(57)【要約】本発明は、幾つかのバイオマーカーのレベルを決定することにより個体の移植寛容を決定する方法に関する。また、本発明は、バイオマーカーのレベルを検出するための試薬を含むキットに関する。また、本発明は、個体の移植寛容を決定するために使用することができる複数の遺伝子の発現レベルを検出するためのセンサーに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓器移植に対する個体の免疫寛容を決定する方法であって、前記個体から得られる試料における、ＴＬＲ５、ＰＮＯＣ、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＣＤ７９Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＨＳ３ＳＴ１、ＭＳ４Ａ１、ＦＣＲＬ１、ＳＬＣ８Ａ１、及びＦＣＲＬ２からなる群から選択される少なくとも２個の遺伝子の発現レベルを決定することを含む方法。
【請求項２】
ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＰＮＯＣ、ＣＤ７９Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＨＳ３ＳＴ１、ＭＳ４Ａ１、ＦＣＲＬ１、及びＦＣＲＬ２の発現レベルが、免疫寛容を示すとみなされる個体の正常レベルより高く、ＴＬＲ５及びＳＬＣ８Ａ１の発現レベルが、免疫寛容を示すとみなされる個体の正常レベルより低い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個体から得られる試料中の遺伝子ＴＬＲ５、ＰＮＯＣ、及びＳＨ２Ｄ１Ｂの発現レベルが決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
臓器移植に対する個体寛容の陽性予測が、ＳＨ２Ｄ１Ｂ及びＰＮＯＣの高レベル発現、及びＴＬＲ５の低レベル発現によりなされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
以下の遺伝子：ＣＤ７９Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＨＳ３ＳＴ１、ＭＳ４Ａ１、ＦＣＲＬ１、ＳＬＣ８Ａ１、及びＦＣＲＬ２の１つ又は複数の発現レベルが更に決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、Ｂ細胞及びＮＫ細胞のレベルを検出することを含み、そのような細胞のレベル上昇が、免疫寛容を示す、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｉｎｔＴ細胞のレベルを決定することを含み、総ＣＤ４＋Ｔ細胞と比べたそのような細胞のレベル低減が、免疫寛容を示す、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、ドナー特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを決定することを含み、そのような細胞のレベル低減が、免疫寛容を示す、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、ＣＤ４＋Ｔ細胞のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子発現レベルに対するＦｏｘＰ３遺伝子発現レベルの比率を決定することを含み、高い比率が免疫寛容を示す、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、ＣＤ３＋細胞に対するＣＤ１９＋の比率を決定することを含み、高い比率が免疫寛容を示す、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ベータアクチン及び／又はＨＲＰＴの発現レベルが、対照として使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＴＬＲ５、ＰＮＯＣ、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＣＤ７９Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＨＳ３ＳＴ１、ＭＳ４Ａ１、ＦＣＲＬ１、ＳＬＣ８Ａ１、及びＦＣＲＬ２からなる群から選択される少なくとも２個の遺伝子の発現レベルを検出するためのセンサー。
【請求項１３】
前記ＴＬＲ５、ＰＮＯＣ、及びＳＨ２Ｄ１Ｂ遺伝子の発現レベルを検出するセンサー。
【請求項１４】
以下の遺伝子：ＣＤ７９Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＨＳ３ＳＴ１、ＭＳ４Ａ１、ＦＣＲＬ１、ＳＬＣ８Ａ１、及びＦＣＲＬ２の１つ又は複数の発現を検出するための、請求項１３に記載
のセンサー。
【請求項１５】
ＴＬＲ５、ＰＮＯＣ、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＣＤ７９Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＨＳ３ＳＴ１、ＭＳ４Ａ１、ＦＣＲＬ１、ＳＬＣ８Ａ１、及びＦＣＲＬ２からなる群から選択される少なくとも２個の遺伝子の発現レベルを検出するための試薬を含むキット。
【請求項１６】
前記ＴＬＲ５、ＰＮＯＣ、及びＳＨ２Ｄ１Ｂ遺伝子の発現レベルを検出するための試薬を含むキット。
【請求項１７】
以下の遺伝子：ＣＤ７９Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＨＳ３ＳＴ１、ＭＳ４Ａ１、ＦＣＲＬ１、ＳＬＣ８Ａ１、及びＦＣＲＬ２の１つ又は複数の発現レベルを検出するための試薬を更に含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
ＲＴ−ＰＣＲにより前記遺伝子の遺伝子発現レベルを検出するための試薬を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幾つかのバイオマーカーのレベルを決定することにより、個体の移植寛容を決定する方法に関する。また、本発明は、バイオマーカーのレベルを検出するための試薬を含むキットに関する。また、本発明は、個体の移植寛容を決定するために使用することができる複数の遺伝子の発現レベルを検出するためのセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
移植寛容は、免疫抑制療法の持続的な非存在下で良好な同種移植片機能を安定して維持することと定義される。臨床分野において、移植寛容は、患者が、全ての免疫抑制を長期間中止したにも関わらず、安定した同種移植片機能を経験する場合にのみ明らかとなる。実効的寛容（operational tolerance）と定義されるこの状態は、腎移植術ではほとんど報告されておらず（１〜５）、肝移植においてより一般的である（６、７）。現在、腎移植の長期生存は、持続的な薬物誘導性免疫抑制に依存している。しかしながら、これには、主に心血管疾患、日和見感染、及び悪性疾患による罹患率及び死亡率の増加が伴う（８）。現在、我々は、移植に対する寛容を発生させ、したがって免疫抑制の部分的な又は完全な中止から利益を得る可能性のある患者を事前に特定するための手段を有していない。したがって、臨床医が、患者特異的な免疫学的特性に基づき免疫抑制を安全に最小限に抑えることを可能にするアッセイを開発し、バイオマーカーを特定する必要性が存在する。
【０００３】
以前の研究により、肝移植レシピエントの寛容に関するバイオマーカーが特定されている。特に、サイトカイン遺伝子多型が、小児レシピエントの集団で研究された。免疫抑制を受けなかった小児の全員及び最小限の免疫抑制を受けた小児の大多数は、維持的免疫抑制を受けた対照患者と比較して、低い腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α特性及び高い／中程度のインターロイキン（ＩＬ）−１０特性を示した（３６）。加えて、２群間の患者で樹状細胞サブセット比率に違いがあった。維持的免疫抑制を受けた患者と比較して、Ｔヘルパー（Ｔｈ）２応答を選択的に誘導することが報告されている形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ２）の循環レベルは、免疫抑制を受けないか又は最小限の免疫抑制を受けた患者において、Ｔｈ１タイプ応答を誘導する単球様樹状細胞（ｐＤＣ１）よりも高かった（３７）。
【０００４】
成人肝移植レシピエントの寛容に関するバイオマーカーを特定する更なる試みが、末梢血遺伝子発現解析及び詳細な血液細胞免疫表現型検査を使用して実施されている。γδΤ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体をコードする遺伝子並びに細胞増殖阻止に関与する遺伝子の特徴を用いて、実効的寛容患者を特定することができることが実証された（３８）。また、彼らは、上皮組織における免疫調節プロセスに関与するとされている非常に多数の循環中の潜在的制御性Ｔ細胞サブセット、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞、及びγδＴ細胞、特にＶδ１＋サブタイプを、寛容患者中に見出した。興味深いことには、この患者集団では、以前に観察された樹状細胞サブセット比率の差異を再現することができなかった。同じ研究グループは、肝移植レシピエントの末梢血中の遺伝子発現特性を研究し、免疫抑制離脱が成功した患者を、離脱プロセスを試みたが免疫抑制の再導入を必要とする急性拒絶に至った患者及び健常対照と比較している（３９）。彼らは、寛容同種移植片肝臓レシピエントと非寛容肝臓同種移植片レシピエントと健常非移植対照とを区別する少数の遺伝子（２〜７個）を含む３つの別個の遺伝子特徴を特定した。実効的寛容に関するこのゲノムフットプリントは、２３人の追加肝移植レシピエントの独立集団で検証されており、ＮＫ、ＣＤ８＋、及びγδＴ細胞により発現される様々な細胞表面受容体をコードする遺伝子を上方制御することを主な特徴とする。末梢血中の推定制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋、γδＴＣＲ＋、及びδ１ＴＣＲ＋Ｔ細胞）の増殖が以前に観察されているが、それは、この新しい群の寛容レシピエントで再現された。まとめる
と、末梢血の転写解析とフローサイトメトリーとを組み合わせると、薬理学的免疫抑制の非存在下で同種移植片を受容することができる肝移植レシピエントを特定することができると考えられる。
【０００５】
Ｓｏｕｌｉｌｌｏｕらは、５人の実効的寛容腎移植レシピエントのＴＣＲレパートリーを分析し、これら患者では、ＴＣＲ  Ｖβ鎖の使用頻度に偏りがあり、それは主にＣＤ８＋サブセットで観察されることを実証した。また、これら細胞は、サイトカイン転写物（ＩＬ１０、ＩＬ２、ＩＬ１３、ＩＦＮ−γ）の減少を特徴としており、低反応性の状態であることを示唆した（４０）。更に、寛容患者では、循環中のＣＤ８＋ＣＤ２８−エフェクターリンパ球が、慢性同種移植片拒絶反応を示す患者と比較して著しくより少数であり、これら患者における細胞毒性の抑制が示唆された（Baeten et al, 2005 (45)）。その後、同じ研究グループは、発現アレイを使用して、実効的寛容腎移植レシピエントを、急性及び慢性同種移植片拒絶反応を示す患者及び健常年齢一致志願者と、特異性高く正確に区別することができる３３個の遺伝子のセットを特定した（４１）。初期及び後期Ｔ細胞活性化の同時刺激遺伝子及びマーカーの発現は、対照と比較して寛容患者では低減され、抗炎症性サイトカイン形質転換増殖因子−β（ＴＧＦβ）の発現は、寛容患者では上方制御されなかったが、多くのＴＧＦβ調節遺伝子は上方制御された。
【０００６】
同じ研究グループは、８人の実効的寛容腎同種移植片レシピエント群の血液細胞表現型及び転写パターンを分析し、循環中Ｂ細胞及び制御性Ｔ細胞（ＣＤ２５ｈｉＣＤ４＋）の絶対数が、慢性拒絶反応を示す対照患者群と比較してより多いこと、慢性拒絶反応を示すレシピエントのＦＯＸＰ３転写レベルが著しく減少することを実証した（４２）。興味深いことには、この研究では、臨床的寛容患者の血液細胞表現型が、健常個体の表現型と異なっておらず、実効的寛容は、制御性Ｔ細胞の貯留増加によるものではなく、慢性拒絶反応を示す患者に欠如している天然状態の維持によるものである可能性が示唆された。対照的に、異なる研究グループは、慢性拒絶反応を示す患者、透析患者、及び健常対照と比較して、長期的に安定した腎移植レシピエントではＴＣＲ−Ｖβレパートリーがより可変性であり、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈの割合がより高いことを報告しており、そのうちの２人は免疫抑制を受けてなかった（４３）。
【０００７】
Brouard et al., 2007 （４１）では、訓練セットで９０％の最大感度を得る４９個の遺伝子のセットが使用されている。大部分が異なる３３個の遺伝子のセットにより、個体は、寛容患者又は慢性拒絶患者に分類されると言われている。ＭＳ４Ａ１は、ＣＤ２０としても知られている分子であり、Ｂリンパ球の表面に発現される。この分子は、Brouard et al, 2007（４１）の論文に記載の両遺伝子セットに、つまり３３個の遺伝子セット及び４９個の遺伝子セットの両方に存在する。更に、Louyet et al, 2005（４４）は、ＭＳ４Ａ１を、ラット動物モデルにおける移植片の寛容と関連するマーカーであると特定した。
【０００８】
臓器移植に対する個体の寛容を効果的に決定するための改良方法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、腎臓器移植に対する個体の免疫寛容を決定する方法であって、個体から得られる試料における、ＴＬＲ５、ＰＮＯＣ、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＣＤ７９Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＨＳ３ＳＴ１、ＭＳ４Ａ１、ＦＣＲＬ１、ＳＬＣ８Ａ１、及びＦＣＲＬ２からなる群から選択される少なくとも２個の遺伝子の発現レベルを決定することを含む方法を提供する。
