(57)【要約】  本発明は、関節炎を予防、治療、または緩和する組成物、具体的に、β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカンを含む関節炎の予防、治療、または緩和に効果的な組成物を提供する。前記組成物の前記β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカンは、グルコースがβ−１，３結合し、前記グルコース１〜２０個ごとにグルコースが１，６結合をし、前記１，６結合をしたグルコースは有機酸と結合することを特徴とする。また、本発明は、前記組成物を含む関節炎治療剤および健康補助食品を提供し、前記組成物の製薬学的有効量を投与することを含む関節炎を予防、治療、または緩和方法を提供する。
2013526515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカンを含む、関節炎の治療、予防、または緩和に効果的な組成物。
【請求項２】
前記β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカンは、下記式Ｉ、
【化１】
2013526515.tif 000010
（Ｉ）
で表される反復単位を含み、前記式Ｉのうち、１，６−分岐グルコースの残基に有機酸が結合したことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカンは、グルコースがβ−１，３結合し、前記グルコース１〜２０個ごとにグルコースが１，６結合をし、前記１，６結合をしたグルコースは有機酸と結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記有機酸は、乳酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、酢酸、ブチル酸、パルミチン酸、酒石酸、アスコルビン酸、尿酸、スルホン酸、スルフィン酸、フェノール、ホルム酸、クエン酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、核酸、ＰＧＡＬ、ＤＰＧＡ、およびＰＧＡからなるグループより選択されることを特徴とする、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記有機酸は乳酸であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記関節炎は骨関節炎またはリューマチ関節炎であることを特徴とする、請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の組成物を含む、関節炎を治療、予防、または緩和するための関節炎治療剤。
【請求項８】
請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の組成物を含む、関節炎の治療、予防、または緩和に効果的な健康補助剤。
【請求項９】
前記健康補助剤は健康補助食品である、請求項８に記載の健康補助剤。
【請求項１０】
製薬学的有効量の請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の組成物または請求項７に記載の関節炎治療剤を投与することを含む、関節炎の治療、予防、または緩和方法。
【請求項１１】
前記関節炎は骨関節炎またはリューマチ関節炎である、請求項１０に記載の関節炎の治療、予防、または緩和方法。
【請求項１２】
前記組成物または治療剤を２１．２５ｍｇ／ｋｇ〜８５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する、請求項１０または１１に記載の関節炎の治療、予防または緩和方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節炎を予防、治療、または緩和する組成物、前記組成物の投与を含む関節炎の予防、治療、または緩和方法、および前記組成物を含む関節炎の予防、治療、または緩和に効果的な健康補助剤に関し、より詳細には、前記組成物はβ−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカンを含む組成物であって、前記β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカンは、グルコースがβ−１，３結合し、前記グルコース１〜２０個ごとにグルコースが１，６結合をし、前記１，６結合をしたグルコースは有機酸と結合することを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
人体は約２００個の関節からなる。関節とは、骨と骨が接する部位である。関節は、骨と骨の間が円滑に運動するように軟骨、関節嚢、滑膜、靭帯、筋、筋肉などで構成されており、動きによって発生する衝撃を吸収する役割を行う。
【０００３】
このような関節に現れる炎症性疾患は、自己免疫が原因であると理解されている慢性関節リューマチ、細菌感染による感染性関節炎、多様な原因によって関節軟骨や骨に変性や破壊が起こる変形性関節炎、結合組織の退行性変化によって可溶性代謝産物が関節周辺の結合組織内に結晶として沈着する結晶性関節炎などに大別される。
【０００４】
退行性関節炎、すなわち骨関節炎は、関節を構成する軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）に老化などの退行が発生し、軟骨細胞で関節の基質物質の類型ＩＩコラーゲン（ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）およびプロテオグリカンなどの合成が阻害すると同時に、インターロイキン−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）および腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）などの炎症性サイトカインが生成されることにより、関節基質を分解する基質金属タンパク質分解酵素（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の合成および活性が関節細胞で増加することによって関節組織が破壊され、これによって誘発される病気である。
【０００５】
また、関節炎は、炎症性サイトカインによる一酸化窒素の生成と、生成された一酸化窒素による自己増幅的なサイトカインの生成により、より多くのＭＭＰの合成が誘発されて関節基質の分解が促進されることでさらに悪化する。これと同時に、炎症性サイトカインは、脂質代謝産物であるプロスタグランジンＥ２の生成を増加させ、関節炎での炎症反応を誘発させる。
【０００６】
リューマチ関節炎は慢性全身性炎症疾患であって、対称性および多発性の関節炎と、これに伴う関節の損傷および変形が生じる疾患である。リューマチ関節炎に対する治療を受けない場合には、経過が不良になって関節機能の障害を引き起こし、さらに持続すれば関節機能の障害によって日常生活にも支障が生じる。国内では全人口の約１％がリューマチ関節炎によって苦しんでいると推定されており、リューマチ関節炎の発生率は男性よりも女性が約３倍高く、主に２０〜４０代で発生するものと知られている。
