(57)【要約】  本発明は製品がダイズゲノム中の特定の箇所において特定の除草剤耐性形質転換イベントを保有することを特徴とする特定のトランスジェニックのダイズ植物、植物性物質又は種子を提供する。生物学的試料中のイベントの迅速かつ明確な識別を可能にするツールも提供される。
2013511293.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３を識別するための方法であって、方法がＥＥ−ＧＭ３中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’又は３’フランキング領域を特異的に認識する特異的プライマー又はプローブを用いたＥＥ−ＧＭ３特異的領域の検出を含む、上記方法。
【請求項２】
プライマー少なくとも２つを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて該生物学的試料中に存在する核酸から５〜１０００ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅することを含み、ここで、該プライマーの一方はＥＥ−ＧＭ３中に存在する除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’フランキング領域、ここで該５’フランキング領域はヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列を含むもの、又はＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの３’フランキング領域、ここで該３’フランキング領域はヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３の相補体のヌクレオチド配列を含むもの、を認識し、該プライマーの他方のプライマーはヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの配列番号２の相補体のヌクレオチド配列、又はヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列を含む外来性ＤＮＡ内部の配列を認識するか、又は、該プライマーの他方のプライマーは配列番号１のヌクレオチド配列又はその相補体を含むか、又はヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８までの配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体を含む、外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
５’フランキング領域を認識する該プライマーはヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列から選択される１７から２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、又は、ＥＥ−ＧＭ３の３’フランキング領域を認識する該プライマーはヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３の相補体のヌクレオチド配列から選択される１７から２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、そして外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する該プライマーは、ヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの配列番号２の相補体のヌクレオチド配列、又はヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列又はその相補体、又はヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８までの配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体から選択される１７から２００個の連続ヌクレオチドを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
５’フランキング領域を認識する該プライマーがその最３’末端においてヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、又はＥＥ−ＧＭ３の３’フランキング領域を認識する該プライマーがその最３’末端においてヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３の相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、そして、外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する該プライマーが、ヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの配列番号２の相補体のヌクレオチド配列、又はヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列又はその相補体、又はヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８までの配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドを含む、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーがそれぞれ配列番号５及び配列番号４の配列、又は、それぞれ配列番号７及び配列番号４の配列を含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＥＥ−ＧＭ３PCR Identification Protocolを用いる約２６３又は７０６bpのフラグメントを増幅することを包含する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＥＥ−ＧＭ３中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’フランキング領域を認識するプライマー１つ、ここで該５’フランキング領域はヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列を含むもの、又はＥＥ−ＧＭ３中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの３’フランキング領域を認識するプライマー１つ、ここで該３’フランキング領域はヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３の相補体のヌクレオチド配列を含むもの、及び外来性ＤＮＡ内部の配列を認識するプライマー１つ、ここで該外来性ＤＮＡはヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの配列番号２の相補体のヌクレオチド配列、又はヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列又はその相補体、又はヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８までの配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体を含むもの、を含むキット。
【請求項８】
該プライマーはヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列から選択される１７から２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、又は、ＥＥ−ＧＭ３の３’フランキング領域を認識する該プライマーはヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３の相補体のヌクレオチド配列から選択される１７から２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、そして外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する該プライマーが、ヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの配列番号２の相補体のヌクレオチド配列、又はヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列又はその相補体、又はヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８までの配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体から選択される１７から２００個の連続ヌクレオチドを含む、請求項７記載のキット。
【請求項９】
５’フランキング領域を認識する該プライマーがその最３’末端においてヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、又はＥＥ−ＧＭ３の３’フランキング領域を認識する該プライマーがその最３’末端においてヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３の相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、そして、外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する該プライマーが、ヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの配列番号２の相補体のヌクレオチド配列、又はヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列又はその相補体、又はヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８までの配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドを含む、請求項７記載のキット。
【請求項１０】
配列番号４の配列を含むプライマー及び配列番号５の配列を含むプライマー又は配列番号５の配列を含むプライマーおよび配列番号７の配列を含むプライマーを含む請求項７記載のキット。
【請求項１１】
最適な検出条件下においてＥＥ−ＧＭ３中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’又は３’フランキング領域内部の配列を特異的に認識する配列を含むＥＥ−ＧＭ３特異的検出における使用に適するプライマーであって、該５’フランキング領域はヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列を含み、そして該３’フランキング領域はヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３の相補体のヌクレオチド配列を含む上記プライマー。
【請求項１２】
該プライマーがヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列から選択される１７から２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列、又はヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３の相補体のヌクレオチド配列から選択される１７から２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む請求項１１記載のプライマー。
【請求項１３】
該プライマーが、その最３’末端において、ヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列、又はヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３の相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む請求項１１記載のプライマー。
【請求項１４】
配列番号５の配列をその最３’末端に含むプライマー。
【請求項１５】
配列番号５の配列をその最３’末端に含む第１のプライマー及び配列番号４の配列をその最３’末端に含む第２のプライマーを含むプライマー対。
【請求項１６】
ＥＥ−ＧＭ３に対して特異的なプローブに生物学的試料の核酸をハイブリダイズさせることを含む請求項１記載の方法。
【請求項１７】
該特異的プローブの配列が、ＥＥ−ＧＭ３の５’フランキング配列又は３’フランキング配列及びそれに近接する外来性ＤＮＡの配列の部分を含む配列と配列同一性少なくとも８０％を有する請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該特異的プローブの配列がヌクレオチド１４３１から１４７２までの配列番号２又はヌクレオチド２２０〜２６１の配列番号３、又は該配列の相補体と配列同一性少なくとも８０％を有する請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＥＥ−ＧＭ３の特定の領域に特異的にハイブリダイズすることができる特異的プローブを含むキット。
【請求項２０】
該特異的プローブの配列がＥＥ−ＧＭ３中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’フランキング配列又は３’フランキング配列の部分及びそれに近接する外来性ＤＮＡの配列を含む配列と配列同一性少なくとも８０％を有する請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
該特異的プローブの配列がヌクレオチド１４４１から１４６２までの配列番号２又はヌクレオチド２３０から２５１までの配列番号３、又は該配列の相補体と配列同一性少なくとも８０％を有するヌクレオチド配列を含む請求項２０記載のキット。
【請求項２２】
生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３の識別のための特異的プローブ。
【請求項２３】
ＥＥ−ＧＭ３中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’フランキング配列又は３’フランキング配列及びそれに近接する外来性ＤＮＡの配列の部分の配列又はその相補体と配列同一性少なくとも８０％を有するヌクレオチド配列を含む請求項２２記載のプローブ。
【請求項２４】
ヌクレオチド１４４１から１４６２までの配列番号２又はヌクレオチド２３０から２５１までの配列番号３、又は該配列の相補体と配列同一性少なくとも８０％を有する請求項２３記載のプローブ。
【請求項２５】
ヌクレオチド１４４１から１４６２までの配列番号２又はヌクレオチド２３０から２５１までの配列番号３、又は該配列の相補体と本質的に類似のヌクレオチド配列を含む特異的プローブ。
【請求項２６】
種子の純度を確認するための方法であって、方法が種子試料中のＥＥ−ＧＭ３中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’又は３’フランキング領域を特異的に認識する特異的プライマー又はプローブによるＥＥ−ＧＭ３特異的領域の検出を含む上記方法。
【請求項２７】
ＥＥ−ＧＭ３の存在に関して種子をスクリーニングするための方法であって、方法が種子ロットの試料中のＥＥ−ＧＭ３中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’又は３’フランキング領域を特異的に認識する特異的プライマー又はプローブによるＥＥ−ＧＭ３特異的領域の検出を含む上記方法。
【請求項２８】
優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含む植物、植物、植物性物質又は種子の接合生殖性を測定するための方法であって、該方法が、プライマー少なくとも３つによるポリメラーゼ連鎖反応を用いてこれら生物学的試料中に存在する核酸から１００〜１０００ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅することを包含し、ここで該プライマーの２つは配列番号５のヌクレオチド配列を含むプライマー又は配列番号６のヌクレオチド配列を含むプライマーのような予備挿入植物ＤＮＡを特異的に認識するものであり、該プライマーの３番目は配列番号７のヌクレオチド配列のような外来性ＤＮＡ内部の配列を認識するものである、上記方法。
【請求項２９】
標的核酸配列の再利用を介してプローブ：標的核酸の比を増幅する実質的に相補な標識された核酸とのハイブリダイゼーションを介して生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３の存在を検出するための方法であって、該方法が下記工程：
ａ）該標的核酸配列を、ヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１４６９までの配列番号２のヌクレオチド配列又はその相補体を含む第１の核酸オリゴヌクレオチド、又は、ヌクレオチド２２３からヌクレオチド２４０までの配列３のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該第１の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること；
ｂ）該標的核酸配列をヌクレオチド１４３４からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列又はその相補体を含む第２の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド２４１からヌクレオチド２５８までの配列番号３のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識された核酸プローブにハイブリダイズさせること、ここで、該第１及び第２のオリゴヌクレオチドはヌクレオチド少なくとも１つで重複しており、そしてここで該第１又は該第２のオリゴヌクレオチドの何れかが標識されて該標識された核酸プローブとなるもの；
ｃ）選択的プローブ切断を起こすことによりデュプレックス解離をもたらす酵素によりプローブ:標的核酸配列デュプレックス内部の標識されたプローブのみを切断し、標的配列は未損傷のままとすること；
ｄ）工程（ａ）から（ｃ）を反復することによる標的核酸配列の再使用；
ｅ)切断された標識されたプローブを検出することにより、該標的核酸配列の存在を測定すること；
を含む上記方法。
【請求項３０】
各々がそのゲノム内に優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むトランスジェニックダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫であって、該イベントを含むレファレンス種子が寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されている上記トランスジェニックダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫。
【請求項３１】
請求項３０記載のトランスジェニックダイズ植物、種子、細胞、部分又は子孫であって、そのゲノムＤＮＡが、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を含むプライマー２つでＥＥ−ＧＭ３に関する優良イベントIdentification Protocolを用いながら分析した場合に、約２６３ｂｐのＤＮＡフラグメントを与える上記トランスジェニックダイズ植物、種子、細胞、部分又は子孫。
【請求項３２】
寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されている優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含む種子又はそれからの誘導物。
【請求項３３】
請求項３２から得ることができる優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物、植物部分、細胞又は組織、又は種子。
【請求項３４】
寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託された種子から生育させたダイズ植物の増殖及び／又はそれとの交配により得ることができる、自身のゲノム内に優良イベントＥＥ−ＧＭ３を各々が含んでいるダイズ植物、又はその種子、細胞又は組織。
【請求項３５】
優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ種子であって、該イベントを含むレファレンス種子が寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されている上記種子。
【請求項３６】
請求項３５記載の種子から得ることができる優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むトランスジェニックダイズ植物、細胞又は組織。
【請求項３７】
請求項３０から３６の何れか１項に記載の植物を別のダイズ植物と交雑させること、及び、該交雑から得られた種子を植えることを含む優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物又は種子を生産するための方法。
【請求項３８】
優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むダイズゲノムＤＮＡ。
【請求項３９】
ヌクレオチド１４４１からヌクレオチド１４５２の配列番号２又はヌクレオチド２３０からヌクレオチド２５１までの配列番号３又は該配列番号の相補体に本質的に類似のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項４０】
ヌクレオチド１４３１からヌクレオチド１４６２の配列番号２又はヌクレオチド２２０から２６１までの配列番号３又は該配列の相補体に本質的に類似のヌクレオチド配列を含む請求項４０記載の単離された核酸分子。
【請求項４１】
下記のヌクレオチド配列：
ａ）ヌクレオチド１から１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列；
ｂ）ヌクレオチド６７６０からヌクレオチド６９５８までの配列番号１のヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列；
ｃ）ヌクレオチド６８７４からヌクレオチド７２９８までの配列番号１のヌクレオチド配列：
ｄ）ヌクレオチド７からヌクレオチド７２９１までの配列番号１のヌクレオチド配列；
ｅ）ヌクレオチド１２からヌクレオチド７２６５までの配列番号１のヌクレオチド配列；
ｆ）ヌクレオチド２１７からヌクレオチド２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列；及び、
ｇ）ヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３のヌクレオチド配列；
