(57)【要約】  本発明は、Ｃｈｋ１を阻害し且つ癌の治療において有用なアミノピラゾール化合物又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンである化合物、又はその薬学的に許容し得る塩。
【請求項２】
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンである請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンメタンスルホン酸塩である請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン酢酸塩である請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンヘミシュウ酸塩である請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンヘミコハク酸塩である請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又は塩と、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項８】
癌を治療する方法であって、有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又は塩をそれを必要としている患者に投与することを含む方法。
【請求項９】
癌を治療する方法であって、有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又は塩と電離放射線とをそれを必要としている患者に投与することを含む方法。
【請求項１０】
癌を治療する方法であって、有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又は塩と１以上の化学療法剤とをそれを必要としている患者に投与することを含む方法。
【請求項１１】
１以上の化学療法剤が、５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びタキソールからなる群より選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
癌が、膀胱癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、腎臓癌及び子宮癌からなる群より選択される請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
治療において使用するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又は塩。
【請求項１４】
癌の治療において使用するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又は塩。
【請求項１５】
癌の治療において電離放射線と同時に、別々に、又は連続して併用して使用するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又は塩。
【請求項１６】
癌の治療において１以上の化学療法剤と同時に、別々に、又は連続して併用して使用するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又は塩。
【請求項１７】
１以上の化学療法剤が、５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びタキソールからなる群より選択される請求項１６に記載の使用のための化合物又は塩。
【請求項１８】
癌が、膀胱癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、腎臓癌及び子宮癌からなる群より選択される請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の使用のための化合物又は塩。
【請求項１９】
薬学的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤と、任意で他の治療成分と共に、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又は塩を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃｈｋ１を阻害し、且つデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）複製、染色体の分配、及び／又は細胞分裂の欠陥を特徴とする癌を治療するのに有用なアミノピラゾール化合物又はその薬学的に許容し得る塩に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃｈｋ１は、ＤＮＡ損傷チェックポイントシグナル伝達経路においてＡｔｍ及び／又はＡｔｒの下流に存在するタンパク質キナーゼである。哺乳類細胞では、Ｃｈｋ１は、電離放射線（ＩＲ）、紫外（ＵＶ）光、及びヒドロキシ尿素を含むＤＮＡ損傷を引き起こす剤に応答してリン酸化される。哺乳類細胞においてＣｈｋ１を活性化するこのリン酸化は、Ａｔｒに依存する。Ｃｈｋ１は、Ａｔｒ依存性ＤＮＡ損傷チェックポイントにおいて何らかの役割を果たして、Ｓ期及びＧ２Ｍにおいて停止させる。Ｃｈｋ１は、通常サイクリンＥ／Ｃｄｋ２を脱リン酸化する二重特異性ホスファターゼであるＣｄｃ２５Ａをリン酸化及び不活化して、Ｓ期からの進行を停止させる。また、Ｃｈｋ１は、サイクリンＢ／Ｃｄｃ２（Ｃｄｋ１としても知られている）を脱リン酸化する二重特異性ホスファターゼであるＣｄｃ２５Ｃをリン酸化及び不活化して、Ｇ２と有糸分裂との境界で細胞周期の進行を停止させる（非特許文献１）。いずれの場合も、Ｃｄｋ活性の制御が細胞周期の停止を誘導して、ＤＮＡ損傷又は非複製ＤＮＡの存在下で細胞が有糸分裂期に入るのを妨げる。
【０００３】
Ｃｈｋ１の様々な阻害剤が報告されている。更に、特許文献１には、グルコース代謝を調節すると主張されている特定のアミノピラゾール化合物について開示されている。
【０００４】
しかし、ＤＮＡ損傷剤の増強物質として有効に作用し得る細胞周期チェックポイントの強力な阻害剤であるＣｈｋ１阻害剤が依然として必要とされている。本発明は、癌の治療に有益であり得るＣｈｋ１の強力な阻害剤である化合物を提供する。前記化合物は、組織培養及びインビボにおいてＤＮＡ損傷剤で処理することによって誘導されるＣｈｋ１媒介性細胞周期停止を強力に抑止する。更に、本発明の化合物は、癌の治療に有益であり得るＣｈｋ２の阻害を提供する。更に、本発明の化合物は、Ｃｈｋ１阻害に依存する機序によって癌細胞の細胞増殖を阻害する。このような新規化合物は、癌の安全且つ有効な治療に関する要件に対処することができた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００５／１２１１２１号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｕｒｎａｒｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：１４９５−７，１９９７年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンである化合物、又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。好ましい実施形態は、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンメタンスルホン酸塩、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン酢酸塩、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンヘミシュウ酸塩、及び（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンヘミコハク酸塩である。
【０００８】
具体的な実施形態として、本発明は、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンである化合物を提供する。
【０００９】
本発明は、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンのメタンスルホン酸塩、酢酸塩、ヘミシュウ酸塩、及びヘミコハク酸塩を提供する。
【００１０】
別の実施形態は、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンの水和物である。
【００１１】
本発明は、結晶形の（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン水和物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、１５．７３、１７．７１及び２０．１２からなる群より選択されるピークのうちの１以上と合わせて、５．１７で２θ±０．２のピークを有するＸ線粉末回折パターンを特徴とする結晶形の（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン水和物を提供する。
【００１３】
