(57)【要約】  本発明は、新規N末端修飾インスリン誘導体、それらを含む医薬組成物およびそれらを作製する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンであり、N末端修飾が、生理学的pHにおいて正に荷電している1つまたは複数のN末端修飾基によるものである、N末端修飾インスリン。
【請求項２】
ペプチド部、親油性置換基およびN末端修飾基からなる、請求項1に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項３】
生理学的pHにおいて正に荷電している修飾基が、親インスリンのN末端とコンジュゲートしている、生理学的pHにおいて正に荷電しており、1モル当たり200g未満のMWを有している1つまたは2つの有機置換基である、請求項1または2に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項４】
生理学的pHにおいて正に荷電している修飾基が、式I:
【化１】
2013540771.tif 000109
または、代替表示として:
【化２】
2013540771.tif 000110
(式中、YおよびZは、インスリンペプチドのN末端アミノ酸と接続している)中でYおよびZと指定される、請求項1から3のいずれか一項に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項５】
アシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンが、ペプチド部としてのプロテアーゼ安定化インスリンおよびペプチド部と接続している親油性置換基からなり、ペプチド部が、少なくとも1つの疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されているように置換されているヒトインスリンであり、前記置換が、インスリンの1つまたは複数のプロテアーゼ切断部位内であるか近接している、請求項1から4のいずれか一項に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項６】
アシル化インスリンであり、N末端修飾が、生理学的pHにおいて中性であるか負に荷電している1つまたは複数のN末端修飾基によるものである、N末端修飾インスリン。
【請求項７】
ペプチド部、親油性置換基およびN末端修飾基からなる、請求項6に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項８】
生理学的pHにおいて中性であるか負に荷電している修飾基が、親インスリンのN末端とコンジュゲートしている、生理学的pHにおいて中性であるか負に荷電しており、1モル当たり200g未満のMWを有している1つまたは2つの有機置換基である、請求項6または7に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項９】
N末端修飾が、カルバモイル、チオカルバモイル、C1〜4鎖アシル基、オキサリル、グルタリルおよびジグリコリルからなる群から選択される、請求項6から8のいずれか一項に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項１０】
アシル化インスリンが、ペプチド部およびペプチド部と接続している親油性置換基からなり、ペプチド部が、ヒトインスリン、desB30ヒトインスリン、修飾が8個未満のヒトインスリンまたは修飾が8個未満のdesB30ヒトインスリンである、請求項6から9のいずれか一項に記載のN末端修飾インスリン。
【請求項１１】
1つまたは複数の脂質およびN末端修飾インスリンを含む経口医薬組成物。
【請求項１２】
N末端修飾インスリンが、ペプチド部、N末端修飾基および、場合により、親油性置換基からなる、請求項11に記載の経口医薬組成物。
【請求項１３】
N末端修飾インスリン(a)、N末端修飾インスリンのための少なくとも1つの極性有機溶媒(b)、少なくとも1つの界面活性剤(c)、少なくとも1つの親油性構成成分(d)、および、場合により、少なくとも1つの固体親水性構成成分(e)を含む固体または半固体医薬組成物であり、自然に分散可能である、請求項11または12に記載の経口医薬組成物。
【請求項１４】
N末端修飾インスリン(a)、N末端修飾インスリンのための少なくとも1つの極性有機溶媒(b)、少なくとも1つの親油性構成成分(c)、および、場合により、少なくとも1つの界面活性剤(d)を含む水を含まない液体医薬組成物であり、澄明な溶液の形態である、請求項11または12に記載の経口医薬組成物。
【請求項１５】
N末端修飾インスリンが、ヒトインスリン、desB30ヒトインスリン、修飾が8個未満のヒトインスリンまたは修飾が8個未満のdesB30ヒトインスリンであるペプチド部を有する、請求項11から14のいずれか一項に記載の経口医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規N末端修飾インスリン誘導体およびそれらを作製する方法に関連している。
【背景技術】
【０００２】
真性糖尿病は、グルコースを利用する能力が部分的または完全に失われる代謝性障害である。障害は、例えば、インスリンを投与することにより治療することができる。
【０００３】
経口経路は、薬物投与のために群を抜いて広く使用される経路であり、特に、慢性療法のために、患者により一般にとてもよく受け入れられる。しかしながら、インスリンの投与は、胃腸(GI)管および腸粘膜における酵素分解、薬物排出ポンプ、腸粘膜からの不十分かつ変わりやすい吸収、ならびに肝臓における初回通過代謝などのいくつかの障壁のために、好ましい経口投与ではなく非経口経路に限定されることが多い。
【０００４】
市販インスリン製剤の一部は、作用の速い発現を特徴とし、他の製剤は、比較的遅い発現を有するが、多かれ少なかれ長期にわたる作用を示す。WO 08/034881は、プロテアーゼ安定インスリン類似体について記載しており、WO 2009/115469は、少なくとも2個の疎水性アミノ酸が、親水性アミノ酸で置換されたある種のアシル化インスリン類似体に関する。WO 2008/145721は、アミノペプチダーゼおよびジペプチジルペプチダーゼによる分解から前記ペプチドを守るためにN末端修飾されたある種のペプチドに関連している。WO 2010/033220は、ポリマーおよび、場合により、炭素原子が最大で10個までの1つまたは複数の部分とカップリングしているペプチドコンジュゲートについて記載している。
【０００５】
治療用ペプチドの医薬組成物は、公共的使用に適しているために数年間の貯蔵寿命を有することが必要とされる。しかしながら、ペプチド組成物は、化学的および物理的な分解に対する感受性のために本質的に不安定である。化学的分解には、酸化、加水分解、ラセミ化または架橋などの共有結合の変化が関わる。物理的分解には、凝集、沈降または表面への吸着などのペプチドの天然構造、すなわち、二次および三次の構造に関するコンホメーション変化が関わる。
【０００６】
WO 08/145728、WO 2010/060667およびWO 2011/086093は、経口投与のための脂質医薬組成物の例を開示している。
【０００７】
医薬組成物は、最高で200ppmまでの濃度でアルデヒドおよびケトンを含有することが多い。アルデヒドおよびケトンは、インスリンと反応するので、組成物中のインスリンの広範な化学的分解を引き起こすことがある。結果として、インスリン組成物の貯蔵寿命は、3カ月未満になることがある。医薬薬物開発は、少なくとも2年間の貯蔵寿命を必要とする。
【０００８】
水性医薬組成物は、安定性目的のためにエチレンジアミンなどの化合物を含むことができることが知られている。例えば、WO 2006/125763は、緩衝剤としてエチレンジアミンを含む水性医薬ポリペプチド組成物について記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO 08/034881
【特許文献２】WO 2009/115469
【特許文献３】WO 2008/145721
【特許文献４】WO 2010/033220
【特許文献５】WO 08/145728
【特許文献６】WO 2010/060667
【特許文献７】WO 2011/086093
【特許文献８】WO 2006/125763
【特許文献９】WO09115469
【特許文献１０】WO05012347
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】GreeneおよびWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999年
【非特許文献２】Stability of Protein Pharmaceuticals、Ahern. T.J.およびManning M.C.、Plenum Press、New York 1992年
【非特許文献３】「Organic Synthesis on Solid Phase」、F.Z. Dorwald、Wiley-VCH、2000年ISBN 3-527-29950-5
【非特許文献４】「Peptides: Chemistry and Biology」、N. SewaldおよびH.-D. Jakubke、Wiley-VCH, 2002年  ISBN 3-527-30405-3
【非特許文献５】「The Combinatorial Chemistry Catalog」1999年、Novabiochem AG
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、組成物へエチレンジアミンまたは他の安定化化合物を添加することなく、医薬組成物、特に、非水性脂質組成物中のインスリンを安定化するための方法は見いだされないままである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、N末端修飾インスリン誘導体に関連している。
【００１３】
本発明のある態様において、アシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンであり、N末端修飾が、生理学的pHにおいて正に荷電している1つまたは複数のN末端修飾基によるものである、N末端修飾インスリンが提供される。
【００１４】
本発明のある態様において、アシル化インスリンであり、N末端修飾が、生理学的pHにおいて中性であるか負に荷電している1つまたは複数のN末端修飾基によるものである、N末端修飾インスリンが提供される。
【００１５】
本発明は、1つまたは複数の脂質およびN末端修飾インスリンを含む経口医薬組成物も企図している。
【００１６】
前記N末端修飾インスリン誘導体を製造する方法についても記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】異なる温度における従来技術の類似体の貯蔵中のUPLCにより測定される不純物の形成を示す図である。
【図２】異なる温度における従来技術の類似体の貯蔵中のHMWP (高分子量生成物)の形成を示す図である。
【図３】異なる温度における実施例1の類似体の貯蔵中のUPLCにより測定される不純物の形成を示す図である。
【図４】異なる温度における実施例1の類似体の貯蔵中のHMWP (高分子量生成物)の形成を示す図である。
【図５】異なる温度における実施例2の類似体の貯蔵中のUPLCにより測定される不純物の形成を示す図である。
【図６】異なる温度における実施例2の類似体の貯蔵中のHMWP (高分子量生成物)の形成を示す図である。
【図７】異なる温度における実施例12の類似体の貯蔵中のUPLCにより測定される不純物の形成を示す図である。
【図８】異なる温度における実施例12の類似体の貯蔵中のHMWP (高分子量生成物)の形成を示す図である。
【図９】異なる温度における実施例33の類似体の貯蔵中のUPLCにより測定される不純物の形成を示す図である。
【図１０】異なる温度における実施例33の類似体の貯蔵中のHMWP (高分子量生成物)の形成を示す図である。
【図１１】異なる温度における実施例38の類似体の貯蔵中のUPLCにより測定される不純物の形成を示す図である。
【図１２】異なる温度における実施例38の類似体の貯蔵中のHMWP (高分子量生成物)の形成を示す図である。
【図１３】異なる温度における実施例39の類似体の貯蔵中のUPLCにより測定される不純物の形成を示す図である。
【図１４】異なる温度における実施例39の類似体の貯蔵中のHMWP (高分子量生成物)の形成を示す図である。
【図１５】異なる温度における実施例40の類似体の貯蔵中のUPLCにより測定される不純物の形成を示す図である。
【図１６】異なる温度における実施例40の類似体の貯蔵中のHMWP (高分子量生成物)の形成を示す図である。
【図１７】異なる温度における実施例41の類似体の貯蔵中のUPLCにより測定される不純物の形成を示す図である。
【図１８】異なる温度における実施例41の類似体の貯蔵中のHMWP (高分子量生成物)の形成を示す図である。
【図１９】異なる温度における実施例59の類似体の貯蔵中のUPLCにより測定される不純物の形成を示す図である。
【図２０】異なる温度における実施例59の類似体の貯蔵中のHMWP (高分子量生成物)の形成を示す図である。
【図２１】異なる温度における実施例60の類似体の貯蔵中のUPLCにより測定される不純物の形成を示す図である。
【図２２】異なる温度における実施例60の類似体の貯蔵中のHMWP (高分子量生成物)の形成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、本明細書でN末端保護インスリンとも命名されている新規N末端修飾インスリン、およびそれらを作製する方法に関連している。新規N末端修飾インスリンは、経口製剤における使用に特に適している。したがって、本発明のある態様は、N末端修飾インスリンを含む経口医薬組成物を企図している。
【００１９】
驚いたことに、本発明によるインスリンは、それらの痕跡量などのアルデヒドおよび/またはケトンを含む医薬組成物中で安定である一方、インスリンの生物学的特性および薬理学的特性は、親インスリン、すなわち、N末端修飾のない同様のインスリンと比較した場合に保持されることが発明者らにより見いだされた。
【００２０】
本発明の一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、皮下注射インスリン療法のために水性製剤中で使用される。
【００２１】
本発明の一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、水性製剤での注射療法としてまたは経口療法として超長時間作用性インスリンとして有用である。
【００２２】
一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンのN末端修飾は、アルデヒドおよび/またはケトンに対する化学的安定性を付与することに加えて、インスリン受容体親和性を変えることができる。例えば、下に記載されているように、生理学的pHにおいて、N末端を中性にするかまたは負に荷電させるN末端修飾は、インスリン受容体に、より低い親和性を付与することができる。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、経口で投与された場合に、満足のいく生物学的利用能を有する、アシル化N末端修飾インスリンなどのN末端修飾インスリンを供給することに関する。同様の用量で与えられるN末端修飾のない類似インスリン(親インスリン)の生物学的利用能と比較して、本発明の好ましいN末端修飾インスリンの生物学的利用能は、同じようである。一態様において、生物学的利用能は、同様の用量で与えられるN末端修飾のない同様のアシル化インスリンの生物学的利用能よりも少なくとも10%高く、一態様において、生物学的利用能は、親インスリンのそれよりも20%高く、一態様において、生物学的利用能は、25%高く、一態様において、生物学的利用能は、30%高く、一態様において、生物学的利用能は、35%高く、一態様において、生物学的利用能は、40%高く、一態様において、生物学的利用能は、45%高く、一態様において、生物学的利用能は、50%高く、一態様において、生物学的利用能は、55%高く、一態様において、生物学的利用能は、60%高く、一態様において、生物学的利用能は、65%高く、一態様において、生物学的利用能は、70%高く、一態様において、生物学的利用能は、80%高く、一態様において、生物学的利用能は、90%高く、一態様において、生物学的利用能は、100%高く、一態様において、生物学的利用能は、100%超高い。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「親インスリン」という用語は、N末端修飾のない同様のインスリンを意味するものとする。例えば、N末端修飾インスリンが、アシル化N末端修飾インスリンであれば、親インスリンは、ペプチド部が同じでかつ親油性置換基が同じであるがN末端修飾のないアシル化インスリンであり、または、例えば、N末端修飾インスリンが、アシル化されたプロテアーゼ安定化N末端修飾インスリンであれば、親インスリンは、ペプチド部が同じでかつ親油性置換基が同じであるがN末端修飾のないアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンである。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、経口で投与された場合に、静脈内投与として投与された場合と比べて満足のいく生物学的利用能を有する、N末端修飾インスリンを供給することに関する。本発明の好ましい化合物の生物学的利用能(静脈内投与と比べて)は、N末端修飾インスリンが静脈内に投与された場合の生物学的利用能と比べて少なくとも0.3%、一態様において、少なくとも0.5%、一態様において、少なくとも1%、一態様において、少なくとも1.5%、一態様において、少なくとも2%、一態様において、少なくとも2.5%、一態様において、少なくとも3%、一態様において、少なくとも3.5%、一態様において、少なくとも4%、一態様において、少なくとも5%、一態様において、少なくとも6%、一態様において、少なくとも7%、一態様において、少なくとも8%、一態様において、少なくとも9%、一態様において、少なくとも10%である。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、経口で投与された場合に、s.c. (皮下)投与として投与された場合と比べて満足のいく生物学的利用能を有する、N末端修飾インスリンを供給することに関する。本発明好ましい化合物の生物学的利用能(皮下投与と比べて)は、N末端修飾インスリンが皮下に投与された場合の生物学的利用能と比べて少なくとも0.3%、一態様において、少なくとも0.5%、一態様において、少なくとも1%、一態様において、少なくとも1.5%、一態様において、少なくとも2%、一態様において、少なくとも2.5%、一態様において、少なくとも3%、一態様において、少なくとも3.5%、一態様において、少なくとも4%、一態様において、少なくとも5%、一態様において、少なくとも6%、一態様において、少なくとも7%、一態様において、少なくとも8%、一態様において、少なくとも9%、一態様において、少なくとも10%である。
【００２７】
インスリン生物学的利用能を測定するための標準的アッセイは、当業者に知られており、とりわけ、同じ種において経口でおよび静脈内に(i.v.)投与される対象とするインスリンの濃度についての相対的曲線下面積(AUC)の測定を包含する。血液(血漿)サンプルにおけるインスリン濃度の定量化は、例えば、抗体アッセイ(ELISA)を使用するか質量分析法により行うことができる。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、満足のいく効力を有するN末端修飾インスリンを供給することに関する。ヒトインスリンの効力と比較して、本発明の好ましいN末端修飾インスリンの効力は、ヒトインスリンの効力の、少なくとも5%、一態様において、少なくとも10%、一態様において、少なくとも20%、一態様において、少なくとも30%、一態様において、少なくとも40%、一態様において、少なくとも50%、一態様において、少なくとも75%、一態様において、少なくとも100%であってよい。
【００２９】
見かけのインビボ効力は、対象とするインスリンの血液グルコース対時間プロファイルの、同様の用量で与えられる比較インスリンとの比較により測定することができる。インビボ効力を測定するための他の手段は、実施例中に与えられる。
【００３０】
インスリンインビトロ効力を測定するための標準的アッセイは、当業者に知られており、とりわけ、(1)インスリンの相対的効力が、細胞膜、例えば、ラット肝原形質膜画分上に存在するインスリン受容体と特異的に結合している125I-インスリンの50%を置き換えるのに必要とされるインスリン類似体に対するインスリンの比と定義されるインスリンラジオレセプターアッセイ;(2)相対的インスリン効力が、[3-3H]グルコースの有機抽出可能な材料(すなわち、脂質)への最大変換の50%を達成するのに必要とされるインスリン類似体に対するインスリンの比と定義される、例えば、ラット脂肪細胞で実施される脂質生成アッセイ;(3)インスリン類似体の相対的効力が、グルコース-1-[14C]の[14CO2]への最大変換の50%を達成するためのインスリン類似体に対するインスリンの比と定義される単離脂肪細胞におけるグルコース酸化アッセイ;(4)インスリンまたはインスリン類似体が、特異的抗インスリン抗体と結合するのに際して125I-インスリンと競合する有効性を測定することによりインスリン類似体の免疫原性を決定することができるインスリンラジオイムノアッセイ;および(5)特異的インスリン抗体を保有するELISAアッセイなどの動物血漿サンプル中の抗体とのインスリンまたはインスリン類似体の結合を測定する他のアッセイを包含する。
【００３１】
本発明によるN末端修飾インスリンは、長期にわたる時間-作用プロファイルを有し、すなわち、ヒトインスリンよりも長く続く高血糖性の、例えば、糖尿病性の患者におけるインスリン効果を提供することがある。言い換えれば、時間-作用プロファイルが長期にわたるインスリンは、ヒトインスリンと比較してグルコースレベルの長期にわたる低下を有する。一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、インスリン分子の単一投与後の約8時間から約2週間までにわたってインスリン効果を提供する。一態様において、インスリン効果は、約24時間から約2週間まで続く。一態様において、効果は、約24時間から約1週間まで続く。さらなる態様において、効果は、約1週間から約2週間まで続く。さらなる態様において、効果は、約1週間続く。さらなる態様において、効果は、約2週間続く。一態様において、効果は、約1日から約7日まで続く。さらなる態様において、効果は、約7日から約14日まで続く。さらなる態様において、効果は、約7日続く。さらなる態様において、効果は、約14日続く、一態様において、効果は、約2日から約7日まで続く。さらなる態様において、効果は、約3日続く。さらなる態様において、効果は、約7日続く。
【００３２】
一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンは、インスリン分子の単一投与後の約8時間から約24時間までにわたってインスリン効果を提供する。一態様において、インスリン効果は、約10時間から約24時間まで続く。一態様において、効果は、約12時間から約24時間まで続く。さらなる態様において、効果は、約16時間から約24時間まで続く。さらなる態様において、効果は、約20時間から約24時間まで続く。さらなる態様において、効果は、約24時間続く。
【００３３】
一態様において、インスリン効果は、約24時間から約96時間まで続く。一態様において、インスリン効果は、約24時間から約48時間まで続く。一態様において、インスリン効果は、約24時間から約36時間まで続く。一態様において、インスリン効果は、約1時間から約96時間まで続く。一態様において、インスリン効果は、約1時間から約48時間まで続く。一態様において、インスリン効果は、約1時間から約36時間まで続く。
【００３４】
作用の持続期間(時間-作用プロファイル)は、血液グルコースが抑えられる時間により、または関連する薬物動態学的特性、例えば、t1/2またはMRT (平均滞留時間)を測定することにより測定することができる。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、ヒトインスリンと比べて経口投与に続いて満足のいく長期にわたる作用を有するN末端修飾インスリンを供給することに関する。ヒトインスリンと比べて、本発明の好ましいN末端修飾インスリンの作用の持続時間は、少なくとも10%長い。一態様において、持続時間は、ヒトインスリンのそれよりも、少なくとも20%長く、一態様において、少なくとも25%長く、一態様において、少なくとも30%長く、一態様において、少なくとも35%長く、一態様において、少なくとも40%長く、一態様において、少なくとも45%長く、一態様において、少なくとも50%長く、一態様において、少なくとも55%長く、一態様において、少なくとも60%長く、一態様において、少なくとも65%長く、一態様において、少なくとも70%長く、一態様において、少なくとも80%長く、一態様において、少なくとも90%長く、一態様において、少なくとも100%長く、一態様において、100%超長い。
【００３６】
一態様において、LysB29 (Nε-テトラデカノイル)desB30ヒトインスリンまたはA21Gly,B31Arg,B32Argヒトインスリンなどの1日1回インスリンと比較して、本発明の好ましいN末端修飾インスリンの作用の持続時間は、少なくとも10%長い。一態様において、持続時間は、LysB29 (Nε-テトラデカノイル)desB30ヒトインスリンまたはA21Gly,B31Arg,B32Argヒトインスリンなどの1日1回インスリンのそれよりも、少なくとも20%長く、一態様において、少なくとも25%長く、一態様において、少なくとも30%長く、一態様において、少なくとも35%長く、一態様において、少なくとも40%長く、一態様において、少なくとも45%長く、一態様において、少なくとも50%長く、一態様において、少なくとも55%長く、一態様において、少なくとも60%長く、一態様において、少なくとも65%長く、一態様において、少なくとも70%長く、一態様において、少なくとも80%長く、一態様において、少なくとも90%長く、一態様において、少なくとも100%長く、一態様において、100%超長い。
【００３７】
一態様において、LysB29 (Nε-テトラデカノイル)desB30ヒトインスリンまたはA21Gly,B31Arg,B32Argヒトインスリンなどの1日1回インスリンと比較して、本発明の好ましいN末端修飾インスリンの作用の持続時間は、少なくとも100%長い。一態様において、持続時間は、LysB29 (Nε-テトラデカノイル)desB30ヒトインスリンまたはA21Gly,B31Arg,B32Argヒトインスリンなどの1日1回インスリンのそれよりも、少なくとも200%長く、一態様において、少なくとも250%長く、一態様において、少なくとも300%長く、一態様において、少なくとも350%長く、一態様において、少なくとも400%長く、一態様において、少なくとも450%長く、一態様において、少なくとも500%長く、一態様において、少なくとも550%長く、一態様において、少なくとも600%長く、一態様において、少なくとも650%長く、一態様において、少なくとも700%長く、一態様において、少なくとも800%長く、一態様において、少なくとも900%長く、一態様において、少なくとも1000%長く、一態様において、1000%超長い。
【００３８】
本発明において使用するためのN末端修飾基は、生理学的pHにおいて中性であるか正に荷電しているか負に荷電しているかであってよい。
【００３９】
N末端修飾インスリンのN末端修飾基の電荷は、N末端修飾インスリンが、親インスリンのインスリン受容体親和性と比較してインスリン受容体(IR)に対して保持されるか変化された親和性を有するように選ばれてよい。
【００４０】
例えば、生理学的pH (すなわち、pH7.4)において、中性であるか負に荷電しているN末端修飾基は、N末端修飾のない親インスリンと比較して低下したIR親和性をもたらすことがある。別の例として、生理学的pHにおいて、正に荷電しているN末端修飾基は、N末端修飾のない親インスリンと比較して保持されるかほんのわずかに低下したIR親和性をもたらすことがある。
【００４１】
本発明の一態様において、アシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンであり、N末端修飾が、正に荷電しているN末端修飾基によるものである、N末端修飾インスリンが得られる。
【００４２】
さらなる態様において、本発明のN末端修飾インスリンは、ペプチド部、親油性置換基およびN末端修飾基からなる。
【００４３】
本明細書において、プロテアーゼ安定化インスリンという用語は、ヒトインスリンと比べてプロテアーゼからの分解に対して改善された安定性を有するインスリンを意味する。
【００４４】
アシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンとは、本明細書において、ヒトインスリンと比べて1つまたは複数のプロテアーゼによるより遅い分解を受ける、アシル化インスリンとして理解されるべきである。一実施形態において、本発明によるプロテアーゼ安定化インスリンは、ヒトインスリンと比べて1つまたは複数のプロテアーゼによるより遅い分解を受ける。本発明のさらなる実施形態において、本発明によるアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンは、ペプシン(例えば、アイソフォームペプシンA、ペプシンB、ペプシンCおよび/またはペプシンFなど)、キモトリプシン(例えば、アイソフォームキモトリプシンA、キモトリプシンBおよび/またはキモトリプシンCなど)、トリプシン、インスリン分解酵素(IDE)、エラスターゼ(例えば、アイソフォーム膵エラスターゼIおよび/またはIIなど)、カルボキシペプチダーゼ(例えば、アイソフォームカルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼA2および/またはカルボキシペプチダーゼB)、アミノペプチダーゼ、カテプシンDおよびラット、ブタまたはヒトに由来する腸抽出物中に存在する他の酵素からなる群から選択される1つまたは複数の酵素による分解に対して安定化される。
【００４５】
