(57)【要約】  本発明は、アイソQC関連疾患に関連するトランスジェニック非ヒト動物、特にアイソQCをコードするトランスジェニックマウスを提供する。本発明は、アイソQCをコードする導入遺伝子を含む細胞及び細胞株を更に提供する。本発明は、アイソQC関連疾患の治療のための組成物における使用のための、アイソQCに影響を及ぼす作用物質を評価するための方法及び組成物を更に提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アイソQCを過剰発現させるためのトランスジェニック非ヒト動物であって、ヒトアイソQCをコードするDNA導入遺伝子を含む細胞を含み、該ヒトアイソQCが、配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1のアミノ酸配列に少なくとも75% 配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号1のアミノ酸配列の断片若しくは誘導体を含むことを特徴とする、前記トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
前記ヒトアイソQCが、配列番号1のアミノ酸配列からなる、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
前記DNA導入遺伝子が、配列番号2のヌクレオチド配列、又は配列番号2に実質的に同じヌクレオチド配列を含む、請求項1又は2記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
前記DNA導入遺伝子が、配列番号2のヌクレオチド配列からなる、請求項１又は2記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
導入遺伝子についてヘテロ接合型である、請求項1〜4のいずれか1項記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６】
導入遺伝子についてホモ接合型である、請求項1〜4のいずれか1項記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７】
マウスである、請求項1〜6のいずれか1項記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８】
前記導入遺伝子が組織特異的プロモータに機能的に連結されている、請求項1〜7のいずれか1項記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
インビボでアイソQC産生を阻害又は促進する生体活性物質のスクリーニング方法であって：
試験作用物質を、請求項1〜8のいずれか1項記載のトランスジェニック非ヒト動物に投与すること；及び、
産生されたアイソQCの量における該作用物質の効果を測定すること；を含む、前記方法。
【請求項１０】
請求項1〜8のいずれか1項記載のトランスジェニック非ヒト動物に由来する細胞又は細胞株。
【請求項１１】
トランスジェニックマウスであって、配列番号2のヌクレオチド配列又は配列番号2に実質的に同じヌクレオチド配列を含み、プロモータに機能的に連結され、該マウスのゲノムに組み込まれているアイソQCをコードするトランスジェニックヌクレオチド配列を含み、アイソQC阻害剤により逆転又は改善できる表現型を示す、前記トランスジェニックマウス。
【請求項１２】
アイソQC活性を阻害又は促進する治療剤のスクリーニング方法であって：
(a)試験作用物質を、請求項11記載のトランスジェニックマウスに投与すること；
(b)該マウスの神経学的表現型における該試験作用物質の効果を評価すること；及び、
(c)アイソQC活性を阻害又は促進する試験作用物質を選択すること；を含む、前記方法。
【請求項１３】
QC関連疾患の治療又は予防の方法であって：
(a)請求項12の選択された試験作用物質を投与すること；及び、
(b)QC関連疾患の臨床指数の減少について患者をモニタすること；を含む、前記方法。
【請求項１４】
アイソQCの生理機能の調査方法であって：
(a)請求項1〜8のいずれか1項記載のアイソQCトランスジェニック非ヒト動物を、所望の疾患に特異的である非ヒト動物モデルと交雑すること；
(b)該交雑動物及び該疾患特異的動物を繁殖及び加齢させること；
(c)該交雑動物における齢依存的疾患状態をモニタすること；
(d)対照群として、アイソQCについてトランスジェニックでない疾患特異的動物モデルにおける齢依存的疾患状態をモニタすること；
(e)該交雑動物対該疾患特異的動物の疾患状態における差異を算出すること；及び、
(f)該疾患状態におけるアイソQC導入遺伝子の効果を測定すること；を含む、前記方法。
【請求項１５】
アイソQCの活性を減少させるエフェクタのスクリーニング方法であって：
(a)請求項1〜8のいずれか1項記載のアイソQCトランスジェニック非ヒト動物を、所望の疾患に特異的である非ヒト動物モデルと交雑すること；
(b)試験作用物質を、交雑動物の治療群に投与すること；
(c)プラセボを、交雑動物の対照群に投与すること；
(d)該治療群における齢依存的疾患状態をモニタすること；
(e)該対照群における齢依存的疾患状態をモニタすること；
(f)該治療群対該対照群の疾患状態における差異を算出すること；及び、
(g)該疾患状態における該試験作用物質の効果を測定すること；を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記交雑動物が、アイソQC導入遺伝子についてヘテロ接合型である、請求項14又は15記載の方法。
【請求項１７】
前記交雑動物が、アイソQC導入遺伝子についてホモ接合型である、請求項14又は15記載の方法。
【請求項１８】
前記交雑非ヒト動物において過剰発現する組換えアイソQCが、前記疾患状態において、前記特異的疾患の初期の発生、前記特異的疾患の経過促進、及び/又は前記特異的疾患のより重篤な経過のうちの１以上の効果をもたらす、請求項14〜17のいずれか1項記載の方法。
【請求項１９】
前記組換えアイソQCが、前記交雑非ヒト動物における1以上のアイソQC基質のレベルの増加又は減少をもたらす、請求項14〜18のいずれか1項記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患特異的動物モデルが、PDAPP、Tg2576、APP23、TgCRND8、PSEN1M146V又はPSEN1M146L、PSAPP、APPDutch、BRI-Aβ40及びBRI-Aβ42、JNPL3、TauP301S、TauV337M、TauR406W、rTg4510、Htau、TAPP、並びに3×TgADから選択される、請求項14〜19のいずれか1項記載の方法。
【請求項２１】
前記アイソQC基質が、[Glu3]Aβ3-40/42/43又は[Glu11]Aβ11-40/42/43から選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患特異的動物モデルがapoE欠損マウスである、請求項14〜19のいずれか1項記載の方法。
【請求項２３】
前記アイソQC基質が、CCL2、CCL8、CCL7、CCL13、CCL 16及びCCL 18から選択されるケモカインである、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
請求項12〜23のいずれか1項記載に定義された選択された試験作用物質を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
軽度認知障害、アルツハイマー病、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、ダウン症候群における神経変性、ハンチントン舞踏病、ケネディ病、潰瘍疾患、ヘリコバクターピロリ感染を伴う又は伴わない十二指腸癌、結腸直腸癌、Zolliger-Ellison症候群、ヘリコバクターピロリ感染を伴う又は伴わない胃癌、病原性精神病状態、精神分裂症、不妊性、新形成、炎症性宿主反応、癌、悪性転移、黒色腫、乾癬、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、膵臓炎、再狭窄、肺線維症、肝線維症、腎線維症、移植片拒絶、後天性免疫不全症候群、体液性及び細胞性免疫応答欠損、内皮における白血球接着及び遊走プロセス、摂食行動障害、睡眠-覚醒障害、エネルギー代謝のホメオスタシス制御障害、自律神経機能障害、ホルモンバランス障害又は体液の制御障害、多発性硬化症、ギランバレー症候群、及び慢性炎症性脱ミエリン化多発神経根筋障害から選択される疾患などのアイソQC関連疾患の治療及び／又は予防における使用のための請求項12〜24のいずれか1項に定義される試験作用物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の技術分野）
本発明は、全般的に、アイソQC（isoQC）関連障害、特にアルツハイマー型障害をスクリーニング及び治療するためのトランスジェニック動物並びに方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（本発明の背景）
グルタミニルシクラーゼ(QC、EC 2.3.2.5；Qpct；グルタミニルペプチドシクロトランスフェラーゼ)は、遊離アンモニア下でのN末端グルタミン残基のピログルタミン酸(5-オキソ-プロリン、pGlu*)への分子内環化、及び遊離水下でのN末端グルタミン酸残基のピログルタミン酸への分子内環化を触媒する。
【０００３】
QCは、Messerにより、1963年に熱帯植物カリカパパイヤのラテックスから最初に単離された(Messer, M.の文献 1963 Nature 4874、1299)。24年後、対応する酵素活性が、動物の下垂体において発見された(Busby, W. H. J.らの文献 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H.及びSpiess, J.の文献 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 3628-3632)。哺乳動物QCについては、QCによるGlnのpGluへの変換が、TRH及びGnRHの前駆体について示され得る(Busby, W. H. J.らの文献 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H.及びSpiess, J.の文献 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 3628-3632)。更に、QCの最初の局在実験は、ウシ下垂体における触媒のその推定的生成物との共局在を示し、これは、ペプチドホルモン合成において示唆されていた機能を更に向上させた(Bockers, T. M.らの文献 1995 J Neuroendocrinol 7, 445-453)。対照的に、植物のQCの生理機能は、比較的明らかでない。C.パパイヤ由来の酵素の場合において、病原微生物に対する植物の防御における役割が示唆された(El Moussaoui、A.らの文献2001 Cell Mol Life Sci 58、556-570)。他の植物由来の推定的QCは、シーケンス比較により、最近同定された(Dahl、S. W.らの文献2000 Protein Expr Purif 20、27-36)。しかしながら、これらの酵素の生理機能は、未だ曖昧である。
【０００４】
動植物由来の公知のQCは、基質のN末端位置のL-グルタミンに厳格な特異性を示し、それらの動力学的挙動がミカエリス-メンテンの式に従うということがわかった(Pohl, T.らの文献 1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88, 10059-10063; Consalvo, A. P.らの文献 1988 Anal Biochem 175, 131-138; Gololobov, M. Y.らの文献 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377, 395-398)。しかしながら、C.パパイヤ由来のQCの一次構造及び哺乳動物由来の高度に保存されたQCの一次構造の比較には、配列相同性が全くみられなかった(Dahl, S. W.らの文献 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36)。植物のQCが新しい酵素ファミリーに属するようであるのに対し(Dahl, S. W.らの文献 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36)、哺乳動物QCは細菌性アミノペプチダーゼに顕著な配列相同性を有することが見出され(Bateman, R. C.らの文献 2001 Biochemistry 40, 11246-11250)、これは、結果として動植物由来のQCが異なる進化的起源を有するという結論をもたらした。
【０００５】
EP 02 011 349.4は、昆虫グルタミニルシクラーゼをコードするポリヌクレオチド、並びにこれによりコードされるポリペチドを開示する。この出願書類は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を更に提供する。昆虫QCを含む単離されたポリペチド及び宿主細胞は、グルタミニルシクラーゼ活性を減少させる作用物質の選別法に有用である。当該作用物質は、農薬としても有用であることが記載されている。
【０００６】
本発明の主題は、アイソQC関連疾患(その1例はアルツハイマー病である) の分野において特に有用である。アルツハイマー病(AD)は、ジストロフィー型ニューロン、反応性星状細胞及びミクログリアに密接に関連する細胞外アミロイド性斑の異常な蓄積によって特徴づけられる(Terry, R. D.及びKatzman, R.の文献 1983 Ann Neurol 14, 497-506; Glenner, G. G.及びWong, C. W.の文献 1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885-890; Intagaki, S.らの文献 1989 J Neuroimmunol 24, 173-182; Funato, H.らの文献 1998 Am J Pathol 152, 983-992; Selkoe, D. J. 2001 Physiol Rev 81, 741-766)。アミロイド-β(Aβと略記される)ペプチドは、老人斑の主成分であり、ADの発病及び進行に直接関与していると考えられ、仮説が遺伝的研究によって支持されている(Glenner, G. G.及びWong, C. W.の文献 1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885-890; Borchelt, D. R.らの文献 1996 Neuron 17, 1005-1013; Lemere, C. A.らの文献 1996 Nat Med 2, 1146-1150; Mann, D. M.及びIwatsubo, T.の文献 1996 Neurodegeneration 5, 115-120; Citron, M.らの文献 1997 Nat Med 3, 67-72; Selkoe, D. J. 2001 Physiol Rev 81, 741-766)。Aβは、β-アミロイド前駆体タンパク質(APP)のタンパク質分解処理によって生じ(Kang, J.らの文献 1987 Nature 325, 733-736; Selkoe, D. J.の文献 1998 Trends Cell Biol 8, 447-453)、これが、N末端でβ-セクレターゼにより、及び、AβのC末端でγ-セクレターゼにより、順次短縮される (Haass, C.及びSelkoe, D. J.の文献 1993 Cell 75, 1039-1042; Simons, M.らの文献 1996 J Neurosci 16 899-908)。N末端にてL-Aspで始まる優性Aβペプチド(Aβ1-42/40)に加え、N末端切断形態の多数の異型が老人斑において生じる。当該短縮型ペプチドは、インビトロにおいてより神経毒性であり、全長アイソフォームよりも迅速に凝集することが報告されている(Pike, C. J.らの文献 1995 J Biol Chem 270, 23895-23898)。N-短縮型ペプチドは、早発型家族性AD(FAD)対象において過剰に産生されて早期に現れること(Saido, T. C.らの文献 1995 Neuron 14, 457-466; Russo, Cらの文献 2000 Nature 405, 531-532)、及びダウン症(DS)脳において経年的に増加すること(Russo, C.らの文献 1997 FEBS Lett 409, 411-416, Russo, C.らの文献 2001 Neurobiol Dis 8, 173-180; Tekirian, T. L.らの文献 1998 J Neuropathol Exp Neurol 57, 76-94)が知られている。最後に、それらの量は、当該疾患の進行的重篤性を反映する(Russo, C.らの文献 1997 FEBS Lett 409, 411-416; Guntert, A.らの文献 2006 Neuroscience 143, 461-475)。追加的な翻訳後プロセスは、N末端を、位置1及び7でのアスパラギン酸の異性化又はラセミ化によって、及び、残基3及び11でのグルタミン酸の環化によって、更に修飾できる。位置3でのピログルタミン酸含有アイソフォーム[pGlu3Aβ3-40/42]は、総Aβ量のほぼ50%を占める、老人斑のN-短縮型の顕著な形態を表すものである（Mori, H.