(57)【要約】  細胞移植片または組織移植片を必要としている対象を処置する方法が開示される。この方法は、以下の（ａ）、（ｂ）を含む：（ａ）非同系の細胞移植片または組織移植片を前記対象に移植すること、ただし、前記移植片は骨髄細胞またはリンパ系細胞を含む、および（ｂ）スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト、Ｂ７分子阻害剤およびＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤を含む、治療効果的な量の免疫抑制療法を前記対象に施し、それにより、前記対象を処置すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞移植片または組織移植片を必要としている対象を処置する方法であって、
（ａ）非同系の細胞移植片または組織移植片を前記対象に移植すること、ただし、前記移植片は骨髄細胞またはリンパ系細胞を含む、および
（ｂ）スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト、Ｂ７分子阻害剤およびＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤を含む、治療効果的な量の免疫抑制療法を前記対象に施し、それにより、前記対象を処置することを含む方法。
【請求項２】
前記免疫抑制療法は短期間の免疫抑制療法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）の前に、亜致死的、致死的または超致死量的な条件のもとで対象を状態調節することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記状態調節することは、骨髄機能非破壊的な状態調節を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記状態調節することはＴ細胞減量を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞減量は短期間のＴ細胞減量を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記状態調節することはアルキル化剤の投与を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記アルキル化剤はブスルファンを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
非同系の細胞移植片または組織移植片の移植片拒絶を対象において軽減させるための、スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト、Ｂ７分子阻害剤およびＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤の使用であって、前記移植片は骨髄細胞またはリンパ系細胞を含む、使用。
【請求項１０】
前記スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト、前記Ｂ７分子阻害剤および前記ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤が短期間の免疫抑制療法の一部として投与される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記骨髄細胞はＴ細胞枯渇化骨髄細胞を含む、請求項１に記載の方法または請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記骨髄細胞は造血系の前駆体細胞を含む、請求項１１に記載の方法または使用。
【請求項１３】
前記細胞移植片または組織移植片は実質臓器を含む、請求項１に記載の方法または請求項９に記載の使用。
【請求項１４】
前記スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニストがＦＴＹ７２０であり、前記Ｂ７分子阻害剤がＣＴＬＡ４−Ｉｇであり、前記ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤が可溶性ＣＤ５８−Ｉｇである、請求項１に記載の方法または請求項９に記載の使用。
【請求項１５】
前記ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤が、可溶性ＣＤ２タンパク質、可溶性ＣＤ５８タンパク質、抗ＣＤ２抗体および抗ＣＤ５８抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法または請求項９に記載の使用。
【請求項１６】
前記可溶性ＣＤ５８タンパク質は可溶性ＣＤ５８−Ｉｇを含む、請求項１５に記載の方法または使用。
【請求項１７】
前記スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト、前記Ｂ７分子阻害剤および前記ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤が同時に投与される、請求項１，９または１４に記載の方法または使用。
【請求項１８】
前記短期間の免疫抑制療法が移植後６ヶ月までの期間行われる、請求項２または１０に記載の方法または使用。
【請求項１９】
前記スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニストの投与が移植後４ヶ月で終了される、請求項１８に記載の方法または使用。
【請求項２０】
前記Ｂ７分子阻害剤および前記ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤の投与が移植後３ヶ月で終了される、請求項１８または１９に記載の方法または使用。
【請求項２１】
前記Ｂ７分子阻害剤および前記ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤の投与が、移植後２日毎に、６日目まで行われる、請求項１８，１９または２０に記載の方法または使用。
【請求項２２】
前記Ｂ７分子阻害剤および前記ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤の投与が、移植の６日目から９０日目まで週に１回行われる、請求項２１に記載の方法または使用。
【請求項２３】
前記対象はヒト対象である、請求項１または９に記載の方法または使用。
【請求項２４】
前記非同系の細胞移植片または組織移植片は、ＨＬＡが同一である同種ドナー、ＨＬＡが非同一である同種ドナー、および、異種ドナーからなる群から選択されるドナーに由来する、請求項１または９に記載の方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、免疫抑制薬物の組合せに関連し、より具体的には、しかし、限定的ではなく、安定かつ永続性のある細胞移植または組織移植を誘導するための該免疫抑制薬物の組合せの使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
長年、特異的かつ持続した免疫寛容を達成することが移植医療の究極の目標となっている。この目標を達成するための１つの主要な取り組みが、潜在的には胸腺に局在化し、ドナー抗原を絶え間なく提示し、かつ、それにより、抗ドナーＴ細胞クローンの行われている枯渇化を誘導することができる造血幹細胞の移植によってである。この考えが６０年以上前に示され、ウシの二卵性双胎子における子宮内循環交換により、形成された血液成分に対する交叉寛容が達成されたことが示された。しかしながら、主要な遺伝的バリアを越える造血キメラ現象を出生後に達成することは、困難な課題を引き起こすことがこの間にわたって見出された。
【０００３】
完全なドナー型キメラ現象が、ハプロタイプ一致の移植組織を受けている患者における大きなＨＬＡ不一致の間でさえ達成され得る。移植片対宿主病の問題を、大々的にＴ細胞枯渇化された移植片を使用することによって防止することができ、また、移植片拒絶の問題が、致死量を超える状態調節（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）を大用量の幹細胞と組み合わせて使用することによって首尾よく克服されることがある。しかしながら、少なくとも２０％の高い移植関連死亡率（ＨＬＡ同一の患者を使用する場合）は、攻撃的な血液学的悪性腫瘍に苦しむ患者においては妥当であるかもしれないが、この割合は、臓器移植を受ける患者で、差し迫った死亡の恐れがない患者については許容できないものである。
【０００４】
