(57)【要約】  ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＵＧＰＰ）、ＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ（ＧＭＰＰ）、ホスホマンノムターゼ（ＰＭＭ）、及びＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ（ＵＧＥ）をコードする配列を含むコーヒー（コフィア属種）から単離される核酸分子が、本明細書において開示される。抽出の特徴及び他の特徴に影響を及ぼすように、コーヒー豆の含有量及び／又は構造を遺伝子調節し、操作するためにこれらのポリヌクレオチドを使用するための方法もまた、開示される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＵＧＰＰ）、ＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ（ＧＭＰＰ）、ホスホマンノムターゼ（ＰＭＭ）、及びＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ（ＵＧＥ）から選択されるガラクトマンナン前駆物質合成酵素をコードするコード配列を含む、コフィア属種（Ｃｏｆｆｅａ  ｓｐｐ．）から単離される核酸分子。
【請求項２】
ガラクトマンナン前駆物質合成酵素が、ＢＬＡＳＴ比較によって決定される、配列番号６〜１０のいずれか１つとその全体にわたって約８０％超同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ガラクトマンナン前駆物質合成酵素が、配列番号６〜１０のいずれか１つを含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
配列番号１〜５のいずれか１つを含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
コード配列が、遺伝子のオープンリーディングフレーム又は遺伝子の転写によって産生されるｍＲＮＡ分子又はｍＲＮＡ分子の逆転写によって産生されるｃＤＮＡ分子を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸分子のコード配列を含むベクター。
【請求項７】
核酸分子のコード配列が、恒常的プロモーターに、又は誘発性プロモーターに、又は任意選択で種子特異的プロモーターであってもよく、さらに任意選択でコーヒー種子特異的プロモーターであってもよい組織特異的プロモーターに作動可能に連結される、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを用いて形質転換された植物細胞から産生される稔性植物であって、植物は任意選択でコーヒー植物である、稔性植物。
【請求項９】
コーヒー種子由来の固体の抽出性を調整するための方法であって、コーヒー種子内の１つ又は複数のガラクトマンナン前駆物質合成酵素の産生又は活性を調整して、コーヒー種子の改変されたガラクトマンナン含有量をもたらすステップを含み、ガラクトマンナン前駆物質合成酵素は、ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＵＧＰＰ）、ＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ（ＧＭＰＰ）、ホスホマンノムターゼ（ＰＭＭ）、及びＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ（ＵＧＥ）から選択される、方法。
【請求項１０】
コーヒー種子内のＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥのうちの１つ又は複数の産生又は活性を増加させるステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
コーヒー種子内のＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥのうちの１つ又は複数をコードする遺伝子の発現を増加させるステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
種子内での発現のために、コーヒー植物の中に、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥのうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数の導入遺伝子を導入するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
コーヒー種子内のＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥのうちの１つ又は複数の産生又は活性を減少させるステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
コーヒー種子内のＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥのうちの１つ又は複数をコードする遺伝子の発現を減少させるステップを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥのうちの１つ又は複数の翻訳の阻害剤をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを種子内での発現のためにコーヒー植物の中に導入するステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業のバイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、ガラクトマンナン前駆物質の合成に関与するコーヒー植物由来の核酸及び酵素並びにコーヒー豆のガラクトマンナン含有量の調整におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物細胞壁は、とりわけ、多糖、タンパク質、及びリグニンを含む複雑で動的な複合体である。多糖は、成熟豆の乾燥重量の５０％まで相当する、生コーヒー豆の主な構成成分である（Ｒｅｄｇｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｌａｎｔａ  ２１７，３１６−３２６）。コーヒー豆において多糖の３つの主な形態：セルロース、アラビノガラクタンＩＩ型、及びガラクトマンナンがあり（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３０，９３−１０１）、ガラクトマンナンが最も豊富である（全体の５０％又は豆の乾燥質量のおよそ２５％）。ガラクトマンナン構造は、比較的単純であり、マンナン主鎖に沿って様々な間隔で単一単位のα−１，６−結合ガラクトシル側鎖を有するβ−１，４結合マンノース分子の直鎖状主鎖から成る。コーヒーについては確かではないが、いくつかの植物では、ガラクトグルコマンナンを生じさせる、マンナンが散在するグルコースもまたある。
【０００３】
Ｃｌｉｆｆｏｒｄ（１９８６，Ｔｅａ  Ｃｏｆｆｅｅ  Ｔｒａｄｅ  Ｊ．１５８，３０−３２）は、アラビカコーヒー（コフィア・アラビカ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ））が、ロブスタコーヒー（コフィア・カネフォラ（Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ））（６〜８％）よりも多くのアラビノガラクタン（９〜１３％）を含有し、同様に、より多くのガラクトマンナン（ロブスタ種では１９〜２２％に対してアラビカ種では２５〜３０％）を含有し得ることを報告している。著者はまた、ロブスタ種におけるガラクトマンナンがより高度に分岐しており、したがってそれほど結晶性ではないことをも示唆した。この提案は、まだ実証されていないが、なぜ、同じ程度の焙煎で、ロブスタ種が、一般に、アラビカ種よりも可溶性の固体を産生するのかを説明するために使用されてきた（Ｃｌｉｆｆｏｒｄ，１９８５，Ｉｎ：Ｍ．Ｎ．Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｋ．Ｃ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｃｏｆｆｅｅ  Ｂｏｔａｎｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅａｎｓ  ａｎｄ  Ｂｅｖｅｒａｇｅ，Ｃｒｏｏｍ  Ｈｅｌｍ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．３０５−３７４．；Ｃｌｉｆｆｏｒｄ，１９８６，ｓｕｐｒａ；Ｔｒｕｇｏ，１９８５，Ｉｎ：Ｒ．Ｊ．Ｃｌａｒｋｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｍａｃｒａｅ，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｃｏｆｆｅｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ．８３−１１４）。あるアラビカ品種及びあるロブスタ品種の豆から単離された多糖の研究において、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）は、それらの試料において多糖の量におけるいかなる有意差も見出さなかったが、アラビカ品種の多糖が、ロブスタ品種よりもわずかに多くのマンノース含有量を有したことが注目される。さらに、検出可能な差異は、検査されたアラビカ品種及びロブスタ品種のガラクトマンナンにおいて見られなかった。Ｒｅｄｇｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３７，４２１−４３１）及びＯｏｓｔｅｒｖｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ５２，２８５−２９６）は、生の豆の中にもともと存在する多糖の４０％超が、より長い焙煎期間後に分解されることを報告した。しかしながら、Ｒｅｄｇｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、前掲）は、アラビノガラクタンが、マンナンよりも、焙煎の間の分解に対して感受性であり、セルロースポリマーは、作用を受けなかったことを示した。焙煎の間のガラクトマンナンの限られた分解により、ガラクトマンナンが、焙煎された豆の中で、抽出するのが最も困難な部分の１つであるという考えが導かれた。ガラクトマンナンが、コーヒー豆の大部分を構成するので、ガラクトマンナンがどのように合成され、コーヒー豆胚乳中で分解されるのか理解するために、かなりの量の研究努力が、費やされてきた。その研究の主な目的は、改変されたガラクトマンナンレベル及び／又は構造を有し、したがって、たとえば、より低い温度での改善された抽出性を有していてもよいコーヒーを開発する及び／又は発見することであった。
【０００４】
ガラクトマンナン合成は、ゴルジ小胞の膜中で共存し、複合体としてともに働くと考えられる２つの酵素、マンナンシンターゼ（ＭａｎＳ）及びガラクトマンナンガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＭＧＴ）によって実行される（Ｄｈｕｇｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，３６３−３６６；Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３４，１１５３−１１６２）。コーヒー豆ガラクトマンナン合成に関与するＭａｎＳ及びＧＭＧＴ遺伝子配列並びに植物の他の部分におけるガラクトマンナン合成のための配列は、単離され、特徴付けられている（Ｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ａｎｎ．Ｂｏｔ．（Ｌｏｎｄ）１０２，２０７−２２０；ＷＯ２００７／０４７６７５Ａ２）。ガラクトマンナン合成の間に、セルロースシンテターゼと関係するＭａｎＳ酵素は、ＧＤＰマンノース（ＧＤＰ−Ｍａｎ）前駆物質を使用して、マンナン主鎖を重合するが、ＧＭＧＴ酵素は、ＵＤＰ−ガラクトース前駆物質から成長中のマンナン主鎖にガラクトース残基を移すことを担う（Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、前掲）。それらの遺伝子によってコードされる酵素の発現又は活性の調整は、植物における、特に豆におけるガラクトマンナンの量を増加させる又は減少させるために使用することができることが示唆された（ＷＯ２００７／０４７６７５Ａ２）。
【０００５】
マンナナーゼは、ガラクトマンナン分解に関与し、これはまた、植物又は植物組織中に存在するガラクトマンナンの量に影響を与え得る。コーヒーマンナナーゼは、単離され、特徴付けられている（ＷＯ００／２８０４６；ＵＳ７，１４８，３９９Ｂ２）。別個のエンド−ベータマンナナーゼ（ｍａｎＡ及びｍａｎＢ）をコードする２つのｃＤＮＡが、発芽コーヒー豆から単離された（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｌａｎｔａ  ２１３：２９６−３０８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
コーヒー豆におけるガラクトマンナンの重要性並びにガラクトマンナン合成及び分解に参加する酵素の絶対的な重要性にもかかわらず、それらの遺伝子又は酵素の使用を通して豆におけるガラクトマンナンの量又は構造のいずれかを調整する際の進歩は、ほとんど得られていない。したがって、コーヒーにおけるガラクトマンナン含有量及び／又は構造を操作するための新しい方法を同定し、開発するための必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＵＧＰＰ）、ＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ（ＧＭＰＰ）、ホスホマンノムターゼ（ＰＭＭ）、及びＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ（ＵＧＥ）から選択されるガラクトマンナン前駆物質合成酵素をコードするコード配列を含む、コフィア属種（Ｃｏｆｆｅａ  ｓｐｐ．）から単離される核酸分子を特徴とする。一実施形態では、ガラクトマンナン前駆物質合成酵素は、ＢＬＡＳＴ比較によって決定される、配列番号６〜１０のいずれか１つとその全体にわたって約８０％超同一であるアミノ酸配列を含む。特に、ガラクトマンナン前駆物質合成酵素は、配列番号６〜１０のいずれか１つを含む。核酸分子は、配列番号１〜５のいずれか１つを含んでいてもよい。ある実施形態では、コード配列は、（１）遺伝子のオープンリーディングフレーム又は（２）遺伝子の転写によって産生されるｍＲＮＡ分子又は（３）ｍＲＮＡの分子の逆転写によって産生されるｃＤＮＡ分子である。
【０００８】
本発明の他の態様は、ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＵＧＰＰ）、ＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ（ＧＭＰＰ）、ホスホマンノムターゼ（ＰＭＭ）、及びＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ（ＵＧＥ）から選択されるガラクトマンナン前駆物質合成酵素をコードする前述のコード配列を含むベクターを特徴とする。一実施形態では、ベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌、酵母、及びウイルスベクターから成るベクターの群から選択される発現ベクターである。核酸分子のコード配列は、恒常的プロモーターに作動可能に連結することができ、又はそれは、誘発性プロモーターに作動可能に連結することができる又はそれは、組織特異的プロモーターに作動可能に連結することができる。いくつかのプロモーターは、誘発性であるのみならず、組織特異的であるが、他のものは、恒常的であり、且つ特異的組織である。任意選択で、組織特異的プロモーターは、種子特異的プロモーターである。コーヒー由来の種子特異的プロモーターは、特に適している。
【０００９】
本発明の他の態様は、前述のベクターのうちの１つ又は複数により形質転換された宿主細胞を特徴とする。宿主細胞は、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞から選択されてもよい。ある実施形態では、宿主細胞は、コーヒー、タバコ、アラビドプシス、トウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、モロコシ、アルファルファ、クローバ、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ピーナッツ、カカオ、オオブドウホオズキ、ジャガイモ、コショウ、ナス、サトウダイコン、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウ、アスター、ベゴニア、キク、ヒエンソウ、ツクバネアサガオ、ヒャクニチソウ、及び芝草から成る植物の群から選択される植物細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、コーヒー由来のものである。前述の植物細胞のいずれかから産生される稔性植物もまた、提供される。
【００１０】
本発明の他の態様は、植物におけるガラクトマンナン含有量を調整するための方法であって、植物内の１つ又は複数のガラクトマンナン前駆物質合成酵素の産生又は活性を調整して、植物の改変されたガラクトマンナン含有量をもたらすステップを含む方法を特徴とする。特定の実施形態では、植物は、コーヒー植物である。そのような方法は、コーヒー種子内のガラクトマンナンの量及び／又は構造を改変することによって、コーヒー種子の抽出性を調整するために使用することができる。ある実施形態では、ガラクトマンナン前駆物質合成酵素は、ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＵＧＰＰ）、ＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ（ＧＭＰＰ）、ホスホマンノムターゼ（ＰＭＭ）、又はＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ（ＵＧＥ）である。
【００１１】
方法の一実施形態は、たとえば、植物内のＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥのうちの１つ又は複数をコードする遺伝子の発現を増加させることによって、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥのうちの１つ又は複数の産生又は活性を増加させるステップを含む。これは、植物の中に、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥのうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数の導入遺伝子を導入することによって達成することができる。
【００１２】
方法の他の実施形態は、たとえば、植物内のＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥのうちの１つ又は複数をコードする遺伝子の発現を減少させることによって、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥのうちの１つ又は複数の産生又は活性を減少させるステップを含む。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡなどのような、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥのうちの１つ又は複数の翻訳の阻害剤をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを植物の中に導入することによって達成されてもよい。
【００１３】
