(57)【要約】修飾されたＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）ポリペプチド（ＭＡＰ）が提供される。抗血管新生活性および抗腫瘍成長活性のためにＭＡＰを投与するための方法が提供される。本発明の組成物はまた、内皮細胞の機能障害を処置するため、およびインテグリンに関連する状態を診断するためにも有用である。本発明では、ＭＡＰとチオレドキシンのＮ末端セグメントの融合タンパク質およびこれらの融合物をコードする核酸も提供される。
2013519374.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸残基：
ａ）Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ＣＤＣ）モチーフのＣ末端側の最初のシステイン；
ｂ）該最初のシステインのＣ末端側の２つの連続したアミノ酸；および
ｃ）トリペプチドモチーフのＣ末端側のシステイン
において修飾されているＡＤＡＭ由来のポリペプチド（ＡＰ）を含む、修飾されたＡＤＡＭ由来のポリペプチド（ＭＡＰ）であって、該アミノ酸残基の該修飾は、独立に、
ａ）欠失；
ｂ）置換；および
ｃ）化学的な修飾
からなる群より選択され、ここで、ＡＤＡＭは「ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ」を意味し、該ＡＰは、
（ｉ）該Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ＣＤＣ）モチーフを含み、
（ｉｉ）図１に示されているトリペプチドモチーフを含み、そして
（ｉｉｉ）ＡＤＡＭのメタロプロテアーゼドメイン、システインリッチドメイン、およびドメイン間のセグメントの全てまたは実質的に全てを欠く
ＡＤＡＭ由来のディスインテグリン様ドメインを含み、該ＡＤＡＭはＡＤＡＭ１７ではない、修飾されたＡＤＡＭ由来のポリペプチド（ＭＡＰ）。
【請求項２】
前記ＭＡＰが、
【化１】
2013519374.tif 000007
からなる群より選択されるＡＤＡＭに由来する、請求項１に記載のＭＡＰ。
【請求項３】
前記ＭＡＰが、
【化２】
2013519374.tif 000008
からなる群より選択される、請求項１に記載のＭＡＰ。
【請求項４】
前記アミノ酸残基の前記修飾が、欠失である、請求項１に記載のＭＡＰ。
【請求項５】
チオレドキシンをコードするＮ末端セグメントと、請求項１に記載の修飾されたＡＤＡＭ由来のポリペプチド（ＭＡＰ）をコードするＣ末端セグメントとを含む融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１に記載のＭＡＰであって、
ａ）該ＭＡＰは、ＨＵＶＥＣまたはＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の、再構成基底膜を通じた移動を阻害することができる；
ｂ）該ＭＡＰは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＦＡＫのリン酸化のレベルを上昇させることができる；または、
ｃ）該ＭＡＰは、培養物中のＨＵＶＥＣの管形成を阻害することができる、
ＭＡＰ。
【請求項７】
請求項１に記載のＭＡＰをコードする核酸。
【請求項８】
前記ＭＡＰをコードする核酸の５’側に、チオレドキシンをコードする核酸配列をさらに含む請求項７に記載の核酸であって、チオレドキシン−ＭＡＰ融合タンパク質をコードする、核酸。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターを用いて形質転換した原核宿主細胞であって、該発現ベクターは誘導性の制御下にあり、該宿主はまた、チオレドキシン還元酵素Ｂ（ｔｒｘＢ）遺伝子および／またはグルタチオン還元酵素（ｇｏｒ）遺伝子に安定な変異を有し、該ｔｒｘＢ変異および該ｇｏｒ変異は、成長の間に該宿主細胞内に該発現ベクター、ならびにｔｒｘＢ変異およびｇｏｒ変異が維持されるように選択可能である、原核宿主細胞。
【請求項１１】
がんに罹患した個体を処置する方法であって、該個体に、有効量の少なくとも１つの請求項１に記載のＭＡＰを投与するステップを含む、方法。
【請求項１２】
前記がんが、インテグリンを発現しているがんである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記がんが、乳がん、結腸直腸がん、基底細胞がん、腺がん、胃腸がん、結腸がん、肝がん、膀胱がん、膵がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、皮膚がん、前立腺がん、腎細胞がん、中枢神経系（ＣＮＳ）のがん、および白血病からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記胃腸がんが、口唇がん、口腔がん、食道がん、小腸がんおよび胃がんからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記皮膚がんが、扁平上皮細胞がんおよび基底細胞がんからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
インテグリンがリガンドと結合することを阻害する方法であって、インテグリンを発現する細胞を、有効量の請求項１に記載のＭＡＰと接触させるステップを含む、方法。
【請求項１７】
前記ＭＡＰが、
【化３】
2013519374.tif 000009
からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＭＡＰが、チオレドキシンのＮ末端セグメントとの融合体をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）前記ＭＡＰは、ＨＵＶＥＣまたはＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の、再構成基底膜を通じた移動を阻害することができる；
ｂ）前記ＭＡＰは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＦＡＫのリン酸化のレベルを上昇させることができる；または、
ｃ）前記ＭＡＰは、培養物中のＨＵＶＥＣの管形成を阻害することができる、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
個体におけるがん細胞の存在を決定する方法であって、該がん細胞を、少なくとも１つの請求項１に記載のＭＡＰと接触させるステップと、該少なくとも１つのＭＡＰを検出するステップとを含む、方法。
【請求項２１】
前記がんが、インテグリンを発現しているがんである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記がんが、乳がん、結腸直腸がん、基底細胞がん、腺がん、胃腸がん、結腸がん、肝がん、膀胱がん、膵がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、皮膚がん、前立腺がん、腎細胞がん、中枢神経系（ＣＮＳ）のがん、および白血病からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記胃腸がんが、口唇がん、口腔がん、食道がん、小腸がんおよび胃がんからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記皮膚がんが、扁平上皮細胞がんおよび基底細胞がんからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＭＡＰが標識されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記標識が陽電子放射型断層撮影法プローブまたは蛍光プローブである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
人工的なＥＣＭ足場を調製する方法であって、該人工的なＥＣＭ足場を、請求項１に記載のＭＡＰでコーティングするステップを含む、方法。
【請求項２８】
前記人工的なＥＣＭ足場に幹細胞前駆体を導入することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記人工的なＥＣＭ足場が、膀胱の足場、食道の足場または肛門の足場を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１に記載のＭＡＰを原核宿主細胞において発現させる方法であって、
ａ）請求項１０に記載の原核宿主細胞を成長させるステップであって、前記発現ベクターは、第１の抗生物質において該発現ベクターを選択可能にする抗生物質耐性遺伝子を有し、前記ｔｒｘＢ変異および前記ｇｏｒ変異は、反応器に播種するのに適した十分な数の細胞を得るための該第１の抗生物質および少なくとも１種の追加的な抗生物質の存在下における成長の間に、該宿主細胞内に該発現ベクターならびにｔｒｘＢ変異およびｇｏｒ変異が維持されるように該少なくとも１種の追加的な抗生物質において選択可能であり、ここで、該反応器において宿主細胞は成長し、融合タンパク質の発現が誘導される、ステップと；
ｂ）ステップａ）の細胞を該反応器に播種し、該細胞を成長させ、該融合タンパク質の発現を誘導するステップであって、該反応器内の該細胞を、該第１の抗生物質の存在下、かつ該少なくとも１種の追加的な抗生物質の非存在下で成長させる、ステップと
を含む、方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞が、前記ｔｒｘＢ遺伝子および前記ｇｏｒ遺伝子の両方の変異体産物を発現する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記宿主細胞が、ｔｒｘＢ遺伝子およびｇｏｒ遺伝子の両方について変異体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｔｒｘＢ遺伝子および前記ｇｏｒ遺伝子が異なる抗生物質において選択可能である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記融合タンパク質のチオレドキシン部分が、配列：
【化４】
2013519374.tif 000010
を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記宿主が、ｏｍｐＴ遺伝子産物またはｌｏｎ遺伝子産物の任意の１つまたは複数を欠損している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
切断部位をコードする配列が、チオレドキシンをコードする配列とジスルフィドリッチタンパク質をコードする配列との間に位置する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記融合タンパク質が、受容体に対するリガンドであるペプチド配列をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記原核宿主細胞がＯｒｉｇａｍｉ株である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１に記載の組成物でコーティングしたステント。
【請求項４０】
ＡＤＡＭ由来のポリペプチド（ＡＰ）を含む、修飾されたＡＤＡＭ由来のポリペプチド（ＭＡＰ）であって、該ＡＤＡＭ由来のポリペプチド（ＡＰ）は、
（ｉ）Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ＣＤＣ）モチーフを含み、
（ｉｉ）図１に示されているトリペプチドモチーフを含み、ならびに
（ｉｉｉ）ＡＤＡＭのメタロプロテアーゼドメイン、システインリッチドメイン、およびドメイン間のセグメントの全てまたは実質的に全てを欠く
ＡＤＡＭ由来のディスインテグリン様ドメインを含み、かつ該ＣＤＣモチーフのＣ末端側の最初のシステインとドメイン間のジスルフィド結合および該トリペプチドモチーフのＣ末端側のシステインとドメイン間のジスルフィド結合の破壊をもたらす１つまたは複数のアミノ酸の修飾をさらに含み、ＡＤＡＭは、「ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ」を意味する、修飾されたＡＤＡＭ由来のポリペプチド（ＭＡＰ）。
【請求項４１】
図２に記載の任意のポリペプチド配列によるポリペプチド。
【請求項４２】
請求項４１に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１０年２月１１日に出願された米国仮出願番号６１／３０３，６３１号の米国特許法１１９条（ｅ）項の下での優先権の利益を主張し、上記米国仮出願番号６１／３０３，６３１号は、全ての図面および表を含めてその全容が、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、多機能のプロテアーゼのＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ））哺乳動物のファミリーに由来する、遺伝子改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）されたポリペプチドのクラス、およびそれを作製する方法に関する。本発明は、これらの遺伝子改変されたポリペプチドの、抗血管新生活性および抗腫瘍成長活性についての使用にも関する。本発明は、遺伝子改変されたポリペプチドを、内皮細胞の機能障害およびインテグリンに関連する状態を診断するために投与することにも関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
本発明は、Ｍｉｎｅａらによる、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｒｉｄｇｅｓ」である特許文献１、および２００９年１１月１２日に出願された、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｒｉｄｇｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｙｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」であるＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０９／６４２５６に関連する。そのどちらの内容も、全ての図面も含めて、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
ＡＤＡＭは、胚発生のあらゆるステップ（そこでは、細胞増殖、細胞遊走、細胞の特異化、軸索伸長および器官の形態形成を制御する）ならびに成人期における多数の生理的プロセスおよび病理学的プロセス（創傷治癒から種々の炎症プロセスまで、ならびに血管新生および転移から器官の修復および再生まで）に関与する多ドメインの哺乳動物の膜貫通タンパク質または分泌タンパク質のクラスである［非特許文献１〜５（１〜５）］。多数の報告により、ＡＤＡＭファミリーの多くのタンパク質分解性のメンバーがヒト悪性腫瘍において過剰発現されていると思われることが示されており、これは、これらのプロテアーゼが腫瘍の進行において重要な役割を果たす可能性があることを示している［非特許文献６〜１５（６〜１５）］。興味深いことに、触媒として活性なＡＤＡＭの過剰発現は、一般に、がんにおける転帰不良に関連づけられると思われるが、非タンパク質分解性のＡＤＡＭは、腫瘍インヒビターとしての役割を果たすと思われる。例えば、ヒト神経膠腫におけるＡＤＡＭ２２の過剰発現は、腫瘍の成長阻害と相関することが示されている［１６］。
【０００５】
