(57)【要約】イムノアッセイの反応性を制御するための方法および組成物を提供する。一つの態様において、試薬および中性物質を含む組成物が基質に対して、該試薬および該中性物質を該基質にカップリングさせるのに適した条件下で適用される、イムノアッセイのための基質を調製するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、イムノアッセイのための基質を調製するための方法：
（a）試薬および中性物質を含む組成物を得る工程；ならびに
（b）該試薬および該中性物質を基質にカップリングさせるのに適した条件下で該組成物を該基質に適用する工程。
【請求項２】
前記試薬が抗体または抗原である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記中性物質が関連性のない種の抗体または血清アルブミンである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記基質が粒子またはウェル表面である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記粒子がミクロスフェアである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
前記組成物中の試薬対中性物質の比率が約1：120から6：1である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記試薬および前記中性物質が共有結合により前記基質にカップリングする、請求項1記載の方法。
【請求項８】
共有結合により表面にカップリングした試薬および中性物質を有する、ミクロスフェア。
【請求項９】
前記試薬が抗体または抗原である、請求項8記載のミクロスフェア。
【請求項１０】
前記中性物質が関連性のない種の抗体または血清アルブミンである、請求項8記載のミクロスフェア。
【請求項１１】
前記試薬対中性物質の比率が約1：120から6：1である、請求項8記載のミクロスフェア。
【請求項１２】
磁気的に反応性である、請求項8記載のミクロスフェア。
【請求項１３】
一つまたは複数の蛍光色素を含む、請求項8記載のミクロスフェア。
【請求項１４】
共有結合によりウェルの表面にカップリングした試薬および中性物質を有するウェルを含む、プレート。
【請求項１５】
前記試薬が抗体または抗原である、請求項14記載のウェル。
【請求項１６】
前記中性物質が関連性のない種の抗体または血清アルブミンである、請求項14記載のウェル。
【請求項１７】
前記試薬対中性物質の比率が約1:120から6：1である、請求項14記載のウェル。
【請求項１８】
以下の工程を含む、多重イムノアッセイにおいて試薬の反応性を制御する方法：
（a）多重イムノアッセイにおいて高反応性を有し、該多重イムノアッセイのための最大使用可能シグナルを上回るアッセイシグナルをもたらす試薬を同定する、工程；
（b）該高反応性試薬を組成物中で中性物質と組み合わせる工程；
（c）該高反応性試薬および該中性物質を基質にカップリングさせるのに適した条件下で該組成物を該基質に適用する工程；ならびに
（d）該中性物質と共に該基質にコカップリングした該高反応性試薬のアッセイシグナルが該多重イムノアッセイのための使用可能なシグナル範囲内であることを確認する工程。
【請求項１９】
前記多重イムノアッセイにおいて高反応性を有する二つまたはそれよりも多い試薬の前記反応性を制御する工程を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記アッセイシグナルが化学発光シグナルまたは蛍光シグナルである、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
前記高反応性試薬が抗体または抗原である、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
前記中性物質が関連性のない種の抗体または血清アルブミンである、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
前記基質が粒子またはウェル表面である、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
前記粒子がミクロスフェアである、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物中の高反応性試薬対中性物質の比率が約1：120から6：1である、請求項18記載の方法。
【請求項２６】
前記高反応性試薬および前記中性物質が共有結合により前記基質にカップリングする、請求項18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2010年7月23日付けで提出されて、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第61/367,281号に対する優先権の恩典を主張する。
【０００２】
発明の背景
A．発明の分野
本発明は一般に分子生物学の分野に関する。より具体的には、イムノアッセイに関連する方法および組成物に関する。特定の態様において、本発明は、イムノアッセイにおいて反応性を制御するためのコカップリング用の試薬に関する。
【背景技術】
【０００３】
B．関連する技術分野の説明
イムノアッセイにおいて産生されるシグナル（例えば、蛍光、化学発光、放射能）の量は、検出装置のために使用可能な範囲内であること、および／または、イムノアッセイのために許容可能な用量反応曲線を作成することが望ましい。1つの分析物を対象とする分析である一重（singleplex）のアッセイでは、産生されるシグナルの量は、典型的にはアッセイにおける分析物の量を調整することによって調整される。しかし、多重アッセイでは、1つの分析物の量を、その検出可能シグナルが最低使用可能レベルを上回るように増加させることにより、別の分析物の検出可能シグナルが、最大使用可能レベルを超えるまで上昇する可能性があるため、すべての分析物の量を適切に調整することが不可能な場合がある。同様に、ある分析物の量を、その検出可能レベルが最大使用可能レベルを下回るようにまたは許容可能な用量反応曲線が得られるように低下させることにより、別の分析物の検出可能シグナルが最低使用可能レベルを下回るまで低下する可能性がある。
【０００４】
