(57)【要約】  標識分子が核酸分子の３’末端に直接結合した標識核酸分子の作製および検出アッセイでの使用のための方法、試薬およびキットが提供される。【選択図】図１
2013511986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識分子が結合した核酸標識分子であって、核酸配列とハイブリダイゼーション可能な５’リン酸基を含むオリゴヌクレオチド伸長配列を含む核酸標識分子。
【請求項２】
分子量が約５ｋＤａ〜約２５０ｋＤａである、請求項１に記載の核酸標識分子。
【請求項３】
１〜約１５個の標識分子を含む、請求項１に記載の核酸標識分子。
【請求項４】
前記標識分子がビオチンまたはフルオロフォアからなる、請求項１に記載の核酸標識分子。
【請求項５】
分子量が約５ｋＤａ以下で３’末端に単一のビオチン分子を有する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの形態である、請求項１に記載の核酸標識分子。
【請求項６】
標識標的ＲＮＡ分子を作製するための方法であって、
ａ）５’末端と３’末端とを有する一本鎖ＲＮＡ分子を提供することと、
ｂ）前記一本鎖ＲＮＡ分子の３’末端にオリゴヌクレオチドテールを結合させることと、
ｃ）センス鎖とアンチセンス鎖とを有する部分的二本鎖核酸配列であって、前記センス鎖が、検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識分子を３’末端に含む核酸標識分子を含み、アンチセンス鎖が、オリゴヌクレオチドテールに相補的な配列を含む一本鎖３’オーバーハングを含む部分的二本鎖核酸配列を提供することと、
ｄ）前記３’オーバーハング配列との相補的塩基対形成により前記部分的二本鎖核酸配列と前記オリゴヌクレオチドテールをアニールさせることと、
ｅ）前記部分的二本鎖核酸配列のセンス鎖の５’末端を前記オリゴヌクレオチドテールの３’末端とライゲートして、検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識分子を含む前記核酸標識分子を、前記ＲＮＡ分子の３’末端と結合させることにより、標識標的ＲＮＡ分子を作製することと
を含む方法。
【請求項７】
前記一本鎖ＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡ分子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸標識分子が、検出可能なシグナルを放出または発生することができる複数の標識分子が結合した多標識ポリマー足場であり、前記多標識ポリマー足場が、５’リン酸基を含み前記部分的二本鎖核酸配列のアンチセンス鎖とハイブリダイゼーション結合することができるオリゴヌクレオチド伸長配列を含み、前記多標識ポリマー足場が、１つ以上の標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする複数の一本鎖部位を有する樹枝状ポリヌクレオチド組成物であり、前記樹枝状ポリヌクレオチド組成物が、５’−３’方向のハイブリダイゼーションにより結合した２つ以上のポリヌクレオチドモノマーから基本的に構成され、前記多標識ポリマー足場の総分子量が約５０〜約３５０ｋＤａである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記多標識ポリマー足場が、１つ以上の標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることができる複数の一本鎖部位を有する三量体直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物であり、
前記直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物が、５’−３’方向のハイブリダイゼーションにより結合した第一、第二および第三のポリヌクレオチドモノマーから基本的に構成され、
各ポリヌクレオチドモノマーが、互いにハイブリダイゼーション結合する前に、第一、第二および第三の一本鎖ハイブリダイゼーション部位を有し、
前記直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物において、前記第一のポリヌクレオチドモノマーの第三の一本鎖ハイブリダイゼーション部位が第二のポリヌクレオチドモノマーの第一の一本鎖ハイブリダイゼーション部位とハイブリダイゼーション結合し、かつ前記第二のポリヌクレオチドモノマーの第三の一本鎖ハイブリダイゼーション部位が前記第三のポリヌクレオチドモノマーの第一の一本鎖ハイブリダイゼーション部位とハイブリダイゼーション結合し、前記第一のポリヌクレオチドモノマーの第一の一本鎖部位が、前記部分的二本鎖核酸配列のアンチセンス鎖とハイブリダイゼーション結合が可能であり、かつ前記直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物内の第二の一本鎖ハイブリダイゼーション部位が、１つ以上の標識分子を含む１つ以上の標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション結合する、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記部分的二本鎖核酸配列のアンチセンス鎖が、前記多標識ポリマー足場のオリゴヌクレオチド伸長配列および前記一本鎖ＲＮＡ分子の３’末端のオリゴヌクレオチドテールの両方とハイブリダイゼーション結合が可能な架橋オリゴヌクレオチドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸標識分子が、検出可能なシグナルを放出または発生することができる、それと結合した１つ以上の標識分子を有し、かつ前記部分的二本鎖核酸配列のアンチセンス鎖とハイブリダイゼーション結合が可能な５’リン酸基を含むオリゴヌクレオチド伸長配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸標識分子が約５ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの分子量である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸標識分子が１〜約１５個の標識分子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標識分子がビオチンまたはフルオロフォアからなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸標識分子が、約５ｋＤａの分子量で３’末端に単一のビオチン分子を有する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの形態である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
段階ａ）〜ｅ）が単一の反応混合物中で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
固体支持体上のＲＮＡアンチセンスプローブを検出するための方法であって、
ａ）ＲＮＡ分子の相補的ヌクレオチド配列を含むアンチセンスプローブを有する固体支持体を、請求項６に記載の方法により作製した標識標的ＲＮＡ分子と接触させることと、
ｂ）前記固体支持体と前記標識標的ＲＮＡ分子を、前記標識標的ＲＮＡ分子が前記ＲＮＡアンチセンスプローブとハイブリダイズすることができる十分な時間および温度でインキュベートすることと、
ｃ）前記固体支持体を洗浄して、ハイブリダイズしていない標識標的ｍＲＮＡを除去することと、
ｄ）ハイブリダイズした前記標識標的ＲＮＡ分子のシグナルを検出して、固体支持体上のＲＮＡアンチセンスプローブを検出することと
を含む方法。
【請求項１８】
前記標識標的ＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡ分子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
標識標的ＤＮＡ分子を作製するための方法であって、
ａ）５’末端と３’末端とを有する一本鎖ＤＮＡ分子を提供することと、
ｂ）前記一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端にオリゴヌクレオチドテールを結合させることと、
ｃ）センス鎖とアンチセンス鎖とを有する部分的二本鎖核酸配列であって、前記センス鎖が、検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識分子を３’末端に含む核酸標識分子を含み、アンチセンス鎖が、オリゴヌクレオチドテールに相補的な配列を含む一本鎖３’オーバーハングを含む部分的二本鎖核酸配列を提供することと、
ｄ）前記３’オーバーハング配列との相補的塩基対形成により前記部分的二本鎖核酸配列と前記オリゴヌクレオチドテールをアニールさせることと、
ｅ）前記部分的二本鎖核酸配列のセンス鎖の５’末端を前記オリゴヌクレオチドテールの３’末端とライゲートして、検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識分子を含む前記核酸標識分子を、前記ＤＮＡ分子の３’末端と結合させることにより、標識標的ＤＮＡ分子を作製することと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
コンピュータに読込み可能な形式の配列表が、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
近年、動植物の遺伝子発現の転写後調節において機能する、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる低分子非コードＲＮＡのクラスが同定されている（ＣａｒｒｉｎｇｔｏｎおよびＡｍｂｒｏｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：３３６（２００３））。ｍｉＲＮＡはセンチュウ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）において最初に同定され、その標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）またはコード配列の相補的な部位と塩基対形成して、その翻訳を抑制することにより作用する（Ｗａｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：１６８８（２００４））。
【０００３】
成熟ｍｉＲＮＡは、約２２ヌクレオチド（ｎｔ）の長さしかないが、ダイサー複合体の作用により約７０ｍｅｒの前駆体（プレ−ｍｉＲＮＡ）配列のヘアピン領域から生じる（Ｌｅｅら，ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：４６６３（２００２））。次いで、成熟ｍｉＲＮＡは、遺伝子調節に対するｍｉＲＮＡの作用を仲介するリボ核タンパク質複合体であるｍｉＲＮＰの中に組み込まれる（Ｍｏｕｒｅｌａｔｏｓら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：７２０（２００２））。
【０００４】
蠕虫およびハエのゲノムでは約１００のｍｉＲＮＡがコードされ、脊椎動物ゲノムでは約２５０のｍｉＲＮＡがコードされていることが、バイオインフォマティクスの研究により予測されている（Ｌａｉら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．４：Ｒ４２（２００３）；Ｌｉｍら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：９９１（２００３）；Ｌｉｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：１５４０（２００３））。これは各ゲノムで予測されるタンパク質コード遺伝子の数の約０．５〜１％を占め、調節遺伝子産物のクラスとしてのｍｉＲＮＡの重要性を裏付けている（ＢｒｅｎｎｅｃｋｅおよびＣｏｈｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．４：２２８（２００３））。
