(57)【要約】  本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質の全部または一部と腫瘍関連抗原の細胞外部分に由来するエピトープを含むアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を使用した、腫瘍免疫療法、特に腫瘍ワクチン接種に関する。特に、本発明は、被験者において腫瘍関連抗原に対する、特にその表面に前記腫瘍関連抗原を担持する細胞に対する体液性免疫応答を誘発するために有用な、腫瘍関連抗原が前記被験者における自己タンパク質である、前記キメラタンパク質を含むウイルス様粒子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部とその中に挿入されたまたはそれに結合されたエピトープを含むアミノ酸配列を含むタンパク質であって、前記エピトープが腫瘍細胞の表面と結合した腫瘍関連抗原の細胞外部分に由来する、タンパク質。
【請求項２】
アジュバントなしにウイルス様粒子の形態で被験者に投与した場合、細胞の表面と結合した前記腫瘍関連抗原に対する体液性免疫応答を誘発することができ、前記腫瘍関連抗原が前記被験者における自己タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記腫瘍関連抗原がクローディンファミリーのタンパク質またはＰＬＡＣ１であり、前記クローディンファミリーのタンパク質が、好ましくはＣＬＤＮ１８．２およびＣＬＤＮ６から成る群より選択される、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記エピトープが、
（ｉ）配列表の配列番号：９〜２３および４５〜７８に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）（ｉ）の下のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であり、免疫学的に等価であるアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）切断型であり、（ｉ）の下のアミノ酸配列と免疫学的に等価である、（ｉ）もしくは（ｉｉ）の下のアミノ酸配列
を含む、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質が、
（ｉ）配列番号：１に示すアミノ酸配列もしくは少なくとも５０アミノ酸のその部分、または
（ｉｉ）（ｉ）の下のアミノ酸配列もしくはその部分と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
エピトープを含む前記アミノ酸配列が、
（ｉ）前記Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のアミノ末端アミノ酸に結合している、および／または
（ｉｉ）前記Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸に結合している、および／または
（ｉｉｉ）前記Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のＭＩＲに対応するアミノ酸配列内に挿入されているもしくはアミノ酸配列内のアミノ酸の１もしくはそれ以上を置換している、および／または
（ｉｖ）前記Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のＭＩＲに対応するアミノ酸配列内に位置する１もしくはそれ以上のアミノ酸に結合している、
請求項１乃至５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
エピトープを含む前記アミノ酸配列が、
（ｉ）配列表の配列番号：１に示す前記アミノ酸配列の７７位と７８位のアミノ酸の間もしくは対応する位置で前記Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質に挿入されている、または
（ｉｉ）配列表の配列番号：１に示す前記アミノ酸配列の７４〜８１位、７６〜８１位、７６〜７９位もしくは７９〜８０位のもしくは対応する位置のアミノ酸を置換している、
請求項１乃至６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
（ｉ）配列番号：３７〜４０に示すアミノ酸配列、または
（ｉｉ）（ｉ）の下のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であり、免疫学的に等価であるアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載のタンパク質をエンコードする核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸または請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載のタンパク質の複数のコピーを含むウイルス様粒子。
【請求項１３】
アジュバントなしで被験者に投与した場合、細胞の表面と結合した腫瘍関連抗原に対する体液性免疫応答を誘発することができ、前記腫瘍関連抗原が前記被験者における自己タンパク質である、請求項１２に記載のウイルス様粒子。
【請求項１４】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項９に記載の核酸、請求項１０に記載のベクター、請求項１１に記載の宿主細胞、または請求項１２もしくは１３に記載のウイルス様粒子ならびに医薬的に許容される希釈剤、担体および／または賦形剤を含有し、好ましくはアジュバントを含まない免疫原性組成物。
【請求項１５】
被験者において細胞の表面と結合した腫瘍関連抗原に対する体液性免疫応答を誘発するための免疫原性組成物であって、腫瘍関連抗原が前記被験者における自己タンパク質である、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
腫瘍の予防的および／または治療的処置のための、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項９に記載の核酸、請求項１０に記載のベクター、請求項１１に記載の宿主細胞、請求項１２もしくは１３に記載のウイルス様粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
被験者において腫瘍関連抗原に対する体液性免疫応答を誘発するための方法であって、腫瘍関連抗原が前記被験者における自己タンパク質であり、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項９に記載の核酸、請求項１０に記載のベクター、請求項１１に記載の宿主細胞、請求項１２もしくは１３に記載のウイルス様粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の免疫原性組成物を前記被験者に投与することを含み、前記被験者が腫瘍に罹患しているかまたは腫瘍を発症する危険性があり、前記腫瘍が腫瘍細胞の表面と腫瘍関連抗原の結合を特徴とし、投与が、好ましくはアジュバントを伴わない方法。
【請求項１８】
被験者において腫瘍関連抗原に対する自己寛容を打破するためまたは被験者において腫瘍を治療するおよび／もしくは予防するための方法であって、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項９に記載の核酸、請求項１０に記載のベクター、請求項１１に記載の宿主細胞、請求項１２もしくは１３に記載のウイルス様粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の免疫原性組成物を前記被験者に投与することを含み、投与が、好ましくはアジュバントを伴わない方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍免疫療法の分野に関する。特に、本発明は、被験者における自己タンパク質である腫瘍関連抗原に対する前記被験者の有効なワクチン接種のための手段を提供する。本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質またはその一部および腫瘍関連抗原のエピトープを含むアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。さらに、本発明は、特に、予防および／または治療適用における使用のため、例えば癌のワクチン接種および／または治療のための、前記タンパク質を含むウイルス様粒子および前記タンパク質または前記粒子を含有する免疫原性組成物を提供する。本発明はまた、上記腫瘍関連抗原に対する自己寛容を打破するため、ならびに被験者において腫瘍形成性疾患を治療するおよび／または予防するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
組換えワクチンは、感染症および癌性疾患の予防および治療のために、人間医学および獣医学において特に重要である。特定の疾患の予防または治療において有効である、特定の抗原に対する特異的免疫反応を誘発することが組換えワクチンによる免疫の目的である。公知の組換えワクチンは、組換えタンパク質、合成ペプチドフラグメント、組換えウイルスまたは核酸に基づく。
【０００３】
組換えワクチンの大部分は、２つのカテゴリー：ａ）特異的抗体産生を生じさせる体液性Ｂ細胞媒介性免疫応答を誘導するワクチン、およびｂ）細胞性Ｔ細胞媒介性免疫応答、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導するワクチンに分けることができる。
【０００４】
感染症に対する予防的ワクチン接種による抗体の誘導（例えば小児疾患に対するワクチン接種）は、最も有効な医学的介入処置の１つであり、長年にわたって適用され、成功を収めてきた。最近、自己タンパク質に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の治療的受動投与が癌または関節リウマチなどの急性および慢性疾患の有効な治療法であることも示された。ｍＡｂ標的構造体の例としては、関節リウマチ、クローン病および乾癬についての可溶性タンパク質腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（ｍＡｂ製剤：インフリキシマブおよびアダリムマブ）、ならびに非ホジキンリンパ腫については細胞表面タンパク質ＣＤ２０（ｍＡｂ製剤：例えばリツキシマブ）ならびに乳癌についてのＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体（ｍＡｂ製剤：トラスツズマブ［Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ］）がある。