【００１０】
上記で示した決定を行うことにより、個体が臓器移植に対して免疫学的に寛容であるか否かを、高特異性で高感度に決定することが可能であることが見出された。特異性は、本
方法において非寛容と特定された真の陰性（非寛容である個体）の割合として定義される。感度は、本方法において寛容と特定された真の陽性（寛容である個体）の割合として定義される。本方法は、ほんの少数のバイオマーカー（つまり、遺伝子発現レベル）を測定するだけで比較的容易に実施することができる高度に正確な検査を提供する。したがって、臓器移植に対する個体の寛容に関する簡便で効果的な検査が提供される。
【００１１】
用語「免疫寛容」は、当業者に公知であり、免疫抑制療法の持続的な非存在下で良好な同種移植片機能を安定して維持することを指し、臨床分野では、長期間、例えば少なくとも１年間にわたって全ての免疫抑制を中止したにも関わらず、患者が安定した同種移植片機能を経験する場合にのみ明らかになる。
【００１２】
本発明の方法を使用して、腎移植に対する個体の寛容を決定することができる。
【００１３】
移植臓器に寛容な個体では、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＰＮＯＣ、ＣＤ７９Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＨＳ３ＳＴ１、ＭＳ４Ａ１、ＦＣＲＬ１、及びＦＣＲＬ２の発現レベルが上昇し、ＴＬＲ５及びＳＬＣ８Ａｌの発現レベルが低下することが見出された。
【００１４】
上記遺伝子の任意の組み合わせを使用して、臓器移植に対する個体の寛容を決定することができる。１０個の遺伝子全てをそのような決定を行うことに使用することができるが、好ましくは、２、３、４、又は５個の遺伝子のみが、そのような決定をなすことに使用され、より好ましくは、３個の遺伝子のみが、そのような決定をなすことに使用される。
【００１５】
本発明の方法は、個体から得られる試料における、遺伝子ＴＬＲ５、ＰＮＯＣ、及びＳＨ２Ｄ１Ｂの発現レベルを決定することを含むことが特に好ましい。臓器移植に対する個体の寛容の陽性予測は、ＳＨ２Ｄ１Ｂ及びＰＮＯＣの高レベル発現、及びＴＬＲ５の低レベル発現によりもたらされる。当業者であれば理解するだろうが、本発明の方法は、以下の遺伝子ＣＤ７９Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＨＳ３ＳＴ１、ＭＳ４Ａ１、ＦＣＲＬ１、ＳＬＣ８Ａ１、及びＦＣＲＬ２の１つ又は複数の発現レベルを決定することを更に含んでいてもよい。
【００１６】
本発明の方法は、１つ又は複数の好適な対照の発現レベルを決定することを更に含んでいてもよい。好適な対照には、ＨＰＲＴ、ベータアクチン、及びベータ２ミクログロブリンが含まれる。対照のレベルは、寛容である個体と非寛容である個体との間で著しく異なるべきではない。
【００１７】
本発明の特に好ましい実施形態では、個体が寛容である確率（Ｐ−Ｔｏｌ）は、下記式により決定される：Ｐ−Ｔｏｌ＝ｅｚ／（ｅｚ＋１）
式中、Ｚ＝−４．４３４７＋２．７１９１＊［ＳＨ２ＤＢ１］−４．１９８７３３＊［ＴＬＲ５］＋３．３００６２０＊［ＰＮＯＣ］であり、０．１１を超えるＰ−Ｔｏｌスコアは、個体が寛容であること示す。
【００１８】
この式は、マイクロアレイ解析を使用して決定された遺伝子発現レベルに適用されるように設計されている。他の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲを使用して遺伝子発現レベルを決定する場合、この式を修正する必要がある場合がある。特に、本発明の特に好ましい実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲを使用して本方法を実施する場合、個体が寛容である確率（Ｐ−Ｔｏｌ）は、下記式により決定される：Ｐ−Ｔｏｌ＝ｅｚ／（ｅｚ＋１）、式中
Ｚ＝−１４．４５７＋９４．１５６＊［ＰＮＯＣ］＋６．２８９＊［ＳＨ２ＤＢ１］＋５．０５４＊［ＴＬＲ５］−１．５２３＊［ＰＮＯＣ］＊［ＳＨ２ＤＢ１］−５１．５８４＊［ＰＮＯＣ］＊［ＴＬＲ５］−２．３３９＊［ＳＨ２ＤＢｌ］＊［ＴＬＲ５］であり、０．０６０２を超えるＰ−Ｔｏｌスコアは、個体が寛容であることを示す。
【００１９】
各遺伝子の発現は２−ｄＣＴとして表され、ｄＣＴは、  各遺伝子と対照遺伝子とのＣＴの差として計算される。
【００２０】
実質的に同一の確率尺度を提供する他の式を使用してもよい。そのような代替式は、当業者であれば明らかであり、容易に計算することができる。
【００２１】
本発明の方法は、Ｂ細胞及びＮＫ細胞のレベルを決定することを更に含んでいてもよい。Ｂ細胞及びＮＫ細胞のレベルを更に決定することにより、本方法の特異性及び感度を更に向上させることができる。特に、移植臓器に寛容な個体では、Ｂ細胞及びＮＫ細胞の両方のレベルが上昇することが見出された。
【００２２】
本発明の方法は、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｉｎｔＴ細胞のレベルを決定することを更に含んでいてもよい。ＣＤ４＋ＣＤ２５ｉｎｔＴ細胞のレベルを更に決定することにより、本方法の特異性及び感度を更に向上させることができる。特に、移植臓器に寛容な個体では、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｉｎｔＴ細胞のレベルが、総ＣＤ４＋Ｔ細胞と比べて低下することが見出された。
【００２３】
本発明の方法は、ドナー特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを決定することを更に含んでいてもよい。ドナー特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルは、下述のようにインターフェロン（inteferon）ガンマＥＬＩＳＰｏｔアッセイを使用して決定することができる。ドナー特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを更に決定することにより、本方法の特異性及び感度を更に向上させることができる。ドナー特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを測定することにより、ドナー臓器に対する個体の応答を決定することができる。特に、移植臓器に寛容な個体では、そのような応答のレベル（つまり、ドナー特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベル）が低下することが見出された。
【００２４】
本発明の方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子発現レベルに対するＦｏｘＰ３遺伝子発現レベルの比率を決定することを更に含んでいてもよい。ＣＤ４＋Ｔ細胞のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子発現レベルに対するＦｏｘＰ３遺伝子発現レベルの比率を更に決定することにより、本方法の特異性及び感度を更に向上させることができる。特に、移植臓器に寛容な個体では、この比率が増加することが見出された。
【００２５】
本発明の方法は、ＣＤ３＋細胞に対するＣＤ１９＋の比率を決定することを更に含んでいてもよい。ＣＤ３＋細胞に対するＣＤ１９＋の比率を更に決定することにより、本方法の特異性及び感度を更に向上させることができる。特に、移植臓器に寛容な個体では、この比率が増加することが見出された。
【００２６】
本方法は、個体から得られる試料で実施される。試料は、上記で言及されたマーカーを測定することが可能であるあらゆる好適な試料であってもよい。好ましくは、試料は、血液、血清、若しくは他の血液画分、尿、又は移植片生検試料である。最も好ましくは、試料は、末梢血試料である。
【００２７】
ＳＨ２Ｄ１Ｂ（タンパク質１Ｂを含有するＳＨ２ドメイン）は、当業者に周知の標準的用語である。特に、ＳＨ２Ｄ１Ｂの多形ヒト型の配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースの受入番号ＧＩ：４２７４４５７２、バージョンＡＡＨ６６５９５．１；受入番号ＧＩ：５４７９２７４５、バージョンＮＰ＿４４４５１２．２；受入番号ＧＩ：１８４９０４０９、バージョンＡＡＨ２２４０７．１；及び受入番号Ｇｌ：５５９６０２９７、バージョンＣＡＩ１５７８０．１に示されている。
【００２８】
ＴＬＲ５（トール様受容体５タンパク質）は、当業者に周知の標準的用語である。特に、ＮＣＢＩタンパク質データベースに示されているＴＬＲ５の多形ヒト型の幾つかの例示的な配列は、受入番号ＧＩ：８０４７８９５４、バージョンＡＡＩ０９１１９．１；受入番号ＧＩ：８０４７５０５２、バージョンＡＡＩ０９１２０．１；受入番号ＧＩ：１３８１０５６８、バージョンＢＡＢ４３９５５．１；及び受入番号ＧＩ：２２２８７５７８０、バージョンＡＣＭ６９０３４．１である。
【００２９】
ＰＮＯＣ（ノシセプチン）は、当業者に周知の標準的用語である。特に、ＰＮＯＣの多形ヒト型の配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースの受入番号ＧＩ：４９４５６８８５、バージョンＣＡＧ４６７６３．１；及び受入番号ＧＩ：４９４５６８３５、バージョンＣＡＧ４６７３８．１に示されている。
【００３０】
ＣＤ７９Ｂ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質ベータ鎖）は、当業者に周知の標準的用語である。特に、ＣＢ７９Ｂの多形ヒト型の配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースの受入番号ＧＩ：１０８７００９、バージョンＡＡＣ６０６５４．１；及び受入番号ＧＩ：２０９８７６２０、バージョンＡＡＨ３０２１０．１に示されている。
【００３１】
ＴＣＬ１Ａ（Ｔ細胞白血病リンパ腫１Ａ）は、当業者に周知の標準的用語である。特に、ＴＣＬ１Ａの多形ヒト型の配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースの受入番号ＧＩ：４８１４５７０９、バージョンＣＡＧ３３０７７．１；受入番号ＧＩ：１４８９２２８７９、バージョンＮＰ＿００１０９２１９５．１；受入番号ＧＩ：１１４１５０２８、バージョンＮＰ＿０６８８０１．ｌ；受入番号ＧＩ：１３０９７７５０、バージョンＡＡＨ０３５７４．１；受入番号ＧＩ：４６２５５８２１、バージョンＡＡＨ１４０２４．１；及び受入番号ＧＩ：１３５４３３３４、バージョンＡＡＨ０５８３１．１に示されている。
【００３２】
ＨＳ３ＳＴ１（ヘパラン硫酸（グルコサミン）３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ１）は、当業者に周知の標準的用語である。特に、ＨＳ３ＳＴ１の多形ヒト型の配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースの受入番号ＧＩ：１１６２８３７０６、バージョンＡＡＨ２５７３５．１；及び受入番号ＧＩ：３４７８５９４３、バージョンＡＡＨ５７８０３．１に示されている。
【００３３】
ＭＳ４Ａ１（膜貫通４ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１；Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０）は、当業者に周知の標準的用語である。特に、ＭＳ４Ａ１の多形ヒト型の配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースの受入番号ＧＩ：２３ｌ１０９８９、バージョンＮＰ＿６９０６０５．ｌ；受入番号ＧＩ：２３１１０９８７、バージョンＮＰ＿０６８７６９．２；及び受入番号ＧＩ：１２８０３９２１、バージョンＡＡＨ０２８０７．１に示されている。
【００３４】
ＦＣＲＬ１（本明細書ではＴＨＣ２４３８９３６とも呼ばれる）（Ｆｃ受容体様タンパク質１（ＦＣＲＬ１）遺伝子の３’付近）は、当業者に周知の標準的用語である。特に、ＮＣＢＩタンパク質データベースに示されているＦＣＲＬ１の多形ヒト型の幾つかの例示的な配列は、受入番号ＧＩ：５５６６２４５４、バージョンＣＡＨ７３０５３．１；受入番号ＧＩ：５５６６１５１３、バージョンＣＡＨ７０２３４．１；受入番号ＧＩ：５５６６１５１１、バージョンＣＡＨ７０２３２．１；受入番号ＧＩ：２１７０７３０３、バージョンＡＡＨ３３６９０．１；及び受入番号ＧＩ：１１７６０６５２０、バージョンＡＢＫ４１９１７．１である。
【００３５】
ＳＬＣ８Ａ１（溶質輸送体ファミリー８（ナトリウム／カルシウム交換体）、メンバー１）は、当業者に周知の標準的用語である。特に、ＳＬＣ８Ａ１の多形ヒト型の配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースの受入番号ＧＩ：６８０８７００８、バージョンＡＡＨ
９８２８５．１；及び受入番号ＧＩ：６７５１４２４２、バージョンＡＡＨ９８３０８．１に示されている。
【００３６】
ＦＣＲＬ２（Ｆｃ受容体様タンパク質２）は、当業者に周知の標準的用語である。特に、ＮＣＢＩタンパク質データベースに示されているＦＣＲＬ２の多形ヒト型の幾つかの例示的な配列は、受入番号ＧＩ：５５６６２４６４、バージョンＣＡＨ７３０６３．１；受入番号ＧＩ；５５６６２４６１、バージョンＣＡＨ７３０６０．１；受入番号ＧＩ：４６６２３０４２、バージョンＡＡＨ６９１８５．１；及び受入番号ＧＩ：１１７６０６５１８、バージョンＡＢＫ４１９１６．１である。
【００３７】
ＦｏｘＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）は、当業者に周知の標準的用語である。特に、ＦｏｘＰ３の多形ヒト型の配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースの受入番号ＧＩ：１４６２６２３９１、バージョン番号ＡＢＱ１５２１０．１；受入番号ＧＩ：２１９５１８９２１、バージョンＡＡＩ４３７８７．１；受入番号ＧＩ；２１９５１７９９６、バージョンＡＡＩ４３７８６．１；受入番号ＧＩ：１０９７３１６７８、バージョンΑΑＩ１３４０４．１；受入番号ＧＩ：１０９７３０４５９、バージョンＡＡＩ１３４０２．１；受入番号ＧＩ：６３０２８４４１、バージョンＡＡＹ２７０８８．１に示されている。