【０００５】
ｍｉＲＮＡは、植物の花および葉の発生、蠕虫の幼生の発生、ハエのアポトーシスおよび脂肪代謝ならびに哺乳動物の造血分化および神経発生を含めた様々な生物学的プロセスに関与すると考えられている（Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ  １１６：２８１（２００４））。さらに、数多くのｍｉＲＮＡ遺伝子が癌に関連したヒト染色体領域（たとえば、脆弱部位、限界点、ヘテロ接合性喪失部位、増幅部位）に位置している（Ｃａｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：２９９９（２００４））。また様々なｍｉＲＮＡが、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）とｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用することも示されており（Ｊｉｎら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：１１３（２００４））、このことは、ヒトの健康および疾患におけるこれら小型のＲＮＡの役割を示唆している。
【０００６】
異なる細胞型および疾患状態が特定のｍｉＲＮＡの発現と関連しているため、ｍｉＲＮＡの時間的および空間的両方の発現プロファイルを入手することが重要である。ｍｉＲＮＡの発現レベルを判定するために、ノーザンハイブリダイゼーションが用いられてきたが（例えば、Ｓｅｍｐｅｒｅら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．５：Ｒ１３（２００４）；Ａｒａｖｉｎら，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ５：３３７（２００３）；Ｇｒａｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １１：１２５３（２００３）；Ｌｉｍら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１７：９９１（２００３）を参照されたい）、この方法は、ハイスループット解析に必要な労力が大き過ぎる。ｍｉＲＮＡの発現をモニターするために、ＰＣＲによる方法が使用されてきたが、こうした方法は、高価な遺伝子特異的プライマー（例えば、Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：ｅ４３（２００４）を参照されたい）またはプライマー結合リンカーをｍｉＲＮＡ分子と結合させるための非効率的な平滑末端ライゲーションの使用を必要とする（例えば、Ｍｉｓｋａら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．５：Ｒ６８（２００４）；Ｇｒａｄ  ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １１：１２５３（２００３）；Ｌｉｍら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１７：９９１（２００３）を参照されたい）。さらにＰＣＲでは、増幅される標的ｍｉＲＮＡ分子の集団に大きなバイアスが生じ得る。
【０００７】
近年、各種組織および細胞型におけるｍｉＲＮＡの発現パターンを同定するためのハイスループットなマイクロアレイが開発されている（例えば、Ｂａｂａｋら，ＲＮＡ  １０：１８１３（２００４）；Ｃａｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１１７５５（２００４）；Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９７４０（２００４）；Ｍｉｓｋａら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．５：Ｒ６８（２００４）；ＳｉｏｕｄおよびＲｏｓｏｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３７：５７４（２００４）；Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙら，ＲＮＡ  ９：１２７４（２００３）を参照されたい）。ｍｉＲＮＡ発現検出でのマイクロアレイの使用にはいくつかの利点があり、一時点における同じ試料内での複数の遺伝子発現を判定する能力、少量のＲＮＡしか必要としないこと、ならびに前駆体および成熟ｍｉＲＮＡ分子両方の発現を同時に同定する可能性が挙げられる。
【０００８】
しかし、成熟ｍｉＲＮＡは長さがわずか約２２ｎｔであり、しかも所与の組織中にごく限られた量で存在するため、低分子ＲＮＡはマイクロアレイの標識および検出が困難である（ＳｉｏｕｄおよびＲｏｓｏｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３７：５７４（２００４））。例えば、マイクロアレイ解析で使用するｍｉＲＮＡ分子を、フルオロフォアの共有結合を用いて直接標識することができるが（例えば、Ｂａｂａｋら，ＲＮＡ  １０：１８１３（２００４）；ＭＩＣＲＯＭＡＸ（商標）ＡＳＡＰ  ｍｉＲＮＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；Ｌａｂｅｌ  ＩＴ（商標）μＡｒｒａｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ，Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩを参照されたい）、この方法はわずかな標的ｍｉＲＮＡ分子を検出するだけの感度がない。また直接標識では、ランダムに組み込まれたフルオロフォアの分子間消光が生じることにより、感度がさらにすることもある。マイクロアレイ解析で使用するｃＤＮＡを作製するために、ランダムプライマーによるｍｉＲＮＡ分子の逆転写が用いられてきたが（例えば、ＳｉｏｕｄおよびＲｏｓｏｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３７：５７４（２００４）；Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９７４０（２００４）を参照されたい）、この方法では、元の完全長ｍｉＲＮＡ集団が正確に示されない。
【０００９】
ｍｉＲＮＡ解析の精度と感度が共に大幅に向上した新たな標識方法が開発されている（例えば、米国特許公開第２００６／００９４０２５号として公開されている同時係属の米国特許出願第１０／９７９，０５２号）。しかし、上記方法は、間接的な標識結合を利用したものであり、アッセイでシグナルを発生させるために複数のハイブリダイゼーション段階を必要とする。さらに上記方法は、結合キネティクスを向上させるために独立したハイブリダイゼーション段階を必要とする、巨大な捕捉試薬分子が負担となる。上記方法では、良好な結果が得られる一方で、ハイスループット解析に容易に適用することができず、所望の結果を得るために、はるかに多くの時間を必要とする。結果的には、マイクロアレイおよびハイスループット解析で使用するためのｍｉＲＮＡ分子を迅速に、高感度でかつ効率的に標識および検出するための方法が早急に必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
出願者らは、核酸標識分子をｍｉＲＮＡ分子の３’末端に直接結合させる、標的ｍｉＲＮＡ分子を標識するための方法を発明した。出願者らは、最適化核酸標識分子の使用により、ＰＣＲを必要とすることなく消光を低減しシグナル強度を増強して、ｍｉＲＮＡ解析、特にハイスループット解析のための改善された方法および試薬が得られることを見出した。最適化核酸標識分子は、好ましくは、検出可能なシグナルを放出または発生することができる複数の標識分子が結合した多標識ポリマー足場である。多標識ポリマー足場は、標識分子が結合することができる任意のポリマー、例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、脂質、脂肪酸、核酸などであり得る。好適な実施形態では、多標識ポリマー足場は、２０〜１０００塩基、より好ましくは３００〜７５０塩基の核酸を含み、かつライゲーション可能な一端および検出可能なシグナルを放出または発生することができる１０〜１５個の標識分子を含む、低分子ＤＮＡデンドリマーを含む。ライゲーション可能な末端は、ｍｉＲＮＡ分子の３’末端とライゲートし得る５’リン酸を有する。核酸標識分子は、マイクロアレイおよびビーズアッセイのような各種検出プラットフォーム上でのｍｉＲＮＡ分子との迅速で効率的なハイブリダイゼーションが可能な十分に小さい大きさである。
【００１１】
したがって、本発明の一態様は、検出可能なシグナルを放出または発生することができる複数の標識分子が結合した多標識ポリマー足場に関し、この多標識ポリマー足場は、核酸配列とのハイブリダイゼーション結合が可能な５’リン酸基を含むオリゴヌクレオチドテールを含む。好適な実施形態では、多標識ポリマー足場は、総分子量が約５０〜約３５０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、標識分子は１つ以上のフルオロフォア部分を含む。他の実施形態では、標識分子は１つ以上のビオチン部分を含む。
【００１２】
好適な実施形態では、伸長配列が結合可能な核酸配列は、同様に核酸分子とハイブリダイズ可能なポリマー足場から独立した別の架橋オリゴヌクレオチドである。ポリマー足場と架橋オリゴヌクレオチドは、核酸分子を標識する系を共に構成する。好ましくは、ポリマー足場から独立した別の核酸分子は、ＲＮＡ分子、より好ましくは非コードＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子である。５’リン酸基が存在することにより、ポリマー足場とＲＮＡ分子３’末端との連結が可能となる。この方法でＤＮＡ分子も標識し得る。
【００１３】
好適な実施形態では、多標識ポリマー足場は、１つ以上の標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な複数の一本鎖部位を有する直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物であり；前記直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物は、５’−３’方向のハイブリダイゼーションにより結合した第一、第二および第三のポリヌクレオチドモノマーからなり；各ポリヌクレオチドモノマーは、互いにハイブリダイゼーション結合する前に、第一、第二および第三の一本鎖ハイブリダイゼーション部位を有し；かつ前述直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物において、第一のポリヌクレオチドモノマーの第三の一本鎖ハイブリダイゼーション部位は、第二のポリヌクレオチドモノマーの第一の一本鎖ハイブリダイゼーション部位とハイブリダイゼーション結合し、かつ第二のポリヌクレオチドモノマーの第三の一本鎖ハイブリダイゼーション部位は、第三のポリヌクレオチドモノマーの第一の一本鎖ハイブリダイゼーション部位とハイブリダイゼーション結合し、第一のポリヌクレオチドモノマーの第一の一本鎖部位が、核酸配列とハイブリダイゼーション結合することができ、かつ前記直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物内の第二の一本鎖ハイブリダイゼーション部位が、１つ以上の標識分子を含む１つ以上の標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション結合する。
