(57)【要約】  本発明は、安定化されたインタクトな抗体製剤、関連する方法およびその使用に関する。特に、本発明は、液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法であって、インタクトな抗体分子のＦｃ領域にある特定のリジンに結合するか、または当該リジンをマスクすることによって、インタクトな抗体の会合を調節することを含んでなり、ここで前記リジン残基が、前記インタクトな抗体分子のＦｃ領域、特に、前記Ｆｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号２のアミノ酸配列の位置番号８に位置することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記リジン残基が、前記インタクトな抗体分子のＦｃ領域、特に、前記Ｆｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号３のアミノ酸配列の位置番号８に位置することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リジン残基が、前記インタクトな抗体分子のＦｃ領域、特に、前記Ｆｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号４または５のアミノ酸配列の位置番号２８に位置することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リジン残基が、前記インタクトな抗体分子のＦｃ領域、特に、前記Ｆｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号１の位置番号７５に位置することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
液体キャリアと、インタクトな抗体と、調節化合物とを含み、前記調節化合物が、インタクトな抗体分子のＦｃ領域にある特定のリジンに対する結合親和性を有し、ここで前記リジン残基が、前記インタクトな抗体分子のＦｃ領域、特に、前記Ｆｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号２のアミノ酸配列の位置番号８に位置することを特徴とする、安定な抗体製剤。
【請求項６】
液体キャリアと、インタクトな抗体と、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2013528570.tif 000008
（式中、ｎ＝０または１であり、ｍおよびｐは、それぞれ独立して０または１であり；Ａは、カルボキシ部位、ホスフェート部位、ホスホネート部位、ホスフィネート部位、ホスホロチオエート部位、サルフェート部位またはスルホネート部位から選択される、負に帯電したアンカー部位であり；Ｌは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケトン基、ハロ基またはカルボキシ基から独立して選択される１つ以上の基によって場合により置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６カルボニル、Ｃ１〜Ｃ６エーテルであるか、あるいは、Ｎ、ＯまたはＳから選択される０〜３個のヘテロ原子を含み、場合により、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケトン基、ハロ基またはカルボキシ基から独立して選択される１つ以上の基によってさらに置換されていてもよい、５員環または６員環の置換された脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；Ｑは、縮合、スピロ縮合または架橋していてもよい、１個の単独の環から５員環または６員環と、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケトン基、アルデヒド基、カルボキシ基、アミン基、ニトロ基、チオ基またはハロ基から独立して選択される１つ以上の基によって場合によりさらに置換されていてもよい、Ｎ、ＯまたはＳから選択される０〜５個のヘテロ原子とを含む、場合により置換されていてもよい脂環式部位、ヘテロ脂環式部位、芳香族部位またはヘテロ芳香族部位から選択される環状部位分である。）
またはその医薬的に許容される塩もしくは互変異性体とを含んでなる、安定な抗体製剤。
【請求項７】
Ａが、モノホスフェート基、ジホスフェート基またはトリホスフェート基から選択されるものである、請求項６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
Ｑが、場合によりＮ、ＯまたはＳから選択される１個または２個のヘテロ原子を含む、場合により置換されていてもよい単独の脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族の６員環、あるいは、２個の５員環または６員環を有し、この環が、酸素原子を介して架橋しており、そして場合によりＮ、ＯまたはＳから選択される１〜５個のヘテロ原子を含む、場合により置換されていてもよい脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族部位から選択され、これらの環が、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケトン基、アルデヒド基、カルボキシ基、アミン基、ニトロ基またはハロ基から独立して選択される１つ以上の基で場合によりさらに置換されていてもよい、ものである、請求項６〜７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
ｍおよびｎが１であり、ｐが０である、請求項７に記載の製剤。
【請求項１０】
ｍ、ｎおよびｐが０である、請求項７に記載の製剤。
【請求項１１】
Ｌがテトラヒドロフランである、請求項６〜９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２】
式（Ｉ）の化合物が、単糖リン酸もしくは二糖リン酸、またはこれらの医薬的に許容される塩から選択されるものである、請求項６〜９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３】
式（Ｉ）の化合物が、α−Ｄ−ガラクトース−１−ホスフェート、α−ラクトース−１−ホスフェート、α−Ｄ（＋）マルトース−１−ホスフェート、もしくはスクロースホスフェート、またはこれらの医薬的に許容される塩から選択されるものである、請求項１２に記載の安定な抗体製剤。
【請求項１４】
式（Ｉ）の化合物がスクロースホスフェートである、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５】
式（Ｉ）の化合物が、フルダラビン、テノホビル、シドフォビル、またはチルドロネートから選択されるものである、請求項６に記載の安定な抗体製剤。
【請求項１６】
式（Ａ）の化合物：
【化２】
2013528570.tif 000009
（式中、Ｒ１は、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、キサンチン、エタノアデニン、イノシン、オロチジンまたはシトシンからなる群から選択される核酸塩基であり；Ｒ２は、ＨまたはＯＲ４であり、ここでＲ４は、ＨまたはＣ１〜４アルキル基であり；Ｒ３は、ＨまたはＯＲ５であり、ここでＲ５は、ＨまたはＣ１〜４アルキル基であり；ｎは、１〜３の整数である。）
またはその医薬的に許容される塩もしくはその互変異性体を含んでなる、請求項６に記載の安定な抗体製剤。
【請求項１７】
前記調節化合物が式（Ｉ）：
【化３】
2013528570.tif 000010
（式中、ｎ、ｍ、ｐ、Ａ、ＬおよびＱは、先行する請求項のいずれか一項に定義されるものである。）
またはその医薬的に許容される塩もしくは互変異性体である、請求項５に記載の安定な抗体製剤。
【請求項１８】
前記インタクトな抗体が、アクセサリー分子に複合してなることを特徴とする、請求項５〜１７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１９】
前記インタクトな抗体がネイティブ抗体である、請求項５〜１８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２０】
前記インタクトな抗体が、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ２ｂ型、ＩｇＧ３型、ＩｇＧ４型、ＩｇＥ型またはＩｇＤ型の免疫グロブリンである、請求項５〜１９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２１】
前記インタクトな抗体がベバシズマブである、請求項５〜２０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２２】
前記製剤が医薬製剤である、請求項５〜２１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２３】
前記製剤は、ｐＨがｐＨ４．５〜ｐＨ７．５の範囲であることを特徴とする、請求項５〜２２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２４】
医薬的に許容される賦形剤をさらに含んでなる、請求項５〜２３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２５】
適切な容器に、請求項５〜２５のいずれか一項に記載の抗体製剤を含んでなる、哺乳動物への眼球投与または静脈内投与に適した医薬単位剤形。
【請求項２６】
医薬として使用するための、請求項５〜２４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２７】
癌、関節リウマチ、移植による拒絶反応、血液凝固、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染、クローン病、循環器疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶、喘息、発作性夜間血色素尿症、乾癬、または新生血管加齢黄斑変性疾患（ＡＭＤ）から選択される疾患または障害を予防または治療するための、請求項５〜２４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項２８】
癌、関節リウマチ、移植による拒絶反応、血液凝固、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染、クローン病、循環器疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶、喘息、発作性夜間血色素尿症、乾癬、または新生血管加齢黄斑変性疾患（ＡＭＤ）から選択される疾患または障害を予防または治療するための医薬組成物の調製のための、請求項５〜２４のいずれか一項に記載の製剤の使用。
【請求項２９】
液体キャリア中でインタクトな抗体の製剤を安定化するための、インタクトな抗体分子のＦｃ領域内にある特定のリジンと相互作用する調節化合物の使用であって、ここで前記リジン残基が、前記インタクトな抗体分子のＦｃ領域、特に、前記Ｆｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号２のアミノ酸配列の位置番号８に位置することを特徴とする、使用。
【請求項３０】
抗体の会合を調節する活性を有する調節化合物を同定する方法であって；インタクトな抗体ベバシズマブの構造の三次元モデルを作成する工程と；インタクトな抗体であるベバシズマブの表面に、候補化合物をコンピュータを利用してドッキングする工程と；インタクトな抗体ベバシズマブのＦｃ領域にあるＬｙｓ４４５Ｂに対応する残基と優先的に結合する調節剤化合物を同定する工程とを含んでなる、方法。
【請求項３１】
液体キャリア中でインタクトな抗体の製剤を安定化するための、請求項３０に記載の方法によって同定された化合物の使用。
【請求項３２】
インタクトな抗体を、式（Ｉ）の化合物；
【化４】
2013528570.tif 000011
（式中、ｎ、ｍ、ｐ、Ａ、ＬおよびＱは、先行する請求項のいずれか一項に定義されるものである。）
またはその医薬的に許容される塩もしくは互換異性体と混合することにより、液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法。
【請求項３３】
インタクトな抗体またはその製剤を調製するプロセスであって、
（ｉ）液体混合物中でインタクトな抗体と式（Ｉ）の化合物（式中、ｎ、ｍ、ｐ、Ａ、ＬおよびＱは、先行する請求項のいずれか一項に定義されるとおりのものである。）またはその医薬的に許容される塩とを混合する工程、あるいは、式（Ｉ）の化合物を含む液体媒体中でインタクトな抗体を製剤化する工程と；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた前記安定化されたインタクトな抗体を含む液体混合物または液体媒体を集める工程とを含んでなり、インタクトな抗体のモノマーの割合が、前記式（Ｉ）の化合物の存在下で調製したインタクトな抗体と比較して増えていることを特徴とする、プロセス。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法または請求項３３に記載のプロセスによって得ることができる、安定化されたインタクトな抗体またはその製剤。
【請求項３５】
前記インタクトな抗体がベバシズマブである、請求項３４に記載の安定化されたインタクトな抗体またはその製剤。
【請求項３６】
式（Ｉ）の化合物が、α−Ｄ−ガラクトース−１−ホスフェート、α−ラクトース−１−ホスフェート、α−Ｄ（＋）マルトース−１−ホスフェート、およびスクロースホスフェート、またはこれらの医薬的に許容される塩から選択される単糖類または二糖類である、請求項３４または３５に記載の安定化されたインタクトな抗体またはその製剤。
【請求項３７】
請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の安定化された抗体またはその製剤を含んでなる医薬製剤。
【請求項３８】
請求項５〜２４のいずれか１項に記載の安定なベバシズマブ製剤または請求項３７に記載の医薬製剤を、それを必要とする被検体に予防または治療に有効な量投与することを含んでなる、癌、関節リウマチ、移植による拒絶反応、血液凝固、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染、クローン病、循環器疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶、喘息、発作性夜間血色素尿症、乾癬、または新生血管加齢黄斑変性疾患（ＡＭＤ）から選択される疾患または障害を予防、治療または改善する方法。
【請求項３９】
インタクトな抗体の会合を調節する活性を有する調節化合物を同定する方法であって、
（ｉ）インタクトな抗体の構造の三次元モデルの表面に、候補化合物を、コンピュータを利用してドッキングさせる工程と；
（ｉｉ）インタクトな抗体のＦｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号２の配列を有するアミノ酸配列の位置番号８にあるリジン残基に優先的に相互作用する調節化合物を同定する工程とを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体調製物に関し、特に、抗体および抗体調製物を安定化する方法、安定性が高い抗体調製物、およびその使用に関する。本発明は、さらに、安定化した抗体調製物を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用抗体は、現在、バイオ医薬品の分野で最も急速に成長している分野である。キメラモノクローナル抗体および完全ヒト化モノクローナル抗体についての最近の開発は、これらの分子が、疾患に関与する分子を特異的に標的とし、それゆえ、従来の薬物療法に付随すると思われる副次的な影響を本質的に回避することができるため、これらの分子を治療薬剤として用いるというこれまでにない興味を生み出した。遺伝子組換え技術の最近の進歩は、モノクローナル抗体のような、診断および治療の用途で生理活性があるタンパク質を大量生産することを可能にした。
【０００３】
安定な治療用タンパク質製剤、特に安定な抗体製剤の供給には、課題が存在する。水媒体中の抗体の物理的化学的な不安定性は、溶液の状態および温度の複雑な関数である。抗体は、例えば、脱アミド化、異性化、酸化、タンパク質分解、会合および他の共有結合の修飾を受けやすい。会合現象による抗体製剤の分解は、特に問題である。会合体の生成は、抗体の活性を下げることによってタンパク質薬物の効能を下げてしまうだけではなく、会合体がタンパク質薬物の免疫原性を高めてしまうこともあるため、臨床的にあり得る副作用または毒性も生じてしまう（Ｄｅｍｅｕｌｅら、２００６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．、６２：１２１−３０)。