【００３８】
１，２−アルファマンノシダーゼは、当業者に周知の標準的用語である。特に、この用語は、１，２−アルファマンノシダーゼＡ１型を指す。ヒト型の１，２−アルファマンノシダーゼの配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースの受入番号ＧＩ：２４４９７５１９、バージョン番号ＮＰ＿００５８９８．２に示されている。
【００３９】
疑念を避けるために、上記で言及されたマーカーの特定の配列は、本出願の優先日においてデータベースに存在するバージョンに関して定義されている。マーカーの特定の配列は、例示である。当業者であれば、ヒト集団には多形変異体が存在することを理解するだろう。
【００４０】
遺伝子の発現レベルを決定するには、ノーザンブロッティング、ｍＲＮＡマイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ法、ディファレンシャルディスプレイ、ＲＮＡ干渉、レポーター遺伝子解析、及び遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）のようなタグに基づく技術を含む多数の方法が存在する。そのような方法は、当業者に周知であり（例えば、Measuring Gene Expression by Matthew Avison, 2007, published by Taylor & Francis Group; ISBN; 978-0-415-37472-9（書籍版)978-0-203-88987-9（電子版）を参照）、コードされているタンパク質の発現レベルを測定して、遺伝子発現のレベルを決定することもできる。タンパク質発現のレベルを決定する多数の方法が、当業者に周知である。
【００４１】
更なるバイオマーカーとして本方法で測定することができる種々の細胞タイプのレベルは、任意の好適な方法を使用して検出することができる。例えば、適切な抗体を使用したフローサイトメトリーを使用することができる。そのような方法は、当業者に周知である。
【００４２】
ＣＤ４＋Ｔ細胞のドナー特異的低応答性のレベルは、任意の好適な方法を使用して決定することができる。好適な方法には、ＥＬＩＳＡ法、Ｌｕｍｉｎｅｘ法により、又はフローサイトメトリーを使用した細胞内サイトカイン産生により、ＩＦＮガンマ産生を測定することが含まれる。そのような測定を行う場合、本方法は下記ステップを含むことが好ましい：
ａ．レシピエントからあるセット数のＣＤ４＋Ｔ細胞を準備するステップ、
ｂ．ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ドナーに由来する細胞又はドナーと同じＨＬＡクラスＩＩを有する（血清学的精度で）個体に由来する細胞で刺激し、細胞は、放射線照射を受けている
（好ましくは、細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が枯渇されている（ＣＤ２及びＴＣＲｇｄ抗体を使用して）ＰＢＭＣである）ステップ、
ｃ．ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ドナーとレシピエントとの間に存在する不一致と類似したＨＬＡクラスＩＩ不一致を有する「第３の個体」に由来する細胞で刺激する（好ましくは、細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が枯渇されている（ＣＤ２及びＴＣＲｇｄ抗体を使用して）ＰＢＭＣである）ステップ、
ｄ．ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ドナー及びレシピエントの両方に対して完全なＨＬＡクラスＩＩ不一致を有する「第４の個体」に由来する細胞で刺激する（好ましくは、細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が枯渇されている（ＣＤ２及びＴＣＲｇｄ抗体を使用して）ＰＢＭＣである）ステップ、及び
ｅ．ＣＤ４＋Ｔ細胞によりＩＦＮガンマ産生の相対的レベルを決定するステップ。
【００４３】
ドナー特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを決定するための好適な方法は、本明細書に下述されている。
【００４４】
上記で言及したマーカーのレベルが正常レベルより大きい（高い）か又は少ない（低い）かどうかを決定するために、典型的には、非寛容個体の関連集団の正常レベルが決定される。関連集団は、例えば、移植された臓器、免疫抑制剤のレベル及び種類、人種的背景、又は正常なマーカーレベルに影響を及ぼし得るあらゆる他の特徴に基づいて規定することができる。正常レベルが判明したら、測定されたレベルを比較し、標準的統計手法を使用して有意差を決定する。測定レベルと正常レベルとの間にかなりの違い（つまり、統計的有意差）がある場合、レベルが測定された個体は、免疫学的に寛容であるとみなすことができる。
【００４５】
本明細書に記載の技術は、移植片（つまり、移植臓器）に対する個体寛容をモニターすることを可能にし、それにより免疫抑制剤の投与を中止することができるか又は免疫抑制剤のレベルを低減することができる個体を特定することができる。また、本技術は、免疫抑制プロトコールの管理及び臓器移植レシピエントの移植後管理を支援することができる。
【００４６】
また、本発明は、ＴＬＲ５、ＰＮＯＣ、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＣＤ７９Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＨＳ３ＳＴ１、ＭＳ４Ａ１、ＦＣＲＬ１、ＳＬＣ８Ａ１、及びＦＣＲＬ２からなる群から選択される少なくとも２個の遺伝子の発現レベルを検出するためのセンサーを提供する。好ましくは、センサーは、ＴＬＲ５、ＰＮＯＣ、及びＳＨ２Ｄ１Ｂ遺伝子の発現レベルを検出するためのものである。マイクロアレイの遺伝子発現レベルをモニターするのに好適なセンサーは、当業者に周知であり、ｍＲＮＡチップ、タンパク質発現センサー等が含まれる。センサーは、一般的に、センサー表面に付着した、検出しようとする遺伝子に特異的な１つ又は複数の核酸プローブを含む。それにより、核酸プローブは、標的遺伝子に由来する遺伝子転写物の検出を可能にする。好ましくは、センサーは、更に、以下の遺伝子ＣＤ７９Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＨＳ３ＳＴ１、ＭＳ４Ａ１、ＦＣＲＬ１、ＳＬＣ８Ａ１、及びＦＣＲＬ２の１つ又は複数、好ましくは全ての発現を検出するためのものである。
【００４７】
また、本発明は、ＴＬＲ５、ＰＮＯＣ、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＣＤ７９Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＨＳ３ＳＴ１、ＭＳ４Ａ１、ＦＣＲＬ１、ＳＬＣ８Ａｌ、及びＦＣＲＬ２からなる群から選択される少なくとも２個の遺伝子の発現レベルを検出するための試薬を含むキットを提供する。好ましくは、キットは、ＴＬＲ５、ＰＮＯＣ、及びＳＨ２Ｄ１Ｂ遺伝子の発現レベルを検出するための試薬を含む。好ましくは、キットは、以下の遺伝子ＣＤ７９Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＨＳ３ＳＴ１、ＭＳ４Ａ１、ＦＣＲＬ１、ＳＬＣ８Ａ１、及びＦＧＲＬ２の１つ又は複数の発現レベルを検出するために試薬を更に含む。遺伝子の発現レベルを検出するための試薬は、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子の遺伝子発現レベルを検出するため
の試薬である。
【００４８】
また、キットは、個体が寛容である確率を計算するためのアルゴリズムを用いてプログラムされたコンピューター、説明書、及び本明細書に記載の方法の実施に有用な他の品目を含むことができる。
【００４９】
本技術の特定の態様は、以下の図を参照し、下記で例により説明されている。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】訓練セット（Ａ〜Ｄ）及び検査セット（Ｅ〜Ｈ）の末梢血リンパ球サブセットのフローサイトメトリー解析を示す図である。リンパ球サブセットは、Ｂ細胞はＣＤ１９＋リンパ球（Ａ、Ｅ）として；ＮＫ細胞はＣＤ５６＋ＣＤ３−リンパ球（Ｂ、Ｆ）として；Ｔ細胞はＣＤ３＋リンパ球（Ｃ、Ｇ）として定義された。ＣＤ１９＋：ＣＤ３＋の比率が示されている（Ｄ、Ｈ）。中央値及び四分位範囲が示されている。Ｔｏｌ−ＤＦ患者と他群との間のマン−ホイットニーＵ検定比較の両側ｐ値が示されている（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、又は＊ｐ＜０．０５）。他の研究群間の比較のｐ値は、表５に示されている。
【図２】訓練セット（Ａ及びＢ）及び検査セット（Ｃ及びＤ）のＣＤ２５の末梢血Ｔ細胞発現に関するフローサイトメトリー解析を示す図である。中程度（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｉｎｔ）及び高（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ）ＣＤ２５発現を示すＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントの中央値及び四分位範囲が示されている。  Ｔｏｌ−ＤＦ患者と残りの群との間のマン−ホイットニーＵ検定比較の両側ｐ値が示されている（＊＊）ｐ＜０．０１又は（＊）ｐ＜０．０５）。他の研究群間の比較のｐ値は、表５に示されている。
【図３】訓練セットで血清ドナー特異的（ＤＳＡ）及び非特異的（ＮＤＳＡ）抗ＨＬＡクラスＩ（ＣＩ）及びクラスＩＩ（ＣＩＩ）抗体の陽性検出を示す患者の群毎の割合を示す図である。（Ｂ）補体結合（ＩｇＧ１、ＩｇＧ３）又は非補体結合（ＩｇＧ２、ＩｇＧ４）ＤＳＡが、存在した（＋ｖｅ）又は存在しなかった（−ｖｅ）患者の腎機能。中央値及び四分位範囲が示されている。群間のマン−ホイットニーＵ検定比較の両側ｐ値が表示されている（＊ｐ＜０．０５）。なお、ＤＳＡレベルは、寛容レシピエントには存在しなかった。
【図４】（Ａ）訓練セット及び（Ｂ）検査セットの患者における直接経路非自己応答の検出に使用したＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔｓを示す図である。ドナー細胞及び第３の個体の細胞（３ｒｄＰ）で刺激した際に、レシピエントＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＦＮγ産生細胞の数を算出して（バックグラウンドを差し引いた）、応答細胞の頻度を取得した。ドナー：３ｒｄＰ刺激に対する応答頻度の比率の中央値及び四分位範囲が示されており、比率値＞１．５は、ドナーに対する低応答性を示す。群間のマン−ホイットニーＵ検定比較の両側ｐ値が示されている（＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）。ドナー及び３ｒｄＰに対する個々の患者のＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ応答頻度は図１０に示されている。ζ：ドナー及び３ｒｄＰ頻度間のウィルコクソン検定  ｐ＜０．０５。
【図５】ＦｏｘＰ３及びα−１，２−マンノシダーゼの末梢血発現のｑＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現解析を示す図である。ＦｏｘＰ３及びα−１，２−マンノシダーゼの発現値の比率を、訓練セット（Ａ）及び検査セット（Ｂ）の患者について計算した。中央値及び四分位範囲が示されている。Ｔｏｌ−ＤＦ患者と他群との間のマン−ホイットニーＵ検定比較の両側ｐ値が示されている（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１）。他の研究群間の比較の統計値は、表６に示されている。また、ＦｏｘＰ３及びα−１，２−マンノシダーゼの個々の発現値は、それぞれ図１１Ａ及び１１Ｂに示されている。
【図６】最大１０個の最も高位に順位付けられた遺伝子を使用して生成された、訓練セット（Ａ）及び検査セット（Ｂ）のＲＯＣ曲線（黒色線）を示す図である。有意な遺伝子発現の差異が、末梢血のマイクロアレイ解析により検出された。２値回帰モデルを階級化に使用し、ＲＯＣ曲線（Ｔｏｌ−ＤＦ群対非寛容群、ＨＣは除く）を、マイクロアレイデータの４階級クラスカル−ワリス分析により特定された上位１０位に順位付けられた有意な遺伝子を使用して生成した。遺伝子は、１％ＦＤＲを用いてそれらのＰ値に基づき訓練セット内で順位付けした。同じ２階級モデルを使用して、同じ遺伝子が、検査セット内のＴｏｌ−ＤＦレシピエントを検出する診断する能力を評価した。
【図７】マイクロアレイ解析により特定されたクロスプラットフォームバイオマーカー及び遺伝子を使用して生成された、訓練セット（Ａ）及び検査セット（Ｂ）のＲＯＣ曲線を示す図である。２階級ＲＯＣ曲線（Ｔｏｌ−ＤＦ群対非寛容群、ＨＣは除く）は、４個のバイオマーカー：Ｂ／Ｔリンパ球比率、％ＣＤ４＋ＣＤ２５ｉｎｔ、抗ドナー：抗３ｒｄＰ  ＥＬＩＳｐｏｔ頻度の比率、及びＦｏｘＰ３／α−１，２−マンノシダーゼ発現の比率を、１０個の最も有意な遺伝子を順次追加することと組み合わせて使用して生成した。寛容のクロスプラットフォームバイオマーカー特徴（４個のバイオマーカー＋１０個の遺伝子）に基づいて寛容であると分類された、訓練セット（Ｃ）及び検査セット（Ｄ）の各研究群の患者の推定確率を２項回帰手順を使用して計算した。
