(57)【要約】  細菌酵素のための基質を用いて、病原性細菌とそれに関連する疾病を検出、定量化、区別、診断、および、画像化するための方法が本明細書で提供される。細菌の存在下で基質または酵素生成物によって発せられた蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルが対照と比較されることで、病原性細菌を検出して位置付ける。有力な治療用化合物の存在下と不在下で、基質と生成物から発せられたシグナルを測定することによって、病態生理学的状態を処置するための治療用薬剤をスクリーニングするための方法と、生物学的サンプルを基質に接触させ、マイコバクテリアβ−ラクタマーゼ生成物から発せられた信号を画像化することで、被験体のマイコバクテリア細菌を検出するための診断方法とが本明細書で提供される。色またはｐＨの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含む蛍光発生基質または基質も提供される。【選択図】図１８【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体においてリアルタイムで病原性細菌を検出するための方法であって、
前記方法は、
被験体に、病原性細菌のβ−ラクタマーゼのための基質を導入する工程、または、被験体のサンプルまたは表面から得られたサンプルを、病原性細菌のβ−ラクタマーゼのための基質に接触させる工程と、
基質におけるβ−ラクタマーゼ活性からの生成物のためにサンプルまたは被験体を画像化する工程と、
β−ラクタマーゼ生成物によって発せられた波長のシグナルを獲得する工程であって、それによって、被験体の病原性細菌を検出する工程を含む、方法。
【請求項２】
被験体の病原性細菌の位置を決定するために、発せられたシグナルの３Ｄ再構成を作成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
感染細胞を定量化する工程と、生体サンプル中で非感染細胞と感染細胞を区別する工程の１つまたは両方をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
感染細胞を区別する工程および／または感染細胞を定量化する工程は、フローサイトメトリー法、共焦点顕微鏡法、または、蛍光分光法の１つ以上を用いることによって行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
基質は、蛍光発生基質ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、ＣＤＣ−５、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５．２、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ８００、ＣＮＩＲ８００．２、ＣＮＩＲ８００−３、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６、または、ＸＨＸ３−３２、あるいは、その誘導体またはアナログである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
基質は、色またはｐＨの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
基質は、粒子または微粒子に結合するか、あるいは、ビオチンに結合する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生物学的サンプルは、痰、胸水、尿、血液、唾液、大便、または、被験体の関心領域からふき取って得られるサンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
病原性細菌は、バクテロイド属、クロストリジウム属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、シュードモナス属、ヘモフィルス属、レジオネラ属、マイコバクテリウム属、エシェリキア属、サルモネラ属、シゲラ属、またはリステリア属の細菌種である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
病原性細菌は、マイコバクテリウムツベルクローシスコンプレックス、または、マイコバクテリウムアビウムコンプレックスを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
獲得されたシグナルは、蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
画像化波長は約３００ｎｍ乃至約９００ｎｍであり、発光波長は約３００ｎｍ乃至約９００ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
画像化波長は約５４０ｎｍ乃至約７３０ｎｍであり、発光波長は約６５０ｎｍ乃至約８００ｎｍである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
被験体の病原性細菌に関連する病態生理学的状態を診断するための方法であって、
前記方法は、
病原性細菌のβ−ラクタマーゼ用の基質を被験体に投与する工程、あるいは、被験体に由来する生物学的サンプルを、病原性細菌のβ−ラクタマーゼ用の基質に接触させる工程、
基質におけるβ−ラクタマーゼ活性の生成物のために被験体を画像化する工程、および、
生成物によって発せられる波長のシグナル強度をリアルタイムで獲得する工程を含み、
測定された対照シグナルよりも大きなシグナル強度は、病態生理学的状態の診断と相関する、方法。
【請求項１５】
病原性微生物の位置を決定するために、シグナルの３Ｄ再構成を作成する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
感染細胞を定量化する工程と、感染細胞を生物学的サンプル中の非感染細胞と区別する工程の１つまたは両方をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
感染細胞を区別するおよび／または定量化する工程は、フローサイトメトリー法、共焦点顕微鏡法、または、蛍光分光法の１以上を用いて行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
病態生理学的状態を処置するのに有効な１以上の治療用化合物を投与する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
被験体に基質を再投与する工程、または、基質に由来する生物学的サンプルを前記基質に接触させる工程と、
治療用化合物の有効性をモニターするために被験体を画像化する工程をさらに含み、
診断時のシグナルと比較した発せられたシグナルの減少は、病態生理学的状態に対する治療効果を示す、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
病態生理学的状態は結核である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
生物学的サンプルは、痰、胸水、尿、血液、唾液、大便、または、被験体の関心領域からふき取って得られるサンプルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
病原性細菌は、バクテロイド属、クロストリジウム属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、シュードモナス属、ヘモフィルス属、レジオネラ属、マイコバクテリウム属、エシェリキア属、サルモネラ属、シゲラ属、または、リステリア属の細菌種である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
病原性細菌は、マイコバクテリウムツベルクローシスコンプレックス、または、マイコバクテリウムアビウムコンプレックスを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
基質は、蛍光発生基質ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、ＣＤＣ−５、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５．２、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ８００、ＣＮＩＲ８００．２、ＣＮＩＲ８００−３、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６、または、ＸＨＸ３−３２、あるいは、その誘導体またはアナログである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
基質は、色またはｐＨの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
基質は、粒子または微粒子に結合するか、あるいは、ビオチンに結合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
測定されたシグナルは、蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
画像化波長は約３００ｎｍ乃至約９００ｎｍであり、発光波長は約３００ｎｍ乃至約９００ｎｍである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２９】
画像化波長は約５４０ｎｍ乃至約７３０ｎｍであり、発光波長は約６５０ｎｍ乃至約８００ｎｍである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
被験体のマイコバクテリア感染を検出するための診断方法であって、
前記方法は、
被験体から生物学的サンプルを得る工程と、
マイコバクテリアのβ−ラクタマーゼ酵素の基質に生物学的サンプルを接触させる工程と、
基質におけるβ−ラクタマーゼ活性の生成物のために生物学的サンプルを画像化する工程と、
生成物によって発せられた波長でシグナルの強度を測定する工程を含み、
測定された対照シグナルよりも大きなシグナルの強度は、マイコバクテリア感染の存在を示す、方法。
【請求項３１】
感染細胞を定量化する工程と、生体サンプル中で非感染細胞と感染細胞を区別する工程の１つまたは両方をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
感染細胞を区別するおよび／または定量化する工程は、フローサイトメトリー法、共焦点顕微鏡法、または、蛍光分光法の１以上を用いて行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
マイコバクテリア感染の検出後、被験体に施される治療計画の治療効果をモニターするために、前記方法の工程を１度以上繰り返す工程をさらに含み、対照と比較した測定されたシグナルの減少は、治療計画に対する肯定的な反応と相関する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
生物学的サンプルは、痰、胸水、尿、血液、唾液、大便、または、被験体の関心領域からふき取って得られるサンプルである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
マイコバクテリア感染は、マイコバクテリウムツベルクローシス、マイコバクテリウムツベルクローシスコンプレックス、マイコバクテリウムアビウム、または、マイコバクテリウムアビウムコンプレックスによって引き起こされる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
基質は、蛍光発生基質ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、ＣＤＣ−５、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５．２、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ８００、ＣＮＩＲ８００．２、ＣＮＩＲ８００−３、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６、または、ＸＨＸ３−３２、あるいは、その誘導体またはアナログである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
基質は、色またはｐＨの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
基質は、粒子または微粒子に結合するか、あるいは、ビオチンに結合する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
測定されたシグナルは、蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルである、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
画像化波長は約３００ｎｍ乃至約９００ｎｍであり、発光波長は約３００ｎｍ乃至約９００ｎｍである、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
画像化波長は約５４０ｎｍ乃至約７３０ｎｍであり、発光波長は約６５０ｎｍ乃至約８００ｎｍである、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
被験体の病原性細菌に関連する病態生理学的状態を処置するために有効な治療用化合物を選抜するための方法であって、
前記方法は、
病原性細菌に有力な治療用化合物を選択する工程と、
細菌細胞または細菌細胞を含む生物学的サンプルを、その細菌β−ラクタマーゼの基質に接触させる工程と、
細菌細胞または細菌細胞を含む生物学的サンプルを、有力な治療用化合物に接触させる工程と、
有力な治療用化合物の存在下および不在下で、細菌細胞によって生成された蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルを測定する工程を含み、
治療用化合物の不在下でのシグナルと比べて、治療用化合物の存在下でのシグナルの減少は、病原性細菌に対する化合物の治療効果を示す、方法。
【請求項４３】
基質は、蛍光発生基質ＣＣ１、ＣＣ２、ＣＨＰＱ、ＣＲ２、ＣＮＩＲ１、ＣＮＩＲ２、ＣＮＩＲ３、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５．２、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ８００、ＣＮＩＲ８００．２、ＣＮＩＲ８００−３、ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、ＣＤＣ−５、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６、または、ＸＨＸ３−３２、あるいは、その誘導体またはアナログである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
基質は、色またはｐＨの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
基質は、粒子または微粒子に結合するか、あるいは、ビオチンに結合する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
病原性細菌は、バクテロイド属、クロストリジウム属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、シュードモナス属、ヘモフィルス属、レジオネラ属、マイコバクテリウム属、エシェリキア属、サルモネラ属、シゲラ属、または、リステリア属の細菌種である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
病原性細菌は、マイコバクテリウムツベルクローシスコンプレックス、または、マイコバクテリウムアビウムコンプレックスを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
病態生理学的状態は結核である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
細菌細胞によって生成されたシグナルは、約３００ｎｍ乃至約９００ｎｍの波長を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
細菌細胞によって生成されたシグナルは、約６５０ｎｍ乃至約８００ｎｍの波長を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
β−ラクタマーゼ活性後の検出可能な蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルを生成する細菌のβ−ラクタマーゼのための基質。
【請求項５２】
基質は、蛍光発生基質ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、ＣＤＣ−５、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５．２、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ８００、ＣＮＩＲ８００．２、ＣＮＩＲ８００−３、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６、または、ＸＨＸ３−３２、あるいは、その誘導体またはアナログである、請求項５１に記載の基質。
【請求項５３】
基質は、基質におけるβ−ラクタマーゼ活性後の色またはｐＨの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含む、請求項５１に記載の基質。
【請求項５４】
粒子、微粒子、または、それらに結合したビオチンをさらに含む、請求項５１に記載の基質。
【請求項５５】
生物学的サンプル中の病原性細菌を明白に検出するためのアッセイ装置であって、
前記アッセイ装置は、
生物学的サンプルと、病原性細菌に関連するβ−ラクタマーゼ酵素用の発色基質とを含む培養混合物を収容するための手段、および、収容手段と流体連通する基質におけるβ−ラクタマーゼ活性によって生じる有色生成物を捕捉して濃縮するための手段を含む、プラットフォームを含んでいる、アッセイ装置。
【請求項５６】
有色生成物のみが収容手段から下流に流れることを可能にするための手段をさらに含む、請求項５５に記載のアッセイ装置。
【請求項５７】
収容手段から下流の内部制御をさらに含む、請求項５５に記載のアッセイ装置。
【請求項５８】
収容手段から下流の流体を吸収するための手段をさらに含む、請求項５５に記載のアッセイ装置。
【請求項５９】
基質は、有色色素または化学試薬を含む、請求項５５に記載のアッセイ装置。
【請求項６０】
基質は、粒子または微粒子に結合する、請求項５５に記載のアッセイ装置。
【請求項６１】
基質は化学試薬を含み、前記アッセイ装置は、化学試薬から発色するための手段として第２の試薬を含む、請求項５５に記載のアッセイ装置。
【請求項６２】
基質はビオチンに結合し、前記アッセイ装置はビオチンに結合した基質を捕捉するための手段としてアビジンをさらに含む、請求項５５に記載のアッセイ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願への相互参照＞
この国際出願は、２０１０年６月４日に出願された係属中の米国一部継続特許出願１２／８０２，３４０号の合衆国法典第３５巻の第１２０条の下で優先権の利益を主張し、該文献は、２００９年８月６日に出願された係属中の米国非仮特許出願１２／４６２，６４４号の合衆国法典第３５巻の第１２０条の下で優先権の利益を主張し、該文献は、２００８年１２月２４日に出願され、放棄された米国特許出願６１／２０３，６０５号と、２００８年８月６日に出願され、放棄された米国仮特許出願６１／１８８，１１２号の合衆国法典第３５巻の第１１９条（ｅ）の下で優先権の利益を主張し、これらのすべての内容はそのまま引用されることによって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、一般的に医学、病原性の微生物学、および、画像化技術の分野に関する。より具体的には、本発明は、被験体のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での画像化中に病原性微生物を検出し特定するのに有用な化合物およびレポーターに関する。
【０００３】
＜関連技術の詳細＞
多くの細菌感染は、世界中でかなりの罹患率および死亡率を引き起こし、最も重要な細菌種の多くはβ−ラクタマーゼ陽性であり、標準的なペニシリン様抗生物質に対する耐性をつけている。これらの多くの感染症とペニシリン耐性の存在を診断することは、困難なことがしばしばあり、易罹患性の決定に先立って、診断施設での大規模な培養を必要とする。
【０００４】
例えば、結核は現在、世界の人口のほぼ３分の１に影響を与え、依然として公衆衛生の深刻な脅威である。簡単に治療することができない複数の薬物耐性かつ広範囲な薬物耐性株が世界中にずっと存在していることを考えると、懸念は一層大きくなる。研究室で、培養細胞中で、および、動物モデルとヒトで感染中に、結核菌の生存率を定量化して評価する方法は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）および／または組織や痰の顕微鏡検査に限定される。これらの方法は時間がかかり、しばしば解釈するのが難しく、比較的感度が低い。ほとんどの方法は、動物と人間の場合に、死後行わなければならない侵襲的な手順を必要とする。これらの欠点ゆえに、動物モデルと患者との両方で、疾患の進行、ワクチンの有効性、および、治療上の結果をはっきりと理解するのが難しい。光学撮像法は、感染中の結核菌の生存率、治療の有効性、および、疾患中の細菌の位置特定の直接的な確認を、非侵入的な方法でリアルタイムに行うことを可能にする。
【０００５】
したがって、細菌性疾患を画像化して診断する方法を改善する必要性が当該技術分野で認められている。より具体的には、先行技術は、細菌感染を診断して見つけ出し、新しい治療法を迅速に探り、新しい薬剤標的を特定するために、インビトロで、かつ、生存している被験体内で用いることが可能な、β−ラクタマーゼ陽性細菌のための高感度で特異的なリアルタイムでの光学画像化が欠けている。本発明は当該技術分野でのこの長年の必要性と要求を満たすものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は被験体においてリアルタイムで病原性細菌を検出するための方法を対象としている。本方法は、被験体または被験体からの生物学的サンプルに、病原性細菌のβ−ラクタマーゼのための蛍光性、発光性、または、発色性の基質を導入する工程と、基質におけるβ−ラクタマーゼ活性からの生成物のためにサンプルまたは被験体を画像化する工程を含む。β−ラクタマーゼ生成物によって発せられた波長のシグナルが獲得され、それによって、被験体の病原性細菌を検出する。本発明は、被験体の病原性細菌の位置を決定するために、発せられたシグナルの３Ｄ再構成を作成する工程をさらに含む、関連する方法を対象としている。本発明は、測定された対照シグナルよりも大きな発せられたシグナル強度に基づいて病原性細菌に関連した病態生理学的状態をリアルタイムで診断する工程をさらに含む、別の関連する方法を対象としている。例えば、蛍光性、発光性、または、発色性の基質は、ＣＮＩＲ２、ＣＮＩＲ３、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ケージドルシフェリン、比色試薬、または、その誘導体あるいはアナログである。
【０００７】
本発明はリアルタイムで病原性細菌を検出するための関連した方法を対象としている。本方法は、病原性細菌のβ−ラクタマーゼ用の基質を被験体へ導入する工程、被験体からの、または、表面から得られた生物学的サンプルを病原性細菌のβ−ラクタマーゼ用の基質に接触させる工程、および、基質におけるβ−ラクタマーゼ活性からの生成物のためにサンプルまたは被験体を画像化する工程を含む。β−ラクタマーゼ生成物によって発せられた波長のシグナルが獲得され、それによって、被験体の病原性細菌を検出する。本発明は、感染細胞を定量化する工程と、生物学的サンプル中で非感染細胞と感染細胞を区別する工程の１つまたは両方をさらに含む、関連した方法を対象としている。本発明は、被験体の病原性細菌の位置を決定するために、発せられたシグナルの３Ｄ再構成を作成する工程をさらに含む、別の関連する方法を対象としている。例えば、基質は、蛍光発生基質ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、ＣＤＣ−５、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５．２、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ８００、ＣＮＩＲ８００．２、ＣＮＩＲ８００−３、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６、または、ＸＨＸ３−３２、その誘導体またはアナログであってもよく、あるいは、基質は、基質におけるβ−ラクタマーゼ活性による色またはｐＨの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含んでもよい。
【０００８】
本発明は、被験体の病原性細菌に関連する病態生理学的状態を診断する方法も対象としている。本方法は、病原性細菌のβ−ラクタマーゼ用の蛍光性または発光性の基質を被験体に投与する工程、あるいは、被験体に由来する生物学的サンプルを、病原性細菌のβ−ラクタマーゼ用の蛍光性または発光性の基質に接触させる工程、および、基質におけるβ−ラクタマーゼ活性の生成物のために被験体を画像化する工程を含む。蛍光性、発光性、または、発色性のシグナル強度は、測定された対照シグナルよりも大きな蛍光性、発光性、または、発色性のシグナル強度が病態生理学的状態の診断と相関するように、生成物によって発せられた波長でリアルタイムで測定される。本発明は、病原性微生物の位置を決定するために、シグナルの３Ｄ再構成を作成する工程をさらに含む関連方法を対象としている。本発明は、病態生理学的状態を処置するのに有効な１つ以上の治療用化合物を投与する工程をさらに含む、別の関連する方法を対象としている。本発明は、被験体に蛍光性化合物を再投与する工程、および、被験体を再画像化する工程または被験体に由来する生物学的サンプルを前記蛍光発生基質に接触させる工程と、診断時のシグナルと比較して発せられたシグナルの減少が病態生理学的状態に対する治療効果を示唆するように、治療用化合物の有効性をモニターするために、被験体または前記生物学的サンプルを画像化する工程を含む、さらに関連する方法を対象としている。例えば、蛍光発生基質または発光基質は、ＣＮＩＲ２、ＣＮＩＲ３、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ケージドルシフェリン、比色試薬、または、その誘導体あるいはアナログである。
【０００９】
