(57)【要約】  対象の検体と反応物の間の反応生成物の検出によって、対象の検体の存在を判定する方法を開示し、この方法は、複合試料マトリックスから対象の検体を抽出することと、対象の検体を初期反応混合物に移すことと、反応生成物の最大の無視しうる濃度（negligible concentration）を有する初期反応混合物においてバックグラウンド測定を行うことであって、初期反応混合物の反応条件が、negligible concentrationの測定可能な変化なしで、バックグラウンド測定を行うことができるように、少なくとも、反応生成物の生成の反応速度を低減することと、初期反応混合物の反応条件を変更して、反応速度を加速させることと、反応生成物の濃度が安定するまで、反応を継続することと、得られた反応混合物に関する第２の測定を行って、濃度に相関するシグナルを得ることと、バックグラウンド測定と第２の測定の間の相違から対象の検体の存在を判定することとを含んでなる。好ましい実施態様において、対象の検体が、プロポフォール（２，６‐ジ-イソプロピルフェノール）であり、また、反応物が、活性化ギブズ試薬（２，６‐ジクロロキノンイミン）である。
2013541009.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の検体と反応物の間の反応生成物の検出によって、対象の検体の存在を判定する方法であって、該方法は、
該反応生成物の最大の無視しうる濃度（negligible concentration）を有する初期反応混合物においてバックグラウンド測定を行うことであって、該初期反応混合物の反応条件が、該無視しうる濃度の測定可能な変化なく、該バックグラウンド測定を行うことができるように、少なくとも、該反応生成物の生成の反応速度を低減することと、
該初期反応混合物の反応条件を変更して、該反応速度を加速させることと、
該反応生成物の濃度が安定するまで、該反応を継続することと、
得られた反応混合物に関する第２の測定を行って、該濃度に相関するシグナルを得ることと、
該バックグラウンド測定と該第２の測定の間の相違から対象の検体の存在を判定することとを含む、
前記方法。
【請求項２】
複合試料マトリックスから前記対象の検体を抽出する工程と、
該対象の検体を初期反応混合物に移す工程と、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象の検体の存在を決定する工程が、前記反応混合物中の対象の検体の濃度を測定することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記最大の無視しうる濃度の測定可能な変化なしで、前記バックグラウンド測定を行うことができるように、該バックグラウンド測定を行う前に、前記初期反応混合物の反応条件を制御することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記初期反応混合物の反応条件を制御する工程が、該初期反応混合物のｐＨ、温度、混合割合、および化学組成のうちの少なくとも１つを制御することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記初期反応混合物の化学組成を制御する工程が、該初期反応混合物から、前記対象の検体および前記反応物のうちの１つを除くことを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記初期反応混合物の化学組成を制御する工程が、該初期反応混合物に反応阻害剤を加えることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
第１および第２測定が、光学測定、蛍光測定、吸着測定、比色定量測定、電気化学測定、および重量測定のうちの１つである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
前記バックグラウンド測定を行うことが、前記初期反応混合物の吸収スペクトルの少なくとも一部を測定することを含み、かつ、
前記第２の測定を行うことが、前記得られた反応混合物の吸収スペクトルの少なくとも一部を測定することを含む、
前記方法。
【請求項１０】
前記対象の検体が、プロポフォール（２，６‐ジ-イソプロピルフェノール）であり、前記反応物が、活性化ギブズ試薬（２，６‐ジクロロキノンイミン）である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記初期反応混合物が、ギブズ試薬（２，６‐ジクロロキノン‐４‐クロロイミド）を含み、前記初期反応混合物の反応条件が、該ギブズ試薬から前記活性化ギブズ試薬への転化を防止するのに十分に低いｐＨを含み、かつ、前記初期反応混合物の反応条件を変更して反応速度を加速させる工程が、初期反応混合物のｐＨを増加させることを含む、前記方法。
【請求項１２】
前記初期反応混合物が、クエン酸緩衝液、ギ酸緩衝液、または重炭酸塩緩衝液などの十分に低いｐＨを維持する緩衝液を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１および第２の測定が、４００ｎｍ〜８００ｎｍの間隔を含む吸光スペクトルから、前記初期反応混合物および前記得られた反応混合物の吸光度をそれぞれ決定することを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１および第２の測定が、５９５ｎｍの第１の波長と、８００ｎｍの第２の波長で、前記初期反応混合物および前記得られた反応混合物の吸光度をそれぞれ決定することを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１および第２の測定が、５９５ｎｍのみの波長で、前記初期反応混合物および前記得られた反応混合物の吸光度をそれぞれ決定することを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１６】
