(57)【要約】【課題】  本発明は、様々な疾患および障害における細胞治療および薬物治療の効果を高めるための方法に関する。【解決手段】  本発明は特に、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞を患者の静脈内或いは動脈内に投与することにより、障害を治療する方法を提供する。治療は、脳卒中などの神経変性疾患に有効である。ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、患者へ投与される前に、冷凍保存および／または継代される。脳卒中を起こしたラットモデルへのＣＴＸ０Ｅ０３細胞の投与は、脳卒中後４８時間以内に行われた。移植時の神経行動状態を測定する持ち上げスウィングボディ試験、および梗塞体積の指標として繰り返されるトリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）染色によるラットモデルの試験によれば、短期間の生存が示されており、顕著に脳卒中から保護された。【選択図】図１
2013525442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の神経変性疾患または神経損傷を治療する方法であって、
治療的有効量のＣＴＸ０Ｅ０３細胞を患者へ投与する工程を含み、
前記投与は静脈内或いは動脈内に行われる
方法。
【請求項２】
前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は約１．０×１０４細胞から約１．０×１０９細胞が投与される請求項１の方法。
【請求項３】
前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は約１×１０５から約１×１０７細胞が投与される請求項２の方法。
【請求項４】
１×１０７のＣＴＸ０Ｅ０３細胞が投与される請求項１の方法。
【請求項５】
更にハンクス液およびＮ−アセチルシステインを更に含む治療的組成物内の前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞を投与する工程を更に含む請求項１の方法。
【請求項６】
前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は冷凍保存されたＣＴＸ０Ｅ０３細胞である請求項１の方法。
【請求項７】
前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は前記患者へ投与される前に継代される請求項６の方法。
【請求項８】
前記神経変性疾患は脳卒中である請求項１の方法。
【請求項９】
前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は前記脳卒中の最初の７日以内に投与される請求項８の方法。
【請求項１０】
前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は前記脳卒中の２日以内に投与される請求項９の方法。
【請求項１１】
患者の神経変性疾患を治療する方法であって、
１×１０７のＣＴＸ０Ｅ０３細胞を患者へ投与する工程を含み、
前記投与は静脈内または動脈内に行われる
方法。
【請求項１２】
ハンクス液およびＮ−アセチルシステインを更に含む治療的組成物内のＣＴＸ０Ｅ０３細胞を投与する工程を更に含む請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は冷凍保存されたＣＴＸ０Ｅ０３細胞である請求項１１の方法。
【請求項１４】
前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は前記患者へ投与される前に継代される請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記神経変性疾患は脳卒中である請求項１１の方法。
【請求項１６】
前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は前記脳卒中の７日以内に投与される請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は前記脳卒中の２日以内に投与される請求項１６の方法。
【請求項１８】
疾患または障害によって引き起こされる神経損傷を修復する方法であって、
１×１０７のＣＴＸ０Ｅ０３細胞を患者へ投与する工程を含み、
前記投与は静脈内または動脈内に行われる
方法。
【請求項１９】
前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は冷凍保存されたＣＴＸ０Ｅ０３細胞である請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は前記患者へ投与される前に継代される請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記神経変性疾患は脳卒中である請求項１８の方法。
【請求項２２】
前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は前記脳卒中の７日以内に投与される請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は前記脳卒中の２日以内に投与される請求項２２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞を使用して、様々な神経の疾患および障害を治療することに関する。とりわけ、本発明は脳卒中を治療するために、条件付きで不死化した胎児の神経幹細胞株ＣＴＸ０Ｅ０３細胞を投与することを提供する。
【背景技術】
【０００２】
脳血管疾患は、非伝染性疾病の上位５位に入る疾患の一つと考えられるものであって、世界中で約５０００万人もの人が罹患しており、その結果、毎年約５５０万人が死亡している。その５０００万人の中でも、約４０００万人が脳卒中である。脳卒中は、先進国における死亡原因の第３位であり、成人の障害の主な原因である。
【０００３】
脳卒中に対して意義深い調査が行われているにも関わらず、深刻な脳卒中の有効な治療方法は、残念ながら殆ど存在しておらず、組織的な脳卒中ケア、初期のアスピリンおよび血栓溶解治療が、判明している唯一の治療法である（非特許文献１）。脳梗塞の開始後最初の数時間で、梗塞体積は増加し、梗塞は徐々に虚血性半影部、即ち血液の供給が著しく減少したが、側副血流によりエネルギ代謝が維持されている領域を組み込んでいく。半影部における神経細胞の生存は、虚血の重症度および継続時間によって左右されるが、再灌流の前に、生理的なカスケードが生じることから、細胞内カルシウムが増加する（非特許文献１）。このカスケードは自己持続的であり、アシドーシスや、リパーゼ、プロテアーゼおよびフリーラジカルの生成活性化を引き起こす（非特許文献１）。
【０００４】
虚血性および出血性の脳卒中に対して、脳卒中後の最初の数時間にのみ存在する治療ターゲットが存在しており、迅速な評価および治療が要求される。しかしながら、研究によれば、それらの脳卒中が疑われる患者の３０パーセントのみがその日にＣＴや他のスキャンを受けていた。
【０００５】
脳卒中の治療には２つのカテゴリー、即ち予防および急性期管理がある。予防治療は目下のところ、抗血小板薬、抗凝血薬、外科的治療、血管形成、生活スタイルの修正、および医療行為の適応からなる。一般的に使用される抗血小板薬はアスピリンである。抗凝血薬の使用は、統計的有意性を有していないように思われる。外科的治療は、特定のサブグループには有効であるようだ。血管形成は未だ実験的な手法であり、十分な分析データが得られていない。生活スタイルの修正には、禁煙、定期的な運動、食事制限、ナトリウムの摂取制限、およびアルコールの摂取抑制が含まれる。医療行為の適応には、血圧を低下させるための薬剤、コレステロールの減少、糖尿病のコントロール、および循環器疾患の
コントロールが含まれる。
【０００６】
急性管理治療は、血栓溶解剤、神経保護薬、酸素化フルオロカーボン栄養乳剤（ＯＦＮＥ）治療、脳血管灌流、ＧＰｌｌｂ／ｌｌｌａ抗血小板薬治療、およびリハビリ／理学療法からなる。
【０００７】
血栓溶解剤は、血栓を誘発し、或いは抑制するものであり、最も一般的に使用される薬剤は、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）である。遺伝子組み換え型ｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ）は、血流を妨げる凝血塊を溶かす（溶解させる）ことにより、脳循環を再構築することを助ける。これは有効な治療法であり、治療域が極めて短く、発病後３時間以内に投与されなければならない。また、治療投与の前に、ＣＴスキャンを行う必要があることから、使える時間が更に短縮されてしまう。ジェネンテック  ファーマシューティカルズ（Genetech
Pharmaceuticals）はＡＣＴＩＶＡＳＥ（登録商標）を製造しており、目下のところ、ｒｔ−ＰＡの唯一の供給源である。最近の研究によれば、ｔＰＡが９０分以内に投与されるならば、期待できる結果の見込みは２．８（９５％Ｃｌ＝１．８−９．５）であり、９１から１８０分の間では１．６（９５％Ｃｌ＝１．１−２．２であることが分かっており、脳卒中後に障害を負わない可能性は、発病から９０分以内に投与されるならば、血栓溶解剤治療の略３倍に増加することが示されている（非特許文献１）。
【０００８】
