(57)【要約】薬剤耐性病原体の検出およびその感染症に対する治療のための方法および組成物が提供される。非オセルタミビル・インフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼ・インヒビターおよびオセルタミビル・カルボン酸塩を利用している競合結合測定によるオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの検出のための方法が提供される。センサに被結合および本発明の方法に役立つインフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼ・インヒビターが、開示される。野生型に対するノイラミニダーゼ・インヒビターとして作動する新規ホスホナート化合物およびＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１およびＨ３Ｎ２ウイルスのオセルタミビル耐性インフルエンザ株が、開示される。シアル酸を経たこれらのホスホナート化合物の調製に対するエナンチオ選択性合成ルートが提供される。
2013528160.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザ ウイルス ノイラミニダーゼ阻害の組成物組成から成る: 式 （I） の化合物の治療に有効な量。
前記 A はPO(OR) （OR5),
前記 R およびR5は独立して選択いない H、CI CIO アルキル、アリール、ルアラルキルおよび X から前記 X アンモニウム、メチル アンモニウム、dimethylammonium、トリメチルアンモニウム、テトラメチル アンモニウム、エタノール アンモニウム、dicyclohexylammonium、グアニジ、第一鉄エチレンジアミン陽イオン、リチウムイオン、ナトリウム イオン、カリウム イオン、セシウム陽イオン、ベリリウム陽イオン、マグネシウム イオン、カルシウムのカチオンと亜鉛イオンから成る群から選択されるカチオン性対イオンです
前記 BNHR6, NH3+Y~R6は N(C=NH) NH2または R6N (C = NH2+) NH2前記 R6水素、CI CIO アルキル、アリール、又は前記Y~は塩化物、臭化、ヨウ化、酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、二リン酸、硝酸、硫酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、サリチル酸から成る群から選択されるアニオン性対イオン、ルアラルキルを表すY"
hydroxynaphthoate、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸、グルコン酸、およびステアリン酸、
前記 R1 CH3またはCF3です。;
前記 H, R2であるCI CIO アルキルまたは 0 = C NHR7R7前記ビオチン、fluorophore 抗炎症剤など機能部位を有する併合リンカーを表すと
前記 R3および R4独立して水素、CICIO アルキルまたは 0 されません = C R8R8 CI CIO アルキル、アリール基、またはルアラルキル; を表す、と
製薬上許容される賦形剤。
2. 前記化合物は、から成る群から選択される請求項1 の構成：
または、治療に有効な塩、エステルまたは並びに当該エステルの塩。
3. クレーム 2、少なくとも1 つの化合物から成る構成:
4. クレーム 2、少なくとも1 つの化合物から成る構成:
5. 少なくとも 1 つの化合物から成る請求項2 の組成
6. 請求項 1 にインフルエンザウイルス組成物を前記バインドの組成は、Hl l、H5N1 と h3n2 型を菌します。
7. 野生型または H274Y変異インフルエンザ ウイルスのノイラミニダーゼを前記です組成物によれば請求項 6 に。
8. P g 式 （I） の化合物
前記 A 前記 Rおよび R5は独立して選択いない H、CI CIO アルキル、アリール、ルアラルキルおよび X から、PO(OR) （または5） は前記 X アンモニウム、メチルアンモニウム、dimethylammonium、トリメチル アンモニウム、テトラメチル アンモニウム、エタノール アンモニウム、dicyclohexylammonium、グアニジから成る群から選択されるカチオン性対イオンです
第一鉄エチレンジアミン陽イオン リチウム イオン、ナトリウムイオン、カリウム イオン、セシウム陽イオン、ベリリウム陽イオン、マグネシウム イオン、カルシウムのカチオン、前記 B ですNHR6, H3亜鉛の陽イオン ^"R6N(C=NH) NH2または R6N (C = NH2+) NH2前記 R6水素、C1 〜 C10 アルキル、アリール、又は前記Y~での塩化物から成る群から選択されるアニオン性対イオン ルアラルキルを表す Y ~、臭化、ヨウ化、酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、二リン酸、硝酸、硫酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸,サリチル酸、hydroxynaphthoate、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸、グルコン酸、とステアリン酸、前記R1は CH3または CF3;前記 R2 H、C1 〜 C10 アルキルまたは 0 で前記 R7ビオチン、fluorophore 抗炎症剤など機能部位を有する併合リンカーを表す、前記R3および R4独立して水素、CI CIO アルキルまたは 0 C NHR7= = C R8ここで R8 Cl C10 アルキル、アリール基、またはルアラルキルを表します、
手順から成るプロセス:
(a) アセチル、キラル前駆体シアルは中間化合物を準備する酸(2)
(3)。
(b) 中間化合物 (3) ジエチルトリメチルシリル亜リン酸を扱うフォーム中間化合物 (4)。
(c) 中級 (4) N ブロモスクシンイミドとピリジンでどのフォーム（5） 中級、ブロモ置換化合物を与えるために光の照射下での治療：
(d) 中間化合物 (5) トリメチルシリルtrifluorosulfonate で治療フォーム中間化合物 (6)。
(e) 中間化合物 (6) トリメチルシリルアジ化と治療フォーム中間化合物 (7)。
9. さらの段階を含んで成る請求項8、プロセス:
(hydrogenating f)中間化合物 (7) と l を反応、化合物 3-bis(tert-butoxycarbonyl)-2-methylthiopseudourea と中間を形成するEt3N (8)。
10 のステップをさらに含む、請求項8 のプロセス:
(g) 中間化合物 （7）bromotrimethylsilane、ナトリウムメトキシドと [フォーム化合物 (la) に順番に、hydrogenating の治療：
11 のステップをさらに含む、請求項8 のプロセス:
(i) 中間化合物 (7) ナトリウムエトキシド、フォームに化合物(lc) を hydrogenating と治療：
12. それ以上の段階を含んで成る請求項9 のプロセス:
(h) 中間化合物 (8)bromotrimethylsilane、しナトリウムメトキシド フォームに化合物 (lb) 治療。
13. さらの段階を含んで成る請求項9 のプロセス：
(j) 中間化合物 (8) を次にトリフルオロ酢酸ナトリウム・ エトキシド フォームに化合物 (Id) を扱います。
14. 請求 8 13 のいずれかのプロセスによって製造された製品です。
15. インフルエンザ感染症の治療方法メソッドを構成します。
請求項 1 の治療に有効な量に件名が必要でその旨を提供します。
16.、の化合物から成る群から選択です：
または、治療に有効な塩、エステルまたは並びに当該エステルの塩。
17. 請求 15、前記件名人間または人間以外の哺乳動物であるの方法。
18. 前記件名が疑われるに感染の請求15、の方法、
インフルエンザ ウイルスが野生型又は H274Y ノイラミニダーゼ変異体を含みます。
19. 請求 18、前記ひずみインフルエンザウイルスの方法は、Hl l、H5 1、h3n2 型から選択されます。
20. オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの存在を決定する方法、
手順を構成する方法:
(a) オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスまたはウイルス粒子から成るの疑いのあるサンプルを提供する;
(b)、インフルエンザから成る結合分子とサンプルを連絡します。
ノイラミニダーゼ認識ユニット (R) の存在そして不在のオセルタミビル （OC）;と
（c） の存在そして不在のオセルタミビルのインフルエンザウイルスまたはウイルス粒子に結合分子の結合の違いを決定する、
前記レベル認識ユニット (R) によって、オセルタミビル敏感なインフルエンザ ウイルス コントロールにアクセスしたときにバインディングのレベルの減少に比べてオセルタミビルの存在下でバインディングで削減の不足は、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスのサンプルの存在を示します。
21. 最新の前記オセルタミビル耐性インフルエンザインフルエンザの変異アミノ酸位置 274 ノイラミニダーゼ (NA) の蛋白質で請求項 20 年の方法。
22. 前記インフルエンザ変異ノイラミニダーゼ阻害薬に抵抗力があるが、まだこの発明において記載される認識単位(R) に敏感である請求項 20、の方法。
23. 前記サンプルを含むインフルエンザウイルスは、粘液、唾液、呼吸器分泌、喉の洗浄、鼻洗浄、脊髄液、喀痰、尿、ザーメン、汗、糞、プラズマ、血、broncheoalveolar 流体、膣分泌液、涙液および組織の生検からなる群から選択されの方法、請求項21。
24. 前記インフルエンザ ウイルスを認識ユニット(R) のバインディングは同時バインドによってオセルタミビルによる競争力のある抑制される請求 20 年の方法。
25. ザナミビル、またはtamiphosphor グアニジン モノエステルまたは phosphazanamivir またはそのモノエステル、と塩、エステル及びその誘導体からの認識の単位(R) の選択前記請求 24、の方法。
26. 請求 20、検出されて、センシングユニット （S） の認識の単位 (R) の結合前記の方法。
27. 結合分子構造 R LS していますように前記認識ユニット (R) リンカー (L) を介してセンシング ユニットに結合されて請求 26、の方法
28. 請求 27、前記脂肪族鎖、はトリアゾール、水溶性リンカー、およびエチレングリコール リンカーからリンカー (L) が選択されているの方法。
29. 請求前記センシング ユニット選択蛍光ラベル、ゴールドラベル、酵素ラベル、放射性ラベル、ラベルの量子ドットから検出可能な部位は、26 の方法ビオチン-アビジン生物は、ラベル、および蛋白質のラベルに基づいてください。
30. 請求 29、前記蛍光ラベル群から選択されの方法
フルオレセインのオレゴンの緑 Cy5、Cy3 Alexa フルアー BODIPY から成る、
tetramethylrhodamine、ローダミンテキサス州赤赤、pyridyloxazole、benzoxadiazole
デリバティブ、NBDハロゲン化物、iodoacetamides、SBD;ルシファー黄色ヨードアセトアミド;
スチルベン、クマリン、ナフタリン、アジリジン、dapoxyl、ピレン、bimanes、キサンテン系、シアニン、ピレン、フタロシアニン、phycobiliprotein、squarene染料、エネルギー転送染料
組み合わせ、およびその誘導体。
31 前記 R L S 分子群から選択され、、請求項20 の方法
成る。
BM 1： ザナミビル-(TriazoleLinker) ビオチン
-(TriazoleLinker)-フルオレセイン
BM 3: ザナミビル-(EthyleneGlycol Linker) ビオチン
前記 x = 1 に4
胆 4： ザナミビル-(EthyleneGlycol Linker)-フルオレセイン
BM 5:(Tamiphosphor グアニジン)-(aliphatic chain Linker)-ビオチン
前記 x = 1 に4
BM 6:(Tamiphosphor グアニジン)-(Ethylene Glycol Linker)-フルオレセイン
BM 7:PhosphaZanamivir-(Triazole Linker)-ビオチン
BM 8:PhosphaZanamivir-(Ethylene Glycol Linker)-フルオレセイン
BM 9:(PhosphaZanamivir モノエステル）-(Ethylene Glycol Linker)-ビオチン
前記 x = 1 に4 と
胆 10： （PhosphaZanamivirモノエステル）-(Ethylene Glycol Linker)-フルオレセイン
前記 x = 1 に4。
32。 前記 Rphosphazanamivir またはその派生物である請求の方法 20 日。
33 競争力のあるオセルタミビルを結合する複合R 式 （I） の化合物である前記 32 請求の方法
前記 A 前記 Rおよび R5は独立して選択いない H、CI CIO アルキル、アリール、ルアラルキルおよび X から、PO(OR) （または5） は前記 X アンモニウム、メチルアンモニウム、dimethylammonium、トリメチル アンモニウム、テトラメチル アンモニウム、エタノール アンモニウム、dicyclohexylammonium、グアニジ、第一鉄エチレンジアミン陽イオン、リチウムイオン、ナトリウム イオン、カリウム イオン、セシウム陽イオン、ベリリウム陽イオン、マグネシウム イオン、カルシウムのカチオンから成る群から選択されるカチオン性対イオンです、および前記NHR6, NH3+Y~R6である B カチオン、亜鉛 N(C=NH) NH2または R6N (C = NH2+) NH2前記 R6水素、C1 〜 C10 アルキル、アリール、又は前記Y~は塩化物、臭化物、ヨウ化、酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、二リン酸、硝酸、硫酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸から成る群から選択されるアニオン性対イオン ルアラルキルを表すY ~、サリチル酸、hydroxynaphthoate、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸、グルコン酸、およびステアリン酸、前記R1は CH3または CF3;前記 R2 H、C1 〜 C10 アルキルまたは 0 で前記 R7ビオチン、fluorophore 抗炎症剤など機能部位を有する併合リンカーを表す、前記R3および R4独立して水素、CI CIO アルキルまたは 0 C NHR7= = C R8R8 Cl C10 アルキル、アリール基、またはルアラルキルを表します。
34. 請求前記競争力のあるオセルタミビルを結合する複合R から成る群から選択される化合物である 32 の方法:
またはその派生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001] このアプリケーションの主張米国仮特許アプリケーションのシリアル番号の優先順位61/333,137、2010 年 5 月 10 日に提出し、「組成と方法の確認」オセルタミビルに対する感受性のインフルエンザ ウイルス、"内容が本明細書で全体を参照によって組み込まれています。
本発明の技術分野
[0002] 本発明のインフルエンザウイルスに対して効果的です新規化合物に関する。本発明は野生型とオセルタミビル耐性 H1N1、H5N1 と h3n2 型インフルエンザ ウイルスの菌株からインフルエンザウイルス ノイラミニダーゼを阻害する新規ホスホン酸化合物に関する。本発明は、薬剤耐性菌の検出に関する。特に、ostelamivir 耐性インフルエンザ ウイルスの検出を本発明します。詳細は、特に本発明本発明の開示する新規化合物によるostelamivir 耐性インフルエンザ ウイルスの検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
[0003] 流行インフルエンザA ウイルスの広範な罹患率と死亡率は世界中を引き起こし続けます。米国だけでも、推定 5 に 20 ％ の人口の約 200,000 入院し、36000 の死を引き起こすインフルエンザウイルスによって毎年、感染しています。包括的な予防接種政策の確立は、インフルエンザの罹患率を制限する有効な手段をされています。ただし、頻繁に遺伝のウイルス漂流潜在的ウイルスの菌株ワクチンの存在とその循環の間にミスマッチをリード、ワクチンの年間再定式化が必要です。
[0004] インフルエンザA ウイルス 9 の構造タンパク質とさらに規制機能を持つ 2 つの非構造的 NS 1 蛋白質のためのコードで構成されます。ウイルスのゲノム セグメント化された自然の遺伝的再集合(ゲノム セグメント exchange) 機構セル異なるウイルス株との混合感染時に場所を取ることができます。インフルエンザ A ウイルスに応じて異なるヘマグルチニン(HA) とノイラミニダーゼ (A) ウイルス蛋白質の表面に表示されるさまざまなサブタイプに分類されます。インフルエンザ A ウイルスの亜型 2 ウイルス表面タンパク質によって、ヘマグルチニン（HA または H） とノイラミニダーゼ (NA または N) が識別されます。各インフルエンザウイルスのサブタイプは、H と N タンパク質の組み合わせによって識別されます。16既知 HA サブタイプと 9 既知 NA サブタイプです。
[0005] インフルエンザ ウイルスは、人間を含む多くの動物種に感染するRNA ウイルス陰性意味を分割です。ウイルス コード化された RNA 依存 RNA ポリメラーゼによるインフルエンザのゲノムの複製を後代に様々 な遺伝シーケンスのすべての回で生成、エラーしやすいプロセスです。実行可能なウイルス変異遺伝子を「抗原ドリフト」変異体が指定されています。セグメント化された自然のウイルスのゲノムと異なる動物種に感染する可能性(p. k. チェン et al, Emerg。「抗原シフト」の変異体を作り出すことができます。感染します。市内中心部 15, 966 （2009））。望ましい条件下で、支配的な亜種は人間または動物のための著名な病原体になるかもしれない。突然変異体の進化につながるプロセスを完全にはありません複数のステップの選択(l. コーエン ダニエル et al, J. Clin。      
【０００３】
理解歯薬出版.44, 138 （2009）;R. ワーグナー、M. Matrosovich h.d. Klenk、牧師医歯薬出版。12, 159 (2002)）。ワクチンはインフルエンザ ウイルス感染症の予防によく使用されるに対し、インフルエンザ感染症の治療の最も有用な治療法タミフル(リン酸塩のオセルタミビル エチル、ロシュの管理を含む研究所、株式会社)リレンザ （登録商標） （ザナミビル、グラクソ ・ ウェルカム社）。（N. j. コックス,J. M. ヒューズ, N. Engl. th1/th2 341、1387年 (1999))。オセルタミビル、ザナミビル、リリースおよび子孫ウイルス粒子内粘膜の分泌物の飛散を防止し、それによりウイルス感染を減らすウイルスシアリダーゼ （ノイラミニダーゼ） の阻害剤です。ノイラミニダーゼ (NA) インフルエンザ ウイルス表面糖タンパク質子孫ウイルスの宿主細胞表面糖鎖受容体から間の連携を壊すことによってウイルスの複製と感染性に不可欠です。したがって、構造に基づく戦略によるNA の阻害は抗インフルエンザ薬の発見に適用されています。
［0006］ ザナミビル（リレンザ TM） (von Itzstein, M. et al. 自然 1993, 363, 418。ダン、c. j.;ゴア、k. l. 薬 1999,58, 761)。インフルエンザの治療のための人気のある薬です。タミフル肝臓エステラーゼの 3 つのアルギニン残 (Argl 18、Arg292、Arg371)と対話するアクティブな阻害剤として対応するオセルタミビル カルボン酸を与えることによって容易に加水分解されるプロドラッグ ウイルス ・ ノイラミニダーゼ(NA) の活性部位にです。(von Itzstein, M. et al. 自然 1993, 363, 418。Lew、et al. クークー W.。Med.chem. 2000, 7, 663ラッセル様 r. j. ら自然 2006, 443, 45）オセルタミビルとザナミビル インフルエンザ ウイルス子孫ウイルスの宿主細胞表面糖鎖受容体から間リンケージ割断ウイルス伝播のため不可欠であるNA を阻害します。NA の阻害剤 (oxa) シクロヘキセン足場 oxonium 遷移状態でシアル酸 （n-アセチルノイラミン酸） の酵素的開裂を模倣するために設計されてバインドウイルス ΝΑ の活性部位に細胞表面糖蛋白質に一番外側の糖類。オセルタミビル カルボン酸とバインディングに対応するは誘導適合の大型の疎水性ポケットを作成する ΝΑ3 ペンチル側鎖のために必要です。(コリンズ、P. J. et al. 自然 2008, 453, 1258年。)比較では、ザナミビル リン酸オセルタミビルより新たに進化した耐性ウイルスにより少なく敏感であります。疎水性結合ポケットを生成するための必要性がない場合は、抑制効力ザナミビルNA ミュータント (例えば臨床的に関連する H274Y 変異) するは変更されません。
［0007］ インフルエンザ a (h1n1) ウイルスに位置 274 (H274Y) ノイラミニダーゼ (NA) 蛋白質のチロシン ヒスチジンのアミノ酸変化を授与オセルタミビル耐性をクマします。2008サージはオセルタミビル耐性 H274Y 変異体季節 HlNl での (A. Moscona, N. th1/th2 Engl. 360, 953 （2009））これらの変異の増加は、オセルタミビル H274Y 流行地域の多くで使用に相関されていないために不可解された (J. Mossong et al., 抗ウイルス研84 91 （2009）;M. Jonges et al, 抗ウイルス研 83 290 （2009））。加え H274Y オセルタミビル耐性パンデミック ・HlNl (A. Gulland、臭素医 j. 339 b4975 （2009））、Η5Ν1 変異体 (Q. M. ル et al, 自然 437 1108年（2005 年）） これらの変異インフルエンザ治療オプション (I. スティーブンソン et al, Clin 影響を与えることを示唆している患者で報告されている。感染します。市内中心部48、389 (2009))。
[0008] ザナミビルの多くデリバティブグリセリル部位足場で改質による oxonium 遷移状態シアル酸の酵素の卵割における模倣に用意されています。ホスホン酸グループは、一般的に薬物設計におけるカルボン酸のバイオアイソとして使用されます。（白、C.L. et al. セクレチン ・分子 1995, 245, 623。Schug k. A.;リンドナー、chem. 牧師 2005, 105, 67 W.。
シュトライヒャー、H.;Busseb,h. Bioorg。Med. chem. 2006 年 14, 1047年。)カルボン酸グアニジ イオン対と比較して, ホスホン酸イオン グアニジ イオンと強い静電相互作用を展示いたします。ザナミビルホスホン酸異性体の期待したがって、H274Y 変異も、HlNl と Η5Ν1 ウイルスのそれらに対してより強力な持っていること。拡張されたアフィニティは、3 アルギニン残基(Argl 18、Arg292、Arg371） でと強いホスホン酸グループの静電相互作用に起因する可能性があります。
生理的条件。
[0009] ソリューション フェーズノイラミニダーゼ阻害アッセイは通常蛍光基板 2'-(4-methylumbelliferyl)-を使用します。アルファ。-D-アセチル-(Potier etal, アナルの自作を用いて定量化することができます蛍光製品の歩留まりするノイラミニダーゼによって切断されるノイラミン酸。Biochem.94:287-296(1979))、しかし、このアッセイ法は高スループット形式に従順ではないです。また、耐性ウイルス株 (Mckimm-breschkin, J. L. 抗ウイルス研2000 年 47, 1-17 を参照) の高速の台頭により、新型インフルエンザ ノイラミニダーゼ阻害薬を見つける必要性は残ります。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
[0010]  世界中のサージ2008年におけるオセルタミビル耐性 HlNl インフルエンザ ウイルスの耐性変異のための調査と開発オセルタミビルに対する感受性の簡単なテストのための必要性を求めています。潜在的流行オセルタミビル耐性HlNl ウイルスの真っ只中に、「ポイント オブ ケア」テストの治療オプションに関する決定をご利用いただけます、医師のオフィスで患者の標本のオセルタミビルに対する感受性の迅速な評価のための必要性です。
[0011] 小説ホスホン酸化合物を説明します。化合物Hl l、H5N1 の野生型とオセルタミビル耐性株に対するノイラミニダーゼ阻害剤としての活動があると
H3n2 型インフルエンザ ウイルス。いくつかの実施形態においては、オセルタミビル耐性インフルエンザひずみノイラミニダーゼH274Y 変異しています。本開示はまた、シアル酸を介して新規ホスホン酸化合物へのエナンチオ選択的合成ルートを提供します。
[0012]  本開示、式（I） の化合物の特徴によると開示します。
【０００５】
前記 A 前記 Rおよび R5は独立して選択いない H、CI CIO アルキル、アリール、ルアラルキルおよび X から、PO(OR)(OR5) は前記 X アンモニウム, メチルアンモニウム, dimethylammonium, トリメチル アンモニウムから成る群から選択されるカチオン性対イオンです
テトラメチル アンモニウム、エタノール アンモニウム, dicyclohexylammonium, グアニジ,第一鉄エチレンジアミン陽イオン リチウム イオン、ナトリウム イオン、カリウムイオン、セシウム陽イオン、ベリリウム陽イオン、マグネシウム イオン、カルシウムのカチオン、前記 NHR6NH3+Y ~ R6である B、亜鉛の陽イオンN(C=NH) NH2または R6N (C = NH2+) NH2前記 R6水素、C1 〜 C10 アルキル、アリール、又は前記 Y - での塩化物から成る群から選択されるアニオン性対イオンルアラルキルを表す Y ~、臭化、ヨウ化、酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、二リン酸、硝酸、硫酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸, サリチル酸、hydroxynaphthoate、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸、グルコン酸、とステアリン酸、前記R1は CH3または CF3;前記 H, R2である CI CIO アルキルまたは 0 前記 R7ビオチン、fluorophore 抗炎症剤など機能部位を有する併合リンカーを表す、前記R3および R4独立して水素、C1 〜 C10 アルキルまたは 0 C NHR7= = C R8R8 C1 〜 C10 アルキル、アリール基、またはルアラルキルを表します。
[0013]  A 組成式（I） と前記組成物がインフルエンザ ウイルス ノイラミニダーゼの活性を阻害する生物を管理する設計されています、製薬上許容される賦形剤の治療に有効な量を含む開示されている.
[0014]  本発明の特徴によると、組成物の少なくとも1 つの治療に有効な量を含む開示されて：
または、少なくとも1 つの:
または、少なくとも1 つの:
[0015] 本開示の特徴によると,プロセス式の組成を作るため開示されて私の手順から成るプロセス。
(a) アセチル、キラル前駆体シアルは中間化合物(3) を準備する酸 (2)。
【０００６】
(b) 中間化合物 (3) ジエチルトリメチルシリル亜リン酸を扱うフォーム中間化合物 (4)。
(c) 中級 (4) N ブロモスクシンイミドとピリジンでどのフォーム（5） 中級、ブロモ置換化合物を与えるために光の照射下での治療：
(d) 中間化合物 (5) トリメチルシリルtrifluorosulfonate で治療フォーム中間化合物 (6)。
【０００７】
と
(e) フォームの中間化合物にトリメチルシリルアジ化と中間化合物 (6) を治療します。
【０００８】
[0016] いくつかの実施形態では、プロセスをさらに致しておりますナトリウムメトキシドとのbromotrimethylsilane と中間化合物 (7) を治療し、その後フォーム化合物 (la) に順番に、hydrogenating:
[0017] 中間化合物(7) を扱ういくつかの実施形態では、プロセスをさらに構成
フォームに化合物(lc) hydrogenating:
[0018] 中間化合物(7) hydrogenating と l を反応プロセスはさらにいくつかの実施形態で構成されて、3 bis(tert-butoxycarbonyl) 2methylthiopseudourea と中間を形成する Et3N 化合物 (8)。
【０００９】
[0019] 中間化合物(8) bromotrimethylsilane、しナトリウムメトキシド治療フォームに化合物 (lb) いくつかの実施形態では、プロセスをさらに構成します。
【００１０】
[0020] いくつかの実施形態では、プロセスをさらに構成中間com ound (8) を次にトリフルオロ酢酸ナトリウム ・ エトキシド フォームに化合物 (Id) の治療の手順：
発明は式 （I） によるとの製品[0021] で 1 つの側面は、ここに開示されたプロセスによって生成。
[0022] 本開示の特徴によると、法の開示はインフルエンザ感染症の治療、する件名が必要でその式（I） によると組成の治療に有効な量の提供を含みます。
[0023]  本発明の特定の側面によると、少なくとも1 つの式 （I） によると化合物であります。
【００１１】
[0024] とノイラミニダーゼ化合物(I) のいずれかの連絡から成るノイラミニダーゼの活性を阻害する方法を言った、本発明の別の実装を提供します。1 つの側面で、ノイラミニダーゼ インフルエンザ ノイラミニダーゼで、アクティビティはin vivo で阻害されます。別の態様では、アクティビティは in vitro で抑制されました。
[0025]  本発明は、薬物とその競争の抑制剤の結合を測定することにより、病原菌の薬剤感受性を決定するために関する。
[0026] 発明の手順から成るメソッドオセルタミビル耐性インフルエンザ ウイルスの存在を決定するためのメソッドは: (a) オセルタミビル耐性インフルエンザ ウイルスまたはウイルス粒子; から成るの疑いのあるサンプルを提供します。(b)に連絡サンプル インフルエンザ ノイラミニダーゼ認識ユニット (R) から成る結合分子の存在と不在 ostelamivir カルボン酸 （OC）;(c) インフルエンザウイルスまたはウイルス粒子に結合分子の結合の違いでの存在そして不在のオセルタミビル、前記レベル ostelamivir 敏感なインフルエンザ ウイルス コントロールにアクセスしたときにバインディングのレベルの減少に比べてオセルタミビルの存在下での認識の単位(R) によってバインドで削減の欠如決定、存在 ostelamivir 耐性インフルエンザ ウイルスのサンプルを示します。インフルエンザ ウイルスに対する認識ユニット(R) のバインディングは、競争力のあるオセルタミビルによる同時バインドによって抑制されました。
[0027] いくつかの実施形態においては、オセルタミビル耐性インフルエンザインフルエンザの変異アミノ酸位置 274 ノイラミニダーゼ (NA) のタンパク質で構成します。いくつかの実施形態において、突然変異 H274Y です。
[0028] いくつかの側面では、サンプルを含むインフルエンザウイルス粘液、唾液、呼吸器分泌、喉の洗浄、鼻洗浄、脊髄液, 喀痰、尿、ザーメン、汗、糞、プラズマ、血、broncheoalveolar 流体、膣分泌液からなる群から選択されると、流体および組織の生検を引き裂きます。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスは細胞培養から得られます。いくつかの実施形態においては、細胞培養 Vero 細胞文化です。いくつかの実施形態では、インフルエンザ ウイルスを含むサンプルインフルエンザ ウイルス感染細胞です。
[0029] いくつかの側面では、サンプルを含むインフルエンザウイルス固体基板上固定化です。固体基板は、マイクロウェル、マイクロタイター プレート、シリコン チップ、スライド ガラス、ビーズ、微粒子、映画、クロマトグラフィー紙、膜、ボトル、料理、スライド、あぶらとり素材、フィルター、繊維、不織布の繊維、形ポリマー、粒子、ディップスティック、試験管、チップ、マイクロ チップ、ラングミュア ・ ブロジェット膜、ガラス、ゲルマニウム、シリコン、(ポリ) テトラフルオロ エチレン、ポリスチレン、ガリウムヒ素、リン化ガリウム、シリコン酸化膜、窒化ケイ素とこれらの組み合わせから成る群から選択可能性があります。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスまたはウイルス粒子結合性炭水化物受容体を介して固体基板上固定です、
インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンのコンポーネント。
[0030] いくつかの側面では、インフルエンザウイルスまたはウイルス粒子固体基板への固定化インフルエンザ ウイルスまたはその粒子のノイラミニダーゼ コンポーネントにバインディングの分子またはオセルタミビルのカルボン酸のバインドを変更しません。
[0031] いくつかの実施形態では、認識の単位(R) ザナミビルから選択されているか
tamiphosphor グアニジンモノエステル、または phosphazanamivir またはそのモノエステルと塩、エステル及びその誘導体。いくつかの実施形態では、認識の単位 (R) 検出されて、センシングユニット （S） を結合されています。結合分子構造 R L S があるようにいくつかの実施形態では、認識の単位 (R) にセンシング ユニット リンカー （L）を介して結合されていくつかの実施形態では、リンカー (L) インフルエンザ ウイルス検知センシング ユニット （S） に認識単位の結合の影響を低減します。
[0032] 脂肪族鎖はトリアゾール、水溶性リンカー、およびエチレングリコール リンカーからリンカー （L） を選択可能性があります。
[0033] いくつかの側面でセンシングユニットは直接または間接的に検出可能なです。いくつか
実施形態は、センシング ユニット、検出可能な部位にストレプトアビジンビオチンの相互作用によって結合されています。
[0034] いくつかの側面でセンシングユニット蛍光ラベル、ゴールド ラベル、酵素ラベル、放射性ラベル、量子ドットのラベル、および蛋白質のラベルから選択した検出可能な部位です。いくつかの実施形態では、検出可能な部位、発光、測色、蛍光光度法から選択信号または放射性信号によって検出されます。
[0035]  いくつかの実施形態において、蛍光ラベルフルオレセインのオレゴンの緑、tetramethylrhodamine、Cy5、Cy3 Alexa フルアー BODIPY から成る群から選択されるローダミン赤、テキサス赤、pyridyloxazole、benzoxadiazole誘導体、NBD ハロゲン化物、iodoacetamides、SBD;ルシファー黄色ヨードアセトアミド;スチルベン、クマリン、ナフタリン、アジリジン,dapoxyl, ピレン,
bimanes、キサンテン系、シアニン、ピレン、フタロシアニン、phycobiliprotein、squarene染料、エネルギー転送染料の組み合わせ、およびその誘導体。
[0036] いくつかの実施形態においては、ビオチンセンシング ユニット ストレプトアビジン標識による蛍光検出可能です。いくつかの実施形態において、蛍光センシング ユニット フルオレセイン芥子 （FITC）、Alexaの染料、量子ドットから選択されています。いくつかの実施形態においては、ビオチンのセンシング ユニット ストレプトアビジン共役酵素 alkalian ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ馬大根ペルオキシダーゼなどによって検出可能です。いくつかの実施形態では、tamiphosphorグアニジン モノエステルはアンモニウム塩並びにです。いくつかの実施形態において、phosphazanamivir はアンモニウム塩並びにです。
[0037] 開示関連化合物は、インフルエンザウイルスまたはその粒子のノイラミニダーゼを結合し、前記バインディングには競争力のあるオセルタミビル カルボン酸で （OC）、前記式 R L--s, を含む化合物抑制する:R ザナミビル、または tamiphosphor グアニジン モノエステルまたは phosphazanamivir またはそのモノエステルと塩、エステル及びその;誘導体から選択L は省略可能であり、トリアゾール リンカー、脂肪族のリンカー、またはエチレング リコール リンカーから選択した;S (a) 部位から直接検出蛍光、colorimety、発光、放射性検出から選択した方法によって選択されているまたは(b) 間接的検出部位ビオチンとストレプトアビジンから共役報告システムを選択します。
[0038] 診断キット、包装材、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの存在を検出するなサンプルを開示の化合物の該組成物を前記組成から成る開示に関する。いくつかの実施形態は、キットはさらに、ラベルを構成またはパッケージから成る兆候を挿入または方向にはサンプルにおけるオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの検出のためのキットを使用します。
変形及び修正精神と開示の新概念の範囲から逸脱することがなくそこに影響を受ける可能性がありますがこれらと他の側面
[0039] が次の図面と組み合わせて撮影の好ましい実施形態の以下の説明から明らかになります。
[0040] 次の図面は現在の仕様の一部を形成、さらには発明1 つ以上のこれらの図面の組み合わせでここに提示された特定の実施形態の詳細な説明への参照をよりよく理解できる本開示の特定の側面を示すために含まれます。特許又は出願ファイルにはカラーで実行される少なくとも一つの図面が含まれています。この色の願書を特許又は特許出願文書のコピーは要リクエスト、必要手数料の支払事務所によって提供されます。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、ザナミビル ホスホン酸異性体および誘導体の合成のためのスキームを示します。[0042] 図 2A から2D 表示化合物ラ (2 a) の分子モデル lb （2 b）、ザナミビル (2 C)、オセルタミビル酸 (2 D)。[0043]  図3 合成ザナミビル ビオチン共役 （ZB, 9) のためのスキームを示します。[0044] 15 と 17 ザナミビル蛍光の合成のためのスキームを抱合図4 に示します。Tamiphosphor ビオチンの合成のためのスキームを[0045] 図 5 示して 24 を共役します。Dizanamivir ビオチンの合成のためのスキームを[0046] 図 6 示して 26 を共役します。[0047] 図 7A 7B 感受性を用いてインフルエンザサンプル固定したオセルタミビル (OC) の定量を示しています。(7 A)この研究で使用される化合物の構造。(7B） OC の影響を受け （S） または OC耐性 (R) WSN ウイルス サンプルされたアンチで動員-HA コーティングのマイクロ プレート ウェル 10 で5104または 10 ウェルあたり3PFU。固定化ウイルス サンプル帳票井戸 30 で培養した nM ZB 合計バインディングまたは 30 nM ZB 150 で競合する OC プラス nMOC 耐性 ZB バインディングを測定します。バインドされたウイルスは、さらにアルカリ性ホスファターゼの触媒作用による相対発光ユニット (RLU) 増加を測定する化学ルミネセンスの基板が続きます共役ストレプトアビジンバインドされたアルカリ性ホスファターゼによるを培養しました。OC 耐性 ZB バインディングの値は、OC 競争の存在下で RLU の比を測定し、それらの OC重要なバインディングの削減結果条件の不在で競合する OC によって測定 p < 0.001 のためにラベル付けされますよう計算されました。バインディング残留ZB でしたが阻害しない完全に OC 高とき 3% 破線価 （10 ウェルあたり5 PFU） 274 H ウイルスのサンプルを用いて上.[0048] 図 8A 8 Dは台湾で 2005年-2009 年に採取した臨床インフルエンザ菌株の OC 感受性の決定を示しています。季節 HlNl 台湾で年間 2005年-2007 (8a) 収集された 2008 (8 b), 2009 (8 C) を OC 感受性の研究のために使用されました。OC 耐性 ZB バインドされた測定、図増加 1％ 以下の値が 1% として提示されたバインドの説明として計算。5 ％ バインディング値をマーク破線テスト ウイルスの感受性ステータスの呼び出しに使用されました。(8D)OC 感受性七つの帳票の測定合計と OC 耐性バインドに行われた場合を除き、2009年パンデミックの HlNl 分離株と同一のファッションで測定されました。さらに、合計とOC 耐性のバインドが表示されます。[0049] 図 9A 9 Dプロトタイプ「ポイント オブ ケア」アッセイ OC 感受性を示すインフルエンザ ウイルスのサンプルの決定。（9 A)PVDF 膜に固定した反-HA 抗体スロット使用されたいずれか 30 でプレインキュベートされたインフルエンザ サンプルを吸収するnM ZB または 30 nM ZB プラス 150 nM の oc。この研究、野生型 WSN （274 H) または 10 で OC 耐性 WSN （274Y）の変異ウイルス4105、10 スロットあたり6 PFU が使用されました。しみが付くことおよび洗浄後膜だった共役ストレプトアビジン アルカリホスファターゼと扱われ、ウイルスサンプルの OC 感受性を視覚的に判断する BCIP/NBT のステンド グラスします。図 8 b での説明 (9 b) 10 2008年台湾季節 H1 1 菌株,膜の試金を使用して検証しました。(9 C) 同様に、図 8 でテストした 4 つのパンデミック H1 1 ウイルス株は、プロトタイプの試金を用いて評価しました。(9D) OC 競争 ZB バインディングのだったのウイルスのサンプルは PVDF 膜抗体なしに直接固定化を伴う変更メソッドを使用していくつかの他の A 型や B型のインフルエンザ ウイルスの決定と同一のファッションでは、処理します。[0050] 図 10 A/ハノイ/30408/2005h5n1 型ウイルスのノイラミニダーゼ cDNA を表現する 293 t 細胞の表面で ZB （ザナミビル ビオチン) バインディングを示します。293 T 細胞pCDNA3.1 NA NA 式ベクトルと lipofectamine によって導入された TM 2000 (インビトロジェン, カールズバッド, 米国)。48時間後、transfected セル 100 で染色した nM ザナミビル ビオチン （ZB） とさらに DyLight 488 共役ストレプトアビジンとインキュベートしました。蛍光イメージはライカTCS SP5 レーザー共焦点顕微鏡を使用して捕獲されました。[0051] 図 11A11F 混合 293 細胞の ZB バインディングで OC 耐性ノイラミニダーゼを発現する細胞の様々 な内容を示しています。組換え 293 t 細胞表現するOC 感受性 (274 H) と示される、OC 耐性 (274Y) 細胞比の異なる混合された: (HA) 274 H: 274Y 正立 (11B) = 274H: 274Y = 999:1 の (11 C) 274 H: 274Y = (11 D) 274 H 99:1: 274Y 95、（彼は） 274 H =:274Y = 90:10 (11 階) 274 H: 274Y = 0:100。混合セルは、10 と扱われた nM ZB, 室温で 1 時間の APC 共役ストレプトアビジンとさらに装飾後、FACSCanto（ベクトン ・ ディッキンソン） と FCS Express 3.0 ソフトウェアによって分析しました。ハ-83.95 ％ であった ZB 標識細胞の割合;11B84.4%;11 C、84.62%;11 D は、86.07%;彼は、83.58%;11F 75.1%。[0052] 図 12A12F OC 耐性ノイラミニダーゼを発現する細胞の様々 な内容を持つ混合 293 t 細胞には、オセルタミビル カルボン酸耐性 ZB バインディングを表示します。図11 のようにセルが 10 nM ZB と過剰に扱われた OC 300 nM と同様に処理します。ZB 標識細胞の割合だった 12A、1.00%;12B2.64%;12 C、2.78 ％;12D、7.10 ％;12 E 12.41%;12F 68.29 ％。[0053] 図 13A13B ショー OC 競争 ZB バインディングにインフルエンザ ウイルスの MDCK 細胞に感染。（13 a） MDCK 細胞には、OC の影響を受け274 H または OC 耐性 274Y ウイルスに感染していた。20 Hr ポスト感染では ZB を 10 で 274 H ウイルス感染細胞を培養した nM(オープン三角形) または 50 nM （白丸） 様々 な濃度の競合の oc。同様に、感染 274Y 細胞はまた 10 で培養した nM ZB (閉じた三角形)または 50 nM ZB （クローズド サークル） 様々 な OC の内容を持つ。バインドされた ZB と細胞は、さらに相対 ZB バインディングで異なる競合OC 濃度を決定する共役ストレプトアビジン アルカリホスファターゼ培養しました。(13B) イメージの MDCK 細胞 OC で影響を受けやすい (274H) または OC 耐性 (274Y) WSN ウイルス感染し、どちらか 30 とインキュベート nM ZB または 30 nM ZB プラス 150nM ストレプトアビジンと孵化によって続いてOC PE を共役。蛍光画像レーザー駆動を終了し、それぞれ 488 と 575 nm で放出されるプレート リーダーを使用して捕獲しました。[0054] 図 14 ショーZB 結合による競合の OC 混合 WSN ウイルスのサンプル 274 H と 274Y ウイルスの内容を変 OC 耐性ウイルス含有量推定のための固定化WSN ウイルスの RABC のアッセイで固定した各でトリプリケートだアンチ-HA コーティング マイクロウェルの作成 10 で5 PFU (三角形) 104PFU (正方形)、および 103 PFU (円) 井戸。彼らは 30 で追加された nM ZB と 150 nM の OC 1 hr カップリング推定 ％ 実験に使われて274Y の内容に対してプロットされている OC 耐性の値を決定する共役ストレプトアビジン アルカリホスファターゼと続き��す。[0055] 図 15 63 開示の化合物のNMR スペクトルを示します。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
[0056] これで使用される用語仕様が一般的にあるその普通の意味アート、発明のコンテキスト内で、特定のコンテキストで各用語が使用されます。本発明の説明に使用される特定の用語の下に、または他の場所を参照して、
仕様は、発明の説明に関する開業医を追加のガイダンスを提供します。便宜上、特定の用語たとえば斜体または引用符を使用して強調する場合があります。強調表示の使用にはスコープと、用語の意味に影響はありません。スコープと、用語の意味は同じ同じコンテキストで強調表示されているかどうか。高く評価されます 1 つ以上の方法で同じことを言うことができます。その結果、代替言語と同義語本明細書で説明した条件のいずれかを使用することがありますまた、用語です詳述または記載かどうかに応じて配置する任意の特別な意義です。特定の用語の類義語が用意されています。1つ以上の類義語のリサイタルでは、他の同義語の使用は除外されません。例例記載、規約などどこにもこの仕様での使用のみ、例示されスコープと意味の発明またはいずれかの例示条件のない方法で制限されます。同様に、本発明はこの仕様で与えられた様々な実施形態に限定されません。
[0057] 別途定義しない限り、記載されているすべての科学的及び技術的な用語として一般的にこの発明に関連する芸術の一般的な技量の1 つによって理解同じ意味があります。紛争の場合は、現在のドキュメント定義などを制御します。
[0058] オセルタミビルによる内因性エステラーゼオセルタミビル (OC) に変換されます、経口プロドラッグです。ザナミビルはレンダリングできませんその宿主細胞を脱出し、他の人に感染するインフルエンザ ウイルスノイラミニダーゼ蛋白質の活性部位にバインドによって動作します。（Cyranoski D
(2005 年 9 月）Natの医学 11 (9): 909)。また、インフルエンザ ウイルスの複製 in vitro および in vivo の阻害剤です。ザナミビルのバイオアベイラビリティの2% であり、それは通常吸入によって投与されます。
[0059] 最近の薬剤耐性の鳥インフルエンザ感染の報告し、副作用でタミフル（登録商標） 治療を受けた子供ノイラミニダーゼ阻害剤 （NAIs） の新しい化学的アイデンティティのパンデミック ・ インフルエンザの脅威との戦いのため必要であることを示唆します。NAの阻害剤 oxonium の遷移状態 (ラッセル et al, 自然 2,006,443: 45) シアル酸の酵素の卵割における模倣する (oxa) シクロヘキセン足場に設計されています。肝臓エステラーゼのアクティブなカルボン酸で加水分解オセルタミビル3 つのアルギニン残 (Argl 18、Arg292、Arg371) と対話するナの活性部位に公開されます。(Id。)。
抗インフルエンザ ウイルス活性を持つザナミビル ホスホン酸同族体の合成
[0060]  本開示小説ホスホン酸ハモザナミビルへの新規合成経路を提供します。D シアル酸は新規アクティブ ノイラミニダーゼ阻害剤の合成キラル前駆体として利用されました。小説ホスホン酸ハモは、それらの野生型とH274Y 変異の日に、h5n1 型ウイルスを抑制することによってオセルタミビルとザナミビルよりもより良いインフルエンザ治療活動を展示します。
[0061] で 1 つの実装、発明は、新規合成法を提供します。
様々 なザナミビル ホスホン酸同族体と合理的に高収率で誘導体の不斉合成合成経路は図 1 に示します。試薬、図 1 に示した手順次のとおりです。
[0062] ステップ 1。シアル酸(2) ピリジン化合物 3 を与える脱炭酸、誘導するために 100 ℃ で加熱された peracetylation の中間体を買う余裕で無水酢酸と扱われました。（ホルン、e.j. ら Carbohydr。研 2008, 343, 936)。
[0063] ステップ 2。化合物3 トリメチルシリル ジエチル リン酸、ホスホン酸化合物 4 余裕の混合物として適切なの求核剤として扱われたとクロマトグラフィーによって分離、NMR スペクトル解析によって特徴づけられることができるβ 対 （2： 3）。
[0064] ステップ 3。ホスホン4 （アノマー混合） として N ブロモスクシンイミド (NBS) と in situ β 除去製品 5, ホスホン酸誘導体の Neu5Ac2en （ダナ） 余裕がピリジンと扱われた、ラジカル型臭素化を受けるCH2CI2 ソリューションで照射しました。この 5 の合成法を以前報告そのアナログ ホスホン酸ジメチル （経営責任者ダニエルバセラ、A.; のために長い手順よりもはるかに効率的だったワイラー、R.Helv。チム。Acta 1991, 74, 451）。
[0065] ステップ 4。無水酢酸、酢酸および濃硫酸のメディアでは、化合物5 オキサゾリン 6 に変換されました。
[0066]  ステップ5。位置および立体選択的開環反応オキサゾリン 6 azidotrimethylsilane とのアジドフェニル化合物 7 を買う余裕つながる化合物ラ、lb 膜、lcおよび id に極めて重要な中間体として実施
[0067] ステップ 6。化合物7 は 3 つの反作用のシーケンスによってホスホン酸 la に変換されました： 両方のエチル グループ bromotrimethylsilane、ナトリウムメトキシドメタノール, 及びアジドフェニル グループにアミンの選択的還元の Lindlar 触媒の存在下での水素化による脱アセチル化と 7 ホスホン酸からの除去。
[0068] あるいは、1 つだけエチルグループ ナトリウムエトキシド エタノール、による治療に関するホスホン酸ジエステル 7 のホスホン酸ジエステル lc アジドフェニル グループの次の減少後を与えることから削除されました。
[0069] ステップ 7。グアニジノ置換基を導入するには、化合物7 アジドフェニル グループはまず l 3 bis(tert-butoxycarbonyl) 2 methylthiopseudourea 塩化水銀とグアニジン化合物8 余裕トリエチルアミンの存在下で反応したアミンを与えるために減少しました。
[0070] ステップ 8。両方のエチルグループ ホスホン酸 8 で bromotrimethylsilane によって削除され、tert-butoxycarbonyl （Boc） グループの同時除去とメタノールによるin situ 生成された HBr 精密検査によって実現しました。ザナミビル ホスホン酸 (lb) 脱アセチル化によって得られました。
[0071]  また、ナトリウムエトキシド、化合物のid を付けますにトリフルオロ酢酸を持つ Boc グループの除去が続くとモノエステルがホスホン酸ジエステル 7 に変換されました
[0072]  本発明の組成物は、必要に応じて塩化合物の本、特に製薬上許容される非毒性塩のたとえば、Na+、李+K+、Ca+++、Mg +++を含む構成します。このような塩は、それらの適切な陽イオン アルカリ及びアルカリ土類金属イオンやアンモニウムと第四紀アミノ酸イオン酸陰イオン部位を有するなどの組み合わせによって派生などがあります。
[0073] 金属塩は、本発明の化合物と金属の水酸化反応して準備されます。この方法で調製する金属塩の例ナ+Li+Kを含む塩です。+.
