(57)【要約】  本発明は、志賀毒素２型の活性を阻害するポリペプチドＴＦ１、それをコードする遺伝子、及びその使用を提供する。本ポリペプチドはＴＦ１と命名され（Ｐ１としても知られる）、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。ポリペプチドＰ１は、志賀毒素２型又は志賀毒素２型を産生する病原菌に起因する疾患を予防及び／又は治療する医薬へと調製することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が配列表の配列１によって表されるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１のポリペプチドに由来する修飾ポリペプチドであって、請求項１のポリペプチドに対して、そのＮ末端及び／又はＣ末端に化学的修飾又は生物学的修飾を行うことによって得られることを特徴とする、修飾ポリペプチド。
【請求項３】
前記化学的修飾がアセチル化又はアミノアシル化であることを特徴とする、請求項２に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項４】
線状ポリペプチド又は分岐ポリペプチドであることを特徴とする、請求項２に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項５に記載の遺伝子を保有する組換えベクター、組換え細菌又はトランスジェニック細胞株。
【請求項７】
Ｓｔｘ２又はＳｔｘ産生病原菌に起因する疾患を予防及び／又は治療する薬物の調製における、請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２〜４のいずれか一項に記載の修飾ポリペプチドの使用。
【請求項８】
前記病原菌が、大腸菌、志賀赤痢菌又はコレラ菌のＳｔｘ２産生株であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記Ｓｔｘ２産生大腸菌が腸管出血性大腸菌Ｏ１５７であることを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、志賀毒素２型（Ｓｔｘ２）の活性を阻害するポリペプチドＴＦ１、それをコードする遺伝子、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
志賀様毒素（Ｓｌｔ）としても知られる志賀毒素（Ｓｔｘ）は、腸管毒性、細胞毒性及び神経毒性を有する細菌外毒素の一種である。志賀毒素は、腸内病原菌によって産生され、１型及び２型（Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２）に分類される。志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、コレラ菌（Vibrio cholera）及び大腸菌（Escherichia coli）等の腸内病原菌の重要な毒性因子であるＳｔｘは、死亡率の高い出血性大腸炎（ＨＣ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）及び溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）等の幾つかの深刻な合併症を引き起こし得る。疫学データ及び臨床データの両方が、Ｓｔｘ２がＳｔｘ１よりも感染性合併症、とりわけＨＵＳとの関連性が高く、したがって薬物の標的とみなされることを実証している。
【０００３】
現在、Ｓｔｘ産生病原菌に起因する感染に関しては、応急処置のための特効性がありかつ効果的な予防薬又は治療薬は存在しない。臨床治療に一般的に使用される抗生物質が、かかる療法を無効にする多剤耐性細菌株の発生を引き起こしている。より深刻なことには、抗生物質の使用は、細菌の破壊によりＳｔｘの過剰放出を誘発し、合併症を発症するリスクを更に増大させる可能性がある。したがって、抗生物質はＳｔｘ関連疾患の治療において慎重に使用しなければならず、新規の効果的な方法として特効性のある薬物を開発しなければならない。
【０００４】