【００１４】
本発明の別の態様は、標識標的ｍｉＲＮＡ分子の作製方法に関するものであり、この方法は、
ａ）５’および３’末端を有する一本鎖ｍｉＲＮＡ分子を提供すること；
ｂ）一本鎖ｍｉＲＮＡ分子の３’末端にオリゴヌクレオチドテールを結合させること；
ｃ）センス鎖とアンチセンス鎖とを有する部分的二本鎖核酸配列であって、センス鎖が検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識分子を含む核酸標識分子を３’末端に含み、かつアンチセンス鎖がオリゴヌクレオチドテールに相補的な配列を含む一本鎖３’オーバーハングを含む核酸配列を提供すること；
ｄ）３’オーバーハング配列による相補的な塩基対形成により、部分的二本鎖核酸配列をオリゴヌクレオチドテールとアニールさせること；および
ｅ）部分的二本鎖核酸配列のセンス鎖の５’末端とオリゴヌクレオチドテールの３’末端をライゲートすることにより、検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識分子を含む核酸標識分子をｍｉＲＮＡ分子の３’末端と結合させて、標識標的ｍｉＲＮＡ分子を作製すること
を含む。
【００１５】
いくつか実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子を全ＲＮＡ源の形で提供し、他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子を低分子量ＲＮＡ分子が濃縮されているＲＮＡ源の形で提供する。オリゴヌクレオチドテールは、好ましくはポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて結合させたポリＡテールである。好ましくは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションを行う。好適な実施形態では、部分的二本鎖核酸配列は、記載の多標識ポリマー足場および架橋オリゴヌクレオチド、より好ましくは上記直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物からなる。
【００１６】
本発明の別の態様は、固体支持体上のｍｉＲＮＡアンチセンスプローブの検出方法に関するものであり、この方法は、
ａ）ｍｉＲＮＡ分子の相補的ヌクレオチド配列を含むアンチセンスプローブを有する固体支持体を、
ｉ）５’および３’末端を有する一本鎖ｍｉＲＮＡ分子を提供すること；
ｉｉ）一本鎖ｍｉＲＮＡ分子の３’末端にオリゴヌクレオチドテールを結合させること；
ｉｉｉ）センス鎖とアンチセンス鎖とを有する部分的二本鎖核酸配列であって、センス鎖が検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識分子を含む核酸標識分子を３’末端に含み、かつアンチセンス鎖がオリゴヌクレオチドテールに相補的な配列を含む一本鎖３’オーバーハングを含む核酸配列を提供すること；
ｉｖ）３’オーバーハング配列による相補的な塩基対形成により、部分的二本鎖核酸配列をオリゴヌクレオチドテールとアニールさせること；および
ｖ）部分的二本鎖核酸配列のセンス鎖の５’末端とオリゴヌクレオチドテールの３’末端をライゲートすることにより、検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識分子を含む核酸標識分子をｍｉＲＮＡ分子の３’末端と結合させて、標識標的ｍｉＲＮＡ分子を作製することを含む方法により作製された標識標的ｍｉＲＮＡ分子と接触させること；
ｂ）固体支持体と標識標的ｍｉＲＮＡ分子を、標識標的ｍｉＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡアンチセンスプローブとハイブリダイズすることができる十分な時間および温度でインキュベートすること；
ｃ）固体支持体を洗浄して、ハイブリダイズしていない標識標的ｍＲＮＡを除去すること；および
ｄ）ハイブリダイズした標識標的ｍｉＲＮＡ分子のシグナルを検出することにより、固体支持体上のｍｉＲＮＡアンチセンスプローブを検出すること
を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、固体支持体はマイクロアレイまたはマイクロタイタープレートのような平面固体支持体であり、他の実施形態では、固体支持体はビーズである。ｍｉＲＮＡプローブは、成熟ｍｉＲＮＡもしくはプレｍｉＲＮＡ配列の両方に対して、またはプレｍｉＲＮＡ配列のみに対して特異的であり得る。
【００１８】
本発明の別の態様は、ｍｉＲＮＡ解析で使用するための標識標的ｍｉＲＮＡ分子作製のためのキットに関するものであり、このキットは、センス鎖とアンチセンス鎖とを有する部分的二本鎖核酸配列であって、センス鎖が、検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識を含む核酸標識分子を含み、かつアンチセンス鎖が、オリゴヌクレオチドテールに相補的な配列を含む一本鎖３’オーバーハングを含む部分的二本鎖核酸配列；および部分的二本鎖核酸配列を用いて標識標的ｍｉＲＮＡ分子を作製するための指示書を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、またキットは、部分的二本鎖核酸配列の一本鎖３’オーバーハング配列に相補的であるオリゴヌクレオチドテールを標的ｍｉＲＮＡ分子の３’末端に結合させるための少なくとも１つの酵素；および部分的二本鎖核酸配列のセンス鎖の５’末端を標的ｍｉＲＮＡ分子の３’末端と結合させるための少なくとも１つの酵素も含む。他の実施形態では、２色以上のアッセイを行うことができるように、異なる検出可能なシグナルを放出または発生することができる複数の核酸標識分子を提供する。好適な実施形態では、部分的二本鎖核酸配列は、上記多標識ポリマー足場および架橋オリゴヌクレオチドからなる。より好適な実施形態では、多標識ポリマー足場は上記直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物である。
【００２０】
本発明の別の態様は、検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識分子が結合した核酸標識分子に関するものであり、この核酸標識分子は、核酸配列とハイブリダイゼーション可能な５’リン酸基を含むオリゴヌクレオチド伸長配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸標識分子は、ＤＮＡを含みかつ総分子量が約５〜約２５０ｋＤａである。好適な実施形態では、核酸標識分子は、総分子量が約２〜約２．３ｋＤａの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標識分子は１つ以上のフルオロフォア部分を含む。他の実施形態では、標識分子は１つ以上のビオチン部分を含む。標識分子は、好ましくは１〜約１５個の標識分子を含む。核酸標識分子を上記方法およびキットに使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ａ〜ｄは、本発明の方法による標的ｍｉＲＮＡ分子の標識およびｍｉＲＮＡプローブの検出を表す図である。
【図２】本発明の好適な核酸標識分子を表す図である。
【図３】核酸標識分子の長さとｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイにおける平均シグナル強度との関係を示すグラフである。
【図４】ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイに使用する１段階標識工程と２段階標識工程を対照比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ＲＮＡマイクロアレイ解析で使用するための核酸分子、方法およびキットに関する。「ＲＮＡ分子」、「ｍｉＲＮＡ分子」、「ｍＲＮＡ分子」、「ＤＮＡ分子」、「ｃＤＮＡ分子」および「核酸分子」という用語は、それぞれ単一種の単一の分子、複数の分子および異なる種の複数の分子を包含することが意図される。また「ｍｉＲＮＡ分子」という用語は、成熟ｍｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡ分子の両方を包含することも意図される。マイクロアレイの用語と一致する「標的ｍｉＲＮＡ」は、標識されるｍｉＲＮＡまたは相補的ｃＤＮＡ配列を指し、「ｍｉＲＮＡプローブ」は、固体支持体と直接結合した未標識のセンスまたはアンチセンスｍｉＲＮＡ配列を指す。「核酸標識分子」という用語は、ｍｉＲＮＡ分子の３’末端とライゲートすることが可能であり、かつ検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識分子を含む、ＤＮＡデンドリマーのような任意の非天然ヌクレオチド配列を指す。
【００２３】
本発明の方法は、検出可能なシグナルを放出または発生することができる標識を含む核酸標識分子を、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子の３’末端に結合させることを含む。次いで、得られた標識ｍｉＲＮＡ分子（１つまたは複数）を用いて、固体支持体と結合したｍｉＲＮＡプローブを検出し、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを得ることができる。適切に標識された標的分子および適切に設計されたプローブを用いて、成熟ｍｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡの発現プロファイルの両方を決定することができる。
【００２４】
現在利用できる技術は、フルオロフォアの共有結合により標的ｍｉＲＮＡ分子を直接標識するか、または標的ｍｉＲＮＡ分子をランダムにプライミングし逆転写して標識ｃＤＮＡ分子を作製するものであり、いずれもｍｉＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション後にわずかな標的ｍｉＲＮＡ分子を検出するのに必要な感度をもたないが、本発明の方法は、こうした技術とは異なる。また本発明の方法は、標識標的分子の集団に増幅バイアスが生じ得るＰＣＲによる標識技術とも異なる。
【００２５】
本発明の方法は、分子生物学分野のルーチン技術を用いる。一般的な分子生物学的方法を開示している基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）が挙げられる。
【００２６】
本発明の方法はＲＮＡ分子源を用いる。好ましくは、源はｍｉＲＮＡ分子が濃縮されている。全体にわたって「ｍｉＲＮＡ」および「濃縮」に言及されるが、本明細書に開示される方法は、濃縮されているか否かに関係なく、植物および細菌中に見られるような修飾された３’末端を有するＲＮＡ分子を含めた、３’末端を有する任意の核酸分子を標識するために使用し得ることを理解するべきである。任意のＲＮＡ分子を標識し得る。また本発明の方法を、デオキシリボヌクレオチドの存在下で３’末端にポリマーテールを合成する酵素と組み合わせて利用できる３’末端を有するＤＮＡ分子の標識にも拡張し得る。デオキシリボヌクレオチドの存在下でポリマーテールを合成することができる酵素の１つの例が、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）である。
【００２７】
全ＲＮＡからｍｉＲＮＡ分子を濃縮するために数多くの方法および市販キットが利用できる。例としては、ｍｉＲｖａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ｍｉｒＰｒｅｍｉｅｒ（商標）マイクロＲＮＡ単離キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、変性ＰＡＧＥゲルでの精製（例えば、Ｍｉｓｋａら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．５：Ｒ６８（２００４）を参照されたい）、適当な大きさの分子量カットオフフィルターを用いた遠心分離（例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭフィルター装置、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）ならびに酢酸ナトリウム／エタノール沈殿（例えば、Ｗａｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：１６８８（２００４）を参照されたい）が挙げられる。
