(57)【要約】１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）経路を有する非天然の微生物は、少なくとも１つの外因性の核酸を含み、この核酸は１，３−ＢＤＯの産生に十分量で発現される１，３−ＢＤＯ経路の酵素またはタンパク質をコードする。１，３−ＢＤＯを産生するための方法は、１，３−ＢＤＯを産生するための条件下で二１，３−ＢＤＯを産生するに十分な期間にわたって非天然の微生物を培養する工程を包含する。
2013513384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）を産生するに十分な量で発現された１，３−ＢＤＯ経路酵素またはタンパク質をコードする少なくとも一つの外因性核酸を含む１，３−ＢＤＯ経路を有する微生物を含み、
上記１，３−ＢＤＯ経路が、
ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンセターゼ、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンセターゼ、またはアセトアセテートレダクターゼ
を含み、
上記１，３−ＢＤＯ経路酵素が、
Ａ：１）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、２）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、３）ギ酸デヒドロゲナーゼ、４）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、５）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、６）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、７）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、８）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、９）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、１０）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、１１）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１２）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１３）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１４）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１５）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、および１６）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；
Ｂ：１）３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、２）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、３）ギ酸デヒドロゲナーゼ、４）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、５）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、６）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、７）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、８）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、９）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、１０）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、１１）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１２）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１３）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１４）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１５）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、１６）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼまたはシンセターゼ、および１７）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；
Ｃ：１）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、２）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、３）ギ酸デヒドロゲナーゼ、４）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、５）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、６）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、７）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、８）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、９）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、１０）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、１１）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１２）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１３）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１４）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、および１５）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；
Ｄ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１５）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、および１６）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；
Ｅ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１５）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、および１６）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；
Ｆ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、および１５）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；
Ｇ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、またはシンセターゼ、１５）アセトアセテートレダクターゼ、１６）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、および１７）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；
Ｈ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、またはシンセターゼ、１５）アセトアセテートレダクターゼ、１６）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、および１７）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；ならびに
Ｉ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、またはシンセターゼ、１５）３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、１６）３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、および１７）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ
より選択される酵素のセットである、非天然の微生物。
【請求項２】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする２個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項３】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする３個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項４】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする４個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項５】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする５個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項６】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする６個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項７】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする７個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項８】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする８個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項９】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする９個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項１０】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１０個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項１１】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１１個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項１２】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１２個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項１３】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１３個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項１４】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１４個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項１５】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１５個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項１６】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１６個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項１７】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１７個の外因性核酸を含む、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項１８】
上記少なくとも一つの外因性核酸が異種性の核酸である、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項１９】
実質的に嫌気性である培養媒体に存在する、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項２０】
１）ＣＯ、２）ＣＯ２およびＨ２、３）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）ＣＯおよびＨ２からなる合成ガス、５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２からなる合成ガス、ならびに６）一つまたはそれ以上の炭化水素
より選択される炭素原料を用いる、請求項１に記載の非天然の微生物。
【請求項２１】
１，３−ＢＤＯを製造するための条件下で十分な期間にわたって、請求項１に記載の非天然の微生物を培養する工程を含む、１，３−ＢＤＯの製造方法。
【請求項２２】
上記非天然の微生物が、実質的に嫌気性である培養媒体に存在する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする２個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする３個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする４個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする５個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする６個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする７個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする８個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする９個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１０個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１１個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１２個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１３個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１４個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１５個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１６個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１７個の外因性核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３９】
上記少なくとも一つの外因性核酸が異種性の核酸である、請求項２１に記載の方法。
【請求項４０】
上記の微生物が、
１）ＣＯ、２）ＣＯ２およびＨ２、３）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）ＣＯおよびＨ２からなる合成ガス、５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２からなる合成ガス、ならびに６）一つまたはそれ以上の炭化水素
より選択される炭素原料を用いる、請求項２１に記載の方法。
【請求項４１】
１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）を産生するに十分な量で発現された１，３−ＢＤＯ経路酵素またはタンパク質をコードする少なくとも一つの外因性核酸を含む１，３−ＢＤＯ経路を有する微生物を含み、
上記１，３−ＢＤＯ経路が、
メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンセターゼ、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンセターゼ、またはアセトアセテートレダクターゼ
を含む、非天然の微生物。
【請求項４２】
上記１，３−ＢＤＯ経路酵素が、
Ａ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１３）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、および１４）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；
Ｂ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１３）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、および１４）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；
Ｃ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、１３）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、および１４）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；
Ｄ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、および１３）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；
Ｅ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、および１３）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；
Ｆ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、またはシンセターゼ、１３）アセトアセテートレダクターゼ、１４）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、および１５）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；
Ｇ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、またはシンセターゼ、１３）アセトアセテートレダクターゼ、１４）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、および１５）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；
Ｈ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、１３）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、またはシンセターゼ、１４）３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、および１５）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；ならびに
Ｉ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、またはシンセターゼ、１３）３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、１４）３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、および１５）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ
より選択される酵素のセットである、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項４３】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする２個の外因性核酸を含む、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項４４】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする３個の外因性核酸を含む、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項４５】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする４個の外因性核酸を含む、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項４６】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする５個の外因性核酸を含む、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項４７】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする６個の外因性核酸を含む、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項４８】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする７個の外因性核酸を含む、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項４９】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする８個の外因性核酸を含む、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項５０】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする９個の外因性核酸を含む、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項５１】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１０個の外因性核酸を含む、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項５２】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１１個の外因性核酸を含む、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項５３】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１２個の外因性核酸を含む、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項５４】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１３個の外因性核酸を含む、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項５５】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１４個の外因性核酸を含む、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項５６】
１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１５個の外因性核酸を含む、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項５７】
上記少なくとも一つの外因性核酸が異種性の核酸である、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項５８】
実質的に嫌気性である培養媒体に存在する、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項５９】
１）メタノールおよびＣＯ、２）メタノール、ＣＯ２およびＨ２、３）メタノール、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）メタノール、ならびにＣＯおよびＨ２からなる合成ガス、５）メタノール、ならびにＣＯ、ＣＯ２およびＨ２からなる合成ガス、６）一つまたはそれ以上の炭化水素、７）メタノールおよび一つまたはそれ以上の炭化水素、ならびに８）メタノール
より選択される炭素原料を用いる、請求項４１に記載の非天然の微生物。
【請求項６０】
１，３−ＢＤＯを製造するための条件下で十分な期間にわたって、請求項４１または４２に記載の非天然の微生物を培養する工程を含む、１，３−ＢＤＯの製造方法。
【請求項６１】
上記非天然の微生物が、実質的に嫌気性である培養媒体に存在する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする２個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする３個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする４個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする５個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする６個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする７個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする８個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする９個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７０】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１０個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７１】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１１個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７２】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１２個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７３】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１３個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７４】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１４個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７５】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１５個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７６】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１６個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７７】
上記微生物が、１，３−ＢＤＯ経路酵素を各々コードする１７個の外因性核酸を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７８】
上記少なくとも一つの外因性核酸が異種性の核酸である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７９】
上記微生物が、
１）メタノールおよびＣＯ、２）メタノール、ＣＯ２およびＨ２、３）メタノール、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）メタノール、ならびにＣＯおよびＨ２からなる合成ガス、５）メタノール、ならびにＣＯ、ＣＯ２およびＨ２からなる合成ガス、６）一つまたはそれ以上の炭化水素、７）メタノールおよび一つまたはそれ以上の炭化水素、ならびに８）メタノール
より選択される炭素原料を用いる、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、2009年12月10日に出願された米国仮特許出願番号61/285,312に基づく優先権を主張し、その内容の全てを本願に援用する。
【０００２】
〔背景技術〕
本発明は、概して生合成プロセスに関する。特に、本発明は、炭化水素、メタノール、合成ガスおよび他のガス状の炭素源を用いて汎用化学物質を製造することができる生物に関する。
【０００３】
１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）は、従来から、アセチレンから水和反応を介して製造される四炭素ジオールである。そのとき、結果として得られるアセトアルデヒドを３−ヒドロキシブチルアルデヒドへ変換し、続いて還元して１，３−ＢＤＯを形成する。近年では、アセトアルデヒドの原料として、アセチレンをより安価なエチレンに切り換えている。一般的に、１，３−ＢＤＯは食品香料剤のための有機溶媒として用いられている。また、１，３−ＢＤＯはポリウレタンおよびポリエステル樹脂のためのコモノマーとしても利用され、そして、１，３−ＢＤＯは血糖低下剤としても広く利用されている。光学活性１，３−ＢＤＯは、生物学的に活性な化合物および液晶の合成に有用な出発原料である。１，３−ブタンジオールの他の利用方法としては、脱水反応により、合成ゴム製品（例えばタイヤ）、ラテックス、および、樹脂を製造するために用いられる化学物質である１，３−ブタジエンを得るという利用方法である（Ichikawa et al., J. Molecular Catalysis A-Chemical, 231:181-189 (2005)、Ichikawa et al., J. Molecular Catalysis A-Chemical, 256:106-112 (2006)を参照）。
【０００４】
合成ガス（ｓｙｎｇａｓ）は、石炭、石油、天然ガス、バイオマスまたは廃棄された有機物のような、任意の有機原料のガス化を介して得ることができる、主に、Ｈ２およびＣＯの混合物である。多くのガス化プロセスが開発されている。ほとんどのプロセス設計は部分酸化に基づいており、ここで、酸素の制限は、高温（５００℃〜１５００℃）での有機物質の完全燃焼を避け、０．５：１〜３：１  Ｈ２／ＣＯ混合物としての合成ガスを与える。場合によって、蒸気を加え、水ガス転化反応を介してＣＯ２生成量を増大させると共に、水素含有量を増大させる。メタノールは、ごく一般的に、触媒を介してＣＯおよびＨ２の合成ガス組成物から工業的に製造される。
【０００５】
現在、石炭は合成ガスを工業的に製造するために用いられる主要な基質である。合成ガスは、従来、火力発電（ｈｅａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｗｅｒ）のために利用され、ならびに、メタノールおよび液体炭化水素のフィッシャートロプシュ合成法の原料として利用されている。多くの大規模な化学系企業、および、エネルギー系企業は、大規模な石炭ガス化プロセスを利用しており、当該技術を用いる産業において経験豊富である。
【０００６】
さらに、現在、世界中のほとんどの場所において、バイオマス、廃棄物、ポリマーおよびそれらに類するもののような大量の他の材料から合成ガスを費用効率的に製造するための方法が存在している。合成ガスは、バイオマスを含むほとんどの有機材料から製造することができるため、合成ガスを利用する利点としては、適応性が含まれる。他の利点としては、合成ガスが安価であることである。加えて、例えば「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．」のような生物にあるような、効率的に合成ガスを利用する既知の経路が存在している。
【０００７】
合成ガスを使用する生物を利用することができるものの、一般的に、既知の生物は特性に乏しく、商業的に開発することにあまり適していない。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍおよびそれに関連する細菌は、ブタノールのような高濃度の特定の生成物に耐えることができない実質的嫌気性の生物であり、それにより、滴定濃度および商業化の見込みが制限される。また、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは多様な生成物を生成し、目的の生成物を得るための単離の問題が存在している。最終的に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ遺伝子を操作するための簡単な遺伝子ツールの開発が始まったばかりである。そのため、目的生成物の生成率や生成特性を改良するための遺伝子工学の影響をすぐには受けない。
【０００８】
化学生成物の環境への影響を最小限にする一方で、安価での適用性の増大、および、すぐに利用できる原料は、持続可能な化学工業の２つの目標である。原料の適用性は、化学製造のための主な原料としての広い範囲の材料の接近および利用を可能にする方法の導入に依存する。アセチレンまたはエチレンのどちらか一方は石油に基づく原料に依存するため、１，３−ブタンジオールへの経路に、および、ブタジエンへの経路に基づく再生可能な原料を開発する必要がある。
【０００９】
従って、１，３−ブタンジオールを製造するために、炭水化物、メタノール、合成ガスまたは他のガス状炭素源を利用する微生物およびそれらの利用方法を開発する必要性がある。本発明は、この必要性を満たすものであり、さらに、関連する利点を供給する。
【００１０】
〔発明の概要〕
一部の形態において、本明細書に開示されている実施形態は、１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）経路を有する非天然の微生物に関し、当該微生物は、１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする少なくとも一つの外因性核酸、または、１，３−ＢＤＯを産生するために十分な量の発現したタンパク質を含む。１，３−ＢＤＯ経路には、メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存性、アルコール形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンセターゼ、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンセターゼ、または、アセトアセテートレダクターゼが含まれる。
【００１１】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている実施形態は、１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）経路を有する非天然の微生物に関し、当該微生物は、１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする少なくとも一つの外因性核酸、または、１，３−ＢＤＯを産生するために十分な量の発現したタンパク質を含む。１，３−ＢＤＯ経路には、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンセターゼ、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンセターゼ、または、アセトアセテートレダクターゼが含まれる。
【００１２】
いくつかの局面において、本明細書に開示されている実施形態は、１，３−ＢＤＯを製造するための条件および一定期間で、前述の非天然の微生物を培養する工程を含む、１，３−ＢＤＯの製造方法に関する。
【００１３】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、酢酸およびエタノールについてのＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路および形成経路を描いたダイヤグラムを示している。合成ガスに対して成長し得る生物に特徴的である変換は、（１）ＣＯデヒドロゲナーゼ、（２）ヒドロゲナーゼ、（３）エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（ＥＣＨ）、および（４）二官能性ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチルＣｏＡシンターゼである．
図２は、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を含むガスをアセチルＣｏＡへ変換し、続いて、細胞塊および生成物（例えばエタノールまたは酢酸）へ変換することを可能にする完全なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を示す。略記；１０ＦＴＨＦ：１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸、５ＭＴＨＦ：５−メチルテトラヒドロ葉酸、ＡＣＴＰ：リン酸アセチル、ＣＦｅＳｐ：コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ＦＯＲ：ホルメート、ＭｅＯＨ：メタノール、ＭＥＴＨＦ：メチルテトラヒドロ葉酸、ＭＬＴＨＦ：メテニルテトラヒドロ葉酸、ＴＨＦ：テトラヒドロ葉酸．
図３は、アセトアセチルＣｏＡから１，３−ブタンジオールへの経路を示している。酵素的な工程は：Ａ）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、Ｂ）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、Ｃ）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ、Ｄ）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、Ｅ）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、Ｆ）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ、Ｇ）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、Ｈ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、Ｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、Ｊ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼまたはシンセターゼ、Ｋ）３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、Ｌ）３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、Ｍ）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼまたはシンセターゼ、Ｎ）アセトアセテートレダクターゼである．
図４は、炭化水素（例えば、グルコース、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を含むガス、ならびに、メタノール）の、アセチルＣｏＡへの変換、さらには、１，３−ブタンジオールへの変換のための生合成代謝経路を示す。生成宿主へ操作された特定の酵素的変換反応が番号付けされ、図中に示される。略記；１０ＦＴＨＦ：１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸、５ＭＴＨＦ：５−メチルテトラヒドロ葉酸、ＡＣＴＰ：リン酸アセチル、ＣＦｅＳｐ：コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ＦＯＲ：ホルメート、ＭｅＯＨ：メタノール、ＭＥＴＨＦ：メチルテトラヒドロ葉酸、ＭＬＴＨＦ：メテニルテトラヒドロ葉酸、ＴＨＦ：テトラヒドロ葉酸．
図５は、炭化水素（例えば、グルコース、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を含むガス、ならびに、メタノール）の、アセチルＣｏＡへの変換、さらには、１，３−ブタンジオールへの変換のための生合成代謝経路を示す。生成宿主へ操作された特定の酵素的変換反応が番号付けされ、図中に示される。略記；１０ＦＴＨＦ：１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸、５ＭＴＨＦ：５−メチルテトラヒドロ葉酸、ＡＣＴＰ：リン酸アセチル、ＣＦｅＳｐ：コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ＦＯＲ：ホルメート、ＭｅＯＨ：メタノール、ＭＥＴＨＦ：メチルテトラヒドロ葉酸、ＭＬＴＨＦ：メテニルテトラヒドロ葉酸、ＴＨＦ：テトラヒドロ葉酸．
図６は、サイズ標準（ライン５）およびＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＣＯＤＨ（Ｍｏｔｈ＿１２０２／１２０３）タンパク質コントロールまたはＭｔｒ（Ｍｏｔｈ＿１１９７）タンパク質コントロール（５０，１５０，２５０，３５０，４５０，５００，７５０，９００および１０００ｎｇ）と共に、１０マイクログラムのＡＣＳ９０（ライン１）、ＡＣＳ９１（ライン２）、Ｍｔａ９８／９９（ライン３および４）の細胞抽出物のウエスタンブロットを示している．
図７は、メチルビオロゲンアッセイに用いたキュベットを示している。ブランクが右側であり、還元されたメチルビオロゲンを有するキュベットが左側である。注釈；各頂点にストッパーおよび真空潤滑油を用いて反応嫌気性状態を維持した．
図８は、添加したＣＨ３−ＴＨＦから精製したＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  コリノイドタンパク質へＣＨ３を移すためのアッセイを行ったＡＣＳ９０セル抽出物のスペクトル像を示す．
図９は、リコンビナントＥ．  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５、空ベクター、ＡＣＳ９０およびＡＣＳ９１の、Ｎ２およびＣＯ中、３７℃で３６時間の嫌気性増殖を、左から右へ示す．
図１０は、１，３−ブタンジオール生合成経路と組み合わせてＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路酵素を用いることにより、グルコースに対して１．０９モル／モルの生成率で１，３−ブタンジオールを製造し得る例示的な流れ分布（ｆｌｕｘ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を示している．
図１１は、基質としてメタノールを同時に利用することを可能にする酵素を用いることによって、グルコースに対して１．２モル／モルの生成率で１，３−ブタンジオールを製造できる例示的な流れ分布を示している。
【００１４】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、１，３−ブタンジオールを製造するための炭化水素、メタノール、合成ガスおよび／またはその他ガス状炭素源を利用することができる微生物を開発および利用することにある。さらに、本発明は、合成ガス利用微生物の生成物の範囲を拡大すること、および、合成ガスを利用することができる遺伝子組換え生物を発生させて１，３−ブタンジオールを製造すること、ならびに、生成物、滴定量および生産性の最適化をすることに関する。成長のための基質および化学生成物のための基質として合成ガスを効果的に利用する組換え生物（例えば、商業スケールに拡大するために有用なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはその他の生物）を開発することは、再生可能な化学物質および燃料製造のための費用利点のあるプロセスを提供する。生物を最適化し、そして、すぐに試験し、合理的なコストとする。
【００１５】
原料としての合成ガスの可能性は、目的の化学物質および燃料に効率的に且つ費用効果的へ変換する能力にある。合成ガス変換の２つの主な技術は、フィッシャートロプシュプロセスおよび発酵プロセスである。フィッシャートロプシュ（Ｆ−Ｔ）技術は、第二次世界大戦時から開発されてきており、メタノールまたは燃料としての混合炭化水素を効率的に製造することができる無機触媒および金属ベースの触媒を必要とする。Ｆ−Ｔプロセスの欠点は、１）生成物の選択性の欠如（結果として目的の生成物の分離が困難である）；２）触媒過敏症の毒性；３）高温および高圧のために必要な高いエネルギーコスト；および４）商業的競争コストでの利用できる生成物の範囲の制限である。
【００１６】
発酵プロセスに関して、合成ガスは、この材料をエタノール、酢酸（ａｃｅｔａｔｅ）および水素のような生成物へ変換することができる多くの嫌気性微生物のための炭素源およびエネルギー源としての役割を果たしている。合成ガスの発酵変換の主な利点は、単一生成物の製造のための生物の選択性、ガス不純物のより大きな耐性、より低い作動温度およびより低い作動圧、および、合成ガスからの生成物の大きな地位(portfolio)の可能性である。発酵処理の主な欠点は、合成ガスを変換するための既知の生物が、エタノールおよび酢酸のような、限られた範囲の化学物質のみを発生する傾向があり、他の化学物質を効率的に産生せず、生物は遺伝子操作により設置された手段が不足し、および、生物は、高濃度で生成を終結させるほど敏感であるということである。
【００１７】
本発明は、合成ガスまたは他のガス状炭素源から１，３−ブタンジオールを製造するのに効率がよい微生物の発生に関する。本発明に係る生物および方法は、コストの面で、従来の石油を主成分とする生成物およびグルコース、スクロースおよびリグノセルロース糖から直接誘導される生成物の両方で非常に有利に、１，３−ブタンジオールを製造することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、合成ガスまたはその他のガス状炭素源を利用可能な非天然の微生物を提供し、１，３−ブタンジオールを製造する方法を提供する。ここで、親微生物は、図４および図５から判るように、合成ガスを利用し、望まれる生成物を生成する自然能力が不足している。上記の微生物において、１つ以上のタンパク質または酵素は、微生物内で発現し、それにより、合成ガスまたはその他のガス状炭素源を利用し、望ましい生成物を生成する経路を与える。他の実施形態において、本発明は、例えば、１，３−ブタンジオールを産生する能率を向上させる、１つ以上の外因性のタンパク質または酵素を発現することにより、遺伝子改変された非天然の微生物を提供する。ここで、親微生物は、糖または他のガス状炭素源を利用し、合成ガスを利用し、望まれる生成物を生成する自然能力を有している。従って、本発明は、合成ガスを利用することができる新しい代謝経路を伴う微生物を発生させる方法、および、合成ガスまたはその他のガス状炭素源を利用して１，３−ブタンジオールを精製する改良された効率性を伴う微生物を発生させる方法に関する。