多重アッセイにおけるイムノアッセイの反応性を制御するための方法は、アッセイの後期段階で用いられる試薬の制御に着目していることが多い。一般に、これはビオチン基または別の官能基が付着した「検出」抗体である。官能基は、ELISAおよびその他の一重アッセイで広く用いられる西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素であってもよい。ビオチンまたはR-フィコエリトリンは広く用いられる別の官能基の例である。しかし、分析物の濃度が高い場合、アッセイの後期段階で用いられる試薬を制御することには、信頼性の低い情報を提供するリスクがある。同一の生物学的試料中の異なる分析物の濃度は1,000倍を超えて異なることがある。例えば、TSHは通常、pg/mlであり、LHおよびFSHはng/mlである。別の例として、23トリソミーのダウン症候群について調べる際にはhCG、E3およびAFPが測定される。HCGはmg/mLであり、E3はng/mLであり、AFPはpg/mLである。これは対数で8の濃度差であり、多重実施を困難にする。いくつかのケースでは、異なる試料間で、同一の分析物について1,000倍を超える差があることがある（例えば、hCGは通常はng/mlであり、妊娠中はmg/mlに増加する）。従って、極めて高濃度の分析物の存在下および著しく異なる濃度の分析物を含有する試料では、制御された反応性およびバランスのとれた測定を提供可能な方法および組成物が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
一つの態様において、本発明は、以下の工程を含む、イムノアッセイのための基質を調製するための方法を提供する：（a）試薬および中性物質を含む組成物を得る工程；および（b）試薬および中性物質が基質にカップリングまたは該基質をコーティングするのに適した条件下で、該組成物を基質に適用する工程。別の態様において、本発明は試薬および中性物質がカップリングまたはコーティングする基質を提供する。本発明のある局面において、試薬および中性物質は共有結合により基質にカップリングする。さらなる態様において、本発明は基質、試薬および中性物質を含むキットを提供する。基質、試薬および中性物質はキット内で別々に包装されてもよく、または、試薬および中性物質は一つの組成物として一緒に提供されてもよく、または試薬および中性物質は基質にカップリングされるかもしくは基質にコーティングされて提供されてもよい。
【０００６】
一つの態様において、本発明は、以下の工程を含む、多重イムノアッセイにおいて試薬の反応性を制御する方法を提供する：（a）高反応性試薬を組成物中で中性物質と組み合わせる工程；および（b）該高反応性試薬および該中性物質を基質にカップリングさせるのに適した条件下で該組成物を基質に適用する工程。ある態様において、方法は、中性物質と共に基質にコカップリングした高反応性試薬のアッセイシグナルが多重イムノアッセイのための使用可能なシグナル範囲内であることを確認する工程をさらに含む。
【０００７】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、多重イムノアッセイにおいて試薬の反応性を制御する方法を提供する：（a）多重イムノアッセイにおいて高反応性を有し、該多重イムノアッセイのための最大使用可能シグナルを上回るアッセイシグナルをもたらす試薬を同定する、工程；（b）高反応性試薬を組成物中で中性物質と組み合わせる工程；（c）高反応性試薬および中性物質を基質にカップリングさせるのに適した条件下で該組成物を基質に適用する工程；ならびに（d）中性物質と共に基質にコカップリングした該高反応性試薬のアッセイシグナルが多重イムノアッセイのための使用可能なシグナル範囲内であることを確認する工程。
【０００８】
本発明のある局面において、方法は多重イムノアッセイにおいて高反応性を有する二つまたはそれよりも多い試薬の反応性を制御する工程を含む。いくつかの態様において、多重アッセイは2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、200、500、1000、2000またはそれよりも多い試薬を含み、これらの試薬の内の1つのサブセットは、多重イムノアッセイにおいて高反応性を有する。いくつかの態様において、多重アッセイは2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000種のまたはそれから導き出せる任意の範囲の試薬を含み、これらの試薬の内の1つのサブセットは、多重イムノアッセイにおいて高反応性を有する。本発明のある局面において、方法は多重イムノアッセイにおいて高反応性を有する3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100またはそれよりも多い試薬の反応性を制御する工程を含む。いくつかの局面において、方法は、多重イムノアッセイにおいて高反応性を有する2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000種のまたはそれから導き出せる任意の範囲の試薬の反応性を制御する工程を含む。当技術分野では様々な検出技術が公知であり、アッセイシグナルを発生させるために用いることができる。いくつかの態様において、アッセイシグナルは化学発光シグナルまたは蛍光シグナルである。その他の態様において、シグナルは比色シグナルまたは放射性シグナルである。使用可能な範囲とは、結果またはシグナルが信頼可能であるような特定の限度内に誤差がある、値のセットを指す。
【０００９】
本明細書で用いられる「多重」または文法上の相当語句は、試料当たり二つ以上の関心対象の標的分析物の並行した検出、分析または増幅を指す。多数の異なる分析物の分析（多重）は同時に実施してもよい。検出はウェルプレートおよびビーズアレイを含む様々なプラットフォームで実施されるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
基質は、免疫検出法で用いられ得る任意の基質であってよい。このような基質の非限定的な例には、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルまたはミクロスフェアが含まれる。基質は、例えば、ニトロセルロース、ナイロン膜、ガラス、活性石英、活性化ガラス、シリカ、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜、ポリスチレン基質、ポリアクリルアミドベースの基質、その他のポリマー、コポリマー、またはポリ（塩化ビニル）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ジメチルシロキサン）、フォトポリマー（標的分子と共有結合を形成することができるニトレン、カルベンおよびケチルラジカルのような光反応性の種を含む）のような架橋ポリマーで作製され得る。平面の固体支持体上に固定化された分子は、典型的には支持体上でのそれらの空間的な位置によって同定される。ミクロスフェア（「ビーズ」）のような非平面的な固体支持体上に固定された分子は、しばしば、後述のように、支持体のいくつかのコード化形態によって同定される。
【００１１】