【００２８】
ｍｉＲＮＡは、任意の生物試料または環境試料中に存在するウイルス粒子、植物および動物源を含めた、ｍｉＲＮＡを含有する任意の組織または細胞源から入手し得る。好ましくは、源は動物組織、より好ましくは哺乳動物組織、最も好ましくはヒト組織である。またＲＮＡは、ＲＮＡ抽出キット、例えばＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）全核酸単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ  Ｔｘ）などを用いて、臨床ＦＦＰＥ試料からも精製し得る。
【００２９】
ＲＮＡを増幅工程に供し得る。ＲＮＡ増幅キットの例としては、ＳｅｎｓｅＡＭＰ  ＲＮＡ増幅キット（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ＲＮＡ増幅キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、Ｏｖａｔｉｏｎ（商標）ＲＮＡ増幅システム（ＮｕＧｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
図１に関して、一本鎖オリゴヌクレオチドテールを一本鎖ｍｉＲＮＡ分子の３’末端に結合させる（図１ａを参照されたい）。オリゴヌクレオチドテールは、ヌクレオチドを一本鎖ＲＮＡと結合させる任意の手段により組み込み得る。好ましくは、適当な緩衝液中、適当なヌクレオチドの存在下で、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）またその他の適当な酵素を用いてオリゴヌクレオチドテールを一本鎖ｃＤＮＡに結合させる。好ましくは、オリゴヌクレオチドテールはホモポリマーヌクレオチドテール（すなわち、ポリＡ，ポリＧ、ポリＣまたはポリＴ）である。好ましくは、オリゴヌクレオチドテールは、一般に約３ヌクレオチド〜５００ヌクレオチド超の長さ、好ましくは約２０〜約１００ヌクレオチドの長さの範囲のポリＡテールである。ＰＡＰを用いる場合、好適な緩衝液は、マグネシウムイオンおよびマンガンイオンの両方を含有するトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（またはその他の適当な緩衝液）である。例えば、緩衝液は、１〜１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１〜２０ｍＭのＭｇＣｌ２および１〜２０ｍＭのＭｎＣｌ２、ならびに０．０１〜２０ｍＭのＡＴＰを含み得る。テーリング反応は通常、３７℃で５〜６０分間行う。
【００３１】
標識標的ｍｉＲＮＡ分子を作製するために、検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識を含む核酸標識分子を３’末端に含むセンス鎖を含む部分的二本鎖デオキシ核酸配列を、ライゲーションにより３’オリゴヌクレオチドテールと結合させる（図１ｂを参照されたい）。この工程は、３’オリゴヌクレオチドテールと、オリゴヌクレオチドテールに相補的なデオキシヌクレオチド配列を含む、部分的二本鎖デオキシ核酸配列のアンチセンス鎖３’末端のオーバーハング配列との間の相補的塩基対形成により促進される。例えば、オリゴヌクレオチドテールがポリＡテールである場合、部分的二本鎖デオキシ核酸配列の３’オーバーハングは、一般に約３ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド超の長さ、好ましくは約１０〜約３０ヌクレオチドの長さの範囲のデオキシチミジン配列を３’末端に含む。配列同士が相補的であると見なされるためには、３’オーバーハング配列の特定のヌクレオチド配列が３’オリゴヌクレオチドテールの特定のヌクレオチド配列に完全に（すなわち、１００％）相補的である必要はなく、また３’オーバーハング配列の長さが３’オリゴヌクレオチドテールの長さとちょうど同じである必要もない。３’オーバーハングが３’オリゴヌクレオチドテールとアニールし捕捉配列が適切にｍｉＲＮＡ分子の３’末端の位置に来るのに十分な相補性が２つの配列間にあるだけでよいということを当業者は認識するであろう。
【００３２】
適切な位置に来れば、ライゲーションにより核酸標識分子を３’オリゴヌクレオチドテールと結合させる。このようなオーバーハングまたは「付着末端」ライゲーション反応は平滑末端ライゲーション反応に比べて、効率的であり、また高い温度で行うことができる。さらに、オリゴデオキシヌクレオチドテールの使用により、デオキシ核酸標識分子ＤＮＡとＤＮＡテールのライゲーションが可能となり、この方がＤＮＡとｍｉＲＮＡを直接ライゲートするよりも効率的である。任意のＤＮＡリガーゼをライゲーションに使用し得る。好ましくは、ＤＮＡリガーゼはＴ４  ＤＮＡリガーゼである。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いる場合、好適な緩衝液は、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）により供給される１０×ライゲーション緩衝液（６６０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）の１／１０希釈物である。反応はＥＤＴＡの添加により停止させることが好ましい。
【００３３】
ｍｉＲＮＡ分子のテール付加および標識分子へのテールのライゲーションは、記載の通りに別々の反応で行うか、または単一の反応混合物中で行い得る。このような「１段階」工程の方が高いスループットが得られ、またアッセイ間の再現性が向上する。単一の反応混合物は通常、１８〜３７℃で３０〜４５分間インキュベートする。
【００３４】
ライゲーション反応で使用する核酸標識分子は、好ましくは、検出可能なシグナルを放出または発生することができる複数の標識分子が結合した多標識ポリマー足場である。また足場は、３’テール付加したｍｉＲＮＡ分子とのライゲーションのための５’リン酸基を含むオリゴヌクレオチド伸長配列も含む（図１ｂを参照されたい）。多標識ポリマー足場は、標識分子が結合することができる任意のポリマー、例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、脂質、脂肪酸、核酸などであり得る。多標識ポリマー足場の総分子量は、好ましくは約５０〜約３５０ｋＤａである。ポリマー足場は、好ましくは、消光が低減もしくは除去されるように、および／または巨大な検出分子（例えば、ストレプトアビジン）への接近が可能であるように相隔たった約２〜１０個の標識分子を含む。当業者は、入手可能な文献に基づいて、適当な標識分子の間隔を決定することができる。例えば、米国特許第６，７６２，２９２号、同第６，０７２，０４３号および同第６，０４６，０３８号には、蛍光標識分子と核酸足場との結合に最適な間隔を決定する工程が記載されている。一般に核酸足場での標識分子の間隔は、少なくとも１０ｎｔあれば十分である。他のタイプの足場での間隔は、適宜決定し得る。
【００３５】
図２は、本発明の好適な多標識ポリマー足場を図示している。多標識ポリマー足場は、核酸配列とのハイブリダイゼーション結合が可能な５’リン酸基を有するオリゴヌクレオチド伸長配列を含む。この実施形態では、核酸配列は図２に示される架橋オリゴヌクレオチドであり、その５’部分はポリマー足場のオリゴヌクレオチドテールに相補的であり、３’部分はｍｉＲＮＡ分子の３’オリゴヌクレオチドテールに相補的である。ポリマー足場と架橋オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ分子を標識するための系を共に構成する。オリゴヌクレオチドテールの５’リン酸基により、ポリマー足場をｍｉＲＮＡ分子とライゲートすることができる。架橋オリゴヌクレオチドは通常、ライゲーション反応中、ポリマー足場のオリゴヌクレオチドテールよりもモル過剰、好ましくは約１．８〜２．６倍のモル過剰である。ハイブリダイズした架橋オリゴヌクレオチド／ポリマー足場オリゴヌクレオチドテールは、上記部分的二本鎖デオキシ核酸配列を共に形成して、ｍｉＲＮＡ分子を標識するための系を構成する。この場合も同様に、図２に示される配列は例示的なものに過ぎず、ハイブリダイゼーション可能な任意の配列を使用し得ることを理解するべきである。
【００３６】
好適な実施形態では、多標識ポリマー足場は、２０〜１０００塩基、より好ましくは３００〜７５０塩基の核酸を含み、１つのライゲート可能な末端および検出可能なシグナルを放出または発生することができる１０〜１５個の標識分子を含む、低分子の直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物である。上で述べたように、ライゲート可能な末端は、テール付加したｍｉＲＮＡ分子とライゲートすることができる５’リン酸を有する。いくつかの実施形態では、直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物は、低分子の３ＤＮＡ（商標）デンドリマー捕捉試薬（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、Ｐａ．）である。デンドリマーは、標識分子と捕捉配列との結合のために、２種類の一本鎖ハイブリダイゼーション「アーム」を表面に含む高度に分岐した核酸分子である。１つのデンドリマーが各種類のアームを複数有し得るため、ハイブリダイゼーションで得られるシグナルが大幅に増強される。樹枝状試薬を用いたシグナル増強は、Ｎｉｌｓｅｎら，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１８７：２７３（１９９７）；Ｓｔｅａｒｓら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３：９３（２０００）；米国特許第５，１７５，２７０号、同第５，４８４，９０４号、同第５，４８７，９７３号、同第６，０７２，０４３号、同第６，１１０，６８７号および同第６，１１７，６３１号；ならびに米国特許公開第２００２／００５１９８１号に記載されている。最適に設計されたデンドリマーの使用により、消光が低減または除去されるように標識分子を配置することができる。さらに、バイアスのかかった標的核酸分子自体の増幅を発生させることなく標識分子中のシグナルを増幅または増強することができる。
【００３７】
直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物は、５’−３’方向のハイブリダイゼーションにより互いに結合した第一、第二および第三のポリヌクレオチドモノマーを含んでもよく、各ポリヌクレオチドモノマーは、互いにハイブリダイゼーション結合する前に、第一、第二および第三の一本鎖ハイブリダイゼーション部位を有する。第一のポリヌクレオチドモノマーの第三の一本鎖ハイブリダイゼーション部位は、第二のポリヌクレオチドモノマーの第一の一本鎖ハイブリダイゼーション部位とハイブリダイゼーション結合し、第二のポリヌクレオチドモノマーの第三の一本鎖ハイブリダイゼーション部位は、第三のポリヌクレオチドモノマーの第一の一本鎖ハイブリダイゼーション部位とハイブリダイゼーション結合している。直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物の第一のポリヌクレオチドモノマーの第一の一本鎖部位は、核酸配列とハイブリダイゼーション結合するように設計されている。本明細書に記載の標識方法において使用する場合、核酸配列は、多標識ポリマー足場を３’オリゴヌクレオチドテール付加されたｍｉＲＮＡ分子と結合するために使用する図２に示される架橋オリゴヌクレオチド配列である。
