(57)【要約】  顕微鏡（２０）で試料（３０）を検査するために、試料（３０）内の色素粒子（４０、４２）が第一照射光ビーム（２４）によって蛍光発光状態に励起される。試料（３０）から放出する蛍光は光学装置（３４）を介してエリアセンサ（３６）へ向けられ、当該光学装置（３４）は、蛍光の複数の部分ビームが自身と干渉するように当該蛍光に作用し、当該干渉によって生じる干渉パターンがエリアセンサ（３６）の高感度表面上に投影されて後者によって検出される。試料（３０）内の色素粒子（４０、４２）の位置が、当該干渉パターンにしたがって決定される。
2013525770.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光発光性色素を含有する試料（３０）を顕微鏡（２０）を用いて検査する方法において、
前記試料（３０）内の色素粒子（４０、４２）を第一照射光ビーム（２４）を用いて蛍光発光状態に励起し、
前記試料（３０）から発する蛍光を光学装置（３４）を介してエリアセンサ（３６）へ向け、前記光学装置（３４）は、前記蛍光の複数の部分ビームが自身と干渉するように前記蛍光に作用して、前記干渉の結果として作り出された干渉パターンがエリアセンサ（３６）の高感度表面上に投影されて検出され、及び、
試料（３０）内の色素粒子（４０、４２）の位置が、前記干渉パターンに基づいて突き止められる、方法。
【請求項２】
選択された色素粒子（４０、４２）だけが蛍光発光状態に励起され、前記選択は互いに区別可能な干渉パターンに基づいてなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
色素粒子（４０、４２）が前もって活性化された場合にのみ蛍光発光状態に励起可能であって、当該色素粒子（４０、４２）の一つの部分集合だけが活性化されて、次に当該活性化された色素粒子（４０、４２）が第一照射光ビーム（２４）を用いて蛍光発光状態に励起されることによって、前記予め選択された色素粒子（４０、４２）を励起する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
色素粒子（４０、４２）が前もって不活性化された場合には、前記色素粒子（４０、４２）をもはや励起することは不可能であって、当該色素粒子（４０、４２）の一つの部分集合だけが不活性化されて、次に残りの活性化された色素粒子（４０、４２）が第一照射光ビーム（２４）を用いて蛍光発光状態に励起されることによって、前記予め選択された色素粒子（４０、４２）を励起する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
試料の一つの部分領域内にある色素粒子（４０、４２）だけが蛍光発光状態に励起されることによって、前記予め選択された色素粒子（４０、４２）を励起する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
試料（３０）内の一つの面が一部分領域として照射される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第一照射光ビーム（２４）が前記面と垂直に延びる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第一照射光ビーム（２４）が前記面と平行である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
第一照射光ビーム（２４）が、前記面でゼロから９０度の既定の角度を囲む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
色素粒子（４０、４２）を活性化又は不活性化するために、活性化光ビームが発生されて、試料（３０）上に向けられる、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記面内の色素粒子（４０、４２）が、多光子励起を用いて蛍光発光状態に励起される、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
