(57)【要約】  抗体を調製するための方法が提供され、この方法では、３−ブロモ−４−ヒドロキシ−安息香酸をタンパク質へ組み込むことにより抗原を形成し、当該抗原により哺乳類宿主に免疫性を与え、当該宿主からかかる抗原に対する親和性を有する抗体を回収する。モノハロチロシンに対する結合親和性を有する抗体が提供されるとともに、モノハロチロシンと結合した抗体を含む組成物が提供される。３−ブロモ−４−ヒドロキシ−安息香酸部分を有するタンパク質を含む組成物も提供される。喘息の重症度を評価するための方法が提供され、この方法では、モノハロチロシンに対する結合親和性を有する抗体を用いて患者の唾液を分析し、タンパク質に結合した抗体の量を測定する。体液中の好酸球活性を決定するための方法も提供され、この方法では、モノハロチロシンに対する結合親和性を有する抗体に対して体液を晒し、結合抗体の量を測定することにより好酸球活性を決定する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノハロチロシンに対する結合親和性を有することを特徴とする抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体において、前記モノハロチロシンはブロモチロシンであることを特徴とする抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体において、前記モノハロチロシンは、クロロチロシンであることを特徴とする抗体。
【請求項４】
請求項１に記載の抗体において、前記モノハロチロシンは、タンパク質の構成部分であることを特徴とする抗体。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体において、前記抗体は、ジハロチロシンに対する結合親和性も有することを特徴とする抗体。
【請求項６】
モノハロチロシンと結合した抗体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物において、前記モノハロチロシンは、タンパク質の構成部分であることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の組成物において、前記モノハロチロシンは、ブロモチロシン及び／又はクロロチロシンのうちの１つ又は両方であることを特徴とする組成物。
【請求項９】
３−ブロモ−４−ヒドロキシ−安息香酸部分を有するタンパク質を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の組成物において、前記タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）であることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
喘息の重症度を評価するための方法であって、該方法は、
モノハロチロシンに対する結合親和性を有する抗体を用いて患者の唾液を分析し、
タンパク質に結合した抗体の量を測定する、
ことを具備することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記測定することは、定性的及び／又は定量的の一方又は両方であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、前記モノハロチロシンは、タンパク質の構成部分であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法において、前記モノハロチロシンは、ブロモチロシン及び／又はクロロチロシンのうちの１つ又は両方であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法であって、さらに、炎症量を決定するために結合抗体の量を相関させることを具備することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の方法であって、さらに、喘息発作への薬物反応をモニタするために結合抗体の量を用いることを具備することを特徴とする方法。
【請求項１７】
体液中の好酸球活性を決定するための方法であって、該方法は、
モノハロチロシンに対する結合親和性を有する抗体に対して体液を晒し、
好酸球活性を決定するために結合抗体の量を測定する、
ことを具備することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記体液は、唾液であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法において、前記モノハロチロシンは、タンパク質の構成部分であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法において、前記モノハロチロシンは、ブロモチロシン及び／又はクロロチロシンのうちの１つ又は両方であることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法であって、さらに、炎症及び／又は薬物反応を決定するために結合抗体の量を相関させることを具備することを特徴とする方法。
【請求項２２】
抗体を調製するための方法であって、該方法は、