一実施形態において、本発明によるアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンは、キモトリプシン、トリプシン、インスリン分解酵素(IDE)、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼおよびカテプシンDからなる群から選択される1つまたは複数の酵素による分解に対して安定化される。さらなる実施形態において、本発明によるアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンは、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼおよびIDEからなる群から選択される1つまたは複数の酵素による分解に対して安定化される。さらなる実施形態において、本発明によるアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンは、キモトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼからなる群から選択される1つまたは複数の酵素による分解に対して安定化される。
【００４６】
本明細書に記載されているようなN末端修飾基に関して使用される場合の「生理学的pHにおいて正に荷電している」という用語は、N末端修飾ポリペプチドを含む溶液中で、N末端修飾基のうちの少なくとも10%が、生理学的pHにおいて+1の電荷を有することを意味する。一態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも30%が、生理学的pHにおいて+1の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも50%が、生理学的pHにおいて+1の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも70%が、生理学的pHにおいて+1の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも90%が、生理学的pHにおいて+1の電荷を有する。
【００４７】
生理学的pHにおいて正に荷電しているN末端修飾基の例は、N,N-ジメチルおよびN,N-ジエチルなどのN,N-ジ-C1〜4アルキル、N-アミジニル(amidinyl)、4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタノイル、3-(1-ピペリジニル)プロピオニル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル、N,N-ジメチル-グリシル、およびN,N,N-トリメチル-グリシル:
【００４８】
【化１】
2013540771.tif 000002
【００４９】
を包含するが、それらに限定されるものではない。
【００５０】
本発明の一態様において、インスリンのN末端位以外の位置における脂肪二酸アシル化などの脂肪酸アシル化であり、N末端修飾が、中性であるか負に荷電しているN末端修飾基によるものである、N末端修飾インスリンが得られる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、本明細書に記載されているようなN末端修飾基に関して使用される場合の「生理学的pHにおいて中性である」という用語は、N末端修飾インスリンを含む溶液中で、N末端修飾基のうちの少なくとも10%が、生理学的pHにおいて中性の電荷を有すること(すなわち、電荷は、0である)を意味する。一態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも30%が、生理学的pHにおいて中性の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも50%が、生理学的pHにおいて中性の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも70%が、生理学的pHにおいて中性の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも90%が、生理学的pHにおいて中性の電荷を有する。
【００５２】
生理学的pHにおいて中性であるN末端修飾基の例は、カルバモイル、チオカルバモイル、ならびにホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどのC1〜4鎖アシル基、およびピログルタミル:
【００５３】
【化２】
2013540771.tif 000003
【００５４】
を包含するが、それらに限定されるものではない。
【００５５】
本明細書で使用される場合、本明細書に記載されているようなN末端修飾基に関して使用される場合の「生理学的pHにおいて負に荷電している」という用語は、N末端修飾インスリンを含む溶液中で、N末端修飾基のうちの少なくとも10%が、生理学的pHにおいて-1 (すなわち、マイナス1)の電荷を有することを意味する。一態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも30%が、生理学的pHにおいて-1の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも50%が、生理学的pHにおいて-1の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも70%が、生理学的pHにおいて-1の電荷を有する。さらなる態様において、N末端修飾ポリペプチドの溶液中のN末端修飾基のうちの少なくとも90%が、生理学的pHにおいて-1の電荷を有する。
【００５６】
生理学的pHにおいて負に荷電しているN末端修飾基の例は、オキサリル、グルタリル、ジグリコリル(他の名称: 3-オキソグルタリルおよびカルボキシメトキシアセチル)を包含するが、それらに限定されるものではない。
【００５７】
一態様において、本発明による生理学的pHにおいて負に荷電しているN末端修飾基は、マロニルでもスクシニルでもない。一態様において、本発明による生理学的pHにおいて負に荷電しているN末端修飾基は、マロニルではない。一態様において、本発明による生理学的pHにおいて負に荷電しているN末端修飾基は、スクシニルではない。
【００５８】
本発明の一態様において、N末端修飾され、さらに、インスリンのN末端のうちの一つ以外の位置において親油性置換基で置換されているインスリンが得られ、親油性置換基は、場合によりリンカーを介してインスリンと接続している脂肪酸またはジ脂肪酸からなる。リンカーは、脂肪酸または脂肪二酸とインスリンへの接続点の中間にある任意の適当な部分であってよく、その部分は、リンカー部分、スペーサーなどと呼ばれることもある。
【００５９】
一態様において、リンカーは、存在し、それらから水素原子および/またはヒドロキシル基が除去されたGly、D-Ala、L-Ala、D-αGlu、L-αGlu、D-γGlu、L-γGlu、D-αAsp、L-αAsp、D-βAsp、L-βAsp、βAla、4-アミノ酪酸、5-アミノ吉草酸、6-アミノヘキサン酸、D-Glu-α-アミド、L-Glu-α-アミド、D-Glu-γ-アミド、L-Glu-γ-アミド、D-Asp-α-アミド、L-Asp-α-アミド、D-Asp-β-アミド、L-Asp-β-アミド、または:
【００６０】
【化３】
2013540771.tif 000004
【００６１】
からなる群から選択される1つまたは複数の実体を含み、式中、qは、0、1、2、3または4であり、この実施形態において、あるいは、7-アミノヘプタン酸または8-アミノオクタン酸であってよく、式中、矢印は、プロテアーゼ安定化インスリンのアミノ基への接続点、または、より多くのリンカーが存在すれば、その方向への接続点を示す。
【００６２】
一態様において、リンカーは、存在し、ガンマ-Glu (γGlu)実体、1つまたは複数のOEG実体またはそれらの組合せを含む。
【００６３】
本明細書において、「脂肪酸」という用語は、少なくとも2個の炭素原子を有し、飽和または不飽和である直線か分岐した、脂肪族カルボン酸をカバーする。脂肪酸の非限定的な例は、ミリスチン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸である。
【００６４】
本明細書において、「脂肪二酸」という用語は、少なくとも2個の炭素原子を有し、飽和または不飽和である直線か分岐した、脂肪族ジカルボン酸をカバーする。脂肪二酸の非限定的な例は、ヘキサン二酸、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸、およびエイコサン二酸である。
【００６５】
N末端修飾インスリンを含む経口医薬組成物も、本発明により企図されている。一態様において、経口医薬組成物は、1つまたは複数の脂質およびN末端修飾インスリンを含む組成物である。
【００６６】
本発明のN末端修飾インスリンは、驚いたことに、脂質医薬製剤中で使用される場合に化学的に安定である。一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンを含む脂質医薬製剤は、少なくとも2週間の使用および1年間の貯蔵に対して化学的に安定である。一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンを含む脂質医薬製剤は、少なくとも4週間の使用および1年間の貯蔵に対して化学的に安定である。一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンを含む脂質医薬製剤は、少なくとも4週間の使用および2年間の貯蔵に対して化学的に安定である。一態様において、本発明によるN末端修飾インスリンを含む脂質医薬製剤は、少なくとも6週間の使用および2年間の貯蔵に対して化学的に安定である。
【００６７】
水性医薬製剤においてインスリンを安定化するための一般的方法は、医薬製剤に亜鉛を添加し、それによって、亜鉛とのインスリン6量体を形成することであることは当業者に知られている。本発明の一態様において、N末端修飾インスリンを含み、亜鉛を含まないか痕跡量の亜鉛のみを含む医薬脂質組成物は、N末端修飾インスリンおよび亜鉛を含む水性医薬製剤と同様に化学的に安定である。
【００６８】
驚いたことに、N末端修飾インスリン、1つまたは複数の脂質および、場合により、1つまたは複数の界面活性剤を含む非水性液体インスリン医薬組成物は、化学的に安定であることが見いだされた。一態様において、本発明の医薬組成物は、N末端修飾インスリン、1つまたは複数の脂質、1つまたは複数の界面活性剤および共溶媒を含む。本発明の一態様において、共溶媒は、プロピレングリコールである。
【００６９】
本発明の一態様において、N末端修飾インスリンは、組成物中の成分の総量の0.1から30% (w/w)までの間の濃度で医薬組成物中に存在する。別の態様において、インスリンは、0.5から20% (w/w)までの間の濃度で存在する。別の態様において、インスリンは、1から10% (w/w)までの間の濃度で存在する。
【００７０】
本発明の一態様において、N末端修飾インスリンは、0.2mMから100mMまでの間の濃度で医薬組成物中に存在する。別の態様において、N末端修飾インスリンは、0.5から70mMまでの間の濃度で存在する。別の態様において、N末端修飾インスリンは、0.5から35mMまでの間の濃度で存在する。別の態様において、N末端修飾インスリンは、1から30mMまでの間の濃度で存在する。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、本明細書において、水とよりも油とより混ざる物質、材料または成分のために使用される。脂質は、水に溶けないかほとんど溶けないが、油または他の非極性溶媒に溶けやすい。
【００７２】
「脂質」という用語は、1つまたは複数の親油性物質、すなわち、水とではなく油と均一な混合物を形成する物質を含むことができる。複数の脂質は、非水性脂質医薬組成物の親油性相を構成し、油態様を形成することがある。室温において、脂質は、固体、半固体または液体であってよい。例えば、固体脂質は、ペースト、粒状形態、粉末またはフレークとして存在することができる。2つ以上の賦形剤が、脂質を含んでいれば、脂質は、液体、固体、または両方の混合物であってよい。
【００７３】
固体脂質、すなわち、室温において固体または半固体である脂質の例は、下記を包含するが、それらに限定されるものではない:
1. Sasol Germany (Witten、Germany)からWITEPSOL HI5として市販されている水素化ココ-グリセリド(約33.5℃から約37℃の融点(m.p.))などのモノ-、ジ-およびトリグリセリドの混合物;脂肪酸トリグリセリドの例、例えば、C10〜C22脂肪酸トリグリセリドは、植物油などの天然油および水素化油を包含する;
2. Gattefosse Corp. (Paramus、NJ)からMONOSTEOL (約33℃〜約36℃の融点)として市販されているプロピレングリコール(PG)ステアレートなどのエステル;Gattefosse Corp.からHYDRINE (約44.5℃から約48.5℃の融点)として市販されているジエチレングリコールパルミトステアレート;
3. Gattefosse Corp.またはGelucire 33/01からLABRAFIL M2130 CSとして市販されている水素化パーム/パーム核油PEG-6エステル(約30.5℃から約38℃の融点)などのポリグリコシル化飽和グリセリド;
4. Cognis Corp. (Cincinnati、OH)からLANETTE 14として市販されているミリスチルアルコール(約39℃の融点)などの脂肪アルコール;脂肪酸の脂肪アルコールとのエステル、例えば、パルミチン酸セチル(約50℃の融点);例えば、約43℃の融点を有する、例えば、Uniqema (New Castle、Delaware)から商品名ARLAMOL ISMLの下で市販されているイソソルビドモノラウレート;
5.約33℃の融点を有する、例えば、UniqemaからBRIJ 52として市販されているポリオキシエチレン(2)セチルエーテル、または、例えば、約43℃の融点を有するUniqemaからBRIJ 72として市販されているポリオキシエチレン(2)ステアリルエーテルを包含するPEG-脂肪アルコールエーテル;
6.ソルビタンエステル、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、例えば、それぞれUniqemaからSPAN 40またはSPAN 60として市販されており、約43℃から48℃または約53℃から57℃および41℃から54℃の融点を有するソルビタンモノパルミテートまたはソルビタンモノステアレート;ならびに
7.グリセリルモノ-C6〜C14-脂肪酸エステル。これらは、グリセロールを植物油でエステル化することと、続く、分子蒸留により得られる。モノグリセリドは、対称モノグリセリド(すなわち、β-モノグリセリド)ならびに非対称モノグリセリド(α-モノグリセリド)の両方を包含するが、それらに限定されるものではない。それらは、同形グリセリド(脂肪酸構成要素が、主に単一脂肪酸からなる)ならびに混合グリセリド(脂肪酸構成要素が、様々な脂肪酸からなる)の両方も包含する。脂肪酸構成要素は、例えば、C8〜C14からの鎖長を有する飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の両方を包含していてよい。特に適しているのは、例えば、Sasol North America (Houston、TX)からIMWITOR 312として市販されているグリセリルモノラウレート、(約56℃〜60℃の融点);SasolからIMWITOR 928として市販されているグリセリルモノジココエート(約33℃〜37℃の融点);IMWITOR 370として市販されているモノグリセリルシトレート、(約59〜約63℃の融点);または、例えば、SasolからIMWITOR 900として市販されているグリセリルモノステアレート(約56〜61℃の融点);または、例えば、SasolからIMWITOR 960として市販されている自己乳化性グリセロールモノステアレート(約56℃〜61℃の融点)である。
【００７４】
液体脂質および半固体脂質、すなわち、室温において液体または半固体である脂質の例は、下記を包含するが、それらに限定されるものではない:
1. Abitec Corp. (Columbus、OH)からCAPMUL MCMとして市販されている中鎖モノ-およびジグリセリド、グリセリルカプリレート/カプレートなどのモノ-、ジ-およびトリグリセリドの混合物;およびDANISCOからRYLO MG08 Pharmaとして市販されているグリセロールモノカプリレート、RYLO MG10 Pharmaとして市販されているグリセロールモノカプレート。
2.例えば、C6〜C18、例えば、C6〜C16例えば、C8〜C10、例えば、C8、脂肪酸のグリセリルモノ-またはジ脂肪酸エステル、またはそのアセチル化誘導体、例えば、Eastman Chemicals (Kingsport、TN)からのMYVACET 9-45もしくは9-08またはSasolからのIMWITOR 308もしくは312;
3.例えば、C8〜C20、例えば、C8〜C12、脂肪酸のプロピレングリコールモノ-またはジ-脂肪酸エステル、例えば、Abitec Corp.またはGattefosseからのLAUROGLYCOL 90、SEFSOL 218、またはCAPRYOL 90もしくはCAPMUL PG-8 (プロピレングリコールカプリレートと同じ);
4.ベニバナ油、ゴマ油、アーモンド油、ピーナッツ油、ヤシ油、コムギ胚芽油、トウモロコシ油、ヒマシ油、ココナッツ油、綿実油、ダイズ油、オリーブ油および鉱油などの油;
5.脂肪酸またはアルコール、例えば、C8〜C20、飽和またはモノ-もしくはジ-不飽和の、例えば、オレイン酸、オレイルアルコール、リノール酸、カプリン酸、カプリル酸、カプロン酸、テトラデカノール、ドデカノール、デカノール;
6.中鎖脂肪酸トリグリセリド、例えば、C8〜C12、例えば、MIGLYOL 812、または長鎖脂肪酸トリグリセリド、例えば、植物油;
7.例えば、Gattefosse CorpからLABRAFIL M2125 CSとして市販されているエステル交換されたエトキシル化植物油;
8.脂肪酸および一級アルコール、例えば、C8〜C20、脂肪酸およびC2〜C3アルコールのエステル化化合物、例えば、Nikko Chemicals (Tokyo、Japan)からNIKKOL VF-Eとして市販されているリノール酸エチル、酪酸エチル、カプリル酸エチルオレイン酸、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルおよびカプリル酸エチル;
9.精油、またはスペアミント油、チョウジ油、レモン油およびペパーミント油などのそれらの特徴的な臭いを植物に与えるある種の揮発油のいずれか;
10.メントール、カルバクロールおよびチモールなどの精油の分画または構成要素;
11.トリアセチン、トリブチリンなどの合成油;
12.クエン酸トリエチル、クエン酸アセチルトリエチル、クエン酸トリブチル、クエン酸アセチルトリブチル;
13.ポリグリセロール脂肪酸エステル、例えば、Nikko Chemicalsからのジグリセリルモノオレエート、例えば、DGMO-C、DGMO-90、DGDO;ならびに
14.ソルビタンエステル、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、例えば、UniqemaからSPAN 20として市販されているソルビタンモノラウレート;
15.リン脂質、例えば、アルキル-O-リン脂質、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジ-O-アルキルホスファチジン酸、L-アルファ-リゾホスファチジルコリン(LPC)、L-アルファ-リゾホスファチジルエタノールアミン(LPE)、L-アルファ-リゾホスファチジルグリセロール(LPG)、L-アルファ-リゾホスファチジルイノシトール(LPI)、L-アルファ-ホスファチジン酸(PA)、L-アルファ-ホスファチジルコリン(PC)、L-アルファ-ホスファチジルエタノールアミン(PE)、L-アルファ-ホスファチジルグリセロール(PG)、カルジオリピン(CL)、L-アルファ-ホスファチジルイノシトール(PI)、L-アルファ-ホスファチジルセリン(PS)、リゾ-ホスファチジルコリン、リゾ-ホスファチジルグリセロール、LARODANから市販されているsn-グリセロホスホリルコリン、またはLipoid GmbHから市販されているダイズリン脂質(Lipoid S100)。
16.ポリグリセロールオレエート(GattefosseからのPlurol Oleique)などのポリグリセロール脂肪酸エステル。
【００７５】
本発明の一態様において、脂質は、モノ-、ジ-、およびトリグリセリドからなる群から選択される1つまたは複数である。さらなる態様において、脂質は、モノ-およびジグリセリドからなる群から選択される1つまたは複数である。さらなる態様において、脂質は、Capmul MCMまたはCapmul PG-8である。さらなる態様において、脂質は、Capmul PG-8である。さらなる態様において、脂質は、グリセロールモノカプリレート(DaniscoからのRylo MG08 Pharma)である。
【００７６】
一態様において、脂質は、グリセロールモノ-カプリレート(例えば、Rylo MG08 Pharmaなど)およびグリセロールモノ-カプレート(例えば、DaniscoからのRylo MG10 Pharmaなど)からなる群から選択される。別の態様において、脂質は、プロピレングリコールカプリレート(例えば、AbitecからのCapmul PG8またはGattefosseからのCapryol PGMCもしくはCapryol 90など)からなる群から選択される。
【００７７】
本発明の一態様において、脂質は、組成物中のインスリンを包含する成分の総量の10%から90% (w/w)までの間の濃度で医薬組成物中に存在する。別の態様において、脂質は、10から80% (w/w)までの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、10から60% (w/w)までの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、15から50% (w/w)までの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、15から40% (w/w)までの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、20から30% (w/w)までの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、約25% (w/w)の濃度で存在する。
【００７８】
本発明の一態様において、脂質は、組成物中のインスリンを包含する成分の総量の100mg/gから900mg/gまでの間の濃度で医薬組成物中に存在する。別の態様において、脂質は、100mg/gから800mg/gまでの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、100mg/gから600mg/gまでの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、150mg/gから500mg/gまでの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、150mg/gから400mg/gまでの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、200mg/gから300mg/gまでの間の濃度で存在する。別の態様において、脂質は、約250mg/gの濃度で存在する。
【００７９】
本発明の一態様において、共溶媒は、組成物中のインスリンを包含する成分の総量の0%から30% (w/w)までの間の濃度で医薬組成物中に存在する。別の態様において、共溶媒は、5%から30% (w/w)までの間の濃度で存在する。別の態様において、共溶媒は、10から20% (w/w)までの間の濃度で存在する。
【００８０】
本発明の一態様において、共溶媒は、組成物中のインスリンを包含する成分の総量の0mg/gから300mg/gまでの間の濃度で医薬組成物中に存在する。別の態様において、共溶媒は、50mg/gから300mg/gまでの間の濃度で存在する。別の態様において、共溶媒は、100から200mg/gまでの間の濃度で存在する。
【００８１】
本発明の一態様において、経口医薬組成物は、油もいかなる他の脂質構成成分もHLBが7未満の界面活性剤も含有しない。さらなる態様において、組成物は、油もいかなる他の脂質構成成分もHLBが8未満の界面活性剤も含有しない。さらなる態様において、組成物は、油もいかなる他の脂質構成成分もHLBが9未満の界面活性剤も含有しない。さらなる態様において、組成物は、油もいかなる他の脂質構成成分もHLBが10未満の界面活性剤も含有しない。
【００８２】
本発明の液体非水性医薬組成物の非イオン性界面活性剤の各々の親水性-親油性バランス(HLB)は、10を超え、それにより、高いインスリンペプチド(インスリン誘導体など)薬物負荷容量および高い経口生物学的利用能が達成される。一態様において、本発明による非イオン性界面活性剤は、HLBが11を超える非イオン性界面活性剤である。一態様において、本発明による非イオン性界面活性剤は、HLBが12を超える非イオン性界面活性剤である。
【００８３】
本明細書で使用される「約」という用語は、プラスまたはマイナス10%などの、記述されている数値の妥当な近傍内であることを意味する。
【００８４】
脂質医薬組成物の非限定的な例は、例えば、特許出願WO 08/145728、WO 2010/060667およびWO 2011/086093中に見いだすことができる。
【００８５】
一態様において、本発明のN末端修飾インスリンは、
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジエチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジエチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B16H,B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1F(Nα,N(Nα,N-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nε-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nε-エイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),B16H,desB27,B29K(Nε-エイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),B16H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαチオカルバモイル),A14E,B1F(Nαチオカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nε-オクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル),A14E,B1(Nα3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタノイル),A14E,B1(Nα4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタノイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα3-(1-ピペリジニル)プロピオニル),A14E,B1(Nα3-(1-ピペリジニル)プロピオニル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nα2-ピコリル),A14E,B1F(Nα2-ピコリル),B25H,desB27,B29K(Nε-オクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B16H,B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A-1(Nαトリメチル),A14E,B-1(Nαトリメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジグリコリル),A14E,B1(Nεジグリコリル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B(Nαスクシニル),B16H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B(Nαグルタリル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
からなる群から選択される。
【００８６】
一実施形態において、本発明によるN末端修飾インスリンは、下記のインスリンペプチド(すなわち、N末端修飾がなく、「親油性置換基」もアシル部分もない本発明のインスリン):A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B1E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B16E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B28D,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27E,desB30ヒトインスリン;A14E,B1E,B25H,B27E,desB30ヒトインスリン;A14E,B1E,B16E,B25H,B27E,desB30ヒトインスリン;A8H,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A8H,A14E,B25H,B27E,desB30ヒトインスリン;A8H,A14E,B1E,B25H,desB30ヒトインスリン;A8H,A14E,B1E,B25H,B27E,desB30ヒトインスリン;A8H,A14E,B1E,B16E,B25H,B27E,desB30ヒトインスリン;A8H,A14E,B16E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B26D,desB30ヒトインスリン;A14E,B1E,B27E,desB30ヒトインスリン;A14E,B27E,desB30ヒトインスリン;A14E,B28D,desB30ヒトインスリン;A14E,B28E,desB30ヒトインスリン;A14E,B1E,B28E,desB30ヒトインスリン;A14E,B1E,B27E,B28E,desB30ヒトインスリン;A14E,B1E,B25H,B28E,desB30ヒトインスリン;A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,desB30ヒトインスリン;A14D,B25H,desB30ヒトインスリン;B25N,B27E,desB30ヒトインスリン;A8H,B25N,B27E,desB30ヒトインスリン;A14E,B27E,B28E,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B28E,desB30ヒトインスリン;B25H,B27E,desB30ヒトインスリン;B1E,B25H,B27E,desb30ヒトインスリン;A8H,B1E,B25H,B27E,desB30ヒトインスリ