本発明は、被験体の病原性細菌に関連する病態生理学的状態を診断するための関連方法を対象としている。本方法は、病原性細菌のβ−ラクタマーゼ用の基質を被験体に投与する工程、あるいは、被験体に由来する生物学的サンプルを、病原性細菌のβ−ラクタマーゼ用の基質に接触させる工程、および、基質におけるβ−ラクタマーゼ活性の生成物のために被験体を画像化する工程を含む。例えば、蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルなどのシグナル強度は、生成物によって発せられた波長でリアルタイムで測定され、測定された対照シグナルよりも大きなシグナルの強度は病態生理学的状態の診断に相関する。本発明は、感染細胞を定量化する工程と、生物学的サンプル中で非感染細胞と感染細胞を区別する工程の１つまたは両方をさらに含む、関連する方法を対象としている。本発明は、病原性微生物の位置を決定するために、シグナルの３Ｄ再構成を作成する工程をさらに含む別の関連方法を対象としている。特に、基質は、蛍光発生基質ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、ＣＤＣ−５、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５．２、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ８００、ＣＮＩＲ８００．２、ＣＮＩＲ８００−３、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６、または、ＸＨＸ３−３２であってもよく、あるいは、その誘導体またはアナログは、基質におけるβ−ラクタマーゼ活性による色またはｐＨの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含んでもよい。
【００１０】
本発明は、被験体のマイコバクテリア感染を検出するための診断方法をさらに対象としている。本方法は、被験体から生物学的サンプルを得る工程と、マイコバクテリアのβ−ラクタマーゼ酵素の基質に生物学的サンプルを接触させる工程を含む。生物学的サンプルは、基質におけるβ−ラクタマーゼ活性の生成物を検出するために画像化され、シグナルの強度は、生成物によって発せられた波長で測定され、測定された対照シグナルよりも大きなシグナルの強度はマイコバクテリア感染の存在を示す。本発明は、感染細胞を定量化する工程と、生物学的サンプル中で非感染細胞と感染細胞を区別する工程の１つまたは両方をさらに含む、関連する方法を対象としている。本発明は、マイコバクテリア感染の検出後、被験体に施される治療計画の治療効果をモニターするために、これらの方法工程を１度以上繰り返す工程をさらに含む別の関連する方法を対象としており、対照と比較して測定されたシグナルの減少は、治療計画に対する肯定的な反応と相関する。基質は、蛍光発生基質ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、ＣＤＣ−５、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５．２、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ８００、ＣＮＩＲ８００．２、ＣＮＩＲ８００−３、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６、または、ＸＨＸ３−３２であってもよく、あるいは、その誘導体またはアナログは、基質におけるβ−ラクタマーゼ活性による色またはｐＨの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含んでもよい。
【００１１】
本発明は、被験体の病原性細菌に関連する病態生理学的状態を処置するために有効な治療用化合物を選抜するための方法をさらに対象としている。本方法は、病原性細菌に有力な治療用化合物を選択する工程と、細菌細胞または細菌細胞を含む生物学的サンプルを、蛍光性、発光性、または、発色性の検出剤に接触させる工程と、細菌細胞を有力な治療用化合物と接触させる工程を含む。細菌細胞または細菌細胞を含む生物学的サンプルによって生じる蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルは、有力な化合物の存在下と不在下で測定され、有力な化合物の不在下でのシグナルと比較して有力な化合物の存在下でのシグナルの減少は、病原性細菌に対する化合物の治療効果を示す。例えば、蛍光性、発光性、または、発色性の検出剤は、ＣＮＩＲ２、ＣＮＩＲ３、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ケージドルシフェリン、比色試薬、または、その誘導体である。
【００１２】
本発明は、被験体の病原性細菌に関連する病態生理学的状態を処置するために有効な治療用化合物を選抜するための方法を対象としている。本方法は、ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、ＣＤＣ−５、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５．２、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ８００、ＣＮＩＲ８００．２、ＣＮＩＲ８００−３、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６、または、ＸＨＸ３−３２、あるいは、その誘導体またはアナログである蛍光発生基質を検出剤として用いて、直前に記載の工程を含むか、あるいは、該基質におけるβ−ラクタマーゼ活性後の色またはｐＨの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含んでもよい。
【００１３】
本発明は、病原性細菌を画像化するための方法をさらに対象としている。本方法は、病原性細菌をそのβ−ラクタマーゼ酵素用の蛍光発生基質に接触させる工程と、基質におけるβ−ラクタマーゼ活性の生成物のために励起波長を病原性細菌に送る工程と、生成物から発せられた蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルを獲得する工程を含む。獲得したシグナルの３Ｄ再構成が生成され、それによって、病原性細菌を画像化する。
【００１４】
本発明は、基質におけるβ−ラクタマーゼ活性後の検出可能な蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルを生成する細菌のβ−ラクタマーゼのための基質をさらに対象としている。代表的な基質は、限定されないが、ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、ＣＤＣ−５、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５．２、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ８００、ＣＮＩＲ８００．２、ＣＮＩＲ８００−３、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６、または、ＸＨＸ３−３２、あるいは、その誘導体またはアナログを含み、あるいは、該基質は、該基質におけるβ−ラクタマーゼ活性後の色またはｐＨの変化をもたらすのに効果的な有色色素または化学試薬を含む。本発明は、粒子、微粒子、または、それに結合したビオチンをさらに含む、別の関連する基質を対象としている。
【００１５】
本発明は、被験体のリアルタイムでの病原性細菌を検出するための方法をさらに対象としている。本方法は、ガンマ放射に関連する同位体で放射標識された基質を被験体に導入する工程を含み、基質は、β−ラクタマーゼ、他の酵素、または、タンパク質に関して病原性細菌に特有である。被験体は、放射放出された基質の活性のあいだ、放射放出された基質からのガンマ放出について画像化され、放出されたガンマ線によって生じたシグナルが獲得される。ガンマ線によって生じたシグナルの強度に基づいた被験体における放射標識の濃度の３Ｄ再構成が作成され、それによって、病原性細菌を検出する。本発明は、その検出に基づいて病原性細菌に関連した病態生理学的状態をリアルタイムで診断する工程をさらに含む関連する方法を対象としている。本発明は、病態生理学的状態を処置するのに有効な１つ以上の治療用化合物を投与する工程をさらに含む別の関連する方法を対象としている。本発明は、被験体に放射標識された基質を再投与する工程と、治療用化合物の有効性をモニターするために被験体を再画像化する工程をさらに含むさらに別の関連する方法を対象としており、ここで、診断時のガンマ放出と比較したガンマ放出の減少は、病態生理学的状態に対する治療効果を示す。
【００１６】
本発明は、本明細書に記載されるようなＰＥＴまたはＳＰＥＣＴイメ−ジングに適した細菌のβ−ラクタマーゼのための放射標識された基質をさらに対象としている。
【００１７】
本発明は、生物学的サンプル中の病原性細菌を明白に検出するためのアッセイ装置をさらに対象としている。アッセイ装置は、生物学的サンプルと、病原性細菌に関連するβ−ラクタマーゼ酵素用の発色基質とを含む培養混合物を収容するための手段、および、収容手段と流体連通する基質におけるβ−ラクタマーゼ活性によって生じる有色生成物を捕捉して濃縮するための手段を含む、プラットフォームを含んでいる。本発明は、有色生成物のみが収容手段から下流に流れることを可能にするための手段をさらに含む関連する発明を対象としている。本発明は、収容手段から下流の内部制御を含む、関連する発明を対象としている。本発明は、基質が化学試薬を含み、装置が、化学試薬から発色するための手段として第２の試薬を含む、別の関連する発明を対象としている。本発明は、基質がビオチンに結合し、装置が、ビオチンに結合した基質を捕捉するための手段としてアビジンをさらに含む、別の関連する発明を対象としている。他のおよびさらなる目的、特徴、および、利点は、開示目的で与えられる本発明の現在好ましい実施形態の以下の記載から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
したがって、明らかになるであろう本発明の上記の列挙された特徴、長所、および、目的と、それ以外のものが達成され、詳細に理解されうる事柄、とりわけ、上記で簡潔に要約された本発明の記載は、添付の図面で例証される特定の実施形態を参照することによって保持されてもよい。これらの図面は明細書の一部を形成する。しかしながら、添付の図面は、本発明の好ましい実施形態を例証しており、したがって、その範囲に限定されるものと考慮されない。
【図１】１Ａ乃至１Ｃは、ＣＮＩＲ４に浸漬させる前のＢｌａＣ変異結晶（ｍｕｔａｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌ）（１Ａ）、ＣＮＩＲ４基質を保持するＢｌａＣ変異結晶（１Ｂ）を示している。図１Ｃは、Ｍｔｂ  ＢｌａＣによるセフォタジム（ｃｅｆｏｔａｚｉｍｅ）の触媒作用と、ラクタム環の加水分解によって形成された生成物を例証する。
【図２】２Ａ乃至２Ｃは、β−ラクタマーゼによる加水分解前後の、ＣＣ１とＣＣ２（１Ａ）、ＣＨＰＱ（２Ｂ）、および、ＣＲ２（２Ｃ）の構造を描いている。
【図３】ＣＮＩＲ１、ＣＮＩＲ２、ＣＮＩＲ３、および、ＣＮＩＲ４の構造と、β−ラクタマーゼによるそれらの加水分解を描いている。
【図４Ａ】近赤外線基質ＣＮＩＲ５を調製するための合成計画を描いている。
【図４Ｂ】ＣＮＩＲ５の大規模な商業用調製のための代替的な合成計画を描いている。
【図４Ｃ】β−ラクタマーゼの存在下および不在下でのＣＮＩＲ５の蛍光強度対波長を描いている。
【図４Ｄ】ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２の構造を描いている。
【図５Ａ】ＱＳＹ  ２１の構造を描いている。
【図５Ｂ】ＱＳＹ２１二スルホン酸塩の構造を描いている。
【図５Ｃ】ＱＳＹ２２二スルホン酸塩の構造を描いている。
【図５Ｄ】ＱＳＹ２２二スルホン酸塩の化学合成を描いている。
【図６Ａ】ＣＮＩＲ７の構造を描いている。
【図６Ｂ】ＣＮＩＲ７の化学合成を描いている。
【図７Ａ】ＣＮＩＲ９の合成計画を描いている。
【図７Ｂ】ＣＮＩＲ１０の合成計画を描いている。
【図８Ａ】蛍光発生（ｆｌｕｏｒｅｏｇｅｎｉｃ）基質ＣＤＣ−１−５の合成計画と加水分解動態を描いている。ＣＤＣ１−４の合成を示している。
【図８Ｂ】蛍光発生（ｆｌｕｏｒｅｏｇｅｎｉｃ）基質ＣＤＣ−１−５の合成計画と加水分解動態を描いている。ＴＥＭ−１  Ｂｌａ、または、Ｍｔｂ  ＢｌａＣでそれぞれ処置した後の４５５ｎｍにおける、プローブＣＤＣ−１、２、３、４の時間に対する発光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）を示している（基質の濃度：５  ｍＭ；ＴＥＭ−１  Ｂｌａの濃度はＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で２ｎＭである；Ｍｔｂ  ＢｌａＣの濃度はＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で１０ｎＭである；４００ｎｍで励起）。
【図８Ｃ】蛍光発生（ｆｌｕｏｒｅｏｇｅｎｉｃ）基質ＣＤＣ−１−５の合成計画と加水分解動態を描いている。ＴＥＭ−１  Ｂｌａ、または、Ｍｔｂ  ＢｌａＣでそれぞれ処置した後の４５５ｎｍにおける、プローブＣＤＣ−１、２、３、４の時間に対する発光を示している（基質の濃度：５  ｍＭ；ＴＥＭ−１  Ｂｌａの濃度はＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で２ｎＭである；Ｍｔｂ  ＢｌａＣの濃度はＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で１０ｎＭである；４００ｎｍで励起）。
【図８Ｄ】蛍光発生（ｆｌｕｏｒｅｏｇｅｎｉｃ）基質ＣＤＣ−１−５の合成計画と加水分解動態を描いている。ＣＤＣ−５の合成を示す。
【図８Ｅ】蛍光発生（ｆｌｕｏｒｅｏｇｅｎｉｃ）基質ＣＤＣ−１−５の合成計画と加水分解動態を描いている。β−ラクタマーゼの処置後の４５５ｎｍでの基質ＣＤＣ−１の時間に対する発光を示している（実線：Ｍｔｂ  ＢｌａＣで処置された；破線：ＴＥＭ−１  Ｂｌａで処置された；プローブの濃度：５ｍＭ；ＴＥＭ−１  Ｂｌａの濃度：ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で２０ｎＭ；４００ｎｍで励起）
【図８Ｆ】蛍光発生（ｆｌｕｏｒｅｏｇｅｎｉｃ）基質ＣＤＣ−１−５の合成計画と加水分解動態を描いている。β−ラクタマーゼの処置後の４５５ｎｍでのプローブＣＤＣ−５の時間に対する発光を示す（実線：Ｍｔｂ  ＢｌａＣで処置された；破線：ＴＥＭ−１  Ｂｌａで処置された；プローブの濃度：５ｍＭ；Ｍｔｂ  ＢｌａＣの濃度：ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で２０ｎＭ；４００ｎｍで励起）。
【図９Ａ】ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１  ＸＨＸ３−２６、および、ＸＨＸ３−３２の化学構造を描いている。
【図９Ｂ】ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１  ＸＨＸ３−２６、および、ＸＨＸ３−３２の化学構造を描いている。
【図９Ｃ】ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１  ＸＨＸ３−２６、および、ＸＨＸ３−３２の化学構造を描いている。
【図９Ｄ】ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１  ＸＨＸ３−２６、および、ＸＨＸ３−３２の化学構造を描いている。
【図９Ｅ】ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１  ＸＨＸ３−２６、および、ＸＨＸ３−３２の化学構造を描いている。
【図９Ｆ】ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−２６、および、ＸＨＸ３−３２を用いて、細菌の数と蛍光シグナル間の相関を実証する。励起：３６０ｎｍ（１ｘ  ＰＢＳ）；最大放出：４５３ｎｍ（１ｘ  ＰＢＳ）；ＸＨＸ−２−８１（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、６０ｍＬ）；ＸＨＸ−２−９１（ＤＭＳＯ中１００ｍＭ、１０ｍＬ）；ＸＨＸ−３−２６（ＤＭＳＯ中２０ｍＭ、４２ｍＬ）；ＸＨＸ−３−３２（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、１００ｍＬ）。
【図１０Ａ】Ｂｌｕｃｏの化学合成を描いている。
【図１０Ｂ】β−ラクタマーゼの連続的なレポーター生物発光アッセイ（ＳＲＥＬ）画像化のためのＢｌｕｃｏの使用を描いている。
【図１１Ａ】ＣＮＩＲおよびＣＮＩＲ様のプローブと、その誘導体およびアナログの調製への代替的な化学合成経路を描いている。
【図１１Ｂ】ＣＮＩＲおよびＣＮＩＲ様のプローブと、その誘導体およびアナログの調製への代替的な化学合成経路を描いている。
【図１１Ｃ】ＣＮＩＲ５．２およびＣＮＩＲ８００．２のような、そのようにして合成されたプローブの構造を描いている。
【図１１Ｄ】ＣＮＩＲ８００−３のような、そのようにして合成されたプローブの構造を描いている。
【図１２】１２Ａと１２Ｂは、ＣＮＩＲ５による、大腸菌（１２Ａ）と結核菌（１２Ｂ）内でのＢｌａの活性の検出を例証する。対照はＬＢ培地および形質変換した大腸菌を含まないＣＮＩＲ５を包含している。
【図１３Ａ】蛍光発光スペクトルを描いている。ＣＮＩＲ４の発光スペクトルは、１０分間のＴＥＭ−１  Ｂｌａによる開裂の前後で示されている。
【図１３Ｂ】蛍光発光スペクトルを描いている。ＣＮＩＲ５の発光スペクトルは、１０分間のＴＥＭ−１  Ｂｌａによる開裂の前後で示されている。
【図１３Ｃ】蛍光発光スペクトルを描いている。ＣＮＩＲ９の発光スペクトルは、１０分間のＴＥＭ−１  Ｂｌａによる開裂の前後で示されている。
【図１３Ｄ】蛍光発光スペクトルを描いている。ＣＮＩＲ１０の発光スペクトルは、１０分間のＴＥＭ−１  Ｂｌａによる開裂の前後で示されている。
【図１３Ｅ】蛍光標識取り込みの動態を描いている。ＣＮＩＲ４の野生型ＭｔｂおよびＭｔｂ  ＢｌａＣ変異体（ｂｌａＣｍ）への直接的な蛍光標識取り込みの動態が示される。
【図１３Ｆ】蛍光標識取り込みの動態を描いている。ＣＮＩＲ５の野生型ＭｔｂおよびＭｔｂ  ＢｌａＣ変異体（ｂｌａＣｍ）への直接的な蛍光標識取り込みの動態が示される。
【図１３Ｇ】蛍光標識取り込みの動態を描いている。ＣＮＩＲ９の野生型ＭｔｂおよびＭｔｂ  ＢｌａＣ変異体（ｂｌａＣｍ）への直接的な蛍光標識取り込みの動態が示される。
【図１３Ｈ】蛍光標識取り込みの動態を描いている。ＣＮＩＲ１０の野生型ＭｔｂおよびＭｔｂ  ＢｌａＣ変異体（ｂｌａＣｍ）への直接的な蛍光標識取り込みの動態が示される。
【図１４】１４Ａと１４Ｂは、ＣＮＩＲ４基質（１４Ａ）との、および、ＣＮＩＲ５基質（１４Ｂ）との、大腸菌ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼおよびヒト結核菌ＢｌａＣ  β−ラクタマーゼの動態を描いている。
【図１５】ＣＮＩＲ４（１５Ａと１５Ｅ）、ＣＮＩＲ５（１５Ｂと１５Ｆ）、ＣＮＩＲ９（１５Ｃと１５Ｇ）、および、ＣＮＩＲ１０（１５Ｄと１５Ｈ）を含む培地でのヒト結核菌細菌のみの蛍光取り込み（１５Ａ乃至１５Ｄ）と蛍光取り込みの分布比（１５Ｅ乃至１５Ｈ）の動態を描いている。
【図１６】ＣＮＩＲ４（１６Ａと１６Ｅ）、ＣＮＩＲ５（１６Ｂと１６Ｆ）、ＣＮＩＲ９（１６Ｃと１６Ｇ）、および、ＣＮＩＲ１０（１６Ｄと１６Ｈ）を含むト結核菌細菌に感染したマクロファージの蛍光取り込み（１６Ａ乃至１６Ｄ）と蛍光取り込みの分布比（１６Ｅ乃至１６Ｈ）の動態を描いている。
【図１７】ヒト結核菌に感染したマクロファージへのＣＮＩＲ４の細胞内での取り込みを示す共焦点顕微鏡画像を描いている。ＤＡＰＩ染色（青）は感染細胞の核を示し、緑色蛍光はＧＦＰ標識された結核菌からのものであり、赤色蛍光は開裂したＣＮＩＲ４からのものである。
【図１８】１８Ａ乃至１８Ｅは、１０８（各マウスの左下）、１０７（左上）、１０６（右上）から様々な濃度で、ＣＮＩＲ４（１８Ａ）、ＣＮＩＲ５（１８Ｂ）、ＣＮＩＲ９（１８Ｃ）、および、ＣＮＩＲ１０（１８Ｄ）の皮内注入によって結核菌に感染したマウスからの蛍光を描いている。１８Ｅは、感染に使用された細菌の各々の濃度で各々の化合物についてシグナル対バックグラウンドを比較している。
【図１９Ａ】ＣＮＩＲ４に関して測定された蛍光シグナルとエアロゾルによる接種とによって肺内の結核菌に感染したマウスからの蛍光画像である。各々の図１９Ａ−１９Ｄでは、各パネル中の左のマウスは感染しておらず、左から２番目のマウスはｂｌａＣ遺伝子中に変異を有する結核菌に感染しており、各パネル中の右側の２匹のマウスは野生型結核菌に感染している。各パネル中の右側の３匹のマウスには、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ９、または、ＣＮＩＲ１０が画像化の２４時間前に点滴で与えられた。
【図１９Ｂ】ＣＮＩＲ５に関して測定された蛍光シグナルとエアロゾルによる接種とによって肺内の結核菌に感染したマウスからの蛍光画像である。各々の図１９Ａ−１９Ｄでは、各パネル中の左のマウスは感染しておらず、左からの２番目のマウスはｂｌａＣ遺伝子中に変異を有する結核菌に感染しており、各パネル中の２匹の右側のマウスは野生型結核菌に感染している。各パネル中の３匹の右側のマウスには、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ９、または、ＣＮＩＲ１０が画像化の２４時間前に点滴で与えられた。
【図１９Ｃ】ＣＮＩＲ９に関して測定された蛍光シグナルとエアロゾルによる接種とによって肺内の結核菌に感染したマウスからの蛍光画像である。各々の図１９Ａ−１９Ｄでは、各パネル中の左のマウスは感染しておらず、左から２番目のマウスはｂｌａＣ遺伝子中に変異を有する結核菌に感染しており、各パネル中の右側の２匹のマウスは野生型結核菌に感染している。各パネル中の右側の３匹のマウスには、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ９、または、ＣＮＩＲ１０が画像化の２４時間前に点滴で与えられた。
【図１９Ｄ】ＣＮＩＲ１０に関して測定された蛍光シグナルとエアロゾルによる接種とによって肺内の結核菌に感染したマウスからの蛍光画像である。各々の図１９Ａ−１９Ｄでは、各パネル中の左のマウスは感染しておらず、左から２番目のマウスはｂｌａＣ遺伝子中に変異を有する結核菌に感染しており、各パネル中の右側の２匹のマウスは野生型結核菌に感染している。各パネル中の右側の３匹のマウスには、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ９、または、ＣＮＩＲ１０が画像化の２４時間前に点滴で与えられた。
【図１９Ｅ】背部画像中の肺領域の各々の化合物のシグナル対バックグラウンドのグラフである。
【図２０Ａ】エアロゾルによって結核菌に感染し、１時間後、基質ＣＮＩＲ５を用いて画像化されたマウスからの蛍光画像である。背側、腹側、または、右側と左側の図の各々のパネルにおいて、左側のマウスは感染しておらず、右側のマウスは感染している。マウスはすべて、明記された時点での画像化の前に、点滴でＣＮＩＲ５に感染した。
【図２０Ｂ】エアロゾルによって結核菌に感染し、１８時間後、基質ＣＮＩＲ５を用いて画像化されたマウスからの蛍光画像である。背側、腹側、または、右側と左側の図の各々のパネルにおいて、左側のマウスは感染しておらず、右側のマウスは感染している。マウスはすべて、明記された時点での画像化の前に、点滴でＣＮＩＲ５に感染した。
【図２０Ｃ】エアロゾルによって結核菌に感染し、２４時間後、基質ＣＮＩＲ５を用いて画像化されたマウスからの蛍光画像である。背側、腹側、または、右側と左側の図の各々のパネルにおいて、左側のマウスは感染しておらず、右側のマウスは感染している。マウスはすべて、明記された時点での画像化の前に、点滴でＣＮＩＲ５に感染した。
【図２０Ｄ】エアロゾルによって結核菌に感染し、４８時間後、基質ＣＮＩＲ５を用いて画像化されたマウスからの蛍光画像である。背側、腹側、または、右側と左側の図の各々のパネルにおいて、左側のマウスは感染しておらず、右側のマウスは感染している。マウスはすべて、明記された時点での画像化の前に、点滴でＣＮＩＲ５に感染した。
【図２０Ｅ】エアロゾルによって結核菌に感染し、９６時間後、基質ＣＮＩＲ５を用いて画像化されたマウスからの蛍光画像である。背側、腹側、または、右側と左側の図の各々のパネルにおいて、左側のマウスは感染しておらず、右側のマウスは感染している。マウスはすべて、明記された時点での画像化の前に、点滴でＣＮＩＲ５に感染した。
【図２０Ｆ】図１９Ａの上部パネル内で円で囲まれた関心領域から得られた蛍光シグナルの量を定量化するグラフである。
【図２１】２１Ａと２１Ｂは、エアロゾルによって結核菌に感染し、バックグラウンドシグナルを減らすために反射率ではなく透視を用いて画像化されたマウス（２１Ａ）と、結核菌に感染しておらず、バックグラウンドシグナルを減らすために反射率ではなく透視を用いて画像化されたマウス（２１Ｂ）の蛍光画像化を描いている。
【図２２Ａ】左肩に異種移植した野生型Ｃ６腫瘍と、右肩にｃｍｖ−ｂｌａを安定的にトランスフェクトしたＣ６腫瘍とを含むヌードマウス内でのＣＮＩＲ５（７ｎｍｏｌ）によるＢｌａ発現の画像化を例証している。図２２Ａは、示された時点で覆われた蛍光かつ明るい視野の画像を示している。
【図２２Ｂ】左肩に異種移植した野生型Ｃ６腫瘍と、右肩にｃｍｖ−ｂｌａを安定的にトランスフェクトしたＣ６腫瘍とを含むヌードマウス内でのＣＮＩＲ５（７ｎｍｏｌ）によるＢｌａ発現の画像化を例証している。図２２Ｂは、各々の腫瘍対時間の平均強度のプロットを示す。
【図２２Ｃ】左肩に異種移植した野生型Ｃ６腫瘍と、右肩にｃｍｖ−ｂｌａを安定的にトランスフェクトしたＣ６腫瘍とを含むヌードマウス内でのＣＮＩＲ５（７ｎｍｏｌ）によるＢｌａ発現の画像化を例証している。図２２Ｃは、切除された腫瘍および器官の画像を示す
【図２２Ｄ】左肩に異種移植した野生型Ｃ６腫瘍と、右肩にｃｍｖ−ｂｌａを安定的にトランスフェクトしたＣ６腫瘍とを含むヌードマウス内でのＣＮＩＲ５（７ｎｍｏｌ）によるＢｌａ発現の画像化を例証している。図２２Ｄは、両方の腫瘍からの抽出物中のＢｌａのＣＣ１アッセイの結果を示す。
【図２３Ａ】左肩に異種移植した野生型Ｃ６腫瘍と、右肩にｃｍｖ−ｂｌａを安定的にトランスフェクトしたＣ６腫瘍とを含むヌードマウス内でのＣＮＩＲ６（７ｎｍｏｌ）によるＢｌａ発現の画像化を例証している。図２３ＡはＣＮＩＲ６の化学構造である。
【図２３Ｂ】左肩に異種移植した野生型Ｃ６腫瘍と、右肩にｃｍｖ−ｂｌａを安定的にトランスフェクトしたＣ６腫瘍とを含むヌードマウス内でのＣＮＩＲ６（７ｎｍｏｌ）によるＢｌａ発現の画像化を例証している。図２３Ｂは示された時点で覆われた蛍光かつ明るい視野の画像を示す。
【図２３Ｃ】左肩に異種移植した野生型Ｃ６腫瘍と、右肩にｃｍｖ−ｂｌａを安定的にトランスフェクトしたＣ６腫瘍とを含むヌードマウス内でのＣＮＩＲ６（７ｎｍｏｌ）によるＢｌａ発現の画像化を例証している。図２３Ｃは、各々の腫瘍対時間の平均強度のプロットを示す。
【図２４】２４Ａと２４Ｂは、４時間後（２４Ａ）と２４時間後（２４Ｂ）の様々な組織内のＣＮＩＲ５の７．５  ｎｍｏｌｅｓの体内分布を例証する。
【図２５】２５Ａと２５Ｂは、造影剤として静脈内のＣＮＩＲ５を用いた、結核菌に感染したマウス（２５Ａ）と、結核菌に感染していない対照マウス（２５Ｂ）のインビボ画像である。
【図２６Ａ】ＣＮＩＲプローブを用いて、ＳＲＥＬの検出の閾値を例証する。図２６Ａは、ＳＲＥＬ画像化によって、β−ラクタマーゼＣＮＩＲプローブを用いて、１００未満の細菌が検出され得ることを示す棒グラフである。
