(57)【要約】  この発明は、微生物によって引き起こされる病原性感染を、処置し、軽減し、又は予防するために有用な化合物を特定する方法、並びに、前記作用を有する化合物を特定するためのＰｑｓＤタンパク質又はその機能的断片もしくは変異体の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物によって引き起こされる病原性感染を処置し、軽減し、又は予防する化合物を特定する方法であって、
その方法が、
ａ）ｐｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体を提供する工程、
ｂ）ｐｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体を試験化合物と接触させる工程、
ｃ）試験化合物のｐｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体への結合を決定する工程を含んでなり、
上記において、試験化合物がｐｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体に結合するときに、試験化合物を、病原性感染を処置し、軽減させ、又は予防するために有用な可能性のある化合物として特定することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
試験化合物のｐｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体への結合を決定することが、ＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体の活性を決定することを含んでなり、ＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体の活性の低下が前記試験システムにおいてコントロールと比較して検出されるときに、試験化合物を、病原性感染を処置し、軽減させ、又は予防するために有用な可能性のある化合物として特定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体が、シュードモナス種、特にシュードモナス・エルジノーサに由来する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体の活性を、ＰｑｓＤタンパク質の基質の生成物への変換を測定することによって決定する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記基質がアントラニロイル−ＣｏＡ及び／又は３−オキソ−（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸であり、そして生成物が４−ヒドロキシ−２−（Ｃ1−Ｃ20）アルキルキノリンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
３−オキソ−（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸が、３−オキソデカン酸であり、生成物がＨＨＱ（４−ヒドロキシ−２−ヘプチルキノリン）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アントラニロイル−ＣｏＡが、２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ又はその機能的断片若しくは変異体の使用によってアントラニル酸から合成される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法がインビトロでの方法である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が自動化フォーマット、特にハイスループットフォーマットにおいて行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
微生物によって引き起こされる病原性感染を処置し、軽減し、又は予防するために有用な化合物を特定するための、ｐｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体の使用。
【請求項１１】
微生物がバイオフィルムを形成する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法、又は請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
バイオフィルムが、カテーテル、薬剤、薬物ポンプ、又はプロステーシスの上、又はそれらの中に形成される、請求項１１に記載の方法又は使用。
【請求項１３】
微生物が、シュードモナス、特にシュードモナス・エルジノーサである、請求項１〜９、１１若しくは１２のいずれか１項に記載の方法、又は請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
薬剤を製造する方法であって、
その方法が、
ａ）請求項１〜９、又は１１〜１３のいずれか１項に記載の方法を行って、試験化合物を特定する工程、
ｂ）十分な量の試験化合物を提供する工程、
ｃ）試験化合物を製薬学的に許容される担体又は補助物質と製剤化する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項１５】
請求項１又は請求項１１〜１３のいずれか１項に定義されている、微生物によって引き起こされる病原性感染の処置において使用するための２−［（２−フェノキシビフェニル−４−カルボニル）アミノ］安息香酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、病原性感染に関連する化合物を特定する方法、並びに病原性感染に関連する化合物を特定するためのＰｑｓＤタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌における細胞間コミュニケーション又は細胞間シグナル伝達は、“クオラムセンシング（ＱＳ）（quorum sensing（QS））”とも呼ばれ、細菌集団における遺伝子発現のコーディネーションを可能にしている。このコミュニケーションは、細胞外領域に放出される拡散性シグナル分子の形成に依存しており、その領域では、それらが特定の閾値を超えるとすぐに、それらはＱＳ依存性標的遺伝子の発現のコーディネートされた変化をもたらす。クオラムセンシングによって調節されるグラム陽性及びグラム陰性細菌の知られている作用は、プラスミドの運動の上昇、バイオフィルムの形成及び病原性の増強である（非特許文献１）。新規な抗感染症薬の可能性のあるアプローチとしてのＱＳ阻害剤の開発は、時々刻々、頻繁に研究されている（非特許文献２）。
【０００３】
日和見性病原体である緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は、軽微な外部感染から、特に免疫不全及び嚢胞性線維症患者における重篤な生命を脅かす疾患に至るまでの多くの院内感染の原因病原体である。しばしば長引くコロニー形成及び長期間の肺損傷によって引き起こされた肺感染は生命を脅かす可能性があり、しかしどんな場合でも患者の回復を長引かせ、その結果ヘルスシステムに更なるコストを生じさせることになりうる。緑膿菌によって排出された多くの異なる病原性因子の大部分の産生は、小分子クオラムセンシングによって制御される。多くの細菌の中に広く存在しているアシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）基のほかに、緑膿菌及び種々の関連種は、病原性因子の発現を調節するために、キノリン環上の種々の置換基によって、並びに二次的作用（例えば、抗菌性）によって異なる、広範囲の種類の２−ヒドロキシ−４−アルキルキノリン（ＨＡＱ）を使用している。調節目的のためには、シュードモナス菌のキノリンシグナル（ＰＱＳ）及びその直接的な前駆体である２−ヒドロキシ−４−ヘプチルキノリン（ＨＨＱ）（図１）は最も重要である。
【０００４】
キノリン核はすべてのこうした化合物に共通である。生合成はアントラニル酸を前駆体として用い、そしてそれをキノリン核を生じさせるβ−ケトカルボン酸と縮合し、ｐｑｓＡＢＣＤＥオペロンによってコードされる酵素によって媒介されているものと考えられる。ｐｑｓＡは、アントラニル酸ＣｏＡリガーゼ（anthranilate CoA ligase）をコードし、一方ｐｑｓＢ、Ｃ及びＤは、タイプＩＩＩのβ−ケト−アシル輸送タンパク質シンターゼと似ているタンパク質をコードする。ＰｑｓＥは、ＨＡＱｓの生合成に関与していない。このＰＱＳ刺激は、ＬｙｓＲ−タイプ転写レギュレーターＰｑｓＲ（LysR-type transcriptional regulator PqsR）（ＭｖｆＲとも呼ばれる）によって媒介される。緑膿菌のｐｑｓＲ変異体は、種々の宿主モデルにおいて病原性の低下を示すものと説明されている（非特許文献３）。極めて同様な作用が、ハロゲン化されたアントラニル酸アナログを緑膿菌培養物に入れることによって得られる可能性があり、上記によってＨＡＱ生合成が阻害され、その結果ＰｑｓＲ依存性遺伝子発現が破壊される（非特許文献４）。こうした結果から、緑膿菌におけるＨＡＱ生合成の標的阻害が治療に有益でありうることが示唆されている。
【０００５】
ＨＨＱ生合成に不可欠な遺伝子は不活性化実験から知られているけれども（ｐｑｓＡＢＣＤ）、ＨＨＱ生合成の生化学的方法は今日まで実験的に解析されていない。図２は、提案されているＨＨＱ生合成スキームを示している。ＰｑｓＢ、ＰｑｓＣ及びＰｑｓＤの作用の正確な機序が知られていないことが明らかになっている。
【０００６】
重篤な緑膿菌感染症は処置するのに困難である。通例、多くの菌株、特にヘルスケア施設で取得されたものは多くの抗生物質に耐性があるので、抗生物質の組み合わせが必要である。一連の医薬が、細菌、及び具体的には緑膿菌感染症の処置のために知られている。しかしながら、副作用及び耐性が公知の抗菌性薬剤に伴う共通の問題点である。これによって、抗菌治療のための新規なアプローチ及び標的が依然として必要であることがわかる。
【０００７】
これまで、ＨＨＱ及び他のＨＡＱｓの合成におけるＰｑｓＤタンパク質の正確な役割は特定されていない。その上、これまで有用な、特に病原性感染を処置し、軽減させ、又は予防するためのＰｑｓＤ阻害剤は、当技術分野では特定されていない。微生物のクオラムセンシングに関連する病原性感染を標的にすることは、適切な試験システム及びスクリーニングアッセイが存在しないため依然として制限されている。
【０００８】
驚くべきことに、ＰｑｓＤタンパク質が、基質であるアントラニロイルＣｏＡ（anthraniloyl-CoA）及び３−オキソデカン酸に起源するクオラムセンシングの重要なレギュレーターであるＨＨＱの生合成を触媒する単独酵素として十分であることが現在見出された。更に、ＨＨＱの合成がインビトロで行なわれうることが見出されている。この新規なアッセイによって、ＨＨＱ生合成の阻害剤のインビトロスクリーニングが可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Deziel E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101: 1339-1344
【非特許文献２】Ni N. et al., Med. Res. Rev. 2009; 29: 65-124
【非特許文献３】Cao H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98: 14613-14618
【非特許文献４】Lesic B. et al., PLoS Pathog. 2007; 3: 1229-1239
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、この発明は、第一の局面では、微生物によって引き起こされる病原性感染を処置し、軽減させ、又は予防する化合物を特定する方法であって、
その方法が、
ａ）ｐｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片（functional fragment）若しくは変異体を提供する工程、
ｂ）ｐｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体を試験化合物と接触させる工程、
ｃ）試験化合物のｐｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体への結合を決定する工程を含んでなり、
上記において、試験化合物がｐｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体に結合するときに、試験化合物を、病原性感染を処置し、軽減させ、又は予防するために有用な可能性のある化合物として特定することを特徴とする、前記方法を提供する。
【００１１】
この発明は、本発明の第二の局面では、試験化合物のｐｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体への結合を決定することが、ＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体の活性を決定することを含んでなり、試験化合物がこの試験システムにおいて、コントロールと比較して、ＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体の活性の低下が検出されるときに、試験化合物を、病原性感染を処置し、軽減させ、又は予防するために有用な可能性のある化合物として特定する方法を提供する。
【００１２】
この発明の第一及び第二の局面の試験システムは、ＨＡＱｓの生合成、特にＨＨＱの生合成、又はＰＱＳの生合成に関与するメカニズムを解明するために使用することができる。具体的には、この試験システムは、ＨＡＱの生合成、特にＨＨＱの生合成、又はＰＱＳの生合成の阻害に関与している、あるいは病原性感染に関連している、あるいは病原性感染を処置し、軽減させ、又は予防するために有用である化合物を開発し、特定し、及び／又は特徴付けるために使用することができる。こうした化合物は、ＰｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質、又はその断片若しくは変異体と相互作用し、特にそれらを不活性化する。特定された化合物は、病原性感染の処置に使用することができる注意を引き付ける治療薬でありうる。
【００１３】
用語“微生物によって引き起こされる病原性感染（pathogenic infection caused by a microorganism）”は、その宿主において疾患を引き起こす感染性微生物による感染を含む。感染は、外来種による宿主微生物の有害なコロニー形成である。感染では、感染微生物（infecting organism）は、通例、宿主を犠牲にして増殖するために宿主の資源を活用しようとする。感染微生物は、宿主の正常な機能を妨害し、そして慢性的な傷、壊疽、感染した手足の喪失、及び死さえもたらしうる。感染に対する宿主の反応は炎症である。この発明では、感染する微生物は、クオラムセンシング分子によって制御される病原性因子の産生によって感染を媒介するクオラムセンシングを含み、かつ利用する。クオラムセンシングを利用する微生物は、シュードモナス属、バークホルデリア属、アルテロモナス属、ストレプトミセス属、ビブリオ属などの種に属する。クオラムセンシング分子は、ペプチド及びＮ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）からフラノン及びＨＡＱｓに至り、化学的に多様である。従って、この発明の実施態様では、この発明の方法に従って特定される化合物によって処置され、軽減され、又は予防される病原性感染は、クオラムセンシング分子であるＨＡＱｓを含む微生物によって引き起こされる。好ましい実施態様では、この微生物は、クオラムセンシング分子である、４−ヒドロキシ−２−アルキルキノリン［ここで、アルキル鎖は、例えば、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル又はウンデシル基である］、好ましくは、ＨＨＱを産生する。更なる好ましい実施態様では、このＨＨＱ分子は、ＰｑｓＤタンパク質によって産生される。更なる好ましい実施態様では、この微生物は、シュードモナス属、又はバークホルデリア属又はアルテロモナス属の種であり、更に好ましくは、シュードモナス属の種であり、特に緑膿菌である。
【００１４】
緑膿菌は、細菌のガンマプロテオバクテリア綱のメンバーである。これは、細菌科（bacterial family）、シュードモナス科（シュードモナダセエ：Pseudomonadaceae）に属するグラム陰性好気性桿菌である。保存的マクロ分子（例えば、１６Ｓ リボソームＲＮＡ）に基づく修正主義者の分類学以後、この科には、単に８つのグループに分かれるシュードモナス属（genus Pseudomonas）のメンバーが含まれる。緑膿菌は、他に１２のメンバーを含むそのグループのタイプ種である。属の他のメンバーのように、緑膿菌は土壌及び水中で通例見出される自由生活性細菌（free-living bacterium）である。緑膿菌は、臨床的関連で拡大している日和見性病原体としてますます認識されるようになっている。緑膿菌は日和見性病原体であり、これは宿主側の防御の休止を利用して感染を開始することを意味する。実際に、緑膿菌はヒトの日和見性病原体の典型である。細菌は、非易感染性組織（uncompromised tissues）に感染することはほとんどないが、それにもかかわらず、組織側防御がある種の形で易感染性である場合には、それが感染しえない組織はほとんどない。これは、特に重篤な熱傷に罹患している患者、及び免疫不全である癌及びＡＩＤＳ患者において、尿路感染症、呼吸系感染症、皮膚炎、軟組織感染症、菌血症、骨及び関節感染症、消化器系感染症及び種々の全身感染症を引き起こす。緑膿菌感染は一般に、長期間の抗生物質治療の使用にもかかわらず、長く持続する。このことは、一つには、緑膿菌がエキソポリサッカライドマトリクスに埋め込まれた細菌集団から成る抗生物質抵抗性のバイオフィルムを形成するという事実によるものである。緑膿菌によって引き起こされるもう一つの問題は、ヒトの体の中で留置メディカルデバイス上にバイオフィルムが形成されることに関連していると理解されていることである。従って、好ましい実施態様では、緑膿菌によって引き起こされるあらゆる疾患は、この発明の意味で、処置され、軽減され、又は予防される。
【００１５】
