(57)【要約】  組換えタンパク顆粒を誘導するためのポリペプチド配列が記載される。これらの配列は、いずれかの末端にある２個のシステイン残基の間にポリプロリンＩＩ（ＰＰＩＩ）構造とＥＲシグナル配列とを含んでなる。組換えタンパク顆粒は、多量の組換えタンパク質の簡単かつ効率的な精製を可能とするのでタンパク質生産に有用である。さらに、例えば予防接種など、組換えタンパク顆粒を使用する他の方法も記載される。
2013532960.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３６アミノ酸長のポリプロリンＩＩ（ＰＰＩＩ）構造を含んでなる組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列（ＰＢＩＳ）であって、
前記ＰＰＩＩ構造が、Ｎ末端の少なくとも２個のシステインと、Ｃ末端の少なくとも２個のシステインとの間に位置し、
前記ＰＰＩＩ構造中のアミノ酸のうち１０％以下がリシンまたはアルギニンであり、かつ
前記ＰＰＩＩ構造が配列（ＰＰＰＶＨＬ）６（配列番号２９）を含まない、
組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列（ＰＢＩＳ）。
【請求項２】
少なくとも３６アミノ酸長のプロリンリッチ配列を含んでなる、組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列（ＰＢＩＳ）であって、
前記プロリンリッチ配列が、Ｎ末端の少なくとも２個のシステインと、Ｃ末端の少なくとも２個のシステインとの間に位置し、
前記プロリンリッチ配列中のアミノ酸のうち１０％以下がリシンまたはアルギニンであり、かつ
前記プロリンリッチ配列が配列（ＰＰＰＶＨＬ）６（配列番号２９）を含まない、
組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列（ＰＢＩＳ）。
【請求項３】
前記ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ領域が少なくとも５個のプロリンリッチリピートを含んでなる、請求項１または２に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項４】
前記プロリンリッチリピートのそれぞれが、ＰＰＰＸＸＸ（配列番号１０）、ＰＰＸＸ（配列番号６）、ＰＸ、ＰＰＰＸＸ（配列番号９）、ＰＰＰＸ（配列番号５）、ＰＰＸ、およびＰＰＰＸＰＸ（配列番号１１）からなる群から独立して選択され、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項３に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項５】
前記ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ領域の長さが約４０〜６０アミノ酸である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項６】
前記ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ領域が、非両親媒性ＰＰＩＩ構造、両親媒性負電荷ＰＰＩＩ構造、および両親媒性非電荷ＰＰＩＩ構造からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項７】
前記ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ領域が負電荷両親媒性配列を含んでなる、請求項６に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項８】
前記負電荷両親媒性配列が、ＰＰＰＶＤＬ（配列番号１９）およびＰＰＰＶＥＬ（配列番号１８）からなる群から独立して選択される少なくとも１個のリピートを含んでなる、請求項７に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項９】
前記負電荷両親媒性配列が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号１２３、および配列番号１２４からなる群から独立して選択される、請求項８に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項１０】
前記ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ領域が非電荷両親媒性配列である、請求項９に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項１１】
前記非電荷両親媒性配列が、ＰＰＰＶＮＬ（配列番号２１）およびＰＰＰＶＱＬ（配列番号２２）の群から独立して選択される少なくとも１個のリピートを含んでなる、請求項１０に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項１２】
前記非電荷両親媒性配列が配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、および配列番号３５の群から独立して選択される、請求項１１に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項１３】
前記ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ領域が非両親媒性配列である、請求項６に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項１４】
前記非両親媒性配列が、ＰＰＰＶＡＬ（配列番号１６）、ＰＰＰＶＴＬ（配列番号２０）、ＰＰＰＶＳＬ（配列番号３６）、ＰＰＰＶＶＬ（配列番号３７）、およびＰＰＰＶＬＬ（配列番号１７）からなる群から独立して選択される少なくとも１個のリピートを含んでなる、請求項１３に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項１５】
前記非両親媒性配列が、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、および配列番号４９からなる群から独立して選択される、請求項１４に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項１６】
前記非両親媒性配列が、プロリンおよびアラニンからなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる、請求項１５に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項１７】
前記プロリンおよびアラニンからなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる配列が、ＰＰＰＡＡＡ（配列番号１３）、ＰＰＰＡＰＡ（配列番号２３）、およびＰＰＰＰＰＰ（配列番号２４）からなる群から選択される少なくとも１個のリピートを含んでなる、請求項１６に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項１８】
前記プロリンおよびアラニンからなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる配列が、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号６０、および配列番号６１からなる群から独立して選択される、請求項１７に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項１９】
前記非両親媒性配列が、配列（ＧＸＹ）ｎ（ここで、ＸおよびＹは独立して任意のアミノ酸であり、ｎは５〜２０の整数である）から本質的になり、かつ前記（ＧＸＹ）ｎを含んでなる配列が少なくとも３０％のプロリンを含んでなる、請求項１３に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項２０】
前記非両親媒性配列が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ３４６８３．１のアミノ酸１３５〜１７９と少なくとも７０％の同一性を示すアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる、請求項１９に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項２１】
前記非両親媒性配列が、配列番号５６および配列番号６８からなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる、請求項２０に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項２２】
前記非両親媒性配列が、表面アドヘシンＡｇＩ／ＩＩ（ミュータンス連鎖球菌ＮＧ８、ＧｅｎｅＢａｎｋ：ＧＱ４５６１７１由来のアミノ酸８８４〜９２７と少なくとも７０％の同一性を示すアミノ酸から本質的になる、請求項１３に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項２３】
前記非両親媒性配列が、配列番号６９および配列番号７０からなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる、請求項２２に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項２４】
Ｃ末端の２個のシステインの間のアミノ酸の数が０〜２０の整数であり、かつ／またはＮ末端の２個のシステインの間のアミノ酸の数が０〜２０の整数である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項２５】
前記ＰＰＩＩ構造のＮ末端のＣ末端システインとＮ末端との間、または前記ＰＰＩＩ構造のＣ末端のＮ末端システインとＣ末端との間のアミノ酸の数が、約１〜３０から独立して選択される整数である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項２６】
前記Ｎ末端の２個のシステインまたは前記Ｃ末端の２個のシステインが第２のプロリンリッチ領域内に見られる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項２７】
前記第２のプロリンリッチ配列が、配列（ＰＸ）ｎ（ここで、ｎは０〜２０の間の整数である）から本質的になる、請求項２６に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項２８】
前記第２のプロリンリッチ配列が、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号１２７からなる群から選択される、請求項２７に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項２９】
前記ＰＢＩＳが、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８７、配列番号８８、配列番号１２５、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、および配列番号１０１からなる群から選択される、請求項２８に記載の組換えＰＢＩＳ。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組換えＰＢＩＳと、異種タンパク質とを含んでなる、融合タンパク質。
【請求項３１】
前記異種タンパク質が組換えＰＢＩＳに対してＣ末端にある、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
前記異種タンパク質が組換えＰＢＩＳに対してＮ末端にある、請求項３１に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
前記ＰＢＩＳと、異種タンパク質とがリンカーにより接続される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
前記リンカーが酵素的または化学的タンパク質分解試薬の標的部位を含んでなる、請求項３３に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
前記酵素的タンパク質分解試薬の標的部位が、エンテロキナーゼ標的部位、因子Ｘａ標的部位、およびインテインからなる群から選択される、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組換えＰＢＩＳまたは請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする配列を含んでなる、核酸分子。
【請求項３７】
前記ＰＢＩＳまたは融合タンパク質を小胞体へと導くシグナル配列をコードする配列をさらに含んでなり、前記シグナル配列が前記ＰＢＩＳまたは融合タンパク質と同じオープンリーディングフレームにある、請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項３８】
前記シグナル配列がγゼインシグナルペプチドである、請求項３７に記載の核酸分子。
【請求項３９】
プロモーターをさらに含んでなる、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４０】
前記プロモーターが、タバコ細胞、哺乳類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、または藻類細胞からなる群から選択される細胞において機能的である、請求項３９に記載の核酸分子。
【請求項４１】
請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項４２】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組換えＰＢＩＳまたは請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含んでなる、ＲＰＢＬＡ。
【請求項４３】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組換えＰＢＩＳ、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の核酸、請求項４２に記載のＲＰＢＬＡの請求項４１に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項４４】
前記細胞が、高等植物細胞、糸状菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、または藻類細胞である、請求項４３に記載の宿主。
【請求項４５】
請求項４３または４４のいずれか一項に記載の細胞を、ＲＰＢＬＡの形成に好適な条件下で培養することを含んでなる、ＲＰＢＬＡの製造方法。
【請求項４６】
（ｉ）請求項４３または４４のいずれか一項に記載の細胞をＲＰＢＬＡの形成に好適な条件下で培養すること、および（ｉｉ）組換えタンパク顆粒を精製することを含んでなる、ＲＰＢＬＡの精製方法。
【請求項４７】
（ｉ）植物宿主系を請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の核酸または請求項４１に記載のベクターで形質転換すること、
（ｉｉ）前記形質転換植物宿主系から植物体を作出すること、および
（ｉｉｉ）前記植物体をＲＰＢＬＡの形成に好適な条件下で栽培すること
を含んでなる、ＲＰＢＬの製造方法。
【請求項４８】
（ｉ）植物宿主系を請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の核酸または請求項４１に記載のベクターで形質転換すること、
（ｉｉ）前記形質転換植物宿主系から植物体を作出すること、
（ｉｉｉ）前記植物体をＲＰＢＬＡの形成に好適な条件下で栽培すること、および
（ｉｖ）前記ＲＰＢＬＡを精製すること
を含んでなる、ＲＰＢＬＡの製造方法。
【請求項４９】
ＲＰＢＬＡの精製が、
（ｉｖ）水性細胞ホモジネートを調製すること、
（ｖ）水性細胞ホモジネート中に密度の異なる領域を形成して、高濃度のＲＰＢＬＡを含有する領域と低濃度のＲＰＢＬＡを含有する領域を設けること、および
（ｖｉ）比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域からＲＰＢＬＡ枯渇領域を分離し、それにより、ＲＰＢＬＡを精製すること
を含んでなる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
（ｉ）包膜融合タンパク質を含んでなるＲＰＢＬＡを準備すること、ここで、前記融合タンパク質は請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質であり、
（ｉｉ）前記ＲＰＢＬＡと、膜を解離する量の界面活性剤を含有する水性緩衝液とを接触させること、
（ｉｉｉ）膜を解離させるのに十分な時間および融合タンパク質を変性させない温度で接触を維持して、融合タンパク質から膜を分離すること、および
（ｉｖ）分離した融合タンパク質を回収すること
を含んでなる、融合タンパク質の精製方法。
【請求項５１】
（ｉ）包膜融合タンパク質を含んでなるＲＰＢＬＡを準備すること、ここで、前記融合タンパク質は請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質であり、
（ｉｉ）前記ＲＰＢＬＡと、膜を解離する量の界面活性剤を含有する水性緩衝液とを接触させること、
（ｉｉｉ）膜を解離させるのに十分な時間および融合タンパク質を変性させない温度で接触を維持して、融合タンパク質から膜を分離すること、
（ｉｖ）分離した融合タンパク質を回収すること、および
（ｖ）組換えＰＢＩＳと、異種タンパク質との間の切断部位を切断すること
を含んでなる、タンパク質の精製方法。
【請求項５２】
治療上有効な量の請求項４２に記載のＲＰＢＬＡを含んでなる、医薬組成物。
【請求項５３】
免疫原性上、有効な量の請求項４２に記載のＲＰＢＬＡを含んでなる、ワクチン。
【請求項５４】
薬学上許容可能な希釈剤をさらに含んでなる、請求項５２に記載の医薬組成物または請求項５３に記載のワクチン。
【請求項５５】
請求項４２に記載のＲＰＢＬＡを含んでなる、食品。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、真核細胞において組換えタンパク顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）の形成を誘導することができるペプチドに関する。さらに、組換えタンパク顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）形成の誘導を媒介する配列に融合された異種ポリペプチドが宿主系において安定的に発現され、蓄積される。
【０００２】
背景技術
数十年前、プロラミンは穀類の内胚乳における天然タンパク顆粒（Protein Body）（ＰＢ）の形成に関与する極めて特殊な貯蔵タンパク質として記載された(Sherry et al, 1990, Biochem. J. 267: 1-12)。しかしながら、これまでにこの種のオルガネラを誘導する機構および必要条件については知られていない。
【０００３】
内胚乳は、他の組織および細胞種よりもタンパク質をＰＢへ選別する傾向が大きいと思われる特殊な植物組織である。これらのタンパク質がプロラミンと融合されない場合であってもそうである。例えば、イネの葉細胞から分泌される組換えフィターゼタンパク質は、内胚乳で発現される場合にはＰＢ内に保持される（Drakakaki et al, 2006, Plant Physiology, 141, 578-586）。同様に、ヒトサイトメガロウイルスの主要糖タンパク質（ｇＢ）(Wright et al, 2001, Transgenic Research 10: 177-181)およびリゾチーム(Yang et al, 2003, Planta 216: 597-603)も、プロラミンと融合されない場合であっても双子葉および単子葉植物内胚乳のＰＢに蓄積する。興味深いことに、リゾチームが非プロラミン関連シグナルペプチドと融合され、および非プロラミンプロモーターの制御下で発現された場合であっても（プロインドリンｂ）、それはイネ内胚乳のＰＢに蓄積する（Hennegan et al., 2005, Transgenic Research 14:583-592）。これらのデータはＰＢ内でのタンパク質の蓄積は内胚乳の特殊な貯蔵環境を必要とし得ることを示唆する。
【０００４】
タンパク質が内胚乳に選別されるこの大きな傾向はまた、ＫＤＥＬ（配列番号１１０）タグを有する組換えタンパク質を用いた実験によっても証明される。ＫＤＥＬタグは、タンパク質を小胞体（ＥＲ）中に維持する助けをすることから、「ＥＲ保持シグナル」としても知られる。従って、ヒト血清アルブミンがＫＤＥＬタグと融合されると、それは葉細胞のＥＲ管腔に局在する。しかしながら、内胚乳で発現されると、ＫＤＥＬタグを有するヒト血清アルブミンは液胞内のプロラミン凝集体に沈着された。さらに、葉の小胞体に効率的に保持されるＫＤＥＬタグを有するモノクローナル抗体は、一部は分泌され、一部は種子のタンパク質貯蔵液胞に選別される（Petruccelli et al, 2006, Plant Biotechnol J. 4:511-27）。
【０００５】
従って、穀類内胚乳細胞内のタンパク質輸送は、小胞体（ＥＲ）由来および液胞タンパク顆粒の存在量を含む内胚乳特異的環境に影響を受ける。よって、内胚乳のＰＢに選別されるタンパク質は他の細胞または組織のＰＢには選別され得ず、内胚乳においてＰＢの形成を誘導するのに十分な配列および構造が、他の細胞または組織におけるＰＢの形成には必ずしも十分でない可能性がある。
【０００６】
さらに、ＰＢの形成を誘導するのに十分な特定の配列および構造は同定されていない。実際に、ＰＢ形成に関与する全タンパク質を比較しても、配列、構造、または物理的および化学的特徴に関して明らかな相同性はほとんどないのが明らかである。
【０００７】
γゼインはトウモロコシのタンパク顆粒の主成分である(Ludevid et al, 1984, Plant Mol. Biol. 3, 227-234)。γゼインのＮ末端ドメインは、ＥＲにおけるγゼインの選別(Geli, et al. Plant Cell 6: 1911 (1994))およびタンパク顆粒の形成に必要なＰｒｏ−Ｘ領域（Ｐ−Ｘ）および多重繰り返し配列（ＰＰＰＶＨＬ）８（配列番号２７）（ＲＤ）を含む。米国特許出願公開第２００７／０２４３１９８号も参照。ｐＨ５の水中での、配列（ＶＨＬＰＰＰ）ｎ（配列番号２８）（ｎ＝３、５、８）の一連の合成ペプチドの円偏光二色性研究では、これらのペプチドがポリプロリンＩＩ（ＰＰＩＩ）ヘリックスをとっていることが示された(Rabanal, Biopolymers 33: 1019-28 (1993))。γゼインはまた数個のシステインも含み、これらは安定なＰＢの形成に必要であることが示された(Pompa, Plant Cell 18: 2608-2621 (2006))。
【０００８】
γゼインのＲＤのＰＰＩＩヘリックスは顕著な両親媒性特徴を有する。従前の研究では、ＰＰＩＩヘリックスの両親媒性は安定なＰＢの形成に重要であることが示唆され、両親媒性ＰＰＩＩヘリックス（ＶＨＬＰＰＰ）８（配列番号２７）の界面活性特性はいくつかのアプローチによって証明された(Kogan et al, 2001, J. Mol. Biol. 312, 907-913003、 Kogan et al, 2002, Biophysical Journal. Volume 83. 1194-1204)。例えば、合成オクタマーペプチド（ＶＨＬＰＰＰ）８は、大きくは、水相から離れるように配向する疎水性部分による空気−水界面への両親媒性物質の吸着のために、水の表面張力を小さくすることができることが示された(Ludevid et al, 1984, Plant Mol. Biol. 3, 227-234)。また、この両親媒性ペプチドはダイズホスファチジルコリンリポソームと相互作用し、会合して膜を越える延長ドメインを形成し、その安定性および透過性を高めることも証明された(Kogan et al, 2004, Biopolymers, Vol. 73, 258-268)。膜における（ＶＨＬＰＰＰ）８（配列番号２７）の自発的両親媒性集合体は、トウモロコシタンパク顆粒内のγ−ゼイン沈着の機構を示唆する。γ−ゼインＲＤの両親媒性特徴に基づき、このタンパク質がＥＲ膜の内面と相互作用して、ＰＢ誘導機構の重要な要素である可能性のある内被を誘導するという提案がなされた(Ludevid et al, 1984, Plant Mol. Biol. 3, 227-234)。そして、この被膜はγゼインの繰り返し配列を挟み込むシステイン残基を含む分子内ジスルフィド架橋によって共有結合的に安定化され得る。
【０００９】
γ−ゼインタンパク質のいくつかの特徴は特定されているが、これらの特徴または特徴の組合せのうちどれがタンパク顆粒の形成に関連するかはこれまでに理解されていない。さらに、他のタンパク顆粒誘導配列は、γ−ゼインと類似の構造または配列をほとんどまたは全く含まない。以下にさらに詳しく記載するように、タンパク顆粒を誘導し得る最小配列が同定された。さらに、組換えタンパク顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）形成能の増大および改良された特徴を備えたＲＰＢＬＡの形成することができるなどの、改良された特性を備えた組換えタンパク顆粒誘導配列が同定された。
【発明の概要】
【００１０】
一つの態様において、本発明は、少なくとも３６アミノ酸長のポリプロリンＩＩ（ＰＰＩＩ）構造を含んでなる組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列（ＰＢＩＳ）であって、
前記ＰＰＩＩ構造がＮ末端の少なくとも２個のシステインと、Ｃ末端の少なくとも２個のシステインとの間に位置し、
前記ＰＰＩＩ構造中のアミノ酸のうち１０％以下がリシンまたはアルギニンであり、かつ
前記ＰＰＩＩ構造が配列（ＰＰＰＶＨＬ）６（配列番号２９）を含まない、組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列に関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、少なくとも３６アミノ酸長のプロリンリッチ配列を含んでなる組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列（ＰＢＩＳ）であって、
前記プロリンリッチ配列がＮ末端の少なくとも２個のシステインと、Ｃ末端の少なくとも２個のシステインとの間に位置し、
前記プロリンリッチ配列中のアミノ酸のうち１０％以下がリシンまたはアルギニンであり、かつ
前記プロリンリッチ配列が配列（ＰＰＰＶＨＬ）６（配列番号２９）を含まない、組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列に関する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、本発明による組換えＰＢＩＳと、異種タンパク質とを含んでなる融合タンパク質に関する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、本発明による組換えＰＢＩＳまたは本発明による融合タンパク質をコードする配列を含んでなる核酸分子、および本発明の核酸を含んでなるベクターに関する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、本発明による組換えＰＢＩＳまたは本発明による融合タンパク質を含んでなるＲＰＢＬＡに関する。別の態様において、本発明は、本発明の組換えＰＢＩＳ、本発明による融合タンパク質、本発明による核酸、本発明によるベクターまたは本発明によるＲＰＢＬＡを含んでなる宿主細胞に関する。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、本発明によるＲＰＢＬＡの生産および精製方法、ならびに本発明によるＲＰＢＬＡの一部を形成する融合タンパク質の精製方法および本発明によるＲＰＢＬＡの一部を形成する融合タンパク質の一部を形成するタンパク質の精製方法に関する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、治療上有効な量の本発明のＲＰＢＬＡを含んでなる医薬組成物、免疫原性上、有効な量の本発明のＲＰＢＬＡを含んでなるワクチン、および本発明によるＲＰＢＬＡを含んでなる食品に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（Ａ）リポーター蛍光タンパク質と融合し、タバコ葉における浸潤法(agroinfiltration)により形質転換させたＲＸ３ペプチドの種々の変異体からのリピートドメイン（ＲＤ）の概略図。ＰＰＩＩヘリックスに沿った非プロリンアミノ酸の相対的位置を三角形で表す。両親媒性ヘリックスを有する変異体では、疎水側（下）と親水側（上）を分ける破線を示す。野生型ＲＸ３リピートドメインを中央に示す（グレーの四角）。ヒスチジン残基がアラニンまたはロイシンで置換された完全疎水性変異体（それぞれＲＸ３（Ａ）およびＲＸ３（Ｌ））を右に示す。ヒスチジン残基がアルギニンまたはリシンで置換された両親媒性正電荷変異体（それぞれＲＸ３（Ｒ）およびＲＸ３（Ｋ））を左に示す。（Ｂ）抗ＧＦＰ抗体でプローブした、ＲＸ３−ＧＦＰ、ＲＸ３（Ｒ）−ＧＦＰ、ＲＸ３−ＥＣＦＰおよびＲＸ３（Ｋ）−ＥＣＦＰを発現する等量のタバコ葉ホモジネートのウエスタンブロット解析。白い矢印は融合タンパク質を示し、黒い矢印は部分的に分解された蛍光タンパク質を示す。（Ｃ）ＧＦＰと融合された野生型ＲＸ３ペプチド（ＲＸ３−ＧＦＰ）、または繰り返しドメインのヒスチジン残基がアラニン、ロイシン、アルギニンまたはリシンに突然変異したＲＸ３ペプチドの数種の変異体（それぞれＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰ、ＲＸ３（Ｌ）−ＧＦＰ、ＲＸ３（Ｒ）−ＧＦＰおよびＲＸ３（Ｋ）−ＥＣＦＰ）を発現するタバコ葉細胞の共焦顕微鏡画像。矢印は分泌タンパク質に相当する蛍光を示す。白い矢印はＥＲ由来のＲＰＢＬＡを示し、黒い矢印は葉緑体を示す。バーは５マイクロメーターに相当する。
【図２】（Ａ）タバコ葉で発現され、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットにより分析された数種の融合タンパク質（ＲＸ３−ＧＦＰ、ＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰおよびＲＸ３（Ｌ）−ＧＦＰ）に関するステップ密度勾配結果の写真。（Ｂ）ステップ密度勾配後のＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰの富化を示すクーマシーブルー染色。密度勾配の異なる画分（（Ｈ）ホモジネート、（Ｓ）上清、（ｆ）相当するＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）クッション上の界面）を示す。
【図３】（Ａ）低速での遠心分離によるＲＰＢＬＡの回収。左のパネルは、タバコ葉で発現されたＲＸ３−ＧＦＰ  ＲＰＢＬＡおよびＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰ  ＲＰＢＬＡの単離後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色を示す。右のパネルは、穏和な条件（５０ｍＭホウ酸塩ｐＨ１０、１０ｍＭ  ｂＭＥ）で洗浄したＲＸ３−ＧＦＰ  ＲＰＢＬＡおよびＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰ  ＲＰＢＬＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色を示す。（Ｂ）クーマシーブルー染色（左）およびウエスタンブロット（右、抗ＧＦＰ抗体）は、ＲＸ３（Ｌ）−ＧＦＰの発現によりタバコ植物において誘導されたＲＰＢＬＡの低速遠心分離による回収を示す。（Ｈ０）明澄化前のホモジネート、（Ｈ１）濾過による明澄化後のホモジネート、（ＳＮ）遠心分離によるＲＰＢＬＡ回収後の上清、（Ｗｓ）洗浄工程の上清、（ｗＰＢ）洗浄工程後に遠心分離により回収されたＲＰＢＬＡ、（ｓＰＢ）ｗＰＢからの可溶化融合タンパク質、および（ｉＰＢ）可溶化工程後の不溶性画分。矢印は相当する単量体融合タンパク質を示す。アスタリスクは、多量体型の融合タンパク質を示す。
【図４】（Ａ）図１に記載されているＲＸ３（Ａ３）由来のリピートドメイン（ＲＤ）の概略図。（Ｂ）ＲＸ３（Ａ３）−ＥＣＦＰ発現ベクターを用いた浸潤法から３日および６日（ｄｐｉ）後のタバコ葉細胞の共焦顕微鏡画像。ＲＰＢＬＡは矢印で示す。バーは２マイクロメーターに相当する。
【図５】（Ａ）図１に記載されているＲＸ３ペプチドの両親媒性負電荷変異体（ＲＸ３（Ｅ）およびＲＸ３（Ｄ））由来のリピートドメインの概略図。（Ｂ）ＲＸ３−ＧＦＰ、ＲＸ３（Ｅ）−ＧＦＰ、ＲＸ３−ＥＣＦＰおよびＲＸ３（Ｄ）−ＥＣＦＰを発現するタバコ葉からの等量のホモジネートに対する抗ＧＦＰウエスタンブロット。（Ｃ）ＲＸ３（Ｅ）−ＧＦＰ（左）、およびＲＸ３（Ｄ）−ＥＣＦＰ（右）を発現するタバコ葉細胞の共焦顕微鏡画像。ＲＰＢＬＡは矢印で示す。バーは２マイクロメーターに相当する。
【図６】（Ａ）図１に記載されているＲＸ３ペプチドの極性非電荷変異体（ＲＸ３（Ｔ）、ＲＸ３（Ｎ）およびＲＸ３（Ｑ））由来のリピートドメインの概略図。（Ｂ）浸潤法から３日および６日（ｄｐｉ）後の、ＥＣＦＰと融合したこれらのアセンブラーペプチドの発現により誘導されたＲＰＢＬＡの画像。３および６ｄｐｉ画像に示されているバーはそれぞれ５および２マイクロメーターに相当する。
【図７】（Ａ）成熟型ＲＸ３、ＰＰおよびＰＡアセンブラーペプチドの配列アラインメント。３つのペプチド間の同一性を太字で示し、システイン残基をグレーの四角で示す。ＳＰはシグナルペプチドを示す。（Ｂ）ＰＰ−ＥＣＦＰ、ＰＡ−ＥＣＦＰおよびＲＸ３−ＥＣＦＰを発現するタバコ葉の等量のホモジネートの抗ＧＦＰウエスタンブロット。矢印は融合タンパク質を示す。（Ｃ）ＲＸ３−ＥＣＦＰ、ＰＰ−ＥＣＦＰおよびＰＡ−ＥＣＦＰを発現するタバコ葉細胞の共焦顕微鏡画像。ＲＰＢＬＡは矢印で示す。
