(57)【要約】  本発明は、試料中の酵素的に活性なＰＳＡによる癌の診断に関する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体における前立腺癌を診断する方法であって、
ａ）尿、精液、前立腺液、又は前立腺マッサージ後尿から選択される、前記被検体から得た試料における前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のタンパク質分解活性のレベルを測定すること；及び
ｂ）前記活性レベルを前立腺癌の存在と関連付けること
を含む、方法。
【請求項２】
被検体における前立腺癌を診断する方法であって、
ａ）尿、精液、前立腺液、又は前立腺マッサージ後尿から選択される、前記被検体から得た試料におけるタンパク質分解活性のレベルを測定し、前記タンパク質分解活性の測定は前立腺癌特異的ペプチドを用いること；及び
ｂ）前記活性レベルを前立腺癌の存在と関連付けること
を含む、方法。
【請求項３】
前記ＰＳＡ酵素活性が前立腺癌特異的ペプチドを用いて測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記前立腺癌特異的ペプチドがＨＳＳＫＬＱである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記前立腺癌特異的ペプチドがＨＳＳＫ−Ｈｉｖ−Ｑである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記前立腺癌特異的ペプチドがＨＳＳＫ−Ｈｉｃ−Ｑである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが標識されている、請求項２、３、４、５又は６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標識が発色性である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記発色性標識が蛍光性である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識が電気化学的である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記前立腺癌特異的ペプチドがフィブロネクチンである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項１２】
前記関連付けが、前記試料中の全ＰＳＡに対して前記タンパク質分解活性の正規化を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記関連付けが、前記被検体の血清中の全ＰＳＡに対して前記タンパク質分解活性の正規化を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記関連付けが、前立腺容量に対して前記タンパク質分解活性の正規化を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料を得ることをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく２０１０年５月２１日に提出した米国仮出願第６１／３４７，１２１号、２０１０年１０月１９日に提出した米国仮出願第６１／３９４，４５８号、２０１１年１月２８日に提出した米国仮出願第６１／４３７，０５６号、及び２０１１年４月１４日に提出した米国仮出願第６１／４７５，４９６号への優先権の利益を享受するものであり、これらはすべて、それら全体、特にそれらの図が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
概要
前立腺癌は、男性に最も多く見られる種類の癌である。毎年２０万件以上の新たな症例が同定され、今年だけでも３万人以上が前立腺癌で死亡するであろう。前立腺癌の早期発見は、最も良い治療法である。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は効果的な腫瘍マーカーと考えられるが、癌に特異的なものではない。前立腺癌の男性患者と良性の前立腺疾患の男性患者には、ＰＳＡの濃度にかなりの共通点がある。さらに、ＰＳＡレベルを用いて、臓器限局性前立腺癌（手術の効果が期待される）の男性患者と非臓器限局性前立腺癌（手術の効果が期待されない）の男性患者とを区別することができない。
【背景技術】
【０００３】
現在、前立腺癌の発見と診断には、血清ＰＳＡ測定と直腸診（ＤＲＥ）とを組み合わせた手法が主流として用いられている。
【０００４】
市販のＰＳＡアッセイは、地域又は地方の試験所で一般的に実施されている。これらのアッセイは、現在の前立腺癌早期発見の方法の一部として役割を果たしている。しかし、ＤＲＥが陰性であって、わずかに異常なＰＳＡ値（４〜１０ｎｇ／ｍｌ）が現れた際に、問題が起こる。このような所見の人のうち、生検で癌腫が見つかるのは２０〜３０％のみである。（Kantoff and Talcott, 8(3) Hematol. Oncol. Clinics N Amer 555 (1994)）
【０００５】
そのため、ＰＳＡ試験の陽性適中率を高めるための方法を開発することが重要である。
【０００６】
また、ＰＳＡは、疾患特異的なマーカーではなく、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）及び前立腺炎の患者の高い割合（２５〜８６％）で高レベルのＰＳＡが検出され（Gao et al., 1997, Prostate 31: 264-281）、また他の非悪性疾患でも検出されることから、このマーカーの診断特異性は非常に限定される。例えば、ＢＰＨでは、４〜１０ｎｇ／ｍｌの血清ＰＳＡの上昇が観察され、また前立腺炎、特に急性前立腺炎では、さらに高い値が観察される。
【０００７】
ＢＰＨは、男性において非常によく見られる状態である。また、ＤＲＥでは疾患の兆候が一切見られない場合でも血清ＰＳＡの上昇が観察される場合があり、またその逆も起こり得ることが、状況をさらに複雑にしている。加えて、現在、ＰＳＡは前立腺特異的ではないことがわかっている（Gao et al.参照）。ＰＳＡは組織特異的かつ性特異的な抗原であるという当初の推測に反して、免疫組織化学的手法及び免疫測定法により、ＰＳＡは、女性及び男性の尿道周囲腺、肛門腺、アポクリン汗腺、アポクリン乳癌、唾液腺腫瘍、そして最近ではヒト母乳において検出されている。
【０００８】
前立腺癌は、男性における癌関連の死因で２番目に多い原因である。Hahnfeld L E and Moon T D (1999) Medical Clinical North America, 83(5), 1231-45。進行したものは治療できないため、前立腺癌を早期に発見することに努力が集中されており、前立腺内にとどめられていればより治療の可能性が高まる。残念ながら、前立腺癌は、腫瘍の転移が他の臓器や構造に広がるまで無症状であり得る。
【０００９】
前立腺癌のスクリーニングは、主に、血中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の検出により行われる。ＰＳＡは良性症状と癌性症状との間で特異性がないため、前立腺癌に対するＰＳＡの診断的重要性は限定的である。Egawa et al., (1999) Int. J. Urology, 6, 493-501。その結果、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、前立腺炎及び梗塞などの良性症状や、その他にも前立腺上皮内腫瘍が、ＰＳＡの血清レベルの上昇に関連する場合がある。ＰＳＡの血清レベルに加えて、直腸診（ＤＲＥ）や経直腸的超音波断層法（ＴＲＵＳ）を含む他の診断手法が用いられている。
【００１０】
実際に、５０歳以上の男性におけるＰＳＡレベルの上昇（＞４ｎｇ／ｍｌ）のおよそ３分の２は、ＢＰＨ又は前立腺炎によるものである。Stenman et al. (1999) Cancer Biology, 9, 83-93。このように、単に患者のＰＳＡレベルが高いというだけでは癌を診断できず、更なる検査が必要となる。この特異性の欠如のため、ＰＳＡレベルが高い男性の百万人以上が前立腺生検を受けている；しかし、癌と診断されるのはわずか４人に１人である。
【００１１】
さらに、前立腺癌と同定された患者のなかでも、現在のＰＳＡスクリーニングの方法では、根治療法を必要とする侵攻性疾患と、「注意深い経過観察」が好ましい緩慢性疾患とを区別することができない。
【００１２】
そのため、前立腺癌が特異的に同定でき、前立腺癌を良性の過形成と区別することができ、ＰＳＡレベルが低い場合でも前立腺癌を同定でき、また疾患進行のステージを同定することができる検定法が求められている。
【発明の概要】
【００１３】
いくつかの実施形態では、被検体の前立腺癌を診断する方法が提供され、開示される方法は、被検体の試料、例えば尿、精液、前立腺液、又は前立腺マッサージ後尿などにおける酵素活性レベル、例えばタンパク質分解活性などを測定すること；及び、酵素活性レベルを前立腺癌の存在と関連付けることを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、被検体の前立腺癌を診断する方法は、尿、精液、前立腺液、又は前立腺マッサージ後尿から選択される被検体の試料中における前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のタンパク質分解活性のレベルを測定すること、及び、該活性レベルを前立腺癌の存在と関連付けることを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ｍｏｒ−ＨＳＳＫＬＱ−ＡＭＣ（本明細書において、「ＡＭＩＤＥ」と呼ぶ場合がある）、Ｍｏｒ−ＨＳＳＫ−Ｈｉｖ−Ｑ−ＡＭＣ（本明細書において、「ＨＩＶ」と呼ぶ場合がある、Ｍｏｒ−ＨＳＳＫ−Ｈｉｃ−Ｑ−ＡＭＣ（本明細書において、「ＨＩＣ」と呼ぶ場合がある）を含む、いくつかのＰＣＳＰの構造を示した図である。
【図２Ａ−２Ｃ】図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、平均的測定を示した図である。図２Ａは、被検患者における全血清ＰＳＡレベルと癌の存在との間に相関関係がないことを示す。図２Ｂは、前立腺癌患者の「マッサージ後尿」（直腸診前立腺マッサージ後）に存在するＨＳＳＫＬＱペプチドに対する酵素活性の検出を、良性疾患の患者と比較して示した図である。この検定では、３０個の試料について、酵素活性のスクリーニングを行った。試料は、グリーソンスコアが６以上で前立腺癌と認められた患者の試料を１５個、及び、正常な前立腺試料だがＢＰＨと診断された患者の試料を１５個含む。ＨＳＳＫＬＱペプチドに対する酵素活性は、Downes et al. (2006) B. J. U. International 99:263-268に記載される内容に従って測定した。図に示されるように、良性疾患の患者の試料の大部分では、ＨＳＳＫＬＱペプチドの切断は最小であったが、生検で前立腺癌と確認された患者の試料では、比較的高い中央値の活性が観察されている。図２Ｃは、前立腺容量に基づく酵素活性の正規化により、前立腺癌患者のマッサージ後尿における酵素活性と良性疾患の患者のものとの相関関係が向上していることを示している。
【図３Ａ−３Ｄ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄは、それぞれ、（Ａ）市販認可された試験を用いた全前立腺特異的抗原（ｔ−ＰＳＡ）（曲線０．５０の下の領域）、（Ｂ）マッサージ後尿におけるＨＳＳＫＬＱペプチドに対する酵素活性（曲線０．５８の下の領域）、（Ｃ）マッサージ後尿における全ＰＳＡについて正規化したＨＳＳＫＬＱに対する酵素活性（曲線０．６４の下の領域）、及び、（Ｄ）前立腺容量で正規化したＨＳＳＫＬＱに対する酵素活性（曲線０．７４の下の領域）、に関する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。
【図４Ａ−４Ｄ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄは、後続の試験で得られた受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。（Ａ）市販認可された試験を用いた全前立腺特異的抗原（ｔ−ＰＳＡ）（曲線０．３４の下の領域）、（Ｂ）マッサージ後尿におけるＨＳＳＫＬＱペプチドに対する酵素活性（曲線０．４７の下の領域）、（Ｃ）マッサージ後尿における、全ＰＳＡについて正規化したＨＳＳＫＬＱに対する酵素活性（曲線０．５４の下の領域）、及び、（Ｄ）前立腺容量について正規化したＨＳＳＫＬＱに対する酵素活性（曲線０．５１の下の領域）。
【図５Ａ−５Ｃ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、マッサージ後尿に存在するＨＳＳＫＬＱペプチドに対する酵素活性をさらに４７個の試料においてアッセイした後続試験を示す。このアッセイでは、光アッセイで観察された酵素活性による蛍光から、尿の自己蛍光が差し引かれている。（Ａ）良性疾患の患者と前立腺癌の患者における、市販認可されたＰＳＡアッセイで測定した血清ｔ−ＰＳＡレベル、及び、（Ｂ）同じ患者の試料における、ＨＳＳＫＬＱに対する酵素活性の測定。予想外にも、血清ｔ−ＰＳＡ値は、実際に前立腺癌の負のバイオマーカーとして機能している様子が見られた；すなわち、癌患者で観察された平均は、良性前立腺肥大症の患者のものより高かった。しかし、先の試験で見られたように、酵素活性の平均は、良性疾患の患者に比べて前立腺癌患者の方が高いままであった。図５Ｃは、前立腺容量に基づく酵素活性が再度、前立腺癌患者と良性疾患患者との区別の向上を示した後続試験からの結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、癌の有無を検出し、また癌と良性疾患（例えばＢＰＨ）を区別することができる方法を提供する。この方法は、患者が癌であるか、又は良性疾患であるか、及び／又は臨床的に癌を患っていないかを分類するために、体液中の特異的な酵素活性、例えばＰＳＡのタンパク質分解活性又は前立腺癌特異的ペプチド（ＰＣＳＰ）の切断などの酵素活性の差異の検出を利用する。
【００１７】
したがって、本発明は、被検体における癌、特に前立腺癌の診断方法を提供する。ある場合では、以下に記載するように、「正常」な患者、すなわち前立腺疾患をまったく患っていない人、癌患者、及びＢＰＨなどの前立腺疾患を持つその他の患者の区別が可能である。ある場合では、本発明の方法を用いて、予後診断を行うことも可能である。
【００１８】
一般的に、この文脈における診断とは、前立腺関連疾患、特に前立腺癌の有無を同定するプロセスである。以下に概説するように、これは酵素的測定法を用いて行われる。ある場合では、以下にさらに一般的に概説するように、本明細書に概説するプロテアーゼアッセイの結果は、例えばこれらに限定されないが、前立腺の大きさや容量、グリーソンスコア、血清ＰＳＡレベル（種々のＰＳＡのアイソフォーム及び遊離ＰＳＡを含む）、年齢、生活習慣などの前立腺癌ノモグラムにおける一般に認められたリスクファクターを含む他の要素と組み合わせることができる。
【００１９】
このように、本発明は、前立腺癌及びその他の前立腺疾患の診断方法を提供する。前立腺癌は、前立腺の悪性疾患で、例えばこれらに限定されないが、腺癌、小細胞型未分化癌、粘液性（膠様）癌などが含まれる。前立腺癌は、前立腺に局在したまま、すなわち臓器限局性であるか、又は、前立腺の外に転移し得る。
【００２０】
前立腺癌を段階付けする体系の１つに、「グリーソン分類」がある。グリーソン分類は、組織試料中の癌の２つの最も大きな領域にそれぞれ段階を付ける。段階は１〜５で、１が最も悪性度が低く、５が最も悪性度が高い。例えば、第３段階では転移はほとんど見られないが、第４又は第５段階では転移がよく見られる。これら２つの段階の合計が、グリーソンスコアとなる。スコア２〜４は低段階、５〜７は中段階、８〜１０は高段階である。グリーソンスコアの低い腫瘍は通常、患者の生存期間中に大きな脅威になり得ないほど十分に成長が遅い。
【００２１】
癌のほか、前立腺の疾患としては、これらに限定されないが、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、前立腺炎、及び前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）などが含まれ、本明細書において、これらのいずれか又はすべてを一般的に「前立腺疾患」という。
