(57)【要約】マルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップは、粘性底部ライニング（１）と、サンプルパッド（２）と、結合パッド（３）と、分析膜（４）と、水吸収パッド（５）とを備える。結合パッド（３）は、複数のアッセイ結合物質（６）と、コントロール結合物質（７）とを固定して有する。アッセイ結合物質（６）は、トレーサー（８）と液相検知プローブ（９）とを接合することによって形成され、コントロール結合物質（７）は、トレーサー（８）と液相コントロールプローブ（１１）とを接合することによって形成される。分析膜（４）は、検知基質ユニット（１２）を備え、各検知基質ユニットは、検知ゾーン（１３）と、コントロールゾーン（１４）とを備える。検知ゾーン（１３）は、複数の固相検知プローブ（１５）からなり、コントロールゾーン（１４）は、固相検知プローブ（１６）からなる。免疫クロマトグラフィの反応モードとチップアッセイ基質の設定とを有機的に統合することによって、１回のサンプル装填で複数の標的物質の同時検知に関する高スループットアッセイが可能となる。
2013525765.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
積層カード［１］と、サンプルパッド［２］と、コンジュゲートパッド［３］と、分析膜［４］と、水吸収パッド［５］と
を備える、マルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項２】
前記積層カード［１］は、剛性材料で作られ、一つの表面上を粘着剤で被覆されたものであり、前記カードはＰＶＣプレートである、請求項１に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項３】
前記サンプルパッド［２］は、大きな総容積と均一な微細構造とを有するものであり、前記パッドは、水吸収紙、セルロース膜、ガラス繊維、不織布、または血液濾過膜から選択される、請求項１に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項４】
前記コンジュゲートパッド［３］は、大きな総容積と均一な微細構造とを有するものであり、前記パッドは、ガラス繊維、ポリエステル膜、または不織布から選択され、いくつかの種類のテストコンジュゲート［６］とコントロールコンジュゲート［７］は、前記コンジュゲートパッド［３］に固定され、各種類の前記テストコンジュゲート［６］は、一種類の液相テストプローブ［９］とマーカー［８］をコンジュゲートさせることによって形成され、ある種類の検知された標的［１０］に対して特異的に一対一で対応し、前記コントロールコンジュゲート［７］は、液相コントロールプローブ［１１］と前記マーカー［８］をコンジュゲートさせることによって形成され、前記免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であるか否かを照合することができる、請求項１に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項５】
前記分析膜［４］は、均一な微細構造を有するものであり、前記膜は、ニトロセルロース膜またはナイロン膜から選択され、前記分析膜［４］は、テスト・アレイ・ユニット［１２］を備え、前記テスト・アレイ・ユニット［１２］は、テストゾーン［１３］とコントロールスポット［１４］とを備え、前記テストゾーン［１３］は、様々な種類の固相テストプローブ［１５］を備え、前記コントロールスポット［１４］は、固相コントロールプローブ［１６］を備え、前記テストゾーン［１３］上の各種類の前記固相テストプローブ［１５］は、明確に画定された位置に固定して配置され、ある種類の検知された標的［１０］の特異的な検知に対応し、前記コントロールスポット［１４］上の前記固相コントロールプローブ［１６］は、明確に画定された位置に固定して配置され、全免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であるか否かを照合する、請求項１に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項６】
前記水吸収パッド［５］は、大きな総容積を有するものであり、前記パッドは、水吸収紙またはセルロース膜から選択される、請求項１に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項７】
各検知された標的［１０］は、２つのテストプローブに対応し、前記テストプローブのうちの一方は、前記分析膜［４］上に前記固相テストプローブ［１５］として固定され、前記液相テストプローブ［９］としての他方のテストプローブは、マーカー［８］とコンジュゲートされ、前記コンジュゲートパッド［３］上に固定された前記テストコンジュゲート［６］を形成する、請求項４または５に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項８】
各種類の前記固相テストプローブ［１５］は、前記分析膜［４］の前記テストゾーン［１３］上で、明確に画定された位置に固定して配置され、ある種類の検知された標的［１０］の特異的な検知に個々に対応し、各種類の前記固相テストプローブ［１５］を、ある種類の検知された標的［１０］および前記テストコンジュゲート［６］の前記対応する種類の液相テストプローブ［９］と特異的に免疫学的に反応させることにより、この種類の固相テストプローブ［１５］が位置決めされた場所である明確に画定された位置において結合された前記マーカー［８］の量が、前記免疫反応によって変化し、それにより、この種類の検知された標的［１０］の存在と濃度を、前記マーカー［８］の量によって明らかにする、請求項５に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項９】
前記固相コントロールプローブ［１６］は、前記分析膜［４］の前記コントロールスポット［１４］上の明確に画定された位置で固定して配置され、前記コントロールコンジュゲート［７］の前記液相コントロールプローブ［１１］と直接結合して、前記免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であるか否かを照合する、請求項５に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項１０】
サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップと、間接免疫クロマトグラフィチップと、競合免疫クロマトグラフィチップとを備え、前記サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップは、抗原検知のための二重抗体サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップと、抗体検知のための二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップとを備え、前記間接免疫クロマトグラフィチップは、血清サンプルにおける特異抗体の検知のために、検知された抗体の二次抗体とマーカーをコンジュゲートさせることによって形成された前記テストコンジュゲートと共に使用され、前記競合免疫クロマトグラフィチップは、１つの抗原決定基だけを有するハプテンなどの小分子物質の検知のために使用される、請求項１に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか１項に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップの調製方法であって、以下の工程：
Ａ．コンジュゲートパッド［３］の調製：様々な種類のテストコンジュゲート［６］とコントロールコンジュゲート［７］を混合してコンジュゲートの混合物を得、コンジュゲートパッド［３］として使用される、一片の、ガラス繊維、ポリエステル膜、または不織布上に前記混合物を塗布し、結果として得られたものを次に使用するために乾燥させる工程、
Ｂ．分析膜［４］の調製：明確に画定され固定されたアドレサブルな位置で、ニトロセルロース膜またはナイロン膜上で丸いスポットの形態の、固相テストプローブ［１５］として働く様々な種類の抗原と、固相コントロールプローブ［１６］として働く抗体とをそれぞれ添加することで、テストゾーン［１３］とコントロールスポット［１４］とをそれぞれ形成し、それによりテスト・アレイ・ユニット［１２］を形成し、それを次に使用するために乾燥させる工程であって、前記テスト・アレイ・ユニット［１２］において、前記様々な種類の固相テストプローブ［１５］と、明確に画定され固定されたそれらの位置とは、ある種類の検知された標的［１０］と一対一で対応し、明確に画定され固定された位置をも有する１つの固相コントロールプローブ［１６］だけを必要とし、より良い方法では、複数のテスト・アレイ・ユニット［１２］が前記分析膜［４］上に調製され、
Ｃ．積層および切断：積層カード［１］として働くＰＶＣプレートに対して順番に、前記サンプルパッド［２］と、前記コンジュゲートパッド［３］と、前記分析膜［４］と、水吸収パッド［５］とを、各部品間の重複関係を確保しながら積層させる工程であって、前記免疫クロマトグラフィチップの完成品は、直接使用されるか、または使用するためにプラスチックカートリッジの中に装填されることができ、より良い方法では、前記ＰＶＣプレートを、前記テスト・アレイ・ユニット［１２］間のブレイクポイント［１７］において、別個の使用可能な完成品に切断し、本発明の免疫クロマトグラフィチップを取得する、
を包含する、調製方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のマルチ免疫クロマトグラフィチップを用いた生物学的標的検知方法であって、
Ａ．サンプル添加：請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫学的クロマトグラフィチップの前記サンプルパッド［２］上に液滴の状態で液体サンプルまたは予備処理された液体サンプルを添加すること、
Ｂ．免疫クロマトグラフィ反応：前記免疫クロマトグラフィ反応が完了するまで数分間静置すること、ここで前記免疫クロマトグラフィ反応プロセスにおいて、特異的な免疫反応が、前記テストコンジュゲート［６］と、前記検知された標的［１０］と、前記固相テストプローブ［１５］との間で生じ、前記マーカー［８］の結合量は、前記分析膜［４］上の前記明確に画定され固定された位置において変化し、ある位置における前記マーカー［８］の結合量は、ある種類の検知された標的［１０］の存在または濃度を直接反映する、
Ｃ．結果判断：カラーマーカー［８］に対する視覚的調査によって直接結果を判断するか、または光信号、電気信号、もしくは磁気信号を発生させるマーカー［８］のための器具を用いて結果を判断する結果判断すること、ここで特定の種類の検知された標的［１０］に対する一種類の固相テストプローブ［１５］が、前記分析膜［４］の上の明確に画定された位置に固定して配置されるので、この種類の検知された標的［１０］を、カラー信号、光信号、電気信号、または磁気信号を含む、前記明確に画定された位置に固定されたマーカー［８］からの信号を判断することによって質的に、そして量的に検知されることができる、