を順次自身のゲノム内に含むダイズ植物。
【請求項４２】
下記のヌクレオチド配列：
ａ）ヌクレオチド１から１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列；
ｂ）ヌクレオチド６７６０からヌクレオチド６９５８までの配列番号１のヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列；
ｃ）ヌクレオチド６８７４からヌクレオチド７２９８までの配列番号１のヌクレオチド配列：
ｄ）ヌクレオチド７からヌクレオチド７２９１までの配列番号１のヌクレオチド配列；
ｅ）ヌクレオチド１２からヌクレオチド７２６５までの配列番号１のヌクレオチド配列；
ｆ）ヌクレオチド２１７からヌクレオチド２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列；及び、
ｇ）ヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３のヌクレオチド配列；
を順次含むＤＮＡ分子。
【請求項４３】
ヌクレオチド１４４１からヌクレオチド１４６２の配列番号２に本質的に類似のヌクレオチド配列を含む核酸分子及びヌクレオチド２３０から２５１までの配列番号３に本質的に類似のヌクレオチド配列を含む核酸分子又は該配列の相補体を含む、イベントＥＥ−ＧＭ３を自身のゲノム内に含むトランスジェニックダイズ植物、植物細胞、組織又は種子。
【請求項４４】
配列番号２と本質的に同様のヌクレオチド配列を含む核酸分子及び配列番号３と本質的に同様のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は該配列の相補体を含む、イベントＥＥ−ＧＭ３を自身のゲノム内に含むダイズ植物、植物細胞、組織、又は種子。
【請求項４５】
ＥＥ−ＧＭ３を含み、そして、ヌクレオチド１４３１から１４７２までの配列番号２と少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列及びヌクレオチド２２０から２６１の配列番号３と少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、又は該配列の相補体を自身の細胞のゲノム内に含む、ダイズ植物、細胞又は種子。
【請求項４６】
配列番号１のヌクレオチド配列又はその相補体との少なくとも９９％の配列同一性、ヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８の配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体との少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体との少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子を自身のゲノム内に含む、ダイズ植物、植物細胞、組織、又は種子。
【請求項４７】
配列番号１のヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイズする、又はヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８の配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体とハイブリダイズする、又は、配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体とハイブリダイズする核酸分子を自身のゲノム内に含む、ダイズ植物、植物細胞、組織、又は種子。
【請求項４８】
ヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８の配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体と少なくとも９９％の配列番号同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１１又はその相補体に少なくとも９９％の配列番号同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項４９】
ヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８の配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイズするか、又は配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１０年７月２３日に出願された米国仮特許出願６１／３６７，２２７号；２００９年１１月２３日に出願された米国仮特許出願６１／２６３，６９０号；及び２００９年１１月２３日に出願された欧州特許出願ＥＰ０９０１４５６４．０号の優先権を主張し、これらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、ダイズゲノムの特定の箇所において、特定の形質転換イベントを保有することにより、特に、除草剤耐性を付与する蛋白をコードする遺伝子の存在により特徴付けられる、トランスジェニックダイズ植物、植物性物質及び種子に関する。本発明のダイズ植物は除草剤の非存在下における非形質転換ダイズ系統と同等の種々異なる遺伝子的背景における作物学的性能、遺伝子的安定性及び機能に除草剤耐性表現型を組み合わせている。本発明は更に生物学的試料中に形質転換イベントＥＥ−ＧＭ３を特に含む植物性物質の存在を識別するための方法及びキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
植物におけるトランスジーンの表現型発現は遺伝子そのものの構造及び植物ゲノム中のそれらの箇所の両方により決定される。同時に、ゲノム中の種々異なる箇所におけるトランスジーン、即ち「外来性ＤＮＡ」の存在が種々異なる態様において植物の全体的表現型に影響することになる。遺伝子操作による植物中の商業的価値のある特質の作物学的又は工業的に成功する導入は種々異なる要因に依存する長い手順となる場合がある。遺伝子的に形質転換された植物の実際の形質転換及び再生は、広範な遺伝子特性化、交配、及び圃場試験における評価を包含し、そして最終的には優良イベントの選択に至る一連の選択工程の最初のものに過ぎない。
【０００３】
優良イベントの明確な識別はＮｏｖｅｌ  Ｆｏｏｄ／Ｆｅｅｄにおける考察、ＧＭＯと非ＧＭＯ産物の分離、及び専売物質の識別を鑑みれば、よりいっそう重要になりつつある。理想的には、そのような識別方法は迅速かつ簡素であり、広範な実験設備を必要としない。更に又、方法は専門的な解釈を要せず優良イベントの明確な測定を可能にするが、必要に応じて専門的な精査検討の下にあり続ける結果をもたらすはずである。生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３の識別において使用するための特定のツールを本明細書に記載する。
【０００４】
本明細書において、ＥＥ−ＧＭ３は、４−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤に対する耐性を付与する遺伝子と組み合わせてグリホセート耐性をコードする遺伝子を共に植物発現可能なプロモーターの制御下に含む除草剤耐容ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）の開発において、トランスジェニックダイズ植物の集団から優良イベントとして識別されている。
【０００５】
除草剤耐性遺伝子を含むダイズ植物は当該分野で開示されている。しかしながら従来技術の開示の何れも本発明を教示又は示唆するものではない。
【０００６】
許容できる作物学的性能を有し、収量を障害せず、そして確実に２種の異なるクラスの除草剤に対して十分な除草剤耐性をもたらすダイズ植物における商業的除草剤耐容優良形質転換イベントを得ることは決して単純ではない。
【０００７】
実際、除草剤耐性を有する市販の最初のダイズイベント（イベント４０−３−２は（近）同遺伝子系の系統と比較して顕著な収量障害があることが報告されている(Elmore et.al.,(2001)Agron.J.93:408-412)。
【０００８】
更に又、最適なＧＡＴ（ＴＭ）ダイズはグリホセートへの耐性をＡＬＳ除草剤に対する耐性と組み合わせるように作成されているが、その開発者によれば、これらのダイズはそれ自体ではグリホセート耐性に関する基準に合致しないと報告されている（イベント４０−３−２のような別のグリホセート耐性ダイズイベントと組み合わせない場合（例えばwww.bloomberg.com/apps/news?pid=newsaixhive&sid=ad4L0hH9MKWE参照））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Elmore et.al.,(2001)Agron.J.93:408-412
【発明の概要】
【００１０】
本発明は２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子のコーディング配列を含む除草剤耐性遺伝子及びＨＰＰＤ−ＰｆＷ３３６のコーディング配列を含む別の除草剤耐性遺伝子（共に本明細書の実施例１．１において記載されており、そして配列番号１において示される通りである）を含む発現カセットを、自身のゲノム内に安定に組み込まれた状態で含んでいる、トランスジェニックダイズ植物、又はその種子、細胞又は組織に関し、これは、グリホセート及びＨＰＰＤ阻害剤除草剤、例えばイソキサフルトールに対して耐性であり、そして、除草剤の非存在下においては、非トランスジェニック同遺伝子系の系統と実質的に同等の作物学的性能を有する。付与された耐性の対象となる除草剤１つ以上の適用の後、植物は非トランスジェニック植物と比較して優れた作物学的表現型を有することになる。
【００１１】
本発明によれば、ダイズ植物又はその種子、細胞又は組織は優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含む。
【００１２】
より特定すれば、本発明は、それぞれＥＥ−ＧＭ３の５’又は３’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡに指向されたプライマー２つを用いながら本明細書に記載したPCR Identification Protocolにおいて分析した場合に、ＥＥ−ＧＭ３に特異的なフラグメントを与えるという事実により自身のゲノムＤＮＡが特徴付けられる、トランスジェニックのダイズ植物、その種子、細胞又は組織に関する。プライマーは配列番号２内部の５’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡにそれぞれ指向させて良い。プライマーは又配列番号３内部の３’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡにそれぞれ指向されて良く、例えばプライマーはそれぞれ配列番号５及び配列番号４又は配列番号７のヌクレオチド配列を含むか、（実質的に）それらよりなり、そして１００〜８００ｂｐのＤＮＡフラグメント、例えば約２６３ｂｐ又は７０６ｂｐのフラグメントをもたらす。
【００１３】
本発明の優良イベントを含むレファレンス種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されている。本発明の１つの実施形態はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５９として寄託されている優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含む種子であり、これは除草剤に対して耐容である、特にグリホセート及び／又はＨＰＰＤ阻害剤、例えばイソキサフルトールに対して特に耐容であるダイズ植物に成長することになる。ＮＣＩＭＢ寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の種子は、成長して除草剤耐性植物となるはずの本発明の優良イベントを含む転移ＤＮＡに対してホモ接合のトランスジェニック種子少なくとも約９５％よりなる種子ロットであり、これにより植物はグリホセート及び／又はイソキサフルトール耐性となる。寄託した種子から得ることが可能か得られている種子又は子孫種子（例えば異なる遺伝子的背景を有する他のダイズ植物との交雑の後）を播種することができ、そして成長中の植物に本明細書に記載する通りグリホセート又はイソキサフルトールで処理することにより本発明の優良イベントを含む１００％グリホセート又はイソキサフルトール耐容植物を得ることができる。本発明は更にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５９を有するＮＣＩＭＢに寄託された種子から成長した本発明の優良イベントを含む植物に由来する細胞、組織、子孫、及び後継物に関する。本発明は更に本発明の優良イベントを含むダイズ植物（例えばアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５９を有するＮＣＩＭＢに寄託された種子から成長した植物）から（例えばその増殖及び／又はそれとの交配によって）得ることが可能な植物に関する。本発明は又優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物に関する。
【００１４】
本発明は更に優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むトランスジェニック植物、又はその細胞又は組織を識別するための方法に関し、その方法は、トランスジェニック植物、細胞又は組織における、特色的ＤＮＡ配列又はそのようなＤＮＡによりコードされるアミノ酸の存在を識別することに基づいている。本発明の好ましい実施形態によれば、そのような特色的ＤＮＡ配列は、１５ｂｐ又は少なくとも１５ｂｐ、好ましくは２０ｂｐ又は少なくとも２０ｂｐ、最も好ましくは３０ｂｐ以上の配列であり、これはイベントの挿入部位、即ち除草剤耐性遺伝子を含む挿入された外来性ＤＮＡの一部及びそれに近接するダイズゲノムの一部（５’又は３’フランキング領域の何れか）の両方を含み、これにより優良イベントの特異的識別が可能になる。本発明は又本明細書において識別されるとおり、イベントＥＥ−ＧＭ３を含む植物にも関する。
【００１５】
本発明は更に、生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３を識別するための方法に関し、その方法はＥＥ−ＧＭ３中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’及び／又は３’フランキング配列を特異的に認識するプライマー又はプローブに基づいている。
【００１６】
より特定すれば、本発明はプライマー少なくとも２つによるポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する核酸の配列を増幅することを含む方法に関し、プライマーのうちの１つはＥＥ−ＧＭ３中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’又は３’フランキング領域を認識し、もう１つは除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列を認識し、これにより好ましくは１００ｂｐ〜８００ｂｐのＤＮＡフラグメントが得られる。プライマーはＥＥ−ＧＭ３の５’フランキング領域内部（配列番号２、１位から１４５１位まで）又はＥＥ−ＧＭ３の３’フランキング領域内部（２４１位から１４０８位までの配列番号３の相補体）の配列及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列（１４５２から１８４３位までの配列番号２又は１位から２４０位までの配列番号３の相補体）をそれぞれ認識してよい。３’フランキング領域を認識するプライマーは配列番号５のヌクレオチド配列を含んでよく、そして、除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列を認識するプライマーは本明細書に記載する配列番号４又は配列番号７のヌクレオチド配列を含んでよい。本発明は又、特異的プライマー及び本明細書に記載する通りこのようなプライマーを用いて増幅した特異的ＤＮＡにも関する。
【００１７】
本発明は生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３を識別するための方法により特定的に関連しており、その方法は、約２６３ｂｐのＤＮＡフラグメントを得るためのそれぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に）なるプライマー２つによるか、又は約７０６ｂｐのＤＮＡフラグメントを得るためのそれぞれ配列番号５及び配列番号７のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に）なるプライマー２つによるポリメラーゼ連鎖反応を用いながら生物学的試料中に存在する核酸の配列を増幅することを含む。このようにして識別された優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含む植物もまた本発明に包含される。
【００１８】
本発明は更に生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ３に対する特異的識別方法を開発するために使用できる本明細書に記載したＥＥ−ＧＭ３の特定のフランキング配列に関する。そのような特定のフランキング配列は識別アッセイにおいてレファレンス対照物質として使用してよい。より特記すれば、本発明は本明細書において更に記載する特異的プライマー及びプローブの開発のために使用できるＥＥ−ＧＭ３の５’及び／又は３’フランキング領域に関する。レファレンス物質として同様に適するものは、配列番号７及び配列番号５又は配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に）なるプライマーにより増幅できる配列を含む、好ましくは約１５０〜８５０ｂｐの核酸分子である。
【００１９】
本発明は更にこのような特異的プライマー又はプローブの使用に基づく生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ３の存在に対する識別方法に関する。プライマーは、配列番号２のヌクレオチド配列から選択される１７から約２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列、例えばヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体から選択される１７から約２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列又はヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になるプライマーと組み合わせられた、ヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列から選択される１７から約２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列又はヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になる。プライマーは又、それらの最３’末端に所在するこれらのヌクレオチド配列を含んでよく、そして更に無関係の配列又は記載したヌクレオチド配列から誘導されるが、ミスマッチを含む配列を含む。
【００２０】
本発明は更に生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３を識別するためのキットに関し、該キットはＥＥ−ＧＭ３中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’又は３’フランキング領域を特異的に認識するプライマー又はプローブ少なくとも１つを含む。
【００２１】
本発明のキットは、PCR Identification Protocolにおける使用のために、ＥＥ−ＧＭ３の５’又は３’フランキング領域を特異的に認識するプライマーに加えてＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列を特異的に認識する第２のプライマーを含んでよい。本発明のキットは特異的プライマー少なくとも２つを含んでよく、その１つはＥＥ−ＧＭ３の５’フランキング領域内部の配列を認識し、そして他方は除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する。３’フランキング領域を認識するプライマーは配列番号５のヌクレオチド配列を含んでよく、そしてトランスジーン即ち除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡを認識するプライマーは配列番号４又は７のヌクレオチド配列を含んでよく、或いは、本明細書に記載する何れかの他のプライマー又はプライマーの組み合わせも包含される。
【００２２】
本発明は更に、本明細書に記載したＥＥ−ＧＭ３PCR Identification Protocolにおける使用のための配列番号５又は配列番号４のヌクレオチド配列を含むかそれより（本質的に）なるＰＣＲプライマーをキットが含んでいる、生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３を識別するための該キットに関する。
【００２３】
本発明は又、ＥＥ−ＧＭ３の特定の領域との配列同一性８０％〜１００％を有する配列に相当する（又はそれに相補な）配列を含むかそれより（本質的に）なる特異的プローブをキットが含む、生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３を識別するための該キットに関する。好ましくは、プローブの配列はＥＥ−ＧＭ３の５’又は３’フランキング領域の部分を含む特定の領域に相当する。より好ましくは、特異的プローブは配列番号２のヌクレオチド１４３１から１４７２の配列と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列又は配列番号３のヌクレオチド２２０から２６０の配列と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列含むかそれより（本質的に）なる（又はそれに相補である）。
【００２４】
本発明によれば、イベントの挿入部位、及び、ダイズゲノムＤＮＡ及び除草剤耐性遺伝子（トランスジーン）を含む外来性ＤＮＡの両方のポリヌクレオチドの十分な長さを含み、これにより、ＥＥ−ＧＭ３の検出のためのプライマーとして有用であり、そしてイベントＥＥ−ＧＭ３を含む植物を特性化するためのＤＮＡ配列が開示される。そのような配列はダイズゲノムＤＮＡのヌクレオチド少なくとも９つ、及び、ジャンクション部位の各側においてＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡのヌクレオチドの同数を、それぞれジャンクション部位の各側に含んでよい。最も好ましくは、そのようなＤＮＡ配列はダイズゲノムＤＮＡのヌクレオチド少なくとも９つ、及び、配列番号２又は配列番号３の挿入部位に近接する除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡのヌクレオチドの同数を含む。本発明の１つの側面において、このような特異的ＤＮＡ配列を含むダイズ植物が提供される。