３−ブロモ−４−ヒドロキシ−安息香酸をタンパク質へ組み込むことにより抗原を形成し、
前記抗原により哺乳類宿主に免疫性を与え、
前記宿主から前記抗原に対する親和性を有する抗体を回収する、
ことを具備することを特徴とする特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、前記タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法において、前記抗体は、モノハロチロシンに対する結合親和性を有することを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法において、前記モノハロチロシンは、ブロモチロシン及び／又はクロロチロシンのうちの１つ又は両方であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２２に記載の方法において、前記抗体は、タンパク質ハロチロシンに対する結合親和性を有することを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法において、前記ハロチロシンは、モノハロチロシン及び／又はジハロチロシンのうちの１つ又は両方であることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法において、前記モノハロチロシンは、３−ブロモチロシン及び／又は３−クロロチロシンのうちの１つ又は両方であることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法において、前記ジハロチロシンは、３、５−ジブロモチロシン及び／又は３、５−ジクロロチロシンのうちの１つ又は両方であることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２２に記載の方法であって、さらに、好酸球活性を決定するために体液に対して抗体を晒すことを具備することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２２に記載の方法であって、さらに、炎症を決定するために体液に対して抗体を晒すことを具備することを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２２に記載の方法であって、さらに、モノハロチロシン及び／又はジハロチロシン部分を有するタンパク質の量を決定するために体液に対して抗体を晒すことを具備することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１０年１０月１９日に出願した米国仮出願第６１／３９４，６４０号及び２０１１年４月２８日に出願した米国仮出願第６１／４８０，１５４号に対して優先権を主張し、これらの各米国仮出願の記載内容はすべて本明細書に援用される。
（政府権利声明）
【０００２】
本発明は、米国エネルギー省によって授与された契約ＤＥ−ＡＣ０５７６ＲＬＯ１８３０の下、政府支援によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。また本研究は、ＮＩＥＨＳ暴露生物学プログラム（Ｕ５４／ＥＳ０１６０１５）及び米国国防総省乳がんポストドクトラルフェローシップＷ８１ＸＷＨ−１０−１−００３１によって支援された。
【０００３】
（技術分野）
本開示は、抗体の調製及びその使用に関する。本開示に特有な実施形態は、モノハロチロシン及びモノハロチロシン部分を有するタンパク質に対して親和性を有する抗体の調製に関連する。
【背景技術】
【０００４】
喘息は、気道の一時的な狭窄という特徴がある一般的な病気である。この病気は、米国において約２，３００万の成人に影響を与える主要な公衆衛生の懸案事項である。細気管支への活性化好酸球の浸潤が、喘息の主要原因と考えられている。唾液及び肺生検標本中の好酸球数と好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）等の分泌された好酸球粒状タンパク質の存在とが、喘息の重症度の指標である。ブロモチロシンタンパク質修飾が喘息患者において増加するのはＥＰＯに起因しており、このＥＰＯは、次亜臭素酸塩の形成と、それに続くブロモチロシンの形成とを触媒する。質量分析検出によるガスクロマトグラフィーを使用した以前の研究では、３−ブロモチロシン及び３、５−ジブロモチロシンが、それぞれ気管支肺胞洗浄液及び喘息患者からの唾液標本において大幅に上昇していたことが判明した。喘息における臭素化タンパク質の役割に関する研究は、生体液におけるブロモチロシンレベルをモニタするための迅速で簡単な方法が存在しなかったために限られていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＹＡＳＵＨＩＲＯ  ＫＡＭＢＡＹＡＳＨＩ  ＥＴ  ＡＬ：  "Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ"，  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＮＵＴＲＩＴＩＯＮ，  ｖｏｌ．  ４４，  ｎｏ．  １，  １  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００９，  ｐａｇｅｓ  ９５−１０３，  ＸＰ５５０３６４３４，  ＩＳＳＮ：  ０９１２−０００９，  ＤＯＩ：  １０．３１６４／ｊｃｂｎ．０８−１９６
