(57)【要約】  ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）酵素活性を示すポリペプチドをコード化する単離された核酸を、コドン最適化を含む、そのような核酸を調製するための分子基準と共に開示する。選択された特性、特に単量体の選択的形成性を有する修飾および／または切断型ＢＣｈＥ分子を調製する方法も記載する。この核酸を含むおよび／または発現するベクターおよび細胞も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＣｈＥ酵素活性を有するポリペプチドをコード化する単離された核酸であって、前記核酸のコード領域におけるグアニンおよびシトシン（Ｇ＋Ｃ）ヌクレオチドの百分率が４０％を超えるが８０％を超えない単離された核酸。
【請求項２】
前記核酸のコード領域におけるグアニンおよびシトシン（Ｇ＋Ｃ）ヌクレオチドの百分率が４５％を超えるが８０％を超えない、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記核酸のコード領域におけるグアニンおよびシトシン（Ｇ＋Ｃ）ヌクレオチドの百分率が５０％を超えるが８０％を超えない、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項４】
前記核酸のコード領域におけるグアニンおよびシトシン（Ｇ＋Ｃ）ヌクレオチドの百分率が５５％を超えるが８０％を超えない、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項５】
前記核酸のコード領域におけるグアニンおよびシトシン（Ｇ＋Ｃ）ヌクレオチドの百分率が６０％を超えるが８０％を超えない、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項６】
前記核酸のコード領域におけるグアニンおよびシトシン（Ｇ＋Ｃ）ヌクレオチドの百分率が少なくとも６０％であるが８０％を超えない、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項７】
前記核酸が内部ＴＡＴＡボックスを含まないまたはコード化しない、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項８】
前記核酸が前記ポリペプチド上に一以上のシアル化部位をコード化しない、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項９】
前記核酸が内部リボソーム進入部位を含まないまたはコード化しない、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
前記核酸がスプライス供与または受容部位を含まないまたはコード化しない、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
前記核酸が開始部位の上流に少なくとも一つのＫｏｚａｋ配列を含むまたはコード化する、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１２】
前記核酸の配列はコドン適応指標（ＣＡＩ）が少なくとも０．７である、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１３】
前記核酸はＣＡＩが少なくとも０．８である、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１４】
前記核酸はＣＡＩが少なくとも０．９である、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１５】
前記核酸はＣＡＩが少なくとも０．９７である、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１６】
前記核酸が配列番号１のヌクレオチド配列に少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１７】
前記核酸が配列番号１のヌクレオチド配列に少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１８】
前記核酸が配列番号１のヌクレオチド配列に少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１９】
前記核酸が配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項２０】
前記ＢＣｈＥポリペプチドが配列番号２の２２〜５６４番アミノ酸を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項２１】
前記ＢＣｈＥポリペプチドが配列番号２におけるアミノ酸の数より少ないアミノ酸を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項２２】
前記ＢＣｈＥポリペプチドが単量体のみを形成する、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項２３】
前記ＢＣｈＥがＷＡＴドメインの全体または一部を欠損している、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項２４】
請求項１に記載の核酸の単離されたフラグメントであって、ＢＣｈＥ酵素活性を有するポリペプチドをコード化するフラグメント。
【請求項２５】
請求項１に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターを含んでなる組み換え細胞。
【請求項２７】
ＢＣｈＥ酵素活性を有するポリペプチドを調製する方法であって、請求項２６に記載の細胞から前記ポリペプチドを発現させることを含んでなる方法。
【請求項２８】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２６に記載の組み換え細胞。
【請求項２９】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２６に記載の組み換え細胞。
【請求項３０】
前記細胞がＰｅｒ．Ｃ６細胞である、請求項２６に記載の組み換え細胞。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが単量体のみを形成する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリペプチドがＷＡＴドメインの全体または一部を含まない、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリペプチドがＷＡＴドメインを含まない、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが配列番号７のアミノ酸配列の全体または一部を含まない、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが配列番号２の２２〜５６４番アミノ酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが配列番号２の２２〜５６４番アミノ酸からなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記核酸がＤＮＡまたはその相補体である、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３９】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡまたはその相補体である、請求項３８に記載の単離された核酸。
【請求項４０】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年１２月２１日に出願された米国仮出願第６１／２８４，４４４号の優先権を主張し、その開示内容全体が参考として本明細書に取り入れられる。
【０００２】
