(57)【要約】核酸配列の分析のためのナノ細孔アレイからの単一分子シグナルの光学的検出のための技法が記載される。これらの技法は、迅速多重ＤＮＡシーケンシングのために有用である。【選択図】図１ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の分析方法であって、以下の：
（ａ）ナノ細孔アレイ中の複数のナノ細孔を通る担体分子の制御移行の間に複数の担体分子から複数の光学的標識化オリゴヌクレオチドを置き換えること（この場合、各担体分子はナノ細孔アレイ中の異なるナノ細孔を通過する）、及び、
（ｂ）光学的標識化オリゴヌクレオチドが異なる担体分子から置き換えられる場合、光学的標識化オリゴヌクレオチドからの複数の光学シグナルを検出すること、
を包含する方法。
【請求項２】
ナノ細孔アレイ中の前記ナノ細孔が、約０．１ｎｍ〜約１μｍの厚みを有する固体状態膜中に存在する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記固体状態膜が機械的に安定な膜を作る物質を含む請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記膜が、ケイ素、窒化ケイ素、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウムまたはグラフェンを含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ナノ細孔が約１〜約２０ｎｍの直径を有する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノ細孔が約０．５〜約１０μｍ離れた間隔で配置される請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノ細孔アレイが２〜約１００，０００個のナノ細孔を備える請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
光源を用いて光学的標識化オリゴヌクレオチドに関連した光学標識を励起すること、を更に包含する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記光源がレーザーである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
光学標識が複数の光源で励起され、各光源が異なる発光スペクトルを有する、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記光学シグナルが膜の表面から検出される請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記光学シグナルが、少なくとも５００フレーム／秒を記録可能な装置で検出される請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記光学シグナルが、少なくとも１，０００フレーム／秒を記録可能な装置で検出される請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
光学的検出が、捕捉センサーの異なる領域上の多重スペクトルスプリットの平行検出を包含する請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記領域数が２である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記領域数が４である請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
捕捉センサー上の各領域が、捕捉フレームあたり１個の個別画像を生じる請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
各画像が当該核酸配列中の単一核酸塩基を表す請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記光学シグナルがＣＣＤ型カメラで検出される請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記光学シグナルがＥＭ−ＣＣＤ型カメラで検出される請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記光学シグナルがＣＭＯＳ型カメラで検出される請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記光学シグナルが膜のいずれかの側面から検出される請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記光学シグナルが膜のシス(cis)側面から検出される請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ナノ細孔アレイ中の単一ナノ細孔を通過する担体分子から１つの光学的標識化オリゴヌクレオチドを置き換えることが、単一の検出可能な光学シグナルを発生させる請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記光学シグナルが蛍光シグナルである請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
個々のナノ細孔からの前記蛍光シグナルが少なくとも５００光子破裂／秒の速度で生成される請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
各蛍光シグナルが当該核酸配列中の単一核酸塩基を表す請求項２５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記蛍光シグナルが蛍光強度比に基づいたヌクレオチド同定を可能にする請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ナノ細孔アレイ中のナノ細孔を通した制御化移行が前記担体分子からの別個の光学的標識化オリゴヌクレオチドの置き換えにより自己調節される請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記担体分子がＤＮＡまたはＲＮＡを含む請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
環状ＤＮＡ転換工程により当該核酸配列から担体分子を作製すること、を更に包含する請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記担体分子が約１００〜約５０，０００ヌクレオチド長である請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
各光学的標識化オリゴヌクレオチドが当該核酸配列中の単一核酸塩基を表す請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ナノ細孔アレイ中のナノ細孔を通した制御移行が酵素またはタンパク質を利用しない請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
約１００〜約５００の光学的標識化オリゴヌクレオチドが、単一担体分子からナノ細孔当たりで置き換えられる請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも５００の光学的標識化オリゴヌクレオチドが、単一担体分子から置き換えられる請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記自己調節が、以下の因子：
（ｉ）膜を横断して適用される電圧勾配；
（ｉｉ）温度；
（ｉｉｉ）置換光学的標識化オリゴヌクレオチド中の核酸塩基数；
（ｉｖ）置換光学的標識化オリゴヌクレオチドのＧ−Ｃ含量；
（ｖ）置換光学的標識化オリゴヌクレオチドの化学組成；および
（ｖｉ）膜のいずれかの側面の電解質状態、
のうちの１つ以上に基づいている請求項２９記載の方法。
【請求項３８】