ビーズは、ビーズの一つの亜集団が別の亜集団と区別できるようにコード化され得る。コード化は様々な技術によって行うことができる。例えば、ビーズは異なる発光スペクトルおよび／または異なるシグナル強度を有する蛍光色素で蛍光標識することができる。ある態様において、ビーズはLuminex MagPlex（登録商標）ミクロスフェア、Luminex xTAG（登録商標）ミクロスフェア、Luminex SeroMap（商標）ミクロスフェア、またはLuminex MicroPlex（登録商標）ミクロスフェアである。別のコード化技術は、ホログラムでコード化したまたはバーコードを付けたビーズを使用する。一つの亜集団をもう一つと区別するために、亜集団のビーズのサイズも使用することができる。ビーズを修飾する別の方法は、Fe3O4のような磁気的に反応性の物質を構造内に組み入れることである。常磁性および超常磁性のミクロスフェアは磁場の非存在下ではほとんど磁性を有さないが、磁場を印加すると該ミクロスフェア内の磁区の整列が誘導され、その結果、ミクロスフェアが磁場源に引き寄せられる。蛍光色素、ビーズサイズ、および／または磁気的に反応性の物質のビーズ内への組み込みの組み合わせは、作出され得るビーズの異なる亜集団の数をさらに増加させることができる。
【００１２】
試薬とは、他の物質についての試験または他の物質との反応において用いられる物質を指す。試薬が反応する物質は、分析物と呼ばれ得る。分析物は検出および／または定量される任意の物質であり得る。分析物は、体液（全血、血清、唾液、尿、精液を含むが、これらに限定されない）または環境試料（水または土壌を含むが、これらに限定されない）などの試料中に存在し得る。特定の態様において、分析物は抗原または抗体である。分析物は、例えば、タンパク質、脂質、炭水化物または核酸であり得る。いくつかの態様において、試薬は抗原、抗体、アプタマーまたはオリゴヌクレオチドである。本発明のいくつかの局面において、試薬は、低分子標的が付着しているタンパク質であり、よってこれを、該低分子を測定するためにイムノアッセイで用いることができる。例えば、ステロイド、低分子ホルモン、またはその他の低分子をBSAに付着させ、基質にカップリングさせることができる。これらの例は、プロゲスチン分子、エストロゲン分子、および甲状腺ホルモン分子である。これらのタンパク質、もっとも一般的には、低分子がカップリングしているBSAは、それ自体がそのままミクロスフェアにカップリングすることができ、または、これらの分子の多くがカップリングしていないBSAでみられるように中性物質と共にコカップリングすることができる。
【００１３】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、IgY、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEのような任意の免疫学的結合物質、ならびにそれらの抗原結合断片を広く意味することを意図する。いくつかの態様において、抗体は、例えば、B型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza type b）（Hib）の多糖類、ならびに破傷風菌（Clostridium tetani）（Tet）およびジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae ）（Dip）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、髄膜炎菌（Meningoccus）、ポリオ、ジフテリア、破傷風、HIV、HBV、HCVのトキソイドに対する抗体であり得る。
【００１４】
一つの態様において、試薬はニワトリIgYを認識するように開発されたウサギポリクローナル抗体である。ある局面において、検出試薬であるR-フィコエリトリンにカップリングしたストレプトアビジン分子と反応することを可能にするために、ウサギ抗ニワトリ抗体は、それにカップリングしたビオチンを有する。いくつかの局面において、ウサギポリクローナル抗体はミクロスフェアにカップリングさせる。
【００１５】
別の態様において、試薬は甲状腺刺激ホルモン（TSH）を認識するように開発されたマウスモノクローナル抗体である。
【００１６】
いくつかの態様において、試薬または分析物はタンパク質であってよい。いくつかの態様において、タンパク質は、例えば、IgY、インスリン、TSH、破傷風の毒素またはトキソイド、ジフテリアの毒素またはトキソイド、下垂体ホルモン、トリプシンまたはトリプシノーゲンであってよい。ある局面において、IgYは、動物に感染したかまたは感染した疑いのある、疾病を引き起こす生物（例えば、ウイルスまたは細菌）に対して反応性である。感染した動物とは、例えば、哺乳類、げっ歯類および鳥類を含む脊椎動物であり得る。動物はヒトであり得る。本発明の様々な態様において、分析物とは、感染、感染性物質（例えば、ウイルス、細菌、真菌）、またはプリオンに対する抗体である。
【００１７】
中性物質とは、アッセイにおける試薬および試料に関して抗原性に中性である物質である。特定の態様において、中性物質は血清アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（BSA））、カゼイン、または関連性のない種の抗体などの非特異的なタンパク質である。試薬および中性物質はそれらを基質にカップリングまたはコーティングする前に混合されるので、該試薬および該中性物質は同一基質または基質の同一領域にコカップリングまたはココーティングされる。例えば、基質がビーズである場合、試薬および中性物質の混合物を同一のビーズにカップリングする。基質がウェルである場合、試薬および中性物質の混合物を同一ウェルの表面に対してカップリングまたはコーティングする。試薬／中性物質混合物の最初のカップリングまたはコーティングに続いて、該基質の残った全ての有効な表面を「コーティング」するために、さらなる中性物質を加えてもよい。このコーティングは、固定化する表面上の非特異的な吸着部位の遮断を可能にし、従って、非特異的な結合によって惹起されるバックグラウンドを低下させる。
【００１８】