【０００５】
免疫療法上有効なモノクローナル抗体の作製（それぞれ、ハイブリドーマまたはファージディスプレイ技術ならびにその後のキメラ化およびヒト化を使用して）は、しかし、時間がかかりかつコストが大きく、そのことがこれまで幅広い臨床適用を妨げてきた。したがって、モノクローナル抗体の受動投与に代わる、自己分子に対する能動ワクチン接種の可能性を提供する差し迫った必要性がある。受動免疫と異なり、能動ワクチン接種においては患者自身の免疫系が抗体を産生するように誘導される。誘導される個別の免疫応答は、したがって、治療に対する不耐性または非応答性などのモノクローナル抗体療法の問題を回避する。
【０００６】
自己タンパク質に対する体液性免疫応答の能動的誘導は、しかし、免疫学的な自己寛容が打破されることを必要とする。自己タンパク質またはそのペプチドは、自己タンパク質に対する免疫学的寛容のためにごく弱くしか免疫原性ではない。自己タンパク質に対する抗体応答の誘導のための組換えタンパク質または合成ペプチドフラグメントに基づく既存の免疫方法は、したがって、免疫刺激性アジュバントと組み合わせた抗原の同時投与に基づく。多くの強力に有効なアジュバントは、しかし、毒性、炎症反応または不要な全身性Ｔ細胞応答などの望ましくない副作用という不都合を示し、したがって、それらの使用は能動ワクチン接種法のためには回避されるべきである。
【０００７】
能動的な免疫療法上有効なワクチン接種に関して特定の必要条件、例えば自己タンパク質に対する自己寛容を打破すること、アジュバントの回避、その天然立体配座のタンパク質に対する抗体特異性、および免疫エフェクター機能を有する抗体の誘導などの必要条件がある。
【０００８】
抗体媒介性癌免疫療法に関連した能動ワクチン接種を成功させるための別の必須因子は、適切な腫瘍標的構造体の選択である。
【０００９】
標的構造体についての基本的必要条件は、腫瘍特異性と細胞表面局在である。これは、誘導される抗体の腫瘍細胞への選択的結合を可能にし、これらの細胞に対する抗体のエフェクター機能の行使の指令を可能にする。特に興味深い腫瘍関連抗原は、いわゆる細胞型特異的分化抗原である。それらの発現は、正常組織では特定の特異性および発生段階の細胞に限定される。しかし、多くの癌性疾患では、これらの抗原は腫瘍形成組織において発現される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
アジュバントの投与を必要とせずに自己寛容を打破する能動免疫化を可能にする手段の開発が緊急に求められている。特に、インビボで、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、アポトーシスの誘導、および増殖の阻害などのエフェクター機能を有する抗体の作製を可能にする手段の開発が必要であり、前記抗体は、腫瘍関連抗原などの自己タンパク質に対する抗体である。
【００１１】
本発明は、生物において、その天然立体配座の自己細胞膜表面抗原に結合し、その後前記細胞膜表面抗原を担持する細胞に治療上有効なエフェクター機能を及ぼす抗体、特に自己抗体を誘導することができる能動ワクチン接種のためのワクチンの開発に関する。
【００１２】
癌の免疫療法ワクチンの開発を、標的構造体クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）、クローディン６（ＣＬＤＮ６）およびＰＬＡＣ１に関してそれぞれ例示的に説明する。作製されるワクチンは、アジュバントの同時投与を必要とせずに、現在の免疫学的自己寛容を打破する有効な体液性免疫応答を誘導することができる。誘導された抗体は、さらに、その天然立体配座のタンパク質を認識し、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣなどの治療上適切なエフェクター機能を及ぼすことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１つの態様では、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部およびその中に挿入されたまたはそれに結合された、エピトープを含むアミノ酸配列を含むタンパク質であって、エピトープが腫瘍細胞の表面と結合した腫瘍関連抗原の細胞外部分に由来するタンパク質を提供する。好ましくは、腫瘍関連抗原は、正常条件下では限られた数の特定組織および／または器官で発現され、腫瘍組織において異常発現される。特に好ましい実施形態では、前記タンパク質は、アジュバントなしで、ウイルス様粒子の形態で被験者に投与した場合、細胞の表面と結合した腫瘍関連抗原に対する体液性免疫応答を誘発することができ、腫瘍関連抗原は前記被験者における自己タンパク質である。好ましくは、体液性免疫応答は、その天然立体配座の腫瘍関連抗原を担持する細胞に対して１またはそれ以上の免疫エフェクター機能を示す抗体の生成を含み、好ましくは、１またはそれ以上の免疫エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、アポトーシスの誘導、ＣＤ４０Ｌ媒介性シグナル伝達の阻害、および増殖の阻害から成る群より選択される。好ましい実施形態では、免疫エフェクター機能は、ＡＤＣＣなどの、エフェクター細胞の活性化である。好ましい実施形態では、腫瘍関連抗原はクローディンファミリーのタンパク質またはＰＬＡＣ１であり、好ましくは、クローディンファミリーのタンパク質はＣＬＤＮ１８．２およびＣＬＤＮ６から成る群より選択される。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸および本発明の核酸を含むベクターを提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、本発明のタンパク質の複数のコピーを含むウイルス様粒子を提供する。ウイルス様粒子は、アジュバントなしで被験者に投与した場合、細胞の表面と結合した腫瘍関連抗原に対する体液性免疫応答を誘発できることが特に好ましく、腫瘍関連抗原は前記被験者における自己タンパク質である。
【００１７】
本発明はさらに、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞またはウイルス様粒子ならびに医薬的に許容される希釈剤、担体および／または賦形剤を含有する免疫原性組成物を提供する。好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、被験者において細胞の表面と結合した腫瘍関連抗原に対する体液性免疫応答を誘発するためのものであり、腫瘍関連抗原は前記被験者における自己タンパク質である。免疫原性組成物はアジュバントを含まないことが特に好ましい。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、腫瘍の予防的および／または治療的処置のための、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子または免疫原性組成物を提供する。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、被験者において腫瘍関連抗原に対する体液性免疫応答を誘発するための方法であって、腫瘍関連抗原が前記被験者における自己タンパク質であり、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子または免疫原性組成物を前記被験者に投与することを含み、前記被験者が腫瘍に罹患しているかまたは腫瘍を発症する危険性があり、前記腫瘍が腫瘍細胞の表面と腫瘍関連抗原と結合していることを特徴とする方法を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、被験者において腫瘍関連抗原に対する自己寛容を打破するための方法であって、好ましくはアジュバントなしで、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子または免疫原性組成物を前記被験者に投与することを含む方法を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、被験者において腫瘍を治療するおよび／または予防するための方法であって、好ましくはアジュバントなしで、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子または免疫原性組成物を前記被験者に投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１はＨＢｃＡｇ発現カセットの概略図（ＨＢｃＡｇ骨格）である。融合タンパク質は、ＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端局在領域から成り、すべてのＨＢｃＡｇ骨格において、ＨＢｃＡｇの主要免疫優性域（ＭＩＲ）の部分は特異的抗原エピトープ（エピトープ）によって置換され得る。ＶＬＰへの組織化の間の柔軟性を高めるためおよびエピトープ立体配座の高い変動性のために、ＭＩＲに挿入されるエピトープはグリシンリンカーによって隣接され得る（Ｇ４ＳＧ４；配列番号：２４）。ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーおよびＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０を除くすべての構築物は、ＨＢｃＡｇのアミノ末端におけるエピトープの付加的な挿入のための制限部位ＳａｌＩおよびＳｐｅＩを担持する。構築物のカルボキシ末端には、６個のヒスチジンから成るＨｉｓタグ（黒い箱）が変性条件下での精製のために組み込まれている。Ｈｉｓタグは、短いリンカー（アミノ酸配列ＧＧＳ）によってＨＢｃＡｇのカルボキシ末端から隔てられている。クローニングおよび修飾目的のために利用可能な制限部位を示す。
【図２】図２は選択したＨＢｃＡｇ融合タンパク質に関する組織化能力を確認するための図である。インビトロで組織化し、精製したＨＢｃＡｇ  ＶＬＰを、未変性アガロースゲル電気泳動またはネガティブコントラスト透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）を用いて分析した。分析を、キメラＨＢｃＡｇ  ＶＬＰ  ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型（ＣＬＤＮ１８．２−リンカー）、ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０  ＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型（ＣＬＤＮ１８．２）、および対照としてＨＢｃＡｇ野生型の切断型変異体（ＨＢｃＡｇΔ；配列番号：７９）について例示的に示す。ＴＥＭ画像内に示す黒い棒は２００ｎｍの長さに相当する。