【００１８】
本発明はさらに、ＭｔａＡＢＣ−タイプのメチルトランスフェラーゼ系と結合したＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のカルボニル分枝に関する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然の微生物を提供する。上記の生物は、メタノール、合成ガスおよびＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２からなるガスからアセチルＣｏＡ細胞塊へ誘導することができる比較的安価な有機原料、ならびに、生成物を変換することができる。さらに、本発明は、アセチルＣｏＡの中へ、体外供給された、または、内因性に得られたメタノールまたは二酸化炭素に存在する炭素を固定するための十分なメカニズムを供給することにより、１モル １，３−ブタンジオール／１モル グルコースである自然で期待される量を超えて、炭化水素原料に対する１，３−ブタンジオールの生成率の増加を達成することができる経路を提供する。
【００１９】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは、匹敵するものが無い遺伝子ツール一式を有する産業的に大きく貢献する生物である。ＣＯ２、ＣＯおよび／またはＨ２をアセチルＣｏＡへ変換し、全ての細胞塊組成物および多くの有用な生成物が誘導され得る主な代謝物を、Ｅ．ｃｏｌｉのような異質な宿主へ変換する能力を操ることは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の種々のタンパク質をコードする外因性遺伝子の続く発現を達成し得る。上記の経路は、１９４２年に単離されてからＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を解析するためのモデル生物であるＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（かつてはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）のような酢酸生産性生物で高い活性作用を有する（Fontaine et al., J Bacteriol. 43:701-715 (1942)）。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は一つの分枝からなる（ＣＯ２をメチルテトラヒドロフルオレート（Ｍｅ−ＴＨＦ）へ変換することができる東（Ｅａｓｔｅｒｎ）分枝（すなわちメチル分枝）、および、メチル−ＴＨＦ、ＣＯおよび補酵素ＡをアセチルＣｏＡへ変換することができる西（Ｗｅｓｔｅｒｎ）分枝（すなわちカルボニル分枝））（図１および図２を参照）。本明細書に開示されているように、本発明は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の両分枝を触媒する遺伝子、および、１，３−ブタンジオールを生成するための遺伝子、を発現する非天然の微生物を提供する。上記の生物は、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２からなるガスをアセチルＣｏＡ、１，３−ブタンジオール、細胞塊および生成物へ変換することができる。また、上記の生物は、化学両論的に最適な生成率で炭化水素から１，３−ブタンジオールを生成することができる。例えば、アセチルＣｏＡの一部を１，３−ブタンジオール経路に結合し、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ酵素は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路酵素が無い場合に達成できる１モル １，３−ブタンジオール／１モル グルコースとは対照的に、グルコース１１モル毎に１，３−ブタンジオール１２モルを生成する手段を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、１，３−ブタンジオールを生成するための遺伝子に加えて、ＭｔａＡＢＣ−タイプのメチルトランスフェラーゼ系と組み合わせてＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のカルボニル分枝を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然の微生物を提供する。上記の生物は、メタノール（合成ガスおよびＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２からなるガスに由来する比較的安価な有機材料）を、アセチルＣｏＡ、１，３−ブタンジオール、細胞塊および生成物へ変換することができる。ガス状基質に加えて、生物は、高い収率で、１，３−ブタンジオールを生成するために、限定的にメタノールを利用することができ、または、グルコースのような炭化水素原料と共にメタノールを利用することができる。
【００２１】
合成ガス（syngas）またはプロデューサガスとしても知られている合成ガス（synthesis gas）は、石炭のガス化、ならびに、農作物および農業廃棄物を含むバイオマス材料のような炭素材料のガス化の主な生成物である。合成ガスは、主に、Ｈ２およびＣＯの混合物であり、制限するわけではないが、石炭、石油、天然ガス、バイオマスおよび廃棄有機物質を含む任意の有機材料のガス化により得ることができる。ガス化は、一般的に、酸素に対する高い燃料比下で実行される。また、大部分がＨ２およびＣＯであるものの、合成ガスは、微量のＣＯ２およびその他のガスを含み得る。従って、合成ガスは、ＣＯ（さらにはＣＯ２）のようなガス状炭素の費用効率的な資源を提供する。
【００２２】
本明細書中に開示されるように、ガス状の炭素源（例えばＣＯおよび／またはＣＯ２を含む合成ガス）は、本発明の非天然の微生物を使用して１，３−ブタンジオールを生成する。本明細書中にて合成ガスとして一般的に例証されているが、ＣＯおよび／またはＣＯ２を含むガス状の任意の炭素源が、本発明の非天然に存在する微生物によって利用され得ることが理解される。したがって、本発明は、ＣＯおよび／またはＣＯ２を炭素源として利用し得る非天然の微生物に関する。
【００２３】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、ＣＯおよびＨ２をアセチルＣｏＡおよび酢酸のようなその他の生成物への変換を触媒する。また、ＣＯおよび合成ガスを利用することができる生物は、一般的に、同一の基本的な酵素一式、および、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路に含まれる変換を通じて、ＣＯ２およびＣＯ２／Ｈ２混合物も利用することができる。微生物によるＣＯ２の酢酸へのＨ２依存変換は、ＣＯが同一の生物により利用されること、および、同一経路を必要とすることが示されるかなり前に認められた。多くのアセトゲンは、必要な還元等量を供給するために水素が存在する限り、ＣＯ２存在下で成長し、酢酸のような化合物を生成することを示す（例えば、Drake, Acetogenesis, pp. 3-60 Chapman and Hall, New York, (1994)を参照）。このことは、以下の式によりまとめることができる：
２ＣＯ２＋４Ｈ２＋ｎＡＤＰ＋ｎＰｉ → ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２Ｈ２Ｏ＋ｎＡＴＰ
従って、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を有する非天然の微生物は、アセチルＣｏＡおよび１，３−ブタンジオールのような他の望ましい生成物を生成するために、ＣＯ２およびＨ２の混合物を利用し得る。
【００２４】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、当業者によりよく知られたものであり、２つの分枝に分けることができる１２の反応からなる（（１）メチル分枝および（２）カルボニル分枝）。カルボニル分枝が、メチル−ＴＨＦをアセチルＣｏＡへ変換するのに対して、メチル分枝は、合成ガスをメチルテトラヒドロフルオレート（メチル−ＴＨＦ）へ変換する。メチル分枝における反応は、以下の酵素またはタンパク質により適切に触媒する；フェレドキシン酸化レダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸環化デヒドロゲナーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、および、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ。カルボニル分枝における反応は、以下の酵素またはタンパク質により適切に触媒する；メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（例えばＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（例えばＡｃｓＦ）、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンセターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、および、ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（例えばＣｏｏＣ）。アセチルＣｏＡ経路の発生をコードする十分な量の核酸を導入するために指導およびガイダンスを本明細書に示すことにより、少なくとも、宿主生物に存在しないＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ酵素またはタンパク質をコードする核酸を導入することに関して、当業者により同一の技術設計が行われると理解され得る。従って、改変された生物が、分枝のまたは完全なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含むように、本発明の１つ以上のコーディング核酸を微生物に導入することにより、合成ガス利用能力を与え得る。
【００２５】
従って、本発明の非天然の微生物は、１，３−ブタンジオールを得るためにＣＯおよび／またはＣＯ２を与える合成ガスまたは他のガス状炭素源を用いることができる。ＣＯ２の場合、添加源には、制限するわけではないが、アンモニアおよび水素プラントにおける副生成物としてのＣＯ２の生成（メタンをＣＯ２へ変換する）；木材や化石燃料の燃焼；ビール、ウイスキーおよびその他のアルコール飲料の醸造、または、その他の発酵プロセスでの糖発酵の副生成物としてのＣＯ２の生成；生石灰ＣａＯの製造における石灰石ＣａＣＯ３の熱分解；リン酸ナトリウム製造における副生成物としてのＣＯ２の生成；および、石灰石またはドロマイトの酸性水の影響により精製する天然の二酸化炭素泉から直接の添加が含まれる。
【００２６】
Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃ．  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、および、Ｃ．  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓのようなアセトゲンは、ヘキ供給源糖から一酸化炭素までの範囲の多くの炭素源となり得る。グルコースのようなヘキ供給源は、まず、Ｅｍｂｄｅｎ−Ｍｅｙｅｒｈｏｆ−Ｐａｒｎａｓ（ＥＭＰ）解糖系経由でピルビン酸に代謝され、次に、ピルビン酸経由でアセチルＣｏＡへ変換される（フェレドキシン酸化レダクターゼ（ＰＦＯＲ））。アセチルＣｏＡは、バイオマス前駆体を形成するために用いられ、アセテートキナーゼおよびリン酸トランスアセチラーゼ経由でエネルギーを産生する酢酸へ変換され得る。グルコースの酢酸、エネルギーおよび還元する等価物への全ての変換は、以下の式で表される：
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋４ＡＤＰ＋４Ｐｉ → ２ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２ＣＯ２＋４ＡＴＰ＋８［Ｈ］
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を介してＣＯ２を酢酸に更へ変換することにより酸化還元平衡を維持する一方で、アセトゲンは、酢酸変換のためにグルコースから更なるエネルギーを抽出する：
２ＣＯ２＋８［Ｈ］＋ｎＡＤＰ＋ｎＰｉ → ＣＨ３ＣＯＯＨ＋ｎＡＴＰ
上記の式の係数ｎは、水素が必要な還元する等価物を供給するために存在する限り、グルコースが存在しない場合でさえ、多くのアセトゲンが、ＣＯ２存在下でＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を介して、成長できるように、上記の変換がエネルギー産生をしようとすることを示している。
【００２７】
２ＣＯ２＋４Ｈ２＋ｎＡＤＰ＋ｎＰｉ → ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２Ｈ２Ｏ＋ｎＡＴＰ
図１に示されたＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、Ｎａ＋依存ＡＴＰシンセターゼまたはＨ＋依存ＡＴＰシンセターゼ（それぞれ酢酸生産性細菌におけるＭｕｌｌｅｒ  Ｖ．  Ｅｎｅｒｇｙ保護）を介してＡＴＰを発生することができるＮａ＋イオン勾配またはＨ＋イオン勾配を得るために対になっている（Appl Environ Microbiol 69:6345-6353 (2003)）。既知の変換に基づき、アセトゲンは、単一炭素およびエネルギー源としてＣＯを用いることができる。特に、ＣＯを酸化し還元する等価物およびＣＯ２を生成することができ、または、ＣＯを直接、アセチルＣｏＡに吸収させることができ、その後、バイオマスまたは酢酸の何れか一方へ変換する。
【００２８】
４ＣＯ＋２Ｈ２Ｏ → ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２ＣＯ２
しかしながら、十分な水素が存在し還元する等価物のための必要条件を満たす場合、なお一層高い酢酸の収率に達する。
【００２９】
２ＣＯ＋２Ｈ２ → ＣＨ３ＣＯＯＨ
図１に続いて起こる、アセチルＣｏＡからのエタノールの生成では１ＡＴＰ分子が発生せず２還元する等価物を必要とする。一方で、アセチルＣｏＡを介する酢酸の生成により１ＡＴＰ分子が発生する。従って、合成ガスからのエタノール生成は、酢酸生成物が存在しない条件において、細胞が成長するために十分なエネルギーを発生しない。しかしながら、特定の条件下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは、合成ガスから主にエタノールを生成し（Klasson et al., Fuel 72.12:1673-1678 (1993)）、このことは、細胞成長を支える十分なエネルギーを実際に発生することを示唆している。
【００３０】
２ＣＯ２＋６Ｈ２ → ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋３Ｈ２Ｏ
６ＣＯ＋３Ｈ２Ｏ → ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋４ＣＯ２
２ＣＯ＋４Ｈ２ → ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋Ｈ２Ｏ
また、R. rubrumのような水素生産性細菌は、ＣＯおよび水の水素への変換によりエネルギーを発生することができる（図１を参照）（Simpma et al., Critical Reviews in Biotechnology, 26.1:41-65 (2006)）。主なメカニズムは、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（ＥＣＨ）およびＣＯデヒドロゲナーゼの協調作用である。ＣＯデヒドロゲナーゼは、ＣＯから、ＥＣＨによりプロトンからＨ２に還元するために用いられる電子を供給し、その活性は、エネルギー発生するプロトン転移と合わされる。最終的な結果としては、水−ガス変換反応を介してエネルギーを発生する。
【００３１】
本明細書に開示されている、合成ガスを介する１，３−ＢＤＯの生合成生成のためのプロセスには、再生可能原料を利用し、エネルギー強度を減らし、且つ、より低い温室効果ガスを放出する持続可能な製造実施が含まれる。さらに、バイオベースの１，３−ＢＤＯの脱水素反応は、燃焼可能な反応性化学物質の輸送が必要ではない小規模最終利用設備におけるブタジエンへの再生可能なルートに相当する。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、用語「非天然」は、本発明の微生物（microbial organism）または微生物（microorganism）を参照して用いられている場合、その微生物が、参照種の野生型系統（strain）を含む参照種の天然の系統に正常には見出されない、少なくとも一つの遺伝的改変を有しているということを意味することが意図される。遺伝的改変には、例えば、発現可能な核酸を導入する変異、他の核酸の付加、核酸の欠失および／または微生物の遺伝物質の、他の機能的破壊が含まれる。上記の変異には、例えば、基準種に関する異種ポリペプチド、同種ポリペプチドまたは異種および同種ポリペプチドのためのコーディング領域および機能性フラグメントが含まれる。付加変位には、例えば、変異が遺伝子またはオペロンの発現を変更する非コーディング調節領域が含まれる。典型的な代謝ポリペプチドには、１，３−ブタンジオール生合成経路における酵素またはタンパク質が含まれる。
【００３３】
代謝性改変は、天然に存在する状態から変更される生化学的な反応をいう。したがって、非天然の微生物は、代謝性ポリペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする核酸に対して遺伝的な改変を有している。典型的な代謝性改変は、本明細書に開示されている。
【００３４】
本明細書に用いられているような「単離された」という用語は、微生物を参照してに用いられる場合、天然に見出される参照微生物としての少なくとも一つの成分が実質的にない生物を意味することが意図される。上記の用語は、その天然の環境にて見出されるような成分の一部または全てから回収された微生物を含む。また、上記の用語は、その微生物が非天然の環境にて見出される場合に、他の物質から部分的または完全に分離されている微生物を含む。したがって、単離された微生物は、天然にて見出される場合または増殖している場合、他の物質から部分的にまたは完全に分離されている。単離された微生物の特定の例は、非天然の、部分的に精製された微生物、実質的に精製された微生物、および媒体中にて培養されている微生物を含む。
【００３５】
本明細書で用いられている「微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）」、「微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）」および「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、始原細菌、細菌または真核生物のドメイン内に含まれる微小細胞として存在する任意の生物を意味することが意図される。したがって、上記の用語は、原核生物細胞若しくは真核生物細胞、または微小サイズを有する原核生物若しくは真核生物を含むことが意図されており、酵母および真菌のような真核生物微生物と同様に、全ての種の細菌、始原細菌および真正細菌を含む。また、上記の用語は、バイオケミカルを生成するために培養され得る任意の種の細胞培養を含む。
【００３６】
本明細書で用いられている「ＣｏＡ」または「補酵素Ａ」という用語は、活性酵素系を形成するための多くの酵素（アポ酵素）の活性のために存在することが必要である有機因子または補助群（酵素の非タンパク質部位）の意味を意図している。特定の凝縮酵素においての補酵素Ａの機能は、アセチル基転移またはその他のアシル基転移における活性、ならびに、脂肪酸合成および酸化、ピルビン酸酸化における活性、ならびに、その他のアセチル化における活性である。
【００３７】
本明細書で用いられている「実質的嫌気性」という用語は、培養条件または成長条件に関して用いられている場合、酸素の量は、液体媒体での溶解酸素として飽和状態に対して約１０％未満である。また、上記の用語は、約１％未満の酸素雰囲気で維持される液体媒体または固体媒体の密閉室（ｃｈａｍｂｅｒｓ）を含むことも意図している。
【００３８】
本明細書で用いられているような「外因性」という用語は、参照分子または参照活性が宿主微生物に導入されることを意味することが意図される。分子が、例えば、宿主染色体、または、プラスミドのような非染色体遺伝物質への組込みによって、コーディング核酸が宿主遺伝物質へ導入されることによって、導入され得る。したがって、コーディング核酸の発現を参照して用いられる場合、この用語は、微生物へ発現可能な形態へのそのコーディング核酸の導入をいう。生合成活性に関して用いられる場合、上記の用語は、宿主参照生物へ導入された活性をいう。その供給源は、例えば、宿主微生物への導入に続いて参照活性を発現する、同種または異種のコーディング核酸であり得る。したがって、「内因性」という用語は、宿主中に存在する参照分子または参照活性をいう。同様に、上記の用語は、コーディング核酸の発現を参照して用いられる場合、微生物内に含まれるコーディング核酸の発現をいう。「同種」という用語は、宿主微生物に由来する分子または活性をいう一方、「異種」という用語は、参照種以外の供給源に由来する分子または活性をいう。したがって、本発明のコーディング核酸の外因性の発現は、異種のコーディング核酸または同種のコーディング核酸のどちらか一方または両方を活用できる。
【００３９】
一つ以上の外因性核酸が微生物に含まれている場合、一つ以上の外因性核酸が、上述されているように基準のコーディング核酸または生合成活性について言及しているということが理解される。さらに、本明細書で述べられているように、上記の一つ以上の外因性核酸を、分離核酸分子の、ポリシストロン性の核酸分子の、または、それらの組み合わせの宿主微生物に導入することができるということが理解される。例えば、本明細書で開示されているように、微生物を、望まれる経路の酵素またはタンパク質をコードする２つまたはそれ以上の外因性核酸を発現するために処理することができる。望まれる活性をコードする２つの外因性核酸を宿主微生物に導入する場合には、２つの外因性核酸を、単一部位または多部位で宿主染色体と一体化し、さらに２つの外因性核酸として見なされる、例えば、単一プラスミド上の、分離プラスミド上の単一核酸として導入することができる。同様に、２つ以上の外因性核酸（例えば３つの外因性核酸）を、単一部位または複数部位で宿主染色体に組み込まれ、さらに２つの外因性核酸として見なされる、例えば、単一プラスミド上の、分離プラスミド上の、何れかの望まれる組合せで宿主生物に導入することができるということが理解される。従って、多くの基準の外因性核酸または生合成活性は、多くのコーディング核酸または多くの生合成活性について言及しており、宿主生物に導入された多くの分離核酸を言及していない。
【００４０】
本発明の非天然の微生物は、安定した遺伝的改変を含み、組換え損失なしで５世代以上の間、培養することができる微生物について言及している。一般的に、安定した遺伝的改変には、１０世代以上持続する変異が含まれ、好ましくは、安定な変異が約２５世代以上持続し、より好ましくは、安定な遺伝子変異が５０世代以上（無制限を含む）である。
【００４１】
本明細書で例示されている代謝性改変を含む遺伝的改変は、望まれる代謝経路のための遺伝子のような望まれる遺伝物質のための、Ｅ．ｃｏｌｉのような適切な宿主生物、および、それに相当する代謝反応、または、適切な供給源生物に関して示されていることが当業者に理解される。しかしながら、広く種々の生物の完全なゲノム配列、および、ゲノム分野の高い技術レベルを前提として、当業者は、不可欠な全ての他の生物についての本発明で示された指導およびガイダンスを活用することができ得る。例えば、本明細書で例示されたＥ．ｃｏｌｉ代謝組換えは、基準の種以外の種からコードする同一または類似の核酸を組み込むことにより、すぐに他の種に活用することができる。上記の遺伝的改変には、例えば、概して、種の相同染色体の遺伝的改変、および、特に、オルソログ、パラログまたは非オルソロガス遺伝子変異を含む。
【００４２】
オルソログは、遺伝子、または、垂直血統（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｄｅｓｃｅｎｔ）に関する遺伝子であり、異なる生物で同類または同一の物質的機能の原因となる。例えば、マウスエポキシドヒドロラーゼ、および、ヒトエポキシドヒドロラーゼは、エポキサイドの加水分解の、生物学的機能のために考慮したオルソログである。遺伝子は、例えばそれらが同一であると表すために十分な量の同様な配列を共有する場合、垂直血統に関し、または、共通祖先からの進化に関する。また、遺伝子は、必然的な配列の類似点ではなく、共通の祖先から一次配列の類似点が特定できないという範囲に進化したことを表すために十分な量の三次元構造を共有する場合、考慮したオルソログである。オルソログである遺伝子は、約２５％〜１００％の、アミノ酸配列単位の配列の類似点を備えるタンパク質をコードすることができる。２５％未満のアミノ酸類似点を共有するタンパク質をコードする遺伝子は、その三次元構造が類似点を示す場合、垂直血統により生じると見なすこともできる。プラスミノゲンアクティベータおよびエラスターゼを含む酵素のセリンプロテアーゼは、共通の祖先から垂直血統により生じたと見なすことができる。
【００４３】
オルソログは、例えば、進化を通じて、構造および全体的活性の枝分かれした遺伝子またはコーディング遺伝子生成物を含んでいる。例えば、ある種が２つの機能を示す遺伝子生成物をコードしている場合、および、上記の機能が第２の種で明確な遺伝子に分離した場合、３つの遺伝子およびそれらに対応する生成物は、オルソログであると見なされる。バイオケミカル生成物の生成に関して、当業者は、導入されたまたは破壊された代謝活性を有するオーソロガス遺伝子が、非天然の微生物の構成に関して選ばれるということを理解し得る。分離可能な活性を示すオルソログの例は、明確な活性が、２つまたはそれ以上の種で、または、単一種で、明確な遺伝子生成物に分離される場合である。好ましい例は、エラスターゼタンパク質加水分解、および、プラスミノーゲンタンパク質加水分解（２つのタイプのセリンプロテアーゼ活性）のプラスミノーゲン活性剤およびエラスターゼとしての明確な分子への分離である。第二の例は、マイコプラズマ ５’−３’エクソヌクレアーゼおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性剤の分離である。第１の種からのＤＮＡポリメラーゼは、第２の種から、エクソヌクレアーゼまたはポリメラーゼのどちらか一方または両方へ、および、その逆のオルソログと見なすことができる。
【００４４】
その一方、パラログは、例えば、同一点または共通点（同一機能群）を有する進化分枝により続く重複により関連付けられるホモログである。パラログは、例えば、同種または異種を起源、または、同種または異種に由来し得る。例えば、ミクロソームエポキシドヒドラーゼ（エポキシドヒドラーゼＩ）、および、溶解性エポキシドヒドラーゼ（エポキシドヒドラーゼＩＩ）は、異なる反応を触媒し、且つ、同種で明確な機能を有する、共通の祖先から共進化した２つの明確な酵素が表れるため、パラログであると見なすことができる。パラログは、お互いに同種であると示される同様な主要配列を備える同種からの、または、共通の祖先から共進化を通じた関係である同種からの、タンパク質である。パラログタンパク質類の一群には、ＨｉｐＡホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチダーゼおよびその他が含まれる。
【００４５】
非オルソロガス遺伝子の置換は、異種における基準の遺伝子機能の代わりになり得る、ある種からの非オルソロガス遺伝子である。代わりになるものとしては、例えば、異種における基準機能と比較して、起源の種にて実質的に同一または同類の機能を行うことができるものが含まれる。一般的に、非オルソロガス遺伝子の置換は、基準機能をコードする既知の遺伝子に構造上に関連付けられるように識別可能であり、それほど構造上に関連ないが、機能的に同様な遺伝子およびそれに関する遺伝子生成物に構造上に関連付けられるように識別可能であり、それでもなお、本明細書の用語の意味が含まれ得る。機能的類似点は、例えば、置換するために求められる機能をコードするための遺伝子と比較して、非オルソロガス遺伝子の生成物の活性部位または結合領域にて、少なくとも一部の構造的類似点が必要である。したがって、非オルソロガス遺伝子には、例えば、パラログ、または、親族以外の遺伝子が含まれる。
【００４６】
１，３−ブタンジオール生合成の機能を有する本発明に係る非天然の微生物を同定および構成する場合、当業者は、代謝改質の同定には、同定および含有物またはオルソログの不活性化を含めることができるという特定の形態を、本明細書に示された指導およびガイダンスを用いることにより理解し得る。パラログおよび／または非オルソロガス遺伝子置換が、同様な代謝反応または物質的に同様な代謝反応を触媒する酵素をコードする基準の微生物に存在している範囲で、当業者は、進化に関する遺伝子を利用することもできる。
【００４７】
オルソログ、パラログおよび非オルソロガス遺伝子置換は、当業者により知られた方法により決定され得る。例えば、核酸または２つのポリペプチドに関するアミノ酸配列の検査により、比較される配列間で、配列の同一性および類似性が現れ得る。上記の類似性に基づき、当業者は、類似性が、共通の祖先からの進化を通じて関係するタンパク質を示すのに十分高い場合、決定することができる。Ａｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗおよびその他のような当業者によりよく知られたアルゴリズムは、未処理の配列の類似性または同一性を比較および決定し、また、重さまたはスコアを割り当てることができる配列での、ギャップの存在および重要性も決定する。また、上記のアルゴリズムは当業者により知られており、ヌクレオチド配列の類似性または同一性の決定のために同様に利用できる。関連あることを決定するための十分な類似性に関するパラメータは、統計的類似性を計算するための既知の方法、または、ランダムポリペプチドにおける類似の対応を見出す確率、および、決定された対応の重要性に基づきコンピュータ計算される。２つまたはそれ以上の配列のコンピュータ比較も、必要であれば、当業者により視覚的に最適化することもできる。関連する遺伝子生成物またはタンパク質は、高い類似性を期待することができる（例えば２５％〜１００％の配列の同一性）。関連しないタンパク質は、十分なサイズのデータベースをスキャンした場合（約５％）、偶然起こることが期待されるのと同じ程度で基本的な同一性を有している。５％〜２４％の間の配列は、比較される配列が関連していると決定するために十分な相同性を示してもよいし、示さなくてもよい。データセットのサイズを与える上記の対応の重要性を決定するためのさらなる統計分析は、上記の配列の妥当性を決定するために実行され得る。
【００４８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いた２つまたはそれ以上の配列の関連性を決定するための典型的なパラメータは、例えば、以下で説明するようなものである。簡潔に、アミノ酸配列配置は、BLASTP version 2.0.8.(Jan-05-1999)および以下のパラメータ（Matrix: 0 BLOSUM62; gap open: 11; gap extension: 1; x_dropoff: 50; expect: 10.0; wordsize: 3; filter: on）を用いて評価することができる。核酸配列配置は、BLASTN version 2.0.6 (Sept-16-1998) および以下のパラメータ（Match: 1; mismatch: -2; gap open: 5; gap extension: 2; x_dropoff: 50; expect: 10.0; wordsize: 11; filter: off）を用いて評価することができる。本技術分野の当業者であれば、改質により、比較の厳しさを増加させるまたは減少させる上記パラメータにて作られるものを判ることができ、２つまたはそれ以上の配列の関連性を決定する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本発明は、１，３−ＢＤＯを産生するのに十分な量を発現する１，３−ＢＤＯ経路酵素またはタンパク質をコードする少なくとも一つの外因性核酸を含む、１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）経路を有する非天然の微生物を提供する。１，３−ＢＤＯ経路は、メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンセターゼ、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンセターゼ、または、アセトアセテートレダクターゼが含まれる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、１，３−ＢＤＯ経路酵素は、Ａ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１３）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、および１４）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；Ｂ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１３）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、および、１４）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；Ｃ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、１３）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、および、１４）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；Ｄ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、および、１３）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；Ｅ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、および、１３）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；Ｆ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、またはシンセターゼ、１３）アセトアセテートレダクターゼ、１４）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、および、１５）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；Ｇ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、またはシンセターゼ、１３）アセトアセテートレダクターゼ、１４）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、および、１５）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；Ｈ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、１３）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、またはシンセターゼ、１４）３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、および、１５）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；Ｉ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、またはシンセターゼ、１３）３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、１４）３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、および、１５）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼから選ばれる酵素のセットである。
【００５１】
非天然の微生物は、いくつかの実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする２個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする３個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする４個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする５個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする６個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする７個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする８個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする９個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする１０個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする１１個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする１２個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする１３個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする１４個の外因性核酸を含み、さらに他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする１５個の外因性核酸を含む。少なくとも一つの外因性核酸の一部は異種の核酸であり、且つ、非天然の微生物は、実質的嫌気性の培養媒体にて培養するために構成され得る。上記の微生物としては、１）メタノールおよびＣＯ、２）メタノール、ＣＯ２およびＨ２、３）メタノール、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）メタノール、ならびにＣＯおよびＨ２からなる合成ガス、５）メタノール、ならびにＣＯ、ＣＯ２およびＨ２からなる合成ガス、６）１つ以上の炭化水素、７）メタノールおよび１つ以上の炭化水素、ならびに８）メタノールから選ばれる炭素原料を用いることができる。典型的な炭化水素には、限定するわけではないが、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、および、グリセロールが含まれる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本発明は、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸環化ヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ、アセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンセターゼ、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡヒドロゲナーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンセターゼ、または、アセトアセテートレダクターゼからなる上述の１，３−ＢＤＯ経路で１，３−ＢＤＯを生成するために十分な量を発現する少なくとも一つの１，３−ＢＤＯ経路酵素またはタンパク質をコードする少なくとも一つの外因性核酸からなる１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）経路を有する微生物からなる非天然の微生物を提供する。
【００５３】
いくつかの実施形態において、１，３−ＢＤＯ経路酵素は、Ａ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸環化ヒドロゲナーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１５）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、および、１６）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；Ｂ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸環化ヒドロゲナーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１５）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、および、１６）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；Ｃ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸環化ヒドロゲナーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、１５）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、および、１６）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；Ｄ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸環化ヒドロゲナーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、および、１５）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；Ｅ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸環化ヒドロゲナーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、および、１５）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；Ｆ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸環化ヒドロゲナーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロゲナーゼまたはシンセターゼ、１５）アセトアセテートレダクターゼ、１６）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、および、１７）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；Ｇ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸環化ヒドロゲナーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロゲナーゼまたはシンセターゼ、１５）アセトアセテートレダクターゼ、１６）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、および、１７）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；Ｈ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸環化ヒドロゲナーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、１５）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロゲナーゼまたはシンセターゼ、１６）ヒドロキシブチレートレダクターゼ、および、１７）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；Ｉ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸環化ヒドロゲナーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロゲナーゼまたはシンセターゼ、１５）３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、１６）３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、および、１７）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼから選ばれる酵素のセットである。
【００５４】
非天然の微生物は、いくつかの実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする２個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする３個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする４個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする５個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする６個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする７個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする８個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする９個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする１０個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする１１個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする１２個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする１３個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする１４個の外因性核酸を含み、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする１５個の外因性核酸を含み、他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする１６個の外因性核酸を含み、さらに他の実施形態では、各々１，３−ＢＤＯ経路酵素をコードする１７個の外因性核酸を含む。少なくとも一つの外因性核酸の一部は異種の核酸であり、且つ、非天然の微生物は、実質的嫌気性の培養媒体にて培養するために構成され得る。上記の微生物としては、１）ＣＯ、２）ＣＯ２およびＨ２、３）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）ＣＯおよびＨ２からなる合成ガス、５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２からなる合成ガス、６）１つ以上の炭化水素から選ばれる炭素原料を用いることができる。典型的な炭化水素には、限定するわけではないが、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、および、グリセロールが含まれる。
【００５５】