試料は関心対象の異なる分析物の様々な濃度を含有してもよい。従って、各分析物からアッセイに使用可能なシグナル範囲内のアッセイシグナルを得ることが、多重アッセイにおける課題であり得る。例えば、最初の分析物のアッセイシグナルがアッセイのための最大使用可能シグナルを上回る場合、試料を希釈することによってこれを補正することが可能であるとは限らない。なぜなら、二番目の分析物のアッセイシグナルが該アッセイのための最低使用可能シグナルを下回る可能性があるからである。本明細書に開示される方法および組成物は、試薬および中性物質のコカップリングによって、アッセイの試薬の面でこの課題に対処する。カップリングに用いられる組成物中の試薬対中性物質の比率は所望のアッセイシグナルを得るために必要に応じて調整することができる。ある態様において、組成物中の試薬対中性物質の比率は、約1：1,000、1：500、1：200、1：100、1：120、1：100、1：80、1：60、1：40、1：20、1：10、1：5、1：2、1：1、2：1、4：1、6：1、8：1、10：1、もしくは20：1、またはそれらより導かれ得る任意の範囲である。例えば、該範囲は約1：120〜6：1、1：120〜1：60、または1：60〜6：1の間であり得る。基質にカップリングする試薬対中性物質の比率は所望のアッセイシグナルを得るために必要に応じて調整してよい。ある態様において、基質にカップリングする試薬対中性物質の比率は、約1：1,000、1：500、1：200、1：100、1：120、1：100、1：80、1：60、1：40、1：20、1：10、1：5、1：2、1：1、2：1、4：1、6：1、8：1、10：1、もしくは20：1、またはそれらより導かれ得る任意の範囲である。例えば、該範囲は約1：120〜6：1、1：120〜1：60、または1：60〜6：1の間であり得る。
【００１９】
本明細書に記載される任意の方法または組成物は、本明細書に記載されるその他の任意の方法または組成物に関して実施できることが意図される。
【００２０】
添付の特許請求の範囲において「または」という用語は、二者択一のみを指すことが明確に示されない限り、または二者択一が相互に排他的である場合を除いて、「および／または」を意味するために用いられるが、本開示では二者択一および「および／または」を指すという定義を支持する。
【００２１】
本出願を通じて、「約」という用語は、ある値が、該値を測定するために用いられる装置または方法についての誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。
【００２２】
長年にわたる特許法に従って、特記する場合を除き、「一つの（a）」および「一つの（an）」という語は、添付の特許請求の範囲または明細書において「含む（comprising）」という語と組み合わせて用いられる場合、一つまたは複数を示す。
【００２３】
「含む（comprise）」（ならびに「含む（comprises）」および「含んでいる（comprising）」のような、含む（comprise）の任意の形）、「有する（have）」（ならびに「有する（has）」および「有している（having）」のような、有する（have）の任意の形、「含有する（contain）」（ならびに「含有する（contains）」および「含有している（containing）」のような、含有する（contain）の任意の形）、ならびに「包含する（include）」（ならびに「包含する（includes）」および「包含している（including）」のような、包含する（include）の任意の形）は制約のない連結動詞である。その結果、一つまたは複数の列記される工程または要素を「含む」、「有する」、「含有する」、または「包含する」方法、組成物、キット、またはシステムはそれらの列記される工程または要素を保有するが、それらの工程または要素しか保有しないと限定されるわけではない；それは、列記されていない要素または工程を保有する（即ち、網羅する）ことができる。同様に、一つまたは複数の列記された特徴を「含む」、「有する」、「含有する」、または「包含する」方法、組成物、キット、またはシステムの要素はそれらの特徴を保有するが、それらの特徴しか保有しないと限定されるわけではない；それは、列記されていない特徴を有し得る。
【００２４】
本方法、組成物、キット、およびシステムのうちいずれかの任意の態様は、記載された工程および／または特徴を、含む／包含する／含有する／有するというよりはむしろ、それらからなり得る、またはそれらから本質的になり得る。従って、任意の請求項において、所与の請求項の範囲を、制約のない連結動詞を用いるものから変更するために、上に列記した制約のない連結動詞のいずれかの代わりに、「〜からなる」または「〜から本質的になる」という用語を用いることができる。
【００２５】
本発明のその他の目的、特徴および利点は、次の詳細な説明から明らかとなる。しかし、当業者には詳細な説明から本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が明白となることから、本発明の具体的態様を示している詳細な説明および具体的な実施例は、例証としてのみ示されるものであることが理解されるべきである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
例証的態様の説明
本発明の態様は、アッセイの開始時にイムノアッセイの反応性を制御する方法および組成物を提供し、従って、分析物のもっとも高濃度での反応性を制御しつつ、測定のすべてのレベルについてバランスのとれた制御を提供する。上述のように、アッセイの後期段階で用いられる試薬の制御に着目した、イムノアッセイの反応性を制御するための従来の方法は、分析物の濃度が高い場合には、信頼できない情報をもたらしやすい。さらに、少量の試薬を固相物質に単純にカップリングさせることは可能ではあるが、以下に説明する試験により、このアプローチでは、不均一にカップリング／コーティングされた表面がもたらされ、これらは、本明細書に開示するコカップリングまたはココーティングのアプローチによって調製されたものよりも反応性の制御の点で効果が低いことが示される。なぜなら該アプローチは、反応性の制御およびカップリング／コーティングした表面の均一性の双方を提供するからである。
【００２７】
I．イムノアッセイ
本明細書に記載する方法および組成物は、イムノアッセイにおいて試薬の反応性を制御するために用いることができる。当業者は、以下に記載するものを含むがこれらに限定されない、イムノアッセイを実施するための様々な方法が存在することを理解する。
【００２８】
いくつかの免疫検出法は、いくつかを挙げると、酵素結合免疫測定法（ELISA）、放射イムノアッセイ（RIA）、免疫放射線測定法、蛍光免疫測定法、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、およびウエスタンブロットを含む。様々な有用な免疫検出法の工程が、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、Doolittle and Ben-Zeev, 1999；Gulbis and Galand, 1993；De Jager et al., 1993；およびNakamura et al., 1987などの科学文献に記載されている。
【００２９】
