(57)【要約】  本発明は、（ｉ）少なくとも１つのエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）構造ポリペプチドと、（ii）少なくとも１つのＥＢＶ溶菌性ポリペプチドと、（iii）膜脂質とを含有し、ＥＢＶ  ＤＮＡの無い粒子を含有するワクチンであって、（ａ）粒子に含有される、Ｂ細胞形質転換に必要な１以上のＥＢＶポリペプチドのＢ細胞形質転換能は無能化されているが、それらの免疫原性は維持され、および／または（ｂ）粒子は、Ｂ細胞形質転換に必要な１以上のＥＢＶポリペプチドが無い、ワクチンに関する。さらに、発明は、粒子を生成する方法、発明の方法で得られる細胞、発明の方法に従って生成されるワクチンまたは粒子を含むキットに関する。さらに、発明は、ＥＢＶ抗原に特異的なＣＤ８＋細胞を生成するための発明の方法に従って生成されるワクチンまたは粒子の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）  少なくとも１つのエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）構造ポリペプチドと、
（ii）  少なくとも１つのＥＢＶ溶菌性ポリペプチドと、
（iii）  膜脂質
とを含有し、ＥＢＶ  ＤＮＡの無い粒子を含有するワクチンであって、
（ａ）  前記粒子に含有される、Ｂ細胞形質転換に必要な１以上のＥＢＶポリペプチドのＢ細胞形質転換能は無能化されているが、それらの免疫原性は維持され、および／または
（ｂ）  前記粒子は、Ｂ細胞形質転換に必要な１以上のＥＢＶポリペプチドが無い、ワクチン。
【請求項２】
前記粒子は、ＢＺＬＦ１およびｇｐ３５０から選択される前記少なくとも１つのＥＢＶポリペプチドを含有し、および／または、少なくとも１つのＥＢＶ潜在性ポリペプチドをさらに含有する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
粒子を生成するための方法であって、
（ａ）  細胞に修飾ＥＢＶゲノムをトランスフェクトするステップを含み、前記修飾ＥＢＶゲノムは、野生型ＥＢＶゲノムと比較して、少なくとも、
（aa）  前記野生型ＥＢＶゲノムのパッケージングに必要な１以上の配列が欠如し、前記パッケージングに必要なＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列が欠如し、および／または、パッケージング能が無能化されているＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列を含有し、
（ab）  Ｂ細胞形質転換に必要なＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列が欠如し、および／または、Ｂ細胞形質転換能が無能化されているＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列を含有し、さらに、
（ac）  ＥＢＶの複製を誘導するのに必要なＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列が欠如し、および／または、ＥＢＶ複製の誘導能が無能化されているＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列を含有し、前記方法はさらに、
（ｂ）  前記ステップ（ａ）で得られた細胞を、前記修飾ＥＢＶゲノムの発現を可能にする条件下で培養するステップと、
（ｃ）  ＥＢＶの複製相を誘導するステップと、
（ｄ）  前記粒子を単離するステップとを含む、方法。
【請求項４】
請求項１の前記（ａ）または請求項３の前記（ab）において、形質転換能が無能化されているポリペプチドは、ＬＭＰ−１ポリペプチドである、請求項１もしくは２に記載のワクチン、または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１の前記（ｂ）または請求項３の前記（ab）に記載の、欠如している、Ｂ細胞形質転換に必要な前記１以上のＥＢＶポリペプチドは、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３ａ、ＥＢＮＡ−３ｂおよびＥＢＮＡ−３ｃからなる群から選択される、請求項１、２もしくは４のいずれかに記載のワクチン、または請求項３もしくは４に記載の方法。
【請求項６】
請求項３の前記（ac）に記載の、欠如している、ＥＢＶの複製を誘導するのに必要な前記１以上のＥＢＶポリペプチド、または、ＥＢＶ複製誘導能が無能化されている前記１以上のＥＢＶポリペプチドは、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１および、これらの任意の組合せからなる群から選択され、請求項３の前記ステップ（ｃ）において、前記複製相は、選択された前記ポリペプチドを前記細胞に付与することによって誘導される、請求項３から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
選択された前記ポリペプチドは、ＢＺＬＦ１である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞への前記１以上のＥＢＶポリペプチドまたは前記ＢＺＬＦ１の付与は、前記細胞に安定的にトランスフェクトされたベクターからの前記１以上のＥＢＶポリペプチドまたは前記ＢＺＬＦ１の発現により行なわれる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記１以上のＥＢＶポリペプチドまたは前記ＢＺＬＦ１の発現は、誘導可能に調節される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｂ）の後かつ前記ステップ（ｃ）の前に、１以上のウイルスもしくは非ウイルスポリペプチド、１以上のウイルスもしくは非ウイルス核酸配列、および／または、１以上のワクチンアジュバントを前記細胞に付与する更なるステップ（ｂ′）を含み、前記１以上のウイルスポリペプチドまたは前記１以上のウイルス核酸配列は、それぞれＥＢＶポリペプチドまたはＥＢＶ核酸配列でない、請求項３から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
１以上のウイルスもしくは非ウイルスポリペプチド、１以上のウイルスもしくは非ウイルス核酸配列、および／または、ワクチンアジュバントを追加的に含有し、前記１以上のウイルスポリペプチドまたは前記１以上のウイルス核酸配列は、それぞれＥＢＶポリペプチドまたはＥＢＶ核酸配列でない、請求項１、２、４、および５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１２】
請求項８から１０のいずれかに記載の方法の前記ステップ（ａ）に従ってトランスフェクトすることにより得られる細胞。
【請求項１３】
請求項１、２、４、５および１１のいずれかに記載のワクチンまたは、請求項３から１０のいずれかに記載の方法に従って生成される粒子を含むキット。
【請求項１４】
ＥＢＶ抗原に特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞を生成するための、請求項１、２、４、５および１１のいずれかに記載のワクチンまたは、請求項３から１０のいずれかに記載の方法により得られる粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ｉ）少なくとも１つのエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）構造ポリペプチドと、（ｉｉ）少なくとも１つのＥＢＶ溶菌性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）膜脂質とを含有し、ＥＢＶ  ＤＮＡが無い粒子を含有するワクチンであって、（ａ）上記粒子に含有される、Ｂ細胞形質転換に必要な１以上のＥＢＶポリペプチドのＢ細胞形質転換能は無能化されているが、それらの免疫原性は維持され、および／または（ｂ）上記粒子は、Ｂ細胞形質転換に必要な１以上のＥＢＶポリペプチドが無い、ワクチンに関する。さらに、本発明は、粒子を生成するための方法、本発明の方法で得られる細胞、本発明の方法に従って生成されるワクチンまたは粒子を含むキットに関する。本発明は、ＥＢＶ抗原に特異的なＣＤ８＋細胞を生成するための本発明の方法に従って生成されるワクチンまたは粒子の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中では、特許出願およびメーカーのマニュアルを含む多くの文献が引用される。これらの文献の開示は、本発明の特許性に関連するとはみなされないが、その全体が引用によりここに援用される。より具体的には、参照される文献すべては、各個々の文献が引用により援用されるように具体的かつ個々に示されたのと同じ程度に、引用により援用される。
【０００３】
エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）は、世界的な人口の９０％以上に感染し、その宿主で終生にわたって存続する、偏在的なヒトヘルペスウイルスである。ほとんどの場合、初感染は幼児期に起こり、通常無症候性である。反対に、感染が遅れて青年期または成年期に起きると、定期的に症候性であり、症例の５０％以下において伝染性単核症（ＩＭ）と呼ばれる通常自然治癒する（self-limiting）良性のリンパ増殖性症候群を引き起こす（RickinsonおよびKieff、２００７年）。この疾患は通常自然治癒するが、長期化した形態のＩＭ（Tobi et al.、１９８２年）または、致命的な予後を伴う慢性活動性ＥＢＶ感染（ＣＡＥＢＶ）が報告されている（Lu et ai.、２００９年、lmashuku、２００７年）。臨床的に顕性のＩＭは、後年にホジキン病および他の型のリンパ腫を発症するリスクを著しく増加させることも分かっている（Becker et al.、２００９年、Goldacre et al.、２００９年）。今日、ＩＭは後年の多発性硬化症の独立危険因子であることも一般的に認められている（Thacker et al.、２００６年、Zaadstra et al.、２００８年）。さらに、ＥＢＶは、上咽頭癌、胃癌および種々の型のリンパ腫のような悪性疾患の異種群（heterogeneous group）の原因として関連付けられている（Lopes et al.、２００３年）ため、ＷＨＯは、ＥＢＶをクラスＩ発癌物質として分類している（Niedobitek、１９９９年）。
【０００４】
ＥＢＶによって引き起こされる上述の病状に加えて、移植レシピエントのような原発性または続発性免疫欠損の患者は、ＥＢＶ感染Ｂ細胞の免疫制御に対する免疫抑制剤の悪影響の結果、ＥＢＶ関連疾患のリスクが特にある。ＥＢＶ関連ＰＴＬＤは、特に重要な形態の移植後合併症であり、臓器レシピエントの２０％以下に生じている（Everly et al.、２００７年、Taylor et al.、２００５年）。重要なことに、免疫抑制の開始時にＥＢＶに対して免疫的に無感作の免疫無防備な移植レシピエントは、ＥＢＶの高い有病率のため、たとえば、ドナー臓器を通したウイルスの伝染を介して移植後にしばしば引き起こされる原発性ＥＢＶ感染による、重篤なＥＢＶおよび移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）を発症するリスクが特に高い。免疫抑制薬への曝露の結果生じるＴ細胞免疫障害のため、これらの患者は、ＥＢＶ感染Ｂ細胞の増殖を制御する際に重大な役割を果たすＥＢＶ特異的Ｔ細胞を有効に予備刺激（prime）することが不可能である。対照的に、移植時にＥＢＶ血清陽性である患者は、ＰＴＬＤを発症するリスクがより非常に低く、ウイルス感染細胞を除去する態勢の整ったＥＢＶ特異的Ｔ細胞の不可欠な役割を示している。一般的に、移植前にＥＢＶ血清陰性である患者は、ＥＢＶ関連疾患を発症するリスクがより非常に高いが、これは、移植臓器中のドナーＥＢＶの伝染またはウイルスの自然感染により、移植後のＥＢＶ血清陰性レシピエントにリンパ増殖性疾患が引き起こされるためである（たとえば、Mendoza et al.、２００６年、Swerdlow et al.、２０００年）。多くのウイルス関連疾患と同様、宿主におけるウイルス感染およびその結果を予防および／または治療するための有望な手段は、ワクチン接種であり、これは、移植前に血清陰性患者をＥＢＶに対して免疫化することにより、該患者におけるＰＴＬＤの高リスクを低減する場合にもあてはまる。
【０００５】
これらのＥＢＶ関連疾患は、後のウイルス感染およびウイルス関連疾患に対処する際に安全（save）かつ効率的なＥＢＶワクチンの開発について、強い議論を提供する。ワクチン候補によるヒトでの最初の試験は、主要なＥＢＶ膜抗原であるＢＬＬＦ−１を発現する組換え牛痘ウイルスを用いて、既に１９９０年代に行われており、ＥＢＶ中和抗体の増加した力価が得られている（Gu et al.、１９９５年）。より最近では、健常なボランティア（Elliott et al.、２００８年、Moutschen et al.、２００７年、Sokal et al.、２００７年）および腎臓移植を控えた子供達（Rees et al.、２００９年）における血清転換およびＩＭの予防を目的とした、種々のペプチド系予防ワクチンが記載されている。これらの子供達では、４人のレシピエントにおいて中和抗体が検出された。しかしながら、免疫応答は急速に低下し、移植後の事象には影響を及ぼさない可能性が高かった。
【０００６】
生弱毒ウイルスは、野生型ウイルスおよび関連疾患による感染から効率的に保護する多価ワクチンである。遺伝減衰（genetic attenuation）は、通常、許容細胞におけるウイルスの連続継代によって達成される。不運なことに、水痘帯状疱疹（Varizeila zoster）のような他のヘルペスウイルスと対照的に、自発的遺伝減衰を可能にする溶菌系は、ＥＢＶについては存在しない。ヒトを故意に野生型ＥＢＶに感染させる陽性転換は、基本的には容易であろうが、ウイルスが明らかに本来腫瘍形成性であるため、非倫理的とみなされる。また、弱毒化ワクチンも、重い副作用および播種感染のリスクのため（Duchini et al.、２００３年、SucciおよびFarhat、２００６年）、原発性および続発性免疫不全の免疫無防備な患者の多くの群には通常推奨されない（Pickering et al.、２００９年）。
【０００７】