干渉パターンの変化が検出されて評価され、試料（３０）内の蛍光発光性の色素粒子（４０、４２）の動きが、干渉パターンにおける変化に基づいて突き止められる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
試料（３０）の部分領域が脱色され、脱色していない色素粒子（４０、４２）が部分領域の外側から当該部分領域内へ移動するなかで、当該部分領域の再生成が、その結果として生じる干渉パターンの変化に基づいて観察される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
二つ以上の異なる色素の色素粒子（４０、４２）が同時に蛍光発光状態に励起されて観察される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
色素粒子（４０、４２）の蛍光発光挙動の減衰過程が観察され、個々の色素粒子（４０、４２）の蛍光発光継続時間が当該減衰過程に基づいて把握されて、当該色素粒子（４０、４２）の環境特性が当該蛍光発光継続時間に基づいて突き止められる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡を用いることにより蛍光発光性色素を含有する試料を検査する方法に関連している。試料中の色素粒子は、顕微鏡の第一照射光ビームを用いることにより蛍光発光状態へ励起される。試料から発する蛍光は、光学装置を介してエリアセンサに向けられる。
【背景技術】
【０００２】
試料内の三次元構造は様々な方法で視覚化することが可能である。例えば、試料表面又は試料内の二次元領域、特に平面内を走査型顕微鏡で走査することができる。前記面に対し垂直な構造は、例えば試料ステージを、又は、顕微鏡の光学システムの一部を検出すべきビーム（以後、検出ビームと呼ぶ）と平行に動かすことによって、解析（解像）することが可能である。しかしながら、これら構成要素の機械的移動には長い時間がかかり、使用する顕微鏡に対し、特に精密で、複雑なデザインを要求する。
【０００３】
その代わりに、検出ビーム自身と干渉する光学装置が検出ビーム路内に配置されることにより、検出ビームと平行な方向に沿って試料内の構造を解析することが知られている。このようにして干渉された光ビームは、次にエリアセンサ上へ向けられる。干渉放射光の結果、エリアセンサ上に干渉パターンを形成する。点光源の場合には、干渉パターンは基本的に同心円状である。一つの面内に、且つ、当該面に対し垂直な光源の位置は、次に干渉パターンに基づいて突き止めることが可能であるので、試料内構造の三次元解析が、顕微鏡の機械要素を動かす必要なく可能となる。該当する方法の一例は、FINCHである。
【０００４】
また、例えば組織試料又は生体細胞のような試料内の構造を、当該試料中に蛍光発光性色素を添加することによって視覚化することが知られている。
【０００５】
試料中の色素粒子は、次に蛍光発光状態に励起されて、試料から放出された蛍光が検出される。前記蛍光発光性色素粒子は、試料内において様々な移送過程を経ることが可能、又は、試料内の構造に付着することが可能であるので、当該移送過程及び構造は、前記放出された蛍光に基づいて夫々調査可能である。適切な色素粒子は、例えば、有機色素、特に蛍光発光性タンパク質、及び／又は、タンデム分子のような有機色素、又は、生物マーカーに結合するナノ結晶のような無機色素である。
【０００６】
また、試料内に活性化可能な色素粒子を添加することも知られており、当該粒子は、活性化した場合にのみ蛍光発光状態に励起されうる。例えば、試料中で色素粒子の部分集合の活性化ができると、活性化された色素粒子の当該部分集合は、次に蛍光発光するように励起されうる。活性化されなかった色素粒子は、励起状態に知覚できるくらいに反応をせず、蛍光を放出しない。これらのプロセスに基づく方法は、例えばPALM又はSTORMと呼ばれている。その代わりに、活性化色素粒子の部分集合を不活性化することが可能であるので、残りの活性化色素粒子を蛍光発光状態に励起することも可能である、これは例えばFPALM又はGISTと呼ばれている。
【０００７】
