）−９−［２−［Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］エチル］−５−［４−ヒドロオキシ−３，５−ジメトキシフェニル］−５，５ａ，６，８，８ａ，９−ヘキソヒドロフロ（３’，４’：６，７）ナフト（２，３−ｄ）−１，３−ジオキソル−６−オン、２，３−（メチレンジオキシ）−５−メチル−７−ヒドロキシ−８−メトキシベンゾ［ｃ］−フェナントリジニウム、６，９−ビス［（２−アミノエチル）アミノ］ベンゾ［ｇ］イソギノリン（ｇｕｉｎｏｌｉｎｅ）−５，１０−ジオン、５−（３−アミノプロピルアミノ）−７，１０−ジヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシエチルアミノメチル）−６Ｈ−ピラゾロ［４，５，１−デ］アクリジン−６−オン、Ｎ−［１−［２（ジエチルアミノ）エチルアミノ］−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−チオキサンテン−４−イルメチル］ホルムアミド、Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）アクリジン−４−カルボキサミド、６−［［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ］−３−ヒドロキシ−７Ｈ−インデノ［２，１−ｃ］キノリン−７−オン、およびディメスナが挙げられる。
【０２３７】
本発明の化合物と併用して使用され得る有糸分裂キネシンの阻害薬、特にヒト有糸分裂キネシンＫＳＰの例としては、限定されないが、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０１／３０７６８、ＷＯ０１／９８２７８、ＷＯ０３／０５０，０６４、ＷＯ０３／０５０，１２２、ＷＯ０３／０４９，５２７、ＷＯ０３／０４９，６７９、ＷＯ０３／０４９，６７８、ＷＯ０４／０３９７７４、ＷＯ０３／０７９９７３、ＷＯ０３／０９９２１１、ＷＯ０３／１０５８５５、ＷＯ０３／１０６４１７、ＷＯ０４／０３７１７１、ＷＯ０４／０５８１４８、ＷＯ０４／０５８７００、ＷＯ０４／１２６６９９、ＷＯ０５／０１８６３８、ＷＯ０５／０１９２０６、ＷＯ０５／０１９２０５、ＷＯ０５／０１８５４７、ＷＯ０５／０１７１９０、ＵＳ２００５／０１７６７７６に記載の阻害薬が挙げられる。一実施形態において、有糸分裂キネシンの阻害薬としては、限定されないが、ＫＳＰの阻害薬、ＭＫＬＰ１の阻害薬、ＣＥＮＰ−Ｅの阻害薬、ＭＣＡＫの阻害薬、Ｋｉｆｌ４の阻害薬、Ｍｐｈｏｓｐｈｌの阻害薬およびＲａｂ６−ＫＩＦＬの阻害薬が挙げられる。
【０２３８】
本発明の化合物と併用して使用され得る「ヒストンデアセチラーゼ阻害薬」の例としては、限定されないが、ＴＳＡ、オキサムフラチン、ＰＸＤ１０１、ＭＧ９８、バルプロ酸およびスクリプタイドが挙げられる。他のヒストンデアセチラーゼ阻害薬に対するさらなる参考文献は、下記の論文；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ａ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６（２４）：５０９７−５１１６（２００３）を見るとよい。
【０２３９】
本発明の化合物と併用して使用され得る有糸分裂の進行に関与しているキナーゼの阻害薬の例としては、限定されないが、オーロラキナーゼの阻害薬、Ｐｏｌｏ様キナーゼ（ＰＬＫ）の阻害薬（特に、ＰＬＫ−１の阻害薬）、ｂｕｂ−１の阻害薬およびｂｕｂ−Ｒ１の阻害薬が挙げられる。
【０２４０】
本発明の化合物と併用して使用され得る抗増殖剤の例としては、限定されないが、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｇ３１３９、ＯＤＮ６９８、ＲＶＡＳＫＲＡＳ、ＧＥＭ２３１、およびＩＮＸ３００１など）、ならびに代謝拮抗薬（エノシタビン、カルモフール、テガフール、ペントスタチン、ドキシフルリジン、トリメトレキサート、フルダラビン、カペシタビン、ガロシタビン、シタラビンオクホスファート、ホステアビン（ｆｏｓｔｅａｂｉｎｅ）ナトリウム水和物、ラルチトレキセド、パルチトレキシド、エミテフール、チアゾフリン、デシタビン、ノラトレキセド、ペメトレキセド、ネルザラビン、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン、２’−フルオロメチレン−２’−デオキシシチジン、Ｎ−［５−（２，３−ジヒドロ−ベンゾフリル）スルホニル］−Ｎ’−（３，４−ジクロロフェニル）尿素、Ｎ６−［４−デオキシ−４−［Ｎ２−［２（Ｅ），４（Ｅ）−テトラデカジエノイル］グリシルアミノ］−Ｌ−グリセロ−Ｂ−Ｌ−マンノ−ヘプトピラノシル］アデニン、アプリジン、エクテイナシジン、トロキサシタビン、４−［２−アミノ−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−ピリミジノ［５，４−ｂ］［１，４］チアジン−６−イル−（Ｓ）−エチル］−２，５−チエノイル−Ｌ−グルタミン酸、アミノプテリン、５−フルオロウラシル、アラノシン、１１−アセチル−８−（カルバモイルオキシメチル）−４−ホルミル−６−メトキシ−１４−オキサ−１，１１−ジアザテトラシクロ（７．４．１．０．０）−テトラデカ−２，４，６−トリエン−９−イル酢酸エステル、スワインソニン、ロメトレキソール、デクスラゾキサン、メチオニナーゼ、２’−シアノ−２’−デオキシ−Ｎ４−パリミトイル−１−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシンおよび３−アミノピリジン−２−カルボキサルデヒドチオセミカルバゾンなど）が挙げられる。
【０２４１】
本発明の化合物と併用して使用され得るモノクローナル抗体ターゲテッド治療用薬剤の例としては、がん細胞特異的または標的細胞特異的モノクローナル抗体に結合させた細胞傷害剤または放射性同位体を有する治療用薬剤（例えば、Ｂｅｘｘａｒなど）が挙げられる。
【０２４２】
本発明の化合物と併用して使用され得る（ｔｈａｔ  ｍａｙ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬の例としては、限定されないが、ロバスタチン（ＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）；米国特許第４，２３１，９３８号、同第４，２９４，９２６号および同第４，３１９，０３９号参照）、シムバスタチン（ＺＯＣＯＲ（登録商標）；米国特許第４，４４４，７８４号、同第４，８２０，８５０号および同第４，９１６，２３９号参照）、ブラバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ（登録商標）；米国特許第４，３４６，２２７号、同第４，５３７，８５９号、同第４，４１０，６２９号、同第５，０３０，４４７号および同第５，１８０，５８９号参照）、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ（登録商標）；米国特許第５，３５４，７７２号、同第４，９１１，１６５号、同第４，９２９，４３７号、同第５，１８９，１６４号、同第５，１１８，８５３号、同第５，２９０，９４６号および同第５，３５６，８９６号参照）ならびにアトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ（登録商標）；米国特許第５，２７３，９９５号、同第４，６８１，８９３号、同第５，４８９，６９１号および同第５，３４２，９５２号参照）が挙げられる。本発明の方法に使用され得るこれらおよびさらなるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬の構造式Ｍ．Ｙａｌｐａｎｉ，「Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｏｗｅｒｉｎｇ  Ｄｒｕｇｓ」，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｐｐ．８５−８９（１９９６年２月５日）の第８７頁ならびに米国特許第４，７８２，０８４号および同第４，８８５，３１４号に記載されている。
【０２４３】
本発明の化合物と併用して使用され得るプレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害薬の例としては、限定されないが、以下の刊行物および特許：ＷＯ９６／３０３４３、ＷＯ９７／１８８１３、ＷＯ９７／２１７０１、ＷＯ９７／２３４７８、ＷＯ９７／３８６６５、ＷＯ９８／２８９８０、ＷＯ９８／２９１１９、ＷＯ９５／３２９８７号、米国特許第５，４２０，２４５号、米国特許第５，５２３，４３０号、米国特許第５，５３２，３５９号、米国特許第５，５１０，５１０号、米国特許第５，５８９，４８５号、米国特許第５，６０２，０９８号、欧州特許公開公報０  ６１８  ２２１、欧州特許公開公報０  ６７５  １１２、欧州特許公開公報０  ６０４  １８１、欧州特許公開公報０  ６９６  ５９３、ＷＯ９４／１９３５７、ＷＯ９５／０８５４２、ＷＯ９５／１１９１７、ＷＯ９５／１２６１２、ＷＯ９５／１２５７２、ＷＯ９５／１０５１４号、米国特許第５，６６１，１５２号、ＷＯ９５／１０５１５、ＷＯ９５／１０５１６、ＷＯ９５／２４６１２、ＷＯ９５／３４５３５、ＷＯ９５／２５０８６、ＷＯ９６／０５５２９、ＷＯ９６／０６１３８、ＷＯ９６／０６１９３、ＷＯ９６／１６４４３、ＷＯ９６／２１７０１、ＷＯ９６／２１４５６、ＷＯ９６／２２２７８、ＷＯ９６／２４６１１、ＷＯ９６／２４６１２、ＷＯ９６／０５１６８、ＷＯ９６／０５１６９、ＷＯ９６／００７３６号、米国特許第５，５７１，７９２号、ＷＯ９６／１７８６１、ＷＯ９６／３３１５９、ＷＯ９６／３４８５０、ＷＯ９６／３４８５１、ＷＯ９６／３００１７、ＷＯ９６／３００１８、ＷＯ９６／３０３６２、ＷＯ９６／３０３６３、ＷＯ９６／３１１１１、ＷＯ９６／３１４７７、ＷＯ９６／３１４７８、ＷＯ９６／３１５０１、ＷＯ９７／００２５２、ＷＯ９７／０３０４７、ＷＯ９７／０３０５０、ＷＯ９７／０４７８５、ＷＯ９７／０２９２０、ＷＯ９７／１７０７０、ＷＯ９７／２３４７８、ＷＯ９７／２６２４６、ＷＯ９７／３００５３、ＷＯ９７／４４３５０、ＷＯ９８／０２４３６、および米国特許第５，５３２，３５９号において知得され得るものが挙げられる。血管新生に対するプレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害薬の役割の一例については、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．９，ｐｐ．１３９４−１４０１（１９９９）を参照のこと。
【０２４４】
本発明の化合物と併用して使用され得る血管新生阻害薬の例としては、限定されないが、チロシンキナーゼ阻害薬、例えば、チロシンキナーゼ受容体Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ１）およびＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）の阻害薬、上皮由来、線維芽細胞由来または血小板由来増殖因子の阻害薬、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）阻害薬、インテグリン遮断薬、インターフェロン−α、インターロイキン−１２、多硫酸ペントサン、シクロオキシゲナーゼ阻害薬、例えば、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（アスピリンおよびイブプロフェンなど）ならびに選択的シクロオキシゲナーゼ−２阻害薬（セレコキシブおよびロフェコキシブなど）が挙げられる（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．８９，ｐ．７３８４（１９９２）；ＪＮＣＩ，Ｖｏｌ．６９，ｐ．４７５（１９８２）；Ａｒｃｈ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ，Ｖｏｌ．１０８，ｐ．５７３（１９９０）；Ａｎａｔ．Ｒｅｃ，Ｖｏｌ．２３８，ｐ．６８（１９９４）；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３７２，ｐ．８３（１９９５）；Ｃｌｉｎ，Ｏｒｔｈｏｐ．Ｖｏｌ．３１３，ｐ．７６（１９９５）；Ｊ  Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，Ｖｏｌ．１６，ｐ．１０７（１９９６）；Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，Ｖｏｌ．７５，ｐ．１０５（１９９７）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．５７，ｐ．１６２５（１９９７）；Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．９３，ｐ．７０５（１９９８）；Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．２，ｐ．７１５（１９９８）；Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７４，ｐ．９１１６（１９９９））、ステロイド系抗炎症薬（コルチコステロイド、鉱質コルチコイド、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレド、ベタメタゾンなど）、カルボキシアミドトリアゾール、コンブレタスタチンＡ−４、スクアラミン、６−Ｏ−クロロアセチル−カルボニル）−フマギロール、サリドマイド、アンギオスタチン、トロポニン−１、アンギオテンシンＩＩ拮抗薬（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら，Ｊ  Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１０５：１４１−１４５（１９８５）参照）、およびＶＥＧＦに対する抗体（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．９６３−９６８（１９９９年１０月）；Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２，８４１−８４４（１９９３）；ＷＯ００／４４７７７；およびＷＯ００／６１１８６参照）。
【０２４５】
また、血管新生をモジュレートまたは阻害する他の治療用薬剤も本発明の化合物と併用して使用され得、凝固系およびフィブリン溶解系をモジュレートまたは阻害する薬剤が挙げられる（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａ．Ｍｅｄ．３８：６７９−６９２（２０００）の概説を参照のこと）。本発明の化合物と併用して使用され得るかかる凝固経路およびフィブリン溶解経路をモジュレートまたは阻害する薬剤の例としては、限定されないが、ヘパリン（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８０：１０−２３（１９９８）参照）、低分子量ヘパリンおよびカルボキシペプチダーゼＵ阻害薬（活性トロンビン活性化性フィブリン溶解阻害薬［ＴＡＦＩａ］の阻害薬としても知られている）（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．１０１：３２９−３５４（２００１）参照）が挙げられる。ＴＡＦＩａ阻害薬は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０３／０１３，５２６および米国特許出願第６０／３４９，９２５号（２００２年１月１８日出願）に記載されている。
【０２４６】
本発明の化合物と併用して使用され得る細胞周期のチェックポイントに干渉する薬剤の例としては、限定されないが、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＣｈｋｌおよびＣｈｋ２キナーゼの阻害薬ならびにＣｄｋおよびｃｄｃキナーゼ阻害薬が挙げられ、特に、７−ヒドロキシスタウロスポリン、フラボピリドール、ＣＹＣ２０２（Ｃｙｃｌａｃｅｌ）およびＢＭＳ−３８７０３２が例示される。
【０２４７】
本発明の化合物と併用して使用され得る受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に干渉する薬剤の例としては、限定されないが、ｃ−Ｋｉｔ、Ｅｐｈ、ＰＤＧＦ、Ｆｌｔ３およびＨＢＶの阻害薬が挙げられる。さらなる薬剤としては、Ｂｕｍｅ−ＪｅｎｓｅｎおよびＨｕｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：３５５−３６５，２００１に記載のＲＴＫの阻害薬が挙げられる。
【０２４８】
本発明の化合物と併用して使用され得る細胞の増殖および生存のシグナル伝達経路の阻害薬の例としては、限定されないが、ＥＧＦＲの阻害薬（例えば、ゲフィチニブおよびエルロチニブ）、ＥＲＢ−２の阻害薬（例えば、トラスツズマブ）、ＩＧＦＲの阻害薬、サイトカイン受容体の阻害薬、ＨＢＶの阻害薬、ＰＩ３Ｋの阻害薬（例えば、ＬＹ２９４００２）、セリン／トレオニンキナーゼ（例えば限定されないが、ＷＯ０２／０８３０６４、ＷＯ０２／０８３１３９、ＷＯ０２／０８３１４０、ＵＳ２００４−０１１６４３２、ＷＯ０２／０８３１３８、ＵＳ２００４−０１０２３６０、ＷＯ０３／０８６４０４、ＷＯ０３／０８６２７９、ＷＯ０３／０８６３９４、ＷＯ０３／０８４４７３、ＷＯ０３／０８６４０３、ＷＯ２００４／０４１１６２、ＷＯ２００４／０９６１３１、ＷＯ２００４／０９６１２９、ＷＯ２００４／０９６１３５、ＷＯ２００４／０９６１３０、ＷＯ２００５／１００３５６、ＷＯ２００５／１００３４４などに記載のＡｋｔの阻害薬）、Ｒａｆキナーゼの阻害薬（例えば、ＢＡＹ−４３−９００６）、ＭＥＫの阻害薬（例えば、ＣＩ−１０４０およびＰＤ−０９８０５９）ならびにｍＴＯＲの阻害薬（例えば、Ｗｙｅｔｈ  ＣＣＩ−７７９）が挙げられる。かかる薬剤としては、小分子阻害薬化合物および抗体拮抗薬が挙げられる。
【０２４９】
本発明の化合物と併用して使用され得るアポトーシス誘導剤の例としては、限定されないが、ＴＮＦ受容体ファミリー構成員（例えば、ＴＲＡＩＬ受容体）の活性化薬が挙げられる。
【０２５０】
本発明の化合物と併用して使用され得る選択的ＣＯＸ−２阻害薬であるＮＳＡＩＤの例としては、限定されないが、米国特許５，４７４，９９５、米国特許５，８６１，４１９、米国特許６，００１，８４３、米国特許６，０２０，３４３、米国特許５，４０９，９４４、米国特許５，４３６，２６５、米国特許５，５３６，７５２、米国特許５，５５０，１４２、米国特許５，６０４，２６０、Ｕ．Ｓ．５，６９８，５８４、米国特許５，７１０，１４０、ＷＯ９４／１５９３２、米国特許５，３４４，９９１、米国特許５，１３４，１４２、米国特許５，３８０，７３８、米国特許５，３９３，７９０、米国特許５，４６６，８２３、米国特許５，６３３，２７２、および米国特許５，９３２，５９８号（これらはすべて、引用により本明細書に組み込まれる）に開示されたＮＳＡＩＤが挙げられる。
