(57)【要約】本発明は、皮膚活性物質探索用キット及びこれを利用して皮膚活性物質を探索する方法に関し、より詳しくは、長寿遺伝子として知られているＫｌｏｔｈｏ遺伝子を含む探索キットを利用して皮膚細胞でＫｌｏｔｈｏ遺伝子発現を誘導する候補物質を分離、精製することにより、保湿物質、抗老化物質及び美白物質などの皮膚活性物質を探索し出す皮膚活性物質探索用キット及びこれを利用して皮膚活性物質を探索する方法に関する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｋｌｏｔｈｏタンパク質遺伝子、配列番号１，２のＫｌｏｔｈｏタンパク質遺伝子増幅用プライマー、配列番号３のプローブ及び皮膚細胞から構成され、
前記皮膚細胞でＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現量を増加させる物質をスクリーニングすることにより、皮膚活性物質を探索する探索キット。
【請求項２】
前記皮膚活性物質は、保湿物質、抗老化物質又は美白物質であることを特徴とする請求項１に記載の探索キット。
【請求項３】
前記皮膚細胞は、ヒト角質形成細胞、線維芽細胞又はメラニン形成細胞であることを特徴とする請求項１に記載の探索キット。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載の探索キットを利用して、
皮膚細胞に候補物質を処理した後、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の発現有無を確認するステップと、
Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の発現を増加させる物質を分離及び精製するステップと、
を経て皮膚活性物質を探索する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚活性物質探索用キット及びこれを利用して皮膚活性物質を探索する方法に関し、より詳しくは、長寿遺伝子として知られているＫｌｏｔｈｏ遺伝子を含む探索キットを利用して皮膚細胞でＫｌｏｔｈｏ遺伝子発現を誘導する候補物質を分離、精製することにより、抗老化物質及び美白物質などの皮膚活性物質を探索し出す皮膚活性物質探索用キット及びこれを利用して皮膚活性物質を探索する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、年を取るか又は太陽光に露出することで老化が進行される。老化が進行されるにつれて、表皮の角質層が落ちて入れ替えるのにより多くの時間がかかって角質層が厚くなり、真皮は、弾力纎維と保湿成分の含量が下がるか又は配列が変わるようになり、弾力と水分含有量が落ちてシワができるようになる。今まで皮膚老化の原因の一つである光老化を防ぐために、紫外線の照射による皮膚の変化を予防することができる方法が活発に研究されてきた。また、加齢に伴う老化、すなわち、遺伝的に調節されている老化を防ぐための方法も研究されてきており、このような努力は、結局、老化を総括的に調節する機序を探ることに集中している。
【０００３】
Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子に対する研究は、そういう努力の一つである。Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子がノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）されたマウスは、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3濃度上昇に関連する動脈硬化、血管石灰化、軟組織石灰化、肺気腫、活動低下、生殖腺形成異常、不妊、皮膚萎縮、運動失調証、低血糖証、及び高リン血症を示す（Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅＫｌｏｔｈｏｇｅｎｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ  ａｇｅｉｎｇ。Ｎａｔｕｒｅ  １９９７；  ３９０、４５−５１）。逆に、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の発現が増加されれば、寿命増加、インスリン抵抗性増加、及びＩＧＦ−１抵抗性増加などが現れる（Ｋｕｒｏｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ヒトにもＫｌｏｔｈｏタンパク質の単一塩基多形成は、寿命短縮、骨粗しょう症、脳卒中、及び冠状動脈疾患に関連することが報告されている（Ａｒｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｋａｗａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；  Ｍｕｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｏｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；  Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０００４】
既存の研究によれば、Ｋｌｏｔｈｏは、ヒトの腎臓で主に発現されて胎盤、前立腺及び小腸でも発現されるといわれている。しかし、Ｋｌｏｔｈｏに対する重要性が増大されている状況において、現在まで皮膚細胞、すなわち角質形成細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、またはメラニン形成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）でＫｌｏｔｈｏが発現されるという報告は未だなかった。したがって、Ｋｌｏｔｈｏ発現を増加させることができる物質に対する研究もなされていない状況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これにより、本発明者は、皮膚細胞でＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現を増加させることができるキットを製作し、これを利用して角質形成細胞、線維芽細胞及びメラニン形成細胞などの皮膚細胞でＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現を確認することにより、抗老化物質及び美白物質などの皮膚活性物質を探索することができることを見つけて、本発明を完成するに至った。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、皮膚細胞でＫｌｏｔｈｏ遺伝子発現の有無により、皮膚活性物質をスクリーニングするための探索キット及びこれを利用して皮膚活性物質を探索する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記した目的を達成するために、本発明では、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質遺伝子、配列番号１，２のＫｌｏｔｈｏタンパク質遺伝子増幅用プライマー、配列番号３のプローブ及び皮膚細胞から構成され、前記皮膚細胞でＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現量を増加させる物質をスクリーニングすることにより、皮膚活性物質を探索する探索キットを提供する。
