(57)【要約】本発明は、非コードＲＮＡ転写物の下方制御によって細胞内の標的遺伝子の発現を増加させるための短いＲＮＡ分子を設計する方法であって、ａ）少なくとも標的遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド上流から標的遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド下流の間の、標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を得るステップと、ｂ）ステップａ）で決定されるヌクレオチド配列に対する逆相補的ＲＮＡ配列を決定するステップと、ｃ）ステップｂ）で決定される配列の領域の逆相補体であるか、または該逆相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有する短いＲＮＡ分子を設計するステップとを含み、前記非コードＲＮＡ転写物の存在が決定されるステップを含まない方法、ならびにそのような短いＲＮＡ分子およびその使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非コードＲＮＡ転写物の下方制御によって細胞内の標的遺伝子の発現を増加させるための短いＲＮＡ分子を設計する方法であって、
ａ）少なくとも前記遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド上流から前記遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド下流の間の、前記標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を得るステップと、
ｂ）ステップａ）で決定される前記ヌクレオチド配列に対する逆相補的ＲＮＡ配列を決定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で決定される前記配列の領域の逆相補体であるか、または前記逆相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有する短いＲＮＡ分子を設計するステップと、を含み、
前記非コードＲＮＡ転写物の存在が決定されるステップを含まない、方法。
【請求項２】
前記標的遺伝子は、多能性誘導遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｃ）で定義される前記領域は、前記遺伝子の転写開始点の逆相補体を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記短いＲＮＡ分子は、１６ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記短いＲＮＡ分子を取り込む二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を産生するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は、１６〜３０ヌクレオチド長であり、前記分子は、少なくとも１２ヌクレオチド長にわたってハイブリダイズされる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記短いＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチド長である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記短いＲＮＡ分子は、ステップｂ）で決定される前記配列の領域の逆相補体であるか、または前記逆相補体と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）は、少なくとも前記遺伝子の転写開始点の５００ヌクレオチド上流から前記遺伝子の転写開始点の５００ヌクレオチド下流の間の、前記標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を得ることを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
非コードＲＮＡ転写物の下方制御によって細胞内の標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、
ａ）少なくとも前記遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド上流から前記遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド下流の間の、前記標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を得るステップと、
ｂ）ステップａ）で決定される前記ヌクレオチド配列に対する逆相補的ＲＮＡ配列を決定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で決定される前記配列の領域の逆相補体であるか、または前記逆相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有する短いＲＮＡ分子を設計するステップと、
ｄ）前記細胞を前記短いＲＮＡ分子と接触させるステップと、を含み、
前記非コードＲＮＡ転写物の存在が決定されるステップを含まない、方法。
【請求項１１】
コンピュータシステムに、
ａ）少なくとも前記遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド上流から前記遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド下流の間の、標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を受信すること、
ｂ）ステップａ）で受信される前記ヌクレオチド配列に対する逆相補的ＲＮＡ配列を決定すること、および
ｃ）非コードＲＮＡ転写物の下方制御によって細胞内の前記標的遺伝子の発現を増加させるように設計される短いＲＮＡ分子であって、ステップｂ）で決定される前記配列の領域の逆相補体であるか、または前記逆相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有する、短いＲＮＡ分子を構築するための情報を出力すること、を命令するためのコンピュータ実行可能な命令を含み、
前記命令は、前記非コードＲＮＡ転写物の存在を決定することを要求する命令を含まない、１つ以上のコンピュータ可読媒体。
【請求項１２】
コンピュータ可読媒体上に短いＲＮＡ分子を構築するための前記情報を出力するための命令をさらに含む、請求項１１に記載のコンピュータシステムに命令するためのコンピュータ実行可能な命令を含む、１つ以上のコンピュータ可読媒体。
【請求項１３】
細胞内の標的遺伝子を上方制御することによって細胞の集団の分化能を維持するかまたは増加させる方法であって、前記標的遺伝子は、多能性誘導遺伝子であり、前記方法は、前記細胞を、前記細胞内の標的ＲＮＡ転写物を特異的に下方制御する短いＲＮＡ分子と接触させることを含み、前記標的ＲＮＡ転写物は、
ｉ）
ａ）前記標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流までの遺伝子座のいずれかの鎖、
ｂ）前記標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流までの遺伝子座のいずれかの鎖、または
ｃ）前記標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座のいずれかの鎖、から転写され、
ｉｉ）前記標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から前記標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む、方法。
【請求項１４】
前記標的ＲＮＡ転写物は、前記標的遺伝子の転写開始点を含むゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的遺伝子は、ＫＬＦ４、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８からなる群から選択される、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的遺伝子は、ＫＬＦ４である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に請求される方法を行うことと、それによって設計されるＲＮＡ分子を合成することと、を含む、ＲＮＡ分子を生成する方法。
【請求項１８】
本明細書の表１〜３に記載される配列のうちのいずれか１つを有する、短いＲＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的遺伝子の発現を調節することができる短いＲＮＡ分子、ならびにそれら
の設計、合成、および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的ｍＲＮＡの配列特異的な下方制御を引き起こす重要な遺伝子制御機構である。ＲＮＡｉは、「ＲＮＡに干渉すること」（ｉＲＮＡ）によって媒介され、ＲＮＡｉプロセスにおいて機能する様々な短い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を包含する包括的用語である。
【０００３】
外来性のｄｓＲＮＡは、リボヌクレアーゼタンパク質であるダイサーによって、３'オーバーハングを形成する各３'末端にいくつかの不対塩基を有する１９〜２５塩基対の二本鎖フラグメントにプロセシングされ得る。これらの短い二本鎖フラグメントは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称され、これらの分子は、標的遺伝子の発現の下方制御に影響を与える。
【０００４】
これらの機能が解明されて以来、ｓｉＲＮＡは、特定の遺伝子を下方制御するためのツールとして使用されてきた。それらは、一過性の抑制を、または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として安定に組み込まれた場合には安定した抑制をもたらすことができる。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、遺伝子発現の低下の影響を観察することによって対象となる遺伝子の機能を調べる「ノックダウン」または「機能喪失」実験において広く使用されてきた。ＲＮＡｉは、ゲノムマッピングおよびゲノムアノテーションのための技術として潜在的利益を有すると考えられる。ＲＮＡ干渉を治療に利用する試みも行われてきている。
【０００５】
ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称されるタンパク質複合体は、ｓｉＲＮＡ鎖のうちの１つを取り込み、標的ｍＲＮＡを認識するためのガイドとしてこの鎖を使用する。ガイドＲＮＡとｍＲＮＡとの間の相補性に依存して、ＲＩＳＣは、ｍＲＮＡの翻訳を破壊または疎外する。完全な相補性は、ｍＲＮＡの開裂および破壊をもたらし、開裂の結果として、ｍＲＮＡは、もはやタンパク質に翻訳され得ない。（特に、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の部位との）部分的な相補性は、翻訳の阻害をもたらす。ＲＮＡｉは、ほとんどの真核生物において保存され、外来性ｓｉＲＮＡを導入することによって、特定の遺伝子を下方制御するためのツールとして使用することができる。
【０００６】
ＲＩＳＣは、主として転写後に遺伝子を制御するが、ＲＮＡｉは、遺伝子転写自体を調節することもできることが最近発見された。分裂酵母において、低分子ＲＮＡは、ＲＩＳＣ複合体の相同体を通してクロマチンを制御する。ＲＮＡを付加されたＲＩＳＣ複合体は、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）に結合し、それによってｎｃＲＮＡ遺伝子座にヒストン調節タンパク質をリクルートすると考えられる。植物、ハエ、線形動物、繊毛虫、および真菌も、同様の機構を有する。哺乳動物において、正確な機構の多くは不明確なままであるが、短いＲＮＡは、制御されたＲＮＡに対してセンスまたはアンチセンスであり、かつ非コード転写物であると推定される破壊転写物（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を標的とすることによって転写を制御すると考えられる。ＲＮＡ標的化によるこれらの非コード転写物の破壊は、ＲＮＡ標的の性質に依存して、エピジェネティックな制御パターンに異なる影響を与える。所与のｍＲＮＡに対してセンスであるｎｃＲＮＡ標的の破壊が、そのｍＲＮＡの転写抑制をもたらすのに対し、所与のｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｎｃＲＮＡ標的の破壊は、そのｍＲＮＡの転写活性化をもたらす。そのようなアンチセンス転写物を標的とすることにより、特定の遺伝子を上方制御するためにＲＮＡｉを使用することができる。標的遺伝子の上方制御を引き起こす短いＲＮＡ分子は、短い活性化ＲＮＡ分子（ｓｈｏｒｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）（ｓａＲＮＡ）と称される。
【０００７】
ｓａＲＮＡの使用により標的遺伝子を上方制御する既知の方法は、対象となる標的遺伝子に対してアンチセンスであるＲＮＡ転写物の検出と、同定された転写物を下方制御する短いＲＮＡ分子の設計とを伴う。標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、対象となる遺伝子の遺伝子座周辺のゲノム領域内の既知の転写物またはＥＳＴのデータベースから同定される。代替として、潜在的な標的ＲＮＡ転写物を同定するために、ＲＮＡを同定するための周知のツールである逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が用いられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
例えば、米国特許出願公開第２００９／００９２９８８号は、コードされたアンチセンス転写物の存在を決定すること、および転写物を該転写物の一部に相補的である外来性二本鎖ＲＮＡと接触させることを含む、哺乳動物細胞のゲノム内の標的遺伝子の発現を選択的に調節する方法を開示している。
【発明の説明】
【０００９】
本発明者は、標的遺伝子を上方制御する短い活性化ＲＮＡ分子を設計する新規アルゴリズム／方法を提供した。この設計法は、多能性に関与する遺伝子を含むゲノム全体にわたって広い適用可能性を見出す。
【００１０】
クルッペル様転写因子４（ｇｕｔ）（ＫＬＦ４）は、胚性幹（ＥＳ）細胞を維持するために重要な転写因子である。ＫＬＦ４ならびに他の３つの転写因子ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４とも称される）、ＳＯＸ２、およびＭＹＣの異所性発現は、マウスおよびヒトの線維芽細胞を人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に再プログラムすることが示されている。ＥＳ細胞の転写ネットワークに関する最近の研究は、ＫＬＦ４が、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、およびＮＡＮＯＧを含む他の多能性因子の発現を制御する主要制御因子であることを示唆している［Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  １３２：１０４９−１０６１］。
【００１１】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の開発は、幹細胞の分野を理解する上で画期的な出来事となった。ｉＰＳＣ技術は、４つの遺伝子ＫＬＦ４、ＰＯＵ５Ｆ１（Ｏｃｔ３／４）、ＳＯＸ２、およびＭＹＣの上方制御、または特定の細胞の場合、これらの４つの遺伝子のうちのいくつか、ならびにＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８等の他の多能性因子の上方制御に依存する。それは、これらの遺伝子を非胚性幹細胞に遺伝子導入することによって実現される。したがって、ＫＬＦ４の発現を操作することが、幹細胞を制御するための効果的な方法であるかもしれないと推測されてきた。
【００１２】
線維芽細胞等の非胚細胞は、上述の遺伝子の活性化によって多能性幹細胞の状態に誘導することができる。治療的観点からすると、ｉＰＳＣの主な利点は、患者自身の線維芽細胞が幹細胞を生成するように再プログラムすることができ、それによって、免疫抑制剤または組織適合性遺伝子の合致の必要性が排除されることである。
【００１３】
多能性因子の発現を上方制御する現在の方法は、遺伝子の余分なコピーを宿主ゲノムに導入するためにウイルスを使用すること、または幹細胞性遺伝子の余分なコピーを発現するプラスミドを導入することのいずれかによって、遺伝子の余分なコピー（当該技術分野において幹細胞性遺伝子として知られる）を導入することを必要とする。したがって、現在、ＫＬＦ４および他の幹細胞性因子の上方制御のためには、細胞内への発現ベクターの侵襲的な一過性トランスフェクションまたは安定したウイルスによる形質導入が必要である。現在の方法は、上方制御剤の非一過性の適用を伴う。これらの方法の限界は、その効果も同様に非一過性であること、すなわち、誘導された幹細胞が増殖することができず、ひいては分化するように再プログラムされ得ないということである。
【００１４】
本発明の発明者は、標的遺伝子の上方制御または下方制御を達成し、上記従来技術の方法と関連する問題を克服する、新しい短いＲＮＡ分子を開発した。具体的には、本発明の分子は、より低侵襲性であり、それらの効果は一過性である。
【００１５】
したがって、本発明者は、標的遺伝子、特に、多能性誘導遺伝子、または分化を引き起こす遺伝子である標的遺伝子を調節するために、宿主細胞内のＲＮＡ転写物を標的とする新規の短いＲＮＡ分子を提供した。本発明の短いＲＮＡは、従来技術の発現ベクターよりも小さな分子であるためより低侵襲性であるが、この発明の分子が宿主自身の制御システムを用いて遺伝子を調節するという事実もまた、宿主に遺伝子の余分なコピーを導入するよりも低侵襲性である。
【００１６】
本発明の短いＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルを上方制御することができる。本発明のアルゴリズム設計法は、標的遺伝子の発現を上方制御する短い活性化ＲＮＡ分子（ｓａＲＮＡ）の設計を導く。ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＢＣＬ２、およびＩＬ−８を含む、本発明の方法を使用して設計されるｓａＲＮＡ分子によって上方制御される、一連の異なる遺伝子の上方制御を本明細書に示す。
【００１７】
ＫＬＦ４−、ＭＹＣ−、ＰＯＵ５Ｆ１−、およびＳＯＸ２を活性化する本発明のＲＮＡは、再生医療技術において使用される造血幹細胞を増殖させるための効果的、非侵襲的、および安全な代替手段である。
【００１８】
本発明の大きな利点は、本発明が、その効果もまた一過性である、遺伝子を活性化する低分子ＲＮＡの一過性の適用に関するということである。これにより、誘導された幹細胞が増殖され、その後、分化するように再プログラムされることが可能になる。
【００１９】
第１の態様において、本発明は、非コードＲＮＡ転写物の下方制御によって細胞内の標的遺伝子の発現を増加させるための短いＲＮＡ分子を設計する方法であって、
ａ）少なくとも遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド上流から遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド下流の間の、標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を得るステップと、