本発明は、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩と、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤と、任意で他の治療成分と共に、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩を含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明は、癌を治療する方法であって、有効な量の（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩を、それを必要としている患者に投与することを含む方法を提供する。更に、本発明は、癌を治療する方法であって、有効な量の（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩と電離放射線とを、それを必要としている患者に投与することを含む方法を提供する。更に、本発明は、癌を治療する方法であって、有効な量の（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩と１以上の化学療法剤とを、それを必要としている患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１６】
本発明は、癌を治療する医薬を製造するための、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩の使用を提供する。更に、本発明は、癌を治療する医薬を製造するための、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩の使用であって、前記治療が、電離放射線との併用療法を含む使用を提供する。更に、本発明は、併用療法によって癌を治療する医薬を製造するための、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩の使用であって、前記併用療法による治療が、同一の患者に対する前記医薬の投与及び１以上の化学療法剤の投与を含む使用を提供する。
【００１７】
本発明は、治療において使用するための、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。更に、本発明は、療法において使用するための、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩、及び電離放射線を提供する。更に、本発明は、療法において使用するための、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩、及び１以上の化学療法剤を提供する。
【００１８】
本発明は、癌の治療において使用するための、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。更に、本発明は、癌の治療において使用するための、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩、及び電離放射線も提供する。更に、本発明は、癌の治療において使用するための、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩、及び１以上の化学療法剤を提供する。
【００１９】
本発明は、癌を治療する医薬を製造するための、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩の使用であって、前記医薬が、電離放射線と同時に、別々に、又は連続して投与される使用を提供する。
【００２０】
本発明は、癌を治療する医薬を製造するための、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩の使用であって、前記医薬が、１以上の化学療法剤も含むか、又は１以上の化学療法剤と同時に、別々に、若しくは連続して投与される使用を提供する。
【００２１】
本発明は、癌の治療において電離放射線と同時に、別々に、又は連続して併用するための、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。
【００２２】
本発明は、癌の治療において１以上の化学療法剤と同時に、別々に、又は連続して併用するための、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。
【００２３】
更に、本発明は、１以上の化学療法剤が５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びタキソールからなる群より選択される、本明細書に記載する方法及び使用の好ましい実施形態を提供する。更に、本発明は、２つの化学療法剤が５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びタキソールからなる群より選択される、本明細書に記載する方法及び使用のより好ましい実施形態を提供する。また、本発明は、化学療法剤が５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びタキソールからなる群より選択される、本明細書に記載する方法及び使用の更により好ましい実施形態を提供する。本明細書に記載する方法及び使用の好ましい実施形態は、膀胱癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、腎臓癌及び子宮癌からなる群より選択される癌である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
上記で使用されたとき且つ本発明の明細書全体にわたって、特に指示されない限り、以下の用語は、以下の意味を有すると理解するものとする：
【００２５】
「薬学的に許容し得る塩」は、本発明の化合物の比較的無毒な無機塩及び有機塩を指す。
【００２６】
本発明の化合物は、例えば、多くの無機酸及び有機酸と反応して、薬学的に許容し得る塩を形成することができる。このような薬学的に許容し得る塩及びそれを調製する慣用的な方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２年）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．１，１９７７年１月を参照されたい。
【００２７】
本発明の化合物は、好ましくは、１以上の薬学的に許容し得る担体、希釈剤又は賦形剤を用いて医薬組成物として製剤化され、様々な経路によって投与される。好ましくは、このような組成物は、経口、皮下、又は静脈内投与用である。このような医薬組成物及びそれを調製する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら編，第２１版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，２００５年）を参照されたい。
【００２８】
用語「治療」、「治療する」、「治療している」等は、障害の進行の遅延又は逆行を含むことを意味する。また、これら用語は、たとえ実際に障害又は状態を消失させなくても、たとえ障害又は状態の進行がそれ自体遅延又は逆行しなくても、障害又は状態のうちの１以上の症状を緩和、寛解、減弱、消失、又は低減することを含む。
【００２９】
「治療上有効な量」又は「有効な量」は、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床家によって求められている組織、系、動物、哺乳類、又はヒトに対する生物学的若しくは医学的応答、又は望ましい治療効果を誘発する本発明の化合物又はその薬学的に許容し得る塩、あるいは本発明の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を含有する医薬組成物の量を意味する。
【００３０】
実際に投与される本発明の化合物の量は、治療される状態、選択される投与経路、投与される実際の本発明の化合物、個々の患者の年齢、体重、及び応答、並びに患者の症状の重篤度を含む関連状況に基づいて医師が決定するであろう。１日当たりの投与量は、通常、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。場合によっては、前述の範囲の下限を下回る投与量レベルでも適切な量を超えている場合もあり、更に多い投与量が使用される場合もある。
【００３１】
本発明の化合物は、当該技術分野において公知である様々な手順、並びに以下の製造例及び実施例に記載される手順により調製され得る。記載される各経路の特定の合成工程を様々な方法で組み合わせて本発明の化合物を調製してもよい。
【００３２】
試薬及び出発物質は、概して、当業者が容易に入手可能なものである。他の試薬及び出発物質は、有機化学及び複素環化学の標準的な技術、既知の構造的に類似する化合物の合成に類似する技術、並びに任意の新規手順を含む以下の製造例及び実施例に記載される手順によって作製され得る。以下の製造例及び実施例は、本発明を更に詳細に例証し、化合物の典型的な合成を示すために提供される。本発明の化合物の名称は、Ａｕｔｏｎｏｍアドインを備えるＩＳＩＳ  Ｄｒａｗ２．５  ＳＰ２によって一般に提供される。
【００３３】
