(57)【要約】  本発明は、アルカンを含む炭化水素生成能を有する変異微生物及びこれを利用したアルカンを含む炭化水素の製造方法に関し、より詳細にはアルカンを含む炭化水素生産に適するように改良された微生物に脂肪酸アシルＡＣＰを遊離脂肪酸に転化させる酵素をコードする遺伝子、遊離脂肪酸を脂肪酸アシルコエンザイムＡに転化させる酵素をコードする遺伝子、脂肪酸アシルコエンザイムＡを脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素をコードする遺伝子及び脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素をコードする遺伝子が導入された変異微生物及びこれを利用することを特徴とするアルカンを含む炭化水素の製造方法に関するものである。本発明に係る変異微生物は、追加的な代謝フラックス操作による菌株改良に活用される可能性が大きいため、アルカンを含む炭化水素の産業的生産に有用である。
2013528057.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びＤＮＡ結合トランスクリプショナル・デュアル・レギュレーターをコードする遺伝子が欠失または弱化されており、脂肪酸アシルＡＣＰを遊離脂肪酸に転化させる酵素をコードする遺伝子、遊離脂肪酸を脂肪酸アシルコエンザイムＡに転化させる酵素をコードする遺伝子、脂肪酸アシルコエンザイムＡを脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素をコードする遺伝子及び脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素をコードする遺伝子が導入または増幅されていることを特徴とする、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素を生成する能力を有する変異微生物。
【請求項２】
アシルコエンザイムＡシンセターゼをコードする遺伝子のネイティブなプロモーター及び脂肪酸外膜トランスポーターをコードする遺伝子のアテニュエーターを含むネイティブなプロモーターは、強力プロモーターに追加的に置換されており、短鎖脂肪酸外膜トランスポーターをコードする遺伝子が追加的に導入されている請求項１に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項３】
ｆａｂＤＨＧオペロンのネイティブなプロモーター及びｆａｂＡオペロンのネイティブなプロモーターは、強力プロモーターに追加的に置換されている請求項１に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項４】
アセテートキナーゼＡ酵素をコードする遺伝子（ａｃｋＡ）が追加的に欠失されている請求項１に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項５】
前記微生物は、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択される請求項１に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項６】
前記バクテリアは、脂肪酸代謝経路を有するバクテリアである請求項５に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項７】
前記脂肪酸代謝経路を有するバクテリアは、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属及び大腸菌からなる群から選択される請求項６に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項８】
前記アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ｆａｄＥ遺伝子である請求項１に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項９】
前記ＤＮＡ結合トランスクリプショナル・デュアル・レギュレーターをコードする遺伝子は、ｆａｄＲである請求項１に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項１０】
前記脂肪酸アシルＡＣＰを遊離脂肪酸に転化させる酵素は、アシルコエンザイムＡチオエステラーゼである請求項１に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項１１】
前記遊離脂肪酸を脂肪酸アシルコエンザイムＡに転化させる酵素は、大腸菌由来のアセチルＣｏＡ：アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼまたはアシルコエンザイムＡシンセターゼである請求項１に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項１２】
前記脂肪酸アシルコエンザイムＡを脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素は、脂肪酸アシルコエンザイムＡリダクターゼである請求項１に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項１３】
前記脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素は、脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼである請求項１に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項１４】
前記アシルコエンザイムＡシンセターゼをコードする遺伝子は、ｆａｄＤであって、短鎖脂肪酸外膜トランスポーターをコードする遺伝子はａｔｏＥである請求項２に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項１５】
前記脂肪酸外膜トランスポーターをコードする遺伝子は、ｆａｄＬである請求項２に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項１６】
前記脂肪酸アシルＡＣＰを遊離脂肪酸に転化させる酵素をコードする遺伝子は、ｔｅｓＡ（アシルコエンザイムＡチオエステラーゼをコードする遺伝子）である請求項１に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項１７】
前記遊離脂肪酸を脂肪酸アシルコエンザイムＡに転化させる酵素をコードする遺伝子は、ａｔｏＤＡ（アセチルＣｏＡ：アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子）またはｆａｄＤ（アシルコエンザイムＡシンセターゼをコードする遺伝子）である請求項１に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項１８】
前記脂肪酸アシルコエンザイムＡを脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素をコードする遺伝子は、ｌｕｘＣ（脂肪酸アシルコエンザイムＡリダクターゼをコードする遺伝子）である請求項１に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項１９】
前記脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素をコードする遺伝子は、ｃｅｒ１（脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼ１をコードする遺伝子）である請求項１に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項２０】
前記炭化水素は、ペンタデカン、ヘプタデカン、オクタン、ノナン及びノネンからなる群から選択される請求項１〜１９のいずれか一項に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項２１】
前記強力プロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターからなる群から選択される請求項２または請求項３に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物。
【請求項２２】
アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｆａｄＥ）及びＤＮＡ結合トランスクリプショナル・デュアル・レギュレーターをコードする遺伝子（ｆａｄＲ）が欠失または弱化されており、アシルコエンザイムＡシンセターゼをコードする遺伝子（ｆａｄＤ）のネイティブなプロモーター及び脂肪酸外膜トランスポーターをコードする遺伝子（ｆａｄＬ）のアテニュエーターを含むネイティブなプロモーターは、強力プロモーターに追加的に置換されており、脂肪酸アシルＡＣＰを遊離脂肪酸に転化させる酵素（アシルコエンザイムＡチオエステラーゼ）をコードする遺伝子、遊離脂肪酸を脂肪酸アシルコエンザイムＡに転化させる酵素をコードする遺伝子、脂肪酸アシルコエンザイムＡを脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素（脂肪酸アシルコエンザイムＡリダクターゼ）をコードする遺伝子及び脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素（脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼ）をコードする遺伝子が導入または増幅されていることを特徴とする、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素を生成する能力を有する変異大腸菌。
【請求項２３】
アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｆａｄＥ）及びＤＮＡ結合トランスクリプショナル・デュアル・レギュレーターをコードする遺伝子（ｆａｄＲ）が欠失または弱化されており、ｆａｂＤＨＧオペロンのネイティブなプロモーター及びｆａｂＡオペロンのネイティブなプロモーターが強力プロモーターに追加的に置換させており、脂肪酸アシルＡＣＰを遊離脂肪酸に転化させる酵素（アシルコエンザイムＡチオエステラーゼ）をコードする遺伝子、遊離脂肪酸を脂肪酸アシルコエンザイムＡに転化させる酵素をコードする遺伝子、脂肪酸アシルコエンザイムＡを脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素（脂肪酸アシルコエンザイムＡリダクターゼ）をコードする遺伝子及び脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素（脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼ）をコードする遺伝子が導入または増幅されていることを特徴とする、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素を生成する能力を有する変異大腸菌。
【請求項２４】
前記炭化水素は、ペンタデカン、ヘプタデカン、オクタン、ノナン及びノネンからなる群から選択される請求項２２または請求項２３に記載の炭化水素生成能を有する変異大腸菌。
【請求項２５】
アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びＤＮＡ結合トランスクリプショナル・デュアル・レギュレーターをコードする遺伝子を欠失または弱化させて、脂肪酸アシルＡＣＰを遊離脂肪酸に転化させる酵素をコードする遺伝子、遊離脂肪酸を脂肪酸アシルコエンザイムＡに転化させる酵素をコードする遺伝子、脂肪酸アシルコエンザイムＡを脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素をコードする遺伝子及び脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素をコードする遺伝子を導入または増幅させることを特徴とする、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素を生成する能力を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２６】
アシルコエンザイムＡシンセターゼをコードする遺伝子のネイティブなプロモーター及び脂肪酸外膜トランスポーターをコードする遺伝子のアテニュエーターを含むネイティブなプロモーターを強力プロモーターに追加的に置換させて、短鎖脂肪酸外膜トランスポーターをコードする遺伝子を追加的に導入する請求項２５に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２７】
ｆａｂＤＨＧオペロンのネイティブなプロモーター及びｆａｂＡオペロンのネイティブなプロモーターを強力プロモーターに追加的に置換する請求項２５に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２８】
アセテートキナーゼＡ酵素をコードする遺伝子（ａｃｋＡ）を追加的に欠失させる請求項２５に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項２９】
前記微生物は、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴とする請求項２５に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項３０】
前記バクテリアは、脂肪酸代謝経路を有するバクテリアである請求項２９に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項３１】
前記脂肪酸代謝経路を有するバクテリアは、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属及び大腸菌からなる群から選択される請求項３０に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項３２】
前記炭化水素は、ペンタデカン、ヘプタデカン、オクタン、ノナン及びノネンからなる群から選択される請求項２５に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物の製造方法。
【請求項３３】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の炭化水素生成能を有する変異微生物を培養して、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素を生成させ、培養液から炭化水素を回収することを特徴とする、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素の製造方法。
【請求項３４】
前記炭化水素は、ペンタデカン、ヘプタデカン、オクタン、ノナン及びノネンからなる群から選択される請求項３３に記載の炭化水素の製造方法。
【請求項３５】
請求項２２または請求項２３に記載の炭化水素生成能を有する変異大腸菌を培養して、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素を生成させ、培養液から炭化水素を回収することを特徴とする、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素の製造方法。
【請求項３６】
前記炭化水素は、ペンタデカン、ヘプタデカン、オクタン、ノナン及びノネンからなる群から選択される請求項３５に記載の炭化水素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカンを含む炭化水素生成能を有する変異微生物及びこれを利用したアルカンを含む炭化水素の製造方法に関し、より詳細にはアルカンを含む炭化水素生産に適するように改良された微生物に脂肪酸アシルＡＣＰ（脂肪酸アシルアシルキャリアタンパク質：fatty acyl-acp）を遊離脂肪酸（free fatty acid）に転化させる酵素をコードする遺伝子、遊離脂肪酸を脂肪酸アシルコエンザイムＡ（fatty acyl-CoA）に転化させる酵素をコードする遺伝子、脂肪酸アシルコエンザイムＡを脂肪酸アルデヒド（fatty aldehyde）に転化させる酵素をコードする遺伝子及び脂肪酸アルデヒドをアルカン（alkane）に転化させる酵素をコードする遺伝子が導入された変異微生物及びこれを利用することを特徴とするアルカンを含む炭化水素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近原油高と環境問題によって微生物を利用したバイオ燃料生産に関心が寄せられている。最近、バイオ燃料が化石燃料の代替燃料として浮上しており、市場規模が非常に速い速度で増加している。特に、アルカンは、エネルギー密度、揮発性制御、十分なオクタン価、低い不純物等、燃料として適した特性を持ち、エタノールよりエネルギー効率が高く、ガソリンとよく混ざり、既存の送油管や自動車エンジン等をそのまま使用できるとの長所を持っている。従って、代替燃料として最も適したアルカンを、微生物を利用して大量生産できれば、原油輸入代替効果及び温室ガス排出減少による環境的効果等をもたらすことができる。
【０００３】