さらなる実施形態において、本発明は、１，３−ブタンジオール経路を有する非天然の微生物を提供する。ここで、非天然の微生物は、二酸化炭素からＦＯＲに、ＦＯＲから１０ＦＴＨＦに、１０ＦＴＨＦからＭＥＴＨＦに、ＭＥＴＨＦからＭＬＴＨＦに、ＭＬＴＨＦから５ＭＴＨＦに、メタノールからＣＨ３−ＭｔａＣに、ＣＨ３−ＭｔａＣから５ＭＴＨＦに、５ＭＴＨＦからＣＦｅＳｐ−ＣＨ３に、ＣＦｅＳｐ−ＣＨ３からアセチルＣｏＡに、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡに、アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチルアルデヒドに、３−ヒドロキシブチルアルデヒドから１，３−ＢＤＯに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡから１，３−ＢＤＯに、アセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンに、アセトアセチルＣｏＡから３−オキソブチルアルデヒド(3-oxobutryaldehyde)に、３−オキソブチルアルデヒドから４−ヒドロキシ−２−ブタノンに、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから１，３−ＢＤＯに、３−オキソブチルアルデヒドから３−ヒドロキシブチルアルデヒドに、アセトアセチルＣｏＡからアセトアセテートに、アセトアセテートから３−オキソブチルアルデヒドに、アセトアセテートから３−ヒドロキシブチレートに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチレートに、および、３−ヒドロキシブチレートから３−ヒドロキシブチルアルデヒドに、変換する酵素またはタンパク質から選ばれる、基質から生成物へ変換する酵素またはタンパク質をコードする少なくとも一つの外因性核酸からなる。当業者であれば、これらが単なる典型例であり、基質から生成物への変換は本技術分野の当業者によりすぐに決定することができるので、望まれる生成物を生成するのに、且つ、適切な活性のために適切な本明細書に開示された基質−生成物の何れも利用可能ということを理解し得る。従って、本発明は、酵素またはタンパク質をコードする少なくとも一つの外因性核酸を含む非天然の微生物を提供することである。ここで、酵素またはタンパク質は、図４および図５に示すような１，３−ブタンジオール経路の基質および生成物を変換する。
【００５６】
１，３−ブタンジオールの経路を含む微生物として概して本明細書に記載されている一方で、本発明は、さらに、１，３−ブタンジオール経路の中間体を生成する十分な量の、１，３−ブタンジオール経路の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも一つの外因性核酸からなる非天然の微生物を提供するということが理解される。例えば、本明細書で開示されているような、１，３−ブタンジオール経路を図４および図５に例示する。従って、１，３−ブタンジオールを生成する１，３−ブタンジオール経路を含む微生物に加えて、本発明は、さらに、１，３−ブタンジオール経路酵素をコードする少なくとも一つの外因性核酸からなる非天然の微生物を提供し、ここで、微生物は、１，３−ブタンジオール経路中間体（例えば、アセチルＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ、アセトアセテート、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレート、３−オキソブチルアルデヒド、４−ヒドロキシ−２−ブタノンおよび３−ヒドロキシブチルアルデヒド）を生成する。
【００５７】
図４および図５の経路を含む、実施例に示されたおよび図に例示されたような、本明細書に開示された何れの経路も、望ましい何れの経路中間体または経路生成物を生成する、非天然の微生物を発生するために利用することができるということが理解される。本明細書に開示されているように、中間体を生成する上記の微生物は、望ましい生成物を生成するための下流経路酵素を発現する他の微生物との組合せにて、利用することができる。しかしながら、本発明に係る非天然の微生物を、例えば、アセトアセテート、３−ヒドロキシブチレート、３−オキソブチルアルデヒド、３−ヒドロキシブチルアルデヒド、または、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを生成するために利用することができる。従って、これらの中間生成物の何れも、図４および図５で示された経路を利用する分離生物にて生成し得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示された非天然の微生物は、図４で示された３つの機能を有する：１）メタノールおよびＴＨＦから５−メチルテトラヒドロ葉酸（Ｍｅ−ＴＨＦ）を生成することができる機能的メチルトランスフェラーゼ系、２）アセチルＣｏＡを形成するためのＣＯ、補酵素Ａ、および、Ｍｅ−ＴＨＦのメチル基を結合する能力、および、３）アセチルＣｏＡから１，３−ブタンジオールを合成する能力。後者は、炭水化物から解糖を介してピルビン酸の生成により促進され得る。解糖は、全ての生物における細胞の細胞質で見られる嫌気性代謝経路である。上記のプロセスは、正味２モルのＡＴＰを供給する一方で、１モルのグルコースを２モルのピルビン酸へ変換する：
Ｇｌｕｃｏｓｅ＋２ＮＡＤ＋＋２Ｐｉ＋２ＡＤＰ → ２ピルビン酸＋２ＮＡＤＨ＋２ＡＴＰ＋２Ｈ＋＋２Ｈ２Ｏ
上記の非天然の微生物は、アセチルＣｏＡ、細胞塊、および、生成物を合成するために、外因性ＣＯおよび／またはＣＯ２ならびにメタノールから炭素を「固定」することができる。メタノールおよび合成ガスからアセチルＣｏＡを形成する経路の使用は、完全なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を利用するのに比べて、エネルギー的に好まれる。例えば、合成ガスの酢酸への直接的変換は、エネルギー的に中性な工程である（図１および図２を参照）。特に、ＡＴＰ１分子は、ホルミル−ＴＨＦシンセターゼによるホルミル−ＴＨＦの形成中に消費され、ＡＴＰ１分子は、酢酸キナーゼ経由で酢酸の生成の間に生成する。本明細書に開示されている経路は、メチル分枝生成物（メチル−ＴＨＦ）のメチル基はＣＯ２よりむしろメタノールから得られることを保証することにより、ＡＴＰ消費を回避する。このことは、酢酸形成が、細胞成長および細胞維持を支えることを助けることができるという、プラスのＡＴＰ生成率を有するということを保証する。補充反応（例えばＥ．ｃｏｌｉ）の機能も有する上記の能力を用いて処理する宿主生物は、硝酸のような適切な外部電子受容体の存在下でアセチルＣｏＡを生成するメタノールおよび合成ガスにて成長することができる。上記の電子受容体は、コハク酸デヒドロゲナーゼを介して形成する還元キノンから電子を受容するために用いられる。外部電子受容体の更なる利点は、細胞成長、細胞維持および生成物生成のためのさらなるエネルギーが、アセチルＣｏＡの吸収作用から生成することができるということである。一部の実施形態では、他の非天然の微生物は、外部電子受容体が存在しない条件下でバイオマス前駆物質の合成を促進するための、ピルビン酸のアセチルＣｏＡへの変換、または、弱点(vice)から逆の(versa)系統(strain)への変換、を促進するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）またはその他の酵素を有する。上記の非天然の微生物のさらなる特徴は、分子状水素から還元する等価物を抽出するための機能である。これにより、エタノール、ブタノール、イソブタノール、イソプロパノール、１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、４−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、乳酸、アジピン酸、メタクリル酸、および、アクリル酸のような還元生成物の高い収率が可能となる。
【００５９】
本発明で開示されている生物は、１）メタノールおよびＣＯ、２）メタノール、ＣＯ２およびＨ２、３）メタノール、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）メタノールならびにＣＯおよびＨ２からなる合成ガス、５）メタノールならびにＣＯ、ＣＯ２およびＨ２からなる合成ガス、６）１つ以上の炭化水素、７）メタノールおよび１つ以上の炭化水素、ならびに８）メタノールから、アセチルＣｏＡ、細胞塊、および、目的化学物質（より好ましくは、１，３−ＢＤＯ）を生成することができる。典型的な炭化水素には、限定するわけではないが、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、および、グリセロールが含まれる。
【００６０】
生物への経路を上手く処理することには、酵素の適切なセットを特定、それらに対応する遺伝子の生成物宿主へのクローニング、これらの遺伝子の安定性および発現の最適化、発酵の条件の最適化、および、発酵に続く生成物形成のための評価、が含まれる。合成ガスおよびメタノールの、アセチルＣｏＡ、さらには１，３−ブタンジオールへの変換を利用する経路の各ステップを触媒する多くの酵素を以下に示す。合成ガスおよびメタノールの利用のための生成物宿主を処理するために、上記の経路の酵素をコードする１つ以上の外因性ＤＮＡ配列は、微生物で発現し得る。
【００６１】
図４に示されるような、異質な宿主で改質されたＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の発現には、メタノールにより得られる炭素および水素、ならびに、ＣＯおよび／またはＣＯ２により得られる炭素を利用するメチルトランスフェラーゼのセットを導入することが含まれる。３−メチルトランスフェラーゼタンパク質の複合体（ＭｔａＡ、ＭｔａＢおよびＭｔａＣで示される）は、望まれるメタノールメチルトランスフェラーゼ活性を示す（Sauer et al., Eur. J. Biochem. 243.3:670-677 (1997)、Naidu and Ragsdale, J. Bacteriol. 183.11:3276-3281 (2001)、Tallant and Krzycki, J. Biol. Chem. 276.6:4485-4493 (2001)、Tallant and Krzycki, J. Bacteriol. 179.22:6902-6911 (1997)、Tallant and Krzycki, J. Bacteriol. 178.5:1295-1301 (1996)、Ragsdale, S.W., Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 39.3:165-195 (2004)を参照）。
【００６２】
ＭｔａＢは、メタノールからＭｔａＣ（コリノイドタンパク質）へのメチル基の転移を触媒する亜鉛タンパク質である。ＭｔａＢおよびＭｔａＣをコードする典型的な遺伝子は、アセトゲン，Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（Das et al., Proteins 67.1:167-176 (2007)）と同様に、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ（Maeder et al., J. Bacteriol. 188.22:7922-7931 (2006)）およびＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ（Galagan et al., Genome Res.  12/4:532-542 (2002)）のようなメタノゲン古細菌で見出すことができる。一般的に、ＭｔａＢ遺伝子およびＭｔａＣ遺伝子は、活性が強い相互作用を示すとき、染色体上で他方に隣接する。M． ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍ． ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、及び、 Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍにおける遺伝子がコードする種々のＭｔａＢおよびＭｔａＣのタンパク質配列を、以下のＧｅｎＢａｎｋ受入番号により、確認することができる：
【００６３】
【表１】
2013513384.tif 000003
【００６４】
M. barkeriからのＭｔａＢ１遺伝子およびＭｔａＣ１遺伝子（YP_304299およびYP_304298）を、E.coliにクローニングし、配列を決定した（Sauer et al., Eur. J. Biochem. 243.3:670-677 (1997)を参照）。また、上記のメタノール−コバラミンメチルトランスフェラーゼ複合体の結晶構造も利用可能である（Hagemeier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103.50:18917-18922 (2006)を参照）。M. barkeriにおいてＭｔａＢ遺伝子（ＹＰ＿３０７０８２及びＹＰ＿３０４６１２）は、ＹＰ＿３０４２９９に対する配列相同性により確認することができた。ＭｔａＢをコードする遺伝子は、トリメチルアミン、ジメチルアミン、モノメチルアミンまたはジメチルスルフィドのような代替基質上で作用するメチルトランスフェラーゼとほとんど類似していないまたは類似していないということを示すため、一般的に、相同性捜索は、メタノールメチルトランスフェラーゼを確認する効果的な手段である。ＭｔａＣ遺伝子（ＹＰ＿３０７０８１及びＹＰ＿３０４６１１）は、ＭｔａＢ遺伝子に対する近さに基づき確認され、また、ＹＰ＿３０４２９８に対する相同性によっても確認される。Ｍ． ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓからのＭｔａＢ遺伝子およびＭｔａＣ遺伝子の３セットは、遺伝子的、生理的、および、生化学的に特徴付けられる（Pritchett and Metcalf, Mol. Microbiol. 56.5:1183-1194 (2005)）。セットの２つが欠落した突然変異体株は、メタノール上にて成長することができ、ここで、ＭｔａＢ遺伝子およびＭｔａＣ遺伝子セットの３セットが全て欠落した株はメタノール上では成長しない。このことは、各遺伝子セットがメタノール利用の役割を演じていることを示している。M. thermoacetica ＭｔａＢ遺伝子は、メタノゲン ＭｔａＢ遺伝子に対する相同性に基づき確認され、メタノール誘導コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）に対する隣接した染色体に対する近さによっても確認され、且つ、結晶化しており（Zhou et al., Acta Crystallogr.Sect.F Struct. Biol Cryst. Commun. 61 Pt. 5:537-540 (2005)を参照）、さらに、ノザンハイブリダイゼーションおよびウエスタンブロッティング （Das et al. Proteins 67.1:167-76 (2007)を参照）により特徴付けられる。
【００６５】
ＭｔａＡは、メタノゲンにおける補酵素Ｍ、または、アセトゲンにおけるメチルテトラヒドロ葉酸の何れかへの、ＭｔａＣからのメチル基の転移を触媒する亜鉛タンパク質である。また、ＭｔａＡは、メチルドナーとしてメチルコバラミンを利用することもできる。ＭｔａＡをコードする例示的な遺伝子は、アセトゲン（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（Das et al., Proteins 67.1:167-176 (2007)））と同様に、メタノゲン古細菌（例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ (Maeder et al., J. Bacteriol. 188.22 7922-7931 (2006)）、および、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ（Galagan et al., Genome Res. 12.4:532-542 (2002)））に見出すことができる。一般に、ＣＨ３−ＭｔａＣからのメチル基の転移を触媒するＭｔａＡタンパク質は、他のコリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼに対して類似性を示す場合、バイオインフォマティックに同定することが困難であり、そして、染色体上にてＭｔａＢ遺伝子およびＭｔａＣ遺伝子に近接して配向されない。とはいえ、ＭｔａＡをコードする多くの遺伝子が特徴付けられている。Ｍ． ｂａｒｋｅｒｉ及びＭ． ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓにおけるこれらの遺伝子のタンパク質配列が、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定され得る：
【００６６】
【表２】
2013513384.tif 000004
【００６７】
Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉからのＭｔａＡ遺伝子（ＹＰ＿３０４６０２）がクローニングされ、配列決定され、そしてＥ．ｃｏｌｉに機能的に過剰発現された（Harms and Thauer, Eur. J. Biochem. 135.3:653-659 (1996)）。Ｍ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓにおいて、ＭａｔａＡ１が、メタノールに対する増殖のために使用される。ここで、ＭｔａＡ２変異体においてメタノールからのメタン産生が低減するにもかかわらず、ＭｔａＡ２は不要である（Bose et al. J. Bacteriol. 190.11:4017-4026 (2008)）。さらに、Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉおよびＭ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓにおいてさらなるＭｔａＡホモログが複数存在する。これらはまだ特徴付けられていないが、コリノイドタンパク質メチルトランフフェラーゼ活性を触媒し得る。
【００６８】
Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにおける推定のＭｔａＡをコードする遺伝子は、特徴付けられたメタノゲンＭｔａＡ遺伝子に類似の配列によって同定されている。詳細には、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ遺伝子は、Ｍ．ｂａｒｋｅｔからのＹＰ＿３０４６０２に高い相同性（３０％よりも高い配列同一性）を有する。メタノゲンＭｔａＡタンパク質は、ＣＨ３−ＭｔａＣから補酵素へのメチル基の転移を天然に触媒するが、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＭｔａＡは、メチル基をメチルテトラヒドロ葉酸へ転移し得、メタノゲンおよびアセトゲンのそれぞれにおけるメチルテトラヒドロ葉酸および補酵素Ｍの類似の役割を担う。推定のＭｔａＡをコードする遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定され得る：
【００６９】
【表３】
2013513384.tif 000005
【００７０】
ＡＣＳ／ＣＯＤＨは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のカルボニルブランチの中心的な酵素である。この酵素は、二酸化炭素から一酸化炭素への可逆的な還元を触媒し、一酸化炭素、補酵素Ａ、および、メチル化したコリノイド鉄−硫黄タンパク質からのメチル基からの、アセチルＣｏＡの合成もまた触媒する。コリノイド鉄−硫黄タンパク質は、メチルトランスフェラーゼを介してメチルテトラヒドロ葉酸によってメチル化される。外来宿主におけるＡＣＳ／ＣＯＤＨの発現は、以下のタンパク質の１つ以上を導入することを含む：メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイド、タンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＡｃｓＦ）、フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、アセチルＣｏＡシンターゼ（ＡｃｓＢおよびＡｃｓＣ）、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、ニッケル−タンパク質アセンブリタンパク質（ＣｏｏＣ）。
【００７１】
一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチルＣｏＡシンターゼ活性に使用される遺伝子は、典型的には、伸長したオペロンであり得るネイティブなゲノムの限定された領域に存在する（(Ragsdale, S.W., Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 39.3:165-195 (2004); Morton et al., J. Biol. Chem. 266.35:23824-23828 (1991); Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86.1:32-36 (1989)）。アセトゲン（Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）からのこのオペロンにおける遺伝子の各々は、すでにクローニングされており、Ｅ．ｃｏｌｉにて活性に発現されている（Morton et al., supra (1991); Roberts et al., supra (1989); Lu et al., J. Biol. Chem. 268.8:5605-5614 91993)）。これらの遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定され得る：
【００７２】
【表４】
2013513384.tif 000006
【００７３】
水素資化細菌であるＣａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓは、アセチルＣｏＡシンターゼによって一酸化炭素を増殖基質として利用し得る（Wu et al. PLos Genet. 1.5:e65 (2005)）。Ｚ−２９０１系統において、アセチルＣｏＡシンターゼ酵素複合体は、フレームシフト変位のために一酸化炭素デヒドロゲナーゼを欠く（Wu et al. PLos Genet. 1.5:e65 (2005)）。一方、ＤＳＭ−６００８系統において、このタンパク質のフレームシフトを起こしていない機能的な全長バージョンが精製された（Svetlitchnyi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101.2:446-451 (2004)）。Ｚ−２９０１系統からのＣ． ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定され得る：
【００７４】
【表５】
2013513384.tif 000007
【００７５】
メタン資化細菌であるＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓはまた、一酸化炭素に対して増殖し得、アセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼ活性を示し、そして酢酸およびホルメートを生成する（Lessner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  103.47:17921-17926 (2006)）。この生物は、ＡＣＳ／ＣＯＤＨ活性をコードする２セットの遺伝子を含む（Rother and Metcalf, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101.48:16929-16934 (2004)）。両方のセットのＭ． ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ遺伝子のタンパク質は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定され得る：
【００７６】
【表６】
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【００７７】
ＡｃｓＣタンパク質、ＡｃｓＤタンパク質、ＡｃｓＢタンパク質、ＡｃｓＥタンパク質およびＡｃｓＡタンパク質は、一般に、メタン資化性ＣＯＤＨ／ＡＣＳのγサブユニット、δサブユニット、βサブユニット、εサブユニット、およびαサブユニットをいう。εをコードする遺伝子のホモログは、アセトゲン（例えばＭ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）または水素資化細菌（例えばＣ． ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）に存在しない。Ｍ． ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓにおける活性な２つのＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンの存在についての仮説としては、一酸化炭素利用性増殖または酢酸利用性増殖を好む触媒特性（すなわち、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、ｋｃａｔ）、あるいは、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ発現を誘導するための種々の刺激を可能にする、異なる遺伝子調節が挙げられる（Rother et al., Arch. Microbiol. 188.5:463-472 (2007)）。
【００７８】
Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａおよびＣ． ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓの両方において、ＣＯＤＨをコードするさらなる遺伝子が、ＡＣＳ／ＣＯＤＨオペロンの外側に位置されている。これらの酵素は、一酸化炭素から二酸化炭素への変換から電子を引き抜く手段を提供する。次いで、アクセプタ（例えば、酸化フェレドキシン、ＮＡＤＰ＋、水、または過酸化水素）へ還元等量が渡されて、それぞれ還元フェレドキシン、ＮＡＤＰＨ、Ｈ２または水を形成する。いくつかの場合において、ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ＣＯＤＨに隣接して位置される。Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍにおいて、コードされたＣＯＤＨ／ヒドロゲナーゼタンパク質は膜結合型酵素複合体を形成する。それは、タンパク質勾配の形態にてＣＯからＣＯ２への変換からエネルギーが生成される位置にあることが示されている（Fox et al., J. Bacteriol.  178.21:6200-6208 (1996)）。Ｃ． ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓのＣＯＤＨ−Ｉ遺伝子および近接する遺伝子は、Ｒ． ｒｕｂｒｕｍ  ＣＯＤＨ／ヒドロゲナーゼ遺伝子クラスターに対する類似性に基づいて類似の機能的役割を職倍することが提唱されている（Wu et al., PLoS Genet. 1.5:e65 (2005)）。Ｃ． ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ  ＣＯＤＨ−Ｉはまた、電極に繋がれた場合に極めて強いＣＯ酸化活性およびＣＯ２還元活性を示すことが示されている（Parkin et al., J. Am. Chem. Soc., 129.34:10328-10329 (2007)）。Ｃ． ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＣＯＤＨ−ＩＩをコードする遺伝子および近接するタンパク質であるＣｏｏＦをコードする遺伝子がクローニングされかつ配列決定されている（Gonzalez and Robb, FEMS Microb. Lett. 191.2:243-247 (2000)）。生じた複合体が膜に結合されたが、ＮＡＤＰＨの機能を触媒するというＣＯＤＨ−ＩＩの細胞質での機能が示された。この機能はタンパク質同化作用の役割を示唆する。ＣＯＤＨ−ＩＩの結晶構造がまた利用可能である（Dobbek et al., Science 293.5533:1281-1285 (2001)）。例示的なＣＯＤＨ遺伝子およびヒロドゲナーゼ遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定され得る：
【００７９】
【表７】
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【００８０】
外部電子受容体の非存在下でのガスおよびメタノールの合成に対する嫌気性の増殖が、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）を介したピルビン酸合成を可能にすることによってＭＴＲ活性およびＡＣＳ／ＣＯＤＨ活性を有する宿主生物に与えられる。この酵素は、ピルビン酸からアセチルＣｏＡへの可逆的な変換を可能にする。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓからのＰＦＯＲがクローニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉに発現され、酸素存在下で数日間にわたって安定な、活性なリコンビナント酵素を生じた（Pieulle et al., , J. Bacteriol. 179.18:5684-5692 (1997)）。酸素安定性は、ＰＦＯＲに比較的共通しないが、Ｄ． ａｆｒｉｃａｎｕｓ酵素のポリペプチド鎖における６０残基の伸長によって付与され得る。Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＰＦＯＲもまた十分に特徴付けられている（Menon and Ragsdale Biochemistry 36.28:8484-8494 (1997)）。そして、独立栄養性増殖の間のピルビン酸合成の方向への高い活性を有することが示されている（Furdui and Ragsdale, J. Biol. Chem. 275.37:28494-28499 (2000)）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉは特徴付けられていないオープンリーディングフレーム（ｙｄｂＫ）を有する。これは、Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＰＦＯＲに５１％同一なタンパク質をコードする。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるピルビン酸オキシドレダクターゼ活性についての証拠が記載されている（Blaschkowski et al., Eur. J. Biochem. 123.3:563-569 (1982)）。これらの例示的なＰＦＯＲ酵素のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定され得る。さらなるＰＦＯＲ酵素のいくつかが以下の総説（Ragsdale, S.W., Chem. Rev. 103.6:2333-2346 (2003)）に記載されている：
【００８１】
【表８】
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【００８２】
ピルビン酸のアセチルＣｏＡへの変換は、他のいくつかの酵素またはそれらの組合せによって触媒される。例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、付随するＮＡＤ分枝からＮＡＤＨへの還元を伴って、ピルビン酸をアセチルＣｏＡへ転換し得る。これは、一連の部分的反応を触媒する複数の酵素複合体であり、ピルビン酸の酸化的脱炭酸反応のアシル化を生じる。この酵素は３つのサブユニット（ピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｅ１）、ジヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼ（Ｅ２）、およびジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｅ３））を含む。この酵素は、いくつかの生物（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む。）において天然に存在する。Ｅ．ｃｏｌｉ酵素において、Ｅ１成分における特定の残基が基質特異性を担う（Bisswanger, H., J. Biol. Chem. 256:815-82 (1981); Bremer, J., Eur. J. Biochem. 8:535-540 (1969); Gong et al., J. Biol. Chem. 275:13645-13653 (2000)）。効果を操作した酵素は、嫌気性条件下での改善されたＥ．ｃｏｌｉ  ＰＤＨ酵素活性を有している（Kim et al., J. Bacteriol. 190:3851-3858 (2008); Kim et al., Appl. Environ. Microbiol. 73:1766-1771 (2007); Zhou et al., Biotechnol. Lett. 30:335-342 (2008)）。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＤＨと比べて、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ複合体は活性であり、嫌気性条件下での増殖に必要とされている（Nakano et al., J. Bacteriol. 179:6749-6755 (1997)）。グリセロールに対する増殖の間に特徴付けられるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＰＤＨもまた、嫌気性条件下で活性である（Menzel et al., J. Biotechnol. 56:135-142 (1997)）。ウシ腎臓からのこの酵素の複合体の結晶構造（Zhou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:14802-14807 (2001)）およびＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉからのＥ２触媒ドメインが利用可能である（Mattevi et al., Science 255:1544-1550 (1992)）。この変換を触媒し得るなお別の酵素はピルビン酸ギ酸リアーゼである。この酵素は、ピルビン酸およびＣｏＡのアセチルＣｏＡおよびホルメートへの変換を触媒する。ピルビン酸ギ酸リアーゼは、原核生物に共通の酵素であり、嫌気性のレドックスバランスの調節を補助するために使用される。例示的な酵素が以下に見出される： ｐｆｌＢによってコードされるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Knappe and Sawers, FEMS.Microbiol Rev. 6:383-398 (1990)）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ（Melchiorsen et al.,  Appl Microbiol Biotechnol 58:338-344 (2002))、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（Takahashi-Abbe et al., Oral.Microbiol Immunol. 18:293-297 (2003)）。Ｅ．ｃｏｌｉは、ｔｄｃＥによってコードされるさらなるピルビン酸ギ酸リアーゼを有し、これはピルビン酸または２−オキソブタノエートのそれぞれアセチルＣｏＡまたはプロピオニルＣｏＡへの変換を触媒する（Hesslinger et al., Mol. Microbiol 27:477-492 (1998)）。Ｅ．ｃｏｌｉからのｐｆｌＢおよびｔｄｃＥの両方が、ＰｆｌＡによってコードされるピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素の存在を必要とする。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｙｆｉＤによってコードされる短いタンパク質は、酸素切断ピルビン酸ギ酸リアーゼと会合し得、そして酸素切断ピルビン酸ギ酸リアーゼに対する活性を回復し得る（Vey et al., Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:16137-16141 (2008)）。Ｅ．ｃｏｌｉからのｐｆｌＡおよびｐｆｌＢが、ＷＯ／２００８／０８０１２４に記載されているようにブタノール産生のたｍの細胞質アセチルＣｏＡを増加させることによってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに発現されていることに注意すべきである。さらなるピルビン酸ギ酸リアーゼおよび活性化酵素候補（それぞれｐｆｌおよびａｃｔによってコードされる）がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍに見出される（Weidner et al.,  J Bacteriol. 178:2440-2444 (1996)）。
【００８３】
さらに、種々の酵素を組み合わせて使用して、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換し得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、アセチルＣｏＡは、先ずピルビン酸を脱炭酸化してアセトアルデヒドを形成させることによって細胞質にて得られる。後者は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによって酢酸に酸化され、続いてアセチルＣｏＡシンセターゼによって活性化されてアセチルＣｏＡを形成する。アセチルＣｏＡシンセターゼは他のいくつかの生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（Kumari et al., J. Bacteriol. 177:2878-2886 (1995)）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ（Starai et al., Microbiology 151:3793-3801 (2005)；Starai et al., J. Biol. Chem. 280:26200-26205 (2005)）、およびＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（すでに記載されている）においてネイティブな酵素である。あるいは、アセテートキナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼによって酢酸を活性化して、アセチルＣｏＡを形成し得る。アセテートキナーゼは先ず、ＡＴＰ分子を一緒に用いて酢酸をアセチルホスフェートに変換する。アセチルホスフェートおよびＣｏＡは次いで、ホスホトランスアセチラーゼによって一リン酸の放出とともにアセチルＣｏＡに変換される。アセテートキナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの両方とも、いくつかのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａおよびＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａにおいて十分に研究されている酵素である。
【００８４】
ピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換するなお別の方法は、ピルベートオキシダーゼを介するものである。ピルベートオキシダーゼは、ユビキオンを電子受容体として用いてピルビン酸を酢酸に変換する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、この活性は、ｐｏｘＢによってコードされる。ＰｏｘＢはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓのピルベートデカルボキシラーゼに対する類似性を有する。この酵素は、チアミンピロホスフェート補因子（Koland and Gennis, Biochemistry 21:4438-4442 (1982)); O'Brien et al., Biochemistry 16:3105-3109 (1977); O'Brien and Gennis, J. Biol. Chem. 255:3302-3307 (1980)）、およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補因子を有する。次いで、上述したように、酢酸は、アセチルＣｏＡシンテターゼ、またはアセテートキナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼのいずれかによってアセチルＣｏＡに変換され得る。これらの酵素のいくつかがまたアセチルＣｏＡからピルビン酸への可逆的反応を触媒し得る。
【００８５】
ＣＯおよびＭｅＯＨのアセチルＣｏＡまたは酢酸へのレドックス中性変換と異なり、より高度に還元された生成物（例えばエタノール、ブタノール、イソブタノール、イソプロパノール、１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、コハク酸、ギ酸、マレイン酸、４−ヒドロキシブチル酸、３−ヒドロキシプロピオニル酸、乳酸、アジピン酸、メタクリル酸、およびアクリル酸）の、ガス状の基質から最大限の収量での産生は、ＣＯおよびＨ２の両方からのさらなる還元等量の抽出に依存する（例えば、図４におけるエタノール形成を参照のこと）。詳細には、一酸化炭素デヒドロゲナーゼを介するＣＯおよび水のＣＯ２への変換によって、あるいは、Ｈ２からアクセプタ（例えばフェレドキシン、フラボドキシン、ＦＡＤ＋、ＮＡＤ＋、またはＮＡＤＰ＋）へ電子を移す水素利用ヒドロゲナーゼの活性から直接的に、還元等量が得られる。
【００８６】
４つのヒドロゲナーゼをコードする複数の遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の腸内細菌にネイティブである（Sawers, G., Antonie van Leeuwenhoek 66.1:57-88 1994); Sawers et al., J. Bacteriol. 168.1:398-404 (1986); Sawers and Boxer, Eur. J. Biochem. 156.2:265-275 (1986); Sawers et al., J. Bacteriol. 164.3:1324-1331 (1985)）。複数の酵素活性の条件下で、Ｅ．ｃｏｌｉおよび別の宿主生物は、入ってくる水素分子を分けて対応するアクセプタを還元するに十分なヒドロゲナーゼ活性を提供し得る。Ｅ．ｃｏｌｉの内因性の水素リアーゼ酵素に、ヒドロゲナーゼ３およびヒドロゲナーゼ４がある。ヒドロゲナーゼ３は、フェレドキシンをアクセプタとして使用する膜結合型酵素複合体であり、ヒドロゲナーゼ４もまたフェレドキシンアクセプタを用いる。ヒドロゲナーゼ３および４は、ｈｙｃ遺伝子クラスターおよびｈｙｆ遺伝子クラスターによってそれぞれコードされる。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるヒドロゲナーゼ活性はまた、ｈｙｐ遺伝子の発現に依存する。この遺伝子に対応するタンパク質はヒドロゲナーゼ複合体のアセンブリに関与する（Rangarajan et al. J. Bacteriol. 190.4:1447-1458 (2008); Jacobi et al., Arch. Microbiol. 158.6:444-451 (1992)）。Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａヒドロゲナーゼは、十分な内因性ヒドロゲナーゼ活性を欠く宿主の産生に、好適な候補である。Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａは、ＣＯ２を排他的な炭素源として用いて増殖し得る。このことは、還元等量が、Wood-Ljungdahl経路を介してＨ２から取り出されて、アセチルＣｏＡ合成を可能にすることを示す（Drake, H. L., J. Bacteriol. 150.2:702-709 (1982); Kellum and Drake, J. Bacteriol. 160.1:466-469 (1984); Drake and Daniel Res. Microbial. 155.10:869-883 (2004)）（図２を参照のこと）。Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａは、Ｅ．ｃｏｌｉからのｈｙｐ遺伝子、ｈｙｃ遺伝子およびｈｙｆ遺伝子のいくつかに相同性を有している。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定され得る。さらに、ヒドロゲナーゼをコードするいくつかの遺伝子クラスターが。Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａに機能的に存在し、これらに対応するタンパク質配列もまた以下に提供される：
【００８７】
【表９】
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【００８８】
Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにおける、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｈｙｐ遺伝子に相同なタンパク質は以下に示される：
【００８９】
【表１０】
2013513384.tif 000012
【００９０】
ヒドロゲナーゼ３は以下に示される：
【００９１】
【表１１】
2013513384.tif 000013
【００９２】
ヒドロゲナーゼ４は以下に示される：
【００９３】
【表１２】
2013513384.tif 000014
【００９４】
Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにおける、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｈｙｃ遺伝子および／またはｈｙｆ遺伝子に相同なタンパク質は以下に示される：
【００９５】
【表１３】
2013513384.tif 000015
【００９６】
Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにおけるさらなるヒドロゲナーゼをコードする遺伝子クラスターは以下に示される。
【００９７】
【表１４】
2013513384.tif 000016
【００９８】
１，３−ブタンジオール産生は、図４および図５に記載される種々の代替経路によって、リコンビナントＥ．ｃｏｌｉにおいて実現され得る。全ての経路が、先ず、チオラーゼを用いて、２分子のアセチルＣｏＡを１分子のアセトアセチルＣｏＡに変換する。
【００９９】
アセトアセチルＣｏＡチオラーゼは、２分子のアセチルＣｏＡを１分子のアセトアセチルＣｏＡおよびＣｏＡに変換する。例示的なアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ酵素としては、Ｅ．ｃｏｌｉからのａｔｏＢの遺伝子産物（Martin et al., Nat. Biotechnol. 21.7:796-802 (2003)）、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからのｔｈｌＡおよびｔｈｌＢ（Hanai et al., Appl. Environ. Microbiol. 73.24:7814-7818 (2007);Winzer et al. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2.4:531-541 (2000)）、ならびにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＥＲＧ１０（Hiser et al., J. Biol. Chem. 269.50:31383-31389 (1994)）が挙げられる。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報は以下の情報を用いて見出される：
【０１００】
【表１５】
2013513384.tif 000017
【０１０１】