【００２２】
「良性前立腺肥大症」（「ＢＰＨ」）は、一般的に、前立腺の臨床的な肥大、又は、刺激性又は閉塞性の排尿パターン、尿閉、及び残尿量の増加を伴う頻尿などを含む下部尿路の症状を表して用いられる。良性前立腺肥大症は、８０歳までの男性の８０％以上で起き、８０歳に達する男性の２５％もの割合で、何らかの治療（通常、外科的処置）が必要になると報告されている（Partin (2000) Benign Prostatic Hyperplasia, in Prostatic Diseases (Lepor H. ed.), W. B. Saunders, Philadelphia, pp 95-105）。ＢＰＨの原因は未だ解明されていない。
【００２３】
前立腺炎は、前立腺の炎症に関連する任意の種類の疾患を意味し、慢性及び急性の細菌性前立腺炎、並びに慢性の非細菌性前立腺炎を含み、通常、頻尿及び／又は尿意逼迫の症状を伴う。前立腺炎とよく似た症状を示す疾患に、前立腺痛（prostadynia）がある。
【００２４】
前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）は、これらに限定されないが、高悪性度前立腺上皮内腫瘍及び低悪性度前立腺上皮内腫瘍を含めた、様々な形態及び／又は程度のＰＩＮを含む。「ＨＧＰＩＮ」は、高悪性度ＰＩＮ又は高悪性度前立腺上皮内腫瘍を意味し、「ＬＧＰＩＮ」は、低悪性度ＰＩＮ又は低悪性度前立腺上皮内腫瘍を意味する。
【００２５】
本発明は、雄の被検体、特にヒトにおける、癌及びＢＰＨを含む前立腺疾患の診断方法を提供する。
【００２６】
本方法は、試料のタンパク質分解活性の試験を含む。本明細書において、「試料」とは、プロテアーゼ活性を含む前立腺疾患に関連する試料を意味し、例えばこれらに限定されないが、尿、精液、前立腺液、精嚢液、前立腺組織試料（例えば生検試料（例えば均質化組織試料）、及び前立腺マッサージ後尿が含まれる。
【００２７】
ＰＳＡは、管腔細胞から上皮基底膜及び前立腺間質を通過して拡散した後、血清に達し、そこで毛細血管基底膜及び上皮細胞を通過するか、又はリンパ管に入る（Sokoll et al. 1997）。また、ＰＳＡは、例えばこれらに限定されないが、精液、精漿、前立腺液、血清、尿、前立腺マッサージ後の尿、及び腹水を含む体液から単離することができる。
【００２８】
そのため、いくつかの実施形態では、試料は尿である。ある場合では、「初尿」又は全試料の標準的な尿を採取している。いくつかの実施形態では、尿試料は、標準的なＤＲＥ前立腺マッサージの後に採取し、これは本明細書において「前立腺マッサージ後尿」という。
【００２９】
別の実施形態では、試験試料は精液（semen)、精液(seminal fluid）又は精漿である。精漿は、精液を１時間室温で液化させ、その後１０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離することで得られる。例えば、Edstrom A. et al. J. Immunol. 181, 3413-3421 (2008)を参照。
【００３０】
血清では、全ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）レベルは、いくつかの遊離アイソフォーム（ｆＰＳＡ）とプロテアーゼ−阻害剤複合体（ｃＰＳＡ）との合計濃度を表し、免疫測定法により認識できる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、血液、血清、及び／又は血漿を用いることができ、いくつかの実施形態では、これらの試料は好ましくない。
【００３２】
試料は、調製を行わずに「そのまま」試験に供するか、又は何らかの調製を行って試験に供することができる。当業者が理解するように、多くの試料調製方法を用いることができ、例えば細胞または非プロテアーゼタンパク質の除去、及び、緩衝剤（例えば高濃度塩等の添加）、試薬、アッセイ用組成物などの添加が含まれる。
【００３３】
本発明は、前立腺疾患に関係する前立腺癌特異的ペプチド（「ＰＣＳＰ」)に対するタンパク質分解活性のアッセイにより被検体を診断する方法を提供する。
【００３４】
本明細書に記載するように、前立腺癌の存在は、ＰＣＳＰを切断するアッセイを用いて測定し、ペプチドに対する活性が高いほど癌との関連性がある。本明細書において、「ペプチド」又は文法上それに対応するものは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチド、誘導体及び類似体を意味し、非天然のアミノ酸及びアミノ酸類似体、並びにペプチド模倣構造を含むタンパク質も含まれる。側鎖は、（Ｒ）又は（Ｓ）配置のどちらでもよい。好適な実施形態では、アミノ酸は（Ｓ）又はＬ配置である。
【００３５】
ペプチドがアッセイ中の基質として用いられる場合（例えばＰＣＳＰ）、ペプチドは、ＰＣＳＰのペプチド模倣残基がペプチドの切断及び／又は活性の診断との相関性を阻害しない限り、天然の構造及びペプチド模倣構造の両方を含むことができる。
【００３６】
以下に説明するように、タンパク質を捕獲基質として用いる場合、多くの実施形態では天然のアミノ酸を用いた捕獲ペプチドが利用されるが、一部の実施形態では、試料混入物による分解を抑えるためにタンパク質類似体を用いることが望ましい。
【００３７】
驚くことに、本発明は、前立腺癌患者とＢＰＨ及び／又は対照患者の間で、前立腺マッサージ後尿などの試料中のＰＣＳＰの切断量に相関があり、これにより、前立腺癌の診断、予後及び治療観察に用いることができる。このように、本発明は、ＰＣＳＰの切断と病態の相関に基づく診断方法を提供する。
【００３８】
したがって、本発明は、ＰＣＳＰである基質ペプチドを提供する。本明細書において、「前立腺癌特異的ペプチド」若しくは「ＰＣＳＰ」、「前立腺疾患特異的ペプチド」、又は文法上それらに対応するものは、試料中の１つ以上のプロテアーゼによる切断が前立腺癌又は前立腺疾患に関連しているペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、以下にさらに詳しく説明するように、ＰＣＳＰはアッセイにおけるＰＳＡに特異的である。すなわち、ペプチドのプロテアーゼに対する特異性は、ほかにどのようなプロテアーゼが存在するかによって変動することができる；例えば、一般的に、精液は尿に比べてプロテアーゼを多く含み、そのため、尿ではペプチドの絶対的な特異性は低くなり得る。
【００３９】
本発明で用いる基質は、標的酵素によって異なる。いくつかの実施形態では、酵素はＰＳＡであり、以下にさらに詳しく説明する。ＰＳＡの場合、本発明において特に有用性があるペプチドは、ペプチドＨＳＳＫＬＱ（配列番号１）であり、グルタミン（Ｑ）の後ろで切断が起こる；Denmeade et al., Cancer Research 57:4924 (1997)を参照（参照によりその全体が本明細書に援用される）。以下に概説するように、ＰＣＳＰは、光（蛍光）標識や電気化学的標識などを含む標識と結合させ、切断を検出することができる。
【００４０】
ＨＳＳＫＬＱペプチドのほかにも、本明細書においてさらに説明するように、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）セリンプロテアーゼに特異的なペプチドを含む、多くのペプチドがＰＣＳＰである。これらのペプチドには、例えばこれらに限定されないが、Denmeade et al.の表１、２及び３に記載されるようなペプチド基質の一部又はすべてが含まれ、例えばこれらに限定されないが、ＫＧＩＳＳＱＹ（配列番号２）、ＳＲＫＳＱＱＹ（配列番号３）、ＧＱＫＧＱＨＹ（配列番号４）、ＥＨＳＳＫＬＱ（配列番号５）、ＱＮＫＩＳＹＱ（配列番号６）、ＥＮＫＩＳＹＱ（配列番号７）、ＡＴＫＳＫＱＨ（配列番号８）、ＫＧＬＳＳＱＣ（配列番号９）、ＬＧＧＳＱＱＬ（配列番号１０）、ＱＮＫＧＨＹＱ（配列番号１１）、ＴＥＥＲＱＬＨ（配列番号１２）、ＧＳＦＳＩＱＨ（配列番号１３）、ＳＫＬＱ、及び類似体などが含まれる。いくつかの実施形態では、好適な類似体としては、これに限定されないが、図１に示す基質があり、本明細書において「ＡＭＩＤＥ」、「ＨＩＣ」、及び「ＨＩＶ」と呼ぶ場合がある。当業者が理解するように、本明細書に記載するペプチド配列は、活性が保持されている限り、様々な方法で修飾することができる。例えば、図１のペプチドは、末端ヒスチジンにモルフォリノ（「ｍｏｒ」）基を有しているが、これは任意選択的である。同様に、図１のペプチドは、蛍光発生脱離基として７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）を有するが、本明細書に概説するように、その他の多くの標識を用いることができる。さらに、これらのペプチドはグルタミンＱの後ろで切断されるが、アッセイの検出系に応じて、この配列（又は本明細書に記載する他の配列）のＮ−末端又はＣ−末端のいずれか（又は両方）にさらにアミノ酸を加えることも可能である。すなわち、例えば蛍光又はＥ０のいずれかなど、切断によりシグナルに測定可能な変化がある限り、ペプチドは本発明において有用性がある。
【００４１】
本発明において有用性のある他のペプチドとしては、Zhao et al., Electrochemistry Communications 12:471 (2010)に記載されるＣＨＳＳＬＫＱＫ（配列番号１４）；Roberts et al., JACS 129: 11353 (2007)に記載されるＣＥＥＥＥＨＳＳＬＫＱＫＫＫＫ（配列番号１５）；Niemela et al., Clinical Chemistry 48(8): 1257 (2002)に記載されるＫＧＩＳＳＱＹ（配列番号１６）；及び、米国特許第６２６５５４０号に記載されるいくつかのペプチド（具体的には配列表に記載のもの）などがあり、これらはすべて参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００４２】
これらのペプチド、及び、配列内に置換、修飾、非天然又は天然のアミノ酸を含むペプチドやアミノ末端又はカルボキシ末端が修飾されているペプチドを含む、他の酵素切断可能なペプチドは、それらの構成成分であるアミノ酸から、通常の技術者によく知られた各種の方法により、容易に入手可能な材料と機器を用いて作製される（例えば、The Practice of Peptide Synthesis (2nd Ed.), M. Bodanskzy and A. Bodanskzy, Springer-Verlag, New York, N.Y. (1994)を参照；その内容は参照により本明細書に援用される）。
【００４３】
これらは、例えば限定されないが、Ｆｍｏｃ法を用いた固相合成を含む（例えば、Change and Meieinhofer, Int. J. Pept. Protein Res. 11:246-9 (1978)を参照）。ペプチド合成について記載している他の文献としては、例えば限定されないが、Miklos Bodansky, Peptide Chemistry, A Practical Textbook 1988, Springer-Verlag, N.Y.; Peptide Synthesis Protocols, Michael W. Pennington and Ben M. Dunn editors, 1994, Humana Press Totowa, N.J.などがある。
【００４４】
上記のように、酵素切断可能なペプチドは、ペプチドを切断可能なペプチダーゼの認識部位となるアミノ酸配列を含む。酵素切断可能なペプチドを構成するアミノ酸は、天然、修飾又は非天然アミノ酸を含むことができ、天然、修飾又は非天然アミノ酸は、Ｄ型又はＬ型のいずれでもよい。天然アミノ酸は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンを含む。
【００４５】
また、酵素切断可能なペプチドは、本発明の酵素切断可能なペプチドへの置換に適した様々な非天然又は修飾アミノ酸を含むことができる。非天然アミノ酸の明確なリストは、Roberts and Vellaccio, The Peptides, Vol. 5, 341-449 (1983) Academic Press, New Yorkに開示されており、その目的のために参照により本明細書に援用される。本明細書において用いられる非天然又は修飾アミノ酸の例としては、これらに限定されないが、以下のものがある：α−アミノ酸、２−アミノアジピン酸（２−アミノヘキサン二酸）、α−アスパラギン、２−アミノブタン酸又は２−アミノ酪酸、γ４−アミノ酪酸、２−アミノカプリン酸（２−アミノデカン酸）、６−アミノカプロン酸、α−グルタミン、２−アミノヘプタン酸、６−アミノヘキサン酸、α−アミノイソ酪酸（２−アミノアラニン）、３−アミノイソ酪酸、β−アラニン、アロ−ヒドロキシリジン、アロ−イソロイシン、４−アミノ−７−メチルヘプタン酸、４−アミノ−５−フェニルペンタン酸、２−アミノピメリン酸（２−アミノヘプタン二酸）、γ−アミノ−β−ヒドロキシベンゼンペンタン酸、２−アミノスベリン酸（２−アミノオクタン二酸）、２−カルボキシアゼチジン、β−アラニン、β−アスパラギン酸、ビフェニルアラニン、３，６−ジアミノヘキサン酸（β−リジン）、ブタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、γ−アミノ−β−ヒドロキシシクロヘキサンペンタン酸、シクロブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、Ｎ５−アミノカルボニルオルニチン、シクロペンチルアラニン、シクロプロピルアラニン、３−スルホアラニン又はシステイン酸、２，４−ジアミノブタン酸、ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノブタン酸、ジフェニルアラニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロパン酸又は２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｓ−エチルチオシステイン、Ｎ−エチルアスパラギン、Ｎ−エチルグリシン、４−アザ−フェニルアラニン、４−フルオロ−フェニルアラニン、γ−グルタミン酸又は（γ−Ｅ）又は（γ−Ｇｌｕ）Ｇｌａγ−カルボキシグルタミン酸、ヒドロキシ酢酸（グリコール酸）、ピログルタミン酸、ホモアルギニン、ホモシステイン酸、ホモシステイン、ホモヒスチジン、２−ヒドロキシイソバレリアン酸、ホモフェニルアラニン、ホモロイシン又はホモ−Ｌホモプロリン又はホモ−Ｐホモセリン、ホモセリン、２−ヒドロキシペンタン酸、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、２−カルボキシオクタヒドロインドール、３−カルボキシイソキノリン、イソバリン、２−ヒドロキシプロパン酸（乳酸）、メルカプト酢酸、メルカプトブタン酸、Ｎ−メチルグリシン又はサルコシン、４−メチル−３−ヒドロキシプロリン、メルカプトプロパン酸、ノルロイシン、ニペコ酸、ノルチロシン、ノルバリン、ω−アミノ酸、オルニチン、ペニシラミン（３−メルカプトバリン）、２−フェニルグリシン、２−カルボキシピぺリジン、サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）、２−アミノ−３−（４−スルホフェニル）プロピオン酸、１−アミノ−１−カルボキシシクロペンタン、スタチン（４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸）、３−チエニルアラニン、ε−Ｎ−トリメチ���リジン、３−チアゾリルアラニン、チアゾリジン４−カルボン酸α−アミノ−２，４−ジオキソピリミジンプロパン酸、及び２−ナフチルアラニン。
【００４６】
また、酵素切断可能なペプチドは、様々な修飾アミノ酸を含んでいてもよく、アミノ酸のアミン基又はヒドロキシ基は、アルキル基、アルケニル基、フェニル基、フェニルアルキル基、複素環基、複素環式アルキル基、炭素環基、又は炭素環式アルキル基によって化学的に修飾されている。化学修飾置換基の例としては、これらに限らないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アリル、フェニル、ベンジル、ピリジル、ピリジルメチル、及びイミダゾリルがある。"The Peptides" Vol 3, 3-88 (1981)では、アミノ酸を修飾するための適切な側鎖官能基が多数開示されており、その目的のために本明細書に援用される。
