(57)【要約】本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に特異的に結合する抗体、および抗ウイルス性サイトカインを含む、融合タンパク質、ならびにそれを使用する方法を提供する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に特異的に結合する抗体、および抗ウイルス性サイトカインを含む、融合タンパク質。
【請求項２】
Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１のアミノ酸残基１８２−１９０のアミノ酸配列を有するか、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０２のアミノ酸残基１８−２７のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
抗体が、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞に特異的に結合する、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
抗ウイルス性サイトカインが、Ｉ型および／またはＩＩ型インターフェロンから選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
融合タンパク質が、ＣＤ８保有Ｔ細胞と同じ特異性を有する、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
抗体が、血清中のＢ型肝炎ウイルス抗原には特異的に結合しない、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
抗体がモノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
抗体が、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体と結合する抗体フラグメントである、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
抗体が（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２を含むか、あるいは抗体が（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
抗体が（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むか、あるいは抗体が（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
抗体が（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むか、あるいは抗体が（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
抗体が
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７のアミノ酸配列もしくはそのヒト化バリアントに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列もしくはそのヒト化バリアントに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；または
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７のアミノ酸配列もしくはそのヒト化バリアントに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列もしくはそのヒト化バリアントに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；
あるいは、
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のアミノ酸配列もしくはそのヒト化バリアントに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のアミノ酸配列もしくはそのヒト化バリアントに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；または
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のアミノ酸配列もしくはそのヒト化バリアントに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のアミノ酸配列もしくはそのヒト化バリアントに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；
を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
抗体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７の、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のＶＨ配列、またはそのヒト化バリアントを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
抗体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のＶＬ配列、またはそのヒト化バリアントを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
１または２つの抗体重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
１または２つの抗体軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
１または２つの抗体軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
抗体が、全長ヒトＩｇＧ１抗体であるか、あるいはトランケート形ヒトガンマ−１重鎖定常部を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項２１】
請求項１６または１８に記載の抗体鎖をコードする単離された核酸。
【請求項２２】
請求項１７に記載の抗体軽鎖をコードする単離された核酸。
【請求項２３】
請求項２０、または２１および２２のいずれか１項に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２４】
請求項２３に記載の宿主細胞を、融合タンパク質が産生されるように培養することを含む、融合タンパク質の調製方法。
【請求項２５】
下記の工程：
（ａ）請求項２３に記載の宿主細胞を用意する；
（ｂ）用意した細胞を培養する；
（ｃ）細胞または培地から融合タンパク質を回収し、それにより融合タンパク質を調製する；
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質および医薬的に許容できるキャリヤーを含む医薬配合物。
【請求項２７】
医薬として使用するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
Ｂ型肝炎ウイルス感染症を処置する際に使用するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
抗ウイルス性サイトカインをＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞へ送達する際に使用するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
医薬の製造における、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３１】
医薬がＢ型肝炎ウイルス感染症の処置のためのものである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
Ｂ型肝炎ウイルス感染症が慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染症である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
医薬が、抗ウイルス性サイトカインをＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞へ送達するためのものである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３４】
Ｂ型肝炎ウイルス感染症を伴う個体を処置する方法であって、その個体に有効量の請求項１〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を投与することを含む方法。
【請求項３５】
抗ウイルス性サイトカインを個体においてＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞へ送達する方法であって、その個体に有効量の請求項１〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を投与して、抗ウイルス性サイトカインをＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞へ送達することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に特異的に結合する抗体、および抗ウイルス性サイトカインを含む、融合タンパク質、ならびにそれを使用する方法に関する。この融合タンパク質は、ウイルス感染症、たとえばＢ型肝炎ウイルス感染症の処置のために使用できる。
【背景技術】
【０００２】
ＨＢＶはＩ型およびＩＩ型インターフェロンの抗ウイルス作用に対して感受性であるが、慢性ＨＢＶは先天性および後天性抗ウイルス免疫応答の抑制を伴うので、慢性ＨＢＶ感染症におけるこれらのサイトカインの有効性は低下する。これらの免疫欠損を回避して慢性ＨＢＶ感染症に対する現在のインターフェロン療法の有効性を高めるために、本発明者らは、ＨＢＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の卓越した特異性とサイトカインの抗ウイルス作用を肝抑制に対して抵抗性の様式で組み合わせた新規なツールを作製した。
【０００３】
インターフェロン、特にインターフェロン２αは、抗ウイルスおよび抗増殖活性をもつ医薬活性タンパク質である。たとえば、インターフェロンはヘアリーセル白血病およびカポジ肉腫の処置に用いられ、また肝炎に対して有効である。安定性および溶解性を改善し、かつ免疫原性を低減するために、インターフェロンなどの医薬活性タンパク質をポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートさせることができる(参照：EP 0 809 996)。
【０００４】
Noy, R.らは、Ｔ細胞受容体様抗体は臨床的な癌免疫および免疫療法のための新規薬剤であると報告している(Expert Review of Anticancer Therapy 5 (2005) 523-536)。
WO 2009/136874には、ＨＢＶエピトープ反応性である外因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびその使用が報告されている。
【０００５】
Sastry, K.S.らは、ＨＢＶ感染した肝細胞を標的とするＴ細胞受容体様抗体を報告している(J. Hepatol. 52 (2010) S5-S6)。WO 03/068201には、Ｔ細胞受容体様の特異性をもち、なおかつより高い親和性をもつ抗体、ならびに癌、ウイルス感染症および自己免疫疾患の検出および治療におけるそれの使用が報告されている。可溶性ＴＣＲ様分子およびそれらの使用がWO 2005/077980に報告されている。WO 2009/136874には、ＨＢＶエピトープ反応性である外因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびその使用が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】EP 0 809 996
【特許文献２】WO 2009/136874
【特許文献３】WO 03/068201
【特許文献４】WO 2005/077980
【特許文献５】WO 2009/136874
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Noy, R., et al., Expert Review of Anticancer Therapy 5 (2005) 523-536
【非特許文献２】Sastry, K.S., et al. ,J. Hepatol. 52 (2010) S5-S6
【発明の概要】
【０００８】
本明細書中に報告する融合タンパク質は、インターフェロン−アルファを、裸またはＰＥＧ化インターフェロンより大きな力価でＨＢＶ感染した標的細胞へ送達できることが見出された。本明細書中に報告する融合タンパク質は、インターフェロンの多面性作用が潜在的に低減した処置法をＨＢＶ感染患者に提供するための新規な標的療法送達プラットホームである。
【０００９】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に特異的に結合する抗体、およびサイトカインを含む、融合タンパク質を提供する。１態様において、サイトカインは抗ウイルス性サイトカインである。
【００１０】
１態様において、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質またはＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質である。
１態様において、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質はＢ型肝炎ウイルスエンベロープ（表面）タンパク質であってペプチドフラグメントはそのアミノ酸残基１７２−１８０に相当し、あるいはＢ型肝炎ウイルスタンパク質はＢ型肝炎ウイルスエンベロープ（表面）タンパク質であってペプチドフラグメントはそのアミノ酸残基１８３−１９１に相当し、あるいはＢ型肝炎ウイルスタンパク質はＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質であってペプチドフラグメントはそのアミノ酸残基１８−２７に相当する。１態様において、ペプチドフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１のアミノ酸残基１７２−１８０のアミノ酸配列を有するか、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１のアミノ酸残基１８２−１９０のアミノ酸配列を有するか、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０２のアミノ酸残基１８−２７のアミノ酸配列を有する。１態様において、ペプチドフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のアミノ酸配列を有するか、あるいはペプチドフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１のアミノ酸配列を有する。
【００１１】
１態様において、抗体はＢ型肝炎ウイルスに感染した対象の肝細胞に特異的に結合する。
１態様において、抗ウイルス性サイトカインはインターフェロンである。１態様において、抗ウイルス性サイトカインは天然の抗ウイルス性サイトカインのバリアントである。１態様において、バリアントは、トランケート形の天然サイトカインまたは抗ウイルス性サイトカインであってコンセンサスアミノ酸配列をもつものである。他の態様において、抗ウイルス性サイトカインはＩ型インターフェロン、またはＩＩ型インターフェロン、またはＩＩＩ型インターフェロンから選択される。１態様において、インターフェロンはヒトインターフェロンα−２ａである。同様にある態様において、抗ウイルス性サイトカインはヒトインターフェロンα−２ａのトランケート形バリアントである。１態様において、インターフェロンはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０３のアミノ酸配列を有するか、あるいはそのフラグメントであってＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０３のポリペプチドに匹敵する生物活性をもつものである。
【００１２】
１態様において、融合タンパク質はＣＤ８保有Ｔ細胞と同じ特異性をもつ。
１態様において、抗体は血清中のＢ型肝炎ウイルス抗原によって阻害されない。
１態様において、抗体はモノクローナル抗体である。
【００１３】
１態様において、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。
１態様において、抗体は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体を特異的に結合する抗体フラグメントである。
【００１４】
１態様において、サイトカインは抗体の軽鎖または重鎖のＮ末端またはＣ末端に融合している。１態様において、サイトカインは抗体の重鎖のＣ末端に融合している。
１態様において、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に特異的に結合する抗体と、抗ウイルス性サイトカインは、リンカーペプチドを介して融合している。１態様において、リンカーペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７から選択される。１態様において、リンカーペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のアミノ酸配列を有する。
【００１５】
１態様において、抗体は（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、またはそのヒト化バリアントを含む。
【００１６】
１態様において、抗体は（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、またはそのヒト化バリアントを含む。
【００１７】
１態様において、抗体は（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、またはそのヒト化バリアントを含む。
【００１８】
１態様において、抗体は（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７のアミノ酸配列もしくはそのヒト化バリアントに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列もしくはそのヒト化バリアントに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；または（ｃ）（ａ）のＶＨ配列および（ｂ）のＶＬ配列、もしくはそのヒト化バリアントを含む。
【００１９】
１態様において、抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７のＶＨ配列またはそのヒト化バリアントを含む。
１態様において、抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のＶＬ配列またはそのヒト化バリアントを含む。
【００２０】
１態様において、抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列を有するか、あるいはそのヒト化バリアントである。
１態様において、抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸配列を有するか、あるいはそのヒト化バリアントである。
【００２１】