【図２６Ｂ】ＣＮＩＲプローブを用いて、ＳＲＥＬの検出の閾値を例証する。生きている未感染マウスのインビボ画像である。
【図２６Ｃ】ＣＮＩＲプローブを用いて、ＳＲＥＬの検出の閾値を例証する。結核菌（図２６Ｃ）に感染した、生きているマウスのインビボ画像である。
【図２７Ａ】臨床サンプル中の結核菌を検出するために、ＣＮＩＲ５の能力を評価した結果を描いている。
【図２７Ｂ】痰サンプル中の結核菌の検出閾値を測定した結果を描いている。
【図２７Ｃ】添加された痰サンプル中のシグナル強度と細菌の数の間の相関を描いている。
【図２７Ｄ】添加された痰サンプルとＰＢＳにおけるシグナル強度と細菌の数の比較を描いている。
【図２７Ｅ】測定可能なシグナルを得るための時間を含む、マイコバクテリア内のイソニアジド＋リファンピン処置の評価を描いている。
【図２８】ＩＲ色素８００シリーズのフルオロフォアの構造を描いている。
【図２９】セフォペラゾンと提案されたＣＮＩＲプローブの構造を描いている。
【図３０】Ｂｌｕｃｏ基質の偏った小規模なライブラリ（ｂｉａｓｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）を構築するための計画である。
【図３１】３’−位置でアリル結合を含む新しいプローブの構造を表示する。
【図３２】３’−位置でカルバミン酸塩結合を含む新しいプローブの構造を描く。
【図３３Ａ】ラテックス粒子または微粒子に結合した、複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）／基質／有色色素を用いた診断アッセイのための目に見える検出システムを描いている。
【図３３Ｂ】ラテックス粒子または微粒子に結合した、複合体／基質／発色性の化学試薬を用いた診断アッセイのための目に見える検出システムを描いている。
【図３３Ｃ】ビオチンに結合した、複合体／基質／有色色素を用いた診断アッセイのための目に見える検出システムを描いている。
【図３３Ｄ】ビオチンに結合した、複合体／基質／発色性の化学試薬を用いた診断アッセイのための目に見える検出システムを描いている。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書で使用されるように、１つ（「ａ」「ａｎ」）は１つ以上を意味してもよい。本明細書で使用されるように、請求項では、「含む」と共に使用される際、１つ（「ａ」「ａｎ」）は１つ以上を意味してもよい。本明細書で使用されるように、「別の」または「他の」は、少なくとも第２のまたはそれ以上の同じまたは異なる請求項の要素またはその構成要素を意味してもよい。さらに、文脈から特段必要とされない限り、単数形は複数を含むこととし、複数形は単数を含むこととする。
【００２０】
本開示は代替物と「および／または」のみを指すという定義を支持しているが、本明細書で使用されているように、請求項の用語「または（ｏｒ）」は、代替物のみを指すと明確に示唆されていない限り、あるいは、代替物が相互に唯一のものである限り、「および／または」を意味するように用いられる。
【００２１】
本明細書で使用されているように、用語「接触させる」は、蛍光発生基質、例えば、蛍光性化合物、蛍光タンパク質、発光タンパク質、または、比色分析タンパク質、あるいは、他の比色分析試薬またはその誘導体、あるいは、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴイメージングに適切な放射標識された基質を、病原性細菌、例えば、限定されないが、マイコバクテリウムツベルクローシス（Ｍｂｔ）、マイコバクテリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムツベルクローシスコンプレックス、または、マイコバクテリウムアビウムコンプレックスと、あるいは、バクテロイド属、クロストリジウム属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、シュードモナス属、ヘモフィルス属、レジオネラ属、マイコバクテリウム属、エシェリキア属、サルモネラ属、シゲラ属、または、リステリア属と、あるいは、生物学的サンプル中のインビボまたはインビトロの病原性細菌に特異的なβ−ラクタマーゼまたは他の酵素またはタンパク質と接触させる任意の適切な方法を指す。インビボまたはインビトロでは、これは、１つ以上の細菌細胞またはβ−ラクタマーゼ、あるいは、他の酵素またはタンパク質を、適切な培地中の蛍光発生基質または蛍光性化合物、あるいは、蛍光性、発光性、または、発色性のタンパク質、あるいは、他の比色試薬またはその誘導体にさらすことによって達成される。細菌細胞またはβ−ラクタマーゼ、あるいは、他の酵素またはタンパク質は、被験体から得られたサンプル中にある。細菌細胞は生存可能なサンプルを含んでもよく、含まなくてもよい。β−ラクタマーゼ酵素あるいは他の酵素またはタンパク質は、生存可能な細菌細胞内で接触してもよく、知られている標準的な方法によって細菌細胞から抽出されてもよく、または、生物学的サンプル中にそれ自体が存在してもよく、または、知られている標準的な方法によって細菌細胞へとトランスフェクトされた組み換え系を含んでもよい。サンプルは、限定されないが、胸水または痰を含んでもよく、細菌を有しているかもしれない血液、唾液、尿、および、便を含む他の体液を含んでもよい。代替的に、インビトロ接触に関して、生物学的サンプルは、例えば、限定されないが、道具、用具、設備、作業対象表面、衣類、または、ヒトの１つ以上の関心領域のような表面から拭き取ることによって得られてもよい。そのようにして得られたサンプルは、当該技術分野で知られている標準的な方法によって、画像化のための適切な培地に移されてもよい。体内での応用に関して、蛍光発生基質、すなわち、蛍光性化合物、蛍光性、発光性、または、発色性のタンパク質、他の比色試薬またはその誘導体、あるいは、放射標識された基質の任意の既知の投与方法は、本明細書に記載されるように適切である。
【００２２】
本明細書で使用されるように、「蛍光発生基質」との用語は、適切な酵素の存在下で、適切な波長による励起後に蛍光性または発光性のシグナルを発するかたは生成するか、あるいは、発色シグナルをもたらす生成物を生成することもある、化学化合物またはタンパク質またはペプチドあるいは他の生物学的に活性の分子を指す。例えば、制限されることなく、蛍光発生基質は、β−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ、または、β−ガラクトシダ−ゼ、あるいは、他の酵素の存在下で、蛍光性、発光性、または、発色性の生成物を生成してもよい。
【００２３】
本明細書で使用されているように、「放射標識された基質」との用語は、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）のための陽電子か、または、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）のためのγ線を放出する、短命の放射性同位体につけられた、または、該放射性同位体に結合したそれ以外のものを指す。
【００２４】
本明細書で使用されるように、「β−ラクタマーゼ陽性細菌」の用語は、β−ラクタマーゼ酵素を自然分泌するか、あるいは、病変形成の間にβ−ラクタマーゼを獲得する、病原性細菌を指す。
【００２５】
本明細書で使用されるように、用語「被験体」は、処置の任意の標的、または、生物学的サンプルが得られる処置の任意の標的を指す。好ましくは、被験体は哺乳動物であり、より好ましくは、被験体は、ウシまたはヒトのいずれか一方である。
【００２６】
被験体における病原性細菌を即時に検出する方法が、本発明の１つの実施形態において提供され、該方法は、被験体またはその生物学的サンプルに、病原性細菌のβ−ラクタマーゼ用の、蛍光基質、発光基質、または比色基質を導入する工程；被験体またはサンプルを、基質上のβ−ラクタマーゼ活性から生じた生成物の励起波長で画像化する工程；および、シグナルをβ−ラクタマーゼ生成物から発せられる波長で得る工程；それらにより被験体における病原体細菌を検出する工程を含む。
【００２７】
さらにこの実施形態に加えて、方法は、被験体における病原性細菌の位置を決定するために、発せられたシグナルの３Ｄ再構成を作成する工程を含む。さらに別の実施形態において、方法は、病原性細菌に関する病態生理学的状態を、測定された対照シグナルよりも大きく発せられたシグナル強度に基づき、リアルタイムで診断する工程を含む。病態生理学的状態の１つの例は、結核である。
【００２８】
本発明の特定の実施形態において、蛍光基質は、蛍光発生基質であり得る。蛍光発生基質の例は、ＣＮＩＲ２、ＣＮＩＲ３、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ケージドルシフェリン、比色薬剤、またはそれらの誘導体である。また、すべての実施形態において、画像化波長、または励起波長および発光波長は、独立して約３００ｎｍ乃至約９００ｎｍであり得る。特定の実施形態において、画像化または励起波長は約５４０ｎｍ乃至約７３０ｎｍであり、ならびに発光シグナルは約６５０ｎｍ乃至約８００ｎｍであり得る。特定の実施形態において、比色指標は、色彩変化によりヒトの肉眼で視覚的に確認され得るか、または代入値（ａｓｓｉｇｎｅｄ  ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｖａｌｕｅ）を測定する装置により測定され得る。さらに、病原性細菌は、バクテロイド属、クロストリジウム属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、シュードモナス属、ヘモフィルス属、レジオネラ属、マイコバクテリウム属、エシェリキア属、サルモネラ属、シゲラ属、またはリステリア属の細菌種を含み得る。特に、病原性細菌は、マイコバクテリウムツベルクローシスコンプレックス、または、マイコバクテリウムアビウムコンプレックスを含み得る。
【００２９】
病原性細菌を画像化する方法が、本発明の関連の実施形態において提供され、該方法は、病原性細菌のβ−ラクタマーゼに関する蛍光発生基質を、被験体に導入し、またはその生体サンプルと接触させ、または表面から得る工程；基質上で、病原性細菌に、β−ラクタマーゼ活性の生成物の励起波長を送達する工程；生成物から発せられた、蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルを得る工程；および、得られたシグナルを３Ｄ再構成を作成し、それにより病原性細菌を画像化する工程を含む。この実施形態の態様において、病原性細菌は、上述の通り、インビボまたはインビトロで上記の蛍光発生基質または発光基質と接触させられる。また、この実施形態の様態において、病原性細菌および励起波長と発光波長は上述の通りである。
【００３０】
別の関連する実施形態において、本発明は病原性細菌をリアルタイムで検出する方法を提供し、該方法は、被験体またはその生体サンプルに病原性細菌のβ−ラクタマーゼに関する基質を導入する工程；基質上のβ−ラクタマーゼ活性から生じる生成物に関して、被験体またはサンプルを画像化する工程；および、β−ラクタマーゼ生成物から発せられた波長でのシグナルを得る工程；それにより被験体における病原性細菌を検出する工程を含む。
【００３１】
さらにこの実施形態に加えて、方法は、被験体における病原性細菌の位置を決定するために、発せせられたシグナルの３Ｄ再構成を作成する工程を含む。さらなる別の実施形態において、方法は、生物学的サンプルにおける感染細胞を定量化し、非感染細胞と識別する工程を含み得る。特に、このさらなる実施形態において、感染細胞の識別化および／または定量化の工程は、血球計算法、共焦点顕微鏡法、または蛍光分光法のうちの１つ以上を利用して行われる。
【００３２】
両方の実施形態において、基質は蛍光発生基質ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、ＣＤＣ−５、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５．２、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＳＮＩＲ８００、ＣＮＩＲ８００．２、ＣＮＩＲ８００−３、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６またはＸＨＸ３−３２、あるいはその誘導体かアナログであり得る。あるいは、基質は有色の色素、または色の変化またはｐＨ変化を誘導するのに効果的な化学試薬を含み得る。さらに、基質は粒子、微粒子、またはビオチンに結合され得る。また、両方の実施形態において、生物学的サンプルは、痰、胸水、尿、血液、唾液、大便、または被験体において関心領域からふき取って得られるサンプルであり得る。得られるシグナルは、蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルであり得る。病原性細菌、画像化（ｉｍａｇｉｎｇ）波長および発光波長は上述の通りである。
【００３３】
被験体における病原体細菌に関連する病態生理学的状態を診断する方法が、本発明の別の実施形態において提供され、該方法は、病原性細菌のβ−ラクタマーゼ用の蛍光基質または発光基質を、被験体に投与する工程；被験体を、基質上のβ−ラクタマーゼ活性の生成物に関して、励起波長で画像化する工程；および、生成物から発せられる波長にある蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルをリアルタイムで測定する工程を含み、ここで、対照シグナルよりも大きな蛍光シグナル強度、発光シグナル強度、または比色シグナル強度は、病態生理学的状態との相関を示す。
【００３４】
さらにこの実施形態に加えて、方法は、病原性細菌の位置を決定するために、シグナルの３Ｄ再構成を作成する工程を含む。さらに別の実施形態において、方法は、病態生理学的状態を処置するのに効果的な、１つ以上の治療用化合物を被験体に投与する工程を含む。さらなる別の方法は、被験体に蛍光基質または発光基質を再投与する工程；および治療用化合物の効果をモニターするために被験体を再び画像化する工程を含み、ここで、発せられたシグナルが、診断時のシグナルと比べて減少していることは、病態生理学的状態への治療的効果を示す。すべての実施形態において、病理生理学的状態、病原性細菌、蛍光基質、および画像化波長または励起波長および発光波長は上述の通りである。
【００３５】
被験体における病原性細菌と関連のある病態生理学的状態を診断する方法が、本発明の関連する実施形態において提供され、該方法は、病原性細菌のβ−ラクタマーゼ用の基質を被験体に投与し、それ由来の生物学的サンプルと接触させる工程；被験体を、基質上のβ−ラクタマーゼ活性の生成物に関して、画像化する工程；および、生成物から発せられた波長でのシグナル強度をリアルタイムで測定する工程を含み、ここで、測定された対照シグナルよりも大きなシグナル強度は、病態生理学的状態の診断との相関を示す。さらにこの実施形態に加えて、方法は、３Ｄ画像を作成し、診断された病理生態学的状態に適切な治療化合物を投与する工程を含み、基質を再投与する工程は上記の通りである。さらに別の実施形態において、方法は、生物学的サンプルにおける感染細胞を定量化し、非感染細胞から識別化する方法のうちの１つ、またはそれらの両方は、上述の通りである。
【００３６】
これらの実施形態において、基質は、上述のように、蛍光発生基質、有色の色素、または化学試薬であり得る。また、病態生理学的状態は結核であり得、生物学的サンプルは、痰、胸水、尿、血液、唾液、大便、または被験体の関心領域からふき取って得られるサンプルであり得る。測定されたシグナルは、蛍光シグナルまたは比色シグナルであり得る。病原性細菌、画像化波長または励起波長、および発光波長は上述の通りである。
【００３７】
被験体における病原性細菌に関連のある病態生理学的状態を診断する方法が、本発明の別の関連する実施形態に提供され、該方法は、前記被験体から得たサンプルを、病原性細菌のβ−ラクタマーゼ用の比色基質と接触させる工程を含み、ここで、基質上のβ−ラクタマーゼ活性の生成物は、裸眼で認識可能な色の変化を生じ、このように診断が行われる。基質は、ストリップ、綿棒（ｑ−ｔｉｐ）、背景、または他の可視指標に配され得る。色の変化は、裸眼で認識可能であり得、任意の装置または外部のエネルギーソースからの刺激がなくても識別可能であり得る。
【００３８】
被験体におけるマイコバクテリア感染を検出する診断方法が、本発明のまた別の実施形態において提供され、該方法は、被験体から生物学的サンプルを得る工程；生物学的サンプルを、マイコバクテリアのβ−ラクタマーゼ酵素の蛍光発生基質と接触させる工程；蛍光発生基質上のβ−ラクタマーゼ活性の生成物に関して、生物学的サンプルを画像化する工程；および生成物から発せられた波長でのシグナル強度を測定する工程を含み、ここで、測定された対照シグナルよりも大きなシグナル強度は、マイコバクテリア感染の存在を示す。さらにこの実施形態に加えて、方法は、マイコバクテリア感染症を検出した時点で被験体へ施行された処置レジメンの、治療的効果をモニターするために、上記の方法の工程を１回以上繰り返させ、ここで、測定された蛍光シグナルが、制御シグナルと比べて減少していることは、処置レジメンへの陽性反応と相関を示す。さらなる別の実施形態において、方法は、上述のように、生物学的サンプルにおける感染細胞を定量化し、非感染細胞から識別する工程の１つまたは両方を含む。
【００３９】
両方の実施形態において、基質は、蛍光発生基質ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、ＣＤＣ−５、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５．２、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ８００、ＣＮＩＲ８００．２、ＣＮＩＲ８００−３、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６、またはＸＨＸ３−３２、あるいはその誘導体かアナログであり得る。あるいは、基質は有色の色素または、色の変化またはｐＨ変化に効果的な化学試薬を含み得る。さらに、基質は、粒子、微粒子、またはビオチンに結合され得る。また、生物学的サンプルは、痰、胸水、尿、血液、唾液、大便、または被験体において関心領域からふきとって得られるサンプルであり得る。加えて、マイコバクテリア感染は、結核菌または結核菌複合体またはトリ結核菌またはトリ結核菌複合体により、引き起こされ得る。さらに、測定されたシグナルは、蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルであり得る。画像化波長および励起波長は上述の通りであり得る。
【００４０】
被験体における病原性細菌と関連のある病態生理学的状態の処置に効果的な、治療化合物をスクリーニングする方法が、本発明のまた別の実施形態において提供され、該方法は、病原性細菌に対して可能性のある治療化合物を選択する工程；細菌細胞を、蛍光検出剤、発光検出剤、または比色検出剤と接触させる工程；細菌細胞を、可能性のある治療化合物と接触させる工程；および、細菌細胞によりもたらされた蛍光シグナルまたは比色シグナルを、可能性のある治療薬の存在下または不在下で測定する工程を含み、ここで、治療薬の存在下でのシグナルが、治療薬の不在下でのシグナルと比べて減少することは、化合物の病原性細菌に対する治療的効果を示す。この実施形態において、病理生理学的状態および病原性細菌は上述の通りである。
【００４１】
この実施形態の１つの態様において、病原性細菌は、組み換え型細菌であり得、その際、細菌を蛍光検出剤、発光検出剤、また比色検出剤と接触させる工程は、野生型細菌を、蛍光検出剤、発光検出剤、または比色検出剤を含有する発現ベクターで形質転換させる工程を含む。この態様において、蛍光検出剤、発光検出剤または比色検出剤は、蛍光タンパク質を含み得る。蛍光タンパク質の例は、ｍＰｌｕｍ、ｍＫｅｉｍａ、Ｍｃｈｅｒｒｙ、またはｔｄＴｏｍａｔｏであり得る。また、この態様において、発現ベクターは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含み得、その際、方法は組み換え型細菌を、β−ガラクトシダーゼ酵素の存在下で蛍光シグナルを発するのに効果的な蛍光団と接触させる工程をさらに含む。蛍光団の例は、Ｃ２ＦＤＧ、Ｃ１２ＲＧ、またはＤＤＡＯＧである。加えて、この態様において、発現ベクターはルシフェラーゼ遺伝子を含み得、その際、方法は、組み換え型細菌をＤ−ルシフェリンと接触させる工程をさらに含む。ルシフェラーゼの例は、ホタルルシフェラーゼ、ｃｌｉｃｋ  ｂｅａｔｌｅ  ｒｅｄ、またはｒＬｕｃ８である。
【００４２】
この実施形態の別の態様において、蛍光検出剤は、病原性β−ラクタマーゼの蛍光発生基質であり得る。１つの実施例において、病原性細菌はインビボで、蛍光基質ＣＮＩＲ２、ＣＮＩＲ３、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ケージドルシフェリン、比色薬剤、またはその誘導体と接触され得る。別の実施例において、病原性細菌は、インビトロで蛍光基質ＣＣ１、ＣＣ２、ＣＨＰＱ、ＣＲ２、ＣＮＩＲ１、またはＣＮＩＲ６と接触され得る。
【００４３】
被験体における病原性細菌に関連する病態生理学的状態を処置するのに効果的な、治療化合物をスクリーニングする方法は、本発明の関連する実施形態にあり、該方法は、病原性細菌に対する可能性のある治療化合物を選択する工程；細菌細胞または同一の細菌細胞を含有する生物学的サンプルを、その病原性β−ラクタマーゼの基質と接触させる工程；細菌細胞または同一の細菌細胞を含有する生物学的サンプルを、可能性のある治療化合物と接触させる工程；および細菌細胞から生じた蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルを、可能性のある治療化合物の存在下および不在下で測定する工程を含み、ここで、治療化合物の存在下でのシグナルが、治療化合物の不在下でのシグナルと比べて減少することは、治療化合物の病原性細菌に対する治療的効果を示す。
【００４４】
この実施形態の１つの態様において、基質は、蛍光発生基質ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、ＣＤＣ−５、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５．２、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ８００、ＣＮＩＲ８００．２、ＣＮＩＲ８００−３、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６、またはＸＨＸ３−３２、あるいはその誘導体かアナログであり得る。あるいは、基質は有色の色素、あるいは色の変化またはｐＨ変化の導入に効果的な化学試薬を含み得る。さらに、基質は、粒子、微粒子、またはビオチンに結合され得る。また、病原性細菌および病態生理学的状態は上述の通りであり得る。加えて、細菌細胞により生じたシグナルは、約３００ｎｍ乃至約９００ｎｍの波長を有し得る。特に、生じたシグナルは、約６５０ｎｍ乃至約８００ｎｍの波長を有し得る。
【００４５】
検出可能な蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルを、生じさせる細菌性β−ラクタマーゼ用の基質が、本発明のまた別の実施形態において提供される。この実施形態の態様において、基質は、蛍光発生基質ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、ＣＤＣ−５、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５．２、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ８００、ＣＮＩＲ８００．２、ＣＮＩＲ８００−３、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６、またはＸＨＸ３−３２、あるいはその誘導体かアナログを含み得るか、またはその上のβ−ラクタマーゼ活性上の、有色の色素または色の変化やｐＨ変化を生じさせるのに効果的な化学試薬を含み得る。また、基質はさらに、粒子、微粒子、またはそれに結合されるビオチンを含み得る。
【００４６】
被験体における病原性細菌をリアルタイムで検出する方法が、本発明のまた別の実施形態において提供され、該方法は、被験体に、ガンマ放出に関連する同位体で放射標識された基質を導入する工程を含み、ここで、基質は、病原性β−ラクタマーゼに特有の、β−ラクタマーゼ、または他の酵素またはタンパク質用の基質であり；被験体を、放射識別された基質からのガンマ放出に関して、その上の活性の間に、画像化する工程；放出されたガンマ線により発生したシグナルを得る工程；および、ガンマ線が発生させたシグナルの強度に基づいた放射標識の、被験体における濃度を、３Ｄ再構成を作成する工程を含み；それにより病原性細菌を検出する工程を含む。
【００４７】
さらにこの実施形態に加えて、方法は、病原性細菌の検出に基づき、それに関連する病態生理学的状態を、リアルタイムで診断する工程を含む。別のさらなる実施形態において、方法は、病態生理学的状態を処置するのに効果的な１つ以上の治療化合物を投与する工程を含む。また別のさらなる実施形態において、方法は、放射標識された基質を被験体へ再投与する工程；および治療化合物の効果をモニターするために、被験体を再画像化する工程を含み、ここで、診断時のガンマ放出と比較したガンマ放出の減少は、病態生理学的状態への治療的効果を示す。これらのさらなる実施形態において、病態生理学的状態は結核であり得る。
【００４８】
すべてのこれらの実施形態の１つの態様において、放射標識はポジトロン放出同位体であり得、画像化はポジトロン断層法（ＰＥＴ）を通じてなされ得る。別の態様において、放射標識は、ガンマ線を直接放出する同位体であり得、画像化は単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）を通じてなされ得る。これらの実施形態のすべての態様において、他の酵素またはタンパク質は、β−ラクタマーゼ様酵素またはペニシリン結合タンパク質であり得る。また、すべての実施形態において、細菌種は上述の通りである。
【００４９】
ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ撮像に適した、放射標識された病原性細菌の基質が、本発明のまた別の実施形態において提供される。この実施形態において、放射標識は、フッ素−１８、窒素−１３、酸素−１８、炭素−１１、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、またはインジウム−１１１であり得る。
【００５０】
本発明のまた別の実施形態において、生物学的サンプルにおける病原性細菌を明白に検出するためのアッセイ装置が提供され、アッセイ装置は、生物学的サンプルと、病原性細菌に関連するβ−ラクタマーゼ酵素用の発色基質とを含む培養混合物を収容するための手段、および、収容手段と流体連通する基質におけるβ−ラクタマーゼ活性によって生じる有色生成物を捕捉して濃縮するための手段を含む、プラットフォームを含んでいる。
【００５１】
さらにこの実施形態に加えて、アッセイ装置は、有色の生成物のみが受取り手段から下流に移動することを可能にするための手段を含み得る。別のさらなる実施形態において、アッセイ装置は、受取り手段から下流に位置する内部対照を含み得る。また別のさらなる実施形態において、アッセイ装置は、受取り手段の顆粒に位置する液体を吸収するための手段を含み得る。
【００５２】