を包含する、生物学的標的検知方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学的診断の技術分野に属し、免疫クロマトグラフィアッセイとチップアッセイとを統合し、１回のサンプル装填で複数の標的物質の同時検知を達成することができるマルチアッセイ（または、「多重検知」）免疫クロマトグラフィチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫クロマトグラフィアッセイは、成熟したオンサイト型迅速検知技術であり、免疫クロマトグラフィストリップは、物理的な構造に以下の部品：積層カード（または、「粘性底部ライニング」）［ａ］と、サンプルパッド［ｂ］と、コンジュゲートパッド（または「結合パッド」）［ｃ］と、分析膜［ｄ］と、水吸収パッド［ｅ］とを備え、一種類のマーカー生体分子コンジュゲート（または「結合物質」）［ｆ］は、コンジュゲートパッドに固定され、一種類の生体分子が、テストライン［ｇ］として分析膜［ｄ］に固定され、別の種類の生体マーカーが、コントロールライン［ｈ］として固定される。サンプルパッド［ｂ］と、コンジュゲートパッド［ｃ］と、分析膜［ｄ］と、水吸収パッド［ｅ］は、ある種類の重複する関係で積層カード［ａ］に固定され、それにより、免疫クロマトグラフィストリップにおける液体の流れの継続性が確保される。検知の間、オペレータが、サンプルパッド［ｂ］上に液滴の形態で液体サンプルを添加すると、サンプルは、固定されたコンジュゲート［ｆ］が再溶解して自由になるように、コンジュゲートパッド［ｃ］の中に浸透し、そして、水吸収パッド［ｅ］の駆動効果と毛細管作用の下で、テストライン［ｇ］とコントロールライン［ｈ］とを通って水吸収パッド［ｅ］に向かって動く。そのプロセスにおいて、特異的な免疫反応が、テストライン［ｇ］とコントロールライン［ｈ］とにおいて生じ、それにより、検知可能な信号［ｊ］が、サンプル中の標的物質の存在によって生成される。検知のために必要とされる全ての生物学的試薬（ｆ、ｇ、ｈ）がストリップに固定されているという事実により、オペレータは、液体サンプルの添加を行わなければならないだけであり、全テストプロセスは、１０〜１５分しかかからない。従って、免疫クロマトグラフィアッセイは、最も簡単で最も迅速なオンサイト型検知技術である。しかしながら、免疫クロマトグラフィアッセイは、通常、１回のサンプル装填で１つの標的物質を分析するために使用されることができるだけであり、高スループットの検知を達成することはできない。
【０００３】
チップアッセイは、生物学的分析における標的物質（核酸またはタンパク質）の高スループットの検知に対する要望に対して出てきたものであり、検知プローブとして使用される核酸またはタンパク質は、検知アレイ（または「基質」）を形成するように、微細アレイによってガラス基板［ｋ］の異なるエリア（［ｌ］、［ｍ］…）に固定され、アレイ上の各エリアは、一種類の標的物質の検知のために使用される。検知可能な信号［ｊ］が、ある種類の標的物質の存在により、チップのアレイ上の特定のエリアで生成されることができるように、（核酸ハイブリダイゼーションまたは免疫反応を達成するための）インキュベーション、リンス、トレーシングなどを含む一連の処理の後で、サンプルは、チップの検知アレイ上に液滴の形態で直接添加される。１回のサンプル装填サイクルが必要とされるだけである免疫クロマトグラフィアッセイの均質モードとは異なり、チップアッセイ、特にタンパク質チップアッセイは、異質モードを利用するので、動作のプロセスにおいてインキュベーションとリンスの工程の繰り返しを当然必要とし、さらに、チップアッセイは、動作の標準化と環境に対してストリンジェントな要求を有する。従って、チップアッセイは、オンサイト型検知に対する要求、またはオンサイト型研究所に対する要求さえも満たすことができない。免疫クロマトグラフィアッセイとチップアッセイとの間の際立った特性を図１に示す。
【０００４】
免疫クロマトグラフィアッセイの迅速さおよび利便性と、チップアッセイの高スループットとを継ぎ目なく組み込むと共に、単純で便利な動作で高スループットのオンサイト型検知を達成することができる新たな技術が開発された場合には、高スループットで迅速なスクリーニングに対するオンサイト型検査、検知、および管理部門（例えば、疾患制御システム）の要求を、より良く満たすことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、マルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップを開示することであり、そのマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップは、免疫クロマトグラフィアッセイが高スループットの検知を達成することができず、チップアッセイが動作での非常に複雑な性質のためにオンサイトで使用されることができないという従来技術における不利な点を克服することができ、免疫クロマトグラフィアッセイの反応モードと、チップアッセイのアレイの設定とを継ぎ目なく統合し、それにより、簡単な動作で高スループットのオンサイト型検知、すなわち、１回のサンプル装填で複数の標的物質の同時検知を達成する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、以下の技術的解決策で成し遂げられる。
【０００７】
構造においては、本発明の免疫クロマトグラフィチップは、（図２に示されるように）積層カード（または「粘性底部ライニング」）［１］と、サンプルパッド［２］と、コンジュゲートパッド（または「結合パッド」）［３］と、分析膜［４］と、水吸収パッド［５］とを備える。
【０００８】
積層カード［１］は、剛性材料で作られ、一つの表面上を粘着剤で被覆されたものであり、該カードはＰＶＣプレートである。
【０００９】
サンプルパッド［２］は、大きな総容積と均一な微細構造とを有するものであり、該パッドは、水吸収紙、セルロース膜、ガラス繊維、不織布、または血液濾過膜から選択される。
【００１０】
コンジュゲートパッド［３］は、大きな総容積と均一な微細構造とを有するものであり、該パッドは、ガラス繊維、ポリエステル膜、または不織布から選択され、いくつかの種類のテストコンジュゲート（または「アッセイ結合物質」）［６］とコントロールコンジュゲート（または「コントロール結合物質」）［７］は、コンジュゲートパッド［３］に固定され、各種類のテストコンジュゲート［６］は、一種類の液相テストプローブ（または「液相検知プローブ」）［９］とマーカー（または「接合トレーサー」）［８］をコンジュゲートさせることによって形成され、ある種類の検知された標的（または「検知される標的」）［１０］に対して特異的に一対一で対応し、コントロールコンジュゲート［７］は、液相コントロールプローブ［１１］と前記マーカー［８］をコンジュゲートさせることによって形成され、免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であるか否かを照合することができる。
【００１１】
分析膜［４］は、均一な微細構造を有するものであり、該膜は、ニトロセルロース膜またはナイロン膜から選択され、分析膜［４］は、テスト・アレイ・ユニット（または「検知基質ユニット」）［１２］を備え、テスト・アレイ・ユニット［１２］は、テストゾーン（または検知ゾーン）［１３］とコントロールスポット（または「コントロールゾーン」）［１４］とを備え、テストゾーン［１３］は、様々な種類の固相テストプローブ（または固相検知プローブ）［１５］を備え、コントロールスポット［１４］は、固相コントロールプローブ［１６］を備え、テストゾーン［１３］上の各種類の固相テストプローブ［１５］は、明確に画定された位置に固定して配置され、ある種類の検知された標的［１０］の特異的な検知に対応し、コントロールスポット［１４］上の固相コントロールプローブ［１６］は、明確に画定された位置に固定して配置され、全免疫クロマトグラフィ分析プロセスが正常な状態であるか否かを照合する。
【００１２】
水吸収パッド［５］は、大きな総容積を有するものであり、該パッドは、水吸収紙またはセルロース膜から選択される。
【００１３】
各検知された標的［１０］は、２つのテストプローブに対応する。そのテストプローブのうちの一方は、分析膜［４］上に固相テストプローブ［１５］として固定され、液相テストプローブ［９］としての他方のテストプローブは、マーカー［８］とコンジュゲートされ、コンジュゲートパッド［３］上に固定されたテストコンジュゲート［６］を形成する。
【００１４】
各種類の固相テストプローブ［１５］は、分析膜［４］のテストゾーン［１３］上で、明確に画定された位置に固定して配置され、ある種類の検知された標的［１０］の特異的な検知に個々に対応する。各種類の固相テストプローブ［１５］を、ある種類の検知された標的［１０］およびテストコンジュゲート［６］の対応する種類の液相テストプローブ［９］と特異的に免疫学的に反応させることにより、この種類の固相テストプローブ［１５］が位置決めされた場所である明確に画定された位置において結合されたマーカー［８］の量が、免疫反応によって変化し、それにより、この種類の検知された標的［１０］の存在と濃度を、マーカー［８］の量によって明らかにすることができる。
【００１５】
固相コントロールプローブ［１６］は、分析膜［４］のコントロールスポット［１４］上の明確に画定された位置で固定して配置され、コントロールコンジュゲート［７］の液相コントロールプローブ［１１］と直接結合して、免疫クロマトグラフィ分析プロセスが正常な状態であるか否かを照合することができる。
【００１６】
本発明の免疫クロマトグラフィチップは、サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップと、間接免疫クロマトグラフィチップと、競合免疫クロマトグラフィチップとを備え、サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップは、抗原検知のための二重抗体サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップと、抗体検知のための二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップとを備え、間接免疫クロマトグラフィチップは、血清サンプルにおける特異抗体の検知のために、検知された抗体の二次抗体とマーカーをコンジュゲートさせることによって形成されたテストコンジュゲートと共に使用され、競合免疫クロマトグラフィチップは、１つの抗原決定基だけを有するハプテンなどの小分子物質の検知のために使用される。
【００１７】
本発明の免疫クロマトグラフィチップの調製方法は、以下の工程を包含する。
【００１８】
Ａ．コンジュゲートパッド［３］の調製：様々な種類のテストコンジュゲート［６］とコントロールコンジュゲート［７］を混合してコンジュゲートの混合物を得、コンジュゲートパッド［３］として使用される、一片のガラス繊維、ポリエステル膜、または不織布上に混合物を塗布し、結果として得られたものを次に使用するために乾燥させる、工程。
