(57)【要約】  本発明はヌカント多価合成化合物及びグリコサミノグリカンからなる組成物、両化合物からなる微粒子を形成する両化合物の混合に関連し、同様に癌、炎症性疾患、等の増殖及び血管新生の調節機能の低下に関わる疾患の治療又は予防のための、又は創傷治癒の促進のためのそれらの使用に関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも三つの偽ペプチド単位がグラフト重合した支持体（Support）を含む、式（Ｉ）で表される多価合成化合物であって：
【化１】
2013540127.tif 000010
ここで
それぞれのＸは独立して任意のアミノ酸を示し；
Ｙ１及びＹ２は独立して塩基性の側鎖を有するアミノ酸から選択され；
Ｚはプロリンであり、そのγ、β、又はδ位が、水酸基、アミン基、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０アルケニル基、Ｃ１−Ｃ１０アルキニル基、Ｃ５−Ｃ１２アリル基、Ｃ５−Ｃ１４アラルキル基、若しくはＣ５−Ｃ１２ヘテロアリル基で置換されていてもよく、これらの基が、ハロゲン原子、ＮＯ２、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ＮＨ２、ＣＮ、トリハロメチル、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ４ジアルキルアミノ、グアニジノ基、及びチオール基からなる群から選ばれる１から６の置換基で置換されていてもよいもの；天然又は非天然のＮ−アルキルアミノ酸；ジアルキルアミノ酸；環状ジアルキルアミノ酸；若しくはピペコリン酸又はそれらの誘導体であり；
ｎ及びｉは独立して０又は１であり；
ｍは０〜３の整数であり；
ｋは３以上の整数であり；かつ
Ψは標準的なペプチド結合よりも、少なくとも一つのプロテアーゼに対する有意に強い耐性がある修飾されたペプチド結合を示すものと；グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）とを含有する組成物。
【請求項２】
前記支持体は直鎖状ペプチド若しくは環状ペプチド、直鎖状若しくは環状のペプトイド、フォルダマー、直鎖状高分子若しくは球状のデンドロマー、糖、又はナノ粒子から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記支持体は下記から選ばれる、請求項２に記載の組成物：
ａ）交互に並ぶＤ体のアルカリ性（Ａ）残基及びＬ体のリジン（Ｋ）残基からなる環状六員ペプチド
ｂ）各リジン残基のεアミノ基でアミド結合により連結された５個の各リジン残基（図２Ｅの化合物Ｎｕｃａｎｔ  ４参照）、及び
ｃ）配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号８，配列番号９，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２２，又は配列番号２４の配列からなる直鎖状ペプチド。
【請求項４】
前記支持体に前記偽ペプチド単位が直接グラフト重合する、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
ｋは３から８である、又は５から６である、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
ｉは１と等しく、Ｚはプロリン（Ｐ）である、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
Ｙ１及びＹ２は独立にアルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）から選択される、又はＹ１はリジン（Ｋ）であり、かつＹ２はアルギニン（Ｒ）である、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
ｎ及びｍはゼロと等しい、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
Ψは還元された結合（-CH2NH-）、逆向きの結合（-NHCO-）、メチレノキシ結合（-CH2-0-）、チオメチレン（-CH2-S-）、炭素結合（-CH2-CH2-）、ケトメチレン結合（-CO-CH2-）、ヒドロキシエチレン結合（-CHOH-CH2-）、（-N-N-）結合、Ｅ−アルケン結合、又は（-CH=CH-）結合を示す、請求項１から８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記多価合成化合物が下記式のＨＢ１９、ヌカント（Ｎｕｃａｎｔ）２，３，４，６，及び７から選ばれる、請求項１に記載の組成物。
【化２】
2013540127.tif 000011
【化３】
2013540127.tif 000012
【化４】
2013540127.tif 000013
【化５】
2013540127.tif 000014
【化６】
2013540127.tif 000015
【化７】
2013540127.tif 000016
【請求項１１】
偽ペプチド単位中のリジン残基は全てＤ体又は全てＬ体である、請求項１から１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
ＧＡＧはヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、及びそれらの組み合わせから選択される、又は前記ＧＡＧはヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、及びコンドロイチン硫酸Ｃから選択される、請求項１から１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
少なくとも１μＭの多価合成化合物を含有する、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
多価合成化合物のＧＡＧに対する質量比が０．０１と２４の間である、請求項１から１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
多価合成化合物はＧＡＧと混合される、又はかかる混合により微粒子が形成される、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
他の活性化合物としての細胞毒性のある薬剤、又は細胞毒性のある薬剤に限定されない他の活性化合物が混合された、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
細胞増殖及び／若しくは血管新生の調節機能の低下が関与する疾患の治療、又はかかる疾患の中でも癌の治療のための、請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
炎症性疾患のための、請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
創傷治癒のための、請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多価の人工化合物及びグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含有する組成物、癌、炎症性疾患、及び血管新生を伴う疾患の治療、並びに創傷治癒の促進のためのこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
有糸分裂は真核細胞の成長、修理、組織の再生を補助するために、及び／又は死細胞を置き換えるために使用される細胞分裂過程である。
【０００３】
癌細胞において、細胞分裂の制御には欠陥があり、これが、癌細胞が無秩序に分裂し、腫瘍を生じる理由である。したがって、がんの発生を防ぐための、効果的な治療ルートの一つは、有糸分裂阻害又は他の抗癌性を有する分子を使用して癌細胞の分裂を阻止することである。
【０００４】
しかしながら、現行の有糸分裂阻害分子（パクリタキセル、例えばタキソール又はコルヒチンの名でよく知られている）はあらゆる細胞を区別せず、細胞非特異的に作用するので、多くの有害な副作用の原因となる。したがって、有害な影響の少ない有糸分裂阻害分子の開発が非常に重要である。
【０００５】
すべての腫瘍は、成長のために栄養と酸素が必要である。これらの要素は、血管新生として知られているメカニズムにより生じる腫瘍血管によって提供される。実際には、これらの血管が存在しない場合は、腫瘍細胞は細胞壊死過程を経るため、腫瘍の成長は減速して停止する。癌と戦うための別の治療ルートの一例は、このメカニズムを制御する分子を妨害し、血管新生の過程を妨害するものである。
【０００６】
現行の抗血管新生の分子の多くは単一の血管新生因子に特異的である。この単一の特異性は抵抗性を生じる。血管新生の補償メカニズムによって、一つの血管新生因子の型の抑制は、別の型の発現をもたらす。したがって、このため、関連する因子に対する、幅広い活性を有する、抗血管新生の分子を使用可能なことは有益である。
【０００７】
しかし、血管新生過程の阻害のみでは、効果的に腫瘍の成長を阻止するには不十分であると一般的に言われている。また、それだけでは転移の形成は阻止されない。
【０００８】
したがって、腫瘍細胞の増殖と腫瘍血管新生とを抑制できる新規抗がん分子は非常に利用価値が高い。
【０００９】
実際、最近の研究は、片方は有糸分裂阻害剤、その他は抗血管新生である、二つの治療用分子の組み合わせが、これらの分子を一方だけで治療した場合と比較して、相乗効果を奏し、全体的な治療の有効性を大幅に増加させることを示している。これまで、これらの有糸分裂阻害及び抗血管新生の作用を有する分子は報告されていない。
【００１０】
また、現行の抗がん剤の大半は腫瘍細胞に対し本当の意味で特異的ではなく、健康な細胞も標的にするため、数多くの、時に深刻な副作用を生じる。腫瘍の表面分子を標的とする抗体の開発によって、いくつかの症例でこの問題が解決された。しかしながら、抗体の使用は他の深刻な問題を有し、さらに非毒性かつ効果のある治療用抗体の開発は時間がかかり、かつ不確実なものであり、かつ高価な方法である。さらに、衛生面と安全面の厳しい制約下での、大規模な抗体の生産は特に困難である。この結果、特定の抗体に基づく治療は、ほとんど例が無く、高額の費用を要する。
【００１１】
パクリタキセルなどの従来の抗悪性腫瘍薬に関連する別の問題は、これらの分子がしばしば高疎水性であり、生体に利用可能な生体適合性を達成するために複雑で高価な製剤の開発を必要とすることである。生体での生体適合性の問題は、核酸を用いた治療の場合、いっそう重大である。なぜなら、これらを効果的かつ特異的に標的細胞に到達させるは非常に難しいからである。
【００１２】
このため、以下の特性を示す新規抗がん分子が利用可能であれば非常に有用である：それらが単独で有効性を示すような、腫瘍増殖及び血管形成に対する二重の抑制作用による、より進歩した効能；従来の化学療法あるいは放射線療法を利用しないことで、これらの種類の治療法に関連する副作用が大きく限定されていること；治療に対する抵抗を防ぐための、血管新生因子に対する適切な広さの活性範囲；腫瘍細胞へのより優れた特異性により全くわずかの副作用しかないこと；工業規模に容易に適応可能な合成方法；容易に利用場合があること；よりよい生体適合性及び／又は生体内でのより長い半減期の結果、著効であること；特に腫瘍細胞用の直接的な特異性の結果として；水性溶媒への好ましい溶解性及び生体内の分解過程に対するより優れた耐久性。
【００１３】
したがって、有害な形態の細胞増殖、特に癌細胞の成長の抑制のための組成物及び方法の分野で必要とされている。
【００１４】
ＷＯ２００７／１２５２１０は、支持するために挿入された３個以上の偽ペプチド（ｐｓｅｕｄｏｐｅｐｔｉｄｅ）単位からなる、多価の又は複数価の人工ペプチドを開示している。この化合物ファミリー（ヌカント（Ｎｕｃａｎｔ）化合物という）が表面ヌクレオリンのＲＧＧ領域と相互作用して抗増殖と抗血管新生特性の両方を持つことで、がんや炎症性疾患の治療のために有用であることが示されている。これらは；血管新生因子に対する適切な広さの活性範囲；水性溶媒への好ましい溶解性；生体内の分解過程に対するより優れた耐久性（偽ペプチドによる修飾された分子結合の存在による）；全くわずかしかない副作用；工業規模に容易に適応可能な合成方法を示した。特定の例示される化合物は、化合物ＨＢ−１９、化合物ヌカント１，２，３，６，７（本願の図２を参照）がある。本明細書はかかる文献が完全に援用する。
【００１５】
ＷＯ２００９／１４１６８７は偽ペプチド単位内のリジン残基はすべて同じＬ型又はＤ型の立体配置を有する、改良型のヌカント化合物を開示している。この文献は、特に化合物ヌカント６Ｌ（Ｎ６Ｌ）について説明している。ＷＯ２００７／１２５２１０で開示された化合物ヌカント６では、偽ペプチド単位のすべてのリジン残基がＬ型の立体配置である。この化合物は、各偽ペプチド単位のリジン残基がＬ型又はＤ型の立体配置になる、錯化合物ヌカント６と比較するとより高い抗癌作用を有する。かかる化合物はまた創傷治癒においてより優れていた。本明細書はかかる文献が完全に援用する。ＷＯ２００９／１４１６８７も化合物ヌカント４，８，９を開示している（当該文献の請求項１０を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第２００７／１２５２１０号
【特許文献２】国際公開第２００９／１４１６８７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上記の二つの文献に言及されるヌカント化合物は、それ自体が非常に興味深いが、その抗増殖性と抗血管新生特性をさらに向上させることがなお望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）と相互作用することで、化合物又は合成物自身の有益な治癒作用、例えば、抗増殖作用を媒介及び／又は強化する、本発明のヌカント化合物又は多価の合成物という驚くべき、かつ予期しない発見に関する。例えば、ＧＡＧ（例えばヘパリン）とヌカントとの組み合わせは、ヌカントの抗癌作用を大幅に向上することができる。
【００１９】
一つの態様では、本発明は、例えば、ヌカントと少なくとも一つのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含有する組成物、特に治療用組成物を提供する。したがって、特定の実施の態様では本発明はＧＡＧと、ここで説明するヌカントとの複合体を含有する組成物、特に治療用組成物を提供する。特定の実施の態様では、ヌカントはペプチド又は偽ペプチド、例えば、ＨＢ−１９又はＮ６Ｌである。本明細書に記載の組成物のいずれにおいても、本発明によって提供される治療用組成物は、任意に、薬理学的に利用可能なキャリア、賦形剤又は補助剤を含むことができる。
【００２０】
別の態様では、本発明は、その組成が細胞の増殖の抑制又は防止に効果的である、有効量の、ヌカント及び少なくとも一つのＧＡＧ、並びに／又は本明細書に記載のヌカントの複合体、及び試験管内、生体内又は生体外で、その複合体の対象となるＧＡＧを含む組成物を投与する方法を含む、細胞の増殖の治療及び又は予防方法を提供する。この態様にかかる実施例では、投与対象は細胞又は個体ある。特定の実施形態において、ヌカントはペプチド又は偽ペプチド、例えば、ＨＢ−１９又はＮ６Ｌである。特定の実施形態では、細胞は真核細胞、例えば、癌細胞又は他の増殖の細胞である。
【００２１】
別の態様では、本発明は、その組成が細胞の成長及び／又は増殖の抑制又は防止に効果的である、有効量の、本明細書に記載のヌカント及びＧＡＧを個体に投与する方法を含む、個体中のがん細胞の成長及び／又は増殖に関連する疾病又は疾患の治療及び又は予防方法を提供する。
【００２２】
予想外かつ驚くべきことに、本明細書に記載のヌカントは、ＧＡＧと混合すると微粒子を形成することを発見した。したがって、特定の態様において、本発明は、本明細書に記載のヌカントとＧＡＧとを含む微粒子を含有する組成物、特に治療用組成物を提供する。その他の態様では、本発明は、それら構成要素が微粒子を自発的に形成する、ヌカントをＧＡＧと混合することで、ヌカント／ＧＡＧ微粒子を形成する方法を提供する。その他の態様では、本発明は有効量の、ヌカントとＧＡＧとの微粒子を含む治療用組成物を、対象又は個体に投与する過程を含んで成る、癌など疾病又は疾患の治療法を提供する。特定の実施形態においては、微粒子が投与前に形成されている。その他の実施の態様では、微粒子は対象や患者への投与後、例えば、生体内で形成される。
【００２３】
本発明は、さらには、本明細書に記載された発明を提供する。
【００２４】
前述の一般的な用途の範囲はあくまで一例として示したものであり、本明細書による開示及び添付の請求項の範囲を限定するものではない。本発明の組成、方法、及び過程に関連付けられる追加要素及び有益な付加は、請求項、発明の詳細な説明、及び実施例を考慮して、当業者によって認識される。例えば、数多くの組み合わせで利用される、本発明のさまざまな態様と実施形態のすべてが本明細書中に明示的に意図されている。これらの付加的な、有益な付加、要素及び形態は明示的に本発明の範囲内に含まれている。本発明の背景を明らかにするために使用される、文献及び他の資料、特定の場合において実施に関する詳細を示すものは、参照によって援用しており、利便性のため、追加の文献目録に表示される。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により治療効果をもたらすのに必要な化合物の量を減らすことができ、治療の費用を減少させ、さらに副作用を限定的なものとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ヌクレオリンタンパク質の構造を表す図である。
【図２Ａ】ＨＢ１９の構造を表す図である。
【図２Ｂ】三価化合物ヌカント０１の構造を表す図である。
【図２Ｃ】五価化合物ヌカント２の構造を表す図である。
【図２Ｄ】五価化合物ヌカント３の構造を表す図である。
【図２Ｅ】五価化合物ヌカント４の構造を表す図である。
【図２Ｆ】六価化合物ヌカント６の構造を表す図である。
【図２Ｇ】六価化合物ヌカント７の構造を表す図である。
【図２Ｈ】四価化合物ヌカント８の構造を表す図である。
【図２Ｉ】八価化合物ヌカント９の構造を表す図である。
【図３】Ｎ６Ｌと各種ＧＡＧとの同時処理の相乗効果を示すグラフである。
【図４】Ｎ６Ｌと各種ＧＡＧとの同時処理の相乗効果を示すグラフである。
【図５】Ｎ６Ｌ及びヘパリンによるＰＡＮＣ−１細胞の処理を示す写真である。
【図６】Ｎ６Ｌ及びヘパリンによるＵ８７−ＭＧ細胞の処理を示す写真である。
【図７】ヌカント−ＧＡＧ微粒子を示す写真である。
【図８】２０μΜのＮ６ＬとＧＡＧとで構成される微粒子の写真である。
【図９】ＰＡＮＣ−１細胞の増殖に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１０】ＰＡＮＣ−１細胞の増殖に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１１】Ｕ８７−ＭＧ細胞の増殖に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１２】Ｕ８７−ＭＧ細胞の増殖に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１３】ＰＡＮＣ−１細胞の増殖に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１４】ＰＡＮＣ−１細胞の増殖に対する抑制効果を示すグラフである。
【図１５】Ｕ８７−ＭＧ細胞の増殖に対する抑制効果を示すグラフである。
【図１６】ヌカント／ＧＡＧの質量比の影響を示すグラフである。
【図１７】ヌカント／ＧＡＧの質量比の影響を示すグラフである。
【図１８】ヌカント／ＧＡＧの質量比の影響を示すグラフである。
【図１９】ヌカント／ＧＡＧの質量比の影響を示すグラフである。
【図２０】ＨＵＶＥＣ細胞の増殖を示すグラフである。
【図２１】ニワトリ胚ＣＡＭ試験を示す写真である。
【図２２】ゲムシタビンの活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
添付の図面は、発明を特定するための事項の一部に援用するとともに、これを形成し、本発明のいくつかの実施形態を説明し、発明の詳細な説明とともに本発明の原理の説明に役立てようとするものである。図面は本発明の一実施形態を示すためのものであり、本発明の限定として解釈されない。本発明のさらなる要素、機能及び利点は、発明の例示的な実施形態を示す添付の図面と組み合わせられた、以下の詳細な説明から明らかになる。
【００２８】
