(57)【要約】基質（１０）であって、特に、生体細胞（２１）を収容しまたは受け入れるための基質（１０）は、支持領域（２）を有する基質本体（１）を含んでおり、その支持領域（２）上に熱応答性のミクロゲル（３）が固定されており、その熱応答性のミクロゲル（３）は、熱応答性のポリマーを含む粒子を含んでいる。また、その基質（１０）を調製する方法、およびその基質（１０）上でその生体細胞（２１）を培養する方法、が記載されている。【選択図】図１
2013521809.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質（１０）、特に生物細胞（２０、２１、２２）を受け入れる基質であって、
−  支持領域（２）を有する基質本体（１）を含み、
−  熱応答性ミクロゲル（３）が前記支持領域（２）上に固定されるものであること
を特徴とする、基質。
【請求項２】
−  前記熱応答性ミクロゲル（３）は、少なくとも１つの荷電されていない非イオン性のポリマーで形成されるものである、請求項１に記載の基質。
【請求項３】
前記熱応答性ミクロゲル（３）は、次のポリマー（ホモポリマーまたはコポリマー）：
−  
【化２０】
2013521809.tif 000022
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、Ｈまたはアルキルであり、好ましくは、Ｒ１はイソプロピルであり、Ｒ２は Ｈであり、ｎ＝０である、
−  
【化２１】
2013521809.tif 000023
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールであり、好ましくは、−Ｒ３は−イソプロピル、−Ｒ４は−Ｈ、−Ｒ４および−Ｒ５は、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ３または−Ｈであり、特に好ましくは、−Ｒ３は−イソプロピル、−Ｒ４は−Ｈ、およびｍ：ｎ＝１００：０であり、
および／または、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、
【化２２】
2013521809.tif 000024
であり、
ここで、Ｒ７乃至Ｒ１１は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、−アルキロイル（alkyloyl）であり、少なくとも１つのＲはＨである、
−  
【化２３】
2013521809.tif 000025
ここで、Ｒ１、Ｒ２はＨまたはＣＨ３であり、Ｒ３、Ｒ４はＨまたはアルキル基であり、ｘ、ｙ＝０乃至２０である、
−  
【化２４】
2013521809.tif 000026
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好ましくは−ＣＨ３であり、
Ｒ３、Ｒ５は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好まくは−Ｈであり、
いずれの場合も、Ｒ３が−Ｈでない場合、Ｒ５は−Ｈであり、
Ｒ４、Ｒ６は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび／または−ＣＨ３、特に好ましくは−ＣＨ３であり、
Ｒ３、Ｒ５が−Ｈ、およびＲ４、Ｒ６が−ＣＨ３、ｘ＝１およびｙ＝７．５の場合、ｍ：ｎは、好ましくは９５：５乃至９０：１０、特に好ましくは９３：７であり、
Ｒ３、Ｒ５が−Ｈ、およびＲ４、Ｒ６が−ＣＨ３、ｘ＝１およびｙ＝４．５の場合、ｍ：ｎは、好ましくは９３：７乃至８０：２０、特に好ましくは８５：１５である、
−  
【化２５】
2013521809.tif 000027
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈであり、
Ｒ３、Ｒ５は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好まくは−Ｈであり、
いずれの場合も、Ｒ３が−Ｈでない場合、Ｒ５は−Ｈであり、
Ｒ４、Ｒ６は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび／または−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈであり、
Ｒ１、Ｒ２が−Ｈ、およびＲ４、Ｒ６が−ＣＨ３、ｘ＝３およびｙ＝４の場合、ｍ：ｎは、好ましくは６５：３５乃至４５：５５、特に好ましくは６０：４０乃至５０：５０である、
−  
【化２６】
2013521809.tif 000028
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈであり、
Ｒ３、Ｒ５は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好まくは−Ｈであり、
Ｒ３が−Ｈでない場合、Ｒ５は−Ｈであり、
Ｒ４、Ｒ６は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび／または−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈである、
−  
【化２７】
2013521809.tif 000029
ここで、Ｒ１、Ｒ２はＨまたはＣＨ３であり、Ｒ３、Ｒ４はＨまたはアルキルであり、ｘ、ｙ＝０乃至２０である、
−  
【化２８】
2013521809.tif 000030
ここで、Ｒ１はＨまたはＣＨ３、ｘ＝３乃至５であり、コポリマーではｘ＝３およびＸ＞３である、
−  
【化２９】
2013521809.tif 000031
ここで、Ｒ１、Ｒ３は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好まくは−Ｈであり、
いずれの場合も、Ｒ３が−Ｈでない場合、Ｒ５は−Ｈであり、
Ｒ２、Ｒ４は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび／または−ＣＨ３、特に好まくは−ＣＨ３である、
−  
【化３０】
2013521809.tif 000032
または
【化３１】
2013521809.tif 000033
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈであり、
Ｒ３、Ｒ５は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好まくは−Ｈであり、
ここで、Ｒ３が−Ｈでない場合、Ｒ５は−Ｈであり、
Ｒ４、Ｒ６は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび／または−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈである、
−
【化３２】
2013521809.tif 000034
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールである、
−  
【化３３】
2013521809.tif 000035
または組成物中のこの３つの要素のコポリマー、
ここで、Ｒ１は、−Ｈ、−アルキル、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈであり、
Ｒ２、Ｒ３は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールであり、
２≦ｎ≦１０、好ましくは３≦ｎ≦６である、
−  
【化３４】
2013521809.tif 000036
ここで、−Ｒは、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールであり、好ましくは−Ｒは−アルキルであり、特に好ましくは−Ｒは−ＣＨ３である、
−  
【化３５】
2013521809.tif 000037
ここで、Ｒ１、Ｒ３は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３であり、
ここで、Ｒ１が−Ｈでない場合、Ｒ３は−Ｈであり、
Ｒ２、Ｒ４は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび／または−ＣＨ３である、
−  
【化３６】
2013521809.tif 000038
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールである、
−  
【化３７】
2013521809.tif 000039
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは、Ｒ１は−ＣＨ３、ｎ＝０であり、
および、セルロース以外の多糖骨格をベースとする類似した構造のホモポリマーまたはコポリマー、
−  
【化３８】
2013521809.tif 000040
ここで、Ｒ１〜Ｒ６は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキロールであり、少なくとも２つのＲはＨである、
−  エラスチン状の複数の単位を有するホモポリマーまたはコポリマー、および
−  変更されたモノマーを有する上記の全ての単位のコポリマー、
の中の少なくとも１種のポリマーで形成されるものである、請求項１または２に記載の基質。
【請求項４】
前記ポリマー主鎖の少なくとも１つの末端の単位は、前記支持領域（２）に対する結合基を含むものである、請求項３に記載の基質。
【請求項５】
前記熱応答性ミクロゲル（３）は、次のポリマーの中の少なくとも１種のポリマーで形成され、
−  ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、
−  −Ｘ−（−ＣＨ２−ＣＲ１ＣＯＯ−Ｒ２−）ｎ−（−ＣＨ２−ＣＲ１ＣＯＯ−Ｒ３−）ｍ−Ｒ４、またはそのコポリマー、および
−  −Ｘ−［（−ＣＨ２−ＣＲ１ＣＯＯ−Ｒ２−）ｎ−（−ＣＨ２−ＣＲ１ＣＯＯ−Ｒ３−）ｍ−Ｒ４］２、またはそのコポリマー、
ここで、Ｘは支持領域に対する結合基であり、Ｒ１はＨまたはＣＨ３であり、Ｒ２／Ｒ３は、エーテル基を有する脂肪族炭化水素鎖であり、Ｒ４は−Ｈ、脂肪族炭化水素鎖または官能基である、請求項１乃至４のいずれかに記載の基質。
【請求項６】
前記熱応答性ミクロゲル（３）は、少なくとも２種の異なるポリマーで形成され、および／または異なる直径を有するものである、請求項１乃至５のいずれかに記載の基質。
【請求項７】
前記熱応答性ミクロゲル（３）は、最小で１０ｎｍおよび／または最大で５０μｍの直径を有するものである、請求項１乃至６のいずれかに記載の基質。
【請求項８】
前記熱応答性ミクロゲル（３）は、コア−シェル構造を有するものである、請求項１乃至７のいずれかに記載の基質。
【請求項９】
−  前記熱応答性ミクロゲル（３）のシェルだけが熱応答性である、
−  前記熱応答性ミクロゲル（３）のコアの凝集は、二次原子価相互作用によって生じる、
−  前記熱応答性ミクロゲル（３）のコアの凝集は、化学的架橋によって生じる、
−  前記熱応答性ミクロゲル（３）のシェルにおけるポリマー鎖は、架橋されていない、
−  前記熱応答性ミクロゲル（３）のシェルにおけるポリマー鎖は、架橋されており、架橋位置の数は、非架橋の繰り返し単位２０個当り１個以下である、
−  前記熱応答性ミクロゲル（３）のシェルの厚さは、少なくとも１０ｎｍである、
の特徴の中の少なくとも１つの特徴を有する、請求項８に記載の基質。
【請求項１０】
前記熱応答性ミクロゲル（３）は、単層、特に１つの閉じたまたは密状態の単層を形成するものである、請求項１乃至９のいずれかに記載の基質。
