(57)【要約】  大豆苗およびそこから抽出可能な組成物について記載される。かかる組成物は、プレニル化イソフラボンおよび少なくとも１つのイソフラボノイドを含み、前記イソフラボノイドは、イソフラボン、クメスタンおよびプテリカルパンの化学分類の１つから選択される。かかる組成物は通常、少なくとも５％のプレニル化イソフラボン、特に、プレニル化ダイゼイン、プレニル化ヒドロキシダイゼイン、プレニル化グリシテイン、プレニル化ヒドロキシゲニステイン、およびプレニル化ゲニステインから選択されるプレニル化イソフラボンを含む。かかる組成物は、プテロカルパンも好ましくは少なくとも２０％の量で含み、グリセオリンＩ対グリセオリンＩＩ対グリセオリンＩＩＩ対グリセオリンＩＶの新規の比を有する。ストレス下、特に真菌の培養物の存在中で、好ましくはリゾープス・ミクロスポラス・バー・オリザエの存在中で大豆を発酵させる段階を含む製造方法も記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレニル化イソフラボンおよび少なくとも１つのイソフラボノイドを含有する組成物、特に大豆から誘導される組成物であって、前記イソフラボノイドがイソフラボン、クメスタンおよびプテロカルパンの少なくとも１つの化学分類から選択される前記組成物。
【請求項２】
少なくとも３つのイソフラボノイド：  イソフラボン、クメスタン、およびプテロカルパンの各々の化学分類の少なくとも１つを含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
存在するイソフラボノイドの総量の少なくとも５％のプレニル化イソフラボンを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
イソフラボノイドが、存在する総イソフラボノイドの少なくとも４％の量でクメスタンを含み、且つ、該クメスタンがプレニル化クメストロールを含む、請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
プレニル化イソフラボノイドが、Ａ環およびＢ環プレニル化ダイゼイン、Ａ環プレニル化２’−ヒドロキシダイゼイン、Ｂ環プレニル化グリシテイン、Ａ環プレニル化２’−ヒドロキシゲニステイン、Ａ環およびＢ環プレニル化ゲニステインおよびそれらの混合物からなる群から選択されるイソフラボンを含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
イソフラボノイドが、イソフラボノイドの総量の少なくとも４０％の量でプテロカルパンを含む、請求項１から５までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
プテロカルパンが、グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩ、グリセオリンＩＩＩ、およびグリセオリンＩＶから選択される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩ、グリセオリンＩＩＩおよびグリセオリンＩＶが、（０．５〜２）対（０．５〜２）対（０．５〜２）対（０．５〜２）の比率で存在する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
最大５％のゲニスチン、好ましくは最大２％のゲニスチンを含む、請求項１から８までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか１項に記載の組成物を含む大豆苗の製造方法であって、以下の段階：
ａ）  大豆を浸漬する段階
ｂ）  該大豆を、少なくとも部分的にストレス下で発芽させる段階
を含む前記方法。
【請求項１１】
段階ａ）およびｂ）を、大麦のモルティングのために通常使用されるモルティング系において実施する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
段階ａ）を、１０〜６０℃で３〜３０時間、より好ましくは１５〜２５℃で１６〜３０時間の間、大豆を水に浸漬することによって実施する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
段階ｂ）を、浸漬された大豆を発芽させた後、０〜１２０時間、１５〜４０℃で、より好ましくは、少なくとも６時間、最も好ましくは２４〜７２時間、２５〜３５℃でストレスを与えることによって実施する、請求項１０から１２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
段階ｂ）において、ストレスを、真菌、特にリゾープス・ミクロスポラス・バー・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ  Ｖａｒ．  ｏｒｙｚａｅ）での接種後、大豆の培養と共に連続的に発芽させることよって与える、請求項１０から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
接種を、浸漬された大豆の発芽の０〜１２０時間後、好ましくは少なくとも６時間後、最も好ましくは２４〜７２時間後に実施する、請求項１０から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
接種を、２０〜４０℃、相対湿度９０〜１００％で４８〜１２０時間、より好ましくは２５〜３５℃、相対湿度９５〜１００％で６６〜７８時間、実施する、請求項１０から１５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
