(57)【要約】  ｖｉ．配列番号１のヌクレオチド配列又はこの相補体と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子；ｖｉｉ．配列番号１のヌクレオチド配列又はこの相補体の少なくとも１５００個の連続するヌクレオチドのフラグメントを含む核酸分子；ｖｉｉｉ．配列番号２と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；ｉｘ．配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントをコードする核酸分子であって、フラグメントが、配列番号２の少なくとも５００個の隣接するアミノ酸を含む上記核酸分子；及びｘ．ＣＤ１３３に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリン又は免疫グロブリンの部分を含有するポリペプチドをコードする核酸分子、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのバリアントをコードする核酸分子であって、６．０×ＳＳＣ中、４５℃でのインキュベーションと、それに続く０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄の条件下で、配列番号１全体又はこの相補体を含む核酸分子にハイブリダイズする上記核酸分子、からなる群から選択される単離された核酸分子。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ．配列番号１のヌクレオチド配列又はこの相補体と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｉｉ．配列番号１のヌクレオチド配列又はこの相補体の少なくとも１５００個の連続するヌクレオチドのフラグメントを含む核酸分子；
ｉｉｉ．配列番号２と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｉｖ．配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントをコードする核酸分子であって、フラグメントが、配列番号２の少なくとも５００個の隣接するアミノ酸を含む上記核酸分子：及び
ｖ．配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのバリアントをコードする核酸分子であって、核酸分子が、６．０×ＳＳＣ中、４５℃でのインキュベーションと、それに続く０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄の条件下で、配列番号１全体又はこの相補体を含む核酸分子にハイブリダイズする上記核酸分子
からなる群から選択される単離された核酸分子。
【請求項２】
ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸、及び
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子
ｃ）ＣＤ１３３に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリン又はＣＤ１３３に結合特異性を有する免疫グロブリンの部分を含有する、請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ベクター核酸配列をさらに含む、請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
【請求項５】
ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントであって、配列番号２の少なくとも６００個の隣接するアミノ酸を含む上記フラグメント；
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのバリアントであって、６．０×ＳＳＣ中、４５℃でのインキュベーションと、それに続く０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄の条件下で、配列番号１全体又はこの相補体を含む核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされる上記バリアント；
ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列又はこの相補体からなる核酸と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるポリペプチド；及び
ｄ）配列番号２と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、コラーゲン及びＣＤ１３３タンパク質に同時且つ選択的に結合することができるポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ＣＤ１３３に結合特異性を有する免疫グロブリンの相補性決定領域を含む、請求項５又は６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
相補性決定領域として配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び／若しくは３０のアミノ酸配列又はこの部分を含む、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ヒト起源の免疫グロブリンに由来する免疫グロブリンフレームワーク領域を含む、請求項７又は８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
二量体である、請求項５〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを産生する方法であって、核酸分子が発現される条件下で請求項４に記載の宿主細胞を培養することを含む上記方法。
【請求項１２】
請求項５〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１３】
心臓血管疾患の予防又は治療又は診断において使用するための、請求項５〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
心臓血管疾患の予防又は治療のための医薬品を製造するための、請求項５〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１５】
不安定なプラークの診断マーカーを調製するための、請求項５〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン及びＣＤ１３３タンパク質に同時且つ選択的に結合することができる核酸分子及びポリペプチドに関する。本発明はまた、本発明の核酸分子を含有する宿主細胞にも関する。さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを産生する方法に関する。該ポリペプチドは、心臓血管疾患の予防、治療、又は診断に使用することができる。したがって、本発明はまた、好ましくは二量体である本発明のポリペプチドを含有する医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は骨髄に存在し、血流に放出され、血流中で止血及び組織修復に関与する。５回膜貫通糖タンパク質であるＣＤ１３３タンパク質は、ＥＰＣの表面で発現され、ＥＰＣが内皮細胞へ分化すると、それにより発現がダウンレギュレートされる。ＣＤ１３３は、血液のいかなる他の細胞型でも発現されず、これがＣＤ１３３をＥＰＣの動員の魅力的な標的にしている。
【０００３】
血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を血管病変部位へ誘引することができる二重特異性タンパク質が、ＷＯ２００８／１０１７００から知られている。ＷＯ２００８／１０１７００により開示されたタンパク質は、高い親和性でＥＰＣ上のＣＤ１３３に結合できる部分を含有する。さらに、ＷＯ２００８／１０１７００により開示されたタンパク質は、血管の内皮層における病変を認識及び結合することができる部分を含有する。ＷＯ２００８／１０１７００によれば、該タンパク質は、血管内皮前駆細胞に結合することができる第１のタンパク質とコラーゲンに結合することができる第２のタンパク質を連結させて調製される。
【０００４】
第１及び第２のタンパク質は、ヘテロ二官能性架橋剤であるＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート）を用いて連結される。第１のタンパク質はＳＰＤＰと反応性の約２５個のリシン残基を含有し、第２のタンパク質は約１８個のリシン残基を含有するため、見込まれる二量体生成物の数は少なくとも４５０（１８×２５）である。さらに、より高次のオリゴマーの形成が不可避である。したがって、架橋生成物は、生成物の異種混合物を含有する。ちなみに、生成物は、第１及び第２のタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子の連結を介して調製されるものではないため、混合物は、第１及び第２のタンパク質のいずれの融合タンパク質も含有しない。
【０００５】
したがって、ＷＯ２００８／１０１７００により利用可能になった生成物はいずれも、融合遺伝子の翻訳の産物、又は最初のタンパク質の各々に由来する機能特性を有する単一のポリペプチドとして見なすことはできない。
【０００６】
ＷＯ２００８／１０１７００により開示されたタンパク質混合物は、混合物が、標準化及び定義された組成並びに治療適用に適した十分な純度を備えることができないため、医薬品としての使用に適さない。さらに、オリゴマーが不可避なため、ＷＯ２００８／１０１７００の混合物の収量及び有効性は問題がある。
【０００７】
一方、ＷＯ２００８／１０１７００の混合物中に存在するポリペプチド配列を含有する融合タンパク質を調製する試みは、血管内皮前駆細胞及びコラーゲンに選択的に及び同時に結合することができる第２のタンパク質を化合させることができなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、コラーゲン及びＣＤ１３３タンパク質に同時且つ選択的に結合することができる小さいサイズのポリペプチドを提供することが本発明の目的であり、これによりタンパク質は、血管壁の内皮細胞へのＥＰＣの分化により直接的に、又は正の調節因子の分泌により間接的に治癒過程を増大させる医薬組成物において有用なように高収量及び高純度で調製することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、特定の融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。融合タンパク質は、露出されたコラーゲンへのＥＰＣのホーミングによる心臓血管疾患の治療若しくは予防において、又は診断目的で使用することができる。
【００１０】
第１の態様によれば、本発明は、
ｉ．配列番号１のヌクレオチド配列又はこの相補体と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｉｉ．配列番号１のヌクレオチド配列又はこの相補体の少なくとも１５００個の連続するヌクレオチドのフラグメントを含む核酸分子；
ｉｉｉ．配列番号２と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｉｖ．配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントをコードする核酸分子であって、フラグメントが、配列番号２の少なくとも５００個の隣接するアミノ酸を含む上記核酸分子；及び
ｖ．配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのバリアントをコードする核酸分子であって、核酸分子が、６．０×ＳＳＣ中、４５℃でのインキュベーションと、それに続く０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄の条件下で、配列番号１全体又はこの相補体を含む核酸分子にハイブリダイズする上記核酸分子
からなる群から選択される単離された核酸分子を提供する。
【００１１】
配列番号１の核酸配列は、次の通りである。
【化１−１】
2013532954.tif 000002
【化１−２】
2013532954.tif 000003
【００１２】
第２の態様によれば、本発明は、本発明の第１の態様の核酸分子を含有する宿主細胞を提供する。
【００１３】
第３の態様によれば、本発明は、
ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントであって、配列番号２の少なくとも６００個の隣接するアミノ酸を含む上記フラグメント；
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのバリアントであって、６．０×ＳＳＣ中、４５℃でのインキュベーションと、それに続く０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄の条件下で、配列番号１全体又はこの相補体を含む核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされる上記バリアント；
ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列又はこの相補体からなる核酸と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるポリペプチド；及び
ｄ）配列番号２と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、コラーゲン及びＣＤ１３３タンパク質に同時且つ選択的に結合することができるポリペプチドを提供する。
【００１４】
第３の態様によるポリペプチドは、心臓血管疾患の予防又は治療における使用に有利である。
【００１５】
配列番号２のアミノ酸配列は、次の通りである。
【化２】
2013532954.tif 000004
【００１６】
第４の態様によれば、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを産生する方法であって、核酸分子が発現される条件下で第３の態様による宿主細胞を培養することを含む上記方法を提供する。
【００１７】
第５の態様によれば、本発明は、本発明の第３の態様によるポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
第６の態様によれば、本発明は、心臓血管疾患の予防又は治療のための医薬品を製造するための、第３の態様によるポリペプチドの使用を提供する。
【００１９】
本発明は、高効率で哺乳動物細胞培養物において発現され得る本発明による融合タンパク質が、高い親和性で標的ＣＤ１３３及びコラーゲンに結合でき、並びにフローチャンバー実験で示されるような動的条件下でさえ、ＣＤ１３３発現ＨＥＫ２９３細胞をコラーゲン被覆表面に固定化できることを示す。
【００２０】
ＧＰＶＩ−Ｆｃと化学的に連結されたＷ６Ｂ３Ｈ１０  ｍＡｂを含有するＷＯ２００８／１０１７００のタンパク質混合物と同程度に、本発明の融合タンパク質は、ヒト臍帯血から単離されたＣＤ１３３陽性前駆細胞を、マウスモデルにおいて誘発された血管病変に動員することができる。さらに、動員されたＥＰＣは、内皮細胞に分化し、故に内皮壁の再生に直接寄与した。したがって、本発明の融合タンパク質は、再内皮化を増大させ、再生血管医療に有益な価値がある。本発明のポリペプチドは、血管壁の内皮細胞への分化により直接的に、又は正の調節因子の分泌により間接的に治癒過程を増大させるのに有用である。
【００２１】