神経保護薬は、虚血カスケードの影響を最小限にする薬剤であると共に、例えばグルタミン酸拮抗薬、カルシウム拮抗薬、麻薬拮抗薬、ＧＡＢＡ−Ａ拮抗薬、カルパイン阻害剤、キナーゼ阻害剤、および抗酸化物質を含む。急性脳梗塞に対する幾つかの異なる臨床試験が進められている。凝血塊の破砕および脳の保護の相補的な機能に起因し、将来的な急性期治療処置は、血栓溶解治療および神経保護治療の組み合わせを含む可能性が極めて高い。しかしながら、血栓溶解剤と同様に、殆どの神経保護薬は、効果をもたらすために、脳卒中後６時間以内に投与される必要がある。
【０００９】
酸素化フルオロカーボン栄養乳剤（ＯＦＮＥ）治療は、酸素および栄養素を、脳脊髄液を介して脳へ運ぶ。脳血管灌流は実験的な処置であり、脳梗塞の被害を最小限にするための方法として、酸素を豊富に含む血液が、脳を通る新経路で送られる。ＧＰｌｌｂ／ｌｌｌａ抗血小板薬治療は、血小板の糖たんぱく質ＧＰｌｌｂ／ｌｌｌａレセプタが凝集または集まる能力を抑制する。リハビリテーション／理学療法は脳卒中後初期に開始されなければならないが、脳の損傷を変えることはできない。リハビリテーションの目的は、脳卒中生存者が出来る限り自立できるように、機能を向上させることである。
【００１０】
幾つかの急性期治療では、臨床試験での明るい見通しを示したが、クリーブランド（Cleveland）において実施された研究によれば、脳卒中症状を呈する患者の僅か１．８パーセントが、ｔ−ＰＡ治療を受けただけである（非特許文献２）。ｔ−ＰＡは目下のところ、上述の急性期脳卒中治療に最も広く使用されているが、任意の新しい「有効な」急性期脳卒中治療を受ける患者数は、１０％にも満たない。これらの統計によれば、脳卒中後２４時間よりも後に急性期脳卒中治療を受けることの明確な必要性が示されている。
【００１１】
これら急性期治療（即ち、ｔ−ＰＡ）の幾つかでは、投与時間が極めて重要である。最近の研究によれば、脳卒中患者の４２％が、病院に到着する前に、２４時間もの間待っており、脳卒中後の平均到着時間は１３時間であることが分かっている。ｔ−ＰＡは、治療を受ける患者の三分の一までで回復を促進することが示されているが、ＦＤＡによって義務付けられた最近の研究（非特許文献３）によれば、３時間の治療時間帯の約三分の一が無視されており、結果的に十分な治療が行われなかったことがわかっている。リハビリテーション以外に、残りの急性期治療は未だ臨床実験段階にあり、米国の特に農村地域では広く利用されておらず、このような農村地域では、必要とされる神経学の専門家や緊急救命室への人材配置を伴う大規模な医療施設が存在せず、これらの新しい脳卒中の診断方法の利用および治療法が限定されることがある。
【００１２】
米国における脳卒中の費用は、直接的費用および間接的費用の両方を含み、４３０億ドルを超えている。直接的費用は、総額の約６０％を占めると共に、病院への滞在、医師の診察代、およびリハビリテーションを含む。これらの費用は通常、最初の三ヶ月で、患者一人当たり１５，０００ドルに達しているが、約１０％のケースで、費用は３５，０００ドルを超えている。間接的費用は残りの部分を占めると共に、脳卒中被害者の生産性の損失、および家族の介護者の生産性の損失を含む（アメリカ国立神経疾患・脳卒中研究所、アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベテスダ）。
【００１３】
毎年米国では約７５万件の脳卒中が発生しており、そのうちの約三分の一が命に関わるものである。残りの患者のうち、約三分の一が僅かに障害し、三分の一が中程度に障害し、三分の一が重大な障害を残している。脳梗塞は、これらの脳卒中の８０％を占める。
【００１４】
団塊世代では、脳卒中の総数は相当増加すると推定される。脳卒中の危険は年齢と共に増加する。５５歳以上では、脳卒中を起こす危険は１０年ごとに倍増し、８０歳代の人の約４０％が脳卒中を起こしている。また、二度目の脳卒中を起こす危険性は、時間とともに増す。二度目の脳卒中を起こす危険性は、最初の脳卒中後５年で２５〜４０％である。団塊世代が全盛期を迎えるときには、６５歳以上の人口の割合が増加することが予想される状態で、この市場規模は相当成長するであろう。また、効果的な治療の要求は、大きく高まるであろう。
【００１５】
脳卒中の悲惨な影響を効果的に軽減することができないので、脳卒中の病的なカスケードがその過程を経る時点で、初期の神経外傷を最小限にすると共に、損傷を負った脳を回復させるための新規の治療方針を発展させることは欠かせない。
【００１６】
幹細胞移植は、脳卒中の治療方法として提案されている。神経幹細胞は、インビトロおよびインビボで、神経細胞、星状膠細胞、および乏突起膠細胞に分化する能力のおかげで、脳卒中および他のＣＮＳ疾患の重要な治療候補である。幹細胞の強力且つ多能的な潜在力は、１よりも多くの神経集団が影響を受ける脳卒中のような神経回路において複雑な崩壊を伴う疾患または損傷を効果的に治療することを可能にするかもしれない。全身的に投与されるヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）細胞は、ラットによる実験的な脳卒中に対して、極めて効果的な治療である。しかしながら、ＨＵＣＢ細胞治療は、疾患の可能性およびこれらの細胞の使用可能性に起因して、人間の治療としては転移に限定される。
【００１７】
脳卒中後に患者を効果的に治療することは困難なことから、当該技術分野において、脳卒中の治療を促進する方法が必要とされる。
【００１８】
幹細胞移植は、中程度の大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）げっ歯類の脳卒中ではある程度成功している。これまでの研究では、老齢のラットへのヒト臍帯血細胞（ｈＵＣＢＣ）の単独静脈注射により、活性化ミクログリアの数を著しく減少させると共に、神経新生を増加させることができ、老齢海馬の微環境を改善すると共に、老齢神経幹／始原細胞を活性化させることが立証された（非特許文献４）。しかしながら、ｈＵＣＢＣは、臍の緒の回収から得られる細胞数に限りがあり、これにより、この治療の有効性が制限される。また、血流に投与される細胞（ｈＥＳ−ＮＰＣ）は、投与される細胞全体の１％未満がＣＮＳに移動できるに過ぎないことが観察された（非特許文献５）
【００１９】
幾つかの研究によれば、成長因子は、生存を高め、内因性神経始原細胞の増殖を促すと共に、これら始原細胞の分化を開始することにより、虚血によって引き起こされた脳の損傷に応えて不可欠である（非特許文献６）。例えば、ＴＧＦβおよびＢＭＰ−４１３などの成長因子は、神経幹細胞の分化を促すことが可能であり、また、ＢＭＰ−４は、平滑筋細胞およびグリア細胞の分化を促すことが可能である（非特許文献７）。ＩＧＦ−Ｉは、ＦＧＦ−２のようなマイトジェンが存在する時には、始原細胞の分化を促すことができ、また、ＦＧＦ−２の使用中止後に分化を促す（非特許文献８）。ＭＣＰ−１エリトロポイエチン、およびＭＭＰは、損傷部位への神経芽細胞の転移に取り込まれる（非特許文献９）。ＧＤＮＦもまた、局所使用後に、梗塞面積および脳浮腫を低減させることが分かっている（非特許文献８）。
【００２０】
しかしながら、昨今の始原細胞治療は、脳への細胞移植に依存しており、これは侵襲的であると共に危険な手術である。脳卒中または他の神経変性疾患の発病後に、神経始原細胞を患者に投与する簡易で安全な方法が必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Dawson & Walters (2006). New andemerging treatments for stroke. Br Med Bull. 77-78
【非特許文献２】Katzan IL, et al.(2000). Use of Tissue-type plasminogenactivator for acute ischemic stroke: the Cleveland area experience. JAMA,283:1151-1158）
【非特許文献３】Albers, et al.(2000) Intravenous Tissue-TypePlasminogen Activator for Treatment of Acute Stroke,The Standard Treatment with Alteplase to ReverseStroke Study. JAMA. 283(9)
【非特許文献４】Bachstetter AD, et al.(2008). Peripheral injection of human umbilical cord bloodstimulates neurogenesis in the aged rat brain, BMC Neurosci. 9:22
【非特許文献５】Crokcer, et al.(2011). Intravenous administration of human ES-derivedneural precursor cells attenuates cuprizone-inducedCNS demyelination. NeuropatholAppl Neurobiol.doi:10.1111/j.1365-2990.2011.01165.x.[Epub ahead of print]
【非特許文献６】Kalluri, et al.(2008). Growth factors, stem cells and stroke. Neurosurg Focus. 24(3-4)
【非特許文献７】Kalluri, et al.(2008). Growth factors, stem cells and stroke. Neurosurg Focus. 24(3-4):E14
【非特許文献８】Yamashita, et al.(2009) Gene and stem celltherapy in ischemic stroke. Cell Transplant. 18(9);999-1002. Epub 2009 Apr 29