本発明の他の特徴及び利点は、続く図面、詳細な説明、及び実施例に対する参照によって理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＣｃＵＧＰＰ（ｐｃｃｃｓ４６ｗ９ｌ８）（配列番号６）、ＳｔＵＧＰＰ（ＣＡＡ７９３５７）（配列番号１１）、ＯｓＵＧＰＰ（ＡＢＤ５７３０８）（配列番号１２）、ＣｍＵＧＰＰ（ＡＢＤ９８８２０）（配列番号１３）、及びＡｔＵＧＰＰ（ＡＡＫ３２７７３）（配列番号１４）のタンパク質配列アライメントを示す図である。コフィア・カネフォラＵＧＰＰ遺伝子（ＣｃＵＧＰＰ）によってコードされるタンパク質配列との、ＮＣＢＩデータベースにおいて入手可能であるソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）ＵＧＰＰ（ＳｔＵＧＰＰ）、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ）ＵＧＰＰ（ＯｓＵＧＰＰ）、ククミス・メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ）ＵＧＰＰ（ＣｍＵＧＰＰ）、及びアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＧＰＰ（ＡｔＵＧＰＰ）タンパク質配列のアライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗを使用して行った。グレーでマークしたアミノ酸は、コフィア・カネフォラＵＧＰＰ配列において見つけられた残基と一致する。
【図２】ＣｃＧＭＰＰ（ｐｃｃｃｌ２２ｉ１９）（配列番号７）、ＳｔＧＭＰＰ（ＡＡＤ０１７３７）（配列番号１５）、ＳｌＧＭＰＰ（ＡＡＴ３７４９８）（配列番号１６）、ＭｓＧＭＰＰ（ＡＡＴ５８３６５）（配列番号１７）、及びＶｖＧＭＰＰ（ＣＡＯ６９１３７）（配列番号１８）のタンパク質配列アライメントを示す図である。コフィア・カネフォラＧＭＰＰ遺伝子（ＣｃＧＭＰＰ）によってコードされるタンパク質配列との、ＮＣＢＩデータベースにおいて入手可能であるソラナム・ツベロサムＧＭＰＰ（ＳｔＧＭＰＰ）、ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）ＧＭＰＰ（ＳｌＧＭＰＰ）、メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）ＧＭＰＰ（ＭｓＧＭＰＰ）、及びビティス・ビネフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）ＧＭＰＰ（ＶｖＧＭＰＰ）タンパク質配列のアライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗを使用して行った。グレーでマークしたアミノ酸は、コフィア・カネフォラＧＭＰＰ配列において見つけられた残基と一致する。
【図３】ＣｃＰＭＭ（ｐｃｃｃｓ４６ｗ３ａ１４）（配列番号８）、ＧｍＰＭＭ（ＡＢＤ９７８７３）（配列番号１９）、ＶｖＰＭＭ（ＣＡＯ３９３５４）（配列番号２０）、ＰｔＰＭＭ（ＡＢＫ９６０５６）（配列番号２１）、及びＡｔＰＭＭ（ＡＢＤ９７８７０）（配列番号２２）のタンパク質配列アライメントを示す図である。コフィア・カネフォラＰＭＭ遺伝子（ＣｃＰＭＭ）によってコードされるタンパク質配列との、ＮＣＢＩデータベースにおいて入手可能であるグリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）ＰＭＭ（ＧｍＰＭＭ）、ビティス・ビネフェラＰＭＭ（ＶｖＰＭＭ）、ポプルス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）ＰＭＭ（ＰｔＰＭＭ）、及びアラビドプシス・タリアナＰＭＭ（ＡｔＰＭＭ）タンパク質配列のアライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗを使用して行った。グレーでマークしたアミノ酸は、コフィア・カネフォラＰＭＭ配列において見つけられた残基と一致する。
【図４】ＣｃＵＧＥ１（ＳＧＮ−Ｕ３４７９５２）（配列番号９）、ＣｃＵＧＥ５（ｐｃｃｃｌ１７ｊ２４）（配列番号１０）、ＡｔＵＧＥ１（ＮＰ＿１７２７３８）（配列番号２３）、ＡｔＵＧＥ３（ＮＰ＿５６４８１１）（配列番号２４）、ＳｔＵＧＥ５１（ＡＡＰ９７４９３）（配列番号２５）、ＡｔＵＧＥ５（ＮＰ＿１９２８３４）（配列番号２６）、ＡｔＵＧＥ２（ＮＰ＿１９４１２３）（配列番号２７）、ＡｔＵＧＥ４（ＮＰ＿１７６６２５）（配列番号２８）、ＰｔＵＧＥ（ＡＢＫ９５３０３）（配列番号２９）、ＳｔＵＧＥ４５（ＡＡＰ４２５６７）（配列番号３０）、及びＶｖＵＧＥ（ＣＡＮ６３４７７）（配列番号３１）のタンパク質配列アライメントを示す図である。コフィア・カネフォラＵＧＥ１（ＣｃＵＧＥ１）及びＵＧＥ５（ＣｃＵＧＥ５）遺伝子によってコードされるタンパク質配列との、ＮＣＢＩデータベースにおいて入手可能であるアラビドプシス・タリアナＵＧＥ１（ＡｔＵＧＥ１）、ＵＧＥ３（ＡｔＵＧＥ３）、ソラナム・ツベロサムＵＧＥ５１（ＳｔＵＧＥ５１）、ポプルス・トリコカルパＵＧＥ（ＰｔＵＧＥ）、ソラナム・ツベロサムＵＧＥ４５（ＳｔＵＧＥ４５）並びにアラビドプシス・タリアナＵＧＥ２（ＡｔＵＧＥ２）、ＵＧＥ４（ＡｔＵＧＥ４）、及びＵＧＥ５（ＡｔＵＧＥ５）タンパク質配列のアライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗを使用して行った。グレーでマークしたアミノ酸は、コフィア・カネフォラＵＧＥ１配列において見つけられた残基と一致する。
【図５】図４において示されるＣｌｕｓｔａｌＷを使用して実行したタンパク質の（ｐｒｏｔｅｉｃ）アライメントに由来する、ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアによって得られた系統樹を示す図である。
【図６】組換えＨｉｓタグ付きＣｃＵＧＥ５及びＣｃＵＧＰＰの発現を示す図である。組換えＨＩＳ−ＣｃＵＧＥ５及びＨＩＳ−ＣｃＵＧＰＰ融合タンパク質（それぞれｐＧＴ２及びｐＧＴ３）の発現の様々なステージ由来の抽出物は、クーマシーブルー染色を使用して、８〜１６％Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＡＧＥ  Ｇｅｌ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．）上で分析した。ラダーは、ゲルの左に置いた（Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｌｏｗ  Ｒａｎｇｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ））。それぞれのタンパク質について、４画分を置き、（左から右に）：非誘発：誘発していないｐＧＴ２（ＨＩＳ−ＣｃＵＧＥ５）又はｐＧＴ３（ＣｃＵＧＰＰ）を含有するＢｌ２１組換え細胞の全溶解物；誘発：０．２ｍＭ  ＩＰＴＧにより誘発したｐＧＴ２（ＨＩＳ−ＣｃＵＧＥ５）又はｐＧＴ３（ＣｃＵＧＰＰ）を含有するＢｌ２１組換え細胞の全溶解物；可溶性：ＢｕｇＢｕｓｔｅｒを使用する溶解処理後の誘発溶解物の可溶性画分；不溶性：ＢｕｇＢｕｓｔｅｒを使用する溶解処理後の誘発溶解物の不溶性画分とする。
【図７】ロブスタ種ＦＲＴ３２、ＦＲＴ０５、及びＦＲＴ６４並びにアラビカ種Ｔ２３０８についての異なる豆発育段階でのＵＧＥ１並びにＵＧＥ５の定量的発現分析を示す図である。それぞれの遺伝子の発現は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、様々な豆試料において測定した。ＲＱは、恒常的に発現される遺伝子ＲＰＬ３９と比べた遺伝子の発現レベルである。ＳＧ、小さな生の段階の豆；ＬＧ、大きな生の段階の豆；ＹＧ、黄色の段階の豆；ＲＧ、赤色の段階の豆。この実験において使用するｃＤＮＡのコードは、ｃＤＮＡ３−ＲＮＡ  ＦＲＴ３２−１、ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ  ＦＲＴ０５−３、ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ  ＦＲＴ６４−３、及びｃＤＮＡ３−ＲＮＡ  Ｔ２３０８−２である。
【図８】ロブスタ種ＦＲＴ３２、ＦＲＴ０５、及びＦＲＴ６４並びにアラビカ種Ｔ２３０８についての異なる豆発育段階でのＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、並びにＰＭＭの定量的発現分析を示す図である。それぞれの遺伝子の発現は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、様々な豆試料において測定した。ＲＱは、恒常的に発現される遺伝子ＲＰＬ３９と比べた遺伝子の発現レベルである。ＳＧ、小さな生の段階の豆；ＬＧ、大きな生の段階の豆；ＹＧ、黄色の段階の豆；ＲＧ、赤色の段階の豆。この実験において使用するｃＤＮＡのコードは、ｃＤＮＡ３−ＲＮＡ  ＦＲＴ３２−１、ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ  ＦＲＴ０５−３、ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ  ＦＲＴ６４−３、及びｃＤＮＡ３−ＲＮＡ  Ｔ２３０８−２である。
【図９】コフィア・カネフォラ（ロブスタ種、ＦＲＴ３２）及びコフィア・アラビカ（アラビカ種、Ｔ２３０８）におけるＵＧＥ１、ＵＧＥ５、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ及び、ＰＭＭの定量的発現分析を示す図である。それぞれの遺伝子の発現は、方法において記載されるように、ＴａｑＭａｎ特異的プローブを使用し、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。それぞれの組織試料についてのＲＱ値は、分析したそれぞれの試料において広範に発現されるｒｐｌ３９遺伝子の転写レベルに対する試験遺伝子の転写レベルを標準化することによって決定した。データは、それぞれの試料について３つの増幅反応から得られた平均値を示し、誤差バーはＳＤを示す。Ｇ、豆；Ｐ、果皮；ＳＧ、小さな生の段階の豆；ＬＧ、大きな生の段階の豆；ＹＧ、黄色の段階の豆；ＲＧ、赤色の段階の豆。この実験において使用するｃＤＮＡのコードは、ｃＤＮＡ３−ＲＮＡ  ＦＲＴ３２−１；ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ  ＦＲＴ０５−３；ｃＤＮＡ１−ＲＮＡ  ＦＲＴ６４−３、及びｃＤＮＡ３−ＲＮＡ  Ｔ２３０８−２である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義：
生体分子及び本発明の他の態様に関係する様々な用語は、本明細書及び請求項を通して使用される。用語が、本明細書においてその他に明確に定義されない限り、用語は、分子生物学及び生化学の分野におけるそれらの通常の意味を有すると見なされる。
【００１６】
「単離」は、天然状態から「人の手によって」改変されたことを意味する。組成物又は物質が自然界で生じる場合、それが、変化している又はそのもとの環境から取り出されている又はその両方である場合、それは、「単離されている」。たとえば、生きている植物又は動物において天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは、「単離されていない」が、その天然状態の共存する物質から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、用語が本明細書において用いられるように、「単離されている」。
【００１７】
「核酸分子」とも呼ばれる「ポリヌクレオチド」は、一般に、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これは、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」は、限定を伴うことなく、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた、１つ又は複数の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ及び安定性又は他の理由のために修飾主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡをも含む。「修飾」塩基は、たとえばトリチル化塩基及びイノシンなどのようなまれな塩基を含む。様々な修飾は、ＤＮＡ及びＲＮＡに対して成すことができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は、自然界において典型的に見つけられるポリヌクレオチドの化学的に、酵素により、又は代謝的に修飾された形態並びにウイルス及び細胞特有のＤＮＡ及びＲＮＡの化学形を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い、比較的短いポリヌクレオチドを包含する。
【００１８】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合、つまりペプチド同配体によって互いにつながれた２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を指す。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチド、又はオリゴマーと呼ばれる短い鎖及び一般にタンパク質と呼ばれる長い鎖を指す。ポリペプチドは、２０の遺伝子にコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含有してもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングなどのような天然のプロセスによって又は当技術分野においてよく知られている化学修飾技術によって修飾されたアミノ酸配列を含む。そのような修飾は、基本的な教科書において、より詳細な学術論文において、及び豊富な研究文献において十分に記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、及びアミノ又はカルボキシル末端を含むポリペプチドにおけるいかなる場所にも生じ得る。同じタイプの修飾が、所与のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じ程度又は様々な程度で存在してもよいことが十分に理解されるであろう。また、所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含有していてもよい。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐していてもよく、それらは、分岐を伴って又は伴わないで環状であってもよい。環状、分岐、分岐環状ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスに起因してもよい又は合成の方法によって作製されてもよい。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのような、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性の追加、及びユビキチン化を含む。たとえばＰｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３及びＷｏｌｄ，Ｆ．，ｐｐ１−１２  ｉｎ  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２，６２６−６４６及びＲａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３，４８−６２を参照されたい。
【００１９】
「変異体」は、用語が本明細書において使用されるように、それぞれ参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドと異なるが、本質的な特性を保持するポリヌクレオチド又はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、他の参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列における変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変してもよい又はしなくてもよい。ヌクレオチド変化は、下記に議論されるように、参照配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、追加、欠失、融合、及び切断をもたらしてもよい。ポリペプチドの典型的な変異体は、他の参照ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般に、差異は、参照ポリペプチド及び変異体の配列が、全体的に厳密に類似しており、多くの領域において同一であるように、限られている。変異体及び参照ポリペプチドは、任意の組み合わせにおいて、１つ又は複数の置換、追加、又は欠失によってアミノ酸配列において異なっていてもよい。置換又は挿入アミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされるものであってもよい又はなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などのように、天然に存在してもよい又はそれは、天然に生じることが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技術又は直接的な合成によって作製されてもよい。
【００２０】
本明細書において使用される「抗体」は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、キメラ、単鎖、並びにヒト化抗体並びにＦａｂの産物又は他の免疫グロブリン発現ライブラリーを含む抗体断片（たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）を含む。抗体に関して、用語「免疫学的に特異的な」又は「特異的な」は、対象のタンパク質の１つ又は複数のエピトープに結合するが、抗原性の生体分子の混合性の集団を含有する試料において他の分子を実質的に認識せず、それに結合しない抗体を指す。抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、よく知られており、当技術分野においてルーチン的に実施される。そのようなアッセイの包括的な議論については、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８），Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。
【００２１】
一本鎖核酸分子に関して、用語「特異的にハイブリダイズする」は、一般に、当技術分野において使用されるあらかじめ決定された条件下でそのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な配列の２つの一本鎖核酸分子の間の関連を指す（時に「実質的に相補的な」と称される）。特に、用語は、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含有される実質的に相補的な配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを指す。非相補的な配列の一本鎖核酸とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実質的に排除する。
【００２２】
「コード配列」又は「コード領域」は、配列が発現する場合に、アミノ酸又はポリペプチドなどのような遺伝子産物を産生するのに必要な配列情報を有する核酸分子を指す。コード配列は、翻訳領域内に非翻訳配列（たとえばイントロン又は５’若しくは３’非翻訳領域）を含んでいてもよい又はそのような介在非翻訳配列を欠いていてもよい（たとえばｃＤＮＡにおいてのように）。ある公的なデータベース、たとえばＧｅｎＢａｎｋでは、用語「ＣＤＳ」は、時に利用される。その文脈におけるＣＤＳは、コードタンパク質におけるアミノ酸の配列と対応するヌクレオチドの配列である。典型的なＣＤＳは、ＡＴＧで開始し、終止コドンで終了する。用語ＣＤＳはまた、ｃＤＮＡの完全なコード配列を指すために使用することもできる。用語「コード配列」は、時に、用語「オープンリーディングフレーム」と区別なく使用される。
【００２３】
「イントロン」は、タンパク質合成と関係する情報をコードしない、核酸におけるポリヌクレオチド配列を指す。そのような配列は、ｍＲＮＡに転写されるが、タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳前に除去される。
【００２４】
用語「作動可能に連結された」又は「作動可能に挿入された」は、コード配列の発現のために必要な調節配列が、コード配列の発現を可能にするように、コード配列に関する適切な位置で核酸分子において配置されることを意味する。例として、プロモーターがそのコード配列の転写又は発現を制御することができる場合、プロモーターは、コード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センス又はアンチセンス配向において、プロモーター又は調節配列に作動可能に連結することができる。用語「作動可能に連結された」は、発現ベクターにおける他の転写制御エレメント（たとえばエンハンサー）の配置に対して時に適用される。
【００２５】