現在商用化されているガソリンは、１分子内に６個〜１０個の炭素を持っており、炭素と炭素が直接連結されている線形構造の炭化水素化合物であり、直線型と分岐がある形態が共存する。また、ｋｇ当り約４０ＭＪのエネルギーを含有していて、常温、常圧で蒸発しやすく顕著な引火性を持つ。ガソリンにおいて最もキーとなる要素はオクタン価（octane number）である。多分岐構造を持ついくつかの炭化水素は、自動車エンジンでやや滑らかに燃焼する反面、分岐がない炭素鎖を持った炭化水素は、シリンダーで爆発してピストンを激しく動かす傾向があり、このような好ましくない爆発は、自動車でノッキング現象を招くが、このノッキング性を定量化する尺度として、多分岐構造を持つ上質の燃料であるイソオクタン（isooctane: 2,2,4-trimethylpentane）をオクタン価１００と仮定し、低質な自動車燃料であるヘプタン（heptane）をオクタン価０にした場合、通常のガソリンは、オクタン価が８７程度である。そのため、イソオクタン（isooctane）のようなガソリンにおいて重要な物質である多分岐炭化水素の大量生産が重要であると見込まれている。
【０００４】
通常原油（crude oil）においてガソリンが占める比は２５％に過ぎないが、これが燃料として最も多く用いられて重要である。従って、石油化学工場では、ガソリンの生産量を高めるために、沸点が高い部分であるＣ１２からＣ１８をクラッキング（Cracking）という工程を介して、炭素数が少なく沸点が低い部分として生成される。こういう観点から、直接的な方法でガソリン、即ち、Ｃ５からＣ１２に該当する物質を生産する方法の他にも間接的にケロシンや軽油に該当する比較的炭素がさらに多い物質を生産できれば、これを既存の精油工場における熱的、触媒的クラッキング（cracking）を利用して改質（reforming）する可能性があることを意味する。微生物を利用した炭化水素（hydrocarbons）の生産研究は、海洋細菌（marine bacteria）と藻類（algae）の細胞から炭化水素様物質（hydrocarbon-like substances）を分離（isolation）させる研究を始めとし、ガス−液体クロマトグラフィー（gas-liquid chromatography）の発展によって順次増え始めた。微生物を利用した炭化水素生産研究は、大きく二種類に分類することができる。一つは、細胞内炭化水素（Intracellular hydrocarbons of microorganism）に関する方法で、他の一つは、細胞外炭化水素（Extracellular hydrocarbons of microorganism）に関する方法である。細胞内生産に関わる微生物の系統的なグループ（systematic groups）は非常に多様であるが、通常は乾燥質量（dry mass）基準０．００５から２．６９％程度の数値を示す。この方法を介して、炭化水素を生産できる菌株としては、シアノバクテリア（cyanobacteria）、嫌気性光合成細菌（anaerobic phototrophic bacteria）、グラム陰性嫌気性硫酸還元性細菌（gram-negative anaerobic sulfate-reducing bacteria）、グラム陰性通性嫌気性細菌（gram-negative facultatively anaerobic bacteria）、酵母（yeasts）、菌類（fungi）等が挙げられるが、各々の菌株毎に多様なプロファイル（profiles）の炭化水素を作り出し、画分（fraction）及び優勢（predominance）が独特の特徴を示す。細胞外生産に関わる研究中、炭化水素の生産能を有する菌株として、テスルホビブリオ（Desulfovibrio）とルクロストリシウム（Clostridium）があり、揮発性非メタン炭化水素（Volatile non-methane hydrocarbons）であるイソプレン（isoprene）の生産能を有する菌株として、放線菌（actinomycetes）、エチレン（ethylene）の生産能を有する菌株として、アスペルギルスクラバタス（Aspergillus clavatus）等が知られている。
【０００５】
従って、微生物を利用した炭化水素の産業的な応用が可能な菌株の中で、培養条件最適化研究と炭化水素に関わる遺伝子及び酵素等のキーとなる物質研究、これに係る代謝フラックスに関する研究が進められている。しかし、現状は、遺伝子及び酵素等を深く分析して、代謝工学の適用に関する研究は十分に行われていない。従って、産業的応用が可能な菌株を選別し、目的の炭化水素（target hydrocarbons）生産関連遺伝子を分析し、これら菌株から代謝フラックス関連酵素を分離して、炭化水素生産工程の最適化によって生産性を高めようとするより根本的なアプローチが必要である。
【０００６】
そこで、本発明者等は、微生物を利用して、アルカンを含む炭化水素を生産する新しい方法を開発しようと鋭意努力した結果、脂肪酸（fatty acid）を基質（substrate）として、アルカンに転化させる代謝回路を新たに構成して、アルカンを含む炭化水素生産に適するように改良された変異微生物を作製して、前記変異微生物がペンタデカン（pentadecane）、ヘプタデカン（heptadecane）を含んだガソリンの範囲のアルカンであるオクタン（octane）、ノナン（nonane）及びノネン（nonene）の生産等、アルカン生成に有用であることを確認して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、アルカンを含む炭化水素生成能を有する変異微生物及びその製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記変異微生物を利用したアルカンを含む炭化水素の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼ（acyl-Coenzyme A dehydrogenase）をコードする遺伝子及びＤＮＡ結合トランスクリプショナル・デュアル・レギュレーターをコードする遺伝子が欠失または弱化されており、脂肪酸アシルＡＣＰを遊離脂肪酸に転化させる酵素をコードする遺伝子、遊離脂肪酸を脂肪酸アシルコエンザイムＡに転化させる酵素をコードする遺伝子、脂肪酸アシルコエンザイムＡを脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素をコードする遺伝子及び脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素をコードする遺伝子が導入または増幅されていることを特徴とする、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素を生成する能力を有する変異微生物及びその製造方法を提供する。
【０００９】
さらに本発明は、本発明に係る炭化水素生成能を有する変異微生物を培養して、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素を生成させ、培養液から炭化水素を回収することを特徴とする、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、アルカンを含む炭化水素生産に適するように変異させた微生物に、アルカンを製造するのに関与する酵素をコードする遺伝子を導入した変異微生物を提供する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】アルカンを含む炭化水素生産に適するように脂肪酸代謝経路（fatty acid metabolism）が改良された微生物からアルカンを生合成する代謝回路を示す。
【図２】ｐＴｒｃ９９ａ_ｌｕｘＣ_ｔａｃ_ｔｅｓＡプラスミドを示す。
【図３】ｐＴａｃ１５ｋ_ａｔｏＤＡＥ_ｔａｃ_ＣＥＲ１プラスミドを示す。
【図４】改良された菌株から生産されたガソリン範疇内の炭化水素を示す。
【図５】ｐＴａｃ１５ｋの切断地図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１３】
一観点において、本発明は、アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びＤＮＡ結合トランスクリプショナル・デュアル・レギュレーターをコードする遺伝子が欠失または弱化されており、脂肪酸アシルＡＣＰを遊離脂肪酸に転化させる酵素をコードする遺伝子、遊離脂肪酸を脂肪酸アシルコエンザイムＡに転化させる酵素をコードする遺伝子、脂肪酸アシルコエンザイムＡを脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素をコードする遺伝子及び脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素をコードする遺伝子が導入または増幅されていることを特徴とする、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素を生成する能力を有する変異微生物に関する。
【００１４】