アセトアセチルＣｏＡからの１つの経路は、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）によるアセトアセチルＣｏＡの３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの還元を必要とする。これは、引き続いて、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼと称されるＣｏＡ依存的アルデヒドレダクターゼを介して３−ヒドロキシブチルアルデヒドに変換され得る。３−ヒドロキシブチルアルデヒドは、最終的に、３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼによって生成物１，３−ＢＤＯに還元され得る。あるいは、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、アルコール形成ＣｏＡ依存的３−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼによって、直接的に１，３−ＢＤＯに還元され得る。この経路の各ステップについての遺伝子は、以下に記載される。
【０１０２】
アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの還元を触媒するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａのいくつかの種においてブチレートへのアセチルＣｏＡ発酵経路に関し、詳細に研究されている（Jones and Woods, Microbiol. Rev. 50.4:484-524 (1986)）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからの酵素（ｈｂｄによってコードされる）はクローニングされており、Ｅ．ｃｏｌｉに機能的に発現されている（Youngleson et al., J. Bacteriol. 171.12:6800-6807 (1989)）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉにおける２つの脂肪酸酸化複合体のサブユニット（ｆａｄＢおよびｆａｄＪによってコードされる）は３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼとして機能する（Binstock and Schulz, Methods Enzymol. 71 Pt. C: 403-411 (1981)）。アセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに還元する他の遺伝子は、Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａからのｐｈａＢ（Ploux et al., Eur. J. Biochem. 171.1:177-182 (1988)）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓからのｐｈａＢ (Alber et al., Mol. Microbiol. 61.2:297-309 (2006))である。前者はＮＡＤＰＨ依存的であり、そのヌクレオチド配列は決定されており（Peoples and Sinskey, Mol. Microbiol. 3.3:349-357 (1989)）、その遺伝子はＥ．ｃｏｌｉに発現されている。この遺伝子についての基質特異性の研究は、これがアセトアセチルＣｏＡの代わりの基質として３−オキソプロピオニルＣｏＡを受容し得るという結論を導く（Ploux et al., Eur. J. Biochem. 171.1:177-182 (1988)）。さらなる遺伝子としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉにおけるＨｂｄ１（Ｃ末端ドメイン）およびＨｂｄ２（Ｎ末端ドメイン）（Hillmer and Gottschalk, Biochim. Biophys. Acta 3334:12-23 (1974））、ならびにＢｏｓ  ｔａｕｒｕｓにおけるＨＳＤ１７Ｂ１０（Wakil et al., J. Biol. Chem. 207.2:631-638 (1954)）が挙げられる。遺伝子およびタンパク質の要約は以下に示される：
【０１０３】
【表１６】
2013513384.tif 000018
【０１０４】
以下に示すように、多くの類似酵素がＣｌｏｓｔｒｉｄｉａおよびＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａの他の種において見出されている（Berg et al., Science 318.5857:1782-1786 (2007)）。
【０１０５】
【表１７】
2013513384.tif 000019
【０１０６】
いくつかのアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼは、アシルＣｏＡをその対応するアルデヒドへ還元し得、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）活性を触媒するために使用され得る。このような酵素をコードする例示的な遺伝子としては、脂肪性アシルＣｏＡレダクターゼをコードするＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのａｃｒ１（Reiser and Somerville, J. Bacteriol. 179.9:2969-2975 (1997)）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ｍ−１の脂肪性アシルＣｏＡレダクターゼ（Ishige et al. Appl. Environ. Microbiol. 68.3:192-195 (2002)）、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉにおけるｓｕｃＤ遺伝子によってコードされるＣｏＡ−およびＮＡＤＰ−依存的コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Sohling and Gottschalk, J. Bacteriol. 178.3:871-880 (1996); Sohling and Gottschalk J. Bacteriol. 178.3:871-880 (1996)）が挙げられる。Ｐ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＳｕｃＤは別のコハクサンセミアルデヒドデヒドロゲナーゼである（Takahashi et al., J. Bacteriol. 182.17:4704-4710 (2000)）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐにおけるアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをアシル化する酵素（ｂｐｈＧによってコードされる）はなお別の酵素であり、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒドおよびホルムアルデヒドを酸化およびアシル化することが実証されている（Powlowski et al., J. Bacteriol. 175.2:377-385 (1993)）。アセチルＣｏＡをエタノールに還元することに加えて、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓａにおけるａｄｈＥによってコードされるこの酵素が、分枝鎖化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリルＣｏＡに酸化することが示されている（Kazahaya et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 18:43-55 (1972); Koo et al., Biotechnol. Lett. 27.7:505-510 (2005)）。ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、溶解性（ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）の生物（例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）において同様の反応（ブチリルＣｏＡのブチルアルデヒドへの変換）を触媒する（Kosaka et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 71.1:58-68 (2007)）。これらの遺伝子およびタンパク質に関する情報を以下に示す：
【０１０７】
【表１８】
2013513384.tif 000020
【０１０８】
アシルＣｏＡをその対応するアルデヒドに変換するさらなる酵素タイプは、マロニルＣｏＡレダクターゼである。この酵素は、マロニルＣｏＡをマロン酸セミアルデヒドに転換する。マロニルＣｏＡレダクターゼは、熱好酸性（thermoacidophilic）の古細菌における３−ヒドロキシプロピオン酸を介する独立栄養性の炭素固定において重要な酵素である（Berg et al., Science 318.5857:1782-1786 (2007); Thauer, R.K., Science 318.5857:1732-1733）。この酵素はＮＡＤＰＨを補因子として利用し、ＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａおよびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｐｐにおいて特徴付けられている（Alber et al., J. Bacteriol. 188.24: 8551-8559 (2006); Hugler et al. 2404-10）。この酵素は、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａにおいてＭｓｅｄ＿０７０９によってコードされる（Alber et al., J. Bacteriol. 188.24: 8551-8559 (2006); (Berg et al., Science 318.5857:1782-1786 (2007)）。Sulfolobus tokodaiiからのマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子がクローニングされ、そしてＥ．ｃｏｌｉにてヘテロ接合性に発現されている（Alber et al., J. Bacteriol. 188.24: 8551-8559 (2006); Alber et al., Mol. Microbiol. 61.2:297-309 (2006)）。この酵素はまた、メチルマロニルＣｏＡのその対応するアルデヒドへの変換を触媒することが示されている。これあの酵素のアルデヒドデヒドロゲナーゼ機能がＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓからの二官能性デヒドロゲナーゼに類似するが、配列類似性はほとんどない。マロニルＣｏＡレダクターゼ酵素の両候補がアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼに高い配列類似性を有しており、この酵素はアスパラチル−４−リン酸のアスパラギン酸セミアルデヒドへの還元および同時に生じる脱リン酸化を触媒する。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓを含むほかの生物におけるタンパク質に対する配列相同性によってさらなる遺伝子が見出され得、以下に挙げられる。ＣｏＡアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼについてのなお別の遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉからのａｌｄ遺伝子である（Toth et al., Appl. Environ. Microbiol. 65.11:4973-4980 (1999)）。この酵素はアセチルＣｏＡおよびブチリルＣｏＡをこれらの対応するアルデヒドに還元することが報告されている（Toth et al., Appl. Environ. Microbiol. 65.11:4973-4980 (1999)）。関連する遺伝子およびタンパク質の情報の要約が以下に示される：
【０１０９】
【表１９】
2013513384.tif 000021
【０１１０】
３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ活性を示す控訴（ＥＣ  １．１．１．６１）が、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（Bravo et al., J. Forensic Sci. 49.2:379-387 (2004)）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ（Wolff and Kenealy, Protein Expr. Purif. 6.2:206-212 (1995)）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Breitkreuz et al., J. Biol. Chem. 278.42: 41552-41556 (2003)）において特徴付けられている。なお別の遺伝子は、Geobacillus thermoglucosidasiusからのアルコールデヒドロゲナーゼａｄｈＩである。遺伝子およびタンパク質の情報の要約が以下に示される：
【０１１１】
【表２０】
2013513384.tif 000022
【０１１２】
別の例示的な酵素は、３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼであり、これは３−ヒドロキシイソブチレートのメチルマロン酸セミアルデヒドへの可逆的な酸化を触媒する。この酵素は、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの分解に関与し、細菌、真核生物、および哺乳動物において同定されている。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＨＢ８からのＰ８４０６７によってコードされるこの酵素は、構造的に特徴付けられている（Lokanath et al., J. Mol. Biol. 352.4:905-917 (2005)）。ヒト３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼの可逆性が、放射標識された基質を用いて実証された（Manning and Pollitt, Biochem. J.231.2:481-484 (1985)）。この酵素をコードするさらなる遺伝子としては、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（Hawes et al. Methods Enzymol. 324:218-228 (2000)）およびOryctolagus cuniculus（Hawes et al. Methods Enzymol. 324:218-228 (2000); Chowdhury et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 60.12:2043-2047 (1996)）における３ｈｉｂｈ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおけるｍｍｓｂ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａにおけるｄｈａｔ（Aberhart and Hsu, J. Chem. Soc. (Perkin 1) 6:1404-1406; Chowdhury et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 60.12:2043-2047 (1996)); Chowdhury et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 67.2:438-441 (2003)）が挙げられる。これらの遺伝子およびＰ路に関する情報を以下に示す：
【０１１３】
【表２１】
2013513384.tif 000023
【０１１４】
アルデヒドのアルコールへの変換を触媒する酵素（すなわちアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドレダクターゼの等価物）をコードする他の例示的な遺伝子であり、３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼの候補として働き得る遺伝子としては、Ｃ２−Ｃ１４の媒体鎖（medium-chain）アルコールデヒドロゲナーゼをコードするａｌｒＡ（Tani et al., Appl. Environ. Microbiol. 66.12:5231-5335 (2000)）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＡＤＨ２（Atsumi et al., Nature 451.7174:86-89 (2008)）、Ｅ． ｃｏｌｉからのｙｑｈＤ（これはＣ３よりも長い分子を嗜好する。）（Sulzenbacher et al., J. Mol. Biol. 342.2:489-502 (2004)）、ならびに、Ｃ． ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからのｂｄｈ Ｉおよびｂｄｈ ＩＩ（これはブチルアルデヒドをブタノールに変換する。）（Walter et al., J. Bacteriol. 174.22:7149;7158 (1992)）が挙げられる。ｙｑｈＤの遺伝子産物は、ＮＡＤＰＨを補因子として用いて、アセトアルデヒド、マロンジアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、およびアクロレインの還元を触媒する（Perez et al., J. Biol. Chem. 283.12:7346-7353 (2008)）。Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓからのＡＤＨ１は、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、およびアクロレインを含む多くのアルデヒドに対する活性を有していることが実証されている。
【０１１５】
これらの例示的な遺伝子産物の各々についてのタンパク質配列は、利用可能な場合、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見出され得る：
【０１１６】
【表２２】
2013513384.tif 000024
【０１１７】
アルコール形成３−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼは、アチルＣｏＡをアルコールへ変換する２ステップオキシドレダクターゼによって触媒され得る。これらとしては、例えば、アセチルＣｏＡからエタノールへ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉからのａｄｈＥ（Kessler et al., FEBS Lett. 281.1-2:59-63 (1991)））およびブチリルＣｏＡからブタノールへ（例えば、C. acetobutylicumからのａｄｈＥ２（Fontaine et al., J. Bacteriol. 184.3:821-830 (2002)））基質を転換する酵素が挙げられる。アセチルＣｏＡをエタノールに還元することに加えて、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓａにおけるａｄｈＥによってコードされるこの酵素が、分枝鎖化合物イソブチルアルデヒドをイソブチリルＣｏＡに酸化することが示されている（Kazahaya et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 18:43-55 (1972); Koo et al., Biotechnol. Lett. 27.7:505-510 (2005)）。これらの遺伝子およびタンパク質に関する情報を以下に示す：
【０１１８】
【表２３】
2013513384.tif 000025
【０１１９】
別の例示的な酵素が、マロニルＣｏＡを３−ＨＰへ変換し得る。この活性を有するＮＡＤＰＨ依存的酵素が、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓにて特徴付けられており、この酵素は、３−ヒドロキシプロピオネートサイクルに関する（Hugler et al.,  J. Bacteriol. 184.9:2404-2410 (2002); Strauss and Fuchs, Eur. J. Biochem. 215.3:633-643 (1993)。この酵素は分子量３００ｋＤａを有し、基質特異性が高く、他の公知のオキシドレダクターゼと配列相同性をほとんど示さない（Hugler et al., J. Bacteriol. 184.9:2404-2410 (2002)）。他の生物において、この特異的反応を触媒する酵素は存在しない。しかし、他の生物が同様の経路を有し得るというバイオインフォマティックの証拠はある（Klatt et al., Environ. Microbiol. 9.8:2067-2078 (2007)）。他の生物（Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＮＡＰ１およびマウスγプロテオバクテリアＨＴＣＣ２０８０）における酵素候補は、配列類似性によって推測され得る。これらの遺伝子およびタンパク質に関する情報を以下に示す：
【０１２０】
【表２４】
2013513384.tif 000026
【０１２１】
より長い鎖のアシルＣｏＡ分子が、アルコール形成脂肪性アシルＣｏＡレダクターゼをコードするホホバ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＦＡＲのような酵素によって還元され得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるその過剰発現は、ＦＡＲ活性を生じ、そして脂肪アルコールの集積を生じる（Metz et al., Plant Physiol. 122.3: 635-644 (2000)）。ＦＡＲに関する情報を以下に示す：
【０１２２】
【表２５】
2013513384.tif 000027
【０１２３】
アセトアセチルＣｏＡから１，３−ブタンジコールへの第二の代替経路は、ＣｏＡ依存的アルデヒド形成アセトアセチルＣｏＡレダクターゼによるアセトアセチルＣｏＡの３−オキソブチルアルデヒドへの還元を介して進行する。次いで、３−オキソブチルアルデヒドは、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン形成）によって３−ヒドロキシブチルアルデヒドへ還元され、最終的には、この中間体は、３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼによって１．３−ブタンジオールへ還元される。これらのステップの各々についてのこれらの酵素およびこれらの酵素をコードする遺伝子は以下に挙げられる。
【０１２４】
アセトアセチルＣｏＡの３−オキソブチルアルデヒドへの転換を職倍するアセトアセチルＣｏＡレダクラーゼ（ＣｏＡ依存的、アルデヒド形成）についての例示的な候補は、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）について本明細書中に上述したものと同じである。
【０１２５】
ケトンをヒドロキシル官能基に変換しかつ３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン形成）活性を触媒するために使用され得るアルコールデヒドロゲナーゼとして例示的ないくつかが存在する。Ｅ．ｃｏｌｉからのこのような酵素の２つは、マロン酸デキヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）によってコードされる。さらに、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａからの乳酸デヒドロゲナーゼは、種々の鎖長の基質（例えば、乳酸、２−オキソブチレート、２−オキソペンタノエート、および２−オキソグルタレート）に対する高い活性を示すことが示されている（Steinbuchel and Schlegel, Eur. J. Biochem. 130.2:329-334 (1983)）。このオキソ機能のヒドロキシル基への変換は、ラットおよびヒトの胎盤に見出されることが報告された酵素２−ケト１，３−ブタンジオールレダクターゼによって触媒され得る（Suda et al., Arch. Biochem. Biophys. 176.2:610-620 (1976); Suda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 342.2:586-591 (1977)）。これらの酵素の全てが、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼとして使用され得る。このステップについてのさらなる酵素は、ヒト心臓からのミトコンドリア３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（ｂｄｈ）であり、これはクローニングされかつ特徴付けられている（Marks et al., J. Biol. Chem. 267.22:15459-15463 (1992)）。この酵素は、３−ヒドロキシ酸に対して作用するデヒドロゲナーゼである。アセトンをイソプロパノールへ変換する別の例示的なアルコールデヒドロゲナーゼは、Ｃ． ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ（Ismaiel et al., J. Bacteriol. 175.16:5097-5105 (1993)）およびＴ． ｂｒｏｃｋｉｉ（Lamed and Zeikus, Biochem. J. 195.1:183-190 (1981); Peretz and Burstein, Biochemistry 28.16:6549-6555 (1989)）に見出される。メチルエチルケトン（ＭＥＫ）レダクターゼ、あるいは２−ブタノールデヒドロゲナーゼが、ＭＥＫの還元による２−ブタノールの形成を触媒する。例示的な酵素が、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ（Kosjek et al., Biotechnol. Bioeng. 86.1:55-62 (2004)）およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（van der Oost et al., Eur. J. Biochem. 268.10:3062-3068 (2001)）に見出され得る。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１２６】
【表２６】
2013513384.tif 000028
【０１２７】
アセトアセチルＣｏＡからの別の経路は、ＣｏＡ依存的アルコール形成アセトアセチルＣｏＡレダクターゼによる、アセトアセチルＣｏＡからの４−ヒドロキシ２−ブタノールへの還元を介して進行する。次いで、この中間体は、４−ヒドロキシブタノンレダクターゼによって１，３−ブタンジオールへ還元される。４−ヒドロキシブタノンはまた、アルデヒド還元３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼによって３−オキソブチルアルデヒドから形成され得る。アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存的、アルコール形成）は、アルコール形成３−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼについての酵素と同一の酵素を利用し得る。
【０１２８】
４−ヒドロキシブタノンレダクターゼ活性は、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼについて上述した遺伝子と同一のものより取得され得る。さらに、Matsuyama et al., US Patent No. 5,413,922によって記載されたように、Bacillus, Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃａｎｄｉｄａ属およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属に属する生物を含む多くの生物が、４−ヒドロキシ２−ブタノンの１，３−ブタンジオールへの還元を触媒し得る。
【０１２９】
アルデヒドのアルコールへの変換を触媒する酵素をコードする例示的な遺伝子（すなわち、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドレダクターゼ）としては、Ｃ２−Ｃ１４に対する中程度の鎖長のアルコールのデヒドロゲナーゼをコードするａｌｒＡ（Tani et al., App. Environ. Microbiol. 66.12:5231-5235 (2000)）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＡＤＨ２（Atsumi et al., Nature 451.7174:86-89 (2008)）、Ｃ３よりも長い分子に優先的な、Ｅ．ｃｏｌｉからのｙｑｈＤ（Sulzenbacher et al., J. Mol. Biol. 342.2:489-502 (2004)）、およびブチルアルデヒドをブタノールへ変換する、Ｃ． ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからのｂｄｈＩおよびｂｄｈＩＩ（Walter et al., J. Bacteriol. 174.22:7149-7158 (1992)）が挙げられる。ｙｑｈＤの遺伝子産物は、ＮＡＤＰＨを補因子として用いて、アセトアルデヒド、マロンジアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、およびアクロレインの還元を触媒する（Perez et al., J. Biol. Chem. 283.12:7346-7353 (2008)）。これらの遺伝子の全てが、３−オキソブチルアルデヒドを４−ヒドロキシブタノンへ変換するための３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）活性を提供し得る。Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓからのＡＤＨ１は、多くのアルデヒド（ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、およびアクロレインを含む。）に対する活性を有することが実証されている（Kinoshita et al., App. Microbiol. Biotechnol. 22:249-254 (1985)）。
【０１３０】
これらの例示的な遺伝子産物の各々についてのタンパク質は、利用可能である場合、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見出され得る：
【０１３１】
【表２７】
2013513384.tif 000029
【０１３２】
アセトアセチルＣｏＡのアセトアセテートへの変換は、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼによって行われ得る。これは、ＣｏＡ−エステル結合に保存されたエネルギーを保存する。この転換を触媒し得るいくつかの例示的なトランスフェラーゼ酵素が以下に提供される。これらの酵素は、所望のアセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を天然に示すか、あるいは、基質としてのアセトアセチルＣｏＡを増強された効率を有して受容するように、指向された進化を介して操作され得る。このような酵素は、天然にかあるいは以下の指向された進化を介して、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの３−ヒドロキシブチレートのトランスフェラーゼ機構を介した変換を触媒するに好適である。
【０１３３】
アセトアセチルＣｏＡ：アセチルＣｏＡトランスフェラーゼは、アセトアセチルＣｏＡおよび酢酸をアセトアセテートおよびアセチルＣｏＡへ天然に変換する。この酵素はまた、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを基質として受容し得るか、そのように機能するように操作され得る。例示的な酵素としては、Ｅ．ｃｏｌｉからのａｔｏＡＤ（Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007)）、Ｃ． ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからのｃｔｆＡＢ（Jojima et al., Appl Microbiol Biotechnol 77:1219-1224 (2008)）、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍからのｃｔｆＡＢ（Kosaka et al., Biosci.Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)）の、の遺伝子産物が挙げられる。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１３４】
【表２８】
2013513384.tif 000030
【０１３５】
スクシニルＣｏＡ：３−ケト酸ＣｏＡトランスフェラーゼは、コハク酸をスクシニルＣｏＡへ天然に変換し、３−ケトアシルＣｏＡを３−ケト酸へ変換する。例示的なスクシニルＣｏＡ：３−ケト酸ＣｏＡトランスフェラーゼは、以下に存在する：Helicobacter pylori (Corthesy-Theulaz et al.,  J.Biol.Chem. 272:25659-25667 (1997))、Bacillus subtilis (Stols et al.,  Protein.Expr.Purif. 53:396-403 (2007))、およびHomo sapiens (Fukao et al., Genomics 68:144-151 (2000); Tanaka et al., Mol.Hum.Reprod. 8:16-23 (2002))。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１３６】
【表２９】
2013513384.tif 000031
【０１３７】
さらに好適なスクシニルＣｏＡ：３−ケト酸ＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉのｃａｔ１、ｃａｔ２およびｃａｔ３の遺伝子産物によってコードされる。これらの酵素は、それぞれスクシニルＣｏＡ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡおよびブチリルＣｏＡのアセチルトランスフェラーゼ活性を示すことが示されている（Seedorf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:2128-2133 (2008); Sohling and Gottschalk, J Bacteriol 178:871-880 (1996)）。同様のＣｏＡトランスフェラーゼ活性がまた、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ（van Grinsven et al., J. Biol. Chem. 283:1411-1418 (2008)）、およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ（Riviere et al., J. Biol. Chem. 279:45337-45346 (2004)）に存在する。所望の変換を生じ得るなお別のトランスフェラーゼは、ブチリルＣｏＡ：アセトアセテートＣｏＡトランスフェラーゼである。例示的な酵素が以下に見出され得る：
Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（Barker et al., J. Bacteriol. 152(1):201-7 (1982)）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＳＢ４（Barker et al., J. Biol. Chem. 253(4):1219-25 (1978)）、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Wiesenborn et al., Appl. Environ. Microbiol. 55(2):323-9 (1989)）。ブチリルＣｏＡ：アセトアセテートについての特異的な遺伝子配列は示されていないが、遺伝子ＦＮ０２７２およびＦＮ０２７３は、ブチレート−アセトアセテートＣｏＡトランスフェラーゼとして知られている（Kapatral et al., J. Bact. 184(7) 2005-2018 (2002)）。Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（例えばＦＮ１８５７およびＦＮ１８５６）におけるホモログは、所望のアセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有し得る。ＦＮ１８５７およびＦＮ１８５６は、リジン発酵に関連する他の多くの遺伝子に隣接して位置されており、よってアセトアセテートブチレートＣｏＡトランスフェラーゼをまさにコードし得る（Kreimeyer, et al., J. Biol. Chem. 282 (10) 7191-7197 (2007)）。Ｐｏｒｐｈｙｒｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓからのさらなる遺伝子／遺伝子産物が同様の様式にて同定され得る（Kreimeyer, et al., J. Biol. Chem. 282 (10) 7191-7197 (2007)）。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１３８】
【表３０】
2013513384.tif 000032
【０１３９】
アセトアセチルＣｏＡは、アセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼによってアセトアセテートに加水分解され得る。同様に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼによって３−ヒドロキシブチレートに加水分解され得る。多くのＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．１．２．１）は、広い基質特異性を有し、天然であっても以下の酵素操作にされていても、これらの転換に好適な酵素である。いくつかのアセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼが、ラット肝臓の細胞質およびミトコンドリアにて同定されているが、その配列は報告されていない（Aragon and Lowenstein, J. Biol. Chem. 258(8):4725-4733 (1983)）。さらに、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓの脳からの酵素（Robinson et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 71:959-965 (1976)）は、ブチリルＣｏＡ、ヘキサノイルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡと反応し得る。ラット肝臓からのａｃｏｔ１２酵素はＣ２〜Ｃ６ｎｏアシルＣｏＡ分子を加水分解することが示されている（Suematsu et al., Eur. J. Biochem. 268:2700-2709 (2001)）。マメの葉のミトコンドリアからの酵素は、アセチルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、ブチリルＣｏＡ、パルミトイルＣｏＡ、オレオイルＣｏＡ、スクシニルＣｏＡおよびクロトニルＣｏＡに対する活性を示したが、その配列は報告されていない（Mack and Buckel, FEBS Lett. 405:209-212 (1997)）。このことは、スクシニルＣｏＡ：３−ケト酸トランスフェラーゼおよびアセチルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする酵素もまた、その機能を変更する特定の変位を有するハイドロラーゼとして使用され得ることを示す。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのアセチルＣｏＡハイドロラーゼ（ＡＣＨ１）は、別の酵素ハイドロラーゼ示す（Buu et al., J.Biol.Chem. 278:17203-17209 (2003)）。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１４０】
【表３１】
2013513384.tif 000033
【０１４１】
別のヒドロラーゼ酵素は、これは、グルタリルＣｏＡ、アジピルＣｏＡ、スベリルＣｏＡ、セバシルＣｏＡおよびドデカネジオイルＣｏＡに対する活性を示すヒトジカルボキシ酸チオエステラーゼａｃｏｔ８（Westin et al., J. Biol. Chem. 280:38125-38132 (2005)）、ならびに、広範なＣｏＡチオエステルを加水分解し得る最も近いＥ．ｃｏｌｉホモログｔｅｓＢであり（Naggert et al., J. Biol. Chem. 266:11044-11050 (1991)）、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（Tseng et al., Appl. Environ. Microbiol. 75(10):3137-3145 (2009)）を含む。同様の酵素がまたラット肝臓において特徴付けられている（Deana, Biochem. Int. 26:767-773 (1992)）。他のＥ．ｃｏｌｉチオエステルヒドロラーゼとしては、ｔｅｓＡ（Bonner and Bloch, J. Biol. Chem. 247:3123-3133 (1972)）、ｙｂｇＣ（Kuznetsova et al., FEMS Microbiol. Rev. 29:263-279 (2005); Zhuang et al., FEBS Lett. 516:161-163 (2002)），ｐａａＩ（Song et al., J. Biol. Chem. 281:11028-11038 (2006)）、およびｙｂｄＢ（ybdB (Leduc et al., J. Bacteriol. 189:7112-7126 (2007)）の遺伝子産物が挙げられる。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１４２】
【表３２】
2013513384.tif 000034
【０１４３】
さらなるヒドロラーゼ酵素としては、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡが挙げられ、これは、バリン分解の間に３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡの３−ヒドロキシイソブチレートへの変換を効率よく触媒することが記載されている（Shimomura et al., J. Biol. Chem. 269:14248-14253 (1994)）。この酵素をコードする遺伝子としては、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Shimomura et al., supra (1994); Shimomura et al., Methods Enzymol. 324:229-240 (2000)）およびHomo sapiens（Shimomura et al., supra (1994)）のｈｉｂｃｈが挙げられる。配列相同性による候補遺伝子としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｈｉｂｃｈおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓのＢＣ＿２２９２が挙げられる。ＢＣ＿２２９２は、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼ活性を示しかつＥ．ｃｏｌｉに操作された場合に３−ヒドロキシブチレート合成の経路の一部として機能することが示されている（Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 79:633-641 (2008)）。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１４４】
【表３３】
2013513384.tif 000035
【０１４５】
ＣｏＡ部分をアセトアセチルＣｏＡまたは３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから除去するための代替法は、リン酸を転移するアシルトランスフェラーゼおよびキナーゼのような酵素の対をアプライしてアセトアセチルＣｏＡまたは３−ヒドロキシブチリルＣｏＡのシンテターゼ活性を分けることである。本明細書中で使用される場合、ホスホトランスアシラーゼおよびキナーゼ酵素の組合せは「シンテターゼ」としていわれる。この活性は、どちらかの分子のＣｏＡ−エステルの正味の加水分解を可能にし同時にＡＴＰを生成する。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからのブチレートキナーゼ（ｂｕｋ）／ホスホトランスブチリラーゼ（ｐｔｂ）システムが、３−ヒドロキシブチレート合成の経路の一部として機能する場合、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからのＣｏＡ基を除去するために首尾よくアプライされている（Tseng et al., Appl. Environ. Microbiol. 75(10):3137-3145 (2009)）。詳細には、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからのｐｔｂ遺伝子は、アシルＣｏＡをアシルホスフェートへ変換し得る酵素をコードする（Walter et al. Gene 134(1): p. 107-11 (1993)); Huang et al. J Mol Microbiol Biotechnol 2(1): p. 33-38 (2000)）。さらなるｐｔｂ遺伝子は、ブチレート産生性細菌Ｌ２−５０（Louis et al. J.Bacteriol. 186:2099-2106 (2004)）およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（Vazquez et al. Curr.Microbiol 42:345-349 (2001)）に見出され得る。リン酸を転移するアシルトランスフェラーゼとしてさらなる例示的なものとしては、ｐｔａによってコードされるホスホトランスアセチラーゼが挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉからのｐｔａ遺伝子は、アセチルＣｏＡをアセチルホスフェートへ変換し得る酵素およびその逆の酵素をコードする（Suzuki, T. Biochim.Biophys.Acta 191:559-569 (1969)）。この酵素はまた、上記プロセスにおいてアセチルＣｏＡ形成プロピオネートの代わりにプロピオニルＣｏＡを利用し得る（Hesslinger et al. Mol.Microbiol 27:477-492 (1998)）。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１４６】
【表３４】
2013513384.tif 000036
【０１４７】