【００１９】
Ｂ．分析膜［４］の調製：明確に画定され固定されたアドレサブルな位置で、ニトロセルロース膜またはナイロン膜上で丸いスポットの形態の、固相テストプローブ［１５］として働く様々な種類の抗原と、固相コントロールプローブ［１６］として働く抗体とをそれぞれ添加することで、テストゾーン［１３］とコントロールスポット［１４］とをそれぞれ形成し、それによりテスト・アレイ・ユニット［１２］を形成し、それを次に使用するために乾燥させる工程。テスト・アレイ・ユニット［１２］において、様々な種類の固相テストプローブ［１５］と、明確に画定され固定されたそれらの位置とは、ある種類の検知された標的［１０］と一対一で対応し、明確に画定され固定された位置をも有する１つの固相コントロールプローブ［１６］だけを必要とする。より良い方法では、複数のテスト・アレイ・ユニット［１２］が分析膜［４］上に調製される（図３を参照）。
【００２０】
Ｃ．積層および切断：積層カード［１］として働くＰＶＣプレートに対して順番に、サンプルパッド［２］と、コンジュゲートパッド［３］と、分析膜［４］と、水吸収パッド［５］とを、各部品間の重複関係を確保しながら積層させて、本発明の免疫クロマトグラフィチップの完成品を取得する工程。免疫クロマトグラフィチップの完成品は、直接使用されるか、または使用するためにプラスチックカートリッジの中に装填することができる。より良い方法では、ＰＶＣプレートを、テスト・アレイ・ユニット［１２］間のブレイクポイント［１７］において、別個の使用可能な完成品に切断する（図４を参照）。
【００２１】
本発明における免疫クロマトグラフィチップを用いた生物学的標的検知方法であって、
Ａ．サンプル添加：本発明における免疫クロマトグラフィチップのサンプルパッド［２］上に液滴の状態で液体サンプルまたは予備処理された液体サンプルを添加すること、
Ｂ．免疫クロマトグラフィ反応：免疫クロマトグラフィ反応が完了するまで数分間静置すること。免疫クロマトグラフィ反応プロセスにおいて、特異的な免疫反応が、テストコンジュゲート［６］と、検知された標的［１０］と、固相テストプローブ［１５］との間で生じ、マーカー［８］の結合量は、分析膜［４］上の明確に画定され固定された位置において変化する。ある位置におけるマーカー［８］の結合量は、ある種類の検知された標的［１０］の存在または濃度を直接反映する、
Ｃ．結果判断：カラーマーカー［８］に対する視覚的調査によって直接結果を判断するか、または光信号、電気信号、もしくは磁気信号を発生させるマーカー［８］のための器具を用いて結果を判断すること。ある種類の検知された標的［１０］に対する一種類の固相テストプローブ［１５］が、分析膜［４］の上の明確に画定された位置に固定して配置されるので、この種類の検知された標的［１０］を、カラー信号、光信号、電気信号、または磁気信号を含む、明確に画定された位置に固定されたマーカー［８］からの信号を判断することによって質的に、そして量的に検知することができる、
を包含する。
【００２２】
本発明の免疫クロマトグラフィチップの検知原理は以下のようなものである。図５に示すように、検知プロセスにおいて、サンプルパッド［２］に液体サンプルを添加した後で、液体サンプルはサンプルパッド［２］を通ってコンジュゲートパッド［３］の中に浸透し、液体サンプルの基材の作用の下で、コンジュゲートパッド［３］に固定されたテストコンジュゲート［６］とコントロールコンジュゲート［７］は、再溶解して自由になり、サンプル中の全種類の検知された標的［１０］と共にコンジュゲートパッド［３］を離れて分析膜［４］の中に入り、毛細管の作用の下で、これらの物質は、テストゾーン［１３］とコントロールスポット［１４］とを通って水吸収パッド［５］に向かって流れ、そのプロセスにおいて、各種類の検知された標的［１０］と、対応する種類のテストコンジュゲート［６］は、免疫反応のモードにより、テストゾーン［１３］上の明確に画定された位置に固定された対応する種類の固相テストプローブ［１５］と免疫学的に特異的に反応し、コントロールコンジュゲート［７］はコントロールスポット［１４］上で固相コントロールプローブ［１６］と直接結合するので、分析膜［４］のテストゾーン［１３］上の明確に画定された位置に固定された固相テストプローブ［１５］と、検知された標的［１０］と、テストコンジュゲート［６］の液相テストプローブ［９］との間の特異的な免疫反応を介して、分析膜［４］のテストゾーン［１３］上の明確に画定され固定された位置におけるマーカー［８］の量が変化し、結局のところ、明確に画定され固定された位置におけるマーカー［８］からの信号の存在と強度とは、検知された標的［１０］の存在と濃度とを指し、分析膜［４］のコントロールスポット［１４］上の明確に画定された位置に固定された固相コントロールプローブ［１６］とコントロールコンジュゲート［７］の液相コントロールプローブ［１１］との間の直接結合を介して、マーカー［８］は、分析膜のコントロールスポット［１４］上の明確に画定され固定された位置で結合し、マーカー［８］の存在は、免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であることを示す。
【発明の効果】
【００２３】
従来技術においては、免疫クロマトグラフィアッセイは、高スループットの検知を達成することができず、チップアッセイは、動作が複雑なのでオンサイトで使用されることができない。それらの問題を解決するために、本発明において、免疫クロマトグラフィチップは、免疫クロマトグラフィアッセイの反応モードとチップアッセイのアレイ設定とを継ぎ目なく統合して、最終的には、オンサイトで使用するのが容易な高スループットの検知、すなわち、１回のサンプル装填で複数の標的物質（すなわち、様々な種類の検知された標的）の同時検知を達成するように設計される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】免疫クロマトグラフィアッセイとチップアッセイとの比較を説明する。  ａ．積層カード、ｂ．サンプルパッド、ｃ．コンジュゲートパッド、ｄ．分析膜、ｅ．水吸収パッド、ｆ．コンジュゲート、ｇ．テストライン、ｈ．コントロールライン、ｉ．液体サンプル流の検知、ｊ．検知可能な信号、ｋ．ガラス基板、ｌ．標的１に対するテストスポット、ｍ．標的２に対するテストスポット、ｎ．液体サンプルの分散方向
【図２】免疫クロマトグラフィチップの構造的な略図を説明する。  １．積層カード、２．サンプルパッド、３．コンジュゲートパッド、４．分析膜、５．水吸収パッド、６．テストコンジュゲート、７．コントロールコンジュゲート、８．マーカー、９．液相テストプローブ、１０．検知された標的、１１．液相コントロールプローブ、１２．テスト・アレイ・ユニット、１３．テストゾーン、１４．コントロールスポット、１５．固相テストプローブ、１６．固相コントロールプローブ  ｏ．特異的検知、ｐ．システムコントロール
【図３】分析膜の調製に関する概略図である。  ４．分析膜、１２．テスト・アレイ・ユニット、１３．テストゾーン、１４．コントロールスポット
【図４】免疫クロマトグラフィチップの積層と切断との概略図である。  １．積層カード、２．サンプルパッド、３．コンジュゲートパッド、４．分析膜、５．水吸収パッド、１７．ブレイクポイント
【図５】免疫クロマトグラフィチップの検知原理を説明する図である。  ６．テストコンジュゲート、７．コントロールコンジュゲート、８．マーカー、９．液相テストプローブ、１０．検知された標的、１１．液相コントロールプローブ、１５．固相テストプローブ、１６．固相コントロールプローブ  ｏ．特異的検知、ｐ．システムコントロール、ｑ．液体サンプル流の方向、ｒ．検知可能な信号
【図６】二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップの構造的な略図を説明する。  Ａ１．積層カード、Ａ２．サンプルパッド、Ａ３．コンジュゲートパッド、Ａ４．分析膜、Ａ５．水吸収パッド、Ａ６．テストコンジュゲート、Ａ７．コントロールコンジュゲート、Ａ８．マーカー、Ａ９．液相テスト抗原、Ａ１０．検知された抗体、Ａ１１．液相コントロール抗原、Ａ１２．テスト・アレイ・ユニット、Ａ１３．テストゾーン、Ａ１４．コントロールスポット、Ａ１５．固相テスト抗原、Ａ１６．固相コントロール抗体  Ａ−ｏ．特異的検知、Ａ−ｐ．システムコントロール
【図７】二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップの検知原理を説明する図である。  Ａ６．テストコンジュゲート、Ａ７．コントロールコンジュゲート、Ａ８．マーカー、Ａ９．液相テスト抗原、Ａ１０．検知された抗体、Ａ１１．液相コントロール抗原、Ａ１５．固相テスト抗原、Ａ１６．固相コントロール抗体  Ａ−ｏ．特異的検知、Ａ−ｐ．システムコントロール、Ａ−ｑ．液体サンプル流の方向、Ａ−ｒ．検知可能な信号
【図８】間接免疫クロマトグラフィチップの構造的な略図を説明する。  Ｂ１．積層カード、Ｂ２．サンプルパッド、Ｂ３．コンジュゲートパッド、Ｂ４．分析膜、Ｂ５．水吸収パッド、Ｂ６．テストコンジュゲート、Ｂ７．コントロールコンジュゲート、Ｂ８．マーカー、Ｂ９．ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｂ１０．検知されたヒト抗体、Ｂ１１．ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ｂ１２．テスト・アレイ・ユニット、Ｂ１３．テストゾーン、Ｂ１４．コントロールスポット、Ｂ１５．固相テスト抗原、Ｂ１６．固相コントロール抗体  Ｂ−ｏ．特異的検知、Ｂ−ｐ．システムコントロール
【図９】間接免疫クロマトグラフィチップの検知原理の図である。  Ｂ６．テストコンジュゲート、Ｂ７．コントロールコンジュゲート、Ｂ８．マーカー、Ｂ９．ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｂ１０．検知されたヒト抗体、Ｂ１１．ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ｂ１５．固相テスト抗原、Ｂ１６．固相コントロール抗体  Ｂ−ｏ．特異的検知、Ｂ−ｐ．システムコントロール、Ｂ−ｑ．液体サンプル流の方向、Ｂ−ｒ．検知可能な信号
【図１０】競合免疫クロマトグラフィチップの構造的な略図を説明する。  Ｃ１．積層カード、Ｃ２．サンプルパッド、Ｃ３．コンジュゲートパッド、Ｃ４．分析膜、Ｃ５．水吸収パッド、Ｃ６．テストコンジュゲート、Ｃ７．コントロールコンジュゲート、Ｃ８．マーカー、Ｃ９．液相テスト抗原、Ｃ１０．検知された抗原、Ｃ１１．ジゴキシン、Ｃ１２．テスト・アレイ・ユニット、Ｃ１３．テストゾーン、Ｃ１４．コントロールスポット、Ｃ１５．固相テスト抗体、Ｃ１６．固相コントロール抗体  Ｃ−ｏ．特異的検知、Ｃ−ｐ．システムコントロール
【図１１】競合免疫クロマトグラフィチップの検知原理を説明する図である。  Ｃ６．テストコンジュゲート、Ｃ７．コントロールコンジュゲート、Ｃ８．マーカー、Ｃ９．液相テスト抗原、Ｃ１０．検知された抗原、Ｃ１１．ジゴキシン、Ｃ１５．固相テスト抗体、Ｃ１６．固相コントロール抗体  Ｃ−ｏ．特異的検知、Ｃ−ｐ．システムコントロール、Ｃ−ｑ．液体サンプル流の方向、Ｃ−ｒ．検知可能な信号