Ｓｔｘ２（Ｓｌｔ２としても知られる）は、単一のＡサブユニット（Ｓｔｘ２Ａ）及び５つのＢサブユニット（Ｓｔｘ２Ｂ）からなる。Ｓｔｘ２Ｂが真核細胞の表面上のグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）受容体に結合した後、Ｓｔｘ２Ａが２８Ｓ  ｒＲＮＡに結合して、細胞障害を引き起こす。したがって、Ｓｔｘ２Ｂと受容体Ｇｂ３との結合が、毒性にとって重要な最初の段階である。かかる結合が遮断されると、Ｓｔｘ２の毒性が実質的に阻害され得る。研究は主に毒素受容体類似体及び抗体療法に焦点を合わせている。Nishikawaは、Ｓｔｘに結合することができる多糖化合物が、潜在的な治療価値を有することを報告している（非特許文献１）。Natori Y.も２００２年に、胃腸管における毒素の拡散を予防する新たな調製物、及び循環におけるＳｔｘの細胞毒性を抑制する水溶性調製物を含む、受容体Ｇｂ３と関連する治療症例を報告している（非特許文献２）。しかしながら、受容体ベースの多糖化合物の複雑な調製プロセス及び副作用が、それらの開発を制限していた。近年、一部の研究者が、受容体の模倣体を発現するプロバイオティクスを、毒素に対するその顕著な中和作用のために、Ｓｔｘ関連疾患の治療において使用することができると報告している（非特許文献３）。しかしながら、このアプローチが安全であるか否かについて更に試験する必要がある。抗体療法に関しては、Sheoran et al.によって報告されているモノクローナル抗体が、Ｓｔｘ２と細胞受容体との間の結合を遮断し、Ｓｔｘ２の毒性を更に中和することができる（非特許文献４）。しかしながら、抗体の調製技術を改良しなければ、これを臨床的に使用することはできない。
【０００５】
薬物としては、ペプチド化合物が、低い分子量、比較的単純な構造、化学合成又は遺伝子工学法による低コストでの大量生産、特定されている機能、低い免疫原性、僅かな副作用、高い安全性、投与経路の多様性、及び吸収の容易さ等のその技術的利点のために、ますます注目を集めている。このため、小分子ペプチドは、薬物スクリーニングの最も重要な供給源の１つとなっている（非特許文献５）。毒素に対する阻害効果を有するポリペプチドをスクリーニングするために、大量のペプチドを含有するファージペプチドライブラリーを使用することが可能である。しかしながら、近年、Ｓｔｘに対するペプチドベースの阻害剤が報告されることはほとんどない。関連文献は主に、２００６年のNishikawa Kの研究（非特許文献６）及びMiura Yの研究（非特許文献７）である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nishikawa K, Matsuoka K, Watanabe M, et al., Identification of the optimal structure required for a Shiga toxin neutralizer with oriented carbohydrates to function in the circulation. J Infect Dis, 2005, 191: 2097-2105
【非特許文献２】Natori Y. New drugs that prevent cytotoxicity of Shiga toxins. Nippon Rinsho. 2002, 60(6): 1131-1137
【非特許文献３】Paton JC, Rogers TJ, Morona R, Paton AW. Oral administration of formaldehyde-killed recombinant bacteria expressing a mimic of the Shiga toxin receptor protects mice from fatal challenge with Shiga-toxigenic Escherichia coli. Infect Immun 2001, 69: 1389-1393
【非特許文献４】Sheoran AS, Chapman-Bonofiglio S, Harvey BR, et al. Human antibody against shiga toxin 2 administered to piglets after the onset of diarrhea due to Escherichia coli O157: H7 prevents fatal systemic complications. Infect Immun 2005; 73:4607-4613
【非特許文献５】Yuexi Li, Peitang Huang. Application of polypeptides in biological drugs and diagnosis reagents. Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics, 2001, 22 (4): 208-210