図１．ヌクレオリンタンパク質の構造。Ａ．７０７のアミノ酸で構成されているヒトヌクレオリン。ヌクレオリンを二つの主要な部分に分けることができる（Ginisty、H.、Sicard、H.、Roger、B.、and Bouvet、P。Structure and functions of nucleolin。（1999） J。Cell Science 112、761-772；Srivastava、M.、and Pollard,Ｈ．B。Molecular dissection of nucleolin's role in growth and cell proliferation：new insights。（1999） FASEB J。13、1911-1922）：Ｎ末端（ａａ  １−３０８）とＣ末端（ａａ  ３０９−７０７）。Ｎ末端領域はグルタミン酸とアスパラギン酸の連続的な繰り返しで構成される４個の長い酸性領域（Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４）で構成されている。Ｃ末端領域は４個のＲＮＡ結合領域（ＲＢＤ  Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，及びＩＶ）を形成し、交互に並ぶ疎水性及び親水性の領域、及びＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの繰り返しで構成されるペプチドからなり、強い塩基性のＲＧＧ領域を備える末端（ａａ  ６４４−７０７）で構成されている。Ｂ．ＲＧＧ領域を必要とする、化合物ＨＢ−１９のヌクレオリン結合領域の特定。Ｎ末端とＣ末端領域に対応するヌクレオリン構造を、ウサギ網状赤血球ライセートのシステムを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳により得た。これにより、それぞれ［３５Ｓ］Ｍｅｔ／Ｃｙｓで標識された１−７０７，１−３０８及び３０９−７０７残基目のアミノ酸を含むヌクレオリン全長並びにＮ末端及びＣ末端の部分を生成した。標識された粗精製物はビオチン化ＨＢ−１９と恒温放置し、その複合体はアビジン−アガロースで精製した。予想通り、ヌクレオリン全長はＨＢ−１９と相互作用する。ヌクレオリンＣ末端部はＨＢ−１９の標的を含んでいる一方で、酸性残基に富む、ヌクレオリンのＮ末端部分はまったく化合物と相互作用しない（Nisole、S.、Said、Ｅ．A.、Mische、C、Prevost、M。C、Krust、B.、Bouvet、P.、Bianco、A.、Briand、J。P.、and Hovanessian、A。Ｇ．The anti-HIV pentameric compose HB-19 binds the C-terminal end of nucleolin and prevents anchorage of virus particles in the plasma membrane of target cells。（2002） J。Biol。Chem。277、20877-20886）。ヌクレオリンＣ末端部がＨＢ−１９の標的を含むことを特定したので、この領域の様々なコンストラクト（図２に記載の１〜９）を作成した。最初のコンストラクトは、４個のＲＢＤ、及びＲＧＧ領域を含み、抗ＧＳＴ（グルタチオントランスフェラーゼ）抗体で検出できるようにするためのＧＳＴタンパク質と融合した、ヒトのヌクレオリンＣ末端部をコードするｃＤＮＡに相当する。また、他の構造は、ＧＳＴと融合した、一つ又は複数の領域が短くなった同じ部分に相当する。これらのタンパク質は、全て大腸菌によって産生した。ＨＢ−１９が各コンストラクトと相互作用する能力を、異なるヌクレオリンのコンストラクトを発現する細菌からの未精製の抽出物をビオチン標識したＨＢ−１９とともに恒温放置し、その後アビジン−アガロースに固定することによって精製することで試験した。これらの試料をポリアクリルアミドゲルとＧＳＴによって分析し、抗ＧＳＴ抗体を用いた免疫検出法（ウェスタンブロッティング）によって明らかにした。これらの結果は、ＲＧＧ領域がＨＢ−１９とヌクレオリンのＣ末端部の間の相互作用に必要であることを示す。さらに、ＲＧＧ領域のみで、この相互作用のために十分である。
【００２９】
図２．Ａ．化合物ＨＢ−１９の構造。Ｂ．支持体としてＤ型構成のアラニン残基（Ａ）とＬ型構成のリジン残基（Ｋ）とが交互に構成される環状六員ペプチドを有する三価の化合物ヌカント０１の構造。３つの偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）は各リジン残基のεアミノ基に共有結合している。Ｃ．５個の偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）が５個の各リジン残基のεアミノ基に共有結合している配列番号１８の配列のらせん状（helicoidal）構造を有する支持体として直鎖状ペプチドを有する五価の化合物ヌカント２（配列番号２０）の構造、ＡｃはＣＨ３−ＣＯ−基を表している。Ｄ．５個の偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）が５個の各リジン残基のεアミノ基に共有結合している配列番号１９の配列のらせん状（helicoidal）構造を有する支持体として直鎖状ペプチドを有する五価の化合物ヌカント３（配列番号２１）の構造、ＡｃはＣＨ３−ＣＯ−基を表している。Ｅ．５個の各リジン残基のα炭素のアミノ基に共有結合するこで、５個の偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）が各リジン残基のεアミノ基とアミド結合で連結している、５つのリジン塩基からなる支持体を有する五価の化合物ヌカント４。Ｆ．６個の偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）が６個の各リジン残基のεアミノ基に共有結合している配列番号１５の配列のらせん状（helicoidal）構造を有する支持体として直鎖状ペプチドを有する六価の化合物ヌカント６（配列番号１６）の構造、ＡｃはＣＨ３−ＣＯ−基を表している。Ｇ．６個の偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）が６個の各リジン残基のεアミノ基に共有結合している配列番号１３の配列のらせん状（helicoidal）構造を有する支持体として直鎖状ペプチドを有する六価の化合物ヌカント７（配列番号１７）の構造、ＡｃはＣＨ３−ＣＯ−基を表している。Ｈ．４個の偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）が４個の各リジン残基のεアミノ基に共有結合している、４個のＬｙｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ（配列番号７）を有するらせん状（helicoidal）構造を有する直鎖状ペプチド（配列番号２２）を支持体として有する四価の化合物ヌカント８（配列番号２３）。Ｉ. ８個の偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）が８個の各リジン残基のεアミノ基に共有結合している、８個のＬｙｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ（配列番号７）を有するらせん状（helicoidal）構造を有する直鎖状ペプチド（配列番号２４）を支持体として有する四価の化合物ヌカント９（配列番号２５）。
【００３０】
図３．化合物ヌカント６Ｌ（Ｎ６Ｌ）と各種ＧＡＧとの同時処理の相乗効果。ＰＡＮＣ−１（ヒト膵癌）細胞の増殖に対するＮ６Ｌ＋各種ＧＡＧの同時処理の効果：Ａ．ＧＡＧ＝ヘパリン；Ｂ．ＧＡＧ＝コンドロイチン硫酸Ａ（Ｃｓ−Ａ）；Ｃ．ＧＡＧ＝コンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃｓ−Ｃ）。Ｎ６Ｌ／ＧＡＧの混合液（約２０μΜのＮ６Ｌに対して０μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌのＧＡＧ）で毎日細胞を処理した。培地（ＤＭＥＭ  ５％  ＳＶＦ）を毎日交換した。ＭＴＴ試験により増殖を評価した。ＧＡＧ単独で増殖に及ぼす作用は認められなかった。
【００３１】
図４．化合物ヌカント６Ｌ（Ｎ６Ｌ）と各種ＧＡＧとの同時処理の相乗効果。Ｕ８７−ＭＧ（ヒト膠芽腫−星状細胞腫）細胞の増殖に対するＮ６Ｌ＋各種ＧＡＧの同時処理の効果：Ａ．ＧＡＧ＝ヘパリン；Ｂ．ＧＡＧ＝コンドロイチン硫酸Ａ；Ｃ．ＧＡＧ＝コンドロイチン硫酸Ｃ。細胞の処理日ごとの混合Ｎ６Ｌ／ＧＡＧを（約２０μΜのＮ６Ｌに対して０μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌのＧＡＧ）。培地（ＤＭＥＭ  ５％  ＳＶＦ）を毎日交換した。ＭＴＴ試験により増殖を評価した。ＧＡＧが増殖に及ぼす作用は認められなかった。
【００３２】
図５．Ｎ６Ｌ及びヘパリンによるＰＡＮＣ−１細胞の処理：Ａ：ＰＡＮＣ−１細胞対照群，Ｂ：２０μΜのＮ６ＬによるＰＡＮＣ−１細胞の処理，Ｃ：２０μΜのＮ６Ｌと１０μｇ／ｍｌのヘパリンとの混合液によるＰＡＮＣ−１細胞の処理，Ｄ：２０μΜのＮ６Ｌと１００μｇ／ｍｌのヘパリンとの混合液によるＰＡＮＣ−１細胞の処理。
【００３３】
図６．Ｎ６Ｌ及びヘパリンによるＵ８７−ＭＧ細胞の処理：Ａ：Ｕ８７−ＭＧ細胞対照群，Ｂ：２０μΜのＮ６ＬによるＵ８７−ＭＧの処理，Ｃ：Ｕ８７−ＭＧ細胞の処理の２０μΜのＮ６Ｌと１０μｇ／ｍｌのヘパリンとの混合液，Ｄ：２０μΜのＮ６Ｌと１００μｇ／ｍｌのヘパリンとの混合液によるＵ８７−ＭＧ細胞の処理。Ｎ６Ｌ／ＧＡＧ（２０μΜ／１０μｇ／ｍｌ）の比で細胞の処理をしたものは、他の比で観察されるものよりもはるかに小さい、細胞上に位置する「泡」を示している。
【００３４】
図７．ヌカント−ＧＡＧ微粒子。Ｎ６Ｌ２０μΜ／ヘパリン１００μｇ／ｍｌを使用したＵ８７−ＭＧ細胞に微粒子が観察された。
【００３５】
図８．泡は２０μΜのＮ６ＬとＧＡＧとで構成される微粒子である。ＧＡＧ１００μｇ／ｍｌで観測された最大のものの大きさは約５００ｎｍである。大きさはＧＡＧの培地中濃度と正の相関をしている。
【００３６】
図９．Ｎ６Ｌをヘパリンと恒温放置することで付着依存性のＰＡＮＣ−１細胞の増殖に対するＮ６Ｌの阻害効果を高めるナノ粒子が形成された。ほぼ同数のＰＡＮＣ−１細胞をＮ６Ｌ又は０．１から１０００μｇ／ｍｌまでの間で濃度を増加させたヘパリンとともに事前に恒温放置したＮ６Ｌで処理した。細胞の処理は毎日、４日間行った。第４日の終わりにＭＴＴ試験を用いて細胞数を定量した。発明者らは処理の３日後、Ｎ６Ｌが付着依存性のＰＡＮＣ−１細胞の増殖を阻害したことを観察した。一方で、発明者らの観察結果は、Ｎ６Ｌを１０、１００又は１０００μｇ／ｍｌのヘパリンと事前に恒温放置したことでペプチドの抑制作用を誘導するナノ粒子の形成につながったことを示した。濃度１０μｇ／ｍｌのヘパリンで最大の効果が観察され、注目すべきことに抑制はほぼ９０％までに達した。結果は少なくとも三つの独立実験の平均値±ＳＤである。＊＊ｐ＜０．０．１，＊＊＊ｐ＜０．００．１。
【００３７】
図１０．Ｎ６Ｌをコンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃｓ−Ｃ）と恒温放置することで付着依存性のＰＡＮＣ−１細胞の増殖に対するＮ６Ｌの阻害効果を高めるナノ粒子が形成された。ほぼ同数のＰＡＮＣ−１細胞をＮ６Ｌ又は０．１から１０００μｇ／ｍｌまでの間で濃度を増加させたＣｓ−Ｃとともに事前に恒温放置したＮ６Ｌで処理した。細胞の処理は毎日、４日間行った。第４日の終わりにＭＴＴ試験を用いて細胞数を定量した。発明者らは処理の３日後、Ｎ６Ｌが付着依存性のＰＡＮＣ−１細胞の増殖を阻害したことを観察した。一方で、発明者らの観察結果は、Ｎ６Ｌを１０．１００又は１０００μｇ／ｍｌのＣｓ−Ｃと事前に恒温放置したことでペプチドの抑制作用を誘導するナノ粒子の形成につながったことを示した。濃度１０μｇ／ｍｌのＣｓ−Ｃで最大の効果が観察され、注目すべきことに抑制はほぼ９０％までに達した。結果は少なくとも三つの独立実験の平均値±ＳＤである。＊＊＊ｐ＜０．００．１。
【００３８】
図１１．Ｎ６Ｌをヘパリンと恒温放置することで付着依存性のＵ８７−ＭＧ細胞の増殖に対するＮ６Ｌの阻害効果を高めるナノ粒子が形成された。ほぼ同数のＵ８７−ＭＧ細胞をＮ６Ｌ又は０．１から１０００μｇ／ｍｌまでの間で濃度を増加させたヘパリンとともに事前に恒温放置したＮ６Ｌで処理した。細胞の処理は毎日、４日間行った。第４日の終わりにＭＴＴ試験を用いて細胞数を定量した。発明者らは処理の３日後、Ｎ６Ｌが付着依存性のＵ８７−ＭＧ細胞の増殖を阻害したことを観察した。一方で、発明者らの観察結果は、Ｎ６Ｌを１０．１００又は１０００μｇ／ｍｌのヘパリンと事前に恒温放置したことでペプチドの抑制作用を誘導するナノ粒子の形成につながったことを示した。濃度１０μｇ／ｍｌのヘパリンで最大の効果が観察され、注目すべきことに抑制はほぼ９０％までに達した。結果は少なくとも三つの独立実験の平均値±ＳＤである。＊＊＊ｐ＜０．００．１。
【００３９】
図１２．Ｎ６Ｌをコンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃｓ−Ｃ）と恒温放置することで付着依存性のＵ８７−ＭＧ細胞の増殖に対するＮ６Ｌの阻害効果を高めるナノ粒子が形成された。ほぼ同数のＵ８７−ＭＧ細胞をＮ６Ｌ又は０．１から１０００μｇ／ｍｌまでの間で濃度を増加させたＣｓ−Ｃとともに事前に恒温放置したＮ６Ｌで処理した。細胞の処理は毎日、４日間行った。第４日の終わりにＭＴＴ試験を用いて細胞数を定量した。発明者らは処理の３日後、Ｎ６Ｌが付着依存性のＵ８７−ＭＧ細胞の増殖を阻害したことを観察した。一方で、発明者らの観察結果は、Ｎ６Ｌを１０．１００又は１０００μｇ／ｍｌのＣｓ−Ｃと事前に恒温放置したことでペプチドの抑制作用を誘導するナノ粒子の形成につながったことを示した。濃度１０μｇ／ｍｌのＣｓ−Ｃで最大の効果が観察され、注目すべきことに抑制はほぼ９０％までに達した。結果は少なくとも三つの独立実験の平均値±ＳＤである。＊＊＊ｐ＜０．００．１。
【００４０】
図１３．強く帯電したＧＡＧ分子で構成されるナノ粒子はＮ６Ｌ、及びわずかな阻害作用を有する弱く帯電したＧＡＧ分子で構成されるナノ粒子とは対照的に付着依存性のＰＡＮＣ−１細胞の増殖を強く阻害する。ほぼ同数のＰＡＮＣ−１細胞を、５％ＦＢＳの存在下で、濃度を増加させたＮ６Ｌ又は濃度を増加させたＮ６Ｌと１０μｇ／ｍｌの各種ＧＡＧ分子とで構成されたナノ粒子で処理した。細胞の処理は毎日、４日間行った。第４日の終わりにＭＴＴ試験を用いて細胞数を定量した。発明者らはＮ６Ｌが付着依存性のＰＡＮＣ−１細胞の増殖を、ＩＣ５０＝１５μΜでもって用量依存的に阻害することを観察した。一方で、発明者らの観察結果は、Ｎ６Ｌを強く帯電したＧＡＧ分子、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ（Ｃｓ−Ａ）、コンドロイチン硫酸Ｂ（Ｃｓ−Ｂ）、コンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃｓ−Ｃ）と恒温放置することで、５μΜの濃度（ＩＣ５０＝２．５μＭ）で最大の効果を示し、付着依存性のＰＡＮＣ−１細胞の増殖を強く抑制するナノ粒子が形成したことを示した。高濃度のＮ６Ｌで構成されるナノ粒子は５μΜのものと同様の効果を発揮する。強く帯電したＧＡＧ分子とは対照的に、Ｎ６Ｌを部分的に帯電したヘパラン硫酸や中性のヒアルロン酸と恒温放置しても、ナノ粒子を形成せず、ＰＡＮＣ−１の増殖をＮ６Ｌと同程度に抑制する。
【００４１】
なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが場合がある。例えば、
【００４２】
図１４．Ｎ６Ｌは、四回の処理の後その効果を発揮する一方で、付着依存性ＰＡＮＣ−１細胞の増殖に対するナノ粒子の抑制効果は１日の処理で観察された。ほぼ同数のＰＡＮＣ−１細胞を、５％ＦＢＳの存在下で、２０μΜのＮ６Ｌ又は２０μΜのＮ６Ｌと１０μｇ／ｍｌのヘパリン若しくはＣｓ−Ｃとで構成されたナノ粒子で処理した。ａ．その後の３日間は増殖させ、最初の日に、ｂ．その後の２日間は増殖させ、最初と二番目の日に、ｃ．その後の１日間は増殖させ、初めの３日間に、ｄ．４日間、細胞を処理した。第４日の終わりにＭＴＴ試験を用いて細胞数を定量した。結果は、Ｎ６Ｌは１日の処理後では抑制効果を発揮せず、またその最大の効果（対照群に対して５０％阻害）は４日後に観察されたことを示す。興味深いことにヘパリン又はＣｓ−Ｃで構成されるいずれかのナノ粒子による１日の処理後では、４日間の処理後のＮ６Ｌ活性と同程度にＰＡＮＣ−１の増殖抑制が観察された。ナノ粒子の抑制効果は全ての処理の後において増加し、４日間の処理の終わりに少数の細胞が生きていた。
【００４３】
図１５．Ｎ６Ｌ又はナノ粒子による１日の処理は付着依存性Ｕ８７−ＭＧ細胞の増殖を抑制するが、ナノ粒子の効果はＮ６Ｌよりも強力である。ほぼ同数のＵ８７−ＭＧ細胞を、５％ＦＢＳの存在下で、２０μΜのＮ６Ｌ又は２０μΜのＮ６Ｌと１０μｇ／ｍｌのヘパリン若しくはＣｓ−Ｃとで構成されたナノ粒子で処理した。ａ．その後の３日間は増殖させ、最初の日に、ｂ．その後の２日間は増殖させ、最初と二番目の日に、ｃ．その後の３日間は増殖させ、初めの１日に、ｄ．４日間、細胞を処理した。第４日の終わりにＭＴＴ試験を用いて細胞数を定量した。発明者らは１日の処理の後観察したところ、Ｎ６Ｌとナノ粒子とはＵ８７−ＭＧ増殖を阻害したが、ナノ粒子の効果はＮ６Ｌよりも強かった。その抑制効果は全ての処理の後において増加し、４日目の終わりにＮ６Ｌの場合はいくつかの細胞が生きて残ったが、ナノ粒子の場合細胞の大半は死んでいた。
【００４４】
図１６，１７，１８，及び１９．ナノ粒子の活性を制御する因子（処理期間とＮ６Ｌの濃度）の研究。Ｎ６Ｌ、又は最終的な比としてＮ６Ｌに対しＣｓ−Ｃを８：１及び１６：１で混合した後形成したナノ粒子の濃度を増加させたもので、ほぼ同数のＰＡＮＣ−１細胞を、毎日２時間処理した。第７日の終わりにＭＴＴ試験を用いて細胞数を定量した。発明者らの結果は、Ｎ６Ｌ及びナノ粒子の活性は７日間、毎日２時間処理した後保持され、細胞の処理で耐性を生じないことを証明し、毎日２時間の処理がＮ６Ｌ及びナノ粒子が生物学的活性を発揮するための最小限の必要な時間であることを示している。さらに、発明者らはＮ６ＬとＣｓ−Ｃとが８：１の比での構成されるナノ粒子がＰＡＮＣ−１細胞の付着依存性の増殖を、１６：１の比又はＮ６Ｌ単独よりも強く阻害することを観察した。結論として、発明者らは、同じ比であったナノ粒子において効果は同じではなかった一方で、異なる濃度のＮ６ＬとＣｓ−Ｃとで形成された場合は効果が異なっていたため、Ｎ６ＬとＣｓ−Ｃとの比はナノ粒子活性の重要な因子はないと考えた。
【００４５】
図２０．Ｎ６Ｌ又はわずかな阻害作用を有する弱く帯電したＧＡＧ分子で構成されるナノ粒子とは対照的に、強く帯電したＧＡＧ分子で構成されるナノ粒子はＨＵＶＥＣ細胞の増殖を阻害する。ほぼ同じ細胞数のＨＵＶＥＣを、５％ＦＢＳの存在下で、Ｎ６Ｌの濃度を増加させて、又はＮ６Ｌと各種ＧＡＧ分子とで構成されたナノ粒子で処理した。細胞は毎日、４日間処理した。第４日の終わりにＭＴＴ試験を用いて細胞数を定量した。発明者らはＩＣ５０＝１０μΜのＮ６Ｌが用量依存的にＨＵＶＥＣの増殖を阻害することを観察した。一方で、発明者らの観察結果は、Ｎ６Ｌを強く帯電したＧＡＧ分子、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ（Ｃｓ−Ａ）、コンドロイチン硫酸Ｂ（Ｃｓ−Ｂ）、コンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃｓ−Ｃ）と恒温放置することで、５μΜの濃度（ＩＣ５０＝２．５μＭ）で最大の効果を示し、ＨＵＶＥＣの増殖を強く抑制するナノ粒子が形成したことを示した。高濃度のＮ６Ｌで構成されるナノ粒子は５μΜのものと同様の効果を発揮する。強く帯電したＧＡＧ分子とは対照的に、Ｎ６Ｌを部分的に帯電したヘパラン硫酸や中性のヒアルロン酸と恒温放置しても、ナノ粒子を形成せず、ＨＵＶＥＣの増殖をＮ６Ｌ（ＩＣ５０＝１０μＭ）と同様に抑制する。
【００４６】
図２１．Ｎ６Ｌ単独と異なり、Ｎ６Ｌ＋ヘパリン又はＮ６Ｌ＋Ｃｓ−Ｃで形成されるナノ粒子は、ニワトリ胚ＣＡＭ試験で測定される通り生体での血管新生を強く阻害する。シリコンリングで区切られたニワトリ胚ＣＡＭの１ｃｍ２の領域を２０μΜのＮ６Ｌ又は２０μΜのＮ６Ｌと１０μｇ／ｍｌのヘパリン若しくはＣｓ−Ｃで構成されたナノ粒子と共に培養した。４８時間後に血管長の合計を定量化した。発明者らは、Ｎ６Ｌが生体での血管新生に影響を及ぼさなかったのとは対照的に、ヘパリン又はＣｓ−Ｃで構成されるナノ粒子が新しい血管の発生を阻害した（それぞれ５０％、及び７０％）ことを観察した。結果は少なくとも三つの独立実験の平均値±ＳＤである。
【００４７】
図２２．Ｎ６Ｌではなくナノ粒子がゲムシタビンの活性を誘導する。ほぼ同数のＰＡＮＣ−１細胞を、５％ＦＢＳの存在下で、濃度を増加させたゲムシタビン単独、又はＮ６Ｌ、Ｃｓ−Ｃ、若しくはＣｓ−Ｃで構成されるナノ粒子との組み合わせで処理した。細胞の処理は毎日、４日間行った。第４日の終わりにＭＴＴ試験を用いて細胞数を定量した。観察結果はゲムシタビンがわずかにＰＡＮＣ−１の増殖を抑制したことを示した。さらにゲムシタビンとＮ６Ｌ又はＣｓ−Ｃとの混合物は追加的な効果を有さなかった。しかしながらゲムシタビンをナノ粒子と混合したものは追加的な効果が認められた。
【００４８】
詳細な説明
本技術分野において技量を有する者による本発明の実施を支援するために提供される本発明の詳細な説明を以下に示す。本発明の意図又は範囲から逸脱しない限り、当該技術分野において一般的な技量を有する者はここに記載された実施形態を変形及び変更をすることが場合がある。別途定義しない限り、ここに使われているすべての科学的及び技術的な用語は本発明が属する技術分野の一般的な技量を有する者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。ここで本発明の説明に使用される用語は特定の実施形態だけを記述するものであり、本発明を限定するものではない。すべての文献、特許出願、特許、図面、記載されているその他の参照文献は明示的にそれら全体として参照により援用する。