近年、Ｋａｗａｉ他［Ｋａｗａｉ  Ｔ．他、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２００８）、３５８：３５３〜３６１］は、片方のＨＬＡハプロタイプが一致していないドナーからの組み合わされた骨髄（ＢＭ）移植および腎臓移植の数ヶ月後、すべての免疫抑制治療が、移植組織の機能に著しい影響を与えることなく中断され得ることをヒトにおいて明らかにした。しかしながら、この取り組みの日常的な臨床適用が、ＭＨＣ不一致のＢＭの一時的な生着さえ可能にするために要求される細胞減少的（ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ）状態調節の重篤な毒性によって制限される。さらに、この取り組みは広範囲にわたる免疫枯渇化を必要としたが、短期かつ一時的な造血キメラ現象のみが達成されただけであった。そのような系における寛容の機構は、一時的な末梢性寛容のみを誘導する調節性Ｔ細胞を伴うと考えられる。
【０００５】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋のＴ調節細胞（Ｔｒｅｇ）によって可能にされるキメラ現象をさらに改善するために、Ｐｉｌａｔ他は、抗ＣＤ４０ＬおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇの両方による共刺激性遮断のもと、マウスＢＭ全体（これは同種反応性Ｔ細胞を含む）を移植した。宿主Ｔｒｅｇを一時的なラパマイシン処置との併用で投与することにより、低レベルのキメラ現象が、骨髄機能破壊的な（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ）事前の状態調節を何ら必要とすることなく生じた［Ｐｉｌａｔ  Ｎ．他、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２０１０）、１０：１〜１２］。しかしながら、抗ＣＤ４０Ｌの使用は、その血栓形成促進（ｐｒｏ−ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ）影響のためにヒトにおいては問題があり、また、使用される必要不可欠な多数のＴｒｅｇは、患者から採取することが困難であるかもしれない。そのうえ、同種反応性Ｔ細胞がＢＭ移植片に含まれることにより、非悪性状態を伴う適用では許容され得ない移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の危険性がもたらされる。
【０００６】
１９８９年に、本発明者らは、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の拒絶が、大用量の造血幹細胞を使用することによって克服され得ることを初めて明らかにした［Ｌａｐｉｄｏｔ  Ｔ．他、Ｂｌｏｏｄ（１９８９）、７３：２０２５〜２０３２］。しかしながら、幹細胞接種物における著しい増大はこれまで、ヒトにおいて達成することが困難であった。Ｇ−ＣＳＦを使用して、ＢＭからの造血系ＣＤ３４幹細胞の動員を促進させ、これらの細胞を末梢血から集めることにより、ただ１人のドナーから採取され得る始原体細胞の数が著しく増大した。従来のＴ細胞枯渇化骨髄（ＴＤＢＭ）を末梢から集められた動員後の始原体細胞により富化することにより、ヒトにおける幹細胞用量増大の概念を検証することが可能になった。Ｒｅｉｓｎｅｒ  Ｙ．およびＭａｒｔｅｌｌｉ  Ｍ．Ｆ．によって行われた予備的研究では、ヒトにおいて、マウスでの場合のように、細胞用量増大により、Ｔ細胞が枯渇化された一致していない造血幹細胞移植片の生着が促進されたことが初めて示された［Ａｖｅｒｓａ  Ｆ他、Ｂｌｏｏｄ（１９９４）、８４：３９４８〜３９５５；Ｒｅｉｓｎｅｒ  ＹおよびＭａｒｔｅｌｌｉ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ（１９９５）、１６：４３７〜４４０］。いくつかの修正の後、最適化されたプロトコル、すなわち、Ｍｉｌｔｅｎｙ磁石ビーズによって単離されるＣＤ３４＋細胞を使用するプロトコルが開発され、危険性の高い白血病患者において臨床において調べられた。低いＧＶＨＤ率を伴う、ハプロタイプ一致の大用量移植組織の原初生着が患者の９３％超で明らかにされ、かつ、ＧＶＨＤ予防が何ら使用されなかった［Ａｖｅｒｓａ  Ｆ他、上掲］。生着が得られなかった少数の患者では、生着が第２の移植の後で達成された。したがって、大用量の精製された幹細胞移植片を使用することによって、遺伝的バリアを克服し、これにより、容易に入手可能なハプロタイプ一致の家族メンバーをＢＭ移植のための供給源として使用すること、および、幹細胞ドナーのプールを特に寛解状態の急性白血病患者のために増大させることが可能である。続いて、本発明者らは、ＣＤ３４＋細胞が、宿主Ｔ細胞によって引き起こされるバリアを克服する機構は、ＣＤ３４＋細胞画分に含まれる細胞が有する特異的な調節活性を伴い、この活性により、ドナーｐＭＨＣに向けられる宿主Ｔ細胞のみが阻害されることを示した［Ｒａｃｈａｍｉｎ他、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９８）、６５：１３８６〜１３９３］。さらに、この寛容化活性が、欠失に基づく機構を介して、ＴＮＦ−α誘導のアポトーシスによって媒介されることが、同種反応性細胞傷害性Ｔ細胞前駆体ＣＴＬｐの限界希釈分析を使用して後に示された［Ｇｕｒ  Ｈ他、Ｂｌｏｏｄ（２００５）、１０５：２５８５〜２５９３］。したがって、固有の特異性、すなわち、ドナーのＡｇに向けられる宿主Ｔ細胞のみを排除し、一方で、さらに持続し、かつ、感染性病原体と闘うことができる他のＴ細胞には危害を加えないことにより、移植寛容を誘導するための特異的かつ効果的な様式が提供され得る。
【０００７】
さらに、本発明者らは、Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−の細胞画分に含まれる初期造血系始原体細胞は、特異的に抗ドナーＴ細胞クローンの頻度をインビトロおよびインビボの両方で低下させることができ、かつ、混合型のキメラ現象を、亜致死的な放射線照射が行われたレシピエントマウスにおいて誘導することを明らかにした。この免疫寛容はまた、ドナー型皮膚移植片に対する特異的な寛容にも関連した。しかしながら、霊長類での研究では、状態調節を臓器移植のために許容され得るレベルにまでさらに軽減することは、現実的にはヒトドナーから集めることができない幹細胞数を必要することが示唆された（Ｇａｎ他、未発表の結果）。
【０００８】
胚での膵臓異種移植を試みた以前の研究［Ｔｃｈｏｒｓｈ−Ｙｕｔｓｉｓ  Ｄ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００９）、５８：１５８５〜１５９４］において、本発明者らは、抗ＬＦＡ−１および抗ＣＤ４８をＦＴＹ７２０による連続免疫抑制との併用で用いる一時的な処置を行ったとき、胚移植片の最適な維持を達成することができた。しかしながら、永続性の寛容を達成することができず、拒絶が、免疫抑制を休止したときに生じた。同様に、生着が、連続したＦＴＹ７２０処置との併用で抗ＣＤ４８およびＣＴＬＡ４−Ｉｇにより一時的に処置されたマウスの７５％で得られた。しかしながら、再度ではあるが、ＦＴＹ７２０処置の終了により、移植片の拒絶が引き起こされた。
【０００９】
追加の背景技術としては、以下のものを含む：米国特許出願第２００９００４１７９０号，米国特許出願第２０１００１８３６１２号，米国特許出願第２０１００１６６７５６号，米国特許出願第２０１０００４１６０２号，米国特許出願第２０１０００２２６２７号，米国特許出願第２０１０００４１６０２号，米国特許出願第２００９００６８２０３号，米国特許出願第２００９００４１７９０号，米国特許出願第２００９００４１７６９号，米国特許出願第２００９００２２７３０号，米国特許出願第２００８０１６００２２号，米国特許出願第２００７０００９５１１号，米国特許出願第２００５０２１４３１３号，米国特許出願第２００５０１２３５３９号，米国特許出願第２００４００２２７８７号，米国特許出願第２００３００８３２４６号，米国特許出願第２００３００２２８３６号、及び米国特許出願第２００２０１８２２１１号。
【発明の概要】
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、細胞移植片または組織移植片を必要としている対象を処置する方法であって、（ａ）非同系の細胞移植片または組織移植片を前記対象に移植すること（ただし、前記移植片は骨髄細胞またはリンパ系細胞を含む）、および（ｂ）スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト、Ｂ７分子阻害剤およびＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤を含む、治療効果的な量の免疫抑制療法を前記対象に施し、それにより、前記対象を処置することを含む方法が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、非同系の細胞移植片または組織移植片（ただし、前記移植片は骨髄細胞またはリンパ系細胞を含む）の移植片拒絶を対象において軽減させるための、スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト、Ｂ７分子阻害剤およびＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤の使用が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫抑制療法は短期間の免疫抑制療法を含む。