【図３Ａ】図３はＢａｌｂ／ｃマウスまたはＮＺＷウサギの免疫性付加後の抗血清の免疫反応性の測定のための間接免疫蛍光分析を示す。Ａ）チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）を、それぞれウサギまたはマウスＣＬＤＮ１８．２およびＣＬＤＮ１８．１と組み合わせたｅＧＦＰ−Ｎ３（ＧＦＰｍｕｔ１変異体）で同時トランスフェクトし、２４時間インキュベートして、次に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、その後０．２％サポニンで透過処理した。希釈した（１：１００）ポリクローナルウサギ血清５（ウサギ血清Ｎｏ．５の作製のために使用した免疫原：ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰ＋フロイントアジュバント）とのインキュベーションを１時間実施した。ＣＹ３結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）モノクローナル抗体を１：２００の希釈で二次抗体として使用し、３０分間添加した。１：１００００の希釈のＤＡＰＩを、細胞核を染色するために使用した。
【図３Ｂ】図３はＢａｌｂ／ｃマウスまたはＮＺＷウサギの免疫性付加後の抗血清の免疫反応性の測定のための間接免疫蛍光分析を示す。Ｂ）ＩＦ分析を上記Ａ）の下で述べたように実施した。ＣＬＤＮ１８．２の検出のために、希釈（１：１００）ポリクローナルマウス抗血清１／４（抗血清１／４の作製のために使用した免疫原：アジュバントなしのＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰ）を使用した。ＣＹ３結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）モノクローナル抗体を１：２００の希釈で二次抗体として使用した。
【図３Ｃ】図３はＢａｌｂ／ｃマウスまたはＮＺＷウサギの免疫性付加後の抗血清の免疫反応性の測定のための間接免疫蛍光分析を示す。Ｃ）ＣＨＯ細胞をｅＧＦＰ−ＴＥＳ８５（細胞核内に局在する）およびヒトＰＬＡＣ１で同時トランスフェクトし、２４時間の培養後、４％ＰＦＡで固定した。希釈（１：５００）ウサギ抗血清ＰＬＡＣ１  Ｎｏ．９（抗血清ＰＬＡＣ１  Ｎｏ．９の作製のために使用した免疫原：ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＰＬＡＣ１  ３番目のループＡ  ＶＬＰ＋フロイントアジュバント）およびＰＬＡＣ１  Ｎｏ．１０（抗血清ＰＬＡＣ１  Ｎｏ．１０の作製のために使用した免疫原：アジュバントなしのＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＰＬＡＣ１  ３番目のループＡ  ＶＬＰ）を、ＰＬＡＣ１（抗血清ＰＬＡＣ１  Ｎｏ．９の作製のために使用した免疫原：ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＰＬＡＣ１  ３番目のループＡ  ＶＬＰ＋フロイントアジュバント）およびＰＬＡＣ１  Ｎｏ．１０（抗血清ＰＬＡＣ１  Ｎｏ．１０の作製のために使用した免疫原：アジュバントなしのＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＰＬＡＣ１  ３番目のループＡ  ＶＬＰ）の検出のためのポリクローナル抗血清として使用した。Ｃｙ３結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）モノクローナル抗体を１：２００の希釈で二次抗体として使用した。
【図４】図４はキメラＨＢｃＡｇ  ＶＬＰを担持するヒトＣＬＤＮ１８．２エピトープでの免疫性付加後のウサギ抗血清の免疫反応性のＦＡＣＳ分析を示す。ヒトＣＬＤＮ１８．２（ｈｓＣＬＤＮ１８．２）を内因性に発現する１×１０５  ＮＵＧ−Ｃ４細胞をＦＡＣＳ分析に使用した。細胞を希釈（１：５０）ウサギ血清と共に１時間インキュベートした。洗浄工程後、希釈（１：１００）Ａｌｅｘａ６４７標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）モノクローナル二次抗体との３０分間のインキュベーションを実施した。ウサギ免疫性付加前血清（白色）と最終血清（それぞれ灰色と黒色）についての蛍光シグナルのヒストグラムの重ね合わせを示す。すべてのウサギをＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰで免疫した。ウサギ３はアジュバントを添加せずに免疫し、ウサギ４および５にはフロイントアジュバントを投与し、ウサギ６には、臨床適用に関して承認されているアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０を投与した。
【図５Ａ】図５はポリクローナル抗血清に対する能動免疫化後のＣＬＤＮ１８．２の細胞傷害性エフェクター機能の分析を示す。Ａ）ルシフェラーゼに基づくＣＤＣアッセイ。ヒトＣＬＤＮ１８．２（ｈｓＣＬＤＮ１８．２）またはアイソフォームクローディン１８．１（ｈｓＣＬＤＮ１８．１）を安定に発現するＣＨＯ細胞を、アッセイの２４時間前にルシフェラーゼをコードするインビトロ転写した（ＩＶＴ）ＲＮＡでトランスフェクトした。その後、細胞を指示されているポリクローナル抗血清と共に３０分間インキュベートした後、活性または熱不活性化ヒト血清を３０分間添加した。ルシフェラーゼを含有する緩衝液の添加後、死滅した細胞のパーセンテージを計算した（バックグラウンド発光を差し引いた後、抗血清を添加せずに活性血清と共にインキュベートした細胞と比較して）。ウサギ３〜６ならびにマウス１／４、６／３および６／４をＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰ（ＣＬＤＮ１８．２−リンカー）で免疫した。ウサギ３およびマウス１／４はアジュバントの添加なしで免疫原を摂取し、ウサギ４および５はフロイントアジュバントを摂取し、ウサギ６はＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０を摂取し、マウス６／３および６／４はＡｂｉｓｃｏ１００を摂取した。Ｃ末端切断型ＨＢｃＡｇ野生型ＶＬＰ（ＨＢｃＡｇΔ）で免疫したウサギ２の抗血清、およびＨＢｃＡｇに挿入されたエピトープと配列が同一であるＣＬＤＮ１８．２のＫＬＨ結合ペプチドを投与したマウス１１／２の抗血清を対照として使用した。
【図５Ｂ】図５はポリクローナル抗血清に対する能動免疫化後のＣＬＤＮ１８．２の細胞傷害性エフェクター機能の分析を示す。Ｂ）ルシフェラーゼに基づくＡＤＣＣアッセイ。アッセイの１日前に、ｈｓＣＬＤＮ１８．２を内因性に発現するＮＵＧ−Ｃ４細胞をルシフェラーゼＩＶＴ−ＲＮＡでトランスフェクトした。その後、細胞を指示されているポリクローナル抗血清と共に３０分間インキュベートした後、単離したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として添加した。５時間のインキュベーション後、ルシフェリン含有緩衝液を添加し、死滅した細胞のパーセンテージを計算した（バックグラウンド発光を差し引いた後、抗血清を添加せずにＰＢＭＣと共にインキュベートした細胞と比較して）。ウサギ３〜６ならびにマウス１／４、６／３および６／４をＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰ（ＣＬＤＮ１８．２−リンカー）で免疫した。ウサギ３およびマウス１／４はアジュバントの添加なしで免疫原を摂取し、ウサギ４および５はフロイントアジュバントを摂取し、ウサギ６はＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０を摂取し、マウス６／３および６／４はＡｂｉｓｃｏ１００を摂取した。Ｃ末端切断型ＨＢｃＡｇ野生型ＶＬＰ（ＨＢｃＡｇΔ）で免疫したウサギ２の抗血清、およびＨＢｃＡｇに挿入されたエピトープと配列が同一であるＣＬＤＮ１８．２のＫＬＨ結合ペプチドを投与したマウス１１／２の抗血清を対照として使用した。
【図６Ａ】図６はポリクローナル抗血清に対する能動免疫化後のＰＬＡＣ１の抗増殖性エフェクター機能の分析を示す。Ａ）ヒト乳癌上皮ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２２）を発現するＰＬＡＣ１の増殖の阻害。５０００細胞／ウエルを１０％ＦＣＳ含有培地に塗布し、抗血清に対する希釈した（１：１００または１：１０００）ポリクローナルＰＬＡＣ１と共に７２時間インキュベートした。その後、Ｄｅｌｆｉａ細胞増殖キットを使用したＢｒｄＵに基づく増殖アッセイを実施した。増殖率（％）を培地対照（＝１００％）に関して計算した。能動免疫化（抗ＣＬＤＮ１８．２）によって作製したポリクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗血清ならびに抗ｍｙｃモノクローナル抗体を対照血清として使用した。
【図６Ｂ】図６はポリクローナル抗血清に対する能動免疫化後のＰＬＡＣ１の抗増殖性エフェクター機能の分析を示す。Ｂ）ＰＬＡＣ１陰性ＭｅｌＨＯ細胞の増殖の阻害なし。手順はＡ）の下で述べたように実施した。ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＰＬＡＣ１  ３番目のループＡ（アジュバント添加した血清Ｎｏ．９、アジュバントなしの血清Ｎｏ．１０）ならびにＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０  ＰＬＡＣ１  ３番目のループＢ（アジュバント添加した血清Ｎｏ．１１）を抗ＰＬＡＣ１能動免疫化のための免疫原として使用した。
【図７Ａ】図７はＨＢｃＡｇ骨格の配列を示す。様々なＨＢｃＡｇ骨格の核酸およびアミノ酸配列を１文字表記で示す。配列の番号をそれぞれ配列の左側と右側に示す。薄い灰色の背景で表記された箇所は、それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端のＨＢｃＡｇドメインを示す；灰色の背景で表記された箇所は挿入されたグリシンリンカー（イタリック体、太字）を示し、濃い灰色の背景で表記された箇所はカルボキシ末端に局在するＨｉｓタグ（太字）を示す。
【図７Ｂ】図７はＨＢｃＡｇ骨格の配列を示す。様々なＨＢｃＡｇ骨格の核酸およびアミノ酸配列を１文字表記で示す。配列の番号をそれぞれ配列の左側と右側に示す。薄い灰色の背景で表記された箇所は、それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端のＨＢｃＡｇドメインを示す；灰色の背景で表記された箇所は挿入されたグリシンリンカー（イタリック体、太字）を示し、濃い灰色の背景で表記された箇所はカルボキシ末端に局在するＨｉｓタグ（太字）を示す。
【図７Ｃ】図７はＨＢｃＡｇ骨格の配列を示す。様々なＨＢｃＡｇ骨格の核酸およびアミノ酸配列を１文字表記で示す。配列の番号をそれぞれ配列の左側と右側に示す。薄い灰色の背景で表記された箇所は、それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端のＨＢｃＡｇドメインを示す；灰色の背景で表記された箇所は挿入されたグリシンリンカー（イタリック体、太字）を示し、濃い灰色の背景で表記された箇所はカルボキシ末端に局在するＨｉｓタグ（太字）を示す。
【図７Ｄ】図７はＨＢｃＡｇ骨格の配列を示す。様々なＨＢｃＡｇ骨格の核酸およびアミノ酸配列を１文字表記で示す。配列の番号をそれぞれ配列の左側と右側に示す。薄い灰色の背景で表記された箇所は、それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端のＨＢｃＡｇドメインを示す；灰色の背景で表記された箇所は挿入されたグリシンリンカー（イタリック体、太字）を示し、濃い灰色の背景で表記された箇所はカルボキシ末端に局在するＨｉｓタグ（太字）を示す。
【図７Ｅ】図７はＨＢｃＡｇ骨格の配列を示す。様々なＨＢｃＡｇ骨格の核酸およびアミノ酸配列を１文字表記で示す。配列の番号をそれぞれ配列の左側と右側に示す。薄い灰色の背景で表記された箇所は、それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端のＨＢｃＡｇドメインを示す；灰色の背景で表記された箇所は挿入されたグリシンリンカー（イタリック体、太字）を示し、濃い灰色の背景で表記された箇所はカルボキシ末端に局在するＨｉｓタグ（太字）を示す。
【図７Ｆ】図７はＨＢｃＡｇ骨格の配列を示す。様々なＨＢｃＡｇ骨格の核酸およびアミノ酸配列を１文字表記で示す。配列の番号をそれぞれ配列の左側と右側に示す。薄い灰色の背景で表記された箇所は、それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端のＨＢｃＡｇドメインを示す；灰色の背景で表記された箇所は挿入されたグリシンリンカー（イタリック体、太字）を示し、濃い灰色の背景で表記された箇所はカルボキシ末端に局在するＨｉｓタグ（太字）を示す。
【図８Ａ】図８はエピトープを担持するＶＬＰの作製のために使用したキメラＨＢｃＡｇ発現構築物の配列を示す。様々なキメラＨＢｃＡｇ発現構築物の核酸およびアミノ酸配列を１文字表記で示す。配列の番号をそれぞれ配列の左側と右側に示す。薄い灰色の背景で表記された箇所は、それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端のＨＢｃＡｇドメインを示す；灰色の背景で表記された箇所は挿入されたグリシンリンカー（イタリック体、太字）を示し、濃い灰色の背景で表記された箇所はカルボキシ末端に局在するＨｉｓタグ（太字）を示す。挿入されたＣＬＤＮ１８．２およびＰＬＡＣ１エピトープのアミノ酸配列をそれぞれ太字で表し、下線を付している。
【図８Ｂ】図８はエピトープを担持するＶＬＰの作製のために使用したキメラＨＢｃＡｇ発現構築物の配列を示す。様々なキメラＨＢｃＡｇ発現構築物の核酸およびアミノ酸配列を１文字表記で示す。配列の番号をそれぞれ配列の左側と右側に示す。薄い灰色の背景で表記された箇所は、それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端のＨＢｃＡｇドメインを示す；灰色の背景で表記された箇所は挿入されたグリシンリンカー（イタリック体、太字）を示し、濃い灰色の背景で表記された箇所はカルボキシ末端に局在するＨｉｓタグ（太字）を示す。挿入されたＣＬＤＮ１８．２およびＰＬＡＣ１エピトープのアミノ酸配列をそれぞれ太字で表し、下線を付している。
【図８Ｃ】図８はエピトープを担持するＶＬＰの作製のために使用したキメラＨＢｃＡｇ発現構築物の配列を示す。様々なキメラＨＢｃＡｇ発現構築物の核酸およびアミノ酸配列を１文字表記で示す。配列の番号をそれぞれ配列の左側と右側に示す。薄い灰色の背景で表記された箇所は、それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端のＨＢｃＡｇドメインを示す；灰色の背景で表記された箇所は挿入されたグリシンリンカー（イタリック体、太字）を示し、濃い灰色の背景で表記された箇所はカルボキシ末端に局在するＨｉｓタグ（太字）を示す。挿入されたＣＬＤＮ１８．２およびＰＬＡＣ１エピトープのアミノ酸配列をそれぞれ太字で表し、下線を付している。
【図８Ｄ】図８はエピトープを担持するＶＬＰの作製のために使用したキメラＨＢｃＡｇ発現構築物の配列を示す。様々なキメラＨＢｃＡｇ発現構築物の核酸およびアミノ酸配列を１文字表記で示す。配列の番号をそれぞれ配列の左側と右側に示す。薄い灰色の背景で表記された箇所は、それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端のＨＢｃＡｇドメインを示す；灰色の背景で表記された箇所は挿入されたグリシンリンカー（イタリック体、太字）を示し、濃い灰色の背景で表記された箇所はカルボキシ末端に局在するＨｉｓタグ（太字）を示す。挿入されたＣＬＤＮ１８．２およびＰＬＡＣ１エピトープのアミノ酸配列をそれぞれ太字で表し、下線を付している。
【図９Ａ】図９はキメラＨＢｃＡｇ  ＶＬＰ（ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰ）を担持するＣＬＤＮ１８．２エピトープでの予防的ワクチン接種は免疫応答性同系マウス腫瘍モデルにおいて部分的防御を与えることを示す。ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰ（ＣＬＤＮ−Ｌｉｎｋ）でワクチン接種したマウスに由来する肺の肉眼的分析は、Ｃ末端切断型タンパク質（アミノ酸１〜１５０）を含むＨＢｃＡｇ−ＶＬＰ（ＨＢｃＡｇΔ）またはＰＢＳ対照群と比較してより少ない数の転移結節（Ａ）および腫瘍細胞で攻撃誘発していないマウスのものに近い有意に低い肺重量（Ｂ）を明らかにした。ＣＬＤＮ１８．２のＩＨＣ染色によってＣＴ２６−ＣＬＤＮ１８．２肺転移を視覚化した後で計算した全肺切片当たりの癌性組織面積のパーセンテージは、ＨＢｃＡｇΔ−ＶＬＰでワクチン接種したマウスまたはＰＢＳ対照群と比較して有意に（ｐ＜０．０５）低かった（Ｃ、Ｄ）。
【図９Ｂ】図９はキメラＨＢｃＡｇ  ＶＬＰ（ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰ）を担持するＣＬＤＮ１８．２エピトープでの予防的ワクチン接種は免疫応答性同系マウス腫瘍モデルにおいて部分的防御を与えることを示す。ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰ（ＣＬＤＮ−Ｌｉｎｋ）でワクチン接種したマウスに由来する肺の肉眼的分析は、Ｃ末端切断型タンパク質（アミノ酸１〜１５０）を含むＨＢｃＡｇ−ＶＬＰ（ＨＢｃＡｇΔ）またはＰＢＳ対照群と比較してより少ない数の転移結節（Ａ）および腫瘍細胞で攻撃誘発していないマウスのものに近い有意に低い肺重量（Ｂ）を明らかにした。ＣＬＤＮ１８．２のＩＨＣ染色によってＣＴ２６−ＣＬＤＮ１８．２肺転移を視覚化した後で計算した全肺切片当たりの癌性組織面積のパーセンテージは、ＨＢｃＡｇΔ−ＶＬＰでワクチン接種したマウスまたはＰＢＳ対照群と比較して有意に（ｐ＜０．０５）低かった（Ｃ、Ｄ）。
【図９Ｃ】図９はキメラＨＢｃＡｇ  ＶＬＰ（ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰ）を担持するＣＬＤＮ１８．２エピトープでの予防的ワクチン接種は免疫応答性同系マウス腫瘍モデルにおいて部分的防御を与えることを示す。ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰ（ＣＬＤＮ−Ｌｉｎｋ）でワクチン接種したマウスに由来する肺の肉眼的分析は、Ｃ末端切断型タンパク質（アミノ酸１〜１５０）を含むＨＢｃＡｇ−ＶＬＰ（ＨＢｃＡｇΔ）またはＰＢＳ対照群と比較してより少ない数の転移結節（Ａ）および腫瘍細胞で攻撃誘発していないマウスのものに近い有意に低い肺重量（Ｂ）を明らかにした。ＣＬＤＮ１８．２のＩＨＣ染色によってＣＴ２６−ＣＬＤＮ１８．２肺転移を視覚化した後で計算した全肺切片当たりの癌性組織面積のパーセンテージは、ＨＢｃＡｇΔ−ＶＬＰでワクチン接種したマウスまたはＰＢＳ対照群と比較して有意に（ｐ＜０．０５）低かった（Ｃ、Ｄ）。
【図９Ｄ】図９はキメラＨＢｃＡｇ  ＶＬＰ（ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰ）を担持するＣＬＤＮ１８．２エピトープでの予防的ワクチン接種は免疫応答性同系マウス腫瘍モデルにおいて部分的防御を与えることを示す。ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰ（ＣＬＤＮ−Ｌｉｎｋ）でワクチン接種したマウスに由来する肺の肉眼的分析は、Ｃ末端切断型タンパク質（アミノ酸１〜１５０）を含むＨＢｃＡｇ−ＶＬＰ（ＨＢｃＡｇΔ）またはＰＢＳ対照群と比較してより少ない数の転移結節（Ａ）および腫瘍細胞で攻撃誘発していないマウスのものに近い有意に低い肺重量（Ｂ）を明らかにした。ＣＬＤＮ１８．２のＩＨＣ染色によってＣＴ２６−ＣＬＤＮ１８．２肺転移を視覚化した後で計算した全肺切片当たりの癌性組織面積のパーセンテージは、ＨＢｃＡｇΔ−ＶＬＰでワクチン接種したマウスまたはＰＢＳ対照群と比較して有意に（ｐ＜０．０５）低かった（Ｃ、Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明を以下で詳細に説明するが、本発明は、本明細書で述べる特定の方法、プロトコールおよび試薬に限定されず、これらは変わり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することだけを目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２４】
以下において、本発明の構成要素を説明する。これらの構成要素を特定の実施形態と共に列挙するが、それらを任意の方法および任意の数で組み合わせて付加的な実施形態を創造し得ることが理解されるべきである。様々に説明する実施例および好ましい実施形態は、本発明を明確に説明される実施形態だけに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に説明される実施形態を、いくつもの開示されるおよび／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を裏付け、包含することが理解されるべきである。さらに、本出願で述べるすべての要素の任意の順序および組合せが、文脈によって特に指示されない限り、本出願の説明によって開示されるとみなされるべきである。例えば、１つの好ましい実施形態において本発明のタンパク質がエピトープ配列に隣接するリンカー配列を含み、別の好ましい実施形態では本発明のタンパク質がペプチドタグを含む場合、本発明のタンパク質はエピトープ配列に隣接するリンカー配列およびペプチドタグを含むことが本発明のタンパク質の企図される好ましい実施形態である。
