(57)【要約】  本発明は、遺伝性疾患、感染および様々な他の医学的状態のアンチセンス治療のための組成物および関連する方法を提供する。特に、本発明の実施形態は、正に荷電したポリマーと接合したアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物（「ＯＮ−ＰＣＰ」）と、負に荷電したポリマーとの組合せを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、正に荷電したポリマーと接合したオリゴヌクレオチド化合物を含む組成物と比較して、改善されたアンチセンス効率および細胞毒性の低減を明らかに示した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
正に荷電したポリマーと接合したアンチセンスオリゴヌクレオチドと、
負に荷電したポリマーまたは両親媒性ポリマーと
の混合物を含有する医薬組成物であって、改善されたアンチセンス効率および／または細胞毒性の低減を示す医薬組成物。
【請求項２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約１５〜４０塩基対単位（モノマー）を有するモルホリノオリゴマーまたはＰＮＡオリゴマーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記モルホリノオリゴマーが、ホスホロジアミデートに連結したモルホリノオリゴマーを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記正に荷電したポリマーが、ペプチド、カチオンポリマーおよびデンドリマー状オクタグアニジンポリマーからなる群から選択される、請求項１、２および３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記負に荷電したポリマーが、約２〜５０塩基対を有するＲＮＡまたはＤＮＡ鎖を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記負に荷電したポリマーが、多糖および２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記負に荷電したポリマーが、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと接合した正に荷電したポリマーにイオン結合している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記負に荷電したポリマーと、正に荷電したポリマーと接合した前記アンチセンスオリゴマーとの比率が約１：１００〜１００：１である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、
正に荷電したポリマーと接合した、ホスホロジアミデートに連結したモルホリノオリゴマーと、
負に荷電したポリマーと、
担体と
を含有する医薬組成物であって、改善されたアンチセンス効率および／または細胞毒性の低減を示す医薬組成物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アンチセンスオリゴマーおよび前記負に荷電したポリマーが、ＤＮＡまたはＲＮＡの同じ標的領域に対してどちらも相補的である、ほぼ相補的である、または相補的ではない、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記負に荷電したポリマーが、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
正に荷電したポリマーと接合したアンチセンスオリゴヌクレオチドと、負に荷電したポリマーまたは両親媒性ポリマーとを含有する組成物の治療有効量を、それを必要とする宿主に投与するステップを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
前記宿主が、細菌またはウイルス感染、癌および筋関連疾患からなる群から選択される医学的状態に罹患している、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記医学的状態が筋ジストロフィである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
正に荷電したポリマーと接合したアンチセンスオリゴヌクレオチドと、負に荷電したポリマーまたは両親媒性ポリマーとを含有する医薬組成物の治療有効量を患者に投与するステップを含む、それを必要とする被験者の医学的状態を治療するための方法。
【請求項１６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロジアミデートに連結したモルホリノオリゴマーまたはＰＮＡオリゴマーを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記正に荷電したポリマーが、ペプチド、カチオンポリマーまたはそれらの組合せである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記医薬組成物を投与するステップの前に、前記負に荷電したポリマーおよび／または両親媒性ポリマーを含む溶液を、正に荷電したポリマーと接合した前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む溶液と混合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記医学的状態が、細菌またはウイルス感染、癌、および筋関連疾患からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記医学的状態が筋ジストロフィである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記医薬組成物を約０．５ｍｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与する、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アンチセンス療法は、相補的核酸鎖（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学的類似体）を、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのＤＮＡまたはＲＮＡ鎖内の標的配列に結合させて、それによって標的遺伝子を不活性化するために使用する、遺伝性疾患、感染、およびその他の疾患のための有望な治療形態である。アンチセンス療法はまた、突然変異遺伝子内にエクソンスキッピングを導入することによって遺伝子機能を回復させるためにも用いられてきた。
【０００２】
天然オリゴヌクレオチドおよび化学修飾されたオリゴマーを含むオリゴマーは、アンチセンス療法において特別な潜在能を示してきた。現在、オリゴマーは、癌（肺癌、結腸直腸癌、膵癌、悪性神経膠腫および悪性黒色腫を包含する）、糖尿病、ＡＬＳ、デュシェンヌ型筋ジストロフィならびに炎症要素を有する喘息および関節炎などの疾患の治療のために検討されている。オリゴマーはまた、ウイルスおよび細菌感染の治療においても有望である。