【図８】（Ａ）ＥＣＦＰと融合したＲＸ３アセンブラーペプチドにおけるシステイン残基の位置を示す図。（Ｂ）タバコ葉の全タンパク質分析を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブルー染色（上のパネル）および抗ＧＦＰ免疫ブロット（下のパネル）：形質転換タバコ（レーン１）、ＲＸ３−ＥＣＦＰ発現タバコ（レーン２）、ＲＸ３  Ｃｙｓ７発現タバコ（レーン３）、ＲＸ３  Ｃｙｓ９発現タバコ（レーン４）、ＲＸ３  Ｃｙｓ６４発現タバコ（レーン５）、ＲＸ３  Ｃｙｓ８２発現タバコ（レーン６）、ＲＸ３  Ｃｙｓ８４発現タバコ（レーン７）、ＲＸ３  Ｃｙｓ９２発現タバコ（レーン８）、ＲＸ３  Ｃｙｓ７−Ｃｙｓ９発現タバコ（レーン９）、およびＲＸ３  Ｃｙｓ８２−  Ｃｙｓ８４−  Ｃｙｓ９２発現タバコ（レーン１０）。矢印はＲＸ３−ＥＣＦＰおよびＲＸ３−ＥＣＦＰ  Ｃｙｓ突然変異体の電気泳動バンドを示し、矢印の先はその他の免疫活性バンドを示す。（Ｃ−Ｋ）ＥＣＦＰと融合したＲＸ３−Ｃｙｓ突然変異体で形質転換された表皮細胞の蛍光パターンを示す共焦画像。Ｃ〜Ｈのバーは１０μｍに相当する。Ｉ〜Ｋのバーは２０μｍに相当する。
【図９】（Ａ）成熟型ＰＰおよびＰＰ２の配列アラインメント。２つのペプチド間の同一性を太字で示し、そしてシステイン残基をグレーの四角で示す。ＳＰはシグナルペプチドを示す。（Ｂ）ＰＰおよびＰＰ２由来ＰＰＩＩヘリックスの概略図。システイン残基が示されている。（Ｃ）ＰＰ２−ＧＦＰを発現するタバコ葉細胞の共焦顕微鏡画像。左のパネルは右のパネルの拡大図である。
【図１０】（Ａ）ＲＤの単位数の漸進的減少を示す、ＥＣＦと融合したＲＸ３ペプチドのバージョンの概略図。単位を符番したグレーの四角で示し、システイン残基をアスタリスクで示す。ＳＰはγゼイン由来のグナルペプチドを示す。ＰＸはｐｒｏ−Ｘドメインを示す。Ｎ１およびＮ２は非繰り返し配列を示す。（Ｂ）ＲＸ３−、Ｒ８（４Ｃ）−、Ｒ７（４Ｃ）−、Ｒ６（４Ｃ）−およびＲ４（４Ｃ）−ＥＣＦＰ融合タンパク質（矢印）を発現するタバコ葉からの等量のホモジネートのタンパク質パターンを示す、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。（Ｃ）Ｒ８（４Ｃ）−、Ｒ６（４Ｃ）−およびＲ４（４Ｃ）−ＥＣＦＰを発現するタバコ葉細胞の共焦顕微鏡画像。挿入画像の矢印はＲＰＢＬＡを示す。バーは、フル画像では２０マイクロメーター、挿入画像では５マイクロメーターに相当する。
【図１１】（Ａ、ＢおよびＣ）ＲＸ３、ＲＸ３（Ａ）およびＲＸ３（Ｅ）ペプチドと融合したｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質を発現するタバコ葉細胞の共焦顕微鏡画像（それぞれＡ、ＢおよびＣ）。（Α’、Ｂ’およびＣ’）ＲＰＢＬＡ（矢印）を強調するためのＡ、ＢおよびＣの高倍率画像。矢印は分泌ＲＸ３−ｍＣｈｅｒｒｙを示す。バーは５マイクロメーターに相当する。
【図１２】（Ａ）ＲＸ３−、ＲＸ３（Ｅ）−およびＲＸ３（Ａ）−ＥＧＦの発現により誘導されたＲＰＢＬＡの低速遠心分離による回収を比較したウエスタンブロット。明澄化後のホモジネート（レーン１）、遠心分離によるＲＰＢＬＡ回収後の上清（レーン２）、洗浄工程の上清（レーン３）および洗浄工程後に遠心分離により回収されたＲＰＢＬＡ（レーン４）。（Ｂ）穏和な条件でインキュベートした後に可溶化されたＲＸ３（Ｅ）−ＥＧＦ（レーン１）、ＲＸ３（Ａ）−ＥＧＦ（レーン２）、およびＲＸ３−ＥＧＦ（レーン３）を示すウエスタンブロット。相当する融合タンパク質の非可溶化画分を１６０００ｘｇで１０分間の遠心分離により回収し、それぞれレーン４、５および６に示す。（Ｃ）ＰＰ−、ＰＡ−、ＲＸ３（Ｅ）−およびＲＸ３−ＥＧＦを発現するタバコ葉からの等量のホモジネートのウエスタンブロット解析。（Ｄ）低速遠心分離により単離された相当するＲＰＢＬＡからの可溶化ＲＸ３（Ｅ）−ＥＧＦ（レーン２）、ＰＰ−ＥＧＦ（レーン５）およびＰＡ−ＥＧＦ（レーン８）融合タンパク質２を示すウエスタンブロット（それぞれレーン１、４および７）。残りの非可溶化融合タンパク質がレーン３、６および９に示されている。
【図１３】（Ａ）低速遠心分離によるＲＰＢＬＡの単離からＦＸａ消化による融合タンパク質の切断までのＲＸ３（Ｅ）−ＥＧＦ下流プロセスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色：分子マーカー（レーン１）、明澄化前のホモジネート（レーン２）、濾過による明澄化後のホモジネート（レーン３）、遠心分離によるＲＰＢＬＡ回収後の上清（レーン４）、洗浄工程の上清（レーン５、６）、洗浄工程後に遠心分離により回収されたＲＰＢＬＡ（レーン７）、可溶化工程後の不溶性画分（レーン８）、ｗＰＢからの可溶化融合タンパク質（レーン９）、および切断ＲＸ３（Ｅ）−ＥＧＦ融合タンパク質（レーン１０）。（Ｂ）逆相ＦＰＬＣによるＥＧＦ精製のクロマトグラム。矢印は、３０％アセトニトリルに相当するＥＧＦピークを示す。（Ｃ）ＲＦ−ＦＰＬＣインプット（レーン１）および純粋なＥＧＦを含有し、（Ｂ）において矢印で示されるピークに相当する画分（レーン２〜３）を示すクーマシーブルー染色。
【図１４】（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーブルー染色（左）およびウエスタンブロット（右）は、単離されたＲＸ３（Ａ）−ｈＧＨ  ＲＰＢＬＡを示す。（Ｂ）ＲＸ３−ｈＧＨおよびＲＸ３（Ａ）−ｈＧＨの可溶化効率を示す抗ｈＧＨウエスタンブロット。（Ｈ０）明澄化前のホモジネート、（Ｈ１）濾過による明澄化後のホモジネート、（ＳＮ）遠心分離によるＲＰＢＬＡ回収後の上清、（Ｗｓ）洗浄工程の上清、（ｗＰＢ）洗浄工程後に遠心分離により回収されたＲＰＢＬＡ、（ｓＰＢ）ｗＰＢからの可溶化融合タンパク質、および（ｉＰＢ）可溶化工程後の不溶性画分。
【図１５】（ＡおよびＢ）タンパク顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）、５個のグリシンリンカー（（Ｇｌｙ）５）、切断部位（ＣＳ）、ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製のインテインＭｘｅＧｙｒＡ（Ｉ）および目的タンパク質（ＰＯＩ）を示す融合タンパク質の概略図。ＣＳはエンテロキナーゼ切断部位（ＥＫ）およびＦＸａ切断部位（ＦＸａ）である。ＰＯＩはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、増強シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、エンテロキナーゼプロテアーゼ（ＥＫｐ）、キシラナーゼ（Ｘｙｌ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。Ｚｅｒａ（Ａｄｈ）融合タンパク質は、ＰＰＩＩヘリックスを形成するアドヘシン断片に由来する以下のＰＢＩＳ：Ｚ（Ａｄｈ）、Ｚ（Ａｄｈ２）、Ｚ（Ａｄｈ）ＰｘおよびＺ（Ａｄｈ２）Ｐｘに基づく融合タンパク質である。Ｚｅｒａ（Ｃｏｌ）融合タンパク質は、ＰＰＩＩヘリックスを形成するコラーゲン断片に由来する以下のＰＢＩＳ：Ｚ（Ｃｏｌ）、Ｚ（Ｃｏｌ  ２）、Ｚ（Ｃｏｌ）Ｐｘ、およびＺ（Ｃｏｌ  ２）Ｐｘに基づく融合タンパク質である。
【図１６】（Ａ）上のパネルは、ＲＸ３ΔＣｙｓ６４，８２，８４，９２−ＥＣＦＰ−ＫＤＥＬ（レーン１）、ＲＸ３−ＥＣＦＰ（レーン２）、およびＳＰ−ＥＣＦＰ−ＫＤＥＬ（レーン３）を発現するタバコ葉の明澄化前のホモジネートからの全タンパク質２０マイクログラムのクーマシーブルー染色。下は、抗ＧＦＰ抗体による同じホモジネートのウエスタンブロットである。矢印は融合タンパク質を示す。（Ｂ）浸潤法から３日および７日（ｄｐｉ）後の、ＲＸ３ΔＣｙｓ６４，８２，８４，９２−ＥＣＦＰ−ＫＤＥＬを発現するタバコ葉の共焦顕微鏡画像。白いバーは５マイクロメーターに相当する。（Ｃ）ステップ密度勾配によるＲＸ３−ＥＣＦＰ（左）およびＲＸ３ΔＣｙｓ６４，８２，８４，９２−ＥＣＦＰ−ＫＤＥＬ（右）の密度測定。等量の回収画分をクーマシーブルー染色（上のパネル）および抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロット（下のパネル）により分析した。各レーンは、（１）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配上にのせたサンプル、（２）１８％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）クッションの上から回収された上清、（３）１８〜３０％の間の画分、（４）３０〜３４％の間の画分、（５）３４〜３８％の間の画分、（６）３８〜４２％の間の画分、（７）４２〜４６％の間の画分、および（８）ペレット中に回収された画分を示す。
【図１７】（Ａ）Ｚ（Ａｄｈ）（配列番号９８）、Ｚ（Ａｄｈ）Ｐｘ（配列番号９４）、Ｚ（Ｃｏｌ）（配列番号１００）およびＺ（Ｃｏｌ）Ｐｘ（配列番号９６）アセンブラーペプチドの配列アラインメント。シグナルペプチド（全ての場合、２７ＫＤａのγゼイン由来）は示されていない。下線のアミノ酸（Ａｄｈ−配列番号１２８、Ｃｏｌ−配列番号１２９）は、アドヘシンまたはコラーゲン遺伝子由来のタンパク質断片に相当する。黒いバーは、ＰＰＩＩ構造をとる高い傾向を有する断片を示す。（Ｂ）Ｚ（Ａｄｈ）Ｐｘ−ＧＦＰ、Ｚ（Ｃｏｌ）Ｐｘ−ＧＦＰ、Ｚ（Ａｄｈ）−ＧＦＰおよびＺ（Ｃｏｌ）−ＧＦＰを発現する等量のタバコ葉（総タンパク質２０マイクログラム）に由来する明澄化前のホモジネートのクーマシーブルー染色（それぞれレーン１〜４）。矢印は、融合タンパク質を示す。（Ｃ）左から右へ、Ｚ（Ａｄｈ）−ＧＦＰ、Ｚ（Ｃｏｌ）−ＧＦＰ、Ｚ（Ａｄｈ）Ｐｘ−ＧＦＰおよびＺ（Ｃｏｌ）Ｐｘ−ＧＦＰを発現するタバコ葉の共焦顕微鏡画像。白いバーは５マイクロメーターに相当する。（Ｄ）クーマシーブルー染色により分析した１５００ｘｇでの低速遠心分離によるＲＰＢＬＡ回収の下流プロセス。明澄化前のホモジネート（レーン１）を１５００ｘｇで遠心分離し、上清（レーン２）を廃棄した。３回の洗浄工程（レーン３〜５）後に、ＲＰＢＬＡに相当するペレットを得た画分（レーン６）。Ｚ（Ａｄｈ）−ＧＦＰ（Ｄ１）、Ｚ（Ｃｏｌ）−ＧＦＰ（Ｄ２）、Ｚ（Ａｄｈ）Ｐｘ−ＧＦＰ（Ｄ３）およびＺ（Ｃｏｌ）Ｐｘ−ＧＦＰ（Ｄ４）を発現する等量のタバコ葉で行ったこのプロセスを示す。
【図１８】（Ａ）成熟型アセンブラーペプチドの概略図：（ｉ）ＲＸ３および（ｉｉ）逆転ＲＸ３（ｉＲＸ３）。種々のドメイン：（Ｎ）Ｎ末端断片、（ＲＤ、グレー）繰り返しドメインおよび（ＰＸ）Ｐｒｏ−Ｘドメインの配向を矢印で示す。システイン残基の位置も示す。（Ｂ）ＲＸ３−ＥＣＦＰ、ＥＣＦＰ−ＲＸ３、ｉＲＸ３−ＥＣＦＰおよびＥＣＦＰ−ｉＲＸ３を発現するタバコ葉細胞の共焦顕微鏡画像。ＲＰＢＬＡは矢印で示す。バーは５マイクロメーターに相当する。（Ｃ）ＲＸ３−ＥＣＦＰ、ＥＣＦＰ−ＲＸ３、ｉＲＸ３−ＥＣＦＰまたはＥＣＦＰ−ｉＲＸ３を発現するタバコ植物のＲＰＬＢＡ密度の測定。ホモジネート（レーン１）を多段階Ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配の上層にのせ、８０．０００ｘｇでの遠心分離後に以下の画分を回収した：（レーン２）上清、（レーン３）１，１１７ｇ／ｃｍ３クッション上の界面、（レーン４）１．１７５ｇ／ｃｍ３クッション上の界面、（レーン５）１．２１ｇ／ｃｍ３クッション上の界面、（レーン６）１．２３３ｇ／ｃｍ３クッション上の界面、（レーン７）１．２６ｇ／ｃｍ３クッション上の界面および（レーン８）試験管の底のペレット。等容量の各画分を抗ＲＸ３抗体によるウエスタンブロットにより分析した。
【図１９】（Ａ）ＣＨＯ細胞のＲＰＢＬＡにおけるｈＧＨ−ｉＲＸ３の蓄積。左のパネルは、ＣＨＯ細胞においてｈＧＨ−ｉＲＸ３発現により誘導されたＲＰＢＬＡ密度の決定を示す。ホモジネート（Ｈ）を多段階スクロース密度勾配にのせ、８０．０００ｘｇでの遠心分離後に以下の画分を回収した：（Ｓ）上清、（Ｆ２７）２７％スクロースクッション上の界面、（Ｆ３５）３５％スクロースクッション上の界面、（Ｆ４２）４２％スクロースクッション上の界面、（Ｆ５６）５６％スクロースクッション上の界面および（Ｐ）試験管の底のペレット。分子マーカーを左にｋＤａで示し、ｈＧＨ−ｉＲＸ３融合タンパク質およびｈＧＨの予測位置を右に矢印で示す。ウエスタンブロットで用いた抗体は抗ｈＧＨに相当する。右のパネルは、哺乳類ＣＨＯ細胞におけるｈＧＨ−ｉＲＸ３融合タンパク質の免疫組織化学を示す。抗ｈＧＨ抗体とともにインキュベートしたｈＧＨ−ｉＲＸ３発現ＣＨＯ細胞の共焦顕微鏡画像は、細胞内ＲＰＢＬＡに融合タンパク質の蓄積を示す（矢印）。（Ｂ）哺乳類ＣＨＯ細胞におけるＥＫ−ＲＸ３およびＤｓＲＥＤ−ｉＲＸ３融合タンパク質の免疫組織化学。左のパネルは、抗ＲＸ３抗体（ａＲ８）とともにインキュベートしたＥＫ−ＲＸ３発現ＣＨＯ細胞の共焦顕微鏡画像を示す。右のパネルは、ＲＰＢＬＡがＤｓＲＥＤ−ｉＲＸ３の固有蛍光(florescence)によって直接観察できることを示す。ＤｓＲＥＤ−ｉＲＸ３融合タンパク質を含有する細胞内ＲＰＢＬＡを矢印で示す。Ｎは細胞核に相当する。（Ｃ）Ｓｆ９昆虫細胞におけるｈＧＨ−ｉＲＸ３の発現によるＲＰＢＬＡの誘導。左のパネルは、抗ｈＧＨ抗体とともにインキュベートしたＧＨ−ｉＲＸ３発現昆虫細胞の共焦顕微鏡画像を示す。上の画像は、バック／グラウンド標識を示す非感染Ｓｆ９細胞に相当する。下の画像は、ＲＰＢＬＡにおけるｈＧＨ−ｉＲＸ３融合タンパク質発現Ｓｆ９細胞を示す（矢印）。右のパネルは、低速遠心分離によるＲＰＢＬＡ回収を示す。ｈＧＨ−Ｉ−ＲＸ３発現Ｓｆ９昆虫細胞の明澄化前のホモジネート（レーン１）は５０００Ｘｇで遠心分離した。上清（レーン２）を廃棄し、相当するＲＰＢＬＡ含有ペレット（レーン３）を数回の洗浄工程の後に得た（レーン３）。矢印はｈＧＨ−Ｉ−ＲＸ３融合タンパク質の位置を示す。
【発明の具体的説明】
【００１８】
以下、組換えタンパク顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）の形成に有用な組換えタンパク顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）を説明する。組換えＰＢＩＳは目的タンパク質と融合させることができ、細胞内でこの融合タンパク質の発現により形成されたＲＰＢＬＡは多量の目的タンパク質を簡単かつ効率的に精製するために使用することができる。さらに、ＲＰＢＬＡは予防接種などの治療法に使用することができる。
【００１９】
本明細書で用いる節の見出しは単に構成のためのものであり、記載されている対象を何ら限定するものではない。
【００２０】
Ｉ．定義
特に断りのない限り、本明細書で使用する用語は、当技術分野におけるそれらの通常の意味に従って理解されるべきである。単数形で用いられる、または「a」もしくは「an」として記載される用語は、文脈によりそうではないことが明示または指摘されない限り、複数のものも含み、その逆の場合もある。標準的な技術および手順は一般に、当技術分野および本明細書を通して示される種々の一般参考文献（一般に、引用することにより本明細書の開示の一部とされる（Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.参照））における従来法に従って実施される。
【００２１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」との用語は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸ポリマーを意味して互換的に用いられる。ポリマーは直鎖または分岐型であってよく、修飾アミノ酸を含んでなってもよく、また非アミノ酸が挿入されていてもよい。これらの用語はまた、天然にまたは介入により修飾されたアミノ酸ポリマーを包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの他の任意の操作もしくは修飾がある。また、例えば、１以上のアミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸など）を含むポリペプチド、ならびに当技術分野で公知の他の修飾もこの定義内に含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づくことから、特定の実施形態では、これらのポリペプチドは一本鎖または会合鎖として存在し得ると理解される。
【００２２】
「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」とは、少なくとも２つのポリペプチドと場合によりその２つのポリペプチドを機能的に連結して１つの連続したポリペプチドとするための架橋配列とを含んでなるポリペプチドである。融合ポリペプチドにおいて連結されたこれら２つのポリペプチドは、一般に２つの独立した供給源に由来し、従って、融合ポリペプチドは、自然界では通常見られない連結の、２つの連結したポリペプチドを含んでなる。これら２つのポリペプチドはペプチド結合によって直接機能的に連結されてもよいし、または本明細書に記載される、もしくはそうでなければ当技術分野で公知のリンカーを介して間接的に連結されていてもよい。
【００２３】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸分子」とは、共有結合した、ヌクレオチドと呼ばれるサブユニットを含んでなるポリマー化合物である。核酸としては、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、双方とも一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡを含む。
【００２４】
２つ以上の核酸またはポリペプチドに関して「同一」または「同一性」パーセントとは、保存的アミノ酸置換を配列同一性の一部と考えずに、比較および最大の一致が得られるようにアラインした際に（必要であればギャップを導入する）、同じであるか、または同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２以上の配列または部分配列を意味する。同一性パーセントは配列比較ソフトウエアもしくはアルゴリズムを用いて、または視認によって評価することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアライメントを得るために使用可能な種々のアルゴリズムおよびソフトウエアが当技術分野で公知である。このような配列アラインメントアルゴリズムの非限定例の１つに、Karlin et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268に記載され、Karlin et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877において改変され、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(Altschul et al, 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402)に組み込まれたアルゴリズムがある。特定の実施形態では、Altschul et al, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されているようなＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが使用可能である。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２(Altschul et al, 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480)、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２(Genentech, South San Francisco, California)またはＭｅｇａｌｉｇｎ(DNASTAR)は、配列をアラインするために使用可能な、公的に利用可能な他のソフトウエアプログラムである。特定の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントはＧＣＧソフトウエアのＧＡＰプログラムを用いて決定される（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよびギャップウエイト４０、５０、６０、７０または９０、およびレングスウエイト１、２、３、４、５または６を使用）。別の特定の実施形態では、Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))のアルゴリズムを組み込んだＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して、２つのアミノ酸配列間の同一性の割合（パーセント）を決定することができる（例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、ギャップウエイト１６、１４、１２、１０、８、６または４、およびレングスウエイト１、２、３、４、５を使用）。あるいは、特定の実施形態では、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Myers and Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))を用いて決定される。例えば、同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用し、ＰＡＭ１２０ウイズ・レシデュー・テーブル(PAM120 with residue table)、ギャップレングスペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて決定することができる。特定のアライメントソフトウエアによる最大アライメントに適当なパラメーターは当技術分野ならば決定することができる。特定の実施形態では、アライメントソフトウエアのデフォルトパラメーターを使用する。特定の実施形態では、第２のアミノ酸配列に対する第１のアミノ酸配列の同一性パーセンテージ「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）（式中、Ｙは第１の配列と第２の配列のアライメントにおいて（視認または特定の配列アラインメントプログラムによりアラインされた際の）および一致として��価されたアミノ酸残基の数であり、Ｚは第２の配列の全残基数である）として計算される。第１の配列の長さが第２の配列よりも長ければ、第２の配列に対する第１の配列の同一性の割合（パーセント）は、第１の配列に対する第２の配列の同一性パーセントよりも長くなる。
【００２５】
非限定例として、任意の特定のポリヌクレオチドが、参照配列に対して、ある特定のパーセンテージの配列同一性（例えば、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、およびいくつかの実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一など）を有しているかどうかは、特定の実施形態では、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)を用いて決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２配列間の相同性の最良のセグメントを見つけ出すために、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムを用いる。特定の配列が本発明による参照配列と例えば９５％の同一性があるか否かを調べるためにＢｅｓｔｆｉｔまたは他のいずれかの配列アラインメントプログラムを用いる場合、パラメーターは、同一性パーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、参照配列のヌクレオチド総数の５％まで相同性ギャップが許容されるように設定される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明の２つの核酸またはポリペプチドは実質的に同一であり、これは、比較および最大の一致が得られるようにアラインした際、配列比較アルゴリズムを用いるかまたは視認により測定される場合に、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、およびいくつかの実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有することを意味する。同一性は少なくとも約１０、約２０、約４０〜６０残基長またはその間の任意の整数値の配列領域にわたって存在することができ、６０〜８０残基より長い領域、例えば、少なくとも約９０〜１００残基にわたってもよく、いくつかの実施形態では、これらの配列は、例えばヌクレオチド配列のコード領域など、比較される配列の全長にわたって実質的に同一である。
【００２７】
「ベクター」とは、宿主細胞において目的の１以上の遺伝子または配列を送達および場合により発現することができる構築物を意味する。ベクターの例としては、限定されるものではないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン濃縮剤と会合されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および生産細胞などのある種の真核細胞が挙げられる。これらのベクターは安定であり得、自己複製可能である。「発現ベクター」とは、それが機能的に会合される遺伝子の発現を導くことができるベクターである。
【００２８】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ断片を意味する。一般に、コード領域は、プロモーターに対して３’側に位置する。プロモーターはそれらの全体が天然遺伝子に由来してもよいし、または自然界に見られるものとは異なるプロモーターに由来する種々のエレメントから構成されてもよく、さらにはまた合成ＤＮＡセグメントを含んでなってもよい。異なるプロモーターは異なる組織もしくは細胞種で、または異なる発達段階で、または異なる環境または生理条件に応答して、遺伝子の発現を指示することが当業者には理解される。ほとんどの細胞種でほとんどの場合に遺伝子を発現させるプロモーターは一般に「構成プロモーター」と呼ばれる。さらに、ほとんどの場合では、調節配列の正確な境界は完全に定義されていないので、長さの異なるＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有し得るということも認識される。プロモーターは一般にその３’末端で転写開始部位と接し、バックグラウンドを越える検出可能なレベルで転写を誘導するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に伸びている。プロモーター内には転写開始部位（好都合には、例えばヌクレアーゼＳ１でマッピングすることにより定義）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。
【００２９】
本明細書において「異種」とは、内在供給源以外の供給源に由来するベクター、プラスミドまたは宿主細胞のエレメントを意味する。従って、例えば、異種配列は、同じ宿主の異なる遺伝子またはプラスミド、宿主細胞の異なる株、または異なる分類群の生物（例えば、異なる界、門、綱、目、科、属または種、これらの分類のうち１つの中のサブグループ）に由来する配列であり得る。「異種」という用語はまた、本明細書では「外因性」という用語と同義で用いられる。
【００３０】
ＤＮＡまたはＲＮＡ「コード領域」は、適当な調節配列の制御下に置かれた際にin vitroまたはin vivoの細胞内で転写され、かつ／またはポリペプチドに翻訳されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。「好適な調節領域」とは、コード領域の上流（５’非コード配列）、コード領域内、またはコード領域の下流（３’非コード配列）に置かれ、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、関連のコード領域の翻訳に影響を及ぼす核酸領域を意味する。調節領域はプロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を含み得る。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳停止コドンによって確定される。コード領域は、限定されるものではないが、原核生物領域、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ分子、合成ＤＮＡ分子、またはＲＮＡ分子を含み得る。コード領域が真核細胞での発現のために意図される場合には、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を通常にはコード領域の３’側に配置する。
【００３１】
「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと略記され、翻訳開始シグナルまたは開始コドン（例えばＡＴＧまたはＡＵＧ）、および終結コドンを含んでなり、ポリペプチド配列へと翻訳され得る、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡいずれかの一定の長さの核酸を意味する。
【００３２】
コード領域は、ＲＮＡポリメラーゼがコード領域をｍＲＮＡへと転写する場合に、細胞内で転写および翻訳制御エレメントの「制御下にある」といえ、次に、このｍＲＮＡはトランス−ＲＮＡスプライシングを受け（コード領域がイントロンを含む場合）、コード領域によりコードされているタンパク質へと翻訳される。
【００３３】
「転写および翻訳制御領域」は、宿主細胞においてコード領域の発現をもたらすプロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなどのＤＮＡ調節領域である。真核細胞では、ポリアデニル化シグナルが制御領域である。
【００３４】
「機能的に結合」および「機能的に連結」とは、一方の機能が他方によって影響を受けるような２つの分子の結合を意味する。例えば、プロモーターは、それがコード領域の発現に影響を及ぼし得る（すなわち、コード領域がプロモーターの転写制御下にある）場合に、コード領域と機能的に結合されている。コード領域は、センス配向またはアンチセンス配向で調節領域と機能的に結合させることができる。２つの分子は、それらが直接結合されていても（例えば、融合タンパク質）または間接的に結合されていても（例えば、リンカーを介して）「機能的に連結」されている。
【００３５】
本明細書において、「発現」とは、核酸鋳型からのＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）の転写および／またはｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を意味する。「発現の増強」は、ｍＲＮＡ産生の増大のレベルおよび／またはポリペプチド発現のレベルでの遺伝子発現の変更を含むものとし、一般に遺伝子産物またはタンパク質の量の増大をもたらす。場合によっては、「発現の増強」は、「過剰発現」または「過剰発現される」という用語と互換的に用いられる。
【００３６】
「選択マーカー」は、その発現が検出可能な表現型を作出し、その選択マーカーを有するプラスミドを含む宿主細胞の検出を助ける遺伝子である。選択マーカーの限定されない例としては、薬剤耐性遺伝子および栄養マーカーが挙げられる。例えば、選択マーカーは、アンピシリン、カナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、カスガマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、Ｄ−シクロセリン、ナリジクス酸、ストレプトマイシン、またはテトラサイクリンからなる群から選択される抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子であり得る。選択マーカーの他の限定されない例としては、アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼおよびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼが挙げられる。単一のプラスミドが１以上の選択マーカーを含むこともできる。
【００３７】
本明細書において、「処置する」または「処置」とは、治療的処置および予防的または回避的手段の双方を意味し、その目的は癌の発生または拡散などの望ましくない生理学的変化または障害を回避または減速（軽減）することである。有益なまたは望ましい臨床結果としては、限定されるものではないが、検出可能なものであれ検出不能なものであれ、症状の緩和、疾病程度の軽減、病状の安定化（すなわち悪化させない）、疾病の進行の遅延または減速、病状の改善または軽減、および緩解（部分的なものであれ全面的なものであれ）が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けなかった場合の期待生存期間に比べて生存期間を延長することも意味し得る。処置を必要とする者には、その症状もしくは障害にすでに罹患している者、ならびにその症状もしくは障害に罹患しやすい者またはその症状もしくは障害が予防される者が含まれる。
【００３８】
「被験体」、「個体」、「動物」、「患者」、または「哺乳類」は、診断、予後または療法が望まれる任意の被験体、特に哺乳類被験体を意味する。哺乳類被験体には、ヒト、家畜、農用動物および動物園の動物、競技用の動物、またはペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛などが含まれる。
【００３９】
ＩＩ．組換えタンパク顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）
タンパク顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）は、内胚乳組織以外に由来する細胞においてタンパク顆粒またはＲＰＢＬＡの形成を媒介し得るポリペプチド配列であり、下記にさらに詳細に記載される。候補ＰＢＩＳの、ＲＰＢＬＡの形成を媒介する能力は、（ｉ）本発明の実施例１に記載されるように、植物細胞において候補ＰＢＩＳと蛍光タンパク質の融合タンパク質を発現させることによる蛍光凝集体の検出、（ｉｉ）本発明の実施例２に記載されるように密度勾配における候補ＰＢＩＳ発現植物抽出物の分画による、約１．１７５〜約１．１９４の密度を有する凝集体の検出、（ｉｉｉ）本発明の実施例３に記載されるように低速遠心分離（一般に４℃にて１０，０００ｘｇで３０分）後の沈降物における、ウエスタンブロットによる候補ＰＢＩＳの同定など、当業者に利用可能な技術を用いて判定することができる。
【００４０】
天然のＰＢＩＳはトウモロコシタンパク質γ−ゼインにおいて同定されており、米国特許第７，５７５，８９８号、米国特許出願公開第２００６／０１２１５７３号、同第２００６／０１２３５０９号、および同第２００７／０２４３１９８号（それぞれ引用することによりその全開示内容が本明細書の開示の一部とされる）にさらに詳しく記載されている。