[0074]  また、塩特定の有機・無機酸、例えば、HC1、HBr、H2S04、または有機スルホン酸の酸の添加から基本的なセンターには、通常アミン形成してもよい。
最後に、それは本明細書の組成は彼らの un-ionized、同様に両性イオン フォームと水和物のように水の化学量論量の組み合わせで発明の化合物を構成することを理解することです。本発明の別の側面のノイラミニダーゼを本発明の化合物を含むの疑いのあるサンプルを治療段階を含んで成るノイラミニダーゼの活性を阻害する方法に関する。
[0075] 本発明の化合物は従来船と通常の練習と一致が選択されます賦形剤と配合されています。錠剤は、賦形剤、glidants、フィラー、バインダーなどが含まれます。水性製剤滅菌のフォームでは、用意されてよりも、他の配信によって意図するとき経口投与一般的に等張されます。すべての製剤は、必要に応じて賦形剤、「ハンドブックの医薬品は明示的その全体の参照によって組み込まれている賦」（1986年） に定めるなどが含まれます。賦形剤アスコルビン酸とキレート剤 EDTA など、炭水化物デキストリン、hydroxyalkylcellulose、hydroxyalkylmethylcellulose、ステアリン酸などの抗酸化物質があります。製剤のpH pH 1 1 について pH 3 についてから範囲しますが、通常 pH 7 ph 10 についてです。
[0076]  (記します有効成分として）発明の 1 つまたは複数の化合物は扱われることを条件に適切な任意のルートで投与されています。適切なルートを含む口腔, 直腸, 鼻, 頬側と舌下）、（を含む局所膣と非経口（含む、皮下、筋肉内、静脈、皮、くも膜下腔と硬膜外) など。その優先ルートをたとえば、受信者の条件変わる可能性があります高く評価されます。
[0077] 単独で投与する有効成分には可能な間、医薬製剤として提示することが望ましいかもしれません。製剤、獣医および人間の使用本発明の両方の少なくとも1 つの有効成分は、上記のように、1 つまたは複数の許容可能なキャリアとともにしたがって定義と必要に応じて他癒しの素材を構成します。キャリア （秒） は、「許容」策定の他の成分と互換性があるという意味で生理的にその旨の受信者は無害でなければなりません。
[0078]、製剤はそれらの前述の管理路線に適してもあります。製剤単位用量フォームで便利に提示される可能性があります、薬局の芸術にでよく知られている方法のいずれかによって準備されることがあります。一般的に技術や製剤レミントンの薬学の研究（マックの出版社、イーストン、ペンシルベニア州） が見られます。このようなメソッドにはアソシエーションに有効成分を 1 つまたは複数の副原料を構成するキャリアをもたらすステップが含まれます。配合は密接の均一に積によって準備される一般的に協会に有効成分液体担体または細かく分けられた固体キャリアをもたらし、その後、必要に応じて、製品を形成します。
[0079] 製剤の経口投与に適した発明は、カプセル、いたる所など、独立した単位として準備されますや各有効成分の所定量を含む錠剤;粉末や顆粒として;ソリューションまたは水性液または非水系液体懸濁液として;油水液体乳剤または水で油の液体エマルジョンとして。有効成分はボーラス、舐またはペーストとしてまた提示する可能性があります。
［ 0080 ]A タブレットです作られた圧縮または成形、必要に応じて 1 つまたは複数のアクセサリー成分と。圧縮錠剤、粉末や顆粒、必要に応じてバインダーと混合など自由に流れるフォームでアクティブな成分、潤滑剤、不活性の希釈剤、防腐剤、表面のアクティブまたは分散エージェントに適したマシンで圧縮によって調製されます。成形錠不活性液体と粉末の有効成分の混合物を湿らに適したマシンで成形による希釈なされるかもしれない。錠剤オプションでコーティングすることがありますまたは得点し必要に応じて遅く提供するために策定されるまたは有効成分の放出制御します。
[0081] 局所軟膏またはクリームたとえばする量のアクティブな成分を含む、0.075に 20 %w/w （0.1 ％ と 20 ％ 刻み 0.1% 0.6 %w/w など w w/の間の範囲内のアクティブな不活含むとして感染目または他の外部の組織は、口や皮膚など、配合の好ましくは適用されているため、0.7％ w/w 等）、好ましくは 0.2 〜15 %w/w、最も好ましくは 0.5 〜 10 ％ w/w。軟膏で定式化すると、有効成分、パラフィンまたは水混和性軟膏の基本と採用可能性があります。
代わりに、アクティブな成分は、水中油クリーム ベースとクリームの処方してよい。
［0082 ] に応じて、クリームベースの水相、たとえば、少なくとも 30 ％ あります w/w は、多価アルコール、プロピレング リコール、ブタン 1, 3-ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールとポリエチレングリコール (PEG 400 など） これらの混合物などの 2 つ以上のヒドロキシル基を有するアルコールすなわち。外用製剤は望ましく吸収または、皮膚や他の被災地を通して有効成分の浸透を強化する化合物などがあります。このような皮膚透過促進剤には、ジメチルスルホキシドと関連類似などがあります。
[0083] この発明のエマルジョンの油相から知られている成分、周知の方法で構成される可能性があります。それは好ましく（それ以外の場合は、emulgent として知られる） 乳化剤単位相を構成する可能性がありますが、少なくとも 1 つの乳化剤、脂肪や油や脂肪と油の混合物を構成します。好ましくは、親水性乳化剤は尾翼として働く親油性の乳化剤と共に含まれています。また、油と脂肪を含めるおくことをお勧めします。一緒に、スタビライザーの有無にかかわらずemulsifier(s) いわゆる乳化ワックス、ワックス、オイルと共にを作り、脂肪作るいわゆる乳化軟膏を基本フォーム クリーム製剤の油性の分散相。
[0084]Emulgents とエマルジョン安定には、発明の製剤で使用に適した剤には、トゥイーン TM 60、スパン TM 80、セトステアリル アルコール、ベンジル アルコール、ミリスチルアルコール、グリセリル モノ ステアリン酸とナトリウム ラウリル硫酸があります。
[0085] に適したオイルまたは策定のための脂肪の選択肢は所望の化粧品の特性を達成することに基づいています。クリームは、好ましくは非油っこいべき非汚損および洗濯できます。
管またはその他のコンテナーからの漏れを避けるために適切な一貫性を持つ製品。直鎖又は分岐鎖、モノまたは二塩基アルキルエステル・ ディ ・ isoadipate、isocetyl ステアリン酸、プロピレング リコールのジエステル ココナッツ脂肪酸、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、2-エチルヘキシル、パルミチン酸またはCrodamol キャップとして知られる分岐鎖エステルのブレンドのなど、最後の 3 つのいるエステルを好んだ。これらは単独または組み合わせに応じて必要なプロパティを使用することがあります。また、白い柔らかいパラフィンおよび/または液体パラフィンまたは他鉱物油などの高融点脂質が使用されます。
[0086] 製剤目に局所投与に適したまた好適なキャリア、特に水溶性有効成分の有効成分の溶解または中断の前記の点眼薬を含めます。有効成分は、好ましくはそのような製剤の0.5 に 20 ％、有利 0.5 〜 10% 特に約 1.5 %w/w の濃度であります。
[0087] 製剤口の中に局所投与に適したトローチ、風味基礎、通常ショ糖とアカシアやtragacanth の活性成分を含む含んでいる;ペースト ゼリー有効成分を不活性にゼラチン、グリセリン、またはショ糖アカシアなどで構成される;液体の好適なキャリアの有効成分を含む洗口剤。
[0088] 直腸投与製剤、坐剤としてたとえばココアバター又はサリチル酸塩の双方を含む適当なベースを提示可能性があります。
[0089] 製剤肺内または鼻投与に適したがある粒子サイズたとえば0.1 を 500 ミクロンの範囲内 （0.1 〜 500 ミクロンの範囲内の粒子径を含むインクリメント 0.5、1、30 ミクロン ミクロン、35 ミクロン等）、鼻の通路を通って急速吸入または肺胞嚢に達するために口から吸入によって投与です。適した製剤の有効成分の水溶性または油性のソリューションがあります。エアロゾルや乾燥粉末管理に適した製剤は、従来の方法によると準備することがありますおよびその他治療薬これまで治療やインフルエンザの予防またはB 感染症に使用される化合物などで配信可能性があります。
[0090] 製剤に適した膣管理が提示されることがありますのpessaries、タンポン、クリーム、ゲル、として貼り付けます、発泡体またはに加えて有効成分を含むスプレー製剤そのようなキャリアとしての芸術適切なが知られています。
[0091] 製剤経口投与に適したされる抗酸化物質、バッファー、bacteriostats、定式化のアイソトニック目的の受信者の血でレンダリング溶質を含む水溶液と非水溶液の無菌性注射ソリューションなどがあります。エージェントと肥厚エージェントを停止するなど水溶液と非水溶液の滅菌サスペンション。
[0092]、製剤単位用量またはたとえばアンプル、バイアル、密封、複数回用量の容器に表示され例水注入、すぐに使用する前に滅菌液体キャリアの追加のみを要する凍結乾燥（凍結乾燥） 状態で格納されることがあります。
その場しのぎの注入ソリューションおよび懸濁液は無菌粉末、顆粒、錠剤前述した種類から用意されています。最寄りの単位用量製剤は毎日線量または単位毎日 sub-dose、として本明細書上記読誦、または、適切な分数の有効成分を含むものです。
[0093] 特に言及上記の本発明の製剤成分に加えて他のエージェントの従来を考慮してたとえばそれら経口投与に適して香料を含める可能性があります問題の定式化の種類芸術に含むかもしれないことを理解する必要があります。
[0094] さらの発明は、少なくとも1 つの有効成分として上記獣医のキャリアと一緒にその定義を含む獣医組成物を提供します。獣医のキャリアは材料の組成の管理目的のために便利です、そうでなければ不活性または獣医のアートで許容ですし、有効成分と互換性のある固体、液体または気体材料があります。これらの獣医組成物は、経口、非経口または他の目的のルートによって管理されるかもしれません。本発明の化合物を使用して放出制御製剤を含む提供として有効成分の1 つまたは複数の化合物を発明 (「放出制御製剤「) の有効成分のリリース制御と少ない周波数投与を許可したり特定の有効成分の薬物動態や毒性プロファイルを改善するために規制します。有効成分の実効線量依存少なくとも扱われて条件毒性の性質上、化合物であるかどうか予防的同盟（低用量) を使われてまたはに対してアクティブなインフルエンザ感染、配信、方法、医薬品の製剤と従来の用量エスカレーション研究を使用して臨床医によって決定されます。について1 日あたり 100 mg/kg 体重を 0.0001 からことが必要に期待できます。通常、約 0.01 〜 約 10 mg/kg から 1 日あたりの体重します。一般的には、約0.01 〜 約 5 mg/kg から 1 日あたりの体重します。通常より、約 0.05 〜 約 0.5 mg/kg から 1 日あたりの体重します。たとえば、吸入約70 kg の体重の大人の人間のための毎日の候補者の線量は 1 mg から 1000 mg、5 mg、500 mg、好ましくは間に及ぶし、単一又は複数の用量の形をとることがあります。
[0095] で 1 つの実装、有効成分、本発明の他の成分と組み合わせて使用も。このような組み合わせは、扱われる条件、成分の相互と薬物-プロパティの組み合わせに基づいて選択されます。たとえば、呼吸器系ウイルス感染症の治療と、特にインフルエンザ感染、本発明の組成物は結合抗ウイルス剤（amantidine、リマンタジン リバビリンなど） を mucolytics、去痰、bronchialdilators、抗生物質, 解熱剤、または鎮痛剤。通常、抗生物質、解熱剤、鎮痛剤は、本発明の化合物と共に用いる投与されています。
[0096] 発明の別の実装が含まれています本明細書に記載の化合物の生体内代謝産物には、小説、かつ自明でないに先行技術に程度にこのような製品です。このような製品は、たとえば、酸化、還元、加水分解、無溶媒、エステル化及び投与の化合物は、主に酵素処理のためのようなから可能性があります。したがって、本発明には小説とこの発明は哺乳類との化合物並びに代謝製品をもたらすのに十分な時間の期間のために連絡を含むプロセスによって生成される非自明な化合物が含まれます。このような製品は、通常、radiolabeled準備することによって識別されます (例えば14C または3H) それ非経口的の検出可能な投与 (0.5 mg/kg について例えばより大きい) ラット, マウス,モルモット, サルのような動物、または発生する代謝の十分な時間を許可する男、（通常は約 30 秒 30 時間） の管理とその変換製品尿から分離する本発明の化合物、血または他の生物のサンプル。ラベルが付いていますので、これらの製品は簡単に分離できる（他の抗体のエピトープの代謝物の存続をバインドの能力の使用によって分離されている）。代謝物構造従来のファッションでは、例えば MS や NMR 分析によって決定されます。一般的に、従来の薬物代謝酵素のよく知られていると同じようにそれら業者には代謝物の分析が行われます。彼らはそれ以外の場合をin vivo で発見されていない限り、コンバージョン製品は独自のノイラミニダーゼ阻害活性を持っているいない場合でも、本発明の化合物の治療的投与の診断アッセイの便利です。
[0097] プロドラッグ小説ホスホン酸同族体の企図されています。極地ホスホン酸とグアニジグループは、必要に応じてさらにかもしれない薬物動態および薬力学的特性を強化する公知技術によって官能基化します。例, 定式化とプロドラッグの使用については、例えばacyloxymethyl ・ アリール ホスホン酸エステル、可能性があります利用可能経口バイオアベイラビリティ (影響とステラ、前売薬物 Deliv. を強化するには牧師1996, 19, 287)。
[0098] で 1 つの側面、発明、ノイラミニダーゼを含むの疑いのあるサンプルの生物などの自然または人造の材料を含んでいる;ティッシュまたは細胞文化;生体試料など生物材料の試料(血血清、尿、脳脊髄液、涙、喀痰、唾液、ティッシュやサンプルのような);研究室のサンプル;食品、水、または空気のサンプル;セルのエキスなどのbioproduct サンプル、目的糖; 合成特に組換え細胞ような。通常サンプルの場合は、ノイラミニダーゼ、頻繁に、病原体はウイルスなどを生産する有機体を含むの疑いがあるでしょう。サンプルは、いかなる媒体など水と水/有機溶媒混合系で格納できます。サンプルでは、人間などの生物細胞培養などの人工材料があります。
[0099] は、組成物前駆体の追加のサンプルにサンプルまたはそれに本発明の組成物を含む追加発明の治療のステップを含みます。添加ステップは、上記のとおり任意の管理方法を含みます。必要に応じて、ノイラミニダーゼの活性組成物の適用後ノイラミニダーゼの活性を検出する直接的および間接的な方法を含む任意のメソッドによって観察することができます。ノイラミニダーゼの活性測定の定量的、定性的および定量的方法すべて企図されています。通常上記のスクリーニング方法の1 つが適用されます、しかし、生物の生理学的特性の観測などの他の方法も適用可能です。
ノイラミニダーゼを含む [0100] 生物細菌 （コレラ、ウェルシュ菌、肺炎球菌、アースロバクター sialophilus)、ウイルス (特に誘導またはパラミクソ(例えば H1N1、H5N1） などのインフルエンザ ウイルス A と B、パラインフルエンザ ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、鶏ペストウイルス、センダイ ウイルス) があります。得られるまたはこれらの生物の内で見つかったノイラミニダーゼの活性阻害内の本発明のオブジェクトです。インフルエンザ ウイルスのウイルスを説明します。
「基礎的ウイルス学」（プレス、ニューヨーク、1986年レイヴン)、章 24。本発明の化合物は、インフルエンザの感染症の予防や既存のインフルエンザ感染アヒルと他の鳥、齧歯動物、豚などの動物や人間の治療に便利です。
［ 0101 ] 組成物発明の阻害活性に対しては上映されます。
ノイラミニダーゼ酵素活性を評価するため, 従来の手法のいずれかによって。本発明の文脈通常組成最初抑制ノイラミニダーゼ in vitro のため上映するほか、組成物の阻害活性を示す[活性の in vivo で上映されています。
少ない約 5 ×10 6 M、通常より約 1 × 10 7 M、好ましくは約 5 × 10 の in vitro 3/4 (阻害定数) を有する組成物8 M が in vivo での使用のために好ましい。
[0102] 有用な invitro 画面は詳細に記載されている、ここでは詳述しません。(Itzstein, M. von et al.;「自然」、363 (6428):418-423 (1993);Potier、M.;et al;"Analyt。
Biochem."、94:287-296(1979 年);チョン、a. k. j.;et al;"Biochem.理・生物物理。Acta"、1077:65-71 （1991）;・コールマン、p. M.;et al;国際公開いいえヲ92/06691 (int. 約号PCT/AU90/00501、出版日 1992 年 4 月 30 日））。Invivo での画面も （Itzstein、et al, 1993 年特定ページ 421, 列 2, ページ 423、列 2、部分の最初の段落の最初の完全段落に、コールマン、p.36） 詳細に記載されています。
[0103] 表 1 ノイラミニダーゼザナミビル ホスホン酸誘導体 la とオセルタミビルとザナミビル酸に比べて lb の抑制、抗インフルエンザ、および細胞毒性の活動を示します。ホスホン酸誘導体la と lb ザナミビルに対してさまざまな野生型と変異型のインフルエンザ ウイルスよりも大きいポーテンシーを示した。
表 1。ノイラミニダーゼ阻害,抗インフルエンザ ウイルス活性および細胞毒性の試金
オセルタミビル
バイオアッセイ測定ラ lb ザナミビル
酸
WSN （H1N1） IC50(nM)J 0.65 ± 0.05 1.2 ± 0.4 5.3 ± 2.1 2.6 ± 1.1
EC50 (nM)c 1.32.4 ± 0.8 23.5 ± 8.5 12.2 ± 2.3
WSN 274Y
IC50 (nM)J 0.50.25 ± 0.05 1.75 ± 0.75 593 ± 68 (H1N1)
EC50 (nM)c 2726 ± 8 290 ± 15 30000 ± 1600年
パンデミック(H1N1) IC50 (nM)J 0.9 0.8 4.3 1.7
EC50 (nM)c 20.326.5 267 76
RG14 （h5n1 型）IC50 (nM)J 1.0 0.8 4.0 0.6
EC50 (nM)c 9781700年 ± 500 16360 ± 2980年 1250年 ± 440
ウドンタニ (型 H3N2)IC50 (nM)J 6.4 5.2 37.9 3.2
EC50 (nM)c 5532 ± 23 41 ± 6 3.0 ± 1.8
293 T 細胞 CC50 （A/WSN/1933（H1N1）、A/WSN/1933 （H1N1）、A/カリフォルニア/7/2009 （パンデミック H1N1）、/ベトナム/1194年/2004 RG14 からH274Y ノイラミニダーゼ変異 （h5n1 型）、A/ウドンタニ/307/1972 (H3N2) ノイラミニダーゼ阻害し抗インフルエンザの試金のためのバイオアッセイ材料として使用されたnM > 30,000 > 50,000 > 100,000 > 100,000はインフルエンザ ウイルス。人間の 293 t 細胞は化合物の細胞毒性測定に使用されました。
b蛍光基質2'-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic 酸 (MUNANA) 化合物濃度 50% 阻害の異なるインフルエンザのノイラミニダーゼ酵素を引き起こしているIC50値を決定するために使用されました。
c阻害定数は MUNANA として基板を用いた速度論的研究によって決定されました。d別インフルエンザ株に対する抗インフルエンザ活動を別のインフルエンザ菌株によって感染による細胞変性効果の50 ％ の保護のための化合物の濃度 EC50値として測定しました。
e 293 t 細胞に対する細胞毒性の試金で顕著な毒性なし使用最高濃度。
[0104] ノイラミニダーゼ阻害アッセイ酵素源として関連付けられたインフルエンザノイラミニダーゼを使用していくつかのインフルエンザ株のノイラミニダーゼに対して測定しました。蛍光基板 MUNANA (2'-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic酸) すべてのウイルスの酵素のためのノイラミニダーゼ活動を測定するために使用されました。表 1 ノイラミニダーゼ活動の 50% 阻害のための化合物の濃度を測定して相対ノイラミニダーゼ阻害ポーテンシーこれらの化合物を評価するIC50値を示しています。
ラと lb 5 つすべてのそれらに対して[0105]、IC50 値すべて著しくザナミビルよりも強力とオセルタミビル酸と同様です。これら 2 つのホスホン酸化合物ペアレンタル ヒスチジン、ノイラミニダーゼ274 位置交換チロシン残基が WSN 274Y のオセルタミビル耐性のノイラミニダーゼ変異体を阻害することで大幅によりアクティブになります。
[0106] これらの化合物の抗インフルエンザ活動に対して5 のインフルエンザ株インフルエンザを介する感染細胞変性効果を保護する能力を測定しました。50 ％ の保護、感染症のための濃度 EC50値細胞変性効果を媒介として抗インフルエンザの活動が決定しました。表1 は、la と lb Hl l インフルエンザ ウイルスなど、WSN 2009 パンデミック Hl l 系統に対する大きい抗インフルエンザ活動が表示されます。
[0107] ラと lb の抗インフルエンザ活動はオセルタミビル耐性WSN （HlNl） ウイルスに対して特に顕著であります。オセルタミビル耐性のノイラミニダーゼ変異位置に 274 HlNl インフルエンザ ウイルス分離株の現行HlNl クリニック （Moscona、A. N. Engl. th1/th2 2005, 353, 2633年） されています。ラと lb この突然変異のノイラミニダーゼの優れた抗インフルエンザ活動この現行のインフルエンザを治療するためのオプションに影響します。HlNlインフルエンザ株に対する抗阻害剤であることに加えて、ラと lb も、RG14 に対する抗インフルエンザ剤としてザナミビルに同等である (Η5Ν1) ・ ウドンタニ（Η3Ν2） インフルエンザの系統。
[0108] バイオアッセイ測定ラとポンドの両方が強力な抗・抗インフルエンザの化合物であることを示した。彼らはザナミビルよりも一般的により強力です、オセルタミビル耐性HlNl インフルエンザ ウイルスに対して非常にアクティブです。さらに強力な抗インフルエンザ剤には、彼らに人間 293 t 細胞試験濃度の高い （表 1） に全く無害です。
[0109] で 1 つの実装、現在開示ホスホン酸ラの強力なΝΑ 阻害剤および抗エージェント, ic5 調べる0と EC50値 0.65 〜 1.3 nM の A/WSN/1933 (HlNl) ウイルスに対するそれぞれです。
[0110] で 1 つの実装、現在開示ホスホン酸ラの強力なNA の阻害剤および抗エージェント A/WSN/1933 (HlNl) ウイルス IC50に H274Y 変異と EC50値 0.5 および 27 nm に対してそれぞれです。これらの,ic5 調べる0と EC50値ザナミビル ホスホン酸のタミフル耐性 HlNl ウイルスは特に印象的です。
本開示, ホスホン酸ラ[0111] で 1 つの実装は、また強力な NA の阻害剤および抗エージェント A/カリフォルニア/7/2009 （パンデミック HlNl) に対してです。
/ベトナム/1194年/2004RG14 （h5n1 型） と A/ウドンタニ/307/1972 (H3N2) ウイルス。
[0112] で 1 つの実装、現在開示ホスホン酸lb の強力な NA の阻害剤および抗エージェント A/WSN/1933 (HlNl) IC50と EC50値 1.2 〜 2.4 nM のウイルスに対してそれぞれです。
[0113] で 1 つの実装、現在開示ホスホン酸lb のため A/WSN/1933 (HlNl) ウイルス IC50に H274Y 変異の強力な NA 阻害剤とタミフル剤です。
EC50値 0.25 および26 nm それぞれ。ポンドに対するタミフル耐性の高能 H1 1 ウイルスは非常に重要。
本開示, ホスホン酸lb の [0114] で 1 つ実装がまた強力な NA の阻害剤 A/カリフォルニア/7/2009 （パンデミック H1N1) インフルエンザ治療剤です。
/ベトナム/1194/2004 RG14 （h5n1 型） と A/ウドンタニ/307/1972 (H3N2) ウイルス。
［ 0115 ] で1 つの側面、本発明のノイラミニダーゼ ホスホン酸複合体のモデル分子の活性部位の 3 つのアルギニン残基とホスホン酸の適切なバインド モードを示します。既知のNl 結晶構造を用いた分子ドッキング実験 （図 2） (PDB コード： 2HU4) ホスホン酸インヒビター lb 強く結合 na、トライ アルギニン残基を加えてC7 C9 グリセリル、C4- フェニルアセトアミドおよび Cs-グアニジノ グループ、ノイラミニダーゼ ザナミビル複雑に同様の結合ポケットに加わる他の相互作用を明らかにします。
[0116] 発明の一態様では、分子モデリングホスホン酸インヒビター ラのノイラミニダーゼの 3 つのアルギニン残基と強い相互作用また C7 C9 グリセリル、C4- フェニルアセトアミドおよび結合ポケット（図 2） Cs アミノ グループによって加えられる他の相互作用を示した。
タミフル耐性ウイルス分離株の同定
[0117] ここに記載の仕様はデザインと抵抗評価バインド競争(RABC) による法開発タミフル耐性ウイルス分離株の効果的な診断のための実践開示しています。
[0118] ザナミビルとOC インフルエンザ ノイラミニダーゼ (NA) の同じアクティブ サイトにバインドします。
ただし、オセルタミビル耐性 H5N1 ウイルス ノイラミニダーゼはまだザナミビルへの感受性を保持できます。（コリンズ PJ、et al. (2008)。自然453 (7199): 1258年-1261年)。Arg224 より大きいの疎水性ポケット OC (M. Z. 王、C. 康太、D. B. メンデル治癒率。 の側鎖を収容するために必要です作成に向けてGlu276 残渣の新しい方向づけを伴いますノイラミニダーゼは誘導適合します。3809 エージェント Chemother.46 (2002);P. j. コリンズet al, 自然 453 1258年 (2008))。Nl グループそれら数百人の疎水性ポケットの形成を防ぐ変異 H274Y などの耐性フォームに進化することができます倍オセルタミビルK 値の。疎水性ポケット、ザナミビル K の必要性の不在で {H274Y のノイラミニダーゼは変更されません (P. J. Collins et al, 自然453 1258年 (2008))。本発明の機能では、バインディングの違い OC 感受性のウイルス分離株の小説の診断は、探検されました。
オセルタミビル結合領域のインフルエンザ ウイルスのノイラミニダーゼとタミフル耐性インフルエンザウイルスの検出のための基礎を発見にオセルタミビル敏感とオセルタミビル耐性インフルエンザ ウイルスのバージョン間の差分のバインディング驚くほどにした使用がバインドされる認識単位 (R) の [0119] 選択します。
[0120] 発明の特定の面で認識ユニット(R)、センサー ユニット （S） に結合されています。いくつかの実施形態では、認識の単位 (R) センシング ユニット (S) に順番に結合されて、リンカー(L) に結合されています。R L S 分子は、タミフル耐性タミフル敏感なインフルエンザ ウイルスから区別するために使用されます。
[0121] されては強力なノイラミニダーゼ阻害剤のオセルタミビル（OC;タミフル （登録商標）)、非 OC 分子 (R) のための効果的なライバルそのインフルエンザ ウイルス NA 分子にバインドされます。ただし、OC まだ非OC 認識ユニット (R) 均等に野生型ナだけでなく、バインド バインド OC 耐性変異体 （例えば、H274Y) のための貧しいライバルです。
[0122] 認識ユニット (R)が通常知られている NA 結合部位そのようなザナミビル、tamiphosphor グアニジン モノエステルまたはザナミビル ホスホン酸ラまたはその誘導体 lb、lcおよび id から選択されます。いくつかの実施形態においては、R が選択されているオセルタミビルを含むホスホン酸から私たちに明らかにいる野生型と H274Y 変異のH1N1 と H5N1 ウイルスに対するノイラミニダーゼ阻害薬としての活動を持つ化合物特許 7,888、337B2。
[0123] にバインドするNA ですから、センシング信号によって検出部位 (すなわち検出部位) を観察することができます。このような同種の蛍光及び熱量センシング鎖は当業者に知られています。参照して、例えば：王 Q. M. et al,「ペプチド p nitroanilides 基板として用いたライノ ウイルス 14 3 C プロテアーゼの連続熱量アッセイ」アナル。Biochem.第252, pp. 238-45 (1997), と Basak S. ら「基質特異性の in vitro 解明とプロタンパク転換酵素の生物検定では蛍光ペプチド急冷4 を用いた分子"Biochem.J. 巻 380, pp. 505-14 （2004 年）。
［ 0124 ] センサユニット直接的または間接的 （アビジン/ストレプトアビジンビオチン、抗体-抗原の芸術知られている他のメソッドを介して) 蛍光ラベル、ゴールド ラベル酵素ラベルから成る群から選択される検出可能な部位にリンクされます。さまざまな種類のセンサーは、特に限定されず、目的に応じて適切に選択することができます。例その放射性ラベル、量子ドットのラベル、タンパク質ラベルなどが含まれます
［ 0125 ] いくつかの側面でセンシングユニットを形成する当該バインディング パートナーへの試薬に共役前記結合ペア形成共役結合パートナーと複雑な検出可能なバインディング。バインディングの組み合わせのいずれかに基づいて可能性があります:いずれの streptavidin:biotin; から成る群から選択されるバインディングの組み合わせであります。アビジン: ビオチン;葉酸酸: 葉酸; 結合タンパク質シアル酸、炭水化物、または糖タンパク質:レクチン;オリゴまたはポリ-dA: oligo - またはポリ-dT;オリゴまたはポリ-dC:oligo-またはポリ dG;フェニルボロン酸: サリチルヒドロキサム酸;アルデヒドとケトン基：hydrazides;sh 基部位: マレイミド;アミノ酸の鎖: N ヒドロキシスクシンイミド エステル;重金属： チオール;IgG の Fc 部分: 蛋白質A/蛋白質 G/タンパク質プロティン;
digoxigenin:anti-ジゴキシゲニン;5-bromodeoxyuridine:anti-ブロモデオキシウリジン;dinitrophenyhanti-ジニトロフェニルアミン;フルオレセインisothiocyanate:anti-フルオレセイン イソチオシアネート;N-2-acetylaminofluorene:anti-N-2-acetylaminofluorene;-2-acetylamino-7-iodofluorene:anti-N-2-acetylamino-7-iodofluorene。
[0126] 特定の面でラベルをfluorphore しています。いくつかの側面で、fluorophore フルオレセイン、ローダミン、クマリン、resorufin、キサンテン系、シアニン,ピレン, フタロシアニン、phycobiliprotein から成る群から選択されるアレクサ、Cy3、Cy5 squarene 染料、エネルギー転送染料とその誘導体の結果の組み合わせ。Alexaの蛍光染料は、Alexa フルアー 647、Alexa フルアー 546 Alexa フルアー 532 から成る群から選択可能性があります。いくつかの実施形態では、fluorophoreから成る群から選択される: BODIPY マレイミド、iodoacetamides、メチル ブロマイド;Alexa フルアー マレイミド;フルオレセイン 5 と6 異性マレイミド類とメチル ブロマイド;オレゴンの緑イソチオシアネートおよびマレイミド;
tetramethylrhodamine5-6 異性 iodoacetamides およびマレイミド;ローダミン赤マレイミド;テキサス赤 bromoacetamides およびマレイミド;pyridyloxazoleマレイミド;
benzoxadiazole 誘導体NBD ハロゲン化 iodoacetamides, SBD を含む;ルシファー黄色ヨードアセトアミド;スチルベン iodoacetamides およびマレイミド;クマリンマレイミドと
iodoacetamides、すなわち腫瘍、IDCC、その他;ナフタレン誘導体、すなわち、acrylodan、badan、:iaans-、MIANS、IAEDANS、およびダンシル;アジリジン;dapoxyl 誘導体、すなわち dapoxyl (2-bromoacetamidly)スルホンアミド;ピレン マレイミド類と iodoacetyl 誘導体;モノーブロム- と monochlorobimanes。
[0127 ] メソッドまたはセンサユニット （S） からの信号を検出するための手段特に限定されるものではないと、目的に応じて適切に選択することができます。信号とき発光、焼入れ等、たとえば、検知する光検出器、カメラ、等によって。
［ 0128 ] 発光部分と焼入の部分の組み合わせは、特に限定されるものではないと目的に応じて適切に選択することができます。たとえば、これらの蛍光共鳴エネルギー移動(FRET) 技術として知られてなどを適当に採用できます。
［ 0129 ] 発光部分それ排出,を生成することができ、目的に応じて適切に選択できる限り、特に限定されません。例並びに蛍光物質、化学発光物質, 電気化学発光物質等を含むものがあります。 またはそれらのこれらの物質の形成します。これらは単独で使用することがあります。または 2 つ以上の組み合わせで使用される可能性があります。なかでも焼入の部分が存在している場合発光部分に隣接して、それらの発光消光の部分のアクションによって焼入れですが望ましい、蛍光物質その視認性が優れているし、検出が簡単だことより好ましいです。蛍光物質は、特に限定されるものではないと目的に応じて適切に選択することができます。その例には、アントラセン、フルオレセイン、フルオレセイン芥子（FITC) rhodamines テトラメチル ローダミンと sulforhodamine、ダンシル塩化テキサス赤、アル 350、indocarbocyanine(CY) などのようながあります。
焼入部分発光部分に隣接し、焼入の部分を適切に選択できる発光部分のタイプ等によるととき発光部分の放出を癒すことができる場合［ 0130 ] 焼入の部分は特に制限されません。例及び消光物質を含むものがあります。 またはそれらの消光物質形成します。焼入の物質は、特に限定されないし、目的に応じて適切に選択することができます。蛍光体の発光部分が形成されると、例消光物質の光とのような蛍光物質を発するとき放出されるエネルギーを吸収物質があります。適切な例には蛍光共鳴エネルギー移動(FRET) 発光物質間許可する物質が含まれます。具体的な例には tetramethylrhodamine 芥子 （TRITC）、dimethylaminobenzenesulfonyl（DABSYL）、金ナノ粒子ブラック ホール クェンチャーのようながあります。
[0131] 認識ユニット結合です、その発光部分と焼入の部分には、センサーに共役です。焼入の部分が存在するときに隣接する発光部分焼入れ部分発光el 部分認識ユニット バインド ターゲット NA に前に、のすなわち、癒すことができます。認識の単位 NA ターゲットにバインド後、焼入部分標的核酸から切り離されます。この結果、焼入部分焼入れの部分のアクションの損失と排出ガスを生成する発光部分をできるように、発光部分から離れて存在します。
［ 0132 ] リンカーユニット (L) は特に制限はありません、発明の効果を損なわない限り、適切に選択することができます。たとえば、水溶性リンカー エチレング リコール リンカーなどを使用できます。水溶性のリンカーの長さを適切な長さに決定できます。
[0133] の 1 つの側面、テストするインフルエンザウイルスのサンプルまたは R L S 複合固体表面に配列として固定化です。固体の表面は、ラングミュア ・ ブロジェット膜、ガラス、ゲルマニウム、シリコン、(ポリ)テトラフルオロ エチレン、ポリスチレン、砒化ガリウム, リン化ガリウム、シリコン酸化膜、窒化ケイ素とこれらの組み合わせから成る群から選択可能性があります。固体表面はいずれ、マイクロウェルまたはマイクロタイタープレートまたは料理、シリコン チップ、スライド ガラス、ビーズ、微粒子、映画または膜、ボトル、料理、スライド、しみが付く素材、フィルター、繊維、不織布の繊維、形ポリマー、粒子、ディップスティック、試験管、チップとマイクロ チップから成る群から選択されることがあります。
[0134] 1 つの実施形態では、インフルエンザウイルスおよび/またはウイルス粒子の炭水化物受容体には、共役または糖タンパク質マウスグリコホリン α− 酸性糖タンパク, a2-マクログロブリン、オボムコイド、どの炭水化物受容体結合はウイルスまたはウイルス粒子のヘマグルチニンコンポーネントにそれらの組み合わせのような組成に位置される天然または合成オリゴからなる群から選択された少なくとも 1 種類が含まれているサポートにバインドされます。特に、インフルエンザウイルスおよび/またはウイルス粒子の既知のすべてを含む鳥インフルエンザ （AI） はタミフル （登録商標） に通常敏感なサブタイプをできますが検出されました。メソッドは、インフルエンザやタミフルに耐性のある高病原性のバリアントを含むウイルス粒子の検出に適しています。本発明は、特にガスクロマトグラフィーによる紙または膜であるサポートを実行できます。そのような材料は、熟練した人に知られています。本発明によると共有結合を添付または炭水化物受容体支援に物理的に吸着することが可能です。(米国のパブです。約第号20100009339 パット）。