【非特許文献２】ＫＡＴＯ  Ｙ  ＥＴ  ＡＬ：  "Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｄｉｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ"，  ＦＲＥＥ  ＲＡＤＩＣＡＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，  ＥＬＳＥＶＩＥＲ  ＳＣＩＥＮＣＥ，  ＵＳ，  ｖｏｌ．  ３８，  ｎｏ．  １，  １  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００５，  ｐａｇｅｓ  ２４−３１，  ＸＰ２７８２９７４６，  ＩＳＳＮ；  ０８９１−５８４９，  ＤＯＩ：  １０．１０１６／Ｊ．ＦＲＥＥＲＡＤＢＩＯＭＥＤ．  ２００４．０９．０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示の更なる利点及び新規な特徴は、以下に記載されると共に、本明細書に記載される説明及び実証から容易に明らかになるであろう。したがって、本開示の以下の説明は、本開示の例示として見なされるべきであり、限定されるべきものではない。
【０００７】
ブロモチロシン変性タンパク質は、気道酸化ストレスの安定したバイオマーカとして有用であり得る。３−ブロモチロシンは、生体内で起こる優勢なブロモチロシンであると考えられる。しかしながら、以前の試みでは、３−ブロモチロシンを認識する有用な抗体を生産することができなかった。例えば、１９３０年、Ｗｏｒｍａｌｌは、３、５−ジブロモチロシンに対するウサギ抗血清の生産を報告しているが、３−ブロモチロシン抗体を生成する試みに失敗している。より最近では、カンバヤシら及びカトウらは、臭素化タンパク質に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体を生成したが、彼らの抗体も３、５−ジブロモチロシンのみと反応する。
【０００８】
このように３−ブロモチロシンを認識する抗体の生産に失敗している理由としては、抗原を生産するために使用される条件に起因する。質量分析及び核磁気共鳴分析によれば、ジブロモチロシン修飾は、生体外タンパク質臭素化の結果として、３−ブロモチロシン修飾に対して優先的に生産されることが示されている。生体内臭素化を模倣することが予想される試薬を用いると、３−ブロモチロシンに対する良好な抗原を生産することは難しくなり得る。
【０００９】
本開示では、３−ブロモ−４−ヒドロキシ−安息香酸部分を有するタンパク質を含有し得る抗原組成を提供する。また本開示では、この抗原の生産方法を提供する。
【００１０】
この抗原からは、ハロチロシンに対して親和性を有する抗体を識別することができ、この抗体は、モノ臭素化されたチロシン残基を認識すると考えられるだけでなく、他のハロゲン化されたチロシン残基を結合する。モノハロチロシン等のハロチロシンに対する親和性に加えて、この抗原に対する親和性を有するこれら抗体を生産するための方法が提供される。ハロチロシン部分を有するタンパク質に対して親和性を有する抗体が提供されると共に、ハロチロシンを結合した抗体を有する組成物が提供される。
【００１１】
さらに本開示では、開示された抗体が、ヒトの唾液タンパク質におけるハロチロシンのレベル別に健常対照者と喘息患者とを区別できる、ということが実証される。喘息の重症度を評価するための方法が提供されると共に、好酸球数を決定するための方法が提供される。
【００１２】
本開示の幾つかの実施形態が、次のような添付図面を参照して以下に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本開示の一実施形態に係る抗原を生産するための合成スキームである。
【図２】図２は、本開示の一実施形態に係る生産された抗体の分析を示している。
【図３】図３は、本開示の一実施形態に係る生産された抗体を利用して得られたデータを示している。
【図４】図４は、本開示の一実施形態に係るタンパク質の構成部分を示すと共に、生産された抗体を利用して得られたデータを示している。
【図５】図５は、本開示の一実施形態に係る生産された抗体を利用して得られたデータを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示の様々な利点及び新規な特徴が、ここに記載されると共に、以下の詳細な説明から当業者に対してさらに容易に明らかになるであろう。これ以前の説明及び以下の説明において、本開示の実施形態は、例示及び説明のために提供される。以下理解されるように、本開示から逸脱することなく、本開示は様々な点で変更が可能である。したがって、以下に説明する実施形態の図面及び説明は制限的なものではなく、事実上例示として見なされるべきである。
【００１５】
本開示により、組成物、抗体、抗原、抗原を生産するための方法、抗体を生産するための方法、喘息を評価するための方法、及び好酸球数を決定するための方法が提供される。
