(57)【要約】生体試料中のグラム陽性菌の有無を検出する方法。生体試料は、任意の哺乳動物から取得可能であり、少なくとも細胞成分を含有する。試料は、アクロモペプチダーゼ等の酵素的溶解薬と組み合わされ、室温で溶解される。次に、酸化第二鉄が、アクロモペプチダーゼを含有する試料に添加される。磁場が試料に適用され、核酸が細胞成分から抽出される。標的核酸は、存在する場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の技術を使用して増幅され、次にグラム陽性菌の有無を検出するのに使用される。黄色ブドウ球菌、およびストレプトコッカス・アガラクティエは、本発明の方法により検出される標的細菌の例である。
2013521804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在する場合、核酸を標的細菌から抽出する方法であって、
ａ）細胞成分を含む生体試料を室温で溶解させるステップであって、前記生体試料が、アクロモペプチダーゼと組み合わされるステップと、
ｂ）酸化第二鉄粒子を前記生体試料と組み合わせるステップであって、前記溶解した試料からの核酸が、前記酸化第二鉄に結合するステップと、
ｃ）前記酸化第二鉄粒子に結合した核酸を前記生体試料から磁気的に分離するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記核酸は、磁場を使用して前記生体試料から抽出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸化第二鉄粒子は、コーティングされていないことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体試料は、緩衝液と組み合わされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記緩衝液は、前記生体試料に対して等張性の環境を形成することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記緩衝液は、前記細胞成分の生存能力を維持することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記緩衝液は、ｐＨが制御された低塩環境を形成することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記緩衝液は、１０％リン酸緩衝化生理食塩水溶液、Ａｍｉｅｓ培地、Ｓｔｕａｒｔｓ培地、およびトリスＥＤＴＡからなる群より選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記標的細菌は、グラム陽性菌であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的グラム陽性菌は、黄色ブドウ球菌、およびストレプトコッカス・アガラクティエからなる群より選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体試料は、尿、精液、喀痰、血液、唾液、粘液、および糞便から本質的になる群から採取されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体試料は、環境から採取されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体試料は、水または土壌から採取されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料は、環境に見出される任意の物体表面から採取されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
生体試料中に存在する場合、標的グラム陽性微生物の核酸を抽出する方法であって、
ａ）細胞成分を含む生体試料を室温で溶解させるステップであって、前記生体試料が、アクロモペプチダーゼおよび１０％リン酸緩衝化生理食塩水溶液と組み合わされるステップと、
ｂ）酸化第二鉄粒子を前記生体試料と組み合わせるステップであって、存在する場合、前記溶解した生体試料からの核酸が、前記酸化第二鉄に結合するステップと、
ｃ）前記酸化第二鉄粒子に結合した核酸を前記生体試料から磁気的に分離するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記標的グラム陽性微生物は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
室温は、約１８℃から約２２℃の範囲内にあることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
生体試料中に存在する場合、標的微生物の有無を検出する方法であって、
ａ）生体試料をアクロモペプチダーゼと組み合わせるステップであって、前記生体試料が、少なくとも細胞成分を含むステップと、
ｂ）前記生体試料の前記細胞成分の少なくとも一部分を約１８℃から約２２℃の温度で溶解させるステップと、
ｃ）酸化第二鉄粒子を前記生体試料と組み合わせるステップと、
ｄ）存在する場合、前記溶解した細胞成分からの核酸を前記酸化第二鉄粒子の少なくとも一部に結合させるステップと、
