(57)【要約】  本発明は、表面に不要なバイオフィルムの形成を防止するための薬剤として機能する、好ましくは深い熱水の生態系からの細菌の発酵によって得られた、エキソ多糖類に関する。本発明はまた、不要なバイオフィルムに通じる一次膜の形成を防止することにより、表面を保護するための方法に関するものであって、方法は、前述の表面を本発明の少なくとも１つの多糖との接触において配置すること、または、前述の表面上に本発明の多糖を接合させることを含む。本発明はまた、前述の表面への不要な細菌バイオフィルムの接着を低減させるよう、表面の物理的特性を変更するための方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面上の微小なバイオフィルムの形成を防止するための薬剤としてのエキソ多糖類（ＥＰＳ）の使用。
【請求項２】
前記ＥＰＳが、中性糖、好ましくはグルコース、ラムノース、マンノース、もしくはガラクトース、糖酸、好ましくは、グルクロン酸、ガラクツロン酸、もしくはヘキスロン酸などのウロン酸、アミノ糖、好ましくはＮアセチルグルコサミン、もしくはＮアセチルガラクトサミン、硫酸塩、および／またはタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１に記載のエキソ多糖類の使用。
【請求項３】
前記ＥＰＳが、深海の熱水の生態系からの細菌の発酵によって得られることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のエキソ多糖類の使用。
【請求項４】
前記深海の熱水の生態系からの細菌が、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）またはシュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属のものであることを特徴とする、請求項３に記載のエキソ多糖類の使用。
【請求項５】
前記エキソ多糖類が、アルテロモナス・マクレオディイ（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃｌｅｏｄｉｉ）またはＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓの発酵によって得られることを特徴とする、請求項３から４のいずれか１項に記載のエキソ多糖類の使用。
【請求項６】
前記エキソ多糖類が、ＨＹＤ６５７、ＨＹＤ１６４４、ＨＹＤ１５４５、ＧＹ７８５、ＭＳ９０７、ＳＴ７１６、ＨＹＤ７２１、ＧＹ７７２、ＨＹＤ７５０、ＧＹ７６８、ＧＹ７８８、ＢＩ７４６、ＧＹ７８６、ＧＹ６８５、ＧＹ６８６、ＳＴ７１９、ＨＹＤ１５７４、ＨＹＤ１５７９、ＨＹＤ１５８２、ＨＹＤ１５８４、ＳＴ７０８、ＳＴ７２２、ＳＴ３４２、ＳＴ３４９、ＨＹＤ１６２５、およびＨＹＤ１６６６から選択されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載のエキソ多糖類の使用。
【請求項７】
前記エキソ多糖類が、ゾステル酸（ｚｏｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）または任意のその誘導体に関連することを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載のエキソ多糖類の使用。
【請求項８】
前記エキソ多糖類が、１つまたはそれ以上のＡＭＰに関連することを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載のエキソ多糖類の使用。
【請求項９】
微小なバイオフィルムの形成を防止することによって表面を保護するための方法であって、少なくとも１つのエキソ多糖と前記表面を接触または接合させることによってエキソ多糖類の保護膜が前記表面上に形成されることを特徴とし、請求項１から９のいずれか１項に記載の前記エキソ多糖類の使用を含む、方法。
【請求項１０】
前記方法が、任意の適切な物理化学的手段によって、少なくとも１つのエキソ多糖と前記表面を接触または接合させることに起因する前記エキソ多糖膜の形成または状態を監視する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記表面が金属であり、前記物理化学的手段が前記表面の電気化学的電位における変化の測定であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記接触が、随時または定期的な間隔で、好ましくは、前記表面付近でＥＰＳ溶液を溶液の全体積に対し０．００１〜１０重量％、好ましくは０．０１〜１重量％の濃度で注入することにより行われることを特徴とする、請求項９から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
表面の物理的特性を変更するための方法であって、前記表面をエキソ多糖と接触または接合させることを特徴とし、請求項１から８のいずれか１項に記載の前記エキソ多糖類の使用を含む、前記表面上の望ましくない細菌バイオフィルムの接着を低減させるようにする方法。
【請求項１４】
請求項１から８のいずれか１項に記載のエキソ多糖類を用いて、または請求項９から１２のいずれか１項に記載された前記方法を用いて得られた、エキソ多糖類でコーティングされた表面。
【請求項１５】
請求項１４に記載の表面を含む製品。
【請求項１６】
前記製品が、パイプラインまたはメタン端末であることを特徴とする、請求項１５に記載の製品。
【請求項１７】