【００４１】
驚くことに、特性が改良された組換えタンパク顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）の形成を媒介する組換えＰＢＩＳが同定され、本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、該組換えＰＢＩＳはポリプロリンＩＩ（ＰＰＩＩ）構造を含んでなる。いくつかの実施形態では、該組換えＰＢＩＳはプロリンリッチ配列を含んでなる。
【００４２】
第１の態様において、本発明は、少なくとも３６アミノ酸長のポリプロリンＩＩ（ＰＰＩＩ）構造を含んでなる組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列（ＰＢＩＳ）であって、
前記ＰＰＩＩ構造がＮ末端の少なくとも２個のシステインと、Ｃ末端の少なくとも２個のシステインとの間に位置し、
前記ＰＰＩＩ構造中のアミノ酸のうち１０％以下がリシンまたはアルギニンであり、かつ
前記ＰＰＩＩ構造が配列（ＰＰＰＶＨＬ）６（配列番号１）を含まない、組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列に関する。
【００４３】
好ましい実施形態では、該ＰＰＩＩ構造は、ＷＯ２００４／００３２０７号公報に記載され配列ＱＰＰＰＰＶＨＬＰＰＰＰＣＨＹＰＴＱＰＰＲＰＱＰＨＰＱＰＨＰ（配列番号１３０）を有するＰ４配列からなるものではない。
【００４４】
好ましい実施形態では、該ＰＰＩＩ構造は、配列（ＰＰＰＶＨＬ）６ＰＰＰＶＨＶＰＰＰＶＨＬ（配列番号２）を含まず、または配列（ＰＰＰＶＨＬ）６ＰＰＰＶＨＶＰＰＰＶＨＬＰＰＰＰＣＨ（配列番号３）を含まない。
【００４５】
好ましい実施形態では、該ＰＰＩＩ構造は、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９または少なくとも４０のアミノ酸を有する。別の実施形態では、ＰＰＩＩ構造はシステイン残基を含まない。さらに別の実施形態では、ＰＰＩＩ構造は、１０％を越えるヒスチジン残基は含まない。
【００４６】
第２の態様において、本発明は、少なくとも３６アミノ酸長のプロリンリッチ配列を含んでなる組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列（ＰＢＩＳ）であって、
前記プロリンリッチ配列がＮ末端の少なくとも２個のシステインと、Ｃ末端の少なくとも２個のシステインとの間に位置し、
前記プロリンリッチ配列中のアミノ酸のうち１０％以下がリシンまたはアルギニンであり、かつ前記プロリンリッチ配列が配列（ＰＰＰＶＨＬ）６（配列番号１）を含まない、組換えタンパク顆粒誘導ポリペプチド配列に関する。
【００４７】
好ましい実施形態では、該プロリンリッチ配列は、ＷＯ２００４／００３２０７号公報に記載され配列ＱＰＰＰＰＶＨＬＰＰＰＰＣＨＹＰＴＱＰＰＲＰＱＰＨＰＱＰＨＰ（配列番号１３０）を有するＰ４配列のＰＢＩＳからなるものではない。
【００４８】
好ましい実施形態では、該プロリンリッチ領域は、配列（ＰＰＰＶＨＬ）６ＰＰＰＶＨＶＰＰＰＶＨＬ（配列番号２）を含まず、または配列（ＰＰＰＶＨＬ）６ＰＰＰＶＨＶＰＰＰＶＨＬＰＰＰＰＣＨ（配列番号３）を含まない。
【００４９】
好ましい実施形態では、該プロリンリッチ領域は、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９または少なくとも４０のアミノ酸を有する。別の好ましい実施形態では、該プロリンリッチ領域は、システイン残基を含まない。さらに別の実施形態では、該プロリンリッチ領域は、１０％を越えるヒスチジン残基を含まない。またはＷＯ２００４／００３２０７号公報に記載され配列ＱＰＰＰＰＶＨＬＰＰＰＰＣＨＹＰＴＱＰＰＲＰＱＰＨＰＱＰＨＰ（配列番号１３０）を有するＰ４配列からなるものではない。
【００５０】
いくつかの実施形態では、該組換えＰＢＩＳは、Ｎ末端の少なくとも２個のシステインとＣ末端の少なくとも２個のシステインの間にＰＰＩＩ構造を含んでなり、さらに該ＰＰＩＩ構造と２個のＣ末端システインの間に１個の付加的システインとプロリンリッチ配列を含んでなる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、該組換えＰＢＩＳは、Ｎ末端の少なくとも２個のシステインと、Ｃ末端の少なくとも２個のシステインの間に第１のプロリンリッチ配列とを含んでなり、さらに該第１のプロリンリッチ配列と２個のＣ末端システインの間に１個の付加的システインと第２のプロリンリッチ配列を含んでなる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列中のアミノ酸のうち約１０％以下がリシンまたはアルギニンである。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列中のアミノ酸のうち約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％または約１％以下がリシンまたはアルギニンである。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列はリシンを含まない。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列はアルギニンを含まない。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列はリシンまたはアルギニンを含まない。
【００５３】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列中のアミノ酸のうち約１５％以下がヒスチジンである。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列中のアミノ酸のうち約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％以下がヒスチジンである。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列はヒスチジンを含まない。
【００５４】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、配列（ＰＰＰＶＨＬ）６ＰＰＰＶＨＶＰＰＰＶＨＬ（配列番号２）を含まない。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、配列（ＰＰＰＶＨＬ）６ＰＰＰＶＨＶＰＰＰＰＶＨＬＰＣＨ（配列番号３）を含まない。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、配列ＰＰＰＶＨＬ（配列番号４）を含まない。
【００５５】
いくつかの実施形態では、該組換えＰＢＩＳは、それが特定の最小濃度で発現される場合にＲＰＢＬＡの形成を媒介し得る。従って、いくつかの実施形態では、該組換えＰＢＩＳは、それがタバコ葉新鮮重１キログラム当たり約０．５グラムで発現される場合にＲＰＢＬＡの形成を媒介し得る。
【００５６】
組換え配列のＰＢＩＳとして機能する能力は、本明細書に記載される方法または当技術分野で公知の他の方法に従って試験することができる。
【００５７】
ＩＩＩ．ポリプロリンＩＩ構造およびプロリンリッチ配列
上記のように、本明細書で用いる組換えＰＢＩＳは、ポリプロリンＩＩ型（ＰＰＩＩ）構造を含んでなり得る。
【００５８】
本明細書において「ポリプロリンＩＩ」または「ＰＰＩＩ」は、らせん状の二次タンパク質構造の一種を意味する。例示的ＰＰＩＩ構造の特定の特徴は例えば、Eisenberg et al, J. Mol. Biol. 179: 125-142 (1984)、 Bicudo et al (2008, Biopolymers, 89: 175-178) Fernandez-Carneado, J. Mol. Biol. 372: 708-22 (2004)、 Bochicchio and Tamburro, Chirality 14:782-92 (2002)、 Knighton et al. Science 253: 414-420 (1991)、およびCaldwell et al. Biopolymers 10: 1891-1904 (1984)（それぞれ引用することによりその全開示内容が本明細書の開示の一部とされる）により記載されている。
【００５９】
ＰＰＩＩヘリックスは二次タンパク質構造である。これは三角プリズムに似た全形を有する左巻きのらせん構造である。このらせんは、らせんピッチ９．３Å／ターン、１ターン当たり３残基、回転角Φおよびψそれぞれ−７５°および１４５°でかなりの延長が可能である。
【００６０】
ＰＰＩＩ構造は、文献に記載されている（例えば、引用することによりその全開示内容が本明細書の開示の一部とされる（Eisenberg D, et al. J. Mol. Biol. 179: 125-142 (1984)参照））。プロリン残基はＰＰＩＩヘリックスに極めて好都合である。グリシンおよびチロシンは一般に好ましくはないが、コラーゲンなどの一部のＰＰＩＩ構造には都合がよい。γゼインのヒスチジンがＡｌａ、ＧｌｕおよびＬｙｓで置換された繰り返し配列の合成ペプチドのコンフォメーション分析は、これらのペプチドが総てＰＰＩＩ型の構造を採っていたことを示す。従って、このＰＰＩＩコンフォメーションは、電荷を有するアミノ酸（ＬｙｓまたはＧｌｕ）上の電荷の符号にも、残基（Ａｌａ）が電荷を有するか有さないかにも独立して採用されている（Dalcol, J. Org. Chem 61: 6775-6782 (1996)）。繰り返し配列の長さ、酸性ｐＨ、および高ペプチド濃度はＰＰＩＩ含量を高めた。ｐＨ３．０では、ヒスチジンがグルタミン酸で置換された場合を除き、ｐＨ７におけるよりもＰＰＩＩ含量が高い。この場合、ＰＰＩＩの不安定化はおそらくｐＨ３におけるグルタミン酸のカルボキシル基のプロトン化とそれに続く水素結合による側鎖−側鎖相互作用によるものである(Dalcol, 1996)。
【００６１】
ＰＰＩＩ構造はタンパク質の動的な特徴である。Bicudo et al (2008, Biopolymers, 89: 175-178)は、トウモロコシＰＢから精製したγゼインの二次構造を、還元剤を含む場合および含まない場合で、水、ＳＤＳおよび２−プロパノール中で可溶化した際の円偏光二色性により分析した。ＰＰＩＩコンフォメーションはＳＤＳ中ではわずか１％、プロパノール中では４％、および水中では７％であった。ＲＤはγ−ゼイン配列全体の２２％を占めることを考慮すれば、これらの結果はこのドメインの少なくとも３０％が水中でのＰＰＩＩ構造を採っていることを示す（Fernandez-Carneado, J. Mol. Biol. 372: 708-22 (2004)、 Bicudo, 2007）。さらに、このＰＰＩＩの範囲は、タンパク質のアセンブリおよびＰＢの形成をもたらすゼイン−ゼイン相互作用によって著しく増大され得る。従って、ポリペプチドは、それらがＰＰＩＩ構造を形成する傾向を有していれば、ＰＰＩＩ構造を有していると考えられる。
【００６２】
配列がＰＰＩＩ構造を形成するかどうかを決定する方法も既知である。例えば、円偏光二色性（ＣＤ）、振動円偏光二色性（ＶＣＤ）およびラマン光学活性（ＲＯＡ）などの光学活性に基づく分光法が使用可能である。例えば、引用することによりその全開示内容が本明細書の開示の一部とされるBochicchio and Tamburro, Chirality 14:782-92 (2002)参照。さらに、結晶化したタンパク質中のＰＰＩＩ構造はＸ線回折によって決定することができる（Knighton et al. Science 253: 414-420 (1991)、Caldwell et al. Biopolymers 10: 1891-1904 (1984)）。ＣＤは二次構造に対して極めて感度が高い。従って、いくつかの実施形態では、ＰＰＩＩ構造を決定する方法はＣＤである。３０〜１００アミノ酸長前後のペプチドのＣＤスペクトルは約ｐＨ７および約５℃で決定することができる。ＰＰＩＩ構造の存在は、最小約λ＝２０２ｎｍおよび最大約λ＝２２８ｎｍのＣＤパターンによって同定することができる。サンプルペプチド中のＰＰＩＩ構造のパーセンテージは、Ｈ−（Ｐｒｏ）ｎ−ＯＨ参照ペプチドに対するサンプルペプチドの［θｍａｘ］Ｍ（最大λ＝２２８ｎｍ前後におけるモル楕円率）の大きさの比によって決定される。サンプルペプチドと同様の長さを有する参照ペプチドは１００％のＰＰＩＩ構造を有するとみなすことができる。ＰＰＩＩ構造を決定するためのＣＤスペクトルに基づく方法のさらに詳細な説明はDalcol et al. Org. Chem. 61: 6675-6782(1996)に見られる。
【００６３】
例えば、ポリプロリンペプチド（Ｈ−（Ｐｒｏ）ｎ−ＯＨ）を参照と考えることができ、１００％ＰＰＩＩヘリックスを形成するとみなすことができる。いくつかの実施形態では、ＰＰＩＩ構造の［θｍａｘ］Ｍは、参照ポリペプチド（（Ｈ−（Ｐｒｏ）ｎ−ＯＨ）の［θｍａｘ］Ｍの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％である。
【００６４】
上記のように、組換えＰＢＩＳは、プロリンリッチ配列を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、ＰＰＩＩ構造はプロリンリッチ配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、ＰＰＩＩヘリックスを形成する傾向を有するＰＰＩＩ構造と、プロリンリッチ配列とを含んでなる。いくつかの実施形態では、プロリンリッチ配列はＰＰＩＩ構造を形成することができる。
【００６５】
本明細書において「プロリンリッチ領域」とは、比較的高い割合のプロリンを含むポリペプチド配列を意味する。いくつかの実施形態では、プロリンリッチ領域は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％のプロリンを含んでなる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、少なくとも３０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は少なくとも３２、少なくとも３４、少なくとも３６、少なくとも３８、少なくとも４０、少なくとも４２、少なくとも４４、少なくとも４６または少なくとも４８アミノ酸長である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、１００以下、９８以下、９６以下、９４以下、９２以下、９０以下、８８以下、８６以下、８４以下、８２以下、８０以下、７８以下、７６以下、７４以下、７２以下、７０以下、６８以下、６６以下、６４以下、６２以下、６０以下、５８以下、５６以下、５４以下または５２以下のアミノ酸長である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、約３６〜約１００アミノ酸長、約３６〜約９０アミノ酸長、約３６〜約８０アミノ酸長または約３６〜約７０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、約４２〜約１００アミノ酸長、約４２〜約９０アミノ酸長、約４２〜約８０アミノ酸長または約４２〜約７０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、約４８〜約１００アミノ酸長、約４８〜約９０アミノ酸長、約４８〜約８０アミノ酸長または約４８〜約４８アミノ酸長である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５のＰＸリピートを含んでなる。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５のＰＸリピートは連続リピートである。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５のＰＸリピートはホモマーである。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５のＰＸリピートはヘテロマーである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の３アミノ酸リピート（例えば、ＰＰＸ、ＰＸＰ、ＸＰＰまたはＰＸＸ）を含んでなる。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の３アミノ酸リピートは連続リピートである。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の３アミノ酸リピートはホモマーである。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の３アミノ酸リピートはヘテロマーである。
【００７１】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の４アミノ酸リピート（例えば、ＰＰＰＸ（配列番号１１９）、ＰＰＸＸ（配列番号１１７）、ＰＸＸＸ（配列番号１３７）、ＰＰＸＰ（配列番号１３８）、ＰＸＰＰ（配列番号１３９））を含んでなる。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の４アミノ酸リピートは連続リピートである。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の４アミノ酸リピートはホモマーである。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の４アミノ酸リピートはヘテロマーである。
【００７２】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の５アミノ酸リピート（例えば、ＰＰＰＸＸ（配列番号１４０））を含んでなる。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の５アミノ酸リピートは連続リピートである。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の３アミノ酸リピート５アミノ酸リピートはホモマーである。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の５アミノ酸リピートはヘテロマーである。
【００７３】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の６アミノ酸リピート（例えば、ＰＰＰＸＸＸ（配列番号１１６）またはＰＰＰＸＰＸ（配列番号１４１））を含んでなる。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の６アミノ酸リピートは連続リピートである。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の６アミノ酸リピートはホモマーである。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５の６アミノ酸リピートはヘテロマーである。
【００７４】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩ構造またはプロリンリッチ領域は両親媒性分子である。
【００７５】
両親媒性分子は、分子の残りの部分に比べて有意に高い疎水性を有する領域を有し、この分子の残りの部分はその領域に比べて疎水性である分子である。分子またはその領域の疎水性または親水性は、周囲の媒体に対するその挙動に重要な影響を有する。疎水性表面は水性媒体との相互作用を避ける傾向にあるが、親水性表面はそれにより安定化される。タンパク質は三次元構造であるので、そのアミノ酸残基の一部だけが媒体に曝される。結果として、タンパク質またはタンパク質領域が疎水性であるか親水性であるか両親媒性であるかを決定する際に考慮すべきなのは、表面に位置する、従って媒体に曝されているアミノ酸だけである。
【００７６】
本明細書に記載されるように、ＰＰＩＩ構造は、１ターン当たり３アミノ酸の、延長された左巻きヘリックスである。各１ターンは三角形として表すことができ（例えば、図１Ａ）、１ターン内の３個のアミノ酸が１個ずつ三角形の頂点の１つに時計回りに配置されている。結果として、ＰＰＩＩ構造の属する三角形（ターン）の重なりがタンパク質またはタンパク質領域の全体構造を表す三角形プリズムを形成する。ＰＰＩＩヘリックスでは、この三角形プリズムのエッジに配置されたアミノ酸が媒体に曝され、疎水性／親水性の決定において総てを考慮すべきである。ＰＰＩＩ構造は三角形プリズムのエッジのうちの１つが、独立して考慮される他の２つのエッジと有意に異なる疎水性を有する場合には両親媒性とみなすことができる。
【００７７】
アミノ酸の疎水性／親水性は、その側鎖の性質によって決定される。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性スケール(Kyte J., Doolittle R.F., J. Mol. Biol. 157: 105-132(1982))は、アミノ酸側鎖の物理化学的特性から導かれるものであり、慣用され、十分に受け入れられている。アミノ酸はＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ値に基づき３群に分類される：（ｉ）非極性または疎水性と考えられる、４．５〜１．８の範囲のアミノ酸（Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、ＭおよびＡ）、（ｉｉ）部分的極性または部分的親水性と考えられる、−０．４〜−１．６の範囲のアミノ酸（Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＰ）、および極性または親水性(polar of hydrophilic)と考えられる、−３．２〜−４．５の範囲のアミノ酸（Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、ＱおよびＫ）。極性群のアミノ酸には、正電荷（Ｒ，ＨおよびＫ）、負電荷（ＤおよびＥ）および非電荷（ＱおよびＮ）のアミノ酸を見出すことができる。ＰＰＩＩヘリックスの疎水性の計算を簡単にするために、この分類を考慮に入れてコンセンサス極性値を割り当てた：（ｉ）非極性アミノ酸は０、（ｉｉ）部分的極性アミノ酸は０．５、および（ｉｉｉ）極性アミノ酸は１。
【００７８】
ＰＰＩＩ構造の両親媒性は、三角プリズム内の空間的アミノ酸分布に関して本明細書に記載されるアミノ酸分類を考慮して算出することができる。親水性アミノ酸のパーセンテージは各エッジ（エッジ１：ｉ、ｉ＋４、ｉ＋７．．．、エッジ２：ｉ＋１、ｉ＋５、ｉ＋８．．．、エッジ３：ｉ＋２、ｉ＋６、ｉ＋９．．．）に関して計算することができ、ＰＰＩＩ構造は、エッジのうちの１つと、独立して考慮される他の２つのエッジとのパーセンテージの差が少なくとも約３５であれば両親媒性とみなすことができる。
【００７９】
従って、ＰＰＩＩ構造の残基は３つ目ごとにヘリックスの１つの面に沿って並ぶので、ヘリックスの１つの面に沿って並ぶ残基の疎水性がそのヘリックスの別の面に沿って並ぶ残基の疎水性と異なっていれば、そのＰＰＩＩヘリックスは両親媒性といえる。γゼインのＲＤのＰＰＩＩヘリックスは、著しい両親媒性を有する。１ターン当たり３．０残基で、γゼインのバリン残基およびロイシン残基がヘリックスの同じ面に並び（それぞれエッジ１および２）、一方、電荷を有する極性ヒスチジン残基がもう一方の面（エッジ３）に並ぶ。この両親媒性は、直前に記載した計算法によって明らかに示され、親水性アミノ酸のパーセンテージは、エッジ１、２および３でそれぞれ２９．４、２９．４および７８．１である（表１参照）。
【００８０】
【表１】
2013532960.tif 000003
2013532960.tif 000004
【００８１】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は両親媒性であり、かつ、負電荷を有する。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は両親媒性であり、かつ、非電荷である。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は非両親媒性である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列の長手方向のプロリンのパーセンテージは一貫している。従って、例えば、いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列の長手方向の１０アミノ酸枠におけるプロリンパーセンテージの違いは約５０％以下、約４５％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下または約５％以下である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列中に存在するプロリンアミノ酸はヒドロキシル化されて、ヒドロキシプロリン（例えば（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシプロリン、またはＬ−ヒドロキシプロリン（Ｃ５Ｈ９Ｏ３Ｎ））となっていてもよい。これはプロリンの一般的な翻訳後修飾であり、プロリンのγ炭素原子と結合しているヒドロキシル（ＯＨ）基が存在することだけが異なる。ヒドロキシプロリンはコラーゲンなどのプロリンリッチ配列に存在する。例えば、標準ＧＸＹトリアッド（ここで、ＸおよびＹは独立して任意のアミノ酸である）において、Ｙａａ位を占めるプロリンがヒドロキシル化され得る。ヒドロキシプロリンはＰＰＩＩヘリックスの形成に干渉しない。
【００８４】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、コラーゲン関連配列を含んでなる。従って、いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は配列（ＧＸＹ）ｎを含んでなり、ここで、ｎは少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８または少なくとも２０である。いくつかの実施形態では、（ＧＸＹ）ｎを含んでなる配列は、少なくとも約３０％のプロリンを含んでなる。
【００８５】
該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は少なくとも３０アミノ酸長である。該組換えＰＢＩＳは、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列のアミノ末端（Ｎ末端）に少なくとも２個のシステイン（すなわち、ＰＰＩ構造またはプロリンリッチ領域の上流に２個のシステイン）を含んでなる。該組換えＰＢＩＳは、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列のカルボキシ末端（Ｃ末端）に少なくとも２個のシステイン（すなわち、ＰＰＩ構造またはプロリンリッチ領域の下流に２個のシステイン）を含んでなる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、少なくとも約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％または約５０％のＰＢＩＳがポリプロリンＩＩ構造を示す。
【００８７】
上記のように、該組換えＰＢＩＳはプロリンリッチ配列を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造はプロリンリッチ配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、該組換えＰＢＩＳはＰＰＩＩヘリックスを形成する傾向を有さないＰＰＩＩ構造と、プロリンリッチ配列を含んでなる。
【００８８】
ＰＰＩＩ構造の残基は３つ目ごとにヘリックスの１つの面に沿って並ぶので、ヘリックスの１つの面に沿って並ぶ残基の疎水性がそのヘリックスの別の面に沿って並ぶ残基の疎水性と異なっていれば、そのＰＰＩＩヘリックスは両親媒性といえる。γゼインのＲＤのＰＰＩＩヘリックスは、著しい両親媒性を有する。１ターン当たり３残基で、γゼインのバリン残基およびロイシン残基がヘリックスの同じ面に並び、一方、ｐＨに応じて電荷を有する極性ヒスチジン残基がもう一方の面に並ぶ。
【００８９】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、プロリンリッチリピートを含んでなる。記載のように、プロリンリッチリピートは、プロリンを含む少なくとも２コピーの配列を含んでなる配列である。該リピートは少なくとも２アミノ酸長（例えば、ＰＸ）、少なくとも３アミノ酸長（例えば、ＰＰＸ、ＰＸＰ、ＸＰＰまたはＰＸＸ）、少なくとも４アミノ酸長（例えば、ＰＰＰＸ（配列番号５）、ＰＰＸＸ（配列番号６）、ＰＸＸＸ（配列番号７）、ＰＰＸＰ（配列番号８）、ＰＸＰＰ（配列番号６５）、少なくとも５アミノ酸長（例えば、ＰＰＰＸＸ（配列番号９））、少なくとも６アミノ酸長（例えば、ＰＰＰＸＸＸ（配列番号１０）またはＰＰＰＸＰＸ（配列番号１１））、少なくとも７アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、または少なくとも１０アミノ酸長であり得る。ここに挙げたリピートは単に例として示されるものである。
【００９０】
該プロリンリッチリピートは、プロリンを含む少なくとも２コピー、少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、少なくとも６コピー、少なくとも７コピー、少なくとも８コピー、少なくとも９コピー、または少なくとも１０コピーの配列を含んでなり得る。該プロリンリッチリピートは、総て同じリピートのコピーを含むこともできるし、（すなわち、ホモマープロリンリッチリピート）またはプロリンリッチリピートの組合せを含むこともできる（すなわち、ヘテロマープロリンリッチリピート）。例として、配列ＰＰＰＡＡＡＰＰＰＡＡＡＰＰＰＡＡＡ（配列番号１２）は、同じＰＰＰＡＡＡ（配列番号１３）リピートを３コピー含むホモマープロリンリッチリピートであり、配列ＰＰＰＡＡＡＰＰＰＡＡＡＰＰＡＰＰＰＰＰＡＰＰＰ（配列番号１４）は、ある配列ＰＰＰＡＡＡ（配列番号１３）を２コピーと違う配列ＰＰＡＰＰＰ（配列番号１５）を２コピー含むヘテロマープロリンリッチリピートである。
【００９１】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、（ｉ）プロリン、（ｉｉ）バリン、（ｉｉｉ）ロイシン、および（ｉｖ）アラニンからなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、（ｉ）プロリン、（ｉｉ）バリン、（ｉｉｉ）ロイシン、（ｉｖ）アスパラギン酸、および（ｖ）グルタミンからなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、（ｉ）プロリン、（ｉｉ）バリン、（ｉｉｉ）ロイシン、（ｉｖ）トレオニン、（ｖ）アスパラギン、および（ｖｉ）グルタミンからなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、（ｉ）プロリン、（ｉｉ）負電荷アミノ酸（すなわち、ＤおよびＥ）、（ｉｉｉ）極性非電荷側鎖を有するアミノ酸（すなわち、ＮおよびＱ）、（ｉｖ）部分的極性非電荷側鎖を有するアミノ酸（すなわち、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＧ）または部分的極性非電荷側鎖を有するアミノ酸（すなわち、Ｓ、ＴおよびＧ）、（ｖ）疎水性側鎖を有するアミノ酸（すなわち、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＶ）、または疎水性側鎖を有するアミノ酸（すなわち、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶ）からなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は、（ｉ）プロリン、および（ｉｉ）アラニンからなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列中のアミノ酸のうち少なくとも約４０％がプロリンである。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列中のアミノ酸のうち少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または１００％がプロリンである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列中のアミノ酸のうち約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下または約５０％以下がプロリンである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は非両親媒性である。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は両親媒性であり、かつ、負電荷を有する。いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列は両親媒性であり、かつ、非電荷である。
【００９５】
一実施形態では、組換えＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ領域は、負電荷両親媒性配列を含んでなる。「負電荷両親媒性配列」という用語は、上記に説明し、上記で定義した方法を用いて計算される正味負電荷を示すＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ領域を意味して用いられる。さらにより好ましい実施形態では、該負電荷両親媒性配列は、ＰＰＰＶＤＬ（配列番号１９）およびＰＰＰＶＥＬ（配列番号１８）からなる群から独立して選択される少なくとも１個のリピートを含んでなる。好ましい実施形態では、該両親媒性配列は、（ＰＰＰＶＥＬ）ｎ（配列番号１８）および（ＰＰＰＶＤＬ）ｎ（配列番号１９）（ここで、ｎは４、５、６、７または８である）から選択される配列を含んでなる。
【００９６】
さらに別の実施形態では、該負電荷両親媒性配列は、以下に定義される配列から本質的になる。
【化１】
2013532960.tif 000005
【００９７】