【図１２】二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップの実験例の結果を説明する。  Ａ−Ａ．インフルエンザウイルスに対する抗体の検知、Ａ−Ｂ．パラインフルエンザウイルスに対する抗体の検知、Ａ−Ｃ．呼吸器合抱体ウイルスに対する抗体の検知、Ａ−Ｄ．肺炎マイコプラズマに対する抗体の検知、Ａ−Ｅ．肺炎クラミジアに対する抗体の検知、Ａ−Ｆ．レジオネラニューモフィラに対する抗体の検知、Ａ−Ｇ．インフルエンザ菌に対する抗体の検知、Ａ−Ｈ．肺炎桿菌に対する抗体の検知、ｘ．ＥＬＩＳＡによるＯＤ測定、ｙ．免疫クロマトグラフィチップによるＴ／Ｃ測定
【図１３】間接免疫クロマトグラフィチップの実験例の結果を説明する。  Ｂ−Ａ．インフルエンザウイルスに対する抗体の検知、Ｂ−Ｂ．パラインフルエンザウイルスに対する抗体の検知、Ｂ−Ｃ．呼吸器合抱体ウイルスに対する抗体の検知、Ｂ−Ｄ．肺炎マイコプラズマに対する抗体の検知、Ｂ−Ｅ．肺炎クラミジアに対する抗体の検知、Ｂ−Ｆ．レジオネラニューモフィラに対する抗体の検知、Ｂ−Ｇ．インフルエンザ菌に対する抗体の検知、Ｂ−Ｈ．肺炎桿菌に対する抗体の検知、ｘ．ＥＬＩＳＡによるＯＤ測定、ｙ．免疫クロマトグラフィチップによるＴ／Ｃ測定
【図１４】競合免疫クロマトグラフィチップの実験例の結果を説明する。  Ｃ−Ａ．アヘンの検知、Ｃ−Ｂ．モルヒネの検知、Ｃ−Ｃ．ヘロインの検知、Ｃ−Ｄ．コカインの検知、Ｃ−Ｅ．コカの葉の検知、Ｃ−Ｆ．アンフェタミンの検知、Ｃ−Ｇ．メタンフェタミンの検知、Ｃ−Ｈ．メスカリンの検知、ｘ．濃度（ｎｇ／ｍｌ）、ｙ．免疫クロマトグラフィチップによるＴ／Ｃ測定。
【００２５】
本発明はさらに、以下の実験例と実施形態とによって詳細に記載されるが、本発明はそれらには限定されない。
【００２６】
実験例１：「起源が不明な発熱と関連付けられる疑わしい病原体に対する抗体」の検知のための二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップ
血液中の、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、肺炎マイコプラズマ、肺炎クラミジア、レジオネラニューモフィラ、インフルエンザ菌、および肺炎桿菌に対する抗体を、二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップを用いて検知し、起源が不明な発熱に罹患する患者に対するその発熱の原因を迅速に決定した。
【００２７】
調製方法：
Ａ．コンジュゲートパッド［Ａ３］の調製：インフルエンザウイルス表面抗原Ａ、パラインフルエンザウイルス表面抗原Ａ、呼吸器合抱体ウイルス表面抗原Ａ、肺炎マイコプラズマ表面抗原Ａ、肺炎クラミジア表面抗原Ａ、レジオネラニューモフィラ表面抗原Ａ、インフルエンザ菌表面抗原Ａ、および肺炎桿菌表面抗原ＡをフルオレセインＣｙ５とそれぞれコンジュゲートさせ、８種類のテストコンジュゲート［Ａ６］を調製し、Ｃｙ５とジオキシンをコンジュゲートさせ、コントロールコンジュゲート［Ａ７］を調製し、ＰＢバッファ溶液（０．０３Ｍ、ｐＨ＝７．２）中でテストコンジュゲート［Ａ６］とコントロールコンジュゲート［Ａ７］を混合し、１ｍｇ／ｍｌでコンジュゲートのそれぞれの濃度を有するコンジュゲートの混合物を形成し、コンジュゲートパッド［Ａ３］として使用される一片の１ｃｍｘ３０ｃｍのガラス繊維に液滴の形態でコンジュゲートの混合物を添加し、結果として得られたものを次に使用するために３７℃で５時間乾燥させた。
【００２８】
Ｂ．分析膜［Ａ４］の調製：固相テスト抗原［Ａ１５］として、インフルエンザウイルス表面抗原Ｂ、パラインフルエンザウイルス表面抗原Ｂ、呼吸器合抱体ウイルス表面抗原Ｂ、肺炎マイコプラズマ表面抗原Ｂ、肺炎クラミジア表面抗原Ｂ、レジオネラニューモフィラ表面抗原Ｂ、インフルエンザ菌表面抗原Ｂ、および肺炎桿菌表面抗原Ｂを獲得し、固相コントロール抗体［Ａ１６］としてウサギ抗ジゴキシンＩｇＧを獲得し、２．５ｃｍｘ３０ｃｍのサイズを有する一片のニトロセルロース膜上に、１５μｌ／スポットの分配速度で丸いスポットの形態で０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で上記９個の生体分子（または「生物活性分子」）を添加して、２．５ｃｍｘ３ｃｍのテスト・アレイ・ユニット［Ａ１２］を形成し、ここで８種類の固相テスト抗原［Ａ１５］は、テストゾーン［Ａ１３］を構成し、１つの固相コントロール抗体［Ａ１６］は、コントロールスポット［Ａ１４］を構成し、１０個のテスト・アレイ・ユニット［Ａ１２］を連続して調製し、次に使用するためにそれらを乾燥させた。
【００２９】
Ｃ．積層および切断：積層カード［Ａ１］として働く７．４ｃｍｘ３０ｃｍのＰＶＣプレートに対して順番で、１．５ｃｍｘ３０ｃｍのサンプルパッド［Ａ２］と、１ｃｍｘ３０ｃｍのコンジュゲートパッド［Ａ３］と、２．５ｃｍｘ３０ｃｍの分析膜［Ａ４］と、３ｃｍｘ３０ｃｍの水吸収パッド［Ａ５］とを積層させ、ここで３ｍｍの重複部分でコンジュゲートパッド［Ａ３］の上にサンプルパッド［Ａ２］を積層させ、１ｍｍの重複部分で分析膜［Ａ４］の上にコンジュゲートパッド［Ａ３］を積層させ、２ｍｍの重複部分で分析膜［Ａ４］の上に水吸収パッド［Ａ５］を積層させ、最終的に、７．４ｃｍｘ３０ｃｍの半完成品を得、ここでテスト・アレイ・ユニット［Ａ１２］間のブレイクポイント［１７］として長手方向で３ｃｍの間隔の場所を取り、ブレイクポイント［１７］において本発明における半完成品を切断して別個の使用可能な完成品を得、本発明の１０個の免疫クロマトグラフィチップを取得した。
【００３０】
サンプル検知プロセスおよび結果：
Ａ．サンプル添加：９００μｌのサンプル希釈剤バッファ（０．５％のＰＥＧ２００００と、０．０５％のＳＤＳと、２％のＢＳＡとを含有するｐＨ＝７．２の０．０３ＭのＰＢ）と１００μｌの血清サンプルを混合し、次に、免疫クロマトグラフィチップのサンプルパッド［Ａ２］上に液滴の形態で１０００μｌの混合物を添加した。
【００３１】
Ｂ．免疫クロマトグラフィ反応：免疫クロマトグラフィ反応が完了するまで５分間静置した。
【００３２】
Ｃ．結果判断：スキャナを用いて、免疫クロマトグラフィチップ上のＣｙ５の蛍光信号を走査し、各検知された抗体［Ａ１０］に対する固相テスト抗原［Ａ１５］の位置を分析膜［Ａ４］上で固定し明確に画定したので、テストゾーン［Ａ１３］上の明確に画定され固定された位置におけるマーカー［Ａ８］からの信号を収集し分析することによって、各検知された抗体［Ａ１０］に対応する信号強度を得、Ｔとして信号強度を特定し、Ｃとしてコントロールスポット［Ａ１４］上の信号強度を特定し、各検知された抗体［Ａ１０］のテスト結果としてＴ／Ｃを獲得した。
【００３３】
Ｄ．検知性能の評価：インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、肺炎マイコプラズマ、肺炎クラミジア、レジオネラニューモフィラ、インフルエンザ菌、および肺炎桿菌に対する臨床的に陽性または陰性の抗体サンプルを用いて免疫クロマトグラフィチップの検知性能を評価し、免疫クロマトグラフィチップの結果とＥＬＩＳＡの結果を比較した（ここでＥＬＩＳＡにおいてＯＤ＜０．２を有するサンプルは陰性であった一方で、ＯＤ＞０．２を有するサンプルは陽性であった）。（図１２に示された）結果より、カットオフ値としてＴ／Ｃ＝０．１５を用いて、免疫クロマトグラフィチップは、陽性の臨床サンプルと陰性の臨床サンプルとを正確に区別することができること、また感度はＥＬＩＳＡの感度と同等であったことを示した。
【００３４】
実験例２：「起源が不明な発熱と関連付けられる疑わしい病原体に対する抗体」の検知のための間接免疫クロマトグラフィチップ
間接免疫クロマトグラフィチップを用いて、血液中の、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、肺炎マイコプラズマ、肺炎クラミジア、レジオネラニューモフィラ、インフルエンザ菌、および肺炎桿菌に対する抗体を検知し、起源が不明な発熱に苦しむ患者に対する発熱の原因を決定した。
【００３５】
調製方法：
Ａ．コンジュゲートパッド［Ｂ３］の調製：フルオレセインＣｙ５とヤギ抗ヒトＩｇＧをコンジュゲートさせ、テストコンジュゲート［Ｂ６］を調製し、Ｃｙ５とヤギ抗ウサギＩｇＧをコンジュゲートさせ、コントロールコンジュゲート［Ｂ７］を調製し、ＰＢバッファ溶液（０．０３Ｍ、ｐＨ＝７．２）中でコントロールコンジュゲート［Ｂ７］とテストコンジュゲート［Ｂ６］とを混合してコンジュゲートの混合物を形成し、ここでテストコンジュゲート［Ｂ６］の最終的な濃度は８ｍｇ／ｍｌであり、コントロールコンジュゲート［Ｂ７］の最終的な濃度は１ｍｇ／ｍｌであり、コンジュゲートパッド［Ｂ３］として使用される一片の１ｃｍｘ３０ｃｍのガラス繊維上に液滴の形態でコンジュゲートの混合物を添加し、結果として得られたものを次に使用するために３７℃で５時間乾燥させた。
【００３６】
Ｂ．分析膜［Ａ４］の調製：固相テスト抗原［Ｂ１５］として、インフルエンザウイルス表面抗原Ｂ、パラインフルエンザウイルス表面抗原Ｂ、呼吸器合抱体ウイルス表面抗原Ｂ、肺炎マイコプラズマ表面抗原Ｂ、肺炎クラミジア表面抗原Ｂ、レジオネラニューモフィラ表面抗原Ｂ、インフルエンザ菌表面抗原Ｂ、および肺炎桿菌表面抗原Ｂを獲得し、固相コントロール抗体［Ｂ１６］としてウサギＩｇＧを獲得し、２．５ｃｍｘ３０ｃｍのサイズを有する一片のニトロセルロース膜上に、１５μｌ／スポットの分配速度で丸いスポットの形態で０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で９個の生体分子を添加して、２．５ｃｍｘ３ｃｍのテスト・アレイ・ユニット［Ｂ１２］を形成し、ここで８種類の固相テスト抗原［Ａ１５］はテストゾーン［Ｂ１３］を構成し、１つの固相コントロール抗体［Ｂ１６］はコントロールスポット［Ｂ１４］を構成し、１０個のテスト・アレイ・ユニット［Ｂ１２］を連続して調製し、次に使用するためにそれらを乾燥させた。
【００３７】
Ｃ．積層および切断：積層カード［Ｂ１］として働く７．４ｃｍｘ３０ｃｍのＰＶＣプレートに対して順番に、１．５ｃｍｘ３０ｃｍのサンプルパッド［Ｂ２］と、１ｃｍｘ３０ｃｍのコンジュゲートパッド［Ｂ３］と、２．５ｃｍｘ３０ｃｍの分析膜［Ｂ４］と、３ｃｍｘ３０ｃｍの水吸収パッド［Ｂ５］とを積層させ、ここで３ｍｍの重複部分でコンジュゲートパッド［Ｂ３］の上にサンプルパッド［Ｂ２］を積層させ、１ｍｍの重複部分で分析膜［Ｂ４］の上にコンジュゲートパッド［Ｂ３］を積層させ、２ｍｍの重複部分で分析膜［Ｂ４］の上に水吸収パッド［Ｂ５］を積層させ、最終的に、７．４ｃｍｘ３０ｃｍの半完成品を得、ここでテスト・アレイ・ユニット［Ｂ１２］間のブレイクポイント［１７］として長手方向で３ｃｍ間隔の場所を取り、ブレイクポイント［１７］において半完成品を切断して別個の使用可能な完成品を得、本発明の免疫クロマトグラフィチップを取得した。
【００３８】
サンプル検知プロセスおよび結果：