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、工程（ａ）の前に、亜致死的、致死的または超致死量的な条件のもとで上記対象を状態調節することを含む。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、状態調節することは、骨髄機能非破壊的な状態調節を含む。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、状態調節することはＴ細胞減量（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ）を含む。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞減量は短期間のＴ細胞減量を含む。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、状態調節することはアルキル化剤の投与を含む。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、アルキル化剤はブスルファンを含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト、Ｂ７分子阻害剤およびＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤が短期間の免疫抑制療法の一部として投与される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、骨髄細胞はＴ細胞枯渇化骨髄細胞を含む。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、骨髄細胞は造血系の前駆体細胞を含む。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞移植片または組織移植片は実質臓器を含む。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニストがＦＴＹ７２０であり、Ｂ７分子阻害剤がＣＴＬＡ４−Ｉｇであり、ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤が可溶性ＣＤ５８−Ｉｇである。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤が、可溶性ＣＤ２タンパク質、可溶性ＣＤ５８タンパク質、抗ＣＤ２抗体および抗ＣＤ５８抗体からなる群から選択される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、可溶性ＣＤ５８タンパク質は可溶性ＣＤ５８−Ｉｇを含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト、Ｂ７分子阻害剤およびＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤が同時に投与される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、短期間の免疫抑制療法が移植後６ヶ月までの期間行われる。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニストの投与が移植後４ヶ月で終了される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂ７分子阻害剤およびＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤の投与が移植後３ヶ月で終了される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂ７分子阻害剤およびＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤の投与が、移植後２日毎に、６日目まで行われる。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂ７分子阻害剤およびＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤の投与が、移植の６日目から９０日目まで週に１回行われる。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象はヒト対象である。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、非同系の細胞移植片または組織移植片は、ＨＬＡが同一である同種ドナー、ＨＬＡが非同一である同種ドナー、および、異種ドナーからなる群から選択されるドナーに由来する。
【００３４】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。  
【００３６】
【図１】図１は、骨髄機能非破壊的な状態調節と、共刺激性遮断とを利用する本発明のキメラ現象誘導プロトコルを記載する。Ｃ３Ｈ／Ｈｅｎレシピエントマウスを、ブスルファン（３０ｍｇ／Ｋｇ、２回）、ならびに、３００ｍｇの抗ＣＤ４および抗ＣＤ８によるＴ細胞減量により状態調節した。移植後の処置では、示された時点で投与される２００ｍｇのＣＴＬＡ４／ＦＣ、２５０ｍｇの抗ＣＤ４８および０．１ｍｇのＦＴＹ７２０が含まれた。
【００３７】
【図２Ａ−２Ｅ】図２Ａ−２Ｅは、長期間の多系統キメラ現象を明らかにするグラフである。図２Ａはキメラ現象レベルを免疫抑制休止後１６３日において示す；図２Ｂ〜図２Ｅは、図２Ａに示されるキメラマウスの脾臓における典型的な多系統キメラ現象を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、免疫抑制薬物の組合せに関連し、より具体的には、しかし、限定的ではなく、安定かつ永続性のある細胞移植または組織移植を誘導するための該免疫抑制薬物の組合せの使用に関連する。
【００３９】
本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解されることができる。
【００４０】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
【００４１】
本発明を実施に移している間に、本発明者らは、免疫抑制薬物の新しい組合せ、すなわち、Ｂ７分子阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）、ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤（例えば、可溶性ＣＤ５８−Ｉｇ）およびスフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト（例えば、ＦＴＹ７２０）を使用することにより、同種のＴ細胞枯渇化骨髄細胞の効率的かつ永続性のある生着がもたらされることを発見している。そのうえ、本発明者らは、この新規な免疫抑制療法による免疫抑制を休止した後における安定なキメラ現象を示している。
【００４２】
本明細書中下記において、また、下記の実施例の節において示されるように、本発明者らは、マウスモデルにおける安定なキメラ現象を、マウスを最初に最小限の骨髄機能除去（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｏｎ）（すなわち、ブスルファンと、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８によるＴ細胞減量とを用いる骨髄機能除去）により状態調節することによって立証している（図１を参照のこと）。次いで、レシピエントマウスには、同種のＴ細胞枯渇化骨髄細胞が移植された（０日目）。移植後、マウスは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび抗ＣＤ４８抗体（マウスＣＤ４８はヒトＣＤ５８に相当する）を含む短期間の免疫抑制療法により、０日目、２日目、４日目、６日目、２１日目および３５日目に処置され、かつ、ＦＴＹ７２０により、０日目〜５日目に毎日、そして、６日目から９０日目まで週に２回処置された。ドナー型のキメラ現象が、免疫抑制休止の数ヶ月（２ヶ月〜５ヶ月）後、レシピエントマウスにおいて認められた（図２Ａ）。さらに、著しいキメラ現象が骨髄系系譜およびリンパ系系譜の両方において得られた（図２Ｂ〜図２Ｅ）。まとめると、これらの発見のすべてが、Ｂ７分子阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）、ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤（例えば、可溶性ＣＤ５８−Ｉｇ）およびスフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト（例えば、ＦＴＹ７２０）の、安定かつ長期間の生着のための混合使用を実証している。
【００４３】