【０２５１】
本発明の化合物との併用に特に有用なＣＯＸ−２の阻害薬としては：３−フェニル−４−（４−（メチルスルホニル）フェニル）−２−（５Ｈ）−フラノン；および５−クロロ−３−（４−メチルスルホニル）−フェニル−２−（２−メチル−５−ピリジニル）ピリジン；またはその薬学的に許容され得る塩が挙げられる。
【０２５２】
ＣＯＸ−２の特異的阻害薬と報告されており、したがって本発明に有用である化合物としては、限定されないが：パレコキシブ、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）およびＢＥＸＴＲＡ（登録商標）またはその薬学的に許容され得る塩が挙げられる。
【０２５３】
本発明の化合物と併用して使用され得る血管新生阻害薬の例としては、限定されないが、エンドスタチン、ユークレイン（ｕｋｒａｉｎ）、ランピルナーゼ、ＩＭ８６２、５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）オキシラニル］−１−オキサスピロ［２，５］オクタ−６−イル（クロロアセチル）カルバメート、アセチルジナナリン、５−アミノ−１−［［３，５−ジクロロ−４−（４−クロロベンゾイル）−フェニル］メチル］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−カルボキサミド、ＣＭ１０１、スクアラミン、コンブレタスタチン、ＲＰＩ４６１０、ＮＸ３１８３８、硫酸化マンノペンタノースリン酸、７，７−（カルボニル−ビス［イミノ−Ｎ−メチル−４，２−ピロロカルボニルイミノ［Ｎ−メチル−４，２−ピロール］−カルボニルイミノ］−ビス−（１，３−ナフタレンジスルホネート）、および３−［（２，４−ジメチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１６）が挙げられる。
【０２５４】
本発明の化合物と併用して使用され得るチロシンキナーゼ阻害薬の例としては、限定されないが、Ｎ−（トリフルオロメチルフェニル）−５−メチルイソオキサゾル−４−カルボキサミド、３−［（２，４−ジメチルピロル−５−イル）メチリデニル）インドリン−２−オン、１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン、４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−［３−（４−モルホリニル）プロポキシル］キナゾリン、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミン、ＢＩＢＸ１３８２、２，３，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−１０−（ヒドロキシメチル）−１０−ヒドロキシ−９−メチル−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１−オン、ＳＨ２６８、ゲニステイン、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、ＣＥＰ２５６３、４−（３−クロロフェニルアミノ）−５，６−ジメチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンメタンスルホネート、４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、４−（４’−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、ＳＵ６６６８、ＳＴＩ５７１Ａ、Ｎ−４−クロロフェニル−４−（４−ピリジルメチル）−１−フタラジンアミン、およびＥＭＤ１２１９７４が挙げられる。
【０２５５】
抗がん化合物以外の化合物との併用も、本発明の組成物および方法に包含される。例えば、本発明の特許請求の範囲に記載の化合物とＰＰＡＲ−γ（すなわち、ＰＰＡＲ−ガンマ）作動薬およびＰＰＡＲ−δ（すなわち、ＰＰＡＲ−デルタ）作動薬との併用は、特定の悪性疾患の処置に有用である。ＰＰＡＲ−γおよびＰＰＡＲ−δは、核ペルオキシソーム増殖因子活性化型受容体γおよびδである。内皮細胞でのＰＰＡＲ−γの発現およびその血管新生における関与が文献に報告されている（Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３１：９０９−９１３（１９９８）；Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：９１１６−９１２１（１９９９）；Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４１：２３０９−２３１７（２０００）参照）。ごく最近、ＰＰＡＲ−γ作動薬は、インビトロでＶＥＧＦに対する血管新生応答を阻害することが示された；トログリタゾンおよびロシグリタゾンマレイン酸はどちらも、マウスにおいて、網膜の新血管形成の発達を抑止する（Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．１１９：７０９−７１７（２００１））。本発明の化合物と併用して使用され得るＰＰＡＲ−γ作動薬およびＰＰＡＲ−γ／α作動薬の例としては、限定されないが、チアゾリジンジオン（ＤＲＦ２７２５、ＣＳ−０１１、トログリタゾン、ロシグリタゾン、およびピオグリタゾンなど）、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、クロゲムフィブロジル、ＧＷ２５７０、ＳＢ２１９９９４、ＡＲ−Ｈ０３９２４２、ＪＴＴ−５０１、ＭＣＣ−５５５、ＧＷ２３３１、ＧＷ４０９５４４、ＮＮ２３４４、ＫＲＰ２９７、ＮＰ０１１０、ＤＲＦ４１５８、ＮＮ６２２、ＧＩ２６２５７０、ＰＮＵ１８２７１６、ＤＲＦ５５２９２６、２−［（５，７−ジプロピル−３−トリフルオロメチル−１，２−ベンゾイソオキサゾル−６−イル）オキシ］−２−メチルプロピオン酸（ＵＳＳＮ０９／７８２，８５６に開示）、ならびに２（Ｒ）−７−（３−（２−クロロ−４−（４−フルオロフェノキシ）フェノキシ）プロポキシ）−２−エチルクロマン−２−カルボン酸（ＵＳＳＮ６０／２３５，７０８および６０／２４４，６９７に開示）が挙げられる。
【０２５６】
本発明の別の実施形態は、がん処置のための遺伝子療法との併用での本開示の化合物の使用である。がんを処置するための遺伝子的ストラテジーの概説については、Ｈａｌｌら（Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６１：７８５−７８９（１９９７））およびＫｕｆｅら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第５版，ｐｐ  ８７６−８８９，ＢＣ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，２０００）を参照のこと。遺伝子療法は、任意の腫瘍抑制遺伝子を送達するために使用され得る。かかる遺伝子の例としては、限定されないが、ｐ５３（これは、組換えウイルス媒介性遺伝子導入によって送達され得る（例えば、米国特許第６，０６９，１３４号参照））、ｕＰＡ／ｕＰＡＲ拮抗薬（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｕＰＡ／ｕＰＡＲ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ，」Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｕｇｕｓｔ  ５（８）：１１０５−１３（１９９８））、およびインターフェロンγ（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：２１７−２２２（２０００））が挙げられる。
【０２５７】
また、本発明の化合物を、固有の多剤耐性（ＭＤＲ）の阻害薬、特に、輸送体タンパク質の高レベル発現と関連しているＭＤＲの阻害薬と併用して投与してもよい。かかるＭＤＲ阻害薬としては、ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の阻害薬、例えば、ＬＹ３３５９７９、ＸＲ９５７６、ＯＣ１４４−０９３、Ｒ１０１９２２、ＶＸ８５３およびＰＳＣ８３３（バルスポダール）が挙げられる。
【０２５８】
本発明の化合物を、単独または放射線療法との本発明の化合物の使用に起因するものであり得る悪心または嘔吐、例えば、急性、遅延型、後期および期待的嘔吐を処置するために、制吐剤と併せて使用してもよい。嘔吐の予防または処置のため、本発明の化合物を、他の制吐剤、特に、ニューロキニン−１受容体拮抗薬、５ＨＴ３受容体拮抗薬、例えば、オンダンセトロン、グラニセトロン、トロピセトロンおよびザチセトロン、ＧＡＢＡＢ受容体作動薬、例えば、バクロフェン、コルチコステロイド、例えば、デカドロン（デキサメタゾン）、ケナログ、アリストコート、ナサリド、プレフェリド（Ｐｒｅｆｅｒｉｄ）、ベネコルテン（Ｂｅｎｅｃｏｒｔｅｎ）またはその他のもの（米国特許第２，７８９，１１８号、同第２，９９０，４０１号、同第３，０４８，５８１号、同第３，１２６，３７５号、同第３，９２９，７６８号、同第３，９９６，３５９号、同第３，９２８，３２６号および同第３，７４９，７１２号に開示されたものなど）、抗ドパミン薬、例えば、フェノチアジン（例えば、プロクロルペラジン、フルフェナジン、チオリダジンおよびメソリダジン）、メトクロプラミドまたはドロナビノールと併せて使用してもよい。一実施形態では、ニューロキニン−１受容体拮抗薬、５ＨＴ３受容体拮抗薬およびコルチコステロイドから選択される抗嘔吐剤が、本発明の化合物の投与によるものであり得る嘔吐の処置または予防のための佐剤として投与される。
【０２５９】
本発明の化合物と併せるのに有用なニューロキニン−１受容体拮抗薬は、例えば、米国特許第５，１６２，３３９号、同第５，２３２，９２９号、同第５，２４２，９３０号、同第５，３７３，００３号、同第５，３８７，５９５号、同第５，４５９，２７０号、同第５，４９４，９２６号、同第５，４９６，８３３号、同第５，６３７，６９９号、同第５，７１９，１４７号；欧州特許公開公報番号ＥＰ  ０  ３６０  ３９０、０  ３９４  ９８９、０  ４２８  ４３４、０  ４２９  ３６６、０  ４３０  ７７１、０  ４３６  ３３４、０  ４４３  １３２、０  ４８２  ５３９、０  ４９８  ０６９、０  ４９９  ３１３、０  ５１２  ９０１、０  ５１２  ９０２、０  ５１４  ２７３、０  ５１４  ２７４、０  ５１４  ２７５、０  ５１４  ２７６、０  ５１５  ６８１、０  ５１７  ５８９、０  ５２０  ５５５、０  ５２２  ８０８、０  ５２８  ４９５、０  ５３２  ４５６、０  ５３３  ２８０、０  ５３６  ８１７、０  ５４５  ４７８、０  ５５８  １５６、０  ５７７  ３９４、０  ５８５  ９１３，０  ５９０  １５２、０  ５９９  ５３８、０  ６１０  ７９３、０  ６３４  ４０２、０  ６８６  ６２９、０  ６９３  ４８９、０  ６９４  ５３５、０  ６９９  ６５５、０  ６９９  ６７４、０  ７０７  ００６、０  ７０８  １０１、０  ７０９  ３７５、０  ７０９  ３７６、０  ７１４  ８９１、０  ７２３  ９５９、０  ７３３  ６３２および０  ７７６  ８９３；ＰＣＴ国際特許公開公報番号ＷＯ９０／０５５２５、９０／０５７２９、９１／０９８４４、９１／１８８９９、９２／０１６８８、９２／０６０７９、９２／１２１５１、９２／１５５８５、９２／１７４４９、９２／２０６６１、９２／２０６７６、９２／２１６７７、９２／２２５６９、９３／００３３０、９３／００３３１、９３／０１１５９、９３／０１１６５、９３／０１１６９、９３／０１１７０、９３／０６０９９、９３／０９１１６、９３／１００７３、９３／１４０８４、９３／１４１１３、９３／１８０２３、９３／１９０６４、９３／２１１５５、９３／２１１８１、９３／２３３８０、９３／２４４６５、９４／００４４０、９４／０１４０２、９４／０２４６１、９４／０２５９５、９４／０３４２９、９４／０３４４５、９４／０４４９４、９４／０４４９６、９４／０５６２５、９４／０７８４３、９４／０８９９７、９４／１０１６５、９４／１０１６７、９４／１０１６８、９４／１０１７０、９４／１１３６８、９４／１３６３９、９４／１３６６３、９４／１４７６７、９４／１５９０３、９４／１９３２０、９４／１９３２３、９４／２０５００、９４／２６７３５、９４／２６７４０、９４／２９３０９、９５／０２５９５、９５／０４０４０、９５／０４０４２、９５／０６６４５、９５／０７８８６、９５／０７９０８、９５／０８５４９、９５／１１８８０、９５／１４０１７、９５／１５３１１、９５／１６６７９、９５／１７３８２、９５／１８１２４、９５／１８１２９、９５／１９３４４、９５／２０５７５、９５／２１８１９、９５／２２５２５、９５／２３７９８、９５／２６３３８、９５／２８４１８、９５／３０６７４、９５／３０６８７、９５／３３７４４、９６／０５１８１、９６／０５１９３、９６／０５２０���、９６／０６０９４、９６／０７６４９、９６／１０５６２、９６／１６９３９、９６／１８６４３、９６／２０１９７、９６／２１６６１、９６／２９３０４、９６／２９３１７、９６／２９３２６、９６／２９３２８、９６／３１２１４、９６／３２３８５、９６／３７４８９、９７／０１５５３、９７／０１５５４、９７／０３０６６、９７／０８１４４、９７／１４６７１、９７／１７３６２、９７／１８２０６、９７／１９０８４、９７／１９９４２および９７／２１７０２；ならびに英国特許公開公報番号２  ２６６  ５２９、２  ２６８  ９３１、２  ２６９  １７０、２  ２６９  ５９０、２  ２７１  ７７４、２  ２９２  １４４、２  ２９３  １６８、２  ２９３  １６９、および２  ３０２  ６８９に充分に記載されている。かかる化合物の調製は、前述の特許および公開公報（引用により本明細書に組み込まれる）に充分に記載されている。
【０２６０】
一実施形態では、本発明の化合物と併せての使用のためのニューロキニン−１受容体拮抗薬は：２−（Ｒ）−（１−（Ｒ）−（３，５−ビス（トリフルオロメチル）−フェニル）エトキシ）−３−（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−４−（３−（５−オキソ−１Ｈ，４Ｈ−１，２，４−トリアゾロ）メチル）モルホリン、またはその薬学的に許容され得る塩（これは、米国特許第５，７１９，１４７号に記載されている）から選択される。
【０２６１】
また、本発明の化合物を、貧血の処置に有用な薬剤と投与してもよい。かかる貧血処置剤は、例えば、連続赤血球生成（ｅｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）受容体活性化薬（エポエチンアルファなど）である。
【０２６２】
また、本発明の化合物を、好中球減少症の処置に有用な薬剤と投与してもよい。かかる好中球減少症処置剤は、例えば、好中球の生成および機能を調節する造血系増殖因子、例えば、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。Ｇ−ＣＳＦの例としては、フィルグラスチムおよびＰＥＧ−フィルグラスチムが挙げられる。
【０２６３】
また、本発明の化合物を、免疫学的増強薬（レバミゾール、イソプリノシンおよびザダキシンなど）と投与してもよい。
【０２６４】
また、本発明の化合物は、他のｓｉＮＡ療法薬と併用する肝臓疾患またはがんの処置または予防にも有用であり得る。
【０２６５】
また、本発明の化合物を、γ−セクレターゼ阻害薬および／またはＮＯＴＣＨシグナル伝達の阻害薬と併用して投与してもよい。かかる阻害薬としては、ＷＯ０１／９００８４、ＷＯ０２／３０９１２、ＷＯ０１／７０６７７、ＷＯ０３／０１３５０６、ＷＯ０２／３６５５５、ＷＯ０３／０９３２５２、ＷＯ０３／０９３２６４、ＷＯ０３／０９３２５１、ＷＯ０３／０９３２５３、ＷＯ２００４／０３９８００、ＷＯ２００４／０３９３７０、ＷＯ２００５／０３０７３１、ＷＯ２００５／０１４５５３、ＵＳＳＮ１０／９５７，２５１、ＷＯ２００４／０８９９１１、ＷＯ０２／０８１４３５、ＷＯ０２／０８１４３３、ＷＯ０３／０１８５４３、ＷＯ２００４／０３１１３７、ＷＯ２００４／０３１１３９、ＷＯ２００４／０３１１３８、ＷＯ２００４／１０１５３８、ＷＯ２００４／１０１５３９およびＷＯ０２／４７６７１（例えば、ＬＹ−４５０１３９）に記載された化合物が挙げられる。
【０２６６】
また、本発明の化合物は、ＰＡＲＰ阻害薬と併用するがんの処置または予防にも有用であり得る。
【０２６７】