ｇｐ３５０サブユニットワクチンに頼る一価ＥＢＶワクチンは、２０年以上の間研究されており、次の種々の結果が得られている。すなわち、ある製剤は、臨床相Ｉ／ＩＩ研究に登録した健常なボランティアに中和抗体を誘導することに成功した（Moutschen et al.、２００７年）が、腎臓移植を控えた子供達における別のワクチン製剤は、移植後ＥＢＶ力価に影響を及ぼし、かつＰＴＬＤから保護することに失敗した（Rees et al.、２００９年）。これはおそらく、ｇｐ３５０は通常ＰＴＬＤおよび他のＥＢＶ関連悪性腫瘍では発現されないためである。したがって、ｇｐ３５０ワクチンは、ＥＢＶ関連癌の発症リスクを低減できないことが疑われ得る。
【０００８】
ＷＯ２００９／０６８６１５号には、ウイルスＤＮＡを含有しないか、または形質転換ＥＢＶ  ＤＮＡを含有しないことを特徴とするウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成が記載されている。上記粒子は、それに従ってＥＢＶ構造抗原に特異的なＣＤ４＋細胞が生成される、エクス・ビボの方法で使用される。形質転換ＥＢＶ  ＤＮＡが無いＤＮＡ中の発癌遺伝子の潜在的な存在、および、ＶＬＰ中の形質転換タンパク質の存在のため、安全面および倫理的な理由から、それらはヒトにおいては使用できない。さらに、生成されるＣＤ４＋細胞は、有力なワクチンとみなすことはできず、ましてや予防ワクチンとして用いることはできない。なぜなら、ＥＢＶ陽性ドナーからはＣＤ４＋細胞しか生成されていないが、それらはＥＢＶ無感作の個人にＥＢＶ特異的免疫細胞を予備刺激することができないためである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の基となる技術的問題は、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連疾患に対する治療的および予防的ワクチン接種を可能にする、代替的および／または改善された手段および方法を特定することにあった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このような技術的問題の解決策は、請求項に特徴が記載される実施形態を提供することによって達成される。
【００１１】
したがって、本発明は、第１の実施形態において、（ｉ）少なくとも１つのエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）構造ポリペプチドと、（ｉｉ）少なくとも１つのＥＢＶ溶菌性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）膜脂質とを含有し、ＥＢＶ  ＤＮＡが無い粒子を含有するワクチンであって、（ａ）上記粒子に含有される、Ｂ細胞形質転換に必要な１以上のＥＢＶポリペプチドのＢ細胞形質転換能は無能化されているが、それらの免疫原性は維持され、および／または（ｂ）上記粒子は、Ｂ細胞形質転換に必要な１以上のＥＢＶポリペプチドが無い、ワクチンに関する。
【００１２】
本発明で使用される「ワクチン」という用語は、個人をＥＢＶに対して予防上または治療上免疫化することを意味する。本発明に従うワクチンは、個人をＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連疾患に対して免疫化する。免疫化は、免疫系をワクチン内の抗原へと刺激し、感作させるプロセスに関する。本発明に従うと、予防免疫化とは、個人の免疫系、すなわち無感作の免疫系のＥＢＶ抗原への１度目の曝露を指す。上記１度目の曝露の結果、曝露された個人の体から上記抗原が排除され、かつ、ＥＢＶ抗原特異的ＣＤ４＋−およびＣＤ８＋−細胞ならびに、抗体を産生する記憶Ｂ細胞が発生する。２度目の曝露後、免疫系は、ＥＢＶ感染を予防し、および／または、上記感染をより効果的に排除することにより、ＥＢＶ関連疾患の発症を予防または緩和することが可能である。具体的には、上記予防免疫化の効果は、ＥＢＶを患う免疫化された個人の感染を予防すること、感染を変更（modifying）または制限すること、上記個人の感染からの回復を援助し、向上させ、強化し、または刺激すること、および、後のＥＢＶ感染を予防または制限する免疫記憶を生成することのうち、少なくとも一つにおいて現れる。上記効果のいずれの存在も、当業者に既知である慣例の方法によって試験、検出できる。好ましくは、患者は、用いられたワクチンの一部であった１以上のＥＢＶ抗原に曝され、上記１以上の抗原に対する抗体力価およびＴ細胞の数が求められる。また、インビトロでヒトＢ細胞の感染を阻害する中和抗体の誘導も求められる。
【００１３】
本発明に従う治療免疫化は、ＥＢＶ抗原に対する免疫応答を同様に誘発する一方で、上記免疫化の前にＥＢＶに曝露されている個人、すなわち、既にＥＢＶに感染している個人に対して行われる。この場合、免疫化は、ＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合されるプロフェッショナルな抗原提示細胞によって提示される形態である同族の抗原と直面する、休止Ｔエフェクター細胞の再活性化につながる。ＥＢＶに対する治療免疫化は、たとえば、移植レシピエントもしくはその他の免疫無防備な患者（ＨＩＶ陽性の個人、癌患者、重症な炎症性疾患もしくは自己免疫疾患の患者）においてウイルスの再活性化が望ましくない場合、または、ＥＢＶ再活性化が、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）および非ホジキンリンパ腫、慢性活動性ＥＢＶ感染（ＣＡＥＢＶ）、口腔毛状白板症のような疾患の発症につながり得るか、つながっている場合、または、ＥＢＶのＢ細胞形質転換能が、たとえば癌などの疾患の発症につながっている場合に、特に関連することが判明するであろう。
【００１４】
本発明に従うワクチンは、以下に詳述されるように、本発明に従って粒子に含有されるＥＢＶ抗原を含有する上に、医薬上許容されるキャリアをさらに含有してもよく、医薬上許容されるキャリアは、ワクチンを受ける個人に有害な免疫応答またはいかなる他の悪反応もそれ自体は惹起しない任意のキャリアを含む。好適なキャリアは、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーなどの徐徐に代謝される大きな巨大分子、および、たとえば油滴またはリポソームなどの脂質凝集物である。更に好適な医薬上許容されるキャリアは、当該技術分野において周知である。さらに、上記キャリアは、以下により詳しく記載される、更なる免疫刺激剤として機能してもよい。さらに、ワクチンは、たとえば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの希釈剤を含有してもよい。さらに、乳化剤および／またはｐＨ緩衝物質など、製剤化目的で必要な物質がワクチンに含有されてもよい。前述の物質のいかなる組合せも、必要に応じて、本発明に従うワクチンの一部であってよい。
【００１５】
効果的な免疫化に必要な量および治療投与計画（treatment regimen）は異り得、個人のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与時間および投与経路、一般的な健康状態、ならびに併用投与されている他の薬などの要因に依存し得る。上記有効な量は、広範囲であることが予想され、任意のある状況について、慣例の実験により容易に求められ、通常の臨床医または医師の技能および判断の範囲内である。投与方式は、免疫化用ワクチンに曝露される個人の免疫化が得られれば、いかなる方式でも可能であり、たとえば、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、胸骨内（intrasternal）投与、皮下投与、関節内注射または注入および吸入、ならびに腸投与などの非経口投与が含まれる。好ましくは、ワクチンは、免疫化の効果を最大限にするために、少なくとも２回投与される。
【００１６】
本明細書で用いられる「粒子」という用語は、ＥＢＶポリペプチドおよび膜脂質からなるとともに、ＥＢＶ  ＤＮＡのない粒子状集合体に関する。「ポリペプチド」という用語は、３０個を超える連続アミノ酸からなる分子を指す。さらに、ポリペプチドの代わりに、「ペプチド」、すなわち、３０個以下のアミノ酸を含有する分子を用いることが、本発明に従って意図される。上記ペプチドが粒子の免疫効果に寄与する範囲で、ペプチドはＥＢＶ抗原性エピトープを含有することが理解される。「ポリペプチド」という用語によって包含されるものには、ポリペプチドのフラグメントもある。「ポリペプチドのフラグメント」という用語は、全長ポリペプチドの（生物学的）活性に関連付けられてもいなくてもよいポリペプチドの部分を指す。好ましくは、活性はフラグメントに起因し得る。ポリペプチドはさらに、１個を超えるポリペプチド分子からなるダイマー、トリマーおよびより高次のオリゴマーをさらに形成してもよい。該ダイマー、トリマーなどを形成するポリペプチド分子は、同一であっても非同一であってもよい。結果的に、対応する高次構造は、ホモまたはヘテロダイマー、ホモまたはヘテロトリマーなどと呼ばれる。ホモまたはヘテロダイマーなどは、「ポリペプチド」という用語の定義に該当する。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、ここで交換可能に用いられ、修飾が、たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などによって行なわれる天然修飾ポリペプチドも指す。このような修飾は当該技術分野で周知である。本発明に従う「ＥＢＶポリペプチド」と呼ばれるポリペプチドは、ＥＢＶのポリペプチドとアミノ酸配列が同一であるポリペプチドである。ここで用いられる「ＥＢＶ」という用語は、任意の野生型、すなわち、天然起源のＥＢＶ株に関し、１つの特定の株に制限されない。具体的には、ＥＢＶ１型株およびＥＢＶ２型株が当該技術分野で周知であり、広範囲で特徴付けされている。これらの２種類のＥＢＶ型は、ＥＢＮＡ−ＬＰ、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３ＢおよびＥＢＮＡ−３Ｃをコードする核内ポリペプチド遺伝子が大きく異なる。ＥＢＮＡファミリーのポリペプチドをコードする遺伝子に関連する差異を超えて、１型および２型のゲノムはほとんど変わらない。１型は、先進国の世界人口において優勢に蔓延しており、２型は、赤道付近アフリカおよびニューギニアでも蔓延している（概要については、KieffおよびRickinson、２００７年）。さらに、ＥＢＶポリペプチドという用語は、配列に関して野生型ＥＢＶ株と同一でないが、野生型ＥＢＶポリペプチドと（各値について）少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％および少なくとも７５％の配列同一性を共有するタンパク質を含有するポリペプチドも含む。ポリペプチド配列の同一性の度合は、当業者に周知の方法によって計算することができ、配列データのアライメントおよび配列相同性の計算を実施するアルゴリズムの自動的実行を含んでもよい。粒子のＥＢＶポリペプチドは種々のＥＢＶ株を起源としてよく、好ましくは１つの株を起源とする。
【００１７】
前述のように、粒子に含有される必要のあるＥＢＶポリペプチドは、ＥＢＶ構造ポリペプチドおよびＥＢＶ溶菌性ポリペプチドの群に属する。当業者には理解されるように、ＥＢＶの特定のポリペプチドは、前述のポリペプチドの群の複数に属してもよい。言い換えると、以下の段落に記述される特定のＥＢＶポリペプチドから明らかであるように、ＥＢＶポリペプチドは、構造ポリペプチドおよび溶菌性ポリペプチドを表わしてもよい。後者の場合、粒子は構造ポリペプチドまたは溶菌性ポリペプチドのいずれかである更なるＥＢＶポリペプチドを含有する必要はない。典型的に、ワクチンの抗原性ポテンシャルを増加させるため、好ましくは、粒子は、前述のＥＢＶポリペプチドの群の各々について少なくとも１つの別々のＥＢＶポリペプチドを含有する。より好ましくは、（各値について）少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または少なくとも１２個の別々のポリペプチドが、独立して、ワクチンの粒子によって含有される上記ポリペプチド群の各々の一部である。
【００１８】
本発明に従うと、ＥＢＶの「構造ポリペプチド」という用語は、ＥＢＶの構造設定（setup）に関与するポリペプチドに関する。上記ポリペプチドは、好ましくは、膜ポリペプチド、外被ポリペプチドおよびキャプシドポリペプチドからなる群から選択される。ＥＢＶ膜ポリペプチドは、ＢＡＬＦ４、ＢＬＬＦ１（ｇｐ３５０とも呼ばれる）、ＢＤＬＦ２、ＢＤＬＦ３、ＢＫＲＦ２、ＢＬＲＦ１、ＢＮＬＦ１（ＬＭＰ−１とも呼ばれる）、ＴＰ（ＬＭＰ−２ａとも呼ばれる）、ＢＸＬＦ２、ＢＺＬＦ２およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるポリペプチドを含有する。ＥＢＶ外被ポリペプチドは、ＢＢＲＦ２、ＢＧＬＦ２、ＢＭＬＦ１、ＢＮＲＦ１、ＢＯＬＦ１、ＢＰＬＦ１、ＢＴＲＦ１、ＢＶＲＦ１およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるポリペプチドを含有する。ＥＢＶキャプシドポリペプチドは、ＢＢＲＦ１、ＢｃＬＦ１、ＢＤＬＦ１、ＢＦＲＦ３およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるポリペプチドを含有する。好ましくは、少なくとも１つの構造ポリペプチドは、ＢＬＬＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＮＲＦ１、または、たとえばＢＬＬＦ１およびＢＭＬＦ１、ＢＬＬＦ１およびＢＮＲＦ１、もしくはＢＭＬＦ１およびＢＮＲＦ１などの、これらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００１９】
「溶菌性ポリペプチド」という用語は、ＥＢＶ溶菌サイクル（ここでは複製相とも呼ぶ）の誘導および維持に関与し、および／または、溶菌サイクルの誘導の結果として発現されるＥＢＶポリペプチドに関する。上記溶菌性ポリペプチドは、好ましくは、最初期遺伝子、初期遺伝子および後期溶菌性遺伝子（KieffおよびRickinson、２００７年）を含む群から選択される。溶菌サイクルは、ともに最初期タンパク質であるＢＺＬＦ１およびＢＲＬＦ１の発現により開始され、続いて、初期および後期タンパク質の発現が行なわれる。誘導に続いて、ウイルス複製が許容となった細胞は、ヘルペスウイルスに特徴的な細胞変性変化を受ける（KieffおよびRickinson、２００７年）。本発明に従って用いられるべき例示的な溶菌性ポリペプチドは、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＡＬＦ５、ＢＧＬ２、ＢＨＲＦ１、ＢＡＬＦ４、ＢＤＬＦ３およびこれらの任意の組合せを含む群から選択される。好ましくは、少なくとも１つの溶菌性ポリペプチドはＢＬＬＦ１（ｇｐ３５０とも呼ぶ）またはその任意の組合せである。