本明細書で使用するとき、以下の用語は、指定の意味を有する：「ＢＣＡ」は、ビシンコニン酸を指し；「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンを指し；「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指し；「ＤＰＢＳ」は、二塩基性リン酸緩衝生理食塩水を指し；「ＤＴＴ」は、ジチオトレイトールを指し；「ＥｔＯＡｃ」は、酢酸エチルを指し；「ＦＢＳ」は、ウシ胎児血清を指し；「ＨＥＰＥＳ」は、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸を指し；「ＭＥＭ」は、最少必須培地を指し；「ＭｅＯＨ」は、メタノールを指し；「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を指し；「ＰＩ」は、ヨウ化プロピジウムを指し；「ＲＮＡａｓｅ」は、リボヌクレアーゼＡを指し；「ＲＰＭＩ」は、ロズウェルパーク記念研究所を指し；「ＴＢＳＴ」は、トリス緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０を指し；「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを指し；「ＴＲ−ＦＲＥＴ」は、時間分解蛍光エネルギー転移を指し；「トリス」は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを指し；「トリトン−Ｘ」は、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコールｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテルを指し；「Ｔｗｅｅｎ−２０」は、ポリソルベート２０を指す。
【００３４】
製造例１
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−３−（６−クロロピラジン−２−イル）オキシピペリジン−１−カルボキシレート
【化１】
2013541586.tif 000002
水素化ナトリウム（２２５．６ｇ、５．６４ｍｏｌ）をＴＨＦ（３Ｌ）に分散させ、温度を０〜５℃に低下させる。（Ｒ）―３−ヒドロキシ−１−ｂｏｃピペリジン（８９１．６ｇ、４．４３ｍｏｌ）のＴＨＦ（３Ｌ）溶液を、０〜５℃の温度を維持しながら１時間かけて添加する。反応物を１時間撹拌する。同じ温度を維持しながら、ＴＨＦ（３Ｌ）溶液として２，６−ジクロロピラジン（６００ｇ、４．０３ｍｏｌ）を１．５時間かけて滴下する。反応物を２５〜３０℃で２時間撹拌し、次いで、氷上に注ぐ。混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出する。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過し、濃縮する。残油をヘキサン中５％のジクロロメタンと共に粉砕して、白色の固体として生成物を得る。固体を濾過によって回収し、乾燥させて、１５３８ｇの粗物質を得る。粗生成物をヘキサン中５％のジクロロメタンと共に粉砕して、定量的収率で白色の固体を得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３１４．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００３５】
製造例２
２−メトキシ−６−メチル−ニコチン酸メチルエステル
【化２】
2013541586.tif 000003
窒素下で２−クロロ−６−メチル−ニコチン酸メチルエステル（１０．４ｇ、５６．５２ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ撹拌溶液に、室温のナトリウム（２．５８ｇ、１１３．０４ｍｍｏｌ）のメタノール（８０．０ｍＬ）溶液（ナトリウム金属が、窒素雰囲気下でメタノールに溶解している）を添加する。反応混合物を一晩還流させる。反応物を室温に冷却し、酢酸を用いてｐＨを７に調整する。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）及び水（３０ｍＬ）で希釈する。有機層を分離し、酢酸エチル（２×７５ｍＬ）で水層を抽出する。合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して粗生成物を得る。収量：７．２５ｇ（７１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３），δ８．０６６−８．０４７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７８２−６．７６４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０２９（ｓ，３Ｈ），３．８７９（ｓ，３Ｈ），２．４８３（ｓ，３Ｈ）；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  １８２．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００３６】
製造例３
５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イルアミン
【化３】
2013541586.tif 000004
ｎ−ＢｕＬｉ（１．２Ｍ、９６．０ｍＬ、１１５．６ｍｍｏｌ）を−７８℃のアセトニトリル（６．０８ｍＬ、１１５．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３００ｍＬ）溶液に添加し、−７８℃で３０分間撹拌する。ＴＨＦ（２００ｍＬ）中の２−メトキシ−６−メチル−ニコチン酸メチルエステル（２０ｇ、１０５．１ｍｍｏｌ）を添加し、更に３０分間−７８℃で撹拌する。反応混合物を、水（５００ｍＬ）を用いて−７８℃で冷却し、ＥｔＯＡｃ（２×２５０ｍＬ）で洗浄する。水層を分離し、蒸発させる。これをトルエンと共に２回共蒸留させて、３−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−３−オキソ−プロピオニトリルを得る。収量＝２１．４ｇ（粗製物）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  １９１．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００３７】
３−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−３−オキソ−プロピオニトリル（２１ｇ、１１０．４ｍｍｏｌ）のエタノール（２００ｍＬ）溶液を、密閉したチューブに入れる。ヒドラジン水和物（３２．１ｍＬ、６６２．４ｍｍｏｌ）及び酢酸（２１．０ｍＬ）を添加し、反応物を２時間１００℃で加熱する。溶媒を蒸発させて除去し、反応混合物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）及び飽和重炭酸ナトリウム溶液（１００ｍＬ）で希釈する。有機層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×２５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、粗生成物を得、これを更に精製することなく次の工程で用いる。収量＝１６．５ｇ（７３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．５０（ｂｓ，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．８８（ｓ，１Ｈ），４．６４（ｓ，２Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ）。
【００３８】
製造例４
５−アミノ−３−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−ピラゾール−１−カルボン酸ｔｅｒｔブチルエステル
【化４】
2013541586.tif 000005
５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イルアミン（１６．０ｇ、７８．３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）溶液を、０℃のＮａＨ（鉱油中６０％、３．４ｇ、８５．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）撹拌懸濁液にゆっくり添加する。０℃で１５分間後、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（１９．８ｍＬ、８６ｍｍｏｌ）を反応混合物にゆっくり添加し、０℃で３０分間撹拌する。反応混合物を氷水（およそ２５０ｍＬ）で冷却し、生成物を酢酸エチル（２×５００ｍＬ）に抽出する。合わせた有機部分を水及び飽和ＮａＣｌ溶液（２００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、粗物質を得る。この物質をヘキサンと共に２回粉砕して、１８．５ｇ（７８％）の表題化合物を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．２８（ｓ，２Ｈ），５．８５（ｓ，１Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），１．５６（ｓ，９Ｈ）。
【００３９】
製造例５
（Ｒ）−３−｛６−［２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ］−ピラジン−２−イルオキシ｝−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
【化５】
2013541586.tif 000006