本発明は、哺乳動物、特にヒトの細胞における発現のために最適化されたポリヌクレオチドコドンを用いて組み換えブチリルコリンエステラーゼおよびその切断型を製造する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）という一般用語は、神経刺激伝達に関与する酵素群を示す。有機ホスフェート化合物またはカルバメート系殺虫剤もしくは薬剤等のコリンエステラーゼ阻害物質は、アセチルコリンの分解を妨げ、その結果、アセチルコリンが集積し、神経系の過敏が引き起こされる。ヒトがこれらの化合物を吸い込むまたは他の態様でこれらの化合物に晒されることにより、「神経ガス」すなわち化学兵器剤としてこれらの化合物が開発されることになった。
【０００４】
ブチリルコリン等、他のタイプのエステルを選択的に加水分解する、その酵素活性が化学抑制剤であるテトライソプロピルピロホスホルアミド（イソ−ＯＭＰＡとしても知られている）に敏感なこれらの酵素はブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ，  ＥＣ  ３．１．１．８）と呼ばれている。血漿、血清、ベンゾイル、偽性またはタイプＩＩ  ＣｈＥとしても知られているブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）は、１１超のアイソザイム変異体を有し、インビトロ基質としてブチリルコリンおよびベンゾイルコリンを選択的に使用する。ＢＣｈＥは、哺乳動物の血漿、肝臓、膵臓、腸粘膜、中枢神経系の白質、平滑筋および心臓に見られる。ＢＣｈＥは、赤血球コリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）と対照的に、血清コリンエステラーゼと呼ばれることがある。
【０００５】
前処理薬としてのコリンエステラーゼの使用が、非ヒト霊長類を含む動物において成功裏に示された。例えば、赤毛猿はウシ胎仔血清誘導ＡＣｈＥまたはウマ血清誘導ＢＣｈＥで前処理すると、戦用ガスとして用いられる毒性の高い有機ホスフェート化合物であるメチルホスホノフルオリド酸ピナコリル（ソマン）の半数致死量（ＬＤ５０）の２〜５倍の攻撃に対して保護された（非特許文献１、非特許文献２）。致死性の予防に加えて、前処理は、系列プローブ再認課題または平衡プラットフォーム遂行課題により測定されるように、ソマン攻撃後の行動不能を予防した。充分な外因性ヒトＢＣｈＥを投与することにより、マウス、ラットおよびサルを、多重致死量有機ホスフェート中毒から保護することができる（非特許文献３、非特許文献４）。ヒトにおける有機ホスフェート中毒を治療するために、精製されたヒトＢＣｈＥが使用され、大きな免疫学的または精神的悪影響は無かった（非特許文献５）。
【０００６】
有機ホスフェート毒素の加水分解におけるその効果に加えて、ＢＣｈＥがコカインの主要な解毒酵素であるという強力なエビデンスがある（非特許文献６）。コカインは、３つの主要な経路：すなわち、ＢＣｈＥによる加水分解によりエクゴニンメチルエステルを形成する工程、ノルコカインからのＮ−脱メチル化する工程、および非酵素的加水分解によりベンゾイルコリンを形成する工程、により代謝される。研究により、ＢＣｈＥの低水準と、生命を脅かすコカイン毒性のエピソードとの直接的関係が示された。最近の研究により、インビトロにおけるコカイン半減期の短縮が、精製ヒトＢＣｈＥの添加と相関することが確認された。
【０００７】
ＣｈＥ酵素の大きな医薬的潜在力を考慮して、研究者は、それらを生成するための組み換え法の開発に集中した。組み換え酵素は、血漿から誘導された酵素とは対照的に、Ｃ型肝炎およびＨＩＶ等のウイルスを含む感染性剤の伝染リスクがかなり低い。
【０００８】
ｃＤＮＡ配列が、ヒトＡＣｈＥ（特許文献１）およびヒトＢＣｈＥ（特許文献２、非特許文献７、非特許文献８）の両方についてクローニングされた。野生型ヒトＢＣｈＥの、および単一アミノ酸変化を有する幾つかのＢＣｈＥ変異体のアミノ酸配列が特許文献３に示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，５９５，９０３号
【特許文献２】米国特許第５，２１５，９０９号
【特許文献３】米国特許第６，００１，６２５号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｒｏｏｍｆｉｅｌｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  （１９９１）  ２５９：６３３−６３８
【非特許文献２】Ｗｏｌｆｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  （１９９２）  １１７（２）：  １８９−１９３
【非特許文献３】Ｒａｖｅｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  （１９９３）  ４２：２４６５−２４７４
【非特許文献４】Ｒａｖｅｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  （１９９７）  １４５．４３−５３，  Ａｌｌｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  （１９９８）  ４３：１２１−１２８
【非特許文献５】Ｃａｓｃｉｏ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｎｅｒｖａ  Ａｎｅｓｔｅｓｉｏｌ  （１９９８）  ５４：３３７
【非特許文献６】Ｘｉｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  （１９９９）  ５５：８３−９１
【非特許文献７】Ｐｒｏｄｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９８７）  ８４：３５５５−３５５９
【非特許文献８】ＭｃＴｉｅｒｎａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  （１９８７）  ８４：６６８２−６６８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特に、有機ホスフェート中毒、手術後無呼吸またはコカイン中毒のような症状を治療するための薬剤として酵素を開発するのに充分な量でＢＣｈＥを生成する能力を有する組み換え発現系は今日まで報告されていない。しかしながら、寿命のさらなる課題がある。すなわち、治療したヒトの系にＢＣｈＥが長く留まるほど、解毒のために利用可能な時間が長い。そのような寿命は、系における「平均滞留時間」（ＭＲＴ）と呼ばれる。
【００１２】
ＢＣｈＥの最新技術は四量体型を作ることに向けられている。何故なら、それが「天然型」であり、そのために、より長い「平均滞留時間」（ＭＲＴ）を有しより安定であると考えられるからである。しかしながら、四量体のかなり大きな寸法故に、調製が困難である。さらに、そのような調製により、通常は、四量体、二量体および単量体型の混合物が低収率で得られる。そのような調製は、かなり面倒であり、精製および特徴付けの費用が高いことが分かった。その結果、有用な治療用産物とするためにかなりの費用がかかるようである。前記事項を考慮すると、ＢＣｈＥを生成するより効果的な方法が必要である。
【００１３】
要約すると、バイオスカベンジャー産物としての天然ＢＣｈＥ分子の製造における近年の問題は、１）低収率、２）複雑な製造プロセス（乳）、３）短い半減期（すなわち、ペグ化が必要）、４）異種性の高い産物（特徴付けおよびＦＤＡ認可を得ることが困難）、および５）産物の高コストである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、特にＢＣｈＥの切断型単量体型を提供することにより、これらの問題の少なくとも一部に対処する。単量体型は四量体型と活性は同程度であるが、四量体よりも安定性が低い（すなわち、「ＭＲＴ」が短い）と考えらえてきた。これは、作られるタンパクが、適切にグリコシル化および／またはシアル化されないためと考えられる。出願人は、この結果を得るために細胞系およびクローンを同定した。さらに、全長ＢＣｈＥを作ると、細胞は、単量体、二量体および四量体の混合物を生成し、そのために、本発明は好ましく単量体型を生成する手段も提供する。