【図８】訓練セット患者及び検査セット患者の末梢血Ｂ細胞サブセットの分析を示す図である。（Ａ）Ｂ細胞サブセットは、ＧＤ１９＋リンパ球でゲート制御することにより分析し、以下のように定義された：後期記憶Ｂ細胞  ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩｇＤ−ＣＤ２４＋ＣＤ３８−／ｉｎｔ；未感作／成熟Ｂ細胞  ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＣＤ２４ｉｎｔＣＤ３８ｉｎｔ；Ｔ１／Ｔ２移行性Ｂ細胞  ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＣＤ２４＋ＣＤ３８ｈｉ。総Ｂ細胞のうちの未感作Ｂ細胞（Ｂ）、Ｔ１／Ｔ２移行性Ｂ細胞（Ｃ）、及び記憶Ｂ細胞（Ｄ）の割合。Ｔ１／Τ２移行性Ｂ細胞：記憶Ｂ細胞の割合の比率（Ｅ）。中央値及び四分位範囲が示されている。有意である場合、群間のマン−ホイットニーＵ検定比較の両側ｐ値が示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図９】Ｂ細胞サイトカイン産生の分析を示す図である。（Ａ）ＴＧＦβ、（Ｂ）ＩＬ−１０、及び（Ｃ）ＩＦＮγのＢ細胞産生は、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート及びイオノマイシンでＰＢＭＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激した後で細胞内サイトカイン染色により評価した。結果は、刺激（＋）及び未刺激（−）培養中のフローサイトメトリーで分析された１×１０４個のＢ細胞当たりの検出されたサイトカイン産生Ｂ細胞の数として表されている（ＣＤ１９＋リンパ球でゲート制御した）。各群の中央値及び四分位範囲が示されている。図（Ｄ〜Ｆ）は、各サイトカイン応答の比率として表された、１×１０４個の刺激Ｂ細胞当たりのサイトカイン産生細胞の数を示す。図Ｇは、ΤＧＦβ及びＩＦＮγ細胞サイトカイン応答を示し、各患者は、塗りつぶし円により表わされており、黒色の塗りつぶし円は、Ｔｏｌ−ＤＦ患者を表し、Ｔｏｌ−ＤＦ患者のＢ細胞が、ＩＦΝγではなくＴＧＦβを産生するより高い能力を有することを示す。ウィルコクソン−マッチドペア検定（Ａ〜Ｃ）及び群間の両側マン−ホイットニーＵ検定（Ｄ〜Ｆ）比較のｐ値が示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１）。試料ｎ；ＨＣ＝８、Ｔｏｌ−ＤＦ＝１０、ｓ−ＬＰ＝８、ｓ−ＣＮＩ＝１６、ＣＲ＝４。
【図１０】（Ａ）訓練セット及び（Ｂ）検査セットでＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによる直接経路非自己応答を検出する細胞機能性アッセイを示す図である。レシピエントＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＦＮγ産生細胞の数を算出した。データは、バックグラウンドを差し引いた後の、ドナーＡＰＣ（○  抗ドナー応答）又は等しく不一致の第３の個体のＡＰＣ（逆三角形は、抗３ｒｄＰ応答を示す）に対するＴ細胞応答の頻度（１応答／ｎ個細胞）及び群頻度中央値（黒色バー）を示す。ドナー頻度及び３ｒｄＰ頻度間のウィルコクソンマッチドペア検定の両側ｐ値（＊＊ｐ＜０．０１）が示されている。
【図１１】訓練セット及び検査セットの末梢血試料全体の（Ａ）ＦｏｘＰ３及び（Ｂ）α−ｌ，２−マンノシダーゼのｑＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図である。ＦｏｘＰ３及びα−１，２−マンノシダーゼの発現レベルは、ＨＰＲＴの発現と比較した単位として表されている。有意である場合、群間のマン−ホイットニーＵ検定比較の両側ｐ値が示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１２】訓練セットで有意に異なる発現を示した遺伝子の幾つかのマイクロアレイ及びｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の相関性を示す図である（Ａ〜Ｅ）。マイクロアレイの各プローブのシグナル強度データを各患者について計算し、その後、ＨＰＲＴと比較した発現を、ｌｏｇ２［目的遺伝子］−ｌｏｇ２［ＨＰＲＴ］として各遺伝子について計算した。ｑＲＴ−ＰＣＲデータは、単位／ＨＰＲＴとして示されている。ピアソン及びスピアマンの順位相関係数及びｐ値が示されている。同じ遺伝子セットのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現データは、Ｆ〜Ｊに示されている。各群の中央値及び四分位範囲が示されている。群間の統計比較は、マン−ホイットニーＵ検定により評価した。有意なｐ値が示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１３】検査セットで有意に異なる発現を示した遺伝子の幾つかのマイクロアレイ及びｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の相関性を示す図である。マイクロアレイの各プローブのシグナル強度データを各患者について計算し、その後、ＨＰＲＴと比較した発現を、ｌｏｇ２［目的遺伝子］−ｌｏｇ２［ＨＰＲＴ］として各遺伝子について計算した。ｑＲＴ−ＰＣＲデータは、単位／ＨＰＲＴとして示されている。ピアソン及びスピアマンの順位相関係数及びｐ値が示されている。同じ遺伝子セットのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現データは、Ｆ〜Ｊに示されている。各群の中央値及び四分位範囲が示されている。群間の統計比較は、マン−ホイットニーＵ検定により評価した。有意なｐ値が示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１４】選択された組み合わせのバイオマーカーを交差検定するために使用した２項回帰モデルの結果を示す図である。ＭＳＥ＝平均２乗誤差、ＳＤ＝標準偏差。
【図１５】１群当たり３個の遺伝子（ＳＨ２ＤＢ１、ＰＮＯＣ、及びＴＬＲ５）の発現レベルを示すボックスプロットである。
【図１６】３個の遺伝子ＴＬＲ５、ＰＮＯＣ、及びＳＨ２ＤＢ１間の主要及び相互作用効果を用いてロジスティク回帰分類指標を使用して得られたＲＯＣ曲線である。ＡＵＣ、感度、及び特異性は、この試料の至適カットオフ（つまり、０．０６０２）で計算した。
【図１７】３個の遺伝子（ＳＨ２ＤＢ１、ＰＮＯＣ、及びＴＬＲ５）を使用して、ロジスティク回帰分類指標により推定された寛容確率のボックスプロットを示す図である。
【図１８】３個の遺伝子、ＴＬＲ５、ＳＨ２ＤＢ１、及びＰＮＯＣを用いて推定された分類ツリーを示す図である。この図は、各分岐でのカットオフ、及び各終端ノードに割り当てられた各結果の確率を示す図である（０−上段−非寛容、１−下段−寛容）。
【図１９】ツリーのカットオフの適用を例示する一連のボックスプロットを示す図である。
【図２０】寛容を予測するために３個の遺伝子を用いた推定分類ツリーを使用して得られたＲＯＣ曲線を示す図である。
【図２１】分類ツリーにより割り当てられた寛容の確率の頻度の棒グラフを患者群毎に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
実施例  材料及び方法
研究対象患者：
訓練セットの説明：
寛容ネットワークインデックス（ＩＯＴ、Indices of Tolerance network）により募集したこの集団患者は、７１人の腎移植レシピエント、及び１９人の年齢及び性別一致健常対照（ＨＣ）で構成されていた。５つの患者群には以下の患者が含まれていた：複数年にわたって免疫抑制を全て中止したにもかかわらず機能的に安定している（血清クレアチニン（ＣＲＴ）＜１６０μｍｏｌ／ｌ、及び過去１２月間に１０％未満の上昇）１１人の腎移植レシピエント（Ｔｏｌ−ＤＦ）、唯一の免疫抑制剤として１０ｍｇ／日未満のプレドニゾンで維持された、機能的に安定した腎機能（同じ基準）を有する１１人の患者（ｓ−ＬＰ）、移植以来カルシニューリン阻害剤を用いずに免疫抑制（アザチオプリン及びプレドニゾン）が維持された１０人の患者（ｓ−ｎＣＮＩ）、標準カルシニューリン阻害剤療法で維持された３０人の患者（ｓ−ＣＮＩ）、生検で証明された（本研究用に全て再評価した）免疫主導性の慢性拒絶反応を有する９人の患者（ＣＲ）。患者の臨床的特徴は、表
１に記述されている。試料は全て、盲目的様式で処理及び分析した。
【００５２】
検査セットの説明：
腎移植レシピエントの独立セットは、アメリカ合衆国で募集された（ＩＴＮ集団）。ＩΤΝ集団は、以下の患者で構成されていた：（１）複数年にわたって免疫抑制を全て中止したにもかかわらず機能的に安定している（血清クレアチニン（ＣＲＴ）が基線の２５％以内）「Ｔｏｌ−ＤＦ」（ｎ＝２４）腎移植レシピエント、（２）ステロイドによる単独療法で維持された安定した腎機能を有する「Ｍｏｎｏ」（ｎ＝ｌｌ）患者、（３）Ｔｏｌ−ＤＦと同じ基準を使用して３剤免疫抑制投与計画（カルシニューリン又はｍＴＯＲ阻害剤、抗増殖剤、及びコルチコステロイドを含む）で維持された臨床的に安定した腎機能を有する「ｓ−ＣＮＴ」被験者（ｎ＝３４）、及び推定免疫媒介性同種移植片拒絶反応による慢性同種移植片腎症及び腎機能障害（最初の移植後基線と比較して登録時の基線ＣＲＴが５０％増加）を有すると定義される「ＣＡＮ」参加者（ｎ＝２０）。腎疾患／機能不全の既往歴又は急性医学的疾患の根拠のない３１人の健常対照志願者（ＨＣ）の群が更に登録された。群の特徴は表３に要約されている。全血ｍＲＮＡ及び凍結ＰＢＭＣは、記載されている選択された検証アッセイを実施する実験室が受領した。
【００５３】
血液試料：
訓練セット試料は、全ての場合で静脈切開の２４時間以内に処理した。ＰＢＭＣを、リンパ球分離培地（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、サマセット、英国）を使用して、密度勾配遠心分離により得た。細胞を洗浄し、１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ社、ドーセット、英国）及びヒト血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ社、フランス）に再懸濁し、直ちに−８０℃で凍結した。２４時間後、細胞を液体窒素に移し、使用まで液体窒素で維持した。
【００５４】
ＰＢＭＣのフローサイトメトリー：
解凍したＰＢＭＣを洗浄し、１×１０６／ｍＬで再懸濁した。滴定量の蛍光色素結合モノクローナル抗体を使用して白血球を識別した。リンパ球の場合はＣＤ４５＋ＣＤ１４−、Ｔ細胞の場合はＣＤ３＋、Ｂ細胞の場合はＣＤ１９＋、ＮＫ細胞の場合はＣＤ５６＋ＣＤ３−、ＣＤ４  Ｔ細胞の場合はＣＤ４＋ＣＤ３＋、ＣＤ８  Ｔ細胞の場合はＣＤ８＋ＣＤ３＋。Ｂ細胞サブセットは、以前に記載されているように（３０）、以下のように定義した：後期記憶Ｂ細胞の場合はＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩｇＤ−ＣＤ２４＋ＣＤ３８−／ｉｎｔ、未感作／成熟Ｂ細胞の場合はＣＤｌ９＋ＣＤ２７−ＣＤ２４intＣＤ３８int、Ｔ１／Ｔ２移行性Ｂ細胞の場合はＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＣＤ２４＋ＣＤ３８ｈｉ（全て、Ｃａｌｔａｇ社製、バーリンガム、アメリカ合衆国）。細胞を１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、４８時間以内にＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒでデータを得た。ＣＤ２５発現を、（３１）に記載のようにＣＤ４＋Ｔ細胞で研究した。ＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＩＬ−１０、及びＩＦＮγ（両方ともｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、英国）のＢ細胞産生を、２μΜモネンシン及び１０μｇ／ｍＬブレフェルジンＡの存在下で、５００ｎｇ／ｍＬホルボール１２−ミリステート１３−アセタート及び１μΜイオノマイシンを用いて、３７℃にて５時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激したＰＢＭＣの細胞内サイトカイン染色により評価した。各試料につき、最低１０，０００回のＣＤ１９＋事象を得た。
【００５５】
抗ドナー抗体検出：
末梢血を、血液凝固活性化因子バキュテーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、サンホゼ、アメリカ合衆国）で収集し、最低２時間及び最大２４時間凝固させた。試料を遠心分離し、収集した血清を使用まで−８０℃で保管した。
【００５６】
ｘＭＡＰ（登録商標）（Ｌｕｍｉｎｅｘ）技術（３２）によるあらゆる特異性のＩｇＧ抗ＨＬＡ抗体のスクリーニング。  洗浄した後、ＨＬＡコーティングＬｕｍｉｎｅｘスクリーニングビーズ及び１２．５μｌの患者血清又は対照血清をプレートに添加し、暗所で
３０分間ゆっくりと混合した。プレートを３回洗浄し、ＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：１０）を、各試験ウエルに添加した。プレートを１時間インキュベートし、洗浄緩衝液を添加し、その後、製造業者の推奨に従って、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００機器を使用してデータを収集した。
【００５７】
ＩｇＧサブクラス及び抗ＨＬＡ広域特異性のスクリーニング：
陽性血清を、ＩｇＧサブクラスの特定、並びにクラス１及びクラスＩＩ広域特異性の識別について試験した。スクリーニングは、クラスＩ及びＩＩ  Ｌｕｍｉｎｅｘ識別キット（Ｑｕｅｓｔ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）を使用して実施した。結合患者抗体の検出に使用した二次抗体は以下の通りだった：ビオチンに結合された抗ヒトＩｇＧ１（クローン８ｃ／６−３９、Ｓｉｇｍａ社）、ビオチンに結合された抗ヒトＩｇＧ２（クローンＨＰ−６０１４、Ｓｉｇｍａ社）、ビオチンに結合された抗ヒトＩｇＧ３（クローンＨＰ−６０５０、Ｓｉｇｍａ社）、ビオチンに結合された抗ヒトＩｇＧ４（クローンＨＰ−６０５０、Ｓｉｇｍａ社）、及びストレプトアビジン−フィコエリトリン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）。