【０００７】
リューマチ関節炎の主要原因が次第に明らかになっているが、遺伝的な要因、感染、ホルモンの異常などが原因因子として考えられている。このような原因因子によって「自己免疫」現象が生じるが、自己免疫とは、我々の体の免疫調節機能の異常により、慢性炎症が体の様々な部位で多発的あるいは持続的に起こる現象である。
【０００８】
一方、前記関節炎治療に使用される薬品は、炎症の減少、病気進行の遅延、尿酸濃度の減少という主な作用機転に基づいて大別することができるが、多くの神経関節炎治療薬品が炎症を減少させる作用をする。炎症とは、痛み、浮腫、熱感、発作、硬直を引き起こす病的過程であり、炎症を迅速に緩和させる薬品としては、アスピリンをはじめとした非ステロイド性抗炎剤とコルチゾンをはじめとしたステロイド性抗炎剤がある。
【０００９】
非ステロイド性抗炎剤は、痛みを減少させて神経関節を楽にし、炎症を緩和させる効果があるが、胃腸障害が現れたり腹痛を誘発する場合があるため、活動性消火性潰瘍や胃腸部位の出血的病歴がある人には使用が禁止されている。ステロイド性抗炎剤は、その効果に比べて体重増加や高血圧などの副作用が深刻であり、退行性神経関節炎にはあまり使用されない。
【００１０】
特に、ステロイド性抗炎剤は、疾患の原因治療とは全く関係なく、単に痛みを一時的に減少させて関節の過剰使用を誘導する素地があるが、これは神経関節を破壊して障害を悪化させる要因になるため、使用には注意を要する。
したがって、関節炎などの関節損傷に使用される従来の治療法は、限定的な有効性を有して明白な有毒性副作用を伴うため、長期間に渡って使用し続けることはできず、その有効性が制限されるため、既存の治療法が持つ短所を克服した新たな新規治療法や治療剤が切に求められている実情にある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカンを含む関節炎の予防、治療、または緩和用組成物、前記組成物を含む関節炎治療剤および健康補助食品、および前記組成物の投与を含む関節炎の治療方法を提供することを目的とする。好ましくは、前記関節炎は、骨関節炎またはリューマチ関節炎である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一側面は、β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカンを含む関節炎の予防、治療、または緩和用組成物を提供する。
【００１３】
好ましくは、前記β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカンは、グルコースがβ−１，３結合し、前記グルコース１〜２０個ごとにグルコースが１，６結合をし、前記１，６結合をしたグルコースは有機酸と結合することを特徴とする。
【００１４】
好ましくは、前記１，６結合をしたグルコースに結合する有機酸は、乳酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、酢酸、ブチル酸、パルミチン酸、酒石酸、アスコルビン酸、尿酸、スルホン酸、スルフィン酸、フェノール、ホルム酸、クエン酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、核酸、ＰＧＡＬ、ＤＰＧＡ、およびＰＧＡからなる群より選択されることを特徴とする。
【００１５】
好ましくは、前記組成物は、体重１ｋｇあたり２１．２５ｍｇ〜８５ｍｇの投与量で投与することを特徴とする。
【００１６】
好ましくは、前記関節炎は、骨関節炎（退行性関節炎）またはリューマチ関節炎であることを特徴とする。
【００１７】
本発明のさらに他の一側面は、前記組成物を含む骨関節炎治療剤を提供する。
【００１８】
本発明のさらに他の一側面は、前記組成物を含むリューマチ関節炎治療剤を提供する。
【００１９】
本発明のさらに他の一側面は、前記組成物の投与を含む関節炎の治療、予防、または緩和方法を提供する。このとき、前記関節炎は、好ましくは骨関節炎またはリューマチ関節炎である。好ましくは、前記組成物は、体重１ｋｇあたり２１．２５ｍｇ〜８５ｍｇの投与量で投与することを特徴とする関節炎の治療、予防、または緩和方法を提供する。
【００２０】
本発明のさらに他の一側面は、前記組成物を含む関節炎の予防、治療、および緩和に効果がある健康補助剤を提供する。
【００２１】
好ましくは、前記健康補助剤は、健康補助食品である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係る前記組成物および前記組成物を含む関節炎治療剤は、副作用が少なく、関節炎の原因を治療し、既存の治療剤が持つ短所を克服した新たな治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】骨関節炎誘発後、何の処理もしない群（ＯＡ対照群）、ジクロフェナクナトリウム処理群、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇを処理した群に属する動物モデルの体重変化を日数によって示すグラフである。
【図２】骨関節炎誘発後、何の処理もしない群（ＯＡ群）、ジクロフェナクナトリウムを処理した群、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇを処理した群に属する動物モデルの膝関節厚さの変化を日数によって示すグラフである。
【図３】骨関節炎を誘発せずに滅菌蒸溜水を投与した正常群（Ｓｈａｍ対照群）、骨関節炎誘発後、ジクロフェナクナトリウム処理群、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇを処理した群に属する動物モデルそれぞれの膝関節厚さおよび最大伸長角度を示すグラフである。
【図４】骨関節炎誘発後、ジクロフェナクナトリウム処理群、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇを処理した群に属する動物モデルのＭａｎｋｉｎ  ｓｃｏｒｅを示すグラフである。
【図５】骨関節炎誘発後、ジクロフェナクナトリウム処理群、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇを処理した群に属する動物モデルの関節部位を切断して関節で軟骨厚さを示すグラフである。
【図６】骨関節炎誘発後、ジクロフェナクナトリウム処理群、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇを処理した群に属する動物モデルの軟骨細胞数を示すグラフである。
【図７】関節炎を誘発せずに滅菌蒸溜水を投与した正常群（Ｓｈａｍ対照群）（ａ、ｂ）、リューマチ関節炎対照群（ＲＡ対照群）（ｃ、ｄ）、リューマチ関節炎誘発後のジクロフェナクナトリウム処理群（ｅ、ｆ）、およびポリカン８５（ｋ、ｌ）、４２．５（ｉ、ｊ）、および２１．２５（ｇ、ｈ）ｍｇ／ｋｇを処理した群の胸腺皮質厚さ増加を示す図である。ここで、Ｃは皮質領域であり、Ｍは骨髄領域である。