【００４９】
値の範囲を示す場合、別途文脈上明示的に指示しないかぎり、下限の単位の十分の一まで、その範囲の上限と下限の限界の間の各中間値と、その記載の範囲内のその他の明示された又は中間の値は、本発明に包まれるものとする。記載の範囲で特に除外された制限のあることを条件として、独立してより小さい範囲に含めることができる、これらのより小さい範囲の上限と下限も発明内に包含される。記載の範囲が一つ又は両方の限界を有する場合、いずれかのこれらの内包される両方の限界を除く範囲も本発明に含まれる。
【００５０】
ここで記述されているものと同様又は同等の、任意の方法及び材料も本発明の実施又は試験において使用することが出来るが、推奨される方法と材料をここで説明する。ここで言及するすべての文献は開示するための参照によってここに援用しており、関連して文献が引用されている、方法及び／又は材料を説明した。
【００５１】
それ以外の場合に定義しない限り、記載されているすべての科学的及び技術的な用語は本発明が属する技術分野における当業者に一般的に理解される意味を有する。以下の参照、参照により本明細書に援用する全体の開示は、本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を技術者に提示する：シングルトン他、微生物学及び分子生物学の辞典（第二編  １９９４年）。科学と技術のケンブリッジ辞典（ウォーカー他、１９８８年）。遺伝学用語集、第五編、Ｒ.リーガー他（編）、シュプリンガー社（１９９１年）。ヘイル  ＆  Ｍａｒｈａｍ、ハーパーコリンズ生物学辞典（１９９１年）。ここで使用されるように、特に指定しない限り以下の用語は以下においてそれらに帰する意味を有する場合がある。ただし、当該技術分野の通常の能力を有する者によって理解され、又は知られている他の意味も有することも可能であり、本発明の範囲にあることを理解すべきである。全ての文献、特許出願、特許、及び記載されているその他の参照はそのまま、参照によって援用する。矛盾する場合は、定義を含む本明細書がこれに優先する。さらに、材料、方法、及び実施例は例示に過ぎず、限定するする意図を有しない。
【００５２】
文脈上明らかにそれ以外を指し示さない限り、本記載及び添付の請求の範囲において、単数形の「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は複数の参照を含むことに注意を要する。ここで使用するすべての科学的及び技術的な用語は同じ意味を有する。
【００５３】
本発明をより容易に理解可能なように、特定の用語を最初に定義する。
【００５４】
ここで使用されるように、「誘導体」は元の化合物から直接に、修飾によって、又は部分置換によって形成された成分である。ここで使用されるように、「類縁体」は、似たような構造を有する成分であるが、元の化合物と一致しないものである。
【００５５】
用語「ペプチド」は少しも限定されないものの、ペプチド結合によって結合している、少なくとも４アミノ酸の組換えのポリペプチドである。さらに、本発明のペプチドはアミノ酸模倣化合物及び類縁体などを含む。例えば、原核生物及び／又は真核生物の細胞での組換え蛋白質の発現の後、一又は二以上の分離と精製の手順をとる方法、及び／又は合成機を使用してペプチドあるいはそのペプチドの部分を化学的に合成する方法といった当該技術分野の当業者によく知られている標準的な方法及びプロトコルにより組換え型のペプチドを生成することができる。
【００５６】
用語「生物学的に活性がある」又は「生理活性」はまったく限定されないが、生理的変化又は応答を奏するために本発明によって提供されるヌカントのような薬剤の活性を意味する場合がある。例えば、成長及び／又は生存率、遺伝子発現、タンパク質量、タンパク質の修飾、タンパク質の活性、あるいはこれらの組み合わせの変化を例としてとして細胞のレベルで、組織レベルで、全身のレベルで、又は、個体レベルで応答を検出する場合がある。例えば、細胞内外の受容体へのリガンドの結合、細胞シグナル経路の活性化、細胞応答を刺激すること又は活性化すること、細胞からの生理活性分子の分泌又は放出、細胞の増殖及び／若しくは分化、又はそれらの組み合わせの測定は、これらの形質の変化を監視するために使用される技術に含まれる。本発明によって提供されるペプチドの生物学的活性を、細胞の成長及び／又は増殖を抑制する活性を検出することによりにより決定できることはその一例である。
【００５７】
用語「有効量／用量」、「薬学的な有効量／用量」、「薬学的な有効量／用量」、又は「臨床学的な有効量／用量」はなんら限定されないが、状態、疾患又は疾病状態の症状を防ぐ、発生を抑制する、回復する、遅延させる又は治療する（ある程度、できれば全ての症状を軽減する）のに十分な分量／用量の、活性を有する医薬品成分を意味する場合がある。有効量は疾患の種類、使用される組成、投与経路、治療を受けている哺乳類の種類、考慮中の特定の哺乳類の生理特性、併用される薬物、及び医療技術の当業者が認識するであろう他の因子に依拠する。一般的に、有効成分は、０．１ｍｇ／ｋｇと１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間で、薬剤の効力に基づいて投与する。そのような化合物の毒性と薬効は、細胞培養又は実験動物を用いた標準的な薬学的手法、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致命的な投与量）と、ＥＤ５０（集団の５０％に治療効果のある投与量）の測定などによって判定できる。
【００５８】
かかる毒性についての用量と治療効果についての用量の比はいわゆる治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表現することができる。治療係数の大きい化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を使用する場合もあり、患部ではない細胞への損傷を最小限に抑え、副作用を減らすために、患部組織の部位を標的としてそのような化合物を送る系を構築すべきことに注意を払う必要がある。細胞培養による検定及び動物による調査から得られたデータは、ヒトで使用するための投与量の範囲の算定に使用できる。このような化合物の投与量は、ＥＤ５０を含み、かつほとんど、あるいは全く毒性を有さない循環濃度の範囲内であることが好ましい。採用する投与量と利用される投与方法内によって決められる、上記範囲内で変化する場合がある。本発明の方法で使用される任意の化合物の治療に有効な投与量は細胞培養による検定から最初に見積もることができる。細胞培養で特定するのと同様に、ＩＣ５０（すなわち、症状抑制の最大半量に達する被検化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために臨床学的な有効量は、動物のモデルで算定する場合がある。このような情報は正確にヒトに有用な用量を決定するために使用できる。例えば、血漿中の水準を高速液体クロマトグラフィーにより測定する場合がある。
【００５９】
用語「医薬組成物」「治療用組成物」「治療用製剤」又は「薬理学的に許容できる製剤」は特に限定されないが、例えば全身投与といった、必要な活性のために最も適切な身体部位への投与に適切な形態を有する、本発明によって提供される薬剤の実効分配のための組成物又は製剤を意味する場合がある。
【００６０】
本発明によって提供されるヌカントを有する製剤に適した剤として以下の物を含む場合がある：シンナモイル、ＰＥＧ、薬のエントリに様々な組織、リン脂質又は脂溶性成分、ホスホロチオエート、例えば中枢神経系のような様々な組織への薬剤の移行を促進するＰ−糖タンパク質阻害剤（プルロニックＰ８５など）（Jolliet-Riant and Tillement、1999、Fundam。Clin。Pharmacol.、13、16-26）；注入後の持続的な放出、送達のための、poly（DL-lactide-coglycolide）からなる微粒子（Emerich、DF et al、1999、Cell Transplant、8、47-58）（Alkermes社，ケンブリッジ，マサチューセッツ州）などの生分解性ポリマー；及び、血液脳関門を超えて薬剤を送達することができ、かつ神経細胞の吸収機構を変更することができる、polybutylcyanoacrylateからなるもの（Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry、23、941-949、1999）などの充填されたナノ粒子。用語「医薬として許容できる」又は「薬理学的に許容できる」は、特に限定されないが、動物やヒトに適切に投与した場合、副作用、アレルギー反応、その他の有害な反応を生じない態様又は組成物を意味する場合がある。
【００６１】
用語「医薬として許容できるキャリア」又は「薬理学的に許容できるキャリア」は、特に限定されないが、あらゆる溶剤、分散媒、被膜、抗菌又は抗真菌剤、等張又は吸収遅延剤など、医薬品投与と適合するものを意味する場合がある。適切なキャリアは、参照によって援用する、当該分野での標準テキストである最新版のレミントンの薬物科学に説明されている。このようなキャリア又は希釈剤の好ましい例は特に限定されないが、水、生理食塩水、finger's solution、ブドウ糖溶液、及び５％ヒト血清アルブミンがある。リポソーム及び非揮発油のような非水系溶媒などを使用することもできる。かかる媒質や薬剤を医薬として活性のある物質のために使用することは当該技術分野でよく知られている。従来の媒質や剤が活性のある化合物と適合しない範囲を除き、熟慮の上それらを組成物中で使用することができる。補助的な活性を有する化合物も、組成物に含めることが出来る。
【００６２】
用語「全身投与」と例えば、血流中の薬物の全身への吸収又は蓄積、さらに全身への分配をにつながることで、薬剤の体全体への分配をもたらす、例えば、経腸又は内服以外のの投与経路を指す。適切な形態は、ある程度、使用又は、例えば経口、経皮、又は注入などの流入経路に依存する。このような形態は組成物又は製剤が標的細胞（すなわち送達するために負に荷電した高分子が必要になる細胞）に到達するのを妨げるものであってはならない。例えば、血流に注入される医薬組成物は溶解性が必要である。その他の因子が、当該技術分野で知られており、組成物又は製剤がその効果を発揮するのを妨げる毒性や形態などの考慮すべき事項を含んでいる。全身の吸収につながる投与経路は制限がなく、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺及び筋肉を含む。薬の循環系への流入率は分子量又は分子サイズの関数として示されている。本発明の組成物を含有するリポソームやその他薬剤キャリアの使用により、例えば内皮毛細血管系（ＲＥＳ）の組織などの特定の種類の組織に薬剤を移行できる。リンパ球及びマクロファージといった細胞の表面への薬剤の取り込みを容易にすることができるリポソーム製剤も利用価値が高い。
【００６３】
用語「保存的な変異」は核酸の変化により化学的に類似のアミノ酸が置き換わるコード配列中で単一のアミノ酸又は少ない数のアミノ酸を変更、追加又は削除する、核酸の置換、削除又は追加を指している。アミノ酸の保存的な置換は以下のとおりとなる場合がある：塩基性：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；親水性：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；疎水性：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄を含む：メチオニン（Ｍ）システイン（Ｃ）。さらに、保存的な変異により異なる配列は一般的に相同である。
【００６４】
用語「結合」は特に限定されないが、直接的又は間接的な二つの分子（例えば、化合物、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリペプチド、又は核酸）の間の生理的又は化学的相互作用を意味する場合がある。結合には共有結合、水素結合、イオン性結合及び非イオン性結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などが含まれる。
【００６５】
用語「細胞」は特に制限されないが、その通常の生物学的な趣旨を意味する場合があるが、多細胞生物の全体を示すものではない。細胞は、例えば、例示として、細胞培養中、又は例示として、鳥、植物、並びにヒト、牛、羊、猿、サル、豚、犬、及び猫などの哺乳類を含む多細胞生物中にある場合を含む、生体内、試験管内、生体外にある場合がある。細胞は原核細胞（例えば、細菌の細胞）でもよく、真核細胞（例えば、哺乳類や植物の細胞）でもよい。
【００６６】
本発明はここで説明するヌカント化合物又はその実施態様がＧＡＧと相互作用することで有益な治療活性、例えば抗増殖作用を媒介する及び／又は高めるという驚くべき、予期しない発見に関する。例えば、ヘパリン等のＧＡＧとヌカントの組み合わせは、ヌカントの抗癌性の効力を大幅に増やすことができる。
【００６７】
特定の実施態様において、本発明は、ここで説明するように、少なくとも一つのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と組み合わた、有効量のＨＢ−１９又はＮ６Ｌ等のヌカントを含む組成物、好ましくは治療用組成物を提供する。
【００６８】
本発明はまた、ここで説明するＧＡＧ及びヌカントの複合体を含む組成物、特に治療用組成物を提供する。
【００６９】
予想外かつ驚くべきことに、本明細書に記載のヌカントは、ＧＡＧと混合すると微粒子を形成することを発見した。したがって、特定の態様において、本発明は、本明細書に記載のヌカントとＧＡＧとを含む微粒子を含有する組成物、特に治療用組成物を提供する。その他の実施形態では、ヌカントとＧＡＧの組み合わせからなる微粒子又は複数の微粒子の発明を提供する。特定の実施形態において、ヌカントはＨＢ−１９又はＮ６Ｌ等のペプチド又は偽ペプチドである。ここに用いられるように、用語「ヌカント」は、ヌクレオリン結合ペプチド、又は例えば、ヌクレオリン結合性のペプチド又は偽ペプチド、又はそれらの誘導体若しくは類縁体（総称して「ヌカントペプチド」）を含むヌクレオリン抗体やヌクレオリン拮抗剤といった実体を意味する場合があるがこれに限定されない。
【００７０】
特定の実施形態では、ヌカント化合物は、少なくとも三つの偽ペプチド単位がグラフト重合した、支持体を含む、式（Ｉ）で表される化合物である。
【００７１】
【化１】
2013540127.tif 000002
【００７２】
ここで
それぞれのＸは独立して任意のアミノ酸を示し；
Ｙ１及びＹ２は独立して塩基性の側鎖を有するアミノ酸から選択され；
Ｚは必要に応じてγ、β又はδ位が；通常の又は非Ｎ−アルキルアミノ酸；ジアルキルアミノ酸；環状ジアルキルアミノ酸；ピペコリン酸又はそれらの誘導体で置換されたプロリンから選択され；
【００７３】
ｎ及びｉは独立して０又は１であり；
ｍは０〜３の整数であり；
ｋは３以上の整数であり；
Ψは標準的なペプチド結合よりも、有意に強い、少なくとも一つのプロテアーゼに対する耐性がある修飾されたペプチド結合を示す。
【００７４】
本発明において、用語「支持体」は少なくとも式（Ｉ）の三つの偽ペプチド単位がグラフト重合することができる、任意の、医薬として許容できる、すなわち固有の毒性を伴わない分子を指している。したがって、許容可能な支持体は、少なくとも三つの式（Ｉ）の偽ペプチド単位、好ましくは３から８個の式（Ｉ）の偽ペプチド単位とグラフト重合することで受け入れることのできる十分な大きさを有する必要がある。このような支持体は、好ましくは、少なくとも３個、好ましくは３から８個の式（Ｉ）の偽ペプチド単位が一つ又は複数のヌクレオリン分子のＲＧＧ領域に集中し、相互作用するのに十分なものである必要がある。さらに、支持体は免疫原性を有してはならない。
【００７５】
直鎖状ペプチド若しくは環状のペプチド、直鎖状若しくは環状のフォルダマー（ｆｏｌｄａｍｅｒ）（溶液中でコンパクトかつ明確かつ予測可能な構造をとる強い傾向を有するオリゴマー又は重合体）、直鎖状高分子若しくは球状のデンドロマー（ｄｅｎｄｒｏｍｅｒ）（多価の中央コアの周りに樹木の成長過程のように結合する高分子からなる巨大分子）、ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）（Ｎ−置換グリシンオリゴマー）、糖又はナノ粒子からこのような支持体を選択することができる。当該支持体は直鎖状若しくは環状のペプチド又は直鎖状若しくは環状のペプトイドから選択されることがより好ましい。
【００７６】
直鎖状ペプチド（図２のヌカントペプチドＨＢ１９、ヌカント２−３、及び６−９の構造を参照）により、支持体を簡単に合成することができ、化合物ＨＢ１９及びＮ６Ｌについて発明者らによって得られた結果は、そのような支持体がこの出願によって提起された技術的な問題を事実上、解決することを示した。本発明の支持体として働く直鎖状ペプチドは、リジンの含まれる割合が２５％以上であれば好ましい。より正確には、直鎖状ペプチドが本発明の支持体として使用される場合は、偽ペプチド単位はリジンのε位にグラフト重合されることが好ましい。直鎖状ペプチドが発明の支持体として使用される場合は、したがって好ましくはこれにグラフト重合する偽ペプチド単位と少なくとも同数のリジンを有する。
【００７７】
例えば、支持体直鎖状ペプチドはKKKGPKEKGC（配列番号１）、KKKKGC（配列番号２）、KKKKGPKKKKGA（配列番号３）又はKKKGPKEKAhxCONH2（配列番号４）、ここでAhxはhexanoic amino acidを表し、CONH2は酸性基がアミド基で置き換えられていることを表すので、AhxCONH2は(2S)-2-aminohexanamideを示す、又は２−４単位からなる直鎖状配列（KAKPG、配列番号１2）、すなわち配列AcKAKPGKAKPGKAKPGCONH2（配列番号１３、Ａｃはアセチル基CH3-CO-表し、CONH2はグリシンの酸性基COOHが、アミド基CONH2に置き換えられていることを意味する）から選択した配列を有する場合がある。支持体の直鎖状ペプチドはKKKGPKEKAhxCONH2（例えば、この直鎖状ペプチドを支持体として有する、図２Ａ、配列番号５のＨＢ１９を参照）又はペプチドAcKAKPGKAKPGKAKPGCONH2（配列番号１３、Ａｃはアセチル基CH3-CO-表し、CONH2はグリシンの酸性基COOHが、アミド基CONH2に置き換えられていることを意味する、例えば、この直鎖状ペプチドを支持体として有する図２Ｇ、配列番号１７のヌカント７）
【００７８】
直鎖状ペプチドのいくつかはらせん状（helicoidal）構造をとることが知られている。本発明においてこれらの直鎖状ペプチドは支持体として用いることが出来る。このような直鎖状ペプチドは、Aibが２−アミノイソブチル酸を示すところ、配列Aib-Lys-Aib-Gly（配列番号６）又はLys-Aib-Gly（配列番号７）のペプチド単位の３以上、好ましくは３から８の整数のそれぞれ繰り返しからなる支持体の有するらせん状（helicoidal）構造から保持する。式（Ｉ）の偽ペプチド単位とグラフト重合するために、一のリジン残基（Lys）からなるこれらの単位のいずれにおいても、同数のこれらの単位の繰り返しが必要とされる。
【００７９】
例えば、４個の式（Ｉ）の偽ペプチド単位からなる四価の化合物を得るために、支持体は化学式Ac-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2（配列番号２２）のらせん状（helicoidal）構造を形成する直鎖状ペプチドであってもよく、ここでＡｃはアセチル基CH3-CO-表し、CONH2はグリシンの酸性基COOHが、アミド基CONH2に置き換えられていることを意味する（例えば、この直鎖状ペプチドを支持体として有する図２Ｈ、配列番号２３のヌカント８を参照）。
【００８０】
あるいは、５個の式（Ｉ）の偽ペプチド単位からなる五価の化合物を得るために、支持体は化学式Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly（配列番号８）又はLys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly（配列番号９）のらせん状（helicoidal）構造を形成する直鎖状ペプチドであってもよい。好ましくは、配列番号８又は９に由来する化学式からなる、らせん状（helicoidal）構造を形成する直鎖状ペプチドを使用する。この化学式はAc-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-CONH2（配列番号１８、ここでＡｃはアセチル基CH3-CO-表し、CONH2はグリシンの酸性基COOHが、アミド基CONH2に置き換えられていることを意味する、例えば、このペプチドを支持体として有する図２Ｃ、配列番号２０のヌカント２を参照）又はAc-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2（配列番号１９、ここでＡｃはアセチル基CH3-CO-表し、CONH2はグリシンの酸性基COOHが、アミド基CONH2に置き換えられていることを意味する、例えば、このペプチドを支持体として有する図２Ｄ、配列番号２１のヌカント３を参照）
【００８１】