【００３８】
直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物を組み立てるために使用する各ポリヌクレオチドモノマー内の各第二の一本鎖ハイブリダイゼーション部位は、１つ以上の標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション結合するように設計されている。標識オリゴヌクレオチドは１つ以上の標識分子を含む。好ましくは、第三のポリヌクレオチドモノマーの第三の一本鎖ハイブリダイゼーション部位も１つ以上の標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション結合している。標識直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物は、組立て後に、例えばソラレンの化学作用を用いて架橋することが好ましい。
【００３９】
他の実施形態では、核酸標識分子（核酸標識試薬とも呼ぶ）は、検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識分子が結合したポリヌクレオチドであり、この核酸標識分子は、核酸配列とのハイブリダイゼーションが可能な５’リン酸基を含むオリゴヌクレオチド伸長配列を含む。好適な実施形態では、核酸標識分子は、ＤＮＡを含み、かつ総分子量が約５〜約２５０ｋＤａである。標識分子は、好ましくは約１〜約１５個の標識分子を含む。特に好適な実施形態では、核酸標識分子は、標識分子を除いた総分子量が約５ｋＤａ以下であり、かつ３’末端に１個の標識分子を含む一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。他の実施形態では、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの分子量は、任意の標識分子を除いて約２〜約２．３ｋＤａである。
【００４０】
核酸標識分子上の標識分子（１つまたは複数）は、検出可能なシグナルを放出または発生することができる任意の分子であり得る。このような分子としては、検出可能なシグナルを直接放出または発生する分子、例えば放射性分子、蛍光分子および化学発光分子、ならびに比色アッセイで使用する西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼのような酵素などが挙げられる。また上記分子として、検出可能なシグナルを直接は発生しないが、直接発生する系において結合する、ビオチン／ストレプトアビジン、抗原／抗体およびその他のハプテンの組合せのような分子も挙げられる。好ましくは、シグナル発生分子は、検出可能なシグナルを直接放出または発生する分子、より好ましくはフルオロフォア、最も好ましくはＣｙ３もしくはＣｙ５色素（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｏｙｓｔｅｒ（登録商標）−５５０もしくはＯｙｓｔｅｒ（登録商標）−６５０色素（Ｄｅｎｏｖｏ  Ｂｉｏｌａｂｅｌｓ、Ｍｉｎｉｓｔｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）５５５もしくは６４７色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）のような他の適当な色素である。標識オリゴヌクレオチドを調製するための標識分子の使用は、当該技術分野で公知である。
【００４１】
次いで、標識ｍｉＲＮＡ分子を、ｍｉＲＮＡプローブを含む固体支持体と接触させる（図１ｃを参照されたい）。本明細書で使用される「固体支持体」は、核酸プローブを含む、スライド、チップ、膜、ビーズおよびマイクロタイタープレートを含めた任意の固体支持体を包含することが意図される。ｍｉＲＮＡプローブを固体支持体に結合させるための方法は当業者に公知である（例えば、Ｂａｂａｋら，ＲＮＡ  １０：１８１３（２００４）；Ｃａｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１１７５５（２００４）；Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９７４０（２００４）；Ｍｉｓｋａら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．５：Ｒ６８（２００４）；Ｓｉｏｕｄ  ａｎｄ  Ｒｏｓｏｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３７：５７４（２００４）；Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙら，ＲＮＡ  ９：１２７４（２００３）を参照されたい）。あるいは、平面およびビーズ型両方のｍｉＲＮＡマイクロアレイを、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ（ＮＣｏｄｅ（商標）ｍｉＲＮＡマイクロアレイ）、Ｅｘｉｑｏｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ（ｍｉＲＣＵＲＹ（商標）ｍｉＲＮＡアレイ）、ＣｏｍｂｉＭａｔｒｉｘ，Ｍｕｋｉｌｔｅｏ，ＷＡ（ｍｉＲＮＡ  ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ（商標））およびＬｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ（ＦｌｅｘｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡパネル）から購入することができる。また標識ｍｉＲＮＡ分子は、酵素結合オリゴ吸着アッセイ（ＥＬＯＳＡ）でも使用し得る。
【００４２】
標識標的ｍｉＲＮＡ分子の場合、固体支持体はアンチセンスｍｉＲＮＡ分子プローブを含む。プローブは成熟ｍｉＲＮＡ配列とプレｍｉＲＮＡ配列の両方を検出するように設計されていてもよく、またはプローブはプレｍｉＲＮＡ配列に特異的であってもよい。比較によりプレ配列と成熟配列の両方のプロファイルを得ることができる。ｍｉＲＮＡプローブは、例えば、ｍｉＲＢａｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｔｈｅ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，ＵＫ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３４：Ｄ１４０（２００６））から公的に入手可能な既知のｍｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡ配列を用いて設計し得る。新規なｍｉＲＮＡ配列を用いてｍｉＲＮＡプローブを設計してもよく、また新規なｍｉＲＮＡ配列を、当業者に公知のコンピュータによる方法（例えば、Ａｍｂｒｏｓら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１３：８０７（２００３）；Ｇｒａｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １１；１２５３（２００３）；Ｌａｉら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．４：Ｒ４２（２００３）；Ｌｉｍら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１７：９９１（２００３）；Ｌｉｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：１５４０（２００３）を参照されたい）またはｍｉＲＮＡクローニングストラテジー（例えば、Ｗａｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：１６８８（２００４）；Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８５３（２００１）；Ｌａｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８５８（２００１）；Ｌｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８６２（２００１）を参照されたい）を用いて同定することができる。
【００４３】
固体支持体と標識ｍｉＲＮＡ分子を、標識ｍｉＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡプローブとハイブリダイズすることができる十分な時間と温度で、ハイブリダイゼーション緩衝液中でインキュベートする。適切なアレイハイブリダイゼーション緩衝液としては、無ヌクレアーゼ水で７５％まで希釈した２×ＳＤＳベースの緩衝液（２×ＳＳＣ、４×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、１％ＳＤＳ、０．５Ｍリン酸ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）および２×増強ハイブリダイゼーション緩衝液（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）が挙げられる。適切なビーズアッセイ緩衝液は、４〜４．５ＭのＴＭＡＣ、５〜１５％の脱イオン化ホルムアミド、０．１〜２％のＢＳＡ、０．２５〜１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含有する。
【００４４】
好ましくは、固体支持体および捕捉配列−標識核酸分子を約０．５〜７２時間、好ましくは１８〜２４時間、約２５〜６５℃、好ましくは４５〜６５℃でインキュベートする。ハイブリダイズしていない余分な標識ｍｉＲＮＡ分子は、予熱した２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ洗浄緩衝液中、２５〜６０℃、好ましくは５０〜５５℃で１５分間、２×ＳＳＣ中、室温で１０〜１５分間、０．２×ＳＳＣ中、室温で１０〜１５分間洗浄することにより除去し得る。次いで固体支持体を、通常はスキャニングにより解析する（図１ｄ）。マイクロアレイアッセイは、適当な機器、例えばＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）Ｐｒｏ３．０ソフトウェアを備えたＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）４０００Ｂマイクロアレイスキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）またはＳｃａｎＡｒｒａｙ（商標）５０００（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）などを用いて解析する。ビーズアッセイは、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）により供給される計測器およびソフトウェアならびに当業者に公知の同様の装置を用いて解析し得る。
【００４５】
本発明の方法および試薬は、好都合にはキットの形態でパッケージ化し得る。このようなキットは、各種研究および診断用途に使用し得る。例えば、本発明の方法およびキットを用いて、異なる細胞もしくは組織、同じ細胞もしくは組織の異なる亜群、同じ細胞もしくは組織の異なる生理状態、同じ細胞もしくは組織の異なる発生段階、または同じ組織の異なる細胞集団における１つ以上のｍｉＲＮＡの発現の比較解析を容易に行うことができる。このような解析により、ｍｉＲＮＡのレベルの統計的な有意差を明らかにし、解析する細胞または組織によっては、次にこれを用いて、各種疾患状態の診断、疾患進行の予後および疾患治療のための標的の特定を容易に行うことができる。
【００４６】