別の実施形態では、本発明によるＰＢＩＳの一部を形成するＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ領域は、非電荷両親媒性配列である。「非電荷両親媒性配列」とは、正味電荷が０であり、ＰＰＩＩ構造の三角プリズム表示のエッジ２の残基がＡｓｎおよびＧｌｎからなる群から選択される配列を意味する。さらにより好ましい実施形態では、該非電荷両親媒性配列は、ＰＰＰＶＮＬ（配列番号２１）およびＰＰＰＶＱＬ（配列番号２２）の群から独立して選択される少なくとも１個のリピートを含んでなる。さらにより好ましい実施形態では、該非電荷両親媒性配列は６リピートを含んでなり、各リピートはＰＰＰＶＮＬ（配列番号２１）およびＰＰＰＶＱＬ（配列番号２２）の群から独立して選択される。好ましい実施形態では、ＰＢＩＳは、（ＰＰＰＶＮＬ）ｎ（配列番号２１）および（ＰＰＰＶＱＬ）ｎ（配列番号２２）（ここで、ｎは４、５、６、７または８である）から選択される配列を含んでなる。
【００９８】
好ましい実施形態では、ＰＰＩＩ構造の一部を形成する非電荷両親媒性配列、または本発明によるＰＢＩＳの一部を形成するプロリンリッチ領域は、以下に定義される配列から独立して選択される。
【化２】
2013532960.tif 000006
【００９９】
別の実施形態では、本発明によるＰＢＩＳの一部を形成するＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ領域は非両親媒性配列である。「非両親媒性配列」とは、正味電荷が０であり、ＰＰＩＩ構造の三角プリズム表示のエッジ２の残基がＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＴｈｒおよびＳｅｒからなる群から独立して選択される配列を意味する。さらにより好ましい実施形態では、該非両親媒性配列は、ＰＰＰＶＡＬ（配列番号１６）、ＰＰＰＶＴＬ（配列番号２０）、ＰＰＰＶＳＬ（配列番号３６）、ＰＰＰＶＶＬ、（配列番号３７）およびＰＰＰＶＬＬ（配列番号１７）からなる群から独立して選択される少なくとも１個のリピートを含んでなる。好ましい実施形態では、該ＰＢＩＳは、（ＰＰＰＶＡＬ）ｎ（配列番号１６）、（ＰＰＰＶＴＬ）ｎ（配列番号２０）、（ＰＰＰＶＳＬ）ｎ（配列番号３６）、（ＰＰＰＶＶＬ）ｎ（配列番号３７）および（ＰＰＰＶＬＬ）ｎ（配列番号１７）（ここで、ｎは４、５、６、７または８である）から選択される配列を含んでなる。
【０１００】
さらにより好ましい実施形態では、該非両親媒性配列は下記からなる群から選択される。
【化３】
2013532960.tif 000007
【０１０１】
別の実施形態では、該組換え非両親媒性配列は、プロリンおよびアラニンからなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる。好ましい実施形態では、プロリンおよびアラニンからなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる配列は、ＰＰＰＡＡＡ（配列番号１３）、ＰＰＰＡＰＡ（配列番号２３）およびＰＰＰＰＰＰ（配列番号２４）からなる群から選択される少なくとも１個のリピートを含んでなる。好ましい実施形態では、該両親媒性配列は、（ＰＰＰＡＡＡ）ｎ（配列番号１３）、（ＰＰＰＡＰＡ）ｎ（配列番号２３）および（ＰＰＰＰＰＰ）ｎ（配列番号：２４）（ここで、ｎは４、５、６、７または８である）から選択される配列を含んでなる。
【０１０２】
なおさらに別の好ましい実施形態では、プロリンおよびアラニンからなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる配列は、下記から選択される。
【化４】
2013532960.tif 000008
【０１０３】
別の実施形態では、該非両親媒性配列は、配列（ＧＸＹ）ｎ（ここで、ＸおよびＹは独立に任意のアミノ酸であり、ｎは１〜２０の整数である）から本質的になり、この（ＧＸＹ）ｎを含んでなる配列は少なくとも３０％のプロリンを含んでなる。さらに別の実施形態では、該非両親媒性配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ３４６８３のアミノ酸１３５〜１７９と少なくとも７０％の同一性を示すアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる。さらに別の実施形態では、該非両親媒性配列は、配列：
【化５】
2013532960.tif 000009
から本質的になる。
【０１０４】
別の実施形態では、該両親媒性配列は、表面アドヘシンＡｇＩ／ＩＩ（ミュータンス連鎖球菌(Streptococcus mutans)ＮＧ８株、ＧｅｎｅＢａｎｋ：ＧＱ４５６１７１のアミノ酸８８４〜９２７と少なくとも７０％の同一性を示すアミノ酸から本質的になる。好ましい実施形態では、該非両親媒性配列は、下記からなる群から選択されるアミノ酸から本質的になる。
【化６】
2013532960.tif 000010
【０１０５】
いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ／Ｐｒｏリッチ配列は、Ｃ末端に４つのプロリン残基を含む。このＰＰＰＰ配列は、Ｃ末端システインの上流、すなわち、ＰＰＩＩ／Ｐｒｏリッチ配列のＣ末端とＣ末端システインの間に見られる。
【０１０６】
ＩＶ．システイン残基
そうではないことが特に記載されていなければ、システイン残基の位置は、ＰＰＩＩ構造、ポリプロリンリッチ配列またはＰＰＩＩ構造とプロリンリッチ配列の双方のＮ末端またはＣ末端に対するものである。
【０１０７】
上記のように、該組換えＰＢＩＳは、Ｎ末端の少なくとも２個のシステインとＣ末端の少なくとも２個のシステインの間にＰＰＩＩ構造、ポリプロリンリッチ配列またはＰＰＩＩ構造とプロリンリッチ配列の双方を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、該組換えＰＢＩＳは、Ｃ末端に少なくとも３個のシステイン、または少なくとも４個のシステインを含んでなる。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、該組換えＰＢＩＳは、１個の付加的システインで隔てられた複数のＰＰＩＩ構造および／またはプロリンリッチ配列を含んでなる。単に例であるが、該組換えＰＢＩＳは、Ｎ末端からＣ末端へと、システイン残基、ＰＰＩＩ構造、システイン残基、プロリンリッチ配列、および２個のシステイン残基を含んでなり得る。他の例では、該組換えＰＢＩＳは、Ｎ末からＣ末端へと、２個のシステイン残基、第１のプロリンリッチ配列、システイン残基、第２のプロリンリッチ配列、および２個のシステイン残基を含んでなり得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、Ｃ末端の２個のシステインの間のアミノ酸の数は０〜２０の整数であり、および／またはＮ末端の２個のシステインの間のアミノ酸の数は０〜２０の整数である。好ましくは、Ｎ末端の２個のシステインは、少なくとも２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個のアミノ酸で隔てられていてもよいし、または隣接していてもよい。好ましくは、Ｃ末端の２個のシステインは、少なくとも２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個のアミノ酸で隔てられていてもよいし、または隣接していてもよい。好ましい実施形態では、Ｎ末端の少なくとも２個のシステインは、１個のアミノ酸で隔てられている（すなわち、ＣＸＣ）か、２個のアミノ酸で隔てられている（すなわち、ＣＸＸＣ（配列番号５７））。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＰＰＩＩ配列またはプロリンリッチ領域のＮ末端の２個のシステインとＰＰＩＩ配列またはプロリンリッチとは、約０〜４０個のアミノ酸で隔てられている（２個のシステインの最Ｃ末端とポリプロリンＩＩまたはプロリンリッチ領域のＮ末端アミノ酸との間のアミノ酸の数として評価）。いくつかの実施形態では、配列またはプロリンリッチ領域のＮ末端の２個のシステインとＰＰＩＩ配列またはプロリンリッチとは、少なくとも４０個、少なくとも３５個、少なくとも３０個、少なくとも２５個、少なくとも２０個、少なくとも１５個、少なくとも１０個、少なくとも５個のアミノ酸で隔てられている。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ＰＰＩＩ配列またはプロリンリッチ領域のＣ末端の２個のシステインとＰＰＩＩ配列またはプロリンリッチとは、約０〜４０個のアミノ酸（２個のシステインの最Ｎ末端とポリプロリンＩＩまたはプロリンリッチ領域のＣ末端アミノ酸との間のアミノ酸の数として評価）で隔てられている。いくつかの実施形態では、ＰＰＩＩ配列またはプロリンリッチ領域のＣ末端の２個のシステインとＰＰＩＩ配列またはプロリンリッチとは、少なくとも４０個、少なくとも３５個、少なくとも３０個、少なくとも２５個、少なくとも２０個、少なくとも１５個、少なくとも１０個、少なくとも５個のアミノ酸で隔てられている。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端の少なくとも２個のシステインは球状ドメインではない。いくつかの実施形態では、Ｃ末端の少なくとも２個のシステインは球状ドメインではない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは球状ドメインにシステインを含まない。好ましい実施形態では、ＰＢＩＳが異種タンパク質との融合タンパク質として提供される場合には、システインは異種タンパク質の一部を形成しない。
【０１１３】
Ｖ．ＰｒｏＸドメイン
別の好ましい実施形態では、ＰＢＩＳは、ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチドメインを挟み込むシステインがＮ１およびＮ２として知られる付加的配列内に見られる、従前の段落に定義された配列を含んでなる。これらのＮ１配列とＮ２配列はＰＰＩＩまたはプロリンリッチ領域を挟み込む。本明細書で使用可能な典型的なＮ１およびＮ２配列としては、限定されるものではないが、下記を含む。
【０１１４】
好適なＮ１配列としては、ＴＨＴＳＧＧＣＧＣＱ（配列番号２５）、ＴＨＰＰＰＰＣＰＣＰ（配列番号２６）またはＱＣＰＳＰＨＰＱＱＣＰＣＰＨＰＱＰＨＰＱＰＲＰＰＱＴＰＹＨＣ（配列番号１２６）が挙げられる。一実施形態では、Ｎ１配列はＰＰＩＩまたはプロリンリッチ領域の上流に見られる。
【０１１５】
Ｎ２配列は、プロリンリッチ領域であり得る。「プロリンリッチ領域」は、主としてプロリンにより形成される配列として上記に定義されている。好ましい実施形態では、プロリンリッチ領域は主としてプロリンにより形成され、その配列全体に均一に分布したプロリンを有する。従って、例えば、いくつかの実施形態では、該ＰＰＩＩ構造またはプロリンリッチ配列の長手方向に１０アミノ酸の枠を描いた場合、各枠と残りの枠とのプロリンパーセンテージの違いは約５０％以下、約４５％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下または約５％以下である。さらにより好ましい実施形態では、プロリンリッチ領域は、主としてプロリンにより形成され、これらのプロリンがその配列全体に均一に分布し、かつ、嵩高の(bulhy)側鎖（Ｔｒｐ、Ｔｙｒおよび／またはＰｈｅ）を有するアミノ酸のパーセンテージがその配列の全長に対するものの１０％を越えない配列である。
【０１１６】
本明細書で使用可能である好適なプロリンリッチ領域としては、γ−ゼインに見られるＰｒｏＸドメインＨＹＰＹＱＰＰＲＰＱＰＨＰＱＰＨＰＣＰＣ（配列番号７１）または配列：
【化７】
2013532960.tif 000011
からなる群から選択される改変配列が挙げられる。
【０１１７】
Ｎ２配列は、ＰＰＩＩ領域またはプロリンリッチ領域(porline-rich region)の下流または上流に見出せる。好ましい実施形態では、Ｎ２配列はＰＰＩＩ領域の下流に見られる。
【０１１８】
従って、好ましい実施形態では、本発明によるＰＢＩＳは、
【化８】
2013532960.tif 000012
（配列中、ｎは４、５、６、７または８である）
からなる群から選択される配列を含んでなる。好ましい実施形態では、ｎは８である。
【０１１９】
別の実施形態では、本発明によるＰＢＩＳは、表２に示される配列から本質的になる。
【０１２０】
【表２】
2013532960.tif 000013
2013532960.tif 000014
【０１２１】
別の態様において、本発明は、Ｎ１領域（２個のＮ末端システインを含んでなる）と、ＲＸ３  ＰＰＩＩの全部または一部を含んでなるが、第２のプロリンリッチ領域を欠いているＰＰＩＩ／プロリンリッチ領域とを含んでなるＰＢＩＳに関する。必要なＣ末端システインを提供するために、これらのＰＢＩＳは、ＰＰＩＩ領域のＣ末端に直接連結されている、ＣＰＰＣテトラペプチドを形成する２個のシステインを含んでなる。従って、別の態様において、本発明は、
Ｒ８（４Ｃ）（配列番号１０２）：
【化９】
2013532960.tif 000015
Ｒ７（４Ｃ）（配列番号１０３）：
【化１０】
2013532960.tif 000016
Ｒ６（４Ｃ）（配列番号１０４）：
【化１１】
2013532960.tif 000017
Ｒ４（４Ｃ）（配列番号１０５）：
【化１２】
2013532960.tif 000018
からなる群から選択されるものを含んでなるＰＢＩＳに関する。
【０１２２】
別の態様において、本発明は、Ｎ１領域（２個のＮ末端システインを含んでなる）と、ＲＸ３  ＰＰＩＩの全部または一部を含んでなるＰＰＩＩ／プロリンリッチ領域と、Ｎ２領域とを含んでなるが、Ｎ１領域はＲＸ３に見られるＰｒｏＸドメインのアミノ酸を逆配向で含んでなり、Ｎ２領域はＲＸ３のＮ１領域に見られるアミノ酸を逆配向で含んでなる、ＰＢＩＳに関する。従って、別の態様では、本発明は、
ｉＲＸ３（配列番号１０６）
【化１３】
2013532960.tif 000019
からなる群から選択されるものを含んでなるＰＢＩＳに関する。
【０１２３】
ＶＩ．ＰＢＩＳ融合タンパク質
本明細書に記載されるように、組換えＰＢＩＳは、いずれの目的産物とも融合させることができる。従って、別の態様では、本発明は、本発明の組換えＰＢＩＳと異種タンパク質とを含んでなる融合タンパク質に関する。「異種タンパク質」とは、本明細書において「目的産物」または「ＰＯＩ」と互換的に用いられ、例えば、タンパク質またはペプチドであり得る。組換えＰＢＩＳは、目的タンパク質またはペプチドのＮ末端と融合させることもできるし、またはＣ末端と融合させることもできる。さらに、組換えＰＢＩＳは、目的タンパク質またはペプチドと直接融合させることもできるし、または目的タンパク質またはペプチドと例えばスペーサーを介して、間接的に結合させることもできる。
【０１２４】
従って、組換えＰＢＩＳは、例えば、酵素、ホルモン（例えば、カルシトニン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ヒト、成長ホルモンおよび上皮細胞増殖因子など）、インターフェロン、またはサイトカインと融合させることができる。目的タンパク質またはペプチドの他の例としては、治療用途、栄養補助用途、農業用途または工業用途を有するいずれのタンパク質も含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、必須アミノ酸が富化されたペプチドと融合させることができる。このような他のタンパク質の例示的活性としては、（ａ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）および赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）などの光捕捉および放出、（ｂ）一次および二次細胞内シグナル伝達および代謝経路と関連付けることができ、エンテロキナーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、フィターゼ、炭酸脱水酵素、および工業用酵素（ヒドロラーゼ、グリコシダーゼ、セルラーゼおよびオキシドレダクターゼなど）により例示される酵素活性、（ｃ）タンパク質−タンパク質、タンパク質−受容体、およびタンパク質−リガンド相互作用、例えば、抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡなどのｍＡｂ））およびそれらの断片、ホルモン（カルシトニン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）など）、プロテアーゼ阻害剤、抗生物質、抗菌物質、ＨＩＶエントリー阻害剤(Ryser et al., 2005 Drug Discov Today. 10: 1085-1094)、コラーゲン、ヒトラクトフェリン、およびサイトカイン、（ｄ）ワクチン用のタンパク質およびペプチド抗原（ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ、Ｂ型肝炎前表面、表面およびコア抗原、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）構造ポリタンパク質遺伝子Ｐ１(Dus Santos et al., 2005 Vaccine.23: 1838-1843)、米国特許第４，８８２，１４５号のＴ細胞刺激ペプチド、胃腸炎コロナウイルスおよびヒト乳頭腫ウイルスなど）、（ｅ）タンパク質−非タンパク質相互作用、例えば、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、リシン毒素サブユニットＢ（ＲＴＢ）、およびその他のレクチンが挙げられる。
【０１２５】
本明細書に記載されるように、目的産物は、組換えＰＢＩＳとの融合体として発現された場合、またはＲＰＢＬＡから精製された場合にはその機能活性を維持することができる。このような発現ポリペプチドの生物活性のアッセイは当技術分野で周知であり、１以上の刊行物に見出せる。例えば、ＥＣＦＰ活性は、そのタンパク質が４５８ｎｍで励起された場合に４７０〜５３０ｎｍの波長において放出される蛍光を定量することによって測定することができる（Richards et al., 2003 Plant Cell Rep. 22: 117-121参照）。例えば、エンテロキナーゼ（ＥＫ）の酵素活性は、２つの異なるアプローチで測定することができる。この活性は、Invitrogen Life Technologies catalog (E180-01およびE180-2)に述べられているように、エンテロキナーゼ特異的切断部位を含む融合タンパク質の切断をウエスタンブロットにより分析することによって、およびまたＥＫの蛍光性ペプチド基質（Ｓｉｇｍａ  Ｇ−５２６１、ＣＡＳ  ＲＮ  ７００２３−０２−８）を用いてＥＫ活性を定量することによって測定することができ、酵素活性は、ペプチドからのβ−ナフチルアミンの放出によって起こる蛍光（励起３３７ｎｍ、発光４２０ｎｍ）の増強によって経時的に測定される（LaVallie et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:23311-23317参照）。酵素β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の活性は、基質ＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリルグルクロニド）から産物ＭＵへの変換によって測定することができる。この産物は、分光蛍光計にて励起３６５ｎｍ、発光４５５ｎｍで蛍光を測定することによって定量することができる（Pai-Hsiang et al., 2001 J. Plant Physiol. 158:247-254、およびJefferson et al., 1987 EMBO J. 6:3901-3907参照）。フィターゼアッセイは、アセトン、５．０Ｎ硫酸、および１０ｍＭモリブデン酸アンモニウムからなるＡＡＭ試薬から遊離した無機オルトリン酸を定量することによって行われる（Ullah et al., 1999 Biochem. Biophys. Res. Commun. 264:2
01-206参照）。
【０１２６】
同様のアッセイが他の生体タンパク質にも利用可能である。ＲＴＢ活性アッセイは、Reed et al., 2005 Plant Cell Rep. 24:15-24に記載されているようにＲＴＢとアシアロフェツイン、ラクトースおよびガラクトースの結合を測定することによって行うことができる。ＥＧＦは線維芽細胞の増殖に関与する増殖因子である。ＥＧＦ活性は、細胞増殖ＥＬＩＳＡキットを用いて、チミジンの代わりにピリミジン類似体である５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の、増殖中の細胞のＤＮＡへの取り込みによって測定されるＤＮＡ合成の誘導の定量によりアッセイすることができる（Oliver, et al., 2004 Am. J. Physiol. Cell Physiol. 286:1118-1129、 Catalog no. 1647229, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）。
【０１２７】
光捕捉および放出は、発光活性としての独立した、特殊なタイプの「生物活性」を構成することに留意されたい。これらのタンパク質は、例えばリポーター分子など、多くのタイプのアッセイ、または分析で用いるスクリーン、または生物学的に重要な分子の発見において有用であり、それらの発光活性には適正な二次および三次タンパク質構造が必要である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳ融合タンパク質は、スペーサーアミノ酸配列を含んでなる。スペーサーアミノ酸配列は、酵素的もしくは化学的手段によって切断可能であるアミノ酸配列であっても、または切断可能でないアミノ酸配列であってもよい。「切断可能でない」とは、スペーサーの切断がその生物学的に活性なポリペプチドの一部または全体の破壊なしには起こらないことを意味する。
【０１２９】
スペーサーは、組換えＰＢＩＳと生物学的に活性なポリペプチドの間に置くことができる。例として、エンテロキナーゼ、Ａｒｇ−Ｃエンドプロテアーゼ、Ｇｌｕ−Ｃエンドプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテアーゼ、因子ＸａおよびＳＵＭＯプロテアーゼなどのプロテアーゼによって切断可能なアミノ酸配列(Tauseef et al., 2005 Protein Expr. Purif. 43: 1-9)などがある。スペーサーはまた、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓその他から市販されているようなＦＭＤＶウイルス自己プロセシング２Ａ配列などの自己切断可能配列、およびＳｓｐ  ＤＮＡｂインテインなどのタンパク質イントロン（インテイン（intein））などにも相当し得る。インテインリンカーの使用は、このような配列がタンパク質スプライシングの発生を選択的に誘発し、それにより、発現され、回収されたタンパク質から自らを除去することができるので有利であり得る。インテインは、目的タンパク質から組換えＰＢＩＳを切断するためにそれらの標的部位に及ぶ大きなタンパク質酵素を必要としないので特に注目される。この特性は、無傷なＲＰＢＬＡから目的タンパク質を直接単離するために特に有用であり得る。あるいは、スペーサーは、例えばメチオニン残基で切断を行う臭化シアノゲンなどの化学試薬によって特異的に切断可能であるアミノ酸配配列であり得る。
【０１３０】
好ましい実施形態では、スペーサーは、ペンタグリシンペプチドを含んでなる。さらにより好ましい実施形態では、スペーサーは、ペンタグリシンペプチドとその後にプロテアーゼ切断部位を含んでなる。さらにより好ましい実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、エンテロキナーゼ切断部位（Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｋ、Ｋ残基の後で切断する）および因子Ｘａ切断部位（Ｉ−Ｄ／Ｅ−Ｇ−Ｒ、Ｒ残基の後で切断する）からなる群から選択される。
【０１３１】
ＶＩＩ．組換えＰＢＩＳおよび組換えＰＢＩＳ融合タンパク質をコードする核酸
組換えＰＢＩＳをコードするポリヌクレオチドもまた本明細書に記載される。同様に、組換えＰＢＩＳを含んでなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも記載される。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態であってもまたはＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡが含まれ、二本鎖であってもまたは一本鎖であってもよく、一本鎖である場合には、コード鎖であってもまたは非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは単離されている。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＰＢＬＡが発現される宿主に対してコドンが最適化されている。
【０１３２】
本発明によるポリヌクレオチドは、ＰＢＩＳまたは融合タンパク質を小胞体へと向けるシグナル配列をコードする配列をさらに含んでなり、該シグナル配列はＰＢＩＳまたは融合タンパク質と同じオープンリーディングフレームにある。
【０１３３】
上記のように、組換えＰＢＩＳは、組換えＰＢＩＳを細胞内の特定の場所へと向けるシグナルを含んでなることができる。例えば、組換えＰＢＩＳは、シグナルペプチドを介して、小胞体（ＥＲ）の管腔へと向けることができる。
【０１３４】
シグナルは組換えＰＢＩＳをＥＲへと向けるいずれのドメインであってもよい。単に例であるが、ＥＲシグナル伝達ドメインは、ゼインタンパク質（例えば、γ−ゼインもしくはα−ゼイン）、グリアジンタンパク質（例えば、α−グリアジンもしくはγ−グリアジン）、またはＰＲ１０クラス２５の病理関連タンパク質に由来するＥＲシグナル伝達ペプチドであり得る。好ましい実施形態では、シグナル配列は、配列ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ（配列番号５８）を含んでなる。あるいは、シグナル配列は、病理関連遺伝子、特に、ＰＲ−１０遺伝子、最も好ましくは、タバコＰＲ−２タンパク質(Veroverd et al, Plant Physiol, 1995, 109: 1199-1205)に由来してもよい。好ましい実施形態では、シグナル配列は、配列ＭＦＬＫＳＰＦＹＡＦＬＣＦＧＱＹＦＶＡＶＴＨＡ（配列番号５９）を含んでなる。
【０１３５】
タンパク質をＥＲへと向けることを担うシグナルペプチドの特徴は鋭意研究されている(von Heijne et al., 2001 Biochim. Biophys. Acta 1541:114-119)。シグナルペプチドは一次構造では相同性を有さないが、共通の三分割構造、すなわち、中央の疎水性ｈ−領域と親水性のＮ末端およびＣ末端隣接領域を有する。これらの類似性、およびタンパク質が見たところ共通の経路を用いてＥＲ膜を介して輸送されるという事実は、異なるタンパク質間で、または異なる門に属す異なる生物に由来するものでさえ、シグナルペプチドの交換を可能とする。Martoglio et al, 1998 Trends Cell Biol. 5:410-415参照。
【０１３６】
シグナルペプチドは、組換えＰＢＩＳが適当な細胞内の場所、例えば、ＥＲに到達したところで切断され得る。ほとんどの真核生物では、シグナルペプチドは同時翻訳的に切断され、従って、内膜コンパートメント（例えば、ＥＲ、ゴルジ体、液胞）に見られるタンパク質の大部分は成熟タンパク質、すなわち、シグナルペプチドを含まないタンパク質である。結果として、成熟タンパク質はＲＰＢＬＡ形成の誘導を担う。好ましい実施形態では、シグナル配列は、配列ＭＲＶＬＬＶＡＬＡＬＬＡＬＡＡＳＡＴＳ（配列番号５８）を有するγゼインシグナルペプチド(gamma zein signal peptide)である。
【０１３７】
このようなポリヌクレオチドは、例えば、細胞内で、組換えＰＢＩＳまたは組換えＰＢＩＳを含んでなる融合タンパク質を産生するための発現ベクターに組み込むことができる。発現ベクターは、好適な転写または翻訳調節エレメントに機能的に連結された、組換えＰＢＩＳまたは組換えＰＢＩＳを含んでなる融合タンパク質をコードする合成またはｃＤＮＡ由来ＤＮＡ断片を有する複製可能なＤＮＡ構築物である。転写または翻訳調節エレメントは、例えば、哺乳類、微生物、ウイルス、昆虫または遺伝子に由来し得る。転写単位は一般に、以下に詳細に記載されるように、（１）遺伝子発現において調節の役割を有する１つの遺伝子エレメントまたは複数の遺伝子エレメント、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡへと転写され、タンパク質へと翻訳される構造配列またはコード配列、および（３）適当な転写および翻訳開始および終結配列を含んでなるアセンブリを含んでなる。このような調節エレメントは、転写を制御するためのオペレーター配列を含み得る。宿主における複製能は通常複製起点によって付与され、形質転換体の認識を補助するための選択遺伝子を付加的に組み込むことができる。ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に連関される場合に機能的に連結されている。例えば、シグナルペプチドのＤＮＡは、それがあるポリペプチドの分泌に関わる前駆体として発現される場合に、そのポリペプチドのＤＮＡと機能的に連結されており、プロモーターは、それがあるコード配列の転写を制御する場合に、その配列と機能的に連結されており、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能とするように配置されている場合に、コード配列と機能的に連結されている。
【０１３８】
発現制御配列および発現ベクターの選択は宿主の選択によって決まる。多様な発現宿主／ベクターの組合せが使用可能である。真核生物宿主のための有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含んでなるベクターが挙げられる。細菌宿主のための有用な発現ベクターとしては、大腸菌(Esherichia coli)由来プラスミド（ｐＣＲ  １、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体を含む）などの既知の細菌プラスミド、より広い宿主域のプラスミド（例えば、Ｍ１３）および線維状一本鎖ＤＮＡファージが挙げられる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターは、多重クローニング部位をさらに含んでなる。多重クローニング部位は、１以上の独特な制限部位を含んでなるポリヌクレオチド配列である。制限部位の限定されない例としては、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｖａＩまたはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１４０】
多重クローニング部位は、組換えＰＢＩＳをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターにおいて、目的タンパク質またはペプチドをコードするポリヌクレオチドの、ベクターへの挿入を簡単にするために使用することができ、その結果、このベクターは組換えＰＢＩＳと目的タンパク質またはペプチドとを含んでなる融合タンパク質を発現させるために使用可能となる。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳをコードするポリヌクレオチドは多重クローニング部位の５’側にある。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳをコードするポリヌクレオチドは多重クローニング部位の３’側にある。
【０１４１】
これらのベクターは少なくとも１つのプロモーターを含んでなり得る。該プロモーターは、組換えＰＢＩＳまたは組換えＰＢＩＳを含んでなる融合タンパク質の発現を駆動するために好適ないずれの配列であってもよい。特定の一実施形態では、該プロモーターはタバコ葉において発現を駆動する。
【０１４２】
種々の宿主が多くの場合、特定のアミノ酸残基をコードするために使用すべき特定のコドンに選択性を有する。このようなコドンの選択性は周知であり、所望の融合タンパク質配列をコードするＤＮＡ配列は、in vitro突然変異誘発を用いて、例えば、融合タンパク質を発現させる特定の宿主にとって宿主選択的コドンが使用されるように変更することができる。
【０１４３】
上記のように、検討される融合タンパク質をコードする遺伝子を定義する外因性の核酸セグメント（例えば、ＤＮＡセグメントまたは配列）に機能的に連結された、適合する真核宿主細胞生物体において遺伝子の発現を駆動するのに好適なプロモーターなどの１以上の調節配列（制御エレメント）を含む遺伝子ベクターまたは構築物を含んでなる、ＤＮＡ分子などの組換え核酸分子も検討される。より詳しくは、目的ポリペプチドに連結されたタンパク顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）をコードする遺伝子を定義するＤＮＡセグメントに機能的に連結された、宿主生物細胞において融合タンパク質の発現を駆動するためのプロモーターを含んでなる遺伝子ベクターを含んでなる組換えＤＮＡ分子も検討される。そのような組換えＤＮＡ分子は、宿主真核細胞における好適なトランスフェクションおよび発現の際に、検討される融合タンパク質をＲＰＢＬＡとして提供する。
【０１４４】
当技術分野で周知のように、必要な核酸、例示的にはＤＮＡ配列が存在する限り（開始および終結シグナルを含む）、通常にはそのＤＮＡセグメントのいずれかの末端に付加的塩基対が存在してもよく、そのセグメントもそのタンパク質を発現させるためにやはり使用可能である。これは、当然のことながら、発現を抑制する、または発現させたい融合タンパク質を消費するさらなる産物を発現する、または所望の融合タンパク質により産生される所望の反応産物を消費する産物を発現する、またはそうでなければ、そのＤＮＡセグメントの遺伝子の発現に干渉する、機能的に連結されたＤＮＡ配列のセグメントに存在しないことも仮定する。
【０１４５】
従って、ＤＮＡセグメントがこのような干渉ＤＮＡ配列を含んでいない限り、本発明のＤＮＡセグメントは約５００〜約１５，０００塩基対の長さであり得る。組換えＤＮＡ分子、特に発現ベクターの最大サイズは、主として利便性と、所望であれば、複製および発現に必要な最小ＤＮＡ配列の総てが存在すれば、宿主細胞により収容され得るベクターサイズによって決まる。最小ベクターサイズは周知である。
【０１４６】
以上に記載した融合タンパク質をコードするＤＮＡセグメントは、化学技術、例えば、Matteucci et al., 1981 J. Am. Chem. Soc, 103:3185のホスホトリエステル法によって合成することができる。当然のことながら、コード配列を化学的に合成することにより、単に天然アミノ酸残基配列をコードするものを適当な塩基に置換することによって、任意の所望の改変を行うことができる。