１態様において、抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列を有するか、あるいはそのヒト化バリアントである。
１態様において、抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列を有するか、あるいはそのヒト化バリアントである。
【００２２】
１態様において、抗体は（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、またはそのヒト化バリアントを含む。
【００２３】
１態様において、抗体は（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、またはそのヒト化バリアントを含む。
【００２４】
１態様において、抗体は（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、またはそのヒト化バリアントを含む。
【００２５】
１態様において、抗体は（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のアミノ酸配列もしくはそのヒト化バリアントに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のアミノ酸配列もしくはそのヒト化バリアントに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；または（ｃ）（ａ）のＶＨ配列および（ｂ）のＶＬ配列、もしくはそのヒト化バリアントを含む。
【００２６】
１態様において、抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のＶＨ配列またはそのヒト化バリアントを含む。
１態様において、抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のＶＬ配列またはそのヒト化バリアントを含む。
【００２７】
１態様において、抗体は全長ヒトＩｇＧ１抗体である。
本発明はさらに、本明細書中に報告する融合タンパク質をコードする単離された核酸を提供する。本明細書中に報告する抗体重鎖をコードする単離された核酸も提供される。さらに、本明細書中に報告する抗体軽鎖をコードする単離された核酸も提供される。
【００２８】
本発明は、本明細書中に報告する１以上の核酸を含む宿主細胞も提供する。
本明細書中に報告する宿主細胞を融合タンパク質が産生されるように培養することを含む、本明細書中に報告する融合タンパク質の調製方法も提供される。１態様において、本方法は下記の工程を含む：（ａ）本明細書中に報告する宿主細胞を用意する；（ｂ）用意した細胞を培養する；（ｃ）細胞または培地から融合タンパク質を回収し、それにより融合タンパク質を調製する。
【００２９】
本発明は、本明細書中に報告する融合タンパク質および医薬的に許容できるキャリヤーを含む医薬配合物を提供する。
本発明はさらに、医薬として使用するための、本明細書中に報告する融合タンパク質を提供する。
【００３０】
本発明はさらに、Ｂ型肝炎ウイルス感染症を処置する際に使用するための、本明細書中に報告する融合タンパク質を提供する。
本発明はさらに、抗ウイルス性サイトカインをＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞へ送達する際に使用するための、本明細書中に報告する融合タンパク質を提供する。
【００３１】
本発明はまた、医薬の製造における、本明細書中に報告する融合タンパク質の使用を提供する。１態様において、医薬はＢ型肝炎ウイルス感染症の処置のためのものである。１態様において、Ｂ型肝炎ウイルス感染症は慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染症である。同様にある態様において、医薬は抗ウイルス性サイトカインをＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞へ送達するためのものである。
【００３２】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス感染症を伴う個体を処置する方法であって、その個体に有効量の本明細書中に報告する融合タンパク質を投与することを含む方法を提供する。
本発明はまた、抗ウイルス性サイトカインを個体においてＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞へ送達する方法であって、その個体に有効量の本明細書中に報告する融合タンパク質を投与して、抗ウイルス性サイトカインをＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞へ送達することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１ａ】図１は、（ａ）インターフェロンα−２ａについて、および（ｂ）抗体（ヒトＦｃ−領域）−インターフェロンα−２ａ融合タンパク質について測定したＳＰＲ結合曲線を示す（実施例３）。
【図１ｂ】図１は、（ａ）インターフェロンα−２ａについて、および（ｂ）抗体（ヒトＦｃ−領域）−インターフェロンα−２ａ融合タンパク質について測定したＳＰＲ結合曲線を示す（実施例３）。
【図２】図２は、重鎖発現プラスミド９９２４のプラスミド地図を示す（実施例１）。
【図３】図３は、軽鎖発現プラスミド９９２２のプラスミド地図を示す（実施例１）。
【図４】図４は、種々のインターフェロンα−２ａバリアントを用いて得た正規化ＲＬＵを示す。
【図５】図５は、ＨＢＶ感染細胞への種々の抗体の結合特異性を示す；両パネルにおける被験抗体：ｉ）Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体、ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体、ｉｉｉ）２つの異なる抗ＭＡＧＥ抗体、ｉｖ）２つの異なる抗ＨＢＶ抗体、ｖ）抗ｈＣＭＶ抗体、ｖｉ）２つの異なる抗ＥＢＶ抗体、およびｖｉｉ）２つの異なる抗インフルエンザウイルス抗体；図（Ａ）では、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体だけが結合を示す；図（Ｂ）では、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体だけが結合を示す。
【図６】図６は、感染した肝細胞（ＨｅｐＧ２細胞）の表面にあるペプチド−ＭＨＣ複合体の、下記による認識を示す：（Ａ）ｉ）Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体、ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体。
【図７ａ】図７は、肝生検材料のＨＢＶ感染した肝細胞の表面にあるペプチド−ＭＨＣ複合体の認識を示す。
【図７ｂ】図７は、肝生検材料のＨＢＶ感染した肝細胞の表面にあるペプチド−ＭＨＣ複合体の認識を示す。
【図８】図８は、本明細書中に報告する融合タンパク質が、ＨＢＶを発現する標的細胞に対するそれの結合性を維持することを示す；１：対照抗体；２：対照ペプチド；３：インターフェロン−アルファ、およびＢ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体を含む、融合タンパク質；４：Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体。
【図９】図９は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のペプチドによるプレブロッキングが、図８に示したインターフェロン−アルファ活性増強を妨げることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
Ｉ．定義
“アクセプターヒト枠組み構造”は、後記に定義するヒト免疫グロブリン枠組み構造またはヒトコンセンサス枠組み構造に由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）枠組み構造または重鎖可変ドメイン（ＶＨ）枠組み構造のアミノ酸配列を含む、ヒト抗体枠組み構造を意味する。ヒト免疫グロブリン枠組み構造またはヒトコンセンサス枠組み構造“に由来する”アクセプターヒト枠組み構造領域は、それと同じアミノ酸配列を含んでもよく、あるいはそれはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。ある態様において、アミノ酸の変化の個数は１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。ある態様において、ＶＬアクセプターヒト枠組み構造の配列は、ＶＬヒト免疫グロブリン枠組み構造配列またはヒトコンセンサス枠組み構造配列と同一である。
【００３５】
用語“親和性（アフィニティー）”は、ある分子（たとえば抗体）とそれの結合パートナー（たとえば抗原）の間の非共有結合相互作用の総和を意味する。分子Ｘの、それのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（ＫＤ）により表示できる。親和性は、本明細書に記載するものを含めた当技術分野で既知の一般法により測定できる。
【００３６】
“アフィニティー成熟(affinity matured)”抗体は、１以上の超可変部（ＨＶＲ）または相補性決定領域（ＣＤＲ）において、そのような変異をもたない親抗体と比較して１以上の変異をもつ抗体を表わし、そのような変異は抗原に対する抗体の親和性の改善、すなわち抗体の結合部位とそれの結合パートナー（抗原）の間の解離定数の低下をもたらす。
【００３７】
用語“アミノ酸”は、一群のカルボキシα−アミノ酸を意味し、それらは直接に、または前駆体の形で、核酸によりコードすることができる。個々のアミノ酸は、３つのヌクレオチド、いわゆるコドンまたは塩基トリプレットからなる核酸によりコードされる。各アミノ酸は、少なくとも１つのコドンによりコードされる。これは“遺伝子コードの縮重”として知られている。本出願内で用いる用語“アミノ酸”は、下記のものを含む天然のカルボキシα−アミノ酸を意味する：アラニン（三文字コード：ａｌａ、一文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）。
【００３８】
用語“Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体”は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体を十分な親和性で結合することができる抗体を表わし、したがってその抗体は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体をディスプレイしている細胞を標的とする際の診断剤および／または療法剤として有用である。ある態様において、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体は、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（たとえば、１０−８Ｍ以下、たとえば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍまで、たとえば１０−９Ｍから１０−１３Ｍまで）の解離定数（Ｋｄ）をもつ。
【００３９】
本明細書中で用いる用語“抗体”は、最も広い意味で用いられ、種々の抗体構造体を包含し、それにはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメント（それらが目的の抗原結合活性を示す限り）が含まれるが、これらに限定されない。天然抗体は、多様な構造をもつ分子である。たとえば、天然ＩｇＧ抗体は約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成され、それらがジスルフィド結合している。Ｎ末端からＣ末端へ、それぞれの重鎖は可変ドメイン（ＶＨ）（可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて３または４つの定常ドメイン（ＣＨＩ、ＣＨ２、ＣＨ３、および場合によりＣＨ４）をもつ。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ、それぞれの軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ）（可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインをもつ。抗体の軽鎖は、それの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）およびラムダ（λ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）と呼ばれる２タイプのひとつに割り当てることができる。
【００４０】
用語“抗体フラグメント”は、無傷抗体以外の分子であって無傷抗体の一部分を含むものを表わし、その部分は無傷抗体が結合する抗原を結合する。抗体フラグメントの例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ディアボディー(diabody)、直鎖抗体、一本鎖抗体分子（たとえばｓｃＦｖ）、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を表わす。
【００４１】
基準抗体としての“同じエピトープに結合する抗体”は、競合アッセイにおいて基準抗体がそれの抗原に結合するのを５０％以上ブロックする抗体を表わし、逆に基準抗体は、競合アッセイにおいて抗体がそれの抗原に結合するのを５０％以上ブロックする。競合アッセイの例は本明細書に示されている。
【００４２】
用語“抗ウイルス性サイトカイン”は、感染後に抗ウイルス応答の樹立を仲介し、炎症細胞を感染部位へ動員するサイトカインを意味する。抗ウイルス性サイトカインは、Ｉ型（インターフェロン（ＩＦＮ）−αおよびＩＦＮ−β）、ＩＩ型（ＩＦＮ−γ）およびＩＩＩ型（ＩＦＮ−λまたはインターロイキン（ＩＬ）−２８／２９）インターフェロンを含む。インターフェロンα、β、γおよびλは、ウイルス感染に対する先天性免疫応答に際して産生される重要なインターフェロンである。
【００４３】
用語“キメラ”抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種から誘導され、一方で重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種から誘導された抗体を意味する。ある態様において、キメラ抗体は第１の供給源または種から誘導された可変ドメインを含み、一方で重鎖および軽鎖の残りの部分は第２の異なる供給源または種から誘導される。
【００４４】
抗体の“クラス”は、それの重鎖がもつ定常ドメインまたは定常部の型を表わす。５つの主要クラスのヒト抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうち幾つかはさらにサブクラス（イソ型）、たとえばＩｇＧ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８および１９）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分類される。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００４５】
“エフェクター機能”は、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を意味し、それらは抗体のイソ型に伴って異なる。抗体のエフェクター機能の例には下記のものが含まれる：Ｃ１ｑ結合性および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合（ＦｃＲｎ）、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性マクロファージ仲介性細胞傷害（ＡＤＭＣ）、細胞表面受容体（たとえば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、およびＢ細胞活性化。
【００４６】
ある作用物、たとえば医薬配合物の“有効量”は、希望する治療または予防の結果または効果を、必要な投与量で必要な時間達成するのに有効な量を意味する。
用語“Ｆｃ領域”は、免疫グロブリン重鎖の定常部の少なくとも一部分を含むＣ末端領域を意味する。この用語には、天然配列Ｆｃ領域およびＦｃ領域バリアントが含まれる。１態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のほぼアミノ酸残基２２６（Ｃｙｓ）またはほぼアミノ酸残基２３０（Ｐｒｏ）からカルボキシ末端にまで及ぶ。ただし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン残基（Ｌｙｓ４４７）は存在してもよく、存在しなくてもよい。別に特定しない限り、抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸残基のナンバリングはＥＵナンバリング方式（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Vols. 1-3, Public Health Service, National Institutes of Health, Publication No. 91-3242, Bethesda, MD (1991)に記載。
【００４７】
用語“ヒト由来の定常部”は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒト抗体の重鎖定常部（たとえば、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ部、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、および場合によりＣＨ４ドメインを含む）、および／または軽鎖定常部κまたはλ領域（ＣＬドメイン）を意味する。そのような定常部は当技術分野で周知であり、たとえばKabat, E.A.により記載されている(たとえば、Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788を参照)。ＩｇＧ４サブクラスの抗体は低いＦｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ）結合を示すが、他のＩｇＧサブクラスの抗体は強い結合を示す。しかし、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ炭水化物の喪失）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４、およびＨｉｓ４３５は、変異すれば同様に低いＦｃ受容体結合を示す残基である(Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434)。１態様において、融合タンパク質の抗体はヒト由来の定常部をもつ。他の態様において、融合タンパク質の抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２から選択される定常部をもつ。同様にある態様において、融合タンパク質の抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８または１９のアミノ酸配列を有する定常部をもつ。
【００４８】
“枠組み構造”または“ＦＲ”は、超可変部（ＨＶＲ）残基または相補性決定領域（ＣＤＲ）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲドメインからなる：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４。したがって、ＨＶＲ（ＣＤＲ）およびＦＲ配列はＶＨ（またはＶＬ）中に一般に下記の順序でみられる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００４９】
