(57)【要約】粒子に共有結合されたコラーゲンを含む組成物であって、共有結合がコラーゲンの反応基と粒子の反応基との間で形成され、かつ粒子が、20から1000ナノメートルに及ぶ平均粒径を有する、組成物を開示する。これら組成物を利用するさまざまな方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子に共有結合されたコラーゲンを含む組成物であって、コラーゲンの遊離カルボン酸基と粒子のアミン反応基との間で共有アミド結合が形成され、かつ粒子が、50〜1000ナノメートルに及ぶ平均粒径サイズを有する、該組成物。
【請求項２】
コラーゲンが架橋されている、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
架橋されたコラーゲンが多孔性であり、かつ500ナノメートルから200マイクロメートルまたは1マイクロメートルから100マイクロメートルに及ぶ平均細孔サイズを有する、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
コラーゲンが粒子を通じて架橋されており、コラーゲンの遊離カルボン酸基と少なくとも1つの粒子上の少なくとも2つのアミン反応基との間で少なくとも2つの共有アミド結合が形成されている、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
コラーゲンがカルボジイミド架橋剤で架橋されている、請求項2記載の組成物。
【請求項６】
粒子が50〜150ナノメートルの平均粒径を有する、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
粒子が金属材料を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
金属材料が、金、銀、白金、チタン、ニッケル、および銅からなる群より選択される、請求項7記載の組成物。
【請求項９】
金属材料が金である、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
粒子がセラミック材料または生分解性材料を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
反応基がメルカプトエチルアミンもしくはシスタミンまたはその両方である、請求項1〜10のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
粒子とコラーゲンとの比率が、コラーゲン1 mgあたり粒子1×109個からコラーゲン1 mgあたり粒子2×1010個の範囲である、請求項1〜11のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
コラーゲン30 mgあたりカルボジイミド架橋剤2〜4 mgを用いて共有結合を形成させる、請求項1〜12のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
粒子1×109〜2×1010個あたりカルボジイミド架橋剤0.5〜0.2 mgを用いて共有結合を形成させる、請求項1〜13のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５】
胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、上皮細胞、外分泌もしくは内分泌細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、間質細胞、肝細胞、島細胞、神経芽細胞、角化細胞、破骨細胞、骨細胞、心臓細胞、軟骨細胞、内皮細胞、または筋肉細胞、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６】
ゲル、溶液、ペースト、または脱水された剛構造である、請求項1〜15のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
注射器の中に含まれる、請求項1〜16のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
真皮または表皮の皮膚等価体である、請求項1〜17のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１９】
コラーゲンの遊離カルボン酸基の15〜20%がアミド結合を通じて粒子に共有結合されている、請求項1〜18のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０】
個人において組織容量を増加させることにより関節軟骨を膨化させるための方法であって、それを必要としている個人に請求項1〜19のいずれか一項記載の組成物を投与する段階を含み、組成物が関節包への注射により投与される、該方法。
【請求項２１】
コラーゲンが架橋されていて、多孔性であり、かつ500ナノメートルから200マイクロメートルに及ぶ平均細孔サイズを有する、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
粒子が50〜150ナノメートルの平均粒径を有する、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
反応基がメルカプトエチルアミンもしくはシスタミンまたはその両方である、請求項20〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
粒子とコラーゲンとの比率が、コラーゲン1 mgあたり粒子1×109個からコラーゲン1 mgあたり粒子2×1010個の範囲である、請求項20〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
組成物が、ゲル、溶液、ペースト、または脱水された剛構造である、請求項20〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
コラーゲンの遊離カルボン酸基の15〜20%がアミド結合を通じて粒子に共有結合されている、請求項20〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
コラーゲン30 mgあたりカルボジイミド架橋剤2〜4 mgを用いて共有結合を形成させる、請求項20〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
粒子1×109〜2×1010個あたりカルボジイミド架橋剤0.5〜0.2 mgを用いて共有結合を形成させる、請求項20〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
個人において間隙、欠損を充填するための方法、または組織容量を増大するための方法であって、それを必要としている患者に請求項1〜19のいずれか一項記載の組成物を投与する段階を含み、組成物が皮内注射または皮下注射によって投与される、該方法。
【請求項３０】
間隙が顔の小じわ、しわ、ひだ、くぼみ、または小さなこぶであり、かつ顔の小じわ、しわ、ひだ、くぼみ、または小さなこぶの出現が組成物の投与後に低減される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
組成物が個人の口唇に投与され、かつ組成物の投与後に口唇の容量が増加する、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
反応アミン基を有しかつ50〜1000ナノメートルに及ぶ平均粒径を有する粒子とコラーゲンを複合化させる段階を含む、酵素的分解によるインビトロでのまたはインビボでのコラーゲン分解を低減する方法であって、ここで共有アミド結合がコラーゲンの遊離カルボン酸基と粒子上の反応アミン基との間で形成され、かつその結果、コラゲナーゼによるコラーゲンの分解が低減される、該方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2010年6月7日付で出願された米国仮特許出願第61/397,100号の恩典を主張する。上記の出願の内容は、参照により組み入れられる。
【０００２】
許諾条項
なし。
【０００３】
A. 発明の分野
本発明は、粒子に共有結合されたコラーゲンに関し、それによってコラゲナーゼ分解のような分解にいっそう耐性である材料が得られる。この材料は広範囲の用途において用いることができる。
【背景技術】
【０００４】
B. 関連技術の説明
尿失禁、心臓発作後うっ血性心不全、関節骨折、ならびに先天性および加齢性の顔面皮膚欠損を処置する際にコラーゲンを用いることは、現在利用可能なコラーゲン材料の安定性および完全性によって制限されている。例えば、顔の老化の処置(例えば、顔の輪郭の回復、しわの改善、瘢痕陥没の矯正など)におよび口唇の拡大に用いられるコラーゲンに基づく皮膚充填剤は、12ヶ月間にわたり分解に対して高感受性である。
【０００５】
コラーゲン分解の問題に対して提唱されている解決法の一つは、巨大分子コラーゲン原線維の間の共有結合の形成によるコラーゲンの架橋結合である。しかしながら、コラーゲンを架橋させるために利用される化学物質の毒性が懸念事項でありうる。例えば、グルタルアルデヒドおよびヘキサメチレンジイソシアネートは、架橋結合中にコラーゲンの足場内に取り込まれるようになり、コラーゲンが分解されるときに体内へ毒性残留物を放出しうる。別の問題は、過度の架橋結合により、硬くて使用できないコラーゲン材料が作出されうることである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、現行のコラーゲンに基づく製品を制約している性能問題の解決法を発見した。この解決法には、コラーゲンと共有結合を形成できる20〜1000ナノメートルの平均粒径を有する粒子の使用が含まれる。複合化された材料(例えば、該材料を含む組成物、複合化されたコラーゲン/粒子、または複合化されたコラーゲン原線維/粒子)は分解(例えば、コラゲナーゼによる)にいっそう耐性であり、生体適合性であり、許容されるレベルの多孔性を有するコラーゲンマトリックスまたは足場をもたらし、それによって細胞内殖を可能にする。細胞内殖は新規の材料における複合化された粒子によって加速される。場合によっては、複合化された材料はまた、抗菌性を有し、これを用いて、患者に投与された後に感染と闘うことができる。