既存の化学的に連結されたコンストラクトより優れて、新規の融合タンパク質は、コラーゲンに対しより高い親和性を有する（図９参照）。これは、血管病変への局所結合についてより高い有効性を有する医薬品としての使用に利点を示す。融合タンパク質の様々な可能性のうち、ｓｃＦｖ−ｌｈのみがＣＤ１３３に対し同程度の高い親和性を示したのに対し、他の得られたコンストラクトは示さなかった（図５参照）。
【００２２】
血管再生過程のための本発明のポリペプチドの適用のほかに、該ポリペプチドは、化学療法又は放射線療法による骨髄除去後の、移植された幹細胞の骨髄へのホーミングを改善するのに使用することもできる。
【００２３】
本発明は、コラーゲン及びＣＤ１３３タンパク質に同時且つ選択的に結合することができる小さいサイズの配列番号２によるポリペプチドを提供する。本発明によるタンパク質は、高収量及び高純度で調製することができ、このことが、該タンパク質を医薬組成物において高度に有用にしている。
【００２４】
本発明によるポリペプチドは、融合タンパク質、すなわち融合遺伝子の翻訳の産物である。融合タンパク質は、一本鎖抗ＣＤ１３３抗体のドメイン、リンカー、Ｆｃ部分、及びＧＰＶＩ部分を含有する。本発明のタンパク質は、二量体の形態にあってもよい。
【００２５】
本発明によるポリペプチドは、連結リンカーペプチドにより１つのポリペプチド鎖上で合体される、モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の可変配列のみから構成される一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）に基づく。この一本鎖抗体は、驚くほど高い親和性で親ｍＡｂの抗原に対する特異性を保持する。本発明により使用される親ｍＡｂは、市販のクローンＷ６Ｂ３Ｃ１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ベルギッシュグラッドバッハ）のサブクローン、マウスハイブリドーマ細胞クローンＷ６Ｂ３Ｈ１０により産生することができる。
【００２６】
本発明によるポリペプチドの抗体部分は、マウスモノクローナル抗体に由来するため、この部分を含有する融合タンパク質は、マウス−ヒトキメラタンパク質である。組換え抗体ベースの医薬品ではマウス由来配列を置換するのに利用可能な技術があるため、ヒト化されたもの又は完全にヒトのものである治療分子を開発することが最先端になっている。これは、特に反復投与された場合、治療タンパク質に対する免疫応答を低減又は予防する。したがって、本発明のポリペプチドの一本鎖部分は、ＣＤＲ移植と呼ばれる方法により、ヒト化過程に供することができる。これには、抗体の抗原結合部位を含むマウス由来相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒトフレームワーク残基に移植される。
【００２７】
種マウスに由来する融合タンパク質の抗体部分は、ヒトコンセンサスアクセプターフレームワーク配列へのマウスＣＤＲのＣＤＲ移植により成功裏にヒト化され得る。ヒト化融合タンパク質は、標的タンパク質ＣＤ１３３及びコラーゲンＩに対する結合特性を保持し、マウス一本鎖配列を有する融合タンパク質と比べて類似の親和性で結合する。
【００２８】
第２の融合パートナーは、血管の内皮層における病変を認識及び結合することができる。ステント移植などの外科的介入による内皮細胞層の損傷後、又はアテローム性動脈硬化プラークの破裂後、内皮下マトリックスの構成要素、コラーゲンは、血流に暴露される。これは、血小板の急速な付着及び活性化をもたらし、今度は、血栓形成及び最終的に血管の閉塞の原因となる可能性がある。
【００２９】
ヒト化融合タンパク質は、血栓形成の面積減少により示されるように、損傷された血管壁への血小板の結合を抑制することができる（図２２参照）。マウス抗体配列を有する前駆体分子と比べて、ヒト化融合タンパク質は、投与後の患者の免疫系の寛容を改善すると期待されている。
【００３０】
血小板は、血小板の表面で発現される膜糖タンパク質受容体、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）を介してコラーゲンに接着する。該タンパク質の細胞外ドメインに対応するヒト血小板糖タンパク質ＶＩの可溶性部分は、コラーゲンに対する高い結合親和性を示す。
【００３１】
ＧＰＶＩは、ホモ二量体として高い親和性でコラーゲンを結合する。一方では二量体化を、他方では親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を促進するため、ヒトＩｇＧのＦｃ部分が可溶性ＧＰＶＩ部分に付着される。Ｆｃフラグメントは、ヒンジ領域の残りの部分で共有ジスルフィド結合を介して二量体を形成し、このことが、ジスルフィド結合形成により恐らく支持されたＧＰＶＩの二量体化を促進する。さらに、Ｆｃタグは、血流中の融合タンパク質の半減期を増加させる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】Ｗ６Ｂ３Ｈ１０軽鎖及び重鎖可変領域ｃＤＮＡのアセンブルされた配列を示す図である。具体的には、図１Ａは、カッパ軽鎖の配列を示す。下線が付された配列は、軽鎖配列の定常領域に属する。図１Ｂは、ガンマ重鎖の配列を示す。
【図２】コンストラクトｓｃＦｖ−ｌｈ（図２Ａ）、及びｓｃＦｖ−ｈｌのヌクレオチド配列（図２Ｂ）を示す図である。Ａで下線を付された配列は重鎖の定常領域に由来し、Ｂで下線が付された配列は軽鎖の定常領域に由来する。Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列がイタリック体で書かれている。
【図３】ＳｔｒｅｐＭＡｂ−Ｃｌａｓｓｉｃ−ＨＲＰ抗体で検出された、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマトリックスを用いたＣＨＯ細胞上清からの一本鎖抗体ｓｃＦｖ−ｌｈの精製のウェスタンブロットを示す図である。フロースルー（ＦＴ）、最初の２つの洗浄分画（Ｗ１、Ｗ２）、溶出液分画１〜５（Ｅ１〜Ｅ５）及び溶出（Ｍ）後のマトリックスが示されている。特異的バンドが、レーンＥ２〜Ｅ５に約２７ｋダルトンの期待されたサイズで示されている。レーンＭは、非特異的シグナルを示す。
【図４】細菌からのｓｃＦｖ−ｈｌの精製のクーマシーゲルを示す図である。Ｂ、細菌溶解物、Ｅ２／３、混合された溶出液２及び３、Ｅ４、Ｅ５、溶出液分画４及び５。
【図５】固定されたＡＣ１３３／２９３細胞でのＣＤ１３３への一本鎖抗体の結合を示す図である。Ａ、濃度依存性結合特性  Ｂ、一本鎖抗体ｓｃＦｖ−ｌｈによる固定されたＡＣ１３３／２９３細胞でのＣＤ１３３への２ｎｍｏｌ／Ｌ  Ｗ６Ｂ３Ｈ１０ｍＡｂの結合の競合。
【図６】融合タンパク質ｓｃＦｖ−ｌｈ−ＧＰＶＩ−Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。図１Ａは、ＣＨＯ細胞での効率的な発現のためにコドン最適化されるヌクレオチド配列を示し、一本鎖部分をコードする配列に下線が付されている。図１Ｂは、ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。示された２０個のアミノ酸リーダーペプチドは、成熟タンパク質では欠如している。一本鎖部分の配列には下線が付されている。ＧＰＶＩ及びＦｃＩｇＧ２は、ボールド体で示されたＧＧＲリンカーにより連結されている。
【図７】非還元及び還元条件下、４〜２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離された融合タンパク質を示す図であり、ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色された。
【図８】固定されたＡＣ１３３／２９３細胞でのＣＤ１３３への融合タンパク質の結合の特徴付けを示す図である。図８Ａは、融合タンパク質及び親ｍＡｂ  Ｗ６Ｂ３Ｈ１０の結合を比較するための滴定ＥＬＩＳＡを示す。図８Ｂは、２ｎＭ  Ｗ６Ｂ３Ｈ１０  ｍＡｂ及びコンペティターとしての融合タンパク質による競合ＥＬＩＳＡを示す。
【図９】ＥＬＩＳＡによる、ＧＰＶＩ−ＦｃＩｇＧ１と比較した、０．１μｇウシコラーゲンＩへの融合タンパク質の結合の測定を示す図である。図９Ａは、濃度依存性結合を示す。図９Ｂは、可溶性コラーゲンＩの量を増やして競合された、１μｇ／ｍｌ固定化コラーゲンＩへの融合タンパク質の結合の競合を示す。
【図１０】２０００／ｓのせん断力下での、コラーゲンへのＣＤ１３３発現細胞及びＨＥＫ  ２９３対照細胞の融合タンパク質媒介性結合を示す図である。
【図１１】生体蛍光顕微鏡法により測定された、ｉｎ  ｖｉｖｏでの結紮誘発損傷後の、マウスの頸動脈へのｑＥＰＣの融合タンパク質媒介性結合を示す図である。
【図１２】左心室の機能（Ａ）及び梗塞サイズ（Ｂ）に対する融合タンパク質の効果を示す図である。Ｎ＝５／６、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５（ｔ検定）。
【図１３】マウス一本鎖配列を内部に有するファージｍ１ｈと比較した、ヒト化配列を含有するファージクローンのＦＡＣＳ分析による親和性測定を示す図である。図１３Ａは、ファージｍ１ｈと比較したファージクローン２６の親和性を示す。図１３Ｂは、ファージｍ１ｈと比較したファージクローン２７及びファージクローン２９の親和性を示す。分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０ソフトウェアを用いて行われた。平均ＦＩ（蛍光指数）、幾何平均ＦＩ又は中央ＦＩが投入された場合、ｐＭでの相対的親和性が測定される。
【図１４】ドナー配列を陰性対照、及びアクセプター配列を陽性対照とした、ヒト化抗体配列のヒトらしさの評価を示す図である。Ａ、ドナーＶＬ；Ｂ、アクセプターＶＬ；Ｃ、クローン２６ＶＬ；Ｄ、ドナーＶＨ；Ｅ、アクセプターＶＨ；Ｆ、クローン２６  ＶＨ
【図１５】ＮＣＢＩのＢｌａｓｔＰプログラムを用いたタンパク質配列の比較を示す図である。図１５Ａは、親マウス一本鎖抗体（配列番号２２；マウス）及びヒトアクセプター配列（配列番号２３；サブジェクト）の配列アラインメントを示す。図１５Ｂは、ヒト化一本鎖抗体クローン２６（配列番号２４；ヒト化）及びヒトアクセプター配列（配列番号２３；サブジェクト）の配列アラインメントを示す。軽鎖（ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号２５）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号２６）及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号２７））及び重鎖（ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号２８）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号２９）及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号３０））の相補性決定領域が、枠で囲まれ示されている。
【図１６】ＮＣＢＩのＢｌａｓｔｘプログラムを用いた、マウス由来一本鎖部分を含有する融合タンパク質（配列番号２；下の列）とのヒト化融合タンパク質（配列番号１５；上の列）のタンパク質配列アラインメントを示す図である。配列は、タンパク質レベルで９５％の同一性を示す。
【図１７】同定されたファージクローン２６由来一本鎖部分を有するヒト化融合タンパク質ｈｓｃＦｖ−ｌｈ−ＧＰＶＩ−Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号１４）及びアミノ酸配列（配列番号１５）を示す図である。図１７Ａは、ＣＨＯ細胞での効率的な発現のためにコドン最適化されるヌクレオチド配列（配列番号１４）を示し、これにより、ヒト化一本鎖部分をコードする配列に下線が付されている。図１７Ｂは、ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号１５）を示す。示された２０個のアミノ酸リーダーペプチドは、成熟タンパク質では欠如している。ヒト化一本鎖部分の配列には下線が付されている。
【図１８】還元及び非還元条件下でそれぞれ、４〜２０％ポリアクリルアミドゲル上でｓｃＦｖ−ｌｈ−ＧＰＶＩ−Ｆｃ（ｍ）と一緒に分離されたヒト化融合タンパク質ｈｓｃＦｖ−ｌｈ−ＧＰＶＩ−Ｆｃ（ｈ）を示す図である。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色された。
【図１９】固定されたＡＣ１３３／２９３細胞でのＣＤ１３３抗原への融合タンパク質の結合の特徴付けを示す図である。図１９Ａは、ヒト化及び非ヒト化融合タンパク質の結合を比較するための細胞ＥＬＩＳＡを示す。図１９Ｂは、ヒト化及び非ヒト化融合タンパク質別の、固定されたＡＣ１３３／２９３細胞への２ｎＭ  Ｗ６Ｂ３Ｈ１０  ｍＡｂの結合の競合を示す。Ｆｃタンパク質は、陰性対照として含まれた。
【図２０】ＥＬＩＳＡにより測定された、０．１μｇ固定化ウシコラーゲンＩへのヒト化及び非ヒト化融合タンパク質の用量依存性結合を示す図である。Ｆｃタンパク質は、陰性対照として使用された。
【図２１】ファージクローン２７由来ヒト化一本鎖抗体のヌクレオチド配列（配列番号１６；図２１Ａ）及びアミノ酸配列（配列番号１７；図２１Ｂ）を示す図である。図２１Ｃは、クローン２７（配列番号１８；クエリ）及びマウス（配列番号２；サブジェクト）一本鎖抗体配列のヒト化配列を含む融合タンパク質をコードする配列のＤＮＡ配列アラインメントを示し、配列同一性は９６％である。
【図２２】ファージクローン２９由来ヒト化一本鎖抗体のヌクレオチド配列（配列番号１９；図２２Ａ）及びアミノ酸配列（配列番号２０；図２２Ｂ）を示す図である。図２２Ｃは、クローン２９（配列番号２１；クエリ）及びマウス（配列番号２；サブジェクト）一本鎖抗体配列のヒト化配列を含む融合タンパク質をコードする配列のＤＮＡ配列アラインメントを示し、配列同一性は９６％である。
【図２３】左総頸動脈の結紮後の血小板凝集のサイズの分析を示す図である。結果は、１群当たり５個体からの平均±ＳＥＭとして与えられている。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
ポリペプチドが、特に本実施例に記載された条件下で、ＣＤ１３３タンパク質とコラーゲンタンパク質の間に架橋を形成する状態で存在し得る場合、該ポリペプチドは、コラーゲン及びＣＤ１３３タンパク質に同時に結合することができる。それぞれ配列番号１又は配列番号２と約８５％同一性、好ましくは９０％、９５％、又は９８％同一性を有するアミノ酸又はヌクレオチド配列は、十分に同一であると本明細書に定義される。したがって、用語「十分に同一」とは、第１及び第２のアミノ酸又はヌクレオチド配列が共通の構造ドメイン及び／又は共通の機能活性を有するように、第２のアミノ酸又はヌクレオチド配列（配列番号１又は配列番号２）と同一又は同等の（例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基）アミノ酸残基又はヌクレオチドの十分な数又は最小数を含有する、第１のアミノ酸又はヌクレオチド配列を指す。本明細書では、「融合タンパク質」は、融合タンパク質活性を発揮するポリペプチドである。本明細書では、「融合タンパク質活性」、「融合タンパク質の生物学的活性」、又は「融合タンパク質の機能活性」とは、コラーゲン及びＣＤ１３３タンパク質への同時及び選択的結合を指す。
【００３４】
核酸分子
本発明は、配列番号１に示されたヌクレオチド配列、又はこの相補体と少なくとも８５％（９０％、９５％、又は９８％）同一であることにより、十分に同一である核酸分子を特徴とする。
【００３５】
本発明は、配列番号１に示されたヌクレオチド配列、又はこの相補体の少なくとも１５００（１６００、１８００、２０００、２２００）個のヌクレオチドのフラグメントを含む核酸分子を特徴とする。ある実施形態では、本発明による核酸分子は、配列番号１に示されたヌクレオチド配列を有する。また、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントをコードする核酸分子も、本発明内にある。