ＡＤＡＭタンパク質の構造は、それらのオルソログである、ＰＩＩＩ−クラスのヘビ毒メタロプロテイナーゼの構造とよく似ている。ＰＩＩＩ−クラスのヘビ毒メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）と同様に、ＡＤＡＭは、メタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリンドメインおよびシステインリッチドメインを保有する多ドメインのタンパク質である［１７、２８］。ＡＤＡＭ足場は、いくつかのドメイン間のシステイン残基およびドメイン内のシステイン残基を含有し、とりわけ、ディスインテグリンループと称される構造要素の先端における、ディスインテグリンドメイン内に位置するものが非常に重要である。ドメイン間のシステイン残基は、メタロプロテアーゼとディスインテグリンドメインとの間およびディスインテグリンとシステインリッチドメインとの間のスペーサー領域内に位置する［２０］。ＡＤＡＭおよびＰＩＩＩ−ＳＶＭＰにおいて見いだされるが、一般に、ヘビ毒ディスインテグリンにおいては見いだされないこれらのシステイン残基は、ＡＤＡＭおよびＰＩＩＩ−ＳＶＭＰにおいて、ドメイン間（スペーサー）領域をメタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリンドメインおよびシステインリッチドメインと連結するジスルフィド架橋を形成する［２０］。これらのＡＤＡＭ足場におけるスペーサー−ドメインジスルフィド架橋は、３つのドメインを一緒に緊密に折りたたまれた構造にロックする構造要素を示し、これらの多ドメインタンパク質が、細胞外の環境において良好に生存する（すなわち、タンパク質分解性の攻撃などに対する抵抗性が増す）ことを可能にしている。この安定化されたＡＤＡＭ足場は、ジスルフィド結合の遺伝子改変によって新しい折りたたみのＰＩＩ−クラスのＳＶＭＰに自然に進化し、これは、タンパク質分解性の攻撃を伴う機構によって遊離のディスインテグリンを生じる。分子進化の結果として、ＡＤＡＭ足場に特徴的なシステイン残基のいくつか（すなわち、スペーサー−ドメインジスルフィド架橋に関与するシステイン残基）が、異なる残基に変異したか、または欠失した。これらの変異の結果、これらの新しいタンパク質（ＰＩＩクラスのＳＶＭＰ）において、スペーサー領域と、メタロプロテアーゼドメインおよびディスインテグリンドメインとの間にジスルフィド架橋をもはや形成することができなくなり、これにより、それらのドメイン間領域は、タンパク質分解を受けやすくなり、個々のドメインがヘビ毒ディスインテグリンの遊離のドメインとして放出される可能性が与えられる［２０］。したがって、ＰＩＩヘビ毒ディスインテグリンは、それらが血小板に特異的なインテグリンアルファＩＩｂベータ３（ａｌｐｈａＩＩｂｂｅｔａ３）との相互作用の親和性が高いことによって、最も強力な天然の血小板凝集インヒビターとなっている、遊離のディスインテグリンドメインポリペプチドのクラスとして明らかになった。ＡＤＡＭ足場のディスインテグリンドメインと対照的に、これらの後期進化のＰＩＩクラスのＳＶＭＰは、血液毒性のヘビの毒液において遊離のポリペプチドとして放出され、かつ新規の１１アミノ酸ディスインテグリンループを保有する。このループは、このクラスの分子に特徴的な独特の構造要素であり、自然に遺伝子改変されて、細胞外マトリックスタンパク質モチーフの作用を模倣することによって強力な可溶性のインテグリンリガンドとしての機能を果たしている（ＥＣＭ−模倣物）［１９］。このループは、ジスルフィド安定化されたポリペプチドコアから自由に突出し、ループの先端に提示されるトリペプチドモチーフ（通常Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフ）を介してインテグリン受容体と相互作用する［２１］。
【０００６】
ヒトインテグリンファミリーには２４種のメンバーが存在し、そのうちの２３種は複雑な発現パターン、組織分布および生理機能を有するが、アルファＩＩｂベータ３インテグリンは、血餅の形成に役立つ、血小板に特異的な受容体である。異常に発現されること、または原形質膜に誤って局在化すること、または不適切に活性化されること、またはこれらの機構の組み合わせのいずれかによって、種々の組織または器官において調節解除された場合に、これらの受容体の多くが異常に機能することが、新形成から炎症性疾患まで、ならびに創傷治癒および組織再生などの複雑な生理応答までにわたる多様な病態に関連づけられている［２２〜２５］。
【０００７】
ヘビ毒ディスインテグリンは、リポソーム処方物で送達される場合、抗がん剤としての治療的な可能性を有する［２１、２６、２７］。それらの天然の生物活性（すなわち、インテグリンアルファＩＩｂベータ３との相互作用の親和性が高いことによる血小板凝集の阻害）に加えて、ヘビ毒ディスインテグリンは、腫瘍関連プロセス、例えば、転移および血管新生などを、これらのプロセスの病因に機構的に関わるインテグリンの定義されたセット（例えば、アルファｖベータ３（ａｌｐｈａｖｂｅｔａ３）、アルファｖベータ５（ａｌｐｈａｖｂｅｔａ５）、およびアルファ５ベータ１（ａｌｐｈａ５ｂｅｔａ１））に関与する能力によって破壊することが示されている［２１］。これらの好都合な特質にもかかわらず、これらのポリペプチドは、依然として、それらがヘビ毒に由来することに起因する、潜在的に負の免疫学的特性を保有する。遊離のディスインテグリンは、ヒトまたは任意の他の哺乳動物において存在することは知られていない−これまでに同定された唯一のヒトディスインテグリンは、ＡＤＡＭファミリータンパク質のメンバーの大きな配列の中に埋もれたサブドメインとして存在する［１７］。哺乳動物界において３０種を超えるＡＤＡＭタンパク質が同定されており（ヒトは２０種の遺伝子および３種の偽遺伝子を保有する）、それらの全てが、ディスインテグリンドメインを保有する［１］。ヒトにおいて同定された２３種のＡＤＡＭ転写物のうち、３種が偽遺伝子由来（ＡＤＡＭ１、ＡＤＡＭ３およびＡＤＡＭ６）であり、それは機能タンパク質に翻訳されない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６０２４６５４１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｅｄｗａｒｄｓ，  Ｄ．Ｒ．，  Ｍ．Ｍ．  Ｈａｎｄｓｌｅｙ，およびＣ．Ｊ．  Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  ＡＤＡＭ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ．  Ｍｏｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｍｅｄ，  ２００８．  ２９（５）：    ｐ．  ２５８−８９．
【非特許文献２】Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，  Ｓ．およびＹ．  Ｏｋａｄａ，  ＡＤＡＭｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，  ２００７．  ９８（５）：  ｐ．  ６２１−８．
【非特許文献３】Ｒｅｉｓｓ，  Ｋ．，  Ａ．  Ｌｕｄｗｉｇ，およびＰ．  Ｓａｆｔｉｇ，  Ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｕｐ  ｔｈｅ  ｔｉｅ：  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，  ２００６．  １１１（３）：  ｐ．  ９８５−１００６．
【非特許文献４】Ｔｏｕｓｓｅｙｎ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｍａｋｅ）  ｓｔｉｃｋ  ａｎｄ  ｃｕｔ  ｌｏｏｓｅ−−ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｂｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｒｅｓ  Ｃ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｔｏｄａｙ，  ２００６．  ７８（１）：  ｐ．  ２４−４６．
【非特許文献５】Ａｒｒｉｂａｓ，  Ｊ．，  Ｊ．Ｊ．  Ｂｅｃｈ−Ｓｅｒｒａ，およびＢ．  Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｊｏｓｅｆａｔ，  ＡＤＡＭｓ，  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ，  ２００６．  ２５（１）：  ｐ．  ５７−６８．
【非特許文献６】Ｂｌａｎｃｈｏｔ−Ｊｏｓｓｉｃ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＤＡＭ１７  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：  ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＥＧＦＲ  ｉｎ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，  ２００５．  ２０７（２）：  ｐ．  １５６−６３．
【非特許文献７】Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＤＡＭ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，  ２００５．  １３１（１）：  ｐ．  ４１−８．
【非特許文献８】Ｍａｚｚｏｃｃａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ＡＤＡＭ９  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｕｍｏｒ−ｓｔｒｏｍａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ２００５．  ６５（１１）：  ｐ．  ４７２８−３８．
【非特許文献９】ＭｃＧｏｗａｎ，  Ｐ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＤＡＭ−１７  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ，  ２００８．  １９（６）：  ｐ．  １０７５−８１．
【非特許文献１０】ＭｃＧｏｗａｎ，  Ｐ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＤＡＭ−１７  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ２００７．  １３（８）：  ｐ．  ２３３５−４３．
【非特許文献１１】Ｍｉｔｓｕｉ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＤＡＭ２８  ｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−３．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ２００６．  ６６（２０）：  ｐ．  ９９１３−２０．
【非特許文献１２】Ｎａｊｙ，  Ａ．Ｊ．，  Ｋ．Ｃ．  Ｄａｙ，およびＭ．Ｌ．  Ｄａｙ，  ＡＤＡＭ１５  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ２００８．  ６８（４）：  ｐ．  １０９２−９．
【非特許文献１３】Ｏ’Ｓｈｅａ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＤＡＭ−９  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００３．  １０５（６）：  ｐ．７５４−６１．
【非特許文献１４】Ｒｉｎｇｅｌ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｂｅｒｒａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １７／ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ２００６．  ６６（１８）：  ｐ．  ９０４５−５３．
【非特許文献１５】Ｗｉｌｄｅｂｏｅｒ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ＡＤＡＭ８  ａｎｄ  ＡＤＡＭ１９  ａｒｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ，  ２００６．  ６５（５）：  ｐ．  ５１６−２７．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
本明細書では、以下のアミノ酸残基：
ａ）Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ＣＤＣ）モチーフのＣ末端側の最初のシステイン；
ｂ）その最初のシステインのＣ末端側の２つの連続したアミノ酸；および
ｃ）トリペプチドモチーフのＣ末端側のシステイン
において修飾されているＡＤＡＭ由来のポリペプチド（ＡＰ）を有する、修飾されたＡＤＡＭ由来のポリペプチド（ＭＡＰ）であって、アミノ酸残基の修飾が、独立に、
ａ）欠失；
ｂ）置換；および
ｃ）化学的な修飾
から選択され、ＡＰが、（ｉ）Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ＣＤＣ）モチーフ、（ｉｉ）図１に示されているトリペプチドモチーフを有し、（ｉｉｉ）ＡＤＡＭのメタロプロテアーゼドメイン、システインリッチドメイン、およびドメイン間のセグメントの全て、または実質的に全てを欠く、ＡＤＡＭ由来のディスインテグリン（ｄｉｓｔｉｎｔｅｇｒｉｎ）様ドメインを有し、ＡＤＡＭが、ＡＤＡＭ１７（ＣＤＣモチーフではなくＣＤＰを有するＡＤＡＭ１７など）ではない、修飾されたＡＤＡＭ由来のポリペプチド（ＭＡＰ）の組成物、およびそれに関連する方法が提供される。本明細書では、これらのＭＡＰをコードする核酸が提供される。
【００１１】
ＭＡＰは、ＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）から得ることができ、ＡＤＡＭとしては、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ１、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ３、ＡＤＡＭ６、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３２、ＡＤＡＭ３３が挙げられる。これらの対応するＭＡＰは、ＭＡＰ１５、ＭＡＰ２８、ＭＡＰ１、ＭＡＰ２、ＭＡＰ３、ＭＡＰ６、ＭＡＰ７、ＭＡＰ８、ＭＡＰ９、ＭＡＰ１０、ＭＡＰ１１、ＭＡＰ１２、ＭＡＰ１８、ＭＡＰ１９、ＭＡＰ２０、ＭＡＰ２１、ＭＡＰ２２、ＭＡＰ２３、ＭＡＰ２９、ＭＡＰ３０、ＭＡＰ３２、ＭＡＰ３３であってよい。
【００１２】
本明細書では、ＭＡＰとチオレドキシンのＮ末端セグメントの融合タンパク質およびこれらの融合物をコードする核酸も提供される。
【００１３】
ＭＡＰは、ＨＵＶＥＣまたはＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の再構成基底膜を通じた移動を阻害する性質、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＦＡＫのリン酸化のレベルを上昇させる性質、または培養物におけるＨＵＶＥＣの管形成を阻害する性質を有し得る。
【００１４】
本明細書では、ＭＡＰを発現させる発現ベクターおよびこれらの発現ベクターを用いて形質転換した原核宿主細胞も提供される。発現ベクターは、誘導性の制御下にあってもよく、例えば、ここで、宿主は、チオレドキシン還元酵素Ｂ（ｔｒｘＢ）遺伝子および／またはグルタチオン還元酵素（ｇｏｒ）遺伝子に安定な変異も有する。
【００１５】
本明細書では、がんに罹患した個体を、有効量の少なくとも１つのＭＡＰを投与することによって処置する方法も提供される。がんは、インテグリンが発現されているがんであってよい。がんは、乳がん、結腸直腸がん、基底細胞がん、腺がん、胃腸がん、結腸がん、肝がん、膀胱がん、膵がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、皮膚がん、前立腺がん、腎細胞がん、中枢神経系（ＣＮＳ）のがん、および白血病であってよい。胃腸がんは、口唇がん、口腔がん、食道がん、小腸がんまたは胃がんであってよい。皮膚がんは、扁平上皮細胞がんまたは基底細胞がんであってよい。
【００１６】
本明細書では、インテグリンを発現している細胞を有効量のＭＡＰまたはその融合物と接触させることによって、インテグリンがリガンドと結合することを阻害する方法も提供される。
【００１７】
本明細書では、個体におけるがん細胞の存在を、がん細胞を少なくとも１つのＭＡＰと接触させ、少なくとも１つのＭＡＰを検出することによって決定する方法も提供される。ＭＡＰは、標識することができ、標識は、陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）プローブまたは蛍光プローブであってよい。
【００１８】
本明細書では、人工的なＥＣＭ足場をＭＡＰでコーティングすることによって、人工的なＥＣＭ足場を調製する方法も提供される。人工的なＥＣＭ足場は、幹細胞前駆体をさらに含んでよい。人工的なＥＣＭ足場は、膀胱の足場、食道の足場または肛門の足場であってよい。
【００１９】
少なくとも１つのＭＡＰを含む組成物でコーティングしたステントも提供される。
【００２０】