浸漬および発芽を暗闇で実施する、請求項１０から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
段階ｂ）の後、大豆苗を抽出段階ｃ）に供して、請求項１から７までのいずれか１項に記載の組成物を有する抽出物を製造する、請求項１０から１７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
食品サプリメントとしての、または肌、爪および髪用に使われる化粧品における、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
薬剤、特にエストロゲン関連の健康状態、特に月経前症候群または閉経期または閉経後期に関連する症状、好ましくは一過性熱感、膣障害、失禁、気分障害、疲労または骨粗しょう症を含む閉経期または閉経後期の症状、前立腺機能および良性前立腺肥大症と関連する症状、ホルモン関連のガン（乳房、子宮内膜、前立腺）の予防および治療における薬剤として使用するための、請求項１から９までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
発酵大豆苗およびそれらの抽出組成物の製造における、リゾープス・ミクロスポラス・バー・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ  Ｖａｒ．  ｏｒｙｚａｅ）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、スイス特許出願１１３３／１０（２０１０年７月１２日出願）の優先権を主張し、その開示は、参照をもってその全文が本願内に開示されるものとする。
【０００２】
技術分野
本発明は、大豆苗、特に栄養学的に改善された大豆苗の製造に関する。
【０００３】
背景技術
健康増進作用を有する植物化学物質または植物化合物を特定することについての興味が高まっている。これらの生物活性化合物を同定するためのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのスクリーニングアッセイは、抗酸化剤、抗癌、抗肥満、コレステロール低下、受容体媒介および多くの他の活動を含む広範な研究を包含する。しばしば、植物化学の特性決定の成功は、健康増進作用を有する新規のサプリメントの開発につながることがある。健康増進作用を有するサプリメントは、栄養補助食品と称される。植物は、１０００００を上回る多種多様な、二次代謝産物として知られる低分子量天然産物を生成する  （Ｂｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）。それらの二次代謝産物は一次代謝の成分とは異なり、なぜなら、それらは一般に基本的な植物の代謝過程にとって必須であるとはみなされていないからである。それらの成分の大半は、イソプレノイド、フェニルプロパノイド、アルカロイドまたは脂肪酸／ポリケチド経路を含む、様々な植物の経路から誘導される。重要な二次代謝産物の１つの群は、フラボノイドの群である。フラボノイドは多くの植物中に遍在し、且つ、花粉媒介昆虫を惹きつけるための花色素として、ＵＶ保護剤として、共生生物のための信号分子として、および病原体に対する防御として、植物に使用される。イソフラボノイドは、フラボノイドの下位分類であり、且つ、主として豆果において見られる構成要素である二次代謝産物である。イソフラボノイドの下位分類は、イソフラボン、クメスタン、およびプテロカルパンの下位−下位分類を含み、記載される発明に関連する。表１は、この命名法を示す。
【０００４】
【表１】
2013540422.tif 000002
【０００５】
様々なガンおよび冠動脈の心疾患のリスクを低減することを含む、重要な健康増進作用は、豆果の消費と関連している  （Ｂｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；  Ｍａｚｕｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８；  Ｍｅｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８；  Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９８５）。栄養学的に関係する量のイソフラボノイドを含有することが最もよく知られている豆果は大豆である。イソフラボンアグリコンのゲニステイン、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）およびグリシテインは、それらの相応のグルコシド型  （ゲニスチン、マロニルゲニスチン、アセチルゲニスチン、ダイズイン（ｄａｉｄｚｉｎ）、マロニルダイズイン、アセチルダイズイン、グリシチン、マロニルグリシチンおよびアセチルグリシチン）とともに、大豆中の主要なイソフラボンである。機能性食品であるとみなされる多くの大豆食品およびサプリメントは、高い濃度の構成要素であるイソフラボンのダイゼインおよびゲニステインを有する。大豆を含む豆果源からの芽も、一般に消費される。ダイスの芽の中で、発芽の間にダイゼインから形成され得るクメストロールが見られることがある。
【０００６】