用語“全長抗体”、“無傷抗体”、“全抗体”は、本明細書中で互換性をもって用いられ、天然抗体の構造に実質的に類似する構造をもつか、あるいは本明細書中で定義するＦｃ領域を含む重鎖をもつ抗体を意味する。
【００５０】
用語“宿主細胞”、“宿主細胞系”、および“宿主細胞培養物”は、互換性をもって用いられ、外因性核酸が導入された細胞を表わし、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には“形質転換体”、“形質転換された細胞”、および“トランスフェクションされた細胞”が含まれ、これは初代形質転換細胞、および継代数に関係なくそれに由来する子孫を含む。子孫は核酸内容が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異体を含むことができる。元の形質転換細胞においてスクリーニングまたは選択したものと同じ機能または生物活性をもつ変異子孫は、本発明に含まれる。
【００５１】
“ヒト抗体”は、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体のもの、またはヒト抗体レパトアもしくは他のヒト抗体コード配列を利用するヒト以外の供給源から誘導された抗体のものに相当するアミノ酸配列をもつ抗体である。ヒト抗体のこの定義は、具体的にはヒト以外の抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【００５２】
“ヒトコンセンサス枠組み構造”は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ枠組み構造配列の選択に際して最も共通にみられるアミノ酸残基を示す枠組み構造である。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ枠組み構造配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループから行なわれる。一般に、その配列サブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD(1991), vols. 1-3中のサブグループである。１態様において、ＶＬに関して、サブグループは前掲のKabat et al.中のサブグループ、カッパＩである。１態様において、ＶＨに関して、サブグループは前掲のKabat et al.中のサブグループＩＩＩである。
【００５３】
用語“ヒト化抗体”は、ヒト以外のＨＶＲ、特にＣＤＲ由来のアミノ酸残基、およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含む、キメラ抗体を表わす。ある態様において、ヒト化抗体は少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、その際、ＨＶＲ（ＣＤＲ）の全部または実質的に全部がヒト以外の抗体のものに相当し、ＦＲの全部または実質的に全部がヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、場合によりヒトに由来する抗体定常部の少なくとも一部分を含んでもよい。ある抗体、たとえばヒト以外の抗体の“ヒト化バリアント”は、ヒト化操作を受けた抗体を表わす。ヒト化抗体または抗体のヒト化バリアントは、ＦＲおよび定常部にアミノ酸変化を含んでもよい。
【００５４】
本明細書中で用いる用語“超可変部”または“ＨＶＲ”は、配列が超可変性であり、および／または構造的に規定されたループ（“超可変ループ”）を形成する、抗体可変ドメインの各領域を表わす。一般に、天然の４鎖抗体は６つのＨＶＲを含み、それらのうち３つはＶＨ中にあり（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、３つはＶＬ中にある（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。ＨＶＲは、一般に、超可変ループ由来または“相補性決定領域”（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、最高の配列可変性をもつものであり、および／または抗原認識に関与する。超可変ループは、１態様において、ＶＬドメインの２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、ならびにＶＨドメインの２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）のアミノ酸残基にみられる(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917)。ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３）は、１態様において、ＶＬドメインについて２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、ならびにＶＨドメインの３１−３５Ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）のアミノ酸残基にみられる(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., vols. 1-3, Public Health Service, National Institutes of Health, Publication No. 91-3242, Bethesda, MD (1991))。ＶＨ中のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原と接触する残基である“特異性決定残基”または“ＳＤＲ”をも含む。ＳＤＲは、ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ−ＣＤＲ、またはａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲ領域に含まれる。ａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、およびａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、１態様において、ＶＬドメインの３１−３４（Ｌ１）、５０−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、ならびにＶＨドメインの３１−３５Ｂ（Ｈ１）、５０−５８（Ｈ２）、および９５−１０２（Ｈ３）のアミノ酸残基にみられる(たとえば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照)。別に指示しない限り、可変ドメインのＨＶＲ残基および他の残基（たとえば、ＦＲ残基）は、本明細書中で、前掲のKabat et al.に従ってナンバリングされる。“イムノコンジュゲート”は、細胞毒物（これらに限定されない）を含めた１以上のヘテロロガス分子にコンジュゲートした抗体である。
【００５５】
“個体”または“対象”は、哺乳動物である。哺乳動物には霊長類（たとえば、ヒト、およびヒト以外の霊長類、たとえばサル）、ウサギ、およびげっ歯類（たとえば、マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある態様において、個体または対象はヒトである。
【００５６】
“単離された”抗体は、それの自然環境の構成要素から分離されたものである。ある態様において、抗体は、たとえば電気泳動法（たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、毛細管電気泳動）またはクロマトグラフィー法（たとえば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）により測定して９５％または９９％を超える純度にまで精製される。抗体純度の評価方法の総説については、たとえばFlatman, S., et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照。
【００５７】
“単離された”核酸は、それの自然環境の構成要素から分離された核酸分子を表わす（単離された核酸には、その核酸分子を通常収容している細胞内に収容されている核酸分子ではあるけれどもその核酸分子が染色体外またはそれの自然界での染色体位置とは異なる染色体位置に存在するものが含まれる）。
【００５８】
“Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に特異的に結合する抗体をコードする、単離された核酸”は、抗体の重鎖および軽鎖（またはそのフラグメント）をコードする１以上の核酸分子を表わし、これには単一ベクター中または個別ベクター中にある核酸分子（単数または複数）、および宿主細胞内の１以上の位置に存在する核酸分子（単数または複数）が含まれる。
【００５９】
本明細書中で用いる用語“モノクローナル抗体”は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を表わす；すなわち、たとえば自然に起きる変異を含むかまたはモノクローナル抗体調製物の調製に際して生じる可能性のあるバリアント抗体を除いて、その集団を構成する抗体は同一であり、および／または同じエピトープを結合する；そのようなバリアントの存在量は一般にわずかである。一般に異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を指向する。したがって、修飾語“モノクローナル”は、その抗体の性質が実質的に均一な抗体集団から得られたものであることを示し、いずれか特定の方法による抗体産生を要求すると解釈すべきではない。たとえば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は多様な手法で作製でき、これにはハイブリドーマ法、単一抗体産生細胞を分離する方法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含むトランスジェニック動物を使用する方法が含まれるが、これらに限定されない；モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の方法例を本明細書に記載する。
【００６０】
“裸の抗体”は、ヘテロロガス部分（たとえば、細胞毒性部分）または放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を表わす。裸の抗体は、医薬配合物中に存在する場合もある。
【００６１】
“天然抗体”は、自然界でみられる多様な構造をもつ免疫グロブリン分子を表わす。たとえば、ＩｇＧ抗体は約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成され、それらがジスルフィド結合している。Ｎ末端からＣ末端へ、それぞれの重鎖は可変部（ＶＨ）（可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて３または４つの定常ドメイン（ＣＨＩ、ＣＨ２、ＣＨ３、および場合によりＣＨ４）をもつ。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ、それぞれの軽鎖は可変部（ＶＬ）（可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインをもつ。抗体の軽鎖は、それの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２タイプのひとつに割り当てることができる。
【００６２】
用語“パッケージ挿入物”は、療法製剤の市販パッケージに通常装入される指示を表わすために用いられ、それらはそのような療法製剤の使用に関して、適応症、用途、投与量、投与法、併用療法、禁忌および／または警告についての情報を含む。
【００６３】
基準ポリペプチド配列に対する“アミノ酸配列同一性パーセント（％）”は、それらの配列をアラインさせ、最大の配列同一性パーセントを達成するために必要であればギャップを導入した後に、いずれかの保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、基準ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセントと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを判定するためのアラインメントは、当業者が容易になしうる多様な方法で、たとえば公に入手できるコンピューターソフトウェア、たとえばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成できる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要ないずれかのアルゴリズムを含めて、配列をアラインさせるのに適したパラメーターを決定できる。しかし、本発明の目的に関して、アミノ酸配列同一性％値は配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により作成され、ソースコードはユーザードキュメンテーションと共にＵ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、そこにＵ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ登録Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公に入手でき、あるいはソースコードからコンパイルできる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルすべきである。すべての配列比較パラメーターがＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変動しない。
【００６４】
ＡＬＩＧＮ−２をアミノ酸配列比較に用いる場合、あるアミノ酸配列Ｂと、Ｂとの、またはＢに対する、あるアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（これは、あるアミノ酸配列Ｂと、Ｂとの、またはＢに対する、特定のアミノ酸配列同一性％をもつあるアミノ酸配列Ａと言い換えることができる）は、下記に従って計算される：
分数Ｘ／Ｙ×１００
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によりそのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて同一マッチとして採点されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％はＡに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくないことは認識されるであろう。別に明記しない限り、本明細書中で用いるすべてのアミノ酸配列同一性％はすぐ上のセクションに記載したようにＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを用いて得られたものである。
【００６５】
用語“医薬配合物”は、それに含有される有効成分の生物活性が有効であるような形態であり、かつその配合物を投与する予定の対象に対して許容できないほど有毒な他の成分を含有しない製剤を表わす。
【００６６】
“医薬的に許容できるキャリヤー”は、医薬配合物中の有効成分以外の成分であって、対象に対して無毒性のものを表わす。医薬的に許容できるキャリヤーには緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書中で用いる“処置”（およびその文法的変形、たとえば“処置する”または“処置すること”）は、処置される個体の自然経過を変異させる目的での臨床介入を表わし、予防のために、または臨床病態の経過中に実施できる。処置の望ましい効果には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：疾患の発症または再発の阻止、症状の軽減、疾患のいずれか直接的または間接的な病的結果の低減、転移の阻止、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または一時的緩和、および予後の寛解または改善。ある態様において、本発明の抗体を用いて疾患の発症を遅延させ、または疾患の進行を遅らせる。
【００６８】
用語“Ｉ型インターフェロン”は、ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２タンパク質鎖（ＩＦＮ−α受容体、ＩＦＮＡＲ）からなる細胞表面受容体複合体に結合するインターフェロン類を意味する。ヒトに存在するＩ型インターフェロン類には、インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンωが含まれる。
【００６９】
用語“ＩＩ型インターフェロン”は、インターフェロン−ガンマ受容体（ＩＦＮＧＲ）に結合するインターフェロン類を意味する。ヒトに存在するＩＩ型インターフェロン類には、インターフェロンγが含まれる。
【００７０】
用語“ＩＩＩ型インターフェロン”は、クラスＩＩサイトカイン受容体（ＣＩＩＣＲ）ＩＬ１０Ｒ２およびＩＦＮＬＲ１からなる受容体複合体を介してシグナル伝達するインターフェロン類を意味する。ＩＩＩ型インターフェロングループは、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２およびＩＦＮ−λ３（それぞれ、インターロイキン−２９、インターロイキン−２８Ａおよびインターロイキン−２８Ｂとも呼ばれる）と呼ばれる３種類のＩＦＮ−λ分子からなる。
【００７１】
用語“可変部”または“可変ドメイン”は、抗体重鎖または軽鎖の、抗原への抗体結合に関与するドメインを表わす。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は、一般に類似の構造をもち、各ドメインは４つの保存された枠組み構造領域（ＦＲ）および３つの超可変部（ＨＶＲ）を含む(たとえば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6thed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照)。抗原結合特異性をもたらすには単一のＶＨまたはＶＬで十分な可能性がある。さらに、特定の抗原を結合する抗体に由来するＶＨまたはＶＬドメインを用いてその抗原を結合する抗体を単離し、相補的ＶＨまたはＶＬドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングすることができる(たとえば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clarkson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照)。
【００７２】
本明細書中で用いる用語“ベクター”は、それに連結させた他の核酸を増殖させることができる核酸分子を表わす。この用語には、自己複製核酸構造体としてのベクター、およびそれを導入した宿主細胞のゲノム中に組み込まれたベクターが含まれる。あるベクターは、それらが作動可能な状態で連結した核酸の発現を指令することができる。そのようなベクターを本明細書中で“発現ベクター”と呼ぶ。
【００７３】
ＩＩ．組成物および方法
本明細書中に報告する融合タンパク質は、肝炎が治癒した患者からのＨＢＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞に類似する感受性を示した。それらは、慢性ＨＢＶ患者に由来するＨＢＶ感染した肝細胞をエクスビボでも認識する。この認識は、循環ＨＢＶ抗原の存在によって影響されなかった。重要なことに、インターフェロン−アルファへの抗体融合は、ＨＢＶ抗原を発現する細胞に対するその抗体の感受性を変異させず、一方、融合したインターフェロン−アルファのそれ自身の受容体に対する親和性は低下した。ＨＢＶ抗原を発現する細胞に対するインターフェロン−アルファ活性は顕著に増強されることが見出された。本明細書中に報告するように、ＭＨＣ／ペプチド部位をＴＣＲＬでプレブロッキングすると、融合タンパク質のインターフェロン−アルファ活性は妨げられた（図９）。