選択した生物学的試料を、免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にするのに十分な期間、有効な条件下で抗体と接触させるとは一般に、単に抗体組成物を試料に添加して、該抗体が、存在する任意の抗原と免疫複合体を形成するのに、即ち結合するのに十分な期間、該混合物をインキュベーションすることである。この時間の後、組織切片、ELISAプレート、ドットブロットまたはウェスタンブロットのような試料−抗体組成物を一般に、任意の非特異的に結合した抗体種を除去するために洗浄し、これによって一次免疫複合体内で特異的に結合した抗体のみを検出することが可能となる。
【００３０】
一般に、免疫複合体形成の検出は当技術分野において周知であり、多くのアプローチの適用によって達成することができる。これらの方法は一般に、放射性タグ、蛍光タグ、生物学的タグ、および酵素的タグのいずれかのように、標識またはマーカーの検出に基づく。このような標識の使用に関する特許には、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、同第3,939,350号、同第3,996,345号、同第4,277,437号、同第4,275,149号、および同第4,366,241号が含まれる。勿論、当技術分野において公知の通り、二次抗体および／またはビオチン／アビジンリガンド結合配置のような二次的な結合リガンドの使用を介して、さらなる利点が見出され得る。高濃度の分析物の存在下では、免疫複合体によって産生される検出可能シグナルの量は検出装置のための最大使用可能範囲を超える可能性がある。従って、本発明の態様は、イムノアッセイの反応性を制御し、かつ従って、分析物の最高濃度における反応性を制御できて、それによって、免疫複合体によって産生される検出可能シグナルが、検出装置について使用可能なシグナル範囲内および規制当局によって定められた許容範囲内に収まる、方法および組成物を提供する。
【００３１】
検出において用いられる選択的な抗体は、検出可能な標識にそれ自体が連結し得、当業者は次に、この標識を検出するだけでよく、それによって、組成物中の一次免疫複合体の量が測定可能となる。または、一次免疫複合体内で結合型となる最初の抗体を、該抗体に対して結合親和性を有する第二の結合リガンドによって検出することができる。これらの場合、第二の結合リガンドは検出可能な標識に連結してもよい。第二の結合リガンドはそれ自体が抗体であることが多く、従って「二次」抗体と呼ばれ得る。一次免疫複合体は、二次免疫複合体の形成を可能にするのに十分な時間、有効な条件下で、標識された第二の結合リガンドまたは抗体と接触させる。続いて、二次免疫複合体は一般に、非特異的に結合した標識二次抗体またはリガンドを除去するために洗浄され、その後、二次免疫複合体において残った標識が検出される。
【００３２】
さらなる方法には、二段階アプローチによる一次免疫複合体の検出が含まれる。上記のように、二次免疫複合体を形成するために、抗体に対して結合親和性を有する第二の結合リガンド、例えば抗体が用いられる。洗浄後、二次免疫複合体を、同じく免疫複合体（三次免疫複合体）の形成を可能にするのに十分な期間、有効な条件下で、第二の抗体に対して結合親和性を有する第三の結合リガンドまたは抗体と接触させてもよい。第三のリガンドまたは抗体は典型的には、検出可能な標識に連結し、従って、このように形成される三次免疫複合体の検出を可能にする。望ましい場合、このシステムは、シグナルの増幅を提供し得る。
【００３３】
上記に詳述するイムノアッセイとは、そのもっとも単純かつ／または直接的な意味において、抗体結合アッセイである。ある好ましいイムノアッセイとは、当技術分野において公知の様々なタイプの酵素結合免疫測定法（ELISA）および／または放射イムノアッセイ（RIA）である。
【００３４】
一つの例示的なELISAにおいて、選択的抗体を、タンパク質親和性を示す選択された表面、例えばポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルに固定化する。続いて、臨床試料のような、抗原を含むことが疑われる試験組成物をウェルに加える。結合および／または、非特異的に結合した免疫複合体を除去するための洗浄の後、結合した抗原が検出され得る。検出は一般に、検出可能な標識に連結した別の抗体の添加によって達成される。このタイプのELISAは単純な「サンドウィッチELISA」である。検出は、第二の選択的抗体の添加によって、および続いて第二の抗体に対して結合親和性を有する第三の抗体の添加によって達成することも可能であり、第三の抗体は検出可能な標識に連結する。
【００３５】
抗原が固定化される別のELISAは、検出における抗体競合の使用を伴う。このELISAでは、抗原に対する標識抗体をウェルに加えて結合させ、かつ／またはその標識によって検出する。次に、未知の試料中の抗原の量を、コーティングしたウェルを用いるインキュベーション期間中に試料と抗原に対する標識抗体とを混合することにより測定する。試料中の抗原の存在は、ウェルへの結合に利用可能な抗原に対する抗体の量を減少させるように作用し、従って、最終的なシグナルの量を減少させる。これはまた、未知の試料中の抗原に対する抗体の検出にも適しており、ここで、未標識の抗体は抗原でコーティングされたウェルに結合し、同じく、標識された抗体を結合させるのに利用可能な抗原の量を減少させる。
【００３６】
用いられる様式に関わらず、ELISAは、コーティング、インキュベーションおよび結合、非特異的に結合した化学種を除去するための洗浄、ならびに結合した免疫複合体の検出などの、共通の一定の特徴を有する。これらを以下に説明する。
【００３７】
抗原または抗体のいずれかを用いたプレートのコーティングにおいては、一般に、プレートのウェルに抗原または抗体の溶液を入れて、一晩または特定の期間、インキュベーションする。抗原または抗体が中性物質とコカップリングしている場合、プレートをコーティングするために抗原または抗体および中性物質を一緒にインキュベーションする。続いて、吸着が不完全な物質を除去するためにプレートのウェルを洗浄する。次に、ウェルの残った全ての有効な表面を、試験抗血清に関して抗原的に中性である非特異的なタンパク質で「コーティング」してもよい。これらには、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼインまたは粉乳溶液が含まれる。このコーティングによって、固定化する表面上の非特異的な吸着部位の遮断が可能になり、従って、表面に対する抗血清の非特異的な結合によって惹起されるバックグラウンドが低下する。コカップリング処理が実施された場合、「遮断」工程で同一の中性物質を使用してもよく、あるいは異なる中性物質を使用してもよい。
【００３８】