転写及び翻訳制御配列は、宿主細胞においてコード配列の発現をもたらす、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのようなＤＮＡ調節配列である。
【００２６】
用語「プロモーター」、「プロモーター領域」、又は、「プロモーター配列」は、一般に、遺伝子の転写調節領域を指し、これは、コード領域の５’若しくは３’側に、コード領域内に、又はイントロン内に見つけられてもよい。典型的に、プロモーターは、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流の（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。典型的な５’プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端で境界を示され、バックグラウンドよりも検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低限の数の塩基又はエレメントを含むように上流に（５’方向）伸長する。プロモーター配列内には、転写開始部位（核酸分解酵素Ｓ１を用いてマッピングすることによって好都合に定義される）及びＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。
【００２７】
「ベクター」は、他の核酸セグメントがセグメントの複製又は発現をもたらすように作動可能に挿入されてもよい、プラスミド、ファージ、コスミド、又はウイルスなどのようなレプリコンである。
【００２８】
用語「核酸構築物」又は「ＤＮＡ構築物」は、適切な調節配列に作動可能に連結され、細胞を形質転換するためにベクターに挿入されるコード配列（複数可）を指すために時に使用される。この用語は、用語「形質転換ＤＮＡ」又は「導入遺伝子」と区別なく使用されてもよい。そのような核酸構築物は、選択マーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子と共に、対象の遺伝子産物についてのコード配列を含有していてもよい。
【００２９】
「マーカー遺伝子」又は「選択マーカー遺伝子」は、そのコード遺伝子産物が、遺伝子を含有していない細胞の中から遺伝子を含有する細胞が選択されるのを可能にする特徴を与える遺伝子である。遺伝子工学のために使用されるベクターは、１つ又は複数の選択マーカー遺伝子を典型的に含有する。選択マーカー遺伝子のタイプは、（１）抗生物質抵抗性遺伝子、（２）除草剤耐性又は抵抗性遺伝子、及び（３）細胞が他の場合には産生することができない必須の構成成分、通常アミノ酸を形質転換細胞が合成するのを可能にする代謝又は栄養要求性マーカー遺伝子を含む。
【００３０】
「レポーター遺伝子」はまた、一種のマーカー遺伝子である。それは、標準的な実験用の手段によってアッセイすることができる又は検出可能である遺伝子産物を典型的にコードする（たとえば酵素活性、蛍光）。
【００３１】
用語「発現する」「発現された」、又は遺伝子の「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。プロセスは、ｍＲＮＡへの遺伝子の転写、次いで１つ又は複数のポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を含み、天然に存在する翻訳後修飾をすべて包含する。
【００３２】
「内因性」は、指定される生物内で天然に見つけることができる任意の構成成分、たとえば遺伝子若しくは核酸又はポリペプチドを指す。
【００３３】
核酸構築物の「異種」領域は、自然界におけるより大きな分子と関連して見つけられない、より大きな分子内の核酸分子の同定可能なセグメント（複数可）である。したがって、異種領域が遺伝子を含む場合、遺伝子には、供給源の生物のゲノムにおけるゲノムＤＮＡが隣接していないＤＮＡが通常隣接するであろう。他の例において、異種領域は、コード配列がそれ自体、自然界において見つけられない構築物である（たとえば、ゲノムコード配列がイントロンを含有するｃＤＮＡ又は天然の遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子変異又は天然に存在する突然変異事象により、本明細書において定義されるＤＮＡの異種領域は生じない。上記に定義される用語「ＤＮＡ構築物」はまた、異種領域、特に、細胞の形質転換において使用するために構築されたものを指すためにも使用される。
【００３４】
細胞は、そのようなＤＮＡが細胞の内部に導入されている場合、外因性又は異種ＤＮＡによって「形質転換されている」又は「トランスフェクトされている」。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムの中に統合（共有結合）されてもよい又はされなくてもよい。たとえば原核生物、酵母、及び哺乳動物細胞において、形質転換ＤＮＡは、プラスミドなどのようなエピソームエレメント上に維持されてもよい。真核細胞に関して、安定して形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体複製を通して娘細胞に遺伝するように、形質転換ＤＮＡが、染色体の中に統合されるようになった細胞である。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団から構成される細胞株又はクローンを確立する真核細胞の能力によって実証される。「クローン」は、有糸分裂によって単一の細胞又は共通祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は、何世代もの間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて安定成長が可能な初代細胞のクローンである。
【００３５】
突然変異体植物に関して、用語「ｎｕｌｌ突然変異体」又は「機能喪失型の突然変異体」は、遺伝子産物が非機能性となる又はほとんど不在となるようにする突然変異を有する生物又はゲノムＤＮＡ配列を示すために使用される。そのような突然変異は、遺伝子のコード及び／又は調節領域において生じてもよく、個々の残基の変化又は核酸の領域の挿入若しくは欠失であってもよい。これらの突然変異はまた、タンパク質が非機能性となる又はほとんど不在となるようにするように、遺伝子及び／又はコードタンパク質を調節してもよい又は制御してもよい他の遺伝子のコード及び／又は調節領域において生じてもよい。
【００３６】
「豆」、「種子」、又は「マメ」は、もう１つの顕花植物の植物に発達することができる、繁殖の顕花植物の単位を指す。本明細書において使用されるように、とりわけ、コーヒー植物に関して、用語は、同義的に区別なく使用される。
【００３７】
「酵素」は、酵素活性を有するタンパク質である。
【００３８】
「ガラクトマンナン前駆物質合成酵素」及び「ガラクトマンナン前駆物質合成遺伝子」は、ガラクトマンナンポリマーの合成に必要とされる前駆物質分子の合成に関与するタンパク質又は酵素及びそれをコードする遺伝子を指す。ガラクトマンナン前駆物質合成酵素は、ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＵＧＰＰ）、ＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ（ＵＧＥ）、ホスホマンノムターゼ（ＰＭＭ）、及びＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ（ＧＭＰＰ）を含む。同様に、ガラクトマンナン前駆物質合成遺伝子は、ＵＧＰＰ、ＵＧＥ、ＰＭＭ、及びＧＭＰＰをコードする遺伝子を含む。
【００３９】
本明細書において使用されるように、用語「植物」は、植物全体、植物器官（たとえば葉、茎、枝、新芽、根）、種子、花粉、植物細胞、植物細胞小器官、及びその稔性子孫を含む子孫への参照を含む。トランスジェニック植物の部分は、たとえば、トランスジェニック植物又はそれらの子孫に由来する植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚及び花、茎、枝、種子、花粉、果実、葉、又は根を含むように本発明の範囲内で理解される。
【００４０】
範囲は、範囲内のそれぞれ及びすべての値を列挙し、記載する必要を回避するために、省略表現として本明細書において使用される。範囲内のあらゆる適切な値を、より上の値、より低い値、又は範囲の末端として、適切である場合、選択することができる。
【００４１】
本明細書において使用されるように、文脈が明確にその他に指示しない限り、単語の単数形は、複数形を含み、その逆も成立する。したがって、指示「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、それぞれの用語の複数形を一般に含む。たとえば、「酵素」、「植物」、若しくは「方法」又は「疾患」への言及は、複数のそのような「酵素」、「植物」、又は「方法」を含む。同様に、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的ではなく、包括的に解釈される。同様に、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「又は」はすべて、そのような解釈が文脈から明確に禁止されない限り、包括的であると解釈される。同様に、用語「例」は、特に用語の列挙が続く場合、単に例示的なものであり、例証となるものであり、排他的又は包括的であると見なされるべきでない。
【００４２】
用語「含む」は、用語「〜から本質的に成る」及び「〜から成る」によって包含される実施形態を含むように意図される。同様に、用語「〜から本質的に成る」は、用語「〜から成る」によって包含される実施形態を含むように意図される。
【００４３】
本明細書において開示される方法及び組成物並びに他の進歩は、当業者が十分に理解するように、それらは変化し得るので、特定の方法、プロトコール、及び試薬に限定されない。さらに、本明細書において使用される術語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためにあり、開示される又は主張されるものの範囲を限定するように意図されず、またそれを限定しない。
【００４４】
その他に定義されない限り、技術及び科学用語、当技術分野の用語、並びに本明細書において使用されるアクロニムはすべて、本発明の分野（複数可）における又は用語が使用される分野（複数可）における当業者によって一般に理解される意味を有する。あらゆる組成物、方法、製品、又は本明細書において記載されるものに類似する若しくは等価である他の手段若しくは物質を本発明の実施において使用することができるが、好ましい組成物、方法、製品、又は他の手段若しくは物質が本明細書において記載される。
【００４５】
本明細書において引用される又は参照される特許、特許出願、刊行物、技術的な及び／又は学術的な記事、並びに他の参考文献はすべて、法律によって許可される程度まで、参照によって本明細書においてそれらの全体が組み込まれる。それらの参考文献の議論は、単に、その中で成される主張を概説するように意図される。あらゆるそのような特許、特許出願、刊行物、若しくは参考文献又はその任意の部分が、関連する題材である又は先行技術であるといういかなる許可も、成されない。関連する資料又は先行技術としてのそのような特許、特許出願、刊行物、及び他の参考文献のあらゆる主張の正確性及び妥当性に異議を唱える権利は、明確に留保される。
【００４６】
説明：
ガラクトマンナンは、生コーヒー豆において見つけられる多糖の重要なグループである。特定のこのコーヒーポリマーは、可溶性にするのが困難であることが知られている。したがって、コーヒー豆におけるガラクトマンナンの量を低下させ、それによって、より低い温度で、焙煎されたコーヒーのより高度な溶解性を達成するための方法を見つけることがある種の研究努力の目的である。他の研究目的は、コーヒー豆におけるガラクトマンナンの溶解性を改変し、その結果、大量に存在していても、より低い温度で抽出するのがより容易となることである。これまでに、そのような努力は、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＭＧＴａｓｅ）、マンナンシンターゼ（ＭａｎＳ）、及びマンナナーゼを使用して、ガラクトマンナン合成及び分解に関与する酵素の量又は活性を改変することに集中してきた。他のより包括的な努力により、事例研究としてコフィア・アラビカを使用して、多数の代謝経路の間の関係を決定することが試みられてきたが、特にガラクトマンナン経路に集中していなかった（Ｊｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｒｉｌ  ２００９，Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．１８２（１），１４６−１６２）。
【００４７】
本発明は、部分的に、発明者の見識から生じる。コーヒー豆内のガラクトマンナン含有量又は構造はまた、合成酵素（ＧＭＧＴａｓｅ及びＭａｎＳ）に対する、基質又は上流の中間体、つまり、マンノース１−ホスフェート、ＧＤＰマンノース、ＵＤＰグルコース、及びＵＤＰガラクトースの有効性を改変することによって調整されてもよい。さらに、発明者らは、（１）ＵＤＰグルコースへのグルコース１−リン酸の変換を触媒するＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＵＧＰＰ）；（２）ＵＤＰガラクトースへのＵＤＰグルコースの変換を触媒するＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ（ＵＧＥ）；（３）マンノース１−ホスフェートへのマンノース６−リン酸の変換を触媒するホスホマンノムターゼ（ＰＭＭ）；及び（４）ＧＤＰマンノースへのマンノース−１−ホスフェートの変換を触媒するＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ（ＧＭＰＰ）を含む、これらの前駆物質の形成に関与する酵素の量又は活性を調整することによって、生物学的レベルでこれを達成することができることを十分に理解した。
【００４８】
下記に詳細に記載されるように、発明者らは、これらの遺伝子に対するコフィア・カネフォラｃＤＮＡを単離し、コーヒーチェリーの発育の間に及び他のいくつかのコーヒー組織において発現を決定した。ガラクトマンナンレベル及び／又はコーヒーの溶解性を調整することを目的とした、ガラクトマンナン前駆物質合成を調整するためにこれらの遺伝子及びそれらのコード酵素を利用するための方法もまた、開発した。
【００４９】
ポリヌクレオチド及びポリペプチド：
本発明の一態様は、ガラクトマンナン前駆物質の合成に関与する酵素をコードする、コーヒー由来の核酸分子を特徴とする。これらは、ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＵＧＰＰ）、ＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ（ＧＭＰＰ）、ホスホマンノムターゼ（ＰＭＭ）、及びＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ（ＵＧＥ）を含み、時に、まとめて「ガラクトマンナン前駆物質合成酵素」と呼ばれる。コフィア・カネフォラ由来の完全なＵＧＰＰをコードするｃＤＮＡは、配列番号１として本明細書において記載され、ＣｃＵＧＰＰと呼ばれる。コフィア・カネフォラ由来の完全なＧＭＰＰをコードするｃＤＮＡは、配列番号２として本明細書において記載され、ＣｃＧＭＰＰと呼ばれる。コフィア・カネフォラ由来の完全なＰＭＭをコードするｃＤＮＡは、配列番号３として本明細書において記載され、ＣｃＰＭＭと呼ばれる。コフィア・カネフォラ由来の完全なＵＧＥをコードする２つのｃＤＮＡは、配列番号４及び配列番号５として本明細書において記載され、それぞれ、ＣｃＵＧＥ１及びＣｃＵＧＥ５と呼ばれる。
【００５０】
本発明の他の態様は、これらの核酸分子の発現によって産生されるタンパク質を特徴とする。配列番号１の翻訳によって産生されるＣｃＵＧＰＰタンパク質の推定されるアミノ酸配列は、配列番号６として本明細書において記載される。配列番号２の翻訳によって産生されるＣｃＧＭＰＰタンパク質の推定されるアミノ酸配列は、配列番号７として本明細書において記載される。配列番号３の翻訳によって産生されるＣｃＰＭＭタンパク質の推定されるアミノ酸配列は、配列番号８として本明細書において記載される。配列番号４及び配列番号５の翻訳によって産生されるＣｃＵＧＥ１及びＣｃＵＧＥ５のタンパク質の推定されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号９及び配列番号１０として本明細書において記載される。
【００５１】
コフィア・カネフォラ由来のガラクトマンナン前駆物質合成ポリヌクレオチド及び酵素は、本明細書において例示されるが、本発明は、下記に記載される目的のために、コフィア・カネフォラポリヌクレオチド及びタンパク質と区別なく使用されるほど十分に類似している、他のコフィア属種由来の核酸及びコードタンパク質を包含するように意図される。したがって、ガラクトマンナン前駆物質合成酵素「ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ」（「ＵＧＰＰ」）、「ＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ」（「ＧＭＰＰ」）、「ホスホマンノムターゼ」（「ＰＭＭ」）、及び「ＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ」（「ＵＧＥ」）が、本明細書において言及される場合、これらの用語は、特に別記されない限り、本明細書において記載される一般的な物理的な、生化学的な、及び機能的な特徴を有するコーヒー属のＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、及びＵＧＥ並びにそれらをコードするポリヌクレオチドをすべて包含するように意図される。
【００５２】
それらの配列に関して考慮すると、本発明のＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、及びＵＧＥポリヌクレオチドは、異なる様々なコフィア・カネフォラ及びコフィア・アラビカにおいて見つけられるであろう、配列番号１〜５の対立遺伝子変異体及び天然の突然変異体並びにコフィア・アラビカを含むが、これらに限定されない様々なコーヒー種において見つけられるであろう、配列番号１〜５の変異体、天然の突然変異体、及び相同体を含む。特定の実施形態では、コフィア・アラビカ由来の変異体、突然変異体、及び相同体が、用いられる。そのような変異体及び相同体が、ヌクレオチド及びアミノ酸配列においてある種の差異を有することが予想されるので、適したガラクトマンナン前駆物質合成ポリペプチドは、それぞれ、配列番号６〜１０のポリペプチドと、少なくとも約８０％又は８１％又は８２％又は８３％又は８４％又は８５％又は８６％又は８７％又は８８％又は８９％又は９０％又は９１％又は９２％又は９３％又は９４％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９９％の同一性を有するものを含む。様々なコーヒー品種及び種におけるこれらの酵素及びそれらをコードする遺伝子の中で存在するであろう天然の配列変異のために、当業者は、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドの特有の特性をなお維持するが、このレベルの変異を見つけることを予想するであろう。そのような予想は、部分的に、遺伝子コードの縮重及び保存的アミノ酸配列変異の知られている進化の結果によるものであり、これらは、コードタンパク質の特徴をあまり改変しない。
【００５３】
コフィア・カネフォラガラクトマンナン前駆物質酵素は、非保存配列を有するタンパク質の領域によって他の種由来のオルソログとさらに区別することができる。それぞれのＣｃＵＧＰＰ、ＣｃＧＭＰＰ、ＣｃＰＭＭ、ＣｃＵＧＥ１、及びＣｃＵＧＥ５についての特有の又は非保存配列は、下記に記載される（単一の残基は、それだけで記載される；２つ以上の配列の隣接する配列は、２つの残基の間にハイフンを用いて示される；たとえば、「１−８」は、隣接残基１〜８（両端を含む）を意味する）。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
ポリヌクレオチド及びポリペプチド：
本発明の核酸分子は、２つの一般的な方法によって調製されてもよい：（１）それらは、適切なヌクレオチド三リン酸から合成されてもよい又は（２）それらは、生物学的供給源から単離されてもよい。両方の方法は、当技術分野においてよく知られているプロトコールを利用する。
【００５６】