１，４−ジオキサン（１．４Ｌ）中５−アミノ−３−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−ピラゾール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５０．０ｇ、１６４．５ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−３−（６−クロロピラジン−２−イル）オキシピペリジン−１−カルボキシレート（５６．６ｇ、１８０．９ｍｍｏｌ）、４，５−ビス−ジフェニルホスファニル−９，９−ジメチル−９Ｈ−キサンテン（１４．２ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）及びＣｓ２ＣＯ３（８５．５ｇ、２６３ｍｍｏｌ）の混合物を２個の並んだ丸底フラスコに均等に分け、両方を２時間アルゴンでパージする。Ｐｄ（ＯＡｃ）２（５．４ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）を添加し（各容器に半分ずつ）、１時間パージし続ける。次いで、反応物を１時間９０〜９５℃で加熱する。反応混合物を室温に冷却し、合わせ、酢酸エチル（１Ｌ）で希釈する。次いで、混合物を珪藻土を通して濾過し、酢酸エチルで洗浄し、濾液を濃縮する。粗生成物を、溶離剤として１５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いてシリカゲルで精製して、５５ｇ（収量５７％）の白色粉末を得る。５５ｇの精製生成物を、１５ｇの同様に調製及び精製した物質（２０ｇの５−アミノ−３−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−ピラゾール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルから得た）と合わせる。合わせた７０ｇの物質をＴＨＦ及びメタノール（１．４Ｌ）の４：１混合物に溶解させ、ＱｕａｄｒａＳｉｌ（商標）ＡＰ（１４０ｇ）で２時間処理する。反応混合物を珪藻土を通して濾過し、酢酸エチル（４×１００ｍＬ）で洗浄する。濾液を、再度ＱｕａｄｒａＳｉｌ（商標）ＡＰ（１４０ｇ）と共に２時間撹拌し、上記の通り濾過する。溶媒を蒸発させて、白色の固体として表題化合物を得る。収量＝７０ｇ（４７％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ５８２．５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【実施例】
【００４０】
実施例１
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン
【化６】
2013541586.tif 000007
（Ｒ）−３−｛６−［２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ］−ピラジン−２−イルオキシ｝−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１３．０ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５０  ｍＬ）撹拌溶液に、０℃で５分間にわたってトリフルオロ酢酸（１２．４ｍＬ、１６７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液を添加する。反応物を室温に加温し、３時間撹拌する。反応物をジクロロメタン（１０００ｍＬ）で希釈し、次いで、飽和重炭酸ナトリウム溶液（２５０ｍＬ）を添加し、次いで、４時間撹拌する。有機部分を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させる。得られる物質をイソプロパノールから結晶化させて、望ましい生成物を得る。収量＝７．２ｇ（８５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．４０（ｓ，１Ｈ），９．７１（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｓ，１Ｈ），７．４６（ｓ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｓ，１Ｈ），４．９４−４．８６（ｍ，１Ｈ），３．９７（ｓ，３Ｈ），３．２０−３．１３（ｍ，１Ｈ），２．８３−２．７５（ｍ，１Ｈ），２．５７（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ），２．５３−２．４５（ｍ  ｏｂｓｃｕｒｅｄ，１Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ），２．１５−２．０５（ｍ，１Ｈ），１．７１−１．６３（ｍ，１Ｈ），１．６０−１．４９（ｍ，１Ｈ），１．４９−１．４０（ｍ，１Ｈ）；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３８２．５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００４１】
実施例２
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンメタンスルホン酸塩
【化７】
2013541586.tif 000008
メタンスルホン酸（０．２４７ｇ、２．５７ｍｍｏｌ）を、０℃の（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン（０．９８２ｇ、２．５７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２５ｍＬ）撹拌溶液に添加する。反応物を室温に加温し、４５分間撹拌する。溶媒を蒸発させ、得られる塩をエーテル（１０ｍＬ）及びペンタン（１０ｍＬ）で連続して洗浄して、望ましい生成物を得る。収量＝１．１３９ｇ（９２．６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６），δ１２．５（ｂｓ，１Ｈ），９．８１（ｓ，１Ｈ），８．７３（ｂｓ，１Ｈ），８．５４（ｂｓ，１Ｈ），８．０７（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｓ，１Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｓ，１Ｈ），５．３１−５．２４（ｍ，１Ｈ），３．９７（ｓ，３Ｈ），３．４８−３．３９（ｍ，１Ｈ），３．３９−３．３０（ｍ，１Ｈ），３．１８−３．１０（ｍ，１Ｈ），３．１０−３．０１（ｍ  １Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），２．０３−１．８５（ｍ，３Ｈ），１．７３−１．６５（ｍ，１Ｈ）；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３８２．４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００４２】
実施例３
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン酢酸塩
【化８】
2013541586.tif 000009
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン（０．１００ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、０℃のジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解している酢酸（０．０１５ｍＬ、０．２６ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を室温で６０分間撹拌し、次いで、溶媒を蒸発させて、残渣を得る。残渣を、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）、次いでｎ−ペンタン（２０ｍＬ）と共に粉砕する。物質を高真空下で４時間乾燥させて、望ましい生成物を得る。収量＝０．０６０ｇ（５１．８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．４０（ｂｓ，１Ｈ），９．７０（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｓ，１Ｈ），７．４６（ｓ，１Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９０（ｓ，１Ｈ），４．９７−４．３８（ｍ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），３．２０−３．１３（ｍ，１Ｈ），２．８３−２．７４（ｍ，１Ｈ），２．６６−２．５６（ｍ，１Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ），２．１４−２．０３（ｍ，１Ｈ），１．８９（ｓ，３Ｈ），１．７４−１．６２（ｍ，１Ｈ），１．６１−１．５１（ｍ，１Ｈ），１．５０−１．４０（ｍ，１Ｈ），１．３０−１．２０（ｍ，１Ｈ）；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３８２．５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００４３】
実施例４
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンヘミシュウ酸塩
【化９】
2013541586.tif 000010