【００２０】
本発明に従って用いられる「膜脂質」という用語は、脂質二重層を形成するように自発的に配列することの可能な脂質に関する。該膜脂質は、疎水性領域および親水性領域を含有する脂質であり、自己組織化の後、膜脂質の疎水性領域は二重層の内側部を形成し、親水性領域は膜の外側面を形成する。好ましくは、膜脂質は、両親媒性リン脂質などの細胞膜を自然に形成する脂質である。また、上記膜脂質は、野生型ＥＢＶが複製可能な宿主細胞を起源とすることが好ましい。より好ましくは、上記膜脂質は、本発明に従う細胞を起源とする。本発明に従うと、粒子中に含有される膜は、粒子の外殻を構成する膜を形成するのに十分な量で存在する。粒子は、上記膜外殻を有しなければならず、膜外殻は、少なくとも１つのＥＢＶ構造ポリペプチドを含有することが好ましい。以下に概説するように、膜結合ＥＢＶ構造ポリペプチドの好ましい例は、ｇｐ３５０ポリペプチドおよびＬＭＰ−１ポリペプチドである。以下にさらに詳述するように、ＬＭＰ−１のＢ細胞形質転換能は無能化されてもよい。さらに、粒子の膜は、たとえば、膜の内側、外側、または膜に貫通して存在し得る更なる膜ポリペプチドなど、ＥＢＶ膜中に自然に存在する更なる膜構成成分を含有する。
【００２１】
粒子が「ＥＢＶ  ＤＮＡが無い」とは、粒子がＥＢＶ  ＤＮＡを含有しない、すなわち、ＥＢＶ  ＤＮＡが一切検出できないことを意味する。具体的には、本発明に従って、「ＤＮＡ」という用語は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡなどのいかなるＤＮＡも含む。この文脈で用いられる「ＤＮＡ」という用語によりさらに含まれるのは、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方である、ＤＮＡの合成または半合成誘導体および混合ポリマーなど、当該技術分野で既知のＤＮＡ模倣分子である。本発明に従うこのようなＤＮＡ模倣分子またはＤＮＡ誘導体は、ホスホロチエート核酸、ホスホロアミデート核酸、２′−Ｏ−メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）を含む（BraaschおよびCorey、２００１年）。ＬＮＡは、リボース環が２′−酸素と４′−炭素との間のメチレン結合によって拘束されているＲＮＡ誘導体である。当業者には容易に認識されるように、それらは追加的な非天然または誘導化ヌクレオチド塩基を含有してもよい。したがって、粒子は、ＥＢＶ  ＤＮＡ配列と同一のＤＮＡ配列を含有してはならず、上記配列は、ＥＢＶ遺伝子配列に関することが好ましい。さらに、粒子は、野生型ＥＢＶ核酸配列と（各値について）少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％および少なくとも７５％の配列同一性を共有する核酸配列を含有してはならない。核酸配列の配列同一性の度合は、当業者によって周知の方法により計算することができ、配列データのアライメントおよび配列相同性の計算を実施するアルゴリズムの自動実行を含んでもよい。さらに、粒子は、発現の際にＥＢＶポリペプチドと機能的に類似するポリペプチドを生成するＤＮＡ配列を含有しなくてもよく、機能的類似点は、Ｂ細胞形質転換能に関することが好ましい。ポリペプチドの機能的に似通った点を試験するための方法は、当業者に周知であるイン・シリコ（in silico）ならびにイン・ビトロ、エクス・ビボおよびイン・ビボの試験を含む。たとえば、機能的類似点を求めるために、ＥＢＶの欠損変異体を生成し、相補性分析を行なうことができる。具体的には、ＥＢＶの欠損変異体は、たとえば、Ｂ細胞形質転換に不可欠なポリペプチドをコードする遺伝子の配列が欠損されたことを特徴とする。結果的に、上記欠損変異体はＢ細胞を形質転換することが不可能である。ＤＮＡ配列の欠損ＥＢＶ配列との機能的類似点を試験するには、たとえば、試験すべき上記ＤＮＡを上記欠損変異体のゲノムＤＮＡ内に取込むことにより、試験すべき上記ＤＮＡを欠損変異体に供給する。次に、斯くして修飾された欠損変異体がＢ細胞を形質転換することが可能であるか、すなわち、欠損を補完して、野生型ＥＢＶと機能的に類似するＥＢＶを生じるかどうかが判断される。上記相補性分析のバリエーションは当該技術分野において既知であり、該分野における当業者の技術的知識に基づいて、当業者の特定のニーズに応じてさらに適合することができる。
【００２２】
更なる実施形態では、ワクチンまたはワクチンに含有される粒子には、いかなる種類のＤＮＡも一切含有されないことが意図される。
【００２３】
しかしながら、粒子はＥＢＶ  ＲＮＡを含有してもよい。ここで用いられる「ＲＮＡ」という用語は、ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ（非コードＲＮＡ）、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡを含むすべての形態のＲＮＡを含むことが理解される。「非コードＲＮＡ」という用語は、天然起源のｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｒａｓｉＲＮＡ（反復関連ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、およびｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）を含む。ウイルスｍＲＮＡは、種々の実施形態でここに記載されるように、粒子に含有されると、感染細胞で翻訳されることができ、翻訳されたポリペプチドに由来するペプチドは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を予備刺激または再活性化するように、ＭＨＣクラスＩ抗原に結合して提示されることができた。対応するＥＢＶウイルスｍＲＮＡは、転写がＥＢＶ「構造ポリペプチド」および「溶菌性ポリペプチド」に属すると上述されたｍＲＮＡ分子である。たとえば、粒子は、ＢＡＬＦ４、ＢＬＬＦ１（ｇｐ３５０とも呼ばれる）、ＢＤＬＦ２、ＢＤＬＦ３、ＢＫＲＦ２、ＢＬＲＦ１、ＢＮＬＦ１（ＬＭＰ−１とも呼ばれる）、ＴＰ（ＬＭＰ−２ａとも呼ばれる）、ＢＸＬＦ２、ＢＺＬＦ２、ＢＢＲＦ２、ＢＧＬＦ２、ＢＭＬＦ１、ＢＮＲＦ１、ＢＯＬＦ１、ＢＰＬＦ１、ＢＴＲＦ１、ＢＶＲＦ１、ＢＢＲＦ１、ＢｃＬＦ１、ＢＤＬＦ１、ＢＦＲＦ３（「「構造ポリペプチド」として）、および／もしくはＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＲＦ１、ＢＭＬＦ１、ＢＡＬＦ２、ＢＡＬＦ５、ＢＧＬ２、ＢＨＲＦ１、ＢＡＬＦ４、ＢＤＬＦ３（「溶菌性ポリペプチド」として）をコードするウイルスＥＢＶｍＲＮＡ、ならびに／または、Ｂ細胞形質転換能は無能化されているが、それらの免疫原性は維持される、対応するポリペプチドを含有してもよい。好ましくは、本発明に従う粒子に含有されるＥＢＶウイルスｍＲＮＡ分子は、好ましい「構造ポリペプチドおよび／または「溶菌性ポリペプチド」および／または、形質転換能が無能化されているが、それらの免疫原性は維持される、対応するポリペプチド、または、粒子に含有されるか、もしくは構成するとして上記に記載されるこれらの好ましい組合せをコードする。言い換えると、粒子に含有されるｍＲＮＡ分子の転写は、本発明に従う粒子のＥＢＶポリペプチド組成を反映する。粒子は、代替的または追加的に、その転写が粒子に含有されないＥＢＶ  ｍＲＮＡを含有してもよいことが同様に意図される。たとえば、ＢＺＬＦ１および／またはＢＲＦＬ１をコードするｍＲＮＡは、本発明に従う粒子に含有され得るが、ＢＺＬＦ１および／またはＢＲＦＬ１ポリペプチドは、上記粒子に含有されない。さらに、粒子は、本発明に従う粒子に含有されるすべてのポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子、すなわち、上記粒子のＥＢＶポリペプチド組成を反映するｍＲＮＡ分子を含有しないことも意図される。好ましくは、ＥＢＶ  ｍＲＮＡをコードする少なくともＢＲＬＦ１および／またはＢＺＬＦ１は、本発明に従う粒子に含有される。上記粒子内へのｍＲＮＡの取込は、たとえば、修飾ＥＢＶゲノムを発現する細胞に存在するＥＢＶ  ｍＲＮＡ分子が粒子内に取込まれる、以下に記載される方法によって達成され得る。本発明に��う粒子内にＥＢＶ  ｍＲＮＡを取込むための更なる方法は、たとえば、電気穿孔法、リポフェクションまたは、脂質膜を通して核酸の移入を行うための当該技術分野で既知の他の方法を含む。本発明の粒子に存在するいかなるｍＲＮＡ分子も、感染細胞の増殖性状態への形質転換を誘導することは不可能であることが、本発明に従って理解される。粒子に含有される上記ＥＢＶ  ｍＲＮＡからの潜在的な形質転換ＥＢＶポリペプチドの発現は、ｍＲＮＡ分子の不安定性および、その結果としてのＥＢＶポリペプチドの低発現率のため、感染細胞の形質転換を誘導するには十分でないことが当業者には理解される。しかしながら、当業者は、単独でまたは更なるＥＢＶポリペプチドと組合されて形質転換活性を有するＥＢＶポリペプチドの発現を排除するために、どのｍＲＮＡを用いることができるか、および／または、対応するＥＢＶ  ｍＲＮＡに対してどのような修飾を行なうべきかを、このことが医薬の活性剤としての認可のプロセスにおいて規制目的で必要である場合には、判断する立場にある。
【００２４】
別の実施形態では、ワクチンまたはワクチンに含有される粒子には、いかなる種類のＲＮＡも一切含有されないことが意図される。
【００２５】
さらに、ワクチンまたはワクチンに含有される粒子には、いかなる種類の核酸も一切含有されないことが意図される。
【００２６】
このように、少なくともＥＢＶ  ＤＮＡが粒子に存在しないのは、野生型ＥＢＶの、Ｂ細胞を不確定な成長が可能な細胞へと形質転換する能力のためである。これは、野生型ＥＢＶゲノム中の潜在的な発癌遺伝子、すなわち、癌の発症に関与する遺伝子の存在のためである。したがって、被免疫化個人への投与の際の本発明のワクチンの安全性に関して、ワクチンから、より具体的には粒子から、ＥＢＶ  ＤＮＡが排除されると、ワクチン接種の直接的な結果として、上記被免疫化個人がＢ細胞形質転換に晒されるリスク、または、癌を発症するリスクが最小限となる。このことは特に、過去にＥＢＶに曝露されておらず、かつ感染していない個人の場合に特に重要である。上記の導入部も参照。
【００２７】
免疫原性に寄与しつつ投与の際のワクチンの安全性を強化させる更なる特徴として、粒子は、Ｂ細胞形質転換能は無能化されているが、それらの免疫原性は維持される、Ｂ細胞形質転換に必要な１以上のＥＢＶポリペプチドを含有してもよい。イン・ビトロでは、ＥＢＶによるＢ細胞形質転換は、感染Ｂ細胞のより長い寿命での増殖につながる。「Ｂ細胞形質転換に必要な」という用語は、本発明に従うと、野生型ＥＢＶによる感染の際、上記１以上のＥＢＶポリペプチドがＢ細胞を形質転換する際に不可欠であることを意味する。言い換えると、上記１以上の不可欠なＥＢＶポリペプチドの非存在下では、Ｂ細胞は感染の際に形質転換されない。したがって、粒子は、Ｂ細胞との融合の際、Ｂ細胞を形質転換することが不可能である。Ｂ細胞形質転換の可能性を排除するためには、１つの不可欠なＥＢＶポリペプチドのＢ細胞形質転換能を無能化すれば足りるであろうが、代替的に、ＥＢＶポリペプチドの不可欠な組合せのＢ細胞形質転換能を無能化して、１つの不可欠なポリペプチドのみを無能化したときに得られるのと同じ結果を達成する、すなわち、Ｂ細胞形質転換の可能性の排除を達成することもできる。好ましくは、複数の上述の不可欠なＥＢＶポリペプチドまたはＥＢＶポリペプチドの不可欠な組合せのＢ細胞形質転換能が無能化される。Ｂ細胞形質転換に不可欠な対応するＥＢＶポリペプチドは、ＥＢＮＡ２、ＬＭＰ１、ＥＢＮＡ−ＬＰである。これらのＥＢＶポリペプチドの１つのＢ細胞形質転換能を無能化すれば、Ｂ細胞形質転換の可能性を排除するのに十分である。Ｂ細胞形質転換に必要なＥＢＶポリペプチドの不可欠な組合せは、ＥＢＮＡ３ＡおよびＥＢＮＡ３Ｃ、ＬＭＰ−２ＡおよびＥＢＮＡ３Ａ、または、ＬＭＰ−２ＡおよびＥＢＮＡ３Ｃである。当業者には容易に理解されるように、対応する不可欠な組合せの１つのメンバーのみが粒子に存在する場合、それ単独であってもＢ細胞を形質転換することが可能であるため、Ｂ細胞形質転換能は無能化されなくてはならない。このことは、組合せが完全でない限り、すなわち、Ｂ細胞形質転換の可能性を排除するのに必要なすべてのメンバーが粒子に存在していない限り、組合せのより多くのメンバーが存在する場合にも同様に当てはまる。言い換えると、不可欠な組合せのすべてのメンバーが無能化されているときのみ、Ｂ細胞形質転換の可能性が排除される。
【００２８】
ワクチンの安全性を確保するために、Ｂ細胞形質転換が無能化されているＢ細胞形質転換に必要な上記１以上のＥＢＶポリペプチドを含有する粒子は、同時に、対応する機能性ＥＢＶポリペプチド相当物を含有しないことが理解される。
【００２９】
上記は、以下の実施形態に準用して適用される。
Ｂ細胞を形質転換する能力の無能化は、Ｂ細胞形質転換のプロセスに機能的に関与するポリペプチドのドメインを修飾するなどの方法によって達成することができる。上記修飾は、たとえば、上記機能ドメインもしくはその一部の欠損、上記機能ドメインもしくはポリペプチド全体の立体阻害、または、機能が不全化される旨での上記機能ドメインの１以上のアミノ酸の置換などの方法によって達成することができる。ポリペプチドのＢ細胞形質転換能を無能化するとき、その免疫原性は維持されるべきである。当業者は、イン・シリコならびにイン・ビボ、イン・ビトロまたはエクス・ビボの慣例の実験方法を使用することによって、タンパク質の免疫原性領域および上記領域内の特異的な免疫原性エピトープを難なく判断する立場である。上記免疫原性領域の判断後、当業者は、ポリペプチドのＢ細胞形質転換能を無能化しつつ、その免疫原性を維持するために好適な戦略を選ぶ立場である。このようにして、機能的に無能化されているが、免疫原性のＥＢＶポリペプチドを得ることができる。たとえば、ＬＭＰ−１（ＢＮＬＦ１とも呼ばれる）などのＢ細胞形質転換能を有する膜貫通ポリペプチドの場合、上記ポリペプチドの膜貫通部分のみを欠損させるが、ウイルス粒子の外側の上記ポリペプチドの膜外部分を保存することによって、上記ポリペプチドをトランケートすることができる。
【００３０】