あるいは、６個の式（Ｉ）の偽ペプチド単位からなる六価の化合物を得るために、支持体は化学式Ac-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-CONH2（配列番号１４、ここでＡｃはアセチル基CH3-CO-表し、CONH2はグリシンの酸性基COOHが、アミド基CONH2に置き換えられていることを意味する）又はAc-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2（配列番号１５、ここでＡｃはアセチル基CH3-CO-表し、CONH2はグリシンの酸性基COOHが、アミド基CONH2に置き換えられていることを意味する、例えば、このペプチドを支持体として有する図２Ｆ、配列番号１７のヌカント６を参照）のらせん状（helicoidal）構造を形成する直鎖状ペプチドであってもよい。
【００８２】
あるいは、８個の式（Ｉ）の偽ペプチド単位からなる八価の化合物を得るために、支持体は化学式Ac-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2（配列番号２４）のらせん状（helicoidal）構造を形成する直鎖状ペプチドであってもよく、ここでＡｃはアセチル基CH3-CO-表し、CONH2はグリシンの酸性基COOHが、アミド基CONH2に置き換えられていることを意味する（例えば、このペプチドを支持体として有する図２Ｉ、配列番号２５のヌカント９を参照）。
【００８３】
環状のペプチド又はペプトイドもまた支持体として好ましく使用できる。特にこれはその構造の柔軟性を制限することが出来る。支持体となる環状のペプチド又はペプトイドは主として、特に交互にＬ体（左旋性）及びＤ体（右旋性）のアミノ酸残基からなる（Ｄ，Ｌ−シクロペプチド）六員、八員、十員、十二員の環状のペプチド、又は鎖状のＮ−アルキルグリシン残基（環状ペプトイド）から選ぶことが出来る。このような支持体を有する化合物の例は、図２Ｂ（化合物０１）で示す、ＫとＰの間のΨ（-CH2N-）結合を有する３個のＫＰＲ単位を有し、交互に並ぶＤ体のアラニン残基及びＬ体のリジン残基からなる六員環ペプチドである。
【００８４】
各リジン残基のεアミノ基でアミド結合により連結された５個の各リジン残基からなる支持体を使用することもできる（図２Ｅの化合物ヌカント４を参照）。
【００８５】
好ましくは、  本発明にかかる式（Ｉ）の化合物のためのかかる支持体は下記の環状六員ペプチドから選ばれる支持体であることが好ましい：
−  交互に並ぶＤ体のアルカリ性（Ａ）残基及びＬ体のリジン（Ｋ）残基（図２Ｂの化合物ヌカント０１を参照）、
−  各リジン残基のεアミノ基でアミド結合により連結された５個の各リジン残基（図２Ｅの化合物ヌカント４を参照）、及び
−  配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号８，配列番号９，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２２，配列番号２４の配列からなる直鎖状ペプチド。
【００８６】
本発明において、偽ペプチド単位に対する用語「グラフト重合する（grafted）」は直接に又は偽ペプチドと支持体の間の中間のスペーサー化合物を介して共有結合により支持体に結合していることを意味する。このため、一の特定の態様において、かかる偽ペプチド単位はそれらと支持体の間のスペーサー化合物なしに直接、支持体にグラフト重合する。他の一態様において、偽ペプチド単位は中間のスペーサーを介して支持体にグラフト重合する。実施可能なスペーサーの例は、エチレングリコール型、ピペラジン型、又はアミノヘキサン酸型若しくはベータ−アラニン型のアミノ酸型の化合物である。
【００８７】
支持体が直鎖状又は環状のペプチドであり、偽ペプチド単位が直接そのペプチドにグラフト重合する場合、ペプチドと偽ペプチド単位との間の結合は、好ましくはリジンのε位（側鎖上の）のアミノ基で、好ましくはペプチドの支持体のリジン残基のε位のアミノ基でなされる。このため偽ペプチド単位のＣ末端のアミノ酸の酸性基COOHと、リジン残基のアミノ基、好ましくはリジンのε位（側鎖上の）のアミノ基との間のアミド結合により、ペプチド支持体に偽ペプチド単位が直接グラフト重合する。
【００８８】
本発明にかかる化合物において、少なくとも３個の偽ペプチド単位が支持体にグラフト重合する。実際に発明者らの結果は化合物ＨＢ１９及び誘導化合物又は類縁体の例外的な抗腫瘍効果にとってヌクレオリンのＲＧＧ領域への結合が重要であることを示している（図１参照）。ヌクレオリンのＲＧＧ領域への結合は式（Ｉ）に表されるようないくつかの偽ペプチド単位の多価の提示によってなされる。KKKGPKEKGC、KKKKGC、KKKKGPKKKKGA又はKKKGPKEKAhxCONH2の配列からなる直鎖状のペプチドである支持体を有する化合物に関して、発明者らは、３より少ない（ｋ＜３）単位では、ヌクレオリンへの結合の効果がより低いこと及び抗腫瘍効果が概ね小さいことを示した。このため、ｋは３以上の整数であり、本発明にかかる該化合物は少なくとも３個の支持体に接続する偽ペプチド単位を含んでいる。このため、本発明にかかる該化合物は好ましくは３−８個の偽ペプチド単位（３≦ｋ≦８）が支持体に接続している。さらに、発明者らは、より大きな数のペプチド単位において、ヌクレオリンへの結合の効果は増えないことから、５個又は６個の偽ペプチド単位のが支持体に接続する（ｋ＝５）ときに好ましい活性を有することを示した。このため、式（Ｉ）の化合物において、ｋは３と８の間、好ましくは４と７の間の、４と６の間の、４と５の間、又は５と６間である。また、式（Ｉ）の化合物において、ｋは好ましくは５又は６に等しい。
【００８９】
本発明において、「任意のアミノ酸」の用語は任意の天然又は合成アミノ酸であり、１又はそれ以上の置換の存在によって修飾されていてもよい。より厳密には、アミノ酸の用語は、下記の一般的構造を有するα位がアミノ化されたアミノ酸を意味する：
【００９０】
【化２】
2013540127.tif 000003
【００９１】
ここでＲはアミノ酸の側鎖を示す。このため本発明において、Ｒは側鎖を有する又は有しないアミノ酸の側鎖を示す。「天然アミノ酸」の用語は生命体の生体内において天然に見いだされる任意のアミノ酸を意味する。このため、天然アミノ酸は、翻訳によってタンパク質に取り込まれるｍＲＮＡでコードされるアミノ酸だけでなく、例えば尿素の産生過程においてアルギニン分解酵素によってＬ−アルギニンから生成されるオルニチンのような代謝過程の生成物又は副生成物のような、生体内で天然に見つかる他のアミノ酸を含む。また、本発明において用いられるアミノ酸は、天然のものとそうでないものがある。天然アミノ酸は一般的にＬ体であることが好ましいが、本発明において、アミノ酸はＬ体又はＤ体をとることが出来る。さらに言うまでもなくＲは天然アミノ酸の側鎖に限定されず、任意に選択可能である。
【００９２】
式（Ｉ）の化合物の偽ペプチド単位において、Ｚはなくてもよく（ｉ＝０）、あってもよく（ｉ＝１）、下記から選ばれる：
プロリン、γ、β、δ位が水酸基、アミン、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルケニル、Ｃ１−Ｃ１０アルキニル、Ｃ５−Ｃ１２アリル、Ｃ５−Ｃ１４アラルキル、Ｃ５−Ｃ１２ヘテロアリル（好ましくはＣ５ヘテロアリル）で置換されていてもよく、これらの置換基が、それら自身が、ハロゲン原子、ＮＯ２、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ＮＨ２、ＣＮ、トリハロメチル、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ４ジアルキルアミノ、グアニジノ基、チオール基から選ばれる１から６の置換基で置換されていてもよい；
天然又は非天然のＮ−アルキルアミノ酸、
ジアルキルアミノ酸（例えばイソブチルアミノ酸）
環状ジアルキルアミノ酸、又は
ピペコリン酸又はそれらの誘導体。
【００９３】
「Ｃ１−Ｃｉアルキル」の用語は、化学式-CjH2j+１の直鎖状又は分枝した飽和炭化水素の遊離基を意味し、１≦ｊ≦ｉである。このため、Ｃ１−Ｃ１０アルキルはＣ１アルキル（メチル）、Ｃ２（エチル）、Ｃ３（ｎ−プロピル又はイソプロピル）、Ｃ４（ｎ−ブチル、イソブチル、第二ブチル、第三ブチル）、Ｃ５（ｎ−ペンチル、ネオペンチル、イソペンチル、第三ペンチル）、及びＣ６からＣ１０のアルキルを含む。「Ｃ１−Ｃ１０アルケニル」の用語は少なくとも一のＣ＝Ｃ二重結合を有する、直鎖状又は分枝した、１から１０の炭素原子からなる、不飽和炭化水素の遊離基を意味する。「Ｃ１−Ｃ１０アルキニル」の用語は少なくとも一のＣ≡Ｃ三重結合を有する、直鎖状又は分枝した、１から１０の炭素原子からなる、不飽和炭化水素の遊離基を意味する。「Ｃ５−Ｃ１２アリル」の用語は、５から１２の炭素原子からなる、芳香族の、多環の、又は一環の炭化水素の遊離基を意味する。
「Ｃ５−Ｃ１４アラルキル」の用語は、５から１４の炭素原子からなる、アルキル及びアリルの組み合わせを意味する。「Ｃ５−Ｃ１２ヘテロアリル」の用語は、直鎖状に５から１２の炭素原子を有する炭化水素鎖上の少なくとも一の炭素原子がＮ、Ｏ又はＳから選ばれる他の原子で置換されているアリル基を意味する。このため、「Ｃ５ヘテロアリル」の用語は炭化水素鎖上の５つの炭素原子中、少なくとも１つがＮ、Ｏ又はＳから選ばれる他の原子で置換されているアリル基を意味する。「Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ」の用語は化学式-O(O)C-(C1-C4 alkyl)、-O(O)C-(C4-C12 cycloalkyl)、-O(O)C-(C4-C12 aryl)、-O(O)C-(C4-C12 arylalkyl)、又は-O(O)C-(C4-C12 heteroaryl)の置換基を意味する。式（Ｉ）の化合物において、「Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ」等は化学式-O(O)C-(C1-C4 alkyl)、-O(O)C-(C4 cycloalkyl)、-O(O)C-(C4 aryl)、-O(O)C-(C4 arylalkyl)、又は-O(O)C-(C4 heteroaryl)の置換基から選ばれる。「Ｃ１−Ｃ４ジアルキルアミノ」の用語は化学式-N(C1-C4 alkyl)2の遊離基を意味し、各アルキルは同一又は非同一である。
【００９４】
「Ｎ−アルキルアミノ酸」の用語は、アミン基の水素原子の一つがＣ１−Ｃ１０アルキル鎖で置換されているか、又は可能であればＣ５−Ｃ１４の、好ましくはＣ５−Ｃ１０の、さらに好ましくはＣ１０のアリルアルキル基で置換されている任意のアミノ酸を意味する。Ｎ−アルキルアミノ酸は例えば、Ｎ−メチルグリシン又はサルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン酸、Ｎ−メチルバリン酸その他を含む。ジアルキルアミノ酸は例えば２−アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）、アミノシクロプロパンカルボン酸その他を含む。「ジアルキルアミノ酸」の用語は、２個の水素原子（中央の炭素又はアミン基）がＣ１−Ｃ１０アルキル鎖で置換されているか、又は可能であればＣ５−Ｃ１４の、好ましくはＣ５−Ｃ１０の、さらに好ましくはＣ１０のアリルアルキル基で置換されている任意のアミノ酸を意味する。ジアルキルアミノ酸は例えば２−アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）、アミノシクロプロパンカルボン酸その他を含む。
【００９５】
Ｚはある方が好ましく、この場合ｉ＝１である。また、好ましくはＺがある場合（ｉ＝１）、Ｚは可能な場合γ、β、δ位が前述の通り置換されているプロリンである。
【００９６】
式（Ｉ）の化合物の偽ペプチド単位において、Ｙ１及びＹ２は独立して塩基性の側鎖を有するアミノ酸から選択される。「塩基性の側鎖を有するアミノ酸」の用語は、側鎖Ｒが７より大きいｐＫａ値を有する（ｐＫａ（Ｒ）＞７）、任意の天然の又は非天然のアミノ酸を意味する。このため、その側鎖が７より大きい、好ましくは７．５よりも大きい、８よりも大きい、８．５よりも大きい、９よりも大きいｐＫａ値を有する限り、任意のアミノ酸をＹ１及びＹ２に用いることが出来る。特に、天然アミノ酸において、側鎖が７より大きいｐＫａ値を有するものは、一般的に天然の塩基性アミノ酸といわれる、リジン（Ｋ、ｐＫａが約１０．５）、アルギニン（Ｒ、ｐＫａが約１２．５）、オルニチン（リジンの下流の同族体、ｐＫａが約１０．８）を含む。このため、好ましい態様において、Ｙ１及びＹ２は独立にアルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）及びオルニチンから選択可能である。さらに好ましくは、Ｙ１はリジン（Ｋ）であり、Ｙ２はアルギニン（Ｒ）である。しかしながら、側鎖ＲのｐＫａ値が７より大きい、好ましくは７．５よりも大きい、８よりも大きい、８．５よりも大きい、９よりも大きい限り、他の非天然のアミノ酸をかわりに用いることができる。
【００９７】
本発明の化合物において、ヌクレオリンのＲＧＧ領域への結合に必須の偽ペプチド単位は式（ＩＩ）のサブユニットである。
【００９８】
【化３】
2013540127.tif 000004
【００９９】
ここで、Ｙ１及びＹ２は以下のように定義される。この必須のサブユニットの一方の又は他方の末端であるにも関わらず、このいくつかの上記のように定義されたアミノ酸からなる存在は、ヌクレオリンへの結合を阻害するようなものではない。これは式（ＩＩ）の必須のサブユニットが一方及び／又は他方の末端において式（Ｉ）中に、（Ｘ）ｎ及び（Ｘ）ｍでそれぞれ示される０個から３個の任意のアミノ酸を含む場合がある理由であり、ｎは０又は１に等しく、ｍは０と３の間の整数である。かかる式（ＩＩ）の必須のサブユニットの一方及び／又は他方の末端において存在するアミノ酸の数は小さいことが好ましく、すなわち、ｎは好ましくは０であり、ｍは好ましくは０と２の間の整数であり、好ましくは０又は１であり、好ましくは０である。このため、好ましい態様において、ｎ及びｍは０に等しい。
【０１００】
本発明の化合物において、式（ＩＩ）のサブユニットは、修飾されたペプチド結合Ψを含んでいるので、少なくとも一のタンパク質分解酵素に対して通常のタンパク質よりも有意に耐性が高い。
【０１０１】
「通常のペプチド結合」の用語は、天然のタンパク質において通常、２個のアミノ酸の間にある、化学式（-CONH-）のアミド結合を意味する。かかる結合はタンパク質分解酵素の作用に感受性がある。「修飾されたペプチド結合Ψ」の用語は化学式（-CONH-）の通常のペプチド結合とは異なる化学式の２個のアミノ酸の間の化学結合を意味する。この修飾された結合Ψは少なくとも一のタンパク質分解酵素に対して化学式（-CONH-）の通常のペプチド結合よりも有意に耐性が高いと考えられる。「タンパク質分解酵素」の用語は、いわゆる「ペプチド分解酵素」又は「タンパク質分解性の酵素」であり、タンパク質中の通常のペプチド結合を切断する任意の酵素を意味する。かかる作用は、水分子の利用を伴っているので、タンパク質分解酵素は加水分解酵素に分類される。本実施形態のタンパク質分解酵素はタンパク質のＮ末端を切断するＮ−ペプチド分解酵素を含むことが好ましい。これらのタンパク質分解酵素は特に修飾されたペプチド結合を有さないペプチドの生体内での安定性の面で不都合を生じる。これが式（Ｉ）の偽ペプチド単位がヌクレオリンへの結合に必須である式（ＩＩ）のサブユニットの、とりわけこれらのＮ‐ペプチド分解酵素に対する耐性を有意に増加するようにＹ１とＺ（ｉ＝１の場合）との間、又はＹ１とＹ２との間（ｉ＝０の場合）に修飾されたペプチド結合Ψ含んでいる理由である。このため結合Ψは少なくとも一のＮ‐ペプチド分解酵素に対する耐性を有意に増加させるものでなければならない。これにより、式（Ｉ）の化合物は生体内又は試験管内での半減期が有意に増加する。例えば修飾された結合Ψを有するＨＢ１９は、３７度ヒト血清中又ウシ胎児血清中で２４時間以上の半減期を有する一方、結合Ψのかわりに通常のペプチド結合と同じ化合物はこれらと同じ条件において半減期が１時間より小さい。
【０１０２】
さらに、発明者らは修飾された結合Ψを有することでヌクレオリンに結合する活性を有意に増加させることが可能なことを見出した。かかる現象はこれがヌカントペプチドにヌクレオリンと不可逆的な複合体を形成させる事実によるものと考えられる。
【０１０３】
さまざまな化学結合が少なくとも一のペプチド分解酵素に対する耐性を有意に増加させると考えられる。このため、好ましい態様においてΨは、プロリンとの結合の場合のように第二アミン基のレベルにおいて結合が生じる場合における（-CH2NH-）又は（-CH2N-）で表される還元された結合、逆向きの結合（-NHCO-）、メチレノキシ結合（-CH2-0-）、チオメチレン（-CH2-S-）、炭素結合（-CH2-CH2-）ケトメチレン結合（-CO-CH2-）、ヒドロキシエチレン結合（-CHOH-CH2-）、（-N-N-）結合、Ｅ−アルケン結合、又は（-CH=CH-）結合を示す。
【０１０４】
Ｙ１とＺ（ｉ＝１の場合）との間、又はＹ１とＹ２との間（ｉ＝０の場合）のかかるΨは、式（Ｉ）の化合物に体系的に導入されているものの、先に述べたとおり偽ペプチド単位の他のペプチド結合が修飾されてもよい。特に、本発明において、不特定のアミノ酸の間の結合は、いずれにおいても、通常のペプチド結合か又は先に述べた修飾された結合Ψとすることができる。結合Ψの追加によりさらに式（Ｉ）の化合物のタンパク質分解酵素に対する耐性を増加させることができる。ただし、Ｙ１とＺ（ｉ＝１の場合）との間、又はＹ１とＹ２との間（ｉ＝０の場合）の、先頭の結合Ｙを有することによる増加はすでに顕著であり、他の結合Ψの付加は偽ペプチド単位、さらに式（Ｉ）の合成を複雑にすることを否定できない。このため、付加的な結合Ψは可能であるが、任意である。
【０１０５】
本発明において利用可能な化合物の例は、特に化合物以下のものである（図２及び実施例を参照）：
【０１０６】
ＨＢ１９（図２Ａ、配列番号５、支持体として５個の偽ペプチド単位（Ψ=CH2-Nを有する）がその５つの各リジン残基のεアミノ基に共有結合している配列番号４の直鎖状ペプチドを有する化合物）、
【０１０７】
ヌカント０１（図２Ｂ）、支持体、交互に並ぶＤ型構成のアラニン残基（Ａ）とＬ型構成のリジン残基（Ｋ）からなる環状六員ペプチドを有する化合物、ここで、３つの偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）は３個ある各リジン残基（Ｋ）のεアミノ基に共有結合している；図２Ｂ参照、
【０１０８】
ヌカント２（図２Ｃ，配列番号２０、５個の偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）が５個の各リジン残基のεアミノ基に共有結合している配列番号１８の配列のらせん状（helicoidal）構造を有する支持体として直鎖状ペプチドを有する化合物）
【０１０９】
ヌカント３（図２Ｄ、配列番号２１、５個の偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）が５個の各リジン残基のεアミノ基に共有結合している配列番号１９の配列のらせん状（helicoidal）構造を有する支持体として直鎖状ペプチドを有する化合物）
【０１１０】
ヌカント４（図２Ｅ、５個の各リジン残基のα炭素のアミノ基に共有結合するこで、５個の偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）が各リジン残基のεアミノ基とアミド結合で連結している、５つのリジン塩基からなる支持体を有する化合物）
【０１１１】
ヌカント６（図２Ｆ、配列番号１６、６個の偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）が６個の各リジン残基のεアミノ基に共有結合している配列番号１５の配列のらせん状（helicoidal）構造を有する支持体として直鎖状ペプチドを有する化合物）
【０１１２】
ヌカント７（図２Ｇ、配列番号１７、６個の偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）が６個の各リジン残基のεアミノ基に共有結合している配列番号１３の配列のらせん状（helicoidal）構造を有する支持体として直鎖状ペプチドを有する化合物
【０１１３】
ヌカント８（図２Ｈ、配列番号２３、４個の偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）が４個の各リジン残基のεアミノ基に共有結合している、４個のＬｙｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ（配列番号７）を有するらせん状（helicoidal）構造を有する直鎖状ペプチド（配列番号２２）を支持体として有する化合物）、及び
【０１１４】
ヌカント９（図２Ｉ、配列番号２５、８個の偽ペプチド単位ＫΨＰＲ（Ψ=CH2-Nを表す。）が８個の各リジン残基のεアミノ基に共有結合している、８個のＬｙｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ（配列番号７）を有するらせん状（helicoidal）構造を有する直鎖状ペプチド（配列番号２４）を支持体として有する化合物）
【０１１５】