【０００３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを正に荷電したポリマーと接合させることは、これらの分子を細胞に導入できる有効性を増大させることが示されている。しかし、正に荷電したポリマーとの接合は毒性の上昇に結びついてきた。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効な治療手段がＬＤ５０用量（実験動物の５０％が死亡する用量）の近くにある場合に特に問題である。結果として、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は限定されてきた。
【０００４】
したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与のための改善された製剤の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、遺伝性疾患、感染および様々な他の医学的状態のアンチセンス治療のための組成物および関連する方法を提供する。特に、本発明の実施形態は、正に荷電したポリマーと接合したアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物（「ＯＮ−ＰＣＰ」）と、負に荷電したまたは両親媒性ポリマーとの組合せを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、正に荷電したポリマーと接合したオリゴヌクレオチド化合物を含む組成物と比較して、改善されたアンチセンス効率および細胞毒性の低減を明らかに示した。１つの特定の実施形態では、本発明は、正に荷電したポリマーと接合したアンチセンスホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）（「ＰＭＯ−ＰＣＰ」）および負に荷電したまたは両親媒性ポリマーの組合せを含む医薬組成物に関する。使用できる他のアンチセンスオリゴマーには、ペプチド核酸ポリマー（ＰＮＡ）が含まれる。
【０００６】
驚くべきことに、正に荷電したポリマーと接合したオリゴヌクレオチド、特にＰＭＯオリゴマーの治療に一般的に付随する細胞毒性が、ＯＮ−ＰＣＰ化合物を負に荷電したポリマーまたは両親媒性ポリマーと組み合わせることにより有意に低減されることが本発明者らによって発見された。また意外にも、ＰＭＯオリゴマーなどのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を標的ＲＮＡ／ＤＮＡ鎖に送達する効率が、負に荷電したポリマーを正に荷電したポリマーと接合したオリゴマー化合物と組み合わせて使用することによって改善されることも発見された。概して、ＰＭＯ−ＰＣＰまたはＰＮＡ−ＰＣＰの有効性は接合しているポリマーの正電荷に関係すると思われ、送達増強は正に荷電したポリマーの細胞膜への結合によるものであると一般的に考えられている。そのため、従来の常識では、負に荷電したポリマーをＯＮ−ＰＣＰと組み合わせることは、正に荷電したポリマーの増強作用を中和させてしまうことになると予測される。驚くべきことに、また予想に反して、本発明者らは、ＯＮ−ＰＣＰを負に荷電したポリマーと組み合わせることにより、アンチセンスオリゴマー化合物の細胞への送達増強をなおも提供しつつ、細胞毒性を低減できることを発見した。一部の実施形態では、負に荷電したポリマーとＯＮ−ＰＣＰとの組合せは実際にアンチセンス作用を増強できることが認められた。
【０００７】
本発明による医薬製剤は、細菌およびウイルス感染、癌、糖尿病ならびに筋ジストロフィなどの遺伝性疾患を含む多種多様な医学的状態を治療するために使用できる。一実施形態では、本発明による医薬製剤は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザウイルス、エボラウイルスおよびマールブルグ病などのウイルス感染を治療するために使用できる。
【０００８】
特許または出願ファイルは、カラーで作製された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を含むこの特許または特許出願公開公報のコピーは、請求および必要な手数料の支払いに応じて特許庁により提供される。
【０００９】
これまで本発明を概括的に説明してきたが、ここで添付の図面を参照する。これらは必ずしも原寸に比例して描画されてはいない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】正常マウス（Ｃ５７）の筋組織、対照ジストロフィｍｄｘ筋（標的ジストロフィンのプレｍＲＮＡに特異的でないスクランブルＰＰＭＯ配列で処置した、左から２番目の欄）、ＰＰＭＯで処置したｍｄｘ筋（左から３番目の欄）、およびＤＮＡオリゴヌクレオチドの製剤とＰＰＭＯで処置したｍｄｘ筋（右の欄）の免疫組織化学染色である。ＰＰＭＯ：ＤＮＡの比率は４：１であった。筋組織における赤色の筋線維膜染色はジストロフィン発現を示し、これは未処置ｍｄｘマウスでは存在しない。３０ｍｇ／ｋｇ  ＰＰＭＯ＋ＤＮＡと表示された右の欄は、種々の組織におけるジストロフィン誘導のレベルが、ＰＰＭＯだけで処置したマウスからの組織と同じであるか、またはＰＰＭＯだけで処置した同じ組織（左から３番目の欄）よりも（心臓において）明らかに高いことを示す。ジストロフィンタンパク質は赤色の膜染色によって示される。
【図２】１２０ｍｇ／ｋｇ  ＰＰＭＯ＋ＤＮＡ処置後のｍｄｘマウスの組織におけるジストロフィン発現の免疫組織化学検出の画像である。強い赤色の膜染色は、すべての筋における正常に近いレベルのジストロフィンを示す。ＰＰＭＯ／ＤＮＡ製剤の単回静脈内注射の２週間後に組織を試験する。
【図３】正に荷電したポリペプチドと接合したオリゴマーへの、負に荷電したポリマーの結合を比較するアガロースゲル画像である。画像は、ＰＰＭＯ、ＶｉｖｏＰＭＯおよびアルギニンリッチペプチド（Ａｒｇペプチド）の核酸結合特性を示す。ＶｉｖｏＰＭＯは２ＯメチルホスホロチオエートＲＮＡオリゴ（２ＯＭｅＰＳ）に最も強く結合する。ＰＭＯＥ２３およびＰＰＭＯＥ２３は、マウスジストロフィンエクソン２３を標的とするオリゴ配列である。より下の強いバンドは、臭化エチジウム染色した２ＯＭｅＰＳオリゴである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
添付の図面を参照しながら本発明を以下でより詳細に説明する。その中で本発明の一部の実施形態を示すが、すべての実施形態を示すわけではない。実際に、これらの発明は多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書で示す実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用される法的要件を満たすために提供されるものである。全体を通して類似の番号は類似の要素を指す。
【００１２】
本発明は、遺伝性疾患、感染および様々な他の医学的状態のアンチセンス治療のための組成物および関連する方法を提供する。特に、本発明の実施形態は、正に荷電したポリマーと接合したアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物（「ＯＮ−ＰＣＰ」）と、負に荷電したポリマーまたは両親媒性ポリマーとの組合せを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、正に荷電したポリマーと接合したオリゴヌクレオチド化合物を含む組成物と比較して、改善されたアンチセンス効率および細胞毒性の低減を示した。