【００４７】
修飾アミノ酸の例としては、これらに限定されないが、Ｎ−メチル化アミノ酸、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、Ν，Ν−ジメチルリジン、 Ｎ’−（２−イミダゾリル）リジン、Ｏ−メチルチロシン、Ｏ−ベンジルチロシン、Ｏ−ピリジルチロシン、Ｏ−ピリジルメチルチロシン、Ｏ−メチルセリン、Ｏ−ｔ−ブチルセリン、Ｏ−アリルセリン、Ｏ−ベンジルセリン、Ｏ−メチルスレオニン、Ｏ−ｔ−ブチルスレオニン、Ｏ−ベンジルスレオニン、Ｏ−メチルアスパラギン酸、Ｏ−ｔ−ブチルアスパラギン酸、Ｏ−ベンジルアスパラギン酸、Ｏ−メチルグルタミン酸、Ｏ−ｔ−ブチルグルタミン酸、及びＯ−ベンジルグルタミン酸がある。
【００４８】
また、酵素切断可能なペプチドは、４−アザヒドロキシフェニルアラニン（４−アザＨｏｆ又はアザＨｏｆ）、４−アミノメチルアラニン、４−ピリジルアラニン、４−アザフェニルアラニン、モルホリニルプロピルグリシン、ピペラジニルプロピルグリシン、Ｎ−メチルピペラジニルプロピルグリシン、４−ニトロ−ヒドロキシフェニルアラニン、４−ヒドロキシフェニルグリシン、又は２−（４，６−ジメチルピリミジニル）リジンである修飾アミノ酸を含んでもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態では、蛍光性（fluorogenic）ＰＣＳＰが用いられる。当技術分野で周知のように、プロテアーゼの切断の測定に用いられる多くの蛍光発生基があり、限定されないが、ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）；ＭＣＡ（（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル）、ｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）などがある。
【００５０】
切断によって活性化される単一の発蛍光団を利用する蛍光発生基質のほかに、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）系を用いることもできる。これらの実施形態では、発蛍光団レポーター及びクエンチャー（quencher）が用いられ、これらの間にプロテアーゼ切断部位が位置する。具体的な例の１つとして、クエンチング部分は、ＦＲＥＴの周知の現象（非放射エネルギー移動又はＦｏｒｓｔｅｒエネルギー移動としても知られる）によりシグナル発蛍光団の蛍光発光を消光させる（quench）ことができる色素分子であってもよい。ＦＲＥＴでは、励起した発蛍光団（供与体色素；この場合ではシグナル発蛍光団）は、その励起エネルギーを別の発色団（受容体色素；この場合ではクエンチャー）に転移する。このようなＦＲＥＴ受容体又はクエンチャーは、それ自身が発色体であって、転移されたエネルギーを蛍光発光で放射してもよく、又は、非蛍光発光であって、転移されたエネルギーを他の崩壊機構により放出してもよい（暗型のＦＲＥＴクエンチャー又は受容体）。効率的なエネルギー移動は、ＦＲＥＴ供与体の放出スペクトルとＦＲＥＴクエンチャー又は受容体の吸収スペクトルの重なり、及び、ＦＲＥＴ供与体と受容体との間の距離に直接的に依存する。切断の前にレポーターとクエンチャーが近接していれば「消光」が起こり、ここでは、レポーターの最大励起での励起により、レポーターがクエンチャーの励起波長で発光し、それがクエンチャー分子に吸収され、その結果レポーターの発光スペクトルは容易に検出できない。しかし、切断により、レポーターとクエンチャーは空間的に近接しなくなり、消光の効果は失われる。
【００５１】
ＦＲＥＴの色素の対であるシグナルとクエンチャーの標識の例は、当技術分野で周知である。例えば、Marras et al., 2002, Nucleic Acids Res., 30(21) e122；Wittwer et al., 1997, Biotechniques 22:130-138; Lay and Wittwer, 1997, Clin. Chem. 43:2262-2267；Bernard et al., 1998, Anal. Biochem. 255: 101-107；米国特許第６，４２７，１５６号；第６，１４０，０５４号、及び第６，５９２，８４７号を参照（これらの内容は、参照により本明細書に援用される）。
【００５２】
いくつかの実施形態では、シグナルプローブのシグナル標識は発蛍光団であり、クエンチャープローブのクエンチャー標識は、シグナル発蛍光団の蛍光シグナルを消光することができる部分である。発蛍光団は当技術分野で公知である。蛍光シグナルを消光することができる部分の例としては、ダブサイル（Dabcyl）、ダブシル（dabsyl）ＢＨＱ−１、ＴＭＲ、ＱＳＹ−７、ＢＨＱ−２、ブラックホールクエンチャー（登録商標）（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、及び、ニトロ又はアゾ基を有する芳香族化合物が含まれる。
【００５３】
別の具体的な例では、消光部分は、ＦＲＥＴではない機構によってシグナル発蛍光団の蛍光発光を消光することができる分子又は発色団であってもよい。衝突又は直接的接触による消光では、シグナル発蛍光団と消光発色団の間にスペクトルの重なりは必要ないが、シグナル発蛍光団と消光発色団が互いに衝突できるような近い距離になければならない。
【００５４】
また、当業者によって容易に理解されるように、上述のような蛍光発光に基づく検出系は、「液相」アッセイとして行うことができる。あるいは、蛍光発光を利用するＰＳＡ酵素活性試験は「固体支持体」アッセイとして行うこともできる。したがって、例えば、上記のような単一の発蛍光団で標識したペプチド、又は二重に標識したＦＲＥＴペプチドのいずれかを固体支持体に結合させ、試験試料を加えて蛍光発光を観察することができる。
【００５５】
同様に、本明細書に記載するように、電気化学的検出のために別のアミノ酸を組み入れることもできる。例えば、本明細書における電気化学的研究では、表面にペプチドを結合させるために、グルタミンの後ろにシステインを用いている。当技術分野において理解されるように、ペプチドは、ペプチド結合でＲＡＭに直接結合するか、又は、ＰＳＡ酵素が基質を切断してシグナルを生じさせ続ける限り（例えば、Ｅ０の変化又は蛍光発光の変化）、アミノ酸類似体を含む追加の／異なるアミノ酸を含ませることができる。
【００５６】
したがって、他のペプチドも、本明細書に記載するアッセイ系に用いる捕獲基質（例えば、「ＰＳＡペプチド」）として用いることができる。例えば、ＰＳＡは、例えばキモトリプシンに比べて、ある程度の特異性をもってＨＳＳＫＬＱペプチドを切断する。試験試料に応じて、より特異性の低いペプチドを用いることができる。当業者が理解するように、ペプチドベースの基質で利用できる多くの光学的（例えば蛍光発光に基づく）アッセイが存在する。一般的に、上記に概説するように、これらは切断によって生じる光学的変化、例えば蛍光発光を利用している。
【００５７】
その他のＰＳＡ基質としては、セメノゲリン（semenogelin）Ｉ、セメノゲリンＩＩ、フィブロネクチン、ラミニン、インスリン様成長因子結合タンパク質、一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、及び副甲状腺ホルモン関連タンパク質などの天然基質が含まれる。
【００５８】
一般的に、これらのＰＣＳＰの切断は、試料中の特定のプロテアーゼの存在と関連がある。プロテアーゼは、ペプチド結合を触媒的に加水分解するタンパク質分解酵素の多数のファミリーを表す。本明細書において、「プロテアーゼ」又は「プロテイナーゼ」とは、アミノ酸を連結しているペプチド（アミド）結合の加水分解によってタンパク質を加水分解することができる酵素を意味する。プロテアーゼの主なグループとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、及びメタロプロテアーゼが含まれる。
【００５９】
前立腺に見られるセリンプロテアーゼは、前立腺癌の浸潤及び転移の原因となるタンパク質分解カスケード反応に関与している可能性がある。２つのそのようなタンパク質は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）とＰＳＡである。ウロキナーゼプロテアーゼの合成の増加は、多くの癌における転移能力の上昇と関連がある。ウロキナーゼは、細胞外空間に遍在するプラスミノーゲンからプラスミンを活性化し、その活性化により、転移性の腫瘍細胞が浸潤する細胞外マトリックス中のタンパク質の分解が引き起される。また、プラスミンはコラゲナーゼを活性化することができ、これにより毛細血管やリンパ系を取り囲む基底膜中のコラーゲンの分解を促進し、その結果、腫瘍細胞が標的組織に浸潤できるようになる（Dano et al. (1985) Adv. Cancer. Res., 44: 139）。
【００６０】
本発明は、試料中のプロテアーゼ、特に前立腺特異的抗原（ＰＳＡ)セリンプロテアーゼの測定法を提供する。すなわち、いくつかの実施形態では、前立腺マッサージ後尿などの試料におけるＰＳＡの活性は、ＰＳＡによって切断され、かつ特定の試料中に存在する他のプロテアーゼにより切断されない基質を用いて測定する。
【００６１】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ)は、通常１５〜６０μＭ（すなわち、０．５〜２ｍｇ／ｍｌ）の濃度で存在し、前立腺液において最も多く存在するセリンプロテアーゼである。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ)は、約３３ｋＤａの糖タンパク質であり、これは腺性カリクレイン様プロテイナーゼと非常によく似た構造を有する。しかし、他のカリクレインに一般的に見られるトリプシン様活性とは対照的に、ＰＳＡはキモトリプシン様活性を示す。ヒトＰＳＡの配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ：ＡＡＤ１４１８５であり；前立腺特異的抗原アイソフォーム１プレプロタンパク質（ヒト）は、ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＰ＿００１６３９であり、また、前立腺特異的抗原アイソフォーム３プレプロタンパク質（ヒト）は、ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＰ＿００１０２５２１８である。
【００６２】
ＰＳＡは、タンパク質分解において、主にプロテアーゼとして独立して作用し、ｕ−ＰＡのようにプラスミンを介さないことが示唆されている。
【００６３】
ＰＳＡは導管上皮及び前立腺腺房で合成され、エキソサイトーシスにより前立腺管の管腔に分泌される。ＰＳＡは、前立腺管の管腔から、前立腺を通過して精液に入る。
【００６４】
精液中には、精嚢で作られるセメノゲリンＩ及びＩＩ、並びにフィブロネクチンを主としたゲル形成タンパク質が存在する。これらのタンパク質は、射精時に形成され、かつ精子を捕捉する働きを持つ精液凝塊の主要な成分である。ＰＳＡは凝塊を液化し、ゲル形成タンパク質のタンパク質分解により精液塊をより小さくかつより溶解性の高い断片に分解し、これにより精子が解放される。
【００６５】
その他の基質が確認されており、これは活性なＰＳＡアイソフォームを前立腺癌の発生に関与させ、例えばこれらに限定されないが、フィブロネクチン、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、インスリン様成長因子結合タンパク質、潜在型形質転換増殖因子β、及び副甲状腺ホルモン関連タンパク質が含まれる。
【００６６】
ＰＳＡは、いくつかの遊離アイソフォームで存在し、異なる体液中のプロテアーゼ阻害剤と錯体を形成している。異なるＰＳＡアイソフォームの測定により、選択した集団における前立腺癌検出の特異性が向上されている。Catalona et al. (1998) J. Am. Med. Assoc. 279: 1542-1547及びJansen et al. (2009) Eur. Urol. 55:563-574。現在、米国で前立腺癌の検出に最も広く用いられているものには、Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ全ＰＳＡ及び遊離ＰＳＡテストキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）と、ＡｘＳＹＭ（登録商標）ＰＳＡアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）がある。
【００６７】
しかし、活性ＰＳＡのタンパク質分解作用は、通常の免疫測定では定量化できない。そのため、ＰＳＡ酵素活性に特異的なアッセイは、良性疾患と悪性疾患を判別するためのこの重要なパラメーターの臨床的有用性を確認するための既存の試験の補助手段として望ましい。Niemela et al. (2002) Clin. Chem. 48: 1257-1264、Wu et al. (2004) Clin. Chem. 50: 125-129、及びZhu et al. (2006) Biol. Chem. 387:769-772。
【００６８】
そのため、本発明では、潜在的な癌の同定を容易にし、最終的には、リスクの高い患者に生検が妥当であることを知らせるための診断のノモグラムに加えるための、ＰＳＡ活性に特異的な診断アッセイの利用について述べる。
【００６９】
本発明は、試料中で、ＰＳＡによって引き起こされるペプチド切断事象を特異的に検出するあらゆるアッセイプラットフォーム（すなわち、光学的、電気化学的なもの）を包含する。
【００７０】
本明細書に概説する発明は、臨床尿試料中のＰＳＡ活性が、癌であると確認された生検結果に有意な相関があることを示す。そのため、いくつかの実施形態では、本発明は、前立腺癌治療（例えば、これらに限定されないが、化学療法的治療、並びに、近接照射療法、体外照射療法、及びその他の種類の放射線又はビーム療法を含む放射線治療）の経過を診断、予測、又は観察する方法を提供する。前記方法は、患者の試料におけるＰＳＡの酵素活性を測定することを含む。
【００７１】
一般的に、診断は、得られた結果を正常な患者のＰＳＡ活性レベルと比較することで行うことができ、ＰＳＡ活性の上昇が前立腺癌の存在のマーカーとなる。治療の観察は、処置を受けている患者のＰＳＡレベルを時間の経過とともに繰り返し測定して観察することにより行うことができ、酵素活性の減少レベルが腫瘍量の減少、存在、又は悪性度に相関する。経時的変化が見られない場合、結果に従い、医師が治療の変更又は増強を行うこともできる。
【００７２】
当業者が理解するように、上述の光学的標識に加えて、以下に概説する電気化学的標識を用いることもできる。
【００７３】
本明細書に概説するように、光学的（例えば、蛍光発光）アッセイは、既知のどのようなフォーマットを用いて行ってもよい。試料は、単独又はバッチで測定してもよく、自動システム等を含むどのようなシステムを用いてもよい。
【００７４】
一態様では、本発明は、電気化学的アッセイを用いて試験試料中のＰＳＡなどの酵素を検出する方法を提供する。一般的なシステムは、米国特許出願第６０／９８０，７３３号；第１２／２５３，８２８号；第６１／０８７，０９４号；第１２／２５３，８７５号；及び、第６１／０８７，１０２号に記載されている；これらすべては、参照によりその全体、及び特に発明の構成要素が、明示的に本明細書に援用される。
【００７５】
当業者が理解するように、本明細書に記載するアッセイ系の構成要素は、最終的な系においてそれぞれ独立して包含及び除外することができ、本発明の構成要素の異なる組み合わせを用いることができる。電気化学的アッセイでは、これらに限定されないが、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）及び共有結合で結合した電気活性な活性部位（ＥＡＭ、又は本明細書において「酸化還元活性分子」（ＲｅＡＭ）とも呼ぶ）を含む電極を含みうる。
【００７６】
「電極」とは、電子装置に接続したときに、電流又は電荷を感知して信号に変換することができる組成物を意味する。好適な電極は当技術分野で周知であり、例えばこれらに限定されないが、以下のものが含まれる：金、白金、パラジウム、ケイ素、アルミニウムを含むある種の金属及びその酸化物；酸化白金、酸化チタン、酸化スズ、酸化インジウムスズ、酸化パラジウム、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化モリブデン（Ｍｏ２Ｏ６）、酸化タングステン（ＷＯ３）、及び酸化ルテニウムを含む金属酸化物電極；及び炭素（ガラス状炭素電極、グラファイト、及びカーボンペーストを含む）。好適な電極としては、金、ケイ素、炭素、金属酸化物電極が含まれ、金が特に好適である。