ELISAでは、直接的な手法よりも二次的または三次的な検出手段を用いることがより慣例的と思われる。従って、タンパク質または抗体のウェルへの結合、バックグランドを低下させるための非反応性物質によるコーティング、および未結合の物質を除去するための洗浄の後、免疫複合体（抗原／抗体）の形成を可能にするのに有効な条件下で固定化表面を試験対象である生物学的試料と接触させる。その後の免疫複合体の検出には、標識された二次的な結合リガンドまたは抗体、および、標識された三次抗体または第三の結合リガンドと組み合わせた二次的な結合リガンドまたは抗体が必要である。
【００３９】
「免疫複合体（抗原／抗体）の形成を可能にするのに有効な条件下」とは、該条件が、好ましくはBSA、ウシγグロブリン（BGG）またはリン酸緩衝生理食塩液（PBS）／Tweenなどの溶液で反応物を希釈する工程を含むことを意味する。これらの添加される物質は、非特異的なバックグラウンドの低下に役立つ傾向もある。「適切な」条件とは、インキュベーションが効果的な結合を可能にするのに十分な温度または期間で行われることも意味する。インキュベーション工程は典型的には約1時間から2〜4時間などであり、温度は好ましくは25℃〜27℃程度であり、または約4℃で一晩などであってもよい。
【００４０】
ELISAにおけるすべてのインキュベーション工程の後、複合体を形成していない物質を除去するために、接触させた表面を洗浄する。好ましい洗浄手順は、PBS/Tweenのような溶液またはホウ酸緩衝液で洗浄する工程を含む。試験試料と元々の結合物質の間の特異的な免疫複合体の形成、および引き続く洗浄の後に、ごく少量の免疫複合体の存在を測定することができる。
【００４１】
検出手段を提供するために、第二または第三の抗体に、検出を可能にするための標識を結合させる。好ましくは、これは適切な色素産生性物質とのインキュベーションにより発色する酵素である。従って望ましい場合、例えば、第一および第二の免疫複合体を、ウレアーゼと、グルコースオキシダーゼと、アルカリホスファターゼと、または水素ペルオキシダーゼと結合した抗体と、さらなる免疫複合体の形成に有利な時間および条件下で（例えば、PBS-TweenのようなPBS含有溶液中で室温にて2時間のインキュベーション）接触またはインキュベーションさせる。
【００４２】
標識抗体とのインキュベーションおよび、未結合の物質を除去するための引き続く洗浄の後、例えば、酵素標識がペルオキシダーゼの場合は、尿素、またはブロモクレゾールパープル、または2,2'-アジノ-ジ-(3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸（ABTS）、またはH2O2のような色素生産性の基質とのインキュベーションによって、標識を定量する。続いて、定量は、例えば可視スペクトルの分光光度計を用いて、発生した色の程度を測定し、既知の量の分析物を用いて産生される同様の値に対して該値を関連付けることによって、達成される。
【００４３】
II．多重アッセイ
A．アレイ
本発明はアレイの使用を伴ってよい。アレイ技術は、遺伝子発現および分子相互作用に関する高処理スクリーニングを可能にする。タンパク質アレイ技術は、それぞれが参照により本明細書に具体的に組み入れられるPandey and Mann (2000)およびMacBeath and Schreiber (2000)で詳細に述べられている。これらのアレイは典型的に、スライドガラス上に滴下されたか小さなウェルに固定化された何千もの異なるタンパク質または抗体を含み、多数のタンパク質の生化学活性および結合プロフィールを一度に調べることを可能にする。このようなアレイを用いてタンパク質の相互作用を調べるために、標識したタンパク質を、アレイ上に固定化した各標的タンパク質とインキュベーションすることができる。続いて、標識分子が多くのタンパク質のうちどれに結合するのか、タンパク質の量もしくは濃度、またはタンパク質のその他の特性を調べるために、アレイを分析する。当業者は、アレイを分析するために利用可能な様々な方法を認識している。
【００４４】
1.  タンパク質バイオチップアッセイ
一般にバイオチップは、選択される検出方法によって位置特定可能であるような基質表面のそれぞれ別個の特定可能な位置に、捕捉分子（「試薬」）のアレイが付着している基質を含む。中性物質は、基質上の特定の位置における反応性を低下させるために、基質上の一つまたは複数の捕捉分子とコカップリングさせてよい。捕捉分子が分析試料に曝露されると、試料中の分析物は、それが親和性を有する表面上の捕捉分子に結合することができる。分析物分子と捕捉分子の間の捕捉または相互作用は、様々な任意の方法で検出または特徴決定される。このような検出または特徴決定の方法は当業者に公知であり、蛍光、発光、吸光度、反射率、透過光、または屈折率（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析、共鳴ミラー法、回折格子カプラー導波管（grating coupler waveguide）法または干渉法）、イムノアッセイ（例えば、ELISA）、気相イオン分光測光法、原子間力顕微鏡法または質量スペクトル、および、特に、SELDIを含むが、これらに限定されるものではない。試料中の分析物の定量は、適切な検出方法を選択することによって達成できる。
【００４５】
2.ビーズアレイ
ミクロスフェアに基づくアッセイは、フローシステムにおいて、またはビーズアレイプラットフォーム上で分析することもできる。一般に、ビーズアレイプラットフォームはアレイ上に分布したビーズおよび分析物を画像化する。この方法では、ビーズアレイの画像化は上記のチップと同様である。しかしながら、分析物がアレイ上の空間的な位置によって同定されるチップとは対照的に、ビーズアレイは典型的に、分析物が結合するコード化されたミクロスフェアによって、分析物を特定する。
【００４６】
例えば、参照によりいずれも本明細書に組み入れられるFulton et al, 1997, Clin. Chem. 43:1749-1756および米国特許第5,736,330号に開示されるように、Luminex（Austin, TX）は、それらの蛍光に従ってミクロスフェアをコード化するための方法を説明している。この方法論は、固有の蛍光プロフィールを有する蛍光ミクロスフェア（ビーズ）を異なる分析物特異的な結合剤に固定化でき、かつ、それぞれのビーズタイプが個別の分析物に対して特異的である分析物特異的なビーズの蛍光に基づくアレイを作出するために用いることができるという原理に基づく。この技術は、それぞれのビーズを独立に同定することを可能にする蛍光色素の組み合わせを採用する。分析物特異的なミクロスフェアを、異なる蛍光色で標識したプローブと一緒に混合して接触させる。プローブは、標識されたミクロスフェア上のそれらのリガンドまたはレセプターに結合し、各ビーズ表面における特異的な分子相互作用を測定するために用いられる。各ミクロスフェアの個別の同定、および対応するプローブ結合シグナルの読み取りを可能にするフローサイトメーターにおいて、試料を読み取ることができる。
【００４７】