固相抽出を用いて、前記複合試料マトリックスからプロポフォールを抽出することをさらに含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記複合試料マトリックスが血液である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抽出工程が、血液試料が固相抽出カラムを通過し、該カラムを洗浄し、適切な溶媒を使用して、プロポフォールを溶出することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶媒がアセトニトリルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記血液試料が、前記カラムを通過する前に、水によって、１：１よりも大きい比、好ましくは血液：水の該比が１：２〜１：５０の範囲に希釈される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法であって、前記初期反応混合物の反応条件を変更して前記反応速度を加速させる工程の後に、かつ、前記反応生成物の濃度が安定する前に、少なくとも１つの中間測定を行うことをさらに含み、前記バックグラウンド測定と第２の測定の間の相違から対象の検体の存在を判定する工程が、該バックグラウンド測定、該第２の測定、および該少なくとも１つの中間測定の間の相違から、該存在を決定、測定することをさらに含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、後に検出される産物を生成するために反応段階を必要とする状況下で、複合試料マトリックス中の検体の検出を向上させる方法に関する。特に、本発明は、全血中の麻酔薬プロポフォールの濃度を選択的に測定するための手段を提供する。
【背景技術】
【０００２】
現代のヘルスケアは、疾患の診断、治療および管理を可能とする、種々の体液についての化学分析試験および生化学分析試験に広く依存している。医学的および技術的進歩は、過去数十年にわたって診断試験の範囲を大幅に拡大した。さらに、マイクロシステムおよびナノテクノロジーなどの発展中の技術の出現と共に、人体への理解が高まることで、診断技術への重大な影響をもたらすと期待されている。
【０００３】
病院における診断試験は、特に、迅速な反応が最重要検討事項であって、治療判断を迅速に行う必要がある状況下で、ますますポイント・オブ・ケア（ＰｏＣ）で行われている。ＰｏＣ試験における最近の進歩にもかかわらず、複数の切実な要求がいまだに満たされていない。たとえば、生体試料中の小分子の検出は、特に、十分な特異性を有する適切な受容体（たとえば、酵素、抗体、アプタマー）がない場合、非常に困難であることが多い。この困難性は、分子が脂溶性であり、細胞、脂質およびタンパク質などの試料マトリックスの疎水性成分との会合によって、検体の大部分が分析に利用できない場合に、より大きい。
【０００４】
複合媒体（たとえば、血液、血漿、唾液、尿、廃水、およびこれらの抽出物）における小分子の検出は、検体と試料マトリックス成分（たとえば、血漿タンパク質および脂質膜）との会合によって、困難であることが多い。自由（非結合）分子の濃度（ピコモルの範囲である場合がある）は、最も一般的に用いられる測定技術（たとえば、電気化学技術、光学技術）の感度限界を下回ることが多い。この理由から、複合媒体における小分子検出の最先端技術は、有機溶媒中への試料の希釈／抽出、遠心分離、蒸発、および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析などの徹底的な試料調製を伴うことが多い。検体分子の特有の特性に応じて、溶出化合物のＨＰＬＣ後カラム検出は、G.F. Plummer, "Improved method for the determination of propofol in blood by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.", Journal of Chromatography, vol. 421 , 1987, p.171、およびR.A. Uebel et al., "Electrochemical determination of 2,6-diisopropylphenol after high-performance liquid chromatography of extracts from serum", Journal of Chromatography, vol. 526, Mar. 1990, pp.293-5に開示されるような、電気化学的方法または光学的方法（吸光分析法もしくは蛍光法）を用いて行われる。
【０００５】
複合試料中の小分子のＨＰＬＣ分析（assay）の複雑で時間のかかる性質は、これらの分析が、非常に少数の専門的研究所によって日常的に行われていることを意味し、この理由から、これらの分析の実用性がかなり制限されている。たとえば、プロポフォールなどの多くの薬剤のための、代替の、小型化分析開発の明確な必要性がある。これによって、ポイント・オブ・ケア（ＰｏＣ）でのリアルタイムに近い測定および臨床的介入が可能になるであろう。
【０００６】
複合媒体中のプロポフォールを検出および測定するための方法は、McGaughran et al., "Rapid measurement of blood propofol levels: A proof of concept study," Journal of Clinical Monitoring and Computing, vol. 20, 2006, pp. 381-381によって記載されている。前記記載された方法は、希釈された全血試料の固相抽出（ＳＰＥ）、続いて、フェノール特異性（ギブズ）試薬、すなわち、２，６‐ジクロロキノン‐４‐クロロイミドと反応させて、強く着色されたインドフェノール生成物を生成すること、および、吸光分析によるこの同じ生成物の検出を含む。
【０００７】
ギブズ／インドフェノール法は、プロポフォールの検出のためにうまく利用されている。ここで、特定は、ＳＰＥ工程（疎水性検体に対して特異的）と、ギブズ反応（プロポフォールなどのパラ‐非置換フェノールに対して特異的）の組合せによって達成され、この事例に関しては、D. Svobodova at al., "Colour reaction of phenols with the Gibbs reagent. The reaction mechanism and decomposition and stabilisation of the reagent," Microchimica Acta, vol. 67, May. 1977, pp. 251 -264、および、H.D. Gibbs, "Phenol tests III. The indophenol test," Journal of Biological Chemistry - vol. 72, 1927, pp. 649-664に記載されている。
【０００８】
前記分析の全過程を図１に説明し、プロポフォールからインドフェノールへの転化の優位な反応スキームを図２に示す。図１に示すように、該過程は、全血試料を１：２の比で蒸留水によって希釈する、工程１０から開始する。工程２０において、希釈物をＳＰＥカラム上に注入し、次に、水と５０％メタノールの混合物でＳＰＥカラムを洗浄して、弱く結合した不純物を除去する、洗浄工程３０が続く。次に、プロポフォールを、工程４０に示すように、アセトニトリルによる溶出によってＳＰＥカラムから抽出する。その後、工程５０において、試薬としてプロポフォールが関与するギブズ反応を行って、着色されたインドフェノール生成物を生成する。原血液試料中のプロポフォール濃度を測定するために、工程６０において、可視吸収分光を用いて、会合された着色インドフェノールの濃度を測定する。ギブズ反応が、プロポフォールを含むすべてのパラ‐非置換フェノールに対して特異的であることに留意すべきである。他のフェノールからのギブズ反応における干渉の可能性は、前記ＳＰＥ抽出工程によって低減される。