本発明に従って多種多様なキットを調製し得る。例えば、標識標的ｍｉＲＮＡ分子の作製のためのキットは、センス鎖とアンチセンス鎖とを有する部分的二本鎖核酸配列であって、センス鎖が、検出可能なシグナルを放出または発生することができる１つ以上の標識を含む核酸標識分子を含み、アンチセンス鎖が、オリゴヌクレオチドテールに相補的な配列を含む一本鎖３’オーバーハングを含む部分的二本鎖核酸配列；および部分的二本鎖核酸配列を用いた標識標的ｍｉＲＮＡ分子を作製するための指示書を含み得る。好適な実施形態では、部分的二本鎖核酸配列は、上記多標識ポリマー足場および架橋オリゴヌクレオチドからなる。他の好適な実施形態では、多標識ポリマー足場は上記直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物である。
【００４７】
指示書は通常、書面または印刷物を含むが、これらに限定されない。このような指示を記憶し、最終使用者に伝達することができる任意の媒体が、本発明により考慮される。このような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学式媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などが挙げられるが、これらに限定されない。このような媒体は、上記指示書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。
【００４８】
またキットは、本発明の標識ｍｉＲＮＡ分子作製のための１つ以上の以下の成分または試薬も含み得る：ＲＮアーゼ阻害剤；オリゴヌクレオチドテールを一本鎖ＲＮＡ分子に結合させるための酵素（例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）；オリゴヌクレオチドテールを一本鎖ＤＮＡ分子に結合させるための酵素（例えば、ＴｄＴ）；逆転写酵素；および部分的二本鎖核酸配列をオリゴヌクレオチドテールと結合させるための酵素（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）。キットは、ハイブリダイゼーション液および洗浄液、インキュベーション容器、カバーガラス、ならびに各種のシグナル検出、シグナル発生、シグナル増強およびシグナル保護試薬を含めた、成分および試薬、ならびにｍｉＲＮＡアッセイで標識ｍｉＲＮＡを使用するための指示書をさらに含み得る。さらにキットは、本発明の標識ｍｉＲＮＡ分子の作製および使用に適合する緩衝液、ヌクレオチド、塩、無ＲＮアーゼ水、容器、バイアル、反応チューブなどを含み得る。成分および試薬は、適当な記憶媒体で番号を付した容器で提供し得る。
【００４９】
本発明の方法による特定の実施形態を以下の実施例で説明する。実施例は単に例示的なものであり、開示の残りの部分を決して限定するものではないことが意図される。
【実施例】
【００５０】
実施例１
全ＲＮＡ中のｍｉＲＮＡ分子の標識およびアンチセンスｍｉＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
直鎖樹枝状ポリヌクレオチド核酸標識分子の調製
三量体の直鎖樹枝状ポリヌクレオチド核酸標識分子を上記のように調製した。標識分子は分子量が１６５ｋＤａで、１５個のフルオロフォア部分を１０〜１５ｎｔの間隔で含み、組立て後にＵＶ−Ａの存在下でトリオキシサレンを用いて架橋された。標識分子は、図２で示される５’−リン酸化オリゴヌクレオチド伸長配列（５’−ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＡＴＧ  ＣＣ−３’；配列番号１）を含んでいた。ＵＶ照射した調製物を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭ−３０マイクロ濃縮器を供給業者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の指示通りに用いて精製した。
【００５１】
直鎖樹枝状ポリヌクレオチド核酸標識分子を含有するライゲーション混合物の調製
４２μｌの精製標識分子（２，３８０ｎｇ／μｌ）を、図２に示される架橋オリゴヌクレオチド（５’−ＧＧＣ  ＡＴＡ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｔ−３’；配列番号２）（９０４ｎｇ／μｌ）１２．３μｌおよび１０×ライゲーション緩衝液（６６０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）３５μｌと混合して最終体積２１０μｌにした。架橋オリゴヌクレオチドを、図２に示される５’−リン酸化オリゴヌクレオチド伸長配列と下記の３’ポリ（Ａ）テール付加したｍｉＲＮＡ分子の両方とハイブリダイゼーション結合するように設計し、標識分子とテール付加ｍｉＲＮＡ分子がライゲートできるようした。混合物を、１リットルビーカーに準備した０．３０Ｌの水浴中、６０℃で１０分間加熱した。次いで、ライゲーション混合物の入ったビーカーを室温まで冷却させた。１０×ライゲーション緩衝液１４０μｌを加え、チューブをボルテックスしてかき混ぜた。次いで混合物を、使用するまで−２０℃で保管した。
【００５２】
ｍｉＲＮＡ分子のテール付加
１．５μｇのラット脳全ＲＮＡおよび１．５μｇのラット肝臓全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を、別々に無ヌクレアーゼ水で１０μｌにした。１．５μｌの１０×反応緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１．５μｌの２５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１μｌの０．０２ｍＭ  ＡＴＰおよび１μｌのポリ（Ａ）ポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）を加え、３７℃で１５分間加熱して、全ＲＮＡにポリ（Ａ）テールを付加した。
【００５３】
ｍｉＲＮＡのライゲーション
ライゲーション混合物４μｌおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（２Ｕ／μＬ）２μｌを加え、室温で３０分間インキュベートして、ポリ（Ａ）テール付加したＲＮＡ分子をライゲートした。停止液（０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ）２．５μｌを加えて反応を停止させた。ラット脳ＲＮＡを、Ｏｙｓｔｅｒ（登録商標）−５５０標識分子を含むデンドリマー分子とライゲートし、ラット肺ＲＮＡを、Ｏｙｓｔｅｒ（登録商標）６５０標識分子を含むデンドリマー分子とライゲートした。
【００５４】
標識ｍｉＲＮＡのマイクロアレイハイブリダイゼーション
マイクロアレイハイブリダイゼーション混合物を調製する前に、２×増強ハイブリダイゼーション緩衝液（無ヌクレアーゼ水で７５％まで希釈したＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（商標）緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を解凍し、再懸濁させた。標識ＲＮＡ分子を５ｕｌの１０％ＢＳＡおよび２×増強ハイブリダイゼーション緩衝液と混合して、１×の最終濃度にした。ハイブリダイゼーション混合物をＮＣｏｄｅ（商標）マイクロアレイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に添加し、ガラスカバースリップを被せ、５２℃で一晩インキュベートした。単色アッセイ用に、一方の標識ｍｉＲＮＡ集団のみを選択されたハイブリダイゼーション混合物中、残りの体積を無ヌクレアーゼ水で満たしインキュベートした。
【００５５】
５２℃に予熱した２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ洗浄緩衝液中でマイクロアレイを洗浄してカバースリップを取り除いた。マイクロアレイを、予熱した２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ洗浄緩衝液中、５２℃で１５分間、２×ＳＳＣ中、室温で１０〜１５分間、０．２×ＳＳＣ中、室温で１０〜１５分間、順に洗浄した。マイクロアレイを乾いた５０ｍＬ遠心チューブに移し、粘着バーコードまたはラベルがすべてチューブの下側に向くようにスライドを配置した。マイクロアレイが入ったチューブを、マイクロアレイを乾燥させるためにチューブキャップをせずに直ちに８００〜１０００ＲＰＭで遠心分離した。マイクロアレイの表面に触れないように注意しながら、マイクロアレイをチューブから取り出した。ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）Ｐｒｏ３．０ソフトウェアを備えたＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）４０００Ｂマイクロアレイスキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いてアレイをスキャンして、元のサンプル中のｍｉＲＮＡ配列の発現プロファイルを作製した。脳と肝臓のプロファイルを比較して、各種ｍｉＲＮＡの差異プロファイルを確立した。肝臓には主としてｍｉＲ１２２が存在し、脳には主としてｍｉＲ１２４ａおよびｍｉＲ９が存在することが観察された。ｍｉＲ１６およびｍｉＲｌｅｔ７ａ−ｆ、ならびにその他のｍｉＲＮＡが脳および肝臓の両方で発現されたが、これらは組織特異的プロファイルを示していた。
【００５６】
実施例２
濃縮ＲＮＡ中のｍｉＲＮＡ分子の標識およびアンチセンスｍｉＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
マイクロアレイハイブリダイゼーションの前に、ラット脳およびラット肝臓全ＲＮＡの低分子量ＲＮＡを濃縮したこと以外は、実施例１の手順に従った。１．５μｇのラット脳およびラット肝臓全ＲＮＡを１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０で１００μｌに別々に希釈し、８０℃まで３分間加熱し、氷上で冷却した。５０μｌの１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０を加え、１３，０００ＲＰＭで３分間遠心分離することにより、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭ−１００マイクロ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を各ＲＮＡ試料用に予湿した。カラムを新たな収集チューブに入れ、各１００μｌの試料を加え、１３，０００ＲＰＭで７分間遠心分離した。低分子量ＲＮＡ分子を含有する各通過画分（約９５μｌ）を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭ−３マイクロ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて１３，０００ＲＰＭで３０分間遠心分離することにより濃縮した。次いで５μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を各試料リザーバに加え、カラム側面を軽くたたいて静かにかき混ぜた。次いで各試料リザーバを新たな収集チューブに逆さにして入れ、１３，０００ＲＰＭで３分間遠心分離して、濃縮された濃縮ＲＮＡを収集した（−５−１０μｌが回収された）。次いで、各濃縮ＲＮＡ試料を無ヌクレアーゼ水で１０μｌにした。
【００５７】
濃縮ＲＮＡ分子に、上記の通りにポリ（Ａ）を付加し、ライゲーションを行い、ＮＣｏｄｅ（商標）マイクロアレイとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後に、アレイを上記の通りに洗浄およびスキャンして、元のサンプル中のｍｉＲＮＡ配列の発現プロファイルを作製した。実施例１（全ＲＮＡ  ｌｏｇ２（肝臓／脳））と実施例２（濃縮ＲＮＡ  ｌｏｇ２（肝臓／脳））のデータを比較すると、０．９３３のＰｅａｒｓｏｎ相関が認められた。
