(57)【要約】  癌疾患を診断および／または予後判定するための、腫瘍細胞の発生源を診断するための、癌患者の療法最適化のための、および腫瘍学用の有効成分をスクリーニングするための方法。この方法では、負荷されるそれぞれの細胞の線形または非線形変形をもたらす機械的負荷下での腫瘍細胞および参照細胞の機械特性を分析する。有向の機械的応力の入力の結果として生じる、細胞のひずみを手がかりに、腫瘍転移のリスク、ならびに場合によっては無制御に増殖する細胞および／または浸潤性細胞の存在、あるいは腫瘍の発生母組織を確定する。その際、腫瘍転移リスクは、標本中の、応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合を手がかりに決定される。無制御に増殖する細胞が存在するリスクは、細胞の非線形変形において、標本中の細胞の応力方向へのひずみの平均値を手がかりに確定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機械的負荷下での細胞のひずみの分析を含み、前記細胞が患者の生物学的材料の試料から入手可能である、癌疾患の診断および／または予後判定方法であって、
ａ）それぞれ一つの細胞に、機械的負荷として、細胞の線形変形が見込まれるように変形性機械的応力を加え、機械的負荷の時点における細胞のひずみを決定し、そして
ｂ）患者試料中の、機械的負荷下で応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合を、参照データと比較し、
患者試料において、機械的負荷下で応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合が参照データにおけるよりも高いと、腫瘍転移の高いリスクがより高いことを示唆する、方法。
【請求項２】
ｃ）機械的負荷下で応力方向にひずみを示す患者試料の分析された細胞のひずみの平均値を参照データと比較することを特徴とし、そして、患者試料での応力方向へのひずみの平均値が参照データにおけるよりも高いと、無制御に増殖する細胞が存在するリスクがより高いことを示唆する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｄ）同一患者試料の少なくとも一つの細胞に、機械的負荷として、細胞の非線形変形が見込まれるように変形性機械的応力を加え、機械的負荷の時点における細胞のひずみを決定し、そして
ｅ）患者試料の分析された細胞のひずみの平均値を参照データと比較すること、
を特徴とし、
患者試料におけるひずみの平均値が参照試料におけるよりも低いと、浸潤性細胞が存在するリスクがより高いことを示唆する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞が、患者の腫瘍組織から、好ましくは原発腫瘍試料から単離されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
機械的負荷下での細胞のひずみの分析を含み、前記細胞が患者の生物学的材料の試料から入手可能である、好ましくは請求項１〜４のいずれか一つに記載の、癌疾患の診断および／または予後判定方法であって、
−患者試料の細胞の寸法を、機械的応力を加えずに算出し、
−続いて、細胞の線形変形が見込まれる機械的応力を、時点ｔＳにおいて細胞に加え、応力入力下に細胞の寸法を算出し、
−続いて、機械的応力を加えずに、細胞の緩和後に時点ｔＲにおいて細胞の寸法を算出し、
−時点ｔＳにおける応力入力下での細胞のひずみおよび時点ｔＲにおける細胞の緩和後の細胞のひずみの差を出すことによって相対緩和を算出し、
−患者試料中の細胞の相対緩和を参照データと比較し、
・参照データと比べて、平均的に、患者試料中の相対緩和がより低いと、無制御に増加する細胞が存在するリスクがより高いことを示唆し、および／または
・参照データと比べて、患者試料中の、０を超える相対緩和を有する細胞の数がより少ないと、無制御に増殖する細胞が存在するリスクがより高いことを示唆する、方法。
【請求項６】
付加的に請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法の少なくとも一つが実施され、そして、機械的負荷下で応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合が、参照データよりも患者試料中で高く、参照データと比べて平均的に患者試料において相対緩和がより低いと、腫瘍転移のリスクがより高いことを示唆する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
機械的負荷下での腫瘍細胞のひずみの分析を含に、前記細胞が患者の生物学的材料の試料から入手可能である、患者の腫瘍細胞の発生母組織を診断するための方法であって、
ａ）それぞれ一つの腫瘍細胞に、機械的負荷として、腫瘍細胞の線形変形または非線形変形が見込まれる変形性機械的応力を加え、機械的負荷の時点における腫瘍細胞のひずみを決定し、そして
ｂ）腫瘍細胞の応力方向へのひずみの平均値を算出し、異なる参照データ一式と比較し、
ここで、それぞれ一つずつ参照データ一式は、特定のヒト組織の細胞の応力方向へのひずみの平均値を含み、
腫瘍の発生母組織として、患者試料と参照データ一式との間でのひずみの平均値の差の値が最も小さい参照データ一式の特定の組織が割り当てられる、方法。
【請求項８】
腫瘍学用の潜在的有効成分としての物質のスクリーニングのための方法であって、複数の腫瘍細胞の機械的負荷下でのひずみが分析され、その際、
ｉ）少なくとも一つの腫瘍細胞を、
−一物質と接触させ、
−続いて、腫瘍細胞に、機械的負荷として、腫瘍細胞が線形または非線形に変形するように変形性機械的応力を加え、そして、腫瘍細胞のひずみを負荷の時点において決定し、
ｉｉ）物質と接触させた腫瘍細胞のひずみを、未処理の同種の腫瘍細胞のひずみの分析に関する参照データと比較する
ことにより、その物質の、腫瘍細胞の生体力学特性に及ぼす影響が検査され、
ここで、細胞の線形変形が見込まれる機械的負荷において、機械的負荷下で応力方向と相反するひずみを示す腫瘍細胞の割合が、未処理の腫瘍細胞と比べて、物質と接触させた腫瘍細胞においてより低い場合に、この物質が、腫瘍学用の潜在的有効成分である、方法。
【請求項９】
−細胞の線形変形が見込まれる機械的負荷下に、物質と接触させた腫瘍細胞の応力方向へのひずみの平均値が、未処理の腫瘍細胞と比べてより低い場合に、および／または
−細胞の非線形変形が見込まれる機械的負荷下に、物質と接触させた腫瘍細胞のひずみの平均値が、未処理の腫瘍細胞と比べてより高い場合に、
この物質が腫瘍学用の潜在的有効成分である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞系の腫瘍細胞が分析されることを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
一物質の、同一腫瘍細胞の生体力学特性に及ぼす影響が決定されることを特徴とし、
−まず未処理腫瘍細胞のひずみを負荷下に算出し、
−続いて、腫瘍細胞を物質と接触させ、そして
−続いて、物質と接触させた腫瘍細胞のひずみを決定する、
請求項８〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
癌疾患を患う患者の治療最適化の方法であって、複数の腫瘍細胞が機械的負荷下に分析され、そしてその際、
ｉ）患者の腫瘍細胞を含む少なくとも二つの試料を、それぞれ、
−一つの有効成分と接触させ、
−続いて、試料のそれぞれ一つずつの腫瘍細胞に、機械的負荷として、腫瘍細胞が線形または非線形に変形するように機械的応力を加え、そして負荷の時点における腫瘍細胞のひずみを決定し、
ｉｉ）それぞれの有効成分と接触させた腫瘍細胞のひずみを、患者の未処理腫瘍細胞の参照データと比較する
ことにより、患者の腫瘍細胞の生体力学特性に及ぼす様々な有効成分の影響が検査され、
ここで、有効成分のうち、その有効成分との接触後に、腫瘍細胞を含む試料で、未処理腫瘍細胞と比べて、
ａ）腫瘍細胞の線形変形が見込まれる機械的負荷下において、応力方向と相反するひずみを示す腫瘍細胞の割合が最も低い、および／または
ｂ）腫瘍細胞の線形変形が見込まれる機械的負荷下において、応力方向への腫瘍細胞のひずみの平均値が最も低い、および／または
ｃ）細胞の非線形変形が見込まれる機械的負荷下において、腫瘍細胞のひずみの平均値が最も高い
有効成分を治療用に選択する方法。
【請求項１３】
分析に先立ち細胞をばらばらにすることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
光学的ストレッチャーの原理に基づいて細胞に機械的応力を加えることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
原子間力顕微鏡、誘電泳動力、マイクロ流体流、光ピンセット、レーザダイオードバー、または超音波顕微鏡を利用して行われることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
機械的負荷としての機械的応力を細胞に加えるため、および負荷時の細胞のひずみを決定するために適した装置の、
ａ）患者の生物学的材料の試料から入手可能な細胞の分析により癌疾患を診断および／または予後判定するための（ただし、腫瘍転移のリスクは、試料中の、応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合を手がかりに、および場合によっては、浸潤性細胞が存在するリスクは、細胞の非線形変形における、試料中の細胞の応力方向へのひずみの平均値を手がかりに算出される）、および／または
ｂ）患者の生物学的材料の試料に由来する腫瘍細胞のひずみの分析により、癌疾患を患う患者の腫瘍の発生母組織を決定するための、および／または
ｃ）腫瘍学用の潜在的有効成分としての物質をスクリーニングするための（ただし、腫瘍細胞の生体力学特性に及ぼす、一物質の影響が検査される）、および／または
ｄ）癌疾患を患う患者の療法最適化のための（ただし、患者の腫瘍細胞の生体力学特性に及ぼす様々な有効成分の影響が検査される）、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌疾患を診断および／または予後判定するための、腫瘍細胞の発生源を診断するための、癌患者の療法最適化のための、および腫瘍学用の有効成分をスクリーニングするための方法に関し、この方法においては、腫瘍細胞、および正常組織に由来する参照細胞の機械特性を分析し、有向の機械的応力の入力の結果として生じる、細胞のひずみから、癌疾患の診断および／または予後判定を下す。本発明は、研究、医学および薬学分野において使用される。
【背景技術】
【０００２】
