(57)【要約】  ある実施形態において、本発明は、１）オリゴヌクレオチドを含み、２）表１から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドのリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーを含み、３）配列番号１〜５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含んでもよく、ならびにオリゴヌクレオチドに付着される１つまたは複数の脂質、可溶化基および／または標的化リガンドを含んでもよい、モジュール組成物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）オリゴヌクレオチド、２）表２から選択される、１つまたは同一であっても異なるものであってもよい複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドのリボース環の２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号１〜５９から選択される、１つまたは同一であっても異なるものであってもよい複数のペプチドであって、前記リンカーに付着されるペプチドを含む、モジュール組成物。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドのリボース環の２’位またはオリゴヌクレオチドの３’位でオリゴヌクレオチドに付着されるコレステロールをさらに含む、請求項１に記載のモジュール組成物。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドのリボース環の２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でオリゴヌクレオチドに付着されるコレステロールをさらに含む、請求項１に記載のモジュール組成物。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項１に記載のモジュール組成物。
【請求項５】
リンカーがｓｉＲＮＡガイド鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される、請求項４に記載のモジュール組成物。
【請求項６】
リンカーがｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される、請求項４に記載のモジュール組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
治療目的での全身的なオリゴヌクレオチドの送達に着目した科学的な取り組みが進行している。オリゴヌクレオチド送達の３つの目を引くアプローチとしては、１）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）カプセル化、２）ポリマーコンジュゲーションおよび３）単一の化学コンジュゲーションが挙げられる。単一の化学コンジュゲーションは、典型的に、オリゴヌクレオチドに付着される標的化リガンドまたは脂質または可溶化基またはエンドソーム溶解性（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）ペプチドまたは細胞透過性ペプチドおよび／または２つもしくは４つ全ての組み合わせを利用する。リンカー、同様に他の機能性がコンジュゲート中に存在することができる。単一の化学コンジュゲートは公知であり、オリゴヌクレオチドの付着はオリゴヌクレオチドの５’もしくは３’末端、両末端、またはオリゴヌクレオチド内部のいずれかで生じる。国際公開第２００５／０４１８５９号パンフレット、国際公開第２００８／０３６８２５号パンフレット、国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／００７６０５６号明細書および国際公開第２０１０／０３９５４８号パンフレットを参照のこと。
【０００２】
相当な量の文献証拠がオリゴヌクレオチド送達の主なハードルは細胞取り込みおよびエンドソーム脱出であるという仮説を支持する。送達効率を改善するため、取り込み促進ペプチドおよび／またはエンドソーム溶解性ペプチドおよび／または電荷遮蔽基は非常に凝集された形態であることを要求されることがある。この点において、多機能プラットフォームおよび内部修飾はこの要求を満たすための唯一の機会を提供する。
【０００３】
本発明の単一の化学的コンジュゲートは、エンドソーム溶解性、細胞透過性および／または膜融合性と考えることができるペプチドを、オリゴヌクレオチドのリボース環の２’位ならびに／またはオリゴヌクレオチドの末端の３’および／もしくは５’位に含有しないか、または１つまたは複数含有することができる。リンカーはペプチドとオリゴヌクレオチドとの間に同様に存在することができる。他の機能性、例えば標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態増強剤、脂質および／またはマスキング剤などが存在していてもよい。典型的にオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。さらに、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖またはガイド鎖である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００５／０４１８５９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００８／０３６８２５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１０／００７６０５６号明細書
【特許文献５】国際公開第２０１０／０３９５４８号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表１から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドのリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号１〜５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【０００６】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【０００７】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【０００８】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表２から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドのリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号１〜５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００１０】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００１１】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００１２】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表１から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドのリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００１４】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００１５】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００１６】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表２から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドのリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００１８】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００１９】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００２０】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００２１】
ある実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表１から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、リボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーおよび３）配列番号１〜５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００２２】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００２３】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００２４】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表２から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、リボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーおよび３）配列番号１〜５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００２６】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００２７】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００２８】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００２９】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表１から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドのリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００３０】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００３１】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００３２】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００３３】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表２から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドのリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００３４】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００３５】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００３６】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００３７】