【００２５】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ  Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（１９９５）に記載されているように定義される。
【００２６】
本発明の実施は、特に指示されない限り、その分野の文献において説明される化学、生化学、細胞生物学、免疫学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９８９参照）。
【００２７】
本明細書および以下の特許請求の範囲全体を通して、文脈上特に必要とされない限り、「含む」という語および「含むこと」などの変形は、記述される成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の包含を意味し、いかなる他の成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の排除を意味しないことが理解される。本発明の説明に関連して（特に特許請求の範囲に関連して）使用される「１つの」および「その」という用語および同様の言及は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書中の数値の範囲の列挙は、単に範囲内に属する各々別々の数値を個別に言及することの簡略化した方法であることが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各々個別の数値は、本明細書で個別に列挙されるがごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書で述べるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図されており、特許請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に必須の特許請求されない要素を指示すると解釈されるべきではない。
【００２８】
いくつかの資料を本明細書の本文全体にわたって引用する。上記または下記で、本明細書において引用される資料の各々は（すべての特許、特許出願、学術出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が、先行発明によるそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
【００２９】
定義
以下において、本発明のすべての態様に適用される定義を述べる。
【００３０】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）の成員である。ウイルス粒子は、外側の脂質エンベロープとＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質で構成される正二十面体ヌクレオカプシドコアから成る。ＨＢＶのゲノムは環状ＤＮＡでできている。Ｃ、Ｘ、ＰおよびＳと呼ばれるゲノムによってコードされる４つの公知の遺伝子がある。コアタンパク質は遺伝子Ｃによってコードされ、その開始コドンに先立って、プレコアタンパク質が産生される上流のインフレームＡＵＧ開始コドンがある。遺伝子Ｃによってコードされるタンパク質は、少なくとも４つの異なる機能的に関連するＨＢＶポリペプチド：ｐ２５（プレＣタンパク質）、ｐ２２（ｐ２５のＮ末端切断型）、ｐ２１（それ自体がＨＢｃＡｇ単量体）およびｐ１７（ＨＢｅＡｇ、ｐ２５のＮ末端およびＣ末端切断型）中に存在する。これらのペプチドのうちで、ＨＢｃＡｇ単量体だけがウイルス様粒子に自己組織化することができる。そのようなウイルス様粒子は１８０または２４０コピーのＨＢｃＡｇタンパク質を含み得、直径約３０ｎｍまたは３４ｎｍであり得る。ＨＢｃＡｇタンパク質は、ウイルス様粒子に自己組織化することができるＮ末端領域を含む。まだＨＢｃＡｇ粒子に自己組織化することができるＣ末端切断についてのＣ末端限界は、アミノ酸残基１３９〜１４４の間とマッピングされた。アミノ酸１５０〜１８３に対応するＣ末端のプロタミン様アルギニンリッチドメインは、自己組織化のために必須ではない。その機能は核酸の結合である。いわゆる主要イムノドミナント領域（ＭＩＲ）は、ＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸残基７４〜８９の周囲の表在性ループ内に局在する。
【００３１】
本発明に関連して「Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質」または「ＨＢｃＡｇタンパク質」という用語は、ヘパドナウイルス科に属する任意のウイルスのポリペプチドｐ２１、好ましくはａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒおよびａｙｗ血清型などの任意のＢ型肝炎ウイルス血清型、またはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ遺伝子型などの遺伝子型のＢ型肝炎ウイルスポリペプチドｐ２１に関する。好ましくは、Ｂ型肝炎ウイルスポリペプチドｐ２１は、Ｂ型肝炎ウイルスａｙｗ血清型に由来する。好ましくは、ＨＢｃＡｇタンパク質は、好ましくは配列番号：１に示すアミノ酸配列、その変異体または部分を含む。配列番号：２に示す核酸配列は、配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードする。本発明に関連して、「Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質」または「ＨＢｃＡｇタンパク質」という用語はその任意の変異体および／または部分を包含し、好ましくは、前記変異体および／またはその部分は、好ましくは１８０または２４０コピーのＨＢｃＡｇサブユニットから成る、ウイルス様粒子に、好ましくは正二十面体ウイルス様粒子に組織化することができる。Ｃ遺伝子はＨＢＶ遺伝子の間で最も保存されているが、数多くのアミノ酸置換がＨＢｃＡｇタンパク質に関して同定されている。したがって、「Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質変異体」という用語は、特に、ＨＢｃＡｇタンパク質の天然に生じる変異体のいずれも包含する。前記用語はまた、天然には生じず、ウイルス様粒子に組織化することができる、任意の合成によって作製された変異体も包含する。
【００３２】
「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」という用語は、ＨＩＶ−１、風疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス、セムリキ森林ウイルス、ＲＮＡファージおよびＢ型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルスを含む、多くのウイルスからのエンベロープおよび／またはカプシドタンパク質の自己組織化によって形成される、空のウイルスカプシドを指す。ウイルス様粒子は、それらが由来するウイルスに類似するが、ウイルス核酸を欠き、それゆえ感染性ではない。本発明のウイルス様粒子はキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質を含む。本発明のウイルス様粒子は、遺伝物質を組み込まずに組織化するため非感染性である。「キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質」という用語は、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質またはその部分およびＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質以外のタンパク質に由来するアミノ酸配列、例えば腫瘍関連抗原に由来するエピトープを含むアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。本発明の好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、異種エピトープの組込みのための担体としてＢ型肝炎ウイルスに由来するＨＢｃＡｇタンパク質を含む。しかし、任意の他のオルトヘパドナウイルス（Ｏｒｔｈｏｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）またはアビヘパドナウイルス（Ａｖｉｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）からのＨＢｃＡｇ遺伝子も使用できる。
【００３３】
「部分」という用語は画分を指す。アミノ酸配列またはタンパク質などの特定の構造体に関して、その「部分」という用語は、前記構造体の連続または不連続画分を表し得る。好ましくは、アミノ酸配列の部分は、前記アミノ酸配列のアミノ酸の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに一層好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を含む。好ましくは、部分が不連続画分である場合、前記不連続画分は、構造体の２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上のパートで構成され、各々のパートは構造体の連続する要素である。例えば、アミノ酸配列の不連続画分は、前記アミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上のパート、好ましくは４以下のパートで構成され得、各々のパートは、好ましくはアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸、少なくとも１０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも３０個の連続するアミノ酸を含む。「パート」という用語は、連続する要素を指す。例えば、アミノ酸配列またはタンパク質などの構造体の１つのパートは、前記構造体の１つの連続する要素を指す。構造体の部分またはパートは、好ましくは前記構造体の１またはそれ以上の機能的特性を含む。例えば、エピトープの部分またはパートは、好ましくはそれが由来するエピトープと免疫学的に等価である。