【００１５】
一つの局面において、本発明は、ＢＣｈＥ酵素活性（例えば、良く知られているＥｌｌｍａｎアッセイを用いて決められる）を有するポリペプチドをコード化する、ｃＤＮＡ等のＤＮＡまたはＲＮＡであってよい、単離された核酸であって、核酸のコード領域におけるグアニンおよびシトシン（Ｇ＋Ｃ）ヌクレオチドの百分率が約４０％超、または４５％超、または５０％超、または５５％超、または少なくとも６０％である、または６０％を超えるが８０％を超えないようにコドン最適化された単離された核酸に関する。
【００１６】
特定の態様において、単離された核酸は、内部ＴＡＴＡボックス、内部リボソーム進入部位またはスプライス供与もしくは受容部位のような対象遺伝子構造体の発現水準を下げる内部構造要素を含まない。
【００１７】
一つの態様において、本発明の単離された核酸は、少なくとも一つのＫｏｚａｋ配列を、好ましくは開始部位の上流に含むまたはコード化する。
【００１８】
本発明の単離された核酸は、合成されたポリペプチド上に一以上のグリコシル化および／またはシアル化部位もコード化する。好ましい態様において、これらは、コード化されたＢＣｈＥを全グリコシル化および／またはシアル化させるための数が充分である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】本発明のＢＣｈＥのコドン最適化ヌクレオチド（配列番号１）および対応するアミノ酸（配列番号２）配列を示す。そのような配列は、挿入された制限部位および他の部位、例えば１〜２１番アミノ酸からなるヒトシグナルまたはリーダー配列を含み、そこで、２２番アミノ酸残基で開始する配列ＥＤＤを有して全長ＢＣｈＥが始まっている。
【図１−２】本発明のＢＣｈＥのコドン最適化ヌクレオチド（配列番号１）および対応するアミノ酸（配列番号２）配列を示す。そのような配列は、挿入された制限部位および他の部位、例えば１〜２１番アミノ酸からなるヒトシグナルまたはリーダー配列を含み、そこで、２２番アミノ酸残基で開始する配列ＥＤＤを有して全長ＢＣｈＥが始まっている。
【図１−３】本発明のＢＣｈＥのコドン最適化ヌクレオチド（配列番号１）および対応するアミノ酸（配列番号２）配列を示す。そのような配列は、挿入された制限部位および他の部位、例えば１〜２１番アミノ酸からなるヒトシグナルまたはリーダー配列を含み、そこで、２２番アミノ酸残基で開始する配列ＥＤＤを有して全長ＢＣｈＥが始まっている。
【図１−４】本発明のＢＣｈＥのコドン最適化ヌクレオチド（配列番号１）および対応するアミノ酸（配列番号２）配列を示す。そのような配列は、挿入された制限部位および他の部位、例えば１〜２１番アミノ酸からなるヒトシグナルまたはリーダー配列を含み、そこで、２２番アミノ酸残基で開始する配列ＥＤＤを有して全長ＢＣｈＥが始まっている。
【図２−１】ヤギ乳におけるトランスジェニック発現のためのヤギカゼインリーダーまたはシグナルポリペプチド（１〜１５番アミノ酸）を含む天然ヒトＢＣｈＥ（すなわち、コドン最適化無し）のヌクレオチド（配列番号５）および対応するアミノ酸（配列番号６）配列を示し、そこで、１７番アミノ酸残基で開始する配列ＥＤＤを有してＢＣｈＥ天然ポリペプチドが始まっている（番号１）のグルタミン酸、および１’として挿入されたアルギニン）。
【図２−２】ヤギ乳におけるトランスジェニック発現のためのヤギカゼインリーダーまたはシグナルポリペプチド（１〜１５番アミノ酸）を含む天然ヒトＢＣｈＥ（すなわち、コドン最適化無し）のヌクレオチド（配列番号５）および対応するアミノ酸（配列番号６）配列を示し、そこで、１７番アミノ酸残基で開始する配列ＥＤＤを有してＢＣｈＥ天然ポリペプチドが始まっている（番号１）のグルタミン酸、および１’として挿入されたアルギニン）。
【図３−１】１〜２１番アミノ酸からなるヒトシグナルまたはリーダー配列を含む本発明の切断型ＢＣｈＥのコドン最適化ヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示し、そこで、２２番アミノ酸残基で開始する配列ＥＤＤを有して切断型ＢＣｈＥが始まっている。
【図３−２】１〜２１番アミノ酸からなるヒトシグナルまたはリーダー配列を含む本発明の切断型ＢＣｈＥのコドン最適化ヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示し、そこで、２２番アミノ酸残基で開始する配列ＥＤＤを有して切断型ＢＣｈＥが始まっている。
【図３−３】１〜２１番アミノ酸からなるヒトシグナルまたはリーダー配列を含む本発明の切断型ＢＣｈＥのコドン最適化ヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示し、そこで、２２番アミノ酸残基で開始する配列ＥＤＤを有して切断型ＢＣｈＥが始まっている。
【図３−４】１〜２１番アミノ酸からなるヒトシグナルまたはリーダー配列を含む本発明の切断型ＢＣｈＥのコドン最適化ヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示し、そこで、２２番アミノ酸残基で開始する配列ＥＤＤを有して切断型ＢＣｈＥが始まっている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書の他の部分で特に明記しない限り、以下の用語の各々は記載された意味を有する。
【００２１】
「ブチリルコリンエステラーゼ酵素」または「ＢＣｈＥ酵素」という用語は、アセチルコリンおよびブチリルコリンを加水分解することができ、その触媒活性が化学抑制剤イソ−ＯＭＰＡにより抑制されるポリペプチドを意味する。本発明により生成される好ましいＢＣｈＥ酵素は、哺乳動物ＢＣｈＥ酵素である。「ＢＣｈＥ酵素」という用語は、そのようなポリペプチドの薬学的に許容される塩も含む。
【００２２】
「組み換えブチリルコリンエステラーゼ」または「組み換えＢＣｈＥ」という用語は、本発明の発現構造体の一つにより指示されるような一過的トランスフェクション、安定的トランスフェクションまたはトランスジェニック宿主細胞または動物により、および直接的化学合成により生成されるＢＣｈＥ酵素を意味する。「組み換えＢＣｈＥ」という用語は、そのようなポリペプチドの薬学的に許容される塩も含む。
【００２３】
「ベクター配列」という用語は、（限定はされないが）プラスミド、コスミド、ファージベクター、ウイルスベクターおよび酵母人工染色体を含む発現構造体のクローニングおよび／または増殖を容易にするために本発明の組み換えＤＮＡ技術において有用性を有する当該技術分野で確立されたいずれかの核酸配列を意味する。
【００２４】
「発現構造体」または「構造体」という用語は、選択された宿主細胞内において標的核酸配列の適切な転写および翻訳を提供する配列要素に操作可能に結合した、その発現が望ましい標的核酸配列を含む核酸配列を意味する。そのような配列要素は、プロモーター、分泌のためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナル、イントロン配列、インスレーター配列、および本発明で記載の他の要素を含み得る。「発現構造体」または「構造体」は、さらに、ベクター配列を含み得る。
【００２５】
「操作可能に結合」という用語は、標的核酸配列および一以上の調節配列（例えば、プロモーターまたはシグナル配列）が、宿主細胞内で標的核酸配列によりコード化されたポリペプチドを発現させるように物理的に結合されることを意味する。
【００２６】
「プロモーター」という用語は、転写を開始させるためのＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するＤＮＡの領域を意味する。
【００２７】
「シグナル配列」という用語は、ポリペプチドをコード化する核酸配列に組み込まれたときに、前記ポリペプチドを発現する細胞からの翻訳ポリペプチド（例えば、ＢＣｈＥ酵素および／またはグリコシルトランスフェラーゼ）の分泌を導く核酸配列を意味する。シグナル配列は、好ましくは、ポリペプチドをコード化する核酸配列の５’−末端に位置し、その結果、シグナル配列によりコード化されたポリペプチド配列が翻訳されたポリペプチドのＮ−末端に位置し、通常はリーダー配列である。「シグナルペプチド」という用語は、シグナル配列の翻訳から生じるペプチド配列を意味する。
【００２８】
「宿主細胞」という用語は、本発明の一以上の発現構造体をトランスフェクションされた細胞を意味する。そのような宿主細胞として、インビトロ培地中の哺乳動物細胞および動物のインビボで見られる細胞が挙げられる。好ましい試験管内培養哺乳動物宿主細胞として、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞が挙げられる。
【００２９】
「トランスフェクション」という用語は、（限定はされないが）マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションまたはウイルス媒介トランスフェクションを含む当該技術分野で充分に確立された方法のいずれかにより、本発明の一以上の発現構造体を宿主細胞に導入するプロセスを意味する。本発明の発現構造体がトランスフェクションによりその中に導入された宿主細胞は、「トランスフェクションされた」ということになる。「一過的にトランスフェクションされた細胞」という用語は、導入された発現構造体が宿主細胞またはその子孫のゲノム内に永続的には一体化されておらず、従って、時間と共に宿主細胞またはその子孫から除去され得る宿主細胞を意味する。「安定的にトランスフェクションされた細胞」という用語は、導入された発現構造体が宿主細胞またはその子孫のゲノム内に一体化されている宿主細胞を意味する。
【００３０】
本発明によれば、「ＤＮＡセグメント」という用語は、実質的に純粋な状態、すなわち汚染性内因性物質を含まない状態で少なくとも一回単離されると共に、例えばクローニングベクターを用いる標準的生化学的方法によりセグメントおよびその成分であるヌクレオチド配列の同定、操作および回復を可能にする量または濃度で単離されたＤＮＡから誘導された、別々のフラグメントとしてのまたは大きなＤＮＡ構造体の成分としてのＤＮＡポリマーを意味する。そのようなセグメントは、内部の非翻訳配列または真核生物遺伝子中に典型的に存在するイントロンにより中断されていないオープンリーディングフレームの状態で提供される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームの下流に存在し得、コード領域の操作または発現を妨げない。
【００３１】
本発明の内容におけるポリペプチド（またはポリヌクレオチド）に関する「単離」は、その最初の環境（例えば、天然産の場合は天然環境）から物質が除去されることを意味する。例えば、生命体中に存在する天然産ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、天然系中の共存物質の一部またはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離される。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、および／または、そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得、そのようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部ではないので、やはり単離される。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離状態で提供され、好ましくは均質まで精製される。
【００３２】
「コード領域」という用語は、その天然ゲノム環境において遺伝子の発現産物を天然にまたは通常コードする遺伝子の部分、すなわち、遺伝子の天然発現産物をインビボでコードする領域を意味する。コード領域は、普通の、突然変異したまたは変化した遺伝子からのものであり得る、または、ＤＮＡ合成の当業者に良く知られている方法を用いて実験室において全体的に合成されたＤＮＡ配列または遺伝子からのものであり得る。
【００３３】
本発明によれば、「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーを意味する。通常、本発明により提供されるタンパクをコード化するＤＮＡセグメントは、ｃＤＮＡフラグメントおよび短鎖オリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられて、微生物またはウイルスオペロンから誘導された調節要素を含む組み換え転写ユニットにおいて発現され得る合成遺伝子が提供される。
【００３４】
「発現産物」という用語は、遺伝子と、遺伝子暗号縮退から生じる相当物をコードすると共に同じアミノ酸をコードする核酸配列との天然翻訳産物であるポリペプチドまたはタンパクを意味する。
【００３５】
ポリペプチドとの関係において用いられた場合、本明細書で用いられる「部分」、「セグメント」、「切断型」および「フラグメント」という用語は、アミノ酸残基等、残基の連続的配列を意味し、その配列は、より大きな配列の部分集団を形成する。例えば、ポリペプチドを、トリプシンやキモトリプシン等、一般的エンドペプチダーゼのいずれかによる処理に付した場合、そのような処理から生じるオリゴペプチドは、開始ポリペプチドの部分、セグメントまたはフラグメントを表す。ポリヌクレオチドとの関係で用いた場合、そのような用語は、一般的エンドヌクレアーゼのいずれかによる前記ポリヌクレオチドの処理により生成される産物を意味する。
【００３６】
コード配列に言及する場合の「フラグメント」という用語は、その発現産物が、完全コード領域の発現産物と同じ生物学的機能および活性を本質的に維持する完全未満のコード領域を含むＤＮＡの部分を意味する。
【００３７】
「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」という用語は、終止コドンは無くアミノ酸をコードする一連のトリプレットを意味し、タンパクに（潜在的に）翻訳され得る配列である。
【００３８】
本明細書で用いられるＤＮＡ配列への言及は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの両方を含む。すなわち、特定の配列は、特に明記されない限り、そのような配列の一本鎖ＤＮＡ、そのような配列とその相補体との二重体（二本鎖ＤＮＡ）、およびそのような配列の相補体を意味する。
【００３９】
本発明によれば、「同一性百分率」または「同一性百分率の」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に言及する場合、明細書または請求の範囲の配列（「参照配列」）と比較すべき配列（「比較配列」）を配列調整した後に、その配列を、請求の範囲または明細書の配列と比較することを意味する。同一性百分率は、次に、以下の式に従って決められる。
同一性百分率＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
【００４０】
式中、Ｃは、参照配列と比較配列との配列間の配列調整の長さに渡る相違の数であり、ここで、（ｉ）比較配列中の対応する配列調整された塩基またはアミノ酸を有しない参照配列中の各塩基またはアミノ酸、（ｉｉ）参照配列中の各ギャップおよび（ｉｉｉ）比較配列中の配列調整された塩基またはアミノ酸と異なる参照配列中の各配列調整された塩基またはアミノ酸が、相違を構成し、またＲは、参照配列中の配列調整の長さに渡る塩基またはアミノ酸の数であり、参照配列中に形成されたギャップを有する比較配列も塩基またはアミノ酸と数えられる。
【００４１】
前述のように計算された同一性百分率が特定された最少同一性百分率と略同じまたはそれ以上である比較配列と参照配列との配列調整が存在する場合、前記計算された同一性百分率が特定された同一性百分率未満である配列調整が存在したとしても、比較配列は、参照配列に対する特定された最少同一性百分率を有する。
【００４２】