別の公知の方法には、検出ビームに垂直な面のみが照射されるSPIM、蛍光発光性色素粒子の励起状態の寿命が検査されて、色素粒子の環境についてそこから結果を導き出すことが可能であるFLIM、結合性及び非結合性色素粒子の拡散時間を互いに比較するFCS、及び、非常に小さな焦点内の個々の色素粒子が、各々二つのほぼ同時に吸収された光子によって蛍光発光状態に励起される、MPつまり多光子励起がある。
【０００８】
特許文献１は、三次元画像用のデジタル式ホログラフィック顕微鏡とその使用方法を開示している。試料は、入射又は透過光法を用いて照射され、その結果、試料中の蛍光発光性物質が蛍光発光状態に励起される。放射蛍光が、微分干渉計により、自身と干渉するようにして重ね合わされる。結果として生じる干渉パターンは、検出器によって検出される。試料の三次元画像が検出光に基づいて創りだされる。
【０００９】
特許文献２は、光学画像の分解能を上げる方法を開示している。回折格子又は複数鏡によって試料内で最大照度と最小照度が生じるので、試料のある部分だけが照射される。照射された部分領域内では、蛍光発光性物質が蛍光発光状態に励起される。このようにして生じた蛍光は、励起フィルタと拡大光学システムを介してエリアセンサに向けられる。
【００１０】
特許文献３は、光変換可能なマーカーを備えた光学顕微鏡を記載している。当該マーカーは活性化光によって活性化されるので、蛍光発光できる。活性化されたマーカーは、励起光によって蛍光発光状態に励起される。結果として生じる蛍光は、フィルタを通り抜けて、蛍光を検出する検出器へ衝突する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】DE 60 2004 005 338 T2
【特許文献２】DE 199 08 883 A1
【特許文献３】WO 2006/127692 A2
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、蛍光発光性色素を含有する試料を顕微鏡で検査する方法を創出することであり、当該方法は、試料内の三次元構造を簡単に解析することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この課題は、独立請求項１の特徴構成によって解決される。有利な実施形態を従属請求項中に示す。
【００１４】
本発明は、蛍光の複数の部分ビームが自身と干渉するように光学装置が蛍光に作用するので、当該干渉の結果作り出された干渉パターンがエリアセンサの高感度表面に投影されて検出される、という点で注目に値する。試料内の色素粒子の位置は、干渉パターン（に基づいて）との相関関係で把握され（突き止められ）る。
【００１５】
色素粒子によって生じた干渉パターンの評価は、顕微鏡の機械要素移動の必要なく、試料内の三次元体積における色素粒子の精密な位置を決定することを可能にする。このことは、三次元分解能が高いにも関わらず顕微鏡が単純な構成で作られ、且つ、保守期間を延長可能にするということをもたらす。
【００１６】
十分に良好な分解能と、したがって個々の色素粒子の十分良好な区別が、既定の領域内における色素粒子の一部分集合だけが蛍光発光状態に励起されることによって達成されることが好ましい。前記部分集合、特に当該部分集合内の色素粒子の数が、相互に区別可能な干渉パターンに基づいて決定される。言い換えると、蛍光発光状態に励起された部分集合とは、最大で、干渉パターンが互いに区別可能であり且つエリアセンサによって評価できる、既定体積内における色素粒子の数のことである。こういうわけで、例えば初期には一部分集合のみが活性化されて次に蛍光発光状態に励起される、又は、初期に全ての色素粒子が活性化されて次に当該色素粒子の一部が不活性化され、残りの活性化色素粒子の部分集合が蛍光発光状態に励起される、という活性化可能な色素粒子を用いることができる。
【００１７】
その代わりに又はそれに加えて、色素粒子の前記部分集合は、試料の部分領域内の色素粒子だけが蛍光発光状態に励起されるということにより決定可能である。試料内の一つの面が、例えば部分領域として選択可能である。それに垂直に延びる顕微鏡の照射光ビームが前記面と平行に進行するか、又は、当該面で０から９０°の予め既定された角度を囲むようにして、前記面を配置することができる。