一実施態様では、上記に定義した感染微生物は、感染個体内で微生物バイオフィルムを形成する。バイオフィルムは、肺などの、微生物によってコロニーが作成される器官内に発生する場合がありうる。バイオフィルムはまた、カテーテル、埋め込み型薬物送達システム、又は、コンタクトレンズ、中心静脈カテーテル及びニードルレスコネクター（needleless connectors）、気管内チューブ、子宮内避妊器具、人工心臓弁（mechanical heart valves）、ペースメーカー、腹膜透析カテーテル、人工関節（prosthetic joints）、中耳腔換気用チューブ、尿道カテーテル、及びボイスプロステーシス（voice prostheses）を含むプロステーシス（prothesis）又はインプラントなどの留置するメディカルデバイスの上、又はそれらの中にも生じる場合もありうる。バイオフィルムは、細胞が互いに、及び／又は表面に付着する微生物の集合体である。こうした付着した細胞は、細胞外高分子物質（extracellular polymeric substance（ＥＰＳ））が自己生産したマトリクス内に頻繁に埋め込まれる。スライム（slime）とも呼ばれる、バイオフィルムＥＰＳは一般に、細胞外ＤＮＡ、タンパク質、及びポリサッカライドから構成される種々の形状の高分子集塊である。バイオフィルムは、生きているか、又は生きていない表面上に形成されえ、そして自然的な、工業的な、及び病院のセッティング中、微生物生命の通常よく見られる状態である。留置されているメディカルデバイスに接しているバイオフィルムは、グラム陽性菌、又はグラム陰性菌でも、あるいは酵母から構成されうる。こうしたデバイスから一般的に単離された細菌には、グラム陽性菌である、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、及びストレプトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridans）；及びグラム陰性菌である、エッシェリキア・コリ（Escherichia coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、及びシュードモナス・エルジノーサ（緑膿菌：Pseudomonas aeruginosa）が含まれる。こうした微生物は、患者又は医療従事者の皮膚、入口が曝されている水道水、又は他の環境における起源に由来しうる。バイオフィルムは、デバイス及び患者のその使用継続期間に応じて単一種又は多数の種から構成されうる。カテーテルは、体腔、導管、又は管に挿入することができるチューブである。それによって、カテーテルは、排液、液体注入、又は外科器具によるアクセスを可能にする。大部分の使用の場合、カテーテルは、薄い、しなやかなチューブ（“軟性（soft）”カテーテル）であるが、但しある種の使用では、カテーテルはより大きく、硬質（solid）（“ハード（hard）”）カテーテルである。一時的に、あるいは恒久的に体内に残しておくカテーテルは、留置するカテーテルと呼ばれうる。恒久的に挿入されたカテーテルは、パームキャス（permcath）と呼ぶ場合もある。体の特定の部分中へのカテーテルの配置によって、膀胱からの排尿；腎臓からの排尿；液貯留の排出などが可能になる。埋め込み型薬物送達システムは、薬物を送達するために使用するデバイスである。実例としては、慢性疼痛又は重篤な痙攣の処置の���めの薬物又は薬物ポンプがある。薬物送達システムは当技術分野で知られている。プロステーシス（prosthesis）は、欠落した体の部分に取って代わる人工補充部分（artificial extension）である。プロステーシスは通例、損傷によって失われた部分、又は生まれたときから欠落している部分に取って代わるために、あるいは欠陥のある体の部分を補充するために使用される。体外のプロステーシスは、体外プロステーシス（exoprostheses）と呼ばれ、一方、体の内部のプロステーシスは、体内プロステーシス（endoprostheses）又はインプラント（埋め込み物）と呼ばれる。人工股関節又は膝プロステーシス（knee prostheses）は、古典的な体内プロステーシスであり、これはインプラントとも呼ばれる場合もある。体から突き出ているオープンインプラント（open implant）とは対照的に、完全に体によって囲まれているクローズドインプラント（closed implant）が知られている。最も有名なインプラントは、歯科インプラントである。体組織の内部では、人工心臓弁が人工心臓及び人口肺と共に通例使用されており、そして活発な技術進歩のもとにある。プロステーシスと見なされうる他のメディカルデバイス及び補助器具には、人工眼球、口蓋塞栓子、胃バンド（gastric bands）及び義歯が含まれる。現在まで、プロステーシス及びインプラントなどの留置メディカルデバイス上のバイオフィルムは、体からデバイスを除去すること、デバイスから汚れを取り除くこと（例えば、熱滅菌）、及び体の中にデバイスを再び導入することによって除去することのみを行なうことが可能である。従って、本発明の実施態様では、化合物は、器官内、あるいは上記に言及したような留置するデバイス上又は留置するデバイス内にバイオフィルムを形成し、ＰｑｓＤタンパク質を含む感染性微生物によって引き起こされる病原性感染を、処置し、軽減し、又は予防するために特定される。好ましくは、バイオフィルムは、唯一の、又は更なる成分として、シュードモナス種、特に緑膿菌を含む。
【００１６】
用語“病原性感染を処置し、軽減し又は予防すること（treating, reducing or preventing a pathogenic infection）”は、最も広い意味で使用され、治療処置と、予防又は防止手段の双方を意味し、上記においてその目的は、標的とする病的な状態又は障害を防止し、又は緩和させることである。より詳細には、処置し、軽減し又は予防することは、病原性感染の病状の進行を防止し、あるいは病原性感染の病状を変化させる意図をもってなされる介入である。
【００１７】
この発明の第一及び第二の局面の方法の第一工程では、ＰｑｓＤタンパク質、又はその機能的断片若しくは変異体が提供される。シュードモナス菌（Pseudomonas）では、ＰｑｓＤはキノロンシグナル生合成酵素として機能する。シュードモナスキノロンシグナル（ＰＱＳ）である２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロンは、日和見性病原体である緑膿菌によって産生される細胞内アルキルキノロンシグナル伝達分子である。ＰＱＳは、トリプトファン経路の中間体である、アントラニラート（anthranilate）から合成される。アントラニラートは、４−ヒドロキシ−２−ヘプチルキノリンを含む多くのＨＡＱｓを作り出すのに関与しており、あるいは、そうでない場合には、中間のＰＱＳ前駆体、２−ヘプチル−４−キノロン（ＨＨＱ）と呼ばれている、ｐｑｓＡＢＣＤＥオペロンによってコードされる酵素及びＰｑｓＨによってＰＱＳに変換される。エキスポートされたＨＨＱ（Exported HHQ）は、隣接する細菌細胞によって取り込まれ、そしてＰｑｓＨによってＰＱＳに変換される（モノオキシゲナーゼが想定される）。これに加えて、ＰＱＳは、ＰｑｓＲ（ＭｖｆＲ）との直接的相互作用を介してｐｑｓＡＢＣＤＥの発現を推進することによってそれ自身の産生を調節する。唯一の生化学的に特徴付けられる反応では、ＰｑｓＡは、それがＰｑｓＤのＣｙｓ１１２に転送される、アントラニラートをＰｑｓＤ活性部位に往復して輸送する（shuttle）活性化されたアントラニロイル−ＣｏＡチオエステルを形成する。次いで、アントラニロイル−ＰｑｓＤとマロニル−ＣｏＡ又はマロニル−ＡＣＰ（第二のＰｑｓＤ基質）間で縮合が起こり、２，４−ジヒドロキシキノリン（ＤＨＱ）を形成する。しかしながら、ＰｑｓＤがＰＱＳなどの他のアルキルキノロンの生合成において果たしている役割は、依然として不明のままである。ＰｑｓＤ−アントラニラート共有結合中間体、及びアントラニラートと複合した、不活性な、Ｃｙｓ１１２Ａｌａ活性部位の変異体のキャラクタリゼーションを含めて、酵素のいくつかの結晶構造を含むＰｑｓＤの構造的及び生物物理学キャラクタリゼーションが報告されてきた。このキャラクタリゼーションによって、ＰｑｓＤは、ＦａｂＨ及び脂肪酸のカルコンシンターゼファミリー及びポリケチドシンターゼに構造的に似ていることが示された。この結晶学的に非対称ユニットは、ＰｑｓＤダイマーを含む。ＰｑｓＤモノマーは、２つのほとんど同一な、およそ１７０残基のアルファベータアルファベータアルファ（αβαβα）ドメイン（alphabetaalphabetaalpha domains）から構成されている。この構造は、アントラニラートによってリガンドされた（anthranilate-liganded）Ｃｙｓ１１２が、およそ１５Åの長さのチャネルの下部にタンパク質インテリア（protein interior）中深く位置し、一方、第二のアントラニロイル−ＣｏＡ分子は、タンパク質表面に繋がっている裂け目にウェイティング（waiting）していることを示している。Ｃｙｓ１１２、Ｈｉｓ２５７及びＡｓｎ２８７は、ＰｑｓＤのＦａｂＨ様触媒三残基を形成する。Ｃ１１２Ａ変異体は、アントラニロイル−ＣｏＡに依然として可逆的に結合するが、不活性である。更に、ＰｑｓＤ活性部位空洞が、ＨＨＱの形成に必要であるであろう３−オキソデカノ��ル−ＡＣＰなどの基質を処理するには不十分であるようであることが報告されている。それ故、彼らは、ＰｑｓＤは、ＨＨＱの生合成に関与していない可能性があることと結論付けている（Bera A.K. et al., Biochemistry 2009; 48: 8644-8655）。
【００１８】
ＰｑｓＤ配列は、アクセッション番号 ＡＢＪ１０１６３．１（配列番号：１（SEQ ID NO: 1））のもとで、ＮＣＢＩ（National Centre for Biotechnology Information; National Library of Medicine 38A, Bethesda, MD20894, USA; www.ncbi.nih.gov）から入手可能である。このタンパク質は、３３７アミノ酸から成る（最初のメチオニン残基を含む）。緑膿菌 ＵＣＢＰＰ−ＰＡ１４のコンプリートゲノムが、シーケンシングされた。この配列は、アクセッション番号 ＮＣ＿００８４６３のもとでＮＣＢＩから入手可能である：このｐｑｓｄ遺伝子は、アイデンティフィケーション（識別）番号 GeneID：４３７９９８３のもとで特定される。緑膿菌 ＵＣＢＰＰ−ＰＡ１４は、熱傷患者から得られた、様々な遺伝的に扱いやすいモデル宿主及びマウスにおいて病原性を示す臨床分離株である。
【００１９】
驚くべきことに、ＰｑｓＤタンパク質が、アントラニロイル−ＣｏＡと３−オキソデカン酸が反応してＨＨＱになる反応を触媒するのに、ＰｑｓＢ又はＰｑｓＣなどの更なる酵素を必要とせずに、唯一の酵素として適しており、十分であることが現在見出された。この発明の意味では、ＰｑｓＤタンパク質は、それが自然的条件下にて、好ましくは、アントラニロイル−ＣｏＡと３−オキソアルカン酸が反応して４−ヒドロキシ−２−アルキルキノリンへ変換すること、より好ましくは、アントラニロイル−ＣｏＡと３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸が反応して４−ヒドロキシ−２−（Ｃ1−Ｃ20）アルキルキノリンへ変換すること及び最も好ましくは、アントラニロイル−ＣｏＡと３−オキソデカン酸が反応してＨＨＱへ変換することを触媒するあらゆる反応を触媒する。
【００２０】
ＨＡＱｓとして文献中に明示されている、少なくとも５つの異なったクラス（すなわち、クラスＡ〜Ｅ）の構造的に関連する分子が存在する。これらの生合成は、とりわけ、ｐｑｓＡＢＣＤＥオペロンの発現によって調節されている。この発明の方法によって生成される最も好ましい分子であるＨＨＱ分子は、ＨＡＱ分子のＡ系列に属する。ＨＡＱ分子は、４−ヒドロキシ−２−アルキルキノリンである。ＨＨＱは、キノリン環構造の２の位置にヘプチル基を持っていることによって特徴付けられる。Ａ系列の他の知られているＨＡＱｓは、キノリン環構造の２の位置でのペンチル、ヘキシル、オクチル、ノニル又はウンデシル基によって、ＨＨＱと異なっている。Ａ系列のＨＡＱｓの提案されている生化学的経路は、図２に提示されている。それによって、アントラニロイル−ＣｏＡと３−オキソアルカン酸が、異なる長さのアルキル鎖がキノリン環構造の２の位置にあるＨＡＱに変換されることが提案されている。これは、アントラニロイル−ＣｏＡ及び３−オキソデカン酸の変換によってキノリン環構造の２の位置にＣ7のアルキル鎖をもつＨＨＱとなることが例示的に示されている。すなわち、この発明の文脈では、環構造の２の位置でのアルキル鎖の長さだけがＨＨＱと異なっているＨＡＱ分子が含まれている。従って、ＨＡＱ分子のアルキル鎖は、１〜２０の炭素原子から成り、より好ましくは５〜１１の炭素原子、そして最も好ましくは５、６、７、８、９又は１１の炭素原子から成る。このアルキル鎖は、飽和していても、それとも不飽和であってもよく、好ましくは、それらは飽和している。このアルキル鎖は、直鎖状のアルキル鎖であっても、それとも分岐鎖状のアルキル鎖であってもよい。それらには、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（デュオデシル：duodecyl）、トリデシル（トレデシル：tredecyl）、テトラデシル（クアトルデシル：quattordecyl）、ペンタデシル（クインデシル：quindecyl）、ヘキサデシル（セスデシル：sesdecyl）、ヘプタデシル（セプトデシル：septdecyl）、オクタデシル（オクトデシル：octdecyl）、ノナデシル（ノンデシル：nondecyl）又はエイコシルがありえ、それらには立体異性コンホメーションはすべて属しうる。それらは、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン、デシレン、ウンデシレン、ドデシレン（デュオデシレン：duodecylen）、トリデシレン（トレデシレン：tredecylen）、テトラデシレン（クアトルデシレン：quattordecylen）、ペンタデシレン（クインデシレン：quindecylen）、ヘキサデシレン（セスデシレン：sesdecylen）、ヘプタデシレン（セプトデシレン：septdecylen）、オクタデシレン（オクトデシレン：octdecylen）、ノナデシレン（ノンデシレン：nondecylen）又はエイコシレンがありえ、それらには、立体異性コンホメーションはすべて属しうる。
【００２１】
アントラニロイル−ＣｏＡ及び３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸の変換によって、キノリン環構造の２の位置でアルキル鎖の長さが、基質３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸の長さに対して３個の炭素原子だけ減少するＨＡＱ分子になるということは注目すべきである。その結果、３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸を用いる場合には、その生成物は、４−ヒドロキシ−２−（Ｃ1−Ｃ20）アルキルキノリンである。アントラニロイル−ＣｏＡを、３−オキソデカン酸と反応させると生成物ＨＨＱが生じる。
【００２２】
好ましくは、この発明により含まれるＰｑｓＤタンパク質は、シュードモナス種に、より好ましくは緑膿菌、そして最も好ましくは緑膿菌 ＵＣＢＰＰ−ＰＡ１４に由来する。
【００２３】
用語“ＰｑｓＤタンパク質（PqsD protein）”はまた、それらが配列番号：１の配列が誘導される同じシュードモナス種（緑膿菌 ＵＣＢＰＰ−ＰＡ１４）に発生するとき、自然的に発生するＰｑｓＤタンパク質を包含し、そしてそれらが他のシュードモナス種及び菌株及びバークホルデリア（Burkholderia）又はアルテロモナス（Alteromonas）種などの非シュードモナス種に発生するときでも、自然的に発生するＰｑｓＤタンパク質を包含し、この場合、クオラムセンシングメカニズムが存在し、そしてＰｑｓＤタンパク質又はそのオルソログ若しくはホモログ（このオルソログ又はホモログは、緑膿菌内のＰｑｓＤタンパク質と同じ機能を有する）の存在を必要とするＨＡＱｓが生成される。好ましくは、自然的に発生するＰｑｓＤタンパク質又はそのオルソログ若しくはホモログは、配列番号：１の配列と、例えば、アミノ酸の付加、欠失、置換、及び／又は挿入によって異なっており、そして、５０％を超える、６０％を超える、好ましくは、８０％を超える、より好ましくは、８５％を超える、更により好ましくは、９０％を超える、更により好ましくは、９５％を超える、最も好ましくは、９７％を超える配列番号：１との配列同一性を有し、及び／又は配列番号：１のＰｑｓＤタンパク質の酵素活性の５％を超える、１０％を超える、２０％を超える、３０％を超える、４０％を超える、５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９７％を超える、又は１００％を超える酵素活性を有する。
【００２４】
この発明の文脈では、上記の定義と同様なＰｑｓＤタンパク質、あるいはこの発明によって包含される自然的に、又は非自然的に発生するその変異体は、ＰｑｓＤタンパク質又は変異体は、その生物学的な機能、すなわち、それが、自然的条件下にて触媒する任意の反応にそれが関与すること（非自然的変異体の場合には、参照タンパク質の生物学的機能）、好ましくは、キノロンシグナルの生合成に関与すること、具体的には、ＨＡＱの生合成に関与すること、そしてより具体的には、ＨＨＱの合成に関与することが維持されているという点において、機能的に活性なタンパク質である。更により好ましくは、このＰｑｓＤタンパク質又はその変異体は、アントラニロイル−ＣｏＡ及び３−オキソアルカン酸の、４−ヒドロキシ−２−アルキルキノリンへの変換を触媒する、更により好ましくは、アントラニロイル−ＣｏＡ及び３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸の４−ヒドロキシ−２−（Ｃ1−Ｃ20）アルキルキノリンへの変換、そして最も好ましくは、アントラニロイル−ＣｏＡ及び３−オキソデカン酸のＨＨＱへの変換を触媒する。
【００２５】
更に、自然的に発生するＰｑｓＤタンパク質の変異体はまた、用語“ＰｑｓＤタンパク質（PqsD protein)”によって包含される。こうした変異体は、例えば、配列番号：１の配列とは異なり（例えば、アミノ酸の付加、欠失、置換及び／又は挿入による）、そして自然的に発生するＰｑｓＤタンパク質に関して、上記に示した配列同一性、及びタンパク質活性を有する。
【００２６】
用語“ＰｑｓＤタンパク質（PqsD protein）”によって包含される非自然的に発生する変異体は、それによって、それぞれの野生型タンパク質（例えば、上記に言及した配列番号：１に関して）の配列同一性、又は活性を含んでいる、限定された数のアミノ酸の欠失、挿入及び／又は置換、特に多くても、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸の欠失、挿入及び／又は置換によって得ることができる。
【００２７】
この変異体は、更なるコンポーネントを含む、修飾されたＰｑｓＤタンパク質又は修飾されたＰｑｓＤタンパク質変異体でありうる。従って、この変異体は、本明細書中で詳述されているような自然的に発生するＰｑｓＤタンパク質又はその変異体から成るドメイン及び少なくとも１つの更なるコンポーネント（component）を有する分子でありうる。１つの好ましい実施態様では、この変異体は、（ｉ）ＰｑｓＤタンパク質又は機能的に活性な変異体、及び（ｉｉ）更なるタンパク質コンポーネントを含んでなる融合タンパク質でありうる。例えば、このタンパク質は、精製目的のために使用されるタグ（例えば、６Ｈｉｓ（又はＨｅｘａＨｉｓ）タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＡタグ、ｃ−ｍｙｃタグ又はグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ）などのマーカーと結合することができる。例えば、高度に精製されたＰｑｓＤタンパク質又は変異体が必要である場合には、二重又は多重マーカー（double or multiple markers）（例えば、上記のマーカー又はタグの組み合わせ）を使用することができる。この場合には、タンパク質は、２回又はそれより多い分離クロマトグラフィー工程で精製され、各場合において第一と次いで第二のタグの親和性を利用する。こうしたダブル又はタンデムタグ（tandem tags）の例には、ＧＳＴ−Ｈｉｓタグ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをポリヒスチジンタグに融合させた）、６×Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ（６個のヒスチジン残基をＳｔｒｅｐタグに融合させた）、６×Ｈｉｓ−タグ１００−タグ（６個のヒスチジン残基を哺乳類ＭＡＰキナーゼ２の１２個のアミノ酸タンパク質に融合させた）、８×Ｈｉｓ−ＨＡ−タグ（８個のヒスチジン残基をヘムアグルチニンエピトープタグ（hemagglutinin-pitope-tag）に融合させた）、Ｈｉｓ−ＭＢＰ（Ｈｉｓタグをマルトース結合タンパク質に融合させた）、ＦＬＡＧ−ＨＡタグ（ＦＬＡＧタグをヘムアグルチニンエピトープタグに融合させた）、及びＦＬＡＧ−Ｓｔｒｅｐタグがある。マーカーはタグタンパク質を検出するために使用することができ、そこでは特異抗体が使用されうる。適切な抗体には、抗ＨＡ抗体（例えば、１２ＣＡ５又は３Ｆ１０）、抗６−Ｈｉｓ抗体、抗ｃ−ｍｙｃ抗体及び抗ＧＳＴ抗体が挙げられる。更に、このＰｑｓＤタンパク質は、緑色蛍光タンパク質などの蛍光マーカー、ストレプトアビジン（steptavidin）などの結合タンパク質、１つ又は複数の小分子色素（例えば、Ｃｙ色素）、又は放射性マーカーなどの異なったカテゴリーのマーカーに連結することができ、これによってＰｑｓＤの検出が可能になる。更なる実施態様では、ＰｑｓＤは、融合タンパク質の一部分であることができ、その場合、酵素活性を有するタンパク質コンポーネントなどの第二部分は検出のために使用することができる。
【００２８】