したがって、１つの実施形態によれば、細胞移植片または組織移植片を必要としている対象を処置する方法であって、（ａ）非同系の細胞移植片または組織移植片を前記対象に移植すること（ただし、前記移植片は骨髄細胞またはリンパ系細胞を含む）、および（ｂ）スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト、Ｂ７分子阻害剤およびＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤を含む、治療効果的な量の免疫抑制療法を前記対象に施し、それにより、前記対象を処置することを含む方法が提供される。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」または用語「その必要性のある対象」は、細胞移植または組織移植を必要としている、任意の年齢の雄性または雌性の哺乳動物（好ましくは、ヒト）を示す。典型的には、対象は、細胞移植または組織移植による処置を受け入れることができる障害、あるいは、病理学的または望まれない健康状態または状態または症候群、あるいは、物理的、形態学的または生理学的な異常のために、細胞移植または組織移植を必要としている（対象はまた、本明細書中ではレシピエントとして示される）。そのような障害の例が下記においてさらに示される。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、表現「細胞移植片または組織移植片」は身体の細胞（例えば、１個だけの細胞または細胞群）または組織（例えば、充実組織または軟部組織、これらは全体または一部を移植することができる）を示す。本発明の教示に従って移植され得る例示的な組織には、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、心臓、肺、皮膚、腸およびリンパ系／造血系組織（例えば、リンパ節、パイエル板、胸腺または骨髄）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の教示に従って移植され得る例示的な細胞には、造血幹細胞（例えば、未成熟な造血細胞）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明ではまた、臓器全体の移植、例えば、腎臓、心臓、肺、肝臓または皮膚などの移植が意図される。
【００４７】
適用に依存して、上記方法は、対象と非同系（すなわち、同種または異種）である細胞または組織を使用して行うことができる。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「同種（の）」は、当該対象と同じ種であるが、当該対象とは実質的に非クローンであるドナーに由来する細胞または組織を示す。典型的には、同じ種の非近交系の非接合体（ｎｏｎ−ｚｙｇｏｔｉｃ）双胎哺乳動物は互いに同種である。同種ドナーは対象に関してＨＬＡ同一またはＨＬＡ非同一であってもよいことが理解される。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「異種（の）」は、当該対象のリンパ球の実質的割合の種に対して異なる種の抗原を実質的に発現する細胞または組織を示す。典型的には、異なる種の非近交系哺乳動物は互いに異種である。
【００５０】
本発明では、異種の細胞または組織が様々な種に由来すること、例えば、ウシ属の動物（例えば、ウシ）、ウマ科の動物（例えば、ウマ）、ブタ類（例えば、ブタ）、オビド類（ｏｖｉｄｓ）（例えば、ヤギ、ヒツジ）、ネコ属の動物（例えば、イエネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、イヌ科の動物（例えば、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター）または霊長類（例えば、チンパンジー、アカゲザル、マカクザル、マーモセット）など（これらに限定されない）に由来することが想定される。
【００５１】
異種起源（例えば、ブタ起源）の細胞または組織が好ましくは、人畜共通感染症（例えば、ブタの内因性レトロウイルスなど）を有さないことが知られている供給源から得られる。同様に、ヒト由来の細胞または組織が好ましくは、実質的に病原体非含有の供給源から得られる。
【００５２】
本発明の１つの実施形態によれば、対象およびドナーの両方がヒトである。
【００５３】
適用および利用可能な供給源に依存して、本発明の細胞または組織は、出生前の生物ドナー、出生後の生物ドナー、成体ドナーまたは死体ドナーから得ることができる。そのうえ、必要とされる適用に依存して、細胞または組織はナイーブであり得るか、または、遺伝子操作され得る。そのような決定は十分に当業者の能力の範囲内である。
【００５４】
この技術分野で知られているどの方法も、（例えば、移植用の）細胞または組織を得るために用いることができる。
【００５５】
細胞または組織を対象に移植することを、様々なパラメーターに依存して、例えば、細胞タイプまたは組織タイプ；レシピエントの疾患（例えば、臓器不全）のタイプ、段階または重篤度；対象に特異的な物理的パラメーターまたは生理学的パラメーター；および／あるいは、所望される治療結果などに依存して、数多くの様式で行うことができる。
【００５６】
本発明の細胞移植片または組織移植片を移植することを、適用に依存して、細胞移植片または組織移植片を様々な解剖学的場所のいずれか１つに移植することによって行うことができる。細胞移植片または組織移植片は同位置の解剖学的場所（移植片のための通常の解剖学的場所）に移植することができ、または、異所性の解剖学的場所（移植片のための変則的な解剖学的場所）に移植することができる。適用に依存して、細胞移植片または組織移植片は好都合には、腎被膜下に、あるいは、腎臓、精巣脂肪、皮下組織、網、門脈、肝臓、脾臓、心臓腔、心臓、胸腔、肺、皮膚、膵臓および／または腹腔内空間の中に埋め込むことができる。
【００５７】
例えば、本発明の教示に従って、肝臓組織を、肝臓、門脈、腎被膜、皮下組織、網、脾臓および腹腔内空間に移植することができる。様々な解剖学的場所（例えば、これらなど）への肝臓の移植が、肝臓移植による処置を受け入れることができる疾患（例えば、肝不全）を処置するためにこの技術分野では一般に実施される。同様に、膵臓組織を本発明に従って移植することを、組織を門脈、肝臓、膵臓、精巣脂肪、皮下組織、網、腸ループ（小腸のＵループの漿膜下組織）および／または腹腔内空間に移植することによって都合よく行うことができる。膵臓組織の移植を、膵臓移植による処置を受け入れることができる疾患（例えば、糖尿病）を処置するために使用することができる。同様に、組織の移植、例えば、腎臓組織、心臓組織、肺組織または皮膚組織などの移植を、例えば、腎不全、心不全、肺不全または皮膚損傷（例えば、火傷）に苦しむレシピエントを処置するという目的のために上記のいずれかの解剖学的場所に対して行うことができる。
【００５８】
本発明の方法はまた、例えば、造血幹細胞移植（例えば、未成熟な造血細胞）を必要とする疾患に苦しむレシピエントを処置するために使用することができる。そのような疾患には、白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫、急性非リンパ芽球性白血病（ＡＮＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、毛様細胞性白血病、Ｔ細胞性前リンパ性白血病、Ｂ細胞前リンパ性白血病および若年性骨髄単球性白血病など；リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、前駆Ｔリンパ球性白血病／リンパ腫、ろ胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／リンパ腫および菌状育肉種など；重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）（アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を含む）、大理石病、再生不良性貧血、ゴーシュ病、サラセミア、および、他の先天的造血系異常または遺伝的に決定された造血系異常などが含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
未成熟な同種または異種の造血細胞（幹細胞を含む）で、例えば、ドナーの骨髄、動員された末梢血（例えば、白血球除去法によるもの）、胎児肝臓、卵黄嚢および／または臍帯血に由来することができ、かつ、典型的には、Ｔ細胞枯渇化されたＣＤ３４＋の未成熟な造血細胞であるものを、疾患に苦しむレシピエントに移植することができる。
【００６０】
本発明の１つの具体的な実施形態によれば、移植片は骨髄細胞またはリンパ系細胞を含む。本発明の別の実施形態によれば、細胞移植片はＴ細胞枯渇化骨髄細胞を含む。本発明の別の実施形態によれば、細胞移植片は造血系の前駆体細胞を含む。
【００６１】
したがって、対象には、約１０×１０６細胞／ｋｇから約１０×１０９細胞／ｋｇにまで及ぶ用量の細胞を投与することができる。
【００６２】