前記製品が、病院用器具、好ましくはチューブまたはカテーテルであることを特徴とする、請求項１５に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、望ましくない微生物バイオフィルムを防止する分野に関する。より具体的には、本発明は、望ましくないバイオフィルムの不時の接着に対して前述の表面を保護するための表面処理方法であって、エキソ多糖類を含む本発明に係る方法を提供する。本発明によれば、処理された表面は、好ましくは溶液中で、エキソ多糖類との、随時または定期的な間隔での接触において配置され、この表面にエキソ多糖類の保護膜を形成することが可能である。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムは、特に細菌、菌類、藻類または原生動物などの微生物が共に表面に接着している共同体である。バイオフィルムの生成は、多種類の表面、特に鉱物、金属、ガラス、合成樹脂に接着可能なマトリックスの分泌によって特徴付けられる。バイオフィルムは、一般的に、水様のまたは湿った環境で観察される。
【０００３】
望ましくないバイオフィルムの接着の現象は、複数の要因で起こる。
１．表面の状態を調製する一次膜の形成。この一次膜は、その環境における有機物の存在から形成される。
２．非共有結合または弱い化学結合による微生物の可逆的接着。
３．より大規模なその後のコロニー形成に対するアンカーポイントとして機能する、糖類のエキソエキソポリマー（ｓａｃｃｈａｒｉｄｉｃ  ｅｘｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）、タンパク質、または糖タンパク質の生成によって促進される微生物の永久接着。永久に表面に固定される微生物膜は、本発明に係るバイオフィルムである。
４．海洋環境において、バイオフィルムによる表面のコロニー形成は、長期的には、高等生物における接着（フジツボ、イガイ、およびより一般的にはマクロ生物、ならびにマクロファウリング）を可能とし得る。
【０００４】
技術的課題
バイオフィルム形成は、産業の分野、および環境または衛生、特に公衆衛生の分野の両方において多くの影響を有し得る。このため、本発明は、様々な分野に適用することができる。
【０００５】
産業分野においては、バイオフィルムは、腐食の原因となり、交換器における熱交換を低減させ、チューブおよびパイプにおける流路抵抗を生じさせる。衛生分野においては、バイオフィルムの形成は、特に、バイオフィルムが、カテーテルなどの外科的な器具へ、またはエアコンもしくは冷却システムにおいて固定する場合、院内疾患の多くの症例の原因となり得ることが認識されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は特に、自然環境、特に海洋環境においてコロニー形成されやすい任意の表面上のバイオフィルムの形成に関する。海洋環境において、海洋環境に浸漬されたほとんどすべての表面は、バイオフィルムの形成の対象であることは、既知である。このバイオフィルムの存在は、海洋学の分野において、および海洋活動にとって多くの問題の源である。確立された汚染を制御するために使用される手段は、たいてい毒（特に殺生物剤）であり、海洋環境における動植物に悲惨な結果をもたらし得る。また、定期的な表面の洗浄作業は、海洋産業の運営経費をかなり増大させる。
【０００７】
したがって、汚染および望ましくないバイオフィルムに対する従来の処理に代替するアプローチを発展させる、本格的な必要性が存在する。
【０００８】
本発明は、それが接着の現象の最初の段階で作用する、すなわち、一次膜ならびに／またはその構造および組成が変更される防止し、可逆的な接着を防止し、その後の永久的な望ましくないバイオフィルムの接着のステージ、ならびにその後のバイオフィルム上のマクロ生物の接着を防止するという点で、特に重要なものである。
【０００９】
従来技術の現状
防汚剤は、従来技術分野において既知である。例えば、米国特許第７０９０８５６号明細書は、海洋環境にとって非毒性であり有害でない防汚剤を記載している。この薬剤は、ビブリオ・アルギノリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）またはビブリオプロテオリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来である。それは、その後脱塩され、一般的に濃縮される、これらの細菌の発酵からの上清で構成することができる。それは、単独で、または塗料、コンクリート、もしくはコーティングの組成物に、使用することができる。これは永久的なコーティング、スプレー、またはリンス液の形態で海洋表面に使用することができる。それは、特にフジツボまたは多毛類などのマクロ生物の幼生の接着を阻害する。しかし、米国特許第７０９０８５６号明細書は、微生物の初期の可逆的な、およびその後の永久的な接着の源である一次膜を防止するための薬剤を記述または示唆していない。米国特許第７０９０８５６号明細書は、同様に、表面での微生物の接着における具体的な防止について記載していない。それどころか、米国特許第７０９０８５６号明細書は、以前に形成された望ましくないバイオフィルム上のマクロ生物の幼生の接着の作用によって、マクロ生物の定着の予防について記載している。
【００１０】
同様に、欧州特許出願公開第１１７０３５９号明細書は、アルテロモナス属の株によって生成される多糖類からなる生物学的ゼリーについて記載している。欧州特許出願公開第１１７０３５９号明細書には、前述のゼリーが表面でのマクロ生物の付着を阻害することが記載されている。欧州特許出願公開第１１７０３５９号明細書は、表面での微生物の接着の防止については記載していない。
【００１１】
表面で固定された微生物の存在が前述の表面でのマクロ生物の定着にとって予備的な要件であることは、当業者にとって既知である。一方、微小なバイオフィルムの存在が自動的にマクロ生物の定着を生じさせるのではないこともまた知られている。この方法において、マクロ生物の定着がないことが、表面にバイオフィルムが存在しないことを意味するものではない。実際、欧州特許出願公開第１１７０３５９号明細書は、多糖を生成するＳＨＹ１−１細菌が固定されている表面であって、前述の多糖は前述の表面のマクロ生物の接着を阻害する、表面が記載されている。