すべての実施形態において、基質は有色の色素または化学試薬を含み得る。また、すべての実施形態において、基質は粒子または微粒子に結合され得る。これらの実施形態の１つの態様において、基質は化学試薬を含み、ならびに、装置は、化学試薬から色を生成する手段として、第２の試薬をさらに含む。これらの実施形態の別の態様において、基質はビオチンに結合され、ならびに、装置は、ビオチン結合の基質を捕捉するための手段として、アビジンをさらに含む。
【００５３】
細菌性疾患および／または感染を光学的に画像化するためのシステムおよび方法が、本明細書に記載される。これらのシステムと方法は、疾患の間、細菌を定量化および局在化するための、および、リアルタイムで抗菌薬活性をインビボで分析するための、感受性の高いツールである。これらのシステムが単離細胞レベルで病原性細菌を検出するのに効果的であることを熟慮されたい。これらの、インビボの画像化（ＩＶＩ）システムおよび方法は、臨床環境における患者に直接適応され得る。
【００５４】
本明細書におけるシステムおよび方法は、自然にβ−ラクタマーゼ活性を保持するか得られる病原性細菌に適応可能である。限定することなく、β−ラクタマーゼ陽性の細菌種の例は、バクテロイド属、クロストリジウム属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、シュードモナス属、レジオネラ属、マイコバクテリウム属、ヘモフィルス属、エシェリヒア属、サルモネラ属、シゲラ属またはリステリア菌の細菌種である。特に、結核菌およびウシ結核菌などのマイコバクテリウム属の診断、局在および定量化を熟慮されたい。本明細書に記載のシステムおよび方法の利点は、利点のために菌株の操作が検出されることを求めないことにあり、検出の感度を改善するために、β−ラクタマーゼの発現、活性、および／または分泌を改善する方法を熟慮されたい。このように、β−ラクタマーゼ細菌種は、β−ラクタマーゼを適応可能な方法により興味のある任意の細菌種または菌株へ導入することにより検出され得、該適応可能な方法は、十分なレベルでβ−ラクタマーゼを発現および分泌させ、それらの高感度な検出を可能にする。これは、インビトロあるいはインビボで、既知および標準の送達方法を用いて達成され得、哺乳動物への適切な送達媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）であるファージを使用する工程を含む。
【００５５】
本発明のインビボの撮像システムは、β−ラクタマーゼ活性用の基質として作用する化合物またはレポーターによって生成された、蛍光性、発光性、または、発色性のシグナルを検出し得る。画像化システムは当該技術分野において周知であり、同時に市販で入手可能である。例えば、連続するレポーター酵素蛍光（ＳＲＥＦ）系、連続するリポーター酵素発光（ＳＲＥＬ）系または生物発光系は、β−ラクタマーゼ活性の生成物を検出するために使用され得る。更に、得られたシグナルは、病原性細菌の位置を確認するのに有用な３Ｄ表現を再び表示するために使用され得る。これらの系に関して、画像化技術分野における通常の技術のうちの１つは、使用される化合物および／またはレポーターに基づいて、励起波長およびと発光波長をうまく選択することができる。一般的に、両方の励起波長または画像化波長、および発光波長の両方は、約３００ｎｍ乃至約９００ｎｍであり得る。励起シグナルの一例は、約５４０ｎｍ乃至約７３０ｎｍの範囲内であり得、発光シグナルは約６５０ｎｍ乃至約８００ｎｍの範囲内であり得る。また、本発明のインビボの撮像システムが、放射により生じるような他のシグナル、または適切な基質または他の検出剤上のβ−ラクタマーゼ活性によって生じた、任意の検知可能か判読可能なシグナルを検出し得る。
【００５６】
本発明のβ−ラクタマーゼ基質は化学的な基質または量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）基質であり得る。ＳＲＥＬまたはＳＲＥＦを使用した画像化のための基質は、例えば、蛍光団、ケージドルシフェリンまたは他の蛍光化合物、発光化合物または比色化合物、レポーターまたは適応に最良のシグナルを与える他の検出剤であり得る。基質は、任意の組織への充分な透過、およびノイズ比率に対する高度なシグナルを可能にするレベルでの毒性を、非常に低く示すか、または全く示さない。シグナルは、近赤外線、赤外線または赤色光シグナルであり得、例えば約６５０ｎｍ乃至約８００ｎｍであり得る。
【００５７】
例えば、基質は蛍光基質またはインビトロまたはインビボで、β−ラクタマーゼによる開裂の際にシグナルを発する量子ドット基質であり得る。蛍光発生基質は、インドシアニン色素（例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、またはＣｙ７、あるいはＩＲＤｙｅ８００）などのＦＲＥＴドナー、消光グループＱＳＹ２１、ＱＳＹ２１ジスルホン酸塩、ＱＳＹ２２、ＱＳＹ２２ジルスホン酸塩、ＩＲＤｙｅＱＣ−１などＦＲＥＴ消光剤を含み得る。加えて、蛍光基質は、細胞の浸透性を改善するため、および／または、限定されないがＴＡＴなど小さなペプチドに結合され得るために、ペルアセチル化したＤ−グルコサミンを含み得る。さらに、基質はそのシグナル強度、組織透過能、特異性、またはすべての組織において十分に分布される能力を改善するために変えられ得る。さらに、組織、細胞、またはこれらの基質と組み合わされている他の化合物を標識する他の方法は、病原性細菌の感知能力と検出を改善するのに有用であることを熟慮されたい。例えば、発光発生基質は、限定されないが、メチル、メトキシ、またはベンジル部分を含み得、および／または、他の脱離基のより大きな放出のために、シスまたはトランス二重結合を含有し得る。
【００５８】
特に、蛍光発生基質は、細菌細胞培養液または単一の培養された細菌細胞における、β−ラクタマーゼ活性をインビトロで検出し得る。化学的な蛍光発生基質の例は、ＣＣ１、ＣＣ２、ＣＨＰＱ、ＣＲ２、ＣＮＩＲ１またはＣＮＩＲ６である。あるいは、インビボの画像化適用に関しては、蛍光発生基質は、ＣＮＩＲ２、ＣＮＩＲ３、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ５−ＱＳＹ２２、ＣＮＩＲ７、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ１０、ＣＮＩＲ７−ＴＡＴ、またはＣＮＩＲ８００、あるいはその誘導体またはアナログ、あるいはＣＮＩＲ５．２などＣＮＩＲ５に類似する蛍光発生基質、ＣＮＩＲ８００．２またはＣＮＩＲ８００−３などＣＮＩＲ８００に類似する蛍光発生基質であり得る。また、蛍光発生基質ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４、およびＣＤＣ−５、またはその誘導体あるいはアナログが、インビトロおよびインビボの画像化のために提供され、これらは、Ｍｔｂ  ＢｌａＣまたは、ＣＤＣ−１、ＣＤＣ−２、ＣＤＣ−３、ＣＤＣ−４およびＣＤＣ−５に類似する蛍光発生化合物上に、７−ヒドロキシクマリンを放出する。特にＣＤＣ−５は、限定しないが、ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６またはＸＨＸ３−３２、あるいはその誘導体かアナログなどである。これらの蛍光発生基質は、連続するレポーター酵素蛍光（ＳＲＥＦ）系において有用である。β−ラクタマーゼ基質は、インビトロまたはインビボで、単一の細菌細胞を検出するのに有効であることを熟慮されたい。
【００５９】
β−ラクタマーゼをインビボで検出するための蛍光発生基質の別の例は、限定しないが、Ｂｌｕｃｏ、Ｂｌｕｃｏ２、またはＢｌｕｃｏ３などのケージドルシフェリンである。この基質は、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）の基質であるＤ−ルシフェリン、およびβ−ラクタマーゼの基質であるβ−ラクタムを含む。酵素によるβ−ラクタムの開裂は、Ｄ−ルシフェリンを放出し、Ｆｌｕｃによる酸化に際して発光する。ケージドルシフェリンは、連続するレポーター酵素発光（ＳＲＥＬ）系、または他の生物発光画像化系に有用である。
【００６０】
また、蛍光タンパク質は、病原性細菌をインビトロおよびインビボで検出するのに有用であり得る。ｍＰｌｕｍ、ｍＫｅｉｍａ、ＭｃｈｅｒｒｙおよびｔｄＴｏｍａｔｏなどの蛍光タンパク質（ＦＰ）は、発現ベクターにクローン化される。結核菌などの興味のある病原性細菌は、ＦＰのコンストラクトにより形質転換される。細菌による蛍光タンパク質の発現は、画像化する上で、検出可能なシグナルを結果として生じさせる。他の画像化系は、β−ガラクトシダーゼなど他の酵素を分泌するために形質転換した、組み換え型の細菌を利用し、蛍光団（例えば、Ｃ２ＦＤＧ、Ｃ１２ＲＧ、またはＤＤＡＯＧ）存在下で蛍光シグナルを生じる。また他の画像化システムは、基質（例えばＤ−ルシフェリン）の存在下でシグナルを発する、ｃｌｉｃｋ  ｂｅｅｔｌｅ  ｒｅｄまたはｒＬｕｃ８など他のルシフェラーゼを示す、他の組み換え系を利用する。
【００６１】
追加の基質は、有色または可視の色素を有し得る。有色または可視の色素は、限定しないが、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ローダミン、ブロモクレソール色素（多色）、シアニン色素を含み得る。さらに、基質は、ｐＨ変化や他の化学的に誘発された色の変化からなどの、ラクタマーゼ活性上の色の変化を生じさせる化学試薬を含み得る。
【００６２】
あるいは、陽電子放射撮影法（ＰＥＴ）または単一電子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）画像化システムが使用され得る。プローブは、β−ラクタマーゼ、β−ラクタマーゼ様酵素、あるいは本明細書に記載される病原性細菌の酵素またはタンパク質に類似する、他の酵素を含み得る。ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴ画像化技術は、当該技術分野において公知である。ＰＥＴ画像化に関して、基質プローブは、限定しないが、フッ素−１８、酸素−１８、炭素−１１、または窒素−１３などの陽電子放射の放射性同位体で標識化され得る。ＳＰＥＣＴ画像化に関して、基質プローブは、限定されないが、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、インジウム−１１１などのガンマ放射の放射性同位体で標識化され得る。ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴのプローブは、標準または公知の化学的および放射線化学的な合成技術を使用して、合成または標識化され得る。
【００６３】
プローブのデザインおよび特異性が、β−ラクタマーゼ酵素のポケットをモデル化するために、セフェロペラゾンなど小分子を使用して、最大化され得ることを熟慮されたい。従って、ハイスループットの小分子システムの使用に関して、基質は、診断目的に関してもっとも感度が高いように設計され、存在する画像化装置で検出可能な深部組織から透過するのに効果的であり、ならびに他の細菌属間での交差反応を防ぐために効果的なシグナルを生じるために適切であり得る。また、そのような高感度なおよび特異的な基質プローブは、単一の細菌のレベルで効果的であり、そこから得られたシグナルの量を、１００乃至１０００倍の間で増加させ得る。また、β−ラクタマーゼ様酵素およびペニシリン結合タンパク質以外の結核菌属におけるβ−ラクタマーゼが、プローブの特異性を改善するために設計され得ることを熟慮されたい。
【００６４】
本明細書に記載のシステムおよび方法は、病原性細菌の生存率を、リアルタイムで、検出し、その位置を確認し、定量化し、および測定するのに効果的である。画像化は、インビボで細胞培養液または単一の培養細胞で行われ得、または臨床サンプルまたは標本の生体外でＳＲＥＬまたはＳＲＥＦを使用して行われ得、またはインビボで、開示された画像化システムのいずれかを使用して被験体で行われ得る。インビトロで使用されるサンプルは、生検に制限されないが、胸水、痰、および病原性細菌を有し得る血液、痰、尿、および大便を含む、他の体液を含み得る。従って、本明細書に記載のシステムおよび方法は、疾患または感染など、病原性細菌に関連のある、病態生理学的状態を診断するのに効果的である。単一の細菌を含む、非常に低いレベルが検出可能であるため、診断は、現在の診断方法よりも、感染のより早い時点で迅速になされ得る。本明細書に記載のシステムおよび方法は、試験のために利用され得、細菌性間性の危険があり得る健康管理者の日常的なスクリーニングであり得る。さらに、これらのシステムおよび方法は、器具、用具、設備、使用済み作業表面、衣服、および、ヒトをスクリーニングし、汚染を検出するために使用され得る。メチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染は、健康管理者の最大４０％にみられ、感染の主な領域が鼻腔、および過度の洗浄によって生じる手のひび割れであるため、本発明は健康管理センターおよびそこの作業員における病原性細菌のスクリーニング方法として有用である。これらのシステムおよび方法は、必要時にβ−ラクタマーゼを検出するために、農業および動物園での適用において使用され得る。
【００６５】
また、細菌の定量に対するシグナルの強さの相関は、本画像化技術の制限内で十分に相関している。従って、化合物、薬物、医薬品あるいは他の治療薬剤は、リアルタイムでモニターされ得る。本明細書に記載のシステムおよび方法は、抗菌剤をスクリーニングするためのハイスループットシステムを提供する。β−ラクタマーゼの検出は、細胞の生存率を必要とするため、１つ以上の治療薬剤の存在下の酵素レベルは、抗菌活性の程度を提供する。特定の細菌に適した基質の使用は、β−ラクタマーゼレベルの変化を迅速に測定することを可能にし、治療剤の効果をほぼ即時に測定することを可能にする。スループットシステムは、マイクロプレートにあるときに、単一のサンプルから無数のサンプルに有用である。
【００６６】
より特定的には、本明細書に記載のＲＥＦ系は、感染細胞を、フローサイトメトリー法、共焦点顕微鏡法、または蛍光分光法を使用して、検出および定量化するための、多くの他のインビトロの方法に有用である。一度β−ラクタマーゼ基質が細胞の中に入ると、細胞基質内の細菌によって分泌されたβ−ラクタマーゼは、β−ラクタム環を開列し、結果として感染細胞を、近赤外蛍光色で標識化する。フローサイトメトリー法を使用して、感染細胞および非感染細胞は、識別されおよび定量化され得る。また、異なる色で標識化された細菌、例えば、限定されないが、緑色蛍光タンパク質で標識化された細菌および凍結切片を使用して、感染組織は蛍光共焦点顕微鏡法により視覚化および分析される。特に、非制限的な例において、青色を生成するＤＡＰＩが細胞核を染色するために使用される場合、細胞質中に蓄積した緑色の細菌および赤色の開裂されたβ−ラクタマーゼ基質が見られるだろう。加えて、β−ラクタマーゼの基質が感染細胞を標識し得るため、開裂された基質の特異的な励起波長および発光波長を使用して、感染細胞または均質な感染組織は蛍光分光法により定量化される。
【００６７】
つぎの実施例は、本発明の種々の実施形態を例証する目的のために与えられたものであり、いかなる方法においても本発明を限定することを意味していない。
【００６８】
実施例１
＜培養中のヒト型結核菌中のＢｌａの検出＞
潜在的な蛍光基質化合物および既知の化合物は、ニトロセフィン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、ＣＥＮＴＡ  Ｂｌａ基質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、Ｆｌｕｏｒｏｃｉｌｌｉｎ  Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）、ＣＣＦ２−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、およびＣＣＦ４−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含んでおり、初期の対数的増殖期に成長した全体の細胞および全体の細胞溶解産物を使用してＭｔｂ内のＢｌａの検出のために比較される。顕著なシグナルを結果として生じる細菌の最小の数又は溶解産物の量を測定するために、希釈がこれらのサンプルのすべてにアッセイされる。タイタ（ｔｉｔｒｅ）は、完全な細胞によるアッセイの前後並びに溶解産物の溶解の前に、使用される実際のＣＦＵの数を測定するために実行される。敏感性と再現性の両方は、１５−１２０分から細菌培養媒体中３７°Ｃで培養されたプレートを９６−ウェルを使用して、分光光度法で４つ一組に対して評価される。最初に、化合物は、製造業者によって推奨された濃度で、かつＣＮＩＲ５、２ｎＭに対して使用される（すなわち、インビボの撮像に使用される）。最も敏感で最も再生可能な化合物の異なる濃度が、最大のシグナルに必要とされる最小の濃度を測定するために、培地において評価される。これらの実験のための対照群は、陽性対照マイコバクテリウムスメグマチスおよび市場で入手し得るＢｌａ（Ｓｉｇｍａ社）を含み、陰性対照群は、Ｂｌａ（１）を欠く結核菌ｂｌａＣ突然変異体（ロチェスター大学のＭ．Ｐａｖｅｌｋａ博士によって提供される、ＰＭ６３８）である。ＢＣＧによるＢｌａの生成も評価される。なぜなら、いくつかの症例において、ＢＣＧがＢＬ２におけるＩＶＩに対して使用され、そこで広範囲の撮像装置が容易に利用可能であるからである。
【００６９】
＜ｂｌａＣ突然変異体および野生型結核菌ツベルクローシスにおける組み換え型Ｂｌａコンストラクトの評価＞
２つの多コピー型ベクターと２つの単コピー型ベクターがＭｔｂにおけるＢｌａの発現のために使用される。当該多コピー型ベクターは、中程度レベルに遺伝子を発現することが示されたｐＭＶ２６２からｈｓｐ６０プロモータ（Ｐｈｓｐ６０）を運ぶｐＪＤＣ８９に基づく。このベクターは、またヒグロマイシン耐性、Ｐｈｓｐ６０のポリリンカー・下流、複製の大腸菌オリジンおよび複製の抗酸菌性ｐＡＬ５０００オリジンを運ぶ。このベクターから発現を増加させるために、Ｐｈｓｐ６０はＬ５プロモータ（ＰＬ５）と置換される。当該Ｌ５プロモーター（ＰＬ５）はＰｈｓｐ６０より５０〜１００倍の高位レベルに遺伝子を発現する。両方のプロモーターは比較的構成的であり、ほとんどのインビボの疾病下に発現される。もし他の方法に言及されなければ、大抵のクローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ２．０ＰＣＲクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用して行われ、当該Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ２．０ＰＣＲクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）は、関心のある領域のＰＣＲのために使用されるプライマー上での１５ｂｐ最小相同領域（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を使用して任意の線形化された構造への断片の直接のクローニングを可能にする。
【００７０】
構築された２つのベクターは、各々のプロモーターの下流に、ｃｃｄＢ遺伝子と、左右の通路組換え配列を下流に含んでいるＰＣＲ断片のクローンを作ることにより、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ドナー・ベクターに対して修正される。この領域を運ぶベクターは、この領域の維持を可能にするｃｃｄＢ生存菌株で維持されなければならない；しかし、他の大腸菌株においては、この領域は致命的であり、クローニングの間に非組み換え型のベクターの維持を防止するために使用される。これらのプロモーターおよび関係するＧａｔｅｗａｙ（登録商標）の領域がｐＹＵＢ４１２にクローンが作られ、当該ｐＹＵＢ４１２は、ヒグロマイシン耐性、複製の大腸菌オリジン、Ｌ５ファージ付着部位（ａｔｔＰ）およびＬ５リコンビナーゼを運び、その結果、抗酸菌性の染色体内のａｔｔＢ部位で統合し、単コピー型でマイコ細菌によって安定して維持される。Ｍｔｂ  Ｂｌａは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＰ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を介してＧａｔｅｗａｙ（登録商標）組換え配列を運ぶプライマーを使用して、ＰＣＲによってこれらのベクターの各々にクローン化されれる。これらのベクターは、記載された（２）として電気穿孔法によってＭｔｂおよびｂｌａＣ突然変異体に形質転換される。結果として生じるＭｔｂ菌株はインビトロのアッセイを使用して、検出のために評価される。当該アッセイは、陰性対照群としてのｂｌａＣ突然変異体のアッセイ、および、適切なベクター骨格のみを含む野生型のアッセイと比較される内因性のＢｌａおよびシグナル強度の分析のために記載される。
【００７１】
ＣＮＩＲ５は高度に浸透性を有する膜であるが、シグナル強度は、細菌単独よりレポーターのために大きな表面積を有し、化合物に対するアクセスを改善する宿主細胞膜に対するＢｌａを標的とすることにより増加され得る。抗酸菌性のファゴソームは静的ではないので、被覆小胞のリサイクルに存在するいくつかのマーカーを有し、経路をリサイクルして、いくつかの脂質および受容体と相互に作用して、適切に標的にされたタンパク質は、抗酸菌性ファゴソームを介して宿主細胞の細胞膜にアクセスするべきである。Ｍｔｂ  Ｂｌａは、そのアミノ末端にあるＴＡＴシグナルによって細菌から分泌され、このタンパク質を細胞膜に向けるカルボキシの末端タグを理想的にする。マクロファージの表面上にかなり発現されるＣＤ１４など、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカータンパク質は、カルボキシ末端のシグナル配列を通じて細胞膜に局在化する。
【００７２】
融合（Ｂｌａ：：ＧＰＩ）は、ＣＤ１４およびＭｔｂよりＢｌａからカルボキシ末端２４のアミノ酸ＧＰＩアンカータンパク質のシグナル配列により構築される。その後、この融合タンパク質は、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）システムを使用してＭｔｂのための４つの発現システムに位置づけられ、野生型ＭｔｂおよびｂｌａＣ突然変異体の両方に形質転換される。結果として生じるＢｌａ：：ＧＰＩを発現する菌株、陰性対照群としてのｂｌａＣ突然変異体、および、オリジナルのＢｌａは、細胞内のアッセイを使用して、感染したマクロファージの表面上で、Ｂｌａの菌株のレベルで評価される。完全に感染したマクロファージ、および当該マクロファージが０．１％のトリトンにより溶解したものの両方が検査される。
【００７３】
＜加水分解前後の基質の蛍光のスペクトル＞
励起と発光のスペクトルは１μＭの濃度におけるＰＢＳ溶液１ｍＬに集められる。この溶液に、精製されたＢｌａの１０ｎＭが加えられ、変化がそれ以上存在しないようになるまで、励起と発光のスペクトルが再び集められる。Ｂｌａの加水分解後のプローブの蛍光シグナルの増加は、ピーク放射波長である６９０ｎｍにおける発光強度を比較することにより推測される。
【００７４】
＜Ｂｌａ基質としてのプローブのインビトロの酵素の動力学＞
〜６９０ｎｍでの蛍光強度の上昇率（ｖ）は、探査（ｐｒｏｂｅ）の加水分解の速度の基準として使用される。速度（ｖ）は、Ｍｔｂ  Ｂｌａの１ｎＭの濃度の異なる濃度５、１０、２０、５０、８０μＭにおいて測定される。基質（１／ｖ）に対して基質濃度（１／［プローブ］）の加水分解速度の二重逆数プロットは、Ｂｌａ加水分解のためのプローブのＫｃａｔの値およびＫｍの値を推測するために使用される。
【００７５】
＜基質のバイオ安定性＞
また生理学的条件の下での基質の自発的な加水分解の速度は、蛍光強度の上昇率から〜６９０ｎｍと推定することができる。水溶性のバッファーおよび血清中の基質の安定性は、それゆえ、室温における１時間の培養後の蛍光定量化によって容易に評価することができる。
【００７６】
＜培養細胞中のＢｌａ発現の撮像＞
基質は、形質移入されたＢｌａ（ｃｍｖ−ｂｌａ）、野生型ジャーカット、Ｃ６神経膠腫細胞系、および公開された撮像条件（３）を使用して、蛍光顕微鏡による撮像によって検査される。
【００７７】
＜ｍＲＮＡレベルと、ＮＩＲＦシグナルとの間の線形相関＞
野生型細胞およびｃｍｖ−ｂｌａジャーカット細胞は、５ｘ１０５／ｍＬの細胞密度における種々の比率（ｃｍｖ−ｂｌａ細胞の１０％、２０％、４０％、６０％および８０％）で混合される。３０分間の細胞の各々の混合物での基質の５μＭの培養の後、各サンプルは、冷たいＰＢＳで洗浄され、遠心分離機にかけられ、溶解される。蛍光測定は最終的な上澄みの上で得られる。ＢｌａのｍＲＮＡおよび酵素のレベルはノーザン解析を使用して定量化される。ｍＲＮＡの濃度対Ｃｙ５．５蛍光強度のプロットは、２つの間にリニアな関係があるか否かを明らかにする。
【００７８】
＜培養中の結核β−ラクタマーゼの局在性および調整＞
Ｂｌａの転写は、０．０５のＯ．Ｄ．において植え付けられたＭｔｂ成長曲線の全体にわたってｑＲＴ−ＰＣＲによって検査され、安定期（Ｏ．Ｄ．＝２）まで成長させた。転写レベルは同じ培養の部分標本からＲＮＡを毎日分離することにより評価され、培養はすべて３回繰り返して成長させる。以前に記載されたように、ＲＮＡ単離（４）およびｑＲＴ−ＰＣＲが、ＳＹＢＲグリーン（５）を用いて実行される。ＲＮＡレベルは、成長曲線で１または２のキーポイントにおいてノーザン法によって確認される。また、測定はすべて１６ＳｒＲＮＡに対して正規化される。データは、全細菌および全細胞溶解産物を使用して、同一の条件下で、ニトロセフィンによりＢｌａ活性の測定と比較される。ｂｌａＣを誘発するβ−・ラクタムの能力が検査される。ＲＮＡ転写物は、成長曲線全体に亘るのと同じ方法で、β−・ラクタムがある状態およびない状態で分析される。Ｂｌａ陰性Ｍｔｂを死滅させる、カルベニシリンの５０、２５０および５００μｇ／ｍｌが、Ｍｔｂと共に培養される。当該Ｍｔｂは、２時間の間は初期の対数増殖期まで成長し、ｂｌａＣ転写のレベルは、全体細胞および全体細胞溶解産物のＢｌａ活性と共に測定される。Ｂｌａのレベルは、市場で入手可能なＢｌａ（シグマ社）を使用して構築される標準曲線を使用して定量化され、同じ方法で成長させたＭｔｂ  ｂｌａＣ突然変異体は、Ｂｌａ活性のための陰性対照として含まれる。
【００７９】
＜マクロファージ中のＢｌａの検出＞
基本的に、Ｊ７７４Ａ．１細胞は、９６−ウェルの平坦な底部プレートに１×１０４で播種され、３７°Ｃで一晩培養される。初期の対数増殖期に成長させたＭｔｂの単一細胞の懸濁液単個細胞浮遊液が、１つの細胞当たり１０００から０．００１の種々の細菌感染多重度で加えられ、３０分間３７°Ｃで培養される。ついで、ウェルはＰＢＳにより２度洗浄され、２００μｇ／ｍｌのアミカシンと共に未使用の媒体が加えられ、３７°Ｃで２時間培養され、細胞外の細菌を死滅させる。その後、ウェルはＰＢＳにより洗浄され、分光測定法によるシグナルの測定前に、６０〜１８０分間、種々の濃度の試験化合物を加えた未使用の培地で培養される。複製のウェルは、得られた測定における宿主細胞透過性の役割を評価するために、化合物を加える前に０．１％のトリトンＸ−１００によって溶解される。
【００８０】
すべての時点において、４つの未処理のウェルが、細胞に関係づけられるＣＦＵの数を測定するために使用される。シグナルの局在化は、最も有効であることを証明する化合物用蛍光顕微鏡によって確認される。顕微鏡法アッセイは、類似したやり方で実行されるが、シグナルを見つけ、陽性シグナルを測定し、および局在化したシグナルの強度を評価するために、８−ウェルのチャンバースライドを用いている。
【００８１】