【０００４】
抗体の会合は、連続して行われる抗体の生産においてバッチ毎の変動の原因でもあり、これを制御することは、規制や品質管理の負担を、これらに関連する費用とともに生じる。
【０００５】
さらに、抗体が会合する傾向は、保存寿命を含む保存時の治療用抗体製剤の安定性にも悪影響を与え、最適な保存条件から逸脱した場合には、使用可能な投与期間にも悪影響を与える。
【０００６】
他のモデルタンパク質とは異なり、抗体の安定性は、必ずしもタンパク質濃度、バッファー濃度、塩濃度、または撹拌に依存するわけではない。抗体は環境条件に非常に影響を受けやすく、特に、個々の抗体が非常に特異的で特徴的な安定性プロフィールを持っていると思われるため、会合および分解を予測するのは非常に困難であり、抗体の安定化には問題がある。物理的な安定性に影響を与えることが一般的に知られている主要な因子に対する影響がないことは、抗体の安定性の機構が、経験にそぐわないものであり、他の十分に研究されているタンパク質とは異なる可能性があることを示唆している。
【０００７】
今まで、臨床用途に導入されたほとんどの治療用モノクローナル抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型の抗体である。例えば、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））は、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）に結合し、この因子の生物活性を阻害する、分子量が１４９ｋＤａの組換えモノクローナルヒトＩｇＧ１抗体である。ＶＥＧＦは、腫瘍の血管新生にきわめて重要な役割を果たすことが知られており、動脈、静脈、リンパ管の内皮細胞にとって顕著な増殖刺激因子である。化学療法にベバシズマブを加えると、転移性結腸癌患者で、全奏効率、奏効期間、および生存率が増加することが示されてきた。ベバシズマブは、ファーストライン治療中の非小細胞肺癌、転移性乳癌、セカンドライン治療中の転移性結腸直腸癌にとって有益である。また、ベバシズマブは、加齢による進行性の失明の一般的な形態である新生血管加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療にも有益である。
【０００８】
抗体の安定性を改善する試みとして、多くの方法が研究されてきた。その中には、免疫グロブリンを含有する溶液に「安定化」剤を加えることに基づく方法、免疫グロブリン分子の会合体形成に関与する部位で１個のアミノ酸を変異させるという試みがある。溶液中の免疫グロブリンの安定性を改善する従来の試みにおいて、「安定化」剤として研究された種の例としては、ポリソルベート系界面活性剤（ＧＢ  ２１７５９０６）、アミノ酸（ＥＰ  ００２５２７５、ＷＯ  ２００５／０４９０７８）、ポリエーテル（ＥＰ  ００１８６０９）、グリセリン、アルブミン、硫酸デキストラン（ＵＳ  ４，８０８，７０５）が挙げられる。しかし、この方法が上手くいくには制限があった。この上手くいくのに制限がある理由のひとつは、「安定化」剤が、免疫グロブリンが含まれる環境を最適化することを目的としており、会合体が生成する際に、免疫グロブリン分子の相互作用の機構を特定的に妨害することを目的としているわけではないからであると考えられる。また、この方法には、好ましい効果を発揮するのに必要であると思われる安定化剤の量についても制限があり、この量は、免疫グロブリン分子に対しタンパク質のアンフォールディングなどの対しタンパク質のアンフォールディングなどの他の悪い影響（例えば、界面活性剤の場合）、または、その後の臨床投与について「安定化された」調製物の適合性および安全性に対し他の悪い影響を与えることがある。
【０００９】
免疫グロブリンの１個のアミノ酸変異は、会合に関与する部位を特異的に標的とする方法を提供することができるが、このような方法は、必然的に免疫グロブリンの構造を変えてしまい、臨床的な効能、受容者の免疫原性の両方に影響を及ぼすことがあり、治療薬剤に対する免疫応答のような望ましくない副作用を生じてしまうことがある。
【００１０】
抗体の会合を防ぐという従前の研究にもかかわらず、抗体−抗体結合の正確な性質、特に、抗体会合体における抗体−抗体接触面の性質は、不明のままである。
【００１１】
多くの異なる方法が提案されてきたが、抗体製剤に採用された方法の中には、依然会合が課題となっているものもある。臨床用途で使用する免疫グロブリンの会合に対し、１つだけの、有効な、そして広く適用可能な解決手段は今までに得られていない。
【００１２】
上記の観点で、抗体の会合を阻害および／または減らすのに有効な方法を提供する必要性が引き続き存在する。
【００１３】
抗体の会合に関する問題によりよく対処するために、会合に関与する抗体の重要な領域を特定し、そして、抗体会合体における抗体−抗体接触面の性質を理解することが必要である。
【００１４】
治療用抗体の製造、製剤化、安定化にとって会合が主な課題であり、生物活性が失われ、溶解性が失われ、さらには増大した免疫原性が失われることもあるため、特に、改善された保存寿命および安定性を提供する治療用抗体調製物、特に、モノクローナル抗体の製剤を提供する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、インタクトな抗体のＦｃ領域の会合接触領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインを阻害することにより、インタクトな抗体を安定化する方法、特に、その会合傾向を下げる方法の予想外な知見に関する。本発明は、前記抗体の前記Ｆｃ領域の会合接触領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインの阻害が、この領域に由来する少なくとも１つの特異的な残基、典型的には、現時点で市販されているか、または開発中である治療用モノクローナル抗体のほとんどに由来するＦｃ領域のＣＨドメインで共通する特定のアミノ酸を含むアミノ酸配列をマスクすることによって達成することができるというさらなる知見に関する。特に、本発明者らは、予想外なことに、インタクトな抗体の会合が、インタクトな抗体分子のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインにあるＩｇＧ１結晶構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）のＩＤ「１ＩＧＹ」、Ｈａｒｒｉｓら、１９９８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．２７５、６、ｐ８６１−８７２）のＬｙｓ４４５ＢおよびＬｙｓ３８３Ｂに対応する少なくとも１つのリジン残基を遮断またはマスクすることによって調節可能であり、このことが会合体の形成に関与していることを知見した。このリジン残基が関わる抗体−抗体相互作用を遮断または抑制すると、インタクトな抗体分子間の会合を誘発する接触が防がれるか、または覆される。
【００１６】
本発明の一つの態様によれば、インタクトな抗体のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインにある会合接触領域を阻害することによって、インタクトな抗体の会合を調節することを含む、液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法が提供される。
【００１７】
本発明の一つの態様によれば、インタクトな抗体分子のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメイン（例えば、ＣＨ３ドメイン）に含まれる配列番号２のアミノ酸配列の位置番号８にあるリジン残基をマスクするか、またはこのリジン残基に結合することによって、インタクトな抗体の会合を調節することを含む、液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法が提供される。
【００１８】
本発明の一つの態様によれば、インタクトな抗体分子のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメイン（例えば、ＣＨ３ドメイン）に含まれる配列番号７のアミノ酸配列の位置番号８にあるリジン残基をマスクするか、またはこのリジン残基に結合することによって、インタクトな抗体の会合を調節することを含む、液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法が提供される。
【００１９】
本発明の一つの態様によれば、抗体−抗体相互作用に関与するインタクトな抗体分子のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインにあるＬｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基をマスクすることによって、インタクトな抗体の会合を調節することを含む、液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法が提供される。
【００２０】
本発明の一つの態様によれば、インタクトな抗体のＦｃ領域、特にＦｃ領域のＣＨドメインにあるＬｙｓ４４５Ｂに対応する残基に結合することによって、インタクトな抗体の会合を調節することを含む、液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法が提供される。
【００２１】
本発明の一つの態様によれば、インタクトな抗体と、インタクトな抗体のＩｇＧ１結晶構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）のＩＤ「１ＩＧＹ」、Ｈａｒｒｉｓら、１９９８、上述）のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインにあるＬｙｓ３８３ＢおよびＬｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基の群から選択されるリジン残基に対する結合親和性を有する調節化合物とを混合することによって、インタクトな抗体の会合を調節することを含む、液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法が提供される。本発明の一つの態様によれば、インタクトな抗体と、インタクトな抗体のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインにあるＬｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基に対する結合親和性をもつ調節化合物とを混合することによって、インタクトな抗体の会合を調節することを含む、液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法が提供される。
【００２２】
本発明の一つの態様によれば、液体キャリアと、インタクトな抗体と、調節化合物とを含み、この調節化合物が、インタクトな抗体のＦｃ領域にあるＬｙｓ４４５Ｂに対応する残基に対する結合親和性を有するものである、安定な抗体製剤が提供される。
【００２３】
本発明の一つの態様によれば、液体キャリアと、インタクトな抗体と、インタクトな抗体のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインにあるＬｙｓ３８３ＢおよびＬｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基の群から選択されるリジン残基に対する結合親和性を有する調節化合物とを含む、安定な抗体製剤が提供される。本発明の一態様によれば、液体キャリアと、インタクトな抗体と、インタクトな抗体のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインにあるＬｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基に結合する調節化合物とを含む、安定な抗体製剤が提供される。
【００２４】
本発明の一つの態様によれば、液体キャリア中でインタクトな抗体の製剤を安定化するための、ＩｇＧ１のＦｃ領域にあるＬｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基に対する結合親和性を有する調節化合物の使用が提供される。
【００２５】
本発明の一つの態様によれば、液体キャリアと、インタクトな抗体と、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2013528570.tif 000002
（式中、ｎ＝０または１であり、ｍおよびｐは、それぞれ独立して０または１であり；Ａは、負に帯電したアンカー部位であり、例えば、カルボキシ部位、ホスフェート部位、ホスホネート部位、ホスフィネート部位、ホスホロチオエート部位、サルフェート部位またはスルホネート部位から選択される。Ａは、好ましくは、ホスホネート部位、ホスフェート部位、またはこれらのバイオアイソスターから選択されてもよく；Ｌは、任意要素のリンカー基であり、存在する場合、Ｌは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケトン基、ハロ基またはカルボキシ基から独立して選択される１つ以上の基によって場合により置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６カルボニル、Ｃ１〜Ｃ６エーテルであるか、または、Ｎ、ＯまたはＳから選択される０〜３個のヘテロ原子を含み、場合により、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケトン基、ハロ基またはカルボキシ基から独立して選択される１つ以上の基によってさらに置換されていてもよい、５員環または６員環の置換された脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；Ｑは、縮合、スピロ縮合または架橋していてもよい、１個の単独の環から５員環または６員環と、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケトン基、アルデヒド基、カルボキシ基、アミン基、ニトロ基、チオ基またはハロ基から独立して選択される１つ以上の基によって場合によりさらに置換されていてもよい、Ｎ、ＯまたはＳから選択される０〜５個のヘテロ原子とを含む、場合により置換されていてもよい脂環式部位、ヘテロ脂環式部位、芳香族部位またはヘテロ芳香族部位から選択される環状部位である。）
またはその医薬的に許容される塩とを含む、安定な抗体製剤が提供される。
【００２６】
本発明の一つの態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、単糖リン酸または二糖リン酸から選択される。一つの態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、α−Ｄ−ガラクトース−１−ホスフェート、α−ラクトース−１−ホスフェート、α−Ｄ（＋）マルトース−１−ホスフェートおよびスクロースホスフェート、またはこれらの医薬的に許容される塩から選択される単糖リン酸または二糖リン酸である。
【００２７】
本発明の一つの態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、リン酸フルダラビン、リン酸テノホビル、リン酸シドフォビル、リン酸チルドロネートまたはリン酸ピリドキサールから選択されてもよい。
【００２８】
本発明の一つの態様によれば、 式（Ｉ）の化合物は、フルダラビン、テノホビル、シドフォビルまたはチルドロネートから選択されてもよい。
【００２９】
一つの態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、式（Ａ）の化合物：
【化２】
2013528570.tif 000003
（式中、Ｒ１は、核酸塩基であり；Ｒ２は、ＨまたはＯＲ４であり、ここでＲ４は、ＨまたはＣ１〜４アルキル基であり；Ｒ３は、ＨまたはＯＲ５であり、ここでＲ５は、ＨまたはＣ１〜４アルキル基であり；ｎは、１〜３の整数である。）
またはその医薬的に許容される塩から選択される。核酸塩基Ｒ１は、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、キサンチン、エタノアデニン、イノシン、オロチジンまたはシトシンからなる群から選択されてもよい。
【００３０】
一つの実施形態によれば、式（Ａ）の化合物は、アデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン５’二リン酸（ＡＤＰ）、またはアデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）を含む群から選択される。一つの実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、アデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ）である。