現在、栄養学者達はフィトアレキシンにも興味を持っている。多くのフィトアレキシンは化学的にはフラボノイドとして分類できる。フィトアレキシンは、感染、傷付き、氷結、紫外線曝露、または微生物への曝露によるストレスに応じてデノボ合成され、且つ、植物中に蓄積する低分子量化合物である。フィトアレキシンの生合成を、植物にストレスを与える非生物（生きていない）または生物（生きている）因子の適用によって操作して、より高いフィトアレキシン濃度を生成または放出できる  （Ｂｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；  Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１；  Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０；  Ｐａｘｔｏｎ  １９９１）。抗真菌、抗微生物、および抗酸化作用は、フィトアレキシンの有益な作用のいくつかであり、それがストレス誘導の間、大豆植物または苗の生き残りを高めることを助ける  （Ｄａｋｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６）。フィトアレキシンは、植物防御の分野においてよく文書化されている。エリシテーション過程における多数の研究が行われており、特定のエリシターが発見されている。しかしながら、フィトレアレキシンは、最近になってはじめて、栄養成分、および健康増進食品の開発のための原料として調査されている。グリセオリン（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）は、研究されている有力な大豆フィトアレキシンである。それらはプテロカルパンの下位−下位分類に属し、且つ、多数の大豆病原体に対する抗微生物作用を示す。近年の研究は、グリセオリンが抗エストロゲン作用および抗癌作用を有することを示している  （Ｂｕｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１；  Ｓａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６；  Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。さらなる研究は、エリシター処理された大豆からの抽出物が、未処理のコントロールと比較した場合により高い抗酸化作用を有することを示している  （Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）。グリセオリンＩ、グリセオリンＩＩおよびグリセオリンＩＩＩは通常、エリシター処理済み（ｅｌｉｃｉｔａｔｅｄ）大豆苗中に、１対２対６の割合で存在する  （Ｋｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８６）。植物の部分によっては、他の割合が見出されることがある。プテロカルパンの下位−下位分類からの大豆フィトアレキシン（植物防御抗微生物物質としてのみ、昔から知られている）は、現在、健康増進特性を評価した場合に他の大豆イソフラボノイドと並ぶとみなすことができる有益な植物化合物と考えられている。これらのフィトアレキシン化合物並びにイソフラボノイド誘導体のいくつかは、エストロゲン受容体アルファおよびベータに結合するための能力について試験されている。一般に、かかる結合試験は、ＨＰＬＣで精製された化合物を用いて行われ、それが、様々なスタンダードアッセイを用いてエストロゲン受容体アルファおよびベータへの相対的な結合について試験される。かかるアッセイはＩＣ５０をもたらし、それは５０％の受容体が試験化合物によって結合される際の濃度を示す。ＩＣ５０値は、以下の表２に示される化合物について公表されている。いくつかの化合物については、１つより多くのＩＣ５０が報告されている。ＩＣ５０の正確な値は、使用されたエストロゲン結合アッセイの詳細に依存しているように思��れる（表２）。
【０００７】
【表２】
2013540422.tif 000003
【０００８】
プレニル化ゲニステイン  （Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）およびプレニル化ＯＨ−ゲニステイン  （Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）が、エストロゲン受容体アルファに対してゲニステインと同様に作用することがさらに記載されている。Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）による研究は、ゲニステインのプレニル化誘導体が拮抗物質として作用し得ることを示唆した。
【０００９】
エストロゲン受容体への結合能力は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのエストロゲンまたは抗エストロゲン作用について標示的であると説明される。このメカニズムは、豆果の健康増進作用のいくつかと関連している。
【００１０】
発明者らは、世界市場における、グリセオリンが強化されたいかなる市販の大豆製品も認識していない。フィトアレキシン富化食品は、より高い濃度、またはデノボ合成されたレベルのフィトアレキシンを含有する植物材料から、エリシター処理の結果、調製される任意の食品として定義できる。エリシター処理は、生物エリシター、例えば微生物（アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、およびリゾ−プス・オリゴスポルス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ））、微生物細胞壁抽出物、および炭水化物から、ＵＶ誘導、損傷（例えば切断）重金属塩（例えばＣｕＣｌ2）および他の化学物質、例えばヨード酢酸を含む、非生物エリシターまでに及ぶ。概念実証として、最近、ラボ規模で、食品グレードのＲ．オリゴスポルスを用いた真菌のストレス下で発芽された黒大豆が、グリセオリンおよびオキシリピンを含有する豆乳および大豆ヨーグルトの製造のために技術的に有用であり得ることが示された  （Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。さらには、Ｒ．オリゴスポルスを用いた黒大豆の３日間の発芽が、スタキオースおよびラフィノース（鼓腸を引き起こすオリゴ糖）を、それぞれ９２％および８０％、低減するために充分であった。この研究は、植物の種の真菌誘発型（ｆｕｎｇｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）発芽が、新規の機能性食品を調査および開発するための食品研究におけるニッチを支えることができることの原理実証として役立つ。