＜バイオアッセイおよび薬物動態学＞
麻酔をかけられたマウス（各々の時点において３匹のマウス）は、注射後の異なる時間間隔（３０分、２４０分、１２時間、２４時間、４８時間および７２時間）において頸椎脱臼によって殺される。血液サンプルは、心臓の穿刺によって集められ、組織（腫瘍、心臓、腎臓、肝臓、膀胱、胃、脳、膵臓、小腸および大腸、肺及脾臓）は、蛍光測定器によって近赤外線蛍光を測定するために急速に採取される。データは、組織のグラム当りの蛍光単位（ＦＵ）として発現される［ＦＵ／（ｇ組織）］。
【００８２】
＜β−ラクタマーゼ活性アッセイ＞
異種移植された腫瘍中のＢｌａの酵素レベルは、以下のプロトコルを使用して測定される：すなわち、冷たいＰＢＳと採取された腫瘍を２度洗浄する；プロメガ（４ｍＬ／ｇ組織）から溶解バッファーを加えて、組織溶液を均質化する；ホモジネートを３回凍らせて溶かし、遠心分離によって上澄みを集める；蛍光発生基質ＣＣ１を使用して、Ｂｌａ活性をアッセイする。ｃｍｖ−ｂｌａ腫瘍中のＢｌａのｍＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．からＲＮＡ抽出プロトコルに従い、ＲＴ−ＰＣＲアッセイを実行することにより確認される。これらの測定は、ｃｍｖ−ｂｌａ導入された腫瘍中に観察された近赤外線シグナルがＢｌａ活性と関連しているか否かを確認する。
【００８３】
＜インビボのＢｌａ  ＲＮＡの測定＞
インビボで発現したＢｌａ  ＲＮＡは、結核（６）用の標準のＲＮＡ抽出プロトコルを使用し、構成的な対照ｒＲＮＡ遺伝子に対するｑＲＴ−ＰＣＲを実行して抽出される。これらの測定は、観察されたＩＶＩシグナルのレベルと比較して、すべての組織中のＢｌａの発現のレベルを評価する手段を提供する。採取されたＲＮＡレベルがＲＴ−ＰＣＲによって検知可能なレベル未満ならば、まだ量れるＣＦＵ、組織の中に存在する相補的ＤＮＡは、高い忠実性で線形的な方法でＤＮＡを増幅する能力を有し、テンプレートポスト増幅のレベルの正確な定量化を可能にするｐｈｉ２９ポリメラーゼ（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用してＲＴ−ＰＣＲに先立って増幅される。
【００８４】
＜インビボのＢｌａ菌株の発現、安定性および毒性＞
４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの８つの群は、１００−１０００ｃｆｕ／ｌｕｎｇのエアロゾルによって感染される。細菌菌株は−８０°Ｃストックから溶かされ、単一の細胞懸濁液を生成するために２７Ｇ注射器針２ｘを通過させ、エアロゾル感染のために使用される。エアロゾル感染は、肺胞腔（７−１０）に飛沫核を直接送達することを設計しているウィスコンシン大学に構築された「Ｍａｄｉｓｏｎ」チャンバーを使用して実行される。Ｍｔｂによる感染は、有毒な結核菌株を処理するように設計された認証されたＢＳＬ３の設備で行なわれる。感染したマウスは、検死までセンター・フォア・コンパラティブ・メディシンーのＡＢＳＬ３抑制に収容される。ＣＦＵ、肺および脾臓内でのｂｌａＣおよびＢｌａ活性のためのＲＮＡレベルを測定するために、各々の菌株（ｂｌａＣとＷＴ）につき４匹のマウスの１つの群は、あらゆる時点（１、１４、２８および７２日）に検死される。本明細書に記載されているように、ニトロセフィンを使用して、ＲＮＡ転写物レベルおよびＢｌａ活性を測定する。
【００８５】
インビボの組み換え型のＢｌａ発現の毒性上の安定性および効果は、ＩＶＩのための見込みを示す２つの組換え型菌株に対して検査される。４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの１２の群が、上述されるように、１００−１０００ｃｆｕ／ｌｕｎｇの間のエアロゾルによって感染される。各々の菌株（野生型、コンストラクト１およびコンストラクト２）につき４匹のマウスの１つの群は、すべての時点（１、１４、２８および７２日）で検死されて、ＣＦＵを測定し、組織病理学を実行し、肺および脾臓における適切なコンストラクトとＢｌａ活性の存在を測定するだろう。コンストラクトを運ぶ細菌の個体群のパーセンテージは、ＣＦＵ滴定プレートから少なくとも２０の個々のコロニー上で処理されたＢｌａアッセイを使用して測定される。残りのＢｌａのすべてのレベルを評価するために、Ｂｌａ活性アッセイは均質化された組織について処理される。Ｂｌａ活性は本明細書に記載されているようにニトロセフィンを使用して評価される。
【００８６】
実施例２
＜細胞移植モデルを用いるイントラバイタル顕微鏡撮像法＞
ユニバーサル・ドナーＴｒ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞が、ＢＣＧに感染した同一遺伝子型のマウスに移植され、これらの細胞の分布が、インビボの生物発光撮像（ＢＬＩ）および画像誘導イントラバイタル顕微鏡法（ＩＶＭ）により経時的に撮像される。ルシフェラーゼがβ−・アクチン・プロモーターによって生成される、一連の遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）マウスが組織と細胞のソースを提供し、当該組織と細胞のソースは遺伝子導入をしない（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）動物（１１−１２）において発光する。この一連のマウス（Ｌ２Ｇ８５）は、ホタル・ルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）から、明るい生物発光を示すが、ＧＦＰ蛍光が弱いので、リンパ球に強いＧＦＰ発現と蛍光とを示す別々の線を伴う。ユニバーサル・ドナー幹細胞および他の細胞の空間分布は、それらが膨張し、再度分散し、或いは取り除かれると、レシピエント中のＢＬＩが追随し、検出された細胞は、ＧＦＰを利用するＩＶＭによって続いて視覚化され得る。
【００８７】
Ｌ２Ｇ８５マウスはＦＶＢバックグラウンドで構築されると、移植細胞の拒絶を防止するＦＶＢ／ＮＪ（ジャクソン・ラブ社）野生型マウスが、Ｌ２Ｇ８５から細胞のためのレシピエントとして使用される。合計８０匹のＦＶＢ／ＮＪマウスが、食塩２０μｌ中のＢＣＧ１０４ＣＦＵで鼻腔内感染される。感染後の肺の初期ＣＦＵを測定するために、４匹のマウスが２４時間で殺される。１４日目に、感染後の４匹の追加のマウスを組織病理学のために殺し、そして肺と脾臓中のＣＦＵを測定する。また、１４日目に、残りの７２匹のマウスは、４つの群に分けられ、尾静脈注射によって、Ｌ２Ｇ８５  Ｔｒ、ＣＤ８  Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞または無細胞（対照）が導入された。２８日目、４２日目および５６日目に、４匹のマウス（対照を含む）の６群は、Ｄ−ルシフェリンの存在中に記載されているように（１２）撮像される。
【００８８】
撮像は、光ファイバーの共焦点の螢光顕微鏡（Ｃｅｌｌ−ｖｉＺｉｏ、Ｍａｕｎａ  Ｋｅａ）を使用するイントラバイタルな顕微鏡法（ＩＶＭ）によって、明白な病変のより詳細な検査によって追跡される。ＩＶＭは、何万もの光ファイバーからなる柔軟なミニプローブを使用する。全身麻酔がかけられ、当該部位は、手術後に動物を殺す必要性を防ぎ、細胞のレベルでの視覚化を可能にして、急速に治癒する、小さな切開口を介して精査される。
【００８９】
対照マウスは、肺および他の器官内でのＣＦＵを測定するために、撮像後に殺され、ここで、細胞が導入されたマウスでシグナルが観察される。背側、腹側、および２つの横の画像が得られ、フォトン・エミッション（ｐｈｏｔｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ）の起点をより良好に測定する。組織を解剖し、Ｄ−ルシフェリン中の未使用の組織を培養し、重なる組織なしにそれらを撮像することにより、さらなる確認が動物のサブセットで得られる。蛍光顕微鏡が移植細胞を発現するＧＦＰを視覚化し、かつヘマトキシリンおよびエオシン並びに抗酸染色を実行して、組織内の細菌および細胞を特定するために、すべての明らかに感染した組織および抗酸染色について詳細な組織病理学が処理される。
【００９０】
＜肉芽腫形成中の個々の細菌および免疫細胞のためのインビボの撮像＞
移植モデルを使用して、最も良く肉芽腫形成の視覚化を可能にする、２つの移植された細胞型が、生きているマウスで細菌と宿主細胞の両方を一緒に視覚化すべく使用するために選択される。病変が丁度視認できるようになり、充分に形成され、最も遅い時点で移植された細胞からシグナルが観察され得る、３つの時点が選択される。合計３２匹のＦＶＢ／ＮＪマウスが、食塩２０μｌ中のＩＶＩレポーター（例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏ）を発現する１０４ＣＦＵのＢＣＧにより鼻腔内に感染する。４匹の対照マウスの追加の群は感染していない。４匹のマウスが、肺の感染後における初期ＣＦＵを測定するために、２４時間目に殺される。１４日目に、感染後の４匹の追加の実験マウスは組織病理学のために殺され、肺と脾臓中のＣＦＵを測定する。また１４日目に、残りの２４匹のマウスは、４つの群に分けられ、かつＬ２Ｇ８５細胞を有しており、これが対照として細胞を有していない１２匹のマウスと共に１２匹のマウスへの尾静脈注射によって導入された肉芽腫形成の視覚化を可能にする。３つの時点で、４匹のマウスの２つの群（細胞を有するもの、対、細胞を有していないもの）は、Ｄ−ルシフェリンの存在下で記載されているように撮像される（１２）。
【００９１】
画像化は、光ファイバーの共焦点の螢光顕微鏡（Ｃｅｌｌ−ｖｉＺｉｏ、Ｍａｕｎａ  Ｋｅａ）を使用して、イントラバイタルの顕微鏡法（ＩＶＭ）によって明白な病変のより詳細な検査によって追跡される。全身麻酔がかけられ、当該領域は小さな切開口を介して精査される。対照マウスは撮像後に殺され、肺および他の器官内でのＣＦＵを測定し、そこで、細胞が導入されたマウスにおいてシグナルが観察される。背側、腹側、また、２つの横の画像が得られ、フォトン・エミッションの起点をより良好に測定する。動物のサブセットにおいて、さらなる確認は、組織を解剖し、Ｄ−ルシフェリン中の未使用の組織を培養し、重なる組織なしに、それらを撮像することにより得られる。フィルター・セットは、切り分けられた組織で移植細胞と、細菌のレポーターシグナルの両方のために使用される。蛍光顕微鏡が移植細胞を発現するＧＦＰを視覚化し、かつ、ヘマトキシリンおよびエオシン並びに抗酸染色を実行して、組織内の細菌および細胞を特定するために、すべての明らかに感染した組織および抗酸染色について詳細な組織病理学が処理される。
【００９２】
＜画像化分析＞
収集された画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．から、市場で入手可能なソフトウェアである、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅｓを使用して、ＰＣコンピュータ上で処理される。関心領域（ＲＯＩ）は、全身の蛍光画像上の腫瘍に描かれる。ＩＶＩＳ画像システムの重要な特徴の１つは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｎｎｏｌｏｇｙ（ＮＩＳＴ）に由来するスペクトル放射ソースに対抗してそれが較正されるということである。この較正は、光学および開口（ｆ／ｓｔｏｐ）を介する損失を考慮し、撮像時間およびビニングの原因となることで、ＣＣＤカメラのカウントの被験体表面上の放射への変換を提供する。ゆえに、結果として生じる画像は、表面の放射（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）の物理ユニットにおいて示される。感染したマウス、対照マウスおよび正常な組織からのＲＯＩ（光子／秒の単位で）から統合シグナルは、異なるマウス（感染したマウス：対照マウス：正常組織比率）を介して比較される。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ３．０（Ｐ＜０．０５、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州、サンディエゴ）を使用して実行される。
【００９３】
実施例３
＜結核菌ＢｌａＣおよびＢｌａＣ突然変異体酵素の結晶化＞
ＢｌａＣの非常に良い結晶が、結晶化の数か月の後に得られた。ペニシリンとの共結晶化は、０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、２０．ＭのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４の結晶化条件を使用して生成された。これらの結晶は、完全なタンパク質活性部位と中間体の視覚化を可能にしたが、初期の結合基質は結晶自体中のターンオーバーにより目に見えなかった。この障害を克服するために、Ｍｔｂ  ＢｌａＣ突然変異体酵素は加水分解（Ｅ１６６Ａ）に関係するＧｌｕ残留物中の突然変異により構築され、当該加水分解は、酵素上のアシル−中間体のトラッピングと、触媒に必要な特異的な相互作用を可能にする。この突然変異体は、ここで、Ｍｔｂ  ＢｌａＣ突然変異体の、基質（図１Ａ）に浸漬される準備がされた高品質結晶をもたらす急速（すなわち、約２週間）結晶化プロセスで結晶化された。基質は、一晩直接浸漬によってＭｔｂ  ＢｌａＣ突然変異体結晶中に取り込まれ得ることが証明される。未使用の溶液に除去後、図１ＢにおいてＣＮＩＲ４のために示されるように、結晶は基質を保持する。直接の浸漬は、複数の基質のより速い分析を提供する。結晶化したＢｌａＣ突然変異体酵素は、鉛化合物セフォタキシム（図１Ｃ）の加水分解された中間体の構造の第１の識別を可能にした。これは、基質化合物の設計を改善するためにＢｌａＣ触媒の機序を解明するために役立つ。
【００９４】
実施例４
＜β−ラクタマーゼ検出のための蛍光発生基質：ＣＣ１、ＣＣ２、ＣＨＰＱ及びＣＲ２＞
蛍光発生化合物ＣＣ１、ＣＣ２、ＣＨＰＱ及びＣＲ２は、インビトロ及び単一の培養細胞でのＢｌａ活性を検出するのに効果的である。これらプローブは、Ｂｌａによる加水分解の前は蛍光性でなく、Ｂｌａ反応の後に蛍光性になる（図２Ａ−２Ｃ）。蛍光放射の範囲は、Ｂｌａを検出するのに必要とされるように選択され得る：青であるＣＣ１及びＣＣ２から、緑であるＣＨＰＱ、赤であるＣＲ２までの範囲内。これら新しい蛍光発生基質は、ＣＣＦ２より小さく、作るのが容易であり、使用しやすく、Ｂｌａ活性の検出に関して高感度であり、多様な生体サンプルにおけるＢｌａ活性の検出を促進する。
【００９５】
ラクタムの３’炭素と脱離基の間のオレフィン基の挿入は、Ｂｌａによる加水分解の動態の効果の改善を助ける。例えば、ＣＣ１について、ｋｃａｔの値は１７４  ｓ−１であるが、挿入された二重結合の無いそのアナログのｋｃａｔの値は、ちょうど３５  ｓ−１である。触媒の効果において約５倍の増加が存在する。全体の動物蛍光画像化のための近赤外線基質を含む、Ｂｌａのための種々様々な蛍光発生基質を引き起こすために、この設計は、一般的な方策として機能し得ることを考慮する。
【００９６】
また、プローブが新しい消光剤ＱＣ−１及び近赤外線蛍光色素分子ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷにより改善され得ることも考慮する。加えて、ＩＲＤｙｅに基づくプローブは、スルホナート基の追加によって変更され得る。
【００９７】
＜ＣＮＩＲ１、ＣＮＩＲ２、ＣＮＩＲ３、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ９及びＣＮＩＲ１０＞
全身の蛍光画像化により生きている動物におけるＢｌａ発現を画像化するため、赤外線／近赤外線が、より優れた組織浸透及び可視光より少ない光散乱を有し、且つヘモグロビン（１３）によってあまり吸収されないため、近赤外線／赤外線の蛍光発生基質は有益である。化合物ＣＮＩＲ１、ＣＮＩＲ２、ＣＮＩＲ３、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ９、及びＣＮＩＲ１０は、培養細胞のＢｌａ発現を画像化するための、一連の近赤外線蛍光発生基質である（図３、６Ａ−６Ｂ）。これら化合物は、Ｂｌａに関する細胞透過性の近赤外線蛍光発生基質を構築するための枠組みとして役立ち、細胞内又は動物内において、細菌に対するプローブの利用可能性（availability）に対する負荷の効果を検査するために使用することができる。
【００９８】
Ｂｌａ活性の報告は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づく。プローブは、ＦＲＥＴドナー及びＦＲＥＴ消光剤を包含する。インビボでの画像化のために、蛍光色素分子は、理想的には６５０ｎｍ以上での発光及び低毒性を有するべきである。インドシアニン色素（Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７）は、６５０から８００ｎｍまでの発光を有し、わずかに報告された副作用を有する何万もの患者に使用された。それ故、Ｃｙ５はＦＲＥＴドナーとして選ばれる。消光基、ＱＳＹ２１は、６６０ｎｍにてピークに達する、５４０から７３０ｎｍまでの広い吸収スペクトルによりそれ自体蛍光ではなく、Ｃｙ５の発光のための効果的な消光剤であることが実証された。
【００９９】
ＣＮＩＲ１は本質的に非蛍光であるが、非常に蛍光な生成物を生成し、Ｂｌａ（１４）による処置にて６６０ｎｍの波長での放射強度において５７倍増加する。しかしながら、ＣＮＩＲ１自体は細胞透過性が無く、したがって、インビボでのＢｌａを画像化することができない。ＣＮＩＲ１の膜透過性を改善するために、ＣＮＩＲ１は、ペルアセチル化した（ｐｅｒａｃｅｔｙｌａｔｅｄ）Ｄ−グルコサミン（ＣＮＩＲ３）と結合し、優れた細胞透過性を有し、単一の生細胞におけるＢｌａ発現を画像化することができる。溶解度を改善するためにＱＳＹ２１に２つのスルホン酸基を加えることにより、ＣＮＩＲ４をもたらす。
【０１００】
＜ＣＮＩＲ５とＣＮＩＲ６＞
ＣＮＩＲ４に対するＣＮＩＲ１は、すべてＣｙ５に基づく。インビボでの動物画像化に関して、Ｃｙ５．５は、そのより長い発光波長のため、より好ましい。したがって、Ｃｙ５は、Ｃｙ５．５により置換され、ＣＮＩＲ５が合成された（図４Ａ）。最終生産物は、ＨＰＬＣによって精製され、質量分析計によって特徴付けられた（Ｃ１２２Ｈ１２３Ｎ１１Ｏ３９Ｓ１０に関して計算された質量：２６８７．９８；ＭＡＬＤＩ−ＭＳで観察された（ｏｂｓｅｒｖｅｄ）［Ｍ＋Ｈ］＋：２６８７．６８）。ＣＮＩＲ５自体は、励起されたときに６９０ｎｍの弱い蛍光を発するが、Ｂｌａの処置に際して、強度は９倍以上増加する（図４Ｄ）。Ｂｌａによるその加水分解動態は、ｐＨ７．１のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において測定された：触媒定数ｋｃａｔ＝０．６２±０．２ｓ−１、及びミカエリス定数Ｋｍ＝４．６±１．２μＭ（値は、加水分解率対基質濃度の二重逆数プロットの加重最小自乗近似から得られた）。その触媒の効果（ｋｃａｔ／ｋｍ）は、１．３６ｘ１０５  Ｍ−１ｓ−１であった。ＣＮＩＲ５は、１．７５ｘ１０−７  ｓ−１の自発性の加水分解率によりＰＢＳにおいて、同様にマウス血清において非常に安定していた。すなわち、蛍光増加は、１２時間のインキュベーションの後でさえ、ほとんど観察されなかった。また、ＣＮＩＲ５は、ＱＳＹ２２によりＱＳＹ２１を置換することにより合成され得る（図４Ｂ）。この合成は、ＣＮＩＲ５のものに非常に類似しており、問題ではない。ＱＳＹ２２の合成は以下に考察される。ＣＮＩＲ６は、ペルアセチル化したＤ−グルコサミンの無いＣＮＩＲ５のアナログであり、対照として役立つ。
【０１０１】
ＣＮＩＲ５はまた、大規模な商業用の使用のために合成され得る。図４Ａで描かれた合成の模式図は、主として基礎的な状態の下のプローブの不安定性のため、大規模な合成に適していない。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、消光剤及び近赤外線ｃｙｅ  Ｃｙ５．５の両方がラクタムに結合するのに必要とされる有機塩基は、一般に、ＣＮＩＲ５の異性体をもたらすβ−ラクタム環上の炭素−炭素二重結合の移動を加速する。このことは、精製プロセスの難しさを著しく増加させる。異性化を回避するために、初期段階でラクタム化合物の６員環の上のスルフィドを酸化してスルホキシドにし、合成の後期段階にてスルフィドにまでスルホキシドを減少させる（図４Ｃ）。異性化は、スルフィドの酸化及び消光剤と色素の結合中に検出されない。
【０１０２】
＜ＣＮＩＲ７＞
ＣＮＩＲ７は、Ｂｌａのインビボでの画像化に対するその感受性を改善する、ＣＮＩＲ５の変形である。ＣＮＩＲ５において使用される消光基ＱＳＹ２１ジスルフォナートは、６７５ｎｍの最大吸収を有するが、Ｃｙ５．５は、６９０ｎｍにて最大に発光する。それ故、ＣＮＩＲ５のように、クエンチング効果はちょうど９０％であり、それは観察された背景蛍光に大きく寄与する。ＱＳＹ２１及びＣｙ５（ＣＮＩＲ１）のＦＲＥＴペア（ＦＲＥＴ  ｐａｉｒ）において、ＱＳＹ２１とＣｙ５の間のより良いスペクトルの重複のため、消光効果は９８％以上であった。したがって、６９０ｎｍにて吸収できる消光基は、Ｃｙ５．５をより良く消光し、バックグラウンドシグナルを減少させる。ＱＳＹ２１に関して、インドリンがテトラヒドロキノリンによって置換されたとき、吸収極大が１４ｎｍずつ赤色移動（ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔｓ）することが報告された。
【０１０３】
したがって、新しい構造ＱＳＹ２２ジスルフォナート（図５Ａ−５Ｄ）は、ＱＳＹ２１におけるインドリン基を、テトラヒドロキノリンにより置換することによって合成され、それは同様に、最大吸収において１４ｎｍずつ赤色移動する。２つの間の唯一の構造の差は、ＱＳＹ２２が６員の縮合環を含むテトラヒドロキノリンを使用し、ＱＳＹ２１が５員のインドリンを使用するということであるため、スルホン化の化学が使用され、ベンゼン環上の同じスルホン化の立場（ｐａｒａ）が期待されるだろう。ＱＳＹ２２ジスルフォナートは、それ故、Ｃｙ５．５をより効率的に消光すべきであり、より低いバックグラウンドシグナルを引き起こす。
【０１０４】
次に、ＣＮＩＲ５に関するｋｃａｔの値は、約０．６  ｓ−１であり、それはＣＣ１とＣＣＦ２よりはるかに小さい。二重結合は消光剤とＣｙ５．５の間に挿入され、それは同様にｋｃａｔの増加を引き起こすべきである。第３に、ＦＲＥＴドナー、Ｃｙ５．５及び消光剤、ＱＳＹ２２ジスルフォナートの間の距離は、エネルギー伝達効果を改善するために減少する。ＣＮＩＲ５は、輸送体の取り込みのためのシステインを含む、長いリンカー群を有する。新しいＣＮＩＲ７において、輸送体は、Ｃｙ５．５の上の他の結合部位に結合され、それ故、もはや長いリンカーを含む必要はない。更に、２−アミノチオフェノールは、ＣＮＩＲ５内で４−アミノチオフェノールを置換し、Ｃｙ５．５と消光剤の間の距離をさらに短くする。ＮＩＲ基質の最終設計、ＣＮＩＲ７、及びその化学合成は、図６Ａ−６Ｂで示される。その合成は、さらに短いルートで達成されることができ、ＣＮＩＲ５より容易である。
【０１０５】
ＣＮＩＲ７はまた、アセチル化したＤ−グルコサミンを置換するＴＡＴ配列などの、短いカチオンのペプチドを含み得る。Ｄ−アミノ酸は、ペプチダーゼ加水分解を回避するためにＬアミノ酸の代わりに使用される。アンテナペディア（１５−１６）のホメオドメインの第３のヘリックスなどの短いカチオンのペプチド、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質及びＨＴＬＶ−１  Ｒｅｘタンパク質塩基性ドメイン、及びＨＩＶ−１  Ｔａｔ  タンパク質塩基性ドメインは、細胞の細胞膜に浸透できることが実証された。
【０１０６】
＜ＣＮＩＲ９とＣＮＩＲ１０＞
図５Ｄで合成された消光剤ＱＳＹ２２は、図７Ａで示される合成の模式図において描かれるように、ラクタム環に付けられてＣＮＩＲ９を生成する。ＣＮＩＲ９は、開裂の際に非常に高い蛍光を示すが、Ｂｌａによる開裂が無い場合は非常に低い蛍光を示す。類似の化合物、ＣＮＩＲ１０は、図７Ｂで示される合成の模式図で描かれるように、より短い架橋基とより少数の硫酸塩により合成された。
【０１０７】
＜ＣＮＩＲ８００及び誘導体＞
ＣＮＩＲ８００は、ＲＥＦ画像化の感受性を改善するために、８００ｎｍのより長い波長にて蛍光を発する、新しい蛍光色素分子、ＩＲＤｙｅ８００により設計された。大半の組織において、組織自己蛍光が７００ｎｍ未満の波長にあるため、ＣＮＩＲ８００のより長い波長は、ＣＮＩＲ５のＣｙ５．５蛍光団よりも良く組織に浸透し、自己蛍光によりバックグラウンドを減少させる。ＣＮＩＲ８００は、ＢｌａＣによる開裂の後に、非常に低いバックグラウンド蛍光と大きな差異（２５倍）を示す。ＣＮＩＲ８００．２（図１１Ｃ）は、実施例５に記載の代替方法によって合成された異なるリンカーを備えたＣＮＩＲ８００プローブであり、ＣＮＩＲ８００−３（図１１Ｄ）は、ラクタム環上のＲ２位置に対するメトキシの置換を有するＣＮＩＲ８００誘導体である。加えて、ＣＮＩＲ８００誘導体は、Ｒ２位置に対するメチル置換又はＲ１位置上の７−アミンに付けられたベンジル基を含み得る。
【０１０８】
＜ＣＤＣ１−５基質＞
Ｍｔｂ  ＢｌａＣがＴＥＭ−１  Ｂｌａより大きな活性部位を有するため、ラクタム環の上のより大きな置換基が、ＴＥＭ−１  Ｂｌａ上のＭｔｂ  ＢｌａＣのための蛍光基質の特異性を改善するのを支援し得ることを述べておく。ラクタム環のアミンに対する置換基の効果は、最初に評価された。合成を単純化し、スクリーニングプロセスを速めるため、蛍光基質は、蛍光団として７−ヒドロキシクマリンを発光する、アミンにより置換されたラクタム環を含む。ＴＥＭ−１  Ｂｌａ又はＭｔｂ  ＢｌａＣの処置に際して、７−ヒドロキシクマリンが発光され、蛍光シグナルが発生する。それ故、蛍光色素分子の発光の際に基質の蛍光強度を単に監視することにより、ＴＥＭ−１  Ｂｌａ及びＭｔｂ  ＢｌａＣの加水分解動態を得ることができる（表１）。
【０１０９】
新しい図８Ａで描かれるように、蛍光発生プローブＣＤＣ−１及びＣＤＣ−２が合成され、ＣＤＣ−２はＣＤＣ−１のスルホキシド相当物である。同様に、ラクタム環のアミン基に付けられるより大きな置換基を有する、プローブＣＤＣ−３及びＣＤＣ−４も調製された。プローブＣＤＣ−１が、ＴＥＭ−１  Ｂｌａに好ましいプローブであり、Ｍｔｂ  ＢｌａＣよりはるかに速い加水分解動態を与えることが示された。ＣＤＣ−３は、より大きな置換基により、Ｍｔｂ  ＢｌａＣに対する特異性を改善できることが考慮される。
【０１１０】
プローブの加水分解動態は、ＴＥＭ−１  Ｂｌａ及びＭｔｂ  ＢｌａＣがそれぞれ存在する状態で、異なる時点で蛍光強度を測定することによって、蛍光測定器により測定された。驚くことに、図８Ｂで示されるように、基質ＣＤＣ−３は、２ｎＭのＴＥＭ−１  Ｂｌａの存在下で、ＣＤＣ−１、ＴＥＭ−１  Ｂｌａに好ましい基質よりもさらに速い加水分解動態を示した。蛍光強度が、同じ酵素濃度（ＰＢＳ中で２ｎＭ）での同じ時間量の間、Ｍｔ  Ｂｌａによる処置の後ではるかに低いため、これらの４つのプローブはすべて、明白であり、ＴＥＭ−１に好ましい。２ｎＭのＭｔｂ  ＢｌａＣの存在下での蛍光強度の増強は、正確な測定が難しくなるほど非常に低い。その後、１０ｎＭのＭｔｂ  ＢｌａＣが、Ｍｔｂ  ＢｌａＣの加水分解動態の測定に使用された（図８Ｃ）。あいにく、小さなプローブＣＤＣ−１は、より大きなサイズのプローブＣＤＣ−３よりもさらに速い、Ｍｔｂ  ＢｌａＣによる加水分解動態を与え、アミン上の置換基の大きさがＢｌａＣ特異性に関して重大ではないことを示した。スルホキシドプローブＣＤＣ−２及びＣＤＣ−４は全て、特異性における任意の著しい改善なしで、それらのスルフィド相当物ＣＤＣ−１及びＣＤＣ−３よりも、それぞれ、はるかに遅いＴＥＭ−１  Ｂｌａ及びＭｔｂ  ＢｌａＣの両方による加水分解動態を示した。