【００７４】
ＨＢＶ感染細胞に対する抗体の特異性を図５に示す。図５（Ａ）では、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体だけが結合を示す；図（Ｂ）では、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体だけが結合を示す。
【００７５】
感染した肝細胞上のペプチド−ＭＨＣ複合体の認識を図６および７に示す。
図８は、本明細書中に報告する融合タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する非コンジュゲート抗体の特異性を維持することを示す。
【００７６】
１観点において、本発明は一部は、たとえば、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞へ抗ウイルス性サイトカインを送達するための、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体、および抗ウイルス性サイトカインを含む、融合タンパク質の開発に基づく。本発明の融合タンパク質は、たとえばＢ型肝炎ウイルスに感染した対象の処置に有用である。
【００７７】
１観点において、ＨＢＶ感染細胞上に提示されるＨＢＶエンベロープ（エンベロープ１８３−１９１／Ａ２０１）およびＨＢＶコア（コア１８−２７／Ａ２０１）抗原のペプチド／ＭＨＣ−Ｉに対する特異性をもつ抗体を含む融合タンパク質を報告する。この抗体は、ＨＢＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞のＴ細胞受容体認識を模倣する。
【００７８】
Ａ．Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体、および抗ウイルス性サイトカインを含む、融合タンパク質の例
１観点において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体、および抗ウイルス性サイトカインを含む、融合タンパク質を提供する。
【００７９】
１観点において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体を含む融合タンパク質であって、下記のものから選択される少なくとも１、２、３、４、５または６つのＨＶＲを含むものを提供する：（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【００８０】
１観点において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体を含む融合タンパク質であって、下記のものから選択される少なくとも１、２、３、４、５または６つのＨＶＲを含むものを提供する：（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【００８１】
１観点において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体を含む融合タンパク質であって、下記のものから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むものを提供する：（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３。１態様において、抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。１態様において、抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。１態様において、抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。
【００８２】
１観点において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体を含む融合タンパク質であって、下記のものから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むものを提供する：（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３。１態様において、抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。１態様において、抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。１態様において、抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。
【００８３】
１観点において、本発明は、下記のものから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＬ  ＨＶＲ配列を含む抗体を含む融合タンパク質を提供する：（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（Ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【００８４】
１観点において、本発明は、下記のものから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＬ  ＨＶＲ配列を含む抗体を含む融合タンパク質を提供する：（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【００８５】
１観点において、本発明の融合タンパク質は、下記のものを含む抗体を含む：（ａ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、ならびに（ｂ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメイン。
【００８６】
１観点において、本発明の融合タンパク質は、下記のものを含む抗体を含む：（ａ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、ならびに（ｂ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメイン。
【００８７】
１観点において、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体、および抗ウイルス性サイトカインを含む、融合タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する下記の抗体を含む：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のアミノ酸配列またはそのヒト化バリアントに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む抗体。ある態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨアミノ酸配列は、基準配列と比較して置換（たとえば保存的置換）、挿入または欠失を含むが、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する能力は保持している。特定の態様において、ＶＨは下記のものから選択される１、２または３つのＨＶＲを含む：（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３。特定の態様において、ＶＨは下記のものから選択される１、２または３つのＨＶＲを含む：（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３。
【００８８】
１観点において、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体、および抗ウイルス性サイトカインを含む、融合タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する下記の抗体を含む：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のアミノ酸配列またはそのヒト化バリアントに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列を含む抗体。ある態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比較して置換（たとえば保存的置換）、挿入または欠失を含むが、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する能力は保持している。他の特定の態様において、ＶＬは下記のものから選択される１、２または３つのＨＶＲを含む：（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（Ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。他の特定の態様において、ＶＬは下記のものから選択される１、２または３つのＨＶＲを含む：（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【００８９】
１観点において、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体、および抗ウイルス性サイトカインを含む、融合タンパク質（Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体を含む）が提供され、その際、抗体は、前記に示したいずれかの態様のＶＨ、および前記に示したいずれかの態様のＶＬを含む。１態様において、抗体はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のＶＨおよびＶＬを含み、これにはこれらの配列の翻訳後修飾体またはそのヒト化バリアントが含まれる。１態様において、抗体はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のＶＨおよびＶＬを含み、これにはこれらの配列の翻訳後修飾体またはそのヒト化バリアントが含まれる。
【００９０】
１観点において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体と同じエピトープに結合するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７のＶＨおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のＶＬを備えた抗体を含む、融合タンパク質を提供する。
【００９１】
１観点において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体に結合する抗体と同じエピトープに結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のＶＨおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のＶＬを備えた抗体を含む、融合タンパク質を提供する。
【００９２】
本発明の１観点において、前記のいずれかの態様および観点による融合タンパク質の抗体はモノクローナル抗体であり、これにはキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体が含まれる。１態様において、抗体は抗体フラグメント、たとえばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ディアボディー、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントである。１態様において、抗体は全長抗体、たとえば無傷のＩｇＧ１抗体、または本明細書中に定義する他の抗体クラスもしくはイソ型である。
【００９３】
１観点において、前記のいずれかの態様および観点による融合タンパク質は、以下のセクションに記載するいずれかの特徴を単独で、または組み合わせて含むことができる。
１．親和性
特定の態様において、本明細書中に示す融合タンパク質、または本明細書中に示す融合タンパク質に含まれる抗体は、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドフラグメントを提示するヒト主要組織適合性複合体からの解離定数（Ｋｄ）≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（たとえば１０−８Ｍ以下、たとえば１０−８Ｍから１０−１３Ｍまで、たとえば１０−９Ｍから１０−１３Ｍまで）をもつ。
【００９４】
１態様において、Ｋｄは表面プラズモン共鳴法により測定される。
インターフェロンα−２ａの、またはインターフェロンα−２ａを含む融合体の、ヒトインターフェロン−アルファ／ベータ受容体ベータ鎖（ＩＦＮＡＲ２）に対する結合親和性は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によりＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００計測器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて２５℃で測定できる。ＩＦＮＡＲ２は、ＩＦＮＡＲ１／２およびリガンドとしてのインターフェロンα−２ａから構成されるヘテロ二量体型インターフェロン受容体複合体の高親和性初期結合成分である。
【００９５】
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システムは、分子相互作用の研究のために十分に確立されている。それによれば、リガンド／被分析体の結合を連続リアルタイムモニタリングし、したがって会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および平衡解離定数（Ｋｄ）を測定することができる。ＳＰＲ法は、金コートしたバイオセンサーチップの表面付近の屈折率の測定に基づく。屈折率の変化は、固定化されたリガンドと溶液に注入された被分析体との相互作用により起きる表面の質量変化の指標となる。表面に固定化されているリガンドに分子が結合すれば質量が増加し、解離した場合には質量が減少する。
【００９６】
約７５０共鳴単位(resonance unit)（ＲＵ）の捕獲システム（たとえば、ヒトＩｇＧに特異的に結合する捕獲モノクローナル抗体，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅ  ｓｅａｒｃｈ）のアミンカップリングは、ＣＭ５チップ上、ｐＨ４．５で、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給されるアミンカップリングキットを用いて実施できる。ｈｕＦｃタグ付きＩＦＮＡＲ２（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ−Ｎｒ．４０１５−ＡＢ）は、５μｇ／ｍｌの濃度で捕獲できる。過剰の結合部位は、１．２５μΜ濃度のヒトＦｃ部分（ｈｕＦｃ）混合物（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｃａｔ−Ｎｒ．５０１７５）を注入することによりブロックできる。０．１ｎＭから５０ｎＭまでの範囲の種々の濃度のインターフェロンまたはインターフェロン融合タンパク質を、流速１０μｌ／分で２９８Ｋのフローセルに１２０〜２４０秒間通して、会合期を記録することができる。解離期を６００秒までモニターすることができ、試料溶液から流動緩衝液に切り換えることによって始動することができる。その表面は、流速３０μｌ／分の１００ｍＭのリン酸溶液で１分間の洗浄により再生できる。この実験には、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給されるＦＩＢＳ−Ｐ＋緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）を選択できる。
【００９７】
バルク屈折率差は、ブランクをカップリングさせた表面から得られる共鳴を差し引くことにより補正できる。ブランク注入も差し引く（＝二重基準化）。
ｋａ／ｋｄとして定義される平衡解離定数（Ｋｄ）は、幾つか異なる濃度で求めたセンソグラム曲線をＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウェアパッケージで分析することにより決定できる。データのフィッティングは適切な結合モデルに従った。
【００９８】
ヒト野生型インターフェロンα−２ａのＫｄを測定するために、０．１ｎＭ〜５０ｎＭのインターフェロンα−２ａをＩＦＮＡＲ２コートしたセンサーチップ上に注ぐことができる。対応するセンソグラムを図１ａ）に示す。ヒト由来Ｆｃ領域のＣ末端に融合したヒトインターフェロンα−２ａについては、そのような融合タンパク質を０．５ｎＭ〜５０ｎＭの濃度でＩＦＮＡＲ２コートした表面に注ぐことができる。複合体の安定性は、インターフェロンα−２ａについての３５秒からインターフェロンα−２ａ  Ｆｃ部分融合タンパク質についての２３分にまで増大する。それぞれ、親和性はインターフェロンα−２ａについての４ｎＭから融合タンパク質についての０．３ｎＭにまで増大する。活性についてはＩＦＮＡＲ１が必須であるので、初期結合だけを検討することができる。このようなアッセイではインターフェロンシグナル伝達活性を検討することはできない。１態様において、融合タンパク質はＩＦＮＡＲ２に対して１ｎＭ以下の親和性をもつ。
【００９９】
２．抗体フラグメント
ある態様において、融合タンパク質の抗体は抗体フラグメントである。抗体フラグメントにはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖフラグメント、ならびに以下に記載する他のフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。ある抗体フラグメントの総説については、Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照。ｓｃＦｖフラグメントの総説については、Plueckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore(eds.), Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); WO 93/16185; US 5,571,894および5,587,458を参照。サルベージ受容体(salvafe receptor)結合エピトープ残基を含む延長したインビボ半減期をもつＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントの考察については、US 5,869,046を参照。
【０１００】
ディアボディー(diabody)は、２つの抗原結合部位を備えた抗体フラグメントであり、二価(bivalent)または二重特異性(bispecific)の可能性がある。たとえば、EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; Hollinger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照。トリアボディー(triabody)およびテトラボディー(tetrabody)も、Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134に記載されている。
【０１０１】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部分を含む抗体フラグメントである。特定の態様において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，マサチュセッツ州ウォルサム; たとえばUS 6,248,516を参照)。
【０１０２】
抗体フラグメントは多様な手法で作製でき、これには本明細書に記載する組換え宿主細胞（たとえば、大腸菌(E. coli)またはファージ）による産生が含まれるが、これに限定されない。
【０１０３】