この発明の別の実施態様では、ＰｑｓＤ変異体は、その断片が依然として機能的に活性であるＰｑｓＤ断片でありうる。これには、短い内部領域及び／又はＣ及び／又はＮ末端領域の欠失（例えば、最大で、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸の欠失）したＰｑｓＤタンパク質が含まれうる。これに加えて、ＰｑｓＤ断片はＰｑｓＤタンパク質の場合に上記に詳述したように更に修飾することができる。
【００２９】
これに代えて、あるいはこれに加えて、上記に述べたようなＰｑｓＤタンパク質又はその変異体は、１つ又は複数のアミノ酸置換を含むことができる。しかしながら、アミノ酸が化学的に関連のあるアミノ酸と置換される半保存的及び特に保存的アミノ酸置換が好ましい。典型的な置換は、脂肪族アミノ酸の間で、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の間で、酸性残基を有するアミノ酸の間で、アミド誘導体の間で、塩基性残基を有するアミノ酸の間で、又は芳香族残基を有するアミノ酸の間でなされる。典型的な半保存的及び保存的置換は以下である：
【００３０】
アミノ酸   保存的置換             半保存的置換
Ａ         Ｇ；Ｓ；Ｔ             Ｎ；Ｖ；Ｃ
Ｃ         Ａ；Ｖ；Ｌ             Ｍ；Ｉ；Ｆ；Ｇ
Ｄ         Ｅ；Ｎ；Ｑ             Ａ；Ｓ；Ｔ；Ｋ；Ｒ；Ｈ
Ｅ         Ｄ；Ｑ；Ｎ             Ａ；Ｓ；Ｔ；Ｋ；Ｒ；Ｈ
Ｆ         Ｗ；Ｙ；Ｌ；Ｍ；Ｈ     Ｉ；Ｖ；Ａ
Ｇ         Ａ                     Ｓ；Ｎ；Ｔ；Ｄ；Ｅ；Ｎ；Ｑ
Ｈ         Ｙ；Ｆ；Ｋ；Ｒ         Ｌ；Ｍ；Ａ
Ｉ         Ｖ；Ｌ；Ｍ；Ａ         Ｆ；Ｙ；Ｗ；Ｇ
Ｋ         Ｒ；Ｈ                 Ｄ；Ｅ；Ｎ；Ｑ；Ｓ；Ｔ；Ａ
Ｌ         Ｍ；Ｉ；Ｖ；Ａ         Ｆ；Ｙ；Ｗ；Ｈ；Ｃ
Ｍ         Ｌ；Ｉ；Ｖ；Ａ         Ｆ；Ｙ；Ｗ；Ｃ；
Ｎ         Ｑ                     Ｄ；Ｅ；Ｓ；Ｔ；Ａ；Ｇ；Ｋ；Ｒ
Ｐ         Ｖ；Ｉ                 Ｌ；Ａ；Ｍ；Ｗ；Ｙ；Ｓ；Ｔ；Ｃ；Ｆ
Ｑ         Ｎ                     Ｄ；Ｅ；Ａ；Ｓ；Ｔ；Ｌ；Ｍ；Ｋ；Ｒ
Ｒ         Ｋ；Ｈ                 Ｎ；Ｑ；Ｓ；Ｔ；Ｄ；Ｅ；Ａ
Ｓ         Ａ；Ｔ；Ｇ；Ｎ         Ｄ；Ｅ；Ｒ；Ｋ
Ｔ         Ａ；Ｓ；Ｇ；Ｎ；Ｖ     Ｄ；Ｅ；Ｒ；Ｋ；Ｉ
Ｖ         Ａ；Ｌ；Ｉ             Ｍ；Ｔ；Ｃ；Ｎ
Ｗ         Ｆ；Ｙ；Ｈ             Ｌ；Ｍ；Ｉ；Ｖ；Ｃ
Ｙ         Ｆ；Ｗ；Ｈ             Ｌ；Ｍ；Ｉ；Ｖ；Ｃ
【００３１】
Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＹからＣへの変更は、新規なシステインが遊離のチオールのままである場合には、半保存的である。更に、当業者であれば、立体的要求がなされる位置ではグリシンは置換されるべきではないこと、そしてＰは、αヘリックス又はβシート構造を有するタンパク質の部分に導入されるべきではないことを理解するであろう。置換を有しているＰｑｓＤタンパク質又はその断片若しくは変異体は、ＰｑｓＤタンパク質又は断片若しくは変異体の場合に上記に詳述されているように修飾することができる。
【００３２】
このＰｑｓＤタンパク質の上記の修飾を組み合わせることができることが注目される。この発明の変異体は、例えば、それと融合するマーカーを有するＰｑｓＤの断片でも、あるいは１つ又は複数のアミノ酸置換を含んでなるＰｑｓＤタンパク質断片であってもよい。最も好ましくは、このＰｑｓＤタンパク質は、上記に詳述したごとく自然的に発生するＰｑｓＤタンパク質であり、更により好ましくは、自然的に発生するシュードモナスＰｑｓＤタンパク質（例えば、配列番号：１）である。本発明の下記の説明では、ＰｑｓＤタンパク質に関して述べられているすべての詳細はまた、特段記載しない限り、その機能的に活性な変異体に関連する。
【００３３】
このＰｑｓＤタンパク質の必要な量は、任意の手段、例えば、自然的源に起源するＰｑｓＤタンパク質を得ることによって、当技術分野で周知の生物工学的方法によって、及び／又は合成方法によって提供されうる。本明細書中では、用語“提供すること（providing）”は、最も広い意味で理解されえ、ＰｑｓＤタンパク質を得るために使用しうる当技術分野で知られている任意の生化学的又は生物工学的方法を含みうるが、これに限定されることはありえない。それ故、このＰｑｓＤタンパク質は、シュードモナス、バークホルデリア又はアルテロモナス、好ましくは、シュードモナス種、より好ましくは緑膿菌、そして最も好ましくは緑膿菌 ＵＣＢＰＰ−ＰＡ１４のようなＰｑｓＤタンパク質を含む微生物などの自然的起源から抽出することによって得ることができる。当業者は、このタンパク質をいかにして単離し、そして精製するかについての方法を知っている。ＰｑｓＤタンパク質を自然的に担持している細胞を当技術分野で知られている任意の手段によって破壊することができるが、その手段は以下を含むがそれらに限定されない：音波破砕、低張緩衝液、洗剤、ウルトラタラックス（UltraTurrax）、フレンチプレス（French press）、凍結−解凍サイクル、機械的ホモジナイゼーション及びスクラッチング（mechanical homogenization and scratching）。次いで、関心のあるタンパク質を公知の方法によって単離することができる。
【００３４】
あるいは、この発明で使用されるＰｑｓＤタンパク質は、組み換え方法、例えば、ＰｑｓＤタンパク質又はその機能的断片若しくは変異体をコードするｐｑｓＤ核酸をクローニングし、そのタンパク質を単離することによって生成できるＰｑｓＤタンパク質でありうる。遺伝子をレシピエント細胞に導入する手順は、トランスフェクションと呼ばれている。ＤＮＡを用いるトランスフェクションでは、安定及び不安定（一過性）細胞株が生じる。一過性細胞株は、染色体外形態でのトランスフェクションされたＤＮＡの生存を反映し；安定細胞株は、ゲノム中への組込みから生じる。遺伝子は、当技術分野で知られている種々の手段で細胞内に導入され、各細胞型に適合され得る。用語“細胞（cell）”とは、それがバクテリア細胞、それとも真核細胞であるかどうかとは無関係に、そして細胞が自然的にｐｑｓＤ遺伝子を発現するか否かとは無関係に、遺伝子が発現される細胞を意味する。核酸分子を導入し、そして発現する当技術分野において周知である組み換えＤＮＡクローニング手法は、異種遺伝子を導入し、そして発現させるのに使用することができる。細胞は、ウイルスベクター、化学トランスフェクタント、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿法又はＤＮＡ直接拡散を含む任意の適切な手段を用いてトランスフェクションすることができる。ベクターは、異種遺伝子を細胞中に輸送する媒介物（agents）であり、プロモーターなどの適切な転写及び翻訳制御シグナルを含みうる。ベクターは、プラスミド、ウイルス又は当技術分野において知られている他のものでありうる。プロモーターは、誘導性又は構成的、一般的又は細胞特異的、核又は細胞質特異的でありうる。プロモーター、ベクター、及び他のエレメントの選択は、ルーチン的な設計事項である。多くのこうしたエレメントは、文献に記載されており、商業上の供給者を通して入手可能である。通例、トランスファー方法は、細胞への選択可能なマーカーのトランスファーを含む。一般に、細胞株は、上記に言及されている、導入遺伝子が、選択可能なマーカーに作動可能なように連結されている手段のいずれによってもトランスフェクションされる。トランスフェクションの後、細胞は適応期間にわたって増殖する。トランスフェクションされた細胞は、その選択に対して耐性を示し、増殖することができるが、一方、トランスフェクションされていない細胞は一般的に死滅する。選択マーカーの場合の例としては、それぞれ、ピューロマイシン、ゼオシン、アミノグリコシドＧ−４１８及びヒグロマイシンに対する耐性を与える、ピューロマイシン、ゼオシン、ネオマイシン及びヒグロマイシンＢが挙げられる。この発明の関連で適切な細胞の例は、エッシェリキア・コリ株（E. coli strains）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母株、例えば、ポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）などからの昆虫細胞株（レピドプテラ）、植物細胞、又はＬ６細胞、３Ｔ３アジポサイト、ＨＥＫ２９３、７４５−Ａ、Ａ−４３１、心房筋細胞（atrial myocytes）、ＢｘＰＣ３、Ｃ５Ｎ、Ｃａｃｏ−２、Ｃａｐａｎ−１、ＣＣ５３１、ＣＦＰＡＣ、ＣＨＯ、ＣＨＯ Ｋ１、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＣＶ−１、ＥＡＨＹ、ＥＡＨＹ ９２６などの哺乳類細胞の細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
樹立又は不死化細胞株は、テロメラーゼ遺伝子の人工発現などのランダム変異又は計画的修飾（deliberate modification）によって無制限に増殖する能力を取得してきた。特定の細胞型の数多くの十分に確立した細胞株代表例があり、適切な細胞株を選択することは当業者の知識内にある。細胞株は、誘導される培養液中で増殖する細胞の集団であり、それ故、遺伝的には、１つの共通の祖先細胞（ancestor cell）に同一である。好ましい細胞株には、ＨＥＫ ２９３細胞（初代ヒト胎児腎臓（primary human embryonic kidney））、３Ｔ３ 細胞（マウス胎児線維芽細胞（murine embryonic fibroblasts））、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣（Chinese hamster ovary））、ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル細胞株（African green monkey cell line））、ヒーラ細胞（HeLa cells）（ヒト子宮頸部類上皮腫（human epithelioid cervical carcinoma））、ＪＵＲＫＡＴ細胞（ヒトＴ細胞白血病（human T-cell leukemia））、ＢＨＫ ２１細胞（ハムスター正常腎臓，線維芽細胞（hamster normal kidney, fibroblast））、及びＭＣＦ−７細胞（ヒト乳癌（human breast cancer））がある。
【００３６】
用語“ｐｑｓＤ核酸（pqsD nucleic acid）”は、上記のＰｑｓＤタンパク質、並びに自然的に発生する、及び非自然的に発生するその変異体（本明細書中に定義されている）を目的としてコーディングされている核酸を包含する。好ましくは、この用語は、ｐｑｓＤ遺伝子のコード領域又は非コード領域に関連し、その場合、こうしたセクションはその遺伝子に特異的であるために適切なサイズである。そうした領域の例には、コード領域又はｐｑｓＤプロモーターなどの調節エレメントがある。最も好ましくは、用語“ｐｑｓＤ核酸（pqsD nucleic acid）”は、ｐｑｓＤ遺伝子、プロモーター、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡに関連する。
【００３７】
最も好ましいｐｑｓＤ核酸は、上記に詳述したように自然的に発生するＰｑｓＤタンパク質、更により好ましくは、自然的に発生するシュードモナスＰｑｓＤタンパク質（例えば、配列番号：１）をコードする。この核酸は、細胞内で遺伝子情報又は形態構造を持っている、モノマーであるヌクレオチドの鎖から構成される任意のマクロ分子でありうる。最も一般的な（そしてそれ故、好ましい）核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）である。
【００３８】
所望の遺伝子情報をコードしている核酸、好ましくは、ＤＮＡは、関心のある遺伝子、プロモーター領域、開始コドン及び終止コドン及び遺伝子の発現を調節するために使用されうるありうる更なる領域を含む。調節領域は、ｐｑｓＤ遺伝子に対して相同的（homologous）であっても、あるいは非相同的（heterologous）であってもよい。この遺伝子情報は、持続的に発現されてもよいし、又はレプレッサー及び／又はプロモーター領域の調節下で発現されてもよい。得られた細胞は、直接使用してもよいし、又は組織培養のために使用してもよく、あるいは細胞を回収し、そしてＰｑｓＤタンパク質を含む試料を、細胞を破壊することによって得ることができる。
【００３９】
あるいは、ＤＮＡ又はＲＮＡは、細胞内で使用してもよいし、無細胞発現系で使用してもよく、これには、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡを固定化し、そして翻訳し、及び／又は、転写及び／又は翻訳に必要な因子（酵素、リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ヌクレオチド、ＡＴＰなど）を含んでいる官能性細胞溶解物（functional cell lysate）を添加することによって転写するマイクロアレイシステムがある。
【００４０】
あるいは、このＰｑｓＤタンパク質はまた、組織培養で発現させることができる。用語“組織培養（tissue culture）”とは、三次元ネットワークを形成する細胞群が培養される方法を意味する。この組織は、細胞自体によって培養物中に形成されてもよいし、あるいは細胞によって作成される細胞外マトリクスによって形成されてもよく、この培養物は自然的、又は人工的な細胞外マトリクス（例えば、コラーゲン、エラスチン、ポリスチレン、ナイロン、ポリリシン）を用いて培養することができ、あるいはこの組織は、ヒトを含む動物から得ることができる。この組織培養は、培地で適切な温度で培養することができる。培地は、栄養素（例えば、シュガー、塩、アミノ酸及び脂質）、バッファー系（しばしば、１つ又は複数の化学バッファー物質（例えば、毒性が低いか、または毒性のない、リン酸類（phosphates）、リン酸水素類（hydrogen phosphates）、及び／又はトリス（Tris）及び／又は炭酸ガス（carbon dioxide(CO2)gassing）を含む、及び／又は所望により１つ又は複数の抗生物質を含むことができる。十分な量の栄養素を提供するために、及び／又は代謝産物を除去するために、必要な場合には、培地を交換することができる。所望により、この組織培養は、培地で灌流することができる。この灌流は、持続的でも、又はパルス灌流（permanent or pulsed perfusion）でもよい。
【００４１】
人工核酸には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸及びロックド核酸（ＬＮＡ）、並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）が含まれる。こうしたものはそれぞれ、分子の骨格の変化によって自然的に発生するＤＮＡ又はＲＮＡと区別される。
【００４２】
この方法を行なうときには、提供されたＰｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質を、この発明の第一及び第二局面の第二工程部分を構成している化合物に接触させる。この発明の文脈では、用語“接触させること（contacting）”は、ＰｑｓＤタンパク質を、試験されうる１つ又は複数の化合物と相互作用することを可能にする任意の手段として最も広い意味で理解されうる。好ましくは、これは、ＰｑｓＤタンパク質を含む１つ又は複数の溶液を、ＰｑｓＤタンパク質の酵素活性に適しているバッファー溶液中の１つ又は複数の化合物と混和することによって達成される。混和するには、好ましくは、そのうちの一方がＰｑｓＤタンパク質を含み、他方が化合物を含んでいる２つ又はそれより多い溶液をピペッティングすること、より好ましくは、混和することによって達成しうる。好ましい実施態様では、接触させることは自動ピペッティングすることによって達成されうる。
【００４３】
本発明を通して、用語“試験化合物（test compound）”又は“化合物（compound）”とは、あらゆる化学特質をもつ任意の試験物質を意味しうる。これは、サイズが５００ダルトン未満の分子量を有する小分子又はその塩、タンパク質、ポリペプチド、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、合成ポリマー、抗体及び／又は抗体誘導体（例えば、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体、ダイアボディ（diabodies）、トリアボディ（triabodies）、フレキシボディ（flexibodies）、タンダブ（tandabs：タンデムダイアボディ））などの高分子量化合物を意味しうる。この化合物は、荷電されていて、荷電されていなくてもよい。更に、この化合物は、親水性であっても、疎水性であっても、あるいは両親媒性であってもよい。この化合物は、１つ又は複数の無機塩、１つ又は複数の塩イオン（salt ions）、１つ又は複数の金属、１つ又は複数の無機塩又はイオンの１つ又は複数の複合体（complexes）及び／又は１つ又は複数の金属の複合体（好ましくは、１つ又は複数の有機分子と複合体化している）でありうる。あるいは、この化合物はガスであってもよい。好ましくは、この化合物は、水溶性バッファー又は水溶性溶媒に可溶性でありうる。この化合物は、既に薬物又は薬剤として使用されていてもよい。あるいは、この化合物はまた、治療的使用が知られていない化学物質であっても、それともアッセイでは使用されている知られていない化学特性を有する物質でもよい。更に、用語“試験化合物（test compound）”又は“化合物（compound）”はまた、この方法中で使用されている分子の前駆体として機能しうる物質を含んでいてもよい。具体的には、これは測定の直前に合成することが必要である不安定な物質の場合に当てはまる場合がある。これに加えて、これは、それらの作用を示す前に代謝される必要がある分子である、薬理学においてしばしば使用されるようなプロドラッグに当てはまる場合がありうる（例えば、活性化合物のアセチル化された、脂質付加された（lapidated）又は酸化された前駆体）。
【００４４】
これに代えて、又はこれに加えて、この化合物は、小分子、ペプチド、タンパク質、ポリサッカライド又は合成ポリマーなどの１つ又は複数の他の分子とコンジュゲート又は結合することができる。好ましくは、これは、１つ又は複数の小分子色素（例えば、Ｃｙ色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５）、Ａｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５４６、Ａｌｅｘａ ６４７）、Ｓ色素（例えば、Ｓ０３８７）、フルオレセイン（fluorescein）及びその官能性誘導体（例えば、ＦＩＴＣ）、ローダミン、HOECHST色素などのような蛍光色素、又はＵＶ／Ｖｉｓ色素）、１つ又は複数の量子ドット（quantumdots）、１つ又は複数の結合モイエティ（例えば、ビオチン、グリココルチコイド、又は例えば、１つ又は複数の活性エステル、イソチオシアネート、マレイミド（maleimids）又はその組み合わせを含むモイエティ）、１つ又は複数の可溶性及び／又は不溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ））、１つ又は複数のスピン標識（spin labels）、１つ又は複数の、及び／又はマイクロビーズ又はナノビーズ（例えば、官能性を付与したシリカビーズ（functionalized silica beads）、シュガーベースビーズ（sugar-based beads）、ポリマーソーム（polymersomes））にコンジュゲートすることができる。更に、この化合物は、シンチレーションアッセイ、又はコンピューター断層撮影法（ＣＴ）に適している、例えば、3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ又はランタノイド系元素（lanthonoids）で、又は陽電子放出型断層撮影法（ＰＥＴ）に適している標識で、放射性標識することができる。