【００１３】
驚くべきことに、正に荷電したポリマーと接合したオリゴヌクレオチド化合物の治療に一般的に付随する細胞毒性が、ＯＮ−ＰＣＰ化合物を負に荷電したポリマーと組み合わせることにより有意に低減されることが本発明者らによって発見された。また意外にも、オリゴヌクレオチドを標的ＲＮＡ／ＤＮＡ鎖に送達する効率が、負に荷電したポリマーを正に荷電したポリマーと接合したオリゴヌクレオチド化合物と組み合わせて使用することによって改善されることも発見された。概して、ＯＮ−ＰＣＰの有効性は接合しているポリマーの正電荷に関係すると思われ、送達増強は正に荷電したポリマーの細胞膜への結合によるものであると一般的に考えられている。そのため、従来の常識では、負に荷電したポリマーをＯＮ−ＰＣＰと組み合わせることは、正に荷電したポリマーの増強作用を中和することになると予測される。驚くべきことに、また予想に反して、本発明者らは、ＯＮ−ＰＣＰを負に荷電したポリマーと組み合わせることにより、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の細胞への送達増強をなおも提供しつつ、特にインビボで全身的に、細胞毒性を低減できることを発見した。一部の実施形態では、負に荷電したポリマーとＯＮ−ＰＣＰとの組合せは実際にアンチセンス効果を増強できることが認められた。
【００１４】
本発明の医薬組成物は、細菌およびウイルス感染、癌、糖尿病ならびに筋ジストロフィなどの遺伝性疾患を含む多種多様な医学的状態を治療するために使用できる。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザウイルス、エボラウイルスおよびマールブルグ病などのウイルス感染を治療するために使用できる。本発明によって標的化することができる細菌の例は米国特許第７，６２５，８７３号に記載されている。
【００１５】
本発明は、アンチセンス療法における使用のために、多種多様なアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物に使用することができる。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」および「アンチセンスオリゴマー」という用語は交換可能に使用され、ヌクレオチド塩基の配列、および、アンチセンスオリゴマーがワトソン−クリック塩基対合によって標的核酸（例えばＲＮＡ／ＤＮＡ）配列にハイブリダイズして、標的配列内で核酸とオリゴマーとのヘテロ二本鎖を形成することを可能にするサブユニット間骨格を指す。典型的には、そのようなオリゴマーは８〜約５０ヌクレオチドサブユニット長であり、より典型的には約１２〜２５ヌクレオチドサブユニット長である。オリゴマーは、標的配列に正確な配列相補性またはほぼ近い相補性を有することができる。
【００１６】
一実施形態では、本発明における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の好ましいクラスには、モルホリノオリゴマーおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。モルホリノオリゴマーは、典型的なポリヌクレオチドに水素結合することができる塩基を支持する骨格を有するポリマー分子であり、該ポリマーは、五炭糖骨格部分、より具体的にはヌクレオチドおよびヌクレオシドに典型的なホスホジエステル結合によって連結されたリボース骨格を欠き、その代わりに環窒素を含み、その環窒素を介して共役している。適切なモルホリノオリゴマーの例にはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーが含まれる。本発明の実施において使用できるモルホリノオリゴマーの例は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号、同第６，１２４，２７１号、同第６，７８４，２９１号、同第７，０４９，４３１号、同第７，５８２，６１５号および同第７，６２５，８７３号においてより詳細に述べられている。
【００１７】
ペプチド核酸ポリマー（ＰＮＡ）も、本発明の実施においてアンチセンスオリゴマーとして使用できる。ＰＮＡは、デオキシリボース骨格と構造的に同形の骨格を有し、核酸塩基が結合しているＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなる。ＰＮＡは、ヒト疾患に関連する遺伝子を標的化するアンチセンスオリゴマーとしての可能性について検討されてきた。正に荷電したポリマーと共にＰＮＡを合成することの容易さから、ＰＮＡおよびその複合体は癌、遺伝性疾患および他の疾患のための実験的治療の薬剤として広く試験されることとなった。
【００１８】
オリゴヌクレオチド化合物、特にモルホリノオリゴマーおよびＰＮＡは、様々な異なる正に荷電したポリマーと接合することができる。正に荷電したポリマーの例には、アルギニンリッチペプチドなどのペプチド（本発明の実施において使用できる正に荷電したペプチドの例には、Ｒ９Ｆ２Ｃ、（ＲＸＲ）４ＸＢ（式中、Ｘは任意のアミノ酸であってよい）、Ｒ５Ｆ２Ｒ４Ｃ、（ＲＦＦ）３、ＴＡＴ配列ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲなどのＴａｔタンパク質、および（ＲＦＦ）３Ｒが含まれる）、デンドリマー状オクタグアニジンポリマーなどのカチオンポリマー、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物への接合に関して当分野で知られている他の正に荷電した分子が含まれる。一実施形態では、正に荷電したポリマーには、約１，０００〜２０，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜１０，０００ダルトンの分子量を有するポリマーが含まれる。正に荷電したポリマーの別の例は、その分枝鎖または非分枝鎖中に多数の正に荷電したアミン基を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩは、他にも遺伝子およびオリゴマー送達小胞として広く使用されてきた。
【００１９】
本発明の実施において使用できる負に荷電したポリマーには、負に荷電したＤＮＡ、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ペプチドおよび多糖類が含まれる。本発明における使用のための負に荷電したオリゴヌクレオチドは、典型的には約２〜１０００塩基、より典型的には約１０〜１００塩基を有し、約１５〜５０塩基がやや好ましく、約２０〜３０塩基がより好ましい。一実施形態では、負に荷電したポリマーには、約１，０００〜２０，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜１０，０００ダルトンの分子量を有するペプチドまたは多糖が含まれる。アルブミンなどの大型の負に荷電したタンパク質も、ＯＮ−ＰＣＰ化合物に関する送達増強および毒性低減のために使用することができる。
【００２０】
