(57)【要約】  本発明は、植物種子結合タンパク質を含み、好ましくは、抗原結合性の植物種子結合タンパク質を含む、種子処理のための組成物に関する。好ましい実施形態において、種子結合タンパク質は、多糖、好ましくは、ペクチンに結合する。さらに、本発明は、植物増強剤を植物種子に結合させるための植物種子結合タンパク質の使用にも関し、および植物種子を処理するための方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物種子結合タンパク質を含む、種子処理のための組成物。
【請求項２】
植物種子結合タンパク質が、植物増強剤を植物種子に結合させることが可能である、請求項１に記載の種子処理のための組成物。
【請求項３】
植物種子結合タンパク質が、担体を植物種子上に結合させることが可能である、請求項１に記載の種子処理のための組成物。
【請求項４】
植物種子結合タンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項１から３のいずれかに記載の種子処理のための組成物。
【請求項５】
抗原結合タンパク質が植物細胞壁構成成分に結合する、請求項４に記載の種子処理のための組成物。
【請求項６】
植物細胞壁構成成分が多糖である、請求項５に記載の種子処理のための組成物。
【請求項７】
多糖が構造多糖である、請求項６に記載の種子処理のための組成物。
【請求項８】
多糖がヘテロ多糖である、請求項６または７に記載の種子処理のための組成物。
【請求項９】
多糖がペクチンである、請求項６、７または８に記載の種子処理のための組成物。
【請求項１０】
ペクチンが低エステル化ホモガラクツロナン（ｈｏｍｏｇａｌａｃｔｕｒａｎ）を含む、請求項９に記載の種子処理のための組成物。
【請求項１１】
抗原結合タンパク質が、４つのフレームワーク領域および３つの相補性領域、またはこれらの機能性断片のいずれかを含むアミノ酸配列を含む、請求項４から１０のいずれかに記載の種子処理のための組成物。
【請求項１２】
抗原結合タンパク質がラクダ科抗体から得られる、請求項１１に記載の種子処理のための組成物。
【請求項１３】
抗原結合タンパク質がＶＨＨ配列を含む、請求項４から１２のいずれかに記載の種子処理のための組成物。
【請求項１４】
ＶＨＨが、配列番号１から配列番号１１からなる群から選択される配列を含む、請求項１３に記載の種子処理のための組成物。
【請求項１５】
植物種子が作物種子である、請求項１から１４のいずれかに記載の種子処理のための組成物。
【請求項１６】
作物が、トウモロコシ、小麦、モロコシ、ライ麦、大豆、米、綿、セイヨウアブラナ、ヒマワリ、サトウダイコン、ジャガイモ、野菜、花、芝草および飼料草からなる群から選択される、請求項１５に記載の種子処理のための組成物。
【請求項１７】
植物種子を処理するための方法であって、（１）請求項１から１６のいずれかに記載の種子処理のための組成物を調製するステップ、および（２）前記組成物を植物種子に適用するステップを含む、方法。
【請求項１８】
４つのフレームワーク領域および３つの相補性領域、またはこれらの機能性断片のいずれかを含むアミノ酸配列を含む少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含む種子処理のための組成物を用いて処理された植物種子。
【請求項１９】
請求項１から１６のいずれかに記載の組成物を用いて処理された植物種子。
【請求項２０】
組成物が、植物種子および／または新生実生（ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ｓｅｅｄｌｉｎｇ）を種子伝染性および／または土壌伝染性の病原体から保護する、請求項１８から１９に記載の植物種子。
【請求項２１】
組成物が、処理された種子からおよび／または処理された種子に非常に近いところで生長する植物を、害虫および／または病気により引き起こされる損傷から保護する、請求項１８から１９に記載の植物種子。
【請求項２２】
組成物が、植物種子、ならびに／または処理された種子からおよび／もしくは処理された種子に非常に近いところで生長する植物を、雑草ならびに／またはその他の望まれない植物により引き起こされる損傷から保護する、請求項１８から１９に記載の植物種子。
【請求項２３】
組成物が、処理された種子からおよび／または処理された種子に非常に近いところで生長する植物の収穫高を増強する、請求項１８から１９に記載の植物種子。
【請求項２４】
植物種子が作物種子である、請求項１８から２３のいずれかに記載の植物種子。
【請求項２５】
作物が、トウモロコシ、小麦、モロコシ、ライ麦、大豆、米、綿、セイヨウアブラナ、ヒマワリ、サトウダイコン、ジャガイモ、野菜、花、芝草および飼料草からなる群から選択される、請求項２４に記載の植物種子。
【請求項２６】
（ｉ）種子を、請求項１から１６のいずれかに記載の組成物を用いて処理するステップ、および（ｉｉ）処理された種子を播種するステップを含む方法であって、前記組成物が、
（ａ）植物種子および／もしくは新生実生を種子伝染性および／もしくは土壌伝染性の病原体から保護し、ならびに／または
（ｂ）処理された種子からおよび／もしくは処理された種子に非常に近いところで生長する植物を、害虫および／もしくは病気により引き起こされる損傷から保護し、ならびに／または
（ｃ）植物種子、ならびに／または処理された種子からおよび／もしくは処理された種子に非常に近いところで生長する植物を、雑草ならびに／またはその他の望まれない植物により引き起こされる損傷から保護し、ならびに／または
（ｄ）処理された種子からおよび／もしくは処理された種子に非常に近いところで生長する植物の収穫高を増強する、
方法。
【請求項２７】
４つのフレームワーク領域および３つの相補性領域、またはこれらの機能性断片のいずれかを含む抗原結合タンパク質である、種子結合タンパク質。
【請求項２８】
抗原結合タンパク質がＶＨＨ配列を含む、請求項２７に記載の種子結合タンパク質。
【請求項２９】
ＶＨＨが、配列番号１から配列番号１１からなる群から選択される配列を含む、請求項２８に記載の種子結合タンパク質。
【請求項３０】
植物細胞壁構成成分に結合する、請求項２７から２９のいずれかに記載の種子結合タンパク質。
【請求項３１】
植物細胞壁構成成分が多糖である、請求項３０に記載の種子結合タンパク質。
【請求項３２】
多糖が構造多糖である、請求項３１に記載の種子結合タンパク質。
【請求項３３】
多糖がヘテロ多糖である、請求項３１から３２のいずれかに記載の種子結合タンパク質。
【請求項３４】
多糖がペクチンである、請求項３１から３３のいずれかに記載の種子結合タンパク質。
【請求項３５】
ペクチンが低エステル化ホモガラクツロナン（ｈｏｍｏｇａｌａｃｔｕｒａｎ）である、請求項３４に記載の種子結合タンパク質。
【請求項３６】
多糖が溶液中にある、請求項３１から３５のいずれかに記載の種子結合タンパク質。
【請求項３７】
多糖が固体表面中に含まれる、請求項３１から３５のいずれかに記載の種子結合タンパク質。
【請求項３８】
多糖が野菜材料中に含まれる、請求項３１から３５のいずれかに記載の種子結合タンパク質。
【請求項３９】
植物増強剤を植物種子に結合させるための、請求項２７から３８のいずれかに記載の種子結合タンパク質の使用。
【請求項４０】
試料中の多糖の存在および／または濃度を決定するための、請求項２７から３８のいずれかに記載の種子結合タンパク質の使用。
【請求項４１】
試料から多糖を精製するための、請求項２７から３８のいずれかに記載の種子結合タンパク質の使用。
【請求項４２】
少なくとも１つの、請求項２７から３８のいずれかに記載の種子結合タンパク質を含む、農薬組成物。
【請求項４３】
１つもしくは複数の多糖の検出および／または１つもしくは複数の多糖の濃度の決定のためのキットであって、少なくとも１つの、請求項２７から３８のいずれかに記載の種子結合タンパク質を含む、キット。
【請求項４４】
１つもしくは複数の多糖の検出および／または１つもしくは複数の多糖の濃度の決定のためのバイオセンサーであって、少なくとも１つの、請求項２７から３８のいずれかに記載の種子結合タンパク質を含む、バイオセンサー。
【請求項４５】
化合物を植物種子に結合させることが可能である標的化剤であって、少なくとも１つの、請求項２７から３８のいずれかに記載の種子結合タンパク質を含む、標的化剤。
【請求項４６】
植物増強剤を植物または植物の部分に結合させるための、請求項４５に記載の標的化剤の使用。
【請求項４７】
植物細胞壁構成成分を改変するための、請求項４５に記載の標的化剤の使用。
【請求項４８】
請求項４５に記載の標的化剤を含む、農薬組成物。
【請求項４９】
種子処理のための組成物である、請求項４８に記載の農薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物種子結合タンパク質、好ましくは、抗原結合性の植物種子結合タンパク質を含む、種子処理のための組成物に関する。好ましい実施形態において、種子結合タンパク質は、多糖、好ましくは、ペクチンに結合している。本発明はさらに、植物増強剤を植物種子に結合させるための植物種子結合タンパク質の使用、および植物種子を処理するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
作物生産は、適切に管理されない場合、種子伝染性および早期の病気および害虫によって、壊滅的な結果となる。これは、発芽種子および新生植物が、特に、生長の早期の段階の間に損傷を受けやすいからである。したがって、種子および新生植物を種子伝染性および土壌伝染性の害虫および病気から適切に保護することが最も重要である。伝統的にこれは、駆除薬を土壌中に直接適用することによって達成されており、駆除薬の大部分は顆粒剤の形態をとる。駆除薬の公衆衛生および環境に対する影響を低下させる試みとして、害虫制御のより最近の進歩は、種子処理のための組成物の形態をとる駆除薬を種子上へ直接適用することを含む。種子および植物を保護し、健全な作物の確立を改善するために、現在、種子を処理するための広範な技術が慣行されている。種子処理のためのこれらの方法は、種子の粉衣、コーティングおよびペレッティングを含む。
【０００３】
種子処理のための適切な組成物を調製するのは、依然として技術的に難しい。これは、このような組成物は、あらゆる範囲の要件を満たさなければならないからである。すなわち、組成物は、活性物質が容易に洗い流されるのを回避するため、および播種の間のほこりの形成を低下させるために、種子表面に良好に付着すべきであるが、同時に、種子が粘着性となって、その結果、種子が相互に付着し、集合体を形成しないように、あるいは、種子が保存容器の壁に粘着することによって、または種子が播種機器を詰まらせることによって、または種子の種まき機を通る流動性が低下し、結果として、種子がまだらにまかれてしまうことによって、種子の保存または取扱いが妨げられないようにするべきである。さらに、組成物は、処理された種子の保存期間および寿命を低下させてはならず、組成物は、種子の発芽に、例えば、まかれた際に、環境からの種子に対する水およびガスの交換を損なうことによって不利な影響を及ぼしてはならず、組成物は、種子処理のための組成物中に存在する活性物質の植物毒性により、種子および実生に損傷を引き起こしてはならない。
【０００４】
発芽時の種子の可触性を確保するために、ＵＳ２，６５１，８８３、ＵＳ３，７０７，８０７およびＵＳ３，５９８，５６５は、水溶性ポリマーのコーティングを使用する種子処理のための方法を記載しており、この場合、コーティングは溶解して、種子を環境に暴露させて、発達させるであろう。ＵＳ３，３１６，６７６およびＵＳ４，２４５，４３２は、水不溶性であるが水感受性である種子コーティングに関し、コーティングの完全性が、水との接触時に、破壊されまたは崩壊する。これらの方法は、発芽の間の種子とその環境との間の良好な接触を可能にするが、また、種子コーティングの迅速な溶解または崩壊は、種子コーティング中に含有される活性物質の素早い喪失も引き起こす。ＵＳ５，８７６，７３９は、種子のための植物毒性のないポリマーに基づいたフィルムコーティングを記載しており、このコーティングは、長期の期間にわたる殺虫剤の制御放出を可能にする。また、ＷＯ２００７／１０３０７６およびＷＯ２０１０／１０７３１２は、ポリマーに基づいた種子コーティングが潤滑化されて、種まきの間の流動性を促進することができることも記載している。しかし、コーティングは依然として、ポリマーの種子への非特異的な粘着に基づいており、植物増強剤を、過剰にコーティング材料中に組み込まなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第２，６５１，８８３号明細書
【特許文献２】米国特許第３，７０７，８０７号明細書
【特許文献３】米国特許第３，５９８，５６５号明細書
【特許文献４】米国特許第３，３１６，６７６号明細書
【特許文献５】米国特許第４，２４５，４３２号明細書
【特許文献６】米国特許第５，８７６，７３９号明細書
【特許文献７】国際公開第２００７／１０３０７６号
【特許文献８】国際公開第２０１０／１０７３１２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
依然として、植物増強剤の植物種子への特異的な結合を可能にし、結果として、薄くかつ透過性のコーティングが得られ、植物増強剤の環境中への望まれない喪失が生じない種子処理のための組成物が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
驚くべきことに、本発明者は、種子処理のための組成物中への植物種子結合タンパク質の組込みが、上記の技術的な問題を解決することができることを見出した。種子結合タンパク質、好ましくは、種子に特異的に結合している抗原結合タンパク質が、種子処理のための組成物中に含まれると、これにより、種子にとって有益な植物増強剤に強力かつ特異的に結合し、一方、依然として、種子とその環境との間の相互作用を可能にして、自然の発芽プロセスを妨げるのを可能な限り減らすことができる組成物をもたらす。
【０００８】
１つの好ましい実施形態において、種子処理のための組成物中に含まれる種子結合タンパク質が、多糖結合タンパク質である。多糖結合タンパク質は、当業者に公知であり、多糖結合タンパク質として、これらに限定されないが、レクチンおよび抗原結合タンパク質が挙げられる。
【０００９】
種子結合タンパク質は、植物増強剤に直接カップリングされ得、または植物増強剤を含む担体にカップリングされ得る。後者の場合は、特定の期間にわたり化合物の緩徐放出が望まれる場合に、とりわけ有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】スペクトル画像解析およびリニアアンミキシングを備える共焦点顕微鏡によって画像化された天然アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）種子へのＶＨＨ結合の図である。種子の自己蛍光およびＡｌｅｘａ４８８スペクトルは記録され、異なる偽色に帰属された。種子はＶＨＨ  ６Ｄ７とインキュベートされ、結合ＶＨＨは抗ヒスチジン／Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗体で検出された。種子へのＶＨＨの特異的結合シグナルだけが示される。
【図２】リンゴ皮の損傷部位へのＶＨＨ結合を示す図である。リンゴ皮のディスクは、穿孔器を用いて作製され、種々のＶＨＨとインキュベートされた。結合ＶＨＨは、Ａｌｅｘａ４８８蛍光色素に直接コンジュゲートされたモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体とのインキュベーションによって検出された。
【図３】ジャガイモ葉穿孔へのＶＨＨ  ６Ｄ７（Ａ）、７Ａ５（Ｂ）、７Ａ７（Ｃ）、７Ｅ９（Ｄ）結合および小麦葉条片へのＶＨＨ  ６Ｄ７（Ｅ）結合を示す図である。葉穿孔は穿孔器を用いて作製され、ＶＨＨとインキュベートされた。条片は小麦葉から切断され、ＶＨＨとインキュベートされた。結合ＶＨＨは抗ヒスチジン／Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗体とのインキュベーションによって検出された。ＶＨＨは葉穿孔または葉小片に、主に創傷組織の部位に強く結合していることが認められた。
【図４】ニトロセルロース上に配置されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−コンジュゲートオリゴ糖３６個（各アレイのカラムＡ−Ｄ）および多糖４５個（各アレイのカラムＥ−Ｉ）を含有するアレイ上でのＶＨＨの結合プロファイルを示す図である。各試料はアレイ上のスポット４個（２種の濃度を２回ずつ）によって表される。アレイは、選択されたＶＨＨ  ５μｇ／ｍｌで探索され、結合ＶＨＨは二次抗ヒスチジンおよび三次酵素−コンジュゲート抗体で検出された。強い結合シグナルが、主にエステル化の程度が低いペクチン上で観察され、ホモガラクツロナンエピトープへの結合を示している。Ｅ１  ライムペクチン、ＤＥ  １１％Ｆ１  ライムペクチン、ＤＥ  ４３％Ｇ１  ライムペクチン、ＤＥ  ０％Ｈ１  ライムペクチン、ＤＥ  １６％Ｉ２  富ＲＧＩＩペクチン（赤ワイン）Ｉ３  種子粘液（アラビドプシス）Ｈ４  ＲＧＩ＃５（ジャガイモ）
【図５】マイクロカプセルの作物種子への結合を示す図である。米（Ａ）、小麦（Ｂ）およびトウロコシ（Ｃ）の種子は、蛍光マイクロカプセルに結合した種子結合ＶＨＨとインキュベートされた。ＶＨＨを含まないマイクロカプセルは、対照条件として各作物種子について示される。
【図６】リンゴ皮の損傷部位および損傷したジャガイモ植物葉表面へのマイクロカプセルの結合を示す図である。リンゴ皮およびジャガイモ葉のディスクは、蛍光マイクロカプセルに結合した種子および創傷組織結合ＶＨＨとインキュベートされた。マイクロカプセルは、果実の損傷部位または植物の創傷組織に優先的に結合した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明の第１の態様は、植物種子結合タンパク質を含む、種子処理のための組成物である。
【００１２】
用語「種子」および「植物種子」は、本明細書において互換的に使用され、温室内、苗床中または農場において生長させた植物から収穫された種子であって、前記植物から取り出され、任意の穂軸、茎、外皮および周囲の果肉またはその他の種子以外の植物材料から分離されている種子を意味する。このような植物種子に加えてまた、用語「種子」および「植物種子」は、発芽種子、根茎、植物および植物部分の栄養繁殖のために使用される、地下茎、ジャガイモの塊茎または球根等の繁殖用の植物の挿し穂も含むことを意図する。好ましくは、用語「種子」および「植物種子」は、温室内、苗床中または農場において生長させた植物から収穫された種子であって、前記植物から取り出され、任意の穂軸、茎、外皮および周囲の果肉またはその他の種子以外の植物材料から分離されている種子を意味する。さらに、植物種子は、サイズ、重量もしくは発芽能力について選別され、清浄され、殺菌され、駆除され、予備刺激され、増強され、ペレッティングされ、表面を覆われ、丸くされまたはコーティングされ得、発芽することが可能であってもよく、または非発芽性であっても、例えば、照射もしくは加熱により、意図的にさえ不活性化されていてもよい。「植物」は、本明細書で使用する場合、裸子植物および被子植物、単子葉植物および双子葉植物、樹木、果樹、農場作物および野菜作物、ならびに観賞用の種を含む。
【００１３】
「種子結合タンパク質」は、本明細書で使用する場合、種子上の、好ましくは、種子表面上の標的分子に、特異的な分子間相互作用を使用して結合することが可能である、タンパク質性（タンパク質、タンパク質様またはタンパク質含有）分子の全部または一部を意味する。種子結合タンパク質は、天然に存在する分子であり得、天然に存在する分子から誘導され得、または完全に人工的に設計され得る。種子結合タンパク質の、種子上の標的分子への結合は、好ましくは、高い親和性を伴って生じる。用語「親和性」は、本明細書で使用する場合、種子結合タンパク質がその標的分子に結合し、その結果、標的分子と種子結合タンパク質との平衡を、これらの結合により形成される複合体が存在する方向にシフトさせる程度を指す。解離定数は、種子結合タンパク質とその標的分子との間の親和性を説明するために一般に使用される。典型的には、種子結合タンパク質と種子上のその標的分子との間の結合の解離定数は１０−５Ｍ未満であり、より好ましくは、解離定数は１０−６Ｍ未満であり、さらにより好ましくは、解離定数は１０−７Ｍ未満であり、最も好ましくは、解離定数は１０−８Ｍ未満である。種子結合タンパク質の、種子上の標的分子への結合は、好ましくは、特異的である。「特異的」は、本明細書で使用する場合、種子結合タンパク質が、異なる分子の均一または不均一な混合物中に存在する特定の標的分子に優先的に結合することを意味する。また、特異性は、種子結合タンパク質のその標的分子に対する親和性と、無関係な分子に対する親和性との差としても表され得る。好ましくは、種子結合タンパク質のその標的分子に対する親和性対無関係な分子に対する種子結合タンパク質の親和性の比は１０超であり、より好ましくは、前記比は１００超であり、最も好ましくは、前記比は１０００超である。
【００１４】
「種子処理のための組成物」は、本明細書で使用する場合、個々の種子１つに適用される、または多くの種子に同時に適用される組成物を意味し、この組成物の意図は、種子の発芽を制御することであり、または発芽率に影響を及ぼすことであり、発芽種子および／もしくは新生植物を害虫もしくは病気による攻撃から保護することであり、発芽種子および／もしくは新生植物を雑草もしくはその他の望まれない植物により引き起こされる損傷から保護することであり、実生および新生植物の活力、生長および／もしくは確立を増強することであり、新生作物の収穫高を増強することであり、種子および／もしくは実生による水の取込みおよび／もしくは水の保持に影響を及ぼすことであり、ならびに／またはこの組成物の意図は、種子表面を滑らかにすることによって種子の取扱いを改善することであってもよく、または種子を保存もしくは取扱いの間の損傷から保護することであってもよく、または程度の差はあるが等しいサイズの種子を生成することによって播種を促進することであってもよい。
【００１５】