【００７７】
ＥＡＭは、第１のＥ０を有する遷移金属錯体を含む。また、電極には、標的酵素の複数の酵素基質（「捕捉基質」、本明細書において、標的酵素がＰＳＡである場合、「ＰＳＡ基質」又は「ＰＳＡペプチド」とも呼ばれる。）が結合されている。
【００７８】
したがって、この方法では、試験試料が電極に付加され、標的酵素と標的酵素の基質とが複数の反応物を形成する。酵素の存在は、ＥＡＭの環境の変化により生じるＥ０の変化を測定することで判定する。
【００７９】
一態様では、本発明は、電極に結合したリガンド構造を提供する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、捕捉基質は配位原子を提供する。他の実施形態では、ＲｅＡＭＣは電極に結合した単一分子であるが、捕捉基質は配位原子を提供しない。その他の実施形態では、ＲｅＡＭＣは含まれない；ＥＡＭと捕捉基質が別々に電極に結合している。
【００８１】
以下にさらに述べるように、本発明では、いくつかの異なる構造を用いることができる。ある実施形態では、ＥＡＭは捕捉基質も含み、本明細書において「酸化還元活性部分複合体」又はＲｅＡＭＣと呼ぶものを形成する。
【００８２】
本明細書に記載する電極は平面で表されるが、これは電極の可能な構造の１つに過ぎず、単に模式的に示すためのものである。電極の構造は、用いる検出方法によって異なる。
【００８３】
例えば、平面状の電極は、光学的検出方法に対して好ましい場合があり、又は、ペプチドアレイを作製する際には、合成と検出の両方のためのアドレス可能な部位が必要になる。あるいは、単一プローブ分析では、電極はチューブ状でもよく、ＳＡＭ、ＥＡＭ及び捕捉リガンドなどの系の構成成分は内表面に結合される。これにより、核酸を含む表面を少量の試料に最大限接触させることができる。
【００８４】
本発明の電極は、通常、バイオチップカートリッジに組み込まれ、様々な構成が可能で、また、作用電極及び基準電極、相互接続子(interconnect）（「基板貫通（through board)」相互接続子を含む）、及び微小流体素子を組み込むことができる。例えば、米国特許第７，３１２，０８７号を参照（参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００８５】
バイオチップカートリッジには、生体分子のアレイを含む基板が組み込まれ、様々な構成が可能である。例えば、チップは、試薬の導入及び除去のための入口と出口とを備えた反応室を含むことができる。また、カートリッジは、微小流体素子を備えたキャップ又は蓋を含むことができ、これにより試料を導入し、試薬を添加し、反応を行い、その後、検出用アレイを含む反応室に試料を加えることができる。
【００８６】
ある好適な実施形態では、バイオチップは、複数のアレイ位置を有する基板を含む。本明細書において、「基板」若しくは「固体支持体」、又は文法上それに対応するものは、捕捉リガンドの付加又は結合に適した別個の個々の部位を含むように変更することができる材料を意味する。
【００８７】
適当な基板としては、金などの金属表面、以下に定義する電極、ガラス及び修飾又は官能性ガラス、繊維ガラス、テフロン（登録商標）、セラミックス、マイカ、プラスチック（アクリル、ポリスチレン及びスチレンと他の物質との共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロン（登録商標）、及びそれらの誘導体などを含む）、ＧＥＴＥＫ（ポリプロピレンオキシドと繊維ガラスの混合物）等、ポリサッカライド、ナイロン又はニトロセルロース、樹脂、シリカ又はシリコンや修飾シリコンを含むシリカ系物質、炭素、金属、無機ガラス、及びその他の様々なポリマーが含まれ、プリント基板（ＰＣＢ）とポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）の物質が特に好適である。
【００８８】
本システムでは、アドレス可能な検出電極の形成基板が存在するアレイフォーマットに特に有用性が見出される（本明細書では、一般的に、「パッド」、「アドレス」又は「微細部位」という）。本明細書において、「アレイ」とは、あるアレイフォーマットにおける複数の捕捉リガンドを意味する；アレイの大きさはその組成と最終用途によって異なる。約２つの異なる捕捉基質から数千のものを含むアレイを作製することができる。
【００８９】
ある好適な実施形態では、検出電極は基板上に形成される。また、本明細書の記述は、概して金電極の利用に関するが、当業者が理解するように、他の電極も用いることができる。本明細書及び引用文献に概説されるように、基板は様々な物質を含むことができる。
【００９０】
一般的に、好適な物質には、プリント基板が含まれる。回路基板材料は、導電膜でコーティングされ、かつリソグラフィー技術、特にフォトリソグラフィー技術を用いて処理され、電極及び相互接続子（当技術分野で相互結線（interconnection）又はリード線と呼ばれる場合がある）のパターンを形成する絶縁基板を含むものである。絶縁基板は、すべてではないが通常、ポリマーである。
【００９１】
当技術分野で周知のように、１つ又は複数の層を用いて、「二次元」（例えば、平面内のすべての電極及び相互結線）又は「三次元」（電極が１つの面にあり、かつ相互接続子が反対側に向けて基板を貫通でき、又は電極が複数の面にある）の基板を作ることができる。三次元系では、ドリル加工又はエッチングを用いることが多く、その後、銅などの金属で電気メッキを行い、「基板貫通」相互結線が作られる。回路基板材料は、銅箔などの箔が基板にあらかじめ付着されたものが多く、必要に応じて、例えば電気メッキにより、追加の銅を加える（例えば相互結線のため）。その後、銅表面は、接着層を取り付けるため、エッチングなどによる粗面化が必要になる場合がある。
【００９２】
したがって、ある好適な実施形態では、本発明は、複数の電極、好適には金電極を含む基板を含むバイオチップ（本明細書において、「チップ」と呼ぶ場合がある）を提供する。電極の数は、アレイについて概説する通りである。各電極は、好適には、本明細書に概説する自己組織化単分子膜を含む。ある好適な実施形態では、単分子膜形成種の１つは、本明細書に概説する捕捉リガンドを含む。また、各電極は、電極に一端が結合され、電極を制御することができる機器に最終的に結合される相互結線を有する。すなわち、各電極は独立してアドレス可能である。
【００９３】
最後に、本発明の構成物は、微小流体要素や自動装置要素などの様々な追加の要素（例えば、米国特許第６，９４２，７７１号及び第７，３１２，０８７号、並びに関連する件を参照；両文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）、及び、信号処理技術を用いたコンピュータを含む検出システム（例えば、米国特許第６，７４０，５１８号を参照；参照によりその全体が本明細書に援用される）を含むことができる。
【００９４】
自己組織化単分子膜スペーサー
いくつかの実施形態では、電極はさらにＳＡＭを含んでいてもよい。本明細書において、「単分子膜」又は「自己組織化単分子膜」又は「ＳＡＭ」とは、表面に自然に化学吸着した分子の比較的整列した集合体であって、分子は互いに略平行で、面に対してほぼ垂直に配置されているものを意味する。各分子は、面に結合する官能基と、単分子膜中の隣接する分子と相互作用して比較的整列したアレイを形成するための部分とを有する。
【００９５】
「混合」単分子膜は異種単分子膜を含んでおり、すなわち、少なくとも２つの異なる分子が単分子膜を構成している。本明細書において概説するように、単分子膜を用いることで、表面への生体分子の非特異的結合の量を減らし、また、核酸の場合、オリゴヌクレオチドの電極からの距離によって、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの効率を高めることができる。このように、単分子膜により、標的酵素を電極表面から離しておくことが容易になる。
【００９６】
また、単分子膜は、電荷キャリアを電極表面から遠ざけておくことにも役立つ。そのため、この膜は、溶媒中で電極とＲｅＡＭ又は電極と荷電種との電気的接触を妨げることに寄与する。このような接触は、直接的な「短絡」、又は試料中に存在する可能性のある荷電種を介した間接的な短絡を引き起こす可能性がある。したがって、単分子膜は、電極表面の均一な層に密にパッキングされ、最小限の「ホール」が存在することが好ましい。このように、単分子膜は、溶媒が電極に到達することを妨げる物理的なバリアとして働く。
【００９７】
いくつかの実施形態では、単分子膜は伝導性オリゴマーを含む。本明細書において、「伝導性オリゴマー」とは、好適には直鎖状である、実質的に伝導性のオリゴマーを意味し、そのいくつかの実施形態は、文字通り「分子ワイヤー」と呼ばれる。本明細書において、「実質的に伝導性」とは、オリゴマーが１００Ｈｚで電子を移動させ得ることを意味する。
【００９８】
一般的に、伝導性オリゴマーは、実質的に重なり合うπ軌道、すなわち共役π軌道を伝導性オリゴマーの単量体ユニット間に有するが、伝導性オリゴマーは、１つ以上のσ結合を含んでいてもよい。加えて、伝導性オリゴマーは、関連するＥＡＭに電子を導入し、又はそれから電子を受け取ることができる能力によって機能的に定義することもできる。さらに、伝導性オリゴマーは、本明細書に定義する絶縁体よりも伝導性が高い。また、本発明の伝導性オリゴマーは、それ自身が電子を供与又は受け取る電気活性ポリマーとは区別される。
【００９９】
伝導性オリゴマーのさらに詳細な説明は、国際公開第１９９９／５７３１７号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に援用される。具体的には、国際公開第１９９９／５７３１７号の１４〜２１ページにある構造１〜９に示される伝導性オリゴマーは、本発明で有用である。いくつかの実施形態では、伝導性オリゴマーは以下の構造を有する：
【０１００】
【化１】
2013528379.tif 000003
【０１０１】
さらに、単分子膜中の少なくとも一部の伝導性オリゴマーの末端は、電子的に露出している。本明細書において、「電子的に露出している」とは、ＥＡＭを末端に非常に近接させ、かつ、適切なシグナルで惹起した後に、ＥＡＭの存在に依存したシグナルが検出され得ることを意味する。伝導性オリゴマーは、末端基を有しても、有していなくてもよい。そのため、好適な実施形態では、付加的な末端基はなく、伝導性オリゴマーは、例えばアセチレン結合などの末端基で終端する。
【０１０２】
あるいは、いくつかの実施形態では末端基が付加され、本明細書において「Ｑ」で表す場合がある。末端基はいくつかの理由で用いられる場合がある；例えば、ＥＡＭの検出のための伝導性オリゴマーの電子的な利用可能性に寄与する、又は、他の理由のためにＳＡＭの表面を変化させる；例えば、非特異的な結合を防ぐなど。例えば、負の電荷を持つ表面を形成するために負の電荷を持つ基が末端にあってもよく、標的検体が本明細書に定義するペプチドであった場合、プロテアーゼＰＳＡの結合が可能になり、それによりペプチドの特異的切断が起きる。好適な末端基としては、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、及び−ＣＨ３などのアルキル基、さらに（ポリ）エチレングリコールなどの（ポリ）アルキルオキシドなどが含まれ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２Ｈ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｈ、及び−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４Ｈが好ましい。
【０１０３】
ある実施形態では、異なる種類の末端基を有する伝導性オリゴマーの混合物を用いることができる。したがって、例えば、一部の末端基は検出を促進し、一部のものは非特異的結合を防ぐことができる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、電極は、好適には電極表面上の単分子膜の形で、不動態化剤（passivation agent）をさらに含む。一部の検体では、検体結合（すなわち、プロテアーゼの一時的な結合とそれに続く切断）の効率は、結合リガンドが電極から離れている際に増加し得る。さらに、単分子膜の存在により、表面への非特異的結合を減少させることができる（これは、末端基を用いることでさらに促進される）。不動態化剤の層は、結合リガンド及び／又は検体を電極表面から遠ざけておくことを容易にする。さらに、不動態化剤は電荷キャリアを電極表面から遠ざけておくことに役立つ。そのため、この層は、溶媒中で電極と電子伝達部分との電気的接触、又は電極と荷電種との電気的接触を妨げることに役立つ。このような接触は、直接的な「短絡」、又は試料中に存在し得る荷電種を介した間接的な短絡を引き起こす恐れがある。
【０１０５】
したがって、不動態化剤の単分子膜は、電極表面の均一な層に密にパッキングされ、最小限の「ホール」が存在することが好ましい。あるいは、不動態化剤は単分子膜の形でなくてもよく、伝導性オリゴマーのパッキングや他の特性を促進するために存在することができる。
【０１０６】
このように、不動態化剤は、溶媒が電極に到達することを妨げる物理的なバリアとして働く。そのため、不動態化剤はそれ自体が実際に、（１）伝導性、又は（２）非伝導性、すなわち絶縁性の分子である。したがって、ある実施形態では、本明細書に述べるように、不動態化剤は、電極への電荷の移動を阻害又は減少させる末端基を有する又は有しない伝導性オリゴマーである。伝導性であり得る他の不動態化剤としては、−−（ＣＦ２）ｎ−−、−−（ＣＨＦ）ｎ−−、及び−−（ＣＦＲ）ｎ−−のオリゴマーが含まれる。ある好適な実施形態では、不動態化剤は絶縁体部分である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、単分子膜は絶縁体を含む。「絶縁体」とは、実質的に非伝導性のオリゴマーであり、好適には直鎖状である。本明細書において、「実質的に非伝導性」とは、絶縁体を介した電子の移動速度が、伝導性オリゴマーを介した電子の移動速度よりも遅いことを意味する。別に言うと、絶縁体の電気抵抗は、伝導性オリゴマーの電気抵抗よりも高い。しかし、−−（ＣＨ２）１６分子などのように、一般的に絶縁体と考えられているオリゴマーであっても、速度は遅いが電子を移動し得ることに注意が必要である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、絶縁体の伝導率Ｓはおよそ１０−７Ω−１ｃｍ−１以下で、およそ１０−８Ω−１ｃｍ−１未満が好ましい。Gardner et al., Sensors and Actuators A 51 (1995) 57-66（参照により本明細書に援用される）。
【０１０９】
一般的に、絶縁体は、σ結合を有するアルキル又はヘテロアルキルのオリゴマー又は部分であり、任意の特定の絶縁体分子は芳香族基又は１つ以上の共役結合を含んでいてもよい。本明細書において、「ヘテロアルキル」とは、少なくとも１つのヘテロ原子、すなわち窒素、酸素、硫黄、リン、ケイ素、又はホウ素を鎖内に含むアルキル基を意味する。あるいは、絶縁体は、電子の移動を好ましくは大きく阻害する又は遅くすることに寄与する１つ以上のヘテロ原子又は結合が付加された伝導性オリゴマーに非常に類似していてもよい。いくつかの実施形態では、絶縁体はＣ６−Ｃ１６アルキルを含む。
【０１１０】
絶縁体を含む不動態化剤は、電極上の部分又は伝導性オリゴマーのパッキングや、絶縁体の親水性又は疎水性、及び絶縁体の可動性、すなわち、回転、ねじれ、又は長軸方向の可動性を変化させるために、本明細書に記載するＲ基で置換されていてもよい。例えば、分枝状アルキル基を用いることができる。また、絶縁体を含む不動態化剤の末端は、単分子膜の露出表面に作用するための追加の基を含んでいてもよく、本明細書において末端基（「ＴＧ」）と呼ぶ場合がある。例えば、試料からの非特異的な結合を阻害し、又は検体等の結合の動態に作用するために、電荷を帯びた基、中性の基、又は疎水性の基を付加することができる。例えば、電荷を帯びた表面を形成して、特定の標的検体の結合を促進又は阻害し、あるいは表面上に横たわるのを退ける又は防止するために、電荷を帯びた基が末端に存在していてもよい。
【０１１１】