【００３６】
本発明はまた、ポリペプチドをコードする核酸分子であって、核酸が、ストリンジェントな条件下（例えば、６＊塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約６０℃でのハイブリダイゼーションと、それに続く０．２＊ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃での１回又は複数回の洗浄）で配列番号２からなる核酸分子にハイブリダイズし、且つ核酸が、翻訳後修飾前に及び還元型で約６５〜８５ｋＤの分子量を有する、少なくとも５００個のアミノ酸長、好ましくは少なくとも７００個のアミノ酸のポリペプチドをコードする、上記核酸分子も含む。
【００３７】
本発明の１つの態様は、融合タンパク質又はこの生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子のほか、融合タンパク質コード核酸（例えば、融合タンパク質ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸分子、及び融合タンパク質核酸分子の増幅又は変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するフラグメントに関する。本明細書では、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、並びにヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００３８】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されるものである。好ましくは、「単離された」核酸には、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて核酸に天然に隣接する配列（好ましくはタンパク質コード配列）が無い。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子には、組換え技術により産生される場合は他の細胞物質、若しくは培養培地が実質的に無くてもよく、又は化学的に合成される場合は化学的前駆体若しくは他の化学物質が実質的に無くてもよい。
【００３９】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列、又はこのヌクレオチド配列のいずれかの相補体を有する核酸分子は、標準的な分子生物学技術及び本明細書に提供された配列情報を用いて単離することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）。
【００４０】
別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１に示されたヌクレオチド配列の相補体である核酸分子、又はこの部分を含む。所与のヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、該ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、これにより安定な二本鎖を形成するほど、所与のヌクレオチド配列に十分に相補的なものである。
【００４１】
さらに、本発明の核酸分子は、融合タンパク質をコードする核酸配列の部分、例えばプローブ若しくはプライマーとして使用することができるフラグメント、又は融合タンパク質の生物学的に活性な部分をコードするフラグメントのみを含むことができる。
【００４２】
融合タンパク質の「生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、融合タンパク質生物学的活性を有するポリペプチドをコードする配列番号１の部分を単離し、融合タンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え発現により）、及び融合タンパク質のコードされた部分の活性を評価することにより、調製することができる。
【００４３】
本発明は、さらに、遺伝暗号の縮重のため配列番号１のヌクレオチド配列とは異なり、故に配列番号１に示されたヌクレオチド配列によりコードされるものと同じ融合タンパク質をコードする核酸分子も包含する。
【００４４】
したがって、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも１５００（１６００、１８００、２０００、２２００）個のヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列、好ましくはコード配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。
【００４５】
本明細書では、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、互いに少なくとも８５％（９５％、９８％）同一のヌクレオチド配列が、典型的には互いにハイブリダイズされたままである、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を記載することが意図される。このようなストリンジェントな条件は当業者に知られており、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）、６．３．１〜６．３．６に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、６＊塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４℃でのハイブリダイゼーションと、それに続く０．２＊ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃（例えば、５０℃又は６０℃又は６５℃）での１回又は複数回の洗浄である。好ましくは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、自然発生の核酸分子に対応する。
【００４６】
変化は、変異により配列番号１のヌクレオチド配列に導入することができ、これにより融合タンパク質の機能的能力を改変することなく、コードされたタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらす。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換が、行われてもよい。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を改変することなく、配列番号２の配列から改変することができる残基であるのに対し、「必須」アミノ酸残基は、融合タンパク質の生物学的活性に必要とされる。
【００４７】
したがって、本発明の別の態様は、活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含有する融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。このような融合タンパク質は、配列番号２とはアミノ酸配列が異なり、それにもかかわらず生物学的活性を保持する。
【００４８】
１つの実施形態では、核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約８５％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号１の配列とは異なる配列を有する融合タンパク質をコードする単離された核酸分子は、１つ又は複数のヌクレオチド置換、付加又は欠失がコードされたタンパク質に導入されるように、１つ又は複数のヌクレオチド置換、付加又は欠失を融合タンパク質（配列番号１）のヌクレオチド配列に導入することにより作製することができる。変異は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ変異誘発などの標準的技術により導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１つ又は複数の予測された非必須アミノ酸残基で行われる。故に、例えば、アミノ酸の１％、２％、３％、５％、又は１０％が保存的置換により置換され得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。故に、融合タンパク質における予測された非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と置換される。或いは、変異は、飽和変異誘発によるなど、融合タンパク質コード配列の全て又は部分に沿ってランダムに導入してもよく、得られた変異体は、融合タンパク質生物学的活性をスクリーニングして活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発後、コードされたタンパク質は組換え的に発現され得、タンパク質の活性が決定され得る。
【００４９】
変異体融合タンパク質は、ＣＤ１３３及びコラーゲンに同時且つ選択的に結合する能力をアッセイされ得る。
【００５０】
本発明はまた、本発明のヒト化免疫グロブリン（例えば、一本鎖抗体）をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子のほか、ヒト化免疫グロブリン軽鎖（例えば、配列番号１２、１３、１４、若しくは１５のアミノ酸配列をコードする配列及び／又は配列番号１１１、１１６のアミノ酸若しくはこの部分をコードする配列）又は重鎖（例えば、配列番号１７、１８、１９、若しくは２０のアミノ酸配列をコードする配列及び／又は配列番号１１０、１１４のアミノ酸配列若しくはこの部分をコードする配列をコードする配列を含む単離された核酸分子にも関する。
【００５１】
さらに、本発明は、ＣＤ１３３に結合特異性を有するヒト以外の抗体に由来する免疫グロブリン（例えば、一本鎖抗体）の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、配列番号２５、２６、２７、２８、２９及び／若しくは３０を含むアミノ酸配列又はこの部分をコードする配列）、及びヒト起源の免疫グロブリンに由来するフレームワーク領域（例えば、配列番号２３のアミノ酸配列又はこの部分をコードする配列）を含むヒト化免疫グロブリンをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子に関する。
【００５２】
本発明は、さらに、ＣＤ１３３に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリン又はこのような免疫グロブリンの鎖の部分を含有する融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。例えば、ＣＤ１３３に結合特異性を有するヒト以外の抗体の軽鎖に由来するＣＤＲ（例えば、配列番号２５、２６、及び／若しくは２７を含むアミノ酸配列又はこの部分をコードする配列）、及びヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターが提供される。ＣＤ１３３に結合特異性を有するヒト以外の抗体の重鎖に由来するＣＤＲ（例えば、配列番号２８、２９、及び／若しくは３０を含むアミノ酸配列又はこの部分をコードする配列）、及びヒト起源の重鎖に由来するフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターは、このようなコンストラクトの別の例である。１つの実施形態では、発現ベクターは、ＣＤ１３３に結合特異性を有するヒト以外の抗体の軽鎖に由来するＣＤＲ及びヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域をコードする第１の核酸配列、並びにＣＤ１３３に結合特異性を有するヒト以外の抗体の重鎖に由来するＣＤＲ及びヒト起源の重鎖由来のフレームワーク領域（例えば、配列番号１７、２０、又は２４を含むアミノ酸配列をコードする配列）を含む重鎖可変領域をコードする第２の核酸配列を含むヒト化免疫グロブリンをコードする核酸を含むことができる。１つの実施形態では、発現ベクターは、例えば、配列番号１（ｎｔ６１〜３８１）由来の軽鎖可変領域をコードする第１の核酸配列を含む軽鎖をコードする核酸、及び例えば配列番号１（ｎｔ４２７〜７９８）又はこの部分由来の重鎖可変領域をコードする第２の核酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、本明細書に記載された軽鎖をコードする核酸、及び本明細書に記載された重鎖をコードする核酸を含むことができる。
【００５３】
単離された融合タンパク質及び抗融合タンパク質抗体
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９５％又は９８％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドにも関する。
【００５４】
本発明の１つの態様は、単離された融合タンパク質、及びこの生物学的に活性な部分のほか、抗融合タンパク質抗体を惹起する免疫原としての使用に適したポリペプチドフラグメントに関する。１つの実施形態では、融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術により産生される。組換え発現の代わりに、融合タンパク質又はポリペプチドは、標準ペプチド合成技術を用いて化学的に合成することができる。
【００５５】
「単離された」又は「精製された」タンパク質又はこの生物学的に活性な部分には、融合タンパク質が由来する細胞又は組織起源由来の細胞物質又は他の夾雑タンパク質が実質的に無い、或いは化学的に合成される場合は化学的前駆体又は他の化学物質が実質的に無い。用語「細胞物質が実質的に無い」には、タンパク質が単離される又は組換え産生される細胞の細胞成分からタンパク質が分離される、融合タンパク質の製剤が含まれる。故に、実質的に細胞物質が無い融合タンパク質には、約３０％、２０％、１０％、又は５％未満（乾燥重量で）の非融合タンパク質（本明細書では「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を有する融合タンパク質の製剤が含まれる。融合タンパク質又はこの生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、融合タンパク質又はこの生物学的に活性な部分には、培養培地も好ましくは実質的に無い、すなわち、培養培地は、タンパク質製剤の容積の約２０％、１０％、又は５％未満に相当する。融合タンパク質が化学合成により産生される場合、融合タンパク質には化学的前駆体又は他の化学物質が好ましくは実質的に無い、すなわち、融合タンパク質は、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質から分離される。したがって、融合タンパク質のこのような製剤は、約３０％、２０％、１０％、５％未満（乾燥重量で）の化学的前駆体又は非融合タンパク質化学物質を有する。
【００５６】
融合タンパク質の生物学的に活性な部分には、完全長の融合タンパク質より少ないアミノ酸を含み、及び少なくとも融合タンパク質活性を示す、融合タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に示されたアミノ酸配列）と十分に同一の又は該アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。典型的には、生物学的に活性な部分は、少なくとも融合タンパク質活性を有するドメイン又はモチーフを含む。融合タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、少なくとも５００、５５０、６００、６５０、又は７００個のアミノ酸長であるポリペプチドであってもよい。好ましい生物学的に活性なポリペプチドは、１つ又は複数の融合タンパク質構造ドメイン、特にＣＤ１３３に選択的に結合する一本鎖抗体、リンカー、Ｆｃ部分、及びＧＰＶＩ部分に由来するドメインを含む。