ｂ）ステップａ）で決定されるヌクレオチド配列に対する逆相補的ＲＮＡ配列を決定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で決定される配列の領域の逆相補体であるか、または該逆相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有する短いＲＮＡ分子を設計するステップとを含み、
前記非コードＲＮＡ転写物の存在が決定されるステップを含まない、方法を提供する。
【００２０】
代替の観点からすると、本発明は、非コードＲＮＡ転写物の下方制御によって細胞内の標的遺伝子の発現を増加させるための短いＲＮＡ分子を設計する方法であって、
ｉ）少なくとも遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド上流から遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド下流の間の、標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を得るステップと、
ｉｉ）ステップｉ）で決定される配列の領域と少なくとも８０％の配列同一性を有する短いＲＮＡ分子を設計するステップであって、配列同一性を決定する目的のために、短いＲＮＡ分子中のウラシルヌクレオチドが、ステップｉ）で決定される配列の領域中のチミン残基と同一であると見なされるステップと、を含み、
前記非コードＲＮＡ転写物の存在が決定されるステップを含まない、方法を提供する。
【００２１】
「設計の方法」および「設計法」という用語は、本明細書において「設計のためのアルゴリズム」および「アルゴリズム」という用語と交換可能に使用される。
【００２２】
遺伝子の「コード鎖」は、遺伝子のｍＲＮＡのコード配列を含む鎖である。遺伝子の「鋳型鎖」は、遺伝子のｍＲＮＡのコード配列を含まないが、実際にはＲＮＡポリメラーゼによって読み取られる鎖である。
【００２３】
本明細書において使用される場合、「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば、部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えによって生成されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または改変によって、自然に発生するＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含む。そのような改変は、ＲＮＡの末端（複数可）、または内部的に、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドへの、非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。また、本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、例えば、自然には発生しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチド等を含んでもよい。これらの改変ＲＮＡは、類似体または自然に発生するＲＮＡの類似体と称されてもよい。
【００２４】
本明細書で使用される「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、リボ核酸二重鎖を指し、内在性および人工的なｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ならびにマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書で使用される「短い干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」という用語は、１つ以上の標的ＲＮＡ転写物の配列特異的に媒介される開裂を介して、ＲＮＡｉによる遺伝子発現の調節が可能な核酸分子を指す。典型的には、ＲＮＡｉにおいてＲＮＡ転写物はｍＲＮＡであるため、この標的の開裂は、遺伝子制御の下方制御をもたらす。しかしながら、本発明において、標的遺伝子の上方制御または下方制御は、対象となる標的遺伝子に対してそれぞれアンチセンスまたはセンスであるＲＮＡ転写物の開裂によって達成され得る。そのような短いＲＮＡ分子は、それらが遺伝子発現を増強する場合、短い（または低分子）活性化ｓａＲＮＡ分子（ｓａＲＮＡｓ）と称され、また、それらは、ｓｉＲＮＡ等の他の短いＲＮＡ分子と同じ構造特性を有し得る。
【００２６】
ｓｉＲＮＡは、典型的には、３'オーバーハングを形成する各３'末端にいくつかの不対塩基を有する１９〜２５塩基対長の二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡ転写物の領域との完全なまたはほぼ完全な相補性の配列を有する１本の鎖を含む。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるタンパク質複合体は、ｓｉＲＮＡ二重鎖（ガイド鎖）のこの鎖を取り込み、標的ＲＮＡ転写物を認識するための鋳型としてそれを用いる。次いで、ＲＩＳＣは、取り込まれた鎖との完全なまたはほぼ完全な相補性を有する標的ＲＮＡ転写物の開裂に関与する。標的ＲＮＡ転写物の領域に相補性を有さない他のｓｉＲＮＡ分子の鎖は、パッセンジャー鎖と称される。
【００２７】
ｓｉＲＮＡ分子ではないが、ＲＩＳＣと関連する開裂により、それらが完全なまたはほぼ完全な相補性を有する標的ＲＮＡ転写物を下方制御することが可能な一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ様活性を有すると言われる。本発明の方法によって設計される短いＲＮＡ分子は、この活性を有する。
【００２８】
遺伝子の「活性化」または「上方制御」とは、遺伝子（複数可）の発現のレベル、または遺伝子もしくはその活性によってコードされるポリペプチド（複数可）のレベル、または本発明の方法によって設計される短いＲＮＡ分子の非存在下で観察される、上記遺伝子から転写されたＲＮＡ分子（複数可）のレベルにおける増加を意味する。
【００２９】
本発明の方法によって設計される短いＲＮＡ分子は、細胞内の標的遺伝子を効果的かつ特異的に上方制御する、すなわち、それらは、標的遺伝子のコード鎖上のゲノム配列に対してアンチセンスであるＲＮＡ転写物の下方制御によって、その標的遺伝子の発現を増加させる。理論に拘束されることを望むわけではないが、アンチセンスＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の発現を抑制し、本発明のアルゴリズムによって設計される短いＲＮＡ分子は、下方制御性のアンチセンスＲＮＡ転写物を下方制御することにより、標的遺伝子を上方制御すると考えられる。上述のように、これは、アンチセンスＲＮＡ転写物内の配列に高度な相補性を有する短いＲＮＡによって達成され得る。
【００３０】
しかしながら、本発明のアルゴリズムは、標的遺伝子に対してアンチセンスであるいずれかのＲＮＡ転写物の同定を必要としない。本発明の発明者は、驚くべきことに、遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド上流から遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド下流の間の領域内で、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列が得られると、すなわち、配列決定によって決定されるか、またはデータベース上に発見され、その領域に対する逆相補的ＲＮＡ配列が決定されると、同様にその後者の配列の逆相補体であるか、または該逆相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有する短いＲＮＡ分子を使用して、標的遺伝子を上方制御することができることを発見した。従来技術における短い活性化ＲＮＡ分子の設計のためのアルゴリズム／方法が、データベースからのまたはＲＴ−ＰＣＲによる、標的に対するアンチセンスＲＮＡ転写物の存在の決定を必要としたのに対し、本発明の方法は、それを必要としない。結果として、本発明の方法は、対象となる任意の標的遺伝子に対する短い活性化ＲＮＡ分子を設計する、はるかに迅速で、廉価であり、より効率的な手段を提供する。ｓａＲＮＡが設計され得る前にアンチセンスＲＮＡ転写物の存在または同一性を確認する必要がないという認識が、本発明者を本発明の方法へと導いた。
【００３１】
したがって、本発明の方法は、前記非コードＲＮＡ転写物（すなわち、下方制御される標的転写物）の存在が決定されるステップを含まない。ｓａＲＮＡを設計する従来技術の方法は、非コードＲＮＡ転写物標的の存在を決定する。「存在の決定」とは、標的遺伝子座周辺のＥＳＴおよび／もしくはアンチセンス転写物のデータベースを検索して、好適な標的転写物を同定すること、またはＲＴ  ＰＣＲもしくは任意の他の既知の技術を使用して、細胞内の標的アンチセンスＲＮＡ転写物の物理的存在を確認することのいずれかを意味する。
【００３２】
本発明の方法のステップａ）またはステップｉ）において、少なくとも遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド上流から遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド下流の間の、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列が得られる。この配列は、当業者に周知である遺伝子配列のデータベースを参照することによって、または配列の配列決定によって得ることができる。対象となる遺伝子の配列決定のためのツールも、当業者には周知である。
【００３３】
好ましくは、上記方法のステップａ）およびステップｉ）は、少なくとも遺伝子の転写開始点の３００ヌクレオチド上流から遺伝子の転写開始点の３００ヌクレオチド下流の間の、標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を得ることを含む。より好ましくは、上記方法のステップａ）およびステップｉ）は、少なくとも遺伝子の転写開始点の５００ヌクレオチド上流から遺伝子の転写開始点の５００ヌクレオチド下流の間の、標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を得ることを含む。さらにより好ましくは、上記方法のステップａ）およびステップｉ）は、少なくとも遺伝子の転写開始点の１０００ヌクレオチド上流から遺伝子の転写開始点の１０００ヌクレオチド下流の間の、標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を得ることを含む。
【００３４】
ある観点からすると、方法は、ステップａ）で決定されるヌクレオチド配列に対する逆相補的ＲＮＡ配列が決定される上記ステップｂ）をさらに含む。従来技術の方法とは異なり、このＲＮＡ配列の存在は決定されない、すなわち、決定されるＲＮＡ配列は、推定上の理論的な配列である。このステップは、任意のデータベースを参照すること、または決定された配列を有するＲＮＡ転写物の実際の存在を決定するための任意の既知の技術を使用することを含まない。
【００３５】
上記ステップｃ）は、ステップｂ）で決定される配列の領域の逆相補体であるか、または該逆相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有する、短いＲＮＡ分子の設計を必要とする。好ましくは、短いＲＮＡ分子は、ステップｂ）で決定される配列の領域の逆相補体であるか、または該逆相補体と少なくとも８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％の配列同一性を有する。第１の配列が第２の配列の逆相補体である場合、それは、逆方向において、その第２の配列と完全なまたはほぼ完全な相補性を有する。
【００３６】
「相補性」および「相補的」とは、第１の核酸が、例えばワトソン・クリック塩基対形成によって、第２の核酸と水素結合（複数可）を形成することができることを意味する。非ワトソン・クリック塩基対形成によって別の核酸と水素結合（複数可）を形成することができる核酸も、相補性を有するという定義内に属する。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対）を形成することができる核酸分子中の残基の割合を意味する（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的であることを意味する）。好ましくは、本発明の方法は、ステップｂ）で決定されるＲＮＡ配列の領域までの全長にわたって任意のそのような相補性の程度を有する短いＲＮＡ分子を設計するステップを含む。短いＲＮＡ分子は、ステップｂ）で決定されるＲＮＡ配列の領域までのその全長にわたって、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％相補的である。
【００３７】
短いＲＮＡは、それが相補的であるステップｂ）で決定されるＲＮＡ転写物の領域の配列との、５つ以下、好ましくは４つまたは３つ以下、より好ましくは２つ以下、さらにより好ましくは１つ以下、最も好ましくはゼロのミスマッチを有する。このシナリオにおいて、「ミスマッチ」とは、２つの配列中の所与の位置で、配列に存在するヌクレオチドが相補的ではない場合である。
【００３８】
２つ以上の配列の相補性の程度の測定は、当該技術分野において既知である任意の方法によって行うことができる。好ましくは、使用される方法は、Ｈｏｓｓｂａｃｈら（上記を参照）に記載される方法である。この方法によれば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｐｉｂｐｃ．ｍｐｇ．ｄｅ／ｇｒｏｕｐｓ／ｌｕｅｈｒｍａｎｎ／ｓｉＲＮＡでアクセス可能なパールスクリプトが使用される。
【００３９】
「完全に相補的」または「完全な相補性」とは、第１の核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列中の同数の連続する残基と水素結合を形成することを意味する。「ほぼ完全に」相補的とは、第１の核酸配列の本質的に全ての連続する残基が、第２の核酸配列中の同数の連続する残基と水素結合を形成するが、第１の核酸が、転写、または生物学的分子の使用を伴う分子生物学的プロセス等の不完全なプロセスによって調製されるという事実に起因して、第１の配列が第２の配列に１００％相補的ではない可能性があることを意味する。しかしながら、第２の配列中の対応する残基と水素結合を形成することができない第１の配列中の残基の数は十分に少ないため、２つの核酸配列は、所望の目的のために必要とされる程度まで水素結合を介してなおも結合している。典型的には、「ほぼ完全な相補性」は、第１の核酸配列が、第２の核酸配列に少なくとも９５％の相補性を有することを意味する。好ましくは、短いＲＮＡ分子は、ステップｂ）で決定されるＲＮＡ配列の領域までのその全長にわたって、ほぼ完全な、より好ましくは完全な相補性を有する。
【００４０】
短いＲＮＡ分子は、ステップｂ）で決定される配列の領域の逆相補体である必要はなく、代わりに、ステップｂ）で決定される配列の領域の逆相補体とある程度の配列同一性を有してもよい。「同一性」、「同一の」、または「配列同一性」とは、第１の核酸が、配列において第２の核酸配列と同一であることを意味する。パーセント同一性は、第２の核酸配列と同一の第１の核酸分子中の残基の割合を意味する（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％同一であることを意味する）。好ましくは、本発明の方法は、ステップｂ）で決定される配列の領域の逆相補体と、その全長にわたってこの程度の配列同一性を有する短いＲＮＡ分子を設計するステップを含む。短いＲＮＡ分子は、ステップｂ）で決定される配列の領域の逆相補体と、その全長にわたって、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。短いＲＮＡは、ステップｂ）で決定される配列の領域の逆相補体の配列との、５つ以下、好ましくは４つまたは３つ以下、より好ましくは２つ以下、さらにより好ましくは１つ以下、最も好ましくはゼロの「ミスマッチ」を有する。このシナリオにおいて、「ミスマッチ」とは、２つの配列中の所与の位置で、配列中に存在するヌクレオチドが相補的ではない場合である。
【００４１】
好ましくは、短いＲＮＡ分子は、それ自体が転写開始点を含む遺伝子のコード鎖の領域の逆相補体であるステップｂ）で決定される配列の領域の逆相補体であるか、または該逆相補体と少なくとも８０％の配列同一性もしくは本明細書に列挙される任意の他の配列同一性を有する。換言すると、好ましくは、短いＲＮＡ分子は、ステップｂ）で決定される配列の領域の逆相補体であるか、または該逆相補体とある程度の配列同一性を有し、前記領域は、その中に遺伝子の転写開始点の逆相補体を含む。
【００４２】
代替の観点からすると、本発明の方法は、ステップｉ）で決定される配列の領域と同一の短いＲＮＡ分子を設計することを含む。「同一性」、「同一の」、または「配列同一性」とは、第１の核酸が、配列において第２の核酸配列と同一であることを意味する。パーセント同一性は、第２の核酸配列と同一の第１の核酸分子中の残基の割合を意味する（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％同一であることを意味する）。好ましくは、本発明の方法は、ステップｉ）で決定される配列の領域と、その全長にわたってこの程度の同一性を有する短いＲＮＡ分子を設計するステップを含む。短いＲＮＡ分子は、ステップｉ）で決定される配列の領域と、その全長にわたって、好ましくは少なくとも８５％、９０％、または９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。短いＲＮＡは、ステップｉ）で決定される配列の領域との、５つ以下、好ましくは４つまたは３つ以下、より好ましくは２つ以下、さらにより好ましくは１つ以下、最も好ましくはゼロの「ミスマッチ」を有する。このシナリオにおいて、「ミスマッチ」とは、２つの配列中の所与の位置で、配列中に存在するヌクレオチドが同一ではない場合である。
【００４３】
好ましくは、短いＲＮＡ分子は、遺伝子の転写開始点を含む遺伝子のコード鎖の領域と同一である。
【００４４】
「完全な同一性」または「完全に同一」とは、第１の核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列中の同数の連続する残基と同一であることを意味する。「ほぼ完全な」同一性とは、第１の核酸配列の本質的に全ての連続する残基が、第２の核酸配列中の同数の連続する残基と同一であるが、第１の核酸が、転写、または生物学的分子の使用を伴う分子生物学的プロセス等の不完全なプロセスによって調製されるという事実に起因して、第１の配列が第２の配列と１００％同一ではない可能性があることを意味する。しかしながら、第２の配列中の対応する残基と同一ではない第１の配列中の残基の数は十分に少ないため、２つの核酸配列は、所与の目的のためになおも十分に同一である。典型的には、「ほぼ完全な同一性」は、第１の核酸配列が、第２の核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有することを意味する。
【００４５】
配列アライメントおよびパーセント同一性またはパーセント相補性の計算は、限定されないが、ＬＡＳＡＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ）、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）、およびＢＬＡＳＴ  ２．０プログラムスイートを含む当該技術分野において既知の任意の方法またはツールを使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公的に入手可能である。当業者は、所望の目的に適合するようにこれらのツールのパラメータを設定することができる。