【非特許文献６】Nishikawa K, Watanabe M, Kita E, et al. A multivalent peptide library approach identifies a novel Shiga toxin inhibitor that induces aberrant cellular transport of the toxin. Faseb J 2006; 20:2597-2599
【非特許文献７】Miura Y, Sakaki A, Kamihira M, Iijima S, Kobayashi K. A globotriaosylceramide (Gb3Cer) mimic peptide isolated from phage display library expressed strong neutralization to Shiga toxins. Biochem Biophys Acta 2006; 1760:883-889
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、志賀毒素２型の活性を阻害するポリペプチドを提供することである。
【０００８】
本発明のポリペプチドはＴＦ１と命名され（Ｐ１とも呼ばれる）、そのアミノ酸配列は配列表の配列１によって表される。
【０００９】
本発明の別の目的は、修飾ポリペプチドを提供することである。
【００１０】
本明細書で提供される修飾ポリペプチドは、上述のＴＦ１を、そのＮ末端及び／又はＣ末端で化学的修飾又は生物学的に修飾することによって得られる。
【００１１】
さらに、前記化学的修飾はアセチル化又はアミノアシル化であり得る。
【００１２】
前記修飾ポリペプチドは線状ポリペプチド又は分岐ポリペプチドであり得る。
【００１３】
前記ポリペプチドをコードする遺伝子も本発明の保護範囲内に包含される。
【００１４】
前記遺伝子を含有する組換えベクター、組換え細菌又はトランスジェニック細胞株も本発明の保護範囲内に包含される。
【００１５】
Ｓｔｘ２又はＳｔｘ２産生病原菌に起因する疾患を予防及び／又は治療する薬物の調製における、前記ポリペプチド又は前記修飾ポリペプチドの使用も本発明の保護範囲内に包含される。
【００１６】
前記病原菌は、大腸菌、志賀赤痢菌又はコレラ菌のＳｔｘ２産生株である。
【００１７】
特に、前記Ｓｔｘ２産生大腸菌は腸管出血性大腸菌Ｏ１５７である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】合成されたペプチドＴＦ１（Ｐ１とも呼ばれる）の質量分析結果を示す図である。図１Ａは質量スペクトロメトリーの画像を示。
【図１Ｂ】合成されたペプチドＴＦ１（Ｐ１とも呼ばれる）の質量分析結果を示す図である。図１Ｂは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の画像を示す。
【図２Ａ】合成されたペプチドＷＡ８（Ｐ８とも呼ばれる）の（２２０ｎｍでの）質量分析結果を示す図である。図２Ａは質量スペクトロメトリーの画像を示す。
【図２Ｂ】合成されたペプチドＷＡ８（Ｐ８とも呼ばれる）の（２２０ｎｍでの）質量分析結果を示す図である。図２Ｂは高速液体クロマトグラフィーの画像を示す。
【図３】Ｓｔｘ２Ｂと、勾配濃度のポリペプチド（Ｐ１、Ｐ８）との間の結合プロファイルを示す図である。結合量は、Ｐ１（又はＰ８）の濃度の増大とともに徐々に増大する。
【図４】ＢＩＡｃｏｒｅシステムによって、Ｓｔｘ２とＴＦ１（Ｐ１とも呼ばれる）（又はＷＡ８（Ｐ８とも呼ばれる））との間の特異的結合を動的に分析する、ポリペプチドとＳｔｘ２との間の結合力学を示すグラフである。最も低い曲線は最も低い濃度を表し、最も高い曲線は最も高い濃度を表す。図４Ａ（ＫＤ：１．２５ｅ−６）におけるＰ１の濃度は０．９６μｍｏｌ／Ｌ〜１５．３８μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、図４Ｂ（ＫＤ：２．４８ｅ−５）におけるＰ８の濃度は２．４４μｍｏｌ／Ｌ〜３９．１２５μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、ポリペプチドＴＦ１及びＷＡ８がＳｔｘ２に対して特異的に、用量依存的に結合することができることが示される。
【図５】光学顕微鏡（×２００）によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察した、細胞毒性に対するＴＦ１（Ｐ１とも呼ばれる）及びＷＡ８（Ｐ８とも呼ばれる）の阻害効果を示す図である。Ｈｅｌａ細胞をインキュベーション後に添加する。Ａ：対照群（ＰＢＳ）。Ｂ：Ｓｔｘ２群。Ｃ：Ｓｔｘ２＋ポリペプチド（Ｐ１又はＰ８）。