例示的なキナーゼとしては、ａｃｋＡによってコードされる、Ｅ．ｃｏｌｉアセテートキナーゼ（Skarstedt and Silverstein J.Biol.Chem. 251:6775-6783 (1976)）、ｂｕｋ１によってコードされるＣ． ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのブチレートキナーゼ（Walter et al. Gene 134(1):107-111 (1993); Huang et al. J Mol Microbiol Biotechnol 2(1):33-38 (2000)）、およびｐｒｏＢによってコードされるＥ．ｃｏｌｉ  γグルタミルキナーゼ（Smith et al. J.Bacteriol. 157:545-551 (1984)）が挙げられる。これらの酵素は、酢酸、ブチレートおよびグルタミン酸をそれぞれリン酸化する。Ｅ．ｃｏｌｉからのａｃｋＡ遺伝子産物はまた、プロピオン酸をリン酸化する（Hesslinger et al. Mol.Microbiol 27:477-492 (1998)）。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１４８】
【表３５】
2013513384.tif 000037
【０１４９】
あるいは、アセトアセチルＣｏＡまたは３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの加水分解は、単一の酵素または酵素複合体によって行われ得る。これは、アセトアセチルＣｏＡまたは３−ヒドロキシブチリルＣｏＡのシンテターゼ活性を示す。この活性は、どちらかの分子のＣｏＡ−エステルの正味の加水分解を可能にし、同時にＡＴＰの生成を生じる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＬＳＣ１遺伝子およびＬＳＣ２遺伝子の産物、ならびにＥ．ｃｏｌｉのｓｕｃＣ遺伝子およびｓｕｃＤ遺伝子の産物は、スクシニルＣｏＡシンｔネターゼ複合体を天然に形成し、これは、コハク酸からのスクシニルＣｏＡの形成を触媒し、付随してＡＴＰ１つを消費する。この反応はインビボで可逆的である（Gruys et al., US Patent No. 5,958,745, filed September 28, 1999）。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１５０】
【表３６】
2013513384.tif 000038
【０１５１】
さらなる例示的なＣｏＡリガーゼとしては、配列が未だ特徴付けられていないラットジカルボキシレートＣｏＡリガーゼ（Vamecq et al., Biochemical J. 230:683-693 (1985)）、Ｐ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍからの特徴付けられた２つのフェニルアセテートＣｏＡリガーゼのいずれか１つ（Lamas-Maceiras et al., Biochem. J. 395:147-155 (2005); Wang et al., Biochem Biophy Res Commun 360(2):453-458 (2007)）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａからのフェニルアセテートＣｏＡリガーゼ（Martinez-Blanco et al., J. Biol. Chem. 265:7084-7090 (1990)）、およびＢａｃｉｌｉｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓからの６−カルボキシヒキサノエートＣｏＡリガーゼ（Boweret al., J. Bacteriol. 178(14):4122-4130 (1996)）が挙げられる。さらなる酵素の候補は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（Hasegawa et al., Biochim. Biophys. Acta 1779:414-419 (2008)）およびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（Ohgami et al., Biochem. Pharmacol. 65:989-994 (2003)）からのアセトアセチルＣｏＡシンテターゼであり、これは、アセトアセテートのアセトアセチルＣｏＡへのＡＴＰ依存的変換を天然に触媒する。４−ヒドロキシブチリルＣｏＡシンテターゼ活性は、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａにて実証されている（Berg et al., Science 318:1782-1786 (2007)）。この機能はＭｓｅｄ＿１４２２遺伝子と名付けられている。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１５２】
【表３７】
2013513384.tif 000039
【０１５３】
ＡＰ形成アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＤ，ＥＣ  ６．２．１．１３）は、アシルＣｏＡエステルのその対応する酸への変換に関連する別の酵素であり、ＡＴＰの合成が付随する。広い酵素特異性を有するいくつかの酵素が文献に記載されている。ＡＦ１２１１によってコードされるＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓからのＡＣＤ  Ｉは、種々の直鎖および分枝鎖の基質（アセチルＣｏＡ，プロピオニルＣｏＡ、ブチリルＣｏＡ、酢酸、プロピオン酸、ブチレート、イソブチレート、イソバレレート、コハク酸、フマル酸、フェニルアセテート、インドール酢酸を含む。）に対して機能することが示されている（Musfeldt et al., J. Bacteriol. 184:636-644 (2002)）。Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉからの酵素（スクシニルＣｏＡシンテターゼとして称される。）は、プロピオン酸、ブチレート、および分子鎖の酸（イソバレレートおよびイソブチレート）を基質として受容し、順方向および逆方向に作用することが示されている（Brasen et al., Arch. Microbiol. 182:277-287 (2004）。好高熱性のｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｎであるＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍからのＰＡＥ３２５０によってコードされるＡＣＤは、特徴付けられたＡＣＤの全ての最も広い基質範囲を示し、アセチルＣｏＡ、イソブチリルＣｏＡ（好ましい基質）およびフェニルアセチルＣｏＡと反応する（Brasen et al., supra (2004)）。Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉおよびＰ．ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍからの酵素が全てクローニングされ、機能的に発現され、そしてＥ．ｃｏｌｉにて特徴付けられている（Musfeldt et al., supra; Brasen et al., supra (2004））。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１５４】
【表３８】
2013513384.tif 000040
【０１５５】
３−ヒドロキシブチレートの３−ヒドロキシブチルアルデヒドへの変換は、３−ヒドロキシブチレートレダクターゼによって行われ得る。同様に、アセトアセテートのアセトアセトアルデヒドへの変換は、アセトアセテートレダクターゼによって行われ得る。これらの転換に好適な酵素は、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓからのアリールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、あるいはカルボン酸レダクターゼである。カルボン酸レアクターゼは、マグネシウム、ＡＴＰおよびＮＡＤＰＨに依存性の、カルボン酸のその対応するアルデヒドへの還元を触媒する（Venkitasubramanian et al., J. Biol. Chem. 282:478-485 (2007)）。ｃａｒによってコードされるこの酵素はクローニングされており、Ｅ．ｃｏｌｉに機能的に発現されている（Venkitasubramanian et al., J. Biol. Chem. 282:478-485 (2007)）。ｎｐｔ遺伝子産物の発現は、翻訳後修飾を介してこの酵素の活性を改善する。ｎｐｔ遺伝子は、特定のホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする。これは、不活性なアポ酵素を活性なホロ酵素へ変換する。この酵素の天然の基質はバニリン酸であり、この酵素は、芳香族および脂肪族の基質に対する広い受容性を示す（Venkitasubramanian et al., in Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnology Industires, ed. R.N. Patel, Chapter 15, pp. 425-440, CRC Press LLC, Boca Raton, FL. (2006)）。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１５６】
【表３９】
2013513384.tif 000041
【０１５７】
さらなるｃａｒ遺伝子およびｎｐｔ遺伝子が配列相同性に基づいて同定され得る：
【０１５８】
【表４０】
2013513384.tif 000042
【０１５９】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓに見出されるさらなる酵素の候補は、ｇｒｉＣ遺伝子およびｇｒｉ２遺伝子によってコードされる。この酵素は、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を３−アミノ−４−ヒドロキシベンズアルデヒドへ変換すると考えられている。なぜなら、ｇｒｉＣまたはｇｒｉＤのいずれかの欠失が、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸代謝の副（ｓｈｕｎｔ）生成物である３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の、細胞外への集積を導くからである（Suzuki, et al., J. Antibiot. 60(6):380-387 (2007)）。Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓのｎｐｔに配列類似性を有する酵素であるＳＧＲ＿６６５を用いたｇｒｉＣおよびｇｒｉＤの同時発現は、有益である。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１６０】
【表４１】
2013513384.tif 000043
【０１６１】
同様の特徴を有する酵素であるα−アミノアジペートレダクターゼ（ＡＡＲ，ＥＣ  １．２．１．３１）は、いくつかの真菌種におけるリジン生合成経路に関する。この酵素は、α−アミノアジペートをα−アミノアジペートセミアルデヒドへ天然に還元する。このカルボキシル基は、先ず、ＡＴＰ依存的なアルデヒド形成を介して活性化され、次いで、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈによって還元されてアルデヒドおよびＡＭＰが得られる。ＣＡＲのように、この酵素はマグネシウムを利用し、ＰＰＴａｓｅによる活性化を必要とする。ＡＡＲおよび対応するＰＰＴａｓｅについての酵素候補は、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Morris et al., Gene 98:141-145 (1991)）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Guo et al., Mol. Genet. Genomics 269:271-279 (2003)）、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Ford et al., Curr. Genet. 28:131-137 (1995)）に見出される。Ｓ．ｐｏｍｂｅからのＡＡＲは、Ｅ．ｃｏｌｉに発現された場合に顕著な活性を示す（Guo et al., Yeast21:1279-1288 (2004）。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍからのＡＡＲは、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システインを代替基質として受容するが、アジピン酸、Ｌ−グルタミン酸またはジアミノピメレートと反応しない（Hijarrubia et al., J. Biol. Chem. 278:8250-8256 (2003)）。Ｐ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのＰＰＴａｓｅをコードする遺伝子は現在まで同定されていない。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１６２】
【表４２】
2013513384.tif 000044
【０１６３】
これらのＣＡＲまたはＣＡＲのような酵素のいずれかは、実質的に３−ヒドロキシブチレートまたはアセトアセテートのレダクターゼ活性を示し得るか、あるいはそのように操作され得る。
【０１６４】
必須の３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼは、アセトアセテートを還元して３−ヒドロキシブチレートを触媒する。例示的な酵素が、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ（Kosjek et al., Biotechnol Bioeng. 86:55-62 (2004)）およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（van der et al., Eur.J.Biochem. 268:3062-3068 (2001)）に見出され得る。この転換を行い得るさらなる第二アルコールデヒドロゲナーゼ酵素としては、Ｃ． ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉからのａｄｈ（Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007); Jojima et al., Appl Microbiol Biotechnol 77:1219-1224 (2008)）およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｏｃｋｉｉからのａｄｈ（Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007); Peretz et al., Anaerobe 3:259-270 (1997)）が挙げられる。Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ （Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ） ＭｅｌｉｌｏｔｉからのｂｄｈＡ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉへのクローニングは、３−ヒドロキシブチレート（Aneja and Charles, J. Bacteriol. 181(3):849-857 (1999)）を炭素源として利用する能力を与える。さらなる３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ（Ito et al., J. Mol. Biol. 355(4) 722-733 (2006)）およびＲａｌｓｔｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ（Takanashi et al., Antonie van Leeuwenoek, 95(3):249-262 (2009)）に見出され得る。これらのタンパク質および遺伝子に関する情報を以下に示す：
【０１６５】
【表４３】
2013513384.tif 000045
【０１６６】
ＣＯ２、ＣＯおよび／またはＨ２をアセチルＣｏＡへ変換する能力を外来宿主（例えばＥ．ｃｏｌｉ）に操作することは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の種々のタンパク質をコードする外因性遺伝子の発現に続いて達成され得る。上記アセチルＣｏＡは、全ての細胞塊成分および有用な多くの生成物が由来し得る主要な代謝物である。上記の経路は、1942年に単離されてからＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を解析するためのモデル生物であるＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（かつてはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）のような酢酸生産性生物で高い活性作用を有する（Fontaine et al., J Bacteriol. 43:701-715 (1942)）。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は二つの枝を含む：ＣＯ２をメチルテトラヒドロフルオレート（Ｍｅ−ＴＨＦ）へ変換することができる東（Ｅａｓｔｅｒｎ）分枝（すなわちメチル分枝）、および、メチル−ＴＨＦ、ＣＯおよび補酵素ＡをアセチルＣｏＡへ変換することができる西（Ｗｅｓｔｅｒｎ）分枝（すなわちカルボニル分枝）（図５を参照）。本明細書において、本発明者らは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のメチル分枝およびカルボニル分枝を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然の微生物を記載する。このような生物は、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２をアセチルＣｏＡ、細胞塊および生成物へ変換することができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、図５に示された経路を利用する非天然の生物は、以下の３つの能力を示す：（１）Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の機能的メチル分枝（ＴＨＦおよびＣＯ２を５−メチルテトラヒドロ葉酸へ変換し得る）；（２）ＣＯ、補酵素Ａ、および、Ｍｅ−ＴＨＦのメチル基を結合してアセチルＣｏＡを形成する能力；および（３）アセチルＣｏＡから１，３−ブタンジオールを合成する能力。
【０１６８】
このような非天然の生物は、外因性のＣＯおよび／または外因性のＣＯ２もしくは外因性に産生されたＣＯ２から炭素を「固定」して、アセチルＣｏＡ、細胞塊および生成物を合成し得る。３つの能力を用いて操作された、アナプレロティック反応（anaplerosis）についての能力も天然に有する宿主生物（例えばＥ．ｃｏｌｉ）は、好適な外部電子受容体（例えばニトレート）の存在下で、合成ガス生成アセチルＣｏＡに対して増殖し得る。この電子受容体は、コハク酸デヒドロゲナーゼを介して形成された還元キノンから電子を受容することを必要とされる。外部電子受容体を添加することのさらなる利点は、細胞の増殖、維持、および生成物の形成のためのさらなるエネルギーがアセチルＣｏＡの呼吸から生成され得ることである。代替の戦略は、ピルベートフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）酵素、またはピルベートをアセチルＣｏＡへ変換する他の酵素を、外部電子受容体の非存在下にてバイオマス前駆体を合成し得る系統へ操作することを含む。操作した生物のさらなる特徴は、水素分子から還元等量を抽出する能力である。これは、還元生成物（例えば、エタノール、ブタノール、イソブタノール、イソプロパノール、１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、コハク酸、フマル酸、マレインさん、４−ヒドロキシブチル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、乳酸、アジピン酸、メタクリル酸およびアクリル酸）の収量を高めることを可能にする。
【０１６９】
非天然の生物は、アセチルＣｏＡ、細胞塊、および標的化された化学物質（より詳細には１，３−ブタンジオール）を、（１）ＣＯ、（２）ＣＯ２およびＨ２、（３）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、（４）ＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、（５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガス、ならびに（６）１つ以上の炭水化物、から、産生する。例示的な炭水化物としては、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノースおよびグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２をアセチルＣｏＡへ変換するために使用される酵素は、図５に示される。ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２の利用のための生産宿主を操作するために、これらの酵素をコードする１つ以上の外因性のＤＮＡ配列がこの微生物中に発現され得る。図５を参照して、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を利用するために組み込まれ得る酵素が、以下に記載される。
【０１７１】
ギ酸デヒドロゲナーゼは、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにてＣＯ２をホスメートに取り込むことを触媒する、２つのサブユニットのセレノシステイン含有タンパク質である（Andreesen and Ljungdahl, J. Bacteriol. 116.2:867-873 (1973); Li et al., J. Bacteriol. 92.2:405-412 (1966); Yamamoto et al..J. Biol. Chem. 258.3:1826-1832 (1983)）。遺伝子座Ｍｏｔｈ＿２３１２およびＭｏｔｈ＿２３１３は、ギ酸デヒドロゲナーゼのαサブユニットをコードすることを担っている、実際に１つの遺伝子であり、βサブユニットはＭｏｔｈ＿２３１４によってコードされる（Pierce et al. Environ. Microbiol. 10:2550-2573 (2008)）。ＣＯ２還元の指向性を有するギ酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする別の遺伝子セットは、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ ｆｕｍａｒｏｘｉｄａｎｓにおけるＳｆｕｍ＿２７０３〜Ｓｆｕｍ＿２７０６によってコードされる（Reda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105.31:10654-10658 (2008); de Bok et al., Eur. J. Biochem. 270.   11: 2476-2485 (2003)）。Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａでのこれらの相同物と同様に、Ｓｆｕｍ＿２７０５およびＳｆｕｍ＿２７０６は実は１つの遺伝子である。同一の機能を行うことが予測される類似の遺伝子セットは、Ｃ． ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓにてＣＨＹ＿０７３１、ＣＨＹ＿０７３２およびＣＨＹ＿０７３３によってコードされる（Wu et al., PLoS Genet.1.5:e65 (2005)）。関連する遺伝子及びタンパク質の情報は、以下に示す情報より得ることができる：
【０１７２】
【表４４】
2013513384.tif 000046
【０１７３】
ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼは、ＡＴＰを１つ消費してホルメートをテトラヒドロ葉酸に連結する。この反応は、Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにてＭｏｔｈ＿０１０９の遺伝子産物によって（O'brien et al., Experientia Suppl.26:249-262 (1976); Lovell et al., Arch. Microbiol. 149.4:280-285 (1988); Lovell et al., Biochemistry 29.24:5687-5694 (1990)）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｉｄｕｒｉｃｉにてＦＨＳの遺伝子産物によって（Whitehead and Rabinowitz, J. Bacteriol. 167.1:205-209 (1986); Whitehead and Rabinowitz, J. Bacteriol. 170.7:3255-3261 (1988)）、そして、Ｃ． ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓにてＣＨＹ＿２３８５によって（Wu et al., PLoS Genet.1.5:e65 (2005)）、触媒される。関連する遺伝子およびタンパク質の情報は、以下に示される情報より得られる：
【０１７４】
【表４５】
2013513384.tif 000047
【０１７５】
Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｅ． ｃｏｌｉおよびＣ． ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓにおいて、メチニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼは、Ｍｏｔｈ＿１５１６、ｆｏｌＤおよびＣＨＹ＿１８７８の二官能性の遺伝子産物によって行われる。これらの遺伝子はそれぞれ、Pierce et al. Environ. Microbiol. 10:2550-2573 (2008)；Wu et al., PLoS Genet.1.5:e65 (2005)；ならびにD'Ari and Rabinowitz, J. Biol. Chem. 266.35:23953-23958 (1991)に記載される。関連する遺伝子およびタンパク質の情報は、以下に示される情報より得られる：
【０１７６】
【表４６】
2013513384.tif 000048
【０１７７】
Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａおよびＣ． ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓにおいて、メチニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼおよびメチｒンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼは、Ｍｏｔｈ＿１５１６、ｆｏｌＤおよびＣＨＹ＿１８７８の二官能性の遺伝子産物によって行われる。これらの遺伝子はそれぞれ、Pierce et al. Environ. Microbiol. 10:2550-2573 (2008)；Wu et al., PLoS Genet.1.5:e65 (2005)；ならびにD'Ari and Rabinowitz, J. Biol. Chem. 266.35:23953-23958 (1991)に記載される。関連する遺伝子およびタンパク質の情報は、以下に示される情報より得られる：
【０１７８】
【表４７】
2013513384.tif 000049
【０１７９】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のメチル分枝の第１ステップは、メチレンテトラヒドロ葉酸デダクターゼによって行われる。Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにおいて、この酵素は酸素感受性であり、鉄−硫黄クラスターを含む（Clark and Ljungdahl, J. Biol. Chem. 259.17:10845-10849 (1984)）。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉにてｍｅｔＦ（Sheppard et al., J. Bacteriol. 181.3:718-725 (1999)）によって、Ｃ． ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓにてＣＨＹ＿１２３３（Wu et al., PLoS Genet.1.5:e65 (2005)）によってコードされる。Ｍ． ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの遺伝子およびＣ． ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓにおけるその相同物は、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ遺伝子クラスターの近くに位置され、推定のヒドロゲナーゼ遺伝子およびテトラジスルフィドレダクターゼ遺伝子によって分けられる。
【０１８０】
【表４８】
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【０１８１】
Ｅ．ｃｏｌｉは、要求される形質転換のいくつかについての能力（すなわち、メチニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ）を天然に有しているが、アセトゲンからのメチル分枝の酵素は、非アセトゲンからのものよりも非常に高い（５０〜１００×）の比活性を有し得る（Morton et al., Genetics and molecular biology of anaerobic bacteria, Ed. M. Sebald, New York: Springer Verlag (1992) pages 389-406）。ギ酸デヒドロゲナーゼは、嫌気性条件に特化し得る（Ljungdahl and Andreesen, FEBS Lett. 54.2:279-282 (1975)）。よって、これらの各々の、ネイティブでない種々のバージョンが、メタノールならびにＣＯ２、ＣＯおよび／またはＨ２を利用し得るＥ．ｃｏｌｉの系統に発現され得る。詳細には、これらの遺伝子はクローニングされ得、そしてセットとしてこれらを発現するように設計された発現ベクターに連結され得る。最初に、高コピー数または中程度のコピー数のベクターが選択され得る（ＣｏｌＥまたはＰ１５Ａのレプリコンを用いる）。例示的なプロモータは強力な構成的プロモータ（例えばλｐＬまたはこのＩＰＴＧ誘導可能バージョン、ｐＬ−ｌａｃＯ）である（Lutz and Bujard, Nucleic Acids Res. 25.6:1203-1210 (1997)）。人工オペロンを作製するために、５’末端プロモータを１つ、遺伝子セットの上流に配置し、各遺伝子はコンセンサスｒｂｓエレメントを受容する。遺伝子の順序は、可能な限り天然の順序に基づく。最終的に、これらの遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉの染色体へ組み込まれる。記載された酵素アッセイが行われる（Ljungdahl and Andreesen, Methods Enzymol. 53:360-372 (1978); Yamamoto et al.. J. Biol. Chem. 258.3:1826-1832 (1983); Lovell et al., Arch. Microbiol. 149.4:280-285 (1988); de Mata and Rabinowitz, J. Biol. Chem. 255.6:2569-2577 (1980); D'Ari and Rabinowitz , J. Biol. Chem. 266.35:23953-23958 (1991); Clark and Ljungdahl, 259.17:10845-10849 (1984); Clark and Ljungdahl, Methods Enzymol. 122:392-399 (1986)）。
【０１８２】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のカルボニル分枝およびメチル分枝の両方を発現するＥ．ｃｏｌｉ系統を構築した後に、これらを、アセチルＣｏＡ、細胞塊、１，３−ブタンジオールへの取り込みのためにＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を利用する能力についてアッセイする。最初の条件は、外因性のグルコースを用いる条件で厳密に嫌気的に増殖する細胞を使用する。グルコースまたは他の炭水化物をアセチルＣｏＡに代謝することは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を介して固定され得るＣＯ２の潜在的供給源の１つを提供する。あるいは、グルコースに加えて、ニトレートが、電子受容体および増殖開始因子として作用するように発酵ブロスへ添加され得る。脂肪酸に対するＥ．ｃｏｌｉの嫌気性増殖は最終的にアセチルＣｏＡｎｉ代謝され、ニトレートの存在かで実証される（Campbell et al., Mol. Microbiol. 47.3:793-805 (2003)）。酸素はまた、その細胞内レベルが操作された酵素の阻害閾値未満を維持する限り提供され得る。これらの実験に好適な組成の「合成ガス」がまた使用され得る。１３Ｃ標識ＣＯおよび／またはＣＯ２が細胞に提供され、そして分析質量分析を使用して標識された炭素のアセテート、１，３−ブタンジオールおよび細胞塊（例えば蛋白質性のアミノ酸への取り込みを測定する。
【０１８３】
合成ガスについてのプロセスの考察としては、高濃度のバイオマス、および良好な気体−液体質量移動が挙げられる（Bredwell et al., Biotechnol. Prog. 15.5:834-844 (1999)）。ＣＯの水への可溶性は、酸素の可溶性よりも幾分低い。連続的に気体を噴射した発酵は、質量分析によるコンスタントオフのガス分析、および定期的な液体サンプリング、およびＧＣおよびＨＰＬＣによる分析を用いて、制御された発酵にて実行され得る。液相はバッチ様式にて機能し得る。発酵産物（例えば、アルコール、有機酸、および残留メタノールを伴う残留グルコース）が、例えば、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（BioRad, Hercules CA）、グルコースおよびアルコールについての屈折指標検出器、ならびに、有機酸についてのＵＶ検出器を用いるＨＰＬＣ（Shimadzu, Columbia MD）によって、定量される。増殖速度が、分光光度計（６００ｎｍ）を用いて光学密度を測定することによって決定される。これらのシステムにおけるパイピングは、嫌気性条件を維持するために全てがガラスまたは金属である。ガス噴霧は、泡サイズを低減しかつ質量移動を改善するためにガラスフリットを用いて行われ得る。約０．１〜１ｖｖｍ（１分間あたりの気相の容積）の範囲の種々の噴霧速度が試験される。ガス取り込み速度の正確な測定値を得るために、定期的なチャレンジが行われ、ここで、ガスフローが一時的に停止され、ガス層組成が時間の関数としてモニタリングされる。
【０１８４】
全体的な標的の生産性に達するために、細胞の保持または再利用の方法が利用される。微生物濃度を増加させるための方法の１つは、副流からの接線方向のフロー膜を介して細胞を再利用することである。Ｍｏｏｒｅｌｌａによってアセテートの生産について以前に記載されたようなバッチ培養の反復（Sakai et al., J. Biosci. Bioeng. 99.3:252-258 (2005)）がまた、使用され得る。種々の他の方法もまた使用され得る（Bredwell et al., Biotechnol. Prog. 15.5:834-844 (1999); Datar et al., Biotechnol. Bioeng.86.5:587-594 (2004)）。さらなる最適化（例えば、１．５気圧での過加圧）が、質量移動の改善のために試験され得る（Najafpour and Younesi, Enzyme and Microbial Technology 38:223-228 (2006)）。
【０１８５】
純粋なＨ２／ＣＯをフィードとして用いることに満足なパフォーマンスが達成されると、市販の合成ガス中に存在すべきインヒビタを含む合成ガス混合物が生成され得る。例えば、典型的な純度のプロファイルは、４．５％ ＣＨ４、０．１％ Ｃ２Ｈ２、０．３５％ Ｃ２Ｈ６、１．４％ Ｃ２Ｈ４、および１５０ｐｐｍ  硝酸である（Datar et al., Biotechnol. Bioeng.86.5:587-594 (2004)）。ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、ｐ−キシレン、ｏ−キシレンおよびナフタレンのような化合物によって示されるタールが、生産に対する任意の効果について試験するためにｐｐｍレベルで添加される。例えば、４０ｐｐｍのＮＯがＣ． ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓに対して阻害性であることが示されている（Ahmed and Lewis, Biotechnol. Bioeng. 97.5:1080-1086 (2007)）。培養物が、発酵器へ移動される前に、振盪フラスコ培養にて試験され得る。この知見を用いて、合成ガスの純度についての明細を開発する。これは、スケールアップした研究および生産のために利用される。任意の特定の化合物が、スケールアップのために合成ガスから低減させることまたは除去することが困難であることが見出された場合、適応性の進化手順を利用して、１つ以上の不純物を許容するために細胞に適用される。
【０１８６】
本発明は、代謝性反応、反応物もしくはその生成物についての一般的な参考文献を用いて、あるいは、参照した代謝性反応、反応物もしくはその生成物に関連する酵素、またはこれらを触媒する酵素、あるいはこれらに関連するタンパク質、をコードする１つ以上の核酸または遺伝子についての特定の参考文献を用いて、本明細書中に記載される。本明細書中において他で明確に示されない限り、反応物または生成物に対する参照はまた、その反応を参照し、これらの代謝性構成成分のいずれかに対する参照はまた、参照した反応、反応物または生成物に関連する触媒酵素またはタンパク質をコードする遺伝子（単数または複数）を参照する。同様に、代謝の生化学、酵素学およびゲノム学の分野で周知である場合、遺伝子またはコード核酸に対する本明細書中での参照はまた、対応するコードされる酵素およびこの酵素が触媒する反応、あるいは反応、ならびにこの反応の反応物および生成物に関連するタンパク質に対する参照を構成する。
【０１８７】
本発明の非天然の微生物は、１つ以上の１，３−ブタンジオール生合成経路に関連する酵素またはタンパク質の１つ以上をコードする核酸を発現可能に導入することによって産生され得る。生合成について選択された宿主微生物に依存して、特定の１，３−ブタンジオール生合成経路のいくつかまたは全てについての核酸が発現され得る。例えば、選択された宿主が、所望の生合成毛糸についての１つ以上の酵素またはタンパク質を欠く場合、欠失した酵素またはタンパク質についての発現可能な核酸が、引き続く外因性発現のためにその宿主へ導入される。あるいは、選択された宿主が経路の遺伝子のいくつかの外因性の発現を示すが、他を欠失している場合、コード核酸が、１，３−ブタンジオール生合成を達成するために、欠失した酵素またはタンパク質が必要とされる。よって、本発明の非天然の微生物は、所望の生合成経路を得るために外因性の酵素活性またはタンパク質活性を導入することによって産生され得る。あるいは、所望の生合成経路は、１つ以上の外因性の酵素またはタンパク質を導入することによって取得され得る。
上記１つ以上の外因性の酵素またはタンパク質は、１つ以上の外因性の酵素またはタンパク質と一緒に、所望の生成物（例えば１，３−ブタンジオール）を生成する。
【０１８８】
宿主微生物は、例えば、細菌、酵母、真菌、藻類、シアノバクテリア、または発酵プロセスに供し得る種々の他の微生物のいずれかより選択され得、そして非天然の微生物が生成され得る。例示的な細菌としては以下より選択される種が挙げられる：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ，およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ。例示的な酵母または真菌としては以下より選択される種が挙げられる：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｕｓ ｏｒｙｚａｅなど。例示的なシアノバクテリアの例としては以下が挙げられる：Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ ＭＢＩＣ１１０１７、Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ． ＰＣＣ ７１２０、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９４１３、Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ ＴＬＳ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ． ＡＴＣＣ ５１１４２、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ ＰＣＣ ７４２１、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＮＩＥＳ−８４３、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ ＡＴＣＣ ２９１３３、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＭＥＤ４、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＭＩＴ９３１３、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＳＳ１２０、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ． ＡＳ９６０１、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ． ＭＩＴ ９２１１、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ． ＭＩＴ ９２１５、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ． ＭＩＴ ９３０１、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ． ＭＩＴ ９３０３、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ． ＭＩＴ ９３１２、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ． ＭＩＴ ９５１５、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ． ＮＡＴＬ１Ａ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ． ＮＡＴＬ２Ａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎ���ｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＣＧＡ００９、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ６３０１、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＣＣ９３１１、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＣＣ９６０５、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＣＣ９９０２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＪＡ−２−３Ｂ／’ａ（２−１３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＪＡ−３−３Ａｂ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＰＣＣ ７００２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＲＣＣ３０７、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＷＨ ７８０３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＷＨ８１０２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ ６８０３、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ ＩＭＳ１０１．例示的な藻類の例としては以下が挙げられる：Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｓｐ．、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｐｒｉｍｏｌｅｃｔａ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．、Ｍｏｎａｌｌａｎｔｈｕｓ ｓａｌｉｎａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ ｓｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｓｐ．、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｕｅｉｃａ。Ｅ．ｃｏｌｉは特に有用な宿主微生物である。なぜなら、Ｅ．ｃｏｌｉは十分に特徴付けられた、遺伝子操作に好適な微生物だからである。任意の好適な微生物宿主を使用して代謝性および／または遺伝的な改変を導入して所望の生成物を産生することが理解される。
【０１８９】
選択された宿主微生物の１，３−ブタンジオール生合成経路構成成分に依存して、本発明の非天然の微生物は、少なくとも１つの外因性に発現した１，３−ＢＤＯ経路をコードする核酸を含み、１つ以上の１，３−ブタンジオール生合成経路についてのコード核酸を全て以下含む。例えば、経路の酵素またはタンパク質を欠く宿主において、１，３−ブタンジオール生合成は、対応するコード核酸の外因性の発現を介して達成され得る。１，３−ブタンジオール経路の酵素またはタンパク質の全てを欠く宿主において、この経路における酵素またはタンパク質の全ての外因性の発現が含まれ得る。これは、宿主が経路の酵素またはタンパク質の少なくとも１つを含む場合であっても、経路の酵素またはタンパク質の全てが発現され得ることが理解される。例えば、１，３−ブタンジオールの産生のための経路における以下の酵素またはタンパク質の全ての外因性の発現が含まれ得る：例えば、図４に示されるような、１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１３）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、１４）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；、１５）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１６）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、１７）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；、１８）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、１９）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、２０）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ（アルコール形成）、２１）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼまたはシンセターゼ、２２）アセトアセテートレダクターゼ、２３）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼまたはシンセターゼ、２４）３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、ならびに、２５）３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ。