ン;A8H,B25H,B27E,desB30ヒトインスリン;B25N,B27D,desB30ヒトインスリン;A8H,B25N,B27D,desB30ヒトインスリン;B25H,B27D,desB309ヒトインスリン;A8H,B25H,B27D,desB30ヒトインスリン;A(-1)P,A(0)P,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B(-1)P,B(0)P,B25H,desB30ヒトインスリン;A(-1)P,A(0)P,A14E,B(-1)P,B(0)P,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B30T,B31L,B32Eヒトインスリン;A14E,B25Hヒトインスリン;A14E,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B10P,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B10E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B4E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14H,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14H,B10E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13H,A14E,B10E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13H,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A18Q,B3Q,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B24H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30ヒトインスリン;A14E,A18Q,A21Q,B3Q,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A18Q,A21Q,B3Q,B25H,B27E,desB30ヒトインスリン;A14E,A18Q,B3Q,B25H,desB30ヒトインスリン;A13H,A14E,B1E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13N,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13N,A14E,B1E,B25H,desB30ヒトインスリン;A(-2)G,A(-1)P,A(0)P,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B(-2)G,B(-1)P,B(0)P,B25H,desB30ヒトインスリン;A(-2)G,A(-1)P,A(0)P,A14E,B(-2)G,B(-1)P,B(0)P,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B27R,B28D,B29K,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27R,B28D,B29K,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B26T,B27R,B28D,B29K,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27R,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27H,desB30ヒトインスリン;A14E,A18Q,B3Q,B25H,desB30ヒトインスリン;A13E,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A12E,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A15E,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13E,B25H,desB30ヒトインスリン;A12E,B25H,desB30ヒトインスリン;A15E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,desB27,desB30ヒトインスリン;A14H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14H,B16H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B26D,B27E,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27R,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27N,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27D,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27Q,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27E,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27G,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27H,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27K,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27P,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27S,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27T,desB30ヒトインスリン;A13R,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13N,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13D,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13Q,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13E,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13G,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13H,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13K,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13P,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13S,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A13T,A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B16R,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B16D,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B16Q,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B16E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14R,B25H,desB30ヒトインスリン;A14N,B25H,desB30ヒトインスリン;A14D,B25H,desB30ヒトインスリン;A14Q,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14G,B25H,desB30ヒトインスリン;A14H,B25H,desB30ヒトインスリン;A8H,B10D,B25Hヒトインスリン;およびA8H,A14E,B10E,B25H,desB30ヒトインスリンからなる群から選択されるペプチド部を有し、この実施形態は、場合により、B25H,desB30ヒトインスリンおよびB25N,desB30ヒトインスリンを含んでいてもよい。
【００８７】
好ましい実施形態において、本発明によるN末端修飾インスリンは、A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B16E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30ヒトインスリン;B25H,desB30ヒトインスリンおよびA14E,B25H,desB27,desB30ヒトインスリンからなる群から選択されるペプチド部を有する。
【００８８】
好ましい実施形態において、本発明によるN末端修飾インスリンは、加えて、desB27変異を含有している上に述べられているインスリンのいずれか一つから選択されるペプチド部を有する。
【００８９】
好ましい実施形態において、本発明によるN末端修飾インスリンは、A14E,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B16E,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;およびB25H,desB27,desB30ヒトインスリンからなる群から選択されるペプチド部を有する。
【００９０】
一実施形態において、本発明によるN末端修飾インスリンは、上述のインスリンのいずれかから選択され、加えて、化学的安定性を改善するためにA21位および/またはB3位に下記の変異のうちの1つまたは2つを含むペプチド部を有する: A21G、desA21、B3Q、またはB3G。
【００９１】
好ましい実施形態において、本発明によるN末端修飾インスリンは、A14E,A21G,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B16E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30ヒトインスリン;A21G,B25H,desB30ヒトインスリンおよびA21G,B25N,desB30ヒトインスリンからなる群から選択されるペプチド部を有し、好ましくは、下記のプロテアーゼ安定化インスリンから選択される: A14E,A21G,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B16E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A21G,B25H,desB30ヒトインスリンおよびA21G,B25N,desB30ヒトインスリン。
【００９２】
本明細書において、「アシル化インスリン」という用語は、場合により、インスリンペプチドへのリンカーを介する1つまたは複数の親油性置換基の接続によるインスリンの修飾をカバーする。
【００９３】
「親油性置換基」とは、本明細書において、場合により、LysB29などのアミノ酸位置において、リンカーまたは等価物を介してインスリンと接続している脂肪酸または脂肪二酸からなる側鎖として理解される。
【００９４】
一実施形態において、N末端修飾インスリンと接続している「親油性置換基」は、一般式;
Acy-AA1n-AA2m-AA3p- (式III)
を有し、
式中、nは、0または1から3までの範囲の整数であり;mは、0または1から10までの範囲の整数であり;pは、0または1から10までの範囲の整数であり;Acyは、約8個から約24個までの炭素原子を含む脂肪酸または脂肪二酸であり;AA1は、中性の直線または環状のアミノ酸残基であり;AA2は、酸性のアミノ酸残基であり;AA3は、中性の、アルキレングリコール含有アミノ酸残基であり;AA1、AA2およびAA3が式中に現れる順序は、独立して交換することができ;AA2は、式に沿って数回現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);AA2は、式に沿って数回独立して(=異なっている)現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);Acy、AA1、AA2および/またはAA3の間の連結は、形式的に、Acy、AA1、AA2およびAA3の各々からの水素原子またはヒドロキシル基(水)の除去により得ることができるアミド(ペプチド)結合であり;ペプチド部への接続は、式(III)のアシル部分におけるAA1、AA2、またはAA3残基のC末端から、または式(III)の部分に存在するAA2残基の側鎖のうちの1つからであってよい。
【００９５】
本発明に従って使用されてよい親油性置換基の非限定的な例は、例えば、特許出願WO 2009/115469中に見いだすことができ、WO 2009/115469の25頁、3行から始まる一節に記載されているようなアシル化ポリペプチドの親油性置換基を包含する。
【００９６】
本発明の一態様において、親油性置換基は、
【００９７】
【表１Ａ】
2013540771.tif 000005
【００９８】
【表１Ｂ】
2013540771.tif 000006
【００９９】
【表１Ｃ】
2013540771.tif 000007
【０１００】
【表１Ｄ】
2013540771.tif 000008
【０１０１】
【表１Ｅ】
2013540771.tif 000009
【０１０２】
からなる群から選択される。
【０１０３】
本発明の一態様において、親油性置換基は、
【０１０４】
【表２Ａ】
2013540771.tif 000010
【０１０５】
【表２Ｂ】
2013540771.tif 000011
【０１０６】
【表２Ｃ】
2013540771.tif 000012
【０１０７】
からなる群から選択される。
【０１０８】
本発明の一態様において、親油性置換基は、
【０１０９】
【表３】
2013540771.tif 000013
【０１１０】
からなる群から選択される。
【０１１１】
「N末端修飾インスリン」とは、本明細書において、「N末端保護インスリン」と同じであり、本明細書でN末端保護基とも命名されている1つまたは複数のN末端修飾基を含むインスリンと定義される。
【０１１２】
「N末端修飾基」とは、本明細書において、「N末端保護基」と同じであり、本発明によれば、インスリンのA-鎖および/またはB-鎖のN末端アミノ基とコンジュゲートしている場合に、例えば、医薬製剤中の賦形剤のうちの1つまたは複数のアルデヒド不純物と反応することから、それぞれ、インスリンのN末端アミノ酸の前記アミノ基(必ずしもそうとは限らないが、典型的には)、A-鎖およびB-鎖のグリシンおよびフェニルアラニンを守る基である。本発明の一態様において、N末端修飾は、親インスリンのN末端とコンジュゲートしている、1モル当たり200g未満のMWを有する1つまたは2つの有機置換基である。
【０１１３】
一態様において、本発明のN末端修飾インスリン誘導体は、示されているインスリンA-鎖の最初の4個の残基(GIVE….)と共に式Iに図示されているような、少なくとも1つの、好ましくは、2つのN末端アミノ酸と接続しているN末端修飾基YおよびZを含む。
式I:
【０１１４】
【化４】
2013540771.tif 000014
【０１１５】
または、代替表示として:
【０１１６】
【化５】
2013540771.tif 000015
【０１１７】
本発明の一態様において、YおよびZは、異なり、
Yは、R-C(=X)-であり、
Zは、Hであり、
Rは、H、NH2、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、(場合により、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、またはトリプロピルアンモニウムで置換されている)、C5〜C6シクロアルキル(場合により置換されている)、5-または6員の飽和ヘテロシクリル(場合により置換されている)であり、
Xは、OまたはSである。
【０１１８】
本発明の一態様において、Yが、R-C(=X)-であり、Zが、Hである場合、インスリンは、desA1およびdesB1変異を含有することができる。
【０１１９】
本発明の別の態様において、Y=Zは、C1〜C4アルキルである。
【０１２０】
本発明の一態様において、A-鎖およびB-鎖のN末端アミノ基のN末端保護基の各々は、同じである。
【０１２１】
本発明の一態様において、本発明の2つのN末端保護基の各々は、150Da未満の分子量を有している。
【０１２２】
本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、生理学的pHにおいて正に荷電しており、すなわち、N末端保護基が、N末端アミノ基と接続/コンジュゲートしている場合、アミノ基、またはアミノ基上の置換基は、正電荷を有する。本発明の一態様において、N末端保護基は、ジメチル、ジエチル、ジ-n-プロピル、ジ-sec-プロピル、ジ-n-ブチル、ジ-i-ブチルなどからなる群から選択される。本発明の別の態様において、N末端保護基は、ジメチルおよびジエチルから選択される。本発明の別の態様において、N末端保護基は、ジメチルである。
【０１２３】
本発明の一態様において、N末端保護基は、N,N-ジメチルグリシル、N,N-ジメチルアミノブタノイル、N,N-ジメチルアミノプロピオニルおよび3-(1-ピペリジニル)プロピオニルからなる群から選択される。
【０１２４】
本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、生理学的pHにおいてN末端アミノ基の正常な正の(または、部分的に正の)電荷を除去する。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、小さなアシル残基から選択される。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、ホルミル、アセチル、プロパノイル、およびブタノイル基から選択される。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、環状アシル残基、例えば、ピログルタミニル(= 5-オキソ-ピロリジン-2-オイル)基から選択される。
【０１２５】
本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、生理学的pHにおいてN末端アミノ基の正常な正の(または、部分的に正の)電荷を除去する。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、カルバモイルおよびチオカルバモイルから選択される。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、カルバモイルである。
【０１２６】
本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、生理学的pHにおいてN末端アミノ基の正常な正の(または、部分的に正の)電荷を除去する。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、オキサリル、グルタリル、またはジグリコリル(他の名称: 3-オキソグルタリル、カルボキシメトキシアセチル)から選択される。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、グルタリルおよびジグリコリル(他の名称: 3-オキソグルタリル、カルボキシメトキシアセチル)から選択される。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、グルタリルである。本発明の一態様において、本発明のN末端保護基の各々は、ジグリコリル(他の名称: 3-オキソグルタリル、カルボキシメトキシアセチル)である。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、ポリペプチドへ置換基を結合させて前記ポリペプチドの特性を修飾するプロセスを示すことが意図されている。したがって、分子およびポリペプチドの「コンジュゲーション」または「コンジュゲーション生成物」とは、ポリペプチドのアミノ酸と結合している前記置換基のための用語であり、したがって、本明細書に記載されているような「置換基」とは、ポリペプチドと接続している置換基を意味する。
【０１２８】
「モノアルキル化」とは、本明細書において、ポリペプチドの遊離アミノ基との1つのアルキル置換基のコンジュゲーションとして理解されるべきであり、「ジアルキル化」とは、下に図示されているように、ポリペプチドの遊離アミノ基との2つのアルキル置換基のコンジュゲーションとして理解されるべきであり、ここで、「遊離アミノ基」とは、一級アミン、R-NH2、または二級アミン、R1-NH-R2 (式中、R、R1およびR2は、置換基を表す)として理解されるべきである。
【０１２９】
「グアニジニル化」とは、本明細書において、下に図示されているように、グアニジニル基へのアミノ基の変換をもたらす、ポリペプチドの遊離アミノ基とのアミジニル置換基(カルボキサミジンとも呼ばれることがある、すなわち、形態: RnC(=NR)NR2 (式中、Rnは、ポリペプチドである)の置換基)のコンジュゲーションとして理解されるべきである。
【０１３０】
【化６】
2013540771.tif 000016
【０１３１】
本明細書で使用される「インスリン(insulin)」、「インスリン(an insulin)」または「インスリン(the insulin)」とは、CysA7とCysB7の間およびCysA20とCysB19の間のジスルフィド架橋ならびにCysA6とCysA11の間の内部ジスルフィド架橋を持つヒトインスリン、ブタインスリンもしくはウシインスリンまたはそれらのインスリン類似体もしくは誘導体を意味する。
【０１３２】
ヒトインスリンは、2つのポリペプチド鎖、それぞれ21個および30個のアミノ酸残基を含有するA鎖およびB鎖からなる。A鎖およびB鎖は、2つのジスルフィド架橋により相互に連結している。大部分の他の種からのインスリンは、同じようであるが、一部の位置にアミノ酸置換を含有することがある。
【０１３３】
本発明で使用されるインスリン類似体は、天然インスリン中に存在する少なくとも1つのアミノ酸残基を欠失させかつ/または置換することにより、および/または少なくとも1つのアミノ酸残基を付加することにより、天然に存在するインスリンの構造、例えば、ヒトインスリンのそれから形式的に誘導することができる分子構造を有するポリペプチドである。
【０１３４】
一態様において、本発明によるインスリン類似体は、ヒトインスリンと比べて8個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。一態様において、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比べて7個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。一態様において、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比べて6個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。別の態様において、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比べて5個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。別の態様において、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比べて4個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。別の態様において、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比べて3個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。別の態様において、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比べて2個未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。
【０１３５】
インスリンの誘導体は、例えば、インスリン骨格の1つまたは複数の位置に側鎖を導入することにより、またはインスリン中のアミノ酸残基の基を酸化もしくは還元することにより、または遊離カルボキシル基をエステル基もしくはアミド基に変換することにより、化学的に修飾された天然に存在するヒトインスリンまたはインスリン類似体である。他の誘導体は、ヒトインスリンまたはdesB30ヒトインスリンのB29位におけるなどの、遊離アミノ基またはヒドロキシ基をアシル化することにより得られる。
【０１３６】
したがって、インスリンの誘導体は、インスリンペプチドの1つまたは複数のアミノ酸と接続している側鎖などの少なくとも1つの共有結合修飾を含むヒトインスリンまたはインスリン類似体である。
【０１３７】
本明細書において、インスリンの命名は、下記の原則に従って行われる:名称は、ヒトインスリンと比べた変異および修飾(アシル化)として与えられる。アシル部分の命名については、ペプチド命名法として行われる。例えば、アシル部分:
【０１３８】
【化７】
2013540771.tif 000017
【０１３９】
の命名は、例えば、「オクタデカンジオイル-γ-L-Glu-OEG-OEG」、「オクタデカンジオイル-γGlu-2×OEG」、「オクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG」、「17-カルボキシヘプタデカノイル-γ-L-Glu-OEG-OEG」、または「17-カルボキシヘプタデカノイル-γ-L-Glu-2×OEG」であってよく、式中
OEGは、アミノ酸残基-NH(CH2)2O(CH2)2OCH2CO-の簡易表記であり、
γ-L-Glu (あるいは、g-L-Glu、gGlu、γGluまたはガンマ-L-Gluと表記される)は、アミノ酸ガンマグルタミン酸部分のL-体の簡易表記である。
【０１４０】
ガンマグルタミン酸部分のエナンチオマー形態が指定されていなければ、部分は、キラルなアミノ酸部分の立体配置が、DかまたはL(または、R/S用語法を使用していれば、RかまたはS)である純粋なエナンチオマーの形態であってよいか、エナンチオマーの混合物(DとL/RとS)の形態であってよい。
【０１４１】
修飾されたペプチドまたはタンパク質のアシル部分は、キラルなアミノ酸部分の立体配置が、DかまたはL(または、R/S用語法を使用していれば、RかまたはS)である純粋なエナンチオマーの形態であってよいか、エナンチオマーの混合物(DとL/RとS)の形態であってよい。本発明の一態様において、アシル部分は、エナンチオマーの混合物の形態である。一態様において、アシル部分は、純粋なエナンチオマーの形態である。一態様において、アシル部分のキラルなアミノ酸部分は、L体である。一態様において、アシル部分のキラルなアミノ酸部分は、D体である。
【０１４２】
「desB30ヒトインスリン」とは、B30アミノ酸残基を欠くヒトインスリンの類似体を意味する。同様に、「desB29desB30ヒトインスリン」とは、B29およびB30のアミノ酸残基を欠くヒトインスリンの類似体を意味する。「B1」、「A1」などは、それぞれインスリンのB-鎖中の1位(N末端から数えて)におけるアミノ酸残基およびインスリンのA-鎖中の1位(N末端から数えて)におけるアミノ酸基を意味する。具体的位置にあるアミノ酸残基は、例えば、B1位におけるアミノ酸残基が、フェニルアラニン残基であることを意味するPheB1として表記されることもある。
【０１４３】
例えば、実施例1のインスリン(配列/構造が下に与えられている)は、ヒトインスリン中のA14位にあるアミノ酸、Yが、Eに変異され、ヒトインスリン中のB25位にあるアミノ酸、Fが、Hに変異され、A1位およびB1位にあるアミノ酸(それぞれ、グリシンおよびフェニルアラニン)が、N末端(アルファ)アミノ基の(形式的な)ジメチル化により修飾され、ヒトインスリン中のB29位にあるアミノ酸、Kが、残基オクタデカンジオイル-γGlu-2×OEGにより、Nεと表記されるB29のリシン残基中のイプシロン窒素上のアシル化により修飾され、ヒトインスリン中のB30位にあるアミノ酸、Tが、欠失されたことを示すために「A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン」と命名される。下の式中のアスタリスクは、対象とする残基が、ヒトインスリンと比較して異なっている(すなわち、変異されている)ことを示す。あるいは、実施例1のインスリン(配列/構造が下に与えられている)は、A1位およびB1位にあるアミノ酸残基が、それぞれG (Gly)およびF (Phe)であることをさらに示すために「A1G(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1F(Nα,Nα-ジメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン」と命名することもできる。さらに、表記「Nα」および「Nε」は、それぞれ「N(アルファ)」または「N(a)」として、および「N(イプシロン)」または「N(eps)」と書くこともできる。