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン（０．１００ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、０℃のＭｅＯＨ（０．１ｍＬ）に溶解しているシュウ酸（０．０１２ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を室温で６０分間撹拌し、次いで、溶媒を蒸発させて、残渣を得る。残渣を、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）、次いでｎ−ペンタン（２０ｍＬ）と共に粉砕する。物質を高真空下で４時間乾燥させて、表題化合物を得る。収量＝０．０９５ｇ（７７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７７（ｓ，１Ｈ），８．０７（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｓ，１Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｓ，１Ｈ），５．３３−５．２４（ｍ，１Ｈ），３．９７（ｓ，３Ｈ），３．４５−３．３０（ｍ，２Ｈ），３．１８−３．０９（ｍ，１Ｈ），３．０８−２．９８（ｍ，１Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ），２．０５−１．８５（ｍ，２Ｈ），１．７４−１．６３（ｍ，１Ｈ），１．１８−１．１０（ｍ，１Ｈ）；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３８２．４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００４４】
実施例５
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンヘミコハク酸塩
【化１０】
2013541586.tif 000011
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン（０．１ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、室温のエタノール（１ｍＬ、５０℃で溶解）に溶解しているコハク酸（０．０１５ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を室温で２時間撹拌する。溶媒を蒸発させ、得られた残渣をジエチルエーテル（２０ｍＬ）、次いでｎ−ペンタン（２０ｍＬ）と共に粉砕する。物質を高真空下で８時間乾燥させて、表題化合物を得る。収量＝０．１０２ｇ（７８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．４（ｂｓ，１Ｈ），９．７２（ｓ，１Ｈ），８．０５−７．９６（ｍ，２Ｈ），７．４８（ｓ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｓ，１Ｈ），５．０６−４．９７（ｍ，１Ｈ），３．９７（ｓ，３Ｈ），２．９０−２．８１（ｍ，１Ｈ），２．７４−２．６２（ｍ，１Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ），２．３０（ｓ，２Ｈ），２．０９−２．０１（ｍ，１Ｈ），１．８０−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．５７−１．４６（ｍ，１Ｈ），１．１４−１．１０（ｍ，１Ｈ），１．１０−１．００（ｍ，１Ｈ）；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３８２．４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００４５】
実施例６
（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン水和物
４８時間周囲温度で、５：９５水−エタノール混合物（１０ｍＬ）に（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン（５２．１ｍｇ；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３８２．２［Ｍ＋Ｈ］＋）を懸濁させ、スラリー状にする。白色の結晶質固体を吸引濾過によって回収する。
【００４６】
３５ｋＶ及び５０ｍＡで稼働する、ＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）及びＶａｎｔｅｃ検出器を備えるＢｒｕｋｅｒ  Ｄ４  Ｅｎｄｅａｖｏｒ  Ｘ線粉末回折計で結晶質固体のＸ線粉末回折（ＸＲＤ）パターンを得る。２θにおいて０．００９°の刻み幅で、２θにおいて４〜４０°でサンプルをスキャンする。乾燥粉末を石英サンプルホルダに充填し、スライドガラスを用いて平滑表面を得る。この場合、２θにおける±０．２のピーク位置変動は、指定の結晶形の絶対的同定を妨げることのない電位変化を考慮に入れる。結晶形の確認は、ピーク（単位：°２θ）、典型的にはより顕著なピークを識別する任意の独自の組合せに基づいて行ってよい。周囲温度及び相対湿度で回収した結晶形回折パターンを、８．８５及び２６．７７°２−シータのＮＩＳＴ  ６７５基準ピークに基づいて調整した。
【００４７】
したがって、化合物のサンプル結晶形は、以下の表１に記載する通り、ＣｕＫａ放射を使用するＸＲＤパターンにより、回折ピーク（２−シータ値）を有すると特徴付けられる。具体的には、パターンは、回折角０．２°の許容差で、１５．７３、１７．７１及び２０．１２からなる群より選択されるピークの１以上と合わせて５．１７にピークを含む。
【００４８】
【表１】
2013541586.tif 000012
【００４９】
Ｃｈｋ１生化学アッセイ
Ｃｈｋ１の生化学的活性に対する化合物の影響は、ＣＨＫ１／基質ペプチドフィルタ結合アッセイを使用して測定することができる。このアッセイでは、Ｃｄｃ２５のアミノ酸配列残基２０６〜２２５に基いた合成ペプチドを、組換え型Ｃｈｋ１タンパク質キナーゼのホスホ−アクセプター基質として使用する。ホスホ−ドナー基質としてγ−３３Ｐ−ＡＴＰを用いて、Ｃｈｋ１は、放射性γ−３３リン酸基を前記合成ペプチドに転移させる。反応は、陽イオン交換濾紙プレートにペプチド基質を捕捉し、放射されるβ粒子をシンチレーション計数することによって測定される。
【００５０】
９６ウェルＶ底ポリスチレンプレートでキナーゼ反応（反応容積４０μＬ）を実施する。Ｃｈｋ１酵素の添加によって反応を開始させる。最終反応条件は、６７ｍＭのＨＥＰＥＳナトリウム塩（ｐＨ７．４）、０．００７％（ｖ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、２．７ｍＭのＤＴＴ、２．７ｍＭのＭｇＣｌ２、１２μＭのペプチド基質、６０μＭのＡＴＰ二ナトリウム塩、０．７５μＣｉのγ−３３Ｐ−ＡＴＰ、０．７５ｎＭの活性Ｃｈｋ１酵素、４％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ、及び化合物の段階希釈物（１：３段階希釈、２０μＭで開始、１０点）である。
【００５１】
Ｃｈｋ１酵素の添加に続いて、反応物を９０分間室温でインキュベートし、次いで、１４０μＬのリン酸を添加して反応を終了させる。反応混合物をホスホセルロース陽イオン交換紙不透明濾板の対応するウェルに移して、３０分間静置する。濾板を、真空マニホールド中にて、０．５％のリン酸（ｖ／ｖ）２００μＬで５回洗浄する。濾板を一晩乾燥させた後、４０μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ（商標）−２０を板の各ウェルに添加する。室温で４時間撹拌した後、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘマイクロプレートシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて板の放射活性を測定する。
【００５２】
ＩＣ５０の測定については、各板において実行した対照から得られるシンチレーション計数比を用いて各濃度の阻害率（％）を計算する。次いで、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ  ４．０を使用して、１０点化合物濃度データを４−パラメータロジスティック方程式に適合させる。得られる曲線から絶対的なＩＣ５０値を計算する。本発明の化合物を、実質的に上記の通り実行するこのアッセイにおいて試験する。例えば、実施例１の化合物を試験すると、＜０．００１μＭ（ｎ＝６）のＩＣ５０を有することが見出される。更に、実施例２の化合物を試験すると、＜０．００１μＭ（ｎ＝３）のＩＣ５０を有することが見出される。これら結果は、本発明の範囲内の化合物がＣｈｋ１の強力な阻害剤であることを示す。
【００５３】
Ｃｈｋ２生化学アッセイ
Ｃｈｋ２の生化学的活性に対する化合物の影響は、ＣＨＫ２／基質ペプチドフィルタ結合アッセイを使用して測定することができる。このアッセイでは、Ｃｄｃ２５Ｃのアミノ酸配列残基２０６〜２２５に基いた合成ペプチドを、組換え型Ｃｈｋ２タンパク質キナーゼのホスホ−アクセプター基質として使用する。ホスホ−ドナー基質としてγ−３３Ｐ−ＡＴＰを用いて、Ｃｈｋ２は、放射性γ−３３リン酸基を前記合成ペプチドに転移させる。反応は、陽イオン交換濾紙プレートにペプチド基質を捕捉し、放射されるβ粒子をシンチレーション計数することによって測定される。
【００５４】