【００１６】
抗体を調製するための方法が提供される。この方法には、３−ブロモ−４−ヒドロキシ−安息香酸等のハロチロシン類似体をタンパク質に組み込むことにより抗原を形成することが含まれ得る。さらにこの方法には、かかる抗原により哺乳類宿主に免疫性を与えること、及びこの宿主から抗原に対する親和性を有する抗体を回収することが含まれ得る。実施例によれば、かかるタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）であり得る。この方法によれば組成物は抗原を有し、この抗原は３−ブロモチロシンを模倣する化合物でＫＬＨを修飾することにより提供される。したがって、３−ブロモ−４−ヒドロキシ−安息香酸部分を有するタンパク質を含み得る組成物が提供され、例えばこのタンパク質はＫＬＨである。
【００１７】
本開示の態様によれば、これにより生体外タンパク質臭素化及び主にジブロモチロシンの生産に関する問題を回避することができる。次に、モノ臭素化を最適化する条件下においてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を臭素化することができ、そしてこのウシ血清アルブミンを用いてハイブリドーマ細胞株をスクリーニングすると共に、生理学的関連チロシン修飾に対して親和性を有し得るクローンを同定する。この結果得られるＢＴＫ−９４Ｃ抗体は、３−ブロモチロシン及び３、５−ジブロモチロシンに対して親和性を有すると共に、３−クロロチロシン及び３，５−ジクロロチロシンに対しても親和性を有する。しかしながらＢＴＫ−９４Ｃ抗体は、非修飾チロシン、３−ニトロチロシン、又は３−ヒドロキシチロシンに対しては親和性を有していない（例えば図２及び４を参照）。
【００１８】
タンパク質のクロロチロシン修飾も、次亜塩素酸塩を使用することにより提供され、この次亜塩素酸塩は、ミエロペルオキシダーゼの産物であり、このミエロペルオキシダーゼは、好中球及びマクロファージで見つかる酵素である。この抗体は、すべての４つの生理学的に関連するハロゲン化されたタンパク質チロシン残基を結合すると考えられることから、ＢＴＫ−９４Ｃは一般的なハロチロシン抗体と考えられ得る。
【００１９】
したがって、本開示の方法により、タンパク質ハロチロシンに対して、特に実施形態においてはモノハロチロシンに対して、結合親和性を有する抗体が提供される。このハロチロシンは、モノハロチロシン及び／又はジハロチロシンの１つ又は両方であり得る。このモノハロチロシンは、ブロモチロシン及び／又はクロロチロシンの１つ又は両方であり得る。またこのモノハロチロシンは、３−ブロモチロシン及び／又は３−クロロチロシンの１つ又は両方であり得る。このジハロチロシンは、３、５−ジブロモチロシン及び／又は３、５−ジクロロチロシンの１つ又は両方であり得る。また、抗原に結合された本開示の抗体を有する組成物が提供され、この抗原はハロチロシン及び／又はハロチロシンタンパク質である。
【００２０】
本開示の抗体を用いた実施例によれば、以前に用いられた方法に関する様々な問題を克服することができる。いくつかのポリクローナル及びモノクローナル抗体が臭素化タンパク質と反応することが報告されている一方で、これらの抗体はジブロモチロシンのみと反応するようであり、３−ブロモチロシンとは反応しない。３−ブロモチロシンは、生体内で観察される優勢な修飾であることから、これは重要な制限である。
【００２１】
さらに本開示により提供される方法は、体液に対してかかる抗体を晒すことにより、例えば、好酸球活性、炎症、及び／又はモノハロチロシン及び／又はジハロチロシン部分を有するタンパク質量のうちの１以上を決定することが含まれ得る。
【００２２】
喘息の重症度を評価するための方法も提供される。この方法には、モノハロチロシンに対する結合親和性を有する抗体を用いて患者の唾液を分析すること、及びタンパク質に結合される抗体の量を測定することが含まれ得る。この方法は、定性的及び／又は定量的のうちの１つ又は両方であり得る。この方法には、結合抗体の量を相関させることにより炎症の量を決定することが含まれ得る。この方法には、別々に又は一緒に、結合抗体の量を使用して喘息発作への薬物反応をモニタすることが含まれ得る。
【００２３】
体液中の好酸球活性を決定するための方法も提供される。この方法には、モノハロチロシンに対する結合親和性を有する抗体に対して体液を晒すこと、及び結合抗体の量を測定することにより好酸球活性を決定することが含まれ得る。かかる体液は、例えば、唾液又は洗浄液であり得る。この方法には、例えば、結合抗体の量を相関させることにより炎症及び／又は薬物反応を決定することも含まれ得る。
【００２４】
そして、ＢＴＫ−９４Ｃは、喘息患者及び健常対照者から収集されたヒト唾液標本でテストされた。ＥＬＩＳＡマイクロアレイ分析によれば、ヒト唾液標本中の４つのタンパク質が、喘息患者の場合には増加したレベルでハロゲン化されていることが実証された。これらのデータによれば、臭素化が好酸球活性の特異的指標であること、及び４つの特異タンパク質が喘息関連の好酸球活性に応じて修飾されることが示されている。さらに、これらのタンパク質のハロゲン化レベルは、喘息をモニタするために有用であり得る。
【００２５】