【００２５】
本発明により包含される方法及びキットは種々の目的、例えば限定しないが、植物、植物性物質又は製品、例えば限定しないが、植物性物質を含むかこれより誘導された食品又は飼料製品（生鮮品又は加工品）の中のＥＥ−ＧＭ３の存在を識別するかその（下限）閾値を決定するために使用することができ；追加的又は代替的に、本発明の方法及びキットはトランスジェニック及び非トランスジェニックの物質の間の分離を目的としてトランスジェニック植物を識別するために使用することができ；追加的又は代替的に、本発明の方法及びキットはＥＥ−ＧＭ３を含む植物性物質の品質（即ちパーセンテージ純物質）を測定するために使用できる。
【００２６】
本発明は更に、ＥＥ−ＧＭ３の５’及び／又は３’フランキング領域並びにＥＥ−ＧＭ３の５’及び／又は３’フランキング配列から開発された特異的プライマー及びプローブに関する。
【００２７】
本発明は又、優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含む植物から得られるゲノムＤＮＡに関する。そのようなゲノムＤＮＡは本明細書に記載する識別アッセイにおけるレファレンス対照物質として使用してよい。
【００２８】
ここで同様に提供されるものは、優良イベント少なくとも１つを各々が含むトランスジェニックの除草剤耐容ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫であり、該優良イベントは下記：
ｉ）植物発現可能なプロモーターの制御下にグリホセート耐容ＥＰＳＰＳ酵素をコードするZea  maysに由来する修飾されたepsps遺伝子を含む第１のキメラ遺伝子；及び、
ｉｉ）植物発現可能なプロモーターの制御下にＨＰＰＤ阻害剤除草剤耐容酵素をコードするPseudomonas fluorescensに由来する修飾されたhppd遺伝子を含む第２のキメラ遺伝子；
を含む外来性ＤＮＡを含む。
【００２９】
１つの実施形態において、該優良イベントは該外来性ＤＮＡの直近上流にありそれに近接している配列番号２のヌクレオチド１から１４５１及び該外来性ＤＮＡの直近下流に有りそれに近接している配列番号３のヌクレオチド２４１から１４０８を含む。その他の実施形態においては、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子から生育させたダイズ植物と交配することにより得ることができる。
【００３０】
別の実施形態において、該ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫のゲノムＤＮＡは、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を含むプライマー２つにより該優良イベントに関する優良イベント識別プロトコルを用いて分析した場合に、(約）２６３ｂｐのＤＮＡフラグメントを与える。
【００３１】
ここで同様に提供されるものは、生物学的試料中のグリホセート及び／又はＨＰＰＤ阻害剤、例えばイソキサフルトールに対して耐容なトランスジェニックダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫を識別するための方法であり、該方法はプライマー少なくとも２つを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する核酸から１００〜５００ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅することを含み、該プライマーの一方は上記特定した優良イベントの５’フランキング領域、ここで該５’フランキング領域はヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列を含むもの、又は該優良イベントの３’フランキング領域、ここで該３’フランキング領域はヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３の相補体のヌクレオチド配列を含むもの、を認識し、該プライマーの他方のプライマーはヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの配列番号２の相補体のヌクレオチド配列、又はヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列を含む外来性ＤＮＡの配列を認識する。
【００３２】
ここで同様に提供されるものは、生物学的試料中のグリホセート及び／又はＨＰＰＤ阻害剤、例えばイソキサフルトールに対して耐容なトランスジェニックダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫を識別するためのキットであり、該キットは上記特定した優良イベントの５’フランキング領域を認識するプライマー１つ、ここで該５’フランキング領域はヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列を含むもの、又は上記優良イベントの３’フランキング領域を認識するプライマー１つ、ここで該３’フランキング領域はヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３の相補体のヌクレオチド配列を含み、そして及び外来性ＤＮＡ内部の配列を認識するプライマー１つ、ここで該外来性ＤＮＡはヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの配列番号２の相補体のヌクレオチド配列、又はヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
本発明の１つの実施形態においては、本明細書で使用する場合、優良イベントＥＥ−ＧＭ３の外来性ＤＮＡは、ヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８までの配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体を含むか、又は、ヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８までの配列番号１１のヌクレオチド配列との配列同一性少なくとも９５、９８、９９、又は９９．５％を有する配列又はその相補体を含む。
【００３４】
ここで同様に提供されるものは、ヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８までの配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体との配列同一性少なくとも９７、９８又は少なくとも９９％を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１１又はその相補体との配列同一性少なくとも９７、９８又は少なくとも９９％を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子を自身のゲノム中に含む、ダイズ植物、植物細胞、組織又は種子である。
【００３５】
本発明の１つの実施形態は、配列番号１のヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイズするか、又は、ヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８までの配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイズするか、又は配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイズする核酸分子を自身のゲノム中に含むダイズ植物、植物細胞、組織又は種子を提供する。
【００３６】
ここで同様に提供されるものは、ヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８までの配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体との配列同一性少なくとも９９％を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１１又はその相補体との配列同一性少なくとも９９％を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、又は、ヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８までの配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイズするか、又は配列番号１１のヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
以下の実施例は記載した特定の実施形態に本発明を限定する意図はなく、以下に示す参照により本明細書に組み込まれる添付の図面との関連において理解してよい。
【図１】図１は引用したヌクレオチド配列とプライマーの間の関係の模式図である。黒色バー：外来性ＤＮＡ；線影バー：植物起源のＤＮＡ；チェーッカー柄の矢印（ａ）:キメラＨＰＰＤ  ＰｆＷ３６６コード遺伝子（キメラ遺伝子の組成については表１参照）；線影矢印（ｂ）：キメラ２ｍＥＰＳＰＳコード遺伝子（キメラ遺伝子の組成については表１参照）；黒矢印：オリゴヌクレオチドプライマー、バー下の数字はヌクレオチド位置を示す；（ｃ）は示したヌクレオチド配列の相補体を指す；注記：スキームは正確な縮尺で描かれていない。
【図２】図２はＥＥ−ＧＭ３に関して開発されたPCR Identification Protocolにより得られた結果を示す。ゲルにロードした配列：レーン１：分子量マーカー（１００ｂｐラダー）；レーン２及び３：トランスジェニックイベントＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物に由来するＤＮＡ試料；レーン４〜７：優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含まないが同じ除草剤耐性遺伝子を含む(他の形質転換イベント）トランスジェニックダイズ植物に由来するＤＮＡ試料；レーン８：野生型ダイズに由来するＤＮＡ試料；レーン９：無鋳型ＤＮＡ対照；レーン１０：分子量マーカー。
【図３】図３はＥＥ−ＧＭ３に関して開発された接合生殖性採点ＰＣＲプロトコルにより得られた結果を示す。ゲルにロードした配列：レーン１：分子量マーカー（１００ｂｐラダー）；レーン２及び５：ホモ接合型のトランスジェニックイベントＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物に由来するＤＮＡ試料；レーン３、８及び９：ヘテロ接合型のトランスジェニックイベントＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物に由来するＤＮＡ試料；レーン４、６及び７：不対のダイズ植物に由来する対照ＤＮＡ試料；レーン１０：無鋳型ＤＮＡ対照；レーン１１：分子量マーカー。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
植物ゲノム中の組み換えＤＮＡ分子の取り込みは典型的には細胞又は組織の形質転換から生じる。取り込みの特定の部位は通常はランダムな組み込みによる。
【００３９】
組み換えＤＮＡ又は「形質転換ＤＮＡ」による植物の細胞又は組織の形質転換の結果として植物ゲノム中に導入され、そしてそのような形質転換ＤＮＡを起源とするＤＮＡを本明細書においては、以後、「トランスジーン」１つ以上を含む「外来性ＤＮＡ」と少する。ＥＥ−ＧＭ３のトランスジーンはグリホセート及びＨＰＰＤ阻害剤の除草剤耐性遺伝子である。本発明の文脈における「植物ＤＮＡ」は形質転換された植物を起源とするＤＮＡを指すことになる。植物ＤＮＡは通常は相当する野生型植物中の同じ遺伝子座に存在することになる。外来性ＤＮＡは植物ゲノム中の組み換えＤＮＡ分子の取り込みの部位における箇所及び配置により特徴付けることができる。組み換えＤＮＡが挿入されている植物ゲノム中の部位はまた、「挿入部位」又は「標的部位」とも称される。「前挿入植物ＤＮＡ」と称される植物ゲノムの領域内への組み換えＤＮＡの挿入は、「標的部位欠失」と称される植物ＤＮＡの欠失に関連する場合がある。「フランキング領域」又は「フランキング配列」とは本明細書においては、導入されたＤＮＡとは異なるＤＮＡ、好ましくは外来性ＤＮＡの直近上流にありそれに近接して、又は直近下流にありそれと近接して所在している植物ゲノム由来のＤＮＡの少なくとも２０ｂｐ、好ましくは少なくとも５０ｂｐ、そして５０００ｂｐまでの配列を指す。外来性ＤＮＡのランダムな組み込みをもたらす形質転換操作法は各形質転換体に特徴的でありユニークな、異なるフランキング領域を有する形質転換体をもたらすことになる。組み換えＤＮＡを伝統的な交雑を介して植物中に導入する場合、その植物ゲノム内の挿入部位、又はそのフランキング領域は一般的には変化しない。
【００４０】
「単離された核酸（配列）」又は「単離されたＤＮＡ（配列）」とは、本明細書においては、既に天然環境にはない核酸又はＤＮＡ（配列）を指し、それは、例えば別の細菌宿主中、又は植物ゲノム中の核酸配列、又は別の起源のＤＮＡ又は核酸に融合された核酸又はＤＮＡからは単離されている。
【００４１】
イベントは遺伝子工学の結果として、目的の遺伝子のコピー又は目的の遺伝子少なくとも１つを含む外来性ＤＮＡ又はトランスジーンを担持する（人工の）遺伝子座として定義される。イベントの典型的な対立遺伝子状態は外来性ＤＮＡの存在又は非存在である。イベントはトランスジーンの発現により表現型として特性化される。遺伝子レベルにおいては、イベントは植物の遺伝子メイクアップの部分である。分子レベルにおいては、イベントは制限地図（例えばサザンブロッティングにより決定される）により、トランスジーンの上流及び／又は下流のフランキング配列、分子マーカーの箇所及び／又はトランスジーンの分子配置により特徴付けることができる。通常は目的の遺伝子少なくとも１つを含む形質転換ＤＮＡを用いた植物の形質転換は各々がユニークである別個のイベントの多くを含む形質転換体の集団をもたらす。イベントは外来性ＤＮＡ及び少なくとも１つのフランキング配列により特徴付けられる。
【００４２】
優良イベントとは、本明細書においては、トランスジーンの発現及び安定性、及び、それを含む植物の最適な作物学的特性とのその適合性に基づいて、同じ形質転換ＤＮＡを用いた形質転換により得られるイベントの群から選択されるイベントである。即ち、優良イベント選択の基準は下記、即ち：
ａ）外来性ＤＮＡの存在が、植物の他の所望の特性、例えば作物学的性能又は商業的価値を犠牲にしないこと；
ｂ）安定に受け継がれ、そしてそのアイデンティティーの管理のための適切なツールを開発することのできる十分定義された分子配置によりイベントが特徴付けられること；
ｃ）イベントを担持する植物が通常の作物学的使用において曝露される可能性のある環境条件の範囲において商業的に許容できるレベルで、イベントのヘテロ接合（又は半接合）及びホモ接合条件の両方において、正確、適切及び安定な空間的及び時間的な表現型の発現を目的の遺伝子が示すこと；
の１つ以上、好ましくは２つ以上、好都合には全てである。
【００４３】
外来性ＤＮＡは、所望の商業的遺伝子背景内への容易なイントログレッションを可能にする植物ゲノム中の位置に会合していることが好ましい。
【００４４】
優良イベントとしてのイベントのステータスは種々異なる該当遺伝子背景における優良イベントのイントログレッション及び上記したａ）、ｂ）及びｃ）等の基準等の１つ、２つ又は全てへの準拠が見られることにより、確認される。
【００４５】
即ち「優良イベント」は上記した基準に合致する外来性ＤＮＡを含む遺伝子座を指す。植物、植物性物質又は子孫、例えば種子は、そのゲノム中に優良イベント１つ以上を含むことができる。
【００４６】
優良イベント又は優良イベントを含む植物又は植物性物質を識別するために開発されたツール、又は、優良イベントを含む植物性物質を含む製品は、優良イベントの特定のゲノム特性、例えば外来性ＤＮＡ、分子マーカー又は外来性ＤＮＡのフランキング領域の配列を含むゲノムの領域の特定の制限地図に基づく。
【００４７】
外来性ＤＮＡのフランキング領域の一方又は両方が配列決定された後、分子生物学的手法を用いて試料の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）中のこの配列を特異的に認識するプライマー及びプローブを開発することができる。例えば、生物学的試料（例えば植物、植物性物質又は植物性物質を含む製品のような試料）中の優良イベントを識別するためにＰＣＲ法を開発することができる。そのようなＰＣＲは、一方が優良イベントの５’又は３’フランキング領域内部の配列を認識し、そして他方が外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する少なくとも２つの特異的「プライマー」に基づく。プライマーは好ましくは、最適化されたＰＣＲ条件下において、優良イベントの５’又は３’フランキング領域内部の配列及び優良イベントの外来性ＤＮＡをそれぞれ「特異的に認識する」、１５〜３５ヌクレオチドの配列を有することにより、特定のフラグメント（「組み込みフラグメント」又は判別(discriminating)アンプリコン）が優良イベントを含む核酸試料から増幅される。このことは、ターゲティングされた組み込みフラグメントのみが、植物ゲノム又は外来性ＤＮＡ中の如何なる他の配列をも排して、最適ＰＣＲ条件下に増幅されることを意味している。
【００４８】
本発明に適するＰＣＲプライマーは以下の通りである。即ち：
−  自身の３’末端において５’フランキング配列（ヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までの配列番号２）における植物ＤＮＡから選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチド、好ましくは２０個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む１７ｎｔから２００ｎｔまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド（５’フランキング配列を認識するプライマー）；又は、
−  自身の３’末端において３’フランキング配列（ヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３の相補体）における植物ＤＮＡから選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチド、好ましくは２０個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む１７ｎｔから２００ｎｔまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド（３’フランキング配列を認識するプライマー）；又は、
−  自身の３’末端において挿入されたＤＮＡ配列（ヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの配列番号２の相補体）から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチド、好ましくは２０個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む１７ｎｔから２００ｎｔまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド（外来性ＤＮＡを認識するプライマー）；又は、
−  挿入されたＤＮＡ配列（ヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までの配列番号３）から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチド、好ましくは２０個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む１７ｎｔから２００ｎｔまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド；又は、
−  挿入されたＤＮＡフラグメント又はその相補体（ヌクレオチド位置１４５２から１６６３８までの配列番号１又は配列番号１１）から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチド、好ましくは２０個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む１７ｎｔから２００ｎｔまでの長さの範囲の適当なオリゴヌクレオチド。
【００４９】
プライマーは当然ながら記載した１７個の連続ヌクレオチドより長くてもよく、そして例えば２０、２１、３０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００ｎｔ又は更に長くてもよい。プライマーはフランキング配列及び外来性ＤＮＡの配列の記載したヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列より完全になるものであってよい。しかしながら、自身の５’末端（即ち３’所在の１７個の連続ヌクレオチドの外側）のプライマーのヌクレオチド配列の厳密性はより低い。即ち、プライマーの５’配列は、適宜、外来性ＤＮＡのフランキング配列から選択されるヌクレオチド配列を含むか、それよりなってよいが、数個（例えば１、２、５又は１０個）のミスマッチを含んでよい。プライマーの５’配列は寧ろ完全に、外来性ＤＮＡのフランキング配列とは無関係のヌクレオチド配列、例えば制限酵素認識部位１つ以上を示すヌクレオチド配列であってよい。そのような無関係の配列又はミスマッチを有するフランキングＤＮＡ配列は好ましくは１００を超えない、より好ましくは５０、更には２５ヌクレオチドより長くならないはずである。
【００５０】
更に又、適当なプライマーは植物ＤＮＡ由来配列と外来性ＤＮＡ配列の間の接合領域（配列番号２のヌクレオチド１４５１〜１４５２及び配列番号３のヌクレオチド２４０〜２４１に所在する）に渡る自身の３’末端におけるヌクレオチド配列を含むかそれより（本質的に）なってよいが、ただし、記載した３’所在１７個の連続ヌクレオチドは配列番号２又は３における外来性ＤＮＡ又は植物由来配列の何れかからのみに由来するものではない。
【００５１】
当業者には明らかであるが、適切に選択されたＰＣＲプライマー対もまた相互に相補である配列を含んではならない。
【００５２】
本発明の目的のためには「配列番号Ｘに示すヌクレオチド配列の相補体」とはＣｈａｒｇａｆｆの規則に従ってヌクレオチドをその相補ヌクレオチドと置き換えること（Ａ⇔Ｔ；Ｇ⇔Ｃ）、及び、配列を５’から３’の方向に、即ち示されたヌクレオチド配列の逆方向に読むことにより、示されたヌクレオチド配列から誘導できるヌクレオチド配列である。
【００５３】