３．キメラ抗体およびヒト化抗体
ある態様において、融合タンパク質の抗体はキメラ抗体である。あるキメラ抗体が、たとえばUS 4,816,567; およびMorrison, L.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に報告されている。一例において、キメラ抗体はヒト以外の可変部（すなわち、マウス由来の可変部）およびヒト由来の定常部を含む。他の例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変化した“クラススイッチ(class switched)”抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
【０１０４】
ある態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。一般に、ヒト以外の抗体はヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化され、一方でヒト以外の親抗体がもつ特異性および親和性は保持される。一般に、ヒト化抗体は１以上の可変ドメインを含み、それらにおいてＨＶＲ、たとえばＣＤＲ（またはその部分）はヒト以外の抗体に由来し、ＦＲ（またはその部分）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、場合によりヒト由来の定常部の少なくとも一部分をも含むであろう。ある態様において、たとえば抗体の特異性または親和性を再構築または改善するために、ヒト化抗体中の若干のＦＲ残基が、ヒト以外の抗体（たとえば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）に由来する対応する残基で置換されている。
【０１０５】
ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、たとえばAlmagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に概説されており、さらにたとえば下記に報告されている：Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Queen, C, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321, およびUS 7,087,409; Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34 （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを報告); Padlan, Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (“表面再生(resurfacing)”を報告); Dall'Acqua, W.F., et al., Methods 36 (2005) 43-60 (“ＦＲシャッフリング(shuffling)”を報告); およびOsbourn, J., et al., Methods 36 (2005) 61-68 およびKlimka, A., et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (ＦＲシャッフリングへの“ガイド付き選択(guided selection)”法を報告)。
【０１０６】
ヒト化に使用できるヒト枠組み構造領域には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：“最良適合(best-fit)”法を用いて選択した枠組み構造領域(たとえば、Sims, J.E., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照)、ヒト抗体の特定のサブグループの軽鎖または重鎖可変部のコンセンサス配列に由来する枠組み構造領域(たとえば、Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 4285-4289; Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照)、ヒト成熟細胞（体細胞として成熟したもの）枠組み構造領域またはヒト生殖細胞系枠組み構造領域(たとえば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照)、およびＦＲライブラリーのスクリーニングにより得られた枠組み構造領域(たとえば、Baca, M., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684; Rosok, M.J., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618を参照)。
【０１０７】
４．ヒト抗体
ある態様において、融合タンパク質の抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は当技術分野で既知の多様な手法を用いて作製できる。ヒト抗体は、全般的にvan Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374; Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459に記載されている。
【０１０８】
ヒト抗体は、抗原攻撃に応答して無傷ヒト抗体またはヒト可変部を備えた無傷抗体を産生するように改変したトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製できる。そのような動物は、一般にヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含み、それらが内因性の免疫グロブリン遺伝子座に置き換わり、あるいはそれらが染色体外に存在するか、またはランダムにその動物の染色体に組み込まれている。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性の免疫グロブリン遺伝子座は一般に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照。たとえば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）法について報告したUS 6,075,181およびUS 6,150,584; ＨｕＭＡＢ（登録商標）法について報告したUS 5,770,429; Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）法について報告したUS 7,041,870；ならびにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法について報告したUS 2007/0061900も参照)。そのような動物により産生された無傷抗体に由来するヒト可変部を、たとえば異なるヒト定常部と組み合わせることにより、さらに修飾することができる。
【０１０９】
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法により作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の作製のためのヒト骨髄腫およびネズミ−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系が報告されている(たとえば、Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New   York (1987) pp. 51-63; Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95を参照)。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により作製されたヒト抗体も、Li, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562に記載されている。他の方法には、たとえばUS 7,189,826（ハイブリドーマ細胞系からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生について報告）およびNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268（ヒト−ヒトハイブリドーマについて報告）に記載のものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ(Trioma)技術）も、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937; Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191に報告されている。
【０１１０】
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても作製できる。そのような可変ドメイン配列を次いで希望するヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する方法を以下に記載する。
【０１１１】
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の融合タンパク質に含まれる抗体は、コンビナトリアルライブラリーを、希望する活性（単数または複数）を備えた抗体についてスクリーニングすることにより単離できる。たとえば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、希望する結合特性をもつ抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための多様な方法が当技術分野で知られている。そのような方法は、たとえばHoogenboom, H.R., et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ)に概説され、さらに、たとえばMcCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597; Marks, J.D. et al., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-176; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V., et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132に報告されている。
【０１１２】
あるファージディスプレイ法において、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパトアをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングし、ファージライブラリーにおいてランダムに組み換え、それらを次いで抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる；Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455に記載。ファージは一般に、抗体フラグメントを一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントとしてディスプレイする。免疫化した供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブレパトアをクローニングして（たとえばヒトから）、免疫化せずに広範な非自己抗原に対して、また自己抗原に対しても、単一の抗体供給源を得ることができる；Griffiths, A D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734に記載。最後に、ナイーブライブラリーは合成により、幹細胞由来の非−再配列Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、高可変性ＣＤＲ３領域をコードしかつ再配列を達成するランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いることによって、インビトロで作製することもできる；Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388により報告。ヒト抗体ファージライブラリーについて報告した特許文献には、たとえば下記のものが含まれる：US 5,750,373、US 2005/0079574、US 2005/0119455、US 2005/0266000、US 2007/0117126、US 2007/0160598、US 2007/0237764、US 2007/0292936, およびUS 2009/0002360。
【０１１３】
ヒト抗体ライブラリーから単離した抗体または抗体フラグメントは、本発明においてヒト抗体またはヒト抗体フラグメントとみなされる。
６．多重特異性抗体
ある態様において、本明細書中に報告する融合タンパク質は、多重特異性抗体、たとえば二重特異性抗体である抗体を含む。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性をもつモノクローナル抗体である。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメントとして作製できる。
【０１１４】
多重特異性抗体を作製する方法には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：異なる特異性をもつ２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え同時発現(参照：Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540); WO 93/08829; およびTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659)、および“ノブインホール(knob-in-hole)”工学(たとえば、US 5,731,168を参照)。多重特異性抗体は、下記によっても作製できる：抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製するための工学的静電ステアリング効果(engineering electrostatic steering effect)(WO 2009/089004);２以上の抗体またはフラグメントの架橋(たとえば、US 4,676,980; およびBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83を参照);二重特異性抗体を作製するためのロイシンジッパーの使用(たとえば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照);二重特異性抗体フラグメントを作製するための“ディアボディー”技術の使用(たとえば、Hollinger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照);および一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用(たとえば、Gruber, M. et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照);および三重特異性抗体の作製：たとえばTutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載。
【０１１５】
“オクトパス抗体(Octopus antibody)”を含めて、３以上の機能性抗原結合部位を備えた工学的に作製した抗体も本発明に含まれる(たとえば、US 2006/0025576を参照)。
抗体またはフラグメントには、第１抗原および他の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む“二重作用(Dual Acting)Ｆａｂ”または“ＤＡＦ”も含まれる(たとえば、US 2008/0069820を参照)。
【０１１６】
抗体または抗体フラグメントには、WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792、およびWO 2010/145793に記載された多重特異性抗体も含まれる。
【０１１７】
７．抗体バリアント
特定の態様において、本明細書中に示す融合タンパク質に含まれる抗体のアミノ酸配列バリアントが考慮される。たとえば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適宜な修飾を導入することにより、またはペプチド合成により作製できる。そのような修飾には、たとえば抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失、および／またはアミノ酸配列中への残基の挿入、および／またはアミノ酸配列中の残基の置換が含まれる。欠失、挿入および置換のいずれかの組合わせを行なって、最終構築体に達することができる；ただし、最終構築体は希望する特性、たとえば抗原結合性をもつ。
【０１１８】
ａ）置換、挿入、および欠失バリアント
ある態様において、１以上のアミノ酸置換をもつ抗体バリアントを含む融合タンパク質が提供される。置換変異形成のための重要な部位にはＨＶＲおよびＦＲが含まれる。保存的置換を表１の見出し“好ましい置換”の下に示す。より多くの実質的な変更は表１の見出し“置換例”の下に示され、以下にアミノ酸側鎖クラスに関連して記載するものである。アミノ酸置換を抗体に導入し、希望する活性、たとえば抗原結合性の保持／改善、免疫原性の低減、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善について生成物をスクリーニングすることができる。
【０１１９】
【表１】
2013541937.tif 000003
【０１２０】
アミノ酸は共通の側鎖特性に従って分類できる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１２１】
非保存的置換は、これらのクラスのうちのひとつのメンバーを他のクラスと交換することを伴うであろう。
置換バリアントの１タイプは、親抗体（たとえば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１以上の超可変部残基を置換することを伴う。一般に、以後の試験のために選択した生成バリアント（単数または複数）は、親抗体と対比してある生物学的特性が改変（たとえば、改善）され（たとえば、親和性の増大、免疫原性の低減）、および／または親抗体のある生物学的特性を実質的に保持するであろう。置換バリアントの例は、アフィニティー成熟抗体であり、それはたとえばファージディスプレイに基づくアフィニティー成熟法、たとえば本明細書に記載の方法を用いて簡便に作製できる。要約すると、１以上のＨＶＲ残基を変異させ、それらのバリアント抗体をファージ上にディスプレイし、特定の生物活性（たとえば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０１２２】
変異（たとえば、置換）は、たとえば抗体の親和性を改善するためにＨＶＲ中において行なうことができる。そのような変異は、ＨＶＲ“ホットスポット”、すなわち体細胞成熟プロセスに際して高頻度で変異を受けるコドンによりコードされる残基(たとえば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2003) 179-196を参照)、および／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において行なうことができ、得られたバリアントＶＨまたはＶＬを結合親和性について試験する。二次ライブラリーを構築してそれから選択することによるアフィニティー成熟法は、たとえばHoogenboom, H.R., et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ)に報告されている。