【図８】関節炎を誘発せずに滅菌蒸溜水を投与した正常群（Ｓｈａｍ対照群）（ａ、ｂ）、リューマチ関節炎対照群（ｃ、ｄ）、リューマチ関節炎誘発後のジクロフェナクナトリウム処理群（ｅ、ｆ）、およびポリカン８５（ｋ、ｌ）、４２．５（ｉ、ｊ）、および２１．２５（ｇ、ｈ）ｍｇ／ｋｇを処理した群の動脈を示す図である。ここで、Ｗは白髄領域であり、Ｒは赤髄領域、Ａは中枢動脈である。
【図９】関節炎を誘発せずに滅菌蒸溜水を投与した正常群（Ｓｈａｍ対照群）（ａ）、リューマチ関節炎対照群（ｂ）、リューマチ関節炎誘発後のジクロフェナクナトリウム処理群（ｃ）、およびポリカン８５（ｆ）、４２．５（ｅ）、および２１．２５（ｄ）ｍｇ／ｋｇを処理した群のＦｅｍｕｒの膝関節の関節表面を示す図である。ここで、Ｓは膝関節の滑液腔であり、Ｂは微細骨である。
【図１０】関節炎を誘発せずに滅菌蒸溜水を投与した正常群（Ｓｈａｍ対照群）（ａ）、リューマチ関節炎対照群（ｂ）、リューマチ関節炎誘発後のジクロフェナクナトリウム処理群（ｃ）、およびポリカン８５（ｆ）、４２．５（ｅ）、および２１．２５（ｄ）ｍｇ／ｋｇを処理した群のＴｉｂｉａの膝関節の関節表面を示す図である。ここで、Ｓは膝関節の滑液腔であり、Ｂは微細骨である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、添付の図面を参照しながら、本発明の好ましい実施形態について説明する。しかし、本発明の実施形態は多様に相違する形態に変形することができ、本発明の範囲が以下で説明する実施形態に限定されることはない。
【００２５】
本発明に係る関節炎を予防、治療、または緩和する組成物は、β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカンを含む。前記β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカンは、グルコースがβ−１，３結合する。本発明に係る薬学組成物は、関節炎のうちでも特に骨関節炎およびリューマチ関節炎の予防、治療、または緩和に効果がある。
【００２６】
前記グルコースは、軟骨細胞を刺激して軟骨形成を促進する。前記β−１，３結合をしたグルコース１〜２０個ごとにグルコースが１，６結合をする。前記β−１，３結合をしたグルコース５個ごとにグルコースが１，６結合をすることが最も好ましい。前記β−１，３結合グルコースの鎖が１未満であれば軟骨形成促進効果が低下し、β−１，３結合グルコースの鎖が２０を超えれば分子量が大きくなって体内吸収が困難になり、軟骨形成効果が低下するため、β−１，３結合をしたグルコース１〜２０個ごとにグルコースが１，６結合をする範囲内が好ましい。前記グルコースは、直鎖状、側鎖上、または環状をなして結合してもよい。
【００２７】
また、好ましくは、前記β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカンは、下記化学式Ｉ：
【化１】
2013526515.tif 000003
のような構造で表される反復単位を含んでもよい。
【００２８】
前記化学式Ｉにおいて、１，６−分岐グルコースの残基には有機酸が結合してもよい。前記有機酸としては、乳酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、酢酸、ブチル酸、パルミチン酸、酒石酸、アスコルビン酸、尿酸、スルホン酸、スルフィン酸、フェノール、ホルム酸、クエン酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、核酸、ＰＧＡＬ、ＤＰＧＡ、ＰＧＡなどが挙げられてもよい。好ましくは、前記有機酸は乳酸である。前記有機酸は、カルシウムの吸収を促進して軟骨細胞を活性化させる。
【００２９】
一方、本発明に係る組成物は、ネズミ、ハツカネズミ、家畜、人間などの哺乳動物に多様な経路で投与されてもよい。投与のすべての方式が予想されるが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜、または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与されてもよい。好ましい投与量は、患者の状態および体重、病気の程度、薬品形態、投与経路、および期間によって異なり、当業者によって適切に選択されてもよい。
【００３０】
前記組成物の投与は、前記組成物約２１．２５ｍｇ／ｋｇ〜８５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与されることが好ましい。前記組成物を２１．２５ｍｇ／ｋｇ未満の量で投与すれば、関節炎の治療および予防が効果的になされず、８５ｍｇ／ｋｇを超えればむしろ効果が低下するため、前記範囲内であることが好ましい。
【００３１】
前記組成物は、骨関節炎治療剤およびリューマチ関節炎治療剤として使用されてもよい。骨関節炎は軟骨消失および関節硬直を引き起こすが、前記薬学組成物はこれを極めて効果的に抑制し、脛骨および大腿骨関節の損失も極めて効果的に抑制する。
【００３２】
骨関節炎は炎症性疾患であり、軟骨損傷などによって周囲関節の腫れが招来し、関節の厚さが著しく増加するという現象を引き起こす［Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６］。前記組成物は、このような炎症を防ぐために免疫反応細胞を著しく増加させ、軟骨も増加させる。
【００３３】
リューマチ関節炎の場合、自己免疫体系の異常によって関節が腫れ上がるが、前記薬学組成物は、免疫調節または抗炎効果によってリューマチ関節炎を予防、治療、または緩和することができる。
【００３４】
前記組成物は、それぞれ通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、座薬、および滅菌注射用液の形態に剤形化して使用してもよい。
【００３５】
本発明に係る組成物は、グルコサミン、コンドロイチン、ヒアルロン酸、メチルスルホニルメタン、およびクレアチン、またはその適合した誘導体および／または製剤補助剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、安定剤、充填剤、香味剤、染料、および甘味料のような生理活性成分を追加で含んでもよい。
【００３６】
前記組成物に含まれてもよい担体、賦形剤、および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、および鉱物油が挙げられてもよい。
【００３７】
製剤化する場合、普通に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。
【００３８】