種子処理のための組成物が種子に強力に結合して、種子への適用の間および／または種子の取扱いの間の組成物の磨耗を回避し、播種の間の飛散を回避し、種子が土壌または繁殖のための別の基質中にまかれたまたは播種された際に、組成物が洗い流されることを回避すべきである。他方、処理された種子の集合体化を引き起こさないため、および／または種子を、保存容器の壁に、または種子処理の間もしくは播種や種まきの間のいずれかに使用されるオペレーターの機器に粘着させないために、種子処理のための組成物は、粘着性であってはならない。本発明による種子結合タンパク質は、種子に高い親和性および特異性で結合し、したがって、種子処理のための組成物中の特に有用な成分である。本発明による種子処理のための組成物は、少なくとも１つの、好ましくは、少なくとも２つの、より好ましくは、３つ以上の、本発明による種子結合タンパク質分子を含む。後に定義されるように、１つまたは複数の種子結合タンパク質分子が、標的化剤を形成することができる。好ましくは、前記標的化剤は、２つ以上の種子結合タンパク質分子の組合せである。
【００１６】
好ましい実施形態において、種子処理のための組成物は、少なくとも１つの植物増強剤をさらに含む。「植物増強剤」は、本明細書で使用する場合、種子の発芽、植物の新生、植物の生長、植物の発達および／または植物の収穫高に有益な影響を及ぼすことが意図される１つまたは複数の活性物質を意味し、植物増強剤として、これらに限定されないが、さらなる定義に従う農芸化学的活性物質、殺菌剤、駆除剤、微生物（窒素を固定するリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）またはアゾスピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）の細菌等）、植物の成長調節因子（ジベレリン酸等）、（微量）栄養素（硝酸カリウム等）、植物ホルモン（オーキシン等）、鉱物、発芽刺激薬、保水剤、ストレス保護物質もしくは植物誘導物質（Ｎｏｄ因子等）または前述の任意の可能な組合せが挙げられる。植物増強剤は、任意のタイプの製剤として存在することができ、好ましい製剤は、散剤、湿潤性散剤、乳剤、乳剤性濃縮物、粉剤、押出成型顆粒剤、懸濁剤、懸濁剤濃縮物、カプセル懸濁剤または流動性濃縮物である。当業者であれば、２つ以上の植物増強剤を組み合わせるのが好都合であり得ることを理解する。例えば、種子処理のための組成物は、１つもしくは複数の殺真菌剤と１つもしくは複数の殺虫剤との組合せまたは１つもしくは複数の殺線虫剤と１つもしくは複数の肥料との組合せ等を含有することができる。いくつかの植物増強剤を組み合わせる利点は、害虫および／もしくは病気のより広い範囲の制御を得ること、ならびに／または２つ以上の植物増強剤の相乗作用を得ることであり得る。好ましい実施形態において、植物増強剤の濃度が、種子の発芽を阻害せず、発芽種子または生長実生に対して、植物毒性をほとんど示さない、好ましくは、全く示さないように、植物増強剤は、種子処理のための組成物中で使用される。好ましくは、処理される種子の総重量に対する植物増強剤の相対的な濃度は、０．００００１−２０％の範囲であり、より好ましくは、０．０００１−１０％の範囲であり、さらにより好ましくは、０．０００５−２％の範囲であり、最も好ましくは、０．００１−１％の範囲である。
【００１７】
本発明の種子処理のための組成物は、
−湿潤および分散のための添加剤、例として、ポリアクリレート、ポリウレタン等、
−増粘剤、例として、天然のガム（キサンタンガム、アラビアゴム、ガッチガム等）、寒天、アルギン酸塩、キチン、ペクチン等、
−着色剤および効果顔料、例として、染料、光沢剤、および真珠光沢顔料を含めた、顔料、
−泡消剤、例として、ポリエチレングリコール、グリセリン、鉱油系泡抑止剤、シリコーン系泡抑止剤等、
−接着剤、例として、アルキレンオキシドのランダムコポリマーおよびブロックコポリマー、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、メチルセルロース、パラフィンろう、蜜ろう等、
−固体の担体、例として、カオリン、タルク、珪藻土、方解石等、
−溶媒、例として、水、芳香族炭化水素（例えば、キシレン、ナフタレン）、脂肪族炭化水素、アルコール、植物油等
をさらに含むことができる。
【００１８】
種子処理のための組成物の提供が意図される種子のタイプに応じて、種子が保存されるおよび取り扱われるはずである条件に応じて、種子が発芽し、生長すると予想される土壌の特徴および気候条件に応じて、以下のさらなる添加剤のうちの１つまたは複数が、種子処理のための組成物に添加され得る。添加剤として、これらに限定されないが、ｕｖ保護剤、凍結防止剤、保存剤、生物学的制御剤もしくは殺生物剤、界面活性剤、増量剤、捕捉剤、可塑剤、リン脂質、流動剤、融合助剤、ろうおよび／または充填剤（例として、粘土、タルク、ガラス繊維、セルロース、微粉化木材等）が挙げられる。
【００１９】
上記した種子処理のための組成物は、例えば、湿潤性散剤、湿潤性顆粒剤、乳剤性濃縮物、懸濁剤濃縮物、マイクロエマルジョン、カプセル懸濁剤、乾燥マイクロカプセル、錠剤もしくはゲル剤として維持され得、または適切な液体媒体（水、または別の適切な水性、有機もしくは油性の媒体等）中に、懸濁し得、分散し得、乳化され得もしくは別の方法により加えられ得、その結果、安定性を有する本発明の（濃縮）液体組成物を提供し、こうした安定性が、本発明の組成物が適切に保存されるのを可能にし、または（必要ならば、さらなる希釈の後に）種子に適用されるのを可能にする。好ましくは、種子処理のための組成物は、湿潤性散剤もしくは水分散性顆粒剤、流動性溶液、乳剤もしくは乳剤濃縮物、懸濁剤もしくは懸濁剤濃縮物、またはカプセル懸濁剤もしくはカプセル懸濁剤濃縮物の形態をとる。好ましくは、本発明の種子処理のための組成物は、最終的な使用の前に、場合によって（通常、好ましくは）適切な液体濃縮物、乾燥散剤、錠剤、カプセル懸濁剤、スラリーまたは「湿潤固形物」として輸送および／または保存され得、これらは、種子への適用の前に、適切な溶媒、好ましくは、水中に、適切に、希釈され得、分散し得、懸濁し得、乳化され得、または別の方法により適切に再構成され得る。本発明による種子処理のための組成物は、任意の適切なまたは所望の手動のまたは機械的な技法、例として、スプレー、注ぐこと、浸漬、浸すこと、粉衣、コーティング、表面を覆うこと、ペレッティングまたは任意のその他の適切な技法を使用する、種子への適用を可能にする。
【００２０】
１つの好ましい実施形態において、本発明の種子処理のための組成物中に存在する種子結合タンパク質は、本発明の組成物中に存在する植物増強剤または植物増強剤の組合せを種子上に結合させることが可能である。「植物増強剤を植物種子上に結合させることが可能である」は、本明細書で使用する場合、種子結合タンパク質が、植物増強剤を、保存用受器にも適用のための機器にも播種機器にも粘着させないが、植物増強剤を植物種子にしっかり付着させることができるように、種子結合タンパク質が植物種子に結合することを意味する。植物増強剤の植物種子上への結合を可能にするために、１つの単一の種子結合タンパク質または複数の種子結合タンパク質のいずれかが、さらなる定義に従う標的化剤中に含まれる場合であってもまたは含まれない場合であっても、植物増強剤に、共有結合、水素結合、双極子間相互作用、弱いファンデルワールス力または前述の任意の組合せのいずれかによりカップリングされ、結果として、植物増強剤にカップリングされている１つまたは複数の種子結合タンパク質の植物種子への結合をもたらす。
【００２１】
１つまたは複数の種子結合タンパク質が、植物増強剤または植物増強剤の組合せを種子に特異的に結合させる場合、これらの種子結合タンパク質は、処理された種子の種子処理のための組成物が磨耗することおよび飛散により喪失することを低下させ、ならびに／または処理された種子の粘着を低下させ、したがって、種子が凝集する機会または種子が保存容器の壁もしくは種子の取扱い機器や種まき機器や播種機器の壁に粘着する機会を低下させる。好ましくは、本発明による種子処理のための組成物中に存在する１つまたは複数の種子結合タンパク質は、植物種子の発芽を誘発することもなく、植物種子の発芽を遅延させるまたは阻害することもない。好ましくは、本発明による種子処理のための組成物中に存在する１つまたは複数の種子結合タンパク質は、植物毒性を示さず、このことは、こうした種子結合タンパク質が、芽が出ることも、実生もしくは新生植物が発達することも妨げないことを意味する。
【００２２】
別の好ましい実施形態において、種子結合タンパク質は、担体を植物種子上に結合させることが可能である。「担体」は、本明細書で使用する場合、その中にまたは上に（上に）、物質が適切に、組み込まれること、含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）こと、固定化されること、吸着されること、吸収されること、結合されること、被包されること、包埋されること、つながれることまたは含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）ことが可能である任意の固体、半固体または液体の担体を意味する。特定の実施形態において、植物種子は、担体の膜で完全に覆われ得る。このような担体の非限定的な例として、ナノカプセル、マイクロカプセル、ナノ球体、マイクロスフェア、ナノ粒子、微小粒子、リポソーム、ベシクル、ビーズ、ゲル、弱いイオン性の樹脂製粒子、リポソーム、渦巻形の送達ビヒクル、小型の顆粒剤、顆粒化物質、ナノチューブ、バッキーボール、油中水型乳剤の一部である水の小滴、水中油型乳剤の一部である油の小滴、有機材料、例として、コルク、木材もしくはその他の植物由来の材料（例えば、種子の莢、木片、果肉、球体、ビーズ、シートの形態をとる材料もしくは任意のその他の適切な形態をとる材料）、紙もしくは段ボール、無機材料、例として、タルク、粘土、結晶セルロース、シリカ、アルミナ、ケイ酸塩およびゼオライトが挙げられ、または微生物細胞（例として、酵母細胞）もしくはこれらの適切な画分や断片さえもが挙げられる。「担体を植物種子上に結合させることが可能である」は、本明細書で使用する場合、種子結合タンパク質の植物種子への結合が、担体を前記植物種子に結合させるのに十分強力であり、より好ましくは、担体を前記植物種子に保持するのに十分強力であることを意味する。担体のサイズおよび種子結合タンパク質の親和性に応じて、１つまたは複数の種子結合タンパク質が、植物種子に存在する１つまたは複数の分子に結合し、結果として生じる、結合部位（複数可）に対する種子結合タンパク質のアビディティーが、植物種子上に、担体を強力に結合させること、好ましくは、担体を保持することを確保するように、協働することができる。「保持する」は、本明細書で使用する場合、１つの単一の種子結合タンパク質または２つ以上の種子結合タンパク質の組合せのいずれかの、これまたはこれらの標的分子に対する親和性またはアビディティーにより生じる結合力が、担体の重力によりかかる力およびトルクと、もしあれば、１つまたは複数の外部因子により引き起こされたせん断力によりかかる力およびトルクとの組合せよりも大きいことを意味する。好ましい実施形態において、前記外部因子は、種子処理または種子の取扱いの間に生じる磨耗である。特異的な結合により担体に結合することの、非特異的な結合を上回る１つの特定の利点は、特異的な結合が、担体に適用される外部のせん断力に対してより抵抗性であることである（Ｃｏｚｅｎｓ−Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９０年）。好ましくは、「保持」は、抗原結合タンパク質を伴う担体の場合、同一条件下で適用して、前記抗原結合タンパク質を伴わない担体と比較して、（接触の持続時間、１つの種子当たりの担体の数または担体と種子との間の距離として表される）担体と種子との間の接触がより良好であるという事実により評価され得る。１つの好ましい実施形態において、１つまたは複数の種子結合タンパク質により植物種子上に結合している担体は、種子結合タンパク質（複数可）を伴わない同じ担体よりも、植物種子への結合を長い期間維持する。
【００２３】
好ましくは、上記の定義に従う植物増強剤または植物増強剤の組合せは、担体中に含まれる。好ましくは、前記担体はマイクロ担体である。「マイクロ担体」は、本明細書で使用する場合、粒子の直径が、５００μｍ未満であり、好ましくは、２５０μｍ未満であり、さらにより好ましくは、１００μｍ未満であり、最も好ましくは、５０μｍ未満である粒子状の担体である。本明細書で使用する場合、マイクロ担体、微小粒子、マイクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、ナノカプセルおよびナノ球体は、互換的に使用され得る。（以下の定義に従う）農芸化学的活性物質の送達のためのマイクロ担体が、とりわけ、参照により本明細書に組み込むＵＳ６１８０１４１、ＷＯ２００４００４４５３、ＷＯ２００５１０２０４５およびＵＳ７４９４５２６に記載されている。マイクロ担体の特徴は、以下のごとくであり得る。すなわち、マイクロ担体は、農芸化学的活性物質の緩徐放出、農芸化学的活性物質の遅延放出または農芸化学的活性物質の即時放出を可能にする。全てのタイプのマイクロ担体が、これらに特異的な用途を有する。マイクロ担体は当然ながら、共有結合によりつながるのに適している架橋結合可能な残基を含んでもよく、またはマイクロ担体は、誘導体化して、当技術分野で周知の方法に適している架橋結合可能な基を導入してもよい。このような誘導体化は、マイクロ担体の製造の前に、すなわち、前記製造プロセスにおいて使用される原材料のレベルで行ってもよく、マイクロ担体の製造プロセスの間に行ってもよく、またはマイクロ担体の製造に続いて行ってもよい。１つの特定の実施形態において、マイクロ担体上の官能基は、連結剤またはスペーサーに結合していてよく、次いで、連結剤またはスペーサーは、上記の定義に従う種子結合タンパク質に結合している。
【００２４】
好ましくは、種子結合タンパク質は、植物増強剤または担体にカップリングされる。「カップリング」は、本明細書で使用する場合、植物増強剤の保持または植物増強剤を種子結合タンパク質により含有する担体の保持を可能にする任意のカップリングであってよい。カップリングは、共有結合であってもよく、水素結合、双極子間相互作用、弱いファンデルワールス力または前述の任意の組合せによる非共有結合であってもよい。好ましくは、前記カップリングは共有結合である。種子結合タンパク質が、担体の外側表面に存在する任意のタイプの官能基にカップリングされ得る方法は、当業者に明らかである。「官能基」は、本明細書で使用する場合、タンパク質が共有結合され得る任意の化学的な基を意味し、それらとして、これらに限定されないが、カルボキシル基、アミン基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基またはアルキン基が挙げられる。非限定的な例として、担体の外側表面上のカルボキシル基と種子結合タンパク質のアミン基との間のカルボジイミド結合の形成によるカップリングが適用され得る。種子結合タンパク質は、担体への連結剤があってもまたはなくても、カップリングされ得る。微生物細胞またはファージの場合、本発明による種子結合タンパク質は、微生物細胞またはファージのゲノムによりコードされ得、一方、植物増強剤は、微生物細胞もしくはファージ中に含有される、または微生物細胞もしくはファージに、融合タンパク質としてもしくは化学的連結によってのいずれかでカップリングされる。「連結剤」は、本明細書で使用する場合、当業者に公知の任意の連結剤であってよい。好ましくは、連結剤は、担体上に結合している（さらなる定義に従う）標的化剤中に含まれる場合であってもまたは含まれない場合であっても、種子結合タンパク質（複数可）の柔軟性を増加させており、これにより、種子結合タンパク質（複数可）の植物種子への結合を促進する。このような連結剤の例を、ＷＯ００２４８８４およびＷＯ０１４０３１０に見出すことができる。
【００２５】
１つまたは複数の種子結合タンパク質は、植物増強剤または植物増強剤の組合せを含む担体を種子に特異的に結合させる場合、好ましくは、処理された種子の種子処理のための組成物が磨耗することおよび飛散により喪失することを低下させ、したがって、担体中に含まれる植物増強剤の喪失を低下させる。
【００２６】
好ましくは、本発明による種子結合タンパク質は、抗原結合タンパク質である。「抗原結合タンパク質」は、本明細書で使用する場合、標的分子に、特異的な分子間相互作用を使用して結合することが可能であるタンパク質性（タンパク質、タンパク質様またはタンパク質含有）分子の全部または一部を意味する。「抗原」は、本明細書で使用する場合、動物において免疫応答を惹起することが可能である分子である。抗原結合タンパク質は、免疫グロブリンに基づいてもよく、またはこれらに限定されないが、微生物タンパク質、プロテアーゼ阻害剤、毒素、フィブロネクチン、リポカリン、単鎖逆平行コイルドコイルタンパク質もしくは反復モチーフタンパク質を含めた、タンパク質中に存在するドメインに基づいてもよい。このような抗原結合タンパク質の非限定的な例が、炭水化物抗原結合タンパク質（ＣＢＤ）（Ｂｌａｋｅら、２００６年）、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら、１９９４年）、ラクダ科重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、新抗原受容体（ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）（Ｎｙｇｒｅｎら、２００８年）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｙ）（ＷＯ２０１００６６７４０）、設計されたアンキリンリピートドメイン（ＤＡＲＰｉｎ）（Ｓｔｕｍｐｐら、２００８年）、アンチカリン（Ｓｋｅｒｒａら、２００８年）、ノッチン（Ｋｏｌｍａｒら、２００８年）および工学的に作製されたＣＨ２ドメイン（ナノ抗体；Ｄｉｍｉｔｒｏｖ、２００９年）である。好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、単一のポリペプチド鎖からなり、翻訳後に修飾されない。より好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、自然免疫系または適応免疫系に由来する。さらにより好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、免疫グロブリンに由来する。最も好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域、またはこれらの適切な断片のいずれか（この場合、これは、相補性決定領域のうちの少なくとも１つを形成するアミノ酸残基のうちの少なくともいくつかを通常含有する。）を含む。好ましくは、抗原結合タンパク質は、高い収率で、好ましくは、微生物の組換え発現系において産生するのが容易であり、続いて単離および／または精製するのが好都合である。また、好ましくは、抗原結合タンパク質は、保存の間および活用の間の両方において安定でもあり、このことは、抗原結合タンパク質の完全性が、保存条件および／もしくは活用条件の下で維持されることまたは保存条件および／もしくは活用条件の後に取り戻されることを意味し、保存条件および／または活用条件として、高温、凍結融解サイクル、ｐＨまたはイオン強度の変化、ＵＶ照射、有害な化学薬品の存在等を挙げることができる。より好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、下記の定義に従う農芸化学的製剤中で安定である。最も好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、周囲温度で最高２年間保存される場合または５４℃で少なくとも２週間の期間保存される場合、（さらなる定義に従う）農芸化学的製剤中で安定な状態を維��する。好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、ＤＡＲＰｉｎ、ノッチン、アルファボディおよびＶＨＨからなる群から選択される。より好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、アルファボディおよびＶＨＨからなる群から選択される。最も好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、ＶＨＨである。
【００２７】
抗原結合タンパク質の、植物種子上の標的分子への結合は、高い親和性を伴って生じる。典型的には、抗原結合タンパク質と種子上の標的分子との間の結合の解離定数は１０−５Ｍ未満であり、より好ましくは、解離定数は１０−６Ｍ未満であり、さらにより好ましくは、解離定数は１０−７Ｍ未満であり、最も好ましくは、解離定数は１０−８Ｍ未満である。好ましくは、抗原結合タンパク質の、種子部位上のその標的分子への結合は特異的であり、このことは、抗原結合タンパク質が、異なる抗原の均一または不均一な混合物中に存在する特定の抗原に優先的に結合することを意味する。抗原結合タンパク質の結合の特異性が、方法、例として、実施例２に記載するＥＬＩＳＡにより解析され得、この方法においては、抗原結合タンパク質のその標的分子への結合が、抗原結合タンパク質の無関係な分子への結合と比較され、抗原結合タンパク質の反応槽への非特異的な粘着と比較される。特定の実施形態において、特異的な結合の相互作用が、試料中の望ましい抗原と望ましくない抗原とを識別し、いくつかの実施形態では、約１０倍超から１００倍以上（例えば、約１０００倍超または約１０，０００倍超）の差で識別する。抗原結合タンパク質の結合は、１つの特定の植物種の種子に特異的であり得、このことは、このような植物種の種子の中もしくは上に存在する標的分子が、その他の植物種の種子の中もしくは上には存在しないまたははるかにより低い程度でしか存在しないことを意味し；または標的分子が、２つ以上の植物種の種子の中もしくは上に存在する場合には、結合は、２つ以上の植物種の種子に、より一般的であり得る。抗原結合タンパク質の結合は、植物種子の特定の部分もしくは側面に特異的であり得、このことは、植物種子のこのような部分もしくは側面の中もしくは上に存在する標的分子が、植物種子のその他の部分もしくは側面の上には存在しないまたははるかにより低い程度でしか存在しないことを意味し；または結合部位が植物種子全体の上に存在する場合には、結合は、植物種子の全体に、より一般的であり得る。