癌および癌疾患という名称のもとに、悪性腫瘍を形成するという共通点を有する疾患群全体がまとめられる。今日までに、２００を超える様々な腫瘍が同定されている。すべての悪性腫瘍に特徴的なことは、細胞の無制御の増殖、健常組織を押しのけることができる（隣接組織の浸潤）能力、および身体全体の組織に転移を形成することができる（遠隔転移）能力である。この三つのプロセスは、癌の進行に関して特徴的であって、癌を癌病期Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ（ないしＡ〜Ｄ）に分類する際の、ないしＴＮＭ分類を利用して病期を分類する際の判断基準として、それゆえ疾患の攻撃性を記載するための判断基準として使用される。病期ＩＩＩ（Ｃ）以降は、癌がその発生領域を越えて成長し、周辺組織を押しのけることが認められる。病期ＩＶ（Ｄ）以降は遠隔転移が認められる。治癒に成功するためには、癌病期に応じて、異なる治療が望ましい。その点では、患者のために適した治療法を選択するためには、腫瘍細胞の攻撃性を評価することが非常に重要である。さらに、適した療法を選択するためには、できる限り早期に分類を行うことができるということも重要である。これまでのところは、原発腫瘍試料を手がかりに、すでに転移形成を伴う進行段階に達しているかどうかを確認することは不可能である。
【０００３】
癌疾患の診断は、患者の訴えに続いて、ＭＲＴ、ＣＴ等々の画像処理法により、ならびに特異的腫瘍マーカーの検出により確認される。腫瘍マーカーとは、主に、患者の血液中もしくは別の体液中または細胞表面に検出されてその濃度上昇が腫瘍を示唆する、タンパク質またはペプチドである。悪性腫瘍細胞は、正常組織の変異細胞から発生するため、腫瘍マーカーは、正常組織の細胞上にも検出可能であって、腫瘍においては、単にその、異なる頻度を特徴とする。複数の異なる腫瘍マーカーが、様々な癌疾患と関連づけられた。腫瘍細胞に対する特異性が低いことから、これらの腫瘍マーカーは、診断目的には大部分は不適切である。腫瘍マーカーを手がかりに癌病期に分類することは、目下のところ不可能である。目下のところは、最終的な診断のために、腫瘍切片の病理検査が行われる。ある腫瘍がすでにどの程度進行しているかを分析するためには、目下の検査方法によると、腫瘍転移を直接探索し、それに加えて例えば疑わしい組織（例えばリンパ節）を除去することが必要である。
【０００４】
それにより、および画像処理法を利用して、癌疾患の分類を行うことが可能である。転移は、十分に大きな細胞塊を形成した時点ではじめて確認することができ、したがってそれぞれの方法において視認可能である。それに対して、始まりつつある転移を検出することは難しい。
【０００５】
癌疾患を診断または予後判定するための、腫瘍マーカーとしてのタンパク質、特に表面タンパク質の普及している分析、それゆえ細胞の生化学特性の分析とは異なり、腫瘍細胞中では、正常組織に由来する細胞と比べて、細胞骨格において、細胞の機械（ここでは「生体力学」ともいう）特性の変化を生じさせる変化が起きたことが認められた。
【０００６】
したがって、細胞の細胞骨格の機械特性に基づき、細胞の増殖に関して記載できることが公知である［Ｌｅｋｋａら１９９９（非特許文献１）、Ｇｕｃｋら２００５（非特許文献２）、Ｃｒｏｓｓら２００７（非特許文献３）、Ｒｅｍｍｅｒｂａｃｈら２００９（非特許文献４）］。腫瘍細胞、つまり無制御に増殖する細胞は、正常組織と比べて高い変形性を有することが認められた。さらに上昇した変形性が、乳癌に関しては、細胞の移動に関するリスク、それゆえ転移形成とも関連づけられた［Ｇｕｃｋら２００５（非特許文献２）、Ｗａｒｄら１９９１（非特許文献５）］。腫瘍細胞のこのより高い変形性は、間期に存在する、細胞のアクチンフィラメントが、細胞の有糸分裂開始とともに退化し、その後はアクチンが、細胞の細胞質中に拡散分布して存在するということにより理由づけられる［Ｓａｎｇｅｒら１９７５（非特許文献６）］。さらに、腫瘍細胞中ではアクチンが発現低下するものと前提される［Ｒａｏ  ＆  Ｃｏｈｅｎ  １９９１（非特許文献７）］。まさにフィラメント形状のアクチンは、細胞の安定化に貢献するため、細胞のより高い変形性は、細胞の無制御な増殖の適したマーカーとして使用することができる。腫瘍細胞のこの変形性上昇は、細胞の線形変形（ｌｉｎｅａｒｅ  Ｖｅｒｆｏｒｍｕｎｇ）を起こす機械的負荷において観察される。アクチンのほかに、微小管、中間径フィラメントのような別の細胞骨格要素、およびそれらに結合する架橋タンパク質とモータータンパク質も、細胞力学に影響を及ぼすことができる。
【０００７】
米国特許第６０６７８５９号（特許文献１）は、いわゆる光学的ストレッチャー（英語：ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ）とともに、それによると負荷下に細胞の変形を引き起こすことができる方法を開示する。その際、２つの逆方向のレーザ光により、変形性機械的応力が、分析されるべき細胞に印加され、この変形性機械的応力が細胞の粘弾性変形を起こす。レーザ光により生み出される引張応力は、負荷（機械的応力の印加）の時点において、レーザ光に沿った方向の、細胞の主軸に沿った細胞の伸長を起こす。その際に算出されるひずみ、つまり応力方向に沿った、細胞の相対的長さ変化は、腫瘍細胞では正常組織よりも大きい。細胞の長さ変化は、光学的に顕微鏡によって追跡され、その結果、ひずみを算出することができる。
【０００８】
しかしながら、細胞がより高い変形性を有するという記載だけでは、癌診断ないし予後判定を下すために十分ではない。ちょうど分裂中の別の細胞もまた、細胞骨格のそのような変化を示す。癌疾患の信頼できる予後判定を下すためには、転移確率ないし周辺組織への細胞の浸潤に関する記載も同様に行われる必要がある。すでに説明したように、転移は、目下のところ、比較的後期の病期においてはじめて、つまり転移形成後にはじめて画像処理法によって確定することができる。
【０００９】
それゆえ、転移性または浸潤性の細胞を、細胞骨格の特別な特性によって特徴づける、そしてこの特性を癌疾患の診断および／または予後判定に使用するという需要が存在する。転移確率または細胞の浸潤性と関連する特別な生体力学特性を介して、細胞の機械特性を変化させるというやり方で、癌療法のための新規の療法アプローチが存在する。さらには、治癒見込みを改善するために、この方法で、患者の療法に適した有効成分を、患者特異的な有効成分スクリーニングによって選択するという需要も存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６０６７８５９号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌｅｋｋａら１９９９
【非特許文献２】Ｇｕｃｋら２００５
【非特許文献３】Ｃｒｏｓｓら２００７
【非特許文献４】Ｒｅｍｍｅｒｂａｃｈら２００９
【非特許文献５】Ｗａｒｄら１９９１
【非特許文献６】Ｓａｎｇｅｒら１９７５
【非特許文献７】Ｒａｏ  ＆  Ｃｏｈｅｎ  １９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、これまでは知られていない、腫瘍細胞の機械特性の分析により、患者における腫瘍転移リスクおよび場合によっては浸潤性細胞の存在に関して記載できる方法を提供することである。さらに、腫瘍細胞の生体力学特性に影響を及ぼす、癌療法のための潜在的有効成分を同定するスクリーニング法を提供することが本発明の課題である。本発明のさらなる一つの課題は、適切な有効成分スクリーニングにより、患者の需要に個別に適合させた療法を可能にすることである。さらに、患者の腫瘍細胞の生体力学特性の分析により、腫瘍の発生源を帰納推理することが、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この課題は、本発明によると、機械的負荷をかけた細胞のひずみの分析を含む、癌疾患の診断方法および／または予後判定方法によって解決され、ただし、この細胞は、患者の生物学的材料の試料（以後は患者試料）から入手可能である。本発明による診断方法および／または予後判定方法では、
ａ）それぞれ一つの細胞に、機械的負荷として、細胞の線形変形が見込まれるように変形性機械的応力を加える。機械的負荷の時点において、応力方向に沿った細胞のひずみを決定する。
ｂ）患者試料中の、機械的負荷下に応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合を、参照データと比較する。その際、患者試料において、機械的負荷下に応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合が参照データにおけるよりも高いと、腫瘍転移のより高いリスクが示唆される。
【００１４】
本発明は、光学的ストレッチャーでの腫瘍細胞の分析において、１〜２Ｐａというわずかな機械的応力を入力すると、わずかな割合の細胞が、応力方向に正のひずみ、つまり正の相対的長さ変化を示したのではなく逆に収縮挙動（応力方向と相反するひずみ）を示したという発見に基づく。これによると、入力された機械的応力は、本来なら細胞直径の増大を引き起こすはずであろうにもかかわらず、機械的負荷下に、細胞直径の減少（「細胞の収縮」）が確認されたということを意味する。この挙動は、ここでは、応力方向と相反するひずみを意味する。
【００１５】
発明者によると、正常組織試料では、この特性の細胞が現れない、ないし非常に少数しか現れないのに対して、腫瘍に由来する組織試料では、それらの細胞が明らかにより高い割合で現れることが確認された。有向の機械的負荷下に応力方向と相反するひずみを示す細胞の頻度は、腫瘍に由来する模範的な組織試料では、１００個の細胞につきおよそ一細胞と見積もられた。
【００１６】
これらの細胞を単離すると、腫瘍組織に由来する（光学的ストレッチャー中で機械的負荷下に正のひずみを示す）その他の細胞とは異なる生物特性を示した。この特性は、これらの細胞が転移に関与していることを示唆する。正常組織に由来する細胞と、腫瘍組織（分類Ｔ１ｂ）に由来する選別されていない細胞とからの共培養は、培養の最中に、腫瘍細胞が正常組織から隔離してクラスタを形成することを示した。つまり、腫瘍細胞は、増殖の際に、同種細胞に対して親和性を示し、その結果、培養の最中に互いに集合する。正常組織との混合はほとんど起こらない。しかしながら、まさに転移に際しては、別の起源の組織への、腫瘍細胞の移行が起こる。正常組織に由来する細胞と、腫瘍組織（分類Ｔ３ｂおよびＴ４）に由来する選別された収縮性細胞とからの共培養は、選別された収縮性腫瘍細胞がクラスタを形成せず、正常組織の細胞との混合物が培養の最中も維持されたままであることを示した。つまり、選別された収縮性細胞は、同種細胞に対する親和性を喪失した（図２）。試料中で、機械的負荷下に応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合が、正常組織に由来する参照データと比較して高いということは、それゆえ、分析された試料が、転移可能な細胞をより多く含有するということを意味する。
【００１７】
したがって、腫瘍細胞のこの機械特性（線形変形範囲での機械的負荷における収縮挙動）の分析により、腫瘍転移の高まるリスクが存在するかどうかについて記載することができる。
【００１８】