【０１１１】
プローブのラクタム環の上に直接置換された基の効果が調査された。図８Ｄで描かれるように、ラクタム環の７−位置の上にメトキシ基を有する基質ＣＤＣ−５が合成された。ＣＤＣ−５の加水分解動態は、上述のものに類似したアッセイにより測定され、ＣＤＣ−１は対照として使用された。ＣＤＣ−５は、ＣＤＣ−１（図８Ｅ）と異なり、高いＭｔｂ  ＢｌａＣ優先度（ｐｒｅｆｅｒａｎｃｅ）を明確に示す（図８Ｆ）。プローブＣＤＣ−５の蛍光強度は、１５分間、ＰＢＳ中の２０ｎＭのＴＥＭ−１  Ｂｌａにより処置された後にわずかに増加するだけである一方で、３０倍以上の蛍光増加は、Ｍｔｂ  ＢｌａＣの同じ濃度により検出することができ、ラクタム環に対する重大な置換された効果を示す。１５分間、Ｍｔｂ  ＢｌａＣにより処置されたＣＤＣ−５の蛍光強度は、ＴＥＭ−１  Ｂｌａによるものより１０倍以上強力である。ＣＤＣ−５は、観察された最初のＭｔｂ  ＢｌａＣに好ましい蛍光発生プローブであると判明した。そのような置換された構造は、ＣＮＩＲ５様（ＣＮＩＲ  ５−ｌｉｋｅ）あるいはＣＮＩＲ８００又はＣＮＩＲ８００様（ＣＮＩＲ  ８−ｌｉｋｅ）、近赤外線プローブ合成において容易に適合され得る。
【０１１２】
【表１】
2013528386.tif 000002
【０１１３】
一般に、表１は、ラクタム基質がＢｌａＣより優れた、ＴＥＭ−１  Ｂｌａに対する加水分解動態を示すことを実証する；しかしながら、メトキシ基又はエトキシ基がラクタム環の７−位置の炭素（新しい図５においてＲ２）に導入されるとき、この傾向が逆転される。例えば、ｂｌａＣに関するプローブＣＤＣ−ＯＭｅのｋｃａｔ／Ｋｍの値は、ＴＥＭ−１  ｂｌａに関するものよりも１，４００倍大きい。ＴＥＭ−１  ｂｌａによるＣＤＣ−ＯＥｔ及び４−６４の加水分解は、測定できないほどに遅い。わずかに大きな基によるプロトンの置換は、ＴＥＭ−１  Ｂｌａ上でのＢｌａＣに関する選択性に対して深遠な効果がある。スルフィド酸化は、ＴＥＭ−１  Ｂｌａ及びＢｌａＣの両方に関する動態の効果を著しく減少させる。エトキシ置換が、メトキシの置換と比較して動態をかなり減少させたため、メトキシ基は、より大きなエトキシ基よりも更に好ましい。ＴＥＭ−１  Ｂｌａは、Ｒ１の上での大きな置換を表わし、Ｒ１の大きさが減少するのと同じぐらいに、ｋｃａｔ／Ｋｍの値が減少する（ＣＤＣ−３＞ＣＤＣ−１＞４−６５）。しかしながら、ＣＤＣ−１は、ＢｌａＣに関するｋｃａｔ／Ｋｍの最大の値を示す。
【０１１４】
＜他の基質＞
ＸＨＸ２−８１、ＸＨＸ２−９１、ＸＨＸ３−１、ＸＨＸ３−２、ＸＨＸ３−２６、及びＸＨＸ３−３２は、ＴＥＭ−１の上のミコバクテリウムのＢｌａＣのための選択性を示す、ＣＮＩＲ８００基質の誘導体又はアナログである（図９Ａ−９Ｅ）。化合物ＸＨＸ３−３２は、構造においてＣＤＣ−５に類似し、１００未満の細菌の検出の閾値を実証し、１０の細菌と同じくらい低い（図９Ｆ）。ＸＨＸ３−１は、マウス中のＭｔｂのより急速な組織分布及びより敏感な検出を付与するＣＮＩＲ８００を合成するために使用される、ラクタム骨格に付けられるＩＲＤｙｅ８００蛍光色素分子及びＩＲＤｙｅＱＣ−１消光剤を含む。しかしながら、これは、検出用のＣｙ５．５に基づいた蛍光色素分子システムを使用して排除しない。ＸＨＸ３−２は、フェノール基の放出動態を増加させるために、改善された脱離基及び二重結合の取り込みを有している。二重結合の配置は、より大きなアリル基ため、以前のｃｉｓ配置の代わりに、ｔｒａｎｓである。
【０１１５】
＜結核症におけるＢｌａを画像化するためケージに入れられたＢｌａ基質＞
Ｂｌａ（Ｂｌｕｃｏ）のためケージに入れられた基質の構造（図１０Ａ）は、Ｄ−ルシフェリン、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）の基質、及びβ−ラクタム、Ｂｌａの基質を含む。Ｄ−ルシフェリンのフェノール基は、Ｆｌｕｃによるその酸化に対して重大な意味を持つ。このフェノール基が、エーテル結合を介してセファロスポリンの３’位置に直接連結されるとき、結果として生じる共役は、Ｆｌｕｃに関して乏しい基質になるが、Ｂｌａに関する基質のまま残る。Ｂｌａによるβ−ラクタム環の開口は、自発性の断片化を誘発し、３’位置にエーテル結合の開裂を引き起こし、及び光線を発生する反応においてＦｌｕｃにより酸化され得る遊離Ｄ−ルシフェリンを発光する。共役の安定性を改善するために、セファロスポリン上のスルフィドは、酸化されてスルホキシドになり、最終の構造Ｂｌｕｃｏをもたらした。Ｂｌｕｃｏの調製は、複数の工程の有機合成によって達成される（図１０Ｂ）。Ｂｌｕｃｏの大きさがＣＮＩＲ系列プローブ（ＣＮＩＲ ｓｅｒｉｅｓ ｐｒｏｂｅ）よりはるかに小さいため、それは、結核菌の細胞膜により良く浸透し得る。７つのアミノの位置で同定された置換は、ＴＢにおけるＢｌａのＳＲＥＬ画像化のためＴＢに特異的なケージに入れられた発光基質を設計するために、単に本明細書において利用され得る。Ｂｌｕｃｏはまた、二重結合（Ｂｌｕｃｏ２）の挿入によって、及びカルバマート連鎖（Ｂｌｕｃｏ３）の使用により、改善されたＫｃａｔを有するために合成され得る。
【０１１６】
実施例５
＜ＣＮＩＲ蛍光発生基質の代替の合成＞
代替の合成の模式図において、ＣＮＩＲプローブは、ユニットに基づいた手法を利用して合成することができる（図１１Ａ）。ユニット１及びユニット２は、以前の化学作用を大量に使用して調製することができる。塩基に触媒された共役を使用する代わりに、軽度の化学連結は、ラクタムユニット２に導入された、遊離したシステインとチオールエステルの間で実施される。この条件下では、異性化は期待されない。生成物３は、大量に高純度において分離することができる。３の上の遊離アミノ基は、Ｃｙ５．５とＮＩＲ８００などのＮＩＲ色素に容易に結合される。標準のＮＨＳエステルに媒介された結合によって、チオール基は、消光剤上のマレイミド基を介して結合される。両方の共役が直交性であるため、それらは、ワンポット合成で実行され得、最終生産物はＨＰＬＣによって精製される。異性化の主な源である、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）などの有機塩基の使用が排除された。加えて、脱保護化学は、消光剤ＱＣ−１がトリフルオロ酢酸を媒介とした脱保護条件における分解によって観察されてから収量を改善する、消光剤が導入された後に必要とされない。重要なことに、単に１つの最終のＨＰＬＣ精製が必要とされる。
【０１１７】
別の代替の合成模式図（図１１Ｂ）において、前駆体１．１はＣＮＩＲ５の合成のための中間体である。中間体１．１上の遊離アミノ基は、Ｃｙ５．５とＮＩＲ８００などのＮＩＲ色素、及びＰＢＳ内での消光剤に同様に反応できる。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、異性化の主な源などの、有機塩基の使用が回避されるため、反応は、ＨＰＬＣの必要性なしでクリーン（ｃｌｅａｎ）である。ラクタム上の保護基の脱保護が実行され、７−位置上のアミノ基は、ＰＢＳにおいて、ＮＩＲ色素（例えば、ＣＹ５．５、ＮＩＲ  ８００）に結合される。最終的な反応生成物はＨＰＬＣ精製にさらされる。図１１Ａで示される模式図と比較して、有機塩基は、色素及び消光剤結合において使用されず、従って最終生産物中の異性化は期待されない。図１１Ａにおける化学合成模式図のように、１つのＨＰＬＣ精製だけが要求され、従ってプローブの大きな産出を可能にする。
【０１１８】
これら化学合成スキーマは、ＣＮＩＲ５．２及びＣＮＩＲ８００．２などのＣＮＩＲプローブを生成することができる（図１１Ｃ）。ＣＮＩＲ８００．２とＣＮＩＲ５．２は消光剤に対してわずかに異なる結合基を有するが、プローブの特性は変更されることを考慮する。限定されないが、ＣＮＩＲ８００−３、ＸＨＸ３−１、及びＸＨＸ３−２等のＣＮＩＲ８００誘導体又はアナログプローブはまた、この化学を使用して大規模に合成され得る。
【０１１９】
実施例６
＜ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ９、及びＣＮＩＲ１０のためのＦＲＥＴ並びに蛍光取り込み動態（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）＞
＜インビトロのＦＲＥＴ：ＣＮＩＲ５による大腸菌及び結核菌におけるＢｌａ活性の検出＞
ＣＮＩＲ５は、生細菌のＢｌａ活性を検出するその能力のために検出された（ｄｅｔｅｓｔｅｄ）。大腸菌はアンピシリン抵抗性のプラスミドにより形質転換され、３０℃で一晩成長させた。細胞を集め、５００ｎＭ  ＣＮＩＲ５の追加の前にＬＢ媒体により２回洗浄した。蛍光スペクトルは、間隔を置いて得られ（Ｅｘ：６４０ｎｍ）、データは図１２Ａで示された。測定（ｔ＝１６０ｍｉｎ）の終わりに、精製されたＢｌａの溶液は、ＣＮＩＲ５の完全加水分解を確認するために加えられた。結果は、ＣＮＩＲ５が大腸菌のＢｌａを検出することができることを示す。比較すると、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．からの蛍光発生基質ＣＣＦ２／ＡＭが同じ条件下で使用された時、ＬＢ媒体中の生きた大腸菌中のＢｌａは検出されなかった。図１２Ｂは、ＣＮＩＲ  ５が、細菌の数の存在と蛍光のシグナルの間の優れた相関性により、１００−１０００Ｍｔｂの間の細菌を検知し得ることを実証する。
【０１２０】
＜ＦＲＥＴスペクトル＞
図１３Ａ−１３Ｄは、１０分間のＢｌａによる開裂の前後での、プローブＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ９及びＣＮＩＲ１０の各々に関する、ＦＲＥＴ発光スペクトルである。４つのすべてのプローブは、β−ラクタマーゼ開裂、及び開裂後の８．５倍（６６０ｎｍ、ＣＮＩＲ４）、２４倍（６９０ｎｍ、ＣＮＩＲ５）、９．５倍（６９０ｎｍ、ＣＮＩＲ９）及び１０倍（６９０ｎｍ、ＣＮＩＲ１０）までの最大の発光の増加の前に、わずかな蛍光を示す。図１３Ｅ−１３Ｈに描かれるように、Ｍｔｂによるこれらプローブの各々の共インキュベーションが、１８時間の共培養後のＣＮＩＲ４に関して２倍、ＣＮＩＲ５に関して３倍、ＣＮＩＲ９に関して１．５倍、及びＣＮＩＲ１０に関して２倍の蛍光の増加により、細菌の直接の標識化をもたらす。
【０１２１】
＜ＣＮＩＲ４とＣＮＩＲ５の基質を有する大腸菌ＴＥＭ−１及び結核菌Ｂｌａ−Ｃの動態＞
表２は、基質としてＣＮＩＲ４とＣＮＩＲ５を有する、大腸菌ＴＥＭ−１と結核菌Ｂｌａ−Ｃ  β−ラクタマーゼ酵素の動態を比較する（図１４Ａ−１４Ｂ）。
【０１２２】
これらＣＮＩＲプローブを使用する、結核菌への蛍光取り込みの動態が、測定された。ＣＮＩＲ４とＣＮＩＲ５プローブの取り込み及び分布は、媒体（図１５Ａ−１５Ｈ）中の結核菌のみにおいて、及びマクロファージ（図１６Ａ−１６Ｈ）により感染した結核菌において、基質として使用された。
【０１２３】
【表２】
2013528386.tif 000003
【０１２４】
＜結核菌へのＣＮＩＲ４の取り込み＞
蛍光の共焦点の顕微鏡法は、ＣＮＩＲ４が、結核菌により感染したマクロファージへと細胞内に取り込まれることを実証する（図１７）。ＤＡＰＩ染色（青）は、感染細胞の核を示し、緑の蛍光は、ＧＦＰ標識化結核菌からのものであり、赤い蛍光は、開列されたＣＮＩＲ４からのものである。ＣＮＩＲ４からの蛍光は、感染細胞内に蓄積するが、非感染細胞は蛍光を示さないことに注意する。
【０１２５】
＜インビボでのＣＮＩＲプローブの蛍光シグナルの検出＞
マウスは、様々な濃度の結核菌に皮内に感染する。下部の左の四分円は１０８の細菌を受け、上部の左の四分円は１０７の細菌を受け、上部の右の四分円は１０６の細菌を受けた。蛍光は、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ９及びＣＮＩＲ１０プローブの各々の存在下で測定される（図１８Ａ−１８Ｅ）。ＣＮＩＲ５は、最も大きな蛍光シグナルのシグナルを示し、接種物の濃度がＣＮＩＲ１０とＣＮＩＲ９の後に増加するにつれて、その中で増加した。ＣＮＩＲ４は、蛍光の増加を実証しなかった。また、ＣＮＩＲ４、ＣＮＩＲ５、ＣＮＩＲ９及びＣＮＩＲ１０プローブからの蛍光は、野生型の結核菌に、又はエアロゾル接種によって肺のｂｌａＣ遺伝子における突然変異を有する結核菌に感染したマウスにおいて測定される（図１９Ａ−１９Ｄ）。ＣＮＩＲ１０は、ＣＮＩＲ９、ＣＮＩＲ５及びＣＮＩＲ４の後に最も高い合計の蛍光を示した（図１９Ｅ）。
【０１２６】
ＣＮＩＲ５は、蛍光取り込みを画像化し、対照のマウスとエアロゾルにより結核菌に感染したマウスにおける経時的なその動態を図示するための基質として使用され、基質ＣＮＩＲ５を使用して画像化された。対照及び感染したマウスからの画像は、１、１８、２４、４８、及び９６時間に得られた（図２０Ａ−２０Ｅ）。ＣＮＩＲ５のピーク取り込みが、エアロゾル感染の４８時間後に生じた（図２０Ｆ）。図２１Ａ−２１Ｂは、未感染のマウス又はエアロゾルによって結核菌に感染したマウスのそれぞれの蛍光画像を描き、バックグラウンドシグナルを減少させるため、反射率よりも徹照法を使用して画像化される。
【０１２７】
実施例７
＜ＣＮＩＲ５によるインビボでの画像化：マウス腫瘍モデル中のＣＮＩＲ５＞
約１ｘ１０６のＣ６ラット神経膠腫細胞は、ヌードマウスの左肩に注入され、ｃｍｖ−ｂｌａにより安定して形質移入された同数のＣ６ラット神経膠腫細胞は、同じヌードマウスの右肩に注入された。腫瘍の大きさが約６ｍｍに達した時、７．０ｎｍｏｌのＣＮＩＲ５が、麻酔をかけたマウスに尾静脈を介して注入された。マウスは、Ｃｙ５．５フィルターセット（励起：６１５−６６５ｎｍ；発光：６９５−７７０ｎｍ）及び異なるポスト注入時間（ｐｏｓｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）での１秒の収集時間により、ＩＶＩＳ  ２００イメージャーにおいてスキャンされた。
【０１２８】
図２２Ａは、注入の前、及び注入の２、４、１２、２４、４８、及び７２時間後に得られた、一連の代表的な画像である。早くとも注入の２時間後に、ｃｍｖ−ｂｌａ腫瘍は、野生型（ｗｔ）Ｃ６腫瘍よりも高度な蛍光強度を示した。対照は、２４時間にて１．６の最高値に達し、その後、４８時間及び７２時間にて約１．３まで減少し始めた（図２２Ｂ）。画像化の終わりに、マウスは、画像化データを確証するエキソビボ画像化及び生物分布研究用の器官及び腫瘍を集めるために殺した。図２２Ｃは、ＣＮＩＲ５の注入の２４時間後に殺したマウスから集められた腫瘍と器官の蛍光画像であり、それは、ｗｔＣ６腫瘍よりも高い、ｃｍｖ−ｂｌａ腫瘍からのＣｙ５．５発光を実証する、インビボでの画像化データに一致する。ｃｍｖ−ｂｌａ腫瘍中のＢｌａの発現を確認するために、ＣＮＩＲ５（図２２Ｄ）を注入されたマウスから切除された腫瘍のＣＣ１アッセイが実行された；結果は、ｃｍｖ−ｂｌａ腫瘍が、高レベルの酵素発現を有し、一方で野生型腫瘍がわずかなＢｌａ活性しか持たなかったことを示した。
【０１２９】
観察された対照が、腫瘍内で発現したＢｌａによるＣＮＩＲ５の活性化によるものであることをさらに立証するため、ＣＮＩＲ６、ペルアセチル化されたＤ−グルコサミンのないＣＮＩＲ５のアナログは、対照として調製された（図２３Ａ）。ＣＮＩＲ６は、ＣＮＩＲ５と同じくらい効率的に、Ｂｌａによってインビトロで加水分解され得るが、細胞透過性が無く、したがって、ＣＮＩＲ６はインビボでのＢｌａを画像化することができない。図２３Ｂ−２３Ｃにおいて、全体の画像化期間を通じて、ｃｍｖ−ｂｌａ腫瘍及び対照腫瘍の間に、任意の著しい対比はなかった。これは、ＣＮＩＲ５が標的細胞へ入り、Ｂｌａによって活性化されたことを明らかに示した。この結果はまた、インビボのＢｌａを画像化するためのＣＮＩＲ５に関するＤ−グルコサミン基の重要性を実証した。
【０１３０】
＜静脈注入後のマウスにおけるＣＮＩＲ５の生物分布及び薬物動態学＞
ＣＮＩＲ５はＢａｌｂ／ｃマウスへ静脈注入された。マウスのグループは、器官収集及び処理のために犠牲にされる。ＣＮＩＲ５の存在は、各々の器官中の蛍光強度によって経時的に評価される。図２４Ａ−２４Ｂは、４時間と２４時間後の注入での、それぞれのＣＮＩＲ５シグナルを示す。安定したシグナルは、２４時間にわたり、ＣＮＩＲ５が全身性であり、この時間にわたって著しく分解されないことを示唆する、すべての組織で観察される。
【０１３１】
＜Ｂｌａによるマウスの結核菌感染を位置付けるためのインビボの画像化＞
４つのＢａｌｂ／ｃマウスの６つのグループの各々は、実施例１に記載されているような１００−１０００ｃｆｕ／肺の間で、エアロゾルによって感染する。４つのマウスの１つのグループは、全ての時点での画像化のために使用され、各々の時点で、４つのマウスのグループは、組織病理学のため、及び肺と脾臓におけるｃｆｕを測定するために殺し、検死される。２４時間、７、１４、２８、及び７２日目に、画像化は、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ２００画像化ステーション（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ２００  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｔａｔｉｏｎ）を使用して、同じＡＢＳＬ３の組で実行される。４つの動物の対照グループは、細菌に感染していないものを画像化するために使用されるが、未開裂の化合物からの背景蛍光を制御するために検出試薬を注入される。動物は、明るい窮屈なチャンバにおいてイソフルオランで麻酔をかけられ、６４０ｎｍの励起、及び６９０ｎｍで捕捉された画像により画像化される。ＩＶＩに十分であると示された５ｎｍｏｌのＣＮＩＲ５は、尾静脈を使用して静脈内に注入される。画像は、化合物の注入、及び１、２及び４時間後の注入の前に得られる。シグナルがこれらの時点のうちの何かにて観察される場合、動物は、シグナルの散逸に従うため、２４、４８及び７２時間後に引き続き画像化される。
【０１３２】
野生型結核菌に感染したマウス（図２５Ａ）と対照マウス（図２５Ｂ）のインビボの画像が示される。両方のマウスは、画像化前にＣＮＩＲ５を静脈注入された。この画像は、感染したマウスが肺から来るシグナルを有することを示す。シグナルの３Ｄ再構築は、平均のシグナル位置が肺の間にあることを実証する。シグナルが平均化され、マウスには２つの肺があるため、この位置が最も大きな点源であることが予期される。したがって、化合物ＣＮＩＲ５は、生きた哺乳動物の結核菌の位置を測定するために使用することができる。Ｘｅｎｏｇｅｎ／キャリパーＩＶＩＳスペクトル画像化システムは、この画像を捕捉するために使用された。
【０１３３】
＜Ｂｌａを有するマウス中の結核菌検出の閾値の測定＞
β−ラクタマーゼＣＮＩＲプローブは、１００Ｍの結核細菌を検出することができ、あるいは実時間でのマウスのＳＲＥＬ画像化によってはあまり検出されない（図２６Ａ）。ＳＲＥＬ画像化は、対照として未感染の生きたマウス（図２６Ｂ）上で、又は結核菌に感染したマウス（図２６Ｃ）上で実行された。カラーバーは、６２０ｎｍでの励起の後の、６８０ｎｍでの発光のレベルを示す。カラーは、Ｍｔｂに感染した肺から生じる強力なシグナルの存在を示し、感染の具体的な局在化を実証する。シュードモナス、スタヒロコッカス及びレジオネラのための検出の閾値も、測定され得る。
【０１３４】
＜Ｂｌａを有するモルモットの結核菌感染のインビボでの画像化＞
４つのモルモットの６つのグループは感染し、以下の例外を除いて、マウスに関して記載される同じ方法で画像化される。最初に、モルモットが後の時点にて著しい死亡率を示し始めると予測されるため、２８日までの感染後の時点のみが試験される。次に、２０倍以上（ＣＮＩＲ５に関して〜１００ｎｍｏｌ）の検出試薬が、マウスに必要とされるのと同じ血中濃度を達成するためにモルモットに必要とされ、化合物が外側の中足骨の静脈に投与される。モルモットは、ＡＢＳＬ３設備中のエアロゾルによって感染し、画像化まで封じ込めて維持される。画像化は、感染後２４時間、７、１４及び２８日目に、ＩＶＩＳ２００画像化ステーションを使用して、ＡＢＳＬ３の組で実行される。４つの動物の対照グループは、細菌に感染していないものを画像化するために使用されるが、未開裂の化合物からの背景蛍光を制御するために検出試薬を注入される。
【０１３５】
画像化前に、ＩＶＩに十分であることを示された１００ｎｍｏｌのＣＮＩＲ５は、尾静脈を使用して静脈内に注入される。画像は、化合物の注入の前、及び注入後１、２及び４時間後に得られる。シグナルがこれらの時点のうちの何かにて観察される場合、動物は、シグナルの散逸に従うため、２４、４８及び７２時間後に引き続き画像化される。
【０１３６】
実施例８
＜ＣＮＩＲ５による臨床サンプル中の結核の検出＞
３０の臨床分離株を、直接、臨床検査室から得、これらは、標準の臨床的な実験室試験によって測定されるように、およそ半分が結核に対して陽性であり、残り半分が陰性である（抗酸性の直接的に濃縮塗抹標本（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｓｍｅａｒ）、抗酸性の培養およびミコール酸ＨＰＬＣ）。これらの臨床サンプルは主に痰（２６のサンプル）であったが、４回の気管支洗浄検査を行った。痰サンプルは、誘発されないもの（２４のサンプル）もあれば、誘発されたもの（２つのサンプル）もあった。陽性サンプル内に４つのマイコバクテリウムアビウムコンプレックス（ＭＡＣ）のサンプルがあった。これらのサンプルの各々を、試験の特異性（＞９４％）および感受性（＞８６％）に関して比較可能な結果を得た、２つの独立した試験において盲目的な方法で試験した。
【０１３７】
臨床サンプルを、ＣＮＩＲ５基質を使用して評価した（図２７ａ）。偽陽性が１つだけ得られたが（ｓａ６）、この患者は臨床疾患を示し、標準の培養および痰検査によって陰性であった。偽陰性が１つだけ得られたが（ｓａ２９）、この患者は培養によって陰性であった。サンプル、ｓａ１８、ｓａ２０およびｓａ２４は、マイコバクテリウムアビウムであった。陰性の痰サンプルをまた、検出の閾値（〜１００−１０００ ＣＦＵ）を決定する、および予めアッセイ条件を最適化する、添加実験（ｓｐｉｋｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）に用いた（図２７Ｂ）。
【０１３８】
３回を超える独立した実験において、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の結核で得られた検出閾値と同様の検出閾値が臨床サンプルを用いて直接得られた。既知数の結核菌が加えられた痰において、存在する細菌数に対して、生成されたシグナル強度の非常に好適な相関性（Ｒ２＝０．９）があった（図２７Ｃ）。感受性は、１００の細菌の検出が実証されるような感受性であって、これは、培養と比較可能な診断テストをもたらすのに必要とされる感受性の範囲内にある。興味深いことに、研究室のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用しようが痰を使用しようが、信頼度と定量的性質の間ではこの系を使用する違いはほとんどなく、このことは、系が極めて強固なものであることを示唆している（図２７Ｄ）。
【０１３９】
さらに、病原菌とシグナル強度との間の相関性を示す能力は、４〜１２時間でイソニアジドおよびリファンピシンの耐性を確認するために使用される薬物感受性プロトコルに対する基準を提供する。この潜在性は、基質ＣＮＩＲ５を使用する抗結核治療の分析によって有効になり、これは、２４時間未満の後の処置において、処置された群と処置されていない群との間の明確な差を示す（図２７Ｅ）。これらのデータは、耐性菌に対して感受性のある菌が、本明細書に提供される基質を使用して、２４時間以内に識別され得ることを示す。これらの基質の最適化した変化が診断アッセイを改善し、検出の閾値を低下させることが予想される。
【０１４０】
実施例９
＜ＣＮＩＲ７によるインビボ撮像：マウス組織中のＣＮＩＲ７の生体内分布＞
マウス組織中のＣＮＩＲ７の生体内分布を、インビボ撮像前に評価する。ＣＮＩＲ７を、（１００μＬの緩衝食塩水中の１０ｎｍｏｌの投与量で）３匹のマウスに静脈注射する。麻酔をかけたマウスを、注射後の異なる時間間隔（３０分、２４０分、１２時間、２４時間、４８時間、および７２時間）で、頸椎脱臼によって殺す（各時点で３匹のマウス）。血液サンプルを、心臓穿刺によって集め、組織（心臓、腎臓、肝臓、膀胱、胃、脳、膵臓、小腸および大腸、肺、および脾臓）を、迅速に採取し、蛍光測定器によって近赤外線蛍光を測定する。データは、１グラムの組織あたりの蛍光ユニット（ＦＵ）［ＦＵ／（ｇ 組織）］として表され、これらの組織器官中の加水分解したＣＮＩＲ７の生成物の量を示す。
【０１４１】
＜マウスモデルにおけるＣＮＩＲ７によるインビボ撮像＞
Ｃ６の膠腫の腫瘍異種移植片を、ＣＮＩＲ７を撮像するために、ヌードマウスにおいて使用した。１Ｌ／分の低速度で１００％の酸素中の２％のイソフルランの吸入によって、マウスに麻酔をかける。外側の尾静脈に、１００μＬのＰＢＳの緩衝液中の１０ｎｍｏｌのＣＮＩＲ７を注入する。３匹のマウスを、ＩＶＩＳ２００ Ｏｐｔｉｃａｌ ＣＣＤシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｉｎｃ）を使用して、小動物のインビボの蛍光撮像系によって撮像する。このシステムは、生物発光と蛍光のインビボ撮像の両方に適しており、小齧歯類を単回の投影に対して迅速に、すなわち、蛍光撮像に対して１秒もの短い時間でスキャンすることができる。視覚化のための完全なソフトウェアツールが、このシステムとともに利用可能である。Ｃｙ５．５によるＮＩＲＦ撮像に関して、励起フィルター（６４０±２５ｎｍ）および発光フィルター（６９５−７７０ｎｍ）を有するフィルターセットを使用する。蛍光画像を、Ｃマウントレンズを装備した赤色光に高感度な白黒のＣＣＤカメラによって収集する。マウスを、生体内分布の研究のために殺す。腫瘍組織のサンプルの一部分を、Ｂｌａ活性の評価のために使用する。
【０１４２】
実施例１０
＜静脈内注入後のマウスにおけるＣＮＩＲ８００の生体内分布および薬物動態＞
マウスは、１０、２０および４０μＭの２．５μｌ／ｇの３回の異なる投与のＣＮＩＲ８００で接種を受ける。１、３、５、１０、２４、４８時間後の投与とは異なる時間間隔で接種を受ける。麻酔をかけたマウスを、頸椎脱臼によって殺す（各時点で３匹のマウス）。血液サンプルを、心臓穿刺によって集め、組織（腫瘍、心臓、腎臓、肝臓、膀胱、胃、脳、膵臓、小腸および大腸、肺、および、脾臓）を、迅速に採取し、蛍光測定器によって近赤外線蛍光を測定する。これらのサンプルを、蛍光測定のための活性化されていないプローブをすべて加水分解するための水酸化ナトリウムの付加によって処理する。したがって、活性化された及び活性化されていないプローブの生体内分布を得ることができ、データを、１グラムの組織あたりの蛍光ユニット（ＦＵ）［ＦＵ／（ｇ 組織）］として表す。したがって、組織中の基質の最適な濃度が決定される。
【０１４３】
＜Ｂｌａを有するマウスにおける結核菌検出の閾値の決定＞
５−７週齢の、１匹の感染していない対照を有する１群当たり５匹の雌のＢａｌｂ／ｃマウスは、肺ルートによって感染する。５０、５００、５０００、５０，０００および５００，０００のｃｆｕ／肺の接種量を用いる。マウスの２つの群が各接種量で感染する。１つの群は撮像せずに１日目に殺し、接種量を確認するために、肺をｃｆｕのために蒔く。マウスの他の群において、ＣＮＩＲ８００の適量を静脈内で与え、マウスを、その後すぐに、および基質送達の１、３、５、１０、２４、および７２時間後に撮像する。
【０１４４】
基質の濃度の最適化は、基質の２分の一の濃度と２倍の濃度とにおける、検出の決定された閾値の２倍の接種量と該閾値の２分の一の接種量とを、合計４つの追加の条件に使用して、撮像実験により達成される。シグナル対雑音比の改善を示す接種量と基質の濃度を、検出の最適化した閾値を再び測定するために使用することができる。