一つの態様において、本発明によって得られるヌカントは鋳型構造上に一又は複数のトリペプチドＫΨＰＲを有する偽ペプチドであり、例えば、図２に示す化合物ＨＢ１９並びにヌカントペプチド１−４及び６−９を含む。かかるトリペプチドは１から６残基のリンカー配列を介してかかる鋳型に連結される。
【０１１６】
いくつか態様において、本発明の組成物中のヌカントペプチドは式（ＩＩＩ）で表される五価のペプチド（ここで図２Ａに示す「ＨＢ−１９」）を含有する又はからなる：
【０１１７】
【化４】
2013540127.tif 000005
偽ペプチドＨＢ−１９の一般的な式もここで以下のように参照している：５［ＫΨ（ＣＨ2Ｎ）ＰＲ］−ＴＡＳＰ、ここでΨは還元されたペプチド結合（CH2N等）を示す。ＨＢ−１９はヌクレオリンの表面に特異的なリガンドであるヌカントファミリーの原型である。ＨＢ−１９はポリリジンマトリクスに支持されているトリペプチドＫΨＰＲの五価のコンストラクトである。さらにＨＢ−１９ペプチドの詳細な議論はここでそれらの全てがあらゆる目的で参考文献として援用されている：Nisole et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 2000 Feb 10; 16(3):237-49; Nisole et al., J. Biol. Chem., 2002 June 7; 277(23)20877-86; Nisole et al., J. Biol. Chem., 1999 Sept 24; 274(39):27875- 84; Krust et al., PNAS, 2001 Nov 20; 98(24): 14090-095; Alete et al., FEBS J, 2006; 273:4668-81；を参照されたい。
【０１１８】
通常の細胞の核に局在することで守られることを必須としながら、ここで述べるヌカント、及び表面にあるヌクレオリン及び／又はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に特異的に結合するそれらの誘導体及び同類物の標的となるヌクレオリンは活発な内皮と同等に増殖しているその細胞の表面に豊富にある。
【０１１９】
ヌカントファミリーを構成するもの他の例は、マトリックス構造によりことなる。例を図２Ｂから２Ｉに示す。
【０１２０】
例えば本発明の好ましい態様において、本発明の組成物中のヌカントペプチドはヌカント６Ｌ（「Ｎ６Ｌ、図２Ｆ参照）を含む又はからなる。
【０１２１】
本発明の組成物中のヌカント化合物は、一様な光学活性を有しなくてもよい、すなわち偽ペプチド単位中のリジン残基は無作為にＬ体であってもよく、Ｄ体であってもよい（光学活性が一様ではない）、また全てＤ体又は全てＬ体であってもよい（光学活性が一様である）。本発明の組成物中のヌカント化合物は一様な光学活性を有することが好ましく、例えば偽ペプチド単位中のリジン残基が全てＤ体又は全てＬ体であればよく、全てＬ体であることが好ましい。このような光学活性が一様な化合物はＷＯ２００９／１４１６８７に記載の方法によって得ることが出来る。
【０１２２】
本発明の方法を実施するために役に立つ免疫化学分析法は、例えば、いずれも特別に参考文献としてここに援用するKlug, T.L. et al, Cancer Res., 44:1048 (1984), Herlyn, M. et al, J. Clin. Immunol, 2:135 (1982), Metzgar, R.S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 81 :5242 (1984), Papsidero, L.D. et al, Cancer Res., 44:4653 (1984), Hayes, D.F. et al, J. Clin. Invest., 75:1671 (1985), Killian, C.S. et al, J. Natl. Cancer Inst., 76:179 (1986), Killian, C.S. et al, Cancer Res., 45:886 (1985), Hedin, A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 80:3470 (1983), Pekary, A.E. et al, Clin. Chem., 30:1213-1215 (1984), Bast, R.C. et al, New England J. Med., 309:883-887 (1983) and Bellet, D.H. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81 :3869-3873 (1984)、に記載されるように当該分野の当業者によく知られている。
【０１２３】
ヌカントペプチドは２種の作用を奏し、それらは各々腫瘍の増殖及び血管新生を阻害することが可能なことを特長とする。現行の市場の製品はかかる２種の活性を示すものではない。本ヌカント複合医薬のもう一方の主な特長は、優れた安全性を示すことである。加えてヌカントペプチドのサイズが小さいことから、抗原性を有さず、また製造効率及びコストが合理的なレベルになると考えられることである。
【０１２４】
ここで述べるヌカントはがん細胞と同様に血管新生の原因となる活発な内皮細胞の表面ヌクレオリンに準不可逆的に結合する。ヌカントは、モデル動物に移植された腫瘍を完全に根絶する二つの作用：腫瘍細胞の成長を直接阻む、及び血管新生を阻害する、を有する。タンパク質のＣ末端部にあるＲＧＧ領域へ特異的に結合する。相互作用した後、その複合体は、温度依存的な機構によって速やかに内部移行する。ヌカントは表面ヌクレオリンの安定的かつ不可逆的なリガンドと考えられる。内部移行後、ヌカントは細胞質に残り、核膜を通過しない。
【０１２５】
ここで用いられるように、「ヌカント」の用語はまた、例えば保存的なアミノ酸修飾、原子価の状態を模倣する化学修飾、並びに安定性、可溶性、腸からの吸収又は血液脳関門（ＢＢＢ）の通過等の生体への取り込み及び／又は生体利用度を向上するための修飾等の少数の修飾を有するペプチドを包含する。ペプチド及びペプチド医薬の脳内での生体利用度を増加させるための戦略及び試験管内又は生体内の分析を用いてＢＢＢにおけるペプチドの透過性を測定する方法を概観するために、ここで引用によってその示唆を援用するEngleton et al.、Peptides 9:1431-1439 (1997)を参照されたい。医薬として許容できるキャリアはブドウ糖、ショ糖、デキストランといった炭水化物；アスコルビン酸やグルタチオンなどの抗酸化剤；キレート剤；低分子性タンパク質といった生理学的に許容できる化合物を含有する場合がある。生体利用度を増加させるヌカントペプチドに対する付加的な修飾には、ペプチドを疎水性のアミノ酸又は化合物といった疎水性成分と複合化することを含む。
【０１２６】
「ヌカント」の用語はさらに、とりわけ、ヌカント配列に一又はいくつかの小さな修飾を有する鋳型構造上に一又は複数のＫΨＰＲトリペプチド、ＫΨＰＲＲテトラペプチドを有する偽ペプチドを包含する。熟慮した上で化学的な、又は酵素的な修飾（アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、その他等）及びヌカント配列に対する一又はいくつかのアミノ酸の置換を含む修飾をすることが出来る。そのような修飾がペプチドの生理活性、生体利用度、安定性を高めるために又はこれの合成又は精製を促進するために望ましい場合があることは、当該技術分野の当業者に認識されると考える。
【０１２７】
付加的な態様において、ここで説明するヌカントは、直接に、又はリンカー部分等によって間接に、一又は複数の担体、診断用の薬剤、又は細胞毒性のある薬剤に接合する。また、細胞毒性のある薬剤はリンカー部分に共有結合し、リンカー部分がさらに担体に共有結合する場合がある。リンカー部分は例えばアミノ酸（模倣物、類縁体、誘導体を含む）、ペプチド又はポリペプチド（模倣物、類縁体、誘導体を含む）、立体構造上不安定な化合物、脂質、脂肪族、炭水化物、グリセリド、ヌクレオチド又は核酸、ペプチド核酸、核酸誘導体、その他である場合がある。ヌカント６Ｌが細胞毒性を有する薬剤５フルオロウラシル（「５−ＦＵ」）に接合している接合体の例を以下に示す：
【０１２８】
【化５】
2013540127.tif 000006
Ａｉｂ＝α−アミノイソブチル酸
【０１２９】
【化６】
2013540127.tif 000007
【０１３０】
熟慮の上、置換されるアミノ酸は同様の構造的又は化学的特徴を有する（無極性アミノ酸を他の無極性のアミノ酸に置き換える；荷電アミノ酸を同様の荷電アミノ酸に置き換える、その他等）ような保存的な変更を含むヌカントペプチド等の本発明のヌカントに対するアミノ酸置換を実施できる。当業者は非保存的な変更（無電荷の極性アミノ酸を無極性アミノ酸に置き換える；荷電アミノ酸を無電荷の極性アミノ酸、その他等）はヌカントの機能に影響を与える場合があると認識できるものと考える。さらに、分枝配列及び環状配列を含む直鎖状ではないヌカント配列の変異、並びに対応するＬ体アミノ酸の代わりに一又は複数のＤ体アミノ酸残基を含む変異が作成可能である。
【０１３１】
付加的な態様において、ヌカントの運搬体としてリポソーム（Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. I to III, 2nd ed. (CRC Press, Boca Raton Fla. (1993))）を援用することが出来る。リン脂質又は他の脂質からなる、リポソームは非毒性であり、生理学的に許容可能であり、代謝される運搬体であり、比較的簡易に作製し投与することができる。他の態様において、ヌカントの運搬体はナノ粒子であることが好ましい。ペプチド化合物をナノ粒子の表面に吸収することはペプチド医薬を脳に送達するのに効果的であることが証明されている（Kreuter et al., Brain Res. 674:171-174 (1995)参照）。ナノ粒子の例は、コロイドを形成する、表面に吸収されたＨＢ−１９Ｐを有し、さらにポリソルベート８０で被膜されたポリシアノアクリル酸ブチルの重合体粒子である。
【０１３２】
当業者であればヌカント配列のどの配列及びどの領域が、修飾に対して寛容であり、臨床的に関連する親和性を有するヌクレオリンへの結合活性を保持するするのかを決定できる。例えば、種間であまり保存されていない残基におけるアミノ酸置換又は化学的若しくは酵素的修飾は、高度に保存された残基の置換より寛容である。このため、特定の態様において、担体は修飾することが出来るので、修飾された担体は診断薬に簡単に結合することが出来る。
【０１３３】
ここで説明するヌカントペプチドは、よく知られた組換方法を用いて又はよく知られた合成法により生産することができる。液相及び固相合成を含む、ペプチドを合成するための方法がいくつかよく知られている。各種方法に関する詳細な議論は例えば、あらゆる目的のためにそれらすべてにおいて引用することでここに援用するAtherton, E.; Sheppard, R.C. (1989). Solid Phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford, England: IRL Press; Stewart, J.M.; Young, J.D. (1984). Solid phase peptide synthesis, 2nd edition, Rockford: Pierce Chemical Company, 91 ; R. B. Merrifield (1963). ''Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide''. J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149-2154; L. A. Carpino (1993). '' 1 -Hydroxy-7-azabenzotriazole. An efficient peptide coupling additive''. J. Am. Chem. Soc. 115 (10): 4397-4398；で見つけることが出来る。
【０１３４】
肉体において最も豊富にあるヘテロ多糖類はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）である。これらの分子は二糖類単位の繰り返しを含む長く分枝のない多糖類である。二糖類単位はＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）又はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）と、グルクロン酸又はイズロン酸等のウロン酸とからなる二つの修飾糖を含んでいる。ＧＡＧは溶媒に強い粘性を与える伸展した構造を有する、高度に負に帯電した分子である。ＧＡＧは初めに細胞の表面又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に局在する。ＧＡＧの強い粘性により、圧縮性は低く、これらの分子は関節の潤滑剤として理想的である。同時にそれらの強剛性は細胞にとっての構造的な整合性を生み、また細胞間の通過経路を作りだし細胞遊走を可能にする。生理学的に意義のある特定のＧＡＧはヒアルロン酸（Hyaluronan）、デルマタン硫酸（dermatan sulfate）、コンドロイチン硫酸（chondoroitin sulfate）、ヘパリン（heparin）、ヘパラン硫酸（heparan sulfate）、及びケラタン硫酸（keratan sulfate）である。これらのＧＡＧはそれぞれ支配的な二糖類成分を有するにも関わらず（下記表１参照）、任意の分類中のＧＡＧの構造において糖類の不均一性がある。
【０１３５】
自然界において利用されるグリコサミノグリカンのいくつかの例は、抗凝固剤としてヘパリン、体の関節における潤滑液の成分としてヒアルロン酸、結合組織、軟骨、腱に見つかるコンドロイチン等がある。グリコサミノグリカンファミリーに含まれるものは、様々な種類のヘキソサミンの型、すなわちそれらの有する六炭糖又はヘキスロン酸（グルクロン酸、イズロン酸、ガラクトース、ガラクトサミン、グルコサミン等）を有する（表１）。それらはまた、グリコシド結合の幾何学上の態様も様々である。
【０１３６】
本発明において、組成物中のＧＡＧは天然又は合成のものである場合がある。「天然」にとは、化学的又は生物化学的な合成により得ることが出来る場合であっても、特に、ＧＡＧが天然の素材から単離されることを意味する。これに対して、「合成」によりとは、特に上記ＧＡＧが天然に存在せず、化学的又は生物化学的な合成のみにより得ることが出来ることを意味する。またＧＡＧの分子鎖は様々な置換基を付加することでさらに修飾されている。
【０１３７】
天然のＧＡＧの例を以下の表１に示す。
【表１】
2013540127.tif 000008
【０１３８】
表１（Table I.）はいくつかの天然のＧＡＧの構造を表す。コンドロイチン硫酸はもっとも普及しているＧＡＧである。デルマンタン硫酸は従来コンドロイチン硫酸Ｂとして知られていた。デルマンタン硫酸はヘキスロン酸単糖類の一部がグルクロン酸である場合があるが、イズロン酸の存在によりコンドロイチンと区別される。ケラタン硫酸のＩＩ型はフコシル化されていてもよい。ヘパリンは生体分子として知られるものの中で最も高い負の電荷密度を有する。ヘパラン硫酸はヘパリンとよく似た構造を有するが、ヘパラン硫酸の二糖単位は硫酸化されている領域及び硫酸化されていない領域に明確に分かれている。ヒアルロン酸は全く硫酸化されていない唯一のＧＡＧである。
【０１３９】
上記の表１中、コンドロイチン硫酸は、下記表２のに表すように硫酸化される部位によって異なるいくつかのＧＡＧを示す。
【０１４０】
【表２】
2013540127.tif 000009
【０１４１】
表２（Table II.）は硫酸化部位に基づくコンドロイチン硫酸の分類を示す。
【０１４２】
「コンドロイチン硫酸Ｂ」はデルマタン硫酸の旧称であり、すでにコンドロイチン硫酸に分類されていない。
【０１４３】
肉体中のＧＡＧの大部分は中心となるたんぱく質に連結し、プロテオグリカンを形成している（ムコ多糖類とも呼ばれる）。ＧＡＧはブラシ状構造の中心から垂直方向に拡がる。ＧＡＧとタンパク質中心との連結には、特定の２個のガラクトース残基及び１個のキシロース残基からなる三糖が関与する（GAG-GalGalXyl-0-CH2-protein）。三糖のリンカーは
Ｏ−グリコシド結合を介して、タンパク質のＳ残基を通じて、タンパク質中心に結合する。いくつかの型のケラタン硫酸はＮ−アスパラギニル結合を介してタンパク質中心と連結する。プロテオグリカンのタンパク質中心はＳ及びＴ残基に富み、複数のＧＡＧを結合する。
【０１４４】
ここで説明する組成物又は方法いかなる態様においても、本発明のヌカントはＧＡＧと混合され、又は複合化され、かかるＧＡＧは少なくともコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、又はこれらの組み合わせからである。
【０１４５】
好ましくは、本願発明組成物又は方法において、ＧＡＧはコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、又はこれらの組み合わせから選ばれる。さらに好ましくは、本願発明組成物又は方法において、ＧＡＧはヘパリン、コンドロイチン硫酸（特にコンドロイチン硫酸Ａ又はＣ）、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂとして知られる）、又はこれらの組み合わせから選ばれる。ヘパラン硫酸及びヒアルロン酸により得られた結果が顕著とは言えない一方で、特に好ましい結果は上記のＧＡＧを用いることで得られる（実施例１を参照）。
【０１４６】
特に好ましい本発明の組成物は、ＨＢ１９（好ましくはＨＢ１９Ｌ又はＨＢ１９Ｄ）ヌカント１（好ましくはヌカント１Ｌ又はヌカントの１Ｄ）、ヌカント２（好ましくはヌカント２Ｌ又はヌカント２Ｄ）、ヌカント３（好ましくはヌカント３Ｌ又はヌカント３Ｄ）、ヌカント６（好ましくはヌカント６Ｌ又はヌカント６Ｄ、より好ましくはヌカント６Ｌ）ヌカント７（好ましくヌカント７Ｌ又はヌカント７Ｄ）、ヌカント８（好ましくヌカント８Ｌ又はヌカント８Ｄ）、及びヌカント９（好ましくヌカント９Ｌ又はヌカント９Ｄ）から選択された一つのヌカント化合物と、ヘパリン、コンドロイチン硫酸（特にコンドロイチン硫酸Ａ又はＣ）及び／又はデルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂとも呼ばれる）との組み合わせを含有する。本発明の特に好ましい組成物はＨＢ１９又はヌカント６Ｌ（Ｎ６Ｌ）と、ヘパリン、コンドロイチン硫酸（特にコンドロイチン硫酸Ａ又はＣ）及び／又はデルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂとも呼ばれる）との組み合わせを含有する。好ましい組成の例は以下を含む：
【０１４７】
−  ＨＢ１９及びヘパリン
−  ＨＢ１９及びコンドロイチン硫酸Ａ
−  ＨＢ１９及びデルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂとして知られる）
−  ＨＢ１９及びコンドロイチン硫酸Ｃ
−  Ｎ６Ｌ及びヘパリン
−  Ｎ６Ｌ及びコンドロイチン硫酸Ａ
−  Ｎ６Ｌ及びデルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂとして知られる）
−  Ｎ６Ｌ及びコンドロイチン硫酸Ｃ
【０１４８】
本発明の組成物において、ＧＡＧとの相乗効果によりその特性を高めるためヌカントの濃度は少なくとも１μＭであり、少なくとも２．５μＭであることが好ましい。
【０１４９】
いくつかの態様において、本発明の治療用組成物はヌカントとＧＡＧの組み合わせを含有し、ヌカントとＧＡＧのモル比は１：１０００から１０００：１であり、この範囲の全ての比を包含する。
【０１５０】
発明者らは特に、低いヌカント濃度において、組成物中のＧＡＧに対するヌカントの質量比の範囲はＧＡＧの相乗効果によりヌカントの特性を保証することに関係することを見出した。このため、好ましくは本発明の組成物において、ＧＡＧに対するヌカントの質量比は多くとも２４、好ましくは多くとも２０、好ましくは多くとも１５、好ましくは多くとも１４、好ましくは多くとも１３、好ましくは多くとも１２、好ましくは多くとも１１、好ましくは多くとも１１、好ましくは多くとも１０、好ましくは多くとも９、好ましくは多くとも８である。本発明の組成物において、ＧＡＧに対するヌカントの質量比は好ましくは少なくとも０．０１、好ましくは少なくとも０．０５、好ましくは少なくとも０．０８、好ましくは少なくとも０．１、好ましくは少なくとも０．２、好ましくは少なくとも０．３、好ましくは少なくとも０．４、好ましくは少なくとも０．５、好ましくは少なくとも０．６、好ましくは少なくとも０．７、好ましくは少なくとも０．８、好ましくは少なくとも０．９、好ましくは少なくとも１である。本発明の組成物の好ましい態様において、ＧＡＧに対するヌカントの質量比は０．０１から２４であり、０．０５から２０であり、０．１から１５であり、０．１から１０であり、０．１から８であり、０．２から８であり、０．３から８であり、０．４から８であり、０．５から８であり、０．６から８であり、０．７から８であり、０．８から８であり、０．９から８であり、１から８である。