ｅ）磁場を使用して核酸を前記生体試料から単離するステップであって、前記核酸が存在する場合、前記標的微生物の前記細胞成分からの核酸を含むステップと、
ｆ）存在する場合、前記標的微生物の前記細胞成分からの前記単離された核酸を増幅するステップと、
ｇ）前記標的微生物の核酸の有無を検出するアッセイを実施するステップと、
ｈ）前記アッセイにおいて検出された前記標的微生物の核酸の前記有無に基づき、標的微生物の有無を判定するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記標的微生物は、グラム陽性菌であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記グラム陽性菌は、黄色ブドウ球菌、およびストレプトコッカス・アガラクティエからなる群より選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体試料は、１０％リン酸緩衝化生理食塩水溶液、Ａｍｉｅｓ培地、Ｓｔｕａｒｔｓ培地、およびトリスＥＤＴＡからなる群より選択される緩衝液と組み合わされることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体試料は、少なくともステップｂ）からステップｅ）について、約１８℃から約２２℃の温度に維持されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［背景技術］
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれている、２０１０年３月１６日に出願された米国特許仮出願第６１／３１４，３１８号明細書の出願日の利益を主張するものである。
【０００２】
いくつかの種のグラム陽性菌は既知の病原体である。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、およびストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）は、哺乳動物における特に悪性感染症の根本的原因であることが知られている２種類の細菌である。これら病原体の検出は、診断および治療の成功にとって重要である。
【０００３】
病原菌を検出するのに有用な多くの方法が存在し、そのいくつかは、細菌細胞壁の溶解に依存する。溶解後、核酸は、その後細胞成分から抽出され、下流プロセス、例えばＰＣＲで増幅される。次に、核酸の有無が感染指標として使用される。
【０００４】
グラム陽性菌の溶解は、一部にはその細胞壁の構造に起因して特に困難である。グラム陰性菌およびグラム陽性菌のいずれも、その細胞壁内にペプチドグリカン層を含む。この層は、ペプチド架橋により架橋したグリカン鎖から構成される。しかし、グラム陽性菌では、ペプチドグリカン層内の架橋の量、厚さ、および程度はより広範に渡る。（例えば、非特許文献１参照）。このより堅牢なペプチドグリカン層は、グラム陽性菌が酵素的に溶解するのを難しくしている。
【０００５】
溶菌酵素アクロモペプチダーゼは、グラム陽性菌の有効な溶解薬である。しかし、これは欠点がないわけではない。アクロモペプチダーゼは、確かにグラム陽性菌の細胞壁を有効に溶解させるが、その活性がある時間が経過した後停止しなければ、さらに下流分析、例えばＰＣＲを行うのに必要なその他の重要な細胞構成成分を溶解させ続ける。
【０００６】
試料温度を顕著に上昇させることは、アクロモペプチダーゼの溶解活性を停止させる１つの方法である。この温度上昇、あるいはヒートスパイクとして知られているものは、この酵素のあらゆる溶解活性を止める。しかし、この種類の熱を生み出すシステムの作製は高価であり、顕著な複雑性を診断プラットフォームに付加する。本発明は、ヒートスパイクをなくすことと、アクロモペプチダーゼの溶解活性を停止させる抽出方法を使用することとによりこれらの困難を克服する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願第１１／７８５，１４４号明細書
【特許文献２】米国特許出願第１１，９７９，７１３号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mahalanabis et al., Cell lysis and DNA extraction of gram-positive and gram negative bacteria from whole blood in a disposable microfluidic chip, Lab Chip, 9, 2811-17 (2009)
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、溶解薬としてアクロモペプチダーゼを使用して核酸を生体試料から抽出する方法を提供する。１つの実施形態では、抽出は、生体試料から開始する。生体試料は、細胞成分を含有するが、その他の構成成分も有する場合がある。生体試料は、次にアクロモペプチダーゼと組み合わされ、室温で溶解される。本明細書で使用する場合、溶解とは、機械的または非機械的外部手段による細胞壁および細胞膜の破壊として定義される。本明細書に記載されている方法は、機械的手段を使用せずに溶解を実現する。さらに別の実施形態では、試料は、１８℃と２２℃との間の特定の温度で溶解される。
【００１０】