【００３１】
別の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、アデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）である。
【００３２】
別の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、アデノシン５’二リン酸（ＡＤＰ）である。
【００３３】
別の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、グアノシン５’一リン酸（ＧＭＰ）である。
【００３４】
別の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、スクロースホスフェートである。
【００３５】
式（Ｉ）の化合物は、その遊離酸の形態であってもよく、または医薬的に許容される塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩、例えば、一ナトリウム塩または二ナトリウム塩）の形態であってもよい。本発明は、本発明の化合物の任意の互変異性体をさらに包含する。
【００３６】
本発明者らは、予想外なことに、インタクトな抗体、特にインタクトなモノクローナル抗体の液体調製物が、本発明の式（Ｉ）の化合物を加えることによって有効に安定化され得ることを知見した。
【００３７】
式（Ｉ）の化合物は、驚くべきことに、インタクトなモノクローナル抗体であるベバシズマブと規則的にドッキングする好ましい分子間相互作用を示すことが示されている。式（Ｉ）の化合物は、コンピュータを利用した規則的なドッキング試験によれば、ベバシズマブのＦｃ領域にあるＬｙｓ４４５Ｂに対応する残基の周辺で優先的な結合を示すことが示されている。
【００３８】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、インタクトな抗体、例えば、インタクトなモノクローナル抗体であるベバシズマブが液体製剤中で会合体を形成する傾向を低減させることができる。本発明の式（Ｉ）の化合物は、インタクトな抗体（例えば、ベバシズマブ）のすでに生成した会合体を実質的にモノマーの状態に回復または破壊させることを誘発することができる。
【００３９】
本発明の別の態様によれば、医薬製剤、例えば、本発明の安定な抗体製剤または本発明の安定化された抗体を含む、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与するために製剤化された製剤が提供される。
【００４０】
本発明の別の態様によれば、本発明の医薬製剤を含む、哺乳動物に投与するのに適した医薬単位剤形が提供される。
【００４１】
本発明の別の態様によれば、１個以上の容器に、本発明の製剤とともに、この製剤の使用説明書を含むキットが提供される。
【００４２】
本発明の別の態様によれば、医薬として使用するための本発明の製剤が提供される。
【００４３】
特定の実施形態では、医薬は、免疫疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、炎症性疾患、神経疾患、血管新生性疾患または腫瘍性疾患から選択される疾患または障害の治療または予防に使用するためのものであってもよい。
【００４４】
本発明の実施形態によれば、癌、関節リウマチ、移植による拒絶反応、血液凝固、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染、クローン病、循環器疾患、自己免疫疾患、喘息、発作性夜間血色素尿症、乾癬、または新生血管加齢黄斑変性疾患（ＡＭＤ）から選択される疾患または障害の予防または治療のための、本発明の製剤が提供される。
【００４５】
本発明の別の態様によれば、水溶液中でインタクトな抗体を安定化する方法が提供される。
【００４６】
本発明の別の態様によれば、本発明のインタクトな抗体の水溶液製剤を調製するプロセスが提供される。
【００４７】
本発明の別の態様によれば、本発明のプロセスまたは方法によって得ることが可能な、安定化されたインタクトな抗体またはその製剤が提供される。
【００４８】
本発明の別の態様によれば、液体キャリア中でインタクトな抗体の製剤を安定化するための、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインにあるＬｙｓ４４５Ｂに対応する残基に対する結合親和性を有する調節化合物の使用が提供される。
【００４９】
本発明の別の態様によれば、インタクトな抗体の会合を調節する活性を有する調節化合物を同定する方法であって：
（ｉ）候補化合物を、インタクトな抗体の構造の三次元モデルの表面にコンピュータを利用してドッキングする工程と；
（ｉｉ）インタクトな抗体のＦｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号２の配列を有するアミノ酸配列の位置番号８にあるリジン残基に優先的に相互作用する調節化合物を同定する工程とを含む方法が提供される。
【００５０】
本発明のさらなる態様によれば、インタクトな抗体の構造の三次元モデルが、本明細書によって教示されるように作成される、本発明の調節化合物を同定する方法が提供される。
【００５１】
本発明の別のさらなる態様によれば、インタクトな抗体が第１表に列挙された抗体であるか、または第１表に列挙された抗体と共通のＦｃ領域のアミノ酸配列を有する、本発明の調節化合物を同定する方法が提供される。特定の実施形態では、インタクトな抗体が、配列番号２の配列、特に、Ｆｃ領域（特に、Ｆｃ領域のＣＨドメイン）にある配列番号３、４、５、６または７の配列を含む抗体である、本発明の調節化合物を同定する方法が提供される。
【００５２】
本発明の別のさらなる態様によれば、インタクトな抗体がベバシズマブである、本発明の調節化合物を同定する方法が提供される。
【００５３】
本発明の別の態様によれば、実施例１に記載されるようなホモロジーモデリングを用い、インタクトな抗体の構造の三次元モデルを作成する工程と；インタクトな抗体であるベバシズマブの表面に、候補化合物をコンピュータを利用してドッキングする工程と；インタクトな抗体のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインにあるＬｙｓ４４５Ｂに対応する残基と好ましく相互作用する調節化合物を同定する工程とを含む、抗体の会合を調節する活性を有する調節化合物を同定する方法が提供される。
【００５４】
本発明の別の態様によれば、実施例１に記載されるようなホモロジーモデリングを用い、インタクトな抗体の構造の三次元モデルを作成する工程と；インタクトな抗体の表面に、候補化合物をコンピュータを利用してドッキングする工程と；インタクトな抗体のＦｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号２の配列を有するアミノ酸配列の位置番号８に位置するリジン残基と好ましく相互作用する調節化合物を同定する工程とを含む、抗体の会合を調節する活性を有する調節化合物を同定する方法が提供される。特定の実施形態では、調節化合物が、インタクトな抗体のＦｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号３の配列を有するアミノ酸配列の位置番号８に位置するリジン残基と好ましく相互作用する、本発明の調節剤を同定する方法が提供される。別の特定の実施形態では、調節化合物が、インタクトな抗体のＦｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号４の配列を有するアミノ酸配列の位置番号２８に位置するリジン残基と好ましく相互作用する、本発明の調節剤を同定する方法が提供される。別の特定の実施形態では、調節化合物が、インタクトな抗体のＦｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号１の配列を有するアミノ酸配列の位置番号７５に位置するリジン残基と好ましく相互作用する、本発明の調節剤を同定する方法が提供される。
【００５５】
本発明の別の態様によれば、液体キャリア中でインタクトな抗体の製剤を安定化するための、本発明の方法により同定される化合物の使用が提供される。
【００５６】
本発明の別の態様によれば、癌、関節リウマチ、移植による拒絶反応、血液凝固、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染、クローン病、循環器疾患、自己免疫疾患、喘息、発作性夜間血色素尿症、乾癬、または新生血管加齢黄斑変性疾患（ＡＭＤ）から選択される疾患または障害を予防、治療または改善する方法が提供され、この方法は、予防または治療に有効な量の本発明の製剤または本発明の安定化されたインタクトな抗体を、それを必要とする被検体に投与することを含む。
【００５７】
本発明の別の態様によれば、癌、関節リウマチ、移植による拒絶反応、血液凝固、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染、クローン病、循環器疾患、自己免疫疾患、喘息、発作性夜間血色素尿症、乾癬、または新生血管加齢黄斑変性疾患（ＡＭＤ）から選択される障害を予防および／または治療するための医薬製剤の調製のための、本発明の製剤または本発明の安定化されたインタクトな抗体の使用が提供される。
【００５８】
本発明の別の態様によれば、治療用配合物に製剤化する前に、抗体の培養、調製、精製および処理中の会合を阻害するための、本発明の製剤または本発明の安定化されたインタクトな抗体の使用が提供される。
【００５９】
本発明の他の目的および利点は、特許請求の範囲および以下の詳細な説明、実施例および添付図面から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、インタクトなモノクローナル抗体であるベバシズマブの構造の三次元モデルを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、インタクトなモノクローナル抗体であるベバシズマブ、および接触領域を示すテンプレートＩｇＧ１の結晶対称性を用いて作成された対称性に関連する分子の三次元モデル構造による、２種類のベバシズマブ抗体の会合パターンを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａに示した２種類のベバシズマブ抗体の抗体−抗体会合接触領域を拡大した画像を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、図２Ｂに示した抗体−抗体会合接触領域をさらに拡大した画像を示す。
【図３】図３は、実施例１に記載されるように、式（Ｉ）の化合物が、本発明の一つの実施形態にしたがって水性キャリア中で製剤化されたモノクローナル抗体ベバシズマブに与える安定化効果を示す。
【図４】図４は、アデノシン５’一リン酸化合物が、実施例２に記載されるように、改質されていない市販製剤（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、「Ａ」）に異なるモル比で製剤化されたモノクローナル抗体ベバシズマブに与える安定化効果をあらわすグラフである。
【図５】図５は、実施例３に記載されるように、４０℃で保存した後、式（Ｉ）の化合物（ＡＴＰまたはＧＭＰまたはスクロースホスフェート、「ＡＢ」）の存在下、非存在下で、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）「Ａ」の安定性比較をあらわす。Ａ：保存１日後（ｔ１）；Ｂ：保存２８日後（ｔ２８）。モノマーの割合は、平均（ｎ＝３）±標準偏差であらわされる。Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）単独の場合と比較して、化合した製剤では、モノマーの顕著な増加が＊によってあらわされており、統計的に有意である（ｐ＜０．０５）。
【図６Ａ】図６は、本明細書に列挙した配列およびそれらの対応する配列番号をあらわす。Ａ：ヒトＩｇＧ１重鎖；矢印は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにあるＬｙｓ４４５に対応するリジンを示す（Ｓｃｏｐは、タンパク質の構造分類を指す。Ｄｓｓｐは、Ｋａｂｓｃｈら、１９８３、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄｅｄ  ａｎｄ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２（１２）、２５７７−２３６７に記載されるタンパク質に二次構造を割り当てるアルゴリズムを指す。ＰＤＢは、タンパク質データベースを指す。
【図６Ｂ−Ｈ】Ｂ−Ｈ：ＣＨドメイン、特に、抗体−抗体相互作用に関与するリジン残基を含む本発明のインタクトな抗体のＦｃ領域のＣＨ３ドメインに含まれるアミノ酸配列；Ｘａａは、任意のアミノ酸であってもよいアミノ酸（特定されないアミノ酸）を指す。
【図６−Ｉ】Ｉ：結晶化したＩｇＧまたは市販のインタクトなモノクローナル抗体薬物のＦｃ領域に由来するＣ末端部分を、相互作用するリジン残基（矢印）を含む配列番号５の６１アミノ酸のコンセンサス配列および配列番号２の１５アミノ酸のコンセンサス配列と比較したＣｌｕｓｔａｌＷ複数アミノ酸配列アラインメント。
【図７】図７は、インタクトな抗体の会合の調節剤を同定するための、本発明の方法で使用される、会合モデルの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
「インタクトな抗体」との用語は、本明細書で使用する場合、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ１またはＦａｂ２フラグメント）またはその一本鎖とは対照的に、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域の両方を有する抗体を指す。本発明のインタクトな抗体は、会合傾向を示す。特定の実施形態では、本発明のインタクトな抗体は、既定の臨床治療の標的に特異性をもつヒト化モノクローナル抗体である。特に、本発明のインタクトな抗体は、そのＦｃ領域のＣＨドメイン中、特に、そのＦｃ領域のＣＨ３ドメイン中に、配列番号２のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体である。さらに特定の実施形態では、本発明のインタクトな抗体は、そのＦｃ領域のＣＨドメイン中、特に、そのＦｃ領域のＣＨ３ドメイン中に、配列番号３のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体である。さらに特定の実施形態では、本発明のインタクトな抗体は、そのＦｃ領域のＣＨドメイン中、特に、そのＦｃ領域のＣＨ３ドメイン中に、配列番号４または５のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体である。さらに特定の実施形態では、本発明のインタクトな抗体は、そのＦｃ領域のＣＨドメイン中、特に、そのＦｃ領域のＣＨ３ドメイン中に、配列番号１のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体である。さらに特定の実施形態では、本発明のインタクトな抗体は、そのＦｃ領域のＣＨドメイン中、特に、そのＦｃ領域のＣＨ３ドメイン中に、配列番号７のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体である。
【００６２】
「モノクローナル抗体」との用語は、本明細書で使用する場合、同一のアミノ酸組成をもつ抗体を産生する細胞の単一のクローンに由来する抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、典型的には、単一のエピトープに対する結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体を調製する方法は、当該技術分野でよく知られており、広く、ハイブリドーマ細胞産生技術または組換え抗体操作技術に基づく。
【００６３】
本発明のインタクトな抗体の「Ｆｃ領域のＣＨドメイン」との用語は、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＤ類、ＩｇＥ類およびＩｇＧ類（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）に由来するＦｃ領域のＣＨドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆｃ領域のＣＨドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインである。
【００６４】