前記変異微生物において、アルカンを含む炭化水素の生成能を増加させるために、アシルコエンザイムＡシンセターゼ（acyl-CoA synthetase）をコードする遺伝子のネイティブなプロモーター（native promoter）及び脂肪酸外膜トランスポーター（fatty acid outer membrane transporter）をコードする遺伝子のアテニュエーター（attenuator）を含むネイティブなプロモーターを強力プロモーター（strong promoter）に追加的に置換することを特徴としており、短鎖脂肪酸外膜トランスポーター（short-chain fatty acid outer membrane transporter）をコードする遺伝子が追加的に導入されてもよい。
【００１５】
本発明の変異微生物において、アルカンを含む炭化水素の生成能を増加させるために、ｆａｂＤＨＧ（fabD: malonyl-CoA-[acyl-Carrier-protein]transacylase; fabG: 3-oxoacyl-[acyl-Carrier-protein]reductase; fabH: 3-oxoacyl-[acyl-Carrier-protein]synthase III）オペロンのネイティブなプロモーター及びｆａｂＡ（beta-hydroxydecanoyl thioester dehydrase）オペロンのネイティブなプロモーターを強力プロモーターに追加的に置換されてもよい。
【００１６】
また、前記変異微生物は、アセテートキナーゼＡ酵素をコードする遺伝子（ａｃｋＡ）が追加的に欠失されてもよい。
【００１７】
本発明において、前記微生物は、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴としており、ここで、バクテリアは、脂肪酸代謝経路を有するバクテリアであってもよく、好ましくはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属及び大腸菌からなる群から選択され、さらに好ましくは、大腸菌であるが、グルコースを炭素源として使用できる微生物であれば、これに限定されない。
【００１８】
本発明において、前記アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ｆａｄＥ遺伝子であってもよく、前記ＤＮＡ結合トランスクリプショナル・デュアル・レギュレーターをコードする遺伝子は、ｆａｄＲであってもよい。前記アシルコエンザイムＡシンセターゼをコードする遺伝子は、ｆａｄＤであってもよく、追加的に導入されてもよい短鎖脂肪酸外膜トランスポーターをコードする遺伝子は、ａｔｏＥであってもよい。一方、前記脂肪酸外膜トランスポーターをコードする遺伝子は、ｆａｄＬであってもよい。
【００１９】
本発明において、前記脂肪酸アシルＡＣＰを遊離脂肪酸に転化させる酵素は、アシルコエンザイムＡチオエステラーゼであってもよく、前記遊離脂肪酸を脂肪酸アシルコエンザイムＡに転化させる酵素は、大腸菌由来のアセチルＣｏＡ：アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼまたはアシルコエンザイムＡシンセターゼであってもよい。
【００２０】
前記脂肪酸アシルコエンザイムＡを脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素は、クロストリジウムクルイベリ（Clostridium kluyberi）由来の脂肪酸アシルコエンザイムＡリダクターゼであってもよく、前記脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素はシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana col.）由来の脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼであってもよいが、導入される宿主細胞から発現して同じ酵素活性を示す限りこれに限定されるのではない。
【００２１】
本発明において、前記脂肪酸アシルＡＣＰを遊離脂肪酸に転化させる酵素をコードする遺伝子は、ｔｅｓＡ（アシルコエンザイムＡチオエステラーゼをコードする遺伝子）であってもよく、前記遊離脂肪酸を脂肪酸アシルコエンザイムＡに転化させる酵素をコードする遺伝子は、ａｔｏＤＡ（アセチルＣｏＡ：アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子）またはｆａｄＤ（アシルコエンザイムＡシンセターゼをコードする遺伝子）であってもよい。ここで、ａｔｏＤＡはａｔｏＤ（アセチルＣｏＡ：アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼαサブユニット（acetyl-CoA: acetoacetyl-CoA transferase alpha subunit））とａｔｏＡ（アセチルＣｏＡ：アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼβサブユニット(acetyl-CoA: acetoacetyl-CoA transferase beta subunit)）からなる。
【００２２】
前記脂肪酸アシルコエンザイムＡを脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素をコードする遺伝子は、ｌｕｘＣ（脂肪酸アシルコエンザイムＡリダクターゼをコードする遺伝子）であってもよく、前記脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素をコードする遺伝子は、ｃｅｒ１（脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼ１をコードする遺伝子）であってもよい。
【００２３】
本発明において、変異微生物に導入される組み換えベクターは、強力プロモーターを含むものであり、ｌｕｘＣ、ｃｅｒ１、ｔｅｓＡ、ａｔｏＤＡＥ遺伝子を含有するベクターであってもよく、前記組み換えベクターは、ｐＴｒｃ９９ａ_ｌｕｘＣ_ｔａｃ_ｔｅｓＡ、ｐＴａｃ１５ｋ_ａｔｏＤＡＥ_ｔａｃ_ＣＥＲ１ベクターであってもよく、前記強力プロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターからなる群から選択されてもよいが、これに制限されることなく当業界において通常用いられるいずれの強力プロモーターを含んでもよい。
【００２４】
他の観点において、本発明は、アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びＤＮＡ結合トランスクリプショナル・デュアル・レギュレーターをコードする遺伝子を欠失または弱化させて、脂肪酸アシルＡＣＰを遊離脂肪酸に転化させる酵素をコードする遺伝子、遊離脂肪酸を脂肪酸アシルコエンザイムＡに転化させる酵素をコードする遺伝子、脂肪酸アシルコエンザイムＡを脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素をコードする遺伝子及び脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素をコードする遺伝子が導入または増幅させていることを特徴とする、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素を生成する能力を有する変異微生物の製造方法に関する。
【００２５】
前記変異微生物の製造方法において、アルカンを含む炭化水素の生成能を増加させるために、アシルコエンザイムＡシンセターゼをコードする遺伝子のネイティブなプロモーター及び脂肪酸外膜トランスポーターをコードする遺伝子のアテニュエーターを含むネイティブなプロモーターを強力プロモーターに追加的に置換してもよく、短鎖脂肪酸外膜トランスポーターをコードする遺伝子を追加的に導入してもよい。
【００２６】
また、前記変異微生物の製造方法において、アルカンを含む炭化水素の生成能を増加させるために、ｆａｂＤＨＧ（fabD: malonyl-CoA-[acyl-Carrier-protein]transacylase; fabG: 3-oxoacyl-[acyl-Carrier-protein]reductase; fabH: 3-oxoacyl-[acyl-Carrier-protein]synthase III）オペロンのネイティブなプロモーター及びｆａｂＡ（beta-hydroxydecanoyl thioester dehydrase）オペロンのネイティブなプロモーターを強力プロモーターに追加的に置換してもよい。
【００２７】
また、前記変異微生物の製造方法において、アセテートキナーゼＡ酵素をコードする遺伝子（ａｃｋＡ）を追加的に欠失させてもよい。
【００２８】