本発明の未成熟な同種または異種の造血細胞は、細胞移植のためにこの技術分野で知られているいずれかの方法を使用して、例えば、細胞注入（例えば、Ｉ．Ｖ．）、腹腔内経路を介する方法または骨内経路を介する方法（これらに限定されない）などを使用してレシピエントに移植され得ることが理解されるであろう。
【００６３】
必要に応じてであるが、本発明の細胞移植片または組織移植片を、欠陥臓器を有する対象に移植するときには、最初、その機能不全臓器を対象から少なくとも部分的に除き、その結果、移植片の最適な発達、および、対象の解剖学的構造／生理機能とのその構造的／機能的な一体化を可能にするようにすることが好都合である場合がある。
【００６４】
本発明の方法ではまた、いくつかの臓器（例えば、心臓および骨髄（例えば、造血幹細胞）、腎臓および骨髄（例えば、造血幹細胞）など）の同時移植が、対象にそのような手法によって利益が達成され得る場合には想定される。
【００６５】
細胞移植片または組織移植片を本発明の教示に従って対象に移植した後では、標準的な医療実務によれば、臓器の成長、機能性および免疫適合性をこの技術分野における様々な標準的技術のいずれか１つに従ってモニターすることが望ましい。例えば、膵臓組織移植片の機能性を標準的な膵臓機能試験（例えば、インスリンの血清中レベルの分析）によって移植後にモニターすることができる。同様に、肝臓組織移植片を標準的な肝機能試験（例えば、アルブミン、総タンパク質、ＡＬＴ、ＡＳＴおよびビリルビンの血清中レベルの分析、ならびに、血液凝固時間の分析）によって移植後にモニターすることができる。細胞または組織の構造的発達をコンピューター断層撮影法または超音波造影によりモニターすることができる。
【００６６】
移植片タイプにかかわらず、移植片拒絶を少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％軽減するために、または、好ましくは移植片拒絶を回避するために、本発明では、スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト、Ｂ７分子阻害剤およびＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤を含む免疫抑制療法を施すことが意図される。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、用語「スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト」は、スフィンゴシン１−リン酸受容体を介するシグナル伝達を活性化する分子を示す。典型的には、この分子は、スフィンゴシン１−リン酸受容体のスーパーアゴニストとして（例えば、胸腺細胞およびリンパ球に）作用し、受容体の異常な内在化およびリンパ球のリンパ節における隔離を誘導する。したがって、スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニストの活性化を明らかにすることを、例えば、末梢リンパ球の数（すなわち、その減少）によって行うことができる。１つの具体的な実施形態において、スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニストは、ＦｉｎｇｏｌｉｍｏｄまたはＦＴＹ７２０とも呼ばれる合成化合物の２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオール塩酸塩を示す。スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニストが、例えば、Ｎｏｖａｒｔｉｓから市販されている（Ｇｉｌｅｎｉａ（登録商標））。ＦＴＹ７２０アナログの例には、ＦＴＹ７２０の（Ｓ）−ホスホナートアナログが含まれるが、これに限定されない。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｂ７分子阻害剤」は、Ｂ７分子（例えば、Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６））に特異的に結合し、その活性化を阻害する分子を示す。１つの具体的な実施形態において、Ｂ７分子阻害剤は可溶性のＣＴＬＡ４タンパク質であり、例えば、ＣＴＬＡ４融合タンパク質、例えば、血清安定性を与える免疫グロブリンドメインとのＣＴＬＡ４融合タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）などである。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＴＬＡ４−Ｉｇ」は、免疫抑制活性を有するヒト融合タンパク質を示す。これは、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４の結合ドメインと、ヒトＩｇＧ１とからなる。ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、抗原提示細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６（すなわち、それぞれ、Ｂ７．１およびＢ７．２）に結合し、それにより、Ｔ細胞表面でのＣＤ２８の会合、すなわち、完全なＴ細胞活性化のために要求される共刺激性シグナルを阻止することによって働く。この共刺激性遮断剤は、Ｔ細胞の活性化、増殖、および、その後のサイトカイン産生を妨げる。このＴ細胞調節タンパク質は、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチなど）を処置することにおいて有用であるかもしれず、また、臓器移植片の拒絶を妨げることを助けるかもしれない。ＣＴＬＡ４−Ｉｇが、例えば、Ｂｒｉｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂから、Ａｂａｔａｃｅｐｔ（これはＯｒｅｎｃｉａとして上市される）として、また、Ｂｅｌａｔａｃｅｐｔとして市販されている。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤」は、特異的に結合し、共刺激性のＣＤ５８／ＣＤ２相互作用を阻害する分子を示す。ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤は、可溶性ＣＤ２タンパク質、可溶性ＣＤ５８タンパク質［すなわち、可溶性の白血球機能抗原−３（ＬＦＡ−３）タンパク質］、抗ＣＤ２抗体または抗ＣＤ５８抗体（すなわち、抗ＬＦＡ−３抗体）を含むことができる。したがって、例えば、可溶性ＣＤ５８タンパク質は、血清安定性を与えるヒトＩｇＧ１の免疫グロブリンドメイン（ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）部分と融合されるＣＤ５８／ＬＦＡ−３の細胞外ＣＤ２結合部分を含むＣＤ５８融合タンパク質を含むことができる（例えば、可溶性ＣＤ５８−Ｉｇ）。そのような可溶性ＣＤ５８−Ｉｇ融合タンパク質には、Ａｌｅｆａｃｅｐｔ（商品名、Ａｍｅｖｉｖｅ）が含まれるが、これに限定されない。別の具体的な実施形態によれば、ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤は、抗体（例えば、モノクローナルな抗ＣＤ５８／ＬＦＡ−３抗体［例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ／Ｕｐｓｔａｔｅ／Ｌｉｎｃｏ）から市販されている。例えば、クローンｂｒｉｃ５］または抗ＣＤ２抗体（例えば、Ａｂｃａｍから市販されている。例えば、クローンＭＥＭ−６５）を含む。
【００７１】
抗体およびＩｇ融合タンパク質を作製する様々な方法がこの技術分野では広く知られている。
【００７２】
本発明で使用される用語「抗体」は、完全な分子、並びにその機能的なフラグメント、例えば、マクロファージに結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどを意味する。これらの機能的な抗体フラグメントは次のように定義される：（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含有するフラグメントであり、完全な抗体を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖と、一方の重鎖の一部とを生じさせることによって作製することができる；（２）Ｆａｂ’は、完全な抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部とを生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラグメントである；２つのＦａｂ’フラグメントが１つの抗体分子あたり得られる；（３）（Ｆａｂ’）２は、その後の還元を行うことなく、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体のフラグメントである；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒にされた２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである；（４）Ｆｖは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；そして（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝子的に融合された単一鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されて、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子である。