【０１５１】
かかる組成においてヌカント濃度が最低限になるほど、より重要なことは、ＧＡＧに対するヌカントの質量比は上述の範囲に含まれることである。
【０１５２】
ヌカントＮ６Ｌについて、ＧＡＧに対するＮ６Ｌの質量比の好ましい範囲は組成物中のＮ６Ｌ濃度によって決定されている（実施例２を参照）：
−  ５μＭにおけるＮ６Ｌ（２０μｇ／ｍｌに対応）：Ｎ６Ｌ／ＧＡＧの質量比は０．２から２の間、
−  ２０μＭにおけるＮ６Ｌ（８０μｇ／ｍｌに対応）：Ｎ６Ｌ／ＧＡＧの質量比は０．８から８の間。
【０１５３】
ヌカント及びＧＡＧ微粒子からなる本発明の組成物中、かかるヌカント／ＧＡＧ微粒子は、好ましくは少なくとも直径５ｍｍより小さく；若しくは約１ｎｍから約１ｍｍであり；若しくは約１ｎｍから１０μｍであり；又は約１０ｎｍから約５００ｎｍである。
【０１５４】
ここに記載の任意の組成物において、本発明の治療用組成物は医薬として利用可能なキャリア、賦形剤、又は補助剤を含有する場合がある。
【０１５５】
また本発明は微粒子又は複数の微粒子を形成するのに十分な量のヌカント及びＧＡＧを混合してなるヌカント及びＧＡＧの微粒子からなる組成物の生産方法である。上記の範囲の質量比でヌカント及びＧＡＧを混合することが好ましい。
【０１５６】
他の観点から見ると、本発明はここで説明する組成物並びに細胞の有害な成長及び／又は増殖に関連する疾患又は障害の治療及び／又は予防する方法である
【０１５７】
このため、本願発明任意の組成物をガン細胞等の細胞の有害な成長及び／又は増殖に関連する疾患又は障害の治療及び／又は予防のために利用することができる。また本発明はここで説明するようにガン細胞等の細胞の有害な成長及び／又は増殖に関連する疾患又は障害を治療及び／又は予防のための薬物の生産のための本発明の組成物の利用に関連する。
【０１５８】
いくつかの態様では、かかる方法はここで説明するように有効量のヌカント及びＧＡＧからなる組成物の、生体内、生体外、試験管内の対象への投与からなり、組成物は有効にガン細胞の成長及び／又は増殖を抑制し、これを防ぐ。実際にヌカント化合物はＷＯ２００７／１２５２１０により知られており、細胞の増殖及び／又は血管新生の調節機能の低下により起こる疾患の治療に役立てることが出来る
【０１５９】
「細胞の増殖及び／又は血管新生の調節機能の低下により起こる疾患」の用語は、本発明において、細胞集団又は組織と同様に、一又は二以上の異常な細胞増殖、及び／又は異常な血管新生の現象が観察される、一又は二以上の個体に影響する任意のヒト又は動物の疾患を意味する。
【０１６０】
かかる疾患中に腺腫、肉腫、上皮腫、リンパ腫、及び特に、卵巣、乳房、膵臓、リンパ節、皮膚、血液、肺、脳、腎臓、肝臓、鼻咽頭腔、甲状腺、中枢神経系、前立腺、結腸、直腸、子宮頸部、睾丸又は膀胱の癌のような全ての種類の癌を含むことは明白である。また、それらに表皮又は皮膚の嚢胞、乾癬、血管腫のような癌ではない皮膚疾患、同様に加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障のような目の疾患を含む。多発性硬化症、パーキンソン及びアルツハイマー等の神経変性疾患、又はループス若しくはリウマチ性多発関節炎のような自己免疫性の疾患、同様にアテローム性動脈硬化に関連する疾患。
【０１６１】
このため、本願発明任意の組成物は細胞増殖及び／又は血管新生の調節機能の低下にかかる疾病の治療に用いることが出来る。また本発明は細胞増殖及び／又は血管新生の調節機能の低下にかかる疾病の治療のための薬物の製造のための本願発明組成物の使用に関する。
【０１６２】
特に、ヌカントをＧＡＧ微粒子に取り込むことで、図３−８及び９−１９に示すように、本発明の多価ヌカントの抗がん効果、具体的には、がん細胞に対する抗増殖効果が高まる。
【０１６３】
また、このため本発明は、個体内のがん細胞の成長及び／又は増殖に関連する疾病又は疾患の治療及び／又は予防のための本発明の組成物、及び方法である。
【０１６４】
このため、本発明の任意の組成物は、ここで説明する個体内のがん細胞の成長及び／又は増殖に関連する疾病又は疾患の治療及び／又は予防中に、特にがんの治療及び／又は予防のために使用するためのものであってもよい。また本発明は個体中のがん細胞の成長及び／又は増殖に関連する疾病又は疾患の治療及び／又は予防、、特にがんの治療及び／又は予防のために薬剤の調製のための本願発明組成物の使用に関連する。
【０１６５】
上記方法はここで説明する有効量のヌカント及びＧＡＧからなる組成物、又はここで説明するヌカント及びＧＡＧの微粒子からなる組成物を個体に投与することからなり、組成物はがん細胞の成長及び／又は増殖抑制又は阻害する効果を有する。
【０１６６】
背景術の欄に示したように、ヌカント化合物は表面ヌクレオリンのＲＧＧドメインに結合することが示されている。また、さらに表面ヌクレオリンは活性化された内皮細胞（Christian, S., Pilch, J., Akerman, M. E., Porkka, K., Laakkonen, P., and Ruoslahti, E. Nucleolin expressed at the cell surface is a marker of endothelial cells in angiogenic blood vessels. (2003) J. Cell Biol. 163, 871-878）、すなわち血管新生過程に関与する細胞の表面と同様に、肝がん由来の腫瘍細胞（Semenkovich, C. F., Ostlund, R. E. J., Olson, M. O., and Yang, J. W. A protein partially expressed on the surface of HepG2 cells that binds lipoproteins specifically is nucleolin. (1990) Biochemistry 29, 9708-9713）、Ｔリンパ球白血病（Callebaut, C, Jacotot, E., Krust, B., Guichar, G., Blanco, J., Svab, J., Muller, S., Briand, J. P., and Hovanessian, A. G. Compose TASP inhibitors of HIV entry bind specifically to a 95-kDa cell surface protein. (1997) J. Biol. Chem. 272, 7159-7166; and Callebaut, C, Blanco, J., Benkirane, N., Krust, B., Jacotot, E., Guichard, G., Seddiki, N., Svab, J., Dam, E., Muller, S., Briand, J. P., and Hovanessian, A. G. Identification of V3 loop-binding proteins as potential receptors implicated in the binding of HIV particles to CD4(+) cells. (1998) J. Biol. Chem. 273, 21988-2199）、子宮がん細胞（Callebaut, C, Jacotot, E., Krust, B., Guichar, G., Blanco, J., Svab, J., Muller, S., Briand, J. P., and Hovanessian, A. G. Compose TASP inhibitors of HIV entry bind specifically to a 95-kDa cell surface protein. (1997) J. Biol. Chem. 272, 7159-7166）等の腫瘍細胞の表面で発現することが示されている。ここで説明するヌカントのヌクレオリンへの結合は全身性の効果があるため、本発明のヌカント含有組成物は任意の知られているがんの治療に適すると考えられる。本発明の組成物及び方法が治療に適するがんの種類は、例えば
急性リンパ性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；副腎皮質癌；ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）関連がん；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；肝外胆管癌；膀胱癌；骨がん；骨肉腫及び悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫；脳腫瘍；胚芽腫；星状細胞腫；頭蓋咽頭腫；上衣芽腫；髄上皮腫；中分化度の松果体実質腫瘍；テント上原始神経外胚葉性腫瘍及び松果体芽腫；脳・脊髄腫瘍；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；大腸癌；大腸癌頭蓋咽頭腫；皮膚Ｔ細胞性リンパ腫；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；神経芽腫；ユーイング肉腫ファミリー腫瘍；頭蓋外胚細胞腫瘍；腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；眼癌；眼内悪性黒色腫；網膜芽細胞腫；胆嚢癌；胃がん；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；頭蓋外胚細胞腫瘍；腺外胚細胞腫瘍；卵巣胚細胞腫瘍；妊娠絨毛性腫瘍；神経膠腫；有毛細胞白血病；頭頸部癌；心臓がん；肝（肝臓）がん；ランゲルハンス細胞組織球増殖症；ホジキンリンパ腫；小児性ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内悪性黒色腫；膵島細胞腫瘍（膵内分泌部）；カポジ肉腫；腎臓（腎細胞）癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；小児性喉頭癌；口唇癌及び口腔癌；非小細胞肺癌；小細胞肺癌；非ホジキンリンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；骨悪性線維性組織球腫及び骨肉腫；髄芽腫；髄上皮腫；悪性黒色腫；メルケル細胞癌；中皮腫；転移性扁平上皮性頸部がん；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍；慢性骨髄増殖性疾患；鼻・副鼻腔がん；上咽頭癌；神経芽細胞腫；非小細胞肺癌；口腔癌；中咽頭癌；骨肉腫及び骨悪性線維性組織球腫；卵巣癌；卵巣胚細胞性腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔・鼻腔がん；副甲状腺癌；陰茎癌；咽頭癌；中分化度の松果体実質腫瘍；松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍；下垂体腫瘍形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；前立腺癌；直腸癌；腎細胞（腎臓）癌；腎盂・尿管移行上皮癌；第１５染色体変異による上気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；肉腫；ユーイング肉腫ファミリー腫瘍；カポジ肉腫；軟部組織肉腫；セザリー症候群皮膚癌（非黒色腫又は扁平上皮細胞）；皮膚がん（悪性黒色腫）；メルケル細胞皮膚がん；胃がん；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；皮膚Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫及びセザリー症候群を参照；精巣癌；咽喉癌；胸腺腫及び胸腺癌；甲状腺癌；腎盂及び尿管の移行上皮癌；尿道癌；子宮内膜癌；子宮肉腫；膣がん；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症及びウィルムス腫瘍を含むものとする。
【０１６７】
予想外かつ驚くべきことに、本明細書に記載のヌカントは、ＧＡＧと混合すると微粒子を形成することを発見した。したがって、その他の態様において本発明は有効量の、ヌカントとＧＡＧとの微粒子を含む治療用組成物を、対象又は個体に投与する過程を含んで成る、癌など疾病又は疾患の治療法を提供する。特定の実施形態においては、微粒子が投与前に形成されている。その他の実施の態様では、微粒子は対象や患者への投与後、例えば、生体内で形成される。
【０１６８】
がんの治療に使用する場合、本発明の組成物はさらに例えばゲムシタビンなどの細胞毒性を有する薬剤を含んでもよい。
【０１６９】
またさらに実施例３及び図２０−２１に示すように、ヌカント化合物の抗血管新生特性はヌカントをＧＡＧとともに微粒子とすることで増強することが出来る。また、本願発明組成物は血管新生の調節機能の低下による疾病の治療に使用することもできる。また本発明は血管新生の調節機能の低下による疾病の治療のための製剤のための本願発明の組成物の使用に関連する。
【０１７０】
ＷＯ２００７／１２５２１０に開示されるように、ヌカント化合物は抗炎症活性を有することが知られており；特に、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−８の産生を、ＬＰＳによって刺激される各種細胞によるＩＣＡＭ−１の発現と同様に阻害する。これらの化合物が興味深い理由は上記のとおりであるが：すなわち発明者らの観察結果によればこれらの化合物は試験管内においても生体内においても有毒な作用を持たず；これらの化合物は工業規模においても管理容易な状態で容易に合成でき；これらの化合物は特定の医薬の形態の開発をする必要が無い程度に、これら自身の生体内での生体適合性が十分にある。
【０１７１】
さらにヌカント化合物の抗炎症効果は、増殖中の炎症細胞の表面ヌクレオリンの発現により、それらが炎症細胞に対し抗増殖作用を奏することに、少なくとも部分的に関連する。またヌカント化合物の抗炎症効果は、表面ヌクレオリンの発現する細胞に対するそれらの抗増殖作用にも関連する。ＧＡＧと混合することの相乗作用によりかかる効果ががん細胞に対し高まり、またＧＡＧと混合することで増殖中の炎症細胞に対しても相乗効果を奏する。
【０１７２】
また本発明は本願発明の組成物を炎症性疾患の治療に利用することにも関連する。また本発明は炎症性疾患の治療のための製剤のための本願発明の組成物の使用に関連する。
【０１７３】
「炎症性疾患」の用語は炎症反応が生体に対する病理学的な意義を持つ、任意の疾病を表す。特に本発明において炎症性疾患は自己免疫疾患（狼瘡やリウマチ性多発関節炎など）、敗血症、敗血症性ショック、炎症性の心疾患（心炎、及び特に心内膜炎、心膜炎、心筋炎、特に黄色ブドウ球菌を原因とするもの等の感染性の原因によるもの）、移植拒絶反応、外傷、関節の炎症性疾患（特に、関節炎のさまざまな形態）、消化器系の炎症性疾患（特に、大腸炎、腸炎、胃炎、胃腸炎、及びクローン病及び出血性直腸結腸炎（ＨＲＣ）などの腸管の慢性炎症性疾患）、皮膚の炎症性疾患（湿疹、、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、皮膚症）、呼吸器系の炎症性疾患、特に慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、並びにアレルギーを含むものとする。
【０１７４】
炎症性疾患としては自己免疫疾患、特に狼瘡又はリウマチ性多発関節炎に対して有効である。また炎症性疾患としては敗血症性ショックに対して有効である。また炎症性疾患としては敗血症性ショックに対して有効である。さらに炎症性疾患としては心内膜炎、特に特に黄色ブドウ球菌を原因とするもの等の感染性の原因による心内膜炎に有効である。
【０１７５】
ＷＯ２００９／１４１６８７に開示されるように、ヌカント化合物は創傷治癒の促進に役立つことが知られている。また、このため本発明は、本願発明の任意の組成物を創傷治癒の促進のために使用することに関連する。また本発明は創傷治癒の促進のための薬剤の調製のための本願発明の組成物の使用に関連する。
【０１７６】
本発明のいかなる態様においても、本発明の治療用組成物は医薬として利用可能な任意の形態及び医薬として利用可能な任意の経路で、糖尿病等の筋の障害又は症状の治療のために、例えば、一日一回分の用量で、又は統合された剤形で経口投与することができる。かかる医薬として利用可能なキャリア及び賦形剤並びに投与方法は、当業者であれば、すぐに理解できるものであり、ここ全て引用することで援用するUSP-NF 2008（United States Pharmacopeia/National Formulary）に記載された組成物及び方法を含んでいる。このため、本発明はここに説明する化合物の医薬として利用可能な製剤である。これらの製剤は、例えば塩酸、臭化水素酸、酢酸、ベンゼンスルホン酸の酸添加塩等の上記化合物の塩を含んでいる。
【０１７７】
活性のある化合物は一般的に、例えば静脈内、関節内、髄腔内、筋肉内、皮下、病変内、腹腔内の各経路で注射、内服以外の投与用に製剤される。当業者であれば、ここに開示する内容から、癌マーカーの抗体、接合体、阻害剤、又は、活性のある成分としてのその他の薬剤を含む水溶液の組成物のような製剤を考えることができると考える。かかる組成物は；液体の溶液又は懸濁液の注射剤として製剤することができるし；注射前に液体を添加し溶液又は懸濁液として調剤するのに適した固体として調剤することもできるし；乳化して調剤することもできるのが典型的である。
【０１７８】
薬理学的な組成物又は製剤は全身投与等の細胞又は投与対象、好ましくは患者への投与方法に適した形態の組成物又は製剤に適する。「全身投与」によるとは生体内での全身の吸収又は血流中の薬剤の集積、及び全身中での分配を意味する。例えば経口、経皮、又は注射等の導入経路の利用によって適した形態が決まる場合がある。かかる形態は、組成物又は製剤が標的細胞（送達するために負に荷電した重合体が望ましい細胞等）に到達することの妨げないものとする。例えば、血流中に注射する薬理学的組成物は可溶でなければならない。組成物又は製剤がその作用を発揮することを妨げる毒性及び形態を考慮することを含む、他の要素は当該分野において知られている。
【０１７９】
本発明の治療にかかる投与のための製剤は、無菌の、水性又は非水性の溶液、懸濁液、及び乳剤を含む。非水溶媒は例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルなどがある。水性のキャリアは、生理食塩水及び緩衝溶媒を含む、水、アルコール／水の溶液、乳剤又は懸濁液がある。溶媒は食塩、リンゲル液のブドウ糖、ブドウ糖及び食塩、液及び補充用栄養素、補充用電解質、その他を含む、乳酸リンゲル液の静脈内の溶媒を含む。例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤及び不活性ガスその他のような保存料及び他の添加剤を添加することが出来る。
【０１８０】
意図する投与経路に適合する本発明の医薬組成物を製剤する。投与経路としては、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（吸入等）、経皮（すなわち局所）、経粘膜、及び腹腔内投与、並びに直腸への投与がある。内服用以外、皮内、又は皮下に適用可能な溶液又は懸濁液は以下のような成分を含有するものであってもよい：注射用の水のような滅菌した希釈剤、食塩、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールや他の合成溶剤；ベンジルアルコールやメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸ナトリウムや亜硫酸水素塩などの抗酸化物質；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸、クエン酸、若しくはリン酸などの緩衝液、及び塩化ナトリウムやブドウ糖などの浸透圧調整剤。内服用以外の製剤はガラス又は樹脂性のアンプル、使い捨ての注射筒、又は複数回の用量分のビンに封入してもよい。
【０１８１】
全身での吸収のための投与経路は限定されず：静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内及び筋肉内がある。循環系への薬剤の移行率は分子量及び分子の大きさの関数として示されている。本発明の組成物を含有するリポソームやその他薬剤キャリアの使用により、例えば内皮毛細血管系（ＲＥＳ）の組織などの特定の種類の組織に薬剤を移行できる。リンパ球及びマクロファージといった細胞の表面への薬剤の取り込みを容易にすることができるリポソーム製剤も利用価値が高い。
【０１８２】
医薬として利用できる製剤によって、とは、所望の活性を発揮するのに最も適した体内での位置に本発明の核酸分子を効果的に分配可能な組成物又は製剤を意味する。