好ましい実施形態では、負に荷電したポリマーには、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じかまたは類似の配列を有する負に荷電したオリゴヌクレオチドが含まれる。好ましいオリゴヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどのそれらの修飾類似体が含まれる。特に、負に荷電したポリマーには、好ましくは、負に荷電したポリマーが同じ標的遺伝子、同じ標的エクソンまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的化される遺伝子の同じ遺伝的標的領域を標的化するように、投与されるアンチセンスオリゴヌクレオチドと同じかまたは類似の配列を有するＲＮＡ、ＤＮＡ、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびそれらの組合せが含まれる。本発明の実施において使用できる負に荷電したポリマーの例には、デュシェンヌ型筋ジストロフィを治療するエクソンスキッピングのためにマウスまたはヒトジストロフィン配列を標的化するＰＭＯ−ＰＣＰオリゴマーを含む製剤中で使用できる１５量体ＤＮＡオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２１】
好ましい実施形態では、本発明の製剤は、プルロニックコポリマーなどの両親媒性ポリマーを使用することができる。該ポリマーの性質は、ＰＭＯ−ＰＣＰまたはＰＮＡ−ＰＣＰの電荷を中和し、送達を増強し、毒性を低減する。
【００２２】
負に荷電したオリゴヌクレオチド／ポリマーまたは両親媒性ポリマー対アンチセンスオリゴヌクレオチドの量の比率は、約１：１００〜１００：１にわたることができる。好ましい実施形態では、負に荷電したオリゴヌクレオチド／ポリマーまたは両親媒性ポリマー対アンチセンスオリゴヌクレオチドの量の比率は、約０．２：１〜１：５である。
【００２３】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬製剤は、任意の好適な生理的に許容される媒体中で投与することができる。標準的な医薬的に許容される担体の例には、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、油／水エマルションなどのエマルション、トリグリセリドエマルション、湿潤剤、錠剤およびカプセルが含まれる。適切な生理的に許容される担体の選択は、選択される投与方法に依存して異なることが認識されるべきである。
【００２４】
本発明の医薬組成物は、治療有効量の医薬製剤で、それを必要とするヒトなどの被験者を処置することによって投与できる。一実施形態では、医薬溶液は、静脈内注射によって被験者に投与することができる溶液中で提供される。例えば、医薬組成物を含む溶液は、正に荷電したポリマーと接合したアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む第一溶液を、負に荷電したポリマーを含む第二溶液と混合することによって調製できる。理論に制約されることを望むものではないが、本発明の製剤では負に荷電したポリマーとＯＮ−ＰＣＰが、負に荷電したポリマーと正に荷電したポリマーとの間の静電引力または水素結合によってイオン錯体を形成すると考えられる。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、直接投与（例えば培地への添加によってインビトロで、または治療部位での注射もしくは局所投与によって、動物において局所的にインビボで）または全身的（例えば非経口的または経口的）投与を含む、任意の適切な手段によって標的細胞に提供することができる。一実施形態では、化合物および組成物は、所望する薬剤の標的細胞への送達に加えて、溶液が細胞または組織または被験者の電解質および／または容積および／または代謝に有害な影響を及ぼさないように、生理的に許容される溶液の部分を構成する。
【００２６】
本発明において使用される医薬組成物および化合物は、鼻内、経口、吸入、経腸、局所、子宮内、経膣、舌下、経直腸、筋肉内、胸腔内、心室内、腹腔内、眼科的、静脈内または皮下的手段によって投与することができる。好ましい実施形態では、医薬溶液は静脈内注射によって提供される。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、液体または固体形態で供給することができる。本発明の組成物は、溶媒、希釈剤、賦形剤、防腐剤、乳化剤や、におい、味、ｐＨ等を調節するための化合物をさらに含むことができる。一般に、活性化合物に加えて、本発明の医薬組成物は、活性化合物を医薬的に使用できる製剤に加工するのを容易にする適切な賦形剤および補助剤を含むことができる。適切な賦形剤には、糖類、例えばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール、セルロース製剤、リン酸カルシウムなどの充填剤、ならびにデンプン、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドンなどの結合剤が含まれる。所望する場合は、上述したデンプンならびにカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩などの崩壊剤を添加することができる。補助剤には、流動調節剤および潤滑剤、例えばシリカ、滑石、ステアリン酸もしくはその塩、および／またはポリエチレングリコールが含まれる。
【００２８】
製剤は、付加的な担体または希釈剤と共にまたはそれらなしで、経口的、全身注射、経皮、経粘膜または他の典型的な経路によって投与することができる。本発明の医薬組成物は、カプレット、錠剤、粒子、顆粒または粉末形態で経口的に投与できる。
【００２９】
本発明はまた、治療有効量および／または予防量の上記医薬製剤を、それを必要とする患者に投与することにより、１以上の医学的状態を治療するおよび／または改善する方法を提供する。本発明によれば、本発明の化合物、組合せまたは医薬組成物の「治療有効量」は、所望の薬理学的作用を達成するのに十分な量である。一般に、有効量の組成物を提供するために必要であり、当業者が調整することができる投与量は、受容者の年齢、健康、身体状態、性別、体重および疾患の程度に依存して異なる。加えて、投与量は、治療の頻度および所望効果の性質と範囲によって決定することができる。
【００３０】
上記で考察したように、正に荷電したポリマーと接合したアンチセンスオリゴヌクレオチドと、負に荷電したポリマーおよび／または両親媒性ポリマーとの組合せは、投与されるアンチセンスオリゴヌクレオチドのより高い用量を可能にする。医薬製剤中のアンチセンスオリゴマーの典型的な投与量は、約０．０５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、特に約１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にわたることができる。一実施形態では、投与量は、約５〜３０ｍｇ／ｋｇ体重を週に１回または２回である。
【００３１】
投与される用量は、言うまでもなく、用途、ならびに有効成分の薬力学的特性、受容者の年齢、健康および体重、症状の性質と程度、併用治療の種類、治療の頻度および所望効果などの公知の因子に依存して異なる。受容者は任意の種類の哺乳動物であり得るが、好ましくはヒトである。一実施形態では、本発明の医薬組成物の投与形態（組成物）は、単位当たり約１μｇ〜１，０００μｇの有効成分、特に単位当たり約２μｇ〜８０μｇの有効成分を含むことができる。
【００３２】