また、本発明の化合物は、以下の治療用薬剤：アバレリクス（Ｐｌｅｎａｘｉｓ  ｄｅｐｏｔ（登録商標））；アルデスロイキン（Ｐｒｏｋｉｎｅ（登録商標））；アルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））；アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））；アリトレチノイン（Ｐａｎｒｅｔｉｎ（登録商標））；アロプリノール（Ｚｙｌｏｐｒｉｍ（登録商標））；アルトレタミン（Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；アミホスチン（Ｅｔｈｙｏｌ（登録商標））；アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））；三酸化ヒ素（Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（登録商標））；アスパラギナーゼ（Ｅｌｓｐａｒ（登録商標））；アザシチジン（Ｖｉｄａｚａ（登録商標））；塩酸ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））；ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｕｚｉｍａｂ）（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））；ベキサロテンカプセル剤（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（登録商標））；ベキサロテンゲル剤（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（登録商標））；ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））；ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））；ブレフェルディンＡ；静脈内ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））；経口ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））；カルステロン（Ｍｅｔｈｏｓａｒｂ（登録商標））；カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））；カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））；カルムスチン（ＢＣＮＵ（登録商標）、ＢｉＣＮＵ（登録商標））；カルムスチン（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））；カルムスチンとＰｏｌｉｆｅｐｒｏｓａｎ  ２０  Ｉｍｐｌａｎｔ（Ｇｌｉａｄｅｌ  Ｗａｆｅｒ（登録商標））；セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標））；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））；クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））；シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））；クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標）、２−ＣｄＡ（登録商標））；クロファラビン（Ｃｌｏｌａｒ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ  Ｔａｂｌｅｔ（登録商標））；シタラビン（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））；リポソームシタラビン（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））；デカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））；ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ（Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標））；ダルテパリンナトリウム注射剤（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））；ダルベポエチンα（Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標））；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標））；リポソームダウノルビシン（ＤａｎｕｏＸｏｍｅ（登録商標））；ダウノルビシン、ダウノマイシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ（登録商標））；ダウノルビシン、ダウノマイシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））；デガレリクス（Ｆｉｒｍａｇｏｎ（登録商標））；デニロイキンジフチトクス（Ｏｎｔａｋ（登録商標））；デクスラゾキサン（Ｚｉｎｅｃａｒｄ（登録商標））；塩酸デクスラゾキサン（Ｔｏｔｅｃｔ（登録商標））；ジデムニンＢ；１７−ＤＭＡＧ；ドセタキセル（Ｔａ���ｏｔｅｒｅ（登録商標））；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  ＰＦＳ（登録商標））；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  ＰＦＳ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（登録商標））；リポソームドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））；プロピオン酸ドロモスタノロン（Ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ（登録商標））；プロピオン酸ドロモスタノロン（Ｍａｓｔｅｒｏｎｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（登録商標））；エクリズマブ注射剤（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標））；エリオットＢ液（Ｅｌｌｉｏｔｔ’ｓ  Ｂ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標））；エルトロンボパグ（Ｐｒｏｍａｃｔａ（登録商標））；エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標））；エポエチンα（ｅｐｏｇｅｎ（登録商標））；エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ（登録商標））；エチニルエストラジオール；エトポシドリン酸（Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標））；エトポシド、ＶＰ−１６（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））；エベロリムス錠剤（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標））；エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））；フェルモキシトール（Ｆｅｒａｈｅｍｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（登録商標））；Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））；フロクスウリジン（動脈内）（ＦＵＤＲ（登録商標））；フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））；フルオロウラシル、５−ＦＵ（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標））；フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標））；ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））；ゲムツヅマブオゾガミシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））；酢酸ゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ  Ｉｍｐｌａｎｔ（登録商標））；酢酸ゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標））；酢酸ヒストレリン（Ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ  ｉｍｐｌａｎｔ（登録商標））；ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））；イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））；イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））；イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））；メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））；インターフェロンα２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ  Ａ（登録商標））；インターフェロンα−２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（登録商標））；イオベングアンＩ  １２３注射剤（ＡｄｒｅＶｉｅｗ（登録商標））；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））；イキサベピロン（Ｉｘｅｍｐｒａ（登録商標））；ラパチニブ錠剤（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；レナリドミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））；レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（登録商標））；ロイコボリン（Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ（登録商標）、Ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ（登録商標））；酢酸ロイプロリド（Ｅｌｉｇａｒｄ（登録商標））；レバミゾール（Ｅｒｇａｍｉｓｏ１（登録商標））；ロムスチン、ＣＣＮＵ（ＣｅｅＢＵ（登録商標））；メクロレタミン、ナイトロジェンマスタード（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））；酢酸メゲストロール（Ｍｅｇａｃｅ（登録商標））；メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ（Ａｌｋｅｒａｎ（登録���標））；メルカプトプリン、６−ＭＰ（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））；メンサ（Ｍｅｓｎｅｘ（登録商標））；メンサ（Ｍｅｓｎｅｘ  ｔａｂｓ（登録商標））；メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（登録商標））；メトキサレン（Ｕｖａｄｅｘ（登録商標））；８−メトキシソラレン；ミトマイシンＣ（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））；ミトタン（Ｌｙｓｏｄｒｅｎ（登録商標））；ミトザントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））；ミトラマイシン；ナンドロロンフェンプロピオナート（Ｄｕｒａｂｏｌｉｎ−５０（登録商標））；ネララビン（Ａｒｒａｎｏｎ（登録商標））；ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ（登録商標））；ノフェツモマブ（Ｖｅｒｌｕｍａ（登録商標））；オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標））；オプレルベキン（Ｎｅｕｍｅｇａ（登録商標））；オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））；パクリタキセル（Ｐａｘｅｎｅ（登録商標））；パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））；パクリタキセルタンパク質結合粒子（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））；パリフェルミン（Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ（登録商標））；パミドロネート（Ａｒｅｄｉａ（登録商標））；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））；パゾパニブ錠剤（Ｖｏｔｒｉｅｎｔｔｍ（登録商標））；ペガデマーゼ（Ａｄａｇｅｎ（Ｐｅｇａｄｅｍａｓｅ  Ｂｏｖｉｎｅ）（登録商標））；ペガスパルガーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標））；ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））；ペメトレキセド二ナトリウム（Ａｌｉｍｔａ（登録商標））；ペントスタチン（Ｎｉｐｅｎｔ（登録商標））；ピポブロマン（Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標））；プレリキサホル（Ｍｏｚｏｂｉｌ（登録商標））；プリカマイシン、ミトラマイシン（Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ（登録商標））；ポルフィマールナトリウム（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標））；プララトレキサート注射剤（Ｆｏｌｏｔｙｎ（登録商標））；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標））；キナクリン（Ａｔａｂｒｉｎｅ（登録商標））；ラパマイシン；ラスブリカーゼ（Ｅｌｉｔｅｋ（登録商標））；塩酸ラロキシフェン（Ｅｖｉｓｔａ（登録商標））；リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））；ロミデプシン（Ｉｓｔｏｄａｘ（登録商標））；ロミプロスチム（Ｎｐｌａｔｅ（登録商標））；サルグラモスチム（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））；サルグラモスチム（Ｐｒｏｋｉｎｅ（登録商標））；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））；ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））；マレイン酸スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））；タルク（Ｓｃｌｅｒｏｓｏｌ（登録商標））；タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標））；テムシロシムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標））；テニポシド、ＶＭ−２６（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））；テストラクトン（Ｔｅｓｌａｃ（登録商標））；チオグアニン、６−ＴＧ（Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ（登録商標））；チオプリン；チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））；トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ（登録商標））；トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ（登録商標））；トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））；トシツモマブ／Ｉ−１３１トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））；トランス−レチノイン酸；トラスツヅマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；トレチノイン、ＡＴＲＡ（Ｖｅｓａｎｏｉｄ（登録商標））；トリエチレンメラミン；ウラシルマスタード（Ｕｒａｃｉｌ  Ｍｕｓｔａｒｄ  Ｃａｐｓｕｌｅｓ（登録商標））；バルルビシン（Ｖａｌｓｔａｒ（登録商標））；ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））；ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））；ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））；ボリノスタット（Ｚｏｌｉｎｚａ（登録商標））；ウォルトマニン；およびゾレドロネート（Ｚｏｍｅｔａ（登録商標））と併用するがんの処置にも有用であり得る。
【０２６８】
上記の併用は、医薬製剤の形態での使用のために簡便に提示され得、したがって、上記の併用を薬学的に許容され得る希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物は、本発明のさらなる態様を表す。
【０２６９】
かかる併用の個々の化合物は、逐次または同時のいずれかで、別々の医薬製剤または併合医薬製剤にて投与され得る。一実施形態において、該個々の化合物は併合医薬製剤にて同時投与される。
【０２７０】
したがって、記載の分子は、当該技術分野で知られた他のＨＢＶ阻害薬などの、被検体または生物体において本明細書に記載の疾患、障害、病状および形質を予防または処置するための１種類以上の既知の化合物、処置薬または手順と併用して使用され得る。
【０２７１】
３．治療適用用途
現在のＨＢＶの研究における一連の知見により、治療的使用のためのＨＢＶ発現が調節され得る方法の必要性が示されている。
【０２７２】
したがって、本発明の一態様は、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ遺伝子発現の作用によって媒介される病状に苦しんでいる被検体（例えば限定されないが、ヒト）の処置方法であって、前記被検体に有効量の本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子を投与することを含む方法を含む。この態様の一実施形態では、該ｓｉＮＡ分子は、配列番号：１、配列番号：４５２、配列番号：２、配列番号：４５３、配列番号：３、配列番号：４５４、配列番号：４もしくは配列番号：４５５の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列；または式（Ａ）を含むものである。
【０２７３】
この態様の一部の実施形態において、該病状はがんである。したがって、一部の特定の実施形態では、本発明の分子および組成物は、がんの処置方法、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）の処置方法に有用である。
【０２７４】
一部の実施形態では、該病状は肝臓疾患である。したがって、一部の特定の実施形態では、本発明の分子および組成物は、肝臓疾患の処置方法、特に肝硬変の処置方法に有用である。
【０２７５】
一部の特定の実施形態において、該ｓｉＮＡ分子の投与は局所投与または全身投与によるものである。他の実施形態において、本発明は、被検体または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と、該当する組織または細胞（肺の細胞および組織など）に対する局所投与によって、例えば、肺経由送達によって接触させることを特色とする。また他の実施形態では、本発明は、被検体または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と、該被検体または生物体の該当する組織または細胞（肝臓またはがん性の組織もしくは細胞）への全身投与によって（該ｓｉＮＡの静脈内または皮下投与などによって）接触させることを特色とする。