経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれるが、このような固形製剤は１つ以上の賦形剤をさらに含んでもよい。前記賦形剤としては、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどがあり、これを前記固形製剤に混合して調剤してもよい。単純な賦形剤の他にも、マグネシウムステアレートやタルクのような潤滑剤を含んでもよい。
【００３９】
経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、油剤、シロップ剤などが該当するが、多く使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他にも多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。
【００４０】
非経口投与のための製剤としては、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレエートのような注射可能なエステルなどが使用されてもよい。座薬の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されてもよい。
【００４１】
前記組成物は、上述で詳察したように関節炎治療剤として使用されるだけでなく、関節炎を予防または緩和させるための健康補助剤として使用されてもよい。
【００４２】
前記健康補助剤は食品として提供されてもよいが、本願で定義される「健康機能食品」とは、健康機能食品に関する法律第６７２７号による人体に有用な機能性を有する原料や成分を使用して製造および加工した食品を意味し、前記「機能性」とは、人体の構造および機能に対して栄養素を調節したり、生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得るという目的で摂取することを意味する。
【００４３】
この他に、本発明に係る健康補助剤は、多様な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤、および天然風味剤などの風味剤、着色剤および増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクト酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含んでもよい。
【００４４】
本発明に係る健康補助剤は、指示された比率で必須成分として前記組成物を含む以外に他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料のように多様な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含んでもよい。天然炭水化物の例としては、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など、ジサッカライド、例えば、マルートス、スクロースなど、およびポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクルロデキストリンなどのような通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、クルリシルリジンなど）、および合成香味剤（サッカリン、アスパルタムなど）を有利に使用してもよい。前記天然炭水化物の比率は、本発明の組成物１００ｍｌあたり一般的に約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇである。
【００４５】
以下、本願発明の組成物を含む一例として、ポリカン（Ｐｏｌｙｃａｎ）ＴＭ［Ｇｌｕｃａｎ  Ｃｏｒｐ．Ｌｔｄ．，Ｋｏｒｅａｎ］を使用した骨関節炎およびリューマチ関節炎に対する効果について、図面を参照しながら詳察する。下記の実験例は、本発明をより適切に理解するためのものであり、これによって本発明が限定されることはない。
【実施例】
【００４６】
実験例１−‘β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカン’の効能検証方法
実験例１−１：実験準備
β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカンのうちの１つである、商業的に購入可能なポリカン（Ｐｏｌｙｃａｎ）ＴＭ（１．７ｂｒｉｘ）［Ｇｌｕｃａｎ  Ｃｏｒｐ．Ｌｔｄ．，ＫＯＲＥＡ］を準備し、前記ポリカン（Ｐｏｌｙｃａｎ）ＴＭの対照薬品としてジクロフェナクナトリウム（Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ  ｓｏｄｉｕｍ）［Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ］を準備した。実験動物としては、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  Ｒａｔｓ（６週齢雄、ＳＬＣ．，ＪＡＰＡＮ）［ＡＮＮＥＸ  Ｉ〜ＩＩＩ］を準備した。
【００４７】
実験例１−２：群分離
実験群を計６群に分け、各群ごとに前記Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  Ｒａｔｓを８匹ずつ準備した。骨関節炎を誘発させないラットとして、滅菌蒸溜水を投与した正常群であるＳｈａｍ対照群を準備した。また、陰性対照群として骨関節炎誘発後に何の処理もしないＯＡ対照群と、陽性対照群として骨関節炎誘発後に２ｍｇ／ｋｇのジクロフェナクナトリウム投与群を準備した。
【００４８】
処理群として、骨関節炎を誘発した後にそれぞれ異なる濃度であるポリカン８５ｍｇ／ｋｇ、４２．５ｍｇ／ｋｇ、および２１．２５ｍｇ／ｋｇで処理したポリカン投与群を準備した。
【００４９】
実験例１−３：投与
ポリカン８５、４２．５および２１．２５ｍｇ／ｋｇを毎日８４日間経口投与した。前記投与時、滅菌蒸溜水を媒体として使用し、５ｍｌ／ｋｇで投与した。また、前記ポリカンを培養液に希釈し、１ｍｌ／ｋｇの濃度で単回関節嚢内に注入した。
【００５０】
陽性対照群として、前記ジクロフェナクナトリウム２ｍｇ／ｋｇを毎日８４日間経皮投与し、生理食塩水を媒体として使用して１ｍｌ／ｋｇで投与した。培養液に希釈した前記ポリカンの注入は骨関節炎誘発から１週間後に実施し、ジクロフェナクナトリウムも骨関節炎誘発の１週間後から投与を開始した。
【００５１】
実験例１−４：骨関節炎の誘発
前記実験動物であるマウスをゾレチル（Ｚｏｌｅｔｉｌｅ  ５０：Ｖｉｒ  ｂａｃ  Ｌａｂ．，Ｆｒａｎｃｅ）で麻酔した後に左側関節嚢を露出し、Ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎおよびｐａｒｔｉａｌ  ｍｅｄｉａｌ  ｍｅｎｉｓｃｅｃｔｏｍｙを実施して骨関節炎を誘発した。Ｓｈａｍ手術群では関節嚢を切除して臓器内側の半月板（ｍｅｄｉａｌ  ｍｅｎｉｓｃｕｓ）を確認した後、切除せずに関節嚢を閉じた。
【００５２】
実験例１−５：観察