適当なプライマーの例は、配列番号５（３’フランキング配列認識プライマー）、配列番号４（３’フランキング配列認識プライマーと共に使用するための外来性ＤＮＡ認識プライマー）、又は配列番号７（３’フランキング配列認識プライマーと共に使用するための外来性ＤＮＡ認識プライマー）のオリゴヌクレオチド配列である。
【００５４】
適当なオリゴヌクレオチドプライマーの他の例は、自身の３’末端に開き配列を含むか、又はそのような配列より（本質的に）なるものである。
ａ．５’フランキング配列認識プライマー：
−  ヌクレオチド２６４からヌクレオチド２８３までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２６６からヌクレオチド２８５までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４０からヌクレオチド１２５９までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２６５からヌクレオチド２８５までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２６５からヌクレオチド２８３までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２３９からヌクレオチド１２５９までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４１からヌクレオチド１２５９までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４４からヌクレオチド１２６３までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４８からヌクレオチド１２６７までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２５０からヌクレオチド１２６９までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２６２からヌクレオチド２７９までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２６３からヌクレオチド２７９までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２６４からヌクレオチド２８５までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２６６からヌクレオチド２８３までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２３８からヌクレオチド１２５９までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４２からヌクレオチド１２５９までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４３からヌクレオチド１２６３までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４５からヌクレオチド１２６３までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４７からヌクレオチド１２６７までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４９からヌクレオチド１２６９までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４９からヌクレオチド１２６７までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２６３からヌクレオチド２８５までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２６７からヌクレオチド２８３までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４２からヌクレオチド１２６３までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４３からヌクレオチド１２５９までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４６からヌクレオチド１２６７までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４６からヌクレオチド１２６３までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４８からヌクレオチド１２６９までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２５０からヌクレオチド１２７１までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２５０からヌクレオチド１２６７までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４１からヌクレオチド１２６３までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４５からヌクレオチド１２６７までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４７からヌクレオチド１２６９までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４７からヌクレオチド１２６３までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４９からヌクレオチド１２７１までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４２からヌクレオチド１２６１までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４１からヌクレオチド１２６１までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４３からヌクレオチド１２６１までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４０からヌクレオチド１２６１までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４４からヌクレオチド１２６１までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２３９からヌクレオチド１２６１までの配列番号２のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１２４５からヌクレオチド１２６１までの配列番号２のヌクレオチド配列
ｂ．５’フランキング配列認識プライマーと共に使用するための外来性ＤＮＡ配列認識プライマー
−  ヌクレオチド１７３２からヌクレオチド１７５１までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３５からヌクレオチド１７５４までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３１からヌクレオチド１７５０までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３２からヌクレオチド１７５０までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３２からヌクレオチド１７５２までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３１からヌクレオチド１７４９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３２からヌクレオチド１７４９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３１からヌクレオチド１７５１までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３２からヌクレオチド１７５３までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３１からヌクレオチド１７４８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３２からヌクレオチド１７４８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３５からヌクレオチド１７５１までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３１からヌクレオチド１７５２までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３２からヌクレオチド１７５４までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３１からヌクレオチド１７４７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７３１からヌクレオチド１７５３までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７２７からヌクレオチド１７４６までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７２７からヌクレオチド１７４５までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７２７からヌクレオチド１７４７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７２７からヌクレオチド１７４４までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７２７からヌクレオチド１７４８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７２７からヌクレオチド１７４９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７２６からヌクレオチド１７４５までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７２６からヌクレオチド１７４４までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７２６からヌクレオチド１７４６までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７２６からヌクレオチド１７４７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７２６からヌクレオチド１７４８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７２４からヌクレオチド１７４４までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７２４からヌクレオチド１７４５までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１７２４からヌクレオチド１７４６までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４６１からヌクレオチド１４７８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７０からヌクレオチド１６８６までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４６９からヌクレオチド１４８６までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１５０８からヌクレオチド１５２７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６６７からヌクレオチド１６８６までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７０からヌクレオチド１６８７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７３からヌクレオチド１６８９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６８８からヌクレオチド１７０４までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６８８からヌクレオチド１７０５までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６９２からヌクレオチド１７０９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４６７からヌクレオチド１４８６までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８１からヌクレオチド１４９７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８１からヌクレオチド１４９８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４９１からヌクレオチド１５０７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４９１からヌクレオチド１５０８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７２からヌクレオチド１６８８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７３からヌクレオチド１６９０までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７３からヌクレオチド１６９１までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６８８からヌクレオチド１７０６までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６９１からヌクレオチド１７０７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６９１からヌクレオチド１７０８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４６９からヌクレオチド１４８７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８１からヌクレオチド１４９９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８９からヌクレオチド１５０５までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８９からヌクレオチド１５０６までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８９からヌクレオチド１５０７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８９からヌクレオチド１５０８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６６６からヌクレオチド１６８６までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６６７からヌクレオチド１６８７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７０からヌクレオチド１６８８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７２からヌクレオチド１６８９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６８８からヌクレオチド１７０７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６９１からヌクレオチド１７０９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６９２からヌクレオチド１７１０までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８１からヌクレオチド１５００までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４９１からヌクレオチド１５０９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７０からヌクレオチド１６８９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７２からヌクレオチド１６９０までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７２からヌクレオチド１６９１までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６８７からヌクレオチド１７０５までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６８７からヌクレオチド１７０６までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６９１からヌクレオチド１７１０までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４７２からヌクレオチド１４８８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８８からヌクレオチド１５０７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４９１からヌクレオチド１５１０までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４９５からヌクレオチド１５１２までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４９５からヌクレオチド１５１３までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４９５からヌクレオチド１５１４までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７３からヌクレオチド１６９２までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７８からヌクレオチド１６９４までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７８からヌクレオチド１６９５までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７８からヌクレオチド１６９６までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６８７からヌクレオチド１７０３までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６８７からヌクレオチド１７０４までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６９２からヌクレオチド１７１１までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４６９からヌクレオチド１４８８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８８からヌクレオチド１５０６までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４９１からヌクレオチド１５１１までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７０からヌクレオチド１６９０までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７８からヌクレオチド１６９７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６８８からヌクレオチド１７０９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４６７からヌクレオチド１４８７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８８からヌクレオチド１５０８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４９５からヌクレオチド１５１１までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４９１からヌクレオチド１５１２までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６６６からヌクレオチド１６８７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６６７からヌクレオチド１６８８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７２からヌクレオチド１６９２までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７３からヌクレオチド１６９３までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６８７からヌクレオチド１７０７までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４７２からヌクレオチド１４９０までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４７２からヌクレオチド１４９１までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８１からヌクレオチド１５０１までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８９からヌクレオチド１５０９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４９５からヌクレオチド１５１５までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７０からヌクレオチド１６９１までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７３からヌクレオチド１６９４までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７８からヌクレオチド１６９８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４６９からヌクレオチド１４８９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６６７からヌクレオチド１６８９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６８７からヌクレオチド１７０８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６８８からヌクレオチド１７１０までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６９１からヌクレオチド１７１１までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４７２からヌクレオチド１４９２までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８９からヌクレオチド１５１０までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６６６からヌクレオチド１６８８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６８７からヌクレオチド１７０９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６９２からヌクレオチド１７１２までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４６７からヌクレオチド１４８８までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４６９からヌクレオチド１４９０までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８８からヌクレオチド１５０９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８９からヌクレオチド１５１１までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７８からヌクレオチド１６９９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４７２からヌクレオチド１４９３までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４７２からヌクレオチド１４９４までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８１からヌクレオチド１５０２までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７０からヌクレオチド１６９２までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４６９からヌクレオチド１４９１までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８８からヌクレオチド１５１０までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６９１からヌクレオチド１７１２までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６９２からヌクレオチド１７１３までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６９２からヌクレオチド１７１４までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４６７からヌクレオチド１４８９までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６７８からヌクレオチド１７００までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１４８１からヌクレオチド１５０３までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド１６９１からヌクレオチド１７１３までの配列番号２のヌクレオチド配列の相補体
ｃ．３’フランキング配列認識プライマー：
−  ヌクレオチド８２８からヌクレオチド８４７までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８３０からヌクレオチド８４９までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８２８からヌクレオチド８４６までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８２８からヌクレオチド８４８までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８３０からヌクレオチド８４８までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８３０からヌクレオチド８５０までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８２８からヌクレオチド８４５までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８３０からヌクレオチド８４７までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８２８からヌクレオチド８４９までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８３０からヌクレオチド８５１までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８２８からヌクレオチド８４４までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８３０からヌクレオチド８４６までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８２８からヌクレオチド８５０までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８３０からヌクレオチド８５２までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド９９２からヌクレオチド１００９までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド７３１からヌクレオチド７５２までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド７７６からヌクレオチド７９５までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド７３１からヌクレオチド７５３までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド７７６からヌクレオチド７９４までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド７７６からヌクレオチド７９６までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド７７６からヌクレオチド７９３までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド７７６からヌクレオチド７９７までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド７７６からヌクレオチド７９２までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド７７６からヌクレオチド７９８までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド７３３からヌクレオチド７５２までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド７３３からヌクレオチド７５３までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド７３３からヌクレオチド７５４までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド７３３からヌクレオチド７５５までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８３８からヌクレオチド８５４までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド２４６からヌクレオチド２６３までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド８３８からヌクレオチド８５５までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
−  ヌクレオチド２４５からヌクレオチド２６４までの配列番号３のヌクレオチド配列の相補体
ｄ．３’フランキング配列認識プライマーと共に使用するための外来性ＤＮＡ配列認識プライマー
−  ヌクレオチド１７３からヌクレオチド１９２までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２２からヌクレオチド４１までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１７２からヌクレオチド１９２までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１７４からヌクレオチド１９２までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１９１からヌクレオチド２１０までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１７１からヌクレオチド１９２までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１７５からヌクレオチド１９２までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１９０からヌクレオチド２１０までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１９２からヌクレオチド２１０までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１７６からヌクレオチド１９２までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１８９からヌクレオチド２１０までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１９３からヌクレオチド２１０までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１８８からヌクレオチド２１０までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１９４からヌクレオチド２１０までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１９９からヌクレオチド２１８までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２００からヌクレオチド２１８までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１９７からヌクレオチド２１８までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２０１からヌクレオチド２１８までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２０１からヌクレオチド２２０までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２００からヌクレオチド２２０までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１９９からヌクレオチド２２０までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド２００からヌクレオチド２２１までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１９９からヌクレオチド２２１までの配列番号３のヌクレオチド配列
−  ヌクレオチド１５０からヌクレオチド１７２までの配列番号３のヌクレオチド配列
【００５５】
本明細書においては、「Ｘ位からＹ位までの配列番号Ｚのヌクレオチド配列」とは両方のヌクレオチド終点を包含するヌクレオチド配列を指す。
【００５６】
好ましくは、増幅されたフラグメントは５０〜５００ヌクレオチドの長さ、例えば１００〜３５０ヌクレオチドの長さを有する。特異的プライマーはそれぞれ優良イベントの５’又は３’フランキング領域内部の配列及び優良イベントの外来性ＤＮＡと８０〜１００％同一である配列を有してよいが、ただし、ミスマッチはなお、最適なＰＣＲ条件下これらのプライマーによる優良イベントの特異的な識別を可能としなければならない。しかしながら許容可能なミスマッチの範囲は実験的に容易に決定でき、そして当該分野で知られている。
【００５７】
組み込みフラグメントの検出は種々の態様において、例えばゲル分析後のサイズ推定を介して行うことができる。組み込みフラグメントは又直接配列決定してもよい。増幅されたＤＮＡフラグメントの検出のための他の配列特異的方法も当該分野で知られている。
【００５８】
プライマーの配列及びそれらのゲノム内の相対的箇所は優良イベントにユニークであるため、組み込みフラグメントの増幅は優良イベント（の核酸）を含む生物学的試料においてのみ起こることになる。好ましくは、未知試料中のＥＥ−ＧＭ３の存在を識別するためのＰＣＲを実施する場合、イベントの植物種の「ハウスキーピング遺伝子」内のフラグメントが増幅できるプライマーのセットの対照品を含める。ハウスキーピング遺伝子は大部分の細胞型内で発現され、そして全ての細胞に共通した基礎代謝活動に関与する遺伝子である。好ましくは、ハウスキーピング遺伝子から増幅されるフラグメントは増幅される組み込みフラグメントよりも大型のフラグメントである。分析すべき試料に応じて他の対照品も包含させる。
【００５９】
標準ＰＣＲプロトコルは当該分野において、例えば「PCR Application Manual」(Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999)及び他の参考文献に記載されている。特異的プライマーの配列を包含するＰＣＲのための最適条件は各優良イベントに関する「PCR(またはPolymerase Chain Reaction)Identification Protocol」中に特定されている。しかしながら、PCR Identification Protocol中のパラメーターの数は特定の実験室条件に対して調節する必要がある場合があり、そして、同様の結果を得るためには僅かに変更してよいと理解される。例えばＤＮＡの調製のための異なる方法の使用は、例えばプライマーの量、ポリメラーゼ及び使用するアニーリング条件の調節を必要とする場合がある。同様に他のプライマーの選択はPCR Identification Protocolのための他の最適条件を支配する場合がある。しかしながらこれらの調節は当業者には明らかであり、そして上記引用したもののような現在のPCRアプリケーションマニュアルに更に詳述されている。
【００６０】
或いは、生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ３を識別するための「特異的プローブ」として使用できる組み込みフラグメントを増幅するために特異的プライマーを用いることができる。生物学的試料中の核酸を、核酸中の相当するフラグメントとのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブに接触させることにより、核酸／プローブハイブリッドの形成がもたらされる。このハイブリッドの形成は検出可能であり（例えば核酸又はプローブの標識を介して）、これによりこのハイブリッドの形成がＥＥ−ＧＭ３の存在を示す。特異的プローブとのハイブリダイゼーションに基づくこのような識別方法（固相担体上又は溶液中の何れか）は当該分野で知られている。特異的プローブは好ましくは、最適条件下、優良イベントの５’又は３’フランキング領域内部であり、そして好ましくはそれに近接する外来性ＤＮＡの部分も含んでいる領域に特異的にハイブリダイズする配列である。好ましくは、特異的プローブは特異的領域のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは８０〜８５％、より好ましくは８５〜９０％、特に好ましくは９０〜９５％、最も好ましくは９５％〜１００％同一（又は相補）である５０〜５００ｂｐ、好ましくは１００〜３５０ｂｐの配列を含む。好ましくは、特異的プローブは優良イベントの特異的領域に同一（又は相補）である約１５から約１００の近接ヌクレオチドの配列を含むことになる。
【００６１】
優良イベントＥＥ−ＧＭ３の検出のためのＰＣＲプライマーとして適するオリゴヌクレオチドもまた優良イベントを含有する植物の接合生殖性のステータスを決定するためのＰＣＲ系プロトコルを開発するために使用できる。この目的のために、組み込み前に野生型遺伝子座を認識する２つのプライマーを、それらが相互を指向し、そしてプライマー間に所在する挿入部位を有するような態様で設計する。これらのプライマーはそれぞれ配列番号２又は３内部に含有される５’及び３’フランキング配列を特異的に認識するプライマーであってよい。これらのプライマーは又５’及び３’フランキング配列を特異的に認識するプライマーであってよい。本発明のためには、組み込み前に野生型遺伝子座を認識する特に適するプライマーは配列番号４及び配列番号６のヌクレオチド配列を含むかそれより（本質的に）なるプライマーである。このセットのプライマーは、形質転換ＤＮＡ配列に相補である第３のプライマー（例えば配列番号７のヌクレオチド配列を含むかそれより（本質的に）なるプライマー）と一緒になって、ＥＥ−ＧＭ３特異的遺伝子座並びに野生型遺伝子座の同時診断的ＰＣＲ増幅を可能にする。トランスジェニックの遺伝子座又は相当する野生型の遺伝子座に関して植物がホモ接合である場合、診断的ＰＣＲはトランスジェニック又は野生型の遺伝子座の何れかに関して、典型的、好ましくは長さにおいて典型的な、単一のＰＣＲ産物をもたらすことになる。植物がトランスジェニックの遺伝子座に関して半接合である場合は、２つの遺伝子座に特異的なＰＣＲ産物が出現することになり、トランスジェニック及び野生型の遺伝子座の増幅の両方を反映している。
【００６２】
更に又、ＰＣＲ系増幅方法とは異なる優良イベントＥＥ−ＧＭ３に特異的な検出方法間もまた本明細書に記載した優良イベント特異的配列情報を用いて開発できる。そのような代替的な検出方法はＩｎｖａｄｅｒＴＭテクノロジーとしても知られている特定の核酸構造の侵襲的切断に基づくリニアシグナル増幅検出方法を包含する（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許５、９８５、５５７号 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids",  ６、００１、５６７号  "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage"に記載）。この目的のために、標的配列はヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１４６９までの配列番号２のヌクレオチド配列又はその相補体を含む標識された第１の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド２２３からヌクレオチド２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識核酸プローブにハイブリダイズされ、そして更に、ヌクレオチド１４３４からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列又はその相補体を含む標識された第２の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド２４１からヌクレオチド２５８までの配列番号３のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識核酸プローブにハイブリダイズされ、ここで、第１及び第２のオリゴヌクレオチドはヌクレオチド少なくとも１つで重複する。このハイブリダイゼーションにより生じるデュプレックス又はトリプレックスの構造は標的配列を未損傷としたまま酵素（Cleavase（登録商標））による選択的プローブ切断を可能とする。切断された標識プローブはその後、潜在的には更なるシグナル増幅をもたらす中間的工程を介して検出される。
【００６３】
「キット」とは本明細書においては、本発明の方法、より特記すれば生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３の識別、又はＥＥ−ＧＭ３含有植物性物質の接合生殖性の測定を実施する目的のための試薬のセットを指す。より特記すれば、本発明のキットの好ましい実施形態は優良イベントの識別のための上記した少なくとも１つ又は２つの特異的プライマー、又は、接合生殖性ステータスの測定のための３つの特異的プライマーを含む。場合により、キットはPCR Identification Protocolにおいて本明細書に記載した何れかの他の試薬を更に含むことができる。あるいは、本発明の別の実施形態によれば、キットは生物学的試料の核酸に特異的にハイブリダイズしてその中の維持さの存在を識別する上記した特異的プローブを含むことができる。場合により、キットは更に、特異的プローブを用いる生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ３の識別のための何れかの他の試薬（例えば限定しないがハイブリダイゼーション緩衝液、標識）を含むことができる。
【００６４】
品質管理（例えば種子ロットの純度）、植物性物質、又は例えば限定しないが食品又は飼料製品のような植物性物質を含むかそれより誘導された物質の中の優良イベントの存在又は非存在の検出を目的として、本発明のキットを使用することができ、そしてその成分を特別に調節することができる。
【００６５】