【００５８】
機能アッセイ用の細胞画分：
ＰＢＭＣを、アッセイ当日に解凍した。Ｔ細胞サブセットＣＤ４＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５−（ＣＤ２５＋が枯渇したＣＤ４＋細胞）を、以前に記述されているように（３３）、標準的陰性免疫分離を使用して分離した。純度は、フローサイトメトリーで検証した。特に、本発明者らは、蛍光色素が結合された２つの特定のセットのモノクローナル抗体を使用して、単離末梢血単核細胞を染色した。以下の分析には、リンパ球（前側及びＣＤ４５＋ＣＤ１４−発現で選択された）を使用した。第1のセットは、ＴＣＲガンマ／デルタ−ＦＩＴＣ、ＣＤ２５−ＰＥ、ＣＤ４−ＡＰＣを含んでいた。ＣＤ４＋Ｔ細胞を選択し、このサブセット内でＣＤ２５の中間発現を研究して、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｉｎｔのレベルを得た（ＣＤ２５陰性から、ＣＤ４ＮＥＧ細胞が示したのと同じくらい高いレベルのＣＤ２５までと定義した。ＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞は、このゲートから除外する）。第２のセットは、ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ５６−ＰＥ、及びＣＤ１９−ＡＰＣを含んでいた。ＣＤ１９＋細胞を選択し、その割合をＣＤ３＋リンパ球の割合で除算して、変数「Ｂ．Ｔ」を得た。
【００５９】
ドナー、代用ドナー、及び第３の個体の細胞：
３１人の生体腎ドナーに由来する細胞を、訓練セットで７１個のドナー特異的細胞アッセイに使用し、２８人のドナーに由来する細胞を、検査セットで６４個の細胞試料に使用した。ドナー血液が入手できなかった場合、元のドナーと同じＨＬＡクラスＩＩ発現を示した代用ドナー細胞を取得した。これら細胞及び同様に不一致の第３の個体の細胞は、以下のものから使用した：Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｎｏｌａｎ骨髄登録からの健常志願者、ＨＬＡ型が決定されている健常志願者、及びロンドンのＨａｍｍｅｒｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｇｕｙ’ｓ病院で献体時に収集された脾細胞。同様に不一致の第３の個体の細胞は、関連ドナー及びレシピエントと比較した際の、クラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−ＤＱ）のＨＬＡ不一致の数により選択した。
【００６０】
ＥＬＩＳｐｏｔ用のＭＬＲ培養：
ヒトＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔＰＲＯ（Ｍａｂｔｅｃｈ社、スウェーデン）キットを使用し、製造業者の説明書に従って発色させた。バックグラウンドを差し引いた陽性スポットを、ＥＬＩＳｐｏｔプレート用の自動的画像分析装置（ＡＩＤ社、ドイツ）を使用して計数した。直接経路ドナー特異的応答Ｔ細胞頻度の定量的評価は、ドナーＰＢＭＣ又はＨＬＡ型が決定された第３の個体の細胞のいずれかから分離されたＴ細胞及びＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣ（ＡＰＣ）でレシピエントＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激することにより行った。同種ＭＬＲ培養を２４時間にわたって実施した。複製物を、典型的には１ウエル当たり２×１０５個の応答細胞から開始した３つの倍加希釈物を用いて準備した。応答細胞に対する刺激
因子の比率は、最高希釈物に使用された応答細胞の数、典型的には１ウエル当たり１×１０５個の応答細胞と比較して、ＡＰＣの数が常に半分になるように使用することにより一定に維持した。ドナー反応性は、ドナーに対する頻度及び第３の個体に対する頻度の比率として表した。頻度の逆数をデータベースに記録し（つまり、５４，０００個の細胞のうち１個は、５４，０００として記録した）、したがって比率値＞１．５は、ドナー刺激に対する低応答を示すと定義した。
【００６１】
遺伝子発現解析用の血液試料採取：
訓練セット集団の場合、末梢静脈血液を、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ（ＱＩＡｇｅｎ社、クロウリー、英国）に直接採取した。全血ＲＮＡを、ＤＮＡｓｅＩ処理を含むＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット（ＱＩＡｇｅｎ社）を使用して抽出した。検査セット集団の場合、末梢静脈血を、Ｔｅｍｐｕｓ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．社）に直接採取した。全血ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って抽出した。全ＲＮＡ試料を、ＲＴ−ＰＣＲ及びマイクロアレイによる遺伝子発現解析にかけた。
【００６２】
ｍＲＮＡ研究用の試料；
以下のもので構成される訓練セットからの９５個の試料を使用した：１０人のＴｏｌ−ＤＦ患者に由来する１３個の試料、１１人のｓ−ＬＰ患者に由来する１６個の試料、８人のｓ−ｎＣＮＩ患者に由来する８個の試料、２８人のｓ−ＣＮＩ患者に由来する４０個の試料、９人のＣＲ患者に由来する１０個の試料、及び８人のＨＣに由来する８個の試料。
検査セットとして、以下のもので構成される１４２個の試料を使用した：２３人のＴｏｌ−ＤＦ患者に由来する３１個の試料、１１人のＭｏｎｏ患者に由来する１４個の試料、３４人のｓ−ＣＮＩ患者に由来する５２個の試料、１８人のＣＡＮ患者に由来する２５個の試料、及び２０人のＨＣに由来する２０個の試料。
【００６３】
ＲＮＡ品質管理：
ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）（訓練セット）及びＴｅｍｐｕｓ（商標）（検査セット）で精製したＲＮＡの品質及び完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）でＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ６０００Ｎａｎｏキットを使用して決定した。ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）でＡ２６０ｎｍを測定することにより、ＲＮＡを定量化した。
【００６４】
ＲＮＡ増幅及び標識化：
試料標識化は、「Ｏｎｅ−Ｃｏｌｏｕｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」プロトコール（バージョン５．５、パーツ番号Ｇ４１４０−９００４０）に詳述されるように実施した。手短かに言えば、０．５μｇの全ＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｌｏｗ  ＲＮＡ  ｉｎｐｕｔ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）をシアニン３−ＣＴＰの存在下で使用した増幅及び標識化ステップに使用した。ｃＲＮＡの収量及び色素取り込み率を、ＮＤ−１０００分光光度計で測定した。
【００６５】
ＲＩＳＥＴ２．０Ａｇｉｌｅｎｔ社製特注マイクロアレイのハイブリダイゼーション：
全血試料は全て、ＲＩＳＥＴ２．０マイクロアレイプラットフォームでハイブリダイズした。これは、三重反復で提供された５，０６９個のプローブを含む特注Ａｇｉｌｅｎｔ社製８×１５Ｋ  ６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドマイクロアレイである。有効なＥｎｔｒｅｚ遺伝子識別記号を有する４６０７個の遺伝子に対応する選択されたプローブ及び有効なＥｎｔｒｅｚ遺伝子識別記号に割り当てることができなかった更なる４０７個のプローブは、最適化されたプローブのハイブリダイゼーション特性で、交差ハイブリダイゼーションを回避し、複数の遺伝子転写物変異体の検出に最適化されていた。ハイブリダイゼ
ーション手順は、ＲＮＡ品質及び完全性を制御した後で、Ａｇｉｌｅｎｔ社製遺伝子発現ハイブリダイゼーションキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して、「Ｏｎｅ−Ｃｏｌｏｕｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」プロトコールに従って実施した。手短かに言えば、ハイブリダイゼーション緩衝液中の０．６μｇのＣｙ３標識断片化ｃＲＮＡを、ＲＩＳＥＴ２．０マイクロアレイに一晩（１７時間、６５℃）ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを、Ａｇｉｌｅｎｔ社製遺伝子発現洗浄緩衝液１で１分間室温にて１回洗浄し、その後０．００５％のＮ−ラウロイルザルコシンを含有する予め加温された（３７℃）Ａｇｉｌｅｎｔ社製遺伝子発現洗浄緩衝液２で第２の洗浄を１分間行った。最後の洗浄ステップは、アセトニトリルを用いて３０秒間実施した。
【００６６】
走査及びデータ分析：
Ａｇｉｌｅｎｔ社製マイクロアレイスキャナーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製社）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ社製マイクロアレイの蛍光シグナルを検出した。Ａｇｉｌｅｎｔ社製特徴抽出ソフトウェア（ＦＥＳ  ｖ．９．５．１．１）を使用して、マイクロアレイ画像ファイルを読み取り、処理した。遺伝子発現の差異を決定するために、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｒｅｓｏｌｖｅｒ遺伝子発現データ分析システム（ｖ．７．１．０．２．、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ  ＬＬＣ社）を使用して、ＦＥＳ由来の出力データファイルを更に分析した。最初に、人為的な共通基準を、ＩＯＴデータセットに含まれていた全ての試料から計算した。この基線を使用して、各遺伝子及び試料のｌｏｇ２比率を計算した。加えて、試料と共通基準との間の観察された差異の信頼性を示すｐ値を、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｒｅｓｏｌｖｅｒソフトウェアに実装されている汎用誤差モデルを適用して、各遺伝子について計算した（３４）。
【００６７】
アノテーション濃縮解析：
異なる試料群の間で差別的であり、両研究セットに共通していることが見出された遺伝子のリストを、完全ＲＩＳＥＴ２．０マイクロアレイ配置と比較して、生物学的経路アノテーション用語の統計的に有意な濃縮について分析した。予測バックグラウンド分布と比較した用語濃縮は、フィッシャー直接検定を使用してスコア化した。アノテーションは、異なる供給源、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ、ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）、シグナル経路メンバシップ、配列モチーフ、染色体近接性、文献キーワード、及び細胞特異的マーカー遺伝子から導き出した。
【００６８】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析；
２００ｎｇの全血全ＲＮＡを、ｑＰＣＲ１本鎖合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用して逆転写し、合成ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ解析にかけた。
【００６９】
マイクロアレイデータ検証：
マイクロアレイ遺伝子発現解析により特定された選択されたセットの遺伝子を、定量的ＲＴ−ＰＣＲで検証した。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、以下の遺伝子についてＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の既製ＴａｑＭａｎパネルを使用して実施した：Ｈｓ０１０１７４５２＿ｍｌ  Ｂリンパ球チロシンキナーゼ（ＢＬＫ）、Ｈｓ００２３６８８１＿ｍｌ  ＣＤ７９ｂ分子（ＣＤ７９ｂ）、Ｈｓ０１０９９１９６＿ｍｌ  ヘパラン硫酸（グルコサミン）３−Ｏ２９  スルホトランスフェラーゼ１（ＨＳ３ＳＴ１）、Ｈｓ０１５９２４８３＿ｍｌ  ＳＨ２ドメイン含有１Ｂ（ＳＨ２Ｄ１Ｂ）、Ｈｓ００１７２０４０＿ｍｌ
Ｔ細胞白血病（ＴＣＬ１Ａ）。
【００７０】
訓練セットでスクリーニングされた他のアッセイ：
本発明者らは、間接経路ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ、並びに直接及び間接経路ｔｒａｎｓ−ｖｉｖｏ  ＤＴＨアッセイも実施した。サイトカイン遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ増幅を、ド
ナー細胞及びレシピエント細胞の直接及び間接経路培養で実施し、ＴＣＲレパートリー解析は、ＴＣＲ−ランドスケープ解析で達成した（データ非表示）。
【００７１】
統計：
多くの群比較においてｎ＜２０であり、データは正規分布していなかったため、ノンパラメトリック検定を使用して統計的有意差を推定した。ウィルコクソンの符号付順位検定を使用して、同じ患者群内の応答を比較した。マン−ホイットニーＵ検定を使用して、患者群間の中央値を比較した。通常はカテゴリーデータ及び抗ＨＬＡ抗体の存在又は非存在として記録される臨床変数間の関連性を比較するために、本発明者らは、フィッシャー直接検定を使用した。０．０５未満だった場合、両側ｐ値を使用して有意差を示した。
【００７２】
マイクロアレイ及びバイオマーカーの統計分析；