【０１２３】
アフィニティー成熟法のある態様において、成熟させるために選択する可変部遺伝子に種々の方法（たとえば、エラープローンＰＣＲ(error-prone PCR)、鎖シャッフリング(chain shuffling)、またはオリゴヌクレオチド指向性変異形成）のいずれかによって多様性を導入する。次いで二次ライブラリーを作製する。このライブラリーを次いでスクリーニングして、希望する親和性を備えたいずれかの抗体バリアントを同定する。多様性を導入するための他の方法はＨＶＲ指向法を伴い、その方法では幾つかのＨＶＲ残基（たとえば、一度に４〜６個の残基）をランダム化する。たとえばアラニンスキャニング変異形成(alanine scanning mutagenesis)またはモデリングを用いて、抗原結合に関与するＨＶＲ残基を具体的に同定することができる。特にＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的となる。
【０１２４】
ある態様において、置換、挿入または欠失を１以上のＨＶＲ内に行なうことができる；ただし、そのような変異により抗体がそれの抗原を結合する能力が実質的に低下しない限りにおいてである。たとえば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変異（たとえば、本明細書に示す保存的置換）をＨＶＲ内に行なうことができる。そのような変異はＨＶＲ“ホットスポット”またはＳＤＲ以外の箇所にあってもよい。前記に示したバリアントＶＨおよびＶＬのある態様において、各ＨＶＲは変異していないか、あるいは１、２または３つを超えるアミノ酸置換を含まない。
【０１２５】
抗体の変異形成の標的となりうる残基または領域の同定に有用な方法は、“アラニンスキャニング変異形成”と呼ばれる；Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085により記載。この方法では、標的残基またはグループ（たとえば、荷電した残基、たとえばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕ）を同定し、中性または負に荷電したアミノ酸（たとえば、アラニンまたはポリアラニン）で交換して、その抗体と抗原の相互作用が影響を受けたかどうかを判定する。初期置換に対して機能感受性を示すアミノ酸位置に、さらに置換を導入してもよい。あるいは、またはそれに加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造により、抗体と抗原の接触点を同定する。そのような接触残基および隣接残基を置換のための候補として標的にし、あるいは除外することができる。バリアントをスクリーニングして、それらが希望する特性を含むかどうかを同定することができる。
【０１２６】
アミノ酸残基の挿入には、長さ１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドに及ぶアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合、ならびに単一または複数アミノ酸残基の配列間挿入が含まれる。末端挿入の例にはＮ末端メチオニル残基をもつ抗体が含まれる。
【０１２７】
ｂ）グリコシル化バリアント
ある態様において、本明細書に示す融合タンパク質は、抗体のグリコシル化度を増大または低下させるように変異させた抗体を含む。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１以上のグリコシル化部位を形成または除去するようにアミノ酸配列を変異させることによって簡便に達成できる。
【０１２８】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物を変異させることができる。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、一般に分岐した二本鎖(biantennary)オリゴ糖を含み、それは一般的にＮ結合によりＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合している(たとえば、Wright, A. et al., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照)。オリゴ糖には、多様な炭水化物、たとえばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸（ＮＡＮＡ、Ｎｅｕ５Ａｃ）、ならびにフコース（二本鎖オリゴ糖構造体の“幹”中のＧｌｃＮＡｃに結合）を含めることができる。ある態様において、ある改善された特性を備えた抗体バリアントを作製するために、抗体中のオリゴ糖の修飾を行なうことができる。
【０１２９】
１態様において、抗体はＦｃ領域に結合した（直接的または間接的）フコースを欠如した炭水化物構造をもつ。たとえば、そのような抗体におけるフコースの量は、１％から８０％まで、１％から６５％まで、５％から６５％まで、５％から２０％まで、または２０％から４０％までであってもよい。フコースの量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定して、Ａｓｎ２９７に結合したすべての糖構造体（たとえば、複合体、ハイブリッド、および高マンノース構造体）の和に対比した、Ａｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより判定される；たとえばWO 2008/077546に報告。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域のほぼ２９７の位置（Ｆｃ領域残基のＥｕナンバリング）にあるアスパラギン残基を表わす。しかしＡｓｎ２９７は、抗体における微小な変動のため、位置２９７の上流または下流の約±３アミノ酸の位置、すなわち位置２９４と３００の間にある可能性もある。そのようなフコシル化バリアントは改善されたＡＤＣＣ機能をもつ可能性がある(たとえば、US 2003/0157108およびUS 2004/0093621を参照)。“脱フコシル化”または“フコース欠損”抗体バリアントに関する刊行物の例には、下記のものが含まれる: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞系の例には、タンパク質のフコシル化を欠損したＬｅｃｌ３  ＣＨＯ細胞(Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; WO 2004/056312、特に例11)、およびノックアウト細胞系、たとえばアルファ−１，６−脱フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８をノックアウトしたＣＨＯ細胞(たとえば、Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; WO 2003/085107を参照)が含まれる。
【０１３０】
bisectedオリゴ糖をもつ抗体を含む、さらに他の融合タンパク質が提供される；たとえば、抗体のＦｃ領域に結合した二本鎖オリゴ糖はＧｌｃＮＡｃにより二分割されている(bisected)。そのような抗体バリアントは、低いフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能をもつ可能性がある。そのような抗体バリアントの例は、たとえば WO 2003/011878; US 6,602,684; およびUS 2005/0123546に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基をもつ抗体を含む融合タンパク質も提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能をもつ可能性がある。そのような抗体バリアントは、たとえばWO 1997/30087; WO 1998/58964; およびWO 1999/22764に記載されている。
【０１３１】
ｃ）Ｆｃ領域バリアント
ある態様において、本明細書に示す融合タンパク質の抗体のＦｃ領域に１以上のアミノ酸修飾を導入し、これによりＦｃ領域バリアントを作製することができる。Ｆｃ領域バリアントは、１以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（たとえば、置換）を含むヒト由来のＦｃ領域配列（たとえば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含むことができる。
【０１３２】
ある態様において、本発明は、若干の、ただし全部ではないエフェクター機能をもつ抗体バリアントを含む融合タンパク質を考慮する；これによってそれは、インビボでの抗体の半減期は重要であるけれどもあるエフェクター機能（たとえば、補体およびＡＤＣＣ）は不必要または有害である用途に望ましい候補となる。インビトロおよび／またはインビボ細胞傷害アッセイを実施して、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認することができる。たとえば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、その抗体がＦｃγＲ結合を欠如し（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠如している可能性があること）、ただしＦｃＲｎ結合活性は保持していることを確認できる。ＡＤＣＣを仲介する初代細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩだけを発現し、一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P. (Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492)の464頁、表3にまとめられている。限定ではないが、目的分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイ法の例は、US 5,500,362 (たとえば、Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063を参照)、およびHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502; US 5,821,337 (参照：Brueggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361)に報告されている。あるいは、非放射性アッセイ法を採用できる(たとえば、ＡＣＴＩ（商標）フローサイトメトリーのための非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州マウンテンビュー）、およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ワイオミング州マディソン）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはそれに加えて、目的分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、たとえば動物モデルにおいて評価することができる；たとえば、Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、その抗体がＣ１ｑを結合できず、したがってＣＤＣ活性を欠如するということを確認してもよい（たとえば、WO 2006/029879およびWO 2005/100402におけるＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照）。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい(たとえば、Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1997) 163-171; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照)。当技術分野で既知の方法を用いて、ＦｃＲｎ結合およびインビボクリアランス／半減期測定を実施することもできる(たとえば、Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769を参照)。
【０１３３】
エフェクター機能が低下した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９のうち１以上が置換されたものが含まれる(たとえば、US 6,737,056を参照)。そのようなＦｃ変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７および３２７のうち２以上に置換をもつＦｃ変異体が含まれ、これには残基２６５および２９７がアラニンに置換されたいわゆる“ＤＡＮＡ”Ｆｃ変異体が含まれる(US 7,332,581)。
【０１３４】
ＦｃＲへの結合性が改善または低減されたある抗体バリアントが報告されている(たとえば、US 6,737,056; WO 2004/056312; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 9 (2001) 6591-6604)。
【０１３５】
ある態様において、抗体はＡＤＣＣを改善する１以上のアミノ酸置換をもつＦｃ領域、たとえばＦｃ領域の位置２９８、３３３、および／または３３４（ＥＵナンバリングの残基）における置換を含む。
【０１３６】
ある態様において、抗体のＦｃ領域に、変異した（すなわち、改善または低減された）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる変異がなされる；たとえば、US 6,194,551、WO 99/51642、およびIdusogie, E E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に報告。
【０１３７】
半減期が延長され、母体ＩｇＧを胎児へ伝達するのに関与する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合(Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593およびKim, J.K. et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)が改善された抗体が、US 2005/0014934に報告されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合性を改善する１以上の置換をもつＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントには、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４のうち１以上に置換をもつもの、たとえばＦｃ領域残基４３４の置換が含まれる(US 7,371,826)。
【０１３８】
Ｆｃ領域バリアントの他の例に関するDuncan, A.R. and Winter, G., Nature 332 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; およびWO 94/29351も参照されたい。
Ｂ．組換えによる方法および組成物
融合タンパク質および抗体は、たとえばUS 4,816,567に報告された組換えによる方法および組成物を用いて作製できる。１態様において、本明細書中に報告する融合タンパク質をコードする１以上の単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／またはＶＨを含むアミノ酸配列（たとえば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードすることができる。１態様において、そのような核酸を含む１以上のベクター（たとえば、発現ベクター）が提供される。１態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような１態様において、宿主細胞は下記のものを含む（たとえば、下記のもので形質転換またはトランスフェクションされている）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、あるいは（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１ベクター、および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２ベクター。１態様において、宿主細胞は真核細胞、たとえばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞もしくはベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞もしくはヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ球様細胞（たとえば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０細胞）である。１態様において、本明細書中に報告する融合タンパク質を作製する方法が提供され、その方法は、前記に示した融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、その融合タンパク質の発現に適した条件下で培養し、場合により宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から融合タンパク質を回収することを含む。
【０１３９】
本明細書中に報告する融合タンパク質を組換え製造するために、前記に示した融合タンパク質をコードする核酸を単離し、以後の宿主細胞におけるクローニングおよび／または発現のために１以上のベクターに挿入する。そのような核酸は、常法を用いて容易に単離および配列決定することができる。
【０１４０】
融合タンパク質をコードする核酸のクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書中に報告する原核細胞または真核細胞が含まれる。たとえば、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要でない場合は、融合タンパク質を細菌において産生させることができる。細菌におけるフラグメントおよびポリペプチドの発現については、たとえばUS 5,648,237、US 5,789,199、およびUS 5,840,523を参照；大腸菌における抗体フラグメントの発現を報告したCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, (2003), pp. 245-254も参照されたい。発現後、融合タンパク質を細菌細胞ペーストから可溶性画分中に分離し、さらに精製することができる。
【０１４１】
原核細胞のほかに、真核微生物、たとえば糸状菌または酵母が、融合タンパク質をコードするベクターに適切なクローニングまたは発現の宿主であり、これには、そのグリコシル化経路が“ヒト化”されていて部分的または完全ヒト型グリコシル化パターンをもつ融合タンパク質を産生する真菌および酵母の菌株が含まれる(参照：Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215)。
【０１４２】
グリコシル化された融合タンパク質の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫の細胞が含まれる。昆虫細胞と併せて使用できる多数のバキュロウイルス株、特にヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションのためのものが同定されている。
【０１４３】