アミノ酸残基の命名は、抗体−抗体相互作用のモデリングに利用されるＩｇＧ配列からなされる(ＰＤＢのＩＤ１ＩＧＹ)。本発明の相互作用するリジンは、ＢおよびＤと命名される重鎖の位置番号４４５にある（すなわち、Ｂ鎖の「Ｌｙｓ４４５Ｂ」）。この残基は、抗体のＦｃ領域の高度に保存されたＣＨドメインの中にある（例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖のＣ末端由来の３３アミノ酸）。しかし、他の完全免疫グロブリン重鎖の中にあるこの数字の位置は、Ｎ末端により近いＶＨ（可変）ドメインの中で自然変異または操作された変異により、または、他の結晶構造の番号付けによる命名の結果として、変動することがある。この理由のため、この重要なリジン残基は、本明細書全体で「Ｌｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基」と呼ばれる。同様に、「Ｌｙｓ３８３Ｂ」との表現は、Ｂと命名された重鎖の位置番号３８３にある本発明の相互作用するリジンに使用される。
【００６５】
本発明の実施形態では、インタクトな抗体は、完全免疫グロブリン分子、特に、ＩｇＤ類、ＩｇＥ類およびＩｇＧ類（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のような免疫グロブリンモノマーであってもよい。
【００６６】
本発明の実施形態では、インタクトな抗体は、ネイティブ抗体であってもよい。
【００６７】
本発明の他の実施形態では、インタクトな抗体は、アクセサリー分子と複合したインタクトなモノクローナル抗体であってもよい（本明細書で「複合体抗体」とも呼ばれる）。
【００６８】
「アクセサリー分子」との用語は、抗体分子に接続または複合する天然由来または合成由来の分子または分子の集合体を含み、付加的な治療、診断、分析の能力または画像化機能を付与することによって、このような機能が、抗体の特異性によって標的化、送達、または活性化される。
【００６９】
アクセサリー分子は、例えば、癌治療に活性な薬剤（例えば、化学療法薬）または放射性薬剤であってもよい。
【００７０】
本発明の実施形態では、インタクトな抗体は、治療、診断または予防のための既知のインタクトなモノクローナル抗体薬物から選択されてもよい。例えば、ＩｇＧ系のインタクトな抗体、例えば、アダリムマブ、アレムツズマブ、バピヌズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、フィギツムマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、モタビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オテリキシズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラキシバクマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブまたはウステキヌマブを挙げることができる。
【００７１】
特定の実施形態では、本発明のインタクトな抗体は、ベバシズマブであり、特に、Ｐｒｅｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５７（１９９７）、４５９３−４５９９に記載されるようなＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）である。
【００７２】
「脂環式」との用語は、単独で使用する場合、または他の用語と組み合わせて使用する場合、環状および多環状の脂肪族炭化水素、並びに架橋したシクロアルキル化合物を含み、１個以上の官能基で場合により置換されていてもよい。したがって、「脂環式」との用語は、シクロアルキル部位、シクロアルケニル部位およびシクロアルキニル部位を含むが、これらに限定されない。この用語は、例えば、シクロペンチル、ＣＨ２−シクロペンチル、シクロヘキシル、−ＣＨ２−シクロヘキシル、シクロヘキセニルエチル、シクロヘキサニルエチルなどの基によって例示され、１個以上の官能基で場合により置換されていてもよい。多環状炭化水素において、環は、縮合、スピロ縮合、または架橋していてもよい。
【００７３】
「脂肪族」との用語は、単独で使用する場合、または他の用語と組み合わせて使用する場合、飽和および不飽和の直鎖または分岐した炭化水素を両方とも含み、１個以上の官能基で場合により置換されていてもよい。したがって、「脂肪族」との用語は、アルキル部位、アルケニル部位またはアルキニル部位を含むが、これらに限定されない。この用語は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｓ−ペンチル、ｉ−ペンチル、ｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓ−ヘキシル、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−ブテン−１−イル、エチニル、１−プロピニルなどの基によって例示される。
【００７４】
「アルキル」との用語は、単独で使用する場合、または他の用語と組み合わせて使用する場合、直鎖または分岐したＣ１〜Ｃ６アルキルを含み、Ｃ１〜Ｃ６アルキルは、１〜６個の炭素原子を含む一価アルキル基を指す。この用語は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチルなどの基によって例示される。
【００７５】
「アルコキシ」との用語は、単独で使用する場合、または他の用語と組み合わせて使用する場合、酸素原子を介して親分子と接続する、アルキル基（すでに記載したとおり）を指す。この用語は、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ペントキシ、ｎ−ヘキサオキシなどの基によって例示される。
【００７６】
「芳香族」または「芳香族部位」との用語は、単独で使用する場合、または他の用語と組み合わせて使用する場合、置換または非置換の、安定な単環または多環炭化水素部位を指し、好ましくは、３〜１８個の炭素原子、好ましくは、３〜１０個の炭素原子を含み、芳香族のヒュッケル則を満たす少なくとも１つの環を含む。多環芳香族において、環は、縮合、スピロ縮合、または架橋していてもよい。
【００７７】
「ヘテロ脂環式」または「ヘテロ環」との用語は、単独で使用する場合、または他の用語と組み合わせて使用する場合、環の１個以上の炭素原子がヘテロ原子と置き換わっている、飽和および不飽和の単環または多環脂肪族炭化水素を指し、１個以上の官能基で場合により置換されていてもよい。ある実施形態では、１個以上のヘテロ原子は、独立して、Ｎ、ＯまたはＳである。この用語は、例えば、ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、ピペリジニル、オキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリルなどの基によって例示される。
【００７８】
「ヘテロ脂肪族」との用語は、単独で使用する場合、または他の用語と組み合わせて使用する場合、環の１個以上の炭素原子がヘテロ原子と置き換わっており、１個以上の官能基で場合により置換されていてもよい、脂肪族部位（すでに記載したとおり）を指す。１個以上のヘテロ原子は、独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＰまたはＳｉであってもよい。
【００７９】
「ヘテロ芳香族」または「ヘテロ芳香族部位」との用語は、単独で使用する場合、または他の用語と組み合わせて使用する場合、環の１個以上の炭素原子がヘテロ原子と置き換わった、安定な置換または非置換の芳香族部位（すでに記載したとおり）を指す。好ましい実施形態では、１個以上のヘテロ原子は、独立して、Ｎ、ＯまたはＳである。この用語は、例えば、ピリジル、ピリミジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、ジヒドロキナゾリルなどの基によって例示される。
【００８０】
個々の置換基の定義と矛盾しない限り、「置換された」との用語は、アミノ、ハロ、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、場合により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基、例えば、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ６アルキル（例えば、ヒドロキシルメチル）などからなる群から選択される１〜５個の置換基で置換された基を指す。
【００８１】
特定の実施形態によれば、場合により置換されていてもよいＱ基は、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、またはＣ１〜Ｃ６アルキル基、例えば、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ６アルキル（例えば、ヒドロキシルメチル）などによって場合により置換されていてもよいＱ基である。
【００８２】
「結合親和性」との用語は、抗体−抗体接触および抗体−抗体会合の開始に関与している、インタクトな抗体分子のＦｃ領域のＣＨドメイン中の部位と相互作用またはこれに結合する傾向に関する。典型的には、結合親和性は、本発明によって教示される方法による、ドッキングスコアリングを用いたモデリングによって評価してもよい。
【００８３】
「加齢黄斑変性症」（ＡＭＤ）との用語は、通常は６０歳以降で発症し、網膜の中央部分である黄斑が進行的に破壊され、中央部の視力が悪くなる目の進行性疾患を含む。
【００８４】
「癌」との用語は、例えば、結腸癌、直腸癌、乳癌、腎細胞癌、多形性膠芽腫、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝臓癌、膵癌、骨癌、骨転移、白血病、脳癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、またはモノクローナル抗体による治療に応答する他の癌のような転移性癌および非転移性癌を含む。
【００８５】
「有効な量」との用語は、本明細書で使用する場合、標的としている組織、系、動物またはヒトで生物学的または医学的応答を引き出すような、本発明の少なくとも１つのポリペプチドまたはその医薬製剤の量を指す。一つの実施形態では、有効な量は、治療される疾患または状態の症状を軽減するための「治療に有効な量」である。別の実施形態では、有効な量は、予防される疾患または状態の症状を予防するための「予防に有効な量」である。
【００８６】
本発明の治療の「効能」との用語は、本発明の使用または方法に応答する疾患の経過の変化に基づいて測定することができる。例えば、本発明の癌治療の効能は、腫瘍の体積の減少、および／または無増悪生存期間の延長によって測定することができる。
【００８７】
「医薬製剤」との用語は、活性成分の生物学的活性を明白に有効にすることができるような形態であり、この製剤が投与されるであろう被検体に対して毒性がある付加成分を含まない調製物を指す。
【００８８】
「医薬的に許容される塩」との用語は、定義された化合物（すなわち、式（Ｉ）の化合物）の望ましい活性を保持し、望ましくない毒性の影響を生じない塩を指す。本発明の特定の実施形態によれば、医薬的に許容される塩は、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩またはカルシウム塩のような塩基付加塩であってもよい。式（Ｉ）の化合物の好ましい医薬的に許容される塩は、ナトリウム塩、例えば、一ナトリウム塩または二ナトリウム塩である。
【００８９】
本発明に関し、「安定な」または「安定化された」との用語は、保存または処理の時に、中に含まれる抗体が物理的な安定性（例えば、会合または会合傾向のレベルが低い、沈殿または変性がない）を保持し、および／または、化学的な安定性（例えば、化学的に変化した形態が存在しない）を保持する製剤を指す。本発明の抗体製剤の安定性は、当業者にとって既知の種々の技術によって測定されてもよい。例えば、安定性は、会合状態の測定（例えば、非対称流フィールドフローフラクショネーション（ＡＦＦＦ）によって分離した後の多角度光散乱（ＭＡＬＳ）、高速サイズ排除クロマトグラフィー、分析用超遠心分離、蛍光顕微鏡または電子顕微鏡）によって測定することができる。好ましくは、製剤の安定性は、選択した温度で、および／または選択した保存期間測定される。典型的には、本発明の製剤の安定性は、温度４０℃で３５日間測定される。
【００９０】
特定の実施形態によれば、本発明の製剤の安定性は、温度４０℃で少なくとも２８日間測定される。
【００９１】
「被検体」との用語は、本明細書で使用する場合、哺乳動物を指す。例えば、本発明によって想定されている哺乳動物としては、ヒト、霊長類、家畜動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、実験用げっ歯類などが挙げられる。
【００９２】
本明細書で使用する場合、「治療」および「治療すること」などは、一般的に、望ましい薬理学的効果および生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、ある疾患、その症状または状態を予防、または部分的に予防するという観点で予防的であってもよく、および／または、ある疾患、その疾患に起因する状態、症状または有害な影響を部分的または完全に治癒させるという観点で、治療的であってもよい。「治療」との用語は、本明細書で使用する場合、哺乳動物、特にヒトの疾患のあらゆる治療を包含し、（ａ）その疾患に罹患しやすいが、まだ罹患しているとは診断されていない被検体で、その疾患が生じるのを防ぐこと、例えば、初期の無症状状態に予防的に介入すること；（ｂ）その疾患を抑制すること、すなわち、その進行を止めること；または、その疾患を緩和すること、すなわち、その疾患および／またはその症状または状態を逆行させること、例えば、損傷の改善または修復を含む。特に、本発明の方法、使用、製剤および組成物は、加齢黄斑変性症患者の視力保護および／または失明の予防および／または癌の治療に有用である。
【００９３】
本発明の一つの態様によれば、インタクトな抗体のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインにある会合接触領域を阻害することによって、インタクトな抗体の会合を調節することを含む、液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法が提供される。特定の実施形態では、ＣＨドメインが、ヒトＩｇＧ重鎖のＣＨ３ドメインである、本発明の方法が提供される。さらに特定の実施形態では、ＣＨドメインは、Ｓａｐｈｉｒｅら、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：１１５５−９に定義されるような、そして配列番号１を有するＣＨ３ドメインである。
【００９４】
本発明の一つの態様によれば、インタクトな抗体分子のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメイン（例えば、ＣＨ３ドメイン）に含まれる配列番号２のアミノ酸配列の位置番号８に位置するリジン残基をマスクするか、またはこのリジン残基に結合することによって、インタクトな抗体の会合を調節することを含む、液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法が提供される。特定の実施形態では、インタクトな抗体分子のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメイン（例えば、ＣＨ３ドメイン）に含まれる配列番号３のアミノ酸配列の位置番号８に位置するリジン残基をマスクするか、またはこのリジン残基に結合することによる、本発明のインタクトな抗体を安定化する方法が提供される。別の特定の実施形態では、インタクトな抗体分子のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメイン（例えば、ＣＨ３ドメイン）に含まれる配列番号４または５のアミノ酸配列の位置番号２８に位置するリジン残基をマスクするか、またはこのリジン残基に結合することによる、本発明のインタクトな抗体を安定化する方法が提供される。別の特定の実施形態では、インタクトな抗体分子のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメイン（例えば、ＣＨ３ドメイン）に含まれる配列番号７のアミノ酸配列の位置番号８に位置するリジン残基をマスクするか、またはこのリジン残基に結合することによる、本発明のインタクトな抗体を安定化する方法が提供される。
【００９５】