配列番号１〜５を有するｃＤＮＡなどのようなヌクレオチド配列情報を入手できることにより、オリゴヌクレオチド合成による単離核酸分子の調製を可能にする。合成オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８Ａ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ又は類似するデバイスにおいて用いられるホスホラミダイト法によって調製されてもよい。結果として生ずる構築物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのような当技術分野において知られている方法に従って精製されてもよい。
【００５７】
ガラクトマンナン前駆物質合成ポリヌクレオチドのコード及び／又は調節領域の一部又はすべてと適切なレベルの配列相同性を有する核酸は、適切なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を使用することによって同定されてもよい。前述の戦略はまた、ゲノム配列に適用される場合、酵素コード配列の単離を可能にすることに加えて、調節配列が、それら自体、適したハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な相同性を共有し得なくても、ガラクトマンナン前駆物質合成遺伝子と関連するプロモーター及び他の遺伝子調節配列の単離をも可能にすることが、当業者らによって十分に理解されるであろう。
【００５８】
典型的な例証として、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、及び５０％までのホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を使用して実行されてもよい。ハイブリダイゼーションは、少なくとも６時間、３７〜４２℃で実行される。ハイブリダイゼーションに続いて、フィルターは、以下のように洗浄される：（１）２×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中で室温で５分間；（２）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で室温で１５分間；（３）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で３７℃で３０分間〜１時間；（４）３０分間ごとに溶液を交換して、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で４５〜５５℃で２時間。
【００５９】
特定される配列相同性の核酸分子の間のハイブリダイゼーションを達成するために必要とされるストリンジェンシー条件を計算するための１つの一般的な式（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．）；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）は、
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（ホルムアミド％）−６００／二重鎖における＃ｂｐ
【００６０】
４２％のＧＣ含有量及び２００塩基の平均プローブサイズと共に、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミドを使用する上記の式の例証として、Ｔｍは、５７℃となる。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、相同性における１％の減少と共に１〜１．５℃ずつ減少する。したがって、約７５％超の配列同一性を有する標的は、４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用して観察されるであろう。一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、３７℃であり、最終洗浄は、４２℃であり、他の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、４２℃であり、最終洗浄は、５０℃であり、さらに他の実施形態では、上記のハイブリダイゼーション及び洗浄溶液と共に、ハイブリダイゼーションは、４２℃であり、最終洗浄は、６５℃である。高度なストリンジェンシーの条件は、上記のハイブリダイゼーション溶液における４２℃でのハイブリダイゼーション並びに１０分間、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中での６５℃での最終洗浄を含む。
【００６１】
核酸は、任意の好都合なクローニングベクター中でＤＮＡとして維持されてもよい。好ましい実施形態では、クローンは、すべて、適した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞において増えることができる、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、又はｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）などのようなプラスミドクローニング／発現ベクター中で維持される。
【００６２】
本発明の核酸分子は、一本鎖、二本鎖、又はさらに三本鎖であってもよいｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、及びその断片を含む。したがって、本発明は、本発明の核酸分子の少なくとも１つの配列とハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのセンス又はアンチセンス鎖）を提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、たとえばＰＣＲ増幅によって植物組織の試験試料におけるガラクトマンナン前駆物質合成遺伝子若しくはｍＲＮＡを検出するための又はタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳時の若しくは前の、ガラクトマンナン前駆物質合成酵素の発現の正の若しくは負の調節のためのプローブとして有用である。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドがそのようなアッセイのためのプローブとして利用されてもよい方法は、（１）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；（２）サザンハイブリダイゼーション、（３）ノーザンハイブリダイゼーション、並びに（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲを含むＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などのような種々の増幅反応を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
任意選択で、オリゴヌクレオチドは、それらのポリヌクレオチドに特有である、つまり、他の種由来のオルソログよりもコーヒー属ポリヌクレオチドとハイブリダイズする可能性が高い、ガラクトマンナン前駆物質酵素コードポリヌクレオチドの領域を含むように構築されてもよい。この様式で標的にするのに適している領域は、上記に記載されるように、コードタンパク質のそれぞれについて特有の領域又は非保存領域をコードする領域を含む。
【００６４】
本発明の核酸分子の少なくとも１つの配列とハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。翻訳にとって決定的なｍＲＮＡの特異的な領域を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、利用されてもよい。あらかじめ決定された遺伝子の発現レベルを減少させるためのアンチセンス分子の使用は、当技術分野において知られている。アンチセンス分子は、転写に際して、アンチセンスＲＮＡ配列を産生するＤＮＡ構築物を用いて植物細胞を形質転換することによってｉｎ  ｓｉｔｕに提供されてもよい。そのような構築物は、完全長の又は部分的なアンチセンス配列を産生するように設計することができる。この遺伝子サイレンシング効果は、多量のｄｓＲＮＡが産生されるように、遺伝子コード配列のセンス及びアンチセンスＲＮＡの両方をトランスジェニックで過剰産生することによって増強することができる。この点に関して、少なくとも１つのイントロンの一部又はすべてに対応する配列を含有するｄｓＲＮＡは、特に有効であることが分かっている。一実施形態では、適切なアンチセンス鎖の一部又はすべては、導入遺伝子によって発現される。他の実施形態では、遺伝子は、市販で入手可能な材料及び方法（たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を使用して、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の使用によって沈黙させてもよい。
【００６５】
ポリペプチドは、知られている方法に従って様々な方法において調製されてもよい。ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて産生される場合、ポリペプチドは、適切な供給源、たとえば種子、果皮、他の植物の部分から精製されてもよい。その代わりに、ポリペプチドをコードする核酸分子を入手できることにより、当技術分野において知られているｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける発現方法を使用する、タンパク質の産生を可能にする。
【００６６】
たとえば、多量のポリペプチドは、適した原核生物又は真核生物系における発現によって産生されてもよい。たとえば、配列番号１〜５のいずれかを有するｃＤＮＡなどのようなＤＮＡ分子の一部又はすべては、細菌細胞（大腸菌など）若しくは酵母細胞（出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）における発現に適したプラスミドベクターの中に又は昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルスベクターの中に挿入されてもよい。そのようなベクターは、宿主細胞におけるＤＮＡの発現を可能にするような様式で位置する、宿主細胞におけるＤＮＡの発現に必要な調節エレメントを含む。発現に必要とされるそのような調節エレメントは、プロモーター配列、転写開始配列、及び任意選択でエンハンサー配列を含む。
【００６７】
組換え原核生物又は真核生物系における遺伝子発現によって産生されるポリペプチドは、当技術分野において知られている方法に従って精製されてもよい。好ましい実施形態では、市販で入手可能な発現／分泌系を使用することができ、それによって、組換えタンパク質を発現させ、その後、宿主細胞から分泌され、その後、周囲の培地から精製される。代替アプローチは、たとえば、組換えタンパク質に特異的に結合する抗体を用いる免疫学的相互作用を介して、親和性分離によって、組換えタンパク質を精製することを含む。前述の方法によって調製される本発明のポリペプチドは、標準的な手順に従って分析されてもよい。
【００６８】
コーヒーから精製される又は組換えで産生されるポリペプチドは、知られている方法に従って、本明細書において定義されるポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、抗体断片、又は誘導体を生成するために使用されてもよい。任意選択で、それぞれのタンパク質の非保存領域に対応する合成ペプチドに対して作製される抗体を生成することができる。
【００６９】
ベクター、キット、及びトランスジェニック生物：
センス又はアンチセンス配向において、ガラクトマンナン前駆物質合成ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、その変異体、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は適切なプロモーター及び他の調節配列の制御下のレポーター遺伝子及び他の構築物を含有するトランスジェニック宿主細胞を産生するためのベクター及びキットもまた、本発明に従って特徴とされる。適した宿主細胞は、植物細胞、細菌細胞、酵母、及び他の真菌細胞、昆虫細胞、並びに哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。種々様々のこれらの宿主細胞を形質転換するためのベクターは、当業者らによく知られている。それらは、プラスミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、並びに他の細菌、酵母、及びウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。典型的に、トランスジェニック宿主細胞を産生するためのキットは、１つ又は複数の適切なベクター及びベクターを使用してトランスジェニック細胞を産生するための説明書を含有するであろう。キットは、少数の例を挙げると、細胞を培養するための培地、細胞の形質転換を実行するための試薬、及び遺伝子発現についてトランスジェニック細胞を試験するための試薬などのような、１つ又は複数のさらなる構成成分をさらに含んでいてもよい。
【００７０】
本発明は、植物の内因性ガラクトマンナン前駆物質合成酵素のうちの１つ又は複数の産生又は機能を阻害する、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡなどのような、ガラクトマンナン前駆物質合成ポリヌクレオチド又は核酸配列の１コピー又は複数コピーを含むトランスジェニック植物を含む。これは、下記に記載されるように、天然又は組換え調節配列によって制御される、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡを含む、ガラクトマンナン前駆物質合成酵素コード配列又はその突然変異体、アンチセンス、若しくは変異体の一部又はすべてを含む導入遺伝子を用いて植物細胞を形質転換することによって達成される。トランスジェニックコーヒー種は、限定を伴うことなく、コフィア・アベオクタ（Ｃ．ａｂｅｏｋｕｔａｅ）、コフィア・アラビカ、コフィア・アルノルディアナ（Ｃ．ａｒｎｏｌｄｉａｎａ）、コフィア・アルウエミエンシス（Ｃ．ａｒｕｗｅｍｉｅｎｓｉｓ）、コフィア・ベンガル（Ｃ．ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）、コフィア・カネフォラ、コフィア・コンゲンシス（Ｃ．ｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）、コフィア・デウェブレイ（Ｃ．Ｄｅｗｅｖｒｅｉ）、コフィア・エクセルサ（Ｃ．ｅｘｃｅｌｓａ）、コフィア・ユージノイデス（Ｃ．ｅｕｇｅｎｉｏｉｄｅｓ）、コフィア・ヘテロカリクス（Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｃａｌｙｘ）、コフィア・カパカタ（Ｃ．ｋａｐａｋａｔａ）、コフィア・ハイシアナ（Ｃ．ｋｈａｓｉａｎａ）、コフィア・リベリア（Ｃ．ｌｉｂｅｒｉｃａ）、コフィア・モロウンドウ（Ｃ．ｍｏｌｏｕｎｄｏｕ）、コフィア・ラセモサ（Ｃ．ｒａｓｅｍｏｓａ）、コフィア・サルバトリックス（Ｃ．ｓａｌｖａｔｒｉｘ）、コフィア・セシフローラ（Ｃ．ｓｅｓｓｉｆｌｏｒａ）、コフィア・ステノフィラ（Ｃ．ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）、コフィア・トラベンコレンシス（Ｃ．ｔｒａｖｅｎｃｏｒｅｎｓｉｓ）、コフィア・ワイティアナ（Ｃ．ｗｉｇｈｔｉａｎａ）、及びコフィア・ザングエバリア（Ｃ．ｚａｎｇｕｅｂａｒｉａｅ）を含む。下記に記載される方法が、他の種におけるガラクトマンナン含有量を調整する際に特に有利であるかもしれないので、任意の種の植物もまた、本発明において含まれる。そのような種は、タバコ、アラビドプシス、及び他の「実験に適した」種、トウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、モロコシ、アルファルファ、クローバなどのような禾穀類、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ピーナッツ、カカオなどのような油を産生する植物、トマト、オオブドウホオズキ、ジャガイモ、コショウ、ナス、サトウダイコン、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウなどのような野菜作物、アスター、ベゴニア、キク、ヒエンソウ、ツクバネアサガオ、ヒャクニチソウ、芝生、及び芝草などのような園芸用植物などを含むが、これらに限定されない。
【００７１】
トランスジェニック植物は、当業者らに知られている標準的な植物形質転換方法を使用して生成することができる。これらは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ベクター、プロトプラストのポリエチレングリコール処理、微粒子銃ＤＮＡ送達、ＵＶレーザミクロ電子放射線、ジェミニウイルスベクター又は他の植物ウイルスベクター、プロトプラストのリン酸カルシウム処理、単離プロトプラストのエレクトロポレーション、形質転換ＤＮＡを用いてコーティングされたマイクロビーズとの溶液中での細胞懸濁液の撹拌、形質転換ＤＮＡを用いてコーティングされたシリコーンファイバーとの溶液中での細胞懸濁液の撹拌、直接的なＤＮＡ取り込み、リポソーム媒介性のＤＮＡ取り込みなどを含むが、これらに限定されない。そのような方法は、当技術分野においてよく知られている。
【００７２】
形質転換の方法は、形質転換されることとなる植物に依存する。アグロバクテリウムベクターは、双子葉植物種を形質転換するために使用されることが多い。アグロバクテリウムバイナリーベクターは、ＢＩＮ１９及びその誘導体、ｐＢＩベクターシリーズ、並びにバイナリーベクターｐＧＡ４８２、ｐＧＡ４９２、ｐＬＨ７０００（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＹ２３４３３０）、及びｐＣＡＭＢＩＡベクターのうちの任意の適した１つ（ＣＡＭＢＩＡ，ＧＰＯ  Ｂｏｘ  ３２００，Ｃａｎｂｅｒｒａ  ＡＣＴ  ２６０１，Ａｕｓｔｒａｌｉａから又はＣＡＭＢＩＡ．ｏｒｇのワールドワイドウェブを介して入手可能である、Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５，９８９−９９４によって構築されたｐＰＺＰベクターに由来）を含むが、これらに限定されない。単子葉植物種の形質転換については、形質転換ＤＮＡを用いてコーティングされた粒子及び形質転換ＤＮＡを用いてコーティングされたシリコーンファイバーを用いる微粒子銃衝撃は、核の形質転換に有用であることが多い。その代わりに、アグロバクテリウム「スーパーバイナリー」ベクターは、イネ、トウモロコシ、及び様々な他の単子葉植物種の形質転換のためにうまく使用されてきた。
【００７３】
選択された植物を形質転換するためのＤＮＡ構築物は、適切な５’（たとえばプロモーター及び翻訳調節配列）並びに３’調節配列（たとえばターミネーター）に作動可能に連結された、対象のコード配列を含む。一実施形態では、それ自体の５’及び３’調節エレメントの制御下のガラクトマンナン前駆物質合成コード配列を利用することができる。他の実施形態では、ガラクトマンナン前駆物質合成コード配列及び調節配列は、形質転換植物の多糖プロファイルを改変するために交換される。
【００７４】
代替の実施形態では、遺伝子のコード領域は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター又はゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどのような強力な恒常的プロモーター下に配置される。本発明において使用するために企図される他の恒常的プロモーターは、Ｔ−ＤＮＡマンノピンシンテターゼ、ノパリンシンターゼ、及びオクトピンシンターゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。他の実施形態では、強力な単子葉植物プロモーター、たとえばトウモロコシユビキチンプロモーター、イネアクチンプロモーター、又はイネチューブリンプロモーターが使用される（Ｊｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２３，１００５−１４）。
【００７５】
誘発性のプロモーター下でガラクトマンナン前駆物質合成酵素コード配列を発現させるトランスジェニック植物もまた、本発明の範囲内にあると企図される。誘発性の植物プロモーターは、少数の例を挙げると、テトラサイクリンリプレッサー／オペレーター制御プロモーター、熱ショック遺伝子プロモーター、ストレス（たとえば創傷）誘発性プロモーター、防御応答性遺伝子プロモーター（たとえばフェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子）、創傷誘発性遺伝子プロモーター（たとえばヒドロキシプロリンリッチ細胞壁タンパク質遺伝子）、化学的誘発性遺伝子プロモーター（たとえば硝酸レダクターゼ遺伝子、グルカナーゼ遺伝子、キチナーゼ遺伝子など）、及び濃誘発性遺伝子プロモーター（たとえばアスパラギンシンテターゼ遺伝子）を含む。