代替的に、または追加的には、粒子は、Ｂ細胞形質転換に必要な１以上のＥＢＶポリペプチドが無くてもよい。Ｂ細胞形質転換に必要な上述のＥＢＶポリペプチドまたはＢ細胞形質転換に必要なＥＢＶポリペプチドの組合せのいずれかは、粒子から欠如していてもよい。しかし、本発明に従うと、少なくとも１つのＥＢＶ構造ポリペプチドおよび少なくとも１つのＥＢＶ溶菌性ポリペプチドなどの他のＥＢＶ粒子の存在のため、粒子はそれでも免疫原性である。１以上の形質転換ポリペプチドが欠如しており、かつ少なくとも１つのＥＢＶポリペプチドが無能化されている場合、欠如している１以上のＥＢＶポリペプチドは同時に無能化することができないと理解される。言い換えると、上記１以上のＥＢＶポリペプチドが無能化されていると、同時に欠如することはできない。ＥＢＶポリペプチドの組合せがＢ細胞形質転換の際に不可欠であれば、組合せの第１のメンバーを無能化し、第２のメンバーが欠如していてもよい。
【００３１】
本実施形態に設けられた定義および説明は、特に明記しない限り、以下のすべての実施形態に準用して適用される。
【００３２】
一般的に、さらに本発明に従うと、ワクチンの抗原性ポテンシャルを最大限にするためには、ワクチンは出来る限り多くの異なるＥＢＶポリペプチドを含有することが望ましい。したがって、代替的な実施例では、本発明は、修飾ＥＢＶを含有する粒子を含有し、上記修飾ＥＢＶは、野生型ＥＢＶと比較して、ＥＢＶ  ＤＮＡが無く、（ａ）上記粒子に含有される、Ｂ細胞形質転換に必要な１以上のＥＢＶポリペプチドのＢ細胞形質転換能は無能化されているが、それらの免疫原性は維持され、および／または（ｂ）上記粒子は、Ｂ細胞形質転換に必要な１以上のＥＢＶポリペプチドが無い、ワクチンに関する。
【００３３】
上記代替的な実施形態の好ましい実施形態では、上記修飾ＥＢＶは、上に特定された特徴についてのみ野生型ＥＢＶと異なる。
【００３４】
この代替的な実施形態は、野生型ＥＢＶの全抗原能を実現するが、被免疫化個人におけるＢ細胞形質転換、または、たとえば伝染性単核症（ＩＭ）、腫瘍などの他のＥＢＶ関連疾患を誘導するワクチンのポテンシャルを排除する。結果として、免疫化された個人の免疫系は、野生型ＥＢＶによく類似するワクチン中の広範囲のＥＢＶ抗原に応答して予備刺激されているため、医学的観点から、ＥＢＶ感染と闘う際に非常に有効とみなされる免疫系の調節が得られている。
【００３５】
上記代替的な実施形態のより好ましい実施形態では、上記修飾ＥＢＶは、ＥＢＶポリペプチドＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３ａ、ＥＢＮＡ−３ｂ、ＥＢＮＡ−３ｃが欠如しているという点において、さらに野生型ＥＢＶと異なる。さらにより好ましくは、ＬＭＰ−１は無能化されており、および／または、ＢＺＬＦ１は修飾ＥＢＶの一部である。
【００３６】
本発明のワクチンに含有される粒子は、標準的クローニングおよび細胞培養技術に関与し、たとえば、サムブルック（Sambrook）著、分子クローニング実験室マニュアル（Molecular Cloning A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー研究所（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８９年）、Ｎ．Ｙ．；「実践的細胞培養技術（“Practical Cell Culture Techniques”）」、ボルトン（Boulton）、ベーカー（Baker）ら（編）、ヒューマナ・プレス（Humana Press）（１９９２年）、ＩＳＢＮ０８９６０３２１４０；「ヒト細胞培養プロトコル（“Human Cell Culture Protocols”）」、ガレス・Ｅ・ジョーンズ（Gareth E. Jones）著、ヒューマナ・プレス（１９９６年）、ＩＳＢＮ０８９６０３３３５Ｘに記載される、当該技術分野で周知の方法によって調製できる。たとえば、ＥＢＶポリペプチドは、粒子の凝集および放出を可能にする宿主細胞内のＤＮＡ配列からの発現によって、組換えにより生成することができる。上記粒子は、合成ベースで一部または全体的に産生することもできる。好ましくは、粒子は以下に詳述される方法のいずれかによって調製される。
【００３７】
上に概説したように、ＥＢＶは、種々の重症な病状に原因として関わっており、さまざまなウイルス株との闘いに関する精力的な研究および成功にも関わらず、ＥＢＶワクチンの発生はこれまで成功していない。とはいえ、近年、たとえばヒト乳頭腫ウイルスおよびＢ型肝炎に対するウイルスワクチンの認可も見られている。本発明者らは、ＥＢＶ無感作の個人にＥＢＶ特異的免疫応答を予備刺激し、かつ、ＥＢＶ陽性個人にＥＢＶ特異的免疫応答を再活性化するのに有効であるワクチンを生成することが初めて可能となったため、長年感じられてきたＥＢＶワクチンに対する必要性に応えている。
【００３８】
最も驚くべきことは、本発明のワクチンは、動物モデルにおいて、強力な体液性免疫応答に加えてＥＢＶ特異的ＣＤ８＋免疫応答、すなわち、細胞性免疫応答を惹起することが可能であり、さらに、ＥＢＮＡ３ポリペプチドがそのＢ細胞転換能のため欠損されたにも関わらず、ＥＢＶ血清陽性のヒトドナーからＥＢＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を再活性化することが可能なことであった。ＥＢＶ感染の際に生成されるＣＤ８＋細胞は、優勢的にＥＢＮＡ３ポリペプチドに対して向けられることが周知であり、上記ＥＢＮＡ３ポリペプチドの無いワクチンは、有力なＥＢＶ特異的ＣＤ８＋細胞応答を生じないと予想されたであろうため、このことは驚くべきことである。さらに、本発明のＥＢＶワクチンの標的であるヒトＢ細胞は、ウイルス粒子由来のＭＨＣクラスＩ制限エピトープを交差提示するポテンシャルを有しないと推測されている（Keller et al.、２００９年）。
【００３９】
発明者らは、本発明のワクチンの一部である粒子内にパッケージングできないように修飾されたＥＢＶヘルパーゲノムを持つ細胞株を用いた。ワクチンの安全性をさらに保証するために、ワクチンは、宿主細胞株中の好ましくは上記のように修飾されたＥＢＶ（ヘルパー）ゲノムの結果として、Ｂ細胞を形質転換できるＥＢＶポリペプチドが無いことが好ましい。したがって、ＥＢＶヘルパゲノムが粒子内に非正統的にパッケージングされてしまう稀な場合においても、Ｂ細胞の形質転換およびウイルスの再活性化を完全に排除することができる。
【００４０】
要約すると、発明者らは、ウイルスＤＮＡが無く、かつ、無感作宿主において多価の強い体液性および細胞性免疫中和反応を確実に誘導する粒子を提供する。したがって、粒子は、いかなる血清状態を有する個人、特に、たとえば移植を控えたＥＢＶ無感作患者に対しても有効かつ安全であり、免疫無防備な患者におけるＥＢＶ関連疾患のリスクを低減するワクチンを構成する。
【００４１】
本発明のワクチンの好ましい実施形態では、上記粒子は、ＢＺＬＦ１およびｇｐ３５０から選択される少なくとも１つのＥＢＶポリペプチドを含有し、および／または、少なくとも１つのＥＢＶ潜在性ポリペプチドをさらに含有する。
【００４２】
ＥＢＶポリペプチドｇｐ３５０（糖タンパク質３５０）は、膜結合型糖タンパク質である。上記ｇｐ３５０は、Ｂ細胞の細胞表面上のＣＤ２１に結合することにより、Ｂ細胞に対する特異性（指向性）の原因となる。追加的な補助的ウイルスポリペプチドは、完全に効率的な感染に寄与してもよい（Chesnokova et al.、２００９年；Omerovic et al.、２００５年、Silva et al.、２００４年、SoremおよびLongnecker、２００９年）。さらに、低効率での感染もｇｐ３５０の無い組換えＥＢＶ粒子により証明されている（Janz et al.、２０００年）。近年の研究によっては、内部移行（internalization）ステップ後であり、かつ、おそらくエンドソーム区画からのウイルスキャプシドの放出の間に、ｇｐ３５０が関わっていることも仮定されている（Busse et al.、２０１０年）。本発明に従うワクチンには決定的ではないが、ｇｐ３５０が粒子の膜に含有されることが好ましい。なぜなら、ワクチンの投与の際に生成される免疫応答が、野生型ＥＢＶによる感染の際に惹起される免疫応答によりよく類似するためである。
【００４３】
ＥＢＶ最初期ポリペプチドＢＺＬＦ１は、潜伏ＥＢＶ感染の破壊を媒介し、一般的に、ＥＢＶの溶菌相の誘導において鍵となる制御因子であるとみなされる。野生型ＥＢＶでは、ＢＺＬＦ１は定常的に発現されない。宿主の体に入る際にはＢＺＬＦ１は発現されず、Ｂ細胞感染の後にのみＢＺＬＦ１は発現されて、溶菌サイクルの誘導が生じる。溶菌サイクルは、宿主の免疫応答がＥＢＶに適合するまで維持され、ＥＢＶが感染の潜伏相に入るときの感染を含むことができる。上記相ではＢＺＬＦ１は発現されない。ＥＢＶによる持続的な感染は、溶菌相および潜伏相が交互にあることを特徴とし、溶菌相の誘導は、これらの時に免疫細胞に提示されるＢＺＬＦ１の発現による。したがって、ＢＺＬＦ１を含有するワクチンは、免疫化された個人の免疫系を、溶菌相の誘導の結果として新しいウイルス粒子が実際に放出される前に動態化されるように予備刺激する。
【００４４】
「潜在性ポリペプチド」という用語は、ＥＢＶ潜伏サイクルの誘導および維持に関与し、および／または、潜伏サイクルの誘導の結果として発現されるＥＢＶポリペプチドに関する。好ましくは、少なくとも１つの潜在性ポリペプチドは、ＬＭＰ−１（ＢＮＬＦ１とも呼ばれる）および／またはＬＭＰ−２である。
【００４５】
本発明はさらに、粒子を生成するための方法であって、（ａ）細胞に修飾ＥＢＶゲノムをトランスフェクトするステップを含み、上記修飾ＥＢＶゲノムは、野生型ＥＢＶゲノムと比較して、少なくとも、（aa）上記野生型ＥＢＶゲノムのパッケージングに必要な１以上の配列が欠如し、上記パッケージングに必要なＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列が欠如し、および／または、パッケージング能が無能化されているＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列を含有し、（ab）Ｂ細胞形質転換に必要なＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列が欠如し、および／または、Ｂ細胞形質転換能が無能化されているＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列を含有し、さらに、（ac）ＥＢＶの複製を誘導するのに必要なＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列が欠如し、および／または、ＥＢＶ複製の誘導能が無能化されているＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列を含有し、方法はさらに、（ｂ）ステップ（ａ）で得られた細胞を、上記修飾ＥＢＶゲノムの発現を可能にする条件下で培養するステップと、（ｃ）ＥＢＶの複製相を誘導するステップと、（ｄ）粒子を単離するステップとを含む、方法にも関する。
【００４６】
「トランスフェクション」という用語は、当該技術分野で受入れられている意味に従って、すなわち、核酸を細胞内に導入するプロセスに従って、本発明に関連して用いられる。トランスフェクションは、たとえば、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションまたはリポソーム媒介トランスフェクションのような化学系の方法などの種々の方法によって達成され得る。さらに、電気穿孔法または超音波穿孔法、または、遺伝子銃媒介トランスフェクションもしくはマグネトフェクションなどの粒子系方法、およびウイルス媒介方法のような非化学方法も当該技術分野で既知である。
【００４７】
「修飾ＥＢＶゲノム」は、野生型ＥＢＶゲノムと比較して修飾される。上記の章に概説したように、その遺伝子構成が当該技術分野で周知であるいくつかの野生型ＥＢＶ株が存在する（RickinsonおよびKieff、２００７年）。上記から明らかであるように、修飾ＥＢＶゲノムは、すべてのＥＢＶ株に共通の配列に関してのみ修飾される。「パッケージング」という用語は、ウイルス組織について当該技術分野で周知であり、ウイルス粒子組織化の間に直鎖ＥＢＶウイルスＤＮＡをウイルス粒子内に導入するプロセスに関する。ＥＢＶゲノムＤＮＡのパッケージングは、上記ゲノムＤＮＡの両端で直接反復される配列（ＴＲ）で開始する。具体的には、上記修飾ＥＢＶゲノムは、野生型ＥＢＶゲノムのパッケージングに必要な１以上の配列が欠如する。「パッケージングに必要な」という用語は、本発明に従うと、上記１以上の配列が野生型ＥＢＶ粒子内にＥＢＶ  ＤＮＡをパッケージングする際に不可欠であることを意味する。言い換えると、上記１以上の配列の非存在下では、ＥＢＶ  ＤＮＡは、野生型ＥＢＶ粒子および、本発明のワクチンに含有されてもよい本発明の方法によって生成された粒子内にパッケージングされない。したがって、パッキングに必要な上記１以上の配列が欠如しているとき、修飾ＥＢＶゲノムはここに記載されるような粒子内にパッケージングされない。たとえば、ＥＢＶの末端反復の配列が欠損され得る。上記末端反復は「ターミナーゼ」と呼ばれる酵素によって認識される。代替的に、または追加的に、上記パッケージングに必要なＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列を欠損させることもできる。このようなＥＢＶポリペプチドは、たとえば、ターミナーゼ酵素である。さらに、上記パッケージングに必要な上記ＥＢＶポリペプチドは、そのパッケージング能を失うように無能化されてもよい。上記無能化は、パッケージングのプロセスに機能的に関与するポリペプチドのドメインを修飾するなどの方法によって達成され得る。上記修飾は、たとえば、上記機能ドメインもしくはその一部の欠損、上記機能ドメインもしくはポリペプチド全体の立体阻害、または、上記機能ドメインの１以上のアミノ酸の置換などの方法によって達成することができる。
【００４８】
パッケージングの可能性を排除するためには、パッケージングに必要な１つの配列もしくは上記パッケージングに必要なＥＢＶポリペプチドをコードする１つの配列を欠損させる、および／または、１つの不可欠なＥＢＶポリペプチドのパッケージング能を無能化すれば足りるであろうが、代替的に、ＥＢＶポリペプチドの組合せのパッケージング能を無能化することによっても、ＥＢＶ  ＤＮＡパッケージングの可能性を排除することができる。
【００４９】
さらに、修飾ＥＢＶゲノムは、Ｂ細胞形質転換に必要なＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列が欠如し、および／または、Ｂ細胞形質転換能が無能化されているＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列を含有する。具体的なＥＢＶポリペプチドおよびその組合せは、上に記載されている。当業者は、上記１以上のポリペプチドをコードするゲノム配列を直接かつ明確に同定する立場である。さらに、当業者は、ＥＢＶゲノムから上記１以上の配列を欠損させるステップを実施し、および／または、上記１以上の配列を修飾して、発現の際の形質転換能が無能化されている１以上のＥＢＶポリペプチドを得る立場である。