【００５７】
有用な融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約８５％、好ましくは９５％又は９９％同一のアミノ酸配列を含み、及び配列番号２の融合タンパク質の機能活性を保持するタンパク質である。
【００５８】
融合タンパク質の抗体部分はマウスモノクローナル抗体に由来するため、融合タンパク質はマウス−ヒトキメラタンパク質であり、抗原認識に関与するものを除いてマウス配列は、抗体ヒト化によりヒト配列に対して置換され得る。一般に、部分的ヒト抗体及び完全ヒト抗体は、他の抗体よりもヒト体内でより長い半減期を有する。したがって、より低用量及びより頻度の低い投与がしばしば可能である。脂質化などの修飾は、抗体を安定化させ、且つ取り込み及び組織透過性（例えば、脳への）を増加させるのに用いることができる。抗体の脂質化の方法は、Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋら（（１９９７年）Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４：１９３）により記載されている。
【００５９】
２つの配列間のパーセント相同性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列を比較するのに利用される好ましい数学的アルゴリズムの非限定例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４〜２２６８頁のアルゴリズム、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７頁のように改変されたアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行って、本発明の核酸分子に類似又は相同なヌクレオチド配列を得ることができる。比較目的のギャップアラインメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁に記載のＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。
【００６０】
２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許す又は許さない、上記技術に類似の技術を用いて決定することができる。パーセント同一性の計算では、典型的には完全な一致がカウントされる。
【００６１】
好ましくは、本発明の融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来技術に従って、例えばライゲーションのための平滑末端又は付着末端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ  ｔｅｒｍｉｎｉ）の使用、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄｓ）の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素的ライゲーションにより、インフレームで共にライゲートされる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成することができる。単離された融合タンパク質、又はこの部分若しくはフラグメントは、ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製のための標準的技術を用いて、融合タンパク質に結合する抗体を生成する免疫原として使用することができる。
【００６２】
完全長融合タンパク質は免疫原として使用することができ、又は、代わりに、本発明は、免疫原として使用するための融合タンパク質の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。融合タンパク質の抗原性ペプチドは、配列番号２に示されたアミノ酸配列の少なくとも８（好ましくは１０、１５、２０、又は３０）個のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して惹起された抗体が、融合タンパク質を有する特定の免疫複合体を形成するように、融合タンパク質のエピトープを包含する。
【００６３】
本発明はまた、ＣＤ１３３に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンの可変領域を含有するポリペプチドも提供する。具体的には、本発明は、ＣＤ１３３に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンフラグメントを含有する、本発明の融合タンパク質のポリペプチドにも関し、免疫グロブリンは、ヒト以外の起源（例えば、齧歯類）の抗原結合領域、及びヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも部分（例えば、ガンマ型のヒトフレームワーク領域、ヒト定常領域）を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、さらに、ヒト起源の定常領域の全部又は部分、例えば、ヒト重鎖定常領域及び／又はヒト軽鎖定常領域の全部又は部分を含むことができる。さらに、本発明のポリペプチドは、１つ又は複数の変異、例えば、Ｆｃ受容体への結合及び／又は補体を固定する能力を低減する１つ又は複数の変異を有するヒト定常領域の全部又は部分を含むヒト化免疫グロブリンを含んでもよい。
【００６５】
融合タンパク質免疫原は、適切な対象、例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、又は他の哺乳動物を、免疫原で免疫して抗体を調製するのに使用することができる。免疫原性融合タンパク質製剤による適切な対象の免疫は、ポリクローナル抗融合タンパク質抗体反応を誘導する。したがって、本発明の別の態様は、抗融合タンパク質抗体に関する。
【００６６】
ポリクローナル抗融合タンパク質抗体は、適切な対象を融合タンパク質免疫原で免疫することにより調製することができる。融合タンパク質に対する抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離することができ、さらに、タンパク質Ａクロマトグラフィーなどのよく知られた技術により精製してＩｇＧ分画を得ることができる。免疫後適切な時期に、抗体産生細胞は対象から得ることができ、及びＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７頁に記載されているハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２頁）、又はＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、７７〜９６頁）などの標準的技術によりモノクローナル抗体を調製するのに使用することができる。
【００６７】
組換え発現ベクター及び宿主細胞
本発明の別の態様は、融合タンパク質（又はこの部分）をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。
【００６８】
本明細書では、用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、別のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二重鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、別のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。ベクターは、ベクターが導入される宿主細胞において自律複製することができ得る（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、ベクターが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、好ましくはプラスミド（ベクター）の形態にある。しかし、本発明はまた、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターも含む。
【００６９】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含む。したがって、組換え発現ベクターは、発現される核酸配列に作動可能に連結される、発現に使用される宿主細胞に基づき選択された１つ又は複数の制御配列を含む。
【００７０】
組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結される」は、対象のヌクレオチド配列が、（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系又はベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする形で、制御配列（単数又は複数）に連結されることを意味することが意図される。
【００７１】
用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０年）に記載されている。制御配列には、多くのタイプの宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列、及び特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指示する配列（例えば、組織特異的制御配列）が含まれる。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されて、これにより本発明の核酸にコードされた融合タンパク質又はペプチドを産生することができる。
【００７２】
本発明の組換え発現ベクターは、原核又は真核細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞、又は哺乳動物細胞での融合タンパク質の発現のために設計することができる（Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０年））。或いは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳することができる。
【００７３】
原核生物でのタンパク質の発現は、タンパク質の発現を指示する構成的又は誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌で行われてもよい。融合ベクターは、この中にコードされたタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的には３つの目的、すなわち、１）組換えタンパク質の発現を増加させること、２）組換えタンパク質の可溶性を増加させること、及び３）親和性精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助けることに適合する。多くの場合、融合発現ベクターでは、タンパク質分解切断部位が融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入されて、融合タンパク質の精製後の融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。このような酵素、及びこの同族認識配列には、因子Ｘａ、トロンビン及びエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８年）Ｇｅｎｅ  ６７：３１〜４０頁）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ベバリー、Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ピスカタウェイ、Ｎ．Ｊ．）が含まれ、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はタンパク質Ａを標的組換え融合タンパク質に融合する。
【００７４】
適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら（１９８８年）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１〜３１５頁）及びｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０年）６０〜８９頁）が含まれる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ  １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎ１）により媒介されるＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にあるＴ７  ｇｎ１遺伝子を内部に有する常在ラムダプロファージから、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【００７５】
大腸菌での組換えタンパク質発現を最大化する１つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた細菌においてタンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０年）１１９〜１２８頁）。別の戦略は、各アミノ酸に対する個々のコドンが大腸菌で優先的に利用されるものであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を改変することである（Ｗａｄａら（１９９２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１〜２１１８頁）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的ＤＮＡ合成技術により行うことができる。
【００７６】
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）での発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７年）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９〜２３４頁）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２年）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３〜９４３頁）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７年）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３〜１２３頁）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、サンディエゴ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＧＡＤ１０（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＹＡＤＥ４及びｐＹＧＡＥ２及びｐＹＰＧＥ２（Ｂｒｕｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｐａｌｌ（１９９３年）Ｙｅａｓｔ  ９：１２９９〜１３０８頁）、ｐＹＰＧＥ１５（Ｂｒｕｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｐａｌｌ（１９９３年）Ｙｅａｓｔ  ９：１３０９〜１３１８頁）、ｐＡＣＴ１１（Ｄｒ．Ｓ．Ｅ．Ｅｌｌｅｄｇｅ、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、並びにｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、サンディエゴ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。