ミクロスフェアは、共有結合により、表面のカルボキシル基を介して、実質的に任意のアミン含有分子にカップリングすることができる。または、アビジンがカップリングしたミクロスフェアを、ビオチン標識した分子を固定化するために利用できる（Fulton et al, 1997, Clin. Chem. 43: 1749-1756）。
【００４８】
市販のビーズアレイのその他の例にはIlluminaのBeadXpress（商標）ReaderおよびBeadStation 500（商標）が含まれる。
【００４９】
3.抗体マイクロアレイ
抗体マイクロアレイはタンパク質マイクロアレイの特別な型である。抗体マイクロアレイは細胞溶解物からのタンパク質の発現を検出するための一般研究で用いられることが多く、診断用途、例えば、血清または尿からの特別なバイオマーカーの検出のために用いられ得る。
【実施例】
【００５０】
III．実施例
以下の実施例は本発明の好ましい態様を示すために含まれる。当業者は、下記の実施例に開示される技術は、本発明者らによって発見された技術が本発明の実践において十分に機能すると示すものであり、かつ従って、その実践のための好ましい形態を構成すると考えられ得ることを認識すべきである。しかし、当業者は本開示に照らして、開示される具体的態様において多くの変更を行うことが可能であり、かつさらに、本発明の精神および範囲から逸脱することなく類似または同様の結果が得られることを認識すべきである。
【００５１】
実施例1−コカップリング手順
Luminexミクロスフェアの濃縮：
Luminexミクロスフェアとカップリングさせるために活性試薬を中性物質と混合することの利点の評価は、5000万個のLuminex MagPlex（登録商標）ミクロスフェアを用いて実施された。MagPlex（登録商標）ミクロスフェアを、磁気分離装置を用いて1.5mL微小遠心管内で0.5mLに濃縮した。この洗浄手順において、MagPlex（登録商標）ミクロスフェアは磁気表面によって微小遠心管の側面に引き寄せられ、これにより、微小遠心管からの上清の効率的な除去が可能になった。微小遠心管内のMagPlex（登録商標）ミクロスフェアを、活性化緩衝液（0.1M 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ヘミナトリウム塩、(MES)緩衝液、pH 6.2）で2回洗浄した。
【００５２】
Luminexミクロスフェアの活性化：
活性化緩衝液 0.4mLを活性化のために各微小遠心管に加えた。スルホ-NHS（N-ヒドロキシスルホスクシンイミド）およびEDC（1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩）を50mg/mLの濃度で調製した。ミクロスフェアを超音波処理および強振盪で懸濁した直後に、活性化のために、5000万個のMagPlex（登録商標）ミクロスフェアを含む各微小遠心管に0.05mLのスルホ-NHSおよびEDC（それぞれ2.5mg）を加えた。ミクロスフェアを再度懸濁して、微小遠心管を、活性化反応中にミクロスフェアを撹拌するために回転器に載せた。20分後、微小遠心管を回収した。
【００５３】
活性化後、余剰なスルホ-NHSおよびEDCを除去するために、活性化ミクロスフェアをカップリング緩衝液（0.1M 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ヘミナトリウム塩（MES）緩衝液、pH 5.0）で2回洗浄した。カップリング緩衝液 1.0mLを5000万個のミクロスフェアを含む各微小遠心管に加えた。
【００５４】
Luminexミクロスフェアへのタンパク質のカップリング：
カップリング緩衝液中の洗浄したMagPlex（登録商標）ミクロスフェアにタンパク質を加えた。以下の実施例においてより詳細に述べる通り、活性化MagPlex（登録商標）ミクロスフェアにカップリングさせるために、活性試薬タンパク質（家禽血清学的アッセイ用のウサギポリクローナル抗ニワトリIgY抗体または精製ニワトリIgY；あるいは、新規アッセイ用のマウスモノクローナル抗甲状腺刺激ホルモン抗体）の異なる量を、中性物質（精製ウサギIgGまたは精製ウシIgG）と混合した。
【００５５】
実施例2−ニワトリIgYまたはウサギ抗ニワトリIgYとウサギIgGとのコカップリングは家禽血清学的アッセイにおける内部対照の機能を向上させる
材料：
様々な領域のためのLuminex MagPlex（登録商標）ミクロスフェア
ウサギ抗ニワトリIgY 2.4mg/mL−MagPlex（登録商標）ミクロスフェアにカップリングした試薬
ニワトリIgY 5.7mg/mL−MagPlex（登録商標）ミクロスフェアにカップリングした試薬
精製ウサギIgG 5.0mg/mL−MagPlex（登録商標）ミクロスフェアにカップリングした中性物質
ビオチン化ウサギ抗ニワトリIgYアッセイ試薬
ストレプトアビジン-R-フィコエリトリンアッセイ試薬
PBS-BSA緩衝液
PBS-Tween、BSA緩衝液
【００５６】
手順および観察：
家禽血清学的アッセイの内部対照のための最初の試薬カップリング要件：
家禽血清学的アッセイにおける内部対照とするために、ウサギ抗ニワトリIgYタンパク質およびニワトリIgYタンパク質をMagPlex（登録商標）ミクロスフェアにカップリングさせた。ウサギ抗ニワトリIgYとカップリングしたミクロスフェアは、IgYを含むニワトリ血清試料がアッセイに添加されていたことを示すために使用した。ニワトリIgYとカップリングしたミクロスフェアは、検出抗体であるビオチン化ウサギ抗ニワトリIgYがアッセイに添加されていたことを示すために使用した。
【００５７】
ウサギ抗ニワトリIgY 10μgおよびニワトリIgY 5μgを5000万個のMagPlex（登録商標）ミクロスフェアにカップリングさせた。試料希釈液（防腐剤としてProClin（登録商標）（2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン、5-クロロ-2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン、および1,2-ベンズイソチアゾリン-3-オン））を含むウシおよびブタタンパク質）で1：500に希釈したニワトリ血清の試料を、捕捉試薬（上記のようにミクロスフェアにカップリングさせた、ウサギ抗ニワトリIgYまたはニワトリIgYのタンパク質）を含むマイクロタイタープレートのウェルに加えた。試料と捕捉試薬をインキュベーションした後、捕捉試薬をウェル内に保持しながら、未反応の試料を除去するためにマイクロタイタープレートを洗浄した。続いて、検出試薬（ビオチン化ウサギ抗ニワトリIgY）を加えた。この検出試薬と共にインキュベーションした後、未反応の検出試薬を除去するためにマイクロタイタープレートを洗浄した。その後、レポーター試薬を加えた。このレポーター試薬（ストレプトアビジン-R-フィコエリトリン）と共にインキュベーションした後、未反応のレポーター試薬を除去するためにマイクロタイタープレートを洗浄した。緩衝液をウェルに加えて、内容物をLuminex LX200（商標）装置で測定した。発生したシグナルはLuminex LX200（商標）装置における23,000〜44,000 MFI当量の範囲内であると判定された。これは、最大使用可能シグナルが約20,000 MFIであるLX200（商標）装置のための使用可能な範囲を大きく上回る値であった。