【０００７】
1つの例では、粒子が20〜1000ナノメートルに及ぶ平均粒径を有する、粒子に共有結合されたコラーゲンを含む材料が開示される。特定の態様において、平均粒径は50〜1000ナノメートルであるものの、他の直径サイズおよび範囲が本段落において下記に論じられるように企図される。共有結合はコラーゲン上の反応基(例えば、カルボン酸基および/またはアミン基)と粒子上の反応基(例えば、アミン反応基、カルボキシレート反応基、チオール反応基、および/またはヒドロキシル反応基)との間で形成されることができる。例えば、および1つの局面において、共有結合はコラーゲン上に存在する遊離カルボン酸基と粒子上のアミン反応基との間で形成されることができ、ここでアミド結合がコラーゲンのカルボン酸基と粒子のアミン反応基との間で形成されることができる。以下で説明されるように、粒子に官能性を持たせて、コラーゲンのカルボン酸基またはアミン基と反応できる反応基を含めることができる。場合によっては、コラーゲンを、カルボジイミド(例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)のような架橋剤によりおよび/または粒子それ自体により架橋させることもできる(例えば、コラーゲンを粒子と架橋させることができ、ここで粒子の少なくとも1つが少なくとも2つの反応基を含み、かつ少なくとも2つの共有結合を、例えば、コラーゲンのカルボン酸基と少なくとも2つの反応基との間で形成させることができ、ここで2つの反応基を、例えば、アミン基の間で形成させることができる)。ある種の局面において、架橋されたコラーゲンは多孔性であり、500ナノメートルから200マイクロメートル(および550、600、650、700、750、800、850、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900ナノメートルのようなその中の任意の整数値または範囲)に及ぶ平均細孔サイズを有することができる。特定の局面において、1マイクロメートルから100マイクロメートル(または10、20、30、40、50、60、70、80、もしくは90マイクロメートルのようなその中の任意の整数値もしくは範囲)に及ぶ細孔サイズを用いることができる。場合によっては、粒子は50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、または1000ナノメートルの平均粒径を有する。特定の態様において、平均粒径は60〜900、70〜800、80〜700、90〜600、100〜500、150〜400、または200〜300ナノメートルに及ぶ。ある種の局面において、平均粒径は50〜150、60〜140、70〜130、80〜120、または90〜110ナノメートルに及ぶ。粒子は金属材料で構成されることができ、または金属材料を含むことができる。金属材料は金、銀、白金、チタン、ニッケルもしくは銅またはそれらの任意の組み合わせであることができる。特定の局面において、金属材料は金または銀である。粒子はまた、セラミック材料もしくは生分解性材料で構成されることができ、またはセラミック材料もしくは生分解性材料を含むことができる。ある種の態様において、粒子とコラーゲンとの比率はコラーゲン1 mgあたり粒子1×109個からコラーゲン1 mgあたり粒子2×1010個の範囲であることができるが、しかしさらに広い範囲(例えば、コラーゲン1 mgあたり1×104〜1×1014個、ならびにその中の任意の範囲および整数値)が企図される。いくつかの局面において、コラーゲン30 mgあたりカルボジイミド架橋剤(例えば、EDC) 2〜4 mgを用いて、共有結合を形成させることができる(特定の局面において、比率はコラーゲン30 mgあたりEDCのようなカルボジイミド架橋剤3.2 mg +/- 0.8 mgであることができ、これを用いることができる)。また、粒子1×109〜2×1010個あたりカルボジイミド架橋剤(例えば、EDC) 0.5〜0.2 mgを用いて、共有結合を形成させることができる。ある種の局面において、本発明の材料はさらに、処置の選択肢を補助するように使用できる細胞を含むことができる。そのような細胞の非限定的な例としては、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、およびそれに由来する細胞、上皮細胞、外分泌かつ内分泌細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、間質細胞、肝細胞、島細胞、神経芽細胞、角化細胞、破骨細胞、骨細胞、心臓細胞、軟骨細胞、内皮細胞、および/または筋肉細胞、ならびにそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、内胚葉、中胚葉または外胚葉由来の細胞が挙げられる。使用できるコラーゲンは、I型、II型、III型、IV型もしくはV型コラーゲン、またはそれらの組み合わせを含む。特定の態様において、材料はゲル状態、溶液、ペースト、静電紡糸ミクロン(electrospun micron)もしくはナノコラーゲン、コラーゲンのシート、または脱水された剛構造であることができる。材料はシリンジ中にまたは注射可能な溶液中に含まれることができる。材料は皮膚科学的に許容される組成物または真皮もしくは表皮の皮膚等価体であることができる。ある種の局面において、複合化されたコラーゲン/粒子材料上に存在する遊離カルボン酸基または遊離アミン基の量は、粒子と複合化されなかったコラーゲンと比較した場合に少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、または90%少ない。別の言い方をすれば、コラーゲンの遊離カルボン酸基または遊離アミン基の少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80もしくは90%またはそれ以上が複合化される。
【０００８】
同様に企図されるのは、少なくとも1つの粒子に共有結合されたコラーゲン原線維であり、ここで少なくとも1つの粒子は、20から1000ナノメートルまたは50から1000ナノメートルに及ぶ平均粒径を有する。特定の局面において、共有結合は、コラーゲン原線維上の遊離カルボン酸基および/または遊離アミン基と、粒子の表面に存在する反応基との間で形成されることができる。反応基は、例えば、アミン反応基、カルボキシレート反応基、チオール反応基、および/またはヒドロキシル反応基であることができる。1つの局面において、共有結合はコラーゲン原線維上に存在する遊離カルボン酸基と粒子上のアミン反応基との間で形成されることができ、ここでアミド結合がコラーゲン原線維のカルボン酸基と粒子のアミン反応基との間で形成されることができる。
【０００９】
別の態様において、必要性の有る患者または哺乳類(例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなど)に、本明細書を通じて開示される材料のいずれかの1つを投与する段階を含む、哺乳類において間隙、欠損を充填するための方法、または組織容量を増大するための方法が開示される。材料、複合化されたコラーゲン/粒子、または複合化されたコラーゲン原線維/粒子は、皮内注射または皮下注射によって投与することができる。間隙は小じわまたはしわであることができ、小じわまたはしわの出現を投与後に減らすことができる。材料、複合化されたコラーゲン/粒子、または複合化されたコラーゲン原線維/粒子は、哺乳類の口唇に投与することができ、ここで口唇の組織容量が投与後に増やされる。
【００１０】
さらなる態様において、本明細書を通じて開示される材料のいずれかの1つを軟組織または硬組織に施すまたは適用する段階を含む、必要性の有る哺乳類において軟組織または硬組織を増強する方法が開示される。軟組織は心筋、平滑筋、骨格筋、メニスカス組織、軟骨、腱、靱帯、筋膜、皮膚、血管、線維組織、または細胞外マトリックスであることができる。例えば、材料を用いて、影響を受けやすい患者または心臓発作を既に有している患者に対して心筋を補助することができる。硬組織に関して、非限定的な例としては、骨または歯が挙げられる。材料は、骨折にまたは骨の内殖の増加が望まれる骨に材料を適用することにより、骨折を処置するために用いることができ、または骨の内殖を増強するために用いることができる。
【００１１】
特定の態様において、必要性の有る個人に、本明細書を通じて記述される材料または組成物のいずれかの1つを関節包へ投与する段階を含む、個人において組織容量を増加させることにより関節軟骨を膨化させるための方法が開示される。
【００１２】
1つの局面において、20〜1000ナノメートルまたは50〜1000ナノメートルに及ぶ平均粒径を有する粒子とコラーゲンを複合化させる段階を含み、ここで共有結合がコラーゲンと粒子との間で形成され、かつここでコラゲナーゼによるコラーゲンの分解がその結果、粒子と複合化されていないコラーゲンと比較した場合に低減される、酵素的分解によるインビトロでのまたはインビボでのコラーゲン分解を低減する方法が開示される。複合化は、コラーゲンの遊離カルボン酸基または遊離アミン基と粒子の表面に存在する反応基との間の共有結合によるものであることができる。反応基は、例えば、アミン反応基、カルボキシレート反応基、チオール反応基、および/またはヒドロキシル反応基であることができる。1つの局面において、共有結合はコラーゲン上に存在する遊離カルボン酸基と粒子上のアミン反応基との間で形成されることができ、ここでアミド結合がコラーゲンのカルボン酸基と粒子のアミン反応基との間で形成されることができる。この方法はさらに、複合化されたコラーゲンを哺乳類に投与する段階(例えば皮内注射もしくは皮下注射または局所適用)を含むことができる。
【００１３】
別の態様において、20〜1000ナノメートルまたは50〜1000ナノメートルに及ぶ平均粒径を有する粒子とコラーゲンを複合化させる段階を含み、ここで共有結合がコラーゲンと粒子との間で形成され、かつここでナノ粒子の表面積対体積比が細胞再生およびコラーゲン合成を誘引する、インビトロでのまたはインビボでの細胞付着を増大する方法が開示される。複合化は、コラーゲンの遊離カルボン酸基または遊離アミン基と粒子の表面に存在する反応基との間の共有結合によるものであることができる。反応基は、例えば、アミン反応基、カルボキシレート反応基、チオール反応基、および/またはヒドロキシル反応基であることができる。1つの局面において、共有結合はコラーゲン上に存在する遊離カルボン酸基と粒子上のアミン反応基との間で形成されることができ、ここでアミド結合がコラーゲンのカルボン酸基と粒子のアミン反応基との間で形成されることができる。この方法はさらに、複合化されたコラーゲンを哺乳類に投与する段階(例えば皮内注射もしくは皮下注射または局所適用)を含むことができる。