また他の観点において、本発明は、本発明に係る炭化水素生成能を有する変異微生物を培養して、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素を生成させ、培養液から炭化水素を回収することを特徴とする、アルカン、アルケン、アルキン及び芳香族炭化水素からなる群から選択される炭化水素の製造方法に関する。
【００２９】
本発明では、脂肪酸をアルカンに転化させる代謝回路を新たに構成して、アルカンを含む炭化水素生成能を有する変異微生物を製造し、製造された変異微生物がアルカンを含む炭化水素を生産できるか否かを確認した。
【００３０】
本発明に係るアルカンを含む炭化水素生産に適する変異微生物は、脂肪酸アシルコエンザイムＡを短鎖脂肪酸アシルコエンザイムＡ（small-Chain fatty acyl-CoA）に転化させる酵素であるｆａｄＥ（アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼ）遺伝子及び脂肪酸代謝経路（fatty acid metabolism）に関与する酵素の遺伝子らを調節するｆａｄＲ（ＤＮＡ結合トランスクリプショナル・デュアル・レギュレーター）遺伝子を弱化または欠失させることによって得られる。また、脂肪酸にＣｏＡを付けるｆａｄＤ（アシルコエンザイムＡシンセターゼ）遺伝子及び外部の脂肪酸をｅ摂取するのに関与するｆａｄＬ（脂肪酸外膜トランスポーター）遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターで置換させることによって得られる。
【００３１】
本発明に係る変異微生物を利用してアルカンを生産するのは、グルコースから転化された脂肪酸アシルＡＣＰがチオエステラーゼ（thioesterase）により脂肪酸（free fatty acid）に転化され、脂肪酸はアシル−ＣｏＡシンテターゼ（acyl-CoA synthetase）により脂肪アシル−ＣｏＡ（fatty acy-CoA）に転化されてから、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ（fatty acyl-CoA reductase）により脂肪アルデヒド（fatty aldehyde）に転化され、脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ（fatty aldehyde decarbonylase）によりアルカン（alkane）に転化されると推定することができる（図１）。
【００３２】
本発明の一実施例では、アルカンを含む炭化水素の生産に適する変異微生物を製造するために、大腸菌Ｗ３１１０においてｆａｄＥ（アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼ）遺伝子及びｆａｄＲ（ＤＮＡ結合トランスクリプショナル・デュアル・レギュレーター）遺伝子を欠失させた。
【００３３】
ｇｌｏｂａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒであるｆａｄＲ（ＤＮＡ結合トランスクリプショナル・デュアル・レギュレーター）遺伝子は、脂肪酸代謝経路（fatty acid metabolism）に関与する大部分の遺伝子を調節する機能をする。グルコースのような炭素源がある場合には、ｆａｄＲ遺伝子が脂肪酸代謝経路（fatty acid metabolism）に関与する大部分の遺伝子らを強く抑制（repression）しているのに対して、グルコースのような炭素源がない場合には、ｆａｄＲが抑制していた全ての遺伝子をリリース（release）させて脂肪酸を分解できることになる。従って、グルコースのような炭素源がある条件では、ｆａｄＲ遺伝子が脂肪酸代謝経路（fatty acid metabolism）に関与する遺伝子を強く抑制（repression）することで、脂肪酸が分解されないため、本発明ではｆａｄＲ遺伝子を欠失させることによって、グルコースが存在する条件でも脂肪酸が分解できるように改良した。
【００３４】
ｆａｄＥ（アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼ）遺伝子は、脂肪酸アシルコエンザイムＡを短鎖脂肪酸アシルコエンザイムＡ形態のアセチルＣｏＡに転化させるため、ｆａｄＥ遺伝子を欠失させることによって脂肪酸アシルコエンザイムＡがアセチルＣｏＡに転化されず脂肪酸アシルアルデヒド（fatty acyl-aldehyde）に転化されるように改良した。
【００３５】
本発明のまた他の実施例では、脂肪酸アシルコエンザイムＡから脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素をコードする遺伝子ｌｕｘＣ（脂肪酸アシルコエンザイムＡリダクターゼをコードする遺伝子）がクローニングされたｐｔｒｃ９９ａ_ｌｕｘＣ_ｔａｃ_ＣＥＲ１ベクターと脂肪酸アシルＡＣＰを遊離脂肪酸に転化させる酵素をコードする遺伝子ｔｅｓＡ（アシルコエンザイムＡチオエステラーゼをコードする遺伝子）及び脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素をコードする遺伝子ｃｅｒ１（脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼ１をコードする遺伝子）がクローニングされたｐＴａｃ１５ｋ_ａｔｏＤＡＥ_ｔａｃ_ｃｅｒ１を作製した後、これを前記変異微生物に導入させることによって、アルカン生成能を有する変異微生物（ＷＥＲＰＬＤ３１１０＋ｐｔｒｃ９９ａ_ｌｕｘＣ_ｔａｃ_ｔｅｓＡ ＋ｐＴａｃ１５ｋ_ａｔｏＤＡＥ_ｔａｃ_ＣＥＲ１）を作製した。
【００３６】
また、本発明の実施例では、本発明により製造された変異微生物を培養して、ペンタデカン、ヘプタデカンを含んだガソリン範囲のアルカン（alkane）であるオクタン、ノナン及びノネンを生産することだけを確認したが、ペンタデカン及びヘプタデカンの他にも微生物で生合成可能な種々の炭素を持った脂肪酸から飽和、不飽和炭化水素を生産でき、微生物で生合成可能な多様な炭素を持った脂肪酸から生産可能な飽和、不飽和炭化水素としては、デカン（decane）、オンデカン（undecane）、トリデカン（tridecane）等が挙げられる。
【００３７】
本発明において、変異微生物の培養及び回収過程は、通常知られた培養方法を用いて行われ、本発明の実施例で用いられた特定培地及び特定培養方法の他にもホエー（whey）、ＣＳＬ（corn steep-liquor）等のハイドロライセート（hydrolysates）を用いてもよく、流加培養（fed-batch culture）、連続培養等の多様な方法を用いてもよい（Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26: 63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58: 663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25: 111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54: 23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72: 41, 2001）。
【００３８】
本発明において「炭化水素」は、炭素と水素だけからなる有機化合物を総称する概念で、分子構造により環状の炭化水素と鎖状の炭化水素で大きく分けて、単一結合だけからなる飽和炭化水素と、二重結合または三重結合を含有している不飽和炭化水素に区別される。
【００３９】
本発明において「弱化」とは、該当遺伝子の一部塩基を変異、置換、または、削除させたり、一部塩基を導入させて該当遺伝子によって発現する酵素の活性を減少させたりすることを包括する概念で、該当遺伝子の酵素が関与する生合成経路の一部または相当部分を遮断するいずれのものを含む。
【００４０】
本発明において「欠失」とは、該当遺伝子の一部または全塩基を変異、置換または削除させたり、一部塩基を導入させて該当遺伝子が発現しないようにしたり、発現しても酵素活性を示すことができないようにすることを包括する概念で、該当遺伝子の酵素が関与する生合成経路を遮断するいずれのものを含む。
【００４１】
特に、下記実施例では、大腸菌Ｗ３１１０を宿主微生物として利用したが、他の大腸菌や、バクテリア、酵母及びカビを用いてもグルコースを炭素源として使用できる限り、これに限定されないことは、当業者には自明であろう。また、下記実施例では導入対象遺伝子として特定菌株由来の遺伝子だけを例示したが、導入される宿主細胞で発現して同様の活性を示す限りその制限がないことは、当業者には自明であろう。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を、実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４３】
実施例１
１−１：ｆａｄＥ遺伝子の欠失（ＷＥ３１１０の作製）