Ａ．サンプル添加：９００μｌのサンプル希釈剤バッファ（０．５％のＰＥＧ２００００と０．０５％のＳＤＳと２％のＢＳＡとを含有する、ｐＨ＝７．２の０．０３ＭのＰＢ）と１００μｌの血清サンプルを混合し、次に、免疫クロマトグラフィチップのサンプルパッド［Ｂ２］の上に液滴の形態で１０００μｌの混合物を添加した。
【００３９】
Ｂ．免疫クロマトグラフィ反応：免疫クロマトグラフィ反応が完了するまで５分間静置した。
【００４０】
Ｃ．結果判断：スキャナを用いて、免疫クロマトグラフィチップ上のＣｙ５の蛍光信号を走査し、各検知された抗体［Ｂ１０］に対する固相テスト抗原［Ｂ１５］の位置を分析膜［Ｂ４］上で固定し明確に画定したので、テストゾーン［Ｂ１３］上の明確に画定され固定された位置におけるマーカー［Ｂ８］からの信号を収集し分析することによって、各検知された抗体［Ｂ１０］に対応する信号強度を得、Ｔとして信号強度を特定し、Ｃとして、コントロールスポット［Ｂ１４］上の信号強度を特定し、各検知された抗体［Ｂ１０］のテスト結果としてＴ／Ｃを獲得した。
【００４１】
Ｄ．検知性能の評価：インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、肺炎マイコプラズマ、肺炎クラミジア、レジオネラニューモフィラ、インフルエンザ菌、および肺炎桿菌に対する臨床的に陽性または陰性の抗体サンプルを用いて免疫クロマトグラフィチップの検知性能を評価し、免疫クロマトグラフィチップの結果とＥＬＩＳＡの結果を比較した（ＥＬＩＳＡにおいてＯＤ＜０．２を有するサンプルは陰性であった一方で、ＯＤ＞０．２を有するサンプルは陽性であった）。（図１３に示された）結果より、カットオフ値としてＴ／Ｃ＝０．１５を用いて、免疫クロマトグラフィチップは、陽性の臨床サンプルと陰性の臨床サンプルとを正確に区別することができること、また感度はＥＬＩＳＡの感度と同等であったことを示した。
【００４２】
実験例３：「違法薬物」の検知のための競合免疫クロマトグラフィチップ
尿中の、アヘン、モルヒネ、ヘロイン、コカイン、コカの葉、アンフェタミン、メタンフェタミン、およびメスカリンを含む違法薬物の痕跡を、競合免疫クロマトグラフィチップを用いて検知した。
【００４３】
調製方法：
Ａ．コンジュゲートパッド［Ｃ３］の調製：ＢＳＡ−アヘン、ＢＳＡ−モルヒネ、ＢＳＡ−ヘロイン、ＢＳＡ−コカイン、ＢＳＡ−コカの葉、ＢＳＡ−アンフェタミン、ＢＳＡ−メタンフェタミン、およびＢＳＡ−メスカリンをフルオレセインＣｙ５とそれぞれコンジュゲートさせ、８種類のテストコンジュゲート［Ｃ６］を調製し、Ｃｙ５とジゴキシンをコンジュゲートさせ、コントロールコンジュゲート［Ｃ７］を調製し、ＰＢバッファ溶液（０．０３Ｍ、ｐＨ＝７．２）中でテストコンジュゲート［Ｃ６］とコントロールコンジュゲート［Ｃ７］を混合し、１ｍｇ／ｍｌでコンジュゲートのそれぞれの濃度を有するコンジュゲートの混合物を形成し、コンジュゲートパッド［Ｃ３］として使用される一片の１ｃｍｘ３０ｃｍのガラス繊維上に液滴の形態でコンジュゲートの混合物を添加し、結果として得られたものを次に使用するために３７℃で５時間乾燥させた。
【００４４】
Ｂ．分析膜［Ｃ４］の調製：固相テスト抗体［Ｃ１５］として、抗アヘンモノクローナル抗体、抗モルヒネモノクローナル抗体、抗ヘロインモノクローナル抗体、抗コカインモノクローナル抗体、抗コカの葉モノクローナル抗体、抗アンフェタミンモノクローナル抗体、抗メタンフェタミンモノクローナル抗体、抗メスカリンモノクローナル抗体を獲得し、固相コントロール抗体［Ｃ１６］としてウサギ抗ジゴキシンＩｇＧを獲得し、一片の２．５ｃｍｘ３０ｃｍのニトロセルロース膜上に１５μｌ／スポットの分配速度で丸いスポットの形態で０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で９個の生体分子を添加して、２．５ｃｍｘ３ｃｍのテスト・アレイ・ユニット［Ｃ１２］を形成し、ここで８種類の固相テスト抗体［Ｃ１５］はテストゾーン［Ｃ１３］を構成し、１つの固相コントロール抗体［Ｃ１６］はコントロールスポット［Ｃ１４］を構成し、１０個のテスト・アレイ・ユニット［Ｃ１２］を連続して調製し、次に使用するためにそれらを乾燥させた。
【００４５】
Ｃ．積層および切断：積層カード［Ｃ１］として働く７．４ｃｍｘ３０ｃｍのＰＶＣプレートに対して順番に、１．５ｃｍｘ３０ｃｍのサンプルパッド［Ｃ２］と、１ｃｍｘ３０ｃｍのコンジュゲートパッド［Ｃ３］と、２．５ｃｍｘ３０ｃｍの分析膜［Ｃ４］と、３ｃｍｘ３０ｃｍの水吸収パッド［Ｃ５］とを積層させ、ここで３ｍｍの重複部分でコンジュゲートパッド［Ｃ３］の上にサンプルパッド［Ｃ２］を積層させ、１ｍｍの重複部分で分析膜［Ｃ４］の上にコンジュゲートパッド［Ｃ３］を積層させ、２ｍｍの重複部分で分析膜［Ｃ４］の上に水吸収パッド［Ｃ５］を積層させ、最終的に、７．４ｃｍｘ３０ｃｍの半完成品を得、ここでテスト・アレイ・ユニット［Ｃ１２］間のブレイクポイント［１７］として長手方向で３ｃｍ間隔の場所を取り、ブレイクポイント［１７］において半完成品を切断して別個の使用可能な完成品を得、本発明の免疫クロマトグラフィチップを取得した。
【００４６】
サンプル検知プロセスおよび結果：
Ａ．サンプル添加：９００μｌのサンプル希釈剤バッファ（０．５％のＰＥＧ８０００と０．１％のＳＤＳと１％のＢＳＡとを含有する、ｐＨ＝７．２の０．０３ＭのＰＢ）と１００μｌの尿サンプルを混合し、次に、免疫クロマトグラフィチップのサンプルパッド［Ｃ２］の上に液滴の形態で１０００μｌの混合物を添加した。
【００４７】
Ｂ．免疫クロマトグラフィ反応：免疫クロマトグラフィ反応が完了するまで５分間静置した。
【００４８】
Ｃ．結果判断：スキャナを用いて、免疫クロマトグラフィチップ上のＣｙ５の蛍光信号を走査し、各検知された抗原［Ｃ１０］に対する固相テスト抗体［Ｃ１５］の位置を分析膜［Ｃ４］上で固定し明確に画定したので、テストゾーン［Ｃ１３］上の明確に画定され固定された位置におけるマーカー［Ｃ８］からの信号を収集し分析することによって、各検知された抗体［Ｃ１０］に対応する信号強度を得、Ｔとして信号強度を特定し、Ｃとして、コントロールスポット［Ｃ１４］上の信号強度を特定し、各検知された抗原［Ｃ１０］のテスト結果としてＴ／Ｃを獲得した。
【００４９】
Ｄ．検知性能の評価：違法薬物に対して陰性である尿を用いて、アヘン、モルヒネ、ヘロイン、コカイン、コカの葉、アンフェタミン、メタンフェタミン、およびメスカリンの標準的なサンプルを連続して希釈し、免疫クロマトグラフィチップの検知性能を評価した。（図１４に示された）結果より、免疫クロマトグラフィチップは、陽性サンプルと陰性サンプルとを正確に区別することができること、また感度は１００ｐｇ／ｍｌに達したことを示した。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
実施形態１：二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップ
二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップを使用して、血清サンプル中の特異抗体を検知し、ここで検知された抗体に対する特異抗原とマーカーをコンジュゲートさせることによってテストコンジュゲートを形成した。
【００５１】
二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップの構造（図６に示される）
二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップは、積層カード［Ａ１］と、サンプルパッド［Ａ２］と、コンジュゲートパッド［Ａ３］と、分析膜［Ａ４］と、水吸収パッド［Ａ５］とを備え、
積層カード［Ａ１］は、剛性材料で作られ、ＰＶＣプレートなどの一つの表面上を粘着剤で被覆されたものであり、その表面上で、サンプルパッド［Ａ２］と、コンジュゲートパッド［Ａ３］と、分析膜［Ａ４］と、水吸収パッド［Ａ５］とが、適切な重複関係で積層および固定され、二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップにおける液体の流れの連続性を確保することができ、
サンプルパッド［Ａ２］は、二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップが使用されるときに液体サンプルが添加される一片の水吸収パッドであり、
コンジュゲートパッド［Ａ３］は、いくつかの種類のテストコンジュゲート［Ａ６］とコントロールコンジュゲート［Ａ７］とが固定される一片のガラス繊維であり、ここで各種類のテストコンジュゲート［Ａ６］は、一種類の液相テスト抗原［Ａ９］とマーカー［Ａ８］をコンジュゲートさせることによって形成され、ある種類の検知された抗体［Ａ１０］に対して特異的に一対一で対応し、コントロールコンジュゲート［Ａ７］は、液相コントロール抗原［Ａ１１］をマーカー［Ａ８］とコンジュゲートさせることによって形成され、免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であるか否かを照合することができる。
【００５２】
分析膜［Ａ４］は、一片のニトロセルロース膜であり、ここで分析膜［Ａ４］は、テスト・アレイ・ユニット［Ａ１２］を備え、テスト・アレイ・ユニット［Ａ１２］は、テストゾーン［Ａ１３］とコントロールスポット［Ａ１４］とを備え、テストゾーン［Ａ１３］は、様々な種類の固相テスト抗原［Ａ１５］を備え、コントロールスポット［Ａ１４］は、固相コントロール抗体［Ａ１６］を備え、テストゾーン［Ａ１３］上の各種類の固相テスト抗原［Ａ１５］は、明確に画定された位置に固定して配置され、ある種類の検知された抗体［Ａ１０］の特異的な検知に対応し、コントロールスポット［Ａ１４］上の固相コントロール抗体［Ａ１６］は、明確に画定された位置に固定して配置され、全免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であるか否かを照合する。
【００５３】
水吸収パッド［Ａ５］は一片の水吸収紙である。
【００５４】
二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップの調製方法は以下の通りであった。
【００５５】
Ａ．コンジュゲートパッド［Ａ３］の調製：様々な種類のテストコンジュゲート［Ａ６］とコントロールコンジュゲート［Ａ７］を混合して、コンジュゲートの混合物を得、コンジュゲートパッド［Ａ３］として使用される一片のガラス繊維上にコンジュゲートの混合物を塗布し、結果として得られたものを次に使用するために乾燥させた。
【００５６】
Ｂ．分析膜［Ａ４］の調製：明確に画定され固定されたアドレサブルな位置で、ニトロセルロース膜上の丸いスポットの形態の、様々な種類の固相テスト抗原［Ａ１５］と固相コントロール抗体［Ａ１６］とをそれぞれ添加して、テストゾーン［Ａ１３］とコントロールスポット［Ａ１４］とをそれぞれ形成し、それにより、テスト・アレイ・ユニット［Ａ１２］を形成し、分析膜［Ａ４］上に連続して複数のテスト・アレイ・ユニット［Ａ１２］を調製し、次に使用するためにそれらを乾燥させた。テスト・アレイ・ユニット［Ａ１２］において、様々な種類の固相テスト抗原［Ａ１５］とそれらの明確に画定され固定された位置とは、ある種類の検知された抗体［Ａ１０］と一対一の関係で対応し、明確に画定され固定された位置をも有する１つの固相コントロール抗体［Ａ１６］だけを必要とした。