さらなる実施形態では、試料は、アクロモペプチダーゼ、および１０％リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）溶液と組み合わされる。ＰＢＳ溶液は、生体試料に対して等張性の環境を提供し、試料内の細胞成分の生存能力を維持するのを支援し、ｐＨレベルが制御された低塩環境をさらに提供する。ＰＢＳ溶液に加え、本発明のさらなる実施形態は緩衝液として、Ａｍｉｅｓ培地、Ｓｔｕａｒｔｓ培地、およびトリスＥＤＴＡを利用する。
【００１１】
溶解後、試料は酸化第二鉄に添加され、核酸が磁場を使用して試料から抽出される。抽出後、核酸は次に増幅され、試料中のグラム陽性菌の有無が検出される。本発明により検出されるグラム陽性菌のうちには、黄色ブドウ球菌およびストレプトコッカス・アガラクティエがある。さらに、本発明の方法は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を標的とするのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】折り取られ、試料チューブ内に放置され得る先端部を有する試料スワブを利用する、本発明の１つの実施形態を示す図である。
【図１Ａ】折り取られ、試料チューブ内に放置され得る先端部を有する試料スワブを利用する、本発明の別の実施形態を示す図である。
【図２】生体試料を保持する能力を有するテーパ付きの底部を備える円筒形の試料チューブを利用する、本発明の１つの実施形態の斜視図である。
【図２Ａ】生体試料を保持する能力を有する円筒形の試料チューブを利用する、本発明の別の実施形態の側面図である。
【図２Ｂ】生体試料を保持する能力を有する円筒形の試料チューブの下面図である。
【図２Ｃ】生体試料を保持する能力を有するテーパ付きの底部を備える円筒形の試料チューブを利用する、Ａに沿った図２の断面を示す図である。
【図２Ｄ】生体試料を保持する能力を有する円筒形の試料チューブを利用する、本発明の別の実施形態の側面図である。
【図３】試料チューブを密封するための貫通可能なキャップを利用する、本発明の第３の実施形態の斜視図である。
【図３Ａ】試料チューブを密封するための貫通可能なキャップを利用する、本発明の１つの実施形態の平面図である。
【図３Ｂ】試料チューブを密封するための貫通可能なキャップを利用する、本発明の１つの実施形態を示す側面図である。
【図３Ｃ】２つの密封膜を備える試料チューブを密封するための貫通可能なキャップを利用する、Ｂに沿った図３の断面を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載されているのは、溶解特性を有する酵素を使用して細胞を溶解させる方法である。あらゆる種類の細胞が、述べられている方法により溶解され得る。好ましい実施形態では、グラム陽性菌の細胞が溶解される。しかし、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方が、本発明の方法を使用して溶解され得る。この方法は、核酸を溶解した細菌から抽出することを企図する。抽出された核酸は、次に当業者に公知の目的（すなわち、核酸が抽出される標的物の診断および検出）で使用される。診断および検出の目的で核酸を使用することは周知であるので、標的核酸の単離および検出のためのアッセイ等について、本明細書では詳細に記載されていない。好ましい実施形態では、標的核酸はＤＮＡである。
【００１４】
あらゆる細菌の細胞が、本明細書に記載されている方法を使用して溶解可能である。したがって、本発明は、幅広い細菌（ｂａｃｅｒｉａｌ）種の診断および検出に有用である。本発明で有用な細菌種の例として、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）およびストレプトコッカス・アガラクティエ（ＧＢＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されている方法により検出可能な細菌のその他の種は、クラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）および淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）である。
【００１５】
標的細菌の有無について、本明細書に記載されている方法により試験される試料は、任意の従来の方法を使用して採取され、決して試料の供給源に限定されない。あらゆる可能な細菌供給源が、本明細書に記載されている方法により分析可能である。
【００１６】
試料採集は、従来の手段、例えばスワブ、採血、尿試料等により可能である。１つの好ましい実施形態では、試料は膣直腸スワブから取得可能である。別の好ましい実施形態では、細菌試料は、鼻腔スワブから取得可能である。試料は、尿、精液、喀痰、血液、唾液、粘液、糞便、またはヒトもしくは動物に由来する任意のその他の組織もしくは体液から、上記従来の採取方法のいずれかを使用して採取可能である。
【００１７】