投与日から８４日間の体重と膝関節厚さの変化を１週間に１回ずつ測定して観察し、最終犠牲日に膝関節の最大伸長角度およびｃａｐｓｕｌｅ露出後の膝関節厚さをそれぞれ測定し、Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏ染色下に大腿骨および脛骨のＭａｋｉｎ  ｓｃｏｒｅと軟骨の厚さをそれぞれ組織形態計測（ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ）的に測定し、大腿骨および脛骨関節面の軟骨においてそれぞれＢｒｄＵ免疫反応性も評価した。
【００５３】
実験例２: ‘β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカン’（ポリカンＴＭ）の骨関節炎に対する効能分析
実験例２−１：体重の変化
図１に示すように、実験例１のように行った結果、全実験期間で正常群（Ｓｈａｍ対照群）および陰性対照群（ＯＡ対照群）で意味のある体重および増体量の変化は認められなかった。８４日間の増体量が、ＯＡ対照群ではＳｈａｍ対照群に比べて−０．８２％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム２ｍｇ／ｋｇ、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれＯＡ対照群に比べて−２．９８、１．７６、７．７６、および８．８８％変化を示した。
【００５４】
実験例２−２：膝関節厚さの変化
図２を参照すれば、骨関節炎対照群（ＯＡ対照群）の場合、正常対照群（Ｓｈａｍ対照群）に比べて有意性のある（ｐ＜０．０１）誘発膝関節厚さの増加がそれぞれ投与日から観察された。一方、前記３種類の容量のポリカンおよびジクロフェナクナトリウム投与群ではそれぞれ投与２１日後から骨関節炎誘発対照群に比べて有意性のある（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）膝関節厚さの減少が認められた。最終解剖検査時、膝関節の厚さは、ＯＡ対照群ではＳｈａｍ対照群に比べて１８．６６％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム２ｍｇ／ｋｇ、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれＯＡ対照群に比べて−５．７９、−５．６１、−４．２８、および−５．７４％変化を示した。
【００５５】
実験例２−３：Ｃａｐｓｕｌｅ露出後の膝関節厚さの変化
すべてのＯＡ誘発群では、Ｓｈａｍ対照群と比較して有意性のある（ｐ＜０．０１）ｃａｐｓｕｌｅ露出後の関節厚さの増加がそれぞれ認めら、ジクロフェナクナトリウムおよびすべてのポリカン投与群では、骨関節炎誘発対照群と類似した厚さをそれぞれ示した。Ｊｏｉｎｔ  ｃａｐｓｕｌｅ露出後、膝関節の厚さは、ＯＡ対照群ではＳｈａｍ対照群に比べて１５．４０％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム２ｍｇ／ｋｇ、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれＯＡ対照群に比べて−０．９９、−２．７７、−１．００、および−２．１７％変化を示した。
【００５６】
実験例２−４：膝関節最大伸長角度
図３を参照すれば、ＯＡ対照群の場合、Ｓｈａｍ対照群に比べて有意性のある（ｐ＜０．０１）膝関節最大伸張角度の増加が認められたが、すべてのポリカン処理群およびジクロフェナクナトリウム投与群では、ＯＡ対照群に比べて有意性のある（ｐ＜０．０１）膝関節最大伸張角度の減少がそれぞれ認められた。膝関節最大伸張角度は、ＯＡ対照群の場合はＳｈａｍ対照群に比べて１５９．３９％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム２ｍｇ／ｋｇ、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれＯＡ対照群に比べて−１８．１８、−１８．５２、−２８．９６、および−２４．０７％変化を示した。
【００５７】
実験例２−５：Ｍａｎｋｉｎ  ｓｃｏｒｅ
Ｍａｎｋｉｎ  ｓｃｏｒｅは関節炎の程度を示す数値であって、伸長角、傷み、発熱、厚さなどを包括して数値として示す値であり、数値が少ないほど正常に近い。図４を参照すれば、ＯＡ対照群では、Ｓｈａｍ対照群に比べて有意性のある（ｐ＜０．０１）脛骨および大腿骨関節面軟骨のＭａｎｋｉｎ  ｓｃｏｒｅの増加がそれぞれ認められたが、すべてのポリカン処理群およびジクロフェナクナトリウム投与群では、ＯＡ対照群に比べて著しく大腿骨および脛骨Ｍａｎｋｉｎ  ｓｃｏｒｅの減少がそれぞれ認められた。
【００５８】
大腿骨のｍａｎｋｉｎ  ｓｃｏｒｅは、ＯＡ対照群の場合はＳｈａｍ対照群に比べて１２１６．６７％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム２ｍｇ／ｋｇ、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれＯＡ対照群に比べて−２７．８５、−３６．７１、−４８．１０、および−３１．６５％変化を示した。
【００５９】
脛骨のｍａｎｋｉｎ  ｓｃｏｒｅは、ＯＡ対照群の場合はＳｈａｍ対照群に比べて２１６６．６７％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム２ｍｇ／ｋｇ、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれＯＡ対照群に比べて−２０．５９、−２９．４１、−２７．９４、および−２０．５９％変化を示した。
【００６０】
実験例２−６：軟骨厚さの変化
図５を参照すれば、ＯＡ対照群では、Ｓｈａｍ対照群に比べて有意性のある（ｐ＜０．０１）脛骨および大腿骨関節面軟骨厚さの減少がそれぞれ認められたが、すべてのポリカン処理群およびジクロフェナクナトリウム投与群では、ＯＡ対照群に比べて有意性のある（ｐ＜０．０１）脛骨および大腿骨軟骨厚さの増加がポリカン２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群を除いてそれぞれ認められた。
【００６１】
一方、ポリカン２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群でも、ＯＡ対照群に比べて有意性のある（ｐ＜０．０１）大腿骨軟骨厚さの増加が認められ、脛骨軟骨厚さも増加を示した。
【００６２】
大腿骨関節面の軟骨厚さは、ＯＡ対照群の場合はＳｈａｍ対照群に比べて−４６．７８％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム２ｍｇ／ｋｇ、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれＯＡ対照群に比べて３５．１１、７１．８４、８６．８７、および６９．３８％変化を示した。
【００６３】