【０２７６】
また、本発明のｓｉＮＡ分子は、エキソビボ適用における試薬としても使用される。例えば、該ｓｉＮＡ試薬は、治療効果のために被検体に移植される組織または細胞内に導入される。該細胞および／または組織は、後でその外植片を受容する生物体または被検体に由来するものであってもよく、移植前の別の生物体または被検体に由来するものであってもよい。該ｓｉＮＡ分子は、細胞または組織内の１つ以上の遺伝子の発現を、該細胞または組織がインビボで移植されたら所望の表現型が得られるように、または機能が発揮されるようにモジュレートするために使用され得る。一実施形態では、患者由来の特定のＨＢＶ標的細胞を抽出する。抽出したこの細胞を、該細胞内の特定のヌクレオチド配列を標的化するＨＢＶ  ｓｉＮＡと、該細胞による該ｓｉＮＡの取込みに適した条件下で接触させる（例えば、カチオン性脂質、リポソームなどの送達試薬を使用するか、または細胞内へのｓｉＮＡの送達を助長するエレクトロポレーションなどの手法を使用する）。次いで、該細胞を同じ患者または他の患者に再導入して戻す。
【０２７７】
治療適用用途では、医薬有効用量の本発明のｓｉＮＡ分子または医薬組成物が被検体に投与される。医薬有効用量は、疾患状態を予防する、その発生を抑止する、または疾患状態を処置する（症状をある程度、好ましくはあらゆる症状を緩和する）ために必要とされる用量である。当業者は、被検体の体格および体重、疾患の進行または浸透の程度、被検体の年齢、健康状態および性別、投与経路ならびに投与が局所であるか全身性であるかなどの要素を考慮することにより、所与の被検体に投与される本発明のｓｉＮＡの治療有効用量を容易に決定することができよう。一般的に、負電荷ポリマーの効力に応じて０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の量の活性成分が投与される。最適な投与スケジュールは、患者の体内の薬物蓄積の測定値から計算され得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、単回用量で投与してもよく、反復用量で投与してもよい。
【０２７８】
本発明のｓｉＮＡ分子は、１ヶ月に１回、週に１回、１日１回（ＱＤ）投与してもよく、１ヶ月、１週間または１日の間に多数回（例えば限定されないが、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）、２週間に１回など）の用量に分けてもよい。当業者は、投与の反復率を、測定された滞留時間および体液または組織中の薬物の濃度に基づいて容易に推定することができよう。
【０２７９】
また、投与は連続的であってもよく（すなわち、毎日）、断続的であってもよい。例えば、本発明の化合物の断続的投与は、１週間に１〜６日の投与であってもよく、サイクルでの投与を意味するものであってもよく（例えば、連続２〜８週間の毎日の投与、次いで最大１週間の投与なしの休薬期間）、隔日での投与を意味するものであってもよい。
【０２８０】
Ｇ．投与
該組成物または製剤は、さまざまな様式で投与され得る。本発明の投与方法の非限定的な例としては、経口、口腔内、舌下、非経口（すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、もしくは筋肉内）、局所経直腸投与または他の局所投与が挙げられる。一実施形態において、本発明の組成物は、吹送および吸入によって投与され得る。該投与は、単回用量で行なっても分割用量で行なってもよい。一部の実施形態において、医薬組成物は、ボーラス注射によって静脈内または腹腔内投与される（例えば、米国特許第５，２８６，６３４号を参照のこと）。脂質核酸粒子は、疾患部位への直接注射によって投与してもよく、疾患部位から遠位の部位への注射によって投与してもよい（例えば、Ｃｕｌｖｅｒ，ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ＭａｒｙＡｎｎ  Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０−７１（１９９４）を参照のこと）。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、本明細書に記載した、および当該技術分野で一般的に知られた細胞、被検体または生物体に投与される。
【０２８１】
１．インビボ投与
本発明の任意の処置方法において、該ｓｉＮＡは被検体に、本明細書に記載のようにして、あるいは当該技術分野で知られているようにして、単独療法剤として単独で、または本明細書に記載した、もしくは当該技術分野で知られたさらなる治療薬との併用でのいずれかで、全身投与され得る。全身投与としては、例えば、当該技術分野で一般的に知られた肺経由（吸入、噴霧化など）、静脈内、皮下、筋肉内、カテーテル法、鼻咽頭経由、経皮、または経口／胃腸投与が挙げられ得る。
【０２８２】
本発明の任意の処置方法または予防方法において、該ｓｉＮＡは被検体に対し、本明細書に記載のようにして、あるいは、当該技術分野で知られているようにして、単独療法剤として単独で、または当該技術分野で知られたさらなる治療薬との併用でのいずれかで、局所投与または局所組織に投与され得る。局所投与としては、例えば、当該技術分野で一般的に知られた吸入、噴霧化、カテーテル法、埋入、直接注射、経真皮／経皮適用、貼付剤、ステント挿入、点耳剤／点眼剤、または該当組織への門脈投与、または任意の他の局所投与手法、方法もしくは処置が挙げられ得る。
【０２８３】
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、肝臓に、当該技術分野で一般的に知られているようにして投与される（例えば、Ｗｅｎら，２００４，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１０，２４４−９；Ｍｕｒａｏら，２００２，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．，１９，１８０８−１４；Ｌｉｕら，２００３，ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１０，１８０−７；Ｈｏｎｇら，２００３，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５４，５１−８；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，２００４，Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．，１４９，１６１１−７；およびＭａｔｓｕｎｏら，２００３，ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１０，１５５９−６６を参照のこと）。
【０２８４】
一実施形態において、本発明は、単球およびリンパ球などの造血系細胞への本発明のｓｉＮＡ分子の送達方法の使用を特色とする。このような方法は、Ｈａｒｔｍａｎｎら，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８５（２），９２０−９２８；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ，９１（３），８５２−８６２；ＦｉｌｉｏｎおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１３２９（２），３４５−３５６；ＭａおよびＷｅｉ，１９９６，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２０（１１／１２），９２５−９３０；ならびにＢｏｎｇａｒｔｚら，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２），４６８１−８に詳細に記載されている。
【０２８５】
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、真皮または小胞に、直接または経表面的（例えば、局所的）に、当該技術分野で一般的に知られているようにして投与される（例えば、Ｂｒａｎｄ，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３，２４４−８；Ｒｅｇｎｉｅｒら，１９９８，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，５，２７５−８９；Ｋａｎｉｋｋａｎｎａｎ，２００２，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，１６，３３９−４７；Ｗｒａｉｇｈｔら，２００１，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，９０，８９−１０４；ならびにＰｒｅａｔおよびＤｕｊａｒｄｉｎ，２００１，ＳＴＰ  ＰｈａｒｍａＳｃｉｅｎｃｅｓ，１１，５７−６８を参照のこと）。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、直接または経表面的に、アルコール（例えば、エタノールまたはイソプロパノール）、水を含み、さらなる薬剤（ミリスチン酸イソプロピルおよびカルボマー９８０など（ｓｕｃｈ））を含んでいてもよい水性アルコールゲル製剤を用いて投与される。他の実施形態では、該ｓｉＮＡは、鼻腔に経表面投与するために製剤化される。経表面用調製物は、罹患領域に１日１回以上の適用によって投与され得る；皮膚領域全体の閉鎖包帯が好都合に使用され得る。連続または長期送達は、接着性レザーバ系によって行なわれ得る。
【０２８６】
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はイオン導入的に、例えば、特定の器官または区画（例えば、目、眼底、心臓、肝臓、腎臓、膀胱、前立腺、腫瘍、ＣＮＳなど）に投与される。イオン導入的送達の非限定的な例は、例えば、ＷＯ０３／０４３６８９およびＷＯ０３／０３０９８９（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２８７】
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、肺に、本明細書に記載のようにして、および当該技術分野で一般的に知られているようにして投与される。別の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、肺の組織および細胞に、米国特許出願公開公報第２００６／００６２７５８号；同第２００６／００１４２８９号；および同第２００４／００７７５４０号に記載のようにして投与される。
【０２８８】
２．エアロゾル剤および送達デバイス
ａ．エアロゾル製剤
本発明の組成物は、単独、または他の適当な成分との併用でのいずれかで、エアロゾル製剤に作製され（すなわち、「霧状にされ」得）、吸入によって（例えば、鼻腔内または気管内）投与され得る（Ｂｒｉｇｈａｍら，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８（１９８９）参照）。エアロゾル製剤は、許容され得る加圧された噴射剤中（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）に収容され得る。
【０２８９】
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤は肺経由送達によって、例えば、吸入デバイスまたはネブライザによって投与されるエアロゾル製剤または噴霧乾燥製剤の吸入によって投与され、該当する肺系組織内への該核酸分子の速やかな局所取込みをもたらす。微粉化核酸組成物の呼吸用乾燥粒子を含む固形微粒状組成物は、乾燥または凍結乾燥させた核酸組成物を磨砕し、次いで、この微粉化組成物を、例えば４００メッシュスクリーンに通して大型凝集塊を分解または解離させることにより調製され得る。本発明のｓｉＮＡ組成物を含む固形微粒状組成物に、エアロゾルの形成を助長する機能を果たす分散化剤ならびに他の治療用化合物を含めてもよい。好適な分散化剤はラクトースであり、これは、該核酸化合物と任意の適当な比率（例えば、重量基準で１対１の比）でブレンドされ得る。
【０２９０】
本発明のｓｉＮＡ分子または組成物を含むスプレー剤組成物は、例えば、加圧パック（定量吸入器など）から適当な液化噴射剤の使用を伴って送達される水性の液剤もしくは懸濁剤として、またはエアロゾル剤として製剤化され得る。一実施形態において、吸入に適した本発明のエアロゾル剤組成物は懸濁剤または液剤のいずれかであり得、一般的には、配列番号：１、配列番号：４５２、配列番号：２、配列番号：４５３、配列番号：３、配列番号：４５４、配列番号：４、もしくは配列番号：４５５の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列；または式（Ａ）を含むｓｉＮＡ分子と、適当な噴射剤（例えば、フルオロカーボンまたは水素含有クロロフルオロカーボンまたはその混合物、特に、ヒドロフルオロアルカン、特に、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパン、またはその混合物）を含むものである。エアロゾル剤組成物には、界面活性剤などの、当該技術分野でよく知られたさらなる製剤用賦形剤を含めてもよい。非限定的な例としては、オレイン酸、レシチンまたはオリゴ乳酸またはその誘導体（Ｗ０９４／２１２２９およびＷ０９８／３４５９６に記載のものなど）ならびに共溶媒（例えば、エタノール）が挙げられる。一実施形態において、本発明の医薬エアロゾル製剤は、本発明の化合物と、噴射剤としてフルオロカーボンまたは水素含有クロロフルオロカーボンまたはその混合物（界面活性剤および／または共溶媒と組み合わせてもよい）とを含むものである。
【０２９１】
本発明のエアロゾル製剤は、適当な緩衝剤の添加によって緩衝されたものであってもよい。
【０２９２】
エアロゾル製剤には、製剤が滅菌状態に調製されていない場合、保存料などの添加剤を含めてもよい。非限定的な例としては、安息香酸メチルヒドロキシ、酸化防止剤、フレーバー、揮発油、緩衝剤および乳化剤および他の製剤用界面活性剤が挙げられる。一実施形態では、分解を低減させるため、およびより安全な生体適合性の本発明の非液状微粒状懸濁剤組成物（例えば、ｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を提供するため、フルオロカーボンまたはパーフルオロカーボン担体が使用される。別の実施形態では、ネブライザを構成するデバイスにより、含フッ素化学物質（これは静菌性であり、それにより適合性のデバイス内での微生物の増殖の可能性を減少させる）を含む本発明の組成物（例えば、ｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を送達する。
【０２９３】
吸入器または吹送器における使用のための本発明の組成物を含むカプセル剤およびカートリッジ剤は、例えばゼラチン製であり、本発明の化合物と適当な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）の吸入用粉末ミックスを含むように製剤化され得る。一実施形態において、各カプセル剤またはカートリッジ剤は、配列番号：１、配列番号：４５２、配列番号：２、配列番号：４５３、配列番号：３、配列番号：４５４、配列番号：４、もしくは配列番号：４５５の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列；または式（Ａ）を含むｓｉＮＡ分子と、１種類以上の賦形剤とを含む。別の実施形態では、本発明の化合物は、ラクトースなどの賦形剤なしで提示され得る。
【０２９４】
本発明のエアロゾル剤組成物は、呼吸器系内に、呼吸用サイズの粒子（例えば、吸入すると鼻、口および喉頭を通過するのに充分小さいサイズの粒子）を含む製剤として、肺の気管支および肺胞を介して投与され得る。一般に、呼吸用粒子は、サイズが約０．５〜１０ミクロンの範囲である。一実施形態において、該微粒状範囲は１〜５ミクロンであり得る。別の実施形態では、微粒状範囲は２〜３ミクロンであり得る。エアロゾル剤中に含まれた呼吸用でないサイズの粒子は、喉に堆積されて嚥下される傾向にあり、したがって、エアロゾル剤中の呼吸用でない粒子の量は最小限になる。経鼻投与では、鼻腔内での保持を確実にするため、１０〜５００ｕｍの範囲の粒径が好ましい。
【０２９５】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ組成物は、鼻に、例えば鼻炎の処置のために加圧エアロゾル製剤、水性製剤によって経表面投与され、加圧ポンプまたは噴霧化によって鼻に投与される。好適な製剤は、この目的のための希釈剤または担体として水を含むものである。一部の特定の実施形態では、肺または鼻への本発明の組成物の投与のための水性製剤は、例えば、緩衝剤、張度改良剤などの慣用的な賦形剤を用いて提供され得る。
【０２９６】
ｂ．デバイス
本発明のｓｉＮＡ分子は、上記に論考したような粒子および／またはエアロゾル剤として製剤化および送達され得、当業者に知られた種々のエアロゾル化デバイスから施薬され得る。
【０２９７】
本発明のｓｉＮＡ分子または製剤を含む液状または非液状粒子のエアロゾル剤は、任意の適当な手段によって、例えば、ネブライザ（例えば、米国特許４，５０１，７２９を参照のこと）（超音波式または空気ジェット式ネブライザなど）を構成するデバイスを用いて作製され得る。
【０２９８】
本発明のｓｉＮＡ分子または製剤と界面活性剤とを含む固形粒子エアロゾル剤は、任意の固形微粒状エアロゾル発生器を用いて作製され得る。本発明のｓｉＮＡ分子に使用される固形粒子エアロゾル発生器の型の一例は吹送器である。実例としてのエアロゾル発生器の第２の型は、定量吸入器（「ＭＤＩ」）を構成しているものである。本明細書において教示する該ｓｉＮＡ分子または製剤を内包するＭＤＩは、当該技術水準の方法によって調製され得る（例えば、Ｂｙｒｏｎ（上記）およびＷＯ９６／３２０９９参照）。
【０２９９】
また、該ｓｉＮＡ分子を、流動体ディスペンサー（ＷＯ０５／０４４３５４に説明および図解されているものなど）からの送達のための流動体製剤として製剤化してもよい。
【０３００】
本発明の一部の特定の実施形態では、意識があり自発呼吸する被検体および調節呼吸下のあらゆる年齢の被検体に対する適用において、ネブライザデバイスが使用される。ネブライザデバイスは、肺への経表面および全身性のターゲテッド薬物送達のために使用され得る。一実施形態において、ネブライザを構成するデバイスは、本発明のｓｉＮＡ分子または製剤を肺または肺系組織に局所送達するために使用される。別の実施形態では、ネブライザを構成するデバイは、本発明のｓｉＮＡ分子または製剤を全身送達するために使用される。
Ｈ．本発明のｓｉＮＡ分子の他の適用／使用