【００１８】
その代わりに、照射光ビームを試料の個々の部分にのみ向けることも可能であるので、当該試料の部分領域のみが照射され、当該部分領域において色素粒子が蛍光発光状態へ励起される。前記面内で色素粒子を励起するための別の可能性は、多光子励起によって実現できる。
【００１９】
干渉パターンは、既定された期間にわたって検出することが可能であるので、干渉パターンにおける変化が観察可能である。当該変化にしたがい、次に試料内の色素粒子の移動についての結論を導き出すことが可能となる。それに基づいて、試料中の移動過程についての結論を導き出すことが可能となる。
【００２０】
蛍光発光状態に励起された色素粒子は、原則蛍光寿命を有している。前記蛍光寿命は、当該励起された色素粒子が、光子を放出することによる基底状態への遷移をするまでに、平均でどれくらいの期間励起状態でいられるかということを表している。試料中の励起した色素粒子は、周囲の構造へエネルギーを移すことができる。当該色素粒子の蛍光寿命はこれによって減る。試料内における色素粒子の蛍光寿命の観察は、したがって色素粒子を取り囲む構造について結論を導き出すのに役立つ。
【００２１】
一色素の色素粒子の観察に加え、二つ以上の色素の色素粒子も観察可能である。
【００２２】
概念図を参照しながら本発明の実施形態を以下にさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】顕微鏡の第一実施形態を表す図である。
【図２】前記顕微鏡の機能原理の図である。
【図３】顕微鏡の第二実施形態を表す図である。
【図４】前記顕微鏡の照射マトリクスの図である。
【図５】前記顕微鏡を操作するためのプログラムのフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
同一の設計又は機能の構成要素には、全ての図にわたり同一の参照符号がふられている。
【００２５】
図１は顕微鏡２０を表している。顕微鏡２０は共焦点走査型顕微鏡である。顕微鏡２０は特に蛍光顕微鏡である。顕微鏡２０は第一照射光源２２を含んでいる。第一照射光源２２は、カラーフィルタ２６を介してビームスプリッタ２８へ向けられる第一照射光ビーム２４を生じる。ビームスプリッタ２８は、第一照射光ビーム２４を試料３０の方へ反射する。試料３０は、蛍光発光状態へ励起される多数の色素粒子を含んでいる。試料３０から出る蛍光（以後「検出光」と呼ぶ）は、当該検出光を第一照射光ビーム２４から分離するビームスプリッタ２８を通り抜け、そこから結果として生じる検出光ビーム３２は、光学装置３４を介してエリアセンサ３６上へ向けられる。
【００２６】
前記光学装置は回折光学要素３４を含んでいる。回折光学要素３４は空間光変調器（SLM）を含んでいる。その代わりに、光学要素３４は、例えばマイクロディスプレイ又はLCOS位相変調器、特にフレネルゾーンプレート又はフレネルレンズを含んでいる。エリアセンサ３６は光検知型CMOSモジュールを含んでいる。代わりに又は更に、エリアセンサ３６はCCDモジュールを含むことも可能である。第一照射光源２２はレーザーを含んでいる。前記レーザーは、好ましくは広帯域レーザー、特に白色光レーザーである。その代わりに、第一照射光源２２は、水銀光源、キセノン光源、又は、LEDを含む。
【００２７】
図２は顕微鏡２０の機能原理の図である。試料３０内に含有された第一色素粒子４０と第二色素粒子４２は、光学装置３４の方へ蛍光を発する。光学装置３４は、複数の蛍光ビームが自身と干渉するようにして当該蛍光ビームに作用する。色素粒子４０、４２から見えるように、干渉パターンが光学装置３４の後方で発生して、エリアセンサ３６上に投影される。特に、第一色素粒子４０は第一リングパターン４４を、且つ、第二色素粒子４２は第二リングパターン４６をエリアセンサ３６の高感度表面上にもたらす。図２に図示した仮想空間は説明を目的としており本当に存在するわけではなく、第一色素粒子４０の画像５０と第二色素粒子４２の画像５２の可視化を目的として用いられているに過ぎない。仮想空間３８内の画像５０、５２の位置、したがって試料３０内の二つの色素粒子４０、４２の実際の三次元位置は、顕微鏡２０の演算ユニットによって突き止められる。