ヒト血清から誘導されるブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）は、分子量約３４０キロダルトンの球状四量体分子である。５７４個のアミノ酸からなる各サブユニット（配列番号６の１７番アミノ酸から始まる）上に９本のＡｓｎ（アスパラギン）結合炭水化物鎖が見られる。四量体型のＢＣｈＥは安定であり、治療用途の分野において好ましいものであった。本発明により製造したＢＣｈＥ酵素は、殺虫剤等の有機ホスフェート、および戦用ガス、サクシニルコリンまたはコカインを結合および／または加水分解する能力を有している。
【００４３】
本発明のＢＣｈＥ酵素は、哺乳動物ＢＣｈＥ、より好ましくはヒトＢＣｈＥにおいて見られる配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、四量体、三量体、二量体または単量体として製造され得る。好ましい態様において、本発明の合成ＢＣｈＥは、天然ヒトＢＣｈＥのプロフィールに同一でないとしても実質的に類似のグリコシル化および／またはシアル化プロフィールを有する。
【００４４】
本発明により製造されるＢＣｈＥは、平均滞留時間が長い単量体型が好ましく、それにより、ペグ化（すなわち、種々の分子量および構造のポリエチレングリコールの一以上の分子を付加させること）等、平均滞留時間を延ばすための費用のかかる合成後修飾の必要性が低減する。ところが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞中に組み換え技術により発現されたＢＣｈＥは、大部分がより安定な四量体型で見つかるのではなく、むしろ、二量体約５５％、四量体１０〜３０％および単量体１５〜４０％からなっていた（Ｂｌｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  Ｖｏｌ．  ３２７，  ｐｐ  ７４７−７５７  （１９９７））。
【００４５】
コラーゲン後部（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔａｉｌ）タンパク質のＮ末端由来のプロリンに富むアミノ酸配列によって、アセチルコリンエステラーゼが四量体型に組み立てられることが、最近の研究により示された（Ｂｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （１９９７）  ２７２（５）：３０１６−３０２１およびＫｒｅｊｃｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （１９９７）  ２７２：２２８４０−２２８４７）。本発明により形成される単量体ＢＣｈＥ酵素の量を大幅に増加させるため、本発明のＢＣｈＥ酵素をエンコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、プロリンに富む連結ドメイン（ＰＲＡＤ）を含まず、あるいは組換えＢＣｈＥサブユニット（例えば、単量体、二量体及び三量体）を用いて四量体会合を形成する。
【００４６】
非四量体型のＢＣｈＥは、有機ホスフェート化合物の貯蔵に用いられた土地の浄化および有機ホスフェートに晒された軍装備品の除染等、インビボ投与を必要としない用途においても有用である。生体外の用途においては、これらの非四量体型のＢＣｈＥを、酵素を装備および人員に局所適用するのに有用なスポンジ、スプレー、清浄液または他の材料に混入することができる。これらの型の酵素は、有機ホスフェート化合物に晒されていたヒト患者の皮膚および衣服に外部から適用することもできる。非四量体型の酵素は、化学兵器戦争状況において用いられる軍服およびガスマスクの継ぎ目および閉鎖に適用される障壁および封止剤として適用することもできる。
【００４７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞、および組み換え技術による本発明のポリペプチドの製造も提供する。
【００４８】
例えば、好ましくはプラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の状態のクローニングベクターまたは発現ベクターであってよい本発明のベクターを用いて、宿主細胞が遺伝子操作（すなわち、形質導入、形質転換またはトランスフェクション）される。必要に応じてプロモーターの活性化、形質転換細胞の選択または本発明の遺伝子の増幅のために修飾された従来の栄養培地において、遺伝子操作宿主細胞を培養することができる。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞を用いて従来使用されていた条件であり、当業者には明らかである。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、組み換え技術によるポリペプチドの生成に好ましく用いられる。そのようなポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか一つに含まれ得る。そのようなベクターとして、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡ、ウイルス性ＤＮＡ、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病ウイルスとの組み合わせにより誘導されるベクター、が挙げられる。しかしながら、宿主細胞中で複製可能で生存可能であるならば他のベクターを用いても良い。
【００５０】
適切なＤＮＡ配列を、種々の手順によりベクター内に挿入することができる。通常、当該技術分野で既知の手順により、ＤＮＡ配列が、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのような手順等は、当業者の知識の範囲内であると考えられる。
【００５１】
発現ベクター内のＤＮＡ配列が、適切な発現対照配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー、シスまたはトランス配置）に操作可能に結合され、ｍＲＮＡが合成される。そのようなプロモーターの代表的な例として、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、ファージラムダＰＬプロモーター、および、真核生物、好ましくはヒトの細胞において遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられる。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターも含む。ベクターは、特に、ヒト細胞、例えば、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞において最適に作用するよう設計されている場合、発現を増幅させるための適切な配列も含む。
【００５２】
本明細書に記載の適切なＤＮＡ配列、および適切なプロモーターまたは対照配列を含むベクターを用いて、適切な宿主を形質転換させて、宿主にタンパクを発現させることができる。
【００５３】
適切な宿主細胞の代表的な例として、ヒト細胞、好ましくはＰｅｒ．Ｃ６細胞（Ｐｅｒｃｉｖｉａ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡから入手される）が挙げられる。
【００５４】
特に、本発明は、先に広く記載している一以上の配列を含む組み換え構造体も含む。構造体は、プラスミドまたはウイルスベクター等のベクターを含み、その中に、本発明の配列が順方向または逆方向に挿入されている。この態様に好ましい局面において、構造体は、さらに、配列に操作可能に結合された例えばプロモーターを含む調節配列を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に既知であり、市販されている。