【０１４４】
配列番号1
【０１４５】
【化８】
2013540771.tif 000018
【０１４６】
同じインスリンは、代替表示:
【０１４７】
【化９】
2013540771.tif 000019
【０１４８】
で図示されてもよい。
【０１４９】
加えて、本発明のインスリンは、IUPAC命名法(OpenEye、IUPAC形式)に従っても命名される。この命名法によれば、上のアシル化N末端修飾インスリンには、下記の名称が割り当てられる:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０１５０】
N末端修飾の表記:
N末端修飾は、アルファアミノ基なしで描かれ、下の例に示されているように理解されるべきである。
式II:
【０１５１】
【化１０】
2013540771.tif 000020
【０１５２】
は、
【０１５３】
【化１１】
2013540771.tif 000021
【０１５４】
を意味し、
【０１５５】
【化１２】
2013540771.tif 000022
【０１５６】
は、
【０１５７】
【化１３】
2013540771.tif 000023
【０１５８】
を意味する。
【０１５９】
ポリペプチドの製造は、当技術分野においてよく知られている。本発明によるN末端修飾インスリンのペプチド部などのポリペプチドは、例えば、古典的ペプチド合成、例えば、t-BocもしくはFmoc化学反応を使用する固相ペプチド合成または他の十分に確立した技法により製造することができ、例えば、GreeneおよびWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999年を参照されたい。ポリペプチドは、ポリペプチドをコード化するDNA配列を含有し、ペプチドの発現を可能にする条件下で適当な栄養培地中でポリペプチドを発現する能力のある宿主細胞を培養することを含む方法により製造することもできる。非天然アミノ酸残基を含むポリペプチドについては、組み換え細胞は、非天然アミノ酸が、例えば、t-RNA変異体の使用により、ポリペプチド中に組み込まれるように修飾されるべきである。
【０１６０】
「安定性」という用語は、本明細書において、組成物の貯蔵寿命について記載するためにN末端修飾インスリンを含む医薬組成物について使用される。したがって、N末端修飾インスリンへ言及する場合の「安定化された」または「安定な」という用語は、N末端修飾されていないインスリンを含む組成物と比べて化学的安定性が増加したか物理的および化学的安定性が増加した組成物を指す。
【０１６１】
本明細書で使用されるN末端修飾インスリンの「化学的安定性」という用語は、天然のタンパク質構造と比較して生物学的効力が潜在的に低くかつ/または免疫原性特性が潜在的に増加した化学分解生成物の形成につながるタンパク質構造の化学的共有結合変化を指す。様々な化学分解生成物が、天然タンパク質のタイプおよび性質ならびにタンパク質が暴露される環境に応じて形成されうる。化学分解の排除は、おそらく、完全に避けることができず、増加する量の化学分解生成物は、当業者によりよく知られているように医薬組成物の貯蔵および使用中に見られることが多い。大部分のタンパク質は、グルタミニル残基またはアスパラギニル残基中の側鎖アミド基が加水分解されて遊離カルボン酸を形成するプロセスである脱アミドを起こしやすい。他の分解経路には、2つ以上のタンパク質分子が、共有結合性のダイマー、オリゴマーおよびポリマー分解生成物につながるアミド基転移および/またはジスルフィド相互作用を通してお互いと共有結合している高分子量変換生成物が関わる(Stability of Protein Pharmaceuticals、Ahern. T.J.およびManning M.C.、Plenum Press、New York 1992年)。酸化は、化学分解の別の変形形態として述べることができる。N末端修飾インスリンの化学的安定性は、異なる環境条件への暴露後の様々な時点において化学分解生成物の量を測定することにより評価することができる(分解生成物の形成は、例えば、温度を上げることにより加速されうることが多い)。各個別の分解生成物の量は、様々なクロマトグラフィー技法(例えば、SEC-HPLCおよび/またはRP-HPLC)を使用して分子サイズ、親水性、疎水性および/または電荷に応じて分解生成物を分離することにより決定されることが多い。
【０１６２】
それ故に、上で概説されているように、N末端修飾インスリンへ言及する場合の「安定化された」または「安定な」とは、化学的安定性が増加したか物理的および化学的安定性が増加したN末端修飾インスリンを指す。一般に、医薬組成物は、期限期日に達するまで使用および貯蔵中(推奨される使用条件および貯蔵条件に従って)に安定でなければならない。
【０１６３】
本発明の一態様において、N末端修飾インスリンを含む脂質医薬組成物などの医薬組成物は、6週間を超える使用に対しておよび2年間を超える貯蔵に対して安定である。
【０１６４】
本発明の別の態様において、N末端修飾インスリンを含む脂質医薬組成物などの医薬組成物は、4週間を超える使用に対しておよび2年間を超える貯蔵に対して安定である。
【０１６５】
本発明のさらなる態様において、N末端修飾インスリンを含む脂質医薬組成物などの医薬組成物は、4週間を超える使用に対しておよび3年間を超える貯蔵に対して安定である。
【０１６６】
本発明のさらなる態様において、N末端修飾インスリンを含む脂質医薬組成物などの医薬組成物は、2週間を超える使用に対しておよび2年間を超える貯蔵に対して安定である。
【０１６７】
下記は、本発明による態様の非限定的なリストである:
1.アシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンであり、N末端修飾が、生理学的pHにおいて正に荷電している1つまたは複数のN末端修飾基によるものである、N末端修飾インスリン。
2.ペプチド部、親油性置換基およびN末端修飾基からなる、態様1に記載のN末端修飾インスリン。
3.生理学的pHにおいて正に荷電している修飾基が、親インスリンのN末端とコンジュゲートしている、生理学的pHにおいて正に荷電しており、1モル当たり200g未満のMWを有している1つまたは2つの有機置換基である、態様1または2に記載のN末端修飾インスリン。
4.生理学的pHにおいて正に荷電している修飾基が、式I:
【０１６８】
【化１４】
2013540771.tif 000024
【０１６９】
または、代替表示として:
【０１７０】
【化１５】
2013540771.tif 000025
【０１７１】
(式中、YおよびZは、インスリンペプチドのN末端アミノ酸と接続している)中でYおよびZと指定される、態様1から3のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
5. YおよびZが、異なり、
Yが、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウムまたはジプロピルアンモニウムで置換されている直鎖または分岐したC2〜C4アシル、5-または6員の飽和ヘテロシクリル、置換された5-または6員の飽和ヘテロシクリル、アミジニルであり、
Zが、Hである、態様4に記載のN末端修飾インスリン。
6. YおよびZが、異なり、
Yが、直鎖C1〜C4アルキル、5-または6員の飽和ヘテロシクリルであり、
Zが、Hである、態様4に記載のN末端修飾インスリン。
7. Y=Z= C1〜C4アルキルである、態様4に記載のN末端修飾インスリン。
8. YおよびZが、同じで、ジメチル、ジエチル、ジ-n-プロピル、ジ-sec-プロピル、ジ-n-ブチル、ジ-i-ブチルからなる群から選択される、態様4に記載のN末端修飾インスリン。
9. YおよびZが、同じで、ジメチルおよびジエチルから選択される、態様4に記載のN末端修飾インスリン。
10. YおよびZが、同じで、ジメチルである、態様4に記載のN末端修飾インスリン。
11. N末端修飾が、N,N-ジ-C1〜4アルキル、N-アミジニル、4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタノイル、3-(1-ピペリジニル)プロピオニル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル、N,N-ジメチル-グリシルおよびN,N,N-トリメチル-グリシルからなる群から選択される、態様1から4のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
12. N末端修飾が、N,N-ジ-C1〜4アルキルである、態様11に記載のN末端修飾インスリン。
13. N末端修飾が、N,N-ジメチルまたはN,N-ジエチルである、態様12に記載のN末端修飾インスリン。
14.アシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンが、ペプチド部としてのプロテアーゼ安定化インスリンおよびペプチド部と接続している親油性置換基からなり、ペプチド部が、少なくとも1つの疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されているように置換されているヒトインスリンであり、前記置換が、インスリンの1つまたは複数のプロテアーゼ切断部位内であるか近接している、態様1から13のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
15.ペプチド部が、A8H、A14E、A14H、A14D、A21G、desA21、B1E、desB1、B3Q、B3G、B16H、B16E、B25H、B25N、B26G、B26D、B26E、B27G、B27E、B27D、desB27、B28G、B28E、B28D、desB28、およびdesB30からなる群から選択される少なくとも1つの位置で置換されている修飾が8個未満のヒトインスリンである、態様14に記載のN末端修飾インスリン。
16.ペプチド部が、A14E、A21G、B3Q、B16H、B16E、B25H、B25N、B26G、B27G、desB27、B28G、およびdesB30からなる群から選択される少なくとも1つの位置で置換されている修飾が8個未満のヒトインスリンである、態様14に記載のN末端修飾インスリン。
17.ペプチド部が、A8H、A14E、A14H、A14D、A21G、desA21、B1E、desB1、B3Q、B3G、B16H、B16E、B25H、B25N、B26G、B26D、B26E、B27G、B27E、B27D、desB27、B28G、B28E、B28D、desB28、およびdesB30からなる群から選択される少なくとも2つの位置で置換されている修飾が8個未満のヒトインスリンである、態様14に記載のN末端修飾インスリン。
18.ペプチド部が、A14E、A21G、B3Q、B16H、B16E、B25H、B25N、B26G、B27G、desB27、B28G、およびdesB30からなる群から選択される少なくとも2つの位置で置換されている修飾が8個未満のヒトインスリンである、態様14に記載のN末端修飾インスリン。
19.ペプチド部が、A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B16E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30ヒトインスリン;B25H,desB30ヒトインスリンおよびA14E,B25H,desB27,desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様14に記載のN末端修飾インスリン。
20.ペプチド部が、A14E,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B16E,B25H,desB27,desB30ヒトインスリンおよびB25H,desB27,desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様14に記載のN末端修飾インスリン。
21.ペプチド部が、A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B27E,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30ヒトインスリンおよびA14E,A21G,desB27,desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様14に記載のN末端修飾インスリン。
22.アシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンが、ペプチド部としてのプロテアーゼ安定化インスリンおよびペプチド部と接続している親油性置換基からなり、親油性置換基が、ペプチド部のアミノ酸位置において、場合により、リンカーを介して、インスリンと接続している脂肪酸または脂肪二酸からなる側鎖である、態様1から21のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
23.ペプチド部が、ただ一つのリシン残基を含み、親油性置換基が、前記リシン残基と、場合によりリンカーを介して、接続している、態様22に記載のN末端修飾インスリン。
24.親油性置換基が、一般式Acy-AA1n-AA2m-AA3p- (式III)
(式中、
nは、0または1から3までの範囲の整数であり;
mは、0または1から10までの範囲の整数であり;
pは、0または1から10までの範囲の整数であり;
Acyは、約8個から約24個までの炭素原子を含む脂肪酸または脂肪二酸であり;
AA1は、中性の直線または環状のアミノ酸残基であり;
AA2は、酸性のアミノ酸残基であり;
AA3は、中性の、アルキレングリコール含有アミノ酸残基であり;
AA1、AA2およびAA3が式中に現れる順序は、独立して交換することができ;AA2は、式に沿って数回現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);AA2は、式に沿って数回独立して(=異なっている)現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);Acy、AA1、AA2および/またはAA3の間の連結は、形式的に、Acy、AA1、AA2およびAA3の各々からの水素原子またはヒドロキシル基(水)の除去により得ることができるアミド(ペプチド)結合であり;ペプチド部への接続は、式(III)のアシル部分におけるAA1、AA2、またはAA3残基のC末端から、または式(III)の部分に存在するAA2残基の側鎖のうちの1つからであってよい)を有する、態様22または23に記載のN末端修飾インスリン。
25.アシル化インスリンであり、N末端修飾が、生理学的pHにおいて中性であるか負に荷電している1つまたは複数のN末端修飾基によるものである、N末端修飾インスリン。
26.ペプチド部、親油性置換基およびN末端修飾基からなる、態様25に記載のN末端修飾インスリン。
27.生理学的pHにおいて中性であるか負に荷電している修飾基が、親インスリンのN末端とコンジュゲートしている、生理学的pHにおいて中性であるか負に荷電しており、1モル当たり200g未満のMWを有している1つまたは2つの有機置換基である、態様24または25に記載のN末端修飾インスリン。
28.生理学的pHにおいて中性であるか負に荷電している修飾基が、式I:
【０１７２】
【化１６】
2013540771.tif 000026
【０１７３】
または、代替表示として:
【０１７４】
【化１７】
2013540771.tif 000027
【０１７５】
(式中、YおよびZは、インスリンペプチドのN末端アミノ酸と接続している)中のYおよびZと指定される、態様25から27のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
29.本発明による生理学的pHにおいて負に荷電しているN末端修飾基が、マロニルでもスクシニルでもない、態様25から28のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
30.本発明による生理学的pHにおいて負に荷電しているN末端修飾基が、マロニルではない、態様25から28のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
31.本発明による生理学的pHにおいて負に荷電しているN末端修飾基が、スクシニルではない、態様25から28のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
32. N末端修飾が、カルバモイル、チオカルバモイル、C1〜4鎖アシル基、オキサリル、グルタリルおよびジグリコリルからなる群から選択される、態様25から31のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
33. N末端修飾が、カルバモイル、チオカルバモイル、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ピログルタミル、オキサリル、グルタリルおよびジグリコリルからなる群から選択される、態様25から31のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
34. N末端修飾が、生理学的pHにおいて中性である、態様25から28のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
35. N末端修飾が、カルバモイル、チオカルバモイル、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、およびピログルタミルからなる群から選択される、態様25から28のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
36. N末端修飾が、生理学的pHにおいて負に荷電している、態様25から31のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
37. N末端修飾が、オキサリル、グルタリルおよびジグリコリルからなる群から選択される、態様25から28のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
38.アシル化インスリンが、ペプチド部およびペプチド部と接続している親油性置換基からなり、ペプチド部が、ヒトインスリン、desB30ヒトインスリン、修飾が8個未満のヒトインスリンまたは修飾が8個未満のdesB30ヒトインスリンである、態様25から37のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
39.ペプチド部が、A8H、A14E、A14H、A14D、A21G、desA21、B1E、desB1、B3Q、B3G、B16H、B16E、B25H、B25N、B26G、B26D、B26E、B27G、B27E、B27D、desB27、B28G、B28E、B28D、desB28、およびdesB30からなる群から選択される少なくとも1つの位置で置換されている修飾が8個未満のヒトインスリンである、態様38に記載のN末端修飾インスリン。
40.ペプチド部が、A14E、A21G、B3Q、B16H、B16E、B25H、B25N、B26G、B27G、desB27、B28G、およびdesB30からなる群から選択される少なくとも1つの位置で置換されている修飾が8個未満のヒトインスリンである、態様38に記載のN末端修飾インスリン。
41.ペプチド部が、A8H、A14E、A14H、A14D、A21G、desA21、B1E、desB1、B3Q、B3G、B16H、B16E、B25H、B25N、B26G、B26D、B26E、B27G、B27E、B27D、desB27、B28G、B28E、B28D、desB28、およびdesB30からなる群から選択される少なくとも2つの位置で置換されている修飾が8個未満のヒトインスリンである、態様38に記載のN末端修飾インスリン。
42.ペプチド部が、A14E、A21G、B3Q、B16H、B16E、B25H、B25N、B26G、B27G、desB27、B28G、およびdesB30からなる群から選択される少なくとも2つの位置で置換されている修飾が8個未満のヒトインスリンである、態様38に記載のN末端修飾インスリン。
43.ペプチド部が、少なくとも1つの疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されているように置換されている、修飾が8個未満のヒトインスリンであり、前記置換が、インスリンの1つまたは複数のプロテアーゼ切断部位内であるか近接している、態様25から42のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
44.ペプチド部が、A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B16E,B25H,desB27,desB30ヒトインスリンおよびB25H,desB27,desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様25から43のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
45.ペプチド部が、A14E,A21G,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B16E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30ヒトインスリン;A21G,B25H,desB30ヒトインスリンおよびA21G,B25N,desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様25から43のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
46.ペプチド部が、A14E,A21G,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B16E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A21G,B25H,desB30ヒトインスリンおよびA21G,B25N,desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様25から43のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
47.ペプチド部が、A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B16E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30ヒトインスリン;B25H,desB30ヒトインスリンおよびA14E,B25H,desB27,desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様25から43のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
48.アシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンが、ペプチド部としてのプロテアーゼ安定化インスリンおよびペプチド部と接続している親油性置換基からなり、親油性置換基が、ペプチド部のアミノ酸位置において、場合により、リンカーを介して、インスリンと接続している脂肪酸または脂肪二酸からなる側鎖である、態様25から47のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
49.ペプチド部が、ただ一つのリシン残基を含み、親油性置換基が、前記リシン残基と、場合によりリンカーを介して、接続している、態様48に記載のN末端修飾インスリン。
50.親油性置換基が、一般式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-式(III)
(式中、
nは、0または1から3までの範囲の整数であり;
mは、0または1から10までの範囲の整数であり;
pは、0または1から10までの範囲の整数であり;
Acyは、約8個から約24個までの炭素原子を含む脂肪酸または脂肪二酸であり;
AA1は、中性の直線または環状のアミノ酸残基であり;
AA2は、酸性のアミノ酸残基であり;
AA3は、中性の、アルキレングリコール含有アミノ酸残基であり;
AA1、AA2およびAA3が式中に現れる順序は、独立して交換することができ;AA2は、式に沿って数回現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);AA2は、式に沿って数回独立して(=異なっている)現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);Acy、AA1、AA2および/またはAA3の間の連結は、形式的に、Acy、AA1、AA2およびAA3の各々からの水素原子またはヒドロキシル基(水)の除去により得ることができるアミド(ペプチド)結合であり;ペプチド部への接続は、式(III)のアシル部分におけるAA1、AA2、またはAA3残基のC末端から、または式(III)の部分に存在するAA2残基の側鎖のうちの1つからであってよい)を有する、態様48または49に記載のN末端修飾インスリン。
51. A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジエチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジエチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B16H,B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1F(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1F(Nα,N(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nε-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nε-エイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),B16H,desB27,B29K(Nε-エイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),B16H,desB27,B29K(Nε-エイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαチオカルバモイル),A14E,B1F(N,Nαチオカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nε-オクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル),A14E,B1(Nα3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタノイル),A14E,B1(Nα4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタノイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα3-(1-ピペリジニル)プロピオニル),A14E,B1(Nα3-(1-ピペリジニル)プロピオニル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nα2-ピコリル),A14E,B1F(Nα2-ピコリル),B25H,desB27,B29K(Nε-オクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B16H,B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A-1(Nαトリメチル),A14E,B-1(Nαトリメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジグリコリル),A14E,B1(Nεジグリコリル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),B16H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
からなる群から選択される、態様1から50のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