以下に説明されるものは、新規のモノクローナル抗体（ＢＴＫ−９４Ｃ）であり、このモノクローナル抗体は、臭素化及び塩素化タンパク質を認識する。これらハロチロシンタンパク質修飾は、炎症細胞活性の指標となる。この抗体は、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて検出試薬として使用され、これにより４つの唾液タンパク質のハロチロシンレベルが喘息患者において増加することが実証された。このようにして、ＢＴＫ−９４Ｃ抗体は、喘息患者における炎症の指標を提供することができ、これらＥＬＩＳＡは、喘息又は強い炎症性要素を有するその他の疾患において薬物反応を予測又はモニタすることに対して有用であることが分かる。
【００２６】
実施例における材料及び方法
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。３−ブロモ−４−ヒドロキシ−安息香酸を、Ｉｎｄｏｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃから購入した。３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド、３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシ安息香酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、３−ニトロチロシン、及びＬ−チロシンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、腹水調整試薬、Ｍｅｌｏｎモノクローナル抗体精製キット、及びビオチン化キットＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ビオチンを、Ｐｉｅｒｃｅ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（イリノイ州ロックフォード）から購入した。次亜臭素酸ナトリウム溶液を、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。２３ＥＬＩＳＡ用のキャプチャ抗体を、補助データに記載されているようにして購入した。
【００２７】
実施例における臭素化抗原及び関連修飾タンパク質の調製
抗原の調製については、"Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｗｉｔｈ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ"，  Ｍｉｎｈ−Ｔａｍ  Ｂ．  Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｆ．  Ｐｒｅｓｔｏｎ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１６，  ４０２−４０７  （１９８１）（この内容は本明細書に援用される）に説明されるような、カルボジイミド法の修正後プロトコルが用いられた。簡単に説明すると、０．１２ｍＭの３−Ｂｒ−ＨＢＡが、２．５ｍｌのメタノールに溶解されると共に、２分間室温において２．５ｍｌの２０ｍＭリン酸カリウムバッファ（ｐＨ５．０）において０．７５ｍＭのＥＤＣと組み合わされた。次にこの５ｍｌ溶液を、２００ｍＭリン酸カリウムバッファ（ｐＨ８．０）において８ｍｌの２．５ｍｇ／ｍｌＫＬＨと混合し、室温で一晩インキュベートした。残っているＥＤＣ及び３−Ｂｒ−ＨＢＡは、４℃で１２０ｍＭ  ＰＢＳに対する透析により除去された。透析後、沈殿物を４℃で２時間かけて５０，０００ｇで遠心分離により除去した。ｐＨ８．０の２００ｍＭリン酸カリウムバッファにおいて、タンパク質濃度について２８０ｎｍで吸光度を測定すると共に臭素化については３１０ｎｍで測定することにより、修飾抗原を定量した。修飾ＫＬＨを、等分し−８０℃で保存した。マウスを免疫して、血清を収集し、ハイブリドーマ細胞株及びそれらの上清、腹水生産、及び抗体アイソタイピングを、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｐｕｌｌｍａｎ）において行った。ＢＴＫ−９４Ｃ抗体を、ＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ）を使用し、製造者のプロトコルにしたがって、ビオチン化した。
【００２８】
臭素化ＢＳＡを、以前に報告したように、次亜臭素酸ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルベニア州ピッツバーグ）を用いて調製した。３、５−ジブロモチロシンに対する３−ブロモチロシンの量を最大化するために、以前に報告したように、我々は最適化された条件を使用した。すなわち、１ｍｌの１０ｍｇＢＳＡ／ｍｌを、新しく調製した２００μｌの２０ｍＭ次亜臭素酸ナトリウム（ｐＨ７．２ＰＢＳにおいて）と、２５℃で１５時間反応させた。そしてこの溶液を、４℃でＰＢＳに対して透析することにより、未反応試薬を除去した。塩素化ＢＳＡ及びニトロ化ＢＳＡを生成するために、６％次亜塩素酸ナトリウム（Ｔｈｅ  Ｃｌｏｒｏｘ  Ｃｏｍｐａｎｙ）及びペルオキシ亜硝酸（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ボストン）を、以前に報告したようにそれぞれ用いた。