【００５０】
さらに、修飾ＥＢＶゲノムは、ＥＢＶの複製を誘導するのに必要なＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列が欠如し、および／または、そのＥＢＶ複製誘導能が無能化されているＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の配列を含有する。ＥＢＶの複製に関与するＥＢＶポリペプチドは、大部分が、ウイルスゲノムの複製およびＥＢＶゲノムの発現に関与し、最終的に感染宿主細胞からウイルス粒子が放出される、溶菌性ポリペプチドと呼ばれるポリペプチドである。「必要な」という用語は、他のポリペプチドについてここで上に説明したのと同じ意味、すなわち、１以上のポリペプチドが特定の局面に関して絶対に必要であるという意味を有する。発明のこの局面では、ＥＢＶポリペプチドをコードする上記１以上の配列の存在は、ＥＢＶの複製の誘導には絶対に必要である。対応するポリペプチドは、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１およびこれらの組合せからなる群から選択され得る。この点においても、当業者は、上記１以上のポリペプチドをコードするゲノム配列を直接かつ明確に同定し、さらに、ＥＢＶゲノムからの上記１以上の配列を欠損させるステップを実施し、および／または、上記１以上の配列を修飾して、発現の際のＥＢＶ複製誘導能が無能化されている１以上のＥＢＶポリペプチドを得る立場である。
【００５１】
「培養」という用語は、当該技術分野で認められるその意味に従って用いられる。一般的に、たとえば、培地構成成分、マーカ選択および選定、細胞定量化および単離などの細胞培養方法が、当該技術分野で周知の方法であり、たとえば、「実践的細胞培養技術（“Practical Cell Culture Techniques”）」、ボルトン（Boulton）、ベーカー（Baker）ら（編）、ヒューマナ・プレス（Humana Press）（１９９２年）、ＩＳＢＮ０８９６０３２１４０；「ヒト細胞培養プロトコル（“Human Cell Culture Protocols”）」、ガレス・Ｅ・ジョーンズ（Gareth E. Jones）著、ヒューマナ・プレス（１９９６年）、ＩＳＢＮ０８９６０３３３５Ｘ、および実施例の欄に例示的に記載されている。培養条件は、細胞型ごとに異なる上に、特定の細胞型について異なる表現型が発現され得る。一般的に、細胞は、典型的には摂氏３７℃、５％ＣＯ2の適切な温度および気体混合物で、（ａ）細胞内および細胞外浸透圧バランスを維持しつつ洗浄、輸送および希釈する液体としての成長培地、（ｂ）正常な細胞代謝に不可欠な水および一定量の無機イオンを細胞に与える成長培地、（ｃ）ブドウ糖などの炭水化物と組合されて、細胞代謝の基本的なエネルギ源を与える成長培地、および（ｄ）培地を生理的ｐＨ範囲内に維持する、すなわち、細胞が生存可能に保たれるように、緩衝系を与える成長培地、の成長培地中で成長、維持される。成長培地の配合は細胞型に依存して大きく異なり、たとえば、限定されないが、成長因子、栄養成分、ブドウ糖、ｐＨを維持する緩衝液、ならびに殺菌剤および抗生物質などを含有する。細胞を培養し、培養細胞を維持するための方法は、当該技術分野で周知であり、成長培地および他の細胞培養に関連する材料、ならびに、細胞の培養を成功させるための説明書および方法は、たとえば、シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich）またはインビトロジェン（Invitrogen）で得ることができる。修飾ＥＢＶゲノムの発現を可能にする条件は、ここで上記の一般的な条件に本質的には対応する。宿主細胞中のＥＢＶゲノムからのポリペプチド発現を向上させる修飾は、当業者には既知である。
【００５２】
本発明の方法で用いられるべき細胞は、好ましくは、ヒト由来の細胞である。微生物および細胞培養の独国コレクション（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク（Braunschweig））または米国組織培養コレクション（American tissue culture collection）（ＡＴＣＣ）などから入手可能である、ＨＥＫ２９３細胞株の使用が好ましい。
【００５３】
ＥＢＶの「複製相を誘導」という用語は、本発明に従うと、最終的に、ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）が細胞内で組織化され、かつ、上記ＶＬＰがここに定義される粒子として放出されるプロセスの開始を意味する。誘導は、たとえば、複製を誘導するのに必要なＥＢＶポリペプチドをコードする上記１以上の配列の欠損のため、および／または、ＥＢＶポリペプチドをコードする上記１以上の配列の修飾のため、宿主細胞に存在しない上記１以上のＥＢＶポリペプチドで細胞を補完する結果、ＥＢＶ複製を誘導することが不可能になることにより達成され得る。上記補完は、たとえば、欠損しているＥＢＶポリペプチドが発現され得る、（安定的にまたは一過的にトランスフェクトされた）プラスミド上などで、上記欠損された１以上の配列を細胞に付与するか、または、複製相を誘導することが可能な機能性ＥＢＶポリペプチドをコードする１以上の修飾されていない配列を細胞に付与することによって、達成され得る。上記１以上のＤＮＡ配列の付与は、ここで上記し、実施例の章に記載するような方法によって行うことができる。代替的に、上記補完は、ＥＢＶの複製を誘導するのに必要な上記１以上のＥＢＶポリペプチドを細胞に付与することによって達成され得る。細胞への上記１以上のポリペプチドの付与は、当該技術分野で周知であり、たとえば、ProteoJuice（登録商標）（メルク（Merck））、TurboFect（登録商標）（フェルメンタス（Fermentas））またはLipodin-Pro（登録商標）（アビオテック（Abbiotec））などの試薬を用いてもよい、タンパク質送達方法によって達成され得る。
【００５４】
斯くして生成された粒子は、宿主細胞からの放出の際、細胞培養上澄みから回収することも、その一部として回収することもできる。たとえば、上記生成された粒子を含有する上澄みをＢ細胞の感染に直接用いたり、上記粒子を超遠心分離法もしくは限外ろ過法によってさらに濃縮することもできる。
【００５５】
本発明の方法に従って生成される粒子は、本発明のワクチンに好適に用いられる。好ましくは、本発明のワクチンに含有される粒子は、野生型ＥＢＶゲノムと比較してＥＢＶゲノムをさらに修飾してもよい、本発明の方法に従って生成される。上記修飾は、当業者であれば、バイオテクノロジーの分野の一般的な常識に基づき、さらに、ここに記載および／または引用される方法に基づいて、難なく行うことができる。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明のワクチンの（ａ）または本発明の方法の（ab）において、形質転換能が無能化されているポリペプチドは、ＬＭＰ−１ポリペプチドである。
【００５７】
ＬＭＰ−１  ＥＢＶポリペプチドは、Ｂ細胞形質転換に必要な膜貫通ポリペプチドである。ＬＭＰ−１は、恒常的活性型ＣＤ４０受容体を模倣する（Gires et al.、１９９７年）。Ｂ細胞形質転換能は、たとえば、上記ポリペプチドの膜貫通部分またはその一部のみを欠損させて、ウイルス粒子の外側の上記ポリペプチドの膜外部分を保存することによる上記ポリペプチドのトランケーションによって無能化することができる。対応する方法は、実施例の章に開示されている。簡潔には、ＬＭＰ−１を、その疎水性領域のみ、すなわち、膜貫通ドメインを含有する（配列番号：４の）アミノ酸２６〜２１０のみを欠損させることによって失活したとともに、その免疫原性を維持する試みで、膜外部分を保存した。したがって、好ましい実施形態では、トランケートされたＬＭＰ−１は、配列番号：１のＤＮＡ配列によってコードされ、配列番号：２のポリペプチド配列からなる。
【００５８】
本発明のワクチンまたは方法の別の好ましい実施形態では、本発明のワクチンの（ｂ）または本発明の方法の（ab）に記載の、欠如している、Ｂ細胞形質転換に必要な１以上のＥＢＶポリペプチドは、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３ａ、ＥＢＮＡ−３ｂおよびＥＢＮＡ−３ｃからなる群から選択される。
【００５９】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、ステップ（ac）において本発明の方法に記載の、欠如している、ＥＢＶの複製を誘導するのに必要な１以上のＥＢＶポリペプチド、または、ＥＢＶ複製誘導能が無能化されている１以上のＥＢＶポリペプチドは、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＭＬＦ１および、これらの任意の組合せからなる群から選択され、上記本発明の方法のステップ（ｃ）において、複製相は、選択されたポリペプチドを上記細胞に付与することによって誘導される。
【００６０】
本発明の方法のより好ましい実施形態では、選択されたポリペプチドは、ＢＺＬＦ１である。
【００６１】
本発明の方法のさらにより好ましい実施形態では、上記細胞への上記１以上のＥＢＶポリペプチドまたは上記ＢＺＬＦ１の付与は、上記細胞に安定的にトランスフェクトされたベクターからの上記１以上のＥＢＶポリペプチドまたは上記ＢＺＬＦ１の発現により行なわれる。
【００６２】
上に概説したように、細胞に上記１以上のＥＢＶポリペプチドまたは上記ＢＺＬＦ１を付与する方法はいくつか存在するが、安定的に組込まれたプラスミドからの発現は、いくつかの理由で有利である。発現されるポリペプチドの発現レベルが一定である、宿主細胞の調節が最低限に低下される、さらに、上記粒子を産生する技術的な複雑性が同様に著しく最小限化され、大規模産生系の場合に有利である。
【００６３】
本発明の方法の最も好ましい実施形態では、上記１以上のＥＢＶポリペプチドまたは上記ＢＺＬＦ１の発現は、誘導可能に調節される。
【００６４】
プラスミドからのポリペプチドの発現を制御する技術は、当該技術分野で周知である。ある技術では、熱、化学物質、または光感受性プロモーターなどの誘導性プロモーターが使用される。たとえば、テトラサイクリン誘導性プロモーター、Ｄｏｘ−誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーターまたは重金属誘導性プロモーターなどが当該技術分野で既知であり、本発明に従って用いられ得る（たとえば図７を参照）。さらに好適なプロモーターは、当業者に周知である。代替的に、ＢＺＬＦ１は、エストロゲン受容体に融合すると調節可能でもあるため、エストロゲンの追加の際に活性化される。
【００６５】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、上記方法は、上記ステップ（ｂ）の後かつ上記ステップ（ｃ）の前に、１以上のウイルスもしくは非ウイルスポリペプチド、１以上のウイルスもしくは非ウイルス核酸配列、および／または、１以上のワクチンアジュバントを上記細胞に付与する更なるステップ（ｂ′）を含み、上記１以上のウイルスポリペプチドまたは上記１以上のウイルス核酸配列は、それぞれＥＢＶポリペプチドまたはＥＢＶ核酸配列でない。
【００６６】
１以上のウイルスもしくは非ウイルスポリペプチド、１以上のウイルスもしくは非ウイルス核酸配列は、上記に述べた定義に従うＥＢＶポリペプチドまたはＥＢＶ核酸配列でない限り、いかなる起源または配列でもあり得る。好ましくは、上記１以上のポリペプチドまたは上記１以上の核酸配列は、免疫原性であり、特定の免疫応答を惹起し、さらに、より好ましくは、免疫化剤として安全かつ有効であることが示されているポリペプチドまたは配列である。
【００６７】
「アジュバント」という用語は、ワクチンに関連して周知の意味に従って用いられる。具体的には、アジュバントは、それ自体が与えられるとき、免疫系に対し、あるとしても少しの直接的な作用しか有さず、ワクチンの効果を変更（modifies）し、好ましくは強化する免疫剤である。本発明に従うと、アジュバントは、特定の抗原と併用して用いられると、抗原特異的免疫応答を促進し、延長させ、または強化することが可能な任意の物質として定義される。好適なアジュバントは、たとえば、アルミニウム塩（たとえば、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムなど）などの無機アジュバント、スクワランまたは油系アジュバントなどの有機アジュバント、およびビロソームとすることができる。
【００６８】
本実施形態は、本発明に従って生成される粒子が、核酸配列と同様にＥＢＶポリペプチド以外の他のポリペプチドを有効に包含し得るため、ワクチンである上に、被免疫化個人にさらなる化合物を送達させる送達手段として作用することに起因する。上記１以上のウイルスもしくは非ウイルスポリペプチド、１以上のウイルスもしくは非ウイルス核酸配列、および／または、１以上のウイルスアジュバントの取込は、上記取込に好適な量で、タンパク質トランスフェクションまたは核酸トランスフェクションなどの上述の技術に従って細胞にこれらを付与することによって簡便に達成され得る。特定の必要量および、上記細胞内レベルを達成するための特定の技術は、当業者によって過度の重荷なしに実験により求められ得る。
【００６９】
本発明のワクチンの好ましい実施形態では、ワクチンは、１以上のウイルスもしくは非ウイルスポリペプチド、１以上のウイルスもしくは非ウイルス核酸配列、および／または、ワクチンアジュバントを追加的に含有し、上記１以上のウイルスポリペプチドまたは上記１以上のウイルス核酸配列は、それぞれＥＢＶポリペプチドまたはＥＢＶ核酸配列でない。
【００７０】
上に述べた定義は本実施形態にも適用され、上記粒子を生成するための方法は、上に同様に記載されている。好ましくは、ワクチンに含有される上記粒子は、粒子の一部として、１以上のウイルスもしくは非ウイルスポリペプチド、１以上のウイルスもしくは非ウイルス核酸配列および／またはワクチンアジュバントを含有する。しかしながら、上記ワクチンは、上記粒子内に取込まれずに、ここに定義される粒子に混合される１以上のウイルスもしくは非ウイルスポリペプチド、１以上のウイルスもしくは非ウイルス核酸配列および／またはウイルスアジュバントを含有することも意図される。
【００７１】
本発明の別の実施形態は、本発明に従う方法のステップ（ａ）に従ってトランスフェクトすることにより得られる細胞に関する。
【００７２】