植物細胞培養物も宿主として利用できる(たとえば、US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978、およびUS 6,417,429 (トランスジェニック植物において抗体を産生するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を報告）を参照。
【０１４４】
脊椎動物細胞も宿主として使用できる。たとえば、懸濁培養での増殖に適応させた哺乳動物細胞系が有用である。有用な哺乳動物宿主細胞系の他の例は、下記のものである：ＳＶ４０により形質転換したサル腎ＣＶ１系列（ＣＯＳ−７）、ヒト胚性腎系列（２９３または２９３細胞、たとえばGraham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に報告されたもの)、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ(sertoli)細胞（ＴＭ４細胞、たとえばMather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に報告)、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル(African green monkey)腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット(buffalo rat)肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳腺腫細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞、たとえばMather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に報告されたもの、ＭＲＣ  ５細胞、およびＦＳ４細胞。他の有用な哺乳動物宿主細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれ、これにはＤＨＦＲ−  ＣＨＯ細胞(Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)、および骨髄腫細胞系、たとえばＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０が含まれる。融合タンパク質の産生に適したある哺乳動物宿主細胞系の総説については、たとえばYazaki, P.J. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa,  NJ), pp. 255-268 (2003)を参照されたい。
【０１４５】
Ｃ．医薬配合物
本明細書中に報告する融合タンパク質の医薬配合物は、希望する純度をもつ融合タンパク質を１種類以上の医薬的に許容できるキャリヤー(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, A. (ed.) (1980))と混合することにより、凍結乾燥配合物または水性液剤の形で調製される。医薬的に許容できるキャリヤーは、使用する投与量および濃度でレシピエントに対して一般に無毒性であり、下記のものを含むが、それらに限定されない：緩衝剤、たとえばリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸、抗酸化剤：アスコルビン酸およびメチオニンを含む；保存剤（たとえば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン類、たとえばメチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、たとえば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン、親水性ポリマー、たとえばポリビニルピロリドン、アミノ酸、たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン、単糖類、二糖類、および他の炭水化物：グルコース、マンノース、またはデキストリン類を含む；キレート化剤、たとえばＥＤＴＡ、糖類、たとえばショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール、塩形成性の対イオン、たとえばナトリウム、金属錯体（たとえば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、および／または非イオン界面活性剤、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。本発明における医薬的に許容できるキャリヤーの例には、さらに侵入型(interstitial)薬物分散剤、たとえば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(soluble neutral-active hyaluronidase glycoprotein)（ｓＨＡＳＥＧＰ）、たとえばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、たとえばｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標），Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）が含まれる。ｒｈｕＰＨ２０を含めた、あるｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法の例は、US 2005/0260186およびUS 2006/0104968に報告されている。
【０１４６】
１観点において、ｓＨＡＳＥＧＰを１種類以上の追加のグリコサミノグリカン類、たとえばコンドロイチナーゼ類と組み合わせる。
凍結乾燥した抗体配合物の例は、US 6,267,958に報告されている。水性の抗体配合物には、US 6,171,586およびWO 2006/044908に報告されたものが含まれ、後者の配合物は酢酸ヒスチジン緩衝剤を含有する。
【０１４７】
本明細書中の配合物は、処置される個々の適応症に必要な、１種類より多い有効成分、好ましくは相互に有害作用しない相補的活性をもつものを含有することもできる。そのような有効成分は、合わせて意図する目的に有効な量で存在するのが適切である。
【０１４８】
有効成分を、たとえばコアセルベーション法または界面重合により調製されたマイクロカプセル、たとえばそれぞれヒドロキシメチルセルロース−またはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル内に、コロイド薬物送達システム（たとえば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）内に、あるいはマクロエマルジョン内に捕捉することができる。そのような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, A. (ed.) (1980)に示されている。
【０１４９】
持続放出製剤を調製することができる。持続放出製剤の適切な例には、融合タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、それらのマトリックスは造形品、たとえばフィルム、またはマイクロカプセルの形態である。
【０１５０】
インビボ投与に使用するための配合物は、一般に無菌である。無菌性は、たとえば無菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成できる。
Ｄ．療法および療法用組成物
本明細書に示す融合タンパク質のいずれかを療法に使用できる。
【０１５１】
１観点において、本発明は医薬の製造または調製における融合タンパク質の使用を提供する。
１観点において、本発明はＢ型肝炎ウイルス感染症を処置するための方法を提供する。
【０１５２】
１観点において、本発明は、たとえば前記のいずれかの療法に使用するための、本明細書に示す融合タンパク質のいずれかを含む医薬配合物を提供する。１態様において、医薬配合物は、本明細書に示す融合タンパク質のいずれか、および医薬的に許容できるキャリヤーを含む。他の態様において、医薬配合物は、本明細書に示す融合タンパク質のいずれか、および少なくとも１種類の追加療法剤、たとえば後記のものを含む。
【０１５３】
本発明の融合タンパク質は、単独で、または他の作用剤と組み合わせて、療法に使用できる。たとえば、本発明の融合タンパク質は少なくとも１種類の追加療法剤と共投与できる。
【０１５４】
前記のような併用療法は、組合わせ投与（２種類以上の療法剤が同一または別個の配合物に含有されている）、および個別投与を包含し、この場合は本発明の融合タンパク質の投与を追加療法剤および／または佐剤の投与前、投与と同時、および／または投与後に行なうことができる。
【０１５５】
本発明の融合タンパク質（およびいずれかの追加療法剤）は、いずれか適切な手段により投与でき、これには非経口、肺内、および鼻腔内、ならびに所望により局所処置、病変部内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投薬はいずれか適切な経路、たとえば注射、たとえば静脈内または皮下注射によることができ、これは一部は、その投与が短期間であるかまたは長期間であるかに依存する。本発明においては多様な投薬計画が考慮され、これには１回投与、または多様な時点にわたる多数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５６】
本発明の融合タンパク質は、適正製造基準に従った様式で配合、投薬、および投与されるであろう。これに関して考慮する要因には、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、および医療専門家に既知である他の要因が含まれる。必要ではないが、場合により、問題となっている障害を予防または治療するために現在用いられている１種類以上の薬剤を融合タンパク質に配合してもよい。そのような他の薬剤の有効量は、配合物中に存在する融合タンパク質の量、障害または処置のタイプ、および前記で考察した他の要因に依存する。これらは一般に、本明細書に記載するものと同じ投与量および投与経路で、または本明細書に記載する投与量の約１％から９９％までで、または経験的／臨床的に適切であると判定されるいずれかの投与量でいずれかの経路により用いられる。
【０１５７】
疾患の予防または治療について、本発明の融合タンパク質の適切な投与量（単独で、または１種類以上の他の追加療法剤と組み合わせて用いる場合）は、処置される疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、その融合タンパク質を予防または治療のいずれの目的で使用するか、それ以前の療法、患者の病歴およびその融合タンパク質に対する応答、ならびに担当医の自由裁量に依存するであろう。融合タンパク質は、一度に、または一連の処置にわたって、患者に投与するのが適切である。疾患のタイプおよび重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（たとえば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の融合タンパク質を、たとえば１回以上の分割投与により、または連続注入により患者に投与する初期の候補投与量とすることができる。一般的な日用量は、前記の要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲またはそれ以上であってもよい。状態に応じて数日またはそれ以上にわたる反復投与について、処置は一般に希望する疾患症状抑制が起きるまで継続されるであろう。融合タンパク質の投与量の一例は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまでの範囲であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ（またはそのいずれかの組合わせ）の量を１回以上、患者に投与することができる。そのような投与量を断続的に、たとえば毎週または３週ごとに投与してもよい（たとえば、患者が約２回から約２０回まで、またはたとえば約６回の抗体投与を受けるように）。より高い初期負荷量、続いて１回以上のより低い用量を投与してもよい。
【０１５８】
Ｅ．製品
本発明の１観点において、前記の障害の治療、予防および／または診断に有用な物質を収容した製品が提供される。この製品は、容器、およびその容器上のまたは容器に付随するラベルまたはパッケージ挿入物を含む。適切な容器には、たとえばボトル、バイアル、注射器、静注液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど多様な材料から作成できる。容器は、それ自体でまたは他の組成物と組み合わせて、その状態の治療、予防および／または診断に有効な組成物を保持し、無菌的取出口を備えていてもよい（たとえば、容器は静注液バッグ、または皮下注射針により穿刺できる栓を備えたバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種類の有効薬剤は、本明細書中に報告する融合タンパク質である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、選択した状態の処置にその組成物を使用することを指示する。さらに、製品は下記のものを含んでもよい：（ａ）本明細書中に報告する融合タンパク質を含む組成物を収容した第１容器、および（ｂ）他の療法剤を含む組成物を収容した第２容器。本発明のこの態様における製品はさらに、それらの組成物を特定の状態の処置に使用できることを指示するパッケージ挿入物を含んでもよい。あるいは、またはそれに加えて、この製品はさらに、医薬的に許容できる緩衝液、たとえば注射用水(water for injection)（ＷＦＩ）、殺菌注射用水(bacteriostatic water for injection)（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー液およびデキストロース溶液を含む組成物を収容した第２（または第３）容器を含んでもよい。それはさらに、商業的立場および利用者の立場から望ましい他の物質を含んでもよく、これには他の緩衝剤、希釈剤、増量剤、注射針、および注射器が含まれる。
【０１５９】
ＩＩＩ．配列の記載
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１    Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質のアミノ酸配列（Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｃ  サブタイプａｄｒ（分離株  日本／Ａ４／１９９４）（ＨＢＶ−Ｃ））
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０２    Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質のアミノ酸配列（Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｃ  サブタイプａｄｒ（分離株  日本／Ａ４／１９９４）（ＨＢＶ−Ｃ））
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０３    成熟ヒトインターフェロンα−２ａのアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０４    ｃ１８／Ａ２  ｍＡｂのＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０５    ｃ１８／Ａ２  ｍＡｂのＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０６    ｃ１８／Ａ２  ｍＡｂのＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７    ネズミ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０８    ｃ１８／Ａ２  ｍＡｂのＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０９    ｃ１８／Ａ２  ｍＡｂのＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０    ｃ１８／Ａ２  ｍＡｂのＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１    ネズミ軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２    ｃ１８／Ａ２  ｍＡｂのキメラネズミ−ヒト重鎖のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３    Ｃ末端ｃ１８／Ａ２抗体重鎖のキメラネズミ−ヒトアミノ酸配列  インターフェロンα−２ａ  抗体融合体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４    ｃ１８／Ａ２  ｍＡｂのキメラネズミ−ヒト軽鎖のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５    Ｃ末端ｃ１８／Ａ２抗体軽鎖のキメラネズミ−ヒトアミノ酸配列  インターフェロンα−２ａ  抗体融合タンパク質
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６    ヒトＩｇカッパ軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７    ヒトＩｇラムダ軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８    ヒトＩｇＧ１定常部（白人アロタイプ）のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９    ヒトＩｇＧ１定常部（アメリカ黒人アロタイプ）のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０    ヒトＩｇＧ１定常部バリアントのアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１    ヒトＩｇＧ４定常部のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２    ヒトＩｇＧ４定常部バリアントのアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３    リンカー１のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４    リンカー２のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５    リンカー３のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６    リンカー４のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７    リンカー５のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８    リンカー６のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９    ＨＢＶ−エンベロープ由来のペプチドフラグメント
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０    ＨＢＶ−コア由来のペプチドフラグメント
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１    ＨＢＶ−エンベロープ由来のペプチドフラグメント