【非特許文献９】Yamashita Yamashita,et al.(2009) Gene and stem cell therapy in ischemic stroke. Cell Transplant.18(9);999-1002. Epub 2009 Apr 29
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、従来技術に関連する問題または欠陥の一つまたはそれより多くを克服し、或いは少なくとも軽減するように意図されている。この点において、本発明は、様々な疾患および障害の細胞療法または薬物療法の治療効果を高める方法を提供する。好適には、障害は脳卒中である。
【００２３】
この点に関して、本発明は、新規であり且つ特有の脳卒中治療法を特定するという必要性を部分的に満たす。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
従って、治療有効量のＣＴＸ０Ｅ０３細胞を患者に投与することにより、患者の神経変性疾患を治療し、或いは疾患または障害によって生じた神経の損傷を修復する方法が提供され、投与は静脈内投与（ＩＶ）または動脈内投与（ＩＡ）で行われる。治療は、脳卒中などの神経変性疾患に有用である。ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、約１．０×１０４細胞から約１．０×１０９細胞で投与されてよく、より好適には、約１×１０５細胞から約１×１０７細胞で投与される。特定の実施形態において、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、１×１０７で投与される。細胞は任意で、治療用組成物、例えばハンクス液およびＮ−アセチルシステインを含む組成物内で投与されてよい。
【００２５】
ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は任意で、使用前に凍結保存され、また、幾つかの変形例では、患者への投与前に継代されてよい。ＣＴＸ０Ｅ０３細胞の投与は、任意の治療効果のある時間に行われてよいが、脳卒中の２日以内に、より好適には脳卒中後４８時間以内に、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞を静脈内または動脈内投与すると、虚血の神経細胞に、統計学的に顕著な脳卒中からの保護を予想外にもたらすことが分かっている。運動非対称性のマーカーとしての持ち上げスウィングボディ試験（ＥＢＳＴ）が、移植時の神経行動的状況の指標として使用され、且つ、梗塞体積の指標としてのトリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）染色と共に、細胞移植後３日間繰り返された。短期間生存もまた、細胞移植の安全性を示すものとして研究された。
【００２６】
本発明をより完全に理解するために、以下の詳細な説明を、添付の図面と併せて参照する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】細胞移植後の死亡率の顕著な減少を示すグラフ。ビークル：治療前ｎ＝８および２日後ｎ＝４。細胞：治療前ｎ＝４および２日後ｎ＝２。＊ｐ＜０．０５カイ二乗検定。
【図２】ビークルおよび細胞治療動物における運動非対称性の指標としてのＥＢＳＴを示すグラフ。運動非対称性は細胞治療された動物において著しく減少したがビークルでは減少しなかった。両グループでＮ＝４。治療前グループと比較した＊ｐ＜０．０５両側ｔ−検定。
【図３】ビークルおよび細胞治療動物における平均梗塞面積の比較を示すグラフ。ｔ−検定によって判定された梗塞面積では著しい差はなかった。２個の比較部位のＴＴＣ染色を示す。両グループでＮ＝４。
【図４】細胞治療された動物において梗塞面積およびＥＢＳＴによって測定された運動非対称性の著しい相関関係を示すグラフ。Ｎ＝４（ｒ２＝０．８７；ｐ＜０．０５）
【図５】ビークル移植ラットおよびＣＴＸ０Ｅ０３移植ラットの移植２日後のＳＧＺおよびＳＧＺ／ＧＣＬ夫々で示される増殖細胞のＢｒｄＵ染色を示すグラフ。ＣＴＸ０Ｅ０３およびビークルの差は、不偏立体分析の光学分留装置法に基づき、細胞移植およびビークル移植ＳＧＺにおける合計ＢｒｄＵ陽性細胞計数（ｐ＜０．００１）で顕著である。ＢｒｄＵ、ブロモデオキシウリジン；ＧＣＬ、顆粒細胞層；ＳＧＺ、副顆粒域。
【図６】ビークル移植ラットおよびＣＴＸ０Ｅ０３移植ラットの移植２日後のＳＧＺおよびＳＧＺ／ＧＣＬ夫々で示される増殖細胞のＤＣＸ染色を示すグラフ。ＣＴＸ０Ｅ０３およびビークルの差は、不偏立体分析の光学分留装置法に基づき、細胞移植およびビークル移植ＳＧＺにおける合計ＢｒｄＵ陽性細胞計数（ｐ＜０．００５）で顕著である。ＤＣＸ、ダブルコルチン；ＧＣＬ、顆粒細胞層；ＳＧＺ、副顆粒域。
【図７】ＳＧＺ内におけるＢｒｄＵおよびＤＣＸ染色の共局在化を示すイメージ図。共焦点像に続く正射影に示されるＢｒｄＵ（濃い灰色）およびＤＣＸ（薄い灰色）での細胞の二重標識。ＢｒｄＵ、ブロモデオキシウリジン；ＤＣＸ、ダブルコルチン；ＳＧＺ、副顆粒域。
【図８】（Ａ）から（Ｃ）は、脳室におけるＣＴＸ０Ｅ０３グラフトの存在を示すが、ＳＧＸには存在しないことを示すイメージ図。イメージ図（Ａ）および（Ｃ）は、必要とされるトラクト（白点線で示す）および脳室に沿って存在する多くのＨｕＮｕ陽性細胞（矢印で示す）を示す。僅かなＨｕＮｕ陽性細胞がＢｒｄＵ陽性細胞と共局在化する（ＢおよびＣの濃い灰色の構成で示す）。省略：ＢｒｄＵ、ブロモデオキシウリジン、ＨｕＮｕ、人間の核内抗原；ＳＧＺ、副顆粒域。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、以下の発明の好適な実施形態の詳細な説明、およびそこに含まれる実施例を参照することにより、より容易に理解される。しかしながら、当該化合物、組成物、および方法が開示および説明される前に、本発明は、特定の核酸、特定のポリペプチド、特定の細胞型、特定の宿主細胞、特定の条件、或いは特定の方法などに限定されないと認識されるものであり、そのため、当然のことながら変更してもよく、また、そのうちの多くの変更および変形が、当該技術分野における通常の知識を有する者には明らかである。また当然のことながら、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定を目的として意図されていない。
【００２９】
ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなど、酵素反応のためのクローン作成、ＤＮＡ単離、増幅、精製の標準的な技術、および種々の分離技術は、当該技術分野において通常の知識を有する者によって周知であるとともに一般的に使用されるものである。多くの標準的な技術は、Sambrook et al.,
1989 Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory,
Plainview, New York、Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,
Plainview, New York、Wu(Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I、Wu(Ed.) 1979
Meth Enzymol. 68、Wu et
al.,(Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 and 101、Grossman and Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65、Miller (ed.) 1972
Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, New York、Old and Primrose, 1981 Principles of
Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley、Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology、Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK、Hames and Higgins
(Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK、およびSetlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and
Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New Yorkに記載されている。使用される省略形および述語体系は、本分野において標準的であると考えられるとともに、本明細書において引用される文献などの専門誌で一般的に使用されている。
【００３０】
「神経変性疾患」という用語は、中枢神経系への損傷によって生じる疾患を説明するために、本明細書で使用されており、またその損傷は、本発明に係る神経細胞を、患者の脳および／または脊髄の破損部分へ移植することにより、軽減および／または緩和される。本発明に係る神経細胞および方法を使用して治療され得る神経変性疾患の例には、例えば、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病）、リソソーム蓄積症（「白質疾患」即ち、例えばFolkerth RD.