【００１１】
従って、未だに新規且つ改善された栄養補助食品およびその製造方法についてのニーズがある。
【００１２】
該製品は、優れた関連エストロゲン受容体結合特性を有する組成を有するべきである。
【００１３】
発明の開示
従って、本発明の全般的な課題は、改善された組成の有益な化合物を有する大豆由来の栄養組成物、特に、健康強化食品の選択肢を提供することによって消費者に有益となる、フィトアレキシンを強化された食品を提供することである。
【００１４】
かかる改善された大豆由来栄養組成物を製造する方法を提供することが、本発明の他の課題であった。従って、フィトアレキシンを生成でき且つ今のところ健康増進食品としてみなすことができず、充分に活用されていない多くの作物、例えば他の種類の豆、エンドウまたは穀類すら使用できるということが他の利点である。
【００１５】
このこと、および下記の記載からすぐに明らかとなる本発明のさらなる課題を実現するために、本発明の大豆栄養補助食品は、それが組成物、特に大豆から誘導可能な組成物であってプレニル化イソフラボンおよび少なくとも１つのイソフラボノイドを含有するものを含み、前記イソフラボノイドがイソフラボン、クメスタン、およびプテロカルパンの化学群の１つから選択されるという特徴によって表される。
【００１６】
従って、本発明の１つの側面は、意外にも、大豆の特別な真菌誘発型発芽技術が、公知および新規のプレニル化イソフラボン、クメスタンおよびプテロカルパンの独特のプロファイルを有する組成物をもたらすことが判明したことである。プレニル化イソフラボン、クメスタンおよびプテロカルパンと関連して使用される際の新規という用語は、それらの化合物が自体公知であるかも知れないが、しかし過去に大豆中で観察されていないことを意味する。
【００１７】
特に、本発明の組成物は７つの新規のプレニル化イソフラボン、２つの新規のグリセオリン（ＩＶおよびＶＩ）、および１つのプレニル化化合物を含み、その全ては過去に大豆中で観察されていなかった。
【００１８】
好ましい組成物中には、イソフラボン、プレニル化イソフラボン、クメスタンおよびプテロカルパンが同時に含まれる。
【００１９】
組成物中で、イソフラボンは、ダイゼイン、グリシテインおよびゲニステイン、およびそれらの相応のグルコシド型を含む。
【００２０】
他の好ましい組成物中に、それら８つの新規に形成されたプレニル化イソフラボノイドの全て、即ち、プレニル鎖で置換された７つのイソフラボンと、プレニル化クメストロール（クメスタン）である１つのクメスタンが含まれる。
【００２１】
プレニル化クメステロールではない７つのプレニル化イソフラボンは、イソフラボンの下位−下位分類に属していると考えられ、且つ、Ａ環およびＢ環がプレニル化されたダイゼイン、Ａ環がプレニル化された２−ヒドロキシダイゼイン、Ｂ環がプレニル化されたグリシテイン、Ａ環がプレニル化された２’−ヒドロキシゲニステイン、Ａ環およびＢ環がプレニル化されたゲニステインである。
【００２２】
本発明の組成物は、組成物中で同定された全てのイソフラボノイドの、好ましくは少なくとも５％のプレニル化イソフラボノイドを含み、より好ましくは少なくとも２％のプレニル化クメストロールも含む。
【００２３】
好ましい組成物においては、プテロカルパンはグリセオリンＩ、グリセオリンＩＩ、グリセオリンＩＩＩ、グリセオリンＩＶおよびそれらの混合物から選択される。該組成物はさらに、他のプテロカルパン、例えばグリセオリジンおよびグリシノール（グリセオリンの生合成経路における前駆物質である）を含む、および好ましくは含む。
【００２４】
さらに他の好ましい組成物においては、プテロカルパンはグリセオリンＩ、グリセオリンＩＩ、グリセオリンＩＩＩ、およびグリセオリンＩＶおよびそれらの混合物から選択され、グリセオリンＩと、グリセオリンＩＩと、グリセオリンＩＩＩと、グリセオリンＩＶとが（０．５〜２）対（０．５〜２）対（０．５〜２）対（０．５〜２）の特定の比である、４つ全てのグリセオリンが同様の相対量で存在することを示す混合物が非常に好ましい。
【００２５】
通常、本発明の組成物は、グリセオリジンを特に、同定された全てのイソフラボノイドの量の少なくとも３％の量で含む（下記参照）。
【００２６】
他の本発明の組成物において、イソフラボン、グリセオリンおよびクメスタン、およびプレニル化イソフラボン並びにグリセオリンの前駆物質、例えばグリセオリジンおよびグリシノールが同時に存在する。
【００２７】
プテロカルパンは通常、同定された全てのイソフラボノイドの量の少なくとも４０％の量で存在する。
【００２８】