（ｉ）Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ＣＤ）モチーフ、（ｉｉ）図１に示されているトリペプチドモチーフを有し、（ｉｉｉ）ＡＤＡＭのメタロプロテアーゼドメイン、システインリッチドメイン、およびドメイン間のセグメントの全て、または実質的に全てを欠き、ＡＤＡＭ由来のディスインテグリン様ドメインを有し、ＣＤＣモチーフのＣ末端側の最初のシステインとドメイン間のジスルフィド結合およびトリペプチドモチーフのＣ末端側のシステインとドメイン間のジスルフィド結合の破壊をもたらすアミノ酸の修飾をさらに含む、ＡＰであるＭＡＰも提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１は、２３種のヒトＡＤＡＭタンパク質（ＡＰ）のディスインテグリン様ドメインのアミノ酸配列を示す。図１Ａは、ヒトＡＤＡＭタンパク質のディスインテグリン様ドメインの配列アラインメントを示す。横線で消されたアミノ酸残基は、対応するＭＡＰポリペプチドでは除去されるアミノ酸を示す。ＡＰ１およびＡＰ１７の太字のアミノ酸は、中程度のサイズのヘビ毒ディスインテグリンのシステインパターンを保存するために、対応するＭＡＰでは別のアミノ酸と交換した。図１Ｂは、ＡＰのディスインテグリン様ドメインのディスインテグリンループのそれぞれの先端に提示されるトリペプチドモチーフ（枠で囲まれたアミノ酸残基）を示す。図１Ｃは、ディスインテグリン様ドメインのディスインテグリンループ（枠で囲まれたアミノ酸残基）を示す。
【図１Ｂ】図１は、２３種のヒトＡＤＡＭタンパク質（ＡＰ）のディスインテグリン様ドメインのアミノ酸配列を示す。図１Ａは、ヒトＡＤＡＭタンパク質のディスインテグリン様ドメインの配列アラインメントを示す。横線で消されたアミノ酸残基は、対応するＭＡＰポリペプチドでは除去されるアミノ酸を示す。ＡＰ１およびＡＰ１７の太字のアミノ酸は、中程度のサイズのヘビ毒ディスインテグリンのシステインパターンを保存するために、対応するＭＡＰでは別のアミノ酸と交換した。図１Ｂは、ＡＰのディスインテグリン様ドメインのディスインテグリンループのそれぞれの先端に提示されるトリペプチドモチーフ（枠で囲まれたアミノ酸残基）を示す。図１Ｃは、ディスインテグリン様ドメインのディスインテグリンループ（枠で囲まれたアミノ酸残基）を示す。
【図１Ｃ】図１は、２３種のヒトＡＤＡＭタンパク質（ＡＰ）のディスインテグリン様ドメインのアミノ酸配列を示す。図１Ａは、ヒトＡＤＡＭタンパク質のディスインテグリン様ドメインの配列アラインメントを示す。横線で消されたアミノ酸残基は、対応するＭＡＰポリペプチドでは除去されるアミノ酸を示す。ＡＰ１およびＡＰ１７の太字のアミノ酸は、中程度のサイズのヘビ毒ディスインテグリンのシステインパターンを保存するために、対応するＭＡＰでは別のアミノ酸と交換した。図１Ｂは、ＡＰのディスインテグリン様ドメインのディスインテグリンループのそれぞれの先端に提示されるトリペプチドモチーフ（枠で囲まれたアミノ酸残基）を示す。図１Ｃは、ディスインテグリン様ドメインのディスインテグリンループ（枠で囲まれたアミノ酸残基）を示す。
【図２Ａ】図２は、ＭＡＰポリペプチドのアミノ酸配列を示す。図２Ａは、典型的な中程度のサイズのヘビ毒ディスインテグリン（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓヘビの毒液から精製した）であるトリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の配列に対してアラインメントした、２３種のＭＡＰポリペプチドのアミノ酸配列を示す。システイン残基をアラインメントし、それに下線が引かれている。ＡＰ１およびＡＰ１７におけるアミノ酸残基に対応する、ＭＡＰ１およびＭＡＰ１７の交換されたアミノ酸残基がそれぞれ太字で示されている。さらに、ＡＰ１、ＡＰ３、ＡＰ６、ＡＰ１８、ＡＰ２１、ＡＰ３０、およびＡＰ３２のＮ末端残基が、それらの対応するＭＡＰにおいてグリシン残基と交換されている。図２Ｂは、ＭＡＰのディスインテグリン様ドメインのディスインテグリンループのそれぞれの先端に提示され、および中程度のサイズのヘビ毒トリメスタチンによって提示されるトリペプチドモチーフ（枠で囲まれたアミノ酸）を示す。図２Ｃは、ＭＡＰおよびトリメスタチンのディスインテグリンループ（枠で囲まれたアミノ酸）を同定する。
【図２Ｂ】図２は、ＭＡＰポリペプチドのアミノ酸配列を示す。図２Ａは、典型的な中程度のサイズのヘビ毒ディスインテグリン（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓヘビの毒液から精製した）であるトリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の配列に対してアラインメントした、２３種のＭＡＰポリペプチドのアミノ酸配列を示す。システイン残基をアラインメントし、それに下線が引かれている。ＡＰ１およびＡＰ１７におけるアミノ酸残基に対応する、ＭＡＰ１およびＭＡＰ１７の交換されたアミノ酸残基がそれぞれ太字で示されている。さらに、ＡＰ１、ＡＰ３、ＡＰ６、ＡＰ１８、ＡＰ２１、ＡＰ３０、およびＡＰ３２のＮ末端残基が、それらの対応するＭＡＰにおいてグリシン残基と交換されている。図２Ｂは、ＭＡＰのディスインテグリン様ドメインのディスインテグリンループのそれぞれの先端に提示され、および中程度のサイズのヘビ毒トリメスタチンによって提示されるトリペプチドモチーフ（枠で囲まれたアミノ酸）を示す。図２Ｃは、ＭＡＰおよびトリメスタチンのディスインテグリンループ（枠で囲まれたアミノ酸）を同定する。
【図２Ｃ】図２は、ＭＡＰポリペプチドのアミノ酸配列を示す。図２Ａは、典型的な中程度のサイズのヘビ毒ディスインテグリン（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓヘビの毒液から精製した）であるトリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の配列に対してアラインメントした、２３種のＭＡＰポリペプチドのアミノ酸配列を示す。システイン残基をアラインメントし、それに下線が引かれている。ＡＰ１およびＡＰ１７におけるアミノ酸残基に対応する、ＭＡＰ１およびＭＡＰ１７の交換されたアミノ酸残基がそれぞれ太字で示されている。さらに、ＡＰ１、ＡＰ３、ＡＰ６、ＡＰ１８、ＡＰ２１、ＡＰ３０、およびＡＰ３２のＮ末端残基が、それらの対応するＭＡＰにおいてグリシン残基と交換されている。図２Ｂは、ＭＡＰのディスインテグリン様ドメインのディスインテグリンループのそれぞれの先端に提示され、および中程度のサイズのヘビ毒トリメスタチンによって提示されるトリペプチドモチーフ（枠で囲まれたアミノ酸）を示す。図２Ｃは、ＭＡＰおよびトリメスタチンのディスインテグリンループ（枠で囲まれたアミノ酸）を同定する。
【図３】図３は、ヘビ毒ディスインテグリンおよびヒトＡＤＡＭタンパク質のディスインテグリン様ドメインの配列アラインメントを示す。ＰＩＩＩ−クラスのヘビ毒メタロプロテアーゼ（ＶＡＰ１およびカトロコラスタチン（Ｃａｔｒｏｃｏｌｌａｓｔａｔｉｎ））のディスインテグリン様配列を長いサイズのヘビ毒ディスインテグリン配列（サルモシン（Ｓａｌｍｏｓｉｎ）３およびビチスタチン（Ｂｉｔｉｓｔａｔｉｎ））、典型的な中程度のサイズのヘビ毒ディスインテグリン（トリメスタチン）およびいくつかのヒトＡＤＡＭのディスインテグリン様ドメイン（ＡＰ７、ＡＰ８、ＡＰ１２、ＡＰ１９、ＡＰ２８、およびＡＰ３３）とアラインメントした。対応するＭＡＰポリペプチドを生成するために、修飾することができる（例えば、欠失）ディスインテグリン様配列（ヘビ起源およびヒト起源の両方）におけるアミノ酸残基が横線で消されて示されている。これらのディスインテグリンおよびディスインテグリン様配列におけるディスインテグリンループの先端に提示されるトリペプチドアミノ酸モチーフが囲み枠の中に示されている。
【図４】図４は、様々なＥ．ｃｏｌｉ宿主（ＢＬ２１対Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ）におけるＴｒｘ−Ｄ９（ネイティブなヒトＡＤＡＭ９ディスインテグリン様ドメイン配列−チオレドキシン融合ポリペプチド）の発現とＴｒｘ−ＭＡＰ９（ＭＡＰ９−チオレドキシン融合ポリペプチド）の発現とを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して比較している。レーンは、左から右に、ＰａｇｅＲｕｌｅｒＴＭＰｌｕｓ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）、カルベニシリンの下で成長させ、誘導した、Ｔｒｘ−Ｄ９で形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からの溶解物、最初に３種のＡＢ（カルベニシリン、カナマイシンおよびテトラサイクリン）上に播いたが、カルベニシリンのみの下でさらに増殖させ、誘導した、Ｔｒｘ−Ｄ９で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細胞からの溶解物、カルベニシリンの下で成長させ、誘導した、Ｔｒｘ−ＭＡＰ９で形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からの溶解物、ならびに、最初に３種のＡＢ（カルベニシリン、カナマイシンおよびテトラサイクリン）上に播いたが、カルベニシリンのみの下でさらに増殖させ、誘導した、Ｔｒｘ−ＭＡＰ９で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細胞からの溶解物を示す。
【図５】図５は、様々なＥ．ｃｏｌｉ宿主（ＢＬ２１対Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ）におけるＴｒｘ−Ｄ１５（ネイティブなヒトＡＤＡＭ１５ディスインテグリン様ドメイン配列−チオレドキシン融合ポリペプチド）の発現とＴｒｘ−ＭＡＰ１５（ＭＡＰ１５−チオレドキシン融合ポリペプチド）の発現とを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して比較している。レーンは、左から右に、ＰａｇｅＲｕｌｅｒＴＭＰｌｕｓ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）、カルベニシリンの下で成長させ、誘導した、Ｔｒｘ−Ｄ１５で形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からの溶解物、最初に３種のＡＢ（カルベニシリン、カナマイシンおよびテトラサイクリン）上に播いたが、カルベニシリンのみの下でさらに増殖させ、誘導した、Ｔｒｘ−Ｄ１５で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細胞からの溶解物、カルベニシリンの下で成長させ、誘導した、Ｔｒｘ−ＭＡＰ１５で形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からの溶解物、ならびに、最初に３種のＡＢ（カルベニシリン、カナマイシンおよびテトラサイクリン）上に播いたが、カルベニシリンのみの下でさらに増殖させ、誘導した、Ｔｒｘ−ＭＡＰ１５で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細胞からの溶解物を示す。
【図６Ａ】図６は、細菌のＴｒｘＡの３’側の、ｐＥＴ３２ａ発現ベクターに挿入されたＭＡＰの核酸配列を示す。図６Ａは、ＭＡＰ１、ＭＡＰ２、ＭＡＰ３、およびＭＡＰ６のＤＮＡ配列を示す。図６Ｂは、ＭＡＰ７、ＭＡＰ８、ＭＡＰ９、およびＭＡＰ１０の核酸配列を示す。図６Ｃは、ＭＡＰ１１、ＭＡＰ１２、ＭＡＰ１５、およびＭＡＰ１７の核酸配列を示す。図６Ｄは、ＭＡＰ１８、ＭＡＰ１９、ＭＡＰ２０、およびＭＡＰ２１の核酸配列を示す。図６Ｅは、ＭＡＰ２２、ＭＡＰ２３、ＭＡＰ２８、およびＭＡＰ２９の核酸配列を示す。図６Ｆは、ＭＡＰ３０、ＭＡＰ３２、およびＭＡＰ３３の核酸配列を示す。
【図６Ｂ】図６は、細菌のＴｒｘＡの３’側の、ｐＥＴ３２ａ発現ベクターに挿入されたＭＡＰの核酸配列を示す。図６Ａは、ＭＡＰ１、ＭＡＰ２、ＭＡＰ３、およびＭＡＰ６のＤＮＡ配列を示す。図６Ｂは、ＭＡＰ７、ＭＡＰ８、ＭＡＰ９、およびＭＡＰ１０の核酸配列を示す。図６Ｃは、ＭＡＰ１１、ＭＡＰ１２、ＭＡＰ１５、およびＭＡＰ１７の核酸配列を示す。図６Ｄは、ＭＡＰ１８、ＭＡＰ１９、ＭＡＰ２０、およびＭＡＰ２１の核酸配列を示す。図６Ｅは、ＭＡＰ２２、ＭＡＰ２３、ＭＡＰ２８、およびＭＡＰ２９の核酸配列を示す。図６Ｆは、ＭＡＰ３０、ＭＡＰ３２、およびＭＡＰ３３の核酸配列を示す。
【図６Ｃ】図６は、細菌のＴｒｘＡの３’側の、ｐＥＴ３２ａ発現ベクターに挿入されたＭＡＰの核酸配列を示す。図６Ａは、ＭＡＰ１、ＭＡＰ２、ＭＡＰ３、およびＭＡＰ６のＤＮＡ配列を示す。図６Ｂは、ＭＡＰ７、ＭＡＰ８、ＭＡＰ９、およびＭＡＰ１０の核酸配列を示す。図６Ｃは、ＭＡＰ１１、ＭＡＰ１２、ＭＡＰ１５、およびＭＡＰ１７の核酸配列を示す。図６Ｄは、ＭＡＰ１８、ＭＡＰ１９、ＭＡＰ２０、およびＭＡＰ２１の核酸配列を示す。図６Ｅは、ＭＡＰ２２、ＭＡＰ２３、ＭＡＰ２８、およびＭＡＰ２９の核酸配列を示す。図６Ｆは、ＭＡＰ３０、ＭＡＰ３２、およびＭＡＰ３３の核酸配列を示す。
【図６Ｄ】図６は、細菌のＴｒｘＡの３’側の、ｐＥＴ３２ａ発現ベクターに挿入されたＭＡＰの核酸配列を示す。図６Ａは、ＭＡＰ１、ＭＡＰ２、ＭＡＰ３、およびＭＡＰ６のＤＮＡ配列を示す。図６Ｂは、ＭＡＰ７、ＭＡＰ８、ＭＡＰ９、およびＭＡＰ１０の核酸配列を示す。図６Ｃは、ＭＡＰ１１、ＭＡＰ１２、ＭＡＰ１５、およびＭＡＰ１７の核酸配列を示す。図６Ｄは、ＭＡＰ１８、ＭＡＰ１９、ＭＡＰ２０、およびＭＡＰ２１の核酸配列を示す。図６Ｅは、ＭＡＰ２２、ＭＡＰ２３、ＭＡＰ２８、およびＭＡＰ２９の核酸配列を示す。図６Ｆは、ＭＡＰ３０、ＭＡＰ３２、およびＭＡＰ３３の核酸配列を示す。
【図６Ｅ】図６は、細菌のＴｒｘＡの３’側の、ｐＥＴ３２ａ発現ベクターに挿入されたＭＡＰの核酸配列を示す。図６Ａは、ＭＡＰ１、ＭＡＰ２、ＭＡＰ３、およびＭＡＰ６のＤＮＡ配列を示す。図６Ｂは、ＭＡＰ７、ＭＡＰ８、ＭＡＰ９、およびＭＡＰ１０の核酸配列を示す。図６Ｃは、ＭＡＰ１１、ＭＡＰ１２、ＭＡＰ１５、およびＭＡＰ１７の核酸配列を示す。図６Ｄは、ＭＡＰ１８、ＭＡＰ１９、ＭＡＰ２０、およびＭＡＰ２１の核酸配列を示す。図６Ｅは、ＭＡＰ２２、ＭＡＰ２３、ＭＡＰ２８、およびＭＡＰ２９の核酸配列を示す。図６Ｆは、ＭＡＰ３０、ＭＡＰ３２、およびＭＡＰ３３の核酸配列を示す。
【図６Ｆ】図６は、細菌のＴｒｘＡの３’側の、ｐＥＴ３２ａ発現ベクターに挿入されたＭＡＰの核酸配列を示す。図６Ａは、ＭＡＰ１、ＭＡＰ２、ＭＡＰ３、およびＭＡＰ６のＤＮＡ配列を示す。図６Ｂは、ＭＡＰ７、ＭＡＰ８、ＭＡＰ９、およびＭＡＰ１０の核酸配列を示す。図６Ｃは、ＭＡＰ１１、ＭＡＰ１２、ＭＡＰ１５、およびＭＡＰ１７の核酸配列を示す。図６Ｄは、ＭＡＰ１８、ＭＡＰ１９、ＭＡＰ２０、およびＭＡＰ２１の核酸配列を示す。図６Ｅは、ＭＡＰ２２、ＭＡＰ２３、ＭＡＰ２８、およびＭＡＰ２９の核酸配列を示す。図６Ｆは、ＭＡＰ３０、ＭＡＰ３２、およびＭＡＰ３３の核酸配列を示す。
【図７Ａ】図７は、ＭＡＰ構築物をｐＥＴ３２ａ発現ベクターにクローニングするために使用するオリゴヌクレオチドプライマー配列を示す。図７Ａは、ＭＡＰ１、ＭＡＰ２、ＭＡＰ３、ＭＡＰ６、ＭＡＰ７、ＭＡＰ８、ＭＡＰ９、ＭＡＰ１０、ＭＡＰ１１、ＭＡＰ１２、ＭＡＰ１５、ＭＡＰ１７、およびＭＡＰ１８をクローニングするために使用するオリゴヌクレオチドプライマーを示す。図７Ｂは、ＭＡＰ１９、ＭＡＰ２０、ＭＡＰ２１、ＭＡＰ２２、ＭＡＰ２３、ＭＡＰ２８、ＭＡＰ２９、ＭＡＰ３０、ＭＡＰ３２、およびＭＡＰ３３をクローニングするために使用するオリゴヌクレオチドプライマーを示す。
【図７Ｂ】図７は、ＭＡＰ構築物をｐＥＴ３２ａ発現ベクターにクローニングするために使用するオリゴヌクレオチドプライマー配列を示す。図７Ａは、ＭＡＰ１、ＭＡＰ２、ＭＡＰ３、ＭＡＰ６、ＭＡＰ７、ＭＡＰ８、ＭＡＰ９、ＭＡＰ１０、ＭＡＰ１１、ＭＡＰ１２、ＭＡＰ１５、ＭＡＰ１７、およびＭＡＰ１８をクローニングするために使用するオリゴヌクレオチドプライマーを示す。図７Ｂは、ＭＡＰ１９、ＭＡＰ２０、ＭＡＰ２１、ＭＡＰ２２、ＭＡＰ２３、ＭＡＰ２８、ＭＡＰ２９、ＭＡＰ３０、ＭＡＰ３２、およびＭＡＰ３３をクローニングするために使用するオリゴヌクレオチドプライマーを示す。
【図８Ａ】図８は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）において発現させた全てのＴｒｘＡ−ＭＡＰ構築物のアミノ酸配列を示す。ＴｒｘＡ（ＣＧＰＣ）の活性部位はイタリック体で示されており、ディスインテグリンループの先端のトリペプチドモチーフには下線が引かれており、ＴＥＶ切断認識部位は囲み枠で強調されており、ＴｒｘＡと種々のＭＡＰ構築物との間のリンカー領域は太字のイタリック体で示されている。ＡＰ１およびＡＰ１７内の残基を交換するために導入された、対応するＭＡＰ１およびＭＡＰ１７内のアミノ酸残基は、太字の二重下線で強調されている。