本発明のその他の実施形態では、試料は水および土壌試料を含むが、これらに限定されない環境から採取可能である。かかる試料は、スワブ等の上記の従来の方法を使用して採取される。水および土壌に加えて、任意の表面または物体が、当技術分野において公知の方法によりスワブで拭き取られ、本明細書に記載されている方法により分析され得る。本発明者らは、本発明の実施形態を使用して環境全体にわたる様々な場所での細菌の存在を検出することを企図する。これには、カウンター、ドアノブ、自動車のハンドルなどの物体の表面、浴室表面、および当業者が細菌を含むと考えることができる環境内の任意のその他の物理的場所等の表面が含まれるが、決してこれらに限定されない。
【００１８】
記載されている方法では、検出用試料からの抽出を目的として、アクロモペプチダーゼを使用して細菌を溶解させて核酸を生物から遊離させる。核酸は、試料中の標的細菌の存在を表すシグネチャー指標である。アクロモペプチダーゼは、塩分増加に対して感受性であることが公知であるので、下記に詳細に記載されている特定のステップが、アクロモペプチダーゼを使用して溶解のための試料を取得および調製するのに好適に採用される。
【００１９】
１つの実施形態では、検体は採取および輸送デバイスにより採取される。輸送デバイスの１つの例は、図２に示されている。輸送デバイスは、湿ったスワブが使用されて標的生物、例えばＭＲＳＡ、ＧＢＳ等を含有する可能性のある試料を採取するシステムである。
【００２０】
本発明の１つの実施形態は、図１および図１Ａで示されているスワブを使用する。湿ったスワブ採取デバイスの目的は、オンサイト試料採取を容易にすること、および採取された生物の生存能力を引き延ばすことである。スワブそのものは、スワブ試料を取得するように構成された先端部１０３を有する。先端部１０３は、当業者に一般的に公知の手段により設計され得る。スワブは、試料部位をスワブで拭き取った後、例えば鼻腔をスワブで拭き取った後、採取部位で採取部分が折り取られて輸送チューブ２０１内に収まり得るように穿孔１０１を備えることもできる。
【００２１】
輸送チューブ２０１は、図２、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、および図２Ｄに示されている。チューブ２０１は、形状が一般的に円筒形であり、開口部２０２および試料空間２１１を備えることができる。チューブ２０１は、ネジ山がその上に配置されていてもよい最上部２０３、および底部２０７を備える。１つの実施形態では、底部２０７は、テーパ部２０９を有し得る。
【００２２】
スワブがその中に保持される輸送チューブ２０１は、図３、図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃに示す通り、貫通可能なキャップ３０１を受容するように構成されていてもよい。採取後、スワブは折られてチューブ２０１内に収まり、チューブ２０１は、貫通可能なキャップにより密閉される。
【００２３】
１つの好ましい実施形態では、貫通可能なキャップ３０１は、キャップ３０１を手で握ることを容易にするための盛り上がった突起部３０３が軸方向に配置されて構成されている。キャップ３０１は、キャップ３０１をチューブ２０１のネジ山２０５に確実に取り付けるために、ネジ受け（３０５）も備え得る。好ましい実施形態では、キャップ３０１は、エアロゾル化および汚染を低減するための上部膜３０７および下部膜３０９を備え得る。本発明の譲受人に譲渡された特許文献１および特許文献２が参考として本明細書に組み込まれており、両文献は、本明細書に詳細に記載されていない、本発明の譲受人に譲渡された貫通可能なキャップの構造および設計ならびにそれらの使用方法について記載している。
【００２４】
好ましくは、チューブ内に収納された輸送培地は、可能性がある将来の培養ために生存能力を保存するように選択される。１つの好ましい実施形態では、輸送培地は、１０％リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）溶液である。本明細書で述べられているように、この溶液は細胞成分の生存能力を維持するのを支援し、またアクロモペプチダーゼ溶解に有利な、ｐＨが制御された低塩環境も提供する。試料は溶解および検出のために輸送培地から抽出されるので、試料と共に抽出される輸送培地が、溶解を妨害しない、あるいはこれに悪影響を及ぼさないことが重要である。
【００２５】
特に、ヒト体液の特性と類似した特性を有する輸送培地が、細胞の完全性および生物の生存能力を保存するのに有用である。この点において、１０％ＰＢＳ溶液を使用することが好ましく、本明細書で述べられている輸送デバイスは、いかなる特定の輸送培地の使用にも拘束されない。したがって、任意の従来の輸送培地が、これまでに記載したように細胞の生存能力を保存する基準を満たす限り、本発明と共に使用するのに適するものと考えられる。かかる輸送培地は、当業者にとって周知であり、本明細書では詳細に記載されていない。その他の輸送培地として、Ｓｔｕａｒｔｓ培地、Ａｍｉｅｓ培地、およびトリスＥＤＴＡ（「ＴＥ」）を挙げることができるが、これらに限定されない。上記の塩分およびｐＨ環境を有する環境を形成するために、これらの培地を希釈することが好ましい。本明細書で述べられているように、等張性の環境を形成する培地は、最適な溶解環境を提供し得る。
【００２６】