(1999) Abnormalities of developing white matter in lysosomal
storage diseases. J Neuropathol Exp Neurol.
58(9):887-902. Reviewに記載されるような神経膠／脱髄疾患）、多発性硬化症、脳損傷、虚血によって生じる外傷、事故、環境障害などを含む。また本発明は、患者の脳卒中または心臓発作の中枢神経系への影響を低減および／または除去するために使用されてよく、これらは、さもなければ患者の脳の所定部位への血流の欠如即ち虚血によって生じるものであり、或いは脳および／または脊髄への物理的損傷から生じている。神経変性疾患はまた、例えば自閉症、および多くの中からとりわけ統合失調症などの関連する神経疾患を含んだ神経発達障害を含む。
【００３１】
本発明の生成細胞におけるＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の単離、産生および試験は、シンデン（Sinden）等（米国特許第７，４１６，８８８号）に詳細に説明されている。細胞の一用途において、脳卒中後６ヶ月から５年後の安定した運動障害者を治療するためのＣＴＸ０Ｅ０３薬剤の定位脳内投与の臨床試験は、スコットランドのグラスゴーにおいて実施中である（Clinical Trials. gov, National Institutes
of Health, Identifier #NCT01151124）。
【００３２】
本発明の神経幹細胞は、動物（非ヒト動物）患者を含む患者へ投与され得、細胞療法が適用可能な多様な病状の症状を緩和する。例えば、本発明の細胞は、脳卒中（例えば脳虚血、低酸素虚血）のような神経障害、ハンチントン病のような神経変性疾患、外傷的脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）および他の脱髄性疾患の症状を軽減させるために、患者に投与されてよい。本発明の好適な実施形態において、細胞は、脳卒中の症状を軽減させるために投与される。
【００３３】
「患者」という用語は、本明細書では、本発明に係る予防的治療を含む細胞治療が提供される動物、好適には人間を説明するために使用される。人間の患者のような特定の動物に特有の上記の感染、病気、および疾患状態の治療に対して、患者という用語は、その特定の動物について言及する。「ドナー」という用語は、患者に使用する臍帯血または胎児の神経幹細胞を提供する個体（人間を含む動物）を説明するために使用される。
【００３４】
「有効量」という用語は、本明細書では、分化剤、胎児の神経幹細胞、前駆細胞、始原細胞、特異性細胞、例えば神経系細胞および／または神経細胞またはグリア細胞、血液脳関門透過剤、および／または幹細胞および／または始原細胞の特異性細胞、例えば神経系細胞、神経細胞および／またはグリア細胞への分化を含む意図された結果を作り出すのに、或いは、神経疾患または脳卒中、心臓発作、または事故の被害者などの患者の中枢神経系の損傷を含む、他の病状を治療するのに、或いは治療される患者へのそれらの細胞の移植を達成するのに有効な他の物質などの化合物の濃度または量を説明するために使用される。本発明に係る組成物は、脳または脊髄において、或いは治療される疾患または病気において好ましい変化を生じさせるために、組成物内の胎児の神経幹細胞を移植させるために使用されてよく、この変化は、治療される疾患または病気の改善（疾患または病気の悪化の停止または反転、神経障害の低減、または神経応答の改善など）または完治である。
【００３５】
「幹細胞」または「始原細胞」という用語は、本明細書では、臍帯血から得られた幹細胞および始原細胞について言及するために、相互に入れ替え可能に使用される。幹細胞および始原細胞という用語は、当該技術分野において周知である（例えば幹細胞: Scientific Progress and Future Research Directions, report
prepared by the National Institutes of Health, June, 2001）。「神経系細胞」という用語は、１個またはそれよりも多くの神経細胞マーカーまたはグリア細胞マーカーの染色などの神経細胞またはグリア細胞の表現型の指標を少なくとも有し、或いは神経細胞マーカーまたはグリア細胞マーカーを示す細胞へ分化させる細胞である。本発明に係り、神経細胞を特定するために使用されてよい神経細胞マーカーの例には、例えば、とりわけニューロン特異的な核たんぱく質、チロシン・ヒドロキシラーゼ、微小管結合たんぱく質、およびカルビンジンを含む。神経細胞という用語はまた、神経前駆細胞、すなわち神経系細胞または最終的には神経細胞マーカーまたはグリア細胞マーカーを示す細胞に分化し或いはそのような細胞になる幹細胞および／または始原細胞である細胞を含み、この用語には、最終的に神経細胞および／またはグリア細胞に分化する多能性幹細胞および／または始原細胞を含む。上記細胞およびその子孫は全て、本発明を目的とした神経系細胞として構成される。神経幹細胞は、有機体の生存期間に増殖し、自己保全または更新を示し、またクローンに関連する神経子孫を産生する能力を備えた細胞である。神経幹細胞は、成長の間に神経細胞、星状膠細胞、および乏突起膠細胞を生じさせるとともに、成人の脳において、多数の神経系細胞を置き換えることが可能である。神経幹細胞は、本発明を目的とした神経系細胞である。「神経系細胞」および「神経細胞」という用語は、本発明の多くの態様において、相互に入れ替え可能に使用されている。本発明に係る特定の態様において使用するのに好適な神経系細胞は、とりわけ、Ｍｕｓａｓｈｉ−１、ネスチン、ＮｅｕＮ、クラスＩＩＩβ−チューブリン、ＧＦＡＰ、ＮＦ−Ｌ、ＮＦ−Ｍ、微小管結合たんぱく質（ＭＡＰ２）、Ｓ１００、ＣＮＰａｓｅ、グリピカン（特にグリピカン４）、神経ペントラキシンＩＩ、神経ＰＡＳ１、神経細胞成長関連たんぱく質４３、神経突起伸長たんぱく質、ビメンチン、Ｈｕ、インターネキシン、Ｏ４、ミエリン塩基性たんぱく質、およびプレイオトロフィンなどの１またはそれより多くの神経系／神経細胞の表現型マーカーを表す細胞を含む。
【００３６】
「投与」または「投与すること」という用語は、本明細書全体において、臍帯血から得られた胎児の神経幹細胞、またはそこから得られるより分化した細胞などの本発明の細胞が、治療を目的として、患者に供給される過程を説明するために使用される。本発明の細胞は、非経口投与（この用語は、静脈内および動脈内、ならびに他の適当な非経口経路について言及している）および髄腔内投与などの多くの方法で投与されるが、これらに限定されるものではなく、とりわけこの用語は、本発明の細胞を、必要とされる最終目的部位へ移動させることである。本発明の細胞は、無傷ＣＴＸ０Ｅ０３不死化胎児神経幹細胞の形態で投与されてよい。本発明に係る組成物は、細胞の増殖、即ち継代を伴うことなく、動員剤または分化剤と共に使用されてよい。投与は、治療される疾患または病気に左右されることが多く、また好適には、非経口経路を介して、例えば静脈内投与であってよい。脳卒中の場合には、好適な投与経路は、脳卒中の部位に左右されるが、頚動脈に直接的であってもよく、或いは、全身に投与されてもよい。本発明の好適な実施形態において、個々の脳卒中後治療の投与経路は、静脈内または動脈内を介する全身投与である。任意で、胎児の神経幹細胞は、シクロスポリンＡまたはタクロリムスなどの免疫抑制剤と併せて投与される。