ある実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表１から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドの末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号１〜５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００３８】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００３９】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００４０】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００４１】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表２から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドの末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号１〜５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００４２】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００４３】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００４４】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００４５】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表１から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドの末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００４６】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００４７】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００４８】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００４９】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表２から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドの末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００５０】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００５１】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００５２】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】化合物Ｃ４−１を使用して処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル。
【図２】化合物Ｃ４−５を使用して処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル。
【図３】化合物Ｃ４−８を使用して処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル。
【図４】化合物Ｃ４−１０を使用して処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル。
【図５】化合物Ｃ６−１を使用して処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル。
【図６】化合物Ｃ６−２を使用して処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル。
【図７】化合物Ｃ７−１を使用して処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル。
【図８】化合物Ｃ８−１を使用して処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル。
【図９】化合物Ｃ１０−７を使用して処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル。
【図１０】化合物Ｃ１０−８を使用して処理したＨｅＬａ細胞におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル。
【図１１Ａ】ラット網膜におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル。
【図１１Ｂ】ラット網膜におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル。
【図１１Ｃ】ラット網膜におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベル。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
ある実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表１から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドのリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号１〜５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００５５】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００５６】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００５７】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００５８】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表２から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドのリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号１〜５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００５９】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００６０】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００６１】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００６２】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表１から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドのリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００６３】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００６４】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００６５】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００６６】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表２から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドのリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００６７】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００６８】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００６９】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００７０】
ある実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表１から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、リボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーおよび３）配列番号１〜５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００７１】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００７２】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００７３】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００７４】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表２から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、リボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーおよび３）配列番号１〜５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００７５】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００７６】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００７７】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００７８】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表１から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドのリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００７９】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００８０】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００８１】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００８２】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表２から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドのリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００８３】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００８４】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００８５】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖のリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００８６】