【０００８】
また、本発明では、前記探索キットを利用して皮膚活性物質を探索する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明による皮膚活性物質探索キットは、皮膚細胞でＫｌｏｔｈｏ遺伝子の発現有無により、抗老化物質、美白物質、及び保湿物質のような皮膚活性物質を迅速で且つ簡便にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１ａ】ヒト胚芽腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、角質形成細胞（ＮＨＫ）及び線維芽細胞（ＮＨＦ）でＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現を確認したＲＴ−ＰＣＲ増幅結果を示す図面である。
【図１ｂ】ヒトのメラニン形成細胞でＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現を確認したＲＴ−ＰＣＲ増幅結果を示す図面である。このとき、ＮＨＭ−ｐｒｏｍｏｂｌａｃｋ及びＮＨＭ−ＤＰは、黒人由来のメラニン形成細胞であり、ＮＨＭ−ＭＰは、東洋人由来のメラニン形成細胞である。
【図２】ヒト胚芽腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、角質形成細胞（ＮＨＫ）及び線維芽細胞（ＮＨＦ）でＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現量を確認したｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ結果を示すグラフである。
【図３】角質形成細胞にレチノイン酸（ＲＡ：ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）及びレチノール（ＲＯＬ：ｒｅｔｉｎｏｌ）を処理した後、２日目及び８日目にＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現量を確認したｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ結果を示すグラフである。
【図４】Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子をノックダウンさせたヒト新生児の上皮角質形成細胞（ＨＥＫ）でＫｌｏｔｈｏ遺伝子発現量の減少を示すグラフである。
【図５】Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子をノックダウンさせたヒト新生児の上皮角質形成細胞（ＨＥＫ）でＭＭＰ−９の発現量の変化を確認した結果を示すグラフである。
【図６】ヒト新生児の上皮角質形成細胞（ＨＥＫ）に再組合Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を処理して、ＭＭＰ−９活性の変化を確認した結果である。
【図７】ヒト新生児の角質形成細胞（ＨＥＫ）に再組合Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を１μg／ｍｌ、０．５μg／ｍｌ処理して、２日目、８日後のＨＡＳ２  ｍＲＮＡ発現量の変化を確認した結果を示すグラフである。
【図８】Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子をノックダウンさせたヒト新生児の真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）でｐ２１の発現量の変化を確認した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、皮膚細胞でＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現量を探索することができる方法に関し、これを通じて皮膚細胞で長寿遺伝子であるＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現を誘導することができる物質をスクリーニングすることにより、皮膚活性物質を探索することができる。前記皮膚活性物質は、皮膚シワや弾力を改善させるか又は荒れた皮膚を改善させる抗老化物質、皮膚の色を明るくするか、しみ、そばかす、皮膚のくすみ及び太陽光線による皮膚の日焼けなどの皮膚色素沈着の現象を改善させる美白物質並びに保湿物質を含んでもよい。
【００１２】
皮膚細胞でＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現量を探索することができる本発明の探索キットは、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質遺伝子、配列番号１，２のＫｌｏｔｈｏタンパク質増幅用プライマー、配列番号３のプローブ（表１を参照）及び皮膚細胞から構成され、前記皮膚細胞でＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現量を増加させる物質をスクリーニングすることにより、抗老化物質を探索することができる。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
本発明の一実施例で前記皮膚細胞は、ヒト角質形成細胞（ＮＨＫ：ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）、線維芽細胞（ＮＨＦ：ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、またはメラニン形成細胞（ＮＨＭ：ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００１５】