【００４６】
一方の配列がＤＮＡ配列であり、他方がＲＮＡ配列である、第１および第２の核酸配列の同一性または相補性を評価する場合、ＲＮＡ配列がウラシルを含むのに対し、ＤＮＡ配列は代わりにチミンを含むであろうことに留意しなければならない。したがって、配列同一性を評価する場合、ウラシル残基がチミン残基と同一であると見なされ、相補性を評価する場合は、ウラシル残基がアデニン残基と相補的である／水素結合を形成することができると見なされる。
【００４７】
短いＲＮＡ分子のサイズに対応する「領域」のサイズ、およびこれらの分子の好ましいサイズを本明細書に定義する。領域および短いＲＮＡ分子は、典型的には、１００ヌクレオチド長未満、好ましくは５０ヌクレオチド長未満であるが少なくとも１２ヌクレオチド長であり、より好ましくは１６〜３０ヌクレオチド長である。
【００４８】
任意選択的に、上記ステップｃ）およびステップｉｉ）は、特に望ましい構造特性および／または機能特性を有する短いＲＮＡ分子の設計を導くさらなるステップを含む。これらの特性については、これらの特性を有する短いＲＮＡ分子を設計するために必要なツールとともに後述する。
【００４９】
次に、本発明の方法によって設計される短いＲＮＡ分子の任意選択的および好ましい特徴について記載する。方法は、好ましくは、これらの好ましい特性の各々、いずれか、および全てを有する短いＲＮＡ分子を設計するステップを含む。
【００５０】
好ましくは、本発明の方法によって設計される「短い」ＲＮＡ分子は、１６ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド長であり、より好ましくは、１９〜３０ヌクレオチド長であり、さらにより好ましくは、１９〜２５または１９〜２３ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、１９もしくは２１ヌクレオチド長である。
【００５１】
設計される短いＲＮＡ分子は、一本鎖であってもよい。しかしながら、好ましくは、方法は、前記短いＲＮＡ分子を組み込む二本鎖分子を産生するさらなるステップを含む。好ましくは、二重鎖の各鎖は、少なくとも１６ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１９ヌクレオチド長である。好ましくは、二重鎖は、少なくとも１２ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、より好ましくは１７ヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも１９ヌクレオチド長にわたってハイブリダイズされる。各鎖は、正確に１９クレオチド長であってもよいか、または好ましい実施形態において、一方の鎖は２５ヌクレオチド長であり、他方は２７ヌクレオチド長である。好ましくは、二重鎖の長さは、３０ヌクレオチド未満である、なぜなら、この長さを超える二重鎖は、インターフェロン応答を誘導するリスクの増加を伴う可能性があるからである。ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する鎖は、等しいかまたは等しくない長さであってもよい。
【００５２】
換言すると、本発明の方法は、好ましくは、これらの好ましい長さの短いＲＮＡ分子を設計するステップを含む。
【００５３】
最も好ましくは、短いＲＮＡ分子は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。
【００５４】
任意選択的に、短いＲＮＡ分子は、３'オーバーハングを形成する各鎖の３'末端に多数の不対ヌクレオチドとともに安定して塩基対を形成する２つの鎖からなるｄｓＲＮＡ分子である。各鎖の３'オーバーハングを形成する不対ヌクレオチドの数は、好ましくは１〜５ヌクレオチド、より好ましくは１〜３ヌクレオチドの範囲、そして最も好ましくは２ヌクレオチドである。
【００５５】
短いＲＮＡ分子の設計および分析のための種々のツールが周知であり、それらによって、当業者は、標的ＲＮＡ転写物、すなわち標的アンチセンス転写物の効果的かつ特異的な下方制御を達成することができるＲＮＡ分子を決定することが可能となる。確立された方法は、例えば、ＧＰｂｏｏｓｔおよびＲｅｙｎｏｌｄｓのアルゴリズム（ＰＭＩＤ：１５２０１１９０、１４７５８３６６）を含む。さらに、短いＲＮＡが標的ＲＮＡの効果的な下方制御を引き起こす能力は、細胞内のＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定するための標準的な技術を使用して評価することができる。例えば、本発明の短いＲＮＡは、培養細胞に送達することができ、標的ＲＮＡのレベルは、限定されないがノーザンブロットもしくはドットブロッティング技術を含む技術によって、または定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定することができる。
【００５６】
好ましくは、設計される短いＲＮＡは、モチーフａａａａ、ｃｃｃｃ、ｇｇｇｇ、またはｔｔｔｔのいずれも保有しない。好ましくは、短いＲＮＡは、少なくとも２０％かつ７５％以下、すなわち、２０％〜７５％、好ましくは２０％〜５５％のＧＣパーセンテージを有する。上記方法の短いＲＮＡは、理想的には熱力学的に安定な二重鎖であり、その場合、各鎖のＧＣパーセンテージは、少なくとも２５％かつ７５％以下、すなわち、２５％〜７５％、好ましくは２０％〜５５％、より好ましくは２０％〜５０％である。
【００５７】
ＲＮＡがモチーフａａａａ、ｃｃｃｃ、ｇｇｇｇ、またはｔｔｔｔを保有するかどうかを決定するための、および分子／鎖のＧＣ含有量のパーセンテージを決定するためのツールおよびアルゴリズムは、当業者に周知である。そのようなツールは、Ｓａｅｔｒｏｍ  ａｎｄ  Ｓｎｏｖｅ，（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２１：２４７−２５３およびＶｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ７：５２０（１７ページ）に記載および言及されるものを含む。
【００５８】
短いＲＮＡは、ＲＩＳＣタンパク質複合体に取り込まれる短いＲＮＡ鎖に対して限定された数のミスマッチを有する非標的転写物の下方制御を誘導する可能性がある。これは、短いＲＮＡ分子の効率を減少させるため、望ましくない。したがって、短いＲＮＡ分子は、意図しないオフターゲット効果を防止するために、意図される標的以外の転写物に対して限定された相補性を有するべきである。短いＲＮＡ候補が開裂に基づくオフターゲット効果を有する確率は、非標的ＲＮＡ配列に対するその相補性の関数であり、当該技術分野において任意の既知の方法によって決定することができる。任意選択的に、ギャップなしのＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法（ＴＦ  Ｓｍｉｔｈ＆ＭＳ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １４７：１９５−１９７）を使用して、候補の短いＲＮＡをＥｎｓｅｍｂｌ（Ｆｌｉｃｅｋ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｅｎｓｅｍｂｌ  ２００８．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６：Ｄ  ７０７−７１４）ヒトトランスクリプトームデータベース（Ｓｎoｖｅ，Ｏ．，Ｊｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２５：７６９−７７３）に対してスクリーニングして、短いＲＮＡの潜在的なオフターゲット転写物を同定することができる。代替として、選択されたＲＮＡ配列の集団、例えば、全体的なＥｎｓｅｍｂｌヒトトランスクリプトームデータベースを包含しない一連のＧｅｎＢａｎｋ配列に対して、短いＲＮＡをスクリーニングすることができる。代替として、ハミング距離法を用いることができる。
【００５９】
好ましくは、短いＲＮＡ分子は、同定されたオフターゲット転写物に対して２つより多くのミスマッチを有する。代替の観点からすると、好ましくは、短いＲＮＡ分子は、全ての潜在的なオフターゲット転写物に対して２よりも大きいハミング距離を有する。短いＲＮＡが二本鎖分子の一部である場合、好ましくは、両方の鎖がこの要件を満たす。
【００６０】
任意選択的に、短いＲＮＡ分子は、既知の高度に効果的な標準的ｓｉＲＮＡと共通の特徴を有する。好ましくは、短いＲＮＡは、または二本鎖分子の一部の場合、短いＲＮＡの片方もしく両方の鎖は、０．１より高いＧＰｂｏｏｓｔスコアを有する。ＧＰｂｏｏｓｔは、既知の遺伝子プログラミングに基づくｓｉＲＮＡの有効性の予測システムであり、ｓｉＲＮＡ鎖のＧＰｂｏｏｓｔスコアを決定するために使用される方法は、「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  ＲＮＡｉ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｏｏｓｔｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ」、Ｐaｌ  Ｓａｅｔｒｏｍ（２００４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０（１７）：３０５５−３０６３に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。代替として、または加えて、短いＲＮＡ分子は、高度に効果的なｓｉＲＮＡと関連する特異的な配列特性を有する。参照により本明細書に組み込まれるＲｅｙｎｏｌｄｓによって記載されるアルゴリズム［Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（３）：３２６−３３０］は、短いＲＮＡがこの種の十分な特徴を有するかどうかの決定を可能にする。当業者は、特定の目的のために閾値を規定し、その精度を上げることができるであろう。
【００６１】
任意選択的に、短いＲＮＡ分子は、高度に効果的なｓｉＲＮＡと関連する位置特異的配列モチーフを含む。ｓｉＲＮＡ有効性予測アルゴリズムは、当該技術分野において周知であり、高度に効果的なｓｉＲＮＡと関連するモチーフは、Ｓａｅｔｒｏｍ  ａｎｄ  Ｓｎｏｖｅ，（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２１：２４７−２５３に論じられており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
任意選択的に、標的転写物を下方制御する上で効果的な所与の短いＲＮＡ配列の尤度のさらなる尺度を提供するために、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用することができる。サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、分類および回帰分析に使用されるデータを分析してパターンを認識する、一連の関連する教師あり学習法のためのコンピュータサイエンスにおける概念である。標準的なＳＶＭは、入力データのセットを読み取り、各所与の入力について、その入力が２つの可能なクラスのうちのどちらのメンバーであるかを予測する、つまりＳＶＭは、非確率論的な２進法による線形分類器である。トレーニング例のセットを与えられると、各々が２つのカテゴリーのうちの１つに属するとマークされ、ＳＶＭトレーニングアルゴリズムが、新しい例をどれか一方のカテゴリーに割り当てるモデルを構築する。ＳＶＭモデルは、空間における点としての例の代表であり、別のカテゴリーの例が可能な限り広い明確なギャップによって分割されるようにマッピングされる。次いで、新しい例が同じ空間内にマッピングされ、それらがギャップのどちらの側に属するかに基づいて、あるカテゴリーに属すると予測される。本発明における使用のためのｓａＲＮＡ分子の設計には、いずれの既知のＳＶＭが使用されてもよい。特に好適なＳＶＭは、Ｓaｔｒｏｍ（２００４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０（１７）：３０５５-３０６３に記載される。好ましくは、短いＲＮＡ分子は、それらが０よりも高いＳＶＭスコアを有する場合に選択される。
【００６３】
好ましくは、短いＲＮＡ分子は、細胞のＲＮＡｉ機構内に直接進入することができるか、または細胞のＲＮＡｉ機構内に進入する前にダイサーによってプロセシングされることができる。短いＲＮＡ分子が細胞のＲＮＡｉ機構内に進入する前にダイサーによってプロセシングされることができるかどうかを決定する方法、例えば、Ｔｉｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＲＮＡ  １６（６）：１２７５−１２８４およびＲｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３（１３）：４１４０−４１５６に開示されるようなインビトロのダイサーアッセイは、当該技術分野において周知である。
【００６４】
短いＲＮＡ分子が二本鎖分子の一部である（すなわち、短いＲＮＡ分子がそのような分子の一方の鎖である）場合、またその鎖のみが、標的ＲＮＡ転写物を効果的かつ特異的に下方制御することができる場合、好ましくは、その鎖は優先的にＲＩＳＣに付加される。一方の鎖が優先的にＲＩＳＣに付加される二本鎖ＲＮＡ分子の設計は、当業者の能力の範囲内である。例えば、標的ＲＮＡ転写物を標的とする短いＲＮＡ分子の鎖の５'末端は、他方の鎖の５'末端よりも熱力学的に安定していないように作製するかまたは選択することができる。好ましくは、標的ＲＮＡ転写物を標的とする短いＲＮＡ分子の鎖の５'末端が、他方の鎖の５'末端よりも熱力学的に安定していないように、二重鎖の熱力学的な末端安定性に大きな差がある。二重鎖の熱力学的な末端安定性における差の絶対値（ΔΔＧ）は、当該技術分野において標準的な任意の方法に従って計算することができる。任意選択的に、二重鎖の熱力学的な末端安定性における差の絶対値は、二重鎖の末端の５つの近接するヌクレオチドを考慮することにより、ＲＮＡｆｏｌｄ（Ｈｏｆａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１３，ｐｐ３４２９−３４３１）を用いて計算される。好ましくは、ＲＮＡｆｏｌｄによって計算される二重鎖の熱力学的な末端安定性における差の絶対値は、０ｋｃａｌ／ｍｏｌより高く、より好ましくは１ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも高く、より好ましくは３ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも高い。
【００６５】
上述したもの等の短いＲＮＡの設計のための多くの標準的なツールは、分子のこの特性を評価するための手段を提供する。例えば、二本鎖分子は、一方の鎖よりも他方の鎖のＲＮＡｉ機構内への取り込みを助長する熱力学的特性を有する場合に、選択されることができる。代替として、一方の鎖の優先的付加は、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または改変によって、自然に発生するＲＮＡとは異なるＲＮＡを含むｄｓＲＮＡを使用することにより達成することができる。そのような修飾は、当業者に周知であり、後に詳述する。
【００６６】
ダイサーは、外来性ｄｓＲＮＡを、３'オーバーハングを形成する各３'末端にいくつかの不対塩基を有する１９〜２５塩基対の二本鎖フラグメントに切断するリボヌクレアーゼタンパク質である。上記方法において使用される短いＲＮＡは、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（Ｄ−ｓｉＲＮＡ）であってもよい。ダイサー基質として設計されるｓｉＲＮＡは、標準的な長さのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡと比較して増加された強度を有し得る。
【００６７】
Ｄ−ｓｉＲＮＡは、その鎖が２２〜３０ヌクレオチド長である非対称的なｓｉＲＮＡ二重鎖である。典型的には、パッセンジャー鎖の３’末端の二重鎖が平滑末端であり、該二重鎖がガイド鎖の３’末端にオーバーハングを有するように、一方の鎖（パッセンジャー鎖）は、２２〜２８ヌクレオチド長、好ましくは２５ヌクレオチド長であり、他方の鎖（ガイド鎖）は、２４〜３０ヌクレオチド長、好ましくは２７ヌクレオチド長である。オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド長、好ましくは２ヌクレオチド長である。パッセンジャー鎖は、５’ホスフェートを含んでもよい。
【００６８】
典型的には、Ｄ−ｓｉＲＮＡにおいて、パッセンジャー鎖の３’末端の２つのヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）ではなくデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。ＤＮＡおよび平滑末端化二重鎖は、それぞれ、元のＤ−ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖およびガイド鎖の５’末端および３’末端で、酵素ダイサーが二重鎖を２１ヌクレオチドからなる２１ｍｅｒの二重鎖にプロセシングすることを確実にする。
【００６９】
標準的な１９ｍｅｒのｓｉＲＮＡ分子をＤ−ｓｉＲＮＡに伸長する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｈｅｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｅｃｈ．１９（４）：２３１−２３７に記載される。
【００７０】
２７ｍｅｒ／２５ｍｅｒのＤ−ｓｉＲＮＡに伸長されると、多くのｓｉＲＮＡ分子は、パッセンジャー鎖の３’末端の予測される不対塩基の数が、ガイド鎖の５’末端の予測される不対塩基の数よりも少ないかまたは等しい末端構造を有する。既知のｍｉＲＮＡの構造およびダイサーのＰＡＺドメインの結合要件に基づくと、この構造はダイサーのプロセシングに準最適である可能性が高いため、ｓｉＲＮＡ分子として有用である一方、そのような二重鎖は、ダイサー−基質ｓｉＲＮＡ分子に伸長された場合にはあまり有用ではない。したがって、好ましくは、本発明の方法によって設計される短いＲＮＡは、そのような構造を保有せず、パッセンジャー鎖の３’末端の予測される不対塩基の数が、ガイド鎖の５’末端の予測される不対塩基の数よりも多い。
【００７１】
任意選択的に、本発明の方法によって設計される短いＲＮＡ分子は、修飾、すなわち、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または改変によって、自然に発生するＲＮＡとは異なるＲＮＡを含むことができる。例えば、短いＲＮＡが二本鎖分子の一部である場合、ｄｓＲＮＡ分子の２つの鎖は、化学結合基またはオリゴヌクレオチドリンカー等の結合成分によって結合されてもよく、その結果、得られるｄｓＲＮＡの構造がヘアピン構造となる。結合成分は、例えば、ＲＩＳＣ複合体内への鎖の付加を阻止することによって、またはダイサーとの会合によって、ｄｓＲＮＡの活性を阻止するかまたは他の方法で悪影響を与えてはならない。多くの好適な化学結合基が当該技術分野において既知である。オリゴヌクレオチドリンカーが用いられる場合、それは、ｄｓＲＮＡの完全な機能性が保持されるいずれの配列または長さであってもよい。好ましくは、リンカー配列は、他のヌクレオチド塩基よりも多い量のウリジンおよびグアニンを含み、約４〜９残基、より好ましくは８または９残基の好ましい長さを有する。
【００７２】
その修飾が、ダイサーの基質としてのＲＮＡ組成物の役割を妨げない限り、短いＲＮＡは、修飾を含むように設計することができる。ｄｓＲＮＡのダイサープロセシングを増強する、より効果的なＲＮＡｉの産生をもたらす、より高いＲＮＡｉ効果を支持する、細胞に送達される各ｄｓＲＮＡ分子当たりのより高い効力をもたらす、および／または治療環境においてｄｓＲＮＡの安定性を確保するのに役立つ、１つ以上の修飾を行うことができる。