【００４５】
本明細書中で使用される際には、用語“方法（method）”又は“アッセイ（assay）”とは、実験活性又は手順として最も広い意味で理解されうる。これは、いくつかの特性を有する化合物を特定するのに、又はある種の化合物を特徴付けるのに使用することができるすべての手段として理解されるであろう。これは１つ又は複数の試料を試験すること、並びに数多くの試料を含むライブラリーをスクリーニングすることを含みうる。
【００４６】
用語“化合物を特定すること（identifying a compound）”は、最も広い意味で、ＰｑｓＤタンパク質と接触させたときに、ＰｑｓＤタンパク質の酵素活性に対する作用を示す化合物、特に、ＰｑｓＤタンパク質と接触させたときに、ＰｑｓＤタンパク質の酵素活性に対する阻害作用を示す化合物を見出すことを意味する。こうした阻害作用を示す化合物は、病原性感染を処置し、軽減し、又は予防する作用を有することが判明している。
【００４７】
用語“阻害剤（inhibitor）”とは、“アンタゴニスト（antagonist）”、“不活性化因子（inactivator）”、“不活性化剤（inactivating agent）”、“相互作用薬（interacting drug）”、“阻害作用を有する化合物（compound with inhibitory effect）”及び“不活性化化合物（inactivating compound）”及び酵素活性を不活性化する物質の他の呼称と互換性があるものと理解されうる。阻害剤は、酵素に結合し、そしてそれらの活性を低下させる分子である。酵素活性を遮断すると代謝不均衡を修正することができるので、薬は酵素阻害剤であることが多い。酵素に結合する分子がすべて阻害剤であるわけではない；酵素活性剤は、酵素に結合してそれらの酵素活性を上昇させる。阻害剤の結合は、結合パートナーが生体分子と相互作用することを阻止することができ、及び／又は生体分子が活性になるか、あるいは活性化することを妨げることができる。阻害剤結合は、可逆的か、あるいは不可逆的である。不可逆的阻害剤は通例、生体分子と反応し、それを化学的に変化させる。こうした阻害剤は、例えば、活性に必要なキーとなるアミノ酸残基を修飾することができる。対照的に、可逆的阻害剤は、非共有結合で結合し、そしてこうした阻害剤が生体分子に結合するか否かに応じて、異なる種類の阻害が引き起こされる。化合物が、ＰｑｓＤタンパク質に対して特異的、かつ有意な減少作用を有する場合には、その化合物は、ＰｑｓＤタンパク質の阻害剤として、それ故、病原性感染を処置し、軽減し、又は予防する作用を有する化合物として特定される。この発明の文脈においてＰｑｓＤタンパク質の阻害剤は、コントロールと比較してＰｑｓＤ酵素活性を低下させる化合物を意味する。当技術分野における当業者であれば、２つの値が互いに有意に異なっているかどうかを評価する統計的手順（例えば、スチューデントのｔ検定又はカイ二乗検定）を知っている。
【００４８】
この発明の第一及び第二の局面の第三工程では、試験化合物のＰｑｓＤタンパク質に対する作用が検出される。この作用は、上記に定義されているように試験化合物のｐｑｓＤ核酸又はＰｑｓＤタンパク質への結合として決定される。好ましい実施態様では、ＰｑｓＤタンパク質の活性は、試験化合物のＰｑｓＤタンパク質への結合の結果として決定される。下記では、一連の異なった検出システムがより詳細に述べられている。しかしながら、こうしたものは例示的なものであり、他の試験システム及び方法である場合がありうることが理解されるべきである。
【００４９】
試験化合物がＰｑｓＤタンパク質に対して特異的、かつ有意な作用を有している場合には、試験化合物は、病原性感染を処置し、軽減し、又は予防するために有用な化合物として特定される。この場合、試験化合物の作用はコントロール、特にネガティブコントロールと比較される。
【００５０】
コントロールは、それらが意図されたものでない影響（例えば、バックグラウンドシグナル）を除去し、又は最小にすることができるので、試験方法の一部分である。コントロール実験は、可変部分の特定の系に対する作用を検討するために使用される。コントロール実験では、一方の群の試料が変化され（又は変化されると考えられる）、そして他方の群の試料が、変化を示さないと想定されるか（ネガティブコントロール）、あるいは明確な変化を示すものと想定される（ポジティブコントロール）。コントロールは、試験物質と共に行なう１つの試験で決定することができる。これは、試験化合物の作用を決定する前または後に決定してもよいし、あるいはこれが知られている値であってもよい。
【００５１】
この発明の関連では、試験化合物は、試験化合物と接触させたＰｑｓＤタンパク質は、コントロール（例えば、試験化合物と接触していない試験システム）のＰｑｓＤ活性と比較して有意により低いＰｑｓＤ活性を生み出す場合に、コントロールと比較して作用を有している。これに加えて、バックグラウンド（ＰｑｓＤ活性と無関係である基質の変換）は、酵素を欠如しているそれぞれのバッファー中の基質を含む試料によって測定することができる。このバックグラウンド試料では、基質の変換は全くないか、あるいはほとんどないであろう。当技術分野における当業者であれば、２つの値が互いに有意に異なっているかどうかを評価する統計的手順（例えば、スチューデントのｔ検定又はカイ二乗検定）を知っている。更に、当業者は、いかに適切なコントロールを選択するかについて知っている。好ましい実施態様では、ＰｑｓＤ活性は、試験化合物によって、コントロールの、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２５％、より好ましくは、少なくとも５０％、更により好ましくは、少なくとも７５％、そして最も好ましくは、少なくとも９０％分変化する。
【００５２】
本発明の方法の場合、検出するあらゆる適切な方法を使用することができる。適切な方法は、試験システム及び試験される化合物の特性に応じて選択することができる。この方法は、ヘテロジニアスアッセイであっても、あるいはホモジニアスアッセイであってもよい。本明細書中で使用される際には、ヘテロジニアスアッセイは、１つ又は複数のの洗浄工程を含むアッセイであり、一方ホモジニアスアッセイは、こうした洗浄工程は必要ない。試薬及び化合物を、単に混和し、測定するだけある。
【００５３】
この試験方法は、連続的アッセイであってもよいし、又は非連続的アッセイであってもよい。連続的アッセイでは、反応速度が得られるが更なる作業は必要ない。連続的アッセイには多くの異なる種類がある。分光光度計によるアッセイ（spectrophotometer assays）では、反応過程は吸光度の変化を測定することによって追跡する。蛍光発光は分子が異なる波長の光を吸収した後、１つの波長の光を放出するときに存在する。蛍光測定アッセイは、生成物からの基質の蛍光の差異を使用して酵素反応を測定する。こうしたアッセイは、一般的に、分光光度計によるアッセイと比較してはるかに高感度であるが、しかしながら、不純物によって引き起こされる干渉、及び光に曝露されるとき多くの蛍光化合物の不安定性を被る可能性がありうる。熱量法は、化学反応によって放出され、又は吸収された熱の測定である。こうしたアッセイは、熱のある程度の変化が必要である反応が多く、そして微量熱量計を用いると酵素又は基質があまり多く必要でないので極めて一般的である。こうしたアッセイは、他のいずれかの方法ではアッセイが不可能である反応を測定するのに使用することができる。化学発光は化学反応による光の放出である。いくつかの酵素反応では光が発生し、そしてこれを測定し生成物形成を検出することができる。こうした種類のアッセイは、発生する光が数日から数週間にわたって写真フィルムによって捕捉することができるので極度に感受性を示しうるが、しかしながら、反応によって放出される光のすべてが検出されるわけではないので定量化することが困難でありうる。静的光散乱は、溶液中のマクロ分子の重量平均モル質量及び濃度の生成物を測定する。測定時間にわたって１つ又は複数の種の一定の総濃度を考慮すると、散乱シグナルは、溶液の重量平均モル質量の直接測定であり、これは、複合体形態又は解離によって変化するであろう。それ故、この測定によって複合体並びに反応速度の化学量論比が定量化される。タンパク質動態の光散乱アッセイは、酵素を必要としない極めて一般的な手法である。
【００５４】
非連続的アッセイは、試料が間隔をおいて酵素反応から取り出され、そして生成物産生又は基質消費の量がこうした試料中で測定されるときに使用される。放射アッセイは放射能の基質への取り込み、又は基質からのその放出を測定する。こうしたアッセイにおいて最も頻繁に使用される放射性同位体は、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ及び125Ｉである。放射性同位体は基質の単一原子を特異的に標識することを可能にしうるので、こうしたアッセイは極めて感受性があり、かつ特異的である。これらは生化学において頻繁に使用され、そして粗抽出物における特異的反応を測定する唯一の方法であることがしばしばある。クロマトグラフィーアッセイはクロマトグラフィーによって反応混合物をそのコンポーネントに分離することによって生成物の生成を測定する。これは通例、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってなされるが、薄層クロマトグラフィーのより簡単な手法を使用することもできる。このアプローチには多くの材料が必要でありうるが、その感受性は、基質／生成物を放射性又は蛍光タグを用いて標識することによって増大させることができる。
【００５５】
この酵素活性が、酵素の量、酵素の活性状態、コアクティベーター又はコレプレッサーなどのコファクターの存在、アクティベーター及びインヒビター（阻害剤）の存在、並びに塩濃度、温度、ｐＨなどの周囲条件を含む一連のファクターによって影響されることは明白である。通例、この酵素活性は、標準的な実験室条件で測定され、そして当該試験システムの最適条件に適合させることができる。従って、有用な治療薬でありうるアクティベーター及びインヒビターなどの酵素の活性状態を変化させる分子を検出又は特定するために、この試験システムを使用することができる。
【００５６】
試験化合物の作用（例えば、結合）及びＰｑｓＤタンパク質に対する作用は、間接的に検出することができる。特に好ましい実施態様では、試験化合物の結合は、ＰｑｓＤの活性の変化によって測定される。所望の酵素活性を得るために、この測定は、ＰｑｓＤタンパク質の活性に適した分子環境で行うことができる。好ましくは、この方法は、中性から弱塩基性のｐＨの水溶性バッファー中で、より好ましくは、約ｐＨ８のｐＨのバッファー中で、更により好ましくは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ヘペス（HEPES）、ビシン（BICINE）、ＭＥＳ、トリエタノールアミン又はリン酸バッファー（phosphate buffer）を含むｐＨ８のバッファー中で行なわれる。好ましくは、このＰｑｓＤタンパク質は、使用するバッファー中でその活性を維持し、そして好ましくは、化合物又は酵素の沈殿をさせないようにする。所望により、試料を酵素活性に適する温度で、好ましくは、０〜５０℃の温度で、より好ましくは１０〜４０℃の温度で、更により好ましくは２０〜４０℃の温度で、最も好ましくは３７℃でインキュベートすることができる。適用される方法は、実施例セクション中により詳細に述べられている。しかしながら、こうしたものは例示的なものであり、そして他の方法もまた適切である場合のありうることが理解されるべきである。この酵素を、所望の濃度に希釈することが必要であり、そしてこの濃度は、酵素の量によって酵素活性が変化するため、様々なバッチによって異なりうることは、当技術分野における当業者にとって自明でありうる。
【００５７】
好ましい実施態様では、このＰｑｓＤタンパク質の活性は、ＰｑｓＤタンパク質の基質の生成物への変換を測定することによって決定される。基質の変換は、酵素作用（enzymatic）に関連し、すなわち、ＰｑｓＤタンパク質によって触媒される変化、あるいは化学化合物の代謝に関連する。本発明を通して、用語“基質（substrate）”は、ＰｑｓＤタンパク質によって生成物に代謝されうる任意の化学物質に関連する。この方法では、それらが上記に定義されているようにＰｑｓＤタンパク質を担持している有機体に存在するので、ＰｑｓＤタンパク質の検出可能な自然的な基質は、ＰｑｓＤタンパク質の酵素活性の検出を可能にするために使用することができる。更に、こうした自然的な基質の検出可能なサロゲート（surrogates）は、ＰｑｓＤタンパク質又はその変異体の酵素活性の検出を可能にするために使用することができる。好ましくは、こうした自然的な基質又はサロゲート及びそれから生じる生成物は、物理化学的な手段によって、より好ましくは、下記に述べられているＨＰＬＣ方法によって検出可能である。用語“サロゲート（surrogate）”は、自然的な基質（複数を含む）の代わりに、代謝され、及び／又は酵素的に変換されうる分子として、最も広い意味で理解されうる。
【００５８】
ＨＡＱの生合成の場合には、２つの基質はＰｑｓＤによって変換される。それ故、好ましい実施態様では、第一の基質は、アントラニル酸、好ましくは、アントラニロイル−ＣｏＡなどのアントラニル酸誘導体である。第二の基質は、好ましくは３−オキソアルカン酸、より好ましくは３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸、そして最も好ましくは３−オキソデカン酸である。最も好ましい実施態様では、第一の基質は、アントラニロイル−ＣｏＡであり、そして第二の基質は、３−オキソデカン酸である。基質である３−オキソアルカン酸、好ましくは、３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸、そしてより好ましくは、３−オキソデカン酸が、物質を活性化する物質に連結し、それによって、基質の生成物への変換が維持される実施態様もまた含まれる。この連結は共有結合的連結でありうる。好ましい物質は、補酵素Ａ又はＡＣＰ（アシルキャリアタンパク質）であり、その結合によって、３−オキソアルカン酸、好ましくは３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸、そしてより好ましくは３−オキソデカン酸の対応するチオエステルが生じる。この発明の関連では、３−オキソアルカン酸、好ましくは３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸、そしてより好ましくは３−オキソデカン酸は、上記に示されているように、アントラニロイル−ＣｏＡと変換反応しＨＡＱになるのに有用であるために誘導体化される必要がないが、アントラニル酸が、活性化された形、すなわち、アントラニロイル−ＣｏＡとして反応混合物中に存在するときに限って反応は進行する。逆に、補酵素Ａ又はＡＣＰによって誘導体化された３−オキソアルカン酸、好ましくは、３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸、そしてより好ましくは３−オキソデカン酸は、アントラニロイル−ＣｏＡと組み合わせるか、又は補酵素Ａがない状態で、アントラニル酸と組み合わせて酵素アッセイで使用することができる。２つの基質のうち少なくとも１つは、すなわち、アントラニル酸の活性化された形で、アントラニロイル−ＣｏＡとして、あるいは、ＨＡＱ分子の活性化された形で、ＨＡＱ−ＣｏＡ又はＨＡＱ−ＡＣＰとして存在すべきである。
【００５９】
アントラニロイル−ＣｏＡは、３−オキソアルカン酸、好ましくは３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸、そして最も好ましくは３−オキソデカン酸と共に、それぞれ、４−ヒドロキシ−２−アルキルキノリンに、好ましくは４−ヒドロキシ−２−（Ｃ1−Ｃ20）アルキルキノリンに、そしてより好ましくはＨＨＱに変換させるＰｑｓＤの基質の１つである。アントラニロイル−ＣｏＡは、ＰｓｑＢ、ＰｓｑＣ及びＰｓｑＤを必要とする一連の工程において、頭−頭縮合（head-to-head condensation）を介してβ−ケト脂肪酸と反応して、ＨＡＱ又は好ましくは、ＨＨＱを形成すると予測される。シュードモナス菌では、アントラニロイル−ＣｏＡが、アントラニロイル−ＣｏＡシンターゼであるＰｑｓＡによってアントラニル酸から生成される。この発明の関連では、アントラニロイル−ＣｏＡを生成するあらゆる方法を使用することができる。当業者であれば、アントラニロイル−ＣｏＡを生成する方法を承知しているであろう。この発明の方法の一実施態様では、アントラニロイル−ＣｏＡは、アントラニル酸から生成される。アントラニル酸は、例えば、商業上の供給源から入手可能である。アントラニロイル−ＣｏＡの生成は、アントラニル酸をアントラニロイル−ＣｏＡに変換する任意の酵素によって酵素的触媒反応によって起こりうる。例えば、ＰｑｓＡは、アントラニル酸をアントラニロイル−ＣｏＡに変換するために使用することができる。ＰｑｓＡは、公知のアントラニラート−補酵素Ａリガーゼ（anthranilate-coenzyme A ligase）である。ＰｑｓＡタンパク質は、種々のアシル補酵素Ａ（アシル−ＣｏＡ）リガーゼに相同的（homologous）であり、そしてＰｑｓＡの明らかな役割は、アントラニラートをＣｏＡチオエステルに変換することである。この生成物は、最終的な４−キノロンを生じさせる縮合の前駆体である。この酵素は、アクセッション番号 ＡＢＪ１０１６０．１（配列番号：２）のもとでＮＣＢＩから入手可能である。緑膿菌 ＵＣＢＰＰ−ＰＡ１４のコンプリートゲノムは、シークエンシングされている。この配列は、アクセッション番号 ＮＣ＿００８４６３のもとでＮＣＢＩから入手可能である：ｐｑｓＡ遺伝子は、アイデンティフィケーション番号 GeneID：４３７９９８０のもとで特定されている。
【００６０】
この発明によって含まれる用語“ＰｑｓＡ”又は“ＰｑｓＡタンパク質（PqsA protein）”は、このＰｑｓＡタンパク質が、配列番号：２のタンパク質と同じ活性、すなわち、それはアントラニル酸のアントラニロイル−ＣｏＡへの変換を触媒することを条件として、それらがそれらから配列番号：２の配列が誘導されるのと同じ種（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14）中に発生したときの自然的に発生するＰｑｓＡタンパク質を包含し、あるいは、それらが他のシュードモナス種及び株、及び非シュードモナス種中に発生したときの自然的に発生するＰｑｓＡタンパク質を包含する。また、ＰｑｓＤタンパク質に関して上記に言及されている如く定義される自然的に、又は非自然的に発生する変異体を含む。
【００６１】
より好ましい実施態様では、アントラニル酸をアントラニロイル−ＣｏＡに変換する２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ(2-aminobenzoate-CoA ligase）が使用される。更により好ましい実施態様では、２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼは、アゾアルカス・エバンシイ（Azoarcus evansii）に起源する。この酵素は、アクセッション番号 ＡＡＬ０２０７７．１（配列番号：３）のもとでＮＣＢＩから入手可能であり、そして対応する核酸配列は、アクセッション番号 ＡＦ３２０２５４．１のもとで入手可能である。
【００６２】
用語“２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ（2-aminobenzoate-CoA ligase）”は、この酵素が、配列番号：３のタンパク質と同じ活性、すなわち、それはアントラニル酸のアントラニロイル−ＣｏＡへの変換を触媒することを条件として、それらがそれらから配列番号：３の配列が誘導される（アゾアルカス・エバンシイ）のと同じ種に発生したときの自然的に発生する２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼを包含し、あるいは、それらが他のアゾアルカス種、及び株及び非アゾアルカス種中に発生したときの自然的に発生する２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼを包含する。また、ＰｑｓＤタンパク質に関して上記に言及されている如く定義される自然的に、及び非自然的に発生する変異体を含む。