【００１２】
また、国際公開第９６０７７５２号は、金属結合剤として、ヒフォモナス属（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ）ファミリー由来の多糖類であって、前述の金属水をきれいにするための多糖類を記載している。
【００１３】
出願人の知る限りでは、どの先行技術文献も、環境にやさしく、かつ、完全に環境を尊重しながら、微小な一次膜、または器具表面上の望ましくないバイオフィルムの形成を、効果的に防止することができるという薬剤を、記載または示唆していない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一つの目的は、表面上の微小なバイオフィルムの形成を防止するための薬剤としてのエキソ多糖類（ＥＰＳ）の使用である。
【００１５】
一実施形態において、前述のＥＰＳは、中性糖、好ましくはグルコース、ラムノース、マンノース、もしくはガラクトース、糖酸、好ましくはグルクロン酸、ガラクツロン酸、もしくはヘキスロン酸などのウロン酸、アミノ糖、好ましくはＮアセチルグルコサミン、もしくはＮアセチルガラクトサミン、硫酸塩、および／またはタンパク質を含む。
【００１６】
別の実施形態において、前述のＥＰＳは、深海の熱水の生態系からの細菌の発酵によって得られる。
【００１７】
別の実施形態において、前述の深海の熱水の生態系からの細菌は、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）またはシュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属のものである。
【００１８】
別の実施形態において、前述のエキソ多糖類は、アルテロモナス・マクレオディイ（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃｌｅｏｄｉｉ）またはＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ菌の発酵によって得られる。
【００１９】
別の実施形態において、エキソ多糖類は、ＨＹＤ６５７、ＨＹＤ１６４４、ＨＹＤ１５４５、ＧＹ７８５、ＭＳ９０７、ＳＴ７１６、ＨＹＤ７２１、ＧＹ７７２、ＨＹＤ７５０、ＧＹ７６８、ＧＹ７８８、ＢＩ７４６、ＧＹ７８６、ＧＹ６８５、ＧＹ６８６、ＳＴ７１９、ＨＹＤ１５７４、ＨＹＤ１５７９、ＨＹＤ１５８２、ＨＹＤ１５８４、ＳＴ７０８、ＳＴ７２２、ＳＴ３４２、ＳＴ３４９、ＨＹＤ１６２５、およびＨＹＤ１６６６から選択される。
【００２０】
別の実施形態において、前述のエキソ多糖類は、ゾステル酸（ｚｏｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）また任意のその誘導体に関連する。
【００２１】
別の実施形態において、エキソ多糖類は、１つまたはそれ以上のＡＭＰに関連する。
【００２２】
本発明の別の目的は、微小なバイオフィルムの形成を防止することによって表面を保護するための方法であって、少なくとも１つのエキソ多糖と前述の表面を接触または接合させることによってエキソ多糖類の保護膜が前述の表面上に形成されていることを特徴とし、上記のようなエキソ多糖類の使用を含む、方法である。
【００２３】
一実施形態において、前述の方法は、任意の適切な物理化学的手段によって、少なくとも１つのエキソ多糖と前述の表面を接触または接合させることに起因するエキソ多糖膜の形成または状態を監視する工程をさらに含む。
【００２４】
別の実施形態において、前述の表面は金属であり、前述の物理化学的手段が前述の表面の電気化学的電位における変化の測定であることを特徴とする。
【００２５】
別の実施形態において、接触は、随時または定期的な間隔で、好ましくは、表面付近でＥＰＳ溶液を溶液の全体積に対し０．００１〜１０重量％、好ましくは０．０１〜１重量％の濃度で注入することにより行われる。
【００２６】
本発明の別の目的は、表面の物理的特性を変更するための方法であって、前述の表面をエキソ多糖と接触または接合させることを特徴とし、上記のようなエキソ多糖類の使用を含む、前述の表面上の望ましくない細菌バイオフィルムの接着を低減させるようにするための方法である。
【００２７】
本発明の別の目的は、上記のエキソ多糖類を用いて、または上記の方法を用いて得られた、エキソ多糖類でコーティングされた表面である。
【００２８】
本発明の別の目的は、上記の表面を含む製品である。
【００２９】
一実施形態において、前述の製品は、パイプラインまたはメタン端末である。
【００３０】
別の実施形態において、前述の製品は、病院用器具、好ましくはチューブまたはカテーテルである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１以下を参照して理解され、実験時間、すなわち、循環する海水への、フィルムでコーティングされたおよびフィルムでコーティングされていない表面の露出時間を示すｘ軸、ならびに、ＥＰＳによる表面被覆率を示すｙ軸を有する、ＥＰＳのフィルムの形成の潜在力を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
したがって、本発明は、望ましくないバイオフィルムの形成を防止するための薬剤としてエキソ多糖類（ＥＰＳ）の使用に関する。
【００３３】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、出願人は、表面上のエキソ多糖膜の形成が、組成物および／または一次膜の構造を変更することを示唆する。ＥＰＳの存在下で形成された一次膜を、以下「改質された一次膜」と呼ぶ。この場合、水様環境の細菌は、この改質された一次膜上に固定することができないといえる。表面上のＥＰＳの存在は、このように、微小なバイオフィルムの形成を阻害する。