【００７３】
修飾は、３'末端領域、５'末端領域、３'末端領域および５'末端領域の両方、または特定の場合において、配列中の種々の位置に組み込むことができる。上述の制限に留意して、任意の数および組み合わせの修飾をＲＮＡ内に組み込むことができる。複数の修飾が存在する場合、それらは同じであるかまたは異なってもよい。塩基、糖部分、リン酸主鎖、およびそれらの組み合わせに対する修飾が企図される。いずれの５'末端がリン酸化されてもよい。
【００７４】
短いｄｓＲＮＡ分子は、パッセンジャー鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によってダイサープロセシングのために修飾することができる、すなわち、ｄｓＲＮＡは、ダイサーの結合およびプロセシングの配向を決定するように設計される。好適な修飾因子は、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド等のヌクレオチド、および蛍光性分子等の立体障害分子を含む。アシクロヌクレオチドは、通常ｄＮＭＰ中に存在する２'−デオキシリボフラノシル糖を２−ヒドロキシエトキシメチル基に置換する。他のヌクレオチド修飾因子は、３'−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３'−アジド−３'−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２'，３'−ジデオキシイノシン（ｄｄｌ）、２'，３l−ジデオキシ−３'−チアシチジン（３ＴＣ）、２'，３'−ジデヒドロ−２'，３'−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに３'−アジド−３'−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２'，３'−ジデオキシ−３'−チアシチジン（３ＴＣ）、および２'，３'−ジデヒドロ−２'，３'−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを含んでもよい。デオキシヌクレオチドが修飾因子として用いられてもよい。ヌクレオチド修飾因子を利用する場合、１つ〜３つのヌクレオチド修飾因子、または２つのヌクレオチド修飾因子が、パッセンジャー鎖の３’末端でリボヌクレオチドで置換される。立体障害分子を利用する場合、それらをパッセンジャー鎖の３’末端でリボヌクレオチドに付着させる。したがって、鎖の長さは、修飾因子の取り込みによって変化しない。任意選択的に、ダイサープロセシングの配向を決定するために、ｄｓＲＮＡ中で２つのＤＮＡ塩基が置換される。任意選択的に、ガイド鎖の５’末端およびパッセンジャー鎖の３’末端で二重鎖の平滑末端を形成する２つのリボヌクレオチドの代わりに、２つの末端ＤＮＡ塩基がパッセンジャー鎖の３’末端に位置し、ガイド鎖の３'末端に２つのヌクレオチドのＲＮＡオーバーハングが位置する。これは、平滑末端にＤＮＡ、そしてオーバーハング末端にＲＮＡ塩基を有する非対称的な組成物である。
【００７５】
リン酸主鎖に企図される修飾の例として、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、およびアルキルホスホトリエステル等のホスホトリエステル修飾等を含むホスホネートが挙げられる。糖部分に企図される修飾の例として、２'−アルキルピリミジン、例えば、２'−Ｏ−メチル、２'−フルオロ、アミノ、およびデオキシ修飾等が挙げられる（例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３を参照）。塩基群に企図される修飾の例として、無塩基糖、２−Ｏ−アルキル修飾ピリミジン、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、および５−（３−アミノアリル）−ウラシル等が挙げられる。ロックド核酸すなわちＬＮＡも、組み込むことができる。多くのほかの修飾が既知であり、上記基準を満たす限り、それらを用いることができる。
【００７６】
また、本発明の方法によって設計される短いＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、または組換えによって生成されたＲＮＡも含むことができる。短いＲＮＡに対する他の可能な改変は、短いＲＮＡの末端（複数可）への、または短いＲＮＡの１つ以上の内部ヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質の付加、短いＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して耐性にする修飾（例えば、２'置換リボヌクレオチドの使用もしくは糖−リン酸主鎖に対する修飾）、または短いＲＮＡ中の１つ以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドとの置換を含む。
【００７７】
短いＲＮＡが二本鎖分子の一部である場合、両方の鎖が、上に定義するように標的ＲＮＡ転写物を効果的かつ特異的に下方制御することができてもよい。そのような多機能性ｓｉＲＮＡ分子を設計する方法は、Ｈｏｓｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３（２）：８２−８９に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
短いＲＮＡ分子が二本鎖分子の一方の鎖（機能鎖、すなわちガイド鎖）である場合、相補的な「パッセンジャー」二重鎖の設計は、当業者の能力の範囲内である。本発明によれば、第１の鎖の相殺効果を最小限に抑えるために、ｓｉＲＮＡまたは他の二本鎖分子の第２の鎖が可能な限り不活性であるように設計されることが好ましい。本明細書に記載されるものを含む標準的なツールを使用して、そのような鎖を設計することができる。
【００７９】
短いＲＮＡが二本鎖分子の一部であり、かつ、両方の鎖が、上に定義するように標的ＲＮＡ転写物を効果的かつ特異的に下方制御することができる場合、好ましくは、二重鎖の熱力学的な末端安定性には大きな差が存在しない。二重鎖の熱力学的な末端安定性における差の絶対値（ΔΔＧ）は、当該技術分野において標準的な任意の方法に従って計算することができる。任意選択的に、二重鎖の熱力学的な末端安定性における差の絶対値は、二重鎖の末端の５つの近接するヌクレオチドを考慮することにより、ＲＮＡｆｏｌｄ（Ｈｏｆａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１３，ｐｐ３４２９−３４３１）を用いて計算される。好ましくは、ＲＮＡｆｏｌｄによって計算される二重鎖の熱力学的な末端安定性における差の絶対値は、３ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、より好ましくは１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である。
【００８０】
ステップｃ）およびｉｉ）は、最初に、候補ｓａＲＮＡの集団を産生すること、次いで、一連のステップにおいて、望ましい特性（単数または複数）を有するものをその集団から選択することを含んでもよい。最初の集団は、それぞれ、ステップｂ）またはステップｉ）で決定される配列と相補的／同一である、選択された長さ（単数または複数）のいくつかのまたはあらゆる可能な短いＲＮＡの一本鎖配列を含んでもよい。
【００８１】
「標的遺伝子」または「対象となる遺伝子」は、その発現が調節されることが望ましい遺伝子である。この用語は、限定されないが、コード領域（複数可）、非コード領域（複数可）、非転写領域（複数可）、イントロン（複数可）、エクソン（複数可）、および導入遺伝子（複数可）を含む同定された遺伝子（複数可）を含んでもよいかまたは含まなくてもよい、任意のヌクレオチド配列を含む。標的遺伝子は、細胞、内在性遺伝子、導入遺伝子、またはその感染後に細胞内に存在する病原体等の外来性遺伝子に由来する遺伝子であり得る。標的遺伝子を含む細胞は、任意の生物に由来するかまたは含まれ得る。「標的ｍＲＮＡ」配列は、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡ配列である。
【００８２】
さらなる態様において、本発明は、本明細書のいずれかの箇所に定義される方法を行うこと、次いで、前記方法によって設計されるＲＮＡ分子のうちの１つ以上を合成することを含む、短いＲＮＡ分子を生成する方法を提供する。
【００８３】
本発明の方法によって設計される短いＲＮＡ分子は、任意の好適な方法によって、例えば、当業者に周知の標準的な分子生物学的技術を用いて、合成的にまたは細胞内の発現によって生成することができる。例えば、Ｔｕｓｃｈｌらの米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号に記載されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａインビトロシステム、またはＶｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９８）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６７：９９−１３４に記載されるＲＮＡ分子を合成する方法（それらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる）等の当該技術分野で既知である方法を用いて、短いＲＮＡを化学合成することができるかまたは組換えによって生成することができる。短いＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて、化学的に合成されてもよい。短いＲＮＡが二本鎖ＲＮＡの一部である場合、それらは、２つの別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する単一ＲＮＡ分子として合成することができる。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の商業供給者は、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．，ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ．，ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）、およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）を含む。
【００８４】
短いＲＮＡは、任意の好適なプロモーターを用いて、環状または線形の組換えＤＮＡプラスミドから発現させることもできる。プラスミドから本発明の短いＲＮＡを発現させるために好適なプロモーターとして、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の好適なプロモーターの選択は、当該技術分野の技術の範囲内である。本発明の組換えプラスミドは、特定の組織または特定の細胞内環境における短いＲＮＡの発現のための誘導性または制御性（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ）プロモーターも含む。
【００８５】
組換えプラスミドから発現させた短いＲＮＡは、標準的な技術によって培養細胞発現系から単離することができる。本発明の方法によって設計される二本鎖の短いＲＮＡは、２つの別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する単一ＲＮＡ分子として、組換えプラスミドから発現させることができる。
【００８６】
短いＲＮＡを発現させるために好適なプラスミドの選択、短いＲＮＡをプラスミド内で発現させるための核酸配列を挿入するための方法、および対象となる細胞に組換えプラスミドを送達する方法は、当該技術分野の技術の範囲内である。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４４６−４４８、およびＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  Ｔ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３（それらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００８７】
また、本発明の方法によって設計される短いＲＮＡは、インビボで細胞内で組換えウイルスベクターから発現させることもできる。本発明の組換えウイルスベクターは、本発明の短いＲＮＡをコードする配列、および短いＲＮＡ配列を発現させるための任意の好適なプロモーターを含む。好適なプロモーターとして、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の好適なプロモーターの選択は、当該技術分野の技術の範囲内である。二本鎖の短いＲＮＡは、２つの別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する単一ＲＮＡ分子として、組換えウイルスベクターから発現させることができる。発現されるｄｓＲＮＡ分子（複数可）のコード配列を許容することができる任意のウイルスベクター、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルス等に由来するベクターが用いられてもよい。ウイルスベクターの向性は、必要に応じて、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原でベクターを偽型化することによって、または異なるウイルスカプシドタンパク質で置換することによって、変更することができる。
【００８８】
組換えウイルスベクターの選択、短いＲＮＡをベクター内で発現させるための核酸配列を挿入するための方法、ウイルスベクターを対象となる細胞に送達する方法は、当該技術分野の技術の範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ  Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０（その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００８９】
本発明の発明者は、上述の方法を使用して、様々な標的遺伝子に対する短い活性化ｓａＲＮＡを設計した。
【００９０】
好ましくは、標的遺伝子は、多能性誘導遺伝子である。多能性誘導遺伝子または「幹細胞性遺伝子」は、多能性の誘導または維持のためにその活性化が必要であることが分かっている遺伝子である。好ましくは、標的遺伝子は、ＫＬＦ４、ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４とも称される）、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８からなる群から選択される遺伝子である。より好ましくは、標的遺伝子は、ＫＬＦ４、ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４とも称される）、ＳＯＸ２、およびＭＹＣからなる群から選択される。最も好ましくは、標的遺伝子はＫＬＦ４である。
【００９１】
さらなる態様において、本発明は、非コードＲＮＡ転写物の下方制御によって細胞内の標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、
ａ）少なくとも遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド上流から遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド下流の間の、標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を得るステップと、
ｂ）ステップａ）で決定されるヌクレオチド配列に対する逆相補的ＲＮＡ配列を決定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で決定される配列の領域の逆相補体であるか、または該逆相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有する短いＲＮＡ分子を設計するステップと、
ｄ）細胞を前記短いＲＮＡ分子と接触させるステップと、を含み、
前記非コードＲＮＡ転写物の存在が決定されるステップを含まない、方法を提供する。
【００９２】
短いＲＮＡ分子を設計する方法に関連する上記定義および説明は、細胞内の標的遺伝子の発現を増加させるこの方法について準用する。
【００９３】
上記短いＲＮＡ分子を設計する方法のステップは、コンピュータ上で行うことができる。したがって、本発明は、非コードＲＮＡ転写物の下方制御によって細胞内の標的遺伝子の発現を増加させるための短いＲＮＡ分子を設計するコンピュータで実施される方法であって、
ａ）少なくとも遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド上流から遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド下流の間の、標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を得るステップと、
ｂ）ステップａ）で決定されるヌクレオチド配列に対する逆相補的ＲＮＡ配列を決定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で決定される配列の領域の逆相補体であるか、または該逆相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有する短いＲＮＡ分子を設計するステップとを含み、
前記非コードＲＮＡ転写物の存在が決定されるステップを含まない、方法も提供する。
【００９４】
短いＲＮＡ分子を設計する方法に関連する上記定義および説明は、短いＲＮＡ分子を設計するコンピュータで実施されるこの方法について準用する。
【００９５】
本発明の短いＲＮＡ分子を設計する方法は、少なくとも部分的に、ソフトウェア、例えばコンピュータプログラムを使用して実施されてもよい。したがって、本発明は、データ処理手段上で実行される場合に、本明細書に記載される方法のうちのいずれかを実行するように特に適合されたコンピュータソフトウェア、プログラム要素がデータ処理手段上で実行される場合に、本明細書に記載される方法のうちのいずれかを行うためのコンピュータソフトウェアコード部を含むコンピュータプログラム要素、およびプログラムがデータ処理手段上で実行される場合に、本明細書に記載される方法のいずれかのステップを行うように適合されたコード手段を備えるコンピュータプログラムを提供する。
【００９６】
また、本発明は、データ処理手段を備えるプロセッサ、電子デバイス、またはシステムを操作するために使用された場合に、前記データ処理手段と連動して、前記プロセッサ、電子デバイス、またはシステムに本明細書に記載される方法のいずれかのステップを実行させるそのようなソフトウェアを備えるコンピュータソフトウェア担体にも及ぶ。
【００９７】
したがって、さらなる態様において、本発明は、
コンピュータシステムに、
ａ）少なくとも遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド上流から遺伝子の転写開始点の２００ヌクレオチド下流の間の、標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を受信すること、
ｂ）ステップａ）で受信されるヌクレオチド配列に対する逆相補的ＲＮＡ配列を決定すること、および