静脈内送達に関しては、医薬製剤の単位用量は、一般に体重ｋｇ当たり０．０５〜２００μｇ／のアンチセンスオリゴマーを含み、好ましくは体重ｋｇ当たり１〜１００μｇ、特に１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０または８０μｇ（μｇ／ｋｇ体重）のアンチセンスオリゴマーを含む。医薬組成物は、１日１回もしくはそれ以上の回数、または週に１回もしくはそれ以上の回数、例えば１日２、３もしくは４回、または週に２、３もしくは４回投与することができ、７０ｋｇの成人についての１日の総量は、通常１０〜７００μｇの範囲内である。好ましい静脈内投与量は、１０ｎｇ〜２００μｇ、好ましくは２〜２００μｇ、より好ましくは１０〜１００μｇの金属／ｋｇ体重にわたる。あるいは、単位用量は２〜２０μｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むことができ、所望する場合は、前記１日量を与えるために複数回投与することができる。これらの医薬組成物において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、組成物の総重量に基づき約０．５〜９５重量％の量で存在する。
【００３３】
１つの特定実施形態では、本発明の医薬組成物は、デュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）などの筋障害の治療において特に有利である。例えば、標的とする筋損傷または筋関連障害の治療のための使用においては、一般的な指針として、有効成分（すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチド）の１日経口投与量は、一般に、静脈内注射によって週に１回の頻度で与えられる場合、約５〜３０ｍｇ／ｋｇにわたることができる。好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、静脈内注射によって１４日ごとに１回与えられる場合、約２０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することができる。投与量は個々の患者に応答に基づいて増加または低減できることが認識されるべきである。使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの実際の量は、使用される特定のアンチセンスオリゴヌクレオチド、製剤される特定の組成物、適用の方法および特定の投与部位に応じて異なることが理解される。
【００３４】
組成物が錠剤またはカプセルの形態である場合の経口投与については、有効成分を、ラクトース、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトール等を含むがこれらに限定されない、経口の、非毒性で医薬的に許容される不活性担体と組み合わせることができる。加えて、所望する場合または必要な場合は、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤も混合物に組み込むことができる。適切な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、グルコースまたはβ−ラクトースなどの天然糖類、トウモロコシ甘味料、アラビアゴム、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等を挙げることができる。これらの投与形態で使用される潤滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等を挙げることができる。崩壊剤には、これらに限定されることはないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が含まれる。
【００３５】
一部の実施形態では、本発明の硝酸エステル製剤も、標的可能な薬剤担体として可溶性ポリマーと連結することができる。そのようなポリマーとしては、例えばポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシド−ポリリシンを挙げることができる。一実施形態では、本発明において、硝酸エステル製剤は、薬剤の制御放出を達成するのに有用な生分解性ポリマーのクラス、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸のコポリマー、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアシレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーに連結することができる。
【００３６】
本明細書で述べる組成物は、持続放出製剤（すなわち投与後に調節剤の緩やかな放出を生じさせるカプセルまたは樹脂またはスポンジなどの製剤）の一部として投与することができる。そのような製剤は、一般に周知の技術を用いて調製することができ、例えば経口、直腸もしくは皮下移植によって、または所望標的部位での移植によって投与できる。持続放出製剤は、担体マトリックス中に分散したおよび／または速度制御膜によって取り囲まれたリザーバー内に含まれる調節剤を含有することができる。そのような製剤中での使用のための担体は生体適合性であり、同時に生分解性であり得る。好ましくは、製剤は比較的一定なレベルの調節剤放出を提供する。
【００３７】
留意すべき点として、ヒトは一般にマウスまたは本明細書で例示される他の実験動物よりも長期間治療される。したがって、治療期間の長さは、一般に疾患または病態生理学的過程の長さまたは強度または事前の期間に比例し、動物の種、薬剤の有効性および必要とされるまたは推奨される効果の程度にさらに依存し得る。用量は、単回投与量または１日から数日間またはそれ以上の期間にわたる多回投与量であり得る。
【００３８】
一実施形態では、本発明の医薬組成物および化合物は、特に治療の標的が、眼、皮膚または下部消化管の疾患を含む、局所適用によって容易にアクセス可能な領域または器官を含む場合、局所的に投与される。局所適用はまた、本発明の組合せ、化合物および組成物を、筋などの皮膚の下の組織に投与するために容易に使用できる。適切な局所製剤は、これらの領域または器官の各々のために調製することができる。
【００３９】
下部消化管のための局所適用は、直腸坐剤製剤中でまたは適切な浣腸製剤中で実施できる。局所的経皮パッチも使用できる。局所適用のために、医薬組成物は、１以上の担体に懸濁または溶解した活性成分を含む適切な軟膏に製剤することができる。本発明の化合物の局所投与のための担体には、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、医薬組成物は、１以上の医薬的に許容される担体に懸濁または溶解した活性成分を含む適切なローションまたはクリームに製剤できる。適切な担体には、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
眼科用には、医薬組成物は、塩化ベンジルアルコニウムなどの防腐剤を含むかまたは含まない、等張性のｐＨ調整された滅菌生理食塩水中の微粒化懸濁液としてまたは、好ましくは、等張性のｐＨ調整された滅菌生理食塩水中の溶液として製剤することができる。あるいは、眼科用には、医薬組成物はペトロラタムなどの軟膏に製剤できる。
【００４１】
眼への局所投与に適する製剤には、有効成分が適切な担体中に、特に有効成分のための水性溶媒中に溶解または懸濁した点眼剤も含まれる。有効成分は、好ましくはそのような製剤中に０．５〜２０重量％、有利には０．５〜１０重量％、特に約１．５重量％の濃度で存在した。