大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ ３９９３６）で配列番号１及び２のプライマーを利用したワンステップ不活化（one step inactivation）方法（Warner et al., PNAS, 6, 97(12): 6640-6645, 2000）を利用して、ｆａｄＥ（アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼ）遺伝子を欠失させて、抗生剤耐性を取り除いた。
[配列番号１]  ＷｆａｄＥ  ｋ／ｏ  Ｆ：
５'−ａｔｇａｔｇａｔｔｔｔｇａｇｔａｔｔｃｔｃｇｃｔａｃｇｇｔｔｇｔｃｃｔｇｃｔｃｇｇｃｇｃｇｔｔｇｔｔｇｔｇｔａｇｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｔｃ−３’]
[配列番号２]  ＷｆａｄＥ  ｋ／ｏ  Ｒ：
５’−ａｃｔｇｇｇｃａｔａａｇｃｃｇａｇａａｃｔｃｃａｇｃｃｃｇｃｃｇｔａｃｔｃｔｔｔｔｔｔｇａｔｇａｔｃｃａｔａｔｇａａｔａｔｃｃｔｃｃｔｔａｇ−３’
【００４４】
１−２：ｆａｄＲ遺伝子の欠失（ＷＥＲ３１１０の作製）
前記１−１で作製された大腸菌ＷＥ３１１０において、配列番号３及び４のプライマーを利用したワンステップ不活化方法（Warner et al., PNAS, 6, 97(12): 6640-6645, 2000）を利用して、ｆａｄＲ（ＤＮＡ結合トランスクリプショナル・デュアル・レギュレーター）遺伝子を欠失させて、抗生剤耐性を取り除いた。
[配列番号３]  ＷｆａｄＲ  ｋ／ｏ  Ｆ：
５'−ａｔｇｇｔｃａｔｔａａｇｇｃｇｃａａａｇｃｃｃｇｇｃｇｇｇｔｔｔｃｇｃｇｇａａｇａｇｔａｃａｔｔａｔｇｔｇｔａｇｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｔｃ−３'
[配列番号４]  ＷｆａｄＲ  ｋ／ｏ  Ｒ：
５'−ｃｃｇｇａｔｔｇｇｃｇａａａｔａｇｔｇａｃｇａｃｃａａｔａｃｇｃｇｔａｔａｃａｇｃｃｃｔｔｔｃａｔｃＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ−３'
【００４５】
１−３：ｆａｄＤのネイティブなプロモーターをｔａｃプロモーターで置換（ＷＥＲＰＤ３１１０の作製）
前記１−２で作製された大腸菌ＷＥＲ３１１０において、ｆａｄＤ遺伝子の発現を強化するために強力なプロモーターであるｔａｃプロモーターに置換えた。
これのために、配列番号５及び６のプライマーを利用して、前記遺伝子除去と同様の方法で、ネイティブなプロモーターをｔａｃプロモーターに置換えた。
[配列番号５]  ＷｆａｄＤｐｃｈ  Ｆ：
５'−ｇｔａｔａａｔｃｃｃｇｇｃｃｃｃｇｃｇａｇａｇｔａｃａａａｃａｇｔｔｇｔａａｃｔｇａａｔａａｔｔｇｃＣＧＣＧＴＣＡＴＡＣＡＣＡＴＡＣＧＡＴＴ−３'
[配列番号６]  ＷｆａｄＤｐｃｈ  Ｒ：
５'−ｔｔｇａｔｃｔｃｃｇｔｃｇｇａａｃｇｔｃｃｇｃｇｇｇａｔａａｃｇｇｔｔａａｇｃｃａａａｃｃｔｔｃｔｔＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧ−３'
【００４６】
１−４：ｆａｄＬのネイティブなプロモーターにあるアテニュエーター配列のｔａｃプロモーターに置換（ＷＥＲＰＤＬ３１１０の作製）
１−３で作製された大腸菌ＷＥＲＰＤ３１１０において、ｆａｄＤ ｐｒｏｍｏｔｅｒ上に位置する転写調節機序に関与するアテニュエーター配列を強力なプロモーターであるｔａｃプロモーターに置換えた。
アテニュエーター配列の置換のために、配列番号７及び８のプライマーを利用して、前記遺伝子除去と同様の方法で、アテニュエーターを含むネイティブなプロモーターをｔａｃプロモーターに置換えた。
[配列番号７]  ＷｆａｄＬｐｃｈ  Ｆ：
５'−ｇａａａｇｔｇｃｔｇｃｔｃｃａｇｔｔｇｔｔａａｔｔｃｔｇｃａａａａｔｃｇｇａｔａａｇｔｇａｃｃｇａａＣＧＣＧＴＣＡＴＡＣＡＣＡＴＡＣＧＡＴＴ−３'
[配列番号８]  ＷｆａｄＤＬｐｃｈ  Ｒ：
５'−ａｃｔｇｃｇａｃｔｇｃｇａｇａｇｃａｇａｃｔｔｔｇｔａａａｃａｇｇｇｔｔｔｔｃｔｇｇｃｔｃａｔｇａｃＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧ−３'
【００４７】
１−５：ａｃｋＡ遺伝子の欠失（ＷＥＲＡＰＤＬ３１１０の作製）
前記１−４で作製された大腸菌ＷＥ３１１０において、配列番号９及び１０のプライマーを利用したワンステップ不活化方法（Warner et al., PNAS, 6, 97(12): 6640-6645, 2000）を利用して、ａｃｋＡ（アセテートキナーゼＡ：acetate kinase A）遺伝子を欠失させて、抗生剤耐性を取り除いた。
[配列番号９]  ＷａｃｋＡ  ｋ／ｏ  Ｆ：
５'−ａｔｇｔｃｇａｇｔａａｇｔｔａｇｔａｃｔｇｇｔｔｃｔｇａａｃｔｇｃｇｇｔａｇｔｔｃｔｔｃａｃｔｇａａＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧ−３'
[配列番号１０]  ＷａｃｋＡ  ｋ／ｏ  Ｒ：
５'−ｔｇｃｃｇｔｇｃｇｃｇｃｃｇｔａａｃｇａｃｇｇａｔｇｃｃｇｔｇｃｔｃｔｔｔｇｔａｃａｇｇｔｔｇｔａａＴＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＧＴＡＣＣ
【００４８】
１−６：ｆａｂＨＤＧオペロンのネイティブなプロモーターをｔｒｃプロモーターに置換（ＷＥＲＡＰＤＬＢ３１１０の作製）
前記１−５で作製された大腸菌ＷＥＲＡＰＬＤ３１１０において、ｆａｂＨＤＧオペロンからなる遺伝子の発現を強化するために強力なプロモーターであるｔｒｃプロモーターに置換えた。
このために、配列番号１１及び１２のプライマーを利用して、前記遺伝子除去と同様の方法で、ネイティブなプロモーターをｔｒｃプロモーターに置換えた。
[配列番号１１]  ＷｆａｂＨＤＧｐｃｈ  Ｆ：
５'−ｇｔｇｇｔｇｇｃｔａｃｔｇｔｔａｔｔａａａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃａａａａｇａｇｃｃｔｇａｃｇａｇｇｃＣＧＣＧＴＣＡＴＡＣＡＣＡＴＡＣＧＡＴＴ−３'
[配列番号１２]  ＷｆａｂＨＤＧｐｃｈ  Ｒ：
５'−ｇｔｃｃｇｃａｃｔｔｇｔｔｃｇｇｇｃａｇａｔａｇｃｔｇｃｃａｇｔａｃｃａａｔａａｔｃｔｔｃｇｔａｔａＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧ−３’
【００４９】
１−７：ｆａｂＡオペロンのネイティブなプロモーターをｔｒｃプロモーターに置換（ＷＥＲＡＰＤＬＢＡ３１１０の作製）
前記１−６で作製された大腸菌ＷＥＲＡＰＬＤＢ３１１０において、ｆａｂＡオペロンからなる遺伝子の発現を強化するために強力なプロモーターであるｔｒｃプロモーターに置換えた。
このために、配列番号１３及び１４のプライマーを利用して、前記遺伝子除去と同様の方法で、ネイティブなプロモーターをｔｒｃプロモーターに置換えた。
[配列番号１３]  ＷｆａｂＡｐｃｈ  Ｆ：
５'−ａｃｃｇｔｔｔｔｃｃａｔｇｇｃｃａｔｔａｃｇｔｔｇｇｃｔｇａａｃｔｇｇｔｔｔａｔｔｃｃｇａａｃｔｇａＣＧＣＧＴＣＡＴＡＣＡＣＡＴＡＣＧＡＴＴ−３'
[配列番号１４]  ＷｆａｂＡｐｃｈ  Ｒ：
５'−ｇｃｇａｃｃａｇａｇｇｃａａｇａａｇｇｔｃｔｔｃｔｔｔｔｇｔａｔａｇｇａｔｔｃｇｃｇｔｔｔａｔｃｔａｃＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧ−３'
【００５０】
実施例２
２−１：ｐＴｒｃ９９ａ_ｌｕｘＣベクターの作製
クロストリジウムクルイベリ（Clostridium kluyberi）菌株（ＤＳＭＺ，ｎｏ.５５２，Ｇｅｒｍａｎ）の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１５と１６のプライマーでＰＣＲを行って、脂肪酸アシルコエンザイムＡリダクターゼをコードするｌｕｘＣ遺伝子切片を作製した。
[配列番号１５]  ｃｋｌｌｕｘＣ  Ｆ：
５'−ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＣＡＴＴＧＧＡＴＧ−３'
[配列番号１６]  ｃｋｌｌｕｘＣ  Ｒ：
５'−ＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＣＧＴＴ−３'
次に、前記製造されたｌｕｘＣ切片をｔｒｃプロモーターの強い遺伝子発現を進行するｐＴｒｃ９９ａプラスミド（ＰｈａｍａｃｉＡ−ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に制限酵素（ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ）を処理した後、Ｔ４ ＤＮＡライゲーズを処理して、制限酵素で切断されたｌｕｘＣ切片及びｐＴｒｃ９９ａプラスミドを接合させることによって、複製率が高い（high copy number）組み換えプラスミドであるｐＴｒｃ９９ａ_ｌｕｘＣを作製した。