【０１４５】
＜感染の間のｃｆｕとのＣＮＩＲ８００ ＲＥＦの撮像の相関性＞
マウスは、自己蛍光を減らすための低クロロフィル食料（ｃｈｏｗ）と水で維持される、雌の５−７週齢のＢａｌｂ／ｃである。１つの群当たり５匹の動物を感染していない対照に用い、４匹の動物を感染した対照に用いる。撮像前に２．５μｌ／ｇの２０μＭのＣＮＩＲ８００で送達された基質を動物に与える。１）１００ｃｆｕ ｘ ３、  ２）１０００ｃｆｕ ｘ １、  ３）１０，０００ｃｆｕ ｘ ６、  ４）１００，０００ｃｆｕ ｘ １、  および、５）１０６ｃｆｕ ｘ １に対応する投与量（群＃ ｘ ５の群の数）は肺に残る。群１からのマウスを、７日目で最初に撮像する。シグナルが観察されると、動物を殺し、ｃｆｕを決める。シグナルが観察されなければ、シグナルが観察されるまで、動物を毎日撮像し、その日付を記入して、ｃｆｕを決める。これは、生理学的に関連する感染がＲＥＦによって目に見えるようになる時点、および、治療が始まり得る最初の時点である。他の２つの群１の数組の動物を、感染の２８日後と６０日後に撮像する。群２を４日目に撮像し、シグナルを観察し、ｃｆｕが決まるまで、群１と同じ方法で処理する。群３において、１組の動物を感染の１、３、５、７、１４、２８日後に撮像し、ｃｆｕを決定する。群４と５において、動物を１日目に撮像し、ｃｆｕを決定する。
【０１４６】
静脈内注入に関して、投与量は、１）１０４ｃｆｕ ｘ １、  ２）１０５ｃｆｕ ｘ ２、  ３）１０６ｃｆｕ ｘ １、  ４）１０７ｃｆｕ ｘ １に相当する。これらの群をすべて、同じ方法で処理し、１、２、３、４、５および７日目に撮像する。一旦シグナルが観察されると、第２の群の動物であった場合を除いてその群を殺す。第２の群の動物は７日目まで各時点で撮像され、この最後の日に殺す。感染の部位での蛍光の取り込みを、全ての動物および切除した器官のレベルでＩＶＩＳ撮像システムを使用して視覚化し、蛍光測定器での組織ホモジェネートにおいて及び組織の凍結切片および蛍光共焦点顕微鏡を使用して確認する。
【０１４７】
＜ＣＮＩＲ８００ ＲＥＦ撮像による治療上のスクリーニング＞
雌の５−７週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、処置の４日前にＭａｄｉｓｏｎチャンバーを使用して、１００−１０００ｃｆｕ／肺で感染させる。１つの群当たり１０匹の動物を、撮像のための対照として感染されてない２匹の動物とともに用い、１つの群当たり５匹の動物を、従来のｃｆｕ研究のために用いる。１つの群の動物を処置し、第２の群をすべての実験で処置しない。すべての動物を、ベースラインを得るために３日目の処置前に撮像し、治療上の処置を４日目に開始し、感染の５、６、７、１４および２８日後に撮像を行う。それと平行して、標準の治療上の評価のために、５匹の動物の１つの群を感染の４、７、１４および２８日後に殺す。また、尾静脈による１０６ｃｆｕの静脈内注入のモデルにおいて、ＩＮＨ、ＲＩＦおよびＭＯＸに関する５、１０、２５および５０ｍｇ／ｋｇで毎日処置を行う。２５ｍｇ／ｋｇのＩＮＨでの処置を用い、従来の撮像と治療上の技術に対して比較を行う。
【０１４８】
実施例１１
＜蛍光タンパク質：ＩＶＩのための蛍光タンパク質の可能性の評価＞
蛍光タンパク質（ＦＰ）ｍＰｌｕｍは、６４９ｎｍの最長の波長と非常に好ましい５９ｎｍのストークスシフトを有し、これは、蛍光タンパク質が非常によく組織を透過し、好ましいシグナル対雑音比を有することを意味する。これは、ＥＧＦＰほど明るくないが、類似した光安定性を有し、その波長およびストークスシフトは、ＩＶＩの間のこの差を十二分に補うべきであるが、これはインビトロでは同じように作用しないこともある。長波長（６２０ｎｍ）を有する第２ＦＰは、ｍＫｅｉｍａであり、これは、背景が励起波長で重なるという懸念がほとんどない１８０ｎｍで、ｍＰｌｕｍよりもさらに優れたストークスシフトを有する。しかしながら、ｍＫｅｉｍａは、ｍＰｌｕｍと類似した明るさを有し、これによって、どのＦＰがＩＶＩの間に、よりよく作用するかを分かりにくくしている。ｍＰｌｕｍまたはｍＫｅｉｍａのいずれかよりも４倍明るい比較的長い波長（６１０ｎｍ）を備える別のＦＰは、ｍＣｈｅｒｒｙである。ｍＣｈｅｒｒｙのためのストークスシフトはわずか２３ｎｍであり、そのため、シグナル対雑音比は、より明るいにもかかわらず依然として問題となり得る。ＦＰ ｔｄＴｏｍａｔｏは、最短の波長（５８１ｎｍ）を有するが、最も明るく、ｍＰｌｕｍおよびｍＫｅｉｍａよりも２０倍明るい。
【０１４９】
４つのＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＫｅｉｍａ、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｔｄＴｏｍａｔｏは、Ｇａｔｅｗａｙ ＰＣＲクローニングを使用して、発現ベクターへとクローン化される。これらのコンストラクトの各々は、Ｍｔｂに形質転換され、９６ウェルのプレートアッセイを使用して、インビトロで評価される。それらは、標準の成長条件下で、および、細胞内の成育アッセイによって培地中で評価される。コンストラクトはすべて、分光測光法で、および、８ウェルのチェンバースライドを使用して、顕微鏡法によって評価される。分光測光法による研究は、各コンストラクトに対する最適な発光波長と最適な励起波長を評価する。ＥＧＦＰが、長波長およびベクターのみでの発光のための陰性対照として使用され、細菌およびマクロファージ自体からの自己蛍光の効果を評価する。顕微鏡法は、細菌の個体群における蛍光の割合の計算を介して、培地の成長後にシグナル強度の任意の変動性および様々なベクターの安定性の評価を可能にする。
【０１５０】
＜ＦＰのためのインビトロの評価パネル＞
ＦＰコンストラクトは、培養中の安定性、転写および翻訳の有効性、検出限界およびイソニアジドによる処置の間／後のシグナルに関して評価される。シグナル強度およびコンストラクトの安定性のばらつきが、個々のＦＰ形質転換体において以前に観察されているので、まず、各ＦＰコンストラクトでの少なくとも２つの形質転換体が、評価のために選択される。その後、各ＦＰに対する単一の最適な菌株がインビボの研究で選択される。
【０１５１】
培養中の安定性は、３０日の成長後に蛍光のままである細菌の割合の選択と測定の有無における各菌株の成長によって評価される。これは、適切な抗生物質の存在下と不在下で希釈液を蒔くことによって確認され、プラスミドから選択可能なマーカーを保持する培養中の細菌の割合を評価する。転写および翻訳の効率研究は、プロモーターが各コンストラクトにおいて適切に機能しているか否か、および、コドン使用頻度がシグナル強度に影響を及ぼし得るまで翻訳に影響を与えるか否かについての見識を与える。これは、各ＦＰコンストラクトを保持するＭｔｂからのＲＴ−ＰＣＲによって評価され、この誘発を相互に関連付ける異なるプロモーターおよび単コピー型または多コピー型ベクターを用いる発光量を、他のレポーターを発現するコンストラクトと比較する。これらの比率は、発現されるレポーターにかかわらず、比較可能でなければならない。
【０１５２】
蛍光強度およびタンパク質レベルを、吸光度測定法およびウエスタン分析を使用して、各菌株に関して測定し比較する。タンパク質対ＲＮＡ対蛍光シグナルの比率は、発現されるレポーターまたは発現されるＲＮＡ転写物のレベルにかかわらず、比較可能であるべきである。幾つかのレポーターが非効率的に翻訳されると、タンパク質のＲＮＡ転写物に対するそれらの比率は、ＲＮＡ発現のレベルが増加するにつれて減少する傾向にある。このような観察は、翻訳の効率を改善するそのＦＰのための、コドン使用頻度を修正する必要があると解釈される。しかしながら、これが、過剰発現による封入体におけるタンパク質の不安定性または隔離の結果である可能性もある。
【０１５３】
検出限界を、平行して調製される培養からの限界希釈の蛍光を評価することによって決定する。これらのデータを、蛍光によって得られた数が、直接、生菌と相互に関連することを確認するために、ＣＦＵに関連して、および蛍光顕微鏡の定量化によって評価する。１μｇ／ｍｌのイソニアジドを、９６ウェルのフォーマットアッセイにおいてＣＦＵおよび蛍光のために既に評価された培養に加えることによって、イソニアジド（ＩＮＨ）処置の効果を評価する。３７℃に設定された培養チャンバーと分光光度計を用いて、および、ＩＮＨの付加後すぐとＩＮＨの付加４８時間後までの様々な時点で、ＣＦＵのために培養されるアリコートを採取することによって、ＣＦＵと蛍光をリアルタイムで追跡する。これによって、各コンストラクトに関する抗生物質による処置後に、シグナル強度、安定性およびシグナルの持続時間に対する知見が得られる。
【０１５４】
＜選択的な組換えＦＰの毒性に対する安定性および効果＞
毒性研究において、菌株をすべて、平行して野生型と比較する。４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの２０の群を、実施例１に記載されるような１００−１０００の間のｃｆｕ／肺で、エアロゾルによって感染させる。各菌株に対する４匹のマウス（野生型、ＦＰ１、ＦＰ２、ＦＰ３、ＦＰ４）の１つの群を、すべての時点（１、１４、２８および７２日）で検死し、ＣＦＵを決定し、組織検査を行い、適切なコンストラクトの存在および肺および脾臓内の蛍光のレベルを決定する。コンストラクトを保持する細菌の個体群の割合を、ＣＦＵのタイタプレートから少なくとも２０の個別のコロニーで処理される蛍光顕微鏡法によって決定する。蛍光レベルは、残りのＦＰの全体のレベルを評価するための、測定された均質化された組織である。
＜エアロゾルによって感染したマウスにおける蛍光タンパク質＞
４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの６つの群を、各々、ｍＰｌｕｍ、ｍＫｅｉｍａ、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｔｄＴｏｍａｔｏのコンストラクト、および、ベクター骨格のみを保持する、１００−１０００の間のｃｆｕ／肺の各菌株とともにエアロゾルによって感染させる（合計３０の群）。菌株を、実施例１に記載されるように、エアロゾル感染のために溶かす。１つは各ＦＰを有し、１つはベクターを単独で有する、４匹のマウスの５つの群を、すべての時点で撮像するために使用し、各時点で４匹のマウスの別の５つの群を組織検査のために殺し、検死し、肺および脾臓内のｃｆｕを決定する。２４時間、７、１４、２８および７２日目で、撮像を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ ２００撮像ステーションを使用して、および各ＦＰのための最適な励起および発光のフィルターを使用して、同じＡＢＳＬ３ｓｕｉｔｅにおいて実行する。ＦＰが、ＩＶＩＳにおいて異なるセットのフィルターの使用を必要とするとき、ベクターはまた、自己蛍光のために制御する同じフィルターセットを使用して、各動物群において単独で撮像される。したがって、細菌重量（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｏａｄ）が、感染後の後の時点で非常に低い（１００ｃｆｕ／肺）実験から非常に高い（＞１０５ｃｆｕ／肺）実験の全体にわたって変化するため、ＩＶＩのための各ＦＰを、この系の感受性と同様に有効にする。ベクター単独の使用によって、自己蛍光、およびＦＰの存在によってもたらされる毒性の潜在的な差の両方が制御される。
【０１５５】
実施例１２
＜培地中の結核の検出に関するＣｌｉｃｋ  ｂｅｅｔｌｅ  ｒｅｄ（ＣＢＲ）＞
ＣＢＲ遺伝子を、既に導入されたＧａｔｅｗａｙ組換え部位を使用して、Ｂｌａに関して記載される４つのコンストラクトのすべてへクローン化する。これらのプラスミドによって、Ｌ５およびｈｓｐ６０プロモーターの両方からの発現が可能となる。発光検知能力を有するマルチモードのマイクロプレートリーダーにおける９６ウェルのプレート、および持続的なシグナルの分解速度と同様に、Ｄ−ルシフェリンを加える間のフラッシュ発光の測定を可能にするインジェクターを使用して、成育培地で各菌株のＤ−ルシフェリンの存在下で光を生成する能力を比較する。アッセイをすべて、細菌の限界希釈法およびＣＦＵの測定とともに４回繰り返して行い、生菌数と生成されるシグナルを相関させることができる。コンストラクトの安定性を、７日間、選択がない状態での成長によって評価し、その後、分光測光法および蛍光の顕微鏡検査によって評価する。シグナル／生存可能な病原菌を測定するために、これらのデータをＣＦＵと相互に関連させ、陽性シグナルを生成する細菌の割合を計算するために、顕微鏡法を用いる。コンストラクトの細菌の生存率に対する効果を、ベクターのみの細菌と比較して、このコンストラクトを保持する細菌の成長を図示することによって、これらのアッセイにおいて評価する。
【０１５６】
＜マウスにおけるＣＢＲの発現、安定性、および、毒性の評価＞
組換えＣＢＲの毒性に対する安定性および効果を、ＩＶＩの保証（ｐｒｏｍｉｓｅ）を示す２つの菌株に関して試験する。毒性研究において、菌株をすべて、平行して野生型と比較する。４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの１２の群を、実施例１に記載されているように、１００−１０００の間のｃｆｕ／肺でエアロゾルによって感染させる。
【０１５７】
各菌株に対する４匹のマウス（野生型、ＣＢＲ１およびＣＢＲ２）の１つの群を、すべての時点（１、１４、２８および７２日）で検死し、ＣＦＵを決定し、組織検査を行い、適切なコンストラクトの存在および肺および脾臓内の蛍光のレベルを決定する。コンストラクトを保持する細菌の個体群の割合を、ＣＦＵのタイタプレートから少なくとも２０の個別のコロニーで処理される蛍光顕微鏡法によって決定する。発光レベルを、残りのＣＢＲの全体のレベルを評価するために、均質化された組織において測定する。
【０１５８】
＜マウス中のＣＢＲを発現する結核およびＢＣＧの菌株の撮像＞
本実施例１に記載されるように、４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの６つの群を、各々、ＲＬｕｃ８とベクター骨格のみを保持する、１００−１０００の間のｃｆｕ／肺の各菌株を用いて、エアロゾルによって感染させる（合計１２の群）。１つがＲＬｕｃ８を有し、１つがベクターのみを有する、４匹のマウスの２つの群を、すべての時点で撮像するために使用し、各時点で、４匹のマウスの別の２つの群を、殺し、検死し、肺および脾臓内のｃｆｕを決定する。２４時間、７、１４、２８および７２日目で、撮像を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ ２００撮像ステーションを使用して、同じＡＢＳＬ３ｓｕｉｔｅで行う。撮像前に、ＩＶＩに十分であると示された１−５μｍｏｌのＤ−ルシフェリンを、尾静脈を用いて静脈内に注入する。
【０１５９】
画像を、化合物の注入前に、および注射の１、２および４時間後に得る。シグナルがこれらの時点のいずれかで観察されると、２４、４８および７２時間後に連続して動物を撮像し、その後、シグナルは消散する。遮光チャンバー中でマトリックスシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して、１００％の酸素中の２％のイソフルランで、イソフルオラン麻酔によって動物に麻酔をかけ、１０ピクセルビンニング（ｐｉｘｅｌ  ｂｉｎｎｉｎｇ）で３〜５分までの積分時間を使用して撮像する。これによって、細菌重量が、感染後の後の時点で非常に低い（１００ｃｆｕ／肺）実験から非常に高い（＞１０５ｃｆｕ／肺）実験の全体にわたって変化するため、このシステムの感受性と同様にＩＶＩのためのＣＢＲが有効となる。ベクターのみを用いることで、自己蛍光、および、ＣＢＲ遺伝子の存在によってもたらされる毒性の潜在的な差の両方が制御される。
【０１６０】
実施例１３
＜ＩＶＩのためのルシフェラーゼ系の潜在性の評価＞
ＲＬｕｃ８ルシフェラーゼを、ＧａｔｅｗａｙＰＣＲクローニングを使用して、記載されるマイコバクテリアの発現系へクローン化する。コンストラクトをＭｔｂへ導入し、細胞全体を使用して、細菌培養培地中で、それらの光生成のために試験する。万一、インタクトな細菌がＣＢＲに対して比較可能な光を生成すれば、細胞内の細菌系は、マウスにおけるＣＢＲと比較することができる。グラム陽性とグラム陰性菌のルシフェラーゼ系は両方とも、基質を生成するという利点を有する。両方のオペロンを、制限消化を使用して、発現系へクローン化することで、それらを、現在のベクターから取り除き、その後、ＧａｔｅｗａｙアダプターおよびＧａｔｅｗａｙ組換えクローニングにライゲーションする。コンストラクトを、細菌培地中でＭｔｂからの光生成のために試験する。光生成が分光光度計のための発光設定で測定されることを除いて、生物発光のためのすべてのアッセイを、Ｂｌａ系に関して記載されるように、９６ウェルのプレートにおいて実行する。光生成をＣＦＵに関連して計算することができるように、すべてのサンプル上で平行して実行される限界希釈およびＣＦＵの決定によって感受性を評価する。
【０１６１】
＜ルシフェラーゼを使用するマクロファージの結核の検出＞
分泌と膜を標的とすることの、マクロファージ中のルシフェラーゼ活性に対する効果を試験する。マイコバクテリアからの分泌は、アミノ末端ＴＡＴシグナルを、Ｍｔｂ ＢｌａＣ（ＢｌａＳＳ）からのシグナル配列に付加し、この融合を、Ｍｔｂ内でＣＢＲを最適に発現する同じコンストラクトに置くことによって、達成される。分泌は、ＣＢＲ、ＢｌａＳＳ：：ＣＢＲおよびベクターのみを発現する初期の対数期まで成長したＭｔｂ菌株からの培養濾液と細胞全体をアッセイすることによって、確認される。この菌株からの培養濾液は、ＣＢＲを発現する菌株よりはるかに高い光生成を有していなければならず、ＢｌａＳＳ：：ＣＢＲからの細胞全体は、ＣＢＲ Ｍｔｂと同じか又はより少ない光生成を有していなければならない。Ｂｌａのために使用されるＣＤ１４からのカルボキシ末端ＧＰＩアンカーを、ＢｌａＳＳ：：ＣＢＲに付加し、融合タンパク質ＢｌａＳＳ：：ＣＢＲ：：ＧＰＩを生成する。
【０１６２】
ＢｌａＳＳ：：ＣＢＲ：：ＧＰＩを発現するＭｔｂを、ＣＢＲとＢｌａＳＳ：：ＲＬｕｃ８を発現する菌株と比較して、細胞内のマクロファージアッセイを使用して、光生成に関して評価する。細菌の滴定および化合物の様々な濃度が試験できるように、Ｊ７７４Ａ．１マクロファージを、９６ウェルのプレートにおいて使用する。アッセイをすべて、Ｂｌａに関して記載されるのと同じ方法で４回繰り返して実行する。得られた測定における宿主細胞透過性の役割を評価するために、Ｄ−ルシフェリンを加える前に、二連のウェルを、０．１％のトリトン Ｘ−１００によって溶解する。すべての時点で、４つの未処置のウェルを、細胞に関係するＣＦＵの数を測定するために使用する。細胞内でのＣＢＲの検出は、Ｄ−ルシフェリンに関する、真核細胞およびマイコバクテリアの液胞の透過性による影響を受け得、そのため、マクロファージ内の細菌に対するその感受性の評価は、非常に重要になる。しかしながら、細菌のルシフェラーゼ系は、細胞内での細菌の成長による著しい影響を受けることが少ない傾向にある。
【０１６３】
細菌のルシフェラーゼ系およびＲＬｕｃ８の各々における光生成を、細胞内アッセイを使用して確認する。ＲＬｕｃ８に関して得られた測定における宿主細胞透過性の役割を評価するために、セレンテラジンを加える前に、二連のウェルを、０．１％のトリトン Ｘ−１００によって溶解する。シグナルの局在化を、最も有効であると示すこれらのコンストラクトについて確認する。これらのアッセイを、類似した方法ではあるが、８ウェルのチャンバースライドを使用して実行する。顕微鏡法は、局在化、陽性シグナルを有する細菌の割合の決定、および局在化されたシグナルの強度の評価を可能にする。
【０１６４】
実施例１４
＜ＩＶＩのための化合物によるＢｇａｌの検出＞
以前に記載された（１７）プロモーターのないＢｇａｌ遺伝子を、制限酵素消化およびＧａｔｅｗａｙアダプターへのライゲーションによって、マイコバクテリアの発現ベクターへクローン化する。これらのベクターを、以前に記載されたような（１８）９６ウェルのプレートにおいて、マイコバクテリアの透過性の蛍光試薬、５−アセチルアミノ−フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｘｃｉｎｅ） ジ−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド （Ｃ２ＦＤＧ）を使用して、細菌培養培地中の評価のためにＭｔｂに移す。この化合物は、Ｂｇａｌによって開裂されるまで、蛍光ではなく、４６０ｎｍで励起され、５２０ｎｍで発光する。最も強力な蛍光シグナルを生成するベクターを、Ｂｇａｌの分泌および宿主細胞の局在化を可能にする追加の融合を構築するために使用する。
【０１６５】
Ｂｇａｌの分泌は、マイコバクテリアの透過性が、Ｂｇａｌを検出するという異なる化合物の能力で役割を果たすかどうかを決定するのを助けるために重要である。Ｂｇａｌを分泌するために、Ｍｔｂ ＢｌａＣ（ＢｌａＳＳ）からのアミノ末端ＴＡＴシグナル配列を付加し、この融合を、Ｍｔｂ内でＢｇａｌを最適に発現する同じコンストラクトに配する。分泌は、ＣＢＲ、ＢｌａＳＳ：：ＣＢＲおよびベクターのみを発現する初期の対数期まで成長したＭｔｂ菌株からの培養濾液と細胞全体をアッセイすることによって、確認される。Ｂｌａのために使用されるＣＤ１４からの同じカルボキシ末端ＧＰＩアンカーを、ＢｌａＳＳ：：Ｂｇａｌに付加し、融合タンパク質ＢｌａＳＳ：：Ｂｇａｌ：：ＧＰＩを生成する。
【０１６６】
Ｂｇａｌコンストラクトをすべて、Ｃ２ＦＤＧ、５−ドデカノイルアミノレソルフィン（ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌａｍｉｎｏｒｅｓｏｒｕｆｉｎ ） ジ−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド （Ｃ１２ＲＧ）および９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＤＤＡＯＧ）による蛍光検出の感受性のために評価する。化合物はすべて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの一部から市販で入手可能である。Ｃ２ＦＤＧが、効率的にＭｔｂにおいてＢｇａｌに入り、検出すると知られているため、この化合物は陽性対照を提供するが、発光のその波長は、ＩＶＩに関して利点を有していない。Ｃ１２ＲＧは、真核細胞を巧みに通り、より長い放出波長（５９０ｎｍ）を有するが、類似した化合物Ｃ１２ＦＤＧは、ＭｔｂにおいてＢｇａｌをさほど検出せず、これは、化合物Ｃ１２ＦＤＧが細菌膜をさほど通らないことを示唆している。
【０１６７】
生成されたシグナルに対する透過性と局在化の効果を確認するために、Ｂｇａｌ活性を、すべての菌株および化合物に関する生菌および細胞全体の溶菌液中で測定する。化合物ＤＤＡＯＧは、真核膜を巧みに通り、Ｂｇａｌ（６６０ｎｍ）による開裂後に最長の発光波長を有しているため、ＩＶＩに関してうまく働くと示された。ＤＤＡＯＧは、Ｂｇａｌ活性を十分に検出する場合、さらなる研究のための最良の化合物になると考えられる。
【０１６８】
＜マウスにおけるＢｇａｌの発現、安定性および毒性＞
組換えＢｇａｌの安定性および毒性に対する効果を、ＩＶＩの保証を示す２つの菌株に関して試験する。毒性研究において、菌株をすべて、平行して野生型と比較する。４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの１２の群を、実施例１に記載されるように、１００−１０００の間のｃｆｕ／肺でエアロゾルによって感染させる。各菌株に対する４匹のマウス（野生型、Ｂｇａｌ１およびＢｇａｌ２）の１つの群を、すべての時点（１、１４、２８および７２日）で検死し、ＣＦＵを決定し、組織検査を行い、適切なコンストラクトの存在およびＣ２ＦＤＧを有する肺および脾臓内のレベルを決定する。コンストラクトを保持する細菌の個体群の割合を、ＣＦＵのタイタプレートから少なくとも２０の個別のコロニーで処理されたＣ２ＦＤＧを使用するＢｇａｌアッセイによって決定する。Ｂｇａｌレベルを、各時点で残るＢｇａｌの全体のレベルを評価するために、均質化された組織において測定する。
【０１６９】
＜マウスにおけるＢｇａｌを発現する結核菌株の撮像＞
Ｌ２Ｇ８５マウスからの細胞がすべて、ＡＣＴＢプロモーターからＦｌｕｃを発現するため、Ｌ２Ｇ８５マウスからの骨髄由来のマクロファージを、Ｍｔｂ菌株を発現するＢｇａｌによって感染させ、ベクターのみを保持する同じ菌株と比較する。マクロファージ感染を、感染したＬ２Ｇ８５マウスからの骨髄由来のマクロファージによって、Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ中の他の細胞内の成育アッセイのための方法と同じ方法で実行する。得られた測定値における宿主細胞透過性の役割を評価するために、Ｌｕｇａｌを加える前に、二連のウェルを、０．１％のトリトン Ｘ−１００によって溶解する。すべての時点で、４つの未処置のウェルを、細胞に関係するＣＦＵの数を測定するために使用する。シグナルの局在化を、最も有効であると示すこれらのコンストラクトのために顕微鏡法によって確認する。これらのアッセイを、類似した方法ではあるが、８ウェルのチャンバースライドを使用して実行する。顕微鏡法は、局在化、陽性シグナルを有する細菌の割合の決定、および局在化されたシグナルの強度の評価を可能にする。Ｌｕｇａｌが検出のためのルシフェリンの代わりに使用されることを除いて、ＣＢＲのために記載されるのと同じプロトコルを使用して、ＩＶＩ研究をマウスで行う。
【０１７０】
実施例１５
＜β‐ラクタマーゼおよび他のタンパク質の結晶構造モデルに基づいた基質プローブ設計：ＢｌａＣ酵素ポケットのモデル化＞
結核菌β‐ラクタマーゼ（ＢｌａＣ）酵素ポケットを、プローブの設計および特異性を改善するために小分子を使用してモデル化する。小分子ライブラリでのように、小分子のハイスループットスクリーニングを、ＢｌａＣの活性部位溝に結合する化合物を確認するために使用して、結晶構造をそこから得た。候補のプローブはインビトロで合成及び試験した。
【０１７１】
＜β‐ラクタマーゼ様酵素及びペニシリン結合タンパク質＞
結核菌内の二つの主要なβ‐ラクタマーゼ様タンパク質（ＢｌａＸ）および二つの主要なペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）をクローン化し、過剰発現させ、精製した。ＢｌａＸとＰＢＰのＫｍ及び結合定数はセフォペラゾン（ｃｅｆｅｒｏｐｅｒａｚｏｎｅ）、ペニシリンおよびシプロフロキサシンにより決定した。候補タンパク質の結晶構造を明らかにし、これを改善されたプローブ活性を持つ特定のプローブを設計するために使用した。
【０１７２】
＜Ｍｔｂ酵素および大腸菌β‐ラクタマーゼＴＥＭ−１間の構造活性の関係性＞
セフォペラゾンを有する、ＢｌａＣおよびＴＥＭ−１の結晶構造を解明する。セフォペラゾン（ｃｅｆｅｒｐｅｒａｚｏｎｅ）に基づいたプローブをモデル化し、設計し、合成する。候補プローブはＢｌａＣおよびＴＥＭ−１のＫｍを決定するために使用する。
【０１７３】
実施例１６
＜新規消光剤及び色素を利用したＲＥＦ感受性の改善＞