前記ナノ細孔直径が担体分子の捕捉の比率を制御する請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ナノ細孔アレイ中のナノ細孔が化学的または生物学的に修飾されていない請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記光学的標識化オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡを包含する請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記担体分子が当該核酸配列の配列情報を表す請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
担体分子からの光学的標識化オリゴヌクレオチドの置き換えにより生成される光学シグナルの逐次的検出から当該核酸配列の配列を獲得すること、を更に包含する請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
当該核酸配列がＤＮＡを包含する請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
異なる担体分子に関連した光学的標識化オリゴヌクレオチドからの前記光学シグナルが同時的に検出される請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
光学シグナルをナノ細孔アレイ中の特定ナノ細孔と関連づけること、を更に包含する請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法を実施するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との相互引照）
本出願は、米国特許仮出願第６１／３９５，３２３号（２０１０年５月１１日出願）（この記載内容の全部を組み込により本明細書中で援用される）に対する利益または優先権を主張する。
（政府支援）
本発明は、米国国立衛生研究所により授与される契約番号ＨＧ−００４１２８下での政府支援によりなされた。米国政府は、本発明にある権利を有する。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、核酸分析の分野に関する。特に本発明は、核酸配列の分析のためのナノ細孔アレイからの単一分子シグナルの光学的画像処理に関する。
【背景技術】
【０００３】
ナノ細孔ベースのＤＮＡシーケンシングは、前途有望な次世代シーケンシングプラットフォームであると、広範にみなされている（本書末の参考文献［１、２］参照）。ナノ細孔法の２つの主な特徴は、単一分子ベースのゲノム解析のためにそれを例外的に有用にする；第一に、電気泳動的に集中させて、大部分からの非常に長いＤＮＡ分子をナノ細孔に通して、微小ＤＮＡ試料を分析できるようにする方法の能力（参考文献［３］）、そして第二に、５ｎｍ未満のナノ細孔は、長いＤＮＡコイルを線状にするために目下ごく普通に用いられており、したがって原則として、ナノ細孔は、長いゲノムに沿って情報を有効に「走査」するために用いられ得る。これらの特徴、ならびに固体状態ナノ細孔が高密度アレイにおいて製作可能である（参考文献［４、５］）、という事実は、大幅な平行検出の開発を可能にし、そして無増幅、低経費および高処理量シーケンシング(参考文献［２、６〜９］)の実現のために極めて重要である。
【０００４】
ナノ細孔は、イオン溶液を含有する２つの小室を分離する超薄膜中のナノメートルサイズの細孔である。膜を横断して適用される外部電場はイオン流ならびに細孔付近の局所的電位勾配を作り出し、これが、単一ファイル方式で細孔を通して生体ポリマーを引き入れて通す（参考文献［３、１０］）。生体ポリマーが細孔に進入すると、それは電解質の一分画を置き換えて、細孔伝導度の変化を生じるが、これは電位計を用いて直接測定され得る。多数のナノ細孔ベースのＤＮＡシーケンシング法が近年提唱されており、２つの主な挑戦を強調している（参考文献［１、１１］に記載）：（１）個々のヌクレオチド間を区別する能力、すなわち、当該系は、単一分子レベルで４つの塩基間を識別することができなければならない；ならびに（２）当該方法は、平行読出しが可能でなければならない。単一ナノ細孔は一度に単一分子のみをプローブし得るので、ナノ細孔のアレイを製造し、同時にそれらをモニタリングするための戦略が必要とされる。
【０００５】
今までのところ、任意のナノ細孔ベースの方法による平行読出しは、未だ実証されていない。今日および将来世代シーケンシング法の多くは、読出し過程における酵素（ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ等）の使用に頼っている。しかしながら、酵素活性の動力学は、読出し速度を増大するための大きな障害であり、これらの方法は酵素の落ち着いた活性に支配されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】（特になし）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、一部は、高処理量ベースの認識のためのナノ細孔ベースの方法が、読み出し段階の間に酵素を必要とせずに可能であるという発見に；そして一部は、多数のナノ細孔からのシグナルの光学的検出を可能にする方法の開発に基づいている。
【０００８】
下記の実施形態のいずれかは、相互排他的である場合を除いて、任意の所望の点で組合わされ得る、と理解される。任意の実施形態または実施形態の組合せは、下記の態様の各々に適用され得る、ということも理解される。
【０００９】
一態様において、本発明は、核酸の分析方法であって、以下の：（ａ）ナノ細孔アレイ中の複数のナノ細孔を通る担体分子の制御移行の間に複数の担体分子から複数の光学的標識化オリゴヌクレオチドを置き換えること（この場合、各担体分子はナノ細孔アレイ中の異なるナノ細孔を通過する）；そして（ｂ）光学的標識化オリゴヌクレオチドが異なる担体分子から置き換えられる場合、光学的標識化オリゴヌクレオチドからの複数の光学シグナルを検出することを包含する方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔アレイ中のナノ細孔は、約０．１ｎｍ〜約１μｍの厚みを有する固体状態膜中に存在する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、固体状態膜は、機械的に安定な膜を作る物質を含む。いくつかの実施形態では、膜は、ケイ素、窒化ケイ素、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウムまたはグラフェンを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔は、約１〜約２０ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ細孔は、約０．５〜約１０μｍ離れた間隔で配置される。いくつかの実施形態では、ナノ細孔アレイは、２〜約１００，０００個のナノ細孔を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、当該方法は、光源を用いて光学的標識化オリゴヌクレオチドに関連した光学標識を励起することをさらに包含する。いくつかの実施形態では、光源はレーザーである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、光学標識は複数の光源で励起されるが、この場合、各光源は異なる発光スペクトルを有する。いくつかの実施形態では、光学シグナルは膜の表面から検出される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、光学シグナルは、少なくとも５００フレーム／秒を記録可能な装置で検出される。いくつかの実施形態では、光学シグナルは、少なくとも１，０００フレーム／秒を記録可能な装置で検出される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、光学的検出は、捕捉センサーの異なる領域上の多重スペクトルスプリットの平行検出を包含する。いくつかの実施形態では、領域数は２である。他の実施形態では、領域数は４である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、捕捉センサー上の各領域は、捕捉フレームあたり１個の個別画像を生じる。いくつかの実施形態では、各画像は当該核酸配列中の単一核酸塩基を表す。