大腿骨関節面の軟骨厚さは、ＯＡ対照群の場合はＳｈａｍ対照群に比べて−６１．９９％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム２ｍｇ／ｋｇ、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれＯＡ対照群に比べて６８．８１、９６．２３、７９．５１、および１８．７４％変化を示した。
【００６４】
実験例２−７：ＢｒｄＵ免疫反応性の変化
図６を参照すれば、ＯＡ対照群では、Ｓｈａｍ対照群に比べて有意性のある（ｐ＜０．０１）脛骨および大腿骨関節面軟骨のＢｒｄＵ免疫反応細胞数の減少がそれぞれ認められたが、ポリカン８５および４２．５ｍｇ／ｋｇ投与群では、ＯＡ対照群に比べて有意性のある（ｐ＜０．０１）ＢｒｄＵ免疫反応性を示す軟骨細胞の数的増加が脛骨および大腿骨関節面軟骨でそれぞれ認められた。
【００６５】
一方、ジクロフェナクナトリウム投与群ではＯＡ対照群と類似したＢｒｄＵ免疫反応細胞数が脛骨および大腿骨でそれぞれ認めら、ポリカン２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群ではＯＡ対照群に比べて著しくＢｒｄＵ免疫反応細胞の増加が脛骨関節軟骨で認められ、大腿骨関節軟骨ではＯＡ対照群と類似した細胞数が認められた。
【００６６】
大腿骨関節面軟骨で、ＢｒｄＵ免疫反応細胞の数は、ＯＡ対照群の場合はＳｈａｍ対照群に比べて−８２．６９％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム２ｍｇ／ｋｇ、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれＯＡ対照群に比べて９．５２、２３９．６８、２０７．９４、および６．３５％変化を示した。
【００６７】
脛骨関節面軟骨で、ＢｒｄＵ免疫反応細胞の数は、ＯＡ対照群の場合はＳｈａｍ対照群に比べて−８０．４３％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム２ｍｇ／ｋｇ、ポリカン８５、４２．５、および２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれＯＡ対照群に比べて１．５６、２５９．３８、２４５．３１、および５７．８１％変化を示した。
【００６８】
実験例３：‘β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカン’（ポリカンＴＭ）のリューマチ治療効能検証実験
実験例３−１：組織処理
胸腺および脾臓の周辺結合組織を分離して１０％中性ホルマリンに固定させた後、一般的な方法によって脱水およびパラフィン包埋を実施して３〜４μｍの縦方向（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ）切片を製作し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅｏｓｉｎ染色を実施して光学顕微鏡下で観察した。
【００６９】
また、両側後肢の膝関節（Ｋｎｅｅ  ｊｏｉｎｔ）また周辺結合組織を分離して１０％中性ホルマリンに固定させた後、脱灰液［２４．４％  ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ、および０．５Ｎ  ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ］を利用して５日間脱灰させ、一般的な方法によって脱水およびパラフィン包埋を実施して３〜４μｍの縦方向（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ）切片を製作し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅｏｓｉｎ染色を実施して光学顕微鏡下で観察した。
【００７０】
実験例３−２：ＨＩＳＴＯＭＯＲＰＨＯＭＥＴＲＹ
ポリカンがコラーゲンとして誘発されたリューマチ関節炎（ＲＡ）ＤＢＡマウスの免疫異常に及ぼす影響を評価するために、胸腺全体および皮質の厚さ、脾臓全体、および白色水質の直径、白色水質の単位面積（１ｍｍ２）あたりの数を４０倍顕微鏡視野で自動映像分析装置（ＤＭＩ−３００  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：ＤＭＩ，Ｋｏｒｅａ）を利用してそれぞれ測定し、以前の方法［Ｄｕｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００：ｖａｎ  Ｈｏｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４：Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７］によって膝関節の大腿骨および脛骨関節面軟骨の厚さ、プロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ）消失程度、および浸食（ｅｒｏｓｉｏｎ）をそれぞれ１００倍顕微鏡視野で自動映像分析装置（ＤＭＩ−３００  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：ＤＭＩ，Ｋｏｒｅａ）を利用して評価した。
【００７１】
プロテオグリカンの消失程度は、以前の方法［Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２：Ｄｕｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００：ｖａｎ  Ｈｏｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４］によってプロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ）特殊染色であるＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏ染色性を３等級に区分して評価した。すなわち、プロテオグリカンの消失がない場合を０とし、完全に消失されて全く染色性を示さない場合を３として評価した。
【００７２】
関節軟骨面の損傷程度も、以前の方法［Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２：ｖａｎＨｏｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４：Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７］によって浸食（ｅｒｏｓｉｏｎ）が全く認められない場合を０、酷い浸食（ｅｒｏｓｉｏｎ）によって骨組織の損傷まで起こった場合を４とし、４等級に区分して評価した。
【００７３】
実験例３−３：動物モデル