【図８Ｂ】図８は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）において発現させた全てのＴｒｘＡ−ＭＡＰ構築物のアミノ酸配列を示す。ＴｒｘＡ（ＣＧＰＣ）の活性部位はイタリック体で示されており、ディスインテグリンループの先端のトリペプチドモチーフには下線が引かれており、ＴＥＶ切断認識部位は囲み枠で強調されており、ＴｒｘＡと種々のＭＡＰ構築物との間のリンカー領域は太字のイタリック体で示されている。ＡＰ１およびＡＰ１７内の残基を交換するために導入された、対応するＭＡＰ１およびＭＡＰ１７内のアミノ酸残基は、太字の二重下線で強調されている。
【図８Ｃ】図８は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）において発現させた全てのＴｒｘＡ−ＭＡＰ構築物のアミノ酸配列を示す。ＴｒｘＡ（ＣＧＰＣ）の活性部位はイタリック体で示されており、ディスインテグリンループの先端のトリペプチドモチーフには下線が引かれており、ＴＥＶ切断認識部位は囲み枠で強調されており、ＴｒｘＡと種々のＭＡＰ構築物との間のリンカー領域は太字のイタリック体で示されている。ＡＰ１およびＡＰ１７内の残基を交換するために導入された、対応するＭＡＰ１およびＭＡＰ１７内のアミノ酸残基は、太字の二重下線で強調されている。
【図８Ｄ】図８は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）において発現させた全てのＴｒｘＡ−ＭＡＰ構築物のアミノ酸配列を示す。ＴｒｘＡ（ＣＧＰＣ）の活性部位はイタリック体で示されており、ディスインテグリンループの先端のトリペプチドモチーフには下線が引かれており、ＴＥＶ切断認識部位は囲み枠で強調されており、ＴｒｘＡと種々のＭＡＰ構築物との間のリンカー領域は太字のイタリック体で示されている。ＡＰ１およびＡＰ１７内の残基を交換するために導入された、対応するＭＡＰ１およびＭＡＰ１７内のアミノ酸残基は、太字の二重下線で強調されている。
【図８Ｅ】図８は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）において発現させた全てのＴｒｘＡ−ＭＡＰ構築物のアミノ酸配列を示す。ＴｒｘＡ（ＣＧＰＣ）の活性部位はイタリック体で示されており、ディスインテグリンループの先端のトリペプチドモチーフには下線が引かれており、ＴＥＶ切断認識部位は囲み枠で強調されており、ＴｒｘＡと種々のＭＡＰ構築物との間のリンカー領域は太字のイタリック体で示されている。ＡＰ１およびＡＰ１７内の残基を交換するために導入された、対応するＭＡＰ１およびＭＡＰ１７内のアミノ酸残基は、太字の二重下線で強調されている。
【図８Ｆ】図８は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）において発現させた全てのＴｒｘＡ−ＭＡＰ構築物のアミノ酸配列を示す。ＴｒｘＡ（ＣＧＰＣ）の活性部位はイタリック体で示されており、ディスインテグリンループの先端のトリペプチドモチーフには下線が引かれており、ＴＥＶ切断認識部位は囲み枠で強調されており、ＴｒｘＡと種々のＭＡＰ構築物との間のリンカー領域は太字のイタリック体で示されている。ＡＰ１およびＡＰ１７内の残基を交換するために導入された、対応するＭＡＰ１およびＭＡＰ１７内のアミノ酸残基は、太字の二重下線で強調されている。
【図８Ｇ】図８は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）において発現させた全てのＴｒｘＡ−ＭＡＰ構築物のアミノ酸配列を示す。ＴｒｘＡ（ＣＧＰＣ）の活性部位はイタリック体で示されており、ディスインテグリンループの先端のトリペプチドモチーフには下線が引かれており、ＴＥＶ切断認識部位は囲み枠で強調されており、ＴｒｘＡと種々のＭＡＰ構築物との間のリンカー領域は太字のイタリック体で示されている。ＡＰ１およびＡＰ１７内の残基を交換するために導入された、対応するＭＡＰ１およびＭＡＰ１７内のアミノ酸残基は、太字の二重下線で強調されている。
【図８Ｈ】図８は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）において発現させた全てのＴｒｘＡ−ＭＡＰ構築物のアミノ酸配列を示す。ＴｒｘＡ（ＣＧＰＣ）の活性部位はイタリック体で示されており、ディスインテグリンループの先端のトリペプチドモチーフには下線が引かれており、ＴＥＶ切断認識部位は囲み枠で強調されており、ＴｒｘＡと種々のＭＡＰ構築物との間のリンカー領域は太字のイタリック体で示されている。ＡＰ１およびＡＰ１７内の残基を交換するために導入された、対応するＭＡＰ１およびＭＡＰ１７内のアミノ酸残基は、太字の二重下線で強調されている。
【図９】図９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ宿主におけるＴｒｘ−ＭＡＰ２（ＭＡＰ２−チオレドキシン融合ポリペプチド）、Ｔｒｘ−ＭＡＰ７（ＭＡＰ７−チオレドキシン融合ポリペプチド）、Ｔｒｘ−ＭＡＰ８（ＭＡＰ８−チオレドキシン融合ポリペプチド）、およびＴｒｘ−ＭＡＰ９（ＭＡＰ９−チオレドキシン融合ポリペプチド）の発現レベルを示す。レーンは、左から右に、ＰａｇｅＲｕｌｅｒＴＭＰｌｕｓ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）、Ｔｒｘ−ＭＡＰ２で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細胞からの溶解物、Ｔｒｘ−ＭＡＰ７で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細胞からの溶解物、Ｔｒｘ−ＭＡＰ８で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細胞からの溶解物、およびＴｒｘ−ＭＡＰ９で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）からの溶解物を示す。形質転換体は全て、最初に３種の抗生物質（カルベニシリン、カナマイシンおよびテトラサイクリン）の上に播いたが、カルベニシリンのみの下でさらに増殖させ、誘導した。
【図１０】図１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ宿主におけるＴｒｘ−ＭＡＰ１０（ＭＡＰ１０−チオレドキシン融合ポリペプチド）、Ｔｒｘ−ＭＡＰ１２（ＭＡＰ１２−チオレドキシン融合ポリペプチド）、Ｔｒｘ−ＭＡＰ１５（ＭＡＰ１５−チオレドキシン融合ポリペプチド）、およびＴｒｘ−ＭＡＰ１７（ＭＡＰ１７−チオレドキシン融合ポリペプチド）の発現レベルを示す。レーンは、左から右に、ＰａｇｅＲｕｌｅｒＴＭＰｌｕｓ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）、Ｔｒｘ−ＭＡＰ１０で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細胞からの溶解物、Ｔｒｘ−ＭＡＰ１２で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細胞からの溶解物、Ｔｒｘ−ＭＡＰ１５で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細胞からの溶解物、およびＴｒｘ−ＭＡＰ１７で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）からの溶解物を示す。形質転換体は全て、最初に３種の抗生物質（カルベニシリン、カナマイシンおよびテトラサイクリン）の上に播いたが、カルベニシリンのみの下でさらに増殖させ、誘導した。
【図１１】図１１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ宿主におけるＴｒｘ−ＭＡＰ１９（ＭＡＰ１９−チオレドキシン融合ポリペプチド）、Ｔｒｘ−ＭＡＰ２３（ＭＡＰ２３−チオレドキシン融合ポリペプチド）、Ｔｒｘ−ＭＡＰ２８（ＭＡＰ２８−チオレドキシン融合ポリペプチド）、およびＴｒｘ−ＭＡＰ３３（ＭＡＰ３３−チオレドキシン融合ポリペプチド）の発現レベルを示す。レーンは、左から右に、ＰａｇｅＲｕｌｅｒＴＭＰｌｕｓ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）、Ｔｒｘ−ＭＡＰ１９で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細胞からの溶解物、Ｔｒｘ−ＭＡＰ２３で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細胞からの溶解物、Ｔｒｘ−ＭＡＰ２８で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細胞からの溶解物、およびＴｒｘ−ＭＡＰ３３で形質転換したＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）からの溶解物を示す。形質転換体は全て、最初に３種の抗生物質（カルベニシリン、カナマイシンおよびテトラサイクリン）の上に播いたが、カルベニシリンのみの下でさらに増殖させ、誘導した。
【図１２】図１２は、図に示されている種々のＴｒｘ−ＭＡＰの、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳がん）への結合の、フローサイトメトリーによる検出を示す。
【図１３】図１３は、図に示されている種々のＴｒｘ−ＭＡＰの、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳がん）の骨ホーミングサブクローンへの結合の、フローサイトメトリーによる検出を示す。
【図１４】図１４は、図に示されている種々のＴｒｘ−ＭＡＰの、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳がん）の脳ホーミングサブクローンへの結合の、フローサイトメトリーによる検出を示す。
【図１５】図１５は、図に示されている種々のＴｒｘ−ＭＡＰの、ジャーカット細胞（ヒトＴ細胞白血病細胞株）への結合の、フローサイトメトリーによる検出を示す。
【図１６】図１６は、ＭＡＰ９およびＭＡＰ１５の、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）への結合、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ヒト乳がん）への結合、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳がん）への結合、および多形神経膠芽腫がん幹細胞株（ＧＢＭ−ＣＳＣ）への結合の、フローサイトメトリーによる検出を示す。
【図１７】図１７は、１０ｎＭのＭＡＰ９またはＭＡＰ１５の存在下でのＨＵＶＥＣの管形成アッセイを示す。パネルＡ−無処置の対照；パネルＢ−１００μＭのスラミン；パネルＣ−１０ｎＭのＭＡＰ９；パネルＤ−１０ｎＭのＭＡＰ１５。細胞をＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭで染色し、共焦点顕微鏡を使用してイメージングした。イメージは全て、同じ倍率で取得した（スケールバー＝５０μｍ）。
【図１８】図１８は、他の抗がん処置（アバスチンおよびドセタキセル）と比較した、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植における、ＭＡＰ１５およびＭＡＰ１５のリポソーム処方物による処置による腫瘍の成長阻害（パネルＡ）および生存（パネルＢ）を示す。
【図１９】図１９は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植における、他の抗がん処置（アバスチンおよびドセタキセル）と比較した、ＭＡＰ１５のリポソーム処方物による処置および他の抗がん処置との組み合わせにおける、微小血管の阻害を、腫瘍血管新生アッセイの顕微鏡写真（パネルＡ）において、およびランダムな顕微鏡写真（パネルＢ）から微小血管の密度を定量化することによって示している。
【図２０】図２０は、ＡＤＡＭ１転写物に対応する核酸配列を示す。
【図２１】図２１は、ＡＤＡＭ２転写物に対応する核酸配列を示す。
【図２２】図２２は、ＡＤＡＭ３転写物、バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）１に対応する核酸配列を示す。
【図２３】図２３は、ＡＤＡＭ６転写物に対応する核酸配列を示す。
【図２４】図２４は、ＡＤＡＭ７転写物に対応する核酸配列を示す。
【図２５Ａ】図２５は、ＡＤＡＭ８転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図２５Ｂ】図２５は、ＡＤＡＭ８転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図２６Ａ】図２６は、ＡＤＡＭ９転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図２６Ｂ】図２６は、ＡＤＡＭ９転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図２７Ａ】図２７は、ＡＤＡＭ１０転写物に対応する核酸配列を示す。
【図２７Ｂ】図２７は、ＡＤＡＭ１０転写物に対応する核酸配列を示す。
【図２８Ａ】図２８は、ＡＤＡＭ１１転写物に対応する核酸配列を示す。
【図２８Ｂ】図２８は、ＡＤＡＭ１１転写物に対応する核酸配列を示す。
【図２９Ａ】図２９は、ＡＤＡＭ１２転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図２９Ｂ】図２９は、ＡＤＡＭ１２転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図３０】図３０は、ＡＤＡＭ１５転写物、バリアント６に対応する核酸配列を示す。
【図３１Ａ】図３１は、ＡＤＡＭ１７転写物に対応する核酸配列を示す。
【図３１Ｂ】図３１は、ＡＤＡＭ１７転写物に対応する核酸配列を示す。
【図３２】図３２は、ＡＤＡＭ１８転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図３３Ａ】図３３は、ＡＤＡＭ１９転写物に対応する核酸配列を示す。
【図３３Ｂ】図３３は、ＡＤＡＭ１９転写物に対応する核酸配列を示す。
【図３３Ｃ】図３３は、ＡＤＡＭ１９転写物に対応する核酸配列を示す。
【図３４】図３４は、ＡＤＡＭ２０転写物に対応する核酸配列を示す。
【図３５】図３５は、ＡＤＡＭ２１転写物に対応する核酸配列を示す。
【図３６Ａ】図３６は、ＡＤＡＭ２２転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図３６Ｂ】図３６は、ＡＤＡＭ２２転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図３６Ｃ】図３６は、ＡＤＡＭ２２転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図３６Ｄ】図３６は、ＡＤＡＭ２２転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図３７】図３７は、ＡＤＡＭ２３転写物に対応する核酸配列を示す。
【図３８Ａ】図３８は、ＡＤＡＭ２８転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図３８Ｂ】図３８は、ＡＤＡＭ２８転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図３９Ａ】図３９は、ＡＤＡＭ２９転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図３９Ｂ】図３９は、ＡＤＡＭ２９転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図４０】図４０は、ＡＤＡＭ３０転写物に対応する核酸配列を示す。
【図４１】図４１は、ＡＤＡＭ３２転写物に対応する核酸配列を示す。
【図４２Ａ】図４２は、ＡＤＡＭ３３転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図４２Ｂ】図４２は、ＡＤＡＭ３３転写物、バリアント１に対応する核酸配列を示す。