大豆の浸漬の際に、イソフラボノイド組成物に関してわずかな変化が生じる。メインピークは良く知られ且つ予想された大豆イソフラボン（それらのグルコシド型を含む）に割り当てられる。単に浸漬された大豆においては、ゲニステインおよびその誘導体が、同定された全てのイソフラボノイドの５０％を上回る主要なイソフラボンを形成する。このレベルは、大豆について典型的であり、次がダイゼインおよびそのグルコシド誘導体であり、それが同定された全てのイソフラボノイドの３０％より多くをなす。真菌誘発下での発芽において主要な変化が現れる：  （プレニル化）プテロカルパン、プレニル化イソフラボン、および（プレニル化）クメスタンが形成され、大豆イソフラボンの相対的なレベルが低下するという不可避の結果を伴う。それらのイソフラボンは、新規の大豆苗組成物を形成する、誘導された化合物のほとんどについて公知の前駆物質である。従って、生じる組成物は、他の大豆由来のイソフラボノイド組成物とは完全に異なっている。
【００２９】
意外なことに、真菌誘発型発芽でのそれらの組成変化は、パイロット規模（中間規模とも称される）の実験において、ラボ規模の実験と比較して一貫してはるかに劇的であった。
【００３０】
単に浸漬された大豆において、ダイゼイン（２０％）、ゲニステイン（２８％）およびゲニスチン（１６％）について最大のピークが見られた一方で、ストレス下での発芽を含む、ラボ規模の発芽においては、まずゲニスチンが＜５％、通常、約１〜２％に低減された。規模を拡大した後、ダイゼインは約１〜３％に低減され、ゲニステインは１〜２％に、およびゲニスチンは１％未満に低減された。同時に、プレニル化イソフラボンの量は、単に浸漬された大豆における約０％から、ストレスをかけた発芽の後にラボ規模においては５％より多くまで、パイロット規模においては二倍の量まで上昇した。
【００３１】
かかる改善された組成物を得るために、大豆を浸漬し、且つ発芽（出芽）させた一方で、マイクロモルティング（ｍｉｃｒｏｍａｌｔｉｎｇ）系において真菌によってストレスをかけた。これが、健康サプリメントおよび／または薬剤のための抽出物をさらに製造するための独自且つ新規の成分の組成物の形成を導いた。大豆内ではないが既に記載された化合物のいくつかは、エストロゲン様であることが公知であり、且つ、新規の成分については、エストロゲン効果がインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのエストロゲン受容体アルファおよびベータへの結合によって実証された。
【００３２】
より詳細には、本発明の組成物を含む大豆苗の製造方法は、以下の段階：
ａ）  大豆を浸漬する段階、
ｂ）  大豆をストレス下で発芽させる段階
を含む。
【００３３】
ストレスは、好ましくは真菌の培養物、好ましくはリゾ−プス・ミクロスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）、例えばリゾ−プス・ミクロスポラス・オリザエの存在によって与えられる。
【００３４】
段階ａ）およびｂ）を、大麦のモルティングのために産業において通常使用されるモルティング系において実施できる。
【００３５】
本発明の組成物を、大豆苗から抽出物を製造することを含む第三の段階ｃ）を追加することによって、大豆苗から単離できる。
【００３６】
好ましい実施態様においては、段階ａ）において大豆を３〜３０時間、１０〜６０℃で、より好ましくは１６〜３０時間、１５〜２５℃で水に浸漬する。
【００３７】
他の特別な実施態様においては、段階ｂ）において、浸漬された大豆を発芽させた後、ストレスを０〜１２０時間、１５〜４０℃、より好ましくは少なくとも６時間、および最も好ましくは２４〜７２時間、２５〜３５℃で与える。
【００３８】
さらに他の好ましい方法においては、段階ｂ）において、真菌、特にリゾープス・ミクロスポラス・オリザエを用いた接種後、大豆の発芽を続ける。大豆苗に、ストレスをかけない単なる発芽の０〜１２０時間後、好ましくは少なくとも６時間後、より好ましくは２４〜７２時間後、接種することができる。該真菌を、２０〜４０℃で、１００％ＲＨ（相対湿度）に近い湿度、例えば９０〜１００％ＲＨで、４８〜１２０時間、より好ましくは２５〜３５℃、９５〜１００％ｒ．ｈ．で６６〜７８時間、成長させる。
【００３９】
さらに他の実施態様において、浸漬および発芽は、暗闇中で実施される。
【００４０】
この新規組成物を、特にエストロゲン関連の健康状態を治療または予防するための食品サプリメントまたは薬剤中で使用できる。
【００４１】
かかるエストロゲン性の健康状態は、例えば前立腺機能、良性前立腺肥大症と関連する症状、月経前症候群または閉経期または閉経後期に関連する症状、特に一過性熱感、膣障害、気分障害、疲労、骨粗しょう症、失禁を含む、閉経期または閉経後期の症状、ホルモン関連のガン(乳房、子宮内膜、前立腺)である。肌、爪および髪におよぼす化粧の効果も含まれる。
【００４２】
これらの理由のために、フィトアレキシン富化食品は、健康強化食品の選択肢を提供することによって、消費者に利益をもたらす。開示された方法は、フィトアレキシンを製造するために使用でき、健康増進食品としてみなされていない、多くの充分に活用されていない作物、例えば他の種類の豆、エンドウまたは穀類のためにもなる。
【００４３】
図面の簡単な説明
以下の詳細な説明を考慮することで、本発明がより良く理解され、且つ、上記で示された以外の課題が明らかとなる。かかる説明は、添付の図面を参照している：
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、ラボ規模および中間規模において製造された、大豆苗由来の組成物の比較を示す。ＵＨＰＬＣクロマトグラムは、真菌誘発型発芽における組成の変化が、パイロット規模の実験において、ラボ規模の実験と比較してより顕著であったことを示す。