52. A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジエチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジエチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B16H,B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1F(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1F(Nα,N(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nε-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nε-エイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),B16H,desB27,B29K(Nε-エイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),B16H,desB27,B29K(Nε-エイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαチオカルバモイル),A14E,B1F(Nαチオカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nε-オクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル),A14E,B1(Nα3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタノイル),A14E,B1(Nα4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタノイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα3-(1-ピペリジニル)プロピオニル),A14E,B1(Nα3-(1-ピペリジニル)プロピオニル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nα2-ピコリル),A14E,B1F(Nα2-ピコリル),B25H,desB27,B29K(Nε-オクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B16H,B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A-1(Nαトリメチル),A14E,B-1(Nαトリメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジグリコリル),A14E,B1(Nεジグリコリル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
からなる群から選択される、態様1から51のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
53. A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-OEG-OEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジエチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジエチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB27,desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B16H,B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B16H,B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαトリメチル),A14E,B1(Nαトリメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB27,desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(N-カルバモイル),A14E.B1(N-カルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nε(オクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(N-アセチル),A14E,B1(N-アセチル),B25H,desB27,B29K(N-ε-(オクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(N-ジメチルアミノプロピオニル),A14E,B1(N-ジメチルアミノプロピオニル,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1-(N-ジメチルアミノブタノイル),A14E,B1-(N-ジメチルアミノブタノイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1-(N-(3-(1-ピペリジニルプロピオニル))),A14E,B1-(N-(3-(1-ピペリジニルプロピオニル))),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB27,desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα、Nα-ジメチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα、Nα-ジメチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2xOEG),desB30ヒトインスリン
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
からなる群から選択される、態様1から52のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
54.上の明細書で具体的に述べられている化合物のいずれか一つである、態様1から53のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン。
55.態様1から54のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリンを含む医薬組成物。
56.経口医薬組成物である、態様55に記載の医薬組成物。
57. 1つまたは複数の脂質およびN末端修飾インスリンを含む経口医薬組成物。
58. N末端修飾インスリンが、ペプチド部、N末端修飾基および、場合により、親油性置換基からなる、態様57に記載の経口医薬組成物。
59. N末端修飾インスリンが、ペプチド部、N末端修飾基および親油性置換基からなる、態様57に記載の経口医薬組成物。
60.無水である、態様57から59のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
61.脂質が、グリセロールモノ-カプリレート(例えば、Rylo MG08 Pharmaなど)およびグリセロールモノ-カプレート(例えば、DaniscoからのRylo MG10 Pharmaなど)からなる群から選択される、態様57から60のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。別の態様において、脂質は、プロピレングリコールカプリレート(例えば、AbitecからのCapmul PG8またはGattefosseからのCapryol PGMC、もしくはCapryol 90など)からなる群から選択される。
62. N末端修飾インスリン(a)、N末端修飾インスリンのための少なくとも1つの極性有機溶媒(b)、少なくとも1つの界面活性剤(c)、少なくとも1つの親油性構成成分(d)、および、場合により、少なくとも1つの固体親水性構成成分(e)を含む固体または半固体医薬組成物であり、自然に分散可能である、態様57から61のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
63. N末端修飾インスリン(a)、N末端修飾インスリンのための少なくとも1つの極性有機溶媒(b)、少なくとも1つの親油性構成成分(c)、および場合により、少なくとも1つの界面活性剤(d)を含む水を含まない液体医薬組成物であり、澄明な溶液の形態である、態様57から61のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
64.界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、態様57から63のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
65.界面活性剤が、ポロキサマーおよびPluronic F-127またはPluronic F-68などのポロキサマーの混合物からなる群から選択される固体界面活性剤である、態様57から63のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
66.親油性構成成分が、モノ-ジ-グリセリドである、態様57から65のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
67.親油性構成成分が、親油性構成成分がプロピレングリコールと混ぜられる場合に溶液が得られるように選択される、態様57から66のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
68.親油性構成成分が、モノ-および/もしくはジ-グリセリドまたはプロピレングリコールカプリレートである、態様57から67のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
69.少なくとも1つのN末端修飾インスリン、少なくとも1つの極性有機溶媒およびHLBが10を超える少なくとも2つの非イオン性界面活性剤を含む液体医薬組成物であり、油もいかなるの他の液体構成成分もHLBが7未満の界面活性剤も含有しない、態様57から61のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
70.組成物が、水性媒体における希釈後にマイクロエマルジョンまたはナノエマルジョンを形成する、態様57から69のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
71.有機溶媒が、ポリオールからなる群から選択される、態様57から70のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
72.有機溶媒が、プロピレングリコール、グリセロールおよびそれらの混合物からなる群から選択される、態様57から71のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
73.有機溶媒が、プロピレングリコールである、態様57から72のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
74.前記非イオン性界面活性剤のうちの1つまたは複数が、C8脂肪酸(カプリレート)、C10脂肪酸(カプレート)またはC12脂肪酸(ラウレート)などの中鎖脂肪酸基を含む、態様69から73のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
75.前記非イオン性界面活性剤のうちの1つまたは複数が、Labrasol (カプリロカプロイルマクロゴールグリセリドとも命名される)、Tween 20 (ポリソルベート20またはポリエチレングリコールソルビタンモノラウレートとも命名される)、Tween 80 (ポリソルベート80とも命名される)、ジグリセロールモノカプリレート、ポリグリセロールカプリレートおよびCremophor RH 40からなる群から選択される、態様69から73のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
76.有機溶媒が、約1%から約15%までの量で存在する、態様57から75のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
77.生理学的pHにおける修飾基が、親インスリンのN末端とコンジュゲートしている、1モル当たり200g未満のMWを有している1つまたは2つの有機置換基である、態様57から76のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
78.生理学的pHにおける修飾基が、式I:
【０１７６】
【化１８】
2013540771.tif 000028
【０１７７】
または、代替表示として:
【０１７８】
【化１９】
2013540771.tif 000029
【０１７９】
(式中、YおよびZは、インスリンペプチドのN末端アミノ酸と接続している)中のYおよびZと指定される、態様57から77のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
79. YおよびZが、異なり、
Yが、R-C(=X)-であり、
Zが、Hであり、
Rが、H、NH2、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジメチルアンモニウム、ジエチルアンモニウムまたはジプロピルアンモニウムで置換されている直鎖または分岐したC2〜C4アシル、C5〜C6シクロアルキル、置換されたC5〜C6シクロアルキル、5-または6員の飽和ヘテロシクリル、置換された5-または6員の飽和ヘテロシクリルであり、
Xが、OまたはSである、態様78に記載の経口医薬組成物。
80. YおよびZが、異なり、
Yが、R-C(=X)-であり、
Zが、Hであり、
Rが、H、NH2、直鎖または分岐したC1〜C4アルキル、C5〜C6シクロアルキル、5-または6員の飽和ヘテロシクリルであり、
Xが、OまたはSである、態様78に記載の経口医薬組成物。
81. Y=Z= C1〜C4である、態様78に記載の経口医薬組成物。
82. YおよびZが、同じで、ジメチル、ジエチル、ジ-n-プロピル、ジ-sec-プロピル、ジ-n-ブチル、ジ-i-ブチルおよびアミジニルからなる群から選択される、態様78に記載の経口医薬組成物。
83. YおよびZが、同じで、ジメチルおよびジエチルから選択される、態様78に記載の経口医薬組成物。
84. YおよびZが、同じで、ジメチルである、態様78に記載の経口医薬組成物。
85. N末端修飾が、生理学的pHにおいて正に荷電している、態様57から84のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
86. N末端修飾が、N,N-ジ-C1〜4アルキル、N-アミジニル、4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタノイル、3-(1-ピペリジニル)プロピオニル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル、N,N-ジメチル-グリシンおよびN,N,N-トリメチルグリシンからなる群から選択される、態様57から84のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
87. N末端修飾が、N,N-ジ-C1〜4アルキルである、態様86に記載の経口医薬組成物。
88. N末端修飾が、N,N-ジメチルまたはN,N-ジエチルである、態様87に記載の経口医薬組成物。
89. N末端修飾基が、マロニルでもスクシニルでもない、態様57から80のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
90. N末端修飾基が、マロニルではない、態様57から80のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
91. N末端修飾基が、スクシニルではない、態様57から80のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
92. N末端修飾基が、N,N-ジメチル、N,N-ジエチル、カルバモイル、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、グルタリル、およびジグリコリルからなる群から選択される、態様57から80のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
93. N末端修飾が、カルバモイル、チオカルバモイル、短鎖アシル基、オキサリル、グルタリルおよびジグリコリルからなる群から選択される、態様57から80のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
94. N末端修飾が、カルバモイル、チオカルバモイル、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ピログルタミル、オキサリル、グルタリルおよびジグリコリルからなる群から選択される、態様57から80のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
95. N末端修飾が、生理学的pHにおいて中性である、態様57から80のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
96. N末端修飾が、カルバモイル、チオカルバモイル、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、およびピログルタミルからなる群から選択される、態様57から80のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
97. N末端修飾が、生理学的pHにおいて負に荷電している、態様57から80のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
98. N末端修飾が、オキサリル、グルタリルおよびジグリコリルからなる群から選択される、態様57から80のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
99. N末端修飾インスリンが、ペプチド部、N末端修飾基および、場合により、ペプチド部と接続している親油性置換基からなり、ペプチド部が、ヒトインスリン、desB30ヒトインスリン、修飾が8個未満のヒトインスリンまたは修飾が8個未満のdesB30ヒトインスリンである、態様57から98のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
100.ペプチド部が、A8H、A14E、A14H、A14D、A21G、desA21、B1E、desB1、B3Q、B3G、B16H、B16E、B25H、B25N、B26G、B26D、B26E、B27G、B27E、B27D、desB27、B28G、B28E、B28D、desB28、およびdesB30からなる群から選択される少なくとも1つの位置で置換されている修飾が8個未満のヒトインスリンである、態様99に記載の経口医薬組成物。
101.ペプチド部が、A14E、A21G、B3Q、B16H、B16E、B25H、B25N、B26G、B27G、desB27、B28G、およびdesB30からなる群から選択される少なくとも1つの位置で置換されている修飾が8個未満のヒトインスリンである、態様99に記載の経口医薬組成物。
102.ペプチド部が、A8H、A14E、A14H、A14D、A21G、desA21、B1E、desB1、B3Q、B3G、B16H、B16E、B25H、B25N、B26G、B26D、B26E、B27G、B27E、B27D、desB27、B28G、B28E、B28D、desB28、およびdesB30からなる群から選択される少なくとも2つの位置で置換されている修飾が8個未満のヒトインスリンである、態様99に記載の経口医薬組成物。
103.ペプチド部が、A14E、A21G、B3Q、B16H、B16E、B25H、B25N、B26G、B27G、desB27、B28G、およびdesB30からなる群から選択される少なくとも2つの位置で置換されている修飾が8個未満のヒトインスリンである、態様99に記載の経口医薬組成物。
104.ペプチド部が、少なくとも1つの疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されているように置換されている、修飾が8個未満のヒトインスリンであり、前記置換が、インスリンの1つまたは複数のプロテアーゼ切断部位内であるか近接している、態様57から104のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
105.ペプチド部が、A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B16E,B25H,desB27,desB30ヒトインスリンおよびB25H,desB27,desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様57から104のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
106.ペプチド部が、A14E,A21G,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B16E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30ヒトインスリン;A21G,B25H,desB30ヒトインスリンおよびA21G,B25N,desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様57から104のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
107.ペプチド部が、A14E,A21G,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B16E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30ヒトインスリン;A21G,B25H,desB30ヒトインスリンおよびA21G,B25N,desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様57から104のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
108.ペプチド部が、A14E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,B16E,B25H,desB30ヒトインスリン;A14E,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B16H,desB27,desB30ヒトインスリン;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30ヒトインスリン;B25H,desB30ヒトインスリンおよびA14E,B25H,desB27,desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、態様57から104のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
109. N末端修飾インスリンが、ペプチド部、N末端修飾基およびペプチド部と接続している親油性置換基からなり、親油性置換基が、ペプチド部のアミノ酸位置において、場合により、リンカーを介して、インスリンと接続している脂肪酸または脂肪二酸からなる側鎖である、態様57から108のいずれか一態様に記載の経口医薬組成物。
110.ペプチド部が、ただ一つのリシン残基を含み、親油性置換基が、前記リシン残基と、場合によりリンカーを介して、接続している、態様109に記載のN末端修飾インスリン。
111.親油性置換基が、一般式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-(式III)
(式中、
nは、0または1から3までの範囲の整数であり;
mは、0または1から10までの範囲の整数であり;
pは、0または1から10までの範囲の整数であり;
Acyは、約8個から約24個までの炭素原子を含む脂肪酸または脂肪二酸であり;
AA1は、中性の直線または環状のアミノ酸残基であり;
AA2は、酸性のアミノ酸残基であり;
AA3は、中性の、アルキレングリコール含有アミノ酸残基であり;
AA1、AA2およびAA3が式中に現れる順序は、独立して交換することができ;AA2は、式に沿って数回現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);AA2は、式に沿って数回独立して(=異なっている)現れることができ(例えば、Acy-AA2-AA32-AA2-);Acy、AA1、AA2および/またはAA3の間の連結は、形式的に、Acy、AA1、AA2およびAA3の各々からの水素原子またはヒドロキシル基(水)の除去により得ることができるアミド(ペプチド)結合であり;ペプチド部への接続は、式(III)のアシル部分におけるAA1、AA2、またはAA3残基のC末端から、または式(III)の部分に存在するAA2残基の側鎖のうちの1つからであってよい)を有する、態様109または110に記載のN末端修飾インスリン。
112.態様1から111のいずれか一態様に記載のN末端修飾インスリン誘導体を製造する方法。
【０１８０】
本明細書で引用されている刊行物、特許出願、および特許を包含するすべての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれると個別にかつ具体的に指示され、本明細書にその全体が記載されているのと同じ程度に(法律で認められている最高の程度に)、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１８１】
すべての表題および小見出しは、本明細書において便宜のためのみに使用され、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１８２】
本明細書において提供されるありとあらゆる実施例、または例示的な言葉(例えば「など(such as)」)の使用は、単に、本発明をより良く解明することが意図されており、別段の主張がない限り、本発明の範囲に対する限定をもたらすものではない。明細書におけるどの言葉も、本発明の実施に不可欠として任意の主張されていない要素を指示していると解釈されるべきではない。
【０１８３】
本明細書における特許文書の引用および組み込みは、便宜のためのみに行われ、そのような特許文書の妥当性、特許性、および/または法的強制力のいかなる見解も反映しない。
【０１８４】
本発明は、適用可能な法律で認められているような本明細書に添付されている特許請求の範囲に列挙されている主題のすべての変更形態および等価形態を包含する。
【０１８５】
(実施例)
下記の実施例は、限定ではなく、例証のために提供される。
【０１８６】
本明細書で使用される略語は、下記のものである:βAlaは、ベータ-アラニルであり、Aocは、8-アミノオクタン酸であり、tBuは、tert-ブチルであり、CVは、カラム体積であり、DCMは、ジクロロメタンであり、DICは、ジイソプロピルカルボジイミドであり、DIPEA=DIEAは、N,N-ジイソプロピルエチルアミンであり、DMFは、N,N-ジメチルホルムアミドであり、DMSOは、ジメチルスルホキシドであり、EtOAcは、酢酸エチルであり、Fmocは、9-フルオレニルメチルオキシカルボニルであり、γGluは、ガンマL-グルタミルであり、HClは、塩酸であり、HOBtは、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、NMPは、N-メチルピロリドンであり、MeCNは、アセトニトリルであり、OEGは、[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エチルカルボニルであり、Suは、スクシンイミジル-1-イル=2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルであり、OSuは、スクシンイミジル-1-イルオキシ=2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシであり、RPCは、逆相クロマトグラフィーであり、RTは、室温であり、TFAは、トリフルオロ酢酸であり、THFは、テトラヒドロフランであり、TNBSは、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸であり、TRISは、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンであり、TSTUは、テトラフルオロホウ酸O-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムである。
【０１８７】
下記の実施例および一般手順は、明細書および合成スキームで同定された中間体化合物および最終生成物に言及する。本発明の化合物の調製は、下記の実施例を使用して詳細に記載されるが、記載されている化学反応は、本発明の化合物の調製へのそれらの一般的適用性の観点から開示されている。たまに、反応は、本発明の開示されている範囲内に包含される各化合物に記載されているように適用可能でないことがある。これが生じる化合物は、当業者により容易に認識されるであろう。これらの場合に、反応は、当業者に知られている従来の改変により、すなわち、妨害する基の適切な保護により、他の従来の試薬に変えることにより、または反応条件の常法に従う改変により成功裏に行うことができる。あるいは、本明細書に開示されているかさもなければ従来の他の反応は、本発明の対応する化合物の調製に適用可能になるであろう。すべての調製方法において、すべての出発材料は、知られているか知られている出発材料から容易に調製することができる。すべての温度は、セ氏温度で記載され、別段の指示がない限り、すべての部および百分率は、収率へ言及する場合には重量により、すべての部は、溶媒および溶離液へ言及する場合には体積による。
【０１８８】
本発明の化合物は、当技術分野内で典型的である下記の手順のうちの1つまたは複数を用いることにより精製することができる。これらの手順は、必要とされれば、グラジエント、pH、塩、濃度、流量、カラムなどに関して改変されてよい。不純物プロファイル、対象とするインスリンの溶解性などの要因に応じて、これらの改変は、当業者により容易に認識され行われうる。
【０１８９】
酸性HPLCまたは脱塩後、化合物は、純粋な画分の凍結乾燥により単離される。
【０１９０】
中性HPLCまたは陰イオン交換クロマトグラフィー後、化合物は、脱塩され、等電pHにおいて沈降され、または酸性HPLCにより精製される。
【０１９１】
典型的な精製手順:
HPLCシステムは、下記からなるGilsonシステムである: 215型液体ハンドラー、322-H2型ポンプおよび155型UV検出器。検出は、典型的には、210nmおよび280nmにおける。
【０１９２】
Akta Purifier FPLCシステム(GE Health Care)は、下記からなる:P-900型ポンプ、UV-900型UV検出器、pH/C-900型pHおよび電導度検出器、Frac-950型フラクションコレクター。UV検出は、典型的には、214nm、254nmおよび276nmにおける。Akta Explorer Air FPLCシステム(Amersham BioGE Health Caresciences)は、下記からなる: P-900型ポンプ、UV-900型UV検出器、pH/C-900型pHおよび電導度検出器、Frac-950型フラクションコレクター。UV検出は、典型的には、214nm、254nmおよび276nmにおける。