【００３４】
本発明の一実施形態によれば、ＥＰＳは、改質された一次膜において有機物の分子を部分的に交換する。この実施形態によれば、改質された一次膜は、有機物およびＥＰＳで形成される。
【００３５】
本発明の別の実施形態によれば、改質された一次膜は、ＥＰＳのみから構成されている。この実施形態によれば、ＥＰＳはまた、望ましくないバイオフィルムを生じさせる一次膜の表面上での形成を防止するための薬剤として有用である。
【００３６】
本発明の一実施形態によれば、本発明で使用されるＥＰＳは、中性糖、糖酸、アミノ糖、硫酸塩、および／またはタンパク質を含む。本発明の一実施形態によれば、本発明で使用されるＥＰＳは、中性糖、糖酸、アミノ糖、硫酸塩、および／またはタンパク質で構成される。
【００３７】
中性糖の例としては、これらに限定されないが、グルコース、ラムノース、マンノース、ガラクトースなどを含む。
【００３８】
酸性糖の例としては、これらに限定されないが、ウロン酸、特にグルクロン酸、ガラクツロン酸、ラクチル残基で３位の炭素上にて置換されたフラン構造を有するヘキスロン酸などのヘキスロン酸などを含む。
【００３９】
アミノ糖の例としては、これらに限定されないが、Ｎアセチルグルコサミン、およびＮアセチルガラクトサミンなどを含む。
【００４０】
本発明の一実施形態によれば、ＥＰＳは、ＥＰＳにおける糖の総数に対する糖の数において、中性糖を３０〜９５％の間で、好ましくは４０〜９０％の間で、より好ましくは４５〜８８％の間で中性糖を含む。
【００４１】
本発明の一実施形態によれば、ＥＰＳは、ＥＰＳにおける糖の総数に対する糖の数において、酸糖を１〜７０％の間で、好ましくは５〜６０％の間で、より好ましくは８〜５３％の間で酸糖を含む。
【００４２】
本発明の一実施形態によれば、ＥＰＳは、ＥＰＳにおける糖の総数に対する糖の数において、アミノ糖の３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１２％未満のアミノ糖を含む。
【００４３】
本発明の一実施形態によれば、ＥＰＳは、ＥＰＳにおいて、１００糖当たり５０未満の硫酸分子、好ましくは４０未満の硫酸分子、より好ましくは１００糖当たり３５未満の硫酸分子を含む。
【００４４】
本発明の一実施形態によれば、ＥＰＳは、ＥＰＳにおいて、１００糖当たり５０未満のタンパク質、好ましくは４０未満のタンパク質、より好ましくは１００糖当たり３７未満のタンパク質を含む。
【００４５】
本発明の一実施形態によれば、ＥＰＳは、アミノアラビノース（ａｍｉｎｏａｒａｂｉｎｏｓｅ）、アミノリボース（ａｍｉｎｏｒｉｂｏｓｅ）、ヘプトース、および／またはキシロースを含まない。
【００４６】
本発明の一実施形態によれば、使用されるＥＰＳは、５００ｋＤａを超える、好ましくは８００ｋＤａを超える、より好ましくは１０００ｋＤａを超える、より好ましくは２０００ｋＤａを超える分子量を有する。
【００４７】
好ましい実施形態によれば、本発明のエキソ多糖類（ＥＰＳ）は、深海の熱水の生態系からの細菌の発酵によって得られる。より具体的には、本発明のＥＰＳは、深海の熱水の生態系からの細菌の発酵中に（炭水化物に富む栄養培地による、高炭素：窒素比によって誘導される栄養のアンバランスという）制御された条件下で合成されたものである（例えば、Guezennec, J. (2002). Deep-sea hydrothermal vents: A new source of
innovative bacterial exopolysaccharides of biotechnological interest? Journal
of Industrial Microbiology & Biotechnology 29: 204-208を参照）。
【００４８】
第一の実施形態によれば、これらのＥＰＳは、ＨＹＤ６５７、ＨＹＤ１６４４、ＨＹＤ１５４５、ＧＹ７８５、ＭＳ９０７、ＳＴ７１６、ＨＹＤ７２１、ＧＹ７７２、ＨＹＤ７５０、ＧＹ７６８、ＧＹ７８８、ＢＩ７４６、ＧＹ７８６、ＧＹ６８５、ＧＹ６８６、ＳＴ７１９、ＨＹＤ１５７４、ＨＹＤ１５７９、ＨＹＤ１５８２、ＨＹＤ１５８４、ＳＴ７０８、ＳＴ７２２、ＳＴ３４２、ＳＴ３４９、ＨＹＤ１６２５、およびＨＹＤ１６６６から選択される。
【００４９】
第二の実施形態によれば、これらのＥＰＳは、本発明日に適用される分類学的区分に従い、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）またはシュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属の細菌によって合成されたものから選択される。分類学上の区分は修正されるべきであり、当業者は、本発明に係るＥＰＳに到達するように分類学上の変更を適応させるべきであろう。有利なことには、これらの細菌はアルテロモナス・マクレオディイ（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃｌｅｏｄｉｉ）菌であり、この実施形態において、好ましくは、ＥＰＳはＨＹＤ６５７である。第三の実施形態によれば、これらの細菌はＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ菌であり、この実施形態において、好ましくは、ＥＰＳはＧＹ７８５である。好ましくは、ＥＰＳはＨＹＤ１５４５またはＨＹＤ１６４４である。
【００５０】
また、本発明は方法にも関する。本発明に係る方法は、表面上の望ましくない細菌バイオフィルムの形成を防止することにより、前述の表面を保護するための方法であって、エキソ多糖の保護膜が、本発明に係る少なくとも１つのエキソ多糖と前述の表面を接触または接合させることによって前述の表面に形成されることを特徴とする。
【００５１】