【００３７】
本発明の胎児の神経幹細胞は、患者個人の病態、投与の部位および方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別、体重、および医療従事者に周知の他の要素を考慮して、良好な医療行為に従い投与および投薬されてよい。従って、本明細書を目的とした製剤的「有効量」は、当該技術分野において周知のこのような留意事項によって決定される。量は、生存率の改善またはより迅速な回復、或いは症状および当該技術分野において通常の知識を有する者によって適当な指標として選択された他の適応症の改善または除去を達成するのに有効でなければならないがこれらに限定されるものではない。
【００３８】
医薬製剤組成物は更に、製剤的に受容可能なキャリアを含んでもよい。医薬製剤組成物は、有効な数の細胞を、任意で製剤的に受容可能なキャリア、添加剤または賦形剤と組み合わせて含む。本発明の特定の態様において、細胞は、無菌食塩水での移植を必要とする患者に投与される。本発明の他の態様において、細胞はハンクス液（ＨＢＳＳ）またはＩｓｏｌｙｔｅ  Ｓ、ｐＨ７．４内で投与される。無血清細胞培地の使用を含む他の方法が使用されてもよい。患者への細胞の全身投与は、特定の適応症において好適であり、罹患および／または破損した組織の部位へ、またはその付近への直接投与は、他の適応症において好適である。
【００３９】
幾つかの実施形態において、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞はホープ（Hope）等（国際特許出願公開２０１０／０６４０５４）によって説明される培地に凍結保存されてよく、洗浄または別の重要な操作を行うことなく、安定的に産生、保存、および治療部位へ運ばれ、解凍および使用され得る凍結細胞生成物質が生成される。
【００４０】
本発明に係る医薬製剤的組成物は、好適には、約１．０×１０４細胞から約１．０×１０９細胞、より好適には約１×１０５から約1×１０７細胞、更に好適には約２×１０５から約８×１０６細胞の範囲にある有効数を、任意で製剤的に受容可能なキャリア、添加剤、または賦形剤と組み合わせて概ね溶媒中に含む。
【００４１】
「非発ガン性」という用語は、細胞が新生物または腫瘍を引き起こさないという事実を言う。本発明で使用する幹細胞および／または始原細胞は、好適には、新生組織形成および悪性腫瘍が存在しない。
【００４２】
従って、胎児の神経幹細胞または始原細胞は、神経細胞表現型への分化前または分化後のいずれかに、遺伝子導入のターゲットである。本発明の臍帯血幹細胞または始原細胞は、異種ヌクレオチド配列、および異種ヌクレオチド配列の発現を促す操作結合された促進剤と遺伝子操作されてよい。ヌクレオチド配列は、多様なたんぱく質または関心のあるペプチドをコードしてよい。遺伝子操作が行われた細胞によって産生される遺伝子産物は、インビトロで採取されてよく、或いは、遺伝子産物のインビボ供給のためのビークルとして使用されてもよい（即ち遺伝子治療）。
【００４３】
以下の記述は、本発明の様々な態様の多くを実現するための例証的な手順および助言を提供する。
【００４４】
当該技術分野において周知であり、特に記載されていない標準的な分子生物学的技術は概ね、サムブルック（Sambrook）等のMolecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)およびオーズベル（Ausubel）等のCurrent
Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)に従う。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は、ＰＣＲプロトコールのように概ね実行される：A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego,
California (1990)。他の核酸技術を含む反応および操作は、特に明記しない限り、サムブロック（Sambrook）等のMolecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Pressに記載されるように、また米国特許第４，６６６，８２８、４，６８３，２０２、４，８０１，５３１、５，１９２，６５９、５，２７２，０５７に記載される方法論で概ね行われ、これらの文献は、参照により本明細書に援用される。インサイチュ  ピーシーアール(in situ PCR)は、フローサイトメトリと組み合わせて、特定のＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列を含む細胞の検出に使用され得る（例えばテストニ(Testoni)等のBlood,
1996, 87:3822を参照）。
【００４５】
当該技術分野において免疫学的に周知であるとともに特に記載されていない標準的な方法は、スタイツ(Stites)等(Eds.)のBasic And Clinical Immunology, 8th Ed., Appleton &
Lange, Norwalk, CT(1994)およびミシェル(Mishell)およびシギ(Shigi)(Eds.)のSelected
Methods in Cellular Immunology, W.H.Freeman and Co.,
New York(1980)に概ね従う。
【００４６】
ＣＴＸ０Ｅ０３細胞（リニューロン・リミテッド(ReNeuron
L.td.)、英国ギルフォード)は先述のように成長させられた（ポロック(Pollock)Ｋ等の(2006). A conditionally immortal
clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke. Exp
Neurol. 199:143-155、ホッジス(Hodges)Ｈ等の(2007).Making stem cell lines suitable for transplantation. Cell
Transplant. 16:101-115）。簡潔にいうと、細胞は継代３３で蘇生されるとともに、ラミニン（インビトロゲン(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバッド）上に、Ｔ１７５フラスコ毎につき３５ｍｌの培地に２×１０７の細胞密度で置かれた(ポロック(Pollock)Ｋ等の(2006).