【００７６】
組織特異的及び発育特異的プロモーターもまた、本発明において使用するために企図される。種子特異的プロモーターの非限定的な例は、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘発性メッセージ）、ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）、ｍｉｌｐｓ（ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ）、及びｃｅｌＡ（セルロースシンターゼ）（米国特許第６，２２５，５２９号）、マメベータファゼオリン、ｎａｐｉｎ、ベータコングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリン、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、ｇ−ゼイン、ｗａｘｙ、ｓｈｒｕｎｋｅｎ１、ｓｈｒｕｎｋｅｎ２、グロブリン１、ダイズ１１Ｓレグミン、並びにコフィア・カネフォラ１１Ｓ種子貯蔵タンパク質を含む。ｅｎｄ１及びｅｎｄ２遺伝子由来の、種子にとって好ましいプロモーターが開示されるＷＯ００／１２７３３もまた参照されたい。ＷＯ２００７／００５９２８において記載されるオレオシ遺伝子プロモーター、ＷＯ２００７／００５９８０において記載されるデヒドリン遺伝子プロモーター、ＷＯ２００７／０２８１１５において記載される９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ遺伝子プロモーターを含む、他のコーヒー属種子特異的プロモーターもまた、利用されてもよい。他の組織特異的プロモーターの例は、光合成組織における発現のためのリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）小サブユニット遺伝子プロモーター（たとえばＭａｒｒａｃｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第７，１５３，９５３号）又はクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ）遺伝子プロモーター及び根における発現が所望される場合の根特異的グルタミンシンテターゼ遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００７７】
コード領域はまた、適切な３’調節配列に作動可能に連結される。天然の３’調節配列が使用されない実施形態では、ノパリンシンテターゼポリアデニル化領域が、使用されてもよい。他の有用な３’調節領域は、オクトピンシンターゼポリアデニル化領域を含むが、これに限定されない。
【００７８】
適切な調節エレメントの制御下の選択されるコード領域は、カナマイシン抵抗性などのような薬剤抵抗性マーカーに作動可能に連結される。他の有用な選択可能なマーカー系は、抗生物質又は除草剤抵抗性（たとえばヒグロマイシン、スルホニル尿素、ホスフィノトリシン、若しくはグリホセートに対する抵抗性）を与える遺伝子又は選択的な成長を与える遺伝子（たとえばマンノース上での植物細胞の成長を可能にするホスホマンノースイソメラーゼ）を含む。選択マーカー遺伝子は、限定を伴うことなく、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、及びヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするものなどのような抗生物質抵抗性をコードする遺伝子並びにグリホセート抵抗性ＥＰＳＰＳ及び／又はグリホセートオキシドレダクターゼ（ＧＯＸ）などのような、除草剤化合物に対する抵抗性を与える遺伝子、ブロモキシニルに対する抵抗性についてのブロモキシニルニトリラーゼ（ＢＸＮ）、イミダゾリノンに対する抵抗性についてのＡＨＡＳ遺伝子、スルホニル尿素抵抗性遺伝子、並びに２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）抵抗性遺伝子を含む。
【００７９】
ある実施形態では、本発明によって包含されるプロモーター及び他の発現調節配列は、レポーター遺伝子に作動可能に連結される。本発明において使用するために企図されるレポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、セリアンサスオレンジ（Ｃｅｒｉａｎｔｈｕｓ  Ｏｒａｎｇｅ）蛍光タンパク質（ｃＯＦＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ（登録商標）、Ｇ４１８（登録商標））、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（α−ガラクトシダーゼをコードする）、及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ベータ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、分泌胚アルカリホスファターゼ、（ＳＥＡＰ）、又はホタル若しくは細菌ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。本発明の実施と関連する多くの標準的な手順のように、当業者は、マーカー又はレポーターの機能を果たすことができるさらなる配列に気づくであろう。
【００８０】
さらなる配列修飾は、細胞の宿主において遺伝子発現を増強することが当技術分野において知られている。これらの修飾は、余分なポリアデニル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様のリピート、及び遺伝子発現に有害となり得る他のそのような十分に特徴付けられた配列をコードする配列の排除を含む。その代わりに、必要ならば、コード配列のＧ／Ｃ含有量は、コーヒー植物細胞において発現される、知られている遺伝子に対する参照によって計算されるように、所与のコーヒー植物細胞宿主について平均的なレベルに調節されてもよい。また、可能な場合、コード配列は、推定されるヘアピン二次ｍＲＮＡの構造を避けるように修飾される。遺伝子発現を増強するための他の代案は、５’リーダー配列を使用することである。翻訳リーダー配列は、当技術分野においてよく知られており、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（オメガ）のシス作用性誘導体（オメガ’）、ブロムモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス、及びカブ黄斑モザイクウイルス由来の５’リーダー配列を含む。
【００８１】
植物は、形質転換され、その後、導入遺伝子産物、導入遺伝子コードｍＲＮＡの存在又は導入遺伝子の発現又は内因性遺伝子の発現を減少させるように設計された配列、たとえばアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、若しくはｍｉＲＮＡの発現と関連する改変された表現型を含む、１つ又は複数の特性についてスクリーニングされる。形質転換植物における導入遺伝子の発現の量並びに発現の組織特異的及び一時的特異的パターンは、核ゲノムの中へのそれらの挿入の位置に依存して変化し得ることが認識されるべきである。そのような位置の影響は、当技術分野においてよく知られている。この理由で、いくつかの核形質転換体は、導入遺伝子の発現について再現され、且つ試験されるべきである。
【００８２】
方法：
本発明の核酸及びポリペプチドは、多くの方法のいずれか１つにおいて使用することができる。それによって、コーヒー植物におけるガラクトマンナン前駆物質合成酵素のうちの１つ又は複数の産生又は活性は、たとえば、マメの製品品質における改善のための様々な表現型の形質に影響を与えるように調整することができる。たとえば、ガラクトマンナン含有量の減少又はガラクトマンナン構造の改変は、インスタントコーヒーを作製するプロセスにおいて固体の回収を大幅に改善することが予想される。ガラクトマンナン含有量の増加は、植物の他の部分にとって又は他の植物種にとって同様に望ましいかもしれない。
【００８３】
コーヒー豆ガラクトマンナン含有量若しくは構造又は他の特徴の改善は、（１）典型的な交配又は（２）遺伝子工学技術によって及びこれらの２つのアプローチを組み合わせることによって得ることができる。両方のアプローチは、本発明に従って、コーヒーにおけるガラクトマンナン前駆物質合成酵素ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、及び／又はＵＧＥをコードするポリヌクレオチドの単離及び特徴付けによってかなり改善された。たとえば、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、及び／又はＵＧＥコード遺伝子は、遺伝学的にマッピングされてもよく、ガラクトマンナン含有量又は構造に関与する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）を同定することができる。次いで、そのようなＱＴＬが、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥ関連遺伝子の位置と相関するかどうかを決定することが可能となるであろう。ガラクトマンナン前駆物質のレベルに影響を与える遺伝子についての対立遺伝子（ハプロタイプ）もまた、同定され、特異的なハプロタイプの存在が、ガラクトマンナン前駆物質合成と強く相関するかどうかを決定するために検査されてもよい。これらのマーカーは、マーカー支援交配プログラムに有利に使用することができる。
【００８４】
ガラクトマンナン前駆物質合成に関与するポリヌクレオチドを単離する他の利点は、本発明者らによって本明細書において実証された。これは、高度の及び低度のガラクトマンナン又はガラクトマンナン前駆物質レベルを有する品種におけるコーヒーマメ成熟の間にこれらの遺伝子についての発現データを生成することである。この情報は、成熟マメにおいて増加した又は減少したガラクトマンナンレベルを有する新規なトランスジェニックコーヒー植物の生成を目的とした遺伝子操作において使用するための遺伝子の選択を導くために使用される。
【００８５】
一態様では、本発明は、植物、好ましくはコーヒーにおけるガラクトマンナンプロファイルを改変するための方法であって、植物における１つ又は複数のガラクトマンナン前駆物質合成酵素の量又は活性を増加させる又は減少させるステップを含む方法を特徴とする。本発明の特定の実施形態は、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、及び／又はＵＧＥの産生を増加させる又は減少させるための方法を提供する。
【００８６】
一実施形態では、コーヒー植物は、コーヒーの様々な組織において、それぞれ、これらの酵素のうちの１つ又は複数を過剰産生する目的のために、配列番号１〜５を含むｃＤＮＡなどのような、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、及び／又はＵＧＥコードポリヌクレオチドのうちの１つ又は複数を用いて形質転換することができる。一実施形態では、コーヒー植物は、たとえば、コード配列に機能的に連結された、ＲｕＢｉｓＣｏ小サブユニット（ＳＳＵ）プロモーター又はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターなどのようなプロモーターの使用を通して、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、及び／又はＵＧＥ産生における全般的な増加のために遺伝子操作される。いくつかの実施形態では、コーヒー植物の修飾は、２、３、又はすべてのＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥを増加させるように遺伝子操作することができる。
【００８７】
前述のＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥコード配列のうちの１つ又は複数を含むトランスジェニック植物はまた、ＷＯ２００７／０４７６７５において記載されるなどのように、ガラクトマンナン合成に直接関与する酵素、つまりマンナンシンターゼ及びガラクトマンナンガラクトシルトランスフェラーゼについてのコード配列を含有していてもよい。それらはまた、ガラクトマンナン分解酵素をコードするＲＮＡを標的にするＲＮＡｉコード配列（下記に記載）を任意選択で含有していてもよい。これらの導入遺伝子の１つ又は複数の組み合わせは、ガラクトマンナン分解性酵素の任意選択のダウンレギュレーションと共に、生合成経路において数レベルでガラクトマンナン合成の有効なアップレギュレーションをもたらすはずである。
【００８８】
ガラクトマンナン前駆物質のプールを構築する努力に生じ得る１つの状況は、そのような前駆物質が、他の生化学経路に流用され、そのため、ガラクトマンナン合成のために利用可能でなくなり得ることである。そのような状況を回避するための１つの方法は、様々な植物種由来の１つ又は複数のガラクトマンナン前駆物質合成遺伝子を利用することであろう。これは、そのような流用を回避すると予想されるであろう、また、種特異的翻訳及び翻訳後阻害から生じ得る問題を回避するであろう。そのような現象は、植物におけるスクロース代謝において観察されてきた（Ｐｒｉｖａｔ，ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．１７８，７８１−７９７）。
【００８９】
ガラクトマンナン前駆物質酵素（複数可）の過剰産生を、対象のシンク器官、つまり豆にのみ制限するように設計された他の実施形態では、豆特異的プロモーター、特に、上記に記載されるコーヒー属豆特異的プロモーターのうちの１つが、利用されてもよい。これらのプロモーターは、下記に記載されるように、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするように意図されるポリヌクレオチドの発現を指示するのにも役に立つ。
【００９０】
改変されたガラクトマンナン又はガラクトマンナン前駆物質プロファイルを示す植物は、たとえば、ガラクトマンナン前駆物質及び任意選択でガラクトマンナンの形成を測定することによって又は様々な酵素の量若しくは活性を測定することによって、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、及び／又はＵＧＥの天然に存在する変異体についてスクリーニングすることができる。たとえば、機能喪失型の（ｎｕｌｌ）突然変異体植物は、現在入手可能な植物突然変異体の集団から生成されてもよい又は選択されてもよい。突然変異体植物の集団はまた、本明細書において記載される方法のうちの１つ又は複数を利用して、ガラクトマンナン前駆物質合成酵素などのような特定の多糖代謝酵素を過少又は過剰発現する突然変異体についてスクリーニングされてもよいこともまた、当業者らによって十分に理解されるであろう。突然変異体集団は、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発、及びトランスポゾン若しくはＴ−ＤＮＡ挿入又はｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｏｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇｅｎｏｍｅｓ（ＴＩＬＬＩＮＧ、たとえばＨｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３５，６３０−６３６；Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ  ＆  Ｈａｕｇｈｎ，２００５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．８，２１１−２１５を参照されたい）によって作製することができる。突然変異体集団を作製するための方法は、当技術分野においてよく知られている。
【００９１】
本発明の核酸は、様々な植物種において、ガラクトマンナン前駆物質合成酵素の突然変異体形態を同定するために使用することができる。トランスポゾン挿入系が利用可能であるトウモロコシ又はアラビドプシスなどのような種において、オリゴヌクレオチドプライマーは、ガラクトマンナン前駆物質合成遺伝子における挿入のための系をスクリーニングするために設計することができる。交配を通して、分断化された遺伝子についてヘテロ接合性又はホモ接合性である植物系を、次いで、発育させてもよい。生合成酵素の完全な切断があまりに有害となり、植物が生存することができないのに対して、部分的な切断は、より望ましい結果をもたらし得るので、ヘテロ接合性は、いくつかの実施形態において、ホモ接合性よりも有用となり得る。
【００９２】
本発明の他の実施形態は、豆において、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、及び／又はＵＧＥのうちの１つ又は複数の量又は活性を減少させることによって、コーヒー豆におけるガラクトマンナンを減少させることを含む。これは、様々な方法において達成されてもよい。
【００９３】
一実施形態では、植物は、突然変異誘発技術によって生成されるｎｕｌｌ突然変異体において見られるものに類似する表現型を示すように遺伝子操作されてもよい。トランスジェニックｎｕｌｌ突然変異体は、「ドミナントネガティブ効果」を生成するようにＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、及び／又はＵＧＥの突然変異体形態を発現させることによって生成することができる。本発明をいずれか１つのメカニズムに制限するものではないが、この突然変異タンパク質は、相互作用タンパク質又は他の細胞因子について、野生型タンパク質と競合するであろう。この種の「ドミナントネガティブ」効果の例は、昆虫及び脊椎系の両方でよく知られている。
【００９４】
他の種類のトランスジェニックｎｕｌｌ突然変異体は、「転写後遺伝子サイレンシング」によって、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、及び／又はＵＧＥコードｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって生成することができる。これらの技術は、植物豆において酵素をダウンレギュレートし、それによって、ガラクトマンナン合成のために利用可能なガラクトマンナン前駆物質の量を減少させるために使用されてもよい。たとえば、ガラクトマンナン前駆物質合成ポリヌクレオチド又はその断片は、コードタンパク質の産生を制御するために利用されてもよい。完全長アンチセンス分子は、この目的のために使用することができる。その代わりに、翻訳にとって決定的なｍＲＮＡの特異的領域を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、利用されてもよい。あらかじめ決定された遺伝子の発現レベルを減少させるためのアンチセンス分子の使用は、当技術分野において知られている。アンチセンス分子は、転写に際して、アンチセンスＲＮＡ配列を産生するＤＮＡ構築物を用いて植物細胞を形質転換することによってｉｎ  ｓｉｔｕに提供されてもよい。そのような構築物は、完全長の又は部分的なアンチセンス配列を産生するように設計することができる。この遺伝子サイレンシング効果は、多量のｄｓＲＮＡが産生されるように、遺伝子コード配列のセンス及びアンチセンスＲＮＡの両方をトランスジェニックで過剰産生することによって増強することができる（たとえば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，１３９５９−１３９６４を参照されたい）。この点に関して、少なくとも１つのイントロンの一部又はすべてに対応する配列を含有するｄｓＲＮＡは、特に有効であることが分かっている。一実施形態では、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、及び／又はＵＧＥコードアンチセンス鎖の一部又はすべては、導入遺伝子によって発現される。
【００９５】