らの文献 1992 J Biol Chem 267, 17082-17086, Saido, T. C.らの文献 1995 Neuron 14, 457-466; Russo, C.らの文献 1997 FEBS Lett 409, 411-416; Tekirian, T. L.らの文献 1998 J Neuropathol Exp Neurol 57, 76-94; Geddes, J. W.らの文献 1999 Neurobiol Aging 20, 75-79; Harigaya, Y.らの文献 2000 Biochem Biophys Res Commun 276, 422-427）。これらは、前アミロイド病変にも存在する(Lalowski, M.らの文献 1996 J Biol Chem 271, 33623-33631)。AβN3(pE)ペプチドの蓄積は、おそらく、凝集を促進し、かつ大部分のアミノペプチダーゼに抵抗を与える構造的変化によるものである(Saido, T. C.らの文献 1995 Neuron 14, 457-466; Tekirian, T. L.らの文献 1999 J Neurochem 73, 1584-1589)。この証拠は、AD発病におけるAβN3(pE)ペプチドの回動的役割についての手掛かりを提供する���しかしながら、その神経毒性及び集合特性については、ほとんど公知でない(He, W.及びBarrow, C. J.の文献 1999 Biochemistry 38, 10871-10877; Tekirian, T. L.らの文献 1999 J Neurochem 73, 1584-1589)。更に、グリア細胞におけるこれらのアイソフォームの作用及びこれらのペプチドに対する神経膠反応は完全には知られていないが、活性化されたグリアは、老人斑と密接に関連しており、アミロイド沈着物の蓄積に能動的に寄与している可能性がある。最近の研究において、Aβ1-42、Aβ1-40、[pGlu3]Aβ3-42、[pGlu3]Aβ3-40、[pGlu11]Aββ11-42及び[pGlu11]Aβ11-40ペプチドの毒性、凝集特性及び異化は、神経細胞及びグリア細胞培養物において調査され、ピログルタミン酸修飾が、Aβ-ペプチドの毒性を悪化させ、培養星状細胞によるそれらの分解を阻害することも示された。Shirotaniらの文献は、インビトロでシンドビスウィルスに感染した初生皮質ニューロンにおける[pGlu3]Aβペプチドの生成を調査した。Shirotaniらは、アミノ酸置換及び削除によって[pGlu3]Aβの潜在的前駆体をコードするアミロイド前駆体タンパク質相補DNAを構築した。天然型前駆体におけるグルタミン酸の代わりに、N末端がグルタミン残基から始まる人工前駆体については、グルタミニルシクラーゼによるピログルタミン酸への自発的変換又は酵素変換が示唆された。 [pGlu3]Aβの天然型前駆体における位置3でのN末端グルタミン酸の環化機構は、インビトロ、インサイチュウ、又はインビボのいずれにおいても測定されなかった(Shirotani, K.らの文献 2002 NeuroSci Lett 327, 25-28)。
【０００７】
QCのアイソザイム(すなわち、イソグルタミニルペプチドシクロトランスフェラーゼ；アイソQC；QPCTL) は、WO 2008/034891、WO 2008/087197及びWO 2010/026209(各々Probiodrug AGの名におけるものである)に記載されている。したがって、アイソQCを過剰発現するトランスジェニック動物を提供することは、本発明の目的である。本発明の別の目的は、アイソQCをコードするDNA構造物を提供することである。プロモータに連結されたアイソQCをコードするDNA構造物を提供することは、本発明の更なる目的である。非ヒトトランスジェニック動物モデル系を提供して、特定の組織型におけるアイソQCのインビボでの及びインビトロでの制御及び効果を研究することは、本発明の更なる目的である。
【発明の概要】
【０００８】
（本発明の要旨）
本発明は、アイソQC関連疾患の非ヒトトランスジェニックモデル、特に哺乳動物モデルに係る方法及び組成物を含む。具体的にいうと、本発明は、アイソQCを過剰発現する非ヒトトランスジェニック動物モデルを含む。
【０００９】
本発明は、以下の疾患を含むがこれらに限定されないアイソQC関連疾患を調節する生物活性物質のスクリーニングのための組成物及び方法を更に含む：軽度認知障害(MCI)、アルツハイマー病(AD)、脳アミロイド脈管症、レビー小体痴呆、ダウン症候群における神経変性、アミロイドーシス(オランダタイプ)を伴う遺伝性脳出血、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症、ヘリコバクターピロリ感染を伴う又は伴わない潰瘍疾患及び胃癌、病原性精神病状態、精神分裂症、不妊性、新形成、炎症性宿主反応、癌、乾癬、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、再狭窄、肺線維症、肝線維症、腎線維症、後天性免疫不全症候群、移植片拒絶、舞踏病ハンチントン(HD)、体液性及び細胞性免疫応答障害、内皮における白血球接着及び遊走プロセス、摂食障害、睡眠-覚醒、エネルギー代謝のホメオスタシス制御障害、自律神経機能障害、ホルモンバランス障害及び体液制御障害、並びにグアムパーキンソン複合型認知症。本発明の別の態様は、アイソQC阻害剤のスクリーニングのための方法及び組成物を含む。
【００１０】
更に、哺乳動物へのアイソQC活性のエフェクタの投与により、胃腸管細胞増殖、好ましくは胃粘膜細胞、上皮細胞の増殖、急性酸分泌、並びに酸産生壁細胞及びヒスタミン分泌型腸クロム親和性細胞様細胞の分化を刺激することが可能であり得る。
【００１１】
更に、哺乳動物へのアイソQC活性のエフェクタの投与により、骨髄性始原細胞の増殖を抑制することが可能であり得る。
【００１２】
加えて、アイソQC阻害剤の投与は、雄性稔性の抑制をもたらし得る。
【００１３】
本発明は、アイソQCの少なくとも一つのエフェクタを、任意に慣習的な担体及び/又は賦形剤との併用で含む、非経口、腸内、又は経口投与のための医薬組成物を提供する。
【００１４】
加えて、本発明は、アイソQC関連疾患の治療及び/又は予防のための方法及び組成物、特にアイソQCを阻害又は促進する方法及び組成物を含む。
【００１５】
阻害研究により、ヒト及びマウスQCが、金属依存的トランスフェラーゼであることが示された。QCアポ酵素は、亜鉛イオンにより最も効率的に再活性化でき、亜鉛依存性アミノペプチダーゼの金属結合モチーフは、ヒトQCにも存在する。活性部位結合金属と相互に作用する化合物は、強力な阻害剤である。
【００１６】
予想外なことに、組換えヒトQC並びに脳抽出物由来のQC活性は、N末端グルタミニル並びにグルタミン酸環化の両方を触媒することが示された。当該発見において最も顕著であることは、QCにより触媒されたGlu1の変換がpH 6.0付近で有利であるのに対し、pGlu誘導体へのGln1の変換が8.0付近の最適pHを発揮するということである。pGlu-Aβ関連ペプチドの形成は、組換えヒトQC及びブタ下垂体抽出物由来QC活性の阻害により抑制され得るので、酵素QCは、例えばアルツハイマー病の治療のための創薬の標的である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明のこれらの及び他の態様の更なる理解は、以下に表す図を参照することにより得られるであろう。
【００１８】
【図１】tgアイソQC発現カセット   トランスジェニックマウス系統におけるｈアイソQCの発現について、ｈアイソQCコード配列は、上流で、プロモータ並びにThy 1遺伝子のエキソン1及びエキソン2を含む5'非翻訳領域を含むマウスThy1プロモータ領域と融合させた。加えて、ｈアイソQCコード配列は、下流で、ポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳Thy1領域と融合させた。
【００１９】
【図２】ｈアイソQC導入遺伝子のPCR検出についての遺伝子型同定戦略  PCR1：プライマー対であるtgアイソQC3(配列番号3)及び-4(配列番号4)並びにｈアイソQCトランスジェニック動物由来の染色体DNAを使用するPCRは、486 bpのPCR生成物を送達し、これは、当該染色体における当該導入遺伝子発現カセットの存在を表すものである。  PCR2：プライマー対であるGX3626(配列番号5)及びGX3627(配列番号6)並びにｈアイソQCトランスジェニック動物由来の染色体DNAを使用するPCRは、7097 bpのPCR生成物を送達し、これは、当該染色体における当該導入遺伝子発現カセットの完全性を表すものである。
【００２０】
【図３】アイソQC抗体を用いての野生型マウス、QPCTLノックアウトマウス、及びtgアイソQC31ヘテロ接合型マウスの海馬の冠状切片の免疫組織化学的染色を示す(スケールバー：500μm)。
【００２１】
【図４】NeuN抗体及びGFAP抗体を用いての野生型マウス、tgアイソQC13ヘテロ接合型マウス、tgアイソQC20ヘテロ接合型マウス、及びtgアイソQC31マウスの海馬CA1領域の冠状切片の免疫組織化学的染色を示す(スケールバー：50μm)。
【００２２】
【図５】GFAP抗体を用いての野生型マウス、QPCTLノックアウトマウス、及びtgアイソQC31ヘテロ接合マウスの海馬の冠状切片の免疫組織化学的染色を示す(スケールバー：100μm)。
【００２３】
【図６】Iba1抗体を用いての野生型マウス、QPCTLノックアウトマウス、及びtgアイソQC31ヘテロ接合マウスの海馬CA1領域の冠状切片の免疫組織化学的染色を示す(スケールバー：200μm)。
【００２４】
【図７】NeuN抗体(赤)及びGFAP(緑)抗体を用いての野生型マウス、tgアイソQC13ヘテロ接合型マウス、tgアイソQC20ヘテロ接合型マウス、及びtgアイソQC31ヘテロ接合マウスの海馬CA1領域の冠状切片の二重免疫蛍光染色を示す(スケールバー：200μm)。
【００２５】
【図８】アイソQCトランスジェニックマウス及び野生型マウスにおけるアイソQC活性測定の結果を示す。全てのトランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較した活性の増加によって示されるように、アイソQCの顕著な過剰発現を示した。
【００２６】
【図９】PhenoMasterシステムを使用する自動化ホームケージ行動分析における野生型マウス及びヘテロ接合型tgアイソQCマウスのx/y-レベルにおける自発運動量を示す。(a) 平均+SEMとして示される136時間の調査期間の間に移動した合計距離(**, p＜0.01, t-検定)、及び(b) 1時間の間隔にわたる合計の平均として示される12時間明/12時間暗サイクル(灰色のバー)の間の自発運動量パターン。
【００２７】
【図１０】PhenoMasterシステムを使用する自動化ホームケージ行動分析における野生型マウス及びヘテロ接合型tgアイソQCマウスのz-レベルの立ち上がり活性（rearing activity）を示す。(a) 平均+SEMとして示される136時間の調査期間の間の立ち上がり活性の合計(***, p＜0.001, t-検定)、及び(b) 1時間の間隔にわたって合計平均として示される12時間明/12時間暗サイクル(灰色のバー)の間の垂直活性パターン。
【００２８】
【図１１】PhenoMasterシステムを使用する自動化ホームケージ行動分析における野生型マウス及びヘテロ接合型tgアイソQCマウスの摂食動態を示す。 (a)合計水消費量、及び(b)平均+SEMとして示される136時間の調査期間の間の合計摂食量。
【００２９】
【図１２】暗-明ボックス試験の間の2.5ヵ月齢の野生型雌マウス及びヘテロ接合型tgアイソQC雌マウスの明区画(平均+SEM, **, p＜0.01, t-検定)における滞在時間を示す。
【００３０】
【図１３】生活の3段階での一次選別で回収したデータから構成されるヘテロ接合型tgアイソQC雌同腹仔及び野生型雌同腹仔の体重経過を示す(平均+SEM)。
【００３１】
【図１４】5回の治験のうちの最良のもの(平均+SEM)における(a)方向転換に要した時間（t-ターン）及び(b)降りるのに要した合計時間としての、ポール上での2.5月齢の野生型雌及びヘテロ接合型tgアイソQC雌の成績を示す。
【００３２】
【図１５】移動した合計距離(平均+SEM)として、加速的ロータロッド(300秒に4〜40rpm)上の3月齢野生型雌及びヘテロ接合型tgアイソQC雌の成績を示す：(a) 9回の治験のうち最良の治験分析、(b)治験進行。
【００３３】
【図１６】3月齢の野生型及びヘテロ接合型tgアイソQC雌マウスのホールボード（holeboard）試験の結果を示す：(a)ノーズポーク（nosepoke）の数、及び(b)穴探査の合計期間が平均+SEM(*、p ＜ 0.05、t検定)として示されている。
【００３４】
【図１７】3月齢の野生型及びヘテロ接合型tgアイソQC雌マウスのテールフリック試験における尾部撤回刺激潜在性(平均+SEM)を示す。
【００３５】
【図１８】恒常ホットプレート(52.5℃+/-0.2、カットオフ60秒)における野生型及びヘテロ接合型tgアイソQC雌の足撤回刺激潜在性を平均+SEMとして示す：(a)非習慣的治験、及び(b) 習慣的治験(**、p ＜ 0.01、t検定)。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（発明の詳細な説明）
本発明の第１の態様によれば、アイソQCを過剰発現させるためのトランスジェニック非ヒト動物であって、ヒトアイソQCをコードするDNA導入遺伝子を含む細胞を含み、前記ヒトアイソQCが、配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1のアミノ酸配列に少なくとも75%の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号1のアミノ酸配列の断片若しくは誘導体を含むことによって特徴づけられる、前記トランスジェニック非ヒト動物が提供される。
【００３７】
配列番号1は、本明細書において、「ヒトアイソQC Met I、タンパク質」、及びWO 2008/034891における配列番号11、及び「GenBankアクセッション番号NM_017659」、及びWO 2008/087197における配列番号16としても開示されている。
【００３８】
アミノ酸、ペプチド又はポリペチドが本明細書で言及されている場合、当該アミノ酸残基は、以下の従来型リストに従う、アミノ酸の慣用名に対応する1文字又は3文字の命名により表されることは理解されるであろう：
【表１】
2013541938.tif 000002
【００３９】
一実施態様において、ヒトアイソQCは、配列番号1のアミノ酸配列に少なくとも80%の配列同一性、例えば配列番号1のアミノ酸配列に85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の任意の一つの配列同一性から選択される配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。具体的実施態様において、ヒトアイソQCは、配列番号1のアミノ酸配列からなる。
【００４０】
一実施態様において、ヒトアイソQCは、配列番号1のアミノ酸配列の断片又は誘導体を含む。ヒトアイソQCが配列番号1のアミノ酸配列の断片を含む場合、配列番号1に記載されている全長アイソQCアミノ酸配列の機能の一部もしくは全部を保持する断片であることが必要であることは、認識されるであろう。本明細書において「配列番号1のアミノ酸配列の誘導体」への言及は、配列番号1のアミノ酸配列の変更態様を含む。
【００４１】
個々の置換、欠失又は追加は、１つのアミノ酸又は一部のアミノ酸(典型的には10%未満、より典型的には5%未満、さらに典型的には1%未満)を変更、追加若しくは欠失させる。アミノ酸配列の「修飾」は、アミノ酸配列の保存的置換を含む。機能的に同等のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において周知である。以下の6つの群は、互いに保存的な置換であるアミノ酸を各々含む:
1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)；
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；
4)アルギニン(R)、リジン(K)；
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；及び、
6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
【００４２】
ポリペチドが配列番号1のアイソQCポリペチドの構造的及び/又は機能的特性の一部若しくは全部を保持する限り、他の軽微な修飾は当該配列に含まれる。例示的な構造的又は機能的特徴には、配列同一性若しくは実質的類似性、抗体反応性、RNA結合ドメイン又は酸性ドメインなどの保存された構造領域の存在が含まれる。
【００４３】
本明細書において、アイソQCへの言及が、イソグルタミニルペプチドシクロトランスフェラーゼ(別名QPCTL又はQC様酵素)に関すること、並びにQC(グルタミニル-ペプチドシクロトランスフェラーゼ(EC 2.3.2.5.))及びアイソQCが、QC活性として更に定義される同一又は類似の酵素活性を有することは、認識されるであろう。
【００４４】
本明細書において使用される用語「QC活性」は、N末端グルタミン残基のピログルタミン酸(pGlu*)への分子内環化、又は、遊離アンモニア下でのN末端L-ホモグルタミン若しくはL-β-ホモグルタミンの環状ピロ-ホモグルタミン誘導体への分子内環化として定義される。スキーム1及び2を参照されたい。
【００４５】