【００２８】
好ましくは、抗原結合タンパク質の結合部位への結合は、過酷な条件、例として、低いまたは高い温度、低いまたは高いｐＨ、低いまたは高いイオン強度、ＵＶ照射、低い水分含量、低い水ポテンシャル、変性を起こす化学薬品の存在等の下でも依然として機能を示す。１つの好ましい実施形態において、前記過酷な条件は、４から９のｐＨ範囲、より好ましくは、３から１０のｐＨ範囲、さらにより好ましくは、２から１０のｐＨ範囲、最も好ましくは、１から１１のｐＨ範囲により定義される。別の好ましい実施形態において、前記過酷な条件は、４−５０℃の温度範囲、より好ましくは、０−５５℃の温度範囲、さらにより好ましくは、０−６０℃の温度範囲により定義される。別の好ましい実施形態において、前記過酷な条件は、５０％未満の水分含量、好ましくは、４０％未満の水分含量、より好ましくは、３０％未満の水分含量、さらにより好ましくは、２５％未満の水分含量、最も好ましくは、２０％未満の水分含量により定義される。さらに別の好ましい実施形態において、前記過酷な条件は、−０．５ＭＰａ未満の水ポテンシャル、好ましくは、−０．７５ＭＰａ未満の水ポテンシャル、より好ましくは、−１ＭＰａ未満の水ポテンシャル、さらにより好ましくは、−１．５ＭＰａ未満の水ポテンシャル、最も好ましくは、−２ＭＰａ未満の水ポテンシャルにより定義される。さらに別の好ましい実施形態において、前記過酷な条件は、さらなる定義に従う種子処理のための方法においてよく見られる条件と定義される。
【００２９】
好ましくは、本発明による種子処理のための組成物中に存在する種子結合タンパク質の、好ましくは、抗原結合タンパク質の、植物種子への結合は、種子の発芽を妨げない。すなわち、抗原結合タンパク質の植物種子への結合は、種子の発芽を誘発することもなく、植物種子の発芽の遅延または阻害を引き起こすこともない。好ましくは、抗原結合タンパク質の植物種子への結合は、植物毒性を示さず、このことは、抗原結合タンパク質の植物種子への結合が、健全に芽が出ることを妨げて悪影響を及ぼすこと、および種子、実生または新生植物の発達を妨げて悪影響を及ぼすことがないことを意味する。
【００３０】
１つの好ましい実施形態において、本発明による種子処理のための組成物中に存在する種子結合タンパク質、好ましくは、抗原結合タンパク質は、植物細胞壁構成成分に結合する。本明細書において使用する「植物細胞壁構成成分」は、高等植物の中葉、一次細胞壁または二次細胞壁の中に存在し、植物細胞壁の構造に寄与する任意の分子を意味する。中葉は、近隣細胞により共有され、これらを一緒にしてしっかり結び付ける。中葉はペクチンに富む。一次植物細胞壁の主要な化学的構成成分は、セルロースを含む。さらに、一次細胞壁は、２つの群の分枝多糖、すなわち、ペクチンおよび架橋結合性グリカンも含有する。架橋結合性グリカンは、セルロースミクロフィブリルと共にネットワークに編成され、セルロースの引張強度を増加させ、一方、ペクチンの同一の広がりをもつネットワークは、圧迫に抵抗する能力を細胞壁にもたらす。これらのネットワークに加えて、少量のタンパク質が、全ての植物一次細胞壁中に見出され得る。二次植物細胞壁は、細胞が成熟するにつれてしばしば、一次細胞壁内部に堆積し、より早期に発達した一次壁の組成とほとんど同一の組成を時には有する。しかしより一般的には、追加の物質、とりわけ、リグニンが、二次細胞壁中に見出される。リグニンに加えて、時には、クチン、スベリンおよびその他のろう状の材料が、植物細胞壁中に見出される。好ましくは、本発明による種子処理のための組成物中に存在する前記種子結合タンパク質、より好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン性多糖、タンパク質、リグニン、スベリン、クチンまたはろうからなる群から選ばれる植物細胞壁構成成分に結合する。より好ましくは、本発明による種子処理のための組成物中に存在する前記種子結合タンパク質、より好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、ヘミセルロース、ペクチン性多糖、リグニン、スベリンまたはクチンからなる群から選ばれる植物細胞壁構成成分に結合する。最も好ましくは、本発明による種子処理のための組成物中に存在する前記種子結合タンパク質、より好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、ペクチン性多糖に結合する。
【００３１】
好ましくは、本発明による種子処理のための組成物中に存在する種子結合タンパク質、より好ましくは、抗原結合タンパク質は、多糖に結合する。「多糖」は、本明細書で使用する場合、グリコシド結合により一緒につなぎ合わされた単糖の反復単位から形成された、ポリマー性の炭水化物構造であり、これらには、ホモ多糖およびヘテロ多糖が含まれるが、非炭水化物性の単位、例として、糖タンパク質およびリポタンパク質との混合性の構造は含まれない。好ましくは、前記多糖には、その他の化合物が混入しておらず、前記多糖は、少なくとも８５％ｗ／ｗ、好ましくは、９０％ｗ／ｗ、より好ましくは、９５％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは、９８％ｗ／ｗ、最も好ましくは、９９％ｗ／ｗの純度を有する。２つ以上のタイプの単糖が、多糖中に存在し得る。場合により、反復単位は、軽微な改変を含有してもよい。ホモ多糖は、全ての反復単位が同じタイプの単糖である場合の多糖である。２つ以上の単糖が存在する場合、多糖は、ヘテロ多糖に分類される。構造は、高い複雑性を有する構造に至るまで、直線であってもまたは分枝であってもよい。好ましくは、本発明による種子処理のための組成物中に存在する前記種子結合タンパク質、より好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、ヘテロ多糖に結合する。
【００３２】
多糖は、オリゴ糖とは、これらのサイズ、複雑性および重合度により明確に異なる。多糖は、本明細書で使用する場合、少なくとも１０個の単糖単位、好ましくは、少なくとも１５個の単糖単位を含む。好ましくは、前記多糖が構造多糖である。構造多糖は、当業者に公知である。構造多糖は、生物または生物の部分の剛性において役割を果たし、構造多糖として、これらに限定されないが、セルロース、グルカン、キシランおよびペクチンが挙げられる。１つの好ましい実施形態において、前記構造多糖は、植物に由来する。
【００３３】
「多糖に結合する」は、本明細書で使用する場合、本発明による種子処理のための組成物中に存在する種子結合タンパク質、好ましくは、抗原結合タンパク質が、多糖構造に、好ましくは、オリゴ糖と交差反応することなく結合することを意味し、オリゴ糖との交差反応は、多糖および関連のオリゴ糖を含む炭水化物マイクロアレイを使用して測定され得る（Ｏｂｒｏら、２００９年）。
【００３４】
さらに好ましい実施形態において、本発明による種子処理のための組成物中に存在する種子結合タンパク質、より好ましくは、抗原結合タンパク質は、ペクチンに結合しており、最も好ましくは、前記ペクチンは、低エステル化ホモガラクツロナンを含む。ペクチンは、複合多糖の不均一な群を含み、これらの多糖は、骨格中のα−（１−４）連結Ｄ−ガラクツロン酸の存在を共有するが、これ以外では、組成、連結および分子間結合の点で異なる。通常、３つのタイプのペクチン性多糖、すなわち、（１）直鎖のα−（１−４）連結Ｄ−ガラクツロン酸からなるホモガラクツロナン（ＨＧ）、（２）反復単位−４）−α−Ｄ−ガラクツロン酸−（１，２）−α−Ｌ−ラムノース−（１−を含むラムノガラクツロナンＩ（ＲＧ−Ｉ）、および（３）高度に分枝したＤ−ガラクツロン酸骨格を有するラムノガラクツロナンＩＩ（ＲＧ−ＩＩ）が区別される。ガラクツロン酸残基のカルボキシル基のうちのいくつかが、主としてメチルエステルとして、エステル化されている。エステル化度は、０−９０％まで変化し得る。５０％未満のカルボキシル基がエステル化されているペクチンは通常、「低エステル化」ペクチンと分類される。エステル化度が、ペクチンの物理的特性および化学的特性を強力に決定する。
【００３５】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明による種子処理のための組成物中に存在する前記種子結合タンパク質、より好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域、またはこれらの適切な断片のいずれか（この場合、これは、相補性決定領域のうちの少なくとも１つを形成するアミノ酸残基のうちの少なくともいくつかを通常含有する。）を含む。より好ましくは、本発明による種子処理のための組成物中に存在する前記種子結合タンパク質、より好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、重鎖ラクダ科抗体に由来し、さらにより好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、ＶＨＨ配列を含む。重鎖ラクダ科抗体、およびＶＨＨに由来する配列は、当業者に公知である。ラクダ科抗体は、とりわけ、参照により本明細書に組み込むＷＯ９４０４６７８およびＷＯ２００７１１８６７０に記載されている。最も好ましくは、前記ＶＨＨは、配列番号１から配列番号１１（ＶＨＨ  ６Ｂ５、６Ｄ７、６Ｄ１１、６Ｆ２、６Ｈ４、７Ａ５、７Ａ７、７Ｅ９、８Ａ４、８Ｄ６および１２Ｃ３）もしくはこれらの適切な断片のいずれか（この場合、これは、相補性決定領域のうちの少なくとも１つを形成するアミノ酸残基のうちの少なくともいくつかを通常含有する。）、またはこれらの相同体からなる群から選択される配列を含み、好ましくは、配列番号１から配列番号１１（ＶＨＨ  ６Ｂ５、６Ｄ７、６Ｄ１１、６Ｆ２、６Ｈ４、７Ａ５、７Ａ７、７Ｅ９、８Ａ４、８Ｄ６および１２Ｃ３）もしくはこれらの適切な断片のいずれか（この場合、これは、相補性決定領域のうちの少なくとも１つを形成するアミノ酸残基のうちの少なくともいくつかを通常含有する。）、またはこれらの相同体からなる群から選択される配列からなる。相同体は、本明細書で使用する場合、それぞれまたは任意のフレームワーク領域およびそれぞれまたは任意の相補性決定領域が、ＢＬＡＳＴｐアラインメントにおいて測定される場合、参照配列中の対応する領域に対して、少なくとも８０％の同一性、好ましくは、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは、９０％の同一性、さらにより好ましくは、９５％の同一性を示す場合の配列である（すなわち、ＦＲ１＿相同体対ＦＲ１＿参照、ＣＤＲ１＿相同体対ＣＤＲ１＿参照、ＦＲ２＿相同体対ＦＲ２＿参照、ＣＤＲ２＿相同体対ＣＤＲ２＿参照、ＦＲ３＿相同体対ＦＲ３＿参照、ＣＤＲ３＿相同体対ＣＤＲ３＿参照、およびＦＲ４＿相同体対ＦＲ４＿参照）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年；ＫａｂａｔによるＦＲおよびＣＤＲの定義）。
【００３６】
さらに別の好ましい実施形態において、植物種子は、作物種子である。「作物」または「換金作物」は、本明細書で使用する場合、生長して、食品として、家畜飼料として、燃料の原材料としてまたは任意のその他の経済的目的で収穫される植物の種または亜種を意味する。非限定的な例として、前記作物は、トウモロコシ；穀類、例として、小麦、ライ麦、大麦および燕麦、モロコシ、米；サトウダイコンおよび飼料用ビート；果実、例として、ナシ状果果実（例えば、リンゴおよびナシ）、柑橘類果実（例えば、オレンジ、レモン、ライム、グレープフルーツもしくはマンダリン）、核果（例えば、桃、ネクタリンもしくはプラム）；木の実（例えば、アーモンドもしくはクルミ）、柔らかい果実（例えば、サクランボ、イチゴ、ブラックベリーもしくはラズベリー）；プランテーン科もしくはブドウ、マメ科の作物、例として、ソラ豆、レンズマメ、エンドウおよび大豆；油料作物、例として、ヒマワリ、ベニバナ、菜種、セイヨウアブラナ、ヒマシもしくはオリーブ；ウリ科の植物、例として、キュウリ、メロンもしくはカボチャ；繊維植物、例として、綿、亜麻もしくは麻；燃料作物、例として、サトウキビ、ススキもしくはスイッチグラス；野菜、例として、ジャガイモ、トマト、トウガラシ、レタス、ホウレンソウ、タマネギ、ニンジン、ナス、アスパラガスもしくはキャベツ；観賞用植物、例として、花（例えば、ペチュニア、ペラルゴニウム、バラ、チューリップ、ユリもしくはキク）；低木；広葉樹（例えば、ポプラもしくはヤナギ）および常緑樹（例えば、針葉樹）；草、例として、芝生（ｌａｗｎ）、芝草（ｔｕｒｆ）もしくは飼料草；またはその他の有用な植物、例として、コーヒー、茶、タバコ、ホップ、コショウ、ゴムもしくはラテックス植物であり得る。好ましい作物は、トウモロコシ、小麦、モロコシ、ライ麦、大豆、米、綿、セイヨウアブラナ、ヒマワリ、サトウダイコン、ジャガイモ、野菜、花、芝草および飼料草からなる群から選択される。
【００３７】
また、本発明は、本発明による種子処理のための組成物を製造するための方法も網羅し、前記方法は、（ｉ）少なくとも１つの本発明による種子結合タンパク質を、好ましくは、より多くの本発明による種子結合タンパク質を、さらなる定義に従う標的化剤中に含める場合であってもまたは含めない場合であっても、選択するステップ、（ｉｉ）前記種子結合タンパク質（複数可）を、植物増強剤または植物増強剤の組合せにカップリングするステップ、ならびに場合によって、（ｉｉｉ）上記の記載に従う（湿潤および分散のための添加剤、増粘剤、着色剤、泡消剤、接着剤、固体の担体ならびに／または溶媒等の）、種子処理のための組成物に適切であり得るさらなる構成成分を添加するステップを含む。好ましくは、前記植物増強剤は、担体中に含まれ、より好ましくは、前記種子結合タンパク質（複数可）は、植物増強剤を含む担体にカップリングされる。
【００３８】
本発明の第２の態様は、植物種子を処理するための方法であり、前記方法は、（１）本発明による種子処理のための組成物を調製するステップ、および（２）前記組成物を種子に適用するステップを含む。
【００３９】
種子処理のための組成物を種子に適用するための方法は、当業者に公知であり、これらの方法として、これらに限定されないが、種子の粉衣、種子を浸すこと、種子のコーティング、フィルムコーティング、多層コーティング、表面を覆うこと、丸くすること、ペレッティングまたは前述の任意の組合せが挙げられる。本発明の種子を処理するための方法には、上記した種子処理のための方法のうちのいずれかを使用して、個々の種子１つに、本発明による種子処理のための組成物を適用すること、またはより多くの種子に同時に、本発明による種子処理のための組成物を適用することが関与する。本発明の種子処理のための組成物は、これ自体として使用され得、または適切な溶媒、好ましくは、水中に、最初に希釈されてから、１つもしくは複数の種子に適用され得る。本発明の組成物を、種子上に、スプレーしても、滴らせてももしくは注いでもよく、または種子を、これらに限定されないが、ドラムコーティング装置、流動床による技法、回転式コーティング装置、回転静止型（ｒｏｔａｓｔａｔｉｃ）種子処理器、ローラーミルによる方法、側口型の皿、タンブル混合機、噴流床等を含めた、適切な機器および技法を使用して、種子処理のための組成物中に浸してももしくは浸漬してもよい。種子は、収穫された状態で処理され得るが、また、種子は、種子処理のための組成物を用いて処理される前に、任意の種類の前処理を受けることもできる。適切な前処理として、これらに限定されないが、清浄化、種子を、サイズ、重量、密度によりもしくは発芽効力により選別すること、種子の殺菌もしくは駆除、および／または種子の予備刺激もしくは発芽前処理を、種子を水中に浸し、種子を再び乾燥する等の方法により行うこともしくは浸透圧調節（ｏｓｍｏｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）やその他の適切な方法により行うことが挙げられる。種子は、収穫と種子の播種または種まきとの間の任意の時期に処理され得る。通常、種子は、種子の播種または種まきの前に、種子処理のための組成物を用いて処理され、処理後に、長期間にわたる保存を可能にするために乾燥される。あるいは、種子は、播種または種まきの直前に処理され得、例えば、種子の粉衣は、播種の直前に、先立って穀類種子に適用され得、または種子処理のための組成物は、米の種子が、水田に播種される前に、水中にあらかじめ浸される際に、米の種子に適用され得る。さらに別の場合には、種子処理のための組成物は、播種または種まきと同時に、種子に適用してもまたは種子に非常に近いところに適用してもよく、ＷＯ９８／２５４４５およびＷＯ２００６／１１２７００に記載されているもの等の特別なデバイスおよび方法が、そうするために活用され得る。
【００４０】
好ましくは、種子を処理するための方法は、種子に損傷を与えることもなく、その中に含まれる農芸化学的活性物質または植物増強剤を分解するまたは不活性化させることもないような方法である。別の好ましい実施形態において、種子を処理するための方法は、種子の発芽を誘発することもなく、種子の発芽を遅延させるまたは阻害することもないような方法である。好ましくは、種子を処理するための方法は、種子上に種子処理のための組成物の均等な分布をもたらすような方法であり、またはあるいは、種子表面にわたり、例えば、主に種子の発芽部位において、種子処理のための組成物の非常に特異的な分布をもたらすような方法でもある。さらにより好ましくは、この方法は、種子処理のための組成物中に存在する種子結合タンパク質（複数可）、より好ましくは、抗原結合タンパク質（複数可）が種子に結合するのを可能にするような方法である。
【００４１】
本発明の第三の態様は、４つのフレームワーク領域および３つの相補性領域、またはこれらの適切な断片のいずれかを含むアミノ酸配列を含む少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含む（したがって少なくとも１つの相補性決定領域を形成するアミノ酸残基の少なくとも一部を通常含有する。）組成物で処理された植物種子である。
【００４２】
４つのフレームワーク領域および３つの相補性領域、またはこれらの適切な断片のいずれかを含むアミノ酸配列を含む前記抗原結合タンパク質は、好ましくは植物種子に特異的に結合し、より好ましくはそれにより植物増強剤または（既に定義の）植物増強剤の組合せを（担体中に含まれているか否かにかわらず）植物種子に結合させることができる。しかし４つのフレームワーク領域および３つの相補性領域、またはこれらの適切な断片のいずれかを含むアミノ酸配列を含む前記抗原結合タンパク質（種子処理のための組成物中に含まれる。）それ自体が（さらに定義される。）農薬活性物質としても作用できることも想定される。確かに４つのフレームワーク領域および３つの相補性領域、またはこれらの適切な断片のいずれかを含むアミノ酸配列は、非限定的例としてそれ自体が抗真菌性（例えば真菌増殖の妨害により）、殺虫性または殺線虫性（例えば非常に重要な消化酵素活性の阻害により）を有しうる。
【００４３】
好ましくは、４つのフレームワーク領域および３つの相補性領域、またはこれらの適切な断片のいずれかを含むアミノ酸配列を含む少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含む種子処理のための前記組成物は、本発明による組成物である。より好ましくは前記抗原結合タンパク質はラクダ科抗体重鎖由来であり、さらにより好ましくは前記抗原結合タンパク質はＶＨＨ配列を含み、最も好ましくは前記抗原結合タンパク質は、配列番号１−配列番号１１もしくはこれらの適切な断片のいずれか（したがって少なくとも１つの相補性決定領域を形成するアミノ酸残基の少なくとも一部を通常含有する。）またはこれらの相同体からなる群から選択されるＶＨＨである。
【００４４】
本発明による組成物での植物種子の処理は、既に記載の任意の方法を用いて種子の播種前の任意の時期、播種の直前または播種中であってよい。
【００４５】
好ましい一実施形態では、本発明による組成物で処理された種子および／または処理された種子から新生する実生および／または本発明による組成物で処理された種子に非常に近いところに播種された種子および／または本発明による組成物で処理された種子に非常に近いところに播種された種子から新生する実生は、種子伝染性および／または土壌伝染性の病原体から保護される。本明細書において使用される「種子伝染性病原体」は、植物種子と共に、植物種子の表面上でまたは中で運ばれる宿主に感染できる生体（例えば胞子、菌糸、菌核、細胞）を介して植物の病気を引き起こす病原体を意味する。種子伝染性病原体の例は、真菌（例えばチレチア・トリチシ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、ウスチラゴ・ヌーダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｎｕｄａ））、細菌（例えばシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ））またはウイルス（例えばレタスモザイクウイルス（ｌｅｔｔｕｃｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ））を含む。本明細書において使用される土壌伝染性病原体は、土壌から植物に来る宿主に感染できる生体（例えば胞子、菌糸、菌核、細胞）を介して植物の病気を引き起こす病原体を意味する。土壌伝染性病原体の例は、真菌（例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ））、細菌（例えばエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ））、ウイルス（例えばレタスネクロティックスタントウイルス（ｌｅｔｔｕｃｅ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｓｔｕｎｔ  ｖｉｒｕｓ））および線虫（例えばメロイドギネ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ））を含む。本明細書において使用される「種子伝染性および／または土壌伝染性の病原体から保護される」は、処理された種子または処理された種子から新生する実生が、本発明による組成物を適用されていない種子またはそれらから新生する実生と比較して、種子伝染性および／または土壌伝染性の病原体によって冒されないまたは非常に少ない程度冒されることを意味する。本明細書において使用される「非常に近いところ」は、処理された種子から１０ｃｍ以内の距離、好ましくは処理された種子から５ｃｍ以内の距離、より好ましくは処理された種子から２ｃｍ以内の距離、最も好ましくは処理された種子から１ｃｍ以内の距離を意味する。