さらに、腫瘍組織に由来する細胞は、細胞の線形変形が見込まれる範囲での機械的負荷下に、一方では、正常組織の細胞と比較して、引張負荷下に、上昇した正のひずみ（つまり応力の方向へのひずみ）を示す細胞をより高い割合で含有すること、および他方では、ひずみの変動幅が、正常組織の細胞におけるよりも大きいことが公知である。このことは、有糸分裂開始後の細胞の細胞骨格のアクチンフィラメントの崩壊で理由づけられた。細胞の線形変形を引き起こす機械的負荷下での腫瘍細胞のこのより高い伸長性は、付加的に、無制御に増殖する細胞が存在することの基準として使用することができる。転移性細胞は、非転移性腫瘍細胞と比べてさらに高い変形性を示す。ひずみの変動幅もさらに大きい（図３）。この点では、正常組織の細胞と比べた患者試料の細胞のより高い変形性は、無制御に増殖する細胞が存在するリスクの上昇の確定にも、転移形成のリスクの確定にも使用することができる。機械的負荷下での、患者試料の細胞のひずみ分析においては、通例は、唯一の参照試料としか比較（Ａｂｇｌｅｉｃｈ）されないため、転移リスクに関する信頼できる記載のためには、付加的に、機械的負荷下に応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合も考慮に入れる必要がある。単に、患者試料中には、機械的負荷下により大きいひずみを示す細胞が正常組織の細胞よりも高い割合で存在するということの確認だけでは、転移リスクに関して確かな記載をするために十分ではないが、そのためには一つの参照が必要であって、どの絶対的限界値も決定のために十分ではないからである。そのためには、非転移性腫瘍細胞とのさらなる比較が必要であろうが、この非転移性腫瘍細胞は、通例は、同一患者からは存在しない。その点では、患者試料中において、機械的負荷下に応力方向と相反するひずみを示す細胞がより高い割合で存在するということの確認は、細胞の、応力方向へのひずみの変動幅、およびこのひずみの平均値が、患者試料では参照試料（例えば、正常組織）よりも有意に高いということの確認と組み合わせて、転移リスクの上昇を確認するために非常に有利である。しかしながら、単に、参照試料と比べた、試料中における、応力方向と相反するひずみをもつ細胞のより高い割合からすでに、腫瘍転移リスクを確定することも可能である。
【００１９】
本発明による方法は、好ましくは付加的に、無制御に増殖する細胞のリスクが試料中に存在するかどうかの決定を含み、ただし、
ｃ）機械的負荷下に応力方向にひずみを示す、患者試料の分析された細胞のひずみの平均値を参照データと比較する。その際、患者試料での応力方向へのひずみの平均値が参照データにおけるよりも高いと、無制御に増殖する細胞が存在するより高いリスクが示唆される。
【００２０】
細胞の線形変形が見込まれる範囲での機械的負荷をかけると、それぞれの場合に参照データと比較して、負荷下に応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合がより高くもあり、応力方向へのひずみの平均値がより高くもあると、患者にとっては、無制御の増殖によって、および転移を形成することができる腫瘍細胞の存在によって引き起こされるような攻撃性腫瘍の高いリスクが存在する。
【００２１】
（応力方向へのひずみを示す）細胞のひずみの平均値に加えて、好ましくは付加的に、変形性応力の方向へのひずみを示す細胞のひずみの分布（頻度分布）が考慮される。より高い平均値のみならず、ひずみの分布における相違もまた、無制御に増殖する細胞が存在するリスクについて記載するために考慮に入れることができる。
【００２２】
分布を比較するために、好ましくは、平均値および標準偏差（試料が正規分布する場合）ないし中央値および第１四分位数と第３四分位数との間の間隔（非正規分布の場合）、ならびに場合によっては試料の検査される細胞の応力方向への最小ひずみおよび最大ひずみを比較する。本発明による方法が、光学的ストレッチャーの原理に基づいて実施されると、より高い平均値およびより大きい標準偏差（試料が正規分布する場合）ないしより高い中央値および第１四分位数と第３四分位数との間のより大きい間隔（非正規分布の場合）も、（応力の方向への）より低い最小ひずみおよび／またはより高い最大ひずみも同様に、無制御に増殖する細胞の存在を示唆する。
【００２３】
標準偏差（正規分布の場合）ないし第１四分位数と第３四分位数との間の間隔（非正規分布の場合）が、参照データと比較して小さい場合には、より幅の狭い分布についてである。
【００２４】
本発明の一形態では、機械的負荷下での細胞のひずみの対案として、またはそれに付加的に、細胞の緩和挙動も分析される。緩和挙動のパラメータとしては、細胞がどの程度その（機械的負荷を及ぼす前の）初期状態に戻るかを示す相対緩和が算出される。相対緩和を算出するために以下のパラメータを決定する：
−機械的応力を及ぼさない、測定前の細胞の本来の寸法（Ｌ０）；
−続いて、細胞の線形変形が見込まれる機械的応力を及ぼした際の細胞の寸法（ＬＳ）、ただし、この寸法ＬＳは、機械的応力がなおも細胞に及ぼされる時点ｔＳにおいて測定する；
−それに続いて、機械的応力の不在下での細胞の寸法（ＬＲ）、ただし、この寸法ＬＲは、機械的応力がもはや細胞に印加されない時点ｔＲにおいて測定する（好ましくは、ｔＲは、細胞にもはや機械的応力が印加されなくなってから１〜５秒の間）。
【００２５】
機械的応力がもはや細胞に印加されなくなったあと、この細胞は、その本来の状態の方向に緩和する。時点ｔＲにおける、細胞の緩和後のひずみ（細胞の相対変形）と時点ｔＳにおける、応力入力下でのひずみとの差から細胞の相対緩和が算出される。それに応じて、細胞の相対緩和Ｒは、以下の関係により記載することができる：
Ｒ＝（ＬＲ−ＬＳ）／Ｌ０（１）
緩和挙動の決定により、有利なことに、無制御に増殖する細胞が存在するリスク、および浸潤性細胞の存在に関して的確にとらえることができる。さらに、患者試料の細胞の相対緩和Ｒの平均値が小さければ小さいほど腫瘍転移のリスクが高いということが当てはまる。
【００２６】
緩和挙動の決定には以下の観察がある。
【００２７】
細胞は、その細胞形状を能動的に変化させることができる粘弾性の物体であると前提される。純弾性の物体では、変形と緩和は鏡像的なプロセスであるのに対して、純粘性の物体では、緩和はまったく起こらない。細胞のような粘弾性物体を観察する場合には、より剛性である（つまり、機械的応力の入力下によりわずかなひずみを示す）細胞がより激しく緩和もすると見込まれる。逆に、（細胞の線形変形が見込まれる機械的応力の入力下に）正常組織の細胞よりも大きいひずみを示す腫瘍細胞の場合は、正常組織の細胞よりも弱い緩和が見込まれるであろう。意外なことに、乳房腫瘍に由来する組織の分析を手がかりに、腫瘍細胞はちょうど逆の挙動を示し、正常組織、この場合乳房組織の細胞よりもさらに激しく緩和するということを示すことができた（図６）。腫瘍細胞は、正常組織の細胞よりも迅速に緩和するということを示すことができ、つまりその分布関数は、より多くの負の値を示し、この効果は、癌が次第に進行するとともに（腫瘍のステージング）増大する。
【００２８】
転移性細胞は応力方向と相反する有向のひずみ挙動を示す（それゆえ、応力入力下での転移性細胞の能動的な変形挙動である）という観察は、腫瘍細胞の緩和挙動における観察によって立証される。癌疾患が進行すると、このような能動的変形挙動を示す細胞がますます多く現れることを示すことができた。細胞のこの特性は、応力入力下でのひずみの決定によると、細胞がすでに、細胞集団を離れることができ転移を形成する（病期３以降の腫瘍）ようになってはじめて検出可能であるのに対して、緩和に基づく細胞の能動的変形挙動は、非転移性細胞（病期１および２）ですでに観察可能である。このことは、それぞれの変形に関する、細胞の異なる力行使によって説明できる。緩和の場合は、細胞が、付加的に入力される応力に抵抗する必要がないが、応力入力下にひずみを算出する場合にはそれが当てはまる。したがって、緩和の変形過程には、応力下での変形よりも少ない力を細胞が必要とする。疾患の進行とともに、能動的変形挙動を示す細胞の数が増加するため、相対緩和の平均値はさらに負の値の方向へと移動する。
【００２９】
したがって、本発明は、緩和挙動を算出することで癌疾患を診断および／または予後判定する、患者の生物学的材料の試料に由来する細胞の、機械的負荷下でのひずみの分析、およびそれに続く機械的負荷の不在下での細胞のひずみの分析を含む方法も含む。その際、この診断および／または予後判定方法は、本発明によると、以下のように行われる：
−機械的応力を印加せずに、患者試料の細胞の寸法Ｌ０を算出する、
−続いて、細胞の線形変形が見込まれる機械的応力を時点ｔＳにおいて細胞に印加し、応力入力下での細胞の寸法ＬＳを算出する、
−続いて、機械的応力を印加せずに、時点ｔＲにおいて、緩和後の細胞の寸法ＬＲを算出する。
−時点ｔＳにおける応力入力下での細胞のひずみγ（ｔＳ）を算出し、時点ｔＲにおける細胞の緩和後の細胞のひずみγ（ｔＲ）を算出し、γ（ｔＲ）とγ（ｔＳ）の差を出すというやり方で相対緩和Ｒを算出する。
【００３０】
その際、ひずみは、前記のように定義され、細胞の相対変形を表す。その際、応力方向に沿った細胞の長さ（Ｌ）から、時間の関数として、Ｌ（ｔ）＝２［ｒ０＋Δｒ（ｔ）］が（ただし、ｒ０は未変形状態での応力方向に沿った細胞の半径であって、Δｒ（ｔ）は、時間ｔＸに依存する細胞の付加的な寸法である）、関係γ（ｔ）＝Δｒ（ｔ）／ｒ０からひずみγ（ｔ）が判明する。その際、好ましくは、相対緩和は式（１）で算出される。
【００３１】
患者試料中の細胞の相対緩和を参照データと比較する。参照データと比べて、平均的に低い、患者試料中の相対緩和は、無制御に増殖する細胞が存在するより高いリスクを示唆する。その対案として、またはそれと組み合わせて、参照データと比べて患者試料中の、０を超える相対緩和を有する細胞の数がよりわずかであると、無制御に増殖する細胞が存在するより高いリスクが示唆される。その対案として、またはそれと組み合わせて、０を超える相対緩和を有する、患者試料の細胞の割合が最大限１％あると、浸潤性細胞が存在するより高いリスクが示唆される。
【００３２】
好ましくは、分析された全細胞の相対緩和の平均値を、参照データと比較すると、患者試料中の平均値の低下は、無制御に増殖する細胞が存在するリスクの上昇を示唆する。好ましくは、患者試料の、分析された全細胞の相対緩和の、≦−０．０１、好ましくは−０．０５〜−０．０１という平均値により、無制御に増殖する細胞が存在するより高いリスクが示唆される。
【００３３】
機械的負荷後の癌細胞の緩和挙動を分析することで癌疾患を診断および／または予後判定する本発明による方法は、それだけで、癌疾患が存在するリスクに関して的確にとらえるために十分である。好ましくは、この方法は、機械的負荷下に応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合（収縮性細胞の割合）の決定と組み合わせて確定される。その際、機械的負荷下に応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合が、参照データよりも患者試料中で高く、参照データと比べて患者試料中では平均的に相対緩和がより低いと、腫瘍転移のより高いリスクが示唆される。両方の方法を組み合わせることにより、有利なことに、腫瘍転移リスクに関してより信頼できる記載をすることが可能になる。
【００３４】
したがって、有利なことに、機械的応力によって入力される機械的負荷下での腫瘍細胞を分析することのみにより、線形変形の範囲において細胞の転移確率および増殖に関して、ならびに浸潤性細胞の存在に関して的確にとらえることができる。
【００３５】
さらに、発明者は、腫瘍細胞が、細胞の非線形変形をもたらす機械的負荷下においても特徴的な挙動を示すことを確認した。正常組織に由来する細胞と比較して、非線形変形の負荷範囲では、腫瘍細胞は、機械的負荷が上昇すると、正常組織の細胞よりも高い剛性を示す。したがって、（非線形変形の）この負荷範囲では、負荷下の腫瘍細胞のひずみは、線形変形を引き起こす負荷の場合とはちょうど逆の傾向を示す。非線形変形の範囲にある機械的負荷下での細胞の応力方向へのひずみは、正常組織に由来する細胞のひずみよりもわずかであって、機械的負荷下にわずかなひずみを示す細胞の割合は、正常組織よりも高い。細胞の非線形変形をもたらす機械的負荷下での、腫瘍細胞のこのより高い剛性は、浸潤性の細胞に特徴的であると示すことができた。非線形変形が見込まれる機械的負荷下での細胞の硬化は、微小管および中間径フィラメントによって引き起こされると前提される。