不動態化剤の長さは必要に応じて変わる。一般的に、不動態化剤の長さは、上述する伝導性オリゴマーの長さと同程度である。また、伝導性オリゴマーは、基本的に不動態化剤と同じ長さであるか又はより長くてもよく、その結果、結合リガンドが溶媒により到達しやすくなる。
【０１１２】
単分子膜は、絶縁体を含む不動態化剤を単一種類含むか、又は異なる種類を含んでいてもよい。
【０１１３】
適当な絶縁体は当技術分野で周知であり、例えばこれらに限定されないが、−−（ＣＨ２）ｎ−−、−−（ＣＲＨ）ｎ−−、及び−−（ＣＲ２）ｎ−−、エチレングリコール、又は酸素の代わりに他のヘテロ原子を用いる誘導体（すなわち窒素又は硫黄（電極が金である場合、硫黄誘導体は好ましくない））を含む。いくつかの実施形態では、絶縁体はＣ６〜Ｃ１６アルキルを含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、電極は金属表面であり、相互接続子又は電気化学反応を行う能力を必ずしも有する必要はない。
【０１１５】
アンカー基
本発明は、アンカー基を含む化合物を提供する。本明細書において、「アンカー」又は「アンカー基」とは、本発明の化合物を電極に結合する化学基を意味する。
【０１１６】
当業者が理解するように、アンカー基の組成は、それが結合する表面の組成に応じて異なる。金電極の場合、ピリジニルアンカー基及びチオール系アンカー基の両方が特に有用である。
【０１１７】
伝導性オリゴマーの共有結合は、使用する電極および伝導性オリゴマーに応じて、様々な方法で達成することができる。一般的に、構造１中の「Ａ」で示されるようなある種のリンカーが用いられ、ここで、Ｘは伝導性オリゴマーを示し、斜線面は電極を示す：
【０１１８】
構造１
【０１１９】
【化２】
2013528379.tif 000004
【０１２０】
この実施形態では、Ａはリンカー又は原子である。「Ａ」の選択は、電極の特性に部分的に依存する。そのため、例えば、金電極が用いられる場合、Ａは硫黄部分であってもよい。あるいは、金属酸化物電極が用いられる場合、Ａは、酸化物の酸素に結合したケイ素（シラン）部分であってもよい（例えば、Chen et al., Langmuir 10:3332-3337 (1994)；Lenhard et al., J. Electroanal. Chem. 78: 195-201 (1977)を参照；これらは参照により明示的に本明細書に援用される）。炭素系電極が用いられる場合、Ａはアミノ部分であってもよい（好適には第一級アミン；例えば、Deinhammer et al., Langmuir 10: 1306-1313 (1994)を参照）。このように、好適なＡ部分としては、これらに限定されないが、シラン部分、硫黄部分（アルキル硫黄部分を含む）、及びアミノ部分が含まれる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、電極は炭素電極、すなわちガラス状炭素電極であり、結合はアミン基の窒素を介して行われる。代表的な構造は、米国特許出願第２００８０２４８５９２号の構造１５に示されており、参照によりその全体、特にそれに記載される構造、異なるアンカー基に関する説明、及び付属する文章が本明細書に援用される。また、追加の原子が存在してもよい（すなわち、リンカー及び／又は末端基）。
【０１２２】
米国特許出願第２００８０２４８５９２号の構造１６（上記のように参照により本明細書に援用される）では、酸素原子は、金属酸化物電極の酸化物に由来する。Ｓｉ原子は他の原子を含んでいてもよく、すなわち、置換基を含むケイ素部分であってもよい。ＳＡＭを他の電極に結合するその他のものについては、当技術分野で周知である；例えば、酸化インジウムスズ電極への結合に関するNapier et al., Langmuir, 1997、及び、酸化インジウムスズ電極へのリン酸塩の化学吸着（H. Holden Thorpe, CHI conference, May 4-5, 1998の発表）を参照。
【０１２３】
ある好適な実施形態では、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）が電極に用いられ、アンカー基はホスホン酸含有種である。
【０１２４】
硫黄アンカー基
構造１では単一の部分として示しているが、伝導性オリゴマーは、２つ以上の「Ａ」部分により電極と結合していてもよい。「Ａ」部分は同一でも異なっていてもよい。したがって、例えば、以下の構造２、３及び４に一般的に示すように、電極が金電極であって、「Ａ」が硫黄原子又は部分である場合、電極への伝導性オリゴマーの結合に複数の硫黄原子が用いられていてもよい。当業者が理解するように、他のこのような構造も作ることができる。構造２、３及び４では、Ａ部分は単純な硫黄原子であるが、置換された硫黄部分を用いることもできる。
【０１２５】
したがって、例えば、以下の構造６に一般的に示すように、電極が金電極であって、「Ａ」が硫黄原子又は部分である場合、以下の構造２、３及び４に一般的に示すように、電極への伝導性オリゴマーの結合に複数の硫黄原子が用いられていてもよい。当業者が理解するように、他のこのような構造も作ることができる。構造２、３及び４では、Ａ部分は単純な硫黄原子であるが、置換された硫黄部分を用いることもできる。
【０１２６】
構造２
【０１２７】
【化３】
2013528379.tif 000005
【０１２８】
構造３
【０１２９】
【化４】
2013528379.tif 000006
【０１３０】
構造４
【０１３１】
【化５】
2013528379.tif 000007
【０１３２】
構造４と同様に、単一の炭素原子で終端し、３つの硫黄部分が電極に結合している伝導性オリゴマーを有し得ることにも注意が必要である。
【０１３３】
別の態様では、本発明は、共役チオールを含むアンカーを提供する。いくつかの典型的な錯体は、共役チオールアンカーとの錯体である。いくつかの実施形態では、アンカーはアルキルチオール基を含む。２つの化合物は、それぞれカルベンおよび４−ピリジルアラニンをベースとしている。
【０１３４】
別の態様では、本発明は、金電極などの電極上で検体を検出するための電気活性部分の構築物においてアンカー基として働く共役多足性（multipodal）チオ含有化合物を提供する。すなわち、スペーサー基（ＥＡＭ、ＲｅＡＭＣ、又は「空」の単分子膜形成種に結合することができる）が２つ以上の硫黄原子を用いて結合されている。これらの多足性アンカー基は、本明細書に記載するように、直鎖状又は環状である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、アンカー基は、金表面に結合する２つの硫黄原子を含む「二足性」であり、直鎖状であるが、一部の場合には、他の多足性（例えば、「三足性」）の系を含むことが可能である。このような多足性のアンカー基は、高い安定性を示し、及び／又は、立体的な制約がある頭部基を持つチオール含有アンカーからＳＡＭを調製するうえでより大きなフットプリントが可能である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、アンカーは環状ジスルフィド（「二足」）を含む。一部の場合では、他の多足性（例えば、「三足性」）を有する環系アンカー基を含むことができる。環の原子の数はさまざまで、例えば５〜１０であり、以下に述べる多環アンカー基も含まれる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、アンカー基は、以下に示すような、７員環で頂点（apex）窒素原子および分子内ジスルフィド結合を有する［１，２，５］−ジチアゼパン単位を含む：
【０１３８】
【化６】
2013528379.tif 000008
【０１３９】
構造（ＩＩＩａ）では、環の炭素原子はさらに置換されていてもよい。当業者が理解するように、異なる員の環も含まれる。さらに、多環構造も用いることができ、環状ヘテロアルカン、例えば上記の［１，２，５］−ジチアゼパンが他の環状アルカン（環状ヘテロアルカンを含む）で置換されたもの、またはや芳香環構造が含まれる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、アンカー基及びスペーサーの一部は、以下の構造を有する。
【０１４１】
【化７】
2013528379.tif 000009
【０１４２】
ここで、「Ｒ」基は、任意の置換基でもよく、ＥＡＭの遷移金属成分のための末端配位リガンドを有する共役オリゴフェニルエチニレン単位を含む。
【０１４３】
アンカーは二足性中間体（Ｉ）（式ＩＩＩの化合物で、Ｒ＝Ｉ）から合成され、これはLi et al., Org. Lett. 4:3631-3634 (2002)に記載されている（参照により本明細書に援用される）。また、Wei et al., J. Org, Chem. 69: 1461-1469 (2004)も参照（参照により本明細書に援用される）。
【０１４４】
硫黄原子の数は、本明細書に概説するように変動することができ、特定の実施形態では、スペーサー当たり１個、２個、又は３個である。
【０１４５】
電気活性部分
アンカー基に加えて、本発明は、電気活性部分を含む化合物を提供する。本明細書において、「電気活性部分（ＥＡＭ）」、「遷移金属錯体」、「酸化還元活性分子」、又は「電子遷移部分（ＥＴＭ）」とは、１つ以上の電子を可逆的又は半可逆的に移動することができる金属含有化合物を意味する。電子供与体と受容体の能力とは相関的である。すなわち、特定の実験条件において電子を失うことができる分子は、異なる実験条件において電子を受容することが可能となる。
【０１４６】
可能な遷移金属錯体の数は非常に多く、電子遷移化合物分野の当業者であれば、本発明において多くの化合物を用いることができる。本明細書において、「遷移金属」とは、原子が一部の又は完全な電子殻を有する金属を意味する。本発明での使用に好適な遷移金属としては、これらに限定されないが、カドミウム（Ｃｄ）、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、オスミウム（Ｏｓ）、レニウム（Ｒｅ）、白金（Ｐｔ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、タングステン（Ｗ）、及びイリジウム（Ｉｒ）が含まれる。すなわち、遷移金属の第一系列、白金族（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ及びＰｔ）が、Ｆｅ、Ｒｅ、Ｗ、Ｍｏ及びＴｃと共に、本発明において特に有用である。特に好適なものは、酸化状態の変化によって配位部位の数が変わらない金属であり、ルテニウム、オスミウム、鉄、白金及びパラジウムが含まれ、オスミウム、ルテニウム及び鉄が特に好ましく、多くの実施形態でオスミウムが特に有用である。いくつかの実施形態では、鉄は好ましくない。一般的に、遷移金属は、本発明においてＴＭ又はＭで示される。
【０１４７】
遷移金属と配位リガンドとが、金属錯体を形成する。本明細書において、「リガンド」又は「配位リガンド」とは（本明細書において、図中で「Ｌ」で示す）、１つ以上の中心原子又はイオンに対して、通常、配位共有結合によりそれ自身の１つ以上の電子を供与する、又は、共有結合によりそれ自身の電子を共有する、原子、イオン、分子、又は官能基を意味する。
【０１４８】
金属のその他の配位部位は、遷移金属錯体を捕捉リガンドに（直接に又はリンカーを用いて間接的に）結合するか、又は電極に結合する（スペーサーが用いられる場合が多く、以下により詳しく述べる）か、あるいはその両方に用いられる。このため、例えば、遷移金属錯体が結合リガンドに直接結合する場合、金属イオンの１つ、２つ又はそれ以上の配位部位が、結合リガンド（間接的結合の場合はリンカー）によって供給される配位原子によって占有され得る。さらに、又はその代りに、金属イオンの１つ以上の配位部位は、遷移金属錯体を電極に結合するために用いるスペーサーにより占有され得る。例えば、以下により詳しく述べるように、遷移金属錯体が結合リガンドとは別に電極に結合する場合、金属の配位部位（ｎ）は、１つを除いてすべて（ｎ−１）、極性リガンドを含む可能性がある。
【０１４９】
本明細書により詳しく述べるように、本明細書において通常「Ｌ」で表される好適な小分子極性リガンドは、大きく２つに分類される。ある実施形態では、小分子極性リガンドは、一般的に脱離基としての性質が低い又はσ供与体として優れているというその特質や金属の特性から、金属イオンに効果的に不可逆的に結合される。これらのリガンドは、「置換不活性」と呼ばれることがある。あるいは、以下により詳しく述べるように、小分子極性リガンドは金属イオンに可逆的に結合する場合があり、標的検体が結合した際に、脱離基として優れている又はσ供与体としての性質が低いというその特性から、検体が１つ以上の配位原子を金属に提供することができ、事実上小分子極性リガンドを置換する。これらのリガンドは、「置換易動性」と呼ばれることがある。リガンドは双極子を形成することが好ましいが、それは、これが高い溶媒再構築エネルギーに寄与するからである。
【０１５０】
いくつかの遷移金属錯体の構造を以下に示す。
【０１５１】
【化８】
2013528379.tif 000010
【０１５２】
Ｌは共リガンドであり、金属イオンの結合に配位原子を提供する。当業者が理解するように、共リガンドの数と種類は、金属イオンの配位数によって決まる。単座、二座、又は多座の共リガンドは、任意の位置で用いることができる。このため、例えば、金属の配位数が６である場合、伝導性オリゴマーの末端からのＬと、核酸から与えられるＬと、ｒとの合計が６になる。したがって、金属の配位数が６である場合、共リガンドがすべて単座であれば、ｒは０（すべての配位原子が他の２つのリガンドから提供される場合）から４となる。したがって、一般的に、金属イオンの配位数と他のリガンドの選択に応じて、ｒは０から８となる。
【０１５３】
ある実施形態では、金属イオンの配位数は６であり、伝導性オリゴマーに結合したリガンドと核酸に結合したリガンドは、ともに少なくとも二座である；すなわち、ｒは好適には０、１（すなわち、残りの共リガンドは二座）、又は２（２つの単座共リガンドが用いられる）である。
【０１５４】
当技術分野において理解されるように、共リガンドは同一でも異なっていてもよい。好適なリガンドは２つに分類される：配位原子として、窒素、酸素、硫黄、炭素、又はリン原子（金属イオンによって決まる）を用いるリガンド（一般的に、文字通りσ供与体と呼ばれる）、及び、メタロセンリガンドなどの有機金属リガンド（一般的に、文字通りπ供与体と呼ばれ、本明細書においてＬｍで表す）。好適当な窒素供与リガンドは、当技術分野において周知であり、これらに限定されないが、以下のものを含む：シアノ（Ｃ≡Ｎ）、ＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ’；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジン及びビピリジンの置換誘導体；ターピリジン及び置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０−フェナントロリン（略記ｐｈｅｎ）、及びフェナントロリンの置換誘導体、例えば４，７−ジメチルフェナントロリン及びジピリドール［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン（略記ｄｐｐｚ）；ジピリドフェナジン；１，４，５，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（略記ｈａｔ）；９，１０−フェナントレンキノンジイミン（略記ｐｈｉ）；１，４，５，８−テトラアザフェナントレン（略記ｔａｐ）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン（略記ｃｙｃｌａｍ）及びイソシアニド。縮合誘導体を含む置換誘導体も用いることができる。いくつかの実施形態では、ポルフィリン及びポルフィリンファミリーの置換誘導体を用いることができる。例えば、Comprehensive Coordination Chemistry, Ed. Wilkinson et al., Pergammon Press, 1987, Chapters 13.2 (pp 73-98), 21.1 (pp. 813-898)及び21.3 (pp 915-957)を参照（これらはすべて、参照により明示的に本明細書に援用される）。
【０１５５】