当業者には上に概説したように理解されるように、上記１以上のＥＢＶポリペプチドまたは上記ＢＺＬＦ１の、好ましくは誘導可能に調節された発現を可能にするベクターの安定的なトランスフェクションは、大規模な設定、および／または、標準化され、質に関して一定な製品が必要な設定において特に有用である。これは、好ましくは本発明のワクチンの一部である、本発明の方法に従って生成される粒子のように、医療用途を目的とし、具体的には、患者への投与を目的とするものには重要であると考えられる。好ましくは、細胞は、培養細胞、細胞株またはイン・ビトロでの細胞である。
【００７３】
別の実施形態では、本発明は、本発明に従うワクチンまたは本発明の方法に従って生成される粒子を含むキットに関する。
【００７４】
キットは、本発明のワクチンまたは方法に従って生成される粒子などの１種類の項目のみを含有してもよい。キットは、発明に従うワクチンを構成するさまざまな成分も含んでよい。
【００７５】
好ましい実施形態では、ワクチンを構成する粒子および医薬上許容されるキャリアが、別々の成分として本発明に従うキットに含有される。
【００７６】
別の好ましい実施形態では、本発明の方法に従って得られる細胞および複製相を誘導するのに必要な化合物が、別々の成分として本発明に従うキットに含有される。したがって、キットのさまざまな成分は、１以上のバイアルなどの１以上の容器中にパッケージ化されてもよい。バイアルは、成分に加えて、保存剤または保存用緩衝液、維持および保存用培地、たとえば、とりわけ、細胞培地、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、ゲンタマイシンを含有してもよい。有利には、キットはさらに、当業者が、たとえば、本発明のさまざまな実施形態を簡便に作業できるように、成分の使用の説明書を含む。いずれの成分も実験的な場で使用されてよい。たとえば、粒子自体またはワクチンを動物および人の研究の免疫応答を研究するのに用いてもよい。
【００７７】
さらに、本発明は、ＥＢＶ抗原に特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞を生成するための、本発明に従うワクチンまたは、本発明の方法により得られる粒子の使用に関する。
【００７８】
本発明に従う使用は、たとえば、以下に記載する方法に従って実施されてもよい。
追加的に、本発明は、ＥＢＶ抗原に特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞を含有する製剤を生成するための方法であって、（ａ）本発明に従うワクチンまたは本発明の方法により得られる粒子とともに、Ｂ細胞を、ＥＢＶ抗原を提示するＢ細胞を含有する製剤を生成するのに十分な時間インキュベートするステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で得られた上記Ｂ細胞をＴ細胞を含有する製剤と混合するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた上記混合物をインキュベートして、ＥＢＶ抗原に特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む製剤を生成するステップとを含む、方法に関する。
【００７９】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞という用語は、当該技術分野で周知である細胞毒性Ｔ細胞という用語と交換可能に用いられる。
【００８０】
「インキュベート」という用語は、本実施形態に従うと、異なるものと接触させるプロセスを指す。本発明のワクチンまたは本発明の方法により得られる粒子とＢ細胞をインキュベートすることに関して、該インキュベートは、Ｂ細胞を生存可能に保ち、かつ上記ワクチンまたは粒子などの抗体に対して反応性に保つ条件下で、特定の時間行なわれる。Ｂ細胞による抗原提示に必要な時間は、実験により求めることができ、選ばれる実験設定に依存して異なり得る。好ましくは、インキュベーションは、（各値について）少なくとも２、４、６、８、１６または少なくとも２４時間維持される。さらに、少なくとも２日、少なくとも３日または少なくとも４日間のインキュベーション時間も意図される。
【００８１】
ステップ（ｂ）においてＢ細胞と混合されるＴ細胞の調製は、無感作Ｔ細胞および／またはＥＢＶ特異的記憶Ｔ細胞および／またはＥＢＶ特異的エフェクターＴ細胞を含む。本発明の方法のインキュベーションステップ（ｃ）は、ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の生成を可能にする時間でなければならない。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の発育に必要な上記の時間は実験により求めることができ、選ばれる実験設定に依存して異なり得る。好ましくは、インキュベーションは、（各値について）少なくとも２、４、６、８、１６または少なくとも２４時間維持される。さらに、少なくとも２日、少なくとも３日または少なくとも４日間のインキュベーション時間が意図される。方法または使用は、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・ビトロな方法または使用であり得る。
【００８２】
発明の本実施形態は、当該技術分野の定説に反して（たとえば、Keller et al.、２００９年、ＷＯ２００９／０６８６１５号）、Ｂ細胞が交差提示およびクロスプライミング可能であるという驚くべき知見による。具体的には、クロスプライミングは、免疫細胞による取込後の抗原をプロセシングして、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ結合提示するプロセスを表わす。上記プロセスは、たとえば、樹状細胞およびマクロファージに制限されると今まで考えられてきた。ＭＨＣクラスＩＩ結合抗原提示がＣＤ４＋  Ｔ細胞の生成を生じる一方で、ＭＨＣクラスＩ結合抗原提示は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、すなわち、抗原特異的Ｔキラー細胞の生成を生じる。Ｂ細胞は、その主な機能が抗体の生成であり、クロスプライミングは不可能であると考えられている。本発明の発明者らは、驚くべきことに、ここに記載されるような粒子をマウスに投与すると、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞の存在が脾臓細胞中に示され得ることを示すことができた（たとえば、実施例４、図５、実施例８、図１１Ｃを参照）。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】２９３−ＶＩＩ＋ヘルパーゲノムは、いくつかの欠損を含有する（三角によって示す）。潜在性遺伝子ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３ａ、−３ｂおよび−３ｃが全体的に欠損された。ウイルス粒子中に存在すると記載されているＬＭＰ−１は、膜貫通ドメインを欠損させることによって機能的に不活性化された。さらに、溶菌サイクルを活性化させるＢＺＬＦ−１およびパッケージングシグナル（ＴＲｓ）も除去された。Ｅ．ｃｏｌｉでの繁殖のために、ゲノムはＦ因子レプリコンを含有する。高感度ＧＦＰをマーカ遺伝子として挿入し、ハイグロマイシン耐性遺伝子は、真核細胞での選択を可能にする。クローニング戦略は、過去により詳細に記載されている（Hettich et al.、２００６年、Delecluse et al.、１９９８年、Delecluse et al、１９９９年）。２９３−ＶＩＩ＋ヘルパーゲノムは、本明細書で詳述される修飾ＥＢＶゲノムの一実施形態を表わす。
【図２】ＶＩＩ＋  ＶＬＰ（本明細書に記載される粒子に相当する）と呼ぶ、生成されるウイルス粒子は、検出可能な量のＥＢＶ−ＤＮＡを含有しない。誘導されたＶＩＩ＋パッケージング細胞株から放出される粒子を、記載されるように、上澄みから単離し、ウイルスＤＮＡが存在するかどうかＰＣＲにより分析した。並行して、産生相の誘導の際に感染ビリオンを放出する、誘導された２０８９細胞から、ウイルス粒子を単離した。２０８９粒子と対照的に、ＶＩＩ＋  ＶＬＰではＥＢＶ−ＤＮＡは一切検出不可であった。ともに高感度ＧＦＰの遺伝子を持つウイルスＤＮＡは、ｇｆｐ特異的プライマーにより検出した。
【図３Ａ】ＶＩＩ＋  ＶＬＰは、ＣＤ２１＋細胞に独占的に結合する。ＶＩＩ＋  ＶＬＰのＢ細胞指向性を試験するために、健常なドナーからのＰＢＭＣＳをＶＩＩ＋  ＶＬＰと一晩インキュベートした。ＧＦＰの移入により明らかになったＶＩＩ＋  ＶＬＰの結合は、ＣＤ２１＋細胞上で独占的に検出可能であった。
【図３Ｂ】ＶＩＩ＋  ＶＬＰは、ＣＤ２１＋細胞に独占的に結合する。ＶＬＰのＢ細胞との相互作用をより詳細に調べるために、ＶＬＰとインキュベートされたＰＢＭＣ上で共焦点顕微鏡法を行なったところ、ＶＩＩ＋  ＶＬＰに存在するｇｐ３５０およびＣＤ２１の細胞表面上での共存が明らかになり、これら２つの分子の率直な相互作用が示唆された。
【図４】ＶＩＩ＋  ＶＬＰは無感作マウスに中和抗体を誘導する。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）を１０μｇのＶＩＩ＋−ＶＬＰ（濃灰色の棒）または同量の２９３エキソソーム（ｎ＝２）（薄灰色の棒）で２回免疫化した。二度目の免疫化後４週間目に血液を採取し、ＥＢＶ特異的抗体があるかどうか分析した。（左）ＶＩＩ＋−ＶＬＰで免疫化されたマウスは、さまざまなＥＢＶタンパク質に対して特異的な抗体を高いレベルで有していたが、２９３エキソームで免疫化されたマウスはそうでなかった。２９３細胞に、対象のウイルスタンパク質の発現プラスミドをトランスフェクトし、１日後溶解した。次に、９６ウェルプレートを異なるライセートでコーティングし、洗浄し、１:２００の希釈度でマウス血清とインキュベートした。結合抗体の存在がペルオキシダーゼ共役抗マウスＩｇＧ抗体で検出された。コントロールとして、ＣＭＶタンパク質ｐｐ６５の発現プラスミドをトランスフェクトした２９３細胞を用いた。（右）誘導されたＥＢＶ特異的抗体は、中和抗体であり、一次Ｂ細胞の感染を阻害する。組換え感染性ＥＢＶ粒子（ＥＢＶ−２０８９）をＶＩＩ＋−ＶＬＰ（ｎ＝２）または２９３エキソソーム（ｎ＝１）のいずれかで免疫化されたマウスからの血清と３０分間プレインキュベートし、次に、０．１の感染多重度（ＭＯＩ）でヒト一次Ｂ細胞を感染させるために用いた。４８時間後、ＧＦＰ発現によって明らかになった感染細胞の数は、フローサイトメトリにより測定した。おそらく２９３特異的抗体の誘導のために、２９３粒子単独で小さな阻害効果を有し、ＥＢＶ−２０８９も２９３由来であることが明らかになった。しかし、ＶＩＩ＋  ＶＬＰ免疫化マウスの血清による阻害の方がより著しく強く、感染をほぼ完全に阻止した。
【図５】ＶＩＩ＋  ＶＬＰはＥＢＶ特異的Ｔ細胞の生成を誘導する。免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスをＶＩＩ＋−ＶＬＰで２回免疫化（１０μｇ、腹腔内）し、脾臓を単離し、２度目の免疫化後４週間目に分析した。ＥＢＶ特異的Ｔ細胞の存在は、示したＥＢＶタンパク質のいずれかの発現プラスミドを一過的にトランスフェクトした２９３細胞からのライセートを添加した、照射した脾細胞を用いて、マウス特異的インターフェロン−γＥＬＩＳＰＯＴで測定した。このＥｌｉｓｐｏｔにより、そのすべてが野生型ＥＢＶに含有されると記載された（Johamnsen et al、２００４年）ＥＢＶポリペプチドに対して特異的な細胞免疫応答が明らかとなった。対照的に、ＥＢＮＡ２および、サイトメガロウイルス由来のポリペプチドであるｐｐ６５に対しては、免疫応答は一切検出不可であり、アッセイの特異性が証明された。
【図６】ＥＢＶ陽性ドナーからのＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の再活性化である。２人のドナーからのＰＢＭＣを、ＥＢＶ由来タンパク質を一切含有しないＶＩＩ＋  ＶＬＰまたは２９３−エキソソームで８日以内に３回刺激した。細胞をカウントし、初めての刺激後１２日目にフローサイトメトリにより分析した。
【図７】２９３−ＶＩＩ＋細胞でのＥＢＶの溶菌相の条件活性化である。２９３−ＶＩＩ＋細胞株の誘導体はＶＬＢの連続産生を可能にする。（Ａ）２９３−ＶＩＩ＋細胞株内に導入されたプラスミドｐ３９８９のプラスミドマップである。この発現プラスミドは、調節遺伝子（ｔｅｒＲ  Ｂ／Ｅ−ＫＲＡＢおよびｒｔＴＡ２ｓ−Ｍ２）、プラスミド由来のＤＮＡ複製、ｏｒｉＰ、およびそのトランスアクチベータＥＢＮＡ１（Bornkamm et al.、２００５年）を伴うテトラサイクリン誘導可能な２方向のプロモーターの制御下で、ＥＢＶの溶菌サイクルの最初期スイッチ遺伝子であるＢＺＬＦ１およびＢＲＬＦ１を含有する。ｐ３９８９は過去に記載された原理に基づく（Urlinger et al.、２０００年、Forster et al.、１９９９年）。ＥＢＶの溶菌相アクチベータタンパク質であるＢＺＬＦ１およびＢＲＬＦ１のテトラサイクリン依存性発現は、テトラサイクリン調節２方向プロモーターから達成される。この条件発現系は、テトラサイクリン制御トランスアクチベータｒｔＴＡ２Ｓ−Ｍ２およびＴｅｔレプレッサＫＲＡＢ融合タンパク質（ｔＴＳ−ＫＲＡＢ）をコードする、２シストロン性発現カセットの恒常的発現に頼っている。対象の遺伝子を操縦する２方向プロモーターは、ドキシサイクリンの非存在下ではｔＴＳ−ＫＲＡＢリプレッサを通して下方調節（downregulated）されるが、その追加の際、ｒｔＴＡ２Ｓ−Ｍ２アクチベータによって誘導される。（Ｂ）ウエスタンブロット分析により、ドキシサイクリンを加えて１２時間後、２９３−ＶＩＩ＋細胞でのｐ３９８９によるＢＺＬＦ１およびＢＲＬＦ１の誘導された発現が示された。（Ｃ）ＥＢＶ血清陽性ドナーからのＰＢＭＣに、ドキシサイクリン誘導２９３−Ｖｌｌ＋−ｐ３９８９細胞からのＶＬＰを添加し、ｇｐ３５０特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンに対する刺激剤として用いた。ＩＦＮ−ｇ放出により、２９３−Ｖｌｌ＋および２９３−Ｖｌｌ＋−ｐ３９８９細胞から生成されるＶＬＰが同等であることが示された。非添加ＰＢＭＣ（ｗ／ｏ）またはＨＥＫ２９３細胞（ｅｘｏ）からのエキソソームが添加されたＰＢＭＣが陰性コントロールとして作用し、自己ＬＣＬが陽性コントロールであった。