本明細書においては、ヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に関する「配列同一性」とは配列２つのうち短い方のヌクレオチドの数で同じヌクレオチドを有する位置の数を割ったものを指す。ヌクレオチド配列２つのアライメントはWilbur and Lipmannのアルゴリズム（Wilbur and Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:726）により、ウインドウサイズ２０ヌクレオチド、ワードレングス４ヌクレオチド及びギャップペナルティー４を用いて実施される。上記した配列アライメントを包含する配列データのコンピューター支援の分析及び解釈は、例えばGenetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin Biotechnology Center)の配列分析ソフトウエアパッケージを用いながら簡便に実施してよい。配列は、その配列が少なくとも約７５％、特に少なくとも約８０％、より特記すれば少なくとも約８５％、非常に特記すれば少なくとも約９０％、とりわけ少なくとも約９５％、よりとりわけ少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する場合に、「本質的に同様」と示される。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と本質的に同様であるか、又は特定の程度の配列同一性を有すると言われる場合、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等しいと考えられる。更に又、僅かな相違又は突然変異は経時的にＤＮＡ配列中に生じる場合があること、そして、一部のミスマッチは本発明のイベント特異的プライマー又はプローブに関しては許容できることは明らかであり、そのため、本発明の何れかの３’又は５’フランキングＤＮＡに関する、又は何れかのインサート又は外来性ＤＮＡ又はプライマー又はプローブに関する本発明の何れかの実施形態において本明細書に示した何れかのＤＮＡ配列もまた、本明細書に提示した配列と本質的に類似の配列、例えば本発明の何れかの３’又は５’フランキングＤＮＡについて、又は何れかのプライマー又はプローブについて、又は、何れかのインサート又は外来性ＤＮＡについて与えられる配列に、ハイブリダイズするか、又はそれと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列も包含する。
【００６６】
「プライマー」という用語は、本明細書においては、ＰＣＲのような鋳型依存性のプロセスにおいてナーセントな核酸の合成をプライミングすることができる如何なる核酸も包含する。典型的には、プライマーは１０から３０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列も使用できる。プライマーは１本鎖型が好ましいが、２本鎖型で提供しても良い。
【００６７】
プローブはプライマーとして使用できるが、標的ＤＮＡ又はＲＮＡに結合するように設計され、そして増幅プロセスにおいて使用しなくても良い。
【００６８】
「認識する」という用語は本明細書においては、特異的プライマーが、方法において示される条件（PCR Identification Protocolの条件等）の下に、優良イベント中の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、これにより陽性および陰性対照の存在により特異性を測定できるという事実を指す。
【００６９】
「ハイブリダイズする」という用語は本明細書においては、特異的プローブに言及している場合は、プローブが、標準的なストリンジェンシー条件下に優良イベントの核酸配列中の特定の領域に結合するという事実を指す。標準的なストリンジェンシー条件とは、本明細書においては、本明細書に記載するハイブリダイゼーションのための条件、又は、Sambrook et.al.,1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)により記載されるような従来のハイブリダイズ条件を指し、それは例えば以下の工程、即ち：１）フィルター上に植物ゲノムＤＮＡフラグメントを固定化すること、２）１から２時間、４２℃において、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬及び０．１％ＳＤＳ中、又は１から２時間、６８℃において６×ＳＳＣ、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬及び０．１％ＳＤＳ中、フィルターを予備ハイブリダイズすること、３）標識してあるハイブリダイズプローブを添加すること、４）１６から２４時間インキュベートすること、５）２０分間室温で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でフィルターを洗浄すること、６）２０分間、各々６８℃において０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でフィルターを３回洗浄すること、及び、７）フィルターを２４から４８時間、×線フィルムに−７０℃において増感紙を用いて露光することを含むことができる。
【００７０】
本明細書においては、生物学的試料は植物、植物性物質又は植物性物質を含む製品の試料である。「植物」という用語は、何れかの段階の成熟度にあるダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）植物組織、並びに何れかのそのような植物から採取した、或いは誘導した何れかの細胞、組織、又は器官、例えば限定しないが、何れかの種子、葉、幹、花、根、単細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物又はプロトプラストを包含することを意図している。「植物性物質」とは、本明細書においては、植物から得られる、又は誘導される物質を指す。植物性物質を含む製品は、植物性物質を用いて生産されるか、又は植物性物質により汚染される場合がある食品、飼料又は他の製品に関する。本発明の文脈においては、そのような生物学的試料は試料中の核酸の存在を意味するＥＥ−ＧＭ３に対して特異的な核酸の存在に関して試験される。即ち生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３を識別するための本明細書において言及する方法は、優良イベントを含む核酸の生物学的試料中の識別に関する。
【００７１】
本明細書においては、「含む」とは、明示された特徴、整数、工程、試薬又は成分を示されるとおりに特定するものとして解釈されるべきであるが、１つより多い特徴、整数、工程又は成分、又はその群の存在又は追加を排除するものではない。即ち、例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸の配列を含む核酸又は蛋白は実際に挙げられているものよりも多くのヌクレオチド又はアミノ酸を含んでよく、即ち、より大きい核酸又は蛋白に包埋されていて良い。機能的又は構造的に定義されているＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子は、追加的なＤＮＡ配列、例えばプロモーター及び転写終止配列を含んでよい。
【００７２】
本発明は又、優良イベントＥＥ−ＧＭ３を、このイベントを含むダイズ植物、これらの植物から得られる優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含む子孫の植物及び種子の中で発生させること、及び、このイベントを含む植物から誘導された植物細胞、又は植物性物質に関する。優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含む植物は実施例１に記載する通り得ることができる。本発明は又、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されている優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含む種子、又は優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むそれからの誘導物にも関する。「誘導物（種子の）」とは、本明細書においては、そのような種子から成長させることができる植物、交雑又は戻し交雑の結果生じる子孫、並びにその植物細胞、器官、部分、組織、細胞培養物、プロトプラスト、及び植物性物質を指す。
【００７３】
ＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物又は植物性物質は実施例２におけるＥＥ−ＧＭ３に関して記載したPCR Identification Protocolに従って識別できる。簡潔に言えば、生物学的試料中に存在するダイズゲノムＤＮＡを、配列番号５の配列番号を有するプライマーのようなＥＥ−ＧＭ３の５’又は３’フランキング配列内部の配列を特異的に認識するプライマー及び配列番号４の配列番号を有するプライマーのような外来性ＤＮＡの配列を特異的に認識するプライマーを用いたＰＣＲにより増幅する。内因性ダイズ配列の部分を増幅するＤＮＡプライマーをＰＣＲ増幅のための陽性対照として使用する。ＰＣＲ増幅時に物質が予測されたサイズのフラグメントをもたらす場合、物質は優良イベントＥＥ−ＧＭ３を保有しているダイズ植物に由来する植物性物質を含有する。
【００７４】
ＥＥ−ＧＭ３を保有している植物はそれらのグリホセート耐性並びにイソキサフルトールのようなＨＰＰＤ阻害剤に対するそれらの耐性により特徴付けられる。ＥＥ−ＧＭ３を保有している植物は又、除草剤適用の非存在下でダイズの市販品種と同等の作物学的特性を有することにより特徴付けられる。本明細書に記載したダイズ植物ゲノムの挿入領域における外来性ＤＮＡの存在は、このイベントを含む植物に対して、特に有利な表現型及び分子の特性を付与する。
【００７５】
本発明の１つの実施形態は、ダイズゲノム中の特定の箇所における２トランスジーンの挿入により得ることができるダイズ植物中の優良イベントをもたらし、その優良イベントはそのようなダイズ植物に対して、グリホセート及びイソキサフルトールのようなＨＰＰＤ阻害剤除草剤に対する耐性を与え、そしてその場合、そのような優良イベントは同遺伝子系の系統と比較してそのようなダイズ植物の収量に悪影響するそのダイズの作物学的性能に対する如何なる作用も誘発しない（本明細書においては、「同遺伝子系の系統」又は「近同遺伝子系の系統」とは、同じ遺伝子的背景であるがトランスジーンを欠いているダイズの系統、例えば形質転換のために使用される植物と同じ遺伝子的背景の植物、又はトランスジーンを失っている分離姉系統である）。特に、本発明は、ダイズ植物のゲノム中の優良イベントの挿入又は存在が、同遺伝子系の系統と比較してそのようなダイズ植物において増大した易罹患性を誘発せず、収量障害を誘発せず、又は増大した倒伏を誘発しない、そのダイズ植物中の該優良イベントを提供する。従って、本発明は同遺伝子系の系統と比較してダイズ植物の収量に悪影響を及ぼすことなくグリホセート及びＨＰＰＤ阻害剤除草剤の適用（同時又は別途）に耐容できるそのようなダイズ植物をもたらすＥＥ−ＧＭ３と標記されるダイズ植物中の優良イベントを提供し、そのダイズ植物は同遺伝子系のダイズ植物とそれらの易罹患性又は倒伏性において統計学的有意差を有さない。これらの特性は本発明の優良イベントをダイズ圃場におけるグリホセート耐性雑草の抑制のために極めて有利なものとしており、そしてダイズ圃場における更なるグリホセート抵抗性の発生を防止又は遅延させる手法においても使用できる（例えばダイズ圃場に対して適用される作用２様式を確保するグリホセート及びイソキサフルトールの適用による）。
【００７６】
本明細書において同様に提供されるものは、イベントＥＥ−ＧＭ３を含む代表的なダイズ種子がアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下に寄託されている、イベントＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物又はその部分である。本明細書において更に提供されるものは、そのようなイベントを含むそのような植物の種子、並びにそのような種子から生産されるダイズ製品であり、ここで該ダイズ製品はイベントＥＥ−ＧＭ３を含む。そのようなダイズ製品は穀粉、粉砕種子、粉末食品、フレーク等であるか、それを含むことができる。特にそのようなダイズ製品はイベントＥＥ−ＧＭ３に対して診断的又は特異的であるアンプリコンを生産する核酸を含み、そのようなアンプリコンは配列番号２又は３を含む。同様に本明細書において提供されるものはイベントＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ種子を得ること、及び、それからダイズ製品を生産することを含む、そのようなダイズ製品を製造するための方法である。同様に本明細書において提供されるものは上記ダイズ植物の何れかの子孫であり、そしてイベントＥＥ−ＧＭ３を含む、ダイズ植物である。
【００７７】
本明細書において更に提供されるものは、特に、イベントＥＥ−ＧＭ３を欠いた第１の植物をＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物と交雑すること、及び、グリホセート及び／又はイソキサフルトールに対して耐容である子孫植物を選択することにより、イベントＥＥ−ＧＭ３をダイズ植物のゲノム内に導入することを含む、グリホセート及び／又はイソキサフルトール除草剤に対して耐容であるそのような植物を製造するための方法である。
【００７８】
同様に本明細書において提供されるものは、特に収量障害を伴わず、そして２ｍＥＰＳＰＳ及びＨＰＰＤ蛋白を含む許容可能な作物学的特性を有し、そしてイベントＥＥ−ＧＭ３に対して診断的なアンプリコンを生成することができるグリホセート及び／又はイソキサフルトール耐容植物である。同様に本明細書において提供されるものは、本明細書に記載する特異的検出ツールを用いながら得ることができる特異的な単離されたアンプリコン（ＤＮＡ配列フラグメント）自体、特に自身の配列内に植物ＤＮＡを起源とするＤＮＡフラグメント及び本明細書において定義する通り形質転換により植物ゲノム内に挿入されたＤＮＡのようなそのような植物に対して外来性であるかヘテロ接合であるＤＮＡフラグメントを包含するアンプリコンである。
【００７９】
本明細書において更に提供されるものは、圃場をイソキサフルトール系除草剤の有効量で処理することを含むイベントＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物の圃場又はそのようなダイズ植物を植栽するべき圃場における雑草を抑制するための方法であり、この場合、そのような植物はそのような除草剤に対して耐容である。
【００８０】
本明細書において更に提供されるものは、配列番号１の配列又はそれに本質的に同様な配列を含むＤＮＡ、及び、そのようなＤＮＡ配列を含む特にダイズの何れかの植物、細胞、組織又は種子、例えばＥＥ−ＧＭ３を含む植物、細胞、組織、又は種子、特に配列番号１を含むかそれより（本質的に）なる隣接領域２つを含むＤＮＡ、又は一部のヌクレオチドが変化、欠失又は付加された配列番号１を含むかそれよりなる隣接領域２つを含むＤＮＡ、例えば４、６、８、又は１０ヌクレオチドが欠失又は置き換えられるか、相互に接近して所在する（例えば２００〜５００ｎｔ、又は２０００又は１００００ｎｔ未満、分離している）配列番号１の重複を含むＤＮＡである。１つの実施形態において、これは２、４、６、８、又は１０ヌクレオチドが別のヌクレオチドにより置き換えられているか、２、４、６、８、又は１０ヌクレオチドが欠失又は付加されているヌクレオチド位置２２５７からヌクレオチド位置１６６０１の配列番号１１のＤＮＡ、配列番号１１のヌクレオチド位置２２５７からヌクレオチド位置１６６０１までの配列番号１１のＤＮＡ、並びに配列番号１１のＤＮＡ、及びそのようなＤＮＡ配列の何れかを含む、特にダイズの何れかの植物、細胞組織又は種子を包含する。同様に本明細書において提供されるものは、配列番号１１のＤＮＡ配列（従来のダイズ植物、種子、組織又は細胞に対してヘテロ接合又は外来性）を含むか、又はヌクレオチド位置２２５７からヌクレオチド位置１６６０１の配列番号１１のＤＮＡ配列を含むか、又は配列番号１１の配列に対して少なくとも９９％又は９９．５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含むか、又はヌクレオチド位置２２５７からヌクレオチド位置１６６０１の配列番号１１の配列に対して少なくとも９９％又は９９．５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む、何れかのダイズ植物、細胞、組織又は種子である。
【００８１】
同様に本明細書において提供されるものは、ヌクレオチド１４４１からヌクレオチド１４６２まで配列番号２と本質的に同様なヌクレオチド配列を含む核酸分子及びヌクレオチド２３０から２５１まで配列番号３と本質的に同様なヌクレオチド配列、又は該配列の相補体を含む核酸分子により特徴付けられるイベントＥＥ−ＧＭ３を自身のゲノム中に含むトランスジェニックのダイズ植物、植物細胞、組織、又は種子、並びに、配列番号２に本質的に類似のヌクレオチド配列を含む核酸分子及び配列番号３と本質的に同様なヌクレオチド配列、又は該配列の相補体を含む核酸分子により特徴付けられるイベントＥＥ−ＧＭ３を自身のゲノム中に含むダイズ植物、植物細胞、組織又は種子である。
【００８２】
本明細書において更にまた提供されるものは、ヌクレオチド１４３１から１４７２までの配列番号２と少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列及びヌクレオチド２２０から２６１の配列番号３と少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、又は該配列の相補体を自身の細胞のゲノム内に含むことにより特徴付けられる、ダイズ植物、細胞又は種子である。
【００８３】
「イソキサフルトール」という用語は本明細書においては、除草剤イソキサフルトール［即ち(5-シクロプロピル−4−イソキサゾリル) [2-(メチルスルホニル)-4-(トリフルオロメチル）フェニル］メタノン］、その活性代謝産物、ジケトニトリル、及び該化合物を含む何れかの混合物又は溶液を指す。本発明のイベントへの適用のために有用なＨＰＰＤ阻害剤除草剤はジケトニトリル、例えば２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）−プロパン−１，３−ジオン及び２−シアノ−１−ｌ４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−ジオン；他のイソキサゾール類；及びピラゾリネート類、例えばトプラメゾン［即ち［３−（４，５−ジヒドロ−３−イソキサゾリル）−２−メチル−４−（メチルスルホニル）フェニル］（５−ヒドロキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾル−４−イル）メタノン］、及びピラスルホトール［（５−ヒドロキシ−１，３−ジメチルピラゾル−４−イル（２−メシル−４−トリフルオロメチルフェニルフェニル）メタノン］；又はピラゾフェン［２−［４−（２，４−ジクロロベンゾイル）−１，３−ジメチルピラゾル−５−イルオキシ］アセトフェノン］である。
【００８４】
本発明の１つの実施形態においてＥＥ−ＧＭ３イベントを含有するダイズ植物を植栽するべき圃場は、ダイズ植物を植栽するか、又は種子を播く前に、イソキサフルトール（ＩＦＴ）のようなＨＰＰＤ阻害剤除草剤で処理することができ、これによりＨＰＰＤ阻害剤により殺傷される雑草を圃場から駆逐し、これにより無耕作業が可能となり、続いて、同じ予備処理された圃場に後日ダイズを植栽するか播種できるようになる（ＨＰＰＤ阻害剤除草剤を用いたバーンダウン適用）。ＩＦＴの残存活性もまた早期生育段階において雑草による競合から出芽成長中のダイズ植物を保護することになる。ダイズ植物が特定のサイズを有し、そして雑草が再出現の傾向を見せるようになった後、グリホセート又はＨＰＰＤ阻害剤−グリホセート混合物を植物の上面に出芽後除草剤として適用することができる。
【００８５】
本発明の別の実施形態においては、ＥＥ−ＧＭ３イベントを含有する種子を播種する圃場を、ダイズ植物が出芽する前であるが種子を播種した後に、ＩＦＴのようなＨＰＰＤ阻害剤除草剤で処理することができ（圃場は他の手段、典型的には鍬入れ、鋤き入れ、又は種子床作成のような従来の耕作作業を用いて播種前に無雑草とすることができる）、その場合、残存活性により圃場は除草剤により殺傷された雑草が存在しない状態に維持されることになり、これにより出芽成長中のダイズ植物は雑草と競合しない（ＨＰＰＤ阻害剤除草剤の出芽前適用）。ダイズ植物が特定のサイズを有し、そして雑草が再出現の傾向を見せるようになった後、グリホセート又はＨＰＰＤ阻害剤−グリホセート混合物を植物の上面に出芽後除草剤として適用することができる。
【００８６】
本発明の別の実施形態においては、ＥＥ−ＧＭ３イベントを含有するダイズ植物は播種された種子から出芽しているダイズ植物の上面にＩＦＴのようなＨＰＰＤ阻害剤除草剤で処理することができ、これによりＨＰＰＤ阻害剤により殺傷される雑草を圃場から駆逐し、この適用は植物の上面への出芽後除草剤としてグリホセートの処理と共に（例えばスプレータンクミックス中で）、その後、又はそれに先立って行うことができる（ＨＰＰＤ阻害剤除草剤の出芽後適用（グリホセート併用又は無併用））。
【００８７】
更に又本発明によれば、ＥＥ−ＧＭ３を保有するダイズ植物は以下の殺虫剤、除草剤又は殺カビ剤で処理してよく、或いは、ＥＥ−ＧＭ３を保有するダイズ種子は以下の殺虫剤、除草剤又は殺カビ剤を含むコーティング剤でコーティングして良い。
【００８８】
ダイズ除草剤：
アラクロル、ベンタゾン、トリフラリン、クロリムロン−エチル、クロランスラム−メチル、フェノキサプロプ、フォメサフェン、フルアジホップ、グリフォセート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、（Ｓ）メトラクロル、メトリブジン、ペンジメタリン、テプラロキシジム、イソキサフルトール。
【００８９】
ダイズ殺虫剤：
ラムダ−シハロスリン、メトミル、パラチオン、チオカルブ、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマネクチン−ベンゾエート、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルスリン、ガンマおよびラムダシハロスリン、4-[[(6-クロルピリジン-3-イル)メチル](2,2-ジフルオロエチル)アミノ]フラン-
2(5H)-オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、ベータ−シフルスリン。
【００９０】
ダイズ殺カビ剤：
アゾキシストロビン、シプロコナゾール、エポキシコナゾール、フルトリアフォル、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、テトラコナゾール。
【００９１】
以下の実施例は優良イベントＥＥ−ＧＭ３の開発及び識別、このイベントを含む種々異なるダイズ系統の開発、及び、生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３の特異的識別のためのツールの開発を記載している。
【００９２】