【図４３Ａ】図４３は、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３２、およびＡＤＡＭ３３ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図４３Ｂ】図４３は、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３２、およびＡＤＡＭ３３ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図４３Ｃ】図４３は、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３２、およびＡＤＡＭ３３ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図４３Ｄ】図４３は、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３２、およびＡＤＡＭ３３ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図４３Ｅ】図４３は、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３２、およびＡＤＡＭ３３ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図４３Ｆ】図４３は、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３２、およびＡＤＡＭ３３ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図４３Ｇ】図４３は、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３２、およびＡＤＡＭ３３ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本明細書では、ＭＡＰ（修飾されたＡＤＡＭ由来のポリペプチド）と称される独特な設計ポリペプチドのクラス、およびそれをコードする核酸が提供される。本明細書で使用される場合、ＭＡＰとは、ＡＤＡＭタンパク質のネイティブなディスインテグリンドメインの修飾された形態を指す。ＡＤＡＭをコードする核酸およびアミノ酸の配列の一覧については付属物を参照されたい。本明細書で使用される場合、本明細書では「ＡＰ」（「ＡＤＡＭ由来ポリペプチド」）と称することができる「ＡＤＡＭタンパク質のディスインテグリンドメイン」は、そのメタロプロテアーゼドメイン、システインリッチドメインおよびドメイン間のセグメントの全て、または実質的に全てを欠く、ＡＤＡＭのディスインテグリンドメインである。実質的に全てを欠くとは、残りのアミノ酸配列が、そのドメインの機能をもはや保持しないことを意味する。図１にＡＰの例が示されている。ＡＰのＮ末端は、ＣＤＣモチーフからＮ末端側に３位のアミノ酸残基で始まり、ＣＤＣのＮ末端側の最初のシステインの直前までである。ＡＰのＣ末端は、ＣＤＣモチーフから１２番目のシステイン残基のＣ末端側に１０位のアミノ酸残基で終わり、前記１２番目のシステイン残基のＣ末端側の次のシステインの直前までである。例外が２つある：（１）ＡＰ１のＣ末端は、ＣＤＣモチーフから１３番目のシステイン残基のＣ末端側の１０位のアミノ酸残基で終わり、前記１３番目のシステイン残基のＣ末端側の最初のシステインの直前までであり、（２）ＡＤＡＭ１７は、ＣＤＣモチーフではなくＣＤＰモチーフを有し、対応するＡＰ（ＡＰ１７）の末端が示されている。
【００２３】
「ＭＡＰ」は、ＡＰの「修飾された」形態であり、修飾は、本明細書に記載の有益な性質を実現するためのＡＰのアミノ酸配列の変更（複数可）を伴う。したがって、ＭＡＰは、通常ＡＰに存在する配列および対応するＡＤＡＭポリペプチドの配列と比較して、修飾された配列を有する。本明細書で使用される場合、「修飾された」とは、アミノ酸が欠失していることか、置換されていることか、または化学修飾されていることを意味し、ある実施形態では、修飾により、ドメイン間のジスルフィド結合の破壊がもたらされる。図２に例示的なＭＡＰが示されている。典型的な中程度のサイズのヘビ毒ディスインテグリンであるトリメスタチンとアラインメントしたＭＡＰ配列が示されている。全てのＭＡＰ構築物を、中程度のサイズのヘビ毒ディスインテグリンにならってモデリングし、それらの配列を、これらのネイティブなヘビ毒分子と同様に折りたたまれるように修飾した。ＭＡＰ（ＭＡＰ１７以外）は、対応するＡＰのＣＤＣモチーフのＣ末端側の最初のシステインおよび前記システインのＣ末端側の２つのアミノ酸ならびにトリペプチドモチーフのＣ末端側のシステインが欠失するように構築した。あるいは、ジスルフィド結合の形成を妨げるために、システイン残基を代替のアミノ酸で置換することができ、またはシステインアミノ酸残基を化学修飾することができる。アミノ酸置換は、保存的であり得、例えば、ＡＰのＣＤＣモチーフのＣ末端側の最初のシステインをセリン残基で置換することができ、システインのＣ末端側のアミノ酸残基を荷電アミノ酸で置換することができ、または、トリペプチドモチーフのＣ末端側のシステインを荷電アミノ酸で置換することができる。そのような変異による手法およびアミノ酸残基の化学的な修飾は当技術分野で周知である。化学的な修飾に関して、例としては、ジスルフィド結合の形成を妨げるために、アルキル化剤を使用してシステイン残基と反応させることがある。ＭＡＰ１０、ＭＡＰ１７、ＭＡＰ１８およびＭＡＰ３２以外、ＭＡＰは、ヘビ毒ディスインテグリンのネイティブなループと同様の１１アミノ酸のディスインテグリンループを提示する。ＭＡＰ１０は、１０アミノ酸のインテグリンループを提示し、ＭＡＰ１７、ＭＡＰ１８、およびＭＡＰ３２は、１２アミノ酸のディスインテグリンループを提示する。
【００２４】
ＭＡＰを、活性な可溶性のジスルフィドリッチポリペプチドの生成およびこれらの生成物についての高い発現収率の両方を支持する細菌系において、独立した生物活性のある分子として発現させ、さらに精製することができる。理論に縛られることを望むものではないが、ネイティブなＡＰから、ＭＡＰを、それらのネイティブなＡＤＡＭのコンフォメーションではなく、ヘビ毒ディスインテグリンの折りたたみをとり得るように設計した。ＭＡＰを、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ株において高収率で発現させ、哺乳動物細胞の表面受容体クラス（インテグリン）と、ネイティブなヘビ毒ディスインテグリンと同様の様式で相互作用することができる安定かつ活性な遊離のポリペプチドとしてさらに精製することができる。ＭＡＰは、ＭＡＰが由来する、ＡＤＡＭポリペプチド由来のＡＰまたはディスインテグリンドメインの活性の特性であるシグナル伝達性質のいくつかも保持し得る。例えば、保持される特性としては、ＡＤＡＭディスインテグリンドメインの、古典的なディスインテグリンループの外側に位置するアミノ酸残基を利用することによってインテグリン受容体に関与すると推定される能力に関連するシグナル伝達特質を挙げることができる。ＡＤＡＭの細胞機能は周知である［１〜５、３４］。
【００２５】
理論に縛られることを望むものではないが、典型的な中程度のサイズのヘビ毒ディスインテグリン（例えば、トリメスタチン、キストリン（Ｋｉｓｔｒｉｎ）、フラボリジン（Ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎ）など）を生じさせるＰＩＩ−クラスのＳＶＭＰは、上流のスペーサー領域とディスインテグリンドメインとの間の重要なジスルフィド架橋を形成することができず、したがって、ディスインテグリンドメインが開始する位置のすぐＮ末端側に位置する残基においてタンパク質分解性の攻撃が起こり、その結果、放出された中程度のサイズのディスインテグリンは、上流のスペーサー領域の部分を含有しない完全なディスインテグリンドメインであると考えられている。対照的に、長いサイズのヘビ毒ディスインテグリン（例えば、ビチスタチン、サルモシン３など）を生じさせるＰＩＩ−クラスのＳＶＭＰは、メタロプロテアーゼドメインと下流のスペーサー領域との間の重要なジスルフィド架橋を形成することができず、したがって、スペーサー領域のさらにＮ末端においてタンパク質分解性の攻撃が起こり、スペーサー領域の一部がＮ末端で遊離のディスインテグリンドメインに付着したより長いディスインテグリンが放出されると考えられている（図３における種々のディスインテグリンおよびディスインテグリンドメインの配列アラインメントを参照されたい）。さらに、ＰＩＩ−ＳＶＭＰが、より多くの変異および／または欠失を含有する場合、同じスペーサー領域においてだけではなく、ディスインテグリンドメインのＮ末端部分においてもジスルフィド架橋を形成することができず、ヘビ毒ディスインテグリンのより短いバリアントが放出されるとも考えられている（例えば、コントルトロスタチン（Ｃｏｎｔｏｒｔｒｏｓｔａｔｉｎ）と同様に二量体化する部分的に短縮されたディスインテグリンドメイン、または、まれな、エキスタチンまたはエリストスタチン（Ｅｒｉｓｔｏｓｔａｔｉｎ）と同様に非常に短縮されたポリペプチドのいずれか）。さらに、ほとんど全ての場合において、遊離のディスインテグリンドメインは、それらの分子のＣ末端側の半分において、ヘビ毒ディスインテグリンの特徴である保存された１１アミノ酸のディスインテグリンループを提示すると考えられている。
【００２６】
ヒトゲノムにおいて同定された２３種の異なるＡＤＡＭ転写物（そのうち３種は通常はタンパク質産物に翻訳されない偽遺伝子である）を、ヘビ毒ディスインテグリンの折りたたみ構造をとる本明細書に記載のコードされたＭＡＰを生み出すための基礎として使用した。
【００２７】
いくつかのＡＤＡＭ転写物は、いくつものアイソフォームをコードする。それにもかかわらず、異なるＡＤＡＭのアイソフォームの内側のディスインテグリンドメインの配列は保存されており、したがって、ＡＤＡＭタンパク質のヒトファミリー内には、２３種のみの異なるディスインテグリンドメインが存在する。組換えによって作出した場合、本発明のＭＡＰは、定義されたインテグリンセットと、高い親和性様式で相互作用することができる。この性質により、これらの変異体ポリペプチドが、臨床的な使用および治療的な使用のための広範なスペクトルのインテグリンリガンドになる。
【００２８】
他のヒトＡＤＡＭメンバーの転写物と同様に、非機能性の転写物は、組換え系において人工的に翻訳された場合に、新規の生物学的機能を有する活性なポリペプチドを生成し得る完全なディスインテグリン配列を含有する。ヒトＡＤＡＭのディスインテグリンドメインは、７６個から８６個のアミノ酸を有し（ＡＤＡＭ１のディスインテグリンドメインが最も短く、一方、ＡＤＡＭ１０のディスインテグリンドメインが最も長い）、例外が２つあり（ＡＤＡＭ１およびＡＤＡＭ１７）、これらは全てＡＤＡＭ足場の標準的なシステイン残基を１４個含有する（下記のヒトＡＤＡＭのアラインメントされた配列を参照されたい）。図１を参照されたい。その大部分がそれらのディスインテグリンループの先端にＲＧＤトリペプチドモチーフを含有する、血小板凝集インヒビターとして機能するように進化したヘビ毒ディスインテグリンとは異なり、ＡＤＡＭのディスインテグリンループは、それらの先端に非常に異なるトリペプチドモチーフを提示し、したがって、より広範な範囲のインテグリンに、それらのヘビ毒対応物とは異なる様式で関与することが予測される。実際、ＡＰのそれぞれは、インテグリン受容体の定義された独特のセットに結合し、したがって、独特の様式でシグナル伝達をすると考えられている（ディスインテグリンループの差異を例示しているＡＤＡＭおよびヘビ毒ディスインテグリンの配列アラインメントについて図３を参照されたい）。理論に縛られることを望むものではないが、２種以上のＭＡＰの組み合わせを使用して、特定の細胞型または細胞型についての疾患状態に特徴的な「インテグリンサイン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」を決定することができると考えられている。インテグリンサインとは、その細胞型またはその細胞型についての疾患状態に独特である細胞の表面上に存在するインテグリンの組み合わせを意味する。
【００２９】
ヒトＡＤＡＭ１５のディスインテグリンドメインは、そのディスインテグリンループ内にＲＧＤトリペプチドモチーフを含有し、これは、ヒトＡＤＡＭ１５が心臓血管系において重要な調節の役割を果たすという仮説を支持する。このＡＤＡＭ１５のＲＧＤトリペプチドモチーフは、図１のＡＰ１５に示されている。
【００３０】
２３種の公知のヒトＡＤＡＭのメンバーの全てのＡＰ部分のそれぞれについて、ＭＡＰを生成した。ヒトＡＤＡＭディスインテグリンドメイン配列を、上記の理論的根拠に従って修飾した。修飾は、通常、ネイティブなＡＤＡＭタンパク質におけるドメイン間−ディスインテグリンドメインのジスルフィド架橋の形成に関与するＡＤＡＭディスインテグリンドメイン内の残基（システイン残基を２つ含むものにおいて）を除去することを含む。理論に縛られることを望むものではないが、これらのジスルフィド架橋の見かけの機能は、ディスインテグリンループをＡＤＡＭ内に緊密にパックしたままにして、インテグリン受容体が利用できないようにすることである。これらのジスルフィド架橋の形成に関与する残基を、例えば、欠失などによって修飾することにより、これらのＭＡＰが、ヘビ毒ディスインテグリンの標準的な１１アミノ酸のループの移動性およびディスインテグリンの折りたたみ特性を獲得する。長いサイズのヘビ毒ディスインテグリンおよび中程度のサイズのヘビ毒ディスインテグリンとアラインメントした場合、ならびにＰＩＩＩ−クラスのＳＶＭＰとアラインメントした場合、ヒトＡＤＡＭの２３種のメンバーの中で、６種のメンバーが上記のスキームに完全に適合する（ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２８およびＡＤＡＭ３３）（ヘビ毒ディスインテグリンおよびヒトＡＤＡＭディスインテグリンドメインのアラインメントについては図３を参照されたい）。それにもかかわらず、これらの修飾を導入することにより、４種のＡＤＡＭ（１０、１７、１８および３２）の例外を伴い、ヒトＡＤＡＭのメンバーの全てが、１１アミノ酸のディスインテグリンループを提示するＭＡＰに変換された。４種の例外に関しては、３種（ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８およびＡＤＡＭ３２）は、わずかに長い、１２アミノ酸のループを提示するＭＡＰに変換され、一方１種のメンバー（ＡＤＡＭ１０）は、わずかに短い、１０アミノ酸のディスインテグリンループを保有するＭＡＰに変換された（ＭＡＰ配列アラインメントについては図２のＡＰ１０を参照されたい）。さらに、２種のＡＰ（ＡＤＡＭ１およびＡＤＡＭ１７）の場合では、ヘビ毒ディスインテグリンドメインのシステインパターン特性を回復させるために、各配列内の１つの追加的なネイティブな残基をアルギニン残基（ＭＡＰ１を生成するため）またはシステイン残基（ＭＡＰ１７を生成するため）のいずれかと交換した（ＭＡＰ配列アラインメントについては図２を参照されたい）。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「ドメイン間領域」または「スペーサー領域」とは、ＡＤＡＭのメタロプロテアーゼとディスインテグリンドメインとの間のポリペプチド部分（「ＭＤドメイン間領域」）、およびディスインテグリンドメインとシステインリッチドメインとの間のポリペプチド部分（「ＤＣドメイン間領域」）のそれぞれを意味し、ＭＤドメイン間領域は、ＡＰのＮ末端側の少なくとも１０アミノ酸残基で始まり、ＤＣドメイン間領域は、ＡＰのＣ末端側の少なくとも１０アミノ酸残基で始まる。各ドメイン間の長さは５〜１５アミノ酸である。
【００３２】
２３種のＭＡＰ全てのＤＮＡ配列を、新規に合成し、ｐＥＴ３２ａ発現ベクター［３０］に、細菌チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）の下流にクローニングした。２００９年１１月１２日に出願された、名称が「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｒｉｄｇｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｙｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」であるＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６４２５６に記載の通り、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）細菌株にＭＡＰを産生させた。この出願では、キメラのヘビ毒ディスインテグリンビクロスタチン（Ｖｉｃｒｏｓｔａｔｉｎ（ＶＣＮ））をＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＥＴ３２ａ系において発現させることを実施形態として含む、米国特許出願公開第２００６０２４６５４１号に開示されている発現系に対する改善が記載されている。改善された方法を使用して、正しく折りたたまれた活性なＭＡＰの量を増加させた。これは、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ細胞を選択性の低い環境において成長させ、したがって、異種組換え型のタンパク質の産生を誘導する間に、より最適なレドックス環境を示すＶＣＮ形質転換体の生成および増大を可能にすることによって実現された。他のＥ．ｃｏｌｉ株とは異なり、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける２つの主要な酸化還元経路の制御に決定的に関与する２つの重要な遺伝子、チオレドキシン還元酵素（ｔｒｘＢ）およびグルタチオン還元酵素（ｇｏｒ）に変異を保有させることによって、この細菌の細胞質内の微小環境が、タンパク質におけるジスルフィド架橋の形成に対する触媒状態である、より酸化的なレドックス状態に人工的にシフトしているという点で独特である［１８、２９］。