【化１】
2013541938.tif 000003
【００４６】
【化２】
2013541938.tif 000004
【００４７】
本明細書において、用語「QC関連疾患」又は「QC関連障害」への言及は、QC又はアイソQCにより調整される全ての疾患、障害又は状態に関する。
【００４８】
本明細書において、用語「導入遺伝子」への言及には、宿主ゲノムに組み込まれている、又は宿主細胞において自律複製でき、かつ1以上の細胞生成物の発現を引き起こすことができるDNAの分節を含む。例示的な導入遺伝子は、対応する非形質変換細胞又は動物と比較して新規な表現型を有する宿主細胞、又は当該細胞から発生した動物を提供する。
【００４９】
一実施態様において、DNA導入遺伝子には、配列番号2のヌクレオチド配列、又は配列番号2のヌクレオチド配列に実質的に同じ配列を含む。
【００５０】
本発明の導入遺伝子を含むアイソQCポリヌクレオチドには、アイソQC cDNAを含み、修飾型アイソQC cDNAも含むものとする。本明細書において使用する核酸の「修飾」には、参照配列に関して1つあるいは複数のヌクレオチドの追加、欠失又は置換を含み得る。核酸の修飾には、遺伝コードの縮重に起因してコードされたアミノ酸配列を変えない、又は、結果として保存的置換になる置換を含み得る。当該修飾は、ポリA尾部の追加などの計画的になされる変更、又は核酸複製の間の突然変異として発生する変更に対応できる。
【００５１】
本願明細書における「実質的に同じヌクレオチド配列」への言及は、参照ポリヌクレオチドに十分な同一性を有し、適度に厳しい（stringent）又はより高い厳しさ（stringency）のハイブリダイゼーション条件下で当該参照ヌクレオチドにハイブリダイズするようなDNAに関する。参照ヌクレオチド配列として「実質的に同じヌクレオチド配列」を有するDNAは、当該参照ヌクレオチド配列に関して、少なくとも60%から少なくとも95%にわたる同一性を有し得る。
【００５２】
「適度に厳しいハイブリダイゼーション」という熟語は、標的核酸が相補核酸に結合することを可能にする条件に関連する。ハイブリダイズした核酸は、通常、少なくとも約60%〜少なくとも約95%の範囲内の同一性を有する。適度に厳しい条件とは、約42℃の50% ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×食塩水リン酸ナトリウムEDTAバッファ(SSPE)、0.2% SDS(Aldrich)でのハイブリダイゼーション 、及びそれに続く約42℃の0.2×SSPE、0.2% SDS(Aldrich)での洗浄に同等の条件である。
【００５３】
高い厳しさのハイブリダイゼーションは、約65℃の0.018M NaClにおいて安定ハイブリッドを形成する当該核酸配列のみのハイブリダイゼーションを許容する条件に関する。例えば、本明細書において意図されるように、ハイブリッドが65℃の0.018M NaClにおいて安定でない場合、当該ハイブリッドは高い厳しさ条件下で安定ではない。高い厳しさ条件は、例えば、約42℃の50% ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2% SDSでのハイブリダイゼーション、及びそれに続く約65℃の0.1×SSPE及び0.1% SDSでの洗浄により提供され得る。
【００５４】
他の適切な適度な厳しさの及び高い厳しさのハイブリダイゼーションバッファ及び条件は、当業者に周知であり、例えば、Sambrookらの文献, 「分子クローニング：研究室マニュアル」, 第2版, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. (1989);及び、Ausubelらの文献 (「分子生物学における最新プロトコル」(補足47), John Wiley & Sons, New York (1999))に記載されている。
【００５５】
一実施態様において、DNA導入遺伝子は、配列番号2のヌクレオチド配列に少なくとも75% 配列同一性、例えば、配列番号2のヌクレオチド配列に、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性のいずれか１つから選択される配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。具体的実施態様において、DNA導入遺伝子は、配列番号2のヌクレオチド配列からなる。
【００５６】
本明細書に開示される配列番号2は、「ヒトアイソQC Met I、核酸」、及びWO 2008/034891における配列番号2、及びWO 2008/087197における配列番号27としても記載される。
【００５７】
一実施態様において、導入遺伝子は、組織特異的プロモータに機能的に連結されている。本願明細書における用語「機能的に連結されている」への言及は、適切な分子(例えば、転写活性化タンパク質)が制御配列に結合している場合に遺伝子発現を許容する様式で連結されているDNA配列及び制御配列に対する言及を含む。
【００５８】
本発明は、先に記載したアイソQC導入遺伝子を含むDNA構築物を更に提供する。本明細書において使用する「DNA構築物」という用語は、DNA分子の遺伝的因子の具体的配置をいう。
【００５９】
本明細書において用語「構築物」に係る言及は、具体的なヌクレオチド配列の発現のために産生され、又は他の組換えヌクレオチド配列の構築物に使用されるものである組換え核酸、一般的には組換えDNAを含む。組換え核酸は、例えばキメラ又はヒト化ポリペチドをコードし得る。
【００６０】
必要に応じて、DNA構築物は、プロモータ又はエンハンサなどの適切な発現要素に機能的に連結し、適切な細胞又は組織におけるDNA構築物の遺伝因子の発現を可能にするように設計できる。発現制御機構の使用は、関心対象遺伝子の標的化送達及び発現を可能にする。例えば、本発明の構築物は、5'-3'方向の転写で、脳組織における遺伝子発現に関連する転写及び翻訳開始領域、変異型又は野生型アイソQCタンパク質をコードするDNA、並びに宿主動物において機能的な転写及び翻訳終結領域を含む発現カセットを使用して構築できる。1以上のイントロンも存在し得る。転写開始領域は、宿主動物に内因性であり得るか、又は宿主動物に対し外来性若しくは外因性であり得る。
【００６１】
本明細書に記載されるDNA構築物は、アイソQCを過剰発現する変異非ヒト哺乳動物を生成するように伝播用ベクターに組み込まれることができ、又は適切な細胞にトランスフェクションでき、これらも本発明に含まれるものである。当業者は、ベクターを所望の特性に基づいて、例えば哺乳動物細胞又は菌体細胞などの特定の細胞におけるベクターの産生について選択できる。
【００６２】
ベクターは、機能的に連結された核酸の組織特異的な又は誘導性の発現を提供する制御エレメントを含むことができる。当業者であれば、所望の組織においてアイソQCポリペプチドを発現することができる適切な組織特異的プロモータ又はエンハンサを容易に決定することができる。本明細書に記載されている組織特異的発現には、好ましい組織以外の組織において発現が完全にないことは必要ではないことに留意すべきである。その代わり、「細胞特異的」、又は「組織特異的」発現は、好ましい細胞タイプ又は組織における関心対象の特定の遺伝子の大部分の発現を指す。
【００６３】
また、制御することができるアイソQCポリペプチド又は核酸の発現のためのベクターに、種々の誘導性プロモータ又はエンハンサのいずれも含めることができる。このような誘導性の系には、例えば、テトラサイクリン誘導性の系（Gossen及びBizardの文献（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89：5547-5551（1992））；Gossenらの文献（Science，268：17664769（1995））；Clontech，Palo Alto，Calif．）；重金属によって誘導されるメタロチオネインプロモータ；エクジソン、又はムリステロン（muristerone）などの関連ステロイドに応答する昆虫ステロイドホルモン（Noらの文献（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，93：3346-3351（1996））；Yaoらの文献（Nature，366：476-479（1993））；Invitrogen，Carlsbad，Calif.）；糖質コルチコイド及びエストロゲンなどのステロイドによって誘導されるマウス乳癌ウイルス（MMTV）（Leeらの文献（Nature，294：228-232（1981））；並びに温度変化によって誘導可能な熱ショックプロモータ；ラットニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモータ（Forss-Petterらの文献（Neuron 5；197-197 （1990）））；ヒトβ-アクチン遺伝子プロモータ（Rayらの文献（Genes and Development（1991）5：2265-2273））；ヒト血小板由来増殖因子B（PDGF-B）鎖遺伝子プロモータ（Sasaharaらの文献（Cell（1991）64：217-227））；ラットナトリウムチャネル遺伝子プロモータ（Maueらの文献（Neuron（1990）4：223-231））；ヒト銅-亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子プロモータ（Ceballos-Picotらの文献（Brain Res．（1991）552：198-214））；並びに哺乳動物POU-ドメイン制御遺伝子ファミリーのメンバーのためのプロモータ（Xiらの文献（（1989）Nature 340：35-42））が含まれる。
【００６４】
プロモータ又はエンハンサを含む制御エレメントは、制御の性質に応じて、構成的であることができ、又は制御することができ、かつ種々の組織、又は1つ若しくは少数の特異的組織において制御することができる。制御配列又は制御エレメントは、ポリヌクレオチド配列と制御配列との間の物理的及び機能的関係により、ポリヌクレオチド配列の転写が可能となるように、本発明のポリヌクレオチド配列の1つに機能的に連結される。真核細胞における発現のために有用なベクターには、例えば、CAGプロモータ、SV40初期プロモータ、サイトメガロウイルス（CMV）プロモータ、マウス乳癌ウイルス（MMTV）ステロイド誘導性プロモータ、Pgtf、モロニーマリン（marine）白血病ウイルス（MMLV）プロモータ、thy-1プロモータ等を含む制御エレメントを含むことができる。
【００６５】
所望の場合、ベクターには、選択可能マーカーを含むことができる。本明細書で使用されるように、「選択可能マーカー」は、選択可能マーカーが導入された細胞に選択可能な表現型を提供する遺伝要素を指す。選択可能マーカーは、一般に、その遺伝子産物が細胞増殖を阻害し又は細胞を死滅させる作用物質に対する耐性を提供する遺伝子である。例えばAusubelらの文献（「分子生物学の最新プロトコル（補遺47）（Current Protocols in Molecular Biology（Supplement 47））」，John Wiley & Sons，New York（1999））、及び米国特許第5,981,830号に記載されるように、例えば、Neo、Hyg、hisD、Gpt、及びBle遺伝子を含む種々の選択可能マーカーを本発明のDNA構築物に使用することができる。選択可能マーカーの存在についての選択のために有用な薬物には、例えば、NeoのためのG418、Hygのためのハイグロマイシン、hisDのためのヒスチジノール、Gptのためのキサンチン、及びBleのためのブレオマイシンが含まれる（上記Ausubelらの文献（1999）；米国特許第5,981,830号参照）。本発明のDNA構築物には、ポジティブ選択可能マーカー、ネガティブ選択可能マーカー、又は両方を組み込むことができる（例えば、米国特許第5,981,830号参照）。
【００６６】
（非ヒトトランスジェニック動物）
本発明は、主に、ゲノムがアイソQCポリペチドをコードする導入遺伝子を含む、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。本明細書における用語「トランスジェニック動物」への言及は、細胞の一部に染色体外因子として存在するか、又は生殖系DNAに安定的に組み込まれている非内因性核酸配列を有する非ヒト動物(通常、哺乳動物) を含む。
【００６７】
一実施態様において、動物は、導入遺伝子についてヘテロ接合型である。代替的実施態様において、動物は、導入遺伝子についてホモ接合型である。更なる態様において、動物は、マウスである。
【００６８】
DNA断片は、当業者に公知の任意の方法によってトランスジェニック動物のゲノムに組み込むことができる。所望の遺伝子配列を含むDNA分子は、導入された分子がその相同領域において組換えを受けることができるであろう任意の方法によって、ES細胞などの多能性細胞に導入することができる。使用することができる技術には、リン酸カルシウム／DNA共沈降、核へのDNAの微量注入、電気穿孔法、無処置細胞との細菌プロトプラスト融合、トランスフェクション、及びポリカチオン（例えば、ポリブレン、ポリオルニチン等）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。DNAは、直鎖状又は環状の一本鎖又は二本鎖DNAであることができる（例えば、Hoganらの文献（「マウス胚の操作：実験室マニュアル（Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual）」Cold Spring Harbor Laboratory（1986））；Hoganらの文献（「マウス胚の操作：実験室マニュアル第2版（Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, second ed.）」，Cold Spring Harbor Laboratory（1994）、米国特許第5,602,299号；第5,175,384号；第6,066,778号；第4,873,191号、及び第6,037,521号；レトロウイルスを媒介した生殖系列への遺伝子導入（Van der Puttenらの文献（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82：6148-6152（1985）））；胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング（Thompsonらの文献（Cell 56：313-321（1989）））；胚の電気穿孔法（Loの文献（Mol Cell．Biol．3：1803-1814（1983）））；及び精子を媒介した遺伝子導入（Lavitranoらの文献（Cell 57：717-723（1989）））参照）。
【００６９】
例えば、接合体は、微量注入のための優良な標的であり、接合体を微量注入する方法は周知である（米国特許第4,873,191号参照）。
【００７０】
また、種々の発生段階の胚細胞を使用して、トランスジェニック動物の作出のために導入遺伝子を導入することができる。胚細胞の発生の段階に応じて、異なる方法が使用される。胚盤胞期胚の胞胚腔に導入され、その後、このようなトランスフェクトされた胚性幹（ES）細胞は、胚にコロニー形成し、結果として生じるキメラ動物の生殖系列に寄与することができる（Jaenischの文献（Science 240：1468-1474（1988））において概説されている。）。トランスフェクトされたES細胞を胞胚腔へ導入する前に、導入遺伝子がこのような選択のための手段を提供する場合、トランスフェクトされたES細胞を種々の選択プロトコルに供して、導入遺伝子が組み込まれたES細胞の比率を高めることができる。或いは、PCRを使用して、導入遺伝子を組み込んだES細胞をスクリーニングすることができる。
【００７１】
加えて、また、レトロウイルス感染も、導入遺伝子を非ヒト動物に導入するために使用することができる。発生中の非ヒト胚は、インビトロで胚盤胞期まで培養することができる。この間、割球は、レトロウイルス感染のための標的となることができる（Jaenischの文献（Proc．Nati．Acad．Sci．USA 73：1260-1264 （1976）））。割球の効率的な感染は、透明帯を除去するための酵素処理によって得られる（上記Hoganらの文献，1986）。導入遺伝子を導入するために使用されるウイルスベクター系は、典型的には、導入遺伝子を有する複製欠陥のあるレトロウイルスである（Jahnerらの文献（Proc．Natl．Acad Sci．USA 82：6927-6931（1985））；Van der Puttenらの文献（Proc．Natl．Acad Sci．USA 82：6148-6152（1985）））。トランスフェクションは、単層のウイルス産生細胞上で割球を培養することによって容易にかつ効率的に行われる（Van der Putten 1985，上記；Stewartらの文献（EMBO J．6：383-388（1987）））。或いは、感染は、より後期に行うことができる。ウイルス又はウイルス産生細胞を胞胚腔に注射することができる（Jahner D．らの文献（Nature 298：623-628（1982）））。組込みは、トランスジェニック動物を形成する細胞のサブセットのみにおいて生じるので、大部分の創立細胞（founder）は、導入遺伝子についてモザイクであるだろう。さらに、創立細胞は、ゲノムの異なる位置にて、一般に子孫において分離するであろう導入遺伝子の種々のレトロウイルス挿入を含むことができる。加えて、導入遺伝子は、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染によって生殖系列に導入してもよい（Jahnerらの文献，1982，上記）。当業者に公知のトランスジェニック動物を作出するためのレトロウイルス又はレトロウイルスベクターを使用するさらなる手段には、レトロウイルス粒子の微量注入、又は受精卵若しくは初期胚の囲卵腔にレトロウイルスを生じるマイトマイシンC処理した細胞を含む（WO 90/08832（1990）；Haskell及びBowenの文献（Mal．Reprod．Dev．40: 386（1995）））。