【図６】マウスにおける５ＬＤ５０に対するポリペプチドの保護効果を示す図である。マウスにポリペプチド、次いで２０分後にＳｔｘ２（５ＬＤ５０）を腹腔内投与した。図６ＡはＰ１の効果を示し、図６ＢはＰ８の効果を示す。どちらのポリペプチドも０．７ｍｇ／ｋｇ〜１１ｍｇ／ｋｇの範囲で投与した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明を以下の具体的な実施例と併せて更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２０】
実施例において用いられる方法は、特に指定のない限り、一般的な方法である。
【実施例】
【００２１】
実施例１．ポリペプチドＴＦ１（Ｐ１とも呼ばれる）及びＷＡ８（Ｐ８とも呼ばれる）の修飾、化学合成及び結合活性分析
１．ポリペプチドＴＦ１（Ｐ１とも呼ばれる）及びＷＡ８（Ｐ８とも呼ばれる）の修飾及び合成
１）ＴＦ１及びＷＡ８の配列のスクリーニング
Ｓｔｘ２Ｂの調製：
ｓｔｘ２Ｂ遺伝子を、大腸菌ＥＨＥＣ  Ｏ１５７：Ｈ７（ATCCから購入した）から、プライマーとして５’−ｃａｔａｔｇｇｃｔａａａｇｇｔａａａａｔｔｇａｇ−３’及び５’−ｇｃｇｇｃｃｇｃｇｃｃｔｃａｇｔｃａｔｃａｇｔｃａｔｔ−３’を用いて増幅した。増幅断片をｐＥＡＳＹ−Ｔ１においてシークエンシングし、そのヌクレオチド配列がＧｅｎｂａｎｋ  ＮＣ＿００２６５５のヌクレオチド番号１３５３３２７〜１３５３５３３であることが確認された。続いて、増幅産物を、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで消化したｐＥＴ２２ｂ＋（Novagenから購入した）に挿入し、組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｓｔｘ２Ｂを構築した。プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｓｔｘ２Ｂを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Transgenから購入した）に形質転換し、組換えｐＥＴ２２ｂ−ｓｔｘ２Ｂ／ＢＬ２１（ＤＥ３）株を得た。組換え株のクローンを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地中で増殖させ、３７℃の水浴内で一晩振盪しながらインキュベートした。次いで、培養株を三角フラスコに１：１００の比率で二次培養し、株を更に成長させた。ＯＤ６００が０．６となるまで培養株が成長した時点で、ＩＰＴＧを１ｍｍｏｌ／Ｌの最終濃度まで添加した。誘導性発現を５時間継続し、Ｓｔｘ２Ｂの効果的な発現をもたらした。細胞を超音波処理によって処理した後、１００００ｒ／分で１０分間遠心分離した。封入体を回収し、ＰＢＳ中６ｍｏｌ／Ｌの塩酸グアニジンに溶解した。その後、変性タンパク質を透析袋に移し、漸減濃度の尿素（６ｍｏｌ／Ｌ、４ｍｏｌ／Ｌ、２ｍｏｌ／Ｌ、１ｍｏｌ／Ｌ、０ｍｏｌ／Ｌ）を含む一連のＴｒｉｓバッファー（１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、０．３ｍｏｌ／Ｌのアルギニン、１ｍｍｏｌ／Ｌの還元型グルタチオン、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌの酸化型グルタチオン、１０％のグリセロール、５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣＩ（ｐＨ８．０））中で透析した。最後の透析バッファーは、１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）であった。変性タンパク質を、溶離液として１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−１ｍｏｌ／ＬのＮａＣＩを用いた、Ｑセファロースカラムを用いる線形溶出によって精製した。この実験の詳細は公開されている（Tu W, Cai K, Gao X, Xiao L, Chen RC, Shi J, Liu H, Hou XJ, Wang Q, Wang H, Improved production of holotoxin Stx2 with biological activities by using a single-promoter vector and an auto-induction expression system. Protein Expr. Purif. 2009, 67(2):169-174）。
【００２２】