【００１４】
さらなる態様において、本明細書を通じて開示される材料のいずれかの1つを胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、およびそれに由来する細胞とともに播種する、または上皮細胞、外分泌かつ内分泌細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、間質細胞、肝細胞、島細胞、神経芽細胞、角化細胞、破骨細胞、骨細胞、心臓細胞、軟骨細胞、内皮細胞、および/もしくは筋肉細胞を含むがこれらに限定されない、内胚葉、中胚葉もしくは外胚葉由来の細胞とともに播種する段階を含む、組織を作出するための方法が開示される。この方法はさらに、複合化されたコラーゲンを哺乳類に投与する段階を含むことができる。
【００１５】
本明細書を通じて開示される材料はまた、必要性の有る哺乳類に該材料、複合化されたコラーゲン/粒子、または複合化されたコラーゲン原線維/粒子を投与することによって泌尿器病(例えば尿失禁)を処置するために用いることができる。例として、材料を骨盤吊り帯に成形させることができ、または既存の骨盤吊り帯とともに用いることができる。あるいは、材料は注射可能な形態であってもよく、該材料を哺乳類へ注射することにより尿失禁を減らすまたは防ぐための充填剤として用いられてもよい。
【００１６】
同様に開示されるのは、必要性の有る哺乳類に本明細書を通じて開示される材料を、血液凝固が望まれる部位(例えば、内傷または外傷)へ投与する段階を含む、血液を凝固させるための方法である。外傷の非限定的な例としては、床擦れ、切傷、掻き傷、切開、開放創、四肢欠損などが挙げられる。
【００１７】
1つの特定の態様において、必要性の有る哺乳類に本明細書を通じて開示される材料のいずれかの1つを投与する段階を含む、変形性関節症を処置するための方法が開示される。例えば、材料を充填剤として関節包または軟骨に投与して、再生を促進することができ、疼痛を減少させることができる。
【００１８】
別の特定の態様において、必要性の有る哺乳類に本明細書を通じて開示される材料のいずれかの1つを投与する段階を含む、神経成長を増強するための方法が開示される。例えば、材料を神経成長または再生のための導管として神経に投与することができる。
【００１９】
同様に開示されるのは、本発明のコラーゲン/粒子複合化材料を作出するための方法である。そのような工程は、1) 予め選択された粒子に官能性を持たせる段階および2) 官能性を持たせた粒子と可溶性コラーゲン原線維とを生体複合化(bioconjugate)試薬の存在下において架橋結合させる段階を含む。この工程はさらに、架橋結合段階の後に重合のためのインキュベーション時間を含むことができる。1つの局面において、この工程は、(1) 官能性を持たせた粒子(例えばシステアミンで官能性を持たせた金のような金属粒子)を得る段階; (2) EDCおよびNHS、任意で緩衝液を含む溶液に、官能性を持たせた粒子を添加する段階; ならびに(3) 混合しながら溶液にコラーゲンを添加する段階を含む。ある種の態様において、粒子とコラーゲンとの比率はコラーゲン1 mgあたり粒子1×109個からコラーゲン1 mgあたり粒子2×1010個の範囲であることができるが、しかしさらに広い範囲(例えば、コラーゲン1 mgあたり1×104〜1×1014個、ならびにその中の任意の範囲および整数値)が企図される。また、コラーゲン30 mgあたりカルボジイミド架橋剤(例えば、EDC) 2〜4 mgを用いて、共有結合を形成させることができ(特定の局面において、比率はコラーゲン30 mgあたりEDCのようなカルボジイミド架橋剤3.2 mg +/- 0.8 mgであることができ、これを用いることができ)、および/または粒子1×109〜2×1010個あたりカルボジイミド架橋剤(例えば、EDC) 0.5〜0.2 mgを用いて、共有結合を形成させることができる。
【００２０】
別の態様において、本明細書を通じて開示される材料または組成物のいずれかの1つを用いて、コラーゲンインプラントまたはコラーゲンに基づく充填剤を作出する段階を含む、細胞充実性を増大するための、細胞の流入を促進するための、細胞接着を促進するための、またはコラーゲンインプラントもしくはコラーゲンに基づく充填剤への細胞移動を促進するための方法が開示される。同様に開示されるのは、コラーゲンを粒子に共有結合させてコラーゲンインプラントまたはコラーゲンに基づく充填剤を形成させる段階を含み、ここで共有アミド結合がコラーゲンの遊離カルボン酸基と粒子のアミン反応基との間で形成され、かつここで粒子が50〜1000ナノメートルに及ぶ平均粒径サイズを有する、細胞充実性、細胞の流入を増大するための、細胞接着を促進するための、またはコラーゲンインプラントもしくはコラーゲンに基づく充填剤への細胞移動を促進するための方法である。そのような方法はさらに、コラーゲンインプラントまたはコラーゲンに基づく充填剤を、それを必要としている個人に投与する段階を含むことができる。
【００２１】
本明細書を通じて開示される材料は、皮膚科学的に許容される媒体、薬学的に許容される媒体、または薬理学的に許容される媒体内に含まれうることが企図される。そのような媒体は、ヒトのような哺乳類に投与された場合に、禁制的毒性(prohibitive toxicity)、不適合性、不安定性、アレルギー反応などを生じないものである。さらに、そのような組成物は粉末形態、無水、静電紡糸(electrospun)、液体形態、ゲル形態、半固体、または固体であることができる。この関連で、本発明の組成物は25℃にて2.5 rpmでTCスピンドルを用いBrookfield Viscometerにて測定した場合に、10 cpsから最大100,000,000 cpsまでの粘度範囲を有することができる。特定の局面において、150,000〜250,000の範囲を用いることができる。
【００２２】
本発明の材料および組成物を投与する経路は、処置される状態の位置および性質によって変わりうる。例としては、局所適用、皮内、非経口、筋肉内、皮下、経皮、気管内、腹腔内、直接注射(例えば、注射可能な溶液)、ならびに外科手術(例えば、標的域での切開および設置による)。
【００２３】
本明細書において論じられる任意の態様を本発明の任意の方法または組成物に関して実施可能であり、その逆の場合も同じであることが企図される。さらに、本発明の組成物を用いて、本発明の方法を達成することができる。
【００２４】
「注射可能なコラーゲン」は、均質または不均質な、コラーゲンのペースト、ゲル、溶液または懸濁液を含み、これらは注射針または噴き出し口を通じてコラーゲンを押し出すようにデザインされた、注射器、チューブまたは適切なプランジャもしくはシステムを備えた他の容器の中に含まれる。注射可能なコラーゲンは注射、套管針による外科手術応用、または創傷表面での直接適用のためにデザインされる。
【００２５】
「哺乳類」はヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含む。
【００２６】
「角質組織」は、哺乳類の最も外側の保護覆として配置されるケラチン含有層を含み、皮膚、毛髪および爪を含むが、これらに限定されることはない。
【００２７】
「局所適用」は、角質組織の表面上に組成物を適用するまたは広げることを意味する。「局所皮膚組成物」は、角質組織上での局所適用に適した組成物を含む。そのような組成物は、典型的には、それらが皮膚に適用された場合に、過度の毒性、不適合性、不安定性などを持たないという点で皮膚科学的に許容される。本発明の局所皮膚ケア組成物は、皮膚への適用後の顕著な液だれまたは滞留を避けるように選択された粘性を有することができる。
【００２８】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように、近似であることと定義され、1つの非制限的な態様において、これらの用語は10%以内、好ましくは5%以内、より好ましくは1%以内、および最も好ましくは0.5%以内であると定義される。
【００２９】
特許請求の範囲および/または本明細書において用いられる場合、「阻害する」もしくは「低減する」という用語またはこれらの用語の任意の変化形には、所望の結果を達成するための任意の測定可能な減少または完全な阻害が含まれる。
【００３０】
本明細書および/または特許請求の範囲において用いられる場合の「有効な」という用語は、望ましい、予想される、または意図される結果を達成するために適切であることを意味する。
【００３１】
特許請求の範囲および/または本明細書において「含む」という用語とともに用いられる場合の「1つの(a)」または「1つの(an)」という言葉の使用は、「1つ」を意味しうるが、同様に「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」、および「1つまたは2つ以上」という意味とも一致する。
【００３２】
「含む(comprising)」(ならびに「含む(comprise)」および「含む(comprises)」などの「含む(comprising)」の任意の形態)、「有する(having)」(ならびに「有する(have)」および「有する(has)」などの「有する(having)」の任意の形態)、「含む(including)」(ならびに「含む(includes)」および「含む(include)」などの「含む(including)」の任意の形態)または「含有する(containing)」(ならびに「含有する(contains)」および「含有する(contain)」などの「含有する(containing)」の任意の形態)という言葉は、包括的または非限定的であり、引用されていないさらなる要素または方法の段階を除外しない。