【００７２】
また、導入遺伝子を非ヒト動物に導入するための任意の他の技術、例えばノックイン又はレスキュー技術を使用して、本発明の問題を解決することができる。ノックイン技術は、例えばCasasらの文献（Am J Pathol 165, 1289-1300（2004））に記載されているように、当技術分野において周知である。
【００７３】
いったん創立動物が作出されると、特定の動物の群体を作出するために該動物を繁殖させ、同系交配させ、異系交配させ、又は交雑させることができる。このような繁殖戦略の例には、下記を含むがこれらに限定されるわけではない：分離した系統を確立するために2つ以上の組込み部位をもつ創立動物の異系交配；各導入遺伝子の相加発現の効果のため、より高レベルにて導入遺伝子を発現させる複合トランスジェニクス（compound transgenics）を生じるための、分離した系統の同系交配；発現を増大させるため、及びDNA分析による動物のスクリーニングの必要性を除去するための両方のために、所与の組込み部位についてホモ接合型であるマウスを作出するためのヘテロ接合型トランスジェニックマウスの交雑；複合のヘテロ接合型又はホモ接合型系統を作出するための、分離したホモ接合型系統の交雑；導入遺伝子の発現及び発現の効果に及ぼす対立遺伝子を修飾する効果を検討するための、異なる近交系の遺伝的背景への動物の繁殖。
【００７４】
トランスジェニック動物は、関心対象の表現型を有する動物を選択するために、スクリーニングされ及び評価される。例えばサザンブロット分析又はPCR技術を使用して初期スクリーニングを実施し、動物組織を解析して、導入遺伝子の組込みが起こったことを検証することができる。また、トランスジェニック動物の組織における導入遺伝子のmRNA発現のレベルは、動物から得られる組織試料のノザンブロット分析、インサイチューハイブリッド形成分析、及び逆転写酵素-PCR（rt-PCR）を含むがこれらに限定されない技術を使用して評価することができる。アイソQCに特異的な抗体を使用して、又はEGFP等のタグを用いて、適切な組織の試料を免疫細胞化学的に評価することができる。本発明の方法に有用な表現型を有する動物を同定するために、トランスジェニック非ヒト哺乳動物をさらに特徴づけることができる。特に、アイソQCを過剰発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、本明細書に開示した方法を使用してスクリーニングすることができる。例えば、組織切片では、リポーター遺伝子の存在を示す蛍光の存在する色素について蛍光顕微鏡下で見ることができる。
【００７５】
アイソQCタンパク質の組織特異的発現に影響を及ぼす別の方法は、組織特異的プロモータを使用することによる。適切な組織特異的プロモータの非限定的な例には、アルブミンプロモータ（肝臓特異的；Pinkertらの文献（（1987）Genes Dev. 1：268-277））；リンパ系特異的プロモータ（Calame及びEatonの文献（（1988）Adv. Immunol. 43：235-275））、特にT細胞受容体（Winoto及びBaltimoreの文献（（1989）EMBO J. 8：729-733））、及び免疫グロブリン（Banerjiらの文献（（1983）Cell 33：729-740）；Queen及びBaltimoreの文献（（1983）Cell 33：741-748））のプロモータ、ニューロン特異的プロモータ（例えば、神経フィラメントプロモータ、Thy-1プロモータ、又はBri-タンパク質プロモータ；Sturchler-Pierratらの文献（（1997）Proc. Natl. Acad Sci. USA 94：13287-13292）、Byrne及びRuddleの文献（（1989）PNAS 86：5473-5477））、膵臓特異的プロモータ（Edlundらの文献（（1985）Science 230：912-916））、心臓特異的発現（αミオシン重鎖プロモータ、Subramaniam, A, Jones WK, Gulick J, Wert S, Neumann J, 及びRobbins J.の文献（「トランスジェニックマウスにおけるα-ミオシン重鎖遺伝子プロモータの組織特異的制御（Tissue-specific regulation of the alpha-myosin heavy chain gene promoter in transgenic mice.）」，J Biol Chem 266：24613-24620，1991）、並びに乳腺特異的プロモータ（例えば、乳清プロモータ；米国特許第4,873,316号、及び欧州出願公開第264,166号）を含む。
【００７６】
本発明はさらに、本発明のDNA構築物を含む単離された細胞を提供する。DNA構築物は、周知の任意のトランスフェクション方法によって細胞に導入することができる（Sambrookらの文献（「分子クローニング：実験室マニュアル第2版（Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 2nd ed.）」、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.（1989））
；Ausubelらの文献、上記、（1999））。或いは、細胞は、本明細書に記載したように作出した変異非ヒト哺乳動物から細胞を単離することによって得ることができる。このように、本発明は、本発明のアイソQC変異非ヒト哺乳動物、特にアイソQC変異体マウスから単離された細胞を提供する。細胞は、マウス等のホモ接合型アイソQC変異非ヒト哺乳動物、又はマウス等のヘテロ接合型アイソQC変異非ヒト哺乳動物から得ることができる。
【００７７】
本発明の更に別の態様によると、トランスジェニックマウスであって、プロモータに機能的に連結され、該マウスのゲノムに組み込まれた、配列番号2のヌクレオチド配列又は配列番号2と実質的に同じヌクレオチド配列を含むアイソQCをコードするトランスジェニックヌクレオチド配列を含み、アイソQC阻害剤により反転又は回復できる表現型を示す、前記トランスジェニックマウスが提供される。
【００７８】
（エフェクタ）
エフェクタは、該用語が本明細書で使用されるときに、酵素に結合し、かつインビトロ及び／又はインビボで該酵素の活性を増大させ（促進し）、又は低下させる（阻害する）分子として定義される。いくつかの酵素は、該酵素の触媒活性に影響を及ぼす分子に対する結合部位を有しており；刺激分子は、活性化因子と呼ばれている。酵素はさらに、2つ以上の活性化因子又は阻害剤を認識するための多数の部位を有していてもよい。酵素は、種々の分子の濃度を検出することができ、かつ該酵素自体の活性を変化させるためにその情報を使用することができる。
【００７９】
酵素は、活性のある高次構造及び不活性な高次構造の両方を想定することができるので、エフェクタは、酵素活性を調整することができ：活性化因子は、正のエフェクタであり、阻害剤は、負のエフェクタである。エフェクタは、酵素の活性部位においてだけでなく、調節部位、又は調節部位が触媒部位とは異なる酵素のエレメントであることを強調するために、及び触媒部位における基質と阻害剤との間の競合によるこの形態の調節を区別するために使用される用語であるアロステリック部位においても作用する（Darnell, J., Lodish, H. 及びBaltimore, D.の文献（1990, 「分子細胞細胞生物学第2版（Molecular Cell Biology 2nd Edition）」, Scientific American Books, New York, page 63））。
【００８０】
（アッセイ及び治療剤の同定）
本発明の方法及び組成物は、アイソQCのエフェクタ、好ましくはアイソQCの活性を減少させるエフェクタ、すなわちアイソQC阻害剤の評価、及び以下から選択される疾患の治療及び予防のための薬剤及び治療剤の開発に特に有用である：軽度認知障害、アルツハイマー病、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、ダウン症候群における神経変性、ハンチントン舞踏病、ケネディ病、潰瘍疾患、ヘリコバクターピロリ感染を伴う又は伴わない十二指腸癌、結腸直腸癌、Zolliger-Ellison症候群、ヘリコバクターピロリ感染を伴う又は伴わない胃癌、病原性精神病状態、精神分裂症、不妊性、新形成、炎症性宿主反応、癌、悪性転移、黒色腫、乾癬、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、膵臓炎、再狭窄、肺線維症、肝線維症、腎線維症、移植片拒絶、後天性免疫不全症候群、体液性及び細胞性免疫応答欠損、内皮における白血球接着及び遊走プロセス、摂食行動障害、睡眠-覚醒障害、エネルギー代謝のホメオスタシス制御障害、自律神経機能障害、ホルモンバランス障害又は体液の制御障害、多発性硬化症、ギランバレー症候群、及び慢性炎症性脱ミエリン化多発神経根筋障害。
【００８１】
本発明のトランスジェニック動物又はトランスジェニック動物細胞は、様々なスクリーニングアッセイに使用できる。それゆえ、本発明の更なる態様では、
(a)本明細書で定義されるように試験作用物質をトランスジェニック非ヒト動物に投与すること；及び、
(b)産生されたアイソQCの量における該作用物質の効果を測定すること；を含む、インビボでアイソQC産生を阻害又は促進する生物活性物質のスクリーニングの方法が提供される。
【００８２】
本発明の更に他の態様では、
(a)本明細書で定義されるように試験作用物質をトランスジェニックマウスに投与すること；
(b)該マウスの神経学的表現型における該試験作用物質の効果を評価すること；及び、
(c)アイソQC活性を阻害又は促進する試験作用物質を選択することを含む、アイソQC活性を阻害又は促進する治療剤のスクリーニングの方法が提供される。
【００８３】
例えば、アイソQC及びアミロイド蓄積に影響を及ぼすことが疑われる様々な潜在的作用物質のいずれか、並びに適切なアンタゴニスト及び遮断治療剤は、トランスジェニック動物への投与、及び該細胞における機能及び表現型、及び該トランスジェニック動物の(神経学的)表現型における当該作用物質の効果を評価することによりスクリーニングできる。
【００８４】
行動研究、例えば運動技能、学習及び記憶欠損を評価するように設計された研究を使用して、潜在的治療剤を試験することもできる。当該試験の例は、モーリス水迷路(Morrisの文献 (1981) Learn Motivat 12:239-260)である。加えて、行動研究は、ローター-ロッド及びオープンフィールドなどによる自発運動量の評価を含み得る。
【００８５】
本発明の方法は、アミロイド蓄積を研究するために、及び潜在的治療化合物を試験するために、ホモ接合型又はヘテロ接合型アイソQC変異非ヒト哺乳動物から単離される細胞を都合よく使用できる。本発明の方法は、トランスフェクションされた細胞株などのアイソQCを発現する細胞を用いて使用することもできる。
【００８６】
本発明の更なる態様では、本明細書で定義されるトランスジェニック非ヒト動物に由来する細胞又は細胞株が提供される。
【００８７】
アイソQCを過剰発現する細胞は、アイソQC関連疾患を治療するための潜在的治療剤としての化合物を選別するためのインビトロ方法に使用できる。当該方法において、化合物は、アイソQCを過剰発現する細胞、遺伝子導入細胞、又はアイソQC変異非ヒト動物由来細胞と接触させて、アイソQCの発現に関連する表現型の変化についてスクリーニングされる。細胞アッセイにおけるAβ産生及びトランスジェニック動物における変化は、当業者に周知の方法により評価できる。
【００８８】
アイソQCの発現が蛍光強度によりモニタできるので、アイソQCなどのアイソQC融合ポリペチドは、当該スクリーニング法に特に有用であり得る。他の例示的な融合ポリペチドには、他の蛍光タンパク質又はその修飾体、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質、ポリHisなど、又は任意の型のエピトープタグを含む。そのような融合ポリペチドは、例えば、当該融合ポリペチドに特異的な抗体を使用して検出できる。融合ポリペチドは、その機能的部分が所望の特性、例えば抗体結合活性又は蛍光活性を保持する限り、完全なポリペチド又はその機能的部分であり得る。
【００８９】
本発明は、上記疾患を治療するのに使用するための潜在的治療剤を同定する方法を更に提供する。本方法は、アイソQCポリペチドをコードするポリヌクレオチドを含むDNA構築物を含む細胞を化合物と接触させる工程、及び該細胞をアイソQC産生の減少についてスクリーニングする工程であって、これによりアイソQC関連疾患を治療するのに使用するための潜在的治療剤を同定する工程を含む。細胞は、アイソQC DNA構築物を含む有核細胞を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離できる。あるいは、細胞は、緑色蛍光タンパク質融合又は他の融合ポリペチドをアイソQCポリペチドと共にコードする核酸を含むDNA構築物を含み得る。
【００９０】
さらに、アイソQCポリペチドを発現する細胞を予備選別に使用して、アイソQC発現に関連する表現型を変える活性を有する潜在的治療剤として化合物を同定することができる。アイソQC変異非ヒト哺乳動物を使用するインビボ選別に伴って、適切な対照細胞を使用して該選別結果を比較できる。アイソQCを発現する細胞を使用する第一のインビトロ選別により同定された化合物の効果は、必要に応じて、本発明のアイソQC変異非ヒト哺乳動物を使用してインビボで更に試験できる。それゆえ、本発明は、例えばハイスループットスクリーニングを使用する、細胞ベースのアッセイを使用する多数の化合物の選別法、並びにAβ関連障害の動物モデルにおける治療剤として更に化合物を試験する方法を提供する。
【００９１】
ゲノムがアイソQCポリペチドをコードする導入遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック動物は、を使用して、インビボでアイソQCの生理機能を調査できる。
【００９２】
好ましい実施態様において、本発明のアイソQCトランスジェニック動物は、認められている疾患特異的動物モデルである既存の動物モデルと交雑される。当該交雑動物を使用して、前記特異的疾患の発生、経過及び重篤性における過剰発現した組換え型アイソQC及び/又はアイソQC活性増加の効果を測定するできる。
【００９３】
適切な方法は、以下の工程を含む：
(a)所望の疾患に特異的である非ヒト動物モデルと、本発明のアイソQCトランスジェニック非ヒト動物とを交雑すること；
(b) 該交雑動物及び該疾患特異的動物を繁殖及び加齢させること；
(c)該交雑動物の疾患状態を齢依存的にモニタすること；
(d)対照群として、アイソQCについてトランスジェニックでない疾患特異的動物モデルの疾患状態を齢依存的にモニタすること；
(e)該交雑動物対該疾患特異的動物（anmal）の疾患状態における差異を算出すること；及び
(f)該疾患状態におけるアイソQC導入遺伝子の効果を測定すること。
【００９４】
更に、前記交雑動物は、アイソQCの活性を減少させるエフェクタ(アイソQC阻害剤)のスクリーニング法における使用に適する。適切なスクリーニング法は、以下の工程を含む：
(a)所望の疾患に特異的である非ヒト動物モデルと、本発明のアイソQCトランスジェニック非ヒト動物とを交雑すること；
(b)試験作用物質を交雑動物の治療群に投与すること；
(c)プラセボを交雑動物の対照群に投与すること；
(d)該交雑動物の疾患状態を齢依存的にモニタすること；
(e)該対照群の疾患状態を齢依存的にモニタすること；
(f)該治療群対該対照群の疾患状態における差異を算出すること；及び、
(g)該疾患状態における該試験作用物質の効果を測定すること。
【００９５】
適切には、交雑動物は、アイソQC導入遺伝子についてヘテロ接合型である。より好ましくは、交雑動物は、アイソQC導入遺伝子についてホモ接合型である。
【００９６】
前記交雑非ヒト動物において過剰発現する組換えアイソQCは、適切には、該疾患状態において以下の効果の一つ以上をもたらす：該特異的疾患のより早期の発生、該特異的疾患の経過促進、及び/又は該特異的疾患のより重篤な経過。
【００９７】
過剰発現したアイソQCの別の効果は、交雑非ヒト動物における1以上のアイソQC基質のレベルの増加又は減少であり得る。
【００９８】
具体的な好ましい実施態様は、アイソQC阻害剤のスクリーニング法における使用である。
【００９９】
適切には、本方法は、以下から選択される疾患の治療のためのアイソQC阻害剤のスクリーニングに使用される：軽度認知障害、アルツハイマー病、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、ダウン症候群における神経変性、ハンチントン舞踏病、ケネディ病、潰瘍疾患、ヘリコバクターピロリ感染を伴う又は伴わない十二指腸癌、結腸直腸癌、Zolliger-Ellison症候群、ヘリコバクターピロリ感染を伴う又は伴わない胃癌、病原性精神病状態、精神分裂症、不妊性、新形成、炎症性宿主反応、癌、悪性転移、黒色腫、乾癬、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、膵臓炎、再狭窄、肺線維症、肝線維症、腎線維症、移植片拒絶、後天性免疫不全症候群、体液性及び細胞性免疫応答欠損、内皮における白血球接着及び遊走プロセス、摂食行動障害、睡眠-覚醒障害、エネルギー代謝のホメオスタシス制御障害、自律神経機能障害、ホルモンバランス障害又は体液の制御障害、多発性硬化症、ギランバレー症候群、及び慢性炎症性脱ミエリン化多発神経根筋障害。