本発明の方法を実施するための好適な実施形態によれば、ＥＰＳは、極性溶媒、好ましくは水に溶解している。特定の一実施形態によれば、溶液中のＥＰＳの濃度は、溶液の総体積に対して、０．００１〜１０％、好ましくは０．０１〜１％、非常に好ましくは０．０２〜０．５％、より好ましくは約０．０２％の重量／体積である。
【００５２】
好ましくは、本発明の方法において、前述の表面を、上記のＥＰＳ溶液と接触させる。
【００５３】
この接触および接合は、前述の表面上に均一な膜の形成をもたらす。本発明の一実施形態によれば、ＥＰＳのフィルムは、前述の表面上に連続している。本発明の一実施形態によれば、ＥＰＳのフィルムは、０．１〜１００μｍ、好ましくは０．５〜２５μｍ、好ましくは１〜１０μｍの厚さを有する。
【００５４】
表面上に均質なＥＰＳのフィルムの形成を促進する条件は、好ましくは以下のとおりである。
−温度は５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃の間。
−溶液は、溶液の総体積に対して、０．００１〜１０％、好ましくは０．０１〜１％、非常に好ましくは０．０２〜０．５％、より好ましくは約０．０２％、すなわち２００ｍｇ／ｌの重量／体積。
−接触時間は１０秒〜５時間、好ましくは１〜１２０分、より好ましくは３〜６０分、さらにより好ましくは５分〜３０分。
【００５５】
第一の実施形態によれば、接触は循環する海水中で行われる。
【００５６】
接触または接合は、望ましくないバイオフィルムの形成される状況に対し表面が露出する前、例えば、限定はしないが、海水環境に浸漬させる前に行われる。好ましくは、接合は、特に小型のセンサなどの小さな表面上で行われる。接合により、単なる接触より表面上でのＥＰＳの優れた安定性を可能にし、従って接合された表面の長期的な保護を可能にし得る。接合は、特に国際公開第２００８０７８０５２号に記載されているような、当業者に既知の任意の方法によって行われ得る。
【００５７】
本発明によれば、方法は、使用を最適化し、リスクを奨励しやすい表面の不均一性における任意のリスク、特に金属表面（金属および合金）、腐食リスク、を防止するように、ＥＰＳの成膜電位、および時間の経過とともにその安定性を、特に物理化学的方法によって、監視するための手段を含み得る。
【００５８】
特定の一実施形態によれば、本発明に係る方法は、任意の適切な物理化学的手段によって、本発明に係る少なくとも１とのエキソ多糖と前述の表面との接触または接合をもたらすエキ多糖膜の形成を監視する工程を含む。より詳細には、金属表面（金属および合金）上のＥＰＳ膜の形成の監視は、電気化学的測定を用いて、特に、限定はしないが、合金または金属の表面の電気化学的電位を測定することにより、測定し得、この電位の前述の電気化学的電位および変化は、基準の電極に関して測定される。
【００５９】
実際、表面とＥＰＳとの接触中、およびＥＰＳのバイオフィルムの形成中、合金または金属の表面の電気化学的電位が変化する。フィルムが均一である場合、この電気化学的電位は安定する。このように、特定の一実施形態によれば、表面が金属である場合には、エキソ多糖類との最初の接触後の金属の電気化学的電位の変化量が測定され、本発明に記載の方法によるＥＰＳと金属表面との接触（溶液中のＥＰＳとの接触、または接合）は、表面の電気化学的電位が安定するまで継続される。
【００６０】
本発明の特定の一実施形態によれば、測定は継続されており、表面の電気化学的電位が不安定である場合、電気化学的電位が再び安定するまで、ＥＰＳとの接触が再開される。実際、保護膜の変性は、細菌のコロニー形成のリスクを伝えるこの電気化学的電位における変化を、および、その結果、さらなるＥＰＳとの接触によって前述の表面上にさらに膜を形成する義務を誘発し得る。このように、一実施形態によれば、本発明に係る方法は、エキソ多糖膜の状態を監視するため、必要に応じて、すなわち、フィルムが均質でないまたは劣化した場合に、発生させるため、ＥＰＳと表面をさらに接触させるための工程をさらに含む。表面が金属の場合、フィルムの不安定さは、表面の電気化学的電位における変化によって、測定および監視することができる。
【００６１】
従って、本発明はまた、金属表面上の保護膜の有無を監視するための方法であって、前述の表面の電気化学的電位が測定される、方法に関する。好ましい一実施形態によれば、所与の期間（１〜３０分）以上で金属表面の電気化学的電位の少なくとも〜１０％の変化が、再びＥＰＳと表面との接触を誘導する。本発明の好ましい一態様によれば、電気化学的電位を測定するための装置で事前に記録されたしきい値が所与の量のＥＰＳと表面との接触を発生させるよう、表面の電気化学的電位を測定するための装置は、ＥＰＳを注入するための装置と結合される。好ましい一実施形態によれば、接触は、処理すべき表面付近でＥＰＳ溶液を注入することによって行われる。
【００６２】
このように、本発明の方法によれば、表面の電気化学的電位が、約１０％の変位を生成する場合、表面とＥＰＳとの接触は、特に金属表面上で、好ましくは反復可能であり、好ましくは繰り返される。
【００６３】
本発明の方法は、問題になっている表面上の細菌の接着、および望ましくないバイオフィルムの形成における顕著な減少をもたらす。
【００６４】
出願人は、本発明の方法は、物理的機構を有し、一次膜の防止におけるエキソ多糖類の作用は、自然において薬物的ではなく、このように、本発明は、環境に配慮したアプローチと適合し、細菌区系への影響を防ぐことができるとの強い推定を有している。
【００６５】
本発明によれば、本発明の方法により堆積されたＥＰＳのフィルムは、例えば、一次膜の物理的特性を変更することによって、表面の物理的特性を変更する。このように、本発明に係る方法はまた、エキソ多糖膜の堆積に起因する前述の表面の物理的特性を変更することにより、表面上の望ましくない細菌バイオフィルムの接着特性を変更するための方法である。従って、本発明は、前述の表面上の望ましくない細菌バイオフィルムの接着を低減させるよう、表面の物理的特性を変更するための方法に関し、変更されるのに適した表面の前述の物理的特性は、ゼータ電位または電気化学的電位、接触角、親水性、およびルイス酸塩基特性であり得る。