【００３３】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明および実施例は、本発明の特定の態様を示しているが、例示するためのみに示されると理解されるべきである。さらに、本発明の趣旨および範囲内での変更および修正が、本詳細な説明から当業者には明らかになるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
以下の図面は本明細書の一部をなし、本発明のある種の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は以下に提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つまたは複数を参照することによってよりよく理解されうる。
【００３５】
【図１】コラーゲンの遊離カルボン酸基とメルカプトエチルアミン(MEA)で官能性を持たせた粒子の反応アミン基との間のアミド結合の形成を介してコラーゲン(「1」と指定)を金粒子(「2」と指定)と共有結合的に複合化させるための模式図。1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)およびN-ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ-NHS)を用いて複合化を容易にする。
【図２】β-メルカプトエチルアミン(MEA)で官能性を持たせた金粒子を示すUVスペクトル。
【図３】金粒子複合化ゲル足場のSEM。
【図４】架橋粒子が足場構造内の金粒子であることを実証するEDS像。
【図５】金粒子と複合化されたコラーゲンのコラゲナーゼ分解に対する耐性の改善を示す棒図表。
【図６】金粒子と複合化されたコラーゲンの存在下での細胞生存性を示す棒図表。
【図７】コラーゲン単独と比較した場合に複合化されたコラーゲン/金粒子材料における遊離カルボン酸基の18%の減少を示す金粒子有りおよび無しのコラーゲンのフーリエ変換赤外分光。
【図８】足場群および経時的処理あたりのDNA濃度。各群に対して、それぞれ、7日目が左側の棒線であり、14日目が右側の棒線である。
【図９】足場群および経時的処理あたりのグリコサミノグリカン(GAG)濃度。各群に対して、それぞれ、7日目が左側の棒線であり、14日目が右側の棒線である。
【図１０】高い生存性および細胞化を実証する7日目の全群の生/死染色。
【図１１】14日目にはさらに複雑な内部浸透を伴った7日目での表面増殖を実証する2つの時点での群の細胞化。AuNP結合チャネルおよび空洞の細胞化が顕著であった。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
例示的な態様の説明
本発明者らは、コラーゲンまたはコラーゲン原線維の遊離カルボン酸基の位置で粒子をコラーゲンに共有結合させることにより、コラーゲンの分解を低減できることを発見した。これによって、特定の疾患または皮膚状態を処置または予防するため哺乳類に投与される場合にさらに安定なコラーゲンに基づく材料が得られる。さらに、20〜1000ナノメートル、50〜1000ナノメートル、または場合によって50〜150ナノメートルの平均粒径を有する粒子を用いることにより、得られるコラーゲン/粒子材料は、20ナノメートルに満たないまたは50ナノメートルに満たない粒子と比較した場合に毒性の低減を示しながら、細胞成長および浸潤を促進する環境を作出する(例えば、患者体内に存在する細胞または材料に取り込まれる細胞は粒子に誘引され、これにより、このような粒子を含んでいないコラーゲンと比較した場合に予想されたよりも高い、細胞の持続的かつ活気ある成長が可能になる)。すなわち、本発明者らは、既存のコラーゲンに基づく材料において現在みられる毒性副作用のリスクなしに細胞成長を促進しながらも、コラーゲン分解を低減することによってコラーゲンを安定化する有効な方法を発見した。
【００３７】
理論によって束縛されることを望むわけではないが、コラーゲンの遊離カルボキシ部位にて形成された共有結合はコラゲナーゼ結合部位のいくつかを妨害および/または遮断し、しかし一方で粒子サイズにより、細胞接着、細胞充実性の増大、およびタンパク質吸着を可能にし、それによって細胞増殖および成長を促進する十分な表面積および表面エネルギーが提供されるものと考えられる。さらに、金属粒子は、活性酸素種および細胞に損傷を与えうる他の遊離基を低減する抗酸化作用をもたらすことができ、金属粒子は抗菌作用をもたらすことができる。さらに、粒子サイズは、細胞による粒子の取り込みを防ぐまたは減らすことによって周辺環境における毒性を低減するのに十分である。
【００３８】
本発明のこれらのおよび他の局面を、以下のさらなる非限定的な詳細において記述する。
【００３９】
A. コラーゲン
コラーゲンは皮膚、骨、腱、筋肉および軟骨のような、生体組織を結び付けかつ支持する、哺乳類においてみられるタンパク質の一種である。コラーゲンはまた、内部器官の支持となり、歯に存在している。体内には天然に存在する25種超のコラーゲンがあり、これらの全てを本発明との関連で用いることができる。より多くみられるコラーゲンには、I型(皮膚、腱、血管、結紮糸(ligature)、器官、骨にみられる)、II型(軟骨にみられる)、III型(細網繊維にみられる)、IV型(細胞基底膜の基部を形成する)ならびにV型(細胞表面、毛髪および胎盤にみられる)が含まれる。コラーゲンの、より多くみられる構造的特徴のいくつかには、グリシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、遊離カルボン酸基、および遊離アミン基の豊富さが含まれる。Collagen Structure and Mechanics (2008)を参照されたい。
【００４０】
皮膚に関して、コラーゲンは強度、柔軟性および弾性を皮膚にもたらす。コラーゲンはまた、皮膚における細胞および血管の成長のための枠組みをもたらす。コラーゲン分解(例えば、老化皮膚、瘢痕、日焼けによる損傷、にきびなどのような、病的な、損傷を受けた皮膚における)は、皮膚での小じわ、しわ、くぼみ、小さなこぶ、ひだなどの存在を引き起こす。これらの皮膚欠損の出現を減らすための一つの方法は、コラーゲンを皮膚へ注射することであり、これが結果的に、皮膚欠損を充填することになり、ゆえに「皮膚充填剤」になる。コラーゲンにはまた、関節可動性の増大、熱傷および他の開放皮膚創の処置、骨形成不全症（すなわち、骨が脆い病気）の処置に及ぶいくつかの医学的用途、ならびに本明細書の全体で開示および主張される他の医学的用途が有る。
【００４１】
本発明との関連で使用できるコラーゲンは、広範囲の供給源(例えば、ブタ、ウシ、ヒト、サカナ、ラット尾部など)から抽出することができる。使用できる非限定的なコラーゲン材料には、組み換えヒトコラーゲン、組織工学によって作製されたヒトに基づくコラーゲン、ブタコラーゲン、ヒト胎盤コラーゲン、ウシコラーゲン、自家コラーゲン、コラーゲン原線維、およびヒト組織コラーゲンマトリックスが含まれる。同様に使用できるさらなるコラーゲンおよびコラーゲンに基づく製品は、市販されており、それらの非限定的な例が、参照により組み入れられるInternational Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 第12版、第1巻、656頁(2008)に掲載されている。本発明との関連で使用できる市販のコラーゲン製品のさらなる非限定的な例としては、Cosmoderm(登録商標) 1および2、CosmoPlast(登録商標)、Zyderm(登録商標)、ならびにZyplast(登録商標)が挙げられ、これらの全てがInamed Corp., Santa Barbara CA. Evolence(登録商標)によって製造されている。特定の態様において、ブタコラーゲンが用いられる。
【００４２】
B. 粒子およびコラーゲンとの共有結合形成
上記で説明されたように、20〜1000ナノメートル、50〜1000ナノメートル、または50〜150ナノメートルの平均粒径サイズを有する粒子を、本発明との関連で用いることができる。平均粒径サイズは動的光散乱(Dynamic Light Scattering; DLS)によって判定することができる。DLSは、懸濁状態の粒子のサイズ分布プロファイルを与える技法である。サイズ分布プロファイルから平均粒子サイズを判定することができる(Thomas (1987))。さらに、特定の直径サイズを有する粒子を購入または入手できるいくつかの供給源が利用可能である(例えば、PELCO(登録商標) Ted Pella, Inc. (Redding, CA)のNanoXact & BioPure金および銀コロイド(Gold and Silver Colloids); NanoPartz, Inc. (Loveland, CO)の精密球状金ナノ粒子(Accurate Spherical Gold Nanoparticles)、金ナノロッド(Gold Nanorodz)、マイクロゴールド(Microgold)、金ナノビーズ(Gold Nanobeads)、金ナノワイア(Gold Nanowires)、白金(Platinum)、パラジウム(Palladium)、およびトライメタルナノ粒子(Trimetallic Nanoparticles); ならびにNanoparticle Biochem Inc, (Columbia, MO)の金ナノ粒子(Gold Nanoparticles)、銀ナノ粒子(Silver Nanoparticles)、白金ナノ粒子(Platinum Nanoparticles)、パラジウムナノ粒子(Palladium Nanoparticles)、およびグリーンナノ粒子(Green Nanoparticles))。
【００４３】
使用できる粒子は、金属材料、セラミック材料および/もしくは生分解性材料またはそれらの組み合わせを含むことができ、またはそれらで構成されることができる。金属粒子に関して、非限定的な例としては、金、銀、白金、チタン、ニッケル、および/または銅が挙げられる。特定の例では、粒子に用いられる材料(例えば、金または銀)は抗菌性を有することができ、これは感染の可能性を低減するのに有用でありうる。さらに、そのような粒子材料は電子受容体として機能することができ、それゆえ、活性酸素種(「ROS」)によって引き起こされる遊離基による損傷を低減することができる。
【００４４】