ある実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表１から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドの末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号１〜５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００８７】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００８８】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００８９】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００９０】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表２から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドの末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号１〜５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００９１】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００９２】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００９３】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００９４】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表１から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドの末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００９５】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【００９６】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【００９７】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【００９８】
別の実施形態において、本発明は１）オリゴヌクレオチド、２）表２から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のリンカーであって、オリゴヌクレオチドの末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着されるリンカーならびに３）配列番号２８、２９、３３、３６、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９から選択される、同一であっても異なるものであってもよい１つまたは複数のペプチドであって、リンカーに付着されるペプチドを含むモジュール組成物を開示する。
【００９９】
上の実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。
【０１００】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡガイド鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡガイド鎖に付着される。
【０１０１】
上の実施形態において、リンカーは、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に付着される。
【０１０２】
上の実施形態の下位実施形態（ｓｕｂ−ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）において、モジュール組成物は１つまたは複数の脂質をさらに含む。
【０１０３】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物は１つまたは複数の脂質をさらに含み、該脂質はオリゴヌクレオチドのリボース環２’位またはオリゴヌクレオチドの３’位でオリゴヌクレオチドに付着される。
【０１０４】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物は１つまたは複数の脂質をさらに含み、該脂質はオリゴヌクレオチドの３’位で付着される。
【０１０５】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物は１つまたは複数の脂質をさらに含み、該脂質はガイド鎖の３’位で付着される。
【０１０６】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物は１つまたは複数の脂質をさらに含み、該脂質はオリゴヌクレオチドのリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でオリゴヌクレオチドに付着される。
【０１０７】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物は１つまたは複数の脂質をさらに含み、該脂質はオリゴヌクレオチドの末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着される。
【０１０８】
上の実施形態の下位実施形態において、モジュール組成物は脂質をさらに含む。
【０１０９】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物は１つの脂質をさらに含み、該脂質はオリゴヌクレオチドのリボース環２’位またはオリゴヌクレオチドの３’位でオリゴヌクレオチドに付着される。
【０１１０】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物は１つの脂質をさらに含み、該脂質はオリゴヌクレオチドの３’位で付着される。
【０１１１】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物は１つの脂質をさらに含み、該脂質はガイド鎖の３’位で付着される。
【０１１２】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物は１つの脂質をさらに含み、該脂質はオリゴヌクレオチドのリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でオリゴヌクレオチドに付着される。
【０１１３】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物は１つの脂質をさらに含み、該脂質はオリゴヌクレオチドの末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着される。
【０１１４】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物は１つの脂質をさらに含み、該脂質はガイド鎖の３’位で付着される。
【０１１５】
上の実施形態の下位実施形態において、モジュール組成物はコレステロールをさらに含む。
【０１１６】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物はコレステロールをさらに含み、該コレステロールはオリゴヌクレオチドのリボース環２’位またはオリゴヌクレオチドの３’位でオリゴヌクレオチドに付着される。
【０１１７】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物はコレステロールをさらに含み、該コレステロールはオリゴヌクレオチドの３’位で付着される。
【０１１８】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物はコレステロールをさらに含み、該コレステロールはガイド鎖の３’位で付着される。
【０１１９】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物はコレステロールをさらに含み、該コレステロールはオリゴヌクレオチドのリボース環２’位ならびに／または末端３’および／もしくは５’位でオリゴヌクレオチドに付着される。
【０１２０】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物はコレステロールをさらに含み、該コレステロールはオリゴヌクレオチドの末端３’および／または５’位を除いてリボース環２’位でオリゴヌクレオチドに付着される。
【０１２１】
上の実施形態の別の下位実施形態において、モジュール組成物はコレステロールをさらに含み、該コレステロールはガイド鎖の３’位で付着される。
【０１２２】
概略図を通じて本発明を説明すると、本発明はオリゴヌクレオチド（［Ｏ１］［Ｏ２］［Ｏ３］．．．．．．［Ｏｎ］）、リンカー（１つまたは複数）（Ｌ）、ペプチド（１つまたは複数）（Ｐ）ならびに任意（ｏｐｔｉｏｎａｌ）で脂質（１つまたは複数）（Ｘ）、標的化リガンド（１つまたは複数）（Ｘ）および／または可溶化基（１つまたは複数）（Ｘ）を含むモジュール組成物を特徴とする。
【０１２３】
ある実施形態において、モジュール組成物の式はＰ−Ｌ−［Ｏ１］［Ｏ２］［Ｏ３］．．．．．．［Ｏｎ］−Ｌ−Ｐであることができる。
【０１２４】
別の実施形態において、モジュール組成物の式はＰ−Ｌ−［Ｏ１］［Ｏ２］［Ｏ３］．．．．．．［Ｏｎ］−Ｘであることができる。
【０１２５】
モジュール組成物の例は以下である。
【０１２６】
【化１】
2013541510.tif 000002
モジュール組成物の別の代表は以下である。
【０１２７】
【化２】
2013541510.tif 000003
これらの例はガイダンスとして用いられる。当業者は所望の構成成分をパッセンジャー鎖およびガイド鎖上に配置するための順列が種々存在することを認識するであろう。
【０１２８】
任意の数のリンカーを、したがって任意の数のペプチドをオリゴヌクレオチドに付着させることが可能である。好ましいリンカー数の範囲は１〜８である。より好ましいリンカー数の範囲は１〜４である。好ましいペプチド数の範囲は１〜８である。より好ましいペプチド数の範囲は１〜４である。
【０１２９】
２つの鎖はそれぞれｎ個およびｎ’個のヌクレオチドを含有する。ｎおよびｎ’の数は等しい、または異なるものであり得る。この数は８から５０までの範囲の整数である。好ましくは、この数は１２〜２８の範囲の整数である。より好ましくは、この数は１９〜２１の範囲の整数である。
【０１３０】
例として、リンカー（Ｌ−Ｐおよび／またはＬ−Ｘ）を含有する各ヌクレオチド［Ｏｎ］または［Ｏｎ’］は、以下の概略図中に示される一般構造を持つ。
【０１３１】
【化３】
2013541510.tif 000004
各ヌクレオチドについて、１）Ｅ＝酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）；２）塩基＝Ａ、Ｕ、ＧまたはＣであり、修飾されているまたは修飾されていないものであり得る；３）Ｄはリボース環とリンカーＬとの間の連結点であり、Ｄ＝酸素（Ｏ）、硫黄（Ｓ、Ｓ（Ｏ）またはＳ（Ｏ）２）、窒素（Ｎ−Ｒ、式中Ｒ＝Ｈ、アルキル、Ｌ−ＰまたはＬ−Ｘ）、炭素（ＣＨ−Ｒ、式中Ｒ＝Ｈ、アルキル、Ｌ−ＰまたはＬ−Ｘ）またはリン（Ｐ（Ｏ）ＲまたはＰ（Ｏ）（ＯＲ）、式中Ｒ＝アルキル、Ｌ−ＰまたはＬ−Ｘ）である。好ましくは、Ｄ＝酸素（Ｏ）である。