酸性HPLC:
カラム: Phenomenex、Gemini、5μ、C18、110Å、250×30cm
流量: 20ml/分
溶離液: A:水中の0.1%TFA B: CH3CN中の0.1%TFA
グラジエント: 0-7.5分: 10%B
7.5-87.5分: 10%Bから60%B
87.5-92.5分: 60%B
92.5-97.5分: 60%Bから100%B
中性HPLC:
カラム: Phenomenex、Gemini、C18、5μm 250×30.00mm、110Å
流量: 20ml/分
溶離液: A:水性10mM TRIS中の20%CH3CN+15mM(NH4)SO4 pH=7.3 B: 80%CH3CN、20%水
グラジエント: 0-7.5分: 0%B
7.5-52.5分: 0%Bから60%B
52.5-57.5分: 60%B
57.5-58分: 60%Bから100%B
58-60分: 100%B
60-63分: 10%B
陰イオン交換クロマトグラフィー:
カラム: RessourceQ、6ml、
流量: 6ml/分
緩衝液A: 0.09%NH4HCO3、0.25%NH4OAc、42.5%エタノール  pH8.4
緩衝液B: 0.09%NH4HCO3、2.5%NH4OAc、42.5%エタノール  pH8.4
グラジエント: 30CVの間に100%Aから100%B
カラム: Source 30Q、30×250mm
流量: 80ml/分
緩衝液A: 50%エタノール中の15mM TRIS、30mM酢酸アンモニウム、pH7.5 (1.25mS/cm)
緩衝液B: 50%エタノール中の15mM TRIS、300mM酢酸アンモニウム、pH7.5 (7.7mS/cm)
グラジエント: 40CVにわたって15%Bから70%B
脱塩:
カラム: Daiso 200Å 15um FeFgel 304、30×250mm
緩衝液A: 20v/v%エタノール、0.2%酢酸
緩衝液B: 80%v/v%エタノール、0.2%酢酸
グラジエント: 1.5CVにわたって0〜80%B
流量: 80ml/分
カラム: HiPrep 26/10
流量: 10ml/分
グラジエント: 6CV
緩衝液: 10mM NH4HCO3
【０１９３】
一般式(II):
(II): Acy-AA1n-AA2m-AA3p-Act、
(式中、Acy、AA1、AA2、AA3、n、m、およびpは、上で定義されている通りであり、Actは、N-ヒドロキシスクシンイミド(OSu)、または1-ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの活性エステルの脱離基であり、
アシル部分のAcyおよびAA2部分内のカルボン酸は、tert-ブチルエステルとして修飾されている)のアシル化試薬の固相合成のための一般手順。
【０１９４】
本発明による一般式(II)の化合物は、固相ペプチド合成の分野において当業者によく知られている手順を使用して固体支持体上で合成することができる。この手順は、ポリスチレン2-クロロトリチルクロリド樹脂へのFmoc保護アミノ酸の接続を含む。接続は、例えば、トリエチルアミンまたはN,N-ジイソプロピルエチルアミンのような三級アミンの存在下に遊離のN末端修飾アミノ酸を使用して達成することができる(下の参考文献を参照)。このアミノ酸のC末端(樹脂と接続している)は、本発明のインスリンとカップリングしている合成配列の末端部にあたる。樹脂へのFmocアミノ酸の接続後、Fmoc基は、例えば、ピペリジンまたはジエチルアミンのような二級アミンを使用して脱保護され、続いて、別の(または、同じ)Fmoc保護アミノ酸とカップリングされ、脱保護される。合成配列は、ヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸またはエイコサン二酸のモノ-tert-ブチルエステルのようなモノ-tert-ブチル保護脂肪(α,ω)二酸のカップリングにより終了される。樹脂からの化合物の切断は、0.5〜5% TFA/DCM (ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸)のような希釈された酸、酢酸(例えば、DCM中の10%、またはHOAc/トリフルオロエタノール/DCM 1:1:8)、またはDCM中のヘキサフルオロイソプロパノールを使用して達成される(例えば、「Organic Synthesis on Solid Phase」、F.Z. Dorwald、Wiley-VCH、2000年ISBN 3-527-29950-5、「Peptides: Chemistry and Biology」、N. SewaldおよびH.-D. Jakubke、Wiley-VCH, 2002年  ISBN 3-527-30405-3または「The Combinatorial Chemistry Catalog」1999年、Novabiochem AG、およびその中に引用されている参考文献を参照)。これは、カルボン酸保護基として化合物中に存在するtert-ブチルエステルが脱保護されないことを保証している。最後に、C末端カルボキシル基(樹脂から解放された)は、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(OSu)として活性化され、本発明のインスリンとの接続におけるカップリング試薬として直接かまたは精製後に使用される。この手順は、WO09115469中の実施例9に記載されている。
【０１９５】
あるいは、上の一般式(II)のアシル化試薬は、下に記載されているような溶液相合成により調製することができる。
【０１９６】
ヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸またはエイコサン二酸のモノ-tert-ブチルエステルなどのモノ-tert-ブチル保護脂肪二酸は、例えば、下に記載されているようなOSu-エステルとしてまたはHOBt-エステルもしくはHOAt-エステルなどの当業者に知られている任意の他の活性化エステルとして活性化される。この活性エステルは、DIPEAまたはトリエチルアミンなどの適当な塩基の存在下にTHF、DMF、NMP (または、溶媒混合物)などの適当な溶媒中でアミノ酸AA1、モノ-tert-ブチル保護AA2、またはAA3のうちの1つとカップリングされる。中間体は、例えば、抽出手順により、またはクロマトグラフィー手順により単離される。得られる中間体は、活性化(上に記載されているように)および上に記載されているようなアミノ酸AA1、モノ-tert-ブチル保護AA2、またはAA3のうちの1つとのカップリングに再び供される。この手順は、望ましい保護中間体Acy-AA1n-AA2m-AA3p-OHが得られるまで繰り返される。これは、一般式(II) Acy-AA1n-AA2m-AA3p-Actのアシル化試薬を得るために、同様に活性化される。この手順は、WO09115469中の実施例11に記載されている。
【０１９７】
上の方法のいずれかにより調製されるアシル化試薬は、OSuエステルとしての活性化後に(tert-ブチル)脱保護することができる。これは、OSu-活性化tert-ブチル保護アシル化試薬のTFA処理により行うことができる。任意のインスリンのアシル化後、結果として生じる本発明の脱保護されたアシル化プロテアーゼ安定化(親)インスリンが得られる。この手順は、WO09115469中の実施例16に記載されている。
【０１９８】
上の方法のいずれかにより調製される試薬が、OSuエステルとしての活性化後に(tert-ブチル)脱保護されなければ、任意のインスリンのアシル化は、対応する本発明のtert-ブチル保護アシル化インスリンを与える。本発明の脱保護されたアシル化インスリンを得るために、保護インスリンは、脱保護されなければならない。これは、本発明の脱保護されたアシル化(親)インスリンを得るためのTFA処理により行うことができる。この手順は、WO05012347中の実施例1に記載されている。
【０１９９】
N末端保護のないアシル化インスリン(すなわち、本発明のN末端修飾類似体(親インスリン)を調製するための出発材料)を調製するための方法は、WO09115469中に見いだすことができる。
【０２００】
本発明のアシル化インスリンの還元N-メチル化のための調製のための一般手順(A)
アシル化インスリン(0.022mol)を、N-メチルホルムアミド、DMF、NMP、THFまたはDMSOなどの極性の非プロトン性またはプロトン性の溶媒(3.8ml)と0.2Mクエン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液または希酢酸、pH4.5 (2.2mL、0.44mmol;緩衝液の調製:クエン酸0.2M+NaOH 0.35M)の混合物に溶かし、混合物を、穏やかに撹拌する。37%水性ホルムアルデヒド溶液(0.063ml、おおよそ0.82mmol)-または、N,N-ジエチル誘導体が望まれるならばアセトアルデヒド-を添加し、続いて、メタノールまたは水(0.3mL)中のシアノ水素化ホウ素ナトリウム(21mg、0.33mmol)の新たに調製した溶液を添加する。混合物を、穏やかに撹拌する。反応の終了後、混合物を、1N塩酸の滴下添加によりpH2〜3まで注意深く酸性化する。生成物を、調製用HPLCにより単離する。
【０２０１】
一般手順(A)は、実施例1において例証される。
【０２０２】
(実施例1)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２０３】
【化２０】
2013540771.tif 000030
【０２０４】
A14E,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン(0.5g)を、DMF (10mL)に溶かし、クエン酸塩緩衝液(0.2M、pH4.5、7mL、0.2Mクエン酸および0.35M NaOHから調製した)を添加した。この溶液に、水性ホルムアルデヒド(37%、0.35mL)と、続いて、メタノール(1mL)に溶かしたシアノ水素化ホウ素ナトリウム(80mg)を添加した。得られた混合物を、15時間にわたって室温において放置し、次いで、水(10mL)を添加し、pHを、1N塩酸で2に調整した。
【０２０５】
類似体は、調製用HPLCにより精製した:
カラム: Phenomenex、Gemini、5μ、C18、110Å、250×30cm
流量: 20ml/分
溶離液: A:水中の0.1%TFA B: CH3CN中の0.1%TFA
グラジエント: 0-7.5分: 10%B
7.5-87.5分: 10%Bから60%B
87.5-92.5分: 60%B
92.5-97.5分: 60%Bから100%B
97.5-100分: 100%B
100-103分: 10%B
【０２０６】
純粋な画分をプールし、凍結乾燥した。乾燥材料を、水(50mL)に溶かし、pH=8.1まで0.1N NaOHを添加し、凍結乾燥すると、表題インスリン類似体0.26gが得られた。
MALDI-MS: m/z: 6434;計算値: 6434
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1609.65 (6434)
【０２０７】
同様に、下記の類似体を調製した:
【０２０８】
(実施例2)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジエチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジエチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジエチル,N{B1},N{B1}-ジエチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２０９】
【化２１】
2013540771.tif 000031
【０２１０】
この類似体は、アセトアルデヒド(0.43mL)を使用するが、上に記載されているように同様に調製した。類似体は、上に記載されているような酸性HPLCにより最初に、続いて、中性HPLCにより精製した:
カラム: Phenomenex、Gemini、5μ、C18、110Å、250×30cm
流量: 20mL/分
溶離液: A:水性10mM TRIS中の20%CH3CN+15mM(NH4)SO4 pH=7.3 B: 80%CH3CN、20%水
グラジエント: 0-7.5分: 0%B
7.5-52.5分: 0%Bから60%B
52.5-57.5分: 60%B
57.5-58分: 60%Bから100%B
58-60分: 100%B
60-63分: 10%B
【０２１１】
純粋な画分を、真空中で濃縮し、水に溶かし、pHを、1N塩酸を使用して2に調整し、HPLCにより脱塩した:
カラム: Phenomenex、Gemini、5μ、C18、110Å、250×30cm
流量: 20mL/分
溶離液: A:水中の0.1%TFA B: CH3CN中の0.1%TFA
グラジエント: 0-7.5分: 0%B
7.5-27.5分: 0%Bから60%B
27.5-32.5分: 60%B
32.5-38分: 60%Bから100%B
38-40分: 100%B
40-43分: 10%B
【０２１２】
純粋な画分をプールし、凍結乾燥した。乾燥材料を、水(50mL)に溶かし、pH=8.1まで0.1N NaOHを添加し、凍結乾燥すると、表題インスリン類似体0.14gが得られた。
MALDI-MS: m/z: 6493;計算値: 6491
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1623.6 (6490)
【０２１３】
(実施例3)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B16H,B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル、N{B1},N{B1}-ジメチル、N{イプシロン-B29}- [(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB16.HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２１４】
【化２２】
2013540771.tif 000032
【０２１５】
A14E,B16H,B25H,desB30ヒトインスリン(2.2g、タンパク質含有量49%)を、水性炭酸ナトリウム(40mL、100mM)に溶かし、pH11まで水性水酸化ナトリウム(1N)を添加した。激しい撹拌下で、N-メチルピロリドン(NMP、4mL)に溶かした(S)-2-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ペンタン二酸5-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル(0.2g)を添加し、得られた混合物を、5分にわたって撹拌した。水(40mL)を添加し、pHを、塩酸(1N)の添加により5.7に調整した。沈殿物を、遠心分離およびデカンテーションにより単離した。残渣を、N,N-ジメチルホルムアミド(20mL)に溶かし、水性クエン酸緩衝液(0.2M、pH4.5)を添加した。水性ホルムアルデヒド(35%、0.12mL)およびメタノール(8mL)中のシアノ水素化ホウ素ナトリウム(0.37g)の溶液を添加し、得られた混合物を、6日にわたって放置した。水(20mL)およびpH1.6まで塩酸を添加し、混合物を、HPLCにより精製した。これにより、表題化合物130mgが得られた。
MALDI-MS: m/z: 6086;計算値: 6090
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1523,56;計算値: 1523.53
【０２１６】
(実施例4)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２１７】
【化２３】
2013540771.tif 000033
【０２１８】
A14E,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン(1g)を、DMF (10mL)およびNMP (10mL)に添加した。得られた懸濁液へ、クエン酸塩緩衝液(25mL 0,2M、pH4.5)を添加した。得られた混合物(pHは、6.5であった)へ、pH4.5まで1N塩酸を添加した。水性ホルムアルデヒド(35%、0.18mL)およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム(0.2g)を、混合物へ添加し、得られた混合物を、30分にわたって室温において穏やかに撹拌した。水(20mL)を、混合物へ添加し、pHを、1.2に調整した。混合物を、調製用HPLCにより精製した。純粋な画分をプールし、凍結乾燥した。インスリンを、水(70mL)に溶かし、pHを、1N NaOHで8.4に調整した。凍結乾燥すると、表題インスリン0.42gが得られた。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1511.69;計算値: 1511.8
【０２１９】
(実施例5)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des- ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２２０】
【化２４】
2013540771.tif 000034
【０２２１】
水(15ml)およびTHF (10ml)中のA14E,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB27,desB30ヒトインスリン(600mg)の溶液を、氷酢酸を使用して4.2にpH調整した。ホルムアルデヒド(37%、0.078ml)と、続いて、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(48mg)を添加した。混合物を、30分にわたって室温において撹拌した。pHを、1N NaOHで11.5に調整した。混合物を、1N NaOHで8にpHを再調整する前に30分にわたって放置した。混合物を、50%エタノールで400mlおよび1.4mS/cmまで希釈した。混合物を、Akta Explorer Airを使用して下記の通り陰イオン交換により精製した:
カラム: Source 30Q、30×250mm
流量: 60ml/分
緩衝液A: 50%エタノール中の15mM TRIS、30mM酢酸アンモニウム、pH7.5 (1,25mS/cm)
緩衝液B: 50%エタノール中の15mM TRIS、300mM酢酸アンモニウム、pH7.5 (7.7mS/cm)
グラジエント: 7CVにわたって15%Bから70%B
【０２２２】
化合物を、400ml中に集め、脱塩前に水で800mlまで希釈した:
カラム: Daiso 200Å 15um FeFgel 304、30×250mm
緩衝液A: 20v/v%エタノール、0.2%酢酸
緩衝液B: 80%v/v%エタノール、0.2%酢酸
グラジエント: 1.5CVにわたって0〜80%B
流量: 80ml/分
【０２２３】
集められた化合物を、真空中で濃縮してエタノールを除去した。pHを、1N NaOHで8.1に調整し、凍結乾燥した。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1584.15;計算値: 1584.36
【０２２４】
(実施例6)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14],des- ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２２５】
【化２５】
2013540771.tif 000035
【０２２６】
この類似体は、一般手順Aに従って調製した。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1586.31;計算値: 1586.85
【０２２７】
(実施例7)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２２８】
【化２６】
2013540771.tif 000036
【０２２９】
この類似体は、ホルムアルデヒドを使用し、上に記載されているように同様に調製した。類似体は、上に記載されているような酸性HPLCにより精製した:
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1610;計算値: 1610.1
【０２３０】
(実施例8)
一般手順(A):
A1G(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1F(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２３１】
【化２７】
2013540771.tif 000037
【０２３２】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1505 (M+1)/4;計算値: 1505
【０２３３】
(実施例9)
一般手順(A):
A1G(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1F(N(アルファ),N(Nα,Nα-ジメチル),B25H,desB27,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２３４】
【化２８】
2013540771.tif 000038
【０２３５】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1577 (M+1)/4;計算値: 1577
【０２３６】
下記の実施例中の類似体は、同様に調製することができる:
【０２３７】
(実施例10)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２３８】
【化２９】
2013540771.tif 000039
【０２３９】
(実施例11)
一般手順(A):
A1(Nα,Nα-ジメチル),A14E,B1(Nα,Nα-ジメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1},N{A1}-ジメチル,N{B1},N{B1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２４０】
【化３０】
2013540771.tif 000040
【０２４１】
本発明のアシル化インスリンのカルバモイル化のための調製のための一般手順(B)
アシル化インスリンを、生理学的pH近辺の緩衝液に溶かし、過剰のシアン酸ナトリウムまたはシアン酸カリウムを添加する。混合物を、反応の終了まで放置する。必要ならば、より多くのシアン酸塩を添加する。生成物を、調製用HPLCイオン交換クロマトグラフィー、または脱塩により単離する。
【０２４２】
一般手順(B)は、下記の実施例において例証される。
【０２４３】
(実施例12)
一般手順(B):
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン:
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２４４】
【化３１】
2013540771.tif 000041
【０２４５】
A14E,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-OEG-OEG),desB30ヒトインスリン(0.4g)を、リン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH7.3、40mL)に溶かし、シアン酸カリウム(300mg)を添加した。混合物を、3日にわたって室温において放置した。場合により、より多くのシアン酸カリウムを反応中に添加する。塩酸(0.1N)を、pH1.6まで添加し、類似体を、調製用HPLCにより精製した:
カラム: Phenomenex、Gemini、5μ、C18、110Å、250×30cm
流量: 20ml/分
溶離液: A:水中の0.1%TFA B: CH3CN中の0.1%TFA
グラジエント: 0-7.5分: 0%B
7.5-22.5分: 0%Bから60%B
22.5-27.5分: 60%B
27.5-33分: 60%Bから100%B
33-38分: 100%B
【０２４６】
純粋な画分をプールし、凍結乾燥した。水を添加し、pHを、0.1N NaOHで8.1に調整し、混合物を凍結乾燥すると、表題インスリン0.172gが得られた。
MALDI-MS: m/z: 6465;計算値: 6464。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1616.9;計算値: 1617.2
【０２４７】
(実施例13)
一般手順(B):
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２４８】
【化３２】
2013540771.tif 000042
【０２４９】
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1538;計算値: 1538
【０２５０】
(実施例14)
一般手順(B):
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２５１】
【化３３】
2013540771.tif 000043
【０２５２】
この類似体は、上に記載されているように同様に調製した。類似体は、実施例10で上に記載されているような酸性HPLCにより精製した。
MALDI-MS: m/z: 6202.75;計算値: 6202.16
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1551.29;計算値: 1551.55
【０２５３】
(実施例15)
一般手順(B):
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２５４】
【化３４】
2013540771.tif 000044
【０２５５】
この類似体は、上に記載されているように同様に調製した。類似体は、実施例10で上に記載されているような酸性HPLCにより精製した。
MALDI-MS: m/z: 6493.52;計算値: 6491.84
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1623.96;計算値: 1624.1
【０２５６】
(実施例16)
一般手順(B):
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２５７】
【化３５】
2013540771.tif 000045
【０２５８】
この類似体は、上に記載されているように同様に調製した。類似体は、実施例10で上に記載されているような酸性HPLCにより精製した。
MALDI-MS: m/z: 6469.46;計算値: 6466.45
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1617,4;計算値: 1617.6
【０２５９】
(実施例17)
一般手順(B):
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２６０】
【化３６】
2013540771.tif 000046
【０２６１】
A14E,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン(1g)を、リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3、50mL)に溶かした。水(10mL)中のシアン酸カリウム(1.01g)を、5時間かけて5回に分けて添加した。より多くのシアン酸カリウム(200mg)を添加し、混合物を、終夜にわたって穏やかに撹拌した。続いて、混合物を、調製用HPLCにより精製した。純粋な画分をプールし、凍結乾燥し、次いで、水に溶かし、pHを、1N NaOHで7.8に調整した。凍結乾燥すると、表題インスリン359mgが得られた。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1519.38;計算値: 1519.3
【０２６２】
(実施例18)
一般手順(B):
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０２６３】
【化３７】
2013540771.tif 000047
【０２６４】
A14E,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン(1g)を、上に記載されているように正確にシアン酸カリウム(0.8g)で処理した。
表題インスリンの収量: 210mg
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1591.84;計算値: 1591.8
【０２６５】
(実施例19)
一般手順(B):
A1G(N(アルファ)カルバモイル),A14E,B1F(N(アルファ)カルバモイル),desB27,B29K(N(イプシロン)ヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２６６】
【化３８】
2013540771.tif 000048
【０２６７】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1515(M+1)/4;計算値: 1515
【０２６８】
(実施例20)
一般手順(B):
A1G(N(アルファ)カルバモイル),A14E,B1F(N(アルファ)カルバモイル),desB27,B29K(Nイプシロン)ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２６９】
【化３９】
2013540771.tif 000049
【０２７０】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1588(M+1)/4;計算値: 1588
【０２７１】
(実施例21)
一般手順(B):
A1G(N(アルファ)カルバモイル),A14E,B1F(N(アルファ)カルバモイル),desB27,B29K(Nイプシロン)-エイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２７２】