【００１８】
いくつかの実施形態では、光学シグナルはＣＣＤ型カメラで検出される。他の実施形態では、光学シグナルはＥＭ−ＣＣＤ型カメラで検出される。さらに他の実施形態では、光学シグナルはＣＭＯＳ型カメラで検出される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、光学シグナルは膜のいずれかの側面から検出される。いくつかの実施形態では、光学シグナルは膜のシス側面から検出される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔アレイ中の単一ナノ細孔を通過する担体分子からの１つの光学的標識化オリゴヌクレオチドを置き換えは、単一の検出可能な光学シグナルを発生させる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、光学シグナルは蛍光シグナルである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、個々のナノ細孔からの蛍光シグナルは、少なくとも５００光子破裂／秒の速度で生成される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、各蛍光シグナルは、当該核酸配列中の単一核酸塩基を表す。いくつかの実施形態では、蛍光シグナルは蛍光強度比に基づいたヌクレオチド同定を可能にする。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔アレイ中のナノ細孔を通した制御化移行は、担体分子からの別個の光学的標識化オリゴヌクレオチドの置き換えにより自己調節される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、担体分子はＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、当該方法は、環状ＤＮＡ転換工程により当該核酸配列から担体分子を作製することをさらに包含する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、担体分子は、約１００〜約５０，０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、各光学的標識化オリゴヌクレオチドは当該核酸配列中の単一核酸塩基を表す。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔アレイ中のナノ細孔を通した制御移行は、酵素またはタンパク質を利用しない。
【００２９】
いくつかの実施形態では、約１００〜約５００の光学的標識化オリゴヌクレオチドは、単一担体分子からナノ細孔当たりで置き換えられる。いくつかの実施形態では、少なくとも５００の光学的標識化オリゴヌクレオチドは、単一担体分子から置き換えられる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、自己調節は、以下の因子：（ｉ）膜を横断して適用される電圧勾配；（ｉｉ）温度；（ｉｉｉ）置換光学的標識化オリゴヌクレオチド中の核酸塩基数；（ｉｖ）置換光学的標識化オリゴヌクレオチドのＧ−Ｃ含量；（ｖ）置換光学的標識化オリゴヌクレオチドの化学組成；および（ｖｉ）膜のいずれかの側面の電解質状態のうちの１つ以上に基づいている。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔直径は、担体分子の捕捉の比率を制御する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔アレイ中のナノ細孔は化学的または生物学的に修飾されない。
【００３３】
いくつかの実施形態では、光学的標識化オリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡを包含する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、担体分子は当該核酸配列の配列情報を表す。
【００３５】
いくつかの実施形態では、当該方法は、担体分子からの光学的標識化オリゴヌクレオチドの置き換えにより生成される光学シグナルの逐次的検出から当該核酸配列の配列を獲得することをさらに包含する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、当該核酸配列はＤＮＡを包含する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、異なる担体分子に関連した光学的標識化オリゴヌクレオチドからの光学シグナルは同時的に検出される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、当該方法は、光学シグナルをナノ細孔アレイ中の特定ナノ細孔と関連づけることをさらに包含する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、上記の方法を実施するための装置を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１ａ】ＤＮＡシーケンシング法における２つのステップの模式図である。第一ステップは、既知のオリゴヌクレオチドへの標的ＤＮＡ配列の各ヌクレオチドの大量生化学的転換とその後の分子ビーコンを用いたハイブリダイゼーション。第二ステップでは、ナノ細孔を介したＤＮＡビーコン複合体の通過が、標的ＤＮＡ配列の光学的検出を可能にする。
【図１ｂ】概念的平行読出しスキームの模式図である。各ナノ細孔は、ＥＭ−ＣＣＤの視野内に特定の位置を有し、したがってナノ細孔のアレイの同時読出しを可能にする。
【図２ａ】図２は、巨大基アンジッピング（unzipping）の電気的／光学的検出のグラフである。（ａ）５ｎｍ未満ナノ細孔を用いたアンジッピング１ビットおよび２ビット複合体の代表的事象。電流を上部に、一方、光学シグナルを下部に示す。
【図２ｂ】図２は、巨大基アンジッピング（unzipping）の電気的／光学的検出のグラフである。（ｂ）総光子数／事象のヒストグラム（各試料に関してｎ＞６００）は、１ビット試料（暗灰色）のほとんどの複合体が１つの光子破裂を生じるが、一方、２ビット試料（明灰色）中のほとんどの複合体は２つの光子破裂を生じる、ということを示す。実線は、ヒストグラムに対するポアソン適合度を表し、１ビットおよび２ビット試料に関する平均値は、それぞれ１．３０±０．０６および２．６５±０．０８である。
【図２ｃ】図２は、巨大基アンジッピング（unzipping）の電気的／光学的検出のグラフである。（ｃ）光子破裂数／事象を計数するための単一強度閾値を用いた事象の分類。１ビット試料（左の３カラム）は、１つの光子破裂を有する事象の〜９０％を示す。２ビット試料（右の３カラム）は、２つの光子破裂を有する事象の〜８０％を示す。
【図３ａ】図３は、Ａ６４７（明灰色）およびＡ６８０（暗灰色）蛍光体を用いた二色案アンジッピング実験のグラフである。（ａ）累積光子強度。単一の顕著なピークが各チャンネルで観察されるが、これは、ＥＭ−ＣＣＤで画像処理した場合のナノ細孔位置を示す。チャンネル１で測定される蛍光強度対チャンネル２で測定されるものの比であるＲ値は、２つの蛍光体に関して０．２および０．４である。
【図３ｂ】図３は、Ａ６４７（明灰色）およびＡ６８０（暗灰色）蛍光体を用いた二色案アンジッピング実験のグラフである。（ｂ）Ａ６４７（上部）およびＡ６８０（底部）を用いた代表的アンジッピング事象に関する電気的／光学的シグナル。
【図３ｃ】図３は、Ａ６４７（明灰色）およびＡ６８０（暗灰色）蛍光体を用いた二色案アンジッピング実験のグラフである。（ｃ）各試料に関する数百のトレースを蓄積して、Ａ６４７およびＡ６８０に関してそれぞれＲ＝０．２０＋マイナし０．０６および０．４０±０．０５を得た。線はガウス関数に適合する。
【図４ａ】図４は、２つの蛍光体を用いた光学的ナノ細孔ヌクレオチド同定のグラフである。（ａ）２つの色は、４つのＤＮＡ核酸塩基すべてに対応する２ビット試料の構築を可能にする。
【図４ｂ】図４は、２つの蛍光体を用いた光学的ナノ細孔ヌクレオチド同定のグラフである。（ｂ）＞２０００事象を用いて生じたＲ分布は、０．２１±０．０５および０．４１±０．０６での２つの様式を明示し、これは、対照試験と並外れて一致して、それぞれＡ６４７およびＡ６８０蛍光体に対応する。線は、二重ガウス適合関数を表す。