本発明の一つの態様によれば、インタクトな抗体のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインにあるＬｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基をマスクすることによって、インタクトな抗体の会合を調節することを含む、液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法が提供される（Ｈａｒｒｉｓら、１９９８に定義されるように（上述））。特定の実施形態では、配列番号１の位置番号７５に位置するリジン残基（このリジン残基は、Ｓａｐｈｉｒｅら、２００１に定義されるように（上述）、ヒトＩｇＧ１の完全長重鎖の配列の位置４４５にあるリジンに対応する）がマスクされている、本発明の方法が提供される。
【００９６】
本発明の一つの態様によれば、インタクトな抗体と、インタクトな抗体のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインにあるＬｙｓ３８３ＢおよびＬｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基の群から選択されるリジン残基に対する結合親和性を有する調節化合物とを混合することによって、インタクトな抗体の会合を調節することを含む、液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法が提供される（Ｈａｒｒｉｓら、１９９８に定義されるように（上述））。本発明の一つの態様によれば、インタクトな抗体と、インタクトな抗体のＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインにあるＬｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基に対する結合親和性を有する調節化合物とを混合することによって、インタクトな抗体の会合を調節することを含む、液体キャリア中でインタクトな抗体を安定化する方法が提供される。
【００９７】
本発明者らは、初めて、インタクトなモノクローナル抗体ベバシズマブの三次元モデルを提供し、そして、インタクトなモノクローナル抗体ベバシズマブの三次元会合モデルの提供に初めて成功した。有利なことに、これらの三次元構造モデルに基づき、本発明者らは、抗体の会合における、抗体−抗体接触面のよりよい理解を可能にした。
【００９８】
ベバシズマブは、その活性に関与するＦａｂ領域と、ＩｇＧ１に由来するＦｃ領域とによって形成されるインタクトなヒト化モノクローナルＩｇＧ１抗体である。ＩｇＧ１のＦｃ領域は、ベバシズマブで保存されている。ベバシズマブの三次元構造は、コンピュータを利用したモデリング技術によって、ベバシズマブの２個のＦａｂ領域および完全免疫グロブリン抗体ＩｇＧ１の結晶構造に基づき、本発明者らによって解明された。図１は、ベバシズマブの三次元構造の表面を示す。
【００９９】
本発明者らは、初めて、インタクトなモノクローナル抗体ベバシズマブの三次元会合モデルの解明に成功した。ベバシズマブの三次元会合モデルは、実施例１に詳細に記載した手順にしたがって、ベバシズマブとＩｇＧ１のホモロジー、ベバシズマブのＦａｂの結晶構造、完全免疫グロブリンＩｇＧ１の既知の結晶対称性、およびベバシズマブの構造の三次元モデルを考慮に入れて、コンピュータを利用したモデリング技術を用い、本発明者らによって解明された。本発明者らによって得られたベバシズマブの三次元会合モデルを図２Ａに示す。
【０１００】
本発明者らは、予想外なことに、ベバシズマブの新規三次元会合モデルに基づき、抗体分子間の会合を誘発する接点を形成するには、単一の抗体−抗体接触ゾーンが重要であることを知見した。さらに、本発明者らは、予想外なことに、インタクトなモノクローナル抗体の会合は、インタクトな抗体分子のＦｃ領域にあるＬｙｓ４４５Ｂ（Ｈａｒｒｉｓら、１９９８（上述））に対応する特定のリジン残基に結合するか、またはこのリジン残基をマスクすることによって調節可能であり、それにより、Ｌｙｓ４４５Ｂに対応する残基が関与する抗体−抗体相互作用を誘発する会合を遮断することができることを知見した。
【０１０１】
抗体の会合機構において、Ｆｃ領域のＣＨドメインにあるＬｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基が関与していることの証拠は、ベバシズマブの三次元会合モデルによって与えられ、２つの抗体間の唯一の近い結晶の接触が、第１のベバシズマブの１つのＦａｂアームに属する鎖Ａのセリン残基Ｓｅｒ２０２と、第２のベバシズマブのＦｃの一部である鎖Ｂのリジン残基Ｌｙｓ４４５との相互作用によってあらわされることを示している。この２つの原子間の最小距離は、ＨＢ２（Ｓｅｒ２０２）からＨＺ２（Ｌｙｓ４４５）＝３．７３Å、およびＨＢ３（Ｓｅｒ２０２）からＨＺ２（Ｌｙｓ４４５）＝４．３５Åであると測定された（すなわち、２つの抗体分子の結合が生じるのに十分近い）。インタクトなモノクローナル抗体の会合を、Ｌｙｓ４４５Ｂに対応する残基との抗体相互作用を遮断または抑制することによって調節することの証拠も、液体キャリア中のベバシズマブ製剤の実験的な安定性試験と組み合わせた、コンピュータを利用したドッキング試験によって与えられる。これらの試験から、水性ベバシズマブ製剤中でベバシズマブの会合を調節するのに有効である化合物は、コンピュータを利用したドッキングモデルにおいて、そのすべてがＬｙｓ４４５Ｂに対応する残基と好ましい相互作用パターンを示し、さらに、そのすべてが、ベバシズマブの表面にある他の残基と比較したとき、Ｌｙｓ４４５Ｂに対応する残基と最も好ましい相互作用パターンを示すことがわかる（実施例を参照）。
【０１０２】
ＩｇＧ１のＦｃ領域のＬｙｓ４４５Ｂに対応する残基は、一般的に、操作されたモノクローナル抗体のＦｃ領域で保存されている。特に、ＩｇＧ１のＦｃ領域のＬｙｓ４４５Ｂに対応する残基は、ＩｇＧ１に由来する治療用モノクローナル抗体（例えば、図６Ｆの第１表に示されているようなベバシズマブ）のＦｃ領域で保存されている。したがって、このＬｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基が、治療用モノクローナル抗体のＦｃ領域で保存されているため、Ｌｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基が関与する抗体−抗体相互作用の遮断が、一般的なレベルで、インタクトなモノクローナル抗体の会合を阻害するのに重要であると考えられる。さらに、このことは、インタクトな抗体のＦｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号２の配列を有するアミノ酸配列の位置番号８に位置しているリジン残基との抗体相互作用を遮断または抑制することにより、インタクトなモノクローナル抗体の会合傾向が減る結果となるであろうことを支持している。特に、インタクトな抗体のＦｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号３の配列を有するアミノ酸配列の位置番号８に位置するリジン残基との抗体相互作用を遮断または抑制することが有益であろう。特に、インタクトな抗体のＦｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号４または５の配列を有するアミノ酸配列の位置番号２８に位置するリジン残基との抗体相互作用を遮断または抑制することが有益であろう。
【０１０３】
上述のリジン残基との相互作用は、調節化合物の負に帯電した部位、例えば、ホスフェート基、ホスホネート基、カルボキシル基またはニトロ基によって与えられてもよい。２個の負電荷をもつホスフェート基またはホスホネート基が好ましいであろう。好ましい実施形態によれば、調節化合物の末端は、ホスフェート基またはホスホネート基である。ホスフェート基は、モノホスフェート基、ジホスフェート基またはトリホスフェート基であってもよい。モノホスフェートまたはジホスフェートが好ましいであろう。
【０１０４】
インタクトな抗体の会合を効果的に阻害するために、調節化合物は、１個の抗体分子のＦｃ領域に結合するとき、第１のインタクトな抗体分子のＦｃ領域にあるＬｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基に近接した会合接触領域と第２の抗体分子のＦａｂ領域との相互作用を阻害するのに十分、抗体表面から飛び出しているべきである。ベバシズマブ会合モデルに基づき計算した抗体分子間の最小距離に関し、調節化合物は、適切には、粒径が約４Å〜約３０Å、好ましくは約４Å〜約２０Å、例えば、約８Å〜約１６Å、例えば、約８Å〜約１３Åの範囲であってもよい。
【０１０５】
調節化合物の分子の大きさは、三次元構造から既知の方法によって、例えば、結晶構造の実験的なＸ線データ解析もしくはＮＭＲデータ解析、またはコンピュータで作成した三次元モデル（ホモロジーモデル）に基づき、推測することができる。
【０１０６】
一つの態様によれば、抗体の会合を調節する活性を有する特定の化合物は、ベバシズマブの三次元構造との低分子相互作用に基づき、コンピュータに基づく分子相互作用モデルを用いて選択された。インタクトな抗体表面全体について、化合物ライブラリーからの分子の規則的なドッキングを行った。分子間相互作用を、ＦｌｅｘＸ  ３．１．３ＴＭのＦｌｅｘＸスコアを用いて評価したが、分子の相互作用の強さを評価することができる他のプログラムも想定されるであろう。抗体−低分子相互作用のスコアの分析、抗体表面にある任意の低分子についての、最も好ましい抗体−低分子相互作用パターンの位置特定、さらにすべてのドッキングポーズの視覚的な分析によって評価を行った。抗体−抗体相互作用表面をうまく妨害するドッキングポーズの数に基づき、化合物を選択した。
【０１０７】
一つの態様によれば、本発明者らは、化合物のライブラリーから、インタクトな抗体の会合を調節する活性を有する化合物を同定する方法を提供した。一つの態様によれば、実施例１に定義されるようなインタクトな抗体ベバシズマブの構造の三次元モデルを作成する工程と；インタクトな抗体であるベバシズマブの表面に、候補化合物をコンピュータを利用してドッキングする工程と；インタクトな抗体ベバシズマブのＦｃ領域、特に、Ｆｃ領域のＣＨドメインにあるＬｙｓ４４５Ｂに対応する残基と優先的に相互作用する調節化合物を同定する（例えば、実施例２に記載されるような妨害体積を用いることによって）工程とを含む、抗体の会合を調節する活性を有する調節化合物を同定する方法が提供される。
【０１０８】
場合により、インタクトな抗体ベバシズマブの表面にあるＬｙｓ４４５Ｂに対応する残基と優先的に相互作用する化合物として同定された化合物を、Ｌｙｓ４４５Ｂに対応する残基が、ベバシズマブの三次元会合モデルおよび結晶対称性において、第２のベバシズマブ分子と相互作用、接触しないようにマスクするように視覚的に確認してもよい。
【０１０９】
一つの態様によれば、抗体の会合を調節する活性を有する調節化合物を同定する方法は、インタクトな抗体ベバシズマブの三次元モデル構造に基づき、２つのインタクトなベバシズマブ分子の三次元会合モデルを作成することを含んでいてもよい。
【０１１０】
一つの態様によれば、抗体の会合を調節する活性を有する調節化合物を同定する方法は、Ｌｙｓ４４５Ｂに対応する残基と優先的に相互作用する化合物として同定される化合物を、インタクトなベバシズマブ分子の三次元モノマーモデルにおけるインタクトな抗体ベバシズマブの表面に、コンピュータを利用してドッキングする工程と；この化合物が、三次元会合モデルにおいて、Ｌｙｓ４４５Ｂに対応する残基が第２のベバシズマブ分子と相互作用または接触しないようにマスクすることを視覚的な観察によって確認する工程とを含んでいてもよい。
【０１１１】
本発明の別の態様によれば、本明細書に教示されるようなインタクトな抗体（例えば、ベバシズマブ）の構造、またはインタクトな抗体分子の構造解析（例えば、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ分光法、または二面偏波式干渉法）によって得られる構造の三次元モノマーモデルを作成する工程と；インタクトな抗体の表面に、候補化合物をコンピュータを利用してドッキングする工程と；インタクトな抗体のＦｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号２の配列を有するアミノ酸配列の位置番号８に位置するリジン残基、例えば、インタクトな抗体のＦｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号３の配列を有するアミノ酸配列の位置番号８に位置するリジン残基、特に、インタクトな抗体のＦｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号４の配列を有するアミノ酸配列の位置番号２８に位置するリジン残基、または、インタクトな抗体のＦｃ領域のＣＨドメインに含まれる配列番号１の配列を有するアミノ酸配列の位置番号７５に位置するリジン残基と優先的に相互作用する調節化合物を同定する（例えば、実施例２に記載されるような妨害体積を用いることによって決定されるような）工程とを含む、抗体の会合を調節する活性を有する調節化合物を同定する方法が提供される。
【０１１２】
場合により、インタクトな抗体の表面にある上述のリジン残基と優先的に相互作用する化合物として同定された化合物を、このリジン残基が、本明細書によって教示されるように、インタクトな抗体の三次元会合モデルにおける第２のベバシズマブ分子と相互作用または接触しないようにマスクするように視覚的に確認してもよい。
【０１１３】
一つの態様によれば、抗体の会合を調節する活性を有する調節化合物を同定する方法は、本記載に教示されるように、インタクトな抗体の三次元モデル構造および結晶対称性に基づき、２つのインタクトな抗体分子の三次元会合モデルを作成することを含んでいてもよい。
【０１１４】
一つの態様によれば、抗体の会合を調節する活性を有する調節化合物を同定する方法は、本明細書に記載されるリジン残基と優先的に相互作用する化合物として同定される化合物を、インタクトな抗体分子の三次元モノマーモデルにおけるインタクトな抗体の表面に、コンピュータを利用してドッキングする工程と；前記化合物が、本明細書に教示されるような三次元会合モデルにおいて、前記リジン残基が第２のベバシズマブ分子と相互作用または接触しないようにマスクすることを視覚的な観察によって確認する工程とを含んでいてもよい。
【０１１５】
化合物ライブラリーからの化合物の予備選択は、場合により、例えば、抗体との結合のための少なくとも１つの負に帯電したアンカー基の存在に基づいて行ってもよく（例えば、末端がホスフェート基またはホスホネート基である分子）、および／または化合物の体積に基づいて行ってもよい（例えば、大きさが８〜１３Åの分子）。
【０１１６】
一つの態様によれば、インタクトな抗体と、液体キャリアと、上述の方法により得られた化合物とを含む安定な抗体製剤が提供される。
【０１１７】
本発明の一つの態様によれば、液体キャリアと、インタクトな抗体と、式（Ｉ）の化合物：
【化３】
2013528570.tif 000004
（式中、ｎ＝０または１であり、ｍおよびｐは、それぞれ独立して０または１であり；Ａは、負に帯電したアンカー部位であり；Ｌは、任意要素のリンカー基であり、存在する場合、Ｌは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケトン基、ハロ基またはカルボキシ基から独立して選択される１つ以上の基によって場合により置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６カルボニル、Ｃ１〜Ｃ６エーテルであるか、または、Ｎ、ＯまたはＳから選択される０〜３個のヘテロ原子を含み、場合により、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケトン基、ハロ基またはカルボキシ基から独立して選択される１つ以上の基によってさらに置換されていてもよい、５員環または６員環の置換された脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；Ｑは、縮合、スピロ縮合または架橋していてもよい、１個の単独の環から５員環または６員環と、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケトン基、アルデヒド基、カルボキシ基、アミン基、ニトロ基、チオ基またはハロ基から独立して選択される１つ以上の基によって場合によりさらに置換されていてもよい、Ｎ、ＯまたはＳから選択される０〜５個のヘテロ原子とを含む、場合により置換されていてもよい脂環式部位、ヘテロ脂環式部位、芳香族部位またはヘテロ芳香族部位の基から選択される環状部位である。）
またはその医薬的に許容される塩もしくは互変異性体とを含む安定な抗体製剤が提供される。
【０１１８】
一つの態様によれば、コルチコステロイド、具体的には、リン酸ベタメタゾンおよびリン酸デキサメタゾンは除外される。
【０１１９】
アンカー部位Ａは、好ましくは、カルボキシ基、ホスフェート基、ホスホネート基、ホスフィネート基、ホスホロチオエート基、サルフェート基、スルホネート基、またはこれらのバイオアイソスターから選択されてもよい。好ましくは、アンカー部位Ａは、ホスホネート基またはホスフェート基である。
【０１２０】