【００５１】
２−２：ｐＴｒｃ９９ａ_ｌｕｘＣ_ｔａｃ_ｔｅｓＡベクターの作製
野生型Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌Ｗ３１１０）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１７と１８のプライマーでＰＣＲを行って、アシルコエンザイムＡチオエステラーゼをコードするｔｅｓＡ遺伝子切片を作製した。
[配列番号１７]  ｔｅｓＡ  Ｆ：
５'−ＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴ−３'
[配列番号１８]  ｔｅｓＡ  Ｒ：
５'−ＴＡＴＴＧＡＧＣＴＣＴＴＡＴＧＡＧＴＣＡＴＧＡＴＴＴＡＣＴＡ−３'
次に、前記製造されたｔｅｓＡ切片をｔｒｃプロモーターの強い遺伝子発現を進行するｐＴｒｃ９９ａプラスミド（ＰｈａｍａｃｉＡ−ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩ）を処理した後、Ｔ４ ＤＮＡライゲーズを処理して、制限酵素で切断されたｔｅｓＡ切片及びｐＴｒｃ９９ａ_ｌｕｘＣプラスミドを接合させることによって、複製率が高い（high copy number）組み換えプラスミドであるｐＴｒｃ９９ａ_ｌｕｘＣ_ｔａｃ_ｔｅｓＡを作製した。
【００５２】
２−３：ｐＴａｃ１５ｋ_ａｔｏＤＡＥ_ｔａｃ_ＣＥＲ１ベクターの作製
ｐＫＫ２２３−３（ＰｈａｒｍａｃｉＡ−ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のｔｒｃプロモーターとｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ部分をｐＡＣＹＣ１７７（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）に挿入して、ｐＴａｃ１５Ｋを作製した。ｐＴａｃ１５Ｋは、構成的（constitutive）発現のための発現ベクターであり、図５の切断地図に示された構成を持っている。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana col.）染色体のＤＮＡを鋳型として、配列番号１９と配列番号２０のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。これから確保されたＣＥＲ１切片を前記ｐＴａｃ１５ｋ（p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBEL stock, tac promoter, 4.0-kb, lap stock）（Zhi-Gang Qian et al., Biotechnology and Bioengineering, 104: 651-654, 2009 and Hiszczyn' ska-Sawicka and Kur, 1997）プラスミドに制限酵素（ＳａｃＩ及びｋｐｎＩ）を処理した後、Ｔ４ ＤＮＡライゲーズを処理して、制限酵素で切断されたＣＥＲ１切片及びｐＴａｃ１５ｋプラスミドを接合させることによって、ｐＴａｃ１５ｋ_ＣＥＲ１を作製した。
次に、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana col.）染色体のＤＮＡを鋳型として、配列番号２１と配列番号２２のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。これから確保されたｆａｔＢ切片をｐＴａｃ１５ｋ_ＣＥＲ１プラスミドに制限酵素（ＸｂａＩとＳｐｈＩ）を処理した後、Ｔ４ ＤＮＡライゲーズを処理して、制限酵素で切断されたａｔｏＤＡＥ切片及びｐＴａｃ１５ｋ_ＣＥＲ１プラスミドを接合させることによって、ｐＴａｃ１５ｋ_ａｔｏＤＡＥ_ｔａｃ_ＣＥＲ１を作製した。これに用いられたプライマー対の塩基配列は下記のとおりである。
[配列番号１９]ＣＥＲ１Ｆ：５'−ＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＣＡＣＣ−３'
[配列番号２０]ＣＥＲ１Ｒ：５'−ＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣ−３'
[配列番号２１]ａｔｏＤＡＥＦ：５'−ＧＣＣＡＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣ−３'
[配列番号２２]ａｔｏＤＡＥＲ：５'−ＴＡＴＴＧＣＡＴＧＣＴＣＡＧＡＡＣＡＧＣＧＴＴＡＡＡＣＣＡＡ−３'
【００５３】
実施例３：変異微生物のアルカン生成能の測定
実施例２−２及び２−３で作製されたｐＴｒｃ９９ａ_ｌｕｘＣ_ｔａｃ_ｔｅｓＡ及びｐＴａｃ１５ｋ_ａｔｏＤＡＥ_ｔａｃ_ＣＥＲ１プラスミドを実施例１−７でアルカン生成に適するように作製したＷＥＲＡＰＤＬＢＡ３１１０に導入して、変異微生物を製造し、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ ３９９３６）を対照群菌株として用いた。アルカン生成能を有する変異微生物をアンピシリン（ampicillin）及びカナマイシン（kanamycin）が各々５０μｇ／ｍＬ及び３０μｇ／ｍＬ添加されたＬＢ平板培地で選別した。前記形質転化菌株を１０ｍＬ ＬＢ培地に接種して、３７℃で１２時間前培養を行った。その後、滅菌後８０℃以上で取り出した１００ｍＬ ＬＢを含有した２５０ｍＬフラスコにグルコース（５ｇ／Ｌ）を添加して、前記前培養額１ｍＬを接種して、３１℃で１０時間培養した。その後、蒸溜水１リットル当り２０ｇグルコース、１３．５ｇ ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｇ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１.７ｇ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ、１．４ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３ｇ酵母エクストラクト、１０ｍＬ微量金属溶液（蒸溜水１リットル当り１０ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３５ｇ ＣａＣｌ２、２．２５ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、１ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１０６ｇ （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．２３ｇ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、３５％ ＨＣｌ １０ｍＬ含有）の成分で構成された培地２．０リットルを含有した５．０リットル醗酵機（ＬｉＦｌｕｓ ＧＸ，Ｂｉｏｔｒｏｎ Ｉｎｃ．，Ｋｏｒｅａ）を１２１℃で１５分間滅菌した後、室温まで降温した。１ｍＭのＩＰＴＧを用いて導入あるいはエンジニアリング（engineering）した遺伝子の発現を誘導し、培養液のｐＨは、５０％（ｖ／ｖ）ＮＨ４ＯＨの自動供給によって６．８に維持した。
【００５４】
前記培地中のグルコースをグルコース分析器（ＳＴＡＴ，Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）で測定して、グルコースが全部消耗した時細胞を回収して蒸溜水で一回洗浄した後、１００℃の乾燥器で２４時間乾燥した。その後、乾燥された菌株にクロロホルム（chloroform）２ｍＬを添加し、３％（ｖ／ｖ）Ｈ２ＳＯ４を含むメタノール１ｍＬを添加した後、この混合物を１００℃で１２時間反応させた。反応終了後、混合物を常温まで冷やして、混合物に蒸溜水１ｍＬを添加して５分間激しく混ぜて、有機溶媒（chloroform）層と水（水溶液）層を分離させて、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、有機溶媒層だけ採取して、ガスクロマトグラフィー（gas chromatography）分析を行うことによって、生成されたアルカンを測定した。
【００５５】
その結果、表１に示された通り、野生型大腸菌Ｗ３１１０では、アルカンが生成されなかったが、本発明に係る変異微生物では、ペンタデカン及びヘプタデカンが、各々２５ｍｇ／Ｌ及び４０ｍｇ／Ｌ、及びガソリン範囲のアルカンのオクタン、ノナン及びノネンが、各々０．１１５６４ｇ／Ｌ、０．４７５ｇ／Ｌ及び０．１２２７６ｇ／Ｌが生産された。
【００５６】
この結果から、本発明に係る変異微生物がガソリン範囲のアルカンを成功的に生成することが確認された。