実施例においては、特段の記載が無い限り、全ての組み換え手法は「Sambrook 1 and Russell DW (eds.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York" and in "Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K (eds.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York」に記載されているような標準的なプロトコルに従って実施した。
【００９３】
標準物質及びレファレンスは「Croy RDD (ed.) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford" and in "Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 2nd Edition, Academic Press, San Diego」に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための標準物質及び方法は「McPherson MJ and M¢ller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" and in "PCR Applications Manual, 3rd Edition (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim or www.roche-applied-science.com」に記載されている。
【００９４】
以下の実施例におけるＰＣＲプロトコルのようないずれかの実験室プロトコルにおける多くのパラメーターは特定の実験室条件に合わせることが必要な場合があり、そして同様の結果を得るために僅かに変更してよいと理解しなければならない。例えばＤＮＡの調製のための異なる方法の使用又はＰＣＲ法における他のプライマーの選択が、ＰＣＲプロトコルに関する他の最適な条件を支配する場合がある。しかしながらこれらの調節は当業者には明らかであり、そして現在のＰＣＲ適用マニュアルに更に詳述されている。
【００９５】
説明及び例においは以下の配列を参照する。
配列番号１：ベクターｐＳＦ１０のＳａｌＩフラグメントヌクレオチド配列
配列番号２：ＥＥ−ＧＭ３中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡにフランキングしている５’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号３：ＥＥ−ＧＭ３中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡにフランキングしている３’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号４：プライマーＳＯＹ０２８
配列番号５：プライマーＳＯＹ０２９
配列番号６：プライマーＳＭＰ１８７
配列番号７：プライマーＳＴＶ０１９
配列番号８：アンプリコンのヌクレオチド配列
配列番号９：対照フラグメントの増幅のためのプライマー１（ＳＯＹ０１）
配列番号１０：対照フラグメントの増幅のためのプライマー２（ＳＯＹ０２）
配列番号１１：ＥＥ−ＧＭ３中の外来性ＤＮＡ及び植物フランキング配列のヌクレオチド配列
配列番号１２：プライマーＳＨＡ１３０
配列番号１３：プライマーＳＨＡ１７８
【実施例】
【００９６】
１．  除草剤耐性遺伝子によるGlycine maxの形質転換
１．１  2mEPSPS及びHPPD-Pf-W336キメラ遺伝子を含む外来性ＤＮＡの説明
プラスミドｐＳＦ１０は約７，３ｋｂのＳａｌＩフラグメント上に所在するキメラ2mepsps遺伝子及びキメラhppd-Pf-W336遺伝子を含有するｐＵＣ１９由来クローニングベクターである。２つのＳａｌ１制限部位の間に含まれるＤＮＡの完全な説明を以下の表１に示す。ヌクレオチド配列は配列番号１に示す。
【００９７】
【表１】
2013511293.tif 000003
【００９８】
１．２  イベントＥＥ−ＧＭ３
約７．３ｋｂのＨＰＬＣ精製ＳａｌＩ線状化ｐＳＦ１０フラグメント（２ｍＥＰＳＰＳグリホセート耐性遺伝子及びＨＰＰＤ阻害剤耐性遺伝子ＨＰＰＤ−Ｐｆ−Ｗ３３６を含有する）を用いてダイズＪａｃｋ種の細胞内への直接遺伝子転移（Nickell, C. D., G. R. Noel, D. J. Thomas, and R. Waller. Registration of 'Jack' soybean. Crop Sci 1365. 30.1990）、ついで、形質転換された植物細胞をトランスジェニック繁殖性ダイズ植物に再生することにより、形質転換されたダイズ植物を得た。
【００９９】
優良イベントＥＥ−ＧＭ３は除草剤耐性遺伝子の良好な発現及び安定性基づいて広範な選択手順に基づいて選択し、そして、植物の草丈、節までの高さ、起立性、活力、種子収量のような最適な作物学的特性とのその適合性を評価した。このイベントを含有するダイズ植物は同じキメラ遺伝子を用いて得られた種々異なる形質転換イベントの広範な範囲から選択した。本イベントの選択において使用したパラメーターは、以下の通り、即ち：ａ）圃場試験におけるイソキサフルトール除草剤適用への許容可能な耐性、ｂ）圃場試験におけるグリホセート除草剤適用への許容可能な耐性、ｃ）圃場試験におけるイソキサフルトール及びグリホセートの複合適用への許容可能な耐性、ｄ）ベクター骨格の非存在下におけるダイズ植物ゲノムの単一の遺伝子座における除草剤耐性トランスジーンの挿入、ｅ）形質転換のために使用する親植物と類似の全体的作物性（成熟性、倒伏性、易罹患性等）、及び、ｆ）形質転換ＤＮＡの挿入により生じる顕著な収量障害が無いこと（同じ条件下に生育させた形質転換に使用した植物系統のようなイベントを有さない同遺伝子系の系統と比較して）とした。
【０１００】
Ｔ３世代において、ダイズ形質転換優良イベントＥＥ−ＧＭ３のホモ接合系統を種子生産用に選択した。多重箇所多連の作物学的圃場試験を親品種であるＪａｃｋの順応の領域において実施した。圃場評価は除草剤耐性及び作物学的性能を包含させた。ＥＥ−ＧＭ３を含む植物の作物学的性能はＪａｃｋに匹敵することがわかった（除草剤を適用しない場合）。圃場評価は又、ＥＥ−ＧＭ３イベントを担持する植物が以下のもの：
−  Ｊａｃｋと比較して類似の植物形態及び種子特性、
−  Ｊａｃｋと比較してダイズの病気に対して変化が無いこと、及び、
−  Ｊａｃｋと比較して種子の発芽に変化が無いこと、
を有することを示していた。
【０１０１】
グリーンハウス中初回形質転換体（Ｔ０）植物（イベントＥＥ−ＧＭ３を生産するようにコンストラクトで形質転換された植物）から収穫した種子（Ｔ１又はＳ１世代）を圃場に植栽した。３ブロックに植栽し、そして０、２又は４ｋｇ／ｈａのグリホセートを噴霧した。除草剤グリホセートに対して所望のレベルの耐性を呈している植物から種子を収穫した。
【０１０２】
圃場に生育した自己受粉したＴ１植物から収穫した種子（Ｔ２世代）を「一個体一列（ｐｌａｎｔ  ｔｏ  ｒｏｗ）」となるように播種した。列の分離データ（完全又は部分的に耐容）及び列内部の個体植物（耐容性又は感受性）のカイ自乗分析は、ＥＥ−ＧＭ３の単一の挿入の予測されたメンデル遺伝を示している。
【０１０３】
選択及び種子増大は、系統が形質転換イベントＥＥ−ＧＭ３に関してホモ接合であると決定され、そして第４世代におけるコア種子生産のために選択されるまで継続した。次に、Ｔ５世代の種子を種々の品種の開発のための候補として使用した。第６世代（Ｔ６世代）の植物を、商業用ダイズ生殖質により広範にイベントを移動させるように設計されたイントログレッションプログラムにおいて従来のダイズ交配系統と交雑させた。Ｆ１雑種植物（ＥＥ−ＧＭ３系統ｘ従来系統）を成熟するまで生育させ、そしてＦ２種子を植栽した。９０１Ｆ２植物の葉試料をＥＥ−ＧＭ３インサートの接合生殖性を識別するために設計されたＰＣＲプライマーにより分析した。メンデルの法則による単一挿入分離に関する１：２：１の予測比が観察された。
【０１０４】
選択されたイベントＥＥ−ＧＭ３を種々異なる商業的遺伝子背景において導入し、そして種々異なる箇所における圃場試験の結果を比較した。種々異なる処理を用いながらグリホセート除草剤及び／又はイソキサフルトール除草剤で植物を攻撃した。植物は良好な除草剤耐性を示した。イベントＥＥ−ＧＭ３を含有する数百種の異なるダイズ栽培品種を遺伝試験において使用し、そして除草剤を適用した。この試行から選択された系統を後に圃場で増大させ、そして同様に除草剤で処理した。その試行から、５０の選択された系統を増大させ、そしてこれらもまた除草剤処理した。イソキサ  フルトール及びグリホセートを噴霧した後者の系統に関する植物毒性評点は応答においてある程度の変動性を示したが、系統間の応答の範囲は同じ処理及び環境の条件下に生育させた元のＪａｃｋの背景におけるＥＥ−ＧＭ３イベントの４連に渡って観察されたとおり同様の変動性を示していた。従って広範な生殖質に渡る該当除草剤に対する耐性がＥＥ−ＧＭ３を含む植物で観察された。
【０１０５】
更に又、イベントＥＥ−ＧＭ３を含有する植物は正常な葉、花及び鞘の形態、優れた繁殖性を示し、そして多数の遺伝子的背景において疾患又は異常な昆虫への感受性を示さなかった。多数の遺伝子的背景内へのイントログレッションの間、異変の問題や異常は観察されなかった。
【０１０６】
１季節において、１０箇所の試験を設計することにより、形質転換親品種Ｊａｃｋ及び幾つかの非トランスジェニックのダイズ栽培品種への形質転換イベントＥＥ−ＧＭ３を含む二重除草剤耐容ダイズの作物学的性能を比較した。無作為完全ブロック設計を用いながら、ＥＥ−ＧＭ３植物を従来の雑草抑制によるか、又は意図する除草剤であるグリホセート及びイソキサフルトールを用いながら、多連の区画において生育させた。形質転換イベントＥＥ−ＧＭ３を含有するダイズ植物の区画にイソキサフルトール除草剤を目標比率７０グラムａｉ／Ｈａで、そしてグリホセート除草剤を目標比率１０６０グラムａｉ／Ｈａで噴霧した。除草剤適用は、概ねＶ４−Ｖ５の植物成長段階において葉面噴霧としてこれらの植物に対して行った。作物学的観察は、季節の早期、中期及び後期の季節に実施した。植物密度（パラメーター；起立数）はＪａｃｋ及び非トランスジェニックの品種の区画のほうが、イベントＥＥ−ＧＭ３区画よりも、１標準偏差分高値であった。早期の起立数の差は種子ロットの品質の結果であったと考えられ、その理由は、ＥＥ−ＧＭ３植栽種子は逆季節苗床において生産され、非トランスジェニック品種の種子は近接した合衆国通常生産季節に生産されたためである。しかしながら、５０％出芽及び植物活力格付けを達成するための日数は同じであり、種子ロットがそれらの性能パラメーターに関しては同等であることを示していた。後期の季節の起立数においては、Ｊａｃｋ及び非トランスジェニック品種はＥＥ−ＧＭ３植物とは１標準偏差分異なったままであった。ＥＥ−ＧＭ３イベント植物の区画収量はやはり１標準偏差分Ｊａｃｋのものよりも低値であり、恐らくはＥＥ−ＧＭ３イベント区画の低い植物密度の結果であると考えられた。非トランスジェニック品種の収量は、より最近の品種において観察される収穫力における進歩から予測される通り、Ｊａｃｋよりも高値であった。
【０１０７】
１つの試行において、植物健康状態格付けは３つの生育段階、即ちＶ４−５、Ｒ１及び完全成熟において行った。初回評価は意図する除草剤適用後、早期に実施した。最終植物健康状態評価の時点において、両方の除草剤を噴霧されたＥＥ−ＧＭ３含有植物は未噴霧Ｊａｃｋ植物、又はＥＥ−ＧＭ３を含む未噴霧植物と同じ評点を有していた。作物学的担当者による格付けにおいて、除草剤噴霧植物はＶ４−５及びＲ１の植物生育段階において３〜４（中等度の傷害）の健康状態格付けを受けた。未噴霧の植物（未形質転換Ｊａｃｋ又はＥＥ−ＧＭ３含有ダイズ植物）は４．６〜４．８に格付けされた（格付け５は無傷害を意味する）。最終植物健康状態格付け時には、全ての区画が同じ格付け５（無傷害）を受けた。
【０１０８】
１試行季節は例外的降雨の季節であり、意図する除草剤適用の後のＥＥ−ＧＭ３植物における作物傷害は他の季節で観察されたものより明白であった。圃場評価は又、健常性（繁殖、疾患抵抗性、肥沃度、種子分散性、休眠状態、永続性）のモニタリングを包含していた。繁殖特性、即ち出芽までの日数、５０％開花までの日数、及び９０％鞘成熟までの日数に関しては、ＥＥ−ＧＭ３及びＪａｃｋ植物は差がなかった。植物疾患及び害虫の天然の蔓延に対する反応においては差は観察されなかった。ＥＥ−ＧＭ３はＪａｃｋより低値の究極的収量をもたらしたが、肥沃度（１００種重量）における差は観察されなかった。種子分散パラメーターの検定（鞘崩壊及び植物倒伏）においては、ＥＥ−ＧＭ３及びＪａｃｋは同じ鞘崩壊評点を有していたが、ＥＥ−ＧＭ３植物が倒伏しにくかった。１０箇所から収穫された種子の評価では発芽又は休眠状態の試験により生じた懸念はなかった。
【０１０９】
例外的降雨のあった季節の間のこれらの試行の間、ＥＥ−ＧＭ３植物の最終収量は雑草抑制処理に関わらず１標準偏差分Ｊａｃｋより低値であった（恐らくはＥＥ−ＧＭ３イベント区画のより低値の植物密度の結果）。例外的湿潤季節においては、作物傷害（作物区域の１０〜３０％において白化）がグリホセート及びイソキサフルトール除草剤の葉面適用後６週間までＥＥ−ＧＭ３区画では報告された。しかしながら、成熟時までに、「無傷害」の植物の健康状態の格付けは全ての区画に割り付けられた。優良ダイズ栽培品種背景においてイントログレッションされたＥＥ−ＧＭ３を用いた多連多数箇所圃場試行は、トランスジーンを含有しない近−同遺伝子系の姉系統と比較して、イベントＥＥ−ＧＭ３を含有する植物と近−同遺伝子系の系統の間に収量の差がないことを示すと期待される（除草剤処理の非存在下）。
【０１１０】
更に又、多連圃場試行において、ＩＦＴ（７０グラムａｉ／ｈａ＋０．５％ＮＩＳ，Ａｇｒｉｄｅｘ）で出芽前又は出芽後に処理した場合に、顕著な作物耐性（１０％未満の白化）がＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物で観察されたが、別のＨＰＰＤ阻害剤除草剤であるピラスルフォトール（３５グラムａｉ／ｈａ＋０．５％ＮＩＳ，Ａｇｒｉｄｅｘ）の出芽後適用により処理した場合に、
ＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物で同様に顕著な作物耐性（１０％未満の白化）が観察された。
【０１１１】
１．２．２  フランキング領域及び優良イベントＥＥ−ＧＭ３の外来性ＤＮＡの識別
ＥＥ−ＧＭ３優良イベントにおける除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡにフランキングする領域の配列を以下の通り決定した。
【０１１２】
１．２．２．１．  右（５’）フランキング領域
５’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、  そしてそのヌクレオチド配列を配列番号２に示す。ヌクレオチド１〜１４５１の配列は植物ＤＮＡに相当し、ヌクレオチド１４５２〜１８４３の配列は外来性ＤＮＡに相当する。
【０１１３】
１．２．２．２．  左（３’）フランキング領域
３’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、  そしてそのヌクレオチド配列を配列番号３に示す。ヌクレオチド１〜２４０の配列は外来性ＤＮＡに相当し、ヌクレオチド２４１〜１４０８の配列は植物ＤＮＡに相当する。
【０１１４】
１．２．２．３．  ＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ
種々異なる分子手法を用いて除草剤耐性遺伝子を含む優良イベントＥＥ−ＧＭ３の外来性ＤＮＡがヘッドトゥーヘッド方向の２つの部分的３’ヒストンＡｔ配列とそれに続くヘッドトゥーテイル方向に配置したｐＳＦ１０のＳａｌＩフラグメントの２つのほぼ完全なコピーを含有することが測定されている（図１参照）。
【０１１５】
即ち、ＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡは順次以下の配列を含有する。
−ヌクレオチド１からヌクレオチド１９９まで：ｎｔ６７６０からｎｔ６９５８までの配列番号１のヌクレオチド配列の相補体に相当するヌクレオチド配列；
−ヌクレオチド２００からヌクレオチド６２４まで：ｎｔ６８７４からｎｔ７２９８までの配列番号１のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列；
−ヌクレオチド６２５からヌクレオチド７９０９まで：ｎｔ７からｎｔ７２９１までの配列番号１のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列；
−ヌクレオチド７９１０からヌクレオチド１５１６３まで：ｎｔ１２からｎｔ７２６５までの配列番号１のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列；及び、
−ヌクレオチド１５１６４からヌクレオチド１５１８７まで：ｎｔ２１７からｎｔ２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列（この配列はｐＳＦ１０プラスミドＤＮＡ又はｗｔ植物ＤＮＡの何れにも相当せず、従ってフィラーＤＮＡと標記する）。
本外来性ＤＮＡは、直近上流において外来性ＤＮＡと近接して、ヌクレオチド１から１４５１までの配列番号２の５’フランキング配列により先行されており、そして、直近下流において外来性ＤＮＡと近接して、ヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの配列番号３の３’フランキング配列により後続されている。
【０１１６】
ＥＥ−ＧＭ３中の外来性ＤＮＡ及びフランキングＤＮＡ配列の確認された完全ＤＮＡ配列決定によれば、配列番号１１に報告されている配列が得られている。この配列において、挿入されたＤＮＡはヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８であり、そしてヘッドトゥーテイル方向に配置したｐＳＦ１０由来の２つのほぼ完全なコピーはヌクレオチド位置２２５７からヌクレオチド位置１６６０１である。配列番号１１の５’フランキングＤＮＡ配列は配列番号１１のヌクレオチド位置１からヌクレオチド位置１４５１までの配列であり、配列番号１１の３’フランキングＤＮＡ配列は配列番号１１のヌクレオチド位置１６６３９からヌクレオチド位置１７８０６までの配列である。
【０１１７】
２．ＥＥ−ＧＭ３に関するポリメラーゼ連鎖反応Identification Protocolの開発
２．１. プライマー
優良イベント内部の配列を認識する特異的プライマーを開発した。
ＥＥ−ＧＭ３の３’フランキング領域内部の配列を認識するプライマーを開発した。次に第２のプライマーを、外来性ＤＮＡの配列内部において、プライマーが約２６３ヌクレオチドの配列に渡るように選択した。以下のプライマーがＥＥ−ＧＭ３ＤＮＡ上のＰＣＲ反応において特に明確で再現性のある結果をもたらすことがわかった。
SOY028: 5'-ATC.gCT.TTA.ACg.TCC.CTC.Ag -3 (配列番号 4)(標的:インサートDNA)
SOY029: 5' -CAA.ggC.CTC.gAg.A TT.A TC -3'(配列番号 5) (標的: 植物DNA)
内因性配列をターゲティングするプライマーは好ましく
はＰＣＲカクテルに包含される。これらのプライマーは未知試料において、そしてＤＮＡ陽性対照において、内部対照として使用される。内因性プライマー対を用いた場合の陽性結果（４１３ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントの存在）は発生させるべきＰＣＲ産物のためのゲノムＤＮＡ調製において十分な品質のアンプルＤＮＡがあることを示している。内因性プライマーは以下の内因性アクチンダイズ遺伝子を認識するように選択した。
SOY01 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT -3' (配列番号 9)
SOY02 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC -3' (配列番号 10)
【０１１８】
２．２．増幅されるフラグメント
ＰＣＲ反応で予測される増幅されるフラグメントは以下の通りである。
プライマー対SOY01-SOY02の場合:４１３ｂｐ（内因性対照）
プライマー対SOY028-SOY029の場合:２６３ｂｐ（ＥＥ−ＧＭ３優良イベント）
【０１１９】
２．３．鋳型ＤＮＡ
鋳型ＤＮＡはEdwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991)に従ってリーフパンチ葉片から調製した。他の方法で調製したＤＮＡを使用する場合、鋳型の種々異なる量を利用するテストランを実施しなければならない。通常はゲノム鋳型ＤＮＡ５０ｎｇが最良の結果をもたらす。
【０１２０】
２．４．割り付ける陽性及び陰性対照
誤った陽性又は陰性を回避するためには以下の陽性及び陰性対照がＰＣＲランに包含されなければならない。
−  マスターミックス対照（ＤＮＡ陰性対照）。これは反応にＤＮＡを加えないＰＣＲである。予測される結果であるＰＣＲ産物無しが観察される場合、これはＰＣＲカクテルに標的ＤＮＡが混在していなかったことを指す。
−  ＤＮＡ陽性対照（トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムＤＮＡ試料）。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にＰＣＲがランされたことを示す。
−  野生型ＤＮＡ対照。これは与えられた鋳型ＤＮＡが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。予測される結果であるトランスジェニックＰＣＲ産物の増幅無し、ただし内因性ＰＣＲ産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムＤＮＡ試料中に検出可能なトランスジーンのバックグラウンド増幅が無いことを示している。
【０１２１】
２．５．ＰＣＲ条件
最適な結果は以下の条件下に得られた（最適な結果のための種々の条件を記載する場合、そのような条件の例を与えることを意味する。当然ながら当業者は条件、試薬及びパラメーターを変更する場合があり、例えば他のＴａｑポリメラーゼを用いて所望の結果を達成しても良い）。
−２５μｌ反応用ＰＣＲミックスは下記のものを含有する。
２０ｎｇ鋳型ＤＮＡ
２．５μＬの１０ｘ増幅緩衝液（Ｔａｑポリメラーゼの製造元により供給）
０．５μＬの１０ｍＭｄＮＴＰ類
０．４μＬのＳＯＹ０１（１０ピコモル／μＬ）
０．４μＬのＳＯＹ０２（１０ピコモル／μＬ）
０．７μＬのＳＯＹ０２８（１０ピコモル／μＬ）
０．７μＬのＳＯＹ０２９（１０ピコモル／μＬ）
０．１μＬのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μＬ）
２５μＬ定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
９５℃４分間
次いで：  ９５℃１分間
５７℃１分間
７２℃２分間
５サイクル
次いで：  ９２℃３０秒
５７℃３０秒
７２℃１分間
２５サイクル
次いで：  ７２℃１０分間
【０１２２】
２．６．アガロースゲル分析
ＰＣＲの結果を最適に可視化するために、ＰＣＲ試料１０〜２０μＬを適切な分子量マーカー（例えば１００ｂｐラダーＰｈａｒｍａｃｉａ）と共に１．５％アガロースゲル（Ｔｒｉｓホウ酸塩緩衝液）上にアプライしなければならないとした。