【請求項１１】
前記支持領域（２）には接着促進剤（４）が供給または配置されるものである、請求項１乃至１０のいずれかに記載の基質。
【請求項１２】
少なくとも１種のモジュレータ物質（５）が設けられまたは配置され、
前記少なくとも１種のモジュレータ物質（５）に対して、生物細胞が、前記熱応答性ミクロゲル（３）に対する前記生物細胞の接着力とは異なる接着力を有し、および／または、前記少なくとも１種のモジュレータ物質（５）に対して、細胞反応が、前記生物細胞の表面受容体への結合によって誘発可能なものとなる、
請求項１乃至１１のいずれかに記載の基質。
【請求項１３】
前記少なくとも１種のモジュレータ物質（５）は、モジュレータ粒子（５．１、５．２）上に、および／または、前記支持領域（２）上のモジュレータ層（５．３、５．４）として、配置されるものである、請求項１２に記載の基質。
【請求項１４】
前記熱応答性ミクロゲル（３）、前記接着促進剤および前記モジュレータ物質の中の少なくとも１つは、前記支持領域（２）上で密度勾配（６）を形成するものである、請求項１乃至１３のいずれかに記載の基質。
【請求項１５】
少なくとも１つの培養キャビティ（９）が前記支持領域（２）上に設けられている、請求項１乃至１４のいずれかに記載の基質。
【請求項１６】
前記基質本体（１）は培養装置（３０）の一部である、請求項１乃至１５のいずれかに記載の基質。
【請求項１７】
請求項１乃至１６のいずれかに記載の基質（１０）を調整する方法であって、
−  前記支持領域（２）を有する基質本体（１）を供給する工程と、
−  前記熱応答性マイクロゲル（３）の分散液を調整する工程と、
−  前記分散液を前記支持領域（２）に塗布する工程と、
−  前記支持領域（２）上に前記熱応答性ミクロゲル（３）を固定する工程と、
を含む、基質の調整方法。
【請求項１８】
−  前記支持領域（２）に接着促進剤を塗布または配置する工程と、
−  前記支持領域（２）に少なくとも１種のモジュレータ物質（５）を塗布または配置する工程と、
−  前記支持領域（２）を殺菌する工程、
の中の少なくとも１つの工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１乃至１７のいずれかに記載の基質（１０）上で生物細胞（２０、２１、２２）を培養する方法であって、
−  前記基質（１０）上に前記生物細胞（２０、２１、２２）を堆積または被着する工程と、
−  前記生物細胞（２０）が、成長、分化、および／または移動する（７）ように、培養条件を設定する工程と、
を含む、方法。
【請求項２０】
−  温度を設定することによって、前記基質（１０）上における前記生物細胞（２０、２１、２２）の接着性を設定する工程と、
−  少なくとも１つのタイプの前記生物細胞（２０、２１、２２）の、細胞タイプに固有の移動（７）を、細胞タイプに固有に作用するモジュレータ物質の密度勾配で設定する工程と、
−  前記生物細胞（２０、２１、２２）が培養キャビティ（９）中に移動する形態で、少なくとも１つのタイプの前記生物細胞（２０、２１、２２）の移動（７）を、モジュレータ物質の密度勾配によって設定する工程、
の中の少なくとも１つの工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物細胞または生体細胞（biologischer Zellen）を収容または受け入れる熱応答性の基質（Substrat）に関し、特に、表面特性が温度に応じて可変な基質に関する。さらに、本発明は、そのような基質を調整する方法に関し、特に、熱応答性のポリマー材料を基質本体に適用する方法に関する。さらに、本発明は、熱応答性の基質上で生物または生体細胞を培養する方法に関する。本発明の適用例は、生物または生体細胞の生体外での（in vitro：管内での）培養におけるものである。
【背景技術】
【０００２】
有機体または生命体（Organismus）外の基質（Substraten：基板）上で生物または生体細胞（以下、単に生物細胞とも称する）を培養すること（生体外（in vitro）培養）が一般的に知られている。培養用に意図された基質（培養基質）は、典型的には、例えば表面（支持領域、担持領域）が官能化された例えばガラス製またはプラスチック製の固体基質本体を特徴として有する。例えば、プラズマ処理、タンパク質（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、等）での被覆、またはポリマー（例えば、ポリリシン（polylysine)、等）での被覆からなるその官能化によって、各細胞のその表面との相互作用が影響を受ける。生物細胞の目標の操作を可能にし、特に、例えば、接着、移動（Migration：遊走）、増殖、分化または細胞形質転換（腫瘍細胞の形成）のような影響を与える操作を可能にする培養基質について、関心が持たれている。特に、表面からの細胞の穏やかな分離または脱離（Abloesung：剥離）は、基本的な問題である。これは、典型的には、酵素処理（トリプシン処理）によって発生し、これが細胞に対する損傷および細胞の損失を生じさせる可能性がある。
【０００３】
実験において、生物細胞の特性が、培養基質の表面の硬さによって影響される可能性があることが、発見された。例えば、ポリアクリルアミドおよび生体分子での順次の被覆（コーティング）によって得られた硬さの各変化は、間葉（mesenchymalen）幹細胞の様々な分化（Differenzierungen）を生じさせた（Discher et al.,“Cell”, 126 (2006), 677-689参照）。さらに、生物細胞の接着性または粘着性は、基質表面の硬さに依存することが、知られている。
【０００４】
さらに、熱応答性ポリマーが知られている。熱応答性ポリマーは、水性媒体中で或る切替え（スイッチング）温度（ＬＣＳＴ、“下限臨界溶液温度”）を有することを特徴としている。水性媒体は、例えば、純水、市販の緩衝液、細胞培養培地（培養基）、または水と有機溶媒の混合物である。切替え温度より低い温度では、熱応答性ポリマーの水溶液は単相性（monophasic）であり、この温度より高い温度では二相性（biphasic）である。熱応答性ポリマーが表面上に固定化されたとき、それらは、温度が切替え温度を超えたときに水性媒体中で相転移（構造遷移）を行い、それらは切替え温度より低い温度では上述のものよりも強く水和される。
【０００５】
熱応答性（感熱）ポリマー ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（“ＰＮＩＰａｍ”）またはその誘導体で被覆され温度依存の水和性を特徴として有する基質上の接着性が、温度に応じて目標を定めた形態で、影響を受け得ること、が判明した（N. Yamada et al.,“Makromol. Chem.”, 11 (1990), 571; C. Williams et al.,“Adv. Mater.”, 21 (2009), 2161-2164, O. Ernst et al.,“Lab Chip”, 7 (2007), 1322参照）。また、この特性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をベース（基材）とするポリマーまたはポリエチレングリコール系のポリマーで示された（E. Wischerhoff et al.,“Angew. Chem.”, 47 (2008), 5666参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Discher et al.,“Cell”, 126 (2006), 677-689
【非特許文献２】N. Yamada et al.,“Makromol. Chem.”, 11 (1990), 571
【非特許文献３】C. Williams et al.,“Adv. Mater.”, 21 (2009), 2161-2164
【非特許文献４】O. Ernst et al.,“Lab Chip”, 7 (2007), 1322
【非特許文献５】E. Wischerhoff et al.,“Angew. Chem.”, 47 (2008), 5666
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００４／０１１６６９号
【発明の開示】
【０００８】
表面が応答性ポリマーで被覆された通常の基質（例えば、ＷＯ２００４／０１１６６９）は、被覆の調整と細胞培養への適性の両方に関して欠点を有する可能性がある。例えば、熱応答性ポリマーで被覆された基質の調製には、高価な装置アセンブリ（組立体）を用いて実現される幾つかの精巧な処理工程が必要である。さらに、ポリマー組成物のほんの限られた変動（ばらつき）が存在する。例えば、第２のポリマー成分がポリマーに添加された場合に、熱応答性ポリマーの熱応答的挙動（性質）は、変化または消失する可能性がある。従って、熱応答性ポリマーで被覆された基質の別の官能化の導入に関して、ほんの限られた柔軟性が存在するに過ぎない。
【０００９】
基質本体の官能化のための様々な手順またはプロトコルが、例えば、シランとの反応、プラズマ処理または化学的処理のような、熱応答性ポリマーで被覆された基質の調整のために、開発された。この関係で、例えば−ＮＨ２、ＣＯＯＨまたはエポキシドのような、官能基が、基質本体の表面に形成され、それによって、特に熱応答性ポリマーのような補完的な官能化された分子が共有結合することが可能になる。これに関連して、官能化の限られた再現性および制御可能性が、特に、接続または架橋の密度および均質性に関し、並びに具体的な基質材料および化学物質への制限 および硬い平面状の基質本体への制限に関して、不利であること、が判明した。相異なる分子の定められた混合物で表面を調整することは、特定の例外的な事例において多大な努力によって可能であるに過ぎない。
【００１０】
熱応答性ポリマーの次に挙げる特性は、特に生物細胞または生体細胞の培養には不利であることが判明した。熱応答性ポリマーは、一般的に、温度の関数としての物理的な相転移を示すポリマーであり、その際、例えば、ポリマー鎖の再配列が生じる。数℃の温度範囲における溶液中の相転移が鋭い形で定められる一方で、複数の層に固定化された熱応答性ポリマーは広い温度外形（プロファイル、特性）の相転移によって特徴づけられる。従って、或るタイプの付着細胞を基質の表面から解放しまたはその接着を解除するのに、最大１時間で３７℃から２０℃未満の温度へ冷却することが必要であることが、判明した（製造業者ヌンク社（Nunc）からの、ＰＮＩＰａｍ被覆された上部細胞（UpCell）培養基質用の“Application Notes”参照）。しかし、この時間におけるそのような冷却は、関連する細胞機能に影響を与える可能性があるので、望ましくない。さらに、熱応答性ポリマー層が、例えばＭＣＦ７腫瘍細胞またはＭＧ６３骨芽細胞のような、様々な細胞株に対して、効果が不充分であり得ること、が実際に発見された。
【００１１】
通常の技術は、さらに、いわゆる共培養での培養における欠点によって特徴付けられる。培養される細胞タイプには、接着状態における成長のためまたは成長力の維持のために他の細胞からのメッセンジャ（パラクリン因子または傍分泌因子）を必要とするので、付着細胞の培養、成長または徒手操作または分析のプロセスは、しばしば、共培養（例えば、幹細胞、およびフィーダ細胞（feeder cells：支持細胞）またはメラノサイト（メラニン細胞）およびケラチノサイト（角化細胞））において共に実行されなければならない。その後の細胞の分離には、現在のところ、液体の細胞懸濁液（サスペンション）中の細胞分離に基づく方法だけが利用可能である。そのために、細胞は、基質から脱離または分離して分離装置（フローサイトメータ（Durchfluss-Zytometer））に移動させる必要があるが、それは、時間および調整コストと低い収率とに起因する重大な欠点を有する。特に、１０５個未満の細胞数の各サンプルについて、通常の細胞分離法は、細胞懸濁液の形成およびフローサイトメータにおける分離の期間中に過剰に多数の細胞が失われるので、有効または実際的でない。