［ 0135 ] 方法発明の粘液、唾液、呼吸器分泌、喉の洗浄、鼻洗浄、脊髄液、喀痰、尿、ザーメン、汗、糞、プラズマ、血、broncheoalveolar流体、膣分泌液、涙液および組織の生検からなる群から選択されたサンプルを含む疑いのあるインフルエンザ ウイルスを使用できます。同様のテクニックも例えば、インフルエンザサンプルの Vero 細胞などの細胞の成長は細胞培養から該当するウイルスのサンプルで使用するためです。本発明の方法は、そのままのインフルエンザ ウイルス感染細胞または細胞無料サンプルインフルエンザ ウイルスの練習のために適しています。インフルエンザ ウイルスは、（人間、馬、豚等） の哺乳類や鳥の起源のすることができます。
キット
本発明のノイラミニダーゼ結合分子を構成する 
［ 0136 ] キットも想定されています。異なるキットのコンポーネントは個別のコンテナーにパッケージ化し、使用直前にした可能性があります。このようなコンポーネントの包装は別々にアクティブ コンポーネントの機能を失うことなくが長期保管を許すことができます。2 つ以上のコンポーネントが同じコンテナーが見つかりましたいる実施形態も考えられます。1つ以上次の試薬の模範的なキットを構成する可能性があります: 異種の試金; を使用して使用するための洗浄バッファー試薬ノイラミニダーゼ バインディング機能の無料ネガティブコントロール試薬;検出可能なシグナル シグナル伝達部位からの開発用の信号生成試薬;注射器やのど綿棒のサンプル コレクション デバイスなどのサンプル コレクションを意味します。本発明のキット必要に応じて、本発明のキットの1 つまたは複数のユニットを含むパックで提示可能性があります。パックは、キットの使用方法に伴うことがあります。製造、使用その研究室の販売を規制する政府機関によって規定する形でコンテナーに関連付けられている通知により、パックにも対応可能性があります。
サプリメントは、通知は組成物の形の機関による承認の反射です。
結合分子の模範的な実施形態:
[0137] 発明のタミフル耐性インフルエンザウイルス株の検出に構造認識ユニット (R) を有する特定の結合分子の結合能を決定する - オプション リンカー (L) - センシング ユニット （S）。
本発明の結合分子(BM) のいくつかの実施形態の ［ 0138 ] 例です。
BM 1： ザナミビル トリアゾールリンカー ビオチン
[0139] トリアゾール グループを含むリンカークリック化学 (1, 3， 双極子付加環化反応のアルキンとアジ化） によって形成されます。蛍光ストレプトアビジン標識ビオチン ユニットを検出するために使用されます。
BM 2： ザナミビル トリアゾールリンカー-フルオレセイン
[0140] フルオレセインに吸収極大494 nm 帯および発光している最大 521 の nm (の水）。フルオレセイン芥子 （FITC) を使用して、リンカーで接続します。また、その他蛍光エンティティAlexa 染料や量子ドットなど使用できます。
BM 3: ザナミビル - エチレングリコール リンカー ビオチン
[0141] エチレング リコールリンカーの長さ x からチューニングできます。
胆 4： ザナミビル- エチレング リコール リンカー-フルオレセイン
BM 5:Tamiphosphor グアニジン リンカー ビオチン
[0142]Tamiphosphor グアニジン インフルエンザ ウイルスのタミフル敏感とタミフル耐性の菌株 (H274Y) をバインドします。Tamiphosphor グアニジンモノエステル アンモニウム塩などの塩の形ですることができます。脂肪族鎖 1 6 炭素を持つことができます (x = 1-4)、リンカーで。また、脂肪族鎖例 3に示すようエチレング リコール鎖によって置き換えることができます。
BM 6:Tamiphosphor グアニジン エチレン グリコール リンカー-フルオレセイン
BM 7:PhosphaZanamivir トリアゾール リンカー ビオチン
[0143]PhosphaZanamivir など、アンモニウム塩の形ですることができます。
BM 8： PhosphaZanamivir- エチレング リコール リンカー-フルオレセイン
[0144]PhosphaZanamivir アンモニウム塩などの塩の形ですることができます。
BM 9:PhosphaZanamivir モノエステル エチレン グリコール リンカー ビオチン
[0145] エチレング リコールリンカーの長さ調整できますから x = x 1 = 4。
BM 10:PhosphaZanamivir モノエステル エチレン グリコール リンカー-フルオレセイン
[0146] エチレング リコールリンカーの長さ x からすることができます。
[0147] インフルエンザNA 結合分子の R L S の一般的な構造の他の手本ケール, R. R. et al, 午前化学工学会誌 2008 年、130、8169-8171 で開示されている;Mckimm-breschkin,J. L. et al, している （Angew chem. int. 編 2003 年 42、31 18-3121;Lu は、c. p.いる （Angew のet アル。Chem. int. 編 2005 年 44 6888 6892;木村康 et al, 四面体 Lett。2009 年、50、3205-3208。
[0148] 初めての本の開示は、NAバインディング能力構造 R L S の分子のインフルエンザ ウイルス タミフル耐性のバージョンを検出するために使用できることを明らかにします。
競争力のあるバインディング NA のオセルタミビル （OC） と R L S 型結合分子
インフルエンザそれらを効果的に結合する [0149] A ビオチン共役ザナミビル （ZB） を調製しました。オセルタミビルの存在下で (OC) ザナミビル バインディングのためのライバルとして、OC感受性決定でした。OC バインディング競争の試金は OC 耐性 h1n1 ウイルスの分離株 2008 年からの劇的な増加と OC 耐性のパンデミック 2009年の外観確認H1 1 台湾。バインドの競争 (RABC) アッセイによる抵抗評価プロトタイプ「ポイント オブ ケア」テスト OC 感受性評価のための開発に使用されました。RABC測定原理は、高スループットの調査と病原菌の薬剤感受性のクイック診断に一般的に適用されるかもしれない。
[0150] A 共役ビオチンザナミビル （ZB） は、この研究のために （図 1、例） を調製しました。ZB ザナミビル多くの削減のノイラミニダーゼ阻害せず誘導体化することができます7-OH 位置するリンカーを介してビオチンの活用によってなされた (D. M. アンドリュース et al, ユーロ J. Med. chem. 34,563 (1999);T. ホンダ et al, Bioorg。Med. chem. Lett。12、1925年 (2002);W. H. Wen etal, J. Med. chem. 52 4903 （2009））。ZB ノイラミニダーゼに対する IC50の値は 7.7 をことが判明した nM、ザナミビルのより高い(2.1 nM)。ZB バインディング インフルエンザ ノイラミニダーゼするノイラミニダーゼ導入細胞 （図 4） を用いた実証された、インフルエンザ感染 (例を参照)、細胞、インフルエンザウイルス (イチジク。 固定化IB）。されては強力なノイラミニダーゼ阻害剤のオセルタミビル （OC） ZB バインディング インフルエンザ ウイルスの効果的なライバルは、ことができます。
[0151] それにもかかわらず、OCも ZB を均等によく結合 OC 耐性 H274Y 変異体のバインディングの悪いライバルは、あることが必要です。イチジク。IB 示しています ZB バインディング上有意にOC 阻害 (p < 0.001) 274 H インフルエンザ ウイルスの測定価とよく 10 の範囲で示されたこと3- 105 PFU。バインドの約 3％ 残留 ZB 高価 274 H ウイルス サンプルの OC の競争に気づいた。対照的に、ZB バインディングによって競合する OC を有意に阻害同じ価でOC 耐性 274Y WSN ウイルスでは観察されなかった。
[0152] 同じ観測を使用して変換し、インフルエンザ感染細胞（図 11-14） を示した。我々 はこのアッセイ抵抗評価競争のバインド、または RABC によって短い名前。また RABC アッセイの混合集団 10 ％ 耐性内容(図 14) より大きい OC 耐 274Y 突然変異体の検出できることを示した。
［ 0153 ] 137台湾季節 H1 1 臨床分離株の合計は、2005年-2009 OC 感受率用 RABC アッセイによって照会された年で収集。ウイルスのサンプルされた反HlNl コーティングのマイクロ プレート ウェルで固定化し、いずれか 30 を使用してバインドをテスト nM ZB または 30 nM ZB プラス 150nM OC で重複の試金。5 ％ 残留 ZB バインディングとしてカットオフ OC 感受性測定用使用されました。すべての季節 H1N1 菌テストは 2008 年前に（図 8 a） を収集または （図 8 b） 2008 年初頭 OC 敏感だった RABC のアッセイを示唆しました。2008 年半ばまでは、OC 耐性h1n1 ウイルスは台湾 （図 8 b) 孤立したないです。同様に、季節の H1N1 2009 年に収集された 50 のうち 48 (図 8) OC 耐性としてゴールしました。またしたパンデミック2009 H1N1 菌株台湾での OC 感受性を調べた。図 8 示しています ##1 を分離 ^1 と菌株 ##5-7 は、OC の感受性および OC 耐性ウイルス、それぞれ。RABCアッセイ 7 系統のブラインドで実施し、結果は後でその OC の感受性とシーケンスの結果と一致するように示されていた。RABC アッセイを用いた感受性予測を評価するには、彼らノイラミニダーゼシーケンスを分析する 60 菌株図 8A C# で記述されている季節の H1N1 サンプルがランダムに選ばれました。OC 機密として RABC アッセイによって予測したすべてのサンプルはそれらのOC 耐性がある tyrosines (表 2) それらの対応する残留 274 であると予測しながらのヒスチジンがあります。抵抗性個体群進化の存在の可能性を追求するには、それらのサンプルと3-5% のよく見残留 ZB バインディング値取った。いくつかの隔離されたウイルスのプラクこれらのサンプルからの分析は、OC 耐性ウイルスによるバインドまたはシーケンス解析を識別できませんでした。
[0154] 表 2 すべての台湾H1N1 の臨床分離株本研究では RABC アッセイでの OC 感受性の地位の決定に使用を示します。60 ウイルス分離株はアミノ酸 274 (AA274; で彼らのシーケンスを決定するランダムに選択されました。N2命名法） のウイルス
ノイラミニダーゼ。さらに、いくつかのサンプルは、クイックのアッセイ膜上の OC 感受性決定を使用してテストされました。RABC が OC 感受性決定の信頼性であることを示すすべてのアッセイの結果に相違は見つかりませんでした。
表 2。台湾季節H1N1 の OC 感受性決定分離されます。
RABC 法によって求め各インフルエンザ分離株のOC 感受性 R （耐性） として指定されているまたは S (感受性) 図 8 の結果によると。いくつかの分離株は AA274 の解析による確認のためランダムされたおよび(または) 膜 (Fig.8B で使用されるサンプル番号に対応する括弧内の数字） 上のクイック テスト。
2009 02548 RTyr 2008 90003 S S (49)
2009-02020 R2008-09020 S 彼
2009 01051 R2008-11548 R
2009 01022 R2008-05866 R Tyr
2009 00516 R2008-05860 R Tyr
2009 00513 R2008-05859 R Tyr
2009 00512 R2008-05858 R Tyr
2009 01524 RTyr 2008-05857 R Tyr
2009 00521 R2008-11547 R
2009 00519 R2008-00286 R Tyr
2009 00518 R2008-05855 R Tyr
2009 04512 R2008-02901 R
2009 00511 R2008-00279 R Tyr
2009 03518 R2008-00839 R
2009 03019 Tyr2008-00275 R
2009 03005 RTyr 2008-08451 R Tyr
2009 90010 R2008-00273 R
2009 02530 RTyr 2008-09159 R Tyr
2009-02027 RTyr 2008-09042 R Tyr R (33)
2009 02031 R2008-08949 R Tyr
2009 01026 RTyr 2008-08885 S 彼
2009 04511 RTyr 2008-05853 R Tyr
2009 01518 R2008-08416 S 彼
2009 01516 R2008-00258 S 彼
2009 04017 R2008-10103 R Tyr R(26)
2009 03522 RTyr 2008-06758 R Tyr
2009 03507 R2008-02885 R Tyr
2009 03003 RTyr 2008-06723 S 彼
2009 03002 RTyr 2008-10099 R Tyr
2009-02022 R2008-10095 S 彼
2009 01043 R2008-08319 S 彼
2009 03006 R2008-02832 R Tyr R(19)
2009 00024 RTyr 2008-00233 S 彼 S (18)
2009 04010 RTyr 2008-05506 S 彼 S (17)
2009 00515 RTyr 2008-07903 S
2009 00514 R2008-07895 R R(16)
2009： 00510 R2008-07860 R Tyr R(13)
2009 04503 RTyr 2008-02808 S 彼
2009 01514 R2008-05815 S 彼
2009 01021 S 彼2008年-03293 S
2009-02013 R2008-09169 S
2009 04007 R2008-04240 S
2009-02010 RTyr 2008 03135 S
2009-01522 S 彼2008年 02612 S
2008-03020 S 彼S(73) 2008 04226 S
2009-00009 R2008 04063 S
2009-00008 RTyr 2008 04169 S
2008-11526 RTyr 2007 05601 S
2008-00846 R2007 02774 S
2008-00842 R2007 02578 S
2008-09219 R2007 05222 S
2008-00843 R2007 04656 S
2008-02904 R2007 02820 S
2008-09202 R2007 02523 S
2008-05878 RTyr 2007 02864 S
2008-09201 R2007 03700 S
2008-06020 S 彼 S(64)2007 02782 S
2008-05879 RTyr 2006 05288 S
2008-02906 R2006 06542 S
2008-08884 S 彼2006年 00061 S
2008-09200 RTyr 2006 05751 S
2008-09199 R2006 00010 S
2008-02415 RTyr 2006 04130 S
2008-00841 R2005 05524 S
2008-10128 RTyr 2005 10393 S
2008-02418 R2005 05515 s
2008-05877 RTyr 2005-03468 s
2008-00302 R
はCDC のウイルスの名前
bOC 感受性
ケア アッセイのポイント
［ 0155 ] 開示本プロトタイプアッセイ インフルエンザ ウイルスの OC 感受性状態の視覚的評価用膜です。Fig.9A は、OC 耐性 274Y WSN の染色は同じ競争に耐性であった一方のOC の影響を受け HlNl （WSN） ZB によって染色 OC 競争によってがブロックされたことを示しています。我々 膜の汚損季節のいくつかの OC 感受性のステータスを確認するために使用し、パンデミックのHlNl 分離株 (Fig.9B と 9 C)。機密の ZB バインディングは HlNl、H3N2、h5n1 型、および直接、膜 (Fig.9D) 固定化されたインフルエンザB インフルエンザ ウイルスも示されました。プロトタイプ RABC に基づいて染色アッセイはクイックで、楽器に検出を必要ありません。それとして「ケアのポイント」アッセイは、医師のオフィスで季節のHlNl またはパンデミック ・ HlNl 感染症治療選択肢のタイムリーな決定を使用できます。さらに、テストは他のほとんどの呼吸器感染性病原体はそれらを持たないため、対他の呼吸器感染症のインフルエンザウイルスを区別するために使用できます。
[0156]、RABC のアッセイ、シンプルで堅牢な方法であり、異なるインフルエンザウイルスや感染細胞アッセイ プラットフォームのさまざまなを使用して実証されています。測定原理は薬剤感受性評価のための他の病原体のターゲットに適用されることができます。
例
[0157] 発明、模範的な機器、装置の範囲を制限する意図がなければ、メソッドとその関連の結果、本発明の実施形態に従って以下のとおりです。タイトルまたはサブタイトルの例でない方法発明の範囲を制限する必要があります読者の便宜のために使用する可能性がありますに注意してください。また、特定の理論は提案され、ここに開示されて;彼らは正しいか間違っているかどうか、任意の特定の理論や行動の計画に関係なく本発明の発明が実施されている限り、ただし、ない方法で彼らは、発明の範囲を制限する必要があります。
[0158] すべての試薬であった市販なしで使用やさらに精製特記のない限り。すべての溶剤無水グレードは、特に明記しない限りだった。すべての非水溶液反応オーブン乾燥ガラスアルゴンのわずかな肯定的な圧力の下で特記のない限り行った。反応は磁気攪拌し、シリカゲルの薄層クロマトグラフィーによって監視されました。フラッシュ クロマトグラフィー60 200 μιη 粒子径のシリカゲル上を行った。利回りを行ないました純粋な化合物が報告されます。融点電熱メル TEMP （登録商標） 1101D 融点装置で記録し、,訂正ができなかった。lH、 13C NMR スペクトル分光器ブルカー アヴァンセ 600 を記録しました。31P NMR スペクトル分光器ブルカー アヴァンセ500 を記録しました。Δ 値テトラメチルシラン (TMS); 相対的ケミカル シフトで与えられています。結合定数 J Hz。 内部で与えられている基準いたCDC13 (δΗ 7.24 =)、MeOH i/4 (3/4 = 3.31) または D20 (δΗ 4.79 =) 3/4 NMR スペクトル、CDC13 (5C= 77.0) または MeOH i/4 (5C 49.15 =) 13C NMR スペクトルと H3P04 D20 (δΡ = 0.00) 31P NMR スペクトルの。分割パターンはs （一重項)、d (ダブレット)、t （トリプレット）、q （カルテット）、m （マルチプレット）、br （広い） と dd (ダブレット ダブル) として報告されます。IRスペクトル サーモ ニコレット 380 FT-IR 分光計で記録されました。光学回転パーキン エルマー モデル 341 ポラリメータに記録されました。ブルカー・ ダルトニクス スペクトロメータを用いた高解像度の ESI の質量スペクトルを記録しました。
例 1: 3-Acetamido-4,6-diacetoxy-2-(l,2,3-triacetoxy)propyl-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran(3)。
【００１４】
[0159] 窒素雰囲気下では、ピリジン（75 mL） と無水酢酸 （75 mL） 中の n-アセチルノイラミン酸 （5 g、16.2 m モル） のサスペンションだった 12 h 間室温で攪拌し、5h は 100 ℃ で加熱します。反応混合物を室温まで冷却し、減圧下にて濃縮します。残留の茶色のガラス質油に溶解した (3/4 (3/4 (150 mL) と連続して飽和水溶液aHCC （100 mL） 水溶液 1 M HC1 洗浄 （100 mL） とブライン (100 mL)。有機層、フィルタ リングし、集中 MgS04上を乾燥させた。茶色の残渣カラムクロマトグラフィーシリカゲル (EtOAc/ヘキサン、正立に 67:33) によって 3 対の不可分の混合物が含まれて、淡い黄色泡として (3.8 g、50%)、余裕がないために精製された(α/β = 1:5）。3 のアノマー混合物は、さらに分離することがなく次の手順で使用されました。C2ああ29大井2;TLC （EtOAc） Rf=0.35;XH NMR (600 MHz、CDC13) δ 6.26 (0.83 H、d、J = 2.5 Hz, Η-il-1)、5.62 (0.17 H、dd、J= 10.3、2.1 Hz H ラ)、5.43 (0.17 H、ddd は、J = 6.1, 4.4, 1.9 Hz)、5.29 5.27 (1.66 H,m) 5.22 (0.83 H、td、J = 10.6, 4.9 Hz)、5.17 (0.83 H、td、J = 6.5, 2.7 Hz)、5.11 5.07(0.34 H, m) 5.03 (0.17 H、ddd、J = 6.5, 2.7 Hz)、4.36 (0.17 H、dd、J 12.5 2.6 Hz =)、4.31(0.83 H、dd、J = 12.5、2.8 Hz)、4.08 3.98 (2.83 H, m) 3.74 (0.17 H、dd、J 10.5、2.5 Hz=)、2.17 2.15 (0.17 H, m) 2.15-2.13 (0.83 H, m) 2.11 (2.49 H, s)、2.10 （0.51 H,s)、2.09 (0.51 H, s)、2.08 (2.49 H, s)、2.07 (0.51 H, s)、2.04 (2.49 H、s）、2.03(0.51 H, s)、2.017 (2.49 H, s)、2.013 (0.51 H, s) 2.00 (2.49 H, s), 2.00-1.98(0.83 H, m)、1.98 1.96 (0.17 H, m) 1.88 (2.49 H, s)、1.87 （0.51 H, s)。
例 2: ジエチル(5-acetamido-4-acetoxy-6-(l,2,3-triacetoxy)propyl-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-2-yl)ホスホン酸 (4)。
[0160] 3 （2.15g、4.52 モル） とジエチル トリメチルシリル亜リン酸 （3.11 mL、13.65 モル） 無水でのアノマーの混合物 （3/4 (3/4 (30 mL) トリメチルシリルtrifluoromethylsulfonate （TMSOTf、1.23 mL、6.78 m モル） は 0 ℃ での扱われました。30 分後、混合物だった部屋の温度に暖められたし、24h を攪拌します。混合物は、氷の水 （20 mL） に注がれ、水層 (3/4 と (3/4 (20 mL, 2 x)。 抽出されました。複合抽出順次飽和水溶液中のaHC03 で洗浄された （50 mL） とブライン MgS04以上、乾燥 (50 mL) フィルターし、集中。残渣は、シリカのゲル (アセトン/EtOAc,1:9) 4 の余裕がないのは、- および β-対 （2:3) 混合物が含まれて、無色シロップとして （1.55 g, 62%）、カラムクロマトグラフィーにより精製した.ホスホン酸4 のアノマーの混合物で使用されていた、
次のステップでさらに分離することがなく。純粋な分析試料を- および β-対 (4 a および 4β) シリカゲル (EtOAc/アセトン、正立 90:10) 上のフラッシュ カラムクロマトグラフィーにより得られました。
[0161] アノマーの 4a: C22H36 O13P;無色の泡。TLC (EtOAc/アセトン, 9:1) Rf= 0.25;(a)D20 +39.4 = (c = 4.6,CH2C12);3/4 の NMR (600 MHz、CDC13) δ 5.30 (1 H、dd、J = 5.7, 1.7 Hz)、5.24 （1 H、d、NH= Hz 9.9 J） 5.18 (1 H、td、J = 6.6、2.5 Hz)、4.98 (1 H、td、J = 10.6, 5.0 Hz)、4.40 (1H、dd、J = 12.3, 5.0 Hz)、4.22-4.09 (5 H, m) 3.97 (1 H, q, J = 10.1 Hz) 3.74 (1 H、td、J= 12.5、2.4 Hz)、3.62 (1 H、dd、J = 10.3、2.0 Hz)、2.27 (1 H、dd、J = 12.8、4.9 Hz)、2.09(3 H, s)、2.05 (3 H, s)、2.02 (3 H, s) 2.01 (3 H, s), 1.98-1.92 (1 H, m) 1.87 (3H, s), 1.35 1.31 (6 H, m);13C NMR (150 MHz、CDC13) δ 170.9 (C) 170.5 （C）、170.3(C)、170.2 (C) 170.1 (C)、79.0 (CH、d は、 3Jc_p 17.3 Hz =)、71.8 (CH、d、 lJc.p = C l174.6 Hz)、71.6 （CH、d は、 3JC_P = 20.9 Hz)、71.0 (CH)、67.9 (CH)、63.4 (チャンネル2d、2JC-P 6.9 Hz、POCH2 =)、62.8 (チャンネル2d、 2JC-P = 6.2 Hz ポックオリオン2)、62.2 (チャンネル2C 8)、49.6(C 4 CH)、31.3 (チャンネル2C 2）、20.7 （CH3 20.8 （CH3）, 20.9 (CH3) 23.1 （CH3）、2 x)、16.5（CH3、d、 3Jc_p = 5.4 Hz ポックオリオン2CH3）、16.3 （CH3、d、 3JC_P = 5.4 Hz ポックオリオン2CH3）;31PNMR (202 MHz、CDC13) 5 18.48;人事管理システム calcd C22H35NO13p: 552.1846、発見: m/z552.1921 (M H)+.
[0162] Β アノマー 4β:C22H36NO13P;無色の泡。TLC (EtOAc/アセトン, 9:1) Rf= 0.28;(a)D20 -40.1 = (c = 3.0、CH2CI2）;'H NMR (600 MHz、CDC13) δ 5.45 （1 H、d、NH = Hz 10.1 J） 5.35 (1 H、dd、J = 7.3、2.3Hz)、5.32 （1 H、td、J = 15.0, 4.8 Hz)、5.21-5.18 (1 H, m) 4.45 （1 H、d、J = 10.0 Hz）4.33 (1 H、dd、J = 12.4、2.8 Hz)、4.30 (1 H、dd、J = 12.3、7.1 Hz)、4.19 4.13 (2 H、m）、4.124.04 (4 H, m) 2.35 2.31 (1 H, m) 2.11 (3 H, s)、2.08 (3 H, s)、2.017 (3 H, s)、2.011(3 H, s) 2.09-2.03 (1 H, m) 1.88 (3 H, s)、1.34 (3 H, t, J = 7.0 Hz) 1.33 (3 H、t、J= 7.0 Hz）;13C NMR (150 MHz、CDC13) δ 170.8 (C) 170.6 （C）、170.2 (C)、170.1 (C)169.8 (C)、74.0 (CH)、69.7 (CH), 69.5 (CH) 67.9 (CH、d、 lJc.p 157.2 Hz、C l =)、67.7(CH)、63.0 (チャンネル2d、 2JC_P = 7.2 Hz、POCH2）、62.7 (CH2d、 2Jc_p = 6.6 Hz、ポックオリオン2)、62.0(チャンネル2C 8)、49.0 (C 4 CH)、29.5 (チャンネル2d、 2Jc_p 3.2 Hz、C 2 =)、16.2 （CH3 20.7 （CH3、2x）、20.9 （CH3） 21.0 （CH3） 23.1 （CH3）、d は、 3JC_P = 5.1 Hz、POCH2CH3）、16.3 (CH3、d、3Jc_p = 5.1 Hz ポックオリオン2CH3);31P NMR (202 MHz、CDC13） δ 21.36;人事管理システム calcdC22H35NO13p: 552.1846、発見: m/z 552.1879 (M - H)+.
例 3: ジエチル(5-acetamido-4-acetoxy-6-(l,2,3-triacetoxy)propyl-4,5,6-trihydropyran-2-yl) ホスホン酸(5)
[0163] アノマー混合物(1.1 g、2 モル) ホスホン酸 4 のと N-ブロモスクシンイミド (885 mg, 5 モル) 無水 CH2CI2 で （20 mL） から 100W タングステン ランプ照射下における逆流に熱していた。反応の進行状況を監視します。完了 (~ 6 h） 混合物が室温に冷却され、析出物のスクシンイミド オフフィルターされました。は
濾液はさらに精製することがなく次の手順で使用された黄色のシロップとして原油 2-ブロモ誘導体を与えるために減圧下蒸発させた。
[0164] A ソリューションの無水ピリジン(10 mL) 化合物の上に準備ブロモ 50 ℃ で 2 時間撹拌しました。ソリューションは、減圧下にて濃縮され、茶色の残渣シリカゲル (EtOAc/アセトン、正立90:10) カラムクロマトグラフィーによる共役ホスホン酸 5 無色泡 (827 mg、75 ％ の 2 つの手順) として余裕がないために精製されました。C22H34NO13P;TLC(EtOAc/アセトン, 9:1) Rf= 0.28;(a)D20 +43.8 = (c = 0.59、CH2C12);※ H NMR (600 MHz、CDCI3)δ 5.74 (1 H、dd、J = 10.7、2.2 Hz)、5.54 （1 H、d、NH = Hz 8.2 J） 5.42 5.40 (2 H, m)5.26 (1 H、td、J = 6.4、2.9 Hz)、4.39 4.34 (2 H, m) 4.29 (1 H, q, J = 9.1 Hz) 4.174.09 (5 H, m) 2.09 (3 H, s)、2.05 (3 H, s)、2.04 (3 H、s）、2.02 (3 H, s), 1.91 (3H, s), 1.35 (3 H、t、J = 7.0 Hz) 1.31 (3 H、t、J = 7.0 Hz）;13C NMR (150 MHz、CDCI3) δ170.8 (C) 170.4 （C）、170.3 (C)、169.8 (C)、169.7 (C)、147.8 (C、d、 lJc.p = 225 Hz、Cl)、113.0 (CH、d は、 2JC_P = 22.8 Hz、C 2)、76.5 (CH、d は、 3Jc_p 9.3 Hz =)、69.9 (CH)、68.4(CH、d は、 3JC_P = 15.2 Hz)、67.2 (CH), 63.2 (チャンネル2d、 2JC_P = 5.4 Hz、POCH2)、63.0(チャンネル2d は、 2Jc_p = 5.7 Hz ポックオリオン2)、61.8 (チャンネル2、C 8)、46.4 (C 4 CH)、23.0 （CH3）、20.78（CH3）、20.73 （CH3）、20.63 （CH3）、20.60 （CH3）、16.16 （CH3、d、 3JC_P = 4.8 Hz ポックオリオン2CH3）,16.12 （CH3、d、 3Jc_p = 4.8 Hz ポックオリオン2CH3）;31P NMR (202 MHz、CDC13） δ 6.374;HRMScalcd C22H3313p「550.1690 が見つかりません: m/z 550.1684 (M - H)+.
例 4: ジエチル(4-(l,2,3-triacetoxy)propyl-2-methyl-3a,7a-dihydro-H pyrano(3,4-<) 白鳥-6-イル) ホスホン酸(6)
[0165] ホスホン酸のソリューションには、5(550 mg, 1 モル) 酢酸 (2 mL) と無水酢酸 (2 mL) の混合物でコーンと扱われました。H2だから4 (0.2 mL)。室温、寒さ （0 ℃）に注いだ 48 h 飽和水溶液 NaHC03 混合物が攪拌された （pH 9） と EtOAc （30 mL, 5 x) を抽出する前に 30 分間攪拌。複合の抽出物は、MgS04上を乾燥、フィルターし、減圧下にて濃縮しました。残油シリカゲル上カラムクロマトグラフィーにより精製した(アセトン/EtOAc, 1:9） 淡い黄色シロップ (394 mg, 2 つの手順のための 80%) として 6 を買う余裕。C20H3011P;TLC(EtOAc/アセトン, 9:1) Rf= 0.30;(a)D20 -11.6 = (c = 0.50、CH2CI2);XH NMR (600 MHz、CDC13)δ 6.20 (1 H、dd、J = 10.3、4.0 Hz)、5.58 (1 H, ddd, J = 6.6, 2.9, 1.1 Hz)、5.38 (1 H、td、J= 7.7, 2.5 Hz)、4.71 (1 H、ddd は、J = 8.6, 4.0, 2.0 Hz)、4.40 (1 H、dd、J = 12.4、2.5Hz)、4.19 (1 H、dd、J = 12.5、5.9 Hz)、4.18 4.07 (4 H, m)、3.93 (1 H、td、J = 9.2、0.6Hz）、3.34 (1 H、dd、J = 10.1、2.7 Hz)、2.11 (3 H, s)、2.04 (3 H, s)、2.03 (3 H, s)、1.98(3 H, s)、1.34 (3 H, t, J = 7.0 Hz) 1.32 (3 H、t、J = 7.0 Hz）;ljC NMR (150 MHz、CDC13)δ 170.5 (C)、169.7 (C)、169.4 (C)、167.2 (C, N = CCH3）、150.1 (C、d、 1J＆ 。P = 225 Hz、Cl)、111.9 (CH、d は、 2JC_P =
23.4 Hz、C 2)、76.1(CH、d は、 3JC_P = 6.3 Hz)、71.2 (CH、d は、 3JC_P = 15.3 Hz)、69.6 (CH)、68.8 (CH)、63.1(チャンネル2d、 2Jc_p 5.9 Hz のポックオリオン2=)、62.9 (チャンネル2d、 2JC_P = 5.7 Hz ポックオリオン2)、61.8(C 4 CH)、61.6 (チャンネル2C 8)、20.7 （CH3）、20.6 （CH3）、20.5 （CH3）、16.2 (CH3、d、 3JC_P =5.1 Hz ポックオリオン2CH3)、16.1 (CH3、d、 3Jc_p = 5.1 Hz ポックオリオン2CH3)、14.0 （CH3, N =CCH3);31P NMR (202 MHz、CDC13) δ 6.375;C20H29NOiiP のための人事管理システム calcd: 発見490.1478: mlz 490.1374 （M - H）+.
例 5: ジエチル(5-acetamido-4-azido-6-(l,2,3-triacetoxy)propyl-4,5,6-trihydropyran-2-yl) ホスホン酸(7)
[0166] の溶液オキサゾリン6 （393 mg、0.8 m モル） にする？-BuOH (10 mL) azidotrimethylsilane (0.53 mL, 4 モル) 80 ℃× 24 h に扱われました。ソリューションは、飽和水溶液 NaHC03に注がれて、EtOAc 30 mL （3 x） を抽出されました。複合の抽出物は、MgS04上を乾燥、フィルタリングし、アジドフェニル化合物 7 次のステップで使用することは実質的に純粋された無色のシロップ (87 %371 mg) として支払うことに集中していた。シリカゲル(EtOAc で 10% アセトン) 上のフラッシュ カラムクロマトグラフィーにより分析試料が得られました。C2ああ34OnP;TLC （江藤 Ac/アセトン,9:1) Rf= 0.30;(a)D20 +82.7 = (c = 0.58、CH2C12);3/4 の NMR (600 MHz、CDC13) δ 5.75(1 H、dd、J = 10.3、2.4 Hz)、5.73 (1 H、d、J = 8.6 Hz） 5.38 (1 H、dt は、J = 7.1、1.5 Hz)、5.26(1 H、ddd は、J = 8.5, 5.8, 2.6 Hz), 4.53-4.50 (2 H, m) 4.36 (1 H、dd、J = 12.5、2.6Hz)、4.17 4.08 （5 H、m） 3.67 (1 H, q, J = 9.2 Hz)、1.34 (3 H, t, J = 7.1 Hz) 1.99(3 H, s)、2.02 (3 H, s) 2.05 (3 H, s) 2.10 (3 H, s) 1.32 (3 H、t、J = 7.1 Hz）;13CNMR (150 MHz、CDC13) δ 170.8 (C) 170.5 （C）、170.1 (C)、169.7 (C) 147.7 (C、d、 lJc.v= 224 Hz、C l)、112.4 (CH、d は、 2JC_P = 22.9 Hz、C 2)、75.9 (CH、d は、 3JC_P 9.2 Hz =)、69.7(CH)、67.3 (CH)、63.5 (チャンネル2d、 2JC_P = 5.7 Hz ポックオリオン2)、63.3 (チャンネル2d、 2JC_P =5.9 Hz ポックオリオン2)、61.9 (チャンネル2C 8)、57.8 (CH、d は、 3JC_P = 14.7 Hz),
48.5 (C 4 CH)、16.2720.71 （CH3）、20.77 （CH3） 20.8 （CH3） 23.2 （CH3） （CH3d、 3JC_P = 5.7 Hz ポックオリオン2CH3）、16.23（CH3d、 3JC_P = 5.7 Hz ポックオリオン2CH3).