【００４６】
本発明による組成物で処理された種子は、種子処理のための組成物中に存在する（担体中に含まれているか否かにかかわらず）植物増強剤（複数可）に結合した種子結合タンパク質、好ましくは抗原結合タンパク質の種子への高親和性結合から（本発明による組成物を適用されていない種子と比較して種子伝染性および／もしくは土壌伝染性の病原体からの長期間の種子の保護を生じうるならびに／または種子伝染性および／もしくは土壌伝染性の病原体からの処理された種子の適切な保護を提供するために種子処理のための組成物中に存在する必要がある植物増強剤の量の低減をもたらしうる。）恩恵を受ける。好ましくは植物増強剤は、殺真菌剤、殺線虫剤、殺虫剤、殺菌剤または殺ウイルス剤からなる群から選択される。種子伝染性および土壌伝染性の病原体を処理するために適切な農薬活性物質の例は、これだけに限らないがカプタン、チラム、メタラキシル、フルジオキソニル、ジネノコナゾール、イプロジオン、テブコナゾール、カルボキシン、ミクロブタニル、フルトリアホール、トリアジメノール、トリチコナゾール、イミザリル、ビテルタノール、フルオキサストロビン、アゾオキシストロビン、ペンシクロン、トリアゾキシド、マンコゼブおよびＰＣＮＢを殺真菌剤として、テルブホス、クロルピリホス、フィプロニル、クロレトキシフォス、テフルトリン、カルボフラン、テブピリミホス、イミダクロプリド、チオメトキサム、シペルメトリン、トリフルムロン、クロラントラニリプロールおよびメチオカルブを殺虫剤として、アバメクチン、チオジカルブおよびアルドキシカルブを殺線虫剤として、ならびにストレプトマイシン、ペニシリン、テトラサイクリン、アンピシリンおよびオキソリニン酸を殺菌剤として含む。同様に好ましくは、種子は、土壌伝染性病原体から（特にライ麦種子を冒す雪腐病などの冬期に雪床下に生じる病原体から）長期間の保護が必要な秋蒔き種子に関して特に有利な緩徐放出または遅延放出のための組成物に含まれる、植物増強剤の１つまたは組合せを含む種子処理のための組成物で処理される。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、本発明による組成物で処理された種子からおよび／または処理された種子に非常に近いところ（上に定義のとおり）に播種された種子から新生する実生は、植物の害虫および／または病気によって引き起こされる損傷から保護されうる。本明細書において使用される「植物の害虫および／または病気」は、地面もしくは大気から植物に来る宿主に感染できる生体（例えば胞子、菌糸、昆虫）を介して植物に損傷を引き起こすおよび／または植物の病気を引き起こす病原体を意味する。植物の害虫および／または病気の例は、昆虫、ダニまたはカタツムリ、真菌、ウイルスを含む。本明細書において使用される「植物の害虫および／または病気から保護される」は、処理された種子からまたは処理された種子に非常に近いところ（上に定義のとおり）に播種された種子から新生する実生が、本発明による組成物を適用されていない種子またはそれらから新生する実生と比較して、植物の害虫および／または病気によって冒されないまたは非常に少ない程度で冒されることを意味する。
【００４８】
本発明による組成物で処理された種子は、種子処理のための組成物中に存在する（担体中に含まれているか否かにかかわらず）植物増強剤（複数可）に結合した種子結合タンパク質、好ましくは抗原結合タンパク質の種子への高親和性結合から（本発明による組成物を適用されていない種子と比較して、植物の害虫および／もしくは病気からの長期間の実生の保護を生じうる、ならびに／または処理されたものから新生する実生の適切な保護を提供するために種子処理のための組成物中に存在する必要がある植物増強剤の量の低減をもたらしうる。）恩恵を受ける。好ましくは植物増強剤は、殺線虫剤、殺ダニ剤、ダニ駆除剤、軟体類駆除剤、殺真菌剤、殺菌剤または殺ウイルス剤からなる群から選択される。植物の害虫および／または病気によって引き起こされる損傷から保護するために適切な農薬活性物質の例は、これだけに限らないがメタラキシル、フルジオキシニル、カルベンダジム、イプコナゾール、カルボキシン、チアベンダゾール、フルキノコナゾール、カルプロパミド、フベリダゾール、プロクロラズ、オキサジキシル、プロチオコナゾールおよびチフルザミドを殺真菌剤として、イミダクロプリド、クロチアニジン、チオメトキサム、チオジカルブおよびアルドキシカルブを殺虫剤として含む。同様に好ましくは種子は、浸透移行性活性を有し、実生の根系によって取り込まれ、生長する実生の地上部に輸送され、新生する実生への表面処理農薬組成物を適用する必要性を減少させることができる植物増強剤の１つまたは組合せを含む種子処理のための組成物で処理される。
【００４９】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明による組成物で処理された種子および／または、本発明による組成物で処理された種子から新生する実生および／または処理された種子に非常に近いところ（上に定義のとおり）に播種された種子は、雑草および／またはその他の望まれない植物によって引き起こされる損傷から保護されうる。本明細書において使用される「雑草および／またはその他の望まれない植物によって引き起こされる損傷から保護される」は、処理された種子ならびに／または処理された種子からおよび／もしくは処理された種子に非常に近いところ（上に定義のとおり）に播種された種子から新生する実生が、本発明による組成物を適用されていない種子またはそれらから新生する実生と比較して、雑草および／またはその他の望まれない植物によって引き起こされる損傷に冒されないまたは非常に少ない程度で冒されることを意味する。種子処理のための組成物中に含まれる植物増強剤が除草剤である場合そのような保護は直接的であってよく、種子処理のための組成物中に含まれる植物増強剤が安全化剤である場合にそれは間接的であってよく、この場合新生植物の保護は除草剤の葉への適用と共に完了する必要がある。本明細書において使用される「安全化剤」は、除草剤損傷から作物を保護する農薬活性物質（さらに定義されるとおり）である。
【００５０】
本発明による組成物で処理された種子は、種子処理のための組成物中に存在する（担体中に含まれているか否かにかかわらず）植物増強剤（複数可）に結合した種子結合タンパク質、好ましくは抗原結合タンパク質の種子への高親和性結合から（本発明による組成物で処理されていない種子と比較して雑草および／もしくはその他の望まれない植物によって引き起こされる損傷からの長期間の実生の保護を生じうる、ならびに／または処理された種子から新生する実生の適切な保護を提供するために種子処理のための組成物中に存在する必要がある植物増強剤の量の低減をもたらしうる。）恩恵を受ける。好ましくは植物増強剤は、除草剤および安全化剤からなる群から選択される。雑草および／またはその他の望まれない植物によって引き起こされる損傷から保護するための適切な農薬活性物質の例は、これだけに限らないがトリアスルフロンおよびクロマゾンを除草剤としてならびにクロキントセット−メチル、シオメトリニル、フルラゾール、フルキソフェニム、メフェンピル−ジエチル、ナフタリックアンヒドリドおよびオキサベトリニルを安全化剤として含む。
【００５１】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明による種子処理のための組成物で処理された種子および／もしくは処理された種子に非常に近いところ（上に定義のとおり）に播種された種子から新生する実生は、増強された収穫高を有しうる。本明細書において使用される「増強された収穫高」は、同一条件下だが対象の方法を適用せずに産生された植物の収穫可能な同じ産生物の収穫高に対する植物の収穫可能な産生物の収穫高における測定可能な程度の増加を意味する。好ましくは収穫高は１％以上増加し、より好ましくは収穫高は１．５％以上増加し、さらにより好ましくは収穫高は２％以上増加し、最も好ましくは収穫高は２．５％以上増加する。収穫高増強化合物は当業者に周知であり、これだけに限らないがオーキシン、ジベリリン、ｎｏｄファクターなどの植物成長調節剤およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｉｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物を含む。しかし、例えば殺真菌剤、殺虫剤、殺線虫剤および除草剤も収穫高の損失を予防することによる収穫高増強効果を有することは当業者に明らかである。
【００５２】
本発明による組成物で処理された種子は、種子処理のための組成物中に存在する植物増強剤の種子への高親和性結合から（本発明による組成物を適用されていない種子と比較して増強された収穫高を生じうるおよび／または測定可能に増強された収穫高を生じるために種子処理のための組成物中に存在する必要がある植物増強剤の量の低減をもたらしうる。）恩恵を受ける。好ましくは植物増強剤は、肥料、微量栄養素、植物成長調節物質、ストレス保護剤、保水剤、植物誘導物質、微生物剤または植物ホルモンからなる群から選択される。
【００５３】
本発明による組成物で処理された植物種子は、粉衣種子、フィルムコート種子、エンクラスト種子、ミニピル、スタンダードピル、スプリットピルの形態または任意の他の適切な形態であってよい。好ましくは本発明による処理された種子は、発芽能力または作物収穫高を失うことなく長期間保存されうる。好ましくは本発明による組成物で処理された植物種子の発芽は、誘導されず、遅延されず、抑制されない。
【００５４】
好ましい実施形態では植物種子は、上に定義の作物の種子である。より好ましくは植物種子は、トウモロコシ、小麦、モロコシ、ライ麦、大豆、米、綿、セイヨウアブラナ、ヒマワリ、サトウダイコン、ジャガイモ、野菜、花、芝草および飼料草からなる群から選択される作物由来の種子である。
【００５５】
別の好ましい実施形態では植物種子は、改良された作物の種子である。本明細書において使用される「改良された作物」は、遺伝的に改変されたまたはそうでなければ自然選択、マーカー利用選択もしくはゲノム選択または、野生型作物に対して改良された形質を有するようにするための（分子）突然変異育種技術をこれだけに限らないが含む従来の育種方法によって選択された作物を意味する。改良された作物の例は、これだけに限らないがグリホサート耐性作物、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒素発現作物、作物の病気耐性変種、増強された収穫高を有するハイブリッド作物変種などを含む。
【００５６】
本発明の第四の態様は、（ｉ）本発明による組成物で種子を処理するステップ、および（ｉｉ）処理された種子を播種するステップ、のステップを含む方法であり、前記組成物が：
（ａ）植物種子を種子伝染性および／もしくは土壌伝染性の病原体から保護する；ならびに／または
（ｂ）処理された種子からおよび／もしくは処理された種子に非常に近いところで生長する植物を害虫および／もしくは病気によって引き起こされる損傷から保護するならびに／または
（ｃ）植物種子ならびに／または処理された種子からおよび／もしくは処理された種子に非常に近いところで生長する植物を雑草および／もしくはその他の望まれない植物によって引き起こされる損傷から保護するならびに／または
（ｄ）処理された種子からおよび／もしくは処理された種子に非常に近いところで生長する植物の収穫高を増強する
方法である。
【００５７】
本発明による種子処理のための組成物で植物種子を処理するステップおよび次いでこれらを播種するステップは（それにより組成物は、そのように処理された種子を種子感染性および／もしくは土壌伝染性の病原体からより良く保護する、ならびに／または新生作物を植物の害虫および／もしくは病気から保護する、ならびに／または種子および／もしくは新生植物を雑草および／またはその他の望まれない植物によって引き起こされる損傷から保護する、ならびに／または収穫高の増強をもたらす）、上に記載の本発明の方法により処理されずに播種された種子と比較してより均一な作物の生長および収穫およびしたがって改善された作物の品質に全て寄与できる。
【００５８】
本発明の第五の態様は、４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域、またはこれらの適切な断片のいずれかを含む（したがって少なくとも１つの相補性決定領域を形成するアミノ酸残基の少なくとも一部を通常含有する。）アミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質である種子結合タンパク質である。
【００５９】
好ましくは前記抗原結合タンパク質は、高収量で容易に（好ましくは微生物組換え発現系において）産生され、続いて簡便に単離および／または精製される。同様に好ましくは前記抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質の完全性が保存および／または利用条件下（温度上昇、凍結融解サイクル、ｐＨもしくはイオン強度の変化、ＵＶ照射、有害化学物質の存在などを含み得る。）で維持されることを意味して、保存中および利用中の両方において安定である。より好ましくは前記抗原結合タンパク質は、下に定義の農薬製剤中において安定である。最も好ましくは前記抗原結合タンパク質は、外気温で２年間まで保存された場合または５４℃で少なくとも２週間保存された場合に農薬製剤（さらに定義されるとおり）中で安定を維持する。
【００６０】
抗原結合タンパク質の植物種子上の標的分子への結合は、好ましくは高親和性で生じる：典型的には抗原結合タンパク質と種子上の標的分子との間の結合の解離定数は１０−５未満、より好ましくは解離定数は１０−６未満、さらにより好ましくは解離定数は１０−７未満、最も好ましくは解離定数は１０−８未満である。好ましくは抗原結合タンパク質のその標的分子への結合は、さまざまな抗原の均一なまたは不均一な混合物中に存在する特定の抗原に抗原結合タンパク質が優先的に結合することを意味して特異的である。抗原結合タンパク質の結合の特異性は、抗原結合タンパク質のその標的分子への結合が抗原結合タンパク質の無関係な分子への結合とおよび抗原結合タンパク質の反応容器への非特異的粘着と比較される実施例２に記載のＥＬＩＳＡなどの方法によって分析されうる。特定の実施形態では特異的結合相互作用は、試料中の望ましい抗原と望まれない抗原との間を、いくつかの実施形態では約１０を超えるから１００倍以上（例えば約１０００または１０，０００倍を超えて）で識別する。好ましくは抗原結合タンパク質のその標的分子への結合は、低温または高温、低いまたは高いｐＨ、低いまたは高いイオン強度、ＵＶ照射、低湿度、低水分ポテンシャル、変性化学物質の存在などの過酷な条件下でさえも機能する。好ましい一実施形態では前記過酷な条件は、ｐＨ範囲４から９、より好ましくはｐＨ範囲３から１０、さらにより好ましくはｐＨ範囲２から１０、最も好ましくはｐＨ範囲１から１１によって定義される。別の好ましい実施形態では前記過酷な条件は、温度範囲４−５０℃、より好ましくは温度範囲０−５５℃、さらにより好ましくは温度範囲０−６０℃によって定義される。別の好ましい実施形態では前記過酷な条件は、湿度５０％未満、好ましくは湿度４０％未満、より好ましくは湿度３０％未満、さらにより好ましくは湿度２５％未満、最も好ましくは湿度２０％未満によって定義される。さらに別の好ましい実施形態では前記過酷な条件は、水分ポテンシャル−０．５ＭＰａ未満、好ましくは水分ポテンシャル−０．７５ＭＰａ未満、より好ましくは水分ポテンシャル−１ＭＰａ未満、さらにより好ましくは水分ポテンシャル−１．５ＭＰａ未満、最も好ましくは水分ポテンシャル−２ＭＰａ未満によって定義される。さらに別の好ましい実施形態では前記過酷な条件は、上に記載の種子処理のための方法において一般的な条件として定義される。
【００６１】
好ましくは前記抗原結合タンパク質は、ラクダ科抗体由来である。より好ましくは前記抗原結合タンパク質は、ＶＨＨ配列に含まれる。最も好ましくは前記抗原結合タンパク質は、配列番号１−配列番号１１（ＶＨＨ  ６Ｂ５、６Ｄ７、６Ｄ１１、６Ｆ２、６Ｈ４、７Ａ５、７Ａ７、７Ｅ９、８Ａ４、８Ｄ６および１２Ｃ３）もしくはこれらの適切な断片のいずれかからなる群から選択されるＶＨＨ配列またはこれらの相同物に含まれる。好ましくは前記抗原結合タンパク質は植物細胞壁構成成分に結合している。より好ましくは前記抗原結合タンパク質はヘミセルロース、ペクチン多糖、リグニン、スベリンまたはクチンからなる群から選択される植物細胞壁構成成分に結合している。さらにより好ましくは本発明による抗原結合タンパク質は、多糖に結合する。好ましくは前記多糖には、他の化合物が混入しておらず、少なくとも８５％ｗ／ｗ、好ましくは９０％ｗ／ｗ、より好ましくは９５％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは９８％ｗ／ｗ、最も好ましくは９９％ｗ／ｗの純度を有する。好ましくは前記多糖は、構造多糖および／またはヘテロ多糖である。さらにより好ましくは本発明による前記抗原結合タンパク質は、ペクチンに結合しており、好ましくは前記ペクチンは低エステル化ホモガラクツロナンを含む。
【００６２】
好ましい一実施形態では前記多糖、好ましくは前記ヘテロ多糖または構造多糖、より好ましくは前記ペクチン多糖は、非限定的例としての果汁中のペクチンのように溶液中にある。別の好ましい実施形態では、前記多糖、好ましくは前記ヘテロ多糖または構造多糖、より好ましくは前記ペクチン多糖は、非限定的例としての種子表面などの固体表面中に含まれる。さらに別の好ましい実施形態では、前記多糖、好ましくは前記ヘテロ多糖または構造多糖、より好ましくは前記ペクチン多糖は、植物、塊茎または鱗茎の野菜増殖のために用いられる挿し木などの野菜材料に含まれる。
【００６３】
さらに別の実施形態では、上記抗原結合タンパク質またはこれらの機能性断片のいずれかをコードする核酸配列も本発明の一部である。本発明は、前記アミノ酸配列に基づく人工的結合ドメインを構築するために植物種子、好ましくは植物細胞壁構成成分、より好ましくは（ペクチン）多糖への特異的結合に関与するアミノ酸配列を単離するための、本発明による任意の抗原結合タンパク質の使用も包含する。実際に本発明による抗原結合タンパク質では、フレームワーク領域および相補性決定領域は周知であり、抗原結合タンパク質の誘導体、同様に植物種子への結合、好ましくは同じ植物細胞壁構成成分への、より好ましくは同じ（ペクチン）多糖への結合の研究は、植物種子との、好ましくは植物細胞壁構成成分との、より好ましくは（ペクチン）多糖との結合に関与する必要不可欠なアミノ酸を推定することを可能にする。この知識は、最小抗原結合タンパク質を構築するためおよびこれらの誘導体を作製するために用いられうる。
【００６４】
さらに本発明は、上記抗原結合タンパク質またはこれらの機能性断片のいずれかをコードする核酸配列を含む発現ベクターおよびそのような発現ベクターを発現する宿主細胞も想定する。適切な発現系は、細菌もしくは酵母での構成的および誘導性発現系、バキュロウイルス、セムリキ・フォレストウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）およびレンチウイルスなどのウイルス発現系、または昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞での一過性形質転換を含む。適切な宿主細胞は、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などを含む。適切な動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ｓ２、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＤＴ４０などを含む。抗原結合タンパク質のクローニング、発現および／または精製は、当業者に周知の技術により実施されうる。
【００６５】
ＶＨＨの天然または合成ライブラリー（そのようなライブラリーの例としてＷＯ９９３７６８１、ＷＯ００４３５０７、ＷＯ０１９０１９０、ＷＯ０３０２５０２０およびＷＯ０３０３５６９４を参照されたい。）は、植物種子への適切な結合剤を含みうるが、本発明の好ましい実施形態は、動物の免疫系を植物細胞壁構成成分に暴露するための数個の植物細胞壁構成成分の１つまたは組合せでのラクダ科種の個体の免疫化を含む。したがって本明細書にさらに記載されるとおり、そのようなＶＨＨ配列は、いくつかの植物細胞壁構成成分の１つまたは組合せでラクダ科種を適切に免疫化するステップによって、前記ラクダ科種から適切な生物学的試料（血液試料またはＢ細胞の任意の試料など）を入手するステップによっておよび前記試料から出発して所望の植物細胞壁構成成分に対するＶＨＨ配列を生成するステップによって好ましくは生成されうるまたは入手されうる。そのような技術は、当業者に明らかである。所望のＶＨＨ配列を入手するためのさらに別の技術は、それ自体が周知である任意の適切な技術を用いて重鎖抗体を発現できるトランスジェニック哺乳動物を適切に免疫化する（すなわち植物細胞壁構成成分に対する免疫応答および／または重鎖抗体を生じさせるための）ステップ、前記トランスジェニック哺乳動物から適切な生物学的試料（血液試料またはＢ細胞の任意の試料など）を入手するステップおよび次いで前記試料から出発して前記植物細胞壁構成成分に対するＶＨＨ配列を生成するステップを含む。例えばこの目的のために、重鎖抗体発現マウスならびにＷＯ０２０８５９４５およびＷＯ０４０４９７９４に記載のさらなる方法および技術は使用されうる。
【００６６】
したがって本発明は、本発明による抗原結合タンパク質を生成する方法を包含する。非限定的例として、
（ｉ）動物を植物細胞壁構成成分の複合混合物で免疫化するステップ、および
（ｉｉ）多糖に富む植物抽出物に結合する抗原結合タンパク質を選択するステップ；および
（ｉｉｉ）（ペクチン）多糖に特異的に結合する抗原結合タンパク質に関してスクリーニングするステップ