マイクロアレイにより検出された有意に変更された発現を、４階級分析、及び１％偽陽性率（ＦＤＲ、False Discovery Rate）のＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を用いたクラスカル−ワリス検定を使用して統計的に決定した。本発明者らは、データが幾つかの場合に正規性から逸脱すると考えられたため、この解析にはノンパラメトリック検定を選択した。同様の手順を使用して、バイオマーカーを順位付けした（欠測値は、試料全体の平均と同値とし、対数スケールで試験した）。寛容患者を検出する幾つかの変数の予測能力を評価するために、本発明者らは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用した。これらを構築するために、まず、４階級分析により、訓練セット内の識別的発現されたＴｏｌ−ＤＦのプローブを特定し、クラスカル−ワリス検定を使用して順位付けした。その後、最上位の発現が有意に異なるプローブを、２項回帰モデルに追加し、試料内の階級化を実施するために使用した。２項回帰手順を使用して、Ｔｏｌ−ＤＦ患者の確率ｐ［１］、．．．．．、ｐ［ｎ］を各被験者について計算した。ＲＯＣ曲線は、確率閾値を０から１の間で変動させることにより生成し、閾値ｔの各々の値について、ｐ［ｉ］＞ｔの場合、被験者ｉの実際の階級対予測階級の２×２階級化表を「Ｔｏｌ−ＤＦ」と同値に設定した。被験者のブートストラップリサンプリングは、試料内階級化結果がロバストであることを示した。検査セットの場合、訓練セット分析と同じプローブを使用した。
【００７３】
寛容腎移植患者のデモグラフィックス：
訓練セットは、７１人のヨーロッパ系腎移植レシピエント及び１９人の年齢及び性別一致健常対照で構成されていた（表１）。Ｔｏｌ−ＤＦ群の大部分は献体ドナーであり（１１人中７人）、高度のＨＬＡ不一致（不一致中央値４．０）は、主に男性であり（１１人中９人）、末期腎不全の原因は様々であり、輸血及び以前の移植等の幾つかの感作事象の根拠があった（表２）。これら患者は、比較的無事象の移植後経過を示しており、１人の患者のみが急性細胞性拒絶反応（ＡＣＲ）の発症が記録されていた。免疫抑制を受けていない期間は、１年〜２１年間と様々であった。検査セットのＴｏｌ−ＤＦ群（表３）は、２４人の患者で構成されており、そのほとんどは、ＨＬＡが高度に一致した生体ドナー（不一致中央値０．０）から移植を受けており、免疫抑制を１〜３２年間中止していた。
【００７４】
Ｔｏｌ−ＤＦレシピエントは、Ｂリンパ球及びＮＫリンパ球の数の増加を示した。図１に示されているように、訓練セットのＴｏｌ−ＤＦ患者は、末梢血Ｂ細胞及びＮＫ細胞の割合の増加、及びそれに対応したＴ細胞の割合の減少を示した。Ｂ細胞及びＴ細胞の割合を比率として表わすと、Ｔｏｌ−ＤＦ患者は、ＨＣを含む他の全ての研究群と比較して、最も高い比率を示した。６人のＴｏｌ−ＤＦ患者及び１０人のｓ−ＣＮＩ患者の場合、１リンパ球サブセット当たりの細胞の絶対数を計算することも可能だった。これにより、比率の変更は、Ｂ細胞及びＮＫ細胞の数の増加によるものであり、Ｔｏｌ−ＤＦ群はいずれもリンパ球減少症でなかったため、Ｔ細胞数の低減によるものではないことが示された（表２）。訓練セットでの知見と一致して、検査セットのＴｏｌ−ＤＦ患者も、ＨＣを除く他の全ての群と比較して、末梢血Ｂ細胞の割合の上昇及びより高い比率のＢ：Ｔ細胞割合
を示した（図１Ｅ及びＨ）。Ｔｏｌ−ＤＦ患者で検出された末梢血Ｂ細胞の特徴的な増殖を考慮して、Ｂ細胞サブセット分析（図８）及びサイトカイン産生（図９）を、両研究セットからの選択された患者で更に評価した。Ｔｏｌ−ＤＦ群は、後期記憶貯留が減少し、移行性及び未感作Ｂ細胞サブセットが同時に増加するというＢ細胞サブセット再分布の傾向を示した。Ｂ細胞サブセットの割合を比率として検討すると、Ｔｏｌ−ＤＦ患者は、ＣＲ患者と比較して、有意により低い割合の記憶Ｂ細胞及びより高い割合の移行性Ｂ細胞を有することが見出された。Ｔｏｌ−ＤＦ患者に由来するＢ細胞のかなりの割合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の際に、ＩＬ−１０又はΙＦΝγではなく、ＴＧＦβを産生することが見出された。しかしながら、ＩＬ−１０産生の有意差は、いずれの研究群でも検出されなかった。各患者群に由来するＢ細胞が、刺激の際にいずれかのサイトカインを産生する能力を、各サイトカインを産生するＢ細胞の数の比率を計算することにより分析した。これにより、Ｔｏｌ−ＤＦ患者のＢ細胞が、偏ったサイトカイン応答を示し、他の研究群に由来するＢ細胞よりも、ＴＧＦβを産生する傾向がより高いことが示唆された。
【００７５】
寛容レシピエントは、末梢血中により少数の活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を有していた。ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ２５の発現を、上述のように分析した。訓練セットのＴｏｌ−ＤＦ患者は、ＨＣ、ｓ−ＬＰ、ｓ−ｎＣＮＩ、及びＣＲ群と比較して、活性化Ｔ細胞であると広く考えられている（９、１０）有意により低い割合の循環中ＣＤ４＋ＣＤ２５ｉｎｔＴ細胞を有することが見出された（図２Ａ）。興味深いことには、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ制御性Ｔ細胞の割合の有意差は、ｓ−ＣＮＩによる完全な免疫抑制を受けた患者と他群との間でのみ検出された（図２Ｂ）。検査セットでも同様の結果が見出され、Ｔｏｌ−ＤＦ患者は、ｓ−ＣＮＩ群及びＣＡＮ群と比較して、有意により低い割合のＣＤ４＋ＣＤ２５ｉｎｔＴ細胞を有するが、ここでも、Ｔｏｌ−ＤＦと他の研究群との間には、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＴｒｅｇの割合の差異は検出されなかった（図２Ｃ及び２Ｄ）。他の群間の統計的比較は、表５に示されている。本発明者らが、ポリクローナル刺激により誘導された自己Ｔ細胞増殖を抑制する濃縮ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＴ細胞の能力を試験すると、いずれの患者群間又は健常対照間でも有意差は見出されなかった（データ非表示）。更に、Ｔｏｌ−ＤＦ患者は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ２８−又はＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞等の、より高い割合の他の制御性Ｔ細胞サブセットを示さなかった（データ非表示）。
【００７６】
大多数の寛容レシピエントは、検出可能な抗ドナーＨＬＡ特異的抗体を有していなかった。血清非ドナー特異的抗体（ＮＤＳＡ）は、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ分析により、訓練セットの全ての研究群に由来する幾人かの患者で検出可能であった（図３Ａ）。この集団内では、Ｔｏｌ−ＤＦ患者は、検出可能なドナー特異的抗体（ＤＳＡ）を有していなかったが、他の全ての群には、検出可能なＤＳＡを有する患者が幾人か存在し、ＣＲ患者のほとんど半分は、検出可能なドナー特異的及び非ドナー特異的抗ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ抗体を両方とも有していた。訓練セットと同様に、検査セット内の２２人のＴｏｌ−ＤＦ患者中１人のみが、検出可能なＤＳＡを有していた（データ非表示）。興味深いことには、一般的に、ＤＳＡ陽性患者は、ＤＳＡ陰性患者よりも不良な移植機能を有し、推定糸球体濾過率は、ＤＳＡ陰性患者の６０（１３〜９４の範囲）と比較して、ＤＳＡ陽性の患者は３１（１７〜８７の範囲）だった。検出された抗ドナー抗体が病原性である可能性を、訓練セットで試験した（図３Ｂ）。抗クラスＩ抗体を有する２０人の患者中７人、及び抗クラスＩＩ抗体を有する１３人の患者中４人に、本発明者らは、補体結合アイソタイプ（ＩｇＧｌ及びＩｇＧ３）を見出し、残りの陽性ケースは、もっぱら非補体結合アイソタイプだった。ＮＤＳＡ抗クラスＩ及び抗クラスＩＩ抗体の検出は、以前に移植を受けていること、移植の前に検出可能なパネル反応性抗体を有することと有意に関連していた（フィッシャー直接検定、ｐ＜０．０５）。しかし、過去の妊娠、輸血、移植片機能不全、又はＡＣＲの発症とは関連しなかった。対照的に、ＤＳＡ抗クラスＩＩ抗体は、過去のＡＣＲ発症、及びドナーとレシピエントとの間のＨＬＡ不一致の数と関連していた（フィッシャー直接検定、ｐ＜０．０５）。
【００７７】
寛容患者は、より低頻度の直接経路抗ドナーＩＦＮγＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す。直接経路ＣＤ４＋Ｔ細胞抗ドナー応答及び抗第３の個体（ドナーと等しく不一致）応答の比較を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔにより評価した。Ｔｏｌ−ＤＦ患者は、訓練セット内の他の全ての安定患者群と比較して、ドナー特異的低応答性を示す、有意により高い比率の応答抗ドナー頻度：抗第３の個体頻度を示した（図４Ａ；ドナー及び第３の個体に対する個々の応答頻度は、図１０に示されている）。ドナー特異的低応答性は、応答Ｔ細胞に由来するＣＤ２５＋細胞の枯渇が、応答頻度の増加をもたらさなかったため、Ｔｒｅｇにより媒介されなかった（データ非表示）。検査セットのＴｏｌ−ＤＦ群は、ドナーとＨＬＡが完全に一致していた頻度が高かったため、抗ドナー及び抗第３の個体ＩＦＮγ応答は、一般的に非常に低かった（応答頻度＞１／２００，０００）。それにも関わらず、このＴｏｌ−ＤＦ群の抗ドナー応答における傾向は、一般的に再現されたが、他群と比較して有意差は検出されなかった（図４Ｂ）。
【００７８】
寛容レシピエントは、末梢血中で、より高い比率のＦｏｘＰ３及びα−ｌ，２−マンノシダーゼ遺伝子の発現を示した。ＦｏｘＰ３及びα−ｌ，２−マンノシダーゼの全血遺伝子発現レベルは、両方とも移植後の抗ドナー免疫反応性と関連することが示されており（１１）、それをｑＲＴ−ＰＣＲで分析した（図１１）。ＦｏｘＰ３及びα−１，２−マンノシダーゼ発現の比率を計算すると、訓練セットのＴｏｌ−ＤＦ群とＣＲ群とＨＣ群との間に、有意差が検出された（図５Ａ）。最も高い比率を示す患者群は、ＨＣ、ｓ−ＬＰ、及びＴｏｌ−ＤＦだったが、この比率は、ＣＲでは劇的により低かった（Ｔｏｌ−ＤＦ以外の群間比較のマン-ホイットニーＵ検定のｐ値は、表６に示されている）。この比率は、ｅＧＦＲと有意に相関しており、血清クレアチニンと逆相関した（ピアソン係数：それぞれ、０．３７２  ｐ＝０．００２及び−０．２９９  ｐ＝０．０１４、データ非表示）。同じ分析を検査セットで実施すると、Ｔｏｌ−ＤＦ患者での比率は、ＨＣを除く他の全ての患者群での比率より有意に高かった（図５Ｂ）。訓練セット及び検査セットの結果を組み合わせると、寛容は、高い比率の末梢血ＦｏｘＰ３及びα−１，２−マンノシダーゼ発現と関連していることが示される。
【００７９】
寛容患者は、特徴的な遺伝子発現プロファイルを示した。移植研究に焦点をおいて設計されたＲＩＳＥＴ２．０特注マイクロアレイを、５，０６９個のプローブを含むように構築し、末梢血試料中の４６０７個の遺伝子（有効なＥｎｔｒｅｚ遺伝子識別記号）の発現を分析するために使用した。マイクロアレイデータの４階級分析を、訓練セットで実施した（図６）。Ｔｏｌ−ＤＦ患者と他の比較群、安定レシピエント（ｓ−ＣＮＩ、ｓ−ｎＣＮＩ、及びｓ−ＬＰ）、ＣＲ、及びＨＣとの間で検出された有意に変更された遺伝子発現を、１％偽陽性率（ＦＤＲ）で補正したクラスカル−ワリスノンパラメトリック検定（１２）を使用して統計的に決定した。他の研究群と比較して、Ｔｏｌ−ＤＦ患者での免疫抑制の欠如を検討するために、ＨＣ群を、この解析に含めた。２５５個の遺伝子に対応する２６０個のプローブが、研究群間で発現が有意に異なると特定された。同様の解析を検査セットで実施すると、発現が有意に変更された、１３５２個の遺伝子に対応する１，３７８個のプローブが特定され、１７４個のプローブ（１７０個の遺伝子）が、訓練セット及び検査セットの両方に共通していたことが見出された（表７）。
【００８０】
マイクロアレイ発現を、下方制御されるか又は上方制御されるかのいずれかであることが検出されたプローブを含む、リスト内で高位に順位付けられた幾つかのプローブのｑＲＴ−ＰＣＲ分析により検証した。全遺伝子の発現は、両アッセイを使用したところ、高度に相関しており（図１２Ａ〜Ｅ）、選択された遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲで定量化された発現は、研究した遺伝子に依存して、少なくとも１つの他の患者群と有意に異なっていた（図１２Ｆ〜Ｊ）。興味深いことには、全ての選択された遺伝子のＴｏｌ−ＤＦ患者試料中の発現レベル中央値は、訓練セットと検査セットとの間で非常に類似していたが、検査セ
ットのサンプル数がより多かったため、それらの相関係数は一般的により高かった（図１３Ａ〜Ｅ）。更に、Ｔｏｌ−ＤＦ患者の遺伝子発現は、試験した５個の遺伝子のうちの４個については、他群のほとんどと有意に異なっていた（図１２及び１３Ｆ〜Ｊ）。上位に順位付けされたプローブのプローブ発現中央値は、表８に示されている。
【００８１】
本発明者らは、寛容個体と非寛容個体を区別する有用性を有する、遺伝子発現解析に対するより正確な定量的手法の遺伝子発現診断能力を、マイクロアレイ解析により特定された上位順位の遺伝子を、任意の単一遺伝子の任意の重複プローブを除いて（例えば、２位及び４位に順位付けられたＴＣＬ１Ａ、４位に順位付けられたプローブは除く）、ＲＯＣ曲線を構築するための追加の２項回帰モデルに使用して調査した。これらのプローブを使用して、まず予測階級を生成する（試料内）ことにより、したがって各個体の階級化により、Ｔｏｌ−ＤＦ患者を特異的に特定する遺伝子発現特徴を構築した。この解析の場合、２階級ＲＯＣ曲線（寛容対非寛容）は、非寛容比較群のＨＣ群を含むもの及び含まないものの両方を構築した。これをしたのは、健常対照と寛容個体を比較することは、寛容特異的遺伝子発現を特定するためには興味深いが、腎移植患者の寛容に関する臨床診断検査を開発するという状況では、この比較は有用ではないからである。ＨＣを除いて構築され、上位１０位に順位付けられた遺伝子の発現に基づく（表４）対応するＲＯＣ曲線（図６Ａ）は、訓練セット内で、０．０１の閾値でピーク特異性及び感度が１、対応する陽性的中率（ＰＰＶ）及び陰性的中率（ＮＰＶ）が１００％であることをもたらした（ＨＣを含むＲＯＣ；閾値０．２、特異性０．８５３、感度０．９２３）。訓練セット内では、良好な寛容患者の識別をもたらすのに３個の遺伝子及び６個の遺伝子で十分だったが、その後の検査セットのＲＯＣ解析の特異性及び感度を向上させたため、上位１０位に順位付けられた遺伝子を、使用のために選択した（図６Ｂ）。検査セットの試料解析内では、０．３５の閾値で０．８９０の特異性及び０．８０６の感度、それぞれ７１％及び９３％のＰＰＶ及びＮＰＶがもたらされた（ＨＣを含むＲＯＣ；閾値０．２３、特異性０．８０１、感度０．８０６）。