【図４ｃ】図４は、２つの蛍光体を用いた光学的ナノ細孔ヌクレオチド同定のグラフである。（ｃ）個々の二色２ビットアンジッピング事象の代表的強度補正蛍光トレース。対応するビットが呼び出され、塩基が呼び出され、確実性スコアは事象より上を示した。２つのチャンネルにおける強度は、各ビットが固定閾値Ｒ値を用いて呼び出された後、コンピューターコードにより自動的に補正された。括弧内の値は、自動的に抽出された各塩基に関する確実性値を表す。
【図５ａ】図５は、ＤＮＡアンジッピング事象の多細孔検出のグラフである。（ａ）累積光学強度を示す表面プロットは、ＳｉＮ膜で製作されるＥＭ−ＣＣＤにより画像処理された場合の３つのナノ細孔の位置を示す。３つのナノ細孔（各々、〜５ｎｍ）の高解像度ＴＥＭ画像を示す。
【図５ｂ】図５は、ＤＮＡアンジッピング事象の多細孔検出のグラフである。（ｂ）４つの代表的トレースは、２つの異なるナノ細孔での共存アンジッピングを示す。電流トレースはナノ細孔位置に関する情報を含有しないが、一方、光学的トレース（異なる灰色影部）はアンジッピング事象の位置の決定を可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
いくつかの実施形態では、本発明は、光学シグナルを高処理量分析して、核酸分析を、具体的には低経費ＤＮＡシーケンシングをもたらすための画像獲得およびプロセシングのための、固体状態ナノ細孔アレイ、単一分子からのシグナルを光学的に記録し得る画像処理装置ならびにデータ記録系を含む装置を提供する。いくつかの実施形態における光学シグナルは、ナノ細孔を通した担体分子の移行中にそれらが置き換えられる（アンジッピングされる）場合、光学的に検出可能なオリゴヌクレオチドを励起する光源により発生される蛍光シグナルである。本明細書中に記載される固体状態ナノ細孔アレイの使用は、酵素、タンパク質または他の化学物質による付加的修飾なしの利益を有する。さらに、シグナルは光学的対電気的に検出されるため、電気回路を用いて各々のおよびすべてのナノ細孔を結びつけるかまたは取り扱う必要はない。
【００４２】
［参考文献および定義］
本明細書中で言及される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。発行済み米国特許、公開米国特許出願、公開済みの外国および国際出願、ならびに本明細書中で引用される参考文献は、各々が参照により援用されるよう具体的に且つ独立して示されたように、参照により本明細書中で援用される。
【００４３】
本明細書中で用いる場合、「シス(cis)側面」は、試料が最初に置かれる膜側面であり、「トランス」側面は、試料またはその一部分がナノ細孔を介した移行後に配置される膜側面である。
【００４４】
本明細書中で用いる場合、「機械的に安定した膜」は電気力が膜を横切って応用されたとき、ナノ細孔アレイが作られ、破裂しない。
【００４５】
本明細書中で用いる場合、「担体分子」は、光学的に検出可能な標識化分子が可逆的に結合し得るモノマー単位を含むポリマーである。いくつかの実施形態では、担体分子は、１０〜１００，０００モノマー単位を含む。モノマー単位は、電気的に、正または負に荷電され、したがってそれらは、固体状態ナノ細孔を通した移行を実行するよう、電場で作用し得る。いくつかの実施形態では、担体分子は、光学的に検出可能な標識化オリゴヌクレオチドが結合（ハイブリダイズ）されるＲＮＡまたはＤＮＡモノマーで構成される一本鎖核酸の負荷電ストランドである。
【００４６】
本明細書中で用いる場合、「ｓｓＤＮＡ」は一本鎖ＤＮＡを指し、「ｄｓＤＮＡ」は二本鎖ＤＮＡを指す。
【００４７】
本明細書中で用いる場合、変数に関する数値範囲の詳述は、その範囲内の値のいずれかと等しい変数を用いて本発明が実行され得るということを伝達するよう意図される。したがって、本質的に別個の変数に関しては、変数は、範囲の終点を含めて数値範囲内の任意の整数値と等しい。同様に、本質的に連続する変数に関しては、変数は、範囲の終点を含めて、数値範囲内の任意の実数値と等しい。一例として（これに限定されない）、０〜２の値を有するとして記載される変数は、その変数が本質的に別個である場合、０、１または２の値をとり得るし、あるいはその変数が本質的に連続する場合には、０．０、０．１、０．０１、０．００１または任意の他の実数値≧０および≦２を取り得る。
【００４８】
本明細書中で用いる場合、具体的に別記しない限り、「または」という語は「および／または」という包括的意味で用いられ、「どちらか／または」という排他的意味ではない。
【００４９】
［固体状態ナノ細孔アレイ］
ナノ細孔または穴のアレイは、約０．１ｎｍ〜約１ｕｍの厚みの固体状態膜中に作られる。固体状態膜は、ケイ素、窒化ケイ素、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウムまたはグラフェンから作られ得る。具体的一実施形態では、固体状態膜は、窒化ケイ素から作られる。いくつかの実施形態では、固体状態膜は、機械的安定膜の作製を可能にする適切な物質から作られる。ナノ細孔アレイの形成後の膜は、一般的に、適用される力、すなわち担体分子を移行するために用いられる力に対して安定であり、移行過程中はつぶれない。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔は、約１〜約２０ｎｍ、１〜５ｎｍ、３〜５ｎｍ、２〜６ｎｍ、３〜６ｎｍまたは２〜１０ｎｍの範囲の直径を有する。ナノ細孔は、秩序アレイ中に整列され得るし、あるいはパターンがランダムであり得る。ナノ細孔の間隔は、固定されるかまたは可変的であり得る。いくつかの実施形態では、ナノ細孔は、０．５〜１０μｍ離れた、１〜８μｍ離れた、２〜１０μｍ離れた、１〜２μｍ離れた、または１．８〜７．７μｍ離れた一定間隔で間隔を置かれる。
【００５１】
ナノ細孔アレイ中のナノ細孔の数は、変わり得る。いくつかの実施形態では、ナノ細孔アレイは、２〜１，０００、１，０００〜１０，０００、１０，０００〜１００，０００または１００，０００より多いナノ細孔を含む。所定のアレイ中のナノ細孔の数は、具体的用途によって可変的である。いくつかの実施形態では、ナノ細孔の数は、画像処理装置の視野が限度を超えないよう、したがって、付加的視野を獲得するために、画像処理装置またはアレイを移動することなく全アレイの画像を装置に獲得させるようなものである。
【００５２】
いくつかの実施形態では、固体状態ナノ細孔アレイチップは、３０ｎｍ厚低応力Ｓｉ３Ｎ４（ＳｉＮ）で被覆される両面研磨ケイ素ウエファから出発して、製作される。ＳｉＮ膜の両側面を曝露する３０×３０μｍ２ウィンドウは、湿式ＫＯＨ蝕刻を用いて作製され得る。ナノ細孔（直径３〜５ｎｍ）は、例えば参考文献［１６］中にさらに詳細に記載されているように、集束電子線を用いて製作され得る。穿孔ナノ細孔アレイチップは、清浄にされ、制御化湿度および温度下で、カバーガラス底を組入れる注文設計テフロン（登録商標）セル上に組み立てられる（参照１３により詳細に記載されている）。ナノ細孔は、シス小室に脱気および濾過済み１Ｍ  ＫＣｌ電解質を付加し、ならびにトランス小室に８．６Ｍ尿素を伴う１Ｍ  ＫＣｌを付加して、全内部反射（ＴＩＲ）画像処理を促すことにより、水和される。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極は、セルの各小室中に浸漬されて、Ａｘｏｎ  ２００Ｂヘッドステージに連結され、それを用いて、膜を横断する固定電圧（全実験に関して３００ｍＶ）を適用し、必要な場合はイオン流を測定する。ナノ細孔流は、５０ｋＨｚローパスフィルターButterworthフィルターを用いて濾過され、そして２５０ｋＨｚ／１６ビットでＤＡＱボードを用いて試料採取される（ＰＣＩ−６１５４、National Instruments, TX）。電気シグナルは、参考文献［１５］に記載されたようなオーダーメイドのＬａｂＶｉｅｗプログラムを用いて獲得され得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、固体状態ナノ細孔は、米国特許第７，２５８，８３８号、第７，８４６，７３８号ならびに公開米国特許出願２０１１−００５３２８４および２００６−０００３４５８に記載されたように生成される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔アレイは、参考文献［１９、２０］でさらに詳述されるように固体状態物質で生成される。