【００７７】
或いは、本発明の融合タンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞で発現され得る。培養昆虫細胞でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈら（１９８３年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６〜２１６５頁）及びｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ（１９８９年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１〜３９頁）が含まれる。
【００７８】
別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０頁）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７年）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７〜１９５頁）が含まれる。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス制御エレメントにより提供されることが多い。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、及びシミアンウイルス４０由来である。原核及び真核細胞の両方に対する他の適切な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）の第１６章及び第１７章を参照のこと。
【００７９】
別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプで優先的に核酸の発現を指示することができる。組織特異的制御エレメントは当技術分野で知られている。適切な組織特異的プロモーターの非限定例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７年）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８〜２７７頁）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ（１９８８年）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５〜２７５頁）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９年）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９〜７３３頁）、及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３年）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９〜７４０頁；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３年）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１〜７４８頁）が含まれる。
【００８０】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクター又は本発明の単離された核酸分子が導入された宿主細胞に関する。この用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫又は潜在的な子孫も指す。変異又は環境の影響によって特定の修飾が後続世代で生じる可能性があるため、このような子孫は、実際は親細胞と同一でない場合があるが、本明細書では該用語の範囲内に依然として含まれる。
【００８１】
宿主細胞は、いずれの原核又は真核細胞であってもよい。例えば、融合タンパク質は、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母又は哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣＯＳ細胞など）で発現されてもよい。
【００８２】
本発明のベクターＤＮＡ又は単離された核酸分子は、従来の形質転換又はトランスフェクション技術を介して原核又は真核細胞に導入することができる。本明細書では、用語「形質転換」及び「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーションを含む、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な技術を指すことが意図される。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、及び他の実験室マニュアルに見出すことができる。
【００８３】
これらの組み込み体を同定及び選択するには、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般に、対象の遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を与えるものが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸は、融合タンパク質をコードするものと同じベクターで宿主細胞に導入されてもよく、又は別個のベクターで導入されてもよい。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定することができる。
【００８４】
培養下の原核又は真核宿主細胞などの本発明の宿主細胞は、本発明による融合タンパク質を産生するのに使用することができる。したがって、本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を用いて融合タンパク質を産生す方法を提供する。１つの実施形態では、方法は、融合タンパク質が産生されるように適切な培地で本発明の宿主細胞（組換え発現ベクター又は融合タンパク質をコードする単離された核酸分子が導入された）を培養することを含む。別の実施形態では、方法は、さらに、培地又は宿主細胞から融合タンパク質を単離することを含む。
【００８５】
医薬組成物
本発明の核酸分子及びポリペプチド（本明細書では「活性化合物」とも呼ばれる）は、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物は、典型的には、核酸分子、融合タンパク質、又は抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書では言葉「薬学的に許容可能な担体」には、薬学的投与に適合する溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤が含まれる。追加の活性化合物が、組成物に組み込まれてもよい。
【００８６】
本発明の医薬組成物は、意図された投与経路に適合するように処方される。好ましい投与経路には、非経口、例えば、静脈内又は動脈内投与が含まれる。非経口投与に使用される溶液又は懸濁液：注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；アセテート、シトレート、又はホスフェートなどの緩衝液、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性を調整する薬剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラス若しくはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、又は複数回投与バイアル中に封入することができる。
【００８７】
注射用途に適した医薬組成物には、滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌水溶液又は分散液及び滅菌粉末が含まれる。静脈内投与に関して、適切な担体には、生理食塩水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（ＢＡＳＦ；パーシッパニー、Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は滅菌されなければならず、容易に注射できる（ｅａｓｙ  ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）程度に流動性であるべきである。組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
【００８８】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、及びこれらの混合物を含有する溶媒又は分散媒体であってもよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトールなどの）、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。
【００８９】
滅菌注射溶液は、活性化合物（例えば、融合タンパク質又は抗融合タンパク質抗体）を、必要に応じて、上に列挙された成分の１つ又はこの組み合わせと共に、適切な溶媒に必要とされる量で組み込むことと、それに続く濾過滅菌により調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒体及び上に列挙されたものの中から必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込んで調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分プラス前もって滅菌濾過されたこの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【００９０】
投与の容易さ及び投与量の均一性のため、投与単位形態で経口又は非経口組成物を処方することは特に有利である。投与単位形態は、本明細書では、治療される被験者に対する単一投与量として適した物理的に別々の単位を指す。各単位は、必要とされる医薬担体と共同して所望の治療効果を生むように計算された活性化合物の所定量を含有する。
【００９１】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入することができ、且つ遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（ＵＳ−Ａ  ５，３２８，４７０）により、又は定位的注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４〜３０５７頁参照）により被験者に送達することができる。
【００９２】
遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含んでもよく、又は遺伝子送達ビヒクルが包埋された徐放性マトリックスを含んでもよい。或いは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞、例えばレトロウイルスベクターからインタクトに産生され得る場合、医薬製剤は、遺伝子送達システムを産生する１つ又は複数の細胞を含むことができる。
【００９３】
医薬組成物は、投与のための説明書と共に容器、パック、又はディスペンサーに含めることができる。
【００９４】
本発明の使用及び方法
本明細書に記載された核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、及び抗体は、１つ又は複数の以下の方法、
ａ）処置（例えば、治療的及び予防的）の方法。
ｂ）スクリーニングアッセイ；
ｃ）予測医療（例えば、診断アッセイ、予後アッセイ）
において使用することができる。
【００９５】
融合タンパク質は、他の細胞タンパク質、特に幹細胞と相互作用し、故に血管壁の内皮細胞へのＥＰＣの分化により直接的に、又は正の調節因子の分泌により間接的に治癒過程を増大させるのに使用することができる。
【００９６】
本発明の単離された核酸分子は、融合タンパク質を発現するのに（例えば、遺伝子治療適用において宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して）使用されてもよい。さらに、融合タンパク質は、融合タンパク質活性又は発現を調整する薬剤又は化合物をスクリーニングするため、及び障害を治療するために使用されてもよい。さらに、本発明の抗融合タンパク質抗体は、融合タンパク質活性を調整するのに使用することもできる。
【００９７】
処置の方法
本発明は、心臓血管障害のリスクがある（又は罹患しやすい）、又は露出された内皮下コラーゲンに関連した心臓血管障害を有する被験者を治療する予防的及び治療的方法の両方を提供する。
【００９８】
予防的方法
１つの態様では、本発明は、被験者における、露出された内皮下コラーゲンに関連した疾患又は状態を予防する方法を提供する。露出された内皮下コラーゲンに起因し又は寄与される疾患のリスクがある被験者は、例えば、高ＬＤＬコレステロールレベル、動脈性高血圧、糖尿病、喫煙などの心臓血管イベントのリスクがある被験者を同定する従来の方法により、且つコントラストＮＭＲ画像法におけるプラーク増加などの不安定な動脈プラーク、トロポニンＴ及びＩ、又はＲＧＤペプチドに対する既存及び新規のバイオマーカーにより、同定することができる。
【００９９】
具体的には、本発明によるポリペプチドは、心臓血管疾患の治療に有用である。特定の心臓血管障害は、血小板に対しコラーゲンを露出させる内皮病変に関連する。本発明によるポリペプチドは、このような障害を治療するのに使用することができる。これらの障害には、（心筋梗塞などの）急性冠症候群などのアテローム性動脈硬化、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）又は脳卒中などの急性若しくは慢性脳血管障害、経皮的カテーテルインターベンション（ＰＣＩ）による心臓及び冠状動脈インターベンション、並びに心臓手術の全ての合併症が含まれる。
【０１００】
さらに、融合タンパク質と共に造血幹細胞のプレインキュベーション、及び融合タンパク質の糖タンパク質ＶＩ成分を介した骨髄コラーゲンの結合により、移植後の幹細胞による骨髄の再増殖が改善され得る。
【０１０１】
治療的方法
本発明のポリペプチドは、心臓血管疾患の予防又は治療のための治療的方法において使用されてもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは、二量体の形態において使用される。特に、本発明のポリペプチドは、血管修復を改善するための前駆細胞のホーミングに使用されてもよい。
【０１０２】
ポリペプチドの投与の投与レジメンは、年齢、体重、性別、及び治療される被験者の状態に依存する。投与量は、好ましくは、患者１人当たり、１日０．０１〜２ｇの本発明のポリペプチドの範囲にあってもよい。ポリペプチドは、好ましくは非経口的に投与されてもよい。投与は、１日１〜５回であってもよい。
【０１０３】
１つの実施形態では、さらなる１つの薬剤、又は薬剤の組み合わせと併用して、本発明のポリペプチドを投与することを含む。さらなる薬剤の例は、ＧＰＶＩ−Ｆｃ、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子などの血栓溶解剤、ＡＤＰ受容体ブロッカー（クロピドグレル、チカグレロール、カングレロール等）などの抗血小板剤、トロンビンアンタゴニスト（ダビガトラン等）、又は因子Ｘアンタゴニスト（リバロキサバンなどの）、又はヘパリンである。