【化４０】
2013540771.tif 000050
【０２７３】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1529(M+1)/4;計算値: 1529
【０２７４】
(実施例22)
一般手順(B):
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),B16H,desB27,B29K(Nイプシロン)-エイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]-エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２７５】
【化４１】
2013540771.tif 000051
【０２７６】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1592.37(M+1)/4;計算値: 1592.33
【０２７７】
(実施例23)
一般手順(B):
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル)、desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２７８】
【化４２】
2013540771.tif 000052
【０２７９】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1522.3(M+1)/4;計算値: 1521.8
【０２８０】
下記の実施例中のインスリンは、同様に調製することができる。
【０２８１】
(実施例24)
一般手順(B):
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB16H,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２８２】
【化４３】
2013540771.tif 000053
【０２８３】
下記の実施例中のインスリンは、同様に調製することができる。
【０２８４】
(実施例25)
一般手順(B):
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２８５】
【化４４】
2013540771.tif 000054
【０２８６】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1594.3(M+1)/4;計算値: 1594.4
【０２８７】
下記の実施例中のインスリンは、同様に調製することができる。
【０２８８】
(実施例26)
一般手順(B):
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２８９】
【化４５】
2013540771.tif 000055
【０２９０】
(実施例27)
一般手順(B):
A1(Nαカルバモイル),A14E,B1(Nαカルバモイル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２９１】
【化４６】
2013540771.tif 000056
【０２９２】
下記の類似体は、上に記載されているように同様に調製することができる。
【０２９３】
(実施例28)
一般手順(B):
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２９４】
【化４７】
2013540771.tif 000057
【０２９５】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1599.0(M+1)/4;計算値: 1598.9
【０２９６】
(実施例29)
一般手順(B):
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０２９７】
【化４８】
2013540771.tif 000058
【０２９８】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1601.7(M+1)/4;計算値: 1601.4
【０２９９】
(実施例30)
一般手順(B):
A1G(Nαカルバモイル),A14E,B1F(Nαカルバモイル),B16H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモイル,N{B1}-カルバモイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB16],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３００】
【化４９】
2013540771.tif 000059
【０３０１】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1594.98(M+1)/4;計算値: 1594.85
【０３０２】
下記のインスリンは、同様に調製することができる。
【０３０３】
(実施例31)
一般手順(B):
A1G(Nαチオカルバモイル),A14E,B1F(Nαチオカルバモイル),B25H,desB27,B29K(Nε-オクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-カルバモチオイル,N{B1}-カルバモチオイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３０４】
【化５０】
2013540771.tif 000060
【０３０５】
この類似体は、シアン酸カリウムの代わりにチオシアン酸カリウムを使用し、カルバモイル誘導体について上に記載されているように同様に調製することができる。
【０３０６】
本発明のアシル化インスリンのN末端アシル化のための調製のための一般手順(C)
リシンアシル化インスリンを、場合により有機共溶媒を含有する緩衝液に溶かす。混合物のpHは、中性からアルカリ性まで(例えば、6〜8近辺から-対象とするインスリンの溶解度に応じて-最高で13または14まで)であってよく、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(OSu)として、過剰のアシル化試薬を添加する。混合物を、反応の終了まで放置する。必要ならば、より多くのアシル化試薬を添加する。生成物を、調製用HPLCにより単離する。
【０３０７】
あるいは、反応を、無水条件下、例えば、有機塩基、例えば、トリエチルアミンを含有するDMSO中で行うことができる。
【０３０８】
一般手順(C)は、下記の実施例において例証される。
【０３０９】
(実施例32)
一般手順(C):
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)。
【０３１０】
【化５１】
2013540771.tif 000061
【０３１１】
A14E,B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン(0.4g、0.066mmol)を、エタノールと0.1M水性Na2CO3の1:1混合物(10mL)に溶かし、pHを、1N塩酸で7.4に調整した。N,N-ジメチルホルムアミド(2mL)に溶かした酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(60mg、0.38mmol)を手早く滴下添加した。混合物を、3時間にわたって放置すると、pHは、9まで上昇した。数滴の水性メチルアミンを添加し、混合物を凍結乾燥した。乾燥材料を、氷酢酸、エタノールおよび水(それぞれ、10、5および20mL)に溶かし、HPLCにより精製した。純粋な画分をプールし、凍結乾燥した。これにより、表題インスリン245mg (60%)が得られた。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1537;計算値:1537
【０３１２】
(実施例33)
一般手順(C):
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３１３】
【化５２】
2013540771.tif 000062
【０３１４】
A14E,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン(1g)を、H2O/DMSO ((2/1)、30mL)に溶かし、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA) 100μLを、pH7.9まで添加した。アセトニトリル(10mL)に溶かした酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(79mg)を、15分かけて少しずつ添加すると、pHは、添加中に10.8まで変化した。2時間後、混合物を、塩酸(4M)の滴下添加により1.7まで酸性化し、得られた混合物を、調製用HPLCにより精製した。純粋な画分をプールし、凍結乾燥した。得られた生成物を、水に溶かし、pHを、1N NaOHを使って7.8に調整し、凍結乾燥した。これにより、表題インスリン160mgが得られた。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1518.71;計算値:1518.8
【０３１５】
(実施例34)
一般手順(C):
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３１６】
【化５３】
2013540771.tif 000063
【０３１７】
この化合物は、上に記載されているように調製した。
【０３１８】
A14E,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン(500mg)を、3.5時間にわたって酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(37mg)で処理した。続いて、pHを、1.5に調整し、続いて、調製用HPLCで精製した。凍結乾燥と、続く、7.8へのpH調整および凍結乾燥により、表題インスリン184mgが得られた。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1616.9;計算値:1616.6
【０３１９】
(実施例35)
一般手順(C):
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A-1},N{A-1}-ジメチル,N{B-1},N{B-1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-GlyA-1,GlyB-1[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３２０】
【化５４】
2013540771.tif 000064
【０３２１】
A14E,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-OEG-OEG),desB30ヒトインスリン(0.3g)を、アセトニトリル(4mL)に溶かし、15mLまで水で希釈した(pH=8)。アセトニトリルに溶かしたN,N-ジメチルグリシンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(38mg、下に記載されているように調製した)を滴下添加し、混合物を、100分にわたって撹拌し、数滴のメチルアミンを添加した。混合物を、氷酢酸で酸性化し、HPLCにより精製した。これにより、表題インスリンが得られた。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1638;計算値:1638
【０３２２】
N,N-ジメチルグリシンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル:
N,N-ジメチルグリシン(25mg)およびテトラフルオロホウ酸O-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム(TSTU、69mg)を、アセトニトリル(2mL)と混ぜ、N,N-ジイソプロピルエチルアミン46μLを添加した。混合物を、溶液が形成されるまで穏やかに加熱した。この混合物を、アシル化反応で、さらに特徴付けすることなく直接使用した。
【０３２３】
(実施例36)
一般手順(C):
A1(Nα3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル),A14E,B1F(Nα3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピオニル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-3-(ジメチルアミノ)プロパノイル,N{B1}-3-(ジメチルアミノ)プロパノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３２４】
【化５５】
2013540771.tif 000065
【０３２５】
3-N,N-ジメチルアミノプロピオン酸(96mg)を、アセトニトリル(10mL)中でTSTU (186mg)と共に溶かした。DIPEAを、pH>8まで添加し、混合物を、30分にわたって室温において撹拌した。次いで、得られた混合物を、水/アセトニトリル((1/1)、20mL)に溶かしたA14E,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン(500mg)の溶液に添加した。pHを、1N NaOHで7.9に調整し、得られた混合物を、30分にわたって室温において穏やかに撹拌した。続いて、pHを、1N NaOHを使用して5分にわたって10.3まで上げ、続いて、4N塩酸でpH1.3まで酸性化した。得られた混合物を、調製用HPLCにより精製した。純粋な画分をプールし、凍結乾燥すると、表題インスリン17mgが得られた。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1645.1;計算値:1645.2
【０３２６】
(実施例37)
一般手順(C):
A1(Nα4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタノイル),A14E,B1(Nα4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタノイル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-4-(ジメチルアミノ)ブタノイル,N{B1}-4-(ジメチルアミノ)ブタノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３２７】
【化５６】
2013540771.tif 000066
【０３２８】
4-(N,N-ジメチルアミノ)ブタン酸(100mg)を、アセトニトリル(10mL)中でTSTU (178mg)と混ぜた。DIPEAを、pH8まで滴下添加し、混合物を、室温において1時間にわたって撹拌した。これにより、茶色がかった液体となり、真空中で濃縮して油とした。続いて、これを、アセトニトリル(10mL)に溶かし、水に溶かしたA14E,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン(420mg)の溶液に添加した。pHは、7.8であったが、30分の反応後に6.3へ変化した。次いで、溶液を、1N塩酸の滴下添加でpH2.5まで酸性化し、得られた溶液を、調製用HPLCにより精製した。純粋な画分をプールし、凍結乾燥し、続いて、水に溶かし、pHを7.9に調整した。最終凍結乾燥後、表題インスリン100mgが得られた。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1652.0;計算値:1652.2
【０３２９】
(実施例38)
一般手順(C):
A1(Nα3-(1-ピペリジニル)プロピオニル),A14E,B1F(Nα3-(1-ピペリジニル)プロピオニル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-3-ピペリジン-1-イルプロパノイル,N{B1}-3-ピペリジン-1-イルプロパノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３３０】
【化５７】
2013540771.tif 000067
【０３３１】
3-(1-ピペリジニル)プロピオン酸(98.5mg)を、アセトニトリル(20mL)中でTSTU (188mg)と共に溶かし、pHをDIPEAの滴下添加で8に調整した。混合物を、30分にわたって室温において撹拌し、次いで、蒸発させて油とし、アセトニトリル(10mL)に再び溶かし、水(20mL)中のA14E,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン(500mg)の溶液に添加した。pHは、7.4であったが、活性化された酸の添加後に6.7へ変化した。15分にわたって室温において撹拌した後、pHを、1N NaOHの添加により10.2に調整し、混合物を、5分にわたって撹拌した。続いて、混合物を、4N塩酸の滴下添加によりpH1まで酸性化した。得られた混合物を、調製用HPLCにより精製した。純粋な画分をプールし、凍結乾燥し、続いて、水に溶かし、pHを1N NaOHを使って7.9に調整した。凍結乾燥すると、表題インスリン111mgが得られた。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1665.2;計算値:1665.2
【０３３２】
(実施例39)
一般手順(C):
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A-1},N{A-1}-ジメチル,N{B-1},N{B-1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-GlyA-1,GlyB-1[GluA14,HisB25],des-Thr27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３３３】
【化５８】
2013540771.tif 000068
【０３３４】
A14E,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン(1.1g)を、水(40mL)およびアセトニトリル(10mL)に溶かすと、得られた溶液のpHは7.5であった。上に記載されているように調製した粗製のジメチルアミノ酢酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル(294mg)を、激しい撹拌下で添加し、得られた混合物を、室温において1時間にわたってさらに撹拌した。メチルアミン(数滴)を添加し、pHを、1N NaOHで12に調整した。30分後、pHを、酢酸で4に調整し、混合物を、調製用HPLCにより精製した。純粋な画分をプールし、凍結乾燥し、続いて、水に溶かし、pHを0.1N NaOHを使って7.8に調整した。凍結乾燥すると、表題インスリン517mgが得られた。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1540.0;計算値:1540,29
【０３３５】
(実施例40)
一般手順(C):
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３３６】
【化５９】
2013540771.tif 000069
【０３３７】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1594 (M+1)/4;計算値:1591
【０３３８】
(実施例41)
一般手順(C):
A1G(Nα2-ピコリル),A14E,B1F(Nα2-ピコリル),B25H,desB27,B29K(N(イプシロン)オクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-ピリジン-2-カルボニル,N{B1}-ピリジン-2-カルボニル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３３９】
【化６０】
2013540771.tif 000070
【０３４０】
この類似体は、アシル化試薬として2-ピコリン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用して上に記載されているように同様に調製した。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1622.74;計算値:1622.88
【０３４１】
下記の実施例中の類似体は、同様にして調製することができる。
【０３４２】
(実施例42)
一般手順(C):
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３４３】
【化６１】
2013540771.tif 000071
【０３４４】
(実施例43)
一般手順(C):
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３４５】
【化６２】
2013540771.tif 000072
【０３４６】
(実施例44)
一般手順(C):
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３４７】
【化６３】
2013540771.tif 000073
【０３４８】
(実施例45)
一般手順(C):
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B16H,B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３４９】
【化６４】
2013540771.tif 000074
【０３５０】
(実施例46)
一般手順(C):
A1(Nαジメチルグリシル),A14E,B1(Nαジメチルグリシル),B16H,B25H,B29K(Nεヘキサデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A-1},N{A-1}-ジメチル,N{B-1},N{B-1}-ジメチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-GlyA-1,GlyB-1[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３５１】
【化６５】
2013540771.tif 000075
【０３５２】
(実施例47)
一般手順(C):
A-1(Nαトリメチル),A14E,B1(Nαトリメチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-[2-(トリメチルアザニウムイル)アセチル],N{B1}-[2-(トリメチルアザニウムイル)アセチル],N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]-エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３５３】
【化６６】
2013540771.tif 000076
【０３５４】
この類似体は、アシル化試薬としてN,N,N-トリメチルグリシンOSuエステルを使用してA1,B1-ジアセチル類似体と同様に調製することができる。
【０３５５】
(実施例48)
一般手順(C):
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３５６】
【化６７】
2013540771.tif 000077
【０３５７】
(実施例49)
一般手順(C):
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３５８】
【化６８】
2013540771.tif 000078
【０３５９】
(実施例50)
一般手順(C):
A1(Nαアセチル),A14E,B1(Nαアセチル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３６０】
【化６９】
2013540771.tif 000079
【０３６１】
(実施例51)
一般手順(C):
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３６２】
【化７０】
2013540771.tif 000080
【０３６３】
(実施例52)
一般手順(C):
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３６４】
【化７１】
2013540771.tif 000081
【０３６５】
(実施例53)
一般手順(C):
A1G(Nαアセチル),A14E,B1F(Nαアセチル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-アセチル,N{B1}-アセチル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３６６】
【化７２】
2013540771.tif 000082
【０３６７】
(環状)カルボン酸無水物を使用する本発明のアシル化インスリンのN末端アシル化のための調製のための一般手順(D)
リシンアシル化インスリンを、場合によりトリエチルアミンまたはN,N-ジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基を含有する極性非プロトン性溶媒に溶かし、過剰の、例えば、コハク酸無水物またはグルタル酸無水物として、アシル化試薬を添加する。混合物を、反応の終了まで放置する。必要ならば、より多くのアシル化試薬を添加する。生成物を、例えば、調製用HPLCによりまたは陰イオン交換クロマトグラフィーにより単離する。
【０３６８】
一般手順(D)は、下記の実施例において例証される。
【０３６９】
あるいは、手順(D)を、実施例55に例証されているようなN-ヒドロキシスクシンイミド活性化二酸(または、無水物)を使用して水性媒体中で行うことができる。
【０３７０】
(実施例54)
一般手順(D):
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-3-カルボキシプロパノイル,N{B1}-3-カルボキシプロパノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３７１】
【化７３】
2013540771.tif 000083
【０３７２】
A14E,B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン(WO 2009/115469、実施例57、1g)を、DMSO (15mL)に溶かし、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、136μL)を添加し、得られた混合物を、30分にわたって放置した。無水コハク酸(40mg)を添加し、得られた混合物を、1時間にわたって穏やかに撹拌した。混合物を、水(150mL)およびエタノール(150mL)で希釈し、pHを、1N塩酸で8に調整した。生成物を、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した:
A緩衝液: 50%エタノール中の15mM TRIS、30mM酢酸アンモニウム、pH8 (1.25mS/cm)
B緩衝液: 50%エタノール中の15mM TRIS、300mM酢酸アンモニウム、pH8 (8mS/cm)
カラム: 30×250mm、Source 30Q (180g)
流量: 40mL/分
【０３７３】
カラムを、A緩衝液で平衡化した。混合物を、カラムに適用し、2CVのA緩衝液と、続く、30分をかける0〜80%Bのグラジエントで溶離した。生成物を含有する画分を、おおよそ100mLまで真空中で濃縮し、生成物を、1N塩酸で4.9にpH調整することにより沈殿させた。沈殿物を、遠心分離により単離し、少しの水で洗浄し、30%アセトニトリル/水(100mL)に溶かした。pHを、1N水酸化ナトリウムで8.0に調整し、混合物を凍結乾燥した。これにより、表題化合物620mg (60%)が得られた。
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1620(M+1)/4;計算値:1620
【０３７４】
(実施例55)
一般手順(D):
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-3-カルボキシプロパノイル,N{B1}-3-カルボキシプロパノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３７５】
【化７４】
2013540771.tif 000084
【０３７６】
この類似体は、上に記載されているように同様に水性方法により調製した
【０３７７】
THF/DMF 1:1 (0.5ml)に溶かしたコハク酸(10mg)に、TSTU (30mg)およびDIPEA (0.02ml)を添加した。混合物を、2時間にわたって室温において放置した後、混合物の半分を、1M NaOHでpH9.3に調整された0.1M NaHCO3 (1ml)中のA14E,B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン(0.1g)の溶液に添加した。2時間にわたって穏やかに撹拌した後、OSu活性化コハク酸のもう半分を添加した。4時間後、pHを、1M HClで7に調整した。表題化合物を、RP HPLCにより単離した:
カラム: Phenomenex、Gemini、5μ、C18、110Å、250×20cm
流量: 10ml/分
溶離液: A: 10mM TRIS、15mM硫酸アンモニウム、20%CH3CN、pH7.3
B: CH3CN中の20%水
グラジエント: 0-7.5分: 0%B
7.5-47.5分: 0%Bから40%B
47.5-52.5分: 40%B
52.5-57,5分: 40%Bから100%B
57.5-60分: 100%B
60-63分: 0%B
【０３７８】
純粋な画分をプールし、凍結乾燥した。乾燥材料を、水およびCH3CN中の0.1%TFAに溶かし、RP HPLCにより脱塩した。
カラム: Phenomenex、Gemini、5μ、C18、110Å、250×20cm
流量: 10mL/分
溶離液: A:水中の0.1%TFA B: CH3CN中の0.1%TFA
グラジエント: 0-7.5分: 25%B