コラーゲンを利用したＲＡ誘発マウスモデルは、現在の多様な物質のＲＡに対する効力評価に最も広く利用されている動物モデルのうちの１つであり［Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８：Ｍｉｙａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８：Ｐａｎａｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８］、自己免疫によるＲＡの誘発が招来する。したがって、コラーゲン誘発ＲＡ時、胸腺と脾臓のリンパ球増加など典型的な免疫増加が起こると知られている［Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００：Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉ，２００３：Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４］。したがって、前記コラーゲンを利用したＲＡ誘発マウスの胸腺と脾臓を観察して本願発明の効果を分析した。
【００７４】
実験例３−４：動物モデルの胸腺と脾臓分析
前記実験例による結果、ジクロフェナクナトリウムおよびポリカン８５ｍｇ／ｋｇ投与群に限定して胸腺皮質厚さの有意性のない増加が認められたが、胸腺では正常対照群（Ｓｈａｍ対照群）と比較して有意性のある変化がすべてのＲＡ誘発群で認められなかった。
【００７５】
一方、図７および図８を参照すれば、脾臓では正常対照群に比べて有意性のある（ｐ＜０．０１）脾臓全体および白色水質の直径増加と著しい白色水質の数的増加、すなわち脾臓の肥大およびリンパ球増生がＲＡ誘発対照群（ＲＡ対照群）で認められた。このような脾臓の肥大は、上述した３つ容量のすべてのポリカン投与によって著しく抑制されるものと観察された反面、ジクロフェナクナトリウム投与群ではＲＡ対照群に比べてむしろ有意性のある（ｐ＜０．０１）脾臓全体厚さの増加を示した。
【００７６】
このようなジクロフェナクナトリウムの効果は、投与経路が経口でない注射経路を取った結果、炎症反応性の増加による二次的な増加と判断され、ポリカンは免疫調節効果の結果と判断される。
【００７７】
本実験の結果、ポリカン２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群と４２．５ｍｇ／ｋｇ投与群では明白な容量依存性が認められたが、８５ｍｇ／ｋｇ投与群では４２．５ｍｇ／ｋｇ投与群と類似するか多少減少した効果が認められた。
【００７８】
胸腺全体厚さは、ＲＡ対照群では正常対照群に比べて２．８４％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム、ポリカン２１．２５、４２．５、および８５ｍｇ／ｋｇ投与群ではＲＡ対照群に比べて−２．８０、１．４５、６．１７、および４．８５％の変化をそれぞれ示した。
【００７９】
胸腺皮質の厚さは、ＲＡ対照群では正常対照群に比べて４．３７％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム、ポリカン２１．２５、４２．５、および８５ｍｇ／ｋｇ投与群ではＲＡ対照群に比べて１８．８３、４．３７、９．８２、および１６．３０％の変化をそれぞれ示した。さらに、下記表１を参照すれば、処理群で胸腺の全体厚さおよび皮質の厚さが増加していることが分かる。
【００８０】
【表１】
2013526515.tif 000004
【００８１】
脾臓全体厚さは、ＲＡ対照群では正常対照群（Ｓｈａｍ対照群）に比べて２４．３２％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム、ポリカン２１．２５、４２．５および８５ｍｇ／ｋｇ投与群ではＲＡ対照群に比べて１７．４９、−６．７１、−１１．１２、および−１０．４４％の変化をそれぞれ示した。
【００８２】
実験例３−５：動物モデルの脾臓白色水質分析
脾臓白色水質の数は、ＲＡ対照群ではＳｈａｍ対照群に比べて１９．４０％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム、ポリカン２１．２５、４２．５、および８５ｍｇ／ｋｇ投与群ではＲＡ対照群に比べて５．００、−６．２５、−５．００、および−１３．７５％の変化をそれぞれ示した。
【００８３】
脾臓白色水質の直径は、ＲＡ対照群ではＳｈａｍ対照群に比べて２４．０９％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム、ポリカン２１．２５、４２．５、および８５ｍｇ／ｋｇ投与群ではＲＡ対照群に比べて−８．１４、−１６．９９、−２２．６５、および−２２．０１％の変化をそれぞれ示した。さらに、下記表２を参照すれば、処理群の全体厚さ、白色水質の数、および白色水質の厚さが減少することが分かる。
下記表では、８匹の動物モデルの±ＳＤ（平均±標準偏差に変更）値で示し、＊ｐ＜０．０１および＊＊ｐ＜０．０５でＳｈａｍ対照群と比較した。†ｐ＜０．０１リューマチ関節炎対照群（ＲＡ対照群）と比較した。
【００８４】
【表２】
2013526515.tif 000005
【００８５】
実験例３−６：プロテオグリカン消失および浸食（ｅｒｏｓｉｏｎ）分析
コラーゲン誘発関節炎では、組織学的に関節軟骨のプロテオグリカンの消失とこれに伴う浸食（ｅｒｏｓｉｏｎ）、すなわち典型的なＲＡが観察されるものと知られている［Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２：Ｄｕｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００：ｖａｎ  Ｈｏｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４：Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７］。本実験の結果でも、正常対照群（Ｓｈａｍ対照群）に比べて有意性のある（ｐ＜０．０１）膝関節の大腿骨および脛骨関節面軟骨のプロテオグリカンの減少、ｅｒｏｓｉｏｎ  ｓｃｏｒｅの増加、および軟骨厚さ自体の減少がＲＡ誘発対照群でそれぞれ認められた。
【００８６】
一方、図９および図１０を参照すれば、このようなコラーゲン誘発ＲＡ所見が２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群の脛骨を除いたすべてのポリカン投与群で投与容量依存的に著しく抑制され、ポリカン２１．２５ｍｇ／ｋｇ投与群でも有意性のある（ｐ＜０．０５）プロテオグリカンの消失の抑制が認められたが、ｅｒｏｓｉｏｎ  ｓｃｏｒｅおよび脛骨関節軟骨の厚さはＲＡ対照群と類似して観察された。
【００８７】
この反面、ジクロフェナクナトリウム投与によっても、コラーゲン誘発ＲＡ所見が著しく抑制された。ジクロフェナクナトリウムは非ステロイド系抗炎症剤であり、プロスタグランジン合成抑制によるコラーゲン誘発ＲＡに対する効果は既に周知であり、多様な物質の抗ＲＡ効果評価に比較薬品として使用されてきた［Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｒｎａｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７：Ｒｏｒｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００５］。