【００５５】
［担体分子］
いくつかの実施形態では、担体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその類似体を含む一本鎖核酸である。ＤＮＡおよびＲＮＡ類似体は、５核酸塩基（アデニン、グアニン、シチジン、チミジンおよびウラシル）、糖（リボースまたは２’−でオキシリボース）またはリン酸塩部分の天然または合成変形体である。担体分子は、ネイティブ遺伝物質であり得るし、あるいは合成的に、例えば環状ＤＮＡ転換工程により生成され得る。各光学的標識化オリゴマーが当該ＤＮＡ中の単一核酸塩基または単一標的配列を示すよう、担体分子は光学的に標識されるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、担体分子は、環状ＤＮＡ転換の工程により生成されるが、この場合、試料核酸の各核酸塩基の順序（配列）は、転換されてポリマーを生成死、モノマー単位は、４つの対応する光学的標識化オリゴマーのうちの１つに対する相補的配列を含む。担体分子ポリマーは、元の試料核酸中に見出される核酸塩基の秩序配列を保持する。そのようにするための方法は、当該技術分野で既知であり、例えばＷＯ２０１０／０５３８２０に記載されている。
【００５７】
いくつかの実施形態では、光学的標識化オリゴマー（単数または複数）は、試料核酸中の遺伝子変更または突然変異を示す標的領域、例えば遺伝子の小配列、エキソン、イントロン、調節単位等と直接的にハイブリダイズする。この例では、試料核酸担体分子に沿った２つ以上の光学的標識化オリゴマーの相対位置を用いて、遺伝子異常を同定する。担体分子からの光学的標識化オリゴヌクレオチドの置き換え中、光子破裂が標識化オリゴヌクレオチドから生じ、これは画像処理系により画像処理される。各個々のナノ細孔は、アレイ中の各々のおよびすべての他のナノ細孔とは関係なく、担体分子を移行し得る。所定の担体分子は、移行事象中に記録されるべき数百の置換事象を生じ得る。記録されたシグナルは、処理され、核酸配列情報を生成するために用いられ得る。
【００５８】
［光学的標識化オリゴヌクレオチド］
いくつかの実施形態では、光学的標識化オリゴヌクレオチドは、１０〜２０、２０〜３０または３０〜５０ヌクレオチドの一本鎖核酸である。いくつかの実施形態では、光学的標識化オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはその類似体、ならびにそれに結合される１つ以上の光学標識を含む。いくつかの実施形態では、光学的標識化オリゴヌクレオチドは、蛍光体およびそれに結合される消光剤を有する。その類似体は、５核酸塩基（アデニン、グアニン、シチジン、チミジンおよびウラシル）、糖（リボースまたは２’−でオキシリボース）またはリン酸塩部分の天然または合成変形体である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、光学的標識化オリゴヌクレオチドは、分子ビーコンの立体配置を有する。分子ビーコンは、相補的標識核酸配列と結合した場合にその蛍光が回復される内部消光蛍光体を伴うヘアピン形分子である。分子ビーコンは、全長１２〜３０のヌクレオチド、一末端上または付近の蛍光体ならびに他の末端上または付近の消光剤分子を含むオリゴヌクレオチドであって、この場合、当該末端は、各末端上に４〜１０塩基の範囲の分子内二本鎖立体配置を形成して、蛍光体及び消光剤を並置し得る。
【００６０】
［光学標識］
いくつかの実施形態では、レーザーは、蛍光標識、例えば光学的標識化オリゴヌクレオチド中の蛍光体（光学的に検出可能なシグナルを発生する）を励起するための光源として用いられる。有機染料、例えば蛍光体は、用いられ得る光学標識のまさに一例である。他の例としては、無機光学標識、例えば金粒子または量子ドットが挙げられる。蛍光体は励起の最適波長を有するため、各々が異なる発光スペクトルを有する種々の波長レーザーが用いられ得る。いくつかの実施形態では、単一レーザーを用いて、多蛍光体を励起し得る。他の実施形態では、多数のレーザーを用いて、多数の蛍光体を励起し得る。
【００６１】
当該技術分野で既知の多数の蛍光体、例えばＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＶＩＣ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、ＴＭＲ、Ｏｙｓｔｅｒ染料、ＲＯＸ、テキサスレッド、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ  ７７０、ＩＲＤ  ８００、ＡｌｅｘａおよびＡｔｔｏ染料が、光学標識として有用であり、唯一の要件は、多数の（例えば２〜４）蛍光体が用いられる場合、各蛍光体は、用いられる他の蛍光体から光学的に分解可能である、ということである。蛍光体間の任意のスペクトル重複は、明白に同定されるべきその能力に何らかのレベルの不確実性を生じる。消光剤、例えばダブシル、エクリプス、ロワ・ブラックＦＱおよびロワ・ブラックＲＱ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＤＤＱ−Ｉ、ＤＤＱ−ＩＩ、ＱＳＹ−７およびＱＳＹ−２１も当該技術分野で広範に知られている。いくつかの消光剤、例えばＢＨＱは、付加的に、担体とのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの安定性の増強を付与して、融点を約４℃増大する。いくつかの実施形態では、蛍光体−消光剤組合せは、シアニン蛍光体、ならびに消光剤のＢＨＱファミリーからの消光剤である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、独立して光学的に検出されるべきでもある蛍光体の数は、１〜５の範囲または５より大きい。各蛍光体は、単一分子として具体的に光学的に分解可能でなければならない。ＤＮＡシーケンシングへの光学的検出の適用において、いくつかの実施形態では、一染料からの光学シグナルは１つの核酸塩基に対応し、４つの蛍光体の全部が用いられる。しかしながら、単一核酸塩基のために多数の蛍光体を用いることが可能である。さらに、いくつかの応用では、付加的塩基、例えばウラシルを検出することが望ましいこともあり、そこで、５つの核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）である。
【００６３】
［光学シグナルの検出］
いくつかの実施形態では、ナノ細孔の全アレイを観察することが可能な広視野を有する高速画像処理装置が、光学的検出のために用いられる。画像処理装置は、膜の表面から全内部反射（ＴＩＲ）を用いて個々の蛍光体からの光子のうちの数十を光学的に検出し得る。画像処理装置は、高フレーム速度で、例えば少なくとも５００フレーム／秒の速度で画像を捕捉する。画像処理装置センサーは、捕捉センサーの領域を分割し得るが、この場合、各領域は光の異なるスペクトル領域に対応し、最小は２領域である。しかしながら、いくつかの実施形態では、４領域が明示される。
【００６４】