【図２】図２は、中間規模の工程によって得られた組成物のＵＨＰＬＣクロマトグラムのより詳細なバージョンを示し、組成物の要素として公知の成分および公知ではない成分について見られたピークを示している。ピークの番号は、表３に示された化合物に関する。
【図３】図３は、抽出物のエストロゲン性が、２つのエストロゲン受容体に向かう誘導工程の間に、１．００として設定されたエストラジオール（Ｅ２）の活性と比較して徐々に増加することを示す。
【００４５】
本発明を実施するための方式
本発明の目的は、特定の組成物における潜在的に生物活性なイソフラボノイドの種類および範囲を目的として、加工された大豆のイソフラボノイド組成物を改善することである。かかる改善された組成物を達成するために、発芽および真菌により誘発する実験を実施して大豆における化学的な変化を誘導する。かかる変化は、真菌の存在中で大豆を発芽させることによって誘導される。有利な組成変化、即ち潜在的なエストロゲン化合物の生成を誘導するためのいくつかの菌株を調査した。イソフラボノイド組成の変化に加えて、公知のグリセオリンの生合成が維持されるべきであること、およびさらなるプレニル化イソフラボン（エストロゲン活性を有する）が、増加した総イソフラボノイド量、例えば１〜３倍増加された量（最近の予備実験において見られた増加に相応）を形成すべきであることが望まれる。
【００４６】
種々の培養条件および真菌を、数回の実験において試験した。発芽大豆に、異なる成長条件下で、真菌の４つの異なる菌株の１つを接種した。４つの異なる菌株の中で、リゾープス・ミクロスポラス・バー（ｖｅｒ．）・オリザエ（単にリゾープス・ミクロスポラス・オリザエとも称する）が、最も活発な成長を有することが観察された。グリセオリン、ダイゼイン、およびゲニステインの最も高い含有率は、リゾ−プス・ミクロスポラス・バー・オリザエを接種された大豆において観察された。さらには、この真菌を用いて、化合物が同時に形成されることが観察され、今まで、そのいくつかは全く記載されておらず、他のものは植物原料と関連して記載されておらず、いずれにせよ大豆と関連して記載されていない。
【００４７】
ガラスジャー内でのラボ規模の実験を、産業的な大麦のモルティングの研究において通常使用されるマイクロモルティング系内でのｋｇ規模へと大規模化した。
【００４８】
実施例１：  ラボ規模（小規模）
大豆を、１％の次亜塩素酸塩（ｍ／ｖ）溶液（豆１ｋｇあたり５ｌ）中に、連続的に攪拌しながら１時間、２０℃で浸漬することによって、表面滅菌した。表面滅菌の後、大豆を、滅菌脱塩水で濯ぎ、その後、４時間、４０℃で、滅菌ミリＱ水中に浸漬した。浸漬後、３７０ｍｌのガラスジャー内で豆を発芽させ、前記ガラスジャーは、豆が干上がるのを防ぐために、滅菌ミリＱ水で加湿されたろ紙で底が覆われていた。該ジャーを、通気が可能なように蓋でゆるく閉じ、且つ、４日間、３０℃で、暗がりで培養した。
【００４９】
大豆の真菌接種のために、例えば、モルト抽出寒天（ＣＭ５９；  Ｏｘｏｉｄ，  Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，  ＵＫ）上で７日間、３０℃で成長させたリゾ−プス・ミクロスポラス・バー・オリザエの、純粋斜面培養からの胞子嚢を掻き落とし、且つ、それらを０．８５％のＮａＣｌを有する滅菌ミリＱ水中に懸濁させることによって（１０8ＣＦＵ  ｍＬ-1）、製造された胞子嚢胞子懸濁液を使用した。該胞子嚢胞子懸濁液（０．２ｍｌ  ｇ-1）の接種の後、豆をさらに４日間、３０℃、暗がりで培養し、その間、真菌の成長並びに苗のさらなる成長が起きる。
【００５０】
実施例２：  パイロット規模への大規模化
中間規模またはパイロット規模の大豆の発芽をそれぞれ、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｊｏｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｍａｌｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｉｃｒｏ−ｍａｌｔｉｎｇ  Ｕｎｉｔ  （Ｐｅｒｔｈ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）内で試験した。制御された条件下で、６．４ｋｇの大豆を、２０〜２４時間、２０℃で浸漬し、４８時間、３０℃、１００％ｒ．ｈ．（相対湿度）で発芽させ、その後、リゾ−プス・ミクロスポラス・バー・オリザエを接種した（実施例１の胞子溶液の調製を参照；  投与量は０．２ｍｌ  ｇ-1の胞子溶液（１０8  ＣＦＵ  ｍＬ-1）であった）。実験を、実施例１と同様の方式で実施された浸漬の前に消毒段階を含む、マイクロモルティング系内で実施した。接種後、発芽が１２０時間、３０℃、１００％ｒ．ｈ．で継続した。７２時間後、循環空気の過飽和を避けるように条件を調節した。苗を回収し、フリーズドライし、且つ抽出した。
【００５１】
実施例３：  分析
装置および手順：
新鮮な大豆、浸漬された大豆、および真菌誘発型発芽大豆をフリーズドライし、その後、粉砕して１ｍｍより小さい粒径を有する粉末をもたらす。粉末をヘキサン抽出によって３０分間、音波処理浴中、３０℃で脱脂した（粉末  ０．０４ｇ／ヘキサン  １ｍｌ）。脱脂後、該脱脂粉末を２段階で連続的に、各々の溶剤を用いて、３０分間、音波処理浴中、３０℃で抽出することによって、フラボノイドを無水ＥｔＯＨ（粉末  ０．０４ｇ／ＥｔＯＨ  １ｍｌ）で抽出した。抽出物を２５００ｇで１５分間、遠心分離した。上澄み液を回収し、且つ、溶剤を蒸発させ、乾燥された抽出物が生じる。乾燥された抽出物を、メタノール（ＭｅＯＨ）中で溶解させて１０ｍｇ  ｍＬ-1のストック濃度にし、且つ、−２０℃で保管した。全ての試料を解凍し、且つ、分析前に遠心分離した。