【００６６】
本発明は、ＥＰＳが、完全に環境に配慮しており、全く抗菌効果を有さず、殺菌性がないという点で特に有利である。本発明は、表面を洗浄するための手段、溶解させる手段、または以前に確立された望ましくない細菌バイオフィルムに打ち勝つための手段ではないことに留意されたい。
【００６７】
本発明はまた、上記のＥＰＳ膜でコーティングされた、または上記の表面保護方法に従って得られた表面にも関する。一実施形態によれば、前述の表面は、金属、例えばセメントやコンクリートなどの鉱物、またはプラスチックである。
【００６８】
本発明はまた、上記のＥＰＳのフィルムでコーティングされた表面を含む製品にも関する。
【００６９】
一実施形態によれば、本発明に係るＥＰＳは、特にメタン端末、微生物学的活性水のパイプライン、海水または淡水回路など、海洋端末などの産業部門における使用に適している。この実施形態によれば、ＥＰＳのフィルムでコーティングされた表面を含む製品として、これらに限定されないが、パイプライン、プラットフォーム、特にメタン端末のチューブおよび導管があげられる。
【００７０】
別の実施形態によれば、本発明に係るＥＰＳは、衛生、特に公衆衛生の分野における使用に適している。この実施形態によれば、ＥＰＳのフィルムでコーティングされた表面を含む製品として、これらに限定されないが、チューブ、カテーテル、注射器、手術器具、および医療器具があげられる。
【００７１】
本発明の一実施形態によれば、ＥＰＳのフィルムは、そのバイオフィルム形成阻害作用を高める薬剤に関連し得る。
【００７２】
一実施形態によれば、ＥＰＳのフィルムに関連する、およびそのバイオフィルム形成阻害作用を高める薬剤は、ゾステル酸（ｚｏｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）である。ゾステル酸（ｚｏｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）は、表面上のバイオフィルム形成の防止を可能にするとして記載されている（参照により本明細書中に援用される、米国特許第５３８４１７６号明細書、米国特許第５６０７７４１号明細書）。
【００７３】
一実施形態によれば、ゾステル酸（ｚｏｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）は天然のものである。別の実施形態によれば、ゾステル酸（ｚｏｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）は化学的に修飾された誘導体であり得、好ましくは、ゾステル酸（ｚｏｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体は、本明細書中に参照として援用される米国特許公開公報第２００７／１２８１５１号明細書に記載されるゾステル酸（ｚｏｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）エステルである。好ましい一実施形態によれば、ゾステル酸（ｚｏｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体は、酸性のゾステル酸（ｚｏｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体である。
【００７４】
一実施形態によれば、ゾステル酸（ｚｏｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）は藻類のアマモから抽出される。
【００７５】
本発明の別の実施形態によれば、ＥＰＳのフィルムは、例えば抗菌ペプチド（ＡＭＰ）などの抗菌剤に関連し得る。この実施形態によれば、抗菌剤に関連するＥＰＳのフィルムは、表面のコロニー形成阻害効果を増強するのに適した抗菌効果を有する。このような作用は、衛生の分野において特に有用である。
【００７６】
抗菌ペプチド（ＡＭＰ）は、進化の過程で保存され、生物の分野を通じて普及した、先天性免疫エフェクター分子である。多種多様なＡＭＰは、構造、大きさ、作用機序の面で大きな多様性を明らかにしており、近年同定されてきている。ＡＭＰは、一般的に、カチオン性および疎水性アミノ酸を多く示すことにより特徴付けられる。これらの分子は、細菌膜とのその相互作用にとって不可欠な、天然ではほとんどもっぱら両親媒性である（Bulet et al. 2004）。ＡＭＰは、洗浄の効果により、もしくは形成もしくは細孔によって、その膜を透過処理する、細菌の壁を形成するペプチドグリカンの合成を阻止する、または細菌の代謝経路を阻害することのいずれかによって微生物を殺生する（Brodgen et al., 2005）。
【００７７】
一般的に使用される化学抗生物質と比較すると、ＡＭＰは、完全に生分解性であるという利点を提供している。それらは、その生物学的特性により、従来の化学抗生物質にとって代わる有力な候補としてあげられている。実際、それらは、広範囲な抗菌活性、低特異性、種々の作用機序、および環境に対する安全性を提供する。
【００７８】
ＡＭＰは、化学合成によって、組換えの細菌、または酵母発現システム（クローニング、発現、精製）によって生成し得る。
【００７９】
本発明の一実施形態によれば、ＡＭＰは、αヘリックスの線形のＡＭＰファミリー、１つまたは複数のアミノ酸の過剰に示すＡＭＰファミリー、１つまたは２つのジスルフィド架橋を有するβヘアピンのＡＭＰファミリー、３つまたはそれ以上のジスルフィド架橋を有するβシートまたはαヘリックスの環状ＡＭＰファミリーに属し得る（Bulet et al., Immunological reviews,