【００６３】
ＰｑｓＡタンパク質及び２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼは、ＰｑｓＤタンパク質に関して上記に述べられているように調製することができる。
【００６４】
ＰｑｓＤタンパク質の第二の基質は、３−オキソアルカン酸、より好ましくは３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸、及び最も好ましくは３−オキソデカン酸である。当業者であれば、３−オキソアルカン酸、より好ましくは３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸、そして最も好ましくは３−オキソデカン酸を、当技術分野において知られている方法によって生成することができるであろう。この実験手順では、３−オキソ−デカン酸の合成は、例示的に開示されている。当業者であれば、３−オキソアルカン酸、例えば、３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸を合成する手順を承知しているであろう。更に、この物質は商業上入手可能である。
【００６５】
この発明の関連では、ＰｑｓＤタンパク質又はその機能的に活性な断片若しくは変異体、及び１つ又は複数の試験化合物を上記に示されている基質と共に、進行する反応に適切である条件下にて接触させる。こうした条件は、上記に示されている通りである。化合物（複数を含む）を、試験開始前、あるいは反応が進行している間に反応混合物に加えることができる。好ましい実施態様ではアントラニロイル−ＣｏＡ、ＰｑｓＤタンパク質及び試験化合物を、こうしたコンポーネントが温度平衡（temperature-equilibrated）になるのに適切な時間及び条件下にて接触させる。次いでこの試験システムを接触させ、そして反応を、試験システムに対する影響を有し、そしてそれを検出するのに適切な時間及び条件下にて、３−オキソアルカン酸、より好ましくは３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸、そして最も好ましくは３−オキソデカン酸を添加することによって開始した。平衡工程及び反応工程のための適正な条件は、基質と酵素の平衡、及び基質の生成物への変換を可能にし、そして例えば、関係のあるタンパク質の変性を避けるための時間及び溶液を含む。適切な条件は、選択された特定の試験システムに左右され、当業者であればその人の通常の知識に基づいてそれを選択することができるであろう。平衡及びインキュベーション工程は、約５秒から数時間まで、好ましくは約１分から約１０分まで（最も好ましくは、２分）変化しうる。しかしながら、この平衡及びインキュベーション時間は、アッセイフォーマット、マーカー、溶液の量、濃度などに左右されるであろう。
【００６６】
ＰｑｓＤ活性の変化を測定する場合には、ＰｑｓＤタンパク質の上流又は下流の作用を検出することができる。例えば、基質の変換又は生成物形成に対する作用を決定することができる。一実施態様では、基質の量又は生成物の量の変化が検出される。
【００６７】
この発明の関連では、好ましくは、アントラニロイル−ＣｏＡ及び３−オキソアルカン酸［好ましくは、３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸、そしてより好ましくは、３−オキソデカン酸］である基質のそれぞれの生成物への酵素変換は、ＰｑｓＤタンパク質又はその変異体の使用によって起こる。反応の工程の間、基質は消費され、そしてその濃度が低下する一方、生成物が形成され、その濃度が上昇する。試験化合物が生成物の生成を阻害するかどうかを決定するためには、基質コンポーネント及びＰｑｓＤタンパク質の双方に一定値を付与する。試験化合物、基質コンポーネントであるアントラニロイル−ＣｏＡ、及び酵素を混和し、そして温度を平衡化する。反応を、３−オキソアルカン酸、好ましくは３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸、そしてより好ましくは３−オキソデカン酸である第二の基質を添加することによって開始し、そして一定期間インキュベートする。次いで、一定時間間隔における基質濃度の低下、又は生成物濃度の上昇を、当技術分野の当業者において公知の方法によって決定することができる。コントロール反応、好ましくは、阻害剤を加えていないコントロール反応との比較によって、試験化合物が基質の生成物への変換を阻害する、すなわち、ＰｑｓＤタンパク質の活性を阻害することができるかどうかが示される。例えば、基質分子の減少がコントロール反応における場合と比較してより少ない場合、あるいは、生成物分子の増加がコントロール反応における場合と比較してより少ない場合には、変換の阻害が起こっており、そして試験化合物は、病原性感染の処置、軽減又は予防に有用な阻害剤として特定される。好ましい実施態様では、基質の減少、あるいは生成物の増加は、コントロールと比較して、試験化合物によって、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２５％、より好ましくは、少なくとも５０％、更により好ましくは、少なくとも７５％、そして最も好ましくは少なくとも９０％だけ変化する。
【００６８】
この発明の文脈では、病原性感染を処置し、軽減し、又は予防する作用は、好ましくは、ＰｑｓＤタンパク質の酵素活性に対して、化合物の阻害効果として測定されるので、この閾値は、一定のＩＣ50値として付与されることが好ましい。当技術分野において通例知られているように、このＩＣ50値は、酵素活性の最大阻害の半分に必要な化合物濃度を意味する。明らかに、ＩＣ50値は、酵素の量、酵素の活性状態、コアクティベーター又はコレプレッサーなどのコファクターの存在、アクティベーター及びインヒビター（阻害剤）の存在、並びに塩濃度、温度、ｐＨなどの周囲条件を含む一連のファクターに依存する相対的な値である。この発明の文脈では、化合物は、好ましくはＩＣ50値が、５０μΜ未満、２０μＭ未満、１０μＭ未満、５μＭ未満、４μＭ未満、３μＭ未満、２μＭ未満、１μＭ未満、０．５μＭ未満、０．４μＭ未満、０．３μＭ未満、０．２μＭ未満、０．１μＭ未満、０．０５μＭ未満、０．０２μＭ未満又は０．０１μＭ未満であるときに、病原性感染を処置し、軽減し、又は予防するために有用である化合物として特定しうる。
【００６９】
種々のアッセイが当技術分野において知られており、このアッセイによって当業者は、化合物の濃度、及びひいては基質及び生成物の濃度がコントロール反応に対して変化するかどうかの尺度を決定することができる。放射能の基質への取り込み、又は基質からのその放出を測定する放射分析アッセイが、明確に言及される。こうしたアッセイにおいて最も頻繁に使用される放射性同位体は、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ及び125Ｉである。クロマトグラフィーアッセイは、クロマトグラフィーによって反応混合物をそのコンポーネントに分離することによって生成物の形成を測定する。これは通例、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってなされるが、薄層クロマトグラフィーのより簡単な手法を使用することもできる。このアプローチには多くの材料が必要でありうるが、その感受性は、基質／生成物を放射性又は蛍光タグを用いて標識することによって増大させることができる。好ましい方法は、ＨＰＬＣ／ＭＳによる定量化である。
【００７０】
液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ，又はこれに代えてＨＰＬＣ−ＭＳ）は、液体クロマトグラフィー（又はＨＰＬＣ）の物理的分離性能をマススペクトロメトリーの質量分析性能と組み合わせた分析化学手法である。ＬＣ−ＭＳは、極めて高感度及び特異性を有する多くの適用対象に用いられる有力な手法である。一般にその利用は、他の化学物質の存在下で（複雑な混合物中）化学物質の特異的な検出及び可能性のある特定化に向けられている。
【００７１】
用語“質量分析法（mass spectrometry）”とは、試料から表面上に気相イオンを発生させ、そして質量分析計を用いて気相イオンを検出するイオン化源の使用を意味する。用語“レーザー脱離質量分析法（laser desorption mass spectrometry）”とは、試料から表面上に気相イオンを発生させ、そして質量分析計を用いて気相イオンを検出するイオン化源としてのレーザーの使用を意味する。アシル化したアシルアクセプターなどの生体分子のための質量分析の好ましい方法は、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法、すなわち、ＭＡＬＤＩである。ＭＡＬＤＩでは通例、分析物を、乾燥すると分析物と共結晶化するマトリクス材料と混和する。マトリクス材料は、そうでないと不安定な生体分子又は分析物を崩壊させるエネルギー源からエネルギーを吸収する。別の好ましい方法は、表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析法、すなわち、ＳＥＬＤＩである。ＳＥＬＤＩでは、分析物が塗布されている表面が分析物捕捉及び／又は脱離において積極的な役割を演じる。本発明の文脈では、試料は、クロマトグラフィー又は他の化学処理を受けた場合もありうる生物学的試料及び適切なマトリクス基質を含んでなる。マススペクトロメトリーで、“見かけの分子質量（apparent molecular mass）”とは、検出されたイオンの分子質量（ダルトン単位）電荷値、ｍ／ｚを意味する。見かけの分子質量がどのように誘導されるかは、使用する質量分析計のタイプに依存する。飛行時間型質量分析計の場合には、この見かけの分子質量は、イオン化から検出までの時間の関数である。用語“シグナル（signal）”とは、検討中の生体分子によって発生されるあらゆる応答を意味する。例えば、用語「シグナル」とは、質量分析計の検出器にヒットする生体分子によって発生される応答を意味する。シグナル強度は生体分子の量又は濃度と相関関係をもつ。このシグナルは２つの値：記載されているように発生した見かけの分子質量値と強度値によって定義される。この質量値は生体分子の元素の特性値であり、一方強度値は、対応する見かけの分子質量値をもつ生体分子の相当する量又は濃度に合致する。従って、“シグナル（signal）”は常に生体分子の特性を意味する。
【００７２】
ＨＰＬＣとの組み合わせでは、解析対象物は、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）又はＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）などの様々なＡＰＩ手法によってイオン化される。分析器では、イオンは、それらのイオンの質量電荷 ｍ／ｚ比に従って分離される。特に好ましい実施態様では、基質であるアントラニロイル−ＣｏＡ及び／又は３−オキソアルカン酸、好ましくは３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸、又はより好ましくは３−オキソデカン酸、あるいは、生成物である４−ヒドロキシ−２−アルキルキノリン、好ましくは４−ヒドロキシ−２−（Ｃ1−Ｃ20）アルキルキノリン、又はより好ましくはＨＨＱの濃度などの基質又は生成物濃度は、ＨＰＬＣ／ＭＳによって決定される。より好ましい実施態様では、４−ヒドロキシ−２−アルキルキノリン、好ましくは、４−ヒドロキシ−２−（Ｃ1−Ｃ20）アルキルキノリン、又はより好ましくは、ＨＨＱなどの生成物の形成は、ＨＰＬＣ／ＭＳによって定量化される。Fletcher et al., Nature Protocols 2:1254-1262 (2007) において、ＰＱＳ、ＨＨＱ及び関連する２−アルキル−４−キノロン分子を決定するための、ＨＡＱｓが特異的に構築されたレポーター株の生物発光を介して検出されるバイオセンサーベースアッセイが記載されている。こうしたアッセイは、時間がかかり、かつ多大の労力が必要であり、自動化（automatisation）の可能性は極めて低く、潜在的に病原体との接触が必要である。アントラニロイル−ＣｏＡ及び３−オキソアルカン酸［好ましくは３−オキソ（Ｃ4−Ｃ23）アルカン酸、又はより好ましくは３−オキソデカン酸など］の基質の、４−ヒドロキシ−２−アルキルキノリン、好ましくは４−ヒドロキシ−２−（Ｃ1−Ｃ20）アルキルキノリン、又はより好ましくはＨＨＱなどの生成物へのインビトロ変換に関連してＨＰＬＣ−ＭＳによる化合物（基質及び生成物）の検出は、自動化及び安全な取り扱いのための迅速な作業及び見込みの可能性を提示している。これは、既に存在している物質ライブラリー中の阻害剤をスクリーニングするための可能性を広げている。ＨＰＬＣ−ＭＳシステムの利点を考慮すると、このシステムは、基質及び／又は生成物、及び好ましくは、この発明における生成物の定量化の好ましいシステムである。
【００７３】
この発明の最も好ましい実施態様は、アントラニロイル−ＣｏＡ及び３−オキソデカン酸が、試験化合物の存在下で、配列番号：１のＰｑｓＤによって変換され、そしてＨＰＬＣ−ＭＳによるＨＨＱの量を測定することによって、試験化合物を含まないコントロール反応と比べて酵素活性を測定する方法である。この反応は、適切な無細胞反応溶液中、インビトロで行なわれる。
【００７４】
これに代えて、ＰｑｓＤ活性は、ＨＡＱの抗菌活性を測定することによって測定することができる。
【００７５】
この発明の別の局面では、試験化合物のＰｑｓＤタンパク質に対する結合及び作用は、ＰｑｓＤタンパク質との相互作用、あるいはＰｑｓＤタンパク質への結合を決定することによって直接的に決定することができる。従って、試験化合物のＰｑｓＤタンパク質との相互作用／結合は、ＰｑｓＤタンパク質及び試験化合物の複合体を検出することによって決定することができる。こうした相互作用は、ＰｑｓＤタンパク質の活性を高めるか、あるいは低下させうる。一実施態様では、試験化合物がＰｑｓＤタンパク質に結合するか、あるいはＰｑｓＤタンパク質と相互作用する能力を決定することは、上記に説明した如く、ＰｑｓＤタンパク質の活性を決定することによって達成することができる。この発明の文脈では、試験化合物は、それがＰｑｓＤタンパク質の活性を低下させる場合には、病原性感染を処置し、軽減し、又は予防するために適している。２つ又はそれより多いコンポーネントの複合体を検出する適切な方法は、下記に詳述されている。
【００７６】
特定のタンパク質又は他の核酸の存在又は量を測定するために設計されている多くの公知の検出方法は、タグ、マーカー又は標識の使用に左右される。試験システム又は試験化合物のコンポーネントは、十分な検出又は精製が可能なように、種々の方法で標識することができる。１つの好ましい実施態様では、検出可能なマーカーは、試験システムに対する作用を検出するために使用される。この場合には、ＰｑｓＤタンパク質、試験化合物及び／又は試験システムの更なるコンポーネントを少なくとも１つの検出可能なマーカーを用いて標識することができる。
【００７７】
通常の標識方法は、コンポーネントの１つ又は複数の官能基を標識するために使用することができる。タンパク質の場合には、これらは、例えば、各ポリペプチド鎖のＮ末端及びリシン残基の側鎖に存在する第１級アミノ基；ジスルフィド結合を還元剤で処理するか、又はリシン残基をスクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）などの試薬で修飾することによって利用可能にしたシステイン残基上に存在するスルフヒドリル基；又は、通例、抗体のＦｃ領域中に存在する炭水化物基［該炭水化物基は、酸化されて、カップリングのための活性なアルデヒドを創成することができる］でありうる。このコンポーネント又は化合物は、ビオチン（アビジン−ビオチン化学のため）、酵素、アミン、スルフヒドリル又は他の官能基標識のための活性化蛍光色素［例えば、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ色素又はアレクサフルオロ（Alexa fluos）を加える］などの一連の種々の作用物質を用いて標識することができる。3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ、125Ｉ又は14Ｃなどの放射性標識、並びにペニシリナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼを含む一般的な酵素標識もまた用いることができる。
【００７８】
そうした化学タグ、マーカー又は標識を介して検出可能である標的特異的プローブの使用がこの発明によって想定される。抗体は最も一般的な種類のプローブである；特定の抗原に対するそれらの結合親和性はそうした標的が複合体試料（complex sample）中に“見出され（found）”、そして検出されることを可能にする。しかしながら、抗体はそれ自身タンパク質であり、それらが可視化のために標識されていないか、あるいは二次的に標識されている別の分子でプローブされていない場合には、それらはアッセイ系中で特異的に検出可能ではない。
【００７９】
マーカー（又はタグ又は標識）は、別の物質又は物質の複合体の存在を指摘することができるあらゆる種類の物質である。このマーカーは、検出される物質に連結するか、あるいは検出される物質中に取り込まれている物質でありうる。検出可能なマーカーは、例えば、タンパク質、酵素反応の生成物、第二メッセンジャー（second messenger）、ＤＮＡ、分子の相互作用などを検出するために分子生物学及び生物工学で使用される。適切なマーカー又は標識の例には、フルオロフォア（fluorophore）、発色団、放射標識、金属コロイド、酵素、又は化学発光若しくは生物発光分子が含まれる。フルオロフォアの例には、フルオレセイン、ローダミン、及びスルホインドシアニン色素Ｃｙ５が含まれる。放射標識の例には、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、99mＴｃ又は125Ｉが含まれる。酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、及びウレアーゼが含まれる。
【００８０】
異なるタイプの化学標識又はタグは二次抗体又は一次抗体及び他の分子にコンジュゲートでき、様々な方法によるそれらの可視化（すなわち、検出及び測定）を容易にすることができる。放射性同位体は過去には広範囲に使用されていたが、こうしたものは高価であり、シェルフライフが短く、シグナルの改善がなく：ノイズ比率、そして特別な取り扱い及び処理が必要である。酵素及びフルオロフォアが、アッセイのための検出可能なタグとして、放射性同位体に大幅に取って代わってきている。試薬及び機器のいくつかの進歩によって、こうしたより新しい技術を、より汎用性があり、かつ有力にさせている。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素タグは、ブロッティング、免疫学的アッセイ、及び免疫組織化学方法の場合に最も一般的に使用される。蛍光タグは細胞イメージング、核酸増幅及びシークエンシング及びマイクロアレイの場合に主に使用されている；しかしながら、蛍光技術はあらゆるタイプのアッセイにおける応用のために急速に発展している。
【００８１】
タンパク質を検出するには、特異抗体の使用がしばしば必要となる。従って、ＰｑｓＤタンパク質又はその機能的変異体の検出は、特異的なＰｑｓＤ抗体を含みうる。抗体は、調製された抗原の形態を用いる、免疫化動物のために十分に確立された手法を使用して調達することができる。種々の試薬が利用可能であり、抗体産生及び精製に役立ち、そして種々の会社が抗体作成サービスを専門にしている。果たすべき適用次第であるが、異なったレベルの純度及び特異性の種類が一次抗体の供給に必要である。ほんの一部のパラメーターをあげると、抗体はモノクローナルであってもよいし、それともポリクローナルであってもよく、抗血清、又はアフィニティー精製溶液として供給され、そして天然タンパク質検出、あるいは変性タンパク質検出の妥当性が検証される。
【００８２】