ＲＥＦ画像化に使用した前記基質で、マウスの肺結核感染の画像化に成功したことから、この方策が非常に有望であることを示唆している。しかしながら、肺内での検出の閾値が＞１０，０００細菌数であるので、ＲＥＦプローブの感受性を高めることによって検出を改善することは有益である。最近、前記化合物の改善を約束するような、新しい色素および消光剤が、８００ｎｍの範囲で働くＬｉＣｏｒを用いて開発された。ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷと名づけられたこの新しい色素はＣｙ５．５より約１０倍明るく、その長波長によりＣｙ５．５よりはるかに良く哺乳類組織の中を通過するはずである。この色素に基づく化合物およびそれによく適合したＱＣ−１と名づけた消光剤に基づく化合物を設計する。この色素と消光剤に基づいた化合物は、現在のＲＥＦ系の劇的な改善を可能にした。また、２つのＩＲＤｙｅ８００色素である、ＩＲＤｙｅ８００ＲＳおよびＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（図２７）をインビボ画像化の用途のためのＦＲＥＴドナーとして検証した。両方とも７８０ｎｍでの励起及び８２０ｎｍでの発光と同じ蛍光スペクトルを有しているが、それらはＩＲＤｙｅ８００ＣＷがＩＲＤｙｅ８００ＲＳより多くのスルホン酸塩群を持つ点で異なる。この差は異なる生体内の生物分散につながる可能性があるため、その両方を検討した。ＩＲＤｙｅ８００の高い消光効率を有した、対応する色素であるＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１を、蛍光性プローブの中でＦＲＥＴアクセプターとして使用した（図２８）。上記のように、プローブへのこれらの分子の取り込みは、ＮＨＳエステルおよびアミンの間の共役化学作用であり、ＣＮＩＲ５を調製したのと同じ合成手順である。まず、ＩＲＤｙｅ８００色素から作られたこれらＣＮＩＲプローブの加水分解動態は、ＴＥＭ−１  ＢｌａおよびＭｔｂ  ＢｌａＣの両方によって特徴づけられ、また前記プローブを、皮下及び肺の感染でのＭｔｂのインビボ画像化のために評価する。
【０１７４】
ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷに基づいた化合物を最初インビトロで試験し、その次に皮下及び肺の感染に対して有効であることを確認するために、細胞内の研究および動物モデルでの研究を行った。感染部位への蛍光の取り込みは、動物全体のレベルでは、ＩＶＩＳ画像化システムを使用して可視化され、細胞レベルでは、組織の一部、共焦点蛍光顕微鏡検査及び感染した組織の生体顕微鏡検査を用いて蛍光測定器で、蛍光の取り込みを組織ホモジェネート内で確認した。
これらの技術の組み合わせは、感染した組織の標識化特性および感染した宿主細胞内のプローブの取り込みについての詳細な特徴づけを可能にするために、感染したマウスモデルで試験されたすべてのプローブに適用される。
【０１７５】
＜基質の構造的変化を利用したＳＲＥＬおよびＲＥＦ感受性の改善＞
現在の基質プローブはＭｔｂ  ＢｌａＣ活性を検出し画像化できる一方、そのＭｔｂ  ＢｌａＣに対する活性は最適ではない。Ｍｔｂ  ＢｌａＣへの酵素反応を改善したプローブは、検出と画像化の両方に、より高い感受性を与える。Ｍｔｂ  ＢｌａＣの結晶構造は、Ｍｔｂ  ＢｌａＣはより大きな活性部位ポケットを有するという、他のクラスＡのβ−ラクタマーゼとの大きな違いを示す。この構造の差は、Ｍｔｂ  ＢｌａＣのために改善された動態を備えたプローブを設計できる可能性を示唆する。主要な３つのアプローチが、セフォペラゾンに基づいたＢｌａＣプローブの構造の改善、化合物の限定されたライブラリーからのスクリーニングおよび脱離基の修飾のために利用される。確認された適切な化合物を、Ｍｔｂ、細胞内の細菌、皮下及び肺の経路によるマウスへの感染を利用した生体外アッセイを使用して、さらに特徴づける。
【０１７６】
セフォペラゾンの構造に基づいた合理的なアプローチ。
ＴＥＭ−１  ＢｌａおよびＭｔｂ  ＢｌａＣによるＣＮＩＲ５の動態：
ＴＥＭ−１  Ｂｌａ、ｋｃａｔ＝０．３３  ｓ−１、ＫＭ＝１．９μＭ、ｋｃａ
ｔ／ＫＭ＝１．７４×１０５  ｓ−１Ｍ−１；
Ｍｔｂ  ＢｌａＣ、ｋｃａｔ＝０．０７  ｓ−１、ＫＭ＝５．９μＭ、ｋｃａｔ／
ＫＭ＝１．２×１０４  ｓ−１Ｍ−１。
【０１７７】
この動態のデータは、ＣＮＩＲ５がＴＥＭ−１  Ｂｌａに対して好ましい基質であるが、ＣＮＩＲ５がＭｔｂ  ＢｌａＣに対して好ましい基質ではないことを示す。Ｍｔｂ  ＢｌａＣへの特異的な活性に必要な構造の要素を確認するために、多くのセファロスポリンラクタム抗生物質（セフォペラゾン、セファロチン、セファゾリン、セフタジジム、セホキシチン、セファマンドール、セフォタキシムおよびセファレキシン）の動態を、ＴＥＭ−１  ＢｌａおよびＭｔｂ  ＢｌａＣとともに測定した。その結果は、ＴＥＭ−１  Ｂｌａと比較して、セフォペラゾン（図２８）がＭｔｂ  ＢｌａＣに対して好ましい基質であることを示した。
【０１７８】
ＴＥＭ−１は  Ｂｌａ、ｋｃａｔ＝０．２６  ｓ−１、ＫＭ＝２６２μＭ、ｋｃａｔ
／ＫＭ＝１×１０３  ｓ−１Ｍ−１；
Ｍｔｂ  ＢｌａＣは、ｋｃａｔ＝２．０１  ｓ−１、ＫＭ＝７６μＭ、ｋｃａｔ／Ｋ
Ｍ＝２．６×１０４  ｓ−１Ｍ−１。
【０１７９】
Ｍｔｂ  ＢｌａＣのｋｃａｔ／ＫＭ値（２．６×１０４  ｓ−１Ｍ−１）はＣＮＩＲ５のその値（１．２×１０４  ｓ−１Ｍ−１）より良いが、ＴＥＭ−１  Ｂｌａのｋｃａｔ／ＫＭ値（１×１０３  ｓ−１Ｍ−１）はＣＮＩＲ５のその値（１．７４×１０５  ｓ−１Ｍ−１）より１００倍小さい。セフォペラゾン中の位置７のアミンにつながった大きな基から、この選択性の原因である主要な構造グループが生じていると仮定され、それはＭｔｂ  ＢｌａＣのＸ線構造からの発見（ＢｌａＣは位置７に大きな基質結合ポケットを有している）によって支持されると思われる。
【０１８０】
したがって、セフォペラゾンの位置７の基はＣＮＩＲ５に取り込まれ、改善された動態を示すＭｔｂ  ＢｌａＣプローブを作製する（図２９）。まず１）バッファー及びマウス血清中のその安定性、２）精製されたＭｔｂ及び細胞内Ｍｔｂの存在下での動態、そして３）精製されたＴＥＭ−１  Ｂｌａ存在下での動態についてインビトロでこのプローブを試験する。それが同等あるいは改善された膜輸送を示しているかどうか、及び以前のプローブによって示された特性を保持しているかどうかを評価するために、その膜透過性特性をその後ＣＮＩＲ５と比較した。その後、皮下およびエアロゾル感染を通じた動物実験を行い、その後のＭｔｂによる画像化を行う。
【０１８１】
よりよくセフォペラゾンＣＮＩＲプローブの構造および活性関係性（ＳＡＲ）を理解するために、ＢｌａＣに対するその結合のコンピュータモデリングを行った。それと並行して、複合体の構造を解明するために、プローブはＢｌａＣとともに共結晶化した。結果として生じた構造についての情報を、改善されたプローブを合理的に設計するために適用した。
【０１８２】
＜改善された感受性を持つプローブを同定するための迅速で限定された構造ライブラリー分析＞
セフォペラゾンＣＮＩＲプローブを合成し試験した後に、ライブラリー・アプローチを、Ｘ線の構造の研究によるＳＡＲの改良と平行して、選択性を改善するために試みた。
【０１８３】
ＣＮＩＲプローブよりＢｌｕｃｏを調製する方がはるかに容易なので、Ｂｌｕｃｏに基づいた基質を、酵素反応を単純に迅速に読み出すために利用した。セフォペラゾンアナログの偏った小規模なライブラリを構築するために、Ｂｌｕｃｏをテンプレートとして利用した。このライブラリを構築し、かつ多様性を作り出すために、位置８をピペラジン２，３―ジオンで置換したもの（Ａ）とともに位置６をフェニルグリシルメチルエステルで置換したもの（Ｂ）を利用した。これらのすべては市販で入手可能である。これは４８のメンバーの生成につながった。
【０１８４】
その後、Ｂｌｕｃｏの最終的な４８のアナログを生成するために、Ｂｌｕｃｏ前駆体（Ｃ）によりライブラリを反応させた。ライブラリをＤ―ルシフェリンのカルボキシラト基を介した固い支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）の上で調整した。ライブラリー調製にこれらの化合物をすべて含む前に、各々のメンバーに関するコンピューター・モデリング研究を、すべてがＢｌａＣの活性部位ポケットに潜在的に適合することを確認するために、ＢｌａＣの利用可能なＸ線構造に基づいて行った。
【０１８５】
ライブラリのスクリーニングを発光マイクロプレート・リーダを使用した、ハイスループットアッセイにより行った。動態のスクリーニングの前に、第１の工程がバッファー中での化合物の安定性をふるいにかけることであった。動態を、共培養の初期の時点で陽性対照として、もとのＢｌｕｃｏ基質およびルシフェリンの発光レベルと比較することにより評価した。有益な動態を有する化合物は、ルシフェリンの急速な加水分解および放出が、基質を加えた後数分以内の高レベルの発光を結果として生じさせることを示した；一方でもとのＢｌｕｃｏ分子は数時間の共培養の後に最大レベルの発光を示す。これらの研究は、光学式画像化に対する高い感受性とＢｌａＣに対する改善された動態を示すＣＮＩＲ及びＢｌｕｃｏの基質の基礎として使用することができる、新しい化合物を提供する。
【０１８６】
＜改善された動態のための修飾された脱離基：３’−位置でのアリル結合（ｌｉｎｋａｇｅ）＞
フェノール類のエーテル間での二重結合の挿入がフェノール基の放出動態を大幅に増加させることは以前に示されている［ＪＡＣＳ、２００３、１２５、１１１４６−１１１４７］。例えば、ｋｃａｔはフェノール類の脱離基に関して５倍から５４  ｓ−１に増加した。この所見に基づいて、二重結合をＣＮＩＲプローブに導入した。例えば、図２８に示される構造について、対応するプローブを図３１に示した。以前の実施例において、二重結合はシス型配置を有するが、その配置はここではるかに大きなアリル基によってトランス型になることが期待される。同様に、Ｂｌｕｃｏへの二重結合の導入は、Ｂｌｕｃｏよりも優れた反応速度を有することが期待されるＢｌｕｃｏ２をもたらす（図３０）。
【０１８７】
＜３’−位置でのカルバマート結合＞
３’−位置での結合の第二のタイプは、加水分解後のより速い分解をもたらし、したがってよりよい感受性をもたらす。この設計はカルバマート結合、ＤルシフェリンおよびアミノＤルシフェリンのアミノアナログを利用する。カルバマート結合は、優れた脱離基としてプロドラッグ設計の中で広く使用されてきた。Ｂｌａ開裂は、カルバマートを放出し、そのカルバマートはその後二酸化炭素およびルシフェラーゼ用の基質である遊離したアミノＤ―ルシフェリン（図３２）へと分解される。同様に、この結合は、ＣＮＩＲプローブにも適用される（図３２）。
【０１８８】
＜組織分布の評価によるＳＲＥＬおよびＲＥＦ感受性の改善＞
組織分布研究はその存在濃度を測定するためにＣＮＩＲ基質の蛍光を使用して行った。開裂によって蛍光は増加するので、非開裂基質の分布はＢｌａＣ存在下で培養され、蛍光を測定することで決定し、開裂基質濃度は直接の蛍光測定によって決定した。この方法によって組織中の基質の存在を見積もることができるが、組織試料内の自己蛍光、潜在的な阻害剤の存在および基質の自発的な加水分解が、得られたデータに影響を与えるので、それは決定的ではない。より多くの詳細な組織分布データが、放射性標識したプローブの分布による試験を通じて得られる。容易にインビボのプローブの分布を追跡できるように、ＣＮＩＲ５をＩ−１２５など放射性ヨウ素により標識化した。ＣＮＩＲ５内の芳香族基を、タンパク質中のチロシンを標識化するプロトコルを使用して、同様にヨウ素化した。標識化されたプローブを、マウスに注入し、動的なＳＰＥＣＴイメージングを行った。異なる期間で、放射能測定用に器官を集めるためにマウスを殺した。並行して、プローブの遊離した画分を、解剖検査の後で得られた可溶性画分を使用して、ＨＰＬＣで直接評価した。（全体の及び可溶性の）組織ホモジェネートをコールドプローブを使用して蛍光によって評価し、ＨＰＬＣによって可溶化し、その後ホットプローブのための画分をシンチレーション検出した。新しいＭｔｂに特異的なプローブが開発され、組織分布を改善できる潜在性という観点を提供するために有効になる時、同じ実験をそのプローブを使って行う。
【０１８９】
＜β‐ガラクトシダーゼを使用したＳＲＥＬとＲＥＦの感受性の改善＞
より良い酵素反応あるいは使用可能な基質に起因して、異なるＳＲＥＬ／ＲＥＦ酵素系はＢｌａＣと比べて重要な利点を有する可能性があるので、ＳＲＥＬ／ＲＥＦをＭｔｂについてβガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）に蛍光を付加したもの（ＤＤＡＯＧ）あるいは発光性基質（Ｌｕｇａｌ）を用いた。ＤＤＡＯＧとＬｕｇａｌの両方は、インビトロ画像化のために、およびＬｕｇａｌはマウス中の皮下感染を画像化するための利用に成功した。ＤＤＡＯＧはインビトロで期待できる結果を示したが、これをインビボでは評価していない。蛍光性基質の利用は、発光基質とともにルシフェラーゼが輸送される必要がある発光性基質を超えるいくつかの利点を持っているので、我々にとってＤＤＡＯＧが生体内でもＬｕｇａｌと同様に感受性があるかどうか確認することが重要になってくる。この系はＢｌｕｃｏが抱えているのと類似の問題を抱えている。ＤＤＡＯＧまたはＤＤＡＯＧに基づいて改善された修飾した化合物は、最も感受性が高い系のうちの１つであると最終的に証明するかもしれない。また、すでに多くの研究者が使用している比色分析レポーター系は多数存在し、生きている動物中の結核感染の画像化に成功すれば、これらの系は即座に結核研究分野のコミュニティーの中で有益なものとなる。
【０１９０】
実施例１７
＜大きなラクタムを用いたＳＲＥＬとＲＥＦプローブの特異性の改善＞
改善された感受性を備えたプローブを開発するために使用されるのに類似した戦略を、他の細菌の種類の中にあるβ‐ラクタマーゼ上のＭｔｂ  ＢｌａＣに選択的なプローブを開発するために使用した。これらのβ‐ラクタマーゼ酵素の中で最もよく特徴づけられているのは、大腸菌ＴＥＭ−１であり、それは多くの動態アッセイに使用されており、また真核生物の系の中で有益なレポーターとして使用されている。感受性を改善するためのそれと比較して、使用されるアプローチの主な違いは、動態の中でＭｔｂ  ＢｌａＣと大腸菌ＴＥＭ−１の間の最も大きな差異を有している化合物に焦点をあてることである。ほとんどのベータ―ラクタムはＴＥＭ−１酵素でより優れた動態を示すが、ＴＥＭ−１よりＭｔｂ  ＢｌａＣでより優れた動態を示す３つのベータ―ラクタムが確認されている。それらはセフォペラゾン、セフォタキシムおよびセホキシチンである。これらの化合物は、それらの動態において大きく異なるが、セフォペラゾンは、ＴＥＭ−１酵素に比べてＭｔｂ酵素と１０−１００倍速い動態を見せるため、この酵素に特異的なプローブの開発のためのよい候補であることを示唆する。ＣＮＩＲ化合物をセフォペラゾンに基づいて構築し、その特異性は、精製されたＢｌａＣおよびＴＥＭ−１を蛍光を含む９６ウェルフォーマットの中でリードアウト（ｒｅａｄｏｕｔ）して使用し、その酵素反応パラメーターを測定して評価される。
【０１９１】
＜限定された構造ライブラリを使用したＳＲＥＬおよびＲＥＦプローブ特異性の改善＞
実施例１６において開発した化合物のライブラリーもＳＲＥＬとＲＥＦプローブの特異性を改善するために使用することができる。しかし、酵素反応ではなく特異性に注目する修正されたハイスループットスクリーンが使用される。基本的に、化合物はそれぞれ上記のようにＢｌｕｃｏに基づいた基質として合成する。また、化合物は、ハイスループット発光アッセイ中の精製されたＢｌａＣおよびＴＥＭ−１が存在する状態で評価する。化合物はすべて、ヒットを確認するためにＢｌａＣで探索し、また他の酵素に乏しい基質を確認するために、ＴＥＭ−１  Ｂｌａにより探索した。加えて、安定した化合物のみが得たことを確認するために、化合物をすべて、３７°Ｃの水の中での安定性によって予めふるいにかけた。複数のアッセイは並行して進め、全ての結果をＴＥＭ−１発光に対するＢｌａＣの比率として表した。最初に、閾値は、３０分間の反応の後に、ＢｌａＣとともに１０倍以上速い動態を示す分子で設定された。固体構造活性相関（ＳＡＲ）を構築するために、化合物をそれぞれ、ＢｌａＣおよびＴＥＭ−１酵素の結晶構造に対してコンピュータモデル化した。これらの結果をＲＥＦのために使用するＣＮＩＲ基質に変換することができるという想定が、ＣＮＩＲ及びＢｌｕｃｏに基づくセフォペラゾンプローブ活性の比較により、先ず確認された。
【０１９２】
手持ちのこれらのデータにより、優れた特異性と同定されたラクタムを、ＲＥＦプローブへとさらに開発し、またマクロファージの細胞内で成長するとき、また皮下とエアロゾル移植の後のマウス内での感染中に、生体外でＭｔｂ全細胞を検出するそれらの能力を評価した。
【０１９３】
実施例１８
＜生きたマウス内を画像化するためのＣＢＲの評価＞
初期の研究では、ｃｌｉｃｋ  ｂｅｅｔｌｅ  ｒｅｄ（ＣＢＲ）ルシフェラーゼが、生体外および培養細胞中でＭｔｂのレポーターとして良く機能することが発見された。ＣＢＲは生成されたシグナル及び生体外での検出の閾値の観点から、ホタル・ルシフェラーゼ（ＦＦｌｕｘ）に匹敵すると見出された。しかしながら、マウスの皮下及び肺の感染中に、ＣＢＲの検出の閾値はＦＦｌｕｘより著しくよかった。この予備的な観察は、生体内での細菌の代謝に対する、あるいは発光の動態に対して効果を表す、接種材料の違いによるものかもしれない。これらのパラメータの各々は肺及び皮下の感染中にＭｔｂの存在率を示すレポーターとしてＣＢＲの有用性を注意深く分析することで評価する。原因であるレポーターを明らかにするために、発光の動態は、同じ動物内で異なる部位に皮下移植することと、生物発光シグナルのスペクトル  ｕｎｍｉｘｉｎｇの使用とを組み合わせることによって、直接ＦＦｌｕｘを評価し、比較した。肺の感染は、同等の病原菌に感染した二匹のマウスを並行して、別々に評価した。低酸素性疾病下の生体外シグナル強度の効果を評価することにより、低酸素性の病変内のＣＢＲの潜在的な感受性への見識が得られた。生体内で遭遇するかもしれない他のストレス、例えば低ｐＨ、およびＲＯＳとＲＮＳの存在、を試験した。
【０１９４】
＜治療上の評価のためのＣＢＲ画像化分析＞
ＣＢＲルシフェラーゼシグナルはＡＴＰの存在に依存するので、この画像化システムは迅速に細菌の生存に対する治療上の効果を評価する、独自の機会を提供する。このシステムに関する主な疑問のうちのいくつかは、シグナルの測定可能な違いがどれくらい迅速に得られるか、また、それを、ＭＩＣを決定するためにどれくらいな正確さで用いることができるかということである。このアッセイではイソニアジドとリファンピシンを使用するので、ＭｔｂのためのＭＩＣを決定できる。実験で決定されたＭＩＣを、ＯＤ及びＣＦＵに基づくアッセイにより得られたそれと比較した。シグナルロスの動態を、全体のＭｔｂ及び細胞内でマクロファージを使用したアッセイを用いて、０．５ｘ、１ｘおよび５ｘＭＩＣの抗生物質存在下で評価した。一度動態がインビトロで測定され、及びＣＦＵによって生存率の違いを比較し、処置後に細菌を生育させる能力およびＣＦＵと発光の間の優れた相関性が残るかを評価した。一旦ＣＦＵと発光の間の相関が生育した細菌の生体外で測定されると、マウス中の皮下及び肺への感染の間の処置の発光に対する効果の動態を試験した。肺および皮下の環境間で細菌へのアクセスのしやすさに差があると思われ、それによりシグナルロスの動態がまた異なる傾向があるので、両方の接種ルートを使用した。これらの研究は、マウスでの治療の迅速な評価のためのＣＢＲの有用性に対する見識を提供する。これらの実験は結果を迅速に得られることを可能にするために、感染の急性期に注目する。しかし、この系が細菌が高い確率で複製していない可能性があるときに、治療上評価するのにも役立つかどうか確認するために、後でこの実験は、マウスで感染の慢性期の間に行う必要がある。
【０１９５】
＜デュアルＣＢＲ−ＲＥＦ光学式画像化システムの開発＞
細菌の生存率について迅速な読み出しが可能であるはずなので、ＣＢＲ系は有利である。しかし、いくつかの場合においては、このタイプの系が最適ではないかもしれない。細菌の代謝率が最大の光生成を可能にするのには十分でない状況では、ルシフェラーゼに基づいた系は最適な代謝条件下ほど敏感ではないかもしれない。ＣＢＲを使用して、治療への効果を評価した。異なる組織中の病原菌の量を測定し、また、ＲＥＦを使用して、それらの細胞の位置を決定した。異なる環境中の細菌数を評価するための、これら２つの系の潜在的な有用性に対する知見を得るために、ＣＢＲおよびＲＥＦシグナルロスの両方の動態を、肺及び皮下感染の後にマウスで試験した。発光は、抗生物質の送達ですぐに減少した。また、ＲＥＦシグナルはシグナルロスを観察するために２４時間を要した。代謝活性に対する、ＣＢＲおよびＲＥＦ間の感受性の差異は、代謝期と共同でリアルタイムの細菌数を評価する潜在的な能力を提供する。これは、Ｍｔｂ感染中に動物内のすべての細菌の代謝期がどうなっているのか不明瞭なままであるので、発展させるべき重要な系である。この画像化システムは、リアルタイムでの各シグナルがある状態またはない状態で、生きている動物内の異なる環境への移動を直接観察することができる最初の手段を提供する。この能力は、治療を評価することにあたって特に重要であると分かるだろう。というのも、治療が他の環境でそうでない中、それはいくつかの環境下で殺菌性でありうるからであり、このことが前臨床研究の継続に対する重大な考慮となる。
【０１９６】
実施例１９
＜比色分析および化学画像化システム＞
＜比色分析アッセイ＞
可視的なアッセイ系では、蛍光色素分子の直接の代替として有色色素を利用することができる。可視の色素としては、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ローダミン、ブロモクレゾール色素（多色）、シアニン染料などが挙げられる。蛍光系と異なり、基質に付加したままの間は、これらのタイプの色素は目に見え、検知可能である。それ故、結合の分離と色素の遊離が必要である。遊離した色素は下流の、後に続く可視化される検出領域へ移動する。これらの色素は非常に小分子であり、それ故に遊離した色素は目で確認できる必要な分の感受性を得るためには、下流で濃縮する必要はある場合がある。
【０１９７】
＜化学試薬アッセイ＞
可視の化学試薬フォーマットは、可視の検出体でも利用することができる。色素の代わりに、ｐＨ変化を誘発するものなど特定の化学物質または他の化学的に色の変化を誘発するものを置換する。化学物質は結合した複合体から分離され、他の試薬との化学的な相互作用によって結果として検出可能な可視のシグナルが得られる、下流の別の検出領域へ移動する。このフォーマットは濃縮方法が必要でないかもしれないことにおいて、可視の色素フォーマットと異なる。増幅のある基準は、ｐＨ変化など変色反応の性質によって達成される。二次的な化学反応が、β‐ラクタマーゼ反応の下流で起こり、例えば、乾燥した二次的な試薬を含んでいるセルロース・パッド内で分離することができる。
【０１９８】
＜比色分析及び化学試薬可視化アッセイでの下流の検出＞
可視の系は、例えば複合体をラテックス粒子またはビオチンに結合させるように、基質（検出分子から遊離した）及び／又は複合体全体（結合検出分子を含んで）を保持するよう設計している。複合体をラテックス粒子に結合させることによって、粒子はろ過膜によって保持されるので、遊離した色素のみが検出領域へ移動することが可能になる。もう一つの方法として、複合体に対するビオチンの結合によって、すなわち、色素または化学試薬を伴う基質、遊離及び結合物質は、固定されたアビジンが基質と複合体に結合する、第２の領域に移動する。遊離した色素のみが検出領域へ移動する。
【０１９９】
これら可視の診断アッセイでは、ラテックス粒子は、他のリガンドに結合して固定する固相として利用することができる。また、それらは有色色素の使用を通じて検出可能な粒子になりうる。タンパク質または他の分子は、一般的に行われる化学作用によって活性化された微粒子の表面へ常に付加することができる。例えば、診断アッセイでは、複合体は、適切な大きさに合わせたラテックス微粒子に直接結合するかもしれない。その後、この試薬は、消毒した痰サンプルと直接混合する。適切な培養期間の後、混合物を装置に加えた。ラテックス粒子は、統合グラスファイバーフィルターによって閉じ込められ、遊離した色素（図３３Ａ）または他の化学物質（図３３Ｂ）のみが、検出領域に向かって下流に移動することを可能にする。液体の移動のメカニズムはニトロセルロースなど吸水性に優れた膜の毛細管作用による。色素は抗体または他の相補的な結合リガンドによって捕捉される。
【０２００】
診断上のアビジン・ビオチン可視の検出系では、ビオチン化された基質の１００％を捕らえるために下流の膜の上でアビジンを固定する。その後、遊離した色素または化学物質のみが、検出領域に向かってストリップに沿いながらさらに流れる。検出領域は、上に提示された系と本質的に同一である。色素は可視化のための線で捕捉される。あるいは、化学反応が吸収性シンク（ａｂｓｏｒｂｅｎｔ  ｓｉｎｋ）内の下流で起こるだろう。色素（図３３Ｃ）または化学試薬（図３３Ｄ）の系のいずれかでは、エンドユーザーが試験の結果を解釈する間にそれらを見ることができないように、基質／複合体アビジン捕捉線を視界から隠すことができる。内部対照線は、有効な痰サンプルが得られ、試験が正確に行なわれたことを使用者に示す。すべてのヒトの痰に共通する標的として、いくつかの選択肢がある。
【０２０１】
以下の参考文献が本明細書にて引用された：
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１１．  Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  ８０：１３４−１３９．
１２．  Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １０１：２２１−２２６．
１３．  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，  Ｒ．  ２００１，  ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １９：３１６：３１７．
１４．  Ｘｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，  １２７：４１５８−４１５９．
１５．  Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７１：１８１８８−１８１９３．
１６．  Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２６９：１０４４４−１０４５０．
１７．  Ｃｉｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７３：７７７２−７７８０．
１８．  Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，  １７９：３１７−３２５．
【０２０２】
この明細書で言及した任意の特許または出版物は、本発明に関係する当業者のレベルを示す。これらの特許と出版物は、あたかも個々の刊行物が参照によって特別かつ個別に組み込まれるかのように、同程度に、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０２０３】
本発明は、上に延べられるような、及び本明細書固有の目的を実行し、結果と効果を得るのに、本発明が非常に適していることを容易に理解するだろう。本発明の精神と範囲から逸脱することなく本発明を実施するにあたり、様々な修正および変更がなされることは、当業者に明らかである。請求項の範囲によって定義されるような本発明の精神の範囲に含まれる本明細書の変更とその他の用途は、当業者はすぐに思い浮かぶであろう。
【図４Ｃ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２６Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【国際調査報告】
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