【実施例】
【０１０４】
材料
以下の方法セクションで言及されるキット及び材料のほか、以下の物質を使用した。オリゴヌクレオチドは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ（エーバースベルク、ドイツ）から購入した。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホヤ、カリフォルニア）をＰＣＲ増幅に使用した。細胞培養のための培地及びＰＢＳは、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ（ベルリン、ドイツ）製であった。化学物質はＲｏｔｈ（カールスルーエ、ドイツ）及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ゼールツェ、ドイツ）製であった。ウシコラーゲンＩは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（サンノゼ、カリフォルニア）から購入した。
【０１０５】
ハイブリドーマ細胞系Ｗ６Ｂ３Ｈ１０の軽鎖及び重鎖の可変配列の増幅及び同定
ｍＲＮＡは、製造者のプロトコールに従い、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ、ヒルデン、ドイツ）を用いて、４×１０６及び１．４×１０７細胞のハイブリドーマ細胞系Ｗ６Ｂ３Ｈ１０から単離した。１８μｌ単離ｍＲＮＡを、製造者のプロトコールに従い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア）を用いたｃＤＮＡ合成に用いた。Ｗ６Ｂ３Ｈ１０抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする配列を増幅するために、種々のプライマー組み合わせ、すなわち、カッパ軽鎖可変配列の増幅にはＢｉ７／Ｂｉ５、Ｂｉ８／Ｂｉ５、Ｂｉ３／Ｂｉ４、ガンマ重鎖可変配列にはＢｉ３ｄ／Ｂｉ４をテストした（プライマーはＤｕｂｅｌ  Ｓら、１９９４年に記載されている）。得られたバンドを、アガロースゲルから切除し、ＧＦＸゲルバンド精製キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー）を用いて精製し、且つ軽鎖配列決定のためＢｉ５ｓｅｑ（５’ＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧ３’；配列番号７）、Ｂｉ５ｆｗｄ（５’ＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＣＡＣＴＴＧ３’；配列番号８），及びＢｉ５ｒｅｖ（５’ＧＧＴＴＴＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＡＧ３’；配列番号９）を用いて配列決定した。重鎖配列は、配列決定プライマーＢｉ４ｓｅｑ（５’ＣＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡ３’；配列番号１０）、Ｂｉ４ｆｗｄ（５'ＣＴＧＡＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧ３’；配列番号１１），及びＢｉ４ｒｅｖ（５’ＴＴＣＡＣＣＣＡＧＴＧＣＡＣＧＴＡＧ３’；配列番号１２）を用いて得た。
【０１０６】
一本鎖抗体並びに融合タンパク質の発現及び精製
一本鎖抗体をコードするＤＮＡコンストラクトは、遺伝子合成により作製し、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア）にクローニングした（Ｇｅｎｅａｒｔ、レーゲンスブルク、ドイツ）。ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションは、製造者のプロトコールに従い、Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ、ヒルデン、ドイツ）又はリポフェクトアミン２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア）のどちらかを用いて行った。コンストラクトｓｃＦｖ−ｈｌで検出できた発現はなく、且つＣＨＯ細胞でのｓｃＦｖ−ｌｈの発現は極めて乏しかったため、両方のコンストラクトのＤＮＡを、Ｎｃｏｌ／Ｘｈｏｌを介して細菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）にサブクローニングした。配列を配列決定により制御し、且つ発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）の大腸菌を、これらのＤＮＡを用いて形質転換した。一本鎖抗体の発現は、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて導入した。タンパク質の単離は、製造者のプロトコールに従い、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ親和性精製（ＩＢＡ  ＢｉｏＴａｇｎｏｌｏｇｙ、ゲッティンゲン、ドイツ）を介して行った。
【０１０７】
ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ中にｓｃＦｖ−ｌｈ−ＧＰＶＩ−ＦｃＩｇＧ２をコードするＤＮＡコンストラクトは、Ｇｅｎｅａｒｔ（レーゲンスブルク、ドイツ）から注文した。安定に発現するＣＨＯ細胞系を、同封されたプロトコールに従い、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド  カリフォルニア）を用いて生成した。融合タンパク質をより大規模に作製するために、ＣＨＯ細胞を、Ｔ５００トリプルフラスコ（ＮＵＮＣ、ロチェスター、ニューヨーク）で培養した。融合タンパク質を単離するために、細胞上清を回収し、１ｍｌ  Ｈｉ  Ｔｒａｐタンパク質Ｇ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー）を用いて精製した。単離されたタンパク質をＰＢＳに対してｏ／ｎ透析した。
【０１０８】
細胞ＥＬＩＳＡによるＨＥＫ２９３細胞で発現されたＣＤ１３３抗原への一本鎖抗体の結合のテスト
ポリ−Ｌ−リシン９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、カリフォルニア）を、ＣＤ１３３発現細胞系ＡＣ１３３／２９３で以下の通りに被覆した。０．２ｍｌの培地中、１×１０５細胞を各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２でｏ／ｎインキュベートして細胞がプレートの表面に付着できるようにした。翌日、ウェルを０．２ｍｌ  ＰＢＳで１回洗浄し、０．１ｍｌ  ２％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中、ｐＨ７．４）で１０〜２０分、ＲＴで固定した。ウェルをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、１×ＲｏｔｉＢｌｏｃｋ又はＰＢＳ−Ｔ中３％乳のどちらかで１時間、ＲＴでブロックした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、それぞれの抗体の連続希釈物をウェルに添加し、振とうしながらＲＴで少なくとも１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、０．１ｍｌのＳｔｒｅｐＭＡｂ−Ｃｌａｓｓｉｃ−ＨＲＰ（ＰＢＳ−Ｔ中１：１００００、Ｉｂａ  ＢｉｏＴａｇｎｏｌｏｇｙ、ゲッティンゲン、ドイツ）又は０．１ｍｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ連結抗マウスＩｇＧ（ＰＢＳ−Ｔ中１：１００００、Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルク、ドイツ）を添加し、振とうしながらＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、０．１ｍｌの１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ブラウンシュバイク、ドイツ）を添加し、十分な青色染色が現れるまでインキュベートした。反応を停止するために、０．１ｍｌ  １Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加し、参照として４５０ｎｍ及び５９５ｎｍでの吸光度を、インフィニットＦ２００プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、メンネドルフ、スイス）で測定した。結合の特異性をテストするために、競合ＥＬＩＳＡを３００ｎｇ／ｍｌ（２ｎＭ）Ｗ６Ｂ３Ｈ１０親ｍＡｂ及び漸増量のコンペティタータンパク質を用いて行った。シグナルを抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ＰＢＳ−Ｔ中１：１００００、Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルク、ドイツ）を用いて検出した。
【０１０９】
固定化コラーゲンＩによる結合ＥＬＩＳＡ
Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２  ＨＢ  ９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ、ロチェスター、ニューヨーク）を、１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６中、０．１ｍｌ  １μｇ／ｍｌウシコラーゲンＩで、ｏ／ｎ、４℃で被覆した。ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ中、０．１ｍｌ  １×ＲｏｔｉＢｌｏｃｋ（Ｒｏｔｈ、カールスルーエ、ドイツ）で１時間ブロックし、融合タンパク質の３倍希釈液０．１ｍｌを添加する前に再度洗浄した。振とうしながらＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ウェルを、０．１ｍｌ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルク、ドイツ）ＰＢＳ−Ｔ中１：１００００と共に、振とうしながらＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、０．１ｍｌ  １−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（ＰＩＥＲＣＥ、ロックフォード、イリノイ）と共にインキュベートした。青色染色が十分に現れた後、反応を、０．１ｍｌ  １Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により停止した。吸光度を、インフィニットＦ２００プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、メンネドルフ、スイス）を用いて、参照波長として４５０ｎｍ及び５９５ｎｍで測定した。ＥＣ５０値を、４パラメーターロジスティックを用いてＳｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ  １１により計算した。
【０１１０】
せん断力下でのコラーゲンへのＣＤ１３３発現細胞の接着
ガラススライドを、Ｌａｎｇｅｒら（２００５年）に従い、１０μｇ／ｍｌコラーゲンＩで被覆し、フローチャンバー（Ｏｌｉｇｅｎｅ、ベルリン、ドイツ）に挿入した。スライドのコラーゲン被覆表面を、１０μｇ／ｍｌの融合タンパク質で３０分間前処理した。結合のＣＤ１３３依存性を示すために、スライドを、Ｗ６Ｂ３Ｈ１０  ｍＡｂと共に同様にインキュベートした。ＡＣ１３３／２９３細胞を添加し、２０００ｓ−１のせん断力下でインキュベートした。実験はビデオ録画し、オフライン評価した。
【０１１１】
マウスにおける頸動脈結紮及び生体顕微鏡法によるＥＰＣ接着の評価
ＣＤ１３３＋細胞は、記載されているように（Ｂｕｅｌｔｍａｎｎ  Ａら、２００３年）、ヒト臍帯血から単離した。
【０１１２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＥＰＣ動員に対する融合タンパク質の効果を評価するために、本発明者らは、記載されているように（Ｍａｓｓｂｅｒｇら、２００２年）、生体蛍光顕微鏡法を使用した。実験前、ＥＰＣを５−カルボキシフルオレセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＤＣＦ）で染色し、融合タンパク質（２０μｇ／ｍｌ／１００ｎＭ）又はＧＰＶＩ−Ｆｃ（１５μｇ／ｍｌ／１００ｎＭ）と共に３０分間インキュベートした。野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ミダゾラム（５ｍｇ／ｋｇ体重；Ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ）、メデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ体重；Ｐｆｉｚｅｒ）、及びフェンタニル（０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、ＣｕｒａＭｅｄ／Ｐｈａｒａｍ  ＧｍｂＨ）の溶液の腹腔内注射により麻酔した。ポリエチレンカテーテル（Ｐｏｒｔｅｘ）を右頸静脈に移植し、蛍光ＥＰＣ（５×１０４／２５０μｌ）を静脈内注射した。総頸動脈を自由に切開し、５分間強く（ｖｉｇｏｒｏｕｓｌｙ）結紮して血管損傷を誘発した。血管損傷の前後で、蛍光ＥＰＣと損傷した血管壁との相互作用を、落射照明用の１００−Ｗ  ＨＢＯ水銀ランプを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｔｅｃｈ顕微鏡（２０×水浸対物レンズ、Ｗ  ２０×／０．５；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を用いて、総頸動脈のｉｎ  ｓｉｔｕ、ｉｎ  ｖｉｖｏビデオ顕微鏡法により可視化した。接着ＥＰＣの数は、１５秒以内に内皮表面から動かない又は剥離しない細胞をカウントして評価した。この数は、細胞／ｍｍ２内皮表面として示される。
【０１１３】
ＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスでの心筋梗塞（Ｍｙｏｃａｒｄ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）モデル
ＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスを上記のように麻酔した。管を人工呼吸のため気管に挿入した。開胸後、左冠動脈下行枝をフィラメントで４５分間結紮した。結紮の開放により再灌流を促進した後、胸部及び気管の両方を縫合した。その直後及び４８時間後に、融合タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）又は等モル量のＦｃ対照タンパク質で３０分間前処理した単離ヒトＣＤ３４＋前駆細胞を、尾静脈を通じて静脈内に適用した。別の対照群は、術後に前駆細胞を全く得なかった。分画面積変化（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ａｒｅａ  ｃｈａｎｇｅ）（ＦＡＣ）を、介入後７及び２８日目に心エコーにより決定して、左心室機能を評価した。この後、マウスを殺処分し、梗塞領域のサイズをエバンズブルー及びＴＴＣ染色により分析した。
【０１１４】
ＣＤＲ移植によるマウス一本鎖抗体のヒト化