例 6: ジエチル{5-フェニルアセトアミド - 4-(7 v 〜2 VJ-bis(teri-butoxycarbonyl)) グアニジノ-6-(l,2,3-triacetoxy)propyl-4,5,6-trihydropyran-2-yl}ホスホン酸 (8)。
【００１５】
[0167] A ソリューションアジ化 7 （350 mg、0.71 モル） エタノール （25 mL） で Lindlar 触媒 (30 mg) の水素雰囲気下で水素化されました。混合物だった5 h を攪拌、セライトのパッドを介してフィルタ リングおよびエタノールの洗浄します。濾液は減圧下で無色の泡 (278 mg） を与えるために集中していた。原油アミン製品だった無水2CIチャンネル2 （30 mL） を解散し、l, 3-bis(tert-butoxycarbonyl)-2-methylthiopseudourea （247mg、0.85 m モル） と Et で治療3N （230 μ■、1.7 m モル）。混合物が 0 ℃ に冷却され、HgCl2 （231 mg、0.85 m モル）が徐々 に追加されました。懸濁液だった部屋の温度に暖め、12 h を攪拌します。その後混合物だった EtOAc で希釈し、セライトのパッドを介してフィルタ リングします。濾液を濃縮し、フラッシュのカラム・ クロマトグラフィ (EtOAc) グアニジン 8 （442 mg、83 ％ の収率） 無色泡として支払うことによって浄化します。TLC （EtOAc）Rf＝ 0.45;(a)D20 +18.5 = (c = 0.88, CH2C12);XH NMR (600 MHz、CDC13) δ 11.32 (1 H,s), 8.48 （1 H、d、J = 8.5 Hz） 6.12 （1 H、d、J = 8.5 Hz） 5.71 (1 H、dd、J = 10.3、2.0Hz)、5.35 （1 H、d、J = 6.6 Hz） 5.23 (1 H、td、J = 6.5, 2.7 Hz)、5.10-5.06 (1 H, m)4.37 (1 H、dd、J = 12.5、2.8 Hz)、4.25-4.20 (2 H、m）、4.19 4.12 (2 H, m) 4.12 4.05 (3H, m) 2.09 (3 H, s)、2.06 (3 H, s)、2.02 (3 H, s)、1.85 (3 H, s)、1.46 (9 H, s)、1.45(9 H, s)、1.36 (3 H, t, J = 7.1 Hz) 1.31 (3 H、t、J = 7.1 Hz）;13C NMR (150 MHz、CDC13)δ 171.0 (C) 170.5 （C）、170.1 (C)、169.8 (C) 162.7 (C)、157.2 (C)、(C) 152.6 147.4(C, d, c p = 224 Hz、C l)、114.2 (CH、d は、 2JC-P = 23.3 Hz、C 2）、83.9 （C）、79.8 （C）、77.9(CH、d は、 3JC_P = 9.3 Hz)、70.1 (CH), 67.4 (CH), 63.4 (CH2d、 2JC_P = 5.7 Hz、POCH2）、63.0(チャンネル2、d、 2Jc_p = 5.7 Hz ポックオリオン2）、62.1 (チャンネル2、C 8)、49.0 (CH、d は、 3JC_P =15.2 Hz)、48.1 (C 4 CH)、28.2 (CH3, 3 x)、28.0 (CH3, 3 x), 23.1 （CH3）、20.9 （CH3）、20.8（CH3）、20.7 （CH3）、16.29 （CH3、ポックオリオン2CH3）, 16.25 (CH3、ポックオリオン2CH3）;人事管理システムcalcd （M+ - H） C3iH50N4大井5P: 発見 749.3010： mlz 749.3172。
例 7： （5-Acetamido-4-amino-6-(l,2,3-hydroxy)propyl-4,5,6-trihydropyran-2-yl)ホスホン酸 （la）。
【００１６】
[0168] A の溶液ホスホン酸ジエチル-7（80 mg、0.15 m モル） に無水 CH2C12 （4 mL） を 0 ° C で bromotrimethylsilane （0.12 mL、0.87モル） 扱われました。攪拌 0 ° C で 24 時間後 MeOH (2 mL) を添加し、混合物は、減圧下にて濃縮しました。残渣だった無水メタノール （5mL） を解散し、ナトリウムメトキシド （5.4 M ソリューション MeOH、0.9 mL、4.86 モル） を施した。室温で 1 時間攪拌した後、混合物はダウエックス50WX8 を通じてフィルターされた (H+フォーム) と、減圧下にて濃縮します。残渣だった MeOH （5 mL） を解散し、水素化を受ける （1 atm）Lindlar の室温 (20 mg) 触媒の存在下で。3 H 後、混合物だったセライトのパッドを介してフィルタ リングし、メタノールですすぎ。濾液を濃縮, し残留固体Et20 で洗浄された (3 x 10 rnL) ホスホン酸ラを買う余裕。
例 8： （5-Acetamido-4-guanidino-6-(l,2,3-hydroxy)propyl-4,5,6-trihydropyran-2-yl)ホスホン酸 (lb)。
【００１７】
[0169] A ソリューションのホスホン酸ジエチル-8（130 mg、0.17 m モル） の無水 (3/4 (3/4 (4 rnL) と bromotrimethylsilane (0.13 mL、0.94 モル) 0の ° C で扱われた、0 ℃ で 24 時間反応混合物を攪拌しました。MeOH (2 mL) 活発な攪拌下で追加されました。として無水メタノール （5 mL）のソリューションは 5.4 M 溶液ナトリウムメトキシド メタノール 1 mL （5.4 m モル） を 30 分後、減圧と残渣の下にソリューションを蒸発させた。室温で1 時間攪拌した後、ソリューションを通じてダウエックス 50WX8 フィルターされた (H+フォーム) と lyophilisation を受けます。残留の淡い黄色の固体Et20 で洗われました (3 x 20 mL） を白色固体としてホスホン酸 lb を買う余裕。
例 9: （5-Acetamido-4-amino-6-(l,2,3-hydroxy)propyl-4,5,6-trihydropyran-2-yl)ホスホン酸エチレングリコールモノエチル エステル (lc)。
【００１８】
[0170] アルゴンの雰囲気下では、PMe3（1.4 mL、THF に 1.4 メートル） の溶液の溶液アジ化 7 （148 mg、0.28 m モル） に無水 THF （5 mL） は 0 ℃ では表面に追加されました室温19 h. Ets (0.5 mL) で混合物を攪拌したと 3/40 (0.5 mL) を追加し、混合物は、別の 30 分間攪拌しました。混合物を減圧下にて濃縮し、アミン製品（1 12 mg、79 ％ の収率） を買う余裕シリカゲルのカラム ・ クロマトグラフィ （MeOH/チャンネル2Ci2、6:94 10:90 に） によって浄化します。
[0171] だったアミン製品（110 mg、0.22 m モル） を解散江藤 (2 mL) と NaOEt のソリューション (490 μ■、江藤 2.68 M） は表面に追加されました。混合物を2 日間撹拌し、監視します。ダウエックス 50 w 樹脂による中和後、濾液を減圧下にて濃縮、シリカゲルのカラム ・ クロマトグラフィを受ける （≪-PrOH/H20,7： 3）。適切な分数を収集し、減圧下にて濃縮しました。残渣は 1 M HC1 扱われた (2 mL) とし、真空中でホスホン酸モノエステル lc （50mg、60 ％ の収率） を与えるために集中しました。Ci2H23N208p: XH NMR (600 MHz、D20） δ 5.48 (1 H、dd、J =9.4、7.6 Hz)、4.38 ^1.33 (2 H, m)、4.18 4.17 (1 H, m)、3.98 3.93 (2 H, m)、3.91 3.86(2 H, m)、3.69 3.64 (2 H, m) 2.07 (3 H, s)、1.26 (3 H、t、J = 7.1 Hz）;13C NMR （150MHz、D20） δ 174.7、153.3 (d, lJCv 208.8 Hz =)、104.3 (d、 2JC-P = 22.5 Hz)、75.4 (d、3JC-P = 8.0 Hz)、69.6、67.6、62.9、62.2 (d、 2JC-P = 5.1 Hz)、49.9 (d、 3JC-P = 13.4Hz) 45.8, 22.1, 15.8 (d、 3JC-P = 5.7 Hz);人事管理システム calcd
Ci2H22 208p「353.1発見 108: mlz 353.1 198 [M - Hf。
例 10： （5-Acetamido-4-guanidino-6-(l,2,3-hydroxy)propyl-4,5,6-trihydropyran-2-yl)ホスホン酸エチレングリコールモノエチル エステル (Id)
[0172] 化合物 8 （52mg、0.07 モル） だった溶解江藤 (1 mL) と NaOEt のソリューション (209 μ■、江藤 2.68 M） は表面に追加されました。混合物を4 日間撹拌し、監視します。ダウエックス 50 w 樹脂による中和後、濾液を減圧下にて濃縮、シリカゲルのカラム ・ クロマトグラフィを受ける （≪-PrOH/H20,8： 2）。適切な分数を収集し、減圧下にて濃縮しました。残渣は 1 M HC1 扱われた (2 mL) とし、真空中で (9 mg、30 ％ の収率) ホスホン酸モノエステルId を与えるために集中。dsH ^ WsP: H NMR (600 MHz、D20） δ 5.41 (1 H、dd、J 9.4, 7.5 Hz =)、4.42^1.40 (1 H, m) 4.35 （1 H、d、J = 10.6 Hz） 4.21 (1 H、t、J = 9.9 Hz) 3.97 3.93 (2 H,m)、3.90 3.85 (2 H, m)、3.67 3.62 (2 H, m) 2.01 (3 H, s)、1.25 (3 H、t、J = 7.1 Hz）;13CNMR （150 MHz、D20） δ 174.3、156.9、151.3 (d、 lJCv 211.2 Hz =)、108.2 (d、 2JC-P =21.6 Hz)、75.8、（d、 3JC-P = 8.6 Hz)、69.7、67.9、62.9、62.1 (d、 2JC-P = 4.8 Hz)、50.9(d、 3JC-P = 13.7 Hz) 47.8、21.9、15.8 (d、 3Jc-P = 5.7 Hz)。
例 11： 合成ザナミビルビオチン共役
[0173] ザナミビル ビオチン共役9 の合成図 3 に示します。アジ化併合ビオチン誘導体 11 はビオチン (10) 5 アジドフェニル l pentylamine トリエチルアミンおよびベンゾトリアゾール1-イルの存在下での凝縮によって準備された-oxytripyrrolidinophosphonium
ヘキサフルオロリン酸 (PyBOP)。（j. w. リー、s. I. 淳、金圭 2709年四面体 Lett.42 (2001))。その一方で、既知の手順に従ってシアル酸から作製した12 の炭酸ザナミビル ニトロフェニル (M. チャンドラーらああ、J. 化学 Soc、パーキン論文誌 1:1 173 (1995 年);L. Ying、J.Gervay ハーグによる 6、1857年 (2005)) 余裕が propargylamine と結合されていました、
アルキニル ヒンジとザナミビル微分 13。(W. H. Wen et al, J. Med. chem. 52 4903 （2009））。その後 1, 3 - の双極子付加(クリックの反作用;V. V. Rostovtsev ら、している （Angew.Chem., int. 編 41, 2596年 (2002);B. 祐李et al, 四面体 Lett。47、5105 (2006)) アジ化併合ビオチン誘導体 11 と、アルキニル間ザナミビル デリバティブ 13CH2CI2/H2O (1:1） 希望ザナミビル ビオチン共役を与えるための混合溶媒で実施された 9 88 ％ の全体的なの降伏後の保護基の除去。
例 12: ビオチン誘導体11。
【００１９】
[0174] A PPh3(5.0 g、19.1 m モル） と 1, 5-diazidopentane （3.36 g、21.8 モル), 1, 5-dibromopentaneNaN3 との置換反応から調製した溶液を 5% を攪拌した精力的に水溶液 HC1 (22 mL) EtOAc/Et20 で (v/v = 1:1、35mL), 室温で 24 h 5 アジドフェニル-l pentylaminesl （1.60 g, 59%） を与えるために。（j. w. リー、s. I. 淳,金圭、四面体 Lett. 42、2709年 (2001 年).)
ビオチン (10 日0.56 モル 136 mg) の [0175] A サンプル 5-アジドフェニル-l-pentylamine で （11, 86 mg 0.69 m モル）ベンゾトリアゾール 1-イルを攪拌した-oxytripyrrolidinophosphonium ヘキサフルオロリン酸 (PyBOP, 360 mg,0.69 m モル） と Et3N （0.116 mL、0.84 mol） DMF 溶液 （5 mL） 中のルーム 3 h の温度。混合物を減圧下にて濃縮し、H20とを洗った。残渣ケイ酸ゲル ・ クロマトグラフィーによる浄化された (CH2C12/メタノール = 15： 1） アジ化併合ビオチン誘導体 11 (180mg, 92%) を与えること。C15H26N602S;無色固体、mp 121 122 ° C;[a] 19 + 87.6 （c 0.0275、MeOH）;IRvmax (ニート) 3297 2924年、2100年、1698 年 1647 cm-1;1 H NMR （400 MHz、CDC13） 57.34 （1 H、t、J= 5.2 Hz)、6.40 (1 H, s)、6.34 (1 H, s), 4.30 4.27 (1 H, m), 4.12 4.09 (1 H, m)3.29 (2 H, t, J = 6.8 Hz) 3.10-3.05 (1 H, m)
3.03-2.98 (2 H,m) 2,80 (1 H、dd、J = 12.4、5.2 Hz)、2.56 （1 H、d、J = 12.4 Hz） 2.03 (2 H、t、J = 7.2Hz) 1.64 1.22 (12 H, m);13C 氏 (100 MHz、DMSO) 5171.5、162.4、61.0、59.1、55.4、50.6、39.8、38.1、35.2,28.7、28.3、28.1、28.0、25.4、23.6;ESI HRMS 計算 Ci5H27 602の s: 355.1916 が見つかりました： メートル/■355.1913 [M + H]+.
例 13： ザナミビルビオチン共役 9。
【００２０】
[0176] A ソリューション（188 mg、0.28 m モル） アジ化併合ビオチン誘導体 11 （100 mg、0.28 mol） とアルキニル ヒンジ ザナミビル デリバティブ 13の CUSO4.5H2O (10 mg、0.04 m モル） を攪拌したとアスコルビン酸ナトリウム （25 mg、0.13 m モル） CH2CI2/H2O で（6 mL, v/v = 1:1） 常温 8 h。水層は、CH2CI2で抽出されました。有機層だった結合、MgS04上を乾燥、フィルター、および減圧下回転蒸発により濃縮します。残渣カラムクロマトグラフィーにより精製した(CELCVMeOH = 20:1 10:1） 保護グループ （270 mg, 95%) を含むザナミビル ビオチン共役を買う余裕。
C45H71N11O14S;TLC（CH2Cl2/MeOH = 9:1) Rf= 0.29;無色固体、mp 157 158 ° C;[a]22D +16.6 （c 0.5、CH2CI2）;IRvmax （ニート） 2930年, 1727年, 1689年, 1643, 1612 cm"1;XH NMR （400 MHz、CDCI3） 511.37 (1 H, s)、8.20 (1 H、d、J = 7.6 Hz)、8.04 （1 H、d、J = 9.2 Hz） 7.95 (1 H, s),7.76-7.70 (2 H, m) 6.40 1 時間 （s）、6.33 (1 H, s)、5.81 （1 H、d、J = 2.0 Hz） 5.17 （1H、d、J = 5.6 Hz） 4.79 t、J = 7.6 Hz （1 H）、4.36 （1 H、d、J = 11.6 Hz） 4.30-4.21 (4H, m)、4.15 4.10 (3 H, m)、4.04 3.97 (2 H, m) 3.86 (1 H、dd、J = 8.8、5.6 Hz)、3.71(3 H, s), 3.10-3.05 m （1 H）、3.00-2.95 (2 H, m) 2.80 (1 H、dd、J = 12.4、5.2 Hz)、2.56（1 H、d、J = 12.4 Hz） 2.02 (2 H、t、J = 7.2 Hz)、1.80 1.77 (2 H, m) 1.74 (3 H, s),1.64-1.19 (10 H, m) 1.45 (9 H, s)、1.39 （9 H, s)、1.25 (6 H, s);13C NMR (100 MHz、CDC13)δ 173.0、170.7、163.7、162.8、161.8、156.7、155.6、152.4、145.4、144.6、122.9、110.1、108.6、83.6、79.6、77.5、77.2,75.1, 69.9、65.7、61.9、60.2、55.8、53.5、52.5、50.0、49.5、47.4、40.6、38.9、37.0、35.8、29.6、28.6、28.3(3 x)、28.1 (3 x)、26.5、25.6、25.5、23.5、23.2;ESI HRMS calcd C45H72N11O14S を： 発見1022.4981: m/z 1022.4986 [M + H]+.
[0177] 保護されたザナミビルビオチン共役 （34 mg、0.033 モル） のサンプルを水酸化ナトリウム水溶液 (1 M、1 mL) と MeOH （1 mL） 15 分間室温での扱われました。混合物はダウエックス50Wx8 を中和した (H+)、フィルタ リング、および減圧下にて濃縮します。残渣は、トリフルオロ酢酸 (TFA、1 mL) CH2CI2 で攪拌した (1mL) 1.5 h 間室温で。混合物は、減圧下蒸発させたし、H20 (1 mL) は室温で追加されました。10 分間攪拌した後、混合物を減圧下にて濃縮し、セファデックス10 列・ クロマトグラフィーによって精製 (溶離液: 0.1% H20 TFA) 希望ザナミビル ビオチン誘導体 9 (24 mg, 93%) を与えること。C31H 49N11O10S;
無色固体、mp170 172 ° C;IR vmax (ニート) 3355 2937）、1675 cm"1;3/4 NMR （400 MHz、CDC13） δ 7.92(1 H, s), 5.96 (1 H, s), 4.98 （1 H、d、J = 8.4 Hz） 4.61-4.57 m （2 H）、4.47 4.39 (5
H, m) 4.33 4.29(1 H, m) 4.16 (1 H、t、J = 9.2 Hz) 4.06-4.04 (1 H, m) 3.65 （1 H、d、J = 9.6 Hz）3.47 (1 H、dd、J = 6.4、12.0 Hz)、3.31 (1 H, m) 3.20-3.10 (2 H, m) 2.98 (1 H、dd、J =4.8、13.2 Hz)、2.77 （1 H、d、J = 13.2 Hz） 2.22 (2 H、t、J = 7.2 Hz)、1.97 (3 H, s),1.93 1.90 (2 H, m)
I.73-1.51 (6 H,m)、1.38 1.22 (4 H, m);13C NMR (100 MHz、CDC13) δ 176.4、173.8、165.3、164.9 162.9(C02 TFA の q、J = 35.0 Hz)、157.0、156.5、124.1、116.5 (CF3 TFA の q、J = 288.1 Hz)、109.1、75.9、70.2、69.0、62.6、62.4、60.5、55.7、51.3、50.8、47.4、40.0、39.2、36.0、35.8、29.4、29.3,28.2、28.1、28.0、25.5、23.3、22.2;ESI HRMS 計算 C3の 1 H 50N11O10s: 768.3463 が見つかりました：メートル/■ 768.3458 [M + H]+.
化合物の例14:14
[0178] 炭酸溶液 12 に0.25 g だ （0.33 m モル）、4-ジメチルアミノピリジン (DMAP、60 mg、0.50 モル) ピリジン (2 mL) で、アミン H2N(CH2CH20)3CH2CH2N3 (0.14 g、0.66 m モル） 追加されました。混合物を室温 N2の雰囲気下で 40 h を攪拌し、HC1 (1M 水溶液の 10 mL) と EtOAc (50 mL) を抽出します。有機層塩水 （30 mL） を洗ったし、飽和 NaHC03 (q) (30 mL)、MgS04以上を乾燥させ、減圧下にて濃縮します。残渣カラムクロマトグラフィーにより精製した (EtOAc/ヘキサン シリカゲル = 1:1) カーバメート系 14(0.2 g、74 ％） を与えるために。CssHjsNsOis;' H NMR (CDC13, 600 MHz) δ 11.41 (1 H, s),8.45 (1 H、d、J = 9 Hz)、6.08 (1 H、d、J = 9 Hz)、5.91 (1 H, s)、5.45 (1 H、t、J = 6 Hz)、5.26(1 H、t、J = 10 Hz)、5.22 (1 H、d、J = 6 Hz)、4.41 (1 H、d、J = 9 Hz)、4.38 (1 H, q, J =10、6 Hz)、4.10-4.14 (2 H, m) 3.81 (3 H, s), 3.60-3.77 (12 H, m)、3.56 3.57 (1
H, m) 3.41 (2 H、t、J= 5 Hz)、3.37 (2 H、d、J = 5 Hz)、1.92 (3 H, s)、1.50 (18 H, s)、1.41 (3 H, s)
I.37 (3 H,s);13 C NMR (CDC13) Δ 170.6、163.0、161.9、156.9、155.6、152.7、145.2、132.1、132.0、131.9,128.5、128.4、109.8, 108.9、83.6、79.6、77.4、74.5、70.6、70.5、70.2、70.0、69.7、66.0、60.4、52.4、50.6、48.7、48.3、41.0、28.2、28.0、26.6、25.4、23.1;ESIHRMS calcd C35H59N8015 を： 発見 831.4100: m/z 831.4134 [M + H]+.
例 15： ザナミビルFITC con ugate 15。
【００２１】
[0179] アジ化ソリューションに14 (80 mg、0.096 モル) 江藤 （1 mL） の Pd(OH)2 （9 mg、0.058 モル） 追加されました。混合物だった 1.5 h, 室温下のH2、雰囲気の中で攪拌し、セライトのパッドを通じてメタノールで溶出によってフィルタ リングします。混合物は、アミンの製品 (66 mg） を与えるために減圧下にて濃縮しました。C35H606O15;lH NMR (CDCI3, 600 MHz) δ 11.36 (1 H, s)。8.40 (1 H、d、J = 8 Hz） 6.18 （1 H、d、J= 9 Hz) 6.04 (1 H, s)、5.87 (1 H, s), 5.17 5.22 (2 H, m)、4.32 4.39 (2 H, m)、3.984.10 (3 H, m) 3.75 (3 H, s), 3.55-3.72 (12 H, m) 3.31 (4 H, s), 2.89 (1 H, s),2.73 （1 H、d、J = 7 Hz）、1.88 (3 H, s)、1.45 (18 H, s)、1.36 (3 H, s) 1.32 (3 H, s)
[0180] N2の雰囲気下では、蛍光チオシアン酸(FITC、37 の mg、0.095 モル） 無水 THF (1 mL) 化合物の上に準備アミンのソリューションに追加されました。混合物の室温で 4 h を攪拌、減圧下にて濃縮およびクロマトグラフィーによって精製(シリカゲル、CH2Cl2/MeOH 92:8 =) 共役製品 （50 mg、52 ％） を与えるために。C56H71N7O20S;3/4 の NMR(MeOD, 600 MHz) δ 7.80 (1 H, s), 7.56 7.59 （2
H, m) 7.48 （1 H、t、J= 8 Hz） 7.17 （1 H、d、J = 8 Hz） 7.09 （1 H、d、J = 8 Hz） 6.63 (2 H, s)、6.56 （2 H、d、J= 9 Hz） 6.48 6.51 (3 H, m) 5.86 （1 H、d、J = 8 Hz） 4.30 (1 H、t、J = 10 Hz) 4.124.23 (2 H, m)、4.07 4.10 (2 H, m)、3.96 4.06 (2 H、m）、3.93 （1 H、t、J = 8 Hz）3.60-3.77 (15 H, m)、3.44 3.58 (4 H, m)、3.16 3.24 (2 H, m) 1.82 (3 H, s),1.40-1.42 (18 H, m) 1.32 (3 H, s)
私は.30 (3H, s)。
[0181] A ソリューション上記準備FITC 共役 （47 mg、0.039 モル） MeOH (1.5 mL) での NaOH (1 mL) 1 M 水溶液の扱われました。混合物でダウエックス50 w を中和室温で 1 時間攪拌した >< 8 (H+)、およびフィルター処理されました。濾液を濃縮, し残渣トリフルオロ酢酸 TFA （1mL） の CH2の C12 (1 mL) 扱われました。1 H、減圧下にて濃縮用撹拌と puritied セファデックス 10 列・ クロマトグラフィーによって混合物をだった(溶離液: 0.1% TFA H20） 希望ザナミビル FITC 共役 15 (10 mg、56 ％） を与えるために。C38H41N7O14S;3/4 のNMR (MeOD, 600 MHz) δ 8.31 (1 H, s), 7.88 （1 H、d、J = 8 Hz） 7.48 7.57 (3 H, m)7.30 (1 H, s), 7.36 (1 H, s), 7.13 (2 H、d、J = 9 Hz)、6.00 (1 H, s), 4.30-4.32 (1H, m) 4。各社 12 (2 H, m)、H 3.81-3.97 (2 H, m)、3.58 3.80 (14 H, m)、3.13-3.28 (3 H,m) 1.80 (3 H, s)。
例 16： ザナミビルFITC con ugate 17。
【００２２】
[0182] （87 mg、0.13m モル） ソリューションのアルキン 13 と 10-azidodecanamine （30 mg、0.16 ミリ モル） で？-BuOH (1 mL) とH20 (lmL) CuS04-5 H20 (4 mg、0.016 モル) 追加されたアスコルビン酸ナトリウム （18 mg、0.091 モル） 及びトリス[(1 - ベンジル - 1 H - 1, 2, 3 - triazol-4-イル） metkyl jamine （TBTA、8 mg、0.04 m モル）。混合物だった部屋の温度で12 時間攪拌し、CH2CI2 とを抽出 （30 mL） と H20 (30 mL)。有機層の MgS04上を乾燥、減圧下にて濃縮およびクロマトグラフィーによって精製(シリカゲル、CH2Cl2/MeOH = 9:1) 複合 16 (53 mg, 50%) を与えること。C4ああ67 9Oi2;黄色の固体、mp 116 ℃XH NMR (CDC13, 600 MHz) δ 11.38 (1 H, s) = 8.43 (1 H、d、J = 8 Hz） 7.84 br s （1 H）、5.88（1 H、d、J = 14 Hz） 5.11 - 5.28 (2 H, m) 4.33 4.45 (6 H, m) 4.18 (1 H, s)、4.08 (1H, s)、3.99 (1 H, s)、3.76 (3 H, s)、1.89 (3 H, s)、1.31 （18 H, s)、1.23 （22 H, s)。
[0183] FITC （45mg、0.115 m モル） と diisopropylethylamine （0.038 mL） の上に準備アミン （0.1 g、0.115 m モル）THF (1 mL) とメタノール (2 mL) でのソリューションに追加されました。混合物を室温 20 h で攪拌し、[赤いソリッドとして共役製品を与えるために減圧下で濃縮します。MeOH(1 mL) 化合物の上に作製した共役溶液 NaOH (1 M 水溶液の 1 mL) でダウエックス 50 w によって中和室温で 1 時間攪拌した>< 8 (H+)、およびフィルター処理されました。溶存だった濃度後の残渣に CH2CI2 (1 mL) 及び TFA (1 mL)。混合物の室温で30 分間攪拌、減圧下にて濃縮およびセファデックス 10 列・ クロマトグラフィーによって精製 (溶離液: 0.1 %tfa 3/40 で) 目的のザナミビルFITC 共役 17 (50 mg, 43%) を与えること。C47H56 10O13S;黄色の固体、mp = 112 ° C;XH NMR (d MeOD,600 MHz) δ 8.13 （1 H、d、J = 7 Hz） 7.63 7.67 (4 H, m)、7.55 7.58 (3 H, m) （1 H、d、J= 7 Hz) の 6.89 4.54 （br s 1 H） 4.31 ^1.38 (2 H, m) 4.17 (1 H, s)、4.00 (br s 1H) 3.58 3.68 (12 H, m)、3.56 (2 H、t、J = 5 Hz)、3.42 3.47 (2 H、m）、2.00 (3 H, s),1.70-1.72 (4 H, m)、1.18-1.36 (12 H, m);ESI HRMS calcd C47H57N10O13s: 1001.3827;見つかりました：mlz 1001.3768 [M + H]+.
Tamiphosphor ビオチン共役の例17: 合成。
[0184] 図 4tamiphosphor ビオチン共役 24 の合成です。ヨウ化物化合物の 18 は、以前に報告された手順に従って準備されました。[J ・ J ・ シエ etal. している （Angew.Chem. int. 編 2008 年、47、5788。]Di[4-(trimethylsilyl)but-3-yn-l-yl]ジアルキル亜リン酸 17 PCI3 2 つの同等の 4-(trimethylsilyl)but-3-yn-l-ol との置換反応によって準備されました。Phosphonylation亜リン酸 19 と 18 の Pd (PPh3)4ホスホン酸 20 で 64 ％ の収率を買う余裕の触媒作用によって達成されました。Boc グループの除去後、アミン中級トリメチルシリルグループ KF 化合物 21 を与えるためとの除去に続いてN,N'-di-Boc-N"-trifluoromethanesulfonyl-guanidine と扱われました。5-Azidopentanamine島、治療が続きますと 21 のクリック反応 phophonate モノエステル 22 を与えられます。20 ビオチン-大須 （23） とのカップリング反応希望tamiphosphor ビオチンの共役保護 Boc 基で 24 を除去した後に結実。
例 18:20 化合物します。
【００２３】
[0185] ヨウ素 18(100 mg、0.21 モル), 19 亜リン酸の混合物 （85 mg、0.26 モル） と diisopropylethylamine （100 mg、0.64m モル） 無水トルエン （2.1 mL） でいた 10 分間窒素をバブリングによって脱し、窒素雰囲気下で丸底フラスコ内に置かれたtetrakis(triphenylphosphine)palladium(0) （10 mg、8.6 μιηο■） に追加。結果のソリューションでした徐々 に90 ° C まで加熱し、12 h の温度を維持します。反応混合物セライトのパッドを通して濾過し、濾液シリカゲルカラム フラッシュ ・ クロマトグラフィーによって精製された黄色の泡(110 mg） を与えるために減圧下蒸発させた [EtOAc/ヘキサン = 1:1 に EtOAc] ホスホン酸 20 (92 mg, 64%) を買う余裕。
C32H57W9P;黄色の油;TLC（EtOAc/ヘキサン、1:1） Rf= 0.29;XH NMR （400 MHz、CDC13） δ 6.59 （1 H、d、J = 22.0 Hz）5.85 （1 H、d、J = 9.2 Hz） 5.04 （1 H、d、J = 9.2 Hz） 3.97 4.11 （5 H、m） 3.89 (br 1 H)3.75 3.81 (1 H, m)、3.29-3.32 (1 H, m)、2.57 2.61 (1 H, m) 2.59 (4 H、t、J = 1.2 Hz）2.20 (1 H, J = 10.0 の td、3.2 Hz)、2.00 (3 H, s), 1.43 1.51 (4 H, m) 1.39 （9 H,s)、0.83 0.88 (6 H, m)、0.07-0.21 (18 H, m);13C NMR (100 MHz、CDC13) δ 170.2、155.6、142.1、127.2,101.2、87.0、82.2 (2 x)、79.7、76.0、63.7 (2 x)、54.8、49.3、49.1、31.4、28.6 (3 x)、26.4、25.9、23.7、22.6、22.5、10.1、9.9,0.5 (6 x);31P NMR (162 MHz、CDCI3) δ 18.0。
化合物の例19:21
[0186] A の溶液ホスホン酸20 （92 mg、0.14 m モル） に無水 CH2CI2 (1.0 mL) 〜 0 ℃ を氷浴中で冷却された、トリフルオロ酢酸 （0.16 mL、2.1m モル） を追加しました。混合物を室温で 1 時間攪拌し減圧下にて濃縮し、無水 CH2の C12 (1.0 mL） を解散だった。N-N'-Di-Boc-N"-trifluoromethanesulfonylguanidine（67 mg、0.21 m モル） トリエチルアミン （0.06 mL、0.41 モル） を追加しました。混合物は, 室温で 3 h 攪拌し、1 M 塩酸 （5mL） と CH2CI2 抽出、(5 mL x 3)。有機層だった MgSC 上を乾燥、フィルター、濃縮、シリカゲルカラム フラッシュ ・ クロマトグラフィーによって精製(EtOAc/ヘキサン = 1:1) グアニジン誘導体を生成します。
[0187] グアニジンMeOH/H で化合物の溶液は20 (v/v、1.2 mL/1.2 mL) KF (71 mg、1.2 m モル） に追加されました。混合物を室温 24 h で攪拌し、減圧下にて濃縮します。混合物はCH2CI2 と抽出された (5 mL x 3) と H20 (5 mL)。有機層だった MgS04上を乾燥、フィルター、濃縮、シリカゲルカラム フラッシュ ・クロマトグラフィーによって精製 (EtOAc/ヘキサン = 1:1) 複合 21 (63 mg, 69%) をもたらす。C32H51N4O9P;無色の油;TLC（EtOAc/ヘキサン、1:1） Rf= 0.24;[a]D22 -27.47 = (c = 1、CH2C12);IR (映画) vmax 3450 2923年2018年、1925年、1870年、1720年、1626年, 1342年、1249年、1203;XH NMR （400 MHz、CDC13） δ 11.34(1 H, s), 8.56 （1 H、d、J = 8.0 Hz） 6.66 （1 H、d、J = 22.4 Hz） 6.28 （1 H、d、J = 9.2Hz） 4.34 4.40 (1 H, m)、4.06-4.16 (5 H, m)、3.96 4.04 (1 H, m)、3.29-3.33 (1 H, m)、2.652.71 (1 H, m)、2.59 2.61 (4 H, m)、2.26 2.40 (1 H, m) 2.03 (1 H、s）、2.00 (1 H, s)、1.90(3 H, s), 1.00-1.78 (22 H, m) 0.83 0.90 (6 H, m);31P NMR (162 MHz、CDC13) δ18.0;C32H52N4O9p: 667.3472、発見のための人事管理システム calcd: m/z 667.3450 [M + H]+.
例 20:Tamiphosphor ビオチン共役 24
[0188] 5 アジドフェニルl pentanamine アジ化物 （46 mg、0.36 m モル） と/-BuOH/H20 の化合物の 19 （120 mg、0.18 m モル） の溶液に(0.6 mL, v/v = 1:1） 追加しました
tetrakis(acetonitrile)copper(I)リン六フッ化。混合物の 12 h を室温で撹拌、減圧下で濃縮し、精製、MeOH/H20 （1:9 9:1) の溶出と RP 18 逆相カラムによって。トリアゾール化合物の原油製品（1.0 mL） 1, 4-ジオキサンの溶解し、1 M KOH(aq) (1.0 mL） を追加しました。ソリューション ( XH nmr による）、120h の 25 ℃ で攪拌し、ソリューションを中和するダウエックス 50 W ※ 8 を追加しました。混合物は、濾過し、減圧下にて濃縮だった。原油の製品 (10mg、0.013 モル） 無水 DMF （0.1 mL）、溶解し、ビオチン-大須 （4.5 mg、0.013 モル） とdiisopropylethylamine （4.2 mg、0.026 モル） を追加しました。混合物を室温 3 h で攪拌し、減圧下にて濃縮します。残渣は、MeOH0.5 mL に溶解した 0 ℃ を氷浴中で冷却し、トリフルオロ酢酸 （0.16 mL、2.1 m モル） を追加しました。混合物の室温で 1 時間攪拌、減圧下にて濃縮、化合物のタイトルを与えるためにRP 18 逆相カラム MeOH/H20 （1:9 9:1) の溶出と精製 (40 mg 収量 30 ％ の全体的な）。C33H57N10O7PS;黄色固体;XHNMR （400 MHz、CDCI3） δ 7.89 (1 H, s), 6.39 （1 H、d、J = 19.6 Hz） 4.90 (1 H、t、J =5.2 Hz) 4.38 (1 H、t、J = 7.2 Hz) 4.29 4.32 (1 H, m) 4.00 (2 H, m) 3.77 3.90 m （2H）、3.40-3.48 (2 H, m)、3.15-3.26 (2 H, m) 3.00 (1 H, t, J = 5.2 Hz) 2.91 2.95 （2H、m）、2.71 （1 H、d、J = 12.8 Hz） 2.53 2.62 (2 H, m) 2.23 (2 H、t、J = 7.2 Hz)1.90-2.03 (5 H, m)、1.29-1.79 (16 H, m)
0.86-0.97(6 H,m);31P NMR (162 MHz、CDC13) δ 13.6;HRMS 負モード calcd C33H56N10O7PS を： 発見 768.3723:m/z 768.3723 [M - H]~.
化合物の例21:25
[0189] のソリューションにdi(5-azidopentyl) アミン （0.12 g、0.49 m モル） の無水 DMF (5 mL) 中ビオチン （0.12 g、0.41 モル） を追加しましたPyBOP （0.25 g、0.49 m モル） と Et3N （0.23 mL、1.64 m モル）。混合物を室温下アルゴン、22 h の攪拌し、減圧下にて濃縮します。残渣カラムクロマトグラフィーにより精製した(シリカゲル、CH2Cl2/MeOH = 13： 1） ビオチン diazide 化合物 25 (0.15 g、79 ％） を与えるために。C2ああ35N902S;淡黄色の油;XHNMR (CDC13, 600 MHz) δ 4.48 （dd、J = 7、5 Hz、1 H）、4.29 (dd、J = 7、5 Hz、1 H）、3.28(t、J = 7 Hz、4 H)、3.25 (t、J = 7 Hz、4 H)、3.20 (t、J = 7 Hz、2 H)、2.89 （dd、J = 12、5Hz、1 H）、2.71 (d, J = 12 Hz、1 H)、2.29 (t、J = 7 Hz、2 H）、1.84 (br s, 3 H)1.50-1.67 m （8 H）、1.43-1.44 m （2 H）、1.32 1.38 （m、4 H）;13C NMR (CDC13, 150 MHz) δ比 172.4、163.2、61.8, 60.1, 55.3、51.2、47.0、46.2、45.6、40.5、32.5、28.7、28.6、28.3、27.3、26.4、25.1、24.1。C20H369行なわれた O2S の ESI HRMS calcd： 発見、466.2707: mlz 466.2703 [M + H]+.
例 22:Dizanamivir ビオチン con ugate 26
[0190] の溶液ビオチンdiazide 25 （36 mg、0.075 ミリ モル） にする？-BuOH (1 mL) と H20 (1 mL) CuS04-5 H20 (0.015モル 4 mg) アスコルビン酸ナトリウム (10 mg、0.045 ミリ モル) と TBTA (8 mg、0.015 モル) を追加されました。5 Minのための混合物を攪拌したし、アルキニル ヒンジ ザナミビル デリバティブ 13 （0.1 g、0.15 m モル） を追加しました。混合室で 12 時間攪拌しました。
CH2CI2 を抽出温度 （20mL） と MgS04以上、乾燥させ、下したの H20 （20 mL） 減圧します。残渣カラムクロマトグラフィーにより精製した (シリカゲル、CH2Cl2/MeOH= 9.5: 1） カップリング製品 (64 mg, 47 ％） を与えるために。XH NMR (CDC13, 600 MHz) δ 1.22 (s、12H) 1.30 (s, 36 H)、1.62 s （4 H）、1.79 （s、2 H）、1.89 s （3 H）、1.94 s （3 H）、2.23 (t、J= 7 Hz、2 H) 2.74 (J = 12 Hz、1 H d)、2.88 (d, J = 12 Hz、1 H) 3.10-3.16 m （4 H）、3.23(s, 2 H) 3.75 (s、6 H)、3.98 (t、J = 7 Hz、2 H) 4.06 (t、J = 8 Hz の、2 H) 4.15 (t、J =10 Hz, 2 H) 4.28 4.43 (m、14 H) 5.16 (s, 2 H)、5.23 (t、J = 6 Hz、2 H) 5.35 s （1 H）、5.70s （1 H）、5.86 (d、J = 2 H 8 Hz)、6.04 (s、1 H）、6.28 (s、1 H)、6.54 (d, J = 9 Hz、1 H)6.63 (d, J = 9 Hz、1 H) 7.79 s （2 H）、8.42 (d, J = 8 Hz の、2 H) 11.38 (s, 2 H)。
[0191] MeOH (1mL) で上記に準備カップリング製品 （60 mg、0.033 モル） 攪拌した NaOH (1 mL) 1 M 水溶液の中和の結果, 50Wx8 と室温で1 h を （H+)、およびフィルター処理されました。溶存だった濃度後の残渣に CH2CI2 (1 mL) 及び TFA (1 mL)。混合物の室温で 1 時間攪拌、減圧下にて濃縮およびセファデックス10 列・ クロマトグラフィーによって精製 (溶離液: 0.1% H20 TFA) dizanamivir ビオチン共役 26 (50 mg, 43 ％） を与えるために。C52H8119O18S;XH NMR (CDCI3, 600 MHz) δ 1.29-1.33 (m, 6 H) 1.45 (br s, 2 H)、1.56-1.61 （m、8H）、1.75 （br s、1 H）、1.84-1.87 m （1 H） 1.97-2.04 (12 H m)、2.36 (br s, 2 H) 2.73(d, J = 12 Hz、1 H)、2.94 (d, J = 12 Hz、1 H）、3.51 （br s、2 H）、3.65 (d, J = 10 Hz、2H）、3.69 (s, 2 H)、3.78 s （4 H）、4.00 (br s, 2 H) 4.19 (br s, 2 H) 4.37 ^1.45 （m、11H） 4.55 br s （4 H）、4.68 (d, J = 8 Hz、4 H)、5.91 s （2 H）、7.57 s （1 H）、8.05 （s、2 H）;ESIHRMS calcd c ^ H ^ NwOisS: 発見 1292.5800： mlz 1292.5916 [M + H]+.