【０１３２】
２個のヌクレオチド［Ｏｎ−１］および［Ｏｎ］、または［Ｏｎ’−１］および［Ｏｎ’］は、ホスホジエステル結合またはチオホスホジエステル結合を通じて連結される。
【０１３３】
オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである場合、「Ｐ−Ｌ」ならびに脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基は同一の鎖上に位置することも、異なる鎖上に位置することもできる。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、「Ｐ−Ｌ」ならびに脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基は同一の鎖上にある。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、「Ｐ−Ｌ」ならびに脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基はパッセンジャー鎖上にある。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、「Ｐ−Ｌ」ならびに脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基はガイド鎖上にある。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、「Ｐ−Ｌ」ならびに脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基は異なる鎖上に位置する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、「Ｐ−Ｌ」はパッセンジャー鎖上にある一方、脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基はガイド鎖上にある。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、「Ｐ−Ｌ」ならびに脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基は異なる鎖上にあるが、二本鎖オリゴヌクレオチドの同じ末端上にある。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、「Ｐ−Ｌ」ならびに脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基は異なる鎖上にあり、二本鎖オリゴヌクレオチドの反対の末端上にある。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、同じまたは異なる性質を持つ付加的な「Ｐ−Ｌ」が上の実施形態において記される脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基の代わりに用いられ得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、「Ｐ−Ｌ」はパッセンジャー鎖またはガイド鎖のいずれかの複数末端上に位置し得るもので、脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基はパッセンジャー鎖およびガイド鎖の残りの末端上に位置し得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、１つの「Ｐ−Ｌ」ならびに２つ以上の脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基がオリゴヌクレオチド中に存在する。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、２つ以上の「Ｐ−Ｌ」ならびに２つ以上の脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基がオリゴヌクレオチド中に存在する。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドであって、複数の「Ｐ−Ｌ」構成成分ならびに／または脂質、標的化リガンドおよび／もしくは可溶化基が存在する場合、かかる複数の「Ｐ−Ｌ」構成成分ならびに／または脂質、標的化リガンドおよび／もしくは可溶化基は二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖または両方の鎖の中に全て存在することができる。
【０１４６】
複数の「Ｐ−Ｌ」構成成分ならびに／または脂質、標的化リガンドおよび／もしくは可溶化基が存在する場合、それらは全て同一であっても異なるものであってもよい。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、「Ｐ−Ｌ」は内側のヌクレオチド上のみにある（すなわちオリゴヌクレオチドの３’および５’末端を除く）。
【０１４８】
別の態様において、本発明はオリゴヌクレオチドを細胞に送達する方法を包含する。本方法は（ａ）本発明のモジュール組成物を供給または入手すること、（ｂ）細胞をモジュール組成物と接触させること、および（ｃ）細胞によって内部にモジュール組成物を移行させることを包含する。
【０１４９】
本方法はインビトロ、エクスビボまたはインビボで、例えばオリゴヌクレオチドを必要とすると認められた対象を治療するために、例えば遺伝子（１つまたは複数）、例えばダウンレギュレートまたはサイレンシングされた疾患関連遺伝子の発現を必要とするヒトを治療するために実施することが可能である。
【０１５０】
１つの態様において、本発明は１つまたは複数の遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は１つまたは複数の細胞を有効量のオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、ここで有効な量とは１つまたは複数の遺伝子の発現を抑制する量である。本方法はインビトロ、エクスビボまたはインビボで実施可能である。
【０１５１】
本発明の方法および組成物、例えば本明細書に記載されるモジュール組成物は、当該技術分野で公知である任意のオリゴヌクレオチドと共に用いることが可能である。加えて、本発明の方法および組成物は、当該技術分野で公知である任意の疾患または傷害の治療に、および任意の対象、例えば任意の動物、任意の哺乳類、例えばヒトなどの治療に用いることが可能である。本発明の方法および組成物を遺伝子（１つまたは複数）のダウンレギュレートまたはサイレンシングの利益を享受するであろう任意の疾患の治療のために用いることができることもまた、当業者は認識するであろう。
【０１５２】
本発明の方法および組成物、例えば本明細書に記載されるモジュール組成物は、本明細書に記載される任意の用量および／もしくは処方、または当該技術分野で公知である任意の用量もしくは処方を使用して用いられることができる。本明細書に記載される投与経路に加えて、他の投与経路を本発明のモジュール組成物を投与するのに用いることができることもまた、当業者は理解するであろう。
オリゴヌクレオチド
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」は多重鎖、二本鎖または一本鎖の、修飾されていないまたは修飾されたＲＮＡ、ＰＮＡまたはＤＮＡである。修飾されたＲＮＡの例としては、ヌクレアーゼ分解に対して、修飾されていないＲＮＡより優れた抵抗性を持つものが挙げられる。さらなる例としては、２’の糖修飾、塩基修飾、一本鎖突出の修飾、例えば３’の一本鎖突出の修飾、またはとりわけ一本鎖の場合には、１つもしくは複数のリン酸基または１つもしくは複数のリン酸基アナログを包含する５’の修飾が挙げられる。オリゴヌクレオチドの例およびさらなる説明は国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレット中に見出すことが可能であり、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。好ましいオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。別の好ましいオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖である。別の好ましいオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡのガイド鎖である。
ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを通じた配列特異的なｍＲＮＡのサイレンシングを指揮する。このプロセスは哺乳類および他の脊椎動物を包含する幅広い種類の生物において生じる。ｓｉＲＮＡを調製および投与する方法ならびに遺伝子機能を特異的に不活性化するためのその使用が知られている。ｓｉＲＮＡは、修飾されたまたは修飾されていないｓｉＲＮＡを包含する。ｓｉＲＮＡの例およびさらなる説明は国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレット中に見出すことが可能であり、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５４】
ｓｉＲＮＡを対象に投与するのに用いることが可能である送達経路は、好例が多数知られている。加えて、ｓｉＲＮＡは当該技術分野で公知である任意の好例の方法に従って処方することが可能である。ｓｉＲＮＡの処方および投与の例およびさらなる説明は国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレット中に見出すことが可能であり、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
ペプチド
高分子薬剤および親水性の薬剤分子の場合、これらは二重膜を容易に横断できず、細胞のエンドソーム／リソソーム区画中での捕捉がその作用部位への有効な送達のための最も大きなハードルと考えられる。理論に拘束されることを望むものではないが、ペプチドの使用はこれらのエンドソーム／リソソーム区画からのオリゴヌクレオチドの脱出または細胞膜を横切ったオリゴヌクレオチドの移行および細胞質ゾル区画内への放出を促進すると思われる。ある特定の実施形態において、本発明のペプチドは、ｐＨ依存的な膜活性および／または膜融合性を示す、ポリカチオン性または両親媒性またはポリアニオン性のペプチドまたはペプチド模倣体であることができる。ペプチド模倣体はペプチドを模倣するように設計された小さなタンパク質様の鎖であることができる。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ペプチドは細胞透過剤、好ましくはヘリックス状の細胞透過剤である。これらのペプチドは一般に細胞透過性ペプチドといわれる。例えば、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｌａｎｇｅｌ，Ｕ．編；２００７年、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボーカラトーン、フロリダ州を参照のこと。好ましくは、構成成分は両親媒性である。ヘリックス状の剤は好ましくはαヘリックス状の剤であり、好ましくは親油性および疎油性の相を持つ。細胞透過剤は、例えば、例として主にＴｙｒ、ＴｒｐおよびＰｈｅからなる細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチドや、デンドリマーペプチド、拘束ペプチド（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）または架橋ペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドの例としては、Ｔａｔ、ペネトラチンおよびＭＰＧが挙げられる。本発明の場合、細胞透過性ペプチドは、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を包含する大きな極性分子を細胞膜を横切って運搬することが可能な「送達」ペプチドであり得ると思われる。細胞透過ペプチドは直線状または環状で、Ｄ−アミノ酸、「逆反転」配列、非ペプチドまたは擬似ペプチド結合、ペプチド模倣物を包含することが可能である。加えてペプチドおよびペプチド模倣物は修飾、例としてグリコシル化、ＰＥＧ化またはメチル化が可能である。ペプチドの例およびさらなる説明は国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレット中に見出すことが可能であり、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。ペプチドの合成は当該技術分野で周知である。