を含む、多糖、好ましくはペクチン多糖に特異的に結合する抗原結合タンパク質を生成するための方法が提供される。
【００６７】
非限定的例として、植物細胞壁構成成分に特異的に結合する抗原結合タンパク質に関するスクリーニングは、それらの表面に重鎖抗体を発現する細胞のセット、収集物もしくはライブラリー（例えば適切に免疫化されたラクダから得られたＢ細胞）を、もしくはｇｅｎＩＩＩとＶＨＨとの融合体をそれらの表面に提示するバクテリオファージをスクリーニングするステップによって、ＶＨＨ配列の（無処理もしくは免疫）ライブラリーのスクリーニングステップによって、またはＶＨＨ配列をコードする核酸配列の（無処理もしくは免疫）ライブラリーのスクリーニングによって例えば実施されることができ、全てそれ自体が周知であるやり方で実施されることができ、方法は場合によって非限定的に例えば親和性成熟のステップ、所望のアミノ酸配列を発現するステップ、所望の植物細胞壁構成成分に対する結合についておよび／もしくは活性についてスクリーニングするステップ、所望のアミノ酸配列もしくは核酸配列を決定するステップ、１つもしくは複数の核酸置換を導入するステップ、適切な多価および／もしくは多特異性形式に形式化するステップ、所望の生物学的および／もしくは生理学的特性についてスクリーニング（すなわち当技術分野において周知の適切なアッセイを用いる。）するステップ、ならびに／またはそのようなステップの１つもしくは複数の任意の組合せを任意の順番でなどの１つまたは複数の他の適切なステップをさらに含むことができる。
【００６８】
本発明の第六の態様は、本発明による種子結合タンパク質の使用である。
【００６９】
好ましい一実施形態では、種子結合タンパク質、好ましくは本発明による抗原結合タンパク質、最も好ましくは配列番号１−１１またはこれらの適切な断片のいずれかからなる群から選択されるＶＨＨは、植物増強剤を植物種子に結合させるために用いられる。上に説明の前記種子結合タンパク質、好ましくは前記抗原結合タンパク質は、植物増強剤または植物増強剤を含む担体に結合されることができ、それにより前記種子結合タンパク質、好ましくは前記抗原結合タンパク質は、前記植物増強剤を特異的方法で種子に結合させることができる、好ましくは保持させることができる。しかし、４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域またはこれらの適切な断片のいずれかを含むアミノ酸配列を含む本発明による植物種子結合タンパク質、特に多糖抗原結合タンパク質が他の使用のために適用されうることは当業者に明らかである。
【００７０】
別の好ましい実施形態では、前記種子結合タンパク質、好ましくは前記抗原結合タンパク質は、試料中の多糖の存在および／または濃度を決定するために用いられる。抗体を用いて化合物、例えば多糖の存在および／または濃度を決定するための方法は、当業者に周知であり、これだけに限らないが免疫沈降、蛍光免疫測定、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）および磁気免疫測定（ＭＩＡ）を含む。種子結合タンパク質、好ましくは本発明による抗原結合タンパク質は、化合物の検出および／または定量を促進するために標識化されうる。抗原結合タンパク質の標識化は、当業者に周知であり、直接標識化および間接標識化を含む。直接標識化では、抗原結合タンパク質それ自体が、これだけに限らないが呈色標識、蛍光標識、放射活性標識または磁気粒子などの直接検出可能な標識によって標識化される。蛍光標識は、特に有用であり、これだけに限らないがフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）および他のフルオレセイン誘導体、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）および他のローダミン誘導体、Ｒ−ピコエリスリン蛍光タンパク質（Ｒ−ＰＥ）およびＲ−ＰＥ：シアニン−５およびアロフィコシアニンを含む。代替的に標識化は、間接的方法によっても実行されうる。この場合種子結合タンパク質、好ましくは本発明による抗原結合タンパク質は、検出可能な二次化合物に結合されうる、または、それ自体は直接検出可能ではないが検出可能な二次化合物に結合することによって検出されうるタグに融合もしくは結合される。検出が、これだけに限らないが化合物の連続的結合または結合後の標識の活性化などの一連の事象の結果であってよいことは当業者に明らかである。
【００７１】
本明細書において使用される「試料」は、１つまたは複数の多糖の存在および／または濃度について分析したい全体を代表する一部、一片またはセグメントである。前記試料は、全体から取り出された一部であってよく、または発酵中にバイオセンサーによってオンラインで測定される試料の場合は代表的な地点および／または時点で測定される全体であってもよい。非限定的例として前記試料は、前記多糖のアレルゲン能との関連で、または食品の品質パラメーターを変化させる（保存期間の変化など）多糖の求められるもしくは求められない物理的、化学的または微生物学的特徴との関連で多糖の存在または濃度が決定されるまたは変更される必要がある食品試料であってよい。非限定的例としてペクチン脱エステル化は、成熟中の果実の軟化において重要な役割を演じ（Ｇｏｕｌａｏ、２０１０）、果実軟化事象における脱エステル化の役割を理解することにおいてペクチン構造の決定は必要不可欠である。果実成熟の際にとりわけ有用なペクチン多糖の免疫プロファイリングは、当業者に周知であり、ＷｉｌｌａｔｓおよびＫｎｏｘ（１９９９）によって記載されている。別の例は、食品の保水能力を増大させるためまたは果汁および乳飲料の安定化のためのペクチンの使用である。付加的にペクチンは加工肉の保存期間を増加させることができ（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）、ペクチンは食物繊維としてしばしば用いられる。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、前記種子結合タンパク質、好ましくは抗原結合タンパク質は、試料から多糖を単離するために用いられる。多糖の単離は、混合物から多糖を精製するために用いられることができ、混入しているまたは他に望まれない多糖を試料から除去することを目的とする場合がある。化合物を単離するために抗体を用いる方法は、当業者に周知であり、これだけに限らないが免疫沈降および親和性クロマトグラフィーを含む。代替的に種子結合タンパク質、好ましくは本発明による抗原結合タンパク質は、膜濾過または同様の技術において用いられるために膜に結合されうる。具体的な実施形態では抗原結合タンパク質は、精製したい目的のタンパク質に融合されることができ、精製は混合物をマトリクスを含む多糖と接触させるステップによって実行される。前記単離および／または精製の非限定的例は、排水処理において見出されうる。実際にいくつかの果汁加工プラントの排水、特にコーヒー産業の排水は、ペクチンに富み、ＢＯＤおよびＣＯＤが高い。化学的凝固を用いる精製および放射線照射での分解がＣＯＤを低下させるために提案されている（Ｚａｙａｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）。しかしこの方法は比較的高価である。免疫親和性工程を用いる精製（Ｈａｒｒｉｓ、１９９９）は、有益な副流としてペクチンの回収を可能にする環境に優しい解決策である。種子結合タンパク質、好ましくは本発明による抗原結合タンパク質は、これらの産生費用が低いことおよび悪環境におけるこれらの安定性からこの目的に特に適している。
【００７３】
同様に、本発明によるペクチン抗原結合タンパク質は、ペクチンの産生において用いられうる。古典的産生方法は、原材料（柑橘類果皮など）の抽出、抽出材料からの分離および果汁からのペクチンのアルコール沈殿からなる。沈殿は、非選択的でありペクチンの混合物が生じる。本発明による抗原結合タンパク質の使用は、低費用で特定の画分を精製することを可能にする。
【００７４】
本発明の第七の態様は、少なくとも１つの種子結合タンパク質、好ましくは本発明による抗原結合タンパク質を含む農薬組成物である。
【００７５】
本明細書において使用される「農薬組成物」は、さらに定義される少なくとも１つの農薬活性物質を含み、場合によって農薬の最適な分散、微粒子化、成膜、葉湿潤化、分配、保持および／または取り込みを好都合にする１つまたは複数の添加剤を含む、さらに定義される農薬的使用のための組成物を意味する。非限定的例としてそのような添加剤は、希釈剤、溶媒、アジュバント、界面活性剤、湿潤剤、分離剤、油、展着剤、増粘剤、浸透剤、緩衝剤、酸性化剤、抗沈降剤、凍結防止剤、光保護材、消泡剤、殺生物剤および／またはドリフト調節剤である。
【００７６】
本明細書において使用される「農薬的使用」は、屋外で栽培される作物における使用のために適するおよび／または使用を目的とする上に定義の農薬組成物の使用を含むだけでなく、これだけに限らないが鱗茎、塊茎、果実および種子を含む植物または植物の部分を（例えば有害生物、病気または害虫から）保護するため、植物の生長を調節するため（好ましくは促進または増進するため）および／または植物もしくは収穫される植物の部分（例えば果実、花、種子など）の収穫高を促進するための温室栽培される作物（例えば園芸／草花栽培）もしくは水耕栽培系における使用または公共のもしくは民間の緑地（例えば民間の庭園、公園、運動場）における使用を意味する農薬組成物の使用、さらに家庭用の使用などの施設以外での（例えば家庭用の除草剤もしくは殺虫剤または生地もしくは木材を有害生物によって生じる損傷から保護するための薬剤）使用、または産業用使用（例えば汚染を防ぐためもしくは有害生物による損傷から保存品を保護するための薬剤）または害虫駆除専門家による使用（例えば望まれない昆虫およびげっ歯類などを駆除するための）を意味する農薬組成物の使用も含む。
【００７７】
本明細書において使用される「農薬活性物質」は、上に定義の農薬的使用のために用いられうる任意の活性物質または活性成分（ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）を意味する。そのような農薬活性物質の例は、当業者に明らかであり、例えば殺虫剤（例えば家庭用殺虫剤を含む接触性殺虫剤、浸透移行性殺虫剤）、ダニ駆除剤、殺ダニ剤、除草剤（例えば家庭用除草剤を含む接触性除草剤、浸透移行性除草剤）、殺菌剤（例えば家庭用殺菌剤を含む接触性殺菌剤、浸透移行性殺菌剤）、殺線虫剤（例えば家庭用殺線虫剤を含む接触性殺線虫剤、浸透移行性殺線虫剤）および他の農薬（例えば殺鳥剤、軟体動物駆除剤、殺魚剤）または殺生物剤（例えば細菌、藻類または巻貝を殺すための薬剤）および生長促進剤；植物ホルモンなどの生長調節剤；微量栄養素、安全化剤；誘引物質；忌避剤；餌（例えば昆虫餌、巻貝餌）；として活性な化合物ならびに／または標的植物（例えば保護される植物もしくは調節される植物）においてまたはそれによって遺伝子発現（および／もしくは他の生物学的または生化学的工程）を調節（すなわち増加、減少、阻害、増強および／もしくは誘発）するために用いられる活性成分を含みうる。農薬活性物質は、化学物質および核酸（例えば１本鎖または２本鎖ＲＮＡ、例えばＲＮＡｉ技術の内容において使用される。）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（種子結合タンパク質または抗原結合タンパク質を含む）および微生物を含む。本明細書において使用される「微生物」は、細菌、真菌、酵母、ウイルスなどを意味する。そのような農薬活性物質の例は、当業者に明らかであり、例えば非限定的に：グリホサート、パラコート、メトラクロール、アセトクロール、メソトリオン、２，４−Ｄ，アトラジン、グルホシネート、スルホサート、フェノキサプロップ、ペンジメタリン、ピクロラム、トリフルラリン、ブロモキシニル、クロジナホップ、フルロキシピル、ニコスルフロン、ベンスルフロン、イマゼタピル、ジカンバ、イミダクロプリド、チアメトキサム、フィプロニル、クロルピリホス、デルタメトリン、ラムダ−シハロトリン、エンドスルファン、メタミドホス、カルボフラン、クロチアニジン、シペルメトリン、アバメクチン、ジフルフェニカン、スピノサド、インドキサカルブ、ビフェントリン、テフルトリン、アゾオキシストロビン、チアメトキサム、テブコナゾール、マンコゼブ、シアゾファミド、フルアジナム、ピラクロストロビン、エポキシコナゾール、クロロタロニル、銅殺菌剤、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、ジフェノコナゾール、カルベンダジム、プロピコナゾール、チオファネート、硫黄、ボスカリドおよび他の周知の農薬またはこれらの任意の適切な組合せ（複数可）を含む。他の適切な農薬は本明細書の開示に基づいて当業者に明らかであり、例えば任意の商業的に入手可能な農薬であってよく、例えばＰｈｉｌｌｉｐｓ  ＭｃＤｏｕｇａｌｌ，ＡｇｒｉＳｅｒｖｉｃｅ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００７  Ｖ４．０、Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ−２００６  Ｍａｒｋｅｔ、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｄｅｘ  １０−２０頁に列挙される各化合物を含む。前記農薬活性物質は、これだけに限らないが結晶として、微結晶として、ナノ結晶として、共結晶として、粉末として、顆粒として、粉剤として、錠剤として、ゲルとして、可溶性濃縮物として、乳剤として、可乳化濃縮物として、懸濁剤として、懸濁剤濃縮物として、サスポエマルジョンとして、分散剤として、分散剤濃縮物として、マイクロカプセル懸濁剤としての形態を含むさまざまな形態または当業者に明らかな農薬製剤の任意の他の形態もしくは種類であってよい。農薬活性物質は、そのまま用いられる活性物質または活性成分だけでなく、（外部要因によって過活性化されうる。）不活性形態の前駆体も含む。非限定的例として前駆体は、虫害での植物創傷によって生じるｐＨ変化によって、真菌攻撃によって生じる酵素作用によってまたは温度変化もしくは湿度変化によって活性化されうる。
【００７８】
本発明による農薬組成物は、液体、半流動体または固体形態であってよく、例えばエアロゾル、流動性粉末、水和剤、水和顆粒剤、可乳化濃縮物、懸濁剤濃縮物、マイクロ乳剤、カプセル懸濁剤、乾燥マイクロカプセル、懸濁される錠剤もしくはゲル、分散剤、乳化剤として維持されてよく、または他に保存もしくは適用のために適切な液体媒体（水もしくは他の適切な水性、有機または油性媒体など）に取り込まれてよい。本発明による農薬組成物は、少なくとも１つの、好ましくはそれ以上の本発明による抗原結合タンパク質を含む。本発明による農薬組成物中の本発明による１つまたは複数の抗原結合タンパク質の存在は、農薬活性物質のその作用部位（植物または植物の部分（例えば果実、塊茎もしくは鱗茎）、植物種子または他の植物由来有機材料など）への結合を確実にする一方で、農薬活性物質の保存容器および／または操作者の器具への粘着は回避される。場合によって組成物は、これだけに限らないが希釈剤、溶剤、アジュバント、界面活性剤、湿潤剤、分離剤、油、展着剤、増粘剤、浸透剤、緩衝剤、酸性化剤、抗沈降剤、凍結防止剤、光保護材、消泡剤、殺生物剤および／またはドリフト調節剤など本発明による組成物における使用に適する１つまたは複数のさらなる化合物をさらに含む。
【００７９】
本発明の第八の態様は、本発明による少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含む１つまたは複数の多糖の検出および／または濃度の決定のためのキットである。
【００８０】
場合により、キットは抗原結合タンパク質の標識化および／または検出および／または定量のために必要な試薬も含む。
【００８１】
本発明の第九の態様は本発明による少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含む、１つまたは複数の多糖の検出および／または濃度決定のためのバイオセンサーである。
【００８２】
好ましくは抗原結合タンパク質は、バイオセンサーの検知層上に固定され、結合の検出は（非限定的例として）光学的、電気化学的、水晶振動子マイクロバランスによって、磁気免疫センサーによってまたはマイクロメカニカルカンチレバーに基づく免疫センサーによってであってよい。抗原結合タンパク質の固定のためおよび抗原−抗原結合タンパク質結合の検出のための技術は当業者に周知であり、特にＭａｒｑｕｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｂｌｕｍ（２００６）、Ｆｒｉｔｚ（２００８）およびＳｋｏｔｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）によって概説されている。
【００８３】
本発明の第十の態様は、化合物の植物種子への結合を可能にする標的化剤であって、前記標的化剤は本発明による少なくとも１つの種子結合タンパク質を含む。
【００８４】
本明細書において使用される「標的化剤」は、少なくとも１つの種子結合タンパク質、好ましくは本発明による抗原結合タンパク質を含む、分子構造物（好ましくはポリペプチド骨格を有する。）である。標的化剤は、その最も簡易な形態において１種類の種子結合タンパク質１つだけからなるが、しかし標的化剤は１つより多い種子結合タンパク質を含むことができ、さらに定義のとおり一価または多価および単一特異性または多特異性であってよい。１種類の１つまたは複数の種子結合タンパク質とは別に、標的化剤は抗原結合タンパク質に化学的に結合または融合されうる他の成分を（Ｎ末端にもしくはＣ末端にまたは内部に融合されるかにかかわらず）さらに含みうる。前記他の成分は、限定することなく標識アミノ酸（例えば蛍光もしくは放射活性標識）または検出可能なアミノ酸（例えば抗体によって検出可能）を含む１つまたは複数のアミノ酸、１つまたは複数の単糖、１つまたは複数のオリゴ糖、１つまたは複数の多糖、１つまたは複数の脂質、１つまたは複数の脂肪酸、１つまたは複数の小分子、または前述の任意の組合せを含む。好ましい一実施形態では、前記他の成分は、前記標的化剤においてスペーサーまたはリンカーとして機能する。
【００８５】
本明細書において使用される「化合物」は、これだけに限らないがタンパク質および酵素などのタンパク質複合体またはこれだけに限らないが既に定義の農薬活性物質を含む化学的化合物を含む任意の化合物、好ましくは活性物質であってよい。好ましくは前記化合物は、既に定義の植物増強剤である。代替として化合物は、担体（好ましくはマイクロ担体）中にまたは上に含まれてよく、前記担体は本発明による少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含む１つまたは複数の標的化剤と（既に定義のとおり）結合されうる。本明細書において使用される「担体に含まれる」は、これだけに限らないが包埋、封入および吸着などの手段による結合または含有を意味する。好ましくは担体は、１つまたは複数の化合物が担体中に（例えばナノカプセル、マイクロカプセル、ナノ球体、マイクロ球体、リポソームまたはビヒクルとして）取り込まれうる、封入されうるまたは含まれうるものである。好ましくは担体は、即時型または徐放型または遅効型放出特徴（例えば数分間、数時間、数日間または数週間にわたる。）を有するものである。同様に担体は、経時的に（例えば数分、数時間、数日または数週間にわたり）破裂するまたはゆっくり分解し（例えば高温もしくは低温、日光、高湿度もしくは低湿度または他の環境因子もしくは条件への長期間の暴露により）、担体から化合物を放出する材料（例えばポリマー）で作製されうる。
【００８６】
本発明による標的化剤は、「単一特異性」標的化剤または「多特異性」標的化剤のいずれであってもよい。「単一特異性」標的化剤によっては、単一の抗原結合タンパク質のいずれかを含むまたは２つ以上の異なる抗原結合タンパク質（それぞれは同じ結合部位に対して方向付けられている。）を含む標的化剤が意味される。したがって単一特異性標的化剤は、単一の抗原結合タンパク質を介してまたは複数の抗原結合タンパク質を介してのいずれかで単一の結合部位に結合できる。「多特異性」標的化剤によっては、それぞれ異なる結合部位に対して方向付けられている２つ以上の抗原結合タンパク質を含む標的化剤が意味される。したがって「二重特異性」標的化剤は２つの異なる結合部位に結合でき；「三重特異性」標的化剤は３つの異なる結合部位に結合でき；「多特異性」標的化剤についても同様。同様に本明細書に記載の標的化剤に関して、用語「一価」は、標的化剤が１つの単一抗原結合タンパク質を含むことを示して使用され；用語「二価」は標的化剤が合計２つの単一抗原結合タンパク質を含むことを示して使用され；用語「三価」は標的化剤が合計３つの単一抗原結合タンパク質を含むことを示して使用され；「多特異性」標的化剤についても同様。
【００８７】
本明細書において使用される「植物種子に化合物を結合できる」は、（植物種子への標的化剤に含まれる。）種子結合タンパク質、好ましくは抗原結合タンパク質の結合が前記化合物（好ましくは前記植物増強剤）を植物種子に結合するために、より好ましくは保持する（上に定義のとおり）ために十分に強いことを意味する。好ましくは化合物は担体、より好ましくはマイクロ担体の中または上に含まれる。好ましくは前記標的化剤は、親和性結合によってまたは共有結合によって前記化合物に、さらにより好ましくは前記化合物（好ましくは前記植物増強剤）を含有する前記担体に結合される。
【００８８】