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２    ｅ１８３／Ａ２  ｍＡｂのＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３    ｅ１８３／Ａ２  ｍＡｂのＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４    ｅ１８３／Ａ２  ｍＡｂのＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５    ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１のアミノ酸残基１８２−１９０のＨＢＶエンベロープペプチドフラグメントに対する抗体のネズミ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６    ｅ１８３／Ａ２  ｍＡｂのＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７    ｅ１８３／Ａ２  ｍＡｂのＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８    ｅ１８３／Ａ２  ｍＡｂのＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９    ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１のアミノ酸残基１８２−１９０のＨＢＶエンベロープペプチドフラグメントに対する抗体のネズミ軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列
【実施例】
【０１６０】
ＩＶ．実施例
以下は本発明の方法および組成物の例である。前記の記述を考慮して多様な他の態様を実施できることは理解される。
【０１６１】
材料および方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., vols. 1-3, Public Health Service, NIH Publication No 91-3242に示されている。
【０１６２】
抗体鎖のアミノ酸は、ＥＵナンバリング法に従ってナンバリングされる(Edelman, G.M., et al., PNAS 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., vols. 1-3, Public Health Service, NIH Publication No 91-3242)。
【０１６３】
組換えＤＮＡ技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New   York (1989)に記載された標準法を用いてＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を製造業者の指示に従って用いた。
【０１６４】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列はＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ  ＧｍｂＨ（ドイツ、ファーテルステッテン）で実施した二本鎖配列決定法により決定された。
【０１６５】
ＤＮＡおよびタンパク質の配列分析および配列データ管理
ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，ウィスコンシン州マディソン）のソフトウェアパッケージバリアント１０．２およびＩｎｆｏｍａｘのＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅスイートバリアント８．０を、配列の作製、マッピング、分析、アノテーションおよびイラストレーションに用いた。
【０１６６】
遺伝子合成
マウスｃ１８／Ａ２  ｍＡｂおよびｅ１８３／Ａ２  ｍＡｂの重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする希望する遺伝子セグメントは、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＧｍｂＨ（ドイツ、レーゲンスブルク）により作製された。発現構築体のクローニングを容易にするために、後記に示すようにそれらの遺伝子フラグメントを個別の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位でフランキングする。サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定法により確認した。
【０１６７】
実施例１
キメラネズミ−ヒトｃ１８／Ａ２  ＴＣＲ様抗体  インターフェロン−α２ａ融合タンパク質のための発現プラスミドの作製
成熟ヒトＩＦＮ−α２ａおよび２つのＧｌｙ４Ｓｅｒ反復配列からなるグリシン−セリンリンカーをコードする化学合成したＤＮＡフラグメントを、わずかにトランケートしたヒトガンマ−１重鎖定常部（最後の天然アミノ酸Ｌｙｓを除去）をコードするｃ１８／Ａ２  ＴＣＲ様抗体重鎖遺伝子の３’末端に融合させることにより、キメラネズミ−ヒトｃ１８／Ａ２  ＴＣＲ様抗体重鎖  インターフェロン−α２ａ融合遺伝子を組み立てた（重鎖．．．ＬＳＰＧ−−ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−−ＩＦＮａ２ａ）。
【０１６８】
キメラネズミ−ヒトｃ１８／Ａ２  ＴＣＲ様−親抗体のための発現プラスミドの作製
マウスｃ１８／Ａ２  ＴＣＲ様ｍＡｂカッパ軽鎖可変部（ＶＫ）および重鎖可変部（ＶＨ）をコードする遺伝子セグメントを、それぞれヒトカッパ軽鎖定常部（ＣＫ）またはヒトガンマ−１重鎖定常部（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）をコードする遺伝子セグメントに結合させた。これらの抗体遺伝子のゲノムエキソン−イントロン構造を含む２つの別個の発現プラスミドから、両方の抗体鎖遺伝子を発現させた。
【０１６９】
抗体鎖の発現を下記により制御する：ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の短縮イントロン−Ａ欠失極初期エンハンサーおよびプロモーター［ヒト重鎖免疫グロブリン５’側非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む］、ネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列、ならびにウシ成長ホルモン由来の強力なポリアデニル化シグナル。これらの発現プラスミドは、大腸菌におけるプラスミド増幅のためのベクターｐＵＣ１８由来の複製起点およびβ−ラクタマーゼ遺伝子、ならびに場合により、安定トランスフェクションされた哺乳動物細胞系の作製／選択のためのネオマイシン耐性遺伝子も含む。
【０１７０】
ａ）プラスミド９９２４
プラスミド９９２４は、キメラネズミ−ヒトｃ１８／Ａ２  ＴＣＲ様抗体γ１−重鎖  ＩＦＮ−α２ａ融合タンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞において一過性発現するための発現プラスミド（ゲノム組織化した発現カセット；エキソン−イントロン組織化）である。
【０１７１】
ｃ１８／Ａ２  ＴＣＲ様抗体γ１重鎖  ＩＦＮ−α２ａ発現カセットのほかに、このベクターは下記のものを含む：
−  大腸菌におけるこのプラスミドの発現を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
−  大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子。
【０１７２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示した成熟ｃ１８／Ａ２  ＴＣＲ様抗体γ１−重鎖  ＩＦＮ−α２ａ融合タンパク質をコードする、ｃ１８／Ａ２  ＴＣＲ様抗体γ１−重鎖  ＩＦＮ−α２ａ融合遺伝子のための転写ユニットは、下記のエレメントを含む：
−  ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の極初期エンハンサーおよびプロモーター
−  ヒト重鎖免疫グロブリン５’側非翻訳領域（ＵＴＲ）
−  ネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列；シグナル配列イントロン（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）を含む
−  ５’末端のユニークＢｓｍｌ制限部位（Ｌ２シグナル配列）およびスプライスドナー部位および３’末端のユニークＸｈｏｌ制限部位と共に配置された、可変重鎖コードセグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）
−  トランケート形マウス／ヒト重鎖ハイブリッドイントロン２；マウス重鎖エンハンサーエレメントを含む（部分ＪＨ３，ＪＨ４）(たとえば、Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378を参照)
−  ゲノム組織化におけるヒトγ１重鎖遺伝子定常部；それからＣ末端Ｌｙｓをコードする最後のコドンを欠失させたもの
−  グリシン−セリンリンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）
−  成熟ヒトＩＦＮａ２ａ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０３）、ならびに
−  ウシ成長ホルモンポリアデニル化(bovine growth hormone polyadenylation)（ＢＧＨ  ｐＡ）シグナル配列。
【０１７３】
重鎖発現プラスミド９９２４のプラスミド地図を図２に示す。
ｂ）プラスミド９９２２
プラスミド９９２２は、キメラネズミ−ヒトｃ１８／Ａ２  ＴＣＲ様抗体軽鎖をＨＥＫ２９３細胞において一過性発現するための発現プラスミド（ゲノム組織化した発現カセット；エキソン−イントロン組織化）である。
【０１７４】
ｃ１８／Ａ２  ＴＣＲ様抗体κ−軽鎖発現カセットのほかに、このベクターは下記のものを含む：
−  ＳＶ４０プロモーター
−  選択マーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子
−  大腸菌におけるこのプラスミドの発現を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製起点
−  大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子。
【０１７５】
ｃ１８／Ａ２  ＴＣＲ様抗体κ−軽鎖遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示した成熟ｃ１８／Ａ２  ＴＣＲ様抗体κ−軽鎖タンパク質をコードする）のための転写ユニットは、下記のエレメントから構成される：
−  ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の極初期エンハンサーおよびプロモーター
−  ヒト重鎖免疫グロブリン５’側非翻訳領域（ＵＴＲ）
−  ネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列；シグナル配列イントロン（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）を含む
−  ５’末端のユニークＢｓｍｌ制限部位（Ｌ２シグナル配列）およびスプライスドナー部位および３’末端のユニークＸｈｏｌ制限部位と共に配置された、可変軽鎖コードセグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
−  トランケート形ヒトカッパ軽鎖イントロン２
−  ヒトカッパ軽鎖遺伝子定常部、ならびに
−  ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ  ｐＡ）シグナル配列。
【０１７６】
軽鎖発現プラスミド９９２２のプラスミド地図を図３に示す。
実施例２
キメラネズミ−ヒトｅ１８３／Ａ２  ＴＣＲ様抗体  インターフェロン−α２ａ融合タンパク質のための発現プラスミドの作製
キメラネズミ−ヒトｅ１８３／Ａ２  ＴＣＲ−Ｌ抗体  インターフェロン−α２ａ融合遺伝子を、キメラネズミ−ヒトｃ１８／Ａ２  ＴＣＲ様抗体  インターフェロン−α２ａ融合遺伝子について記載したものと同じ方法で組み立てて、発現プラスミド９９７６（抗体重鎖−ＩＦＮ−α２ａ融合遺伝子）、９９７７（抗体軽鎖遺伝子）を得た。
【０１７７】
実施例３
ＨＥＫ２９３細胞における免疫グロブリン−インターフェロンアルファ融合タンパク質の一過性発現、精製および分析解明
免疫グロブリン−インターフェロンアルファ融合タンパク質を、Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）で培養したＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎細胞２９３由来）の一過性トランスフェクションにより調製した。トランスフェクションのために“２９３−Ｆｒｅｅ”トランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いた。免疫グロブリン軽鎖および重鎖を２つの異なるプラスミドから、等モル比の軽鎖−対−重鎖コーディングプラスミドを用いて発現させた。トランスフェクションは、“２９３−Ｆｒｅｅ”製造業者の指示書の記載に従って実施された。融合タンパク質を含有する細胞培養上清を、トランスフェクションの７日後に収穫した。上清を精製するまで低温に保存した。
【０１７８】
たとえばＨＥＫ２９３細胞におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に示されている。
抗体を含有する培養上清を濾過し、２工程クロマトグラフィーによって精製した。０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７、で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＣＬ−４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を捕獲した。結合しなかったタンパク質を平衡化用緩衝液で洗い去り、抗体を０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３．５、で溶離し、次いで直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基でｐＨ６．０に中和した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上におけるサイズ排除クロマトグラフィーを第２精製工程として用いた。サイズ排除クロマトグラフィーは、２０ｍＭヒスチジン緩衝液、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０、中で実施された。溶出した抗体を、Ｂｉｏｍａｘ−ＳＫ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，マサチュセッツ州ビレリカ）を備えたＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ遠心フィルターユニットで濃縮し、−８０℃で保存した。
【０１７９】
抗体および抗体融合体のタンパク質濃度を、２８０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）により、アミノ酸配列に基づいて計算した分子吸光係数を用いて判定した。抗体および抗体融合体の純度および適正な四量体形成を、還元剤（５ｍＭ  １，４−ジチオトレイトール）の存在下または不存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびクーマシーブリリアントブルーによる染色により分析した。抗体および抗体融合体調製物の凝集物含量を、ＳＫ３０００ＳＷｘｌ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈａａｓ，ドイツ、シュツットガルト）を用いる高速ＳＥＣにより分析した。還元した抗体および抗体融合体の軽鎖および重鎖のアミノ酸主鎖の統合性を、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）処理によりＮ−グリカン類を除去した後にＮａｎｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ＱＴＯＦ質量分析により確認した。
【０１８０】
実施例４
結合親和性の測定
約７５０共鳴単位（ＲＵ）の捕獲システム（ヒトＩｇＧに対して特異的な捕獲ｍＡｂ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅ  ｓｅａｒｃｈ）のアミンカップリングを、ＣＭ５チップ上、ｐＨ４．５で、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが供給するアミンカップリングキットを用いて実施した。ＨｕＦｃタグ付きＩＦＮＡＲ２（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ−Ｎｒ．４０１５−ＡＢ）を５μｇ／ｍｌの濃度で捕獲した。濃度１．２５μΜのｈｕＦｃ混合物（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｃａｔ−Ｎｒ．５０１７５）を注入することにより、過剰の結合部位をブロックした。０．１ｎＭから５０ｎＭまでの範囲の種々の濃度のインターフェロンまたはインターフェロン融合体を、流速１０μｌ／分で２９８Ｋのフローセルに１２０〜２４０秒間通して、会合期を記録した。解離期を６００秒までモニターし、試料溶液から流動緩衝液へ切り替えることにより始動させた。流速３０μｌ／分の１００ｍＭリン酸緩衝液で１分間の洗浄により、表面を再生した。すべての実験に、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給されるＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液を選択した（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸））、ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）。
【０１８１】
ブランクカップリングした表面から得られた応答を差し引くことにより、バルク屈折率差を補正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重基準法）。
ｋａ／ｋｄとして定義した平衡解離定数（Ｋｄ）は、幾つかの異なる濃度で得られたセンソグラム曲線をＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウェアパッケージを用いて分析することにより判定された。データのフィッティングは適切な結合モデルに従った。
【０１８２】
野生型ＩＦＮ  α−２ａについては、図１ａ）に示すように、０．１ｎＭ〜５０ｎＭのＩＦＮ  α−２ａをＩＦＮＡＲ２コートしたセンサーチップ上に注いだ。ｈｕＦｃフラグメントにＣ末端融合したＩＦＮ  α−２ａについては、そのようなタンパク質を０．５〜５０ｎＭの濃度で、ＩＦＮＡＲ２コートした表面に注いだ。二価結合性のため、複合体安定性はＩＦＮ  α−２ａについての３５秒から、Ｆｃ−ＩＦＮ  α−２ａ融合体についての２３分に増大する。親和性は、それぞれ、ＩＦＮ  α−２ａについての４ｎＭから、見掛け親和性０．３ｎＭに増大する。活性についてはＩＦＮＡＲ１が必須であるので初期結合だけを検討することができ、このようなアッセイではインターフェロンシグナル伝達活性を検討することはできない。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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