【００１２】
本発明の目的は、通常の技術の欠点を克服することによって、生物細胞を収容しまたは受け入れるための改良された熱応答性の基質を実現することである。本発明の目的は、改良された熱応答性の基質を実現することであり、特に、簡単な調整、表面特性の設定における高い柔軟性、拡張された官能化能力、細胞タイプの数の増大に対する適合性、および／または、小さい温度差での穏やかな細胞培養および接着性制御に対する適合性、によって特徴付けられる改良された熱応答性の基質を実現することである。本発明の別の目的は、特に生体細胞を収容しまたは受け入れるための、熱応答性の基質を調整する改良された方法を実現することであり、それによって通常の基質調整方法の欠点が克服される。本発明の別の目的は、熱応答性基質を用いて改良された培養方法を実現することであり、それによって通常の培養地の欠点および限界が克服される。
【００１３】
これらの目的は、独立請求項の特徴を有する基質および方法によって達成される。本発明の有利な実施形態および適用例は、従属請求項に記載されている。
【００１４】
本発明の第１の観点によれば、基質、特に、生物細胞を収容しまたは受け入れるための基質であって、支持領域を有する基質本体を有する基質が実現される。本発明によれば、支持領域上に熱応答性ミクロゲルが配置される。等方性の（isotropen）または均質の（homogenen）ポリマー層を有する通常の熱応答性ミクロゲルとは対照的に、本発明による基質は、熱応答性ミクロゲル（熱応答性または感熱性ポリマーを含む粒子）が支持領域上に露出する形態の、基質本体の支持領域によって特徴づけられる。熱応答性ミクロゲルは、所定の臨界温度（切替え温度）で異なる水和状態間での物理的な相転移を示す、支持領域に固定されたポリマー粒子である。
【００１５】
発明の第２の観点によれば、本発明による基質の調整方法では、熱応答性ミクロゲルが分散体または分散液（ミクロゲル分散液、μゲル分散液）として生成される。基質本体の支持領域上に熱応答性ミクロゲルを配置するために、分散液が支持領域に塗布または適用され、また、例えば支持領域から洗浄されて分離されて、過剰なミクロゲルが分離される間に、支持領域に接触する熱応答性ミクロゲルが後者（支持領域）に付着または接続される（verbunden）。
【００１６】
本発明の第３の観点によれば、本発明による基質上の生物細胞の培養方法では、生物細胞は、露出された熱応答性ミクロゲルと接触して配置される。本発明によれば、基質上の細胞の培養条件は、細胞が、非破壊的に脱離し（基質から分離され）、成長し、分化し、および／または細胞移動（遊走）するように、設定されている。
【００１７】
本発明による熱応答性ミクロゲルを有する培養基質の実現には、物理的および／または化学的表面特性の設定、目標とする 表面特性の改変もしくは調節、培養基質の調整、および培養基質の新しい適用例または機能の創成に関して、多数の利点がある。発明者たちは、熱応答性ミクロゲルの相転移が、溶解された熱応答性ポリマーの相転移の狭い温度外形（プロファイル）と同程度の狭い温度範囲内で生じることを見出した。通常の等方性ポリマー層で発生するような、２０℃乃至３０℃の各区間または各間隔にわたる広い温度外形は、本発明によって回避される。
【００１８】
発明者たちは、相転移が、熱応答性ポリマーの強度または堅さパラメータ（例えば、堅さ、塑性変形能または弾性変形能、特に、ヤング率（Young'scher Elastizitaetsmodul：ヤングの剪断弾性係数））の変化によって特徴づけられること、を見出した。強度パラメータと共に、細胞の接着力は、相転移の臨界温度（ポリマーの切替え温度）の上下で変化する。それと同時に、熱応答性ポリマーの含水量が変化する。その結果、細胞の接着力が影響を受ける。接着力の設定は、通常のポリマー層より高い信頼性および再現性で可能であるという利点がある。発明者たちは、固定されたミクロゲルの相転移で、表面の相互作用の大幅な（有意な）数の増加が、提供されまたは中断され、従って、細胞の、温度制御された解放の信頼性が向上することを、見出した。
【００１９】
目標とする表面特性の調節または改変に関して、特別な利点として、本発明による基質が、熱応答性ミクロゲルの応答的振舞い（活動、特性）を失うことなく、生物細胞に対する官能化を生じさせることができる、ことが示された。本発明による基質の調整の利点は、数週間または数ヶ月にわたる粒子分散（液）の安定性と、ミクロゲルで支持領域を被覆した後の基質の即時利用性から得られる。熱応答性基質の官能化は、新しい適用例、例えば、基質表面上の細胞移動（遊走）の受動的な制御に関する、または所定の基質領域における目標とする細胞の脱離に関する新しい適用例、を提供する。
【００２０】
本発明による基質は、生物細胞用の培養基質である。その基質は、生物体細胞を収容しまたは受け入れ、生理的な培養条件を提供するよう構成される。特に、その基質は、液体培養培地に細胞を収容しまたは受け入れるよう適合化され、即ち支持領域は培養培地を収容しまたは受け入れるのに適している。基質本体は、剛性のまたは可撓性の若しくは柔軟な（折り曲げ可能な）固体材料から生成してもよい。基質本体の材料は、好ましくは温度安定性があり、特に熱応答性がない。支持領域は、好ましくは平坦な領域であるが、代替的に、湾曲する形態で形成することができる。
【００２１】
熱応答性ミクロゲルには、生理的温度範囲で相転移を示すポリマーが含まれる。特に体積相転移である相転移は、４０℃より低い温度で、特に３７℃より低い温度で、例えば３５℃より低い温度で生じることが好ましい。相転移は、１０℃より高い温度で、特に２０℃より高い温度で、例えば３２℃より高い温度で生じることが好ましい。相転移が生じる温度区間または間隔（Temperaturintervall）は、好ましくは１５℃より低く、特に１０℃より低く、例えば５℃またはそれより低い。
【００２２】
熱応答性ミクロゲルは、少なくとも１種の非荷電の（荷電されていない）非イオン性の（イオン化可能でない）ポリマーで形成されることが好ましい。特に好ましくは、そのミクロゲルは、少なくとも１種の非荷電の非イオン性のポリマーの少なくともその表面上に構成される。そうすることによって、細胞表面との不所望な相互作用が最小限に抑えられる、という利点がある。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態によれば、熱応答性ミクロゲルは、以下の複数のポリマーまたは複数のポリマー群のポリマーの中の少なくとも１種から形成される。
【００２４】
（１）ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、
【００２５】
（２）−Ｘ−（−ＣＨ２−ＣＲ１ＣＯＯ−Ｒ２−）ｎ−（−ＣＨ２−ＣＲ１ＣＯＯ−Ｒ３−）ｍ−Ｒ４、またはそのコポリマー（共重合体）、
【００２６】
（３）−Ｘ−［（−ＣＨ２−ＣＲ１ＣＯＯ−Ｒ２−）ｎ−（−ＣＨ２−ＣＲ１ＣＯＯ−Ｒ３−）ｍ−Ｒ４］２、またはそのコポリマー、
ここで、Ｘは支持領域に対する結合基であり、Ｒ１はＨまたはＣＨ３であり、Ｒ２／Ｒ３は、少なくとも１つのエーテル基を有する脂肪族炭化水素鎖、好ましくは１乃至２０のエーテル基（好ましくは、ポリエチレンオキオキシド）を有する脂肪族炭化水素鎖であり、Ｒ４は−Ｈ、脂肪族炭化水素鎖または官能基、例えば、− ハロゲン（基）、−Ｎ３（基）、−チオカルボニル（基）、−（ジ）チオカルバミル（基）である。
【００２７】
（４）次の一般的な構造のホモポリマー（単独重合体）またはコポリマー（共重合体）。
【化１】
2013521809.tif 000003
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、Ｈまたはアルキル（基）であり、好ましくは、Ｒ１はイソプロピル（基）であり、Ｒ２は Ｈであり、ｎ＝０である。
【００２８】
（５）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化２】
2013521809.tif 000004
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル（基）、アルキニル（基）、アリール（基）であり、好ましくは、−Ｒ３は−イソプロピル、−Ｒ４は−Ｈ、−Ｒ４および−Ｒ５は、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ３または−Ｈであり、特に好ましくは、−Ｒ３は−イソプロピル、−Ｒ４は−Ｈ、およびｍ：ｎ＝１００：０であり、
および／または、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、
【化３】
2013521809.tif 000005
であり、
ここで、Ｒ７乃至Ｒ１１は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、−アルキロイル（alkyloyl）（基）であり、少なくとも１つのＲはＨである。
【００２９】
（６）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化４】
2013521809.tif 000006
ここで、Ｒ１、Ｒ２はＨまたはＣＨ３であり、Ｒ３、Ｒ４はＨまたはアルキルであり、ｘ、ｙ＝０乃至２０である。
【００３０】
（７）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化５】
2013521809.tif 000007
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好ましくは−ＣＨ３であり、
Ｒ３、Ｒ５は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好まくは−Ｈであり、
ここで、Ｒ３が−Ｈでない（≠−Ｈ）場合、Ｒ５は−Ｈであり、
Ｒ４、Ｒ６は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび／または−ＣＨ３、特に好ましくは−ＣＨ３であり、
もし、Ｒ３、Ｒ５が−Ｈ、およびＲ４、Ｒ６が−ＣＨ３、ｘ＝１およびｙ＝７．５の場合、ｍ：ｎは、好ましくは９５：５乃至９０：１０、特に好ましくは９３：７であり、
もし、Ｒ３、Ｒ５が−Ｈ、およびＲ４、Ｒ６が−ＣＨ３、ｘ＝１およびｙ＝４．５の場合、ｍ：ｎは、好ましくは９３：７乃至８０：２０、特に好ましくは８５：１５である。
【００３１】
（８）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化６】
2013521809.tif 000008
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈであり、
Ｒ３、Ｒ５は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好まくは−Ｈであり、
ここで、Ｒ３が−Ｈでない（≠−Ｈ）場合、Ｒ５は−Ｈであり、
Ｒ４、Ｒ６は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび／または−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈであり、