当技術分野において理解されるように、本発明では、供与体（１）−架橋−供与体（２）のリガンド（ここで、供与体（１）は金属に結合し、供与体（２）は周囲の媒体（溶媒、タンパク質など）との相互作用に用いられる）、特にシアノのように供与体（１）及び供与体（２）がπ系を介して共役するもの（シアノでは、Ｃが供与体（１）、Ｎが供与体（２）、π系がＣＮの三重結合）を用いることができる。１つの例はビピリミジンであり、ビピリジンとよく似ているが、媒体との相互作用のためのＮ供与体を「裏面」に有している。その他の共リガンドとしては、これらに限定されないが、シアネート、イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）、チオシアネート、イソニトリル、Ｎ２、Ｏ２、カルボニル、ハロゲン化物、アルコキシド、チオラート、アミド、リン化物、及び含硫黄化合物（例えば、スルフィノ、スルホニル、スルホアミノ、及びスルファモイル）が含まれる。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、異なる金属との錯体形成の共リガンドとして、複数のシアノを用いることができる。例えば、７個のシアノがＲｅ（ＩＩＩ）に結合する；８個のシアノがＭｏ（ＩＶ）及びＷ（ＩＶ）に結合する。したがって、本発明では、Ｒｅ（ＩＩＩ）において６個以下のシアノと１つ以上のＬ、若しくは、Ｍｏ（ＩＶ）又はＷ（ＩＶ）において７個以下のシアノと１つ以上のＬを用いることができる。Ｗ（ＩＶ）系をもつＥＡＭは、より不活性で、より作製が容易で、より好ましい還元電位を持つことから、他のものに対して非常に有利である。一般的に、ＣＮ／Ｌ比が大きい方ほど移動が大きくなる。
【０１５７】
炭素、酸素、硫黄、及びリンを用いた好適なσ供与リガンドは、当技術分野で既知である。例えば、適当なσ炭素供与体は、Cotton and Wilkenson, Advanced Organic Chemistry, 5lh Edition, John Wiley & Sons, 1988などに見出される（参照により本明細書に援用される）；例えば３８ページを参照。同様に、適当な酸素リガンドとしては、クラウンエーテル、水、及びその他の当技術分野において既知のものが含まれる。ホスフィン及び置換ホスフィンも同様に好適である；Cotton and Wilkensonの３８ページを参照。
【０１５８】
酸素、硫黄、リン、及び窒素供与リガンドは、ヘテロ原子が配位原子として働くことができるように結合される。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、有機金属リガンドが用いられる。酸化還元部分として用いるための純粋な有機化合物や、供与原子が複素環置換基又は環外置換基であるδ結合した有機リガンドを有する種々の遷移金属配位錯体に加えて、π結合した有機リガンドを有する様々な遷移金属有機金属化合物を用いることができる（Advanced Inorganic Chemistry, 5lh Ed., Cotton & Wilkinson, John Wiley & Sons, 1988, chapter 26；Organometallics, A Concise Introduction, Elschenbroich et al., 2nd Ed., 1992, VCH；及びComprehensive Organometallic Chemistry II, A Review of the Literature 1982-1994, Abel et al. Ed., Vol. 7, chapters 7, 8, 10 & 1 1 , Pergamon Pressを参照；参照により本明細書に明示的に援用する）。このような有機金属リガンドには、シクロペンタジエニドイオン［Ｃ５Ｈ５（−１）］などの環状芳香族化合物、及び、インデニリド（−１）イオンなどの様々な環置換及び環縮合誘導体が含まれ、ビス（シクロペンタジエニル）金属化合物（すなわちメタロセン）のクラスを形成する；例えば、Robins et al., J. Am. Chem. Soc. 104: 1882-1893 (1982)；及びGassman et al., J. Am. Chem. Soc. 108:4228-4229 (1986)を参照（参照により本明細書に援用される）。このうち、フェロセン［（Ｃ５Ｈ５）２Ｆｅ］及びその誘導体は典型的な例であり、様々な化学的（Connelly et al., Chem. Rev. 96:877-910 (1996)、参照により本明細書に援用される）及び電気化学的（Geiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 23: 1-93；及びGeiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 24:87、参照により本明細書に援用される）電子移動又は「酸化還元」反応に用いられている。様々な第一、第二、及び第三遷移金属のメタロセン誘導体は、核酸のリボース環又はヌクレオシド塩基に共有結合する酸化還元部分として可能性のある候補である。
【０１６０】
その他の可能性のある好適な有機金属リガンドとしては、ベンゼンなどの環状アレーンが含まれ、ビス（アレーン）金属化合物、並びにその環置換及び環縮合誘導体を形成し、ビス（ベンゼン）クロムが典型的な例である。その他の非環式のπ結合したリガンド、例えばアリル（−１）イオン又はブタジエンは、可能性のある好適な有機金属リガンドを与え、これらのリガンドはすべて、他のπ結合及びδ結合したリガンドとの伝導において、金属−炭素結合を有する有機金属化合物の一般的なクラスを構成している。架橋有機リガンドを持つ化合物及び追加の非架橋リガンドを持つ化合物、並びに金属−金属結合を持つ又は持たない化合物の種々のダイマー及びオリゴマーの電気化学的研究は、核酸分析において、可能性のある酸化還元部分の候補である。
【０１６１】
共リガンドの１つ以上が有機金属リガンドである場合、通常、リガンドは有機金属リガンドの炭素原子の１つを介して結合するが、複素環リガンドでは他の原子を介して結合してもよい。好適な有機金属リガンドとしてはメタロセンリガンドが含まれ、これは置換誘導体及びメタロセンオファン（metalloceneophanes）を含む（前掲のCotton and Wilkenson、１１７４ページを参照）。例えば、メチルシクロペンタジエニルなどのメタロセンリガンドの誘導体（ペンタメチルシクロペンタジエニルなどの複数のメチル基を有するものが好ましい）を、メタロセンの安定性を高めるために用いることができる。ある好適な実施形態では、メタロセンの２つのメタロセンリガンドの一方だけが誘導体化される。
【０１６２】
本明細書に記載するように、リガンドは任意に組み合わせて用いることができる。好適な組み合わせには、ａ）すべてのリガンドが窒素供与リガンドである；ｂ）すべてのリガンドが有機金属リガンドである；及びｃ）伝導性オリゴマーの末端のリガンドがメタロセンリガンドであり、核酸が提供するリガンドが窒素供与リガンドであり、必要に応じてその他のリガンドが窒素供与リガンド又は有機金属リガンド、若しくはその混合物であるものが含まれる。
【０１６３】
一般的に、非大環状キレート剤を含むＥＡＭは、金属イオンに結合して非大環状キレート化合物を形成するが、その理由は、金属の存在によって、複数のプロリガンドが互いに結合し、多くの酸化状態が作られるからである。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、窒素供与プロリガンドが用いられる。好適な窒素供与プロリガンドは当技術分野において周知であり、例えばこれらに限定されないが、以下のものが含まれる：ＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ’；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジン及びビピリジンの置換誘導体；ターピリジン及び置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０−フェナントロリン（略記ｐｈｅｎ）、及びフェナントロリンの置換誘導体、例えば４，７−ジメチルフェナントロリン及びジピリドール［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン（略記ｄｐｐｚ）；ジピリドフェナジン；１，４，５，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（略記ｈａｔ）；９，１０−フェナントレンキノンジイミン（略記ｐｈｉ）；１，４，５，８−テトラアザフェナントレン（略記ｔａｐ）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン（略記ｃｙｃｌａｍ）及びイソシアニド。縮合誘導体を含む置換誘導体を用いることもできる。
金属イオンを配位的に飽和させず、また別のプロリガンドを加えることが必要な大環状リガンドは、本用途では、非大環状と見なされる。当業者が理解するように、複数の「非大環状」リガンドを共有結合させて、配位的に飽和された化合物を形成することができるが、これには環状骨格がない。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、単座（例えば、少なくとも１つのシアノリガンド）、二座、三座、及び多座のリガンド（飽和するまで）の混合物をＥＡＭの構築に用いることができる。
【０１６６】
一般的に、遷移金属錯体が溶媒にアクセス可能である（solvent accessible）かどうかは、リガンドの組成又は特性によって決まる。本明細書において、「溶媒にアクセス可能な遷移金属錯体」又は文法上それに対応するものは、少なくとも１つ、好適には２つ、より好適には３つ、４つ又はそれ以上の小分子極性リガンドを有する遷移金属錯体を意味する。極性リガンドの実際の数は、金属イオンの配位数（ｎ）によって決まる。極性リガンドの好適な数は、（ｎ−１）及び（ｎ−２）である。例えば、以下により詳しく述べるように、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｏｓなどの配位数が６の金属では、溶媒にアクセス可能な遷移金属錯体は、他の部位の条件に応じて、１〜５個、好適には２〜５個、特に好適には３〜５個の小分子極性リガンドを有することが好ましい。ＰｔやＰｄなどの配位数が４の金属は、１個、２個、又は３個の小分子極性リガンドを有することが好ましい。
【０１６７】
「溶媒にアクセス可能」及び「溶媒阻害」は関連する用語である。すなわち、加えられたエネルギーが高ければ、溶媒にアクセス可能な遷移金属錯体であっても、電子の移動が引き起こされる場合がある。溶媒にアクセス可能な金属、及び対応するＥＡＭは、米国特許出願公開第２０１１／００３３８６９号、第２０１０／０００３７１０号、及び第２００９／０２５３１４９号に記載されており、これらすべては、その全体、及び特に記載される図及び定義が、明示的に本明細書に援用される。
【０１６８】
ＥＡＭのいくつかの例を本明細書に記載する。
【０１６９】
シアノ系（cyano-based）錯体
一態様では、本発明は、遷移金属及び少なくとも１つのシアノ（−Ｃ≡Ｎ）リガンドを有するＥＡＭを提供する。金属の価数及び系の構成（例えば、捕捉リガンドが配位原子を提供するなど）に応じて、１、２、３、４、又は５個のシアノリガンドを用いることができる。一般的には、最も多いシアノリガンドを用いる実施形態が好ましい；この場合も、系の構成によって決まる。捕捉リガンドとは別に結合された、オスミウムなどの六座の金属を用いるＥＡＭは、５個のシアノリガンドを用いることができ、６番目の配位部位は結合リンカーの末端で占有される。六座の金属が、配位原子を提供する結合リンカーと捕捉リガンドとを両方持つ場合、４個のシアノリガンドが存在し得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、結合リンカー及び／又は捕捉リガンドは、１より大きい数の配位原子を提供することができる。したがって、例えば、結合リンカーは、２つの配位原子を提供するビピリジンを含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、シアノリガンド以外のリガンドを、少なくとも１つのシアノリガンドと組み合わせて用いることができる。
【０１７２】
Ｒｕ−Ｎ系錯体
一態様では、本発明は、配位が単座、二座、三座、又は多座である、Ｒｕ−Ｎ系錯体の新たな構造を提供する。したがって、配位リガンドＬ（アンカー及び捕捉リガンドに共有結合するもの）の数は、１、２、３、又は４個であり得る。
【０１７３】
電荷中和リガンドは、当技術分野で周知の任意の好適なリガンドであってよく、本明細書に述べるように、例えば、ジチオカルバメート、ベンゼンジチオレート、又はシッフ塩基が含まれる。捕捉リガンド及びアンカーは、同一のフレームワークに又は別々に存在し得る。
【０１７４】
本発明の別の態様では、ＥＡＭリガンド構造の各成分は、Ｒｕの配位化学ではなく、共有結合により結合されている。本明細書に記載する構造の構築は、最新の合成有機化学的方法論に従う。設計で考慮すべき重要な点としては、アンカー及び捕捉リガンド成分中と配位リガンド成分中に存在する官能基の必須の直交的反応が含まれる。
【０１７５】
好適には、化合物全体が合成でき、合成の最終工程の付近で、酸化還元活性遷移金属をリガンドに配位する。本明細書に記載する配位リガンドは、確立されたルテニウムペンタアミン前駆体の無機方法論に従う。Gerhardt and Week, J. Org. Chem. 71:6336-6341 (2006)；Sizova et al., Inorg. Chim. Acta, 357:354-360 (2004)；及び、Scott and Nolan, Eur. J. Inorg. Chem. 1815-1828 (2005)を参照（参照によりこれらすべてが本明細書に援用される）。
【０１７６】
当業者が理解するように、本明細書に記載する化合物のアンカー成分は、アルキルと多足性チオールとの間で交換可能である。
【０１７７】
フェロセン系ＥＡＭ
いくつかの実施形態では、ＥＡＭは置換フェロセンを含む。フェロセンは空気中で安定である。フェロセンは、捕捉リガンド及びアンカー基の両方によって容易に置換される。標的タンパク質がフェロセン上の捕捉リガンドに結合すると、フェロセンの周囲の環境を変化させるだけでなく、シクロペンタジエニル環の回転を阻害し、それによりエネルギーを約４ｋＪ／ｍｏｌ変化させる。国際公開第１９９８／５７１５９号；Heinze and Schlenker, Eur. J. Inorg. Chem. 2974-2988 (2004)；Heinze and Schlenker, Eur. J. Inorg. Chem. 66-71 (2005)；及び、Holleman-Wiberg, Inorganic Chemistry, Academic Press 34th Ed, at 1620、参照によりこれらすべてが本明細書に援用される。
【化９】
2013528379.tif 000011
【０１７８】
【化１０】
2013528379.tif 000012
【０１７９】
いくつかの実施形態では、アンカー及び捕捉リガンドは、より簡単な合成のために、同一のリガンドに結合される。いくつかの実施形態では、アンカー及び捕捉リガンドは異なるリガンドに結合される。
【０１８０】
本明細書に開示する新たな構造の構築に用いることができる多くのリガンドが存在する。例えば、これらに限定されないが、カルボン酸塩、アミン、チオレート、ホスフィン、イミダゾール、ピリジン、ビピリジン、ターピリジン、ｔａｃｎ（１，４，７−トリアザシクロノナン）、サレン（Ｎ，Ｎ’−ビス（サリチリデン）エチレンジアミン）、アカセン（Ｎ，Ｎ’−エチレンビス（アセチルアセトンイミネート（−））、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、Ｃｐ（シクロペンタジエニル）、ピンサー型（pincer）リガンド、及びスコルピオネートが含まれる。いくつかの実施形態では、好適なリガンドはペンタアミンである。
【０１８１】
ピンサー型リガンドは、特殊な種類のキレートリガンドである。ピンサー型リガンドは、それ自身で金属中心のまわりを包み、金属の両側及びその間に結合を形成する。金属核電子に対するピンサー型リガンドの化学作用の効果は、アミン、ホスフィン、及び混合供与体リガンドと似ている。これは、金属の活性を目的に合わせて作ることができる独特な化学的状態を作る。例えば、ピンサー型リガンドを適応させるには、錯体の立体構造に対する高い要求があるため、金属が関与できる反応は制限され、選択的である。
【０１８２】