【００４２】
患者の全身循環中への活性物質の経皮通過によって本発明の医薬組成物を送達する局所投与が使用できる。皮膚部位には、前腕、腹部、胸部、背部、臀部、大腿および耳介後方領域などの、薬剤を経皮的に投与するための解剖学的領域が含まれる。化合物は、化合物を含む局所製剤または化合物を投与する経皮薬剤送達装置のいずれかを皮膚上に置くことによって皮膚に投与される。いずれの実施形態でも、送達媒体は、容易に設置され、皮膚上で快適に保持されるように設計され、成形され、製造され、適合されるか、または製剤は、処方される量およびスケジュールで皮膚に直接適用される。
【００４３】
局所投与に適する製剤には、皮膚を通した浸透に適する液体または半液体製剤（例えばリニメント、ローション、軟膏、クリーム、ゲルまたはペースト）、および眼、耳または鼻への投与に適する点滴剤が含まれる。本発明の化合物の有効成分の適切な局所用量は、１日１〜４回、好ましくは１日１回または２回投与される０．１ｍｇ〜１５０ｍｇである。局所投与のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、製剤の０．００１重量％〜１０重量％、例えば１重量％〜２重量％を構成することができるが、製剤の１０重量％までをも構成してもよく、しかし５重量％以下または０．１％〜１％を構成することもできる。
【００４４】
軟膏に製剤される場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドはパラフィン系または水混和性軟膏基剤と共に用いることができる。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、乳化クリーム基剤と共にクリームに製剤できる。所望する場合は、クリーム基剤の水相は、例えば少なくとも３０重量％の多価アルコール、例えばプロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物などを含むことができる。局所製剤は、望ましくは、皮膚または他の患部を通した有効成分の吸収または浸透を促進する化合物を含むことができる。そのような皮膚浸透促進剤の例には、メトカルバモール、長鎖アルコール、ジメチルスルホキシドおよび関連類似体が含まれる。
【００４５】
様々な経皮薬剤送達装置が本発明の医薬製剤に関して使用できる。例えば、裏打ち材およびアクリレート接着剤を含む簡単な接着パッチが調製できる。薬剤および任意の浸透促進剤を接着剤成型溶液に製剤することができる。接着剤成型溶液を裏打ち材上に直接流し込むか、または接着コーティングを形成するように皮膚に適用することができる。
【００４６】
経皮投与は、リザーバーと多孔質膜型または固体マトリックス型のいずれかのパッチを用いて達成できる。いずれの場合も、活性物質はリザーバーまたはマイクロカプセルから膜を通して、受容者の皮膚または粘膜と接触する活性物質透過性接着剤へと継続的に送達される。活性物質が皮膚を通して吸収される場合は、活性物質の制御された所定の流量が受容者に投与される。マイクロカプセルの場合は、封入剤が膜としての機能も果たすことができる。
【００４７】
他の実施形態では、本発明の化合物は、液体リザーバーシステムの薬剤送達装置を用いて送達される。これらのシステムは、典型的には裏打ち材、膜、アクリレートベースの接着剤および剥離ライナーを含む。膜は裏打ち材に密封されてリザーバーを形成する。次に、薬剤または化合物および任意の媒体、促進剤、安定剤、ゲル化剤等をリザーバーに組み込む。
【００４８】
裏打ち材、薬剤／浸透促進剤マトリックス、膜および接着剤を含むマトリックスパッチも、本発明の化合物を経皮的に送達するために使用できる。マトリックス材料には、典型的にはポリウレタンフォームが含まれる。薬剤、任意の促進剤、媒体、安定剤等をフォーム前駆物質と組み合わせる。フォームを硬化させて、直接裏打ち材に貼り付けることができる粘着性で弾性のマトリックスを形成する。
【００４９】
非毒性の医薬的に許容される局所用担体と共に、典型的には約０．００１％〜１０％の範囲内の濃度で本発明の化合物を含む、皮膚への局所適用のための製剤も本発明に包含される。これらの局所製剤は、本発明における有効成分を、局所用乾燥、液体およびクリーム製剤において一般的に使用される従来の医薬希釈剤および担体と組み合わせることによって調製できる。軟膏およびクリームは、例えば水性または油性基剤を用いて、適切な増粘剤および／またはゲル化剤を添加して製剤できる。そのような基剤としては、水および／または油、例えば流動パラフィンまたは落花生油もしくはヒマシ油などの植物油を挙げることができる。基剤の性質に応じて使用できる増粘剤には、軟パラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、羊毛脂、水素添加ラノリン、蜜ろう等が含まれる。
【００５０】
ローションは、水性または油性基剤を用いて製剤することができ、一般に、以下のもの、すなわち、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、着香剤、着色剤、香料等の１以上も含むことができる。粉末は、任意の適切な粉末基剤、例えば滑石、ラクトース、デンプン等を用いて形成することができる。点滴剤は、１以上の分散剤、懸濁化剤、可溶化剤、着香剤、着色剤等を同時に含む、水性基剤または非水性基剤を用いて製剤できる。
【００５１】
本発明のエマルションの油相は、公知の成分から公知の方法で構成することができる。油相は単に乳化剤だけを含むこともできるが、少なくとも１つの乳化剤と、脂肪または油との混合物、または脂肪と油の両方との混合物を含むことができる。好ましくは、親水性乳化剤が、安定剤として働く親油性乳化剤と共に含まれる。油と脂肪の両方を含むことも好ましい。合わせると、安定剤を伴うまたは伴わない乳化剤は、いわゆる乳化ろうを構成し、ろうは油および脂肪と共にいわゆる乳化軟膏基剤を構成し、該乳化軟膏基剤はクリーム製剤の油性分散相を形成する。本発明の製剤における使用に適する乳化剤および乳化安定剤には、単独またはろうを伴う、Ｔｗｅｅｎ（商標）６０、Ｓｐａｎ（商標）８０、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ラウリル硫酸ナトリウム、ジステアリン酸グリセリル、または当分野で周知の他の材料が含まれる。
【００５２】
医薬乳化製剤において使用される可能性が高い大部分の油への活性化合物の溶解度は非常に低いので、製剤のための適切な油または脂肪の選択は所望の表面特性を達成することに基づく。したがって、クリームは、好ましくは、チューブまたは他の容器からの漏出を避けるために適切な粘稠度を備えた、べたべたせず、着色性でない、洗い落すことができる製品であるべきである。直鎖または分枝鎖の、一塩基性または二塩基性アルキルエステル、例えばジイソアジピン酸塩、ステアリン酸イソセチル、ココナツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、２−パルミチン酸エチルへキシルなど、または分岐鎖エステルの混合物を使用することができる。これらは、必要とされる性質に依存して単独でまたは組み合わせて使用することができる。あるいは、白色ワセリンおよび／もしくは流動パラフィンなどの高融点脂質または他の鉱油が使用できる。
【００５３】