例 23: 細胞、ウイルス、および生物試薬。
[0192] 両方の MDCK2 つのインフルエンザ ウイルスおよび 293 t 細胞: A/愛知/2/68 (H3N2) と B/李/40 調製し, から (マナッサス、バージニア州、米国）をそれぞれ得られました。インフルエンザ ウイルス A/WSN/1933 （H1N1）、A/ウドンタニ/307/1972 (H3N2)、A/広報/8/1934 （H1N1）、A/台湾/3446/2002(H3N2) インフルエンザ B/2004/台湾/7064 分離された博士新 Ru Shih ラボ (チャン庚大学、台湾） とは/ベトナム/1 194/2004RG14 から （H5 1） A/カリフォルニア/7/2009 （H1 1） は、/ブリスベン/10/2007 (H1N1) とは/ブリスベン/10/2007(H3N2) された博士 Jia Tsrong から 1 月のラボ （ゲノミクス研究センター、アカデミア ・ シニカ （台湾）。オセルタミビル耐性 WSN 変異株6 通路 OC （オセルタミビル） 濃度を徐々 に増加 MDCK 細胞で選ばれました。このインフルエンザの変異も 1 μΜ OC の存在下で成長してシーケンス分析によって確認そのNA 遺伝子で単一 H274Y 変異を運ぶ。臨床 H1 1 分離株その他台湾インフルエンザ コレクション センター センター疾病管理 （台湾/台北） 得られた、表1 で説明。7 S-OIV 株もセンターから疾病管理 （台北、台湾） を得られたし、#1 （A/台湾/T 1941/2009）、#2 (2009/A/台湾/T1338)、#3 （A/台湾/T 1339/2009）、#4 （A、台湾 6662、2009）、#5 としてコード化されました。
（A/台湾/6663/2009）、（A/台湾/7717/2009）、#6と #7 （A、台湾 7855、2009）。インフルエンザ NP 抗体と蛍光標識二次抗体ケミコン株式会社 (ビレリカ、マサチューセッツ州、米国） とシグマ （セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）からそれぞれ購入しました。アンチ WSN ウサギ抗体は不活化 WSN インフルエンザ抗原として用いた実験室で準備されました。反-HA 抗体 （アビーム、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）Interlab 会社 （台湾） から購入しました。
ノイラミニダーゼ発現細胞を用いた OC 感受性アッセイの例 24: 開発。
[0193] ザナミビルとZB のノイラミニダーゼ阻害活性を比較したし、それ ZB はまだ非常に、, ic5 調べる0 7 のノイラミニダーゼ阻害が発見された nM やや下回るがアクティブし、,ic5 調べる0 2 件とザナミビル nM。細胞表面に発現機能のノイラミニダーゼ ZB バインディングのモデル系と OC 感受性評価のための OC 競争として役に立つかもしれない。A/ハノイ/30408/2005（H5N1） のノイラミニダーゼ cDNA 発現プラスミドの複製し、transfect 293 t 細胞 (274 H) 野生型ノイラミニダーゼの表現のために使用します。表明ノイラミニダーゼは、バインディングを許可とラベリングZB （図 10） を使用して主に細胞表面上に位置するが見つかりませんでした。ノイラミニダーゼ cDNA OC 耐性 274Y 変異体酵素の発現スクリーニングしました。野生型と人為のcDNA はそれぞれ 274 H と 274Y それらの表現のための安定した 293 t セルラインを生成に使用されました。これら 2 つのセルに異なる比率の混合物だったZB または ZB プラス余分な OC の孵化と APC を装飾
共役のストレプトアビジン ZB 流れ cytometry 解析によってバインド セルの人口を決定します。図 11 は、ZB 274 H と 274Y 発現細胞類似のエクステントにバインドすることを示します。過剰のOC の存在下で 274Y 発現細胞への ZB バインドは事実上変化はなかったに対し 274 H ノイラミニダーゼを発現する細胞 （図 12） ZB バインディングが完全にブロックされました。これらの結果は原理実証そのZB バインディング使用できます OC に敏感な OC 耐性のそれらを区別する OC 競争によって。
例 25: インフルエンザウイルスを用いた OC 感受性の定量細胞を感染。
[0194] OC 阻害 NA表現する細胞を用いた ZB バインディング上の結果私たちの ZB および OC インフルエンザ ウイルスの OC 感受性を査定する濃度を定義するように求めいた。どちらのOC の影響を受けまたは OC 耐性の WSN ウイルス感染 MDCK 細胞は様々 な ZB および OC 濃度を用いた OC 感受性評価の可能性をテストに使用されました。図13A OC 競争のインフルエンザ ウイルスに感染した MDCK 細胞への ZB バインドを示しています。インフルエンザの感染細胞 10 または 50 nmZB を分類することによって、OC 感受性のウイルスに感染するの OC で競争バインディング 0.5-10 倍の濃度のラベリング ZB から推論できませんでした。たとえば、影響を受けやすいOC の区別をオフにし、OC 耐性 WSN 亜種 ZB ラベリング処理による治療の感染細胞で観察された 30 nM と競合する OC 150 nM （図13B)。
[0195] MDCK 細胞は野生型（274 H） または OC 耐性 (274Y) WSN ウイルスに感染していた。16-20 Hr 感染後に感染した細胞を扱われたどちらかと 30 nM ZBまたは 30 nM ZB プラス 150 nM の oc。結果として得られる細胞ストレプトアビジン - 洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて観察 FITC と、飾られていた。流れのcytometry 研究所標識細胞 ZB いたさらに trypsinized として扱う PE 共役ストレプトアビジンとの抗 NP 抗体を使用してラベル付けプラスDyLight 649 抗第 2 抗体の標識、両方ジャクソン抗体研究所 （西グローブ、PA、アメリカ） から購入しました。追加の洗浄後のセルはFACSCanto の BD バイオ サイエンスによって （サンノゼ、カリフォルニア州、米国） を分析しました。多くのサンプルの分析は、感染した細胞の培養に黒96 ウェル明確な底マイクロ プレートを用いた高スループット法を開発した.16-20 Hr 感染後でセル 30 とラベル付けされた nM ZB または 30nM ZB プラス 150 nM OC、洗浄、および PE-ストレプトアビジンと扱われます。プレートはその後、Isocyte TM レーザースキャニング分子デバイス(マウンテン ビュー、カリフォルニア州、米国） のプラットフォームで 488 でスキャンされた nm。
固定化インフルエンザ試料を用いた OC 耐性の内容の例 26: 推定。
[図 7B に関連して説明に従って0196] RABC アッセイは固定化ウイルスでのマイクロ井戸を用いた OC 感受性の判定のために適当であります。固定化ウイルスを用いた RABC のアッセイは両方のOC 感受性および耐性ウイルスから成る混合された人口の OC 耐性突然変異体の含量の推定にも使用できます。274 H および 274Y の WSN ウイルス トータルウイルス コンテンツで 10 の異なる比率でウイルス サンプル3104、および 10 ウェルあたり5 PFU OC 耐性 ZB OC 耐性の推定としてバインドの内容を測定するために固定しました。図14 は、10% を超えている実験 274Y ウイルス内容よく推定の OC 耐性の内容が一致していることを示します。混ざっている人口の 10 ％ 未満を含む耐性ウイルス、ここ耐性の内容の観察されたおそらく高価のウイルスのサンプルを使用してアッセイの高いバックグラウンド バインドのため。
[0197] 高い結合 96 ウェルマイクロ プレート 655061 からグライナー バイオ 1 （Frickenhausen、ドイツ） をコートしたアンチで一晩-HA 抗体 (アビーム)150 で ng あたりまあし、PBS で 3 %bsa を用いた消されました。インフルエンザのサンプル 30 と扱われた nM ZB または 30 nMZB プラス 150 nM の OC 30 分と被覆抗体井戸を追加。30 分間インキュベーション後、マイクロウェルの作成と 3 %bsa 共役アルカリホスファターゼストレプトアビジン 30 再びと BSA PBS で洗浄し、発光の基板 (インビトロジェン, カールズバッド、カリフォルニア州、米国) の製造元とエメラルドII TM 指示にしたがって追加分と追加 PBS で洗浄しました。RLU (相対発光ユニット） パーキン エルマー (ウォルサム、マサチューセッツ州、米国） からの想像を使用して読まれました。パーセントの相対抵抗パーセントRLU OC 競争の欠如で測定した ZB バインディングの合計 RLU で割った OC の存在下で測定した ZB バインディングの決定として算出した.
例 27: インフルエンザノイラミニダーゼ シーケンスの決定です。
[0198] 総 RNA はロシュ・ ダイアグノスティックスから高い純粋なウイルス RNA キットを使用してウイルス台北ファーマ （台湾） で購入したインフルエンザから抽出されました。RNA のサンプルは、ランダムなhexamers と MMLV RTase の東洋紡生命科学部 （東京） 5'--tggtcagcaagtgcwtgccatg、および 5' 2 つのプライマーを用いたPCR によって増幅された cDNA の合成を用いた転写逆だった gacactggaccacaactgcct は、200 nM。DNA の製品精製し, NA のシーケンスを決定するために使用します。
例 28: インフルエンザウイルス膜上の OC 感受性の急速な検出。
バイオナノ ドットSF バイオラッド社の上 （バイオラッド、CA、USA） マウントされている [0199] PVDF 膜のメタノールで濡らしたし、アンチ 1 μ g/ml を追加-HA抗体 (アビーム) スロット吸引によって。
以前 1 hr いずれか30 と扱われたインフルエンザ ウイルスのサンプル nM ZB または 30 nM ZB プラス 150 nM OC は隣接スロットに吸引によって導入されました。膜3 %bsa を PBS を使用して、[共役アルカリホスファターゼ ストレプトアビジン KPL （ゲイサーズバーグ、MD、アメリカ） からと、製造元の指示に従ってインキュベート消されました。3％ の BSA、アルカリホスファターゼ基板、Amresco エル 16 PBS を使用して追加の洗浄後
ソリューションAmresco 株式会社 （ソロン、オハイオ州、米国） のカラー開発を追加しました。目に見える色通常 2 分で開発、写真で記録されました。
安定的組換えの野生型 （274 H） と OC 耐性 (274Y) それらを表現する 293 t 細胞の例 29: 準備。
[0200] ノイラミニダーゼ遺伝子のcDNA シーケンス インフルエンザからみた
A/ハノイ/30408/2005(H5N1) (ジーンバンク: AB239126.1） だった Geneart （ドイツ ・ レーゲンスブルク) この遺伝子の合成バージョンを準備するために使用し、インビトロジェン(カールズバッド、カリフォルニア州、米国） の pCDNA3.1 の BamHl と Xhol 制限サイトに pCDNA3.1-ナとして複製A 遺伝子QuickChange（登録商標） XL Site-Directed 突然変異誘発キット アジレント H274Y の OC 耐性 NA の突然変異体をプライマーのペアを使用して製造する技術（ラホーヤ、カリフォルニア州、アメリカ） からを使用してれました: 5'--gCTggACgCTCCCAACTACCACTACgAggAgTg 3' と5'-gTAgTTgggAgCgTCCAgCTCCACggAC - 3。野生型 （274 H） と OC 耐性変異株 (274Y) NA 遺伝子配列の解析によって検証されました。これらのNA 遺伝子野生型と OC 耐性のそれらのための過渡 NA 式使用されていました。彼らはまただったクロンテック （マウンテン ビュー、カリフォルニア州、米国）の pRetro IRES GFP ベクトルに pRetro NA(274H) IRES GFP と pRetro-NA (274Y) として - IRES- GFP それぞれクローンします。これら 2 種のプラスミドと pGagPol と pVSVG を使用した組換えのレトロ ウイルスは 293 t 細胞と変換に使用されました。安定したセルラインは、蛍光活性化セルソーターの95 ％ 以上の GFP の表現集団による選択および OC の感受性や耐性のそれらの合成を検証しました。
[0201 ] すべての出版物と引用この仕様での特許出願を本明細書にあります。
各パブリケーションごと、または特許出願具体的には、個別に参照によって組み込まれることを示されたかのように参考として組み込まれます。
[0202] 前述の発明いくつかの詳細図と理解の明快さの目的のための例の方法で記載されているが、特定変更と修正若しくは精神またはアペンドされた請求の範囲から逸脱することがなく行うことができるこの発明の教えを照らして芸術の一般的な技量の人に明らかに容易になります。
【図１】
2013528160.tif 000003
【図２（Ａ）】
2013528160.tif 000004
【図２（Ｂ）】
2013528160.tif 000005
【図２（Ｃ）】
2013528160.tif 000006
【図２（Ｄ）】
2013528160.tif 000007
【図３】
2013528160.tif 000008
【図４】
2013528160.tif 000009
【図５】
2013528160.tif 000010
【図６】
2013528160.tif 000011
【図７Ａ】
2013528160.tif 000012
【図７Ｂ】
2013528160.tif 000013
【図８Ａ】
2013528160.tif 000014
【図８Ｂ】
2013528160.tif 000015
【図８Ｃ】
2013528160.tif 000016
【図８Ｄ】
2013528160.tif 000017
【図９Ａ】
2013528160.tif 000018
【図９Ｂ】
2013528160.tif 000019
【図９Ｃ】
2013528160.tif 000020
【図９Ｄ】
2013528160.tif 000021
【図１０】
2013528160.tif 000022
【図１１Ａ】
2013528160.tif 000023
【図１１Ｂ】
2013528160.tif 000024
【図１１Ｃ】
2013528160.tif 000025
【図１１Ｄ】
2013528160.tif 000026
【図１１Ｅ】
2013528160.tif 000027
【図１１Ｆ】
2013528160.tif 000028
【図１２Ａ】
2013528160.tif 000029
【図１２Ｂ】
2013528160.tif 000030
【図１２Ｃ】
2013528160.tif 000031
【図１２Ｄ】
2013528160.tif 000032
【図１２Ｅ】
2013528160.tif 000033
【図１２Ｆ】
2013528160.tif 000034
【図１３Ａ】
2013528160.tif 000035
【図１３Ｂ】
2013528160.tif 000036
【図１４】
2013528160.tif 000037
【誤訳訂正書】
【提出日】平成25年3月8日(2013.3.8)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスノイラミニダーゼを阻害するための組成物であって、治療上有効な量の、式（Ｉ）の化合物：
【化６６】
2013528160.tif 000038
（式中、Ａは、ＰＯ（ＯＲ）（ＯＲ５）であり、
ここでＲおよびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、アラルキルおよびＸから独立して選択され、ここでＸは、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、エタノール−アンモニウム、ジシクロヘキシルアンモニウム、グアニジニウム、エチレンジアンモニウムカチオン、リチウムカチオン、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、セシウムカチオン、ベリリウムカチオン、マグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、および亜鉛カチオンからなる群より選択されるカチオン性対イオンであり、
式中、Ｂは、ＮＨＲ６、ＮＨ３＋Ｙ−、Ｒ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２もしくはＲ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ２＋）ＮＨ２Ｙ−であり、ここでＲ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルを表し、ここでＹ−は、クロリド、ブロミド、ヨージド、アセテート、トリフルオロアセテート、ホスフェート、ジホスフェート、ニトレート、スルフェート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、サリチレート、ヒドロキシナフトエート、フマレート、マレエート、ラクテート、マレート、スクシネート、タートレート、シトレート、グルタメート、グルコネート、およびステアレートからなる群より選択されるアニオン性対イオンであり、
式中、Ｒ１は、ＣＨ３もしくはＣＦ３であり；
式中、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−ＮＨＲ７であり、ここでＲ７は、ビオチン、蛍光団および抗炎症因子のような官能部分が付加されたリンカーを表し、そして
式中、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−Ｒ８であり、ここでＲ８は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルを表す）、
および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、
組成物。
【請求項２】
前記化合物は、
【化６７】
2013528160.tif 000039
からなる群もしくは治療上有効なその塩、エステルもしくは該エステルの塩より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
以下の化合物：
【化６８】
2013528160.tif 000040
のうちの少なくとも１種を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
以下の化合物：
【化６９】
2013528160.tif 000041
のうちの少なくとも１種を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
以下の化合物：
【化７０】
2013528160.tif 000042
のうちの少なくとも１種を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、およびＨ３Ｎ２を結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼは、野生型もしくはＨ２７４Ｙ変異型である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
式（Ｉ）の化合物：
【化７１】
2013528160.tif 000043
（式中、Ａは、ＰＯ（ＯＲ）（ＯＲ５）であり、ここでＲおよびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、アラルキルおよびＸから独立して選択され、ここでＸは、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、、トリメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、エタノール−アンモニウム、ジシクロヘキシルアンモニウム、グアニジニウム、エチレンジアンモニウムカチオン、リチウムカチオン、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、セシウムカチオン、ベリリウムカチオン、マグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、および亜鉛カチオンからなる群より選択されるカチオン性対イオンであり、式中、Ｂは、ＮＨＲ６、ＮＨ３＋Ｙ−、Ｒ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２もしくはＲ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ２＋）ＮＨ２Ｙ−であり、ここでＲ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルを表し、ここでＹ−は、クロリド、ブロミド、ヨージド、アセテート、トリフルオロアセテート、ホスフェート、ジホスフェート、ニトレート、スルフェート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、サリチレート、ヒドロキシナフトエート、フマレート、マレエート、ラクテート、マレート、スクシネート、タートレート、シトレート、グルタメート、グルコネート、およびステアレートからなる群より選択されるアニオン性対イオンであり、式中、Ｒ１は、ＣＨ３もしくはＣＦ３であり；式中、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−ＮＨＲ７であり、ここでＲ７は、ビオチン、蛍光団および抗炎症因子のような官能部分が付加されたリンカーを表し、そして式中、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−Ｒ８であり、ここでＲ８は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルを表す）
を製造するためのプロセスであって、
該プロセスは、以下の工程：
（ａ）キラル前駆体シアル酸（２）をアセチル化して、中間体化合物（３）：
【化７２】
2013528160.tif 000044
を調製する工程；
（ｂ）中間体化合物（３）をジエチルトリメチルシリルホスファイトで処理して、中間体化合物（４）：
【化７３】
2013528160.tif 000045
を形成する工程；
（ｃ）中間体（４）をＮ−ブロモスクシンイミドで、光照射下で処理して、ブロモ置換化合物を生成し、該ブロモ置換化合物は、ピリジン中で中間体（５）：
【化７４】
2013528160.tif 000046
を形成する工程；
（ｄ）中間体化合物（５）をトリメチルシリルトリフルオロスルホネートで処理して、中間体化合物（６）：
【化７５】
2013528160.tif 000047
を形成する工程；ならびに
（ｅ）中間体化合物（６）をトリメチルシリルアジドで処理して、中間体化合物（７）：
【化７６】
2013528160.tif 000048
を形成する工程、
を包含する、プロセス。
【請求項９】
さらに以下の工程：
（ｆ）中間体化合物（７）を水素化し、次いで、１，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−メチルチオプソイドウレアおよびＥｔ３Ｎと反応させて、中間体化合物（８）：
【化７７】
2013528160.tif 000049
を形成する工程、
を包含する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
さらに以下の工程：
（ｇ）中間体化合物（７）をブロモトリメチルシランで処理し、ナトリウムメトキシドで処理し、次いで、順次水素化して、化合物（１ａ）：
【化７８】
2013528160.tif 000050
を形成する工程、
を包含する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１１】
さらに以下の工程：
（ｉ）中間体化合物（７）をナトリウムエトキシドで処理し、次いで、水素化して、化合物（１ｃ）：
【化７９】
2013528160.tif 000051
を形成する工程、
を包含する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１２】
さらに以下の工程：
（ｈ）中間体化合物（８）をブロモトリメチルシランで処理し、次いで、ナトリウムメトキシドで処理して、化合物（１ｂ）：
【化８０】
2013528160.tif 000052
を形成する工程、
を包含する、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１３】
さらに以下の工程：
（ｊ）中間体化合物（８）をナトリウムエトキシドで処理し、次いで、トリフルオロ酢酸で処理して、化合物（１ｄ）：
【化８１】
2013528160.tif 000053
を形成する工程、
を包含する、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれかに記載のプロセスによって製造される、生成物。
【請求項１５】
インフルエンザ感染を処置するための方法であって、
治療上有効な量の、請求項１に記載の組成物を、それが必要な被験体に提供する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記化合物は、以下：
【化８２】
2013528160.tif 000054
【化８３】
2013528160.tif 000055
からなる群もしくは治療上有効なその塩、エステルもしくは該エステルの塩より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体は、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体は、野生型もしくはＨ２７４Ｙノイラミニダーゼ変異型を含むインフルエンザウイルスに感染していると疑われている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記インフルエンザウイルス株は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、およびＨ３Ｎ２から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの存在を決定するための方法であって、
（ａ）オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスもしくはオセルタミビル耐性インフルエンザウイルス粒子を含むと疑われるサンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルと、インフルエンザノイラミニダーゼ認識ユニット（Ｒ）を含む結合分子とを、オセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）の存在下および非存在下で接触させる工程；ならびに
（ｃ）オセルタミビルの存在下および非存在下での該インフルエンザウイルスもしくはウイルス粒子への該結合分子の結合における差異を決定する工程、
を包含し、ここでオセルタミビル感受性インフルエンザウイルスコントロールと接触させた場合の結合レベルにおける低下と比較して、オセルタミビルの存在下で該認識ユニット（Ｒ）による結合レベルの低下の欠如は、該サンプル中のオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの存在を示す、方法。
【請求項２１】
前記オセルタミビル耐性インフルエンザは、該インフルエンザのノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質のアミノ酸２７４位に変異を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記インフルエンザ変異体は、ノイラミニダーゼインヒビター薬物に耐性であるが、本発明に記載される前記認識ユニット（Ｒ）になお感受性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記インフルエンザウイルス含有サンプルは、粘液、唾液、呼吸器分泌物、のど洗浄液、鼻洗浄液、脊髄液、痰、尿、精液、汗、糞便、血漿、血液、気管支肺胞洗浄液、膣液、涙液および組織生検からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記インフルエンザウイルスへの前記認識ユニット（Ｒ）の結合は、オセルタミビルカルボキシレートによる同時結合によって競合的に阻害される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記認識ユニット（Ｒ）は、ザナミビル、またはタミホスホルグアニジンモノエステル、またはホスファザナミビルもしくはそのモノエステル、およびこれらの塩、エステルおよび誘導体から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記認識ユニット（Ｒ）は、検出可能である感知ユニット（Ｓ）に繋がれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記認識ユニット（Ｒ）は、リンカー（Ｌ）を介して前記感知ユニットに繋がれ、その結果、前記結合分子は、構造Ｒ−Ｌ−Ｓを有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記リンカー（Ｌ）は、脂肪族鎖、トリアゾール、水溶性リンカー、およびエチレングリコールリンカーから選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記感知ユニットは、蛍光標識、金標識、酵素標識、放射活性標識、量子ドット標識、ビオチン−アビジンベースの標識、およびタンパク質標識から選択される検出可能な部分である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記蛍光標識は、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、ピリジルオキサゾール、ベンゾオキサジアゾール誘導体、ＮＢＤハライド、ヨードアセトアミド、ＳＢＤ；ルシファーイエロー、ヨードアセトアミド；スチルベン、クマリン、ナフタレン、アジリジン、ダポキシル、ピレン、ビマン、キサンテン、シアニン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、スクアライン色素、エネルギー移動色素の組み合わせ、およびこれらの誘導体からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｒ−Ｌ−Ｓ分子は、以下：
ＢＭ  １：ザナミビル−（トリアゾールリンカー）−ビオチン
【化８４】
2013528160.tif 000056
ＢＭ−２：ザナミビル−（トリアゾールリンカー）−フルオレセイン
【化８５】
2013528160.tif 000057
ＢＭ  ３：ザナミビル−（エチレングリコールリンカー）−ビオチン
【化８６】
2013528160.tif 000058
式中、ｘ＝１〜４である；
ＢＭ  ４：ザナミビル−（エチレングリコールリンカー）−フルオレセイン
【化８７】
2013528160.tif 000059
ＢＭ  ５：（タミホスホルグアニジン）−（脂肪族鎖リンカー）−ビオチン
【化８８】
2013528160.tif 000060
式中、ｘ＝１〜４である；
ＢＭ  ６：（タミホスホルグアニジン）−（エチレングリコールリンカー）−フルオレセイン
【化８９】
2013528160.tif 000061
ＢＭ  ７：ホスファザナミビル−（トリアゾールリンカー）−ビオチン
【化９０】
2013528160.tif 000062
ＢＭ  ８：ホスファザナミビル−（エチレングリコールリンカー）−フルオレセイン
【化９１】
2013528160.tif 000063
ＢＭ  ９：（ホスファザナミビルモノエステル）−（エチレングリコールリンカー）−ビオチン
【化９２】
2013528160.tif 000064
式中、ｘ＝１〜４である；および
ＢＭ  １０：（ホスファザナミビルモノエステル）−（エチレングリコールリンカー）−フルオレセイン
【化９３】
2013528160.tif 000065
式中、ｘ＝１〜４である；
からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｒは、ホスファザナミビルもしくはその誘導体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
オセルタミビルカルボキシレートを競合的に結合する前記化合物Ｒは、式（Ｉ）の化合物：
【化９４】
2013528160.tif 000066
（式中、Ａは、ＰＯ（ＯＲ）（ＯＲ５）であり、ここでＲおよびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、アラルキルおよびＸから独立して選択され、ここでＸは、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、、トリメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、エタノール−アンモニウム、ジシクロヘキシルアンモニウム、グアニジニウム、エチレンジアンモニウムカチオン、リチウムカチオン、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、セシウムカチオン、ベリリウムカチオン、マグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、および亜鉛カチオンからなる群より選択されるカチオン性対イオンであり、式中、Ｂは、ＮＨＲ６、ＮＨ３＋Ｙ−、Ｒ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２もしくはＲ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ２＋）ＮＨ２Ｙ−であり、ここでＲ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルを表し、ここでＹ−は、クロリド、ブロミド、ヨージド、アセテート、トリフルオロアセテート、ホスフェート、ジホスフェート、ニトレート、スルフェート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、サリチレート、ヒドロキシナフトエート、フマレート、マレエート、ラクテート、マレート、スクシネート、タートレート、シトレート、グルタメート、グルコネート、およびステアレートからなる群より選択されるアニオン性対イオンであり、式中、Ｒ１は、ＣＨ３もしくはＣＦ３であり；式中、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−ＮＨＲ７であり、ここでＲ７は、ビオチン、蛍光団および抗炎症因子のような官能部分が付加されたリンカーを表し、そして式中、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−Ｒ８であり、ここでＲ８は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルを表す）である、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
オセルタミビルカルボキシレートを競合的に結合する前記化合物Ｒは、以下：
【化９５】
2013528160.tif 000067
【化９６】
2013528160.tif 000068
からなる群もしくはこれらの誘導体より選択される化合物である、請求項３２に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ」と題された、２０１０年５月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／３３３，１３７号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、インフルエンザウイルスに対して有効である新規な化合物に関する。本発明は、野生型、ならびにＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１およびＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスのオセルタミビル耐性株に由来するインフルエンザウイルスノイラミニダーゼを阻害する新規なホスホネート化合物に関する。本発明は、薬物耐性病原体の検出に関する。特に、本発明は、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの検出に関する。より具体的には、本発明は、本発明において開示される新規な化合物を使用する、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの検出に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
インフルエンザＡウイルスの大流行により、全世界で罹患率および死亡率の広がりが続いている。米国単独において、人口のうちの推定５〜２０％が、毎年インフルエンザＡウイルスに感染し、約２００，０００人が入院し、３６，０００人の死亡を引き起こしている。包括的ワクチン接種方針の確立は、インフルエンザ罹患率を制限するのに有効な手段であった。しかし、上記ウイルスの頻繁な遺伝的浮動から、毎年上記ワクチンの再処方が必要となり、潜在的には、上記ワクチンに存在するウイルス株と、蔓延しているウイルス株との間でのミスマッチがおこっている。
【０００４】
インフルエンザＡウイルスは、９個の構造タンパク質からなり、さらに２個の、調節機能を有する非構造ＮＳ  １タンパク質をコードする。上記ウイルスゲノムの分節に分かれた性質は、異なるウイルス株が細胞に混合感染する間に、遺伝的リアソートメント（ゲノム分節の交換）の機構が起こることを可能にする。上記インフルエンザＡウイルスは、それらの表面に提示される異なるヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）のウイルスタンパク質に依存して、種々のサブタイプに分類される。インフルエンザＡウイルスサブタイプは、２種のウイルス表面糖タンパク質である、ヘマグルチニン（ＨＡもしくはＨ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡもしくはＮ）によって同定される。各インフルエンザウイルスサブタイプは、Ｈタンパク質およびＮタンパク質のその組み合わせによって同定される。１６種の公知のＨＡサブタイプおよび９種の公知のＮＡサブタイプが存在する。
【０００５】
インフルエンザウイルスは、ヒトを含む多くの動物種に感染し得るマイナスセンス分節に分かれたＲＮＡウイルスである。上記ウイルスがコードしたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるインフルエンザゲノムの複製は、間違いが起こりやすいプロセスであり、このことから、常に変化した遺伝子配列を有する子孫が生成される。遺伝子変化を有する生きたウイルスは、「抗原連続変異」変異体といわれる。上記ウイルスゲノムの分節に分かれた性質、および異なる動物種に感染する可能性から、「抗原不連続変異」変異体が生成され得る（Ｐ．  Ｋ．  Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｍｅｒｇ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １５，  ９６６  （２００９））。望ましい条件下では、ドミナントバリアントがヒトもしくは動物にとって突出した病原体になり得る。変異体進化をもたらす多ステップの選択プロセスは、完全には理解されていない（Ｌ．  Ｃｏｈｅｎ−Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４４，  １３８  （２００９）；  Ｒ．  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｍ．  Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈ，  Ｈ．  Ｄ．  Ｋｌｅｎｋ，  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．  １２，  １５９  （２００２））。ワクチンはしばしば、インフルエンザウイルス感染症を予防するために使用されるのに対して、インフルエンザ感染症の処置に関する最も有用な治療は、タミフル（登録商標）（オセルタミビルエチルエステルのリン酸塩，Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）およびリレンザ（登録商標）（ザナミビル，Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ，  Ｉｎｃ．）の投与を含む（Ｎ．  Ｊ．  Ｃｏｘ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｈｕｇｈｅｓ，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４１，  １３８７  （１９９９））。オセルタミビルおよびザナミビルは、ウイルスシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）インヒビターであり、粘膜分泌物内での子孫ビリオンの放出および分散を妨げ、それによって、ウイルス感染性を低下させる。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）（上記インフルエンザウイルス表面に発現される糖タンパク質）は、宿主細胞の表面シアロレセプターと該子孫ウイルスとの間の結合を壊すことによって、ウイルス複製および感染性に必須である。従って、構造ベースのストラテジーによるＮＡの阻害は、抗インフルエンザ薬の発見に適用されてきた。
【０００６】
ザナミビル（リレンザＴＭ）（ｖｏｎ  Ｉｔｚｓｔｅｉｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９９３，  ３６３，  ４１８．  Ｄｕｎｎ，  Ｃ．Ｊ．；  Ｇｏａ，  Ｋ．Ｌ．  Ｄｒｕｇｓ  １９９９，  ５８，  ７６１．）は、インフルエンザの処置に関して普及した薬物である。タミフルは、肝臓エステラーゼによって容易に加水分解されて、その対応するオセルタミビルカルボン酸を、ウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）の活性部位における３個のアルギニン残基（Ａｒｇ１１８、Ａｒｇ２９２およびＡｒｇ３７１）と相互作用する活性インヒビターとして与える、プロドラッグである（ｖｏｎ  Ｉｔｚｓｔｅｉｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９９３，  ３６３，  ４１８．  Ｌｅｗ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２０００，  ７，  ６６３．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｒ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，  ４４３，  ４５．）。オセルタミビルおよびザナミビルはともに、宿主細胞の表面シアロレセプターと該子孫ウイルスとの間の結合を切断することによって、ウイルス増殖に必須であるインフルエンザウイルスＮＡを阻害する。上記ＮＡインヒビターは、シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）（これは、ウイルスＮＡの活性部位との結合のための、細胞表面糖タンパク質上の最も外側にあるサッカリドである）の酵素切断部位において（オキサ）シクロヘキセン足場を有してオキソニウム遷移状態を摸倣するように設計される。オセルタミビルカルボン酸との結合に適合させるために、大きな疎水性ポケットを作り出すための上記ＮＡの誘導適合は、３−ペンチル側鎖のために必要とされる（Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｐ．  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００８，  ４５３，  １２５８．）。比較すると、ザナミビルは、オセルタミビルホスフェートより新たに進化した耐性ウイルスに影響されにくい。上記疎水性結合ポケットを生成する必要がない場合、上記ＮＡ変異型（例えば、臨床的に関連するＨ２７４Ｙ変異型）へのザナミビルの阻害効力は、変化を受けない。
【０００７】
インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスは、上記ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質の２７４位においてヒスチジンからチロシンへのオセルタミビル耐性付与アミノ酸変化（Ｈ２７４Ｙ）を有する。季節性Ｈ１Ｎ１における上記オセルタミビル耐性Ｈ２７４Ｙ変異体の２００８年の急増（Ａ．  Ｍｏｓｃｏｎａ，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３６０，  ９５３  （２００９））は、混乱を生じた。なぜなら、これら変異の増大は、上記Ｈ２７４Ｙ流行地域のうちの多くでのオセルタミビルの使用に相関しないからである（Ｊ．  Ｍｏｓｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ，  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．  ８４，  ９１  （２００９）；  Ｍ．  Ｊｏｎｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．  ８３，  ２９０  （２００９））。さらに、上記Ｈ２７４Ｙオセルタミビル耐性汎流行性Ｈ１Ｎ１（Ａ．  Ｇｕｌｌａｎｄ，  Ｂｒ．  Ｍｅｄ．  Ｊ．  ３３９，  ｂ４９７５  （２００９））およびＨ５Ｎ１変異体（Ｑ．  Ｍ．  Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４３７，  １１０８  （２００５））は、患者において報告されている。このことは、これらの変異体が、インフルエンザ治療の選択に影響を及ぼし得たことを示唆する（Ｉ．  Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ４８，  ３８９  （２００９））。
【０００８】
ザナミビルの多くの誘導体は、シアル酸の酵素切断においてオキソニウム遷移状態を摸倣するように、グリセリル部分の足場における改変によって調製されてきた。ホスホネート基は、一般に、薬物設計においてカルボキシレートのバイオ同配体（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）として使用される（Ｗｈｉｔｅ，  Ｃ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９５，  ２４５，  ６２３．  Ｓｃｈｕｇ，  Ｋ．  Ａ．；  Ｌｉｎｄｎｅｒ，  Ｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ２００５，  １０５，  ６７．Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒ，  Ｈ．；  Ｂｕｓｓｅｂ，  Ｈ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２００６，  １４，  １０４７．）。カルボキシレート−グアニジニウムイオン対と比較すると、ホスホネートイオンは、上記グアニジニウムイオンとのより強力な静電相互作用を示す。従って、上記ザナミビルホスホネート同族体（ｃｏｎｇｅｎｅｒ）は、Ｈ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１ウイルス、さらには上記Ｈ２７４Ｙ変異型のノイラミニダーゼに対して、より強力であると予測される。その増強された親和性は、生理学的条件において、上記ホスホネート基と、３個のアルギニン残基（Ａｒｇ１１８、Ａｒｇ２９２およびＡｒｇ３７１）との強力な静電相互作用の原因であり得る。
【０００９】
溶液相ノイラミニダーゼ阻害アッセイは、通常、蛍光原基質２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−アセチル−ノイラミン酸を使用し、上記基質は、ノイラミニダーゼによって切断されて、蛍光計を使用して定量化され得る蛍光生成物を生じる（Ｐｏｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ９４：２８７−２９６  （１９７９））。しかし、このアッセイ法は、ハイスループット形式には対応しない。さらに、耐性ウイルス株の素早い出現に起因して（ＭｃＫｉｍｍ−Ｂｒｅｓｃｈｋｉｎ，  Ｊ．  Ｌ．  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．  ２０００，  ４７，  １−１７を参照のこと）、未だ、新たなインフルエンザノイラミニダーゼインヒビターを見いだす必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
２００８年におけるオセルタミビル耐性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスの全世界的な急増から、耐性変異体に対する調査ならびにオセルタミビル感受性についての迅速試験開発の必要性が促がされた。潜在的に蔓延しているオセルタミビル耐性Ｈ１Ｎ１ウイルスのただ中において、医師の診療室における患者の標本のオセルタミビル感受性を迅速評価するための「ポイントオブケア」検査が必要であり、それは、処置選択肢に関する決定に利益をもたらす。
【００１１】
新規なホスホネート化合物が記載される。上記化合物は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１およびＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスの野生型およびオセルタミビル耐性株に対してノイラミニダーゼインヒビターとして活性を有する。いくつかの実施形態において、上記オセルタミビル耐性インフルエンザ株は、ノイラミニダーゼにおいてＨ２７４Ｙ変異を含む。本開示はまた、シアル酸を介した新規なホスホネート化合物へのエナンチオ選択的合成経路を提供する。
【００１２】
本開示の特徴によれば、式（Ｉ）に従う化合物が開示され、
【００１３】
【化１】
2013528160.tif 000069
【００１４】
式中、Ａは、ＰＯ（ＯＲ）（ＯＲ５）であり、ここでＲおよびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、アラルキルおよびＸから独立して選択され、ここでＸは、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、エタノール−アンモニウム、ジシクロヘキシルアンモニウム、グアニジニウム、エチレンジアンモニウムカチオン、リチウムカチオン、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、セシウムカチオン、ベリリウムカチオン、マグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、および亜鉛カチオンからなる群より選択されるカチオン性対イオンであり、式中、Ｂは、ＮＨＲ６、ＮＨ３＋Ｙ−、Ｒ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２もしくはＲ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ２＋）ＮＨ２Ｙ−であり、ここでＲ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルを表し、ここでＹ−は、クロリド、ブロミド、ヨージド（ｉｏｄｉｄｅ）、アセテート、トリフルオロアセテート、ホスフェート、ジホスフェート、ニトレート、スルフェート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、サリチレート、ヒドロキシナフトエート、フマレート、マレエート、ラクテート、マレート、スクシネート、タートレート、シトレート、グルタメート、グルコネート、およびステアレートからなる群より選択されるアニオン性対イオンであり、式中、Ｒ１は、ＣＨ３もしくはＣＦ３であり；式中、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−ＮＨＲ７であり、ここでＲ７は、ビオチン、蛍光団および抗炎症因子のような官能部分が付加されたリンカーを表し、そして式中、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−Ｒ８であり、ここでＲ８は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルである。