【００７３】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにそれらのフラグメントを製造する様々な方法がこの技術分野では広く知られている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８）を参照のこと。これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。抗体をヒト化する様々な方法を、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって、Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈａｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）から利用することができる。したがって、そのようなヒト化抗体はキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、ならびに、下記の科学刊行物において：Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３（１９９４）：Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３（１９９５））。
【００７４】
本発明の免疫抑制療法は、細胞移植片または組織移植片を移植する前に、あるいは、細胞移植片または組織移植片を移植するのと同時に、あるいは、細胞移植片または組織移植片を移植した後で対象に施すことができる。
【００７５】
したがって、例えば、また、下記の実施例の節において教示されるように、Ｂ７分子阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）および／またはＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤（例えば、可溶性ＣＤ５８−Ｉｇ）を、移植日（すなわち、０日目）に開始して、連続して２日毎に６日目まで対象に投与することができる。その後、Ｂ７分子阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）および／またはＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤を移植の６日目から３５日目まで２週間毎に投与することができる。スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト（例えば、ＦＴＹ７２０）を、移植の０日目から５日目までは毎日、そして、移植の６日目から９０日目までは１週間に２回、対象に投与することができる。
【００７６】
本発明の１つの具体的な実施形態によれば、免疫抑制療法が短期間にわたって対象に施される。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、表現「短期間」は、一時的な処置、すなわち、長期にわたる処置でないことを示す。本発明の１つの実施形態によれば、免疫抑制療法が、移植後１年未満にわたって、１０ヶ月未満にわたって、８ヶ月未満にわたって、６ヶ月未満にわたって、５ヶ月未満にわたって、４ヶ月未満にわたって、または、３ヶ月未満にわたって対象に施される。
【００７８】
処置は毎日の処置として開始することができ、その後、週に２回の実施、毎週の実施、２週間毎に１回、１ヶ月に１回などとすることができる。対象は、上記で記載されるように移植片拒絶についてモニターされる。
【００７９】
本発明の１つの具体的な実施形態によれば、Ｂ７分子阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）および／またはＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤の投与を、移植後２０日で、２５日で、３０日で、３５日で、４０日で、４５日で、５０日で、５５日で、６０日で、６５日で、７０日で、７５日で、８０日で、８５日で、９０日で、１００日で、１１０日で、１２０日で、５ヶ月で、６ヶ月で、７ヶ月で、８ヶ月で、９ヶ月で、１０ヶ月で、１１ヶ月で、１２ヶ月で、１８ヶ月で、または、２４ヶ月で終了することができる。同様に、スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト（例えば、ＦＴＹ７２０）の投与を、移植後５０日で、５５日で、６０日で、６５日で、７０日で、７５日で、８０日で、８５日で、９０日で、９５日で、１００日で、１０５日で、１１０日で、１１５日で、１２０日で、５ヶ月で、６ヶ月で、７ヶ月で、８ヶ月で、９ヶ月で、１０ヶ月で、１１ヶ月で、１２ヶ月で、１８ヶ月で、または、２４ヶ月で終了することができる。
【００８０】
Ｂ７分子阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）、ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤およびスフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト（例えば、ＦＴＹ７２０）が、処置の経過期間中にわたって互いに同時に、または、互いに連続して対象に投与され得ることが理解されるであろう。
【００８１】
理論にとらわれることはないが、治療効果的な量とは、移植片拒絶を対象において軽減するために効率的な免疫抑制療法の量である。本発明の免疫抑制療法は短期間にわたって対象に施され得るので、より大きな用量のＢ７分子阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）、ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤およびスフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト（例えば、ＦＴＹ７２０）が、当該療法の有益な効果（例えば、移植片拒絶を軽減すること）を達成するために必要となることがある。
【００８２】
本発明の方法において使用されるどのような調製物についても、その治療効果的な量または用量を、最初はインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量を、所望される濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて定めることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【００８３】
例えば、Ｔ細胞枯渇化骨髄移植の場合には、移植の約１週間前から始まり、移植後の約５週間まで対象に投与されるスフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト（例えば、ＦＴＹ７２０）の用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇから約１．５ｍｇ／ｋｇにまで、約０．７５ｍｇ／ｋｇから約１．２５ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇにまで及ぶはずである。移植後の約５週間目から始まり、移植後の約１２０日まで対象に投与されるスフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト（例えば、ＦＴＹ７２０）の用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１．０ｍｇ／ｋｇにまで、約０．２ｍｇ／ｋｇから約０．６ｍｇ／ｋｇまたは約０．３ｍｇ／ｋｇにまで及ぶはずである。１つの具体的な実施形態によれば、スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト（例えば、ＦＴＹ７２０）の用量が毎日投与される。
【００８４】