９６ウェルＶ底ポリスチレンプレートでキナーゼ反応（反応容積４０μＬ）を実施する。Ｃｈｋ２酵素の添加によって反応を開始させる。最終反応条件は、６７ｍＭのＨＥＰＥＳナトリウム塩（ｐＨ７．４）、０．００７％（ｖ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、２．７ｍＭのＤＴＴ、２．７ｍＭのＭｇＣｌ２、１２μＭのペプチド基質、６０μＭのＡＴＰ二ナトリウム塩、０．７５μＣｉのγ−３３Ｐ−ＡＴＰ、１．４ｎＭの活性Ｃｈｋ２酵素、４％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ、及び化合物の段階希釈物（１：３段階希釈、２０μＭで開始、１０点）である。
【００５５】
Ｃｈｋ２酵素の添加に続いて、反応物を９０分間室温でインキュベートし、次いで、１４０μＬのリン酸を添加して反応を終了させる。反応混合物をホスホセルロース陽イオン交換紙不透明濾板の対応するウェルに移して、３０分間静置する。濾板を、真空マニホールド中にて、０．５％のリン酸（ｖ／ｖ）２００μＬで５回洗浄する。濾板を一晩乾燥させた後、４０μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ（登録商標）−２０を板の各ウェルに添加する。室温で４時間撹拌した後、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘマイクロプレートシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて板の放射活性を測定する。
【００５６】
ＩＣ５０の測定については、各板において実行した対照から得られるＴＲ−ＦＲＥＴ比を用いて各濃度の阻害率（％）を計算する。次いで、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ  ４．０を使用して、１０点化合物濃度データを４−パラメータロジスティック方程式に適合させる。得られる曲線から絶対的なＩＣ５０値を計算する。本発明の化合物を、実質的に上記の通り実行するこのアッセイにおいて試験する。例えば、実施例１の化合物を試験すると、０．０１１μＭ（ＳＥ＝０．００２、ｎ＝６）のＩＣ５０を有することが見出される。更に、実施例２の化合物を試験すると、０．０１２μＭ（ＳＥ＝０．００８、ｎ＝３）のＩＣ５０を有することが見出される。これら結果は、本発明の範囲内の化合物がＣｈｋ２の強力な阻害剤であることを示す。
【００５７】
Ｃｈｋ１の自己リン酸化細胞に基づくアッセイ
Ｃｈｋ１の阻害剤は、タンパク質のキナーゼ活性によって、ＤＮＡ損傷応答が活性化されている細胞において基質がリン酸化されるのを防ぐ。Ｃｈｋ１の容易に検出できる基質は、Ｃｈｋ１自体の自己リン酸化部位であるセリン２９６である。以下の免疫ブロットアッセイを用いて、Ｃｈｋ１のセリン２９６のリン酸化の量、及び間接的にＣｈｋ１タンパク質キナーゼの活性レベルを測定することができる。１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎児血清、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、１×ピルビン酸ナトリウムを添加した、Ｌ−グルタミンと共にアール平衡塩類溶液を含有するＭＥＭ中でＨｅＬａ細胞を培養し、２４ウェル細胞培養プレートの１ウェル当たり６００μＬのＭＥＭ培養培地中に１×１０５個の細胞をプレーティングした。３７℃、５％ＣＯ２及び湿度９５％〜１００％で２４時間細胞をインキュベートする。培養培地中４μＭのドキソルビシン原液のうちの１６μＬを各適切なウェルに添加して、ドキソルビシンの最終濃度を１００ｎＭにする。プレートをインキュベータに戻して、更に２４時間インキュベートした後、Ｃｈｋ１阻害剤化合物を添加する。化合物を１００％のＤＭＳＯで１０ｍＭになるように溶解させ、次いで、４０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯで２ｍＭに希釈し、次いで、培養培地及び４％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯで１００μＭに希釈する。次いで、１００μＭ〜０．００５μＭの範囲の前記化合物の段階希釈物（１：３）を調製する。６６μＬの化合物原液をプレートの適切なウェルに添加して、最終ＤＭＳＯ濃度を０．４％（ｖ／ｖ）に、最終化合物濃度範囲を１μＭ〜０．０００５μＭにする。プレートをインキュベータに戻して、更に２時間インキュベートし、次いで、細胞溶解及び処理のために取り出す。次いで、プレートから培地を除去し、各ウェルを氷冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）０．５ｍＬで一回洗浄し、全ての液体を除去し、残りの手順のためにプレートを氷上に置く。各ウェルに、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ００４４＋Ｐ５７２５）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号１１８３６１５３００１）を含有する細胞抽出バッファからなる７５μＬの氷冷溶解バッファを添加する。１０分間後、各ウェルからこすり取り、氷上の１．５ｍＬポリプロピレン微小遠心管に溶解物を移す。各溶解物を、水／氷浴に懸濁させながら、プレートカップホーンソニケーター（Ｍｉｓｏｎｉｘ）で４５秒間超音波処理する。各サンプル５０μＬを、４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファを２５μＬ含有する０．５ｍＬのポリプロピレン微小遠心管に移し、５分間９５℃で加熱し、−８０℃で凍結保存する。残りの溶解物は、タンパク質濃度の測定（ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に使用する。サンプルバッファ中各細胞溶解物５μｇをＥ−Ｐａｇｅ９６ウェルゲルに適用し、電気泳動に供する。当技術分野において十分に理解されている手順に従って、ゲルからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰメンブレンＰＶＤＦ（０．４５μｍ）にタンパク質を電気転写する（Ｔｏｗｂｉｎら，ＰＮＡＳ（１９７９年）７６（９），４３５０−４）。メンブレンを１０ｍＭのトリス／��Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）で短時間すすぎ、ＴＢＳＴ／５％（ｖ／ｖ）で再構成したＣａｒｎａｔｉｏｎ（登録商標）インスタントミルク中に２５℃で１時間浸漬する。メンブレンを５分間ＴＢＳＴで４回洗浄し、次いで、ウサギ抗−ホスホ−Ｃｈｋ１（セリン２９６）を適切に希釈したＴＢＳＴ／５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン中に２４時間４℃で浸漬する。メンブレンを２５℃にて５分間ＴＢＳＴで４回洗浄し、次いで、ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしているロバ抗ウサギＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＮＡ９３４０）の適切な希釈物を含有するＴＢＳＴ／５％ミルク中に２時間２５℃で浸漬して、自己リン酸化されたＣｈｋ１タンパク質を検出する。メンブレンを、再度２５℃にて５分間ＴＢＳＴで４回洗浄する。メンブレンに固定された抗原−抗体−レポーターコンジュゲートを、ＦＵＪＩ  ＬＡＳ−４０００イメージングシステムを使用してＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｆｅｍｔｏ  ＨＲＰ−検出試薬で検出する。ホスホ−Ｃｈｋ１（ｓｅｒ２９６）のバンド強度を「Ｔｏｔａｌ  Ｌａｂ」ソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて計算する。ドキソルビシン誘導性Ｃｈｋ１自己リン酸化の阻害率（％）を、以下の式を用いることによって計算する：阻害率（％）＝（サンプルのホスホＣｈｋ１バンド強度−ドキソルビシン無しのネガティブコントロールのホスホＣｈｋ１バンド強度）／（ドキソルビシンポジティブコントロールのホスホＣｈｋ１バンド強度−ドキソルビシン無しのネガティブコントロールのホスホＣｈｋ１バンド強度）×１００。本発明の化合物を、実質的に上記の通り実行したこのアッセイにおいて試験する。例えば、実施例１の化合物をこのアッセイで試験すると、＜０．００１μＭ（ｎ＝１）のＥＣ５０を有することが見出される。例えば、実施例３の化合物をこのアッセイで試験すると、＜０．００１μＭ（ｎ＝１）のＥＣ５０を有することが見出される。これら結果は、本発明の範囲内の化合物がＣｈｋ１の強力な阻害剤であることを示す。
【００５８】
ドキソルビシン誘導性Ｇ２Ｍチェックポイント廃止のＨｅＬａ細胞に基づくＡｃｕｍｅｎアッセイ