化合物（好ましくは前記植物増強剤）および／または担体を標的化剤に結合する方法は、当業者に周知であり、これだけに限らないが共有結合および親和性結合を含む。共有結合の例は融合タンパク質であり、標的化剤およびタンパク質性の化合物は、好ましくは組換えタンパク質発現の手段によって一体として産生される。融合タンパク質を用いる代替的手法は、例えばＦｉｐｕｌａ（２００７）によっておよびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ（２００８）において記載される共有結合化学を用いる（第二のタンパク質または別の化学的化合物でありうる。）化合物への共有結合のための標的化剤中の残基の化学的架橋結合の使用である。システインなどのスルフヒドリル基を含むアミノ酸残基は、例えばサクシニミジルマレイミドフェニルブチレート（ＳＭＰＢ）などの二重特異性試薬を用いて共有結合されうる。代替的にタンパク質表面に位置するリシン基は、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）を用いて従来のカルボジイミド結合によって第二タンパク質上の活性化カルボキシル基に結合されうる。標的化剤と化合物または担体（化合物が含まれる。）との間の結合は、直接であってよく、またはスペーサーもしくはヒンジ分子が用いられてもよい。そのようなスペーサーの例はＷＯ００２４８８４およびＷＯ０１４０３１０において確認されうる。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１つの種子結合タンパク質、好ましくは本発明による抗原結合タンパク質、最も好ましくは配列番号１−１１またはこれらの適切な断片のいずれかからなる群から選択されるＶＨＨを含む標的化剤の、植物増強剤を植物種子に保持するための使用である。好ましくは標的化剤は、種子処理、種子保存、種子操作および／または種子栽植の間に植物増強剤を植物種子に保持するために使用される。好ましくは前記標的化剤は、親和性結合または共有結合によって前記植物増強剤に結合される。さらにより好ましくは、前記標的化剤は、親和性結合または共有結合によって（前記植物増強剤が含まれる。）担体（上に定義のとおり）に結合される。本実施形態は、化合物が（化合物の徐放を確実にするためまたは化合物の存続時間を増加させるために（リゾバクテリア（Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ）などの生きた細菌を封入する場合など））マトリクスに封入、包埋または吸着される必要がある場合に特に有用である。
【００９０】
本発明の第十一の態様は、植物増強剤を植物または植物の部分に結合させるための本発明による標的化剤の使用である。
【００９１】
本明細書において使用される「植物の部分」は、無傷の生きたもしくは生長している植物の部分であるか、または無傷の生きた植物から単離されたもしくは分離されたにかかわらず植物の任意の一部を意味し、さらに枯れた植物材料も想定されうる。好ましくは前記植物の部分は、種子、根、果実、球果、鱗茎および茎からなる群から選択される。より好ましくは前記植物の部分は、種子および果実からなる群から選択される。最も好ましくは前記植物の部分は、トウモロコシ、小麦、モロコシ、ライ麦、大豆、米、綿、セイヨウアブラナ、ヒマワリ、サトウダイコン、ジャガイモ、野菜、花、芝草の種子およびリンゴ、ナシ、柑橘類、バナナまたはストーンフルーツツリーの果実の群から選択される。
【００９２】
植物または植物の部分への植物増強剤の結合、好ましくは保持を可能にするために、１つの単一または複数のいずれかの標的化剤は、共有結合によって、水素結合によって、双極子−双極子相互作用によって、弱いファンデルワールス力によってまたは前述の任意の組合せによってのいずれかで植物増強剤に融合または結合される。本明細書において使用される「結合」は、結合する、連結する、粘着する、混合するまたは包含することを意味する。
【００９３】
本発明の好ましい実施形態は、植物もしくは植物の部分に植物増強剤を結合する植物増強剤を保持するための少なくとも１つの種子結合タンパク質、好ましくは本発明による抗原結合タンパク質、最も好ましくは配列番号１−１１またはこれらの適切な断片のいずれかからなる群から選択されるＶＨＨを含む標的化剤の使用である。
【００９４】
好ましくは植物増強剤は、担体、好ましくはマイクロ担体中または上に含まれる。好ましくは本発明による標的化剤に含まれる種子結合タンパク質は、前記植物または植物の部分に含まれる植物細胞壁構成成分に結合している。好ましくは植物細胞壁構成成分は、多糖であり、より好ましくは植物細胞壁構成成分は構造的多糖またはヘテロ多糖であり、最も好ましくは前記植物細胞壁構成成分はペクチン多糖である。
【００９５】
好ましい一実施形態では前記植物細胞壁構成成分は、これだけに限らないが収穫方法によってまたは咀嚼昆虫もしくは吸汁昆虫によって生じる創傷などの植物または植物の部分の創傷組織に含まれる。そのような場合では、非限定的例として昆虫を殺す化合物がさらなる損傷を回避するために創傷に標的化されることができ、または殺真菌性化合物もしくは殺真菌性化合物の組合せが傷ついた植物組織の真菌感染を回避するために植物創傷に標的化されうる。より好ましくは前記創傷組織は果実、鱗茎、塊茎または種子に含まれる。
【００９６】
本発明の第十二の態様は、植物細胞壁構成成分を改変するための本発明による標的化剤の使用である。
【００９７】
本明細書において使用される「植物細胞壁構成成分を改変するため」は、これだけに限らないが植物細胞壁構成成分の色、臭気、味もしくは感触を含む外観を変化させること（例えば植物細胞壁構成成分への色素、芳香性もしくは軟化剤の結合によって）、植物細胞壁構成成分複合体混合物中の１つもしくは複数の植物細胞壁構成成分の濃度を増加もしくは減少させること（例えば分解酵素を植物細胞壁構成成分に標的化することによってもしくは特定の植物細胞壁構成成分を除去することによって）、または天然に存在しない完全に新規の植物細胞壁構成成分（「デザイナー植物細胞壁構成成分」）を作製すること（例えばエンド−ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ、エンド−ラムノガラクツロナンリアーゼ、エンド−ガラクタナーゼ、エンド−アラビナーゼ、アルビノフラノシダーゼ、ガラクトシダーゼまたはエキソ−ガラクツロシダーゼなどの植物細胞壁修飾酵素を標的化することによって）を意味する。本明細書において使用される「標的」化は、化合物がその作用部位にまたは近くに送達されることを意味する。
【００９８】
植物細胞壁構成成分を改変することは、植物および植物産生物を改善するために、加工特性を改善するためにおよび食物成分または医用材料としての新規材料を生成するために有用であることを証明できる。本発明による標的化剤は、植物細胞壁構成成分の混合物に直接適用される場合またはさらに、参照により本明細書に組み込むＷＯ０１／５９１３７に記載の方法を用いるトランスジェニック植物でのインビボの場合のいずれでも植物細胞壁構成成分を改変するために有用でありうる。
【００９９】
好ましい実施形態では本発明による標的化剤は、融合タンパク質である。融合タンパク質は当業者に周知であり、化学的手段（架橋結合によってまたは共有結合によってなど）によってまたは組換えＤＮＡ法によってのいずれかで合わせて結合される２つ以上のタンパク質、タンパク質の部分またはペプチドからなる。融合タンパク質は、それらが融合パートナーに特定の機能的特徴を付与する（例えば溶解度の増大または基質特異性の改変）ことから特に有用である。本発明による融合タンパク質は、少なくとも１つの本発明による抗原結合タンパク質を含み、抗原結合タンパク質は特定の特徴（例えば植物細胞壁構成成分に対する親和性）を融合パートナーに提供する。好ましい一実施形態では融合タンパク質に含まれる抗原結合タンパク質は、バイオエタノール産生のための基質混合物中のリグニンへのリグニン分解酵素の標的化などの、融合タンパク質の植物細胞壁構成成分への標的化を可能にする。別の好ましい実施形態では融合タンパク質に含まれる抗原結合タンパク質は、融合タンパク質の精製のために特に有用である任意の種類の固体マトリクス上への融合タンパク質の固定を可能にする（例えばセファロースマトリクス上での精製のための抗原結合タンパク質のセファロースへの結合）。
【０１００】
本発明の最後の態様は、少なくとも１つの本発明による標的化剤を含む農薬組成物である。
【０１０１】
好ましくは前記農薬組成物（上に定義のとおり）は、種子処理のための組成物である。好ましくは前記標的化剤は、１つより多い種子結合タンパク質を含む。１つより多い種子結合タンパク質の１つの標的化剤中への組合せは、付加的利益として種子結合がより強いまたはそれがより特異的であるのいずれかを有しうる。
【０１０２】
（図面の簡単な説明）
図１は、スペクトル画像解析およびリニアアンミキシングを備える共焦点顕微鏡によって画像化された天然アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）種子へのＶＨＨ結合の図である。種子の自己蛍光およびＡｌｅｘａ４８８スペクトルは記録され、異なる偽色に帰属された。種子はＶＨＨ  ６Ｄ７とインキュベートされ、結合ＶＨＨは抗ヒスチジン／Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗体で検出された。種子へのＶＨＨの特異的結合シグナルだけが示される。
図２は、リンゴ皮の損傷部位へのＶＨＨ結合を示す図である。リンゴ皮のディスクは、穿孔器を用いて作製され、種々のＶＨＨとインキュベートされた。結合ＶＨＨは、Ａｌｅｘａ４８８蛍光色素に直接コンジュゲートされたモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体とのインキュベーションによって検出された。
図３は、ジャガイモ葉穿孔へのＶＨＨ  ６Ｄ７（Ａ）、７Ａ５（Ｂ）、７Ａ７（Ｃ）、７Ｅ９（Ｄ）結合および小麦葉条片へのＶＨＨ  ６Ｄ７（Ｅ）結合を示す図である。葉穿孔は穿孔器を用いて作製され、ＶＨＨとインキュベートされた。条片は小麦葉から切断され、ＶＨＨとインキュベートされた。結合ＶＨＨは抗ヒスチジン／Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗体とのインキュベーションによって検出された。ＶＨＨは葉穿孔または葉小片に、主に創傷組織の部位に強く結合していることが認められた。
図４は、ニトロセルロース上に配置されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−コンジュゲートオリゴ糖３６個（各アレイのカラムＡ−Ｄ）および多糖４５個（各アレイのカラムＥ−Ｉ）を含有するアレイ上でのＶＨＨの結合プロファイルを示す図である。各試料はアレイ上のスポット４個（２種の濃度を２回ずつ）によって表される。アレイは、選択されたＶＨＨ  ５μｇ／ｍｌで探索され、結合ＶＨＨは二次抗ヒスチジンおよび三次酵素−コンジュゲート抗体で検出された。強い結合シグナルが、主にエステル化の程度が低いペクチン上で観察され、ホモガラクツロナンエピトープへの結合を示している。
Ｅ１  ライムペクチン、ＤＥ  １１％
Ｆ１  ライムペクチン、ＤＥ  ４３％
Ｇ１  ライムペクチン、ＤＥ  ０％
Ｈ１  ライムペクチン、ＤＥ  １６％
Ｉ２  富ＲＧＩＩペクチン（赤ワイン）
Ｉ３  種子粘液（アラビドプシス）
Ｈ４  ＲＧＩ＃５（ジャガイモ）
図５は、マイクロカプセルの作物種子への結合を示す図である。米（Ａ）、小麦（Ｂ）およびトウロコシ（Ｃ）の種子は、蛍光マイクロカプセルに結合した種子結合ＶＨＨとインキュベートされた。ＶＨＨを含まないマイクロカプセルは、対照条件として各作物種子について示される。
図６は、リンゴ皮の損傷部位および損傷したジャガイモ植物葉表面へのマイクロカプセルの結合を示す図である。リンゴ皮およびジャガイモ葉のディスクは、蛍光マイクロカプセルに結合した種子および創傷組織結合ＶＨＨとインキュベートされた。マイクロカプセルは、果実の損傷部位または植物の創傷組織に優先的に結合した。
【実施例】
【０１０３】
［実施例１］
ＶＨＨの生成および選択
ジャガイモ葉破砕物または小麦葉破砕物でのラマの免疫化
表面露出植物材料に対する免疫応答を発生させる目的で、ラマをジャガイモ葉破砕物または小麦葉破砕物で次のとおり免疫化した：ジャガイモ植物（ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）変種デシリー（Ｄｅｓｉｒｅｅ））または小麦植物（トリチカム・エスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）変種ボルド（Ｂｏｌｄｕｓ））由来の葉破砕物を葉を液体窒素中で凍結するステップおよび微粉末が得られるまで前記葉を乳鉢および乳棒で破砕するステップによって調製した。ブラッドフォードタンパク質アッセイを総タンパク質濃度を決定するために用いた。一定分量を作製し、−８０℃保存し、懸濁液を免疫化に用いた。
【０１０４】
ラマは、標準的手順に従って破砕ジャガイモ葉または破砕小麦葉の６回の筋肉内注射で１週間間隔で免疫化した。ラマ３匹「４０７９２８」「Ｃｈｉｌｅａｎ  Ａｕｔｕｍｎ」および「Ｎｉａｇａｒａ」は破砕したジャガイモ葉で免疫化し、別のラマ２匹「３３７３３」および「Ｏｒｇａｎｚａ」は破砕した小麦葉で免疫化した。ラマ「４０７９２８」および「３３７３３」は、アジュバントＬＱ（Ｇｅｒｂｕ）を用いて免疫化し、ラマ「Ｃｈｉｌｅａｎ  Ａｕｔｕｍｎ」「Ｎｉａｇａｒａ」および「Ｏｒｇａｎｚａ」はフロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）を用いて免疫化した。ラマ「４０７９２８」および「３３７３３」の免疫化のための用量は０、７、１４、２１、２８、３６日目のそれぞれについて総タンパク質１ｍｇであり、ＰＢＬは４０日目に採取した。４０日目のＰＢＬ採取時にラマ「４０７９２８」および「３３７３３」の血清を採取した。ラマ「Ｃｈｉｌｅａｎ  Ａｕｔｕｍｎ」「Ｎｉａｇａｒａ」および「Ｏｒｇａｎｚａ」の免疫化のための用量は０日目に総タンパク質１００μｇおよび７、１４、２１、２８および３５日目に５０μｇであった。０日目、２５日目および３８日目のＰＢＬ採取時にラマ「Ｃｈｉｌｅａｎ  Ａｕｔｕｍｎ」「Ｎｉａｇａｒａ」および「Ｏｒｇａｎｚａ」の血清を採取した。
【０１０５】
ライブラリー構築  −  免疫化した各ラマから別々のＶＨＨライブラリーを作製した。ＲＮＡを末梢血リンパ球から単離し、製造者の説明書に従ってランダムヘキサマープライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるｃＤＮＡ合成が続いた。第一ＰＣＲをフォワードプライマーミックス［ｃａｌｌ００１（５’−ｇｔｃｃｔｇｇｃｔｇｃｔｃｔｔｃｔａｃａａｇｇ−３’）およびｃａｌｌ００１ｂ（５’−ｃｃｔｇｇｃｔｇｃｔｃｔｔｃｔａｃａａｇｇｔｇ−３’）の１：１比］およびリバースプライマーｃａｌｌ００２（５’−ｇｇｔａｃｇｔｇｃｔｇｔｔｇａａｃｔｇｔｔｃｃ−３’）を用いてＶＨＨおよびＶＨを増幅するために実施した。ＶＨＨ断片の単離後、第二ＰＣＲをフォワードプライマーＡ６Ｅ（５’−ｇａｔｇｔｇｃａｇｃｔｇｃａｇｇａｇｔｃｔｇｇｒｇｇａｇｇ−３’）およびリバースプライマー３８（５’−ｇｇａｃｔａｇｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｇｇａｇａｃｇｇｔｇａｃｃｔｇｇｇｔ−３’）を用いて実施した。ＰＣＲ断片を制限酵素ＰｓｔｌおよびＥｃｏ９１ｌ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて消化し、ベクターｐＭＥＳ４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＱ９０７２４８．１）中のｐｌｌｌ遺伝子の上流にライゲートした。ライゲーション産物を標準的プロトコールに従ってエタノール沈殿させ、水中に再懸濁し、ＴＧ１細胞内に電気穿孔処理した。ライブラリーサイズは、独立クローン１Ｅ＋０８個から６Ｅ＋０８個の範囲であった。ライブラリーから無作為に選んだクローンについての単一コロニーＰＣＲをライブラリーの挿入百分率を評価するために実施した。８０％の挿入百分率を有した免疫化ラマ「Ｏｒｇａｎｚａ」由来のライブラリーを除く全てのライブラリーが≧９０％の挿入百分率を有した。ラマ「４０７９２８」「３３７３３」「Ｃｈｉｌｅａｎ  Ａｕｔｕｍｎ」「Ｎｉａｇａｒａ」および「Ｏｒｇａｎｚａ」についてライブラリーをそれぞれ２７、２８、２９、３１、３２と番号付けた。各ライブラリー由来のファージを標準的プロトコールに従ってＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを用いて作製した。
【０１０６】
植物細胞壁構成成分に富む抽出物または葉全体についてのファージ選択
植物細胞壁構成成分に富むジャガイモ葉抽出物をジャガイモ植物茎から条片に切除されたクチクラおよび接着表皮から調製した。植物細胞壁構成成分に富む小麦葉抽出物を小麦鞘葉から条片に切除されたクチクラおよび接着表皮から調製した。ペクチン多糖に富む抽出物をＣＤＴＡを用いて抽出した（Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。条片を液体窒素中で凍結し、微粉末が得られるまで乳鉢および乳棒で挽いた。ペクチン多糖に富む抽出物を、挽いた材料１ｇ当たり１０ｍｌの５０ｍＭ  ＣＤＴＡ  ｐＨ６．５を用いて微粉末を再懸濁し、４℃で３０分間回転撹拌（（ｈｅａｄ−ｏｖｅｒ−ｈｅａｄ  ｒｏｔａｔｉｏｎ））することによって調製した。抽出物および不溶性材料をフィルターに適合するシリンジを用いて分離した。抽出物は微量遠心分離機での２０，０００ｇ、５分間の遠心分離によってさらに澄ませた。
【０１０７】
ジャガイモ表皮ＣＤＴＡ抽出物についての第１回選択は、０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ８．３中に１０倍または１０００倍希釈したジャガイモ表皮ＣＤＴＡ抽出物でコートした（第１回および第２回選択の両方とも）９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）のウェルで実施した。コーティングは、４℃で一晩実施した。ウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ＰＢＳ中の５％スキムミルク（５％ＭＰＢＳ）でブロックした。ファージを２．５％ＭＰＢＳに懸濁し、各ウェルについておよそ２Ｅ＋１１ｃｆｕを用いた。室温で２時間ウェルに結合させた後、未結合のファージをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０およびＰＢＳでの十分な洗浄によって除去した。結合ファージをＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍｌトリプシン（Ｓｉｇｍａ）、室温、３０分間で溶出させた。溶出したファージを過剰量のＡＥＢＳＦトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を含むポリプロピレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に移した。濃縮を評価するために標的でコートしたウェルからのファージの力価をブランクウェルからのファージの力価と比較した。ファージを標準的手順に従って新鮮ＴＧ１細胞を用いて増幅した。第１回選択での濃縮は、ライブラリー２７、２８、２９、３１、３２のそれぞれについて１Ｅ＋０３、２０、２０、１５および５倍であり、第２回選択では全てのライブラリーについて＞１００倍であった。小麦表皮ＣＤＴＡ抽出物についての選択は、ジャガイモ表皮ＣＤＴＡ抽出物についての選択と同様に実施したが、ウェルは第１回および第２回の選択回両方において２０倍および２０００倍希釈小麦表皮ＣＤＴＡ抽出物でコートした。第１回選択での濃縮は、ライブラリー２７、２８、２９、３１、３２のそれぞれについて＞１００、＞１０、１、１０および５倍であった。第２回選択での濃縮は、ライブラリー２９については＞１０倍ならびにライブラリー２７、２８、３１および３２については＞１００倍であった。ジャガイモ葉についての選択は、１回目は葉粒子を、２回目は葉全体を用いる２回連続の選択で実施した。ライブラリー２７、２８、２９、３０、３１および３２を葉についての選択のために用いた。第１回選択のための葉粒子は、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５ホモジナイザーを用いてジャガイモ葉をＰＢＳ中に混合することによって調製した。葉粒子は懸濁液から遠心分離によって回収した。本明細書において「葉破砕物可溶性画分」と称される上清は、細胞内構成成分に富むと想定され、細胞内エピトープへの結合剤と競合させるためにファージ選択中の溶液において用いた。ライブラリーファージを葉破砕物可溶性画分と２％ＭＰＢＳ中で回転撹拌を用いて室温、３０分間、予備インキュベートした。混合物を葉粒子に添加し、回転撹拌して室温、２時間、インキュベートした。結合したファージを伴う葉粒子を遠心分離によって回収し、上清を廃棄した。結合したファージを伴う葉粒子をＰＢＳでの持続的洗浄によって十分に洗浄した。洗浄は、葉粒子をＰＢＳ中に再懸濁するステップ、葉粒子を遠心沈殿するステップおよび上清を廃棄するステップによって実施した。ファージの溶出およびＴＧ１の感染は既に記載のとおり実施した。第２回選択のために未処理葉の全���を用いた。葉を２％ＭＰＢＳ中のファージ溶液で上下を逆に浮かせてインキュベートし、ファージを室温、２時間結合させた。葉をＰＢＳを含む新たなチューブに移すことによって葉を十分に洗浄した。結合したファージの溶出は水中の１００ｍＭ  ＴＥＡで実施し、溶出したファージを含む溶液を溶出したファージ容積の半量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５を用いて中和した。ＴＧ１の感染は既に記載のとおり実施した。
【０１０８】
選択結果からの単一コロニーの選択  −  個々のクローンをジャガイモ表皮ＣＤＴＡ抽出物についての第１回および第２回選択から選んだ：全てのライブラリーから第１回および第２回選択の両方の後に合計３２１個のクローンを選んだ。小麦表皮ＣＤＴＡ抽出物についての選択から、全てのライブラリーから第２回選択後にクローン合計１６２個を選んだ。ジャガイモ葉選択から、ライブラリー２７、２８、２９、３１および３２からの第２回選択後にクローン合計１８４個を選んだ。新鮮ＴＧ１細胞に系列希釈した溶出ファージを感染させ、ＬＢアガー；２％グルコース；１００μｇ／ｍｌアンピシリン上に蒔いた。単一コロニーを１ウェル当たり１００μｌの２×ＴＹ；１０％グリセロール；２％グルコース；１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む９６ウェルプレートに選び入れた。プレートを３７℃でインキュベートし、マスタープレートとして−８０℃で保存した。