例えば、Ｔ細胞枯渇化骨髄移植の場合には、対象に投与されるＢ７分子阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、例えば、Ｂｅｌａｔａｃｅｐｔなど）の用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇにまで、約１．０ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇまで、約２．０ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇまたは約２０ｍｇ／ｋｇにまで及ぶはずである。１つの具体的な実施形態によれば、Ｂ７分子阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、例えば、Ｂｅｌａｔａｃｅｐｔなど）が、移植の０日目、４日目および７日目に投与され、その後、週に１回で移植後の約６０日目まで投与される。
【００８５】
例えば、Ｔ細胞枯渇化骨髄移植の場合には、対象に投与されるＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤（例えば、Ａｌｅｆａｃｅｐｔ）の用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１．０ｍｇ／ｋｇにまで、約０．２ｍｇ／ｋｇから約０．６ｍｇ／ｋｇまたは約０．６ｍｇ／ｋｇにまで及ぶはずである。１つの具体的な実施形態によれば、ＬＦＡ−３／ＣＤ５８阻害剤（例えば、Ａｌｅｆａｃｅｐｔ）が、移植の０日目、４日目および７日目に筋肉内（Ｉ．Ｍ．）投与され、その後、週に１回の投与が移植後の約６０日目まで行われる。
【００８６】
本明細書中に記載される免疫抑制療法の実施回数、実施継続期間および治療効果的な量は、移植のタイプおよび療法に対する対象の応答を考慮に入れて必要とされるように調節することができる。実施回数、実施継続期間および治療効果的な量の決定は、とりわけ本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００８７】
細胞移植片または組織移植片の生着を促進させるために、上記方法はさらに好都合には、細胞移植片または組織移植片を移植する前に、あるいは、細胞移植片または組織移植片を移植するのと同時に、あるいは、細胞移植片または組織移植片を移植した後で、対象をさらなる免疫抑制薬物および／または免疫抑制の放射線照射により状態調節することを含むことができる。
【００８８】
したがって、本発明の１つの実施形態によれば、対象が、細胞移植片または組織移植片の移植の前に、亜致死的、致死的または超致死量的な条件のもとで状態調節される。
【００８９】
したがって、例えば、対象を、骨髄機能破壊的または骨髄機能非破壊的な状態調節により処置することができる。そのような状態調節は、例えば、また、下記の実施例の節において詳しく記載されるように、Ｔ細胞減量、例えば、抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体によるＴ細胞減量、または、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）を用いたＴ細胞減量（例えば、移植の６日前）、および、アルキル化剤（例えば、ブスルファン（ＭｙｌｅｒａｎまたはＢｕｓｕｌｆｅｘ）など）による処置（例えば、移植の３日前および２日前、例えば、約８ｍｇ／ｋｇの用量で）を含むことができる。本発明の１つの具体的な実施形態によれば、Ｔ細胞減量が短期間にわたって行われる。
【００９０】
移植のための好適な免疫抑制剤を選択し、投与するための十分な指針がこの技術分野の文献において提供される（例えば、下記を参照されたい：Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ  ＣＨ．およびＲｏｗｌａｎｄｓ  ＤＴ  Ｊｒ．、１９９２、ＪＡＭＡ、２６８、２９５２；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＲＭ．他、１９９６、Ｌａｎｃｅｔ、３４８、１２０８；Ｓｕｔｈａｎｔｈｉｒａｎ  Ｍ．およびＳｔｒｏｍ  ＴＢ．、１９９６、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３１、３６５；Ｍｉｄｔｈｕｎ  ＤＥ．他、１９９７、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ．、７２、１７５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＶＡ．他、１９９４、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．、９７、１４；Ｈａｎｔｏ  ＤＷ．、１９９５、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．、４６、３８１；Ｓｅｎｄｅｒｏｗｉｃｚ  ＡＭ．他、１９９７、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．、１２６、８８２；Ｖｉｎｃｅｎｔｉ  Ｆ．他、１９９８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３８、１６１；Ｄａｎｔａｌ  Ｊ．他、１９９８、Ｌａｎｃｅｔ、３５１、６２３）。
【００９１】
本発明の教示の免疫抑制療法の好適な実施経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜、とりわけ、経鼻的送達、腸管送達または非経口送達を包含することができ、これらには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、同様にまた、クモ膜下腔内注射、直接の心室内注射、心臓内注射（共通冠状動脈内に）、静脈内注射、腹膜内注射、鼻腔内注射または眼内注射が含まれる。
【００９２】
本発明の免疫抑制剤は、免疫抑制剤を包装する少なくとも１つの包装材を含む製造物に詰めることができる。１つの具体的な実施形態において、包装物は、３つの薬剤のすべて、すなわち、Ｂ７分子阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）、ＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤およびスフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト（例えば、ＦＴＹ７２０）を含む。別の具体的な実施形態において、スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト（例えば、ＦＴＹ７２０）が別個の包装物に包装され、一方で、Ｂ７分子阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）およびＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤が共配合される。別の具体的な実施形態において、これらの免疫抑制剤のそれぞれ、すなわち、スフィンゴシン１−リン酸受容体アゴニスト（例えば、ＦＴＹ７２０）、Ｂ７分子阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）およびＣＤ２／ＣＤ５８経路阻害剤のそれぞれが別個の包装物に包装される。製造物は、細胞移植片または組織移植片を受ける対象の（上記で提供される指針と一致する）処置における使用のための説明書を含むことができる。
【００９３】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【００９４】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【００９５】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【００９６】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【００９８】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【００９９】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１００】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０１０１】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１０２】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１０３】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１０４】
一般に、本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌ���ｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１０５】
一般的な材料および実験手順