【０００９】
十分に高いｐＨで、かつ一級または二級アルコールの存在下において、図２に示すように、および、D. Svobodova et al., "The colour reaction of phenols with the Gibbs reagent," Microcimica Acta, vol. 70, 1978, pp.197-211によって詳細に説明されるように、ギブズ試薬（Ａ）は、活性形態（Ｂ）に急速に転化し、次に、これがプロポフォール（Ｃ）と反応して、着色インドフェノール生成物（Ｄ）が生成する。９．５を超えるｐＨでは、ギブズ試薬（Ａ）から活性化形態（Ｂ）への転化の速度は、プロポフォールと活性化ギブズ試薬の間の反応速度よりもはるかに大きい。この場合において、活性化ギブズ試薬とプロポフォールとの間での反応からのインドフェノール生成物の生成が、律速段階である。したがって、高いｐＨであって、ギブズ試薬の濃度がプロポフォールに対して過剰である場合、平衡状態のインドフェノール生成物の濃度、および試料中のプロポフォールの初期濃度は、互いに比例する。ここで、５９５ｎｍにおけるインドフェノール生成物の吸光度ピークの平衡測定は、ランベルト・ベールの法則によってインドフェノール濃度に正比例し、この測定値によって、反応前の試料中の初期プロポフォール濃度が提供される。
【００１０】
McGaughran et al., "Rapid measurement of blood propofol levels: A proof of concept study," Journal of Clinical Monitoring and Computing, vol. 20, 2006, pp. 381-381によって開示されるように、プロポフォール測定のためのＳＰＥおよびギブズ／インドフェノール反応を利用するデバイスの試験は、全血中の１ μｇ／ｍｌまでプロポフォール濃度に対して、優れた精度、線形性および正確性を示した。この検出限界によって、外科手術時に、デバイスが特にプロポフォール測定に適するようになる。外科手術時において、平均血液プロポフォール濃度が２ μｇ／ｍｌを十分に超えることを保証するのに十分なプロポフォールが患者に通常投与される。たとえば、Schafer et al., "Pharmacokinetics and pharmacodynamics of propofol infusions during general anesthesia," Anesthesiology, vol. 69, Sep. 1988, pp. 348-356は、患者が、大手術で４．０５＋／−１．０１μｇ／ｍｌの平均血液プロポフォール濃度、大手術ではない手術で２．９７＋／‐１．０７μｇ／ｍｌの平均血液プロポフォール濃度を必要とすることを報告した。手術後に患者（ＥＣ５０）の５０％が意識があり、見当識が保たれた血液プロポフォール濃度はそれぞれ、１．０７ μｇ／ｍｌおよび０．９５ μｇ／ｍｌであった。デバイス導入前に単純な血液試料希釈液のみを必要とするだけであり、試料調製が簡単であるため、この方法および装置は、ＨＰＬＣに基づく方法よりも、これらの設定に用いるのに適している。さらに、通常の測定時間は、およそ３〜５分で非常に速い。さらにまた、前記機器は、同等のＨＰＬＣデバイスよりも非常に小さいフットプリントおよび少ない複雑性を有する。
【００１１】
集中治療室（ＩＣＵ）などのプロポフォールが鎮静に使用される状況では、全血中のプロポフォール濃度は通常、J. Barr et al., "Propofol dosing regimens for ICU sedation based upon an integrated pharmacokinetic-pharmacodynamic model," Anesthesiology, vol. 95, 2001, p.324に開示されるように、０．２５〜２ μｇ／ｍｌの範囲にある。したがって、上述したプロポフォール分析における検出および測定の下限を拡大する必要がある。しかしながら、１ μｇ／ｍｌ未満の全血中のプロポフォールの光学測定は、ＳＰＥカラムに結合し、該ＳＰＥカラムから共溶出し、また、インドフェノールシグナルの領域で吸収する、血液試料中の化学種（species）の存在によって制限される。
【００１２】
さらに、不溶性凝集物が存在し、光を散乱させる場合もあり、これによって、検出器の測定強度が低減する。これらの化学種は、５９５ｎｍのインドフェノールシグナル領域において測定される吸光度スペクトルに寄与し、この波長で測定された吸光度のオフセットを発生させ、１ μｇ／ｍｌ未満のプロポフォールを含む血液試料中のプロポフォール濃度を正確に測定する機器の性能を制限する。この非プロポフォールシグナルが種々の血液試料で変化するので、干渉する化学種によるこのオフセットを、データに、たとえば相関係数を適用することによって、補正することができない。吸光スペクトル（干渉する化学種の存在の性質に依存して）の大部分についての情報を用いて、余剰の吸光シグナルの補正をすることは理論上可能である。しかしながら、対象の吸光ピーク側、およびピークへのバックグラウンドの寄与を減じるためにシグナルを補間する側のいずれかで、吸光シグナルを測定するために、高価な分光計の使用を必要とするだろう。そして、これは、デバイスのコストおよび複雑性を増加させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、反応段階が、検体（特に、プロポフォール）の存在を質的または定量的に評価するために、その後検出される反応生成物を発生させるのに必要な状況下で、該検体の検出および／または濃度測定の下限を改善する方法を提供することを試みる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第１の態様によれば、対象の検体と反応物の間の反応生成物の検出によって、対象の検体の存在を判定する方法であって、該方法は、反応生成物の最大の無視しうる濃度（negligible concentration）を有する初期反応混合物においてバックグラウンド測定を行うことであって、該初期反応混合物の反応条件が、該無視しうる濃度の測定可能な変化なしで、バックグラウンド測定を行うことができるように、少なくとも、反応生成物の生成の反応速度を低減することと、初期反応混合物の反応条件を変更して、該反応速度を加速させることと、反応生成物の濃度が安定するまで、該反応を継続することと、得られた反応混合物に関する第２の測定を行って、該濃度に相関するシグナルを得ることと、バックグラウンド測定と第２の測定の間の相違から対象の検体の存在を判定することとを含んでなる。