【００５７】
Ｃ．積層および切断：積層カード［Ａ１］として働くＰＶＣプレートに対して順番で、サンプルパッド［Ａ２］と、コンジュゲートパッド［Ａ３］と、分析膜［Ａ４］と、水吸収パッド［Ａ５］とを、各部品間の重複関係を確保しながら積層させ、テスト・アレイ・ユニット［Ａ１２］間のブレイクポイント［１７］において、ＰＶＣプレートを別個の使用可能な完成品に切断して、本発明の免疫クロマトグラフィチップの完成品を取得し、免疫クロマトグラフィチップの完成品は、直接使用されるか、または使用するためにプラスチックカートリッジの中に装填されることができる。
【００５８】
本発明の二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップを用いた生物学的標的検知方法は以下の通りであった。
【００５９】
Ａ．サンプル添加：本発明の免疫クロマトグラフィチップのサンプルパッド［Ａ２］上に液滴の形態で液体サンプルまたは予備処理された液体サンプルを添加した。
【００６０】
Ｂ．免疫クロマトグラフィ反応：免疫クロマトグラフィ反応が完了するまで数分間静置し、免疫クロマトグラフィ反応プロセスにおいて、特異的な免疫反応が、テストコンジュゲート［Ａ６］と、検知された抗体［Ａ１０］と、固相テスト抗原［Ａ１５］との間に生じ、マーカー［Ａ８］の結合量は、分析膜［Ａ４］の上の明確に画定され固定された位置において変化し、ある位置におけるマーカー［Ａ８］の結合量は、ある種類の検知された抗体［Ａ１０］の存在または濃度を直接反映した。
【００６１】
Ｃ．結果判断：カラーマーカー［Ａ８］に対する視覚的調査によって直接結果を判断するか、または光信号、電気信号、もしくは磁気信号を発生させたマーカー［Ａ８］のための器具を用いて結果を判断した。ある種類の検知された抗体［Ａ１０］に対する一種類の固相テスト抗原［Ａ１５］が、分析膜［Ａ４］上の明確に画定された位置に固定して配置されたので、この種類の検知された抗体［Ａ１０］は、カラー信号、光信号、電気信号、または磁気信号を含む、明確に画定された位置に固定されたマーカー［Ａ８］からの信号を判断することによって質的に、そして量的に検知することができる。
【００６２】
本発明の二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップ（図７に示される）の検知原理
検知プロセスにおいて、サンプルパッド［Ａ２］に液体サンプルを添加した後で、液体サンプルはサンプルパッド［Ａ２］を通ってコンジュゲートパッド［Ａ３］の中に浸透し、液体サンプルの基材の作用の下で、コンジュゲートパッド［Ａ３］に固定されたテストコンジュゲート［Ａ６］とコントロールコンジュゲート［Ａ７］は、再溶解して自由になり、サンプル中の全種類の検知された抗体［Ａ１０］と共にコンジュゲートパッド［Ａ３］を離れて分析膜［Ａ４］の中に入り、毛細管の作用の下で、これらの物質は、テストゾーン［Ａ１３］とコントロールスポット［Ａ１４］とを通って水吸収パッド［Ａ５］に向かって流れ、そのプロセスにおいて、各種類のテストコンジュゲート［Ａ６］が、ある種類の検知された抗体［Ａ１０］の一部位と特異的に結合した一方で、同時に、この種類の検知された抗体［Ａ１０］の別の部位が、テストゾーン［Ａ１３］上の明確に画定された位置に固定された対応する種類の固相テスト抗原［Ａ１５］と特異的に結合し、コントロールコンジュゲート［Ａ７］はコントロールスポット［Ａ１４］上で固相コントロール抗体［Ａ１６］と直接結合したので、分析膜［Ａ４］のテストゾーン［Ａ１３］上の明確に画定された位置に固定された固相テスト抗原［Ａ１５］と、検知された抗体［Ａ１０］と、テストコンジュゲート［Ａ６］の液相テスト抗原［Ａ９］との間の特異的二重抗原サンドイッチ免疫反応を介して、分析膜［Ａ４］のテストゾーン［Ａ１３］上の明確に画定され固定された位置におけるマーカー［Ａ８］の量が変化し、結局のところ、明確に画定され固定された位置におけるマーカー［Ａ８］からの信号の存在と強度とは、検知された抗体［Ａ１０］の存在と濃度とを指し、ここでマーカー［Ａ８］の信号強度は、検知された抗体［Ａ１０］の濃度に比例し、分析膜［Ａ４］のコントロールスポット［Ａ１４］上の明確に画定された位置で固定された固相コントロール抗体［Ａ１６］とコントロールコンジュゲート［Ａ７］の液相コントロール抗原［Ａ１１］との間の直接結合を介して、マーカー［Ａ８］は、分析膜［Ａ４］のコントロールスポット［Ａ１４］上の明確に画定され固定された位置で結合し、マーカー［Ａ８］の存在は、免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であったことを示した。
【００６３】
実施形態２：間接免疫クロマトグラフィチップ
間接免疫クロマトグラフィチップを使用して血清サンプル中の特異抗体を検知し、ここで検知された抗体の二次抗体とマーカーをコンジュゲートさせることによってテストコンジュゲートを形成した。以下、ヒト血清サンプルの検知例を使用して本実施形態を説明する。
【００６４】
間接免疫クロマトグラフィチップ（図８に示される）の構造
間接免疫クロマトグラフィチップは、積層カード［Ｂ１］と、サンプルパッド［Ｂ２］と、コンジュゲートパッド［Ｂ３］と、分析膜［Ｂ４］と、水吸収パッド［Ｂ５］とを備え、
積層カード［Ｂ１］は、剛性材料で作られ、ＰＶＣプレートなどの一つの表面上を粘着剤で被覆されたものであり、その表面上で、サンプルパッド［Ｂ２］と、コンジュゲートパッド［Ｂ３］と、分析膜［Ｂ４］と、水吸収パッド［Ｂ５］とが、適切な重複関係で積層および固定され、間接免疫クロマトグラフィチップにおける液体の流れの連続性を確保することができ、
サンプルパッド［Ａ２］は、間接免疫クロマトグラフィチップが使用されるときに液体サンプルが添加される一片のセルロース膜であり、
コンジュゲートパッド［Ｂ３］は、テストコンジュゲート［Ｂ６］とコントロールコンジュゲート［Ｂ７］とが固定される一片のポリエステル膜であり、ここでテストコンジュゲート［Ｂ６］は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ［Ｂ９］とマーカー［Ｂ８］をコンジュゲートさせることによって形成され、検知されたヒト抗体［Ｂ１０］と特異的に反応してもよく、コントロールコンジュゲート［Ｂ７］は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ［Ｂ１１］とマーカー［Ｂ８］をコンジュゲートさせることによって形成され、免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であるか否かを照合することができ、
分析膜［Ｂ４］は、一片のナイロン膜であり、ここで分析膜［Ｂ４］は、テスト・アレイ・ユニット［Ｂ１２］を備え、テスト・アレイ・ユニット［Ｂ１２］は、テストゾーン［Ｂ１３］とコントロールスポット［Ｂ１４］とを備え、テストゾーン［Ｂ１３］は、様々な種類の固相テスト抗原［Ｂ１５］を備え、コントロールスポット［Ｂ１４］は、固相コントロール抗体［Ｂ１６］、すなわち、ウサギ抗ＩｇＧを備え、テストゾーン［Ｂ１３］上の各種類の固相テスト抗原［Ｂ１５］は、明確に画定された位置に固定して配置され、ある種類の検知されたヒト抗体［Ｂ１０］の特異的な検知に対応し、コントロールスポット［Ｂ１４］上の固相コントロール抗体［Ｂ１６］は、明確に画定された位置に固定して配置され、全免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であるか否かを照合する。
【００６５】
水吸収パッド［Ｂ５］は一片のセルロース膜である。
【００６６】
間接免疫クロマトグラフィチップの調製方法は以下の通りであった。
【００６７】
Ａ．コンジュゲートパッド［Ｂ３］の調製：テストコンジュゲート［Ｂ６］とコントロールコンジュゲート［Ｂ７］を混合してコンジュゲートの混合物を得、コンジュゲートパッド［Ｂ３］として使用された一片のポリエステル膜上にコンジュゲートの混合物を塗布し、結果として得られたものを次に使用するために乾燥させた。
【００６８】
Ｂ．分析膜［Ｂ４］の調製：明確に画定され固定されたアドレサブルな位置で、ナイロン膜上の丸いスポットの形態の、様々な種類の固相テスト抗原［Ｂ１５］と固相コントロール抗体［Ｂ１６］とをそれぞれ添加して、テストゾーン［Ｂ１３］とコントロールスポット［Ｂ１４］とをそれぞれ形成し、それにより、テスト・アレイ・ユニット［Ｂ１２］を形成し、分析膜［Ｂ４］上に連続して複数のテスト・アレイ・ユニット［Ｂ１２］を調製し、次に使用するためにそれらを乾燥させた。テスト・アレイ・ユニット［Ｂ１２］において、様々な種類の固相テスト抗原［Ｂ１５］とそれらの明確に画定され固定された位置とは、ある種類の検知されたヒト抗体［Ｂ１０］と一対一の関係で対応し、明確に画定され固定された位置をも有する１つの固相コントロール抗体［Ｂ１６］だけを必要とした。
【００６９】
Ｃ．積層および切断：積層カード［Ｂ１］として働くＰＶＣプレートに対して順番で、サンプルパッド［Ｂ２］と、コンジュゲートパッド［Ｂ３］と、分析膜［Ｂ４］と、水吸収パッド［Ｂ５］とを、各部品間の重複関係を確保しながら積層させ、テスト・アレイ・ユニット［Ｂ１２］間のブレイクポイント［１７］において、ＰＶＣプレートを別個の使用可能な完成品に切断して、本発明の免疫クロマトグラフィチップの完成品を取得し、免疫クロマトグラフィチップの完成品は、直接使用されるか、または使用するためにプラスチックカートリッジの中に装填されることができる。
【００７０】
本発明の間接免疫クロマトグラフィチップを用いた生物学的標的検知方法は以下の通りであった。
【００７１】
Ａ．サンプル添加：本発明の免疫クロマトグラフィチップのサンプルパッド［Ｂ２］上に液滴の形態で液体サンプルまたは予備処理された液体サンプルを添加した。
【００７２】
Ｂ．免疫クロマトグラフィ反応：免疫クロマトグラフィ反応が完了するまで数分間静置し、免疫クロマトグラフィ反応プロセスにおいて、特異的な免疫反応が、テストコンジュゲート［Ｂ６］と、検知された抗体［Ｂ１０］と、固相テスト抗原［Ｂ１５］との間に生じ、マーカー［Ｂ８］の結合量は、分析膜［Ｂ４］上の明確に画定され固定された位置において変化し、ある位置におけるマーカー［Ｂ８］の結合量は、ある種類の検知されたヒト抗体［Ｂ１０］の存在または濃度を直接反映した。
【００７３】
Ｃ．結果判断。カラーマーカー［Ｂ８］に対する視覚的調査によって直接結果を判断するか、または光信号、電気信号、もしくは磁気信号を発生させたマーカー［Ｂ８］に対する器具を用いて結果を判断した。ある種類の検知されたヒト抗体［Ｂ１０］に対する一種類の固相テスト抗原［Ｂ１５］が、分析膜［Ｂ４］上の明確に画定された位置に固定して配置されたので、この種類の検知されたヒト抗体［Ｂ１０］を、カラー信号、光信号、電気信号、または磁気信号を含む、明確に画定された位置に固定されたマーカー［Ｂ８］からの信号を判断することによって質的に、そして量的に検知することができる。
【００７４】
本発明の間接免疫クロマトグラフィチップ（図９に示される）の検知原理