【００３４】
ＨＢｃＡｇタンパク質に関連して「その部分」という用語は、ＨＢｃＡｇタンパク質の少なくとも３０、好ましくは５０、より好ましくは８０、より好ましくは９０、より好ましくは１００、さらに一層好ましくは１１０、さらに一層好ましくは１２０、さらに一層好ましくは１３０またはそれ以上のアミノ酸を含むＨＢｃＡｇタンパク質の部分を指す。「部分」という用語はまた、ＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列の不連続な部分を包含する。例えば、１３８アミノ酸のＨＢｃＡｇ部分は、配列番号：１に示すＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸１〜７５および８２〜１４４または配列番号：１の前記アミノ酸に対応するアミノ酸で構成され得る。不連続性がＭＩＲに対応する領域内にある、例えばＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸７４〜８９の周囲の領域にあることが好ましい。ＨＢｃＡｇの部分はウイルス様粒子に組織化できることが好ましい。ＨＢｃＡｇタンパク質の不連続な部分の場合、前記不連続な部分は、不連続な部分のパートがそれらの天然の順序で共に連結された場合、ウイルス様粒子に組織化できることが好ましい。この結合は直接であってよくまたはリンカーによって、例えばエピトープ配列を含むアミノ酸配列によってでもよい。
【００３５】
「タンパク質はウイルス様粒子に組織化することができる」という表現または同様の語句は、複数のタンパク質（および１コピーだけではないタンパク質）がウイルス様粒子に組織化できることを意味する。これに関連して、組織化されたウイルス様粒子は、必ずしも天然のＨＢｃＡｇウイルス様粒子構造、すなわち正二十面体の形状で１８０または２４０サブユニットを有する構造を取る必要はなく、ウイルス様粒子が妥当な程度に安定である限り、任意のウイルス様粒子構造、例えば不規則な形状を示し得る、例えば３０、５０、７０、９０または１５０サブユニットで構成されるウイルス様粒子に類似した任意の構造を取る。例えば、ウイルス様粒子は、医薬組成物に製剤され、患者に投与されるのに十分なだけ安定であるべきである。当業者は、タンパク質がウイルス様粒子に組織化できるかどうかを容易に判定することができる。例えば、タンパク質は異種発現系において発現され得る。ウイルス様粒子の組織化は発現宿主の細胞質内で起こる。細胞を、例えば接線流ろ過によって採取し、例えばマイクロフルイダイザーを使用して溶解する。細胞残屑を除去し、可溶性溶解物をウイルス様粒子の存在に関して検定する。例えば、ウイルス様粒子を、限外ろ過、疎水性相互作用、ヒドロキシアパタイトまたはセファロースブルークロマトグラフィによって濃縮し、予備精製し得る。ウイルス様粒子は、陰イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィおよび／または限外ろ過によってさらに精製し得る。濃縮し、精製したウイルス様粒子を、次に、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡検査、未変性アガロースゲル電気泳動、動的光散乱（ＤＬＳ）と組み合わせた非対称フローフィールドフローフラクショネーション（ＡＦ４）、および／または配座特異的モノクローナル抗体を用いた捕捉ＥＬＩＳＡによって検出し得る。
【００３６】
別のアミノ酸配列（第二アミノ酸配列）「に挿入された」アミノ酸配列（第一アミノ酸配列）または「その中に挿入された」アミノ酸配列とは、第一アミノ酸配列が、第二アミノ酸配列の一次構造の２個のアミノ酸の間で第二アミノ酸配列に組み込まれていることを意味する。好ましくは、第一と第二のアミノ酸配列はペプチド結合によって連結されている。本発明に関連して挿入されたアミノ酸配列の一例は、例えば腫瘍関連抗原に由来する、エピトープ配列の、ＨＢｃＡｇタンパク質のＭＩＲ内の２個のアミノ酸の間および／または図１に示すＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端内の２個のアミノ酸の間、例えばＳａｌＩ制限部位とＳｐｅＩ制限部位の間の挿入である。本発明に関連して、第二アミノ酸配列に挿入された第一アミノ酸配列はまた、第一アミノ酸配列が第二アミノ酸配列の１またはそれ以上、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸を置換していることを意味し得る。
【００３７】
アミノ酸配列（第一アミノ酸配列）は、別のアミノ酸配列（第二アミノ酸配列）に、第一アミノ酸配列が第二アミノ酸配列の任意のアミノ酸に、例えば化学的架橋またはペプチド結合によって連結されている場合、「結合して」いる。アミノ酸配列が第二アミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸に連結されている場合、アミノ酸配列は第二アミノ酸配列に結合している。様々な架橋剤が、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓおよびＳｉｇｍａなどの主要供給者から市販されている。第一級アミン基（すなわちリシン残基のε−アミノ基）と特異的に反応する、ホモ二官能性試薬を使用し得る。それらは水性溶媒に可溶性であり、共有結合を形成することができる。さらに、それらの反応性末端基の間に様々な長さのスペーサーアームを有するホモ二官能性イミドエステル、例えば８．６Å、１１Åまたは９．２Åのスペーサーアームを有する、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）およびジメチルピメリミデート（ＤＰＭ）などを使用し得る。さらに、可逆的ホモ二官能性架橋剤、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、例えばジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）またはジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）なども使用し得る。あるいは、ヘテロ二官能性架橋剤、例えば一方に反応性末端および他方にスルフヒドリル反応性部分を有する架橋剤を使用し得る。例えば、一方の末端にＮＨＳエステルおよびＳＨ反応性基、例えばマレイミドまたはピリジルジスルフィドを有するヘテロ二官能性架橋剤が使用できる。光反応性基を含むヘテロ二官能性試薬、例えばビス［２−（４−アジドサリチルアミド）エチル］］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）も使用し得る。
【００３８】
アミノ酸配列（第一アミノ酸配列）は、単数または複数のアミノ酸または別のアミノ酸配列（第二アミノ酸配列）を、前記アミノ酸または第二アミノ酸配列が完全に除去され、その代わりに前記アミノ酸または第二アミノ酸配列が位置していた位置に第一アミノ酸配列が置かれている場合、「置換している」。
【００３９】
２またはそれ以上のポリペプチド中の残基は、残基がポリペプチド構造中の類似の位置を占有する場合、互いに「対応する」と言い表す。当分野で周知のように、２またはそれ以上のポリペプチド中の類似の位置は、アミノ酸配列類似性または構造類似性に基づきポリペプチド配列を整列することによって決定され得る。そのようなアラインメントツールは当業者に周知であり、例えば、ワールドワイドウエブ、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）またはＡｌｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）上で、標準的な設定を使用して、好ましくは、Ａｌｉｇｎに関してはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、キャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５を使用して得られる。当業者は、満足し得るアラインメントを作成するためにいずれかの配列にギャップを導入する必要があり得ることを理解する。２またはそれ以上のポリペプチド配列中の残基は、残基が最良の配列アラインメントで整列される場合、「対応する」と言われる。２つのポリペプチドの間の「最良の配列アラインメント」は、整列される同一残基の数が最大となるアラインメントと定義される。２つの整列された配列の間の配列類似性、好ましくは同一性が、１０、２０または３０アミノ酸の長さにわたって３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満に低下した場合、「最良の配列アラインメントの領域」は終了し、したがって類似性スコアの決定のための比較配列の長さの境界ｓを決定する。
【００４０】
本発明の目的上、タンパク質もしくはペプチドの、またはアミノ酸配列の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体はまた、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。
【００４１】
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列内に単一のまたは２もしくはそれ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１またはそれ以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列内の特定の部位に挿入されるが、生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダムな挿入も可能である。
【００４２】
アミノ酸付加変異体は、１またはそれ以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合を含む。例えば、本発明に関連して、Ｈｉｓタグなどのカルボキシ末端に融合したペプチドタグを含むＨＢｃＡｇタンパク質は、ＨＢｃＡｇ付加変異体とみなされる。
【００４３】
アミノ酸欠失変異体は、配列からの１またはそれ以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失はタンパク質の任意の位置であり得る。本発明で使用されるＨＢｃＡｇタンパク質に関連して、ＨＢｃＡｇの好ましいアミノ酸欠失変異体は、ＭＩＲ領域内、例えば配列番号：１の７４〜８９位の周囲のアミノ酸内または対応するアミノ酸内の欠失である。また、本発明に関連して、ＨＢｃＡｇタンパク質がＣ末端切断型である、すなわちＣ末端欠失／切断を有することも好ましい。好ましくは、前記Ｃ末端切断は、Ｃ末端から、配列番号：１に示すアミノ酸配列または対応するアミノ酸配列中の１４０位のアミノ酸に至るまでの任意のアミノ酸に及び、その任意のアミノ酸を含む。１４０位のアミノ酸におけるタンパク質のＣ末端切断は、完全長タンパク質のＣ末端側の１４０位のアミノ酸がＣ末端切断型タンパク質では失われていること、すなわちＣ末端切断型タンパク質はアミノ酸１３９終わる（アミノ酸１３９を含む）ことを意味する。