【００３３】
Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ株は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ株を用いて得られる成長速度およびバイオマス収率と同様の成長速度およびバイオマス収率を有し、これにより、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ株が、ＶＣＮのような、発現させることが難しい組換えタンパク質についての魅力的かつスケーラブルな産生の代替になる。この株は、ＢＬ２１のｌａｃＺＹ変異体からも得られる。ＢＬ２１のｌａｃＹ１欠失変異体（元のＴｕｎｅｒ株）により、培養物中の全ての細胞によるタンパク質の発現のレベルを調整可能にすることができる。ｌａｃ透過酵素（ｌａｃＹ１）変異により、ＩＰＴＧ（ラクトース誘導体）を集団内の全ての細胞に均一に入れることが可能になり、これにより、制御された、より均一な誘導がもたらされる。ＩＰＴＧの濃度を調整することにより、標的タンパク質の発現を最適化することができ、有意に低いレベルのＩＰＴＧで理論的に最大のレベルを実現することができる。したがって、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂは、ＢＬ２１（ｏｍｐＴおよびｌｏｎプロテアーゼを欠損している）宿主、Ｔｕｎｅｒ（ｌａｃＺＹ変異体）宿主およびＯｒｉｇａｍｉ（ｔｒｘＢ／ｇｏｒ変異体）宿主の望ましい特性を１つの株内で併せ持つ。上記の通り、チオレドキシン還元酵素（ｔｒｘＢ）とグルタチオン還元酵素（ｇｏｒ）の両方の変異により、細胞質におけるジスルフィド結合の形成が大きく促進される［２９］。
【００３４】
Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ株により、ＢＬ２１のような細胞質内環境が還元性であるＥ．ｃｏｌｉ株を超える明らかな利点が提供されるが（図４および５に、株間の発現レベルの比較が示されている）、単にＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ株およびｐＥＴ３２ａ発現ベクターを使用することでは、可溶性かつ／または活性な産物が生成されることは自動的には保証されない。Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂにおけるジスルフィドリッチポリペプチドの生成は、配列依存的であると思われる。例えば、ＭＡＰ（例えば、ＭＡＰ９およびＭＡＰ１５）は、同じ系および産生技法を使用したという事実にもかかわらず、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂにおいて、それらの対応するヒトＡＤＡＭ９およびＡＤＡＭ１５のＡＰバージョンと比較して有意に高い発現収率で発現させることができる（図４および５）。したがって、ＡＰを修飾してＭＡＰにした結果、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ細胞における発現収率がより高いディスインテグリンドメインを有するポリペプチドがもたらされ得る。
【００３５】
さらに、ＡＤＡＭ９およびＡＤＡＭ１５の発現したディスインテグリンドメイン（ＡＰ）をＴＥＶプロテアーゼ処理およびＲＰ−ＨＰＬＣ精製を伴うプロセスで精製した後、収集される遊離のポリペプチドは、不安定であり、凍結乾燥した粉末から再構成した後に溶液から沈殿するようである。対照的に、同じ精製ステップを用いることによって生成した対応するＭＡＰポリペプチドは、凍結乾燥した後に水で再構成した際に、より可溶性かつ安定であるようである。
【００３６】
本発明のＭＡＰは、実質的に単離または実質的に精製されるように調製する。本明細書で使用される場合、ＭＡＰに関して、「実質的に精製された」（または単離された）という用語は、絶対的な純度を必要としない。その代わりに、ＭＡＰは、好ましくは５０％超純粋であるか、より好ましくは少なくとも７５％純粋であるか、および最も好ましくは少なくとも９５％純粋であるか、少なくとも９９％純粋であるか、最も好ましくは１００％純粋であるという指標を表す。ＭＡＰは、本明細書に記載の通り、合成的に調製することができ、または組換え発現によって調製することができる。
【００３７】
「実質的に」という用語は、本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、プラス１０％またはマイナス１０％を意味する。
【００３８】
ＭＡＰを含有する薬学的組成物は、最低でも、所望の効果（例えば、がんの成長を阻害するか、またはがんの転移を妨げるかもしくは阻害する）を実現するために有効な量のＭＡＰを含むべきであり、また、緩衝剤、塩、および／または適切なキャリアもしくは賦形剤を含む。一般に、これらの組成物中、ＭＡＰは、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇ、および最も好ましくは１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇをもたらすために十分な量で存在する。
【００３９】
ＭＡＰは、それを被験体の体内（例えば、血流内）に相当量で送達するために適した、種々のこれまでに公知の手段によって投与することができる。現在、適切な液体ビヒクルまたは賦形剤中のＭＡＰを静脈内投与することが、好ましい投与経路であると考えられている。ＭＡＰは水溶性であり、したがって、適切な水溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）において有効に投与することができる。あるいは、ＭＡＰは、経口的に（適切な結合剤材料または賦形剤材料を用いて処方した錠剤またはカプセル剤の形態で、あるいは水性または油性の懸濁物、溶液、乳剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形態で）、または非経口的な懸濁物として投与することができる。ＭＡＰは、動脈内または管内に送達することもでき、または意図された作用部位に局所的に導入することができる。当技術分野で周知の通り、アジュバントまたは賦形剤、例えば、局所麻酔薬、保存料、緩衝剤、潤滑剤、湿潤剤、着色料、矯味矯臭薬、充填剤および希釈剤などを、任意のこれらの処方物に適切に含めることができる。
【００４０】
ＭＡＰは、リポソームによって送達することができる。リポソーム送達は、当技術分野で周知であり、ディスインテグリンの送達について記載されている。例えば、Ｓｗｅｎｓｏｎらは、乳がんの療法のための、リポソームに入れたコントルトロスタチンの静脈内送達の使用について記載している［２６］。
【００４１】
ＭＡＰ、例えば、ＭＡＰ９などは血管新生促進（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）効果を示す（以下を参照されたい）。理論に縛られることを望まないが、これは、ＡＤＡＭファミリーのメルトリンクラスのメンバー（ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１２、およびＡＤＡＭ１９）のより一般的な特性を示し得る。メルトリンは、筋肉細胞の分化誘導の過程において発現され、そこで、細胞融合および他のプロセスに関与し、新生血管の安定化において重要な役割を果たし得ることが最初に記載された間葉系のＡＤＡＭである［３３］。したがって、ＡＤＡＭタンパク質のメルトリンクラスに由来する組換え型のポリペプチドを、疾患、例えば、冠動脈疾患（ＣＡＤ）または他の虚血性の状態などにおいて、新しい毛細管網目構造の形成を刺激し、側副毛細血管の成長を維持するために治療的に使用することができる。したがって、例えば、ＭＡＰは、ステントを利用するＣＡＤおよび関連疾患の療法において使用するために、ステントをコーティングすること、またはステントに化学的にカップリングさせることができる。
【００４２】
ＭＡＰを、薬物、毒素、放射性核種などと直接または間接的に結合体化し、これらの結合体を診断または治療への適用ために使用することもできる。例えば、ＭＡＰを使用して、関連のインテグリンを発現している組織または器官を同定または処置することができる。ＭＡＰまたはその生物活性のある断片もしくは部分を、検出可能な分子または細胞傷害性分子とカップリングさせ、１つまたは複数の関連のインテグリンを発現している細胞、組織または器官を有する哺乳動物に送達することができる。
【００４３】
適切な検出可能な分子を、ＭＡＰに直接または間接的に付着させることができ、その適切な検出可能な分子としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子などが挙げられる。適切な細胞傷害性分子を、ポリペプチドまたは抗体に直接または間接的に付着させることができ、その適切な細胞傷害性分子としては、細菌毒素または植物毒素（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、リシン、アブリンなど）、ならびに治療的な放射性核種、例えば、ヨウ素−１３１、レニウム−１８８またはイットリウム−９０などが挙げられる（ポリペプチドまたは抗体に直接付着させるか、または、例えば、キレート化部分によって間接的に付着させる）。ＭＡＰは、細胞傷害性薬物、例えば、アドリアマイシンなどと結合体化することもできる。検出可能な分子または細胞傷害性分子を間接的に付着させるために、検出可能な分子または細胞傷害性分子を、補体／抗補体対のメンバーと結合体化することができ、ここで、他方のメンバーはポリペプチドまたは抗体部分に結合する（ビオチン／ストレプトアビジンなど）。
【００４４】
開示された組成物は、内皮細胞の機能障害に関連する疾患を処置するために、単独で、または組み合わせで使用することができる。ある実施形態では、開示された組成物は、がん処置のために有用である。がんは上皮起源のものであってよい。がんは、乳がん、結腸直腸がん、基底細胞がん、腺がん、胃腸がん、例えば、口唇がん、口腔がん、食道がん、小腸がんおよび胃がんなど、結腸がん、肝がん、膀胱がん、膵がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、および皮膚がん、例えば、扁平上皮細胞がんおよび基底細胞がんなど、前立腺がん、腎細胞がん、中枢神経系（ＣＮＳ）のがん、白血病ならびに全身の上皮細胞に影響を及ぼす他の公知のがんであってよい。理論に縛られることを望むものではないが、がんの多くの形態において、ＡＤＡＭ（膜に繋ぎ止められた形態および／または分泌された形態）とそれらのインテグリン対受容体（ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）との間に、がんが進行するために機構的に重要なプロセスである病原性のクロストークが存在する。これらの病理学的な相互作用は、がんにおける、腫瘍の進行における以下のいくつかの重要なインテグリン駆動ステップを実行するプロセスにおいて、高度に遊走性の細胞（がん細胞、炎症細胞または内皮細胞）によって組み立てられる多タンパク質複合体（すなわち、インバドソーム（ｉｎｖａｄｏｓｏｍｅ））にインテグリンを介してＡＤＡＭのメタロプロテイナーゼをリクルートする働きをする：重要な支持的な役割を果たすことが示されている炎症細胞による腫瘍間質の浸潤、腫瘍血管新生に関連する遊走性のステップ（ここで、既存の血管由来の内皮細胞は、新生血管を組み立てるためにリクルートされる）、および、最後に、転移に関連する遊走性かつ侵襲的な事象。これらの病理学的プロセスをＭＡＰによって破壊することにより、悪性腫瘍が縮小する。それらの、抗血管新生効果、抗炎症効果および抗転移効果の潜在性に加えて、広範なスペクトルの抗インテグリンＭＡＰは、腫瘍の分化にも影響を与える可能性がある。がん幹細胞に正しい分化シグナルを送る能力は、がん療法の主要な目標の１つのままである（療法の過程において、より安定かつ分化した表現型を獲得させることによる）。例えば、Ｙｕａｎらにより、ヒト多形神経膠芽腫（脳がんの非常に侵攻性の形態）から単離した幹細胞特性を有する細胞集団を操作して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させ、より良性の特徴をとるようにすることができることが示された［３２］。可溶性のインテグリンリガンド（例えば、単一のＭＡＰまたはＭＡＰの組み合わせ）によって分化シグナルがもたらされ、種々のヒト悪性腫瘍のがん幹細胞を、それらの分化系列に完全にコミットさせ（ｃｏｍｍｉｔ）、分化したままになるように誘導することができる。
【００４５】
本発明の組成物は、候補化合物を、ＭＡＰ特異的結合について、ＭＡＰの存在下および非存在下で、前記候補化合物のインテグリンへの相対的な結合を比較することによってスクリーニングするためにも使用することができ、ここで、前記ＭＡＰの存在下でインテグリンの結合が減少することは、前記ＭＡＰ特異的インテグリン結合性分子がＭＡＰ特異的であることを示す。
【００４６】
本発明の組成物は、がん細胞によって提示される特異的な「インテグリンサイン」を利用することによって、がんを早期検出するために使用することができる。「インテグリンサイン」または「インテグリンプロファイル」は、細胞の表面で発現される１つまたは複数のインテグリンである。例えば、がんおよび肉腫は、腫瘍の分化および器官への局在化の状態に基づいて、特異的な「インテグリンサイン」を提示し得る。インテグリンサインに基づいて種々のがんの種類を同定し、診断するために、ＭＡＰに特異的な結合を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるがんイメージング剤（診断的なイメージング）および／またはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍検体を染色するための分子ツール（診断的な病理学的方法）として用いることができる。後者の場合、がん検体を様々なＭＡＰで染色することにより、種々の腫瘍の起源および悪性度分類に応じた特徴的な染色パターンを導くことができる。本発明の組成物は、がんを病期分類するため、がんの進行または療法をモニターするために使用することができる。がんは上皮起源のものであってよい。がんは、乳がん、結腸直腸がん、基底細胞がん、腺がん、胃腸がん、例えば、口唇がん、口腔がん、食道がん、小腸がんおよび胃がんなど、結腸がん、肝がん、膀胱がん、膵がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、および皮膚がん、例えば、扁平上皮細胞がんおよび基底細胞がんなど、前立腺がん、腎細胞がん、ならびに全身の上皮細胞に影響を及ぼす他の公知のがんであってよい。ＭＡＰは、公知のインテグリン親和性を有するＭＡＰが、特定の固形腫瘍のそれぞれの特異的なインテグリンの発現に基づいて、原発腫瘍、転移性の病巣、ならびに腫瘍の新脈管構造（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）に異なって結合する独特の能力を活用するために、ＰＥＴ（陽電子放出断層撮影法）プローブと一緒に使用することができる。例えば、ＭＡＰは、Ｎ−スクシンイミジル−４−１８Ｆ−フルオロベンゾエート（１８Ｆ−ＳＦＢ）を最適化されたフッ素化反応条件下で用いることによって、アミノ基を通じて１８Ｆで標識することができ、または、金属キレート化剤であるＤＯＴＡ／ＮＯＴＡと結合体化することによって６４Ｃｕ／６８Ｇａで標識することができる。さらに、蛍光標識したＭＡＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、およびｅｘ  ｖｉｖｏで（生検検体上で）、腫瘍インテグリンの発現プロファイル分析のために使用することができる。
【００４７】