【０１００】
更に好ましい実施態様において、本方法は、アルツハイマー病又はダウン症候群における神経変性の治療のためのアイソQC阻害剤のスクリーニングに使用される。
【０１０１】
更に別の好ましい実施態様において、本方法は、家族性英国型認知症又は家族性デンマーク型認知症の治療のためのアイソQC阻害剤のスクリーニングのために使用される。
【０１０２】
更に、本方法は、好ましくは、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、再狭窄及び膵臓炎から選択される疾患の治療のためのアイソQC阻害剤のスクリーニングのために使用される。
【０１０３】
アルツハイマー病、家族性英国型認知症又は家族性デンマーク型認知症、及び例えばダウン症候群における神経変性の治療のためのアイソQC阻害剤の有効性は、アルツハイマー病の既存の動物モデルで試験できる。
【０１０４】
アイソQCは、アミロイドβペプチドの凝集に関与するピログルタミン酸の形成に関与し得る。従って、上記方法が利用されるときにモニタできる適切なアイソQC基質は、[Glu3]Aβ3-40/42/43又は[Glu11]Aβ11-40/42/43から選択されるものである。これらのペプチドは、アルツハイマー病及びダウン症候群における神経変性の開始及び進行に関与する。本発明の交雑非ヒト動物において発現される組換えアイソQCは、以下の1以上の効果をもたらし得る：[pGlu3]Aβ3-40/42/43若しくは[pGlu11]Aβ11-40/42/43のうちの少なくとも1つのより早期の形成、[pGlu3]Aβ3-40/42/43若しくは[pGlu11]Aβ11-40/42/43のうちの少なくとも1つのより速い形成、又は[pGlu3]Aβ3-40/42/43若しくは[pGlu11]Aβ11-40/42/43のうちの少なくとも1つのレベルの増加。
【０１０５】
従って、交雑非ヒト動物におけるスクリーニング方法を利用することにより選択されるアイソQC阻害剤は、[pGlu3]Aβ3-40/42/43又はAβ3-40/42/43[pGlu11]のうちの少なくとも1つの形成の阻止をもたらし、それに続いてアミロイドβ-ペプチドの沈殿及び斑形成の阻止をもたらし得る。最後に、前記アイソQC阻害剤は、以下に示す効果の1以上を適切にもたらすべきものである：交雑非ヒト動物のアルツハイマー病及びダウン症候群における神経変性の発生延期、経過遅延及び/又は重篤性の減少。
【０１０６】
アルツハイマー病の適切な動物モデルは、McGowanらの文献, TRENDS in Genetics, Vol. 22, No. May 2006, pp 281-289において総説されており、以下に記載するようにPDAPP、Tg2576、APP23、TgCRND8、PSEN1M146V又はPSEN1M146L、PSAPP、APPDutch、BRI-Aβ40及びBRI-Aβ42、JNPL3、TauP301S、TauV337M、TauR406W、rTg4510、Htau、TAPP、3×TgADから選択される。アルツハイマー病の別の適切なモデルは、5XFADモデルである(Oakley H.らの文献、5つの家族性アルツハイマー病突然変異を有するトランスジェニックマウスにおける神経細胞内β-アミロイド凝集、神経変性及びニューロン欠損：アミロイドプラーク形成における潜在的因子。J Neurosci. 2006 Oct 4;26(40):10129-40)。
【０１０７】
PDAPP：頑強なプラーク病状を有する第一の変異体APPトランスジェニックモデル。マウスはインディアナ型変異（APPV717F）を有するヒトAPP cDNAを発現する。プラーク病状は、ヘミ接合型PDAPPマウスにおいて6〜9ヶ月間の間に始まる。シナプスは失われているが、明らかな細胞の損失及びNFT病状は観察されない。このモデルは、ワクチン接種治療法戦略において広く使用されてきた。
【０１０８】
Tg2576：マウスは、ハムスタープリオンプロモータの制御下で変異体APPSWEを発現する。プラーク病状は、9ヶ月齢から観察される。これらのマウスは、認知障害を有するが、細胞の損失又はNFT病状がない。最も広く使用されるトランスジェニックモデルの1つである。
【０１０９】
APP23：マウスは、Thy1プロモータの制御下で変異体APPSWEを発現する。顕著な脳血管アミロイド、アミロイド沈着が6ヶ月齢から観察され、いくつかの海馬ニューロンの損失がアミロイドプラーク形成と関連している。
【０１１０】
TgCRND8：マウスは、複数のAPP変異を発現する（スウェーデン型＋インディアナ型）。認知障害は、3ヶ月齢までにおける迅速な細胞外プラーク発達と一致している。認知障害は、Aβワクチン接種治療法によって逆転することができる。
【０１１１】
PSEN1M146V又はPSEN1M146L（それぞれ、6．2系及び8．9系）：これらのモデルは、変異体PSEN1がAβ42を選択的に上昇させることをインビボで最初に示している。明らかなプラーク病状は観察されない。
【０１１２】
PSAPP（Tg2576×PSEN1M146L、PSEN1-A246E＋APPSWE）：二遺伝子トランスジェニックマウスであり、変異体PSEN1導入遺伝子の付加によって、単一トランスジェニック変異体APPマウスと比較してアミロイド性病態が著しく促進しており、PSEN1により駆動されるAβ42の上昇がプラーク病態を亢進することを示した。
【０１１３】
APPDUTCH：マウスは、ヒトにおけるアミロイドーシス-オランダ型とともに遺伝性脳出血を生じるオランダ型変異を有するAPPを発現する。APPDUTCHマウスは、重度のコンゴーレッド親和性アミロイド血管障害を発症する。変異体PSEN1導入遺伝子の付加は、脈管及び実質性アミロイド病態におけるAβ40及びAβ42について異なる役割を示す実質に対してアミロイド病態を再配分する。
【０１１４】
BRI-Aβ40及びBRI-Aβ42：マウスは、APPを過剰発現しない個々のAβアイソフォームを発現する。Aβ42を発現するマウスのみが老年性プラーク及びCAAを発症するのに対し、BRI-Aβ40はプラークを発症せず、Aβ42がプラーク形成に必須であることを示唆している。
【０１１５】
JNPL3：マウスは、P301L変異を有する4R0N MAPTを発現する。これは顕著な混乱した病態及び細胞の損失を有する最初のトランスジェニックモデルであり、このことはMAPT単独で細胞性損傷及び損失を生じることができることを示す。JNPL3マウスは、脊髄における重度の病態及び運動ニューロン欠損による加齢随伴性運動障害を発症する。
【０１１６】
TauP301S：P301S変異を有する4R MAPTの最も短いアイソフォームを発現するトランスジェニックマウス。ホモ接合型マウスは、脳及び脊髄における広範な神経原線維の病態並びに脊髄におけるニューロン欠損とともに、5〜6ヶ月齢で重度の不全対麻痺を発症する。
【０１１７】
TauV337M：血小板由来増殖因子（PDGF）のプロモータによって駆動されるV337M変異を有する4R MAPTの低レベルの合成（1／10の内因性MAPT）。これらのマウスにおける神経原線維の病態の発症は、絶対的なMAPT細胞内濃度よりもむしろ、MAPTの性質が病態を駆動することを示唆する。
【０１１８】
TauR406W：CAMKIIプロモータの制御下でR406W変異を有する4RヒトMAPTを発現するマウス。マウスは、18ヶ月齢から前脳におけるMAPT封入を発症し、かつ連合記憶障害を有する。
【０１１９】
rTg4510：TETオフシステムを使用する誘導性MAPTトランスジェニックマウス。異常なMAPT病態が1ヶ月齢から生じる。マウスは、進行性NFT病態及び重度の細胞損失を有する。認知欠陥は2.5ヶ月齢から顕性である。導入遺伝子をオフにすることによって、認知能力が改善されるが、NT病態は悪化する。
【０１２０】
Htau：ヒトゲノムMAPTのみを発現するトランスジェニックマウス（マウスMAPTノックアウト）。Htauマウスは、高リン酸化型のMAPTを6ヶ月齢から蓄積し、15ヶ月齢の時点までチオ-S-ポジティブのNFTを発症する。
【０１２１】
TAPP（Tg2576×JNPL3）：変異体APP及び／又はAβが下流のMAPT病態に影響を及ぼすことができることを示唆する、TAPPマウスにおけるJNPL3と比較して高いMAPT前脳病態。
【０１２２】
3×TgAD：PSEN1M146V「ノックイン」背景（PSNE1-KI）における変異体APPSWE、MAPTP301Lを発現する三重トランスジェニックモデル。マウスは6ヶ月齢からプラークを、12ヶ月齢の時点からMAPT病態を発症し、APP又はAβが神経原線維病態に直接影響を及ぼすことができるという仮説を強化する。
【０１２３】
5XFAD：アミロイド前駆体タンパク質(APP)及びプレセニリン(PS1、PS2)についての遺伝子の突然変異は、β-アミロイド42(Aβ42)の産生を増加させて、家族性アルツハイマー病(FAD)を引き起こす。FAD変異APP及びPS1を発現するトランスジェニックマウスは、Aβ42を過剰産生し、ADにおいて見出されるものに類似するアミロイド斑病理学を呈するが、大部分のトランスジェニックモデルは斑をゆっくり発達させる。斑発達を加速させて非常に高い脳Aβ42レベルの効果を調査するために、5つのFAD突然変異(5XFADマウス)を共発現してAβ42産生を追加的に増加させるAPP/PS1二重トランスジェニックマウスを産生した。5XFADマウスは、ほぼ排他的にAβ42を産生し、大量の脳Aβ42レベルを迅速に蓄積する。アミロイド沈着(及びグリオーシス)は、2月齢に始まって、特に海馬台及び深皮層で非常に大きい負担に達する。5XFAD脳において(斑形成前)1.5月齢に始まる神経細胞内Aβ42蓄積は、(チオフラビンS染色により測定されるものとして)凝集し、ニューロン神経細胞体及び軸索突起内で発生する。一部のアミロイド沈着物は、神経細胞内Aβを含む形態学的に異常なニューロン神経細胞体内で生じる。シナプスマーカーであるシナプトフィジン、シンタキシン及びシナプス後肥厚-95は、5XFAD脳において経年的に減少し、皮層5及び海馬台における大きな錐体ニューロンは失われる。さらに、サイクリン依存性キナーゼ5 (p25) の活性化サブユニットのレベルは、5XFAD脳の9月齢に著しく上昇する。最後に、5XFADマウスは、Y-迷路において記憶障害を有する。
【０１２４】
適切な研究デザインは従来型である。アイソQC阻害剤は、飲用溶液若しくは食事、又は任意の他の従来型投与経路、例えば経口、静注又は皮下を介して適用できる。
【０１２５】
アルツハイマー病及びダウン症候群における神経変性に関して、アイソQC阻害剤の有効性は、SDS及びギ酸を使用するAβの経時的な抽出によりアッセイできる。はじめに、最も高いAβ濃度を含むSDS及びギ酸画分は、全Aβ(x-42)又はAβ(x-40)並びに[pGlu3]Aβ3-40/42/43又は[pGlu11]Aβ11-40/42/43を定量化するELISAを使用して解析できる。特に、適切なアイソQC阻害剤は、[pGlu3]Aβ3-40及び／又は[pGlu3]Aβ3-42の形成を減少させることができる。 [pGlu11]Aβ11-40及び／又は[pGlu11]Aβ11-42の形成を減少させることができるアイソQC阻害剤さえ好ましい。
【０１２６】
［pGlu3］Aβ3-42の定量化のためのELISAキットは、IBL，カタログ番号JP27716から市販されている。
【０１２７】
［pGlu3］Aβ3-40の定量化のためのELISAは、2008年にSchillingら（Schilling S, Appl T, Hoffmann T, Cynis H, Schulz K, Jagla W, Friedrich D, Wermann M, Buchholz M, Heiser U, von Horsten S, Demuth HUの文献（「グルタミニルシクラーゼの阻害はインビボ／インサイチュウでの皮質内／海馬への微量注入後のpGlu-Aβ形成を予防する。（Inhibition of glutaminyl cyclase prevents pGlu-Abeta formation after intracortical／hippocampal microinjection in vivo／in situ.）」, J Neurochem. 2008 Aug；106（3）：1225-36））に記載されている。
【０１２８】
アイソQC阻害剤治療の後に引き続き、該交雑非ヒト動物は、行動変化に関して試験できる。適切な行動試験のパラダイムは、例えば、海馬依存性学習の異なる態様に対処するものである。そのような神経学的試験の例は、モーリス水迷路試験、及び前後関係記憶変化に注目する恐怖条件付け試験である (Comery, TAらの文献, (2005), J Neurosci 25:8898-8902; Jacobsen JSらの文献, (2006), Proc Natl. Acad. Sci USA 103:5161-5166)。更に適切な行動試験は、本願の実施例で概説される。適切には、本発明のスクリーニング法を利用することにより選択されるアイソQC阻害剤は、行動変化を減少させるか、又は交雑非ヒト動物の行動をより適切に改善する。
【０１２９】
本発明により意図される炎症性疾患、例えばアテローム性動脈硬化の動物モデルは、既存のアテローム性動脈硬化動物モデル、例えばapoE欠損マウスであり得る。アポリポタンパクEノックアウトマウスモデルは、アテローム性動脈硬化の主要なモデルの1つになった(Arterioscler Thromh Vase Biol., 24: 1006-1014, 2004; Trends Cardiovasc Med, 14: 187-190, 2004)。本発明の交雑非ヒト動物を用いる研究は、Johnsonらの文献「Circulation, 111 : 1422-1430, 2005」に記載されるように、又はその変更態様を使用して、実施できる。アポリポタンパクE欠損マウスモデルアポリポタンパクE (apoE)は、カイロミクロン、VLDL及びHDLを含むいくつかの血清リポタンパク質の成分である。これらのリポタンパク質粒子の受容体媒介型異化は、LDL受容体(LDLR)を用いる、又はLDLR関連タンパク質(LRP)を用いる、apoEの相互作用により媒介される。ApoE欠損マウスは、高コレステロール血症を呈し、ヒトにおいて見出されるものと類似の複合型アテローム性病変を発症する。本発明の化合物の有効性は、この動物モデルを使用しても評価した。
【０１３０】
前記スクリーニング法における使用に適する炎症性疾患のための他の動物モデルには、炎症が人工刺激の使用により開始されるものを含む。当該動物モデルは、チオグリコール酸誘導型炎症モデル、コラーゲン誘導型関節炎モデル、抗体誘導型関節炎モデル、及び再狭窄モデル(例えば、バルーンカテーテル損傷に応答してのマウス頸動脈における検査化合物の効果)である。当該人工刺激を使用して、本発明の交雑非ヒト動物モデルにおける炎症反応を開始させることができる。
【０１３１】
炎症性疾患において、走化性サイトカインが役割を担う。走化性サイトカイン(ケモカイン)は、白血球を引きつけて活性化させるタンパク質であり、炎症において基本的な役割を果たすと考えられている。ケモカインは、N末端システイン残基の出現により分類される4つの群(「C」-ケモカイン；「CC」-ケモカイン；「CXC」-ケモカイン、及び「CX3C」-ケモカイン)に分けられる。「CXC」-ケモカインは、好中球に優先的に作用する。対照的に、「CC」-ケモカインは、単球を炎症部位に優先的に引きつける。単球浸潤は、多くの疾患条件において重要な事象であると考えられている (Gerard, C.及びRollins, B. J.の文献 (2001) Nat.Immunol 2, 108-115; Bhatia, M.らの文献, (2005) Pancreatology. 5, 132-144; Kitamoto, S., Egashira, K.及びTakeshita, A.の文献 (2003) J Pharmacol Sci. 91, 192-196)。ケモカインの1つのファミリーとしてのMCPファミリーは、4つのメンバー(MCP-1-4)からなり、これらは、単球を引きつける嗜好性を示すが潜在力において差異を示す(Luini, W.らの文献, (1994) Cytokine 6, 28-31; Uguccioni, M.らの文献, (1995) Eur J Immunol 25, 64-688)。CCL18は、N末端にグルタミン(Gln)残基を有しており、それゆえにアイソQCの基質である。
【０１３２】
したがって、アイソQCは、ケモカインCCL2、CCL8、CCL7、CCL13、CCL 16及びCCL 18のN末端でピログルタミン酸の形成に関与し、これはプロテアーゼ及びアミノペプチダーゼによる分解に対し当該ケモカインを安定化させ、それにより走化性における生物学的活性を維持できる。本発明の交雑非ヒト動物において発現される組換えアイソQCは、以下の1以上の効果をもたらし得る：[pGlu1]CCL2、[pGlu1]CCL8、[pGlu1]CCL7、[pGlu1]CCL13、[pGlu1]CCL 16若しくは[pGlu1]CCL 18のうちの少なくとも1つの早期形成、[pGlu1]CCL2、[pGlu1]CCL8、[pGlu1]CCL7、[pGlu1]CCL13、[pGlu1]CCL 16若しくは[pGlu1]CCL 18のうちの少なくとも1つのより早い形成、又は[pGlu1]CCL2、[pGlu1]CCL8、[pGlu1]CCL7、[pGlu1]CCL13、[pGlu1]CCL 16若しくは[pGlu1]CCL 18のうちの少なくとも1つのレベルの増大。
【０１３３】