上記の通り、生理食塩水の含量が高いと、アクロモペプチダーゼの溶解活性が阻害される。特定の低い生理食塩水培地、例えば上記のものは、アクロモペプチダーゼの活性を保存する。１つの好ましい実施形態では、輸送培地は、上記の１０％ＰＢＳ溶液の溶液である。この希釈溶液は、０．０２３ｍＭのリン酸二水素カリウム、０．６２９ｍＭのリン酸水素二カリウム、１４．５ｍＭの塩化ナトリウム、および水を混合することにより調製される１００％ＰＢＳ溶液を使用して調製される。別の実施形態では、１０％から５０％のＳｔｕａｒｔｓ培地が使用される。表１はＳｔｕａｒｔｓ培地の構成成分を示す。
【００２７】
【表１】
2013521804.tif 000003
【００２８】
さらに別の好ましい実施形態では、１０％から５０％のＡｍｉｅｓ培地が使用可能である。表２は１００％Ａｍｉｅｓ培地の組成を表す。
【００２９】
【表２】
2013521804.tif 000004
【００３０】
部分的には、ＰＢＳ、Ａｍｉｅｓ培地、Ｓｔｕａｒｔｓ培地、およびＴＥは、ヒト体液に見出される環境と類似した等張性の環境を提供するので、これらは酵素的溶解、特にアクロモペプチダーゼ溶解と関連して有用な緩衝液である。
【００３１】
さらに別の好ましい実施形態では、試料および上記の培地を含む採取チューブは、これが、標的核酸の存在について、または任意のさらなる分析について試料をアッセイするデバイス内に直接配置可能であるように構成されている。これは、輸送培地と溶解環境との間の相乗作用の必要性を強調する。採取チューブ内の試料中の生物が溶解した後、チューブは自動化された抽出および標的核酸の有無についてのアッセイのためのツール内に直接配置され得る。１つのかかるツールは、（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）から市販されているＶｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲプラットフォームである。
【００３２】
本明細書に記載されている１つの実施形態は、細菌試料を酵素的に溶解させること、ＤＮＡを試料から抽出すること、および抽出された細菌ＤＮＡを診断手順においてその後使用することを提供する。やはり上記したように、好ましくはリシルエンドペプチダーゼとしても公知のアクロモペプチダーゼ（「ＡＣＨ」）が、溶菌酵素として使用されて、細菌である黄色ブドウ球菌、およびストレプトコッカス・アガラクティエを溶解させる。アクロモペプチダーゼは、溶菌特性、およびタンパク質分解特性を有する。アクロモペプチダーゼは、全般的な溶菌薬として有用であるが、その他の溶菌酵素、例えばリゾチームに対して耐性のグラム陽性生物を溶解させるのに特に有用である。この耐性は、グラム陽性菌の細胞壁中に存在するが、グラム陰性菌には存在しない化学物質に関連すると考えられている。そのようにいわれているが、本明細書に記載されている方法は、アクロモペプチダーゼによる溶解に限定されず、任意の酵素的溶解薬、例えばリゾチームを使用して実践可能である。
【００３３】
アクロモペプチダーゼは、細菌試料と共に、３７℃から５０℃の範囲の温度でインキュベートしたときに有効な溶解性酵素であることが公知である。しかし、アクロモペプチダーゼ等のリゾチームは、その持続したタンパク質分解活性が、抽出された核酸のその後の診断および検出に悪影響を及ぼすので、溶解後不活性化されなければならない。溶解活性の休止を実現する手段として、アクロモペプチダーゼのタンパク質分解作用を停止させるために、ヒートスパイクを試料に実施することが挙げられる。本発明のために、「ヒートスパイク」とは、試料温度を約９５℃に上昇させることとして定義される。ヒートスパイクを提供する１つの従来の手法は、試料がその上に配置されているブロックを９５℃に５分間加熱することである。
【００３４】
試料が溶解したら、核酸は試料成分の残りの部分から抽出可能である。本明細書に記載されている方法では、当技術分野において公知の核酸抽出の任意の機構が、有用なものと考えられる。かかる機構は周知されており、本明細書では詳細に記載されていない。１つの好ましい実施形態では、抽出はＶｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲ上で実施される。Ｖｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲは、ＦＯＸ粒子を使用して、ＫＯＨおよびその他の構成成分を含有する抽出溶液から非選択的に核酸を抽出することを兼備する。
【００３５】
溶解、抽出溶液、および物理的条件の間の相互作用は複雑であり、互いに依存している。これらの環境では、溶解が終了するところと、抽出が開始するところとの間の正確な線引きは困難である。また、溶解溶液が抽出機構に与える効果も十分に理解されていない。そのように言われているが、本明細書で開示されているのは、アクロモペプチダーゼを使用する室温溶解を可能にする、溶解条件と抽出条件との特に有利な組合せである。この組合せにより、アクロモペプチダーゼが溶解にもたらす完全な利益が得られ、アクロモペプチダーゼが抽出された核酸に与える負の効果が回避される。本出願人らは、特定の理論に拘束されるつもりはないが、出願人らは、アクロモペプチダーゼを使用して室温溶解し、続いてＫＯＨおよびこれとともに使用されるその他の抽出溶液構成成分中の酸化第二鉄粒子を使用して非選択的に核酸を抽出することによって、特に有利な溶解および抽出プロトコールが提供されると考える。この好ましい実施形態は、アクロモペプチダーゼが抽出される核酸に与える負の効果が回避されるのであれば、その他の抽出プロトコールを本明細書に記載されている室温アクロモペプチダーゼ溶解と共に使用することを排除するものではない。代替の抽出プロトコールの選択について調査は、当業者の能力範囲内に十分にある。