【０１９０】
あるいは、図５に示されるような、１，３−ブタンジオールの産生のための経路における以下の酵素またはタンパク質の全ての外因性の発現が含まれ得る：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、１５）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、１６）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ、１７）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１８）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、１９）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ、２０）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、２１）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、２２）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、２３）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、又はシンセターゼ、２４）アセトアセテートレダクターゼ、２５）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ又はシンセターゼ、２６）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ、ならびに、２７）３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ。
【０１９１】
本明細書中にて提供される教示およびガイダンスによって、当業者は、発現可能な形態にて導入されるコード核酸の数が、少なくとも、選択された宿主微生物の１，３−ブタンジオール経路欠損と対応することを、理解する。よって、本発明の非天然の微生物は、本明細書中で開示されかつ図４および５に示される１，３−ブタンジオール生合成経路を構成する酵素またはタンパク質をコードする核酸を、全て以下（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個）有する。いくつかの実施形態において、非天然の微生物はまた、他の遺伝的改変を含み得る。これは、１，３−ブタンジオール生合成を容易にするかまたは最適化する、あるいは、宿主微生物に有用な機能を付与する。このような他の機能の１つとしては例えば、１，３−ブタンジオール経路前駆体（例えば、アセチルＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ、アセトアセチレート、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、３−オキソブチルアルデヒドまたはヒドロキシブチルアルデヒド）の１つ以上の合成の増大が挙げられ得る。
【０１９２】
一般に、宿主微生物は、１，３−ブタンジオール経路の前駆体を、天然に産生される分子または操作された生成物として産生するように選択される。これらは、所望の前駆体のｄｅ  ｎｏｖｏ産生、あるいは、宿主微生物によって天然に産生される前駆体の増加した産生のいずれかを提供する。例えば、アセチルＣｏＡは、宿主微生物（例えばＥ．ｃｏｌｉ）にて天然に産生される。宿主微生物は、本明細書中に開示されるような前駆体の産生を増加するように操作され得る。さらに、所望の前駆体を産生するように操作されている微生物は、宿主生物として使用され得、１，３−ブタンジオール経路の酵素またはタンパク質を発現するようにさらに操作され得る。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、本発明の非天然の微生物は、１，３−ブタンジオールを合成する酵素的能力を含む宿主から生成される。この実施形態において、例えば、１．３−ブタンジオール経路反応を１，３−ブタンジオール生産へ向けて駆動するために、本発明の非天然の微生物は、１，３−ブタンジオール経路の生成物の合成または集積を増大させるために有用であり得る。増大した合成または集積は、例えば、上記１，３、−ブタンジオール経路の酵素またはタンパク質の１つ以上をコードする核酸の過剰発現によって達成され得る。タ１，３−ブタンジオール経路の酵素および／またはタンパク質の過剰発現は、例えば外因性の遺伝子の外因性の発現を介して、あるいは、異種性の遺伝子の外因性の発現を介して、生じ得る。よって、天然の微生物は、本明細書中で開示されかつ図４および５に示される１，３−ブタンジオール生合成経路を構成する酵素またはタンパク質をコードする核酸の、全て以下（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個）の過剰発現を介して例えば、１，３−ブタンジオールを産生する本発明の非天然の微生物として容易に生成され得る。さらに、非天然の微生物は、１，３−ブタンジオール生合成経路における酵素の活性増加を生じる内因性遺伝子の変位誘発によって生成され得る。
【０１９４】
特に有用な実施形態において、コード核酸の外因性の発現が使用される。外因性の発現は、発現エレメントおよび／または調節エレメントを特別に調整する能力、ならびに、使用者によって制御される所望の発現レベルを達成するための適用を、宿主に付与する。しかし、外因性の発現はまた、誘導性プロモータまたは他の調節エレメントに連結された場合に、ネガティブな調節エフェクタまたは遺伝子のプロモータの誘導を除去することによって、他の実施形態にて利用され得る。よって、天然の誘導性プロモータを有する外因性遺伝子は、適切な誘導剤を提供することによって情報制御され得、内因性の遺伝子の調節領域は、誘導性の調節エレメントを組み込むように操作され得、これにより、内因性の遺伝子の発現増大を所望の時点で調節することを可能にする。同様に、誘導性のプロモータは、非天然の微生物に導入された外因性の遺伝子についての調節エレメントとして含まれ得る。
【０１９５】
本発明の方法において、１つ以上の外因性核酸のいずれかが、本発明の非天然の微生物を生成するために微生物へ導入され得ることが理解される。核酸は、例えば、１，３−ブタンジオール生合成経路を微生物に付与するように導入され得る。あるいは、コード核酸は、生合成能を有する中間体微生物を生成して、必要とされる反応のいくつかを触媒して１，３−ブタンジオール生合成能を付与するために導入され得る。例えば、１，３−ブタンジオール生合成経路を有する非天然の微生物は、所望の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも２つの外因性核酸を含み得る。よって、生合成経路の２つ以上の酵素またはタンパク質の任意の組合せが、本発明の非天然の微生物に含まれ得ることが理解される。同様に、生合成経路の３つ以上の酵素またはタンパク質の任意の組合せが、本発明の非天然の微生物に含まれ得ることが理解される。同様に、所望される場合、所望の生合成経路の酵素および／またはタンパク質の組合せが対応する所望の生成物の産生を生じる限り、生合成経路の４つ以上の酵素またはタンパク質の任意の組合せが、本発明の非天然の微生物に含まれ得る。同様に、所望される場合、所望の生合成経路の酵素および／またはタンパク質の組合せが対応する所望の生成物の産生を生じる限り、生合成経路の５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個の酵素またはタンパク質の任意の組合せが、本発明の非天然の微生物に含まれ得る。
【０１９６】
本明細書に開示されるように、本発明の非天然の微生物に含まれる、生合成経路の１７個の外因性の酵素またはタンパク質の例示的な組合せとしては、以下が挙げられる：
Ａ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼもしくはアセトアセチルＣｏＡシンセターゼ、１５）アセトアセテートレダクターゼ、１６）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、または１７）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；
Ｂ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼもしくはアセトアセチルＣｏＡシンセターゼ、１５）アセトアセテートレダクターゼ、１６）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、または１７）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；
Ｃ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、１５）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼもしくは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンセターゼ、１６）３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、または１７）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；
Ｄ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼもしくはアセトアセチルＣｏＡシンセターゼ、１５）３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、１６）３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、または１７）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ。
【０１９７】
本明細書に開示されるように、本発明の非天然の微生物に含まれる、生合成経路の１６個の外因性の酵素またはタンパク質の例示的な組合せとしては、上記Ａ〜Ｄに開示された１７個の酵素のうちの１６の任意の組合せ、あるいは以下が挙げられる：
Ｅ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１５）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、および１６）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；
Ｆ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１５）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、および１６）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；
Ｇ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、１５）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、および１６）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ。
【０１９８】
本明細書に開示されるように、本発明の非天然の微生物に含まれる、生合成経路の１５個の外因性の酵素またはタンパク質の例示的な組合せとしては、上記Ａ〜Ｇに開示された酵素のうちの１５の任意の組合せ、あるいは以下が挙げられる：
Ｈ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、および１５）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；
Ｉ：１）ギ酸デヒドロゲナーゼ、２）ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、３）メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、４）メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、５）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、６）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、７）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、８）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、９）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、１０）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、１１）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１２）ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、１３）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、および１５）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）；
Ｊ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンセターゼ、１３）アセトアセテートレダクターゼ、１４）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、１５）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；
Ｋ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンセターゼ、１３）アセトアセテートレダクターゼ、１４）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、１５）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；
Ｌ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、１３）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンセターゼ、１４）３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、１５）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；
Ｍ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンセターゼ、１３）３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、１４）３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、１５）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ。
【０１９９】
本明細書に開示されるように、本発明の非天然の微生物に含まれる、生合成経路の１４個の外因性の酵素またはタンパク質の例示的な組合せとしては、上記Ａ〜Ｍに開示された酵素のうちの１４の任意の組合せ、あるいは以下が挙げられる：
Ｎ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１３）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、および１４）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ；
Ｏ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、１３）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、および１４）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ；
Ｐ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、１３）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、および１４）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ。
【０２００】
本明細書に開示されるように、本発明の非天然の微生物に含まれる、生合成経路の１３個の外因性の酵素またはタンパク質の例示的な組合せとしては、上記Ａ〜Ｐに開示された酵素のうちの１３の任意の組合せ、あるいは以下が挙げられる：
Ｑ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、および１３）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）；
Ｒ：１）メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、２）コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、３）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、４）メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、５）コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、６）ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、７）フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、８）アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、９）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、１０）ヒドロゲナーゼ、１１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、１２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、および１３）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ。
【０２０１】
本明細書に開示されるように、本発明の非天然の微生物に含まれる、生合成経路の１２個の外因性の酵素またはタンパク質の例示的な組合せとしては、上記Ａ〜Ｒに開示された酵素のうちの１２の任意の組合せが挙げられる。本明細書に開示されるように、本発明の非天然の微生物に含まれる、生合成経路の１１個の外因性の酵素またはタンパク質の例示的な組合せとしては、上記Ａ〜Ｒに開示された酵素のうちの１１の任意の組合せが挙げられる。本明細書に開示されるように、本発明の非天然の微生物に含まれる、生合成経路の９個の外因性の酵素またはタンパク質の例示的な組合せとしては、上記Ａ〜Ｒに開示された酵素のうちの９の任意の組合せが挙げられる。本明細書に開示されるように、本発明の非天然の微生物に含まれる、生合成経路の７個の外因性の酵素またはタンパク質の例示的な組合せとしては、上記Ａ〜Ｒに開示された酵素のうちの７の任意の組合せが挙げられ、同様に、上記Ａ〜Ｒに開示された酵素の２つの任意の組合せにまで落とし込むことができる。
【０２０２】
本明細書中に記載される場合、１，３−ブタンジオールの生合成に加えて、本発明の非天然の微生物および方法はまた、互いに、あるいは当該分野にて周知の他の微生物および方法との種々の組合せにて、他の経路による生成物生合成を実現するために利用され得る。例えば、１，３−ブタンジオールプロデューサの使用以外に１，３−ブタンジオールを産生するための代替の１つは、１，３−ブタンジオール経路の中間体を１，３−ブタンジオールへ変換し得る別の微生物の添加を介するものである。このような手順の１つとしては、例えば、１，３−ブタンジオール経路の中間体を産生する微生物の発酵が挙げられる。次いで、１，３−ブタンジオール経路の中間体は、１，３−ブタンジオール毛色の中間体を１，３−ブタンジオールへ変換する第２の微生物についての基質として使用され得る。１，３−ブタンジオール経路の中間体は、第２の生物の別の培養物へ直接的に添加され得るか、あるいは、１，３−ブタンジオール経路の中間体のプロデューサの元々の培養物は、これらの微生物から例えば細胞分離によって枯渇され得、次いで、第２の生物の発酵ブロスへの添加は、中間体を精製する工程を行うことなく第１の生成物を産生するために利用され得る。
【０２０３】
他の実施形態において、本発明の非天然の微生物および方法は、例えば１，３−ブタンジオールの生合成を実現するために、広範な種々の副経路にアセンブリされ得る。これらの実施形態において、本発明の所望の生成物についての生合成経路は、異なる微生物へ分離され得、異なる微生物は、最終生成物を産生するために同時培養され得る。このような生合成スキームにおいて、特定の微生物の生成物は、最終の生成物が合成されるまで、第２の微生物についての基質である。例えば、１，３−ブタンジオールの生合成は、特定の経路の中間体から別の経路の中間体または生成物への変換のための生合成経路を含む微生物を構築することによって達成され得る。あるいは、１，３−ブタンジオールはまた、同一の容器内での２つの微生物を用いる同時培養または同時発酵を介して、微生物から生合成的に産生され得る。ここで、第１の微生物は、１，３−ブタンジオール中間体を産生し、第２の微生物は、その中間体を１，３−ブタンジオールへ変換する。
【０２０４】
本明細書中にて提供される教示およびガイダンスによって、当業者は、副経路を有する他の非天然の微生物の同時培養を用い、そして、１，３−ブタンジオールを生成するために当該分野にて周知のほかの化学的および／または生化学的な手順の組合せを用いる、本発明の非天然の微生物および方法についての、広範な種々の組合せおよび順列、ならびに他の微生物が存在することを、理解する。
【０２０５】
１，３−ブタンジオール経路の酵素またはタンパク質についてのコード核酸の供給源は、例えば、任意の種を含み、ここで、コードされる遺伝子産物が参照された反応を触媒し得る。このような種としては、原核生物および真核生物（細菌（古細菌、真正細菌を含む。）、真核生物（酵母、植物、藻類、昆虫、動物、ヒトを含む哺乳動物を含む。）を含むが、これらに限定されない。）が挙げられる。このような供給源のための例示的な主としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ならびに、本明細書中に開示される他の例示的な種または対応する遺伝子についの供給源生物として利用可能なものが挙げられる。しかし、現在では、３９５以上の微生物のゲノムおよび種々の酵母、真菌、植物および哺乳動物のゲノムを含む５５０種を超える完全なゲノム配列が利用可能である（これらの利用可能なものの半分以上がＮＣＢＩのような好適なデータベースにある）ので、関連種または異なる種における１つ以上の遺伝子について、必要な１，３−ブタンジオール生合成活性をコードする遺伝子の同定（例えば、公知の遺伝子の、ホモログ、オルソログ、パラログ、および非パラログ遺伝子の置換を含む。）、および生物間での遺伝的改変の置換えは、日常的な作業であり、当該分野において周知である。よって、Ｅ．ｃｏｌｉのような特定の生物を参照して本明細書中にて記載される１，３−ブタンジオールの生合成を可能にする代謝性の改変は、他の微生物（原核生物、真核生物など）に容易に適用され得る。本明細書中にて提供される教示およびガイダンスによって、当業者は、特定の生物において例証される代謝性の改変が他の生物に等価に適用され得ることを、理解する。
【０２０６】
いくつかの例において、例えば、関連しない種において代替の１，３−ブタンジオール生合成経路が存在する場合、１，３−ブタンジオール生合成は、例えば、関連しない種からのパラログの外因性発現によって、宿主種に付与され得る。上記パラログは、参照された反応を置換するために、同様であるが同一でない代謝性反応を触媒する。特定の種々の代謝性ネットワークが異なる生物間に存在するので、当業者は、異なる生物間で実際の遺伝子を用いることが異なるかもしれないことを理解する。しかし、本明細書中にて提供される教示およびガイダンスによって、当業者はまた、目的の種において１，３−ブタンジオールを合成する微生物を構築するために、本明細書中に例証されたものへの同系の代謝性変更を用いて本発明の教示および方法が全ての微生物に適用され得ることを理解する。
【０２０７】
非天然の１，３−ブタンジオール産生宿主を構築しかつその発現レベルを試験するための方法は、例えば、当該分野において周知の組換え法および検出法によって実行され得る。このような方法は、例えば以下に記載されていることが見出され得る：例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)。
【０２０８】
１，３−ブタンジオールの産生のための経路に関連する外因性の核酸配列は、当該分野において周知の技術を用いて宿主細胞へ安定的にまたは一過性に導入され得る。上記技術としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：接合（conjugation）、エレクトロポレーション、化学的形質転換、トランスダクション、トランスフェクション、および超音波形質転換。Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の原核生物細胞における外因性発現のために、真核生物の核酸の遺伝子またはＤＮＡおけるいくつかの核酸配列は、標的化シグナル（例えばＮ末端ミトコンドリア標的化シグナルまたは他の標的化シグナル）をコードし得る。これは、所望される場合、原核生物宿主細胞への形質転換の前に除去され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増加された発現を導くミトコンドリアリーダー配列の除去（Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)）。酵母または他の真核生物細胞における外因性発現のために、遺伝子は、リーダー配列を付加することなく細胞質中に発現され得るか、あるいはミトコンドリアまたは他の器官に標的化され得るか、あるいは好適な標的化配列（例えば、宿主細胞に好適なミトコンドリア標的化シグナルまたは分泌シグナル）を付加することによって分泌に標的化され得る。よって、核酸配列に対する、標的化配列を除去するかまたは含ませるための適切な改変が、外因性核酸配列に組み込まれて所望の特性を付与するということが、理解される。
【０２０９】
発現ベクターが、１つ以上の１，３−ブタンジオール生合成経路のコード核酸（例えば本明細書中に例示されているもの）を、宿主生物において機能的な発現制御配列に作動可能に連結されて含むように構築され得る。本発明の宿主微生物に使用可能な発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび人工染色体が挙げられ、ベクターおよび分泌配列または宿主染色体への安定的な組込みに作動可能なマーカーを含む。さらに、発現ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子および適切な発現制御配列を含み得る。選択マーカー遺伝子はまた、例えば、抗生物質または毒素に対する抵抗性、栄養要求性欠損の相補性を付与するもの、あるいは培養培地以外にて必須の栄養素を供給するものが含まれ得る。発現制御配列は、構成的かつ誘導性のプロモータ、転写エンハンサ、転写ターミネータなどを含み得、ｋろえらは当該分野において周知である。２つ以上の外因性のコード核酸が同時発現される場合、両方の核酸が、例えば、単一の発現ベクター中に、あるいは別々の発現ベクター中に挿入され得る。単一のベクターでの発現のために、コード配列は、特定の共通の発現制御配列に作動可能に連結され得るか、あるいは異なる発現制御配列（例えば、特定の誘導性プロモータおよび１つの構成的プロモータ）に連結され得る。代謝性経路すなわち合成経路に関連する外因性の核酸配列の形質転換は、当該分野において周知の方法を用いて確認される。このような方法としては、例えば、核酸分析（例えばノザンブロッティングまたはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ），ｍＲＮＡの増幅、または遺伝子産物の発現についてのイムノブロッティング）、あるいは導入した核酸配列またはその対応する遺伝子産物の発現を試験するに好適な他の分析方法を用いて確認され得る。外因性の核酸が、所望の生成物を十分量にて産生されることが、当業者に理解され、当該分野において周知の方法および本明細書中に開示された方法を用いて十分な発現を得るように発現レベルが最適化され得ることが理解される。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、本発明は、１，３−ＢＤＯを産生するための方法を提供する。本方法は、１，３−ＢＤＯを産生するに十分な量にて発現された１，３−ＢＤＯ経路の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性の核酸を有する１，３−ＢＤＯ経路を有する非天然の微生物を、１，３−ＢＤＯを産生するための条件下にて１，３−ＢＤＯを産生するに十分な期間にわたって培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、１，３−ＢＤＯ経路は、以下を含む：メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、コリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンセターゼ、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンセターゼ、またはアセトアセテートレダクターゼ。
【０２１１】
他の実施形態において、本発明は、１，３−ＢＤＯを産生するための方法を提供する。本方法は、１，３−ＢＤＯを産生するに十分な量にて発現された１，３−ＢＤＯ経路の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性の核酸を有する１，３−ＢＤＯ経路を有する非天然の微生物を、１，３−ＢＤＯを産生するための条件下にて１，３−ＢＤＯを産生するに十分な期間にわたって培養する工程を包含する。１，３−ＢＤＯ経路は以下を含む：ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）、ニッケル−タンパク質会合タンパク質（ＡｃｓＦ＆ＣｏｏＣ）、フェレドキシン（Ｏｒｆ７）、アセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡｃｓＢ＆ＡｃｓＣ）、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）、ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＡｔｏＢ）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンセターゼ、３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡヒドロラーゼ、またはアセトアセチルＣｏＡシンセターゼ。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、非天然の微生物を培養する工程は、１，３−ＢＤＯを産生するための条件下にて１，３−ＢＤＯを産生するに十分な期間にわたって培養することを含む。いくつかの実施形態において、培養する工程は、実質的に嫌気性の培養媒体にて行われる。いくつかの実施形態において、微生物の少なくとも１つの外因性の核酸は、異種性の核酸である。上述したように、培養された非天然の微生物は、任意の数（１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７を含み、これらｈ１，３−ＢＤＯ経路をコードする核酸の全て以下である。）の外因性の核酸を１，３−ＢＤＯ経路に有する。本発明の非天然の微生物は、以下より選択される炭素フィードバックを利用し得る：１）メタノールおよびＣＯ、２）メタノール、ＣＯ２およびＨ２、３）メタノール、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）メタノール、ならびにＣＯおよびＨ２からなる合成ガス、５）メタノール、ならびにＣＯ、ＣＯ２およびＨ２からなる合成ガス、６）１つ以上の炭化水素、７）メタノールおよび１つ以上の炭化水素、ならびに８）メタノール。いくつかの実施形態において、炭素フィードバックは、以下より選択される：１）ＣＯ、２）ＣＯ２およびＨ２、３）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）ＣＯおよびＨ２からなる合成ガス、５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２からなる合成ガス、６）１つ以上の炭化水素。
【０２１３】
１，３−ブタンジオールの好適な精製および／または１，３−ブタンジオールの産生について試験するためのアッセイは、周知の方法を用いて行われ得る。好適な複製物（例えば、三連の培養物）は、試験されるべき操作された系統の各々について増殖され得る。例えば、操作された宿主における生成物および副生成物の形成がモニタリングされ得る。最終生成物および中間体、ならびに他の有機化合物が、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィ−質量分析）、およびＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィ−質量分析）のような方法、あるいは、当該分野において周知の慣用的な手順を用いる好適な他の分析方法によって分析され得る。発酵ブロスにおける生成物の放出はまた、培養上清を用いて試験され得る。副生成物および残留グルコースが、例えば、グルコースおよびアルコールについての屈折指標検出器、ならびに、有機酸についてのＵＶ検出器（Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779 (2005)）を用いるＨＰＬＣによって、あるいは、当該分野において周知のほかの好適なアッセイおよび検出法を用いて、定量される。外因性のＤＮＡ配列からの個々の酵素またはタンパク質の活性がまた、当該分野において周知の方法を用いてアッセイされ得る。
【０２１４】
１，３−ブタンジオールは、当該分野において周知の広範な方法を用いて、培養物中の他の成分から分離され得る。このような分離方法としては、例えば、抽出手順、ならびに、連続的液体−液体抽出、浸透気化、膜濾過、膜分離、逆浸透圧、電気泳動、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、吸収クロマトグラフィ、および限外濾過を含む方法が挙げられる。これらの方法の全てが当該分野において周知である。
【０２１５】
本明細書中に記載された非天然の微生物のいずれかが培養されて、本発明の生合成生成物が産生および／または分泌される。例えば、１，３−ブタンジオールのプロデューサが、１，３−ブタンジオールの生合成性の産生のために培養され得る。
【０２１６】
１，３−ブタンジオールの生産のために、組換え系統が、炭素源および他の必須栄養素を有する培地中で培養される。プロセス全体のコストを低減するために発酵槽において嫌気性条件を維持することが非常に望ましい。このような条件は、例えば、先ず、培地を窒素と共に噴霧すること、次いで、フラスコを中隔またはクリンプキャンプでシールすることによって得られ得る。増殖が嫌気的に観察されない系統のために、制限された換気のための小さな孔で中隔に穴を開けることによって、微小好気性条件が適用され得る。例示的な嫌気性条件は、これまでに記載されている。例えば米国特許出願番号第１１／８９１，６０２号（２００７年８月１０日出願）。発酵は、本明細書中に記載されたようなバッチ様式、フェドバッチ様式または連続的様式にて行われ得る。
【０２１７】
所望される場合、培地のｐＨが、培養媒体を所望のｐＨで維持することが必要とされる場合、塩基（例えばＮａＯＨまたは他の塩基）または酸を添加することによって所望のｐＨ（特に中性のｐＨ（例えばｐＨ約７））で維持され得る。増殖速度は、分光光度計（６００ｎｍ）を用いて吸光度を測定することによって測定され得、グルコース取り込み速度は炭素源の枯渇を長時間にわたってモニタリングすることによって測定され得る。
【０２１８】
したがって、本明細書中に提供された教示およびガイダンスによって、当業者は、炭素源（例えば、合成ガス、メタノール、またはＣＯ、ＣＯ２、水素などの組合せ）に対して増殖する場合に本発明の生合成された化合物を分泌する非天然の微生物が生産され得ることを、理解する。このような化合物としては、例えば、１，３−ブタンジオール、および１，３−ブタンジオール経路における中間体代謝物のいずれかが挙げられる。所望の化合物または中間体の生合成を達成するために必要とされる酵素またはタンパク質の活性の１つ以上において操作されることは、必要とされることの全てであり、例えば、１，３−ブタンジオール生合成経路のいくつかまたは全てを包含することを含む。
【０２１９】
本発明の非天然の微生物は、本明細書中に例示されるような当該分野において周知の方法を用いて、１，３−ブタンジオール経路の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を、１，３−ブタンジオールを賛成するに十分な量にて外因性に発現するように構築される。本発明の微生物が、１，３−ブタンジオールを産生するに十分な条件下で培養されることが、理解される。本明細書中に提供された教示およびガイダンスに従って、本発明の非天然の微生物は、１，３−ブタンジオールの生合成を達成し得、約０．１〜２００ｍＭまたはそれ以上の細胞内濃度を生じる。一般に、１，３−ブタンジオールの細胞内濃度は、約３〜１５０ｍＭであり、特に約５〜１２５ｍＭであり、より詳細には約８〜１００ｍＭであり、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、８０ｍＭまたはそれ以上を含む。これらの例示した範囲内およびそれ以上の細胞内濃度はまた、本発明の非天然の微生物により達成され得る。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、培養条件は、嫌気性の増殖条件、または実質的に嫌気性の増殖条件、または維持条件を含む。例示的な嫌気性条件は、上述したものおよびと奪い分野にて周知のものである。発酵プロセスのための例示的な嫌気性条件は、本明細書中に記載されており、例えば、米国特許公開番号ＵＳ  ２００９／００４７７１９（２００７年８月１０日出願）に記載されている。これらの条件のいずれか、ならびに当該分野にて周知の嫌気性条件が、非天然の微生物とともに使用され得る。このような嫌気性条件の下で、１，３−ブタンジオールプロデューサが、細胞内濃度５〜１０ｍＭまたはそれ以上、ならびに本明細書中で例示した他の濃度の全ての１，３−ブタンジオールを合成し得る。上記では細胞内濃度を言及したが、１，３−ブタンジオール賛成微生物は、１，３−ブタンジオールを産生し得る、および／または細胞媒体中に生成物を分泌し得る。
【０２２１】
本明細書中に開示された培養条件および発酵条件に加えて、１，３−ブタンジオールの生合成を達成するための増殖条件は、培養条件に対する浸透圧保護剤の添加を含む。特定の実施形態において、本発明の非天然の微生物は、浸透圧保護剤の存在下にて本明細書中に記載されたように維持され、培養され、または発酵され得る。簡単には、浸透圧保護剤は、浸透圧調節物質（ｏｓｍｏｌｙｔｅ）として作用する化合物をいい。本明細書中に記載されるような微生物が浸透圧ストレスを生き延びることを補助する。浸透圧保護剤としては、ベタイン、アミノ酸および糖トレハロースが挙げられるがこれらに限定されない。このようなものの非限定的な例は、グリシンベタイン、プラリンベタイン、ジメチルセチン、ジメチルスルホニオプロピオネート、３−ジメチルスルホニオ−２−メチルプロピオネート、ピペコリン酸、ジメチルスルホニオアセテート、コリン、Ｌ−カルニチンおよびエクトインである。１つの局面において、浸透圧保護剤は、グリシンベタインである。本明細書中に記載の微生物を浸透圧ストレスから保護するに好適な浸透圧保護剤の量および型が、使用される微生物に依存することは、当業者に理解される。培養条件下での浸透圧保護剤の量は、例えば、約０．１ｍＭ以下、約０．５ｍＭ以下、約１．０ｍＭ以下、約１．５ｍＭ以下、約２．０ｍＭ以下、約２．５ｍＭ以下、約３．０ｍＭ以下、約５．０ｍＭ以下、約７．０ｍＭ以下、約１０ｍＭ以下、約５０ｍＭ以下、約１００ｍＭ以下、約５００ｍＭ以下であり得る。
【０２２２】
培養条件としては、例えば、液体培養手順および発酵ならびに他の大規模培養手順が挙げられ得る。本明細書中に記載されるように、特に有用な収量の本発明の生合成生成物が、嫌気性条件下または実質的に嫌気性の条件下で取得され得る。
【０２２３】
本命最中に記載されるように、１，３−ブタンジオールの合成を達成するための特定の例示的増殖条件は、嫌気性培養または発酵培養を含む。特定の実施形態において、本発明の非天然の微生物は、嫌気性条件下または実質的に嫌気性の条件下にて維持され、培養され、または発酵され得る。簡単には、嫌気性条件は、酸素を欠く環境をいう。実質的に嫌気性の条件は、例えば、培地中に溶解した酸素の濃度が０〜１０％飽和を維持するような培養、バッチ発酵または連続的発酵をいう。実質的に嫌気性の条件はまた、酸素１％未満の雰囲気で維持されたシールされたチャンバの内部の液体培地中または固体アガー上での増殖期または静止期の細胞を含む。酸素の割合は、例えば、培養物を、Ｎ２／ＣＯ２混合物または好適な非酸素ガスで噴霧することによって維持され得る。
【０２２４】
本明細書中に記載された培養条件は、スケールアップされえ、１，３−ブタンジオールを製造するために連続的に増殖され得る。例示的な増殖手順としては、例えばフェドバッチ発酵およびバッチ分離（フェドバッチ発酵および連続的分離、または連続的発酵および連続的分離）が挙げられる。これらの手順の全てが当該分野にて周知である。発酵手順は、市販品質の１，３−ブタンジオールの生合成的な生産に特に有用である。一般に、そして非連続的な培養手順を用いる場合、１，３−ブタンジオールの連続的および／またはほぼ連続的な生産は、本発明の非天然の１，３−ブタンジオール産生微生物を、対数増殖期にて増殖を維持するおよび／またはほぼ維持するために十分な栄養素および培地にて培養することを含む。このような条件下での連続的な培養としては、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日またはそれ以上にわたって増殖させることを含み得る。あるいは、連続的な培養は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間またはそれ以上、から数ヶ月までの長期間を含む。あるいは、本発明の微生物は、特定の適用に好適である場合、数時間に渡って培養され得る。連続的および／またはほぼ連続的な培養条件がまた、これらの例示的な期間における間隔の全ての時点を含み得ることは、理解されるべきである。さらに、本発明の微生物を培養する時間が、所望の目的に十分量の生成物を産生するために十分な期間にわたることも、理解される。
【０２２５】
発酵手順は、当該分野にて周知である。簡単には、１，３−ブタンジオールの生合成的な生産のための発酵は、例えば、フェドバッチ発酵およびバッチ分離（フェドバッチ発酵および連続的分離、または連続的発酵および連続的分離）において利用され得る。バッチ発酵手順および連続的発酵手順は当該分野にて周知である。
【０２２６】
実質的な量の１，３−ブタンジオールの連続的生産のための本発明の１，３−ブタンジオールプロデューサを用いる上記発酵手順に加えて、１，３−ブタンジオールプロデューサはまた、例えば、生成物を他の化合物へ変換するための化学的な合成手順に同時に供され得るか、あるいは、生成物は、発酵培養物から分離されて、所望される場合、生成物を他の化合物へ変換する化学的変換に同時に供され得る。
【０２２７】
よりよいプロデューサを生成するために、増殖条件を最適化するために代謝性モデリングが利用され得る。モデリングはまた、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計するために使用され得る（例えば、米国特許公開ＵＳ  ２００２／００１２９３９，ＵＳ  ２００３／０２２４３６３、ＵＳ  ２００４／００２９１４９、ＵＳ  ２００４／００７２７２３、ＵＳ  ２００３／００５９７９２、ＵＳ  ２００２／０１６８６５４およびＵＳ  ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９を参照のこと）。モデリング分析は、１，３−ブタンジオールのより効率的な生産へ向けて代謝をシフトすることによる細胞増殖に対する効果の信頼し得る予測を可能にする。
【０２２８】
所望の生成物の生合成に都合よい代謝性の変更を同定および設計するための、コンピュータ利用方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータ利用ネットワークである（Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003)）。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、遺伝子欠失戦略または遺伝子破壊戦略を示唆する代謝性モデリングおよび刺激プログラムであり、これは、標的生成物を過剰産生する遺伝的に安定な微生物である。詳細には、このネットワークは、遺伝子操作を示唆するために微生物の完全な代謝および／またはバイオケミカルのネットワークを試験する。上記遺伝子操作は、所望のバイオケミカルが細胞増殖の必須の副生成物となることを強いる。戦略的に配置した遺伝子欠失または他の機能的な遺伝子破壊を介してバイオケミカル生産を細胞増殖と結合することによって、バイオリアクタ内に長期間置かれた操作された系統に強いられた増殖選択圧は、強制的な増殖結合バイオケミカル生産の結果としてパフォーマンスの改善を導く。最終的には、遺伝子欠失が構築される場合、設計された系統がその野生型系統へ戻る可能性がわずかにある。なぜなら、ＯｐｔＫｎｏｃｋによって選択された遺伝子は、ゲノムから完全に除かれるべきだからである。したがって、このコンピュータ利用方法論は、所望の生成物の生合成を導く代替の経路を同定するために使用され得るか、あるいは、所望の生成物の生合成をさらに最適化するために非天然の微生物と組み合わせて使用される。
【０２２９】
簡単には、ＯｐｔＫｎｏｃｋは、細胞性代謝をモデリングするためのコンピュータ方法およびコンピュータシステムを参照して本明細書中で使用される用語である。ＯｐｔＫｎｏｃｋプログラムは、特定の構成要素をフラックスバランス分析（ＦＢＡ）モデルに組み込むモデルおよび方法のネットワークに関する。これらの構成要素は、例えば、質的な動力学的情報、質的な調節情報、および／またはＤＮＡマイクロアレイ実験データを含む。ＯｐｔＫｎｏｃｋはまた、例えば、フラックスバランスを介して得られるフラックスバウンダリを厳しく制限すること、および引き続いて、遺伝子の付加または欠失の存在下での代謝性ネットワークのパフォーマンス制限を探ることによって種々の代謝性問題に対する解決策を算出する。ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータネットワークは、モデル処方の構築を可能にする。ｋろえは、代謝性ネットワークのパフォーマンス制限の効率的なクエリを可能にし、生じた混合整数線形プログラミング問題を解決するための方法を提供する。本明細書中にてＯｐｔＫｎｏｃｋというこの代謝性モデリング方法および刺激方法は、例えば、米国特許公開ＵＳ  ２００２／０１６８６５４（２００２年１月１０日出願）、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／００６６０（２００２年１月１０日出願）、および米国特許公開ＵＳ  ２００９／００４７７１９（２００７年８月１０日出願）に記載される.