他の実施形態では、ガラクトマンナン前駆物質合成遺伝子は、植物系について現在利用可能な様々な他の転写後遺伝子サイレンシング（ＲＮＡサイレンシング）技術の使用を通して沈黙させてもよい。ＲＮＡサイレンシングは、ＲＮアーゼＨベースの酵素（「ダイサー」又は「ダイサー様」）による小さな２１〜２８ヌクレオチド断片への二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のプロセシングを含む。ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）である分解産物は、配列特異的な方式で、遺伝子発現を調節するタンパク質エフェクター複合体の中に組み込まれる（植物におけるＲＮＡサイレンシングの概説については、Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ，２００４，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７２，６５−７３；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４３１，３５６−３６３；Ｈｅｒｒ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３２，９４６−９５１を参照されたい）。ｓｉＲＮＡは、その標的と完全に塩基対形成し、標的ＲＮＡを切断することによって発現を低下させると考えられる。それに比べて、ｍｉＲＮＡは、最も多くの場合メッセージの３’非コード領域の内の標的ｍＲＮＡと不完全な塩基対二重鎖を形成することによって遺伝子発現を調節する。一般に、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害するが、いくつかの場合において、それらはまた、標的ｍＲＮＡの半減期、そのためそのレベルを低下させ得る。
【００９６】
低分子干渉ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡは、化学的に合成され又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写され、且つ増幅され、次いで細胞に送達されてもよい。送達は、マイクロインジェクション、化学的トランスフェクション、エレクトロポレーション、若しくは陽イオンリポソーム媒介性トランスフェクション、又は当業者によって十分に理解されるであろう、当技術分野において入手可能な任意の他の手段を通してのものであってもよい。その代わりに、ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、たとえばプラスミドの手段によって、対象の細胞の中にｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡについてのＤＮＡ鋳型を挿入することによって細胞内で発現させてもよく、細胞を選択するために特異的に標的にされてもよい。低分子干渉ＲＮＡは、植物の中にうまく導入されてきた。
【００９７】
本発明におけるＲＮＡサイレンシングの好ましい方法は、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の使用である。特定の所望のｓｉＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターは、任意の一般的な手段によって標的細胞の中に送達される。一度、細胞において、ＤＮＡ配列が、それら自体とループするＲＮＡ分子に継続的に転写されると、分子内塩基対形成を通してヘアピン構造を形成する。これらのヘアピン構造は、一度、細胞によって処理されると、ｓｉＲＮＡ分子に相当し、所望のタンパク質のＲＮＡサイレンシングを媒介するように細胞によって使用される。植物におけるＲＮＡサイレンシングについての特定の有用性の様々な構築物は、Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ，２００４、前掲によって記載されている。典型的に、そのような構築物は、プロモーター、「センス」配向で沈黙させられることとなる標的遺伝子の配列、スペーサー、標的遺伝子配列のアンチセンス、及びターミネーターを含む。
【００９８】
しかし、他のタイプの合成ｎｕｌｌ突然変異体もまた、「同時抑制」の技術によって生成することができる（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６，６５１−６５９）。植物細胞は、抑圧のために標的にされる内因性遺伝子のコピーを用いて形質転換される。多くの場合において、これは、天然の遺伝子及び導入遺伝子の完全な抑圧をもたらす。一実施形態では、対象の植物種由来のガラクトマンナン前駆物質合成遺伝子は、単離され、その同じ種の細胞を形質転換するために使用される。
【００９９】
前述の技術のいずれも、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、又はＵＧＥコード配列にのみ適用されてもよいのではなく、ガラクトマンナン合成に直接関与する酵素、つまり、ＷＯ２００７／０４７６７５において記載されるものなどのような、マンナンシンターゼ及びガラクトマンナンガラクトシルトランスフェラーゼについてのコード配列の発現を阻害することもまた、含んでいてもよい。技術は、任意選択で、選択される組織におけるガラクトマンナン分解を加速するために、１つ又は複数のマンナナーゼの過剰発現と組み合わせられてもよい。これらの導入遺伝子の１つ又は複数の組み合わせは、ガラクトマンナン分解性酵素の任意選択のアップレギュレーションと共に、生合成経路において数レベルでガラクトマンナン合成の有効なダウンレギュレーションをもたらすはずである。
【０１００】
前述の翻訳阻害技術の適用における重要な考慮は、そのような阻害のタイミングである。適切なタイミングでコーヒー種子において発現されるガラクトマンナン前駆物質合成遺伝子のうちの１つ又は複数を選択し、次いで、その遺伝子の発現を低下させるようにＲＮＡｉ構築物を設計することは有利である。遺伝子制御は、発育特異的であるだけではなく、組織特異的、たとえば豆特異的、任意選択で、豆の選択される部分に対してやや特異的（ｓｕｂ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）でもあるべきである。実施例４において記載されるＣｃＵＧＰＰ、ＣｃＧＭＰＰ、ＣｃＰＭＭ、及びＣｃＵＧＥについての遺伝子発現データは、そのようなパラメーターに基づいて選択を行う目的で有用である。たとえば、４つの遺伝子についての豆発現データは、２つの「上流」の方の遺伝子、ＵＧＰＰ及びＰＭＭが、豆発育の段階にわたり比較的均一の様式で発現されるが、下流の遺伝子、ＵＧＥ及び特にＧＭＰＰが、やや、より発育に関連するプロファイルを示したことを示し（特に、ＧＭＰＰ発現は、発育の後期の段階において減少することが観察された）、それらの発現が、ガラクトマンナン合成並びに他のＵＤＰガラクトース及びＧＤＰマンノースの反応の実際の必要性をより厳密に反映し得ることを示す。したがって、本発明の一実施形態は、それらの発現がより高度となる発育段階でのコーヒー豆におけるＧＭＰＰ及び／又はＵＧＥの選択的阻害を特徴とする。本明細書において示されるデータはまた、ＵＧＥの様々な対立遺伝子が、様々なコーヒー品種において様々な効果を有することを示唆する。したがって、他の実施形態は、品種に依存して、単独で又はともにＵＧＥ１又はＵＧＥ５を選択的に操作することを特徴とする。他の実施形態では、ＧＭＰＰ発現が最も高度となる発育における時期に、ＵＧＰＰは、ダウンレギュレートされてもよく、ＵＧＥ１及び／又はＵＧＥ５は、アップレギュレートされてもよい。そのような操作は、スクロースをＵＤＰガラクトースに導き、それによって、ＧＭＰＰをダウンレギュレートすることができる。そのような操作は、上記に記載されるコーヒープロモーターを含む、使用されるプロモーターの最適化から利益を得るであろう。
【０１０１】
前述の方法のいずれかによって産生される突然変異体又はトランスジェニック植物もまた、本発明に従って特徴とされる。好ましくは、植物は、稔性であり、それによって、交配の目的に有用である。したがって、前述の望ましい表現型のうちの１つ又は複数を示す突然変異体又は植物は、植物育種のために又は農業若しくは園芸の適用において直接、使用することができる。ある導入遺伝子又は特定される突然変異を含有する植物はまた、増強された表現型又は組み合わせられた表現型を有する植物を産生するために、相補的な導入遺伝子又は遺伝子型を含有する植物と交雑させてもよい。
【０１０２】
以下の実施例は、本発明をより詳細に記載するために提供される。実施例は、説明の目的のためのものあり、本発明を限定するようには意図されない。
【実施例】
【０１０３】
実施例１：続く実施例についての材料及び方法
植物材料．Ｑ−ＰＣＲによって遺伝子発現を理解するために、１つのコフィア・アラビカ遺伝子型（Ｔ２３０８）並びに３つのコフィア・カネフォラ遺伝子型（ＦＲＴ３２、ＦＲＴ０５、及びＦＲＴ６４）を使用した。
【０１０４】
コフィア・アラビカ（Ｔ２３０８、０４−２００３）組織（様々な発育段階の根、枝、若い葉、花、及びチェリー）並びにコフィア・カネフォラＦＲＴ３２の若い葉を、温室（２５℃及び７０％の相対湿度）で成長させた木から収穫し、使用前に−８０℃で保管した。コフィア・カネフォラ（ＦＲＴ３２、２００１）のチェリー、枝、根、及び花は、インドネシアで栽培された木から収穫した。チェリーの発育段階は、以下のように定義される：小さな生の果実（ＳＧ）、大きな生の果実（ＬＧ）、黄色の果実（Ｙ）、及び赤色の果実（Ｒ）。試料は、使用前に、輸送のために液体窒素ですぐに冷凍した。
【０１０５】
コフィア・カネフォラ（ロブスタ種）ＦＲＴ０５及びＦＲＴ６４のチェリーは、エクアドルで圃場栽培された木から収穫し、次いで、使用前に、輸送のために−２０℃ですぐに冷凍した。続いて、試料はすべて、使用まで−８０℃で保存した。
【０１０６】
ＲＮＡ抽出．全ＲＮＡは、「植物材料」の部において上記に記載されるコフィア・アラビカＴ２３０８、コフィア・カネフォラＦＲＴ３２、ＦＲＴ０５、及びＦＲＴ６４の様々な組織から、−８０℃で保存した液体窒素を用い、ＳＰＥＸ  ＣｅｒｔｉＰｒｅｐ  ６８００  Ｆｒｅｅｚｅｒ  Ｍｉｌｌにおいてホモジナイズした粉末を使用して、以前に記載されるように（Ｌｅｐｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７２，９７８−９９６）、抽出し、処理した。様々な段階からのコーヒーチェリーの場合には、これらは、最初に、果皮及び豆組織に分離し、次いで、ＲＮＡは、上記に記載されるようにそれぞれから抽出した。
【０１０７】
ｃＤＮＡ合成．ｃＤＮＡを作製するために使用される方法は、１００ｎｇのポリｄＴ（１８）（Ｓｉｇｍａ）をＴ２３０８及びＦＲＴ３２について使用し、７５ｎｇのランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＦＲＴ０５及びＦＲＴ６４について使用した以外は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において記載されるプロトコールと同一とした。生成したｃＤＮＡ試料は、次いで、滅菌水中で１００倍に希釈し、Ｑ−ＰＣＲにおける後の使用のために−２０℃で保存した。手短かに言えば、特定のｃＤＮＡの調製のために、１μｇの全ＲＮＡ及びオリゴｄＴ（上記）を、ＤＥＰＣ処理水中に溶解した（１２μｌ最終容量）。この混合物は、続いて、１０分間、７０℃でインキュベートし、次いで、氷上で急速に冷却した。次に、４μｌの５×ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌのＤＴＴ  ０．１Ｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１μｌのｄＮＴＰ  ｍｉｘ（それぞれ１０ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を追加した。これらの反応ミックスは、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｎａｓｅ  Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を追加する前に２分間、４２℃でプレインキュベートした。続いて、チューブは、１０分間、２５℃で、次いで、５０分間、４２℃でインキュベートし、その後に、１０分間、７０℃で加熱することによって酵素の不活性化を続けた。最後に、１ＵのＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を反応ミックスに追加し、その後に、３０分間、３７℃でのインキュベーションを続けた。生成したｃＤＮＡ試料は、次いで、滅菌水中で１００倍に希釈し、ＱＰＣＲにおける後の使用のために−２０℃で保存した。
【０１０８】
ｃＤＮＡライブラリー．コフィア・カネフォラ（ロブスタ種）ｃＤＮＡライブラリーのセットは、Ｎｅｓｔｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びＣｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの共同作業の一部として生成した。様々なライブラリーからの６２，０００を超えるｃＤＮＡクローンを単離し、若い葉において並びに発育中の果皮組織（すべての段階を混合）及び発育中の豆（いくつかの別個の段階）において発現しているコフィア・カネフォラ遺伝子に相当するＥＳＴ（発現配列タグ）を生成するために５’末端配列決定にかけた。品質評価後に、４６，９１４の高品質のＥＳＴを残し、次いで、これらの配列を集めて、「ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ」コーヒー遺伝子配列の特有のセットにした（「ｕｎｉｇｅｎｅ」セット、つまり、特有の非重複コーヒーｃＤＮＡ  ＤＮＡ配列のセット）。これらのライブラリーの構築及び生成したＥＳＴデータの生物情報学分析に関する詳細は、以前に公開されている（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１２，１１４−１３０）。
【０１０９】
ＤＮＡ配列分析．プラスミドＤＮＡは、メーカーから提供される説明書に従ってＱｉａｇｅｎキットを使用し、宿主から精製した。調製したプラスミドＤＮＡ及びＰＣＲ産物は、ジデオキシターミネーション法（ｄｉｄｅｏｘｙ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ（Ｋｏｎｓｔａｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって配列決定した。コンピューター解析は、Ｌａｓｅｒ  Ｇｅｎｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して実行した。配列相同性は、Ｓｏｌサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｇｎ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ）及びＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）にあるＢＬＡＳＴプログラムを使用して、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに対して確認した。
【０１１０】
リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ．これらの実験のために使用したｃＤＮＡは、上記に記載されるように調製した。ＴａｑＭａｎプローブを使用する定量的ＰＣＲは、ｃＤＮＡ希釈及びＴａｑｍａｎプライマー／プローブが異なる以外は、Ｑ−ＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ７５００で以前に記載されるように（Ｓｉｍｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１６３，６９１−７０８）、実行した。もとのＲＮＡのおよそ０．２５ｎｇに対応するｃＤＮＡの１００倍希釈液を、すべての試料について使用した。
【０１１１】
使用したＱ−ＰＣＲプライマー及びＴａｑＭａｎプローブは、ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｂｒａｎｃｈｅｓ）を用いて設計し、表１において列挙する。それぞれの配列の右側に対する括弧中の番号は、配列番号（たとえば「ＳＩＤ３２」）である。
【０１１２】
【表２】
2013521003.tif 000003
【０１１３】
定量は、参照として恒常的に発現されるリボソームタンパク質ｒｐｌ３９を使用し、相対的な定量の方法を使用して実行した。相対的な定量の方法を使用するために、遺伝子配列についての増幅効率が、明確に定めたプライマー及びプローブセットを使用して、参照配列（ｒｐｌ３９  ｃＤＮＡ配列）の増幅効率とほぼ同等であることを示すことが必要であった。この相対的な同等性を決定するために、適切なｃＤＮＡ配列を含有するコーヒーデータバンクからのプラスミドＤＮＡを、１／１０００、１／１０，０００、１／１００，０００、及び１／１，０００，０００倍に希釈し、上記に記載されるＱ−ＰＣＲ条件を使用して、曲線Ｃｔ＝ｆ（Ｌｏｇ  ＤＮＡの量）の傾斜を、それぞれのプラスミド／プライマー／ＴａｑＭａｎプローブのセット（表１）について計算した。効率を決定するために使用したプラスミドは、ｒｐｌ３９についてはｐｃｃｃｓ３０ｗ２１ｏ１３、ＵＧＰＰについてはｐｃｃｃｓ４６ｗ９ｌ８、ＧＭＰＰについてはｐｃｃｃｌ２２ｉ１９、ＰＭＭについてはｐｃｃｃｓ４６ｗ３ａ１４、ＵＧＥ１についてはｐｃｃｃｓ３０ｗ３３ｃ４、及びＵＧＥ５についてはｐｃｃｃｌ１７ｊ２４とした。
【０１１４】
検証を完成させるために、すべてのプライマー／ＴａｑＭａｎプローブセットを、Ｑ−ＰＣＲ発現において使用する様々な遺伝子型に対応するゲノムＤＮＡに対して試験した。これについては、ゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、遺伝子型Ｔ２３０８、ＦＲＴ３２、ＦＲＴ０５、及びＦＲＴ６４（上記に列挙）由来の若い葉から抽出した（表１）。
【０１１５】
１００％の効率に相当する３．３２に近い傾斜を有する曲線を提供するプラスミド／プライマー／ＴａｑＭａｎのプローブセットは、許容されると見なした。使用したプラスミド／プライマー／ＴａｑＭａｎプローブセットを、表１において示し、すべて、Ｃｔ＝ｆ（Ｌｏｇ  ＤＮＡの量）について許容される値を示した。蛍光レポーター染料ＶＩＣを用いて５’末端で及びクエンチャーＴＡＭＲＡを用いて３’末端で標識したＲＰＬ３９プローブ以外は、ＭＧＢプローブはすべて、蛍光レポーター染料６−カルボキシフルオレスセイン（ＦＡＭ）を用いて５’末端で及びクエンチャー染料６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）を用いて３’で標識した。
【０１１６】
ＵＧＰＰ及びＵＧＥ５の過剰発現、精製、及び活性アッセイ．２つのベクターから構成されるＧａｔｅｗａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）：エントリーベクターｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ及び発現ベクターｐＤＥＳＴ１７は、ＵＧＰＰ及びＵＧＥ５コーヒータンパク質を過剰産生するために使用した。戦略は、Ｎ末端に位置するＨｉｓタグ配列とインフレームで、第１のベクター（ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ）の中にＵＧＰＰ（ｐｃｃｃｓ４６ｗ９ｌ８中に含有される）又はＵＧＥ５（ｐｃｃｃｌ１７ｊ２４中に含有される）のＯＲＦを移入することから成った。これを達成するために、２つの特異的なプライマーをそれぞれの構築物について設計した（ｐｃｃｃｓ４６ｗ９ｌ８及びｐｃｃｃｌ１７ｊ２４挿入配列に基づいて）。センスプライマー（ＣｃＵＧＰＰ−フォワードプライマー及びＣｃＵＧＥ５−フォワードプライマー）（表２）は、ＯＲＦ（開始コドンＡＴＧから始まる）の最初の少数のコドンに対して特異的な配列及びｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯにおけるクローニングを指示するのに必要なＣＡＣＣアダプター（ＡＴＧコドンに対して５’）を含む。リバースプライマー（ＣｃＵＧＰＰ−リバースプライマー及びＣｃＵＧＥ５−リバースプライマー）（表２）は、ＯＲＦの終止コドン及び３’ＵＴＲ由来のいくつかの塩基を含有する。それぞれの配列の右側に対する括弧中の番号は、配列番号（たとえば「ＳＩＤ５０」）である。
【０１１７】
【表３】
2013521003.tif 000004
【０１１８】