【０１０９】
［実施例２］
ＶＨＨの特徴付け
単一位置結合ＥＬＩＳＡ  −  単一位置結合ＥＬＩＳＡを植物抽出物に結合するクローンを同定するために用いた。ＥＬＩＳＡ用にＶＨＨ含有抽出物を次のとおり調製した。１ウェル当たり１００μｌの２×ＴＹ、２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む９６ウェルプレートをマスタープレートから播種し、３７℃で一晩増殖させた。１ウェル当たり２５μｌの一晩培養物を１ウェル当たり１ｍｌの２×ＴＹ、０．１％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む新たな９６ウェルディープウェルプレートに播種するために用いた。振盪インキュベーター中での３７℃、３時間の増殖後、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加し、組換えＶＨＨが４時間の追加的インキュベーション中に産生された。細胞を３，０００ｇ、２０分間の遠心分離によって遠沈し、−２０℃で一晩保存した。細胞ペレットを融解し、短くボルテックスし、１ウェル当たり１２５μｌの室温ＰＢＳを添加した。細胞を室温、１５分間、ＥＬＩＳＡ振盪プラットホームで再懸濁した。プレートを３，０００ｇで２０分間遠心分離し、１ウェル当たり１００μｌのＶＨＨ含有抽出物をポリプロピレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に移し、さらなる使用まで−２０℃で保存した。
【０１１０】
ジャガイモ表皮ＣＤＴＡ抽出物選択由来のクローンの結合を、１ウェル当たり１００μｌの０．１Ｍ炭酸ｐＨ８．３中、３０倍希釈ジャガイモおよび３０倍希釈小麦の表皮ＣＤＴＡ抽出物でコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて、ジャガイモ表皮ＣＤＴＡ抽出物および小麦表皮ＣＤＴＡ抽出物の両方について分析した。小麦表皮ＣＤＴＡ抽出物選択由来のクローンの結合を、１ウェル当たり１００μｌの０．１Ｍ炭酸ｐＨ８．３中、２０倍希釈小麦表皮ＣＤＴＡ抽出物でコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて分析した。４℃で一晩コートおよび翌日継続して室温で１時間コートした後、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ＰＢＳ中５％スキムミルクで１．５時間ブロックした。プレートを空にし、１ウェル当たり９０μｌの１％ＭＰＢＳで満たした。各クローンからＶＨＨ含有抽出物１０μｌを抗原コートウェル（複数可）およびブランクウェルに添加した。ＶＨＨを室温、１時間結合させ、未結合ＶＨＨをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄するステップによって除去した。結合ＶＨＨを１％ＭＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０中のモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）および１％ＭＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０中のアルカリホスファターゼでコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧ全分子抗体（ＲａＭ／ＡＰ）での連続的インキュベーションで検出した。未結合抗体を各抗体インキュベーション後にＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄するステップによって除去した。プレートを追加的にＰＢＳで２回洗浄し、ｐＮＰＰ二ナトリウム六水和物基質（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを各ウェルに添加した。
【０１１１】
４０５ｎｍでの吸光度を測定し、標的コートウェル（複数可）および非標的コートウェルに結合したＶＨＨの比を各クローンについて算出した。クローンの２３％が２より大きな比を有し、これらのクローンをより詳細な特徴付けのために最初に選んだ。１．１５から２の間の比を有し、全クローンの１０％を占める第二群のクローンは、後に再検討した。１．１５より低い比を有するクローンはさらには分析しなかった。
【０１１２】
全葉選択由来のクローンのために適合ＥＬＩＳＡを開発した。上下を逆に浮かせた葉ディスクを抗原でコートしたウェルの代わりに用いた。インキュベーションは抽出物ＥＬＩＳＡと同様であった。基質とのインキュベーション後に葉ディスクをピンセットを用いてウェルから取り出し、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。各クローンから得られたシグナルを、一次抗体インキュベーションを行わない葉ディスクを含むウェルから得られたシグナルと比較し、比を算出した。表皮抽出物選択から見出され、特徴付けられた葉表面結合抗体を陽性対照抗体として用いた。１．５より大きな比を有するＶＨＨを配列決定によってさらに分析した。
【０１１３】
単一コロニーＰＣＲおよび配列決定  −  単一コロニーＰＣＲおよび配列決定をＥＬＩＳＡ陽性クローンについて次のとおり実施した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを含むマスタープレートウェル由来の培養物を滅菌水中に１０倍希釈した。これらの希釈クローンから５μｌを、フォワードプライマーＭＰ５７（５’−ｔｔａｔｇｃｔｔｃｃｇｇｃｔｃｇｔａｔｇ−３’）およびリバースプライマーＧＩＩＩ（５’−ｃｃａｃａｇａｃａｇｃｃｃｔｃａｔａｇ−３’）を用いるＰＣＲのための鋳型として用いた。ＰＣＲ産物を、プライマーＭＰ５７（ＶＩＢ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｗｅｒｐ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いるサンガー配列決定法によって配列決定した。植物細胞壁構成成分に富む抽出物についての選択からＶＨＨ  ６Ｄ７、ＶＨＨ  ７Ａ５、ＶＨＨ  ６Ｂ５、ＶＨＨ  ６Ｄ１１、ＶＨＨ  ６Ｆ２、ＶＨＨ  ６Ｈ４、ＶＨＨ  ７Ａ７、ＶＨＨ  ７Ｅ９、ＶＨＨ  ８Ａ４およびＶＨＨ  ８Ｄ６が見出された。クローンＶＨＨ  ６Ｂ５、ＶＨＨ  ６Ｄ１１、ＶＨＨ  ６Ｆ２、ＶＨＨ  ６Ｈ４はＶＨＨ  ７Ａ５の単一アミノ酸変種である。ＶＨＨ  ７Ｅ９はＶＨＨ  ７Ａ７の単一アミノ酸変種である。ＶＨＨ  ８Ａ４およびＶＨＨ  ８Ｄ６は相互に単一アミノ酸変種である。葉粒子および全葉についての選択からＶＨＨ  １２Ｃ３が見出された。
【０１１４】
抗体産生および精製  −  ＶＨＨをイー・コリ  サプレッサー株ＴＧ１または非サプレッサー株ＷＫ６において標準的手順に従って産生した（Ｆｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅ  １６  Ｎｕｍｂｅｒ  １４  １９８８）。簡潔にはコロニーストリークを作製し、単一コロニーから一晩培養物を２×ＴＹ；２％グルコース；１００μｇ／ｍｌアンピシリン中に接種した。一晩培養物を２×ＴＹ；０．１％グルコース；１００μｇ／ｍｌアンピシリンの新鮮培養物に１：１００で接種するために用いた。振盪インキュベーターで３７℃、３時間増殖させた後、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加し、組換えＶＨＨは４時間の追加的インキュベーションの間に産生された。細胞を遠沈し、元の培養物容積の１／５０のペリプラズム抽出緩衝液（５０ｍＭリン酸  ｐＨ７；１Ｍ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、回転撹拌して４℃、一晩インキュベートした。スフェロプラストを３，０００ｇ、４℃、２０分間の遠心分離によって遠沈した。上清を新たなチューブに移し、再度３，０００ｇ、４℃、２０分間の遠心分離した。ヘキサヒスチジンタグＶＨＨをペリプラズム抽出物から抽出容積の１／１５のＴＡＬＯＮ金属親和性レジン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者の説明書に従って用いて精製した。精製ＶＨＨを濃縮し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）デバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を製造者の説明書に従って用いてＰＢＳに対して透析した。
【０１１５】
［実施例３］
植物種子へのＶＨＨ結合
未処理作物種子へのＶＨＨの結合  −  ＶＨＨ抗体断片の多種多様な作物種子への結合をトウモロコシ、トマト、米および小麦の種子を用いて調査した。トマト、米および小麦の種子は、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中に２．５−５μｇ／ｍｌヘキサヒスチジンタグＶＨＨを含有する溶液中で４回反復でインキュベートし、９６ウェル０．４５μｍディープウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で１時間、ＥＬＩＳＡ振盪プラットホーム上で穏やかに揺らしてインキュベートした。対照条件は、無関係の非種子結合ＶＨＨでのインキュベーションおよびＶＨＨを含有しないインキュベーションを含んだ。非結合ＶＨＨを含む溶液は、濾過プレートセットアップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて除いた。結合ＶＨＨをＰＢＳ中１％ＢＳＡ中のモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）およびＰＢＳ中１％ＢＳＡ中のアルカリホスファターゼでコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧ全分子抗体（ＲａＭ／ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ）での連続的インキュベーションで検出した。各抗体インキュベーションの間に５回の連続的洗浄を実施した。洗浄は、ＰＢＳでＥＬＩＳＡ振盪プラットホーム上で穏やかに揺らすインキュベーションによって実施した。洗浄溶液は濾過プレートセットアップを用いて除いた。ｐＮＰＰ二ナトリウム六水和物基質（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加し、基質の色が明確に可視化されるまで反応させた（５−２５分間）。基質を濾過プレートセットアップを用いて回収し、４０５ｎｍでの吸光度を測定し、種子結合ＶＨＨのシグナルをブランク種子および無関係の対照ＶＨＨで処理した種子での基質の色と比較した。米、小麦およびトマトなどの作物種子への明確で再現可能なＶＨＨ結合が観察された、すなわちＶＨＨ  ７Ａ７および１２Ｃ３（表１を参照されたい。）。
【０１１６】
同様のアッセイをＶＨＨ抗体断片のトウモロコシ種子への結合を調査するために実施した。トウモロコシ種子を、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中に２．５−５μｇ／ｍｌヘキサヒスチジンタグＶＨＨを含有する溶液中で４回反復でインキュベートし、２ｍｌ反応チューブまたは１２ウェルプレートのウェルで１時間、ＥＬＩＳＡ振盪プラットホーム上で穏やかに揺らしてインキュベートした。対照条件は、無関係の非種子結合ＶＨＨでのインキュベーションおよびＶＨＨを含有しないインキュベーションを含んだ。非結合ＶＨＨを含む溶液は、真空吸引システムを用いて除いた。結合ＶＨＨをＰＢＳ中１％ＢＳＡ中のモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）およびＰＢＳ中１％ＢＳＡ中のアルカリホスファターゼでコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧ全分子抗体（ＲａＭ／ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ）での連続的インキュベーションで検出した。各抗体インキュベーションの間に５回の連続的洗浄を実施した。洗浄は、ＰＢＳでＥＬＩＳＡ振盪プラットホーム上で穏やかに揺らすインキュベーションによって実施した。洗浄溶液は真空吸引を用いて除いた。ｐＮＰＰ二ナトリウム六水和物基質（Ｓｉｇｍａ）を各チューブまたはウェルに添加し、基質の色が明確に可視化されるまで反応させた（５−２５分間）。基質を回収し、４０５ｎｍでの吸光度を測定し、種子結合ＶＨＨのシグナルをブランク種子および無関係な対照ＶＨＨで処理した種子での基質の色と比較した。トウモロコシなどの作物種子への明確で再現可能なＶＨＨ結合が観察された、すなわちＶＨＨ  ７Ａ７（表１を参照されたい。）。選択およびスクリーニングは植物種子については実施されていないにもかかわらず、ＶＨＨが特定の植物種子への明確で特異的な結合を示すことが認められたことは驚くべきことである。
【０１１７】
【表１】
2013541508.tif 000002
【０１１８】
アラビドプシス種子へのＶＨＨの結合  −  種子へのＶＨＨの結合を固定および非固定のアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）種子で分析し、顕微鏡で分析した。種子は、５０ｍＭ  １，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５ｍＭエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）中の４％パラホルムアルデヒド中、室温で３０分間インキュベートするステップによって固定した。固定後種子をＰＢＳ中で３回洗浄した。ＰＢＳでの３回洗浄を抗体断片で標識化する前に未変性種子に実施した。ＰＢＳをウェルから除去し、５％ＭＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌ  ＶＨＨの溶液を添加し、６０−９０分間インキュベートした。未結合ＶＨＨをＰＢＳで５回洗浄するステップによって除去した。結合ＶＨＨはＡｌｅｘａ−４８８蛍光色素（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）に直接コンジュゲートしたモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体との５％ＭＰＢＳ中での１時間のインキュベーションで検出した。未結合抗体をＰＢＳで５回洗浄するステップによって除去した。種子を１８ウェルμスライドに置き、顕微鏡によって分析した。ＶＨＨ  ６Ｄ７について例示されるとおり種子表面への種々のＶＨＨの明確な結合が観察された（図１）。
【０１１９】
［実施例４］
創傷植物組織へのＶＨＨの結合
損傷したリンゴ皮へのＶＨＨの結合  −  損傷したリンゴ皮ディスクへのＶＨＨの結合を調査した。未処理リンゴ皮のディスクをリンゴ皮を穿孔器で穿孔するステップによって調製した。一連のリンゴ皮ディスクをリンゴ皮ディスクの外側表面に切り込みを作るステップによって意図的に傷つけた。損傷したリンゴ皮への各抗体の結合を対照としての未処理リンゴ皮との比較で各抗体について別々のインキュベーションにおいて調査した。リンゴ皮ディスクをＰＢＳを含むマルチウェルプレートのウェルに上下を逆に置いた。ＰＢＳをウェルから除去し、新鮮ＰＢＳを各ウェルに添加した。この洗浄サイクルを２回繰り返した。ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中に５μｇ／ｍｌ  ＶＨＨを含有する溶液を皮ディスクに添加し、６０−９０分間インキュベートした。未結合ＶＨＨをＰＢＳで５回洗浄するステップによって除去した。結合ＶＨＨはＡｌｅｘａ−４８８蛍光色素（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）に直接コンジュゲートしたモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体とのＰＢＳ中１％ＢＳＡ中での１時間のインキュベーションで検出した。未結合抗体をＰＢＳで５回洗浄するステップによって除去した。リンゴ皮ディスクをペトリ皿に置き、マクロズーム顕微鏡系（Ｎｉｋｏｎ）で顕微鏡によって分析した。ＶＨＨ  ６Ｄ７およびＶＨＨ  ７Ａ７などいくつかのＶＨＨでは、リンゴ皮ディスクの主に損傷領域への結合が認められた（図２）。
【０１２０】
創傷植物葉へのＶＨＨの結合  −  非固定ジャガイモ葉ディスクおよび小麦葉条片へのＶＨＨの結合を調査した。葉ディスクは新鮮ジャガイモ葉を穿孔器で穿孔するステップによって作製した。小麦葉小片は、およそ０．２５ｃｍ２に葉小片を切断するステップによって調製した。葉ディスクおよび葉小片をＰＢＳを含む９６ウェルプレートのウェルに置いた。ＰＢＳをウェルから除去し、新鮮ＰＢＳを各ウェルに添加した。この洗浄サイクルを２回繰り返した。ジャガイモ葉ディスクおよび小麦葉小片を５％ＭＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌ  ＶＨＨを含有する溶液に移し、６０−９０分間インキュベートした。未結合ＶＨＨをＰＢＳで５回洗浄するステップによって除去した。結合ＶＨＨはＡｌｅｘａ−４８８蛍光色素（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）に直接コンジュゲートしたモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体との５％ＭＰＢＳ中での１時間のインキュベーションで検出した。未結合抗体をＰＢＳで５回洗浄するステップによって除去した。葉ディスクを８ウェルμスライドに置き、顕微鏡によって分析した。ＶＨＨ  ６Ｄ７、７Ａ５、７Ａ７および７Ｅ９は葉ディスクまたは葉小片に、主に創傷組織（葉の穿孔または切り込みによって生じた）の部位に強く結合することが認められた（図３）。
【０１２１】
［実施例５］
ＥＬＩＳＡでの多糖に富む植物抽出物へのＶＨＨの結合
ＥＬＩＳＡでのさまざまな植物種抽出物および大豆可溶性多糖へのＶＨＨ結合  −  ジャガイモ植物（ソラナム・ツベロサム変種デシリー）、小麦植物（トリチカム・エスチバム変種ボルド）、ドクムギ植物（ロリウム・ペレンネ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ））、エンドウ豆植物（ピサム・サチバム（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ））、イヌホオズキ植物（ソラナム・ニグラム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｎｉｇｒｕｍ））由来植物葉抽出物へのおよび大豆可溶性多糖へのＶＨＨ結合をＥＬＩＳＡで分析した。細胞壁多糖に富んだ全葉抽出物をＣＤＴＡを用いて抽出した（Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。葉を液体窒素中で凍結し、微粉末が得られるまで乳鉢および乳棒で破砕した。細胞壁多糖に富んだ抽出物を挽いた材料１ｇ当たり１０ｍｌの５０ｍＭ  ＣＤＴＡ  ｐＨ６．５を用い、４℃で３０分間回転撹拌して微粉末を再懸濁することによって調製した。抽出物および不溶性材料をフィルターに適合するシリンジを用いて分離した。抽出物は微量遠心分離機で２０，０００ｇ、５分間の遠心分離によってさらに澄ませた。粗大豆可溶性多糖をＮａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）によって記載された方法により抽出し、次いで５０ｍＭ  ＣＤＴＡ緩衝液ｐＨ６．５中に溶解した。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中３０倍希釈ＣＤＴＡ抽出物で４℃、一晩コートした。翌日室温で１時間コーティングを継続した。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ＰＢＳ中５％スキムミルクで１−２時間ブロックした。精製ＶＨＨの５μｇ／ｍｌ希釈物を１％ＭＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０中に調製した。抗体希釈物を植物抽出物でコートしたプレートに移し、ＶＨＨを１時間、室温で結合させた。結合ＶＨＨを１％ＭＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０中のモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）およびアルカリホスファターゼでコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧ全分子抗体（ＲａＭ／ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ）での連続的インキュベーションで検出した。未結合抗体を各抗体インキュベーション後にＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄するステップによって除去した。プレートを追加的にＰＢＳで２回洗浄し、ｐＮＰＰ二ナトリウム六水和物基質（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを各ウェルに添加した。４０５ｎｍでの吸光度を測定した（表２を参照されたい。）。ＶＨＨは、ジャガイモ、小麦、ドクムギ、エンドウ豆、イネ科草および大豆可溶性多糖抽出物へのさまざまな特異性を有する結合を明確に示す。大豆については、ＣＤＴＡ可溶性ペクチン画分がラムノガラクツロナンおよびキシロガラクツロナンから構成されており、ホモガラクツロナンでは構成されないことが記載されている（Ｈｕｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。本ＥＬＩＳＡ設定では、特徴付けられていない粗抽出物が用いられていることから、さまざまな試料への結合は定性的に評価され、異なる抽出物間の直接比較はなされなかった。