交雑非ヒト動物におけるスクリーニング方法を利用することにより選択されるアイソQC阻害剤は、それゆえ、[pGlu1]CCL2、[pGlu1]CCL8、[pGlu1]CCL7、[pGlu1]CCL13、[pGlu1]CCL 16又は [pGlu1]CCL 18の少なくとも１つの形成の阻止をもたらす。
【０１３４】
アイソQC阻害剤の有効性は、インビトロ及びインビボでMCP-1により誘導される単球細胞の走化性の阻害を測定することにより、又は、チオグリコール酸塩、コラーゲン、抗体又はLPS誘導により引き起こされる炎症反応を測定することにより、アッセイできる。有効なアイソQC阻害剤は、チオグリコール酸塩、コラーゲン、抗体又は炎症のLPS誘導の後に低減した単球浸潤を示さなければならない。
【０１３５】
更に、[pGlu1]CCL2、[pGlu1]CCL8、[pGlu1]CCL7、[pGlu1]CCL13、[pGlu1]CCL 16又は[pGlu1]CCL 18の形成の阻害は、インビトロで、及びインビボで、試験できる。
【０１３６】
一実施態様において、本発明は、本発明の動物モデルの使用により選択されるものとして、軽度認知障害、アルツハイマー病、ダウン症候群、家族性デンマーク型認知症及び家族性英国型認知症におけるpGlu-アミロイドペプチド形成の抑制のためのアイソQCの活性低減エフェクタの使用を提供する。
【０１３７】
さらなる実施態様において、本発明は、胃腸管細胞増殖、特に胃粘膜細胞増殖、上皮細胞増殖、酸を産生する壁細胞及びヒスタミンを分泌する腸クロム親和様（ECL）細胞の分化、並びにECL細胞におけるヒスタミンの合成及び貯蔵と関連した遺伝子発現の刺激のための、並びに活性型［pGlu1］-ガストリンの濃度を維持すること又は増大させることによる哺乳動物における急性の酸分泌の刺激のための、本発明の動物モデルを使用して選択されるアイソQCの活性増大エフェクタの使用を提供する。
【０１３８】
さらなる実施態様において、本発明は、不活性型［Gln1］ガストリンの活性型［pGlu1］ガストリンへの変換速度を低下させることによって、哺乳動物におけるヘリコバクターピロリ感染を伴う又は伴わない十二指腸潰瘍疾患及び胃癌の治療のための、本発明の動物モデルを使用して選択されるアイソQCの活性低減エフェクタの使用を提供する。
【０１３９】
別の実施態様において、本発明は、抗精神病薬の製造のための、及び／又は哺乳動物における統合失調症の治療のための、本発明の動物モデルを使用して選択されるアイソQCの活性増大エフェクタの使用を提供する。アイソQCのエフェクタは、活性型［pGlul］ニューロテンシンの濃度を維持するか又は増大させるかのいずれかである。
【０１４０】
さらなる実施態様において、本発明は、受精抑制薬の製造のための、及び／又は哺乳動物における受精能を減少させるための、本発明の動物モデルを使用して選択されるアイソQC活性低減エフェクタの使用を提供する。アイソQCの活性低減エフェクタは、活性型［pGlu1］FPPの濃度を減少させて、精子の受精能獲得の予防、及び精細胞の非活性化を引き起こす。対照的に、アイソQCの活性増大エフェクタは、雄における受精能を刺激して、不妊症を治療することができることを示すことができた。
【０１４１】
別の実施態様において、本発明は、骨髄系前駆細胞の増殖の抑制、腫瘍、炎症性宿主反応、癌、悪性転移、メラノーマ、乾癬、関節リウマチ、粥状硬化、肺線維症、肝線維症、腎線維症、移植片拒絶反応、後天性免疫不全症候群、液性の及び細胞媒介型免疫応答の障害、内皮における白血球接着及び遊走過程など、病態生理学的状態の治療のための医薬の製造のための、本発明の動物モデルを使用して選択されるアイソQCのエフェクタの使用を提供する。
【０１４２】
さらなる実施態様において、本発明は、摂食障害及び睡眠-覚醒状態、エネルギー代謝の恒常性制御の障害、自律神経機能の障害、ホルモンバランスの障害、並びに体液の制御の障害の治療のための医薬の製造のための、本発明の動物モデルを使用して選択されるアイソQCのエフェクタの使用を提供する。
【０１４３】
さらなる実施態様において、本発明は、パーキンソン病、及びハンチントン病の治療のための医薬の製造のための、本発明の動物モデルを使用して選択されるアイソQCのエフェクタの使用を提供する。
【０１４４】
別の実施態様において、本発明は、上記に選択された検査薬を使用することによって、アイソQCの酵素活性を減少させ又は阻害する一般的な方法を提供する。
【０１４５】
上記のスクリーニング方法によって選択された作用物質は、アイソQCの少なくとも1つの基質の変換を低減することによって（負のエフェクタ、阻害剤）、又はアイソQCの少なくとも1つの基質の変換を増大させることによって（正のエフェクタ、活性化因子）、作用することができる。
【０１４６】
本発明の更なる態様では、以下を含む、アイソQC関連疾患の治療又は予防の方法が提供される：
(a)選択された試験作用物質を本明細書で定義されるように投与すること；及び、
(b)アイソQC関連疾患の臨床インデックスの減少について患者をモニタすること。
【０１４７】
一実施態様において、アイソQC関連疾患は、アルツハイマー病である。
【０１４８】
本発明の更なる態様では、アルツハイマー病などのアイソQC関連疾患の治療及び/又は予防における使用のための本明細書で定義される試験作用物質が提供される。
【０１４９】
本発明の化合物は、酸付加塩、特に医薬として許容し得る酸付加塩に変換できる。
【０１５０】
本発明の化合物の塩は、無機塩又は有機塩の形態でもよい。
【０１５１】
本発明の化合物は、酸付加塩、特に医薬として許容し得る酸付加塩に変換することができる。医薬として許容し得る塩は、一般に、塩基性側鎖が無機酸又は有機酸でプロトン化された形態をとる。代表的な有機酸又は無機酸には、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、シュウ酸、パモ酸、2-ナフタレンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、サッカリン酸、又はトリフルオロ酢酸を含む。本発明の化合物の医薬として許容し得るすべての酸付加塩形態は、本発明の範囲に包含されることが意図される。
【０１５２】
遊離化合物とこれらの塩の形態の化合物との間の緊密な関係からみて、化合物が、この状況において言及されるときはいつでも、対応する塩も意図されるが、ただし、これが該状況下で可能であり又は適切であることを条件とする。
【０１５３】
本発明に従った化合物が少なくとも1つのキラル中心を有する場合、該化合物は、従って鏡像異性体として存在してもよい。該化合物が2つ以上のキラル中心を有する場合、該化合物は、加えてジアステレオマーとして存在してもよい。このような異性体及び該異性体の混合物がすべて、本発明の範囲内に包含されることを理解すべきである。さらに、化合物の結晶形態のいくつかは、多形として存在してもよく、従って本発明に含まれることが意図される。加えて、化合物のいくつかは、水（すなわち、水和物）又は共通の有機溶媒と溶媒和物を形成してもよく、このような溶媒和物も本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【０１５４】
また、それらの塩を含む化合物は、これらの水和物の形態で得ることができ、又はこれらの結晶化のために使用されるその他の溶媒を含むことができる。
【０１５５】
さらなる実施態様において、本発明は、アイソQC酵素活性の制御によって媒介される状態を予防し又は治療する必要のある対象において、該状態を予防し又は治療する方法であって、状態を治療するために治療的に有効な量及び投与計画で、本発明の任意の化合物又はその医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。加えて、本発明は、対象においてアイソQC活性の制御によって媒介される状態の予防又は治療のための医薬の製造のための、本発明の化合物及びこれらの対応する医薬として許容し得る酸付加塩形態の使用を含む。該化合物は、静脈内、経口、皮下、筋肉内、皮内、非経口的、及びこれらの組み合わせを含むがそれらに限定されるわけではない任意の従来の投与経路によって患者に投与してもよい。
【０１５６】
さらに好ましい実施の形態において、本発明は、少なくとも1つの本発明の化合物、又は試験作用物質又はその塩を、任意に1つ以上の医薬として許容し得る担体及び／又は溶媒と組み合わせて含む医薬組成物に、いわば医薬に関する。
【０１５７】
前記医薬組成物は、例えば、非経口製剤又は経腸製剤の形態であってもよく、かつ適切な担体を含んでいてもよく、又は該医薬組成物は、経口投与に適した適切な担体を含んでいてもよい経口製剤の形態であってもよい。好ましくは、該医薬組成物は、経口製剤の形態である。
【０１５８】
本発明に従って投与されるアイソQC活性のエフェクタは、医薬として投与可能な製剤若しくは製剤複合体において、哺乳動物におけるアイソQCタンパク質濃度を減少させる、阻害剤として、又は阻害剤、基質、偽基質、アイソQC発現の阻害剤、結合タンパク質、若しくはこれらの酵素タンパク質の抗体と組み合わせて使用してもよい。本発明の化合物は、治療を患者及び疾患に対して個々に調整することができ、特に個々の不耐性、アレルギー、及び副作用を回避することができる。
【０１５９】
また、前記化合物は、時間の関数として、異なる程度の活性を示す。これにより、治療を提供する医師は、個々の患者の状況に対して異なって反応する機会が与えられ：彼は、正確に、一方では、作用開始の速度を、もう一方では、作用の期間及び特に作用の強度を調整することができる。
【０１６０】
本発明に従った好ましい治療方法は、哺乳動物においてアイソQC酵素活性の制御によって媒介される状態の予防又は治療のための新たなアプローチになる。これは、特に哺乳動物、特にヒトの医療における生理活性のあるアイソQC基質のアンバランスな濃度に基づく疾患の治療において、都合よく簡便であり、市販の適用の余地があり、かつ使用に適している。
【０１６１】
前記化合物は、例えば、従来技術から知られている希釈剤、賦形剤、及び／又は担体のような通例の添加物と組み合わせて活性成分を含む医薬製剤の形態で、都合よく投与してもよい。例えば、該化合物は、非経口的に（例えば、生理塩類溶液における静脈内投与）、又は経腸的に投与することができる（例えば、通例の担体と共に製剤されたものを経口的に）。
【０１６２】
前記化合物の内因的安定性及び該化合物の生物学的利用能に応じて、血糖値の望ましい正常化を達成するために、化合物の1回以上の用量を1日につき与えることができる。例えば、ヒトにおけるこのような薬用量範囲は、1日あたり約0.01mg〜250.0mgの範囲であってもよく、好ましくは、体重1kgあたり約0.01〜100mgの範囲であってもよい。
【０１６３】
哺乳動物に対してアイソQC活性のエフェクタを投与することにより、軽度認知障害、アルツハイマー病、ダウン症候群、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症、ハンチントン病、ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）感染を伴う又は伴わない潰瘍疾患及び胃癌、病原性精神病性状態、統合失調症、不妊症、腫瘍、炎症性宿主反応、癌、乾癬、関節リウマチ、粥状硬化、再狭窄、肺線維症、肝線維症、腎線維症、移植片拒絶反応、後天性免疫不全症候群、液性の及び細胞媒介型免疫応答の障害、内皮における白血球接着及び遊走過程、摂食障害、睡眠-覚醒状態、エネルギー代謝の恒常性制御の障害、自律神経機能の障害、ホルモンバランスの障害、並びに体液の制御障害から選択されたアイソQC関連状態を予防し又は軽減し又は治療することが可能であり得る。
【０１６４】
さらに、哺乳動物に対してアイソQC活性のエフェクタを投与することにより、胃腸管細胞増殖、好ましくは胃粘膜細胞、上皮細胞の増殖、急性の酸分泌、並びに酸を産生する壁細胞及びヒスタミンを分泌する腸クロム親和様細胞の分化を刺激することが可能であろう。
【０１６５】
加えて、哺乳動物に対するアイソQC阻害剤の投与は、従って、雄の受精能を抑制する精細胞機能の喪失を引き起こすかもしれない。従って、本（prevent）発明は、雄の受精能の制御及び制御のための方法、並びに雄のための避妊薬物の製造のためのアイソQCの活性低減エフェクタの使用を提供する。
【０１６６】
さらに、哺乳動物に対してアイソQC活性のエフェクタを投与することにより、骨髄系前駆細胞の増殖を抑制することが可能であるかもしれない。
【０１６７】
従って、本発明に従って使用される化合物は、それ自体公知の様式で、例えば錠剤、カプセル、糖衣錠、丸剤、坐剤、顆粒、エアロゾル、シロップ、液体、固体、及びクリーム様の乳剤及び懸濁液、並びに溶液などの従来の製剤に、不活性な、非毒性の、医薬として適切な担体及び添加物又は溶媒を使用して変換することができる。これらの製剤の各々において、治療的に有効な化合物は、好ましくは総混合物のおよそ0.1〜80重量％、より好ましくは1〜50重量％の濃度で、すなわち、言及した薬用量の許容範囲が得られるのに十分な量で存在する。
【０１６８】
物質は、糖衣錠、カプセル、かむことができるカプセル、錠剤、ドロップ、シロップの形態の医薬として、又は坐剤として若しくは点鼻スプレーとしても、使用することができる。
【０１６９】
製剤は、例えば溶媒及び／又は担体を使用して、任意に乳化剤及び／又は分散剤を使用して、活性成分を希釈することによって、都合よく調製してもよく、例えば、水が希釈剤として使用される場合、有機溶媒を補助的な溶媒として任意に使用することができる。
【０１７０】
本発明と関連して有用な賦形剤の例には、下記を含む：水、パラフィン（例えば、天然の油画分）、植物油（例えば、菜種油、落花生油、ゴマ油）、アルコール（例えば、エチルアルコール、グリセロール）、グリコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）などの非毒性有機溶媒；例えば、天然の粉末状ミネラル（例えば、高度に分したシリカ、ケイ酸）、糖（例えば、粗糖、乳糖、及びデキストロース）などの固体担体；非イオン性及び陰イオン性の乳化剤などの乳化剤（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、スルホン酸アルキル、及びスルホン酸アリール）、分散剤（例えば、リグニン、亜硫酸蒸煮液、メチルセルロース、デンプン、及びポリビニルピロリドン）、及び潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ステアリン酸、及びラウリル硫酸ナトリウム）、及び任意に調味料。
【０１７１】
投与は、通常の様式で、好ましくは経腸的又は非経口的に、特に経口的に実施してもよい。経腸投与の場合、記載した担体に加えて、錠剤は、デンプン、好ましくはジャガイモデンプン、ゼラチン等などの種々の添加物と共に、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、及びリン酸カルシウムなどのさらなる添加物を含んでいてもよい。さらに、錠剤化するために、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及び滑石などの潤滑剤を付随して使用することができる。経口投与が意図される水性懸濁液及び／又はエリキシル剤の場合、上記の賦形剤に加えて、種々の食味調整剤又は着色料を活性成分に添加することができる。
【０１７２】
非経口投与の場合、適切な液体担体を使用する活性成分の溶液を使用することができる。一般に、静脈内投与の場合、有効な結果を得るために1日あたりおよそ0.01〜2.0mg／体重kg、好ましくはおよそ0.01〜1.0mg／体重kgの量を投与することが有利であることが見いだされており、経腸投与の場合、薬用量は、1日あたりおよそ0.01〜2mg／体重kgに、好ましくはおよそ0.01〜1mg／体重kgである。
【０１７３】
それにもかかわらず場合によっては、実験動物若しくは患者の体重に応じて、又は投与経路のタイプに応じて、それだけでなく、動物の種及び医薬に対するその個々の反応又は投与が実施される間隔に基づいて、明示された量から逸脱することが必要であるかもしれない。従って、場合によっては、上記の最小量未満の使用で十分かもしれないが、他の場合には、言及した上限を上回られなければならないであろう。比較的多量が投与されている場合、該量を1日にわたって数回の単回用量に分けることが望ましいかもしれない。ヒトの医療における投与のためには、同じ薬用量の許容範囲が提供される。上記の所見は、その場合に類似して適用される。
【０１７４】
医薬製剤の例については、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれるWO 2004／098625の50〜52ページの実施例に対して具体的に参照される。
【０１７５】
上記の開示は、一般に本発明を記載している。より完全な理解は、下記の実施例を参照することによって得ることができる。これらの実施例は、単に例証の目的のみのために記載してあり、本発明の範囲を限定するよう意図するものではない。具体的な用語を本明細書に使用したが、このような用語は、説明的な意味で意図されており、限定目的のためではない。
【実施例】
【０１７６】
（実施例1）:トランスジェニックマウスの製造
（トランスジェニックマウス）
ヒトグルタミニルシクラーゼのアイソザイムは、ヒト肝細胞癌細胞株Hep-G2において同定された。該cDNAは、標準的な分子生物学技術を適用して単離され、ベクターpPCRScript(Stratagene)にサブクローン化された。正確な配列は、DNA塩基配列測定により検査された。その後、それぞれのcDNAは、標準的な分子生物学技術を適用するマウスThy-1配列を含むベクターpUC18に挿入した。全ての構築物は、シークエンシングにより検査した。トランスジェニックマウスは、受精C57Bl6卵母細胞(PNI、JSW, Graz, Austriaにより産生された)の雄前核注射(PNI)により生成した。注射された卵母細胞は、それから、満期発生のため里親マウスに移植した。結果として生じた子孫(5匹の創始体)はPCR解析により導入遺伝子組込みについて更に特徴づけ、C57Bl6野生型マウスと交配した後、その結果として生じたF1世代をRT-PCRによる導入遺伝子発現の解析に使用した(各系統につきｎ＝3〜5)。低い発現レベル、中間の発現レベル、及び高い発現レベルを有する3系統を、それぞれ、更なる繁殖及び交雑育種実験のために選択した(tgアイソQC13、tgアイソQC20及びtgアイソQC31)。