【０１４７】
融合タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡセグメントはまた、その遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子（プラスミドベクター）から得ることもできる。
【０１４８】
宿主細胞において融合タンパク質遺伝子の発現を指示するベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。発現ベクターは、プロモーターを含む発現制御エレメントを含む。融合タンパク質コード遺伝子は、プロモーター配列に、ＲＮＡポリメラーゼの結合および融合タンパク質コード遺伝子の発現を指示させるように発現ベクターに機能的に連結される。ポリペプチドコード遺伝子の発現に有用なのは、Paszkowski et al., 1989 EMBO J., 3:2719およびOdell et al., 1985 Nature, 313 :810により記載されている誘導型、ウイルス性、合成、構成的、ならびにChua et al., 1989 Science, 244:174-181に示されている時間的に調節される、空間的に調節される、および時空的に調節されるプロモーターである。
【０１４９】
哺乳類、藻類または昆虫などの細胞と適合するものなど、真核細胞と適合する発現ベクターが本明細書において検討される。このような発現ベクターもまた、本発明の組換えＤＮＡ分子を形成するために使用可能である。真核細胞発現ベクターは当技術分野で周知であり、いくつかの商業ソースから入手可能である。通常、このようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントおよびプロモーター配列の挿入のための１以上の便宜な制限部位を含む。場合により、このようなベクターは真核細胞における使用のために特異的な選択マーカーを含む。
【０１５０】
どの発現ベクターを選択するか、また、最終的にはどのプロモーターに融合タンパク質コード遺伝子を機能的に連結させるかは、直接的には、所望の機能的特性、例えば、タンパク質発現の場所およびタイミング、ならびに形質転換させる宿主細胞によって異なる。これらは、組換えＤＮＡ分子の構築に関する当技術分野に固有の周知の制限である。しかしながら、本発明の実施に有用なベクターは、それが機能的に連結されているＤＮＡセグメントに含まれる融合タンパク質遺伝子の複製を、および好ましくは発現も（発現ベクターの場合）指示することができる。
【０１５１】
高等植物および哺乳類由来の細胞における遺伝子の発現に有用な典型的なベクターは当技術分野で周知であり、Rogers et al. (1987) Meth. in Enzymol, 153:253-277に記載されているアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドに由来する植物ベクター、ならびに上記の哺乳類発現ベクターｐＫＳＶ−１０およびｐＣＩ−ｎｅｏ(Promega Corp., #E1841, Madison, Wis.)を含む。しかしながら、Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 52:58-24により記載されているｐＣａＭＶＣＮ転移制御ベクターをはじめ、他のいくつかの発現ベクター系も植物において機能的であることが知られている。プラスミドｐＣａＭＶＣＮ（Pharmacia, Piscataway, N.J.から入手可能）は、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ  ３５Ｓ  プロモーターを含む。
【０１５２】
ＶＩＩＩ．組換えタンパク顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）、宿主細胞および組換えタンパク顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）の調製方法
天然タンパク顆粒は、穀類の内胚乳においてすでに記載されている。それらはプロラミンおよびグルテリンの発現によって誘導される。タンパク顆粒は、集合したタンパク質（例えば、プロラミンおよびグルテリン）が著しく富化され、ＥＲまたは液胞に由来し得る膜によって取り囲まれたオルガネラである。ほとんどのタンパク顆粒は、直径約０．５〜約３．０ミクロンの丸い形状（一般に、球形）の構造である。
【０１５３】
組換えタンパク顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）は、細胞における組換えＰＢＩＳの発現によって形成され得る。ＰＢＩＳが著しく富化されたオルガネラである天然タンパク顆粒と同様に、ＲＰＢＬＡは組換えＰＢＩＳが著しく富化された組換えオルガネラである。オルガネラ内で集合したＰＢＩＳまたは組換えＰＢＩＳは膜に取り囲まれている。細胞では、ＲＰＢＬＡは一般に細胞の細胞質に見られ、従って、さらなる膜（原形質膜）に取り囲まれている。これらの膜（原形質膜およびオルガネラ膜）はＲＰＢＬＡの回収プロセス中に除去され得るが、このオルガネラはやはりＲＰＢＬＡと見なされる。
【０１５４】
動物細胞で発現された場合、ＲＰＢＬＡは一般に球形で、直径約０．５〜約３ミクロンであり、周囲の膜を有している。植物細胞で発現されたＲＰＢＬＡも通常球形であり、直径約０．５〜約２ミクロンであり、膜に取り囲まれている。しかしながら、ＲＰＢＬＡは不定形で、不均一な大きさである場合もある。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ＲＰＢＬＡは少なくとも約０．３、少なくとも約０．４、または少なくとも約０．５マイクロメーターである。いくつかの実施形態では、ＲＰＢＬＡは約３マイクロメーター以下、約２．５マイクロメーター以下、または約２マイクロメーター以下である。いくつかの実施形態では、ＲＰＢＬＡは約０．３〜約３．０マイクロメーター、約０．３〜約２．５マイクロメーター、または約０．３〜約２マイクロメーターである。いくつかの実施形態では、ＲＰＢＬＡは、約０．５〜約３．０マイクロメーター、約０．５〜約２．５マイクロメーター、または約０．５〜約２マイクロメーターである。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ＲＰＢＬＡは、融合タンパク質によって異なり得るが、調製される特定の融合タンパク質の宿主によって断定できる所定の密度を有する。そのようなＲＰＢＬＡの所定の密度は一般に、ホモジネート中に存在する内因性の宿主細胞タンパク質の実質的に総てのものの密度よりも大きく、一般に、約１．１〜約１．４ｇ／ｍｌである。このＲＰＢＬＡの高密度は、組換え融合タンパク質の、自己集合し、膜と会合した規則的な凝集体へと蓄積する一般的な能力によるものである。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＲＰＢＬＡは、少なくとも約１．０ｇ／ｍｌの密度を有する。いくつかの実施形態では、ＲＰＢＬＡは、約１．１〜約１．４ｇ／ｍｌ、約１．１５〜約１．３５ｇ／ｍｌ、または約１．０〜約１．３ｇ／ｍｌの密度を有する。いくつかの実施形態では、ＲＰＢＬＡは約１．４ｇ／ｍｌ以下の密度を有する。
【０１５８】
検討されるＲＰＢＬＡは、上記のようなそれらの密度、ならびにそれらの大きさおよび形状によって同定することができる。実施例ならびに材料および方法に記載されているステップ−クッションイオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標））密度勾配は、あるＲＰＢＬＡの密度を決定するのに有用な方法である。ＲＰＢＬＡの密度を決定するために使用可能な他の補足的または好適な方法としては、スクロース、グリセロールおよびパーコールなどの他の密度設定溶質に基づくステップ−クッション密度勾配が含まれる。
【０１５９】
別の態様において、本発明は、
（ｉ）植物宿主系を本発明による核酸またはベクターで形質転換すること、
（ｉｉ）前記形質転換植物宿主系から植物体を作出すること、および
（ｉｉｉ）前記植物体をＲＰＢＬＡの形成に好適な条件下で栽培すること
を含んでなる、ＲＰＢＬＡの製造方法に関する。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、ＲＰＢＬＡは真核細胞で生産される。例えば、ＲＰＢＬＡは植物、動物、昆虫または真菌で生産することができる。ＲＢＰＬＡの生産に好適な宿主細胞には、例として、高等植物（例えば、トマト、タバコ、アラビドプシス属(Arabidopsis)、アルファルファ）、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳおよび２９３Ｔ細胞）、糸状菌（例えば、トリコデルマ・リーゼイ(Tricoderma resei)およびアスペルギルス種(Aspergillum sp.)）、昆虫細胞が含まれる。引用することにより本明細書の開示の一部とされ、本明細書に記載されるＲＰＢＬＡを生産するために使用可能な他の宿主細胞例を記載している、米国特許第７，５７５，８９８号および米国特許出願公開第２００６／０１２１５７３号も参照。いくつかの実施形態では、ＲＰＢＬＡはタバコ植物細胞で発現される。
【０１６１】
さらに他の実施形態では、宿主細胞は高等真核細胞である。高等真核細胞としては、哺乳類起源の確立された細胞系統が含まれる。種々の哺乳類細胞培養系は、タンパク質が一般に正しく折り畳まれ、適切に修飾され、かつ、完全に機能的であるので、ＲＰＢＬＡを発現させるのに有利に使用される。好適な哺乳類宿主細胞系統の例としては、Gluzman (Cell 23: 175, 1981)により記載されているサル腎臓細胞のＣＯＳ−７系統、および例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系統をはじめとする、適当なベクターを発現し得る他の細胞系統が挙げられる。昆虫細胞における異種タンパク質の生産のためのバキュロウイルス系は、Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)により記載されている。
【０１６２】
ＲＰＢＬＡはまた、葉、穀粒、根および子葉などの種々の組織でも生産可能である。いくつかの実施形態では、ＲＰＢＬＡはタバコ葉細胞で発現される。
【０１６３】
以下に詳細に記載するように、ＲＰＢＬＡは、組換えＰＢＩＳまたは組換えＰＢＩＳを含んでなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞をＲＰＢＬＡの形成に好適な条件下で培養することにより生産することができる。例えば、ＲＰＢＬＡは、植物宿主細胞を、組換えＰＢＩＳまたは組換えＰＢＩＳを含んでなる融合タンパク質をコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドで形質転換すること、その宿主細胞から形質転換植物体を作出すること、およびそれらの植物体をＲＰＢＬＡの形成に好適な条件下で栽培することにより、植物宿主細胞において生産することができる。
【０１６４】
ＲＰＢＬＡの形成に好適な特定の条件を以下の実施例に記載する。ＲＰＢＬＡの形成に好適な他の条件は、本明細書に記載されるように組換えＰＢＩＳを発現させ、試験条件下での、このような既知の組換えＰＢＩＳのＲＰＢＬＡ形成能を評価することにより、当業者によって決定することができる。
【０１６５】
ＩＸ．ＲＰＢＬＡ、組換えＰＢＩＳを含んでなる融合タンパク質、および目的タンパク質の精製
本発明によるＲＰＢＬＡは、既知の方法を用いて精製することができる。特に、ＲＰＢＬＡは宿主細胞中に存在する他のタンパク質に比べて高密度であることから、ＲＰＢＬＡは特に、細胞ホモジネートの遠心分離により回収しやすい。
【０１６６】
従って、別の態様において、本発明は、（ｉ）本発明による宿主細胞をＲＰＢＬＡの形成に好適な条件下で培養すること、および（ｉｉ）組換えタンパク顆粒を精製することを含んでなる、ＲＰＢＬＡの精製方法に関する。さらに別の態様では、ＲＰＢＬＡの製造方法は、
（ｉ）植物宿主系を本発明による核酸またはベクターで形質転換すること、
（ｉｉ）前記形質転換植物宿主系から植物体を作出すること、
（ｉｉｉ）前記植物体をＲＰＢＬＡの形成に好適な条件下で栽培すること、および
（ｉｖ）ＲＰＢＬＡを精製すること
をさらに含んでなる。
【０１６７】
従って、好ましい実施形態では、ＲＰＢＬＡの精製は、
（ｉ）水性細胞ホモジネートを調製すること、
（ｉｉ）水性細胞ホモジネート中に密度の異なる領域を形成して、高濃度のＲＰＢＬＡを含有する領域と低濃度のＲＰＢＬＡを含有する領域を設けること、および
（ｉｉｉ）比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域からＲＰＢＬＡ枯渇領域を分離し、それにより、ＲＰＢＬＡを精製すること
を含んでなる。
【０１６８】
従って、密度の異なる領域は、ホモジネート中に、比較的高濃度のＲＰＢＬＡを含有する領域と比較的低濃度のＲＰＢＬＡを含有する領域を設けるために形成される。ＲＰＢＬＡ枯渇領域を比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域から分離し、それにより、前記ＲＰＢＬＡを精製する。
【０１６９】
ＲＰＢＬＡが精製されれば、回収されたＲＰＢＬＡは、ＲＰＢＬＡが経口ワクチンとして使用される場合には、融合タンパク質を単離する必要はなく、そのまま使用される。しかしながら、その後に比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域を回収することもできるし、またはＲＰＢＬＡもしくはその中の融合タンパク質の単離の前に１以上の試薬で処理するか、もしくは１以上の手順を施すこともできる。従って、別の態様において、本発明は、
（ｉ）包膜融合タンパク質を含んでなるＲＰＢＬＡを準備すること（ここで、該融合タンパク質は本発明による融合タンパク質である）、
（ｉｉ）前記ＲＰＢＬＡと、膜を解離する量の界面活性剤および／または還元剤を含有する水性緩衝液とを接触させること、
（ｉｉｉ）膜を解離させるのに十分な時間および融合タンパク質を変性させない温度で接触を維持して、融合タンパク質から膜を分離すること、および
（ｉｖ）分離した融合タンパク質を回収すること
を含んでなる、融合タンパク質の精製方法に関する。
【０１７０】
生物学的に活性なポリペプチドを含有する融合タンパク質は、回収されたＲＰＢＬＡから周囲の膜を、洗剤および／または還元剤を含有する水性緩衝液に溶解させることにより得ることができる。例示的還元剤としては、２−メルカプトエタノール、チオグリコール酸およびチオグリコール酸塩、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、亜硫酸イオンまたは銃亜硫酸イオンが挙げられ、その後、通常のタンパク質単離法を行う。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は好ましい洗剤であるが、他のイオン性界面活性剤（デオキシコール酸塩および’Ｎ−ラウロイルサルコシンなど）、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０およびオクチルグルコシドなど）および両性イオン界面活性剤（ＣＨＡＰＳおよびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）３−Ｘ系など）も使用可能である。融合タンパク質を溶解または分散させる最少量の界面活性剤が用いられる。
【０１７１】
組換えＰＢＩＳまたは組換えＰＢＩＳを含んでなる融合タンパク質は、他のいずれの好適な方法によって精製してもよい。標準法としては、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、またはタンパク質精製のための他の任意の標準技術によるものが挙げられる。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのアフィニティータグをタンパク質に結合させて、適当なアフィニティーカラムを通すことにより容易な精製を可能とすることもできる。
【０１７２】
単離されたタンパク質は、タンパク質分解、核磁気共鳴およびＸ線結晶学などの既知の技術を用いて物理的に特性決定を行うことができる。
【０１７３】
別の態様において、本発明は、
（ｉ）包膜融合タンパク質を含んでなるＲＰＢＬＡを準備すること（ここで、該融合タンパク質は本発明による融合タンパク質である）、
（ｉｉ）前記ＲＰＢＬＡと、膜を解離する量の界面活性剤を含有する水性緩衝液とを接触させること、
（ｉｉｉ）膜を解離させるのに十分な時間および融合タンパク質を変性させない温度で接触を維持して、融合タンパク質から膜を分離すること、
（ｉｖ）分離した融合タンパク質を回収すること、および
（ｖ）組換えＰＢＩＳと異種タンパク質との間の切断部位を切断すること
を含んでなる、タンパク質の精製方法に関する。
【０１７４】
融合タンパク質は、動物、動物細胞培養物、植物または植物細胞培養物、真菌培養物、昆虫細胞培養物または藻類培養物などの真核生物宿主細胞系を、（ｉ）組換えＰＢＩＳをコードする第１の核酸を、（ｉｉ）生物学的に活性な目的ポリペプチド産物をコードする第２の核酸  配列と機能的に連結させて含んでなる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列で形質転換することを含んでなる方法に従って調製することができる。ウイルスの形質導入または感染を介するものなど、ＤＮＡを導入する間接的手段の使用も検討され、トランスフェクションなどの直接的ＤＮＡ送達法と互換的に使用されるものとする。
【０１７５】
形質転換された宿主細胞または実体は、融合タンパク質の発現および発現された融合タンパク質が集合してＲＰＢＬＡとなるのに好適な時間および培養条件下で維持される。発現すると、結果として生じる融合タンパク質は形質転換宿主系にＲＰＢＬＡとして蓄積する。その後、融合タンパク質を宿主細胞から回収することもできるし、または所望により、追加の栄養素もしくは栄養補助を含有する動物食品の場合には、融合タンパク質を含有する宿主細胞を使用することもできる。融合タンパク質はＲＰＢＬＡの一部として単離することもできるし、またはＲＰＢＬＡ不含とすることもできる。
【０１７６】
融合タンパク質の発現に好適な培養条件は一般に、各種宿主実体または宿主細胞のよって異なる。しかしながら、そのような条件は当業者には既知であり、容易に決定される。同様に、維持期間も宿主細胞によって、また、生産しようとする融合タンパク質の量によって異なり得る。ここでも、そのような条件は周知であり、具体的な状況において容易に決定することができる。さらに、具体的な培養条件は、本明細書の引例および実施例から得ることができる。
【０１７７】
別の特定の実施形態では、融合タンパク質は、動物、動物細胞培養物、植物、植物細胞培養物、真菌または藻類などの宿主細胞系を、従前に記載した核酸配列（ｉ）および（ｉｉ）の他、スペーサーアミノ酸配列をコードするフレーム核酸配列（ｉｉｉ）を含んでなる核酸配列で形質転換することを含んでなる方法に従って調製される。スペーサーアミノ酸配列は、以上に記載したように、酵素的もしくは化学的手段によって切断可能であるアミノ酸配列であっても、または切断可能でないアミノ酸配列であってもよい。特定の一実施形態では、核酸配列（ｉｉｉ）は前記核酸配列（ｉ）と（ｉｉ）の間に位置し、例えば、第３の核酸配列（ｉｉｉ）の３’末端が第２の核酸配列（ｉｉ）の５’末端に連結される。別の実施形態では、第３の核酸配列（ｉｉｉ）の５’末端が、第２の核酸配列（ｉｉ）の３’末端に連結される。
【０１７８】
昆虫細胞系もまた検討される融合タンパク質を発現させるのに使用可能である。例えば、このような１つの系において、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）またはバキュロウイルスが、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞またはトリコプルシア・ラルバエ(Trichoplusia larvae)において外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いられる。融合タンパク質をコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子などの、ウイルスの非必須領域にクローン化し、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。融合タンパク質配列が上手く挿入されれば、ポリヘドリン遺伝子が不活性となり、コートタンパク質を欠いた組換えウイルスが生産される。次に、これらの組換えウイルスを用いて、例えば、例えば、ヨトウガ細胞またはトリコプルシア・ラルバエに感染させることができ、そこで融合タンパク質は、例えば、Engelhard et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3224-3227、およびV. Luckow, "Insect Cell Expression Technology", pages 183-218, in Protein Engineering: Principles and Practice, J. L. Cleland et al. eds., Wiley-Liss, Inc, 1996)に記載されているように発現させることができる。オートグラファ・カリフォルニカ核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターの制御下に位置する異種遺伝子は多くの場合、感染後期に高レベルで発現される。
【０１７９】
融合タンパク質遺伝子を含む組換えバキュロウイルスは、Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ（商標）バキュロウイルス発現系(Life Technologies)として市販されているバキュロウイルスシャトルベクター系(Luckow et al., 1993 J. Virol, 67:4566-4579)を用いて構築される。組換えウイルスの原株を調製し、組換えタンパク質の発現を標準プロトコール(O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York, 1992、およびKing et al., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman & Hall, London, 1992)により測定する。T. Kostおよび共同研究者ら（例えば、Merrihew et al., 2004 Methods Mol. Biol. 246:355-365参照）により記載されている「ＢａｃＭａｍ」系などの哺乳類細胞におけるバキュロウイルスまたは他の送達ベクター、または当業者に知られているような他のこのような系も本発明において検討される。
【０１８０】
植物発現系は一般に、挿入された導入遺伝子の全身的または構成的発現をもたらす。全身的発現は、植物体の大部分または全部ＲＰＢＬＡおよびそれらの融合タンパク質の供給源として用いられるので有用であり得る。しかしながら、それらの粒子がより容易に単離または摂取され得る根、種子または果実などの植物貯蔵器官においてＲＰＢＬＡおよびそれらの融合タンパク質内容物を発現させるのがより効率的であり得る。
【０１８１】
貯蔵器官発現を達成する他の方法は、予め選択されたまたは予め決められた１以上の非光合成植物器官においてその制御された遺伝子を発現するプロモーターを使用することである。根、種子または果実と葉または茎など、予め選択された１以上の貯蔵器官において発現され、他の器官における発現がほとんどまたは全くない場合を、本明細書では増強されたまたは優先的発現と呼ぶ。実質的にある貯蔵器官でのみ発現し、他の貯蔵器官では実質的に発現しない場合を器官特異的発現と呼び、すなわち、ある貯蔵器官と他の器官の発現産物の比が約１００：１またはそれを越える場合に器官特異性を示す。従って、貯蔵器官特異的プロモーターは、貯蔵器官増強プロモーター種のメンバーである。
【０１８２】
例示的植物貯蔵器官としては、ニンジン、タロイモまたはキャッサバの根、バレイショ塊茎、およびレッドグアバ、パッションフルーツ、マンゴー、パパイア、トマト、アボカド、チェリー、タンジェリン、マンダリンミカン、パーム、メロン類（例えば、カンタロープおよびスイカ）、および他の多肉果（例えば、西洋カボチャ、キュウリ、マンゴー、アプリコット、桃）といった果肉、ならびにトウモロコシ（コーン）、ダイズ、コメおよびアブラナなどの種子が挙げられる。
【０１８３】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いた植物細胞のトランスフェクションは一般に、双子葉植物で最も良好に行われている。単子葉植物は通常、いわゆるプロトプラストの直接的遺伝子導入により最も容易に形質転換される。直接的遺伝子導入は通常、エレクトロポレーションによって、またはポリエチレングリコール媒介導入もしくは必要とするＤＮＡを担持する微粒子による細胞衝撃によって行われる。これらのトランスフェクション法は当技術分野で周知であり、ここでこれ以上述べなくてもよい。トランスフェクト細胞およびプロトプラストから植物体全体を再生する方法も、植物組織から所望のタンパク質を得るための技術と同様に周知である。米国特許第５，６１８，９８８号および同第５，６７９，８８０号およびそれらの中の引例も参照。
【０１８４】
アグロバクテリウム形質転換、エレクトロポレーションまたは他の方法を用いて形成されたトランスジェニック植物は一般に、一染色体上に単一の遺伝子を含む。トランスジェニック植物はまた付加された構造遺伝子に関して同型接合性であってよく、すなわち、トランスジェニック植物は２つの付加的遺伝子を含み、染色体対の各染色体上の同じ遺伝子座に遺伝子１つずつ有する。同型接合性トランスジェニック植物は、単一の付加的遺伝子を含む独立した分離トランスジェニック植物を生殖的に交配（自家受粉）させ、生産された種の一部を発芽させ、結果として生産された植物を、対照（天然型非トランスジェニック）または独立した分離トランスジェニック植物に比べてキメラ粒子の蓄積が増強されたかどうかを分析することによって得ることができる。同型接合性トランスジェニック植物は、天然型非トランスジェニック植物および独立した分離トランスジェニック植物の双方に比べてキメラ粒子の蓄積の増強を示す。
【０１８５】
当業者ならば、記載の本発明を用いて生産可能なタンパク質またはペプチドの選択肢は大きく多様であることが分かるであろう。それらは例えば、工業用酵素、抗原、サイトカイン、受容体、アゴニスト、栄養補助タンパク質、付加価値製品および医薬活性タンパク質などであり得る。これには、限定されるものではないが、１６ＥＳＨ、ＣＴＢ、Ｇｂ、Ｌｅｓ、ＴＢ、ＰＡＰ、Ｃａｐ、Ｅ２、ＮＰ、Ｈｅｒ、グルコサオキシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、オルタナティブオキシダーゼ、ＧＯＯＸ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースアミラーゼ、リパーゼ、汎用性リパーゼ、クロロペルオキシダーゼ(cloroperoxidase)、キシロースイソメラーゼ、Ｍｎペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ(dehidrogenase)、アルコールデヒドロゲナーゼ(dehidrogenase)、α１アンチトリプシン、デフェンシン、ヒト成長ホルモン(human groth hormone)、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、肝細胞増殖因子が含まれる。当然のことながら、このリストは網羅を意味するものではないと考えられる。
【０１８６】
Ｘ．ＲＰＢＬＡの医薬としての使用
本明細書に記載されるように、ＲＰＢＬＡの形成は、極めて簡単な技術を用いて、組換えＰＢＩＳを含んでなる融合タンパク質の精製を可能とする。従って、組換えＰＢＩＳと目的タンパク質とを含んでなる融合タンパク質を容易に発現させ、精製することができる。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は治療用タンパク質である。従って、治療薬は、組換えＰＢＩＳと目的タンパク質とを含んでなる融合タンパク質を精製し、場合により、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の方法を用いて組換えＰＢＩＳを除去することによって調剤することができる。その後、単離された目的タンパク質を、公知の技術に従って医薬使用のために調剤することができる。
【０１８７】
従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって得られる融合タンパク質または目的タンパク質を、「薬学上許容可能な」形態に調剤することができる。「薬学上許容可能な」とは、健全な医学的判断の範囲内にあり、過度な毒性またはその他の合併症なく、ヒトおよび動物の組織との接触に好適であり、妥当な利益／リスク比に見合った生物製品を意味する。
【０１８８】
本明細書に記載の方法によって得られる融合タンパク質または目的タンパク質は、ヒトをはじめとする哺乳類に投与するための医薬組成物へと調剤することができる。本発明の方法で用いられる医薬組成物は、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂）の部分グリセリド混合物を含む薬学上許容可能な担体を含んでなる。
【０１８９】
本発明の方法で用いられる組成物は、任意の好適な方法、例えば、非経口、脳室内、経口、吸入、噴霧、局所、直腸、鼻腔、口内、膣内または移植リザーバーを介して投与することができる。本明細書において「非経口」とは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術を含む。
【０１９０】
任意の特定の患者に対する特定の用量および治療計画は、用いる特定の抗体、患者の年齢、体重、健康状態、性別および食事、ならびに投与時間、排泄速度、併用薬物、および治療する特定の疾患の重篤度を含む様々な因子によって異なる。医療従事者によるこのような因子の判断は当業者の範囲内である。この量はまた、治療を受ける個々の患者、投与経路、処方物の種類、用いる化合物の特徴、疾患の重篤度および所望の効果によっても異なる。使用量は当技術分野で周知の薬理学的および薬物動態的原理によって決定することができる。
【０１９１】
さらに、ＲＰＢＬＡはそれら自体で治療使用が可能である。例えば、ワクチンおよび接種物におけるＲＰＢＬＡの使用が、引用することによりその全開示内容が本明細書の開示の一部とされる米国特許出願公開第２００７／０２４３１９８号に記載されている。
【０１９２】
ＲＰＢＬＡはヒト患者またはその他の好適な動物宿主（例えば、チンパンジー、マウス、ラット、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌまたはネコなど）において接種物またはワクチンの免疫原として使用することができる。接種物は免疫原性エピトープまたは抗原決定基と免疫反応を起こす抗体の生産、またはこのようなエピトープに対するＴ細胞の活性化などのＢ細胞またはＴ細胞応答（刺激）を誘導することができ、一方、ワクチンは、免疫原がＢ細胞応答またはＴ細胞応答の一方または双方を介して誘導された実体からの保護を提供する。
【０１９３】
検討されるワクチンまたは接種物のＲＰＢＬＡは、ＲＰＢＬＡを飲み込み、それらの内容物を処理する樹状細胞および単球／マクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）に作用することができる。それらの細胞種に作用する上で、ＲＰＢＬＡは抗原提示細胞に対する抗原送達を改善することができる。それらのＲＰＢＬＡはまた、抗原プロセシングおよび抗原提示細胞に対する提示も改善することができる。
【０１９４】
従って、ワクチンまたは接種物は、免疫原性上、有効な量の組換えタンパク顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）を薬学上許容可能な希釈剤に溶解または分散させることによって調製することができる。ＲＰＢＬＡは、それ自身、連結された２つの配列（一方の配列は組換えＰＢＩＳであり、他方は、前記ワクチンまたは接種物により免疫応答が誘導されるべき生物学的に活性なポリペプチドである）を含んでなる組換え融合タンパク質を含み得る。
【０１９５】
Ｔ細胞の活性化は、様々な技術によって測定することができる。慣例法では、宿主動物において検討されるＲＰＢＬＡワクチンまたは接種物を接種し、その後、末梢単核血液細胞（ＰＭＢＣ）を採取する。このようなＰＭＢＣを次にin vitroにて生物学的に活性なポリペプチド（Ｔ細胞免疫原）の存在下で約３〜５日間培養する。その後、培養されたＰＭＢＣを増殖またはＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦもしくはＩＦＮ−γ(GM-CSF of IFN-. gamma.)などのサイトカインの分泌に関してアッセイする。Ｔ細胞の活性化に関するアッセイは当技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，４７８，７２６号およびその中に引用されている文献を参照。
【０１９６】
検討される接種物またはワクチンは、一般に水も含有する薬学上許容可能な希釈組成物中に溶解または分散されている免疫原性上、有効な量のＲＰＢＬＡを含んでなる。免疫誘導を必要とする宿主動物などの、生物学的に活性なポリペプチドに対する免疫応答がそのワクチンもしくは接種物により誘導される宿主動物、または哺乳類（例えば、マウス、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル、無尾猿またはヒト）または鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルまたはガチョウ）などの、抗体の誘導が望まれる宿主動物に投与されると、接種物は生物学的に活性な標的ポリペプチドの１以上の抗原決定基と免疫反応を起こす抗体を誘導する。
【０１９７】
各免疫誘導に用いられるＲＰＢＬＡ免疫原の量は免疫原性上、有効な量と呼ばれ、とりわけ、ＲＰＢＬＡ免疫原、被免疫患者、およびワクチン中のアジュバントの存在によって幅広く異なり得る。（ｉ）ワクチンおよび（ｉｉ）接種物として免疫原的に有効な量は、上記に記載された、それぞれ（ｉ）保護または（ｉｉ）抗体またはＴ細胞の活性をもたらす。
【０１９８】
ワクチンまたは接種物は一般に、１回の接種（単位用量）当たり約１マイクログラム〜約１ミリグラム、好ましくは、単位用量当たり約１０マイクログラム〜約５０マイクログラムのＲＰＢＬＡ免疫原濃度を含む。本発明のワクチンまたは接種物に関して「単位用量」とは、動物に対する単回投与として好適な物理的に分かれた単位を意味し、各単位は所望の免疫原性効果を個々にまたは集合的に提供するように計算された所定量の有効材料を、希釈剤、すなわち、担体またはビヒクルと会合して含有する。