次いで、ＰＣＲ反応は、上記に記載される特異的なプライマー及び産物の５’末端にアデニンを生成せず、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯの中へのＣｃＵＧＰＰ及びＣｃＵＧＥ５のＰＣＲ産物の直接的なクローニングを可能にするＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔａｔａｇｅｎｅ）を用いて実行した。ＰＣＲ増幅は、最終５０μｌ容量で以下のように実行した：１μｌのｐｃｃｃｓ４６ｗ９ｌ８又はｐｃｃｃｌ１７ｊ２４プラスミド（１／１０希釈）、５μＬ  １０×ＰＣＲバッファー（ｃｌｏｎｅｄ  Ｐｆｕ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）、４００ｎＭの両方の特異的プライマー、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、及び１．２５ＵのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。ＰＣＲサイクリング条件は、以下のとおりとした：２分間、９４℃；次いで、１分間、９４℃、１分３０秒間、アニール温度５５℃、及び１分３０秒間、７２℃を３５サイクル。伸長のさらなる最終ステップは、７分間、７２℃で行った。次いで、挿入物は、メーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から提供される説明書に従ってｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターの中にクローニングした。本実験は、プラスミドｐＧＴ３８及びｐＧＴ２５を形成するために、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（カナマイシン抵抗性）の中にＣｃＵＧＰＰ及びＣｃＵＧＥ５  ＯＲＦをそれぞれ入れた。挿入物のクローニングは、ＰＣＲの間にエラーのない正確なクローニングを確認するＭ１３−ＲＰ及びＭ１３−ＦＰユニバーサルプライマーを用いて配列決定することによって確認した。
【０１１９】
次に、ｐＧＴ３８及びｐＧＴ２５は、それぞれ、ＯＲＦが、ｐＤＥＳＴ１７におけるＮ末端ＨｉｓタグとインフレームにあるｐＧＴ３及びｐＧＴ２を産生するために、メーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって示されるプロトコールＧＡＴＥＷＡＹに従ってｐＤＥＳＴ１７（アンピシリン抵抗性）を用いて組換えた。組換えの産物は、コンピテント細胞Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中に形質転換した。アンピシリン抵抗性陽性クローンは、表２において記載される特異的なプライマーＣｃＵＧＰＰ−フォワードプライマー／ＣｃＵＧＰＰ−リバースプライマー又はＣｃＵＧＥ５−フォワードプライマー／ＣｃＵＧＥ５−リバースプライマーを用いるＰＣＲスクリーニングによって、ＣｃＵＧＰＰ又はＣｃＵＧＥ５挿入物を含有することを確認した。次いで、精製後に、ｐＧＴ３及びｐＧＴ２は、供給者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって示されるプロトコールに従って、コンピテント細胞ＢＬ２１−ＡＩ（商標）ＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（タンパク質発現用）中に形質転換した。次いで、クローニングは、ＣｃＵＧＰＰ及びＣｃＵＧＥ５がＮ末端Ｈｉｓタグとインフレームにあることを示すＴ７ユニバーサルプライマーを用いて配列決定することによって確認した。
【０１２０】
タンパク質発現については、ｐＧＴ３又はｐＧＴ２を用いて形質転換したＢｌ２１ＡＩ細胞の２ｍＬの培養物（４０％グリセロール）は、ＯＤ６００ｎｍ＝０．６まで、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１００ｍｌのＬＢ培地において、３７℃及び２００ｒｐｍで約３時間、成長させた。次いで、１ｍＬの培養物は、続くタンパク質抽出のために及びＳＤＳ  Ｐａｇｅゲル上で可視化するために保管した。次いで、クローニングしたタンパク質の発現は、０．２％のＬ−アラビノースを用いて誘発し、培養物は、２７℃でさらに２時間、インキュベートした。１ｍＬの誘発培養物は、抽出及びＳＤＳ  Ｐａｇｅゲル用に保管した。
【０１２１】
細胞は、４℃で３０分間、５５００ｇでペレットにし、次いで、採取した細菌ペレットは、５μＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びプロテアーゼ阻害剤Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ）を追加した５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）において再懸濁した。７０ｒｐｍでの室温での３０分間のインキュベーション後に、溶解させた細胞は、可溶性タンパク質抽出物（上清）及び不溶性タンパク質画分（ペレット）を得るために、４℃で３０分間、１００００ｇで遠心分離した。
【０１２２】
次いで、１５（１５）μＬの収集した誘発／非誘発抽出物及び可溶性／不溶性タンパク質抽出物は、変性バッファー５×Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．）を使用し、８−１６％Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＡＧＥ  Ｇｅｌｓ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．）上で、Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｌｏｗ  Ｒａｎｇｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて可視化した。使用した移動バッファーは、Ｔｒｉｓ−ＨＥＰＥＳ−ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．）、１００Ｖとした。次いで、ゲルは、着色溶液（０．２５％ｗ／ｖクーマシーブルー、１０％酢酸、及び２０％エタノール）を用いて７０ｒｐｍで２０分間、着色し、次いで、強力な脱色溶液（４０％エタノール、７％酢酸）を用いて７０ｒｐｍで２０分間、２回洗浄し、次いで、薄い脱色溶液（１０％エタノール、１０％酢酸、５％グリセロール）を使用して、７０ｒｐｍで、一晩、１回、洗浄した。
【０１２３】
実施例２：コフィア・カネフォラＰＭＭ、ＧＭＰＰ、ＵＧＰＰ、及びＵＧＥをコードするｃＤＮＡの単離及び特徴付け
本実施例は、ガラクトマンナン合成のための重要な前駆物質であるＵＤＰガラクトース及びＧＤＰマンノースの合成に直接関与するタンパク質コードするｃＤＮＡ配列の単離及び特徴付けについて記載する。選択した酵素は、ＰＭＭ（ホスホマンノムターゼ）、ＧＭＰＰ（ＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ）、ＵＧＰＰ（ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ）、及びＵＧＥ（ＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ）とした。様々なＢＬＡＳＴプログラム（実施例１を参照されたい）は、生化学的に特徴付けられたＰＭＭ、ＧＭＰＰ、ＵＧＰＰ、及びＵＧＰＰタンパク質をコードする公的データベースタンパク質配列と最も高度な類似性を有するｕｎｉｇｅｎｅ配列を検索するために使用した。ＵＧＥ１を除き、次いで、それぞれの「ｂｅｓｔ  ｕｎｉｇｅｎｅ  ｈｉｔ」の最も長いｃＤＮＡを、完全な配列決定のために選択した。結果は、表３及び表４において要約する。
【０１２４】
表３は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｇｎ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕでＢｌａｓｔによってコーヒーＵｎｉｇｅｎｅｓを同定するために使用したコーヒー以外の生物由来のＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、及びＵＧＥタンパク質配列を参照する。Ｔｂｌａｓｔｎの同一性は、タンパク質に翻訳されるすべてのコフィア・カネフォラＵｎｉｇｅｎｅｓのヌクレオチド配列を含有するデータベースに対してクエリーとして完全なタンパク質配列を使用して実行したｂｌａｓｔからもたらされる。Ｂｌａｓｔｎの同一性は、すべてのコフィア・カネフォラＵｎｉｇｅｎｅｓのヌクレオチド配列を含有するデータベースに対してクエリーとして完全なコード配列（ＣＤＳ）を使用して実行したｂｌａｓｔからもたらされる。
【０１２５】
表４は、ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、ＰＭＭ、及び２つのＵＧＥコーヒータンパク質を可能性としてコードするとしてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｇｎ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕで同定されたコフィア・カネフォラＵｎｉｇｅｎｅｓのリストを記載する。同定されたＵｎｉｇｅｎｅｓの「ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ」配列を確認するために完全に特徴付けられ、配列決定されたクローンの名前及びそれぞれのＵｎｉｇｅｎにおいて見つけられるＥＳＴの数を示す。ＳＧＮ  ＩＤは、ＳＧＮウェブサイトでアクセス可能なコフィア・カネフォラＢｕｉｌｔ  ＃２由来のＵｎｉｇｅｎｅｓ配列に属するＳＧＮ番号に対応する。
【０１２６】
【表４】
2013521003.tif 000005
【０１２７】
【表５】
2013521003.tif 000006
【０１２８】
Ａ．ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＣｃＵＧＰＰ）
酵素ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＵＧＰＰ）をコードするコーヒーｃＤＮＡを見つけるために、生化学的に特徴付けされたＵＧＰＰタンパク質をコードする２つのタンパク質配列、オリザ・サティバＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １９，８４７−８６１；受託番号ＡＢＤ５７３０８）及びククミス・メロＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １４２，２９４−３０４；受託番号ＡＢＤ９８８２０）を、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを用いてＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌ’ｕｎｉｇｅｎｅ’Ｂｕｉｌｔ２を検索するために使用した。この検索により、オリザ・サティバ及びククミス・メロＵＧＰＰタンパク質配列に対して相同性を示す１つのｕｎｉｇｅｎｅ（ＳＧＮ−Ｕ３４８６９５）を発見した（それぞれ８７％及び８６％の同一性、ｅ−ｖａｌｕｅ＝０）。
【０１２９】
次いで、ｕｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３４８６９５（ｐｃｃｃｓ４６ｗ９ｌ８）の５’末端を示し、可能性としてこのタンパク質の完全なＯＲＦをコードするｃＤＮＡを、単離し、配列決定した。このＵｎｉｇｅｎｅは、開花４６週間後の豆から単離された９つのＥＳＴ、果皮由来の２つ、葉由来の８つ、及び様々な発育段階のチェリー由来の３つのＥＳＴを含む（表４）。
【０１３０】
ｐｃｃｃｓ４６ｗ９ｌ８の挿入物は、１７５０ｂｐ長であり、１４３４ｂｐのＯＲＦをコードする。推定されるタンパク質配列は、４７７のアミノ酸を含み、５２．４９ｋＤａの予測される分子量を有する。アラビドプシス・タリアナ、ククミス・メロ、オリザ・サティバ由来のＵＧＰＰタンパク質配列及びソラナム・ツベロサム由来のオルソロガス配列とのｐｃｃｃｓ４６ｗ９ｌ８（ＣｃＵＧＰＰ）のタンパク質配列の最適化アライメント（ＣｌｕｓｔａｌＷ）は、ｐｃｃｃｓ４６ｗ９ｌ８によってコードされるタンパク質が、それぞれ、これらのタンパク質配列と８１．７％、８６．８％、８７％、及び８７．８％の同一性を共有することを実証する（図１及び表５）。
【０１３１】
【表６】
2013521003.tif 000007
【０１３２】
アライメントデータは、ｐｃｃｃｓ４６ｗ９ｌ８が、コフィア・カネフォラＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＣｃＵＧＰＰ）についての完全長ｃＤＮＡをコードすることを示す。アラビドプシス・タリアナ、ククミス・メロ、オリザ・サティバ、及びソラナム・ツベロサム由来のＵＧＰＰの完全なＣＤＳ配列をコードするＤＮＡ配列との、ｐｃｃｃｓ４６ｗ９ｌ８において含有される完全なＣＤＳ配列をコードするＤＮＡ配列の最適化アライメント（Ｊｏｔｕｎ  Ｈｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄ）は、コーヒーＣｃＵＧＰＰのＯＲＦ  ＤＮＡ配列が、それぞれ、これらのＣＤＳ  ＤＮＡ配列と７５．１％、７８．８％、７７．１％、及び８０．６％の同一性を共有することを実証した。
【０１３３】
Ｂ．ＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ（ＣｃＧＭＰＰ）
コーヒーＧＭＰＰをコードするｃＤＮＡを見つけるために、生化学的に特徴付けられたソラナム・ツベロサムＧＭＰＰタンパク質配列（受託番号ＡＡＤ０１７３７；（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９（２），１３１−１４１）を、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを用いるＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌ’ｕｎｉｇｅｎｅ’Ｂｕｉｌｔ２に対するｔＢＬＡＳＴｎ検索のためのクエリー配列として使用した（表３）。得られたｂｅｓｔ  ｍａｔｃｈは、ｕｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３５２１１２であった（ｅ  ｖａｌｕｅ＝１ｅ−１６３、Ｓｃｏｒｅ＝５６７ｂｉｔｓ（１４６２）、Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝２８３／３１０（９１％））。このＵｎｉｇｅｎｅは、開花４６週間後の豆から単離された７つのＥＳＴ及び葉由来の８つのＥＳＴを含む（表４）。
【０１３４】
ｕｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３５２１１２（ｐｃｃｃｌ２２ｉ１９）の５’末端を示し、したがって、ジャガイモＧＭＰＰに関してＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌデータベースにおいて最も長いコーヒーｃＤＮＡをコードするｃＤＮＡを、単離し、配列決定した。ｐｃｃｃｌ２２ｉ１９の挿入物は、１５７６ｂｐ長であることが分かり、３６１のアミノ酸のタンパク質をコードする１０８６ｂｐの完全なＣＤＳ配列を含んだ（３９．４３ｋＤａの推定分子量）。ソラナム・ツベロサム、ソラナム・リコペルシカム、メディカゴ・サティバ（Ｍ．ｓａｔｉｖａ）、及びビティス・ビネフェラのタンパク質配列（それぞれ、受託番号ＡＡＤ０１７３７、ＡＡＴ３７４９８、ＡＡＴ５８３６５、及びＣＡＯ６９１３７）とのｐｃｃｃｌ２２ｉ１９によってコードされる完全なコーヒータンパク質配列ＣｃＧＭＰＰのアライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して、このコーヒー配列の最初のアノテーションを確認する、つまり、ｐｃｃｃｌ２２ｉ１９のＣＤＳは、コーヒーＧＭＰＰタンパク質をコードする（図２及び表６）。
【０１３５】
【表７】
2013521003.tif 000008
【０１３６】
タンパク質レベルで、このコーヒーＧＭＰＰ配列は、ソラナム・ツベロサム、ソラナム・リコペルシカム、メディカゴ・サティバ、及びビティス・ビネフェラＧＭＰＰタンパク質配列と、９２．２％、９２％、９３．１％、及び９４．５％の同一性を示す。核のレベルで、なおＣｌｕｓｔａｌＷ法を使用して、コーヒー配列の完全なＣＤＳは、それぞれ、ソラナム・ツベロサム、ソラナム・リコペルシカム、メディカゴ・サティバ、及びビティス・ビネフェラの完全なＣＤＳ配列と、８３．５％、８２．７％、８１．４％、及び８４％の同一性を示す。ＤＮＡレベルの同一性データは、ＣＤＳ配列についてのみであり、したがって、ｃＤＮＡの５’及び３’ＵＴＲ配列と概して関連する、より低いレベルの同一性により、それは、おそらく、完全なｃＤＮＡ配列の類似性を過大評価することが注意されるべきである。
【０１３７】
Ｃ．ホスホマンノムターゼ（ＣｃＰＭＭ）
コーヒーホスホマンノムターゼをコードするｃＤＮＡを見つけるために、生化学的に特徴付けられたアラビドプシス・タリアナホスホマンノムターゼタンパク質配列（受託番号ＡＢＤ９７８７０；Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４９（３），３９９−４１３）を、Ｎｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌ’ｕｎｉｇｅｎｅ’に対するｔｂｌａｓｔｎ検索のためにクエリー配列として使用した（表３）。得られたｂｅｓｔ  ｈｉｔは、ｕｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３５１３５２であった（ｅ  ｖａｌｕｅ＝１ｅ−１１１、Ｓｃｏｒｅ＝３９５ｂｉｔｓ（１０１４）、Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝１９０／２３３（８１％））。このＵｎｉｇｅｎｅは、豆から単離された６つのＥＳＴ（開花の３０週間後に１つ及び開花の４６週間後に５つ）、果皮由来の２つ、及び葉由来の１つを含む（表４）。
【０１３８】
ｕｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３５１３５２（ｐｃｃｃｓ４６ｗ３ａ１４）の５’末端を示し、したがって、アラビドプシスＰＭＭに関してＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌデータベースにおいて最も長いコーヒーｃＤＮＡをコードするｃＤＮＡを、単離し、配列決定した。ｐｃｃｃｓ４６ｗ３ａ１４の挿入物は、１２１８ｂｐ長であることが分かり、２４６のアミノ酸のタンパク質をコードする７４１ｐｂの完全なＣＤＳ配列を含んだ（２７．５９ｋＤａの推定分子量）。グリシン・マックス、ビティス・ビネフェラ、ポプルス・トリコカルパ、及びアラビドプシス・タリアナのタンパク質配列（それぞれ、受託番号ＡＢＤ９７８７３、ＣＡＯ３９５３４、ＡＢＫ９６０５６、及びＡＢＤ９７８７０）とのｐｃｃｃｓ４６ｗ３ａ１４によってコードされるＣｃＰＭＭの完全なコーヒータンパク質配列のアライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して、このコーヒー配列の最初のアノテーションを確認する、つまり、ｐｃｃｃｓ４６ｗ３ａ１４のＣＤＳは、コーヒーＰＭＭタンパク質をコードする（図３）。タンパク質レベルで、このコーヒーＰＭＭ配列は、グリシン・マックス、ビティス・ビネフェラ、ポプルス・トリコカルパ、及びアラビドプシス・タリアナのＰＭＭタンパク質配列と、９０．７％、８８．２％、８８．６％、及び８０．１％の同一性を示す（表７）。
【０１３９】
【表８】
2013521003.tif 000009
【０１４０】
核のレベルで、なおＣｌｕｓｔａｌＷ法を使用して、コーヒー配列の完全なＣＤＳは、それぞれ、グリシン・マックス、ビティス・ビネフェラ、ポプルス・トリコカルパ、及びアラビドプシス・タリアナの完全なＣＤＳ配列と、８０．４％、７９．６％、７８．９％、及び７１．８％の同一性を示す。ＤＮＡレベルの同一性データは、ＣＤＳ配列についてのみであり、したがって、ｃＤＮＡの５’及び３’ＵＴＲ配列と概して関連するより低いレベルの同一性により、それは、おそらく、完全なｃＤＮＡ配列の類似性を過大評価することが注意されるべきである。
【０１４１】
Ｄ．ＵＤＰグルコース４−エピメラーゼをコードする２つのｃＤＮＡクローン（ＣｃＵＧＥ１、ＣｃＵＧＥ５）
コフィア・カネフォラＥＳＴデータバンクにおけるＵＤＰグルコース４−エピメラーゼをコードするコーヒーｃＤＮＡを同定するために、生化学的に特徴付けられたアラビドプシス・タリアナＵＧＥ５タンパク質配列（受託番号ＮＰ＿１９４１２３；Ｒｏｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １９（５），１５６５−１５７９）を、Ｎｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌ’ｕｎｉｇｅｎｅ’Ｂｕｉｌｔ２に対するｔｂｌａｓｔｎ検索のためにクエリー配列として使用した（表３）。アラビドプシスにおいて、ＡｔＵＧＥ５は、植物の全体にわたって、成長及び細胞壁炭水化物生合成に影響を及ぼすことが示されている（Ｒｏｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、前掲）。得られた２つｂｅｓｔ  ｈｉｔは、ｕｎｉｇｅｎｅｓ  ＳＧＮ−Ｕ３５２５６４（ｅ  ｖａｌｕｅ＝１ｅ−１０９、Ｓｃｏｒｅ＝３９０ｂｉｔｓ（１００３）、Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝２０９／２３１（８０％））及びＳＧＮ−３４７９５２（ｅ  ｖａｌｕｅ＝１ｅ−１２７、Ｓｃｏｒｅ＝４４８ｂｉｔｓ（１１５３）、Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝２６６／３３９（６２％））であった。Ｕｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３５２５６４は、葉から単離された３つのＥＳＴを含み、ＳＧＮ−３４７９５２は、開花３０週間後の豆由来の２つ及び全チェリー由来の２つのＥＳＴを含む（表４）。