本発明との関連で用いられる粒子は反応基を含むことができ、この非限定的な例としてはアミン反応基、カルボキシレート反応基、チオール反応基、カルボン酸反応基、もしくはヒドロキシル反応基、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。そのような官能性を持たせた粒子は、市販されており、当業者によって作出されうる。さらに、架橋剤の使用は、コラーゲンと粒子との間の共有結合の形成を促進するために用いることができ、コラーゲンそれ自体の間での架橋結合を促進するために用いることもできる(例えば、コラーゲンの架橋結合は、官能基の一方がコラーゲンと共有結合を形成し、他方の官能基がコラーゲンと第2の共有結合を形成するように存在する少なくとも2つの官能基を粒子が有する場合に粒子を介して行われることができ、または架橋剤による場合にはコラーゲンそれ自体の間で共有結合を形成する)。非限定的な工程を以下に示す。
【００４５】
特定の態様において、粒子は、コラーゲンに存在する遊離カルボン酸基とアミド結合を形成できるアミン反応基を含む。例として、図1にはそのような態様が記述されている。具体的には、図1では、コラーゲン原線維1上のカルボン酸官能基がEDCによって最初に活性化され、その後、求核付加を通じて、コラーゲン原線維と金属ナノ材料2との間でアミド結合を作出することが例証されている。EDCはコラーゲン原線維上のカルボキシレート基と活性エステル官能基を形成する; しかし加水分解がすぐに起こり、したがってEDCは、通常、スルホ-NHSとカップリングされてスルホ-NHSエステル中間体を形成する。エステル中間体が次に、金属ナノ粒子上のアミン基と反応する。EDC-スルホ-NHSはイソ尿素副産物を放出して、粒子に付着されたMEAとコラーゲンとの間のアミド結合を促進する。一般的にNHSをEDCに加えて、安定性および結合を増強する。
【００４６】
コラーゲンと粒子との間の共有結合の形成を促進するために、ならびにコラーゲンを架橋するために利用される化学物質の毒性が考慮されるべきである。グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、およびEDCは全て、一般的に用いられる架橋剤であるが、しかしカルボジイミドだけが無毒性であり、架橋結合中にコラーゲンの足場内に取り込まれるようにならない(Shanmugam (2006)、Lee (2001)、Rault (1996)、Grtzer (2001)、Chan (2005)、Billiar (2001)、Pieper (1999)、Haidekker (2006)を参照のこと)。逆に、グルタルアルデヒドおよびヘキサメチレンジイソシアネートは、足場内に取り込まれるようになり、足場が分解されるときに体内へ毒性残留物を放出しうる。さらに、過剰な架橋結合は微細構造を劇的に変化させることがあり、足場を、線維層で覆われるようになって、健常組織に決して置き換えられないほど分解に対して耐性にさせることがある。
【００４７】
C. 複合体を作出するための工程
以下の手順は本発明の複合化された材料を作出するための非限定的な方法である:
(1) 非重合化コラーゲンを得る:
a. 凍結乾燥コラーゲン30 mgを酢酸(10 mM) 1 mLと混合する。
b. バイアルをゆっくり回転させることによって室温で3時間溶解する。
(2) 濃縮された官能性ナノ材料を調製する:
a. 100 nmの金ナノ粒子懸濁液(AuNP濃度5.6×109粒子/mL 1.344 mLを7,000 rpmで5分間回転させる。
b. 水1.144 mLを除去し、AuNPの水懸濁液0.2 mLを残す。
c. 0.12 Mシステアミン(=β-メルカプトエチルアミン; MEA) 9.1 uLをAuNP懸濁液0.2 mLに加える。
d. ピペットにより、3回反転させて、または室温における5秒間のボルテックスによって官能性ナノ材料を得るように混合する。
(3) 10×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液を調製する。
(4) EDC (1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩) 0.0032 gおよびスルホ-NHS (N-ヒドロキシスクシンイミド) 0.00424 gを10×PBS緩衝液0.2 mLに溶解する。
(5) ラットコラーゲンが使われるなら、10×PBS緩衝液中のEDCおよびNHS 0.2 mLに官能性ナノ材料 全0.209 mLを加える。ヒトコラーゲンが使われるなら、同じ緩衝系が使われてもよく、または異なるもの(例えば、リン酸ナトリウム二塩基緩衝系)が使われてもよい。
(6) PBS緩衝液中のナノ材料に1 M NaOH 0.045 mLを加える。
(7) 30 g/Lのコラーゲン溶液1 mLに対してNaOHを有する10×PBS緩衝液中の官能性ナノ材料 EDC、NHS 0.454 mLを混合する。
(8) 5〜10回ピペッテイングにより上下させて混合を確実にする。
(9) 37℃のインキュベーター中に90分間置いて重合させる。
(10) 新たに形成された足場をインキュベーターから取り出し、30 Gaの注射針から注射されるように調整し、または足場を他の形態に調製する。
【００４８】
上記のように、この工程は、本発明との関連のなかで粒子/コラーゲン複合体を作出するための一つの方法の非限定的な例である。修正および変形が企図され、特定の処置選択肢に望ましい最終産物を調製するためになされうる。
【００４９】
D. 本発明の組成物
上記のように、本発明の複合化された材料(例えば、複合化されたコラーゲン/粒子、または複合化されたコラーゲン原線維/粒子)は、注射可能な組成物、局所組成物、移植可能な組成物などの組成物に含めることができ、種々(例えば、液体、粉末状、無水、半固体、ゲル、固体、硬直など)の形態をとることができる。組成物はまた、投与の経路の性質および/または処置される特定の疾患に依り、美容的成分(活性と非活性の両方)および薬学的成分(活性と非活性の両方)のようなさらなる成分を含むことができる。
【００５０】
CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook (2008)、第12版には、本発明との関連で使用できる多種多様の非限定的な美容的成分が記述されている。局所製品に有用でありうるこれらの成分の例としては、吸着剤、乳化剤、安定剤、滑沢剤、溶媒、保湿剤(例えば、皮膚軟化剤、保湿剤、皮膜形成剤、密封剤、および皮膚の天然湿潤機構に影響を与える薬剤を含む)、撥水剤、ビタミン(例えば、A、B、C、D、E、およびK)、植物抽出物、抗菌剤、抗酸化物質(例えば、BHTおよびトコフェロール)、キレート剤(例えば、EDTA二ナトリウムおよびEDTA四ナトリウム)、ならびに保存料が挙げられる。
【００５１】
同様に使用できる薬学的成分の非限定的な例としては、鎮痛剤、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬を含む抗炎症剤、抗生物質、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗がん活性剤(anti-cancer actives)、抗乾癬剤、抗脂漏剤、生物学的に活性なタンパク質およびペプチド、熱傷処置剤、焼灼剤(cauterizing agent)、皮膚保護薬/バリア剤、ホルモンおよびコルチコステロイドを含むステロイド、創傷処置剤、創傷治癒剤などが挙げられる。
【００５２】
E. キット
本発明のある種の局面において用いられるものとしてキットも企図される。例えば、本発明の材料または組成物はキットの中に含めることができる。キットは容器を含むことができる。容器はボトル、金属チューブ、ラミネートチューブ、プラスチックチューブ、注射器、分注器、加圧容器、バリア容器、包装、仕切り、または材料もしくは組成物が保持される射出もしくは中空成形プラスチック容器のような他の種類の容器を含むことができる。キットは、キットおよび/または組成物を用いるための使用説明書を含むこともできる。使用説明書は、組成物をどのように適用するか、使用するか、および維持するかの説明を含むことができる。
【実施例】
【００５３】
実施例
以下の実施例は、本発明のある種の非限定的な局面を実証するために含まれる。以下に続く実施例において開示される技法は、本発明の実践において十分に機能することが本発明者によって発見された技法に当たることが当業者によって理解されるはずである。しかしながら、当業者は、本発明の開示に照らして、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示される特定の態様において多くの変更を加えることができ、それでもなお同様のまたは類似の結果を得ることができるものと理解するはずである。
【００５４】
実施例1 (官能性を持たせたAuNP)
20ナノメートルの平均粒径サイズを有する金ナノ粒子(AuNP)に15 uMの2-メルカプトエチルアミン(MEA)で官能性を持たせた。FT-IR分光分析により、AuNP上の官能基の存在を確認する。さらに、MEAの最適濃度を電解質(10% NaCl)の添加前後のUV-Vis分光法の使用によって判定する。最適濃度は、AuNPを安定化し、10% NaClの添加後でさえも凝集を阻止し、分散を維持したMEAの濃度と定義された。図2に示されるように、UV/Visスペクトルは、MEAで官能性を持たせた場合に吸光度ピークの変化を起こす。官能性を持たせたナノ材料を次いで、コラーゲン原線維上のカルボキシル基との共有結合を容易にするために2 mM EDC (1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)および5 mMスルホ-NHS (スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド)と混合する。
【００５５】
実施例2 (AuNP-コラーゲン複合化材料)
AuNP-コラーゲンゲルの足場を形成させるため、ラット尾部コラーゲン(9 mg/mlの濃度) 2.5 mLを10×PBS 0.5 mL、1 M NaOH 0.057 mL、EDC 4.0 mg、スルホ-NHS 5.3 mgおよび官能性AuNP溶液0.5 mL (粒子9.408×109個)の混合物に加えた。次に、このマトリックスを、重合および架橋結合のために90分間37℃のインキュベーター中に置いた。ナノ粒子の数とコラーゲン溶液との間の比率は、ラット尾部コラーゲン9 mgあたりAuNP 3.8×109個である。