マウス配列に由来する融合タンパク質の一本鎖部分は、ＣＤＲ移植によるヒト化に供した。開始材料としての、一本鎖抗体の配列を内部に有する細菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ−ｓｃＦｖ−ｌｈのほか、ＣＤ１３３発現ＨＥＫ２９３細胞系ＡＣ１３３／２９３及びＨＥＫ２９３対照細胞を使用した。ヒト化手順に使用した方法を以下詳細に列挙する。
【０１１５】
ファージディスプレイライブラリーをパッキングするプロトコール
１．ヘルパーファージを調製する
ヘルパーファージは、対数期ＴＧ１細菌細胞を、３７℃、３０分間、種々の希釈でヘルパーファージに感染させ、２ＴＹプレートのトップアガーに播種して調製した。小さいプラークを、３ｍＬ液体２ＴＹ培地でＴＧ１の３０μＬ一晩培養物と共にインキュベートし、３７℃で２時間増殖させた。この培養物を１Ｌ  ２ＴＹ培地で希釈し、１時間増殖させた。カナマイシンを５０μｇ／ｍＬまで添加した後、培養物を３７℃で１６時間増殖させた。細胞を遠心分離（５０００ｇで１０分）により取り除き、０．２５ｖｏｌのファージ沈殿剤を添加してファージを上清から沈殿させた。氷上で３０分インキュベーション後、ファージ粒子を５０００ｇで１０分間、遠心分離により回収し、この後５ｍＬ  ＰＢＳにペレットを再懸濁し、０．２２μｍフィルターを通じて滅菌した。ヘルパーファージを、１００μＬ  ＴＧ１（飽和培養物）及びファージの希釈液を含有するトップアガー層を用いて２ＴＹプレートでプラーク形成単位（ｐｆｕ）の数を決定して滴定した。ファージストック溶液は、１×１０１３ｐｆｕ／ｍＬまで希釈し、−２０℃で、小アリコートで貯蔵した。
【０１１６】
２．オリジナルのライブラリーファージを調製する
ライブラリーファージは、５００ｍｌ  ２ＴＹ−Ｇにライブラリーグリセロールストックを接種し、６００ｎｍの光学密度０．８〜０．９まで２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートして調製した。ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを５×１０９ｐｆｕ／ｍｌの最終濃度まで培養物に添加し、培養物を振とうせずに３７℃で３０分間、次いで２００ｒｐｍでの静かな振とうにより３０分間インキュベートしてファージを感染させた。細胞を２，２００ｇ、１５分間遠心分離して回収し、ペレットを同じ容量の２ＴＹ−ＡＫに再懸濁した。この培養物は、急速振とう（３００ｒｐｍ）により３０℃で一晩インキュベートした。細胞を、４℃、１５分間、７０００ｇで遠心分離してペレット化し、ファージを含有する上清を、予冷した１Ｌボトルに回収した。０．３ｖｏｌのファージ沈殿剤を上清に添加し、混合し、氷上で１時間インキュベートしてファージを沈殿させた。ファージを、同じボトルで４℃、１５分間、７０００ｇで２回遠心分離してペレット化した。できるだけ多量の上清を回収し、ペレットを８ｍＬ  ＰＢＳに再懸濁した。ファージは、１０分間、１２，０００ｇ、より小さい管で再遠心分離し、出現する可能性がある細菌ペレットを妨害することなく、ファージを上清を介して回収した。最後に、ＴＧ１細胞をファージストックの希釈液で感染させ、２ＴＹ−ＡＧに播種し、インキュベートし、且つ出現するアンピシリン耐性コロニーの数を係数することにより、ファージストックを滴定した。ファージは、次いで４℃で、アリコートで貯蔵した。
【０１１７】
パンニングファージディスプレイライブラリーのプロトコール
マイクロタイターパンニングプレートのウェルを、３７℃で２時間インキュベートしてＣＤ１３３発現ＡＣ１３３／２９３細胞から直接得たＣＤ１３３組み込み膜製剤で被覆し、４℃、一晩、ブロッキング緩衝液（２％乳を含有するＰＢＳ）でブロックした。ブロックしたウェルを、０．１％ＰＢＳＴ（０．１〜０．３％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｖ／Ｖ）を含むＰＢＳ）で６回洗浄し、０．５ｍＬの合計容量中、等容量のファージライブラリーの混合物及び４％ＰＢＳＭを対照ウェルに添加した［プレブロックした］。
【０１１８】
初回のスクリーニング中、ファージ粒子の数は、ライブラリーサイズより少なくとも１００×高くなるべきである（例えば、１０１０クローンのライブラリーに対して１０１２ｃｆｕ）。初回後、多様性は１０６に低下し、故にスクリーニングのこの後の回にこのような要件は無い。プレートを、室温で３０分間インキュベートして結合部位をブロックした。インプットファージミックスを、パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）ウェル［標的タンパク質で被覆した］に添加し、室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳＭＴ（２％乳を含有するＰＢＳ）で１０〜２０回洗浄した。ファージを、２００μＬ酸性溶出緩衝液と共に室温で５分間インキュベートして溶出した。ファージを含有する上清を新たな管に移し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で中和した。大腸菌ＴＧ１の新鮮な指数関数的に増殖する培養物を、溶出したファージに感染させ、これらの半分を選択のさらなる回のため増幅させた。残りの溶出液は４℃で貯蔵した。
【０１１９】
品質管理（ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）ファージＦＡＣＳのプロトコール
ＡＣ１３３／２９３細胞を、５ｍｉｃｒｏＭ  ＥＤＴＡ（１０マイクロリットルの０．５Ｍストック）を含有する１ｍｌ  ＰＢＳに回収し、直ちに混合して凝固を回避し、氷上で維持した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ又は５％ＦＢＳのどちらかが補充された、０．０５％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）で２〜３×洗浄し、最終洗浄からの細胞ペレットを、５０マイクロリットルＦＡＣＳ緩衝液に懸濁した。１０マイクロリットルのファージ溶液を、５０マイクロリットルの細胞懸濁液に添加し、静かに混合し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２〜３×洗浄し、５０マイクロリットルＦＡＣＳ緩衝液に懸濁した。１０マイクロリットルの抗体［ウサギ抗Ｍ１３ｐＡｂ−ＦＩＴＣ］溶液を５０マイクロリットルの細胞懸濁液に添加し、静かに混合し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２〜３×洗浄し、分析のため２００〜３００マイクロリットルＦＡＣＳ緩衝液に懸濁した。
【０１２０】
ファージＦＡＣＳ方法及びＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ４．０ソフトウェアによる親和性測定のプロトコール
対象のファージディスプレイｓｃＦｖは、アッセイ前に同じ力価に標準化し、種々の力価に希釈し、上記のようにアッセイした。ファージＦＡＣＳのアウトプットは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４．０ソフトウェアのユーザーマニュアルに例示されているように、段階的に対象のｓｃＦｖの親和性を計算するために使用した。
【０１２１】
ヒト化融合タンパク質の発現及び精製
ヒト化一本鎖抗体クローン２６の配列情報を受け取った後、ヒト化融合タンパク質の配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでアセンブルし、合成し、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア）にクローニングした（Ｇｅｎｅａｒｔ、レーゲンスブルク、ドイツ）。安定な細胞系を、前述したプロトコールに従い生成し、融合タンパク質が、発現され、ＣＨＯ細胞の上清に分泌され、１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐタンパク質Ｇ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー）を用いて精製された。単離されたタンパク質をＰＢＳに対してｏ／ｎ透析した。
【０１２２】
細胞ＥＬＩＳＡによるＨＥＫ２９３細胞で発現されたＣＤ１３３抗原へのヒト化融合タンパク質の結合のテスト
ポリ−Ｌ−リシン９６ウェルプレートを、１ウェル当たり６〜７×１０４ＡＣ１３３／２９３細胞のみで被覆したことを除く、上記のような方法。
【０１２３】
左総頸動脈の結紮後の血小板凝集を決定するための生体顕微鏡法
生体顕微鏡実験のため、オスＣ５７ＢＩ／６Ｊマウスを使用した。血小板リッチ血漿は、タイロード緩衝液、ｐＨ６．５で２ｍｌに調整していたドナーマウスの１ｍｌクエン酸血から、１０分間、１２０×ｇでの遠心分離により調製した。血小板を含有する上清を分離し、血小板を、２０μｌ  ５−カルボキシ−フルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加、及び暗所で、ＲＴで５分間のインキュベーションにより蛍光標識した。容量をタイロード、ｐＨ６．５で４ｍｌまで満たし、血小板を１２分間、９００×ｇでの遠心分離により沈降させた。血小板を２５０μｌのタイロード、ｐＨ６．５、及びタイロード、ｐＨ７．４にそれぞれ再懸濁し、アリコートをカウントし、血小板数を２．８×１０１０／ｍｌに調整した。実験マウス（２４±２ｇ）を、メデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ体重；Ｐｆｉｚｅｒ）、ミダゾラム（５ｍｇ／ｋｇ体重；Ｒｏｃｈｅ）、及びフェンタニル（０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）の溶液の腹腔内注射により麻酔した。術中の体温は、恒温ブランケットシステム（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて３８．５℃で一定に維持した。ポリエチレンカテーテル（Ｐｏｒｔｅｘ）を左尾静脈に移植し、左総頸動脈の切開後、２５０μｌ（７×１０９）標識血小板を尾静脈に静脈内注射した。この後、１ｍｇ／ｋｇ体重のヒト化融合タンパク質、又は等モル量のＦｃＩｇＧ２対照タンパク質を静脈内に適用した。左総頸動脈を、フィラメント（７−０  Ｐｒｏｌｅｎｅ、Ｅｔｈｉｃｏｎ）で５分間強く結紮して血管損傷を誘発した。結紮の領域は、結紮後種々の時間間隔で、落射照明用の１００Ｗ  ＨＢＯ水銀ランプを備えた蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ２  ＦＳ  ｍｏｔ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）及びｓ／ｗ−ＣＣＤカメラＢＣ７１（Ｈｏｒｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いてモニターした。血小板凝集は、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ５ソフトウェア（血小板凝集により生じたより高い光強度を有する領域のサイズがピクセルで測定され、次いで規定のグリッドを用いてμｍ２に移される）による３つの固定画像の平均の分析により決定した。
【０１２４】
結果及び考察
モノクローナル抗体Ｗ６Ｂ３Ｈ１０をコードする可変配列の同定及びコンストラクト設計
各プライマー組み合わせを有する生成物をもたらしたＰＣＲ増幅後、バンドをゲルから切除し、精製し、配列決定した。各々３つの異なるプライマーを有する、配列決定から得られた配列をアセンブルし（図１）、ＮＣＢＩのＩＧＢＩａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を用いてＩｇＧデータベースと比較した。
【０１２５】
２つの可能性のある配向「軽−重」又は「重−軽」での一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の配列を確立するために、各々リーダー配列をデータベースＶ−Ｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ参照）からランダムに選択して、哺乳動物細胞培養物の培地への抗体の分泌を促進した。
【０１２６】
重鎖及び軽鎖の配列は、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（配列番号１３）をコードするＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーにより連結した。親和性精製による一本鎖抗体の単離を可能にするために、Ｓｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩをコードする配列をＣ末端に付加した。ｓｃＦｖ−ｌｈ及びｓｃＦｖ−ｈｌと名付けられたコンストラクトの確立配列を、図２に示す。
【０１２７】
一本鎖抗体の発現及びＣＤ１３３への結合のテスト
一本鎖コンストラクトによるＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクション後、弱い発現をｓｃＦｖ−ｌｈで検出することができた（図３参照）。
【０１２８】
大規模トランスフェクション後、細胞ＥＬＩＳＡでＣＤ１３３への結合をテストするのに十分なタンパク質を単離することができた。同時に、タンパク質は、十分なストック作製のため大腸菌でも発現させた。ＣＨＯ細胞で発現させることができなかったＳｃＦｖ−ｈｌは、大腸菌からのみ作製及び精製した（図４参照）。
【０１２９】
一本鎖抗体がこれらの抗原ＣＤ１３３を認識するかテストするために、一本鎖抗体の３倍希釈系列を、表面でＣＤ１３３抗原を発現している固定されたＡＣ１３３／２９３細胞でインキュベートした。低ナノモル範囲で高い親和性でのｓｃＦｖ−ｌｈの明らかな結合があったのに対し、驚くべきことに、ＣＤ１３３に対するｓｃＦｖ−ｈｌの親和性（図５Ａ参照）は検出されなかった。
【０１３０】
大腸菌から精製したｓｃＦｖ−ｌｈが、哺乳動物細胞培養物から単離したものと同じ結合特性を示したため、この所見は、異なる発現系によるものではなかった。
【０１３１】
ＣＤ１３３とのｓｃＦｖ−ｌｈの相互作用の特異性をテストするため、固定されたＡＣ１３３／２９３細胞におけるＣＤ１３３への２ｎＭのＷ６Ｂ３Ｈ１０  ｍＡｂの結合を、漸増量の一本鎖抗体と競合させた。これは、ｓｃＦｖ−ｌｈが、３．１ｎＭのＩＣ５０値で、抗原ＣＤ１３３へのモノクローナル抗体の結合を効率的にブロックできることを明らかに実証した（図５Ｂ）。この予想外に高い親和性は、より大きいｍＡｂよりもｓｃＦｖ−ｌｈに対して固定化ＣＤ１３３を近づけさせる、はるかに小さいサイズの分子に起因している可能性がある。
【０１３２】
融合タンパク質の設計、発現及び特徴付け
融合タンパク質の成分としてｓｃＦｖ−ｌｈを同定した後、ＧＰＶＩ−ＦｃＩｇＧ２を二官能性タンパク質の第２の部分として選択した。ＧＰＶＩがコラーゲンへの結合を媒介するはずである一方、ＩｇＧ２のヒトＦｃ部分は、一方で親和性精製を促進するため、他方でより一般的に使用されるＦｃＩｇＧ１に関連した望ましくないエフェクター機能を回避するために選択した。したがって、融合タンパク質は、一本鎖抗体成分ｓｃＦｖ−ｌｈの後に可溶性糖タンパク質ＶＩ及びＦｃＩｇＧ２が続き、より柔軟性を持たせるため３つのアミノ酸ＧＧＲリンカーにより分離されるように設計した（図６）。
【０１３３】
融合タンパク質は、Ｔ５００トリプルフラスコで安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の接着培養で発現させた。上清は、タンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。融合タンパク質の典型的な収量は、２〜２．７ｍｇ／ｌの範囲にあった。
【０１３４】