モノホスフェート基、ジホスフェート基およびトリホスフェート基が想定される。ただし、トリホスフェート基は、抗体表面でのトリホスフェート基のドッキングの自由度が大きく、抗体−抗体の会合界面をうまく妨害する分子のドッキングポーズおよびインターフェアリングポーズの数が少なくなるため、あまり好ましくない。モノホスフェート基およびジホスフェート基が好ましいだろう。リンカー部位Ａとして、モノホスフェート基およびモノホスホネート基が好ましい。
【０１２１】
特定の実施形態によれば、リンカー基Ｌは、置換テトラヒドロフラン基である。Ｌが置換テトラヒドロフラン基である場合、置換基は、好ましくは、独立して、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシから選択される。
【０１２２】
一つの実施形態によれば、ｎ、ｍ、ｐは０である。
【０１２３】
別の実施形態によれば、ｎおよびｍは１であり、ｐは０である。
【０１２４】
環状基Ｑは、好ましくは、場合により、Ｎ、ＯまたはＳから選択される１個または２個のヘテロ原子を含む、単独の脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族の６員環、あるいは、２個の５員環または６員環を含み、この環が、縮合していてもよく、場合により、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケトン基、アルデヒド基、カルボキシ基、アミン基、ニトロ基またはハロ基から独立して選択される１つ以上の基で場合により置換されていてもよい、Ｎ、ＯまたはＳから選択される１〜５個のヘテロ原子を含む、場合により置換されていてもよい脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族部位から選択されてもよい。別の実施形態によれば、環状基Ｑは、場合により、Ｎ、ＯまたはＳから選択される１個または２個のヘテロ原子を含む、場合により置換されていてもよい単独の脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族の６員環、あるいは、２個の５員環または６員環を有し、この環が架橋していてもよく（例えば、典型的には、−Ｏ−およびアルコキシから選択されるリンカーを介するもの（例えば、場合により置換されていてもよいメトキシ、例えば、Ｏ−ＣＨ２架橋）、そして場合により、Ｎ、ＯまたはＳから選択される１〜５個のヘテロ原子を含む、場合により置換されていてもよい脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族部位から選択されてもよく、これらの環は、場合により、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケトン基、アルデヒド基、カルボキシ基、アミン基、ニトロ基またはハロ基から独立して選択される１つ以上の基で場合によりさらに置換されていてもよい。
【０１２５】
好ましい実施形態によれば、環状基Ｑは、場合により置換されていてもよいピリジンまたはプリンである。プリン基Ｑは、場合により、アミン基、ハロ基、ヒドロキシ基またはＣ１〜Ｃ６アルコキシ基から独立して選択される１つ以上の基、例えば、１〜３個の基で置換されていてもよい。好ましい実施形態によれば、Ｑは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、キサンチン、エタノアデニン、イノシン、オロチジンまたはシトシンから選択される核酸塩基である。
【０１２６】
別の実施形態によれば、環状基Ｑは、場合により、Ｎ、ＯまたはＳから選択される１個または２個のヘテロ原子を含む、場合により置換されていてもよい単独のヘテロ脂環式、あるいは、２個の５員環または６員環を有し、この環が、酸素原子を介して架橋しており、そして場合により、Ｎ、ＯまたはＳから選択される１〜５個のヘテロ原子を含む、場合により置換されていてもよい脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族部位から選択されてもよく、これらの環は、場合により、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ケトン基、アルデヒド基、カルボキシ基、アミン基、ニトロ基またはハロ基から独立して選択される１つ以上の基で場合によりさらに置換されていてもよい。特定の実施形態では、Ｑは、単糖類または二糖類である。
【０１２７】
別の好ましい実施形態によれば、リンカー基Ｌは存在せず、Ｑは、単糖類または二糖類である。適切な単糖類としては、グルコース、フルクトース、フコース、ガラクトースが挙げられ、好ましいのはガラクトースである。適切な二糖類の例としては、ラクトース、マルトース、スクロース、ラクツロース、トレハロースおよびセロビオースが挙げられる。好ましい実施形態では、二糖類は、ラクトース、マルトースまたはスクロースから選択される。
【０１２８】
一つの好ましい実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、単糖リン酸または二糖リン酸から選択される。好ましい実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、α−Ｄ−ガラクトース−１−ホスフェート、α−ラクトース−１−ホスフェート、α−Ｄ（＋）マルトース−１−ホスフェートおよびスクロースホスフェート、またはこれらの医薬的に許容される塩から選択される。
【０１２９】
別の態様によれば、液体キャリアと、インタクトな抗体と、式（Ａ）の化合物：
【化４】
2013528570.tif 000005
（式中、Ｒ１は、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、キサンチン、エタノアデニン、イノシン、オロチジンまたはシトシンからなる群から選択される核酸塩基であり；Ｒ２は、ＨまたはＯＲ４であり、ここでＲ４は、ＨまたはＣ１〜４アルキル基であり；Ｒ３は、ＨまたはＯＲ５であり、Ｒ５は、ＨまたはＣ１〜４アルキル基であり；ｎは、１〜３の整数である。）
またはその医薬的に許容される塩もしくは互変異性体とを含む安定な抗体製剤が提供される。
【０１３０】
一つの実施形態によれば、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、ＨまたはＯＨである。特定の実施形態によれば、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＯＨである。特定の実施形態によれば、Ｒ２とＲ３は、両方ともＯＨである。
【０１３１】
式（Ａ）の特定の化合物としては、アデノシン５’一リン酸、二リン酸または三リン酸、グアノシン５’一リン酸、二リン酸または三リン酸、ウリジン５’一リン酸、二リン酸または三リン酸；シチジン５’一リン酸、二リン酸または三リン酸、デオキシアデノシン５’一リン酸、二リン酸または三リン酸、デオキシグアノシン５’一リン酸、二リン酸または三リン酸、チミジン５’一リン酸、二リン酸または三リン酸、デオキシウリジン５’一リン酸、二リン酸または三リン酸、デオキシシチジン５’一リン酸、二リン酸または三リン酸、キサンチン５’一リン酸、二リン酸または三リン酸、エタノアデノシン５’一リン酸、二リン酸または三リン酸、イノシン５’一リン酸、二リン酸または三リン酸、オロチジン５’一リン酸、二リン酸または三リン酸が挙げられる。式（Ａ）の好ましい化合物としては、アデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ）およびアデノシン５’二リン酸（ＡＤＰ）が挙げられ、特に、アデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ）が挙げられる。
【０１３２】
本発明の別の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、リン酸フルダラビン、リン酸テノホビル、リン酸シドフォビル、リン酸チルドロネートまたはリン酸ピリドキサールから選択される。
【０１３３】
本発明の別の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、フルダラビン、テノホビル、シドフォビルまたはチルドロネートから選択される。
【０１３４】
式（Ｉ）の化合物は、その遊離酸の形態であってもよく、または医薬的に許容される塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩、好ましくは、一ナトリウム塩または二ナトリウム塩）の形態、または互変異性体の形態であってもよい。
【０１３５】
式（Ｉ）の化合物は、当該技術分野で既知の従来のプロセスにしたがって調製または単離されてもよい。
【０１３６】
本発明の製剤は、１種類以上の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩を含有していてもよい。
【０１３７】
有利なことに、インタクトな抗体、特にインタクトなモノクローナル抗体の液体調製物は、本発明の式（Ｉ）の化合物を加えることによって、有効に安定化されるであろう。
【０１３８】
式（Ｉ）の化合物は、実施例１に記載されるように、インタクトなモノクローナル抗体ベバシズマブとの規則的なドッキングに対し、驚くべきことに、好ましい分子間相互作用スコアを示すことが示されている。式（Ｉ）の化合物は、コンピュータを利用した規則的なドッキング試験によって、ベバシズマブのＦｃ領域にあるＬｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基周囲で優先的な結合を示すことが示されている。
【０１３９】
式（Ｉ）の化合物は、有利なことに、インタクトな抗体（例えば、インタクトなモノクローナル抗体ベバシズマブ）が液体製剤中で会合体を形成する傾向を減らすことができる。
【０１４０】
本発明の式（Ｉ）の化合物を含むインタクトな抗体の製剤、特に水性製剤は、加速保存条件（例えば、４０℃で保存）で１〜３０日間保存した後、式（Ｉ）の化合物を含まないインタクトな抗体の対応する製剤と比較した場合、例えば、会合形態の抗体の比率の１０〜８０％低下、例えば、３０％〜７０％低下を示してもよい。
【０１４１】
本発明は、ＡＦＦＦに接続したＭＡＬＳによって、４０℃で３５日間保存している間に測定した場合、抗体の２０％未満、さらに１５％未満、さらに１０％未満が会合形態である、インタクトな抗体の水性キャリア製剤の調製を可能にする。
【０１４２】
一つの実施形態によれば、本発明は、ＡＦＦＦに接続したＭＡＬＳによって、４０℃で３５日間保存している間に測定した場合、ベバシズマブの１０％未満が会合した形態である、本発明の製剤を提供する。
【０１４３】
式（Ｉ）の化合物は、有利なことに、インタクトな抗体（例えば、ベバシズマブ）のすでに生成した会合体を実質的にモノマーの状態に回復または破壊することを誘発することが示されている。
【０１４４】
例えば、すでに生成した会合体を含む、例えば、製剤中の抗体分子の少なくとも２０％の割合が会合形態であるインタクトな抗体の製剤、特に水性製剤に式（Ｉ）の化合物を加えると、かなりの割合のすでに生成した会合体を実質的にモノマーの状態に回復することを誘発することができる。例えば、本発明の式（Ｉ）の化合物を加えた後、製剤中の抗体モノマーの量が、例えば、５％〜５０％、例えば、１０％〜３０％増加したことが示されるであろう。
【０１４５】
さらに、有利なことに、本発明の式（Ｉ）の化合物は、非常に低い濃度で存在する場合であっても、インタクトな抗体の液体調製物を安定化させる効果を有することができる。
【０１４６】
有利なことに、本発明のインタクトな抗体（例えば、ベバシズマブ）の安定化された製剤は、既知の製剤と比較して、会合する傾向を減らすことが示されている。
【０１４７】
本発明者らの知見によれば、インタクトな抗体が会合体を形成する傾向を減らす、および、インタクトな抗体分子のすでに形成した会合体を実質的にモノマーの状態に回復させることを誘発する式（Ｉ）の化合物の効能は、式（Ｉ）の化合物と、抗体のＦｃ領域にあるＬｙｓ４４５Ｂに対応する残基との相互作用に起因しており、これによって、第２の抗体分子のＦａｂ領域との会合を誘発する接触を妨害または遮断すると考えられる（図２Ａの会合モデルで示されるように）。それによって、式（Ｉ）の化合物は、抗体分子にある会合結合部位での競争的な結合機構に起因して、抗体分子間の会合体形成を阻害する。
【０１４８】
本発明の製剤は、少なくとも１つのインタクトな抗体を含む。一般的に、本発明の製剤は、１種類のインタクトな抗体をネイティブ形態またはアクセサリー分子に複合した形態で含むであろう。しかし、本発明の製剤は、１種類より多いインタクトな抗体（例えば、２種類または３種類の異なるインタクトな抗体）を含んでもよい。
【０１４９】
本発明のインタクトな抗体は、好ましくは、インタクトなモノクローナル抗体である。インタクトなモノクローナル抗体は、免疫グロブリンであってもよく、例えば、特に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であってもよい。また、インタクトなモノクローナル抗体は、治療、診断または予防のための既知のインタクトなモノクローナル抗体薬物のいずれであってもよく、例えば、アダリムマブ、アレムツズマブ、バピヌズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、フィギツムマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、モタビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オテリキシズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラキシバクマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、またはウステキヌマブであってもよい。
【０１５０】
特に関心のあるインタクトなモノクローナル抗体としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、およびＩｇＧ１のＦｃ領域と実質的に同一のＦｃ領域を有するモノクローナル抗体が挙げられ、例えば、アダリムマブ、アレムツズマブ、バピヌズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、フィギツムマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、モタビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オテリキシズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラキシバクマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、またはウステキヌマブが挙げられる。
【０１５１】
好ましい実施形態によれば、インタクトな抗体がベバシズマブである、本発明の安定な抗体製剤が提供される。
【０１５２】
α−Ｄ−ガラクトース−１−ホスフェート、α−ラクトース−１−ホスフェート、α−Ｄ（＋）マルトース−１−ホスフェートまたはスクロースホスフェートのような単糖リン酸または二糖リン酸を使用する利点は、特に、ガラクトース、ラクトース、マルトースおよびスクロースといった糖類が、一般的な食品中に広く見い出され、食品添加物としての使用が世界的に許容されていることである。ＡＭＰも、広く許容されており、食品添加物として使用されているという利点がある。ＡＭＰは、ＦＤＡによってＧＲＡＳ（一般に安全と認められる商品）通知ＧＲＮ番号１４４で承認されている。ＡＭＰは、例えば、チューイングガム、コーヒー、紅茶、砂糖代替品、スナック食品、スープ、スープミックスの香味向上剤および／または香味改質剤として広く使用されている。糖リン酸およびＡＭＰの利点は、特に、糖およびＡＭＰが広く市販されており、低コストであることである。
【０１５３】
非治療用化合物（例えば、既知の賦形剤または添加剤化合物、例えば、インタクトな抗体の液体製剤の安定化剤としての糖またはＡＭＰ）の使用は、さらに、抗体と別の治療薬剤または生理活性薬剤を安定化剤として組み合わせるときに起こり得る問題（例えば、活性薬剤の組み合わせに関連する、抗体活性の低下、可能性の高い望ましくない副作用、または毒性の影響の問題）を避けるという点で利益を提供する。
【０１５４】
リン酸アデノシン（特にＡＭＰ）は、インタクトな抗体（例えば、ベバシズマブ）の液体製剤に対し安定化効果を示すことが示されている。ＡＭＰは、インタクトな抗体（例えば、インタクトなモノクローナル抗体ベバシズマブ）が液体製剤中で会合体を形成する傾向を顕著に減らすことが示されている。さらに、ＡＭＰは、インタクトな抗体（例えば、ベバシズマブ）のすでに形成した会合体を実質的にモノマーの状態に顕著に回復または破壊することを誘発することが示されている。
【０１５５】