【００１５】
本発明によれば、反応生成物、たとえば、ギブズ‐インドフェノール反応生成物、の生成速度は、試料の参照測定を実施できるようにするために、温度、ｐＨ、緩やかな混合、１以上の反応物の欠乏もしくは除去、および／または阻害剤の添加を含むが、これらに限定されない適切な測定を用いて、初期に停止させるか、または遅くさせる。反応の欠乏または低い反応速度によって、バックグラウンド「非検体」シグナルのレベルを測定するのに十分な時間が許容される。参照測定の終了後、反応を進行させる。一旦標的反応生成物の濃度が安定したならば、第２の測定である試料測定を行う。干渉する化学種の存在を考慮するために、参照測定値は、その後、標的検体の濃度の正確な評価を得るために、試料測定値から減じられる。
【００１６】
実施形態において、該方法は、複合試料マトリックスから対象の検体を抽出する工程と、対象の検体を初期反応混合物に移す工程とをさらに含む。
【００１７】
別の実施形態において、対象の検体の存在を判定する工程は、前記反応混合物中の対象の検体の濃度を測定することを含む。
【００１８】
第１および第２の測定は、光学測定、蛍光測定、吸着測定、比色定量測定、電気化学測定、および重量測定のうちの１つから選択されてもよい。
【００１９】
好ましくは、バックグラウンド測定を行う工程は、初期反応混合物の少なくとも一部の吸収スペクトルを測定することを含んでなり、また、第２の測定を行う工程は、得られた反応混合物の吸収スペクトルの少なくとも一部を測定することを含んでなる。
【００２０】
特に適切な実施形態において、対象の検体は、プロポフォール（２，６‐ジ‐イソプロピルフェノール）であり、また、反応物は、活性化ギブズ試薬（２，６‐ジクロロキノンイミン）である。初期反応混合物は、ギブズ試薬（２，６‐ジクロロキノン‐４‐クロロイミド）を含み得る、初期反応混合物の反応条件は、ギブズ試薬から活性化ギブズ試薬への転化を防止するのに十分に低いｐＨであって、かつ、初期反応混合物の反応条件を変更して反応速度を加速させる工程が、初期反応混合物のｐＨを増加させることを含んでなる。
【００２１】
初期反応混合物は、クエン酸緩衝液、ギ酸緩衝液、または重炭酸塩緩衝液などの十分に低いｐＨを維持する緩衝液をさらに含んでなり得る。
【００２２】
第１および第２の測定は、４００〜８００ｎｍの間隔を含む吸光スペクトルから、初期反応混合物および得られた反応混合物の吸光度をそれぞれ決定することを含んでなり得る。
【００２３】
第１および第２の測定は、５９５ｎｍの第１の波長と、８００ｎｍの第２の波長で、初期反応混合物および得られた反応混合物の吸光度をそれぞれ決定することを含んでなり得る。
【００２４】
より具体的には、第１および第２の測定は、５９５ｎｍのみの波長で、初期反応混合物および得られた反応混合物の吸光度をそれぞれ決定することを含んでなり得る。
【００２５】
該方法は、固相抽出を用いて、複合試料マトリックスからプロポフォールを抽出することをさらに含んでなり得る。複合試料マトリックスは、血液であり得る。抽出工程は、前記血液試料が固相抽出カラムを通過し、該カラムを洗浄し、適切な溶媒を使用して、プロポフォールを溶出することを含んでなり得る。溶媒はアセトニトリルが好ましい。
【００２６】
実施形態において、血液試料は、前記カラムを該血液試料が通過する前に、水によって、１：１よりも大きい比（該比は、１：２〜１：５０の血液：水の範囲にあることが好ましい）に希釈される。
【００２７】
該方法は、初期反応混合物の反応条件を変更して前記反応速度を加速させる工程の後に、かつ、反応生成物の濃度が安定する前に、少なくとも１つの中間測定を行うことをさらに含み得るとともに、バックグラウンド測定と第２の測定の間の相違から対象の検体の存在を判定する工程は、バックグラウンド測定、第２の測定、および少なくとも１つの中間測定の間の相違から、該存在を測定、判定することをさらに含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明の実施形態は、より詳細に、また、次に示す添付図面に関して非限定例として説明される。
【図１】図１は、ギブズ／インドフェノールプロポフォール分析の操作工程を概略的に表す。
【図２】図２は、プロポフォールに適用されたギブズ／インドフェノール反応を概略的に表す。
【図３】図３は、本発明の方法の実施形態を利用する、プロポフォール分析のバックグラウンド減算（Ａ）、およびシグナルの改善（Ｂ）を概略的に表す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
図面は、模式的なものにすぎず、実寸で描かれていないことが理解されるべきである。また、同じ参照数字が全図面に用いられ、同一のまたは同様の部分を示すことも理解されるべきである。
【００３０】
本発明の実施形態は、標的検体の存在を質的または定量的に評価するために、その後検出される反応生成物を発生させるために反応段階が必要な状況に適用することができる。概して、本発明は、次に示す段階（下記および図１に要約される）からなる。
【００３１】
１．対象の検体を含んでなる複合媒体の抽出物を調製する。抽出方法は、対象の検体に特異的であり、当業者に公知である。この抽出物の組成は、所望の反応およびその後の対象の反応生成物の検出に適合する必要がある。交換（たとえば、ＳＰＥ）の方法によって、測定に干渉し得るいずれかの化学種に対する検体の精製は、この段階で達成される。
【００３２】
好ましい実施形態において、プロポフォールを含む全血抽出物は、ＳＰＥカラム（たとえば、適切な逆相材料を含む）上の希釈全血試料（水によって、１：１よりも大きい比の血液：水、好ましくは、１：２〜１：５０の血液：水に希釈された血液）を通過し、たとえば５０％メタノール溶液でカラムを洗浄し、最終的にアセトニトリルを使用して溶出することによって、生成される。別の実施形態において、希釈していない血液は、希釈化をせずに、直接ＳＰＥカラムに適用でき、同じ方法で洗浄および溶出工程が行われる。
【００３３】
２．反応／検体検出モジュールへの対象の検体を含む複合媒体の抽出物の移動。このモジュールは、抽出装置（たとえば、ＳＰＥカラム）とは別に、または、流体連結を介して該抽出装置に直接連結されてもよく、また、反応に適した環境を提供することが必要である。これは当業者に公知である。検出モジュールは、種々の異なる分析法を用いてもよく、たとえば、光学的、蛍光的、吸着的、比色定量アプローチ、電気化学アプローチ、または重量的アプローチに限定されない。プロポフォールの検出のための好ましい実施形態において、検出モジュールは、５９５ｎｍおよび８００ｎｍの波長での吸光分析用装置を含んでなる。