本発明の核酸製剤に適した剤は限定されないが、例えば：ＰＥＧに接合した核酸、リン脂質に結合した核酸、脂溶性成分、ホスホロチオエート、例えば中枢神経系のような様々な組織への薬剤の移行を促進するＰ−糖タンパク質阻害剤（プルロニックＰ８５など）（Jolliet-Riant and Tillement、1999、Fundam。Clin。Pharmacol.、13、16-26）；注入後の持続的な放出、送達のための、生分解性の重合体、poly（DL-lactide-coglycolide）からなる、Alkermes社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州の微粒子（Emerich、DF et al、1999、Cell Transplant、8、47-58）などの生分解性ポリマー；例えば血液脳関門を超えて薬剤を送達することができ、かつ神経細胞の吸収機構を変更することができる、polybutylcyanoacrylateからなる充填されたナノ粒子（Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry、23、941-949、1999）。他の送達の戦略として、Boado et al., 1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler et al, 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA., 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15, 73-107; Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; and Tyler et al., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058.に記載される材料を含有する核酸分子のＣＮＳ送達があるがこれに限定されない。これら全ての引用は、ここでの引用によって援用する。
【０１８３】
本発明はポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ修飾、又は長期間循環するリポソーム若しくはステルスリポソーム）を含み、表面が修飾されたリポソームからなる組成物を利用することを特徴とする。本発明の核酸分子はまた、共有結合によって付加された様々な分子量のＰＥＧ分子からなるものでもよい。これらの製剤によって、標的組織への薬剤の集中を高める方法をとることができる。かかる薬剤キャリアに分類されるものは単核の食細胞系（ＭＰＳ又はＲＥＳ）による最適化及び除去に抵抗性があるので血流中でより長い時間留まり、封入された薬剤に組織を暴露することを可能にする（Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011）。肝臓及び膵臓のような代謝に積極的なＭＰＳ組織に集中することを避けるそれらの力に基づき、長期間循環するリポソームはまた、陽性のリポソームに比べてより薬剤を核酸分解から保護する。これら全ての引用は、ここでの引用によって援用する。
【０１８４】
本発明の化合物、それらの誘導体、断片、類縁体、及び近縁体は、投与に適した医薬組成物に援用可能である。かかる組成物は核酸分子、タンパク質、又は抗体及び医薬として利用可能なキャリアからなることが典型的である。ここで用いられるように、「医薬として利用可能なキャリア」は、あらゆる溶剤、分散媒、被膜、抗菌又は抗真菌剤、等張又は吸収遅延剤など、医薬品投与と適合するものを意図している。適切なキャリアは、参照によって援用する、当該分野での標準テキストである最新版のレミントンの薬物科学に説明されている。このようなキャリア又は希釈剤の好ましい例は特に限定されないが、水、生理食塩水、finger's solution、ブドウ糖溶液、及び５％ヒト血清アルブミンがある。リポソーム及び非揮発油のような非水系溶媒などを使用することもできる。かかる媒質や薬剤を医薬として活性のある物質のために使用することは当該技術分野でよく知られている。従来の媒質や剤が活性のある化合物と適合しない範囲を除き、熟慮の上それらを組成物中で使用することができる。補助的な活性を有する化合物も、組成物に含めることが出来る。
【０１８５】
今回の発明はまた、医薬として利用可能なキャリア又は希釈剤中の、薬学的に有効量の所望の化合物の貯蔵又は投与のために調製される組成物である。治療に利用可能なキャリア又は希釈剤は製薬分野でよく知られており、例えばここで引用とすることで援用するRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。例えば防腐剤、安定剤、染料や香料を提供することが出来る。これらには、ナトリウム安息香酸、ソルビン酸及びパラオキシ安息香酸エステルが含まれる。また、抗酸化物質及びと懸濁剤を使用できる。
【０１８６】
そのような化合物の毒性と薬効は、細胞培養又は実験動物を用いた標準的な薬学的手法、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致命的な投与量）と、ＥＤ５０（集団の５０％に治療効果のある投与量）の測定などによって判定できる。かかる毒性についての用量と治療効果についての用量の比はいわゆる治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表現することができる。治療係数の大きい化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を使用する場合もあり、患部ではない細胞への損傷を最小限に抑え、副作用を減らすために、患部組織の部位を標的としてそのような化合物を送る系を構築すべきことに注意を払う必要がある。細胞培養による検定及び動物による調査から得られたデータは、ヒトで使用するための投与量の範囲の算定に使用できる。このような化合物の投与量は、ＥＤ５０を含み、かつほとんど、あるいは全く毒性を有さない循環濃度の範囲内であることが好ましい。採用する投与量と利用される投与方法内によって決められる、上記範囲内で変化する場合がある。本発明の方法で使用される任意の化合物の治療に有効な投与量は細胞培養による検定から最初に見積もることができる。細胞培養で特定するのと同様に、ＩＣ５０（すなわち、症状抑制の最大半量に達する被検化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために臨床学的な有効量は、動物のモデルで算定する場合がある。このような情報は正確にヒトに有用な用量を決定するために使用できる。例えば、血漿中の水準を高速液体クロマトグラフィーにより測定する場合がある。
【０１８７】
製剤は、通常の非毒性の医薬として利用可能なキャリア、補助剤、溶媒を含む、用量単位の製剤として、経口により、局所的に、内服以外により、吸入若しくは噴霧により、又は直腸より、投与することができる。ここで用いる内服以外の、の用語は、経皮、皮下、血管内（静脈内等）、筋肉内、髄腔内の注射又は注入技術等を含む。さらに本発明の核酸分子及び医薬として利用可能なキャリアからなる医薬製剤示す。本発明の一又は二以上の核酸分子は、一又は二以上の非毒性の医薬として利用可能なキャリア及び／若しくは希釈剤、並びに／又は補助剤、場合によっては所望の他の活性成分と共に提供されるものであってもよい。本発明の医薬組成物は、例えば、錠剤、穴の開いたトローチ剤、ドロップ状のトローチ剤、水性又は油性の懸濁剤、分散性の粉末剤又は顆粒剤、乳剤、硬質又は軟質のカプセル剤、シロップ剤又はエリキシル剤といった経口での利用に適した形態とすることができる。
【０１８８】
特に経口使用する組成物は、医薬組成物の製造分野において知られる任意の方法によってによって製剤することができ、かかる組成物を医薬として洗練され、呈味のよい製剤とするために甘味料、香料、着色料、保存料を添加してもよい。経口投与のために、かかる医薬組成物を例えば、医薬として利用可能な結合剤（予めゼラチン化されたトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；賦形剤（乳糖、結晶セルロース、又はリン酸水素カルシウム等）；潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ等）；崩壊剤（ジャガイモ澱粉、又はデンプングリコール酸ナトリウム等）；湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）とともに通常の方法で製剤される錠剤又はカプセル剤の形態とすることができる。錠剤は当該分野でよく知られる方法で被膜してもよい。経口投与用の液剤は例えば溶液、シロップ、又は懸濁液の形態としてもよく、またそれらは使用前に水又は他の適当な溶媒と組み合わせることのできる乾燥品であってもよい。かかる液剤は、懸濁剤（ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、水素添加食用油脂等）；乳化剤（レシチンやアカシア等）；非水溶媒（アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、分画した植物油等）；及び保存料（メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸やソルビン酸等）のように医薬として利用可能な添加剤とともに通常の方法で調製することが出来る。かかる製剤はまた、所望の緩衝塩、香料、着色料、及び甘味料を添加してもよい。経口投与のための製剤は所望のとおり活性のある化合物を放出するよう調整して組成を決めてもよい。頬での投与（バッカル錠）のため、組成物は通常の方法で組成が決められた錠剤又はドロップ状のトローチ剤の形態であってもよい。
【０１８９】
賦形剤は例えば、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムやリン酸ナトリウム等の不活性な希釈成分；顆粒化剤及び崩壊剤は例えばトウモロコシ澱粉又はアルギニン酸；結合剤は例えば澱粉、ゼラチン、アカシア等；潤滑剤はステアリン酸マグネシウムやタルク等とすることができる。かかる被膜は消化管での崩壊及び吸収を遅らせ、長時間にわたる持続的な作用を奏するために、知られている技術によって調製することができる場合がある。例えば、モノステアリン酸グリセリン、又はジステアリン酸グリセリンを、時間を遅らせる材料として用いることが出来る。経口で使用する製剤は例えば、活性成分を例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムやカオリン等の不活性な固体の希釈成分混合した硬質のゼラチンカプセル、又は活性成分を水又は例えば落花生油、液体パラフィン、又はオリーブ油等の油性の媒質と混合し、軟質のゼラチンカプセルとすることができる。
【０１９０】
水性懸濁液は水性懸濁液の製造に適した賦形剤に混合した活性のある材料を含む。かかる賦形剤は例えばカルボキシルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギニン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム、アカシアガムといった懸濁剤であり；分散剤又は湿潤剤は例えばレシチンのような天然由来のリン脂質、若しくは例えばステアリン酸ポリオキシエチレンのような、脂肪酸とアルキレンオキシドの縮合化合物、若しくは例えばヘプタデカエチレノキシエタノール（heptadecaethyleneoxycetanol）のようなヘプタ長鎖脂肪族アルコールとエチレンオキシドの縮合化合物、又は例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン酸のようなエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合化合物であってもよい。水性懸濁液はまた、例えばエチル、又はｎ−プロピルのｐ−ヒドロキシ安息香酸のような一又は二以上の保存料、一又は二以上の着色料、一又は二以上の香料、及びスクロース又はサッカリンのような一又は二以上の甘味料を含んでいてもよい。
【０１９１】
油性懸濁液は、活性のある材料を落花生油、オリーブ油、胡麻油、ココナッツ油をはじめとする植物油に、又は流動パラフィンをはじめとする鉱物油に懸濁することで生成することができる。油性懸濁液は、みつろう、固形パラフィン、セチルアルコールをはじめとする、濃厚さを増す剤を含ませることが出来る。口腔用の製剤の呈味をよくするため甘味料及び香料を加えてもよい。これらの組成物はアスコルビン酸をはじめとする酸化防止剤を加えることで保存することができる。
【０１９２】
水に加えることで水性懸濁液を調合するのに適し、分散させることのできる散剤及び顆粒剤によって、分散剤若しくは湿潤剤、懸濁剤及び一又は二以上の保存料とともに混合された活性成分を生成することができる。適切な分散剤若しくは湿潤剤又は懸濁剤は上述のとおりである。甘味料、香料及び着色料をはじめとする他の賦形剤を加えてもよい。本発明の医薬組成物の剤形は水中油滴型乳剤であってもよい。油層は植物油若しくは鉱物油又はこれらの混合物でもよい。乳化剤はアカシアガムやトラガントガムをはじめとする天然由来のガム、大豆、レシチン、及び脂肪酸及びヘキシトールに由来するエステル又は部分エステル、並びにモノオレイン酸ソルビタンをはじめとする無水物、並びにポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタンをはじめとする上記部分エステルのエチレンオキシドとの縮合物が適当である。乳剤に甘味料及び香料を添加してもよい。
【０１９３】
シロップ剤及びエリキシル剤はグリセリン、プロピレング リコール、ソルビトール、ブドウ糖、ショ糖をはじめとする甘味料とともに調合することができる。かかる製剤に粘滑剤、保存料、香料、及び着色料を加えてもよい。医薬組成物の剤形は滅菌された、注射用の水性又は油性の懸濁液とすることができる。かかる懸濁液は上述の所定の分散剤又は潤滑剤及び懸濁剤を用いるよく知られた技術によって調合することができる。滅菌された注射剤はまた滅菌された注射剤、又は１，３−ブタンジオール溶液をといった非毒性の内服以外で利用できる希釈液又は溶媒に懸濁した液としてもよい。許容可能な溶媒又は溶解剤の中で利用可能なのは水、リンゲル液、及び等張食塩水である。さらに、滅菌された不揮発油を溶剤又は懸濁剤として通常通り利用できる。かかる目的のため、合成されたモノ又はジグリセリドを含む任意の無菌の非揮発油を利用することができる。さらに、オレイン酸をはじめとする脂肪酸を注射製剤に用いることができる。
【０１９４】
吸入投与のため、本発明に沿って使用するにあたり、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、炭酸ガス、その他の適当なガス等の所定の噴霧剤を利用して加圧した充填容器又はネブライザーから提供されるエアロゾルスプレー剤の剤形で配合し送達するのが好都合である。加圧したエアロゾル場合、一定量を送達するための弁によって用量単位を定めてもよい。吸入器又は注入器に使用するためのゼラチン等のカプセル及び薬包は化合物の粉末混合物及び乳糖、澱粉をはじめとする所定の粉末基剤を含有するように調合することができる。急速投与又は持続点滴等の注入による、内服以外の投与のために上記配合をし、調製してもよい。
【０１９５】
また、例えばココアバターや他のグリセリンをはじめとする通常の坐薬基材を含む坐薬又は保持する浣腸等の直腸用の組成物として調合してもよい。さらに上記の化合物の調合にあたり、デポ剤として調製してもよい。かかる長期間作用する製剤は埋め込み（皮下や筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与する場合がある。このため、例えば化合物は所定の重合体や疎水性の材料（利用可能な乳剤等）若しくはイオン交換樹脂とともに、又は適度な可溶性のある塩等の適度な可溶性のある誘導体として調合してもよい。
【０１９６】
注射用に適した医薬組成物は、滅菌された注射用の溶液又は分散液を速やかに調製するため、滅菌水溶液（水溶性の）又は分散液及び滅菌された粉末を備える。注射用製剤は保存料を添加した用量単位の剤形、アンプル又は複数回の用量分の容器等で提供することができる。上記組成物は懸濁液、溶液、油性又は水性の溶媒による乳剤といった剤形をとることができ、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤等の調合すべき剤を含む場合がある。あるいは、活性成分は使用前に、滅菌された、パイロジェンを含有しない水等の所定の溶媒を含む組成とするための散剤であってもよい。静脈内注射のため、所定のキャリアは生理食塩水、静菌的な水、Cremophor（BASF, Parsippany, N.J.）、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。あらゆる場合において、組成物は滅菌されていなければならず、かつ管内を容易に流動できる程度の液体でなければならない。製造及び保管の状態において安定でなければならず、かつバクテリア、真菌等の微生物が混入しないように保存しなければならない。キャリアは例えば水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、その他等）、及びそれらの所定の混合物を含有する、媒質としての溶液又は分散液でもよい。例えばレシチン等の被膜の使用により、分散させる場合には所定の粒子径の維持により、及び界面活性剤の使用により、適当な流動性を有する場合がある。パラベン、塩化ブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の様々な抗菌・抗真菌剤によって微生物の活動を阻害できる。例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、食塩といった等張性を与える剤を含ませた方がよい場合が多い。吸収に要する時間を延ばすため注射する組成物に、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン等の吸収を遅らせる剤を組成中にを含ませることができる。
【０１９７】
一形態において、活性のある化合物を埋め込みやをマイクロカプセルによる送達系を含む、放出を制御するための調合のように、体内からの急速な排出から、かかる化合物を保護するキャリアとともに調製する。エチレン−酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸等の生分解性、生体適合性の重合体を用いることができる。かかる製剤を調合する方法は当業者にとってすでに明らかにされていると考える。かかる材料はAlza社及びNova Pharmaceuticals社から入手できる。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染細胞を標的とするリポソームを含む）を医薬として許容可能なキャリアとして使用することができる。例えば米国特許４，５２２，８１１号に記載の当業者に知られる方法により、これらを調製できる。
【０１９８】
経口又は非経口の組成物を用量単位の剤形で調合することは、投与を容易にし、容量をより均一にする上で特に好ましい。ここで用いられるような容量単位の剤形は、治療対象に均一な用量で処方するのに適する、物理的に分離した単位のものであり；各単位は所定の医薬用キャリアとともに、所望の治療効果を奏するように算出し、あらかじめ決められた量の活性化合物を含有する。本発明の用量単位の剤形の特性は活性物質特有の性質及び達成すべき個々の治療効果並びに個々に対する治療のための活性物質の配合にかかる固有の技術的限界によって規定され、直接依拠する。
【０１９９】
持続的な放出をする製剤を調合することができる。持続的な放出をする製剤の適した例は、薄膜、マイクロカプセル等に造形されており、抗体を有する固体の疎水性重合体の半透性マトリックスである。持続的に放出するマトリックスは例えばポリエステル、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル）やポリ（ビニルアルコール）のヒドロゲル、ポリ乳酸（米国特許３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体、LUPRON DEPOT（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸リュープロリドからなる注射可能な微粒子）のような分解性の乳酸−グリコール酸共重合体、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を備える。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸のような重合体であれば分子を１００日以上にわたり放出させることが可能な一方で、タンパク質をより短い時間の間に放出するヒドロゲルもある。
【０２００】
人間以外の動物に投与するために本発明の治療用組成物に動物用飼料又は飲用水を加えてもよい。摂食に伴って動物が摂取する治療に適した量の組成物を摂取するために動物用飼料及び飲用水の組成物を調合することが好ましい。また、飼料又は飲用水に添加するために予め混合用に作られた組成物とすることも好ましい。またかかる組成物を全体の治療効果を向上させるため他の治療用化合物とともに対象に投与することができる。適応症を治療するための複数の化合物の使用により、副作用が減る一方で、よい作用を向上する。
【０２０１】
本発明のいくつかの利点を図面及び以下の実施例中で詳細に説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。付加、利点及び改変は当業者であれば容易に理解できると考えられ、また当該分野において常用される技術の応用を含んでおり、それ自体、明確に本発明の範囲内にあると考えられる。
【実施例】
【０２０２】
本発明の代表的な形態は、以下に述べる実施例に限定されない；むしろ、本発明の代表的な形態は本願に表された任意かつあらゆる応用、及び当業者がなし得るあらゆる変更を含むものである。