【００２９】
実施例におけるＥＬＩＳＡマイクロアレイアッセイ及び修飾チロシン類似体の阻害研究
初期ビオチン信号を、ビオチニルチラミドと組み合わせて西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に結合したヤギ抗マウスｌｇＭにより生成した以外は、サンドイッチＥＬＩＳＡマイクロアレイを前述したように実施した。簡潔に説明すると、遠心分離によって如何なる微粒子をも除去した後、唾液標本をＰＢＳにおいて０．１％ＢＳＡ中で５倍に希釈した。各希釈サンプル／チップの２５μｌを、３つのチップにおいて分析した。各チップが、各キャプチャ抗体に対する４つの複製スポットを含むようにすることによって、２３ＥＬＩＳＡのそれぞれについて合計１２複製物／サンプルが存在するようにした（例えば下記の表１参照）。
【００３０】
表Ｓ１−−選択されたプラズマバイオマーカ及び喘息に対してこれらタンパク質を関連付けるリファレンス
【表１】
2013541560.tif 000003
【００３１】
抗体結合特性を定義するためのマイクロアレイアッセイについては、変性及び未変性タンパク質を、それぞれアミノプロピルシランでコーティングされたスライド上にプリントした。次いでこれらスライドを、ＰＢＳにおいて２％ＢＳＡでブロックした。５０μＬのハイブリドーマ上清を、５０μＬの特定濃度のケミカルコンペティタ（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳにおいて）により、１２時間室温で、プレインキュベートした。個々のケミカルコンペティタを、ハイブリドーマ上清と混合する前に、連続的に希釈した。２５μＬの混合物を、室温での１６時間にわたるインキュベーションの前に、各マイクロアレイチップに装填した。プレートを、前述したように、ＰＢＳにおいて０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。ビオチン信号を、Ｃｙ３に結合したストレプトアビジンにより検出した後、ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＨＴ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ダウナーグローブ、イリノイ）を用いて画像化した。ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いて、画像を分析し、スポット蛍光シグナルを決定した。
【００３２】
実施例におけるＥＬＩＳＡマイクロアレイ
ＥＬＩＳＡマイクロアレイチップのプリント及び処理については、"Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａｒｒａｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ"，  Ｄｏｎ  Ｓｉｍｏｎｅ  Ｄａｌｙ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ９，  Ｉｓｓｕｅ  １，  ２０１０，  Ａｒｔｉｃｌｅ  １４（この内容は本明細書に援用される）において、以前に詳述した。緑蛍光タンパク質（１００ｐｇ／ｍＬ）を、各唾液サンプルにスパイクし、チップにおいて別々のキャプチャ及び検出抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して分析した。この分析データを用いて、他のＥＬＩＳＡからのデータを正規化し、この正規化では、ＰｒｏＭＡＴ  Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒというカスタムのバイオインフォマティクスプログラムを用いた。このプログラムは、我々がこの目的のために特別に開発したもので、"Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａｒｒａｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ"，  Ｄｏｎ  Ｓｉｍｏｎｅ  Ｄａｌｙ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ９，  Ｉｓｓｕｅ  １，  ２０１０，  Ａｒｔｉｃｌｅ  １４、及び"Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ"，  Ｙａｓｕｈｉｒｏ  Ｋａｍｂａｙａｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｎｕｔｒ．  ４４，  ９５−１０３，  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００９（これらそれぞれの内容のすべてが本明細書に援用される）に説明されている。ＰｒｏＭＡＴ  Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒは、ｗｗｗ．ｐｎｌ．ｇｏｖ／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ／ＰｒｏＭＡＴ／において自由に利用できる。実質上マイクロアレイチップを処理する手順は、単一検出抗体のみを使用した以外は、"Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａｒｒａｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ"，  Ｄｏｎ  Ｓｉｍｏｎｅ  Ｄａｌｙ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ９，  Ｉｓｓｕｅ  １，  ２０１０，  Ａｒｔｉｃｌｅ  １４において以前に報告された手順と同じである。