【００３６】
周辺組織へと浸潤性に広まる腫瘍細胞は、転移性細胞とは異なり、たいていの場合は、細胞塊を離れる単一細胞ではない。むしろ、細胞塊全体が、周辺組織内へと広まり、その結果、周辺組織を押しのける。このことは、周辺組織の細胞による抵抗が、腫瘍の増殖によってもたらされる力よりも低い間しか、起こり得ない。腫瘍細胞は、負荷が高い場合に、非腫瘍細胞よりも高い剛性を示すので、それらの腫瘍細胞は、この負荷下ではより伸長性のある、正常組織の細胞を押しのけるか解離させることができる。アガロースを含むハイドロゲル中で腫瘍細胞が培養された観察実験（Ａｎｓｃｈａｕｕｎｇｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）により、細胞塊中の腫瘍細胞は最高１０ｋＰａの応力に耐え得ることが確認された（図５）。
【００３７】
つまり、細胞の非線形変形をもたらす機械的負荷におけるひずみから、浸潤性細胞が存在するリスクの上昇があるかどうかを導き出すことができる。その際、加えられる機械的応力は、細胞の線形変形をもたらす機械的応力よりも明らかに高い。
【００３８】
そのために、本発明による方法では、好ましくは付加的に、
ｄ）同一患者試料の少なくとも一つの細胞に、機械的負荷として、細胞の非線形変形が見込まれるように変形性機械的応力を印加する。機械的負荷の時点において細胞のひずみを決定する。
ｅ）患者試料の分析された細胞のひずみの平均値を参照データと比較する。その際、患者試料におけるひずみの平均値が参照試料におけるよりも低いと、浸潤性細胞が存在するより高いリスクが示唆される。この浸潤性細胞は、腫瘍が、周辺組織の圧力に逆らって根づくことを可能にする。
【００３９】
したがって、線形変形および非線形変形下に組織試料に由来する細胞のひずみを分析することにより、無制御な増殖、浸潤性に関する記載も、転移確率に関する記載もすることができる。その際、本発明による診断方法および／または予後判定方法によると、有利なことに、表面マーカーの分析によってではなくその機械特性の分析によって腫瘍細胞を特徴づけることが可能である。このことは、例えば、抗体、その種の他のものによる染色によって、細胞の生命力および細胞の機能状態を損ない得る細胞の変化が起こらないという利点を有する。その際、本発明による診断方法および／または予後判定方法における細胞の機械特性の分析によって、有利なことに、癌疾患の、癌病期Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶへの分類、ないしＴＮＭ分類の病期分類への分類が可能である。その際、しかも、一次腫瘍（原発腫瘍）の細胞に由来する転移の実際の形成前にすでに、転移形成のリスクが確定可能であることから、目下のところ既存の分類枠組みよりも正確に分類することすら考えられる。
【００４０】
本発明による診断方法および／または予後判定方法において分析される細胞は、患者の生物学的材料の試料に由来する。その際、好ましいのは、患者の腫瘍に由来する、侵襲性または低侵襲性に採取された組織試料である。低侵襲性採取には、パンチ生検、穿刺吸引生検または穿刺が好ましい。特に好ましいのは、患者の原発腫瘍に由来する組織試料であるが、それというのも、そのような試料に由来する細胞の分析においては、有利なことに、原発腫瘍の細胞から、転移形成のリスクが存在するかどうかを確認することが可能であるからである。そのためには、本発明による診断方法および／または予後判定方法において、好ましくは、患者の外科的に除去された腫瘍に由来する薄層からの細胞を分析する。しかしながら、本発明による診断方法および／または予後判定方法においては、患者から非侵襲性に、例えば塗抹標本により採取された細胞も好ましい。塗抹標本に由来する細胞は、これらの細胞がすでにばらばらにされた形状で存在し、それゆえ手間のかかる付加的な手順によってばらばらにされる必要がないという利点を有する。本発明による診断方法および／または予後判定方法において分析される、さらに好ましい細胞は、患者の体液試料、特に血液試料、腰椎穿刺からの試料、または胸腔ドレナージ試料に由来する。そのうち特に好ましいのは、血液試料に由来する細胞である。
【００４１】
負荷下での細胞のひずみの分析により、癌疾患の診断および／または予後判定を下すことができる。分析された機械特性は、複数の癌疾患に該当する。その点では、腫瘍細胞のこれらの機械特性の変化は、ある特定の癌疾患に特徴的ではなく、複数の癌疾患、好ましくは固形腫瘍が出現する癌疾患の診断および／または予後判定に転用することができる。好ましくは、本発明による方法は、乳癌、口腔および咽頭腔の癌、肺癌、子宮頸部癌、皮膚癌、胃癌、腸癌、または前立腺癌を診断および／または予後判定するために使用される。白血病細胞も、正常の白血球と比べて、機械的負荷（線形変形）下に応力方向と相反するひずみを示す細胞をより高い割合で示す。
【００４２】
好ましくは、本発明による、癌疾患の診断方法および／または予後判定方法は、患者の腫瘍組織試料、特に原発腫瘍試料に由来する細胞を分析し、続いて転移確率、および場合によっては浸潤性、および／または無制御な増殖を的確にとらえることにより使用される。
【００４３】
診断の枠内での分類も、有利なことには本発明による方法を用いて、腫瘍組織試料に基づいて行われる。従来技術から公知の方法と比較して特に有利なことに、原発腫瘍試料に基づいて、転移形成に関して記載することもできる。本発明による方法を利用した、分類が続いて行われる癌疾患の診断は、好ましい使用である。
【００４４】
さらに、診断のために、好ましくは、個体から非侵襲性または低侵襲性に獲得された試料に由来する細胞も分析される。これは、例えば、塗抹標本、パンチ生検、または穿刺吸引生検であっても、または疑わしい組織の組織試料、例えば外科的に除去された腫瘍に由来する薄層であってもよい。分析は、好ましくは生細胞において行われる。試料中に、無制御に増殖する細胞が存在すれば、癌疾患の第１徴候が存在しているということになる。このことは、線形変形が見込まれる機械的負荷下において、個体の細胞の、変形性応力の方向へのひずみの平均値が、参照データにおけるよりも高く、および場合によっては、参照データと比べて、患者試料におけるひずみの分布に差が存在するのであれば当てはまる。その対案として、またはそれと組み合わせて、負荷後の細胞の緩和挙動が決定される場合には、参照データと比べて患者試料中では細胞の相対緩和の平均値がより低いのであれば、無制御に増殖する細胞を示唆するもう一つの徴候が存在することになる。その上、機械的負荷下に応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合が（参照データと比べて）より高いのであれば、癌疾患における転移の徴候が存在することになる。
【００４５】
細胞の非線形変形が見込まれる機械的負荷がかけられた試料において、個体の試料中の（応力方向への）ひずみの平均値が、参照試料中よりも低い場合には、癌疾患における浸潤性細胞が存在する徴候が与えられている。この浸潤性細胞は、腫瘍が、周辺組織の圧力に逆らって根づくことを可能にする。
【００４６】
これらのデータを組み合わせることにより、個体の第１試料から、癌疾患の徴候が存在するかどうか、そして癌疾患が存在するのであれば、この疾患がすでにどの程度進行しているかを記載することができる。そのためには、腫瘍組織試料に由来する細胞を分析することは必ずしも必要ではなく、そのためには、例えば患者の血液試料、穿刺試料、または塗抹標本のような、非侵襲性または低侵襲性に採取された試料に由来する細胞を分析することも可能である。
【００４７】
本発明による診断方法および／または予後判定方法は、常に、分析された腫瘍細胞ないし潜在的な腫瘍細胞のひずみの、参照データとの比較を要求する。参照データとは、適した参照試料の細胞の負荷下のひずみの分析データと理解され、このデータは、患者試料の細胞と同様の方法で分析されたものである。その際、参照試料としては、診断および／または予後判定の場合、好ましくは、一人または複数名の健康な個体の同一組織の細胞が考慮される。その対案として、同一患者の、腫瘍が浸潤していない健常組織の細胞もまた同様に好ましい。そのためには、特に、患者から腫瘍を切除した後に、腫瘍細胞と非腫瘍細胞とを分離し、別々に分析する。
【００４８】
本発明による診断方法および／または予後判定方法の原理によると、血液中の腫瘍細胞の分析により、原発腫瘍の場所を帰納推理することも同様に可能である。腫瘍細胞は、その腫瘍細胞がそこから発生した発生母組織と比べて、生体力学特性の点で相違を示すものの、腫瘍細胞は、その伸長性の規模の点で、発生母組織に非常に似ている。発生母組織の細胞もその伸長性の点で異なることから（例えば、肺組織の細胞は乳房組織の細胞よりも伸長性がある）、機械的負荷下に算出される、ひずみの規模（絶対値）により、腫瘍の発生源を帰納推理することができる。そのためには、患者の生物学的材料の試料に由来する腫瘍細胞を、機械的負荷下に分析し、応力方向へのひずみの平均値を算出する。この平均値を、それぞれにおいて異なるヒト組織の細胞のひずみが決定された参照データの（応力方向への）ひずみの平均値と比較する。腫瘍細胞が、ある特定の発生母組織に由来する可能性は、両方のひずみの平均値の間で絶対的な相違が最もわずかである、参照データのデータ一式（組織）において最も高い。
【００４９】
そのため、本発明は、患者の腫瘍細胞の発生母組織を診断するための、機械的負荷下での腫瘍細胞のひずみの分析を含む方法も含み、ただし、腫瘍細胞は、患者の生物学的材料の試料から入手可能である。腫瘍細胞の発生母組織を診断するための本発明による方法においては、
ａ）それぞれ一つの腫瘍細胞に、機械的負荷として、腫瘍細胞の線形変形または非線形変形が見込まれる変形性機械的応力を印加する。腫瘍細胞のひずみを、機械的負荷の時点において決定する。
ｂ）腫瘍細胞の応力方向へのひずみの平均値を算出し、異なる参照データ一式と比較し、ただし、それぞれ一つの参照データ一式は、ある特定のヒト組織の細胞の、応力方向へのひずみの平均値を含む。その際、腫瘍の発生母組織としては、患者試料と参照データ一式との間での、ひずみの平均値の差が最もわずかである参照データ一式の特定の組織が割り当てられる。
【００５０】
本発明による、発生母組織を診断するための方法において分析される細胞を、患者の生物学的材料の試料から獲得し、公知の方法によって単離しばらばらにする。その際、試料は、好ましくは、非侵襲性または低侵襲性に採取された患者試料であって、原発腫瘍の組織試料ではない。好ましくは、腫瘍細胞は、患者の体液試料から、特に好ましくは、血液試料、腰椎穿刺に由来する試料、または胸腔ドレナージ試料から獲得される。特に好ましくは、本発明による方法によって、患者の血液試料に由来する循環腫瘍細胞の発生母組織を決定する。
【００５１】