【００２８】
図３は顕微鏡２０の別の実施形態を表している。顕微鏡２０のこの実施形態は、カラーフィルタ２６が省略され、第一照射光源２２に加えて第二照射光源５３が加えられたことだけを除き、顕微鏡２０の第一実施例と殆んど同じである。第二照射光源５３は第二照射光ビーム５４を生じる。第二照射光ビーム５４は、側方から、かつ、特に第一照射光ビーム２４に対して９０°の角度でもって試料３０を照射する。第二照射光源５３は、特に試料３０内の面を照射するのに適しており、それによって当該面内の色素粒子を活性化及び／又は励起する。
【００２９】
図３に記載の顕微鏡２０は様々な手法で操作可能である。例えば、試料３０を照射するために専ら第二照射光ビーム５４が使用可能であり、次に第一照射光源２２を省略することが可能である。その代わりに、試料３０内の活性化可能な色素粒子を二つの照射光ビーム２４、５４のうち一つで活性化し、且つ、当該二つの照射光ビーム２４、５４のうちのもう一方で励起することも可能である。
【００３０】
図４は顕微鏡２０の照射マトリクス（照射行列）５６を表している。照射マトリクス５６は、第一照射光ビーム２４によって選択的に照射することが可能な個々のセルを備えている。例えば、試料３０は黒色に着色した領域内を専ら照射可能である。このことは、第一照射光ビーム２４を試料３０にわたって走査することにより、且つ、黒色に着色したセルの外側で第一照射光ビーム２４を遮断することにより、走査型顕微鏡を用いて実現される。
【００３１】
図５は、顕微鏡２０を用いて蛍光発光性色素を含有する試料３０を検査するためのプログラムのフローチャートを表している。前記プログラムは、試料３０内の個々の色素粒子４０、４２の三次元位置を、特に顕微鏡の機械構成要素の移動をすることなく識別するために用いられる。
【００３２】
前記プログラムは、変数が適用可能となるように初期化されるところのステップＳ１で開始する。
【００３３】
ステップＳ２は、試料３０の既定された領域内に存在する色素粒子の数が、それらの干渉パターンがもはや区別可能でなくなった場合に実行される。ステップＳ２は、既定した範囲内に存在する色素粒子の一部分集合を単に励起するために用いられる。ステップＳ２において、活性化可能な色素粒子４０、４２が用いられる場合には、当該活性化可能な色素粒子の一部分集合が活性化されるか、又は、複数の活性色素粒子を不活性化できることにより、残りの活性色素粒子の部分集合を引き続いて励起できる。
【００３４】
ステップＳ３において、活性色素粒子４０、４２、従って励起可能な色素粒子４０、４２が蛍光発光状態に励起される。
【００３５】
代わりに又は加えて、色素粒子の部分集合は、試料３０内における一つの面内の色素粒子だけを活性化及び／又は励起することによって励起可能である。例えば多光子励起が、第一照射光源２２によって実行可能であり、それによって前記面内だけに、適切な励起を達成するのに十分高い励起確率が存在する。その代わりに、例えば第二光源５３が小さな部分集合内、特に試料３０内における面内の色素粒子だけを励起するのに用いられうる。その代わりに、試料３０の全領域を高エネルギー放射光で脱色することが可能であり、それによって前記領域内の全ての蛍光発光色素粒子が不活性化されるか、又は、破壊される。試料３０内の移送運動の結果、活性化又は活性化された色素粒子が当該脱色された領域内に移送されて、その中で励起可能である。これら移送過程は、より長い期間に渡って干渉パターンを観察することによって観察可能である。代わりに又は加えて、試料３０は選択的に照射可能である、例えば照射マトリクス５６の個々のセルを専ら照射することが可能である。選択的照射は、例えばスキャナ、個々に切換可能なLED、又は、切換可能な光学装置、例えば切換可能なSLMを用いることによって実行可能である。これについて次に、照射された領域に由来するデータだけを読み出すことが可能であり、したがって読み出し速度を増加する。様々に照射された領域からのデータは、共に評価することが可能である（FCS）。
【００３６】
ステップＳ４において、試料３０から放出された蛍光が、個々の蛍光ビーム３２が自身と干渉するようにして、自身に重ね合わせられる。