生成物の生合成的な生産に都合よい代謝性の変更を同定および設計するための、別のコンピュータ利用方法は、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）と称される代謝性モデリングおよび刺激システムである。このコンピュータ方法およびシステムは、例えば、米国特許公開ＵＳ  2003/0233218（２００２年１月１４日出願）、および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８８３８８（２００３年６月１３日出願）に記載される。ＳｉｍＰｈｅｎｙは、ネットワークモデルをインシリコで生成するために使用され得、そして、生物学的システムの化学反応を介して質量、エネルギーまたはチャージのフラックスを刺激して、システム中の化学反応に起こり得る機能のいずれかまたは全て含む解決スペースを規定し、これにより、生物学的システムに対して許された活性の範囲を決定する。このアプローチは、制限ベースのモデリングといわれる。なぜなら、解決スペースが、制限（例えば、含まれる反応の化学量論、ならびに反応を介する最大限のフラックスに関連する反応熱力学および性能制限）によって規定されるからである。これらの制限によって規定されるスペースは、表現型の能力、および生物学的システムの挙動またはそのバイオケミカル成分の挙動を決定するために質問され得る。
【０２３０】
これらのコンピュータアプローチは、生物学的な現実と一致する。なぜなら、生物学的システムはフレキシブルであり、そして多くの種々の方法において同一の結果に達し得るからである。生物学的システムは、進化メカニズムを介して設計される。これは、全ての生活システムが向き合わねばならない基本的な制約によって制限されている。従って、制約ベースのモデリング戦略は、これらの一般的な現実を受け入れる。さらに、制約を厳しくすることを介してネットワークモデルにさらなる制限を連続的に強いる能力は、解決スペースのサイズにおける削減を生じ、これにより、物理的パフォーマンスまたは表現型が予測され得る精度を増強する。
【０２３１】
本明細書中に提供される教示およびガイダンスによれば、当業者は、代謝性モデリングおよび刺激についての種々のコンピュータフレームワークを適用して、宿主微生物中での所望の化合物の生合成を設計および実行し得る。このような代謝性モデリング方法および刺激方法としては、例えば、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）およびＯｐｔＫｎｏｃｋとして上記で例示したコンピュータシステムが挙げられる。本発明を例証するために、いくつかの方法が、モデリングおよび刺激のためのＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータフレームワークを参照して本明細書中に記載される。当業者は、ＯｐｔＫｎｏｃｋや、当該分野にて周知の任意の他の代謝性モデリングおよび刺激のコンピュータフレームワークおよび方法を用いて、代謝性の変更の同定、設計および実行をどのように適用するのかを理解している。
【０２３２】
上記方法は、破壊するための代謝性反応の１セットを提供する。このセット内の各反応を消去することは、生物の増殖期の間に所望の生成物を必須の生成物として生じ得る。反応が公知であるので、ビレベル（ｂｉｌｅｖｅｌ）ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題に対する解決策はまた、反応セット内の各反応を触媒する１つ以上の酵素をコードする関連遺伝子を提供する。１セットの反応、およびこれらに対応する、各反応に関連する酵素をコードする遺伝子の同定は、一般に自動化プロセスであり、酵素とコード遺伝子との間の関係を有する反応データベースとの反応の相関を介して達成される。
【０２３３】
一旦同定されると、所望の生成物の生産を達成するために除去されるべき反応セットは、セット内の各代謝性反応をコードする少なくとも１つの遺伝子の機能的破壊によって、標的細胞または標的器官に関連される。この反応セットの機能的破壊を達成するための１つの特定の有用手段は、各コード遺伝子の欠失による。しかし、いくつかの例において、他の遺伝的異常（例えば、調節領域（例えばプロモータまたは調節因子のためのｃｉｓ結合部位）の変位、欠失）によって、あるいは多数の遺伝子座のいずれかにおけるコード配列の短縮によって、その反応を破壊することは有利であり得る。後者の異常は、その遺伝子セットの総欠失よりも少なく生じて、例えば、生成物のカップリングの迅速な評価が望まれる場合または遺伝的転位がほとんど生じていない場合に有用であり得る。
【０２３４】
上記のビレベルＯｐｔＫｎｏｃｋ問題は、破壊するためのさらなる反応セット、および生合成（所望の生成物の増殖結合生合成）を生じ得る代謝性改変を導く。上記問題に対するさらなる生産的解決策を同定するために、整数カットを称される最適化方法が実行される。この方法は、各反復にて整数カットとして称されるさらなる制約の組込みを用いて、上記で例示したＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を繰り返して解決することによって進行する。整数カットの制約は、任意の繰り返しにおいて同定された正確に同一の反応セットを選択することから解決手順を効率的に妨げる。これは、増殖するために生成物生合成を必然的に結合する。例えば、以前に同定した増殖結合代謝性改変は、破壊のために反応１、２および３を特徴付け、次いで、引き続く制約が、同一の反応を次の解決策において同時に考慮されることから妨げる。整数カット法は、当該分野にて周知であり、例えば、Burgard et al., Biotechnol. Prog. 17:791-797 (2001)に記載されることが見出され得る。代謝性モデリングおよび刺激のためのＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータフレームワークと組み合わせる使用を参照して本明細書中に記載された方法の全てと同様に、繰り返しコンピュータ分析におけるリダンダンシーを低減する整数カット方法はまた、当該分野にて周知のほかのコンピュータフレームワーク（例えばＳｉｍＰｈｅｎｙを含む）を用いて適用され得る。
【０２３５】
本明細書中に例証される方法は、所望の生成物を生合成的に産生する細胞および器官の構成を可能にする。これは、標的バイオケミカル生成物の産生を、同定された遺伝的変更を保有するように操作された細胞または器官の増殖に、不可欠に結合することを含む。したがって、本明細書中に記載されるコンピュータ法は、代謝性改変の同定および実施を可能にする。これは、ＯｐｔＫｎｏｃｋまたはＳｉｍＰｈｅｎｙより選択されるインシリコ法によって同定される。代謝性改変のセットは、例えば、１つ以上の生合成経路の酵素の付加、および／または、１つ以上の代謝性反応の破壊（例えば遺伝子欠失による破壊を含む）を含み得る。
【０２３６】
上述したように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ方法論は、長期間の増殖選択に供される場合にコンピュータによって予測される最大増殖表現型へ向けて変異体微生物ネットワークが進化され得ることを前提に発展される。すなわち、このアプローチは、選択圧下にて自己で最適化する生物の能力を利用する。ＯｐｔＫｎｏｃｋフレームワークは、遺伝子欠失組合せの網羅的な算出を可能にする。これは、ネットワーク化学量論に基づいてバイオケミカル産生と細胞増殖との間の結合を強いる。最適な遺伝子／反応ノックアウトの同定は、ビレベル最適化問題の解決を必要とする。上記問題は、活性な反応のセットを選択し、その結果、生じるネットワークについての最適な増殖解決策が目的のバイオケミカルを過剰産生することである（Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003)）。
【０２３７】
Ｅ．ｃｏｌｉ代謝のインシリコ化学量論モデルを使用して、これまでに例示し以下に記載されるような代謝経路に必須の遺伝子を同定し得る：例えば、米国特許公開  ＵＳ  ２００２／００１２９３９、ＵＳ  ２００３／０２２４３６３、ＵＳ  ２００４／００２９１４９、ＵＳ  ２００４／００７２７２３、ＵＳ  ２００３／００５９７９２、ＵＳ  ２００２／０１６８６５４、およびＵＳ  ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９。本明細書中に開示されるように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ数学的フレームワークは、ピンポイントの遺伝子欠失に適用され得る。上記欠失は所望の生成物の増殖結合産生を導く。さらに、ビレベルＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解決は、唯一の欠失セットを提供する。意味のある解決策の全て、すなわち、増殖結合産生形成を導くノックアウトの全てのセットを挙げるために、整数カットと称される最適化技術が実行され得る。これは、上述したように、各反復時に、整数カットといわれるさらなる制約の取込みを用いてＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を解決することを反復して必要とする。
【０２３８】
本明細書中に開示されるように、１，３−ブタンジオール経路の所望の活性をコードする核酸が、宿主生物へ導入され得る。いくつかの場合において、１，３−ブタンジオール経路の酵素またはタンパク質の活性を改変して１，３−ブタンジオールの産生を増加することが所望され得る。例えば、タンパク質または酵素の活性を増加させる公知の変位が、コード核酸分子へ導入され得る。さらに、最適化方法が、酵素またはタンパク質の活性を増加するために、および／または、阻害活性を低減させる（例えば、ネガティブ調節因子の活性を低減させる）ために、適用され得る。
【０２３９】
このような最適化方法の１つが有向（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）進化である。有向進化は、強力な手段である。これは、酵素の特性を改善および／または変更するために標的化された変位を特定の遺伝子へ導入することを含む。改善および／または変更された酵素は、多くの酵素改変体（例えば、＞１０４）の自動化されたスクリーニングを可能にする高感度なハイスループットスクリーニングアッセイの開発および実行を介して同定され得る。変位誘発およびスクリーニングの反復ラウンドが、最適化された特性を有する酵素を産生するために実行される。変位誘発についての遺伝子の領域を同定することを補助し得るコンピュータアルゴリズムがまた開発されて、酵素改変鯛の数を顕著に減少させ得る。これは生成されることおよびスクリーニングされることを必要とする。多様な改変体ライブラリを生成する際に効果的である多くの有向進化技術（レビューのために以下を参照のこと：Hibbert et al., Biomol.Eng 22:11-19 (2005); Huisman and Lalonde, In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries pgs. 717-742 (2007), Patel (ed.), CRC Press; Otten and Quax. Biomol.Eng 22:1-9 (2005).; and Sen et al., Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223 (2007)）が開発されており、これらの方法は、多くの酵素クラスにわたる広範な特性の改善に首尾よく適用されている。有向進化技術によって改善および／または変更された酵素の特徴としては、例えば以下が挙げられる：選択性／特異性（非天然の基質の変換にのために）；温度安定性（非常に高い温度でのプロセッシングのために）；ｐＨ安定性（より低いまたはより高いｐＨ条件下でのバイオプロセッシングのために）基質または生成物の体制（高い生成物力価を得るために）；結合（Ｋｍ）（非天然の基質に結合する基質を広げることを含む。）；阻害（Ｋｉ）（生成物、基質または重要な中間体による阻害を除くために）；活性（ｋｃａｔ）（所望のフラックスを達成するために酵素反応速度を上昇させるために）；発現レベル（タンパク質収量および経路全体のフラックスを増加させるために）；酸素安定性（好気性条件下での空気感受性の酵素の操作のために）；および、嫌気性活性（酸素の非存在下での好気性酵素の操作のために）。
【０２４０】
特定の酵素の所望の特性を標的化するための遺伝子の変位誘発および多様化について、多くの例示的な方法が、開発されている。このような方法は、当該分野にて周知である。これらのいずれかを使用して、１，３−ブタンジオール経路の酵素またはタンパク質の活性を変更および／または最適かし得る。このような方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ｅｐＰＣＲ（ＰＣＲ反応におけるＤＮＡポリメラーゼの忠実度を低減することによってランダムな点変位を導入する。）（Pritchard et al., J Theor.Biol. 234:497-509 (2005)）；Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ｅｐＲＣＡ）（全体が環状のプラスミドをテンプレートとして使用し、ランダムな６ｍｅｒ（最後の２つのヌクレオチドにエンドヌクレアーゼ耐性チオリン酸が連結している。）を使用してプラスミドを増幅し（ここで、プラスミドはタンデムリピートにて再度環状化される。）、続いて細胞に形質転換するということを除いてｅｐＰＣＲと同様である。）（Fujii et al., Nucleic Acids Res. 32:e145 (2004); and Fujii et al., Nat. Protoc. 1:2493-2497 (2006)）；ＤＮＡまたはファミリーのシャッフリング（典型的には、ヌクレアーゼ（例えばＤＮａｓｅまたはＥｎｄｏＶ）を用いた、ランダムフラグメントのプールを生成するための２つ以上の改変体遺伝子の消化を含む。上記フラグメントは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下にてアニーリングおよび伸長のサイクルによってリアセンブリされてキメラ遺伝子のライブラリを生成する。）（Stemmer, Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751 (1994); and Stemmer, Nature 370:389-391 (1994)）；時差伸長（Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）（ＳｔＥＰ）（テンプレートのプライミングを行い、続いて、変性および非常に短いアニーリング／伸長の期間（約５秒間）の２ステップＰＣＲの反復サイクルを行う。）（Zhao et al., Nat. Biotechnol. 16:258-261 (1998)）；ランダムプライミングリコンビネーション（ＲＰＲ）（ランダムな配列のプライマーを使用して、テンプレートの種々のセグメントに相補的な多くの短いＤＮＡフラグメントを生成する。）（Shao et al., Nucleic Acids Res 26:681-683 (1998)）。
【０２４１】
さらなる方法としては以下が挙げられる：ヘテロ二重鎖リコンビネーション（線状プラスミドＤＮＡを用いてミスマッチリピートによって修復されたヘテロ二重鎖を形成する。）（Volkov et al, Nucleic Acids Res. 27:e18 (1999); and Volkov et al., Methods Enzymol. 328:456-463 (2000)）；一時的なテンプレートに対するランダムなキメラ誘発（Ｒａｎｄｏｍ  Ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｎ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）（ＲＡＣＨＩＴＴ）（一本鎖ＤＮＡの、ＤＮａｓｅ  Ｉフラグメンテーションおよびサイズ分画を使用する。）（Coco et al., Nat. Biotechnol. 19:354-359 (2001)）；短縮化したテンプレートに対するリコンビナント伸長（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）（ＲＥＴＴ）（フラグメントのプールとして使用される一方向ｓｓＤＮＡフラグメントの存在下で、プライマーから一方向に成長する鎖のテンプレートスイッチを引き起こす。）（Lee et al., J. Molec. Catalysis 26:119-129 (2003)）；変性オリゴヌクレオチド遺伝子シャッフリング（ＤＯＧＳ）（変性プライマーを使用して分子間のリコンビネーションを制御する）（Bergquist and Gibbs, Methods Mol.Biol 352:191-204 (2007); Bergquist et al., Biomol.Eng 22:63-72 (2005); Gibbs et al., Gene 271:13-20 (2001)）；ハイブリッド酵素の生成のための増大した短縮化（Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＩＴＣＨＹ）（目的の遺伝子または遺伝子フラグメントの１塩基対欠失を有するコンビナトリアルライブラリの生成）（Ostermeier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3562-3567 (1999); and Ostermeier et al., Nat. Biotechnol. 17:1205-1209 (1999)）；ハイブリッド酵素の生成のためのチオ増大した（Ｔｈｉｏ−Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ）短縮化（ＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹ）（ホスホチオネートｄＮＴＰを用いて短縮化を生成することを除いてＩＴＣＨＹと同様である。）（Lutz et al., Nucleic Acids Res 29:E16 (2001)）；ＳＣＲＡＴＣＨＹ（遺伝子を再結合させるための、ＩＴＣＨＹおよびＤＮＡシャッフリングの２つの方法を結合する。）（Lutz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:11248-11253 (2001)）；ランダムドリフト変位誘発（ＲＮＤＭ）（ｅｐＰＣＲを介して作製した変位に続いて、残存する利用可能な活性をスクリーニング／選択する。）（Bergquist et al., Biomol. Eng. 22:63-72 (2005)）；配列飽和変位誘発（ＳｅＳａＭ）（ホスホチオネートヌクレオチドのランダム組込みおよび消化を用いてランダムな長さのフラグメントのプールを生成するランダム変位誘発法であり、上記フラグメントをテンプレートとして用いて、「ユニバーサル」塩基（例えば、イノシン）の存在下で伸長させ、イノシン含有相補体の複製がランダムな塩基の組込みを生じ、結果として変位誘発を生じる。）（Wong et al., Biotechnol. J. 3:74-82 (2008); Wong et al., Nucleic Acids Res. 32:e26 (2004); and Wong et al., Anal. Biochem. 341:187-189 (2005)）；合成シャッフリング（「標的中の遺伝的多様性の全て」をコードするように設計された重複オリゴヌクレオチドを用い、シャッフルした子孫について非常に高い多様性を可能にする。）（Ness et al., Nat. Biotechnol. 20:1251-1255 (2002)）；ヌクレオチド交換および切除技術（ＮｅｘＴ）（ｄＵＴＰ組込み、引き続くウラシルＤＮＡグリコシラーゼでの処���、次いでピペリジンでの処理の組合せを使用して、末端でのＤＮＡフラグメント化を実行する。）（Muller et al., Nucleic Acids Res. 33:e117 (2005)）。
【０２４２】
さらなる方法は、配列相同性非依存的タンパク質組換え（ＳＨＩＰＲＥＣ）（ここで、線形を使用して、距離的に関連するかまたは関連しない２つの遺伝子の間での融合を容易にし、この２つの遺伝子の間で特定の範囲のキメラを生成し、単一のクロスオーバーハイブリッドのライブラリを生じる（Sieber et al., Nat. Biotechnol. 19:456-460 (2001)。）；遺伝子部位飽和変位誘発（ＧＳＳＭＴＭ）（ここで、出発物質は、インサートを含むスーパーコイルの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プラスミド、および所望の部位の変位誘発を生成する２つのプライマーを含む（Kretz et al., Methods Enzymol. 388:3-11 (2004)。）；コンビナトリアルカセット変位誘発（ＣＣＭ）（これは、制限された領域を多数のアミノ酸配列変更と置換する短いオリゴヌクレオチドカセットの使用を含む（Reidhaar-Olson et al. Methods Enzymol. 208:564-586 (1991)およびReidhaar-Olson et al. Science 241:53-57 (1988)。）；コンビナトリアルマルチカセット変位誘発（ＣＭＣＭ）（これは、ＣＣＭと実質的に同様であり、ホットスポットおよびホットリージョンを同定するために高変異率でｅｐＰＣＲを使用し、次いで、タンパク質配列スペースの規定された領域をカバーするためにＣＭＣＭによる伸長を使用する（Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40:3589-3591 (2001)。）；変位系統技術（Mutator Strains technique）（ここで、コンビナトリアルｔｓミューテータプラスミド、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの変位体サブユニットをコードするｍｕｔＤ５遺伝子を利用し、選択の間のランダムかつ天然の変位頻度を２０〜４０００×に増加することを可能にし、選択が必要とされない場合、有害な変位の集積をブロックする（Selifonova et al., Appl. Environ. Microbiol. 67:3645-3649 (2001)); Low et al., J. Mol. Biol. 260:359-3680 (1996)。）を含む。
【０２４３】
さらなる例示的方法としては、Look-Through 変位誘発（ＬＴＭ）（これは、選択されたアミノ酸の変位を評価しかつ最適化する多次元の変位誘発方法である（Rajpal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:8466-8471 (2005)。）；遺伝子リアセンブリ（これは、複数の遺伝子に一時に適用され得るか、単一遺伝子のキメラ（複数の変位）の大きなライブラリを生成するためのＤＮＡシフト法である（Ｔｕｎａｂｌｅ ＧｅｎｅＲｅａｓｓｅｍｂｌｙＴＭ（ＴＧＲＴＭ）。この技術はＶｅｒｅｎｉｕｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって供給される。)、インシリコタンパク質設計自動化（ＰＤＡ）（これは、特定のフォールドを処理する構造的に規定されたタンパク質骨格をアンカリングする最適化アルゴリズムであり、タンパク質エネルギー論の全体を安定化し得るアミノ酸置換についての配列スペースを探索し、一般に三次元構造とともにタンパク質に対して最も効率的に作用する（Hayes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:15926-15931 (2002)。）；ならびに、反復飽和変位誘発（ＩＳＭ）（これは、酵素改善のための類似部位を選択するための構造／機能の知識を用いること、変位誘発法（例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Stratagene; San Diego CA)）を用いて選択した部位で飽和変位誘発を行うこと、所望の特性についてスクリーニング／選択すること、そして改善したクローンを用いること、別の部位で開始して所望の活性が達成されるまで連続して反復すること（Reetz et al., Nat. Protoc. 2:891-903 (2007); and Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 45:7745-7751 (2006))）を含む。
【０２４４】
変位誘発について上述した方法のいずれかが、単独でかまたは任意の組合せにて使用され得る。さらに、指向された評価ｈ情報のいずれか１つまたは組合せが、本明細書中に記載されるような適応性の評価技術と組み合わせて使用され得る。
【０２４５】
本発明の種々の実施形態の活性に実質的に影響を与えない改変もまた、本明細書中で提供される本発明の基底の範囲内に含まれることが理解される。従って、以下の実施例は、本発明の例が意図とされ、本発明を限定しない。
【０２４６】
〔実施例１〕
メタノール、ＣＯおよび／またはＣＯ２を炭素源として用いる１，３−ＢＤＯの生産
本実施例は、炭素源としてのメタノール、ＣＯおよび／またはＣＯ２から１，３−ＢＤＯを生成するために非天然の微生物がどのように構築され得るのかを示す。
【０２４７】
クローニングプロセスおよび発現プロセスの第一段階は、メタノールからＭｅ−ＴＨＦを生成するために必要な最小限の遺伝子セット（例えば、ＭｔａＡ、ＭｔａＢおよびＭｔａＣ）をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させることである。これらのメチルトランスフェラーゼ活性は、補因子としてコエンザイムＢ１２（コバラミン）を必要とする。Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにおいて、メチルトランスフェラーゼタンパク質のカスケードは、メタノール由来のメチル基をアセチルＣｏＡ合成経路へ組み込むことを媒介する。最近の研究（Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ６７．１：１６７−１７６（２００７））は、ＭｔａＡＢＣがＭｏｔｈ＿１２０８−０９およびＭｏｔｈ＿２３４６によってコードされていることを示している。これらの遺伝子は、プルーフリーディングＰＣＲを介してクローニングされ、抑制可能なＰＡ１−ｌａｃＯ１プロモータの制御下でのｐＺＥ２２−Ｓのような高コピー数ベクターにおける発現のために、一緒に結合される（Ｌｕｔｚ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５．６：１２０３−１２１０（１９９７））。クローニングした遺伝子を、ＰＣＲおよび／または制限酵素マッピングによって確認し、発現ベクターへの３−遺伝子のセットの挿入および構築を示す。上記推定クローンのＤＮＡシーケンシングを行って、各々の遺伝子の期待される配列を確認する。確認後、０．０５ｍＭから１ｍＭの最終濃度になるようにＩＰＴＧ誘導物質を加えることにより、最終構築物をＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２（ＭＧ１６５５）にて発現させる。クローニングされた遺伝子の発現は、全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてモニタリングする。可溶性タンパク質  対  （潜在的に封入体に由来する）ペレットタンパク質のレベルを最適化するために、それらのレベルに対するプロモータの滴定の効果を試験し得る。受容し得ない発現が得られる場合、高コピー数または低コピー数のベクターまたはプロモータ強度におけるバリアントを試験する。
【０２４８】
Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来のＭｔａＡＢＣタンパク質の発現が、メタノールからテトラヒドロフォレート（ＴＨＦ）へメチル基を転移させる能力をＥ．ｃｏｌｉに付与するかどうかを決定するために、組換え系統に、種々の濃度のメタノールが給餌される。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにおけるメチル供給源としてバニレートについて記載されているように（Ｎａｉｄｕ  ａｎｄ  Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｊ．ＢＡｃｔｅｒｉｏｌ．  １８３．１１：３２７６−３２８１（２００１））、またはＭｅｔｈａｎｏｓａｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉのメタノールメチルトランスフェラーゼについて記載されているように（Ｓａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４３．３：６７０−６７７（１９９７））；Ｔａｌｌｅａｎｔ  ａｎｄ  Ｋｒｚｙｃｋｉ，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。１７９．２２：６９０２−６９１１（１９９７）；Ｔａｌｌｅｎｔ  ａｎｄ  Ｋｒｚｙｃｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８．５：１２９５−１３０１（１９９６））、メチルトランスフェラーゼ系の活性を、嫌気的にアッセイする。ポジティブコントロールのために、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ細胞を平行して培養し、嫌気的にアッセイして、内因性のメチルトランスフェラーゼ活性を確認する。外因性に加えられた補酵素Ｂ１２に対する依存性を実証することによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるメタノールコリノイドメチルトランスフェラーゼ活性を確認する。
【０２４９】
メチルトランスフェラーゼの発現を達成した後に、上記発現の最適化するためにさらなる研究を行う。発現ベクターにおけるプロモータの滴定は、一定範囲の発現レベルを試験することを可能にする。このことは、シングルコピーに必要な発現のためのガイドとして用いられ、また、これらの遺伝子のシングルコピーが十分な発現を可能にするかどうかの決定を可能にする。もしもそうであれば、メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、単一の合成オペロンとして染色体へ組み込まれる。このことは、ＲｅｃＥＴに基づいた「ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ」を用いる、標的化された組込みを必要とする。（Ａｎｇｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７．１７：ｅ１６８９（１９９９）；Ｍｕｙｒｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７．６：１５５５−１５５７（１９９９）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｎｅｔ．２０．２：１２３−１２８（１９９８））。カセットのＲｅｃＥＴに基づく組込み、およびＦＲＴまたはｌｏｘＰを結合した選択マーカーのＦＬＰまたはＣｒｅによる除去の、潜在的な課題は、各々の組込み部位にて組換えの傷痕が生じることである。組込み部位にて組換えの傷痕が生じることによって生じる問題は、多くの方法によって最小化することができるが、一方、ゲノムに傷痕を残さない他の方法が利用可能である。標準的な代替法は、組込み可能な「自殺」プラスミドを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃＢ  遺伝子によって行われるようなカウンターセレクション（Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９．２０：６２２８−６２３７（１９７７））と一緒に用いて所望の遺伝子を導入する方法である。この方法では、Ｅ．ｃｏｌｉの染色体における任意の位置にて、マーカーなしおよび傷痕なしの挿入を生成し得る。最終目標は、誘導性のプロモータ制御下にて（染色体に組み込まれた）シングルコピーにおいてメタノールコリノイドメチルトランスフェラーゼ活性を発現するＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２の系統である。
【０２５０】
標準的なＰＣＲ法を用いて、ＡＣＳ／ＣＯＤＨのオペロン全体を、ｐＺＡ３３−Ｓ（Ｐ１５Ａに基づく）またはｐＺＳ１３（ｐＳＣ１０１に基づく）のような低コピー数または中程度のコピー数のベクターにアセンブリする。上記メチルトランスフェラーゼ遺伝子について記載されるように、クローニングした遺伝子の構造および配列を確認する。発現を、必須金属（Ｎｉ、Ｚｎ、Ｆｅ）および補酵素Ｂ１２の存在下にて厳密に嫌気的な条件下で増殖された全細胞溶解物のタンパク質ゲル電気泳動を介してモニタリングする。必要な場合、明らかな任意のターミネータの同定および除去によって、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいて効果的であることが知られている部位から選択されたコンセンサスリボゾーム結合部位を導入することによって、上記遺伝子クラスターは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現のために改変されている（Ｂａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２．７：１２８７−１２９５（１９９４）；Ｒｉｎｇｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６．９：１２１９−１２２９）。しかし、各遺伝子クラスターをクローニングし、そしてそのネイティブな構造および発現に平行する様式にて発現させる。これは、種々の遺伝子産物（これらのほとんどが互いに相互作用する。）の間における所望の化学量論を保証することを補助する。嫌気性条件下におけるＣＯＤＨ／ＡＣＳ遺伝子クラスターの十分な発現を実現した後に、これらの遺伝子を発現する細胞の、ＣＯおよび／またはＣＯ２を細胞内炭素に固定する能力をアッセイする。初期条件は、基質準位のリン酸化、または電子受容体としてのニトレートを用いる嫌気呼吸を介して、炭素源およびエネルギー源としての外因性のグルコースの存在下にて厳密に嫌気的に増殖させた細胞を、使用する。さらに、外因性に提供されるＣＨ３−ＴＨＦを媒体に添加し得る。
【０２５１】
上記ＡＣＳ／ＣＯＤＨ遺伝子を、クローニングし、そしてメタノールメチルトランスフェラーゼ系もまた発現する細胞に発現させる。このことを、ＭＴＲ発現細胞に、適合性のあるＡＣＳ／ＣＯＤＨ発現プラスミドを導入することによって達成することができる。さらなる長期間の安定性のために、ＡＣＳ／ＣＯＤＨ遺伝子およびＭＴＲ遺伝子もまた、染色体に組み込むことができる。Ｍｅ−ＴＨＦを生成するためにメタノールを利用することが可能でありかつ活性ＣＯＤＨ／ＡＣＳ遺伝子を発現することが可能なＥ．ｃｏｌｉの系統を作製した後に、これらの系統を、アセチルＣｏＡ、アセテートおよび細胞塊への取り込みのためにメタノールおよび合成ガスの両方を利用する能力についてアッセイする。初期条件は、炭素源およびエネルギー源としての外因性のグルコースの存在下にて厳密に嫌気的に増殖させた細胞を使用する。代替的に、またはグルコースに加えて、ニトレートを発酵ブロスに添加して、電子受容体および増殖の開始因子として機能させることができる。最終的にアセチルＣｏＡに代謝される脂肪酸上での嫌気的なＥ．ｃｏｌｉの増殖が、ニトレート存在下にて実証されている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７．３：７９３−８０５（２００３））。細胞内酸素レベルが、操作された酵素の任意の阻害閾値よりも低く維持されている限り、酸素もまた供給されることができる。１３Ｃ標識メタノール、１３Ｃ標識炭酸水素または１３Ｃ標識ＣＯを細胞に供給し、そして、解析的マススペクトロメトリーを使用して、アセテートおよび細胞塊への標識炭素の取り込みを計測する。
【０２５２】
メタノールメチルトランスフェラーゼ系に対する代替または補完は、メチル基有するＡＣＳ／ＣＯＤＨを供給するためにＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のメチルブランチを操作することを含む。Ｅ．ｃｏｌｉは、上述した必要とされる活性（ｆｄｈ、ｍｅｔＦ、ｆｏｌＤ）のいくつかを実行することができる酵素をコードする遺伝子を有するが、アセトジェン由来のメチルブランチ酵素が非アセトジェン由来の酵素よりも（５０−１００倍）高い特異的活性を有するかもしれないことが示されている（Ｍｏｒｏｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｎａｅｒｒｏｂｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。上記Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのバージョンとしては、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ｆｄｈＡ、Ｍｏｔｈ＿２３１２−Ｍｏｔｈ＿２３１３  ａｌｐｈａ，Ｍｏｔｈ＿２３１４  ｂｅｔａ）、ホルミルテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）シンセターゼ（Ｍｏｔｈ＿０１９０）、メチニルＴＨＦシクロヒドロラーゼ／メチレンＴＨＦデヒドロゲナーゼ（ｆｏｌＤ、Ｍｏｔｈ＿１５１６）、メチレンＴＨＦレダクターゼ（ｍｅｔＦ、Ｍｏｔｈ＿１１９１）およびメチルトランスフェラーゼ（ａｃｓＥ、Ｍｏｔｈ＿１１９７）が挙げられる。メチルトランスフェラーゼ（ａｃｓＥ、Ｍｏｔｈ＿１１９７）以外の遺伝子が、ＣＯＤＨ／ＡＣＳクラスターの一部としてクローニングされ、これらの遺伝子は、１つのセットとして発現させるように設計された発現ベクターにクローニングされかつ連結される。メチルブランチ遺伝子のクローニングおよび発現は、上述したように行われる。初めに、高コピー数または中程度のコピー数のベクターを選択する（ＣｏｌＥ１またはＰ１５Ａレプリコンの使用）。これらの遺伝子もまたＥ．ｃｏｌｉの染色体に組み込むことができる。
【０２５３】
Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｄ．ａｆｒｉｎｕｓおよびＥ．ｃｏｌｉに由来するピルベートフェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子をクローニングし、ＡＣＳ／ＣＯＤＨ活性を示す系統に発現させることができる。条件、プロモータなどは上述の通りである。ＰＦＯＲ遺伝子サイズが大きくかつ対応する酵素が酸化感受性である場合、低コピー数もしくはシングルコピーのプラスミドベクターまたはシングルコピーの染色体組換体を用いて試験を行うことができる。活性を実証するために、参照文献（Ｆｕｒｄｕｉ  ａｎｄ  Ｒａｇｓｄａｌｅ，  Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５．３７：２８４９４−２８４９９（２０００））に記載されている活性アッセイを適用することができる。さらに、外部電子受容体の非存在下でのガス状炭素源およびメタノールに対する増殖の実証は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＦＯＲ活性についてのさらなる証拠を提供する。