循環腫瘍細胞のひずみがそれと比較される参照データ一式は、好ましくは、本発明による診断方法および／または予後判定方法の参照データと同一である。患者試料に由来する腫瘍細胞の発生源がまず決定される必要があるため、様々な参照データ一式を、本方法において算出された、患者試料に由来する腫瘍細胞のひずみと比較する。その際、参照データ一式は、ある定義されたヒト組織、特に好ましくはヒト正常組織のひずみ分析の結果を含む。腫瘍細胞のひずみを、異なる組織の複数の参照データ一式と比較することにより、腫瘍の発生源を予後判定することが可能である。患者試料の腫瘍細胞のひずみを、様々なヒト正常組織からの参照データ一式と比較することの対案としては、参照データとして、それぞれが定義されたヒト腫瘍組織のひずみ分析の結果を含むデータ一式が使用される。その際、理想的には、参照データ一式中に、少なくとも二人の参照患者からのデータが含まれており、ひずみの値は、様々な参照患者試料の平均値である。
【００５２】
腫瘍転移リスクおよび浸潤性細胞の存在を示唆する、腫瘍細胞の機械特性は、これまでは知られていなかった。したがって、細胞の生体力学特性を変化させる物質は、腫瘍学用の潜在的有効成分である。細胞の線形変形が見込まれる機械的負荷において細胞の変形性の低下をもたらす物質、および細胞の非線形変形が見込まれる機械的負荷において細胞の変形性の上昇をもたらす物質は、腫瘍学用の潜在的有効成分である。さらに、細胞の線形変形が見込まれる負荷下に、応力方向と相反するひずみを示す腫瘍細胞の割合を低下させる物質もまた、腫瘍学用の潜在的有効成分であり得る。腫瘍学用の有効成分として特に高い潜在性を有するのは、これらの、細胞の生体力学特性の変化の複数をもたらす物質である。原則的には、腫瘍細胞の増殖または移動を妨げるように腫瘍細胞の機械特性に影響を及ぼす物質は、腫瘍学用の潜在的有効成分として評価され得ると推論することができる。
【００５３】
それゆえ、本発明は、腫瘍学用の潜在的有効成分としての物質をスクリーニングするための方法（スクリーニング法）も含み、この方法では、機械的負荷下での複数の腫瘍細胞のひずみが分析されるというやり方で、腫瘍細胞の生体力学特性に及ぼす、物質の影響が検査される。その際、
ｉ）少なくとも一つの腫瘍細胞を、
−一物質と接触させ、
−続いて、腫瘍細胞に、機械的負荷として、腫瘍細胞が線形または非線形に変形するように変形性機械的応力を印加する。腫瘍細胞のひずみを、負荷の時点において決定する。
ｉｉ）物質と接触させた腫瘍細胞のひずみを、未処理の同種の腫瘍細胞のひずみの分析の参照データと比較する。細胞の線形変形が見込まれる機械的負荷において、機械的負荷下に応力方向と相反するひずみを示す腫瘍細胞の割合が、未処理の腫瘍細胞と比べて、物質を接触させた腫瘍細胞においては低い場合に、この物質は、腫瘍学用の潜在的有効成分として評価される。
【００５４】
好ましくは、この物質は、
−細胞の線形変形が見込まれる機械的負荷下に、この物質と接触させた腫瘍細胞の、応力方向へのひずみの平均値が、未処理の腫瘍細胞と比べて低い、および／または
−細胞の非線形変形が見込まれる機械的負荷下に、この物質と接触させた腫瘍細胞のひずみの平均値が、未処理の腫瘍細胞と比べて高い場合に、
腫瘍学用の潜在的有効成分として評価される。
【００５５】
本発明によるスクリーニング法で分析される物質は、天然または合成起源の分子を含む。本発明によるスクリーニング法で分析される好ましい物質は、天然分子、特にペプチド、タンパク質、核酸、そのうち特にｓｉＲＮＡ、合成有機分子、特にモノマー、ポリマー、合成無機分子、および低分子（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）から選択されている。
【００５６】
本発明によるスクリーニング法では、患者の組織試料に由来するか、または細胞株に由来するかのいずれか一方である腫瘍細胞を検査する。好ましくは、本発明によるスクリーニング法では、そのより容易な培養性および入手性により、細胞系に由来する腫瘍細胞を使用する。
【００５７】
その際、参照データとしては、物質と接触させないが、その他の点では同一に処理された（ここでは「未処理」細胞ともいう）同種細胞のひずみの分析が利用される。したがって、細胞系を使用する場合には、それぞれの細胞系の未処理腫瘍細胞のひずみの分析が参照として利用される。このデータを、物質と接触させた同一細胞系の細胞のひずみと比較する。組織試料、好ましくは腫瘍組織試料を使用する場合には、同一組織試料の未処理細胞を参照として分析する。
【００５８】
特に好ましくは、データをさらに正常参照データとも比較する。その際、正常参照のデータを集めるには、同種の非腫瘍細胞を利用し、その同種非腫瘍細胞に関して、腫瘍細胞のためと同じく、同一原理に基づいてひずみを決定する。本発明によるスクリーニング法を、腫瘍細胞系で行う場合には、正常参照として、腫瘍細胞を含有しない細胞系を使用する。本発明による方法が、組織試料に由来する腫瘍細胞を用いて行われる場合には、正常参照として、好ましくは、同種組織の、ただし腫瘍細胞へと変性していない細胞を使用するか、または対案として、健常な個体の同一組織に由来する細胞を使用する（例えば、スクリーニング法が、乳癌細胞において行われる場合には、正常参照として、同一患者の乳腺組織の非腫瘍細胞か、健常な個体の乳房組織に由来する細胞のいずれか一方を使用する）。腫瘍細胞の機械特性が、物質との接触により、正常参照の特性の方向に変化する場合、それもまた、この物質が腫瘍学用の潜在的有効成分である徴候である。
【００５９】
本発明によるスクリーニング法は、本発明による癌疾患の診断方法および／または予後判定方法と同様に、線形ないし非線形の変形における細胞のひずみが腫瘍細胞の攻撃性の判断基準として考慮できるという効果に基づいている。両方の方法ともにおいて、機械的負荷下での細胞のひずみが算出され、ただし、この負荷は、変形性機械的応力により細胞に加えられ、それによって細胞が変形する。
【００６０】
好ましい本発明による一スクリーニング法では、腫瘍細胞に、細胞の線形変形が見込まれるように機械的負荷を加える。さらなる好ましい本発明による一スクリーニング法では、細胞の非線形変形が見込まれるように機械的負荷を加える。さらに好ましくは、腫瘍細胞の、線形変形が見込まれる機械的負荷下でのひずみも、非線形変形が見込まれる機械的負荷下でのひずみも算出する。
【００６１】
本発明のスクリーニング法の特別な一形態では、同一腫瘍細胞の、機械的負荷下でのひずみを決定する。その際、まず、未処理の腫瘍細胞のひずみを負荷下に決定する。そのためには、ひずみの算出後も腫瘍細胞が生きている方法を使用しなくてはならない。そのためには、好ましくは、光学的ストレッチャーが適している。続いて、腫瘍細胞を物質と接触させ、続いて、物質と接触させた腫瘍細胞のひずみを算出する。この形態では、同一細胞が物質との接触前と接触後に分析されるため、腫瘍細胞の機械特性に及ぼす物質の影響が特に良好に算出できる。
【００６２】
本発明によるスクリーニング法の原理に基づくと、さらに、個々の患者の癌療法のために、適した有効成分を選択することが可能である（個人化された療法）。そのためには、患者の生物学的材料の試料に由来する腫瘍細胞を、様々な有効成分と接触させ、検査された全有効成分のうち、患者細胞の生体力学特性に最大の影響を及ぼし、この患者細胞を、好ましくは、疾患の進行を妨害するように改変する有効成分を治療用に選択する。このことは、分裂能もしくは移動能の阻止により、細胞の殺滅により、または細胞の生体力学特性を、非腫瘍細胞と類似するように再現することによって起こり得る。そのためには、好ましくは、（線形変形の範囲の負荷での）細胞のひずみを、細胞分裂がもはや不可能であるように低下させる有効成分が適している。同様に、そのためには、応力方向への（同種の非腫瘍細胞と比べて）より高い平均ひずみが腫瘍細胞を選択的に殺滅するか、または（線形変形範囲での負荷において）応力方向と相反するひずみを示す腫瘍細胞のみを選択的に殺滅するか、または応力と相反する有向のひずみを阻止することで転移を阻害する有効成分が適している。
【００６３】
そのためには、本発明は、癌疾患を患う患者の治療最適化の方法も含み、この方法では、患者の腫瘍細胞の生体力学特性に及ぼす、様々な有効成分の影響を検査する。その際、患者の腫瘍細胞の多数を機械的負荷下に分析し、ただし、
ｉ）患者の腫瘍細胞を含む少なくとも二つの試料が提供され、それぞれを、
−一つの有効成分と接触させ、
−続いて、試料のそれぞれ一つの腫瘍細胞に、機械的負荷として、腫瘍細胞が線形または非線形に変形するように機械的応力を加え、腫瘍細胞のひずみを負荷の時点において決定する。
ｉｉ）それぞれの有効成分と接触させた腫瘍細胞のひずみを、患者の未処理腫瘍細胞の参照データと比較する。
【００６４】
有効成分のうち、その有効成分との接触後には、腫瘍細胞を含む試料で、未処理腫瘍細胞と比べて、
ａ）腫瘍細胞の線形変形が見込まれる機械的負荷下において、応力方向と相反するひずみを示す腫瘍細胞の割合が最も低い、および／または
ｂ）腫瘍細胞の線形変形が見込まれる機械的負荷下において、応力方向への腫瘍細胞のひずみの平均値が最も低い、および／または
ｃ）細胞の非線形変形が見込まれる機械的負荷下において、腫瘍細胞のひずみの平均値が最も高い
有効成分を療法用に選択する。
【００６５】
好ましくは、このような、本発明による方法において、癌患者を治療的に処置するために適した有効成分を選択するために、患者のそれぞれの癌疾患の治療に承認されている様々な有効成分を検査する。その際、適した有効成分としては、判断基準ａ）〜ｃ）の少なくとも一つ、好ましくは判断基準ａ）〜ｃ）の少なくとも二つ、理想的には三つの全判断基準を満たす有効成分が選択される。
【００６６】
治療最適化のための本発明による方法において使用される、患者の腫瘍細胞は、本発明による診断および／または予後判定方法で使用される患者細胞を含む試料と同様な種類とやり方で獲得することができる。この腫瘍細胞は、好ましくは、侵襲性または低侵襲性に採取された、患者の腫瘍組織試料に由来する。好ましくは、同一試料の細胞を、まず、本発明による診断方法および／または予後判定方法により分析し、続いて、本発明による治療最適化の方法において使用する。このやり方で、まず疾患を分類し、同一試料の患者細胞をもとに、それぞれの患者を対象としてねらいを定めた適切な有効成分スクリーニングを行うことができる。
【００６７】
検査された有効成分が、患者の腫瘍細胞に対して効果を有するかどうかを比較するための参照細胞としては、好ましくは、同一患者試料に由来する腫瘍細胞を、しかしいずれにせよ同一患者の腫瘍細胞を使用する。
【００６８】
本発明による方法の一つにおいて細胞を分析する前に、これらの細胞は、好ましくはばらばらにして提供されるため、それぞれ一つの細胞に機械的負荷を加え、負荷下のひずみを決定する。つまり、単一細胞の機械特性を分析する。その際、複数の細胞、好ましくは、少なくとも１０個、特に少なくとも１００個の細胞を、本発明による方法の一つで分析し、その分析から、応力方向へのひずみの平均値および場合によってはひずみの分布、ならびに応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合、ならびに場合によっては応力方向へのひずみを示す細胞の割合を算出する。
【００６９】
好ましくは、本発明による方法の一つにおいて、細胞に一時点では細胞の線形変形が見込まれる機械的負荷を加え、別の一時点では細胞の非線形変形が見込まれる機械的負荷を加えるというやり方で、同一細胞の、線形変形および非線形変形でのひずみを決定する。本発明の一形態で実施される、光学的ストレッチャーでの分析においては、その際、順々に上昇的または下降的に機械的負荷を印加し、印加された各応力において、検査される細胞のひずみを決定する。