【０１７７】
（PCR遺伝子型同定戦略）
導入遺伝子のランダムな組込みの検出のためのスクリーニングは、PCR増幅により達成された。2つのPCRが設計された(図2を参照):
・PCR1は、導入遺伝子のランダムな組込み事象を効率的に検出するように設計されている。選択されたプライマー対は、導入遺伝子配列内の短いDNA配列の増幅を可能にし、特異的な486bpのPCR生成物を産生する。
・PCR2は、導入遺伝子発現カセットの完全性を評価するように設計されている。選択されたプライマー対は、5'プロモータ領域及びThy1遺伝子の3'領域から伸びているDNA配列の増幅を可能にし、特異的な7037bpのPCR生成物を産生する。Thy1プロモータカセットがマウスゲノム配列に由来するので、該導入遺伝子発現カセットの完全性を調査するために使用されるPCR選別は、内因性Thy1遺伝子に由来する7413bp生成物の増幅ももたらす。
【０１７８】
【表２】
2013541938.tif 000005
【０１７９】
これらの試験は、プライマーの特異性及びPCR反応の感受性をモニタするために実施した。いったん確立したら、これらのPCR条件は、F0世代(創始動物)を選別するために使用した。
【０１８０】
【表３】
2013541938.tif 000006
【０１８１】
【表４】
2013541938.tif 000007
【０１８２】
（tgアイソQC遺伝子導入系：導入遺伝子発現レベル）
トランスジェニック動物の生成が成功したことを証明するために、野生型及びヘテロ接合型トランスジェニックマウスの脳ホモジェネートの酵素活性を評価した。当該戦略が成功である場合、その後、アイソQC活性の顕著な増加が予想された。細胞ホモジネートにおけるアイソQC又はQCにより触媒されるL-グルタミニル-β-ナフチルアミンからL-pGlu-β-ナフチルアミンの形成の検出に基づく方法を適用して、酵素活性を測定した(Cynis, H.らの文献 2006 Biochim Biophys Acta 1764, 1618-1625)。手短にいうと、本アッセイは、H-Gln-βNAのpGlu-βNAへの変換に基づく。サンプルは、25mM MOPS, pH 7.0、0.1mM N-エチルマレインイミド(NEM)及び酵素溶液(最終容積1ml)中の50μM H-Gln-βNAから構成された。基質及びNEMは、15分間、30℃で、前インキュベートした。該サンプルを4℃で20分間、16,000×gで遠心分離した。反応は、100μlの脳ホモジェネートの添加によって開始した。反応混合物を30℃で更にインキュベートし、サーモミキサー(Eppendorf、Germany)において300rpmで常に振盪した。試験用試料は、0〜45分の異なる時点で採取した。反応は、4分間煮沸することによって、ただちに止めた。試験用試料は氷冷し、-20℃で保存した。解析のために、サンプルを氷上解凍し、16,000×gで20分間4℃で遠心分離した。全てのHPLC測定は、RP18 LiChroCART HPLC-カートリッジ及びHPLCシステムD-7000(Merck-Hitachi)を使用して実施した。手短にいうと、20μlのサンプルを注入し、8%から20%の増加濃度の溶媒A(0.1% TFAを含むアセトニトリル)の溶媒B(0.1% TFAを含むH2O)溶液により、分離した。アイソQCのQC活性は、アッセイ条件で測定されるpGlu-βNA(Bachem、Bubendorf、Switzerland)の標準曲線から定量化した。
【０１８３】
解析の結果は、図8に示されている。全ての遺伝子導入系は、脳においてアイソQC活性の顕著な増加を示し、これは、当該タンパク質の発現及びトランスジェニックマウスの成功的生成を示唆した。測定は、該マウスにおけるアイソQCの発現の異なる程度を検出するのに有用であった：最も高い発現率はtgマウス系31で観測され、最も低い発現はtgマウス系20で観測された。しかしながら、マウス系tgアイソQC 20においてさえも、活性は、wtマウスと比較して、10倍高かった。
【０１８４】
（免疫組織化学及び組織学）
（方法）：
免疫組織化学的染色のために、2月齢マウス(tgアイソQC31ヘテロ接合型、野生型、及びQPCTLノックアウト)を二酸化炭素で安楽死させ、137mM NaCl、22mM デキストロース、23mM スクロース、0.2mM CaCl2及び0.2mM カコジル酸ナトリウム、pH 7.3からなる洗浄バッファ(0℃)、及びその後に1.3M パラホルムアルデヒド、0.2M スクロース及び104mM カコジル酸ナトリウムからなる固定バッファで経心的に潅流させた。脳サンプルは、慎重に解剖し、4℃の固定バッファで後固定して、ゼラチンマルチ脳マトリックスに共に包埋した。脳は、滑走式ミクロトームを使用して凍結切片化した(30μm)。免疫組織化学のために、切片は、ABC法(ビオチン化された二次抗体と結合するアビジン-ビオチン複合体)及び基質としてDABを使用して、染色された遊離浮遊染色した。QPCTL標識のために、ウサギにおいて調製されたアフィニティ精製ポリクローナルアイソQC3285抗体(Probiodrug)は一次抗体として1:1000で使用した。ニューロン標識のために、マウスにおいて調製されたモノクローナルb-NeuN抗体(AbCam)は一次抗体として1:1500で使用した。アストログリア標識のために、ウサギにおいて調製されたポリクローナルGFAP抗体(Dako)は一次抗体として1:50000で使用した。ミクログリア標識のために、ウサギにおいて調製されたポリクローナルIba-1抗体(Wako)は抗体として1:10000で使用した。各染色のために、適切なビオチン化された二次抗体を1:250希釈で使用した。
【０１８５】
免疫蛍光染色のために、2月齢マウス(野生型、tgアイソQC13ヘテロ接合型、tgアイソQC20ヘテロ接合型、及びtgアイソQC31ヘテロ接合型)は二酸化炭素で安楽死させ、リン酸塩緩衝食塩水(PBS)で経心的に潅流した。脳は、解剖してサンプル片(~3×5mm)に切り分け、HOPE I(hepesグルタミン酸バッファ媒介型有機溶媒保護効果)溶液(終夜/4℃)で浸漬固定した。脳片は、HOPE II溶液(2時間/0℃)、アセトン(3×2時間/0℃)でインキュベートし、低融点パラフィン(終夜/55℃)で予熱した。10μmの冠状切片は、滑走式ミクロトーム上でパラフィンブロックから切り、顕微鏡スライド上に移した。スライドは、抗原検索のため、20% ギ酸にてインキュベートした。内因性ペルオキシダーゼは、0.5% H2O2の0.25% トリトンX 100含有TBS溶液で不活性化させた(10分)。不特定の結合部は、5% 正常ヤギ血清の0.25% トリトンX 100含有TBSでブロックした(1時間)。ニューロン標識のために、マウスにおいて調製されたモノクローナルb-NeuN抗体(AbCam)は一次抗体(4℃/終夜)として1:2000で使用した。アストログリア標識のために、ウサギにおいて調製されたポリクローナルGFAP抗体(Dako)は一次抗体(4℃/終夜)として1:2000で使用した。二次抗体として、Cy2標識ヤギ-抗ウサギ及びCy3標識ヤギ-抗マウスを使用した(1:500；1時間/室温)。
【０１８６】
（結果）：
アイソQCの過剰発現は、ニューロンのゴルジ装置におけるアイソQCシグナルの明らかな増加をもたらし、これはQPCTL-ノックアウトマウスにおいてはみられなかった(図3)。この過剰発現は、2月齢のtgアイソQCマウスの海馬においてみることのできる発現依存的な神経炎症をもたらし(図7)、これは1月齢ではみられなかった(データは示されていない)。炎症は、アストログリア(図5)及びミクログリア(図6)の活性化により特徴づけられ、海馬のCA1領域においてみることのできるニューロン細胞欠損(図4)を伴う。
【０１８７】
（実施例2）：行動試験
行動的特徴付けのため、18匹の雌からなる表現型のセットを生成した(9匹の野生型及び9匹のヘテロ接合マウス)。3月齢の当該動物は、9つの連続的な試験のバッテリー、及びその後の4及び6月齢での一次選別における短い試験で調査した。
【０１８８】
（自動化ホームケージ行動解析）
方法：自発運動量及び摂取挙動の日周期パターンは、PhenoMasterシステム(TSE Systems、Bad Homburg、Germany)を使用して評価した。2つの水平に支えられた赤外線センサーフレームは、x/y-レベルの移動及びz-レベルの立ち上がり行動事象を検出し、一方で、水及び摂食量は、2つのバランスで測定した。全4つのパラメータは、136時間(6.5日)、1分間隔の合計として、自動的に記録した。実験は12時間明/12時間暗サイクル(6:00に明、18:00に暗)の下で行われ、動物は、個々の観測装置(格子蓋を有する標準III型ケージ)において自由に水及び食餌を受けた。
【０１８９】
結果：野生型動物と比較して、ヘテロ接合型tgアイソQCマウスは、x/y-レベルにおいて自発運動量の45% 増加 (図9(a))並びに136時間の調査期間にわたる立ち上がり活性の120% 増加(図10(a)) を示した。この変化は、暗サイクルにおいて観測され、立ち上がり活性の場合、はじめの4時間の光相においても観測された(図9(b)及び10(b))。摂取挙動の解析は、両方の遺伝子型群において、ほとんど同一の摂水及び摂食レベルを示した(図11)。日周期活性パターンも、見かけ上のシフトを示さなかった。
【０１９０】
（暗明ボックス試験）
方法：マウスの、新規環境探索に対する自然な葛藤、及び有害オープンフィールドを回避する傾向を利用する暗明ボックス試験を使用して、不安挙動の調査を実施した(Crawley J. N.の文献 (2007) 「私のマウスはどうしたの：不安関連挙動（What´s Wrong With My Mouse: Anxiety-Related Behaviors.）」 Wiley, 第2版, 240-241)。暗-明ボックスモジュール(TSE Systems、Bad Homburg、Germany)は、小狭通路により連結されている、大きく(34×28 cm)開いており明るく照らされた(700-1000ルクス)区画及び小さく(16×28 cm)閉じた暗い(1-2ルクス)区画の2つの区画に不均等に分けられたプレキシグラス室から構成される。動物を明るく照らされたアリーナに個別的に置き、10分間、自由に両区画を探索させた。明区画の滞在時間は、不安レベルの指数とした。
結果：ヘテロ接合型tgアイソQCマウスは、野生型腹子と比較して、明区画における滞在時間が大きく減少した(約40%)ことが示された(図12)。
【０１９１】
（一次選別）
方法：動物の全般的健康状態、神経学的反射及び感覚機能(筋肉及び下側運動ニューロン機能、脊髄小脳の知覚的神経精神医学的及び自律神経的機能)を促し、更に行動アッセイを妨げることができる一次選別を使用した。これは、観測的な評価により行動的及び機能的プロファイルを提供するSHIRPAプロトコルの指針 (Rogers D.C.らの文献、1997、「マウス表現型の行動的及び機能的解析：SHIRPA（網羅的表現型調査用プロトコルの提案）（Behavioral and functional analysis of mouse phenotype: SHIRPA, a proposed protocol for comprehensive phenotype assessment.）」、Mamm Genome, 8:711-713)に基づいた。調査は、家庭用ケージにおける社会的行動 (「ホームケージ観測」)、及びその後の90秒間の透明なプレキシグラスアリーナの不乱行動(「個々の観測」) を観測することで始めた。マウス挙動のこのモニタリングの後、以下の更なる特徴付けのための短い一連の試験のバッテリーが続いた：音響驚愕反射、懸垂行動、視覚性配置、落下行動、立直り反射、姿勢反射、負の走地性、ワイヤ懸垂、耳攣縮、ひげ攣縮、及び瞬目。最後に評価を完了するために、動物は、形態学的異常及び重量異常について測定した。
【０１９２】
結果：約3月齢ですでに、ヘテロ接合型tgアイソQC動物は、一次選別において興奮性及び機能亢進的挙動を示した。ホーム及び観測ケージの隅における集中的ジャンプ、並びに個々の観測及び懸垂行動における非常に速い動きは、この活動亢進の主要な特徴であった。更に、重量は、WT腹子と比較して、HETにおいて著しく減少していた(p＜0.01、図13)。
【０１９３】
4及び6月齢での一次選別検査は、3月齢の動物に見られたように、ヘテロ接合マウスにおいて同じ表現型異常を示した。さらに、懸垂行動の間の痙攣、及びワイヤ懸垂アッセイにおける初期の落下は、HET tgアイソQCマウスにおいて、高い割合で検出できた。6月齢で、重量の相違が見出せたが、統計的有意差はなかった。
【０１９４】
（ポールアッセイ）
方法：ポールは、運動調整欠陥のための簡易試験として使用した。それは、滑り止めテープで包まれ、プラスチックボールを頂端に有し、重いプラットフォーム上に垂直に挿入された金属ポール(直径: 1.5cm、長さ: 50cm)から構成される。試験するために、動物は直接ボール下に頭を上にして置き、自身を下方に向ける時間(t-ターン)及びポール長を下る時間(t-合計)を測定した(カットオフ時間:120秒)。異常な活動（例えば、落下、ジャンプ、摺動)は、120秒として記録した。5回の治験を通じて最善の成績を解析に使用した。
結果：ポールにおける成績は、両方の遺伝子型群間で同等であった(図14)。
【０１９５】
（ロータロッド）
方法：ロータロッドは、齧歯動物の神経筋成績を調査するために広く使われている標準試験である。動物はロッドから落ちることを回避するために水平の回転シリンダ上を前方に継続的に歩かなければならないので、ロータロッドは協調及びバランスの定量的評価を提供する。試験は、コンピュータ制御RotaRodシステム(TSE Systems、Bad Homburg、Germany)を使用して、2日連続で実施した。第1の朝のセッションにおいて、マウスは、少なくとも60秒間ドラム上に留まることができるまで、定常的に回転ロッド上で訓練した(10回転/分)。午後に、及びその翌日に、各々3回の治験をからなる3つの試験セッションを実施した。ロッド速度は、5分間にわたって4〜40rpmに加速した。動物が落ちるまで動いた合計距離を前記システムにより自動的に算出した。成績は、最善の治験解析(運動協調性)を使用して、各治験の試験(運動学習)ごとに測定した。
【０１９６】
結果：最善の治験解析は、HETの減少について弱い傾向のみが見られたものの、HET雌とWT tgアイソQC雌との間で、最大移動距離の成績が同等であることを示した(図15(a))。9回の治験試験における改善は、WT腹子と比較して、HETにおいて明らかに減少したが、有意差は見出だせなかった(図15(b))。
【０１９７】
（ホールボード試験）
方法：マウスは、その鼻を壁又は床の穴に挿す傾向がある。ホールボード試験は、探査行動の状態を評価するために、この固有の挙動を利用する。マウスは、床に9つの穴(1.5cmの直径)が等しく配置された正方形の(24×24 cm) ホールボードモジュール(TSE Systems、Bad Homburg、Germany)に個別的に入れた。ノーズポーク回数及び穴探査の合計時間を10分間自動的にモニタした。
【０１９８】
結果：ノーズポーク回数は、野生型と比較して、ヘテロ接合型tgアイソQC動物において著しく増加し(図16(a))、探査の合計時間も明らかに増加した(図16(b))。
【０１９９】
（テールフリック試験）
方法：テールフリックは、マウスが有害な皮膚熱刺激の経路からその尾部を出す、脊髄反射である。侵害知覚を評価するために、動物はTailFlick 60200 Analgesiaシステム(TSE Systems、Bad Homburg、Germany)で試験し、焦束光(約51℃)の強力ビームに対する尾部撤回刺激潜在性を3回測定した。
【０２００】
結果：ヘテロ接合型tgアイソQCマウスは、野生型腹子と比較して、見かけ上侵害知覚の変化を示さなかった(図17)。
【０２０１】
（恒常ホットプレート）
方法：急性熱痛覚感受性の試験は、恒常ホットプレート(TSE Systems、Bad Homburg、Germany)で実施した。マウスは、52.5℃に暖めた該ホットプレートの表面上のプレキシグラスシリンダに置き、後足撤回刺激潜在性(又は後足の振盪/舐め)を2回測定した(非馴化対馴化)。第1の測定は、前馴化なしで行った。馴化の後、32.0℃ホットプレート上で動物を再試験した。カットオフ時間は、60秒であった。
【０２０２】
結果：非馴化試験において、3月齢のHET雌及びWT tgアイソQC雌のホットプレート成績における明らかな違いは見出だせなかった(図18(a))。しかし、該装置及び試験手順への動物の馴化後における成績の解析は、ヘテロ接合型動物における足撤回刺激潜在性の顕著な減少を示した(図18(b))。
【０２０３】
（恐怖条件付け）
マウスにおける脈絡的合図恐怖応答を調査するために、市販のコンピュータ制御の「恐怖条件付けシステム(FCS)」(TSE Systems、Bad Homburg、Germany)が使用される。
【０２０４】
実験の設定は、Oliver Stiedlのプロトコル(Stiedl O.らの文献, 2004 「マウスにおける脈絡的恐怖条件付けの間の行動及び自立性動態（Behavioral and autonomic dynamics during contextual fear conditioning in mice.）」 Auton. Neurosci. Basic and Clinical 115(1-2):15-27)に従って選択される。FCSの調査は、2日連続で実施し、以下の三相に分ける:
条件付け位相(第１相)：条件付けは、常に照らされた恐怖条件付けモジュール内の透明なアクリル区画において実施する。拡声器は、恒常的な白色暗雑音を提供する。第一の馴化期間の後、マウスは、定義済み聴覚性キュー(条件刺激) (例えば30秒の10kHz、75dBのSPL)を与えられる。聴覚性キューの端の間、短い電気フットショック(無条件刺激)が投与される(例えば、2秒の0.7mA、定電流)。マウスは、ショック終了の30秒後に、それらのホームケージに戻される。
脈絡的保持(第２相)：条件付け(第１相)の24時間後、動物は、第一の脈絡に再び曝露し、自発運動量及び不動をそれぞれ270秒モニタする。
キュー保持(第３相)：条件刺激(聴覚性キュー)についての記憶は、新規脈絡(ショック格子の代わりに、黒色平面底板のために光強度が減少した同サイズの黒色アクリル箱)において、第2相の1時間後に試験する。該新規脈絡における270秒の自由探査の後、第1相と同じ聴覚性キューを180秒適用し、自発運動量及び不動をそれぞれFCSにより自動的に記録する。
【０２０５】
（Y-迷路）
Y-迷路における自発的交代率は、齧歯動物の空間学習についての指数として扱う。交代（alternation）は、重複3セットにおける、三角形Y形迷路の3本のアームへの連続的侵入として定義される。侵入は、マウスがアームに4つ全ての足で侵入したときに、成功と定義する。10分間の治験の間の交代率は、あり得る交代に対する実際の比として、「ビューア」ビデオ検出システム(Biobserve、Bonn、Germany)により自動的に算出する。
【０２０６】
（オープンフィールド）
オープンフィールド実験は、自発運動量の評価のための短い試験である。マウスは、プレキシグラス壁及び50×28cmの表面積及び高さ25cmの壁を有する灰色のプラスチック床から構成されるPhenoMasterシステム(TSE Systems、Bad Homburg、Germany)のためのオープンフィールドモジュールを使用して試験する。活動は、水平活動(x/y-レベル)及び垂直活動(z-レベル)を検出するために、2つの水平に支えられた赤外線センサーフレームにより自動的にモニタする。最高60分のセッションの間に登録される行動パラメータは以下のものである：(i)定義済みの間隔に移動する距離、(ii) アリーナの中心部における活動(ビームが破壊する破壊)、(iii)立ち上がり事象(動物が前脚を空気中に又は壁にして後肢で立った回数)。
【０２０７】
（交差迷路）
交差迷路は、黒いプラスチック物質からなる(アームサイズ:30.0cm長、8.0cm幅、15.0cm壁高)。隣接するアームは、90°の位置にある。4本のアームは、正方形で8.0cmの中心空間から伸びる。それゆえ、動物は、中心空間を介してアームを訪問する。20.0分の試験セッションの間に、各マウスは、はじめにランダムに1本のアームに置かれ、自由に迷路を移動できる。個々のアームは、1〜4と命名する。交代は、重複４セットの連続的侵入における4本の異なるアームへの侵入として定義する  (例えば、2,3,4,1又は4,2,3,1であるが、1,2,3,2ではない)。侵入は、マウスが4つ全ての足でアームに侵入したときに、成功であると定義した。交代率は、観測の期間の間における、全体の実施された交代に対する実際の比として算出する。匂いキューを減弱させるために、迷路は、各治験後、30% エタノール、60% 水及び10% 無臭石鹸を含む溶液で洗浄した。試験は、適度な白色光条件下で実施される。試験についてのより短い時間枠(すなわち10分)が可能である。
【０２０８】
（T-迷路連続交代作業(T-CAT)）
T-迷路は、Gerlaiにより提供される測定法(Gerlai, R. (1998) 「T-迷路における新しい連続的交代作業がマウスにおける海馬機能不全を検出する。系統比較及び病変研究。（A new continuous alternation task in T-maze detects hippocampal dysfunction in mice. A strain comparison and lesion study.）」 Behav Brain Res., 95, 91-101)に従って使用した。該装置は、黒い床及びギロチンドアを有する黒い塑性物質から構成された。マウスの試験は、1件の強制選択治験で開始し、その後に14件の自由選択治験が続く、単一セッションから構成された。
【０２０９】
(i)強制選択治験：第一の治験において、2本のゴールアームのうちの1本は、ギロチンドアを降ろすことによってブロックされる。マウスがスタートアームから放たれたあと、マウスは迷路を調べ、開いたアームに入り、開始位置に戻る。マウスがスタートアームに戻ったらすぐに、ギロチンドアを降ろし、動物を5秒間閉じ込める。
【０２１０】
(ii)自由選択治験：スタートアームのドアを開けた後、動物は、全てのギロチンドアが開いているので、両方のゴールアームのどちらかを選ぶことができる。いったんマウスがゴールアームに入ったら、別のゴールアームは閉じられる。マウスがスタートアームに戻った場合、スタートアームに5秒間閉じ込めた後、次の自由選択試験が始まった。
【０２１１】
30分後、又は14件の自由選択試験を実施した後、試験セッションを終了した。動物は該タスクの間決して操作されず、実験者は、試験動物の遺伝子型を知らなかった。交代比率は、交代選択の数を選択の合計数で除することによって、動物ごとに算出した。所与の時間枠で8未満の選択をする動物は、解析から除外した。
【０２１２】
（モーリス水迷路）
典型的なパラダイムにおいて、マウスは、最初にストレスを回避する小さな水プールのバックエンドに置き、バイアスを回避するプールサイドに向かわせ、これは、水面の数ミリメートル下に隠されているエスケーププラットフォームを含む。着色形状などの視覚のキューは、プールのまわりに、動物に良く見える状態で配置する。プールは、通常、直径4〜6フィート及び深さ2フィートである。喫水線より上の側面は、マウスが研究室活動により動揺することを予防する。放たれると、マウスは、プール付近に出口を捜して泳ぐが、このとき、プールの各四半部に費やされる時間、プラットフォーム(刺激潜在性)に到達するのに要する時間、及び合計移動距離を含む様々なパラメータが記録される。水からのマウスの脱出は、迅速にプラットフォームを見つけたいというその願望を補強し、(同じ位置のプラットフォームを用いる)次の試験において、該マウスは、より迅速にプラットフォームに位置することができる。マウスは、はっきり見える視覚キューとの関連で、隠れされたプラットフォームがどこに位置するかを学ぶので、成績における改善が生じる。十分な実施の後、能力があるマウスは、任意の解放点からプラットフォームへと直接的に泳ぐことができる。
【０２１３】
（把持試験）
把持行動を試験するために、マウスは、30秒間尾部で懸垂させ、後肢把持時間をスコア化した。0秒の把持時間にはスコア0を与え、1〜10秒にはスコア1を与え、10〜20秒にはスコア2を与え、20秒超の把持時間にはスコア3を与えた(Nguyen, T., Hamby, A. & Massa, S.M.の文献 (2005)「クリオキノールは、インビトロで変異体ハンチンチン発現を下方制御し、ハンチントン舞踏病マウスモデルの病理を緩和する(Clioquinol down-regulates mutant huntingtin expression in vitro and mitigates pathology in a Huntington's disease mouse model.)」 Proc Natl Acad Sci U S A., 102, 11840-11845)。
【０２１４】
（足跡解析）
足跡を得るために、後足を青い無毒性インクで標識した。動物は、末端が閉じた箱である暗いトンネル(30cm×7cm直径)の一端に配置した。該トンネルの床には、白い紙を並べた。動物はトンネルの他端へ歩いて行くことができ、そこで該動物は検索してそのホームケージに落ち着いた。2つのノンストップのパスの最小値が要求された。歩長は、各ステップの間の距離を測定することにより決定され、平均歩長が算出された(Barlow, C., Hirotsune, S., Paylor, R., Liyanage, M., Eckhaus, M., Collins, F., Shiloh, Y., Crawley, J.N., Ried, T., Tagle, D. & Wynshaw-Boris, A.の文献 (1996) 「Atm欠損マウス：運動失調毛細血管拡張症のパラダイム（Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia.）」Cell., 86, 159-171)。
【０２１５】
（平均台）
バランス及び全般的運動機能は、平均台タスクを使用して評価した。1cmのダウェル梁を、パッドをあてた表面の44cm上の2つの支持カラムに取り付ける。長さ50cmの梁のいずれかの端に、9×15cmの脱出プラットフォームを取り付ける。動物を梁の中央に置いて放す。各動物は、試験一日間に3回治験される。動物が梁上にいた時間を記録し、全3回の治験の落下に係る結果的刺激潜在性を平均化する。動物が全60秒の試験の間、梁の上にいる場合、又はプラットフォームの一方に避難する場合、最長時間である60秒が記録される(Arendash, G.W., Gordon, M.N., Diamond, D.M., Austin, L.A., Hatcher, J.M., Jantzen, P., DiCarlo, G., Wilcock, D. & Morgan, D.の文献 (2001) 「長期Aβワクチン接種後におけるアルツハイマー病トランスジェニックマウスの行動調査：行動特異性及びAβ堆積と空間記憶との間の相関関係（Behavioral assessment of Alzheimer's transgenic mice following long-term Abeta vaccination: task specificity and correlations between Abeta deposition and spatial memory.）」DNA Cell Biol., 20, 737-744)。
【０２１６】
（紐懸垂タスク）
機敏さ及び握力の試験として、3mmの綿の紐を、梁装置のパッドをあてた表面の35cm上に吊るす。動物にその前肢で紐を握らせて放す。１回の60秒の治験の間のこのタスクの各動物の成績を評価するために0〜5の評点法を使用する：0＝紐上に留まることができない；1＝前足又は後足のみによってぶら下がる；2＝1に関連するが紐上に登ることを試みる；3＝紐上に座り、バランスを保つことができる；4＝紐のまわりに4本の足及び尾を掛けて側方移動する；5＝逃げる(Moran, P.M., Higgins, L.S., Cordell, B. & Moser, P.C.の文献 (1995) 「ヒトβ-アミロイド前駆体タンパク質の751-アミノ酸のアイソフォームを発現するトランスジェニックマウスの年齢関連性の学習欠損（Age-related learning deficits in transgenic mice expressing the 751-amino acid isoform of human beta-amyloid precursor protein.）」Proc Natl Acad Sci U S A, 92, 5341-5345)。
【０２１７】
（垂直グリップ懸下タスク）
動物は、ワイヤバー(1cm間隔で1mmのワイヤを有する40×20cmの領域)から吊るすことによって、神経筋異常(バランス及び筋力)について試験した。60秒以内に落ちた刺激潜在性は、マウスがバー上に居てひっくりかえった後に、測定した(高さ30cm)(Erbel-Sieler, C., Dudley, C., Zhou, Y., Wu, X., Estill, S.J., Han, T., Diaz-Arrastia, R., Brunskill, E.W., Potter, S.S. & McKnight, S.L.の文献 (2004) 「NPAS1及びNPAS3転写因子欠損マウスにおける行動及び制御異常（Behavioral and regulatory abnormalities in mice deficient in the NPAS1 and NPAS3 transcription factors.）」Proc Natl Acad Sci U S A., 101, 13648-13653)。
【０２１８】
（強制水泳試験）
強制水泳試験は、モーリス水迷路におけるプローブ試験と同一の様式で、実施される(Spittaels, K., Van den Haute, C., Van Dorpe, J., Bruynseels, K., Vandezande, K., Laenen, I., Geerts, H., Mercken, M., Sciot, R., Van Lommel, A., Loos, R. & Van Leuven, F.の文献 (1999) 「4リピートヒトタウタンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスの脳及び脊髄における顕著な軸索障害（Prominent axonopathy in the brain and spinal cord of transgenic mice overexpressing four-repeat human tau protein.）」Am J Pathol, 155, 2153-2165)。手短にいうと、110cmの直径を有するプールを20cmの高さに不透明な水で満たし、22℃に保つ。マウスは1回の60秒の単一試験についてプールの中央に置き、合計水泳距離及び水泳速度をコンピュータ自動化追尾システム(VideoMot2、TSE-Systems)を使用して計測した。
【０２１９】
（上昇プラス迷路（Elevated Plus-Maze））
上昇プラス迷路は、Lister(1987)の説明に従って構築した。これは、5×5cmの中央正方形プラットフォームを有する黒いプレキシグラス床を有し、該プラットフォームから高さ0.25cmの端を有する2本の45×5cmの開いたアーム、及び透明なプレキシグラスから構成される高さ40cmの壁を有する2本の45×5cmの閉じたアームが放射していた。移動を測定するように4本のアームの各々に沿って道の半分に白い線を描いた。装置は、プラス形の合板基材上の床より45cm上に上げた。装置は、60ワットの赤い電球で照らした2×5mの研究室に置いた。
【０２２０】
手順：マウスを、それらのホームケージ内の試験ルームに運んだ。マウスは、常にその尾部の付け根で扱った。マウスは、一回に一匹、開いたアームに面しているプラス迷路の中央の正方形に置いた。その後、マウスに5分間、装置を調査させた。装置から約1mに静置している観測体は、迷路における動物の挙動を記録した。迷路の中心より150 cm上に位置するビデオカムコーダも挙動を記録した。挙動は、Limelightを使用して記録した。5分後に、マウスは、その尾部の付け根により迷路から取り出され、そのホームケージに戻された。その後、迷路を70% エチルアルコール溶液で洗浄し、試験の間に乾燥させた。
【０２２１】
記録される挙動には、以下のものを含む：
１．開いたアームの侵入：動物が開いたアームに入った頻度。侵入としてカウントするには、マウスの足の全4本がアーム内にあることを要求した。
２．閉じたアームの侵入：動物が閉じたアームに入った頻度。侵入としてカウントするには、マウスの足の全4本がアーム内にあることを要求した。
３．開いたアームの滞在時間：動物が開いたアームに費やした延べ時間。
４．閉じたアームの滞在時間：動物が閉じたアームに費やした延べ時間。
５．中央正方形の侵入：動物が全ての4本の足で中央の正方形に入った頻度。
６．中央正方形の滞在時間：動物が中央の正方形に費やした延べ時間。
７．頭の液浸：動物が開いたアームの側をこえて床の方へ頭を降ろした頻度。
８．体長伸展（Stretch attend postures）：動物が頭部及び肩の前方の伸長、及びその後に元の位置に収縮することを示す頻度。
９．立ち上がり行動：動物が後肢で立っているか又は前足で迷路の壁にもたれる頻度。
１０．非予備的挙動：身繕い、又はマウスが移動していない全ての時間。
１１．放尿：尿のパドル又はストリークの数。
１２．排便：生じた糞便の数。
１３．移動：動物が開いたアーム及び閉じたアーム上に描いた線を横切った回数。
【０２２２】
これらの結果から、アーム侵入の合計に基づき、開いたアーム及び閉じたアームへの侵入の割合を各動物について算出した。開いたアーム及び閉じたアームに費やされる時間の割合は、5分の試験を通じて算出した。開いたアーム回避の指数(Trullas, R., & Skolnick, P.の文献 1993. 「近交系マウス系の恐怖動機づけ動態における差異（Differences in fear motivated behaviors among inbred mouse strains.）」Psychopharmacology, 111, 323-331)は、[100−(開いたアームにおける時間の割合＋開いたアームへの侵入回数の割合＼2]として算出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年7月12日(2013.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013541938000001.app
【国際調査報告】
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