7.5-37.5分: 25%Bから60%B
37.5-42.5分: 60%B
42.5-48分: 60%Bから100%B
48-50分: 100%B
50-53分: 25%B
MALDI-MS: m/z: 6580.0;計算値: 6578.5。
LC-MS (エレクトロスプレー): (m+4)/4: 1645.68 (6578.7)
【０３７９】
(実施例56)
一般手順(D):
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-3-カルボキシプロパノイル,N{B1}-3-カルボキシプロパノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３８０】
【化７５】
2013540771.tif 000085
【０３８１】
この類似体は、上に記載されているように同様に調製した。
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1623(M+1)/4;計算値:1623
【０３８２】
(実施例57)
一般手順(D):
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-4-カルボキシブタノイル,N{B1}-4-カルボキシブタノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３８３】
【化７６】
2013540771.tif 000086
【０３８４】
この類似体は、上に記載されているように同様に調製した。
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1623(M+1)/4;計算値:1623
【０３８５】
(実施例58)
一般手順(D):
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-4-カルボキシブタノイル,N{B1}-4-カルボキシブタノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３８６】
【化７７】
2013540771.tif 000087
【０３８７】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1630(M+1)/4;計算値:1630
【０３８８】
(実施例59)
一般手順(D):
A1(Nαジグリコリル),A14E,B1(Nαジグリコリル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-[2-(カルボキシメトキシ)アセチル],N{B1}-[2-(カルボキシメトキシ)アセチル],N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３８９】
【化７８】
2013540771.tif 000088
【０３９０】
この類似体は、アシル化試薬として無水ジグリコール酸を使用して上に記載されているように同様に調製した。
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1628.14(M+1)/4;計算値:1628.35
【０３９１】
(実施例60)
一般手順(D):
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-4-カルボキシブタノイル,N{B1}-4-カルボキシブタノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３９２】
【化７９】
2013540771.tif 000089
【０３９３】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1627.4(M+1)/4;計算値:1627.4
【０３９４】
(実施例61)
一般手順(D):
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),desB27,B29K(Nεオクタデカンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-3-カルボキシプロパノイル,N{B1}-3-カルボキシプロパノイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３９５】
【化８０】
2013540771.tif 000090
【０３９６】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1550.1(M+1)/4;計算値:1550.3
【０３９７】
下記の類似体は、同様に調製することができる。
【０３９８】
(実施例62)
一般手順(D):
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-3-カルボキシプロパノイル,N{B1}-3-カルボキシプロパノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０３９９】
【化８１】
2013540771.tif 000091
【０４００】
(実施例63)
一般手順(D):
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-3-カルボキシプロパノイル,N{B1}-3-カルボキシプロパノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０４０１】
【化８２】
2013540771.tif 000092
【０４０２】
(実施例64)
一般手順(D):
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),B16H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-3-カルボキシプロパノイル,N{B1}-3-カルボキシプロパノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB16],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０４０３】
【化８３】
2013540771.tif 000093
【０４０４】
(実施例65)
一般手順(D):
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-3-カルボキシプロパノイル,N{B1}-3-カルボキシプロパノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０４０５】
【化８４】
2013540771.tif 000094
【０４０６】
(実施例66)
一般手順(D):
A1(Nαスクシニル),A14E,B1(Nαスクシニル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-3-カルボキシプロパノイル,N{B1}-3-カルボキシプロパノイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０４０７】
【化８５】
2013540771.tif 000095
【０４０８】
(実施例67)
一般手順(D):
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-4-カルボキシブタノイル,N{B1}-4-カルボキシブタノイル,N{イプシロン-B29}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０４０９】
【化８６】
2013540771.tif 000096
【０４１０】
下記の類似体は、同様に調製した。
【０４１１】
(実施例68)
一般手順(D):
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名：
N{A1}-4-カルボキシブタノイル,N{B1}-4-カルボキシブタノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14],des-ThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)
【０４１２】
【化８７】
2013540771.tif 000097
【０４１３】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1637.1(M+1)/4;計算値:1636.9
【０４１４】
(実施例69)
一般手順(D):
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
【０４１５】
【化８８】
2013540771.tif 000098
【０４１６】
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z=1634.4(M+1)/4;計算値:1634.4
【０４１７】
下記の類似体は、同様に調製することができる。
【０４１８】
(実施例70)
一般手順(D):
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),desB27,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
【０４１９】
【化８９】
2013540771.tif 000099
【０４２０】
(実施例71)
一般手順(D):
A1(Nαグルタリル),A14E,B1(Nαグルタリル),B25H,B29K(Nεエイコサンジオイル-gGlu-2×OEG),desB30ヒトインスリン
IUPAC (OpenEye、IUPAC形式)名:
N{A1}-4-カルボキシブタノイル,N{B1}-4-カルボキシブタノイル,N{イプシロン-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-インスリン(ヒト)
【０４２１】
【化９０】
2013540771.tif 000100
【０４２２】
(実施例72)
本発明の選択されたインスリン誘導体のインスリン受容体親和性:
ヒトインスリン受容体に対する本発明のアシル化インスリン類似体の親和性は、SPAアッセイ(シンチレーション近接アッセイ)マイクロタイタープレート抗体捕捉アッセイにより決定される。SPA-PVT抗体結合性ビーズ、抗マウス試薬(Amersham Biosciences、カタログ番号PRNQ0017)を、結合緩衝液(100mM HEPES pH7.8;100mM塩化ナトリウム、10mM MgSO4、0.025% Tween-20) 25mlと混合する。単一のPackard Optiplate (Packard No.6005190)用の試薬ミックスは、1:5000に希釈された精製組み換えヒトインスリン受容体(エクソン11があるかまたはない) 2.4μl、試薬ミックス100μl当たり5000cpmに相当する量のA14Tyr [125I]-ヒトインスリンのストック溶液、1:1000希釈のF12抗体12μl、SPA-ビーズ3mlおよび合計12mlまでの結合緩衝液からなる。次いで、試薬ミックス合計100μlを、Packard Optiplate中の各ウェルに添加し、インスリン誘導体の希釈系列を、適切なサンプルからOptiplate中で作製する。次いで、サンプルを、穏やかに振盪させながら16時間にわたってインキュベートする。次いで、相を、1分にわたる遠心分離により分離し、プレートを、Topcounter中でカウントする。結合データは、GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software、San Diego、CA)における非線形回帰アルゴリズムを使用して適合させた。親和性は、ヒトインスリンの親和性に対して(百分率(%)で)表される。
【０４２３】
生理学的条件を模倣するために、結合緩衝液が1.5% HSAも含有する関連アッセイも使用する。
【０４２４】
【表４Ａ】
2013540771.tif 000101
【０４２５】
【表４Ｂ】
2013540771.tif 000102
【０４２６】
【表４Ｃ】
2013540771.tif 000103
【０４２７】
(実施例73)
本発明のインスリン誘導体の疎水性:
インスリン誘導体の疎水性は、定組成条件下での逆相HPLCの実行により見いだされる。インスリン誘導体の溶離時間を、同じ条件下で、疎水性が知られているヒトインスリン(本明細書においてHIと命名される)および別の誘導体と比較する。疎水性、k'relは、k'relderiv=((tderiv-t0)/(tref-t0))*k'relrefとして算出される。参照としてのHIを使用すると、k'relref=k'relHI=1。HPLCシステムの空隙時間、t0は、0.1mM NaNO3 5μlを注入することにより決定される。実行条件:
カラム: Lichrosorb RP-C18、5μm、4×250mm
緩衝液A: 0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.3、10vol% CH3CN
緩衝液B: 50vol% CH3CN
注入体積: 5μl
実行時間:最大60分
【０４２８】
初期グラジエントを実行した後、誘導体および参照(例えば、HI)を実行するための定組成レベルを選択し、定組成条件下での誘導体および参照の溶離時間を、上の式で使用し、k'relderivを算出する。
【０４２９】
データは、上の表に与えられている。
【０４３０】
(実施例74)
十二指腸管腔酵素を使用するインスリン類似体の分解:
SPDラットからの十二指腸管腔酵素(十二指腸管腔内容物の濾過により調製される)を使用するインスリン類似体の分解。アッセイは、インスリン類似体および標準品に対して16ウェルが使用可能な96ウェルプレート(2ml)中でロボットにより行われる。インスリン類似体約15μMを、37℃において100mM Hepes、pH=7.4中で十二指腸酵素と共にインキュベートし、サンプルを、1、15、30、60、120および240分後に採取し、反応を、TFAの添加によりクエンチする。各点におけるインタクトなインスリン類似体を、RP-HPLCにより決定する。分解半減時間を、データの指数関数フィッティングにより決定し、各アッセイにおいて参照インスリン、A14E,B25H,desB30ヒトインスリンまたはヒトインスリンについて決定される半減時間に対して正規化する。分解のために添加される酵素の量は、参照インスリンの分解半減時間が60分と180分の間であるようになっている。結果は、同じ実験からの参照インスリンの分解半減時間により除されるラット十二指腸中のインスリン類似体についての分解半減時間(相対的分解速度)として与えられる。ヒトインスリンに対する本発明のインスリンの相対的安定性は、一般的に、A14E,B25H,desB30ヒトインスリンに対するよりも12倍高い。
【０４３１】
データは、下の表に与えられている。
【０４３２】
【表５Ａ】
2013540771.tif 000104
【０４３３】
【表５Ｂ】
2013540771.tif 000105
【０４３４】
【表５Ｃ】
2013540771.tif 000106
【０４３５】
(実施例75)
ラット脂肪細胞における脂質生成
本発明のインスリンのインビトロ効力の尺度として、脂質生成を使用することができる。
【０４３６】
初代ラット脂肪細胞を、精巣上体の脂肪体から摘出し、例えば、0.1%無脂肪HSAおよび標準品(ヒトインスリン、HI)かまたは本発明のインスリンを含有する緩衝液中で3H-グルコースと共にインキュベートする。標識グルコースは、用量依存的に抽出可能な脂質に変換され、完全な用量反応曲線をもたらす。結果は、標準品(HI)と比較した本発明のインスリンの95%信頼限界付きの相対的効力(%)として表される。
【０４３７】
データは、上の表に与えられている。
【０４３８】
(実施例76)
脂質製剤で製剤化されるインスリン類似体の化学的安定性:
脂質製剤で製剤化されるインスリン類似体の化学的安定性を、ここに記載されているプロトコルに従って評価した。コンパレーターとして、N末端保護基のない実施例1の類似体を使用し、本明細書において「従来技術」と表示した。
【０４３９】
製剤の組成:
試験されることになるインスリン(75μM)
15%プロピレングリコール
30% Tween20、ポリソルベート20
55%ジグリセロールカプリレート
【０４４０】
試験されることになるインスリン(pH7.5から凍結乾燥された)を、16時間にわたって暗所でプロピレングリコールに溶かす。ジグリセロールカプリレートを添加し、混合物を撹拌する。Tween20を添加し、混合物を、5分にわたって撹拌する。混合物を、均一になるまで穏やかにかき混ぜる。
【０４４１】
アッセイ:
抽出:
抽出ミックス: 1-ブタノール+0.1% (w/w) Tween80、0.1M Na2HPO4/NaH2PO4 pH7.0
1.製剤を、室温に到達させる。
2.各エッペンドルフチューブに、製剤20μlを添加する。
3. 1-ブタノール490μlと、続いて、リン酸塩緩衝液990μlを添加する。ボルテックスにかけて30分にわたって室温においてインキュベートする。
4.再びボルテックスにかけ、20分にわたって14000rpmで室温において遠心分離する。純度およびHMWP形成について下部水相を分析する。
【０４４２】
あるいは、別の抽出方法を使用することができる:
1.製剤を、室温に到達させる。
2.各エッペンドルフチューブに、製剤50μlを添加する。
3.抽出緩衝液950μlを添加する。十分にボルテックスにかける。直後に、スピンカラム上の精製のために800μl (2×400μl)をロードする。下のスピンプロトコルを参照されたい。
【０４４３】
SartoriusからのQスピンカラム上のイオン交換
緩衝液:
・平衡化緩衝液: 25mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH7.0
・洗浄緩衝液: 100mM NaCl、25mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH7.0
・溶離緩衝液: 500mM NaCl、25mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH7.0
スピンカラム:
・Vivapure IEX Qスピンカラム
スピンプロトコル:
(下記において、すべてのスピンステップは、2000×gで5分にわたる)
1.各スピンカラムに平衡化緩衝液400μlを適用し、スピンさせる。フロースルーを捨てる。
2.各抽出サンプル2×400μlを適用する。各適用間にカラムをスピンさせる。フロースルーを捨てる。
3.洗浄緩衝液400μlを適用して各スピンカラムを洗浄し、スピンさせる。洗浄液を捨てる。
4.各スピンカラムに溶離緩衝液400μlを適用し、スピンさせる。純度およびHMWP形成について溶離物を分析する。
【０４４４】
純度方法:
パラメーター:
カラム: Waters BEH Shield RP18 UPLCカラム(2.1×100mm、1.7μm)
波長: 215nm
カラム温度: 50℃
流量: 0.4ml/分
実行時間: 18.5分
負荷量: 7.5μl
緩衝液A: 0.09Mリン酸水素ジ-アンモニウムpH3.0、10% (v/v)アセトニトリル
緩衝液B: 90%アセトニトリル。
【０４４５】
【表６】
2013540771.tif 000107
【０４４６】
HMWP方法:
パラメーター:
カラム: Waters Insulin HMWP SECカラム
波長: 215nm
カラム温度: 50℃
流量: 0.5ml/分
実行時間: 30分
負荷量: 40μl
緩衝液: 500mM NaCl、10mM NaH2PO4、5mM H3PO4、50% (v/v) 2-プロパノール
【０４４７】
【表７】
2013540771.tif 000108
【０４４８】
化学的安定性研究の結果は、図1〜22にさらに示されている。
【０４４９】
(実施例77)
ラット薬物動態、静脈内ラットPK:
麻酔ラットに、様々な用量でインスリン類似体を静脈内に(i.v.)投与し、用いられた化合物の血漿濃度を、投与後4〜6時間または最高で48時間以上までにわたる指定された間隔でイムノアッセイまたは質量分析法を使用して測定する。続いて、薬物動態パラメーターを、WinNonLin Professional (Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)を使用して算出する。
【０４５０】
おおよそ200グラムの重さがある非絶食雄性ウィスターラット(Taconic)を使用する。
【０４５１】
体重を測定し、続いて、ラットを、Hypnorm/Dormicum (各化合物を、滅菌水中で1:1に別々に希釈し、次いで、混ぜる;実験日に新たに調製される)で麻酔する。麻酔は、2ml/kg Hypnorm/Dormicum混合物皮下により開始され、30分間隔での1ml/kg皮下の2回の維持用量および45分間隔での1ml/kg皮下の2回の維持用量が続く。必要とされれば、初めから終わりまでラットを軽い麻酔状態に保つために、さらなる用量1〜2ml/kg皮下が供給される。秤量および初期麻酔は、ラットを一つの部屋から別の部屋へと移動することにより動物にストレスを与えるのを避けるためにラット保持室内で行われる。
【０４５２】
(実施例78)
ラット薬物動態、小腸内注射に続くラットPK:
麻酔ラットに、インスリン類似体を小腸内に(空腸中に)投与する。用いられた化合物の血漿濃度ならびに血液グルコース変化を、投薬後4時間以上にわたって指定された間隔で測定する。続いて、薬物動態パラメーターを、WinNonLin Professional (Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)を使用して算出する。
【０４５３】
約18時間にわたって絶食させた250〜300gの重さがある雄性スプラーグドーリーラット(Taconic)を、初回用量としてのHypnorm-Dormicum皮下(クエン酸フェンタニル0.079mg/ml、フルアニソン2.5mg/mlおよびミダゾラム1.25mg/ml) 2ml/kg (試験物質投薬に先立つ-60分の時点まで)、20分後の1ml/kgと、続く、40分毎の1ml/kgを使用して麻酔する。
【０４５４】
小腸内注射モデルで試験されることになるインスリンは、上の胃管モデルについて製剤化されたように製剤化される。
【０４５５】
麻酔ラットを、37℃において安定化された恒温ブランケット上に置く。20cmのポリエチレンカテーテルを取り付けた1-mlシリンジに、インスリン製剤またはビヒクルを満たす。4〜5cmの正中切開を腹壁に行う。カテーテルを、腸壁の貫通により盲腸から約50cmの空腸中に穏やかに挿入する。腸内容物が存在すれば、適用部位を±10cm移動する。カテーテル先端を、腸セグメントの管腔内のおおよそ2cmに置き、結紮を使用せずに固定する。腸を、腹腔中で注意深く元に戻し、腹壁および皮膚を、各層にオートクリップで閉じる。時間0において、ラットに、カテーテルを介して試験化合物またはビヒクル0.4ml/kgを投与する。
【０４５６】
全血液グルコース濃度を決定するための血液サンプルを、尾端における毛細血管の穿刺によりヘパリン処置した10μlの毛細管に集める。血液グルコース濃度を、Biosen自動分析装置(EKF Diagnostic Gmbh、Germany)を使用してグルコースオキシダーゼ法により500μl分析緩衝液中の希釈後に測定する。平均血液グルコース濃度経過(平均±SEM)を、各化合物に対して作成する。
【０４５７】
サンプルを、血漿インスリン濃度を決定するために集める。血液サンプル100μlを、EDTAを含有する冷やしたチューブ中に抜き取る。サンプルを、遠心分離する(7000rpm、4℃、5分)まで氷上に保ち、血漿を、Micronicチューブ中にピペットで移し、次いで、アッセイまで20℃において凍結させる。インスリン類似体の血漿濃度を、個々の類似体について適切と考えられるか検証されているイムノアッセイで測定する。
【０４５８】
血液サンプルを、t=-10 (血液グルコースのみのため)、t=-1 (投薬直前)および投薬後4時間以上にわたって指定された間隔で抜き取る。
【０４５９】
(実施例79)
ヒトインスリンと比べた本発明のアシル化インスリン類似体の効力
実験日に238〜383gの重さがあるスプラーグドーリー雄性ラットを、クランプ実験のために使用する。ラットは、制御された周囲条件下で自由に餌を食べることができ、クランプ実験に先立って終夜にわたって(午後3時から)絶食させられる。
【０４６０】
実験プロトコル:
ラットを、外科手順に先立って少なくとも1週間にわたり動物施設において馴化させる。クランプ実験のおおよそ1週間前に、Tygonカテーテルを、頸静脈(注入のため)および頸動脈(血液採取のため)中にハロタン麻酔下で挿入し、露出させて頸部の裏に固定する。ラットに、手術後にStreptocilin vet. (Boehringer Ingelheim;0.15ml/ラット、筋肉内)を与え、回復期間中は動物ケアユニット(25℃)に入れる。無痛覚を得るために、アノルフィン(Anorphin) (0.06mg/ラット、皮下)を、麻酔中に投与し、リマディル(Rimadyl) (1.5mg/kg、皮下)を、麻酔からの完全な回復後(2〜3時間)後および2日にわたって1日1回再び投与する。
【０４６１】
実験日の午前7時に、終夜にわたって(前日の午後3時から)絶食させたラットを計量し、サンプリングシリンジおよび注入システム(Harvard 22 Basicポンプ、Harvard、およびPerfectum Hypodermicガラスシリンジ、Aldrich)につなぎ、次いで、ラットが実験の始まる前に約45分休む個々のクランプゲージに入れる。ラットは、全実験中にその通常の床敷上を自由に動くことができ、自由に飲料水を飲むことができる。血漿グルコースレベルを10分間隔で測定した30分の基礎的期間後、試験されることになるインスリン誘導体およびヒトインスリン(ラット当たり1用量レベル、用量レベル当たりn=6〜7)を、300分にわたって一定速度にて注入する(静脈内)。場合により、試験されることになるインスリン誘導体の初回ボーラス注入が、血漿中の定常状態レベルに直ぐに到達させるために投与される。初回ボーラス注入の用量は、薬物動態当業者により静脈内ボーラス薬物動態から得られるクリアランスデータに基づいて算出することができる。血漿グルコースレベルを、初めから終わりまで10分間隔で測定し、正常血糖を維持するために、20%水性グルコースの注入を調整する。再懸濁させた赤血球のサンプルを、各ラットからプールし、頸動脈カテーテルを介して約1/2ml体積で戻す。
【０４６２】
各実験日に、試験されることになる個々のインスリン誘導体の溶液およびヒトインスリン溶液のサンプルを、クランプ実験の前および終了時に採取し、ペプチドの濃度を、HPLCにより確認する。ラットインスリンおよびC-ペプチドならびに試験されることになるインスリン誘導体およびヒトインスリンの血漿濃度を、研究の前および終了時の関連時点に測定する。ラットを、ペントバルビタール過用量を使用して実験の終了時に殺す。
【０４６３】
(実施例80)
対照インスリン誘導体と比べた本発明のアシル化インスリン誘導体の効力、ラットへの皮下投与
雄性スプラーグドーリーラット(群当たりn=6)は、ビヒクルまたはインスリン類似体の皮下単回用量(それぞれ、作用持続時間が中程度か作用持続時間が長い類似体について50または200nmol/動物)を受ける。血液(舌下)を抜き取り、血漿を、それぞれ、作用持続時間が中程度か作用持続時間が長い類似体について、投薬後の時点0、1、2、4、8、24および48または0、2、4、8、24、48、72および96時間に集める。血漿を、グルコースについてアッセイする。グルコース低下効果を、時間の関数として-デルタ血漿グルコースの曲線下面積として算出し、対照インスリン誘導体と比較する。
【０４６４】
(実施例81)
イヌ薬物動態、静脈内イヌPK:
雄性ビーグル犬(おおよそ12kg)は、インスリン類似体の静脈内単回用量(2nmol/kg)を受ける。血液を抜き取り、血漿を、投薬後の時点-0.17、0、0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、8、10、12、16、24、32、48、72、96、120、144および168時間に集める。血漿サンプルを、サンドイッチイムノアッセイかまたはLCMSにより分析する。血漿濃度-時間プロファイルを、WinNonlin Professional 5.2 (Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)を使用する非コンパートメント薬物動態解析により分析する。血液グルコースまたは血漿グルコースの同時測定も行うことができる。
【０４６５】
(実施例82)
イヌ薬物動態、経口投薬:
雄性ビーグル犬(おおよそ12kg)は、腸溶コーティングされたサイズ00のカプセルに製剤化されたインスリン類似体の経口単回用量(120nmol/kg)を受ける。血液を抜き取り、血漿を、投薬後の時点0、15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、180、210、240、270、300、360、480、600、720、1440分(24時間)、30時間、48時間および72時間に集める。血漿サンプルを、サンドイッチイムノアッセイかまたはLCMSにより分析する。血漿濃度-時間プロファイルを、WinNonlin Professional 5.2 (Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)を使用する非コンパートメント薬物動態解析により分析する。血液グルコースまたは血漿グルコースの同時測定も行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2013540771.tif 000123
【図１４】
2013540771.tif 000124
【図１５】
2013540771.tif 000125
【図１６】
2013540771.tif 000126
【図１７】
2013540771.tif 000127
【図１８】
2013540771.tif 000128
【図１９】
2013540771.tif 000129
【図２０】
2013540771.tif 000130
【図２１】
2013540771.tif 000131
【図２２】
2013540771.tif 000132
【国際調査報告】
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2013540771.tif 000134
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