標的抗原、本件ではＰｑｓＤ又はその機能的変異体を認識する抗体は、“一次抗体（primary antibody）”と呼ばれる。この抗体を、タグを用いて標識する場合には、この抗原の直接検出が可能である。しかしながら、通例、直接検出の場合にはこの一次抗体は標識されない。その代わり、検出可能なタグで標識された“二次抗体（secondary antibody）”を、標的抗原に結合している一次抗体プローブに第二工程中で加える。すなわち、この抗原は間接的に検出される。間接的検出の別の形態では、ビオチンのようなアフィニティータグで標識されている一次又は二次抗体を用いることが必要である。次いで検出可能な酵素又はフルオロフォアタグで標識したストレプトアビジンのような二次（又は三次）プローブを、ビオチンタグプローブするために使用し、検出可能なシグナルを生じさせることができる。こうしたプロービングのいくつかの変異体及び検出ストラティジーが存在する。しかしながら、１つ１つは特異的プローブ（例えば、一次抗体）に左右され、その存在は直接又は間接的に、ある種の測定可能なタグ（たとえば、その活性が、その基質と反応して着色生成物をもたらすことができる酵素）に連結する。
【００８３】
通例、検出可能な標識のない一次抗体及びある種の二次（間接的）検出法が、アッセイ方法の中で必要である。それにもかかわらず、ほとんどすべての抗体は、必要に応じて、ビオチン、ＨＲＰ酵素又はいくつかのフルオロフォアの１つで標識することができる。大抵の一次抗体はマウス、ウサギ又は他のいくつかの種の１つで作成される。ほとんどすべてのこうしたものはＩｇＧクラスの抗体である。それ故、製造業者が、大部分の利用及び検出システムのためにすぐに使用できる標識二次抗体を作成し、供給することは比較的簡単であり、かつ経済的である。然れども、純度レベル、ＩｇＧ及び種特異性、並びに検出標識レベルの点で異なる、数百のオプションが利用可能である。二次抗体の選択は、一次抗体が調達される動物種（宿主種）に左右される。例えば、一次抗体がマウスモノクローナル抗体である場合には、二次抗体はマウス以外の宿主から得られた抗マウス抗体である必要がある。
【００８４】
プローブとしてのビオチン結合タンパク質である場合には、ビオチンと、アビジン若しくはストレプトアビジンタンパク質の間の高度に特異的なアフィニティー相互作用が、多くの種類の検出及びアフィニティー精製方法のベースである。酵素標識は、ブロッティング及び免疫アッセイで検出のための二次抗体（又はストレプトアビジン）タグとして最も一般的に使用されている。酵素はそれらの活性を介して検出可能なシグナルを提供する；特異的基質との化学反応が、着色した光放出、又は蛍光生成物を生ぜしめる。実例としては、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がある。検出のための蛍光標識は、フローサイトメトリー（ＦＣ）、蛍光活性化セルソーティング（fluorescence-activated cell sorting）（ＦＡＣＳ）及び蛍光顕微鏡を用いる免疫組織化学（ＩＨＣ）などの少数の細胞生物学的応用において歴史的に使用されてきた。標識プローブのための通常のフルオロフォアの例としては、フルオレセイン（フルオレセインイソチオシアネート，ＦＩＴＣ）及びローダミン（テトラメチルローダミンイソチオシアネート，ＴＲＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びフィコビリタンパク質（アロフィコシアニン、フィコシアニン、フィコエリスリン及びフィコエリスロシアニン）がある。
【００８５】
これに代えて、あるいはこれに加えて、２つの物質［例えば、試験化合物及びＰｑｓＤタンパク質］の近接性を検出するために、２つのマーカーを使用することができる。これらのマーカーは、例えば、１つの放射性又は蛍光性マーカーと、１つのシンチレータでもよく（例えば、シンチレーション近接アッセイの場合）、あるいは２つの蛍光マーカーを使用することもできる（例えば、ＦＲＥＴの場合）。一実施例では、ＰｑｓＤタンパク質及び試験物質は、第一及び第二マーカーで標識することができる。試験物質がタンパク質に結合し、それ故、標識が非常に近接している場合には、エネルギーは第一から第二の標識に移動することができ、従って、ＰｑｓＤタンパク質と試験物質の相互作用を検出することができる。この試験は、公知のＰｑｓＤリガンドが標識の１つを担持している競合結合試験として設計することができる。
【００８６】
適切なマーカーの組み合わせの例には、イットリウム珪酸塩又はポリビニルトルエンなどのシンチレータと組み合わせた放射標識、3Ｈ、33Ｐ、35Ｓ又は14Ｃ、125Ｉ［例えば、微粒子に分けられる］、あるいは、ＬＣ−Ｒｅｄ ６１０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６７０、ＬＣ−Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミン ローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミン ｘ イソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート又はランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユーロピウム、テルビウム）などのアクセプター蛍光マーカーと組み合わせた、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリスリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエロー ＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル １−ピレンブチレート（succinimdyl 1-pyrenebutyrate）、及び４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸誘導体などのドナー蛍光マーカーが含まれる。
【００８７】
競合結合試験の場合には、公知のリガンド又は結合分子ＰｑｓＤを少なくとも１つの検出可能なマーカーで標識し、そしてｂ）のインキュベーション工程に加える。工程ｂ）の後、結合した標識リガンドを非結合リガンドから分離する。この分離は、ろ過、遠心分離、固定化、相分離及び液体の除去などの一般的な分離工程によってなされうる。標識によって提供されたシグナルの量は、結合したリガンドの量を示しており、それ故、また、リガンドと試験化合物は生体分子への結合を得るために争うので、生体分子に結合した試験化合物の量をも示している。
【００８８】
一実施態様では、試験化合物とＰｑｓＤタンパク質の相互作用を検出のためのアッセイは、ＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ、ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ、又はＦＰ（蛍光偏光）アッセイである。
【００８９】
ＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）は、生化学スクリーニングのために使用されるホモジニアス系において広範囲のプロセスの迅速であり、かつ感受性を有する測定を生物学的に可能にする技術の一種である。ＳＰＡにかかわるビーズのタイプは、寸法、及びビーズ自身の内部は微視的であり、それが刺激されたときに光を放出するシンチラントが存在する。刺激は、放射標識分子がビーズと相互作用するときに生じる。この相互作用は、ビーズが光を放出するのを誘発することになり、それはシンチレーションカウンターを用いて検出することができる。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）では、２つの発色団間の放射のないエネルギー移動が述べられている。励起状態でのドナーの発色団は、非放射長距離の双極子−双極子カップリングメカニズムによってエネルギーを近接している（通例、＜１０ｎｍ）アクセプターフルオロフォアに移動させることができる。タンパク質が作用物質に結合することをモニタリングする場合には、一方の分子をドナーで標識し、他方をアクセプターで標識し、そしてこうしたフルオロフォア標識分子を混和する。これらが非結合状態で存在するときには、ドナー放出がドナー励起して検出される。分子が結合すると、このドナー及びアクセプターは近接状態になり、そしてドナーからアクセプターへの分子間ＦＲＥＴのため、アクセプター放出が主に観察される。ＦＲＥＴ技術における種々のアクセプター蛍光モイエティと共に使用することができる代表的なドナー蛍光モイエティには、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリスリンなどが含まれる。代表的なアクセプター蛍光モイエティには、使用されるドナー蛍光モイエティに左右されるが、ＬＣ−Ｒｅｄ ６１０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６７０、ＬＣ−Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミン ローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート又はランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユーロピウム、又はテルビウム）が含まれる。ドナー及びアクセプター蛍光モイエティは、例えば、Molecular Probes (Junction City, OR) 又は Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO）から得ることができる。また、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）は、この発明の試験システムのために使用することができる。ＴＲ−ＦＲＥＴは、ＴＲＦ（時間分解蛍光）とＦＲＥＴの原理を統合したものである。この組み合わせによって、ＴＲＦの低いバックグラウンドの利点とＦＲＥＴのホモジニアスアッセイフォーマットが合体される。ＦＲＥＴについては既に上記に述べられているところであるが、ＴＲＦは長い半減期を有する、ランタニド類（lanthanides）又は他の任意のドナーのユニークな特性を利用している。ＴＲ−ＦＲＥＴの場合の好適なドナーには、とりわけ、ランタニドキレート（クリプタート）及び他のいくつかの金属リガンド複合体が挙げられ、これらは、マイクロからミリ秒時間範囲内の蛍光半減期を持つことができ、従って、また、これらによってエネルギー移動がマイクロからミリ秒測定値で生じさせることが可能となる。蛍光偏光（ＦＰ）に基づくアッセイは、溶液中の蛍光性基質を励起するために偏光を使用するアッセイである。こうした蛍光性基質は、溶液中において遊離型であり、そして回転（tumble）し、その結果放出光が脱分極する。基質がより大きな分子、すなわち、アシル基に結合すると、その回転速度は大幅に減少し、放出光は高度に分極されたままとなる。これに代えて、マススペクトロメトリーを使用することができる。
【００９０】
この発明の更なる局面では、この方法はインビトロで行なわれる。インビトロ（ラテン語：ガラス器内で）で行なわれる手順が、生体内ではなく、試験管又はペトリ皿中など制御された環境内で行なわれる。基質であるアントラニロイル−ＣｏＡと３−オキソデカン酸をインキュベーションして、タンパク質ＰｑｓＤを用いることによって、ＨＨＱの生成がなされることになるという本発明者らの知見によって、インビトロアッセイシステムでのこの反応の遂行が可能になる。このことはＨＨＱ及び他のＨＡＱｓの生合成を更に詳細に研究する可能性を広げるのみならず、ＰｑｓＤタンパク質の阻害剤をスクリーニングするシステムを開発する新規なアプローチを付与することになる。インビトロアッセイは、インビボ方法において発生しうる不利な点を回避し、その一例を挙げれば、例えば、ＨＡＱｓ、特に、ＨＨＱ又はＰＱＳの合成に関与しているコンポーネントが存在する場合にありうる不明瞭な点、可能性のある病原性作用物質に関する検討、自動化の可能性の制限、及び時間及び労働の消費の増大がある。インビトロアッセイでは、反応に参加しているコンポーネントは、試験管中で結合しており、その反応が進行し、そして、コンポーネントの結合、又は基質の生成物への変換が決定される。それ故、この発明の好ましい実施態様はインビトロアッセイである。
【００９１】
これによって、この発明のアッセイは、好ましくは、無細胞アッセイであり、ＰｑｓＤタンパク質又はその変異体を試験化合物に接触させ、そしてＰｑｓＤタンパク質又はその変異体に結合する試験化合物の能力を決定することを含んでなる。試験化合物のＰｑｓＤタンパク質又はその変異体への結合は、上記に説明した如く、直接的あるいは間接的に決定することができる。
【００９２】
あるいは、当業者であれば、ＰｑｓＤタンパク質を用いて酵素反応を行なう細胞ベースの方法を使用することができる。当業者は、それによって、先行技術及び提供される教示に基づいて、そうした方法を開発する状態にある。すなわち、この発明の実施態様では、この試験システムは、動物細胞、細菌細胞又は真菌細胞などの細胞内である。好ましくは、この細胞は、クオラムセンシングシステムを含まず、より好ましくは、この細胞はＨＡＱｓを生成せず、そして更により好ましくは、この細胞はＨＨＱを生成しない。この細胞は、上記に述べられている、少なくともｐｑｓＤ遺伝子又はその機能的に活性な変異体が導入される、遺伝子操作されている細胞でありうる。この細胞がもっぱらｐｑｓＤ遺伝子でトランスフェクションされている場合には、アントラニロイル−ＣｏＡを試験する方法のために加えることが必要でありうる。これに代えて、これに加えて、アントラニロイル−ＣｏＡを生成する遺伝子を、必要ならば加えることができる。こうした遺伝子は、当技術分野における当業者に知られている。例えば、こうした遺伝子は、上記に言及した２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ（例えば、アゾアルカス・エバンシイ由来（配列番号：３））、あるいは、上記に言及したＰｑｓＡ遺伝子（例えば、緑膿菌由来（配列番号：２を有するタンパク質などの））でありうる。この場合、アントラニロイル−ＣｏＡの代わりにアントラニラート（anthranilate）を試験反応に加える。ｐｑｓＤ遺伝子、及び場合により、ＰｑｓＡ遺伝子ような生成物の形成を可能にする更なる遺伝子、又は２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ遺伝子でトランスフェクションされた細胞及び細胞株の調製は当技術分野で知られており、そして遺伝子操作によるＰｑｓＤタンパク質の調製に関しては本明細書中に記載されている。
【００９３】
あるいは、細胞溶解物（粗製の、分画された、又は精製された）が使用されうる。こうしたものを生成する例示的な方法は当業者に知られており、フラグメンテーション、遠心分離及び再懸濁を含みうる。
【００９４】
別の実施態様では、この方法は、上記に定義されている通り、ＰｑｓＤタンパク質をコードするｐｑｓＤ核酸を提供し、そしてｐｑｓＤの発現の阻害剤を特定することを含んでなる。ｐｑｓＤの発現の阻害剤は、細胞を試験化合物と接触させ、そして細胞内でのｐｑｓＤ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を決定する方法で特定される。試験化合物の存在下で、ｐｑｓＤ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを、試験化合物の不存在下でのｐｑｓＤ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルと比較する。次いでこの試験化合物を、ｐｑｓＤ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が、試験化合物の不存在下の場合と比較してより低い場合に、こうした比較に基づいてｐｑｓＤ発現の阻害剤として特定することができる。ｐｑｓＤ ｍＲＮＡ又はタンパク質を決定する方法は、当技術分野で知られているか、または本明細書中に記載されている。
【００９５】
試験化合物の核酸に対する作用は、種々の発現、又はシグナル伝達レベル（signal transduction levels）によって決定することができる。試験化合物は、ｐｑｓＤ遺伝子の調節配列（regulatory sequence）、又はｐｑｓＤ遺伝子自体に結合するように設計しうる。それによって、試験化合物は、遺伝子発現に対する作用を持つことができうる。従って、試験化合物の調節配列への結合は、調節配列又は遺伝子と、試験化合物の複合体を検出することによって決定しうる。２つ又はそれより多いコンポーネントの複合体を検出する適切な方法は、本明細書中に詳述されている。調節配列は、転写因子などの調節タンパク質が優先的に結合するＤＮＡの断片である。こうした調節タンパク質は、ゲノム中で適切に位置している（通例、調節されている遺伝子の短い距離の‘上流（upstream）’）調節領域と呼ばれるＤＮＡの短いストレッチに結合する。そうすることによって、こうした調節タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼとよばれる、別のタンパク質複合体を動員することができる。このように、それらは遺伝子発現を制御する。調節配列は、通例、他の調節領域と共同して働いて、所与の遺伝子の転写のレベルを方向づけるプロモーター領域を含む。
【００９６】
あるいは、試験化合物の作用（例えば、結合）及び遺伝子転写に対する作用は、間接的に検出することができる。この場合には、ｐｑｓＤ遺伝子の下流の作用が、検出することができる。例えば、ｐｑｓＤに関連する転写及び翻訳に対する作用を決定することができる。一実施態様では、ｐｑｓＤ ｍＲＮＡ又はＰｑｓＤタンパク質の量が検出される。
【００９７】
ｍＲＮＡを検出する適切な方法には、当技術分野において知られている方法、例えば、ノーザンブロット解析、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＮＰＡ）、ｉｎ ｓｉｔｕ（インサイチュ）ハイブリダイゼーション、及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が含まれる。ノーザンブロッティング手順の場合には、膜結合性ｐｑｓＤ核酸にハイブリダイゼーションさせるために、ランダムプライミングされたＤＮＡプローブ、ニック翻訳を行なったＤＮＡプローブ、又はＰＣＲによって作製されたＤＮＡプローブ、インビトロ転写ＲＮＡプローブ、及びオリゴヌクレオチドを含めて、非同位体放射標識プローブ又は高比活性放射標識プローブを使用することができる。これに加えて、部分的にのみ相同性を有する配列（例えば、異なる種由来のｃＤＮＡ）をプローブとして使用することができる。ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＮＰＡ）は、特異的なｍＲＮＡを検出及び定量のための極めて高感度な方法である。ＮＰＡの原理は、アンチセンスプローブ（放射性標識又は非同位体）をＲＮＡ試料に溶液ハイブリダイゼーションすることである。ＲＴ−ＰＣＲでは、ＲＮＡテンプレートが、レトロウイルス逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）にコピーされる。次いでこのｃＤＮＡを、ＰＣＲによって指数的に増幅させる。
【００９８】
上記の方法は、核酸標識を含みうる。ＤＮＡ、ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドの標識を可能にする一連の手法は当業者に知られている。こうしたものには、例えば、ＤＮＡプローブのニックトランスレーション標識、ＤＮＡプローブのランダムプライミングＤＮＡ標識、ＤＮＡプローブのＰＣＲ標識及びオリゴヌクレオチド３’／５’末端標識、ＲＮＡプローブの転写標識、オリゴヌクレオチド３’／５’末端標識及びオリゴヌクレオチドテイリングが挙げられる。上記の標識方法に使用することができる種々の標識が知られている。それらの検出を含めてそうしたものの一部を以下に例示的に記載する：
【００９９】