A conditionally immortal clonal stem cell line from
human cortical neuroepithelium for the treatment of
ischemic stroke. Exp Neurol. 199:143-155、ホッジス(Hodges)Ｈ等の(2007).Making stem cell lines suitable for transplantation. Cell
Transplant. 16:101-115）。細胞は、採取、ならびにハンクス液（インビトロジェン（Invitrogen）)およびＮ−アセチルシステイン（シグマ（Sigma）、ミズーリ州セントルイスのビークル）に５×１０４細胞／μＬの濃度で再懸濁する前に、４日間または８０パーセントのコンフルエンスまで成長させられた。
【００４７】
全ての実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従って行われており、また、サウスフロリダユニバーシティ医学部の動物実験委員会によって承認された。
【実施例１】
【００４８】
体重が２２５〜２５０ｇのオスの成体ＳＤ（Sprague Dawley）ラット（ハーラン(Harlan)）は、温度が調節された部屋に、１２時間の明暗周期で入れられるとともに、食べ物および水分は自由に摂取できるようにされた。（ヤスハラ(Yasuhara)Ｔ等の(2008). Intravenous grafts recapitulate the neurorestoration
afforded by intracerebrally delivered multipotent adult progenitor cells in neonatal
hypoxic-ischemic rats, J Cereb Blood Flow Metab. 28(11):1804-10. Epub 2008
Jul 2)によって先述された過渡的腔内閉塞脳卒中モデルが、本研究で用いられた。ラットは５％のイソフルレン（３％維持）で麻酔がかけられ、且つ、フィラメント塞栓が右側ＭＣＡＯに導入されるとともにそこに１時間固定された。最初の８分間、梗塞を妨げかねない側副再灌流を減少させるために、左側ＭＣＡＯは結紮された。損傷を確認するために、脳血流のレーザドップラ測定法が用いられ、７０％未満の低下は除外基準とした。脳の検視解剖に際して、かなりの損傷または瘢痕組織、特に蓑胞形成が観察されるならば、或いは動物が研究の結論前に死亡するならば、または例えば頭位傾斜のような異常行動を示すならば、動物はまた、レトロスペクティブスタディから除外された。一時間後、麻酔状態下で、フィラメント塞栓は右側ＭＣＡＯから取り除かれ、切開が縫合され、且つ、ラットは適切な術後救命処置により回復した。
【００４９】
ＭＣＡＯの２日後、動物は２つのグループに分けられ、細胞またはビークルのいずれかで治療が施された。動物は５％イソフルレン（３％維持）で麻酔がかけられ、右側頚静脈が露出させられた。動物は無作為に、０．５ｍｌのビークル（ハンクス液；ＨＢＳＳ＋０．５ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン；ＮＡＣ）或いは同じビークルに１×１０７のＣＴＸ０Ｅ０３細胞のいずれかが１分間注射されるように割り当てられた。切開は縫合され、且つラットは適切な観察の下で回復した。
【００５０】
冷凍保存されたＣＴＸ０Ｅ０３細胞は解凍され、（ポロック(Pollock)等の(2006). A
conditionally immortal clonal stem cell line from human
cortical neuroepithelium for the treatment of
ischemic stroke. Exp Neurol. 199(1) に）先述されるように、ラミニンが塗布されたフラスコ上において培地内に置かれ、且つ、ＴｒｙｐＺｅａｎ／ＥＤＴＡ（キャンブレックス(Cambrex)）および粉末溶液（ＤＭＥＭ：Ｆ１２内に０．５５ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤（シグマ）、１％のＨＳＡ、２５Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（メルク(Merck)）との結合の前に、３７℃で５％のＣＯ２および８０％のコンフルエンスで成長させられ、ＴｒｙｐＺｅａｎおよびダイジェスト裸ＤＮＡを中和させた。遠心分離およびＤＭＥＭ：Ｆ１２（インビトロゲン）での洗浄に続き、細胞は２×１０４細胞／ｍｌの濃度で、ビークルに再懸濁された。
【００５１】
４匹の動物に細胞が注入され、８匹がビークルを受けいれた。移植３日後、図１に示すように、ビークル治療された動物の半分が死亡したのに比べて、細胞治療された動物はいずれも死亡しておらず、カイ二乗分析によって明らかにされるように、統計的に顕著であった。移植前および移植３日後の運動非対称性は、図２に示すように、細胞治療が行われたラットで著しく減少したことが分かった。
【００５２】
治療３日後、ラットは終末的に麻酔がかけられるとともに、冷生理食塩水が灌流された。次に、脳が取り出されるとともに、２ｍｍの冠状塊に薄く切断された。次に、塊は暗室で１０分間、２％のトリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）染色が入ったＰＢＳで染色された。次に、脳のスライスは４％のパラホルムアルデヒドで色留めされた。翌日、線条体を含む脳の６箇所が撮影され、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて、治療に関して盲検化された２名の観察者によって、閉塞の領域が測定された（ＴＴＣ染色の欠如）。閉塞面積は対側大脳半球で正常化されるとともに、脳全体で計算された。ビークルおよび細胞の間において、灌流治療からの生存動物は、カイ二乗検定によって比較された。図３に示すように、細胞およびビークル治療されたラットの間において、梗塞面積は大きく差がなかった。これは、サンプルの寸法に起因している。
【００５３】
しかしながら、運動制御検査は、細胞内における運動非対称率および平均梗塞面積率の間における顕著な相関関係を示した。ＭＣＡＯ２日後、生存するラットは、運動非対称性を判定するために、持ち上げスウィングボディ試験（ＥＢＳＴ）を用いて行動的に検査された。ラットは高く囲まれた箱内のベッド上に、その尻尾により保持され、動物の回転方向が２０回監視された。損傷していない動物は、左右に均等に回転することが予期され、従って、その運動非対称性は５０％となる。これは、治療に盲検化された人物によって、治療後３日繰り返され、値がｔ−検定によって比較された。図４に示すように、梗塞面積が増大するにつれて、非対称性の割合は直線関係的に増加することが分かった。この結果は、ビークル治療された動物では示されなかった（データ図示なし）。
【００５４】
従って、ＭＣＡＯ２日後の細胞治療の後で、（ＥＢＳＴによって測定された）運動行動および動物の生存で著しい改善があった。しかしながら、ＥＢＳＴとの相関関係は存在する（しかしビークル治療動物では存在しない）が、梗塞面積の同様の重要な変化は観察されておらず、著しい差が存在し得ることを示唆している。ＣＴＸ０Ｅ０３細胞で治療された動物の死亡率の減少はまた、これら細胞の移植が安全であるだけでなく、細胞は結果の改善をももたらすことを示唆している。
【００５５】
実験的な脳梗塞の２日後に、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞の点滴移植を行うと、有効な神経学的な影響を及ぼす。移植細胞は損傷部位へ移され、且つ宿主細胞に組み込まれ、或いは成長因子の分泌が促されて、再生プロセスを誘発し、観察される機能回復を仲介した。
【実施例２】
【００５６】
１２匹のオスの２２ヶ月のフィッシャー（Fisher）（F３４４）ラット（NIA）にイソフルレンで麻酔がかけられるとともに、定位装置に置かれた。ハミルトン製シリンジを用いて、ビークル（ｎ＝６）またはＣＴＸ０Ｅ０３細胞（ｎ＝６；４．５μｌに４．５×１０５細胞）のいずれかが、各ラットへ、脳室内のブレグマに対して−１ｍｍ前方、＋１．６ｍｍ内方、−４．５ｍｍ背方の座標へゆっくりと移植された。翌日、ラットには２回、腹腔内に５０ｍｇ／ｋｇのブロモデオキシウリジン（５−ブロモ−２−デオキシオリジン、ＢｒｄＵ、シグマ）が８時間あけて注射され、一日後に、パラホルムアルデヒドが経心灌流された。次に、脳が取り出されるとともに、ミクロム（Ｍｉｃｒｏｍ）クライオスタット（リチャード−アラン  サイエンティフィック(Richard-Allan Scientific)、ミシガン州カラマズー）を用いて、４０μの矢状断面に切断される前に冷凍保存された。各グループから６匹にビークルまたは細胞のいずれかが移植された。
【００５７】