【００５８】
実施例３
ＥＬＯＳＡ
プレートのコーティング
ＣｏＳｔａｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｌｏｗｅｌｌ、ＭＡ）マイクロタイタープレートの各ウェルに１×ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのヒトｍｉＲ１２２アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  Ａ−３’；配列番号３）を１００μｌ加えてコーティングした。プレートをマイクロプレート圧着シーラー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で覆い、室温で一晩インキュベートした。次いで、プレートを１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄し、吸い取り紙で乾燥させた。
【００５９】
プレートのブロッキングおよびｍｉＲＮＡの標識
各ウェルに１×ＰＢＳ中４％のＢＳＡを２００μｌ加えた。プレートにカバーをして、室温で１〜２時間インキュベートした。プレートのブロッキングインキュベーション時に、全ＲＮＡおよび濃縮ＲＮＡ中のｍｉＲＮＡ分子を標識した。１μｇ、０．７５μｇ、０．５μｇおよび０．２５μｇのラット肝臓全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）から、上の実施例に記載されている通りに、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭ−１００マイクロ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて低分子量ＲＮＡを濃縮し、次いでＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭ−３マイクロ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて濃縮した。上の実施例１に記載されている通りに、濃縮ＲＮＡ試料ならびに１μｇ、０．７５μｇ、０．５μｇおよび０．２５μｇのラット肝臓全ＲＮＡにポリ（Ａ）テールを付加した。ライゲーション混合物４μｌおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（２Ｕ／μＬ）２μｌを加え、室温で３０分間インキュベートして、テール付加ＲＮＡ分子をライゲートした。ライゲーション混合物は、直鎖樹枝状ポリヌクレオチド核酸標識分子がフルオロフォア部分ではなくビオチン部分を含む以外は、実施例１のライゲーション混合物と同じであった。停止液（０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ）２．５μｌを加えて反応を停止させ、２３．５μｌのビオチン化ＲＮＡを得た。ブロッキングが完了した後、プレートを１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄し、吸い取り紙で乾燥させた。
【００６０】
試料のハイブリダイゼーション
１９μｌのＴＭＡＣ溶液（４．５Ｍ  ＴＭＡＣ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、７５ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８、０．１５％サルコシル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、６ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ））、２６μｌの脱イオン化ホルムアミド（ＥＭＤ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）、５μｌの１０％ＢＳＡおよび無ヌクレアーゼ水１．５μｌを２３．５μｌの各ビオチン化試料に加えて、最終体積７５μｌにした。各試料を静かにかき混ぜ、遠心分離し、コーティングされたブロック済みウェルに添加した。試料をプレートで３〜４時間、室温でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、最初に５２℃まで予熱した２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ洗浄緩衝液で２回洗浄し、次いで室温で２×ＳＳＣで２回洗浄し、次いで室温で０．２×ＳＳＣで２回洗浄した。
【００６１】
ストレプトアビジン−ＨＲＰハイブリダイゼーション
ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＳＡ−ＨＲＰ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、製造者の推奨に従って１×ＰＢＳ中４％のＢＳＡ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ、Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ、ＴＸ）で希釈した。希釈したＳＡ−ＨＲＰを各ウェルに５０μｌ加え、プレートを穏やかに振盪しながら室温で１時間、インキュベートした。次いで、プレートを１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で２〜４回洗浄し、吸い取り紙で乾燥させた。
【００６２】
シグナル発現
ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）１００μｌを各ウェルに加え、プレートを室温で１〜１５分間インキュベートした。ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（商標）停止緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）１００μｌを各ウェルに加えた。Ｖｉｃｔｏｒ３マルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。濃縮ＲＮＡおよび全ＲＮＡの両方において、入力したＲＮＡと観察されたシグナルとの間に、相関係数がそれぞれ０．９８５および０．９７３の直線関係が見られた。ｍｉＲ１２２の検出限界は、濃縮ｍｉＲＮＡまたは全ＲＮＡのいずれでも全ＲＮＡの０．２５μｇ未満であると判定された。
【００６３】
実施例４
ｍｉＲＮＡ分子のＬｕｍｉｎｅｘビーズ検出
実施例３で上に述べた通りに、ラット脳および肝臓由来の全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）にポリ（Ａ）テールを付加し、ビオチン化樹枝状ポリヌクレオチド核酸標識分子とライゲートした。２種類の蛍光色素を様々な量で含有し、２種類の蛍光色素の比から一方のタイプのビーズを別のタイプのものと区別することができる各種Ｌｕｍｉｎｅｘ銘柄のカルボキシル化マイクロビーズ調製物（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を、Ｌｕｍｉｎｅｘの手順を用いて、選択されたラット成熟ｍｉＲＮＡ配列（ｍｉＲＢａｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ；ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を表す各種アミノ化２２ｍｅｒアンチセンスｍｉＲＮＡプローブ（ＩＤＴ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共有結合させた。複数のｍｉＲＮＡ特異性を同時に検出するために設計された多重検出アッセイでは、ライゲートしたＲＮＡ試料１７μｌを、１０％ホルムアミド、４．５Ｍ  ＴＭＡＣ、０．１％ＢＳＡおよび２５ｎｇ／μｌのサケ精子ＤＮＡを含む緩衝液３３μｌ中の複数の各種タイプのＬｕｍｉｎｅｘビーズに加えた。ビーズ−ＲＮＡ混合物を、５００μｌポリプロピレンチューブ中、４７℃で一晩、３００ＲＰＭで水平方向に攪拌しながらインキュベートした。ビーズをフィルターマイクロプレートに移し、５６℃まで予熱した２×ＳＳＣ、２０％ホルムアミドで吸引ろ過により洗浄した後、室温において２×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣおよび１×ＰＢＳで洗浄した。１×ＰＢＳ中のストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）（２ｎｇ／μｌ）１００μｌを各ビーズ混合物に加え、３７℃で３０分間、３００ＲＰＭで攪拌しながらインキュベートした。ビーズを１×ＰＢＳで３回洗浄し、１２５μｌの１×ＰＢＳ中に再懸濁させ、製造者の推奨に従ってＬｕｍｉｎｅｘ  １００  ＩＳシステムで解析した。バックグランド値の２倍を上回る特異的ｍｉＲＮＡプローブの平均蛍光強度（ＭＦＩ）値が、ライゲートＲＮＡ調製物中のｍｉＲＮＡ分子の特異的検出を表した。脳および肝臓ｍｉＲＮＡのプロファイルを、実施例１および２のｍｉＲＮＡアレイで観察されたプロファイルと比較した。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームで試験したすべてのｍｉＲＮＡのプラットフォーム間で同様の肝臓／脳プロファイルが観察された。
【００６４】
実施例５
アンチセンスｍｉＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーションための標的ｍｉＲＮＡ分子を直接標識するキット
標識標的ｍｉＲＮＡ分子の作製およびマイクロアレイハイブリダイゼーションのためのキットを以下の成分で構築した：
Ｏｙｓｔｅｒ（登録商標）−５５０および６５０ライゲーション混合物（直鎖樹枝状ポリヌクレオチド組成物２５０ｎｇ／μｌおよび架橋オリゴヌクレオチド３１．７ｎｇ／μｌ）（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）；
１０×反応緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）；
ＭｎＣｌ２（２５ｍＭ）；
ＡＴＰ混合物（ｌＯｍＭ）；
ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）；
２×ＳＤＳベースのハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、４×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、１％ＳＤＳ、０．５Ｍリン酸ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）；
２×増強ハイブリダイゼーション緩衝液（予め無ヌクレアーゼ水で７５％に希釈したＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（商標）緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ））；
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（２Ｕ／μＬ）；ならびに
無ヌクレアーゼ水。
【００６５】
番号を付したバイアルに成分を入れ、キット成分を用いた標識標的ｍｉＲＮＡ分子の作製およびマイクロアレイハイブリダイゼーションのための印刷された取扱説明書を添付した容器に入れた。
【００６６】
実施例６
全ＲＮＡ中のｍｉＲＮＡ分子の標識およびアンチセンスｍｉＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
直鎖樹枝状ポリヌクレオチド核酸標識分子の調製