【００３３】
簡単に説明すると、各キャプチャ抗体を、４通りのスポットにおいて各チップ上にプリントした。このとき、一度にチップの４通りのうちのそれぞれにプリントした。加えて、ＧＦＰ用抗体及びオリエンテーションスポットを、各チップに４通りでプリントした。個々のチップを、１つの希釈唾液標本とインキュベートすると共に、各標本を３つのチップ上で分析した。上述したビオチン化ハロチロシンモノクローナル抗体（ＢＴＫ−９４Ｃ）を用いて、キャプチャした抗原における３−ブロモチロシンを検出した。処理したスライドを、ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＨＴ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、米国イリノイ州ダウナーグローブ）を用いて画像化した。ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いて、画像を分析し、スポット蛍光強度を決定した。
【００３４】
実施例における統計
一元配置分散分析（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，１９９２）を用いて、統計比較を行った。統計的に有意な場合、Ｔｕｋｅｙ'ｓ  Ｈｏｎｅｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ法を用いて、どの喘息グループがブロモチロシンの高いレベルを有しているかを定義した。確率値ｐ≦０．０５を用いて、すべての分析についての統計的有意性を表現した。
【００３５】
実施例の結果
ハロチロシンのモノクローナル抗体の評価
次亜臭素酸塩が、タンパク質チロシンと反応することにより、３−ブロモチロシンと３、５−ジブロモチロシン修飾との両方を生産する（図１Ｂ）。手順を用いて、３−臭素化チロシン又は関連するタンパク質修飾を含む抗原を発現させた。Ａは、タンパク質への３−ブロモ安息香酸の結合であり、これはマウス免疫に用いたＫＬＨ抗原を生成するために使用された。Ｂは、どのようにして次亜臭素酸ナトリウムが、生体内でチロシン残基を改変すると考えられているかを示す図である。この同じ化学的性質を用いて、修飾ＢＳＡ抗原を生成した。当該修飾ＢＳＡ抗原は、ハイブリドーマ細胞株のスクリーニングに使用された。３、５−ジブロモチロシン修飾は生体外反応について優勢である一方、３−ブロモチロシンは、生体内で優勢である。したがって、生体外臭素化抗原に対して精製された以前の抗体が二臭化チロシン修飾のみを認識するという事実から、この障害が抗原を反映している可能性があることが示唆される。抗原については、３−ブロモチロシンを模倣するタンパク質修飾、すなわちＫＬＨに付加された３−ブロモ−４−ヒドロキシ−安息香酸が用いられた。このようにして、かかる人工抗原が、生理学的関連臭素化タンパク質修飾を認識する抗体を生産したことが確認された。修飾ＫＬＨ抗原で免疫したマウスの血清から回収された抗体が認められ、この抗体は臭素化ＢＳＡと結合する一方で、未修飾ＢＳＡとは結合しなかった（データは示されない）。これは、ブロモチロシン模倣体の結果、生物学的に関連するタンパク質修飾と反応する抗体が生じたことを示している。
【００３６】
そして免疫したマウスを用いて、２２５のモノクローナルハイブリドーマ細胞株を生成した。これらの培養された細胞株からの上清を、臭素化ＢＳＡ、塩素化ＢＳＡ、ニトロ化ＢＳＡ、及び未修飾ＢＳＡの個々のスポットを含んだカスタムのタンパク質マイクロアレイチップを用いて、反応性及び特異性についてテストした。これらのテストにより、ＢＴＫ−９４抗体が、臭素化ＢＳＡと強く反応し、塩素化ＢＳＡと弱く反応し、未修飾ＢＳＡ又はニトロ化ＢＳＡと反応しないことが実証された（図２）。
【００３７】
図２は、異なる生体外修飾ＢＳＡでのＢＴＫ−９４Ｃの認識パターンの評価を示している。左側は、スライド上にプリントされた抗原のパターンを示している。スポット径は、約２００ミクロンである。右側は、Ｃｙ３スキャン蛍光画像であり、ＢＴＫ−９４Ｃの結合パターンを示している。Ａ５４３は、Ａｌｅｘａ５４３で修飾された抗体であり、オリエンテーションスポットとして使用される。ＢＳＡ−ＢｒＯは、次亜臭素酸塩で処理されたＢＳＡである。ＢＳＡ−ＣＩＯは、次亜塩素酸塩で処理されたＢＳＡである。ＢＳＡ−ＯＮＯＯは、ペルオキシ亜硝酸で処理されたＢＳＡである。
【００３８】
このハイブリドーマ細胞株をさらに培養し、それが本当にモノクローナルであることを確認した。この後のすべてのテストで使用されるＢＴＫ−９４Ｃ抗体は、これらモノクローナル細胞株に由来する。テストにより、この抗体がＢＴＫ−９４（図２）について示されたものと同じ結合特性を有することが示された。