ｃ）非コードＲＮＡ転写物の下方制御によって細胞内の標的遺伝子の発現を増加させるように設計される短いＲＮＡ分子であって、ステップｂ）で決定される配列の領域の逆相補体であるか、または該逆相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有する、短いＲＮＡ分子を構築するための情報を出力すること、を命令するためのコンピュータ実行可能な命令を含み、
命令は、非コードＲＮＡ転写物の存在を決定することを要求する命令を含まない、１つ以上のコンピュータ可読媒体を提供する。
【００９８】
好ましくは、１つ以上のコンピュータ可読媒体は、短いＲＮＡ分子を構築するための情報をコンピュータ可読媒体に出力する命令をさらに含む。
【００９９】
短いＲＮＡ分子を設計する方法に関連する上記定義および説明は、これらの１つ以上のコンピュータ可読媒体について準用する。
【０１００】
そのような媒体は、ＲＯＭチップ、ＣＤ‐ＲＯＭ、またはディスク等の物理的な（非一時的な）記憶媒体であってもよいか、あるいは一時的な媒体または信号、例えば、回線上の電子信号、光信号、もしくは電波信号等であってもよい。
【０１０１】
本発明の方法の全てのステップがコンピュータソフトウェアによって実行される必要はないことをさらに理解されたい。したがって、本発明は、コンピュータソフトウェア、および本明細書に記載される方法のステップのうちの少なくとも１つを実行するためのコンピュータソフトウェア担体に実装されるそのようなソフトウェアを提供する。
【０１０２】
そのため、本発明は、電子デバイスまたはシステムとともに使用するためのコンピュータプログラム製品として好適に具現化されてもよい。そのような実施は、コンピュータ可読媒体等の有形的表現媒体、例えば、ディスケット、ＣＤ‐ＲＯＭ、ＲＯＭ、もしくはハードディスク上に固定されているか、あるいは、限定されないが、光通信回線もしくはアナログ通信回線を含む有形的表現媒体を通して、または、限定されないが、マイクロ波、赤外線伝送技術、もしくは他の伝送技術を含む無線技術を用いて無形的に、モデムまたは他のインターフェースデバイスを介してコンピュータシステムに伝送可能であるかのいずれかである、一連のコンピュータ可読命令を含んでもよい。一連のコンピュータ可読命令は、本明細書に前述した機能性の全てまたは一部を具現化する。
【０１０３】
当業者は、多くのコンピュータアーキテクチャまたは操作システムとともに使用される多数のプログラミング言語でそのようなコンピュータ可読命令を書き込むことができることを理解するであろう。さらに、そのような命令は、限定されないが、半導体、磁気、もしくは光学を含む、現存のまたは将来的な任意の記憶技術を用いて格納されてもよいか、あるいは、限定されないが、光学、赤外線、もしくはマイクロ波を含む、現存のまたは将来的な任意の通信技術を用いて伝送されてもよい。そのようなコンピュータプログラム製品は、コンピュータシステム、例えば、システムのＲＯＭもしくは固定ディスクに予め搭載された添付の印刷文書または電子文書を伴う取り外し可能な媒体、例えば、収縮包装された市販のソフトウェアとして流通されてもよいか、あるいは、ネットワーク、例えば、インターネットまたはワールドワイドウェブを通してサーバーまたは電子掲示板から流通されてもよいことが企図される。
【０１０４】
さらなる態様において、本発明は、細胞内の標的遺伝子を上方制御することによって体細胞または多分化能細胞を多能性細胞にプログラムする方法であって、前記標的遺伝子は、多能性誘導遺伝子であり、前記方法は、前記細胞を、前記細胞内に存在する標的ＲＮＡ転写物を特異的に下方制御する短いＲＮＡ分子と接触させることを含み、前記標的ＲＮＡ転写物は、
ｉ）
ａ）標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流までの遺伝子座のいずれかの鎖、
ｂ）標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流までの遺伝子座のいずれかの鎖、または
ｃ）標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座のいずれかの鎖、から転写され、
ｉｉ）標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む、方法を提供する。
【０１０５】
代替の観点からすると、本発明は、細胞内の標的遺伝子を上方制御することによって前記細胞の集団の分化能を維持するかまたは増加させる方法であって、前記標的遺伝子は、多能性誘導遺伝子であり、前記方法は、前記細胞を、前記細胞内の標的ＲＮＡ転写物を特異的に下方制御する短いＲＮＡ分子と接触させることを含み、前記標的ＲＮＡ転写物は、
ｉ）
ａ）標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流までの遺伝子座のいずれかの鎖
ｂ）標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流までの遺伝子座のいずれかの鎖、または、
ｃ）標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座のいずれかの鎖、から転写され、
ｉｉ）標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む、方法を提供する。
【０１０６】
体細胞は、生殖系列細胞（配偶子）、そこから配偶子が作られる細胞（生殖母細胞）、多分化能細胞、および多能性細胞を除く、生物の体を形成する任意の種類の細胞である。体細胞は、いずれの動物に由来してもよいが、好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
【０１０７】
多能性細胞は、内胚葉（内側の胃壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、または外胚葉（上皮組織および神経系）の３つの胚葉のうちのいずれかに分化する可能性を有する細胞である。分化能は、細胞が異なる種類の細胞に分化することができる程度である。多能性細胞は、多分化能細胞よりも高い分化能を有する。細胞の集団において、個々の細胞は、異なる分化能を保有し得る。多分化能細胞の集団は、時が経つと、体細胞に分化した特定の細胞、および分化しなかったが、なおも多分化能性である特定の細胞を含み得る。同様に、多能性細胞の集団は、時が経つと、多分化能細胞および体細胞、ならびに多能性細胞を含み得る。したがって、細胞の集団の分化能を維持するかまたは増加させる上記方法は、体細胞、多分化能細胞、または多能性細胞の集団とともに使用されてもよい。
【０１０８】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞と略される）は、特定の遺伝子の「強制的な」発現を誘導することによって、非多能性細胞、典型的には成人体細胞から人工的に生じる多能性幹細胞の一種である。
【０１０９】
多分化能細胞は、複数ではあるが限定された数の系統から細胞を生じさせる可能性を有する細胞である。多分化能細胞の例は、いくつかの種類の血液細胞に発達することができるが、脳細胞または他の種類の細胞には発達することができない血液幹細胞である造血細胞である。間葉系幹細胞すなわちＭＳＣは、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）（軟骨細胞ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｃｅｌｌ）、および脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）（脂肪細胞ｆａｔ  ｃｅｌｌ）を含む様々な細胞の種類になる多分化能幹細胞である。
【０１１０】
好ましくは、本発明の方法の全ては、インビトロで行われる。
【０１１１】
本発明の方法において、体細胞もしくは多分化能細胞の多能性細胞への再プログラミング、または多能性幹細胞の誘導は、標的多能性誘導遺伝子（複数可）を上方制御すること、すなわち活性化することによって達成される。上方制御は、「シス」上方制御である。この文脈において、「シス」上方制御とは、標的ＲＮＡ転写物が、標的遺伝子の遺伝子座と関連する遺伝子座から転写されることを意味する。そのような「関連性」は、以下の３つの様式のうちの１つであり得る。
【０１１２】
第１に、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流までの遺伝子座から転写されてもよい。第２に、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のアノテートされた転写終了点の１００ｋｂ下流までの遺伝子座から転写されてもよい。第３に、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座から転写されてもよい。この後者の場合、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点からいずれの距離の遺伝子座から、またさらには異なる染色体上の遺伝子座から転写されてもよい。ＤＮＡの異なる領域が、同じ染色体内または異なる染色体内のいずれかで長距離にわたって相互作用できることは、当該技術分野において周知である［Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ−Ａｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：２８９−２９３］。
【０１１３】
反対に、「トランス」上方制御は、標的ＲＮＡ転写物が、標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流以内または標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流以内のいずれかである遺伝子座から転写されず、標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座から転写されない場合に起こる。本発明の方法において、「トランス」上方制御は企図されない。
【０１１４】
したがって、上記方法の標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流までの遺伝子座から、標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流までの遺伝子座から、または標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座から転写される。好ましくは、ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の６０ｋｂ上流までの遺伝子座から、標的遺伝子の転写終了点の６０ｋｂ下流までの遺伝子座から、または標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座から転写される。より好ましくは、ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の４０ｋｂ上流までの遺伝子座から、標的遺伝子の転写終了点の４０ｋｂ下流までの遺伝子座から、または標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座から転写される。より好ましくは、ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の２０ｋｂ上流までの遺伝子座から、標的遺伝子の転写終了点の２０ｋｂ下流までの遺伝子座から、または標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座から転写される。任意選択的に、ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の１ｋｂ上流までの遺伝子座から、標的遺伝子の転写終了点の１ｋｂ下流までの遺伝子座から、または標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座から転写される。任意選択的に、ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の１００ヌクレオチド上流までの遺伝子座から、標的遺伝子の転写終了点の１００ヌクレオチド下流までの遺伝子座から、または標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座から転写される。
【０１１５】
本発明の標的ＲＮＡ転写物の文脈において、「（特定の遺伝子座）から転写される」という用語は、「（特定の遺伝子座に）標的ＲＮＡ転写物の転写開始点が見出される」ことを意味する。標的ＲＮＡ転写物の転写開始点は、標的ＲＮＡ転写物の他の本質的な特性が存在する限り、標的遺伝子を含む染色体のいずれかの鎖上に見出されてもよい。好ましくは、本発明の標的ＲＮＡ転写物は、上に定義される領域ｉ）ａ）またはｉ）ｂ）のうちの１つの中に、その転写開始点およびその転写終了点を有する。換言すると、好ましくは、標的ＲＮＡ転写物の転写開始点および転写終了点の両方が、標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流までまたは標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流までのいずれかに別々に位置する。標的ＲＮＡ転写物が転写される位置に関連して上述される好ましい実施形態は、標的ＲＮＡ転写物の転写終了点の位置について準用する。
【０１１６】
上記方法において、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む。より好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の６０ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の６０ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む。より好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の４０ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の４０ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む。より好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の２０ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の２０ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む。より好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の１ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む。より好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の１００ヌクレオチド上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ヌクレオチド下流の終端に位置するゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む。任意選択的に、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のコード領域を含むゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む。
【０１１７】
本発明の文脈において核酸配列について説明するために使用される「センス」という用語は、その配列が標的遺伝子のコード鎖上の配列と同一性を有することを意味する。本発明の文脈において核酸配列について説明するために使用される「アンチセンス」という用語は、その配列が標的遺伝子のコード鎖上の配列に相補的であることを意味する。
【０１１８】
「相補的」および「相補性」という用語については上に定義した。好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は、その全長に沿って、標的遺伝子のコード鎖上の配列に少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％相補的な配列を含む。好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は、その全長に沿って、標的遺伝子のコード鎖上の配列との完全なまたはほぼ完全な相補性を有する配列を含む。
【０１１９】
代替として、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のコード鎖上の配列との完全なまたはほぼ完全な相補性を有するギャップなしの配列を１つ以上、通常はいくつか（例えば、少なくとも３つまたは少なくとも６つ）含み、前記ギャップなしの配列は、少なくとも１６ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長である。
【０１２０】
本発明のいくつかの態様において、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子内の配列に対してセンスである配列を含み得る、すなわち、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のコード鎖上の配列との同一性を有する配列を含み得る。「同一性」および「同一の」という用語については上で定義した。好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は、その全長に沿って、標的遺伝子のコード鎖上の配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一の配列を含む。好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は、その全長に沿って、標的遺伝子のコード鎖上の配列との完全なまたはほぼ完全な同一性を有する配列を含む。
【０１２１】
代替として、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のコード鎖上の配列との完全なまたはほぼ完全な同一性を有するギャップ無しの配列を１つ以上、通常はいくつか（例えば、少なくとも３つまたは少なくとも６つ）含み、前記ギャップ無しの配列は、少なくとも１６ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長である。
【０１２２】
ＲＮＡ転写物（複数可）と上述のゲノム配列（複数可）との間の同一性／相補性を評価する場合、コード鎖／鋳型鎖は、遺伝子の転写された領域の上流および下流に伸長すると考えられる、すなわち、「コード鎖」および「鋳型鎖」という用語は、実際の鎖の標識であるに過ぎず、いずれかの長さの限界を示唆するものではない。
【０１２３】
標的ＲＮＡ転写物は、コードＲＮＡ分子、すなわち、アミノ酸配列をコードするＲＮＡ分子であるか、または非コードＲＮＡ分子、すなわち、アミノ酸配列をコードしないＲＮＡ分子であるかのいずれかである。好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は、非コードＲＮＡである。
【０１２４】
標的ＲＮＡ転写物は、好ましくは少なくとも１６ヌクレオチド長である。しかしながら、好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は、少なくとも１００長、より好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド長、可能であれば少なくとも４０００ヌクレオチド長である。
【０１２５】