適切な画像処理装置の例としては、ＣＣＤ型カメラ、ＣＭＯＳ−ＣＣＤ型カメラおよびＥＭ−ＣＣＤ型カメラが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＣＤは、電荷結合素子を意味する；ＣＭＯＳは、相補型金属酸化物半導体を意味する。これらは、画像処理装置により捕捉される光がその上に集束されるチップである。それらのシグナルは、さらに画像処理装置の内側で処理され、そして最終的に、それが、テープであっても、ＤＶＤ、あるいは内部または外部ハードドライブであっても、画像は記憶媒体に記録される。多重画像センサーを有するカメラは、光原色（赤、緑および青）当たり１つのチップを用い、別個の画像プロセッサを利用して、３つのシグナルをカラービデオ画像と組合せる。より新しく且つより安価なＣＭＯＳチップは、画像センサーおよび画像プロセッサの両方を単一チップに束ねる。ＣＣＤデザインは、典型的には、実際の光捕捉センサーとは別個の画像プロセッサを利用する。ＥＭ−ＣＣＤは、センサー中に形成される独自の電子増倍構造により達成可能な高量子効率を保持しながら、単一光子事象を検出できる定量的デジタルカメラ技法である。慣用的ＣＣＤと異なり、ＥＭ−ＣＣＤは、高読出し速度で操作される場合でも、出力増幅器の読出しノイズにより制限されない。これは、固体状態電子増倍（ＥＭ）レジスタを標準シリアルレジスターの末端に加えることにより達成され、このレジスタは、任意の読出しノイズが出力増幅器により付加される前に弱いシグナルを増倍させるので、読出しノイズが無視できる。ＥＭレジスタは、標準クロック電圧より高く用いる数百の段階を有する。電荷は各段階を通して伝達されるので、衝突電離の現象を利用して二次電子を、それゆえＥＭゲインを生じる。これが数百段階に亘って行なわれる場合、その結果生じるゲインは、単一から数百まで、あるいは数千倍（ソフトウェア）制御され得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、レーザーおよび画像処理装置が、膜のシス（cis） 側面上に画像処理装置を有する膜の反対側に配置されるよう、光学的画像処理系が設計される。膜のシス側面は、試料が導入され、そして膜を通過する前に存在する側面である。１つの例示的立体配置では、レーザーおよびカメラはナノ細孔膜の同一側面に置かれる。シスおよびトランス側面は、負および正の極性がそれぞれ適用される膜の反対側である。極性の配向は、移行されるべき試料上の電荷によって決まる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、画像処理系は、それらが単一ナノ細孔を通した移行中に担体分子から置き換えられる（すなわちアンジッピング（unzipped）される）場合、光学的標識化オリゴヌクレオチドからの光子破裂のシグナルを記録する。具体的一実施形態では、光学標識は蛍光体である。蛍光体の使用は、特定蛍光体のスペクトルシグナルを特定核酸塩基にむすびつけさせる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、光学シグナルは、強度比を用いてシグナルを特定核酸塩基に割り当てる強度である。強度比は、用いられる蛍光体の各々と関連する定義済み波長帯域内で放射される総光子を合計することにより算定される。次いで、帯域の各々対他の帯域の比が算定される。これは、その絶対強度にかかわらず、２つ以上の放射色間を区別する確固とした方法を提供する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、単一レーザー源を用いて、２つの異なる蛍光タグを励起し得る。これは、必要レーザー源数を低減する。このような実施形態では、２つの蛍光体の発光において有意のスペクトル重複が認められ、したがって、２つの検出チャンネル間に混線が存在する。しかしながら、両検出チャンネルにおける各蛍光体の強度の相対比を用いることにより、２つの染料間を識別し得る。本明細書中に記載されるような光学ナノ細孔アレイの利益は、非常に多くの個々の移行が平行して記録されて、超高処理量シーケンシングを可能にする、ということである。
【００６９】
いくつかの実施形態では、各塩基に関して１つの蛍光体を用いる４色検出系の履行は、転換ＤＮＡ長（すなわち、担体分子の長さ）を半分にして、検出速度を２倍にするが、一方、塩基呼び出しに関する精度も増大する。４色系は、潜在的フレームシフトの結果として、２色系において生じる誤差も除去し得る。
【００７０】
付加的には、シグナルは光学画像処理装置により記録されるため、移行中に各ナノ細孔からの電気的シグナルを記録するための要件はなく、したがって低経費、低複雑性固体状態ナノ細孔アレイの製造を可能にする。
【００７１】
［ナノ細孔を通した移行の調節］
いくつかの実施形態では、担体分子がナノ細孔を通って移行する速度を制御するために、ナノ細孔移行過程は調節され得る。一実施形態では、光学的標識化オリゴヌクレオチドのデザインは置換比率を制御するが、この場合、オリゴヌクレオチド長（核酸塩基単位の数）、Ｇ−Ｃ含量および／または化学組成（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはその類似体）は分子が所定のナノ細孔を通って移行する速度を決定する制御または自己調節の一レベルである。置換比率は、外的物理学的制御、例えば膜を横断する電圧勾配、温度、ならびに膜のいずれかの側面上の電解質条件によっても制御され得る。ナノ細孔直径も、ナノ細孔への担体分子の捕捉または進入の速度を調節するために変更され得る。これらの調節素子の各々は、独立して、可変的である。
【００７２】
ＤＮＡの一方の鎖の、もう１つの鎖からのアンジッピング過程は、エネルギーバリアにより指図される。いくつかの実施形態では、アンジッピング過程は自己調節され、以下のうちの１つ以上によって決まる：（ｉ）膜を横断して適用される電圧勾配（これは、分子に及ぼす力を増大し、それゆえ、アンジッピングのエネルギーバリアを低減する）；（ｉｉ）温度（温度は、二重鎖の熱力学的安定性にも影響を及ぼし、それゆえ、アンジッピングのエネルギーバリアを変更し得る）；（ｉｉｉ）置換光学的標識化オリゴヌクレオチド中の核酸塩基数がエネルギーバリア高を指図する；（ｉｖ）置換光学的標識化オリゴヌクレオチドのＧ−Ｃ含量がエネルギーバリア高を指図する；（ｖ）置換光学的標識化オリゴヌクレオチドの化学組成（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはその類似体；化学的に異なる核酸組成物は異なる結合強度を有し、それゆえ、アンジッピングのエネルギーバリアを変更する）；ならびに（ｖｉ）膜のいずれかの側面の電解質状態は、適用される力に及ぼす作用をともに有する（（ｉ）と同様にして、ＤＮＡに沿った電荷のスクリーニングに影響を与えるが、したがってアンジッピングのエネルギーバリアに影響を与える）。
【００７３】
いくつかの実施形態では、固体状態ナノ細孔は、機能的であるために化学的または生物学的分子による修飾を必要としない。担体分子またはその生成物の移行は、酵素作用により速度限定されず、したがって、迅速無酵素読出しを提供する。
【００７４】
［核酸シーケンシングのための適用］
本発明のいくつかの実施形態は、高処理量の、精確な、低経費核酸分析または核酸シーケンシングに有用な、ナノ細孔アレイ上での単一分子光学的画像処理のための方法に関する。当該方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する個々のヌクレオチドの順序を表す光学的（多色蛍光）シグナルの高処理量分析を可能にするため、有益である。当該方法は、穿孔ナノ細孔または穴のアレイ（ナノ細孔アレイ）を含む低複雑性の固体状態膜、光源、画像処理装置、ならびに画像獲得が可能で、光学的に検出可能な標識化オリゴヌクレオチドがナノ細孔を通した制御化移行中に担体分子から置き換えられる（アンジッピング化される）場合にシグナルを処理するデータ記録系を包含する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ分子の生化学的調製（環状ＤＮＡ転換）は、各核酸塩基を、非修飾化固体状態ナノ細孔を用いて直接的に読み取られうる形態に転換する。大規模平行転換工程は、オフラインで実施され、酵素固定化または増幅ステップを必要としない。この生化学的調製ステップのため、ナノ細孔読出し速度および読み取り長は酵素限定されない。さらに、ナノ細孔における生体分子をプローブするために電気的シグナルを用いる方法に対比して、本明細書中に記載される方法および装置は、ＤＮＡ配列を検出するための光学的検出である。慣行的全内部反射（ＴＩＲ）法（これは、ナノ細孔を通って移行する個々のＤＮＡ分子の高空間時間的分解および広視野光学的検出を可能にする）は、２色迅速単一分子検出のために用いられる（ＴＩＲ法は、参考文献［１３］にさらに詳細に記載されている）。いくつかの実施形態では、当該装置は、多数のナノ細孔からのシグナルを同時に光学的に検出し得る。
【００７６】