【００３４】
３．反応／検出モジュールへの試薬の添加および反応の阻害。その後、一部のまたはすべての公知の容量の反応成分を、反応細胞に加える。これらの試薬は、抽出段工程時に（すなわち、ＳＰＥ溶出剤の一部として）導入するか、または、抽出物が反応／検出細胞に移された後、加えてもよい。この段階では、反応は阻害されるか、または、反応速度は、たとえば、温度、ｐＨ、緩やかな混合、１以上の反応物の欠乏もしくは除去、および／または阻害剤の添加を含むが、これらに限定されない、適切な方法、例えば、１以上の刺激剤を用いて、低減させる。阻害および／または反応速度低減の他の方法は、当業者に公知である。
【００３５】
好ましい実施形態において、アセトニトリルを使用して、全血からプロポフォール抽出物を溶出した後、ギブズ試薬を加え、８未満にｐＨを維持する。別の実施形態において、適切なｐＨ（たとえば、ｐＨ８以下）の弱い低ｐＨ緩衝液を、ギブズ試薬中に含め、分離溶液として加え（ギブズ試薬の前に）、または、ＳＰＥカラムからの溶出に使用したアセトニトリル溶液中に導入することができる。低いｐＨによって、プロポフォールがギブズ試薬と非常にゆっくりと反応することが保証される。弱い緩衝液の例には、低濃度のクエン酸およびギ酸が含まれるが、これらに限定されない。必要な場合、すべての必要な溶液の添加後、反応細胞は、反応細胞の撹拌、磁気撹拌、および／または溶液を通過するガスの通気を含むが、これらに限定されない、方法を用いて、混合することができる。
【００３６】
４．参照測定値の取得。本発明の一実施形態において、反応を阻害し／遅くさせ、また、意図した測定法を、所望の反応生成物がない状態の溶液を測定するために適用した。たとえば、好ましい実施形態では、吸光分析法を用いて、ｐＨ８未満におけるアセトニトリル中全血プロポフォール抽出物およびギブズ試薬を含む溶液の５９５ｎｍ（Ａ５９５）および８００ｎｍ（Ａ８００）の吸光度を測定する。２つの波長測定（たとえば、５９５ｎｍおよび８００ｎｍ）、または全スペクトル（たとえば、４００ｎｍ〜８００ｎｍであるが、これに限定されない）のいずれかを測定して、これらのデータを収集することができる。低いｐＨでは、このｐＨでのギブズ反応の動態は、十分に遅く、このため、反応は、阻害されると考えることができる。ここで、参照シグナルは、５９５ｎｍの吸光度（インドフェノールピーク吸光度）マイナス（−）８００ｎｍの吸光度（８００ｎｍの測定は、バックグラウンド光散乱の補正、および試料における入射光強度変化を提供するために用いられる）として定められる。また、８００ｎｍ以外の波長（０または十分に低いインドフェノール吸光度を有することが知られている）も、バックグラウンド散乱のレベルを定量化するのに使用してもよく、これらは、当業者に公知である。別の実施形態において、光強度が試料と参照測定の間で変化しない状況下では、散乱寄与（キュベット中の粒子による）が、この低いｐＨ参照時に５９５ｎｍで測定されるので、Ａ８００シグナルを減じる必要はない。この場合、５９５ｎｍの吸光度を記録する必要があるだけである。ＡＸという用語（式中、Ｘは正の数）は、Ｘ ｎｍの波長で測定された吸光度を示す意味があることに留意すべきである。
【００３７】
本発明の別の実施形態において、測定の多くは、生成物が徐々に生成されるので、混合してシグナルの発達を監視した後に、様々な時点でなされる。これらの測定から、所望の生成物がない状態の初期「非生成物」シグナルによるバックグラウンド反応は、たとえば、試薬を反応混合物に加えたときに対する曲線の適合または推定によって、判定することができる。
【００３８】
５．試料シグナルの取得。バックグラウンド反応を測定した後、阻害メカニズムを除去して、所望の反応を平衡状態に移行させる（または完了させる）。次いで、工程４に用いるものと同じ検出方法を用いて、バックグラウンド反応と所望の反応生成物からのシグナルを測定する。または、反応は遅すぎて、適切な時間で平衡状態に達することができない場合、種々の時間での測定値を用いて、たとえば、平衡状態に達すると考えられる時間に対する曲線の適合または推定によって、平衡状態における最終生産物の濃度を予測することができる。
【００３９】
たとえば、ギブズ／インドフェノール法によって全血中のプロポフォール濃度を検出することを目的とした好ましい実施形態において、塩基性溶液（たとえば、適切に高いｐＨ（たとえば、ｐＨ９．５以上）の緩衝液）の公知の容量を、アセトニトリル抽出物に加え、試料を完全に混合して、ｐＨを上昇、好ましくは９．５以上のｐＨ値まで上昇させた。緩衝液を先の工程で加えて、ｐＨを低下させ、反応を阻害する場合、この工程で使用される緩衝液は、工程４の溶液組成の低いｐＨ緩衝作用を克服するのに十分に強力である必要がある。好ましい実施形態において、ｐＨ９．６の２０ ｍＭ重炭酸塩バッファーを使用して、ｐＨを上昇させ、インドフェノール生成物の生成の速度を増加させる。他の適切な緩衝系、またはｐＨを増加させる代替方法は、当業者に公知であろう。これによって、ギブズ反応が平衡状態（完了）に達し、初期のプロポフォール濃度と直接関係のあるインドフェノール生成物の濃度をもたらすことができる。血液試料中のプロポフォールの濃度が測定される場合、反応平衡状態のインドフェノール生成物の濃度がプロポフォール濃度を表すことを保証するのに、ギブズ試薬が（抽出物中のプロポフォール濃度に対して）十分過剰であることを必要とする。前述と同様に、５９５ｎｍおよび８００ｎｍの吸光度の相違を測定する。２つの波長測定（５９５ｎｍおよび８００ｎｍ）、または全スペクトル（４００ｎｍ〜８００ｎｍ）のいずれかを測定して、これらのデータを収集することができる。別の実施形態において、光強度が試料と参照測定の間で変化しない状況下では、散乱寄与（キュベット中の粒子による）が、低ｐＨ参照測定時に５９５ｎｍで測定されたので、Ａ８００シグナルを測定する必要はない。
【００４０】
６．干渉する化学種によって発生したシグナルの減算。この工程において、工程４で得られたバックグラウンド（「対象の非生成物」）反応を用いて、工程５で得られたシグナルへ干渉する化学種の寄与を除去することができる。
【００４１】
たとえば、ギブズ／インドフェノール法によって全血中のプロポフォール濃度を検出することを目的とした好ましい実施形態において、ｐＨ７の（Ａ５９５〜Ａ８００）吸光シグナルは、ｐＨ９．６の（Ａ５９５〜Ａ８００）吸光シグナルから減じられる。これは、補正されたインドフェノール吸光シグナルとして知られている。または、別の実施形態において、十分な吸光スペクトルが（５９５ｎｍおよび８００ｎｍの２つの波長吸収測定よりも）工程４から５の間で得られる状況下で、工程４の参照スペクトルは、工程５の試料スペクトルから減じられる。その後、補正されたインドフェノール吸光シグナルは、５９５ｎｍおよび８００ｎｍの吸光度の相違を測定することにより、この減じられたプロットから算出される。