本発明のｓｉＮＡ分子はまた、診断適用、研究適用および／または医薬（ｍｅｄｉｃａｎｔ）の製造のためにも使用され得る。
【０３０１】
一態様において、本発明は、被検体の疾患、形質または病状の診断方法であって、被検体に本発明の組成物を、該被検体の該疾患、形質または病状の診断に適した条件下で投与することを含む方法を特色とする。
【０３０２】
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、被検体または生物体の形質、疾患または病状と関連しているハプロタイプ多型によって生じるＨＢＶタンパク質の発現を下方調節または阻害するために使用される。ＨＢＶ遺伝子またはＨＢＶタンパク質もしくはＲＮＡレベルの解析は、かかる多型を有する被検体、または本明細書に記載の形質、病状もしくは疾患が発生するリスクのある被検体を特定するために使用され得る。このような被検体は、処置に対して、例えば、本発明のｓｉＮＡ分子および標的遺伝子発現に関連する疾患の処置に有用な任意の他の組成物での処置に対して寛容である。そのため、ＨＢＶのタンパク質またはＲＮＡレベルの解析を用いて、被検体の処置における処置の型および治療過程が決定され得る。ＨＢＶのタンパク質（例えば、Ｂ型肝炎のコア抗原、もしくはＨｂｃＡｇ）、ＨＢＶ表面抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ）またはＲＮＡレベルのモニタリングは、処置の転帰を予測するため、ならびに形質、障害、病状または疾患と関連している特定のＨＢＶタンパク質のレベルおよび／または活性をモジュレートする化合物および組成物の有効性を判定するために使用され得る。
【０３０３】
別の実施形態では、本発明は、医薬の製造における使用のための本発明による二本鎖核酸の使用を含む。一実施形態において、医薬は、ＨＢＶ感染またはＨＢＶの作用によって媒介される病状の処置における使用のためのものである。一実施形態では、医薬はＨＢＶ感染の処置における使用のためのものである。一部の実施形態では、医薬は、がんの処置における使用のためのものである。特別な一実施形態では、本発明の化合物は肝細胞癌の処置に有用である。一実施形態において、医薬は肝臓疾患の処置における使用のためのものである。特別な一実施形態では、本発明の化合物は肝硬変の処置に有用である。
【０３０４】
一部の特定の実施形態において、少なくとも一方の鎖が配列番号：１、配列番号：４５２、配列番号：２、配列番号：４５３、配列番号：３、配列番号：４５４、配列番号：４もしくは配列番号：４５５の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列；または式（Ａ）を含むものであるｓｉＮＡは、ＨＢＶ感染の処置方法における使用のためのものである。
【０３０５】
一部の特定の実施形態において、少なくとも一方の鎖が配列番号：１、配列番号：４５２、配列番号：２、配列番号：４５３、配列番号：３、配列番号：４５４、配列番号：４もしくは配列番号：４５５の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列；または式（Ａ）を含むものであるｓｉＮＡは、がんの処置方法における使用のためのものである。
【０３０６】
一部の特定の実施形態において、少なくとも一方の鎖が配列番号：１、配列番号：４５２、配列番号：２、配列番号：４５３、配列番号：３、配列番号：４５４、配列番号：４もしくは配列番号：４５５の少なくとも１５個のヌクレオチドの配列；または式（Ａ）を含むものであるｓｉＮＡは、肝臓疾患の処置方法における使用のためのものである。
Ｉ．実施例
次に、本発明を、以下の非限定的な例とともに説明する。当業者には、本質的に同じ結果が得られるように変更または修正され得るさまざまなノンクリティカルパラメータが容易に認識されよう。
【実施例１】
【０３０７】
ＨＢＶに対するｓｉＮＡ活性体の設計、合成および同定
ＨＢＶ  ｓｉＮＡの合成
一連のｓｉＮＡ分子を設計し、合成し、ＨＢＶ遺伝子発現に対する有効性について評価した。ＨＢＶ配列は、可能な１９種類すべてのヌクレオチド配列をＨＢＶゲノム血清型ａｄｗ２（受託番号Ｘ０２７６３）から選択し、次いで、これらの配列を表７に示した２２種類の他のＨＢＶサブタイプのゲノム配列と比較することにより設計して選択した。２２種類すべてのゲノムと完璧なマッチを有するか、または２２種類のゲノムのうち２１種類に完璧なマッチと残りのゲノムに対して１つまたは２つのミスマッチを有する１９種類のヌクレオチド配列を保留した。これらの配列を標準的なフィルタリング（例えば、ヒトゲノムに対するオフターゲット、同じ塩基の連続（ｒｕｎ）、ヒトｍｉＲＮＡシード配列とのマッチ）に供した（配列設計方法および標準的なフィルタリングについては、米国特許出願第６０／１８２，６０５号も参照のこと）。残りの候補は、プロプライエタリサイレンシング予測スコアによって分類し、特定の配列を選択した。
【０３０８】
ヒトｓｉＮＡのＨＢＶ配列の設計のための主な基準は、（ｉ）多種類のＨＢＶ遺伝子型間および血清型間の相同性ならびに（ｉｉ）プロプライエタリアルゴリズムで測定したときの高い有効性スコアとした。選択したｓｉＮＡの標的配列を表１ａに示す（標的配列）。表１ａの標的配列に対応するｓｉＮＡ配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を表１ｂに示す。合成した種々の化学修飾ｓｉＮＡを表１ｃに示す。
【０３０９】
【表１】
2013537423.tif 000005
2013537423.tif 000006
2013537423.tif 000007
【０３１０】
【表２】
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標的配列の各オリゴヌクレオチドについて、ｓｉＮＡの２つの個々の相補鎖を、固相合成を用いて別々に合成し、次いで、逆相固相抽出（ＳＰＥ）によって別々に精製した。相補鎖をアニーリングさせて二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ／ｄｕｐｌｅｘ）を形成し、所望の濃度で選択したバッファーにて送達した。
【０３１１】
簡単には、一本鎖オリゴヌクレオチドを自動固相合成装置で、当該技術分野で一般的に知られた手順でホスホルアミダイト化学反応を用いて合成した（例えば、米国特許出願第１２／０６４，０１４号を参照のこと）。合成用カラムには、第１ヌクレオシド残基（天然または化学修飾体）を用いて誘導体化した固相支持体を充填した。合成は、酸不安定性５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基の脱トリチル化によって５’−ヒドロキシルを放出させることにより開始した。好適に保護したホスホルアミダイトと適当な活性化剤（アセトニトリル中）を、合成用カラムに同時に送達すると、５’−ヒドロキシルへのアミダイトのカップリングがもたらされた。次いで、カラムを溶媒（アセトニトリルなど）で洗浄した。酸化性溶液（ヨウ素溶液など）をカラム中にポンプ輸送し、亜リン酸トリエステル結合Ｐ（ＩＩＩ）をそのホスホトリエステルＰ（Ｖ）類似体に酸化させた。未反応の５’−ヒドロキシル基を、２，６−ルチジンおよびＮ−メチルイミダゾールの存在下、無水酢酸などの試薬を用いてキャップした。次のホスホルアミダイトの組込みのため、脱トリチル化工程により伸長サイクルを再開させた。このプロセスを、所望の配列が合成されるまで繰り返した。合成は、最後の５’末端保護基（トリチルまたは５’−Ｏ−ジメトキシトリチル）を用いて終結させた。
【０３１２】
合成が終了したら、固相支持体と結合オリゴヌクレオチドをアルゴン圧下または真空下で乾燥させた。水性塩基を添加し、スクシニル結合の切断が行なわれるまで混合物を加熱し、リン酸シアノエチル保護基を除去し、環外アミン保護の脱保護を行なった。
【０３１３】
以下のプロセスを、リボヌクレオチドを含まない１種類の鎖において行なった。固相支持体を水性塩基で処理した後、混合物を濾過し、固相支持体を、脱保護された粗製合成物質から分離した。次いで、固相支持体を水ですすぎ洗浄し、これを濾液と合わせた。塩基性溶液が得られることにより、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基が保持され、５’末端の位置に残存することが可能になる（トリチル−オン）。
【０３１４】
リボヌクレオチドを含む１種類の鎖には、以下のプロセスを行なった。固相支持体を水性塩基で処理した後、混合物を濾過し、固相支持体を脱保護された粗製合成物質から分離した。次いで、固相支持体をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ですすぎ洗浄し、これを濾液と合わせた。この混合物に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩などのフッ化物試薬を添加し、溶液を加熱した。反応液を適当なバッファーでクエンチし、最後の５’末端位置に５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基を有する粗製の１種類の鎖の溶液を得た。
【０３１５】
粗製の１種類の鎖の各々のトリチル−オン溶液を、クロマトグラフィー精製（ＳＰＥ  ＲＰＣ精製など）を用いて精製した。トリチル基の疎水性の性質により、所望の完全長オリゴ体が、非トリチル化切断型の不完全配列よりも強力に保持されることが可能になる。不完全配列は、少量割合のアセトニトリルなどの適当な溶媒を用いて樹脂から選択的に洗い流した。次いで、保持されたオリゴヌクレオチドを、トリフルオロ酢酸を用いてカラム上で脱トリチル化し、酸不安定性トリチル基を除去した。残留している酸をカラムから洗い流し、塩交換を行ない、物質の最終脱塩を開始させた。完全長オリゴ体を、水性有機溶媒を用いて精製形態で回収した。次いで、最終生成物を、純度（ＨＰＬＣ）、実体（Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ  ＭＳ）および収率（ＵＶ  Ａ２６０）について解析した。オリゴ体を真空乾燥または真空濃縮によって乾燥させた
アニーリング：生成物の解析に基づき、乾燥させたオリゴ体を適切なバッファーに溶解させた後、等モル量（理論消衰係数を用いて計算）のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を混合した。次いで、この溶液を、二本鎖の純度（クロマトグラフィー法により）および所望の終濃度について解析した。解析でいずれかの鎖が過剰であることが示された場合は、過剰でないさらなる鎖を、二本鎖形成が完全になるまで滴定した。解析によって目的の生成物純度が得られたことが示された場合、該物質を送達し、使用可能状態とした。
【０３１６】
以下は、このプロトコルを用いて合成した、またはこのプロトコルを用いて、もしくは当該技術分野で知られた方法を用いて合成され得る種々の修飾ｓｉＮＡを示す表である。
【０３１７】
【表３】
2013537423.tif 000010
2013537423.tif 000011
2013537423.tif 000012
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市販の調製物のさらなる合成工程
アニーリング工程後に解析によって標的生成物の純度が得られたことが示されたら、該物質を、濃縮および脱塩のためにタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システムに移す（これをアニーリング工程の前に行なうのとは反対）。
【０３１８】
限外濾過：アニーリング生成物の溶液を、適切な分子量カットオフ膜を含むＴＦＦシステムを用いて濃縮する。濃縮後、この生成物の溶液をダイアフィルトレーションによってＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて、濾液の電導度が水のものになるまで脱塩する。
【０３１９】
凍結乾燥：濃縮された溶液をボトルに移し、フラッシュ凍結させ、凍結乾燥機に取り付ける。次いで、生成物をフリーズドライして粉末にする。ボトルを凍結乾燥機から取り出すと、使用可能状態になっている。
初期スクリーニングプロトコル（９６ウェルプレートトランスフェクション）
細胞培養物の調製：
ヒトヘパトーマ細胞株ＨｅｐＧ２、またはマウスヘパトーマ細胞株Ｈｅｐａ１−６を、改変イーグル培地中で培養した。培養培地にはすべて、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１％重炭酸ナトリウムを補給した。
トランスフェクションおよびスクリーニング
部分ＨＢＶゲノムをｐＳｉＣｈｅｃｋ２プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内でウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の下流のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入したプラスミド（ｐＳｉＣｈｅｃｋ−ＨｅｐＢ−Ｐａｒｔｉａｌ，参照ＩＤ：１１０４）を作製した。それにより、ウミシイタケルシフェラーゼのｍＲＮＡ転写物がＨＢＶ転写物の上流で発現され、したがって、ＨＢＶゲノムに標的化されるｓｉＮＡＳによりＨＢＶ転写物のノックダウンが引き起こされ、また、ウミシイタケルシフェラーゼ転写物のノックダウンももたらされる。ウミシイタケルシフェラーゼ転写物レベルは、ウミシイタケルシフェラーゼ活性の量を直接測定すること（ｍｅｓｔｕｉｎｇ）により測定され得る。また、このプラスミドにより、ＨＢＶ  ｓｉＮＡに影響されないホタルルシフェラーゼの遺伝子も発現され、細胞をトランスフェクトしたプラスミドの量のばらつき（あれば）を考慮するためにデータを標準化するのに使用することができる。
【０３２０】
この部分ＨＢＶゲノムは、２２７０ｎｔのａｄｗ２遺伝子型ＡのＨＢＶウイルス（ＥｃｏＲＩ部位をｎｔ１としたときのｎｔ１５８〜２４２７）からなるものであった。
部分ＨＢＶ  ＤＮＡ配列（配列番号：５０３）：
【０３２１】
【化３】
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細胞を、処理済組織培養９６ウェルプレートのすべてのウェル内に、１００００細胞／ウェルの最終計数で、１００μＬの適切な培養培地中にプレーティングした。細胞は、プレーティング後、５％ＣＯ２の存在下で３７℃にて一晩培養した。
【０３２２】
翌日、ｓｉＮＡ、ｐＳｉＣｈｅｃｋ−ＨｅｐＢ−Ｐａｒｔｉａｌプラスミド、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む複合体を、以下のようにして作出した。５００ｎＭのｓｉＮＡと３０ｎｇ／ｕｌのプラスミドを含むｓｉＮＡとプラスミドの溶液を作製した。平行して、ＯＰＴＩ−ＭＥＭで３３倍に希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの溶液を調製した。室温で５分間のＲＮＡｉＭａｘ／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液のインキュベーション後、各ｓｉＮＡについて、等容量のｓｉＮＡ溶液とＲＮＡｉＭａｘ溶液を一緒に添加した。
【０３２３】
混合すると、ｓｉＮＡの濃度が６０ｎＭであり、プラスミドが３．６ｎｇ／μｌであるｓｉＮＡ／ＲＮＡｉＭａｘの溶液が生成された。この溶液を室温で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、２０μＬの溶液を、該当する各ウェルに添加した。各ウェル内のｓｉＮＡの終濃度を１０ｎＭとし、プラスミドは０．６ｎｇ／μｌとした。各ウェル内のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの最終容量を０．３ｕｌとした。
【０３２４】
１２点用量応答曲線試験のため、一連のｓｉＮＡを、３０ｎＭから初めて６倍連続希釈または４０ｎＭから初めて４倍連続希釈する。トランスフェクションはすべて、生物学的に多数の連で設定した。
【０３２５】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ｓｉＮＡ複合体とのインキュベーション時間は４８時間とし、トランスフェクションとスクリーニングおよび用量応答曲線試験のための収集とで培地は変えなかった。
ルシフェラーゼアッセイ
５０μｌのＤｕａｌ−ＧｌｏＴＭ  Ｆｉｒｅｆｌｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、次いで、プレートを室温で１０分間インキュベートした。次いで、ホタル発光の読み出しをＷａｌｌａｃ  Ｅｎｖｉｓｏｎプレートリーダーで、ルシフェラーゼプロトコルを用いて行なった。Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の５０μｌの１：１００希釈物を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、次いで、プレートを室温で１０分間インキュベートした。次いで、ウミシイタケ発光の読み出しをＷａｌｌａｃ  Ｅｎｖｉｓｏｎプレートリーダーで、ルシフェラーゼプロトコルを用いて行なった。
計算
対象遺伝子の発現レベルおよび遺伝子発現の阻害％（ＫＤ％）は比較法を用いて計算した。
【０３２６】
Ｌ＿ホタル＝ｌｏｇ２（ホタル発光光度）
Ｌ＿ウミシイタケ＝ｌｏｇ２（ウミシイタケ発光光度）
ｄＬ＝Ｌ＿ホタル−Ｌ＿ウミシイタケ
ｄｄＬ（ｌｏｇ２（変化倍数））＝ｄＬ＿ｓｉＲＮＡ−ｄＬ＿ＮＴＣ
相対発現レベル＝２−ｄｄＬ
ＫＤ％＝１００×（１−２−ｄｄＬ）
最も関連性のある対照であるため、特に記載のない限り、非標的化用対照ｓｉＮＡを、遺伝子発現の阻害（ノックダウン）パーセントを計算する比較対象の値として選択した。
【０３２７】
さらに、標準化データ（これは、細胞の一般的な健全状態および該プラスミドとｓｉＮＡの量を反映する）のみを調べた。これは、処理細胞内の２種類の異なるｍＲＮＡ（第１のものは標的ｍＲＮＡであり、第２のものは標準化体ｍＲＮＡである）のレベルを調べることにより行なった。これは、各ウェル内のウミシイタケルシフェラーゼ（標的）のｌｏｇ２発光を、プレート全体のホタルルシフェラーゼ（標準化体）のｌｏｇ２発光と比較することにより行なわれる。これにより、対象遺伝子のノックダウンだけでなく、細胞に毒性の可能性があり得るｓｉＮＡの排除が可能であった。
【０３２８】
ＩＣ５０の計算はすべて、Ｒ．２．９．２ソフトウェアを用いて行なった。データは、単純なリガンド結合に対するシグモイド用量応答（傾き可変）式を用いて解析した。阻害（ノックダウン）パーセントの計算ではすべて、計算は、特に記載のない限り、非標的化対照（Ｃｔｒｌ  ｓｉＮＡ）で処理した試料における対象遺伝子の標準化発現レベルに相対して行なった。
結果：