【０１２２】
【表２】
2013541508.tif 000003
【０１２３】
［実施例６］
ＥＬＩＳＡでの植物細胞壁構成成分へのＶＨＨ結合
ＥＬＩＳＡでのペクチン多糖へのＶＨＨ結合  −  さまざまなペクチン種への精製ＶＨＨのアレイの結合をＥＬＩＳＡで分析した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を１ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌ  ７０−７５％エステル化リンゴペクチン（Ｓｉｇｍａ）、柑橘類果実由来≧８０％エステル化ペクチン、柑橘類果実由来２０−３４％エステル化ペクチン（Ｓｉｇｍａ）または陰性対照としてのアラビアゴム（Ｓｉｇｍａ）でコートした。プレートを４℃で一晩コートし、コーティングは翌日室温で１時間継続した。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ＰＢＳ中５％スキムミルクで１時間ブロックした。精製ＶＨＨを１％ＭＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ中に３μｇ／ｍｌに希釈し、ペクチンコートプレートに添加し、ＶＨＨを１時間、室温で結合させた。結合ＶＨＨを１％ＭＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０中のモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）およびアルカリホスファターゼをコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧ全分子抗体（ＲａＭ／ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ）での連続的インキュベーションで検出した。未結合抗体を各抗体インキュベーション後にＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄するステップによって除去した。プレートを追加的にＰＢＳで２回洗浄し、ｐＮＰＰ二ナトリウム六水和物基質（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを各ウェルに添加した。４０５ｎｍでの吸光度を測定し、結合を得た結合プロファイルを全てのクローンに関して比較した（表３Ａを参照されたい。）。多様で異なる結合パターンがさまざまなＶＨＨに関して観察された。
【０１２４】
ＥＬＩＳＡ滴定でのペクチン多糖へのＶＨＨ結合  −  １ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌ  ７０−７５％エステル化リンゴペクチン（Ｓｉｇｍａ）または柑橘類果実由来２０−３４％エステル化ペクチン（Ｓｉｇｍａ）でコートしたＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃ）上でＶＨＨの滴定を実施した。プレートは４℃で一晩コートし、コーティングは翌日室温で１時間継続した。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ＰＢＳ中５％スキムミルクで１時間ブロックした。精製ＶＨＨの４倍系列希釈物をポリプロピレン９６ウェルプレートで１％ＭＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０中に調製した。抗体濃度は３μｇ／ｍｌから１２ｎｇ／ｍｌの範囲であった。抗体希釈物をペクチンコートプレートに移し、ＶＨＨを１時間、室温で結合させた。結合ＶＨＨを１％ＭＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０中のモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）およびアルカリホスファターゼをコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧ全分子抗体（ＲａＭ／ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ）での連続的インキュベーションで検出した。未結合抗体を各抗体インキュベーション後にＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄するステップによって除去した。プレートを追加的にＰＢＳで２回洗浄し、ｐＮＰＰ二ナトリウム六水和物基質（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを各ウェルに添加した。４０５ｎｍでの吸光度を測定し、抗体濃度の関数としてプロットした（表３Ｂおよび３Ｃを参照されたい。）。ＶＨＨ  ７Ａ５、ＶＨＨ  ７Ａ７およびＶＨＨ  ６Ｄ７は、ＥＬＩＳＡで用量依存的様式で低エステル化ペクチンに結合していた。高エステル化ペクチンでの結合シグナルは、ＶＨＨ  ７Ａ５およびＶＨＨ  ７Ａ７に関して低エステル化ペクチンより低かった。ＶＨＨ  ６Ｄ７はＥＬＩＳＡで高エステル化ペクチンに有意な結合を示さなかった。ＶＨＨ  ７Ａ５、ＶＨＨ  ７Ａ７およびＶＨＨ  ６Ｄ７の低エステル化ペクチンへの優先的結合はアレイデータと一致する（図４）。
【０１２５】
【表３】
2013541508.tif 000004
【０１２６】
【表４】
2013541508.tif 000005
【０１２７】
【表５】
2013541508.tif 000006
【０１２８】
［実施例７］
オリゴ糖および多糖アレイ上のＶＨＨの結合
ＶＨＨでのオリゴ糖および多糖のアレイの探索  −  植物特異的オリゴ糖および多糖のアレイを、選択されたＶＨＨによるエピトープ分類結合のさらなる解明のために用いた。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）コンジュゲートオリゴ糖３６個および多糖４５個をニトロセルロース上に配置した。アレイ上で各試料はスポット４個（２種の濃度を２回ずつ）によって表される。オリゴ糖および多糖のアレイは、選択されたＶＨＨの５μｇ／ｍｌで探索され、結合ＶＨＨは二次抗ヒスチジンおよび三次アルカリホスファターゼ−コンジュゲート抗体で検出した。個々のアレイの写真を撮り、さまざまなＶＨＨインキュベーションについてヒートマップを記録した（図４）。結合データは、異なるエステル化の程度を有する（スポットＧ１、Ｅ１、Ｈ１、Ｆ１についてそれぞれ０％、１１％、１６％、４３％）ライムペクチン試料に全てのＶＨＨが結合したことからそれらが高度に特異的なペクチン結合剤であることを示した。純度が低いラムノガラクツロナンＩＩ試料（スポットＩ２）への結合は、この試料中に存在するペクチンドメインによっておそらく生じた。選択されたＶＨＨがメチルエステル化の程度が低いペクチンに優先的に結合することは、ホモガラクツロナン（ＨＧ）エピトープへの結合を示唆している。興味深いことにＶＨＨ結合パターンは、同じアレイで検査された周知の従来の抗体結合パターン（すなわちＪＩＭ５（Ｋｎｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｗｉｌｌａｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｃｌａｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ＪＩＭ７（Ｋｎｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｗｉｌｌａｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｃｌａｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ＪＩＭ８（Ｐｅｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、ＪＩＭ１３（Ｋｎｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｙａｔｅｓ，１９９６）、ＬＭ１０（ＭｃＣａｒｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、ＬＭ１５（Ｍａｒｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、ＬＭ１８（Ｖｅｒｈｅｒｔｂｒｕｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、ＬＭ１９（Ｖｅｒｈｅｒｔｂｒｕｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、ＬＭ２０（Ｖｅｒｈｅｒｔｂｒｕｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９））とは異なっていた。
【０１２９】
［実施例８］
マイクロカプセルに結合したＶＨＨの植物種子への結合
ＶＨＨ機能化ポリウレアマイクロカプセルを生成する目的で、ベンジルベンゾエート中１．５％Ｕｖｉｔｅｘ  ＯＢ（Ｃｉｂａ）のコア、および表面に露出するカルボキシル基のために取り込まれたリシンを含むシェルを有するマイクロカプセルにＶＨＨを結合させた。ベンジルベンゾエート中１．５％Ｕｖｉｔｅｘ  ＯＢのコアは、マイクロカプセルの蛍光可視化のために用いられる。マイクロカプセルの産生後、マイクロカプセルを水で洗浄し水中にカプセル懸濁物として保存する。ＶＨＨの結合の前に、９６ウェルディープウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および真空マニホールド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてマイクロカプセルをＭＥＳ／ＮａＣｌ緩衝液（０．１Ｍ  ＭＥＳ／０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ６）で洗浄した。ＶＨＨのパネルをＭＥＳ／ＮａＣｌ緩衝液に透析し、最終濃度１０−７０μＭまで添加し、マイクロカプセルと１５−３０分間インキュベートした。１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドハイドロクロリド（ＥＤＣ）（Ｐｉｅｒｃｅ）をＭＥＳ／ＮａＣｌ緩衝液に溶解し、最終濃度５０ｍＭまで迅速に添加した。ＶＨＨを室温、２時間の継続的撹拌を伴うインキュベーションによって結合させた。結合反応は、グリシンまたはＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５を最終濃度１００ｍＭまで添加するステップおよび室温、３０分間のインキュベーションによって停止させた。非結合ＶＨＨをディープウェル回収プレートを用いる濾過プレートセットアップを用いて回収した。マイクロカプセルをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁し、使用まで４℃で保存した。マイクロカプセルがペクチン結合ＶＨＨの結合によって機能化されたことを実証するために、マイクロカプセルのアラビドプシス・タリアナ種子への結合実験を実施した。この目的のために種子を、ＶＨＨ結合マイクロカプセルと、ブランクマイクロカプセルとまたはマイクロカプセルを含ませずにインキュベートした。マイクロカプセルの種子への結合を顕微鏡的および蛍光定量的に分析した。簡潔には、アラビドプシス・タリアナ種子１ウェル当たり４個をポリプロピレン９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェルに入れた。各条件は、１ウェル当たり種子４個で４ウェルからなる４回反復で実施した。マイクロカプセルおよそ３．８Ｅ＋０４個を含むマイクロカプセル懸濁液２５μｌを各ウェルに添加し、ＥＬＩＳＡ振盪プラットホームで室温、１時間インキュベートした。マイクロカプセルを再懸濁する慎重なピペッティングによって未結合マイクロカプセルを種子から洗浄除去し、上清を廃棄した。ＰＢＳでの洗浄を３回実施した。結合したマイクロカプセルを有する種子を１８ウェルμスライド（ｌｂｉｄｉ）に移し、落射蛍光を用いて顕微鏡的に分析した。Ｕｖｉｔｅｘ  ＯＢをエタノールを用いて結合マイクロカプセルから遊離させ、上清を回収し、蛍光を測定した。種子だけを含むウェルから放出された蛍光をブランクマイクロカプセルとインキュベートした種子を含むウェルおよびＶＨＨ  ６Ｄ７と結合したマイクロカプセルとインキュベートした種子を含むウェルと比較した。平均蛍光測定値（標準偏差）は種子とＶＨＨ  ６Ｄ７を有するマイクロカプセルとを含むウェル、種子とブランクマ��クロカプセルとを含むウェルおよび種子だけを含むウェルについてそれぞれ３０４４１（±１２９３４）、８７２２（±４０２４）および１７８４（±２３８）であり、本発明によるＶＨＨが植物種子にマイクロカプセルを結合させるために用いられうること、および本発明によるＶＨＨを有さないマイクロカプセルとの比較において植物種子に保持されるマイクロカプセル内容物の量をこの結合が実質的に増加させることを実証している。
【０１３０】
未処理作物種子へのＶＨＨ機能化マイクロカプセルの結合  −  作物種子へのマイクロカプセルの結合を米、小麦およびトウモロコシの種子ならびにＶＨＨ  ７Ａ７およびＶＨＨ  ７Ａ５と結合したＶＨＨ機能化マイクロカプセルを用いて調査した。Ｕｖｉｔｅｘ  ＯＢを含有するコアを有する蛍光マイクロカプセルを１ｍｌ当たりマイクロカプセル１Ｅ＋０５個に希釈した。種子およびマイクロカプセルを回転撹拌で室温、１時間、ＰＢＳ中または１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で米および小麦ならびにトウモロコシの種子についてそれぞれインキュベートした。非結合マイクロカプセルをＰＢＳで洗浄するステップによって除去した。結合したマイクロカプセルを有する種子を結合したマイクロカプセルについてマクロズーム顕微鏡系（Ｎｉｋｏｎ）上で分析した。ＤＡＰＩフィルターをＵｖｉｔｅｘ  ＯＢマイクロカプセルを可視化するために用いた。ＶＨＨ結合マイクロカプセルに対する対照は、ＶＨＨが結合されていないブランクマイクロカプセルを含んだ。ＶＨＨを含まないブランクマイクロカプセルと比較してＶＨＨ  ７Ａ７またはＶＨＨ  ７Ａ５を有する有意に多いマイクロカプセルが米および小麦の種子に結合することが見出された（米については図５Ａを小麦については５Ｂを参照されたい。）。ＶＨＨを含まないブランクマイクロカプセルと比較してＶＨＨ  ７Ａ７を有する有意に多いマイクロカプセルがトウモロコシ種子に結合することが見出された（図５Ｃを参照されたい。）。定量的測定のためにトウモロコシ種子に結合したマイクロカプセルからＵｖｉｔｅｘ  ＯＢを遊離させた。１つの条件当たり３個のトウモロコシ種子を結合したＶＨＨ  ７Ａ７を有するマイクロカプセルとインキュベートした。マイクロカプセル種子結合を既に記載のとおり実施した。Ｕｖｉｔｅｘ  ＯＢを種子結合マイクロカプセルから１００％エタノール中で５分間強く振盪するインキュベーションによって遊離させた。上清を回収し、溶液中蛍光をＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ  ａｐｐａｒａｔｕｓ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて測定した。ＶＨＨ結合マイクロカプセルに対する対照は、ＶＨＨが結合されていないブランクマイクロカプセルおよびマイクロカプセル有さない種子を含んだ。種子に結合したマイクロカプセルの数を、マイクロカプセルの標準的濃度系列を測定する手段によって算出した。ＶＨＨ  ７Ａ７と結合したトウモロコシ種子について算出されたマイクロカプセル数は３．１Ｅ＋０２であった。ブランクマイクロカプセルまたは無関係の対照ＶＨＨを有するマイクロカプセルについて算出されたマイクロカプセル数はそれぞれ１０および９１であり、本発明によるＶＨＨが植物種子にマイクロカプセルを結合させるために用いられうることおよびこの結合が本発明によるＶＨＨを含まないマイクロカプセルと比較して植物種子に保持されるマイクロカプセルの数を実質的に増加させることを実証している。
【０１３１】
植物増強剤を含むＶＨＨ機能化マイクロカプセルの未処理作物種子への結合  −  次に植物増強剤を含むＶＨＨ機能化マイクロカプセルが米および小麦の作物種子に結合および保持されうるかどうかを調査した。したがってピレスロイド殺虫剤ラムダ−シハロトリンをベンジル−ベンゾエート中に溶解し、最終負荷量４０％まで機能化ポリウレアマイクロカプセル中に封入した。これらのマイクロカプセルを続いて本実施例の最初の段落に記載したものと同様の方法を用いて種子結合タンパク質と結合させた。１０個の米および小麦の種子をＰＢＳ中に１ｍｌ当たりマイクロカプセル１Ｅ＋０５個を含有するマイクロカプセル懸濁液と個々に回転撹拌で１時間、室温でインキュベートした。未結合マイクロカプセルをＰＢＳで洗浄するステップによって除去した。結合したマイクロカプセルを有する洗浄した種子をガラスバイアルに移し、マイクロカプセルをラムダシハロトリンを遊離するためにアセトン中に溶解した。試料を＃０．０５％トリフェニルホスフェートを内部標準として含むヘキサンの添加によって希釈した。ラムダ−シハロトリンの量を較正溶液と比較してＧＣ／ＭＳ−ＭＳによって決定した。ラムダ−シハロトリン０．３４ｍｇ／ｋｇ（マイクロカプセル１．３Ｅ＋０４個に相当する。）がＶＨＨ  ６Ｄ７と結合されたマイクロカプセルで処理した米種子上で測定され、一方ラムダ−シハロトリン０．２５ｍｇ／ｋｇ（マイクロカプセル９．６Ｅ＋０３個に相当する。）だけが米種子に対する低い親和性を有する対照ＶＨＨと結合されたマイクロカプセルで処理した米種子上に検出された。同様にラムダ−シハロトリン０．５３ｍｇ／ｋｇ（マイクロカプセル２．０Ｅ＋０５個に相当する。）がＶＨＨ  ６Ｄ７と結合されたマイクロカプセルで処理した小麦種子上で測定され、一方ラムダ−シハロトリン０．４３ｍｇ／ｋｇ（マイクロカプセル１．７Ｅ＋０４個に相当する。）だけが小麦種子に対する低い親和性を有する対照ＶＨＨと結合されたマイクロカプセルで処理した小麦種子上に検出された。これらの結果に基づいて、本発明者らは本発明によるＶＨＨがマイクロカプセルに含まれる植物増強剤（この場合：ラムダ−シハロトリン）を種子表面に効率的に結合および保持させることが可能であることならびに種子上に存在する植物増強剤の量が用いられるＶＨＨの結合親和性および特異性と関連することを結論付けた。
【０１３２】
本発明による（植物増強剤を含む）種子処理組成物の有効性が次の：最初に本発明による種子処理のための組成物（植物増強剤を含む）を１つまたは複数の適切な種子に適用し、続いて前記処理された種子を土壌または土壌を含む鉢に播種し、最後に種子または実生（浸透移行性植物増強剤の場合）に存在する植物増強剤の量を経時的に適切な分析方法を用いて決定する、のとおり評価されうることは当業者に明らかである。本発明による組成物で処理した種子に存在する植物増強剤の量が、本発明による種子結合タンパク質を欠いた類似する種子処理組成物で処理した種子に存在する植物増強剤の量よりも多いことは認められる。代替的に、播種された処理種子は土壌伝染性病原体に暴露され、または新生実生（ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ｓｅｅｄｌｉｎｇ）は害虫または病原体に暴露され、新生植物に生じる損傷は、これだけに限らないが冒された植物の部分の外観検査を含む当業者に周知の任意の適切な方法を用いて経時的にモニターされる。本発明による組成物で処理した実生への損傷の量は、本発明による種子結合タンパク質を欠いた類似する種子処理のための組成物で処理した実生への損傷より少ないことが認められる。
【０１３３】
［実施例９］
マイクロカプセルに結合されたＶＨＨの損傷果実および創傷植物組織への結合
リンゴ皮ディスクでの結合アッセイをＶＨＨ機能化マイクロカプセルの損傷果実への結合を調査するために用いた。ジャガイモ葉ディスクでの結合アッセイをＶＨＨ機能化マイクロカプセルの創傷植物組織への結合を調査するために用いた。未処理リンゴ皮のディスクを、リンゴ皮を穿孔器で穿孔するステップによって調製した。一連のリンゴ皮ディスクをリンゴ皮ディスクの外側表面に切り込みを作るステップによって意図的に傷つけた。未処理ジャガイモ葉（変種デシリー）のディスクを穿孔器で葉を穿孔するステップによって調製した。一連のジャガイモ葉ディスクをジャガイモ葉ディスクの上側表面に切り込みを作るステップによって意図的に傷つけた。さまざまな結合ＶＨＨを有するマイクロカプセルの結合を、各条件について別々のインキュベーションにおいて調査した。リンゴ皮ディスクまたはジャガイモ葉ディスクをマルチウェルプレートのウェルに上を向けて置いた。Ｕｖｉｔｅｘ  ＯＢを含有するマイクロカプセルを適切な密度で０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中の１％スキムミルク中に希釈した。マイクロカプセルをリンゴ皮およびジャガイモ葉のディスクに添加し、１時間、マイクロカプセルを定着および結合させた。未結合マイクロカプセルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄するステップによって除去した。リンゴ皮およびジャガイモ葉のディスクを結合マイクロカプセルについてマクロズーム顕微鏡系（Ｎｉｋｏｎ）上で分析した。ＤＡＰＩフィルターをＵｖｉｔｅｘ  ＯＢマイクロカプセルを可視化するために用いた。ＶＨＨ結合マイクロカプセルに対する対照は、ＶＨＨが結合されていないブランクマイクロカプセルおよび無関係なＶＨＨが結合されたマイクロカプセルを含む。Ｕｖｉｔｅｘ  ＯＢマイクロカプセルでのリンゴ皮およびジャガイモ葉のディスク結合アッセイの結果に基づいて、本発明のＶＨＨのいくつか（例えばＶＨＨ  ６Ｄ７）が、マイクロカプセルを果実の損傷部位または植物上の創傷組織に特異的に結合および保持させることが可能であると証明されたことが見出された（図６）。
【０１３４】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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