【０１９９】
ワクチンまたは接種物は、一般に回収されたＲＰＢＬＡ免疫原から、粒子形態の免疫原を生理学上耐用性のある（許容される）希釈ビヒクル、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、酢酸緩衝生理食塩水（ＡＢＳ）またはリンゲル液などに分散させて水性組成物とすることによって調製される。希釈ビヒクルはまた、以下に述べるような落花生油、スクアランまたはスクアレンなどの油性材料も含み得る。
【０２００】
有効成分としてタンパク質性材料を含む接種物およびワクチンの調製もまた当技術分野では良く理解されている。一般に、このような接種物またはワクチンは非経口薬としての液体溶液または懸濁液として調製され、また、注射前に液体中の溶液または懸濁液とするのに好適な固体形態も調製することができる。この調製物はまた乳化させることもでき、これが特に好ましい。
【０２０１】
免疫原的に有効なＲＰＢＬＡは、薬学上許容され、かつ有効成分と適合する賦形剤と混合される場合が多い。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールなど、およびそれらの組合せである。さらに、所望であれば、接種物またはワクチンは、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、組成物の免疫原的有効性を増強する微量の補助物質を含むことができる。
【０２０２】
ＸＩ．ＲＰＢＬＡの食品としての使用
ＲＰＢＬＡはまた、食品の栄養価を高めるために使用することもできる。例えば、組換えＰＢＩＳと栄養的価値を持つタンパク質またはペプチド（例えば、必須アミノ酸を富化したペプチド）とを含んでなる融合タンパク質を食品中で発現させることができる。このような融合タンパク質は、いくつかの実施形態では、野生型ＰＢＩＳよりもアレルゲン性の低い組換えＰＢＩＳを含み得る。本発明の著者らは、本発明によるＰＢＩＳが非改変型ゼインＰＢＩＳ（ＲＸ３）と比べた場合に低減された予測アレルゲン性を示すことを見出した。さらに、この所見に基づき、本発明の著者らはまた、低減されたアレルゲン性を示す新たなＰＢＩＳ（以下、ＲＸ３−ＬＡ１およびＲＸ３−ＬＡ２と呼ぶ）も開発した。
【０２０３】
従って、別の態様において、本発明は、非アレルゲン型のＰＢＩＳに関し、前記ＰＢＩＳはＲＸ３−ＬＡ１（配列番号６０）およびＲＸ３−ＬＡ２（配列番号６１）からなる群から選択される。
ＲＸ３−ＬＡ１（配列番号６０）
【化１４】
2013532960.tif 000020
ＲＸ３−ＬＡ２（配列番号６１）
【化１５】
2013532960.tif 000021
【０２０４】
いくつかの実施形態では、前記組換えＰＢＩＳは野生型ＰＢＩＳ、例えば、トウモロコシγ−ゼインのＰＢＩＳよりもアレルゲン性が低い。
【０２０５】
アレルゲン性は、本明細書に記載の方法または当技術分野で公知の他の方法に従って決定することができる。例えば、アレルゲン能を評価するためにアミノ酸配列相同性が用いられている。新たに発現または同定されたタンパク質が既知のアレルゲンとどの程度構造が類似しているかを決定するためには、配列相同性比較を使用することができる。この情報により、そのタンパク質がアレルゲン能を有しているか否かを予測できる。これらの比較は、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＰなどの、全体的な構造的類似性を予測するための種々のアルゴリズムを用いて行うことができる。新たに発現または同定されたタンパク質と既知のアレルゲンとの間のＩｇＥ交差反応性は、８０以上のアミノ酸のセグメントにおいて３５パーセントを越える同一性が存在する場合に、可能性が考えられる(Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) and the World Health Organization (WHO), 2001)。他の化学的に妥当性のある判定基準も、ＩｇＥ交差反応性を予測するために使用することができる。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳのアレルゲン性は、The Food Allergy Research and Resource Programによって開発された、アレルゲンオンラインデータベース（バージョン１０．０、２０１０年１月、http://www.allergenonline.com）を用いて決定される。従って、いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、アレルゲンオンラインデータベースを用いて、トウモロコシγ−ゼインのＰＢＩＳよりも、アレルゲン性ペプチドと３５％を越える同一性を有するヒットが少ない。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３５％の同一性を有するヒットを９以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３５％の同一性を有するヒットを８以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３５％の同一性を有するヒットを７以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３５％の同一性を有するヒットを６以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３５％の同一性を有するヒットを５以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３５％の同一性を有するヒットを４以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３５％の同一性を有するヒットを３以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３５％の同一性を有するヒットを２以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３５％の同一性を有するヒットを１以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３５％の同一性を有するヒットを含まない。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３０％の同一性を有するヒットを９以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３０％の同一性を有するヒットを８以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３０％の同一性を有するヒットを７以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３０％の同一性を有するヒットを６以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３０％の同一性を有するヒットを５以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３０％の同一性を有するヒットを４以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３０％の同一性を有するヒットを３以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３０％の同一性を有するヒットを２以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３０％の同一性を有するヒットを１以下しか含まない。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、既知のアレルゲン性ペプチドと少なくとも３０％の同一性を有するヒットを含まない。
【０２０９】
アレルゲンの投与の後に生じたアレルゲン性応答を測定するためにいくつかの技術が開発されている。例えば、アレルゲン性に関連する免疫グロブリンであるＩｇＥの存在は、ＥＬＩＳＡアッセイおよびＥＬＩＳＡ競合試験によって測定することができた（Kim et al, Yonsei Medical Journal 47:505-12 (2006)、 Fritsche, Toxicology letters 140-141:303-309 (2003)）（双方とも、引用することによりその全開示内容が本明細書の開示の一部とされる）。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、in vivoにおいてトウモロコシγ−ゼインのＰＢＩＳに比べて低減されたＩｇＥ抗体応答を生じる。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、アレルギー皮膚プリックテストにおいてトウモロコシγ−ゼインのＰＢＩＳに比べて低減された応答を生じる。
【０２１０】
さらに、数種の食物アレルゲンにおいては、ペプシン消化耐性が見られている。従って、ペプシンによる消化に対する耐性とアレルゲン能の間に相関が存在する。この相関の確立には米国薬局方（１９９５）概要が示されている方法が用いられた。引用することによりその全開示内容が本明細書の開示の一部とされるAstwood et al. Nat Biotechnol 14: 1269-73(1996)参照。従って、適当な条件下、ペプシンの存在下での分解に対するタンパク質の耐性は、タンパク質がアレルゲン能を持ち得ることを示す。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、トウモロコシγ−ゼインのＰＢＩＳよりもペプシンの存在下でのタンパク質分解耐性が低い。
【０２１１】
新たに発現または同定されたタンパク質のアレルゲン能の見込みを決定するためにさらなる分析を行うことができる。また、細胞または組織培養を用いたアレルゲン性試験としてのex vivo手順も記載されている。Evaluation of Allergenicity of Genetically Modified Foods: Report of Joint FAO/WHO Expert Consultation on Allergenicity of Foods Derived from Biotechnology、 Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO)、 Rome Italy (2001)。これらの技術の１つは、ＩｇＥにより媒介される、アレルゲン性エピトープの肥満細胞誘発能が機能的in vitroアッセイを用いて測定可能であるということに基づく。特定のラットＩｇＥに受動感作させ、３Ｈ−セロトニンで標識したラット腹腔内肥満細胞に基づけば、細胞はアレルゲンの標準希釈液でメディエーターの放出を誘発される。Fritsche, Toxicology letters 140-141:303-309 (2003)。従って、いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、トウモロコシγ−ゼインのＰＢＩＳに比べて低減されたメディエーターの放出を生じる。
【０２１２】
ＩｇＥ依存的アレルギー反応は２相から構成される。第１相は誘導(inducing)段階であり、宿主の免疫系がアレルゲンにより増感される。結果として、特定のＩｇＥ抗アレルゲン抗体が生産され、次に、これらの抗体は肥満細胞によって標的器官内に固定される。第２相は、アレルゲンがこれらのＩｇＥ抗体に結合し、肥満細胞からのメディエーター（ヒスタミン）の放出を刺激することにより媒介される誘発(triggering)段階である。抗原のアレルゲン性を評価するためには、一方または双方の相を、本質的にFritsche, Toxicology letters 140-141:303-309 (2003)（引用することによりその全開示内容が、本明細書の開示の一部とされる）に記載されているような適当なin vivo試験によって調べることができる。従って、例えば、いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、トウモロコシγ−ゼインのＰＢＩＳに比べて低減されたＩｇＥ抗体生産を生じる。いくつかの実施形態では、組換えＰＢＩＳは、トウモロコシγ−ゼインのＰＢＩＳに比べて低減された肥満細胞からのメディエーターの放出を生じる。
【０２１３】
別の態様において、本発明は、本発明によるＲＰＢＬＡを含有する食品、栄養補助食品、化粧品調製物、栄養配合物、または該ＲＰＢＬＡを含んでなる宿主細胞または生物体に由来する材料を提供する。ＲＰＢＬＡは、ＰＢＩＳそれ自体で、またはＲＰＢＬＡを含んでなる融合タンパク質により形成され得る。好ましい実施形態では、食品の一部を形成するＲＰＢＬＡは、ＰＡ、ＲＸ３（Ａ３）、Ｒ８（４Ｃ）、ＲＸ３−ＬＡ１、ＲＸ３−ＬＡ２およびそれらの組合せからなる群から選択されるＰＢＩＳを含んでなる融合タンパク質の集合により形成される。
【０２１４】
本明細書において「食料品」とは、ヒトおよび／または動物の消費に好適な物質または組成物を意味する。本明細書において「食料品」とは、そのまま摂取できる形態の食品を意味し得る。しかしながら、その代わりにまたはそれに加えて、本明細書において食料品とは、食料品の調製に用いられる１以上の食品材料を意味し得る。単に例として、食料品とは、生地から生産された焼き製品ならびにその焼き製品の調製に用いられた生地の双方を包含する。
【０２１５】
本発明による食料品は、本発明によるＲＰＢＬＡを発現する組換え生物体の全部または一部に由来するものであり得る。例えば、食料品は、ＲＰＢＬＡを発現する植物の内胚乳に由来するのであり得る。本発明の増殖材料またはその一部を含有する食品および栄養補助食品としては、穀類に基づく食品、例えば、朝食用穀類、穀粉およびこれらの穀粉を含有する食品、例えば、パン、パン粉、バター、ケーキ、練り粉菓子、ビスケット、焼き製品およびパスタが挙げられる。さらに、野菜またはその一部（例えば、塊茎およびヤマノイモ）の増殖材料を含有する食品および栄養補助食品も提供される。食品は例えば（ａ）ベビーフードもしくは配合物、または（ｂ）ベーカリー製品（例えば、パン、イースト製品またはケーキ）、（ｃ）ベーカリー供給製品（例えば、カスタードまたはバーカリーフィリングもしくはトッピング）、（ｄ）バター、または（ｅ）パン粉、または（ｆ）穀粒、または（ｇ）菓子、または（ｈ）フレーバーもしくは飲料エマルション、または（ｉ）フルーツフィリング、または（ｊ）グレービー、スープ、ソースもしくは食品増粘剤、または（ｋ）ミールもしくはミール成分、または（ｌ）食肉製品、または（ｍ）ペットフード、または（ｎ）医薬もしくは機能性食品、または（ｏ）バレイショもしくはヤマノイモ製品、または（ｐ）乳製品（例えば、デザートもしくはヨーグルト）、または（ｑ）サラダドレッシング、または（ｒ）スナックもしくはクラッカー、または（ｓ）スプレッド、または（ｔ）パスタ製品（例えば、ヌードル）から選択することができる。
【０２１６】
上記のような本発明のトランスジェニック植物は、ヒトならびに家畜、家禽、ペットおよび他の動物に適用可能である。
【０２１７】
以下、本発明を下記の実施例によって詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示として解釈されるべきであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０２１８】
材料および方法
植物形質転換のためのプラスミド構築
プラスミド構築物は総て、図１５ａおよび１５ｂに示される融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＳａｌI／ＢａｍＨＩ消化により、同じ制限酵素で開環したｐＣ２３００ベクター（ＡＦ２３４３１５）へクローニングすることによって構築された。
【０２１９】
植物材料
タバコ（ニコチアナ・ベンサミアナ(Nicotiana benthamiana)）植物を、in vitro生育チャンバーにて２４〜２６℃、１６時間明期で栽培した。成熟植物を温室にて１８〜２８℃で栽培した。湿度は５５〜６５％の間に維持し、平均明期を１６時間とした。
【０２２０】
浸潤法(Vaquero et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 96(20):11128-11133、 Kapila et al., 1997 Plant Sci. 122:101-108)のための小植物体を種子から上記のin vitro条件で４〜６週間栽培した。
【０２２１】
真空によるタバコ浸潤法
所望の構築物を含むＡ．ツメファシエンスＥＨＡ  １０５株を、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）およびリファンピシン（１００ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／ｌ）上、２８℃で浸透しながら（２５０ｒｐｍ）一晩（約１８時間）増殖させた。次に、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）およびリファンピシン（１００ｍｇ／ｌ）も添加した３０ｍｌのＬＢ中にアグロバクテリウムを接種した。一晩（約１８時間）２８℃で培養した後、アグロバクテリウム細胞を３，０００ｘｇで１０分間の遠心分離により回収、ＭＥＳ(Sigma Chemical)４．９ｇ／ｌおよびスクロース３０ｇ／ｌを含むｐＨ５．８の液体ＭＳ培地１０ｍｌ中に再懸濁させた。この細菌培養物を浸潤法のために最終ＯＤ６００が０．１となるように調整した。その後、この細胞培養物にアセトシリンゴンを終濃度０．２ｍＭとなるまで添加し、２８℃で９０分間インキュベートした(Torrent, M., Llop-Tous, I., and Ludevid, M.D. (2009) In Recombinant Proteins from plants. Methods in Molecular Biology. Vol 483. Ed by Gomord V and Faye L, Springer Verlag, Humana Press, Heidelberg、 pp 193-208、 Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., and Baulcombe, D. (2003) Plant J. 33, 949-956)。ＲＸ３構築物とＨＣ−Ｐｒｏサイレンシングサプレッサー構築物(Goytia et al., 2006)を担持する個々のアグロバクテリウム培養物を一緒に混合した。これらの植物体を懸濁液で全部覆い、５〜６秒間真空（１００ＫＰａ）を適用した。懸濁液を除去し、植物体を温室で維持した。植物材料を回収し、全タンパク質抽出物を、適当な抗体を用いた免疫ブロットにより分析した。
【０２２２】
シリンジによるタバコ浸潤法
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ  １０５株を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬリファンピシンを添加したＬ−培養液中、２８℃にて静止期まで増殖させた。細菌を５０００ｇ、室温で１５分の遠心分離により沈降させ、１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２００μΜアセトシリンゴンに、最終ＯＤ６００が０．２となるように再懸濁させた。細胞を室温で３時間この培地中に残した。ＲＸ３構築物とＨＣ−Ｐｒｏサイレンシングサプレッサー構築物(Goytia et al., 2006)を担持する個々のアグロバクテリウム培養物を一緒に混合し、２〜４週齢のニコチアナ・ベンサミアナ植物の葉の背軸面に浸潤させた。
【０２２３】
タンパク質の抽出および全タンパク質または免疫ブロット分析
形質転換葉からの全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳおよび２００ｍＭ  ＤＴＴを含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５中、室温で１時間抽出した。得られた抽出液を４℃にて３０分間、１０，０００ｘｇで遠心分離し、ＴＳＰをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離した。これらのタンパク質はクーマシーブルー染色もしくは銀染色によるかまたは抗Ｒ８抗血清(Torrent, M., Llompart, B., Lasserre-Ramassamy, S., Llop-Tous, I., Bastida, M., Marzabal, P., Westerholm-Pavinen, A., Saloheimo, M., Heifetz, P. B., and Ludevid, M.D. (2009) BMC Biology 7, 5)、大腸菌(E.Coli)細胞から発現および精製された組換えＧＦＰもしくｈＧＨタンパク質を注射したウサギで生成した抗ＧＦＰ、もしくは抗ｈＧＨ、ならびに市販の抗ＥＧＦ(Abcam)を用いた免疫ブロットにより検出した。
【０２２４】
細胞下画分およびＲＰＢＬＡ密度測定
浸潤済みのタバコ葉組織を０℃にて乳鉢で、ＨＢホモジナイゼーション緩衝液（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ  ｐＨ８．０、０．２５Ｍスクロースおよびプロテアーゼ阻害剤）中で摩砕した。このホモジネートを２層のミラクロス（２２〜２４マイクロメーター、Calbiochem）で濾過して組織残渣を除去した後、４℃にて５分間、５０ｘｇで遠心分離した。得られた種々の組織からの明澄なホモジネートを、ＨＢ緩衝液で緩衝させた多段階イオジキサノール(Optiprep, Sigma)密度勾配（密度の計算に好ましい段階は、１．１１、１．１７、１．１９、１．２１、１．２３および１．２５ｇ／ｃｍ３）にのせた。これらの勾配をＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４０  Ｔｉローターにて、４℃にて２時間、８０，０００ｘｇで遠心分離した。上清、界面画分およびペレットの等量アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および特異的抗体を用いた免疫ブロットにより分析した。
【０２２５】
上記で示したように、この技術はＲＰＢＬＡの密度を決定するのに好適な技術である。下表に、所定のクッション中のイオジキサノール（ｗ／ｖ）の％と相当する密度の間の詳細な比率を示す。
【０２２６】
【表３】
2013532960.tif 000022
【０２２７】
免疫組織化学および撮像法：共焦顕微鏡
蛍光誘導配列で形質転換したタバコ葉組織の切片を直接的共焦観察のために水で標本化した。共焦点レーザー走査顕微鏡Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ(Heidelberg, Germany)を用いて顕微鏡写真を得た。緑色蛍光画像は、５１５ｎｍで励起した後、５３０〜６３０ｎｍの発光域を用いて採取した。青色蛍光画像は、励起４５８ｎｍおよび発光域４７０〜５３０ｎｍで採取した。緑色蛍光タンパク質画像は、アルゴンイオンレーザーを用いて、励起４８８ｎｍおよび４９５〜５３５ｎｍに設定した発光域を用いて採取した。赤色蛍光画像は、ＨｅＮｅレーザーを用いて５４３ｎｍで励起した後、発光域５５０〜６００で採取した。光学的切片は厚さ０．５μｍとした。デジタル画像および投影図を、共焦顕微鏡ソフトウエアを用いて記録した。顕微鏡像で提供した画像は少なくとも５回の独立した実験の代表例である。
【０２２８】
共焦顕微鏡によるＲＰＢＬＡの数およびサイズ
時間軸に沿ったＰＢのサイズ分布（相対的パーセント）を、各時点（２、４、７および１０ｄｐｉ）での５００前後のＰＢの見かけの直径を評価することにより決定した。各時点で３個体の独立した形質転換植物を分析し、ソフトウエアＯｌｙｍｐｕｓ  ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ｖ．１．６ａを用いて、ＦＶ１０００  Ｏｌｙｍｐｕｓ共焦顕微鏡下で見られた蛍光ＰＢを評価した。ＰＢ数の決定については、１０５μｍ３（７０×７０×２０）の形質転換組織に相当する共焦投影図を用いた。各時点で８個体の形質転換植物からの４０の共焦画像を分析した。これらの結果を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびボンフェローニ多重比較検定により統計学的に分析した（ｐ＜０．０５を有意に異なるとみなした）。
【０２２９】
低速遠心分離(low seep centrifugation)でのＲＰＢＬＡの単離
１グラム前後の浸潤済みタバコ葉組織を０℃にて乳鉢で、５ｍＬのＰＢＰ３ホモジナイゼーション緩衝液（Ｔｒｉｓ  １００ｍＭ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５Ｍ  ＮａＣｌ））中で摩砕した。ホモジネート（Ｈ０）を１層のミラクロス（２２〜２４マイクロメーター、Calbiochem）で濾過した。明澄化前のホモジネート（Ｈ１）から得られた明澄なホモジネートを低速（１，５００ｘｇ）で１０分間遠心分離し、得られたペレットおよび上清（ＳＮ）を分析した。低速遠心分離ペレットを穏やかな音波処理（サイクル５０％、出力制御３、１０秒、Ｂｒａｎｄｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０）によって、３〜５ｍＬの洗浄緩衝液（０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００）に再懸濁させ、最後に室温で１５〜６０分間インキュベートした。２回目の低速遠心分離の後、等量の得られたペレット（ｗＰＢ）および上清（Ｗｓ）を分析した。
【０２３０】
ＥＧＦの精製
８０グラム（新鮮重）のＺｅｒａ（Ｅ）−ＥＧＦを浸潤させたタバコ植物葉からのｗＰＢ画分を上記で示したように可溶化し、３７℃にて２ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下、３０マイクロリットルのＦＸａ(Quiagen)で切断した。３時間後に５０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することで反応を停止させた。次に、このサンプルを緩衝液Ａで５倍に希釈した。ＥＧＦを、Amershamからの３ｍＬ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ逆相カラムにより精製した。アセトニトリル勾配は、緩衝液Ａ（１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ４、２ｍＭ  ｂＭＥおよび５％アセトニトリル）および緩衝液Ｂ（１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ４、２ｍＭ  ｂＭＥおよび７５％アセトニトリル）を用いた２０カラム容量で行った。アセトニトリル４０％前後の２画分において純粋なＥＧＦを回収し、３．５ｋＤＡ透析膜にて、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、２ｍＭ  ｂＭＥおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌに対して４℃で一晩透析した。
【０２３１】
ＥＧＦの活性アッセイ
ＥＧＦ受容体を過剰発現するヒト上皮癌細胞系統細胞（Ａ４３１）をプレート（Ｐ−３５）に０．５×１０５細胞／プレートで播種した。細胞を増殖培地（ＭＥＭ×１、２ｍＭグルタミン、１％の非必須アミノ酸）および１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）中で４８時間インキュベートした。その後、それらを、ＦＢＳを含まない増殖培地で一晩飢餓状態にした。次に、Promegaからの標準ＥＧＦ（０〜１００ｎｇ  ＥＧＦ／ｍＬ）と相当するサンプル（可溶化済みＲＸ３（Ｅ）−ＥＧＦおよびＥＧＦ）を同じ濃度範囲で加え、細胞を９分間インキュベートした。その後、これらの細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、液体Ｎ２中で凍結させて細胞代謝を停止させた。ＥＧＦ受容体のリン酸化を分析するために、これらの細胞を破砕し、等量の全タンパク質を、ＰａｔｈＳｃａｎ（商標）Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＧＦ受容体（Ｔｙｒ１０６８）サンドイッチＥＬＩＳＡキットにより、本質的に製造者が記載しているように分析した。
【０２３２】
実施例１：形質転換タバコ植物体のＲＰＢＬＡにおけるＲＸ３−ＧＦＰ、ＲＸ３（Ｒ）−ＧＦＰ、ＲＸ３（Ｋ）−ＥＣＦＰ、ＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰおよびＲＸ３（Ｌ）−ＧＦＰの蓄積
ＲＸ３のリピートドメインの両親媒性が自己集合およびＲＰＢＬＡの形成において不可欠であることが記載されている(Ludevid et al, Plant Mol. Biol. (1984) 3:277-234、 Kogan et al., J. Mol. Biol. (2001) 312:907-913)。ＲＰＢＬＡ誘導能に対する両親媒性の重要性を特徴付けるために、リポーター蛍光タンパク質（ＧＦＰまたはＥＣＦＰ）に融合されたＲＸ３タグセットを分析した（図１Ａ）：ヒスチジンを有する天然ＲＸ３（ＰＰＰＶＨＬ）８（配列番号６２）［ＲＸ３］、両親媒性が増強された２つのＲＸ３変異体、すなわち、ヒスチジンをアルギニンで置換することにより得られる（ＰＰＰＶＲＬ）８（配列番号６３）［ＲＸ３（Ｒ）］およびリシンで置換することにより得られる（ＰＰＰＶＫＬ）８（配列番号６４）［ＲＸ３（Ｋ）］、ならびに完全疎水性ＲＤを有する２つのＲＸ３変異体、すなわち、ヒスチジンがアラニンで置換された（ＰＰＰＶＡＬ）８（配列番号６６）［ＲＸ３（Ａ）］およびロイシンで置換された（ＰＰＰＶＬＬ）８（配列番号６７）［ＲＸ３（Ｌ）］。
【０２３３】
予測されたように、ＲＸ３−ＧＦＰで形質転換されたタバコ植物は、細胞内に直径約１マイクロメーターの丸い形状の蛍光ＲＰＢＬＡを多数蓄積した。驚くことに、両親媒性ＲＤが存在しないにもかかわらず、融合タンパク質ＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰおよびＲＸ３（Ｌ）−ＧＦＰもまた、細胞の小胞体（ＥＲ）内に留まり、ＲＰＢＬＡを形成した（図１Ｃ）。
【０２３４】
ＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰ融合タンパク質は大きなＲＰＢＬＡ内に蓄積したが、これはＲＸ３−ＧＦＰの発現から得られたＲＰＢＬＡよりもやや大きかった。これらのＲＸ３（Ｌ）−ＧＦＰ  ＲＰＢＬＡは約０．５マイクロメーターであると測定された。細胞の表面に蛍光は見られず、該タンパク質はＲＰＢＬＡ内に効率的に蓄積され、分泌されなかったことを示す。これらの研究はまた、完全疎水性ＲＤを有するＲＸ３タグが集合して、植物においてＲＰＢＬＡの形成を誘導し得ることを示す。
【０２３５】
疎水性ＲＤを含有するＲＸ３タグで得られた驚くべき結果に基づき、総てのヒスチジンがアルギニンで置換された［ＲＸ３（Ｒ）］またはリシン［ＲＸ３（Ｋ）］で置換された両親媒性ＲＸ３の蓄積を分析することにより、ＲＸ３タグのＲＤ両親媒性の重要性をさらに特徴付けることにした。アルギニンおよびリシンは、ヒスチジンに比べて高いｐＫａ（それぞれ１２および１０．５）を有する。従って、これらの置換は、小胞体のｐＨ値においてより高い正の正味電荷を有するＲＤ、そのＲＤの高い正味正電荷および高い両親媒性をもたらす。驚くことに、共焦顕微鏡分析は、これらの構築物を用いた場合に極めて低い蛍光を示した。他のＲＸ３変異体に用いたものと同じ条件をＲＸ３（Ｒ）−ＧＦＰおよびＲＸ３（Ｋ）−ＥＣＦＰに適用したところ、有意なシグナルは見られなかった。同様に、ＲＸ３（Ｒ）−ＧＦＰおよびＲＸ３（Ｋ）−ＥＣＦＰ融合タンパク質の低い蓄積が、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットにより見られた。図１Ｂに示されるように、ＲＸ３（Ｒ）−ＧＦＰはＲＸ３−ＧＦＰに比べて蓄積が少なく、ＲＸ３（Ｋ）−ＥＣＦＰ融合タンパク質は見られなかった。興味深いことに、ＲＸ３（Ｋ）−ＥＣＦＰを発現するホモジネートでは、抗ＧＦＰ抗体と免疫反応性がある、より移動度の高いバンドのみが見られた。このバンドはおそらく部分的に分解されたＥＣＦＰに相当する（図１Ｂ、レーン４、黒い矢印の先）。ｐＲＸ３（Ｒ）−ＧＦＰまたはｐＲＸ３（Ｋ）−ＥＣＦＰを浸潤させたタバコ葉の長時間露光画像は、このタンパク質がＥＲ由来ＲＰＢＬＡ中に効率的に保持されないことを示した。ＲＸ３（Ｒ）−ＧＦＰの発現は、大部分の融合タンパク質の分泌をもたらし、細胞内に蓄積されたＲＰＢＬＡは少なく、かつ極めて小さいものでしかなかった（図１Ｃ）。ＲＸ３（Ｋ）−ＥＣＦＰに関しては、ＲＰＢＬＡが見られず、蛍光が葉緑体および分泌物に伴っていたことから（図１Ｃ、四角の中）これらの結果はいっそう驚くべきものであった。この実験およびほとんどの融合タンパク質が分解されると思われるという事実に基づけば、葉緑体に伴う蛍光は部分的に分解されたＥＣＦＰによるものである可能性がある。ＲＸ３（Ｋ）−ＥＣＦＰがこのオルガネラに選別されるとは考えにくい。
【０２３６】
これらの結果を考え合わせると、文献で示唆されていることとは対照的に、ＲＸ３の両親媒性はタンパク質集合およびＲＰＢＬＡ誘導に必要な重要な要素ではない。さらに、ヒスチジンをアルギニンまたはリシンで置換することによるＲＤの両親媒性の増強は、これらのペプチドのＲＰＢＬＡ形成誘導能を有意に低下させる。
【０２３７】
実施例２：タバコ植物においてＲＸ３−ＧＦＰ、ＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰおよびＲＸ３（Ｌ）−ＧＦＰにより誘導されたＲＰＢＬＡの密度の特性決定
ＲＰＢＬＡの１つの特徴はそれらの高密度であり、ステップ密度勾配(Torrent, BMC Biology 2009, 7:5)により決定することができる。本研究において、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配は、濾過した植物ホモジネートを下記のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）ステップクッション下に置くことによって行った。
【０２３８】
【表４】
2013532960.tif 000023
【０２３９】