【００５６】
システインEDC/NHS架橋剤を通じて20 nm AuNPが付着されている例示的なコラーゲンゲルの足場のSEMが、図3。SEMは、コラーゲンゲルの足場における金ナノ粒子の分布および密度を特徴付ける。100×でAuNP-コラーゲン材料のSEMを表示している図3に示されるように、AuNPは足場全体に存在しており、これは、AuNPがコラーゲン原線維に結合していることを示す。ゲルは、あらゆる未結合のAuNPをコラーゲンの足場から除去する徹底的な洗浄を受けている(Haidekker (2006))。
【００５７】
図3に示されたSEM顕微鏡写真からナノ粒子の付着が確認される一方で、図4から、付着された粒子が金粒子であることが確認される。図4は、コラーゲンの足場に共有結合的に固定化された金ナノ粒子のEDS (エネルギー分散分光法)像である。
【００５８】
実施例3 (分解アッセイ法)
上記のように、本発明者らは、コラーゲン原線維上のカルボン酸結合部位の一部分を粒子で遮断することにより、コラゲナーゼ活性の減少および結果として生じるコラーゲン分解速度の減少が起こりうるものと考える。これが実験的に確認された(図5におけるデータを参照のこと)。図5に例示されるように、異なる濃度でコラーゲン分解に及ぼすナノ材料の効果を調べ、ナノ材料なしのサンプルと比較する。金ナノ粒子(AuNP)の直径サイズは100 nmで各サンプルに対して一定とし、複合化された材料を作出した工程は、本明細書の例示的な態様の説明のC節 (「複合体を作出するための工程」)に記述されているものであり、これは参照により本実施例に組み入れられる。濃度はサンプル間で異なった(1×、2×、4×)。長さゼロの架橋剤1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)の濃度もサンプル間で異なった。対照サンプルには、ナノ粒子なしでECD (1×)により架橋されたラット尾部コラーゲンを含有させた。コラゲナーゼアッセイ法を行って、架橋されたサンプルの生物学的安定性を試験した。サンプルの分解を通じた生物学的安定性は、ヒドロキシプロリン放出の量によって測定した。分解されたマトリックスの割合は、図5に対照(EDC 1× ナノ粒子なし)と比べて報告してある。誤差棒は8サンプルから算出された標準偏差を表す。長さゼロの架橋剤ECDの濃度を単純に倍増することによって、足場の分解が30%だけ顕著に減らされた(p<0.001)。金ナノ粒子をマトリックスに加えることによっても、マトリックスの分解を減らす顕著な効果があった(p<0.001)。100 nmの金ナノ粒子の1×濃度は50%の分解を低減し、その上、2×濃度ではたったの7%の分解にまで顕著に低減された(p<0.01)。AuNP (2×)およびAuNP (4×)ならびに2×濃度までのEDCの増加とともにAuNP (1×)の間には有意差がない。これらの結果は、100 nmの金ナノ粒子の添加がコラーゲンのタンパク質分解耐性に役立ち、マトリックスの生物学的安定性を増大することを示す。これらの結果はまた、コラーゲン原線維に沿ってコラゲナーゼ結合部位にナノ材料が付着することで足場の分解速度が低下することを示す。これらの結果はさらに、約20〜約1000 nmの直径を有するナノロッドなどの、さまざまなサイズおよび形状のナノ材料を利用できることを示す。
【００５９】
さらに、アミン基(MEA)でナノ材料に官能性を持たせることによって、ナノ材料とコラーゲンとの間で形成される結合の数を最大化することができる。さらに、各ナノ粒子は複数の(2つ超の)付着部位を与えられるが、大部分の架橋剤は、典型的には、コラーゲン原線維間の2点結合を与える。この手法は、組織内殖および天然コラーゲン沈着に最適な、特定の予め定められたコラーゲンマトリックス細孔サイズの製造を可能にしうる。金ナノ材料は遊離基捕捉剤として作用するので、足場はまた、抗菌作用も与えながら抗酸化作用に寄与するであろう。
【００６０】
体内へ挿入されたら特異的な相互作用を容易にするように他のタンパク質をナノ材料に複合化させてもよい。例えば、線維素をMEAでナノ材料に付加させて、創傷治癒中の血液凝固を補助することができる。
【００６１】
実施例4 (細胞生存性アッセイ法)
図6は、WST-1生存性アッセイ法を介して細胞生存性に用いられた金ナノ粒子の効果を示すデータを提供する。特に、1×、2×、4×、および8×の濃度にて実施例3で調製された金ナノ粒子を有するコラーゲンの足場を3日間細胞とともにインキュベートした。細胞の生存性をUV-Visで記録された吸光度値へのWST-1の変換によって判定した。図3に示される結果は、対照の生存性がナノ粒子の存在下での細胞生存性よりも有意に高くないことを示す。それゆえ、ナゾ材料は非常に低い細胞毒性を有する。いっそう高濃度の金ナノ粒子からのいっそう高い吸光度読み値により、いっそう多くのWST-1を変換する金ナノ粒子の存在下でのいっそう高い細胞代謝回転が認められ、またはAuNPの2×濃度での結合部位の数は飽和しており、金ナノ粒子を培地中に残し、UV-Vis吸光度値に干渉していることが示唆される。
【００６２】
実施例5 (カルボン酸結合分析)
実施例3において調製されたコラーゲンの足場を分析して、足場上に残存している遊離カルボン酸基の量を判定した。具体的には、金粒子有りおよび無しの足場に対してフーリエ変換赤外分光を用いた。この技法は、コラーゲン上のCOOHへの金の結合を示すカルボン酸部位でのピークの低減を示すために用いられる。図7に例示されるように、1125〜920 nm域でのピークの減少が認められたが、これはC-OH結合(遊離COOH基)の低減を示す。曲線下の面積は0.3680から0.3になったが、これはコラーゲン/粒子複合体の足場上の遊離カルボン酸基の18%の減少である。
【００６３】
実施例6 (細胞充実性、細胞保持、および細胞外マトリックス産生のインビトロでの評価)
本実施例では、細胞充実性、細胞生存性、細胞外マトリックス産生、および細胞分布に及ぼす複合化されたコラーゲン/粒子材料の効果を未処理対照と比べて示すデータを提供する。
【００６４】
材料および方法
足場群の割付:
金ナノ粒子およびコラーゲンゲルの5つの異なる組み合わせを評価した。これらの群に1〜5の番号を付けたが、その概要を表1に示す。計10個の構築体を皮膚線維芽細胞に播種し、7日間および14日間インキュベートした。計50サンプルを分析した。
【００６５】
【表１】
2013528108.tif 000002
【００６６】
線維芽細胞の収集および培養:
皮膚真皮を本研究とは無関係の理由でバルビツール酸塩の過剰摂取によって人道的に安楽死されたイヌから収集した。組織を輸送のため、10%ウシ胎仔血清、0.008%ヘペス緩衝液、0.008%非必須アミノ酸、0.002%ペニシリン100 IU/mLストレプトマイシン(streptomyic) 100 ug/mL、アンフォテリシンB (amphoterocin B) 25 ug/mL、0.002% L-アスコルビン酸塩、0.01% L-グルタミンを有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM + FBS)中に入れた。無菌操作下で#10の手術用メスの刃を用いて真皮組織を2 mm × 2 mmの切片にした。組織断片をRPMI 1640溶液中7.5 mg/mLの濃度で、無菌のIA型クロストリジウムコラゲナーゼ溶液(Sigma, USA)と混ぜ合わせた。混合物を6時間37℃、5% CO2、95%湿度のインキュベーター中で撹拌した。消化溶液を10分間1000 RPMで遠心分離した。上清をデカントし、細胞ペレットをDMEM + FBS 5 mLに再懸濁した。フラスコを37℃、5% CO2、95%湿度でインキュベートし、無菌の培地交換を3日ごとに行った。組織培養フラスコあたり95%の細胞集密が観察されるまで倒立顕微鏡を用い成長について線維芽細胞をモニタリングした。細胞を、3回目の継代が達成されるまで継代培養により75 mLの組織培養フラスコに移し入れ、その後、将来使うために凍結した。細胞をその後、融解し、単層から放出させ、使用の前に溶液中に置いた。
【００６７】
足場の播種:
近似体積でコラーゲンゲル250 μlをそれぞれの群および処理から形作った。各群の構築体10個(n=10)を24時間PBS中、組織培養プレートの個々のウェルに配し、予浸順化として37℃、5% CO2、95%湿度の無菌インキュベーター内に配した。事前の微生物培養および感受性検査により、3日間の構築体の培養3日後に成長のないことが確認された。予浸後に、培地を各ウェルから除去し、細胞1×106個/mlの濃度の線維芽細胞溶液と置き換えた。構築体を細胞溶液とともに静的に24時間培養し、その時点で、細胞溶液をDMEM+FBS培地と試験の間中、置き換えた。
【００６８】
構築体の収集および評価:
5つ(n=5)の構築体を7日目および14日目に各群から収集した。細胞生存性および分布の評価のために各構築体から断面をとった。エチジウムホモ二量体-1 (4 uL/ml PBS)およびカルセインAM (Calcein AM) (アセトキシメチルエステル) (0.4 ul/ml PBS)蛍光染色(LIVE/DEAD生存性/細胞毒性キット、Molecular Probes Co.)を用い、紫外線鏡検法を用いて細胞生存性を判定した。1マイクロメートルの切片を作出し、室温で20分間染色剤とともにインキュベートし、ガラス顕微鏡スライド上に置き、数滴のPBSで湿らせ、蛍光二重標識法を用いて染色した。切片を10×の倍率下で調べた。各切片の像をOlympus DP-70 (Olympus, Melville, NY)デジタルカメラによってデジタル的に捕捉し、Tiffファイルとして保存した。各構築体の残りを凍結乾燥し、乾燥重量を得て、その後、パパイン(Papin)溶液1 mlと混合した。各消化物の一部分を用いて、ジメチルメチレンブルーアッセイ法によりGAG含量を、およびヒドロキシプロリン濃度の判定によりコラーゲン含量を判定した。残りの溶液を4時間水浴中にて60℃でインキュベートした。Quant-iT PicoGreenTM二本鎖DNA定量化アッセイ法(Invitrogen)を用いて、残りの足場の細胞充実性を判定した。ウシ胸腺から抽出された二本鎖DNAをTE緩衝液(Invitrogen)と混合して、1,000、100、10および1 ng/mlの標準DNA濃度を作出した。標準物質および各パパイン消化サンプル(上記のGAGおよびヒドロキシプロリンアッセイ法において用いた) 100 ulを96ウェルプレートに加えた。2 ug/mlのPico Green試薬100 uLを各ウェルに加え、プレートを5分間インキュベートした。サンプル蛍光をSyngergy HT-KC-4分光光度プレートリーダー(BioTec, Winooski Vermont)により485 nmの励起/528 nmの発光で読み取った。吸光度をng/l濃度に変換し、総二本鎖DNAの収量をFT4ソフトウェア(BioTec, Winooski Vermont)によりng単位で表した。