【０１５６】
ペプチドは、システインまたは他のチオール含有部をＣまたはＮ末端に付加することにより、いずれかの末端または両末端でコンジュゲートされることができる。Ｎ末端上に官能基を持たない場合、ペプチドはアセチル基によりキャップされ、または脂質、ＰＥＧもしくは標的化部を使用してキャップされることができる。ペプチドのＣ末端がコンジュゲートされていないまたは官能基を持たない場合、ペプチドはアミドとしてキャップされ、または脂質、ＰＥＧもしくは標的化部を使用してキャップされることができる。
【０１５７】
本発明のペプチドは、
ＨＦＨＨＦＦＨＨＦＦＨＦＦＨＨＦＦＨＨＦ  （配列番号：  １）；    
ＷＨＨＷＷＨＷＷＨＨＷＷＨＨＷ  （配列番号：  ２）；
ＨＷＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  ３）；
ＨＬＨＨＷＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  ４）；
ＨＬＨＨＬＷＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  ５）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＷＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  ６）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＷＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  ７）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＷＬＨＨＬ  （配列番号：  ８）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＷＨＨＬ  （配列番号：  ９）；
ＨＰＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  １０）；
ＨＬＨＨＰＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  １１）；
ＨＬＨＨＬＰＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  １２）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＰＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  １３）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＰＨＨＬ  （配列番号：  １４）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＰ  （配列番号：  １５）；
ＥＬＥＥＬＬＥＥＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  １６）；
ＥＬＨＨＬＬＨＥＬＬＨＬＬＨＥＬＬＨＨＬ  （配列番号：  １７）；
ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡＣ  （配列番号：  １８）；
ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ  （配列番号：  １９）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  ２０）；
ＨＷＨＨＷＷＨＨＷＷＨＷＷＨＨＷＷＨＨＷ  （配列番号：  ２１）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＷＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  ２２）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＷＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  ２３）；
ＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＷ  （配列番号：  ２４）；
ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬ  （配列番号：  ２５）；
ＨＨＨＨＨＨＨＬＬＬＬＬＬＬ  （配列番号：  ２６）；
ＬＴＴＬＬＴＬＬＴＴＬＬＴＴＬ  （配列番号：  ２７）；
ＫＬＬＫＬＬＫＬＷＬＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬ  （配列番号：  ２８）；
ＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  ２９）；
ＦＬＧＧＩＩＳＦＦＫＲＬＦ  （配列番号：  ３０）；
ＦＩＧＧＩＩＳＦＩＫＫＬＦ  （配列番号：  ３１）；
ＦＩＧＧＩＩＳＬＩＫＫＬＦ  （配列番号：  ３２）；
ＨＬＬＨＬＬＬＨＬＷＬＨＬＬＨＬＬＬＨＬＬ  （配列番号：  ３３）；
ＧＩＧＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ  （配列番号：  ３４）；
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ  （配列番号：  ３５）；
ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ  （配列番号：  ３６）；
ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ  （配列番号：  ３７）；
ＧＧＧＡＲＫＫＡＡＫＡＡＲＫＫＡＡＫＡＡＲＫＫＡＡＫＡＡＲＫＫＡＡＫＡＡＫ  （配列番号：  ３８）；
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ  （配列番号：  ３９）；
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ  （配列番号：  ４０）；
ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＩＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ  （配列番号：  ４１）；
ＷＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＨＬＡＥＡＬＡＥＡＥＡＬＥＡＬＡＡ  （配列番号：  ４２）；
Ｄ（ＮＨＣ１２Ｈ２５）ＮｌｅＫＮｌｅＫＮｌｅＨＮｌｅＫＮｌｅＨＮｌｅ  （配列番号：  ４３）；
ＫＬＬＫＬＬＬＫＬＷＬＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬ  （配列番号：  ４４）；
ＧＬＦＥＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ  （配列番号：  ４５）；
ＧＬＦＨＡＩＡＡＨＦＩＨＧＧＷＨＧＬＩＨＧＷＹＧ  （配列番号：  ４６）；
ＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧＷＹＧ  （配列番号：  ４７）；
ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ  （配列番号：  ４８）；
ＧＬＦＫＡＩＡＫＦＩＫＧＧＷＫＧＬＩＫＧＷＹＧ  （配列番号：  ４９）；
ＧＬＦＥＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ  （配列番号：  ５０）；
ＧＬＦＥＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ  （配列番号：  ５１）；
ＧＬＦＨＡＩＡＡＨＦＩＨＧＧＷＨＧＬＩＨＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ  （配列番号：  ５２）；
ＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ  （配列番号：  ５３）；
ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ  （配列番号：  ５４）；
ＧＬＦＫＡＩＡＫＦＩＫＧＧＷＫＧＬＩＫＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ  （配列番号：  ５５）；
ＧＦＦＡＬＩＰＫＩＩＳＳＰＬＦＫＴＬＬＳＡＶＧＳＡＬＳＳＳＧＥＱＥ  （配列番号：  ５６）；
ＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＧＧＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ  （配列番号：  ５７）；
ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＧＧＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  ５８）；  
および
ＬＩＲＬＷＳＨＩＨＩＷＦＱＷＲＲＬＫＷＫＫＫ  （配列番号：５９）；
であって、
該ペプチドはシステインもしくは他のチオール含有部をＣもしくはＮ末端に付加することによりいずれかの末端でコンジュケートされていてもよく；またはＮ末端上に官能基を持たない場合、ペプチドはアセチル基、脂質、ＰＥＧもしくは標的化部によりキャップされていてもよく；またはＣ末端上に官能基を持たない場合、ペプチドはアミド、脂質、ＰＥＧもしくは標的化部によりキャップされていてもよい。
【０１５８】
好ましいペプチド（Ｐ）は、
ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ  （配列番号：  １９）；
ＫＬＬＫＬＬＬＫＬＷＬＫＬＬＫＬＬＬＫＬＬ  （配列番号：  ２８）；
ＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  ２９）；
ＨＬＬＨＬＬＬＨＬＷＬＨＬＬＨＬＬＬＨＬＬ    （配列番号：  ３３）；
ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ  （配列番号：  ３６）；
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ  （配列番号：  ４０）；
ＧＬＦＥＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ  （配列番号：  ５０）；
ＧＬＦＥＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ  （配列番号：  ５１）；