【００５５】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを、選択可能なマーカーと共に用いて、所望の遺伝子から選択することができる。ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７が二つの適切なベクターである。真核生物プロモーターとして、最初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業界の通常の知識の水準の範囲内である。
【００５６】
さらなる態様において、本発明は、前記構造体を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は好ましくはヒト細胞である。何故なら、本発明の核酸はそのようなヒト発現に最適化されているからである。構造体の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行うことができる（Ｄａｖｉｓ，  Ｌ．，  Ｄｉｂｎｅｒ，  Ｍ．，  Ｂａｔｔｅｙ，  Ｉ．，  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  （１９８６））。宿主細胞中の構造体を、従来法において用い、組み換え配列によりコード化される遺伝子産物を生成することができる。あるいは、本発明のポリペプチドを、従来のペプチド合成器により合成的に生成することができる。
【００５７】
真核生物宿主において用いるための適切なクローニングおよび発現ベクターが、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  （１９８９）に記載されており、その開示内容が参考として本明細書で取り入れられる。
【００５８】
高度の真核生物、特にヒトの細胞により本発明のポリペプチドをコード化するＤＮＡの転写が、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することにより促進される。エンハンサーは、転写を促進するためにプロモーターに作用する、通常約１０〜約３００個の塩基対からなる、ＤＮＡのシス作用性要素である。その例として、複製起点の後期側の１００〜２７０個の塩基対からなるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【００５９】
通常、組み換え発現ベクターは、複製の起点および宿主細胞を形質転換させるための選択性マーカー、ならびに下流構造配列の転写を行うため高度に発現された遺伝子から誘導されるプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、中でも、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）等の糖分解酵素をコード化するオペロン、α−因子、酸ホスファターゼ、またはヒートショックタンパクから誘導することができる。非相同構造配列が、適切な相において、翻訳開始および終止配列、好ましくは、翻訳されたタンパクを細胞周辺腔または細胞外培地中に分泌させることのできるリーダー配列と組み立てられる。場合により、非相同配列は、所望の特性、例えば、発現された組み換え産物の安定化または単純精製を付与するＮ−末端同定ペプチドを含む融合タンパクをコードすることができる。
【００６０】
適切な宿主菌株の形質転換および宿主菌株が適切な細胞密度に成長した後、選択されたプロモーターが適切な手段（例えば、温度変化または化学誘導）により誘発され、細胞が、さらなる期間培養される。細胞は、典型的には遠心分離により集められ、物理的または化学的手段により分離され、得られる粗抽出物をさらなる精製のために保持する。
【００６１】
哺乳動物、特にヒトの細胞の発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを含み、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、転写終止配列および５’フランキング非転写配列も含む。ＳＶ４０スプライスおよびポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列を用いて、必要な非転写遺伝子要素を提供することができる。
【００６２】
ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイロクロマトグラフィーおよびレシチンクロマトグラフィーを含む方法により、組み換え細胞培地から回収および精製することができる。必要であれば、成熟タンパクの構造の完成において、タンパクリフォールディング工程を用いることができる。最後に、最終精製工程のために高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。
【００６３】
遺伝子暗号の縮退のために、特定のアミノ酸をコード化するために２種以上のコドンを用いることができる。しかしながら、同じアミノ酸をコード化している全てのコドンが均一に利用されるわけではない。細胞、例えばヒト細胞における最適発現のために、発現する核酸、例えばＤＮＡを、その種または特別の型の細胞により最も一般的に用いられるコドンを利用するコード領域を含むようにコドン最適化することができる。コドン最適化は、現在良く知られている技術であり、合成遺伝子の設計において用いられる。異なる有機体は、これら異なるコドンの一種または他の種類を選択的に利用する。コドン最適化により、選択された細胞型において特定のタンパクの発現水準を大きく挙げることができる。
【００６４】
前記事実に従って、本発明の単離された核酸の態様はコドン最適化され、そのコドン最適化はコドン適応指標（ＣＡＩ）として発現され、本発明の核酸についてのそのＣＡＩは、少なくとも０．７、好ましくは少なくとも０．８、より好ましくは少なくとも０．９、および最も好ましくは少なくとも０．９７である。野生型（非最適化ヒトＢＣｈＥ遺伝子）について、ＣＡＩは０．６９またはその前後である。そのようなコドン適応指標は、当該技術分野で既知の方法に従い、所望の発現系における所定のアミノ酸について最も頻繁に用いられているコドンの品質値を１００に設定し、残りのコドンをそれに従って見積もることにより決められる（Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｌｉ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ．  １５（３），  ９９．  １２８１−１２９５  （１９８７）を参照）。ＣＡＩは、ある種からの高度発現遺伝子の参照群を用いて、各コドンの相対的利点を決め、前記遺伝子における全てのコドンの使用頻度から遺伝子のスコアを計算する。この指標は、遺伝子の発現の水準の予想に有用であり、おそらく所定の細胞系における非相同遺伝子発現の成功を示す。
【００６５】
一部の態様において、本発明の核酸、例えば、ＤＮＡの、さらなるパラメーターを用いた最適化も行った。例えば、野生型ヒトＢＣｈＥ遺伝子の分析により、種々のヌクレオチド位置の周囲の塩基対４０個の枠におけるＧＣ含量を決めることにより、平均Ｇ＋Ｃ含量が約４０％であることが分かった。逆に、本明細書に開示のコドン最適化核酸のような本発明の核酸のＧＣ含量は、平均ＧＣ含量が約６０％である。例えば、本発明の核酸の生成において、非常に高いまたは低いＧＣ含量が回避され、それにより、３０％未満または８０％超のＧＣ含量が回避された。
【００６６】
本発明は、ＢＣｈＥ酵素活性を有するポリペプチドをコード化する単離された核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡに関し（例えば、良く知られているＥｌｌｍａｎアッセイを利用、Ｅｌｌｍａｎ，  Ｇ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  Ｖｏｌ．  ７，  ｐｐ．  ８８−９５  （１９６１））、前記核酸のコード領域におけるグアニンおよびシトシン（Ｇ＋Ｃ）ヌクレオチドの百分率は４０％超、または４５％超、または５０％超、または５５％超、または少なくとも６０％である、または６０％を超えるが８０％未満である。全ての場合に、コドンの利用を、ヒト（ホモサピエンス）遺伝子のコドンの偏りに適応させた。