もし、Ｒ１、Ｒ２が−Ｈ、およびＲ４、Ｒ６が−ＣＨ３、ｘ＝３およびｙ＝４の場合、ｍ：ｎは、好ましくは６５：３５乃至４５：５５、特に好ましくは６０：４０乃至５０：５０である。
【００３２】
（９）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化７】
2013521809.tif 000009
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈであり、
Ｒ３、Ｒ５は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好まくは−Ｈであり、
ここで、Ｒ３が−Ｈでない（≠−Ｈ）場合、Ｒ５は−Ｈであり、
Ｒ４、Ｒ６は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび／または−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈである。
【００３３】
（１０）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化８】
2013521809.tif 000010
ここで、Ｒ１、Ｒ２はＨまたはＣＨ３であり、Ｒ３、Ｒ４はＨまたはアルキルであり、ｘ、ｙ＝２乃至２０である。
【００３４】
（１１）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化９】
2013521809.tif 000011
ここで、Ｒ１はＨまたはＣＨ３、ｘ＝３乃至５であり、コポリマーではｘ＝３およびＸ＞３である。
【００３５】
（１２）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化１０】
2013521809.tif 000012
ここで、Ｒ１、Ｒ３は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好まくは−Ｈであり、
ここで、Ｒ３が−Ｈでない（≠−Ｈ）場合、Ｒ５は−Ｈであり、
Ｒ２、Ｒ４は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび／または−ＣＨ３、特に好まくは−ＣＨ３である。
【００３６】
（１３）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化１１】
2013521809.tif 000013
または
【化１２】
2013521809.tif 000014
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈであり、
Ｒ３、Ｒ５は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好まくは−Ｈであり、
ここで、Ｒ３が−Ｈでない（≠−Ｈ）場合、Ｒ５は−Ｈであり、
Ｒ４、Ｒ６は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび／または−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈである。
【００３７】
（１４）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマーである。
【化１３】
2013521809.tif 000015
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールである。
【００３８】
（１５）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化１４】
2013521809.tif 000016
または、組成物中のこの３つの要素のコポリマー。
ここで、Ｒ１は、−Ｈ、−アルキル、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３、特に好ましくは−Ｈであり、
Ｒ２、Ｒ３は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールであり、
２≦ｎ≦１０、好ましくは３≦ｎ≦６である。
【００３９】
（１６）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化１５】
2013521809.tif 000017
ここで、−Ｒは、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールであり、好ましくは−Ｒは−アルキルであり、特に好ましくは−Ｒは−ＣＨ３である。
【００４０】
（１７）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化１６】
2013521809.tif 000018
ここで、Ｒ１、Ｒ３は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび−ＣＨ３であり、
ここで、Ｒ１が−Ｈでない（≠−Ｈ）場合、Ｒ３は−Ｈであり、
Ｒ２、Ｒ４は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは−Ｈおよび／または−ＣＨ３である。
【００４１】
（１８）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化１７】
2013521809.tif 000019
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールである。
【００４２】
（１９）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化１８】
2013521809.tif 000020
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、好ましくは、Ｒ１は−ＣＨ３、ｎ＝０である。
【００４３】
（２０）次の一般的な構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【化１９】
2013521809.tif 000021
ここで、Ｒ１〜Ｒ６は、−Ｈ、−アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキロールであり、少なくとも２つのＲはＨである。
【００４４】
（２１）セルロース以外の多糖骨格（Polysaccharidgeruesten）をベース（基材）とする、１９より小さい（上記（１）〜（１９）の）、類似した構造のホモポリマーまたはコポリマー。
【００４５】
（２２）エラスチン状の（エラスチンと同様の）複数の単位（ユニット）を有するホモポリマーまたはコポリマーである。
【００４６】
（２３）変更された単量体（モノマー）を有する上述の全ての単位（ユニット）のコポリマー。
【００４７】
上述のコポリマーは、ランダムな、交互の、またはブロック状のコポリマーとすることができる。
【００４８】
上記（４）〜（２５）によるポリマーにおいて、ポリマー主鎖（またはポリマー骨格）の少なくとも１つの末端の単位（ユニット）は、支持領域に対する結合基を含むことが好ましい。
【００４９】
支持領域は、基質本体の直接的な表面であることができ、例えば、ガラス、シリコン、またはプラスチックで形成され、例えば、ポリスチレン、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、ポリカーボネートのようなプラスチック製のものであり、または、この上に金属膜によって形成することができ、例えば、金、銀、白金、チタンまたはクロムで形成することができる。支持領域の化学的組成に応じて、Ｘは、官能基とすることができ、例えば−ＳＳ−、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２（ＳＳは左右対称的に置換されたジスルフィド基）とすることができる。好ましくは、ｎ＋ｍ＞１０である。
【００５０】
これらのポリマーは、物理的または化学的表面特性を設定するときに、生体適合性または適応性（柔軟性、順応性）について、特に有利であることが判明した。
【００５１】
支持領域上のミクロゲルは、全て、単一（１種）のポリマーから同様に形成することができる。ミクロゲルが、代替的な変形例により、少なくとも２種（２つ）の異なるポリマーで形成されるとき、その結果として、表面特性の設定に関する利点が得られる。さらに、この場合、相異なる組成を有するミクロゲルを、支持領域上に配置することができる。相異なる組成を有するミクロゲルは、例えば支持領域上に相異なる培養条件を与えるように、複数の部分領域に別々に配置することができる。代替形態として、その相異なる組成を有するミクロゲルは、支持領域上に混合し分散して配置することができる。代替形態としてまたは追加形態として、複数のミクロゲルは、異なる直径を有することができる。例えば、相異なる直径を有する複数の熱応答性ミクロゲルは、支持領域の相異なる部分領域に別々に固定することができ、または支持領域上に混合し分散して配置することができる。
【００５２】
利点として、分散されたコロイド粒子の各所定の直径（径）を有する各ミクロゲルを製造することができる（M. Andersson, S.L. Maunu,“J. Poly. Sci.”, B 44 (2006), 3305; X. Wu et al.,“Coll. Poly. Sci.”, 272 (1994), 467参照）。これによって、そのサイズを、または、相異なる径を有する粒子が配置される場合には複数の熱応答性ミクロゲルの相異なるサイズを、目標として設定することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、熱応答性ミクロゲルは、少なくとも１０ｎｍの直径（径）を有し、特に少なくとも２０ｎｍ、特に好ましくは少なくとも５０ｎｍ、例えば少なくとも１００ｎｍの直径を有する。その粒径の上限は、５０μｍであることが好ましい。熱応答性ミクロゲルの直径は、特に好ましくは３０μｍ以下（３０μｍに等しいまたは３０未満μｍ）であり、特に２０μｍ以下（２０μｍに等しいまたは２０μｍ未満）であり、例えば、１０μｍ以下（１０μｍに等しいまたは１０μｍ未満）であり、例えば１μｍ未満である。
【００５３】
別の変形形態によれば、熱応答性ミクロゲルはコア−シェル（中心部−外殻）構造を有することができ、コアは、非熱応答性材料、特に固形担体（支持）粒子、または架橋型の熱応答性材料のいずれかで構成することができる。シェルは、熱応答性ポリマー材料だけで構成されることが好ましい。固体担体粒子は、無機ガラス、金属、セラミックまたはプラスチック、特にポリメチルメタクリレートまたはポリスチレン、で形成することができ、その固体担体粒子を使用することによって、本発明による基質の表面の或る最小の硬さの形成に関する利点を得ることができる。熱応答性ミクロゲルのコアの凝集または結合（Zusammenhalt）は、好ましくは、二次原子価相互作用または二次価電子相互作用（Nebenvalenz-wechselwirkungen）（分子間の非共有結合性相互作用、例えば、ファンデルワールス相互作用、水素結合、疎水性相互作用）によって、または化学的架橋によって、生じることが好ましい。
【００５４】