本発明における局所医薬組成物はまた、１以上の防腐剤または静菌剤、例えばヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、クロロクレゾール、塩化ベンザルコニウム等を含むことができる。局所医薬組成物はまた、抗菌剤、特に抗生物質、麻酔薬、鎮痛薬およびかゆみ止めならびに抗真菌薬などの他の有効成分も含むことができる。蒸発することにより、局所製剤／適用を「硬化させる（ｓｅｔ）」かまたは乾燥させつつ、組成物ににおいを与える香料または揮発性物質も含めることができる。
【００５４】
本発明の医薬組成物はまた、粘膜を通して送達することもできる。経粘膜（すなわち舌下、口腔および膣）薬剤送達は、活性物質を全身循環に効率よく入り込ませ、肝臓および腸壁微生物叢による即時代謝を低減する。経粘膜薬剤投与形態（例えば錠剤、坐剤、軟膏、ペッサリー、膜および粉末）は、典型的には粘膜と接触して保持され、速やかに崩壊および／または溶解して即時全身吸収を可能にする。
【００５５】
関連する態様では、本発明は、標的タンパク質の発現を阻害するまたは変化させることにより疾患状態を治療するまたは予防する方法を包含する。そのような疾患状態には、ウイルス、細菌または真菌感染、癌性腫瘍、および再狭窄、過剰増殖性皮膚障害または炎症などの、細胞増殖を特徴とする他の状態が含まれる。標的化される遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで）には、多くの癌遺伝子、受容体タンパク質、基質タンパク質、構造タンパク質およびウイルスタンパク質を包含する、転写因子が含まれる。そのようなタンパク質の阻害は、一般に細胞周期、ウイルス複製または他の重要な機能の破壊を生じさせる。
【００５６】
一実施形態では、本発明の方法は、被験者にアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に特定の遺伝子発現を回復させるまたは遺伝子のアイソフォームを切り替えることを目的として特定の遺伝子領域を標的化するように選択されるモルホリノオリゴマーを投与することによって実施される。一般に、該方法は、適切な医薬担体中で、完全性、転写またはスプライシングを妨げ、したがってタンパク質の正常な発現を抑制するもしくは回復させる、または異なるアイソフォームの発現に切り替えるのに有効な量のアンチセンス薬を被験者に投与することを含む。好ましい実施形態では、該方法は、タンパク質のドミナントネガティブ変異体の発現を生じさせる。該方法の１つの態様では、被験者はヒト被験者である。抗ウイルス治療における使用のために、経口および非経口経路、例えば静脈内、皮下、腹腔内および筋肉内を含む様々な全身送達経路、ならびに吸入、経皮および局所送達が使用できる。
【００５７】
典型的には、１回分またはそれ以上の用量のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を、一般に一定の間隔で、好ましくは１日に１回から１か月に１回までの間隔で投与する。経口投与のための好ましい用量は、約１ｍｇ／ｋｇ体重のオリゴマーから約６００ｍｇ／ｋｇ体重のオリゴマーまで、より好ましくは約３０ｍｇ／ｋｇ体重のオリゴマーから約３００ｍｇ／ｋｇ体重のオリゴマーまでである。ＩＶ投与については、好ましい用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重のオリゴマーまでである。投与量は、患者の年齢、健康、性別、大きさおよび体重、投与経路、ならびに特定の疾患状態に関するオリゴヌクレオチド薬の効果などの因子によって異なる。感染病原体の治療のためには、好ましい投与量は、典型的には約０．１〜約１０μＭ、より好ましくは約４００〜１０００ｎＭアンチセンスオリゴマーの血中濃度を達成するのに必要な用量である。この濃度は様々な方法で達成することができる。持続ＩＶ注入による約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／時の用量が許容されることが認められている。より多いまたはより少ない量のオリゴヌクレオチドを必要に応じて投与することができる。
【００５８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した有効なインビボ治療投薬計画は、投与の頻度および経路、ならびに治療下にある被験者の状態によって異なる。所与の経路についての最適投与量は、当分野で公知の方法に従って通常の実験により決定することができる。そのようなインビボ療法は、一般に治療される疾病の特定の種類に適切な試験によって観測され、最適治療結果を達成するために用量または治療レジメンの対応する調整を行うことができる。
【実施例】
【００５９】
本発明の医薬製剤の毒性を検討した。結果を以下の表１に要約する。この実施例では、様々な用量レベルのＰＭＯ−ＰＣＰの毒性を、負に荷電したポリマーと組み合わせてＰＭＯ−ＰＣＰを投与した場合の毒性と比較した。試験Ｎｏ．１〜４の各々において、８匹のマウスにＰＭＯ−ＰＣＰを含む医薬組成物を１回注射した。試験３および４では、医薬組成物は、ＰＭＯ−ＰＣＰに加えて負に荷電したポリマーを含んだ。ＰＭＯ−ＰＣＰは、マウスジストロフィンのエクソン２３およびイントロン２３の接合部を標的化し、（ＲＸＲＲＢＲ）２ＸＢ配列（Ｒ＝アルギニン、Ｘ＝６−アミノヘキサン酸およびＢ＝□アラニン）のペプチドと接合しているアンチセンスオリゴマー、Ｅ２３＋７−１８である。負に荷電したポリマーは１５量体ＤＮＡである。試験Ｎｏ．２では、ＰＭＯ−ＰＣＰの用量は１２０ｍｇ／ｋｇであり、１匹を除くすべてのマウスの死亡を生じさせた。試験Ｎｏ．４では、試験Ｎｏ．２と同じＰＭＯ−ＰＣＰ用量を使用した。しかし、試験Ｎｏ．４では、ＰＭＯ−ＰＣＰ組成物を負に荷電した１５量体ＤＮＡオリゴヌクレオチドと混合した。表１からわかるように、試験Ｎｏ．２と比較して、アンチセンスオリゴマーを負に荷電したＤＮＡオリゴヌクレオチドと共に製剤した場合は、８匹のマウスのうち１匹だけが同じ用量のＰＭＯ−ＰＣＰで死亡した。ＰＭＯ−ＰＣＰとＤＮＡの比率は４：１である。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
この実施例では、ジストロフィマウスの処置における本発明の医薬組成物の作用を、正に荷電したペプチドと接合したホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）（ＰＰＭＯ）で処置したマウスと比較した。本発明の組成物中のＰＰＭＯを、２０量体のＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む負に荷電したＤＮＡオリゴマーと混合した。ＰＰＭＯ対ＤＮＡの比率は４：１であった。マウスを単回静脈内注射で処置し、ＰＰＭＯの用量は３０ｍｇ／ｋｇ体重であった。１４日後、評価と染色のために組織試料を採取した。図１は、ＰＰＭＯ／ＤＮＡオリゴマー製剤で処置したｍｄｘマウスの筋組織中のジストロフィンタンパク質（赤色の膜染色）の免疫組織化学画像である。正常対照組織はＣ５７ＢＬ１０マウス由来である。ｍｄｘ対照組織はスクランブルＰＰＭＯ配列で処置したマウス由来である。３０ｍｇ／ｋｇ  ＰＰＭＯ＋ＤＮＡと表示された図１の右の欄は、種々の組織におけるジストロフィン誘導のレベルが、ＰＰＭＯだけで処置したマウスからの組織と同じであるか、またはＰＰＭＯだけで処置した同じ組織よりも明らかに高い（心臓において）（左から３番目の欄）ことを示す。ジストロフィンタンパク質は、ジストロフィンに特異的な抗体での赤色の膜染色によって示される。