ビオチン標識化合物は、例えば、抗ビオチン抗体によって、又はアビジン又はストレプトアビジンコンジュゲートによって検出することができる。抗ビオチン抗体［例えば、モノクローナル抗ビオチン抗体又はＦａｂ−断片（アルカリホスファターゼ（ＡＰ）でコンジュゲートされている）］を、ナイロンメンブレンでの発光を伴う酵素免疫アッセイによってビオチン標識核酸を検出する際に使用することができる。アビジン又はストレプトアビジンコンジュゲートは、いくつかの免疫学的検出系の場合に使用できるビオチン標識物質（例えば、ビオチン化抗体）を検出する場合に使用される。この場合には、例えば、ストレプトミセス・アビジニイ（Streptomyces avidinii）に起源するアビジン又はストレプトアビジンは、アルカリホスファターゼ又はβ−ペルオキシダーゼとカップリングすることができる。プローブ−標的ハイブリッドは、酵素結合免疫アッセイを用いて検出することができる。この免疫化学検出工程は通例、放射性検出手順と比較してより高感度である。このアッセイでは、メンブレンをブロッキングし、抗体とフィルターとの非特異的相互作用を妨ぐことができる。ジゴキシゲニンに特異的なアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体は、標識ハイブリッド上のジゴキシゲニン（digoxigenin）分子を認識する。アルカリホスファターゼ基質を添加すると、このハイブリッドの可視化が可能になる。化学発光検出の場合には、アルカリホスファターゼの適切な基質は、３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２−（５−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート・二ナトリウム、又は４−クロロ−３−（メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２−（５−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート・二ナトリウムなどのジオキセタンフェニルホスフェートである。アルカリホスファターゼによって脱リン酸化すると中間体が形成され、その分解によって、例えば、Ｘ線フィルムに記録することができる光放出がもたらされる。ＤＩＧ標識プローブ比色検出は通例、レドックス系を形成する無色基質と共に行なわれる。例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート及び４−ニトロ−ブルー−テトラゾリウム−クロリドなどがある。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェートは、アルカリホスファターゼによって酸化され、ホスフェート基の放出によってインジゴになる。並列して、４−ニトロ−ブルー−テトラゾリウム−クロリドは、還元されてジホルマザンになる。この反応生成物は、メンブレンの種類によるが、水不溶性の暗青色から帯褐色沈殿を形成する。
【０１００】
種々のレポーター分子は、検出抗体とカップリングして、特定のプローブターゲットハイブリダイゼーション［これには、酵素結合抗体（enzyme-coupled antibodies）、蛍光色素標識抗体（蛍光色素によって放出される、波長の可視化を可能にする蛍光顕微鏡及び特定のフィルターによって検出）、及び金コロイドに結合する抗体（冷却した切片（cryostatic sections）を電子顕微鏡によって検出）などが含まれるが、それらには限定されない］を可視化することができる。
【０１０１】
複数・同時ハイブリダイゼーション（Multiple simultaneous hybridizations）は、ジゴキシゲニン標識プローブ、ビオチン標識プローブ、及び蛍光色素標識プローブの組み合わせを用いて、１つの調製物中で異なる染色体領域又は異なるＲＮＡ配列を局在化させることによって行うことができる。こうしたマルチプローブ（multiprobe）試験は、抗体にカップリングした異なる蛍光色素の可用性によって可能になる。こうしたものには、フルオレセイン又はＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート；黄色）、ローダミン又はＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート；赤）、及びＡＭＣＡ（アミノ−メチルクマリン酢酸；青）が挙げられる。
【０１０２】
調節配列に対する作用はまた、レギュレーター（regulator）配列をレポーター遺伝子に結合させ、そしてその結果生じたＤＮＡコンストラクトを細胞又は有機体（organism）に導入することよって検出することができる。培養液中の細菌又は真核細胞の場合には、これは通例、プラスミドと呼ばれる環状ＤＮＡ分子の形態である。レポーターの発現は、目的遺伝子を成功裡に取り込むためのマーカーとして使用しているので、研究中の細胞又は有機体中、天然では発現しないレポーター遺伝子を使用することが重要である。可視的に識別可能な特性を誘導する一般的に使用されるレポーター遺伝子には通例、蛍光及び発光タンパク質が必要である；例としては、クラゲ（jelly fish）の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ酵素、及びｄｓＲｅｄ遺伝子由来の赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。別の細菌中の一般的なレポーターには、ｌａｃＺ遺伝子がある。細菌中の選択可能なマーカーレポーターの例には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子がある。試験化合物の影響は、コントロールと比較して上記のシグナルの量を決定することによって検出することができる。
【０１０３】
この発明の好ましい実施形態では、方法はハイスループットスクリーニング方法である。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、特に薬物発見において使用され、生物学及び化学の分野に関連する科学実験のための方法である。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、例えば、ロボット工学、データ処理及び制御ソフトウェア、液体ハンドリング装置、及び高感度検出器を用いて、研究者が何千、又はそれどころか何百万個の生化学的、遺伝的又は薬理学的試験を迅速に行なうことを可能にする。このプロセスによって、特定の生体分子経路をモジュレートする活性化合物、抗体又は遺伝子を迅速に同定することができる。通例、ＨＴＳは、候補化合物のライブラリーに対するアッセイのスクリーニングを行なうのに自動化を用いる。典型的なＨＴＳスクリーニングライブラリー又は“デックス（decks）”は、１００，０００乃至２，０００，０００を超える化合物を含むことができる。ほとんどの場合、ＨＴＳの重要な試験容器は、マルチウェルプレート又はマイクロプレートである。ＨＴＳのための現代のマイクロプレートは通例、９６、３８４、１５３６、又は３４５６ウェルを有している。こうしたものは、すべて９６の倍数単位であり、８×１２ ９ｍｍ間隔ウェルを有しているオリジナルの９６ウェルマイクロプレートを反映している。大部分のウェルは、実験的に有用な物質、しばしば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び他の何らかの化学化合物の水溶液を含み、後者はプレート全体のそれぞれのウェルごとに異なる。他のウェルは、空である場合もあり、所望の実験コントロールとして使用することが意図されている。アッセイを準備するには、研究者はプレートの各ウェルに彼らが実験を行ないたい何らかの生物学的実体を充填させる。この場合には、ｐｑｓＤ核酸又はタンパク質を含む実験系をその中に充填させることになる。一定のインキュベーション時間が経過して、生物学的物質を、ウェル中の化合物に吸収させ、それに結合させ、さもなければそれと反応させ（又は反応させずに）た後、すべてのプレートのウェル全部を、手動、又は機器によって測定する。特殊化された自動式の分析機器によって、ウェル上でいくつかの実験（例えば、それらに偏光を照らし、そして反射率を測定する（これによってタンパク質結合が示されうる））が行なわれうる。この場合、該機器はそれぞれの数を１つのウェルから得られた値にマッピングして、グリッド数値として各実験の結果をアウトプットすることができる。高容量分析機器は、何千という実験データポイントを非常に迅速に作成して、このように数分間隔で数十のプレートを測定することができる。この発明の方法は、例えば、ロボットプレーティング（robotic plating）及びロボット液体輸送（例えば、微小液体を用いて）、すなわち、チャネル構造を含めてロボットシステムで行なうのが好都合である。
【０１０４】
更なる局面では、この発明は微生物によって引き起こされる病原性感染を処置し、軽減し、又は予防する化合物を特定する場合に、ｐｑｓＤ核酸又はタンパク質の使用を提供する。用語“ｐｑｓＤ核酸（pqsD nucleic acid）”又は“ＰｑｓＤタンパク質（pqsD protein）”及び“微生物によって引き起こされる病原性感染を処置し、軽減し、又は予防するための化合物を特定すること（identifying a compound for treating reducing or preventing a pathogenic infection caused by a microorganism）”に関しては、それはこの発明の方法の文脈で提供されている定義を指している。上記に述べられている方法が特定のために使用することができるということが注目される。
【０１０５】
この発明の更なる局面では、本明細書中で説明されている方法によって特定される化合物によって、処置、軽減、又は予防される感染は、微生物を形成するバイオフィルムによって引き起こされ、該微生物は、例えば、カテーテル、薬剤、又は薬物ポンプ、又はプロステーシスなどの薬物送達デバイスの上又はそれらの中にバイオフィルムを形成し、該微生物は、好ましくは、シュードモナスであり、特に緑膿菌である。
【０１０６】
この発明の方法では、試験化合物は、ＰｑｓＤ活性の低下が検出された場合に、病原性感染を処置し、軽減し、又は予防するために有用である。その結果、この試験化合物は阻害剤として機能する。ＰｑｓＤ活性の阻害剤として機能する化合物は、この発明によって特定化され、病原性感染を処置し、軽減し、又は予防するために有用である薬剤に導かれうる。薬剤を製造する場合には、特定化された目的物又はその製薬学的に許容される塩は一般的に、所望の特性を提供するように組み合わせた製薬学的に許容される担体又は補助剤などの成分の混合物から成る医薬投与剤形の形態でなければならない。こうして特定された阻害剤の例は、２−［（２−フェノキシビフェニル−４−カルボニル）アミノ］安息香酸である。
【０１０７】
この製剤は、少なくとも１つの適切な製薬学的に許容される担体又は補助剤を含んでなる。こうした物質の例には、脱塩水、等張生理食塩水、リンゲル液、緩衝剤、有機又は無機酸及び塩基並びにその塩、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、プロピレングリコールなどのグリコール類、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル類、グルコース、スクロース及びラクトースなどの糖類、とうもろこしデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン類、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミドなどの可溶化剤及び乳化剤、落花生油、綿実油、トウモロコシ油、大豆油、ひまし油などの油類、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルなどの合成脂肪酸エステル、ゼラチン、デキストラン、セルロース及びその誘導体、アルブミンなどの高分子アジュバント、有機溶媒、シトレート（citrates）及び尿素などの錯化剤、安定化剤、例えば、プロテアーゼ又はヌクレアーゼインヒビター、好ましくは、アプロチニン、ε−アミノカプロン酸又はペプスタチンＡ、ベンジルアルコールなどの保存剤、亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤、ワックス及びＥＤＴＡなどの安定化剤がある。着色剤、放出剤（releasing agents）、コーティング剤、甘味料、矯味矯臭剤及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤もまた、この組成物中に存在することができる。生理学的バッファー溶液は、およそ６．０〜８．０のｐＨ、殊におよそ６．８〜７．８のｐＨ、特におよそ７．４のｐＨ、及び／又はおよそ２００〜４００ミリオスモル／リットル、好ましくはおよそ２９０〜３１０ミリオスモル／リットルの浸透圧モル濃度を有することが好ましい。薬剤のｐＨは、一般に、例えば、好ましくは、リン酸塩バッファー、トリスバッファー （トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ヘペスバッファー（［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ］エタンスルホン酸）、又はＭＯＰＳバッファー （３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸）などの適切な有機又は無機バッファーを用いて調整される。それぞれのバッファーの選択は、一般的に、所望のバッファーのモル濃度に左右される。リン酸塩バッファーは、例えば、注射及び点滴溶液に適切である。薬剤を製剤化する方法並びに適切な製薬学的に許容される担体または補助剤は、当技術分野の当業者に周知である。製薬学的に許容される担体及び補助剤は、広く使用されている投与剤形及び識別された化合物に応じて、数ある中
で選択される。
【０１０８】
医薬組成物は、経口、経鼻、直腸、非経口、膣内、局所的又は膣内投与用に製造することができる。非経口投与には、皮下、皮内、筋肉内、静脈内又は腹腔内投与が含まれる。
【０１０９】
薬剤はカプセル剤、錠剤、丸剤、粉末剤及び顆粒剤などの経口投与のための固体投与剤形、製薬学的に許容されるエマルション、ミクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルなどの経口投与のための液体投与剤形、注入可能な製剤、たとえば、滅菌した注入可能な水性又は油性の懸濁液、好ましくは、坐剤である、直腸又は膣内投与のための組成物、並びに軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤又はパッチなどの局所又は経皮投与のための投与剤形を含む、様々な投与形態として製剤化することができる。
【０１１０】
任意の具体的な患者のための具体的な治療的に有効な投与量レベルは、特定された化合物の活性、投与剤形、患者の年齢、体重及び性別、処置期間、及び医療分野においてよく知られている同種類のファクターを含めて種々のファクターに左右されるであろう。
【０１１１】
ヒト又は他の哺乳類に１回又は分割投与で投与されるこの発明の化合物の１日当たりの総投与量は、例えば、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の量でありえ、あるいは、より好ましくは約０．１〜約２５ｍｇ／ｋｇ（体重）でありうる。単回投与の組成物はこうした量又はその約数を含み、１日投与量を作製することができる。一般に、この発明による処置レジメンは、こうした処置を必要とする患者に、１日あたり約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇのこの発明の化合物の化合物（複数を含む）を単回又は複数回投与量で投与することを含んでなる。
【０１１２】
本発明を更に、以下の図面及び実施例によって説明するが、該図面及び実施例は、この発明の範囲を説明するためであり、この発明の範囲を限定する意図ではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】４−ヒドロキシ−２−ヘプチルキノリン（ＨＨＱ）（パネルＡ）及びシュードモナスキノリンシグナル（ＰＱＳ）（パネルＢ）の化学構造を示す。
【図２】先行技術において提示されているＨＨＱ生合成の生合成スキームを示す。基質であるアントラニロイル−ＣｏＡ及び３−オキソデカン酸は、想定される中間体を介してＨＨＱに変換される。生合成における、ＰｑｓＢ、ＰｑｓＣ及びＰｑｓＤタンパク質の役割は不明のままである。
【図３Ａ】ＨＰＬＣ−ＭＳクロマトグラム、ＨＨＱ参照物質のＭＳスペクトル及びＭＳ2スペクトルを示す。
【図３Ｂ】ＰｑｓＤアッセイのＨＰＬＣ−ＭＳクロマトグラム、ＭＳスペクトル及びＭＳ2スペクトルを示す。ＰｑｓＤアッセイによって生成された化合物は、ＨＨＱであることは明らかである。ＢＰＣは、基準ピーククロマトグラム（base peak chromatogram）を表し、ＥＩＣは、抽出イオンクロマトグラム（extracted ion chromatogram）を表す。
【図４】アントラニロイル−ＣｏＡ濃度を固定、そして３−オキソデカン酸濃度を変化させた場合でのＰｑｓＤの反応速度論パラメーターを示す。ＰｑｓＤタンパク質はミカエリス−メンテンに適合していることが示された。Ｋm値は、０．５６ｍＭであると決定された。
【図５】２−［（２−フェノキシビフェニル−４−カルボニル）アミノ］安息香酸によるＨＨＱ生成の阻害を示す。ＩＣ50値は、３５μＭであると決定された。
【図６】ＰｑｓＤタンパク質の阻害剤として特定された２−［（２−フェノキシビフェニル−４−カルボニル）アミノ］安息香酸の化学構造を示す。
【実施例】
【０１１４】
実施例１：ＰｑｓＤタンパク質によるＨＨＱの生成
実験プロトコル：
ＨＨＱの構造は、その生成はアントラニル酸又はそのＣｏＡ誘導体を３−オキソデカン酸と縮合することによって行なわれることが示唆されている（図２）。この理論は、キノリン環系のヘテロ環部分が更に、アセタートユニット（acetate units）から合成される必要があるということを明確に示している標識アセタートでの検討が供給されたことによって裏付けられた（Bredenbruch F. et al. J Bacteriol. 2005; 187: 3630-3635）。キノリン環の３と４の炭素間の炭素−炭素結合の形成は、β−ケトアシル−アシルキャリアタンパク質シンターゼＩＩＩファミリーにすべて相同性を示す、タンパク質 ＰｑｓＢ、ＰｑｓＣ又はＰｑｓＤの１つによって触媒される可能性がある。ＰｑｓＤがＨＨＱ生成に必要であるかどうかを試験するために、我々は組み換えＰｑｓＤタンパク質を精製し、そしてインビトロでＨＨＱ生成を再調整することを試みた。非相同的タンパク質を、アントラニロイル−ＣｏＡ及び３−オキソデカン酸と共にインキュベートし、そしてこの反応をＨＰＬＣ−ＭＳによって解析した。
【０１１５】
結果：
このアッセイにおけるＨＨＱの生成を、同じ保持時間（１４．４分）で溶出し、そして同一のマススペクトル及びフラグメンテーションパターンを示した、ＨＨＱ参照物質と比較することによって確認した（図３Ａ及び３Ｂ）。ＨＰＬＣ−ＭＳ2によるＨＨＱの定量化方法を、１５９Ｄａで最も豊富な（abundant）ＨＨＱのフラグメントイオンに基づいて展開した。これによって、インビトロアッセイにおいて生成されたＨＨＱの量が決定されうる。
【０１１６】
アントラニロイル−ＣｏＡの濃度を２００μＭに固定し、３−オキソデカン酸の濃度を変化させて、ＰｑｓＤの反応速度論パラメーターが付与された。３−オキソデカン酸の場合のＰｑｓＤのＫm値はこの条件下で、５６２±９１μＭであった（図４）。
【０１１７】
実施例２：インビトロでのＰｑｓＤ阻害剤の決定
実験プロトコル：
今まで確立してきたＰｑｓＤアッセイを用いて、インビトロにおけるＰｑｓＤによるＨＨＱ生成の阻害剤である可能性をスクリーニングすることが可能である。この目的のために、アントラニロイル−ＣｏＡ、３−オキソデカン酸及びＰｑｓＤタンパク質の濃度に一定値を付与する。初めにＰｑｓＤ、アントラニロイル−ＣｏＡ及び試験化合物を一定期間プレインキュベートした。想定される阻害剤を、濃度を増加させながらアッセイに加えた。この反応を３−オキソデカン酸を添加することによって開始し、そして一定期間インキュベートした。次いでこの反応を、メタノールを添加することによってクエンチし、５０パーセントの最終濃度にした。それぞれの反応の場合、ＨＨＱ生成をＨＰＬＣ／ＭＳ2によって定量化した。異なる濃度の阻害剤の存在下で、生成したＨＨＱの量を、阻害剤を加えないコントロール反応の濃度と比較することによって、ＨＨＱ生成がコントロール反応の５０パーセントである阻害剤の濃度（ＩＣ50）を算出することができる。