【００４４】
アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されることを特徴とする。修飾が相同なタンパク質もしくはペプチドの間で保存されていないアミノ酸配列内の位置であることおよび／またはアミノ酸が類似の特性を有する他のアミノ酸で置換されることが好ましい。好ましくは、タンパク質変異体内のアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち類似の荷電アミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換を含む。天然に生じるアミノ酸は一般に４つのファミリーに分けられる：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時として芳香族アミノ酸として一緒に分類される。
【００４５】
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の、例えば配列番号：１に示す好ましいＨＢｃＡｇ配列とＨＢｃＡｇ変異体との間の、または、例えば配列表に示す、好ましい腫瘍関連抗原配列と腫瘍関連抗原変異体との間の類似性の程度、好ましくは同一性の程度は、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０または１６０アミノ酸の領域に対して与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は参照アミノ酸配列の全長に対して与えられる。配列類似性、好ましく配列同一性を決定するためのアラインメントは、当分野で公知のツールを用いて、好ましくは最良の配列アラインメントを使用して、例えばＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５を用いて実施することができる。好ましい実施形態では、ＨＢｃＡｇ変異体は、例えばＭＩＲ内に欠失を担持するまたはカルボキシ末端に切断を担持する、欠失変異体および／または切断変異体である。さらに、特に好ましい実施形態では、変異体は天然に生じる変異体である。ＨＢｃＡｇタンパク質変異体の好ましい例は、配列番号：１を参照配列として使用する場合は、１またはそれ以上の位置に突然変異を含む。
【００４６】
本発明のタンパク質および核酸配列はまた、本発明のタンパク質および本発明の核酸配列の変異体を含む。タンパク質変異体についての上記定義は、対応して核酸配列変異体にも適用される。
【００４７】
本明細書で述べるタンパク質および核酸配列変異体は、当業者によって、例えば組換えＤＮＡ操作によって容易に調製され得る。置換、挿入または欠失を有するタンパク質およびペプチドを調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）において詳細に説明されている。さらに、本明細書で述べるペプチドおよびアミノ酸変異体は、例えば固相合成および類似の方法などによる、公知のペプチド合成技術を用いて容易に調製され得る。
【００４８】
本明細書で述べるタンパク質およびペプチドは、タンパク質およびペプチドの誘導体であり得る。本発明によれば、タンパク質およびペプチドの「誘導体」は、タンパク質およびペプチドの修飾形態である。そのような修飾は、任意の化学修飾を含み、炭水化物、脂質および／またはタンパク質またはペプチドなどの、タンパク質またはペプチドに関連する任意の分子の単一または複数の置換、欠失および／または付加を含む。「誘導体」という用語はまた、前記タンパク質およびペプチドのすべての機能的な化学的等価物に及ぶ。好ましくは、修飾ペプチド、すなわち誘導体ペプチドは、高い安定性および／または高い免疫原性を示す。
【００４９】
本発明によれば、ペプチドもしくはタンパク質の、または核酸配列もしくはアミノ酸配列の変異体、誘導体、部分、パートまたはフラグメントは、好ましくは、それぞれ、それが由来するペプチドまたはタンパク質または核酸配列またはアミノ酸配列の機能的特性を有する。そのような機能的特性は、抗体との相互作用、タンパク質のペプチドまたはタンパク質との相互作用、およびウイルス様粒子への組織化などの免疫学的特性を含む。
【００５０】
「免疫学的に等価」という用語は、免疫学的に等価のアミノ酸配列が、同じもしくは基本的に同じ免疫学的特性を示し、ならびに／または、例えば体液性および／もしくは細胞性免疫応答の誘導などの免疫学的作用のタイプ、誘導される免疫反応の強さおよび／もしくは期間、または誘導される免疫反応の特異性に関して、同じもしくは基本的に同じ免疫学的作用を及ぼすことを意味する。本発明のキメラＨＢｃＡｇタンパク質に関連して、「免疫学的に等価」という用語は、好ましくはキメラＨＢｃＡｇタンパク質に含まれる腫瘍関連抗原に由来するエピトープの免疫学的作用または特性に関して使用される。特定の免疫学的特性は、抗体に結合して、適切な場合は、好ましくは抗体の生成を刺激することにより、免疫応答を生じさせる能力である。例えば、アミノ酸配列が、被験者の免疫系に暴露されたとき、腫瘍関連抗原のパートを形成する参照アミノ酸配列などの参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応、好ましくは抗体を誘導する場合、前記アミノ酸配列は参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。
【００５１】
本発明に関連して、「腫瘍関連抗原」または「腫瘍抗原」という用語は、正常条件下では限られた数の組織および／または器官において、または特定の発生段階で特異的に発現されるタンパク質に関し、例えば腫瘍関連抗原は、正常条件下では胃組織、好ましくは胃粘膜において、生殖器官、例えば精巣において、栄養膜組織、例えば胎盤において、または生殖系細胞において特異的に発現され得、１またはそれ以上の腫瘍組織において発現または異常発現される。これに関連して、「限られた数」は、好ましくは３以下、より好ましくは２以下を意味する。腫瘍関連抗原の発現は、腫瘍の起源、すなわち腫瘍が発生する／由来する組織または器官に関わりなく、腫瘍組織において再活性化される。本発明に関連して腫瘍関連抗原は、例えば分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、すなわち正常条件下では特定の分化段階で特定の細胞型において特異的に発現されるタンパク質、癌／精巣抗原、すなわち正常条件下では精巣においておよび時として胎盤において特異的に発現されるタンパク質、ならびに生殖系列特異的抗原を含む。本発明に関連して、腫瘍関連抗原は、好ましくは腫瘍細胞の細胞表面と結合しており、好ましくは正常組織では発現されないまたはまれにしか発現されない。好ましくは、腫瘍関連抗原または腫瘍関連抗原の異常発現は、腫瘍細胞、好ましくは癌性細胞を同定する。本発明に関連して、被験者、例えば腫瘍形成性疾患に罹患している患者において腫瘍細胞によって発現される腫瘍関連抗原は、好ましくは前記被験者における自己タンパク質である。好ましい実施形態では、腫瘍関連抗原に対する自己抗体は、前記腫瘍関連抗原を担持する被験者において正常条件下では検出可能レベルで見出すことができないか、またはそのような自己抗体は、前記腫瘍関連抗原を担持する組織または細胞への損傷を引き起こすのに必要な閾値濃度未満の量でしか見出すことができない。好ましい実施形態では、本発明に関連して腫瘍関連抗原は、正常条件下では、必須でない組織もしくは器官、すなわち免疫系によって損傷された場合に被験者の死亡をもたらさない組織もしくは器官において、または免疫系がアクセスできないもしくはほとんどアクセスできない器官もしくは身体構造において特異的に発現される。好ましくは、腫瘍関連抗原のアミノ酸配列は、正常組織で発現される腫瘍関連抗原と腫瘍形成組織で発現される腫瘍関連抗原との間で同一である。本発明に関連して、腫瘍関連抗原は、その突然変異が前記腫瘍関連抗原を発現する被験者の生殖系に存在するのでない限り、好ましくは突然変異した腫瘍抑制遺伝子または突然変異した癌遺伝子または何らかの他の突然変異した遺伝子の産物ではない。本発明に関連して、腫瘍関連抗原は、好ましくは癌ウイルスによって産生される腫瘍抗原ではない。
【００５２】
腫瘍免疫療法、特に腫瘍ワクチン接種における標的構造体として本発明によって企図される腫瘍関連抗原についての基準を理想的に満たす分化抗原の例は、ＣＬＤＮ６およびＣＬＤＮ１８．２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質ならびにＰＬＡＣ１である。ＣＬＤＮ１８．２は胃粘膜の分化した上皮細胞において正常組織で選択的に発現され、ＣＬＤＮ６およびＰＬＡＣ１は胎盤特異的発現産物と説明されてきた。これらの分化抗原は、以下で述べるように様々な起源の腫瘍において発現され、それらの選択的発現（毒性に関連する正常組織では発現されない）および形質膜への局在のゆえに、抗体媒介性癌免疫療法に関連する能動ワクチン接種方法の開発のための標的構造体として特に適する。
【００５３】
「正常組織」または「正常状態」という用語は、健康な組織または健康な被験者における状態、すなわち非病的状態を指し、「健康な」は、好ましくは非腫瘍形成性または非癌性を意味する。
【００５４】
「特異的に発現される」という用語は、タンパク質が、基本的に特定の組織または器官においてのみ発現されることを意味する。例えば、胃粘膜において特異的に発現される腫瘍関連抗原は、前記タンパク質が主として胃粘膜において発現され、他の組織では発現されないまたは他の組織または器官型では有意の程度に発現されないことを意味する。したがって、胃粘膜の細胞において排他的に発現され、精巣などの他の組織では有意に低い程度に発現されるタンパク質は、胃粘膜の細胞において特異的に発現される。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原はまた、正常条件下では２以上の組織型または器官、例えば２または３の組織型または器官において、しかし好ましくは３以下の異なる組織または器官型において特異的に発現され得る。この場合、腫瘍関連抗原はこれらの器官において特異的に発現される。例えば、腫瘍関連抗原が、正常条件下では、好ましくは肺と胃においてほぼ等しい程度に発現される場合、前記腫瘍関連抗原は肺と胃において特異的に発現される。
【００５５】