【図８】ＶＬＰ添加Ｂ細胞は、ＥＢＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを効率的に再活性化させる。（Ａ）ＶＬＰ添加Ｂ細胞は、ＢＮＲＦ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの強力な刺激剤である。ミニＬＣＬ株（Moosmann et al.、２００２年）に、溶菌により誘導された２９３−ＶＩＩ＋細胞から得られたＶＬＰの段階希釈を添加した。添加細胞は、ＢＮＲＦ１特異的エピトープを認識する自己ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンに対する刺激剤として用いられた（Mautner et al.、２００４年）。ＨＥＫ２９３細胞からのエキソソーム（ｅｘｏ）を添加したミニＬＣＬ株によるＴ細胞クローンの刺激を陰性コントロールとして用い、ＢＮＲＦ１を発現する自己ＬＣＬを陽性コントロールとして用いた。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２＋／Ｂ３５＋ドナーからのＰＢＭＣを２９３−Ｖｌｌ＋細胞からのＶＬＰとともに一晩インキュベートするか、または未処理のまま放置し、次に、ＥＢＶタンパク質であるＢＺＬＦ１（ＥＰＬ、（Green et al.、２００４））およびＢＲＬＦ１（ＹＶＬ、（Saulquin et al.、２０００年））に特異的なＨＬＡマッチドＣＤ８＋Ｔ細胞クローンに対する刺激剤として用いた。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡにより、ＶＬＰ処理ＰＢＭＣとインキュベートしたＴ細胞の、弱いが明確な活性化は明らかになったが、非処理ＰＢＭＣについてはそうでなかった。
【図９】ＶＬＰによるＥＢＶ特異的Ｔリンパ球の再活性化は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞に依存する。健常なドナーからのＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＨＥＫ２９３細胞または２９３−Ｖｌｌ＋細胞からのエキソソーム（ｅｘｏ）またはＶＬＰと一晩プレインキュベートした、示したような致死的に照射した自己刺激剤細胞で、１４日間内に３回刺激した。刺激剤細胞は、未分画のＰＢＭＣをＭＡＣＳによりソートしたＣＤ１９＋Ｂ細胞か、Ｂ細胞が欠乏された（ＣＤ１９−）ＰＢＭＣのいずれかであった。３回の刺激の後、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞の再活性化を、標的としてＶＬＰまたはエキソソームを添加した自己ＰＢＭＣを用いて、ＩＦＮ−γＥｌｉｓｐｏｔアッセイで評価した。Ｔ細胞再活性化は、刺激剤としてのＣＤ１９＋Ｂ細胞の存在に厳密に依存していた。
【図１０】２９３−Ｖｌｌ＋細胞からのＶＬＰは、ＥＢＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に拡大させる。異なるＥＢＶ陽性ドナーからのＰＢＭＣを致死的に照射し、溶菌により誘導された２９３−Ｖｌｌ＋細胞からのＶＬＰを添加するか、ＨＥＫ２９３細胞からのエキソソームを添加するか、または、未処理のまま放置し、自己ＰＢＭＣに対する刺激剤として用いた。２８日後で、かつ３回の刺激後、細胞をＦＡＣＳにより分析した。（Ａ）最近記載されたように（Adhikary et al.、２００８年）、照射したＶＬＰ添加ＰＢＭＣはＣＤ４＋細胞を拡大させたが、照射したエキソソーム添加（ｅｘｏ）または非処理（ｗ／ｏ）ＰＢＭＣはそうでなかった。（Ｂ）ＶＬＰが添加されたＰＢＭＣは、選択されたＥＢＶタンパク質エピトープにＨＬＡ  Ｂ０３／Ｂ０８またはＡ０２制限された三量体／五量体による染色によって明らかになったように、ＥＢＶ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を再活性化させ、拡大させた。細胞タンパク質Ｈｅｒ２／ｎｅｕへの四量体（ＫＩＦ）は、陰性コントロールとして作用した。（Ｃ）照射したＶＬＰ添加ＰＢＭＣは、異なる４人のドナーからのＥＢＶ特異的ＣＤ８＋細胞を２８日内で１５倍まで確実に拡大させたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の全数は、初期ＣＤ８＋Ｔ細胞数と比較して、約半分に低下した。
【図１１】ＶＬＰは、免疫化されたマウスにＥＢＶ特異的な体液性および細胞性免疫応答を惹起する。ＢＡＬＢ／ｃマウスを２９３Ｖｌｌ＋細胞（ｎ＝４）からの１０μｇのＶＬＰまたは同量のＨＥＫ２９３細胞からのエキソソーム（ｎ＝２）で２回免疫化した。血清および脾細胞を最後の免疫化後４週間目に分析した。（Ａ）ＥＬＩＳＡでは、エキソソームで免疫化されたマウス（灰色の棒）からでなく、ＶＬＰで免疫化されたマウス（黒色の棒）からの血清は、ビリオンに存在するＥＢＶタンパク質に特異的な抗体を含有する。（Ｂ）２９３−Ｖｌｌ＋細胞からのＶＬＰで免疫化されたマウスに生成された抗体は、感染性ＥＢＶを中和する。ＧＦＰ陽性２０９８ＥＢＶ保存液を、ＶＬＰ（ＶＬＰ）またはエキソソーム（ｅｘｏ）で免疫化されたマウスからの血清で３０分間プレインキュベートし、その後、０．１と計算される感染多重度でヒト一次Ｂ細胞を感染するために用いた。４８時間後、ＧＦＰを発現する感染細胞の数をフローサイトメトリにより求めた。抗ｇｐ３５０中和抗体７２Ａ１は２つの異なる濃度で陽性コントロールとして用いられた。（Ｃ）２９３−Ｖｌｌ＋細胞からのＶＬＰは、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を活性化させる。ＶＬＰで免疫化されたマウス（黒色の棒）またはエキソソームで免疫化されたマウス（灰色の棒）でのＥＢＶ特異的Ｔ細胞の発生は、示したウイルスタンパク質をコードする発現プラスミドを一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのライセートを添加した抗原提示細胞として、照射した脾細胞を用いて、マウス特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴで測定した。
【実施例１】
【００８４】
実施例により本発明を説明する。
２９３−Ｖｌｌ＋細胞は、誘導の際、ウイルスＤＮＡは欠如するが、さまざまなＥＢＶタンパク質を含有するＶＬＰを放出する。
【００８５】
本発明者らは最近、ＥＢＶ由来ベクターを組換えウイルス粒子内にキャプシド形成するための２つのヘルパー細胞株の構築を記載した（Delecluse et al.、１９９９年、Hettich et al.、２００６年）。これらの細胞株は、ウイルスのパッケージングシグナルである末端反復（ＴＲ）が欠如するが、代わりに、ｇｆｐの遺伝子を含有するＥＢＶヘルパーゲノムを持つ。結果的に、これらのヘルパーゲノムは、ウイルス粒子内にキャプシド形成はできないが、好適なウイルスベクターのパッケージングならびに、組換えおよび感染性ＥＢＶ粒子の組織化および放出に必要なタンパク質をすべてイン・トランス（in trans）で送達する。第一世代細胞株であるＴＲ−２は、一次ヒトＢ細胞の完全な形質転換能を保持する、それ以外ではインタクトなＥＢＶゲノムを持っていた（Delecluse et al.、１９９９年）。ヘルパーゲノムの稀な非正統的キャプシド形成および、ウイルスベクターとヘルパーゲノムとの間の偶発的な組換えの結果、形質転換能を有する組換えウイルス粒子が放出されてしまうことに対処するために、本発明者らは、Ｂ細胞形質転換に不可欠なウイルス遺伝子のほとんどが欠如しているＥＶＢヘルパーゲノムにより、第二世代パッケージング細胞株である２９３−Ｖｌｌ＋を後に設計した（図１）（Hettich et al.、２００６年）。
【００８６】
驚くべきことに、これらのヘルパー細胞株から放出される組換えウイルス粒子は、野生型ＥＢＶの特性を維持しており、正常および悪性Ｂリンパ球の両方についてＢ細胞指向性および伝達能を提示する。おそらくヘルパーゲノムからのその過剰発現により、これらの粒子はＧＦＰタンパク質も含有しており、標的細胞とのそれらの相互作用が容易にモニターできる。興味深いことに、本発明者らは、ＢＺＬＦ１発現プラスミドであるｐ５０９による溶菌サイクルの誘導の際（HammerschmidtおよびSugden、１９８８年）、パッキング可能なウイルスベクターが同時トランスフェクトされていないときでさえ、２９３−ＶＩＩ＋細胞は大量のＧＦＰ陽性粒子を上澄み内に放出することを観察した。多くの細胞型および永久細胞株が、エキソソームと呼ばれる微小胞を恒常的に放出し、多くのウイルスが、それ自体の組織化および放出のためにエキソソーム生合成を活用することから（Calistri et al.、２００９年、Mori et al.、２００８年、Pelchen-Matthews et al.、２００４年）、産生サイクルの誘導の際に２９３−ＶＩＩ＋細胞から放出される粒子は、ウイルスタンパク質を含有するエキソソーム様粒子ではないかが問われた。
【００８７】
したがって、本発明者らは、これらの粒子の組成および特性をより詳細に分析した。まず、本発明者らは、ＶＩＩ＋細胞からのＶＬＰがウイルスＤＮＡを含有していないかどうかをＰＣＲによって調べた。このために、本発明者らは、ｐ５０９を有するＶＩＩ＋細胞にＥＢＶの溶菌相を導入し、陽性コントロールとして、ＴＲ＋  ＥＢＶゲノムを持ち、感染性ウイルス粒子を放出する２０８９細胞にも導入した（Delecluse et al.、１９９８年）。３日後、これらの細胞株から上澄みを採取し、超遠心分離法により放出された粒子を沈殿させた。これらの粒子のＰＣＲ分析により、ＥＢＶ−ＤＮＡは２０８９粒子では容易に検出され得るが、ＶＩＩ＋細胞からのＶＬＰではそうでないことが明らかになった（図２）。
【実施例２】
【００８８】
２９３−ＶＩＩ＋−ＶＬＰは、ＥＢＶ様Ｂ細胞指向性を有する
ＶＬＰ内に取込まれていることが分かったタンパク質の１つは、ＣＤ２１との相互作用によってビリオンのヒトＢリンパ球への結合を媒介する主要なウイルス外膜タンパク質である、ｇｐ３５０／２２０であった。したがって、本発明者らは、ＶＬＰが野生型ＥＢＶと同様のＢ細胞指向性を有しているかを解明したかった。そのために、本発明者らは、新たに単離したＰＢＭＣを、濃縮したＶＩＩ＋  ＶＬＰと一晩インキュベートし、ＶＬＰの結合をＦＡＣＳによって分析した。これらの実験のために、本発明者らは、ＶＩＩ＋ヘルパーゲノムから発現された高感度ＧＦＰもＶＬＰ内に取込まれていることを利用した。図３ａで証明されるように、ＶＬＰの結合は、ＣＤ２１＋細胞のみがＧＦＰ陽性になることから判断されるように、ＣＤ２１＋細胞、最も確実にはＢ細胞に制限されている。対照的に、ＶＬＰのＣＤ２１陰性細胞への結合は観察できなかった。ＶＬＰのＢ細胞との相互作用をより詳細に調べるために、本発明者らは、ＶＬＰとインキュベートされたＰＢＭＣで共焦点顕微鏡法を行ったところ、ＶＬＰに存在するｇｐ３５０およびＣＤ２１の細胞表面上での共存が明らかになり、これらの２つの分子の率直な相互作用が示された（図３ｂ）。
【００８９】
最近、２９３／ＴＲ−に由来するＶＬＰが、ヒトＰＢＭＣによる貪食の際に、ＥＢＶ特異性ＣＤ４＋  Ｔ細胞を効率的に再活性化（reactive）できることが記載され（Adhikary et al.、２００８年）、このことがＶｌｌ＋−ＶＬＰについてもあてはまるかどうかを求める試みがなされた。この問題に対処するために、本発明者らは、健常なドナーからの照射した一次ＰＢＭＣにＶｌＩ＋−ＶＬＰを添加し、次に、ＥＢＶ構造タンパク質ＢＬＬＦ１およびＢＮＲＦ１に特異的な自己ＣＤ４＋  Ｔ細胞クローンまたは自己ＰＢＭＣのいずれかと共培養した。これらの実験により、ＶｌＩ＋−ＶＬＰ添加ＰＢＭＣは、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイで測定すると、特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞クローンおよび自己バルクＴ細胞を効率的に再活性化させることが証明された。
【実施例３】
【００９０】
ＶｌＩ＋−ＶＬＰは、無感作宿主にＥＢＶ特異的中和抗体を誘導する
前の章からの結果により、ＶＬＰのＥＢＶ特異的復活（recall）免疫応答を刺激するポテンシャルが証明された。したがって、次の一連の実験では、本発明者らは、ＶＬＰが、イン・ビボで無感作宿主にＥＢＶ特異的免疫応答も誘導できるかどうかについて評価した。これは、予防ワクチンにとっても当然前提条件である。その目的で、本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１０μｇのＶＬＰ（ｎ＝４）を１４日の期間内に２回腹腔内ワクチン接種し、コントロールマウス（ｎ＝２）を２９３の上澄みから単離した同量のエキソソームで免疫化した。２度目の免疫化後４週間目に、血清を採取し、ＥＢＶ特異的抗体が存在するかどうかを分析し、脾細胞をＥＢＶ特異性があるか試験した。このために、本発明者らは、さまざまなＥＢＶタンパク質の発現プラスミドを一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの一連のライセートで、９６ウェル・クラスタープレートをコーティングした。
【００９１】
図４に示されるように、２９３エキソソームで免疫化されたマウスでなく、ＶＩＩ＋−ＶＬＰで免疫化されたマウスからの血清により、強い免疫反応性が明らかになったため、ＥＢＶ粒子の成分として最近同定されたさまざまなＥＢＶタンパク質に対して特異的な抗体の誘導が明らかになった（Johannsen et al.、２００４年）。全ての抗体は、１：２００の希釈度（図４）および１：１．０００の希釈度（図示せず）で、ＶＬＰ免疫化マウスからの血清中で明確に検出可能であった。興味深いことに、本発明者らは、前述のように、ＶＬＰを放出するＶＩＩ＋細胞中に高レベルで存在し、かつ、ＶＩＩ＋  ＶＬＰ内に取込まれている転写因子ＢＺＬＦ−１に対する抗体も検出した。対照的に、２９３エキソソームで免疫化されたマウスでは、検出可能なレベルのＥＢＶ特異的抗体は一切明らかにならなかった。コントロールとして、本発明者らは、ＣＭＶの主要な外皮タンパク質ｐｐ６５およびＥＢＶトランスアクチベータＥＢＮＡ２をコードする発現プラスミドをトランスフェクトした２９３細胞からのライセートに対する血清の反応性を測定した。このタンパク質は、ＶＩＩ＋ヘルパーゲノムから欠損されたオープンリーディングフレームＢＹＲＦ１から翻訳されている（図１を参照）。本発明者らは、これらの２つのタンパク質に対する反応性を一切検出することができず、これらのアッセイの特異性が示された。興味深いことに、初めての免疫化後７日目に、ＶＬＰ注入マウスで大きな抗体力価が既に検出可能であり、ＶＩＩ＋−ＶＬＰの高い免疫原性が示された（データは図示せず）。
【００９２】