さらに、コア−シェル型の粒子は、粒子の力学的凝集に影響を与えることなく、非架橋または弱い架橋のポリマー鎖をミクロゲル中に組み込む可能性を与える。非架橋または弱い架橋のミクロゲルには、熱応答性鎖が高い移動性を維持し、従って相変化の期間における立体的な構造変化（Konformationsaenderung）がより高い有効性を有することができる、という利点がある。弱い架橋の粒子が用いられる場合は、架橋密度は２０個の繰り返し単位（ユニット）当り１個以下であるべきであり、好ましくは、１００個の繰り返し単位（ユニット）当り１個と、５００個の繰り返し単位（ユニット）当り１個との間の値である（１／１００〜１／５００）ことが好ましい。顕著な熱応答性効果を達成するために、シェルの厚さは少なくとも１０ｎｍであり最大で４００ｎｍであるべきであり、好ましくは３０ｎｍと１００ｎｍの間（３０ｎｍ乃至１００ｎｍ）であるべきである。コア−シェル型の粒子の生成に関する一般的な例が、例えば、Schuller,“Kolloid Z. Z. Polym.”, 211, 113-121 (1966)、Fulda et al.,“Progr. Colloid Polym. Sci.”, 101, 178-183 (1996)、またはGao et al.,“Macromolecules”, 39, 3154-3160 (2006)に記載されている。
【００５５】
支持領域上の熱応答性ミクロゲルの層の厚さは、ミクロゲルの直径または径より小さいかまたはそれに等しいことが好ましい。ミクロゲルは、単層を形成するが好ましい。特に、閉じた単層、即ちミクロゲルを有する支持領域の閉じた（密の）被覆またはカバー、またはミクロゲル相互間に隙間を有する部分単層を設けることができる。固定されたミクロゲルは平坦化された形状を有することができるので、熱応答性ミクロゲルの層の厚さは、粒径よりも小さくすることができる。多層の場合と比較すると、ミクロゲル単層には、生物細胞の接着をより高い信頼性で制御することができる、という利点がある。
【００５６】
代替形態として、一層は熱応答性ミクロゲルの幾つかの層を含むことができる。この場合、結果的に、欠陥に対する大きい構造安定性（堅牢性）による利点が、得られる。
【００５７】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、支持領域に接着促進剤を用いることができる。ミクロゲルの固定化に適し生体適合性のある全ての各物質を、接着促進剤として使用することができる。接着促進剤は、例えば、支持領域および熱応答性ポリマーとの共有結合を形成することができる。さらに、特定の生物学的な受容体（Rezeptor：レセプタ）−リガンド（Ligand）結合、例えば、ストレプトアビジン（Streptavidin）とビオチン（Biotin）の結合を、ポリマーの固定化に用いることができる。最後に、接着促進剤は、例えば電荷相互作用、疎水性相互作用またはファンデルワールス相互作用のように、非特異的な相互作用によって、ポリマーを結合するよう設計することができる。これらの相互作用によって、熱応答性ポリマーは、温度に関係なく、支持領域上に良好に固定される。支持領域上での粒子の固定は、熱応答性ポリマーの相転移に関係なく、持続する。
【００５８】
本発明の別の特に好ましい実施形態によれば、基質に、少なくとも１種（１つ）のモジュレータ物質（Modulatorsubstanz：調節因子物質、調整因子物質、修飾物質）が設けられる。少なくとも１種のモジュレータ物質は、基質の露出表面上に配置され、即ち、熱応答性ミクロゲル間に配置され、および／または、少なくとも部分的にこれらを覆ってまたは重複して配置される。利点として、少なくとも１種のモジュレータ物質を用いることによって、基質の官能化が可能になる。従って、本発明のこの実施形態は、このような官能化に適さないであろう熱応答性ポリマーを有する通常の培養基質と比較して、重大なまたは有意な改善を示す。これとは対照的に、少なくとも１種のモジュレータ物質は、ミクロゲルの温度特性を損なうまたは温度特性に影響を与えることなく、基質上の培養条件に影響を与えることができる。
【００５９】
利点として、様々な異なるタイプのモジュレータ物質を単独でまたは組み合わせて使用することができる。例えば、生物細胞の接着能力を増大させるモジュレータ物質（接着力を増大させるモジュレータ物質、細胞を引きつける分子）を使用することができる。これに関連して、次の物質の中の少なくとも１つが挙げられる。
−  生体分子、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、
−  接着促進ペプチド、例えば、アミノ酸配列ＲＧＤを含むペプチド、
−  合成ポリマー、例えば、ポリ−Ｌ−リジン（poly-L-Lysin）、スルホン酸ポリスチレン（Polystyrolsulfonat）、ポリアリルアミン（Polyallylamin）、ポリエチレンイミン（Polyethylenimin）。
【００６０】
代替形態として、生物細胞の接着能力を低減するモジュレータ物質（接着力低減モジュレータ物質、細胞を遠ざける（反発）分子）を用いることができる。この場合、次の物質の中の少なくとも１つがモジュレータ物質として使用される。
−  タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン（Rinderserumalbumin）（bovine serum albumin、ＢＳＡ）、
−  接着力低減ペプチド、例えば、高いロイシン（leucine）およびイソロイシン（isoleucine）の含有量を有するペプチド、
−  合成ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）の鎖を含むポリマー、および
−  脂質。
【００６１】
さらに、接着力を増大させるモジュレータ物質および接着力を低減するモジュレータ物質を、基質上に組合せて設けまたは配置することができる。例えば、様々な異なる効果を有するモジュレータ物質を、支持領域の相異なる部分領域に別々に、または支持領域上に混合し分散して配置することができる。後者の場合、接着力増大モジュレータ物質と接着力低減モジュレータ物質の混合比によって、有効な接着能力または接着力を基質の表面に設定でき、同時に熱応答性ミクロゲルを使用することによって、温度依存性の、細胞の固定または分離もしくは脱離が維持される。
【００６２】
本発明の別の変形形態によれば、代替的にまたは追加的に、生物細胞における細胞反応（応答）を誘導するのに適したモジュレータ物質が使用できる。例えば、反応（応答）を誘発するように細胞の表面受容体に付着するモジュレータ物質を与えることができる。この機能のために、物質、例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のタンパク質、例えばフィブロネクチン（fibronectin）、成長因子を結合する受容体に対する抗体（ＥＧＦＲ）、または、例えばＴ細胞のＣＤ２８およびＣＤ３等に対する抗体（免疫反応の活性化）が、特に好ましく与えられる。
【００６３】
本発明の別の利点は、少なくとも１種のモジュレータ物質の与え方の柔軟性によって得られる。第１の変形例によれば、提供されるモジュレータ粒子は、少なくとも１種のモジュレータ物質で構成され、またはその物質で被覆され、支持領域上の熱応答性ミクロゲル相互間に配置される。モジュレータ粒子は、利点として、ミクロゲルに加えられ、支持領域上に後者（ミクロゲル）と共に塗布することができる。代替形態としてまたは追加的に、少なくとも１種のモジュレータ物質は、熱応答性粒子を配置できる支持領域上の物質層として形成することができる。
【００６４】
本発明の別の実施形態によれば、支持領域上の基質の表面特性の空間的な調節を実現できるという利点がある。支持領域は、少なくとも２つの部分領域に相異なる表面特性を有する。利点として、それらの部分領域は、熱応答性ミクロゲル、接着促進剤および少なくとも１種のモジュレータ物質の中の少なくとも１種を、少なくとも１つの空間密度勾配を有する支持領域上に配置することによって、形成することができる。基質の表面の上述の成分の中の少なくとも１つには、支持領域に沿った少なくとも１つの方向に可変である空間密度が与えられる。密度勾配は、段階的にまたは連続的に形成することができる。少なくとも１つの密度勾配を設けることによって、利点として、支持領域に沿った細胞は、相異なる接着能力、相異なる温度応答（反応）、相異なる細胞応答（反応）、例えば、相異なる分化、および／または相異なる細胞移動もしくは遊走（Zellwanderungen）、を示すことができる。
【００６５】
本発明の別の有利な実施形態によれば、少なくとも１つの培養キャビティ（空洞）を支持領域上に設けることができる。培養キャビティは、支持領域を部分的に覆うまたは支持領域に部分的に重なるように形成されその支持領域を越えて突出する突起部である。培養キャビティは、例えば、片側が開いた中空空間またはポケット状の形状を含み、少なくとも１つの生物細胞または生体細胞を収容しまたは受け入れるように適合化されている。培養キャビティによって、空間的な培養条件が、セル構造の形の培養において、複製またはシミュレートされる。
【００６６】
利点として、基質の表面の官能化のための少なくとも１つの密度勾配は、細胞が培養キャビティに移動または遊走してそこで別の培養および／または分化を生じるようにされる形態で、形成することができる。
【００６７】
本発明による基質は、生物細胞の培養のために設計される。この目的を達成するために、基質本体は、培養装置の一部であることが好ましく、例えば、細胞が培養可能である培養容器または流体装置、例えばマイクロ流体システムである。基質本体は、培養装置に固定することができ、例えば培養容器の底部を形成することができ、または、培養装置から分離可能であり、例えば、培養容器内に挿入できる一部分を構成する。
【００６８】
生物細胞を培養するための本発明による方法は、次の方法の工程（ステップ）の中の１つまたは複数の工程で実行することができる。例えば、基質上の生物細胞の接着性の設定は、基質の温度を設定することによって実現できる。温度の設定は、基質全体に対して大域的に（グローバルに）または少なくとも１つの部分領域に対して局所的に（ローカルに）行うことができる。温度を設定することによって、基質表面の堅さ（強さ）パラメータが影響を受ける。さらに、少なくとも１つのタイプの生物細胞の、細胞タイプ固有の移動または遊走の設定は、少なくとも１つの細胞タイプ（種類、型）の細胞、例えば少なくとも１つの分化タイプの細胞を刺激して、その細胞がモジュレータ物質の濃度勾配に沿って移動するようにすることによって、実現できる。さらに、少なくとも１つの細胞体タイプの細胞の移動の設定は、生物細胞が培養キャビティ中に移動するような、モジュレータ物質の密度勾配によって、実現できる。
【００６９】
本発明の更なる詳細および利点を、図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、本発明による基質の第１の実施形態の概略的な斜視図である。
【図２】図２は、熱応答性ミクロゲルの相転移の概略図である。
【図３】図３は、熱応答性ミクロゲルの相転移を示す実験結果を示している。
【図３Ｃ】.
【図４】図４は、コア−シェル構造を有する熱応答性ミクロゲルの概略図である。
【図５】図５〜８は、本発明による基質の他の実施形態を示している。
【図６】.
【図７】.
【図８】.
【図９】図９は、本発明による基質を備えた培養装置の概略図である。
【図１０】図１０〜１３は、少なくとも１種のモジュレータ物質を備えた、本発明による基質の他の実施形態の概略図である。
【図１１】.
【図１２】.
【図１３】.
【図１４】図１４〜１７は、表面成分の密度勾配を有する、本発明による基質の他の実施形態の概略図である。
【図１５】.
【図１６】.
【図１７】.