【００１５】
治療上有効な量の式（Ｉ）および薬学的に受容可能な賦形剤を含む組成物が開示され、ここで上記組成物は、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの活性を阻害するために生物に投与されるように設計される。
【００１６】
本発明の特徴によれば、治療上有効な量の、以下のうちの少なくとも１種：
【００１７】
【化２】
2013528160.tif 000070
【００１８】
もしくは以下のうちの少なくとも１種：
【００１９】
【化３】
2013528160.tif 000071
【００２０】
もしくは以下のうちの少なくとも１種：
【００２１】
【化４】
2013528160.tif 000072
【００２２】
を含む組成物が開示される。
【００２３】
本開示の特徴によれば、式Ｉの組成物を作製するためのプロセスが開示され、上記プロセスは、以下の工程を包含する：
（ａ）キラル前駆体シアル酸（２）をアセチル化して、中間体化合物（３）：
【００２４】
【化５】
2013528160.tif 000073
【００２５】
を調製する工程；
（ｂ）中間体化合物（３）をジエチルトリメチルシリルホスファイトで処理して、中間体化合物（４）：
【００２６】
【化６】
2013528160.tif 000074
【００２７】
を形成する工程；
（ｃ）中間体（４）をＮ−ブロモスクシンイミドで、光照射下で処理して、ブロモ置換化合物を生成し、上記ブロモ置換化合物は、ピリジン中で中間体（５）：
【００２８】
【化７】
2013528160.tif 000075
【００２９】
を形成する工程；
（ｄ）中間体化合物（５）をトリメチルシリルトリフルオロスルホネートで処理して、中間体化合物（６）：
【００３０】
【化８】
2013528160.tif 000076
【００３１】
を形成する工程；ならびに
（ｅ）中間体化合物（６）をトリメチルシリルアジドで処理して、中間体化合物（７）：
【００３２】
【化９】
2013528160.tif 000077
【００３３】
を形成する工程。
【００３４】
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、中間体化合物（７）をブロモトリメチルシランで処理し、ナトリウムメトキシドで処理し、次いで、順次水素化して、化合物（１ａ）：
【００３５】
【化１０】
2013528160.tif 000078
【００３６】
を形成する工程をさらに包含する。
【００３７】
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、中間体化合物（７）をナトリウムエトキシドで処理し、次いで、水素化して、化合物（１ｃ）：
【００３８】
【化１１】
2013528160.tif 000079
【００３９】
を形成する工程をさらに包含する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、中間体化合物（７）を水素化し、次いで、１，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−メチルチオプソイドウレアおよびＥｔ３Ｎと反応させて、中間体化合物（８）：
【００４１】
【化１２】
2013528160.tif 000080
【００４２】
を形成する工程をさらに包含する。
【００４３】
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、中間体化合物（８）をブロモトリメチルシランで処理し、次いで、ナトリウムメトキシドで処理して、化合物（１ｂ）：
【００４４】
【化１３】
2013528160.tif 000081
【００４５】
を形成する工程をさらに包含する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、中間体化合物（８）をナトリウムエトキシドで処理し、次いで、トリフルオロ酢酸で処理して、化合物（１ｄ）：
【００４７】
【化１４】
2013528160.tif 000082
【００４８】
を形成する工程をさらに包含する。
【００４９】
一局面において、本発明は、本明細書で開示されるプロセスによって生成される式（Ｉ）に従う任意の生成物に関する。
【００５０】
本開示の特徴によれば、インフルエンザ感染を処置するための方法が開示され、上記方法は、治療上有効な量の、式（Ｉ）に従う組成物を、それを必要とする被験体に提供する工程を包含する。
【００５１】
本発明の特定の局面によれば、式（Ｉ）に従う化合物は、以下のうちの少なくとも１種：
【００５２】
【化１５】
2013528160.tif 000083
【００５３】
である。
【００５４】
本発明の別の実施は、ノイラミニダーゼの活性を阻害する方法を提供し、上記方法は、上記ノイラミニダーゼと、化合物（Ｉ）のうちのいずれか１種とを接触させる工程を包含する。一局面において、上記ノイラミニダーゼは、インフルエンザノイラミニダーゼであり、その活性は、インビボで阻害される。別の局面において、上記活性は、インビトロで阻害される。
【００５５】
本発明は、上記薬物およびその競合的インヒビターの結合を測定することによって、病原体の薬物感受性を決定することに関する。
【００５６】
本発明は、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの存在を決定するための方法に関し、上記方法は、（ａ）オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスもしくはウイルス粒子を含むことが疑われるサンプルを提供する工程；（ｂ）上記サンプルと、インフルエンザノイラミニダーゼ認識ユニット（Ｒ）を含む結合分子とを、オセルタミビル（ｏｓｔｅｌａｍｉｖｉｒ）カルボキシレート（ＯＣ）の存在下および非存在下で接触させる工程；ならびに（ｃ）オセルタミビルの存在下および非存在下での上記インフルエンザウイルスもしくはウイルス粒子への結合分子の結合における差異を決定する工程を包含し、ここでオセルタミビル感受性インフルエンザウイルスコントロールと接触させたときの結合レベルにおける低下と比較して、オセルタミビルの存在下での上記認識ユニット（Ｒ）による結合レベルにおける低下の欠如は、上記サンプル中のオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの存在を示す。上記インフルエンザウイルスへの上記認識ユニット（Ｒ）の結合は、オセルタミビルカルボキシレートによる同時結合（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ）によって競合的に阻害される。
【００５７】
いくつかの実施形態において、上記オセルタミビル耐性インフルエンザは、インフルエンザのノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質のアミノ酸２７４位において変異を含む。いくつかの実施形態において、上記変異は、Ｈ２７４Ｙである。
【００５８】
いくつかの局面において、上記インフルエンザウイルス含有サンプルは、粘液、唾液、呼吸器分泌物、のど洗浄液、鼻洗浄液、脊髄液、痰、尿、精液、汗、糞便、血漿、血液、気管支肺胞洗浄液、膣液、涙液および組織生検からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記インフルエンザウイルスは、細胞培養物から得られる。いくつかの実施形態において、上記細胞培養物は、Ｖｅｒｏ細胞培養物である。いくつかの実施形態において、上記インフルエンザウイルス含有サンプルは、インフルエンザウイルスに感染した細胞である。
【００５９】
いくつかの局面において、上記インフルエンザウイルス含有サンプルは、固体基材に固定される。上記固体基材は、マイクロウェル、マイクロタイタープレート、シリコンチップ、ガラススライド、ビーズ、微粒子、フィルム、クロマトグラフィー用紙、膜、ボトル、ディッシュ、スライド、ブロッティング材料、フィルタ、ファイバー、織布繊維、成形ポリマー、粒子、ディップスティック、試験管、チップ、マイクロチップ、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ｂｌｏｄｇｅｔｔ膜、ガラス、ゲルマニウム、ケイ素、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ヒ化ガリウム、リン化ガリウム、酸化ケイ素、窒化ケイ素、およびこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。いくつかの実施形態において、上記インフルエンザウイルスもしくはウイルス粒子は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン成分への炭水化物レセプターの結合を介して、上記固体基材に固定される。
【００６０】
いくつかの局面において、上記固体基材への上記インフルエンザウイルスもしくはウイルス粒子の固定は、上記インフルエンザウイルスもしくはその粒子のノイラミニダーゼ成分への、上記結合分子もしくはオセルタミビルカルボキシレートの結合を変化させない。
【００６１】
いくつかの実施形態において、上記認識ユニット（Ｒ）は、ザナミビル、またはタミホスホルグアニジンモノエステル、またはホスファザナミビルもしくはそのモノエステル、ならびにこれらの塩、エステルおよび誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、上記認識ユニット（Ｒ）は、検出可能である感知ユニット（Ｓ）に繋がれる。いくつかの実施形態において、上記認識ユニット（Ｒ）は、リンカー（Ｌ）を介して上記感知ユニットに繋げられ、その結果、上記結合分子は、構造Ｒ−Ｌ−Ｓを有する。いくつかの実施形態において、上記リンカー（Ｌ）は、上記認識ユニットの上記インフルエンザウイルスへの結合による上記感知ユニット（Ｓ）の検出への効果を低下させる。
【００６２】
上記リンカー（Ｌ）は、脂肪族鎖、トリアゾール、水溶性リンカー、およびエチレングリコールリンカーから選択され得る。
【００６３】
いくつかの局面において、上記感知ユニットは、直接的にもしくは間接的に検出可能である。いくつかの実施形態において、上記感知ユニットは、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用によって検出可能な部分に繋げられる。
【００６４】
いくつかの局面において、上記感知ユニットは、蛍光標識、金標識、酵素標識、放射活性標識、量子ドット標識、およびタンパク質標識から選択される検出可能な部分である。いくつかの実施形態において、上記検出可能な部分は、発光シグナル、比色シグナル、蛍光シグナル、もしくは放射活性シグナルから選択されるシグナルによって検出される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、上記蛍光標識は、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、ピリジルオキサゾール、ベンゾオキサジアゾール誘導体、ＮＢＤハライド、ヨードアセトアミド、ＳＢＤ；ルシファーイエロー、ヨードアセトアミド；スチルベン、クマリン、ナフタレン、アジリジン、ダポキシル、ピレン、ビマン、キサンテン、シアニン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、スクアライン（ｓｑｕａｒｅｎｅ）色素、エネルギー移動色素の組み合わせ、およびこれらの誘導体からなる群より選択される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ビオチン感知ユニットは、蛍光標識されたストレプトアビジンによって検出可能である。いくつかの実施形態において、蛍光感知ユニットは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ色素および量子ドットから選択される。いくつかの実施形態において、上記ビオチン感知ユニットは、ストレプトアビジン結合体化酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）によって検出可能である。いくつかの実施形態において、タミホスホルグアニジンモノエステルは、そのアンモニウム塩である。いくつかの実施形態において、ホスファザナミビルは、そのアンモニウム塩である。
【００６７】
本開示は、インフルエンザウイルスもしくはその粒子のノイラミニダーゼに結合する化合物に関し、ここで上記結合は、オセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）によって競合的に阻害され、上記化合物は、式Ｒ−Ｌ−Ｓを含み、ここで：Ｒは、ザナミビル、またはタミホスホルグアニジンモノエステル、またはホスファザナミビルもしくはそのものエステル、およびこれらの塩、エステルおよび誘導体から選択され；Ｌは、任意選択であり、トリアゾールリンカー、脂肪族リンカー、もしくはエチレングリコールリンカーから選択され；そしてＳは、（ａ）蛍光検出、比色検出、発光検出および放射活性検出から選択される方法によって直接検出可能な部分、または（ｂ）ビオチンおよびストレプトアビジン結合体化レポートシステムから選択される間接的に検出可能な部分、から選択される。
【００６８】
本開示は、診断キットに関し、上記診断キットは、包装材料およびサンプル中のオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの存在を検出するための組成物を含み、ここで上記組成物は、本開示に従う化合物を含む。いくつかの実施形態において、上記キットは、サンプル中のオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの検出のためのキットを使用するための適応または指示を含むラベルもしくはパッケージ挿入物をさらに含む。
【００６９】
これらおよび他の局面は、以下の図面に関連して考慮される好ましい実施形態の以下の記載から明らかになるが、そこでのバリエーションおよび改変は、本開示の新規な概念の趣旨および範囲から逸脱することなく用い得る。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の局面をさらに実証するために含まれ、本発明は、本明細書で提示される具体的実施形態の詳細な記載と合わせて、これら図面のうちの１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。特許もしくは出願ファイルは、カラーで制作された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）付きのこの特許もしくは特許出願の公報のコピーは、請求および必要な料金の支払いの際に当該官庁によって提供される。
【図１】図１は、ザナミビルホスホネート同族体および誘導体の合成のためのスキームを示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、化合物１ａ（２Ａ）、１ｂ（２Ｂ）、ザナミビル（２Ｃ）およびオセルタミビル酸（２Ｄ）の分子モデルを示す。
【図３】図３は、ザナミビル−ビオチン結合体（ＺＢ，９）の合成のためのスキームを示す。
【図４】図４は、ザナミビル−フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ）結合体１５および１７の合成のためのスキームを示す。
【図５】図５は、タミホスホルビオチン結合体２４の合成のためのスキームを示す。
【図６】図６は、ジザナミビル−ビオチン結合体２６の合成のためのスキームを示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、固定したインフルエンザサンプルを使用する、オセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）感受性の決定を示す。（７Ａ）本研究において使用される化合物の構造。（７Ｂ）ＯＣ感受性（Ｓ）もしくはＯＣ耐性（Ｒ）のＷＳＮウイルスサンプルを、１０５、１０４、もしくは１０３  ＰＦＵ／ウェルで、抗ＨＡ被覆マイクロプレートウェルに固定した。三連のウェルにおいて上記固定したウイルスサンプルを、完全な結合のために３０ｎＭ  ＺＢとともに、もしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭの競合ＯＣとともにインキュベートして、ＯＣ耐性ＺＢ結合（ＯＣ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＺＢ  ｂｉｎｄｉｎｇ）を測定した。結合したウイルスを、ストレプトアビジン結合体化アルカリホスファターゼとともに、続いて、化学発光基質とともにさらにインキュベートして、結合したアルカリホスファターゼによる触媒作用に起因する相対発光単位（ＲＬＵ）増大を測定した。ＯＣ耐性ＺＢ結合の値を、ＯＣ競合の存在下で測定されたＲＬＵと、ＯＣの非存在下で測定されたＲＬＵとの比として計算した。競合するＯＣによる有意な結合低下を生じる条件は、ｐ＜０．００１について「＊＊」で表示される。破線は、高力価（１０５  ＰＦＵ／ウェル）  ２７４Ｈウイルスサンプルを使用した場合に、ＯＣで完全に阻害できない、３％の残留ＺＢ結合を記した。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、２００５〜２００９年において台湾で集められた臨床インフルエンザ分離株のＯＣ感受性の決定を示す。２００５〜２００７年（８Ａ）、２００８年（８Ｂ）、および２００９年（８Ｃ）に台湾で集めた季節性のＨ１Ｎ１を、ＯＣ感受性研究に使用した。ＯＣ耐性ＺＢ結合を測定し、図１Ｂに記載されるように計算した。１％未満の結合値を、１％として示した。５％の結合値を記した破線は、試験ウイルスの感受性状態を評するために使用した。（８Ｄ）  ７つの２００９年の汎流行性Ｈ１Ｎ１分離株のＯＣ感受性を、完全なおよびＯＣ耐性の結合に対して三連の測定を行ったことを除いて同一の様式で測定した。さらに、完全なおよびＯＣ耐性結合をともに示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、インフルエンザウイルスサンプルのＯＣ感受性決定のためのプロトタイプの「ポイントオブケア」アッセイを示す。（９Ａ）  固定した抗ＨＡ抗体スロットを有するＰＶＤＦ膜を使用して、３０ｎＭ  ＺＢ、もしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭ  ＯＣのいずれかとともにプレインキュベートしたインフルエンザサンプルを吸収した。この研究において、１０４、１０５、１０６  ＰＦＵ／スロットでの野生型ＷＳＮ（２７４Ｈ）もしくは上記ＯＣ耐性ＷＳＮ（２７４Ｙ）変異ウイルスを使用した。ブロッティングおよび洗浄の後、上記膜を、ストレプトアビジン結合体化アルカリホスファターゼで処理し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴで染色して、上記ウイルスサンプルのＯＣ感受性を視覚的に決定した。（９Ｂ）  １０個の２００８年の台湾季節性Ｈ１Ｎ１分離株（図８Ｂに記載した）を、上記膜アッセイを使用して確認した。（９Ｃ）  同様に、図８Ｄにおいて試験した４つの汎流行性Ｈ１Ｎ１ウイルス株を、上記プロトタイプアッセイを使用して評価した。（９Ｄ）  ＺＢ結合のＯＣ競合を、抗体なしのＰＶＤＦ膜への上記ウイルスサンプルの直接固定を含む改変法を使用して、いくつかの他のＡ型もしくはＢ型のインフルエンザウイルスで決定し、次いで、同じ様式で処理した。
【図１０】図１０は、Ａ／Ｈａｎｏｉ／３０４０８／２００５  Ｈ５Ｎ１のノイラミニダーゼ  ｃＤＮＡを発現する２９３Ｔ細胞の表面におけるＺＢ（ザナミビル  ビオチン）結合を示す。上記２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミンＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＵＳＡ）によって、ＮＡ発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１−ＮＡでトランスフェクトした。４８時間後、トランスフェクトした細胞を、１００ｎＭ  ザナミビル−ビオチン（ＺＢ）で染色し、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８結合体化ストレプトアビジンとともにさらにインキュベートした。免疫蛍光画像を、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ５レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して獲得した。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｆは、ＯＣ耐性ノイラミニダーゼを発現する細胞を種々の含量混合した２９３細胞のＺＢ結合を示す。ＯＣ感受性細胞（２７４Ｈ）およびＯＣ耐性細胞（２７４Ｙ）を発現する組換え２９３Ｔ細胞を、以下に示されるように異なる比へと混合した：（１１Ａ）  ２７４Ｈ：２７４Ｙ＝１００：０、（１１Ｂ）  ２７４Ｈ：２７４Ｙ＝９９９：１、（１１Ｃ）  ２７４Ｈ：２７４Ｙ＝９９：１、（１１Ｄ）  ２７４Ｈ：２７４Ｙ＝９５：５、（１１Ｅ）  ２７４Ｈ：２７４Ｙ＝９０：１０、（１１Ｆ）  ２７４Ｈ：２７４Ｙ＝０：１００。混合した細胞を、１０ｎＭ  ＺＢで、室温において１時間にわたって処理し、続いて、さらにＡＰＣ結合体化ストレプトアビジンを付加し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．０ソフトウェアによって分析した。ＺＢ標識細胞のパーセンテージは、１１Ａ，８３．９５％；  １１Ｂ，８４．４％；  １１Ｃ，８４．６２％；  １１Ｄ，８６．０７％；  １１Ｅ，８３．５８％；  および１１Ｆ，７５．１％であった。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｆは、ＯＣ耐性ノイラミニダーゼを発現する細胞を種々の含量混合した２９３Ｔ細胞におけるオセルタミビルカルボキシレート耐性ＺＢ結合を示す。細胞を、図１１のように、１０ｎＭ  ＺＢおよび３００ｎＭの過剰のＯＣで処理し、同様に処理した。ＺＢ標識細胞のパーセンテージは、１２Ａ，１．００％；  １２Ｂ，２．６４％；  １２Ｃ，２．７８％；  １２Ｄ，７．１０％；  １２Ｅ，１２．４１％；  および１２Ｆ，６８．２９％であった。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、インフルエンザウイルス感染ＭＤＣＫ細胞へのＺＢ結合のＯＣ競合を示す。（１３Ａ）  ＭＤＣＫ細胞を、ＯＣ感受性２７４ＨウイルスもしくはＯＣ耐性２７４Ｙウイルスに感染させた。感染後２０時間で、上記２７４Ｈウイルス感染した細胞を、１０ｎＭ（白三角）もしくは５０ｎＭ（白丸）のＺＢとともに、種々の濃度の競合するＯＣの存在下でインキュベートした。同様に、上記２７４Ｙ感染細胞をまた、種々のＯＣ含量を含んで、１０ｎＭ  ＺＢ（黒三角）もしくは５０ｎＭ  ＺＢ（黒丸）とともにインキュベートした。ＺＢが結合した細胞を、さらに、ストレプトアビジン結合体化アルカリホスファターゼとともにインキュベートして、競合ＯＣの種々の濃度における相対的ＺＢ結合を決定した。（１３Ｂ）  ＯＣ感受性（２７４Ｈ）ＷＳＮウイルスもしくはＯＣ耐性（２７４Ｙ）ＷＳＮウイルスに感染させ、３０ｎＭ  ＺＢもしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭ  ＯＣのいずれかとインキュベートし、続いて、ストレプトアビジン結合体化ＰＥとインキュベートしたＭＤＣＫ細胞の画像。蛍光画像を、４８８ｎｍおよび５７５ｎｍにおいてそれぞれ励起および発光させレーザー駆動プレートリーダーを使用して獲得した。
【図１４】図１４は、ＯＣを競合させてのＺＢ結合によって、ＯＣ耐性ウイルス含量を推定するための、固定ＷＳＮウイルスのＲＡＢＣアッセイを示す。種々の含量の２７４Ｈウイルスおよび２７４Ｙウイルスと混合したＷＳＮウイルスサンプルを、１ウェルあたり１０５  ＰＦＵ（三角）、１０４  ＰＦＵ（四角）、および１０３  ＰＦＵ（丸）、抗ＨＡ被覆マイクロウェルに各々３連で固定した。それらに、１時間にわたって３０ｎＭ  ＺＢおよび１５０ｎＭ  ＯＣを添加し、続いて、ストレプトアビジン結合体化アルカリホスファターゼと結合させて、上記実験に使用した２７４Ｙの含量に対してプロットされるＯＣ耐性の推定％値を決定した。
【図１５】図１５〜６３は、本開示の化合物のＮＭＲスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
（発明の詳細な説明）
本明細書で使用される用語は、一般に、当該分野で、本発明の状況内において、および各用語が使用される具体的な状況においてそれらの通常の意味を有する。本発明を記載するために使用される特定の用語は、本発明の記載に関して実施者にさらなるガイダンスを提供するために、以下で、もしくは本明細書中の他の箇所で述べられる。便宜上、例えば、斜体および／もしくは引用符を使用して、特定の用語が強調され得る。強調の使用は、用語の範囲および意味に何ら影響を及ぼさない；用語の範囲および意味は、同じ状況においては、強調されようがされまいが、同じである。同じことが、１つより多くの方法で言われ得ることが、認識される。その結果として、代替の言葉および類義語が、本明細書で述べられる用語のうちのいずれか１つ以上に使用され得るが、用語が本明細書で練られもしくは述べられていても、そうでなくても、何ら特別に重きは置かれない。特定の用語に関する類義語が、提供される。１種以上の類義語の詳述は、他の類義語の使用を排除しない。本明細書で述べられる任意の用語の例を含む、本明細書でいずれかの箇所での例示の使用は、例示に過ぎず、本発明の範囲および意味も、いかなる例示される用語の範囲および意味も、決して限定しない。同様に、本発明は、本明細書で与えられる種々の実施形態にも限定されない。
【００７２】
別段定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義も含めて本文書が優先する。
【００７３】
オセルタミビルは、内因性エステラーゼによって、オセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）へと変換される経口プロドラッグである。ザナミビルは、上記ノイラミニダーゼタンパク質の活性部位へ結合することによって作用し、インフルエンザウイルスを、その宿主細胞から脱出できなくして、他の細胞へ感染できなくする（Ｃｙｒａｎｏｓｋｉ  Ｄ（２００５年９月）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１  （９）：  ９０９）。それはまた、インビトロおよびインビボでのインフルエンザウイルス複製のインヒビターである。ザナミビルのバイオアベイラビリティーは２％であり、これは通常、吸入によって投与される。
【００７４】
薬物耐性トリインフルエンザ感染およびタミフル（登録商標）処置を受けた小児における副作用に関する近年の報告から、ノイラミニダーゼインヒビター（ＮＡＩ）の新たな化学的な本質（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が、汎流行性インフルエンザの脅威に対する戦いに必要とされることが示唆される。上記ＮＡインヒビターは、シアル酸の酵素切断におけるオキソニウム遷移状態を摸倣するために、（オキサ）シクロヘキセン足場を有するように設計される（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４３  ：４５）。肝臓エステラーゼによる加水分解に対して、活性なカルボキシレートであるオセルタミビルは、ＮＡの活性部位における３個のアルギニン残基（Ａｒｇ１１８、Ａｒｇ２９２およびＡｒｇ３７１）と相互作用するように曝される（同上文献）。
【００７５】
（抗インフルエンザ活性を有するザナミビルホスホネート同族体の合成）
本開示は、ザナミビルの新規なホスホネート同族体（ｃｏｎｇｅｒ）への新規な合成経路を提供する。Ｄ−シアル酸を、新規な活性ノイラミニダーゼインヒビターの合成のためのキラル前駆体として利用した。新規なホスホネート同族体は、Ｈ１Ｎ１ウイルスおよびＨ５Ｎ１ウイルスの野生型およびＨ２７４Ｙ変異型のノイラミニダーゼを阻害することによって、ザナミビルおよびオセルタミビルより良好な抗インフルエンザ活性を示す。
【００７６】
一実施において、本発明は、合理的に高収量を有する種々のザナミビルホスホネート同族体およびその誘導体のエナンチオ選択的合成のための新規な合成法を提供する。上記合成経路は、図１に示される。図１に記載される試薬および工程は、以下のとおりである：
工程１．  シアル酸（２）を、ピリジン中の無水酢酸で処理して、過アセチル化中間体を得、これを、１００℃において加熱して、脱カルボキシル化を誘導し、化合物３を得た（Ｈｏｒｎ，  Ｅ．  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  ２００８，  ３４３，  ９３６）。
【００７７】
工程２．  化合物３を、適切な求核剤としてトリメチルシリルジエチルホスフェートで処理して、ホスホネート化合物４を、αアノマーおよびβアノマーの混合物（２：３）として得、これを、クロマトグラフィーによって分離し、ＮＭＲスペクトル分析によって特徴付けることができた。
【００７８】
工程３．  ホスホネート４（アノマー混合物として）を、ＣＨ２Ｃｌ２溶液中のＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）に曝して、ラジカルタイプ臭素化を受けさせ、これを、ピリジンでインサイチュ処理して、β脱離生成物５（Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎのホスホネート誘導体（ＤＡＮＡ））を得た。５についてのこの合成法は、ジメチルホスホネートのそのアナログに関して以前に報告されていた冗長な手順より遙かに効率的であった（Ｖａｓｅｌｌａ，  Ａ．；  Ｗｙｌｅｒ，  Ｒ．  Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  １９９１，  ７４，  ４５１）。
【００７９】
工程４．  無水酢酸、酢酸および濃Ｈ２ＳＯ４の媒体中で、化合物５を、オキサゾリン６に変換した。
【００８０】
工程５．  アジドトリメチルシランでのオキサゾリン６のレジオ選択的および立体選択的な開環反応を行って、アジド化合物７を重要な中間体として得た。これは、化合物１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄをもたらした。
【００８１】
工程６．  化合物７を、一連の３つの反応によってホスホン酸１ａに変換した：ブロモトリメチルシランでホスホネート７からの両方のエチル基の除去、メタノール中のナトリウムメトキシドを使用しての、脱アセチル化、およびＬｉｎｄｌａｒ触媒の存在下での水素化による、アジド基の、アミンへの選択的還元。
【００８２】
あるいは、１個のみのエチル基を、エタノール中のナトリウムエトキシドでの処理においてホスホネートジエステル７から除去し、アジド基のその後の還元後に、ホスホネートジエステル１ｃを得た。
【００８３】
工程７．  グアニジノ置換基を導入するために、化合物７におけるアジド基を、最初に還元して、アミンを得、これを、１，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−メチルチオプソイドウレアと、塩化水銀およびトリエチルアミンの存在下で反応させて、グアニジン化合物８を得た。
【００８４】
工程８．  ホスホネート８における両方のエチル基を、ブロモトリメチルシランによって除去し、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基の同時の除去を、インサイチュで生じたＨＢｒに起因して、メタノールでのワークアップによって実現した。上記ザナミビルホスホネート（１ｂ）を、脱アセチル化によって得た。
【００８５】
あるいは、ホスホネートジエステル７を、ナトリウムエトキシドでモノエステルに変換し、続いて、トリフルオロ酢酸でＢｏｃ基を除去して、化合物１ｄを得た。
【００８６】
本発明の組成物は、必要に応じて、本明細書における化合物の塩（特に、薬学的に受容可能な非毒性塩（例えば、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、およびＭｇ＋＋を含む））を含む。このような塩としては、適切なカチオン（例えば、アルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンもしくはアンモニウムイオンおよび四級アミンイオン）と酸アニオン部分との組み合わせによって得られるものが挙げられ得る。
【００８７】
金属塩は、金属水酸化物と本発明の化合物とを反応させることによって調製される。このようにして調製される金属塩の例は、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋を含む塩である。
【００８８】
さらに、塩は、塩基性中心（代表的には、アミン）への特定の有機酸および無機酸（例えば、ＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ２ＳＯ４、もしくは有機スルホン酸）の酸付加から形成され得る。最後に、本明細書中の組成物は、本発明の化合物をそれらの非イオン化形態および両性イオン形態、ならびに水和物でのように化学量論的な量の水と結合（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）して含むことが理解されるべきである。本発明の別の局面は、ノイラミニダーゼの活性を阻害する方法に関し、上記方法は、ノイラミニダーゼを含むと疑われるサンプルを本発明の化合物で処置する工程を包含する。
【００８９】
本発明の化合物は、従来のキャリアおよび賦形剤とともに処方され、上記キャリアおよび賦形剤は、通常の実施に従って選択される。錠剤は、賦形剤、滑沢剤、充填剤、および結合剤などを含む。水性処方物は、滅菌形態で調製され、経口投与以外による送達が意図される場合、一般に、等張性である。すべての処方物は、必要に応じて、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」（１９８６）（これは、その全体において参考として明示的に援用される）に示されるもののような賦形剤を含む。賦形剤としては、アスコルビン酸および他の抗酸化剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、デキストリン）、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルメチルセルロース、およびステアリン酸などが挙げられる。上記処方物のｐＨは、約ｐＨ３〜約ｐＨ１１の範囲に及ぶが、通常は、約ｐＨ７〜ｐＨ１０である。
【００９０】
本発明の１種以上の化合物（本明細書で活性成分といわれる）は、処置されるべき状態に適した任意の経路によって投与される。適切な経路としては、経口、直腸、鼻、局所（口腔および舌下を含む）、膣および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外を含む）などが挙げられる。好ましい経路が、例えば、レシピエントの状態で変動し得ることは、認識される。
【００９１】
上記活性成分が単独で投与されることは可能性がある一方で、それらを薬学的処方物として提示することは、好ましいことであり得る。本発明の処方物（獣医学的使用およびヒト使用の両方）は、少なくとも１種の活性成分（上記で定義されるとおり）と一緒に、そのための１種以上の受容可能なキャリア、および必要に応じて、他の治療成分を含む。上記キャリア（複数可）は、上記処方物の他の成分と適合性であり、そのレシピエントにとって生理学的に無害であるという意味において「受容可能」でなければならない。
【００９２】
上記処方物は、上記の投与経路に適切なものを含む。上記処方物は、便利なことには、単位剤形において提示され得、薬学分野で周知の方法のうちのいずれかによって調製され得る。技術および処方は、一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．）において見いだされる。このような方法は、上記活性成分と１種以上の補助成分を構成するキャリアとを会合した状態にする工程を包含する。一般に、上記処方物は、均一にかつ密接に、上記活性成分と、液体キャリアもしくは微細に分割した固体キャリア、またはその両方を会合した状態にし、次いで、必要であれば、上記生成物を成形することによって、調製される。
【００９３】
経口投与に適した本発明の処方物は、別個の単位（例えば、カプセル剤、カシェ剤もしくは錠剤（各々は、所定の量の活性成分を含む））として；散剤もしくは顆粒剤として；液剤または水性の液体もしくは非水性の液体中の懸濁物として；または水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型液体エマルジョンとして、調製される。上記活性成分はまた、ボーラス、舐剤もしくはパスタ剤として提示され得る。
【００９４】
錠剤は、必要に応じて、１種以上の補助成分とともに圧縮もしくは成形することによって作製される。圧縮錠剤は、適切な機械において、自由に流動する形態の活性成分を（例えば、粉末もしくは顆粒）を、必要に応じて、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤または分散剤と混合して圧縮することによって、調製され得る。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤でしめらせた粉末化した活性成分の混合物を適切な機械で成形することによって作製され得る。上記錠剤は、必要に応じて、被覆され得るかまたは刻み目が付けられ、必要に応じて、上記活性成分のゆっくりとしたもしくは制御された放出を提供するために処方される。
【００９５】
眼もしくは他の外部組織（例えば、口および皮膚）の感染に関して、上記処方物は、好ましくは、例えば、０．０７５〜２０％  ｗ／ｗ（０．１％  ｗ／ｗずつ増えて、０．１％〜２０％の間の範囲の活性成分（複数可）を含む（例えば、０．６％  ｗ／ｗ、０．７％  ｗ／ｗなど））、好ましくは、０．２〜１５％  ｗ／ｗおよび最も好ましくは、０．５〜１０％  ｗ／ｗの量において、上記活性成分（複数可）を含む局所軟膏剤もしくはクリーム剤として適用される。軟膏剤に処方される場合、上記活性成分は、パラフィン基剤もしくは水混和性軟膏基剤のいずれかとともに使用され得る。
【００９６】
あるいは、上記活性成分は、クリーム剤において、水中油型クリーム基剤とともに処方され得る。
【００９７】
所望であれば、クリーム基剤の水相は、例えば、少なくとも３０％  ｗ／ｗの多価アルコール（すなわち、２個以上のヒドロキシル基を有するアルコール（例えば、プロピレングリコール、ブタン１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ４００を含む）ならびにこれらの混合物））を含み得る。局所処方物は、望ましくは、皮膚もしくは他の罹患領域を通って上記活性成分の吸収もしくは浸透を増強する化合物を含み得る。このような皮膚浸透増強剤の例としては、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）および関連アナログが挙げられる。
【００９８】
本発明のエマルジョンの油相は、公知の様式において公知の成分から構成され得る。上記相は、単に乳化剤（別途、乳化剤（ｅｍｕｌｇｅｎｔ）として公知）を含み得る一方で、望ましくは、少なくとも１種の乳化剤と、脂肪もしくは油との、または脂肪および油の両方との混合物を含む。好ましくは、親水性乳化剤が、安定化剤として作用する親油性乳化剤と一緒に含まれる。油および脂肪の両方を含むこともまた、好ましい。一緒に、安定化剤（複数可）が存在もしくは存在しない乳化剤（複数可）は、いわゆる乳化ワックスを構成し、上記ワックスは、上記油および脂肪と一緒に、いわゆる乳化軟膏基剤（これは、クリーム処方物の油性分散相を形成する）を構成する。
【００９９】
本発明の処方物における使用に適した乳化剤およびエマルジョン安定化剤としては、ＴｗｅｅｎＴＭ  ６０、ＳｐａｎＴＭ  ８０、セトステアリルアルコール、ベンジルアルコール、ミリスチルアルコール、グリセリルモノステアレートおよびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【０１００】
上記処方物に適切な油もしくは脂肪の選択は、所望の審美的特性を達成することに基づく。上記クリーム剤は、好ましくは、ベタベタせず、色移りせず、チューブもしくは他の容器から漏れるのを回避するために適切な粘稠度を有する洗浄可能な生成物であるべきである。直鎖もしくは分枝鎖の、一塩基性アルキルエステルもしくは二塩基性アルキルエステル（例えば、ジイソアジペート、イソセチルステアレート、ココナツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、イソプロピルミルステート、デシルオレエート、イソプロピルパルミテート、ブチルステアレート、２−エチルヘキシルパルミテートまたは分枝鎖エステル（Ｃｒｏｄａｍｏｌ  ＣＡＰとして公知）のブレンド）が使用され得、最後の３つは、好ましいエステルである。これらは、必要とされる特性に依存して、単独で、もしくは組み合わせにおいて使用され得る。あるいは、高融点脂質（例えば、白色ワセリンおよび／もしくは流動パラフィンまたは他のミネラルオイル）が使用される。
【０１０１】
眼への局所投与に適した処方物としてはまた、上記活性成分が適切なキャリア（特に、上記活性成分のための水性溶媒）に溶解もしくは懸濁される点眼剤が挙げられる。上記活性成分は、好ましくは、０．５〜２０％、有利なことには、０．５〜１０％、特に、約１．５％  ｗ／ｗの濃度で、このような処方物に存在する。
【０１０２】
口内での局所投与に適した処方物としては、上記活性成分を、風味を添えた基剤（通常は、スクロースおよびアカシアもしくはトラガカント）に含むロゼンジ；上記活性成分を不活性基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア）に含む香錠；および上記活性成分を適切な液体キャリアに含むマウスウォッシュが挙げられる。
【０１０３】
直腸投与のための処方物は、適切な基剤（例えば、カカオ脂もしくはサリチレートを含む）による坐剤として提示され得る。
【０１０４】
肺内投与もしくは鼻投与に適した処方物は、例えば、０．１〜５００ミクロンの範囲の粒径（ミクロンずつ増えて、０．１〜５００ミクロンの間の範囲の粒径（例えば、０．５ミクロン、１ミクロン、３０ミクロン、３５ミクロンなど）を含む）を有し、これは、肺胞嚢に達するように、鼻経路からの迅速な吸入によって、もしくは口からの吸入によって、投与される。適切な処方物は、上記活性成分の水性溶液もしくは油性溶液を含む。エアロゾルもしくは乾燥粉末の投与に適した処方物は、従来の方法に従って調製され得、他の治療剤（例えば、インフルエンザＡもしくはインフルエンザＢ感染症の処置もしくは予防において本明細書以前で使用された化合物）とともに送達され得る。
【０１０５】
膣投与に適した処方物は、上記活性成分に加えて、適切であることが当該分野で公知であるような、このようなキャリアを含む、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、発泡物（ｆｏａｍ）もしくはスプレー処方物として提示され得る。
【０１０６】
非経口投与に適した処方物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および上記処方物を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含み得る、水性および非水性の滅菌注射液剤；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る、水性および非水性の滅菌懸濁剤が挙げられる。
【０１０７】
上記処方物は、単位用量もしくは複数用量の容器（例えば、シールされたアンプルおよびバイアル）において提示され、使用直前に滅菌液体キャリア（例えば、注射用水）の添加のみを必要とするフリーズドライした（凍結乾燥した）状態で貯蔵され得る。即席の注射溶液および懸濁物は、以前に記載された種類のうちの滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製される。好ましい単位投与量の処方物は、本明細書で上記に記載されるように、上記活性成分の日用量もしくは単位１日分割用量（ｕｎｉｔ  ｄａｉｌｙ  ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）、またはその適切な小部分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含むものである。
【０１０８】
上記で特に言及される成分に加えて、本発明の処方物は、問題の処方物のタイプを考慮して、当該分野で従来の他の剤を含み得ることは、理解されるべきである（例えば、経口投与に適したものとしては、香味剤が挙げられ得る）。
【０１０９】
本発明は、獣医学的組成物のための獣医学的キャリアと一緒に、上記で定義されるとおりの少なくとも１種の活性成分を含む獣医学的組成物をさらに提供する。獣医学的キャリアは、上記組成物を投与する目的で有用な材料であり、そしてそれは、固体、液体もしくは気体の材料であり得、これらは、別の方法で、不活性であるかもしくは獣医学分野において受容可能であり、上記活性成分と適合性である。これら獣医学的組成物は、経口的に、非経口的に、もしくは任意の他の所望の経路によって、投与され得る。本発明の化合物は、活性成分として１種以上の本発明の化合物を含む、制御された放出の薬学的処方物（「制御放出処方物」）を提供するために使用される。ここで上記活性成分の放出は制御および調節されて、より少ない頻度の投薬を可能にするか、所定の活性成分の薬物動態プロフィールもしくは毒性プロフィールを改善する。活性成分の有効用量は、少なくとも、処置される状態の性質、毒性、上記化合物が、予防的に使用される（低用量）のか、または活発なインフルエンザ感染に対して使用されるのか、送達法、および薬学的処方に依存し、従来の用量漸増試験を使用して、臨床医によって決定される。それは、約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ  体重／日、代表的には、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ  体重／日、より代表的には、約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇ  体重／日、より代表的には、約０．０５〜約０．５ｍｇ／ｋｇ  体重／日であると予測され得る。例えば、吸入に関しては、約７０ｋｇ体重の成人の１日の候補用量は、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは、５ｍｇ〜５００ｍｇの間の範囲であり、そして単一用量もしくは複数用量の形態をとり得る。
【０１１０】
一実施において、本発明の活性成分はまた、他の活性成分と組み合わせて使用される。このような組み合わせは、処置されるべき状態、成分の交差反応性および上記組み合わせの薬物特性に基づいて選択される。例えば、呼吸器系のウイルス感染症（特に、インフルエンザ感染）を処置する場合に、本発明の組成物は、抗ウイルス剤（例えば、アマンタジン（ａｍａｎｔｉｄｉｎｅ）、リマンタジンおよびリバビリン）、粘膜溶解薬、去痰薬、気管支拡張薬（ｂｒｏｎｃｈｉａｌｄｉｌａｔｏｒ）、抗生物質、解熱剤、もしくは鎮痛剤と組み合わせられる。通常は、抗生物質、解熱剤、および鎮痛剤が、本発明の化合物と一緒に投与される。
【０１１１】
本発明の別の実施は、本明細書に記載される化合物のインビボ代謝生成物が先行技術を通して新規かつ非自明である程度まで、そのような生成物を含む。このような生成物は、例えば、主に酵素的プロセスに起因して、投与される上記化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、およびエステル化などから生じ得る。よって、本発明は、本発明の化合物と哺乳動物とを、その代謝産物を生じるに十分な期間にわたって接触させる工程を包含するプロセスによって生成される、新規かつ非自明の化合物を包含する。このような生成物は、代表的には、本発明の放射標識された（例えば、１４Ｃもしくは３Ｈ）化合物を調製し、これを、検出可能な用量（例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇより多い）において動物（ラット、マウス、モルモット、サルなど）、もしくはヒトに非経口投与し、十分な時間を与えて代謝が起こるようにし（代表的には、約３０秒間〜３０時間）、そしてその変換生成物を、尿、血液もしくは他の生物学的サンプルから単離することによって、同定される。これら生成物は、容易に単離される。なぜなら、それらは、標識されているからである（他のものは、代謝産物に残っているエピトープを結合し得る抗体の使用によって単離される）。代謝産物の構造は、従来の様式で（例えば、ＭＳもしくはＮＭＲ分析によって）決定される。一般に、代謝産物の分析は、当業者に周知の従来からの薬物代謝研究と同じ方法で行われる。上記変換生成物は、それらが別の方法でインビボで見いだされない限り、たとえ、それら自体がノイラミニダーゼ阻害活性を有さないとしても、本発明の化合物の治療的投薬のための診断アッセイにおいて有用である。
【０１１２】
新規なホスホネート同族体のプロドラッグが、企図される。極性のホスホネート基およびグアニジニウム基はともに、必要に応じて、薬物動態および／もしくは薬力学的特性を増強するために、当該分野で公知の技術によってさらに官能化され得る。例えば、プロドラッグ（例えば、アシルオキシメチルホスホネートエステルおよびアリールホスホネートエステル）の処方および使用は、経口的なバイオアベイラビリティーを増強するために利用され得る（Ｋｒｉｓｅ  ａｎｄ  Ｓｔｅｌｌａ，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  １９９６，  １９，  ２８７）。
【０１１３】
本発明の一局面において、ノイラミニダーゼを含むと疑われるサンプルは、天然の材料もしくは人の手で作られた材料（例えば、生きている生物；組織もしくは細胞培養物；生物学的サンプル（例えば、生物学的材料のサンプル（血液、血清、尿、脳脊髄液、涙液、痰、唾液、および組織サンプルなど））；実験室サンプル；食品、水、もしくは空気のサンプル；生体生成物サンプル（例えば、細胞抽出物、特に、所望の糖タンパク質を合成する組換え細胞など））を含む。代表的には、上記サンプルは、ノイラミニダーゼを生成する生物（頻繁には、ウイルスのような病原性生物）を含むと疑われる。サンプルは、水および有機溶媒／水混合物を含む任意の媒体に含まれ得る。サンプルは、生きている生物（例えば、ヒト）、および人の手で作られた材料（例えば、細胞培養物）を含む。
【０１１４】
本発明の処理工程は、本発明の組成物を上記サンプルに添加する工程を包含するか、または上記組成物の前駆物質を上記サンプルに添加する工程を包含する。上記添加工程は、上記のような、任意の投与法を含む。所望であれば、上記組成物の適用後のノイラミニダーゼの活性を、任意の方法（ノイラミニダーゼ活性を検出する直接的および間接的な方法が挙げられる）によって観察し得る。ノイラミニダーゼ活性を決定する定量的、定性的、および半定量的な方法が、すべて企図される。代表的には、上記のスクリーニング法のうちの１つが適用されるが、任意の他の方法（例えば、生きている生物の生理学的特性の観察）もまた、適用可能である。
【０１１５】