2004, 198: 169-184; Brogden, Nature Review Microbiology, 2005, 3:238-250）。
【００８０】
線形αヘリックスのＡＭＰの例として、これらに限定されないが、セクロピン、ｓｔｏｍｏｘｙｎ、ｐｏｎｅｒｉｃｉｎ、ｓｐｉｎｉｇｅｒｉｎ、ｏｘｙｏｐｉｎｉｎ、ｃｕｐｉｅｎｎｉｎ、ｃｌａｖａｎｉｎ、ｓｔｙｅｌｉｎ、ｐａｒｄａｘｉｎ、ｍｉｓｇｕｒｉｎ、ｐｌｅｕｒｏｃｉｄｉｎ、ｐａｒａｓｉｎ、ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｉｎ、ｍｏｒｏｎｅｃｉｄｉｎ、マガイニン、ｔｅｍｐｏｒｉｎ、カテリシジン、およびインドリシジンがあげられる。
【００８１】
１つもしくは複数のアミノ酸、プロリン、アルギニン、グリシン、またはトリプトファンを豊富に有するＡＭＰの例として、これらに限定されないが、ｂａｃｔｅｎｉｃｉｎｓ、ＰＲ−３９、ａｂａｅｃｉｎｓ、ａｐｉｄｅａｃｉｎｓ、ｄｒｏｓｏｃｉｎ、ｐｙｒｒｈｏｃｏｒｉｃｉｎｓ、Ｃｇ−Ｐｒｐ、ｐｒｏｐｈｅｎｉｎ、およびｉｎｄｏｌｉｃｉｎがあげられる。
【００８２】
２〜４つのシステインを含むヘアピンのＡＭＰの例として、これらに限定されないが、タキプレシン、プロテグリン、ｔｈａｎａｔｉｎ、ａｎｄｒｏｃｔｏｎｉｎ、ｇｏｍｅｓｉｎ、ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓｉｎ、ヘプシジン、ｂｒｅｖｉｎｉｎ、ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎ、ｔｉｇｅｒｉｎｉｎ、またはｂａｃｔｅｎｅｃｉｎがあげられる。
【００８３】
６つまたはそれ以上のシステイン残基を含む、または開環を有する環状ＡＭＰＳの例として、これらに限定されないが、（脊椎動物、無脊椎動物、または植物の）デフェンシン、ｔｅｒｍｉｃｉｎ、ｈｅｌｉｏｍｙｃｉｎ、ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ、ＡＳＡＢＦ、ｐＢＤ、ｐｅｎａｅｄｉｎｓ、ＡＬＦ、および大デフェンシン（ｂｉｇ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）があげられる。
【００８４】
本発明の好ましい一実施形態によれば、ＡＭＰは、タキプレシンまたはデフェンシンである。
【００８５】
本発明の一実施形態によれば、ＡＭＰは、化学合成により合成される。本発明の別の実施形態によれば、ＡＭＰは、好ましくは酵母系において、細菌または真菌の組換え系の生物学的合成により合成される。
【００８６】
一実施形態によれば、ＥＰＳのフィルムでコーティングされた表面を、１〜１０ＭＩＣの濃度で１つまたはそれ以上のＡＭＰを含む溶液と接触させる。
【００８７】
本発明によれば、ＡＭＰは、水、エタノール、トリフルオロエタノール（ＣＦ３ＣＨ２ＯＨ、ＴＦＥ）、または水／ＴＦＥなどのその混合物、好ましくはトリフルオロエタノール（ＣＦ３ＣＨ２ＯＨ）などの生物学的に許容可能な極性溶媒中の溶液であり得る。
【００８８】
本発明の一実施形態によれば、接触は、一定の温度で、好ましくは１〜１０℃で、より好ましくは約４℃で行われる。
【００８９】
本発明の一実施形態によれば、接触は、２４〜１２０時間、好ましくは４８〜９６時間、より好ましくは７２時間行われる。
【００９０】
定義
用語ＥＰＳは、深海の熱水の生態系からの細菌の発酵中に（炭水化物に富む栄養培地による、高炭素：窒素比によって誘導される栄養のアンバランスという）制御された条件下で合成されたエキソ多糖類を指し、特に限定はしないが、ＥＰＳは以下である。
【表１】
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【００９１】
これらのＥＰＳの相対的な組成物は、以下の表に示される。
【表２】
2013532161.tif 000003
【００９２】
用語「ＥＰＳ溶液」は、極性溶媒、およびＥＰＳまたはＥＰＳの混合物で形成された溶液を指す。
【００９３】
用語「表面」は、一般的には高分子物質といった合成由来、もしくは一般的にはガラスやコンクリートといった鉱物由来の物質であり得る、またはそれは金属、特に銅、チタンであり得る物質のかたまりの、表面の領域、または外側部分を指し、好ましい金属表面は、３１６Ｌステンレス鋼、チタン、インコネル６００、ニッケル、海事真鍮、およびクロムである。
【００９４】
用語「一次膜」は、周囲の環境からの、タンパク質もしくはタンパク質断片、炭水化物、脂質、例えば鉱物塩などの鉱物物質から形成されるコンディショニングフィルムを指す。この一次膜は、細菌の接着を促進する。
【００９５】
用語「望ましくないバイオフィルム」は、最初の可逆的な、およびその後の不可逆的な接着の工程において、一次膜の上に固定される微生物、一般的には細菌の膜を指す。本発明の範囲内では、バイオフィルムは、微生物により形成されている。用語「バイオフィルム」、「微小なバイオフィルム」、「細菌バイオフィルム」、および「望ましくないバイオフィルム」は、交換可能である。この方法において、表面上に固定されたマクロ生物は、本発明に係るバイオフィルムを形成しない。
【００９６】
用語「接合」は、表面上に本発明に係るＥＰＳを固定するための任意の手段を指す。
【００９７】
用語「接触角」は、液体界面が固体表面に交わる角度を指す。接触角はゴニオメーターによって測定される。接触角の測定は、表面上に広がる液体の能力を示す。方法は、物質の表面で、物質上に堆積する液滴のプロファイルの接線の角度を測定することで構成される。それにより、液体または固体の表面エネルギーの測定を可能にする。接触角の測定により、表面の自由エネルギーへのアクセスを可能にする。それはまた、液体／固体界面での相互作用の極性または非極性の性質の識別を可能にする。このように、表面の親水性または疎水性の性質を、推測することができる。
【００９８】