ＨＢＶ  ｓｉＮＡは、先に記載のとおりにして設計し、合成した。種々のｓｉＮＡを、ｐＳｉＣｈｅｃｋ−ＨｅｐＢ−ＰａｒｔｉａｌプラスミドでトランスフェクトしたＨｅｐＧ２またはＨｅｐａ１−６細胞においてスクリーニングした。ヒト細胞において種々の修飾ＨＢＶ  ｓｉＮＡで処理したときのＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現レベルのｌｏｇ２（変化倍数）を表３ａとｂに示す。各スクリーニングは４８時間目に、ルシフェラーゼアッセイ法を用いて行なった。
【０３２９】
【表４】
2013537423.tif 000029
2013537423.tif 000030
2013537423.tif 000031
【０３３０】
【表５】
2013537423.tif 000032
2013537423.tif 000033
2013537423.tif 000034
ノックダウンを確認するため、および異なるプレートで合成したｓｉＮＡを直接比較するため、一次スクリーニングで大きなｌｏｇ２（変化倍数）を有した表３ａと表３ｂのｓｉＮＡのサブセットを、単一の９６ウェルプレートに三連で再搭載し、ｐＳｉＣｈｅｃｋ＿ＨｅｐＢ−ｐａｒｔｉａｌでトランスフェクトしたヒトＨｅｐＧ２細胞においてスクリーニングした。表４にデータをまとめる。ｓｉＮＡは、ＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現レベルのｌｏｇ２（変化倍数）に基づいてランク付けした。
【０３３１】
【表６】
2013537423.tif 000035
2013537423.tif 000036
表４の選択した高ランキング（ｌｏｇ２（変化倍数）値が大きい）ｓｉＮＡを、ｐＳｉＣｈｅｃｋ−ＨｅｐＢ−ｐａｒｔｉａｌプラスミドでトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞において、有効性と効力についてさらに解析した。値を確立するため、細胞をｓｉＮＡの１：６連続用量滴定液で処理した。効力５０は、５０％の標的ｍＲＮＡのノックダウンがもたらされるｓｉＮＡトランスフェクション濃度の計算値である。これらのｓｉＮＡの結果を表５に示す。
【０３３２】
【表７】
2013537423.tif 000037
2013537423.tif 000038
先のスクリーニングでの高ランキング（ｌｏｇ２（変化倍数）値が大きく、効力５０値が低いこと）に基づいて特定した表５の選択した上位成績配列に、次いで、パッセンジャー鎖とガイド鎖の両方に対して種々の化学修飾を合成した。次いで、これらのｓｉＮＡを有効性と効力について、ｐＳｉＣｈｅｃｋ−ＨｅｐＢ−ｐａｒｔｉａｌプラスミドでトランスフェクトしたＨｅｐａ１−６細胞において解析した。ヒト細胞において種々の修飾ＨＢＶ  ｓｉＮＡで処理したときのＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現レベルのｌｏｇ２（変化倍数）を表６Ａに示す。各スクリーニングは４８時間目にルシフェラーゼ（ｌｕｉｃｆｅｒａｓｅ）アッセイ法を用いて行なった。
【０３３３】
【表８】
2013537423.tif 000039
2013537423.tif 000040
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ノックダウンを確認するため、および異なるプレートで合成したｓｉＮＡを直接比較するため、一次スクリーニングで大きなｌｏｇ２（変化倍数）を有した表６ａのｓｉＮＡのサブセットを、単一の９６ウェルプレートに三連で再搭載し、ｐＳｉＣｈｅｃｋ＿ＨｅｐＢ−ｐａｒｔｉａｌでトランスフェクトしたマウスＨｅａｐ１−６細胞において再スクリーニングした。表６Ｂにデータをまとめる。ｓｉＮＡは、ＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現レベルのｌｏｇ２（変化倍数）に基づいてランク付けした。
【０３３４】
【表９】
2013537423.tif 000046
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2013537423.tif 000048
表６ｂの選択した高ランキング（ｌｏｇ２（変化倍数）値が大きい）ｓｉＮＡを、ｐＳｉＣｈｅｃｋ−ＨｅｐＢ−ｐａｒｔｉａｌプラスミドでトランスフェクトしたＨｅｐａ１−６細胞において、有効性と効力についてさらに解析した。値を確立するため、細胞をｓｉＮＡの１：６連続用量滴定液で処理した。効力５０は、５０％の標的ｍＲＮＡのノックダウンがもたらされるｓｉＮＡトランスフェクション濃度の計算値である。これらのｓｉＮＡの結果を表６ｃに示す。
【０３３５】
【表１０】
2013537423.tif 000049
2013537423.tif 000050
【実施例２】
【０３３６】
ｓｉＮＡのインビトロ血清安定性の測定
ｓｉＮＡを、Ｈ２Ｏで５０μＭ〜１００μＭストック溶液として再構成させ、ヒト血清（３７℃まで予備加温）に終濃度２０μｇ／ｍＬまで添加する。次いで、混合物を３７℃で０、１および２時間インキュベートする。各時間点の終了時、等容量のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｙｓｉｓ−Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒと混合することにより反応を停止させる。オリゴヌクレオチドを、９６ウェル形式でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎによって精製し、Ｌａｂｃｏｎｃｏ  Ｔｒｉａｄ  Ｌｙｏ−００４１７で乾固するまで凍結乾燥させる。この凍結乾燥試料を１５０μＬの１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＲＮａｓｅ無含有Ｈ２Ｏを用いて調製）中で再構成させる。次いで、試料溶液を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｏｒｂｉｔｒａｐでの液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）解析のために１ｍＭ  ＥＤＴＡで５倍に希釈する。ｓｉＮＡの血清中代謝産物を、測定された分子量に基づいて調べた。
【実施例３】
【０３３７】
サイトカイン誘導の試験
脂質ナノ粒子（例えば、４０／４８／２／１０の比のＤＬｉｎＤＭＡ／コレステロール／Ｓ−ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ）中に負荷した本発明の種々のｓｉＮＡの免疫賦活効果を評価するため、Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、単回３ｍｐｋ用量のＬＮＰ製剤化ｓｉＮＡを尾静脈注射によって投与する。血清または血漿試料を投与の３時間後と２４時後に収集する。これらの試料中のサイトカインおよびケモカインレベルを、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ  ＩＲ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ（Ａｕｓｈｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を製造業者の使用説明書に従って用いて測定する。測定したサイトカインおよびケモカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＫＣ、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＧＭＣＳＦ、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１／ＪＥ、およびＲＡＮＴＥＳである。
【実施例４】
【０３３８】
マウスにおける有効性試験
インビボ有効性試験は、後でＨＢＶを注射するヒト化肝臓を有するＳＣＩＤマウスにおいて行なう。罹患肝臓を有するトランスジェニックマウスにヒト一次肝細胞を注入し、７０％がヒト肝細胞になるまでマウス肝臓に生着させる。次いで、マウスにヒトＨＢＶ分離株を接種する。感染マウスに、尾静脈注射によってＬＮＰ封入ｓｉＮＡまたはビヒクル対照を、単回３ｍｐｋ用量を用いてＩＶ投与する。投与後の種々の時間点で血清試料を採取し、次いで血清中の循環ＨＢＶゲノムレベルをｑＰＣＲによって測定し、ウイルス量に対するｓｉＮＡの効果を調べる。
【実施例５】
【０３３９】
非ヒト霊長類における薬力学試験
ＨＢＶ感染チンパンジーに、単回２．５ｍｐｋ用量のｓｉＮＡ負荷脂質ナノ粒子を静脈内注入によって投与する。ＨＢＶウイルス量をモニタリングするため、投与前および投与後の種々の時間点で血清試料を採取し、ＨＢＶゲノムレベルをｑＰＣＲによって測定する。手順はすべて、ＵＳＤＡ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ（９  ＣＦＲ，パート１、２および３）に概要が示された規定ならびにＴｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（ＩＬＡＲ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，１９９６，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ）に明記された条件を順守したものである。
【実施例６】
【０３４０】
ｓｉＮＡ  ＬＮＰ製剤
Ａ．ＤＬｉｎＤＭＡ製剤に関するＬＮＰプロセスの一般記載：
脂質ナノ粒子を衝突噴流プロセスによって調製する。この粒子は、アルコールに溶解させた脂質を、クエン酸バッファーに溶解させたｓｉＮＡと混合することにより形成させる。ｓｉＮＡに対する脂質の混合比は、脂質が４５〜５５％およびｓｉＮＡが６５〜４５％を目標にする。脂質溶液は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質（コレステロール）、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ）脂質およびＤＳＰＣを、アルコール（例えば、エタノール）中に５〜１５ｍｇ／ｍＬ（目標９〜１２ｍｇ／ｍＬ）の濃度で含むものにする。脂質の比率は、カチオン性脂質を２５〜９８（目標３５〜６５）のモルパーセント範囲を有し、ヘルパー脂質は、０〜７５（目標３０〜５０）のモルパーセント範囲を有し、ＰＥＧ脂質は１〜１５（目標１〜６）のモルパーセント範囲を有し、ＤＳＰＣは０〜１５（目標０〜１２）のモルパーセント範囲を有するようにする。ｓｉＮＡ溶液は、１種類以上のｓｉＮＡ配列を、クエン酸ナトリウム緩衝塩溶液（３．５〜５の範囲のｐＨを有する）中に０．３〜１．０ｍｇ／ｍＬの（目標０．３〜０．９ｍｇ／ｍＬ）の濃度範囲で含むものにする。この２つの溶液を１５〜４０℃（目標３０〜４０℃）の範囲の温度まで加熱し、次いで、衝突噴流混合機内で混合すると、即座にＬＮＰが形成される。Ｔ字部内径（ｔｅｅＩＤ）は０．２５〜１．０ｍｍの範囲であり、総流速は１０〜６００ｍＬ／分にする。流速とチューブ内径の組合せは、ＬＮＰの粒径を３０〜２００ｎｍに制御する効果を有する。次いで、この溶液を緩衝溶液と高ｐＨで、１：１〜１：３（ｖｏｌ：ｖｏｌ）（だが１：２（ｖｏｌ：ｖｏｌ）を目標にした）の範囲の混合比で混合する。この緩衝溶液を１５〜４０℃（目標３０〜４０℃）の範囲の温度にする。混合ＬＮＰを３０分〜２時間保持した後、アニオン交換濾過工程を行なう。インキュベーション時の温度は１５〜４０℃（目標３０〜４０℃）の範囲にする。インキュベーション後、この溶液を０．８ｕｍフィルターに通して濾過する（アニオン交換分離工程を含む）。このプロセスでは、１ｍｍ  ＩＤ〜５ｍｍ  ＩＤの範囲のチューブ内径および１０〜２０００ｍＬ／分の流速が使用される。ＬＮＰは濃縮され、限外濾過プロセスによってダイアフィルトレーションされ、このとき、アルコールが除去され、クエン酸バッファーが最終バッファー溶液（リン酸緩衝生理食塩水など）と交換される。限外濾過プロセスには、タンジェンシャルフロー濾過形式（ＴＦＦ）を使用する。このプロセスでは、３０〜５００ＫＤの名目分子量カットオフ範囲の膜を使用する。膜形式は、中空繊維またはフラットシートカセットである。適正な分子量カットオフを用いたＴＦＦプロセスにより、ＬＮＰが保持液中に保持され、濾液または透過液中にアルコール；クエン酸バッファー；および最終バッファー廃物が含有される。ＴＦＦプロセスは、初期濃度からｓｉＮＡ濃度１〜３ｍｇ／ｍＬまでの多工程プロセスである。濃縮後、ＬＮＰ懸濁液を最終バッファーに対して１０〜２０容量でダイアフィルトレーションし、アルコールを除去してバッファー交換を行なう。次いで、この物質をさらに１〜３倍に濃縮する。ＬＮＰプロセスの最終工程は、濃縮ＬＮＰ溶液の滅菌濾過およ��生成物のバイアル封入である。
【０３４１】
解析手順：
１）ｓｉＮＡ濃度
ｓｉＮＡ二本鎖の濃度は、強アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）により、Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅシステム（Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）を２９９６  ＰＤＡ検出器とともに用いて測定される。ＬＮＰ（あるいは、ＲＮＡｉ送達媒体（ＲＤＶ）とも称する）を、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理して全ｓｉＮＡを遊離させ、ＳＡＸ分離により、Ｄｉｏｎｅｘ  ＢｉｏＬＣ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ  ２００（４×２５０ｍｍ）カラム（２５４ｎｍでＵＶ検出）を用いて解析する。移動相は、Ａ：２５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２０％ＥｔＯＨ，ｐＨ７．０と、Ｂ：２５０ｍＭ  ＮａＣｌＯ４，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２０％ＥｔＯＨ，ｐＨ７．０を０分から１５分までの線形勾配で構成し、流速を１ｍｌ／分とする。ｓｉＮＡ量は、ｓｉＮＡ標準曲線との比較により求める。
【０３４２】
２）封入速度
蛍光試薬ＳＹＢＲ  ＧｏｌｄをＲＮＡ定量に使用し、ＲＤＶの封入速度をモニタリングする。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とともに、または無しでＲＤＶを使用し、遊離ｓｉＮＡおよび全ｓｉＮＡの量を調べる。アッセイは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅマイクロプレート分光測光器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）製）を用いて行なわれる。試料を４８５ｎｍで励起し、蛍光放射を５３０ｎｍで測定する。ｓｉＮＡ量は、ｓｉＮＡ標準曲線との比較により求められる。
【０３４３】
封入速度＝（１−遊離ｓｉＮＡ／全ｓｉＮＡ）×１００％
３）粒径および多分散性
１μｇのｓｉＮＡを内包しているＲＤＶを、１×ＰＢＳで最終容量３ｍｌまで希釈する。試料の粒径および多分散性を、動的光散乱法によりＺｅｔａＰＡＬＳ機器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて測定する。散乱強度は、Ｈｅ−Ｎｅレーザーで２５℃にて９０°の散乱角で測定する。
【０３４４】
４）ゼータ電位の解析
１μｇのｓｉＮＡを内包しているＲＤＶを、１ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）で最終容量２ｍｌまで希釈する。試料の電気泳動移動度をＺｅｔａＰＡＬＳ機器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）（電極および光源としてＨｅ−Ｎｅレーザーを有する）を用いて調べる。ゼータ電位の計算では、スモルコフスキー限界を想定する。
【０３４５】
５）脂質の解析
個々の脂質濃度を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅシステム（Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）をコロナ荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）（ＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ）とともに用いて測定する。ＲＤＶ内の個々の脂質を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−ＣＩ８（５０×４．６ｍｍ，１．８μｍ粒径）カラムをＣＡＤとともに用いて６０℃で解析する。移動相は、Ａ：０．１％ＴＦＡ（Ｈ２Ｏ中）とＢ：０．１％ＴＦＡ（ＩＰＡ中）で構成した。勾配は、６０％移動相Ａおよび４０％移動相Ｂで時間０から４０％移動相Ａおよび６０％移動相Ｂに１．００分まで；４０％移動相Ａおよび６０％移動相Ｂで１．００から５．００分まで；４０％移動相Ａおよび６０％移動相Ｂで５．００分から２５％移動相Ａおよび７５％移動相Ｂに１０．００分まで；２５％移動相Ａおよび７５％移動相Ｂで１０．００分から５％移動相Ａおよび９５％移動相Ｂに１５．００分まで；および５％移動相Ａおよび９５％移動相Ｂで１５．００から６０％移動相Ａおよび４０％移動相Ｂに２０．００分まで変化させ、流速は１ｍｌ／分にする。個々の脂質濃度は、ＲＤＶ内のすべての脂質成分を二次曲線にフィットさせた標準曲線との比較により求める。各脂質のモル分率を、その分子量に基づいて計算する。
Ｂ．７１．９：２０．２：７．９の比率のＣＬｉｎＤＭＡ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧの一般的な配合手順
ｓｉＮＡ溶液を、ｓｉＮＡを２５ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ４．０）に０．８ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させることにより調製した。脂質溶液は、７１．９：２０．２：７．９の比率の２Ｓ−オクチル−ＣｌｉｎＤＭＡ、コレステロールおよびＰＥＧ−ＤＭＧの混合物を無水エタノールに約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させることにより調製した。等容量のｓｉＮＡ溶液と脂質溶液を、２つのシリンジポンプを同じ流速で用いて混合Ｔ字コネクタに送達した。得られた乳状混合物を滅菌ボトル内に収集した。次いで、この混合物を等容量のクエン酸バッファーでゆっくり希釈し、サイズ排除中空ファイバーカートリッジに通して濾過し、混合物中の遊離ｓｉＮＡ（あれば）を除去した。クエン酸バッファー（ｐＨ４．０）に対する限外濾過を用いてエタノールを除去し（ＡＬＣＯスクリーンの検査スティック）、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対する限外濾過を用いてバッファー交換した。所望の容量まで濃縮し、０．２ｍｍフィルターに通して滅菌濾過することにより最終ＬＮＰを得た。得られたＬＮＰを、粒径、アルコール含量、総脂質含量、封入核酸および総核酸濃度に関して特性評価した。