検知プロセスにおいて、サンプルパッド［Ｂ２］に液体サンプルを添加した後で、液体サンプルは、サンプルパッド［Ｂ２］を通ってコンジュゲートパッド［Ｂ３］の中に浸透し、液体サンプルの基材の作用の下で、コンジュゲートパッド［Ｂ３］に固定されたテストコンジュゲート［Ｂ６］とコントロールコンジュゲート［Ｂ７］は再溶解して自由になり、サンプル中の全種類の検知されたヒト抗体［Ｂ１０］と共にコンジュゲートパッド［Ｂ３］を離れて分析膜［Ｂ４］の中に入り、毛細管の作用の下で、これらの物質は、テストゾーン［Ｂ１３］とコントロールスポット［Ｂ１４］とを通って水吸収パッド［Ｂ５］に向かって流れ、そのプロセスにおいて、テストコンジュゲート［Ｂ６］が、特定の種類の検知されたヒト抗体［Ｂ１０］の一部位と特異的に結合した一方で、同時に、この種類の検知されたヒト抗体［Ｂ１０］の別の部位が、テストゾーン［Ｂ１３］上の明確に画定された位置に固定された対応する種類の固相テスト抗原［Ｂ１５］と特異的に結合し、コントロールコンジュゲート［Ｂ７］はコントロールスポット［Ｂ１４］上の固相コントロール抗体［Ｂ１６］、すなわち、ウサギ抗ＩｇＧと直接結合したので、分析膜［Ｂ４］のテストゾーン［Ｂ１３］上の明確に画定された位置に固定された固相テスト抗原［Ｂ１５］と、検知されたヒト抗体［Ｂ１０］と、テストコンジュゲート［Ｂ６］のヤギ抗ヒトＩｇＧ［Ｂ９］との間の特異的な免疫反応を介して、分析膜［Ｂ４］のテストゾーン［Ｂ１３］上の明確に画定され固定された位置におけるマーカー［Ｂ８］の量が変化し、結局のところ、明確に画定され固定された位置におけるマーカー［Ｂ８］からの信号の存在と強度とは、検知されたヒト抗体［Ｂ１０］の存在と濃度とを指し、ここでマーカー［Ｂ８］の信号強度は、検知されたヒト抗体［Ｂ１０］の濃度に比例し、分析膜［Ｂ４］のコントロールスポット［Ｂ１４］上の明確に画定された位置に固定された固相コントロール抗体［Ｂ１６］（すなわち、ウサギ抗ＩｇＧ）とコントロールコンジュゲート［Ｂ７］のヤギ抗ウサギＩｇＧ［Ｂ１１］との間の直接結合を介して、マーカー［Ａ８］は、分析膜［Ｂ４］のコントロールスポット［Ｂ１４］上の明確に画定され固定された位置で結合し、マーカー［Ｂ８］の存在は、免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であったことを示した。
【００７５】
実施形態３：競合免疫クロマトグラフィチップ
競合免疫クロマトグラフィチップを使用して、１つの抗原決定基だけを有するハプテンなどの小分子を検知した。
【００７６】
競合免疫クロマトグラフィチップ（図１０に示される）の構造
競合免疫クロマトグラフィチップは、積層カード［Ｃ１］と、サンプルパッド［Ｃ２］と、コンジュゲートパッド［Ｃ３］と、分析膜［Ｃ４］と、水吸収パッド［Ｃ５］とを備え、
積層カード［Ｃ１］は、剛性材料で作られ、ＰＶＣプレートなどの一つの表面上に粘着剤で被覆されたものであり、その表面上で、サンプルパッド［Ｃ２］と、コンジュゲートパッド［Ｃ３］と、分析膜［Ｃ４］と、水吸収パッド［Ｃ５］とが、適切な重複関係で積層および固定され、競合免疫クロマトグラフィチップにおける液体の流れの連続性を確保することができ、
サンプルパッド［Ｃ２］は、競合免疫クロマトグラフィチップが使用されるときに液体サンプルが添加される一片のガラス繊維であり、
コンジュゲートパッド［Ｃ３］は、いくつかの種類のテストコンジュゲート［Ｃ６］とコントロールコンジュゲート［Ｃ７］とが固定される一片の不織布であり、ここで各種類のテストコンジュゲート［Ｃ６］は、一種類の液相テスト抗原［Ｃ９］とマーカー［Ｃ８］をコンジュゲートさせることによって形成され、ある種類の検知された抗原［Ｃ１０］と特異的に一対一で対応し、この種類の検知された抗原［Ｃ１０］と同じ抗原決定基を有し、コントロールコンジュゲート［Ｃ７］は、ジゴキシン［Ｃ１１］とマーカー［Ｃ８］をコンジュゲートさせることによって形成され、免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であるか否かを照合することができ、
分析膜［Ｃ４］は、一片のニトロセルロース膜であり、ここで分析膜［Ｃ４］は、テスト・アレイ・ユニット［Ｃ１２］を備え、テスト・アレイ・ユニット［Ｃ１２］は、テストゾーン［Ｃ１３］とコントロールスポット［Ｃ１４］とを備え、テストゾーン［Ｃ１３］は、様々な種類の固相テスト抗体［Ｃ１５］を備え、コントロールスポット［Ｃ１４］は、固相コントロール抗体［Ｃ１６］を備え、テストゾーン［Ｃ１３］上の各種類の固相テスト抗体［Ｃ１５］は、明確に画定された位置に固定して配置され、ある種類の検知された標的［Ｃ１０］の特異的な検知に対応し、コントロールスポット［Ｃ１４］上の固相コントロール抗体［Ａ１６］（すなわち、ウサギ抗ジゴキシン）は、明確に画定された位置に固定して配置され、全免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であるか否かを照合する。
【００７７】
水吸収パッド［Ｃ５］は一片の水吸収紙である。
【００７８】
競合免疫クロマトグラフィチップの調製方法は以下の通りであった。
【００７９】
Ａ．コンジュゲートパッド［Ｃ３］の調製：様々な種類のテストコンジュゲート［Ｃ６］とコントロールコンジュゲート［Ｃ７］を混合してコンジュゲートの混合物を得、コンジュゲートパッド［Ｃ３］として使用された一片の不織布上にコンジュゲートの混合物を塗布し、結果として得られたものを次に使用するために乾燥させた。
【００８０】
Ｂ．分析膜［Ｃ４］の調製：明確に画定され固定されたアドレサブルな位置で、ナイロン膜上で丸いスポットの形態の、様々な種類の固相テスト抗体［Ｃ１５］と固相コントロール抗体［Ｃ１６］とをそれぞれ添加することで、テストゾーン［Ｃ１３］とコントロールスポット［Ｃ１４］とをそれぞれ形成し、それによりテスト・アレイ・ユニット［Ｃ１２］を形成し、分析膜［Ｃ４］上に連続して複数のテスト・アレイ・ユニット［Ｃ１２］を調製し、次に使用するためにそれらを乾燥させた。テスト・アレイ・ユニット［Ｃ１２］において、様々な種類の固相テスト抗体［Ｃ１５］と明確に画定され固定されたそれらの位置とは、ある種類の検知された抗原［Ｃ１０］と一対一で対応し、明確に画定され固定された位置をも有する１つの固相コントロール抗体［Ｃ１６］だけを必要とした。
【００８１】
Ｃ．積層および切断：積層カード［Ｃ１］として働くＰＶＣプレートに対して順番に、サンプルパッド［Ｃ２］と、コンジュゲートパッド［Ｃ３］と、分析膜［Ｃ４］と、水吸収パッド［Ｃ５］とを、各部品間の重複関係を確保しながら積層させ、テスト・アレイ・ユニット［Ｃ１２］間のブレイクポイント［１７］において、本発明のＰＶＣプレートを別個の使用可能な完成品に切断して、本発明の免疫クロマトグラフィチップの完成品を取得した。免疫クロマトグラフィチップの完成品は、直接使用されるか、または使用するためにプラスチックカートリッジの中に装填されることができる。
【００８２】
本発明の競合免疫クロマトグラフィチップを用いた生物学的標的検知方法は以下の通りであった。
【００８３】
Ａ．サンプル添加：本発明の免疫クロマトグラフィチップのサンプルパッド［Ｃ２］上に液滴の形態で液体サンプルまたは予備処理された液体サンプルを添加した。
【００８４】
Ｂ．免疫クロマトグラフィ反応：免疫クロマトグラフィ反応が完了するまで数分間静置し、免疫クロマトグラフィ反応プロセスにおいて、特異的な免疫反応が、テストコンジュゲート［Ｃ６］と、検知された抗原［Ｃ１０］と、固相テスト抗体［Ｃ１５］との間に生じ、マーカー［Ｃ８］の結合量は、分析膜［Ｃ４］の上の明確に画定され固定された位置において変化し、ある位置におけるマーカー［Ｃ８］の結合量は、ある種類の検知された抗原［Ｃ１０］の存在または濃度を直接反映した。
【００８５】
Ｃ．結果判断：カラーマーカー［Ａ８］に対する視覚的調査によって直接結果を判断するか、または光信号、電気信号、もしくは磁気信号を発生させたマーカー［Ａ８］のための器具を用いて結果を判断した。ある種類の検知された抗原［Ｃ１０］に対する一種類の固相テスト抗体［Ｃ１５］が分析膜［Ｃ４］上の明確に画定された位置に固定して配置されたので、この種類の検知された抗原［Ｃ１０］は、カラー信号、光信号、電気信号、または磁気信号を含む、明確に画定された位置に固定されたマーカー［Ｃ８］からの信号を判断することによって質的に、そして量的に検知されることができる。
【００８６】
本発明の競合免疫クロマトグラフィチップ（図１１に示される）の検知原理
検知プロセスにおいて、サンプルパッド［Ｃ２］に液体サンプルを添加した後で、液体サンプルは、サンプルパッド［Ｃ２］を通ってコンジュゲートパッド［Ｃ３］の中に浸透し、液体サンプルの基材の作用の下で、コンジュゲートパッド［Ｃ３］に固定されたテストコンジュゲート［Ｃ６］とコントロールコンジュゲート［Ｃ７］は再溶解して自由になり、サンプル中の全種類の検知された抗原［Ｃ１０］と共にコンジュゲートパッド［Ｃ３］を離れて分析膜［Ｃ４］の中に入り、毛細管の作用の下で、これらの物質は、テストゾーン［Ｃ１３］とコントロールスポット［Ｃ１４］とを通って水吸収パッド［Ｃ５］に向かって流れ、そのプロセスにおいて、各種類のテストコンジュゲート［Ｃ６］と、ある種類の検知された抗原［Ｃ１０］とが、テストゾーン［Ｃ１３］上の明確に画定された位置に固定された対応する種類の固相テスト抗体［Ｃ１５］と特異的に結合するように競合し、コントロールコンジュゲート［Ｃ７］はコントロールスポット［Ｃ１４］上の固相コントロール抗体［Ｃ１６］（すなわち、ウサギ抗ジゴキシン）と直接結合したので、検知された抗原［Ｃ１０］と、テストコンジュゲート［Ｃ６］の液相テスト抗原［Ｃ９］と、分析膜［Ｃ４］のテストゾーン［Ｃ１３］上の明確に画定された位置に固定された固相テスト抗体［Ｃ１５］との間の特異的免疫反応を介して、分析膜［Ｂ４］のテストゾーン［Ｂ１３］上の明確に画定され固定された位置におけるマーカー［Ｂ８］の量が変化し、すなわち、各種類のテストコンジュゲート［Ｃ６］は、対応する種類の固相検知抗体［Ｃ１５］の全結合部位を占有し、それによりある種類の検知された抗原［Ｃ１０］が存在しなかった場合には、マーカー［Ｃ８］の最も強い信号をもたらしたが、ある種類の検知された抗原［Ｃ１０］が、対応する種類の固相テスト抗体［Ｃ１５］の結合部位に関して、対応する種類のテストコンジュゲート［Ｃ６］と競合し、それによりこの種類の検知された抗原［Ｃ１０］が存在した場合には、マーカー［Ｃ８］のより弱い信号をもたらし、結局のところ、明確に画定され固定された位置におけるマーカー［Ｃ８］からの信号の存在と強度とは、ある種類の検知された抗原［Ｃ１０］の存在と濃度とを指し、ここでマーカー［Ｃ８］の信号強度は、この種類の検知された抗原［Ｃ１０］の濃度に反比例し、分析膜［Ｃ４］のコントロールスポット［Ｃ１４］上の明確に画定された位置で固定された固相コントロール抗体［Ｃ１６］（すなわち、ウサギ抗ジゴキシン）とコントロールコンジュゲート［Ｃ７］のジゴキシン［Ｃ１１］との間の直接結合を介して、マーカー［Ｃ８］は、分析膜［Ｃ４］のコントロールスポット［Ｃ１４］上の明確に画定され固定された位置で結合し、マーカー［Ｃ８］の存在は、免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であったことを示した。
【図１】
2013525765.tif 000003
【図２】
2013525765.tif 000004
【図３】