【００６７】
本発明の単離された核酸の特定の態様は、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補体に、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含む。好ましい態様において、本発明の核酸は、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補体を含む、より好ましくは本質的にそれらからなる、および最も好ましくはそれらからなる。全ての場合において、そのような核酸は、配列番号１そのものに加えて、ＧＣ含量および／またはＣＡＩ等のパラメーターに関する本発明の他の要求を満たす。
【００６８】
一つの態様において、本発明の核酸によりコード化されたＢＣｈＥポリペプチドは、配列番号２の２２〜５６４番アミノ酸を含み、好ましくはそれらからなる。一部の態様において、コード化されたＢＣｈＥポリペプチドは、配列番号２におけるアミノ酸の数より少ないアミノ酸を含む（すなわち、前記配列の切断された、変異または修飾型、例えば、配列番号４としておよび／または図３に示す切断型、シグナル配列は含む場合と含まない場合がある）。そのような修飾は、得られるＢＣｈＥ酵素の全体的３次元構造または形状に影響を与え得る。結果として、得られるコード化されたポリペプチドは、四量体を容易に形成せず、二量体でさえ容易に形成しないが、単量体状態を維持する。
【００６９】
本発明によれば、そのような単量体ＢＣｈＥポリペプチドは、配列番号６の天然ＢＣｈＥと異なるＢＣｈＥポリペプチドを、または、配列番号２または４の配列または前記配列の２２〜５６４番アミノ酸への同一性が１００％未満であるが前記ポリペプチドのＢＣｈＥ酵素活性の実質的に全てを保持しているポリペプチドのような前記ポリペプチドの変異体であるＢＣｈＥポリペプチドを生成することにより達成され、あるいは、そのようなポリペプチド中に存在する一以上のアミノ酸は異なっているまたは前記ポリペプチドに含まれず、従って、変異体または短縮もしくは切断型ポリペプチドであり、大部分がまたは全てが単量体を形成する、または単量体のみを形成する。
【００７０】
例えば、そのような切断型は、通常、特定のドメインが存在しない点において、天然または全長ＢＣｈＥ（例えば、配列番号６、１７番アミノ酸で開始）と異なる。好ましい態様において、そのようなドメイン（当該技術分野においてＷＡＴドメインと呼ばれる）は、ＢＣｈＥポリペプチドのＣ−末端部分、好ましくは天然ＢＣｈＥのＣ−末端の２０〜４０個のアミノ酸、より好ましくは天然ＢＣｈＥのＣ−末端の２５〜３５個のアミノ酸、最も好ましくはそのようなＢＣｈＥのＣ−末端の３１個アミノ酸を含む。本発明の切断型を生成するために、配列番号２（図１）の５６４番残基におけるトリプトファン残基の後のアミノ酸セグメントを、成熟タンパクの配列から除去することができる。一つの態様において、前記ＢＣｈＥポリペプチドは単量体を形成しない。何故なら、前記ＷＡＴドメインの全体または一部が除去されているから、または、一以上のアミノ酸置換が前記ドメインに導入されて、得られる成熟ポリペプチドの多量体形成を誘発する目的にとって非機能的になるからである。
【００７１】
ＤＮＡからの発現は、トリプトファンをコード化するコドンの次に終止コドンを、その直後に、または前記トリプトファンコドンのコドン３’の後に挿入することにより達成され、それにより、ＢＣｈＥタンパクの得られるコード化アミノ酸配列がその後短縮することになる。後者が直接的化学合成により合成される場合、配列番号２のＮ−末端から５６４番残基におけるトリプトファンまでまたはそれを超える配列が合成産物に含まれるが、前記トリプトファンのアミノ酸Ｃ−末端の一部、大部分または全ては含まれずに、切断型が形成される。本発明の切断型ＢＣｈＥは、図１、２または３に示されるようなシグナル配列を含んでも含まなくてもよい。すなわち、本発明により、成熟ポリペプチドの切断型が考えられる。そのような例の一つは、配列番号４の２２〜５６４番アミノ酸からなる。
【００７２】
そのような単量体、特にそのような切断型からなる単量体は、より良く規定されたアミノ酸配列の利点を有し、ＢＣｈＥの四量体型の通常合成量の１０倍、２０倍または４０倍以上の量で、費用を大きく減らして合成することができ、それにより、臨床的および商業的、両観点から、さらにより望ましい治療薬になる。
【００７３】
配列番号２の５６５〜５９５番アミノ酸残基に配された配列ＫＡＧＦＨＲＷＮＮＹＭＭＤＷＫＮＱＦＮＤＹＴＳＫＫＥＳＣＶＧＬ（配列番号７）は、ＢＣｈＥの二量化および／または四量化等、多量体ＢＣｈＥ分子の形成に含まれることが分かった（例えば、そのようなドメインに関するさらなる構造情報を含むＢｌｏｎｇらの前記書を参照されたい）。このドメインの一部または全体を除去することにより、得られるＢＣｈＥ産物の全てではないにしても大部分が、多量体を形成することができなくなり、それにより単量体型で残る。本発明のそのような切断型の形成において、合成された単量体からの二量体または四量体形成を防止するために、このドメインの大部分を除去するだけでよい。配列番号４（図３）のような一つの態様においては、その全てが欠損している。そのような産物では、単量体の発現が高度であり、精製および特徴付けが容易であり、産物の費用が本質的に低い。
【００７４】
一つの好ましい態様において、ＢＣｈＥのこの切断型は、選択された最適クローンと共にＰｅｒ．Ｃ６細胞において発現される。この切断型ＢＣｈＥは、ＭＲＴが長く、薬産物として好ましい型になる。他の態様において、そのような切断型は、直接合成、および、非相同タンパクの高水準のグリコシル化および／またはシアル化を達成する組み換え細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞、最も好ましくはＰｅｒ．Ｃ６（またはＰｅｒＣ６）細胞を用いる等、他の手段によっても調製され、あるいは、インビトロまたはインビボ合成の後にインビトログリコシル化および／またはシアル化が行われる。
【００７５】
好ましい態様において、本発明の切断型ＢＣｈＥは、Ｎ−末端においてヒトシグナル配列を含む配列番号４のアミノ酸配列（図３に示す）を含む。
【００７６】
このように、本発明の切断型ＢＣｈＥは、ＷＡＴドメインの一部または全体が除去されたＢＣｈＥ分子である。ＷＡＴドメインが機能していないと、分子は、四量体および／または二量体等の多量体を形成せず、単量体のみではないとしても殆ど単量体のみを形成する。（例えば、配列番号２の）５６４番におけるＷの後に、例えば、切断部位を選択すると、より均一なＣ−末端領域が容易に得られる。高度グリコシル化および高度シアル化クローンの選択と共にＰｅｒ．Ｃ６細胞を用いると、長い血清半減期が確保され、本発明の好ましい態様となる。要するに、そのような切断型ＢＣｈＥ構造体は単純であり、より高い収率、より長い血清半減期およびより均質な産物が得られ、効果的な医薬剤に必要とされる全ての要求が満たされる。
【００７７】
本発明の切断型ＢＣｈＥは、直接的化学合成を含む当該技術分野で既知の手段により生成することができ、そのような切断型の配列は、コード化ＤＮＡの発現により調製される場合、コドン最適化ＤＮＡから誘導される必要はない。本発明の核酸およびポリペプチドを生成するための分子生物学および遺伝子工学の分野において良く知られている手順を含む標準的な参考文献が利用される。有用な参考文献としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  （１９８９）、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９９７）、およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ６２，  （Ｔｕａｎ，  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ，  １９９７）が挙げられ、その開示内容が参考として本明細書で取り入れられる。
【００７８】