ＧＬＦＨＡＩＡＡＨＦＩＨＧＧＷＨＧＬＩＨＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ  （配列番号：  ５２）；
ＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ  （配列番号：  ５３）；
ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ  （配列番号：  ５４）；
ＧＬＦＫＡＩＡＫＦＩＫＧＧＷＫＧＬＩＫＧＷＹＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ  （配列番号：  ５５）；
ＧＦＦＡＬＩＰＫＩＩＳＳＰＬＦＫＴＬＬＳＡＶＧＳＡＬＳＳＳＧＥＱＥ  （配列番号：  ５６）；
ＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＧＧＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ  （配列番号：  ５７）；
ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＧＧＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬＨＨＬＬＨＨＬＬＨＬＬＨＨＬＬＨＨＬ  （配列番号：  ５８）；  
および
ＬＩＲＬＷＳＨＩＨＩＷＦＱＷＲＲＬＫＷＫＫＫ  （配列番号：５９）；
であって、
該ペプチドはシステインもしくは他のチオール含有部をＣもしくはＮ末端に付加することによりいずれかの末端でコンジュケートされていてもよく；またはＮ末端上に官能基を持たない場合、ペプチドはアセチル基、脂質、ＰＥＧもしくは標的化部によりキャップされていてもよく；またはＣ末端上に官能基を持たない場合、ペプチドはアミド、脂質、ＰＥＧもしくは標的化部によりキャップされていてもよい。
リンカー
本発明のモジュール組成物のペプチドとオリゴヌクレオチドとの間の共有結合にはリンカーが介在する。このリンカーは用途に依存して、切断可能であっても切断可能でなくてもよい。ある特定の実施形態において、切断可能なリンカーは、エンドソームから細胞質への輸送の後にオリゴヌクレオチドを放出するのに用いることができる。コンジュゲーションもしくはカップリング相互作用の所期の性質、または所望の生物学的作用は、リンカー基の選択を決定するであろう。リンカー基はより複雑な構造を実現するために組み合わせてもよく、分岐させてもよい。リンカーの例およびさらなる説明は国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレット中に見出すことが可能であり、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
本発明のリンカーは表１中に示される。
【０１６０】
【表１】
2013541510.tif 000005
2013541510.tif 000006
好ましいリンカーは表２中に示される。
【０１６１】
【表２】
2013541510.tif 000007
前記リンカーの組み合わせを包含する市販のリンカーは様々な供給業者、例えばＰｉｅｒｃｅまたはＱｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎから入手可能である。リンカーはまた、下のそのような一例において説明されるように１から８個のペプチドを収容するより複雑な分岐構造を生み出すために組み合わされてもよい。
【０１６２】
【化４】
2013541510.tif 000008
標的化リガンド
本発明のモジュール組成物は標的化リガンドを含むことができる。いくつかの実施形態において、この標的化リガンドはモジュール組成物を特定の細胞へと指向させることができる。例えば、標的化リガンドは標的細胞の表面上の分子と特異的にまたは非特異的に結合することができる。標的化部は標的細胞への特異的なアフィニティーを有する分子であり得る。標的化部としては、標的細胞の表面上に見出されるタンパク質に対する抗体、または標的細胞の表面上に見出される分子のリガンドもしくはリガンドの受容体結合部分を挙げることが可能である。標的化リガンドの例およびさらなる説明は国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレット中に見出すことが可能であり、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
標的化リガンドは、抗体、受容体のリガンド結合部分、受容体のリガンド、アプタマー、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）、多価Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、コレステロール、脂肪酸、リポタンパク質、葉酸塩、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン、炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フルクトース、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、血漿タンパク質の結合を増強する親油性部、ステロイド、胆汁酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣物、イブプロフェン、ナプロキセン、アスピリン、葉酸塩ならびにこれらのアナログおよび誘導体からなる群より選択される。
【０１６４】
好ましい標的化リガンドは、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣物、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ＧａｌＮＡｃ２およびＧａｌＮＡｃ３、コレステロール、葉酸塩ならびにこれらのアナログおよび誘導体からなる群より選択される。
脂質
親油性部、例えばコレステロールまたは脂肪酸などは、高度に親水性の分子、例えば核酸などに付着された場合、血漿タンパク質の結合およびその結果としての循環半減期を実質的に増強することが可能である。加えて、親油性基は細胞取り込みを増加させることが可能である。例えば、脂質はある特定の血漿タンパク質、例えばリポタンパク質などに結合することが可能であり、その結果として対応するリポタンパク質受容体（例えば、ＬＤＬ受容体またはスカベンジャー受容体ＳＲ−Ｂ１）を発現する特異的な組織中への取り込みを増加させることが示されている。親油性コンジュゲートは標的化送達アプローチとしても考えられ得るもので、その細胞内輸送はエンドソーム溶解剤との組み合わせにより潜在的にさらに改善され得る。
【０１６５】
血漿タンパク質の結合を増強する親油性部の好例としては、ステロール、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、フェノキサジン、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥおよびビオチンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。脂質の例およびさらなる説明は国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレット中に見出すことが可能であり、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
脂質の例としては以下が挙げられる。
【０１６７】
【化５】
2013541510.tif 000009
好ましい脂質はコレステロールである。
可溶化剤
モジュール組成物は、水溶性、循環半減期および／または細胞取り込みを増強することができる他の部分／リガンドを１つまたは複数含むことができる。これらとしては、天然起源の物質、例えばタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）またはグロブリン）、または炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）などを挙げることが可能である。これらの部分は組換えまたは合成の分子、例えば合成ポリマーまたは合成ポリアミノ酸などであってもよい。例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ−０．５Ｋ、ＰＥＧ−２Ｋ、ＰＥＧ−５Ｋ、ＰＥＧ−１０Ｋ、ＰＥＧ−１２Ｋ、ＰＥＧ−１５Ｋ、ＰＥＧ−２０Ｋ、ＰＥＧ−４０Ｋ）、メチルＰＥＧ（ｍＰＥＧ）、［ｍＰＥＧ］２、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンが挙げられる。可溶化剤の例およびさらなる説明は国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレット中に見出すことが可能であり、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６８】
好ましい可溶化基はＰＥＧの０．５Ｋから３０Ｋである。
治療方法
１つの態様において、本発明は、本発明のモジュール組成物の投与の利益を享受することができる疾患のリスクがあるまたは疾患を患っている対象を治療する方法を特徴とする。本方法は、本発明のモジュール組成物をそれを必要とする対象に投与すること、それによって対象を治療することを含む。投与されるオリゴヌクレオチドは治療される疾患に依存するであろう。例えば、本発明のコンジュゲートはがんの治療に有用である。具体的な適応症の治療方法に関するさらなる詳細については国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットを参照されたい。
処方
オリゴヌクレオチド化合物のコンジュゲートを調製する方法は多数ある。技術は当業者によく知られているはずである。かかる反応についての有用な参考文献はＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州、１９９６年である。他の参考文献としては、国際公開第２００５／０４１８５９号パンフレット、国際公開第２００８／０３６８２５号パンフレットおよび国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットが挙げられる。
【実施例】
【０１６９】
本発明は以下の例によりさらに説明されるが、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願の全体にわたって引用される全ての参考文献、係属中の特許出願および公開された特許の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本明細書に記載されるｓｉＲＮＡは、普遍的に発現している遺伝子ＳＳＢ（シェーグレン症候群抗原Ｂ；ＮＭ＿００９２７８．４）を標的とするように設計された。
【０１７０】
オリゴヌクレオチド合成は当該技術分野で周知である（米国特許出願：米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２４０５５４号明細書、米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書、米国特許出願公開第２００９／０２６３４０７号明細書および米国特許出願公開第２００９／０２８５８８１号明細書ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレット、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット、国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレット、国際公開第２０１０／０４２８７７号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４３８４号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４４０５号パンフレットおよび国際公開第２０１０／０５４４０６号パンフレットを参照のこと）。実施例中で開示され使われるｓｉＲＮＡは、標準的な固相手法を通じて合成された。