タンパク質の同一性及び純度は、西洋ワサビペルオキシダーゼに連結した抗ヒトＩｇＧ抗体を用いるウェスタンブロット（データ不図示）、及びクーマシーブリリアントブルー染色ポリアクリルアミドゲル（図７）により制御した．
【０１３５】
還元条件下の融合タンパク質の分離は、約９０ｋＤのバンドサイズをもたらした。非還元条件下の分子量は、約１８０ｋＤであり、タンパク質が二量体として存在することを明らかに示した。
【０１３６】
７９．１ｋＤの単量体タンパク質の理論的分子量は、タンパク質が、最も好ましくはグリコシル化により、翻訳後修飾されなければならないことを示している。
【０１３７】
血小板糖タンパク質ＶＩについて、唯一のＮ連結グリコシル化部位は、アミノ酸９２に記載されている（Ｋｕｎｉｃｋｉら、２００５年）。一本鎖抗体部分がＮ連結グリコシル化のコンセンサス配列を持たないのに対し、ＩｇＧ２のＦｃ部分も１つのＮ連結グリコシル化部位を内部に有する。これら２つのグリコシル化部位は、観察されたサイズ差を説明するのに十分でないため、融合タンパク質は、さらなるＯ連結グリコシル化部位を含有している可能性がある。
【０１３８】
ＣＤ１３３及びコラーゲンへの融合タンパク質の結合特性
ＣＤ１３３への融合タンパク質及びＷ６Ｂ３Ｈ１０  ｍＡｂの結合を、ＥＬＩＳＡにより固定されたＡＣ１３３／２９３細胞と比較した（図８Ａ）。観察された、融合タンパク質のＥＣ５０値０．２１ｎＭ及びＷ６Ｂ３Ｈ１０  ｍＡｂのＥＣ５０値０．１２ｎＭは、同じ桁であった。故に抗原ＣＤ１３３への融合タンパク質の結合特性は、一本鎖抗体と比べて改善した。これは、完全長抗体で見出される状態に類似した２つの同一抗原結合部位をもたらす、融合タンパク質の二量体化により部分的に説明され得るのみである。
【０１３９】
一本鎖ポリペプチドに続くＧＰＶＩ−ＦｃＩｇＧ２ポリペプチドは、一本鎖抗体部分の三次元構造に対するいくらかの安定効果を有している可能性があり、抗原結合に有益であると思われる。結合の特異性を確認するため、競合ＥＬＩＳＡを、２ｎＭ  Ｗ６Ｂ３Ｈ１０  ｍＡｂ及び漸増量の融合タンパク質で行った。固定されたＡＣ１３３／２９３細胞へのｍＡｂの結合の効率的な抑制は、結合がＣＤ１３３に媒介されることを裏付けている（図８Ｂ参照）。
【０１４０】
第２の結合パートナー、コラーゲンＩへの融合タンパク質の結合も示された。固定化コラーゲンＩを用いたＥＬＩＳＡでは、融合タンパク質の結合をＧＰＶＩ−ＦｃＩｇＧ１の結合と比較した。両方について用量依存結合を観察することができたが、驚くべきことに、結合親和性は異なっていた（図９Ａ）。コラーゲンへの融合タンパク質の結合の特異性を、可溶性コラーゲンＩを用いた競合ＥＬＩＳＡにより確認した（図９Ｂ）。
【０１４１】
動的条件下の融合タンパク質の二重特異性結合
前の実験では、各結合パートナーへの融合タンパク質の結合は別々に実証した。両方の標的タンパク質への同時結合による分子の二官能性を確認するために、ガラススライドを１０μｇ／ｍｌコラーゲンＩで被覆し、フローチャンバーに挿入し、１０μｇ／ｍｌの融合タンパク質と共にプレインキュベートし、且つヒト血流に見られる条件を模した２０００／ｓのせん断力下でＣＤ１３３発現ＡＣ１３３／２９３細胞と共にインキュベートした。この実験は、融合タンパク質が、せん断力下でさえコラーゲンへのＣＤ１３３発現細胞の結合を極めて効率的に媒介することを実証する。
【０１４２】
結合は、親Ｗ６Ｂ３Ｈ１０ｍＡｂの添加により逆転することができた。これは、コラーゲン表面でのＡＣ１３３／２９３細胞の固定化がＣＤ１３３依存性であることを示している（図１０）。
【０１４３】
損傷血管へのＥＰＣのｉｎ  ｖｉｖｏでの結合
ＣＤ１３３発現ＥＰＣが効率的に動員され得、且つ損傷血管の壁に付着され得るかをテストするために、ＥＰＣをヒト臍帯血から単離し、蛍光標識し、融合タンパク質又は対照タンパク質ＧＰＶＩ−Ｆｃのどちらかと共にプレインキュベートし、次いで麻酔したマウスの頸静脈に静脈内適用した。頸動脈の血管壁の損傷後、付着したＥＰＣの数を漸増時間間隔でカウントした。融合タンパク質は、対照タンパク質と比べて、付着したＥＰＣの数を有意に増加させたことが明らかに示され、最多数の細胞は損傷の５分後であったが、６０分後も依然として有意な数の細胞であった（図１１）。
【０１４４】
対照タンパク質とのＥＰＣプレインキュベーションも、相当量の接着ＥＰＣをもたらすという観察は、ＥＰＣが血管損傷の部位に接着する（血小板により媒介される）という確立された所見により説明することができる（Ａｂｏｕ−Ｓａｌｅｈら、２００９年）。融合タンパク質とのプレインキュベーションは、循環ＥＰＣの数が低く且つ同種ＥＰＣ移植又はｅｘ  ｖｉｖｏ増殖自家ＥＰＣ移植のどちらかにより治療され得る、冠状動脈疾患のリスク因子を有する患者において特に有益であり得る。
【０１４５】
ＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスにおける心筋梗塞モデルでの左心室機能及び梗塞領域に対する融合タンパク質の影響
梗塞は、左下行冠状動脈の結紮によりＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスで誘発した。左心室の機能及び梗塞領域のサイズの両方に対する、２０μｇ／ｍｌの融合タンパク質で前処理したＣＤ３４＋前駆細胞の適用の効果を、心エコー及び殺処分後の心臓の染色により分析した。左心室機能に対する効果は、手術７日後では観察することができなかったのに対し、２８日目での有意差は、前駆細胞で治療していない動物及びＦｃ対照とインキュベートした前駆細胞で治療した動物と比べて明らかであった（図１２Ａ参照）。融合タンパク質治療は、図１２Ｂに示されているように梗塞領域のサイズの有意な減少ももたらした。観察されたプラスの効果の根底にある機構は、これまで確認されていない。多くの動物試験は、心筋修復のために移植された幹細胞のほんの一部のみが、心筋細胞又は血管細胞に分化したことを示しているが、観察された心臓の改善は、栄養サポートによって、又は前駆細胞により分泌され、且つ隣接細胞に有益な効果を与え得若しくは常在心臓幹細胞を活性化し得るパラクリン因子によって生じる可能性があると考えられている（Ｇｒｅｃｏ＆Ｌａｕｇｈｌｎ、２０１０年）。
【０１４６】
ヒト化ｓｃ抗体を発現するファージの特徴付け
ＣＤＲ配列がヒトサブグループコンセンサス（Ｈ−Ｓｕｂｌ−κ及びＨ−Ｓｕｂｌ−ＶＨ）アクセプターフレームワーク配列に移されるＣＤＲ移植による抗体ヒト化の手順は、膜結合ＣＤ１３３に著しい親和性を有する３つのファージクローン（２６、２７、２９）の同定をもたらした。ファージ希釈系列のＦＡＣＳ測定は、クローン２６については（平均蛍光指数）３２．１９ｐＭ、並びにクローン２７及び２９については５０．７８ｐＭ及び１０２．９ｐＭのＫＤをそれぞれ示した（図１３Ａ、１３Ｂ）。比較すると、オリジナルのマウス一本鎖抗体を内部に有するファージは、２つの独立した実験において２５．６３及び２６．９３ｐＭのＫＤを示した。マウスドナー及びヒトアクセプター配列と比較した、オンラインツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｈａｂ／）を用いたクローン２６のＶＬ及びＶＨ配列のヒトらしさの評価は、ヒトアクセプター配列の値の方へのＺスコアの移行を示し（図１４参照）、ヒト化配列のよりヒト様の特性を裏付けている。これは、マウス又はヒトアクセプター配列を有するヒト化一本鎖抗体のタンパク質配列の比較によっても実証することができる（図１５参照）。ヒト化抗体は、７６％の配列同一性を示し、違いは異なる相補性決定領域が主な原因であるのに対し、マウス一本鎖抗体は、ヒトアクセプター配列と比べてアミノ酸配列で５９％同一であるのみである。両方のアラインメントにおいて、連結リンカーペプチド配列は除外した。ヒト化融合タンパク質のヌクレオチド配列と、マウス由来一本鎖部分を有する親分子のアミノ酸配列とのアラインメントは、９５％の配列同一性をもたらした（図１６参照）。
【０１４７】
ヒト化融合タンパク質の生成及びこの発現及び特徴付け
マウス一本鎖配列と比べて同じ桁であった、膜結合ＣＤ１３３に最も高い親和性を示すヒト化一本鎖抗体の配列（クローン２６）を、ヒト化融合タンパク質ｈｓｃＦｖ−ｌｈ−ＧＰＶＩ−Ｆｃを確立するのに選択した（図１６参照）。タンパク質のバッチを、安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞系により作製し、タンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーにより細胞上清から精製した。タンパク質の同一性は、融合タンパク質のＦｃフラグメントに結合する抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてウェスタンブロットにより確認した。純度は、クーマシーブリリアントブルー色素で染色したポリアクリルアミドゲルにおいて制御した。還元及び非還元条件の両方で、ヒト化融合タンパク質は、マウス一本鎖部分を有する融合タンパク質と同じ泳動挙動を示した（図１８参照）。したがって、ヒト化の過程は、分子のグリコシル化パターン又は二量体化のように、翻訳後修飾に関して融合タンパク質を改変しなかったことが最も考えられる。
【０１４８】
ＣＤ１３３抗原及びコラーゲンへのヒト化融合タンパク質の結合のテスト
固定された細胞を用いた細胞ＥＬＩＳＡによる、安定な細胞系ＡＣ１３３／２９３での膜貫通タンパク質ＣＤ１３３へのヒト化融合タンパク質の結合を、親融合タンパク質の結合と比較した（図１９）。シグマプロット１１．０により計算した両方の分子のＥＣ５０は、０．２５〜０．３ｎＭの同じ範囲にあった。２ｎＭ  Ｗ６Ｂ３Ｈ１０ｍＡｂ及びコンペティターとしての融合タンパク質を用いた競合ＥＬＩＳＡは、結合の特異性を裏付け、且つヒト化及びマウス融合タンパク質について、それぞれ２．７及び３．１ｎＭのＩＣ５０値を示した。融合タンパク質のヒト化は、コラーゲンＩに対するＧＰＶＩ部分の結合特性を改変しなかったはずである。この仮定を証明するために、固定化ウシコラーゲンＩを用いてＥＬＩＳＡにより結合を測定した。ヒト化及び親融合タンパク質について、それぞれ４．７及び６．３ｎＭのＥＣ５０値により、両方のタンパク質の用量依存結合が示され得た（図２０参照）。
【０１４９】
マウスモデルにおける総頸動脈の損傷後の血小板凝集に対するヒト化融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ効果
ヒト化融合タンパク質が総頸動脈の損傷後の血小板凝集に対し何らかの影響を与えるかをテストするために、ドナーマウスの蛍光標識血小板を静脈内投与し、この後、１ｍｇ／ｋｇのヒト化融合タンパク質又は等モル量のＦｃ対照タンパク質を注入し、血管を直ちに結紮した。結紮後６０分までに形成された血小板凝集のサイズの決定は、ヒト化融合タンパク質で治療した群と対照群との間の高い有意差を示し（ｐ＜０．００５、スチューデントｔ検定）図２３参照）、ｉｎ  ｖｉｖｏでのコラーゲン結合をめぐって血小板結合ＧＰＶＩと競合するヒト化融合タンパク質の能力を裏付けた。これは、同様に血小板活性化及び凝集体形成の減少をもたらした。
【０１５０】
（参考文献）
Ａｂｏｕ−Ｓａｌｅｈ  Ｈ、Ｙａｃｏｕｂ  Ｄ、Ｔｈｅｏｒｅｔ  ＪＦ、Ｇｉｌｌｉｓ  ＭＡ、Ｎｅａｇｏｅ  ＰＥ、Ｌａｂａｒｔｈｅ  Ｂ、Ｔｈｅｒｏｕｘ  Ｐ、Ｓｉｒｏｉｓ  ＭＧ、Ｔａｂｒｉｚｉａｎ  Ｍ、Ｔｈｏｒｉｎ  Ｅ、Ｍｅｒｈｉ  Ｙ、内皮前駆細胞は血小板に結合し血小板機能及び血栓形成を抑制する（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｉｎｄ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｕｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２０（２００９年）、２２３０〜２２３９頁
Ｂｕｅｌｔｍａｎｎ  Ａ、Ｇａｗａｚ  Ｍ、Ｍｕｎｃｈ  Ｇ、Ｕｎｇｅｒｅｒ  Ｍ、Ｍａｓｓｂｅｒｇ  Ｓ、糖タンパク質ＶＩドメインを含むイムノアドヘシン（Ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｄｏｍａｉｎ）、ＷＯ０３１０４２８２（２００３年）
Ｄｕｂｅｌ  Ｓ、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  Ｆ、Ｆｕｃｈｓ  Ｐ、Ｚｅｗｅ  Ｍ、Ｇｏｔｔｅｒ  Ｓ、Ｗｅｌｓｃｈｏｆ  Ｍ、Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  Ｇ、Ｌｉｔｔｌｅ  ＭＪ、プライマーの単純セットによるポリメラーゼ連鎖反応を用いた様々なマウス及びラットハイブリドーマ細胞系からのＩｇＧ抗体Ｆｖ−ＤＮＡの単離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｖ-ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｒａｔ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｐｒｉｍｅｒｓ）。Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５（１９９４年）、８９〜９５頁。
Ｇｒｅｃｏ  Ｎ及びＬａｕｇｈｌｎ  ＭＪ、心筋修復及び再生のための臍帯血幹細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）。Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．６６０（２０１０年）２９〜５２頁。
Ｋｕｎｉｃｋｉ  ＴＪ、Ｃｈｅｌｉ  Ｙ、Ｍｏｒｏｉ  Ｍ、Ｆｕｒｉｈａｔａ  Ｋ、血小板糖タンパク質ＶＩの機能に対するＮ連結グリコシル化の影響（Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｎ-ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ）、Ｂｌｏｏｄ  １０６（２００５年）、２７４４〜２７４９頁
Ｌａｎｇｅｒ  Ｈ、Ｍａｙ  ＡＥ、Ｂｕｌｔｍａｎｎ  Ａ、Ｇａｗａｚ  Ｍ、ＡＤＡＭ１５は血小板ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａの接着受容体であり血小板活性化を誘導する（ＡＤＡＭ  １５  ｉｓ  ａｎ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ＧＰＩＩｂ-ｌｌｌａ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．９４、（２００５年）、５５５〜６１頁
Ｍａｓｓｂｅｒｇ  Ｓ、Ｂｒａｎｄ  Ｋ、Ｇｒｕｎｅｒ  Ｓ、Ｐａｇｅ  Ｓ、Ｍｕｌｌｅｒ  Ｅ、Ｍｕｌｌｅｒ  Ｉ、Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ  Ｗ、Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｔ、Ｌｏｒｅｎｚ  Ｍ、Ｋｏｎｒａｄ  Ｉ、Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  Ｂ、Ｇａｗａｚ  Ｍ、アテローム性動脈硬化病変形成の開始における血小板接着の重要な役割（Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６（２００２年）、８８７〜８９６頁
Ｍｏｒｏｉ  Ｍ及びＪｕｎｇ  ＳＭ、血小板糖タンパク質ＶＩ：その構造及び機能（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ：ｉｔｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．１１４、（２００４年）、２２１〜３３頁。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013532954.tif 000033
2013532954.tif 000034