【０２０３】
実施例１．各種ＧＡＧをヌカント６Ｌとともに同時処理したときの、ヌカント６Ｌの抗増殖特性に与える相乗効果について。
【０２０４】
ヒト膵癌細胞（ＰＡＮＣ−１、ヒト膵癌）の成長に対する効果
【０２０５】
がん細胞に対するヒト膵癌細胞（ＰＡＮＣ−１、ヒト膵癌）に対するＮ６Ｌ＋様々なＧＡＧによる同時処理（図３参照）。図３ＡにおいてヘパリンをＧＡＧの代表例として使用した。図３Ｂ及びＣにおいて、コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸ＣをＮ６Ｌと組み合わせて使用した。Ｎ６Ｌ／ＧＡＧの混合液（約２０μΜのＮ６Ｌに対して０μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌのＧＡＧ）で毎日細胞を処理した。培地（ＤＭＥＭ  ５％  ＳＶＦ）を毎日交換した。ＭＴＴ試験により増殖を評価した。ＧＡＧ単独で増殖に及ぼす作用は認められなかった。図５においてＰＡＮＣ−１をいずれも処理しなかった（Ａ）又は２０μΜのＮ６Ｌ（Ｂ）、２０μΜのＮ６Ｌと１０μｇ／ｍｌのヘパリンとの混合液（Ｃ）、若しくは２０μΜのＮ６Ｌと１００μｇ／ｍｌのヘパリンとの混合液で処理した。
【０２０６】
図９において、ＰＡＮＣ−１細胞を処理しなかった（対照実験）、又は２０μΜのＮ６Ｌのみ、若しくは２０μΜのＮ６Ｌと０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、若しくは１０００μｇ／ｍｌのヘパリンとの混合液で処理した。対照群（無処理細胞）と比較したところ、３日間及び４日間の処理後、Ｎ６Ｌは付着依存性のＰＡＮＣ−１細胞の増殖を有意に５０％〜６０％の範囲で阻害した。予めＮ６Ｌを１０μｇ／ｍｌから１０００μｇ／ｍｌの範囲の各濃度のヘパリンとともに恒温放置しておくことで、この阻害作用が増強されたことは興味深い。観察したところ濃度１０μｇ／ｍｌのヘパリンで効果が最大であり、特に４日間の処理後に阻害は８６％に達した。当該試験で使用されたいかなる濃度のヘパリンにおいても、ヘパリン単独での細胞培養時には効果が見られなかった。
【０２０７】
図１０において、ＰＡＮＣ−１細胞を処理しなかった（対照実験）、又は２０μΜのＮ６Ｌのみ、若しくは２０μΜのＮ６Ｌと０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、若しくは１０００μｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃｓ−Ｃ）との混合液で処理した。対照群（無処理細胞）と比較したところ、３日間及び４日間の処理後、Ｎ６Ｌは付着依存性のＰＡＮＣ−１細胞の増殖を有意に５０％〜６０％の範囲で阻害した。予めＮ６Ｌを１０μｇ／ｍｌから１０００μｇ／ｍｌの範囲の各濃度のＣｓ−Ｃとともに恒温放置しておくことで、この阻害作用が増強されたことは興味深い。観察したところ濃度１０μｇ／ｍｌのＣｓ−Ｃで効果が最大であり、特に４日間の処理後に阻害は９０％に達した。当該試験で使用されたいかなる濃度のＣｓ−Ｃにおいても、Ｃｓ−Ｃ単独での細胞培養時には効果が見られなかった。
【０２０８】
ヒト膠芽腫に対する効果（Ｕ８７−ＭＧ、ヒト膠芽腫−星状細胞腫）
【０２０９】
Ｕ８７−ＭＧ（ヒト膠芽腫−星状細胞腫）細胞の増殖に対するＮ６Ｌ＋各種ＧＡＧの同時処理の効果（図４参照）。図４ＡにおいてヘパリンをＧＡＧの代表例として使用した。図４Ｂ及びＣにおいて、コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸ＣをＮ６Ｌと組み合わせて使用した。Ｎ６Ｌ／ＧＡＧの混合液（約２０μΜのＮ６Ｌに対して０μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌのＧＡＧ）で毎日細胞を処理した。培地（ＤＭＥＭ  ５％  ＳＶＦ）を毎日交換した。ＭＴＴ試験により増殖を評価した。ＧＡＧが増殖に及ぼす作用は認められなかった。図６においてＵ８７−ＭＧをいずれも処理しなかった（Ａ）又は２０μΜのＮ６Ｌ（Ｂ）、２０μΜのＮ６Ｌと１０μｇ／ｍｌのヘパリンとの混合液（Ｃ）、若しくは２０μΜのＮ６Ｌと１００μｇ／ｍｌのヘパリンとの混合液で処理した。
【０２１０】
図１１において、Ｕ８７−ＭＧ細胞を処理しなかった（対照実験）、又は２０μΜのＮ６Ｌのみ、若しくは２０μΜのＮ６Ｌと０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、若しくは１０００μｇ／ｍｌのヘパリンとの混合液で処理した。対照群（無処理細胞）と比較したところ、３日間及び４日間の処理後、Ｎ６Ｌは付着依存性のＵ８７−ＭＧ細胞の増殖を有意に５０％〜６０％の範囲で阻害した。予めＮ６Ｌを１０μｇ／ｍｌから１０００μｇ／ｍｌの範囲の各濃度のヘパリンとともに恒温放置しておくことで、この阻害作用が増強されたことは興味深い。観察したところ濃度１０μｇ／ｍｌのヘパリンで効果が最大であり、特に４日間の処理後に阻害は８９％に達した。当該試験で使用されたいかなる濃度のヘパリンにおいても、ヘパリン単独での細胞培養時には効果が見られなかった。
【０２１１】
図１２において、Ｕ８７−ＭＧ細胞を処理しなかった（対照実験）、又は２０μΜのＮ６Ｌのみ、若しくは２０μΜのＮ６Ｌと０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、若しくは１０００μｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃｓ−Ｃ）との混合液で処理した。対照群（無処理細胞）と比較したところ、３日間及び４日間の処理後、Ｎ６Ｌは付着依存性のＵ８７−ＭＧ細胞の増殖を有意に５５％〜７０％の範囲で阻害した。予めＮ６Ｌを１０μｇ／ｍｌから１０００μｇ／ｍｌの範囲の各濃度のＣｓ−Ｃとともに恒温放置しておくことで、この阻害作用が増強されたことは興味深い。観察したところ濃度１０μｇ／ｍｌのＣｓ−Ｃで効果が最大であり、特に４日間の処理後に阻害は９０％に達した。当該試験で使用されたいかなる濃度のＣｓ−Ｃにおいても、Ｃｓ−Ｃ単独での細胞培養時には効果が見られなかった。
【０２１２】
予め各種グリコサミノグリカンとともに恒温放置されたＮ６Ｌで全日処理した場合の膵癌細胞ＰＡＮＣ１の付着依存性の増殖に対する効果
【０２１３】
がん細胞の付着依存性の増殖に対するＮ６Ｌの作用を調節する、各種グリコサミノグリカンの効果を比較するため、ヒト膵癌細胞系統（ＰＡＮＣ−１）をＮ６Ｌとこれらのグリコサミノグリカンとともに培養し、ＭＴＴ試験により細胞増殖を定量した（図１３参照）。０から５０μΜの範囲の各種濃度のＮ６Ｌを使用し、予め１０μｇ／ｍｌの各ヘパリン、Ｃｓ−Ａ、Ｃｓ−Ｂ、Ｃｓ−Ｃ、ヘパラン硫酸又はヒアルロン酸と恒温放置した。細胞の処理は毎日、４日間行った。第４日の終わりにＭＴＴ試験を用いて細胞数を定量した。
【０２１４】
単独で使用したＮ６Ｌは、用量依存的にＰＡＮＣ−１細胞の付着依存性の増殖を阻害し、阻害濃度の最大半量（ＩＣ５０）は１５μＭであった。図５に示すように予めＮ６Ｌをヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ（Ｃｓ−Ａ）、コンドロイチン硫酸Ｂ（Ｃｓ−Ｂ）、コンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃｓ−Ｃ）を含む硫酸化されたＧＡＧ分子と恒温放置することで、Ｎ６Ｌを単独で使用した時の効果を増強し、５μΜの濃度で最大の効果を示し、ＩＣ５０＝２．５μＭとなった。これに対し、予めＮ６Ｌをヘパラン硫酸や中性のヒアルロン酸と恒温放置した場合、ＰＡＮＣ−１の付着依存性の増殖をＮ６Ｌと同程度に抑制した。
【０２１５】
Ｎ６Ｌ単独、又はＮ６Ｌを予めヘパリン又はＣｓ−Ｃと恒温放置したＮ６Ｌの、ＰＡＮＣ１膵癌細胞系統に対する阻害効果の速度論。
【０２１６】
ＰＡＮＣ１細胞を２０μＭのＮ６Ｌ（対照細胞）で、又は１０μｇ／ｍｌのヘパリン若しくはＣｓ―Ｃのいずれかとともに予め恒温放置したＮ６Ｌでで処理した。細胞は１）その後の３日間は増殖させ、最初の日、若しくは２）その後の２日間は増殖させ、最初と二番目の日、若しくは３）その後の１日間は増殖させ、初めの３日間、ｄ．４日間、のいずれかで処理した。第４日の終わりにＭＴＴ試験を用いて細胞数を定量した。
【０２１７】
図１４に示すようにＮ６Ｌは１日の処理後では抑制効果を発揮せず、またその最大の効果に相当する、対照群に対しての５０％阻害は４日後に観察された。観察したところでは、興味深いことに予めヘパリン又はＣｓ−Ｃを含むＧＡＧで恒温放置したＮ６Ｌで処理した細胞において時間依存的に、細胞増殖を阻害した。今回の場合、細胞増殖の阻害は１日の処理後で５０％阻害相当であり、４日間の処理後で８０%以上であった。
【０２１８】
Ｎ６Ｌ単独、又はＮ６Ｌを予めヘパリン又はＣｓ−Ｃと恒温放置したＮ６Ｌの、Ｕ８７−ＭＧ脂肪芽細胞腫がん細胞系統に対する阻害効果の速度論。
【０２１９】
Ｕ８７−ＭＧ細胞を２０μＭのＮ６Ｌ（対照細胞）で、又は１０μｇ／ｍｌのヘパリン若しくはＣｓ―Ｃのいずれかとともに予め恒温放置したＮ６Ｌでで処理した。細胞は１）その後の３日間は増殖させ、最初の日、若しくは２）その後の２日間は増殖させ、最初と二番目の日、若しくは３）その後の１日間は増殖させ、初めの３日間、ｄ．４日間、のいずれかで処理した。第４日の終わりにＭＴＴ試験を用いて細胞数を定量した。
【０２２０】
図１５に示すようにＮ６Ｌは１日の処理後では抑制効果を発揮せず、またその最大の効果に相当する、対照群に対しての５０％阻害は４日後に観察された。観察したところでは、興味深いことに予めヘパリン又はＣｓ−Ｃを含むＧＡＧで恒温放置したＮ６Ｌで処理した細胞において時間依存的に、細胞増殖を阻害した。今回の場合、細胞増殖の阻害は１日の処理後で８０％阻害相当であり、４日間の処理後で９０%以上であった。
【０２２１】
Ｎ６ＬをＧＡＧと混合することで微粒子を形成する。
【０２２２】
細胞をＮ６Ｌ／ＧＡＧ（２０μＭ／１０μｇ／ｍｌ及び／又は１００μｇ／ｍｌ）で処理したところ、他の比率で処理するよりもかなり小さい微粒子又は「気泡」であって、細胞に局在するものが見られた（図７及び８）。かかる気泡はＮ６Ｌ及びＧＡＧからなる微粒子である。最大のものはＧＡＧ１００μｇ／ｍｌで観察され、大きさは約５００ｎｍであった。その大きさは培地中のＧＡＧの濃度と明確な相関を有していた。Ｎ６ＬはＧＡＧと共に微粒子を形成し、その大きさはＧＡＧの濃度と相関していた。
【０２２３】
結論
総じて、ＧＡＧ単独では増殖に対する効果が見られなかった一方で、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸として知られる）、及びコンドロイチン硫酸ＣはいずれもＮ６ＬのＰＡＮＣ１（ヒト膵癌細胞）及びＵ８７−ＭＧ（ヒト神経膠芽腫細胞）抗増殖作用を高めた（図３−６及び９−１２参照）。観察したところかかるＮ６Ｌの抗増殖特性の亢進はヒアルロン酸又はヘパリンでは見られなかった（図示しないデータと図１３による）。
【０２２４】
さらに、処理の繰り返し（毎日）は有意にＮ６Ｌの抗増殖作用を向上させ、予めヘパリン又はコンドロイチン硫酸と混合したＮ６Ｌの抗増殖作用をわずかに高めた（図１４−１５参照）。実際に、事前にヘパリン又はコンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃｓ−Ｃ）と混合したＮ６Ｌによる一回の処理であっても、時間依存的にＰＡＮＣ１及びＵ８７−ＭＧがん細胞を阻害した。
【０２２５】
Ｎ６ＬをＧＡＧと混合することで、両化合物は相互作用し、微粒子を形成した（図７−８）
【０２２６】
実施例２．ヌカント６Ｌの抗増殖特性における相乗作用に対するヌカント６ＬとＧＡＧの質量比の影響
【０２２７】
約５×１０３のＰＡＮＣ１（ＡＴＣＣ，American Type Culture Collectionから得た）細胞を１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭに懸濁し、４８穴の培養プレートに播種し、３７℃で２４時間培養した。その後、培養培地を０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに入れ換えた。その後、細胞を予めＮ６ＬとＣｓ−Ｃの間の質量比で８−１６になるようＣｓ−Ｃと恒温放置した又はしていない２．５μＭから４０μＭの範囲の濃度のＮ６Ｌで２時間処理し、その後、７日間全ての日において処理した。最後の７日目においてＭＴＴ試験により細胞数を計測した。
【０２２８】
図１６から１９に結果を示すように、Ｃｓ−Ｃと予め恒温放置したＮ６Ｌによって毎日２時間処理することで十分に付着依存性の細胞増殖を阻害した。さらに成長曲線を比較すると、Ｎ６Ｌ／Ｃｓ−Ｃの質量比が１６のときよりＮ６Ｌ／Ｃｓ−Ｃの質量比が８のときの方が効率的であることが分かった。
【０２２９】
観察したところ、予めＣｓ−Ｃと恒温放置した場合、Ｎ６Ｌ濃度２．５μＭ（図１９）又はそれ以上（図１６−１９）で時間依存的に阻害していた。
【０２３０】
さらに、低いＮ６Ｌ濃度（２．５又は５μＭ、図１８−１９参照）では理想的なＮ６Ｌ／Ｃｓ−Ｃの質量比８の選択が特に重要である一方で、より高いＮ６Ｌ濃度（２０又は４０μＭ、図１８−１９参照）では重要ではないことが特徴的であった。
【０２３１】
実施例３．ヌカント６Ｌの抗血管新生特性に対する様々なＧＡＧとヌカント６Ｌの同時処理の相乗効果
【０２３２】
予め各種グリコサミノグリカンと恒温放置したＮ６Ｌのヒト内皮細胞の付着依存性の増殖に対する効果に関する研究（図２０）。
【０２３３】
概要：各種ＧＡＧによるＮ６Ｌのヒト内皮細胞の付着依存性の増殖に対する作用の調節の効率を比較するため、ＨＵＶＥＣ細胞をＮ６Ｌ及びこれらのＧＡＧとの混合液に曝露した。４日後、細胞増殖をＭＴＴ試験で定量した。
【０２３４】
方法：同等の数（５×１０３）のＨＵＶＥＣ細胞を、０．１から５０μＭまでの範囲でＮ６Ｌ濃度を増加させ、予め１０μｇ／ｍｌのＣｓ−Ａ、Ｃｓ−Ｂ、Ｃｓ−Ｃ、ヘパリン、ヘパラン硫酸若しくはヒアルロン酸のいずれかで恒温放置し又はせずに処理した。細胞は毎日、４日間処理した。第４日の終わりにＭＴＴ試験を用いて細胞数を定量した。
【０２３５】
結果：単独で使用したＮ６Ｌは、用量依存的にＨＵＶＥＣ細胞の付着依存性の増殖を阻害し、５０μＭで最大の活性を示した。予めＮ６Ｌをヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａ（Ｃｓ−Ａ）、コンドロイチン硫酸Ｂ（Ｃｓ−Ｂ）、コンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃｓ−Ｃ）を含む硫酸化されたＧＡＧ分子と恒温放置することで、Ｎ６Ｌを単独で使用した時の効果を増強し、５μΜの濃度で最大の効果を示し、ＩＣ５０＝２．５μＭとなったことが興味深い。これに対し、予めＮ６Ｌをヘパラン硫酸や中性のヒアルロン酸と恒温放置した場合、ＨＵＶＥＣの付着依存性の増殖をＮ６Ｌと同程度に抑制した（図２０）。
【０２３６】
予め硫酸化グリコサミノグリカンと恒温放置したＮ６Ｌの生体内の血管新生に対する効果に関する研究（図２１参照）。
【０２３７】
概要：硫酸化グリコサミノグリカンと恒温放置したＮ６Ｌの生体内の血管新生に対する効を調べるためのニワトリ胚絨毛尿膜試験を用いる
【０２３８】
方法：レッグホーン種の受精卵を４日間３７℃で保温した。卵殻に孔を開けＣＡＭを曝露した。孔を滅菌テープで覆い卵を孵卵器に戻した。胚の成長の９日目に、２０ｍｌの蒸留水を対照とし、又はそれぞれ単独の２０μＭのＮ６Ｌ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン若しくは１０μｇ／ｍｌのＣｓ−Ｃ、若しくは予め１０μｇ／ｍｌのヘパリン若しくは１０μｇ／ｍｌのＣｓ−Ｃと恒温放置した２０μＭのＮ６Ｌを含む蒸留水を、１ｃｍ２の領域に制限するためにシリコンリング内に加えた。３７℃で保温し４８時間後、卵から切り出し、ＣＡＭを切片として生理食塩水で緩衝されたホルマリンで固定し、スライドに載せ、放置して空気乾燥した。写真撮影し、ＰＣ画像解析ソフト（Scion社、アメリカ合衆国）で血管長の合計を定量した。結果は３回以上の独立した試験の平均値±ＳＤを示す。
【０２３９】
結果：水で行った対照と比較すると、２０μＭで使用したＮ６Ｌは生体内での血管新生に対して有意な効果を示さなかった。これに対して、予め２０μＭのＮ６Ｌを１０μｇ／ｍｌのヘパリン又は１０μｇ／ｍｌのＣｓ−Ｃと恒温放置し、ニワトリ胚絨毛尿膜に添加したところ、新しい血管の発生の有意な阻害が見られた（それぞれ５０％、及び７０％、図２１参照）。対照実験と同様、ヘパリン又はＣｓ−Ｃを単独でニワトリ胚絨毛尿膜に添加した場合には、効果が見られなかった。結果は少なくとも三つの独立実験の平均値±ＳＤである。
【０２４０】
結論
上記結果はヌカント化合物とＧＡＧの混合により、それらの抗増殖活性を相乗的に高めるだけでなく、それらの抗血管新生活性も相乗的に高めることを示している。
【０２４１】
実施例４．Ｎ６Ｌを予めＣｓ−Ｃ及びゲムシタビンと恒温放置することの相乗効果
【０２４２】
概要：この研究の目的は予めＣｓ−Ｃ及びゲムシタビンと恒温放置した又はしなかったＮ６Ｌが相乗効果を有するか否かを確かめることである。
【０２４３】
方法：
約５×１０３のＰＡＮＣ１（ＡＴＣＣ，American Type Culture Collectionから得た）細胞を１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭに懸濁し、４８穴の培養プレートに播種し、３７℃で２４時間培養した。その後、培養培地を５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに入れ換えた。その後、１ｎＭから５０ｎＭの各種濃度のゲムシタビン存在下又は非存在下で予めＣｓ−Ｃと恒温放置した又はしていない１μＭから５０μＭの範囲の濃度のＮ６Ｌで４日間全ての日において細胞を処理した。最後の４日目においてＭＴＴ試験により細胞数を計測した。
【０２４４】
結果：上記実験条件において、ゲムシタビンにより細胞増殖の阻害がわずかに見られたものの、ゲムシタビンを予めＣｓ−Ｃと恒温放置しても相乗効果は見られなかった。期待された通り、Ｎ６Ｌを予めＣｓ−Ｃと恒温放置することで、Ｎ６Ｌ単独よりも相乗効果が表れた。注目すべきはゲムシタビンを、Ｎ６Ｌ＋Ｃｓ−Ｃの混合物へ添加することでさらに相乗効果が表れたことである。
【０２４５】
全ての参考文献、特許、係属中の特許出願及び発行された特許の内容は、本願全体を通して引用され、明確に参考文献の欄によって援用される。
【０２４６】
実質的に等しい範囲について
当業者であれば本願発明の特定の実施形態と実質的に等しい多くのものを理解でき、また慣用される実験方法を超えない範囲で確かめることができると考える。クレームには上記の実質的に等しいものを含んでいる。
【０２４７】
本願の詳細な実施例及び実施形態は説明のための例示に過ぎず、本発明を限定するものではない。それらを考慮した各種の修正又は変更は、当業者に示されており、かつ本願の意図するところ及び範囲に含まれており、かつ添付のクレームの範囲に含まれると考える。例えば、相対的な成分量は所望の効果を奏するように変更可能であり、成分の追加が可能であり、かつ／又は上述の一又は二以上の成分を類似する成分に置換することが可能である。好ましい特徴及び本発明のシステム、方法、過程に付随する機能性として追加可能なものはクレームから明白であろうと考える。さらに当業者であれば本願発明の特定の実施形態と実質的に等しい多くのものを理解でき、また慣用される実験方法を超えない範囲で確かめることができると考える。クレームには上記の実質的に等しいものを含んでいる。
【０２４８】
参考文献
以下に挙げる参考文献をここに参照することでそれら全体をあらゆる目的のために援用する。
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WO2007/125210 
WO2009/141687
【図１】
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【図２Ａ】
2013540127.tif 000018
【図２Ｂ】
2013540127.tif 000019
【図２Ｃ】
2013540127.tif 000020
【図２Ｄ】
2013540127.tif 000021
【図２Ｅ】
2013540127.tif 000022
【図２Ｆ】
2013540127.tif 000023
【図２Ｇ】
2013540127.tif 000024
【図２Ｈ】
2013540127.tif 000025
【図２Ｉ】
2013540127.tif 000026
【図３】
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【図４】
2013540127.tif 000028
【図９】
2013540127.tif 000029
【図１０】
2013540127.tif 000030
【図１１】
2013540127.tif 000031
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2013540127.tif 000040
【図２２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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