例えば、すでに生成した抗体会合体を含むインタクトなモノクローナル抗体（例えば、ベバシズマブ）の液体製剤にＡＭＰを加えると、液体製剤中の会合体の量を減らすことが示され、液体製剤中の抗体モノマーの量の増加（例えば、モノマー形態中に存在する抗体の比率は、一般的に１０％〜３０％である。）が観察されるであろう。
【０１５６】
ＡＭＰは、インタクトなモノクローナル抗体（例えば、ベバシズマブ）が、保存すると液体製剤中で会合体を形成する傾向を下げることが示されている。有利なことに、ＡＭＰを含む本発明のインタクトな抗体の水性製剤は、ＡＦＦＦに接続したＭＡＬＳによって、４０℃で３５日間保存している間に測定した場合、抗体の２０％未満、さらに１５％未満、さらに１０％未満を会合形態で含んでいてもよい。
【０１５７】
本発明の抗体製剤に適した液体キャリアとしては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、植物油などが挙げられる。水性キャリアが好ましい場合もある。好ましい医薬的に許容されるキャリアとしては、滅菌水溶液または分散液、部分的に滅菌した注射可能な溶液または分散液が挙げられる。注射可能な溶液または分散液は、典型的には、注射可能な滅菌食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または当該技術分野で既知の他の注射可能なキャリアに基づいていてもよい。
【０１５８】
本発明の水性製剤は、一般的に、ｐＨがｐＨ４．０〜８．０、例えば、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．０付近のｐＨ）であってもよい。
【０１５９】
本発明によれば、製剤が医薬製剤であり、特に、哺乳動物、典型的にはヒト哺乳動物に投与するように製剤化された医薬製剤である、本発明の製剤が提供される。
【０１６０】
本発明の医薬製剤は、医薬的に許容されるバッファー（例えば、ＰＢＳバッファー）をさらに含有していてもよい。本発明の医薬製剤は、医薬的に許容される賦形剤、例えば、既知の医薬的に許容される防腐剤、抗菌剤、分散剤、懸濁剤、湿潤剤、乳化剤、香味剤、着色剤などをさらに含んでいてもよい。懸濁剤としては、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、水素化食用油脂が挙げられるが、これらに限定されない。乳化剤としては、レシチン、ソルビタンモノオレエート、アカシアが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
本発明の製剤中のインタクトな抗体の望ましい濃度は、特に、使用する特定の抗体、治療対象の病状、剤形、投薬計画、治療対象の患者によって変わるであろう。一般的に、非経口投与（例えば、注射または点滴）のための抗体の水性製剤では、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌの範囲の抗体の濃度が通常である。一つの実施形態によれば、本発明は、ベバシズマブが約１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約２ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度である本発明の製剤を提供する。
【０１６２】
本発明の製剤中の式（Ｉ）の化合物の望ましい濃度は、特に、製剤中の抗体の濃度、望ましい安定化度などによって変わるだろう。例えば、非経口投与（例えば、注射または点滴）のための本発明の抗体の水性製剤では、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０．１〜約２０ｍｇ／ｍｌの範囲の式（Ｉ）の化合物の濃度を想定してもよい。
【０１６３】
一般的に、式（Ｉ）の化合物とインタクトな抗体のモル比は、約０．１：１〜約５００：１、好ましくは、約１：１〜約２００：１である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物とインタクトな抗体のモル比は、約１：１〜約１００：１、特に、約１：１〜約５０：１、例えば、約１：１〜約１０：１である。
【０１６４】
本発明の製剤は、非経口、経皮、直腸内、経粘膜、眼球内、またはこれらの組み合わせのような任意の方法で投与されてもよい。非経口投与としては、静脈内（ｉ．ｖ．）、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、髄腔内、関節内が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の組成物は、インプラントの形態で投与されてもよく、組成物の徐放およびゆっくりと制御したｉ．ｖ．点滴を可能にする。
【０１６５】
眼球内投与としては、硝子体液、結膜下、テノン嚢下への注射、局所適用が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の製剤を、組成物を徐放することが可能な眼用インプラントの形態で投与してもよい。
【０１６６】
好ましい実施形態によれば、本発明は、製剤がヒトへの注射（例えば、硝子体内または静脈内）に適した医薬製剤である、本発明の製剤を提供する。特定の実施形態では、製剤は、ヒトの眼球に注射（例えば、硝子体内）するのに適した医薬製剤である。別の実施形態では、製剤は、ヒトの静脈内注射に適した医薬製剤である。
【０１６７】
本発明の製剤は、従来から使用されるアジュバント、キャリア、希釈剤または賦形剤とともに、医薬組成物およびその単位剤形の形態にセットされてもよく、このような形態で、溶液、懸濁物、エマルション、エリキシル剤のような液体もしくはこれらが充填されたカプセルとして、または眼球（硝子体腔内を含む）に使用するための滅菌した注射可能な溶液の形態で使用されてもよい。このような医薬組成物およびその単位剤形は、付加活性化合物または化学成分とともに又はこれらを含まない、構成成分を従来の比率で含んでいてもよく、そしてこのような単位剤形は、使用すべき目的の１日投薬範囲に合うような任意の適切な有効な量の活性成分を含有していてもよい。
【０１６８】
このような液体調製物は、添加剤を含有していてもよく、添加剤としては、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。懸濁剤としては、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、水素化食用脂が挙げられるが、これらに限定されない。乳化剤としては、レシチン、ソルビタンモノオレエート、アカシアが挙げられるが、これらに限定されない。注射可能な組成物は、典型的には、注射可能な滅菌食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水、または当該技術分野で既知の他の注射可能なキャリアに基づく。
【０１６９】
本発明の製剤は、１個以上の容器に、本発明の製剤とともに、この製剤の使用説明書を含むキットの形態で提供されてもよい。
【０１７０】
製剤は、繰り返し投与することによって送達するように適用されてもよい。
【０１７１】
本発明のプロセスまたは方法によって得ることが可能な、本発明の安定化されたインタクトな抗体およびその製剤は、免疫疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶、感染性疾患、炎症性疾患、神経疾患、血管新生性疾患または腫瘍性疾患のような疾患または障害の予防および／または治療に有用である。
【０１７２】
一つの実施形態によれば、医薬として使用するための本発明の製剤が提供される。
【０１７３】
特に、本発明の製剤は、免疫疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、炎症性疾患、神経疾患、血管新生性疾患または腫瘍性疾患から選択される疾患または障害の予防または治療を想定していてもよい。
【０１７４】
本発明の特定の実施形態によれば、癌または新生血管加齢黄斑変性疾患（ＡＭＤ）から選択される疾患または障害を予防または治療するための本発明の製剤が提供される。
【０１７５】
本発明の一つの実施形態によれば、本発明の安定なインタクトな抗体製剤、または本発明のプロセスまたは方法によって得ることができる安定化されたインタクトな抗体の製剤を、それを必要とする患者に予防または治療に有効な量投与することを含む、免疫疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、炎症性疾患、神経疾患、血管新生性疾患または腫瘍性疾患の疾患または障害を予防、治療または改善する方法が提供される。
【０１７６】
本発明の特定の実施形態によれば、安定なベバシズマブ製剤、または本発明のプロセスまたは方法によって得ることができる安定化されたベバシズマブの製剤を、それを必要とする被検体に予防または治療に有効な量投与することを含む、新生血管加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を予防、治療または改善する方法が提供される。
【０１７７】
一つの態様によれば、本発明は、本発明の安定化された抗体製剤または本発明の安定化されたベバシズマブの製剤を、それを必要とする被検体に予防または治療に有効な量投与することを含む、癌を予防、治療または改善する方法を提供する。
【０１７８】
特に考慮される癌としては、例えば、結腸癌または直腸癌から選択される転移性癌が挙げられる。
【０１７９】
典型的には、結腸直腸癌のような癌治療のための、本発明の安定化されたベバシズマブの治療に有効な投薬量は、約３ｍｇ／体重ｋｇ〜約２０ｍｇ／体重ｋｇである。
【０１８０】
個体に単回投与または複数回投与として投与される投薬量は、薬物動態特性、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康および身長）、症状の程度、併用する治療、治療頻度、望ましい効果を含む種々の因子によって変わるであろう。
【０１８１】
本発明の別の態様によれば、インタクトな抗体と式（Ｉ）の化合物とを混合することによって、水溶液中でインタクトな抗体を安定化させる方法が提供される。
【０１８２】
一つの実施形態によれば、インタクトな抗体またはその製剤を調製するプロセスであって、
（ｉ）液体混合物中でインタクトな抗体と式（Ｉ）の化合物とを混合する工程、または式（Ｉ）の化合物を含む液体媒体中でインタクトな抗体を製剤化する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた前記安定化されたインタクトな抗体を含む液体混合物または液体媒体を集める工程とを含み、インタクトな抗体のモノマーの割合が、前記式（Ｉ）の化合物の存在下で調製したインタクトな抗体と比較して増えていることを特徴とする、プロセスが提供される。
【０１８３】
典型的には、安定化されたインタクトな抗体のモノマーの割合は、２５ｍｇ／ｍｌで、４０℃で３５日後、少なくとも約９０％である。
【０１８４】
特定の実施形態では、インタクトな抗体がベバシズマブである本発明の方法が提供される。例えば、本発明の方法またはプロセスで使用されるベバシズマブは、Ｐｒｅｓｔａら、１９９７（上述）に記載されるようなプロセスによって得られてもよい。
【０１８５】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物がＡＭＰまたはＡＤＰ、特に、ＡＭＰである本発明の方法またはプロセスが提供される。
【０１８６】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物がＧＭＰである本発明の方法またはプロセスが提供される。
【０１８７】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物がＡＴＰである本発明の方法またはプロセスが提供される。
【０１８８】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物がスクロースホスフェートである本発明の方法またはプロセスが提供される。
【０１８９】
また、本発明の方法またはプロセスは、製造プロセス中、および／またはすでに会合した抗体を含む製造バッチを回収するときに、会合した抗体を実質的にモノマー状態に回復させることによって、インタクトな抗体の会合能力を下げるために有用に適用されてもよい。
【０１９０】
本発明の方法またはプロセスは、保存寿命を延ばし、複数回投薬の調節を可能にするインタクトな抗体の安定な製剤を調製するために有用に適用されてもよい。
【０１９１】
以下の非限定的な実施例によって、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０１９２】
以下の省略語は、それぞれ以下の定義を指す。
ｍＭ（ミリモル濃度）、ｎｍ（ナノメートル）、ＡＦＦＦ（非対称流フィールドフローフラクショネーション）、ＭＡＬＳ（多角度光散乱）、ＵＶ（紫外線）。
【０１９３】
実施例１：ベバシズマブの三次元会合モデルの決定
ベバシズマブの三次元モデルを構築するために、（ｉ）ＶＥＧＦとの複合体におけるベバシズマブの２つのＦａｂ領域（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＢＪ１、解像度２．４０Å、空間群Ｐ２１）（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、６：１１５３−１１６７）および（ｉｉ）ＩｇＧ１  Ｆａｂ領域およびＦｃ領域を含む完全長マウスＩｇＧ１（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＩＧＹ、解像度３．２Å、空間群Ｐ２１）（Ｈａｒｒｉｓら、１９９８、上述）のタンパク質データバンクの結晶構造を使用した。
【０１９４】
初期のベバシズマブ三次元モデルは、Ｓｙｂｙｌ  ８．０（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．）で実行した以下のモデリング工程から得られた。
（１）配列アラインメントによる、ベバシズマブおよびＩｇＧ１の対応するＦａｂの構造の重ね合わせ、および
（２）マウスＩｇＧ１  ＦａｂをベバシズマブのＦａｂと置き換え、ベバシズマブのＦａｂと、マウスＩｇＧ１のヒンジ−Ｆｃとを接続。
【０１９５】
さらに、マウスＩｇＧ１のヒンジ−Ｆｃ領域が、対応する適切な結晶構造を有する入手可能な唯一のヒトＩｇＧ１（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＨＺＨ）から得たヒンジ−Ｆｃ領域の配列とマッチするように、この領域の残基を「変異させる」ことによって「ヒト化」された改良モデルを作成した（Ｓａｐｈｉｒｅら、２００１、上述）。完全ヒトＩｇＧ１結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＨＺＨ）は独特の結晶対称性を有するため、使用することができなかった（Ｆｃ領域の軸に対し、Ｆａｂの配置が強くねじれている）。初期モデル（非ヒト化）および改良モデル（ヒト化）で同様の結果が得られ、このことは、このモデルが、ヒトＦｃ領域を有するインタクトな治療用抗体に関連するものであることを裏付けている。
【０１９６】
初期モデルの接続領域について、Ｓｙｂｙｌ  ８．０のデフォルトパラメータを用い、ジスルフィド架橋をインタクトなままに保持しつつ、エネルギーを最小化させた。得られたモデルの品質を、Ｐｒｏｃｈｅｃｋ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら、１９９３、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．、２６、２８３−２９１）を用いて評価した。ＦｃおよびＦａｂｓ双方の結晶構造間の解像度平均を用いたアミノ酸コンホメーションのラマチャンドランプロット分析（Ｐｒｏｃｈｅｃｋによる）から、Ｓｙｂｙｌでの重要な側鎖のねじれを補正し、入力した結晶構造に相当するコンホメーションに達するまで、手順を繰り返した。得られたベバシズマブの三次元モデルを図１に示す。
【０１９７】
ベバシズマブの会合モデルを得るために、まず、完全ＩｇＧ１結晶構造の結晶対称性（Ｐ２１）を構築し、次いで、Ｄｅｅｐ  Ｖｉｅｗ  Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢビューア（Ｇｕｅｘ  ａｎｄ  Ｐｅｉｔｓｃｈ、１９９７、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１８、２７１４−２７２３）を用い、得られた層をユニットセルに沿って翻訳した。得られたすべての翻訳結果を視覚的に観察した後、近い結晶接触を有する翻訳結果のみ（すなわち、４Å程度のもの（最初の翻訳結果に対応する））をタンパク質データバンク（ｐｄｂ）フォーマットで保存した。三次元ベバシズマブ構造モデルを、Ｓｙｂｙｌでα炭素の位置にしたがって上に重ね合わせた。ベバシズマブ三次元構造モデルおよびその翻訳結果を示すと、そのひとつは、１個のＦｃの底部が、第２のベバシズマブの２個のＦａｂ領域の間にあることを示す。２個の抗体の２個のＦｃ領域は、第１のＦｃが、他の抗体に由来する１個のＦａｂと相互作用するように、この理想的な場合からわずかでも逸れない場合には、同じ面に位置しているだろう。得られたベバシズマブの会合モデルを図２Ａ〜２Ｂに示す。