【００６９】
各データセットを調べ、外れ値を、残りのデータセットから外れて2標準偏差を上回ったまたは下回った値により判定し、それらの値を捨てた。統計的有意性をp<0.05に設定し、さまざまな事後の全ペアワイズ(post-hoc all-pairwise)試験によって個々の群間の差異を判定し、一元配置ANOVA検定で群内および群間の差異を統計的に解析した。
【００７０】
結果
細胞充実性の指標としてのDs DNA評価:
図8に例示されるように、7日目: 群1は群2、3および5よりも顕著に多い量のDNAを保有していた。その他の有意差は検出されなかった。14日目: 群2は群5よりも顕著に多い量のDNAを保有していた。その他の有意差は検出されなかった。群1は経時的なDNA含量の著しい低下を示したが、群2および3は2時点の間にDNAの増加を示した。その他の有意差は検出されなかった。
【００７１】
グリコサミノグリカン(GAG)評価:
図9に例示されるように、7日目: 群1は群5よりも顕著に多い量のGAGを保有していた。その他の有意差は検出されなかった。14日目: 群2は群1および5よりも顕著に多い量のGAGを保有していた。その他の有意差は検出されなかった。群1は経時的なGAG含量の著しい低下を示したが、群2および3および5は2時点の間にGAGの増加を示した。その他の有意差は検出されなかった。
【００７２】
細胞生存性/集積の評価:
細胞生存性は主観的に、全時点で全群において> 95%であった(図11)。生存細胞充実性の集密が圧倒的であったためにコンピュータ画像解析による特異的な生存性の定量化を不可能にする、著しい細胞ラフティング(cell rafting)が全群において明らかであった。細胞死の指標と解釈されるようなものを示す群はなかった。各群は細胞接着、保持および増殖を示した(図12)。7日目の群では大きなラフトにおいて細胞表面増殖のより多くの証拠が示されたが、14日目までに、ゲル構築体の内部へのさらに深い浸透が各群において目撃された。主観的に、群間の細胞浸透の度合いまたは程度において差異を検出できなかった。ゲルにおいてAuNPの結合した空洞が目撃された切片において、細胞増殖はチャネルに沿って豊富であることに気が付いた(7日目、群2および5を参照のこと)。
【００７３】
結論
実施例6におけるこれらのデータは、コラーゲンゲルの初期細胞化が非処理ゲルにおいて最適であるように思われたが、長期的な分析から、一般的に、AuNP処理群が非処理ゲル構築体よりも良好に細胞を保持するように思われまたはその増殖を助長するように思われることが明らかにされたことを示唆する。これらの所見が14日目時点だけでの傾向に主に基づいており、群間のDNA含量に関する唯一の統計的差異は、群5よりも高い細胞充実性を保有している群2であったことに留意すべきである。これらの2つの群間の処理の差異は、細胞保持または増殖に悪影響を与えうる群5でのEDC濃度の倍加であった。しかし、各処理内の2時点を調べると、群2および3は増加を示したのに対し、群1は、経時的な細胞充実性の著しい低下を示した唯一の群である。細胞有糸分裂誘発または増殖はここでは特に調べられなかったが、それらの群におけるこの細胞充実性の増加は、いずれの時点でもさらなる細胞が加えられなかったので、細胞充実性の増大の結果(一部分において)である可能性が高かった。全群で、検出可能な細胞死の証拠なく経時的に細胞を保持する能力およびゲル構築体の内部へのその集積を助長する能力が示された。対をなすdsDNA/細胞生存性のデータに基づき、細胞は7日目と14日目の間で群1においてあまりうまく保持されなかった(しかし必ずしも細胞死の量の増大を起こすことはなかった)ようであり、かくして処理群はまた、とりわけ群2および3 (2×および1× AuNP濃度)において、さらに良好に細胞保持に有利に働いたことを意味していた。この細胞充実性の増大は、14日目の時点の群2におけるGAG産生の、対応する大幅な増加に関与していた可能性が高い。コラーゲン産生の決定因子としてのヒドロキシプロリンの試験に関して、群1、2および3の活性は両方の時点で非常に似通っていた。興味深いことに、群4 (4×AuNP)は、とりわけ14日目に、より低いレベルのHP濃度を示した。図5は、経時的に顕著に低下したHP含量の初期の急激な上昇を示した。
【００７４】
本明細書において開示および主張される材料、組成物、または方法の全てを本開示に照らして過度の実験なしに作出および実行することができる。本発明の材料、組成物、または方法を特定の態様に関して記述してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく材料、組成物、または方法に変形を適用できることが当業者には明らかであろう。
【００７５】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書において記述されるものを補足する例示的な手順のまたは他の詳細を提供する程度まで、参照により組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年4月2日(2013.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子に共有結合されたコラーゲンを含む注射可能または移植可能な組成物であって、可溶性コラーゲンの遊離カルボン酸基と粒子のアミン反応基との間で共有アミド結合が形成され、かつ粒子が、50〜1000ナノメートルに及ぶ平均粒径サイズを有する、該組成物。
【請求項２】
コラーゲンが架橋されている、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
架橋されたコラーゲンが多孔性であり、かつ500ナノメートルから200マイクロメートルまたは1マイクロメートルから100マイクロメートルに及ぶ平均細孔サイズを有する、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
コラーゲンが粒子を通じて架橋されており、コラーゲンの遊離カルボン酸基と少なくとも1つの粒子上の少なくとも2つのアミン反応基との間で少なくとも2つの共有アミド結合が形成されている、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
コラーゲンがカルボジイミド架橋剤で架橋されている、請求項2記載の組成物。
【請求項６】
粒子が50〜150ナノメートルの平均粒径を有する、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
粒子が金属材料を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
金属材料が、金、銀、白金、チタン、ニッケル、および銅からなる群より選択される、請求項7記載の組成物。
【請求項９】
金属材料が金である、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
粒子がセラミック材料または生分解性材料を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
反応基がメルカプトエチルアミンもしくはシスタミンまたはその両方である、請求項1〜10のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
粒子とコラーゲンとの比率が、コラーゲン1 mgあたり粒子1×109個からコラーゲン1 mgあたり粒子2×1010個の範囲である、請求項1〜11のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
コラーゲン30 mgあたりカルボジイミド架橋剤2〜4 mgを用いて共有結合を形成させる、請求項1〜12のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
粒子1×109〜2×1010個あたりカルボジイミド架橋剤0.5〜0.2 mgを用いて共有結合を形成させる、請求項1〜13のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５】
胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、上皮細胞、外分泌もしくは内分泌細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、間質細胞、肝細胞、島細胞、神経芽細胞、角化細胞、破骨細胞、骨細胞、心臓細胞、軟骨細胞、内皮細胞、または筋肉細胞、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６】
ゲル、溶液、ペースト、または脱水された剛構造である、請求項1〜15のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
注射器の中に含まれる、請求項1〜16のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
真皮または表皮の皮膚等価体である、請求項1〜17のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１９】
コラーゲンの遊離カルボン酸基の15〜20%がアミド結合を通じて粒子に共有結合されている、請求項1〜18のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０】
個人において組織容量を増加させることにより関節軟骨を膨化させるための方法であって、それを必要としている個人に請求項1〜19のいずれか一項記載の組成物を投与する段階を含み、組成物が関節包への注射により投与される、該方法。
【請求項２１】