Ｃｈｋ１の阻害剤は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるドキソルビシンで処理されたｐ５３−マイナス腫瘍細胞におけるＧ２Ｍ  ＤＮＡ損傷チェックポイントを無効にする。Ｇ２Ｍチェックポイント廃止の指標は、細胞がＧ２Ｍチェックポイントを通過し、有糸分裂に入った後に生じるセリン１０におけるヒストンＨ３のリン酸化である。以下のハイコンテンツイメージングアッセイを用いて、細胞におけるヒストンＨ３のリン酸化を測定することができる。ＨｅＬａ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加したＭＥＭ培地で培養し、１ウェル当たり１００μＬの体積のポリＤ−リシンでコーティングされた透明底黒色プレートに１ウェル当たり２０００個の細胞をプレーティングする。次いで、１８〜２４時間（３７℃、５％ＣＯ２及び相対湿度９５％）、細胞培養インキュベータにおいてプレートをインキュベートする。最初のインキュベーション後、２０μＬのＭＥＭ培地と６２５ｎＭのドキソルビシンを含有している１０％のＦＢＳとをプレートの適切なウェルに添加して、最終濃度を１２５ｎＭにする。プレートを、インキュベータに戻し、Ｇ２Ｍチェックポイントで細胞を停止させるのに十分な２４時間インキュベートする。次の日、細胞を化合物で処理する。化合物を１０ｍＭになるように１００％のＤＭＳＯに溶解させ、次いで、５０μＭで始めて、ＭＥＭと４％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯとで１０倍原液に希釈する。次いで、５０μＭ〜０．３９μＭの範囲の化合物の段階希釈物（１：２）を調製する。１３μＬの化合物原液をプレートの適切なウェルに添加して、最終ＤＭＳＯ濃度を０．４％（ｖ／ｖ）に、最終化合物濃度範囲を５μＭ〜０．０３９μＭにする。プレートをインキュベータに戻して更に７時間インキュベートし、次いで、固定するために取り出す。液体を各ウェルから慎重に除去し、１００μＬのＰＲＥＦＥＲ（商標）固定剤を添加する。プレートを室温で２０分間保持し、固定剤を除去し、次いで、１０分間かけてＤＰＢＳ中０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００を１００μＬ／ウェル添加することにより細胞を透過処理する。溶液を除去し、プレートを１ウェル当たり１００μＬのＤＰＢＳで２回洗浄し、次いで、室温で１時間かけて５０μｇ／ｍＬのリボヌクレアーゼＡ（ＲＮＡａｓｅ、ウシの膵臓由来）を含有しているＤＰＢＳ１００μＬを添加する。ＲＮＡａｓｅ溶液を除去し、ウサギ抗ｐＨＨ３（ｓｅｒ１０）及び１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡの１：５００希釈物を含有しているＲＮＡａｓｅ溶液５０μＬを各ウェルに添加することによって、セリン１０（ｐＨＨ３）においてリン酸化されたヒストンＨ３の存在について細胞を染色する。プレートを密閉し、一晩４℃で維持する。各プレートを１ウェル当たり１００μＬのＤＰＢＳで２回洗浄することにより一次抗体を除去し、ＤＰＢＳ及び１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（２ｍｇ／ｍＬ）の１：７５０希釈物５０μＬで置換する。プレートを室温で１時間、光から保護するためにアルミニウム箔で被覆した状態で維持する。プレートを、再度１ウェル当たり１００μＬのＤＰＢＳで２回洗浄し、１５ｎＭのヨウ化プロピジウム（原液からＰＢＳで１：１００希���）１００μＬで置換する。光からプレートを保護するためにプレートを黒いシールで密閉する。プレートを３０分間でインキュベートして、核を染色する。４８８ｎｍの励起（ＴＴＰ  ＬＡＢＴＥＣＨ  ＬＴＣ）を用いてＡＣＵＭＥＮ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）レーザー走査型蛍光マイクロプレートサイトメーターを用いてプレートをスキャンして、ｐＨＨ３、並びに２Ｎ及び４Ｎを含むＤＮＡ含量を測定する。ｐＨＨ３陽性細胞は、Ａｌｅｘａ４８８からの５１９ｎｍにおける平均強度によって同定される。ヨウ化プロピジウム／ＤＮＡからの６５５〜７０５ｎｍにおける合計強度を用いて、細胞周期（２Ｎ細胞、４Ｎ細胞）における個別細胞及び亜集団を同定する。各集団の最終読出し値は、合計細胞％を正規化し、％ｐＨＨ３、％２Ｎ及び％４Ｎの最終アッセイ出力を作成することによって決定される。次いで、１００ｎＭで阻害剤対照化合物の最大濃度で細胞を処理して、各化合物の最終の活性％を決定することによって、１００％の活性を決定する。０％の活性は、化合物未処理に基づく。相対ＥＣ５０は、ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＢＡＳＥ（商標）、エクセルフィット、４パラメータロジスティック適合を用いる曲線適合、ｅｑｕａｔｉｏｎ２０５を用いて、１００％の対照最大に対する％ｐＨＨ３を測定することによって決定される。本発明の化合物を、実質的に上記の通り実行するこのアッセイにおいて試験する。実施例１の化合物を試験すると、０．０２９μＭ（ｎ＝１）のＥＣ５０を有することが見出される。実施例２及び実施例３の化合物を試験すると、それぞれ０．０３３μＭ（ｎ＝１）及び０．０１９μＭ（ｎ＝１）のＥＣ５０結果を有することが見出される。これら結果は、本発明の範囲内の化合物が、Ｇ２Ｍ  ＤＮＡ損傷チェックポイントを無効にすることを示す。
【００５９】
ＥＣｔｆｓ（二倍感作）アッセイ
Ｃｈｋ１の阻害剤は、Ｓ期内のチェックポイントを廃止することを通してゲムシタビン（又は他の細胞毒）の抗増殖性活性を増強して、ＤＮＡ損傷を維持及び増加させることができる。ＤＮＡ損傷後に腫瘍細胞が継続して増殖する能力は、そのＤＮＡを複製する細胞の能力を測定することにより分析することができる。このアッセイは、細胞がＤＮＡ損傷を修復する機会を有した後、細胞がそのＤＮＡを複製する能力を評価する。このアッセイでは、ゲムシタビンの希釈系列で細胞を処理し、次いで、２２時間後、実施例３の化合物で処理する。更に４４時間後、ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）色素還元アッセイによって相対的な細胞数を評価する。ＥＣｔｆｓパラメータは、Ｃｈｋ１阻害が存在しない状態でこのアッセイにおいて測定される、ゲムシタビンのＧＩ９０濃度を半分に減少させるのに必要なＣｈｋ１阻害剤の濃度の尺度である。ＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣから入手した）を、ＲＰＭＩ１６４０及び１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ＦＢＳ中で増殖させる。９６ウェル組織培養プレートに１００μＬの体積で１ウェル当たり２．５×１０３個の細胞をプレーティングし、２４時間インキュベートする。マッコイの５Ａ培地（改変）（１×）を用いて６倍濃度のゲムシタビン希釈物を調製し、１ウェル当たり２０μＬをウェルに添加する。ゲムシタビン希釈物を、ゲムシタビンの最高最終濃度が１．０μＭになるように設定し、３倍刻みで０．５ｎＭまで希釈する。
【００６０】
Ｃｈｋ１阻害剤は、４０００×最終濃度になるまでＤＭＳＯで希釈し、次いで、マッコイ培地で６６６倍希釈して、６倍原液を作製することによって調製する。Ｃｈｋ１阻害剤の希釈は、２５ｎＭから始めて０．３ｎＭまで２．５倍刻みで進める。ゲムシタビン添加の２２時間後に、１２０μＬの培地及びゲムシタビンを含有するウェルに２４μＬの体積のＣｈｋ１阻害剤を添加する。各ゲムシタビン希釈物に、単一のＣｈｋ１阻害剤希釈物を添加する。対照ウェルにはＤＭＳＯ、ゲムシタビン又はＣｈｋ１阻害剤のみを添加する。Ｃｈｋ１阻害剤の添加の４４時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓアッセイ試薬３０μＬを各ウェルに添加し、１時間４５分間室温で保持する。４９０ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）分光光度計を用いて吸光度を読み取る。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計から得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４．０で分析する。まず、各プレートから得られたデータのマトリクスにおいて全ての他の値から平均した細胞無しの対照の吸光度を減じる。次に、デュープリケートのデータ点を平均する。各Ｃｈｋ１阻害剤濃度についてデータを正規化し、０％細胞数を補正されたＡ４９０＝０として設定し、１００％細胞数を０ｎＭのゲムシタビン平均値として設定する。次いで、これら結果を変換する。ゲムシタビン濃度をｌｏｇ濃度に変換し、正規化した細胞数値を阻害率（％）に変換する（阻害率（％）＝１００−正規化した値）。変換したデータをプロットし、非線形回帰を実施して、各Ｃｈｋ１阻害剤濃度におけるゲムシタビンのＩＣ５０値を推定する。非線形回帰を計算して、傾斜を変化させ、用量応答曲線の頂部又は底部については制約されない。ＥＣｔｆｓ値を以下の通り計算する：各Ｃｈｋ１阻害剤濃度におけるゲムシタビンのＧＩ５０値を決定し、プロットし、ゲムシタビン単独のＧＩ５０を２分の１に減少させるのに必要なＣｈｋ１阻害剤の濃度を内挿によって決定する。
【００６１】
本発明の範囲内の化合物を、実質的に上記の通り実行するこのアッセイにおいて試験する。例えば、実施例３の化合物を試験すると、１．０ｎＭ（ＳＥ＝０．１、ｎ＝３）のＥＣｔｆｓ値を有することが見出される。更に、２５ｎＭの化合物が、ＨＴ−２９結腸癌細胞においてゲムシタビンのＥＣ５０を２２ｎＭから３ｎＭへ７分の１に減少させる。単独では、２５ｎＭの実施例３の化合物は、ＨＴ−２９細胞の増殖に対する効果をほとんど有しない。これら結果は、本発明の範囲内の化合物が、低濃度でゲムシタビンの抗増殖性活性を有効に増強することを示す。
【００６２】
【表２】
2013541586.tif 000013
【００６３】
Ｃｈｋ１インビボ標的阻害アッセイ