【０１９８】
実施例２：式（Ｉ）の化合物とベバシズマブ抗体の表面との分子相互作用試験
Ｓｙｂｙｌ  ８．０において、ドッキングのための低分子の設定を行った。この低分子量分子に水素を加え、それぞれのホスフェートは、プロトン化されないままであり、Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ−Ｈｕｃｋｅｌ電荷が加わった。得られた分子を、Ｓｙｂｙｌ  ８．０のデフォルトＰｏｗｅｌｌ極小化プロトコルを１００工程用いて最小化した。次いで、ＦｌｅｘＸ  ３．１．３を用いて、ベバシズマブ抗体表面（ＦａｂｓおよびＦｃ)の全体に規則的なドッキングを行い、それぞれのアルギニンおよびリジンの付近１０Åのいくつかのセグメントに分けた。分子およびドッキング部位あたり、１０個のポーズを作成した。ドッキングポーズについて、ＦｌｅｘＸスコアリング関数でスコアをつけ、帰属したベバシズマブ−低分子相互作用スコアを分析し、あらゆるポーズを視覚的に観察し、ベバシズマブ表面から飛び出したポーズを保持する（すなわち、以下に定義し、図７で定義するような妨害体積の内側）ことによって評価した。ベバシズマブ−ベバシズマブ相互作用界面をうまく妨害するドッキングポーズの数（１０回の解のうち）は、低分子量化合物の重要な選択／分析基準であった。
【０１９９】
破壊するポーズを含む妨害体積は、図７にあらわされるように、円筒形で定義されており、その底部の中央が、Ｌｙｓ４４５に対応するリジン残基のＣα原子であると定義され、底部の平面は、Ｌｙｓ４４５に対応するリジン残基のＮ原子を含み、半径を７Åに設定した。他の抗体モノマーの隣接するＦａｂに対し、円の表面にほぼ位置するＦｃ原子を用い、底部から直角に、高さ１２〜１５Åのところに線を引いた。この図によれば、ＡＭＰおよびトリアムシノロンアセトニドホスフェート（ＴＡＰ）が、ネガティブコントロールとして使用される非破壊因子であり、Ｆｃに近接して重なっており、これらのホスフェートは、両方ともＬｙｓ  ４４５に対応するリジン残基と相互作用していることがわかるであろう。しかし、ＡＭＰは、隣接する抗体のＦａｂを妨害するのに十分な体積および空間を占めているが、ＴＡＰは、一般的には、そうではない。０から５の妨害スコア（０から２のスコアは、会合破壊傾向がないか、または最低限の会合破壊傾向を定義しており、３から５のスコアは、顕著な会合破壊傾向を定義している）から、以下の第２表に記載するように、調節剤の候補物質を定義することができる。
【０２００】
【表１】
2013528570.tif 000006
【０２０１】
いくつかの会合破壊因子およびコントロールとしての非破壊分子について、１００個のドッキングポーズのうち、１０個の最適なＦｌｅｘＸスコアを有するドッキングポーズから得られるスコアを以下の第３表に列挙している（トリアムシノロンアセトニド（ＴＡ）およびトリアムシノロンアセトニドホスフェート（ＴＡＰ））。
【０２０２】
【表２】
2013528570.tif 000007
【０２０３】
結果から、式（Ｉ）の化合物（例えば、ＡＭＰ、α−ラクトース−１−ホスフェート、α−Ｄ（＋）マンノース−１−ホスフェート、フルダラビン、テノホビル、シドフォビルおよびチルドロネート）は、Ｌｙｓ４４５Ｂに対応するリジン残基に有効にドッキングし、隣接する抗体を妨害するように位置しているが示された。
【０２０４】
第３表からわかるように、ＡＭＰもスクロースホスフェートも、モデリングされた集団の中で強力に妨害するポーズを示す。ＡＭＰからＡＤＰおよびＡＴＰへと妨害スコアが低下するのは、すべてのホスフェート基が、かなりの程度の自由度を与えてしまい、ドッキングプログラムが標準偏差（ＲＭＳＤ）の観点で（すなわち、ＲＭＳＤ≦２Å）類似したポーズを見つけることがより難しくなっているという、予想されるスコアと一致している。実験結果から、ＡＴＰがＡＭＰほど強い破壊因子ではないことを確認した。
【０２０５】
シドフォビル、テノホビル、チルドロネート、アミフォスチンおよびフルダラビンは、このスコア範囲によって、中程度の会合破壊特性をもち、おそらくＡＤＰと同じ範囲であると予想される。
【０２０６】
実施例３：ベバシズマブ単独、およびアデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ）との会合体の安定性の比較
４種類の異なるサンプルを試験した。
６０ｍｇ／ｍｌのトレハロース無水物および０．０４％ポリソルベート２０を含有する５１ｎＭリン酸バッファー（ｐＨ６．２）中、２５ｍｇ／ｍｌのベバシズマブを含む市販のベバシズマブ製剤（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａ、ライナハ、スイス）を、等張性バッファーの中で一晩透析し、市販製品中に存在する賦形剤の量を減らし、ｐＨを変えた。５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を使用した。バッファーの選択は、生理学的に認められ、抗体の安定性に許容されるｐＨ範囲および緩衝能力に基づいて行われた。
【０２０７】
透析の後、抗体にストレスを与え、会合体の生成を誘発するために、濃度２５ｍｇ／ｍｌのベバシズマブ調製物を温度４０℃、ｐＨ７．０で７日間保存した。
【０２０８】
ベバシズマブの第１のサンプルを分離した（ベバシズマブ単独の会合を試験するため）。
【０２０９】
ストレスを与えたベバシズマブサンプルに、アデノシン５’一リン酸粉末（純度９９％、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）を３種類の異なる濃度で加え、以下のモル比を得た。
ｉ．  ベバシズマブ：ＡＭＰ  １：１５３
ｉｉ．  ベバシズマブ：ＡＭＰ  １：１５．３
ｉｉｉ．  ベバシズマブ：ＡＭＰ  １：１．５３
【０２１０】
全サンプルを４０℃で２８日間保存した。調製直後（ｔ０）、および７日後、１４日後、２８日後にサンプルを分析した。抗体の会合状態を、非対称流フィールドフローフラクショネーション（ＡＦＦＦ）によって分離した後、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）によって測定した。ベバシズマブの濃度を、ＵＶ分光法によって吸光係数１．７ｃｍ  ｍｌ／ｍｇに基づいて２８０ｎｍで決定した。データを集め、Ａｓｔｒａソフトウエア（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、デルンバッハ、ドイツ）を用いて分析した。会合状態を、時間に対するモノマーの割合としてあらわした。
【０２１１】
ベバシズマブ単独の安定性について、濃度（５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．２）中、５、１０、１８、２５ｍｇ／ｍｌ）、並びに保存ｐＨおよび温度（ｐＨ５．０およびｐＨ７．０、４℃、２５℃、４０℃で３５日間）が抗体安定性に及ぼす影響に関し、さらにコントロール実験を行った。
【０２１２】
ベバシズマブとＡＭＰとが会合することによって、ベバシズマブ単独のサンプルと比較して、驚くべき抗体の安定化が生じる（図３）。温度４０℃、ｐＨ７．０で１４日間保存後、ＡＭＰを含むベバシズマブの製剤中のモノマーの割合は、９４％より大きい（ｎ＝３）。温度４０℃、ｐＨ７．０で２８日間保存後、モノマーの割合は、ベバシズマブ：ＡＭＰのモル比＝１：１５３のとき、依然９０％付近であり（ｎ＝３）（図３）；ベバシズマブ：ＡＭＰのモル比＝１：１５．３または１：１．５３のときの、温度４０℃、ｐＨ７．０で１４日間保存後の８０％より高く、温度４０℃、ｐＨ７．０で２８日間保存後の７６％（ｎ＝３）より高い。これを、ベバシズマブ単独のときの、温度４０℃、ｐＨ７．０で１４日間保存後の平均モノマー割合（ｎ＝３）７５％、および、温度４０℃、ｐＨ７．０で２８日間保存後の平均モノマー割合７１％と比較する。
【０２１３】
これらのデータは、インタクトな抗体（例えば、ベバシズマブ）と式（Ｉ）の化合物（例えば、ＡＭＰ）の化合によって、安定化された抗体製剤が有利に導かれることを明らかに示している。
【０２１４】
実施例４；アデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ）が市販のベバシズマブ製剤（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））に及ぼす影響
市販のベバシズマブ製剤（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａ、ライナハ、スイス）のサンプルを、３種類のモル比（１：１、１：１０、および１：１００  Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）：ＡＭＰ）でＡＭＰと混合する。全サンプルを温度４０℃で２８日間保存し、実施例３に記載するように安定性を測定し、同じ条件で保存したＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）単独のサンプルと比較する。
【０２１５】
市販のＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）製剤単独のサンプルと比較して、１：１０のサンプルおよび１：１００のサンプルの両方で抗体の顕著な安定化（モノマー量の増加）が観察される（ｐ＜０．０５）。１：１０のサンプルの場合、ｔ１、ｔ１４、ｔ２８で顕著な安定化が測定され、一方、１：１００のサンプルの場合、このような安定化は、より長いインキュベーション時間の場合にのみ（ｔ１４およびｔ２８）観察される（図２）。したがって、他のモル比１：１および１：１００と比較して、１：１０のサンプルは、抗体を良好に安定化する結果となる。結論として、これらの結果は、実施例３の結果を裏付けるものであり、式（Ｉ）の化合物（例えば、アデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ））が、改質していない市販の抗体製剤をも安定化することができることを示している。
【０２１６】
実施例５：ベバシズマブ単独、およびグアノシン５’一リン酸（ＧＭＰ）、アデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）、またはスクロースホスフェートとの会合体の安定性の比較
市販のベバシズマブ製剤（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａ、ライナハ、スイス）のサンプルを、実施例３に記載するように、ｐＨ７．０で、ＰＢＳ中で透析した後に、プレストレスを与えた（温度４０℃で７日間）。プレストレスを与えた後、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）サンプルを、ＡＴＰ、ＧＭＰまたはスクロースホスフェートと、３種類のＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）：式（Ｉ）の化合物のモル比（１：１、１：１０、および１：１００）で混合した。全サンプルを温度４０℃で２８日間保存し、実施例３に記載するように安定性を測定し、同じ条件で保存したＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）単独のサンプルと比較する。ＧＭＰの場合、ＧＭＰの希釈は、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で行い、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）と混合する前にｐＨを７．０に再調整し、抗体製剤にＮａＯＨを直接加えることによってさらに高次の会合体が生成する危険性を防いだ。スクロースホスフェートについて、濃度に依存する安定化を観察し：すべての時点で、１：１００の製剤は良好な安定化をもたらし、それに１：１０、その後に１：１のサンプルが続く。
【０２１７】
ＡＴＰを加えた後、１４日まではＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）の濃度に依存する安定化が観察される。ｔ２８では、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）単独のサンプルと、１：１および１：１０の化合物とで顕著な違いはみられない。１：１００のサンプルは、保存２８日後に抗体の顕著な安定化を示すが、少量の会合体も観察されている。これらの会合体は、おそらく、このサンプルのｐＨ調整に起因するものである。ＧＭＰを加えた後、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）の濃度に依存する安定化が同様に観察され：全時点で、１：１００の製剤は、会合を破壊するのに最も有効であり、それに１：１０、その後に１：１のサンプルが続く。
【０２１８】
したがって、初期段階（例えば、４０℃で１日保存：ｔ１）で、ＡＴＰまたはスクロースホスフェートを加えた後、３種類すべてのモル比で安定化効果が観察される（図３Ａ）。ＧＭＰは、１：１００のサンプルのみが抗体を安定化させる能力を示し、一方、１：１のサンプルおよび１：１０のサンプルは不安定であるとおり、ＡＴＰに比べると有効ではないと考えられる。後期段階（例えば、４０℃で２８日保存：ｔ２８）では、ＡＴＰは、１：１００のサンプルの場合、依然として抗体に対して顕著な安定化効果を示すが、１：１のサンプルおよび１：１０のサンプルは、抗体単独の場合と同様の安定性を示す（図３Ｂ）。スクロースホスフェートの場合、濃度に依存する安定化効果は、４０℃で２８日間保存しても継続している。
【０２１９】
したがって、ＡＴＰは、会合を破壊する効果を示すが、これらの効果は、賦形剤を抗体に加えた直後に最も顕著である。ＧＭＰが抗体と相互作用し、抗体ダイマーの生成を妨害するには、より多くの時間を要すると考えられる。
【０２２０】
結論として、式（Ｉ）の賦形剤は、安定化特性を有する。ＡＴＰおよびスクロースホスフェートの場合、抗体に対する短期間の効果が最も顕著であり、一方、ＧＭＰは、４０℃で２８日保存した後に、最も明らかな安定化特性を示す。
【０２２１】
実施例６：抗体単独および本発明の化合物との会合体の安定性の比較
種々の抗体に対する本発明の式（Ｉ）の化合物の安定化効果を以下のように評価する。
【０２２２】
長期安定性試験
２０ｍＭのヒスチジンバッファー（ｐＨ６．０）中、濃度２５ｍｇ／ｍｌの抗体を、同じバッファーのストック溶液由来の式（Ｉ）の化合物（例えば、ＡＭＰ）と、同じバッファー中、抗体：化合物のモル比１：１および１：１０で混合する。次いで、抗体の濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上であるように得られたサンプルを、通常の保存温度（５℃）または高温（例えば、２５℃または４０℃）で保存する。次いで、それぞれのサンプルのモノマー、ダイマー、それより大きい抗体会合体の割合に基づいて、種々の技術（例えば、非対称流フィールドフローフラクショネーション（ＡＦＦＦ）、サイズ排除クロマトグラフィー、または分析用超遠心分離）によって、保存中に、例えば、サンプルを調製した直後、保存を開始してから２週間後、１ヶ月後、３ヵ月後、および６ヶ月後に会合状態を測定する。式（Ｉ）の化合物の存在下、および非存在下で会合状態を比較し、式（Ｉ）の化合物が会合を防ぐ能力を示す。
【０２２３】
ストレス条件下での短期安定性試験
２０ｍＭのヒスチジンバッファー（ｐＨ６．０）中、濃度２５ｍｇ／ｍｌの抗体に、既知の会合条件（例えば、Ｋｉｅｓｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、９７（１０）、４３４７−４３６６に記載されるような温度、ｐＨ、撹拌）を用いてプレストレスを与えた後、式（Ｉ）の化合物（例えば、ＡＭＰ）を、バッファー中のＭａｂ：化合物のモル比が１：１および１：１０になるように加える。次いで、抗体の濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上であるように得られたサンプルを、式（Ｉ）の化合物を加えた直後と開始１週間後に、それぞれのサンプルのモノマー、ダイマー、それより大きな抗体会合体の割合に基づいて、種々の技術（例えば、非対称流フィールドフローフラクショネーション（ＡＦＦＦ）、サイズ排除クロマトグラフィー、または分析用超遠心分離）によって、会合状態を決定するために分析する。式（Ｉ）の化合物の存在下、および非存在下で会合状態を比較し、式（Ｉ）の化合物が会合を後退させる能力を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−Ｈ】
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【図６−Ｉ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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