本発明の組成物は、再生医療における分子ツールとして利用することもできる。例えば、人工的なＥＣＭ足場（器官の型）をＭＡＰまたはＭＡＰの組み合わせでコーティングすることにより、幹細胞前駆体を誘導してこれらの足場に配置し、望ましい上皮の層および間葉系の層に分化させることができる。例えば、そのような１つまたは複数のＭＡＰを含有する組成物でコーティングした膀胱の足場を使用して、幹細胞前駆体を尿路上皮および筋層の両方にコミットするように向かわせることができる。他の例としては、そのような１つまたは複数のＭＡＰを含有する組成物でコーティングした食道の足場および直腸の足場を使用して、幹細胞前駆体を関連する組織層にコミットするように向かわせることができることが挙げられる。本発明の組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚性幹細胞の成長を支持し、その幹細胞性を維持すること、または同じ系において、これらの全能性細胞がそれらの分化系列にコミットすることをガイドすること、ができる定義された組織培養プレートのコーティングを生み出すためにも使用することができる。
【００４８】
本発明の組成物は、種々の虚血性の状態において、毛細血管の側副成長を支持するための新規の薬物、例えば、薬物溶出ステントなどとして使用することができる。例えば、ＭＡＰは、放射性核種、例えば、ベータ線放射性核種などと結合体化して、再狭窄を低下させることができる。そのような治療的手法は、放射性の療法を施す臨床医への危険が少ない。
【実施例】
【００４９】
（実施例１）
ＭＡＰの調製および精製
図６は、ｐＥＴ３２ａ発現ベクターにクローニングした合成のＭＡＰのＤＮＡ配列の一覧を示す。図７は、ＭＡＰをｐＥＴ３２ａベクターにクローニングするために利用した、対応するオリゴヌクレオチドプライマーの一覧を示す。図８は、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）において発現させた全てのＴｒｘＡ−ＭＡＰ構築物のアミノ酸配列を示す。ＴｒｘＡの活性部位およびディスインテグリンループの先端のトリペプチドモチーフに下線が引かれており、ＴＥＶ切断部位が囲み枠で強調されており、ＴｒｘＡと種々のＭＡＰ構築物との間のリンカー領域が黒い太字のイタリック体で示されている。ＭＡＰ１およびＭＡＰ１７のネイティブな残基と交換するために導入した新しい残基が、太字の二重下線で強調されている。
【００５０】
細菌細胞および試薬。Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ株および細菌チオレドキシンＡ遺伝子（ｔｒｘＡ）を保有するｐＥＴ３２ａ発現ベクターは、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。２３種のＭＡＰ全てのＤＮＡ配列は、Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｇａｒ  Ｌａｎｄ、ＴＸ）によって新規に合成され、プラスミドに挿入された。ＡＰのＤＮＡ配列は、ＨＵＶＥＣ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、およびジャーカット（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を含めたいくつかの哺乳動物の細胞系から作製したｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した。ＡＰのＤＮＡ配列およびＭＡＰのＤＮＡ配列をｐＥＴ３２ａ発現ベクターにさらにクローニングするために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によって合成された。ＡＰのＤＮＡ配列およびＭＡＰのＤＮＡ配列をｐＥＴ３２ａ発現ベクターにクローニングするために使用した制限酵素およびリガーゼは全て、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から購入した。組換えＴＥＶプロテアーゼは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。
【００５１】
ＭＡＰ発現ベクターの構築および組換え産生。ｐＥＴ３２ａ発現ベクターに、ＴｒｘＡの下流においてクローニングした合成のＭＡＰのＤＮＡ配列が図６Ａ〜Ｆに列挙されている。ＭＡＰをクローニングするために使用したオリゴヌクレオチドプライマーが図７Ａ〜Ｂに列挙されている。生成した、ＴｒｘＡ遺伝子の下流にＭＡＰのＤＮＡ配列がクローニングされたｐＥＴ３２ａプラスミドを、最初にＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉにおいて増幅し、精製し、配列決定した後、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉに移入した。次いで、各ＭＡＰ構築物について形質転換された細胞を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍＬ）、およびカナマイシン（１５μｇ／ｍＬ）を補充したＬＢ寒天に播き、３７℃で一晩成長させた。これらのプレートから、形質転換されたＯｒｉｇａｍｉ  Ｂの個々のコロニー由来の各ＭＡＰ構築物について、これらのコロニーを、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地に移すことによって、複数の培養物を確立した。これらの最初の培養物を一晩成長させ、さらに、より大きな容積のカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地に接種するために使用し、それをシェーカーインキュベーター内、３７℃、２５０ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．６〜１に到達するまで成長させた。この時点で、個々のＭＡＰ培養物由来の細胞を、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導し、さらに４〜５時間、３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。誘導期間の最後に、個々のＭＡＰ培養物由来の細胞を、４０００×ｇでペレットにし、マイクロフルダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍ−１１０Ｌ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）で溶解した。マイクロフルダイザーの作動条件は、適用圧力が１４，０００〜１８，０００ｐｓｉであること、細菌のスラリー流速が１分当たり３００〜４００ｍｌであること、およびスラリーを、プロセッサを複数回通過させることを含んだ。個々のＭＡＰ培養物から処理された溶解物由来の不溶性の細胞の破片を、遠心分離によって（４０，０００×ｇ）除去し、各ＭＡＰ培養物について、Ｔｒｘ−ＭＡＰを含有する可溶性の材料を収集した。次いで、収集した可溶性の溶解物中の発現された融合タンパク質（すなわち、Ｔｒｘ−ＭＡＰ）を、組換えＴＥＶプロテアーゼと一緒に室温で一晩インキュベートすることによって、タンパク質分解し、それによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターされた通り、個々のＭＡＰが、そのＴｒｘＡ融合パートナーから効率的に切断された。タンパク質分解が完了したら、タンパク質分解された溶解物を、０．２２μｍのフィルターを通過させ、２回蒸留したＨ２Ｏにおいて１：１００に希釈し、５０，０００ＭＷＣＯのカートリッジ（Ｂｉｏｍａｘ５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して限外濾過し、次いで、接線流限外濾過デバイス（Ｌａｂｓｃａｌｅ  ＴＦＦ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して５，０００ＭＷＣＯのカートリッジ（Ｂｉｏｍａｘ５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に対して再濃縮した。
【００５２】
ＭＡＰについて上記されているのと同じ手順を用いて、ＡＰをｐＥＴ３２ａにクローニングし、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂに導入して形質転換し、発現させた。
【００５３】
組換えＭＡＰの精製。ＭＡＰを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）手順を、ヘビ毒ディスインテグリンに対して以前確立されたプロトコールに従って用いることによって、濾過された溶解物から精製した［２］。ネイティブなＣＮを精製するために以前使用された標準の溶出条件を用いて、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによって精製を実施した［２］。上記の通り処理した個々の濾過された溶解物を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（２１８ＴＰ５４、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）にローディングした。カラムを、０．１％のＴＦＡを含有する水溶液で１０分間リンスし（１分当たり５ｍｌ）、その後、８０％のアセトニトリルおよび０．１％のＴＦＡを含有する移動相において、直線勾配（０〜１００％）で１５０分にわたって溶出した。ＭＡＰは、３５〜４０％のアセトニトリルで溶出し始めた。
【００５４】
ＭＡＰの発現分析。振とうフラスコ中、３７℃で一晩成長させたＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を、１ｍＭのＩＰＴＧ中、３７℃、２５０ｒｐｍで５時間誘導した。誘導期間の最後に、細胞を４，０００×ｇでペレットにし、複数の凍結融解サイクルによって溶解し、さらに４０，０００×ｇで遠心分離して不溶性の細胞破片を除去した。種々のＥ．ｃｏｌｉ宿主由来の可溶性の細胞溶解物５μｌを、還元条件下で、プレキャスト４〜２０％のＮｕＳｅｐ  ｉＧｅｌ（ＮｕＳｅｐ  Ｉｎｃ．、Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ、ＧＡ）にローディングし、次いでクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色した。
【００５５】
得られたＡＰ９およびＡＰ１５の発現収率は、それらの対応するＭＡＰ（ＭＡＰ９およびＭＡＰ１５）と比較して低かった（図４および５）。ＭＡＰ９およびＭＡＰ１５はどちらも、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）において、細菌培養物１リットル当たりのＨＰＬＣ精製されたタンパク質が２００ｍｇから３５０ｍｇであるバッチ間の発現収率で生成した。これらの高収率の精製組換えＭＡＰは、誘導ステップの最後に、ペレットにした細菌の形質転換体を、マイクロフルダイザーを用いて溶解することによって実現された。同様の作出技法により、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）系において組換えＭＡＰを同様の発現収率で生成した（図９〜１１）。対照的に、同様にジスルフィド架橋の形成を支持する、密接に関連する細菌宿主におけるＭＡＰの発現によっては（例えば、ｔｒｘＢ変異のみを有するＫ１２誘導体であるＡＤ４９４（ＤＥ３）、または、まれなコドンの使用について最適化されたＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ誘導体であるＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３））、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）における産生に対する追加的な利点は提供されないと思われた。
【００５６】
（実施例２）
ＭＡＰの異なる細胞結合
上記の方法を用いてＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）において産生されたＴｒｘ−ＭＡＰを、複数の細胞株への異なる結合について、フローサイトメトリーによって分析した（図１２〜１５）。それは、ヒト乳がん株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、および異なるインテグリンプロファイルに基づく、異なる器官に対する向性を有するこの株の２つの転移性のサブクローン−骨−ホーミングサブクローン（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＢＯＮＥ）および脳−ホーミングサブクローン（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＢＲＡＩＮ）を含んだ。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１株の２種のサブクローンは、最初にそれらを単離した研究者からの寄贈品であった［３１］。細胞を、示されているＴｒｘ−ＭＡＰと一緒にインキュベートし、対応する抗Ｔｒｘポリクローナル抗血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて調べた。結合した分子を、抗ウサギＦＩＴＣ−標識した抗体を用いてさらに検出した。ＦＩＴＣで標識した二次抗体のみ、または抗Ｔｒｘ抗血清および二次抗体のいずれかと一緒にインキュベートした細胞を対照として使用した。様々な系列の免疫細胞で発現され、免疫応答に関与することが以前示された、ＡＤＡＭ８およびＡＤＡＭ２８に対応するＴｒｘ−ＭＡＰ８およびＴｒｘ−ＭＡＰ２８は、フローサイトメトリー分析によって示された通り、ジャーカット細胞（Ｔ細胞白血病細胞株）に優先的に結合する（図１５）。さらに、２つのＨＰＬＣによって精製したＭＡＰ（ＭＡＰ９およびＭＡＰ１５）をＦＩＴＣで標識し、がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５）、ヒト神経膠芽腫（ＧＢＭ−ＣＳＣ）から単離されたがん幹細胞集団［３２］、ならびにヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）への直接的な結合についてフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリーのデータ（図１６）は、精製されたＭＡＰ９およびＭＡＰ１５が、全く異なるインテグリンプロファイルを示すことが予測される、異なる細胞株に非常によく結合することを示している。
【００５７】
（実施例３）
ＭＡＰの抗血管新生効果
次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＨＵＶＥＣ管形成アッセイを用いて、ＭＡＰを血管新生活性について試験した。ＨＵＶＥＣ細胞を、１０ｎＭのＭＡＰ９またはＭＡＰ１５のいずれかの存在下で「内皮細胞管形成」プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に播いた。公知の管形成インヒビター（スラミン）を陰性対照として使用した。図１７を参照されたい：パネルＡ−無処置の対照；パネルＢ−１００μＭのスラミン；パネルＣ−１０ｎＭのＭＡＰ９；パネルＤ−１０ｎＭのＭＡＰ１５。細胞をＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭで染色し、共焦点顕微鏡を使用してイメージングした。イメージは全て、同じ倍率で取得した（スケールバー＝５０μｍ）。このアッセイにおいて、ＭＡＰ１５は有意な抗血管新生活性を示した。このアッセイにおいて、ＭＡＰ９は、無処置の対照と比較したときに、増加した数の管の形成を導くことによって血管新生促進効果を有すると思われた。このＭＡＰ９の血管新生促進効果は、ＭＡＰ９のリポソーム処方物をＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植の動物モデルにおいて静脈内に投与すると、腫瘍の成長が促進されること（すなわち、無処置の対照と比較して、速い腫瘍の成長、大きな腫瘍および生存の減少）を示すｉｎ  ｖｉｖｏにおける観察によって支持される。
【００５８】