上記方法において、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む。明確性のために、これ以降、「ゲノム配列」という用語は、「標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列」という用語の省略形として使用する。換言すると、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のコード鎖上のゲノム配列に相補的な配列を含む。
【０１２６】
任意選択的に、それに対して標的ＲＮＡ転写物がアンチセンスであるゲノム配列は、標的遺伝子のプロモーター領域の一部を含む。換言すると、任意選択的に、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してアンチセンスであり、かつ標的遺伝子のプロモーター領域の一部を含む配列を含む。この特性を説明する別の方法は、アンチセンス標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のプロモーター領域に「重複する」ということである。遺伝子は、複数のプロモーター領域を有し得、その場合、標的ＲＮＡ転写物は、１つ、２つ、またはそれ以上のプロモーター領域と重複し得る。遺伝子のプロモーター領域を同定するために、アノテートされた遺伝子座のオンラインデータベースが用いられてもよい。
【０１２７】
任意の所与のプロモーター領域について、プロモーター領域全体が重複している必要はなく、プロモーター領域内のサブ配列が標的ＲＮＡ転写物によって重複されていれば十分である、すなわち、重複は、部分的な重複であり得る。同様に、標的ＲＮＡ転写物全体がプロモーター領域内の配列に対してアンチセンスである必要はなく、標的ＲＮＡ転写物が、プロモーター領域に対してアンチセンスである配列を含む必要があるだけである。
【０１２８】
標的ＲＮＡ転写物と標的遺伝子のプロモーター領域との間の重複の領域は、単一ヌクレオチド長と同じくらい短くてもよいが、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長である。以下の特定の構成の各々は、「重複」という用語の範囲内に属することが意図される：
ａ）標的ＲＮＡ転写物および標的遺伝子のプロモーター領域は、長さが同一であり、それらの全長にわたって重複する（すなわち、それらは相補的である）。
ｂ）標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のプロモーター領域よりも短く、その全長にわたって標的遺伝子のプロモーター領域と重複する（すなわち、その全長にわたって標的遺伝子のプロモーター領域内の配列と相補的である）。
ｃ）標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のプロモーター領域よりも長く、標的遺伝子のプロモーター領域が、それによって完全に重複される（すなわち、標的遺伝子のプロモーター領域は、その全長にわたって標的ＲＮＡ転写物内の配列と相補的である）。
ｄ）標的ＲＮＡ転写物および標的遺伝子のプロモーター領域は、同じかまたは異なる長さであり、重複の領域は、標的ＲＮＡ転写物の長さおよび標的遺伝子のプロモーター領域の長さのどちらよりも短い。
【０１２９】
上記「重複」の定義は、本明細書を通して他の重複する配列の説明について準用する。明らかに、アンチセンスＲＮＡ転写物が、プロモーター領域以外の標的遺伝子の領域と重複していると記載される場合、転写物の配列は、プロモーター領域内の配列ではなく、その領域内の配列と相補的である。あるセンス標的ＲＮＡ転写物について言及する場合、「重複」という用語は、標的ＲＮＡ転写物が、プロモーター領域または標的遺伝子の他の記載される領域内の配列に対してセンスである配列を含むことを意味する。換言すると、センス標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のコード鎖上の配列および標的遺伝子の指定された領域内の配列と同一である／同一性を有する配列を含む。
【０１３０】
好ましくは、ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点を含むゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む。換言すると、好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点と重複する配列を含む。
【０１３１】
理論に拘束されることを望むわけではないが、本発明の短いＲＮＡは、標的遺伝子の領域に対してアンチセンス（または、ある場合においては、センス）であるＲＮＡ転写物のｓｉＲＮＡ様開裂を誘導することによって、標的遺伝子の調節を達成すると考えられる。また、本発明の短いＲＮＡは、アルゴノートタンパク質と複合化して、制御性のクロマチン調節タンパク質のアンカーとして機能することができるかもしれない。
【０１３２】
ＲＮＡ転写物が細胞内に存在するかどうかを決定する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、対象となる遺伝子の遺伝子座周辺のゲノム領域で、スプライスされた発現配列タグを検索することができる。発現配列タグすなわちＥＳＴは、転写されたｃＤＮＡ配列の短いサブ配列である。ＥＳＴは、遺伝子転写物を同定するために一般的に使用される。ＥＳＴの公的データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースは、当該技術分野において既知である。代替として、ＲＮＡを同定するための周知のツールである逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して潜在的な標的ＲＮＡ転写物を同定することもできる。代替として、ハイスループットシーケンシングまたは他のそのような方法を使用して、全ＲＮＡ、サイズ分画されたＲＮＡ、または他の好適なＲＮＡのサブセットを配列決定することができ、そのようなシーケンシングライブラリーを使用して対象となる領域から生じるＲＮＡ転写物を同定する。代替として、好適な転写物を同定するために既知のＲＮＡ転写物の集団を検索することができる。当該技術分野で既知である任意のＲＮＡ転写物のデータベース、例えば、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（ＵＣＳＣ）  Ｓｐｌｉｃｅｄ  ＥＳＴ  ｔｒａｃｋが使用されてもよい。代替として、集団は、独自の特定の目的のために本発明を研究している当業者が有する集団から調製されてもよい。例えば、標的遺伝子が特定の細胞型において発現されることが分かっている場合、転写物のデータベースは、その細胞型に存在することが分かっている転写物のデータベースであってもよい。当業者は、特定の所望の目的に使用するために集団を決定することができるであろう。
【０１３３】
体細胞または多分化能細胞を多能性細胞に再プログラムするためには、通常、ＫＬＦ４、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、およびＭＹＣの各々が活性化されることが必要である。上で論じた方法は、標的遺伝子、すなわち、少なくとも１つの標的多能性誘導遺伝子を上方制御するための短いＲＮＡの使用を必要とする。したがって、方法は、本発明の短いＲＮＡの使用によって活性化されないこれらの多能性誘導遺伝子が、当該技術分野において既知である他の手段によって活性化されることを許容する。任意選択的に、上記方法は、本発明の短いＲＮＡを使用することによる、ＫＬＦ４、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、およびＭＹＣからなる群から選択される２つまたは３つの標的遺伝子の上方制御を含む。好ましくは、本発明の短いＲＮＡによって上方制御される標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＫＬＦ４である。任意選択的に、方法は、本発明の短いＲＮＡによるＫＬＦ４、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、およびＭＹＣの各々の上方制御を含む。任意選択的に、そのような方法は、当該技術分野において既知である任意の方法によるＮＡＮＯＧまたは／およびＬＩＮ２８の上方制御をさらに含む。好ましくは、方法がＮＡＮＯＧまたは／およびＬＩＮ２８を上方制御するステップを含む場合、上方制御は、本発明の短いＲＮＡ分子の使用によって達成される。
【０１３４】
上記方法において、細胞または細胞の集団が、本発明の短いＲＮＡ分子と接触させられる。短いＲＮＡ分子は、本発明の短いＲＮＡとともに任意の好適な送達試薬を使用して前記細胞に投与することができる。そのような好適な送達試薬は、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えば、ポリリジン）、ウイルスに基づく粒子、電気穿孔もしくはリポソームを含む。好ましい送達試薬は、リポソームである。例えば、Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７および米国特許第４，２３５，８７１号および第５，０１９，３６９号（それらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるようなリポソームを調製するための様々な方法が既知である。
【０１３５】
特に好ましくは、例えば、構造の表面に結合するオプソニン作用阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを回避するために、本発明の短いＲＮＡを被包するリポソームが改変される。一実施形態において、本発明のリポソームは、オプソニン作用阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
【０１３６】
短いＲＮＡを発現する組換えプラスミドも、直接的に、またはＭｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（例えば、ポリリジン）、もしくはリポソームを含む好適な送達試薬とともに、投与することができる。短いＲＮＡを発現する組換えウイルスベクターおよびそのようなベクターを細胞に送達するための方法は、当該技術分野において既知である。
【０１３７】
好ましくは、前記接触させるステップは、毎日、または少なくとも１日おき、好ましくは少なくとも４日おき、より好ましくは少なくとも６日おき、さらにより好ましくは少なくとも８日おき、さらにより好ましくは少なくとも１２日おき、さらにより好ましくは約１８〜２３日おき、最も好ましくは約２１日おきに行われる。好ましくは、前記接触させるステップは、１日に１回、２回、もしくは３回、または隔日で行われる。上記方法において、１つより多くの遺伝子が上方制御される場合、異なる標的遺伝子を上方制御するために使用される短いＲＮＡは、異なる頻度および異なる期間で投与されてもよい。使用される特定の投与計画は、所望の目的、特定の出発細胞型、および送達方法に適合するように、当業者によって容易に決定され得る。例として、ピコモル濃度の本発明の短いＲＮＡ分子が用いられてもよい。
【０１３８】
本発明の短いＲＮＡは、考慮される特定の方法において効果を有することが知られている、単独で、または他の既知の活性薬剤（複数可）と組み合わせて提供されてもよい。他の活性薬剤（複数可）は、本発明の短いＲＮＡと同時に、別々に、または連続して投与されてもよい。したがって、単一の本発明の短いＲＮＡ、２つ以上の本発明の短いＲＮＡの組み合わせ、または適用可能な場合は、前記短いＲＮＡ（複数可）と他の活性物質（複数可）との組み合わせを使用することが可能である。
【０１３９】
さらなる態様において、本発明は、標的遺伝子を上方制御する方法であって、前記標的遺伝子は、多能性誘導遺伝子であり、前記方法は、前記標的遺伝子を含む細胞を、前記細胞内に存在する標的ＲＮＡ転写物を特異的に下方制御する短いＲＮＡ分子と接触させることを含み、前記標的ＲＮＡ転写物は、
ｉ）
ａ）標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流までの遺伝子座のいずれかの鎖、
ｂ）標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流までの遺伝子座のいずれかの鎖、または
ｃ）標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座のいずれかの鎖、から転写され、
ｉｉ）標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む、方法を提供する。
【０１４０】
体細胞もしくは多分化能細胞を多能性細胞に再プログラミングする方法、または細胞の集団の分化能を維持するかもしくは増加させる方法に関連する上記定義および説明は、標的多能性誘導遺伝子を上方制御するこの方法について準用する。
【０１４１】
さらなる態様において、本発明は、標的遺伝子を下方制御する方法であって、前記標的遺伝子は分化を引き起こし、前記方法は、前記標的遺伝子を含む細胞を、前記細胞内に存在する標的ＲＮＡ転写物を特異的に下方制御する短いＲＮＡ分子と接触させることを含み、前記標的ＲＮＡ転写物は、
ｉ）
ａ）標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流までの遺伝子座のいずれかの鎖、
ｂ）標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流までの遺伝子座のいずれかの鎖、または
ｃ）標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座のいずれかの鎖、から転写され、
ｉｉ）標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してセンスである配列を含む、方法を提供する。
【０１４２】
上記方法は、単独で、あるいは必要に応じて、上で論じた体細胞もしくは多分化能細胞を多能性細胞に再プログラミングする方法、または細胞の集団の分化能を維持するかもしくは増加させる方法における追加のステップとして使用することができる。分化の阻害は、それらが制御不可能に分化しないように、多能性細胞の調製において有利であり得る。
【０１４３】
別途記載のない限り、体細胞もしくは多分化能細胞を多能性細胞に再プログラミングする方法、または細胞の集団の分化能を維持するかもしくは増加させる方法に関連する上記定義および説明は、分化を引き起こす標的遺伝子を下方制御するこの方法について準用する。
【０１４４】
分化を引き起こす標的遺伝子を下方制御するこの方法において、下方制御は「シス」下方制御である。本文脈における「シス」という用途については上述の通りである。
【０１４５】
分化を引き起こす標的遺伝子を下方制御するこの方法において、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子に対してセンスである。「センス」という用語については上述の通りである。
【０１４６】
分化を引き起こす標的遺伝子を下方制御するこの方法において、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してセンスである配列を含む。換言すると、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置する標的遺伝子のコード鎖上の配列と同一である／同一性を有する配列を含む。
【０１４７】
任意選択的に、それに対して標的ＲＮＡ転写物がセンスであるゲノム配列は、標的遺伝子のプロモーター領域の一部を含む。換言すると、任意選択的に、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してセンスであり、かつ標的遺伝子のプロモーター領域の一部を含む配列を含む。この特性を説明する別の方法は、センス標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のプロモーター領域に「重複する」ということである。遺伝子は、複数のプロモーター領域を有し得、その場合、標的ＲＮＡ転写物は、１つ、２つ、またはそれ以上のプロモーター領域と重複し得る。遺伝子のプロモーター領域を同定するために、アノテートされた遺伝子座のオンラインデータベースが用いられてもよい。
【０１４８】
任意の所与のプロモーター領域について、プロモーター領域全体が重複している必要はなく、プロモーター領域内のサブ配列が標的ＲＮＡ転写物によって重複されていれば十分である、すなわち、重複は、部分的な重複であり得る。同様に、標的ＲＮＡ転写物全体がプロモーター領域内の配列に対してセンスである必要はなく、標的ＲＮＡ転写物が、プロモーター領域に対してセンスである配列を含む必要があるだけである。重複の領域については上で定義した通りである。
【０１４９】
好ましくは、ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点を含むゲノム配列に対してセンスである配列を含む。換言すると、好ましくは、標的ＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始点と重複する配列を含む。
【０１５０】
さらなる態様において、本発明は、細胞内の標的遺伝子の発現を調節する短いＲＮＡ分子の設計のためのアルゴリズムであって、
（ｉ）
ａ）標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流までの遺伝子座のいずれかの鎖
ｂ）標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流までの遺伝子座のいずれかの鎖、または
ｃ）標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座のいずれかの鎖、から転写される前記細胞内に存在する潜在的な標的ＲＮＡ転写物の集団を同定するステップと、
（ｉｉ）前記標的遺伝子の上方制御が所望される場合、標的遺伝子に対してアンチセンスであるステップ（ｉ）で同定されるこれらのＲＮＡ転写物を同定するステップ、または前記標的遺伝子の下方制御が所望される場合、標的遺伝子に対してセンスであるステップ（ｉ）で同定されるこれらのＲＮＡ転写物を同定するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で同定されるＲＮＡ転写物から、標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列と重複する配列を含むこれらのＲＮＡ転写物を同定するステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で同定されるセンスまたはアンチセンスの非コードＲＮＡ転写物に相補的な短いＲＮＡ配列を再生するステップと、を含むアルゴリズムを提供する。
【０１５１】
上記アルゴリズムの、そして実際には本発明の全ての態様の重要な特徴は、本発明の短いＲＮＡを有するアンチセンスＲＮＡ転写物を標的とすることが、標的遺伝子の上方制御をもたらす一方で、センスＲＮＡ転写物を標的とすることは、標的遺伝子の下方制御をもたらすということである。
【０１５２】
ステップ（ｉ）における潜在的なＲＮＡ転写物の同定は、当該技術分野で既知であるいずれの方法によって行われてもよい。例えば、潜在的なアンチセンス転写物の同定は、対象となる遺伝子の遺伝子座周辺のゲノム領域で、スプライスされた発現配列タグを検索することによって行うことができる。発現配列タグすなわちＥＳＴは、転写されたｃＤＮＡ配列の短いサブ配列である。ＥＳＴは、遺伝子転写物を同定するために一般的に使用される。ＥＳＴの公的データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースは当該技術分野において既知である。
【０１５３】
そのようなデータベースは、典型的には、標的遺伝子の転写点からの距離という観点からのみならず、それが位置する鎖ならびにその転写の方向および長さの観点からも、ＥＳＴの位置を開示する。したがって、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のいずれも、上記ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）に列挙する要件の全てを満たす標的ＲＮＡ転写物が１つの検索ステップにおいて同定される、組み合わせたステップとして行われてもよい。例えば、