【００４２】
別の実施形態において、入射光強度が試料と参照測定の間で変化しない状況下で、減じられたＡ８００シグナルを補正されたインドフェノール吸光シグナルの算出に用いる必要はない。これは、５９５ｎｍの散乱オフセット（キュベット中の粒子による）が、低ｐＨ参照測定時に測定されるからである。本明細書で説明する３つの実施形態のすべてにおいて、非インドフェノール吸光シグナル（たとえば、タンパク質、脂質および光散乱）が、参照と試料の双方のスペクトル中に存在するために、最終的に補正されたインドフェノール吸光シグナルは、インドフェノールのみの吸光度を表す。試料中のギブズ試薬のモル過剰がある場合、この補正されたインドフェノール吸光シグナルは、分析された血液試料中のプロポフォール薬物濃度に正比例する。薬物の既知濃度を用いて構成された検量線との比較は、試料中の原薬物濃度の的確で正確な評価をもたらす。
【００４３】
本発明の方法の実施形態に係る測定技術は、先行技術からみて顕著な利点を有する。これらの利点は、本発明の好ましい実施形態として用いられるプロポフォール測定の場合において、最も容易に実証される。まず、全血中のプロポフォールの低濃度（５０ ｎｇ／ｍｌ未満）の検出における最先端技術は、ＨＰＬＣである。確立されたギブズ／インドフェノール法は、装置の複雑性、財務コスト、試料調製、および測定時間において、ＨＰＬＣを超える相当な節約をもたらすが、該ギブズ／インドフェノール法は、比較的不十分な検出限界（１ μｇ／ｍｌ）を有する。本発明は、インドフェノール生成物のない状態で、バックグラウンド測定を導入するための試薬および方法について詳述する。そして、これは、感度の顕著な増加を提供し、また、バックグラウンド吸収／散乱シグナルの可変オフセットを除去することができるので、全血抽出物に適用されるギブズ／インドフェノール法における検出の下限の減少を提供する。また、検出および濃度測定のために、単一の波長の使用（先行技術に記載されている全スペクトルの測定よりも）を必要とするだけであるので、吸光度測定機器の計測の顕著な単純化をもたらす。したがって、本発明は、ギブズ／インドフェノール法を用いて、測定装置の単純性と、ＨＰＬＣによって得られた高感度検出の利益とを組み合わせる。１００ ｎｇ／ｍｌ未満まで全血中のプロポフォール濃度の一貫性のある測定をすることができる。そして、これによって、単純で迅速かつ低コストの分析が可能になり、本発明は、低濃度のプロポフォールを日常的に測定する状況に対し比類ない程度に適している（たとえば、集中治療室）。
【００４４】
本発明の方法は、全血中の麻酔薬プロポフォールなどのパラ‐非置換フェノールの検出および濃度測定のための分析に利用されてもよく、該分析は、上述する固相抽出／ギブズ反応分析の新規改良を提供する。好ましい実施形態において、反応細胞への固相後抽出物(post-solid phase extract)の移動後、反応のｐＨは、フェノールとギブズ試薬の間の反応を効果的に阻害するために、最初に制御される。
【００４５】
ギブズ試薬（図２、Ａ）から活性化形態（図２、Ｂ）への転化が、低いｐＨ（たとえば、ｐＨ８以下）で効果的に防止されて、この阻害が達成される。反応は、たとえば、I. Pallagi et al., "Mechanism of the Gibbs Reaction. Part 4.1: Indophenol Formation via N-Chlorobenzoquinone Imine Radical Anions.
The Aza-SRN2 Chain Reaction Mechanism. Chain Initiation with 1 ,4-Benzoquinones and Cyanide Ion," The Journal of Organic Chemistry, vol. 64, 1999, pp. 6530-6540に開示されるように、代替機構によって進行ことができるが、インドフェノールは、高いｐＨ状況下で約１分未満よりも、１時間を超える平衡状態への時間で、高いｐＨ状況下に対して、非常に遅い速さで生成する。
【００４６】
したがって、数分間にわたって、試料中のインドフェノールの濃度は、これらの反応条件下で十分に低く、たとえば、０付近または、着色されたインドフェノール生成物がない状態で、いずれかの汚染する種からのバックグラウンドシグナルを測定するために、吸光スペクトルに顕著な影響を与えず、付加的な吸光度測定を行うことができる程度に少なくとも十分に低い。参照測定が行われた後、抽出物のｐＨが増加し（たとえば、ｐＨ９．５を超える）、図２に示す機構によって、反応を迅速に進行させることができる。系が平衡状態に達した後、試料スペクトルを得、インドフェノール生成物の量は、適切な参考データの減算後に定量化される。
【００４７】
ギブズ／インドフェノール法によるプロポフォールの測定のための別の実施形態において、単一の波長参照および試料の測定が行われる（全スペクトルよりも）。この場合において、５９５ｎｍの吸光シグナルのみが、いずれかの非インドフェノール吸光度、および最終シグナルへの光散乱の関係を測定するのに必要であるにすぎない。これによって、L. McGaughranらなどによる先行技術に記載されている代替の全スペクトル（たとえば、４００ｎｍ〜８００ｎｍ）測定よりも相当に安価なデバイスが可能になる。
【００４８】
また、ＰｏＣ設定における１ μｇ／ｍｌ未満の全血中のプロポフォール濃度のリアルタイム分析も可能になり、これによって、ＩＣＵなどの臨床設定における分析の有用性を高める。本実施形態における他の用途には、体液、廃水または食品試料中の低濃度のフェノール化合物の分析が含まれるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００４９】
本発明を、次に示す非限定例によって、さらに詳細に説明する。本実施例において、固相抽出（ＳＰＥ）、続いて、ギブズ反応および吸光分析法による検出を用いて、麻酔薬プロポフォールが全血から検出される。低いプロポフォール濃度のために確立されている測定プロトコールは、時間が掛かり、複雑なＨＰＬＣ系分析に依存する。この実施例に説明される方法の低い複雑性およびコストによって、患者に近い設定(near patient setting)で行うことができるプロポフォール分析が可能になる。
【００５０】