【表１】
2013528057.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、アルカンを含む炭化水素生産に適するように変異させた微生物に、アルカンを製造するのに関与する酵素をコードする遺伝子を導入した変異微生物を提供する効果がある。本発明に係る変異微生物は、追加的な代謝フラックス操作による菌株改良に活用される可能性が大きいため、アルカンを含む炭化水素の産業的生産に有用である。
【００５８】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
2013528057.tif 000004
【図２】
2013528057.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年2月8日(2013.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
前記脂肪酸アシルコエンザイムＡを脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素は、クロストリジウムクルイベリ（Clostridium kluyveri）由来の脂肪酸アシルコエンザイムＡリダクターゼであってもよく、前記脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素はシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana col.）由来の脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼであってもよいが、導入される宿主細胞から発現して同じ酵素活性を示す限りこれに限定されるのではない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
本発明のまた他の実施例では、脂肪酸アシルコエンザイムＡから脂肪酸アルデヒドに転化させる酵素をコードする遺伝子ｌｕｘＣ（脂肪酸アシルコエンザイムＡリダクターゼをコードする遺伝子）、及び脂肪酸アシルＡＣＰを遊離脂肪酸に転化させる酵素をコードする遺伝子ｔｅｓＡ（アシルコエンザイムＡチオエステラーゼをコードする遺伝子）がクローニングされたｐｔｒｃ９９ａ_ｌｕｘＣ_ｔａｃ_ｔｅｓＡベクターと脂肪酸アルデヒドをアルカンに転化させる酵素をコードする遺伝子ｃｅｒ１（脂肪酸アルデヒドデカルボニラーゼ１をコードする遺伝子）がクローニングされたｐＴａｃ１５ｋ_ａｔｏＤＡＥ_ｔａｃ_ｃｅｒ１を作製した後、これを前記変異微生物に導入させることによって、アルカン生成能を有する変異微生物（ＷＥＲＰＬＤ３１１０＋ｐｔｒｃ９９ａ_ｌｕｘＣ_ｔａｃ_ｔｅｓＡ ＋ｐＴａｃ１５ｋ_ａｔｏＤＡＥ_ｔａｃ_ＣＥＲ１）を作製した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
実施例２
２−１：ｐＴｒｃ９９ａ_ｌｕｘＣベクターの作製
クロストリジウムクルイベリ（Clostridium kluyveri）菌株（ＤＳＭＺ，ｎｏ.５５２，Ｇｅｒｍａｎｙ）の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１５と１６のプライマーでＰＣＲを行って、脂肪酸アシルコエンザイムＡリダクターゼをコードするｌｕｘＣ遺伝子切片を作製した。
[配列番号１５]  ｃｋｌｌｕｘＣ  Ｆ：
５'−ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＣＡＴＴＧＧＡＴＧ−３'
[配列番号１６]  ｃｋｌｌｕｘＣ  Ｒ：
５'−ＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＣＧＴＴ−３'
次に、前記製造されたｌｕｘＣ切片をｔｒｃプロモーターの強い遺伝子発現を進行するｐＴｒｃ９９ａプラスミド（ＰｈａｍａｃｉＡ−ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に制限酵素（ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ）を処理した後、Ｔ４ ＤＮＡライゲーズを処理して、制限酵素で切断されたｌｕｘＣ切片及びｐＴｒｃ９９ａプラスミドを接合させることによって、複製率が高い（high copy number）組み換えプラスミドであるｐＴｒｃ９９ａ_ｌｕｘＣを作製した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
２−３：ｐＴａｃ１５ｋ_ａｔｏＤＡＥ_ｔａｃ_ＣＥＲ１ベクターの作製
ｐＫＫ２２３−３（ＰｈａｒｍａｃｉＡ−ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のｔｒｃプロモーターとｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ部分をｐＡＣＹＣ１７７（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）に挿入して、ｐＴａｃ１５Ｋを作製した。ｐＴａｃ１５Ｋは、構成的（constitutive）発現のための発現ベクターであり、図５の切断地図に示された構成を持っている。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana col.）染色体のＤＮＡを鋳型として、配列番号１９と配列番号２０のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。これから確保されたＣＥＲ１切片を前記ｐＴａｃ１５ｋ（p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBEL stock, tac promoter, 4.0-kb, lap stock）（Zhi-Gang Qian et al., Biotechnology and Bioengineering, 104: 651-654, 2009 and Hiszczyn' ska-Sawickaand Kur, 1997）プラスミドに制限酵素（ＳａｃＩ及びｋｐｎＩ）を処理した後、Ｔ４ ＤＮＡライゲーズを処理して、制限酵素で切断されたＣＥＲ１切片及びｐＴａｃ１５ｋプラスミドを接合させることによって、ｐＴａｃ１５ｋ_ＣＥＲ１を作製した。
次に、大腸菌染色体のＤＮＡを鋳型として、配列番号２１と配列番号２２のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。これから確保されたｆａｔＢ切片をｐＴａｃ１５ｋ_ＣＥＲ１プラスミドに制限酵素（ＸｂａＩとＳｐｈＩ）を処理した後、Ｔ４ ＤＮＡライゲーズを処理して、制限酵素で切断されたａｔｏＤＡＥ切片及びｐＴａｃ１５ｋ_ＣＥＲ１プラスミドを接合させることによって、ｐＴａｃ１５ｋ_ａｔｏＤＡＥ_ｔａｃ_ＣＥＲ１を作製した。これに用いられたプライマー対の塩基配列は下記のとおりである。
[配列番号１９]ＣＥＲ１Ｆ：５'−ＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＣＡＣＣ−３'
[配列番号２０]ＣＥＲ１Ｒ：５'−ＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣ−３'
[配列番号２１]ａｔｏＤＡＥＦ：５'−ＧＣＣＡＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣ−３'
[配列番号２２]ａｔｏＤＡＥＲ：５'−ＴＡＴＴＧＣＡＴＧＣＴＣＡＧＡＡＣＡＧＣＧＴＴＡＡＡＣＣＡＡ−３'
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
前記培地中のグルコースをグルコース分析器（ＳＴＡＴ，Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）で測定して、グルコースが全部消耗した時細胞を回収して蒸溜水で一回洗浄した後、１００℃の乾燥器で２４時間乾燥した。その後、乾燥された菌株にクロロホルム（chloroform）２ｍＬを添加し、３％（ｖ／ｖ）Ｈ２ＳＯ４を含むメタノール１ｍＬを添加した後、この混合物を１００℃で１２時間反応させた。反応終了後、混合物を常温まで冷やして、混合物に蒸溜水１ｍＬを添加して５分間激しく混ぜて、有機溶媒（chloroform）層と水（水溶液）層を分離させて、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、有機溶媒層だけ採取して、ガスクロマトグラフィー（gas chromatography）分析を行うことによって、生成されたアルカン及び脂肪酸を測定した。
【国際調査報告】
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