また、本発明は、前記探索キットを利用して、皮膚細胞に候補物質を処理した後、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の発現有無を確認するステップと、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の発現を増加させる物質を分離及び精製するステップとを経て、皮膚活性物質を探索する方法に関する。
【００１６】
本発明の一実施例では、前記探索キットを利用して抗老化物質として知られているレチノイン酸とレチノールがＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現を増加させることを確認し、本発明による探索方法が、未だ知られていない抗老化物質及び皮膚活性物質のスクリーニングに適したものであることを確認した。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明の内容を実施例及び試験例を通じてさらに具体的に説明する。これらの実施例は、本発明の内容を理解するために提示されたものに過ぎず、本発明の権利範囲がこれらの実施例及び試験例に限定されるものではなく、当業界で通常的に周知された変形、置き換え及び挿入などを遂行することができ、これに関するものも本発明の範囲に含まれる。
【００１８】
［試験例１］皮膚細胞でＫｌｏｔｈｏの発現有無
皮膚細胞でＫｌｏｔｈｏタンパク質が発現されるか否かを調べるために、Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＭ＿００４７９５）を増幅させることができる配列番号１，２プライマーを製作した後、前記プライマー対と配列番号３のプローブ（ＴａｑＭａｎTM  ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｂｅ）を利用して角質形成細胞（ＮＨＫ）、線維芽細胞（ＮＨＦ）、ＮＨＭ−ｐｒｏｍｏｂｌａｃｋ｛Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ（ＮＨＥＭ）ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｆｏｒｅｓｋｉｎ、黒人由来のメラニン形成細胞、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ｝、ＮＨＭ−ＤＰ（ＮＨＭ−ｄａｒｋ  ｐｉｇｍｅｎｔ；  黒人由来のメラニン形成細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＮＨＭ−ＭＰ（ＮＨＭ−ｍｏｄｅｒａｔｅ  ｐｉｇｍｅｎｔ；  東洋人由来のメラニン形成細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のｃＤＮＡでＫｌｏｔｈｏ  ｍＲＮＡを検出することができるか否かをＲＴ−ＰＣＲで観察した。このとき、ＰＣＲ反応条件は、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、及び７２℃で６０秒間拡張するサイクルを３５回繰り返して遂行した。陽性対照群として既存にＫｌｏｔｈｏ遺伝子が発現されると知られているヒト胚芽腎臓細胞であるＨＥＫ２９３（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞のｃＤＮＡを利用して、その結果を図１ａ及び図１ｂに示した。図１ａ及び図１ｂの結果において、本発明で使用した角質形成細胞、線維芽細胞及びメラニン形成細胞でＫｌｏｔｈｏ遺伝子が発現されることを確認した。
【００１９】
また、Ｋｌｏｔｈｏ  ｍＲＮＡが各細胞で発現された量をｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲで確認した結果を図２に示した。
【００２０】
［試験例２］レチノイン酸（ＲＡ）及びレチノール（ＲＯＬ）が処理された角質形成細胞でＫｌｏｔｈｏ  ｍＲＮＡの発現量の調査
抗老化物質としてよく知られているレチノイン酸とレチノールが角質形成細胞でＫｌｏｔｈｏの発現に及ぼす影響を調べるために、前記試験例１と同一条件でｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲを遂行し、前記レチノイン酸０．１μＭ及び１μＭと、レチノール１μＭ及び１０μＭとをそれぞれ処理した後、２日目及び８日目にＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現量を調査し、その結果を図３に示した。
【００２１】
図３の結果において、レチノイン酸とレチノールを処理した８日目にＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現量が格段に増加することを確認した。
【００２２】
［試験例３］ヒト新生児の上皮角質形成細胞（ＨＥＫ）でＫｌｏｔｈｏ遺伝子ノックダウン（ｋｎｏｃｋ  ｄｏｗｎ）
ヒト新生児の上皮角質形成細胞（ＨＥＫ；  Ｌｏｎｚａ社、ＮＨＥＫ−Ｎｅｏ−Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ、Ｐｏｏｌｅｄ）を６−ｗｅｌｌに培地（ＫＢＭ−ｇｏｌｄ、Ｌｏｎｚａ社）に１×１０5ずつ分注して、３７℃で２４時間の間に培養して培地を捨て、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）に交換した後、Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子に相補的配列を有するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社、ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ）１００ｎＭと、トランスフェクション試薬（ＲＮＡｉＭＡＸ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μｌとを混合して、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）で２０分間３７℃で培養したことを添加し、３７℃で６時間培養し、ＤＭＥＭ培地で３７℃に４日間維持させた。対照群としては、何もターゲッティングしないｓｉＲＮＡを処理したＨＥＫ細胞（図４のｓｃ）と、ｓｉＲＮＡを入れずにトランスフェクション試薬（ＲＮＡｉＭＡＸ）のみを処理したＨＥＫ細胞（図４のＶＣ）とを使用した。
【００２３】
Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子ノックダウンの有無を確認するために、前記試験例１と同一条件でｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲを遂行した結果を図４に示した。
【００２４】
図４の結果において、ｓｉＲＮＡとトランスフェクション試薬を添加した場合に、Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子発現が顕著に減少することを確認することができる。
【００２５】
［試験例４］Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子をノックダウン（ｋｎｏｃｋ  ｄｏｗｎ）させたヒト新生児の上皮角質形成細胞（ＨＥＫ）でＭＭＰ−９の発現量増加
コラーゲンを分解して老化を起こす因子として知られているＭＭＰ−９にＫｌｏｔｈｏタンパク質が及ぼす影響を調べるために、Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子をノックダウンさせたヒト新生児の上皮角質形成細胞（Ｈｕｍａｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＨＥＫ）でＭＭＰ−９の発現量の変化をＲＴ−ＰＣＲで観察した。
【００２６】
ヒト新生児の上皮角質形成細胞（ＨＥＫ；  Ｌｏｎｚａ社のＮＨＥＫ−Ｎｅｏ−Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ、Ｐｏｏｌｅｄ）を６−ｗｅｌｌに培地（ＫＢＭ−ｇｏｌｄ、Ｌｏｎｚａ社）に１×１０5ずつ分注して、３７℃で２４時間の間に培養して培地を捨て、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）に交換した後、Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子に相補的配列を有するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社、ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ）１００ｎＭと、トランスフェクション試薬（ＲＮＡｉＭＡＸ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μｌとを混合して、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）で２０分間３７℃で培養したことを添加し、３７℃で６時間培養してＤＭＥＭ培地で３７℃に４日間維持させた。対照群としては、何もターゲッティングしないｓｉＲＮＡを処理したＨＥＫ細胞（図５のＨＥＫｎ  ｓｃ）と、ｓｉＲＮＡを入れずにトランスフェクション試薬（ＲＮＡｉＭＡＸ）のみを処理したＨＥＫ細胞（図５のＨＥＫｎ  ＶＣ）とを使用した。
【００２７】
培養されたＨＥＫ細胞からＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ｑｉａｇｅｎ社）を利用してＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でＲＴ−ＰＣＲを遂行してｃＤＮＡを合成した。ＭＭＰ−９に対するプローブ｛ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ｝を使用してｑｕａｎｔｉｔｉａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを遂行し、ＭＭＰ−９  ｍＲＮＡの発現様相を観察して、結果を図５に示した。図５の結果において、Ｋｌｏｔｈｏの発現量を下げたＨＥＫでＭＭＰ−９の発現量が増加することが分かり、これによって下げられたＫｌｏｔｈｏの発現量がＭＭＰ−９の活性を増加させて皮膚老化を促進させることが分かる。
【００２８】
［試験例５］再組合Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を処理したヒト新生児の上皮角質形成細胞（ＨＥＫ）でＭＭＰ−９の活性減少
ヒト新生児の上皮角質形成細胞（ＨＥＫ；  Ｌｏｎｚａ、ＮＨＥＫ−Ｎｅｏ−Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ、Ｐｏｏｌｅｄ）を６−ｗｅｌｌに培地（ＫＢＭ−ｇｏｌｄ）に５×１０4ずつ分注して、３７℃で２４時間の間に培養した後、再組合Ｋｌｏｔｈｏタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ Ｋｌｏｔｈｏ）１μｇ／ｍｌを処理して８日間培養した。対照群は、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を処理しないＨＥＫを使用した。
【００２９】
培養されたＨＥＫ培養液をゼラチンゲルにローディングし、ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙを通じて結果を図６に示した。
【００３０】
図６の結果において、再組合Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を供給したＨＥＫで対照群に比べてＭＭＰ−９の活性が減少したことを確認することができる。これを通じてＫｌｏｔｈｏタンパク質が供給され、ＭＭＰ−９の活性が減少することによってゼラチン分解が減少され、基底膜の維持效果を有することが分かる。
【００３１】
［試験例６］再組合Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を処理したヒト新生児の上皮角質形成細胞（ＨＥＫ）でＨＡＳ２  ｍＲＮＡの発現増加
皮膚保湿因子として知られているヒアルロン酸の合成酵素であるヒアルロン酸合成酵素（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ２、ＨＡＳ２）の発現に対するＫｌｏｔｈｏタンパク質の影響を調べるために、ヒト新生児の上皮角質形成細胞（Ｌｏｎｚａ、ＮＨＥＫ−Ｎｅｏ−Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ、Ｐｏｏｌｅｄ）に再組合Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を処理して、ＨＡＳ  ｍＲＮＡの発現様相を観察した。
【００３２】