ｉ）
ａ）標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流まで、
ｂ）標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流まで、または
ｃ）標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座に位置し、
ｉｉ）標的遺伝子のコード鎖（センス転写物の同定が所望される場合）または標的遺伝子の鋳型鎖（アンチセンス転写物の同定が所望される場合）のいずれかに存在し、
ｉｉｉ）十分な長さのＲＮＡ分子の転写の開始点をマークし、標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に重複するために必要な方向に転写されるＥＳＴの検索に、ＥＳＴのデータベースが用いられてもよい。
【０１５４】
別途記載のない限り、本発明の方法に関連する上記定義および説明は、本発明のアルゴリズムの態様について準用する。
【０１５５】
上記アルゴリズムのステップ（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）は、いずれの順序で行われてもよい。しかしながら、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｖ）の前に行われなければならない。
【０１５６】
代替として、ＲＮＡを同定するための周知のツールである逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して潜在的な標的ＲＮＡ転写物を同定することもできる。代替として、ハイスループットシーケンシングまたは他のそのような方法を使用して、全ＲＮＡ、サイズ分画されたＲＮＡ、または他の好適なＲＮＡのサブセットを配列決定することができ、そのようなシーケンシングライブラリーを使用して対象となる領域から生じるＲＮＡ転写物を同定する。
【０１５７】
代替として、上記基準を満たす転写物を同定するために、既知のＲＮＡ転写物の集団を検索することもできる。当該技術分野で既知である任意のＲＮＡ転写物のデータベース、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（ＵＣＳＣ）Ｓｐｌｉｃｅｄ  ＥＳＴ  ｔｒａｃｋが使用されてもよい。代替として、集団は、独自の特定の目的のために本発明を研究している当業者が有する集団から調製されてもよい。例えば、標的遺伝子が特定の細胞型において発現されることが分かっている場合、転写物のデータベースは、その細胞型に存在することが分かっている転写物のデータベースであってもよい。当業者は、特定の所望の目的に使用するための集団を決定することができるであろう。
【０１５８】
上記アルゴリズムのステップ（ｉｖ）は、ステップ（ｉｉｉ）で同定されるセンスまたはアンチセンスの非コードＲＮＡ転写物の効果的かつ特異的な下方制御をもたらす短いＲＮＡ分子の設計を必要とする。短いＲＮＡ分子は、上述のいずれかの箇所に定義されるように設計することができる。したがって、上記アルゴリズムは、上述のいずれかの箇所に記載される特性を有する短いＲＮＡ分子の設計または選択を必要とするさらなるステップまたは上記ステップの改良版を含んでもよい。上記考察は、これらのステップを行うために使用することができる、当業者に周知のツールおよび方法について詳述している。好ましくは、上記アルゴリズムは、以下のステップ（ｉｖ）を含む：
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で同定されるセンスまたはアンチセンスの非コードＲＮＡ転写物に相補的であり、かつ、ステップ（ｉｉｉ）で同定されるセンスまたはアンチセンスの非コードＲＮＡ転写物を含む細胞への投与後のハイブリダイゼーションによって、ステップ（ｉｉｉ）で同定されるセンスまたはアンチセンスの非コードＲＮＡ転写物の下方制御を達成する、短いＲＮＡ分子を産生するステップ。
【０１５９】
上記アルゴリズムにおいて同定される標的ＲＮＡ転写物は、上述のいずれかの箇所に定義される通りであり得る。したがって、上記アルゴリズムは、上述のいずれかの箇所に定義される特性を有する標的ＲＮＡ転写物の同定を必要とするさらなるステップまたは上で論じたステップの改良版を有し得る。
【０１６０】
具体的には、好ましくは、上記アルゴリズムは、ステップ（ｉｖ）の前に行われるさらなるステップ（ｉｉｉ）（ａ）を含む：
（ｉｉｉ）（ａ）ステップ（ｉｉｉ）で同定されるＲＮＡ転写物から、標的遺伝子のプロモーター領域の一部または標的遺伝子の転写開始点を含むゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含むものを同定するステップ。
ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｉｉ）（ａ）は、いずれの順序で行われてもよいが、但し、それらは、ステップ（ｉｖ）の前に行われる。
【０１６１】
代替として、上記アルゴリズムは、ステップ（ｉｖ）の前に行われるさらなるステップ（ｉｉｉ）（ａ）'を含む：
（ｉｉｉ）（ａ）'ステップ（ｉｉｉ）で同定されるＲＮＡ転写物から、標的遺伝子のプロモーター領域の一部または標的遺伝子の転写開始点を含むゲノム配列に対してセンスである配列を含むものを同定するステップ。
ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｉｉ）（ａ）は、いずれの順序で行われてもよいが、但し、それらは、ステップ（ｉｖ）の前に行われる。
【０１６２】
上記アルゴリズムにおいて、標的遺伝子は、上述の標的遺伝子のうちのいずれであってもよい。好ましくは、標的遺伝子は、多能性誘導遺伝子であるか、または分化を引き起こす遺伝子であり、より好ましくは多能性誘導遺伝子である。さらにより好ましくは、多能性誘導遺伝子は、ＫＬＦ４、ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４とも称される）、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８からなる群から選択され、より好ましくはＫＬＦ４、ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４とも称される）、ＳＯＸ２、およびＭＹＣからなる群から選択される。最も好ましくは、標的遺伝子はＫＬＦ４である。
【０１６３】
さらなる態様において、本発明は、上に定義されるアルゴリズムを行うことを含む、短いＲＮＡ分子を設計する方法を提供する。
【０１６４】
さらなる態様において、本発明は、上に定義されるアルゴリズムを行うことと、次いで、前記アルゴリズムによって産生されるＲＮＡ分子のうちの１つ以上を合成することとを含む、短いＲＮＡ分子を生成する方法を提供する。
【０１６５】
さらなる態様において、本発明は、細胞内に存在する標的ＲＮＡ転写物を下方制御することによって、前記細胞内の標的遺伝子を特異的に上方制御する短いＲＮＡ分子であって、前記標的遺伝子は、多能性誘導遺伝子であり、前記標的ＲＮＡ転写物は、
ｉ）
ａ）標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流までの遺伝子座のいずれかの鎖、
ｂ）標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流までの遺伝子座のいずれかの鎖、または
ｃ）標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座のいずれかの鎖、から転写され、
ｉｉ）標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む、短いＲＮＡ分子を提供する。
【０１６６】
さらなる態様において、本発明は、細胞内に存在する標的ＲＮＡ転写物を下方制御することによって、前記細胞内の標的遺伝子を特異的に下方制御する短いＲＮＡ分子であって、前記標的遺伝子は、分化を引き起こす遺伝子であり、前記標的ＲＮＡ転写物は、
ｉ）
ａ）標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流までの遺伝子座のいずれかの鎖、
ｂ）標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流までの遺伝子座のいずれかの鎖、または
ｃ）標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座のいずれかの鎖、から転写され、
ｉｉ）標的遺伝子の転写開始点の１００ｋｂ上流から標的遺伝子の転写終了点の１００ｋｂ下流の間に位置するゲノム配列に対してセンスである配列を含む、短いＲＮＡ分子を提供する。
【０１６７】
別途記載のない限り、本発明の方法に関連する上記定義および説明は、本発明の製品の態様について準用する。
【０１６８】
実施例において論じられるように、上記アルゴリズムを使用して、本発明の発明者は、多数の遺伝子の活性を効果的に調節する特定の短いＲＮＡ分子を設計した。したがって、さらなる態様において、本発明は、下の表に示される特定の配列を有する短いＲＮＡ分子を提供する。
【０１６９】
ＫＬＦ４に対する低分子ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）候補の活性化
この表は、アンチセンスＥＳＴ  ＤＢ４６１７５３（ＩＤ：ＤＢ−１およびＤＢ−２）ならびにＫＬＦ４’のプロモーター領域（ＩＤ：Ｐｒ−１およびＰｒ−２）に対する最も有望な２つのｓｉＲＮＡを列挙している。「Ｐｏｓ」は、ＥＳＴまたはＫＬＦ４のプロモーター領域内で始まる標的部位であり、「エクソン」は、標的部位のエクソンの数であり、「センス」は、ｓｉＲＮＡの１９ｍｅｒ標的部位配列を示し、「アンチセンス」は、対応する逆相補的配列を示す。センスおよびアンチセンス配列、ならびにそれらの３’末端の２ｎｔオーバーハング配列（ＵＵ：表には記載せず）が、ｓｉＲＮＡ二重鎖候補を形成する。
【表１】
2013532973.tif 000003
【０１７０】
ＭＹＣ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２に対する低分子ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）候補の活性化
この表は、アンチセンスＥＳＴならびにＭＹＣ、ＰＯＵ５Ｆ１、およびＳＯＸ２のプロモーター領域に対する最も有望な２つのｓｉＲＮＡを列挙している。
【表２】
2013532973.tif 000004
ＢＣＬ２およびＩＬ８に対する低分子ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）候補の活性化
【表３】
2013532973.tif 000005
【０１７１】
本発明は、上記個々の鎖配列を含むかまたはそれらからなる一本鎖ＲＮＡ分子も提供する。
【０１７２】
本発明は、上述のＲＮＡ分子と同等であるＤＮＡ分子も提供する。
【０１７３】
さらなる態様において、本発明は、本発明の短いＲＮＡを含む細胞を提供する。
【０１７４】
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法のうちのいずれか１つによって調製される多能性細胞、およびそのような細胞の治療における使用を提供する。
【０１７５】
さらなる態様において、本発明は、治療に使用するための本発明の短いＲＮＡを提供する。
【０１７６】
さらなる態様において、本発明は、本発明の短いＲＮＡを、それを必要とする患者に投与することを含む、遺伝子療法の方法を提供する。
【０１７７】
本発明は、患者における多能性細胞または多分化能細胞の欠損に関連する疾患の治療に使用するための本発明の短いＲＮＡを提供する。
【０１７８】
任意選択的に、本発明は、多能性細胞または多分化能細胞が欠損している患者の造血系の再生に使用するための本発明の短いＲＮＡを提供する。
【０１７９】
本発明の短いＲＮＡ分子は、再生または修復の方法を含む治療方法に直接使用されてもよい。任意選択的に、再生または修復は、損傷した器官の再生または修復である。代替として、再生または修復は、それ自体は「損傷」を受けていないが、正常な様式で発達しなかった器官の再生または修復であってもよい。したがって、「再生」は、器官の成長または改善の全ての方法を含むよう、広義に解釈されるべきである。
【０１８０】
本発明の短いＲＮＡは、当該技術分野において既知である任意の手段または送達ビヒクルによって、例えば、ナノ粒子、陽イオン性脂質、ポリマー、デンドリマー、アプタマー、または抗体ｓｉＲＮＡ複合体、ｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ模倣体を発現させるウイルスベクターによって、それを必要とする患者に投与することができる。
【０１８１】
例えば、出版物および特許を含む種々の文書が、本開示を通して引用されている。全てのそのような文書は、関連部分において、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる所与の文書の引用も、それが本発明に対する先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきではない。この文書における用語のいずれかの意味または定義が、参照によって組み込まれる文献における用語のいずれかの意味または定義と対立する範囲については、本文書におけるその用語に割り当てられた意味または定義が優先するものとする。
【０１８２】
本発明において用いられる種々の成分を含む構成要素に関する商品名が本明細書に言及される。本発明者は、特定の商品名の材料によって制限されることを意図しない。商品名によって言及されるものの均等の材料（例えば、異なる名称または参照番号の異なる源から得られるもの）が、本明細書の説明において置き換えられてもよく、また用いられてもよい。
【０１８３】
特徴および実施形態が相互排他的である場合、そのように行うことが不可能である場合、またはそのように行うことが本発明の目的と矛盾する場合を除いて、上に開示する本発明の任意選択的および好ましい特徴および実施形態は、単独で、または任意の数および任意の組み合わせで用いられてもよいことが明確に意図される。
【０１８４】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図するものであり、当業者に本発明を作製および使用することを教示することを意図するものである。これらの実施例は、いかなる様式においても本発明を制限することは意図されない。次に、以下の実施例および図面において、本発明について詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】ＫＬＦ４遺伝子座および潜在的なアンチセンス標的候補を示す略図。この図は、ＫＬＦ４のゲノム位置、ＫＬＦ４転写物の構造、および周辺領域からスプライシングされたＥＳＴを示す（画像はＵＣＳＣゲノムブラウザから抜粋）。赤い四角は、ＫＬＦ４のプロモーター領域およびＫＬＦ４（ＤＢ４６１７５３）上流の最も近いアンチセンスＥＳＴを囲んでいる。アンチセンスＥＳＴ  ＤＢ４６１７５３は、ＫＬＦ４の転写開始点（ＴＳＳ）の約１５ｋｂから始まり、２５ｋｂよりも遠くて終端する。赤い矢印は、低分子ＲＮＡ候補の潜在的な標的部位を示す。
【図２】ＭＹＣ遺伝子座および潜在的なアンチセンス標的候補を示す略図。この図は、ＭＹＣのゲノム位置、ＭＹＣ転写物の構造、および周辺領域からスプライシングされたＥＳＴを示す（画像はＵＣＳＣゲノムブラウザから抜粋）。赤い四角は、ＭＹＣのプロモーター領域およびＭＹＣ（ＢＣ０４２０５２）上流の最も近いアンチセンス転写物を囲んでいる。アンチセンスｎｃＲＮＡ遺伝子ＢＣ０４２０５２は、ＭＹＣの約２０００ｎｔ上流に位置する。赤い矢印は、低分子ＲＮＡ候補の潜在的な標的部位を示す。
【図３】ＫＬＦ４の短い活性化ＲＮＡが、Ｃｄ３４＋細胞（ＯｍｎｉＣｙｔｅ）の急速およびさらなる増殖をもたらすことを示す。（Ａ）Ｃｄ３４＋細胞をＫＬＦ４の短い活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）または対照細胞で処理し、細胞増殖を２８日間モニタリングした。４つのｓａＲＮＡのうち３つが、対照で処理した細胞と比較して細胞数を増加させ、ＤＢ−１  ｓａＲＮＡが最も急速な細胞増殖を示した。（ｂ−ｃ）（Ｂ）ＲＴ−ＰＣＲまたは（Ｃ）免疫ブロットによって測定された、トランスフェクションから７２時間後のＤＢ−２で処理した細胞におけるＮａｎｏｇ発現レベル。（Ｄ）ｓａＲＮＡは、ＫＬＦ４の発現を誘導する。ＫＬＦ４の発現は、処理後４８時間および７２時間に、ｓａＲＮＡまたは対照を用いて処理した細胞においてＲＴ−ＰＣＲにより測定した（上および下）。７２時間後、全てのｓａＲＮＡが、対照と比較してＫＬＦ４の発現の増加をもたらし、ＤＢ−２が、最も高いＫＬＦ４の発現を示した。
【図４】対照で処理した細胞と比較して、ＣＤ３４＋細胞におけるＫｌｆ４  ｓｉＲＮＡ処理後に（Ａ）Ｋｌｆ４および（Ｂ）Ｓｏｘ２の発現の増加を示すＫｌｆ４で処理した細胞のｑＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【図５】対照で処理した細胞と比較して、ｃ−Ｍｙｃ活性化オリゴで処理したＭＳＣにおけるＭｙｃの発現を示す。
【図６】対照で処理した細胞と比較して、ＫＬＦ４活性化オリゴ候補で処理したＭＳＣにおけるＫＬＦ４の発現を示す。この場合、間葉系幹細胞の培地に、８日間毎日オリゴを添加した。活性化効果は、他のオリゴの場合よりも機能性オリゴＰＲ−１の場合に持続され、ＫＬＦ４−ＰＲ１が、ＭＳＣ内でＫＬＦ４を上方制御することが裏付けられる。
【図７】対照で処理した細胞と比較して、Ｋｌｆ活性化オリゴ候補がＭＳＣ内のＫｌｆ４の発現に与える影響を示す。
【図８】対照で処理した細胞と比較して、ＭＳＣを優秀なＫｌｆ４活性化オリゴであるＫｌｆ４−ＰＲ１に曝露した場合のＮａｎｏｇのＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示す。これは、Ｋｌｆ４の活性化が、下流遺伝子の転写に影響を与えることを示している。Ｍｙｃは、２．５倍上方制御され（図７）、Ｎａｎｏｇは、３００倍上方制御された。
【図９】ＫＬＦ４を標的とするＰＲ１  ｓａＲＮＡオリゴを用いた処理後に、ｈＭＳＣのタンパク質レベルにＫＬＦ４による上方制御がウエスタンブロットによって確認されたことを示す。左側のパネルは、ＫＬＦ４（左上のパネル）、βアクチン（左中央のパネル、各レーンにおける等しい付加を確認するため）、またはｃ−Ｍｙｃに対する抗体でプローブしたウエスタンブロットを示す。レーン：対照＝スクランブル配列対照ＲＮＡオリゴで処理した陰性対照ＭＳＣ、ＰＲ１：ＰＲ１  ｓａＲＮＡオリゴで処理したＭＳＣ、ウイルス：ＣＭＶプロモーターによって誘導された、外来性ＫＬＦ４導入遺伝子を発現するレンチウイルスベクターで処理した陽性対照ＭＳＣ。ＰＲ１レーンにおいて、ＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣのタンパク質レベルに明らかな上方制御が見られ、ウイルス（陽性対照）レーンではＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣレベルにわずかな減少が見られた。右側のパネルは、ウエスタンブロットのバンド強度の発光検出による定量化を示す。Ｙ軸は、対照（スクランブル配列オリゴ、１として設定）に対する倍増の観点からの相対バンド強度を表す。
【図１０】ＭＳＣを優秀なＫｌｆ４活性化オリゴＫｌｆ４−ＰＲ１に曝露した後８日目の、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびｃ−ＭｙｃのｍＲＮＡ発現レベルについてのＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示す。この結果は、ＰＲ１オリゴによるＫｌｆ４の活性化も、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＭｙｃの活性化を引き起こすことを示している。