【００３９】
実施例における臭素化タンパク質に対するモノクローナル抗体の調製及びキャラクタリゼーション
ＢＴＫ−９４Ｃのアイソタイピングによって、これがＩｇＭ抗体であり、濃度依存的に臭素化ＢＳＡと反応したことが示された（図３）。図３では、臭素化ＢＳＡで生産された信号が、ＢＴＫ−９４Ｃ抗体の濃度と相関している。この細胞株からの腹水も、タンパク質マイクロアレイ分析を用いて特異性及び交差反応性について分析した。ハイブリドーマ上清からの結果と一致しており（上記参照）、腹水で生産されたＢＴＫ−９４Ｃ抗体は、臭素化及び塩素化ＢＳＡを結合する一方で、未修飾又はペルオキシ亜硝酸で処理されたＢＳＡとの反応性は観察されなかった（データは示されない）。したがって、この抗体が優先的にハロゲン化タンパク質と反応することがさらに確認された。
【００４０】
さらに当該抗体の特異性を特徴付けるため、臭素化ＢＳＡに結合するＢＴＫ−９４Ｃ抗体を阻害するためにチロシン修飾を模倣する試薬の能力を評価した。臭素化ＢＳＡに対するＢＴＫ−９４Ｃの結合が、３−ブロモ−４−ヒドロキシ安息香酸及び３，５−ジブロモ、４−ヒドロキシ安息香酸によって強く阻害される一方、３−クロロチロシン及び３，５−ジクロロ，４−ヒドロキシ安息香酸によってはそれほど強くなく阻害された（図４Ｂ）。臭素化ＢＳＡに対する結合は、そのままのチロシン、３−ニトロチロシン、又は３，４−ジヒドロキシ安息香酸によって阻害されなかった（図４）。
【００４１】
図４を参照すると、修飾チロシン類似体による阻害に基づく臭素化アルブミンに対するＢＴＫ−９４Ｃの結合特性が示されている。個々の化学物質及びＢＴＫ−９４Ｃを一晩インキュベートし、臭素化ＢＳＡとプリントされたタンパク質マイクロアレイチップに対して加えられた。略称、関連化学名、及び構造が、パネルＡに示される。３−Ｂｒ−ＨＢＡは、３−ブロモ−４−ヒドロキシ安息香酸であり、ＤｉＢｒ−ＨＢＡは、３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンズアルデヒドであり、ＤｉＣＩ−ＨＢＡは、３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシ安息香酸であり、３−ＯＨ−ＨＢＡは、３，４−ジヒドロキシ安息香酸であり、３−Ｎ０２−Ｔｙｒは、３−ニトロチロシンであり、そしてＴｙｒは、Ｌ−チロシンである。パネルＢでは、結果がＢ／Ｂ０として相対的コンペティションとして表現されており、ここでＢは、コンペティタの存在下で結合した抗体の量であり、Ｂ０は、コンペティタの不在下での量である。各点は、３通りの分析の中央値を示している。これら結果により、ＢＴＫ−９４Ｃが３−ブロモチロシン及びクロロチロシンタンパク質修飾を認識することが、さらに示唆される。
【００４２】
実施例によるヒト唾液タンパク質におけるハロゲン化チロシン修飾のＢＴＫ−９４Ｃ分析
この抗体により喘息患者における好酸球活性を評価することができるかを決定するために、ＥＬＩＳＡマイクロアレイプラットフォームを利用し、このプラットフォームでは、ＢＴＫ−９４Ｃを唯一の検出抗体として用いた。このＥＬＩＳＡチップには、喘息に関連する可能性のある抗原に対する２３のキャプチャ抗体がプリントされた（補足データ参照）。これらキャプチャ抗原のうち、健常対照者と比べると、喘息患者において唾液標本中の高い好酸球数又は低い好酸球数と共にＡＧＴ、ＩＣＡＭ、ＰＤＧＦ、及びＲＡＮＴＥＳの臭素化レベルについて統計学的に有意な増加が観察された（図５）。
【００４３】
図５を参照すると、ハロゲン化タンパク質は、喘息患者からの唾液中に存在するタンパク質で上昇している。Ａは、この調査でテストした唾液標本からの好酸球数である。Ｂでは、非免疫ウサギＩｇＧを、ＥＬＩＳＡマイクロアレイ上にプリントし、ネガティブコントロールスポットは、すべてのテストされた唾液標本を通じて完全にフラットな信号を示した。Ｃは、細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ）についてのハロチロシンレベルであり、Ｄは、血小板由来増殖因子ＡＡ（ＰＤＧＦ）であり、Ｅは、ＡＧＴであり、Ｆは、ＲＡＮＴＥＳである。側線は、中央値を示しており、ボックスは、２５番目と７５の変位値である。
【００４４】
ＥＬＩＳＡマイクロアレイ分析のデータによれば、ＡＮＯＶＡ及びＴｕｒｋｅｙのテストに基づいて有意に異なる（ｐ＜０．０５）ことが示されている。これに対して、かかるチップを用いて実施した他の１９のアッセイでは、如何なる有意差も示さなれなかった。このＥＬＩＳＡマイクロアレイ分析については、非免疫ウサギＩｇＧをネガティブコントロールとしてプリントした。このスポットからの信号は、他のものと比較して低く、この信号には治療関連の変化が存在しなかった（図５Ｂ）。これにより、キャプチャ抗体を含むスポットにおいて観測された喘息に関連の差分信号は、キャプチャ抗原の差分ハロゲン化に起因していたことが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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