画分ｆ１８のミクロソーム（ＥＲ、ゴルジなど）は、１８％のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）を含む低密度クッションの上の界面に沈降する。一般に、ＲＰＢＬＡはミクロソームよりも高密度であり、２６〜２８％のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）よりも高密度の画分から回収される。
【０２４０】
図２に示されるように、融合タンパク質ＲＸ３−ＧＦＰを発現するタバコ植物のホモジネートを所定のステップ密度勾配で超遠心分離にかけると、予測されたように、ほとんどのタンパク質が密度画分ｆ３４およびｆ３８において回収された。この結果は、融合タンパク質がＥＲ内に稠密に集合し、高密度のＲＰＢＬＡを形成することを示す。一部のＲＸ３−ＧＦＰはミクロソームに相当する低密度画分ｆ１８に見られるが、これはおそらく、高密度構造にまだ完全に集合してない新たに合成された融合タンパク質に相当する。
【０２４１】
上述のように、分析した２つの構築物は完全疎水性ＲＤ（ＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰおよびＲＸ３（Ｌ）−ＧＦＰ）を有しており、双方とも細胞内でＲＰＢＬＡの形成を誘導した。ＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰを密度勾配により分析したところ、ほとんどの融合タンパク質が高密度画分（ｆ３０およびｆ３４）に蓄積したが、これにより、ＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰが高密度ＲＰＢＬＡ内に蓄積することが確認される。ＲＸ３（Ｌ）−ＧＦＰで形質転換したタバコ葉からの明澄化したホモジネートを分析した際にも同様の結果が得られた。この場合、ＲＰＢＬＡはＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰの発現により誘導されたものよりも低密度であったとしても、それらの主要な画分は高密度画分に回収された（図２Ｂ、ｆ３０およびｆ３４）。
【０２４２】
これらのデータは、両親媒性ＲＤが存在しないにもかかわらず、ＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰおよびある程度まではＲＸ３（Ｌ）−ＧＦＰは、ＲＰＢＬＡ内に効率的に自己集合することができ、これらはほとんどの細胞夾雑物から単離されるに十分な密度である。ＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰホモジネートをのせた密度勾配から回収された等容量の画分のクーマシーブルー染色による分析を図２Ｂに示す。ほとんどの細胞夾雑物は画分Ｓおよびｆ１８に回収されたが、ｆ３０およびｆ３４は極めて純粋なＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰ画分を含んでいたことを見て取れる。
【０２４３】
実施例３：低速遠心分離によるタバコ植物体からのＲＰＢＬＡ単離の下流手順
密度勾配遠心分離はＲＰＢＬＡ密度の決定に適当な分析手法であるが、これらのオルガネラの大規模精製には好適でない。明澄なＲＰＢＬＡ画分の回収を可能とする簡単な低速遠心分離と回収した沈降物の数回の洗浄工程に基づく下流プロセス（実験手順参照）が開発されている。
【０２４４】
この簡単な下流プロセスをＲＸ３−ＧＦＰおよびＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰで形質転換したタバコ植物に適用し、このプロセスの種々の段階の等量をウエスタンおよびクーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図３Ａに示されるように、対応するホモジネート（Ｈ０）中に存在する融合タンパク質のほとんど総てがＲＰＢＬＡ画分（ｗＰＢ）に回収された。両場合とも収量は同等であり、上清（ＳＮ）および洗浄工程（Ｗｓ）において融合タンパク質の損失はないことから極めて高かった。この所見はウエスタンブロットにより確認された。処理した同量のバイオマスからＲＸ３−ＧＦＰよりも多くのＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰ融合タンパク質が回収されるという事実は（図３Ａ、ｗＰＢ画分を比較）、より良好な回収率を反映するものではなく、タバコ葉におけるＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰの蓄積率が高いことを反映している。ＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰ  ＲＰＢＬＡがＲＸ３−ＧＦＰよりも低密度であることを考えれば、この効率的な回収は極めて驚くべき結果である。
【０２４５】
このプロセスにおいて達成された富化も著しく高い。ホモジネート（Ｈ０）中に存在するほとんどの夾雑物はこのプロセスで除去され、洗浄済みＲＰＢＬＡに相当する画分（ｗＰＢ）はほぼ排他的に融合タンパク質を含んでいた。ｗＰＢ画分にはいくつかのバンドが確認されたが、それらは同じ融合タンパク質のいくつかのオリゴマー化状態に相当するものであって、タンパク質の不純物ではない。
【０２４６】
ＲＸ３（Ｌ）−ＧＦＰのＲＰＢＬＡの下流回収は、この融合タンパク質を含有する小型で低密度のオルガネラをより効率的に回収するために相当するホモジネートをより高速（４，０００〜５，０００ｘｇ）で遠心分離することにより適合させた（図２）。驚くことに、ＲＸ３（Ｌ）−ＧＦＰでさえも、この収率は極めて効率的であり、図３Ｂ（右のパネル）に見られるように、ほとんどの融合タンパク質がＲＰＢＬＡ画分（ｗＰＢ）に回収された。ＲＸ３（Ｌ）−ＧＦＰ含有ＲＰＢＬＡを回収するためにより高速を必要とするという事実は、クーマシーブルーにより染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより示されたように（図３Ｂ、左のパネル）、このプロセスの富化に有意な影響を及ぼさない。これらの結果により、完全疎水性ＲＤを有するＲＸ３タグがＲＰＢＬＡの単離によるタンパク質生産および精製に好適であることが確認される。
【０２４７】
実施例４：ＲＸ３融合タンパク質の可溶化
ＲＰＢＬＡ画分からのＲＸ３に基づく融合タンパク質の可溶化は、ＲＰＢＬＡ下流プロセシングにおける重要な工程の１つである。本質的に実施例３に示されるように低速遠心分離により回収されたＲＰＢＬＡ画分を用いて、ＲＸ３−ＧＦＰおよびＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰの溶解度を比較した。ＲＤのヒスチジンをアラニンで置換すると、そのタンパク質の全体的な極性が小さくなることから水溶液中の融合タンパク質の溶解度が低下すると予想されたが、驚くことに、ＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰは試験した各条件ではるかに高い可溶性であった。
【０２４８】
一例として、図３Ａにおいて、明澄化したＲＰＢＬＡ画分（ｗＰＢ）を穏和な緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、５ｍＭ  ＴＣＥＰおよび１０ｍＭ  ２ｂＭＥ）中で４時間インキュベートした後、可溶化画分（ｓＰＢ）を非可溶化（ｕＰＢ）画分と比較する。可溶化工程の直後に、サンプルを１６，０００ｇで１０分間遠心分離し、ｓＰＢを上清として回収した。ｕＰＢはペレットとして回収した。
【０２４９】
予測されたように、ＲＸ３−ＧＦＰは、部分的に可溶化されたに過ぎなかった。単量体形態のほとんどの融合タンパク質は所定の条件で可溶化されるが（図３Ａ、ｓＰＢとｕＰＢを比較、矢印の先）、強固に凝集した多量体型の融合タンパク質が多量に非可溶化画分に残存する（図３Ａ、アスタリスク）。これに対して、同じ可溶化条件で、事実上総てのＲＸ３（Ａ）−ＧＦＰタンパク質が、その凝集形態とは無関係に可溶化された。洗浄済みのＲＰＢＬＡからの融合タンパク質の回収において極めて高収率を可能とするというこの驚くべき結果は、以下に示すような数種のタンパク質と融合された広範囲の完全疎水性アセンブラーペプチドで確認された。
【０２５０】
実施例５：形質転換タバコ植物のＲＰＢＬＡにおけるＲＸ３（Ａ３）−ＥＣＦＰの蓄積
従前の実験において、新たなＲＸ３変異体は総て、ＲＤに中に存在するヒスチジンの単一の突然変異からなったので、ヒスチジンの前後のバリンおよびロイシン残基はまだ分析されていなかった。これを行うため、新たなＲＸ３非両親媒性変異体（ＲＸ３（Ａ３））においてＲＤ上に存在するバリン、ヒスチジンおよびロイシン残基を総てアラニンで置換した（図４Ａ）。タバコ葉を、ＥＣＦＰに融合されたＲＸ３（Ａ３）ペプチドを発現するベクターで形質転換させ、浸潤の３日および６日後（ｄｐｉ）に共焦顕微鏡によりＲＰＢＬＡの形成を分析した。第１の浸潤後日数（３ｄｐｉ）でさえ、多数の小型ＲＰＢＬＡの存在が確認され、ＲＸ３（Ａ３）変異体が極めて有効であったことが示唆される。この所見は、６ｄｐｉにおいて、クラスター内に組織化された極めて多数の大型ＲＰＢＬＡの存在により確認され（図４Ｂ）、この新たなアセンブラーペプチドが予期しないことに野生型ＲＸ３よりも有効であることを示す。
【０２５１】
この植物におけるＲＸ３（Ａ３）−ＥＣＦＰ発現の分析は、ＲＤ中に存在するバリンおよびロイシン残基がタンパク質の集合およびＲＰＢＬＡの形成に必要ではないことを示す。この結論の明確な帰結は、ＲＤ中に存在するバリン、ヒスチジンおよびロイシンが、そのＲＤ構造が折り畳まれない限り、他の任意の疎水性アミノ酸で置換可能であるということである。次の実験は、これらの残基が極性非電荷および負電荷アミノ酸でも置換可能であることを示す。
【０２５２】
実施例６：形質転換タバコ植物体のＲＰＢＬＡにおけるＲＸ３（Ｅ）−ＧＦＰおよびＲＸ３（Ｄ）−ＥＣＦＰの蓄積
上述のように、ＲＤのヒスチジン残基をリシンまたはアルギニンで置換すると正味電荷が増し、その結果、このドメインの両親媒性が増す。驚くことに、それはまた、ＲＰＢＬＡの形成および全体的なタンパク質蓄積に関するアセンブラーペプチドの効率を劇的に低下させる。これらの結果に基づけば、ヒスチジンをアスパラギン酸およびグルタミン酸で置換しても、これらの残基の付加もＲＤの正味電荷を増し、従って、その両親媒性を増すことから、ＲＰＢＬＡにおける蓄積が低下することになると予測された。しかしながら、図５Ｂに示されるように、ＲＸ３（Ｅ）−ＧＦＰ、ＲＸ３（Ｄ）−ＥＣＦＰおよび対応する対照（それぞれＲＸ３−ＧＦＰおよびＲＸ３−ＥＣＦＰ）で形質転換したタバコ植物体からの全タンパク質抽出物のウエスタンブロットは、酸性アミノ酸を有する融合タンパク質は対照よりもやや良好に蓄積した。ＲＸ３（Ｅ）−ＧＦＰおよびＲＸ３（Ｄ）−ＥＣＦＰの低い移動度は、これまでに他のタンパク質に関して報告されているように、酸性アミノ酸の含量が高いことで説明することができる。
【０２５３】
さらに、ＲＸ３（Ｅ）−ＧＦＰおよびＲＸ３（Ｄ）−ＥＣＦＰで形質転換したタバコ植物体は、クラスター内に組織化された多数の大型で丸い形状の蛍光ＲＰＢＬＡの形成を誘導した（図５Ｃ）。実際に、１〜２マイクロメーターの大型のＲＰＢＬＡは形質転換細胞のほとんどに高頻度で存在する。興味深いことに、これらのＲＰＢＬＡの平均サイズは、ＲＸ３と融合されたＧＦＰまたはＥＣＦＰの発現によって誘導されたものよりも有意に大きかった。
【０２５４】
実施例７：タバコ植物体のＲＰＢＬＡにおけるＲＸ３（Ｔ）−ＥＣＦＰ、ＲＸ３（Ｎ）−ＥＣＦＰおよびＲＸ３（Ｑ）−ＥＣＦＰの蓄積
上記の結果は、ヒスチジンを疎水性または酸性アミノ酸で置換すると、アセンブラーペプチドのＲＰＢＬＡ誘導能が増強されたことを示す。さらに、ヒスチジンを塩基性アミノ酸で置換することによるＲＤの正電荷を増すことの負の影響が見られた。しかしながら、アセンブラーペプチドの機能性に対する極性非電荷アミノ酸の影響はまだ知られていない。従って、ＲＤのヒスチジンをトレオニン、アスパラギンおよびグルタミン残基で置換し、ＥＣＦＰと融合させた３つの新たな構築物（それぞれＲＸ３（Ｔ）−ＥＣＦＰ、ＲＸ３（Ｎ）−ＥＣＦＰ、およびＲＸ３（Ｑ）−ＥＣＦＰ）を作出した。これらのアミノ酸の付加は、両親媒性であるが正味電荷を持たないＲＤをもたらす（図６Ａ）。
【０２５５】
これらの構築物を総て発現するタバコ葉を、浸潤３日および６日後（ｄｐｉ）に共焦顕微鏡により分析した。３ｄｐｉでは、多数の小型ＲＰＢＬＡが見られ、これらのＲＸ３変異体は総て極めて有効であったことを示唆する。この所見は６ｄｐｉにおいて、クラスター内に組織化された多数の大型ＲＰＢＬＡの存在により確認された（図４Ｂ）。
【０２５６】
これらの結果は、植物体における極性非電荷アミノ酸を有するＲＸ３変異体の発現はＲＰＢＬＡの形成をもたらすことを示す。
【０２５７】
実施例８：形質転換タバコ植物体のＲＰＢＬＡにおけるＰＰ−ＥＣＦＰおよびＰＡ−ＥＣＦＰの蓄積
ＲＸ３の２つの主要なドメイン（ＲＤおよびＰＸ）は双方とも、一般にＰＰＩＩ構造を採るプロリンリッチ配列である。合成ＲＤの円偏光二色性による研究により、水溶液中でのこのドメインにＰＰＩＩヘリックスが存在することが確認された(Dalcol, J. Org. Chem., 1996, 61 (20), pp 6775-6782)。ＰＰＩＩドメインを有するタンパク質は植物および他の生物に豊富に存在する。しかしながら、それらは一般にＲＰＢＬＡ形成誘導能を有さない。例えば、コラーゲン(Caldwell JW, Applequist J.,. Biopolymers 1984、10: 1891-1904)、α−カゼイン乳汁タンパク質(Syme CD. et al, Eur J Biochem 2002、269: 148-156)、およびＰＫＡ(Knighton D.R. et al, Science 1991、253:414-420)は、ＰＰＩＩヘリックスを有するが、ＲＰＢＬＡ誘導能を有さないタンパク質の例である。結果として、ＰＰＩＩ構造配列に加え、ＲＸ３の他のエレメントもＲＰＢＬＡ形成誘導に必要であると思われた。
【０２５８】
ＲＸ３配列上のこのようなエレメントを特定するために、ＲＤおよびＰＸドメインを、ＲＸ３と相同でないプロリンに基づく配列で置換した。ＰＰＩＩ構造を維持し、システイン残基の数および相対的位置は変更しなかった（ＰＰ、図７Ａ）。さらに、ＲＤおよびＰＸドメインを、その配列の全域にリピートを有するヘキサペプチドＰＰＰＡＰＡで置換した、類似であるがより疎水性のペプチドを合成した（ＰＡ、図７Ａ）。これらの２つのペプチドはＲＸ３と本質的に同じＰＰＩＩ構造を有するが、高プロリン含量とシステインの数および位置以外の主要な相同性は有さない。
【０２５９】
ＲＸ３−ＥＣＦＰ、ＰＰ−ＥＣＦＰまたはＰＡ−ＥＣＦＰを過剰発現するタバコ葉のウエスタンブロットによる分析は、驚くことに、ＥＣＦＰと融合されたこれらの２つの合成ペプチドが天然ＲＸ３よりも高い効率で蓄積したことを示した（図７Ｂ、レーン１および２と３を比較）。ＰＰ−ＥＣＦＰ、および程度は低いがＰＡ−ＥＣＦＰは、３つの融合タンパク質が総て同数のアミノ酸を有していても、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいてＲＸ３−ＥＣＦＰよりも低い移動度を示した。これは、ＰＰおよびＰＡが、ウエスタンブロット条件であっても、ＲＸ３よりも安定なＰＰＩＩ延長ヘリックスを呈することを示唆する。結果として、これらの合成ペプチドの集合は好都合であり、ウエスタンブロットにより判定した際に、このタンパク質は蓄積の増加を示すことになろう。この仮説は、ＲＸ３−、ＰＰ−およびＰＡ−ＥＣＦＰ融合タンパク質を発現するベクターでの形質転換から６日後の、共焦顕微鏡によるタバコ葉の観察により確認された。図７Ｃは、ＰＰ−ＥＣＦＰおよびＰＡ−ＥＣＦＰで形質転換した葉の共焦画像を示し、ＲＸ３−ＥＣＦＰを発現する葉に比べて多数のＲＰＢＬＡを呈した。さらに、ＰＰ−およびＰＡ−ＥＣＦＰ発現により誘導されたＲＰＢＬＡの平均サイズはＲＸ３−ＥＣＦＰ  ＲＰＢＬＡの平均サイズよりも２倍大きかった。
【０２６０】
これらの３つのタンパク顆粒誘導配列の配列を比較すると（図７Ａ）、それらの唯一の相同性領域はシグナルペプチドの後の最初の１０個のアミノ酸（ＴＨＴＳＧＧＣＧＣＱ）（配列番号２５）であることが明らかである。この配列がタンパク質集合において特別な役割を果たさないことを確認するために、この配列をプロリンに基づく合成配列（ＴＨＰＰＰＰＣＰＣＰ）（配列番号２６）で置換した。プロリンに基づく配列は、ＰＡ−ＥＣＦＰ構築物に関してシステインの位置を維持していた。この構築物（ＮＰＡ−ＥＣＦＰ）は、ＲＰＢＬＡ誘導においてＰＡ−ＥＣＦＰと同等に有効であった。
【０２６１】
さらに、ＲＸ３由来のγ−ゼインのシグナルペプチドも、ＰＲ−Ｓとしても知られるＰＲ１０シグナルペプチド(Veroverd et al, Plant Physiol, 1995, 109: 1199-1205)で置換した。得られた構築物をＧＦＰと融合させた（ＲＸ３（ＰＲ１０）−ＧＦＰ）。このシグナルペプチドは、タンパク質がＥＲに入る際に同時翻訳的に切断されることから、ＲＰＢＬＡの形成に影響を及ぼすとは考えにくく、予測されたように、ＲＰＢＬＡの蓄積速度および誘導は用いるシグナルペプチドとは完全に無関係であった。
【０２６２】
ＰＰ、ＰＡ、ＮＰＰおよびＮＰＡペプチドがＲＸ３との主要な配列相同性を有さないという事実は、予期しないことに、ＲＰＢＬＡ集合および誘導能がＲＸ３の配列に依存せず、その三次元構造に依存することを示す。ＲＸ３、ＰＰ、ＰＡペプチド、およびそれらの変異体に存在する延長されたＰＰＩＩヘリックスは、ＲＰＢＬＡ誘導を担う重要な特徴である。
【０２６３】
クローニング上の理由から、ＰＰおよびＰＡペプチドはＲＸ３リピートドメインの最後のリピートの部分を維持する。ＲＤ由来のこの最後のＲＸ３リピート単位がＲＰＢＬＡの形成に必要とされるということを棄却するために、このリピートが存在しない構築物の新たなセット：ＰＰ３およびＰＡ２を作出した。これらの２つの構築物はＲＰＢＬＡ形成能を維持している。
【０２６４】
実施例９：形質転換タバコ植物体におけるＲＰＢＬＡの誘導または安定化に関与するＲＸ３のシステイン残基の決定
ここで示される研究は、その多量体形成およびＲＰＢＬＡ形成を可能とするＲＸ３の特異な形質に重要な洞察を与える。関連があるが、独特ではない形質として、ＲＸ３分子間のジスルフィド結合に関与し得るシステイン残基の存在がある。
【０２６５】
６つのシステインのそれぞれの点突然変異を、ＲＸ３重合におけるジスルフィド結合の役割を決定するための直接的方法として用いた。Ｃ７またはＣ９を欠くＲＸ３−ＥＣＦＰ（ＲＸ３Ｃ７Ｇ−ＥＣＦＰおよびＲＸ３Ｃ９Ｇ−ＥＣＦＰ）の過剰発現は明らかに融合タンパク質の多量体形成プロセスを妨げ、両突然変異体は旺盛に分泌された（図８Ｃ〜Ｄ）。実際に、個々のＣ７またはＣ９突然変異体で形質転換した表皮細胞の細胞ごとの画像解析において、融合タンパク質は主として分泌され、数個の強い蛍光の単細胞だけが蛍光ＲＰＢＬＡ様のスポットを示した。この所見は、ＥＲにおける組換えタンパク質の高い発現率が凝集効率の増大をもたらすことを示唆し、このことは、野生型ＲＸ３に比べてタンパク質凝集により高い臨界タンパク質濃度が必要とされることを示す（図８Ｃ〜Ｄ、四角の中）。予測されたように、両方のシステイン残基を同時に突然変異させた場合には（図８Ｉ、ＲＸ３Ｃ７，９Ｇ−ＥＣＦＰ）、ＲＰＢＬＡの蓄積は見られなかった。これらの結果は、ＲＸ３ドメインのＮ末端付近の２個のシステイン残基の存在が、ＲＰＢＬＡの形成を誘導するためのＥＲにおけるタンパク質の保持に必要であることを示す。しかしながら、最初の２個のシステインをもっぱら維持する多重突然変異体ＲＸ３Ｃ６４，８２，８４，９２Ｇ−ＥＣＦＰは、Ｃ７とＣ９は融合タンパク質をＥＲ内に保持し、それにＲＰＢＬＡを形成させるのに十分でないことを示した（図８Ｋ）。従って、ＲＸ３ペプチド中に存在する他のいくつかのシステインが、その適正なタンパク質集合に役割を果たしている。
【０２６６】
ＲＸ３ドメインの中央に位置するシステイン残基の突然変異（Ｃ６４）オリゴマー化プロセスに有意な影響はなく、タンパク質はＲＰＢＬＡに蓄積した（図８Ｅ、ＲＸ３Ｃ６４Ｇ−ＥＣＦＰ）。さらに、ＲＸ３のＣ末端に位置するこれらの３個のシステイン残基の個々の突然変異（Ｃ８２、Ｃ８４またはＣ９２）は、ＲＰＢＬＡにおける蓄積能に有意な影響はなかった（図８Ｆ〜Ｈ、それぞれＲＸ３Ｃ８２Ｇ−ＥＣＦＰ、ＲＸ３Ｃ８４Ｇ−ＥＣＦＰまたはＲＸ３Ｃ９２Ｇ−ＥＣＦＰ）。これらの単一突然変異体の通常の凝集能は、これらの残基の中に、それ自体、ＲＰＢＬＡの誘導および安定化に必要とされるものはないという仮説を裏付ける。しかしながら、多重Ｃ末端Ｃｙｓ突然変異体（図８Ｊ、ＲＸ３Ｃ８２，８４，９２Ｇ−ＥＣＦＰ）はＲＰＢＬＡの生合成とともに進行不能であり、ＲＸ３はＲＰＢＬＡの形成にＣ末端付近の少なくとも２個のシステイン残基もまた必要とすることが明らかである。
【０２６７】
さらに、タンパク質濃度は、自己集合ペプチドの凝集を制御する重要なパラメーターであることが知られている(Wetzel, R. (1999) In Methods in Enzymology, vol. 309, Academic Press, San Diego, California)。しかしながら、ＲＸ３−ＥＣＦＰおよびＲＸ３  Ｃｙｓ突然変異体の発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーブルー染色ゲルにおいて明らかに視認され、ＲＰＢＬＡを形成したタンパク質と分泌され、凝集しなかったタンパク質との間にタンパク質レベルの有意な差は見られなかった（図８Ｂ）。従って、供試したＲＸ３突然変異体のタンパク質の多量体形成における違いは、凝集能に影響を及ぼすそれらの固有の特性の違いに関連する。ＲＸ３配列の改変はオリゴマー化に必要なタンパク質濃度閾を引き上げるかのいずれかの可能性がある。
【０２６８】
ＲＰＢＬＡの有効な誘導を可能とするためにアセンブラーペプチドに必要とされるシステインの最小数の決定は重要である。まず、アセンブラーペプチドにおけるシステイン残基は、主としてこのタンパク質もシステイン残基を含む場合に、目的タンパク質の適正な折り畳み、従ってその活性に負の影響を及ぼし得る。しかしながら、アセンブラーペプチドにおけるシステインの存在は、ジスルフィド結合の形成による融合タンパク質の架橋を保証する。この架橋は、ＲＰＢＬＡの安定化およびロバスト性をもたらす。これらの特徴は、このオルガネラの容易な単離を可能とするので望ましい。さらに、ＲＰＢＬＡオルガネラが用いられる産業上の利用はいずれもジスルフィド結合の形成による架橋に依存する。緒論に記載したように、プロラミン以外のＰＢＩＳは、タンパク質のＣ末端にＫＤＥＬ配列を付加することによりＲＰＢＬＡの形成を誘導することができる。このアプローチがＲＰＢＬＡの形成を可能とするにしても、これらのオルガネラの単離はそれらの低い安定性のために困難であろう。
【０２６９】
実施例１０：システイン残基の配向は、形質転換タバコ植物体におけるＲＰＢＬＡへのＰＰペプチド蓄積能に影響を及ぼさない
タンパク質集合およびＲＰＢＬＡ誘導におけるシステイン残基の重要性は、実施例９におけるこれらの残基の単一および多重突然変異によって実証された。しかしながら、これらの残基の配向の影響はまだ探求されていない。これを行うために、新たなアセンブラーペプチド（ＰＰ２）を合成した。ＰＰ２は、いくつかのシステイン残基の位置以外はＰＰと相同である（図９Ａ、Ｃ９→１０、Ｃ８４→８５およびＣ９２→９１）。
【０２７０】
プロリンが極めて豊富なペプチドは、図９Ｂに示されるように、１ターン当たり３アミノ酸を有することを特徴とするＰＰＩＩヘリックスを形成する(Brochicchio, 2002, Chirality, 14: 782-92)。天然ＲＸ３では、システイン残基はヘリックスの３つの面のそれぞれに向かって配向する。この配向は、天然およびＲＰＢＬＡを、ジスルフィド架橋によって集合および安定化されたタンパク質が詰まった通常、大きな（最大３マイクロメーター）丸い形状のオルガネラへと形成することを可能とする、３方向総てにおける集合および安定化を促進するのに重要であり得るという仮説が立てられた。従って、ＰＰ２は、システイン残基が総てヘリックスの同じ面に配向されるように設計された。予期しないことに、ＧＦＰと融合されたＰＰ２は、ＰＰ−ＧＦＰと同等に蓄積することができ、いっそう驚くことに、大きなＲＰＢＬＡの形成を誘導することができた（図９Ｃ）。
【０２７１】
実施例１１：形質転換タバコ植物のＲＰＢＬＡにおけるＲ８（４Ｃ）−ＥＣＦＰ、Ｒ７（４Ｃ）−ＥＣＦＰ、Ｒ６（４Ｃ）−ＥＣＦＰおよびＲ４（４Ｃ）−ＥＣＦＰの蓄積
ＲＰＢＬＡの生合成に必要なＰＰＩＩの最小長も決定した。これを行うため、最小ＲＸ３−ＥＣＦＰ由来のタンパク質Ｒ８（Ｃ４）−ＥＣＦＰを、ＲＸ３のＰＸ配列を削除し、付加的な最小配列を付加することによって作出した。従って、Ｒ８（Ｃ４）−ＥＣＦＰはＣ８２、Ｃ８４およびＣ９２を欠き、鎖内ジスルフィド架橋を強化するために２個のプロリンによってＣ６４と連結された付加的な新たなシステイン残基を含む（図１０Ａ）。Ｎ．ベンサミアナ葉において発現された場合のＲ８（Ｃ４）−ＥＣＦＰタンパク質の分布パターンは、高倍率で小型のＲＰＢＬＡであると見て取れる明白な球状蛍光スポットに蓄積した（図１０Ｃ）。ＲＸ３−ＥＣＦＰにより誘導されたＲＰＢＬＡは４ｄｐｉにおいて平均直径１．４μｍに達し、７ｄｐｉにおいて最大２μｍに達するまで徐々に増大したが、Ｒ８（Ｃ４）−ＥＣＦＰにより誘導された蛍光スポットは７ｄｐｉにおいて直径１μｍに達することは稀であった（下表参照）。従って、従前に示唆されたように、ＰＰＩＩヘリックス（Ｒ８（Ｃ４）に関してはＲＤ）の各面のシステイン対はＲＰＢＬＡへと発達するタンパク質凝集体の核を形成するのに十分である。ＲＸ３−ＥＣＦＰがＲ８（Ｃ４）−ＥＣＦＰよりも、大きなＲＰＢＬＡを形成する強い傾向を有するという所見は、ＲＸ３−ＥＣＦＰオリゴマーがその６個のシステイン残基により鎖内架橋を増やすことによってより大きな成長見込みを有するという事実によるものであり得る。
【０２７２】
従って、重合がＰＰＩＩの長さに関連する程度も検討した。これらの実験はＲＤを徐々に短縮することによって行った。Ｒ８（Ｃ４）−ＥＣＦＰからさらに３つの構築物を作出した。リピートドメインを７、６および４ＰＰＰＶＨＬ単位に短縮した（図１０Ａ）。図１０Ｃに示されるように、６または４リピート単位を含む過剰発現タンパク質（それぞれＲ６（Ｃ４）−ＥＣＦＰおよびＲ４（Ｃ４）−ＥＣＦＰ）はなお小さな凝集体を形成することができたが、リピートドメインの短縮に伴い分泌が高まる（図１０Ｂの挿入）。Ｒ７（Ｃ４）−ＥＧＦもＲ８（Ｃ４）−ＥＧＦと同様の結果をもたらした。
【０２７３】
ＲＸ３末端切断型タンパク質を過剰発現する葉から抽出された全タンパク質のクーマシーブルー染色分析（図１０Ｂ）は、組換えタンパク質の濃度がどの場合でも同等であったことを示した。これは、各融合タンパク質が安定であること、および良好な発現レベルがＲＰＢＬＡが効率的に形成される証明にはならないことを示す。言い換えれば、突然変異体の低い凝集効率はタンパク質発現レベルに関するものではなかった。これらの結果は、最適なＲＸ３ペプチド相互作用に都合のよい、また、ＰＢ形成の効率を決定する臨界サイズが存在することを示唆する。
【０２７４】
【表５】
2013532960.tif 000024
【０２７５】
他の構築物に比べてＲ４（Ｃ４）−ＥＣＦＰの融合タンパク質分泌の有意な増強に基づけば、Ｒ４（Ｃ４）は、有効なアセンブラーペプチドの最小長を示す。これらの結果は、ＰＰＩＩヘリックスを採り、各末端において１対のシステイン残基により挟み込まれた２４アミノ酸（Ｒ４（Ｃ４）リピートドメインの長さ）より長いペプチドであれば、ＥＲに保持され、ＲＰＢＬＡ形成を誘導するのに十分であることを示す。
【０２７６】
実施例１２：形質転換タバコ植物体のＲＰＢＬＡにおけるＲＸ３（Ａ）−ｍＣｈｅｒｒｙ  ＲＸ３（Ｅ）−ｍＣｈｅｒｒｙの蓄積
蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙは、ＲＸ３と融合させた場合、著しく可溶性となり、ＲＰＢＬＡに蓄積しにくくなる。ＲＸ３−ｍＣｈｅｒｒｙ発現するベクターで形質転換したタバコ葉の共焦顕微鏡分析は、図１１Ａに示されるような明確な分泌パターンを示し、見られる赤色蛍光の大部分が細胞の末梢に位置した。興味深いことに、タバコ葉をＲＸ３（Ａ）−ｍＣｈｅｒｒｙで形質転換した場合には、蛍光の大部分が細胞内に見られ、融合タンパク質が細胞内に効率的に保持されたことを示す。
【０２７７】
さらに、明確な粒子パターンが見られ（図１１Ｂおよび１１Ｂ’）、融合タンパク質がＲＰＢＬＡに蓄積したことを示唆する。これらの組換えタンパク顆粒のサイズ（直径約１マイクロメーター）は、いくつかの融合タンパク質で形質転換した植物体において従前に同定されたＲＰＢＬＡと一致する（米国特許第７，５７５，８９８号および米国特許出願公開第２００６０１２３５０９号、同第２００６０１２１５７３号および同第２００７０２４３１９８号参照）。
【０２７８】
この結果は少なくとも２つの理由で予期されないものであった。第一に、ｍＣｈｅｒｒｙをＲＸ３（Ａ）と融合させた場合には、天然型リピートドメインを含む非改変型プロラミン由来ＲＸ３に比べてＲＰＢＬＡの形成効率が高まった。さらに、ＲＸ３のリピートドメインの両親媒性がタンパク顆粒の形成に重要であると記載されており(Kogan et al., 2001, J. Mol. Biol. 312:907-913)、完全疎水性リピートドメインを有するようにＲＸ３（Ａ）を変異させた（実施例１参照）。
【０２７９】
上記で示したように、ｍＣｈｅｒｒｙの高い溶解度は、ｍＣｈｅｒｒｙの天然型ＲＸ３と融合してＲＰＢＬＡを形成する能力を低下させる主要な要因の１つであり得る。ＲＸ３（Ａ）のより高い性能が単にＲＤの疎水性含量の増加（ヒスチジン（正電荷アミノ酸）を疎水性アラニンへ置換）によるものかどうかを判定するために、ｍＣｈｅｒｒｙとＲＸ３（Ｅ）の融合物を発現させた。図１１Ｃに示されるように、ＲＸ３（Ｅ）−ｍＣｈｅｒｒｙは細胞内に効率的に保持され、さらに、それはＲＸ３（Ａ）−ｍＣｈｅｒｒｙの発現のより誘導されたものよりもはるかに大きいＲＰＢＬＡに蓄積した。
【０２８０】
両親媒性電荷ＲＤを有するＲＸ３（Ｅ）もまた、ｍＣｈｅｒｒｙと融合させた場合にＲＰＢＬＡの形成を誘導し得るという事実は、ＲＸ３に比べてのＲＸ３（Ａ）の性能の向上がそのペプチドの疎水性特徴の非特異的増大によるものではなく、これらの２つの合成ＲＸ３由来ペプチドの集合能、従ってタンパク顆粒誘導能の増大によるものであることを示唆する。
【０２８１】
実施例１３：形質転換タバコ植物体におけるＲＸ３、ＲＸ３（Ａ）、ＲＸ３（Ｅ）、ＰＰおよびＰＡアセンブラーペプチドと融合されたＥＧＦの蓄積
タバコ浸潤植物におけるＲＸ３と融合された上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の生産および精製は従前に報告されている（ＷＯ２００６／０５６４８４号公報）。ＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質の低速遠心分離、可溶化および切断、ならびにその後の逆相（ＲＦ）ＦＰＬＣによるＥＧＦの精製によるＲＰＢＬＡ単離のプロセスはＷＯ２００７／０９６１９２号公報において開発されている。新たなアセンブラーペプチドの有効性を試験するために、ＥＧＦをＲＸ３（Ａ）およびＲＸ３（Ｅ）と融合させ、同じ下流プロセスを行った。ＲＸ３（Ａ）−ＥＧＦおよびＲＸ３（Ｅ）−ＥＧＦの発現によって誘導されたＲＰＢＬＡは、ＲＸ３−ＥＧＦの発現によって誘導された対照と同程度効率的に低速遠心分離のより回収された（図１２Ａ）。３つの場合の総てにおいて、融合タンパク質のほとんど総てがｗＰＢ画分に回収され（図１２Ａ、レーン４）、上清（図１２Ａ、レーン２）および洗浄工程（図１２Ａ、レーン３）においては有意でない損失が見られたに過ぎなかった。これらの結果から、ほとんど総ての融合タンパク質がＲＰＢＬＡ内で強固に集合し、オルガネラはｗＰＢ画分において容易に回収されることが明らかである。
【０２８２】
下流における重要なポイントは、ＲＰＢＬＡからの融合タンパク質の可溶化である。ＲＸ３−ＥＧＦ  ＲＰＢＬＡを穏和な条件（５０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ１０および１０ｍＭのｂＭＥ、２５℃で４時間）で可溶化した後には、低いパーセンテージの融合タンパク質が可溶化されたに過ぎなかった。実際に、可溶化されたのはＲＸ３−ＥＧＦ単量体の５０％に過ぎなかった（図１２Ｂ、レーン３（ｓＰＢ）とレーン６（ｉＰＢ）を比較）。驚くことに、ＲＸ３（Ａ）−ＥＧＦまたはＲＸ３（Ｅ）−ＥＧＦを含有するＲＰＢＬＡの可溶化ははるかに効率的であった。単量体形態のＲＸ３（Ａ）−ＥＧＦはほとんど総て可溶化され、用いた条件で不溶性のままであると思われるＲＸ３（Ａ）−ＥＧＦはほとんどなかった（図１２Ｂ、レーン１（ｓＰＢ）とレーン４（ｉＰＢ）を比較）。
【０２８３】
下流プロセシングに対するＰＰ−ＥＧＦおよびＰＡ−ＥＧＦの影響もまた検討した。図１２Ｃは、これらの２つの融合タンパク質がタバコ浸潤葉においてＲＸ３−ＥＧＦおよびＲＸ３（Ｅ）−ＥＧＦと同様のレベルで蓄積することを示す。さらに、低速遠心分離によるＲＰＢＬＡ回収の後、ＰＰ−ＥＧＦおよびＰＡ−ＥＧＦは上記の穏和な条件においてＲＸ３（Ｅ）−ＥＧＦと同様に極めて効率的に可溶化された（図１２Ｄ）。上述のように、これらの総ての融合タンパク質間での電気泳動移動度の違いは、タンパク質サイズの違いに関するものではなく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下であってもタンパク質コンフォメーションのわずかな違いによるものである。
【０２８４】
予期しないことに、新たなアセンブラーペプチドＲＸ３（Ａ）、ＲＸ３（Ｅ）、ＰＰおよびＰＡは総て、それらの集合し、ＲＰＢＬＡの形成を誘導する能力に影響を及ぼさずに融合タンパク質の溶解度を大きく高める。この目立った結果は、それがプロセスの総収量を劇的に高める（ＲＸ３（Ａ）に関しては少なくとも２倍、ＲＸ３（Ｅ）、ＰＰおよびＰＡに関しては１０倍を超える）ことから、ＲＰＢＬＡの下流プロセシングにおいて主として重要である。
【０２８５】
これらの新たなアセンブラーペプチドによって生産されたＥＧＦのコンフォメーションを評価するために、可溶化されたＲＸ３（Ｅ）−ＥＧＦ、ならびにこの融合タンパク質からＦＸａにより切断され、ＲＦ−ＦＰＬＣにより精製されたＥＧＦの活性を試験した。図１３Ａは非明澄化ホモジネートから切断工程までの総ての下流工程を伴う場合の銀染色ゲルを示す。部位特異的プロテアーゼＦＸａで切断した後、遊離したＥＧＦを材料および方法に記載のようにＲＦ−ＦＰＬＣにより精製した。ＥＧＦタンパク質は、図１３Ｂにおいて矢印で示される鋭いピークに相当する２つの画分でのみ３０％のアセトニトリルで回収された。回収された２つの画分（図１３Ｃ）の混合物の純度は、ＨＰＬＣにより９２％を越えると評価された。ＥＧＦ活性は、in vitroにおいて、漸増量のＲＸ３（Ｅ）−ＥＧＦおよびＥＧＦとともにインキュベートしたＡ４３１細胞のＥＧＦ受容体リン酸化の分析により測定した。陰性対照として、これらの細胞を並行してＲＸ３とともにインキュベートした。３回の独立した実験は、ＲＸ３（Ｅ）−ＥＧＦおよびＥＧＦがPromegaから市販されているＥＧＦ（ＧＳ０２Ａ）に比べて、それぞれ５０％および１００％の活性があったことを示した。