【図１８】図１８は、培養キャビティを有する、本発明による基質の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本発明の好ましい実施形態を、培養基質の支持領域（または保持領域）上への熱応答性ミクロゲルの供給または配置と、その任意に行われる官能化とを参照して、説明する。培養方法の詳細、特に生物細胞または生体細胞およびその目標とする影響を取り扱う方法は、従来技術で知られているので、説明しない。さらに、図面は、本発明による培養基質の断面の概略的拡大図であることを強調しておく。本発明の実際の実現形態は、例示のものに限定されることなく、基質の変更された形状、サイズおよび組成で実現することも可能である。
【００７２】
図１は、本発明による、上面（支持領域２）に熱応答性ミクロゲル３が配置された基質本体１を有する基質１０の第１の実施形態を概略的斜視図で示している。基質本体１は、例えば、金属類、例えば、金、チタン、白金、ガラス、シリコン・ウェハ、等、または、プラスチック類、例えば、ポリスチレン、ＣＯＰ、ポリカーボネート、等で形成され、その表面は支持領域（Traegerflaeche：担持領域）２を形成する。熱応答性ミクロゲル３は、熱応答性ポリマーのコロイド成分から形成される。熱応答性ミクロゲル３は、概略的に示された球形状以外に、実際には、例えば、半球形状または被覆条件に応じて不規則に変形されまたは歪んだ形状を有することができる。
【００７３】
熱応答性ミクロゲル３は、例えばＰＮＩＰａｍから生成されたものであり、図２Ａ〜２Ｃに概略的に示された相転移を示す。熱応答性ミクロゲル３は、架橋されたコア３．１を含み、そのコアからポリマー鎖３．２が外側に放射状にまたは半径方向に突出するように形成される。培養の適用例において、典型的には数℃、例えば２℃〜１０℃、３７℃未満に選択される臨界温度（“より低い臨界溶液温度”（lower critical solution temperature）、ＬＣＳＴ；切替え温度、転移温度）より高い温度では、ポリマー鎖３．２が折り畳み状態で存在する（図２Ａ）。所定の温度差ΔＴだけ冷却して臨界温度より低い温度になったとき、ポリマー鎖３．２は、非折り畳み（膨潤）状態に変化する（図２Ｂ）。熱応答性ミクロゲルの大きさまたはサイズは、流体力学的な（hydrodynamischen）半径で記述され、その折り畳み状態での半径（Ｒ１）はその非折り畳み状態での半径（Ｒ２）よりもより小さい。非折り畳み状態（即ち、臨界温度より低い温度）では、鎖橋（チェーン・ブリッジ、鎖間の架橋）３．３がポリマー鎖３．２（図２Ｃ）相互間に残り、それが機械的変形特性に影響を与え、従って生物細胞用の基質１０の接着特性に影響を与える。
【００７４】
実際の例では、折り畳まれた粒子の半径Ｒ１は、例えば２ｎｍ乃至５μｍの範囲内に選択される。それに対応して、非折り畳み状態の半径Ｒ２は、例えば４ｎｍ乃至１０μｍの範囲内に達するようにすることができる（例えば、２００ｎｍ乃至４２０ｎｍまたは３００ｎｍ乃至４８０ｎｍ、Wu et al.,“Coll. Poly. Sci.”272 (1994) 467参照；例えば、９２ｎｍ乃至２００ｎｍ、４２ｎｍ乃至９７ｎｍ、２９ｎｍ乃至６５ｎｍ、および１９ｎｍ乃至３５ｎｍ、M. Andersson et al.,“J. Poly. Sci.”B44 (2006), 3305参照）。
【００７５】
熱応答性ミクロゲル３を支持領域２上に固定（不動）化するために、ミクロゲル粒子をコロイド粒子として含むミクロゲル分散液（dispersion）が最初に生成される。半径Ｒ１はミクロゲルの生成の期間におけるその反応条件によって設定される。そのミクロゲル分散液は安定に保存することができる。
【００７６】
ミクロゲル分散液の生成において、次のような粒子の各パラメータが設定されることが好ましい。
−  ポリマー鎖（チェーン）長さ、
−  架橋密度（例えば、鎖橋の形成）、
−  折り畳み状態での粒子半径Ｒ１、
−  非折り畳み状態での粒子半径Ｒ２、
−  折り畳み状態でのヤング率、
−  非折り畳み状態でのヤング率、および
−  （任意選択的に）内側から外側の方向における半径方向の剛性の勾配（Gradient der Steifigkeit）。
【００７７】
その各ミクロゲル・パラメータは、基質１０の適用例に応じて選択される。上述の特性を有する複雑なパラメータ空間がスパンされる（aufgespannt：広がる）が、具体的に使用されるそのパラメータの選択は、培養される細胞、および（幾何学的に、物理的に、化学的に）実現される培養条件に応じて、例えば、簡単な試験または表形式の値を用いることによって、可能である。発明者たちは、熱応答性ミクロゲル３上の生物細胞の接着とその弾性特性の間には、強い相関関係、特にミクロゲルの弾性特性の選択によって培養条件の最適化を達成することができるような、強い相関関係が存在すること、を発見した。例えば、ミクロゲルのヤング率を６００ｋＰａ（ＬＣＳＴより高い温度で）から１００ｋＰａ（ＬＣＳＴより低い温度で）へ変化させたときに（図３Ｃ参照）、非常に良好な接着または細胞脱離（分離、剥離）特性が得られること、が判明した。
【００７８】
基質１０を調整または準備するために、ミクロゲルが支持領域２に塗布または配置される。既知の堆積技術または被着技術、例えば、スピン・コーティング、浸漬、スプレー、スタンピング、または、例えば針またはディスペンサ・ノズルなどでの分注（ディスペンス）など、が用いられる。熱応答性ミクロゲル３は、支持領域２に接触し、例えば、支持領域２と共有結合する。その後、支持領域２は、例えば水などで洗浄されて、過剰で結合しなかった粒子が分離される。図１に概略的に示されているように、支持領域２に固定された応答性ミクロゲル３は、規則的な密な充填、または代替的に間隙のある不規則な充填を形成することができる。
【００７９】
その後、ミクロゲル３が配置された支持領域２の乾燥を行うことができる。但し、乾燥処理は必須ではない。代替形態として、追加的な生物細胞の官能化または生物細胞の培養を、洗浄の直ぐ後に行うことができる。さらに、例えば、電離性またはイオン化放射線（ガンマ線）またはガス処理（例えば、エチレンオキシドで）によって、熱応答性粒子の露出面の殺菌を行うことができる。
【００８０】
図１に概略的に示されているように、少なくとも１つの生物細胞２１が、折り畳み状態の熱応答性ミクロゲル３を有する表面上に接着的に配置される。温度を低下させることによって、熱応答性ミクロゲル３の非折り畳み状態への相転移を誘導することができ、その非折り畳み状態では、熱応答性ミクロゲル３を有する表面の硬さが、折り畳み状態の場合と比較して低減される。少なくとも１つの生物細胞２１は、低減された硬さを有するその表面上で低減された接着能力を有し、分離または脱離することができるようになり、例えば、基質の上の液体培地（培養基）によって洗い落とすまたは洗い流すことができる（図１には示されていない）。
【００８１】
図３には、熱応答性ミクロゲル３の相転移を示す実験結果が例示的に示されている。図３Ａは、様々な異なる温度における原子間力顕微鏡を用いて測定された、個々のミクロゲル３（ＰＮＩＰａｍ）のトポグラフィ（地形図）を例示している。図３Ｂには、吸着状態のミクロゲル３の膨張曲線または膨潤曲線が示されている。図３Ｂにおける小さいグラフは、ミクロゲル３の頂点に関する平均の高さプロファイル（外形）（直径座標の関数としての高さＨ、それぞれμｍ単位）を示している。最後に、図３Ｃは、原子間力顕微鏡を用いた測定から導出されたミクロゲルのヤング率の温度依存性を示している。ヤング率が３７℃で３００ｋＰａを超える一方で、ヤング率は２５℃で１００ｋＰａ未満の値に減少する。同時に、その粒子は、より高い温度で低い含水率約６５％を有し、その一方で、ミクロゲルの含水率は２５℃で約９０％である。
【００８２】
その実験結果は、ミクロゲル３の熱応答特性、特に吸着状態での相転移の急激に変化する（鋭い）温度プロファイルが、液体状態のものと同等であることを示している。マウス線維芽細胞を用いた実験の試験によって、表面上の線維芽細胞の接着が、ヤング率の変化によって相転移が測定された温度範囲内で、相転移温度より高い温度での接着状態から、相転移温度より低い温度での非接着状態へと変化することができること、が示された。細胞は、相転移温度より高い温度、例えば３７℃では、相転移温度より低い温度におけるよりも、基質との間により大きい接触面積を有する。
【００８３】
図４〜６は、特に具体的な培養の課題に応じて選択できる本発明の変形例を示している。例えば、図４によれば、コア−シェル構造を有する熱応答性ミクロゲル３が実現される。コア３．４は、例えばラテックスで形成されたものであり、培養条件下では変化せず、特に温度が変化する場合にも、変化しない。シェル３．５は、熱応答性ポリマー、例えばＰＮＩＰａｍによって形成される。コア−シェル構造を有する粒子を形成するためのミクロゲル分散液の調整そのものは既知である（Hellweg et al.,“Langmuir” 20 (2004), 4330；Fernandez-Barbero et al.,“Phys Rev E 66” (2002), 051803／1-10参照）。支持領域上でのコア−シェル構造を有する熱応答性ミクロゲル３の固定と、基質の更なる処理とが、図１に関連して上述したように行われる。
【００８４】
熱応答性ミクロゲル３は、支持領域２上に、密状態のまたは閉じた状態の単層（図５）または隙間が介在する密でない状態または閉じていない状態の単層（図６）を形成することができる。図５による熱応答性ミクロゲルの規則的なアレイまたは配列は、自己組織化（最密の充填の形態）によって生成することができる。これとは対照的に、図６による閉じていない層では、熱応答性ミクロゲル３の規則的なアレイまたは配列は、支持領域の予備理、例えば局所的に塗布された接着促進剤の複数の島によって、達成することができる。図５および６とは異なる形態で、熱応答性ミクロゲル３は、支持領域２上に不規則なアレイまたは配列を形成することができる。
【００８５】