スコルピオネートリガンドは、ｆａｃの形で金属に結合する三座リガンドを意味する。スコルピオネートの最も一般的なクラスは、トリス（ピラゾリル）ヒドロホウ酸塩又はＴｐリガンドである。ＣｐリガンドはＴｐに対してアイソローバル（isolobal）である。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、以下の制限が望ましい：金属錯体が、溶媒と密接することを可能にする小分子極性リガンドを有する。
【０１８４】
電荷中和リガンド
別の態様では、本発明は、荷電リガンドを含む金属錯体を有する組成物を提供する。中性から荷電に変化させる系の再構築エネルギー（例えば、Ｍ＋＜−＞Ｍ０；Ｍ−＜−＞Ｍ０）は、極性化していない環境への変化、又はその環境からの変化に適応するために水分子がさらに「再構築」されることで単純に電荷が変化する系のもの（例えば、Ｍ２＋＜−＞Ｍ３＋）よりも大きい場合がある。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、アンカー及び捕捉リガンドを金属中心に結合するために、荷電リガンドの陰イオン性化合物を用いることができる。ハロゲン化物イオンＸを錯体内圏に有する金属錯体は、これらに限定されないが以下のものを含む荷電リガンドと反応する：チオール（Ｒ−ＳＨ）、チオレート（ＲＳ−Ｅ；Ｅ＝脱離基、すなわち、トリメチルシリル基）、炭酸、ジチオール、炭酸塩、アセチルアセトネート、サリチル酸塩、システイン、３−メルカプト−２−（メルカプトメチル）プロパン酸。この反応の原動力はＨＸ又はＥＸの形成である。陰イオンリガンドが捕捉リガンド及びアンカーの両方を含む場合、１つの置換反応が必要であり、そのため、反応する金属錯体は内圏に１つのハロゲンリガンドを有する必要がある。アンカー及び捕捉リガンドが別々に導入される場合、出発物質は一般的に配位内圏に２つのハロゲン化物を含む必要がある。Seidel et al., Inorg. Chem 37:6587-6596 (1998)；Kathari and Busch, Inorga. Chem. 8:2276-2280 (1978)；Isied and Kuehn J. Am. Chem. Soc. 100:6752-6754；及び、Volkers et al., Eur. J. Inorg. Chem. 4793-4799 (2006)、参照によりこれらすべてが本明細書に援用される。
【０１８６】
好適な金属錯体の例は以下である（以下に示す構造は、複数の単座リガンドを表し、多座リガンドは、シアノリガンドなどの単座リガンドの代用とすることができ、又はそれと組み合わせることができる）：
【０１８７】
【化１１】
2013528379.tif 000013
【０１８８】
【化１２】
2013528379.tif 000014
【０１８９】
いくつかの実施形態では、以下の例のように、電荷中和リガンドとしてジチオカルバメートが用いられる。
【０１９０】
【化１３】
2013528379.tif 000015
【０１９１】
いくつかの実施形態では、以下の例のように、電荷中和リガンドとしてベンゼンジチオレートが用いられる。
【０１９２】
【化１４】
2013528379.tif 000016
【０１９３】
上記の構造において、Ｌｎは配位リガンドを示し、ｎ＝０又は１である。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、ＥＡＭはシッフ塩基系の錯体を含む。本明細書において、「シッフ塩基」又は「アゾメチン」とは、窒素原子がアリール又はアルキル基に結合しているが、水素に結合していない炭素−窒素二重結合を含む官能基を意味する。シッフ塩基は一般式Ｒ１Ｒ２Ｃ＝Ｎ−Ｒ３で表され、Ｒ３はシッフ塩基を安定なイミンにするフェニル又はアルキル基である。シッフ塩基は、芳香族アミンとカルボニル化合物から求核付加によりヘミアミナールを形成し、続いて脱水によりイミンを生成することで合成できる。
【０１９５】
アカセン（acacen）は、小さい平面状の四座リガンドで、その窒素原子と酸素原子を介して周囲の水分子と水素結合を形成することができ、これにより再構築エネルギー効果が高まる。アカセンは多くの官能基で修飾でき、例えば、これらに限定されないが、カルボン酸及びハロゲン化物が含まれ、これらはアカセンリガンドを捕捉リガンド及びアンカー基に結合させるために用いることができる。これにより、ＥＡＭにおいて様々な異なる金属中心を用いることができる。このリガンドは２つの酸素原子および２つの窒素原子によって結合するため、４つの配位部位だけが占有されている。そのため、金属中心によっては、さらに２つの配位部位が空いている。これらの配位部位は、様々な有機及び無機リガンドで占有することができる。これらの追加的な空いた部位は、内圏の置換（例えば、不安定なＨ２Ｏ又はＮＨ３をタンパク質結合により置換できる）、又は外圏の作用（例えば、Ｈ結合にＣＯ、ＣＮ）に利用し、捕捉リガンドが標的に結合した際の電位のシフトを最適化することができる。国際公開第１９９８／０５７１５８号、国際公開第１９９７／２１４３１号、Louie et al., PNAS 95:6663-6668 (1999)、及び、Bottcher et al., Inorg. Chem. 36:2498-2504 (1997)、参照によりこれらすべてが本明細書に援用される。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、サレン錯体も用いられる。Syamal et al., Reactive and Functional Polymers 39:27-35 (1999)。
【０１９７】
いくつかのアカセン系錯体及びサレン系錯体の構造を以下に示す。捕捉リガンド及び／又はアンカーによる官能化に適したリガンド上の位置は、アスタリスクで示している。
【０１９８】
【化１５】
2013528379.tif 000017
【０１９９】
アカセンをリガンドとして用いてコバルト錯体を形成する１つの例を以下に示す：
【０２００】
【化１６】
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【０２０１】
式中、Ａ及びＢは置換基を示し、Ｌｎは配位リガンドを示し、ｎ＝０又は１である。
【０２０２】
スルファト（sulfato）リガンド
いくつかの実施形態では、ＥＡＭはスルファト錯体を含み、例えばこれらに限定されないが、［Ｌ−Ｒｕ（ＩＩＩ）（ＮＨ３）４ＳＯ４］＋及び［Ｌ−Ｒｕ（ＩＩＩ）（ＮＨ３）４ＳＯ２］２＋が含まれる。ＳＯ４−Ｒｕ（ＩＩＩ）錯体は空気中で安定である。リガンドＬは捕捉リガンド及びアンカーを含む。硫酸塩リガンドは、アミンよりも極性が高く、負に荷電されている。そのため、表面の錯体は、［Ｌ−Ｒｕ（ＮＨ３）５−Ｌ’］及び［Ｌ−Ｒｕ（ＮＨ３）５］２＋よりも多くの水分子によって囲まれる。Isied and Taube, Inorg. Chem. 13: 1545-1551 (1974)、参照により本明細書に援用される。
【０２０３】
【化１７】
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【０２０４】
スペーサー基
いくつかの実施形態では、ＥＡＭ又はＲｅＡＭＣは、結合リンカーと電極との結合を可能にする官能基部分を通常さらに含む結合リンカー又はスペーサー（「スペーサー１」）を介して、アンカー基（電極に結合している）に共有結合している。例えば、米国特許第７，３８４，７４９号を参照のこと（その全体、及び特に結合リンカーについての記述が、参照により本明細書に援用される）。金電極の場合、硫黄原子を官能基として用いることができる（本発明の目的のため、この結合は共有結合と考えられる）。本明細書において、「スペーサー」又は「結合リンカー」とは、酸化還元活性錯体を電極の表面から離した状態とする部分を意味する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、本明細書に概説するように伝導性オリゴマーであるが、好適なスペーサー部分には、以下に概説するように不動態化剤及び絶縁体が含まれる。いくつかの場合では、スペーサー分子はＳＡＭ形成種である。スペーサー部分は、実質的に非伝導性であってもよいが、好適には（必須ではないが）、酸化還元活性分子と電極（ＨＡＢ）の間の電子結合は、電子移動の律速段階とはならない。
【０２０５】
また、ＲｅＡＭＣを用いる場合、結合リンカーは、捕捉リガンドの配位原子と捕捉リガンド自体との間に用いることができる。同様に、結合リンカーは分枝状であってもよい。さらに、結合リンカーは、ＲｅＡＭＣに関与していない場合、捕捉リガンドを電極に結合させるために用いることができる。
【０２０６】
結合リンカーの一端はＥＡＭ／ＲｅＡＭＣ／捕捉リガンドに結合し、他端（しかし、当業者が理解するように、どちらも厳密な末端である必要はない）は、電極に結合している。
【０２０７】
酸化還元活性分子を含む伝導性オリゴマーの共有結合（及び、他のスペーサー分子の結合）は、使用する電極と伝導性オリゴマーに応じて、様々な方法で達成される。例えば、米国特許出願公開第２００２０００９８１０号の構造１２〜１９及び付随する文章を参照（参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０２０８】
一般的に、スペーサーの長さは、米国特許第６，０１３，４５９号、第６，０１３，１７０号及び第６，２４８，２２９号、並びに第７，３８４，７４９号において伝導性オリゴマー及び不動態化剤について概説される通りである（これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に援用される）。当業者が理解するように、スペーサーが長くなりすぎると、酸化還元活性分子と電極との間の電子結合は急激に減少する。
【０２０９】
作製方法
別の態様では、本発明は、本明細書に記載する組成物の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、米国特許第６，０１３，４５９号、第６，２４８，２２９号、第７，０１８，５２３号、第７，２６７，９３９号、米国特許出願第０９／０９６５９３号及び第６０／９８０，７３３号、２００８年８月７日に提出された米国仮出願番号第６１／０８７，１０２号（これらは、すべての目的のためにその全体が本明細書に援用される）に開示される方法に従って作製される。
【０２１０】
ある実施形態では、以下に示す化合物１（末端フェロセン基及びマレイミド基を有する非対称ジアルキルジスルフィド）を、実施例に詳細に示すように、合成して金電極上に沈着させた。
【０２１１】
【化１８】
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【０２１２】
診断
【０２１３】
本発明は、試料中のＰＣＳＰに対する酵素活性、具体的には試料中のＰＳＡの酵素活性に基づく前立腺疾患の診断法を提供する。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析により、選択したバイオマーカーの異なる切断点での感度及び特異性を評価する。ＲＯＣ曲線上の各点は、選択したバイオマーカーの値の特定の決定しきい値（正規化したもの、又はしていないもの）に対応する感度／特異性の対を表す。当技術分野で周知のように、ＲＯＣ曲線は診断試験評価の基本ツールである。ＲＯＣ曲線では、有病正診率（感度）を無病誤診率（１００−特異性）の関数中に、１つ又は複数のパラメーターの異なる切断点でプロットする。ＲＯＣ曲線上の各点は、特定の決定しきい値に対応する感度／特異性の対を表す。ＲＯＣ曲線の下側の領域は、パラメーターが２つの診断グループ（疾患／正常）をどれだけ区別できるかを示す指標となる。そのため、ＲＯＣ曲線分析は、疾患のケースと正常なケースとを判別する試験の診断能力の評価、又は試験の精度を評価するために実施される（Metz, 1978; Zweig and Campbell, 1993）。また、ＲＯＣ曲線は、２つ以上の試験所又は診断テストの診断能力の比較にも用いることができる（Griner et al., 1981）。
【０２１５】
本発明では、ＲＯＣ曲線は、以下に述べる１つのパラメーター又はパラメーターの組み合わせを用いて、確立した試料（例えば、予め確認された（独立した診断）試料）により、前記の対象を疾患グループと非疾患グループの２つの異なるグループに分類する盲検試験によって作成される。
【０２１６】
本発明では、ＲＯＣ曲線は、単一のパラメーター、例えば、本明細書に定義する試料中のＰＣＳＰに対する酵素活性又はＰＳＡ酵素活性を用いて作成される。
【０２１７】
あるいは、ＲＯＣ曲線は、これらに限定されないが、以下を含むリストから任意に独立して選択される１つ以上のパラメーターを用いて作成される：ａ）試料中の酵素活性；ｂ）前立腺容量；ｃ）グリーソンスコア；ｃ）血清中の全ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、及び、又は、遊離ＰＳＡ／全ＰＳＡの比率；ｄ）活性を試験した試料中の全ＰＳＡ；ｆ）前立腺液の量（当技術分野で既知のように一般的に亜鉛濃度を用いて正規化される）；ｇ）尿の量（一般的にクレアチニンの量を用いて正規化される）；ｈ）ＨＧＰｉｎ、及びｉ）ＰＩＮ。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、酵素活性と上記リストの任意の他のパラメーターとを組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、ＲＯＣ曲線は２つのパラメーターを用いて作成され、例えばこれらに限定されないが、以下のものが含まれる：ａ）試料中の酵素活性と前立腺容量；ｂ）試料中の酵素活性と全ＰＳＡ（試料中で活性なもの及び非活性なもの（例えば結合したもの）を含む）；ｃ）試料中の酵素活性と全ＰＳＡ（患者の血清中で活性なもの及び非活性なもの（例えば結合したもの）を含む）；ｄ）試料中の酵素活性とグリーソンスコア。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、ＲＯＣ曲線は３つのパラメーターを用いて作成され、例えばこれらに限定されないが、以下のものが含まれる：ａ）試料中の酵素活性、試料中の全ＰＳＡ量、及び前立腺容量、並びに、ｂ）試料中の酵素活性、血清中の全ＰＳＡ量、及び前立腺容量。
【０２２０】
当業者が理解するように、多重パラメーター分析は、除法（例えば、試料中の酵素活性を前立腺容量で割る）、乗法、又は定数を作るその他の方法で行うことができる。
【０２２１】
一度作成すれば特定の値が得られ、これにより、確立されたＲＯＣ曲線によって決定されるしきい値と比較することで新たな臨床試料の診断が可能になる。
【０２２２】
さらに、又はあるいは、単一又は多重パラメーター分析は、既存の前立腺癌及び前立腺疾患のリスクノモグラムと組み合わせることができる。当技術分野において周知のように、ノモグラムは様々な要素を用いて作成され、試料のＰＣＳＰに対する酵素活性及び／又はＰＳＡ酵素活性もそれに加えることができる。
【０２２３】
さらに、又はあるいは、ＲＯＣ曲線は、２以上の正常な（例えば疾患を持たない）患者、前立腺癌の患者、及び／又は癌ではない前立腺疾患（例えばＢＰＨ）の患者から得た試料を用いて作成することができる。これらのＲＯＣ曲線は、以下の要素の１つ以上に対して正規化した試料中の酵素活性を用いて作成することができる：ａ）前立腺容量；ｂ）グリーソンスコア；ｃ）血清中の全ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、及び、又は、遊離ＰＳＡ／全ＰＳＡの比率；ｄ）活性を試験した試料中の全ＰＳＡ；ｅ）前立腺液の量（当技術分野で既知のように一般的に亜鉛濃度を用いて正規化される）；ｆ）尿の量（一般的にクレアチンレベルを用いて正規化される）；ｇ）ＨＧＰｉｎ、及びｈ）ＰＩＮ。
【０２２４】
別の実施形態では、ザイモグラフィーを用いて、ＰＣＳＰに対する試料中のプロテアーゼの酵素活性を測定する。ザイモグラフィーは、一般的に、基質を含むゲル中で又は電気泳動ゲル試験後のオーバーレイを用いて天然の条件下で（例えば、還元剤や界面活性剤の非存在下）試料を泳動する電気泳動技術である。Webber et al.に記載されるように、プロテアーゼの細胞外マトリクス分解能を評価するための手法であるＰＳＡ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥザイモグラフィーにより、ＰＳＡはゼラチン分解プロテアーゼ活性を示している。Webber et al.では、精液中のセメノゲリン及びフィブロネクチンに対するプロテアーゼの生理活性によるフィブロネクチン及びラミニンの分解を用いたＰＳＡ活性の測定について述べている。Webber et al., (1995) Clin. Cancer Res. 1 : 1089（参照により本明細書に援用される）。このため、本明細書に概説するように、ある実施形態では、基質はゲルに組み込まれ、この基質はフィブロネクチン様基質であってよく、測定は、一般的に、酵素が存在するゲルの不透明度の変化に基づくか、又は光学的ペプチド基質の使用による発色シグナルの発生によって行う。基質をゲルに組み込む方法に代えて、電気泳動の終わりに、さらなるゲル又はゲルに加える発光基質を含む溶液によるオーバーレイゲルを用いることもできる。一般的に、校正は、濃度計又は光学式読み取り装置（蛍光発生基質の場合は、蛍光光度計を含む）によって行う。