既知濃度のプロポフォールを含む、血液試料（好ましくは１ ｍｌ）を、１：２に水で希釈し、次いで、既知の容量（好ましくは１．５ ｍｌ）のこの希釈した試料を、逆相ＳＰＥカラムに注入する。カラムを、（好ましくは１．５ ｍｌの）脱イオン水、および（好ましくは０．７５ ｍｌの）水とメタノールの１：１混合物で洗浄し、弱く結合した不純物を除去する。その後、プロポフォール抽出物を、既知の容量（好ましくは０．７５ ｍｌ）のアセトニトリルを使用して、ＳＰＥカラムから溶出する。アセトニトリルへのプロポフォールの固相抽出は、L. McGaughranらによって詳述されている。次いで、ＳＰＥカラムからの溶離液を光吸収測定セルに移し、メタノール中既知の容量（好ましくは１００ μｌ）および既知の濃度（好ましくは０．８ ｍｍｏｌ．ｌ−１）のギブズ試薬（図２、化合物Ａ）を加え、キュベットを通過する、既知の圧力の窒素ガス（１５ ｐｓｉ）の通気によって混合する。ギブズ試薬とプロポフォールの間の反応が十分に遅い場合、インドフェノール生成物の濃度は、この時点では無視できると考えることができる。その後、溶液の光透過率を、既知の光路長の溶液を通して透過光（４００ｎｍ〜８００ｎｍ）のスペクトルで分散した強度を測定することによって、決定する。このスペクトルは参照スペクトルである。
【００５１】
５９５ｎｍおよび８００ｎｍのシグナルの透過強度を記録する（それぞれ、Iref，595nmおよびIref,800nm）。
【００５２】
その後、ｐＨ９．６の２０ ｍＭ重炭酸塩緩衝液の既知の容量（好ましくは１００ μｌ）を、キュベットに加え、上述のように、窒素ガスの通気を用いて混合する。ｐＨの増加によって、ギブズ試薬（図２、化合物Ａ）から活性化形態（図２、化合物Ｂ）への転化が生じ、その後、試料中の溶出されたプロポフォールと急速に反応して、５９５ｎｍの最大吸光度を有した着色インドフェノール生成物が生成する。反応が平衡状態（および、定常状態に達するインドフェノールの濃度）に達することを可能にする、規定された待機時間（好ましくは４０秒）の後に、スペクトルの透過強度を、前述と同様に、同じ既知の光路長の溶液を通した透過光（４００ｎｍ〜８００ｎｍ）のスペクトルで分散した強度を記録することによって、測定する。また、５９５ｎｍおよび８００ｎｍのシグナルの透過強度を記録する（それぞれ、Is,595nmおよびIs,800nm）。したがって、インドフェノール生成物(Afinal)の吸光度を、ランベルト・ベールの法則(B eer-Lambert  Law)によって定義する（方程式１）。
【００５３】
【数１】
2013541009.tif 000003
【００５４】
この最終吸光度は、非インドフェノール種（たとえば、ＳＰＥ抽出で全血からキャリーオーバーされたタンパク質、脂質）の５９５ｎｍのバックグラウンド吸光度、および試料（たとえば、不溶性凝集物から発生する）の濁度によるバックグラウンド光散乱で補正された、インドフェノール生成物の吸光度である。したがって、この吸光シグナルは、最終インドフェノール種の濃度に正比例し、試料中の初期の濃度のプロポフォールの干渉によって、反応が定常状態であり、ギブズ試薬が超過していることが想定される。
【００５５】
この増強されたバックグラウンド減算スキームの結果を図３に示す。パネルＡは、本来のプロポフォール濃度（０．８ μｇ／ｍｌ）を有する全血試料からの固相抽出物における波長に対する吸光度のプロットを示す。メタノール参照に対する低ｐＨ参照スペクトル（トレース２）の検証は、顕著な非インドフェノール吸光度が５９５ｎｍであることを示す。これによって、インドフェノールに起因しないメタノール参照に対するｐＨ９．６試料のスペクトル（トレース１）のオフセットが生成する。このオフセットは試料ごとに変化し、このため、補正する必要がある。ｐＨ９．６スペクトルからの低ｐＨ参照スペクトルの減算によって、インドフェノールのみの吸光度に起因する５９５ｎｍの吸光度ピークを有した最終スペクトル（トレース３）が生成する。
【００５６】
パネルＢは、古いメタノール参照（トレース４）および新しい低ｐＨ参照減算スキーム（トレース５）の予測濃度データに対する吸光度の最終プロットを示す。また、適合のための線形回帰および関連方程式も示す。線形性の改善、および新しい低ｐＨ参照スキームから得たオフセットの低減に留意すべきである。
【００５７】
McGaughran et al., Rapid measurement of blood propofol levels: A proof of concept study," Journal of Clinical Monitoring and Computing, vol. 20, 2006, pp. 381-381（試料スペクトルは、参照（図３Ａ、トレース１）としてキュベット中で「メタノールのみ」試料を使用する）によって定義された通常の減算法を用い、スペクトルの非インドフェノールバックグラウンドにより、吸光度には顕著なオフセットがある。この「非インドフェノール」バックグラウンドシグナルは、低いｐＨでの付加的な参照測定によって、直接測定することができ（図３Ａ、トレース２）、次いで、試料スペクトルから減じて、インドフェノールのみのスペクトル（図３Ａ、トレース３）を得ることができる。
【００５８】
既知のプロポフォール濃度に対する最終吸光度（方程式１）のプロットの検証は、この新しい減算スキームが測定された吸光度を効果的に低減し、図３Ｂに示すように、バックグラウンドシグナルの変化によって導入された可変オフセットの除去により、プロットの線形性を改善することを示す。したがって、インドフェノール生成物の濃度、したがって、本来のプロポフォール濃度によって、これらの非常に低濃度の試料をより正確に判定することができる。そして、最終減算スペクトル（図３Ａ、トレース３）の８００ｎｍにおけるオフセットの低減にも留意すべきである。これは、低ｐＨ参照測定が光散乱から生じる吸光シグナルの原因であることを実証する。したがって、５９５ｎｍの単一の波長測定は、本明細書に説明する全スペクトル（４００ｎｍ〜８００ｎｍ）の測定よりも、プロポフォール濃度を測定するのに用いることができる。これは、装置の複雑性の削減およびコストの相当な節約をもたらす。
【００５９】
上述の実施形態は、本発明を限定するよりもむしろ説明するものであり、当業者が添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、多数の代替実施態様を設計できることに留意すべきである。特許請求の範囲において、括弧間に配置されたいかなる引用符号も、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されないものとする。「含んでなる(comprising)」という語は、特許請求の範囲に記載された構成要素または工程以外の構成要素または工程の存在を排除するものではない。構成要素に先行する「a」または「an」という語は、かかる構成要素が複数存在することを排除するものではない。本発明は、複数の異なる構成要素を含んでなるハードウェアによって実施することができる。複数の手段を列挙するデバイスの特許請求の範囲において、これらの手段の幾つかは、ハードウェアのまったく同一のアイテムによって具体化することができる。特定の測定が相互に異なる従属項に記載されているという事実だけで、これらの測定の組合せが有利に使用できないことを示すものではない。