【０１７１】
リンカー基は結合付着点（ＬＡＰ）でオリゴヌクレオチド鎖（１つまたは複数）に連結することができ、少なくとも１つの酸素原子、少なくとも１つの亜リン酸原子および／または少なくとも１つの窒素原子を持ついくつかの実施形態において、任意の炭素含有部を包含することができる。いくつかの実施形態において、亜リン酸原子はリンカー基上の末端のリン酸またはホスホロチオエート基の一部を形成し、オリゴヌクレオチド鎖への連結点として機能することができる。ある特定の実施形態において、窒素原子はリンカー基上の末端のエーテル、エステル、アミノまたはアミド（ＮＨＣ（Ｏ）−）基の一部を形成し、目的のリンカー、エンドソーム溶解性単位、細胞透過性ペプチド、可溶化基、脂質、標的化基または付加的な目的のリンカーへの連結点として機能することができる。これらの末端のリンカー基としては、Ｃ６ヘキシル、Ｃ５第二ヒドロキシ、Ｃ３チオールまたはＣ６チオール部が挙げられるが、これらに限定されるものではない。下に記載されるＲＮＡ配列からの例は、Ｃ６ヘキシル：［（ＣＨ２）６ＮＨ２］である。
実施例１
【０１７２】
【化６】
2013541510.tif 000010
０．５ｍＬの無水ＤＣＥ中のＮＨＳエステルＬ−２（１００．０ｍｇ、０．３２０ｍｍｏｌ）溶液に、０．５ｍＬの無水ＤＣＥ中のアジドアミンＬ−１（２５３．０ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）を添加し、その後に１．５当量のトリエチルアミンを添加した。結果として得られた溶液を室温で１時間撹拌し、反応混合物をシリカカラムにロードし、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝０／１００から１０／９０で２５分間かけて溶出した。回収されたＬ−３画分をＬＣ−ＭＳ分析に供し、その結果は産物の純度が＞９５％であることを指し示した。
【０１７３】
類似手法に従って、アジドジスルフィドＬ−４からＬ−６を＞９５％のＨＰＬＣ純度で調製し、Ｌ−７を多分散されたＳＰＤＰ−ＰＥＧ−ＮＨＳエステルから調製した。
実施例２
未精製のオリゴヌクレオチドＲ−１  １５ｍｇを、３ｍＬのＤＭＡ／水＝３／１中のアジド−ＰＥＧ９−ＳＰＤＰ  Ｌ−３（２５．３ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）およびＣｕＢｒ・Ｍｅ２Ｓ（０．７６０ｍｇ、３．７０μｍｏｌ）を使用して処理した。結果として得られた反応混合物を室温で４８時間撹拌し、その後に２．０ｍＬの４０％  ＮＨ４Ｆ／水＝１／１を添加した。二相の混合物を６５℃で１時間撹拌し、次いでＣ１８カートリッジにより精製して、未精製の白色固体Ｒ−２を約５ｍｇ得た。
【０１７４】
類似手法に従って、ＲＮＡジスルフィドＲ−３〜Ｒ−１１をそれぞれ調製した。
【０１７５】
【化７】
2013541510.tif 000011
2013541510.tif 000012
2013541510.tif 000013
2013541510.tif 000014
実施例３
未精製のオリゴヌクレオチドＲ−１２  ５０ｍｇを、４ｍＬのＤＭＡ／水＝３／１中のアジド−ＰＥＧ９−ＳＰＤＰ  Ｌ−３（４０．０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）およびＣｕＢｒ・Ｍｅ２Ｓ（２．５０ｍｇ、１２μｍｏｌ）を使用して処理した。結果として得られた反応混合物を室温で４８時間撹拌し、その後に２．０ｍＬの４０％  ＮＨ４Ｆ／水＝１／１を添加した。二相の混合物を６５℃で１時間撹拌し、次いでＣ１８カートリッジにより精製して、未精製の白色固体Ｒ−１３を約１５ｍｇ得た。
【０１７６】
類似手法に従って、ＲＮＡジスルフィドＲ−１４〜Ｒ−１８をそれぞれ調製した。
【０１７７】
【化８】
2013541510.tif 000015
2013541510.tif 000016
2013541510.tif 000017
実施例４
４００μＬのホルムアミド／ｐＨ＝６．８  Ｔｒｉｓバッファー＝３／１中の化合物Ｒ−２（１．５０ｍｇ、０．２１１μｍｏｌ）を、４００μＬの同バッファー中のペプチド配列番号１９（１．７２４ｍｇ、０．４２３μｍｏｌ）を使用して処理し、結果として得られた反応混合物を１時間撹拌した。反応物をホルムアミド／ｐＨ＝６．８  Ｔｒｉｓバッファー＝３／１の添加により総容量２．５ｍＬに希釈し、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム上で強アニオン交換クロマトグラフィー（Ａ中にＢを２５〜７５％、Ａ：ホルムアミド／Ｈ２Ｏ＝１／１、２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４、Ｂ：ホルムアミド／Ｈ２Ｏ＝１／１、２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍｍｏｌ  ＮａＣｌＯ４、ｐＨ＝７．４）により精製した。併合された産物画分を水を使用して希釈し、ＭＷ１０，０００のカットオフ膜を使用して水に対して４回、遠心力で透析した。透析物を凍結乾燥して、Ｒ−１９が白色固体、質量＝１１０６３としてもたらされた。
【０１７８】
等モル量のガイド鎖Ｇ１を化合物Ｒ−１９と混合し、対応する二本鎖デュプレックスＣ４−１を生産した。デュプレックスの完全性をＣＥ分析によりチェックし、コンジュゲートを生物学的評価に供した。
【０１７９】
類似手法に従って、ＲＮＡジスルフィドコンジュゲートＣ４−２からＣ４−１４をそれぞれ調製し、生物学的評価に供した。
【０１８０】
【化９】
2013541510.tif 000018
2013541510.tif 000019
2013541510.tif 000020
2013541510.tif 000021
実施例５
ペプチド配列番号１９（１０．０ｍｇ、２．４５μｍｏｌ）を５００μＬのｐＨ＝６．５のＴＥＡＡバッファー中に溶解し、５００μＬのＴＥＡＡ  ｐＨ＝６．５バッファー中のリンカーＬ−８（３８．４ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）に滴加した。反応物を２時間撹拌し、ＲＰ  ＨＰＬＣにより１０〜９０％のＭｅＣＮ／水で２０分間かけて精製した。回収された画分を凍結乾燥して、ＬＣ−ＭＳ分析による純度が＞９５％である白色固体の配列番号１９−１を得た。
【０１８１】
反応物Ｒ−３（２．００ｍｇ、０．２８２μｍｏｌ）およびＴＣＥＰ（０．８０８ｍｇ、２．８２μｍｏｌ）をｐＨ＝６．８のＴｒｉｓバッファー０．５ｍＬ中に溶解し、２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ追跡がＲ−３のジスルフィド結合の切断を指し示し、次いで反応混合物をＰＤ−１０脱塩カラムにロードした。回収された画分を凍結乾燥して白色固体Ｒ−２０を得て、さらなる精製なしに次の反応のために用いた。
【０１８２】
３００μＬのホルムアミド／ｐＨ＝６．８  Ｔｒｉｓバッファー＝３／１中の化合物Ｒ−２０（２．００ｍｇ、０．２８６μｍｏｌ）を、３００μＬの同バッファー中のペプチド配列番号１９−１（３．９５ｍｇ、０．８５９μｍｏｌ）を使用して処理し、結果として得られた反応混合物を１時間撹拌した。反応物をホルムアミド／ｐＨ＝６．８  Ｔｒｉｓバッファー＝３／１の添加により総容量２．５ｍＬに希釈し、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム上で強アニオン交換クロマトグラフィー（Ａ中にＢを２５〜７５％、Ａ：ホルムアミド／Ｈ２Ｏ＝１／１、２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４、Ｂ：ホルムアミド／Ｈ２Ｏ＝１／１、２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍｍｏｌ  ＮａＣｌＯ４、ｐＨ＝７．４）により精製した。併合された産物画分を水を使用して希釈し、ＭＷ１０，０００のカットオフ膜を使用して水に対して４回、遠心力で透析した。透析物を凍結乾燥して、白色固体としてＲ−２１（０．７１ｍｇ、２１．４％、＞９５％純度）がもたらされた。
【０１８３】
等モル量のガイド鎖Ｇ１を化合物Ｒ−２１と混合し、対応する二本鎖デュプレックスＣ５−１を生産した。デュプレックスの完全性をＣＥ分析によりチェックし、コンジュゲートを生物学的評価に供した。
【０１８４】
【化１０】
2013541510.tif 000022
実施例６
３００μＬのホルムアミド／ｐＨ＝６．８  Ｔｒｉｓバッファー＝３／１中の化合物Ｒ−１３（３．００ｍｇ、０．３８２μｍｏｌ）を、３００μＬの同バッファー中のペプチド配列番号１９（４．９８ｍｇ、１．２２２μｍｏｌ）を使用して処理し、結果として得られた反応混合物を１時間撹拌した。反応物をホルムアミド／ｐＨ＝６．８  Ｔｒｉｓバッファー＝３／１の添加により総容量２．５ｍＬに希釈し、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム上で強アニオン交換クロマトグラフィー（Ａ中にＢを２５〜７５％、Ａ：ホルムアミド／Ｈ２Ｏ＝１／１、２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４、Ｂ：ホルムアミド／Ｈ２Ｏ＝１／１、２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍｍｏｌ  ＮａＣｌＯ４、ｐＨ＝７．４）により精製した。併合された産物画分を水を使用して希釈し、ＭＷ１０，０００のカットオフ膜を使用して水に対して４回、遠心力で透析した。透析物を凍結乾燥して、白色固体としてＲ−２２（＞９０％純度）がもたらされた。
【０１８５】
等モル量のガイド鎖Ｇ１を化合物Ｒ−２２と混合し、対応する二本鎖デュプレックスＣ６−１を生産した。デュプレックスの完全性をＣＥ分析によりチェックし、コンジュゲートを生物学的評価に供した。
【０１８６】
類似手法に従って、ＲＮＡジスルフィドコンジュゲートＣ６−２からＣ６−６を調製し、生物学的評価に供した。
【０１８７】
【化１１】
2013541510.tif 000023
2013541510.tif 000024
2013541510.tif 000025
実施例７
シスタミン（１．１３ｇ、５．０２ｍｍｏｌ）およびコレステロールクロロホルメート（４．９６ｇ、１１．０４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ２０ｍＬ中に溶解し、その後に０℃でＴＥＡ（３．５０ｍｌ、２５．０９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温まで温め、１時間撹拌した。溶媒を除去し、残渣をシリカカラムにより精製して（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン類）＝０／１００から５０／５０で２５分間かけて）、白色固体としてＬ−９（２．４４ｇ、５０％）を産した。
【０１８８】
Ｌ−９（４４０ｍｇ、０．４５０ｍｍｏｌ）およびＤＴＴ（１７４ｍｇ、１．１２５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／水＝２０／１中に溶解して、一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣をシリカカラムにより精製して、白色固体としてチオールＬ−１０（３００ｍｇ、６８％）を産した。
【０１８９】
Ｒ−３（３．００ｍｇ、０．４２３μｍｏｌ）およびＬ−１０（２．０７１ｍｇ、４．２３μｍｏｌ）をＴＨＦ／ｐＨ＝６．８  Ｔｒｉｓバッファー＝１０／１  ６００μＬ中に溶解し、３時間撹拌した。反応混合物を、添加物としてＴＥＡＡを使用したＣ４  ＲＰ  ＨＰＬＣにより精製した。回収された画分を３ｋの膜に対して３回透析し、凍結乾燥して、白色固体のＲ−２３（０．６１ｍｇ、１９％、＞９５％純度）を得た。