ファージディスプレイ法を用いて、Ｓｔｘ２Ｂに特異的に結合するポリペプチドを、無作為の線状１２ペプチド（twelve-peptided）ライブラリーから、組換えＳｔｘ２Ｂに対するそれらの親和性に基づいてスクリーニングした。最も高頻度で生じた２つの配列を、スクリーニングしたペプチドから選び出し、ＴＦ１（Ｐ１とも呼ばれる）及びＷＡ８（Ｐ８とも呼ばれる）と命名した。続いて、ＴＦ１及びＷＡ８の物理化学的特性を、ｐｒｏｔｐａｒａｍツール（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）によって予測した。結果から、ＴＦ１が１２個のアミノ酸からなり、式Ｃ７７Ｈ１０１Ｎ１７Ｏ１８Ｓ１によって表すことができ、分子量が１５８４．８であり、理論的ｐＩは５．１９であることが示された。加えて、ＷＡ８が１２個のアミノ酸からなり、式Ｃ７９Ｈ９６Ｎ１６Ｏ１８によって表すことができ、分子量が１５５７．７であり、理論的ｐＩが６．７４であることが見出された。
【００２３】
２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの化学的修飾及び合成
ポリペプチドＴＦ１及びＷＡ８を、それらの一次構造を変更することなく、Ｎ末端でアセチル化した。これは水溶性及び安定性を改善し得る。かかる化学的修飾は、Shanghai Bootech Bioscience&Technology Co., Ltdによって行われた。ペプチドを固相合成によって合成した後、質量スペクトロメトリー及びＨＰＬＣを行った。図１及び図２に示されるように、ＴＦ１の分子量は１５８４．９であり（図１Ａ、質量スペクトル）、これは理論値と一致し、その純度は９５．１％であった（図１Ｂ、ＨＰＬＣ）。ＷＡ８の分子量は１５５７．７であり（図２Ａ、質量スペクトル）、これは理論値と実質的に一致し、その純度は９５．３％であった（図２Ｂ、ＨＰＬＣ）。
【００２４】
ＴＦ１（Ｐ１とも呼ばれる）のアミノ酸配列を配列表の配列１によって表し、ＷＡ８（Ｐ８とも呼ばれる）のアミノ酸配列を配列２によって表した。
【００２５】
２．ポリペプチドＴＦ１（Ｐ１とも呼ばれる）及びＷＡ８（Ｐ８とも呼ばれる）の結合活性の分析
バイオセンサーシステムＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００、ＣＭ５チップ及び対応する試薬はGEから購入し、ＨＲＰ結合抗ヒスチジン抗体はPierceから購入した（ＥＬＩＳＡ力価：１：２０００）。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ、大腸菌ＤＨ５α及びｐＥＡＳＹ−Ｔ１単純クローニングベクターは、Beijing TransGen Biotech（中国）から購入した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及び制限エンドヌクレアーゼは、New England Biolabs（中国、北京）から入手した。ＰＣＲプライマーはBeijing Sunbio Tech Co. Ltdによって合成された。プラスミドミニキット及びゲル抽出キットは、Beijing Biomed Co. Ltdから購入した。ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（５ｍｌ）は、GE Healthcare（中国、北京）から購入した。分画分子量（Weight cut-off）８ｋＤａ〜１０ｋＤａの透析膜チューブは、Beijing Kehaijunzhou Biotechnology Development Centerから購入した。発現ベクターｐＥＴ３２ａはNovagenから購入した。
【００２６】
１）ポリペプチドとＳｔｘ２Ｂとの間の相互作用の酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）分析
ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに、勾配濃度のポリペプチド（陰性対照としてＢＳＡ）を４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳＴで洗浄した。次いで、３％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで洗浄した。工程１において調製したＳｔｘ２Ｂを添加した後、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ洗浄の後、抗ヒスチジン抗体を使用して、ポリペプチドに結合したＳｔｘ２Ｂを試験した。比色反応の後、４５０ｎｍでの吸光度を記録した。図３に示されるように、ポリペプチド（Ｐ１又はＰ８）の濃度が増大するとともに、Ｓｔｘ２Ｂに対するポリペプチド結合の量が徐々に増大した。同じ濃度ではＷＡ８よりも多くのＰ１がＳｔｘ２Ｂに結合した。