【００６２】
上記で結果を考察した実施例は、アンチセンスオリゴマーの効果に有意の影響を及ぼさずに毒性を低減するために、負に荷電したポリマーまたは両親媒性ポリマーを使用することの効果を明らかにする。実際に、この結果は、全身送達によってさえもアンチセンスオリゴマーの効果を増強する潜在的可能性を明らかにした。
【００６３】
図２に示す実施例では、ジストロフィ筋組織への本発明の医薬組成物の作用を検討した。特に、１２０ｍｇ／ｋｇ  ＰＰＭＯ＋ＤＮＡ（４：１）処置後のｍｄｘマウスの組織におけるジストロフィン発現の免疫組織化学検出を評価した。図２において、強い赤色の膜染色は、すべての筋における正常に近いレベルのジストロフィンを指示する。ＰＰＭＯ／ＤＮＡ製剤の単回静脈内注射の２週間後に組織を試験した。結果は、治療効果を達成するためにより高い用量のＰＭＯ−ＰＣＰが必要とされる場合、本発明の製剤を使用すればそのような高用量を使用することが可能になることを示す。
【００６４】
図３は、ＰＰＭＯ、ＶｉｖｏＰＭＯおよびアルギニンリッチペプチド（Ａｒｇペプチド）の核酸結合特性を明らかにするアガロースゲル画像である。ＶｉｖｏＰＭＯは、２ＯメチルホスホロチオエートＲＮＡオリゴ（２ＯＭｅＰＳ）に最も強く結合する。ＰＭＯＥ２３およびＰＰＭＯＥ２３は、マウスジストロフィンエクソン２３を標的化するオリゴマー配列である。より下の強いバンドは、臭化エチジウム染色した２ＯＭｅＰＳオリゴである。
【００６５】
本明細書で述べる本発明の多くの変更および他の実施形態が、前記説明および付随する図面の中で提示される教示を利用して、これらの発明が関連する分野の当業者に想起される。したがって、本発明は開示される特定の実施形態に限定されないこと、ならびに変更および他の実施形態は添付の特許請求の範囲に包含されるものであることが理解されるべきである。特定の用語が本明細書で用いられるが、それらは一般的および説明的意味でのみ使用され、限定を目的としない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年1月15日(2013.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正に荷電したポリマーと接合したアンチセンスオリゴヌクレオチド、但し該アンチセンスオリゴヌクレオチドはモルホリノオリゴマーを含む、と、
負に荷電したポリマーまたは両親媒性ポリマーと
の混合物を含有する医薬組成物であって、投与された場合、改善されたアンチセンス効率および／または細胞毒性の低減を示す、医薬組成物。
【請求項２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約１５〜４０塩基対単位（モノマー）を有するモルホリノオリゴマーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記モルホリノオリゴマーが、ホスホロジアミデートに連結したモルホリノオリゴマーを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記正に荷電したポリマーが、ペプチド、カチオンポリマーおよびデンドリマー状オクタグアニジンポリマーからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記負に荷電したポリマーが、約２〜５０塩基対を有するＲＮＡまたはＤＮＡ鎖を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記負に荷電したポリマーが、多糖、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記負に荷電したポリマーが、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと接合している正に荷電したポリマーにイオン結合している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記負に荷電したポリマーと、正に荷電したポリマーと接合した前記アンチセンスオリゴマーとの比率が約１：１００〜１００：１、特に約０．２：１〜１：５である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが、正に荷電したポリマーと接合した、ホスホロジアミデートに連結したモルホリノオリゴマーを含み、前記組成物が担体をさらに含有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アンチセンスオリゴマーおよび前記負に荷電したポリマーが、ＤＮＡまたはＲＮＡの同じ標的領域に対してどちらも相補的である、ほぼ相補的である、または相補的ではない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記負に荷電したポリマーが、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を患者に投与するステップを含む、それを必要とする被験者の医学的状態を治療するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロジアミデートに連結したモルホリノオリゴマーまたはＰＮＡオリゴマーを含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記正に荷電したポリマーが、ペプチド、カチオンポリマーまたはそれらの組合せである、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記医薬組成物を投与するステップの前に、前記負に荷電したポリマーおよび／または両親媒性ポリマーを含む溶液を、正に荷電したポリマーと接合した前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む溶液と混合する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記医学的状態が、細菌もしくはウイルス感染、癌、筋関連疾患、または筋ジストロフィである、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記医薬組成物を約０．５ｍｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与する、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
正に荷電したポリマーと接合したアンチセンスオリゴヌクレオチド、但し該アンチセンスオリゴヌクレオチドはモルホリノオリゴマーを含む、と、
負に荷電したポリマーまたは両親媒性ポリマーと
の混合物を含有する医薬組成物であって、投与された場合、改善されたアンチセンス効率および／または低い毒性を示し、かつ、該負に荷電したポリマーが該アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じまたは類似の配列を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
前記負に荷電したポリマーが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2013526519.tif 000006
2013526519.tif 000007
2013526519.tif 000008