図７および８は、接着促進剤４が支持領域２上に配置される場合に、支持領域２上の熱応答性ミクロゲル３の固着性が改善できることを、概略的に示している。接着促進剤４は、支持領域２を完全に覆い（図７）、従って、調整された支持領域を形成することができ、その支持領域は熱応答性ミクロゲル３を固定するために露出される。図８は、臨界温度より高い温度での折り畳み状態の熱応答性ミクロゲル３（図８Ａ）、および臨界温度より低い温度での非折り畳み状態の熱応答性ミクロゲル３（図８Ｂ）を有する、本発明による基質１０の断面を示している。さらに、図８Ｂは、接着促進剤４とその一方側の基質本体１の間と、接着促進剤４とその他方側の熱応答性粒子３との間に形成された結合または接着の各変形例を、概略的に示している。例えば、結合部位または結合位置３．６は、接着促進剤４との共有結合または生物特異的（biospezifische）結合４．１のための、熱応答性ミクロゲル３のポリマー鎖３．２の自由末端に設けることができる。結合部位３．６は、ミクロゲルの生成の期間中に形成することができる。共有結合は、ポリマー鎖３．２の各自由末端における、例えば、エポキシ、カルボキシ、アミノ、ヒドラジド、チオールまたはマレイミド結合に基づくものである。共有結合または生物特異的結合４．１を形成するために、接着促進剤層４には、熱応答性ミクロゲル３の結合部位３．６と反応する結合部位４．２がそれに対応して設けられる。同時に、結合部位４．２は、基質本体１との間に共有結合または生物特異的結合を形成する。特に、生物特異的結合は、例えば、レセプタ−リガンド結合、例えばストレプトアビジンとビオチンの間の結合によって、形成することができる。
【００８６】
図８Ｂの左側には、接着促進剤４の効果が、一方の熱応答性粒子３との間の非特異的な相互作用４．３、および他方の基質本体１との間の非特異的な相互作用４．３に基づいて得られるものであることが、概略的に示されている。
【００８７】
接着促進剤４は、例えば１ｎｍ乃至１μｍの厚さ有するビオチン層を含んでいる（Spinke et al.,“J. Chem. Phys.” 99 (1993), 7012；Hong et al.,“Progr. Colloid Polym. Sci.”93 (1993), 98；Zao et al.,“Electroanal.” 18 (2006), 1737参照）。その層は、既知の方法で、例えばスピン・コーティングまたはその溶液からの自己組織化によって、基質本体１の表面上に形成される。
【００８８】
本発明による基質１０は、図９に例示的に示されているような、培養装置３０の一部とすることができる。培養装置３０は、底部３２および周囲の側壁３３を有する培養容器３１を含んでいる。培養容器３１は、液体培地３４を収容または受け入れるよう意図されており、液体培地３４は、供給ライン（管）３５を通して培養容器３１内に導入することができ、培養容器３１から出口ライン３６を通して取り出すことができる。本発明による基質１０は、底部３２上に配置される。代替形態では、底部３２は基質１０を形成する。熱応答性粒子３は、培養容器３１の内側または内面に対面する基質１０の面側に露出形態で配置される。生物細胞２０、２１は、基質１０上に存在する。
【００８９】
さらに、図９は、温度設定用の装置４０、およびマニピュレータ（操作）装置５０を、概略的に示している。温度設定用の装置４０によって、基質１０の温度または基質１０の部分領域（セグメント）の温度は、熱応答性ミクロゲル３の相転移の臨界温度より高い温度から、その臨界温度より低い温度まで、選択的にまたは目標を定めて設定することができる。その温度設定用の装置は、例えば、加熱装置、例えば抵抗ヒータ、または加熱装置と、冷却装置、例えばペルチェ冷却装置、の組合せを含んでいる。マニピュレータ装置５０は、例えば供給ライン５１を含んでおり、その供給ラインを通して細胞懸濁液（サスペンション）を培養容器３１内に注ぎ入れることができる。
【００９０】
さらに、培養装置３０は、監視装置、例えば顕微鏡、および測定装置、例えば温度センサ（図示せず）を装備することができる。
【００９１】
図１０〜１７は、本発明による、少なくとも１種のモジュレータ物質を有する基質の官能化（Funktionalisierung：官能基化、官能性付与）の相異なる変形例を例示している。その少なくとも１種のモジュレータ物質は、モジュレータ粒子を有する基質の支持領域上に（例えば、図１０〜１２）および／またはモジュレータ層として（例えば、図１３、１５）、設けまたは配置することができる。少なくとも１種のモジュレータ物質は、一般的に、単一の化学物質または複数の化学物質の組成物を含んでおり、生物細胞は、熱応答性ミクロゲル（上述の例を参照）と比較して、その化学物質または化学物質の組成物に対して変えられた（改変された）接着能力を有し、および／または、その化学物質または化学物質の組成物との細胞反応は、生物細胞において誘導可能である。
【００９２】
細胞反応を誘発する物質は、一般的に、例えば、生物細胞の表面のレセプタに結合することによって、増大された接着力、移動（細胞移動または細胞遊走）、分化（特に、幹細胞分化）、活性状態の変化、または悪性度の変化、を生じさせる物質である。そのような物質は、例えば、次のものである。
−  ケモカイン（Chemokines）。例えばＦＧＦ、これは走化性（Chemotaxis）を誘発する、または
−  オステオネクチン（Osteonektin）（これは、幹細胞の心筋細胞への分化を誘発する）。
【００９３】
相異なる作用のモジュレータ物質の組合せによって、有利な形態で、所定の物理的または化学的な表面特性を、選択的にまたは目標を定めて設定することが可能になる。少なくとも１種のモジュレータ物質を、ミクロゲルの調製の期間中に熱応答性ポリマーのコロイド粒子の分散液に加えることができるので、熱応答性ミクロゲルおよび少なくとも１種のモジュレータ物質を、モジュールのように自由に組み合わせることができる。本発明による基質の表面は、モジュラー組み立てブロック・システムのように設計することができる。
【００９４】
図１０に概略的に示された例では、熱応答性ミクロゲル３、細胞を引きつける分子で被覆されたプラスチック粒子（接着力を増大させるモジュレータ粒子５．１）、および細胞を遠ざける（に反発する）分子で被覆されたプラスチック粒子（接着力を減少させるモジュレータ粒子５．２）が、組み合わされる。モジュレータ粒子５．１、５．２の直径は、例えば、５０ｎｍ乃至１μｍの範囲内で選択される。
【００９５】
図１１は、接着力を増大させるモジュレータ粒子５．１と、接着力を減少させるモジュレータ５．２との熱応答性ミクロゲルの組合せの相異なる効果を示している（図１１Ａにシンボルまたは記号で示されている）。図１１Ｂによれば、接着力を増大させるモジュレータ粒子５．１は、細胞２１の接着結合用の相対的に多数の結合部位によって、細胞２１と基質表面の間に相対的に小さい接触面積を形成させる。細胞２１は、より小さい接触面積で、相対的に少ない数の熱応答性ミクロゲル３と接触して、その効果が温度依存の相転移において減少するようにされる。その結果、細胞２１の基質１０への強い結合が達成される。
【００９６】
図１１Ｃによれば、接着力を減少させるモジュレータ粒子５．２は、反対の効果を生じさせる。細胞２１は、基質１０の表面上に分散配置されて、細胞２１の接着接触用の結合部位が見つけられるようにされる。細胞２１は、それに対応して、相対的に多数の熱応答性ミクロゲル３と接触する。従って、熱応答性ミクロゲル３の相転移は、接着力を増大させるモジュレータ粒子５．１（図１１Ｂ）の場合よりも強い効果を有する。基質１０の表面上の細胞２１の接着力は減少される。
【００９７】
ミクロゲルの調製用の分散液における、少なくとも１つのタイプのモジュレータ粒子５．１、５．２との熱応答性ミクロゲル３の定量的な混合比を設定することによって、基質表面の接着特性（接着または脱離（分離）パラメータ）は、このようにして利点として広い範囲にわたって変化することができ、その一方で、その表面の熱応答特性が維持されかつその表面が１つのまたは幾つかの細胞タイプ用の最適な接着特性を有する。利点として、分散液の調製のための各キャリア（担持、支持）溶液の混合比は、重量測定によって簡単に生成することができる。熱応答性ポリマーの粒子およびモジュレータ粒子を含むミクロゲル分散液を使用することによって、単一の堆積工程（ステップ）で、基質の支持領域上へのその協調した移送または移動が可能になる。
【００９８】
図１１の概略図において選択された一方の生物細胞２１と他方のミクロゲル３、５．１および５．２とのサイズ比は、図面上の実務的な理由で選択されている。図とは対照的に、かなり小さい粒径、例えば最大５０ｎｍまたはそれより小さい、またはそうでなければそれより大きい粒子、例えば１０μｍの粒子を使用することができる。
【００９９】
本発明の別の変形例によれば、様々な異なるサイズまたは粒径を有する粒子を、図１２に例示されているように、基質１０の表面上で組み合わせることができる。例えば、接着力を増大させるモジュレータ粒子５．１は、熱応答性ミクロゲル３よりも大きい半径を有することができる（図１２Ａ）。この場合、モジュレータ粒子５．１の接着力増大の効果は、熱応答性ミクロゲル３と比較して、細胞２１に対してより良好なアクセス可能性があるので、増強される。これとは対照的に、図１２Ｂによれば、モジュレータ粒子５．２の効果は、接着力を減少させるモジュレータ粒子５．２の半径が熱応答性ミクロゲル３の半径より小さくなるに従って、減少する。例えば、より小さい（小径の）接着力増大モジュレータ粒子５．１および／またはより大きい（大径の）接着力減少モジュレータ粒子５．２のような、他の組合せも、同様に可能である。
【０１００】
その結果、表面の接着特性が設定可能なだけでなく、表面の或る粒度を与えることも可能である。滑らかでないきめの粗いまたは粒状の表面を与えることは、高台（山）および窪み（谷）を有する表面トポロジーが生成されること、を意味する。利点として、表面の粒度は、或る細胞タイプの接着パターンの典型的な寸法に適合化させることができる（ヒトおよびウシ毛細血管内皮細胞、C.S. Chen et al.,“Science”276 (1997), 1425；C2C12 筋細胞参照、U. Joos et al.,“Eur. J. Cell Bio.”85 (2006), 225参照）。
【０１０１】