【００２７】
２）Ｓｔｘ２に対するＴＦ１及び／又はＷＡ８の特異的結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術に基づく動態分析
Ｓｔｘ２の調製：
ｓｔｘ２遺伝子を、大腸菌ＥＨＥＣ  Ｏ１５７：Ｈ７から、プライマーとして５’−ＧＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡＴＡＴＴＡＴＴＴＡＡＡＴＧＧＧ−３’（プライマー１）及び５’−ＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＴＡＡＡＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＧ−３’（プライマー２）を用いて増幅した。増幅断片をｐＥＡＳＹ−Ｔ１においてシークエンシングに供し、そのヌクレオチド配列がＧｅｎｂａｎｋ  ＮＣ＿００２６５５のヌクレオチド番号１３５３３２７〜１３５３５３３であることが確認された。単一のプロモーターとともに２つのオープンリーディングフレームを含有する、組換えｐＥＴ３２ａ−ｓｔｘ２／ｐｌｙｓＳ株を構築した。具体的には、増幅産物を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ  Ｉ及びＳａｌ  Ｉで消化したｐＥＴ３２ａに挿入して、組換えプラスミドｐＥＴ３２ａ−ｓｔｘ２を構築した。次いで、このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ株（Transgenから購入した）に形質転換して、組換えｐＥＴ３２ａ−ｓｔｘ２／ｐｌｙｓＳ株を得た。
【００２８】
組換えプラスミドｐＥＴ３２ａ−ｓｔｘ２は、１つのＴ７プロモーターを有するものであり、ｓｔｘ２の完全長クローンは、２つのオープンリーディングフレーム（ｓｔｘ２ａ及びｓｔｘ２ｂ）を含有するものであった。ＩＰＴＧを１ｍｍｏｌ／Ｌの最終濃度まで添加した。その後、細胞を水浴内で振盪しながら３０℃で５時間培養し、Ｓｔｘ２の非常に効果的な発現をもたらした。純度が９０％以上のＳｔｘ２が、ＨｉｓＴｒａｐ  Ｎｉカラムにおける処理後に得られ、Ｓｔｘ２は生物活性を示した。関連実験の詳細は公開されている（Tu W, Cai K, Gao X, Xiao L, Chen RC, Shi J, Liu H, Hou XJ, Wang Q, Wang H, Improved production of holotoxin Stx2 with biological activities by using a single-promoter vector and an auto-induction expression system. Protein Expr. Purif. 2009, 67(2):169-174）。
【００２９】
調製されたＳｔｘ２に対するポリペプチドの特異的結合を、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーシステムにおいて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて試験した。具体的には、Ｓｔｘ２（２２３５．９ＲＵ）を、ＥＤＣ／ＮＨＳによって活性化し、エタノールアミンによってブロッキングしたＣＭ５チップ内のＦｃ４と共役させた。種々の濃度の（倍加希釈した（double diluted））ポリペプチドとＳｔｘ２との間の結合動態を検出した後、曲線で示した。検出は２０μＬ／分で行い、Ｓｔｘ２に対するポリペプチド（ＴＦ１又はＷＡ８）の動的結合プロセスをセンサーグラムによって観察した。分析はＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０によって行い、Ｋａ及びＫｄをそれぞれ曲線の結合部分及び解離部分から得た。データは種々の濃度のポリペプチドで全く異なっていた。Ｋａ、Ｋｄ、ＫＡ及びＫＤは、分析報告に基づいて以下の式に従って算出した：
Ｒｍａｘ＝（ＭＷアナライト／ＭＷリガンド）×Ｒリガンド×Ｓ結合価          （１）
Ｋａ＝（ｄＲ／ｄｔ）／ｔ                                   （２）
Ｋｄ＝（ｄｔ／ｄＲ）／Ｒ                                   （３）
ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ＝Ｃ×（Ｒｍａｘ−Ｒｅｑ）／Ｒｅｑ         （４）
Ｒ：或る時点でのＳＰＲシグナル（単位：ＲＵ）。Ｒｅｑ：アナライトの安定結合レベル（単位:ＲＵ）。Ｒｍａｘ：ペプチドの最大結合能。ｔ：時間。ｄＲ／ｄｔ：ＳＰＲシグナル変換速度。Ｃ：ペプチド濃度。