もう一つの局面において、本発明は、本発明の核酸を含むベクター、および、そのようなベクターを含むと共に本発明の核酸を発現することによりＢＣｈＥポリペプチドを発現する組み換え細胞に関し、好ましくは、その核酸は、本発明のベクター内に存在する。本発明は、本明細書で記載されているような組み換え細胞からポリペプチドを発現することを含んでなる、そのようなＢＣｈＥ酵素活性を有するポリペプチドを調製する方法にも関し、好ましくは、ポリペプチドは配列番号４（例えば、配列番号２）のアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが単量体のみを形成する場合が含まれ、例えば、そのようなポリペプチドは、そのような上記分子構造の形成を促進する一以上のドメインの部分を含まず、ドメイン全体が存在しないまたは配列が変化している場合が含まれる。
【００７９】
前述のように、単量体は四量体よりも活性が低いと考えられるが、これは、おそらく、不適切なグリコシル化による。本発明は、優れた保持時間を有する充分に活性な単量体として適切にグリコシル化された切断型分子の発現に特に有用な細胞系と共に適切なグリコシル化部位およびＢＣｈＥをコード化するコドン最適化核酸を提供する。
【００８０】
本発明の実施において有用な細胞を形質転換するために用いられる本発明の核酸は、配列番号１の核酸が唯一の特異的なしかし好ましい例である合成遺伝子である。そのような核酸は、配列番号１の修飾型を含む。「修飾型」という表現は、ＧＣ含量％および本発明により挙げられる他の基準が満たされていることを条件に、ＢＣｈＥ（そのフラグメントまたは変異体を含む）をコード化すると共にＢＣｈＥ酵素活性を有するが、異なるコドンを利用する他の核酸配列を意味する。適切な修飾型としては、配列番号１に少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、および更により好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するものが挙げられる。
【００８１】
一つの態様において、配列番号１および／または配列番号３の核酸配列は、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞（組み換えアデノウイルスベクターと共に用いるための充分に特徴付けられたヒト細胞系、Ｃｒｕｃｅｌｌ  Ｌ．Ｖ．，  Ｌｅｉｄｅｎ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手）のようなヒト細胞における発現のためにコドン最適化された。この細胞系は、非相同タンパクを良好な収率で生成する利点を有する。これは、プリオンを含まず、外因性遺伝子が容易にトランスフェクションされ、動物および／またはヒト誘導タンパクを含まない市販媒体において良好に成長することも分かった。
【００８２】
コドン最適化に加えて、核酸の発現およびその後のＢＣｈＥの合成を低下させるポリヌクレオチド配列要素の含有を回避するために本発明の核酸をさらに最適化することにより本発明の異なる態様が達成された。特に、前記配列要素は、負の要素または繰り返し配列、スプライス部位等のシス作用性モチーフ、内部ＴＡＴＡボックスおよびリボソーム進入部位からなる群より選択することができる。
【００８３】
ＴＡＴＡボックス（またはＴＡＴＡ）部位は、当該技術分野で良く知られており、通常、ヒト細胞のような哺乳動物細胞において見られるＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写される遺伝子のプロモーター領域において見られるコンセンサス配列を表す。（配列５’ＴＡＴＡＡＡＡ３’（配列番号１１）を有することが多い）転写開始部位の上流に約２５個のヌクレオチドが配されることが多い。これは、遺伝子転写のための開始部位を決めることに関係する。しかしながら、そのような部位が遺伝子のコード領域内に存在すると、遺伝子発現に悪影響を与える（すなわち、遅延させる）ことができ、従って、効率的高水準発現が求められる場合は避けるべきである。可能な場合、本発明の核酸において、そのような配列は回避した。
【００８４】
遺伝子発現は、遺伝子のコード領域において見られる他の構造モチーフによっても遅くなる。そのようなモチーフの一つはｃｈｉ−部位であり、これは相同的組み換えを誘発し、それによりクローニングされた遺伝子を崩壊させることができる。例えば、酵素ＲｅｃＢＣＤ（二本鎖ＤＮＡ切断において相同的組み換えを開始するヘテロ三量体ヘリカーゼ）は、「ｃｈｉ」と表されるＤＮＡ配列（すなわち、５’−ＧＣＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号８））により修飾することができる。好ましくはそのようなｃｈｉ−部位を含まずコード化もしない本発明の核酸を得る際に、そのようなｃｈｉ部位を可能な場合は回避した。
【００８５】
真核生物において、短い５’非翻訳領域中に位置するＫｏｚａｋ配列５’−ＡＣＣＡＣＣＡＵＧＧ−３’（配列番号９）または５’−ＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ−３’（配列番号１０）が、ｍＲＮＡの翻訳を引き起こし、転写開始部位（転写を開始するＡＵＧコドン）の上流に位置する。これらの配列は、リボソームにより翻訳開始部位であると効果的に認識され、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはｍＲＮＡ分子の５’キャップを含む内部リボソーム結合部位（ＲＢＳ）とは異なる。Ｋｏｚａｋ配列の強度は、ｍＲＮＡの翻訳の程度、および、従って生成されたタンパクの量を決めることができる。本発明の核酸を得る際に、可能な場合は、内部リボソーム進入部位を回避した。しかしながら、本発明の核酸または遺伝子構造体は、本発明の組み換え細胞からの発現の目的で、好ましくは、開始部位の上流にＫｏｚａｋ部位をコード化する。
【００８６】
哺乳動物のタンパクをコードしている遺伝子は、転写完了後であるがリボソームにおける翻訳の前に起こるＲＮＡスプライシングに含まれるイントロンも含む。そのような部位の配列は、当該技術分野で既知であり、可能な場合、ほとんどがコード配列からなり、従って本質的にｃＤＮＡである本発明の核酸の配列の設計において回避された。例えば、そのようなスプライス部位は、より大きなあまり保存されていない領域の一部としてイントロンの５’末端ではほとんど不変のＧＴ配列を含み得る。３’スプライス部位またはスプライス受容部位は、ほとんど常に存在するＡＧ配列にてイントロンを終結させる。このＡＧ部位の上流に、しばしば、ピリミジンを含む配列（すなわち、ＣおよびＴヌクレオチド）が見られる。そのような構造モチーフは、当該技術分野で良く知られており、可能な場合、本発明の核酸またはＤＮＡ構造体の達成において同様に回避された。
【００８７】
組み換えブチリルコリンエステラーゼ型は、しばしば、分子に結合した異なる糖において見られる糖残基の型の変化を示す。そのような変化は、インビボのＢＣｈＥ分子の平均滞留時間（ＭＲＴ）に悪影響を与え得る。そのような可変性を決めることができる因子として、非シアル化ガラクトースおよびマンノース残基の数および配列ならびにＢＣｈＥ発現におけるグリコシル化最終産物を生成するために用いられる宿主細胞が挙げられる。何故なら、異なる発現系はＢＣｈＥ分子を異なってグリコシル化し得るからである。そのような問題を避けるために、合成後のインビトログリコシル化のプロセスが、当業者により試された。例えば、末端炭水化物残基にシアル酸をキャップすることによりＢＣｈＥの安定性が影響を受けることが示された。何故なら、キャップの無いガラクトース残基は、肝細胞上の受容体に結合し、それにより、系からタンパクを取り除くからである。本発明は、ＢＣｈＥについて天然ヒトグリコシル化にできるだけ近い特許を達成するために、好ましくは、Ｐｅｒ．Ｃ６発現系を利用する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【配列表】
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