ＥＢＶ特異的抗体が中和抗体であるかどうかを試験するために、本発明者らは、それらがどの程度ＥＢＶによる一次Ｂ細胞の感染を阻害するかを定量化した。このために、本発明者らは、感染細胞で発現されたｇｆｐ遺伝子を持つ組換えＥＢＶ（２０８９）を利用した（Delecluse et al.、１９９８年）。新たなアデノイドから単離した一次Ｂ細胞をＥＢＶ−２０８９に感染させ、０．１ＭＯＩでマウス血清と３０分間プレインキュベートし、感染細胞の数をＦＡＣＳ分析によって４８時間後に定量化した。図４に示すように、ＶＬＰに感染したマウスからの血清は、ＥＢＶによる一次ヒトＢ細胞の感染を阻害した。見られるように、２９３で免疫化したマウスからの血清も、おそらく２９３由来ＥＢＶ−２０８９を認識する２９３特異的抗体のために、弱い阻害効果を有する。
【実施例４】
【００９３】
ＶＩＩ＋−ＶＬＰは、ＥＢＶ特異的細胞性免疫応答を誘導する
次に、本発明者らは、無感作マウスのＶＬＰによる免疫化が、ウイルスおよびＥＢＶ感染細胞の免疫監視に不可欠であることが知られている（Hislop et al.、２００７年）、ＥＢＶ特異的細胞性免疫応答も誘導するかどうかを問うた。したがって、本発明者らは、ＶＬＰ免疫化マウスの脾臓を単離し、単一細胞浮遊液を生成した。ＥＢＶ特異的抗体の検出にも用いられたＥＢＶタンパク質のいずれかの発現プラスミドを一過的にトランスフェクトした２９３細胞からのライセートと、２×１０５脾細胞を一晩インキュベートして、貪食、タンパク質分解およびＶＬＰ由来タンパク質の提示を可能にした。Ｔ細胞の活性化は、インターフェロンγＥｌｉｓｐｏｔによって２４時間後に測定した。
【実施例５】
【００９４】
第３世代パッケージング細胞株の導入
ＴＲ−２および２９３−Ｖｌｌ＋は、潜伏サイクルから溶菌サイクルへの切換えを開始するのに十分である、ＢＺＬＦ１をコードする発現プラスミドの一過性トランスフェクションによってＥＢＶの産生ライフサイクルが誘導される、２つのパッケージング細胞株である。しかしながら、臨床グレードのＶＬＰの大規模産生は、永続的に放出する細胞株に依存する。
【００９５】
これらの制限を克服し、ＶＬＰの、標準化されたより一定の産生への最初のステップに近づくために、本発明者らは、ＶＩＩ＋ヘルパーゲノムに加えて、誘導可能なＢＺＬＦ１および、追加的に、ＢＺＬＦ１と協働して上皮細胞に溶菌サイクルを誘導する別のウイルス最初期タンパク質であるＢＲＬＦ１（Zalani et al.、１９９６年）をコードする第２のプラスミドを安定して持つ、ｉＶｌｌ＋と呼ばれる新しいパッケージング細胞株を設計した。ドキシサイクリンの存在下で培養すると、ｉＶｌｌ細胞は、溶菌サイクルを維持し、細胞表現型における検出可能な変化は一切なしに、ＶＬＰを恒常的に放出する。
【実施例６】
【００９６】
ＥＢＶ特異的Ｔ細胞の再活性化
２９３−Ｖｌｌ＋細胞から得られたＶＬＰは、ヒトＢ細胞によって貪食され、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を再活性化させるポテンシャルを有するかどうかを定義するために、ミニＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球様Ｂ細胞株（ＬＣＬ）（Kempkes et al.、１９９５年）を２９３−Ｖｌｌ＋細胞からのＶＬＰとインキュベートした。次に、添加されたＬＣＬを、ミニＥＢＶ（Kempkes et al.、１９９５年）ではコードされないＥＢＶ外皮タンパク質であるＢＮＲＦ１に特異的な自己ＣＤ４＋  Ｔ細胞クローンと共培養した。実験により、ＶＬＰ添加Ｂ細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡアッセイによって測定すると、ＣＤ４＋  Ｔ細胞クローンを効率的に再活性化することが証明された（図８Ａ）。この実験のセットにより、２９３−ＶＩＩ＋細胞は、ヒトＢ細胞と特異的に相互作用し、かつヒトＢ細胞によって貪食され、さらに、ヒトＢ細胞は、強力な抗原提示細胞であり、かつＥＢＶ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の刺激剤であることが分かり、このことは、Adhtkary et al.、２００８年の知見を裏付けた。
【実施例７】
【００９７】
ＶＬＰＳは、血清陽性宿主からのＣＤ８＋  Ｔ細胞を再活性化する
ワクチンの効能は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方に頼っている、持続性の免疫記憶の生成に依存する。２９３−ＶＩＩ＋細胞のＶＬＰが、イン・ビボでＥＢＶ感染細胞の監視に必須の細胞集団である、ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化できるかどうか求める試みがなされた。ＶＬＰのＣＤ８＋  記憶Ｔ細胞を再活性化させる（reactive）能力を試験するために、ＰＢＭＣをまず、２９３−Ｖｌｌ＋細胞からのＶＬＰまたは２９３細胞からのエキソソームと一晩インキュベートして、次に、ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンの標的として用いた。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡにより、ＶＬＰとプレインキュベートされたＰＢＭＣとインキュベートされたＴ細胞の、弱いが明確な活性化が明らかになった（図８Ｂ）。次の一連の実験で、ＥＢＶ血清陽性ドナーからのＰＢＭＣを、２９３−Ｖｌｌ＋細胞からのＶＬＰとプレインキュベートされた、照射した自己ＰＢＭＣにより刺激した。２８日後、かつ３回の刺激の後、詳細なフローサイトメトリ分析により、２９３−Ｖｌｌ＋細胞からのＶＬＰを添加したＰＢＭＣは、親ＨＥＫ２９３細胞または未処理ＰＢＭＣからのエキソソームを添加したＰＢＭＣとは対照的に、自己ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖を誘導することが明らかになった（図１０Ａ）。ＶＬＰもＥＢＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を再活性化させたかどうかを求めるために、ドナーＰＢＭＣでのそれらの初めの頻度を測定し、感染宿主において強いＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答を惹起する既知のＨＬＡクラスｌ制限ＥＢＶエピトープの特異的な認識のための、イン・ビトロのＶＬＰ拡大ＣＤ８＋  Ｔ細胞集団と比較した。ＨＬＡ  Ｂ０３／Ｂ０８またはＡ０２制限性である、潜在性タンパク質ＬＭＰ２のペプチドエプトープＣＬＧならびに、初期溶菌性タンパク質ＢＺＬＦ１、ＢＭＬＦ１およびＢＲＬＦ１それぞれのペプチドエピトープＥＰＬ／ＲＡＫ、ＧＬＣおよびＹＶＬが選ばれた。ＨＬＡ／ペプチド五量体での染色により、主に初期溶菌性エピトープを認識する初めのドナーＰＢＭＣでの少ないが検出可能なＣＤ８＋  Ｔ細胞のフラクションが明らかになった（図１０Ｂ）。エピトープ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のフラクションは、３回のＶＬＰ刺激で約０．１５％から０．２５％、１．１％、２．４％へと拡大し（図１０Ｂ）、エピトープ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の絶対数は、およそ１０倍まで増加した（図１０Ｃ）。この知見は、最近の発表と矛盾している。なぜなら、Ｂ細胞は、樹状細胞またはマクロファージなどのプロフェッショナルな抗原提示細胞と対照的に（Keller et al.、２００９年）、ウイルス粒子またはＶＬＰを効率的にプロセシングして、ＨＬＡクラスｌ結合交差提示しなかったためである。したがって、ＰＢＭＣ中の単球またはマクロファージは、ＶＬＰ由来ペプチドをＣＤ８＋  Ｔ細胞に提示して活性化させることが予想された。このような論議に対応するために、ＣＤ１９＋およびＣＤ１９−細胞をＰＢＭＣから精製して、分画した単核細胞を２９３−ＶＩＩ＋細胞からのＶＬＰまたはＨＥＫ２９３細胞からのエキソソームとインキュベートした。ＶＬＰ添加ＰＢＭＣでの３回目の刺激直後のＴ細胞の活性化をＣＤ１９＋およびＣＤ１９−ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γＥｌｉｓｐｏｔアッセイで定量化し���。結果により、ＣＤ１９＋Ｂ細胞のみがＶＬＰ由来ウイルス抗原の強力なプレゼンターであることが明示された（図９）。ＣＤ１９−  ＰＢＭＣを抗原提示細胞として用いた場合、ほとんど全くＴ細胞は同定されず（図９）、Ｂ細胞のみが、ＨＬＡクラスＩ制限ＣＤ８＋  Ｔ細胞を含むウイルスエピトープ特異的Ｔ細胞を活性化させたことが示唆された。
【実施例８】
【００９８】
ＶＬＰは、無感作Ｂａｌｂ／ｃマウスにＥＢＶ特異的な高力価中和抗体および細胞性免疫応答を惹起する
これは、更なるデータ（図１１を参照）を含む、実施例３（図４も参照）の繰返しである。方法論はバリエーションを含むため、完全性のために再説明する。本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃマウス（４匹の動物）を１０μｇのＶＬＰで１４日の期間内に２回免疫化し、コントロールマウス（２匹の動物）を同量のＨＥＫ２９３細胞からのエキソソームで免疫化した。２度目の免疫化後４週目に、血清を、ＥＬＩＳＡおよび、図１１Ａに示すように、単一のＥＢＶタンパク質の発現プラスミドを一過的にトランスフェクトした抗原としてのＨＥＫ２９３細胞からのタンパク質ライセートにより、ＥＢＶ特異的抗体の存在があるかどうか分析した。ＨＥＫ２９３由来タンパク質に対して産生された抗体により引起こされるバックグラウンド信号を回避するために、血清を、細胞培養プレートにコーティングしたＨＥＫ２９３ライセートと２時間プレインキュベートした。図示するように、ＨＥＫ２９３細胞からのエキソソームで免疫化されたマウスではなく、ＶＬＰ免疫化マウスからの血清により、ＥＢＶのビリオンの成分である、選択されたウイルスタンパク質に対する強い免疫反応性が明らかになった。全ての抗体は、１〜２００の希釈度でＶＬＰ免疫化マウスからの血清中で明確に検出可能であった（図１１Ａ）。ＶＬＰ免疫化マウスでは、ＢＺＬＦ１遺伝子によりコードされる転写因子Ｚｔａに対する抗体も高レベルで発生した。コントロールとして、ＣＭＶ外皮タンパク質ｐｐ６５およびＥＢＶトランスアクチベータＥＢＮＡ２をコードする発現プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのライセートに対する血清の反応性を測定した。ＥＢＮＡ２は、２９３−ＶＩＩ＋細胞中のＥＢＶヘルパーゲノムにおいて欠損されたＢＹＲＦ１遺伝子から翻訳される（図１）。予期されたように、ＶＬＰ免疫化マウスでのこれらの２つのタンパク質に対する体液性応答は一切検出されず、これらのアッセイの特異性が示された。
【００９９】
ＶＬＰ免疫化動物からの血清が、ＥＢＶによる細胞感染を阻害できるＥＢＶ特異的中和抗体を含有するかどうかを知るために、感染の定量的測度としてＢ細胞にＧＦＰ蛍光を与える、２０８９ＥＢＶをコードする組換えｇｆｐ（Delecluse et al.、１９９８年）を用いた。２０８９ＥＢＶのウイルス保存液をマウス血清と３０分間プレインキュベートし、次に、０．１と計算された感染多重度で、一次ヒトＢ細胞を感染させるのに用いた。４８時間後、ＧＦＰ陽性感染細胞をフローサイトメトリによって定量化した。図１１Ｂに図示するように、ＶＬＰ免疫化マウスからの血清はＥＢＶによる感染を障害したが、ＨＥＫ２９３細胞からのエキソソームで免疫化したマウスからの血清も、おそらく２９３由来タンパク質に対する抗体の誘導のため、より弱いが阻害効果を有していた。２０８９ＥＢＶのウイルス保存液は、ＨＥＫ２９３産生細胞から得られ（Delecluse et al.、１９９８年）、このことは、ＨＥＫ２９３細胞からのエキソソームで免疫化したマウスからの血清も、２０８９ＥＢＶ粒子を認識し、その感染力を損なうことができたことを示唆している。
【０１００】
次に、マウスの免疫化が、ＥＢＶの免疫監視に不可欠なＥＢＶ特異的細胞免疫応答の誘導につながるかどうかが問われた。上記ＶＬＰ免疫化マウスおよびコントロールマウスの脾臓から単一細胞を調製した。個々のマウスからの致死的に照射した脾細胞を、図１１Ｃで図示するウイルス遺伝子をコードし、ビリオンに存在する単一の発現プラスミドを一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から得られたライセートとインキュベートした。外因的に加えたライセートの吸着、タンパク質分解および提示を可能にするために、脾細胞を５時間インキュベートし、続いて洗浄して遊離ライセートを除去した。細胞の抗原提示能を、指標として加えた５×１０５非放射脾細胞で評価した。指標細胞の活性化を２４時間後にＩＦＮ−γＥｌｉｓｐｏｔアッセイで求めた。図１１Ｃに図示するように、ＶＬＰで免疫化したマウスからの脾細胞は、明らかに再活性化されたが、ＨＥＫ２９３細胞からのエキソソームで免疫化したコントロールマウスからの脾細胞ではそうでなかった。まとめると、この実験により、２９３−Ｖｌｌ＋細胞からのＶＬＰは、無感作マウスにＥＢＶ特異的細胞性免疫応答を誘導できることが示された。
【０１０１】
［文献］
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【０１０２】
2013541507.tif 000003
【０１０３】
2013541507.tif 000004
【０１０４】
2013541507.tif 000005
【図３ａ】
2013541507.tif 000006
【図３ｂ】
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【図９】
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【図１】
2013541507.tif 000009
【図２】
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【図４】
2013541507.tif 000011
【図５】
2013541507.tif 000012
【図６】
2013541507.tif 000013
【図７】
2013541507.tif 000014
【図８】
2013541507.tif 000015
【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
2013541507000001.app
【国際調査報告】
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2013541507.tif 000019
2013541507.tif 000020
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