図１３は本発明の別の変形例を示しており、この変形例において、少なくとも１種のモジュレータ物質が、熱応答性ミクロゲル３との組み合わせで、接着力増大モジュレータ層５．３として、または接着力減少モジュレータ層５．４として提供される（図１３Ａ）。この場合も、基質１０の表面のモジュレータの設計は、様々な構成要素（コンポーネント）を有する細胞２１との相互作用を重ね合わせることによって有利に達成される。モジュレータ粒子の使用とは対照的に、少なくとも１種のモジュレータ物質は、ミクロゲルに加えられずに、熱応答性ミクロゲルの塗布または配置の前または後に基質本体の支持領域を被覆しまたはコーティングすることによって、追加的な堆積または被着工程（ステップ）で提供される。
【０１０２】
図１３Ｂは、図１１Ｂに類似して、細胞２１の減少された接触面積が得られる接着力増大モジュレータ層５．３の効果を示しており、従って熱応答性ミクロゲル３の減少された効果を示している。これとは対照的に、図１３Ｃによれば、接着力減少モジュレータ層５．４は、細胞２１の分散配置を実現し、従って、熱応答性ミクロゲル３の増強された効果を与える。
【０１０３】
図１３Ｂおよび１３Ｃの変形例において熱応答性ミクロゲル３が基質本体と上述の付着または接続タイプの中の１つのタイプで結合される一方で、図１３Ｄによれば、熱応答性ミクロゲル３を接着力増大モジュレータ層５．３に付着または接続する代替的な可能性が存在する。この場合、接着力増大モジュレータ層５．３は、接着促進剤として（上述の図７、８参照）およびモジュレータ物質としての二重の機能を満たす。
【０１０４】
別の変形例（図示せず）によれば、熱応答性ミクロゲル３は、基質本体１と最初に付着または接続することができ、その後で、接着力増大または接着力減少モジュレータ層を塗布しまたは配置することができる。
【０１０５】
図１４、１５および１６は本発明の各実施形態を示している。その各実施形態において、熱応答性ミクロゲル、接着促進剤、および／またはモジュレータ物質は、少なくとも１つの密度勾配を有する基質本体の支持領域上に配置される。これらの実施形態は、共培養での培養における生物細胞の操作に特に有益である。密度勾配の形成によって、基質の表面特性は、細胞のタイプに応じて付着細胞の移動（細胞移動、細胞遊走）が誘導されるような形態で、調節または改変することができる。この目的を達成するために、走化性特性（chemotaktischen Eigenschaften）を有する、少なくとも１種のモジュレータ物質の濃度勾配（図１４、１５）および／または機能勾配（Funktions-gradient）（図１６）を設けることができる。
【０１０６】
図１４によれば、熱応答性ミクロゲル３および接着力増大モジュレータ粒子５．１の、基質本体１の支持領域２上への配置は、接着力増大モジュレータ粒子５．１と比較して熱応答性粒子３のより高い面密度が第１の部分領域１．１に形成される形態で、およびその逆に、接着力増大モジュレータ粒子５．１と比較して熱応答性粒子３のより低い密度が第２の部分領域１．２に形成される形態で、行われる。その結果、接着力増大モジュレータ粒子５．１の増大する面密度または熱応答性ミクロゲル３の減少する面密度によって特徴づけられる密度勾配６が支持領域２に沿って形成される。図１４に概略的に示された密度勾配６は、実際には、基質本体１の相異なる部分領域上に様々な異なる組成を有するミクロゲルの堆積または被着によって段階的に生成することができる。
【０１０７】
図１４によれば、関心のある第１の細胞タイプの生物細胞２１をフィーダ（支持）細胞２２と共に培養するために、その共培養の形成は、高い含有量の熱応答性粒子３を有する第１の部分領域１．１において行われる（ステップＳ１）。例えば細胞２１の分化などを含む培養に続いて、フィーダ細胞２２は、接着力増大モジュレータ粒子５．１の特定の活動の下で第１の部分領域１．１の外へ移動する（移動７、ステップＳ２）。その後、関心のある細胞２１の分離または脱離は、基質１０の温度変化による熱応答性ミクロゲル３の相転移を誘発すること、また、部分領域１．１における生物細胞２１に対する接着能力をかなり減少させることによって、生じる。次いで、細胞２１は、図９に示されているように、例えば操作装置を用いて、基質１０から取り出すことができる。  
【０１０８】
細胞タイプに固有の形態で細胞を移動または遊走させるよう刺激するために、多数のモジュレータ物質が利用可能である。例えば、ｆＭＬＰ（ホルミル−メチオニル−ロイシル−プロリン）が、ＨＬ６０白血病細胞の移動（遊走）にだけ影響を与え、その一方で、他の細胞タイプ（の細胞）は影響を受けない状態を維持する。
【０１０９】
図１４に概略的に示された複数の付着細胞の混合物からの１つの細胞タイプの選択的移動（遊走）７の原理は、それに対応して、２つより多い細胞タイプ（の細胞）の混合物に一般化することができる。その際、接着力増大モジュレータ物質の選択は、その混合物から少なくとも１つの細胞タイプ（の細胞）が離れて移動または遊走しまたは少なくとも１つの細胞タイプ（の細胞）が変化しない状態を維持して移動または遊走を示さないように、行われる。これにより、少ない細胞数、特に１０５個未満の細胞を有する小細胞サンプル（標本）は、利点として、共培養の後で、分離することができる。
【０１１０】
相異なる細胞タイプ（の細胞）の混合物の分離は、接着力増大モジュレータ粒子の使用による方法に限定されるものではない。代替的にまたは追加的に、熱応答性粒子３は、図１５に概略的に示されているように、接着力増大モジュレータ層５．３と組み合わせることができる。密度勾配６は、熱応答性ミクロゲル３の増大された面密度を有する基質本体１の第１の部分領域１．１と、接着力増大モジュレータ層５．３の増大された面密度を有する基質本体１の別の部分領域１．２との間に、形成される。図１４の場合に類似して、関心ある生物細胞２１の堆積または被着および共培養が、フィーダ細胞２２と共に、最初に行われ（ステップＳ１）、その後で、細胞混合物の外へのフィーダ細胞２２の、細胞タイプに固有の移動７が生じ（ステップＳ２）、最後に、関心ある生物細胞２１の分離または脱離が、熱応答性ミクロゲル３の、温度で誘発される相転移によって、生じる（ステップＳ３）。
【０１１１】
細胞２１の分離または脱離には、様々な異なるオプション（任意選択）が利用可能である。図１５および１６によれば、基質１０全体の温度は、臨界温度（ＬＣＳＴ）より低い温度に低下させることができる。これは、部分領域１．２において付着状態を維持する細胞２２が、熱応答性粒子３の相転移の影響を受けない状態を維持する場合に、特に可能である。代替形態として、図１６に概略的に示されているように、温度の局所的な低下が実現できる。本発明のこの実施形態では、温度を設定するための装置４０（図９も参照）は、基質本体１の部分領域１．１上に局所的に動作するように配置される。この場合、熱応答性ミクロゲル３の相転移は、局所的に部分領域１．１内に限定して誘導することができ、その一方で、熱応答性ミクロゲルは他の部分領域において変化のない状態を維持する。
【０１１２】
しかし、基質表面上での、細胞タイプに固有の移動または遊走は、密度勾配を必ずしも必要としない。代替的にまたは追加的に、図１７に概略的に示されているように、走化性に作用する物質８を培地（培養基）に加えることができる。
【０１１３】
図１７によれば、本発明による基質１０が使用され、その基質本体１上に熱応答性粒子３が均一に分散配置される。基質１０上での細胞２１、２２の共培養（ステップＳ１）に続いて、走化性に作用する物質８を培地に加えて、細胞の移動７が誘発されるようにされる。走化性に作用する物質８を選択することによって、移動７は細胞タイプに固有の形態で誘発される。例えば、ｆＭＬＰがＨＬ６０白血病細胞だけの移動を生じさせ、その一方で、健康な組織から得られる細胞株からの細胞は、影響を受けない状態が維持される。
【０１１４】
関心ある細胞２１を分離または脱離させるために、局所的に限られた温度低下が、ステップＳ３において生じる。熱応答性粒子３は、細胞２１が分離または脱離することができる形態で、非折り畳み態への相転移を示す。
【０１１５】
図１８は、基質１０が培養キャビティ９を備える、本発明の別の変形形態を示している。培養キャビティ９は、幹細胞ニッチ（Stammzellnischen：幹細胞の生態的地位のある場所、窪み）における分化過程の生体外（in vitro）でのシミュレーションまたは複製に使用することができる。例えば、生物有機体または生命体において、幹細胞は、所定の生化学的および／または細胞の株を有するキャビティにおいて利用可能な状態に保持され（David T. Scadden,“Nature”441 (2006), 1075；M.C. Dusseiller et al.,“Biointerphases” 1 (2006), P1参照）、分化するようにされる。そのような幹細胞ニッチの例は、毛嚢（Haarfollikeln）である。
【０１１６】
本発明による基質１０の培養キャビティ９によって、生物細胞２１用の微小環境が生成され、その環境において有機体または生命体における各条件または状態が再現され形成される。人工的培養キャビティを生物細胞でライニングする（内側を覆う）通常の細胞操作技術では、光ピンセットまたは誘電泳動的に作用する要素を使用する必要がある。これは、装置コストおよび複雑な方法の点で不利である。この問題は、細胞が培養キャビティ９中へと選択的にまたは目標を定めて移動するという事実によって、図１８による本発明による基質で解決される。
【０１１７】
図１８のステップＳ１によれば、培養キャビティ９内に配置される生物細胞２１、２２の細胞混合物が、基質本体１の第１の部分領域１．１に塗布または配置されて、任意選択的に培養される。第２のステップＳ２において、細胞２１、２２の、培養キャビティ９中への選択的なまたは目標を定めた移動が生じ、その際、上述の機構の１つ、例えば、密度勾配、および／または培地からの走化性物質の作用、が使用される。
【０１１８】
以上の説明に開示された発明の特徴、図面および特許請求の範囲は、個々に重要であり、またその他の実施形態において本発明を実現するための組合せでも重要である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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