【００５２】
試料を、ポンプ、オートサンプラー、およびＰＤＡ（フォトダイオードアレイ）検出器を備えたＵＨＰＬＣ（超高圧液体クロマトグラフィー）システムにおいて分析した。試料（１μｌ）を、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８  Ｖａｎｇｕａｒｄプレカラムを備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８カラムに注入した。０．１％（ｖ／ｖ）の酢酸で酸性化された水  （溶出液Ａ）、および０．１％（ｖ／ｖ）の酢酸で酸性化されたアセトニトリル（ＡＣＮ）  （溶出液Ｂ）を、溶出液として使用した。流速は３００μＬ  分-1であり、カラムオーブンの温度は２５℃に調節され、且つ、ＰＤＡ検出器を、２００〜４００ｎｍの範囲での測定用に設定した。以下の溶出プロファイルを使用した：  ０〜２分、１０％から２５％  （ｖ／ｖ）のＢの直線勾配；  ２〜９分、２５％から５０％  （ｖ／ｖ）のＢの直線勾配；  ９〜１２分、５０％のＢにおける定組成；  １２〜２２分、５０％から１００％  （ｖ／ｖ）のＢの直線勾配；  ２２〜２５分、１００％のＢにおける定組成；  ２５〜２７分、１００％から１０％  （ｖ／ｖ）のＢの直線勾配；  ２７〜２９分、１０％  （ｖ／ｖ）のＢにおける定組成。質量分析データは、ＲＰ−ＵＨＰＬＣ  に結合されたＥＳＩ−ＭＳプローブを備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ−ＸＬにて試料を分析することによって得られた。ヘリウムをシースガスとして、且つ窒素を補助ガスとして使用した。１５０〜１５００のｍ／ｚ範囲にわたってデータを採取した。３５％の正規化された衝突エネルギーを用いて、データ依存ＭＳn分析を行った。ＭＳnフラグメンテーションは常に、ＭＳn-1スペクトルにおける最も強い娘イオンについて行われる。ほとんどの設定は、「ｔｕｎｅ  ｐｌｕｓ」を使用して自動チューニングを介して最適化された。
【００５３】
該システムは、ゲニステインを用いて、正イオン化モード（ＰＩモード）と、負イオン化モード（ＮＩモード）との両方においてチューニングされた。ＮＩモードにおいては、イオン輸送管温度は３５０℃であり、且つ、電源電圧は４．８ｋＶであった。ＰＩモードとＮＩモードとの両方において、イオン輸送管温度は３５０℃であり、且つ、電源電圧は４．８ｋＶであった。データ取得および再加工は、Ｘｃａｌｉｂｕｒ２．０．７を用いて行われた。分析の参照ＨＰＬＣ標準が、同定されたほとんどの化合物について利用可能ではなかったため、全ての化合物の定量化を、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｎｅｕｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入された単離ダイゼイン（最低純度９８％）を使用して、ｍｇ／ｇでのダイゼイン当量として行った。従って、組成は存在し且つ同定された総イソフラボノイドの存在の％で表現される。
【００５４】
インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）活性試験：
酵母に基づくアッセイを使用して、抽出物のエストロゲン活性を実証した。このバイオアッセイの原理は、（Ｂｏｖｅｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４ａ）内に記載されている。試料をＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍｌ）中で可溶化し、該ＤＭＳＯはさらなる希釈のための原液として使用された。一連の濃度を９６マイクロウェル（ＭＷ）プレートに分取した（２μｌ）。該アッセイを、（Ｂｏｖｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４ｂ）内に記載されるとおりに実施した。
【００５５】
成果／結果：
小規模（ラボ規模）実験：
浸漬されていない豆、浸漬された豆、および真菌誘発型発芽豆のＥｔＯＨ抽出物のＵＨＰＬＣ−ＵＶプロファイルは、イソフラボノイド組成における変化が浸漬で生じ、発芽および真菌誘発型発芽が続くことを示す。合計３０個のピークが、３つ全てのＵＨＰＬＣプロファイルにおいて暫定的に指定された（図１、および表３における保持時間と化合物との相関を参照）。浸漬されていない大豆および浸漬された大豆のＵＨＰＬＣプロファイルは、主たる大豆イソフラボンのゲニステイン、ダイゼイン、グリシテインおよびそれらのグルコシド誘導体の存在を特徴とした。イソフラボンアグリコン、ゲニステインおよびダイゼインが、最も豊富であった。
【００５６】
真菌誘発型発芽に従う発芽の際、グルコシド共役イソフラボンは小さなピークへと減少する一方で、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステインおよびマロニルゲニステインは、ＵＶプロファイルにおける支配的なピークとなった。さらには、いくつかの新しいピークがクロマトグラム内に現れた（図１、表４参照）。
【００５７】
図１におけるピークの第一のクラスタはゲニステインの直後に溶出され、且つ暫定的に、グリセオリジンＩ＋ＩＩおよびクメストロールについての共溶出ピークとして指定され、グリセオリンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶＩが続く。グリセオリンおよびそれらの前駆物質グリセオリジンは、グリシノール、非プレニル化プテロカルパン（真菌誘発型大豆苗のＵＶプロファイルにおいても見られた）から誘導されるプレニル化プテロカルパンである。さらには、オキシリピンの群は、クロマトグラムの後半に溶出されることが判明した。それらのピークは暫定的にオキソオクタデカジエン酸（ＫＯＤＥ）  （Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）として指定されるが、本発明のためには重要ではない。