【０１４２】
第２の特徴付けられたアラビドプシス・タリアナＵＧＥタンパク質配列、ＵＧＥ１（受託番号ＮＰ＿１７２７３８；Ｒｏｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、前掲）は、Ｂｕｉｌｔ２からのコフィア・カネフォラＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｇｅｎｅｓ配列に対してｔＢｌａｓｔｎを実行するためにクエリー配列として使用した。３つのｈｉｔが得られ、５０％を超える同一性を示した。さらに、得られた２つのｂｅｓｔ  ｈｉｔは、ｕｎｉｇｅｎｅｓ  ＳＧＮ−３４７９５２（ｅ  ｖａｌｕｅ＝１ｅ−１７２、Ｓｃｏｒｅ＝６００  ｂｉｔｓ（１５４６）、Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝２８９／３５０（８２％））及びＳＧＮ−Ｕ３５２５６４（ｅ  ｖａｌｕｅ＝５ｅ−８５、Ｓｃｏｒｅ＝３０９ｂｉｔｓ（７９１）、Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝１５１／２３４（６４％））であった。
【０１４３】
ＣｃＵＧＥ１をコードするコフィア・カネフォラｃＤＮＡクローン．Ｕｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３４７９５２は、アラビドプシスＵＧＥ１配列に関して、Ｎｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌデータベースにおける完全な「ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ」コーヒーｃＤＮＡをコードすることが分かった。ｕｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３５１３５２の５’末端を示す最も長い完全なｃＤＮＡは、入手可能ではなかった。しかしながら、このｕｎｉｇｅｎｅ（ｐｃｃｃｓ３０ｗ３３ｃ４）の６９６〜１４２４ｂｐに相当する他の部分的なｃＤＮＡを、単離し、配列決定した。ｐｃｃｃｓ３０ｗ３３ｃ４の挿入物は、７３２ｂｐ長であることが分かり、部分的なＣＤＳ配列を含み（５４６ｂｐ長であり、５’末端から５０９ｂｐ欠けている）、１８１のアミノ酸の部分的なＯＲＦをコードした（２０．２４ｋＤａの推定分子量）。
【０１４４】
Ｓｅｑｍａｎソフトウェアによって実行した挿入物ｐｃｃｃｓ３０ｗ３３ｃ４配列とのＵｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３４７９５２の「ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ」配列のアライメントは、このｃＤＮＡ配列及びｕｎｉｇｅｎｅ配列が、７２９ｂｐにわたり１００％同一であることを示した。Ｕｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３４７９５２由来の「ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ」配列の生物情報学研究もまた、このＵｎｉｇｅｎｅが、３５１ａａ長のタンパク質をコードする１０５６ｂｐの完全なＣＤＳを有することを示した（３９ｋＤａの推定分子量）。ｐｃｃｃｓ３０ｗ３３ｃ４由来の挿入物の配列及びｕｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３４７９５２の５’末端クローン由来の配列（ｃＤＮＡ配列ＣＣ−Ｆ０１＿０１７＿Ｌ０５及びＣＣ−Ｆ０１＿０１４＿Ｐ０９）がすべて、Ｕｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３４７９５２と１００％の同一性を示すことを考慮すれば、Ｕｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３４７９５２由来の「ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ」配列が、正確であり、単一の遺伝子のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ配列に相当すると言うことができる。次いで、このＵｎｉｇｅｎｅ配列は、他のアラビドプシス・タリアナＵＧＥよりも高い、アラビドプシス・タリアナＵＧＥ１とのその同一性のレベルのために、ＣｃＵＧＥ１と命名した。
【０１４５】
アラビドプシス・タリアナ、ポプルス・トリコカルパ、ソラナム・ツベロサム、及びビティス・ビネフェラ（図４において入手可能な受託番号）のＵＧＥタンパク質配列（ＵＧＥ１〜ＵＧＥ５）とのＳＧＮ−Ｕ３４７９５２によってコードされる完全なコーヒータンパク質配列ＣｃＵＧＥ１のアライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して、このコーヒー配列の最初のアノテーションを確認する、つまり、ＳＧＮ−Ｕ３４７９５２のＣＤＳは、コーヒーＵＧＥタンパク質をコードする（図４）。タンパク質レベルで、Ｕｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３４７９５２に由来するこのコーヒーＣｃＵＧＥ１配列は、アラビドプシス・タリアナＵＧＥ１（８２．３％）、アラビドプシス・タリアナＵＧＥ３（７９．５％）、及びソラナム・ツベロサムＵＧＥ５１（８１．８％）タンパク質とより高いレベルの同一性を示す（図４、図５、及び表８）。５つのアラビドプシスＵＧＥタンパク質配列に基づいて、ＡｔＵＧＥ１は、ＳＧＮ−Ｕ３４７９５２によってコードされるコーヒータンパク質と最も密接に関連し、したがって、この後者の配列は、ＣｃＵＧＥ１と明確に命名された（注：完全長ｃＤＮＡは、現在、この配列について存在しない）。
【０１４６】
【表９】
2013521003.tif 000010
【０１４７】
ＣｃＵＧＥ５をコードするコフィア・カネフォラｃＤＮＡクローン．ｕｎｉｇｅｎｅ  ＳＧＮ−Ｕ３５２５６４（ｐｃｃｃｌ１７ｊ２４）の５’末端を示し、したがって、アラビドプシスＵＧＥ２配列に関してＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌデータベースにおいて最も長いコーヒーｃＤＮＡをコードするｃＤＮＡを、単離し、配列決定した。ｐｃｃｃｌ１７ｊ２４の挿入物は、１４３４ｂｐ長であることが分かり、３５０のアミノ酸のタンパク質をコードする１０５３ｂｐの完全なＣＤＳ配列を含んだ（３８．４２ｋＤａの推定分子量）。アラビドプシス・タリアナ、ポプルス・トリコカルパ、ソラナム・ツベロサム、及びビティス・ビネフェラ（図４において入手可能な受託番号）のＵＧＥタンパク質配列（ＵＧＥ１〜ＵＧＥ５）とのｐｃｃｃｌ１７ｊ２４によってコードされる完全なコーヒータンパク質配列のアライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して、このコーヒー配列の最初のアノテーションを確認する、つまり、ｐｃｃｃｌ１７ｊ２４のＣＤＳは、コーヒーＵＧＥタンパク質をコードする（図４、図５、及び表８）。タンパク質レベルで、このコーヒー配列は、ＶｖＵＧＥ（８５％）、ＰｔＵＧＥ（８４．４％）、ＳｔＵＧＥ４５（８３％）、ＡｔＵＧＥ５（８１．６％）、ＡｔＵＧＥ２（７９．４％）、及びＡｔＵＧＥ４（７８．３％）タンパク質とより高いレベルの同一性を示す。ｐｃｃｃｌ１７ｊ２４によってコードされるこのコーヒータンパク質配列はまた、ＣｃＵＧＥ１とも６３％の同一性を共有し、ＣｃＵＧＥ５と命名した。
【０１４８】
実施例３：組換えＣｃＵＧＰＰ及びＣｃＵＧＥ５の過剰発現
ｐｃｃｃｓ４６ｗ９ｌ８（ＣｃＵＧＰＰ）及びｐｃｃｃｌ１７ｊ２４（ＣｃＵＧＥ５）のアノテーションを確認するために、これらのタンパク質は、大腸菌において組換え形態で発現させた。実施例１において記載されるように、Ｇａｔｅｗａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙクローニングシステムは、ＣｃＵＧＰＰ及びＣｃＵＧＥ５を発現させるために使用した。完全なＯＲＦは、それぞれ、プラスミドｐＧＴ３８及びｐＧＴ２５を形成するために、最初に、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯエントリーベクターの中にクローニングし、次いで、ｐＧＴ３８及びｐＧＴ２５は、Ｎ末端ＨｉｓタグとインフレームのＣｃＵＧＰＰ及びＣｃＵＧＥ５の完全なコード配列を含有するｐＧＴ３及びｐＧＴ２プラスミドを産生するために、ｐＤＥＳＴ１７目的ベクターを用いて組換えた。次いで、これらの２のプラスミドｐＧＴ３及びｐＧＴ２は、ＢＬ２１−ＡＩ細胞の中に形質転換し、ＣｃＵＧＰＰ及びＣｃＵＧＥ５タンパク質は、アラビノースによる発現の誘発を使用して過剰発現させた。次いで、収集した誘発／非誘発抽出物及び可溶性／不溶性タンパク質抽出物は、ゲル上で可視化した。図６は、この過剰発現実験の結果を示し、予想されるおよそのサイズを有するｈｉｓタグ付きタンパク質ＵＧＰＰ及びＵＧＥ５（それぞれおよそ５２．５ｋＤａ及び３８．４ｋＤａプラス融合タグについての２．６ｋＤａ）の好適な誘発が、形質転換細胞の誘発後に生じたことを実証する。とりわけＣｃＵＧＥ５の場合に、可溶性画分におけるより高度な産生を伴ったが、可溶性及び不溶性画分における強力なシグナルは、ＣｃＵＧＰＰ及びＣｃＵＧＥ５タンパク質が両方の画分において産生されたことを示す。
【０１４９】
実施例４：ＰＭＭ、ＧＭＰＰ、ＵＧＰＰ、及びＵＧＥ遺伝子の組織特異的発現
ＰＭＭ、ＧＭＰＰ、ＵＧＰＰ、及びＵＧＥ遺伝子からの転写の定量的発現は、遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブ（表１）を使用し、アラビア品種Ｔ２３０８並びにロブスタ品種ＦＲＴ３２、ＦＲＴ０５、及びＦＲＴ６４のいくつかの組織について決定した。これらの実験のための様々なｃＤＮＡは、（１）発育中のアラビカ種Ｔ２３０８並びにロブスタ種ＦＲＴ３２、ＦＲＴ０５、及びＦＲＴ６４コーヒーチェリーの４つの様々な段階から単離される豆及び果皮組織並びに（２）実施例１において記載されるアラビカ種Ｔ２３０８及びロブスタ種ＦＲＴ３２由来の根、枝、葉、及び花から単離されるＲＮＡを用い、実施例１において記載される方法によって調製した。これらの実験の結果は、図７、８、及び９において示す。定量は、参照として恒常的に発現されるリボソームタンパク質ｒｐｌ３９を使用し、相対的な定量の方法を使用して実行した。
【０１５０】
Ａ．３つのロブスタ種（ＦＲＴ３２、ＦＲＴ０５、及びＦＲＴ６４）並びにアラビカ種Ｔ２３０８の豆成熟の間のＰＭＭ、ＧＭＰＰ、ＵＧＰＰ、及びＵＧＥの相対的な発現
この実験において使用されるすべてのプライマー／プローブセットは、それぞれの配列を含有するプラスミドベースのｃＤＮＡを使用して検証し、また、これらの実験において使用したそれぞれの遺伝子型のゲノムＤＮＡに対しても試験した（表１）ことに注目されたい。そのような実験は、使用されるプライマー／プローブが、単純な状態（プラスミドＤＮＡ）でそれらの特異的な配列の存在を定量的に測定するのに効率的であり、また、およそ同じ効率まで、分析されるすべての植物において遺伝子を認識することを確実にする、つまり、（ａ）遺伝子の存在は、それぞれのゲノムにおいて確認される及び（ｂ）これは、試験されている配列における対立遺伝子変化による、検出における差異がないことを確実にする。ゲノムＤＮＡに対するプライマー／プローブの効率の場合には、ＰＭＭ遺伝子に対して特異的なプライマー／プローブセットは、ゲノムＤＮＡの増幅を可能にしなかったことにさらに注目されたい。このセットが、９７％の効率で、プラスミドＤＮＡを増幅することができたので、プライマー及び／又はプローブは、エキソン及びイントロンの接合部で設計されたかもしれず、したがって、ゲノムＤＮＡを増幅することができなかったことが推測された。しかしながら、ｃＤＮＡを用いて好適な結果が得られたので、ＰＭＭ遺伝子に対して特異的なプライマー／プローブが、本実施例において記載されるＱ−ＲＴ−ＰＣＲ実験について許容されることが結論付けられた。
【０１５１】
Ｂ．豆発育の間の発現の比較
図８は、ロブスタ品種ＦＲＴ０５、ＦＲＴ６４、及びＦＲＴ３２における並びにアラビカ品種Ｔ２３０８（ＣＣＣＡ０２）におけるＧＭＰＰ、ＵＧＰＰ、ＰＭＭをコードするコーヒー遺伝子からの転写物蓄積プロファイルを示す。ＵＧＰＰ遺伝子についての発現プロファイル及び発現レベルは、およそ０．１〜０．２のＲＱを有する発現レベルで、すべての４つの品種について比較的、類似している。しかしながら、発育進行と共に、ＦＲＴ  ３２についての転写レベルがわずかに上昇し、ＦＲＴ０５についてわずかに下がる傾向があることに注目されたい。いくつかの遺伝子については、アラビカ種Ｔ２３０８豆の大きな生の段階で、転写レベルにおける上昇もまた、現れる。ＰＭＭについての発現プロファイルはまた、いくつかの小さな差異があるが、様々な品種における豆発育の間、全体的に安定している（図８）。一般に、ＰＭＭの発現レベルは、ＲＱ  ０．１〜０．４の範囲にある。しかしながら、ＦＲＴ０５及びＦＲＴ６４のＲＱレベルは、目盛の高域にあり、黄色の段階で上昇を有し、その後に、赤色の段階での低下が続くように思われる。アラビカ種において、発現レベルは、目盛の低域にあるが、発育期間の全体にわたって比較的一定である。ＧＭＰＰについての発現プロファイルは、やや複雑である。全体的に、ＲＱは、およそ０．０１〜０．１４４の範囲にあった。２つの別個のパターンの発現、初期及び後期の段階のＦＲＴ３２並びに次いで、他のもの（ＦＲＴ０５、ＦＲＴ６４、及びアラビカ種Ｔ２３０８）でのかなり低い発現があるように思われ、発現は、小さな生の豆において最も高度であり、次いで、続くステップのそれぞれで減少した。品種はすべて、赤色の段階で、比較的同様のレベルのＧＭＰＰ転写を有した。
【０１５２】
２つの特徴付けられたＵＧＥ遺伝子についての発現データは、図７において示され、下記の表９（ＵＧＥ１）及び１０（ＵＧＥ５）において記載される。
【０１５３】
【表１０】
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【０１５４】
【表１１】
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【０１５５】
ＵＧＥ１は、２つのタイプの発現パターンを示すように思われ、発現の両方のパターンは、一連の発現レベル、ロブスタ種についてＲＱ０．０１〜０．２８及び試験した単一のアラビカ種についてＲＱ０．１７〜０．５９を有する。発現の第１のパターンは、ロブスタ種ＦＲＴ３２及びアラビカ種Ｔ２３０８によって示される。これらの品種は、発育のそれぞれの段階で比較的高度なレベルの発現を示す。この結果は、やや予期されないものであった、つまり、一方のロブスタ種は、アラビカ種の発現パターンに非常に類似したが、他方のロブスタ種と異なった。第２のパターンは、２つの他のロブスタ種（ＦＲＴ０５及びＦＲＴ６４）によって示され、この場合、初期の小さな生の段階において比較的高度なレベルの転写があったが、次いで、転写レベルは、それぞれの後期の段階で著しく下がった。ＵＧＥ５についての発現パターンは、わずかに複雑である。それにもかかわらず、さらに発現の２つの異なるグループがあると思われ、一方は、すべての段階で比較的低いレベルのＵＧＥ５転写があり（ＦＲＴ３２及びアラビカ種Ｔ２３０８）、他の２つのロブスタ種は、はるかに高度なレベルを示す。コーヒーＵＧＥ１及びＵＧＥ５遺伝子についての定量的転写発現データからの１つの観察は、ＵＧＥ１転写のレベルが、ロブスタ種ＦＲＴ３２及びアラビカ種Ｔ２３０８におけるＵＧＥ５転写レベルよりもはるかに著しく、他の２つのロブスタ種についてその逆が真であるということである。この観察は、これらの２つの遺伝子が、豆において互いに置換することができることを示唆し得る。
【０１５６】
ＵＧＰＰ、ＧＭＰＰ、及びＰＭＭ遺伝子についての発現データは、図８において示され、下記の表１１（ＵＧＰＰ）、１２（ＧＭＰＰ）、及び１３（ＰＭＭ）において記載される。
【０１５７】
【表１２】
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【０１５８】
【表１３】
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【０１５９】
【表１４】
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【０１６０】
全体的に、４つの遺伝子についての豆発現データは、２つの「上流」の方の遺伝子、ＵＧＰＰ及びＰＭＭが、試験した豆発育の段階にわたり比較的均一の様式で発現されることを示す。このプロファイルは、おそらく、これらの２つの遺伝子の、よりハウスキーピング型の機能を示す。対照的に、下流の遺伝子（ＧＭＰＰ及びＵＧＥ）は、より発育に関連するプロファイルを示すように思われ、それらの発現が、ガラクトマンナン合成並びに他のＵＤＰガラクトース及びＧＤＰマンノースの反応の実際の必要性をより厳密に反映し得ることを示唆する。たとえば、豆におけるＧＭＰＰ転写物の転写物蓄積は、成熟の初めに（小さな生の段階で）、より高度であり、次いで、成熟の間に次第に減少する。これは、ガラクトマンナン合成におけるＧＤＰマンノースに対する高い需要を反映し得、これは、大きな生の及び黄色の段階でのＭａｎＳ１遺伝子の発現の増加に十分に一致する（Ｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０１６１】
Ｃ．ロブスタ種ＦＲＴ３２及び／又はアラビカ種Ｔ２３０８の異なる組織及び／又は発育段階におけるＰＭＭ、ＧＭＰＰ、ＵＧＰＰ、及びＵＧＥの相対的な発現分析
図９は、ＰＭＭ、ＧＭＰＰ、ＵＧＰＰ、及びＵＧＥについて得られた、より包括的な発現データを示す。明らかに、これらの遺伝子は、植物において広く発現され、それらが中心的な代謝に関与し、ＵＧＥを除いて、少なくともアラビドプシスゲノムにおいて単一の遺伝子によって示されるという事実を反映する。ＲＱ中央値は、表１４及び１５において示される。
【０１６２】
【表１５】
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【０１６３】
【表１６】
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【０１６４】
ロブスタ種については、ＵＧＰＰは、黄色の、とりわけ赤色の段階で著しくより高いように思われるが、すべての遺伝子は、比較的同様のレベルで果皮において発現され、関連する代謝産物の流量の増加が、果実の成熟のこれらの段階で生じ、ＵＤＰ−Ｇｌｕレベルの増加を引き起こし得る、おそらく、果実におけるスクロース合成の増加又はＧｌｕ−１−Ｐ産生の増加を引き起こし得ることを示唆する。アラビカ種における発現は、ＵＧＥ５のレベルが、ロブスタ種について見られるよりもわずかに低かった以外は、同じ一般的なパターンに従った。同様の発現パターンはまた、根、枝、葉、及び花についても見られた。これらの発現データの注目すべき側面は、ＵＧＥ１及びＵＧＰＰの遺伝子について花において見られる発現の非常に高いレベルであり、発育のこの段階の花において高レベルのＵＤＰガラクトースフラックス（前方又は後方）があり得ることを示唆する。
【０１６５】
アラビドプシス・タリアナにおいて、ＵＧＥは、若い小植物の好適な発育に必要であることが示された（Ｒｏｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、前掲）。また、オリザ・サティバ由来のＵＧＰＰ１遺伝子は、小花における、とりわけ、葯の発育の間の花粉における発現のピークを伴って、植物の全体にわたって発現されることが示された（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、前掲）。ＲＮＡ干渉又は同時抑制によるＵＧＰＰ１サイレンシングは、雄性不妊及び様々な多面的な発育異常をもたらし、このＵＧＰａｓｅが、植物生育及び発育において重要な役割を果たすことを示唆した。おそらく、コーヒーのオルソログは、同様の機能を有するであろう。
【０１６６】
本発明は、上記に記載され、例証される実施形態に限定されないが、添付の請求項の範囲内での変形及び修飾が可能である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図６】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013521003.tif 000032
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