【００７０】
この場で、細胞の機械特性の決定との関連で本明細書において使用された、いくつかの用語をより詳細に定義する。
【００７１】
ひずみ（Ｄｅｈｎｕｎｇ）とは、力学においては、相対的長さ変化、つまりある物体、この場合は検査される細胞の負荷下での伸長、さらには短縮に関するデータである。ひずみは、負荷下での、本来の長さに対する（変形性機械的応力の方向に沿った）長さ変化の割合を示し、つまりひずみは、長さ変化と細胞の本来の長さとからの商である。したがって、ひずみは、無次元の値である。機械的負荷下に細胞の寸法が大きくなると、ひずみは正であり（「正のひずみ」）、機械的負荷下に細胞の寸法が小さくなると、ひずみは負の符号を有する（「負のひずみ」）。細胞が応力方向に増大すると、ひずみは応力方向に正の符号を有する（応力方向への正のひずみ、例えば引張応力下での細胞の伸長）。細胞が応力方向に縮小すると（例えば、引張応力下での細胞の収縮）、ひずみは応力方向に負の符号を有し、それゆえひずみは応力方向に相反している。このことは、応力方向への負のひずみとも応力方向と相反する正のひずみとも呼ばれ得る。
【００７２】
細胞のひずみは、本発明による方法においては、機械的負荷の時点において負荷の方向で算出される。その際、好ましくは、機械的負荷下に負荷の方向で細胞直径を決定し、負荷前の細胞直径と比較し、それによりひずみを算出する。細胞直径のほかに、ひずみの算出には、サイズ変化の基準として考慮することができる、細胞の別のあらゆるパラメータも適しており、特に細胞の断面積、離心率、長主軸と短主軸の比率、テイラーの変形パラメータ、または細胞形状の二次モーメントおよび高次モーメントである。ひずみは、各単一細胞に関して、ある特定の機械的負荷の時点において算出される。その際、連続的に複数の細胞を分析する。その際、「負荷時点での」ひずみの決定とは、本発明の趣旨では、細胞は負荷終了直後には緩和しないので、機械的負荷終了後にさらになおひずみを算出可能であると理解されるものである。しかしながら、特に有利には、実際の負荷時点でひずみを算出することである。
【００７３】
複数の単一細胞の分析により、検査される試料に関して不可欠なパラメータ（それぞれのひずみの割合、平均値、分布）が算出される。
【００７４】
機械的負荷としては、本発明による方法のすべてにおいて、細胞の変形をもたらす機械的応力を加える（変形性機械的応力）。この用語は、ここでは、力学におけるその定義と類似に使用され、想定される断面積内の単位面積あたり、一物体に、この場合は細胞に作用する力を意味する。細胞に加えられる機械的応力は、細胞の変形をもたらし、好ましくは、そのために圧縮応力（Ｋｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎｓｓｐａｎｎｕｎｇ）、特に引張応力もしくは押圧応力（Ｄｒｕｃｋｓｐａｎｎｕｎｇ）、および／またはせん断応力（Ｓｃｈｅｒｓｐａｎｎｕｎｇ）、特にせん断応力（Ｓｃｈｕｂｓｐａｎｎｕｎｇ）をかける。通常は、細胞の変形は、その変形が応力方向に作用するように起こる。つまり、引張応力がかけられると、細胞は引張応力の方向に伸長し（正のひずみ）、それに対して、押圧応力がかけられると、細胞は押圧応力の方向に収縮する（負のひずみ）。
【００７５】
好ましくは、本発明による方法では、引張応力をかける。細胞が、応力に沿って大きくなると（この場合は細胞の正のひずみ）、ひずみは応力方向に作用する。細胞が小さくなると（細胞の収縮、この場合は細胞の負のひずみ）、ひずみは応力方向と相反して作用する。
【００７６】
腫瘍組織のいくつかの細胞は、細胞に印加された機械的応力の方向に伸長するのではなく、応力方向と相反したひずみを示す。このような挙動においては、引張応力が印加されると、細胞は収縮し、または細胞に押圧応力がかけられると細胞は伸長する。この特性は、組織移行性であって転移を形成することができる腫瘍細胞に特徴的である。
【００７７】
細胞の変形の大きさは、印加された負荷に依存し、つまり細胞のひずみは、細胞に印加された機械的応力に依存する。その際、変形に不可欠な応力は、異なる細胞型間で、および実行される、細胞に応力を入力する方法に応じて、数Ｐａから１０００００Ｐａまで複数桁にわたり変動し得る。
【００７８】
細胞は、複合的な生物学的かつ機械的物体である。機械的負荷下での細胞の変形は、純弾性ではなく、少なくとも粘弾性である。つまり、細胞は、印加された機械的負荷の終了後には不完全にしか緩和しない、ないし完全な緩和（本来の状態への復帰）のために少なくとも非常に長い時間を必要とする。
【００７９】
線形変形範囲では、ひずみは応力に対して比例する。細胞の線形変形が見込まれる範囲は、異なる起源の細胞間で異なる。ある特定の組織型の細胞に関し、線形範囲での細胞の変形をもたらすために適している機械的応力は、その特定の組織型の細胞のひずみを、一連の様々な機械的応力において算出して、応力ひずみ線図での線形範囲を読み取る簡単なやり方によって決定することができる。
【００８０】
細胞が、本発明による方法の一つにおいて光学的ストレッチャーの原理に基づいて分析される、本発明の形態では、好ましくは最大限５Ｐａの機械的応力のもと、本発明による方法で分析される細胞において線形変形を見込むことができる。好ましくは、細胞が光学的ストレッチャーの原理に基づいて分析される、本発明による一方法において、負荷として、１Ｐａ〜５Ｐａ、好ましくは１Ｐａ〜４Ｐａ、特に２Ｐａ〜３Ｐａの機械的応力を印加する。
【００８１】
機械的負荷がより高くなると、細胞のひずみはもはや応力に対して比例しない。この範囲では、印加された応力に依存して、細胞の非線形変形が確認される。この負荷範囲においては、細胞を、浸潤性細胞の存在に関して記載するために、本発明による診断方法および／または予後判定方法で分析する、ないし、その挙動に影響を及ぼす、適した物質または有効成分を確定するために、本発明によるスクリーニング法および療法最適化の方法で分析する。この場合も、細胞の非線形変形を引き起こすためにどのような機械的応力が印加されるべきであるかは細胞型に依存する。この範囲も同様に、前記の応力ひずみ線図から読み取ることができる。
【００８２】
好ましくは、細胞が原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）の原理に基づいて分析される、本発明による方法では、１０Ｐａ〜５０ｋＰａの機械的応力を細胞に印加する。その際、好ましくは、１００Ｐａ超〜５０ｋＰａの、特に好ましくは５ｋＰａと５０ｋＰａとの間の範囲の機械的応力を印加する。
【００８３】
本発明による方法のすべてでは、細胞に機械的応力を印加するため、その結果、この細胞は変形する。その際、この機械的応力は、本発明による方法の一形態においては、電磁放射線による力によって細胞に印加され、この電磁放射線は、好ましくは二つの逆方向のレーザ光を一つの単一細胞に衝突させることによって生み出される。これは、好ましくは、光学的ストレッチャーの原理に基づいて行われる。
【００８４】
ひずみの算出は、好ましくは、細胞のサイズ変化が検出可能である光学的方法によって行われる。好ましくは、ひずみの算出は、顕微鏡を用いて行われ、ただし、負荷前および負荷中（つまり機械的応力の印加前と印加中）の細胞直径を、変形が実行される方向に沿って測定し、それによりひずみを算出する。本発明による方法の特に好ましい一つでは、細胞の機械特性の分析が光学的ストレッチャー（ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ）によって行われる。光学的ストレッチャーでの分析、ないし電磁放射線、好ましくは（細胞によって著しくは吸収されない）レーザ光による機械的応力の入力は特に有利であるが、それというのも細胞の損傷が引き起こされず、この細胞をひずみ測定後に引き続き培養できるからである。したがって、細胞は、分析後に再獲得可能であって、ほとんど変化なく、さらなる分析または培養に提供され得る。このことは、細胞の表面特性が例えば、抗体による染色によって確定される、これまでの方法によると、その形では不可能であるが、それというのも、結合された抗体が細胞の反応にどの程度まで影響を及ぼし得るかが定かでないからである。
【００８５】
さらなる好ましい本発明による方法では、原子間力顕微鏡、誘電泳動力を利用して、特に誘電泳動ケージ、マイクロ流体流（ｍｉｋｒｏｆｌｕｉｄｉｓｃｈｅ  Ｆｌｕｅｓｓｅ）、光ピンセット、レーザダイオードバー（Ｌａｓｅｒｄｉｏｄｅｎｂａｒｓ）、または超音波顕微鏡を利用して方法を確定し、ただし、この群からは、原子間力顕微鏡が特に好ましい。これらの方法では、それぞれの装置によって細胞に機械的応力を印加し、好ましくは光学的方法によってひずみを算出する。
【００８６】
本発明による方法においてひずみを分析するには、原則的に、単一細胞に機械的応力を印加するため、およびその細胞の負荷下でのひずみを算出するために適したすべての方法が考慮の対象になる。
【００８７】
対応する装置が、従来技術から公知である。腫瘍細胞の機械特性の分析によりその攻撃性を的確にとらえることができるという特性は、これまでは知られていなかったので、本発明は、好ましくはばらばらにされた細胞に機械的負荷として機械的応力を印加するため、および負荷時点での細胞のひずみを測定するために適した装置の、
ａ）患者の生物学的材料の試料から入手可能な細胞の分析により癌疾患を診断および／または予後判定するための（ただし、腫瘍転移のリスクは、試料中の、応力方向と相反するひずみを示す細胞の割合を手がかりに、および場合によっては、浸潤性細胞が存在するリスクは、細胞の非線形変形における、試料中の細胞の応力方向へのひずみの平均値を手がかりに算出される）、および／または
ｂ）患者の生物学的材料の試料に由来する腫瘍細胞のひずみの分析により、癌疾患を患う患者の腫瘍の発生母組織を決定するための、および／または
ｃ）腫瘍学用の潜在的有効成分としての物質をスクリーニングするための（ただし、腫瘍細胞の生体力学特性に及ぼす、一物質の影響が検査される）、および／または
ｄ）癌疾患を患う患者の治療最適化のための（ただし、患者の腫瘍細胞の生体力学特性に及ぼす様々な有効成分の影響が検査される）、
使用も含む。
【００８８】
好ましくは、それらの装置を、本発明による方法の一つにおいて使用する。そのために特に適した好ましい装置は、光学的ストレッチャーである。さらに好ましい装置は、原子間力顕微鏡である。その上、以下の装置、誘電泳動場ケージ、マイクロ流体流中で細胞変形を分析するための装置、ダイオードレーザバーを含む光ピンセット、および／または超音波顕微鏡が、本発明による使用に好ましい。
【００８９】
腫瘍細胞の機械特性の分析により、適した分析方法を介して、この腫瘍細胞を必然的にその生存能力の点で損なうことなしに、腫瘍細胞の攻撃性を確定することが有利に可能である。したがって、特に、腫瘍細胞であるということを確認するために、抗体または類似の分子を利用して細胞を標識することが必要とされない。単に負荷下での細胞のひずみの分析から、これを的確にとらえることができる。
【００９０】