Ｃ．表１０の種々の製剤の一般的なＬＮＰ調製物
表１０のｓｉＮＡナノ粒子懸濁液を、ｓｉＮＡおよび／または担体分子を２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）に約０．４０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させることにより調製した。脂質溶液は、カチオン性脂質（例えば、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン，表１１の構造参照）、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−ＤＭＧ（表１０に示した比率）の混合物を無水エタノールに、約８ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させることにより調製した。リン酸部に対する窒素の比率は６：１と概算された。
【０３４６】
ほぼ等容量のｓｉＮＡ／担体溶液と脂質溶液を、２つのＦＰＬＣポンプを同じ流速で用いて混合Ｔ字コネクタに送達した。背圧弁ワイス（ｗａｉｓ）を使用し、所望の粒径に調整した。得られた乳状混合物を滅菌ガラスビン内に収集した。次いで、この混合物を等容量のクエン酸バッファーで、続いて等容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、イオン交換膜に通して濾過し、混合物中の遊離ｓｉＮＡ／担体（あれば）を除去した。ＰＢＳ（７．４））に対する限外濾過を使用し、エタノールを除去してバッファーを交換した。所望の容量まで濃縮し、０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過することにより最終ＬＮＰを得た。得られたＬＮＰを、粒径、ゼータ電位、アルコール含量、総脂質含量、封入核酸および総核酸濃度に関して特性評価した。
ＬＮＰ製造プロセス
非限定的な例において、ＬＮＰを、バルクで以下のようにして調製した。このプロセスは、（１）脂質溶液の調製；（２）ｓｉＮＡ／担体溶液の調製；（３）混合／粒子の形成；（４）インキュベーション；（５）希釈；（６）限外濾過および濃縮からなるものとした。
【０３４７】
１．脂質溶液の調製
２Ｌ容のガラス試薬ビンとメスシリンダーを脱パイロジェン処理した。脂質を室温まで昇温させた。このガラス試薬ビン内に、８．０ｇの（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミンをピペットで移し、１．２ｇのＤＳＰＣ、３．５ｇのコレステロール、０．９ｇのＰＥＧ−ＤＭＧを添加した。この混合物に１Ｌのエタノールを添加する。試薬ビンを、加熱した水浴（５０℃を超えない温度）中に入れた。脂質懸濁液を撹拌バーで撹拌した。この懸濁液中に、丸底フラスコの口の１つから密封アダプターを付けて熱電対プローブを入れた。懸濁液を透明になるまで３０〜４０℃で加熱した。この溶液を室温まで放冷した。
【０３４８】
２．ｓｉＮＡ／担体溶液の調製
滅菌容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ保存ビン）内に、水補正因子（およそ１．２）の０．４倍のｇ数のｓｉＮＡ粉末を量り入れた。このｓｉＮＡを、脱パイロジェン処理した２Ｌ容ガラス試薬ビンに移した。この秤量容器をクエン酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ５．０）で３回すすぎ洗浄し、すすぎ液をこの２Ｌ容ガラスビンに入れ、１Ｌになるまでクエン酸バッファーで分量供給（ＱＳ）した。ｓｉＮＡ溶液の濃度を、ＵＶ分光計により以下の手順を用いて測定した。該溶液から２０μＬを取り出し、希釈し、５０倍の１０００μＬにし、クエン酸バッファーでのブランク測定後にＵＶ読み値をＡ２６０ｎｍで記録した。これを繰り返した。注：２つの試料の読み値が整合している場合は、平均をとり、ｓｉＮＡの消散係数に基づいて濃度が計算され得る。最終濃度が０．４０±０．０１ｍｇ／ｍＬの範囲外である場合、さらにｓｉＮＡ／担体粉末を添加すること、またはさらにクエン酸バッファーを添加することにより濃度が調整され得る。このプロセスは、適用可能な場合は第２のｓｉＮＡで反復してもよい。
【０３４９】
ｓｉＮＡ／担体溶液を、２種類以上のｓｉＮＡ二本鎖および／または担体のカクテルではなく１種類のｓｉＮＡ二本鎖で構成した場合、ｓｉＮＡ／担体を２０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に溶解させ、０．４ｍｇ／ｍＬの終濃度を得た。
【０３５０】
次いで、脂質溶液とエタノール溶液をＰａｌｌ  Ａｃｒｏｐａｋ  ２０  ０．８／０．２μｍ滅菌フィルターＰＮ  １２２０３に通して滅菌濾過し、Ｍａｓｔｅｒ  Ｆｌｅｘ  Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  Ｐｕｍｐ  Ｍｏｄｅｌ  ７５２０−４０を用いて脱パイロジェン処理したガラス槽内に入れ、封入プロセスのための滅菌出発物質を得た。濾過プロセスは、２０ｃｍ２の膜面積で８０ｍＬ規模にて実施した。流速は２８０ｍＬ／分とした。このプロセスは、チューブ直径と濾過面積を増大させることによりスケールアップ（ｓｃａｌｅ）することができる。
【０３５１】
３．粒子形成−混合工程
ツーバレルシリンジ駆動型ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  ３３  Ｔｗｉｎ  Ｓｙｒｉｎｇｅ）を使用し、滅菌脂質／エタノール溶液と、滅菌ｓｉＮＡ／担体またはｓｉＮＡ／担体カクテル／クエン酸バッファー（２０ｍＭクエン酸バッファー，ｐＨ５．０）溶液を、０．５ｍｍ  ＩＤ  Ｔ−混合機（混合ステージＩ）内で、等しいまたはほぼ等しい流速で混合した。得られた排出ＬＮＰ懸濁液には、４０〜５０ｖｏｌ％のエタノールが含まれていた。４５ｖｏｌ％エタノール排出懸濁液を得るため、滅菌脂質／エタノールと、滅菌ｓｉＮＡ／担体またはｓｉＮＡ／担体カクテル／クエン酸バッファー溶液を、それぞれ、５４ｍＬ／分および６６ｍＬ／分の流速で、排出混合物の総流速が１２０ｍＬ／分となるように混合した。
【０３５２】
４．希釈
混合ステージＩの排出流は直接、４ｍｍ  ＩＤ  Ｔ−混合機（混合ステージＩＩ）内に供給され、ここで、高ｐＨの緩衝溶液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム，３００ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ６．０）により１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ％）の比率で希釈された。この緩衝溶液は３０〜４０℃の範囲の温度であり、４ｍｍ  Ｔ−混合機に蠕動ポンプ（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ  ＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ  Ｌ／Ｓ  ６００  ＲＰＭ）によって１２０ｍＬ／分の流速で送達した。
【０３５３】
混合ステージＩＩの排出流は直接、６ｍｍ  ＩＤ  Ｔ−混合機（混合ステージＩＩＩ）内に供給され、ここで、高ｐＨ緩衝溶液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）により１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ％）の比率で希釈された。この緩衝溶液は１５〜２５℃の範囲の温度であり、６ｍｍ  Ｔ−混合機に蠕動ポンプ（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ  ＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ  Ｌ／Ｓ  ６００  ＲＰＭ）によって２４０ｍＬ／分の流速で送達された。
【０３５４】
５．インキュベーションおよび遊離ｓｉＮＡの除去
混合ステージＩＩＩの排出流は、３０分間のインキュベーションのための混合後に保持した。インキュベーションは３５〜４０℃の温度で行ない、プロセス内懸濁液を光から保護した。インキュベーション後、遊離の（封入されていない）ｓｉＮＡを、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑクロマトグラフィーフィルター（カプセル）でのアニオン交換によって除去した。使用前、クロマトグラフィーフィルターを、逐次、１Ｎ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌ、および最終の１２．５ｖｏｌ％エタノール溶液（ＰＢＳ中）のフラッシュ液で前処理した。最終フラッシュ液のｐＨは、ｐＨ＜８が確実であることが確認された。次いで、インキュベーションしたＬＮＰ流を、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑフィルターによって蠕動ポンプ（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ  ＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ  Ｌ／Ｓ  ６００  ＲＰＭ）によっておよそ１００ｍＬ／分の流速で濾過した。濾過流を、以下の限外濾過および濃縮のために滅菌ガラス容器内に受容した。
【０３５５】
６．限外濾過、濃縮および滅菌濾過
限外濾過プロセスは時限的プロセスであり、流速は注意深くモニタリングしなければならない。これは２工程プロセスであり；最初は、希釈物質を採取し、およそ０．３〜０．６ｍｇ／ｍＬの濃度のｓｉＮＡにおよそ８倍濃縮する濃縮工程である。
【０３５６】
第１の工程では、限外濾過膜１００  ｋＤａ  ＰＥＳ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）が取り付けられたリングスタンドを蠕動ポンプ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ＫｒｏｓＦｌｏＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ）に装着した。９．２Ｌの滅菌蒸留水をレザーバに添加し；３Ｌをドレイン排出して廃棄し、残りを透過液中にドレイン排出して廃棄した。５．３Ｌの０．２５Ｎ水酸化ナトリウムをレザーバに添加し、１．５Ｌをドレイン排出して廃棄し、３．１Ｌを透過液中にドレイン排出して廃棄した。残りの水酸化ナトリウムを、消毒のために系内に保持し（少なくとも１０分間）、次いでポンプをドレイン排出した。９．２Ｌの７０（ｖ／ｖ）％イソプロピルアルコールをレザーバに添加し、１．５Ｌをドレイン排出して廃棄し、残りを透過液中にドレイン排出して廃棄した。６Ｌのコンディショニングバッファー（リン酸緩衝生理食塩水中１２．５％エタノール）を添加し、１．５Ｌをドレイン排出して廃棄し、残りを、廃液が中性ｐＨ（７〜８）になるまで透過液中にドレイン排出した。膜の流出値を記録し、次いでポンプをドレイン排出した。
【０３５７】
希釈ＬＮＰ溶液をレザーバ内に１．１Ｌの印まで入れた。ポンプを２．３Ｌ／分で作動させた。５分間の再循環後、透過液ポンプを６２．５ｍＬ／分で作動させ、液レベルをレザーバ内で、およそ９５０ｍＬに一定にした。希釈ＬＮＰ溶液を９．８Ｌから１．１Ｌまで１４０分間で濃縮し、希釈ＬＮＰ溶液がすべてレザーバに移されたらポンプを一時停止した。
【０３５８】
第２工程は、エタノール／水性バッファーをリン酸緩衝生理食塩水に交換するダイアフィルトレーション工程とした。この工程中、およそ１０〜２０ダイアフィルトレーション容量のリン酸緩衝生理食塩水を使用した。ダイアフィルトレーション後、２回目の濃縮を行ない、ＬＮＰ懸濁液をおよそ１〜１．５ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡに３倍濃縮した。濃縮された懸濁液を滅菌プラスチックＰＥＴＧビン内に収集した。次いで、最終懸濁液を、逐次、Ｐａｌｌ  ０．４５ｕｍ  ＰＥＳフィルターおよびＰａｌｌ  ０．２ｕｍ  ＰＥＳフィルターによって最終滅菌のために濾過した後、バイアルに充填した。
【０３５９】
得られたＬＮＰを、粒径、ゼータ電位、アルコール含量、総脂質含量、封入核酸および総核酸濃度に関して特性評価した。
Ｄ．新規なカチオン性脂質の合成
新規なカチオン性脂質の合成は、脂質酸（ｉ）を出発物質とする線形プロセスである。Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンにカップリングさせると、ワインレブアミドｉｉが得られる。グリニャール付加によりケトンｉｉｉが生成される。チタン媒介性還元的アミノ化によりｉｖの型の最終生成物が得られる。
【０３６０】
一般スキーム１
【０３６１】
【化４】
2013537423.tif 000051
単一炭素ホモログ化カチオン性脂質ｖの合成は、脂質ケトン（ｉｉｉ）を出発物質とする線形プロセスである。該ケトンのニトリル（ｉｖ）への変換は、ＴＯＳＭＩＣおよびカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドでの処理によって行なわれる。該ニトリルを第１級アミンに還元した後、還元的アミノ化を行なうと最終のカチオン性脂質ｖが得られる。
【０３６２】
一般スキーム２
【０３６３】
【化５】
2013537423.tif 000052
二炭素ホモログ化カチオン性脂質ｖｉｉｉの合成は、脂質ケトン（ｉｉｉ）を出発物質とする線形プロセスである。該ケトンのα，β−不飽和アミドｖｉへの変換は、ピーターソン条件下で行なわれる。該α，β−不飽和の共役還元は、ＬＳ−セレクトリドを用いて行なわれ、アミドｖｉｉが得られる。該アミドを水素化アルミニウムリチウムで還元すると、最終のカチオン性脂質ｖｉｉｉが得られる。
【０３６４】
一般スキーム３
【０３６５】
【化６】
2013537423.tif 000053
シクロプロピル含有脂質は一般スキーム４に従って調製される。不飽和ワインレブアミドｉｉをシモンズ・スミスシクロプロパン化条件に供すると、シクロプロピル含有ワインレブアミドｉｘが得られる。これを、一般スキーム１〜３に概略を示したようにして最終生成物にする。
【０３６６】
一般スキーム４
【０３６７】
【化７】
2013537423.tif 000054
アリル型アミンカチオン性脂質ｘｖの合成は、アルデヒドｘを出発物質とする線形プロセスである。酢酸ｔ−ブチルを付加すると、β−ヒドロキシエステルｘｉが生成される。該ヒドロキシル官能部をフルオロ基に変換させた後、酸処理を行なうと、β−フルオロ酸ｘｉｉが生成される。該酸をワインレブアミドに変換させた後、グリニャール付加を行なうと、β−フルオロケトンｘｉｖが得られる。還元的アミノ化により、同時脱離がもたらされ、所望のアリル型アミンｘｖが生成される。
【０３６８】
一般スキーム５
【０３６９】
【化８】
2013537423.tif 000055
２０，２３−ノナコサジエン−１０−アミン，Ｎ，Ｎ−ジメチル−，（２０Ｚ，２３Ｚ）（化合物１）
【０３７０】
【化９】
2013537423.tif 000056
１１，１４−エイコサジエン酸，（１１Ｚ，１４Ｚ）−（５０ｇ，１６２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（３１．６ｇ，３２４ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（４４．１ｇ，３２４ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（４５．２ｍＬ，３２４ｍｍｏｌ）、およびＥＤＣ（６２．１ｇ，３２４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（８１０ｍＬ）中で混合し、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、反応液を５×７００ｍＬの水で洗浄し、次いで１×６００ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨ洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、セライトに通して濾過し、エバポレートし、５３．０６ｇ（９３％）の１１，１４−エイコサジエンアミド，Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−，（１１Ｚ，１４Ｚ）を透明な金色の油状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．３５（ｍ，４Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），３．１８（ｓ，３Ｈ），２．７７（ｍ，２Ｈ），２．４１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），２．０５（ｍ，４Ｈ），１．６３（ｍ，２Ｈ），１．４０−１．２６（ｍ，１８Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ）。
【０３７１】
【化１０】
2013537423.tif 000057
１１，１４−エイコサジエンアミド，Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−，（１１Ｚ，１４Ｚ）−１（４ｇ，１１．３８ｍｍｏｌ）を、２５０ｍＬ容フラスコ内の乾燥ＴＨＦ（５０．０ｍｌ）に溶解させた。次いで、１Ｍのノニルマグネシウムブロミド（２２．７６ｍｌ，２２．７６ｍｍｏｌ）を窒素下、周囲温度で添加した。１０分後、過剰の飽和水性ＮＨ４Ｃｌで反応液をゆっくりクエンチした。反応液を分液漏斗内でヘキサンと水にて洗浄し、振り、下側の水層を廃棄し、上側の層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、エバポレートし、粗製ケトンを金色の油状物として得た。上記の粗製ケトンに、ジメチルアミン（ＴＨＦ中２Ｍ）（１４．２２ｍｌ，２８．４ｍｍｏｌ）を添加した後、Ｔｉ（Ｏ−ｉ−Ｐｒ）４（６．６７ｍｌ，２２．７６ｍｍｏｌ）を添加し、一晩撹拌状態にした。翌日、ＥｔＯＨ（５０ｍｌ）を添加した後、ＮａＢＨ４（０．６４６ｇ，１７．０７ｍｍｏｌ）を添加した。５分間の撹拌後、直接全反応液を、３３０ｇシリカカラムに合わせた４０ｇシリカカラムに注入した。１０分間は１００％ＤＣＭで、次の３０分間は０から１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出させると、２０，２３−ノナコサジエン−１０−アミン，Ｎ，Ｎ−ジメチル−，（２０Ｚ，２３Ｚ）（１）（２．４５ｇ，５．４７ｍｍｏｌ，４８．１％収率）がかすかに金色の油状物として収集された。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．３５（ｍ，４Ｈ），２．７８（ｍ，２Ｈ），２．２３（ｍ，１Ｈ），２．２１（ｓ，６Ｈ），２．０５（ｍ，４Ｈ），１．４５−１．１６（ｍ，３８Ｈ），０．８９（ｍ，６Ｈ）。ＨＲＭＳ  Ｃ３１Ｈ６１Ｎの計算値４４８．４８７７，実測値４４８．４８７２。