コラーゲンが架橋されていて、多孔性であり、かつ500ナノメートルから200マイクロメートルに及ぶ平均細孔サイズを有する、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
粒子が50〜150ナノメートルの平均粒径を有する、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
反応基がメルカプトエチルアミンもしくはシスタミンまたはその両方である、請求項20〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
粒子とコラーゲンとの比率が、コラーゲン1 mgあたり粒子1×109個からコラーゲン1 mgあたり粒子2×1010個の範囲である、請求項20〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
組成物が、ゲル、溶液、ペースト、または脱水された剛構造である、請求項20〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
コラーゲンの遊離カルボン酸基の15〜20%がアミド結合を通じて粒子に共有結合されている、請求項20〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
コラーゲン30 mgあたりカルボジイミド架橋剤2〜4 mgを用いて共有結合を形成させる、請求項20〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
粒子1×109〜2×1010個あたりカルボジイミド架橋剤0.5〜0.2 mgを用いて共有結合を形成させる、請求項20〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
個人において間隙、欠損を充填するための方法、または組織容量を増大するための方法であって、それを必要としている患者に請求項1〜19のいずれか一項記載の組成物を投与する段階を含み、組成物が皮内注射または皮下注射によって投与される、該方法。
【請求項３０】
間隙が顔の小じわ、しわ、ひだ、くぼみ、または小さなこぶであり、かつ顔の小じわ、しわ、ひだ、くぼみ、または小さなこぶの出現が組成物の投与後に低減される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
組成物が個人の口唇に投与され、かつ組成物の投与後に口唇の容量が増加する、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
反応アミン基を有しかつ50〜1000ナノメートルに及ぶ平均粒径を有する粒子とコラーゲンを複合化させる段階を含む、酵素的分解によるインビトロでのまたはインビボでのコラーゲン分解を低減する方法であって、ここで共有アミド結合が可溶性コラーゲンの遊離カルボン酸基と粒子上の反応アミン基との間で形成され、かつその結果、コラゲナーゼによるコラーゲンの分解が低減され、該コラーゲンが注射可能または移植可能である、該方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
[本発明1001]
粒子に共有結合されたコラーゲンを含む組成物であって、コラーゲンの遊離カルボン酸基と粒子のアミン反応基との間で共有アミド結合が形成され、かつ粒子が、50〜1000ナノメートルに及ぶ平均粒径サイズを有する、該組成物。
[本発明1002]
コラーゲンが架橋されている、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
架橋されたコラーゲンが多孔性であり、かつ500ナノメートルから200マイクロメートルまたは1マイクロメートルから100マイクロメートルに及ぶ平均細孔サイズを有する、本発明1002の組成物。
[本発明1004]
コラーゲンが粒子を通じて架橋されており、コラーゲンの遊離カルボン酸基と少なくとも1つの粒子上の少なくとも2つのアミン反応基との間で少なくとも2つの共有アミド結合が形成されている、本発明1003の組成物。
[本発明1005]
コラーゲンがカルボジイミド架橋剤で架橋されている、本発明1002の組成物。
[本発明1006]
粒子が50〜150ナノメートルの平均粒径を有する、本発明1001〜1005のいずれかの組成物。
[本発明1007]
粒子が金属材料を含む、本発明1001〜1006のいずれかの組成物。
[本発明1008]
金属材料が、金、銀、白金、チタン、ニッケル、および銅からなる群より選択される、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
金属材料が金である、本発明1008の組成物。
[本発明1010]
粒子がセラミック材料または生分解性材料を含む、本発明1001〜1009のいずれかの組成物。
[本発明1011]
反応基がメルカプトエチルアミンもしくはシスタミンまたはその両方である、本発明1001〜1010のいずれかの組成物。
[本発明1012]
粒子とコラーゲンとの比率が、コラーゲン1 mgあたり粒子1×109個からコラーゲン1 mgあたり粒子2×1010個の範囲である、本発明1001〜1011のいずれかの組成物。
[本発明1013]
コラーゲン30 mgあたりカルボジイミド架橋剤2〜4 mgを用いて共有結合を形成させる、本発明1001〜1012のいずれかの組成物。
[本発明1014]
粒子1×109〜2×1010個あたりカルボジイミド架橋剤0.5〜0.2 mgを用いて共有結合を形成させる、本発明1001〜1013のいずれかの組成物。
[本発明1015]
胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、上皮細胞、外分泌もしくは内分泌細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、間質細胞、肝細胞、島細胞、神経芽細胞、角化細胞、破骨細胞、骨細胞、心臓細胞、軟骨細胞、内皮細胞、または筋肉細胞、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、本発明1001〜1014のいずれかの組成物。
[本発明1016]
ゲル、溶液、ペースト、または脱水された剛構造である、本発明1001〜1015のいずれかの組成物。
[本発明1017]
注射器の中に含まれる、本発明1001〜1016のいずれかの組成物。
[本発明1018]
真皮または表皮の皮膚等価体である、本発明1001〜1017のいずれかの組成物。
[本発明1019]
コラーゲンの遊離カルボン酸基の15〜20%がアミド結合を通じて粒子に共有結合されている、本発明1001〜1018のいずれかの組成物。
[本発明1020]
個人において組織容量を増加させることにより関節軟骨を膨化させるための方法であって、それを必要としている個人に本発明1001〜1019のいずれかの組成物を投与する段階を含み、組成物が関節包への注射により投与される、該方法。
[本発明1021]
コラーゲンが架橋されていて、多孔性であり、かつ500ナノメートルから200マイクロメートルに及ぶ平均細孔サイズを有する、本発明1020の方法。
[本発明1022]
粒子が50〜150ナノメートルの平均粒径を有する、本発明1021の方法。
[本発明1023]
反応基がメルカプトエチルアミンもしくはシスタミンまたはその両方である、本発明1020〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
粒子とコラーゲンとの比率が、コラーゲン1 mgあたり粒子1×109個からコラーゲン1 mgあたり粒子2×1010個の範囲である、本発明1020〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
組成物が、ゲル、溶液、ペースト、または脱水された剛構造である、本発明1020〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
コラーゲンの遊離カルボン酸基の15〜20%がアミド結合を通じて粒子に共有結合されている、本発明1020〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
コラーゲン30 mgあたりカルボジイミド架橋剤2〜4 mgを用いて共有結合を形成させる、本発明1020〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
粒子1×109〜2×1010個あたりカルボジイミド架橋剤0.5〜0.2 mgを用いて共有結合を形成させる、本発明1020〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
個人において間隙、欠損を充填するための方法、または組織容量を増大するための方法であって、それを必要としている患者に本発明1001〜1019のいずれかの組成物を投与する段階を含み、組成物が皮内注射または皮下注射によって投与される、該方法。
[本発明1030]
間隙が顔の小じわ、しわ、ひだ、くぼみ、または小さなこぶであり、かつ顔の小じわ、しわ、ひだ、くぼみ、または小さなこぶの出現が組成物の投与後に低減される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
組成物が個人の口唇に投与され、かつ組成物の投与後に口唇の容量が増加する、本発明1029の方法。
[本発明1032]
反応アミン基を有しかつ50〜1000ナノメートルに及ぶ平均粒径を有する粒子とコラーゲンを複合化させる段階を含む、酵素的分解によるインビトロでのまたはインビボでのコラーゲン分解を低減する方法であって、ここで共有アミド結合がコラーゲンの遊離カルボン酸基と粒子上の反応アミン基との間で形成され、かつその結果、コラゲナーゼによるコラーゲンの分解が低減される、該方法。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明および実施例は、本発明の特定の態様を示しているが、例示するためのみに示されると理解されるべきである。さらに、本発明の趣旨および範囲内での変更および修正が、本詳細な説明から当業者には明らかになるものと考えられる。
【国際調査報告】
2013528108.tif 000015
2013528108.tif 000016