このことは、一方では、機械特性の分析後に細胞がまったく汚染されずにさらなる分析または培養のために用意され得るという利点を含む。さらに、細胞の機械特性の分析は、分子細胞マーカー（表面マーカー、特に腫瘍マーカー）またはマーカーセットの使用に対して、著しいコスト利点を有する。細胞マーカーは、それぞれの癌形状ごとに非常に異なるため、すべての異なる疾患ごとに、ある固有のマーカーセットが使用され、このマーカーセットが、分子マーカーに付属するある特定の「サイン」を指定する。それにもかかわらず、腫瘍細胞の突然変異から生じる多様性ゆえに、このサインにおける逸脱も起こり得るため、選択された分子マーカーセットにより、すべての腫瘍が検出可能であるとは保障されていない。しかしながら、本発明による、診断または予後判定するための方法において使用される、細胞の機械特性は、様々な癌形状に関して再現性がある。
【００９１】
本発明による方法において分析される、腫瘍細胞のひずみの変化は、細胞の細胞骨格中での変化の特定に基づいている。このような変化は、公知の装置によって高感度で検出することができる。
【００９２】
癌疾患を診断および予後判定するための本発明による方法の特別な利点は、腫瘍転移の出現リスクを、比較的早い時点ですでに、例えば原発腫瘍の細胞から算出できることである。この場合、腫瘍転移の出現リスクは、転移形成前、ないし遠隔組織における新生腫瘍の出現前にすでに算出することができる。それに応じて、患者の治療を、この情報によって適合させることが可能である。つまり、転移がすでに画像処理法において検出可能であることなしに、ないし検出されなかった場合も、転移のリスクを知った上で、すでに相応して療法を調整することができる。
【００９３】
本発明による診断方法および／または予後判定方法、ならびに腫瘍の発生源の特定方法の決定的な利点は、患者の体液試料、特に血液試料からすでに、癌疾患が存在するかどうか、およびどの組織に原発腫瘍が存在するかについて記載することが可能であることである。このやり方で、比較的簡単かつ低コストの検査により、例えば血液試料の分析により、癌疾患に関して、目下の血液検査を利用して可能であるよりも明らかに多くの情報を得ることができる。腫瘍の発生源を検出するためには、目下の従来技術によると、画像処理法が不可欠である。
【００９４】
本発明による患者の治療最適化の方法を用いると、有利なことに、個別の各患者を対象に、適した有効成分を個別に選択することが可能である。いくつかの腫瘍疾患に関しては、例えば、最高９種の異なる化学療法が可能である。癌疾患の早期かつ個々人に応じた特徴づけおよび分類、ならびに直接に患者固有の細胞を用いた様々な有効成分のスクリーニングにより、療法をより的確に選択し、患者に個別に合わせることが可能であって、それにより、治癒見込みを高めてコストを下げることができる。
【００９５】
さらに、癌疾患の進行を阻止するように腫瘍細胞の生体力学特性に影響を及ぼす新規有効成分群を見つけ出すことが可能である。そのためには、有利なことに、本発明によるスクリーニング法が適している。
【００９６】
以下の図および例示的実施形態を手がかりに、それらに制限することなく、本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】原発乳房腫瘍（黒色棒）および乳房縮小からの健常細胞（白色棒）に由来する細胞のひずみを示す。光学的ストレッチャーを用いて２Ｐａの機械的応力のもと分析を行った。左側の黒色棒は、分類Ｔ４の腫瘍に由来する。右側の黒色棒は、分類Ｔ１ｂの腫瘍に由来する。両方向矢印は、負のひずみをもつ細胞と正のひずみをもつ細胞との間の境界を示す。すべての細胞を、ＨｕＭＥＣ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で測定した。
【図２】子宮頸部腫瘍の腫瘍組織に由来する、選別された収縮性細胞の液滴培養中での蛍光顕微鏡分析を示す。収縮性細胞は、正常組織に由来する細胞との共培養後に、固有の細胞塊を形成しない。子宮頸部腫瘍細胞（分類Ｔ１ｂ）と子宮頸部細胞とからなる共培養のａ）培養開始時、およびｂ）培養２４時間後（比較例）、ｃ）選別された収縮性子宮頸部腫瘍細胞（分類Ｔ３ｂおよびＴ４）と子宮頸部細胞とからなる共培養の培養２４時間後。染色は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）シリーズの赤色および緑色の蛍光色素を用いて行った。
【図３】光学的ストレッチャー中において機械的応力５Ｐａ（細胞の線形変形）のもと測定された、細胞系ＭＣＦ１０（非癌性乳腺上皮細胞）、ＭＣＦ７（非転移性腫瘍細胞）および改変ＭＣＦ７（転移性腫瘍細胞）の細胞のひずみを示す。腫瘍細胞は、正常組織に由来する細胞よりも大きいひずみを示す。ひずみのさらなる上昇が、転移性細胞において確認される。
【図４】原子間力顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＦＭ）を利用して算出された腫瘍細胞の収縮を示す。ＭＣＦ１０Ａ（非癌性乳腺上皮細胞、比較例）、ＭＣＦ７（非転移性腫瘍細胞）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（転移性腫瘍細胞）。線形変形においては、腫瘍細胞ＭＣＦ７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、より高い収縮を示す。転移性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、最も高い収縮性を示す。
【図５】１％アガロースを含む細胞培養培地からなる、剛性が１〜２ｋＰａのハイドロゲル中で培養した、スフェロイドとしての腫瘍細胞（ＭＣＦ７）の、ａ）２日後、ｂ）４日後、ｃ）１４日後およびｄ）１８日後の増殖を示す。スフェロイドは、ハイドロゲルを押しのけ、６〜１０ｋＰａの剛性まで成長する。
【図６】原発乳房腫瘍に由来する腫瘍細胞（ＢＴ１〜４）および正常組織に由来する細胞（Ｎ１、Ｎ２）の相対緩和を示す。分析された腫瘍細胞は、以下の癌病期に由来する：ＢＴ１．．．病期Ｉ、ＢＴ２．．．病期ＩＩ、ＢＴ３およびＢＴ４．．．病期ＩＩＩ。
【実施例】
【００９８】
例１：低い負荷下での腫瘍細胞のひずみの分析は、応力方向と相反するひずみを示す細胞の出現を示す
光学的ストレッチャー中で、分類Ｔ４（遠隔転移）の患者の組織試料に由来する悪性ヒト乳房腫瘍からの細胞（図１ａ、黒色棒、それぞれ左側）のひずみを分析した。細胞を通例の方法で処理し、ばらばらにした。続いて、細胞を光学的ストレッチャー中で応力２Ｐａのもと分析した。この機械的応力のもとでは、光学的ストレッチャー中で細胞の線形変形が見込まれる。参照試料として、乳房縮小に由来するヒト乳房組織試料からの細胞も同じく、ばらばらにし、応力２Ｐａのもと光学的ストレッチャー中で分析した（図１ａ、白色棒、健常個体の細胞を用いた比較例）。さらに、分類Ｔ１ｂの患者の組織試料に由来する悪性ヒト乳房腫瘍からの細胞を分析した。この病期ではまだ転移は存在しない（図１ａ、黒色棒、それぞれ右側）。
【００９９】
図１は、分析された試料中のひずみの分布を示す。分類Ｔ４の乳癌患者に由来する、転移が存在するヒト組織試料においてのみ、応力方向と相反するひずみを示した細胞（「収縮性細胞」）の割合が認められた。負荷下に、これらの細胞の直径は、入力された機械的引張応力の方向に縮小した（負のひずみ）。分類Ｔ４の組織試料の１００個の細胞中およそ１個が、この挙動を示す。
【０１００】
正常組織中では、収縮性細胞の割合は、検出限界を下回った。このことは、同様に、分類Ｔ１ｂの乳癌患者に由来するヒト組織試料からの細胞にも当てはまる。
【０１０１】
機械的負荷下に応力の方向と相反するひずみを示すという、腫瘍細胞の意外な機械的挙動は、転移を伴う患者に由来する組織試料でのみ認められる。非転移性腫瘍細胞とは反対に、この（転移性）細胞は、腫瘍の細胞塊を離れて別の起源の組織中に移行することができる。転移性細胞の細胞骨格のある種の特定の特性が、組織細胞が本来の細胞塊（組織）を離れることを通常は阻止する表面張力効果に打ち勝つことができるように変化していると想定される。非転移性腫瘍細胞と比べた場合に転移性細胞中に存在する、細胞骨格中のこれらの変化は、明らかに、これらの細胞が入力された機械的応力においてまったく意外な仕方で反応し応力の方向にではなく相反する方向のひずみを示すという趣旨の生体力学特性の変化をもたらす。
【０１０２】
機械的負荷下に応力方向と相反するひずみを示す腫瘍細胞は、（光学的ストレッチャー中で応力方向に正のひずみを示す）別の腫瘍細胞とは異なる生物特性を示すという証明を実施例２において実施した。
【０１０３】
例２：腫瘍細胞と正常組織との共培養
細胞培養実験を手がかりに、光学的ストレッチャー中で２Ｐａの機械的負荷下（線形変形の範囲）に収縮挙動を示す腫瘍細胞が、生物学的挙動において、機械的負荷下に正のひずみを示す腫瘍細胞と異なるかどうかを検査した。
【０１０４】
そのために、以下の異なる組織試料に由来する細胞を検査した。正常組織としては、患者の健常子宮頸部組織に由来する細胞を用意した。この細胞を、分類Ｔ１ｂ（臨床的に認識可能な、子宮頸部に限定された病変）の子宮頸部腫瘍に由来する細胞との、または分類Ｔ３ｂ（膣の下部３分の１および／または骨盤壁の浸潤）およびＴ４（遠隔転移）の子宮頸部腫瘍に由来する収縮性細胞とのいずれか一方との共培養において液滴培養中で培養した。収縮性細胞は、選別によって獲得され、その際、細胞を、それぞれ光学的ストレッチャーを利用して変形させ、２Ｐａの機械的応力下に負のひずみを示した細胞を選別した。これらの細胞を正常組織の細胞との共培養に使用した。
【０１０５】
使用される細胞を培養に先立ちばらばらにした。共培養では、それぞれ、正常組織に由来する同数の細胞を、腫瘍組織に由来するそれぞれの細胞と混合し、ＨｕＭＥＣ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の液滴培養で２４時間培養した。
【０１０６】
そのために、細胞を、培養に先立ち、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）シリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の赤色および緑色の蛍光色素で異なって染色し、蛍光顕微鏡で分析した。図２ａは、培養開始前の細胞の状態を示す。
【０１０７】
分類Ｔ１ｂの患者に由来する腫瘍細胞間では、腫瘍細胞の細胞塊の形成（中央）および正常組織の細胞の細胞塊の形成が観察された（図２ｂ）。腫瘍細胞は、類似細胞、つまり別の腫瘍細胞と集合して細胞クラスタとなる。正常組織の細胞との混合自体は、細胞塊の周りの周縁領域においてさえもわずかな程度でしか起こらない。
【０１０８】
分類Ｔ３ｂおよびＴ４の子宮頸部腫瘍に由来する選別された収縮性細胞と正常組織の細胞との共培養の細胞は、異なるイメージを示す。同一培養条件下での２４時間の培養後に、腫瘍細胞および正常組織の細胞からなる細胞塊の形成は認められなかった。機械的負荷下に負荷と相反する有向のひずみ挙動を示す腫瘍細胞は、細胞培養中でも、機械的負荷下に負荷方向にひずみを示す腫瘍細胞とは振る舞いが異なる。つまり、細胞骨格の変化は、これらの細胞が、同種組織に対する親和性を失い、別種細胞（ここでは正常組織の細胞）との均質な混合物中に存在するような生物学的変化と関連している。
【０１０９】
転移性細胞は、まさにこの、腫瘍の細胞塊を離れることができ別種組織に浸潤できるという特性を示す。実施例１によると、機械的負荷下でのそのひずみが負荷と相反する細胞は、転移形成を伴う患者に由来する組織試料においてしか認められない。その点では、組織試料中にこの生体力学特性を有する細胞が存在することにより、腫瘍転移の高まるリスクが存在すると推論することができる。