【０１９０】
等モル量のガイド鎖Ｇ１を化合物Ｒ−２３と混合し、対応する二本鎖デュプレックスＣ７−１を生産した。デュプレックスの完全性をＣＥ分析によりチェックし、コンジュゲートを生物学的評価に供した。
【０１９１】
【化１２】
2013541510.tif 000026
実施例８
０．３ｍＬのｐＨ＝８  Ｔｒｉｓバッファー中のＲ−２（５．００ｍｇ、０．７０５μｍｏｌ）溶液を０℃まで冷却し、０．３ｍＬのＭｅＣＮ中のＬ−１１（２．７６ｍｇ、４．９３μｍｏｌ）溶液を使用して処理した。結果として得られた溶液を室温で０．５時間撹拌した。未精製の反応物を１８ｍＬの水を使用して希釈し、ＭＷ  ３Ｋの透析膜を用いて水に対して４回、遠心力で透析した。透析物を凍結乾燥し、所望の産物Ｒ−２４が綿毛状の白色非晶質粉末、測定された質量＝７５４０としてもたらされた。
【０１９２】
４００μＬのホルムアミド／ｐＨ＝６．８  Ｔｒｉｓバッファー＝３／１中のＲ−２４（１．０ｍｇ、０．１３３μｍｏｌ）溶液を、４００μＬのホルムアミド／ｐＨ＝６．８  Ｔｒｉｓバッファー＝３／１中の配列番号１９（２．１６４ｍｇ、０．５３０μｍｏｌ）溶液を使用して処理し、結果として得られた溶液を室温で１時間撹拌した。未精製の反応物を６ｍＬのＲｅｓｏｕｒｃｅＱ  カラムおよびＢに対する２５〜７０％のＡの直線的勾配（Ａ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、５０％ホルムアミド、ｐＨ＝７．４；Ｂ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、５０％ホルムアミド、ｐＨ＝７．４）を用いたＧｉｌｓｏｎ装置上で調製用アニオン交換クロマトグラフィーにより精製した。産物のピークを水を使用して希釈し、ＭＷ  １０Ｋの透析膜を用いて水に対して４回、遠心力で透析した。透析物を凍結乾燥し、０．３２ｍｇの所望のコンジュゲートＲ−２５が綿毛状の白色非晶質粉末としてもたらされた。
【０１９３】
等モル量のガイド鎖Ｇ１を化合物Ｒ−２５と混合し、対応する二本鎖デュプレックスＣ８−１を生産した。デュプレックスの完全性をＣＥ分析によりチェックし、コンジュゲートを生物学的評価に供した。
【０１９４】
類似手法に従って、ＲＮＡジスルフィドコンジュゲートＣ８−２からＣ８−６を調製し、生物学的評価に供した。
【０１９５】
【化１３】
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実施例９
未精製のオリゴヌクレオチドＧ３  ５０ｍｇを、３ｍＬのＤＭＡ／水＝３／１中のアジド−ＰＥＧ９−ＳＰＤＰ  Ｌ−３（３８．６ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）およびＣｕＢｒ・Ｍｅ２Ｓ（２．７４ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を使用して処理した。結果として得られた反応混合物を室温で４８時間撹拌し、その後に２．０ｍＬの４０％  ＮＨ４Ｆ／水＝１／１を添加した。二相の混合物を６５℃で１時間撹拌し、次いでＣ１８カートリッジにより精製して、未精製の白色固体Ｇ４を得た。
【０１９６】
類似手法に従って、ＲＮＡジスルフィドＧ５およびＧ６をそれぞれ調製した。
【０１９７】
【化１４】
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実施例１０
３００μＬのホルムアミド／ｐＨ＝６．８  Ｔｒｉｓバッファー＝３／１中の化合物Ｇ４（３．００ｍｇ、０．３９１μｍｏｌ）を、３００μＬの同バッファー中のペプチド配列番号１９（３．１９ｍｇ、０．７８２μｍｏｌ）を使用して処理し、結果として得られた反応混合物を０．５時間撹拌した。反応物をホルムアミド／ｐＨ＝６．８  Ｔｒｉｓバッファー＝３／１の添加により総容量２．５ｍＬに希釈し、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム上で強アニオン交換クロマトグラフィー（Ａ中にＢを２５〜７５％、Ａ：ホルムアミド／Ｈ２Ｏ＝１／１、２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４、Ｂ：ホルムアミド／Ｈ２Ｏ＝１／１、２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、４００ｍｍｏｌ  ＮａＣｌＯ４、ｐＨ＝７．４）により精製した。併合された産物画分を水を使用して希釈し、ＭＷ１０，０００のカットオフ膜を使用して水に対して４回、遠心力で透析した。透析物を凍結乾燥して、Ｇ７  ３．５ｍｇが白色固体、質量＝１１６４０としてもたらされた。
【０１９８】
等モル量のガイド鎖Ｇ７をパッセンジャー鎖Ｒ−２８と混合し、対応する二本鎖デュプレックスＣ１０−１を生産した。デュプレックスの完全性をＣＥ分析によりチェックし、コンジュゲートを生物学的評価に供した。
【０１９９】
類似手法に従って、ＲＮＡジスルフィドコンジュゲートＣ１０−２からＣ１０−８をそれぞれ調製し、生物学的評価に供した。
【０２００】
【化１５】
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アッセイ
ｓｉＲＮＡアッセイの一般的プロトコール
本明細書に記載されるｓｉＲＮＡは普遍的に発現している遺伝子ＳＳＢ（シェーグレン症候群抗原Ｂ；ＮＭ＿００９２７８．４）を標的とするよう設計された。用いられるｓｉＲＮＡの配列はヒト、マウスおよびラットの転写産物で相同である。ｓｉＲＮＡコンジュゲートのサイレンシング活性を試験するため、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん細胞株）細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充した培地（ＤＭＥＭ）中に蒔き、一晩培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。翌日、培地をｓｉＲＮＡコンジュゲートを１０〜０．００１５μΜの範囲の濃度で含有する無血清培地で置換し、細胞を合計で７２時間（３７℃、５％ＣＯ２）そのままにした。ＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを供給業者による説明書によった分岐ＤＮＡアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  １．０  ｂＤＮＡ  Ｋｉｔ  ＃ＱＧ０００２）またはＬｕｃアッセイを用いて分析した。細胞生存率をＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔ＃ＴＢ２４５）を用いて査定し、全てのデータを未処理細胞由来のレベルに正規化した。
【０２０１】
ＨｅＬａ細胞を、指示された化合物を用量依存的な方法で使用して７２時間処理し、ＳＳＢ  ｍＲＮＡのレベルをｂ−ＤＮＡまたはＬｕｃアッセイにより分析した。
【０２０２】
図１に、化合物Ｃ４−１を使用してＨｅＬａ細胞を７２時間処理（３７℃、５％ＣＯ２）した後のＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０２０３】
図２に、化合物Ｃ４−５を使用してＨｅＬａ細胞を７２時間処理（３７℃、５％ＣＯ２）した後のＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０２０４】
図３に、化合物Ｃ４−８を使用してＨｅＬａ細胞を７２時間処理（３７℃、５％ＣＯ２）した後のＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０２０５】
図４に、化合物Ｃ４−１０を使用してＨｅＬａ細胞を７２時間処理（３７℃、５％ＣＯ２）した後のＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０２０６】
図５に、化合物Ｃ６−１を使用してＨｅＬａ細胞を７２時間処理（３７℃、５％ＣＯ２）した後のＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０２０７】
図６に、化合物Ｃ６−２を使用してＨｅＬａ細胞を７２時間処理（３７℃、５％ＣＯ２）した後のＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０２０８】
図７に、化合物Ｃ７−１を使用してＨｅＬａ細胞を７２時間処理（３７℃、５％ＣＯ２）した後のＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０２０９】
図８に、化合物Ｃ８−１を使用してＨｅＬａ細胞を７２時間処理（３７℃、５％ＣＯ２）した後のＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０２１０】
図９に、化合物Ｃ１０−７を使用してＨｅＬａ細胞を７２時間処理（３７℃、５％ＣＯ２）した後のＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０２１１】
図１０に、化合物Ｃ１０−８を使用してＨｅＬａ細胞を７２時間処理（３７℃、５％ＣＯ２）した後のＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを示す。
インビボｓｉＲＮＡアッセイの一般的プロトコール
動物に関する全ての手法はＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈに従って行われ、Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウェストポイント、ペンシルバニア州のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の許可を受けた。雄性Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラット（６〜８週）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ｓｉＲＮＡを感染のリスクを最小限にするため無菌的に調製した。硝子体内投薬の場合、ラットをケタミン／キシラジン（４０〜９０／５〜１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）を使用して麻酔し、１％プロパラカイン塩酸塩（１〜２滴）を局所麻酔薬として眼に適用した。硝子体内注射の場合、清潔な鉗子一組を用いて眼を穏やかに突出させて適所に保ち、３０Ｇ鋭利な針を付けたシリンジを用いて５μＬの試験ｓｉＲＮＡまたは対照媒体を角膜輪部の直後の硝子体内に注射した。屠殺の日、ラットをペントバルビタールナトリウム（１５０〜２００ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）を使用して安楽死させた。眼球摘出の後、硝子体、網膜およびＲＰＥ／脈絡膜を解剖して凍結した。
【０２１２】
眼の試験を硝子体内注射の直前に、および収穫の直前に行った。
【０２１３】
図１１Ａに、コンジュゲートＣ４−１、Ｃ４−２、Ｃ４−３、Ｃ４−４についてのラット網膜におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０２１４】
図１１Ｂに、コンジュゲートＣ６−５についてのラット網膜におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０２１５】
図１１Ｃに、２つの異なる用量のコンジュゲートＣ１０−２についてのラット網膜におけるＳＳＢ  ｍＲＮＡレベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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