【０２５４】
上述したように、水素の存在下および非存在下における細胞の増殖によって、宿主生物の内因性の水素資化性ヒドロゲナーゼ活性を試験することができる。より還元した形成物の形成へ向かう劇的な移行が、発酵の間に観察される場合（例えば、アセテートに対するエタノールの増加）、このことは、内因性のヒドロゲナーゼ活性が十分に活性であることを示している。この場合、異種性のヒドロゲナーゼはクローニングされず、そして発現されない。ネイティブな酵素が、十分な活性を有していない場合、または、必要とされるアクセプタを還元する場合、個々のヒドロゲナーゼ複合体をコードする遺伝子をクローニングし、ＡＣＳ／ＣＯＤＨ活性を示す系統に発現し得る。条件、プロモータなどは上述の通りである。
【０２５５】
１，３−ブタンジオールの合成に必要とされるネイティブでない遺伝子を、上述したように発現プラスミドにクローニングする。宿主系統はまた、メタノールメチルトランスフェラーゼ活性、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ活性、ならびに、推定のＰＦＯＲ活性およびヒドロゲナーゼ活性を発現する。この点において、これらの（ＣＯＤＨ／ＡＣＳなど）遺伝子は、ゲノムに組み込まれ、そして構成的に使用され得るかまたはインデューサを有するプロモータから発現し得る（例えば、ＰＡ１−ｌａｃＯ１は、ｌａｃＩを含む細胞において誘導が可能であるか、または構成的である。）。１，３−ＢＤＯの発現および収量が最適化されると、基本系統は、中立的な遺伝子座にこれらの遺伝子のシングルコピーを組み込むことによってさらに改変され得る。酵素の数が相対的に限られている場合（最小で３、最大で４）、必要とされる遺伝子をコードする人工オペロンが構築され得る。このオペロンは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃＢ遺伝子によって行われるようなカウンターセレクション法（Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９．２０：６２２８−６２３７（１９７７））に結合される。この方法では、Ｅ．ｃｏｌｉの染色体における任意の位置にて、マーカーなしおよび傷痕なしの挿入を生成することができる。最適化は、リボゾーム結合部位およびプロモータと同様に、遺伝子の順序の変更を含む。
【０２５６】
任意のネイティブな遺伝子、例えば、１，３−ブタンジオールの生産に必要なＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのアセチルコエンザイム（ＣｏＡ）トランスフェラーゼの代替として作用する、Ｅ．ｃｏｌｉのネイティブなａｔｏＢ（ｂ２２２４）遺伝子を過剰発現させるために、ＲｅｃＥＴに基づく方法を適用してより強力な上流プロモータを組み込む。ａｔｏＢの場合、ａｔｏＢはオペロンにおける最終の遺伝子であり、下流に位置する次の遺伝子（ｙｆａｐ）は、必須なものでなくかつ逆向きの配向である。したがって、極性は問題であるべきでない。ＦＲＴまたはｌｏｘＰの部位に隣接されるスぺクチノマイシン耐性またはクロラムフェニコール耐性のような選択マーカーを含むカセットを使用して、強力な構成的プロモータ（例えばｐＬ）の導入について選択する。ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて正しいクローンが取得されかつ確認された後に、ＦＬＰまたはＣｒｅの発現を用いて、ＦＲＴ結合マーカーまたはｌｏｘＰ結合マーカーの除去について選択する。
【０２５７】
〔実施例２〕
Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ＴｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＡＣＳ／ＣＯＤＨをコードする遺伝子のクローニングおよび発現
本実施例は、ＣＯＤＨ、ＡＣＳ、メチルトランスフェラーゼおよびコリノイド鉄−硫黄タンパク質のために使用される遺伝子を含む、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＡＣＳ／ＣＯＤＨオペロン遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉプラスミドの生成を記載する。本実施例はさらに、観察可能なＣＯ酸化活性、メチルトランスフェラーゼ活性およびコリノイド鉄−硫黄タンパク質活性を生じる、Ｅ．ｃｏｌｉへのこれら遺伝子の発現を記載する。最後に、本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉが高濃度のＣＯに耐性があり、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来のＣＯ資化性遺伝子産物が発現する場合にＣＯを完全に（ｅｖｅｎ）消費することを実証する。
【０２５８】
発現ベクターを、ＬｕｔｚおよびＢｕｊａｒｄ（Ｌｕｔｚ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５．６：１２０３−１２１０（１９９７））によって記述されているセットから選択する。これらのベクターは、一定の範囲のコピー数をカバーする適合性のレプリコンを生じる。さらに、各ベクターは、ｐｒＡ１−ｌａｃｏ１を含む。このＴ７初期遺伝子プロモータは、ＩＰＴＧによって誘導可能であり、ＩＰＴＧ存在下で非常に高いレベルの転写を導くことができ、他の条件下では抑制する。ＡＣＳ／ＣＯＤＨをコードするオペロンは、Ｍｏｔｈ＿１２０４（ｃｏｏＣ）からＭｏｔｈ＿１１９７までクローニングされた。Ｍｏｔｈ＿１２０３からＭｏｔｈ＿１１９７のみを含む第２のバージョンをまた構築した。これらのフラグメント（１０−１１ｋｂｐ）の両方をＤＮＡシークエンス解析によって確認した。これらのフラグメントを、中程度のコピー数から高コピー数のための、ｐ１５ＡおよびＣｏｌＥ１の両方に基づくベクターに構築した。
【０２５９】
組換えタンパク質の最終濃度を見積もるために、ＣＯ酸化、ＡＣＳ、メチルトランスフェラーゼおよびコリノイドＦｅ−Ｓのアッセイに使用した細胞抽出物と同一のものに対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析、引き続くウエスタンブロット解析を行った。使用した抗血清は、精製したＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＡＣＳ／ＣＯＤＨタンパク質およびＭｔｒタンパク質に対してポリクローナルであり、アルカリフォスターゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体を用いて可視化した。ウエスタンブロットを図６に示す。ＡＣＳ９０およびＡＣＳ９１におけるＣＯＤＨの量を、コントロールレーンとの比較によって５０ｎｇと見積もった。
【０２６０】
一酸化炭素酸化アッセイ（Ｓｅｒａｖａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３．１３：３９４４−３９５５（２００４））を使用して、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来の、ＣＯＤＨをコードする遺伝子の機能的発現が達成したか否かを試験した。空ベクター、または「Ａｃｓ９０」もしくは「Ａｃｓ９１」を発現するベクターを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５の培養物を、嫌気性条件下でＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で増殖させた（シアノコバラミン、第一鉄および還元剤を補充した。）。この増殖を、中程度から高度の密度に達するまで行い、その時点で、ＩＰＴＧを、最終濃度０．２ｍＭで添加してプロモータを誘導した。３７℃での増殖を３．５時間行った後に、細胞を収集し、スピンダウンし、リゾチームおよび軽い界面活性剤を用いて溶解した。５５℃で５００Ｕまたは２５℃で約６０Ｕの、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨ特異的活性の水準図が存在する。このアッセイは、ＣＯ存在下におけるメチルビオロゲンの還元を用いる。これは、栓をした嫌気的なガラスキュベットの中で５７８ｎｍにて測定される。ＣＯＤＨによるＣＯ酸化にポジティブな反応は、深い紫色に変化させる（図７参照）。ウエスタンブロッティングによって見積もられたように、細胞性タンパク質の約５％がＣＯＤＨであった。したがって、表１におけるデータは、純粋なＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨの５００Ｕ／ｍｇ活性よりもおよそ５０倍弱い。にもかかわらず、本実施例は、ネガティブコントロールにおいて、非常に少量で、リコンビナントＥ．ｃｏｌｉ中のＣＯ酸化活性を明確に実証した。ネガティブコントロールにて見られたこの少量のＣＯ酸化（ＣＨ３ビオロゲン還元）は、Ｅ．ｃｏｌｉがＣＨ３ビオロゲンを還元するための制限された能力を有し得ることを示す。
【０２６１】
【表４９】
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【０２６２】
本アッセイは、メチルテトラヒドロ葉酸、ＣＯおよびＣｏＡからＡＣＳ／ＣＯＤＨ、メチルトランスフェラーゼおよびＣＦｅＳＰを用いてメチルテトラヒドロ葉酸、ＣＯおよびＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成するインビトロ反応である（Ｒａｙｂｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７．２０：７６９８−７７０２（１９８８））。関与する酵素の各々を添加するかまたは除外することによって、このアッセイは、１つあるいはそれ以上の精製された酵素または活性についての細胞抽出物を試験することから、種々の条件下での反応または制限された量の基質もしくは酵素を用いる反応の動力学を測定することまでの、広範な実験に使用され得る。種々の時間点にて取り出された反応サンプルを、１Ｍ  ＨＣｌでクエンチし、アセチルＣｏＡ最終生成物からアセテートを遊離させる。Ｄｏｗｅｘカラムを用いる精製の後に、アセテートを、クロマトグラフィー、質量分析、または放射能の測定によって解析し得る。上記反応に使用される特異的基質によって、正確な方法を決定することができる。
【０２６３】
本アッセイを、Ｅ．ｃｏｌｉに発現されるＡＣＳ／ＣＯＤＨオペロンが、Ｆｅ−Ｓコリノイドタンパク質の活性を発現するかどうかを決定するために行った。したがって、１４Ｃ標識したメチル−ＴＨＦを標識基質として使用して、アセテート合成を、単離したアセテートサンプルへの放射能の取り込みによって測定した。６つの異なる条件を試験した：
１．ポジティブコントロールとしての、精製したＡＣＳ／ＣＯＤＨ、ＭｅＴｒおよびＣＦｅＳＰ
２．ＡＣＳ９０細胞抽出物を用いた精製ＡＣＳ／ＣＯＤＨ
３．ＡＣＳ９１細胞抽出物を用いた精製ＡＣＳ／ＣＯＤＨ
４．ＡＣＳ９０細胞抽出物を用いた精製ＡＣＳ／ＣＯＤＨ、ＭｅＴｒ
５．ＡＣＳ９１細胞抽出物を用いた精製ＡＣＳ／ＣＯＤＨ、ＭｅＴｒ
６．可能な限り多くのＡＣＳ９１細胞抽出物を用いた精製ＡＣＳ／ＣＯＤＨ、ＭｅＴｒ（ＭＥＳバッファーを除く）
反応物を、ＣＯを充填したアッセイバイアル中の嫌気的なチャンバーに集めた。反応物の総量は、バイアルの容量と比較して少量であり、試薬を添加した後にバイアルをＣＯで充填し、高気密性ハミルトン製シリンジを使用し、試薬を嫌気的に保った。反応物（総量約６０μＬ）は細胞抽出物（＃１を除く）、ＣｏＡ、クエン酸チタン（ＩＩＩ）、ＭＥＳ（＃６を除く）、精製ＡＣＳ／ＣＯＤＨ、１４Ｃ−メチルテトラヒドロ葉酸、メチルビオロゲンおよびフェレドキシンからなる。さらに、精製ＭｅＴｒを＃１および＃４−６に添加し、そして精製ＣＦｅＳＰを＃１に添加した。
【０２６４】
反応を、５５℃の砂風呂中での嫌気的なチャンバーにて行った。添加する最後の試薬は、１４Ｃ−メチルテトラヒドロ葉酸であり、上記添加によって反応を開始した（ｔ＝０ｓ）。最初のサンプルを迅速に取り出し、続いて３０分、１時間および２時間でのサンプルを取り出した。６つの条件を同時に進めたので、上記サンプルの採取時間は正確でない（なぜなら、この実験は、主として定性的なものだからである。）。シンチレーションバイアルにおいて、１５μＬのサンプルを１５μＬの１Ｍ  ＨＣｌに添加した。反応混合物の計数の後に、ＡＣＳ９０抽出物におけるコリノイドＦｅ−Ｓタンパク質が、ポジティブコントロールのおよそ１／５に達する総活性を有することを決定した。
【０２６５】
本質的なメチルトランスフェラーゼ活性が、ＡＣＳ／ＣＯＤＨオペロン内にコードされている。この活性は、アセチルＣｏＡの合成の一部としてメチルテトラヒドロ葉酸からＡＣＳ複合体へのメチル基の移行を触媒する（すなわち、上記メチル基の移行は、メチル経路およびカルボニル経路を一緒に連結するステップである。）。なお、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにおけるオペロンにおいて、Ｍｔｒをコードする遺伝子はＭｏｔｈ＿１１９７であり、主たるＣＯＤＨサブユニットおよびＡＣＳサブユニットの後に出現する。したがって、Ｍｔｒ活性は、より近接する遺伝子が発現され得ることの間接的な証拠を構成する。
【０２６６】
Ｍｔｒ活性を分光器によってアッセイする。詳細には、メチル化していないＣＦｅＳｐ（Ｃｏ（I）を有する）が約３９０ｎｍに大きな吸収ピークを有する一方で、メチル化したＣＦｅＳｐ（Ｃｏ（III）を有する）は、約４５０ｎｍに小さな吸収ピークを有する。このスペクトルは、コバルトおよび硫化鉄クラスター発色団の両方に起因する。さらに、ＣＦｅＳｐは自然とＣｏ（II）に酸化し、約４７０ｎｍに広い吸収ピークを生成する（Ｓｅｒａｖａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８．１８：５７２８−５７３５（１９９９））。ＡＳＣ９０を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞からの結果について、図８を参照のこと。
【０２６７】
飽和量のＣＯの存在下において、Ｅ．ｃｏｌｉが嫌気的に増殖することが可能であるか否かを試験するために、嫌気的な条件において５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（ＮｉＣｌ２、Ｆｅ（II）ＮＨ４ＳＯ４およびシアノコバラミンを加えた。）を有する１２０ｍＬの血清ボトルを作製した。これらの血清ボトルの半分を、窒素ガスで３０分間平衡化し、半分を、ＣＯガスで３０分間平衡化した。空ベクター（ｐＺＡ３３）をコントロールとして使用し、ＡＣＳ９０およびＡＣＳ９１の両方をＮ２およびＣＯの両方で試験した。全てを、３７℃で振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３６時間にわたって増殖させた。３６個の期間の終わりに、フラスコの試験は全てにおいて多量の増殖を示した（図９）。観察された増殖の大部分は、ある程度の（低度であるが可視的である）密度の大きな遅延を伴って、一晩で生じた。接種物の量は、Ｅ．ｃｏｌｉストックの約０．５ｍＬであった。
【０２６８】
結果を表２に示す。系統をＣＯ存在下または非存在下のいずれで培養した場合であっても、増殖は同様のレベルに達した（目視での観察による。）。さらに、ＡＣＳ／ＣＯＤＨオペロンを発現する系統について、ＣＯの最終濃度が６８８μＭおよび７２８μＭであるのに対して、ネガティブコントロールのＣＯの最終濃度は９３０μＭであった。標準偏差が大きい場合、これらのＣＯ濃度の計測における誤差は大きい。にもかかわらず、この試験は、２つの仮の結論を与える：１）Ｅ．ｃｏｌｉは、嫌気的な条件下でのＣＯへの曝露に耐性であり得る；および２）ＡＳＣ／ＣＯＤＨオペロンを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、一部のＣＯを代謝する。第２の結論は、第１の結論よりも確実性がかなり低い。
【０２６９】
【表５０】
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【０２７０】
〔実施例３〕
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素を用いた、糖に対する１，３−ブタンジオールの収量の増強
本実施例において、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のカルボニルブランチを触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する非天然の微生物を記載する。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素は、ホルメートの形態における炭素、ＣＯおよび／またはＣＯ２をアセチルＣｏＡに同化する。続いて、アセチルＣｏＡは、１，３−ブタンジオールのような有用な化学物質に変換され得る。また、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、グルコースのような他の基質に対する増殖の間に二次的な炭素同化経路としても作用し得る。詳細には、１ｍｏｌのグルコースから２ｍｏｌのアセチルＣｏＡへの変換は、還元等量およびＣＯ２の両方を生成する。ＷＬ経路酵素は、ＣＯ２および／またはホルメートをさらなるアセチルＣｏＡに変換するために上記還元等量を利用することができ、アセチルＣｏＡは、１，３−ブタンジオール形成にさらに使用され得る。
【０２７１】
１，３−ブタンジオールは、本願にてすでに記載したいくつかの代替経路によってアセチルＣｏＡから合成され得、図４および５に示されている。グルコースからの上記経路のいずれかについての１，３−ブタンジオールの最大到達収量は、例えば、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素の非存在下において１ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．５ｇ／ｇ）である。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を介したＣＯ２の付加的な同化は、この収量を化学量論の理論的な最大値である１．０９ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．５４５ｇ／ｇ）にさらに改善する。最大理論的収量を達成するための推定の流れ分布を図１０に示す。
【０２７２】
さらに、１，３−ブタンジオールの収量を増加させるために、メタノールを炭水化物（例えばグルコース）とともに給餌し得る。例えば、１．０：０．４の比率にて利用グルコースとメタノールは、１ｍｏｌのグルコース当たり１ｍｏｌの１，３−ブタンジオール（０．５ｇ／ｇ）から１ｍｏｌのグルコース当たり１．２  ｍｏｌの１，３−ブタンジオールの増加を提供する。このメタノールの給餌による生成増加に対する予想される流れ分布を図１１に示す。
【０２７３】
〔実施例４〕
コバラミン合成の生物への操作
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の重要な酵素であるＡＣＳ／ＣＯＤＨは、機能するためにコバラミン（ビタミンＢ１２）を必要とする。Ｂ１２は、いくつかの生物において、新たに合成されるが、他の生物へ外因的に供給されなければならない。さらに他の生物（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、Ｂ１２を効率的に取り込む能力を欠いている。本実施例は、Ｂ１２を新たに合成する能力を生物内へ操作するための戦略を記載する。
【０２７４】
Ｂ１２の生合成経路は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＬＴ２（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：３３０３−３３１６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＣＲＬ１０９８（Ｈａｒｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈａｕｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３５：６５３−６５９（１９９６））およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（Ｂｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６７：６２３−６３０（１９８６））を含む数種の生物において特徴付けられている。細菌性のＢ１２生合成経路は、１またはそれ以上のオペロンにおいて一緒にクラスターを形成している２０〜３０個の遺伝子が関与している。後期挿入（好気性のみ）および早期挿入（嫌気性）の２つのコバラミン生合成経路が記載されている（Ｓｃｏｔｔ，Ａ．Ｉ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６８：２５２９−２５３９（２００３））。ビタミンＢ１２の生合成の最終生成物は、５’−デオキシアデノシルコバラミン（補酵素Ｂ１２）およびメチルコバラミン（ＭｅＣｂｌ）である。ビタミンＢ１２は、業界で一般に調製される形態であるシアノコバラミン（ＣＮＣｂｌ）として規定される。本実施例において、Ｂ１２は３つのアナログ分子の全てをいう。
【０２７５】
嫌気的なコバラミン生合成経路は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＬＴ２（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：３３０３−３３１６）において、十分に特徴付けられている。経路の遺伝子は、ｃｏｄオペロンと名付けられている大きなオペロンにおいてクラスターを形成している。ｃｏｂオペロン（ｐＡＲ８８２７）由来の以下の２０個の遺伝子を含むプラスミドをＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、コバラミンを新たに合成する能力を与える（Ｒａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：７５３−７６７（１９９６））。コビリン酸前駆体の収量をさらに改善するために、本発明者らは、公知の抑制エレメントｃｄｉＡを除去し、ＲＢＳを変更した。遺伝子、対応するＧｅｎＢａｎｋ識別子およびｇｉ番号を、以下に挙げる。
【０２７６】
【表５１】
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【０２７７】
Ｂ１２を新たに合成することができないいくつかの生物は、合成経路のいくつかのステップを触媒することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、コリンリング構造を合成することができない。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉは、経路におけるいくつかの反応を触媒するタンパク質をコードする（Ｒａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：７５３−７６７（１９９６））。ｃｙｓＧ遺伝子は、ウロポルフィリノゲンIIIをプレコリン−２へ変換する多官能性酵素である、機能的なＣｙｓＧをコードする（Ｈｕｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２４０４−２４１０（２００２）；Ｉｓｈｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１１９２−１１９５（２００２））。ｃｏｂＴＳＵによってコードされるタンパク質は、コビナミドをコバラミンへ転換し、５’−デオキシアデノシル基を導入する（Ｒａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ（１９９６））。
【０２７８】
【表５２】
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【０２７９】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、Ｂ１２を新たに合成することができないか、または、検出可能なレベルでビタミンを取り込むことができない。しかし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムは、Ｍｅｔ１ｐおよびＭｅｔ８ｐの２つのタンパク質をコードし、これらは、いくつかのＢ１２の経路の反応を触媒する。Ｍｅｔ１ｐは、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのウロポルフィリノゲンIIIトランスメチラーゼ  ＣｙｓＧに類似しており、ＣｙｓＧは、ウロポルフィリノゲンIIIからのＢ１２生合成の最初のステップを触媒する（Ｒａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３８（ｐｔ．３）：７０１−７０８（１９９９））。Ｍｅｔ８ｐタンパク質は、ウロポルフィリノゲンIIIトランスメチラーゼ活性、およびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのＣｙｓＧに類似したコバルトケラターゼ活性の、二官能性のタンパク質である（Ｒａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ（１９９９））。
【０２８０】
【表５３】
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【０２８１】
これらの遺伝子のいずれかまたは全てを、１つあるいはそれ以上のコバラミン合成の構成要素を欠いている生物に導入して、コバラミン合成を可能にするかあるいはコバラミン合成の効率を増加させることができる。
【０２８２】
〔実施例５〕
生物における、増強されたコバラミン取り込み能力の操作
本実施例は、Ｂ１２の取り込み能力を宿主生物へ操作することを記載する。Ｂ１２の取り込みは、特異的な輸送システムを必要とする（Ｓｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：１０５３−１０８６（１９８１））。Ｅ．ｃｏｌｉのＢ１２輸送システムは、広く研究されている。外膜を横切る高親和性輸送は、カルシウム依存性であり、６６ｋＤａの外膜ポリンＢｔｕＢによって媒介される（Ｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６１：８９６−９０３（１９８５））。ＢｔｕＢは、ＴｏｎＢエネルギー変換システム（ＴｏｎＢ−ＥｘｂＢ−ＥｘｂＤ）と相互作用し、エネルギー依存性の移動を促進し、ペリプラズムの結合タンパク質ＢｔｕＦに結合する（ＷＯ／２００７／１４１２０８；Ａｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：８６−８９（２００８））。内膜を横切る輸送は、ＢｔｕＦ、ＢｔｕＤ（ＡＴＰ結合成分）およびＢｔｕＣ（ペルミアーゼ）から構成されるＡＢＣ型取り込みシステムによって促進する（Ｂｉｎｓｔｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７１（ｐｔ．Ｃ）：４０３−４１１（１９８１））。ＢｔｕＣＤＦ複合体の結晶構造は利用可能である（Ａｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｔ．，ｓｕｐｒａ（２００８）；Ｂｉｎｓｔｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ（１９８１））。さらなるタンパク質であるＢｔｕＥは、ｂｔｕＣＥＤオペロンに同時発現されるが、このタンパク質は、Ｂ１２の輸送に必要とされておらず、その機能は知られていない（Ｒｉｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１７：３０１−３０８（１９８９））。ｂｔｕＣＥＤオペロンは構成的に発現されている。Ｂ１２の輸送と関連する遺伝子のジーンバンク識別子およびＧＩ番号を、以下に挙げる。
【０２８３】
【表５４】
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【０２８４】
生物のＢ１２の取り込み能力は、必須の輸送タンパク質をコードする遺伝子の過剰発現、および抑制性の調節性制御低減または消去によってさらに改善され得る。ｂｔｕＢＣＤＦ遺伝子の過剰発現は、Ｂ１２の膜への結合の増加および細胞への取り込み率の増加を導く。別の戦略は、調節性制御を除去することである。ｂｔｕＢ  ｍＲＮＡ翻訳は、５’ＵＴＲにてＢ１２によって直接的に抑制される（Ｎａｈｖｉ  ｅｔ  ａｉ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：１０４３（２００２））。この相互作用は、翻訳を開始するためのリボソームの接近をブロックするｍＲＮＡのフォールデイングを誘導し得る。Ｂ１２結合部位の変異または排除は、Ｂ１２の取り込みの阻害を除外し、Ｂ１２の取り込みの効率を改善する（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，４３２，６８６，Ｂｕｌｔｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）。これらの戦略を首尾よく用いて、１，３−ＰＯＤを生産する微生物（ＷＯ／１９９９／０５８６８）および（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，４３２，６８６，Ｂｕｌｔｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）におけるＢ１２の取り込み能力を改善する。最近の特許出願は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｂｔｕＲ２のような抑制性の調節性タンパク質を欠失させることによる、Ｂ１２の取り込み効率の改善を記載する（ＷＯ／２００８／１５２０６１）。
【０２８５】
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、Ｂ１２についての高親和性のトランスポータおよび低親和性のトランスポータの両方を有する。高親和性トランスポータは、ｂｔｕＢにコードされる（Ｒｉｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：２９８６−２９９３（１９８９））。今日までに、原形質膜を横切る輸送については特徴付けられていないが、Ｅ．ｃｏｌｉのように、原形質膜を横切る輸送は、ＡＢＣ輸送システムを介して生じることが予想される。Ｂ１２結合タンパク質は、ｂｔｕＤおよびｂｔｕＥにコードされており、ｂｔｕＣは，ペルミアーゼをコードすると予想される。
【０２８６】
【表５５】
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【０２８７】
コバラミンの取り込みを可能にさせるまたは取り込み効率を増加させるために、これらの任意の遺伝子またはこれらの遺伝子のいずれかまたは全てを、１つあるいはそれ以上のコバラミン取り込みの構成要素を欠いている生物に導入して、効率的なコバラミンの取り込みを可能にするかあるいは効率的なコバラミンの取り込みの効率を増加させることができる。
【０２８８】
培養媒体中のＢ１２を定量する方法。培養媒体中のＢ１２の量を定量するために、細胞が存在しないサンプルをＨＰＬＣにて解析する。コバラミンの定量は、２７８ｎｍおよび３６１ｎｍでのピーク領域の比を標準と比較し、次いでコバラミンの標準曲線のピーク領域を利用することによって達成される。
【０２８９】
本願を通して、種々の刊行物が括弧内に言及されている。本発明に関与する技術水準を十分に記載するために、これらの刊行物の開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０２９０】
本発明は、開示された実施形態を参照して記載されているが、当業者は、特定の実施例および詳細に述べられた研究が、単に本発明の例証であることを容易に理解する。本発明の精神から逸脱することなく、種々の改良がなされ得ることが理解されるべきである。よって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０２９１】
【図１】酢酸およびエタノールについてのＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路および形成経路を描いたダイヤグラムを示している。合成ガスに対して成長し得る生物に特徴的である変換は、（１）ＣＯデヒドロゲナーゼ、（２）ヒドロゲナーゼ、（３）エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（ＥＣＨ）、および（４）二官能性ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチルＣｏＡシンターゼである。
【図２】ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を含むガスをアセチルＣｏＡへ変換し、続いて、細胞塊および生成物（例えばエタノールまたは酢酸）へ変換することを可能にする完全なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を示す。略記；１０ＦＴＨＦ：１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸、５ＭＴＨＦ：５−メチルテトラヒドロ葉酸、ＡＣＴＰ：リン酸アセチル、ＣＦｅＳｐ：コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ＦＯＲ：ホルメート、ＭｅＯＨ：メタノール、ＭＥＴＨＦ：メチルテトラヒドロ葉酸、ＭＬＴＨＦ：メテニルテトラヒドロ葉酸、ＴＨＦ：テトラヒドロ葉酸。
【図３】アセトアセチルＣｏＡから１，３−ブタンジオールへの経路を示している。酵素的な工程は：Ａ）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルデヒド形成）、Ｂ）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、Ｃ）３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ、Ｄ）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存、アルコール形成）、Ｅ）３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、Ｆ）４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ、Ｇ）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、Ｈ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、Ｉ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、Ｊ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼまたはシンセターゼ、Ｋ）３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、Ｌ）３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ、Ｍ）アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼまたはシンセターゼ、Ｎ）アセトアセテートレダクターゼである。
【図４】炭化水素（例えば、グルコース、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を含むガス、ならびに、メタノール）の、アセチルＣｏＡへの変換、さらには、１，３−ブタンジオールへの変換のための生合成代謝経路を示す。生成宿主へ操作された特定の酵素的変換反応が番号付けされ、図中に示される。略記；１０ＦＴＨＦ：１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸、５ＭＴＨＦ：５−メチルテトラヒドロ葉酸、ＡＣＴＰ：リン酸アセチル、ＣＦｅＳｐ：コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ＦＯＲ：ホルメート、ＭｅＯＨ：メタノール、ＭＥＴＨＦ：メチルテトラヒドロ葉酸、ＭＬＴＨＦ：メテニルテトラヒドロ葉酸、ＴＨＦ：テトラヒドロ葉酸。
【図５】炭化水素（例えば、グルコース、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を含むガス、ならびに、メタノール）の、アセチルＣｏＡへの変換、さらには、１，３−ブタンジオールへの変換のための生合成代謝経路を示す。生成宿主へ操作された特定の酵素的変換反応が番号付けされ、図中に示される。略記；１０ＦＴＨＦ：１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸、５ＭＴＨＦ：５−メチルテトラヒドロ葉酸、ＡＣＴＰ：リン酸アセチル、ＣＦｅＳｐ：コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ＦＯＲ：ホルメート、ＭｅＯＨ：メタノール、ＭＥＴＨＦ：メチルテトラヒドロ葉酸、ＭＬＴＨＦ：メテニルテトラヒドロ葉酸、ＴＨＦ：テトラヒドロ葉酸。
【図６】サイズ標準（ライン５）およびM.thermoacetica CODH（Moth_1202/1203）タンパク質コントロールまたはＭｔｒ（Moth_1197）タンパク質コントロール（50,150,250,350,450,500,750,900および1000ng）と共に、１０マイクログラムのＡＣＳ９０（ライン１）、ＡＣＳ９１（ライン２）、Ｍｔａ９８／９９（ライン３および４）の細胞抽出物のウエスタンブロットを示している。
【図７】メチルビオロゲンアッセイに用いたキュベットを示している。ブランクが右側であり、還元されたメチルビオロゲンを有するキュベットが左側である。注釈；各頂点にストッパーおよび真空潤滑油を用いて反応嫌気性状態を維持した。
【図８】添加したＣＨ３−ＴＨＦから精製したM.thermoacetica コリノイドタンパク質へＣＨ３を移すためのアッセイを行ったＡＣＳ９０セル抽出物のスペクトル像を示す。
【図９】リコンビナントE. coli MG1655、空ベクター、ＡＣＳ９０およびＡＣＳ９１の、Ｎ２およびＣＯ中、３７℃で３６時間の嫌気性増殖を、左から右へ示す。
【図１０】１，３−ブタンジオール生合成経路と組み合わせてＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路酵素を用いることにより、グルコースに対して１．０９モル／モルの生成率で１，３−ブタンジオールを製造し得る例示的な流れ分布（ｆｌｕｘ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を示している。
【図１１】基質としてメタノールを同時に利用することを可能にする酵素を用いることによって、グルコースに対して１．２モル／モルの生成率で１，３−ブタンジオールを製造できる例示的な流れ分布を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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