ノイラミニダーゼを含む生物としては、細菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉａｌｏｐｈｉｌｕｓ）およびウイルス（特に、オルソミクソウイルスもしくはパラミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルスＡ（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１）およびインフルエンザウイルスＢ）、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、家禽ペストウイルス、およびセンダイウイルス）が挙げられる。これら生物のうちのいずれかから得られるもしくはいずれかに見出されるノイラミニダーゼ活性の阻害は、本発明の目的の範囲内である。インフルエンザウイルスのウイルス学は、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８６），第２４章に記載される。本発明の化合物は、インフルエンザ感染症の予防、または動物（例えば、アヒルおよび他のトリ、齧歯類、ブタ）、もしくはヒトにおける既存のインフルエンザ感染症の処置において有用である。
【０１１６】
本発明の組成物は、酵素活性を評価するための従来技術のうちのいずれかによって、ノイラミニダーゼに対する阻害活性についてスクリーニングされる。本発明の状況内で、代表的には、組成物は、最初に、ノイラミニダーゼの阻害についてインビトロでスクリーニングされ、阻害活性を示す組成物は、次いで、活性についてインビボでスクリーニングされる。
【０１１７】
約５×１０−６Ｍ未満、代表的には、約１×１０−７Ｍ未満、および好ましくは、約５×１０−８Ｍ未満のインビトロＫｉ（阻害定数）を有する組成物は、インビボでの使用に好ましい。
【０１１８】
有用なインビトロスクリーニングは、詳細に記載されており、ここでは詳述されない（Ｉｔｚｓｔｅｉｎ，  Ｍ．  ｖｏｎ  ｅｔ  ａｌ．；  「Ｎａｔｕｒｅ」，  ３６３（６４２８）：４１８−４２３  （１９９３）；  Ｐｏｔｉｅｒ，  Ｍ．；  ｅｔ  ａｌ；  「Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」，  ９４：２８７−２９６  （１９７９）；  Ｃｈｏｎｇ，  Ａ．  Ｋ．  Ｊ．；  ｅｔ  ａｌ；  「Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ」，  １０７７：６５−７１  （１９９１）；およびＣｏｌｍａｎ，  Ｐ．  Ｍ．；  ｅｔ  ａｌ；国際公開番号ＷＯ  ９２／０６６９１  （国際出願番号ＰＣＴ／ＡＵ９０／００５０１（公開日１９９２年４月３０日）））。インビボスクリーニングもまた、詳細に記載されている（Ｉｔｚｓｔｅｉｎ，  ｅｔ  ａｌ，  １９９３  特に、４２１頁第２欄第１段落の全て〜第４２３頁第２欄１段落の一部、およびＣｏｌｍａｎ，ｐ．３６）。
【０１１９】
表１は、ザナミビルおよびオセルタミビル酸との比較において、ザナミビルホスホネート誘導体１ａおよび１ｂのノイラミニダーゼ阻害、抗インフルエンザ活性、および細胞傷害活性を示す。上記ホスホネート誘導体１ａおよび１ｂは、種々の野生型インフルエンザウイルスおよび変異型インフルエンザウイルスに対してザナミビルより有効性を示した。
【０１２０】
【表１】
2013528160.tif 000084
【０１２１】
ａインフルエンザウイルス  Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）に由来するＨ２７４Ｙノイラミニダーゼ変異型、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（汎流行性Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４  ＲＧ１４（Ｈ５Ｎ１）、およびＡ／Ｕｄｏｒｎ／３０７／１９７２（Ｈ３Ｎ２）を、ノイラミニダーゼ阻害および抗インフルエンザアッセイのためのバイオアッセイ材料として使用した。ヒト２９３Ｔ細胞を、化合物についての細胞傷害性測定のために使用した。
ｂ蛍光基質である２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＭＵＮＡＮＡ）を、異なるインフルエンザノイラミニダーゼ酵素の５０％阻害を引き起こす化合物濃度であるＩＣ５０値を決定するために使用した。
ｃ阻害定数を、基質としてＭＵＮＡＮＡを使用する動態研究によって決定した。
ｄ異なるインフルエンザ株に対する上記抗インフルエンザ活性を、異なるインフルエンザ株による感染に起因して、細胞変性効果の５０％防御についての化合物濃度であるＥＣ５０値として測定した。
ｅ最高濃度を、２９３Ｔ細胞に対する細胞傷害性のアッセイにおいて顕著な毒性効果なく使用した。
【０１２２】
上記ノイラミニダーゼ阻害アッセイを、酵素源としてインフルエンザ関連ノイラミニダーゼを使用して、いくつかのインフルエンザ株のノイラミニダーゼに対して測定した。蛍光基質であるＭＵＮＡＮＡ（２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸）を使用して、すべてのウイルス酵素についてのノイラミニダーゼ活性を測定した。表１は、ノイラミニダーゼ活性の５０％阻害のための化合物濃度を測定し、これら化合物の相対的ノイラミニダーゼ阻害効力を評価するＩＣ５０値を示す。
【０１２３】
すべての５種のノイラミニダーゼに対する１ａおよび１ｂの両方についてのＩＣ５０値は、すべて、ザナミビルより顕著に強力であり、オセルタミビル酸のものについては同様である。これら２種のホスホネート化合物は、チロシン残基が上記ノイラミニダーゼの２７４位において親ヒスチジンを置き換えるＷＳＮ  ２７４Ｙのオセルタミビル耐性ノイラミニダーゼ変異型を阻害することにおいて顕著により活性である。
【０１２４】
これら化合物の抗インフルエンザ活性を、インフルエンザ感染媒介性細胞変性効果を防御する能力について、５つのインフルエンザ株に対して測定した。上記抗インフルエンザ活性を、上記感染媒介性細胞変性効果の５０％防御のための濃度であるＥＣ５０値として決定した。表１は、１ａおよび１ｂが、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス（例えば、ＷＳＮ株および２００９年の汎流行性Ｈ１Ｎ１株）に対してより大きな抗インフルエンザ活性を有することを示す。
【０１２５】
１ａおよび１ｂの抗インフルエンザ活性は、上記オセルタミビル耐性ＷＳＮ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスに対して特に顕著である。２７４位において上記オセルタミビル耐性ノイラミニダーゼ変異を有するＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスは、クリニックにおいて優勢なＨ１Ｎ１分離株であった（Ｍｏｓｃｏｎａ，  Ａ．  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ２００５，  ３５３，  ２６３３）。この変異ノイラミニダーゼについて１ａおよび１ｂの優れた抗インフルエンザ活性は、この優勢なインフルエンザ株を処置するための選択に影響を及ぼし得る。上記Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株に対する強力な抗インフルエンザインヒビターであることに加えて、１ａおよび１ｂはまた、ＲＧ１４（Η５Ν１）およびＵｄｏｒｎ（Η３Ν２）インフルエンザ株に対する抗インフルエンザ薬剤として、ザナミビルに匹敵する。
【０１２６】
バイオアッセイ測定値は、１ａおよび１ｂの両方が、強力な抗ノイラミニダーゼ化合物および抗インフルエンザ化合物であることを示した。それらは、一般に、ザナミビルより強力であり、上記オセルタミビル耐性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対して非常に活性である。強力な抗インフルエンザ薬剤であることに加えて、それらは、最高の試験濃度においてヒト２９３Ｔ細胞に対して非毒性である（表１）。
【０１２７】
本開示の一実施において、ホスホネート１ａは、強力なＮＡインヒビターであり、それぞれ、０．６５ｎＭおよび１．３ｎＭのＩＣ５０およびＥＣ５０値を有するＡ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスに対する抗インフルエンザ薬剤である。
【０１２８】
本開示の一実施において、ホスホネート１ａは、強力なＮＡインヒビターであり、それぞれ、０．５ｎＭおよび２７ｎＭのＩＣ５０値およびＥＣ５０値を有するＡ／ＷＳＮ／１９３３  （Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＨ２７４Ｙ変異体に対する抗インフルエンザ薬剤である。上記ザナミビルホスホネートのこれらＩＣ５０値およびＥＣ５０値は、タミフル耐性Ｈ１Ｎ１ウイルスについて特に印象的である。
【０１２９】
本開示の一実施において、ホスホネート１ａはまた、強力なＮＡインヒビターであり、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（汎流行性Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４  ＲＧ１４（Ｈ５Ｎ１）、およびＡ／Ｕｄｏｒｎ／３０７／１９７２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスに対する抗インフルエンザ薬剤である。
【０１３０】
本開示の一実施において、ホスホネート１ｂは、強力なＮＡインヒビターであり、それぞれ、１．２ｎＭおよび２．４ｎＭのＩＣ５０値およびＥＣ５０値を有するＡ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスに対する抗インフルエンザ薬剤である。
【０１３１】
本開示の一実施において、ホスホネート１ｂは、強力なＮＡインヒビターであり、それぞれ、０．２５ｎＭおよび２６ｎＭのＩＣ５０値およびＥＣ５０値を有するＡ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＨ２７４Ｙ変異体に対する抗インフルエンザ薬剤である。タミフル耐性Ｈ１Ｎ１ウイルスに対する１ｂの高い効力は、非常に顕著である。
【０１３２】
本開示の一実施において、ホスホネート１ｂはまた、強力なＮＡインヒビターであり、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（汎流行性Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４  ＲＧ１４（Ｈ５Ｎ１）、およびＡ／Ｕｄｏｒｎ／３０７／１９７２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスに対する抗インフルエンザ薬剤である。
【０１３３】
本発明の一局面において、ノイラミニダーゼ−ホスホネート複合体の分子モデリングは、上記ホスホネートと活性部位における３個のアルギニン残基との直接関係のある結合様式を示す。既知のＮｌ結晶構造（ＰＤＢコード：  ２ＨＵ４）を使用する分子ドッキング実験（図２）は、上記ホスホネートインヒビター１ｂが、ＮＡの３個のアルギニン残基と強力に結合すること、加えて、ノイラミニダーゼ−ザナミビル複合体と同様に結合ポケットにおいて、Ｃ７−Ｃ９グリセリル基、Ｃ４−アセトアミド基およびＣ５−グアニジノ基によって発揮される他の相互作用を明らかにしている。
【０１３４】
本発明の一局面において、ホスホネートインヒビター１ａの分子モデリングは、ノイラミニダーゼの３個のアルギニン残基との強い相互作用、加えて、結合ポケットにおけるＣ７−Ｃ９グリセリル基、Ｃ４−アセトアミド基およびＣ５−アミノ基によって発揮される他の相互作用を示した（図２）。
【０１３５】
（タミフル耐性ウイルス分離株の同定）
本明細書は、ここで、タミフル耐性ウイルス分離株の有効な診断法を開発するための結合競合による耐性評価（Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｎ）（ＲＡＢＣ）の方法の設計および実施を開示する。
【０１３６】
ザナミビルおよびＯＣは、インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）の同じ活性部位に結合する。しかし、オセルタミビル耐性Ｈ５Ｎ１ウイルスノイラミニダーゼは、ザナミビルになお感受性を保持し得る（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＰＪ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５３  （７１９９）：  １２５８−  １２６１）。Ｇｌｕ２７６残基の、Ａｒｇ２２４への再配向（より大きな疎水性ポケットを作り出す）を包含するノイラミニダーゼの誘導適合は、ＯＣの側鎖を収容する（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｅ）ために必要とされる（Ｍ．  Ｚ．  Ｗａｎｇ，  Ｃ．  Ｙ．  Ｔａｉ，  Ｄ．  Ｂ．  Ｍｅｎｄｅｌ，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６，  ３８０９  （２００２）；  Ｐ．  Ｊ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ  ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５３，  １２５８  （２００８））。Ｎ１群のノイラミニダーゼは、変異を有する耐性形態（例えば、上記疎水性ポケットの形成を妨げ、オセルタミビルのＫｉ値において数百倍の増大を生じるＨ２７４Ｙ）へと進化し得る。疎水性ポケットの必要性がない場合、Ｈ２７４Ｙノイラミニダーゼに対するザナミビルのＫｉは、変化しない（Ｐ．  Ｊ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ  ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５３，  １２５８  （２００８））。本発明の特徴において、結合の差異を調査して、ウイルス分離株のＯＣ感受性についての新規な診断法を開発した。
【０１３７】
インフルエンザウイルスノイラミニダーゼのオセルタミビル結合領域に結合する認識ユニット（Ｒ）の選択、およびインフルエンザウイルスのオセルタミビル感受性バージョンと、オセルタミビル耐性バージョンとの間の差次的結合を使用することは、驚くべきことに、インフルエンザウイルスのタミフル耐性株を検出するための基本であることがわかった。
【０１３８】
本発明の特定の局面において、上記認識ユニット（Ｒ）は、感知ユニット（Ｓ）に繋がれる。いくつかの実施形態において、上記認識ユニット（Ｒ）は、リンカー（Ｌ）に繋がれ、続いて、リンカー（Ｌ）が感知ユニット（Ｓ）に繋がれる。そのＲ−Ｌ−Ｓ分子は、タミフル耐性インフルエンザウイルスを、タミフル感受性インフルエンザウイルスから区別するために使用される。
【０１３９】
強力なノイラミニダーゼインヒビターであることから、オセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ；タミフル（登録商標））は、インフルエンザウイルスにおけるＮＡ分子に結合する非ＯＣ分子（Ｒ）の有効な競合因子である。しかし、ＯＣは、非ＯＣ認識ユニット（Ｒ）をなお結合し、等しく野生型ＮＡも結合するＯＣ耐性変異型（例えば、Ｈ２７４Ｙ）に対する結合の不十分な競合因子である。
【０１４０】
上記認識ユニット（Ｒ）は、代表的には、ザナミビルのような既知のＮＡ結合部分、タミホスホルグアニジンモノエステル、またはザナミビルホスホネート１ａもしくはその誘導体１ｂ、１ｃおよび１ｄから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒは、米国特許第７，８８８，３３７Ｂ２号に開示されるように、Ｈ１Ｎ１ウイルスおよびＨ５Ｎ１ウイルスの野生型およびＨ２７４Ｙ変異型に対するノイラミニダーゼインヒビターとしての活性を有するオセルタミビル含有ホスホネート化合物から選択される。
【０１４１】
ＮＡへの結合は、上記感知部分（すなわち、検出可能な部分）からのシグナルが観察され得ることによって検出される。このような同種の（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）蛍光感知部分および熱量感知部分は、当業者に公知である。例えば、Ｗａｎｇ  Ｑ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，「Ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ−１４  ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅｓ  ａｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ２５２，  ｐｐ．  ２３８−４５  （１９９７）、およびＢａｓａｋ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｂｉｏａｓｓａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ４  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  Ｖｏｌ．  ３８０，  ｐｐ．  ５０５−１４  （２００４）を参照のこと。
【０１４２】
上記感知ユニットは、直接的にもしくは間接的に（アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン、抗体−抗原、もしくは当該分野で公知の他の方法を介して）、蛍光標識、金標識および酵素標識からなる群より選択される検出可能な部分に連結される。種々の種類のセンサーは、特に限定されず、上記目的に従って適切に選択され得る。その例としては、放射活性標識、量子ドット標識、およびタンパク質標識などが挙げられる。
【０１４３】
いくつかの局面において、上記感知ユニットは、結合体化した結合パートナーと検出可能な結合複合体を形成し（結合対を形成する）、ここで上記結合パートナーは、試薬に結合体化されている。上記結合対は、以下のうちのいずれかに基づき得る：上記結合対は、ストレプトアビジン：ビオチン；  アビジン：ビオチン；  葉酸：フォレート（ｆｏｌａｔｅ）結合タンパク質；  シアル酸、炭水化物、もしくは糖タンパク質：レクチン；  オリゴ−ｄＡもしくはポリ−ｄＡ：オリゴ−ｄＴもしくはポリ−ｄＴ；  オリゴ−ｄＣもしくはポリ−ｄＣ：オリゴ−ｄＧもしくはポリ−ｄＧ；  フェニルボロン酸：サリチルヒドロキサム酸；  アルデヒドおよびケトン部分：ヒドラジド；  スルフヒドリル部分：マレイミド；  アミノ部分：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；  ならびに重金属：チオール；  ＩｇＧのＦｃ部分：プロテインＡ／プロテインＧ／プロテインＡ／Ｇ；  ジゴキシゲニン：抗ジゴキシゲニン；  ５−ブロモデオキシウリジン：抗ブロモデオキシウリジン；  ジニトロフェニル：抗ジニトロフェニル；  フルオレセインイソチオシアネート：抗フルオレセインイソチオシアネート；  Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン：抗Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン；  ならびにＮ−２−アセチルアミノ−７−ヨードフルオレン：抗Ｎ−２−アセチルアミノ−７−ヨードフルオレンからなる群より選択されるいずれか１つである。
【０１４４】
特定の局面において、上記標識は、蛍光団を含む。いくつかの局面において、上記蛍光団は、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、レゾルフィン、キサンテン、シアニン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、Ａｌｅｘａ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、スクアライン色素、エネルギー移動色素を生じる組み合わせ、ならびにこれらの誘導体からなる群より選択される。上記Ａｌｅｘａ蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態において、上記蛍光団は、ＢＯＤＩＰＹマレイミド、ヨードアセトアミドおよびメチルブロミド；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒマレイミド；フルオレセイン５−およびフルオレセイン６−アイソマーマレイミドならびにメチルブロミド；オレゴングリーンイソチオシアネートおよびマレイミド；テトラメチルローダミン５−アイソマー  ヨードアセトアミドおよびマレイミドならびにテトラメチルローダミン６−アイソマー  ヨードアセトアミドおよびマレイミド；ローダミンレッドマレイミド；テキサスレッドブロモアセトアミドおよびマレイミド；ピリジルオキサゾールマレイミド；ベンゾオキサジアゾール誘導体（ＮＢＤハライドおよびヨードアセトアミドを含む）、ＳＢＤ；ルシファーイエローヨードアセトアミド；スチルベンヨードアセトアミドおよびマレイミド；クマリンマレイミドおよびヨードアセトアミド、すなわち、ＭＤＣＣ、ＩＤＣＣなど；ナフタレン誘導体（すなわち、アクリロダン、バダン、ＩＡＡＮＳ、ＭＩＡＮＳ、ＩＡＥＤＡＮＳ、およびダンシル；アジリジン；ダポキシル誘導体（すなわち、ダポキシル（２−ブロモアセトアミジル）スルホンアミド；ピレンマレイミドおよびヨードアセチル誘導体；ならびにモノブロモ−およびモノクロロビマンからなる群より選択される。
【０１４５】
上記感知ユニット（Ｓ）からのシグナルを検出するための方法もしくは手段は、特に限定されず、上記目的に従って適切に選択され得る。例えば、上記シグナルが発光、消光などである場合、それは、光検出器、カメラなどによって検出される。
【０１４６】
上記発光部分と消光部分との組み合わせは、特に制限されず、上記目的に従って適切に選択され得る。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などの技術として公知のものは、適切に採用され得る。
【０１４７】
上記発光部分は、これが発光し得る限りにおいて特に限定されず、上記目的に従って適切に選択され得る。その例としては、蛍光物質、化学発光物質、電気化学発光物質などを含むもの、またはこれら物質から形成されるものが挙げられる。これらは、単独で使用されてもよいし、２種以上が組み合わされて使用されてもよい。これらの中で、上記消光部分が上記発光部分に隣接して存在する場合、上記消光部分の作用によって発光が消光されるものが好ましく、蛍光物質が、その視認性が優れておりかつ検出が容易であるという点で、より好ましい。上記蛍光物質は、特に限定されず、上記目的に従って適切に選択され得る。その例としては、アントラセン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン（例えば、テトラメチルローダミン、およびスルホローダミン）、ダンシルクロリド、テキサスレッド、ＡＬ  ３５０、およびインドカルボシアニン（ＣＹ）などが挙げられる。
【０１４８】
上記消光部分は、これが、上記発光部分に隣接して位置する場合に上記発光部分の発光を消光し得るようであれば、特に限定されず、上記消光部分は、上記発光部分のタイプなどに従って適切に選択され得る。その例としては、消光物質を含むもの、または上記消光物質から形成されるものが挙げられる。上記消光物質は、特に限定されず、上記目的に従って適切に選択され得る。上記発光部分が、上記蛍光物質から形成される場合、上記消光物質の例としては、上記蛍光物質が発光する場合に放出されるエネルギーを吸収し得る物質などが挙げられる。適切な例としては、上記発光物質の間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を可能にする物質を含む。具体例としては、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ジメチルアミノベンゼンスルホニル（ＤＡＢＳＹＬ）、金ナノ粒子、およびブラックホールクエンチャーなどが挙げられる。
【０１４９】
上記認識ユニットは、センサーに結合体化され、上記センサーは、続いて、発光部分および消光部分に結合される。上記消光部分は、上記認識ユニットがその標的ＮＡに結合する前に（すなわち、上記消光部分が、上記発光部分に隣接して存在する場合に）、上記発光部分の発光を消光し得る。上記認識ユニットがその標的ＮＡに結合した後、上記消光部分は、上記標的核酸から解離する。結果として、上記消光部分は、上記発光部分から離れ存在し、上記消光部分の作用の喪失を生じ、上記発光部分が発光を生じることを可能にする。
【０１５０】
上記リンカーユニット（Ｌ）は、特に限定されず、本発明の効果を損なわない限り、適切に選択され得る。例えば、水溶性リンカー（例えば、エチレングリコールリンカー）が、使用され得る。上記水溶性リンカーの長さは、適切な長さへと決定され得る。
【０１５１】
一局面において、試験されるべきインフルエンザウイルスサンプルもしくはＲ−Ｌ−Ｓ複合体のいずれかが、アレイのような固体表面に固定される。上記固体表面は、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、ガラス、ゲルマニウム、ケイ素、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ヒ化ガリウム、リン化ガリウム、酸化ケイ素、窒化ケイ素、およびこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。上記固体表面は、マイクロウェルもしくはマイクロタイタープレートもしくはディッシュ、シリコンチップ、ガラススライド、ビーズ、微粒子、フィルムもしくは膜、ボトル、ディッシュ、スライド、ブロッティング材料、フィルタ、ファイバー、織布繊維、成形ポリマー、粒子、ディップスティック、試験管、チップ、およびマイクロチップからなる群より選択される任意のものであり得る。
【０１５２】
一実施形態において、上記インフルエンザウイルスおよび／もしくはウイルス粒子は、天然もしくは合成のオリゴサッカリド（これは、グリコホリン、α１−酸糖タンパク質、α２−マクログロブリン、オボムコイド、およびこれらの組み合わせのような糖タンパク質に結合体化されるか、またはこれらとの組成物中に置かれる（ｓｉｔｕａｔｅｄ））からなる群より選択される炭水化物レセプター（該炭水化物レセプターは、上記ウイルスおよび／もしくはウイルス粒子のヘマグルチニン成分に結合する）のうちの少なくとも１つのタイプを含む支持体に結合される。特に、タミフル（登録商標）に通常感受性であるすべての公知のトリインフルエンザ（ＡＩ）サブタイプを含むインフルエンザウイルスおよび／もしくはウイルス粒子は、検出され得る。上記方法は、タミフル（登録商標）に耐性である非常に病原性のバリアントを含むインフルエンザウイルスおよび／もしくはウイルス粒子を検出するために適している。本発明は、特に、クロマトグラフィー用紙もしくは膜である支持体を用いて行われ得る。このような材料は、当業者に周知である。本発明によれば、上記炭水化物レセプターを上記支持体に共有結合的に結合させるか、または物理的に吸着させることは可能である（米国特許出願公開第２０１００００９３３９号）。
【０１５３】
本発明の方法は、粘液、唾液、呼吸器分泌物、のど洗浄液、鼻洗浄液、脊髄液、痰、尿、精液、汗、糞便、血漿、血液、気管支肺胞洗浄液、膣液、涙液および組織生検からなる群より選択される、インフルエンザウイルス含有が疑われているサンプルで使用され得る。類似の技術もまた、細胞培養物からのウイルスサンプル（例えば、細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞など）において増殖したインフルエンザサンプル）での使用に適用可能である。本発明の方法は、インタクトなインフルエンザウイルス感染細胞もしくはインフルエンザウイルスの無細胞サンプルで実施するのに適している。上記インフルエンザウイルスは、哺乳動物（ヒト、ウマ、ブタなど）もしくはトリが起源のものであり得る。
【０１５４】
（キット）
本発明のノイラミニダーゼ結合分子を含むキットはまた、想定される。種々のキット成分が、別個の容器に包装され得、使用直前に混合され得る。上記成分をこのように別個に包装することは、上記活性成分の機能を失うことなく、長期の貯蔵を可能にし得る。成分のうちの２種以上が同じ容器中に見いだされる実施形態はまた、企図される。例示的なキットは、以下の試薬のうちの１種以上を含み得る：ヘテロジニアスアッセイを使用して使用するための洗浄バッファ試薬；ノイラミニダーゼ結合能がない陰性コントロール試薬；シグナル生成部分から検出可能なシグナルを発生させるためのシグナル生成試薬；およびサンプル採取手段（例えば、シリンジ、咽頭スワブ、もしくは他のサンプル採取デバイス）。本発明のキットは、所望であれば、本発明のキットの１つ以上のユニットを含み得るパックにおいて提示され得る。上記パックは、上記キットを使用するための指示が添えられ得る。上記パックはまた、実験用補助物質（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）の製造、使用もしくは販売を規制する政府当局によって指示された（ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ）形態において、上記容器と関連する通知によって適合させられ得、この通知は、上記組成物の形態の、機関による承認を示す。
【０１５５】
（結合分子の例示的実施形態）
本発明は、認識ユニット（Ｒ）-任意選択のリンカー（Ｌ）-感知ユニット（Ｓ）という構造を有する特定の結合分子の結合能を決定することによる、タミフル耐性インフルエンザウイルス株の検出に関する。
【０１５６】
本発明に従う結合分子（ＢＭ）のいくつかの実施形態の例は、以下である：
ＢＭ  １：  ザナミビル−トリアゾールリンカー−ビオチン
【０１５７】
【化１６】
2013528160.tif 000085
【０１５８】
トリアゾール基含有リンカーは、クリックケミストリー（アルキンおよびアジドの１，３−双極環付加）によって形成される。蛍光標識したストレプトアビジンは、ビオチンユニットを検出するために使用される。
【０１５９】
ＢＭ  ２：  ザナミビル−トリアゾールリンカー−フルオレセイン
【０１６０】
【化１７】
2013528160.tif 000086
【０１６１】
フルオレセインは、（水中で）４９４ｎｍにおいて最大吸収を有し、５２１ｎｍで最大発光を有する。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、上記リンカーに接続するために使用される。あるいは、他の蛍光実体（例えば、Ａｌｅｘａ色素および量子ドット）が、使用され得る。
ＢＭ  ３：ザナミビル−エチレングリコールリンカー−ビオチン
【０１６２】
【化１８】
2013528160.tif 000087
【０１６３】
エチレングリコールリンカーの長さは、ｘ＝１からｘ＝４まで調節され得る。
ＢＭ  ４：  ザナミビル−エチレングリコールリンカー−フルオレセイン
【０１６４】
【化１９】
2013528160.tif 000088
【０１６５】
ＢＭ  ５：  タミホスホルグアニジン−リンカー−ビオチン
【０１６６】
【化２０】
2013528160.tif 000089
【０１６７】
タミホスホルグアニジンは、インフルエンザウイルスのタミフル感受性およびタミフル耐性（Ｈ２７４Ｙ）の両方の株に結合する。上記タミホスホルグアニジンモノエステルは、塩形態（例えば、アンモニウム塩）で存在し得る。上記肪族鎖は、上記リンカーに１〜６個の炭素（ｘ＝１〜４）を有し得る。あるいは、上記脂肪族鎖は、実施例３に示されるように、エチレングリコール鎖によって置き換えられ得る。
ＢＭ  ６：タミホスホルグアニジン−エチレングリコールリンカー−フルオレセイン
【０１６８】
【化２１】
2013528160.tif 000090
【０１６９】
ＢＭ  ７：ホスファザナミビル−トリアゾールリンカー−ビオチン
【０１７０】
【化２２】
2013528160.tif 000091
【０１７１】
ホスファザナミビルは、塩形態（例えば、アンモニウム塩）で存在し得る。
ＢＭ  ８：ホスファザナミビル−エチレングリコールリンカー−フルオレセイン
【０１７２】
【化２３】
2013528160.tif 000092
【０１７３】
ホスファザナミビルは、塩形態（例えば、アンモニウム塩）で存在し得る。
ＢＭ  ９：ホスファザナミビルモノエステル−エチレングリコールリンカー−ビオチン
【０１７４】
【化２４】
2013528160.tif 000093
【０１７５】
エチレングリコールリンカーの長さは、ｘ＝１からｘ＝４まで調節され得る。
ＢＭ  １０：ホスファザナミビルモノエステル−エチレングリコールリンカー−フルオレセイン
【０１７６】
【化２５】
2013528160.tif 000094
【０１７７】
エチレングリコールリンカーの長さは、ｘ＝１からｘ＝４までであり得る。
【０１７８】
一般構造Ｒ−Ｌ−ＳのインフルエンザＮＡ結合分子の他の例は、Ｋａｌｅ，  Ｒ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ，  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００８，  １３０，  ８１６９−８１７１  ；Ｍｃｋｉｍｍ−Ｂｒｅｓｃｈｋｉｎ，  Ｊ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ，  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２００３，  ４２，  ３１１８−３１２１；  Ｌｕ，  Ｃ．−Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２００５，  ４４，  ６８８８−６８９２；  Ｋｉｍｕｒａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ２００９，  ５０，  ３２０５−３２０８に開示されている。
【０１７９】
本開示は、初めて、上記構造Ｒ−Ｌ−Ｓの分子のＮＡ結合能が、インフルエンザウイルスのタミフル耐性バージョンを検出するために使用され得ることを明らかにする。
【０１８０】
（ＮＡと、オセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）およびＲ−Ｌ−Ｓタイプ結合分子との競合的結合）
インフルエンザノイラミニダーゼを効率的に結合するビオチン結合体化ザナミビル（ＺＢ）を調製した。ザナミビル結合の競合因子としてのオセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）の存在下で、ＯＣ感受性が決定され得る。そのＯＣ結合競合アッセイから、２００８年のＯＣ耐性Ｈ１Ｎ１分離株の劇的な増加および台湾におけるＯＣ耐性汎流行性２００９  Ｈ１Ｎ１の出現が確認された。結合競合による耐性評価（ＲＡＢＣ）アッセイを使用して、ＯＣ感受性評価のためのプロトタイプ「ポイントオブケア」試験を開発した。上記ＲＡＢＣアッセイ原理は、一般に、ハイスループット調査および病原体の薬物感受性の迅速診断に利用可能であり得る。
【０１８１】
ビオチン結合体化ザナミビル（ＺＢ）を、この研究のために調製した（図１Ａ，実施例）。ザナミビルへの、その７−ＯＨ位置でのリンカーを介するビオチンの結合体化によって、ＺＢを作製し、それにより、ノイラミニダーゼ阻害の大きな低下なくして誘導体化できた（Ｄ．  Ｍ．  Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３４，  ５６３  （１９９９）；  Ｔ．  Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  １２，  １９２５  （２００２）；  Ｗ．  Ｈ．  Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ５２，  ４９０３  （２００９））。ノイラミニダーゼに対するＺＢのＩＣ５０値は、７．７ｎＭであり、ザナミビル（２．１ｎＭ）のＩＣ５０値より高いことがわかった。インフルエンザノイラミニダーゼへのＺＢの結合を、ノイラミニダーゼをトランスフェクトした細胞（図４）、インフルエンザ感染細胞（実施例を参照のこと）、および固定インフルエンザウイルス（図１Ｂ）を使用して実証した。強力なノイラミニダーゼインヒビターであるので、オセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）は、インフルエンザウイルスへのＺＢ結合についての有効な競合因子であり得る。
【０１８２】
にも拘わらず、ＯＣはまた、ＺＢが等しく良好に結合するＯＣ耐性Ｈ２７４Ｙ変異体の結合についての不十分な競合因子であると予測された。図１Ｂは、ＺＢ結合に対する有意なＯＣ阻害（ｐ＜０．００１）は、１０３〜１０５  ＰＦＵの範囲の力価で、２７４Ｈインフルエンザウイルスの測定において示されたことを示す。残留するＺＢ結合約３％は、より高い力価の２７４ＨウイルスサンプルのＯＣ競合において認められた。対照的に、競合するＯＣによるＺＢ結合の有意な阻害は、同じ力価のＯＣ耐性２７４Ｙ  ＷＳＮウイルスにおいて認められなかった。
【０１８３】
形質転換された細胞およびインフルエンザ感染細胞を使用して同じ観察が実証された（図１１〜１４）。本発明者らは、このアッセイを、結合競合による耐性評価、すなわち、ＲＡＢＣ（略称）と称した。本発明者らはまた、上記ＲＡＢＣアッセイが、１０％を超える耐性内容物を含む混合集団中のＯＣ耐性２７４Ｙ変異体の検出を可能にすることを示した（図１４）。
【０１８４】
２００５〜２００９年に集めた合計１３７株の台湾の季節性Ｈ１Ｎ１臨床分離株を、ＯＣ感受性についてＲＡＢＣアッセイによって調べた。上記ウイルスサンプルを、抗Ｈ１Ｎ１被覆マイクロプレートウェルに固定し、二連のアッセイにおいて、３０ｎＭ  ＺＢもしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭ  ＯＣのいずれかを使用して結合について試験した。５％残留するＺＢ結合を、ＯＣ感受性決定のためのカットオフとして使用した。上記ＲＡＢＣアッセイ結果は、すべての試験した、２００８年より前に集めた季節性Ｈ１Ｎ１分離株（図８Ａ）もしくは２００８年の早期に集めた季節性Ｈ１Ｎ１分離株（図８Ｂ）が、ＯＣ感受性であることを示唆した。２００８年半ばになって初めて、ＯＣ耐性Ｈ１Ｎ１が、台湾で単離された（図８Ｂ）。同様に、２００９年に集めた５０株の季節性Ｈ１Ｎ１のうちの４８株を、ＯＣ耐性として評価した（図８Ｃ）。本発明者らはまた、台湾で集めた汎流行性２００９  Ｈ１Ｎ１分離株のＯＣ感受性を試験した。図８Ｄは、分離株＃＃１〜４および分離株＃＃５〜７が、それぞれ、ＯＣ感受性ウイルスおよびＯＣ耐性ウイルスであることを示す。上記７株のＲＡＢＣアッセイを、ブラインドで行い、結果は、後に、それらのＯＣ感受性および配列結果と一致していることが示された。ＲＡＢＣアッセイを使用する感受性予測を評価するために、図８Ａ〜Ｃに記載される上記季節性Ｈ１Ｎ１サンプルの６０の分離株を、無作為に取りあげ、それらのノイラミニダーゼ配列を分析した。上記ＲＡＢＣアッセイによってＯＣ感受性と予測されるすべてのサンプルは、ヒスチジンを有する一方で、ＯＣ耐性であると予測されるサンプルは、上記ノイラミニダーゼの対応する残基２７４においてチロシンを有する（表２）。進化している耐性集団が存在する可能性を調べるために、本発明者らは、３〜５％残留するＺＢ結合値を有するそれらサンプルをより詳細に調べた。これらサンプルからのいくつかの単離ウイルスプラークの分析から、結合分析もしくは配列分析によってＯＣ耐性ウイルスを同定できなかった。
【０１８５】
表２は、上記ＲＡＢＣアッセイによるそれらのＯＣ感受性状態の決定について、この研究において使用したすべての台湾の臨床Ｈ１Ｎ１分離株を列挙する。６０株のウイルス分離株を、ウイルスノイラミニダーゼのアミノ酸２７４（ＡＡ２７４；Ｎ２命名法）においてそれらの配列を決定するために無作為に選択した。さらに、数個のサンプルを、ＯＣ感受性決定のため、膜での迅速アッセイを使用して試験した。すべてのアッセイ結果において矛盾は全く見いだされなかった。このことから、上記ＲＡＢＣが、ＯＣ感受性決定に対して信頼性があることが示された。
表２．  台湾の季節性Ｈ１Ｎ１分離株のＯＣ感受性決定
上記ＲＡＢＣアッセイによって決定した各インフルエンザ分離株のＯＣ感受性を、図８の結果に従ってＲ（耐性）もしくはＳ（感受性）として示す。いくつかの分離株を、ＡＡ２７４の分析および（もしくは）膜での迅速試験（括弧中の数字は、図８Ｂにおいて使用されるサンプル番号に対応する）によって確認のために無作為に選択した。
【０１８６】
【表２−１】
2013528160.tif 000095
【０１８７】
【表２−２】
2013528160.tif 000096
【０１８８】
（ポイントオブケアアッセイ）
本明細書で開示されるのは、上記インフルエンザウイルスのＯＣ感受性状態の視覚的評価のための膜でのプロトタイプアッセイである。図９Ａは、ＺＢによるＯＣ感受性Ｈ１Ｎ１（ＷＳＮ）の染色が、ＯＣ競合によってブロックされた一方で、ＯＣ耐性２７４Ｙ  ＷＳＮの染色が、同じ競合に対して耐性であったことを示す。本発明者らは、膜での染色を使用して、いくつかの季節性および汎流行性Ｈ１Ｎ１分離株のＯＣ感受性の状態を確認した（図９Ｂおよび図９Ｃ）。感受性株のＺＢ結合はまた、膜に直接固定したＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＢ型インフルエンザウイルスに対して実証された（図９Ｄ）。上記プロトタイプＲＡＢＣベースの染色アッセイは、迅速であり、検出のために機器を何ら必要としない。これは、上記季節性Ｈ１Ｎ１もしくは汎流行性Ｈ１Ｎ１感染症の処置の選択を、時宜を得て決定するために、医師の診療室において「ポイントオブケア」アッセイっとして使用され得る。さらに、上記試験は、他の呼吸器感染症に対してインフルエンザウイルスを区別するために使用され得る。なぜなら、大部分の他の呼吸器感染病原体は、ノイラミニダーゼを有しないからである。
【０１８９】
上記ＲＡＢＣアッセイは、単純でかつ強力な方法であり、それは、種々のアッセイプラットフォームを使用して、異なるインフルエンザウイルスおよび感染細胞で実証されてきた。上記アッセイの原理は、薬物感受性評価について、他の病原体標的に適用可能であり得る。
【実施例】
【０１９０】
本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の実施形態に従う例示的機器、装置、方法およびそれらの関連する結果が、以下に提供される。標題もしくは副題は、読み手の便宜のために実施例において使用され得るが、本発明の範囲を決して限定すべきではないことに注意。さらに、特定の理論が、本明細書において提唱され、開示される；しかし、これらが正しかろうと誤っていようと、それらは、本発明が任意の特定の理論もしくは作用機序に拘わらず、本発明に従って実施される限りにおいて、本発明の範囲を決して限定するべきではない。
【０１９１】
すべての試薬は市販されており、別段示されなければ、さらに精製せずに使用した。すべての溶媒は、別段示されなければ無水グレードであった。すべての非水性の反応は、オーブン乾燥したガラス製品において、別段注記されなければ、僅かに陽圧のアルゴン下で行った。反応を、磁気を用いて撹拌し、シリカゲルの薄層クロマトグラフィーによってモニターした。フラッシュクロマトグラフィーを、６０〜２００μｍ粒径のシリカゲルで行った。収量は、分光光度的に純粋な化合物に対して報告する。融点は、Ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ  ＭＥＬ−ＴＥＭＰ（登録商標）  １１０１Ｄ融点装置で記録した。そして上記融点は、補正していない。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ６００分光計で記録した。３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ５００分光計で記録した。化学シフトを、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対するδ値で与える；カップリング定数Ｊは、Ｈｚで与えられる。内部標準は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルについてはＣＤＣｌ３（δＨ＝７．２４）、ＭｅＯＨ−ｄ４（δＨ＝３．３１）もしくはＤ２Ｏ（δＨ＝４．７９）、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルについてはＣＤＣｌ３（δＣ＝７７．０）もしくはＭｅＯＨ−ｄ４（δＣ＝４９．１５）、および３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルについてはＤ２Ｏ中のＨ３ＰＯ４（δＰ＝０．００）であった。分裂パターンを、ｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｍ（多重線）、ｂｒ（ブロード）およびｄｄ（二重線の二重線（ｄｏｕｂｌｅ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅｔｓ））として報告する。ＩＲスペクトルを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｎｉｃｏｌｅｔ  ３８０  ＦＴ−ＩＲ分光計で記録した。旋光を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３４１偏光計で記録した。高分離能ＥＳＩ質量スペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ分光計で記録した。
【０１９２】
実施例１：  ３−アセトアミド−４，６−ジアセトキシ−２−（１，２，３−トリアセトキシ）プロピル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（３）
【０１９３】
【化２６】
2013528160.tif 000097
【０１９４】
窒素雰囲気下で、ピリジン（７５ｍＬ）および無水酢酸（７５ｍＬ）中のＮ−アセチルノイラミン酸（５ｇ，１６．２ｍｍｏｌ）の懸濁物を、室温において１２時間にわたって撹拌し、次いで、１００℃において５時間にわたって加熱した。その反応混合物を室温へと冷却し、減圧下で濃縮した。その残留物の褐色のガラス状オイルを、ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）に溶解し、飽和水性ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）、水性１Ｍ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で順次洗浄した。その有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。その褐色の残留物を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，６７：３３〜１００：０）によって精製して、３を淡黄色発泡物として得た（３．８ｇ，５０％）。これは、分離できないアノマー混合物を含んでいた（α／β＝１：５）。３のアノマー混合物を、さらに分離せずに次の工程において使用した。
【０１９５】
【化２７】
2013528160.tif 000098
【０１９６】
実施例２：ジエチル（５−アセトアミド−４−アセトキシ−６−（１，２，３−トリアセトキシ）プロピル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ホスホネート（４）
無水ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中の３のアノマー混合物（２．１５ｇ，４．５２ｍｍｏｌ）およびジエチルトリメチルシリルホスファイト（３．１１ｍＬ，１３．６５ｍｍｏｌ）を、０℃においてトリメチルシリルトリフルオロメチルスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ，１．２３ｍＬ，６．７８ｍｍｏｌ）で処理した。３０分後、上記混合物を、室温へと加温し、２４時間にわたって撹拌した。上記混合物を氷水（２０ｍＬ）に注ぎ、その水層を、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（２０ｍＬ，２×）。その合わせた抽出物を、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で順次洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。その残留物を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（アセトン／ＥｔＯＡｃ，１：９）によって精製して、４を無色シロップ状物として得た（１．５５ｇ，６２％）。これは、α−アノマーおよびβ−アノマー（２：３）の混合物を含んでいた。ホスホネート４のアノマー混合物を、さらに分離せずに次の工程において使用した。純粋なα−アノマーおよびβ−アノマー（４αおよび４β）の分析サンプルを、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／アセトン，１００：０〜９０：１０）によって得た。
【０１９７】
【化２８】
2013528160.tif 000099
【０１９８】
実施例３：ジエチル（５−アセトアミド−４−アセトキシ−６−（１，２，３−トリアセトキシ）プロピル−４，５，６−トリヒドロピラン−２−イル）ホスホネート（５）
無水ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中のホスホネート４のアノマー混合物（１．１ｇ，２ｍｍｏｌ）およびＮ−ブロモスクシンイミド（８８５ｍｇ，５ｍｍｏｌ）を、１００Ｗタングステンランプの照射下で加熱還流した。反応の進行を、ＴＬＣによってモニターした。完了したら（約６時間）、その混合物を室温へと冷却し、その沈殿物であるスクシンイミドを、濾別した。その濾液を減圧下でエバポレートして、粗製の２−ブロモ誘導体を黄色のシロップ状物として得た。これを、さらに精製せずに次の工程において使用した。
【０１９９】
無水ピリジン（１０ｍＬ）中の上記で調製したブロモ化合物の溶液を、５０℃において２時間にわたって撹拌した。その溶液を減圧下で濃縮し、その褐色の残留物を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／アセトン，１００：０〜９０：１０）によって精製して、結合体化したホスホネート５を無色発泡物として得た（８２７ｍｇ，２工程について７５％）。
【０２００】
【化２９】
2013528160.tif 000100
【０２０１】
実施例４：ジエチル（４−（１，２，３−トリアセトキシ）プロピル−２−メチル−３ａ，７ａ−ジヒドロ−４Ｈ−ピラノ（３，４−ｄ）オキサゾール−６−イル）ホスホネート（６）
【０２０２】
【化３０】
2013528160.tif 000101
【０２０３】
酢酸（２ｍＬ）と無水酢酸（２ｍＬ）の混合物中のホスホネート５（５５０ｍｇ，１ｍｍｏｌ）の溶液に対し、濃Ｈ２ＳＯ４（０．２ｍＬ）で処理した。その混合物を、４８時間にわたって室温において撹拌し、冷たい（０℃）飽和水性ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９）中に注ぎ、３０分間にわたって撹拌し、その後、ＥｔＯＡｃで抽出した（３０ｍＬ，５×）。その合わせた抽出物を、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。その残留物の油状物を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（アセトン／ＥｔＯＡｃ，１：９）によって精製して、６を淡黄色シロップ状物として得た（３９４ｍｇ，２工程について８０％）。
【０２０４】
【化３１】
2013528160.tif 000102
【０２０５】
実施例５：ジエチル（５−アセトアミド−４−アジド−６−（１，２，３−トリアセトキシ）プロピル−４，５，６−トリヒドロピラン−２−イル）ホスホネート（７）
ｔ−ＢｕＯＨ（１０ｍＬ）中のオキサゾリン６（３９３ｍｇ，０．８ｍｍｏｌ）の溶液に対し、アジドトリメチルシラン（０．５３ｍＬ，４ｍｍｏｌ）で、８０℃において２４時間にわたって処理した。その溶液を、飽和水性ＮａＨＣＯ３中に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した（３０ｍＬ，３×）。その合わせた抽出物を、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、アジド化合物７を無色のシロップ状物として得た（３７１ｍｇ，８７％）。これは、実際には純粋であったので、次の工程において使用した。分析サンプルを、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ中の１０％  アセトン）によって得た。