【０２８６】
実施例１４：形質転換タバコ植物体におけるＲＸ３およびＲＸ３（Ａ）アセンブラーペプチドと融合されたｈＧＨの蓄積
ヒト成長ホルモンをＲＸ３変異体の下流プロセス増強能を確認するためのさらなる例として選択した。ＲＸ３（Ａ）−ｈＧＨ融合タンパク質を発現するタバコ植物体をホモジナイズし、誘導されたＲＰＢＬＡを低速遠心分離により単離した。図１４Ａ（左パネル）に示されるように、ホモジネート（Ｈ０）からＲＰＢＬＡの極めて純粋な画分（ｗＰＢ）が得られた。クーマシー染色により分析したところ、その種々のオリゴマー形態の融合タンパク質ＲＸ３（Ａ）−ｈＧＨがこの画分に見られる唯一のタンパク質である。興味深いことに、このプロセスの収量をウエスタンブロットにより分析したところ、ほとんどの融合タンパク質が安定な強固に集合したＲＰＢＬＡに蓄積しており、これは遠心分離により回収することができ、対応する上清中の損失は少量だけである（図１４Ａ、左パネル）。
【０２８７】
ＲＸ３（Ａ）−ｈＧＨを含有するＲＰＢＬＡがこの簡単な遠心分離法によってひと度得られたら、それらを穏和な可溶化緩衝液（５０ｍＭホウ酸  ｐＨ１０、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）室温）中で３時間インキュベートした。参照として、ＲＸ３−ｈＧＨを含有する等量のＲＰＢＬＡを同じ条件でインキュベートし、抗ｈＧＨ  抗体を用いるウエスタンブロットにより並行して分析した。ＲＰＢＬＡの回収が高収量であることが、これらの２つの融合タンパク質のうちいずれか一方の発現により誘導されたオルガネラが双方とも安定で、強固に集合していることを示唆するとしても、驚くことに、ＲＸ３（Ａ）−ｈＧＨ融合タンパク質はＲＸ３−ｈＧＨよりもはるかに可溶であった。この水溶解度の上昇は驚くことに、ＲＸ３ヒスチジン残基をＲＸ３（ａ）のアラニンで置換すると、アセンブラーペプチドの疎水性が高まるという事実を与える(Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179: 125-142)。
【０２８８】
実施例１５：形質転換タバコ植物体における高密度ＲＰＢＬＡ生合成におけるＣｙｓ残基の依存性
上述のように、高密度ＲＰＢＬＡ形成におけるＰＢＩＳの必須要素の１つが、ポリプロリンＩＩ型ドメインの各末端における少なくとも２個のシステイン残基の存在である。しかしながらやはり、ＥＲ内に保持され、ジスルフィド架橋形成の不在下であっても、ＫＤＥＬ配列と融合された際に小胞様構造に蓄積する他のアセンブラーペプチド（例えば、ヒドロホビン、ＥＬＰ）も存在する。ある特定のアセンブラータンパク質のＣ末端におけるＫＤＥＬの存在は、その分子をＥＲ内に保持するのに十分であり、このタンパク質のアセンブラー能は小胞構造の形成をもたらす。
【０２８９】
ＲＸ３アセンブラーペプチドの末端におけるＥＲ保持配列の付加がＣｙｓ残基の必要を補填できるかどうかを判定するために、ＲＸ３変異体ＲＸ３ΔＣｙｓ６４，８２，８４，９２−ＥＣＦＰ（実施例９に示されるように、ＲＰＢＬＡを誘導できず、分泌された）を、ＫＤＥＬを有するＥＣＦＰと融合させた（ＲＸ３ΔＣｙｓ６４，８２，８４，９２−ＥＣＦＰ−ＫＤＥＬ）。
【０２９０】
ＲＸ３−ＥＣＦＰおよびＲＸ３ΔＣｙｓ６４，８２，８４，９２−ＥＣＦＰ−ＫＤＥＬを過剰発現するタバコ葉のクーマシー染色およびウエスタンブロットによる分析（図１６Ａ）は、これら２つのＲＸ３に基づく融合タンパク質が同等のレベルで蓄積したことを示した。ＲＸ３ΔＣｙｓ６４，８２，８４，９２−ＥＣＦＰ−ＫＤＥＬがＲＰＢＬＡに蓄積するかどうかを判定するために、この融合タンパク質を発現する葉を浸潤３日および７日後（ｄｐｉ）に共焦顕微鏡のより分析した。従前にＲＸ３−ＥＣＦＰ発現タバコ葉で見られたように、ＲＸ３ΔＣｙｓ６４，８２，８４，９２−ＥＣＦＰ−ＫＤＥＬの発現により誘導された１マイクロメーター前後の丸い形状の小胞がわずか３ｄｐｉでも見られた（図１６Ｂ）。この所見は、ＥＣＦＰのＣ末端と結合されたＫＤＥＬ配列が細胞内の融合タンパク質の有効な保持を可能とすることを示す。さらにまた、この所見は、ＲＸ３に基づくペプチドのアセンブラー能が自己集合および小胞構造の誘導を可能にすることも示す。これらの小胞構造は３ｄｐｉ後も成長を維持し、興味深いことに、７ｄｐｉでは、５マイクロメーターを越えるものもある不規則な大型の小胞構造が見られた（図１６Ｂ）。このサイズのＲＰＢＬＡは、対照ＲＸ３−ＥＣＦＰ融合タンパク質を過剰発現するタバコ葉では見られず、このことはＲＰＢＬＡ中へのＲＸ３−ＥＣＦＰの自己集合がＲＸ３ΔＣｙｓ６４，８２，８４，９２−ＥＣＦＰ−ＫＤＥＬ小胞の集合機構と同じでないことを示唆する。
【０２９１】
小胞構造内での融合タンパク質集合の強固さを間接的に特徴付ける技術的アプローチは、ステップクッションＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配による小胞構造の密度の測定である。従って、タバコ植物体においてＲＸ３ΔＣｙｓ６４，８２，８４，９２−ＥＣＦＰ−ＫＤＥＬ（またはＲＸ３−ＥＣＦＰ）発現により誘導された小胞構造は、濾過した植物ホモジネートを下記のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）ステップクッションの上にのせることによって決定した。各ステップクッションの密度は上記の表４に定義する通りである。
【０２９２】
ＲＸ３−ＥＣＦＰ勾配により例示されるように、高密度ＲＰＢＬＡ１．２ｇ／ｍＬ前後の密度を有する画分から回収され（図１６Ｃ、左、レーン５および６）、これには内因性タンパク質はほとんど含まれない。実際に、ＲＰＢＬＡの密度および堅牢性は、米国特許出願公開第２００６／０１２３５０９号にすでに記載されているように、ＲＰＢＬＡ単離において大いに注目される点である。ＲＸ３ΔＣｙｓ６４，８２，８４，９２−ＥＣＦＰ−ＫＤＥＬ小胞構造を同じ手段により分析したところ、驚くことに、ほとんど総ての融合タンパク質が上清画分に回収された（図１６．Ｃ、右）。この結果は明らかに、ＲＸ３ΔＣｙｓ６４，８２，８４，９２−ＥＣＦＰ−ＫＤＥＬ融合タンパク質が、真のＲＰＢＬＡとはみなすことができない小胞様構造に蓄積することを示す。ＥＲまたはゴルジ体に由来する細胞内オルガネラ、例えば、一般にＯｐｔｉｐｒｅｐクッションの１８〜３０％の間の沈降物であるが、組織ホモジナイゼーションプロセスの際に、ミクロソームの管腔に存在する大きな割合の可溶性タンパク質が遊離し、上清中に回収されることになる。従って、ＲＸ３ΔＣｙｓ６４，８２，８４，９２−ＥＣＦＰ−ＫＤＥＬ融合タンパク質がＥＲ内に保持されるが、集合しないか、または弱く集合するに過ぎず、高密度ＲＰＢＬＡが形成されないと結論付けることができる。
【０２９３】
実施例１６：形質転換タバコ植物のＲＰＢＬＡにおけるＺ（Ａｄｈ）−ＧＦＰ、Ｚ（Ａｄｈ）Ｐｘ−Ｇｆｐ、Ｚ（Ｃｏｌ）−Ｇｆｐ、Ｚ（Ｃｏｌ）Ｐｘ−Ｇｆｐの蓄積
ＲＸ３と低い配列相同性を有するＰＢＩＳはＲＰＢＬＡを生じ得ることが示されている。ＰＰおよびＰＡはＲＸ３配列と、Ｃ９〜Ｃ６４残基の間に６０％未満の同一性を有する。他方、ＰＰおよびＰＡ配列は高いパーセントのプロリンを有し（それぞれ９６．２および６７．９％）、これは野生型ＲＸ３（５４．７％）よりも有意に高いことを指摘しておくことが重要である。ＰＰＩＩ構造を採る他のタンパク質配列のＲＰＢＬＡ誘導能を評価した。これらの配列は以下の判定基準を満たした：（ｉ）ＲＸ３に対して４０％未満、および（ｉｉ）プロリン含量４０％未満。アミノ酸１３５〜１７９を含んでなるヒトコラーゲンＣＯＬ２Ａ１（ＡｃｃＮ：ＣＡＡ３４６８３）の断片、および表面アドヘシンＡｇＩ／ＩＩ（ミュータンス連鎖球菌株ＮＧ８、ＧｅｎｅＢａｎｋ：ＧＱ４５６１７１．ＡｃｃＮ：ＡＣＶ６９９１９）由来の８８４〜９２７断片を選択した。図１７Ａに示されるように、このような配列を用いてＲ８（Ｃ４）（Ｚ（Ａｄｈ）およびＺ（Ｃｏｌ））またはＲＸ３（Ｚ（Ａｄｈ）ＰｘおよびＺ（Ｃｏｌ）Ｐｘ）アセンブラーペプチドのＲＤを置換した。
【０２９４】
ＧＦＰに融合されたこれらのアセンブラーペプチドはタバコ葉に高レベルで蓄積し、これらの葉からの明澄化前のホモジネートにおいて、クーマシーで染色された主要なバンドとして現れた（図１７Ｂ）。Ｚ（Ａｄｈ）−ＧｆｐおよびＺ（Ａｄｈ）Ｐｘ−Ｇｆｐ（それぞれ推定分子量３７．７ｋＤａおよび３４．６ｋＤａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて低い移動度を有する。上記のＰＰＩＩ構造を採るほとんどのアセンブラーペプチド（例えば、ＰＰ、ＲＸ３（Ｅ）など）でも見られたこの移動のシフトは、この二次構造の強い安定性に帰することができる。
【０２９５】
Ｚ（Ａｄｈ）−ＧＦＰ、Ｚ（Ａｄｈ）Ｐｘ−ＧＦＰ、Ｚ（Ｃｏｌ）−ＧＦＰおよびＺ（Ｃｏｌ）Ｐｘ−ＧＦＰを発現するタバコ植物体の共焦顕微鏡による分析は、これらの融合タンパク質が細胞内の直径約１マイクロメーターの丸い形状の蛍光ＲＰＢＬＡに蓄積したことを示した。ＲＸ３との低い相同性パーセンテージおよび低プロリン含量にもかかわらず、これらの融合タンパク質も小胞体（ＥＲ）内に保持され、それらの集合は効率的にＲＰＢＬＡの形成を誘導した（図１７Ｃ）。
【０２９６】
ＥＬＰ、ヒドロホビンまたはＲＸ３ΔＣｙｓ６４，８２，８４，９２−ＥＣＦＰ−ＫＤＥＬにより生産された顆粒とは異なり、ＲＰＢＬＡの重要な特徴は高密度オルガネラ内のタンパク質の稠密な充填である。この特徴は遠心分離によるＲＰＢＬＡ単離を可能とする。従って、Ｚ（Ａｄｈ）−ＧＦＰ、Ｚ（Ａｄｈ）Ｐｘ−ＧＦＰ、Ｚ（Ｃｏｌ）−ＧＦＰおよびＺ（Ｃｏｌ）Ｐｘ−ＧＦＰが１５００ｘｇでの遠心分離の後にペレット（ＲＰＢＬＡ画分）に回収されるという所見（図１７Ｄ）は、これらの融合タンパク質が高密度ＲＰＢＬＡの形成を誘導することを示す。Ｐｘドメインの存在、従って、Ｃｙｓ残基数の増加（４〜６）、また、プロリンリッチ配列によるアセンブラーペプチドの拡張は、集合の強固さの有意な増大およびより高い効率のＲＰＢＬＡ回収をもたらす（図１７においてＺ（Ａｄｈ）−ＧＦＰとＺ（Ａｄｈ）Ｐｘ−ＧＦＰおよびＺ（Ｃｏｌ）−ＧＦＰとＺ（Ｃｏｌ）Ｐｘ−ＧＦＰを比較）。密度勾配およびＦＲＡＰ実験がこのデータを裏付ける。
【０２９７】
Ｚ（Ａｄｈ）−ＧＦＰ、Ｚ（Ａｄｈ）Ｐｘ−ＧＦＰ、Ｚ（Ｃｏｌ）−ＧＦＰおよびＺ（Ｃｏｌ）Ｐｘ−ＧＦＰの配列比較から見て取れるように（図１７Ａ）、ＲＸ３リピートドメインの最後のリピートは、総ての場合でクローニング上の理由から維持された。ＡｄｈおよびＣｏｌ  ＰＰＩＩがＲＰＢＬＡを形成するためにＲＤ由来のこの最後のＲＸ３リピート単位を必要とするということを棄却するために、このリピートが存在しない構築物の新たなセット：Ｚ（Ａｄｈ２）−ＧＦＰ、Ｚ（Ａｄｈ２）Ｐｘ−ＧＦＰ、Ｚ（Ｃｏｌ２）−ＧＦＰおよびＺ（Ｃｏｌ２）Ｐｘ−ＧＦＰを作出した。これらの新たな構築物は総て、ＲＰＢＬＡ誘導能を維持していた。
【０２９８】
実施例１７：形質転換タバコ植物体におけるＲＸ３−Ｘｙｌ、ＲＸ３（Ｌ）−Ｘｙｌ、ＲＸ３（Ｅ）−Ｘｙｌ、ＲＸ３（Ａ）−Ｘｙｌ  ＰＰ−ＸｙｌおよびＰＡ−Ｘｙｌの発現により誘導されたＲＰＢＬＡ上のキシラナーゼ活性の測定
従前に記載されているように（ＷＯ２００７／０９６１９２Ａ１号公報）、野生型ＲＸ３由来融合タンパク質の発現により誘導されたＲＰＢＬＡは、このようなＰＢＩＳと融合された目的タンパク質（ＰＯＩ）の活性を維持する能力を有する。
【０２９９】
本明細書に記載のアセンブラーペプチドがそれらに融合されたタンパク質の活性にどのような影響を及ぼすか決定するために、非両親媒性（ＰＰ、ＰＡ、ＲＸ３（Ａ）およびＲＸ３（Ｌ））および負電荷両親媒性（ＲＸ３（Ｅ））アセンブラーペプチドを検討した。キシラナーゼ酵素（ＤＱ４６５４５２）をリポーターＰＯＩとして選択し、これらの総てのアセンブラーペプチドならびに参照としての野生型ＲＸ３と、５個のグリシンを含んでなるリンカーを介して融合させた。
【０３００】
ＰＰ−Ｘｙｌ、ＰＡ−Ｘｙｌ、ＲＸ３（Ｅ）−Ｘｙｌ、ＲＸ３（Ｌ）−Ｘｙｌ、ＲＸ３（Ａ）−ＸｙｌおよびＲＸ３−Ｘｙｌを過剰発現するタバコ葉を浸潤法の６日後に、矛盾および変動をなくすために壊死組織を避けて採取した。各構築物に低速遠心分離による下流プロセシングを行い、富化ＲＰＢＬＡ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにてクーマシーブルー染色により分析した。総ての場合で、ＲＰＢＬＡ画分は融合タンパク質が著しく富化されており、画分にタンパク質が最も豊富であった。タンパク質含量はＥＺＱタンパク質定量キット(Invitrogen, Molecular Probes)により測定し、各サンプルに伴うキシラナーゼ活性は合成基質（ＤｉＦＭＵＸ２）を用い、対応する蛍光産物を２分おきに測定する（波長：励起３６０／４０ｎｍ、発光４６０／４０ｎｍ）ことで定量した。
【０３０１】
予期しないことに、分析した総てのサンプルのうち、最低の比活性（１１．７ｎｍｏｌｓ／（分＊タンパク質マイクログラム））を有するＲＰＢＬＡ画分がＲＸ３−Ｘｙｌ融合タンパク質に相当した。この融合タンパク質を参照として、ＲＸ３（Ａ）−Ｘｙｌはほぼ２倍の比活性を示し、ＲＸ３（Ｅ）−ＸｙｌおよびＲＸ３（Ｌ）−Ｘｙｌは約３倍の増強を示し、ＰＰ−ＸｙｌおよびＰＡ−Ｘｙｌは参照の７倍を超える比活性を有した（表４参照）。この活性は同量の融合タンパク質を用いて測定したので、ＲＸ３と比較した場合のこれらのアセンブラーペプチドの比活性の増大は、ＲＰＢＬＡ特性の違いに関連づけることができる。高い比活性は酵素適用における有用な属性であることを考えれば、この所見は極めて重要である。
【０３０２】
【表６】
2013532960.tif 000025
【０３０３】
実施例１８：タバコ植物のＲＰＢＬＡ誘導能におけるシステイン残基に対する、および目的ポリペプチドに対するＲＸ３リピートドメインの配向の独立性
野生型ＲＸ３由来の繰り返しドメイン（ＲＤ）には、それぞれＮ末端およびＣ末端に位置する２個および４個のシステイン残基が隣接している。この非対称分布は、集合能および／またはＲＰＢＬＡ誘導の効率に関して何らかの重要性を持つ可能性がある。これを試験するために、このＲＤの隣接領域が交換され、逆配向でクローニングされるように新たな構築物を（ｉＲＸ３）作出した（図１８Ａ）。タバコ葉に、ＥＣＦＰと融合させた逆配向のＲＸ３アセンブラーペプチド（ｉＲＸ３−ＥＣＦＰ）をコードする構築物を浸潤させたところ、大型の丸い形状のＲＰＢＬＡが見られた。驚くことに、誘導されたＲＰＢＬＡのサイズは、参照として用いたＲＸ３−ＥＣＦＰ融合タンパク質の発現により得られた対応するＲＰＢＬＡよりも有意に大きかった（図１８Ｂ）。ＲＸ３−ＥＣＦＰおよびｉＲＸ３−ＥＣＦＰの平均サイズはそれぞれ約１および２．５マイクロメーターであった。
【０３０４】
ＲＰＢＬＡの高い密度と強固さは、遠心分離による、残りの細胞オルガネラおよび可溶性タンパク質からの効率的な単離を可能とすることから（米国特許出願公開第２００６／０１２３５０９号）、ｉＲＸ３−ＥＣＦＰ  ＲＰＢＬＡの密度を多段階Ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配により測定した。ｉＲＸ３−ＥＣＦＰおよびＲＸ３−ＥＣＦＰの発現により誘導された密度勾配によるＲＰＢＬＡ分布を比較したところ、有意な違いは示されなかった。どちらの場合も、大多数のＲＰＢＬＡが浸潤６日後に生じ、１．１７５〜１．２６ｇ／ｃｍ３の範囲の高密度画分から回収された（図１８Ｃ、レーン４〜７）。これらの画分もまた、内因性の細胞タンパク質をほとんど含んでない。
【０３０５】
目的タンパク質（ＥＣＦＰ）に対するアセンブラーペプチド（ＲＸ３およびｉＲＸ３）の相対的位置の重要性も分析した。ＥＣＦＰのＣ末端にＲＸ３またはｉＲＸ３アセンブラーペプチドをクローニングすることにより、さらに２つの構築物を作出した（図１８、ＥＣＦＰ−ＲＸ３およびＥＣＦＰ−ｉＲＸ３）。これらの融合タンパク質を発現するタバコ葉はＲＰＢＬＡを誘導することができたが、対応するＮ末端融合タンパク質（ＲＸ３−ＥＣＦＰおよびｉＲＸ３−ＥＣＦＰ）よりも有効性が低かった。図１８Ｂにおいて、共焦画像は、ＥＣＦＰ−ＲＸ３およびＥＣＦＰ−ｉＲＸ３が多数の小型のＲＰＢＬＡを誘導することを示し、それらのほとんどは０．５マイクロメーター前後であった。興味深いことに、サイズは小さくなったものの、ＲＰＢＬＡは、密度画分１．１７５および１．２１ｇ／ｃｍ３で回収した場合（図１８Ｃ、レーン４および５）、細胞夾雑物をほとんど含んでいない。低密度画分におけるいくらかの融合タンパク質の存在（図１８Ｃ、レーン２および３）は、おそらく集合速度が遅かったために完全なＲＰＢＬＡに集合しなかった融合タンパク質に相当する。また、目的タンパク質のＣ末端に連結されたアセンブラーペプチドを有する融合タンパク質の発現により誘導されたＲＰＢＬＡが遠心分離により単離可能であると結論付けることもできる。
【０３０６】
実施例１９：ＣＨＯ細胞のｈＧＨ−Ｉ−ＲＸ３、ＤｓＲＥＤ−Ｉ−ＲＸ３およびＥＫ−ＲＸ３におけるＲＰＢＬＡの蓄積
ＰＯＩのＣ末端に融合されたＰＢＩＳがＣＨＯ細胞においてＲＰＢＬＡの形成をし得ることを証明するために、以下の融合タンパク質：（ｉ）ｈＧＨ−Ｉ−ＲＸ３、（ｉｉ）ＥＫ−ＲＸ３、および（ｉｉｉ）ＤｓＲＥＤ−Ｉ−ＲＸ３を発現する３つの構築物を作出した（図１９参照）。３つの場合の総てで、ＣＨＯ細胞のトランスフェクション後、細胞内スポットの特徴的なパターンを観察したところ、対応する融合タンパク質が細胞内のＲＰＢＬＡに保持されたことが証明された（図１９ＡおよびＢ）。図１９Ａにおいて明らかに見て取れるＲＰＢＬＡサイズの不均一性は、ＲＰＢＬＡ形成段階の違い、またはトランスフェクション効率の違いおよびその結果としての融合タンパク質発現レベルの違いに関連するものであり得る。
【０３０７】
タンパク顆粒内の融合タンパク質集合の強固さを間接的に特徴付けるための技術的アプローチは、ステップクッションスクロース勾配によるＲＰＢＬＡ密度の決定である。従って、ＣＨＯ細胞においてｈＧＨ−Ｉ−ＲＸ３の発現により誘導されたＲＰＢＬＡを、以下のスクロースステップクッション勾配の上にのせた。
【０３０８】
【表７】
2013532960.tif 000026
【０３０９】
密度勾配から回収された等容量の種々の画分をウエスタンブロットにより分析したところ、添加した融合タンパク質（図１９Ａ、レーンＨ）の大部分が高密度画分に回収されたことが示された（図１９Ａ、レーンＦ４２およびＦ５６）。集合していない少量の融合タンパク質も、おそらく集合速度が遅かったために、ＳおよびＦ２７画分に見られた。高密度ＲＰＢＬＡは一般に１．２ｇ／ｍＬ前後の密度を有する画分から回収されるので、ＲＰＢＬＡはタンパク質のＣ末端にＲＸ３ドメインを有する融合タンパク質によって誘導され得ると結論付けることができる。
【０３１０】
実施例２０：ＳＦ９昆虫細胞におけるｈＧＨ−Ｉ−ＲＸ３のＲＰＢＬＡにおける蓄積
タンパク質のＣ末端にＲＸ３アセンブラーペプチドを有する融合タンパク質は昆虫細においてＲＰＢＬＡを誘導することができるという証明をｈＧＨ−Ｉ−ＲＸ３を用いて行った。ｈＧＨ−Ｉ−ＲＸ３を発現するｐＢａｃＰＡＫ８組換えウイルスに感染させた昆虫細胞は、ＲＰＢＬＡ蓄積の特徴的な免疫蛍光パターンを示した（図１９Ｃ）。細胞に均一に分布したスポットはＲＰＢＬＡに相当し、融合タンパク質がＥＲに効率的に保持されることを示した。ｈＧＨ−Ｉ−ＲＸ３を発現するＳＦ９細胞をホモジネートし、低速で遠心分離し（３０００ｘｇ）、大きな割合の融合タンパク質がＲＰＢＬＡ画分に回収された（図１９Ｃ、右のパネル、レーン３）。Ｎ末端ＲＸ３融合タンパク質で見られたように（米国特許出願公開第２００６／０１２３５０９号公報）、ＲＸ３：ＲＸ３相互作用によって誘導された高密度オルガネラ（ＲＰＢＬＡ）における強固な集合は、ＲＰＢＬＡに著しく富化された画分の効率的な回収を可能とする。
【０３１１】
実施例２１：哺乳類細胞におけるＲＰＢＬＡの蓄積
以下のタンパク質をコードする配列を、キシラナーゼをコードする配列と融合させ、哺乳類細胞で発現させるためにベクターｐｃＤＮＡ３．１(Invitrogen)にクローニングした：ＲＸ３、ＲＸ３（Ａ）、ＲＸ３（Ｌ）、ＲＸ３（Ａ３）、ＲＸ３（Ｅ）、ＲＸ３（Ｄ）、ＲＸ３（Ｔ）、ＲＸ３（Ｎ）、ＲＸ３（Ｑ）、ＰＰ、ＰＡ、ＲＸ３Ｃ６４Ｇ、ＲＸ３Ｃ８２Ｇ、ＲＸ３Ｃ８４Ｇ、ＲＸ３Ｃ９２Ｇ、ＰＰ２、Ｒ８（Ｃ４）、Ｒ７（Ｃ４）、Ｒ６（Ｃ４）、Ｒ４（Ｃ４）、Ｚ（Ａｄｈ）、Ｚ（Ａｄｈ）Ｐｘ、Ｚ（Ｃｏｌ）、Ｚ（Ｃｏｌ）ＰｘおよびｉＲＸ３。得られたベクターを、リポフェクタミンに基づくトランスフェクション法(Invitrogen)を用いて２９３Ｔ、Ｃｏｓ１およびＣＨＯ細胞に導入した。
【０３１２】
トランスフェクト細胞のウエスタンブロットは、総ての融合タンパク質の蓄積を示す。さらに、免疫細胞化学による融合タンパク質の局在は、融合タンパク質が直径約０．５〜約３ミクロンの球形ＲＰＢＬＡに蓄積することを示す。ＲＰＢＬＡの密度は、スクロースステップクッションにのせることによって測定し、約１．１〜約１．４ｇ／ｍＬである。これらのＲＰＢＬＡを、低速遠心分離（約５０００ｘｇ未満）を用いて精製し、回収されたＲＰＢＬＡは少なくとも約９５％の純度であった。ＲＰＢＬＡは、穏和な緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、５ｍＭ  ＴＣＥＰおよび１０ｍＭ  ２ｂＭＥ）中で約４時間インキュベートした後、約１６，０００ｇで約１０分間遠心分離を行うことによって可溶化する。可溶化部分のタンパク質は高収量で回収される。キシラナーゼ活性は合成基質（ＤｉＦＭＵＸ２）を用いて測定し、高い活性レベルが見られる。
【０３１３】
実施例２２：昆虫細胞におけるＲＰＢＬＡの蓄積
以下のタンパク質をコードする配列を、キシラナーゼをコードする配列と融合させ、ｐＦａｓｔＢＡｃｋバキュロウイルス発現ベクター系(Invitrogen)にクローニングする：ＲＸ３、ＲＸ３（Ａ）、ＲＸ３（Ｌ）、ＲＸ３（Ａ３）、ＲＸ３（Ｅ）、ＲＸ３（Ｄ）、ＲＸ３（Ｔ）、ＲＸ３（Ｎ）、ＲＸ３（Ｑ）、ＰＰ、ＰＡ、ＲＸ３Ｃ６４Ｇ、ＲＸ３Ｃ８２Ｇ、ＲＸ３Ｃ８４Ｇ、ＲＸ３Ｃ９２Ｇ、ＰＰ２、Ｒ８（Ｃ４）、Ｒ７（Ｃ４）、Ｒ６（Ｃ４）、Ｒ４（Ｃ４）、Ｚ（Ａｄｈ）、Ｚ（Ａｄｈ）Ｐｘ、Ｚ（Ｃｏｌ）、Ｚ（Ｃｏｌ）ＰｘおよびｉＲＸ３。組換えウイルスを、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄトランスフェクションキット（PharMingen, San Diego, California, USA）を用いて生産する。Ｓｆ９細胞を培養ディッシュの底に接着させ、１５分〜１時間のインキュベーションの後、これらの培養物にウイルス原液を添加し、加湿空気中、２７℃で約３０〜約３６時間維持する。
【０３１４】
感染細胞のウエスタンブロットは、総ての融合タンパク質の蓄積を示す。さらに、免疫細胞化学による融合タンパク質の局在は、それらの融合タンパク質が直径約０．５〜約３ミクロンの球形ＲＰＢＬＡに蓄積することを示す。ＲＰＢＬＡの密度は、スクロースステップクッションにのせることによって測定し、約１．１〜約１．４ｇ／ｍＬである。これらのＲＰＢＬＡを、低速遠心分離（約５０００ｘｇ未満）を用いて精製し、回収されたＲＰＢＬＡは少なくとも約９５％の純度である。ＲＰＢＬＡは、穏和な緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、５ｍＭ  ＴＣＥＰおよび１０ｍＭ  ２ｂＭＥ）中で約４時間インキュベートした後、約１６，０００ｇで約１０分間遠心分離を行うことによって可溶化する。可溶化部分のタンパク質は高収量で回収される。キシラナーゼ活性は合成基質（ＤｉＦＭＵＸ２）を用いて測定し、高い活性レベルが見られる。
【０３１５】
実施例２３：糸状菌細胞におけるＲＰＢＬＡの蓄積
以下のタンパク質をコードする配列を、キシラナーゼをコードする配列と融合させ、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)発現ベクターにクローニングし、Ｔ．リーゼイＲｕｔＣ−３０株[Montenecourt BS, Eveleigh DE: Selective screening methods for the isolation of high yielding cellulase mutants of Trichoderma reesei. Adv Chem Ser 1979, 181 :289-301]に、本質的に記載のとおりに[Penttila M, Nevalainen H, Ratto M, Salminen E, Knowles J: A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 1987, 61:155-164]導入した：ＲＸ３、ＲＸ３（Ａ）、ＲＸ３（Ｌ）、ＲＸ３（Ａ３）、ＲＸ３（Ｅ）、ＲＸ３（Ｄ）、ＲＸ３（Ｔ）、ＲＸ３（Ｎ）、ＲＸ３（Ｑ）、ＰＰ、ＰＡ、ＲＸ３Ｃ６４Ｇ、ＲＸ３Ｃ８２Ｇ、ＲＸ３Ｃ８４Ｇ、ＲＸ３Ｃ９２Ｇ、ＰＰ２、Ｒ８（Ｃ４）、Ｒ７（Ｃ４）、Ｒ６（Ｃ４）、Ｒ４（Ｃ４）、Ｚ（Ａｄｈ）、Ｚ（Ａｄｈ）Ｐｘ、Ｚ（Ｃｏｌ）、Ｚ（Ｃｏｌ）ＰｘおよびｉＲＸ３。形質転換体は１２５μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含有するプレートで選択する。これらの形質転換体を、誘導発現のためにラクトースを含有する選択培地に画線塗布し、蛍光顕微鏡によりスクリーニングする。最高量の融合タンパク質を産生する形質転換体からの菌糸を濾過により採取する。
【０３１６】
形質転換菌糸細胞のウエスタンブロットは、総ての融合タンパク質の蓄積を示す。さらに、免疫細胞化学による融合タンパク質の局在は、それらの融合タンパク質が直径約０．５〜約３ミクロンの球形ＲＰＢＬＡに蓄積することを示す。ＲＰＢＬＡの密度は、Ｏｐｔｉｐｒｅｐステップクッションにのせることによって測定し、約１．１〜約１．４ｇ／ｍＬである。これらのＲＰＢＬＡを、低速遠心分離（約５０００ｘｇ未満）を用いて精製し、回収されたＲＰＢＬＡは少なくとも約９５％の純度である。ＲＰＢＬＡは、穏和な緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、５ｍＭ  ＴＣＥＰおよび１０ｍＭ  ２ｂＭＥ）中で約４時間インキュベートした後、約１６，０００ｇで約１０分間遠心分離を行うことによって可溶化する。可溶化部分のタンパク質は高収量で回収される。キシラナーゼ活性は合成基質（ＤｉＦＭＵＸ２）を用いて測定し、高い活性レベルが見られる。
【０３１７】
実施例２４：本発明によるＰＢＩＳを用いて得られたＲＰＢＬＡの特性の概要
ＲＸ３、ＲＸ３（Ｅ）、ＲＸ３（Ｄ）、ＲＸ３（Ｑ）、ＲＸ３（Ｎ）、ＲＸ３（Ｔ）、ＲＸ３（Ａ）、ＲＸ３（Ａ３）、ＲＸ３（Ｌ）、ＰＡ、ＰＰおよびｉＲＸ３  ＰＢＩＳおよびＥＣＦＰ（ｉＲＸ３  ＰＢＩＳを用いる場合には、融合タンパク質をＥＣＦＰに対して両配向のＰＢＩＳを用いて構築した）の融合タンパク質を発現する対応する構築物を浸潤させたタバコ植物体から調製したＲＰＢＬＡの直径および密度を上記で説明した通りに測定した。結果を表９に示す。
【０３１８】
【表８】
2013532960.tif 000027
【０３１９】
実施例２５：非アレルゲン性ＰＢＩＳの構築
プロラミンタンパク質およびプロラミン由来のペプチドはアレルゲン性であり得る。興味深いことに、ＲＸ３ペプチドの推定アレルゲン性を、The Food Allergy Research and Resource Program（ＦＡＲＲＰ）によって開発された、アレルゲンオンラインデータベース（バージョン１０．０、２０１０年１月、http://www.allergenonline.com）によって分析したところ、アレルゲン性ペプチドと３５％を越える同一性を有する１０件が見つかった。この結果は、野生型ＲＸ３がアレルゲン能を有することを示唆する。このペプチドの低アレルゲン性または非アレルゲン性バージョンはいくつかの適用（すなわち、栄養用途）に有用である。従って、本出願に記載されるＲＸ３ペプチドの種々の変異体を用いて同じ分析を行ったところ、それらの結果は、ＰＡおよびＲＸ３（Ａ３）が野生型ＲＸ３よりも有意にアレルゲン性が低いことを示した。アレルゲンオンラインデータベースでのＰＡおよびＲＸ３（Ａ３）の配列分析は、アレルゲン性ペプチドと３５％を超える同一性を有するヒットをそれぞれ３つおよび２つだけ示した。これらの所見に基づき、ＲＸ３アセンブラーペプチドのいくつかの新たな非アレルゲン性バージョンを合成した：ＲＸ３（ＬＡ１）（配列番号１１０）およびＲＸ３（ＬＡ２）（配列番号１１１）。これらの２つのペプチドに、アレルゲン性ペプチドと３５％を超える同一性を有するヒットはなく、それらにアレルゲン性がないことを示唆する。ＲＸ３（ＬＡ１）およびＲＸ３（ＬＡ２）とＧＦＰおよびＥＣＦＰとの融合タンパク質をタバコ葉で発現させたが、それらのＲＰＢＬＡ誘導能に影響はない。
ＲＸ３−ＬＡ１（配列番号６０）
【化１６】
2013532960.tif 000028
ＲＸ３−ＬＡ２（配列番号６１）
【化１７】
2013532960.tif 000029
【０３２０】
特に、Ｒ８（４Ｃ）にはアレルゲン性ペプチドと３５％を越える同一性を有するヒットはなく、それらに全くアレルゲン性がないことを示唆する。この結果は、ＲＸ３のアレルゲン性が主としてＰｒｏ−Ｘドメインのアミノ酸配列によることを示唆する。アセンブラーペプチドにおいて推定されるアレルゲン性作用を避けるために、いくつかの非アレルゲン性Ｒ８（４Ｃ）変異体を合成したところ、タバコ植物体におけるＲＰＢＬＡ誘導を首尾よく試験することができた。
【０３２１】
詳細な説明の節は特許請求の範囲を説明するために用いられることが意図されるが、概要および要約の節はそうではないと理解すべきである。概要および要約の節は、本発明者らが検討する本発明の１以上の例示的実施形態を示し得るが、総てを示すものではなく、従って、本発明および添付の特許請求の範囲を何ら限定するものではない。
【０３２２】
本発明は、特定の機能およびその関連する実施形態を例示する機能的構成ブロックを活用して上記に記載した。これらの機能的構成ブロックの境界は、記載に便利なように本明細書において任意に規定した。特定の機能およびその関係が適宜遂行される限り、別の境界を規定することができる。
【０３２３】
上記の特定の実施形態の記載は本発明の一般的性質を十分に明らかにしているので、他者は当業者の範囲内の知識を適用することで、本発明の一般的概念から逸脱することなく、過度な実験を行わずに、このような特定の実施形態の種々の適用に合わせて容易に改変し、かつ／または適合させることができる。従って、このような適合および改変も、本明細書に示される教示および指針に基づき、開示されている実施形態の均等物の意味および範囲内にあるものとする。本明細書の術語または用語は限定ではなく説明を目的とするものであり、従って、本明細書の用語または術語は教示および指針を鑑みて当業者により解釈されるべきであると理解される。
【０３２４】
本発明の広さおよび範囲は上記の例示的実施形態のいずれかによって限定されるものではなく、下記の特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ規定されるべきである。
【０３２５】
本出願の特許請求の範囲は、親出願または他の関連出願の特許請求の範囲とは異なる。従って、本出願人らは本出願に関する親出願またはいずれかの前権利者出願においてなされた特許請求の範囲のいずれの放棄も無効にする。従って、審査官から、放棄およびそれを回避するためになされた参考文献の引用を再検討する必要があるのではないかという助言があった。さらに、審査官は、本出願においてなされたいずれの放棄も親出願に読み込まれる、または読み取られるべきではないことについても気づかせている。
【図１Ａ】
2013532960.tif 000030
【図１Ｂ】
2013532960.tif 000031
【図１Ｃ】
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【図３Ａ】
2013532960.tif 000033
【図３Ｂ】
2013532960.tif 000034
【図４Ａ】
2013532960.tif 000035
【図４Ｂ】
2013532960.tif 000036
【図５Ａ】
2013532960.tif 000037
【図５Ｂ】
2013532960.tif 000038
【図５Ｃ】
2013532960.tif 000039
【図６Ａ】
2013532960.tif 000040
【図６Ｂ】
2013532960.tif 000041
【図７Ａ】
2013532960.tif 000042
【図７Ｂ】
2013532960.tif 000043
【図７Ｃ】
2013532960.tif 000044
【図８】
2013532960.tif 000045
【図９Ａ】
2013532960.tif 000046
【図９Ｂ】
2013532960.tif 000047
【図９Ｃ】
2013532960.tif 000048
【図１０Ａ】
2013532960.tif 000049
【図１０Ｂ】
2013532960.tif 000050
【図１０Ｃ】
2013532960.tif 000051
【図１１】
2013532960.tif 000052
【図１２Ａ】
2013532960.tif 000053
【図１２Ｂ】
2013532960.tif 000054
【図１２Ｃ】
2013532960.tif 000055
【図１２Ｄ】
2013532960.tif 000056
【図１３】
2013532960.tif 000057
【図１４Ａ】
2013532960.tif 000058
【図１４Ｂ】
2013532960.tif 000059
【図１５Ａ】
2013532960.tif 000060
【図１５Ｂ】
2013532960.tif 000061
【図１６Ａ】
2013532960.tif 000062
【図１６Ｂ】
2013532960.tif 000063
【図１６Ｃ】
2013532960.tif 000064
【図１７Ａ】
2013532960.tif 000065
【図１７Ｂ】
2013532960.tif 000066
【図１７Ｃ】
2013532960.tif 000067
【図１７Ｄ】
2013532960.tif 000068
【図１８Ａ】
2013532960.tif 000069
【図１８Ｂ】
2013532960.tif 000070
【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
2013532960.tif 000072
【図１９Ｂ】
2013532960.tif 000073
【図１９Ｃ】
2013532960.tif 000074
【図２】
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【配列表】
2013532960000001.app
【国際調査報告】
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2013532960.tif 000079
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