【００５８】
アッセイにおける総MFI反応を減少させる試みのために、少量の2種類の試薬を5000万個のMagPlex（登録商標）ミクロスフェアにカップリングさせた。カップリングしたニワトリIgYの量は、1.68、1.24および0.84μgニワトリIgYであり、2.4、1.2、0.6μgウサギ抗ニワトリIgYであった。MFI反応は大半のカップリングにおいて25,000 MFIを上回る値のままであった。低下したシグナル（ある場合には15,000 MFI）が得られた場合もあったが、この最低シグナルは最少量の試薬にカップリングしたミクロスフェアに対応するものではなかった。別の場合には低下が観察されたが、結果は16,000から23,000 MFIまで大きく変動していた。反復実験では、8回の反復において様々な結果が得られて、変動係数は最大36％であった。従って、カップリング反応における試薬の量を単に減らすだけでは信頼性のあるデータは得られず、試薬の高反応性の抑制には有効ではないことが結論付けられた。
【００５９】
反応範囲が縮小された家禽血清学的アッセイの内部対照を調製するためのコカップリング：
試薬および中性物質を以下の1〜4群において記載する通りに混合して、上記の実施例1で記載した通りに5000万個のミクロスフェアにカップリングさせた。
1群−ウサギ抗ニワトリIgY抗体 2.5μgおよび精製ウサギIgG 147.5μgの混合物を、活性化MagPlex（登録商標）ミクロスフェアにカップリングさせた。
2群−ウサギ抗ニワトリIgY抗体 1.25μgおよび精製ウサギIgG 148.75μgの混合物を、活性化MagPlex（登録商標）ミクロスフェアにカップリングさせた。
3群−ニワトリIgY 2.5μgおよび精製ウサギIgG 147.5μgの混合物を、活性化MagPlex（登録商標）ミクロスフェアにカップリングさせた。
4群−ニワトリIgY 1.25μgおよび精製ウサギIgG 148.75μgの混合物を、活性化MagPlex（登録商標）ミクロスフェアにカップリングさせた。
【００６０】
試料希釈液で1：500希釈したニワトリ血清の試料を、1〜4群について記載した通りに捕捉試薬を含むマイクロタイタープレートのウェルに加えた。試料および捕捉試薬をインキュベーションした後、捕捉試薬をウェル内に保持しながら、未反応の試料を除去するためにマイクロタイタープレートを洗浄した。続いて、検出試薬（ビオチン化ウサギ抗ニワトリIgY）を加えた。この検出試薬と共にインキュベーションした後、未反応の検出試薬を除去するためにマイクロタイタープレートを洗浄した。次に、レポーター試薬（ストレプトアビジン-R-フィコエリトリン）を加えた。このレポーター試薬と共にインキュベーションした後、未反応のレポーター試薬を除去するためにマイクロタイタープレートを洗浄した。緩衝液をウェルに加えて、内容物をLuminex LX200（商標）装置で測定した。
【００６１】
上記の混合物を使用する目的は、Luminex LX200（商標）装置を用いたイムノアッセイ反応を20,000 MFI未満の値まで低下させることであった。これは4群のすべてで達成された。
1群−アッセイ反応は17,000 MFIであった。
2群−アッセイ反応は12,000 MFIであった。
3群−アッセイ反応は19,400 MFIであった。
4群−アッセイ反応は13,900 MFIであった。
【００６２】
従って、該アッセイにおいて、基質に対する中性物質（例えば、ウサギIgG）および活性試薬（ウサギポリクローナル抗ニワトリIgYまたは精製ニワトリIgY）のコカップリング  
【００６３】
実施例3−新規四重アッセイにおける試薬のコカップリング
マウスモノクローナル抗甲状腺刺激ホルモン抗体 300μgおよび精製ウシIgG 50μgの混合物を、上記の実施例1に記載する通り活性化MagPlex（登録商標）ミクロスフェアにカップリングさせた。ある容量の抽出した血液試料を、捕捉試薬（上記の通り、精製ウシIgGと共にMagPlex（登録商標）ミクロスフェアにコカップリングさせたマウスモノクローナル抗甲状腺刺激ホルモン抗体）を含むマイクロタイタープレートのウェルに加えた。検出試薬（ビオチン化マウスモノクローナル抗甲状腺刺激ホルモン抗体）もウェルに加えた。試料、捕捉試薬および検出試薬をインキュベーションした後、捕捉試薬がウェル内に保持しながら、未反応の試料および検出試薬を除去するためにマイクロタイタープレートを洗浄した。次に、レポーター試薬（ストレプトアビジン-R-フィコエリトリン）を加えた。このレポーター試薬と共にインキュベーションした後、未反応のレポーター試薬を除去するためにマイクロタイタープレートを洗浄した。緩衝液をウェルに加えて、内容物をLuminex LX200（商標）装置で測定した。これによりアッセイ反応は14,000 MFIとなり、これはTSHアッセイについての標準曲線の作製における使用に関して許容可能な範囲内である。
【００６４】
本明細書に開示されて特許請求されるすべての組成物および方法は、本開示に照らして必要以上の実験を行うことなく、作製および実施することができる。本発明の組成物および方法は好ましい態様の観点から説明されているが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、説明される方法の工程または一連の工程における組成物および方法に対して変更を加えることができることが明らかである。より具体的には、同一または同等の結果が得られつつ、化学的および生理学的な両面で関連する一部の物質を本明細書に述べられる物質に置き換えられることが明らかである。当業者に明白なこのような同等の置き換えおよび修正はすべて、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
【００６５】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されるものの追加となる例示的な手順またはその他の詳細を示すという範囲で、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
2013532821.tif 000002
【国際調査報告】
2013532821.tif 000003
2013532821.tif 000004
2013532821.tif 000005
2013532821.tif 000006