2013525765.tif 000005
【図４】
2013525765.tif 000006
【図５】
2013525765.tif 000007
【図６】
2013525765.tif 000008
【図７】
2013525765.tif 000009
【図８】
2013525765.tif 000010
【図９】
2013525765.tif 000011
【図１０】
2013525765.tif 000012
【図１１】
2013525765.tif 000013
【図１２】
2013525765.tif 000014
【図１３】
2013525765.tif 000015
【図１４】
2013525765.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成24年10月23日(2012.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
積層カード［１］と、サンプルパッド［２］と、コンジュゲートパッド［３］と、分析膜［４］と、水吸収パッド［５］と
を備える、マルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップであって、
いくつかの種類のテストコンジュゲート［６］とコントロールコンジュゲート［７］は、前記コンジュゲートパッド［３］に固定され、各種類の前記テストコンジュゲート［６］は、対応する種類の液相テストプローブ［９］とマーカー［８］をコンジュゲートさせることによって形成され、各種類の検知された標的［１０］に対して特異的に一対一で対応し、
前記分析膜［４］は、テスト・アレイ・ユニット［１２］を備え、前記テスト・アレイ・ユニット［１２］は、テストゾーン［１３］とコントロールスポット［１４］とを備え、前記テストゾーン［１３］は、様々な種類の固相テストプローブ［１５］を備え、前記テストゾーン［１３］上の各種類の前記固相テストプローブ［１５］は、明確に画定された位置に固定して配置され、ある種類の検知された標的［１０］の特異的な検知に対応する、マルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項２】
前記積層カード［１］は、剛性材料で作られ、一つの表面上を粘着剤で被覆されたものであり、前記カードはＰＶＣプレートである、請求項１に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項３】
前記サンプルパッド［２］は、大きな総容積と均一な微細構造とを有するものであり、前記パッドは、水吸収紙、セルロース膜、ガラス繊維、不織布、または血液濾過膜から選択される、請求項１に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項４】
前記コンジュゲートパッド［３］は、大きな総容積と均一な微細構造とを有するものであり、前記パッドは、ガラス繊維、ポリエステル膜、または不織布から選択され、前記コントロールコンジュゲート［７］は、前記液相コントロールプローブ［１１］と前記マーカー［８］をコンジュゲートさせることによって形成され、前記免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であるか否かを照合することができる、請求項１に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項５】
前記分析膜［４］は、均一な微細構造を有するものであり、前記膜は、ニトロセルロース膜またはナイロン膜から選択され、前記コントロールスポット［１４］は、固相コントロールプローブ［１６］を備え、前記コントロールスポット［１４］上の前記固相コントロールプローブ［１６］は、明確に画定された位置に固定して配置され、全免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であるか否かを照合する、請求項１に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項６】
前記水吸収パッド［５］は、大きな総容積を有するものであり、前記パッドは、水吸収紙またはセルロース膜から選択される、請求項１に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項７】
各検知された標的［１０］は２つのテストプローブに対応し、前記テストプローブのうちの一方は、前記分析膜［４］上に前記固相テストプローブ［１５］として固定され、前記液相テストプローブ［９］としての他方のテストプローブは、マーカー［８］とコンジュゲートされ、前記コンジュゲートパッド［３］上に固定された前記テストコンジュゲート［６］を形成する、請求項１に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項８】
各種類の前記固相テストプローブ［１５］は、前記分析膜［４］の前記テストゾーン［１３］上で、明確に画定された位置に固定して配置され、ある種類の検知された標的［１０］の特異的な検知に個々に対応し、各種類の前記固相テストプローブ［１５］を、ある種類の検知された標的［１０］および前記テストコンジュゲート［６］の前記対応する種類の液相テストプローブ［９］と特異的に免疫学的に反応させることにより、この種類の固相テストプローブ［１５］が位置決めされる前記明確に画定された位置において結合された前記マーカー［８］の量が、前記免疫反応によって変化し、それにより、この種類の検知された標的［１０］の存在と濃度を、前記マーカー［８］の量によって明らかにする、請求項１に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項９】
前記固相コントロールプローブ［１６］は、前記コントロールコンジュゲート［７］の前記液相コントロールプローブ［１１］と直接結合して、前記免疫クロマトグラフィ分析が正常な状態であるか否かを照合する、請求項５に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項１０】
サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップと、間接免疫クロマトグラフィチップと、競合免疫クロマトグラフィチップとを備え、前記サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップは、抗原検知のための二重抗体サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップと、抗体検知のための二重抗原サンドイッチ免疫クロマトグラフィチップとを備え、前記間接免疫クロマトグラフィチップは、血清サンプルにおける特異抗体の検知のために、検知された抗体の二次抗体とマーカーをコンジュゲートさせることによって形成された前記テストコンジュゲートと共に使用され、前記競合免疫クロマトグラフィチップは、１つの抗原決定基だけを有するハプテンなどの小分子物質の検知のために使用される、請求項１に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップ。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか１項に記載のマルチアッセイ免疫クロマトグラフィチップの調製方法であって、以下の工程：
Ａ．コンジュゲートパッド［３］の調製：様々な種類のテストコンジュゲート［６］とコントロールコンジュゲート［７］を混合してコンジュゲートの混合物を得、コンジュゲートパッド［３］として使用される、一片の、ガラス繊維、ポリエステル膜、または不織布上に前記混合物を塗布し、結果として得られたものを次に使用するために乾燥させる工程、
Ｂ．分析膜［４］の調製：明確に画定され固定されたアドレサブルな位置で、ニトロセルロース膜またはナイロン膜上で丸いスポットの形態の、固相テストプローブ［１５］として働く様々な種類の抗原と、固相コントロールプローブ［１６］として働く抗体とをそれぞれ添加することで、テストゾーン［１３］とコントロールスポット［１４］とをそれぞれ形成し、それによりテスト・アレイ・ユニット［１２］を形成し、それを次に使用するために乾燥させる工程であって、前記テスト・アレイ・ユニット［１２］において、前記検知された標的［１０］と一対一で対応する各種類の前記固相テストプローブ［１５］は、明確に画定された位置で固定され、明確に画定され固定された位置をも有する１つの固相コントロールプローブ［１６］だけを必要とし、
Ｃ．積層および切断：積層カード［１］として働くＰＶＣプレートに対して順番に、前記サンプルパッド［２］と、前記コンジュゲートパッド［３］と、前記分析膜［４］と、水吸収パッド［５］とを、各部品間の重複関係を確保しながら積層させる工程であって、前記免疫クロマトグラフィチップの完成品は、直接使用されるか、または使用するためにプラスチックカートリッジの中に装填されることができ、本発明の免疫クロマトグラフィチップを取得する、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記工程Ｂにおいて前記分析膜［４］上に複数の前記テスト・アレイ・ユニット［１２］を調製すること、前記工程Ｃに続いて、前記ＰＶＣプレートを、前記テスト・アレイ・ユニット［１２］間のブレイクポイント［１７］において、別個の使用可能な完成品にさらに切断すること
をさらに包含する、請求項１１に記載の調製方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のマルチ免疫クロマトグラフィチップを用いた生物学的標的検知方法であって、
Ａ．サンプル添加：請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫学的クロマトグラフィチップの前記サンプルパッド［２］上に液滴の状態で液体サンプルまたは予備処理された液体サンプルを添加すること、
Ｂ．免疫クロマトグラフィ反応：前記免疫クロマトグラフィ反応が完了するまで数分間静置すること、ここで前記免疫クロマトグラフィ反応プロセスにおいて、特異的な免疫反応が、前記テストコンジュゲート［６］と、前記検知された標的［１０］と、前記固相テストプローブ［１５］との間で生じ、前記マーカー［８］の結合量は、前記分析膜［４］上の前記明確に画定され固定された位置において変化し、ある位置における前記マーカー［８］の結合量は、ある種類の検知された標的［１０］の存在または濃度を直接反映する、
Ｃ．結果判断：カラーマーカー［８］に対する視覚的調査によって直接結果を判断するか、または光信号、電気信号、もしくは磁気信号を発生させるマーカー［８］のための器具を用いて結果を判断することにより、前記明確に画定され固定された位置に対応するある種類の検知された標的［１０］に対する質的検知結果と量的検知結果とを取得すること、
を包含する、生物学的標的検知方法。
【国際調査報告】
2013525765.tif 000017
2013525765.tif 000018
2013525765.tif 000019
2013525765.tif 000020
2013525765.tif 000021
2013525765.tif 000022