【００８８】
実験例３−７：動物モデルの大腿骨関節軟骨分析
大腿骨関節軟骨のＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏ  ｓｃｏｒｅは、ＲＡ対照群では正常対照群（Ｓｈａｍ対照群）に比べて１０００．００％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム、ポリカン２１．２５、４２．５、および８５ｍｇ／ｋｇ投与群ではＲＡ対照群に比べて−６３．６４、−３６．３６、−６３．６４、および−５９．０９％の変化をそれぞれ示した。
【００８９】
大腿骨関節軟骨のｅｒｏｓｉｏｎ  ｓｃｏｒｅは、ＲＡ対照群ではＳｈａｍ対照群に比べて４００．００％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム、ポリカン２１．２５、４２．５、および８５ｍｇ／ｋｇ投与群ではＲＡ対照群に比べて−３６．００、−２０．００、−４４．００、および−４４．００％の変化をそれぞれ示した。
【００９０】
大腿骨関節軟骨の厚さは、ＲＡ対照群ではＳｈａｍ対照群に比べて−４３．７９％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム、ポリカン２１．２５、４２．５、および８５ｍｇ／ｋｇ投与群ではＲＡ対照群に比べて３３３．７０、２１．１２、４４．１４、および６４．６５％の変化をそれぞれ示した。
下記表３を参照すれば、処理群は対照群に比べてＳａｆｒａｎｉｎ値、ｅｒｏｓｉｏｎ値、および脛骨関節軟骨厚さは著しく減少することが分かる。また、下記表は、１６関節の±ＳＤで示し、ｐ＜０．０１および＊＊ｐ＜０．０５でＳｈａｍ対照群と比較した。†ｐ＜０．０１リューマチ関節炎対照群（ＲＡ対照群）と比較した。
【００９１】
【表３】
2013526515.tif 000006
【００９２】
実験例３−８：動物モデルの脛骨関節軟骨分析
脛骨関節軟骨のＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏ  ｓｃｏｒｅは、ＲＡ対照群ではＳｈａｍ対照群に比べて２０９．０９％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム、ポリカン２１．２５、４２．５、および８５ｍｇ／ｋｇ投与群ではＲＡ対照群に比べて−２９．４１、−２９．４１、−５０．００、および−７３．５３％の変化をそれぞれ示した。
【００９３】
脛骨関節軟骨のｅｒｏｓｉｏｎ  ｓｃｏｒｅは、ＲＡ対照群ではＳｈａｍ対照群に比べて９６６．６７％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム、ポリカン２１．２５、４２．５、および８５ｍｇ／ｋｇ投与群ではＲＡ対照群に比べて−７５．００、−６．２５、−４６．８８、および−４６．８８％の変化をそれぞれ示した。
【００９４】
脛骨関節軟骨の厚さは、ＲＡ対照群では正常対照群に比べて−４３．００％の変化を示し、ジクロフェナクナトリウム、ポリカン２１．２５、４２．５、および８５ｍｇ／ｋｇ投与群ではＲＡ対照群に比べて３８．７５、０．６７、１４．０８、および３６．６４％の変化をそれぞれ示した。
下記表３を参照すれば、処理群はリューマチ対照群（ＲＡ対照群）に比べてＳａｆｒａｎｉｎ値およびｅｒｏｓｉｏｎ値は減少する傾向を示し、脛骨関節軟骨の厚さは増加することが分かる。また、下記表は１６関節の±ＳＤで示し、ｐ＜０．０１および＊＊ｐ＜０．０５でＳｈａｍ対照群と比較した。†ｐ＜０．０１リューマチ関節炎対照群（ＲＡ対照群）と比較した。
【００９５】
【表４】
2013526515.tif 000007
【００９６】
実験例４−‘β−１，３−１，６−分岐Ｄ−グルカン’（ポリカンＴＭ）の毒性実験
実験例４−１：マウス準備
６週齢の雄ＩＣＲマウスと雌ＩＣＲマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｊａｐａｎ）それぞれ２０匹を準備した。前記マウスを２０〜２５℃の温度、３０〜３５％の湿度でポリカーボネートケージごとに５匹ずつ置いた。昼と夜のサイクルを１２時間：１２時間とした。さらに、制限をおかずに水を供給し、すべてのネズミは犠牲前まで夜間は食事を与えなかった。
【００９７】
実験例４−２：試験物および配合
ポリカンＴＭ（Ｇｌｕｃａｎ  Ｃｏｒｐ．Ｌｔｄ．，Ｋｏｒｅａ）は茶色を帯びた粘液質であるが、均一な溶液である。前記ポリカンを４℃の冷蔵室に保管した。雄および雌マウスのグループごとに、それぞれ１０００、５００、および２５０ｍｇ／ｋｇで試験物を経口投与した。マウスは下記表５のようにグループ分けして番号を付けた。
【００９８】
【表５】
2013526515.tif 000008
【００９９】
実験例４−３：統計学的分析
ＬＤ５０は、Ｐｒｏｂｉｔ方法によって計算された。統計学的分析は、Ｗｉｎｄｏｗに使用されるＳＰＳＳ（Ｒｅｌｅａｓｅ  ６．１．３，ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を使用して行われた。
【０１００】
実験例４−４：結果
表５に示す条件のように、それぞれの投与量を異にして経口投与したすべてのマウスの日経過による生存率を下記表６に示した。
【０１０１】
【表６】
2013526515.tif 000009
【０１０２】
表６を詳察すれば、前記雌と雄マウスがすべて生き残ったことが分かる。したがって、ポリカンを経口投与した後の雌および雄マウスすべてのＬＤ５０および近似値ＬＤは、１０００ｍｇ／ｋｇを越えるものと算定された。
本発明は、上述した実施形態および添付の図面によって限定されることはなく、添付する特許請求の範囲によってその範囲が定められる。したがって、特許請求の範囲に記載された本発明の技術的な思想を逸脱しない範囲内で、当技術分野の通常の知識を有する者によって多様な形態の置換、変形、および変更が可能であり、これも本発明の範囲に属する。
【図７】
2013526515.tif 000011
【図８】
2013526515.tif 000012
【図９】
2013526515.tif 000013
【図１０】
2013526515.tif 000014
【図１】
2013526515.tif 000015
【図２】
2013526515.tif 000016
【図３】
2013526515.tif 000017
【図４】
2013526515.tif 000018
【図５】
2013526515.tif 000019
【図６】
2013526515.tif 000020
【国際調査報告】
2013526515.tif 000021
2013526515.tif 000022
2013526515.tif 000023
2013526515.tif 000024
2013526515.tif 000025
2013526515.tif 000026