【００５８】
いくつかのプレニル化イソフラボノイド、例えばプテロカルパン、グリセオリンＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶＩ、およびグリセオリジンＩ／ＩＩの存在によって、真菌誘発型大豆苗の抽出が、可能な他のプレニル化フラボノイドをスクリーニングするための興味深い供給源となる。大豆製品における成分として今まで観察されていなかったいくつかの新規のプレニル化イソフラボノイドが誘導される。
【００５９】
中間規模（パイロット規模）実験：
ＵＨＰＬＣ−ＵＶプロファイルにおいて見られるとおり、大規模化は、誘導の際の新規化合物の含有率におけるさらなる増加をもたらし（１４分と１８分との間に溶出）、４つの主群の化合物：  「従来の」大豆イソフラボン、プレニル化クメストロールを含むクメスタン、プテロカルパン（グリシノール、グリセオリン、およびグリセオリジン）、および新規のプレニル化イソフラボンを含む組成物をみちびく（図１および２（ピーク数と化合物との間の相関は表３に記載）、表４および表５参照）。かかる組成物は、今まで記載されていなかった。
【００６０】
【表３】
2013540422.tif 000004
【００６１】
【表４−１】
2013540422.tif 000005
【００６２】
【表４−２】
2013540422.tif 000006
【００６３】
【表５】
2013540422.tif 000007
*保持時間は時間にわたって変化するが、ピークのシーケンスは安定である。
【００６４】
この組成物を、酵母に基づく生体活性アッセイにおいて試験した。
【００６５】
アッセイにおける最終的な抽出濃度１０μｇ／ｍｌで、ＥＲαについてのエストロゲン活性における、時間による明らかな増加が観察された。最終濃度１μｇ／ｍｌで測定した場合、時間による同様の増加傾向がＥＲβについて観察された（図３参照）。図３は、抽出物のエストロゲン性が、誘導工程の間に両方のエストロゲン受容体に向かって徐々に増加することを示す。
【００６６】
結論：
新しい大豆の浸漬に際しては、ＬＣ−クロマトグラムのＵＶプロファイルにおける化合物のダイゼイン、ゲニステインおよびゲニスチンについてのピークが、最も支配的なピークである。ラボ規模における大豆の浸漬、次の発芽および真菌誘発型発芽の後、ダイゼインおよびゲニステインは、ＵＶプロファイルにおいて、発芽しておらず且つストレスを与えられていない大豆の結果と比較して、未だ支配的なピークであったが、しかし、クロマトグラム中に新たなピークが現れ、そのピークは、クメスタン、プテロカルパン、イソフラボンおよびプレニル化イソフラボンの現れとして指定することができる。大豆製品にとって新規である、１０のプレニル化イソフラボノイドを誘導できた。意外なことに、それらの新規化合物の誘導を、発芽の大規模化によって高めることができる。この大規模化は意外なことに、今まで観察されなかった化合物のさらなる新規且つ予想外の化学組成物を、高められた水準でもたらした。８つの新たなプレニル化イソフラボノイドのうち、７つはイソフラボンの下位−下位分類に属し、且つ、暫定的にＡ環（ａ）およびＢ環（ｂ）プレニル化ダイゼイン、Ａ環プレニル化２’−ヒドロキシダイゼイン、Ｂ環プレニル化グリシテイン、Ａ環プレニル化２’−ヒドロキシゲニステイン、Ａ環およびＢ環プレニル化ゲニステインとして指定される。さらには、さらなるプレニル化イソフラボノイドは暫定的にプレニル化クメストロール（クメスタン）として指定された。
【００６７】
現在のところ、加工された丸大豆（ｗｈｏｌｅ  ｓｏｙｂｅａｎ）、発酵または出芽形成大豆製品が食材として市場に存在するか、またはそれらからの抽出物が、食品サプリメント中に配合されているかのいずれかのみである。それらの製品は主として、ダイゼイン、グリシテインおよびゲニステインおよびそれらのグルコシド型を有効成分として含有する。
【００６８】
本発明によって処理された大豆の、より広い範囲の生物活性な健康成分を有する改善された組成により、それらが、未処理の大豆から製造された製品と比較してはるかにより高い健康保持活性を有する健康食品、サプリメントとして、および／または薬剤の製造のために適するようになる。
【００６９】
さらなる利益は、健康成分の含有率がより高いおかげで、より少ない推奨用量しか必要とされず、エンドユーザーにとって摂取がより楽になることである。
【００７０】
さらなる利点は、真菌誘発型発芽大豆苗を、大規模、即ち工業生産規模で製造できる可能性があることである。
【００７１】
現在のところ好ましい本発明の実施態様が示され且つ記載されているが、本発明はそれに限定されるわけではなく、以下の特許請求の範囲内で様々に具体化され且つ実用化され得ることが明らかに理解されるべきである。
【００７２】
文献：
2013540422.tif 000008
【００７３】
2013540422.tif 000009
【００７４】
2013540422.tif 000010
【図１】
2013540422.tif 000011
【図２】
2013540422.tif 000012
【図３】
2013540422.tif 000013
【国際調査報告】
2013540422.tif 000014
2013540422.tif 000015