【００３６】
本明細書に記載されている方法の１つの態様では、アクロモペプチダーゼを伴うインキュベーション、それに続く酸化第二鉄（Ｆｅ2Ｏ3）（「ＦＯＸ」）粒子を用いる核酸抽出が、室温で実施される。インキュベーションおよび抽出の期間に、試料温度および周囲温度は、いずれも室温である。本明細書で使用する場合、「室温」とは、約１６℃から約２２℃の範囲内の温度として定義される。あるいは、アクロモペプチダーゼによる溶解は、室温よりも高い温度で実施可能である。しかし、これらのより高い温度での溶解はあまり好ましくない。
【００３７】
試料中のアクロモペプチダーゼの濃度を高めれば、より低い温度で溶解を生じさせることができる。しかし、アクロモペプチダーゼの濃度が高いほど、分析をより困難にするおそれがあり、より長いインキュベーション時間を必要とする場合がある。本明細書に記載されている方法によれば、ヒートスパイク無しに室温でインキュベーションおよび抽出を行うと、これまでに遭遇した付随的困難を伴わずに、より高い濃度のアクロモペプチダーゼを使用できるようになる。その結果、インキュベーション時間がより短くなり、使用可能な核酸収量がより多くなる可能性がある。
【００３８】
試料中の細胞の溶解に続いて、核酸は溶解した試料の残りの部分から抽出される。抽出は酸化第二鉄（Ｆｅ2Ｏ3）（「ＦＯＸ」）粒子を細菌試料に導入して実施される。ＦＯＸ粒子は、溶解した試料の負に荷電したＤＮＡに結合する。次に磁石が、結合したＤＮＡを引き付けるように試料に適用され、溶離液が従来の手段により除去される。この抽出手順は、ＤＮＡを溶解した細菌から抽出するのに上首尾である。ＦＯＸ粒子は、ＢＤ  Ｖｉｐｅｒ（商標）システムで核酸を抽出するのに使用される。
【００３９】
ＤＮＡが抽出されたら、診断および検出の目的でさらなる分析が実施可能である。下流分析の例としてポリメラーゼ連鎖反応、ゲル電気泳動等が挙げられるが、これらに限定されない。試料からの標的核酸抽出の有無について生体試料を生物学的に試験するためのプラットフォームとして、ＢＤ  Ｖｉｐｅｒ（商標）システムが挙げられる。
【実施例】
【００４０】
実施例でのプロトコール
【００４１】
下記の実施例では、溶解させその後ＤＮＡを細菌から抽出するのに必要な条件が調査された。下記の実施例すべてに存在する２種類の細菌生物は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（「ＭＲＳＡ」）、ＡＴＣＣ＃４３３００、亜種アウレウ・ローゼンバッハ（ａｕｒｅｕｓ  Ｒｏｓｅｎｂａｃｈ）、およびストレプトコッカス・アガラクティエ（「ＧＢＳ」）、ＡＴＣＣ＃１２９７３（ＡＴＣＣによって分類菌株（ｔｙｐｉｎｇ  ｓｔｒａｉｎ）Ｖ８と命名されている）であった。リゾチーム、すなわちアクロモペプチダーゼ（「ＡＣＨ」）（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡより入手）が、溶解薬として下記の実施例すべてで使用された。
【００４２】
ＭＲＳＡおよびＧＢＳ（まとめて「細菌試料」）に対するＡＣＨの溶解効果を実証するために、細菌試料が、異なる濃度のアクロモペプチダーゼと組み合わされ、異なる時間、室温でインキュベートされた。
【００４３】
下記の実施例それぞれについて、７．５×１０4ＣＦＵ／ｍｌの生物が、各実施例に記載されているその他の構成成分と組み合わされた。構成成分および条件が、溶解および核酸抽出に与える効果を調べた。
【００４４】
核酸抽出が、酸化鉄（ＦＯＸ）技術を利用してＢＤ  Ｖｉｐｅｒ（商標）システム上で実施された。ＢＤ  Ｖｉｐｅｒ（商標）システムは市販されており、その操作については本明細書では詳細に記載されていない。最初に、溶解した細菌試料を、ＢＤ  Ｖｉｐｅｒ（商標）システム内に配置した。細菌試料を、細菌ＤＮＡを含む溶解した細菌の核酸のヌクレオチド断片に結合するＦＯＸ粒子と組み合わせた。次に試料を磁場に供して、結合した核酸を試料の他の部分から単離した。磁場による単離後、試料の他の成分を除去した。次にＰＣＲために調製する際に、核酸成分をＦＯＸ粒子から溶離させた。ＡＣＨの溶解作用を停止させるのに、インキュベーションプロセスの期間で、ヒートスパイクは採用されなかった。
【００４５】
溶解手順およびその後のＤＮＡ抽出の結果は、サイクル閾値（「Ｃｔ」）により測定された。本明細書で使用される場合、サイクル閾値とは、蛍光が一定の閾値を超えるときのフラクショナルサイクル数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｃｙｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ）として定義される。サイクル閾値は、試料中に臨床的に有意な量の核酸が存在することを示す陽性指標を判定するための周知の技術であり、本明細書では詳細に記載されていない。
【００４６】
ＭＲＳＡの場合、サイクルは、抽出されたＤＮＡ試料の温度を９５℃に１５秒間上昇させ、続いて５９℃に６０秒間曝露することから構成された。ＧＢＳの場合、サイクルは、抽出されたＤＮＡ試料の温度を、９５℃に１５秒間上昇させ、続いて５６℃に６０秒間曝露することからなった。ＭＲＳＡおよびＧＢＳそれぞれについて４５サイクル実施した。サイクル閾値を上回る蛍光読み取り値に対応するサイクル数がＣｔである。