図１８Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルにおける、様々な処置によって誘導される腫瘍の成長の阻害を示す。同所性に接種したヌードマウス（乳房の脂肪パッド；完全なマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）中、マウス１匹当たり２．５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）について、処置を開始する前に、触知できる腫瘍を成長させた（矢印によって示される）。動物の群（ｎ＝１０）に、ＬＭＡＰ１５を１回の注射当たり１００μｇのＭＡＰ１５の用量当量で週２回静脈内に投与する処置、または、アバスチン（１回の注射当たり４００μｇ；およそ２０μｇ／ｇｒ）を１週間に１回静脈内に投与する処置、または、ドセタキセル（ＤＴＸ、１６０μｇ）を１週間に１回腹腔内に投与する処置、またはこれらの作用剤の組み合わせの処置を行った。対照群には、空のリポソームのみを与えた。対照群と比較して、全ての処置群において腫瘍の成長に有意な遅延が観察された。統計分析を、ダネットの事後多重比較検定を用いたＡＮＯＶＡを使用して行った（＊は、Ｐ＜０．００１を示す）。図１８Ｂは、動物の生存データを示す。処置群は、対照群と比較して生存の増加を示した（対照の動物は全て７週目までに死亡した）。ＬＭＡＰ１５で処置した群またはＬＭＡＰ１５およびアバスチンで処置した群のいずれかの生存が最も高かった。この動物モデルからのｉｎ  ｖｉｖｏにおける効力データは、ＬＭＡＰ１５が、アバスチンまたはドセタキセルのいずれとも同様の抗腫瘍の効力を示すことを示している。リポソームＭＡＰ１５単独で処置した動物は、同じ異種移植モデルにおいてアバスチンもしくはドセタキセルのいずれかで処置した動物、または組み合わせ療法で処置した動物と比較して、良好な生存率（すなわち、試験終了時にまだ生存している動物の数）を示した。
【００５９】
（実施例４）
ＬＭＡＰ１５の抗血管新生効果
単独でまたは組み合わせて投与されたＬＭＡＰ１５の抗血管新生効果を評価するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１試験における各群からの腫瘍を、死亡した動物または屠殺した動物から解剖し、摘出し、その後、微小血管の密度について免疫組織学的検査によって分析した。摘出した腫瘍をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ（「Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ」化合物、Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ）に包埋し、次いで、ドライアイス中で凍結させ、５ミクロンの切片に切り、アセトン中に固定し、染色するまで４℃で貯蔵した。ＣＤ３１を染色するために、アセトンで固定したスライドをＰＢＳで洗浄し、５％ヤギ血清を含有するＰＢＳにおいてブロッキングし、次いで、ＰＢＳ中に１：５０に希釈したラットポリクローナル抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）２００μｌと一緒に室温で一晩インキュベートし、製造者のプロトコールに従ってスライドに適用した。この後、ＰＢＳ中で複数回洗浄し（１回の洗浄当たり７分間）、１：１００に希釈したビオチン化ヤギ抗ラット二次抗体２００μｌを加え、室温で４５分間適用した。ＰＢＳでさらに３回洗浄した後、２ｍｌのＰＢＳ中１滴に希釈したアビジン結合複合体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）２００μｌを各スライドに室温で３０分間適用し、その後、抗体で染色した微小血管を可視化するために、３−アミノ−９−エチルカルバゾール色素原を加えた。ＰＢＳでさらに３回洗浄した後、スライドを、Ｍｙｅｒｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎを用いて対比染色し、その後マウントした。ＣＤ３１で染色された微小血管を定量化するために、スライドを、「ランダム視野（ｒａｎｄｏｍ  ｆｉｅｌｄ）」分析［３５、３６］に供した。イメージを、顕微鏡に取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ  Ｅ２０Ｎデジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を使用して、２００×で、各スライドにおいてランダム視野から盲検的に取り込んだ。各群について、４つの腫瘍を染色し、４０のランダム視野を分析した。各ランダム視野についてＣＤ３１陽性領域を、「ＳｉｍｐｌｅＰＣＩ」高度イメージングソフトウェア（Ｃ−Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｒａｎｂｅｒｒｙ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ、ＰＡ）を使用して、染色された全面積の％としてコンピュータで計算し、次いで、各群について平均した。偏りを排除するために、ランダム視野のイメージを取り込み、その後、取り込んだイメージの処理および分析を盲検的に行った。ＬＭＡＰ１５は、単独療法として、または異なる作用機構を有する他の抗血管新生薬（例えば、アバスチン）もしくは化学療法薬（例えば、ドセタキセル）と組み合わせて投与されると、この異種移植モデルにおいて微小血管の密度を有意に低下させることが示された（図１９）。
【００６０】
（実施例５）
転移性乳がんモデル
ＭＡＰの抗侵襲薬／抗転移薬としての治療効果を評価するために、自然発生的な転移性乳がんのいくつかの動物モデルにおいて光学的なルシフェラーゼイメージング手法（ｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光）を使用する。以下の細胞株に、アデノウイルス形質導入系を安定に感染させた：ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子の両方を伴う、ヒト乳がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、トリプル陰性細胞株）および２種のマウス乳がん株（４Ｔ１、ＨＥＲ２陰性株、およびＤ２Ｆ２、ＨＥＲ２陽性株）。ヒト異種移植ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルでは、完全なマトリゲルに懸濁させた細胞２×１０６個の接種材料をヌードマウスの乳房の脂肪パッドに注射し、形成された腫瘍が触知できるまで成長させた（移植のおよそ２週間後）。以下の処置群（１群当たり動物５匹）を形成する：対照群１（処置または操作を受けない動物）、対照群２（空のリポソームを静脈内に与えた動物）、対照群３（ＰＢＳを静脈内に与えた動物）、処置群１（アバスチンを静脈内に与えた動物）、処置群２（ドセタキセルを腹腔内に与えた動物）、処置群３（静脈内へのアバスチンと腹腔内へのドセタキセルの組み合わせを与えた動物）、処置群４（ＭＡＰ１５を静脈内に与えた動物）、処置群５（ＭＡＰ１５のリポソーム処方物を静脈内に与えた動物）、処置群６（静脈内へのＭＡＰ１５、静脈内へのアバスチンおよび腹腔内へのドセタキセルの組み合わせを与えた動物）、および処置群７（静脈内へのＭＡＰ１５のリポソーム処方物、静脈内へのアバスチンおよび腹腔内へのドセタキセルの組み合わせを与えた動物）。処置は、以下の通り施す：アバスチンおよびドセタキセルは、以前に文献において、このモデルにおいて原発腫瘍および転移病巣に対して効果的であると報告された最大の投与量を用いて週に１回投与し、ＭＡＰ１５は、１回の注射当たりポリペプチド１００μｇの用量で１日おきに投与し、リポソームＭＡＰ１５は、１回の注射当たりポリペプチド１００μｇの用量当量で週２回投与する。
【００６１】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルと同様に、２つのマウス乳がんモデル（４Ｔ１モデルおよびＤ２Ｆ２モデル）においてもＭＡＰ１５の抗侵襲薬／抗転移薬としての効力を決定する。これらのモデルにおいて、ＰＢＳ中の細胞５×１０５個の接種材料（４Ｔ１またはＤ２Ｆ２）を免疫応答性のＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房の脂肪パッドに注射し、腫瘍が触知できるようになるまで成長させた（移植後およそ１〜１．５週間）。腫瘍が触知できるようになったら、以下の処置群（１群当たり動物５匹）について処置を開始する：対照群１（処置または操作を受けない動物）、対照群２（空のリポソームを静脈内に与えた動物）、対照群３（ＰＢＳを静脈内に与えた動物）、処置群１（アバスチンを静脈内に与えた動物）、処置群２（ラパチニブを静脈内に与えた動物）、処置群３（ハーセプチンを静脈内に与えた動物）、処置群４（アバスチン、ラパチニブおよびハーセプチンの組み合わせを静脈内に与えた動物）、処置群５（ＭＡＰ１５を静脈内に与えた動物）、処置群６（ＭＡＰ１５のリポソーム処方物を静脈内に与えた動物）、処置群７（ＭＡＰ１５、アバスチン、ラパチニブ、およびハーセプチンの組み合わせを静脈内に与えた動物）、および処置群８（ＭＡＰ１５のリポソーム処方物、アバスチン、ラパチニブ、およびハーセプチンの組み合わせを静脈内に与えた動物）。処置は、以下の通り施す：アバスチン、ラパチニブおよびハーセプチンは、以前に文献において、これらのモデルにおいて原発腫瘍および転移病巣に対して効果的であると報告された最大の投与量を用いて週に１回投与し、ＭＡＰ１５は、１回の注射当たりポリペプチド１００μｇの用量で１日おきに投与し、リポソームＭＡＰ１５は、１回の注射当たりポリペプチド１００μｇの用量当量で週２回投与する。
【００６２】
処置を開始する前、および処置を開始した後の、乳房の脂肪パッドおよび遠位の部位における腫瘍の成長を、全てのモデルにおいて、週に１回のＸｅｎｏｇｅｎ生物発光イメージングによってモニターする。原発腫瘍サイズも、カリパスによって測定し、体積を式：１×ｗ２×０．５に基づいて算出する。週に１回の生物発光（ルシフェラーゼ）イメージングのために、マウスに、ルシフェリン溶液（ＰＢＳ中１５ｍｇ／ｍＬまたは３０ｍｇ／ｋｇ、５〜５０ｍｇ／ｋｇの用量）を腹腔内経路によって注射し、約５〜１５分間、麻酔していない動物において分布させる。次いで、マウスを、妨げられることなく動物を目視検査し、それらの呼吸の状況をモニターすることを可能にする、透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓ麻酔箱（２〜４％のイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ））に置く。この設定では、麻酔を箱に供給する麻酔送達管を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  １００イメージング計器のイメージングチャンバーの内側に位置する麻酔多岐管に同じ濃度の麻酔が送達されるように分離する。マウスを完全に麻酔した後、マウスを麻酔箱からイメージングチャンバー内の多岐管に取り付けた麻酔ノーズコーン（ｎｏｓｅ  ｃｏｎｅ）に移し、扉を閉め、Ｘｅｎｏｇｅｎ計器を使用してイメージを取得する。イメージングの時間は、実験に応じて、面（背面／腹面）当たり１〜５分である。動物を背面から腹面に回転させる際（逆もまた同じ）、苦痛または生命力の変化の任意の徴候についてモニターする。取得したイメージを、対照および処置した腫瘍の部位におけるルシフェラーゼ活性のレベルを比較することによって、および各処置群における腫瘍からの発光に関連する曲線下分布面積を比較することによって評価する。上記の手法を用いることによって、原発腫瘍および生物発光の転移病巣に対するＭＡＰ１５の効力を決定する。動物の体重も週２回測定し、動物を、ストレス応答または倦怠感の任意の徴候について視覚的に観察する。障害の重篤な徴候を示した動物は実験から排除する。
【００６３】
これらの試験の終わりに（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルにおける処置の８週間後、および４Ｔ１モデルおよびＤ２Ｆ２モデルにおける処置の３週間後）、これらの腫瘍モデルにおいて原発腫瘍の成長を阻害すること、転移病巣の数およびサイズまたはその両方を低下させること、および動物の生存を延長することにおいて、ＭＡＰ１５が、単独で、試験した単独療法のいずれか（アバスチンまたはドセタキセルまたはラパチニブまたはハーセプチンのいずれか）と同じくらい効果的であるか、またはそれよりも効果的であるかの決定を行う。さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルにおいてアバスチンとドセタキセルと組み合わせて、または４Ｔ１モデルにおいてアバスチンとラパチニブと組み合わせて、またはＤ２Ｆ２モデルにおいてアバスチンとラパチニブとハーセプチンと組み合わせて投与すると、ＭＡＰ１５は、これらの腫瘍モデルにおいて原発腫瘍の成長を阻害すること、転移病巣の数およびサイズまたはその両方を低下させること、および生存を延長することにおいて、任意の単独療法または他の組み合わせよりも効果的であることが証明された。
【００６４】
（付属物）
ＡＤＡＭの核酸配列およびアミノ酸配列
ＡＤＡＭのＲＮＡ転写物に対応する核酸配列が図２０〜４２に提供されている。対応するＡＤＡＭポリペプチドのアミノ酸配列が図４３に提供されている。
【００６５】
特に定義されていなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００６６】
本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書において具体的に開示されていない、任意の要素、限定が存在しないところで適切に実施することができる。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、限定されることなく、広く読み取られるべきである。さらに、本明細書で使用される用語および表現は、説明する用語として使用され、限定するものではなく、また、そのような用語および表現の使用において、示され、記載されている特徴の等価物またはその部分のいずれも排除するものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲内で種々の改変が可能であることが理解される。
【００６７】
したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、当業者は、本明細書の開示の中で具体化される本発明の改変、改善および変形を行うことができること、およびそのような改変、改善および変形は、本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。本明細書で提供される材料、方法および実施例は、好ましい実施形態を表し、例示的であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６８】
本明細書では、本発明が広範かつ一般的に記載されている。包括的な開示の範囲に入る狭義の種および下位のグループ分けのそれぞれも本発明の一部を形成する。これは、削除される材料が本明細書において具体的に列挙されているか否かにかかわらず、類概念から任意の対象物を取り除く但し書きまたは否定的な限定を伴う本発明の包括的な説明を包含する。
【００６９】
本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、全ての式および図面を含めて、それぞれが、個別に参照により組み込まれる場合と同じ程度に、明白にその全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めた本明細書が優先する。
【００７０】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に記載されている。
【００７１】
【数１】
2013519374.tif 000003
【００７２】
【数２】
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【００７３】
【数３】
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【００７４】
【数４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３７】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
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【図４３Ｅ】
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【図４３Ｆ】
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【図４３Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２２】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2013519374.tif 000094
2013519374.tif 000095