ＢｒｄＵ（増殖マーカー）、ダブルコルチン（ＤＣＸ；幼若神経細胞）、イオン化カルシウム結合アダプタ分子Ｉ（ＩＢＡ−１、ミクログリア）、グリア細胞繊維性酸性たんぱく質、（ＧＦＡＰ、星状膠細胞）、人間の核抗原（ＨｕＮｕ；移植された人間の胎児の皮質細胞）の免疫組織化学的染色が、先述（バックステッター(Bachstetter)ＡＤ等.(2008). Peripheral injection of human umbilical cord bold
stimulates neurogenesis in the aged rat brain． BMC Neurosci．
9:22）のように浮遊部位に行われた。簡潔に言うと、ＢｒｄＵ染色では、海馬を囲む連続の６箇所全てが、６５℃の５０％のフォルムアルデヒド／２％のＳＳＣで２時間前処理され、続いて、抗原回復のために、３７℃の２Ｎ  ＨＣｌおよびホウ酸塩緩衝剤（ｐＨ８．５）で洗浄された。メタノールに０．３％の過酸化水素を含む内因性ペルオキシダーゼクエンチが、１時間のブロッキング溶液（０．１ＭＰＢＳに３％の正常ウマ血清および０．２５％のトリトンＸ−１００）の後に行われ、続いて、マウス抗ラットＢｒｄＵで一晩培養された（１：５０；ロシェ（Roche）、インディアナ州インディアナポリス）。この後、ジアミノベンジジン基質の可視化に先立ち、ビオチン化二次抗体（１：２００；ベクター  ラボラトリーズ（Vector laboratories）、カリフォルニア州バーリンゲーム）およびアビジン−ビオチン基質（ＡＢＵキット；ベクターラボラトリーズ）が続いた。次に、上記部位はペルマウント（Permount）（商標名）マウント培地（フィシャー  ケミカルス、ニュージャージー州）を用いて、マウントおよびカバースリップされた。ＤＣＸは新しい細胞の産生から３週間までの間発現するとともに、信頼できる神経細胞新生の指標であることが以前から分かっているので、ＤＣＸは神経細胞移動のマーカーとして使用することができる（ラオ(Rao)ＭＳおよびシェティ(Shetty)ＡＫ. (2004). Efficacy of doublecortin as a marker to analyse
the absolute number and dendritic growth of newly
generated neurons in the adult dentate gyrus. Eur J Neurosci. 19:234-246、コラード‐デプレ(Couillard-Despres)Ｓ等(2005). Doublecortin expression levels in
adult brain reflect neurogenesis. Eur
J Neurosci. 21:1-14）.ＤＣＸの免疫組織化学は抗原回復がなく、ウマ血清および多クローン性ヤギ抗原（１：１５０；サンタ-クルズ  バイオタック（Santa-Cruz Biotuch）、カリフォルニア州）、および適当な二次抗原を用いて行われた。
【００５８】
ＢｒｄＵおよびＩＢＡ−１、或いはＢｒｄＵおよびＧＦＡＰの共局在化を比較するとともに、ＢｒｄＵおよびＤＣＸの共局在化を明示するために、免疫蛍光法が使用された。室温の２Ｎ  ＨＣｌが抗原回復に用いられ、且つ、一次培養は、ラット抗ＢｒｄＵ（１：４００；アキュレート  ケミカル（Accurate Chemical）、ニューヨーク州ウェストバリー）および表現型定義一次抗体（ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：５００、ダコ(Dako)、カリフォルニア州カーピンテリア）、またはウサギ抗ＩＢＡ１（１：１，０００、ワコ(Wako)、バージニア州リッチモンド）またはＤＣＸ（１：１５０、サンタクルズ  バイオテック（SantaCruz Biotech）、カリフォルニア州））から、４℃で一晩で構成された。可視化は、適当なアレクサフルオロ共役二次抗体（モレクラー  プローブス(Molecular Probes)、カリフォルニア州）を二時間使用して達成され、次に上記部位は、ヴェクタシールド(Vectashield)（ベクター  ラボズ（Vector Labs））を用いてマウントおよびカバースリップされた。移植細胞の存在は、人間の核に対して特異的なマウスモノクローナルＨｕＮｕ抗体（１：５０；ケミコン(Chemicon)、カリフォルニア州）を用いて検出された。可視化は、アレクサフルオロ共役二次抗体（モレクラー  プローブス）を用いて達成された。
【００５９】
ＳＧＺ領域内における標識化された細胞の数量化およびイメージ化は、不偏立体細胞計数の光学分留装置法を使用して、ニコン  エクリプス  ６００（ＢｒｄＵ＋細胞用）またはオリンパスＢＸ６０（ＤＣＸ＋細胞用）マイクロスコープ、およびステレオインヴェスティゲータソフトフェア（マイクロブライトフィールド(MicroBrighfield)、バーモント州）を用いて行われた（ウェスト(West)ＭＪ等(1991). Unbiased stereological
estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat
hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231:482-497）。老齢の動物では少数のＢｒｄＵ＋細胞が観察されることから、増殖の研究に対して、部位に存在する細胞全てを計数できるように、１２５μｍ×１２５μｍの寸法を有する同一の仮想グリッドおよび計数フレームが用いられた。解剖学的構造は、１０Ｘ／０．４５対物レンズを用いて輪郭が描かれた一方、細胞の数量化のために、６０Ｘ／１．４０対物レンズが用いられた。ＤＣＸ細胞については、仮想グリッドおよび計数フレームは両方とも１５０μｍ×１５０μｍであった。解剖学的構造の輪郭形成は、１０Ｘ／０．３０対物レンズを用いて行われた一方、細胞の数量化について、４０Ｘ／０．７５対物レンズが用いられた。歯状回のＳＧＺを顆粒細胞層（ＧＣＬ）の両側にある２細胞の直径として定義して、ＳＧＺ内のＢｒｄＵ＋細胞の数が計数された。ＤＣＸ＋細胞の計数は、予期される細胞移動に起因して、ＳＧＺ／ＧＣＬ内で行われた。ＢｒｄＵ細胞内で共発現する細胞の型特異性マーカを特定するために、１０Ｘ／０．３０、２０Ｘ／０．４０または４０Ｘ／０．６０対物レンズおよびＤＰマネージャと連結されたオリンパスＤＰ  ７１カメラを備えたオリンパスＩＸ  ７０マイクロスコープ（オリンパス、日本）を用いて、免疫蛍光共局在化が評価された。これらの細胞の計数は、ＳＧＺ／ＧＣＬ内で行われた。
【００６０】
データは平均±ＳＥＭを表しており、統計的検定は、有意としてＰ＜０．０５を用いて、対応のない両側ｔ検定によるものであった。
【００６１】
１２匹の老齢のラットにＣＴＸ０Ｅ０３細胞またはビークルのいずれかが移植され、２４時間後に、ＢｒｄＵで治療が行われた。最初の移植から４８時間、動物にはパラホルムアルデヒドが灌流され、動物の脳が取り出されるとともに、４０μｍで矢状薄片にされる前に冷凍保存された。それらの部位には、歯状回のＳＧＺでの細胞増殖、表現型、および生存を判定するために、多様な抗体で標識が付された。
【００６２】
増殖細胞の存在は、核ＢｒｄＵ標識を用いて判定された。これは、ビークル（２１８．０±３１．００）および細胞治療（６９４．９±１３０．０）の両方の動物において、歯状回のＳＧＸで明らかであった。図５に示すように、細胞治療が行われたラットでは、細胞数で３倍の有意な増加が見られた（ｔ＝３．８９４；ｄｆ＝９；Ｐ＝０．００３７；ｎ＝６）。神経前駆細胞の存在は、ＳＧＺのＤＣＸ標識を用いて判定された。標識細胞は、ビークル動物（９７０±３２．７）および細胞治療動物（１，２０２．４±６１．９）の両方で見られたが、この場合も、図６に示すように、細胞数が、ビークル（ｔ＝４．２９；ｄｆ＝８；Ｐ＝０．００２；ｎ＝５）と比べて、細胞治療動物において著しく増加した。
【００６３】
ＤＣＸ細胞はＢｒｄＵ陽性でもあることの確認は、図７に示すように、共局在化染色および共焦点像化によって示された。増殖細胞の可能な表現型の更なる特定は、ＢｒｄＵの局在化を伴い、ミクログリアおよび星状膠細胞のＩＢＡ−１およびＧＦＡＰ染色夫々を使用することによって判定された。
【００６４】
免疫蛍光ＩＢＡ−１およびＧＦＡＰ陽性染色細胞は豊富であったが、核ＢｒｄＵ陽性細胞は少なかった。それ故、ＢｒｄＵおよびＩＢＡ−１の共局在化は非常に限られており、ＢｒｄＵおよびＧＦＡＰの共発現はＳＧＺ内で見られなかった。ビークル治療動物および細胞治療動物の染色の間では、著しい差は観察されなかった（データ表示なし）。
【００６５】
注射部位およびＳＧＺ内での移植細胞の存在は、ＨｕＮｕ染色を用いて判定された。人間の核染色は、ＳＧＺ内にＨｕＮｕ陽性細胞を示しておらず、ＢｒｄＵ標識細胞は移植細胞ではなく、内因性のものであることを証明した。図８（Ａ）〜（ｃ）に示すように、幾つかのＨｕＮｕ染色は針穿刺経路に沿って、また脳室内で見られた。しかしながら、ＨｕＮｕ陽性細胞は、ビークル移植ラットまたは細胞移植ラットのいずれもＳＧＺ内で見られておらず、ＳＧＺ内のＢｒｄＵ標識細胞のいずれもが移植細胞ではなく、内因性のものであることを明らかにした。
【００６６】