Ｃａｌｕ−６細胞を、増殖培地（１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ＦＢＳ、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、１×ピルビン酸ナトリウムを添加した、Ｌ−グルタミンと共にアール平衡塩類溶液を含有するＭＥＭ）中で培養し、拡大する。細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、増殖培地（血清を含まない）中１×１０６個の細胞を等体積のＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリクスと混合し、次いで、前照射した（４．５Ｇｙ）ヌードマウス（無胸腺ヌードマウス）の側腹部に皮下注射する。移植（腫瘍サイズ＝１５０〜２００ｍｍ３）後１５日目に、毎日生理食塩水で新たに製剤化したゲムシタビンを、１５０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内経路によって動物に投与する。６時間後、希ＮａＯＨの添加によってｐＨを６．８に調整した０．２％Ｔｗｅｅｎ−８０／０．５％メチルセルロースで製剤化したＣｈｋ１化合物を経口投与する。Ｃｈｋ１阻害剤投与の２時間後に動物を屠殺し、腫瘍を摘出し、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ００４４＋Ｐ５７２５）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号１１８３６１５３００１）を含有する氷冷細胞抽出バッファ中で直ちに処理する。１５秒間ｈｉｇｈに設定した電動組織ホモジナイザーを使用して、氷冷した１５ｍＬのポリプロピレンコニカルチューブ中にて、１．５〜２．０ｍＬの溶解バッファで腫瘍を処理する。氷上でサンプルを維持したまま、２５ゲージの針を備える１ｍＬのシリンジを通して溶解物を４回吸い出す。０．３５ｍＬの腫瘍溶解物を、４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファ０．１５ｍＬを含有している１．５ｍＬのポリプロピレン微小遠心管に移す。次いで、サンプルを混合し、９５℃で５分間加熱し、Ｍｉｓｏｎｉｘ３０００プレートホーンソニケーターで高出力を用いて１分間超音波処理する。次いで、ウエスタンブロットによる標的阻害評価のためにサンプルを氷上で保存するか又は−８０℃で保存する。サンプルバッファ中各腫瘍溶解物５μｇをＥ−Ｐａｇｅ９６ウェルゲルに適用し、電気泳動に供する。当技術分野において十分に理解されている手順に従って、ニトロセルロースＢＡ８３  Ｐｒｏｔｒａｎメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ、カタログ番号１０４０２４０５）にタンパク質を転写する（Ｔｏｗｂｉｎら，ＰＮＡＳ（１９７９年）７６（９），４３５０−４）。次いで、メンブレンを処理して、セリン２９６が自己リン酸化されているＣｈｋ１タンパク質を測定する。メンブレンを水、次いで１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）で短時間すすぎ、ＴＢＳＴ／５％（ｗ／ｖ）で再構成したＣａｒｎａｔｉｏｎインスタントミルク中に２５℃で１時間浸漬する。次いで、メンブレンを５分間ＴＢＳＴで４回洗浄する。メンブレンをウサギ―ホスホＣｈｋ１抗−ホスホ−Ｃｈｋ１（セリン２９６）の適切な希釈物中ＴＢＳＴ／５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡに１６時間４℃で浸漬する。次いで、メンブレンを２５℃にて５分間ＴＢＳＴで４回洗浄し、次いで、ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしているロバ抗ウサギＩｇＧの適切な希釈物を含有するＴＢＳＴ／５％ミルク中に２時��２５℃で浸漬して、ホスホ−Ｃｈｋ１（ｓｅｒ２９６）を検出する。メンブレンを２５℃にて５分間ＴＢＳＴで４回再度洗浄する。メンブレン上に固定された抗原−抗体−リポーターコンジュゲートを、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｆｅｍｔｏ  ＨＲＰ−検出試薬で検出する。
【００６４】
シグナルをＦＵＪＩ  ＬＡＳ−４０００イメージングシステムを使用して検出及び捕捉する。「Ｔｏｔａｌ  Ｌａｂ」ソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いてホスホ−Ｃｈｋ１（ｓｅｒ２９６）バンドの強度を計算する。ゲムシタビン誘導性Ｃｈｋ１自己リン酸化の阻害率（％）を、以下の式を用いることによって計算する：阻害率（％）＝（サンプルのホスホＣｈｋ１バンド強度−平均ゲムシタビン（Ｍａｘ）ポジティブコントロールのホスホＣｈｋ１バンド強度）／（平均ネガティブコントロール（Ｍｉｎ）のホスホＣｈｋ１バンド強度−平均ゲムシタビン（Ｍａｘ）ポジティブコントロールのホスホＣｈｋ１バンド強度）×１００。
【００６５】
本発明の範囲内の化合物を、実質的に上記の通り実行するこのアッセイにおいて試験する。例えば、実施例３の化合物を試験すると、１．３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１）のＣｈｋ１自己リン酸化の標的調節５０％有効量（ＴＭＥＤ５０）を有することが見出される。この結果は、本発明の範囲内の化合物が、インビボにおいてＣｈｋ１タンパク質キナーゼの活性化を強力に阻害することを示す。
【００６６】
ヒト腫瘍異種移植片モデル
ＤＮＡ損傷剤による殺腫瘍を強化するＣｈｋ１阻害剤の能力は、Ｃａｌｕ−６肺及びＨＴ−２９結腸腫瘍異種移植片有効性モデルを使用してインビボで測定することができる。Ｃａｌｕ−６肺癌細胞は、増殖培地（１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ＦＢＳ、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、１×ピルビン酸ナトリウムを添加したＬ−グルタミンと共にアール平衡塩類溶液を含有するＭＥＭ）中で培養し、ＨＴ−２９結腸癌細胞（ＡＴＣＣ）は、増殖培地（１０％のＦＢＳを添加したマッコイの５Ａ培地）中で培養し、拡大する。
【００６７】
細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、増殖培地（血清を含まない）中で５×１０６個の細胞（ＨＴ−２９）又は１×１０６個の細胞（Ｃａｌｕ−６）を、等体積のＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリクスと混合し、次いで、ヌードマウス（ＣＤ−１ｎｕ／ｎｕ）の側腹部へ皮下注射する。
【００６８】
Ｃｈｋ１阻害剤の皮下投与
移植（１５０〜２００ｍｍ３）後約１６日目に、ゲムシタビンを毎日生理食塩水で新たに製剤化し、６０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内経路によって動物に投与する。２４時間後、動物に、０．２％Ｔｗｅｅｎ−８０／０．５％メチルセルロース中の実施例３の化合物を１日２回皮下投与する。２日間の休息後、投与を更に３周期繰り返す（実施例３の化合物を４日間毎に合計４回（Ｑ４Ｄｘ４）オフセット＋２４時間）。ビヒクル処理対照群の平均腫瘍サイズからの化合物処理群の平均腫瘍サイズの減少率（％）として腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を計算する。本発明の範囲内の化合物を、実質的に上記の通り実行するこのアッセイにおいて試験する。例えば、ゲムシタビンと組み合わせて投与された実施例３の化合物は、ＨＴ−２９及びＣａｌｕ−６腫瘍異種移植片モデルの両方において優れた用量依存的な抗腫瘍活性を示すことが見出され、ゲムシタビンのみに対して腫瘍成長阻害が最高６倍増加する。この結果は、皮下に投与された本発明の範囲内の化合物が、ヒト腫瘍異種移植片モデルにおけるゲムシタビンの抗腫瘍活性を著しく増加させることを示す。
【００６９】
【表３】
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【００７０】
【表４】
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【００７１】
Ｃｈｋ１阻害剤の経口投与
移植（１５０〜２００ｍｍ３）後約１６日目に、ゲムシタビンを毎日生理食塩水で新たに製剤化し、４０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内経路によって動物に投与する。２４時間後、動物に、０．２％Ｔｗｅｅｎ−８０／０．５％メチルセルロース中のＣｈｋ１化合物を１日２回経口経路により投与する。３日間の休息後、投与を更に３周期繰り返した（実施例３の化合物を５日間毎に合計４回（Ｑ５Ｄｘ４）オフセット＋２４時間）。前段落に記載の通り、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を計算する。本発明の範囲内の化合物を、実質的に上記の通り実行するこのアッセイにおいて試験する。例えば、実施例３の化合物をゲムシタビンと組み合わせて投与すると、ＨＴ−２９及びＣａｌｕ−６腫瘍異種移植片モデルの両方において優れた用量依存的な抗腫瘍活性を示すことが見出され、ゲムシタビンのみに対して腫瘍増殖阻害が最高２．９倍増加する。この結果は、経口投与された本発明の範囲内の化合物が、ヒト腫瘍異種移植片モデルにおけるゲムシタビンの抗腫瘍活性を著しく増加させることを示す。
【００７２】
【表５】
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【００７３】
【表６】
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【国際調査報告】
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