【０２２５】
前立腺癌における前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の役割は明らかになっていない。前立腺癌のバイオマーカーとして用いられているが、癌との相互関係は必ずしも直接的ではない。本発明は、前立腺癌の存在又は非存在に関連し、正常と良性疾患（例えば良性前立腺肥大症（ＢＰＨ））とを区別することができる簡易検定法を提供する。
【実施例】
【０２２６】
実施例１
Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎから３０個の臨床尿試料を入手した。匿名化したこれらの尿試料は、血清ｔＰＳＡが高い患者からＤＲＥ前立腺マッサージ後に採取した。試料には、生検で確認され、グリーソンスコアが６以上である陽性の前立腺癌患者の試料が１５個、及び前立腺の生検は正常だがＢＰＨを持つ陰性患者の試料が１５個含まれる。市販の蛍光性ペプチドＨＳＳＫＬＱ−ＡＭＣを用いて、前述のように蛍光発光切断アッセイ（fluorescence cleavage assay)を盲検的に実施した。Denmeade et al. (1997) Can Res. 57:4924-4930。結果を図２に示す。陰性対照試料の大部分は最小限のＰＳＡ活性を示し、一方、癌が確認された群ではＰＳＡ活性レベルの中央値は高く、これは、血清ｔ−ＰＳＡレベルの結果とは全く逆となっている。この活性の一因となる他の数値があるかどうかを示すため、広範囲な統計分析を実施した。調査した臨床的数値を下記の表に示す（過去の数値は最大７回まで収集した）。
【０２２７】
これにより、患者の前立腺容量が偽陽性及び偽陰性の一因となっている可能性が見出された。したがって、活性データは前立腺容量で正規化し（例えば、ペプチド活性を患者の前立腺容量で割る）、これにより２つの集団に対する統計的に異なる数値が得られた。また、尿試料中の全ＰＳＡ量の活性の正規化によって、同様のより良い相関が得られた。
【０２２８】
実施例２
別の４７個の試料一式を採取した。前回同様の活性が確認されている。これら一式について、試料自体についても試験し、尿の自己蛍光を活性曲線から引き、より良い結果が得られた。この工程は、先の３０試料を用いた分析では行っていない。
【０２２９】
これらのデータについても、市販の血清ｔ−ＰＳＡ値は一切相関が見られないだけでなく、事実上負のバイオマーカーであり、癌の平均はＢＰＨ患者のものより低い（直観に反する）。しかし、ＰＳＡ活性については、癌患者の平均はＢＰＨの患者より高く、先の分析の結果と一致する。
【０２３０】
下記のグラフにより明らかなように、活性データを全ＰＳＡの存在と前立腺容量とで正規化することで、同様により良く区別される。
【０２３１】
再び、本明細書に述べるすべての関連するバイオマーカーについて、同様のＲＯＣ曲線分析を行ったが、図中の曲線下面積（ＡＵＣ）値の増加及びｐ値の減少に見られるように、活性は血清ｔ−ＰＳＡよりも優れたバイオマーカーであることが明らかである。
【０２３２】
実施例３
同様にＰＳＡにより切断され、ＡＭＩＤＥペプチドに類似した別の基質である「ＨＩＣ」及び「ＨＩＶ」が、試料中の別の酵素、特にエステラーゼによって加水分解され得るかどうかを試験するため、対照実験を実施した。この切断の事象は蛍光定量的に検出することはできないが、これは、グルタミン（Ｑ）アミノ酸が発蛍光団（ＡＭＣ）に結合したままとなり、蛍光シグナルの発生を阻害するためである。さらに、試料中のＰＳＡはこの配列（Ｑ−ＡＭＣ）を認識せず、そのため偽陰性の結果をもたらす。
【０２３３】
この試験は、尿試料（＋ペプチド基質；０．４ｍＭ）と「犠牲(sacrificial)エステル」（アラニンメチルエステル；４０ｍＭ）の有無により行った。試料中にエステラーゼが存在すれば、比較的高い濃度のエステルを加えることでペプチド基質の切断が阻害され、その結果、基質の転換（turnover）がより高まると考えられる。１回の実験を行った結果では、エステルの有無により違いが見られないことが示されている。そのため、考えられる選択肢は以下である：ａ）エステラーゼがこの特定の試料中に存在しない；ｂ）エステラーゼが存在した場合、ペプチド基質は切断せず、犠牲エステルを切断する、及びｃ）エステラーゼが存在した場合、犠牲エステルは切断せず、ペプチド基質を切断する。
【０２３４】
この活性アッセイで考慮すべき別の要素は、陽性シグナルを発生しうる尿中の別のプロテアーゼ（ＰＳＡ以外、又はＰＳＡの別のアイソフォーム）の可能性である。ペプチド基質に作用するプロテアーゼがＰＳＡだけであることを実証するため、ＰＳＡに対して抗触媒活性を持つことが示されているモノクローナル抗体（Ｄａｋｏ社より入手可能、ｍＡｂ０７５０、クローンＥＲ−ＰＲ８）の有無により試料を試験した。両方の試料について、活性の減少が見られたが、シグナルが完全に失われることはなかった。可能性としては以下が含まれる：ａ）活性で基質を切断する他のプロテアーゼが試料中に存在する、及びｂ）ＰＳＡ活性を完全に抑えるにはより高い濃度のｍＡｂが必要。
【０２３５】
実験
【０２３６】
ＰＳＡ酵素活性を測定するための光学的検定法
【０２３７】
試薬：バッファーＡ：５０ｍＭトリスＨＣｌ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ＝７．５、Ｍｏｒ−ＨＳＳＫＬＱ−ＡＭＣ；Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔ．ロット＃９１９９６１；ＭＷ＝９５６．０３ｇ／ｍｏｌ；バッファーＡ中０．４  ｍＭ。Ｍｏｒ−ＨＳＳＫ−Ｈｉｃ−Ｑ−ＡＭＣ；Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔ．ロット＃０００１１１Ｃ；ＭＷ＝９７０．０６ｇ／ｍｏｌ；バッファーＡ中０．４ｍＭ。Ｍｏｒ−ＨＳＳＫ−Ｈｉｖ−Ｑ−ＡＭＣ；Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔ．ロット＃９２２３９１；ＭＷ＝９５５．４４ｇ／ｍｏｌ；バッファーＡ中０．４ｍＭ。ＰＳＡ；Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１アリコート（２ｕｇ／２０ｕＬ）；ロット＃２３６４５０１；ＭＷ＝３３，０００；５８６ｕＬのバッファーＡを添加（＝１００ｎＭ）。７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）；Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＷ＝１７５．１８ｇ／ｍｏｌ、ＤＭＳＯ中２２．２ｍＭ。抗触媒ｍＡｂ  Ｍ０７５０；Ｄａｋｏ；ロット＃０００６０４０４；６６ｍｇ／ｍＬ、α−キモトリプシン；Ｓｉｇｍａ（Ｃ３１４２）；ロット＃０２６Ｋ７６９５；ＭＷ＝２５，０００；バッファーＡ中１００ｎＭ、トリプシン−タイプ１；Ｓｉｇｍａ（Ｔ８００３）；ロット＃０３７Ｋ７０１５；ＭＷ＝２３，８００；バッファーＡ中１００ｎＭ、トシルフェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）；Ａｃｒｏｓ、９９％、ロット＃２２７８０００１０、ＭＷ＝３５１．８４ｇ／ｍｏｌ、ＤＭＳＯ中２１ｍＭ、フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）；Ｓｉｇｍａ、９８．５％、ロット＃０８０Ｍ１１６９Ｕ、１７４．１９ｇ／ｍｏｌ、ＤＭＳＯ中２１ｍＭ、ＺｎＣｌ２；Ａｌｄｒｉｃｈ、１３６．３ｇ／ｍｏｌ；バッファーＡ中２２０ｎｍ（ＢＳＡ含まず）。
【０２３８】
試料：Ｄ１〜Ｄ４７臨床尿試料をノースウェスタン大学のWilliam Catalona博士より入手した。各５００ｕＬの試料を１０個に分注し、使用時まで−８０℃で保管した。匿名の研究ボランティアから得た男性尿コントロール。匿名の研究ボランティアから得た女性尿コントロール。
【０２３９】
機器：Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ（登録商標）４マルチプレートリーダー；蛍光モード（３８０ｎｍ励起／４５０ｎｍ発光）；Ｃｏｓｔａｒ  ９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３６０３）
【０２４０】
実験の概要：
【０２４１】
線形蛍光範囲を決定するためのＡＭＣ（試薬＃６）の段階希釈
【０２４２】
ＰＳＡ（試薬＃５）の段階希釈＋基質
【０２４３】
Ｍｏｒ−ＨＳＳＫＬＱ−ＡＭＣ（試薬＃２）
【０２４４】
Ｍｏｒ−ＨＳＳＫ−Ｈｉｃ−Ｑ−ＡＭＣ（試薬＃３）
【０２４５】
Ｍｏｒ−ＨＳＳＫ−Ｈｉｖ−Ｑ−ＡＭＣ（試薬＃４）
【０２４６】
α−キモトリプシン（試薬＃８）の段階希釈＋基質
【０２４７】
Ｍｏｒ−ＨＳＳＫＬＱ−ＡＭＣ（試薬＃２）
【０２４８】
Ｍｏｒ−ＨＳＳＫ−Ｈｉｃ−Ｑ−ＡＭＣ（試薬＃３）
【０２４９】
Ｍｏｒ−ＨＳＳＫ−Ｈｉｖ−Ｑ−ＡＭＣ（試薬＃４）
【０２５０】
トリプシン−タイプ１（試薬＃９）の段階希釈＋基質
【０２５１】
Ｍｏｒ−ＨＳＳＫＬＱ−ＡＭＣ（試薬＃２）
【０２５２】
Ｍｏｒ−ＨＳＳＫ−Ｈｉｃ−Ｑ−ＡＭＣ（試薬＃３）
【０２５３】
Ｍｏｒ−ＨＳＳＫ−Ｈｉｖ−Ｑ−ＡＭＣ（試薬＃４）
【０２５４】
ＴＰＣＫ（試薬＃１０）及びＰＭＳＦ（試薬＃１１）を用いたＰＳＡ及びキモトリプシン活性の阻害
ａ．基質としてＭｏｒ−ＨＳＳＫＬＱ−ＡＭＣ（試薬＃２）
【０２５５】
ｂ．基質としてＭｏｒ−ＨＳＳＫ−Ｈｉｖ−Ｑ−ＡＭＣ（試薬＃４）
【０２５６】
Ｄ１〜Ｄ４７臨床試料（二重；５０ｕＬ＋１５０ｕＬ基質＃２）
【０２５７】
Ｄ１〜Ｄ４７臨床試料（一重；５０ｕＬ＋１５０ｕＬ基質＃２）
【０２５８】
Ｄ１〜Ｄ４７臨床試料（一重；５０ｕＬ＋１５０ｕＬ基質＃２）＋原臨床試料
【０２５９】
Ｄ５、Ｄ６、Ｄ２１、Ｄ２２、Ｄ２７、Ｄ２９、臨床試料（一重；５０ｕＬ＋基質＃３）＋原試料
【０２６０】
抗触媒活性ｍＡｂ＋基質（試薬＃２）＋Ｄ３９（又はＤ４０）
【０２６１】
マイクロプレート実験の一般的手順
【０２６２】
所望の臨床尿試料を室温で解凍し、穏やかにボルテックスし、短時間遠心分離して（＜２０秒）、チューブの底に試料を堆積させた。試料を５０ｕＬずつピペットで９６ウェルマイクロプレートに移した。ＰＳＡ標準物質（２０ｕＬ）を調製し、同様に入れた。マルチチャンネルピペットを用いて、基質（１５０ｕＬ）を一度に１列ずつ移し、開始時間を記録した。プレート全体の充填を終えた後、マイクロプレートリーダーに挿入し、１０分ごとに２〜１２時間分析した。
【０２６３】
タンパク質希釈の一般的手順：７個の低結合性マイクロ遠心チューブを並べ、１９０μＬのタンパク質保存液をチューブ＃１に加え、残りのチューブには１３０μＬのバッファーＡを加えた。チューブ１から２に６０μＬを移し、ボルテックスし、短時間遠心分離した。チューブ２から６０μＬを取り、チューブ３に加え、ボルテックスし、遠心分離した。最終的な濃度は、２５．０ｎＭ−０．２５ｎＭとなった。
【０２６４】
実験の詳細：線形蛍光範囲を決定するためのＡＭＣ（試薬＃６）の段階希釈：試薬＃６（３５．９ｕＬ）を２．０ｍＬのバッファーＡに希釈し、０．４ｍＭの濃度とした。１：２希釈を行い、最終濃度範囲は０．４ｍＭ〜０．０２４ｕＭとなった。これを９６ウェルマイクロプレートに２ウェルずつ入れ、スキャンを１回行った。ＰＳＡ（試薬＃５）の段階希釈＋基質：２０ｕＬの各ＰＳＡ標準物質の標準溶液（上記タンパク質希釈の一般的手順を参照）を９６ウェルマイクロプレートに２ウェルずつ入れ、次にペプチド基質のバッファーＡ溶液１５０ｕＬを加え（上記一般的手順を参照）、少なくとも３時間、スキャンを行った。α−キモトリプシン（試薬＃８）の段階希釈＋基質：試薬＃８を用いたこと以外は実験２と同じ。トリプシン−タイプ１（試薬＃９）の段階希釈＋基質：試薬＃９を用いたこと以外は実験２と同じ。
【０２６５】
ＴＰＣＫ、ＰＭＳＦ、及び亜鉛を用いたＰＳＡ及びキモトリプシン活性の阻害。９６ウェルマイクロプレートに、２０ｕＬの酵素溶液（１３３．３ｎＭのバッファーＡ溶液；下記プレートマップを参照）を入れた。１９０ｕＬの試薬＃２及び試薬＃４を８〜１２列に入れた。マルチチャンネルピペットを用いて、各基質溶液を１８０ｕＬずつ移し、反応を開始させた（７から１；８から２；９から３；１０から４；１１から５；１２から６）。プレートは１０分ごとにスキャンしながら７７分間読み取り、その後、それぞれの阻害剤１０ｕＬを対応するウェルに加えた。プレートはさらに１２３分間読み取った。
【０２６６】
Ｄ１〜Ｄ４７臨床試料（二重；５０ｕＬ＋１５０ｕＬ基質＃２）
【０２６７】
臨床試料Ｄ１〜Ｄ４７を９６ウェルマイクロプレートに入れ（上記手順参照）、ＰＳＡの標準希釈物を加えた（２ウェルずつ）。１５０ｕＬの試薬＃２を各列に加えて反応を開始し、プレートを１０分ごとに１２時間スキャンした。
【０２６８】
Ｄ１〜Ｄ４７臨床試料（一重；５０ｕＬ＋１５０ｕＬ基質＃２）
【０２６９】
臨床試料Ｄ１〜Ｄ４７を９６ウェルマイクロプレートに入れ（上記手順参照）、ＰＳＡの標準希釈物を加えた（２ウェルずつ）。１５０ｕＬの試薬＃２を各列に加えて反応を開始し、プレートを１０分ごとに１２時間スキャンした。
【０２７０】
Ｄ１〜Ｄ４７臨床試料（一重；５０ｕＬ＋１５０ｕＬ基質＃２）＋原臨床試料
【０２７１】
臨床試料Ｄ１〜Ｄ４７を９６ウェルマイクロプレートに２ウェルずつ入れ（上記手順参照）、ＰＳＡの標準希釈物を加えた（２ウェルずつ）。１５０ｕＬの試薬＃２を臨床試料の第１のセットとＰＳＡの希釈系列の各列に加えた。臨床試料の別のセットは１５０ｕＬのバッファーＡで希釈した（尿の自己蛍光を差し引くため）。プレートを１０分ごとに８時間スキャンした。
【０２７２】
Ｄ５、Ｄ６、Ｄ２１、Ｄ２２、Ｄ２７、Ｄ２９臨床試料（一重；５０ｕＬ＋基質＃３）＋原試料
【０２７３】
臨床試料を９６ウェルマイクロプレートに２ウェルずつ入れた。試薬＃３（１５０ｕＬ）を第１のセットに加え、１５０ｕＬのバッファーＡを第２のセットに加えた。プレートを１０分ごとに４時間スキャンした。
【０２７４】
抗触媒活性ｍＡｂ＋基質（試薬＃２）＋Ｄ３９（又はＤ４０）
【０２７５】
データ解析：純粋なバッファー中で試験した試料から得られたデータは、蛍光対時間でプロットした。尿中で試験した試料（臨床試料又はコントロール）は、原尿試料（基質を含まない）と並べて試験し、バックグラウンドの自己蛍光を試料＋基質のデータから差し引いた。その後、これを蛍光対時間でプロットした。
【０２７６】
傾き（活性）を測定するため、１００分〜２００分の時間のデータで線形回帰分析を行い、最良適合線から傾きを得た。Ｒ２の値が０．９より小さいデータは除外し、個別に検討した。
【図１】
2013528379.tif 000021
【図２Ａ】
2013528379.tif 000022
【図２Ｂ】
2013528379.tif 000023
【図２Ｃ】
2013528379.tif 000024
【図３Ａ】
2013528379.tif 000025
【図３Ｂ】
2013528379.tif 000026
【図３Ｃ】
2013528379.tif 000027
【図３Ｄ】
2013528379.tif 000028
【図４Ａ】
2013528379.tif 000029
【図４Ｂ】
2013528379.tif 000030
【図４Ｃ】
2013528379.tif 000031
【図４Ｄ】
2013528379.tif 000032
【図５Ａ】
2013528379.tif 000033
【図５Ｂ】
2013528379.tif 000034
【図５Ｃ】
2013528379.tif 000035
【配列表】
2013528379000001.app
【国際調査報告】
2013528379.tif 000036
2013528379.tif 000037
2013528379.tif 000038
2013528379.tif 000039
2013528379.tif 000040
2013528379.tif 000041