ＳＧＺ内でのＨｕＮｕ染色の欠如は、注射２日後に、移植細胞は、幼若神経細胞となるように作用させ、或いは分化させるために原発部位に移動しておらず、代わりに、直接的に細胞増殖を誘発し、或いは間接的に炎症を低減させて、注射部位からの細胞増殖を促進させるなどの影響を作用させている。おそらく細胞は、ＩＬ−１０などの抗炎症サイトカイン、或いは脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン-３などの神経栄養因子の迅速な分泌を介して作用しており、これらは新しい神経細胞の成長および分化を促すことで知られている。ＣＴＸ０Ｅ０３細胞はインビトロでＶＥＧＦおよび他の因子を分泌することをこれまでに示した（エバ(Eva)ＤＪ，等(2008). Release of VEGF by ReN001
cortical stem cells. Cell Transplant. 17:464-465）。パルマー(Palmer)等(Palmer TD, et al.(2000). Vascular niche for adult hippocampal neurogenesis. J Comp
Neurol. 425:479-494）によれば、成年ラットのＳＧＺにおいて、神経発生は血管のすぐ近くで起きており、そこではＶＥＧＦの発現が高く、また血管形成が開始していることが報告された。この証拠または他のものに基づいて、パルマー等（Palmer TD, et al.(2000). Vascular niche for adult hippocampal neurogenesis. J Comp
Neurol. 425:479-494）は、神経新生および血管形成はメカニズム的に関連している可能性があると論じており、ＶＥＧＦをこのような関連をもたらし得る因子と言及している。また、ＶＥＧＦの脳室内注射は、ＳＧＺおよびＳＶＺでの神経前駆細胞の増殖を、インビトロおよびインビボの両方で促進させたことが分かっている（ジン(Jin)Ｋ，等(2002). Vascular endothelial growth
factor (VEGF) stimulates neurogenesis in vitro and in
vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 99:11946-11950、サン（Sun）Ｙ, 等(2006). Vascular endothelial growth
factor-B (VEGFB) stimulates neurogenesis: evidence
from knockout mice and growth factor administration. Dev Biol. 289:329-335）。いかなる理論に束縛されるつもりはないが、上記の観察から、内因性神経増殖へのＣＴＸ０Ｅ０３細胞の影響は、ＶＥＧＦによって調節され得る。これには、細胞がＶＥＧＦなどの因子を分泌する馴化培地、および移植に適するように減弱化された細胞の使用を含んでおり、例えば、細胞は凍結溶解作用または熱不活化によって減弱化される。これによれば、効果は細胞によって分泌される因子に起因しており、細胞自体に起因するのではないことが分かる。
【００６７】
ラットの脳へのＣＴＸ０Ｅ０３細胞の脳室内移植は、結果的に、脳の内因性幹細胞保有宿主の少なくとも一つの内での増殖の増加をもたらす。この増殖は、ＤＣＸ染色の増加によって示すように、幼若神経細胞でのものであるが、ＩＢＡ−１およびＧＦＡＰのＢｒｄＵとの著しい共局在化の欠如である。ＤＣＸ染色によって表された神経前駆細胞は（ＢｒｄＵ共局在化によって示すように）増殖性であることの確証も得られた。
【００６８】
ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、内因性神経細胞増殖へ影響を及ぼすように考えられる一方、どのようにしてこれが生じるのかについては正確に明らかではない。これまでの研究によれば、酵素カスパーゼ-１の変換抑制によるプロ-インターロイキン（ＩＬ）−１βからＩＬ−１βへの変換を阻止しているラットでの神経炎症の減少が、幾匹かのラットを年齢に関連する神経発生の減少から救い出し（ゲンマ(Gemma)Ｃ，等(2007)
Blockade of caspase-1 increases neurogenesis in the
aged hippocampus. Eur J Neurosci.
26:2795-2803）、その結果、認知機能の改善がもたらされたことが分かっており、この認知機能は、脳卒中に関連する脳の損傷によって影響を受けることが多い（ゲンマ  Ｃ，等(2005). Improvement of memory for context by inhibition of caspase-1
in aged rats. Eur J Neurosci.22:1751-1756）。また、ｈＵＣＢＣを伴い、外因性幹細胞は内因性神経始原細胞を促し、増殖を増加させるとともに、活性化ミクログリアの数の減少によって明らかなように、神経炎症を低下させる（バステッター(Bachstetter)ＡＤ，等(2008).Peripheral
injection of human umbilical cord blood stimulates neurogenesis
in the aged rat brain. BMC Neurosci.9:22）。増殖部位において、ビークルおよび細胞の間では、ごくわずかな共局在化されたＢｒｄＵおよびＩＢＡ陽性細胞の顕著な増加は観察されておらず、細胞および注射のいずれもが、新しいミクログリア細胞の免疫反応を誘発していないことが示唆されている。また、先の研究によれば、人間の臍帯血供給細胞の作用を制御するためのヒト末梢血単核細胞の投与は、神経細胞の増殖または海馬神経新生を変えないことが分かっている。（バステッター  ＡＤ，等(2008).Peripheral injection of human umbilical cord blood stimulates
neurogenesis in the aged rat brain. BMC Neurosci.9:22）。ｈＵＣＢＣ移植後の歯状回内での神経細胞増殖の増加の観察（バステッター(Bachstetter)ＡＤ，等(2008).Peripheral
injection of human umbilical cord blood stimulates neurogenesis
in the aged rat brain. BMC Neurosci.9:22）と同様に、ラットおよびマウスからのグリア拘束始原細胞またはＮＳＣは、より若いラット（２２ヶ月と比べて１２ヶ月）において、内因性ＮＳＣの数およびより長期にわたる研究での生存を促すことが示されており、細胞移植動物では、細胞数が３倍に増加した（ハッチアンガディ(Hattiangady)Ｂ，等(2007).Increased
dentate neurogenesis after grafting of glial restricted progenitors or neural stem cells in the
aging hippocampus. Stem cells.25:2104-2117）。
【００６９】
クローンヒトＮＳＣ株、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、４‐ヒドロキシ‐タモキシフェンが存在する状態で培養されたときに、制御された増殖を可能にするために、融合導入遺伝子ｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭを使用して、条件付きで不死化している。安全性または毒性の問題について、この細胞株ではインビボ研究で特定されていない。本明細書に提示されるデータは、脳の内因性回復特性を促進させるために、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞の付加的な使用を証明している。
【００７０】
先の明細書において、開示される全文献、作用および情報は、それらの文献、作用、またはそれらの任意を組み合わせた情報が、公的に入手でき、周知であり、当該技術分野の一般的知識の一部であり、また、優先時に任意の問題を解決することと関連性があると知られていたことを承認していない。
【００７１】
上記で引用された全ての発行物の開示は、各々が個々に参照により援用されたような範囲で、夫々の全体が、参照により本明細書へ明白に援用される。
【００７２】
神経変性疾患の静脈内治療または動脈内治療の特定の実施形態が説明および例証されているが、当該技術分野に属する者には当然のことながら、本発明の広範な精神および原則から逸脱することなく、変更および変形が可能である。前述の説明に含まれ、或いは添付の図面に示す全ての事項は、例証的なものとして解釈されるべきであって、限定的なものとみなされるべきではない。また当然のことながら、以下の請求の範囲は、本明細書に記載される発明の包括的および具体的な特徴全て、ならびに言語上それに当てはまると言える本発明の範囲の全ての声明を網羅することが理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【国際調査報告】
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