【００３７】
ステップＳ５において、エリアセンサ３６の高感度表面上に投影された干渉パターンが検出される。
【００３８】
ステップＳ６において、演算ユニットを用いることにより、エリアセンサ３６の信号が読み出されて、リングパターン４６、４４によって表された強度分布に基づいて評価される。特に、第一の部分ステップ（サブステップ）において、リングパターンの中心（中心点とも呼ばれる）が突き止められる。試料３０内の色素粒子の三次元位置が次に、リングパターンの半径と、前記中心とに基づいて突き止められる。面からの信号は、これらリングパターンが一致することによって検出可能である。試料３０内の面は、これを考慮して規定可能であり、且つ、データが専らその面から得られうる。加えて、特徴検出又は対象物検出機能によってデータの可視化が促進されうる。
【００３９】
ステップＳ７において、干渉パターンがより長い期間に渡って観察されうる。より長い期間に渡る観察は、試料３０内の移動する色素粒子４０、４２を追跡することを可能にさせ、したがって、試料３０内の移動過程を可視化することを可能にさせる。代わりに又は加えて、蛍光発光性色素粒子４０、４２の蛍光寿命が、観察した色素粒子を取り巻く構造についての情報をもたらす、干渉パターンのうち一つの強度変化に基づいて突き止めることが可能である。特にこれに関して、試料３０が短パルス幅を有するパルスレーザーによって照射される。観察可能な減衰過程は、個々の色素粒子の特性であり、色素粒子が付着している構造に関連して変化する。次にこの減衰過程に基づいて個々のマーカーの近隣についての結論を導き出すことが可能である。
【００４０】
ステップＳ８（図５に示さず）において、プログラムは終了する。しかしながら、前記プログラムが顕微鏡２０の操作中に常時実行されることが好ましい。
【００４１】
既定の期間に渡って全三空間方向での色素粒子の観察が、対象物追跡、したがって、自動焦点（オートフォーカス）機能を使って試料３０内の色素粒子を追跡するために用いられる。それに加えて、自動焦点機能を単独で実行可能である。3-Dデータメモリを読み出すことも可能である。
【００４２】
本発明は記載の例示的な実施形態に制限されない。本発明は、試料３０内における個々の色素粒子の精確な位置について干渉の評価が可能なようにして、エリアセンサ３６の高感度表面上の結果として生じる干渉パターンが依然として区別可能であるくらいに十分小さい、選択した蛍光発光性色素粒子を励起可能である、いかなる顕微鏡にも適している。加えて、光学要素３４は、前記蛍光を二つの部分ビームへ分割する一つのビームスプリッタによって実行可能であり、次に前記二つの部分ビーム間の路差が、別のビーム誘導装置または別の光学要素によって実現される。前記部分ビームは続いて再度組み合わせられて、自身と干渉する。そのうえ、様々な色の色素粒子も同時に観察可能である。
【符号の説明】
【００４３】
２０  顕微鏡
２２  第一照射光源
２４  第一照射光ビーム
２６  カラーフィルタ
２８  ビームスプリッタ
３０  試料
３２  蛍光ビーム
３４  光学装置
３６  エリアセンサ
３８  仮想空間
４０  第一色素粒子
４２  第二色素粒子
４４  第一リングパターン
４６  第二リングパターン
５０  第一色素粒子の画像
５２  第二色素粒子の画像
５４  第二照射光ビーム
５６  照射行列（照射マトリックス）
START  プログラム開始
END  プログラム終了
S1-S8  １から８までのステップ
【図１】
2013525770.tif 000003
【図２】
2013525770.tif 000004
【図３】
2013525770.tif 000005
【図４】
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【図５】
2013525770.tif 000007
【国際調査報告】
2013525770.tif 000008
2013525770.tif 000009
2013525770.tif 000010
2013525770.tif 000011
2013525770.tif 000012
2013525770.tif 000013