ＤＮＡシーケンシングのための例示的アプローチは、２つのステップ（図１ａ）を包含する：第一ステップでは、標的ＤＮＡ中の４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）の各々は、定義済み核酸ポリマーに転換され、これは、例えば参考文献［１２］に記載されているように、特定の蛍光体を保有する分子ビーコン（例えば光学的標識化オリゴヌクレオチド）とハイブリダイズされる。このＤＮＡ転換は、例えば、「環状ＤＮＡ転換」（ＣＤＣ）として言及される方法を用いて実施され得る。環状ＤＮＡ転換は、当該技術分野で既知であり、例えば米国特許第６，７２３，５１３号に記載されたように実行され得る。第二ステップ（図１ａ）では、ハイブリダイズ化分子は、ナノ細孔アレイ中のナノ細孔を通して移行され、分子ビーコンが転換ＤＮＡ分子（すなわち、担体分子）から解離すると、光学シグナルが検出される。
【００７７】
２色読出し（すなわち、２つの型の蛍光体）が用いられる実施形態では、Ａが「１  １」であり、Ｇが「１  ０」であり、Ｔが「０  １」であり、最後にＣが「０  ０」であるよう（図１ａ）、４つの配列は２つの定義済み独自配列、ビット「０」およびビット「１」の組合せである。２つの型の蛍光体を保有する２つの型の分子ビーコンは、「０」および「１」配列と特異的にハイブリダイズする。転換化ＤＮＡおよびハイブリダイズ化分子ビーコンは、電気泳動的に固体状態ナノ細孔に通され、この場合、ビーコンとも呼ばれる光学的標識化オリゴヌクレオチドは逐次的に剥ぎ取られる（置換されるかまたはアンジッピングされる）。ビーコンが剥ぎ取られるたびに、新しい蛍光体は消光されず、光子の破裂を生じて、ナノ細孔の位置で記録される（図１ｂ）。各ナノ細孔位置での２色光子破裂の配列（図１ｂ）は、標的ＤＮＡ配列の二進コードである。このアプローチは、個々の塩基を検出する必要性を妨げ、無酵素読出しを促す。付加的には、この方法は広視野画像処理を可能にし、そして空間的に固定されたナノ細孔は、電子増倍電荷結合素子（ＥＭ−ＣＣＤ）カメラによる多数のナノ細孔の同時検出への直接適合を可能にする（図１ｂに模式的に示されている）。
【００７８】
いくつかの実施形態では、読出しは、固体状態ナノ細孔を用いて、転換化一本鎖ＤＮＡ分子（担体分子）からハイブリダイズ化分子ビーコンを剥ぎ取る。これは、一般的に、２ｎｍ未満の範囲の細孔の使用を要するが、それは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の横断面直径が２．２ｎｍであるためである。しかしながら、このような小型細孔へのＤＮＡ進入の確率は、大型細孔よりもはるかに小さく、大量のＤＮＡの使用を要する。さらに、エラーに対する許容範囲がほとんどなく、困難が高密度ナノ細孔アレイに関して段階的に拡大するので、小型細孔の慣例的製造は技術的挑戦の危険をはらんでいる。３〜５ｎｍサイズの「巨大」基（例えば、タンパク質またはナノ粒子）を分子ビーコンと共有結合させると、複合体の分子横断面を５〜７ｎｍに有効に増大して、３〜６ｎｍのサイズ範囲でのナノ細孔の使用を可能にする、ということが発見されている。これは、ＤＮＡ分子の捕捉率を１０倍以上増大し、そしてナノ細孔アレイの製作工程を大いに助長する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、慣行的ＴＩＲ画像処理を用いて、懸濁窒化ケイ素膜付近の個々の蛍光体の高速単一分子検出を達成する。ＴＩＲがＳｉＮ膜で生じて、シス小室に光が進行するのを防止し、したがって付加的バックグラウンドを低減するよう、トランス小室溶液の屈折率が調整され得る。セルは高ＮＡ対物レンズ（オリンパス６０×／１．４５）上に載せられて、その後焦点面で軸外点に入射６４０ｎｍレーザー光線（ｉＦｌｅｘ２０００、Point-Source UK）を集束し、それにより入射角の角度を制御することにより、ＴＩＲが最適化され得る。蛍光発光は二色性鏡（例えば、Semrock, ＦＦ６８５Ｄｉ０１）を用いて２つの別個の光路に分割され、２つの画像がＥＭ−ＣＣＤカメラ（例えば、Andor, ｉＸｏｎ  ＤＵ−８６０）に並んで投影され得る。ＥＭ−ＣＣＤは、最大ゲインおよび１ｍｓ積分時間で働いた。電気シグナルと光学シグナルとの間の同期化は、カメラ「ファイア」パルスをカウンターボード（例えばＰＣＩ−６６０２、National Instruments）に連結することにより達成され得るが、これは、主ＤＡＱボードと同じサンプリングクロックおよび出発の引き金を共有する。併合データ流は、各ＣＣＤフレームの開始時に独自の時間スタンプを包含し得るが、これは、イオン流サンプリングと同調された。２つの別個の判定基準が、各事象を分類するために用いられ得る。第一の判定基準は、ユーザー限定閾値レベルを下回るイオン流の急低下であり、少なくとも１００μｓの間、そのレベルのままで、その後、元の状態に戻った。第二の判定基準は、対応するＣＣＤフレームにおける事象データ取込み時間（シグナルが閾値より下に留まる時間）中のナノ細孔の領域でのみの光子数の増大であり得る。
【００８０】
以下の実施例により本発明をさらに例証するが、本発明はそれらに限定されるものではない。ただの慣例的実験、特定物質の多数の等価物、ならびに本明細書中に記載される手順を用いて、当業者は認識し、確証し得る。このような等価物は、以下の実施例の後に述べる特許請求の範囲に包含されるよう意図される。
【実施例】
【００８１】
［実施例１］
アビジン（４．０×５．５×６．０ｍｍ）を、蛍光体−消光剤対（ＡＴＴＯ６４７Ｎ−ＢＨＱ２、「Ａ６４７−ＢＨＱ」と省略）を含有するビオチニル化分子ビーコンと結合した。このビーコンおよび同様に構築されるオリゴヌクレオチド（一端に消光剤を含有するが、しかし他端に蛍光体を有さない）をともに、標的ｓｓＤＮＡとハイブリダイズした（「１ビット」試料）。図２ａに模式的に示すように、２つのビーコン分子を含有する同様の複合体を合成した（「２ビット」試料）。大量の試験は、そのハイブリダイズ化状態である場合、Ａ６４７蛍光体は隣接ＢＨＱ消光剤により〜９５％消光される、ということを実証した。この非常に高い消光効率を考えると、蛍光破裂は、鎖分離が起きる場合のみ、単一分子レベルで検出され得る。
【００８２】
１−ビット試料（複合体当たり１ビーコン分子を含有する）および２−ビット試料（複合体当たり２ビーコン分子を含有する）の両方に関するナノ細孔実験を、６４０ｎｍレーザーを用いて実行し、そしてＥＭ−ＣＣＤカメラを用いて１，０００フレーム／秒で画像処理した。図２ａは、２つの試料に関する典型的アンジッピング事象を示し、１−ビット試料では１ビーコン／複合体、そして２−ビット試料では２ビーコン／複合体である。電気シグナルを黒色で示し、そして光学シグナル（ナノ細孔位置で電気シグナルと同期的に測定）を異なる灰色陰影で示す。電流の急低下は細孔への分子の進入を意味し、電気シグナルが開口細孔上部状態に戻ると、取り除かれる。ここで観察されるアンジッピング事象は、巨大基の存在のため、従来報告された（参考文献［１３］）よりも実質的に長い、ということが注目される。光学シグナルは、それぞれ１−ビットおよび２−ビット試料に関して、１または２つの光子破裂を明瞭に示す。これは、細孔に到達する前に蛍光体が消光され、そしてビーコンが鋳型からアンジッピングされた直後に再び自己消光されるために、予測される。電気シグナルにより限定されるように、各事象中の光学強度を単に合計して、２つの試料に関するポアソン分布を得る（図２ｂの実線）。平均値は、１−ビット試料に関しては１．３０±０．０６であり、２−ビット試料に関しては２倍の２．６５±０．０８（各場合、ｎ＞６００事象、誤差はＳＴＤを表す）。これは、光子破裂を限定するために用いられるモデルに関係なく、単一アンジッピング事象が１−ビット試料に関しては起こり、そして２−ビット試料に関しては２つのアンジッピング事象が起きた、ということを立証する。さらに、強度閾値分析の使用により（平均強度＋２ＳＴＤ）、１−ビット試料における収集事象のほぼ９０％が単一蛍光体は列を含有したが、一方、２−ビット試料では、〜８０％の収集自称が２つのこのような破裂を示した（図２ｃ）、と確定された。このデータは、３〜５ｎｍナノ細孔を用いて実施された個々のアンジッピング事象において、１ビット試料と２ビット試料とを光学的に識別することが可能である、ということを実証する。
【００８３】