【０１１０】
例３：腫瘍細胞の変形性はその攻撃性と関連している。
【０１１１】
従来技術からは、腫瘍細胞での変形性（それゆえ機械的負荷下でのひずみ）は、正常組織に由来する細胞と比べて上昇することが公知である。図３は、このことを、光学的ストレッチャーの原理に基づく検査において、分析された細胞のひずみを示すヒストグラムを手がかりに示す。
【０１１２】
細胞系に由来する三つの細胞集団を検査した。正常組織としては、ヒト非癌性乳腺上皮細胞の細胞系である、細胞系ＭＣＦ１０の細胞を分析した。この細胞系は、乳腺線維症の３６歳の女性の乳腺組織から獲得された。腫瘍細胞系としては、６９歳の女性乳癌患者の細胞から調製された腺癌細胞系の細胞系ＭＣＦ７を利用した。この細胞は、非転移性および非浸潤性細胞のモデルである。細胞系ＭＣＦ７の細胞に、ホルボールエステル、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）を混合すると（１００ｎｍｏｌ／ｌのＴＰＡを培養中に１８時間添加）、これらの細胞において浸潤能および転移能の著しい上昇が認められる（Ｊｏｈｎｓｏｎら１９９９）。ＴＰＡを混合したＭＣＦ７細胞は、ここでは、「改変ＭＣＦ７」細胞と呼ばれ、本実験では転移性細胞のモデル細胞系として利用された。
【０１１３】
光学的ストレッチャーの原理に基づいて５Ｐａの応力のもとひずみを算出した（図３）。ＭＣＦ１０細胞は、平均して、応力方向に最もわずかなひずみを示す。ＭＣＦ７細胞は、ＭＣＦ１０細胞と比べて、平均してより大きい、応力方向へのひずみを示す。さらに、この試料中では単一細胞のひずみの揺らぎがより大きいため、ひずみの標準偏差がＭＣＦ１０細胞と比べてＭＣＦ７細胞ではより大きいということが確認された。転移性の改変ＭＣＦ７細胞の分析は、そのひずみが、ＭＣＦ１０と比較してもＭＣＦ７細胞と比較しても平均値でより高いということを示す。その標準偏差もまた、未改変の、非転移性ＭＣＦ７細胞と比べて、さらに大きい［Ｇｕｃｋら２００５］。
【０１１４】
原子間力顕微鏡（ＳＦＭ）を利用した乳腺組織細胞系の検査は、この生体力学特性を立証した（図４）。「リアル・タイム・スキャン」モードにおいて１ｎＮ／秒の割合でＳＦＭ設定値を絶えず上げること、および１０Ｈｚの速度で帰属のカンチレバーのたわみ量（Ｂｉｅｇｕｎｇｓｒａｔｅ）を記録することにより、データを算出した。
【０１１５】
ＭＣＦ１０Ａ細胞（正常組織、ＡＴＣＣ−ＬＧＣ−Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ、ドイツ）、およびＭＣＦ７細胞（非転移性、非浸潤性腫瘍組織、ＡＴＣＣ−ＬＧＣ−Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ、ドイツ）を使用した。転移性細胞としては、転移性腫瘍に由来する細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ−ＬＧＣ−Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ、ドイツ）を分析した。図４は、細胞が線形変形において異なるひずみ特性を示すことを示す。ＭＣＦ１０Ａ細胞は、最も低い収縮を示すのに対して、腫瘍細胞はそれと比べて著しく高い収縮値を示す。転移性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、非転移性ＭＣＦ７細胞と比べてさらに著しく高い収縮を示す。
【０１１６】
したがって、応力方向へのひずみのより高い平均値から、無制御に増殖する細胞が存在するかどうかについて的確にとらえることができる。
【０１１７】
分析された患者試料において、正常組織に由来する細胞と比べて、細胞の応力方向への有向のひずみの平均値がより高いと同時に、分析された患者試料の細胞が、負荷下に応力方向と相反するひずみを示す細胞をより高い割合で示すと、腫瘍転移が出現する高められたリスクが存在する。
【０１１８】
例４：周辺組織への腫瘍細胞の根づき（侵襲）のシミュレーション
非線形変形をもたらす高い負荷下での細胞の硬化（非線形変形における腫瘍細胞の応力に沿ったわずかな有向のひずみ）が、腫瘍細胞が、周辺正常組織に逆らって根づくことができ、そうすることで周辺組織に侵襲できることの原因であると想定される。
【０１１９】
立証するために、腫瘍細胞系（ＭＣＦ７）の細胞、ならびにもう一つの実験では女性乳癌患者に由来する原発腫瘍細胞を、スフェロイドとして、１％アガロースを含有するハイドロゲル（１％アガロースを含む細胞培養培地）中で培養した（図５）。この細胞の、光学的ストレッチャーの原理に基づく分析は、ばらばらにされた細胞が、線形変形において、１０００Ｐａ未満という最大機械的抵抗力を示したことを示した。ハイドロゲル中での培養によると、細胞塊がハイドロゲル中で、明らかにより高い抵抗に逆らって根づくことができることが認められた。腫瘍細胞スフェロイドは、１８日間の培養において、その剛性ゆえに６０００〜１００００Ｐａの圧力を印加するハイドロゲル中に根づいた（図５ｄ）。ハイドロゲルの剛度は、流量計で測定された。その結果、腫瘍細胞スフェロイドは、線形変形下に算出されたよりも明らかに高い機械的応力に抵抗できるということを示すことができた。
【０１２０】
例５：原発乳房腫瘍に由来する腫瘍細胞と正常組織に由来する細胞の緩和挙動
光学的ストレッチャー中で、悪性ヒト乳房腫瘍に由来する細胞の緩和挙動を分析し、参照試料の細胞（乳房縮小からのヒト乳房組織試料に由来する細胞）の緩和挙動と比較した。そのために、細胞をばらばらにして８００ｍＷのもと光学ストレッチャー中で分析し、ただし、２秒間、応力をかけ、さらなる２秒間細胞を観察した。入力された機械的応力のもとでは、光学的ストレッチャー中で細胞の線形変形が見込まれる。
【０１２１】
以下の細胞を分析した（図６）：
−Ｎ１（比較例）：乳房縮小からの原発乳腺上皮細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＨＭＥＣ細胞）
−Ｎ２（比較例）：乳房縮小からの原発乳腺上皮細胞（Ｐｒｏｍｏｚｅｌｌ、ＨＭＥｐＣ細胞）
−ＢＴ１：原発乳腺腫瘍病期Ｉ
−ＢＴ２：原発乳腺腫瘍病期ＩＩ
−ＢＴ３：原発乳腺腫瘍病期ＩＩＩ
−ＢＴ４：原発乳腺腫瘍病期ＩＩＩ
以下のパラメータを測定した：
−機械的応力を入力する前の細胞の寸法（Ｌ０）、
−機械的応力の入力開始から２秒後（時点ｔＳに相応）の細胞の寸法（ＬＳ）、
−応力入力の終了から２秒後（時点ｔＲに相応）の細胞の寸法（ＬＲ）。
【０１２２】
算出されたパラメータを手がかりに、分析された細胞の相対緩和を算出した（Ｒ＝（ＬＲ−ＬＳ）／Ｌ０）。結果を図６に示し、ここでは分析された試料における相対緩和の分布が示されている。
【０１２３】
病期ＩＩ以降の原発乳腺腫瘍に由来する細胞は、平均してより低い相対緩和を示す、つまり初期状態へのより強い収縮を示すことが認識できる。さらに、病期ＩＩ以降の原発乳腺腫瘍の細胞は、きわめてわずかな割合のみが緩和しない（相対緩和＞０）ことが明らかになる。
【０１２４】
引用された非特許文献
（Ｃｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）  Ｃｒｏｓｓ  ＳＥ，  Ｊｉｎ  ＹＳ，  Ｒａｏ  Ｊ，  Ｇｉｍｚｅｗｓｋｉ  ＪＫ．  Ｎａｎｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００７  Ｄｅｃ；２（１２）：７８０−３．  
（Ｇｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）  Ｇｕｃｋ  Ｊ，  Ｓｃｈｉｎｋｉｎｇｅｒ  Ｓ，  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｂ，  Ｗｏｔｔａｗａｈ  Ｆ，  Ｅｂｅｒｔ  Ｓ，  Ｒｏｍｅｙｋｅ  Ｍ，  Ｌｅｎｚ  Ｄ，  Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ＨＭ，  Ａｎａｎｔｈａｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｒ，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｄ，  Ｋaｓ  Ｊ，  Ｕｌｖｉｃｋ  Ｓ，  Ｂｉｌｂｙ  Ｃ．  Ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｆｏｒｍａｂｉｌｉｔｙ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．  ２００５  Ｍａｙ；８８（５）：３６８９−９８．  
（Ｌｅｋｋａ  ａｔ  ａｌ．  １９９９）  Ｌｅｋｋａ  Ｍ，  Ｌａｉｄｌｅｒ  Ｐ，  Ｇｉｌ  Ｄ，  Ｌｅｋｋｉ  Ｊ，  Ｓｔａｃｈｕｒａ  Ｚ，  Ｈｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  ＡＺ．  Ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｅｕｒ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．  １９９９；２８（４）：３１２−６．
（Ｒａｏ  ＆  Ｃｏｈｅｎ  １９９１）  Ｒａｏ  ＫＭ，  Ｃｏｈｅｎ  ＨＪ．  Ａｃｔｉｎ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ．  １９９１  Ｍａｒ−Ｎｏｖ；２５６（２−６）：１３９−４８．
（Ｒｅｍｍｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）  Ｒｅｍｍｅｒｂａｃｈ  ＴＷ，  Ｗｏｔｔａｗａｈ  Ｆ，  Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｊ，  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｂ，  Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ  Ｃ，  Ｇｕｃｋ  Ｊ．  Ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｂｙ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００９  Ｍａｒ  １；６９（５）：１７２８−３２．  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｆｅｂ  １７．
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【図１】
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【図２ａ）】
2013541338.tif 000003
【図２ｂ）】
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【図２ｃ）】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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