【００３０】
図４に示されるように、Ｐ１の濃度は０．９６μＭ〜１５．３８μＭの範囲であり、Ｐ８の濃度は２．４４μＭ〜３９．１２５μＭの範囲であった。Ｓｔｘ２に対するＰ１結合の親和性定数ＫＤは１．２５×１０−６Ｍであり、Ｓｔｘ２に対するＰ８結合の親和性定数ＫＤは２．４８×１０−５Ｍであると算出された。
【００３１】
実施例２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞毒性に対するＴＦ１又はＷＡ８の阻害効果、及び毒素と標的細胞との結合に対するＴＦ１又はＷＡ８の遮断効果
Ｈｅｌａ細胞、パンクレアチン及び抗体はHyclone Laboratories Inc.から、ＤＭＥＭ培地、ウシ胎仔血清、ＭＴＴ及びＦＩＴＣはそれぞれGIBCO Inc.、Biochorm Ltd.、sigma Inc.及びLaibao Incから購入した。細胞培養フラスコ及びプレートはCORNING Incから購入した。ＣＯ２インキュベーター、倒立顕微鏡、フローサイトメーターはそれぞれ、Sanyo Inc.（日本）、Olympus Inc.（日本）及びCoulter Incの製品であった。
【００３２】
１．細胞毒性中和アッセイ
対数増殖期のＨｅｌａ細胞を回収した後、その濃度を或る特定の程度まで調整した。１００μｌの細胞培養物を９６ウェルマイクロタイタープレートに注入し、各々のウェルにおける細胞の密度を１０４個／ウェルに調整した（周縁部のウェルは滅菌ＰＢＳで満たした）。プレートを５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。続いて、１００μｌのポリペプチド（１５０μＭの最終濃度を有する）を、２．５ｎｇのＳｔｘ２（５ＣＤ５０）と混合した。その後、混合物を４℃で一晩インキュベートした。同時に、２つの対照群を、一方に正常対照としてＰＢＳのみを添加し、他方にＳｔｘ２のみを添加して準備した。混合物を９６ウェルマイクロプレートで培養した細胞に添加し、５％ＣＯ２、３７℃で７２時間インキュベートした後、倒立顕微鏡を用いて細胞を観察した。培養液を捨て、細胞をＰＢＳで２、３回慎重に洗浄した。５０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）を各々のウェルに添加し、培養を更に４時間継続した。続いて、培養液を慎重に捨て、１５０μｌのＤＭＳＯを各々のウェルに添加した。プレートを振盪機内で５分間穏やかに振盪し、それにより結晶を十分に溶解した。吸光度をＯＤ５７０でマイクロプレートリーダーを用いて測定した。阻害率を以下の式に従って算出した：阻害率％＝（ＯＤ５７０（ペプチド＋Ｓｔｘ２）−ＯＤ５７０（Ｓｔｘ２））／（ＯＤ５７０（正常対照）−ＯＤ５７０（Ｓｔｘ２））。図５に示されるように、濃度が同じ場合、Ｐ１の阻害率はＰ８よりも高かった。Ｓｔｘ２（５×ＣＤ５０）を、致死量を超える量で添加した場合、Ｐ１のＩＣ５０（半数阻害濃度）は１８０μＭであり、Ｐ８のＩＣ５０は１９３μＭであった。加えて、Ｐ１の濃度が３００μＭである場合に阻害率は８２％に達し、Ｐ８の濃度が３００μＭである場合に阻害率は５４％であった。
【００３３】
２．フローサイトメトリーによる、Ｓｔｘ２Ｂと細胞との結合に対するポリペプチドの効果についての分析
選択したＨｅＬａ細胞はＧｂ３＋細胞であり、Ｓｔｘ２ＢがＳｔｘ２の受容体結合部位であった。Ｓｔｘ２Ｂは受容体Ｇｂ３を介してＨｅＬａ細胞に特異的に結合した。かかる細胞モデルに基づいて、Ｓｔｘ２ＢとＨｅＬａ細胞との結合に対するポリペプチドの遮断効果を試験することができる。ＦＩＴＣ−Ｓｔｘ２Ｂを、Ｓｔｘ２ＢをフルオレセインＦＩＴＣで標識することによって調製した。具体的には、上で言及した精製Ｓｔｘ２Ｂを炭酸バッファー（ｐＨ９．２）で透析し、ＤＭＳＯ中のＦＩＴＣを添加した（タンパク質１ｍｇ当たり０．０５ｍｇのＦＩＴＣ）。混合物を暗所、室温で２時間撹拌し、ＦＩＴＣが生じなくなるまでバッファーを交換しながら、リン酸バッファー（ｐＨ７．２）で透析した。その後、調製されたＦＩＴＣ−Ｓｔｘ２Ｂ（５μｇ）をポリペプチド（１００μｌ、最終濃度：３００μＭ）と混合した後、４℃で一晩インキュベートした（暗所に維持する）。約１０６個の細胞を添加した後、インキュベーションを３７℃で２時間継続し、混合物を１０００ｒ／分で５分間遠心分離した。続いて、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、４℃で１０分間、４０％パラホルムアルデヒドで固定した。遠心分離の後、一部の細胞をＰＢＳ中に懸濁し、次いでフローサイトメトリーによって検出した。