【０１２３】
２．７．結果のバリデーション
単一のＰＣＲラン及び単一のＰＣＲカクテルの内部におけるトランスジェニック植物ＤＮＡ試料から得られたデータは、１）ＤＮＡ陽性対照が予測されたＰＣＲ産物（トランスジェニック及び内因性のフラグメント）を示し、２）ＤＮＡ陰性対照がＰＣＲ増幅に関して陰性（フラグメント無し）であり、そして３）野生型ＤＮＡ対照が予測された結果（内因性フラグメント増幅）を示すことが成立しない限り許容してはならないとした。
上記したＥＥ−ＧＭ３に関するPCR Identification Protocolに従った場合、予測されるサイズのトランスジェニック及び内因性ＰＣＲ産物の目視可能な量を示すレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡの調製元の相当する植物がＥＥ−ＧＭ３優良イベントを受け継いでいることを示している。トランスジェニックＰＣＲ産物の何れかの目視可能な量を示さず、そして内因性ＰＣＲ産物の目視可能な量を示しているレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡの調製元の相当する植物が優良イベントを含まないことを示している。内因性およびトランスジェニックのＰＣＲ産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムＤＮＡの質及び／又は量がＰＣＲ産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムＤＮＡ調製は反復しなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなＰＣＲランを実施しなければならない。
【０１２４】
２．８．ＥＥ−ＧＭ３を識別するための判別ＰＣＲプロトコルの使用
未知物のスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照を用いたテストランを実施する。開発されたプロトコルは実験室間で異なる場合がある要素（鋳型ＤＮＡ調製、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの品質、ｄＮＴＰ類、サーモサイクラー等）。
内因性配列の増幅はプロトコルにおける重要な役割を果たす。１つは既知トランスジェニックゲノムＤＮＡ鋳型における内因性及びトランスジェニックの配列の両方の等モル量を増幅するＰＣＲ及び熱サイクリングの条件を得ることである。ターゲティングされる内因性フラグメントが増幅されない場合、又は、ターゲティングされる配列がアガロースゲル電気泳動で判断した場合に同じ臭化エチジウム染色強度で増幅されない場合は、ＰＣＲ条件の最適化が必要な場合がある。
一部がＥＥ−ＧＭ３を含む多くのダイズ植物に由来する葉材料を上記したプロトコルに従って試験した。優良イベントＥＥ−ＧＭ３由来及びダイズ野生型由来の試料をそれぞれ陽性及び陰性対照として採取した。
図２は多くのダイズ植物試料上のＥＥ−ＧＭ３に関して、優良イベントPCR Identification Protocolを用いて得られた結果を示す。レーン２及び３の試料は２６３ｂｐのバンドが検出されていることから優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含有することがわかり、レーン４〜８の試料はＥＥ−ＧＭ３を含んでいない。レーン６及び７は同じ除草剤耐性キメラ遺伝子を用いて得られた他のダイズ形質転換イベントに由来する試料を含み；レーン８は野生型ダイズ植物由来のＤＮＡを含有し、そしてレーン９は陰性対照（水）試料を示し、レーン１及び１０は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）を示す。
【０１２５】
２．９．バルク化種子におけるＥＥ−ＧＭ３検出のためのｄＰＣＲアッセイ
判別ＰＣＲ（ｄＰＣＲ）アッセイをバルク化種子中のＥＥ−ＧＭ３の低レベルの存在を検出するためにセットアップする。非トランスジェニック種子のバルク中のトランスジェニック種子の０．４％（ｗ／ｗ）の最低レベルが反復可能な条件下に良好に検出できた。従って検出限界を０．４％（ｗ／ｗ）と決定した。
以下のプライマーをこの標的ＰＣＲ反応に適用する。
Ｔ−ＤＮＡ配列にターゲティングされたフォワードプライマー：
SHA130   5'- CTA.TAT.TCT.ggT.TCC.AAT.TTA.TC -3' (配列番号l2)
３’フランキング配列にターゲティングされたリバースプライマー：
SMP178   5'- TgA.ggC.ACg.TAT.TgA.TgA.CC- 3'（配列番号13)
これらのプライマーからＰＣＲ反応において予測される増幅されたフラグメントは１１５ｂｐである。
変更したＧｅｎｔｒａ  ＰｕｒｅｇｅｎｅＤＮＡ精製抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）に従って粉砕バルク化種子から調製した鋳型ＤＮＡ約２００ｎｇに対して標的ＰＣＲ反応を実施した。他の方法で調製したＤＮＡを使用する場合、ＥＥ−ＧＭ３の既知相対レベルを有する試料を用いたテストランを実施しなければならない。
内因性配列にターゲティングしたバリデーションされたレファレンス系のＰＣＲ反応は、理想的には、誤った陰性結果を回避するためにＰＣＲ分析に対するＤＮＡ試料の適性を検証するために、別個のＰＣＲランにおいて実施しなければならない。
未知試験試料に関しては、ＰＣＲ実験は理想的には適切な陽性及び陰性対照試料、即ち如何に記載するものを包含しなければならない。
−  マスターミックス対照（ＤＮＡ陰性対照）。これは反応にＤＮＡを加えないＰＣＲである。標的及びレファレンス系の反応の両方に関して予測される結果（ＰＣＲ産物無し）が観察される場合、これはＰＣＲカクテルに標的ＤＮＡが混在していなかったことを指す。
−  ＤＮＡ陽性対照（トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムＤＮＡ試料）。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にＰＣＲがランされたことを示す。
−  同様に野生型ＤＮＡ対照をこのＰＣＲに加えることができる。これは与えられた鋳型ＤＮＡが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。予測される結果であるトランスジェニックＰＣＲ産物の増幅無し、ただし内因性ＰＣＲ産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムＤＮＡ試料中に検出可能なトランスジーンのバックグラウンド増幅が無いことを示している。
最適な結果は以下の条件下に得られる。
当然ながら、他のＴａｑポリメラーゼも使用することができ、そしてその場合、条件を供給元の推奨に従って変えることができる。
−２５μｌ反応用ＰＣＲミックスは下記のものを含有する。
２００ｎｇの鋳型ＤＮＡ
５μＬの５ｘ反応緩衝液
０．２５μＬの２０ｍＭｄＮＴＰ類
０．７μＬのＳＨＡ１３０（１０ピコモル／Ｌ）
０．４μＬのＳＭＰ１７８（１０ピコモル／Ｌ）
０．１μＬのＧＯ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５単位／Ｌ）
２５μＬ定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
９５℃４分間
次いで：  ９５℃１分間
５７℃１分間
７２℃２分間
５サイクル
次いで：  ９２℃３０秒
５７℃３０秒
７２℃１分間
３０サイクル
次いで：  ７２℃１０分間
ＰＣＲの結果を最適に可視化するために、ＰＣＲ産物２５μＬを適切な分子量マーカー（例えば５０ｂｐラダー）と共に１．５％アガロースゲル（Ｔｒｉｓホウ酸塩緩衝液）上にアプライしなければならないとした。
上記したＰＣＲ法に従う場合、予測されるサイズの標的及びレファレンス系のＰＣＲ産物の目視可能な量を示すレーンはゲノム鋳型ＤＮＡの調製元の被験試料が標的反応の検出限界より高いＥＥ−ＧＭ３優良イベントのレベルを含有していたことを示す。
標的ＰＣＲ産物の目視可能な量を示さないが、レファレンス系ＰＣＲ産物の目視可能な量を示すレーンはゲノム鋳型ＤＮＡの調製元の被験試料が標的反応の検出限界より低いＥＥ−ＧＭ３のレベル優良イベントを含有していたことを示す。
内因性及びトランスジェニックのＰＣＲ産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムＤＮＡの質及び／又は量がＰＣＲ産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムＤＮＡ調製は反復しなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなＰＣＲランを実施しなければならない。
【０１２６】
３．ＥＥ−ＧＭ３を含む物質の検出のためのプローブとしての特異的組み込みフラグメントの使用
ＥＥ−ＧＭ３の特異的組み込みフラグメントは、配列番号８のヌクレオチド配列を有するアンプリコンをもたらす特異的プライマーＳＯＹ０２８（配列番号４）及びＳＯＹ０２９（配列番号５）を用いたＰＣＲ増幅によるか、又は、化学合成により得られ、そして標識される。この組み込みフラグメントを、生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ３の検出のための特異的プローブとして使用する。核酸は標準的操作法に従って試料から抽出される。次にこの核酸をハイブリッドの形成を可能にするように最適化されたハイブリダイゼーション条件下に特異的プローブと接触させる。次にハイブリッドの形成が検出され、試料中のＥＥ−ＧＭ３核酸の存在を示す。場合により、試料中の核酸は、特異的プローブとの接触よりも前に特異的プライマーを用いて増幅される。或いは、組み込みフラグメントの代わりに特異的プローブと接触させる前に核酸を標識する。場合により試料との接触の前に特異的プローブを固体担体（例えば限定しないがフィルター、ストリップ又はビーズ）に結合させる。
【０１２７】
４．ＥＥ−ＧＭ３ダイズ植物物質の接合生殖性ステータスのＰＣＲ計測定のプロトコル
４．１．プライマー
優良イベントの挿入の前の野生型遺伝子座のヌクレオチド配列を認識する２つのプライマーを、それらが相互に指向し、そして除草剤耐性遺伝子を中間に含む外来性ＤＮＡの挿入部位を有するように設計した。このプライマーセットは、外来性ＤＮＡ配列に相補でありフランキングＤＮＡを指向している第３のプライマーと一緒になって、ＥＥ−ＧＭ３特異的配列並びに野生型配列の同時ＰＣＲ増幅を可能とする。
以下のプライマーがＥＥ−ＧＭ３ＤＮＡ上の接合生殖性採点ＰＣＲ反応において特に明確で再現性のある結果をもたらすことがわかった。
SMP187: 5'- ATA.TCA.ACC.CgT.AgC.TCg.AC-3'（配列番号６）
(標的:３’フランキング配列上流の野生型植物ＤＮＡ)
SOY029 5' -CAA.ggC.CTC.gAg.ATT.ATC -3'（配列番号５）
(標的:３’フランキング配列の植物ＤＮＡ)
5'- ggC.ATT.AAA.TTg.gTg.AAA.ATT.gC-3'（配列番号７）
(標的:インサートＤＮＡ)
【０１２８】
４．２．増幅されるフラグメント
ＰＣＲ反応で予測される増幅されるフラグメントは以下の通りである。
プライマー対ＳＭＰ１８７−ＳＯＹ０２９の場合:３１９ｂｐ（野生型遺伝子座）
プライマー対ＳＴＶ０１９−ＳＯＹ０２９の場合:７０６ｂｐ（ＥＥ−ＧＭ３遺伝子座）
【０１２９】
４．３．鋳型ＤＮＡ
鋳型ＤＮＡはEdwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, pl349, 1991)に従ってリーフパンチ葉片から調製した。他の方法で調製したＤＮＡを使用する場合、鋳型の種々異なる量を利用するテストランを実施しなければならない。通常はゲノム鋳型ＤＮＡ２５又は５０ｎｇが最良の結果をもたらす。
【０１３０】
４．４．割り付ける陽性及び陰性対照
誤った陽性又は陰性を回避するためには以下の陽性及び陰性対照がＰＣＲランに包含されなければならない。
−  マスターミックス対照（ＤＮＡ陰性対照）。これは反応にＤＮＡを加えないＰＣＲである。予測される結果であるＰＣＲ産物無しが観察される場合、これはＰＣＲカクテルに標的ＤＮＡが混在していなかったことを指す。
−  ＤＮＡ陽性対照（トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムＤＮＡ試料）。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にＰＣＲがランされたことを示す。
−  野生型ＤＮＡ対照。これは与えられた鋳型ＤＮＡが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。予測される結果であるトランスジェニックＰＣＲ産物の増幅無し、ただし内因性ＰＣＲ産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムＤＮＡ試料中に検出可能なトランスジーンのバックグラウンド増幅が無いことを示している。
【０１３１】
４．５．ＰＣＲ条件
最適な結果は以下の条件下に得られた。明らかに、他のＴａｑポリメラーゼ、例えばＧＯ−Ｔａｑも使用することができ、そしてその場合、条件を供給元の推奨に従って変えることができる。
−２５μｌ反応用ＰＣＲミックスは下記のものを含有する。
ｘμＬの鋳型ＤＮＡ（２５ｎｇ）
２．５μＬの１０ｘ増幅緩衝液（Ｔａｑポリメラーゼの製造元により供給）
０．５μＬの１０ｍＭｄＮＴＰ類
０．５μＬのＳＮＰ１８７（１０ピコモル／μＬ）
０．５μＬのＳＯＹ０１９（１０ピコモル／μＬ）
１μＬのＳＯＹ０２９（１０ピコモル／μＬ）
０．１μＬのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μＬ）
２５μＬ定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
９５℃４分間
次いで：  ９５℃１分間
５７℃１分間
７２℃２分間
５サイクル
次いで：  ９２℃３０秒
５７℃３０秒
７２℃１分間
２５サイクル
次いで：  ７２℃１０分間
【０１３２】
４．６．アガロースゲル分析
ＰＣＲの結果を最適に可視化するために、ＰＣＲ試料１０〜２０μＬを適切な分子量マーカー（例えば１００ｂｐラダーＰｈａｒｍａｃｉａ）と共に１．５％アガロースゲル（Ｔｒｉｓホウ酸塩緩衝液）上にアプライしなければならないとした。
【０１３３】
４．７．結果のバリデーション
単一のＰＣＲラン及び単一のＰＣＲマスターミックスの内部におけるトランスジェニック植物ＤＮＡ試料から得られたデータは、以下が成立しない限り許容してはならないとした。
−陽性対照が予測されたＰＣＲ産物を示す（トランスジェニック標的増幅）；
−野生型陽性ＤＮＡ対照が予測された結果を示す（野生型標的増幅）；
−陰性対照がＰＣＲ増幅に関して陰性である（フラグメント無し）。
予測されたサイズのトランスジェニックＰＣＲ産物の目視可能な量を示し、そして野生型ＰＣＲ産物の目視可能な量を示さないレーンは、ゲノムＤＮＡ鋳型の調製元の相当する植物がトランスジェニック遺伝子カセットに関してホモ接合であることを示している。
トランスジェニック及び野生型ＰＣＲ産物の目視可能な量を示すレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡの調製元の相当する植物がトランスジェニック遺伝子カセットに関して半接合であることを示している。トランスジェニックＰＣＲ産物の目視可能な量を示さず、そして野生型ＰＣＲ産物の目視可能な量を示しているレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡの調製元の相当する植物がアッセイ対象であるトランスジェニック配列を受け継いでおらず、従って野生型遺伝子座に関してホモ接合であることを示している。
トランスジェニック及び野生型のＰＣＲ産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムＤＮＡの質及び／又は量がＰＣＲ産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムＤＮＡ調製は反復しなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなＰＣＲランを実施しなければならない。
【０１３４】
４．８．ＥＥ−ＧＭ３含有植物の接合生殖性ステータスの識別のための接合生殖性採点プロトコルの使用
図３は多くのダイズ植物試料上のＥＥ−ＧＭ３に関する接合生殖性採点ＰＣＲを用いて得られた結果を示す。レーン２及び５中の試料は優良イベントＥＥ−ＧＭ３に関して特徴的なＰＣＲフラグメント（７０６ｂｐ）のみを含有していることがわかったのに対し、レーン４、６及び７の試料はｗｔ遺伝子座の存在に関して特徴的なフラグメントのみを含有していた。レーン３，８及び９は両方のフラグメントを含有していた。従ってレーン２及び５はホモ接合型でＥＥ−ＧＭ３を含有し、レーン３，８及び９は半接合型でＥＥ−ＧＭ３を含有し、そしてレーン４、６及び７はホモ接合型でｗｔ遺伝子座を含有している（ＥＥ−ＧＭ３については不対）。レーン１０は陰性対照（水）試料を示し、そしてレーン１及び１１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）を示す。
【０１３５】
５．好ましい栽培変種植物内へのＥＥ−ＧＭ３のイントログレッション
優良イベントＥＥ−ＧＭ３は反復逆交雑により、商業的なダイズ栽培品種、例えば限定しないがダイズ栽培品種（Soybean Cultivar）7631014 (US2009252860)；ダイズ栽培品種 7431014 (US2009252859)；ダイズ栽培品種 7925084 (US2009252858)；ダイズ栽培品種 7311153 (US2009252857)；ダイズ栽培品種 S070159 (US2009252856)；ダイズ栽培品種 7535357 (US2009246353)；ダイズ栽培品種 S070160 (US2009246352)；ダイズ栽培品種 26074414 (US2009249508)；ダイズ栽培品種7509171 (US2009249507)；ダイズ栽培品種 S070158 (US2009246351)；ダイズ栽培品種 7511119 (US2009249506)；ダイズ栽培品種 7113111 (US2009238945)；ダイズ栽培品種 S06-02RM018047 (US7592518)；ダイズ栽培品種 7013345 (US2009232957)；ダイズ栽培品種 7041461 (US2009235376)；ダイズ栽培品種 7549450 (US2009232956)；ダイズ栽培品種 7317090 (US2009232955)；ダイズ栽培品種 2N2V58015 (US2009226597)；ダイズ栽培品種 7243182 (US2009226596)；ダイズ栽培品種 7143182 (US2009226595)；ダイズ栽培品種 7043182 (US2009220673)；ダイズ栽培品種 S070157 (US2009222950)；ダイズ栽培品種 306924721 (US2009220672)；ダイズ栽培品種 7614385 (US2009220671)；ダイズ栽培品種 7925118 (US2009214750)；ダイズ栽培品種 7821295 (US2009214749)；ダイズ栽培品種 7811336 (US2009214748)；ダイズ栽培品種 S070150 (US2009214747)；ダイズ栽培品種 6214260 (US2009214746)；ダイズ栽培品種 S070152 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【０１３６】
これらの栽培変種植物内への優良イベントのイントログレッションはこれらの栽培変種植物の所望の表現型又は作物学的な特性の何れにも大きく影響しない（収量障害無し）のに対し、グリホセート及び／又はイソキサフルトール耐性により測定されるトランスジーンの発現は商業的に許容できるレベルに合致していることがわかる。これらによりイベントＥＥ−ＧＭ３のステータスが優良イベントであることが確認できる。
【０１３７】
優良イベントＥＥ−ＧＭ３は市販されているその他のダイズイベント１つ以上、例えば限定しないが他の除草剤耐性イベント、例えばＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ申立書：０９−３４９−０１ｐ、０９−２０１−０１ｐ、０９−１８３−０１ｐ、０９−０８２−０１ｐ、０９−０１５−０１ｐ、０６−３５４−０１ｐ、０６−２７１−０１ｐ、０６−１７８−０１ｐ、９８−２３８−０１ｐ、９８−０１４−０１ｐ、９７−００８−０１ｐ、９６−０６８−０１ｐ、９５−３３５−０１ｐ、９３−２５８−０１ｐに記載のイベント（例えばｗｗｗ．ａｐｈｉｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ｂｒｓ／ｎｏｔ＿ｒｅｇ．ｈｔｍｌ参照）、又はＵＳ２００６−２８２９１５に記載のイベントＭＯＮ８９７８８（グリホセート耐性）、ＷＯ２００８／０５４７４７に記載のイベントＤＰ−３０５４２３−１（高オレイン酸／ＡＬＳ阻害剤耐性）、ＷＯ２００６１１０８６７４又はＷＯ２００６１１０８６７５にそれぞれ記載のイベントＡ２７０４−１２及びＡ５５４７−１２７（グルフォシネート耐性）、ＵＳ２００９１３００７１に記載のＭＯＮ８７７０１、ＵＳ２００９０３６３０８に記載のイベント３５６０．４．３．５、ＵＳ２００８３１２０８２に記載のイベントＤＰ−３０５４２３−１、又はＷＯ２０１０／０８０８２９のイベントＢＰＳ−ＣＶ１２７−９（Ｅｖｅｎｔ１２７）と好都合に組み合わせてよい。
【０１３８】
以下の請求項において使用する場合、特段の記載が無い限り、「植物」という用語は何れかの成熟段階の植物組織、並びに何れかのそのような植物から採取されるか誘導された何れかの細胞、組織、又は器官、例えば限定しないが、何れかの種子、葉、幹、花、根、単細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物又はプロトプラストを包含することを意図している。
【０１３９】
優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むレファレンス種子はＮＣＩＭＢアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下２００９年１０月１２日にＮＣＩＭＢ(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Scotland)に３２−ＲＲＭＭ−０５３１として寄託されており、そしてその品種は確認されている。ＥＥ−ＧＭ３の別名はイベントＦＧ−０７２、又はイベントＭＳＴ−ＦＧA７２−３である。
【０１４０】
本発明の上記記載は例示であって、限定的なものではない。
【０１４１】
記載した実施形態における種々の変化又は変更は当業者が想到し得るものである。これらは本発明の精神又は範囲を逸脱することなく行うことができる。
【図１】
2013511293.tif 000004
【図２】
2013511293.tif 000005
【図３】
2013511293.tif 000006
【配列表】
2013511293000001.app
【国際調査報告】
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