【図１１】８日目に、異なる用量のＫｌｆ活性化オリゴ候補がＭＳＣ内のＫｌｆ４の発現に与える影響、およびｃ−Ｍｙｃ活性化オリゴがＭＳＣ内のｃ−Ｍｙｃの発現に与える影響を示すＲＴ−ｑＰＣＲの結果の結果を示す。調べたオリゴの用量（５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ）を各グラフに示す。
【図１２】ｃ−ＭｙｃオリゴＰＲ１またはＰＲ２と組み合わせたＫｌｆ４オリゴＰＲ１で処理した後、８日目のＭＳＣにおける影響を示すＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示す。ｃ−Ｍｙｃの活性化は、ｃ−Ｍｙｃオリゴ単独よりもＫｌｆ４オリゴと組み合わせた場合に高いようである。
【図１３】Ａ）ＨｅｐＧ２細胞における、ＢＣＬ２を標的とするｓａＲＮＡ  ＰＲ１、ＰＲ２、ＰＲ３、およびＰＲ４によるトランスフェクションの影響を示すＲＴ−ｑＰＣＴの結果、Ｂ）Ｏｍｎｉｃｙｔｅにおける、ＢＣＬ２を標的とするｓａＲＮＡ  ＰＲ１、ＰＲ２、ＰＲ３、およびＰＲ４によるトランスフェクションの影響を示すＲＴ−ｑＰＣＴの結果、Ｃ）ＨｅｐＧ２細胞における、ＩＬ８を標的とするｓａＲＮＡ  ＰＲ１、ＰＲ２、およびＰＲ３によるトランスフェクションの影響を示すＲＴ−ｑＰＣＴの結果、Ｄ）Ｏｍｎｉｃｙｔｅにおける、ＩＬ８を標的とするｓａＲＮＡ  ＰＲ１によるトランスフェクションの影響を示すＲＴ−ｑＰＣＴの結果を示す。
【図１４】Ａ）本発明の設計法のステップａ）〜ｃ）を概説するフロー図、Ｂ）本発明の設計法のステップｃ）およびｉｉ）の任意選択的な追加のステップを概説するフロー図を示す。
【図１５】Ａ）本発明の設計法のコンピュータによる実施における回路の配置、Ｂ）好ましい本発明の設計法を概説するフロー図を示す。
【実施例】
【０１８６】
【実施例１】
【０１８７】
概要
この試験の目的は、短いＲＮＡの付加による非遺伝的手法を使用することによって、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇ等の多能性遺伝子の発現を上方制御することができるかどうかを確認することであった。Ｋｌｆ４［他の多能性因子の発現を制御する主要制御因子］およびＭｙｃタンパク質を上方制御するための合成オリゴを設計し、それらがＣＤ３４＋造血幹細胞および間葉系幹細胞に与える影響について調べた。
【０１８８】
ＥＳＴ領域においてアンチセンスを標的とするＤＢ１およびＤＢ２、ならびにＫｌｆ４遺伝子のプロモーター領域においてアンチセンス配列を標的とするＰＲ１およびＰＲ２の４つの構築物を設計した。
【０１８９】
造血性ＣＤ３４＋細胞において、Ｋｌｆ４活性化オリゴは、ＤＢ１およびＤＢ２構築物を有するＫｌｆ４の発現の増加をもたらした。これは、細胞増殖の増加と関連していた。別の構築物であるＫｌｆ４−ＰＲ２構築物は、Ｓｏｘ２遺伝子産物の発現の増加をもたらした。間葉系幹細胞において、Ｍｙｃ活性化オリゴＰＲ１およびＰＲ２が、ｃ−ｍｙｃの上方制御をもたらした。同様に、Ｋｌｆ４−ＰＲ１活性化オリゴが、Ｋｌｆ４タンパク質およびＫｌｆ４調節遺伝子ｃ−ｍｙｃおよびｎａｎｏｇの上方制御をもたらした。
結論として、一本鎖および二本鎖オリゴは、成人骨髄由来幹細胞において多能性遺伝子の上方制御をもたらすことができ、これは、実用的用途を有し得る。
【０１９０】
材料および方法
細胞増殖曲線
骨髄由来の造血性ＣＤ３４+幹細胞をＧｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４（７）：１８２２−３０に従って培養した。簡潔に述べると、ＣＤ３４+単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、骨髄由来ＣＤ３４+細胞を単核細胞細胞から単離した。増殖曲線分析のために、個々のＫＬＦ４オリゴヌクレオチド（１００ｎＭ）を用いて、製造者のプロトコル（ＰＡＡ  Ｌｔｄ）に従ってナノフェクタミン（Ｎａｎｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）試薬を使用して細胞（１ｘ１０5）をトランスフェクトした。調べたＫＬＦ４オリゴヌクレオチドは、ＫＬＦ４＿ＤＢ−１、ＫＬＦ４＿ＤＢ−２、ＫＬＦ４＿Ｐｒ−１、およびＫＬＦ４＿Ｐｒ−１であった。７日ごとに２８日間、細胞をトランスフェクトした。週に１度、合計生細胞を数え、新鮮な培地と交換した。
【０１９１】
間葉系幹細胞［ＭＳＣ］については、全ての実験において、１日目に複製ウェルに２０，０００個のＭＳＣ（Ｋｌｆ４のテストには継代Ｐ８、ｃ−Ｍｙｃには継代Ｐ５）を播種し、０、２、４、および６日目に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸを使用して各ウェルを５０ｎＭの候補オリゴでトランスフェクトした。細胞を溶解し、２、４、６、および８日目にＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙキットを使用してＲＮＡを単離した。ＡＢＩ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡキットを使用してｃＤＮＡを産生させるための逆転写を行い、ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いたｑＰＣＲによりサンプルを増幅した（全て、製造者の標準プロトコルに従った）。内部標準としてβアクチンを使用し、相対定量法によりスクランブル配列対照オリゴにサンプルを標準化した。ＲＱが＞３００ｘであったため、Ｋｌｆ４オリゴによるＮａｎｏｇの活性化をｌｏｇスケール上に示す。
【０１９２】
ウエスタンブロット
ウエスタンブロット分析のために、製造者（ＰＡＡ）の推奨に従ってナノフェクタミン試薬を使用して、ＫＬＦ４＿ＤＢ−２オリゴヌクレオチドを１ｘ１０5細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間および７２時間後に、全タンパク質溶解物を溶解バッファ（ＰＢＳ中の１％ＮＰ−４０および１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）中に収集した。７２時間で回収したＲＮＡは、ＫＬＦ４＿ＤＢ−２オリゴヌクレオチドのトランスフェクションを２回連続して受けた。タンパク質ＤＣアッセイ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いてタンパク質濃度を測定した。約１００ｕｇのタンパク質を付加し、Ｎｏｖｅｘ４−２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分解した。ゲル電気泳動によりタンパク質を分離し、半乾性ブロッティング装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してニトロセルロース膜上に移した。５％脱脂乳を含むＴＢＳ中で１時間膜をブロックしてから、室温で１時間、一次抗体でインキュベートした。１：２００希釈のＫＬＦ４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１：２００希釈のＮａｎｏｇ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、１：５００希釈のアクチン（Ｓｉｇｍａ）に対する一次抗体を用いてブロットをプローブした後、１：５０００希釈の適切な二次複合化アルカリホスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いた。数回洗浄した後、ＢＣＩＰ／ＮＴＢ試薬（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いてブロットを検出した。Ｇｅｌｄｏｃシステム（ＵＶＰ）を使用してブロットを撮像した。
【０１９３】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＫＬＦ４＿ＤＢ−２オリゴヌクレオチドを１ｘ１０5細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間および７２時間後に全ＲＮＡを回収した。７２時間で単離したＲＮＡは、オリゴヌクレオチドのトランスフェクションを２回連続して受けた。
製造者の推奨に従ってＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−Ｍｉｃｒｏキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して全ＲＮＡを回収した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００微量サンプル定量装置を使用してＲＮＡを定量化した。製造者の推奨に従ってＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して各サンプルから約２００ｎｇの全ＲＮＡを逆転写した。９４°Ｃで４５秒、５５°Ｃで４５秒、および７２°Ｃで４５秒の３２周期でプライマー対（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＰＣＲにより、ヒトＮａｎｏｇの発現を半定量的に測定した。９４°Ｃで４５秒、６０°Ｃで４５秒、および７２°Ｃ秒で１分間の３６周期で、ＧＡＰＤＨプライマー、順方向（５’ＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧ３’）および逆方向（５’ＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＴＣ３’）をローディングコントロールとして用いた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分析し、Ｇｅｌｄｏｃシステム（ＵＶＰ）を使用して撮像した。
【０１９４】
結果
ＫＬＦ４の発現を活性化するための短いＲＮＡの設計
ＫＬＦ４は、９番染色体（９ｑ３１．２）の長腕のサブバンド２であるバンド３１に位置する。ＫＬＦ４基準配列ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００４２３５）は、５つのエクソンからなり、ヌクレオチド１０９，２８６，９５４〜１０９，２９１，８６８（ヒトゲノムアセンブリバージョンｈｇ１８；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（ＵＣＳＣ）ゲノムブラウザ、図１）の９番染色体の陰性鎖から転写される。
【０１９５】
ＫＬＦ４の遺伝子座から潜在的なアンチセンス転写物を同定するために、ＫＬＦ４を取り囲むゲノム領域で、陽性鎖にマッピングしたスプライシングされた発現配列タグ（ＥＳＴ）を検索した。通常、ＥＳＴの転写配向を決定することは困難であるが、スプライシングされたＥＳＴのスプライシング部位の特徴を用いて配向を決定することができる。ＫＬＦ４と重複するスプライシングされたＥＳＴは見られなかったが、走査によりＫＬＦ４のアノテートされた転写開始点（ＴＳＳ）の約１５ｋｂ上流に１つのアンチセンスＥＳＴ（ＤＢ４６１７５３）が同定された。したがって、このＥＳＴを標的候補として選択した。
【０１９６】
また、ＫＬＦ４のプロモーター領域からの潜在的なアンチセンス転写物を標的とする短い活性化ＲＮＡを設計することも決定された。より具体的には、ＫＬＦ４のＴＳＳから５００ｎｔ上流および下流のアンチセンス配列（ＫＬＦ４＿ＡＳ＿ＴＳＳ＋／−５００と略される）を第２の標的候補として用いた。
【０１９７】
目的は、２つの候補配列を下方制御するための短いＲＮＡを設計することであった。候補の短いＲＮＡは、標的配列の効果的な阻害をもたらすべきであり、また理想的には、潜在的なオフターゲット効果が最小限に抑えられるように、可能な限り特異的であるべきである。したがって、ＧＰｂｏｏｓｔ  ｓｉＲＮＡの設計アルゴリズムを使用して、２つの候補配列を下方制御するための潜在的な短いＲＮＡを同定した。予測されるｓｉＲＮＡ候補のリストから、アンチセンスＥＳＴ  ＤＢ４６１７５３の第２のエクソン中の最も有望な２つの非重複ｓｉＲＮＡ標的部位と、アンチセンスプロモーター配列中のＫＬＦ４  ＴＳＳ（ＫＬＦ４＿ＡＳ＿ＴＳＳ＋／−５００）の各側の最も有望なｓｉＲＮＡ標的部位を選択した。ＧＰｂｏｏｓｔから予測される有効性スコア、配列モチーフａａａａ、ｃｃｃｃ、ｇｇｇｇ、およびｔｔｔｔが存在しないこと、２０％〜５５％の中間的なＧＣ含有量、ならびに少なくとも２つ〜全ての潜在的なオフターゲット転写物のハミング距離に基づいて、候補ｓｉＲＮＡを選択した。表４は、ＫＬＦ４の発現を活性化するために得られた候補の短いＲＮＡを示す。この表は、短いＲＮＡ二重鎖の両方の鎖を示しているが、活性化ＲＮＡは、一本鎖オリゴ（ＰＭＩＤ：１２２３０９７４）として投与されてもよい。
【０１９８】
ＫＬＦ４に対する低分子ＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）候補の活性化
この表は、アンチセンスＥＳＴ  ＤＢ４６１７５３（ＩＤ：ＤＢ−１およびＤＢ−２）ならびにＫＬＦ４のプロモーター領域（ＩＤ：Ｐｒ−１およびＰｒ−２）に対する最も有望な２つのｓｉＲＮＡを列挙している。「Ｐｏｓ」は、ＥＳＴまたはＫＬＦ４のプロモーター領域内で始まる標的部位であり、「エクソン」は、標的部位のエクソンの数であり、「センス」は、ｓｉＲＮＡの１９ｍｅｒ標的部位配列を示し、「アンチセンス」は、対応する逆相補的配列を示す。センスおよびアンチセンス配列、ならびにそれらの３’末端の２ｎｔオーバーハング配列（ＵＵ：表には記載せず）が、ｓｉＲＮＡ二重鎖候補を形成する。
【表４】
2013532973.tif 000006
【０１９９】
候補の短いＲＮＡは、ＣＤ３４＋細胞におけるＫＬＦ４の発現を活性化する
Ｃｄ３４＋を異なるＫｌｆ４活性化オリゴ［ＤＢ１、ＤＢ２、ＰＲ１、およびＰＲ２］で処理した。Ｋｌｆ４−ＤＢ１は、強い増殖効果を有するようである［図３］。ＤＢ１およびＤＢ２は、細胞内で最も高いＫｌｆ４の発現を有する［図４ａ］。ＰＲ２、ＤＢ１、およびＰＲ１は、Ｓｏｘ２の発現の増加を示す［図４ｂ］。
【０２００】
候補の短いＲＮＡは、間葉系幹細胞におけるＫＬＦ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびｎａｎｏｇの発現を活性化する
ＫＬＦ４と同じ手法を用いて、再プログラミング因子ＭＹＣ、ＰＯＵ５Ｆ１、およびＳＯＸ２を活性化するためのオリゴを設計した（表５）。ＭＳＣをｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４活性化オリゴで処理した。図５は、ｃ−ｍｙｃ活性化オリゴ投与後のｃ−ｍｙｃの発現を示す。ＰＲ１およびＰＲ２オリゴを用いると最も高い効果が観察された。図６、７、および８は、ｋｌｆ４活性化オリゴによるＫｌｆ４、ｃ−ｍｙｃ、およびｎａｎｏｇの発現を示す。Ｋｌｆ４−ＰＲ１オリゴは、Ｋｌｆ４およびその下流遺伝子［ｃ−ｍｙｃおよびｎａｎｏｇ］の最も高い発現を引き起こすことが示された。
【０２０１】
ＭＹＣ、ＰＯＵ５Ｆ１、およびＳＯＸ２に対する低分子ＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）候補の 活性化
この表は、アンチセンスＥＳＴならびにＭＹＣ、ＰＯＵ５Ｆ１、およびＳＯＸ２のプロモーター領域に対する最も有望な２つのｓｉＲＮＡを列挙している。
【表５】
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【０２０２】
考察
図面に示し、図面の説明において論じてきたように、標的遺伝子に対してアンチセンスな配列を含むＲＮＡ転写物を標的とする短いＲＮＡは、機能的であり、標的の強い上方制御をもたらすことが示された。具体的には、標的遺伝子のプロモーター領域に対してアンチセンスである配列を含むＲＮＡ転写物を標的とするこれらの短いＲＮＡが、最も効果的であった。
【０２０３】
短いＲＮＡの機能は、特定の標的細胞型に依存し得る、すなわち、予想されたように、短いＲＮＡ分子が効果を有するためには、接触される細胞内に標的ＲＮＡ転写物が存在することが必要である可能性がある。示したように、ＫＬＦ４のＲＮＡ  ＤＢ−１およびＤＢ−２等の短いＲＮＡは、ＯｍｎｉＣｙｔｅにおいてＫＬＦ４の強い上方制御を示したが、ＭＳＣにおける効果は低かった。これは、標的転写物が細胞型特異的発現を有することによる可能性が高い。またこの結果は、ＫＬＦ４を上方制御する短いＲＮＡも、ＫＬＦ４の下流標的Ｎａｎｏｇおよびｃ−Ｍｙｃの上方制御をもたらすことを示している。これは、ＫＬＦ４がＮａｎｏｇおよびｃ−Ｍｙｃを転写的に制御し、意図される活性化ＲＮＡの機能を示す、確立されたモデルによるものである。
【実施例２】
【０２０４】
ａ）転写開始点の５００ヌクレオチド上流から転写開始点の５００ヌクレオチド下流の領域において標的遺伝子の配列を得ること、ｂ）ステップａ）の配列に対する逆相補的ＲＮＡ配列を決定すること、およびｃ）ｂ）で決定される配列の領域に対して相補的なｓａＲＮＡを設計することによる本発明の方法に従って、以下のｓａＲＮＡ分子を設計した。
ＢＣＬ２およびＩＬ８に対する低分子ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）候補の活性化
【表６】
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【０２０５】
ｓａＲＮＡ分子を生成し、Ｏｍｎｉｃｙｔｅまたは体細胞（ＨｅｐＧ２およびＳＨＳＹ５Ｙ）のいずれかにトランスフェクトした。ＲＴ−ＰＣＲにより標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを定量化することによって、標的遺伝子の発現における影響を評価した。
ｓａＲＮＡオリゴヌクレオチドのトランスフェクション
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いてｓａＲＮＡオリゴヌクレオチド対（上の表６に示すセンスおよびアンチセンス）を最初にアニールし、その後、９０°Ｃでの変性ステップ、そしてその後、室温までの漸進的なアニーリングステップを行った。次いで、製造者の指示に従ってナノフェクタミン（ＰＡＡ、ＵＫ）を使用して、１５０ｎｇの対合ｓａＲＮＡを細胞にトランスフェクトした。次いで、トランスフェクションから２４時間後に、ｒｔＰＣＲ分析のために細胞を回収した。
【０２０６】
半定量的ｒｔＰＣＲのための全ＲＮＡの単離
製造者の指示に従ってＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−Ｍｉｃｒｏキット（Ａｍｂｉｏｎ，ＵＫ）を使用して、全ての全ＲＮＡ抽出を行った。簡潔に述べると、細胞を穏やかに遠心分離した後、溶解バッファ（Ａｍｂｉｏｎ，ＵＫ）中、出力３で３パルスの超音波処理を行った。次いで、ＲＮＡ結合カラムを通して細胞溶解物をプロセスした後、複数回洗浄および溶出した。単離した全ＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ２０００分光光度計により定量化した。製造者の指示に従ってＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、５００ｎｇの全ＲＮＡを逆転写した。それぞれのプライマー対を使用した逆転写ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）により標的遺伝子の発現を行った。ｍＲＮＡレベルをハウスキーピング遺伝子アクチンと比較して比較して表す。
【０２０７】
結果
その結果を図１３に示す。ｓａＲＮＡでトランスフェクトした細胞のｍＲＮＡプロファイルは、対照と比較して標的ｍＲＮＡ転写物が増加したことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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