ヒト新生児の角質形成細胞（ＨＥＫ）（Ｌｏｎｚａ、ＮＨＥＫ−Ｎｅｏ−Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ、Ｐｏｏｌｅｄ）を６−ｗｅｌｌ培地（ＫＢＭ−ｇｏｌｄ）に２×１０5ずつ３ｗｅｌｌ、５×１０4ずつ３ｗｅｌｌで分注して、３７℃で２４時間の間に培養した後、再組合Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を表２のようにそれぞれ１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ濃度で処理し、２日間、８日間３７℃で培養した。
【００３３】
【表２】
2013541960.tif 000004
【００３４】
培養されたＨＥＫからＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ｑｉａｇｅｎ社）を利用してＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でＲＴ−ＰＣＲを遂行してｃＤＮＡを合成した。ＨＡＳ２に対するプローブ｛ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ｝を使用してｑｕａｎｔｉｔｉａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを遂行し、ＨＡＳ２  ｍＲＮＡの発現様相を観察し、結果を図７に示した。
【００３５】
図７の結果において、２日目の無処理対照群である参考例１よりも８日目の無処理対照群である参考例４の場合に、ＨＡＳ２  ｍＲＮＡの発現が減少され、８日目の再組合Ｋｌｏｔｈｏタンパク質処理群である参考例５で、２日目の無処理対照群である参考例１よりもＨＡＳ２  ｍＲＮＡの発現が顕著に増加したことを確認することができる。これを通じて参考例４が参考例１よりもＨＡＳ２  ｍＲＮＡの発現が減少されることは、ＨＥＫが分化されて角質化される過程で起こる現象であると思われ、再組合Ｋｌｏｔｈｏタンパク質処理によって８日目に減少されたＨＡＳ２を回復させることから見て、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質は、表皮層の保湿力を回復させる役目をすることが分かる。
【００３６】
［試験例７］Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子をノックダウン（ｋｎｏｃｋ  ｄｏｗｎ）させたヒト新生児の真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）でｐ２１の発現量増加
老化が進行されるほど発現量が増加されると知られているｐ２１にＫｌｏｔｈｏタンパク質が及ぼす影響を調べるために、Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子をノックダウンさせたヒト新生児の真皮線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦ）でｐ２１の発現量の変化をＲＴ−ＰＣＲで観察した。
【００３７】
ヒト新生児の真皮線維芽細胞（Ｌｏｎｚａ社、ＮＨＤＦ−Ｎｅｏ−Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を６０ｍｍディッシュに培地（ＤＭＥＭ）を利用して２×１０5ずつ分注し、３７℃で２４時間の間に培養して培地を捨て、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）に移した後、Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子に相補的配列を有するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社、ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ）１００ｎＭと、トランスフェクション試薬（ＲＮＡｉＭＡＸ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μｌとを混合して、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）で２０分間３７℃で培養したことを添加し、３７℃で６時間培養し、ＤＭＥＭ培地で３７℃に４日間維持させた。対照群としては、何もターゲッティングしないｓｉＲＮＡを処理したＨＤＦ細胞（図８のＨＤＦｎ  ｓｃ）と、ｓｉＲＮＡを入れずにトランスフェクション試薬（ＲＮＡｉＭＡＸ）のみを処理したＨＤＦ細胞（図８のＨＥＫｎ  ＶＣ）とを使用した。
【００３８】
培養されたＨＤＦからＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ｑｉａｇｅｎ社）を利用してＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でＲＴ−ＰＣＲを遂行してｃＤＮＡを合成した。老化マーカーであるｐ２１に対するプローブ｛ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ｝を使用してｑｕａｎｔｉｔｉａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを遂行し、ｐ２１  ｍＲＮＡの発現様相を観察し、結果を図８に示した。
【００３９】
図８の結果において、対照群に比べてＫｌｏｔｈｏ遺伝子をノックダウンさせた場合に、ｐ２１の発現量が増加することを確認した。これを通じてＫｌｏｔｈｏが皮膚真皮線維芽細胞の老化を抑制する役目を遂行することが分かる。
【配列表フリーテキスト】
【００４０】
配列番号１及び２は、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質遺伝子増幅用プライマーのＤＮＡ塩基配列であり、配列番号３はＴａｑＭａｎ  ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃプローブのＤＮＡ塩基配列である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
2013541960.tif 000006
【図２】
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【図３】
2013541960.tif 000008
【図４】
2013541960.tif 000009
【図５】
2013541960.tif 000010
【図７】
2013541960.tif 000011
【図８】
2013541960.tif 000012
【図６】
2013541960.tif 000013
【配列表】
2013541960000001.app
【国際調査報告】
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