残りの細胞をＰＢＳ中に懸濁し、Ｈｅｌａ細胞に対するＦＩＴＣ−Ｓｔｘ２Ｂの結合プロファイルをフローサイトメトリーによって分析した。この実験は、陰性対照群（ＰＢＳ）、ＦＩＴＣ−Ｓｔｘ２Ｂ群及びＦＩＴＣ−Ｓｔｘ２Ｂ＋ポリペプチド群という３つの群を含んでいた。結果（データは示さない）から、ＦＩＴＣ−Ｓｔｘ２Ｂで処理したＨｅＬａ細胞の９７．２２％が蛍光を示し、ＦＩＴＣ−Ｓｔｘ２Ｂ＋ポリペプチドＴＦ１（Ｐ１とも呼ばれる）とともにインキュベートしたＨｅｌａ細胞の５２．７７％が蛍光を示すことが実証された。このため、ＴＦ１（Ｐ１とも呼ばれる）（３００μｍｏｌ／Ｌ）は、ＦＩＴＣ−Ｓｔｘ２ＢとＨｅＬａ細胞との間の結合の４５．７％を遮断した。ＷＡ８（Ｐ８とも呼ばれる）（３００μｍｏｌ／Ｌ）の遮断率は２４．８％であった。
【００３４】
実施例３．マウスにおけるＳｔｘ２に対するポリペプチド（ＴＦ１又はＷＡ８）の保護効果
雄のＢａｌｂ／Ｃマウス（１７ｇ〜１９ｇ）は、軍事医学科学院の実験動物センターから提供された。ＴＦ１（Ｐ１とも呼ばれる；純度９５％超（グラム））及びＷＡ８（Ｐ８とも呼ばれる；純度９５％超（グラム））を本実験において使用した。
【００３５】
Ｉ．マウスモデルにおけるＳｔｘ２致死性に対するポリペプチド（ＴＦ１又はＷＡ８）の保護効果
１．粗Ｓｔｘ２の調製
Ｓｔｘ２を発現することが可能な大腸菌Ｏ１５７（ATCCから購入した）をＬＢ培地に播種し、３７℃で一晩培養した。その翌日に、培養物を１Ｌの培地で１：１００の比率で希釈し、更に７２時間振盪しながら培養した。培養物を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、集めた細胞をＰＢＳ中に懸濁し、超音波で破壊した。１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、飽和硫酸アンモニウム溶液を、５０％の濃度に達するまで上清に添加した。続いて、沈殿を集め、ＰＢＳに溶解した。完全な透析の後、Ｓｔｘ２の粗生成物が得られた。
【００３６】
２．ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳｔｘ２に対するＴＦ１及びＷＡ８の阻害効果
雄のＢａｌｂ／Ｃマウス（１７ｇ〜１９ｇ）を、各々の群が２０匹のマウスを含む６つの群に無作為に分けた。ＴＦ１（Ｐ１とも呼ばれる）又はＷＡ８（Ｐ８とも呼ばれる）をマウスに腹腔内注射した。２０分後、マウスを５０ｎｇの粗Ｓｔｘ２（５ＬＤ５０）で腹腔内注射によってチャレンジした。プラセボ対照群（図６を参照されたい；Ｓｔｘ２）に、腹腔内注射による５０ｎｇの粗Ｓｔｘ２のチャレンジの前に、生理食塩水を注射した。１０日間観察を続け、各々の群の生存を１日２回記録した。図６に示されるように、プラセボ対照群の全ての動物が４日目又は５日目に死亡した。しかし、種々の用量のポリペプチド（Ｐ１又はＰ８）は種々の程度の保護効果をマウスにもたらした。Ｐ１は、用量が１１ｍｇ／ｋｇに達している場合に、マウスを完全に保護することができ（図６Ａを参照されたい）、Ｐ８は同じ濃度で８０％の保護率を示した（図６Ｂ）。Ｐ１又はＰ８は、用量依存的な保護効果を示した。Ｐ１は、致死量を超える量でＳｔｘ２を添加した場合に、Ｐ８よりも良好な保護能を示した。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
実験から、Ｐ１の濃度が増大するとともに、より多くのＰ１がＳｔｘ２に結合することが証明された。また、Ｓｔｘ２に対するＰ１の親和性定数ＫＤは１．２５×１０−６Ｍであった。細胞毒性中和の実験において、Ｐ１の濃度が３００μＭである場合に、Ｓｔｘ２に対する阻害率が８２％に達することが見出された。さらに、ＴＦ１（Ｐ１とも呼ばれる）（３００μｍｏｌ／Ｌ）は、ＦＩＴＣ−Ｓｔｘ２ＢとＨｅＬａ細胞との結合の４５．７％を遮断した。動物実験において、プラセボ対照群の全ての動物が４日目又は５日目に死亡した。しかし、種々の用量のポリペプチド（ＴＦ１又はＷＡ８）は種々の程度の保護効果をマウスにもたらした。Ｐ１は、用量が１１ｍｇ／ｋｇに達している場合に、マウスを完全に保護することができ（図６Ａを参照されたい）、ポリペプチドは用量依存的な保護効果を示した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年5月23日(2013.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
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【国際調査報告】
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