【００８２】
本発明者らは、訓練セットと検査セットとの間で特定された、１７４個の重複するプローブのセットでアノテーション濃縮解析を実施した。アノテーションされた経路と任意の有意な関連性を有することが見出された遺伝子の大部分は、Ｂ細胞関連経路内に濃縮されていた（表９）。これらデータと一致して、１０個の遺伝子に対応する上位１１位に順位付けられたプローブのうち、６個の遺伝子が、Ｂ細胞により発現されると記述されているか、又はＢ細胞機能に関連すると記述されている（表４）。このプローブリスト内で濃縮されたＢ細胞関連経路に加えて、タンパク質チロシンキナーゼ、二次シグナル伝達メッセンジャー分子の産生、及び他のＴ細胞活性化関連経路を含む他の経路も有意だった（表９）。
【００８３】
クロスプラットフォームバイオマーカー診断能力。
材料及び方法の項に記載されている全アッセイを、Ｔｏｌ−ＤＦ患者と他の全ての研究群とを区別するそれらの診断能力に関して、並行して試験した。検査セットで実施したアッセイは、訓練セット内で寛容を高度に予測した。それらは上記で考察されている。寛容の存在を示す種々のバイオマーカーを組み合わせることにより、本発明者らは、任意のそのような個別検査の診断能力を著しく向上させることが可能であると予期した。これは、検査セットで実際に観察された。実際、１）Ｂ／Ｔリンパ球サブセットの比率、２）ＣＤ４＋ＣＤ２５ｉｎｔＴ細胞の割合、３）抗第３の個体ＥＬＩＳｐｏｔ頻度に対する抗ドナーの比率、４）ＦｏｘＰ３／α−１，２−マンノシダーゼ発現の比率、及び５）上位１０位に順位付けられた遺伝子の特徴を使用して、バイオマーカー及びマイクロアレイデータを組み合わせて分析すると、訓練セットの特異性及び感度は、０．０１の閾値で１だった。これは、ＰＰＶ及びＮＰＶが１００％だったことを意味した（図７Ａ）。検査セットを分析すると、０．２７の閾値で、０．９２３のピーク特異性及び０．９０３の感度が得ら
れ、ＰＰＶは８０％、ＮＰＶは９６％だった（図７Ｂ）。これにより、遺伝子発現のみで得られたものと比較して、診断能力が向上した。したがって、クロスプラットフォームバイオマーカー特徴の適用は、遺伝子発現及び表現型解析に加えて、寛容の機械論的基盤の記述とより密接に関連する場合がある個体の免疫学的機能状態を考慮に入れることができるため、真の寛容を特定する能力を向上させた。この点で、患者Ｔ細胞及びＢ細胞応答の研究は有用な手法であり、本発明の中でバイオマーカーとしても使用することもできる。このクロスプラットフォームバイオマーカー特徴の有用性は、知らないうちに実効的寛容である場合がある腎移植患者を特定するその能力にある。図７Ｃ及びＤに示されているように、検査セットの５人の安定レシピエントが、寛容特徴を有すると特定することができ、したがって、管理された免疫抑制離脱から利益を得ることができる。興味深いことには、検査セットの２人のＣＡＮ患者も、寛容である確率が高いと特定された。訓練セットのＣＲ群とは異なり、ＣＡＮ患者は、免疫媒介性拒絶反応を有することが生検により明らかにならならなかったが、不良な移植片機能に基づいて定義されたため、この知見は、慢性拒絶反応の臨床評価の差異により説明することができる。これら患者の検査に使用したクロスプラットフォームバイオマーカーは、これら２つの患者群間の微妙な差異、これら等の患者を経時的に連続して免疫モニタリングすることにより明らかにされる場合がある特性を検出するのに十分な感度を有することが可能である。
【００８４】
統計データ
統計専門家が、訓練セットを使用して、以下の感度及び特異性を計算した；
【００８５】
【表１】
2013526862.tif 000002
【００８６】
その後、検査セットを使用して同じ計算を行った；
【００８７】
【表２】
2013526862.tif 000003
【００８８】
統計専門家が、訓練セットを使用して、表にある遺伝子の感度及び特異性を計算した；
【表３】
2013526862.tif 000004
【００８９】
その後、検査セットを使用して同じ計算を行った；
【００９０】
【表４】
2013526862.tif 000005
【００９１】
最良の予測値並びに良好な一般化可能性を提供する可能性のある遺伝子及び追加バイオマーカーの中で最良のサブセットを選択するために、更なる解析を実施した。最初に、各サイズ（１〜１４個のバイオマーカー）の最良のサブセットを、赤池の情報量基準に基づいて選択した。各サブセットの選択されたバイオマーカーは、下記の表に示されている。
【００９２】
【表５】
2013526862.tif 000006
【００９３】
【表６】
2013526862.tif 000007
【００９４】
２項回帰モデルを、これらサブセットの各々について推定し、検査セット中のオーバーフィッティングを回避するために、交差検定を使用して解の安定性を確立した。図１４には、交差検定の結果が示されている。交差検定の結果は、このモデルが追加マーカーを包含した検査セットの特定の特徴にオーバーフィッティングし始めると考えられるため、最適解が少数のマーカー（例えば、２〜５個、又は好ましくは２〜３個）を含むべきであることを示唆した。
これを確認するために、各サイズの最良のサブセットを含む２項回帰モデルを使用して、ＲＯＣ曲線、並びに訓練セットの対応する最適感度及び特異性を推定した。
【００９５】
【表７】
2013526862.tif 000008
訓練セット
【００９６】
続いて、各サブセットサイズの訓練セットで得られた係数を使用することにより、検査セットの患者の寛容の確率を推定した。これら確率を最適カットオフ（訓練セットでも推定した）と組み合わせて使用して、検査セットの感度及び特異性を計算した。
【００９７】
【表８】
2013526862.tif 000009
【００９８】
これら結果により、交差検定の結果が確認され、個々の患者で最良の寛容確率を予測するために、好ましくは、２、３、４、又は５個のバイオマーカー、より好ましくは２又は３個のバイオマーカーを用いたモデルの使用が支持される。
【００９９】
考察
本発明者らは、様々な程度の免疫抑制下で安定した腎機能を示す患者、慢性拒絶反応を起こす患者、及び健常対照から寛容な腎移植レシピエントを識別する１セットのバイオマーカーを開発した。寛容患者の訓練セットで特定されたバイオマーカーを、独立検査セットで検証した。本発明者ら、非投薬寛容レシピエントの末梢血中のＢ細胞及びＮＫ細胞の増殖を見出した。これは、類似患者のより小さな集団での従来の研究結果に類似している（１３）。また、マイクロアレイ解析は、Ｔｏｌ−ＤＦと他群との間で発現が変更された遺伝子が、明白に及び強力にＢ細胞に偏っていることを明らかにした。特に、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＴＬＲ５、及びＰＮＯＣ遺伝子の組み合わせが、個体の寛容を決定するための非常に有効な検査を提供することが判明した。同種移植片拒絶反応（１４及び１５）及び寛容（１６）の開始及び維持におけるＴ細胞の役割は、明白に確立されているが、Ｂ細胞の役割及びＢ細胞が寛容状態に寄与することができる機序は、まだ解明されていない。興味深いことには、抗ＣＤ４５ＲＢ療法により誘導された、移植寛容に関するネズミ研究は、Ｂ細胞の機構的役割を示している（１７）。また、最近のデータは、未感作Ｂ細胞には、心臓移植のネズミモデルにおいて、抗原特異的同種相互作用後に、移植片拒絶反応を阻害する制御性Ｔ細胞を誘導する能力があることを示している（１８）。Ｂｒ−１（ＩＬ−１０産生Ｂ細胞）の著しい増加は、この研究内のいずれの患者群でも検出されなかったが、本明
細書で示されたデータは、Ｂ細胞移行性集団及び後期記憶集団の比率が変更されたこと、ＴＧＦβ産生細胞が相対的に増加したこと、血清ドナー特異的抗体及びドナー特異的直接Ｔ細胞低応答性が寛容レシピエントに存在しないことを示す。これらの観察は、腎移植寛容が、Ｔ細胞及びＢ細胞媒介性機能の両方の変更と関連している可能性があるという推測を可能にする。しかしながら、腎移植及び骨髄移植混合レシピエントのＢ細胞免疫及びＴ細胞免疫の両方を研究したＰｏｒｃｈｅｒａｙらによる最近の研究は、研究した寛容患者の幾人かでは、Ｔ細胞及びＢ細胞抗ドナー免疫が関連していないことを実証した（１９）。この点において、この研究で寛容腎患者に観察されたＢ細胞特徴は、寛容の促進にＢ細胞が重要な役割を果たすこと示している可能性がある。
【０１００】
機能アッセイを使用して抗ドナー応答をモニターすることにより、直接経路Ｔ細胞の低応答性は、固形臓器移植後に経時的に発生することが実証されている（２０、２１）。臨床の状況では、抗ドナーＴ細胞の頻度を計数することは、ステロイド退薬プロトコールに有用であることが判明している（２２）。本研究では、ＥＬＩＳｐｏｔによる抗ドナー直接経路応答を測定することも、有用であることが判明し、ドナーＴ細胞及び第３の個体のＴ細胞に対する応答の比率を決定することにより、寛容患者のドナー特異的低応答性が明らかになる。しかしながら、この検査は、ドナー及びレシピエントが、幾つかのＨＬＡ不一致を有する場合により有用である。これと同様の研究は、寛容肝臓レシピエント（２３、２４）の遺伝子解析に注目しており、寛容腎臓レシピエント（２５、２６）の遺伝子解析にも注目している。これら研究で発現が異なっていた遺伝子のセットは、本明細書で特定されたものとは異なっており、個体が免疫学的に寛容か否かを決定するにはそれほど効果的ではない。これは、使用した臓器、患者群、ＲＮＡ供給源及び調製プロトコール、又は使用した解析プラットフォームの違いを反映している可能性が高い。実際、この研究で使用したマイクロアレイは、公開及び未公開データの両方に基づき移植用に重点をおいて選択的に設計されており、したがって、かなりの数の免疫応答関連プローブを含んでいた。
【０１０１】
訓練セット内で見出された、最も高位に順位付けされた寛容関連遺伝子のうちの２つ、ＴＣＬＩＡ（順位２位）  ＭＳ４Ａ１（ＣＤ２０）（順位５位）は、両方ともＢ細胞関連遺伝子である。ＭＳ４Ａ１は、寛容腎移植患者に関連することが、以前にＢｒａｕｄら（２５）により特定されている。
【０１０２】
この研究により記述された寛容特徴の考え得る解釈は、検出された免疫学的バイオマーカーは、Ｔｏｌ−ＤＦ群の薬物媒介性免疫抑制の欠如によるものに過ぎないということであり得る。この可能性を検討するために、訓練セットの研究群を、別個の免疫抑制投与計画を受けている安定した腎移植患者、及び免疫抑制を受けていない被験者として健常対照を含むように特に選択した。訓練セットにおいて健常対照とＴｏｌ−ＤＦ群との間に明白な相違が観察されたが、これらの相違は、検査セットでは再現されなかった。この知見は、寛容の機序が、訓練セットとは対照的に、寛容レシピエントがドナーとＨＬＡが高度に一致している検査セット内でよりわずかである可能性があるという事実に起因する可能性がある。これら研究群を全て考慮に入れたため、本明細書に記載したバイオマーカーの組み合わせは、単に免疫抑制がなかったためではなく、移植寛容に特異的な記述であると考えられる。寛容患者及び健常対照の詳細な比較は、寛容の機構論的基盤についてより多くのことを明らかにすることができるが、臨床の状況では、この比較は関連性がないとするのが妥当である。
【０１０３】
興味深い比較は、訓練セットのＴｏｌ−ＤＦ及びｓ−ＬＰ患者群の比較であり、それらは、１０ｍｇ／日のプレドニゾンの使用において異なり、多くの臨床医により疑似生理学的なものとみなされている。ｓ−ＬＰ群は、より高い割合の女性レシピエント、より高い割合の献体ドナー、及びＴｏｌ−ＤＦ群より不良な腎機能を有していた。むしろ直観には
反するが、記載されているアッセイのほとんどで、これら２つの群間に、免疫表現型、抗ドナー応答、ＦｏｘＰ３／α−１，２−マンノシダーゼ比率、及び遺伝子発現の明白な相違があった。これは、ステロイド単独療法が、バイオマーカーにより明らかにすることができる、患者免疫状態の有意差を誘発することができるという概念を支持する。訓練セット内のＴｏｌ−ＤＦ患者のうちの１人は、骨髄供与を受けており、その４年前に同じドナーからの腎移植を受けていた。キメラ現象の証拠が検出されたため、この患者の免疫抑制は、初期に中止された。寛容誘発の機序がこの患者では異なる可能性があったため、バイオマーカー及びＲＯＣ曲線解析は、この患者を含む場合と含まない場合で実施したが、この患者は、研究されたアッセイのいずれでも寛容群内の外れ値として出現することはなかった。
この寛容特徴の有用性は、安全に免疫抑制を離脱することができる移植レシピエントを特定するその能力に依存する。本発明者らは、今や、バイオマーカーの特異的及び高感度のセットを開発した。それらを組み合わせると、寛容腎臓同種移植片レシピエントを特定することができ、免疫抑制剤を受けている幾人かの腎移植レシピエントも特定することができる。これらバイオマーカーの検証は、完全に独立したセットの患者を使用して達成された。この検証は、検査セットが、遺伝的に異なる集団に由来していた事実、並びに検査セット試料及び訓練セット試料の収集及び処理にも相違があったという事実により補強される。バイオマーカーは、臨床設定における決定ツールとして実用化することができる。それは、腎臓同種移植片レシピエントの個別化された安全な臨床的移植後管理を可能にすることができる。
【０１０４】
ＲＴ−ＰＣＲを使用した更なる検証
寛容を決定する本方法を更に検証にするために、本発明者らは、異なる患者群で更なる研究（「ＧＡＭＢＩＴ」研究）を実施した。
【０１０５】
新しい研究群；
寛容患者：１年を超えて完全に免疫抑制を受けておらず、ＣＲＴの上昇が中止前の基線から１０％未満である新しい患者。（ＩＯＴ研究の指標群に相当する）