【００４７】
Ｃｔ値が３０未満であれば、試料中に大量の標的核酸が存在することを示した。本明細書に記載されている実施例のために、３０〜３５の間のＣｔ値は、中等度から低い陽性反応を表し、良好な結果と考えられた。３５と４５との間のＣｔ値は、弱い反応を表した。これは、最低量のＤＮＡしか試料から抽出されなかったことを示す。４５を超えるＣｔ値は、ＤＮＡが検出不能である試料を表した。
【００４８】
（実施例１）室温溶解
ＭＲＳＡおよびＧＢＳ細菌を、培地内で増殖させ、次に１×ＴＥ（１０ｍＭトリス／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）溶液１ｍＬを含む個々の試験管内で希釈して、溶液中の細菌濃度約７５００ＣＦＵ／ｍＬを得た。したがって、試料は標的生物を含有するようにスパイクされた。
【００４９】
ＡＣＨを１×ＴＥに溶解させ、そして希釈済みの細菌試料と組み合わせた。各試料中のＡＣＨ濃度は、１．０１Ｕ／μＬから５．０５Ｕ／μＬの範囲であった。細菌およびアクロモペプチダーゼの得られた懸濁液を、１０分から３０分の範囲で２２℃または３７℃のいずれかの温度でインキュベートした。細菌の試料各１ｍＬ中のＡＣＨの最終濃度は、約１０００Ｕから約５０００Ｕの範囲であった。
【００５０】
インキュベーションに続いて、本明細書に記載されているプロトコールに従って、ＢＤ  Ｖｉｐｅｒ（商標）システムを使用して、ゲノムＤＮＡを含む核酸を抽出した。抽出後、ＰＣＲを実施して抽出されたＤＮＡを増幅した。
【００５１】
抽出後速やかに、ＡＢＩ  ７５００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でＰＣＲを実施した。下記の成分を含有する各試料に対して、５０ｕＬのＰＣＲ反応を行った：２００ｕＭのｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）；２ＵのＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑポリメラーゼ；０．９ｕＭの右および左のプライマー（ルーティング０４７３８４０３００１）；０．２５ｕＭの標的特異的分子ビーコン；および６０ｎＭのＲＯＸ（参照色素）、すべて市販のＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）中］。
【００５２】
ＭＲＳＡおよびＧＢＳを含有する試料においてＰＣＲの期間で使用された熱プロファイルは、以下の通りであった：５０℃で２分間；９５℃で１０分間；ならびに９５℃で１５秒間および５９℃で１分間の４５サイクル。
【００５３】
増幅に続いて、試験されたすべての試料は、３５．０未満のＣｔ値を有した。これらのＣｔ値は、ＭＲＳＡおよびＧＢＳのＤＮＡが、ＡＣＨによる室温溶解に続くＦＯＸ技術により、溶解を停止させるためにヒートスパイクを実施せずに抽出され得ることを明らかにした。
【００５４】
（実施例２）より広い範囲のＡＣＨ濃度を用いる室温溶解
細菌試料を、本明細書に記載されているプロトコールに従って調製し、１×ＴＥの溶液を使用して希釈して、約７５００ＣＦＵ／ｍＬの濃度を得た。
【００５５】
希釈された細菌を含有する試料を、最終濃度が３０００Ｕから７０００Ｕとなるように、３．０３Ｕ／ｕＬから７．０７Ｕ／ｕＬのＡＣＨの濃度の範囲で１×ＴＥに溶解したアクロモペプチダーゼの溶液と組み合わせた。細菌およびアクロモペプチダーゼを含有する試料を、溶解を可能にするために室温で２０分間インキュベートした。
【００５６】
インキュベーションに続いて、本明細書に記載されているプロトコールに従って、ＢＤ  Ｖｉｐｅｒ（商標）システムを使用して、ゲノムＤＮＡを含む核酸を抽出した。抽出後、ＰＣＲを実施して抽出されたＤＮＡを増幅した。
【００５７】
ＡＢＩ  ７５００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でＰＣＲを実施した。５０ｕＬのＰＣＲ反応を各試料に対して行った［２００ｕＭのｄＮＴＰ、２ＵのＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑポリメラーゼ、０．９ｕＭの右および左のプライマー、０．２５ｕＭの標的特異的分子ビーコン、６０ｎＭのＲＯＸ、すべて市販のＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）中］。ＭＲＳＡに使用された下記の熱プロファイルは、５０℃で２分間；９５℃で１０分間；９５℃で１５秒間、５９℃で１分間の４５サイクルであった。ＧＢＳに使用された下記の熱プロファイル：５０℃で２分間；９５℃で１０分間；９５℃で１５秒間、および５６℃で１分間の４５サイクル。
【００５８】
４０００から６０００ＵのＡＣＨを用いて溶解した試料から、最良の結果が得られた。これらの試料のすべてから、３５．０未満のＣｔ値が得られ、これによってＦＯＸ抽出技術と組み合わせたとき、幅広い範囲のＡＣＨ濃度を利用する室温溶解が実行可能であることが示された。
【００５９】
（実施例３）２レベルのＡＣＨ濃度を用いる室温溶解および生物レベルの力価測定