【０２０６】
【化３２】
2013528160.tif 000103
【０２０７】
実施例６：ジエチル｛５−アセトアミド−４−（Ｎ２，Ｎ３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル））グアニジノ−６−（１，２，３−トリアセトキシ）プロピル−４，５，６−トリヒドロピラン−２−イル｝ホスホネート（８）
【０２０８】
【化３３】
2013528160.tif 000104
【０２０９】
エタノール（２５ｍＬ）中のアジド７（３５０ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）の溶液を、水素雰囲気下で、Ｌｉｎｄｌａｒ触媒（３０ｍｇ）により水素化した。その混合物を５時間撹拌し、セライトのパッドを通して濾過し、エタノールで洗浄した。その濾液を減圧下で濃縮して、無色の発泡物を得た（２７８ｍｇ）。その粗製のアミン生成物を、無水ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解し、１，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−メチルチオプソイドウレア（２４７ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（２３０μｌ，１．７ｍｍｏｌ）で処理した。その混合物を０℃へと冷却し、ＨｇＣｌ２（２３１ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。その懸濁物を室温へと加温し、１２時間にわたって撹拌した。その後、その混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、セライトのパッドを通して濾過した。その濾液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）によって精製して、グアニジン８（４４２ｍｇ，８３％収率）を無色発泡物として得た。
【０２１０】
【化３４】
2013528160.tif 000105
【０２１１】
実施例７：（５−アセトアミド−４−アミノ−６−（１，２，３−ヒドロキシ）プロピル−４，５，６−トリヒドロピラン−２−イル）ホスホン酸（１ａ）
【０２１２】
【化３５】
2013528160.tif 000106
【０２１３】
０℃において無水ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中のジエチルホスホネート７（８０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）の溶液を、ブロモトリメチルシラン（０．１２ｍＬ，０．８７ｍｍｏｌ）で処理した。２４時間にわたって０℃において撹拌した後、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）を添加し、その混合物を減圧下で濃縮した。その残留物を、無水ＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（ＭｅＯＨ中５．４Ｍ溶液，０．９ｍＬ，４．８６ｍｍｏｌ）で処理した。１時間にわたって室温において撹拌した後、その混合物を、Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ８（Ｈ＋形態）を通して濾過し、次いで、減圧下で濃縮した。その残留物を、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解し、Ｌｉｎｄｌａｒの触媒（２０ｍｇ）の存在下で室温において水素化（１気圧）に供した。３時間後、その混合物を、セライトのパッドを通して濾過し、ＭｅＯＨですすいだ。その濾液を濃縮し、残留するその固体を、Ｅｔ２Ｏで洗浄して（３×１０ｍＬ）、ホスホネート１ａを得た。
【０２１４】
実施例８：（５−アセトアミド−４−グアニジノ−６−（１，２，３−ヒドロキシ）プロピル−４，５，６−トリヒドロピラン−２−イル）ホスホン酸（１ｂ）
【０２１５】
【化３６】
2013528160.tif 000107
【０２１６】
無水ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中のジエチルホスホネート８（１３０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）の溶液を、ブロモトリメチルシラン（０．１３ｍＬ，０．９４ｍｍｏｌ）で、０℃において処理し、その反応混合物を、２４時間にわたって０℃において撹拌した。ＭｅＯＨ（２ｍＬ）を、激しく撹拌しながら添加した。３０分後、その溶液を減圧下でエバポレートし、無水ＭｅＯＨ（５ｍＬ）の溶液としてのその残留物を、メタノール（１ｍＬ，５．４ｍｍｏｌ）中のナトリウムメトキシドの５．４Ｍ溶液で処理した。１時間にわたって室温において撹拌した後、その溶液を、Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ８（Ｈ＋形態）を通して濾過し、凍結乾燥に供した。その残留物の淡黄色固体を、Ｅｔ２Ｏで洗浄して（３×２０ｍＬ）、ホスホネート１ｂを白色固体として得た。
【０２１７】
実施例９：（５−アセトアミド−４−アミノ−６−（１，２，３−ヒドロキシ）プロピル−４，５，６−トリヒドロピラン−２−イル）ホスホン酸モノエチルエステル（１ｃ）
【０２１８】
【化３７】
2013528160.tif 000108
【０２１９】
アルゴン雰囲気下で、ＰＭｅ３（１．４ｍＬ，ＴＨＦ中１．４Ｍ）の溶液を、０℃において無水ＴＨＦ（５ｍＬ）中のアジド７（１４８ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。その混合物を、室温において１９時間にわたって撹拌した。Ｅｔ３Ｎ（０．５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（０．５ｍＬ）を添加し、その混合物をさらに３０分間にわたって撹拌した。その混合物を減圧下で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２，６：９４〜１０：９０）によって精製して、アミン生成物を得た（１１２ｍｇ，７９％収率）。
【０２２０】
上記アミン生成物（１１０ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（２ｍＬ）に溶解し、ＮａＯＥｔ（４９０μｌ，ＥｔＯＨ中２．６８Ｍ）の溶液を滴下して加えた。その混合物を、２日間にわたって撹拌し、ＴＬＣによってモニターした。Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ樹脂によって中和した後、その濾液を減圧下で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ，７：３）に供した。適切な画分を集め、減圧下で濃縮した。その残留物を、１Ｍ  ＨＣｌ（２ｍＬ）で処理し、次いで、真空中で濃縮して、ホスホネートモノエステル１ｃを得た（５０ｍｇ，６０％収率）。
【０２２１】
【化３８】
2013528160.tif 000109
【０２２２】
実施例１０：（５−アセトアミド−４−グアニジノ−６−（１，２，３−ヒドロキシ）プロピル−４，５，６−トリヒドロピラン−２−イル）ホスホン酸モノエチルエステル（１ｄ）
【０２２３】
【化３９】
2013528160.tif 000110
【０２２４】
化合物８（５２ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、ＮａＯＥｔの溶液（２０９μｌ，ＥｔＯＨ中２．６８Ｍ）を滴下して加えた。その混合物を、４日間にわたって撹拌し、ＴＬＣによってモニターした。Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ樹脂によって中和した後、その濾液を減圧下で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ，８：２）に供した。適切な画分を集め、減圧下で濃縮した。その残留物を、１Ｍ  ＨＣｌ（２ｍＬ）で処理し、次いで、真空中で濃縮して、ホスホネートモノエステル１ｄを得た（９ｍｇ，３０％収率）。Ｃ１３Ｈ２５Ｎ４Ｏ８Ｐ；
【０２２５】
【化４０】
2013528160.tif 000111
【０２２６】
実施例１１：ザナミビル  ビオチン結合体の合成
図３は、ザナミビル−ビオチン結合体９の合成を示す。アジドが付加されたビオチン誘導体１１を、トリエチルアミンおよびベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）の存在下で、ビオチン（１０）と５−アジド−１−ペンチルアミンとの縮合によって調製した（Ｊ．  Ｗ．  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｉ．  Ｊｕｎ，  Ｋ．  Ｋｉｍ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４２，  ２７０９  （２００１））。他方で、ザナミビルｐ−ニトロフェニルカーボネート１２（公知の手順に従ってシアル酸から調製した（Ｍ．  Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｈ，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  １：  １１７３  （１９９５）；  Ｌ．  Ｙｉｎｇ，  Ｊ．  Ｇｅｒｖａｙ  −Ｈａｇｕｅ，  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ６，  １８５７  （２００５））を、プロパルギルアミノとカップリングして、アルキニルヒンジが付いたザナミビル誘導体１３を得た（Ｗ．−Ｈ．  Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ５２，  ４９０３  （２００９））。その後の、アジドが付加されたビオチン誘導体１１と、アルキニルザナミビル誘導体１３との間の１，３−双極付加（クリック反応；Ｖ．  Ｖ．  Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ４１，  ２５９６  （２００２）；  Ｂ．−Ｙ．  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ４７，  ５１０５  （２００６））を、ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ（１：１）の混合溶媒中で行って、所望のザナミビル−ビオチン結合体９を、保護基を除去した後に、８８％の全体収率で得た。
【０２２７】
実施例１２：ビオチン誘導体１１
【０２２８】
【化４１】
2013528160.tif 000112
【０２２９】
ＰＰｈ３（５．０ｇ，１９．１ｍｍｏｌ）および、１，５−ジブロモペンタンとＮａＮ３との置換反応から調製した１，５−ジアジドペンタン（３．３６ｇ，２１．８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＥｔＯＡｃ／Ｅｔ２Ｏ（ｖ／ｖ＝１：１，３５ｍＬ）中の５％水性ＨＣｌ（２２ｍＬ）とともに、室温において２４時間にわたって激しく撹拌して、５−アジド−１−ペンチルアミン１（ｐｅｎｔｙｌａｍｉｎｅｓ１）（１．６０ｇ，５９％）を得た（Ｊ．  Ｗ．  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｉ．  Ｊｕｎ，  Ｋ．  Ｋｉｍ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ４２，  ２７０９  （２００１）．）。
【０２３０】
ビオチン（１０，  １３６ｍｇ，０．５６ｍｍｏｌ）のサンプルを、ＤＭＦ溶液（５ｍＬ）中の５−アジド−１−ペンチルアミン（１１，  ８６ｍｇ，０．６９ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ，３６０ｍｇ，０．６９ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（０．１１６ｍＬ，０．８４ｍｏｌ）とともに室温において３時間にわたって撹拌した。その混合物を減圧下で濃縮し、Ｈ２Ｏで洗浄した。その残留物を、シリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝１５：１）によって精製して、アジドが付加されたビオチン誘導体１１を得た（１８０ｍｇ，９２％）。
【０２３１】
【化４２】
2013528160.tif 000113
【０２３２】
実施例１３：ザナミビル−ビオチン結合体９
【０２３３】
【化４３】
2013528160.tif 000114
【０２３４】
アジドが付加されたビオチン誘導体１１（１００ｍｇ，０．２８ｍｏｌ）の溶液、およびアルキニルヒンジが付いたザナミビル誘導体１３（１８８ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ（６ｍＬ，ｖ／ｖ＝１：１）中のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（２５ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）とともに、室温において８時間にわたって撹拌した。その水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。その有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、回転蒸発によって減圧下で濃縮した。その残留物を、カラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝２０：１〜１０：１）によって精製して、保護基を含むザナミビル−ビオチン結合体を得た（２７０ｍｇ，９５％）。
【０２３５】
【化４４】
2013528160.tif 000115
【０２３６】
上記保護されたザナミビル−ビオチン結合体（３４ｍｇ，０．０３３ｍｍｏｌ）のサンプルを、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）中の水性ＮａＯＨ（１Ｍ，１ｍＬ）で、室温において１５分間にわたって処理した。その混合物を、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗｘ８（Ｈ＋）で中和し、濾過し、減圧下で濃縮した。次いで、その残留物を、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，１ｍＬ）とともに、室温において１．５時間にわたって撹拌した。その混合物を減圧下でエバポレートし、Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）を室温において添加した。１０分間にわたって撹拌した後、その混合物を減圧下で濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラムでのクロマトグラフィー（溶離液：  Ｈ２Ｏ中の０．１％  ＴＦＡ）によって精製して、所望のザナミビル−ビオチン誘導体９（２４ｍｇ，９３％）を得た。
【０２３７】
【化４５】
2013528160.tif 000116
【０２３８】
実施例１４：化合物１４
【０２３９】
【化４６】
2013528160.tif 000117
【０２４０】
ピリジン（２ｍＬ）中のカーボネート１２（０．２５ｇ，０．３３ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ，６０ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、アミンＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３（０．１４ｇ，０．６６ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、４０時間にわたって室温において、Ｎ２雰囲気下で撹拌し、次いで、ＨＣｌ（１０ｍＬの１Ｍ水溶液）およびＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出した。その有機層を、ブライン（３０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）（３０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。その残留物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：１）によって精製して、カルバメート１４（０．２ｇ，７４％）を得た。
【０２４１】
【化４７】
2013528160.tif 000118
【０２４２】
実施例１５：ザナミビル−ＦＩＴＣ結合体１５
【０２４３】
【化４８】
2013528160.tif 000119
【０２４４】
ＥｔＯＨ（１ｍＬ）中のアジド１４（８０ｍｇ，０．０９６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ（ＯＨ）２（９ｍｇ，０．０５８ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、１．５時間にわたって室温において、Ｈ２雰囲気下で撹拌し、次いで、ＭｅＯＨでの溶出によってセライトのパッドを通して濾過した。その混合物を減圧下で濃縮して、アミン生成物（６６ｍｇ）を得た。
【０２４５】
【化４９】
2013528160.tif 000120
【０２４６】
Ｎ２雰囲気下で、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（ＦＩＴＣ，３７ｍｇ，０．０９５ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（１ｍＬ）中の上記で調製したアミン化合物の溶液に添加した。その混合物を、４時間にわたって室温において撹拌し、減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９２：８）によって精製して、コンジュゲート形成生成物を得た（５０ｍｇ，５２％）。
【０２４７】
【化５０】
2013528160.tif 000121
【０２４８】
ＭｅＯＨ（１．５ｍＬ）中の上記で調製したＦＩＴＣ結合体（４７ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）の溶液を、ＮａＯＨ（１ｍＬの１Ｍ水溶液）で処理した。その混合物を、１時間にわたって室温において撹拌し、Ｄｏｗｅｘ  ５０ｗｘ８（Ｈ＋）で中和し、濾過した。その濾液を濃縮し、その残留物を、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，１ｍＬ）で処理した。その混合物を１時間にわたって撹拌し、減圧下で濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラム（溶離液：  Ｈ２Ｏ中の０．１％  ＴＦＡ）でのクロマトグラフィーによって精製して、所望のザナミビル−ＦＩＴＣ結合体１５を得た（１０ｍｇ，５６％）。
【０２４９】
【化５１】
2013528160.tif 000122
【０２５０】
実施例１６：ザナミビル−ＦＩＴＣ結合体１７
【０２５１】
【化５２】
2013528160.tif 000123
【０２５２】
ｔ−ＢｕＯＨ（１ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１ｍＬ）中のアルキン１３（８７ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）および１０−アジドデカンアミン（３０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（４ｍｇ，０．０１６ｍｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（１８ｍｇ，０．０９１ｍｍｏｌ）およびトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ，８ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、１２時間にわたって室温において撹拌し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（３０ｍＬ）で抽出した。その有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９：１）によって精製して、化合物１６を得た（５３ｍｇ，５０％）。
【０２５３】
【化５３】
2013528160.tif 000124
【０２５４】
ＴＨＦ（１ｍＬ）およびＭｅＯＨ（２ｍＬ）中の上記で調製したアミン（０．１ｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＦＩＴＣ（４５ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．０３８ｍＬ）を添加した。その混合物を、室温において２０時間にわたって撹拌し、次いで、減圧下で濃縮して、コンジュゲート形成生成物を赤色固体として得た。ＭｅＯＨ（１ｍＬ）中の上記で調製したコンジュゲート形成化合物の溶液を、ＮａＯＨ（１ｍＬの１Ｍ水溶液）とともに、１時間にわたって室温において撹拌し、Ｄｏｗｅｘ  ５０ｗｘ８（Ｈ＋）によって中和し、濾過した。濃縮後、その残留物を、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）およびＴＦＡ（１ｍＬ）に溶解した。その混合物を、３０分間にわたって室温において撹拌し、減圧下で濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラム（溶離液：Ｈ２Ｏ中０．１％  ＴＦＡ）でのクロマトグラフィーによって精製して、所望のザナミビル−ＦＩＴＣ結合体１７を得た（５０ｍｇ，４３％）。
【０２５５】
【化５４】
2013528160.tif 000125
【０２５６】
実施例１７：タミホスホルビオチン結合体の合成
図４は、タミホスホルビオチン結合体２４の合成を示す。ヨウ化化合物１８を、以前に報告された手順に従って調製した。［Ｓｈｉｅ，  Ｊ．−Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２００８，  ４７，  ５７８８．］。ジ［４−（トリメチルシリル）ブタ−３−イン−１−イル］ジアルキルホスファイト１７を、ＰＣｌ３の、２当量の４−（トリメチルシリル）ブタ−３−イン−１−オールによる置換反応によって調製した。１８の、ホスファイト１９でのホスホニル化（ｐｈｏｓｐｈｏｎｙｌａｔｉｏｎ）を、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４の触媒によって達成して、ホスホネート２０を６４％の収率で得た。Ｂｏｃ基を除去した後に、アミン中間体を、Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｂｏｃ−Ｎ”−トリフルオロメタンスルホニル−グアニジンで処理し、続いて、トリメチルシリル基をＫＦで除去して、化合物２１を得た。２１と５−アジドペンタンアミンとのクリック反応、続いて、ＫＯＨでの処理から、ホスホネートモノエステル２２を得た。２０と、ビオチン−ＯＳｕ（２３）とのカップリング反応から、保護Ｂｏｃ基の除去の後に、ついに所望のタミホスホルビオチン結合体２４になった。
【０２５７】
実施例１８：化合物２０
【０２５８】
【化５５】
2013528160.tif 000126
【０２５９】
無水トルエン（２．１ｍＬ）中のヨウ素１８（１００ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）、ホスファイト１９（８５ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１００ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素を１０分間にわたって通気することによって脱酸素し、次いで、窒素雰囲気下で丸底フラスコに入れたテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１０ｍｇ，８．６μｍｏｌ）に添加した。得られた溶液を、９０℃へと徐々に加熱し、この温度において１２時間にわたって維持した。その反応混合物を、セライトのパッドを通して濾過し、その濾液を減圧下でエバポレートして、黄色発泡物を得た（１１０ｍｇ）。これを、シリカゲルカラムでのフラッシュクロマトグラフィー［ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：１〜ＥｔＯＡｃ］によって精製して、ホスホネート２０を得た（９２ｍｇ，６４％）。
Ｃ３２Ｈ５７Ｎ４Ｏ９Ｐ；黄色油状物；  ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，１：１）  Ｒｆ＝０．２９；
【０２６０】
【化５６】
2013528160.tif 000127
【０２６１】
実施例１９：化合物２１
【０２６２】
【化５７】
2013528160.tif 000128
【０２６３】
無水ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のホスホネート２０（９２ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）の溶液を、アイスバス中で０℃へと冷却し、トリフルオロ酢酸（０．１６ｍＬ，２．１ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、１時間にわたって室温において撹拌し、減圧下で濃縮し、次いで、無水ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）に溶解した。Ｎ−Ｎ’−ジ−Ｂｏｃ−Ｎ”−トリフルオロメタンスルホニルグアニジン（６７ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．０６ｍＬ，０．４１ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、室温において３時間にわたって撹拌し、１Ｍ  ＨＣｌ（５ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ×３）で抽出した。その有機層を、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮し、シリカゲルカラムでのフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：１）によって精製して、グアニジン誘導体を得た。
【０２６４】
ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１．２ｍＬ／１．２ｍＬ，ｖ／ｖ）中のそのグアニジン化合物の溶液に、ＫＦ（７１ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、室温において２４時間にわたって撹拌し、次いで。減圧下で濃縮した。その混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ×３）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）で抽出した。その有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮し、シリカゲルカラムでのフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：１）によって精製して、化合物２１を得た（６３ｍｇ，６９％）。Ｃ３２Ｈ５１Ｎ４Ｏ９Ｐ；無色の油状物；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，１：１）  Ｒｆ＝０．２４；
【０２６５】
【化５８】
2013528160.tif 000129
【０２６６】
実施例２０：タミホスホルビオチン結合体２４
【０２６７】
【化５９】
2013528160.tif 000130
【０２６８】
ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（０．６ｍＬ，ｖ／ｖ＝１：１）中の５−アジド−１−ペンタンアミンアジド（４６ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）および化合物１９（１２０ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラキス（アセトニトリル）銅（Ｉ）リンヘキサフルオリドを添加した。その混合物を、室温において１２時間にわたって撹拌し、減圧によって濃縮し、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：９〜９：１）の溶出を用いたＲＰ−１８逆相カラムによって精製した。トリアゾール化合物の粗製生成物を、１，４−ジオキサン（１．０ｍＬ）に溶解し、１Ｍ  ＫＯＨ（水溶液）（１．０ｍＬ）を添加した。その溶液を、２５℃において１２０時間にわたって撹拌し（１Ｈ  ＮＭＲによってモニター）、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗｘ８を添加して、上記溶液を中和した。その混合物を濾過し、減圧下で濃縮した。その粗製生成物（１０ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（０．１ｍＬ）に溶解し、ビオチン−ＯＳｕ（４．５ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（４．２ｍｇ，０．０２６ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、室温において３時間にわたって撹拌し、減圧下で濃縮した。その残留物を、ＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）に溶解し、アイスバス中で０℃へと冷却し、トリフルオロ酢酸（０．１６ｍＬ，２．１ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、１時間にわたって室温において撹拌し、減圧下で濃縮し、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：９〜９：１）の溶出を用いたＲＰ−１８逆相カラムで精製して、標題化合物を得た（４０ｍｇ，３０％  全体収率）。Ｃ３３Ｈ５７Ｎ１０Ｏ７ＰＳ；黄色固体；
【０２６９】
【化６０】
2013528160.tif 000131
【０２７０】
実施例２１：化合物２５
【０２７１】
【化６１】
2013528160.tif 000132
【０２７２】
無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中のジ（５−アジドペンチル）アミン（０．１２ｇ，０．４９ｍｍｏｌ）の溶液に、ビオチン（０．１２ｇ，０．４１ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（０．２５ｇ，０．４９ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（０．２３ｍＬ，１．６４ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、２２時間にわたって室温において、アルゴン下で撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。その残留物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝１３：１）によって精製して、ビオチン−ジアジド化合物２５を得た（０．１５ｇ，７９％）。Ｃ２０Ｈ３５Ｎ９Ｏ２Ｓ；淡黄色油状物；
【０２７３】
【化６２】
2013528160.tif 000133
【０２７４】
実施例２２：ジザナミビル−ビオチン結合体２６
【０２７５】
【化６３】
2013528160.tif 000134
【０２７６】
ｔ−ＢｕＯＨ（１ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１ｍＬ）中のビオチン−ジアジド２５（３６ｍｇ，０．０７５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（４ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（１０ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）、およびＴＢＴＡ（８ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、５分間にわたって撹拌し、上記アルキニルヒンジが付いたザナミビル誘導体１３（０．１ｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、１２時間にわたって室温において撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。その残留物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９．５：１）によって試製して、カップリング生成物を得た（６４ｍｇ，４７％）。
【０２７７】
【化６４】
2013528160.tif 000135
【０２７８】
ＭｅＯＨ（１ｍＬ）中の上記で調製したカップリング生成物（６０ｍｇ，０．０３３ｍｍｏｌ）を、ＮａＯＨ（１ｍＬの１Ｍ水溶液）とともに、１時間にわたって室温において撹拌し、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗｘ８（Ｈ＋）で中和し、濾過した。濃縮後、その残留物を、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）およびＴＦＡ（１ｍＬ）に溶解した。その混合物を、１時間にわたって室温において撹拌し、減圧下で濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラム（溶離液：Ｈ２Ｏ中の０．１％  ＴＦＡ）でのクロマトグラフィーによって精製して、ジザナミビル−ビオチン結合体２６を得た（５０ｍｇ，４３％）。
【０２７９】
【化６５】
2013528160.tif 000136
【０２８０】
実施例２３：細胞、ウイルス、および生物学的試薬
ＭＤＣＫ細胞および２９３Ｔ細胞の両方、ならびに２種のインフルエンザウイルス：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／Ｌｅｅ／４０を、それぞれ、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ，  ＵＳＡ）から得た。インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｕｄｏｒｎ／３０７／１９７２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｔａｉｗａｎ／３４４６／２００２（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＢ／Ｔａｉｗａｎ／７０６４／２００４分離株を、Ｓｈｉｎ−Ｒｕ  Ｓｈｉｈ博士の研究室（Ｃｈａｎｇ  Ｇｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｔａｉｗａｎ）からのものであり、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４  ＲＧ１４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）を、Ｊｉａ−Ｔｓｒｏｎｇ  Ｊａｎ博士の研究室（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ，  Ｔａｉｗａｎ）から得たものであった。上記オセルタミビル耐性ＷＳＮ変異体を、ＯＣ（オセルタミビルカルボキシレート）の濃度を徐々に上げて、ＭＤＣＫ細胞で６継代することによって選択した。この変異インフルエンザは、１μΜ  ＯＣの存在下で十分に増殖し、そのＮＡ遺伝子において単一のＨ２７４Ｙ変異（配列分析によって確認される）を有する。台湾の他の臨床Ｈ１Ｎ１分離株を、疾病管理センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）（Ｔａｉｐｅｉ，  Ｔａｉｗａｎ）のインフルエンザ収集センターから得た。これらは、表１に記載される。７種のＳ−ＯＩＶ分離株をまた、疾病管理センター（Ｔａｉｐｅｉ，  Ｔａｉｗａｎ）から得、＃１（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／Ｔ１９４１／２００９）、＃２（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／Ｔ１３３８／２００９）、＃３（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／Ｔ１３３９／２００９）、＃４（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／６６６２／２００９）、＃５（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／６６６３／２００９）、＃６（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／７７１７／２００９）、および＃７（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／７８５５／２００９）として符号化した。インフルエンザＮＰに対する抗体およびフルオレセイン標識２次抗体を、それぞれ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）およびＳｉｇｍａ  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）から購入した。抗ＷＳＮウサギ抗体を、不活性化ＷＳＮインフルエンザを抗原として使用して、本研究室において調製した。抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を、Ｉｎｔｅｒｌａｂ  Ｌｔｄ．（Ｔａｉｐｅｉ，  Ｔａｉｗａｎ）から購入した。
【０２８１】
実施例２４：ノイラミニダーゼ発現細胞を使用するＯＣ感受性アッセイの開発
ザナミビルおよびＺＢのノイラミニダーゼ阻害活性を比較したところ、ＺＢが、ＩＣ５０  ７ｎＭを有して、ノイラミニダーゼに関してなお非常に強力なインヒビターであるが、ＩＣ５０  ２ｎＭを有するザナミビルより僅かに活性が低いことがわかった。細胞表面で発現する機能的ノイラミニダーゼは、ＯＣ感受性評価のためのＺＢ結合およびＯＣ競合のためのモデルシステムとして有用であり得た。Ａ／Ｈａｎｏｉ／３０４０８／２００５（Ｈ５Ｎ１）のノイラミニダーゼについてのｃＤＮＡを、発現プラスミドにクローニングし、これを使用して、野生型（２７４Ｈ）ノイラミニダーゼの発現のために２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。発現したノイラミニダーゼは、主に細胞表面に位置することが見出され、ＺＢを使用する結合および標識が可能であった（図１０）。上記ノイラミニダーゼ  ｃＤＮＡを、ＯＣ耐性２７４Ｙ変異酵素の発現のために変異誘発した。野生型および変異誘発したｃＤＮＡの両方を使用して、それぞれ、２７４Ｈノイラミニダーゼおよび２７４Ｙノイラミニダーゼの発現についての安定な２９３Ｔ細胞系を生成した。異なる比でのこれら２つの細胞の混合物を、ＺＢもしくはＺＢ＋過剰なＯＣとともにインキュベートし、次いで、ＡＰＣ結合体化ストレプトアビジンで修飾して、フローサイトメトリー分析によって、ＺＢを結合する細胞の集団を決定した。図１１は、ＺＢが２７４Ｈ発現細胞および２７４Ｙ発現細胞を同様の程度に結合したことを示す。過剰のＯＣの存在下では、ＺＢ結合は、２７４Ｈノイラミニダーゼを発現する細胞において完全にブロックされたのに対して、２７４Ｙ発現細胞へのＺＢ結合は、実質的に変化しなかった（図１２）。これら結果から、ＺＢ結合は、ＯＣ競合によってＯＣ感受性ノイラミニダーゼおよびＯＣ耐性ノイラミニダーゼを区別するために使用され得るという原理が立証される。
【０２８２】
実施例２５：インフルエンザウイルス感染細胞を使用したＯＣ感受性の決定
ＮＡ発現細胞を使用する、ＺＢ結合に対する競合的ＯＣ阻害の結果から、本発明者らは、インフルエンザウイルスのＯＣ感受性を評価するためにＺＢおよびＯＣの濃度を定義することをすすめた。ＯＣ感受性もしくはＯＣ耐性のＷＳＮウイルスのいずれかに感染させたＭＤＣＫ細胞を使用して、種々のＺＢおよびＯＣ濃度を使用して、上記ＯＣ感受性評価の実行可能性を試験した。図１３Ａは、インフルエンザウイルス感染ＭＤＣＫ細胞へのＺＢ結合のＯＣ競合を示す。インフルエンザ感染細胞を、１０ｎＭもしくは５０ｎＭのＺＢのいずれかで標識することによって、感染しているウイルスのＯＣ感受性を、上記標識ＺＢの０．５〜１０倍濃度における、ＯＣとの競合結合から推定できた。例えば、ＯＣ感受性およびＯＣ耐性のＷＳＮバリアントの明らかな区別は、３０ｎＭにおける標識ＺＢおよび１５０ｎＭにおける競合ＯＣを使用して感染細胞を処理することによって観察した（図１３Ｂ）。
【０２８３】
ＭＤＣＫ細胞を、野生型（２７４Ｈ）ＷＳＮウイルスもしくはＯＣ耐性（２７４Ｙ）ＷＳＮウイルスのいずれかに感染させた。感染後１６〜２０時間において、上記感染細胞を、３０ｎＭ  ＺＢもしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭ  ＯＣのいずれかで処理した。得られた細胞を、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで修飾し、洗浄し、蛍光顕微鏡を使用して観察した。フローサイトメトリー研究のために、上記ＺＢ標識した細胞を、抗ＮＰ抗体を使用してさらに標識し、トリプシン処理し、次に、ＰＥ結合体化ストレプトアビジン＋ＤｙＬｉｇｈｔ−６４９標識抗ウサギ２次抗体（両方を、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ，  ＵＳＡ）から購入した）で処理した。さらなる洗浄後、上記細胞を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）のＦＡＣＳＣａｎｔｏによって分析した。より多くのサンプルの分析については、感染細胞を培養するために、黒色９６ウェル透明底マイクロプレートを使用するハイスループット法を開発した。感染後１６〜２０時間において、細胞を、３０ｎＭ  ＺＢもしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭ  ＯＣで標識し、洗浄し、ＰＥ−ストレプトアビジンで処理した。次いで、上記プレートを、４８８ｎｍにおいてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）のＩｓｏｃｙｔｅＴＭ  レーザー走査型プラットフォームでスキャンした。
【０２８４】
実施例２６：固定インフルエンザサンプルを使用するＯＣ耐性内容物の推定
図７Ｂを参照して記載されるように、上記ＲＡＢＣアッセイは、マイクロウェルにおいて固定されたウイルスを使用して、ＯＣ感受性決定のために適用可能である。固定されたウイルスを使用する上記ＲＡＢＣアッセイは、ＯＣ感受性ウイルスおよびＯＣ耐性ウイルスの両方からなる混合集団において、ＯＣ耐性変異体の含量を推定するためにも使用できた。総ウイルス含量が１０３、１０４、および１０５  ＰＦＵ／ウェルであって、２７４Ｈ  ＷＳＮウイルスおよび２７４Ｙ  ＷＳＮウイルスが種々の比にあるウイルスサンプルを固定して、ＯＣ耐性含量の推定として、ＯＣ耐性ＺＢ結合を測定した。図１４は、上記推定ＯＣ耐性含量が、１０％より大きい実験２７４Ｙウイルス含量と良好に一致したことを示す。１０％未満の耐性ウイルスを含む混合集団に関しては、上記耐性含量の過大評価が認められた。このことは、おそらく、高力価ウイルスサンプルを使用するアッセイにおいてより高い、バックグラウンド結合に起因する。
【０２８５】
高結合９６ウェルマイクロプレート６５５０６１（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製）を、１５０ｎｇ／ウェルにおいて抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）で一晩コーティングし、次いで、３％  ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッティングした。インフルエンザサンプルを、３０ｎＭ  ＺＢもしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭ  ＯＣで、３０分間にわたって処理し、抗体被覆ウェルに添加した。３０分間のインキュベーション後、上記マイクロウェルを、ＰＢＳ中の３％  ＢＳＡで洗浄し、アルカリホスファターゼ結合体化ストレプトアビジンを３０分間にわたって添加し、再びＰＢＳ中のＢＳＡで洗浄し、次いで、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）の指示に従って、発光基質Ｅｍｅｒａｌｄ−ＩＩＴＭを添加した。上記ＲＬＵ（相対発光単位）を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）のＥｎｖｉｓｉｏｎを使用して読み取った。パーセント相対耐性を、ＯＣ競合の非存在下で測定されたＺＢ結合についての総ＲＬＵで除算された、ＯＣの存在下で測定されたＺＢ結合についての決定されたＲＬＵの％として計算した。
【０２８６】
実施例２７：インフルエンザノイラミニダーゼ配列の決定
総ＲＮＡを、Ｔａｉｐｅｉ  Ｐｈａｒｍａ（Ｔａｉｐｅｉ，  Ｔａｉｗａｎ）において購入したＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製のＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡキットを使用して、インフルエンザウイルスから抽出した。上記ＲＮＡサンプルを、ランダムヘキサマーおよび２００ｎＭにおいて２種のプライマー：５’−
【０２８７】
【数１】
2013528160.tif 000137
【０２８８】
を使用して、ＰＣＲによって増幅されるｃＤＮＡ合成のために、Ｔｏｙｏｂｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）のＭＭＬＶ  ＲＴａｓｅを使用して逆転写した。そのＤＮＡ生成物を精製し、そのＮＡ配列を決定するために使用した。
【０２８９】
実施例２８：膜上でのインフルエンザウイルスのＯＣ感受性の迅速検出
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）のＢｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦ上に載せたＰＶＤＦ膜を、メタノールで濡らし、吸引によって１スロットあたり１μｇの抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）を添加した。３０ｎＭ  ＺＢもしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭ  ＯＣのいずれかで１時間にわたって予め処理したインフルエンザウイルスサンプルを、吸引によって隣接するスロットに導入した。上記膜を、３％  ＢＳＡを含むＰＢＳを使用してブロッティングし、次いで、製造業者の指示に従って、ＫＰＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）製のアルカリホスファターゼ結合体化ストレプトアビジンとともにインキュベートした。３％  ＢＳＡを含むＰＢＳを使用してさらに洗浄した後、アルカリホスファターゼ基質である、Ａｍｒｅｓｃｏ  Ｉｎｃ．（Ｓｏｌｏｎ，  ＯＨ，  ＵＳＡ）のＡｍｒｅｓｃｏ  Ｅ１１６溶液を、発色させるために添加した。目に見える色は、通常は、２分間で発色し、写真法で記録した。
【０２９０】
実施例２９：組換え野生型（２７４Ｈ）およびＯＣ耐性（２７４Ｙ）ノイラミニダーゼを安定に発現する２９３Ｔ細胞の調製
インフルエンザＡ／Ｈａｎｏｉ／３０４０８／２００５（Ｈ５Ｎ１）（ＧｅｎｅＢａｎｋ：  ＡＢ２３９１２６．１）から推定した上記ノイラミニダーゼ遺伝子のｃＤＮＡ配列を使用して、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）によるこの遺伝子の合成バージョンを調製し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）のｐＣＤＮＡ３．１のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位に、ｐＣＤＮＡ３．１−ＮＡとしてクローニングした。上記ＮＡ遺伝子を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）製のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用して改変して、１対のプライマー：
【０２９１】
【数２】
2013528160.tif 000138
【０２９２】
を使用して、Ｈ２７４ＹのＯＣ耐性ＮＡ変異型を生成した。野生型（２７４Ｈ）ＮＡ遺伝子およびＯＣ耐性変異（２７４Ｙ）ＮＡ遺伝子をともに、配列分析によって確認した。これらのＮＡ遺伝子を、野生型ノイラミニダーゼおよびＯＣ耐性ノイラミニダーゼについて一過性のＮＡ発現のために使用した。それらをまた、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）のｐＲｅｔｒｏ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターに、それぞれｐＲｅｔｒｏ−ＮＡ（２７４Ｈ）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰおよびｐＲｅｔｒｏ−ＮＡ（２７４Ｙ）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰとしてクローニングした。これら２つのプラスミドおよびｐＧａｇＰｏｌを使用して作製した組換えレトロウイルスと、ｐＶＳＶＧとを使用して、２９３Ｔ細胞を形質導入した。安定な細胞系を、９５％を超えるＧＦＰを発現する集団について蛍光活性化セルソーターによって選択し、ＯＣ感受性ノイラミニダーゼまたはＯＣ耐性ノイラミニダーゼの合成について確認した。
【０２９３】
本明細書において引用されるすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物もしくは特許出願が、参考として援用されるのが具体的にかつ個々に示されるかのように、本明細書に参考として援用される。
【０２９４】
上記の発明は、理解を明瞭にする目的で、図示および例示によって幾分詳細に記載されてきたが、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の趣旨もしくは範囲から逸脱することなく、本発明に対してなされ得ることは、本発明の教示に鑑みれば、当業者には容易に明らかである。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2013528160.tif 000139
【図３】
2013528160.tif 000140
【図４】
2013528160.tif 000141
【図６】
2013528160.tif 000142
【図８】
2013528160.tif 000143
【図１４】
2013528160.tif 000144
【図２】
2013528160.tif 000145
【図５】
2013528160.tif 000146
【図７】
2013528160.tif 000147
【図９】
2013528160.tif 000148
【図１０】
2013528160.tif 000149
【図１１】
2013528160.tif 000150
【図１２】
2013528160.tif 000151
【図１３】
2013528160.tif 000152
【国際調査報告】
2013528160.tif 000153
2013528160.tif 000154
2013528160.tif 000155
2013528160.tif 000156
2013528160.tif 000157