【０１０６】
安定患者；移植してから５年を超えており、任意の免疫抑制療法で維持されており、過去５年間に全体的な安定した腎臓機能（平均ｅＧＦＲ変化が１５％未満）を示している、安定的機能を示す成人腎移植レシピエント。（ＩＯＴ研究の対照群１、２、及び３に相当する）
【０１０７】
慢性拒絶患者：過去３か月に移植片生検を受けており、免疫主導性の慢性同種移植片腎症を有すると分類された、移植後の１年間を超えて機能不全が増加している成人及び小児腎移植レシピエント（ＩＯＴ研究の対照群４に相当する）。
【０１０８】
この研究では、本発明者らは、以下の患者群から新しい試料を収集した：
安定患者から３３個の試料
慢性拒絶患者から１２個の試料、及び
寛容患者から５個の試料、
健常対照から１個の試料
寛容を喪失した患者から１個の試料。
【０１０９】
ＲＴ−ＰＣＲを、以下のプロトコールを使用して、選択された１０個の遺伝子について実施した。
【０１１０】
ＲＴ−ＰＣＲプロトコール
全血を、末梢静脈から、細胞を溶解しｍＲＮＡを安定化させる溶液を含有する「Ｔｅｍ
ｐｕｓ  Ｔｕｂｅ（商標）」（ＡＢＩ社  カタログ番号：４３４２７９２）に直接収集した。チューブは、使用まで−２０℃で保管した。
【０１１１】
全血ＲＮＡを、ＴｅｍｐｕｓスピンＲＮＡ単離キット（ＡＢＩ社  カタログ番号：４３８０２０４）を使用して抽出した。ｍＲＮＡの量及び品質を、ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して測定した。その後、ＲＮＡを−８０℃で保管した。
【０１１２】
１μｇの全血全ＲＮＡを、ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎ逆転写合成キット（ＡＢＩ社  カタログ番号：４３０４１３４）を使用して、ｃＤＮＡに逆転写し、直ちに使用した。ｃＤＮＡを、３８４ウエルプレート（ＡＢＩ社  カタログ番号：４３０６７３７）の１ウエル当たり２０μｌ反応容積中で、下記に示したプライマー及びプローブを使用してＲＴ−ＰＣＲ解析にかけた。
【０１１３】
【表９】
2013526862.tif 000010
【０１１４】
健常対照に由来する試料中の遺伝子発現のレベルをチェックし、同じ遺伝子の発現が患者由来の全血試料でも検出されることを実証する最初のＲＴ−ＰＣＲステップの後、ＲＴ−ＰＣＲを、この研究の患者ｃＤＮＡで実施した。
【０１１５】
データ前処理ステップ：
・データを読み込み、異なるプレートのデータと統合する。
・プレートタイプの変化（９６ウエルプレート及び３８４ウエルプレート間）によるバッチ効果をチェックする。バッチ効果は見られなかった。
・ウエルを非テンプレート対照でチェックし、プレート汚染の可能性を検出する。
・３５を超えるＣＴ値を未決定とコード化する。
・技術的複製の変動係数をチェックし、３％を超える場合はいかなる場合も警告を喚起する。本発明者は、複製品質が良好であり、懸念の理由はないことを見出した。
・平均値を使用して複製を総計する。
・ｄＣＴを、目的遺伝子とＨＰＲＴ（制御遺伝子）との間のＣＴ値の差として算出する。
・２−ｄＣＴを使用してｄＣＴを再スケーリングして、陽性値のみを得る。
・過剰レベルの未決定発現による遺伝子ＳＬＣ８Ａ１からのデータを排除する。この遺伝子の発現は非常に低く、ＲＴ−ＰＣＲによる検出は不良である。この遺伝子は、外れ値により元々選択された偽陽性だった可能性が高い。
・欠測値を有する患者のデータを排除する（安定患者のみが排除された）。
【０１１６】
データをヒートマップ形式で生成し（非表示）、樹状図は、１０又は３個の遺伝子のいずれかを使用した、患者の教師なし階層的クラスタ分析の結果を示す。１０個の遺伝子の使用は、寛容患者を一緒にグループ化することを支援しないが、交差検定により選択された３個の遺伝子を使用すると、５人の寛容患者が、樹状図の最後の分岐下の右側に一緒にクラスタ化される傾向があることは明らかである。データ非表示。
【０１１７】
３個の遺伝子ＰＮＯＣ、ＳＨ２ＤＢ１、及びＴＬＲ５の発現レベルを示すボックスプロットが示されている。図１５を参照されたい。
【０１１８】
当業者であれば明白であろうが、この３個の遺伝子を組み合わせて寛容患者と非寛容患者を区別する分類指標を生成するには、幾つかの方法が可能である。本発明者らは、本明細書において、２つの分類指標：１）主要及び相互作用効果を用いたロジスティク回帰モデル、及び２）分類ツリーの結果を示す。
【０１１９】
これらモデルのパラメーターを計算するために、本発明者らは、安定患者、慢性拒絶患者、及び寛容患者のデータを使用したが、結果を寛容対非寛容に二分する。
【０１２０】
ロジスティク回帰フィッティングの結果：
【０１２１】
【表１０】
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（２項ファミリーの分散パラメーターは１に設定した）
Ｎｕｌｌ逸脱度：４９の自由度で３２．５０８
残差逸脱度：４３の自由度で１４．８９２
ＡＩＣ：２８．８９２
【０１２２】
「推定」列の係数は、寛容確率を計算するために使用した係数である。ロジスティク回帰分類指標を使用して得られたＲＯＣ曲線については、図１６を参照されたい。図１７は、ロジスティク回帰分類指標を使用して推定された寛容確率のボックスプロットを示す。
【０１２３】
この方法を使用すると、単一の慢性拒絶患者が誤って寛容と分類され、５人の安定患者が寛容と分類され、これは、安定集団の１５％を構成し、免疫抑制離脱に適している可能性のあると予測された２０％以内に入る。
【０１２４】
回帰アルゴリズム：
Ｚ＝−１４．４５７＋９４．１５６＊ＰＮＯＣ＋６．２８９＊ＳＨ２ＤＢｌ＋５．０５４＊ＴＬＲ５−ｌ．５２３＊ＰＮＯＣ＊ＳＨ２ＤＢｌ−５１．５８４＊ＰＮＯＣ＊ＴＬＲ５−２．３３９＊ＳＨ２ＤＢｌ＊ＴＬＲ５
Ｐ（Ｔｏｌ）＝ｅｚ／（ｅｚ＋１）
注意：各遺伝子の発現は２−ｄＣＴとして表されており、ｄＣＴは、各遺伝子と対照遺伝子（ＨＰＲＴ）との間のＣＴの差として計算される。患者は、Ｐ（Ｔｏｌ）が＞０．０６０２である場合、寛容と分類される。
【０１２５】
図１８は、３個の遺伝子（ＰＮＯＣ、ＳＨ２ＤＢ１、及びＴＬＲ５）を用いて推定され
た分類ツリーを示す。分類指標の性能が最適である場合、０より大きな寛容確率を有するあらゆる患者が寛容と分類される。終端ノードのうちの２つが、０より大きな寛容確率と関連した：１）ＴＬＲ５＜３．３７及びＳＨ２ＤＢ１＞１．０２及びＴＬＲ５＜１．５８を示す患者（寛容確率＝０．６００）；及び２）ＴＬＲ５＜３．３７及びＳＨ２ＤＢ１＞１．０２及びＴＬＲ５＞１．５８及びＰＮＯＣ＜０．０４２を有する患者（寛容確率＝０．３３３）。
【０１２６】
図１９は、分類ツリーのカットオフのボックスプロットを示す。
【０１２７】
図２０は、推定分類ツリーの使用からもたらされたＲＯＣ曲線を示す。
【０１２８】
感度、特異性、及びＡＵＣは、０より大きな寛容確率を有するあらゆる患者を寛容と分類することに起因する。図２１は、様々な確率に割り当てられた各群の患者の数を示す。
【０１２９】
１人のＣＲ患者が誤って寛容と分類された（回帰を使用した場合と同じ誤分類）。同様に、５人の安定患者が寛容と分類された。
【０１３０】
これらの結果は、これら３個の遺伝子を使用して、寛容患者と非寛容患者の区別の成功が得られたことを示す。実施の成功は、異なる分類法を使用して達成することができ、それらのうちの２つは、本明細書で例示されている。
【０１３１】
【表１１】
2013526862.tif 000012
表１：訓練セット（ＩＯＴ集団）の臨床及びデモグラフィック特徴
ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ：群ごとの中央値及び四分位範囲が示されている。
a  年齢（年）；ｂ  各群の女性のパーセント；ｃ  移植後の期間（年）；ｄ  ＭＤＲＤ機能を使用した推定糸球体濾過率、ｈｔｔｐ：／／ｎｅｐｈｒｏｎ．ｏｒｇ／ｍｄｒｄ＿ｇｆｒ＿ｓｉ；ｅ  血清クレアチニン値（正常範囲６０〜１０５μｍｏｌ／Ｌ）；ｆ  末梢血リンパ球計数（１Ｌ当たり×１０９細胞）；ｇ  最初の移植を受けた患者のパーセント；ｈ  献体ドナーでの患者のパーセント；ｉ  ドナー及びレシピエント間のＨＬＡ  Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲ、及びＤＱ不一致の数の中央値（最大１０）；ｊ  試料収集時にＣＮＩを受けていた患者数；ｋ  ミコフェノール酸モフェチルを受容していた患者の数；ｌ  アザチオプリンを受容していた患者の数；ｍ  ステロイドを受容していた患者の数；ｎ  抗体
誘発療法により治療された患者の数。ＨＣ、健常対照；Ｔｏｌ−ＤＦ、寛容薬物非投与
【０１３２】
【表１２】
2013526862.tif 000013
表２：訓練セット（ＩＯＴ集団）のＴｏｌ−ＤＦ患者の臨床及び病歴の要約。
ａ  年齢（年）；ｂ  移植後の期間（年）；ｃ  ＭＤＲＤ機能を使用した推定腎糸球体濾過率、ｈｔｔｐ：／／ｎｅｐｈｒｏｎ．ｏｒｇ／ｍｄｒｄ＿ｇｆｒ＿ｓｉ；ｄ  末梢血リンパ球計数（１Ｌ当たり×１０９細胞）；ｅ  ドナー及びレシピエント間のＨＬＡ  Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲ、及びＤＱ不一致の数（最大１０）；ｆ  患者が全ての免疫抑制剤を受容していない年数；ｇ  移植回数；Ｔｒ：複数の移植前輸血を受けていた患者；ＰＲＡ、パネル反応性抗体  ｐｒｅＴｘ：ＰＲＡ＞移植前に記録された１％；Ｐｅａｋ  ＰＲＡ：任意の既往ＰＲＡ＞記録された１％；ＡＣＲ  ＩＩＡ：生検で確認されたＢａｎｆｆスコアＩＩＡの急性細胞性拒絶反応の１発症。Ｎ／Ｄ：データなし。
【０１３３】
【表１３】
2013526862.tif 000014
表３：検査セット（ＩＴＮ集団）の臨床及びデモグラフィック特徴
ａ、ｃ、ｄ、ｅ：中央値及び四分位範囲は示されている。a  年齢（年）；ｂ  女性のパーセント；ｃ  移植後の期間（年）；ｄ  血清クレアチニン値（正常範囲６０〜１０５μｍｏｌ／Ｌ）；ｅ  白血球数（１Ｌ当たり×１０９細胞）；ｆ  移植を初めて受けた患者のパーセント；ｇ  ドナー及びレシピエント間のＨＬＡ  Ａ、Ｂ、及びＤＲ不一致の数の中央値（最大６）。ＨＣ、健常対照；Ｔｏｌ−ＤＦ、寛容非薬物投与；Ｍｏｎｏ、単独療法；ｓ−ＣＮＩ、安定カルシニューリン阻害剤；ＣＡＮ、慢性同種移植片腎症。
【０１３４】
【表１４】
2013526862.tif 000015
表４：訓練セット及びそれらのアノテーション濃縮内の上位に順位付けられた有意な遺伝子のリスト。
灰色で網掛けした遺伝子は、Ｂ細胞関連遺伝子であることを示す。Ｔｏｌ−ＤＦによる相対的発現；Ｔｏｌ−ＤＦ群による相対的な遺伝子発現上方制御（↑）又は下方制御（↓）（表８に示されている各群の遺伝子発現の倍数差の中央値）
【０１３５】
【表１５】
2013526862.tif 000016
表５：フローサイトメトリーにより末梢血リンパ球サブセットの構成比を分析した際に、訓練セット及び検査セットの非寛容患者群間で実施されたマン−ホイットニーＵ検定の両側ｐ値。
【０１３６】
【表１６】
2013526862.tif 000017
表６：両研究集団の非寛容な患者群間のＦｏｘＰ３及びα−１，２−マンノシダーゼ発現の計算された比率に対して実施したマン−ホイットニーＵ検定の両側ｐ値。
【０１３７】
表７：４階級分析後に研究群による発現が有意に異なることが特定された訓練セット及び検査セットの両方に共通する１７４個のプローブのリスト。１％の偽陽性率（ＦＤＲ）で補正したクラスカル−ワリス検定によるｐ値で順位付けした。
【表１７−１】
2013526862.tif 000018
【表１７−２】
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【表１７−３】
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【表１７−４】
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【表１７−５】
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【０１３８】
【表１８】
2013526862.tif 000023
表８：訓練セットの患者群で検出された発現が異なるプローブの発現における対数倍数変化（ｌｏｇ−ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）の中央値（全試料の中央値と比較して）、１％ＦＤＲで順位付けした。有意な識別的発現が検出された全ての遺伝子についての、訓練セット及び検査セットの各患者群の発現倍数を示すプロットは、オンライン資料で入手可能である。安定；混合群ｓ−ＣＮＩ、ｓ−ｎＣＮＩ、ｓ−ＬＰ。
【０１３９】
【表１９】
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表９：有意に異なる発現を示し、訓練セット及び検査セットと共通した遺伝子のアノテーション濃縮。列挙されている遺伝子は、列挙されているアノテーション付経路と有意に関連していると特定された遺伝子である。網掛けした列は、Ｂ細胞関連経路であることを示す。
【０１４０】
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【図１】
2013526862.tif 000025
【図２】
2013526862.tif 000026
【図３】
2013526862.tif 000027
【図４】
2013526862.tif 000028
【図５】
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【図６】
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【図７】
2013526862.tif 000031
【図８】
2013526862.tif 000032
【図９】
2013526862.tif 000033
【図１０】
2013526862.tif 000034
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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