【図１】
2013541009.tif 000004
【図２】
2013541009.tif 000005
【図３】
2013541009.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成25年7月12日(2013.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロポフォール（２，６‐ジ-イソプロピルフェノール）と活性化ギブズ試薬（２，６‐ジクロロキノンイミン）の間の反応生成物の検出によって、プロポフォールの存在を判定する方法であって、該方法は、
該反応生成物の最大の無視しうる濃度（negligible concentration）を有する初期反応混合物においてバックグラウンド測定を行うことであって、該初期反応混合物の反応条件が、該無視しうる濃度の測定可能な変化なしで、該バックグラウンド測定を行うことができるように、少なくとも、該反応生成物の生成の反応速度を低減することと、
該初期反応混合物の反応条件を変更して、該反応速度を加速させることと、
該反応生成物の濃度が安定するまで、該反応を継続することと、
得られた反応混合物に関する第２の測定を行って、該濃度に相関するシグナルを得ることと、
該バックグラウンド測定と該第２の測定の間の相違からプロポフォールの存在を判定すること、とを含む、
前記方法。
【請求項２】
複合試料マトリックスから前記プロポフォールを抽出する工程と、
前記プロポフォールを初期反応混合物に移す段階と、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロポフォールの存在を判定する工程が、前記反応混合物中のプロポフォールの濃度を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記最大の無視しうる濃度の測定可能な変化なしで、前記バックグラウンド測定を行うことができるように、該バックグラウンド測定を行う前に、前記初期反応混合物の反応条件を制御することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記初期反応混合物の反応条件を制御する工程が、該初期反応混合物のｐＨ、温度、混合割合、および化学組成のうちの少なくとも１つを制御することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記初期反応混合物の化学組成を制御する工程が、該初期反応混合物から、プロポフォールおよび前記活性化ギブズ試薬のうちの１つを除くことを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記初期反応混合物の化学組成を制御する工程が、該初期反応混合物に反応阻害剤を加えることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
第１および第２測定が、光学測定、蛍光測定、吸着測定、比色定量測定、電気化学測定、および重量測定のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
前記バックグラウンド測定を行うことが、前記初期反応混合物の吸収スペクトルの少なくとも一部を測定することを含み、かつ、
前記第２の測定を行うことが、前記得られた反応混合物の吸収スペクトルの少なくとも一部を測定することを含む、前記方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記初期反応混合物が、前記ギブズ試薬（２，６‐ジクロロキノン‐４‐クロロイミド）を含み、前記初期反応混合物の反応条件が、該ギブズ試薬から前記活性化ギブズ試薬への転化を防止するのに十分に低いｐＨを含んでなり、かつ、前記初期反応混合物の反応条件を変更して反応速度を加速させる工程が、前記初期反応混合物のｐＨを増加させることを含む、前記方法。
【請求項１１】
前記初期反応混合物が、クエン酸緩衝液、ギ酸緩衝液、または重炭酸塩緩衝液などの十分に低いｐＨを維持する緩衝液を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１および第２の測定が、４００ｎｍ〜８００ｎｍの間隔を含む吸光スペクトルから、前記初期反応混合物および前記得られた反応混合物の吸光度をそれぞれ決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１および第２の測定が、５９５ｎｍの第１の波長と、８００ｎｍの第２の波長で、前記初期反応混合物および前記得られた反応混合物の吸光度をそれぞれ決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１および第２の測定が、５９５ｎｍのみの波長で、前記初期反応混合物および前記得られた反応混合物の吸光度をそれぞれ決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
固相抽出を用いて、前記複合試料マトリックスから前記プロポフォールを抽出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記複合試料マトリックスが血液である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抽出工程が、前記血液試料が固相抽出カラムを通過し、該カラムを洗浄し、適切な溶媒を使用して、前記プロポフォールを溶出することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶媒がアセトニトリルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記血液試料が、前記カラムを通過する前に、水によって、１：１よりも大きい比（該比は、１：２〜１：５０の血液：水の範囲にあることが好ましい）に希釈される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法であって、前記初期反応混合物の反応条件を変更して反応速度を加速させる工程の後に、かつ、前記反応生成物の濃度が安定する前に、少なくとも１つの中間測定を行うことをさらに含んでなり、前記バックグラウンド測定と第２の測定の間の相違から前記プロポフォールの存在を判定する段階が、該バックグラウンド測定、該第２の測定、および該少なくとも１つの中間測定の間の相違から、該存在を決定、測定することをさらに含む、前記方法。
【国際調査報告】
2013541009.tif 000007
2013541009.tif 000008
2013541009.tif 000009