【０１１８】
細菌ＦａｂＨの公知の阻害剤である２−［（２−フェノキシビフェニル−４−カルボニル）アミノ］安息香酸（Nie Z. et al., J. Med. Chem. 2005; 48: 1596-1609）を、ＰｑｓＤを用いて（濃度 ５、１０、２０、５０、１００及び２００μＭ）試験した。
【０１１９】
結果：
ＰｑｓＤによるＨＨＱ生成の場合、２−［（２−フェノキシビフェニル−４−カルボニル）アミノ］安息香酸のＩＣ50は、約３５μＭの範囲であると決定された（図５）。この知見は、ＰｑｓＤの可能性のある阻害剤のスクリーニングにおいて、このアッセイを用いる原理の実験的証拠として役立つ。これは、インビボ実験の起こりうる不明瞭な点がなく、インビトロでの阻害剤スクリーニングを可能にした。インビボで阻害剤を試験することは、病原菌株を用いて検討することを意味する。優れた阻害剤候補のインビボでの試験は不可欠であるけれども、そうしたことは、インビボで物質ライブラリーの全体をスクリーニングする必要がある場合には、望ましくない。このことは、インビトロアッセイで提示される非常に大きい利点である。こうしたことによって、細菌における他の相互連続したクオラムセンシングシステムによって影響されない迅速な結果が届けられる。
【０１２０】
実験プロトコル
材料：
アントラニル酸は、Sigma-Aldrichから購入した。補酵素Ａ（ＣｏＡ）トリリチウム塩は、AppliChemから購入した。４−ヒドロキシ−２−ヘプチルキノリンは、Susanne Haeusler（the Department of Chronical Pseudomonas Infections at the Helmholtz-Centre for Infection Research, Braunschweig (Germany）)から供給された。エチル ３−オキソデカノアートは、Pharmten Chemical Co. （China）から購入した。
【０１２１】
３−オキソ−デカン酸の合成：ＮａＯＨの２．０５Ｍ水溶液（２．５ｍｍｏｌ（１．２２ｍｌのＨ2Ｏ中））を、室温でエチル ３−オキソ−デカノアート（２１５ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ）に加え、そしてこの混合物を終夜撹拌した。水で希釈した後、アルカリ溶液（ｐＨ １２〜１３）を、エチルエーテルで抽出した（このエチルエーテルは捨てた）。水層を１Ｍ ＨＣｌ水溶液で酸性にし、ｐＨを１とし、そして遊離の酸をジクロロメタンで３回（dichloromethane3）抽出した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、そして蒸発させるとβ−ケト酸が白色固体として生じた（１６３ｍｇ，０．８７５ｍｍｏｌ，８８％）。
【０１２２】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ケト:エノール 84:16): ケト: δ = 0.86 (t, 3J10,9 = 6.91 Hz, 3 H, 10-H), 1.21-1.32 (m, 8 H, 6-H-8-H), 1.52-1.64 (m, 2 H, 5-H), 2.54 (t, 3J4,5 = 7.39 Hz, 2 H, 4-H), 3.49 (s, 2 H, 2-H). エノール (選択シグナル): δ = 2.21 (t, 3J4,5 = 7.62 Hz, 2 H, 4-H), 5.01 (s, 1 H, 2-H), 11.80 (s, 1 H, OH)。
【０１２３】
２−［（２−フェノキシビフェニル−４−カルボニル）アミノ］安息香酸の合成：合成はNie Z. et al. (J. Med. Chem. 2005; 48: 1596-1609）によって述べられている通りに行なった。
【０１２４】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.27 (s, 1H), 8.68 (d, J ) 8.4 Hz, 1H), 8.08 (dd, J ) 1.5 及び 7.9 Hz, 1H), 7.88 (dd, J ) 1.7 及び 8.1 Hz, 1H), 7.77 (d, J ) 8.0 Hz, 1H), 7.38-7.69 (m, 9H), 7.26 (t, J ) 7.8 Hz, 1H), 7.17 (t, J ) 7.9 Hz, 1H), 7.05 (m, 2H)。
【０１２５】
図６は、２−［（２−フェノキシビフェニル−４−カルボニル）アミノ］安息香酸の化学構造を示す。
【０１２６】
アントラニロイル−ＣｏＡの合成：アントラニロイル−ＣｏＡは、下記に述べられている通り、アントラニル酸及びＣｏＡから、アゾアルカス・エバンシイに起源する２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼによってインビトロで創成された。
【０１２７】
細菌菌株、プラスミド及び培地：緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＵＣＢＰＰ−ＰＡ１４（Rahme L.G. et al., Science 1995, 268:1899-1902）に起源するゲノムＤＮＡを、Susanne Haeusler（the Department of Chronical Pseudomonas Infections at the Helmholtz-Centre for Infection Research, Braunschweig (Germany）)ら得た。エッシェリキア・コリ ＤＨ１０Ｂ（Invitrogen）及びプラスミド ｐＥＴ２８ｂ（＋）（Novagen）を、ＤＮＡ操作のために使用した。Stratageneに起源するエッシェリキア・コリ（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｎ末端Ｈｉｓタグタンパク質の発現のために使用した。培地及び増殖条件は、Sambrook et al. (Molecular cloning：A laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に記載されている標準的プロトコルに従った。
【０１２８】
プラスミドの構築：制限酵素及びｄＮＴＰｓを、Fermentasによって購入した。Finnzymesに起源するPhusionポリメラーゼをＰＣＲ反応のために使用した。ＰＣＲ反応の条件は、以下の通りであった：初期変性ステップ（Initial deanturation step）：９５℃で２分、変性 ９５℃で１８秒、アニーリング ６５℃で１４秒、伸長 ７２℃で２５秒、サイクル ３０回、最終的な伸長ステップ（terminal elongation step） ７２℃で５分。プライマーは、制限サイトの４塩基対５’オーバーハング（a four base pair overhang 5'of the restriction sites）を含めて設計された。ＰＣＲ産物及びｐＥＴ２８ｂ（＋）プラスミドは、それぞれの制限酵素を用いて、３７℃で２時間、ダブルダイジェスションした。ダイジェストしたＤＮＡ断片を、０．９％アガロースゲルを用いてゲル電気泳動によって精製し、そしてＳＹＢＲ緑色色素（Invitrogen）を用いて可視化した後に切り出した。ＤＮＡをMacherey-Nagelに起源するNucleoSpin Extract IIキットを用いて、製造業者の使用説明書に従ってゲルから溶出した。
【０１２９】
ｐＥＴ２８ｂ（＋）−ｐｑｓＤの構築−ｐｑｓＤを、プライマーＩである５’−ＣＴＡＧＣＡＴＡＴＧＧＧＴＡＡＴＣＣＧＡＴＣＣＴＧＧＣ−３’（アンダーラインした文字はＮｄｅＩサイトを示す；配列番号：４）、及びプライマーＩＩである５’−ＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＣＡＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＴ−３’（アンダーラインした文字はＥｃｏＲＩサイトを示す；配列番号：５）を用いてＰＣＲによって増幅した。このｐｑｓＤの１−ｋｂのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＥＴ２８ｂ（＋）のＮｄｅＩとＥｃｏＲＩサイト間でクローニングして、ｐＥＴ２８ｂ（＋）−ｐｑｓＤとした。
【０１３０】
ｐＥＴ２８ｂ（＋）−２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ Ａ．ｅｖａｎｓｉｉの構築−２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ Ａ．ｅｖａｎｓｉｉを、プライマーＩである５’−ＧＴＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＣＧＡＧＴＣＡＣＧＴＣＧＡ−３’（アンダーラインした文字はＮｄｅＩサイトを示す；配列番号：６）、及びプライマーＩＩである５’−ＧＴＴＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＧＴＴＴＣＣＣＣＴＣＧＣＧＣＡ−３’（アンダーラインした文字はＨｉｎｄＩＩＩサイトを示す；配列番号：７）を用いてＰＣＲによって増幅した。この２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ Ａ．ｅｖａｎｓｉｉの１．６−ｋｂのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＥＴ２８ｂ（＋）のＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩサイト間でクローニングして、ｐＥＴ２８ｂ（＋）−２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ Ａ．ｅｖａｎｓｉｉとした。
【０１３１】
大腸菌（E. Coli）中の組み換えＰｑｓＤ及び２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ Ａ．ｅｖａｎｓｉｉの産生及び精製：Ｎ末端Ｈｉｓタグ融合タンパク質としてのＰｑｓＤ及び２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ Ａ．ｅｖａｎｓｉｉの産生のために、それぞれ、ｐＥＴ２８ｂ（＋）−ｐｑｓＤ又はｐＥＴ２８ｂ（＋）−２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ Ａ．ｅｖａｎｓｉｉを持つＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を、５０μｇ ｍｌ-1カナマイシンを含む２５０ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で、ＯＤ600がおよそ０．８ Units
になるまで増殖させた。タンパク質発現のために、培養を０．２ｍＭ イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、そして１６℃で１６時間インキュベートした。細胞を、７３００Ｘｇ、１２分間、４℃で、遠心分離（Beckman Coulter Avanti J-E centrifuge）にて回収した。下記の工程はすべて４℃で行なわれた。細胞ペレットを、２５ｍｌの結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ イミダゾール、グリセロール １０％（v/v））中で再懸濁し（resuspended）、そしてフレンチプレスで溶解した。細胞破壊片を２５０００Ｘｇで４５分間、遠心分離によって除去した。上清を１．２μｍのアクロディスク・シリンジフィルター（PALL life Sciences）に通してろ過した。ろ過した上清（２５ｍｌ）を、１ｍｌ Hi-Trap Hisカラムに、Aekta purifier system（双方ともGE Healthcare）を用い、１ｍｌ 分-1の流速でローディングした。非結合試料をカラム容積の５倍量の結合バッファーで洗い流した。Ｈｉｓタグ異種タンパク質を溶出するために、各工程のカラム容積の６倍量を有する、７％、１６％、４０％及び１００％の溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５００ｍＭ イミダゾール，グリセロール １０％（v/v））の階段状勾配が適用された。異種タンパク質を含む画分については、ＰＤ１０カラム（Amersham Biosciences）を用いて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、グリセロール １０％（v/v）にバッファー交換し、そして更にアミコンウルトラ遠心式フィルターデバイス（Amicon ultracentrifugal filter devices）（３０ｋＤａ，Millipore）を用いて、３２００Ｘｇで濃縮した。ＰｑｓＤを、５ｍｇ ｍｌ-1の最終濃度で得た。２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ Ａ．ｅｖａｎｓｉｉを２ｍｇ ｍｌ-1の最終濃度で得た。５０μｌのアリコートを液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。
【０１３２】
タンパク質解析：Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットで標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（０．５〜８μｇ ｍｌ-1）を用い、製造業者の使用説明書に従ってタンパク質濃度を決定した。タンパク質画分を、１２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動によって分離した。タンパク質をCoomassie Brilliant Blue R-250で着色することによってゲル中で可視化した。マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ−ＭＳ）のために、タンパク質バンドをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し、そしてトリプシンでゲル内消化を行なった。試料を、Ｚｉｐ−Ｔｉｐｓ（Millipore）を用いて調製した。
【０１３３】
２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ Ａ．ｅｖａｎｓｉｉによるインビトロで作成されたアントラニロイル−ＣｏＡの生成及び単離：５ｍｇのアントラニル酸を、１．２ｍｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）中に溶解した。この溶液に、１５０μｌ ＭｇＣｌ2（０．１Ｍ）、２５０μｌ ＡＴＰ（０．１Ｍ）、２５０μｌ 補酵素Ａ（ＣｏＡＳＨ）（０．１Ｍ）、及び１５０μｌ ２−アミノ安息香酸−ＣｏＡリガーゼ Ａ．ｅｖａｎｓｉｉ（２ｍｇ ｍｌ-1）を加えた。この反応混合物を３７℃で３時間インキュベートした。水を凍結乾燥によって除去し、残留物を５００μｌの５０％水及び５０％メタノール（v/v）の混合物中に溶解した。精製を、２５４５バイナリグラジエントモジュール（2545 binary gradient module）、フロー供給（make-up flow）のための５１５ＨＰＬＣポンプ、ＳＦＯ（システムフルイディクスオーガナイザー（system fluidics organizer））、２９９８ＰＤＡ、３１００質量検出器（3100 mass detector）及び２７６７サンプルマネージャー（2767 sample manager）から構成され、X-Bridge RP-C18カラム（１９×１００ｍｍ，５μＭ）で動作する、Watersに起源する分取ＨＰＬＣシステムを用いて行なった。溶媒は、水性２０ｍＭギ酸アンモニウムバッファー（aqueous 20 mM ammonium formate buffer）及び５％水性２０ｍＭアンモニウムホルマートバッファー（ammonium formiate buffer）を含むメタノールであった。グラジエントは、９０％水性バッファー（３分間維持）で開始し、次いで９５％有機溶媒（１５分以内）に増加させた。流速は、２５ｍｌ 分-1であった。画分を、８８７．６Ｄａの質量トリガーでの質量ガイドフラクションコレクション（mass-guided fraction collection）を利用して回収した。
【０１３４】
ＨＰＬＣ−ＭＳ2によるＨＨＱ定量−ＨＰＬＣ−ＭＳ解析を、陽性イオン化モード（positive ionization mode）で作動するブルカーダルトニックス（Brucker Daltonics）HCTultra ESI-MS iontrap instrumentに連結したAgilent 1100シリーズに起源するＨＰＬＣシステムを用いて行なった。分離のために、Onyx Monolythic C18カラム（５０×２ｍｍ，Phenomenex）を用いた。流量は、４００μｌ 分-1であり、１０％アセトニトリル（１．５分維持）で開始し、次いで６５％アセトニトリルに増加し（５分にわたって）、そして最後は０．５分で９５％アセトニトリルまで勾配させた。ＨＨＱ定量化のために、２４４．０Ｄａのフラグメンテーションによって作成された１５９．０Ｄａフラグメントイオンのシグナル強度を使用した。標準曲線の作成のために、１、５、１０、２０、５０、１００及び２００ｎｇ ｍｌ-1を含むＨＨＱ標準が測定された。
【０１３５】
ＰｑｓＤの反応速度論パラメーターの決定：反応混合物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０，ＰｑｓＤタンパク質（１μｇ）、０．２ｍＭ アントラニロイル−ＣｏＡ及び３−オキソデカン酸（５０μｌの全容積中、０．０２〜２ｍＭの濃度範囲である）を含有していた。３−オキソデカン酸を除くすべてのコンポーネントを、混和し、そして３７℃で２分間、温度平衡化した。反応は、３−オキソデカン酸を添加することによって開始し、そして３７℃で２分間、インキュベートした。インキュベーション時間を前述の如く変動させることによって、この期間にわたる安定した状態パラメーター（steady-state parameters）が保証された。反応を５０μｌのメタノールを添加することによって停止させた。ＨＨＱは、１０μｌの反応混合物を注入することによってＨＰＬＣにより定量化された。３−オキソデカン酸の全ての試験濃度での反応が三連で（triplicates）行なわれた。
【０１３６】
ＨＨＱ生成阻害の決定：反応混合物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、ＰｑｓＤタンパク質（１μｇ）、０．２ｍＭ アントラニロイル−ＣｏＡ、０．３５ｍＭ ３−オキソデカン酸及び２−［（２−フェノキシビフェニル−４−カルボニル）アミノ］安息香酸（５０μｌの全容積中、５から、これを超えて１０、２０、５０、１００、２００μＭまでの濃度の範囲にわたる）を含有していた。阻害剤を３−オキソデカン酸を除く全てのコンポーネントと共に、３７℃で２分間プレインキュベートした。反応は、３−オキソデカン酸を添加することによって開始し、そして３７℃で２分間インキュベートした。反応を５０μｌのメタノールを添加することによって停止させた。ＨＨＱを、１０μｌの反応混合物を注入することによってＨＰＬＣにより定量化した。阻害剤を加えないコントロール反応が並行して行なわれ、そして生成されたＨＨＱの量を１００％に設定した。
【０１３７】
参照資料
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Bredenbruch F. et al., J Bacteriol. 2005; 187: 3630-3635
Cao H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98: 14613-14618
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Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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