【０３７２】
化合物２〜３０は新規なカチオン性脂質であり、上記の一般スキーム１に従って調製した。
【０３７３】
【表１１】
2013537423.tif 000058
2013537423.tif 000059
2013537423.tif 000060
2013537423.tif 000061
（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（化合物３１）
【０３７４】
【化１１】
2013537423.tif 000062
ケトンｉｉｉ（４．０ｇ，９．５５ｍｍｏｌ）、ＴＯＳＭＩＣ（２．４ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）を含むジメトキシエタン（４５ｍＬ）の溶液を０℃まで冷却し、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１９．１ｍｍｏｌ，１９．１ｍＬの１ＭのｔＢｕＯＨ溶液）で処理した。９０分後、反応液をヘキサンと水に分配した。有機部分を水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。この物質をフラッシュクロマトグラフィーによって精製し（０から５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）、所望の生成物を得た（約２０％の出発物質（ｓ．ｍ．）を含有）。この混合物を次の工程に、そのままの状態で持ち越した。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝４３０．６。
【０３７５】
【化１２】
2013537423.tif 000063
水素化アルミニウムリチウム（２３．９ｍｍｏｌ，２３．９ｍＬの１ＭのＴＨＦ溶液）をニトリルｉｖ（３．４２ｇ，８ｍｍｏｌ）に直接、周囲温度で添加し、反応液を２０分間撹拌した。反応液を１００ｍＬのＴＨＦで希釈し、０℃まで冷却し、硫酸ナトリウム十水和物溶液を用いて注意深くクエンチした。固形物を濾別し、ＴＨＦで洗浄した。濾液を真空にてエバポレートし、直接、次の反応に粗製状態で持ち越した。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝４３４．６。
【０３７６】
【化１３】
2013537423.tif 000064
第１級アミン（３．４５ｇ，６．２ｍｍｏｌ）のジクロロエタン（１００ｍＬ）溶液をホルムアルデヒド（１．６ｍＬ，２１．７ｍｍｏｌ）で処理した後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（６．６ｇ，３１ｍｍｏｌ）で処理した。５分後、反応液をジクロロメタンと１Ｎ  ＮａＯＨ間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。粗製混合物を逆相分取用クロマトグラフィー（Ｃ８カラム）によって精製し、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２，１５−ジエン−１−アミンを得た。ＨＲＭＳ  計算値４６２．５０３３，実測値４６２．５０２６。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．３５（ｍ，４Ｈ），２．７８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．１８（ｓ，６Ｈ），２．０５（ｍ，６Ｈ），１．３（ｍ，３９Ｈ），０．８９（ｍ，６Ｈ）。
（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（化合物３２）
【０３７７】
【化１４】
2013537423.tif 000065
シリルアミドのピーターソン試薬（３．１ｇ，１６．７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３５ｍＬ）に溶解させ、−６３℃まで冷却した。この溶液にｎＢｕＬｉ（１６．７ｍｍｏｌ，６．７ｍＬの２．５Ｍ溶液）を添加した。反応液を周囲温度まで３０分間昇温させた。ケトン（５．０ｇ，１１．９ｍｍｏｌ）を第２のフラスコ内のＴＨＦ（２５ｍＬ）に溶解させた。ピーターソン試薬を−６０℃のケトン溶液に移した。反応液を−４０℃まで１時間昇温させ、次いで、０℃まで３０分間昇温させた。重炭酸ナトリウムを用いて反応液をクエンチし、さらに水で希釈し、水／ヘキサン間に分配した。有機部分をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。フラッシュクロマトグラフィーによって精製し（０から４０％までのＭＴＢＥ／ヘキサン）、α，β−不飽和アミドｖｉを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．７５（ｓ，１Ｈ），５．３６（ｍ，４Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ），２．９９（ｓ，３Ｈ），２．７８（ｔ，２Ｈ），２．２８（ｔ，２Ｈ），２．０５（ｍ，６Ｈ），１．３５（ｍ，３４Ｈ），０．８９（ｍ，６Ｈ）。
【０３７８】
【化１５】
2013537423.tif 000066
α，β−不飽和アミドｖｉ（１ｇ，２．１ｍｍｏｌ）とＬＳ−セレクトリド（４．１ｍｍｏｌ，４．１ｍＬの１Ｍ溶液）を密封チューブ内で合わせ、６０℃まで２４時間加熱した。反応液を周囲温度まで冷却し、塩化アンモニウム溶液とヘプタンに分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートし、アミドｖｉｉを得た。この中間体を直接、次の反応に粗製状態で持ち越した。
【０３７９】
【化１６】
2013537423.tif 000067
アミドｖｉｉ（２．８５ｇ，５．８ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化アルミニウムリチウム（８．７ｍｍｏｌ，８．７ｍＬの１Ｍ溶液）を添加した。反応液を周囲温度で１０分間撹拌し、次いで、硫酸ナトリウム十水和物溶液をゆっくり添加することによってクエンチした。固形物を濾過し、ＴＨＦで洗浄し、濾液を真空にてエバポレートした。粗製混合物を逆相分取用クロマトグラフィー（Ｃ８カラム）によって精製し、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（化合物３２）を油状物として得た。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）計算値４７６．５１９０，実測値４７６．５１８９。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．３７（ｍ，４Ｈ），２．７８（ｔ，２Ｈ），２．４２（ｍ，８Ｈ），２．０５（ｑ，４Ｈ），１．２８（ｍ，４１Ｈ），０．８９（ｍ，６Ｈ）。
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−アミン（化合物３３）
【０３８０】
【化１７】
2013537423.tif 000068
０℃まで冷却したオレイン酸（１ｇ，３．５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５００ｍＬ）溶液に、ＣＤＩ（０．６３ｇ，３．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を周囲温度まで３０分間昇温させた後、０℃まで冷却し、まずトリエチルアミン（０．３９ｇ，３．９ｍｍｏｌ）で、次いでジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（０．３８ｇ，３．９ｍｍｏｌ）で処理した。１時間後、反応液を水とヘプタンに分配した。有機部分を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートし、粗製ワインレブアミドｉｉを得、これを直接、次の反応に持ち越した。
【０３８１】
【化１８】
2013537423.tif 000069
ジエチル亜鉛（７０．３ｍｍｏｌ，７０．３ｍＬの１Ｍ溶液）のジクロロメタン（１３０ｍＬ）溶液を−１℃まで冷却し、ＴＦＡ（８．０ｇ，７０．３ｍｍｏｌ）の滴下で処理した。３０分後、ジヨードメタン（１８．８ｇ，７０．３ｍｍｏｌ）を添加し、これを氷浴内で３０分間熟成させた。この溶液に、ワインレブアミドｉｉ（７．６ｇ，２３．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を周囲温度まで昇温させ、１時間撹拌した。塩化アンモニウム溶液（１００ｍＬ）を用いて反応液をクエンチし、有機層を分配して取り出し、１０％チオ硫酸ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。精製はフラッシュクロマトグラフィーとし（０から３０％までのＭＴＢＥ／ヘプタン）、所望の生成物ｉｘを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ３．７２（ｓ，３Ｈ），３．２２（ｓ，３Ｈ），２．４８（ｔ，２Ｈ），１．６５（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｍ，２２Ｈ），１．１８（ｍ，２Ｈ），０．９１（ｔ，３Ｈ），０．６８（ｍ，２Ｈ），０．５９（ｍ，１Ｈ），−０．３２（ｍ，１Ｈ）。
【０３８２】
【化１９】
2013537423.tif 000070
ワインレブアミドｉｘの化合物３３への変換は、上記の化合物１について記載のものと同様の様式で行なった（ノニルグリニャール付加の後、還元的アミノ化）。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝４３６．６．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ２．２５（ｓ，６Ｈ），１．３０（ｍ，４５Ｈ），０．９１（ｍ，６Ｈ），０．６８（ｍ，２Ｈ），０．５９（ｍ，１Ｈ），−０．３１（ｍ，１Ｈ）。
【０３８３】
化合物３４〜４３は新規なカチオン性脂質であり、上記の一般スキーム１〜４に従って調製した。
【０３８４】
【表１２】
2013537423.tif 000071
2013537423.tif 000072
（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２３−トリエン−１０−アミン（化合物４４）
【０３８５】
【化２０】
2013537423.tif 000073
−７８℃まで冷却したＬＤＡ（９５ｍｍｏｌ，４７．５ｍＬの２Ｍ溶液）のＴＨＦ（１２７ｍＬ）溶液に、酢酸ｔ−ブチルを添加した。反応液を１５分間撹拌した後、アルデヒドｘを添加した。直ちに塩化アンモニウム溶液を用いて反応液をクエンチし、周囲温度まで昇温させ、水／ペンタン間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ）＝３２５．４。
【０３８６】
【化２１】
2013537423.tif 000074
ヒドロキシケトンｘｉ（７ｇ，１８．４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５０ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却し、デオキソフルオル（７．３ｇ，３３．１ｍｍｏｌ）で処理した。反応液を１６時間撹拌して、周囲温度まで昇温させた後、重炭酸ナトリウム溶液を用いてクエンチした。反応液を分配し、有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍｏｔａｇｒａｐｈｙ）（０から５％までの酢酸エチル／ヘキサン）により、フルオロエステルを得た。
【０３８７】
フルオロエステル中間体（６ｇ，１５．６ｍｍｏｌ）（ジクロロメタン中）を塩化水素（１５７ｍｍｏｌ，３９．２ｍＬの４Ｍのジオキサン溶液）で処理し、反応液を周囲温度で１６時間撹拌した。反応液を真空にてエバポレートし、所望のβ−フルオロ酸ｘｉｉを得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝３２７．３。
【０３８８】
【化２２】
2013537423.tif 000075
フルオロカルボン酸ｘｉｉ（５．１ｇ，１５．７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（６．０ｇ，３１．４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（３．１ｇ，３１．４ｍｍｏｌ）、トリメチルアミン（４．０ｇ，３９．２ｍｍｏｌ）、およびＨＯＡｔ（４．３ｇ，３１．４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７８ｍＬ）中で合わせ、周囲温度で１６時間撹拌した。反応液を水／ＤＣＭ間に分配し、有機部分を水（３×）とＮａＯＨ溶液（１×）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。粗製物質を逆相分取用クロマトグラフィーによって精製し、所望のワインレブアミドｘｉｉｉを得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝３７０．４。
【０３８９】
【化２３】
2013537423.tif 000076
ワインレブアミドｘｉｉｉ（４．３ｇ，１１．７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液を、ノニルマグネシウムブロミド（２３．４ｍｍｏｌ，２３．４ｍＬの１Ｍ溶液）で周囲温度にて処理した。１時間後に塩化アンモニウム溶液を用いて反応液をクエンチし、水とペンタン間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。この物質を次の工程に粗製状態で持ち越した。
【０３９０】
【化２４】
2013537423.tif 000077
ケトンｘｉｖ（５．１ｇ，１１．７ｍｍｏｌ）をジメチルアミン（２９．３ｍｍｏｌ，１４．７ｍＬの２ＭのＴＨＦ溶液）とチタン（ＩＶ）イソプロポキシド（６．７ｇ，２３．５ｍｍｏｌ）で処理し、反応液を周囲温度で１６時間撹拌した。反応混合物にエタノール（５０ｍＬ）を添加した後、水素化ホウ素ナトリウム（０．６７ｇ，１７．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を直接シリカカラムに負荷し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した（０から１５％までのＭｅＯＨ／ＤＣＭ）。この物質は、分取用逆相クロマトグラフィーによる２回目の精製が必要であり、（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２３−トリエン−１０−アミンを得た。ＨＲＭＳ  計算値４４６．４７２０，実測値４４６．４７２４。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．４８（ｍ，１Ｈ），５．３７（ｍ，４Ｈ），５．２３（ｍ，１Ｈ），２．７８（ｔ，２Ｈ），２．５８（ｍ，１Ｈ），２．２２（ｓ，６Ｈ），２．０４（ｍ，６Ｈ），１．５６（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｍ，３１Ｈ），０．８９（ｍ，６Ｈ）。
【０３９１】
化合物４５は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，２８，１７２−１７６、ＷＯ２０１０／０４２８７７  Ａ１、ＷＯ２０１０／０４８５３６  Ａ２、ＷＯ２０１０／０８８５３７  Ａ２、およびＷＯ２００９／１２７０６０  Ａ１に記載のＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡである。
【０３９２】
【化２５】
2013537423.tif 000078
化合物４６は、ＷＯ２０１０／０５４４０１、およびＷＯ２０１０／１４４７４０  Ａ１に記載のＭＣ３である。
【０３９３】
【化２６】
2013537423.tif 000079
Ｅ．脂質ナノ粒子組成物
以下の本発明の脂質ナノ粒子組成物（ＬＮＰ）：
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ５６．６／３８／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６７．３／２９／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ４９．３／４７／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ５０．３／４４．３／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０；および
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ５８／３０／２／１０
は、オリゴヌクレオチド、特に本発明のｓｉＮＡ分子の送達に有用である。
【０３９４】
当業者には、本発明が、課題を遂行するため、ならびに記載の目的および利点ならびに本発明に固有の目的および利点を得るために充分適合したものであることが容易に認識されよう。現時点で代表的な好ましい実施形態である本明細書に記載の方法および組成物は、例示的であり、本発明の範囲に対する限定を意図しない。当業者には、本発明の精神に包含され、特許請求の範囲によって規定される本発明の変形例および他の使用が思いつくであろう。
【０３９５】
【表１３】
2013537423.tif 000080
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【０３９６】
【表１４】
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2013537423.tif 000084
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【０３９７】
【表１５】
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【０３９８】
【表１６】
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【０３９９】
【表１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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