動物：下記系統の６週齢〜１２週齢の雌マウスを使用した：Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ６、レシピエント、Ｈ−２ｂ、Ｌｙ−５．２）、Ｂ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃａ  Ｐｅｐ３ｂ／ＢｏｙＪマウス（コンジェニック系統、ドナー、Ｈ−２ｂ、Ｌｙ−５．１）、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ドナー、Ｈ−２ｄ）およびＣ３Ｈ／Ｈｅｎ（レシピエント、Ｈ−２ｋ）マウス（すべてを、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ（Ｅｉｎ  Ｋｅｒｅｍ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｆａｒｍ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）から購入した）。すべてのマウスを特定病原体除去条件のもとで収容し、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ワイツマン科学研究所）の施設内実験動物委員会によって承認された条件のもとで維持した。
【０１０６】
ブスルファンによる最小限の骨髄機能除去の決定：Ｃ５７ＢＬ／６（Ｌｙ−５．２）レシピエントマウスの種々の群を下記の最終的用量のＩＶ  Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（Ｏｔｓｕｋａ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）により状態調節した：１０ｍｇ／Ｋｇ／マウス、２０ｍｇ／Ｋｇ／マウス、４０ｍｇ／Ｋｇ／マウス、５０ｍｇ／Ｋｇ／マウス、６０ｍｇ／Ｋｇ／マウス、８０ｍｇ／Ｋｇ／マウスおよび１００ｍｇ／Ｋｇ／マウス。ＩＶ  Ｂｕｓｕｌｆｅｘのこれらの最終的用量を２つに分け、２日前および１日前に（ＩＰ）投与した。０日目に、Ｂ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃａ  Ｐｅｐ３ｂ／ＢｏｙＪ（Ｌｙ−５．１）ドナーから単離された２５×１０６個のＴ枯渇化骨髄細胞を（ＩＶ）移植し、ドナー型キメラ現象の確立を、コンジェニックドナーのマーカー（Ｌｙ−５．１）のＦＡＣＳ分析によって、血液、脾臓およびＢＭにおいて移植後１ヶ月および１２ヶ月で明確にした。ドナーキメラ体の脾臓およびＢＭにおけるＬＹ−５．１＋（ドナー）細胞における、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ４５／Ｂ２２０およびＣＤ１ｂの各マーカーの表現型発現分析を移植後１２ヶ月で行った。
【０１０７】
骨髄機能非破壊的な状態調節および共刺激性遮断プロトコル：Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊ（Ｈ−２Ｋｋ）レシピエントマウスを、３００μｇの抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、クローンＧｋ１．５）および抗ＣＤ８抗体（Ｂｉｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、クローン５３．６．７２）による６日前でのＴ細胞減量の後、３０ｍｇ／ｋｇのＩＶ  Ｂｕｓｕｌｆｅｘにより３日前および２日前に状態調節した。０日目に、Ｂａｌｂ／ｃ−Ｎｕｄｅ（Ｈ−２Ｄｄ）ドナーから得られる２５×１０６個のＴ枯渇化ＢＭ細胞を移植し、下記のように投与された２００μｇのＣＴＬＡ４／ＦＣ（Ｃｈｉｍｅｒｉｇｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２５０μｇの抗ＣＤ４８（Ｂｉｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、クローンＨＭ４８）および０．１ｍｇのＦＴＹ７２０（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）からなる共刺激性遮断に供した：ＣＴＬＡ４／ＦＣおよび抗ＣＤ４８を、０日目、２日目、４日目、６日目、２１日目および３５日目にＩＰ注射し、一方、ＦＴＹ７２０をＯＳにより０日目から５日目までの５日間接種し、そして、６日目から９０日目までは週に２回接種した。キメラ現象の分析をＦＡＣＳ分析によって３０日毎にモニターした。
【０１０８】
キメラ現象についてのフローサイトメトリーおよび多系統分析：キメラ現象の分析のために、血液単核細胞を、宿主（Ｈ−２Ｋｋ）のＭＨＣクラスＩ抗原について特異的な標識抗体（フィコエリトリン（ＰＥ））およびドナー（Ｈ−２Ｄｄ）のＭＨＣクラスＩ抗原について特異的な標識抗体（フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ））により染色した。コンジェニックモデルにおいては、抗ＣＤ４５．２−ＰＥ抗体および抗ＣＤ４５．１−ＦＩＴＣ抗体を使用して、宿主とドナーを区別した。
【０１０９】
多系統キメラ現象を移植後７０日および１６３日でドナーキメラ体について行った。脾臓細胞を、宿主（Ｈ−２Ｋｋ）に対する抗体（ＰＥ）、ドナー（Ｈ−２Ｄｄ）に対する抗体（ＦＩＴＣ）、ならびに、下記の系譜マーカー、抗ＣＤ４−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、抗ＣＤ８−ＡＰＣ、抗ＣＤ４５／Ｂ２２０−ＰＥおよび抗ＣＤ１ｂ−ＰＥにより多色染色した。すべての染色を製造者の説明書（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従って行った。蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を、改変されたＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎを使用して行った。
【０１１０】
実施例１
最小限の状態調節のためのマウスモデルの確立
成功したＢＭ生着のための条件（要件）を提供することの重要性を考慮して、本発明者らは、コンジェニックＢ６−ＳＪＬ（Ｌｙ−５．１）のＴ細胞枯渇化骨髄（ＴＤＢＭ、２５×１０６個）をＢ６（Ｌｙ−５．２）マウスに注入した後で永続性のキメラ現象を誘導するブスルファンによる最小限の骨髄機能除去を最初に求めた。１０ｍｇ／Ｋｇのブスルファンから１００ｍｇ／Ｋｇのブスルファンにまで及ぶ用量を試験したとき、本発明者らは、５０％を超えるドナー型キメラ現象が５０ｍｇ／Ｋｇを超える用量で得られたことを示した（４０±２６％、６６±７％および７５±２％のキメラ現象が、５０ｍｇ／Ｋｇ、６０ｍｇ／Ｋｇおよび１００ｍｇ／Ｋｇにおいてそれぞれ得られた）。その結果、６０ｍｇ／Ｋｇの亜致死的用量を、抗ＣＤ４枯渇化抗体および抗ＣＤ８枯渇化抗体の単回注入による宿主リンパ球の一時的な減量との併用で、同種キメラ現象を誘導するためのすべての試みにおけるさらなる使用のために選択した。
【０１１１】
実施例２
新しい臨床的に実現可能な薬剤によるキメラ現象誘導
上記の実施例１において記載される十分に寛容される組み合わされた亜致死的な状態調節は、同種の「大用量」のＴ細胞枯渇化骨髄を生着させるための対処しがたい障壁を引き起こし、また、骨髄（ＢＭ）を単独で使用したとき、または、ＢＭをＦＴＹ７２０とともに使用したときには、キメラ現象が全く達成されなかった。
【０１１２】
しかしながら、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ４８およびＦＴＹ７２０による一時的な移植後処置を加えることにより（図１）、２つの独立した実験において、顕著なドナー型キメラ現象がもたらされ、１１６日のメジアン・フォローアップ（７０日〜１６３日の範囲）は免疫抑制の休止を越えていた（図２Ａ）。したがって、キメラ現象が、ＦＴＹ単独により移植後に処置されたマウスでは全く検出できなかった（７匹中０匹のマウス）が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ４８およびＦＴＹ７２０による一時的な移植後の免疫抑制は、８０％を超えるドナー型キメラ現象を１１匹中８匹のマウスにおいて生じさせた。図２Ｂ〜図２Ｅにおいて認められ得るように、著しいキメラ現象が骨髄系系譜およびリンパ系系譜の両方において得られた。
【０１１３】
Ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）およびＡｌｅｆａｃｅｐｔ（これはＣＤ４８の相互作用を阻止する）などの薬剤が臨床使用のために利用可能であるので、これらの結果により、永続性の造血キメラ現象を骨髄機能非破壊的な状態調節のもとで誘導するための潜在的に実現可能な共刺激性遮断の取り組みが、細胞治療および臓器移植のための基盤として示唆される。
【０１１４】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０１１５】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【図１】
2013540731.tif 000002
【図２Ａ−２Ｅ】
2013540731.tif 000003
【国際調査報告】
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