上記の通りに１つ以上のビオチン化オリゴヌクレオチドを緩衝剤（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）および塩（１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を含有する溶液中で混合することにより、ポリヌクレオチド核酸標識分子を調製した。標識ポリヌクレオチド分子は分子量が５〜２５０ｋＤａ（いずれの標識分子も除く）であり、１〜１５個の標識分子（ビオチンまたは蛍光色素）を含んでいた。フルオロフォア部分に１０〜１５ｎｔの間隔を置いた。標識ポリヌクレオチドは、組立て後にＵＶ−Ａの存在下でトリオキシサレンを用いて架橋した。標識分子は、図２に示される５’−リン酸化オリゴヌクレオチド伸長配列（５’−ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＡＴＧ  ＣＣ−３’；配列番号１）を含んでいた。ＵＶ照射した調製物を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＹＭ−３０マイクロ濃縮器を供給業者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の指示通りに用いて精製した。
【００６７】
直鎖樹枝状ポリヌクレオチド核酸標識分子を含有するライゲーション混合物の調製
精製標識分子を、図２に示される架橋オリゴヌクレオチド（５’−ＧＧＣ  ＡＴＡ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｔ−３’；配列番号２）および３５μｌの１０×ライゲーション緩衝液（６６０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）と混合し２１０μｌの最終体積にした。架橋オリゴヌクレオチドを、図２に示される５’−リン酸化オリゴヌクレオチド伸長配列および下記の３’ポリ（Ａ）テール付加したｍｉＲＮＡ分子の両方とハイブリダイゼーション結合するように設計し、標識分子とテール付加ｍｉＲＮＡ分子がライゲートできるようにした。混合物を、１リットルビーカーに準備した０．３０Ｌの水浴中、６０℃で１０分間加熱した。次いで、ライゲーション混合物の入ったビーカーを室温まで冷却させた。１０×ライゲーション緩衝液１４０μｌを加え、チューブをボルテックスしてかき混ぜた。次いで混合物を、使用するまで−２０℃で保管した。
【００６８】
ｍｉＲＮＡ分子のテール付加およびライゲーション
２段階工程：
１μｇのラット脳全ＲＮＡおよび１μｇのラット肝臓全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を、別々に無ヌクレアーゼ水で１０μｌにした。１．５μｌの１０×反応緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１．５μｌの２５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１μｌの０．０２ｍＭ  ＡＴＰおよび１μｌのポリ（Ａ）ポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）を加え、３７℃で１５分間加熱して、全ＲＮＡにポリ（Ａ）テールを付加した。
【００６９】
ライゲーション混合物４μｌおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（２Ｕ／μＬ）２μｌを加え、室温で３０分間インキュベートして、ポリ（Ａ）テール付加したＲＮＡ分子をライゲートした。停止液（０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ）２．５μｌを加えて反応を停止させた。ラット脳ＲＮＡを、Ｏｙｓｔｅｒ（登録商標）−５５０標識分子を含むデンドリマー分子とライゲートし、ラット肺ＲＮＡを、Ｏｙｓｔｅｒ（登録商標）−６５０標識分子を含むデンドリマー分子とライゲートした。
【００７０】
１段階工程：
１μｇのラット脳全ＲＮＡおよび１μｇのラット肝臓全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を、別々に無ヌクレアーゼ水で１０μｌにした。１．５μｌの２５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、４μｌのライゲーション混合物、２μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（２Ｕ／μＬ）および１μｌのポリ（Ａ）ポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）を加え、２５〜３７℃で４５分間インキュベートして、全ＲＮＡを標識した。停止液（０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ）２．５μｌを加えて反応を停止させた。２段階工程と同様に、ラット脳ＲＮＡを、Ｏｙｓｔｅｒ（登録商標）−５５０標識分子を含むデンドリマー分子とライゲートし、ラット肺ＲＮＡを、Ｏｙｓｔｅｒ（登録商標）−６５０標識分子を含むデンドリマー分子とライゲートした。
【００７１】
蛍光標識ｍｉＲＮＡのマイクロアレイハイブリダイゼーション
マイクロアレイハイブリダイゼーション混合物を調製する前に、２×増強ハイブリダイゼーション緩衝液（無ヌクレアーゼ水で７５％まで希釈したＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（商標）緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ））を解凍し、再懸濁させた。標識ＲＮＡ分子を５ｕｌの１０％ＢＳＡおよび２×増強ハイブリダイゼーション緩衝液と混合して、１×の最終濃度にした。ハイブリダイゼーション混合物をＮＣｏｄｅ（商標）マイクロアレイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に添加し、ガラスカバースリップを被せ、５２℃で一晩インキュベートした。単色アッセイ用に、一方の標識ｍｉＲＮＡ集団のみを選択されたハイブリダイゼーション混合物中、残りの体積を無ヌクレアーゼ水で満たしインキュベートした。
【００７２】
５２℃に予熱した２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ洗浄緩衝液中でマイクロアレイを洗浄してカバースリップを取り除いた。マイクロアレイを、予熱した２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ洗浄緩衝液中、５２℃で１５分間、２×ＳＳＣ中、室温で１０〜１５分間、０．２×ＳＳＣ中、室温で１０〜１５分間、順に洗浄した。マイクロアレイを乾いた５０ｍＬ遠心チューブに移し、粘着バーコードまたはラベルがすべてチューブの下側に向くようにスライドを配置した。マイクロアレイが入ったチューブを、マイクロアレイを乾燥させるためにチューブキャップをせずに直ちに８００〜１０００ＲＰＭで遠心分離した。マイクロアレイの表面に触れないように注意しながら、マイクロアレイをチューブから取り出した。ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）Ｐｒｏ３．０ソフトウェアを備えたＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）４０００Ｂマイクロアレイスキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いてアレイをスキャンして、元のサンプル中のｍｉＲＮＡ配列の発現プロファイルを作製した。脳と肝臓のプロファイルを比較して、各種ｍｉＲＮＡの差異プロファイルを確立した。肝臓には主としてｍｉＲ１２２が存在し、脳には主としてｍｉＲ１２４ａおよびｍｉＲ９が存在することが観察された。ｍｉＲ１６およびｍｉＲｌｅｔ７ａ−ｆ、ならびにその他のｍｉＲＮＡは脳および肝臓の両方で発現されたが、これらは組織特異的プロファイルを示していた。
【００７３】
ビオチン標識ｍｉＲＮＡのマイクロアレイハイブリダイゼーション
標識ＲＮＡ分子を、２×ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーション緩衝液（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂ  Ｗａｓ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）５０μｌ、１００％ホルムアミド（ＶＷＲ）５μｌ、ＤＭＳＯ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂ  Ｗａｓ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）１０μｌ、２０×真核Ｈｙｂ対照（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）５μｌ、対照Ｂ２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）１．７μｌおよび無ヌクレアーゼ水（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｘ）１０μｌと混合した。ハイブリダイゼーション混合物をＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）マイクロＲＮＡマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に添加し、製造者の推奨に従って４７℃で一晩（１６時間）インキュベートした。アレイを洗浄し、Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｃｒｉｐｔ、ＦＳ４５０＿００３を用いてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ４５０で染色した。
【００７４】
結果
所与の実験で使用したビオチン標識したポリヌクレオチド標識試薬に応じて、標識タグの推定の大きさは約１００〜７００塩基長の間であった（この長さには、オリゴヌクレオチドテールの長さと標識試薬の長さが含まれる）。各種の大きさのポリヌクレオチド標識試薬を比較したＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）マイクロＲＮＡアレイで観察された結果を図３にまとめる。１試薬当たりのビオチン分子数に関係なく、低分子の標識試薬の方が大きな分子のものよりも有意に良好に機能した。
【００７５】
蛍光標識したポリヌクレオチド標識試薬を用いた２段階標識工程と１段階標識工程の対照比較では、１段階法の方が、はるかにワークフローが容易であり、多数の試料の並行処理に適していることが示された。アレイの結果（図４）では、２段階法と１段階法の平均にほとんどまたは全く差が示されず、このことは、反応を別々に行うか、１つの反応混合物中にまとめるかに関係なく、２つの酵素的段階（ポリＡテール付加およびライゲーション）が同様の効率で行われることを示唆している。また再現性は、２段階工程よりも１段階工程の方が高かった。
【００７６】
本明細書に引用されるすべての刊行物は、特許刊行物および非特許刊行物ともに、本発明が属する分野の当業者の技術レベルを示すものである。これらの刊行物はすべて、個々の刊行物が、参照により組み込まれるものとしてそれぞれ具体的かつ個別に明記された場合と同様に、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００７７】
本発明は、本明細書では特定の実施形態に関して記載されているが、これらの実施形態は、単に本発明の原理および応用の例示に過ぎないことを理解するべきである。したがって、以下の特許請求の範囲により定められる本発明の精神および範囲を逸脱することなく、数多くの修正が例示の実施形態に施され得ること、また他の構成が考案され得ることを理解するべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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