４つすべてのヌクレオチド間を区別するために、同一の６４０ｎｍレーザーにより同時に励起される２つの高収量蛍光体Ａ６４７（ＡＴＴＯ６４７Ｎ）およびＡ６８０（ＡＴＴＯ６８０）を用いて、一色コードスキームから２色コードスキームに、系を拡大した。二色性鏡を用いて発光シグナルをチャンネル１および２に分割し、同一ＥＭ−ＣＣＤカメラで並べて画像処理した。ナノ細孔位置に中心を置く３×３ピクセル領域での強度を読み取ることにより、二色強度分析を実施した（例えば、図３ａ参照）。２つの蛍光体の発光スペクトルが重複すると、Ａ６４７発光の一分画がチャンネル２に「漏出し」、そしてＡ６８０の一分画がチャンネル１に「漏出する」。Ａ６４７またはＡ６８０蛍光体で標識した１−ビット複合体を用いて、２つの較正測定を実施した（図３ａ）。各場合に＞５００アンジッピング事象の蓄積後に、ナノ細孔の位置に対応して、各チャンネルにおいて単一の別個のピークが明らかに観察される。チャンネル２対チャンネル１における蛍光強度の比率（Ｒ）は、Ａ６４７試料に関しては０．２、Ａ６８０試料に関しては０．４である。
【００８４】
２つの試料の各々に関する（５００より多くの中からの）代表的事象、ならびにＲの対応する分布を、それぞれ図３ｂおよび３ｃに示す。単一の顕著な蛍光ピークが、各移行事象中に観察され（黒色で示される電気的トレース）、強度は、蛍光基線変動の標準偏差より＞３倍大きい。すべての単一分子事象を総計すると、それぞれＡ６４７およびＡ６８０に関して、Ｒ＝０．２０±０．０６および０．４０±０．０５（平均±標準偏差）となって、図３ａに示した（全事象に関する）累積蛍光に関する比率と完全に一致した。Ｒは、ガウス分布に従う（図３ｃにおける実線適合により示される）。これらの対照測定値は、個々の蛍光体の同一性を確定するためにＲを用いることが可能である、ということを示す。較正データを用いて、慣行的ＬａｂＶｉｅｗコードで自動的に、識別を実施した（図３ｃ）。２つの染料の各々の決定における誤差は、分布間の重複領域から算定され、Ａ６４７に関しては＜９％、Ａ６８０に関しては＜１３％を得た。ＩＧＯＲ  Ｐｒｏ（Wavemetrics）を用いてデータ分析を実施し、適合を作成して、カイ二乗を最適化した。
【００８５】
図３ｃに示した較正分布を用いて、４つの塩基すべてに関する４つの２−ビット組合せ、すなわち１１（Ａ）、００（Ｃ）、０１（Ｔ）および１０（Ｇ）（ここで、「０」および「１」はそれぞれＡ６４７およびＡ６８０ビーコンに対応する）を含有する環状ＤＮＡ転換からの生成物を同定する能力を試験した。２つの別個の光子破裂が検出された＞２０００アンジッピング事象の分析は、０．２１±０．０５および０．４１±０．０６（図４ｂ）で２つの方式を有するＲの並数分布を明示し、較正測定と完全に一致した（図３ｃ）。Ｒ＜０．３０を有する光子破裂はすべて、「０」と分類され、Ｒ＞０．３０を有する者は「１」と分類された（０．３０は、図４ｂにおける分布の極小値である）。Ｒの分布は、分類の間違いの確率をコンピューター計算するためにも用いられた。これにより、２つの蛍光体間の最適識別のために２つのチャンネルを構成するためのさらなる統計学的手段が得られる。図４ｃは、４つのＤＮＡ塩基すべての単一分子同定を示す代表的２色蛍光強度事象を提示する。
【００８６】
二色同定の確かさは、主として、光子破裂の優れたシグナル／バックグラウンドレベルに、ならびに２つのチャンネルに関する蛍光体強度比間の分離によるものであると考えられる。蛍光シグナルにおける無作為ノイズ（例えば、偽性スパイク）を濾し取り、較正分布（図３ｃ）を用いてビット列を同定し、その後、塩基判定する自動ピーク同定を実施するために、コンピューターアルゴリズムを開発した。アルゴリズムは、２つの確実性スコア、すなわちビット判定に関するものと、塩基判定に関するものを出力する。典型的結果を、図４ｃに示す。生強度データから自動的に抽出される各塩基に関する確実性値（０〜１の範囲）を、括弧内に示す。
【００８７】
広視野ベースの検出スキームの利点の１つは、多数のナノ細孔が平行してプローブされて、最後に高処理量読出しを可能にする簡易性にある。平行読出しに関する概念の照明として、多数の３〜５ｎｍサイズのナノ細孔を、数ミクロン隔てて、同一窒化ケイ素膜上に作り上げた。図５ａに、３つのナノ細孔を含有する膜を用いて得られた累積蛍光強度画像を示す。単一ナノ細孔実験と同様に、膜におけるすべてのナノ細孔から、蛍光破裂が記録された。数千のアンジッピング事象からの光子数を累積して、各ピクセルでの光子強度の表面地図を得た。３−細孔膜に関する３つのピーク間の距離は１．８μｍおよび７．７μｍで、製作工程中に測定されるナノ細孔間の距離と一致した。このデータは、広視野光学的検出計画の実現可能性に関する直接証拠を提供する。
【００８８】
図５ｂでは、単一膜中の多数のナノ細孔から同時に光子破裂をプローブする系の能力を実証した。４つの代表的トレースは、３つのナノ細孔からプローブされた１−ビット試料を用いた電流および光学的シグナルを示す。各ナノ細孔での各分子の進入およびアンジッピング過程は、確率論的過程である。この実験に用いられる条件下で、＞３、０００アンジッピング事象のうち、〜５０が同時に２つのナノ細孔を通って進入する分子を包含した、ということが判明した。すべてのナノ細孔から蓄積される電流トレースは２つの別個の遮断レベルを表示するが、これは、ナノ細孔が占有される情報を伴わずに、特定時期での占有ナノ細孔の総数を示している。光学的トレースは、占有ナノ細孔を非多義的に明示する。これは、本明細書中に記載される方法がより大きなアレイに拡大され、そして単に、光学的測定に頼って、計器計測要件を簡易化する場合、電流測定の必要性を最終的に排除する。
【００８９】
ナノ細孔を用いるＤＮＡシーケンシング法は、代替方法を上回るいくつかの利点を提供する。読出し速度は、適用電圧を調整することにより完全に制御可能であり、単に、検出様式分解能により限定される。より明るい蛍光体およびより高い感度のＣＣＤの将来的開発は、より迅速な読出し速度へと直進的に変わり得る。単一分子法として、それは、大型試料濃度規定を有さず、したがって、経費および試料増幅エラーをともに下げるのに役立つ。最後に、ここに示したナノ細孔読出しは、予め定義されたまたは無作為の位置での酵素の固定化を包含せず、したがって、読取りプラットフォームを高度に簡易化する。ここでは、二元性コード（２ビット／塩基）を用いて各ＤＮＡ塩基を表す２色転換ＤＮＡ読出しの実現可能性を実証した。いくつかの実施形態では、当該系は、５０〜２５０塩基／秒／ナノ細孔を読取り得る。
【００９０】
４色に関する直接的適合、ならびに最適化試薬の使用は、少なくとも５００塩基／秒／ナノ細孔の達成を可能にして、塩基分類エラーを明確に低減する、と予測される。在庫ありで直ぐに入手可能な試薬を用い、そして単一レーザー線を用いた場合でも、ヌクレオチド分類エラーは約１０％（単一読取り当たり）である。ＤＮＡ転換工程は無構造ＤＮＡを生じるため、それは、読出し段階からシステムエラーを自動的に除去する（すなわち、エラーはＤＮＡ鋳型配列によって決まらない）。したがって、読出しエラーの顕著な源は、同一配列の多重読み取りで実質的に低下され得る。最後に、多細孔読出しの実現性を実証したが、これは、ナノ細孔ベースの方法に関する最初のものであると考えられる。
【００９１】
本明細書中に記載した結果は、光学的ＤＮＡシーケンシングのために固体状態ナノ細孔を用いることの実現可能性を示している。
【００９２】
結果は、最初の全固体状態ＤＮＡ配列読出しであると考えられるものを実証する。このような超迅速且つ手ごろな系は、生物医学的研究において、ならびにヒト疾患の診断および処置において、多数の用途を有する。
【００９３】
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【図１ａ】
2013526280.tif 000003
【図１ｂ】
2013526280.tif 000004
【図２ａ】
2013526280.tif 000005
【図２ｂ】
2013526280.tif 000006
【図２ｃ】
2013526280.tif 000007
【図３ａ】
2013526280.tif 000008
【図３ｂ】
2013526280.tif 000009
【図３ｃ】
2013526280.tif 000010
【図４ａ】
2013526280.tif 000011
【図４ｂ】
2013526280.tif 000012
【図４ｃ】
2013526280.tif 000013
【図５ａ】
2013526280.tif 000014
【図５ｂ】
2013526280.tif 000015
【国際調査報告】
2013526280.tif 000016
2013526280.tif 000017
2013526280.tif 000018