増殖培地によりＭＲＳＡおよびＧＢＳ試料を調製し、次に試料を５つの異なる試験レベルに希釈した。試料を１×ＴＥで下記のレベルに希釈した：７５０００、３５０００、７５００、５０００、および１０００ＣＦＵ／ｍＬ。アクロモペプチダーゼを１×ＴＥに溶解させた。希釈した細菌試料を、最終ＡＣＨ濃度３０００Ｕまたは５０００Ｕとなるように、３．０３または５．０５Ｕ／ｕＬのいずれかの濃度で溶解したアクロモペプチダーゼの溶液と組み合わせた。細菌試料およびアクロモペプチダーゼを、２２℃で２０分間インキュベートした。
【００６０】
インキュベーションに続いて、本明細書に記載されているプロトコールに従って、ＢＤ  Ｖｉｐｅｒ（商標）システムを使用して、ゲノムＤＮＡを含む核酸を抽出した。抽出後、ＰＣＲを実施して抽出されたＤＮＡを増幅した。
【００６１】
ＡＢＩ  ７５００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でＰＣＲを実施した。５０ｕＬのＰＣＲ反応を各試料に対して行った［２００ｕＭのｄＮＴＰ、２ＵのＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑポリメラーゼ、０．９ｕＭの右および左のプライマー、０．２５ｕＭの標的特異的分子ビーコン、６０ｎＭのＲＯＸ、すべて市販のＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）中］。
【００６２】
ＭＲＳＡに使用された下記の熱プロファイルは、５０℃で２分間；９５℃で１０分間；９５℃で１５秒間、５９℃で１分間の４５サイクルであった。ＧＢＳに使用された下記の熱プロファイル：５０℃で２分間；９５℃で１０分間；９５℃で１５秒間、５６℃で１分間の４５サイクル。
【００６３】
全標的レベルの全試料を検出し、Ｃｔ値は２７．５から３６．２の範囲であった。結果から、試験されたＡＣＨ濃度のいずれの間においても実際的な差異は認められなかった。Ｃｔ値によって、複数のＡＣＨ濃度を利用する室温溶解が、ＦＯＸ抽出技術と組み合わせたとき実行可能であり、当技術分野において公知の分析、例えばＰＣＲを実施するのに十分なＤＮＡの量をもたらしたことが示されている。
【００６４】
（実施例４）周囲温度抽出データ
ＴＥ緩衝液中のＧＢＳおよびＭＲＳＡ生物の試験を、実施例２に記載されている方法により実施した。この実験では、アクロモペプチダーゼを使用して、３７℃で３０分間、生物を溶解させた。実験対象のサブセットは、９５℃で５分間、ヒートキルを受け、続いてＦｅＯを用いる抽出を受けた。別のサブセットは、ヒートキル無しにＦｅＯ抽出を受け、生物の最後のサブセットは、何らの抽出無しにＰＣＲ反応に直接進んだ（しかし、ヒートキル有りおよびヒートキル無しの両方で）。対照として、別の試料セットは溶解されず、ヒートキルに供されないが、抽出および分析に供された。下記の表３および４は、ＧＢＳおよびＭＲＳＡの結果をそれぞれ示す。表３および４に示す通り、各サブセットは２回の反復操作を受けた。この反復操作は、「ｒｅｐ１」および「ｒｅｐ２」と名付けて示されている。次に、各反復操作について、２回のＰＣＲを実施した。サイクル閾値（「Ｃｔ」）を表３および４に示す。すべての試料について、より低いＣｔは、ＤＮＡの元の試料からの回収率がより高いことを示した。抽出を受けなかった試料では、溶解後、各試料についてＰＣＲを直接実施した。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
【表４】
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【００６７】
表３および４に示す通り、３７℃で３０分間溶解しヒートキル無しに抽出された生物は、ヒートキルを受けた生物と類似した結果を有した。平均Ｃｔカウント３５未満は、いずれも陽性回収率とみなされた。表３および表４の両方に示す通り、溶解せずヒートキルに供されなかった生物は、ＧＢＳについて３９を上回るＣｔカウントを有し、ＭＲＳＡについて３４．５を上回るＣｔカウントを有した。溶解せずヒートキルに供されなかった生物を使用して、実験群がＤＮＡを試料生物から抽出するのに実際に有効であることが示された。
【００６８】
ＧＢＳおよびＭＲＳＡの両方の場合について、ヒートキルに曝露されなかった溶解した生物の平均Ｃｔカウントは、ヒートキルに曝露された溶解した生物と本質的に同等であった。これらの結果から、臨床的に有用な量のＤＮＡが、アクロモペプチダーゼを用いて細菌から上首尾に抽出され、ヒートキル無しにＦｅＯを用いて抽出され得ることが示される。
【００６９】
本明細書の本発明は、特定の実施形態を参照しながら記載されているが、かかる実施形態は、本発明の原理および用途を説明するに過ぎないことを理解されたい。したがって、例示的な実施形態に対して非常に多くの改変をなすことができ、添付の特許請求の範囲により定義された本発明の精神および範囲から逸脱せずに、その他の構成も考案可能であることを理解されたい。
【図１】
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【図１Ａ】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【国際調査報告】
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