用語「ＭＩＣ」は、一晩インキュベートした後の微生物の目に見える成長を薬剤が阻害する最小濃度を指す。薬剤のＭＩＣを決定するための方法は、従来技術において周知である。
【００９９】
以下の実施例は、非限定的な方法で本発明を示す、本発明の特定の実施形態を記載する。
【実施例】
【０１００】
実施例１−望ましくない細菌バイオフィルムの汚染を低減させるＥＰＳの効果
多数のＥＰＳを、試験した。図１は、以下のＥＰＳ、ＨＹＤ７２１、ＭＳ９０７、ＳＴ７１６、ＨＹＤ１５４５、ＨＹＤ１６４４、ＧＹ７８５、およびＨＹＤ６５７により得られた結果を含む。一般的な方法は、以下の４つのＥＰＳ、
ＨＹＤ６５７
ＧＹ７８５
ＨＹＤ１５４５
ＨＹＤ１６４４
を参照として説明する。
【０１０１】
これらのＥＰＳは、従来技術において既知であり、特に以下の刊行物に記載されている。
【表３】
2013532161.tif 000004
【０１０２】
実験
３１６Ｌステンレス鋼の試料を、細菌の発酵から得られた生体高分子による表面の前処理の影響についての研究に使用した。鋼の試料は、タンパク質、および／または２００ｍｇ／Ｌ（すなわち０．０２％重量／体積）の濃度でバイオテクノロジー的発酵方法から得られた細菌のエキソ多糖類が補充された浸透・精製水に浸漬することにより、事前に調製した。２０℃の一定温度での２時間の接触後に、様々な試料を、試験前に、２００ｍｌの生理水ですすぎ、層流フード下で乾燥させた。事前に調製していない試料は、参照として使用した。
【０１０３】
動的な機序での接着の試験は、非補充循環海水を用いて行った。様々なエキソ多糖類で調整していないおよび調整した試料の細菌のコロニーは、コンピュータに接続されたカメラを搭載した電子顕微鏡を用いて、動的接着細胞を用いて監視した。
【０１０４】
いくつかのエキソ多糖類での表面の事前調整により、試験した基板（３１６Ｌステンレス）の被膜率の大幅な低減をもたらした。試験の１２０時間後、実験システムにさらにエキソポリマーを追加することにより調整を繰り返すことなく、汚染率（細菌の被膜率）が５〜１０％間で推移した。
【０１０５】
このように、これらの測定値は、循環する天然の海水において、多糖フィルムの不在において７０％の基準値と比較して、バイオフィルムを補給することなく、露出の６日後に海洋細菌との表面（３１６Ｌステンレススチールおよびガラス）の被膜率が１０％未満と実証した。
【０１０６】
例２：ＥＰＳのフィルムの抗菌活性の欠如を示す試験
原則：
希薄された細菌培養を、既知の濃度で、ＥＰＳ溶液を用いて、マイクロウェルにおいて接触させる。結果は、３０℃での成長の１８時間後にウェル内の光学密度（ＯＤ）を測定することによって得た。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、ＥＰＳが細菌の増殖を阻害する最低の濃度である。最小殺菌濃度（ＭＢＣ）は、ＥＰＳが細菌を殺生する最低の濃度である。
【０１０７】
方法：
試験は３つの細菌、
−大腸菌ＳＢＳ３６３（グラム陰性桿菌）
−ミクロルテウスＣＩＰ５３．４５（グラム陽性球菌）
−シュードモナス属（海洋株）
で実施した。
【０１０８】
最初のスクリーニングは、潜在的に活性なＥＰＳを検出するために、高濃度（１００または５００μｇ／ｍｌ）ですべてのＥＰＳにおいて行った。２番目の試験は、ＭＩＣを検出するために、活性なＥＰＳの希釈系列を用いて行った。阻害を示すウェルの中身は、ＭＢＣを検出するために、寒天培地に塗抹した。
【０１０９】
結果：全てのＥＰＳが活性でないことが判明した
【表４】
2013532161.tif 000005
【０１１０】
例３：ＥＰＳフィルムが殺生性ではないことを示す二回目の試験
原則：
希薄化後の細菌培養は、既知の濃度で、ＥＰＳ溶液を用いて、マイクロウェルに接触させる。結果は、３０℃で成長の１８時間後にウェル内の光学密度（ＯＤ）を測定することによって得た。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、ＥＰＳが細菌の増殖を阻害する最低濃度である。最小殺菌濃度（ＭＢＣ）は、ＥＰＳが細菌を殺生する最低濃度である。
【０１１１】
方法：
試験は４つの細菌および１つの酵母
−大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（グラム陰性桿菌）
−枯草菌ＡＴＣＣ６６３３（グラム陽性桿菌）
−緑膿菌ＡＴＣＣ９０２７（グラム陰性桿菌）
−黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ６５３８（グラム陽性球菌）
−カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１（酵母）
で実施した。
【０１１２】
各ＥＰＳは、１ｍｇ／ｍｌで滅菌水の溶液中に配置し、０．５ｍｇ／ｍｌおよび０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈した。これらの溶液は、最終濃度が１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および２５μｇ／ｍｌの濃度で抗菌性試験を実施するために使用された。
【０１１３】
阻害を示すウェルの内容は、ＭＢＣを同定するために、寒天培地上に広げた。
【０１１４】
結果：
試験濃度では、株が任意のＥＰＳの存在下で増殖する。
【表５】
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【図１】
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【国際調査報告】
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2013532161.tif 000010
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