本発明に関連して特定の被験者に関する「自己タンパク質」という用語は、前記被験者のゲノムによってコードされ、正常条件下、すなわち非病的条件下では、場合により前記被験者の特定の正常組織型または特定の発生段階で発現されるタンパク質を意味する。好ましくは、自己タンパク質は、獲得した突然変異を有するタンパク質を含まない。被験者における自己タンパク質である腫瘍関連抗原は、前記被験者において正常条件下では特定の組織または特定の発生段階で発現されるまたは発現された、ならびに前記被験者の腫瘍形成組織において、好ましくは同じ形態および／または同じ構造で、異常にまたは異所性に発現される腫瘍関連抗原を含む。「自己抗体」は、それが産生される個体の細胞、組織または天然タンパク質と反応する、すなわち前記個体の自己タンパク質と反応する抗体である。
【００５６】
「自己寛容」という用語は、身体が自己タンパク質に対して免疫応答を開始しない機構を表す。通常、自己寛容は、特に生物自身のＴ細胞およびＢ細胞が生物自身の組織と反応するのを防止する免疫系内の発生事象によって早期に発現される。
【００５７】
本発明に関連して「腫瘍関連抗原の細胞外部分」という用語は、細胞の細胞外空間に面した、好ましくは、例えば細胞の外側から、例えば細胞の外側に位置する抗体によって、前記細胞の外側からアクセス可能である腫瘍関連抗原の一部を指す。好ましくは、この用語は、好ましくは前記腫瘍関連抗原に特異的な腫瘍関連抗原の細胞外ループまたはその一部または何らかの他の細胞外パートを指す。好ましくは、前記パートは、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５０アミノ酸またはそれ以上を含む。
【００５８】
「細胞の表面に結合した腫瘍関連抗原」という用語は、腫瘍関連抗原が前記細胞の形質膜と結合して、そこに位置しており、腫瘍関連抗原の少なくとも一部が前記細胞の細胞外空間に面し、例えば細胞の外側に位置する抗体によって、前記細胞の外側からアクセス可能であることを意味する。これに関連して、一部とは、好ましくは少なくとも４、好ましくは少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸である。結合は直接または間接的であり得る。例えば、結合は、１もしくはそれ以上の膜貫通ドメイン、１もしくはそれ以上の脂質アンカーによって、または何らかの他のタンパク質、脂質、サッカリドもしくは細胞の形質膜の外側リーフレット上で認められ得る他の構造体との相互作用によってであり得る。例えば、細胞の表面と結合した腫瘍関連抗原は、細胞外部分を有する膜貫通タンパク質であり得るか、または膜貫通タンパク質である別のタンパク質との相互作用によって細胞の表面と結合したタンパク質であり得る。
【００５９】
「腫瘍関連抗原に由来するエピトープ」という用語は、例えば、腫瘍関連抗原の部分またはパート、好ましくは腫瘍関連抗原に特異的な腫瘍関連抗原の部分またはパート、またはその変異体もしくは誘導体、好ましくは免疫学的に等価であるその変異体もしくは誘導体であるエピトープを意味する。好ましくは、エピトープ配列に基づいてエピトープが由来する腫瘍関連抗原を同定することが可能である。「特定組織に由来する腫瘍」という用語に関連して、「に由来する」という用語は「から生じる」を意味する。
【００６０】
本発明によれば、「腫瘍」または「腫瘍疾患」という用語は、細胞の異常増殖によって形成される腫脹または病変（新生細胞または腫瘍細胞と呼ばれる）を指す。「腫瘍細胞」とは、急速で制御不能の細胞増殖によって成長し、新たな成長を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける異常細胞を意味する。腫瘍は、構造機構および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常、良性、前悪性または悪性であり得る、明確な組織塊を形成する。
【００６１】
好ましくは、本発明による「腫瘍疾患」は癌疾患、すなわち悪性疾患であり、腫瘍細胞は癌細胞である。好ましくは、腫瘍疾患は、抗原、すなわち腫瘍関連抗原、好ましくは上記で定義した腫瘍関連抗原が発現または異常発現される細胞を特徴とする。好ましくは、腫瘍疾患または腫瘍細胞は、腫瘍関連抗原の表面発現を特徴とする。本発明の好ましい実施形態では、腫瘍細胞または癌細胞は、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２またはＰＬＡＣ１などの、主要関連抗原に結合した細胞表面によって同定できる。
【００６２】
「異所発現」または「異常発現」は、本発明によれば、非腫瘍形成性正常細胞または健康な個体、すなわち特定のタンパク質、例えば腫瘍関連抗原の異所または異常発現に関連する疾患を有していない個体における状態と比較して、発現が変化している、好ましくは増大していることを意味する。発現の増大は、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％または少なくとも１００％またはそれ以上の増大を指す。１つの実施形態では、発現は疾患組織においてのみ認められ、健康な組織における発現は抑制されている。
【００６３】
好ましくは、本発明による腫瘍疾患は癌であり、本発明による「癌」という用語は、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎癌、副腎癌、甲状腺癌、血液の癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頸癌、腸癌、肝癌、結腸癌、胃癌、腸癌、頭頸部癌、胃腸の癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵癌、耳、鼻および咽喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌および肺癌ならびにそれらの転移を含む。それらの例は、肺癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、腎細胞癌腫、子宮頸癌腫、または上記で述べた癌型または腫瘍の転移である。本発明による「癌」という用語はまた、癌転移を含む。
【００６４】
本発明に関連して好ましい腫瘍関連抗原は、クローディンファミリーのタンパク質、好ましくはＣＬＤＮ６もしくはＣＬＤＮ１８．２、またはＰＬＡＣ１である。
【００６５】
クローディンは密着結合の最も重要な成分であるタンパク質のファミリーであり、密着結合においてクローディンは上皮の細胞の間の細胞間隙中の分子の流れを制御する傍細胞バリアを確立する。クローディンは、膜を４回横切る膜貫通タンパク質であり、Ｎ末端およびＣ末端の両方が細胞質に位置する。ＥＣ１またはＥＣＬ１と称される最初の細胞外ループは平均で５３アミノ酸から成り、ＥＣ２またはＥＣＬ２と称される２番目の細胞外ループは約２４アミノ酸から成る。本発明に関連して、好ましいクローディンは、ＣＬＤＮ６（配列番号：３および４）ならびにＣＬＤＮ１８．２（配列番号：５および６）である。ＣＬＤＮ６およびＣＬＤＮ１８．２は腫瘍組織において特異的に発現されると同定されており、ＣＬＤＮ１８．２を発現する唯一の正常組織は胃および精巣であり、ＣＬＤＮ６を発現する唯一の正常組織は胎盤である。
【００６６】
例えば、ＣＬＤＮ１８．２は、膵癌腫、食道癌腫、胃癌腫、気管支癌腫、乳癌腫およびＥＮＴ腫瘍において発現されることが認められている。ＣＬＤＮ１８．２は、胃癌、食道癌、膵癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝癌、頭頸部癌および膀胱の癌などの原発腫瘍、ならびにそれらの転移、特にクルーケンベルク腫瘍などの胃癌転移、腹膜転移およびリンパ節転移の予防および／または治療のための有用な標的である。ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞は、好ましくは癌細胞であり、特に、腫瘍形成性胃癌、食道癌、膵癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝癌、頭頸部癌および膀胱癌の細胞から成る群より選択される。
【００６７】
ＣＬＤＮ６は、例えば卵巣癌、肺癌、胃癌、乳癌、肝癌、膵癌、皮膚癌、黒色腫、頭頸部癌、肉腫、胆管癌、腎細胞癌および膀胱癌において発現されることが認められている。ＣＬＤＮ６は、卵巣癌、特に卵巣腺癌および卵巣奇形癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む肺癌、特に扁平上皮肺癌および腺癌、胃癌、乳癌、肝癌、膵癌、皮膚癌、特に基底細胞癌および扁平上皮癌、悪性黒色腫、頭頸部癌、特に悪性多形腺腫、肉腫、特に滑膜肉腫および癌肉腫、胆管癌、膀胱の癌、特に移行上皮癌、腎癌、特に明細胞腎細胞癌および乳頭状腎細胞癌を含む腎細胞癌、結腸癌、精巣胎児性癌および胎盤絨毛癌、ならびにそれらの転移形態の予防および／または治療のための特に好ましい標的である。１つの実施形態では、ＣＬＤＮ６発現に関連する癌疾患は、卵巣癌、肺癌、転移性卵巣癌および転移性肺癌から成る群より選択される。好ましくは、卵巣癌は癌腫または腺癌である。好ましくは、肺癌は癌腫または腺癌であり、好ましくは細気管支癌腫または細気管支腺癌などの細気管支癌である。１つの実施形態では、ＣＬＤＮ６発現に関連する腫瘍細胞は、そのような癌の細胞である。
【００６８】
ＰＬＡＣ１（配列番号：７および８）は、様々な腫瘍型において、特に乳癌においてしばしば異常活性化され、高発現される胎盤特異的遺伝子である。ＭＣＦ‐７およびＢＴ−５４９乳癌細胞におけるＰＬＡＣ１のＲＮＡｉ媒介性サイレンシングは、運動性、移動および浸潤を大きく損ない、Ｇ１／Ｓ細胞周期のブロックを誘導して、増殖をほぼ完全に廃する。ＰＬＡＣ１のノックダウンは、サイクリンＤ１の発現低下およびＡＫＴキナーゼのリン酸化減少に関連する。さらに、ＰＬＡＣ１は癌細胞の表面に局在し、この分子の生物学的機能に拮抗する抗体にアクセスしやすい。
【００６９】
ＰＬＡＣ１は、それを治療用抗体ならびに／または予防的および／もしくは治療的ワクチン接種にとって極めて魅力的な標的にするいくつかの特性を有する。例えば乳癌の場合、患者の８２％がこの標的を担持する。この癌型の治療のために利用可能な唯一のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎの標的、Ｈｅｒ２／ｎｅｕは、これに対し、乳癌患者の２０〜２５％においてのみ過剰発現される（Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｏｄｏｌｐｈｉｎ，Ｗ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ａ．，Ｈｏｌｔ，Ｊ．Ａ．，Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｇ．，Ｋｅｉｔｈ，Ｄ．Ｅ．，Ｌｅｖｉｎ，Ｗ．Ｊ．，Ｓｔｕａｒｔ，Ｓ．Ｇ．，Ｕｄｏｖｅ，Ｊ．，Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，７０７−７１２）。ＰＬＡＣ１がそれぞれ症例の４２および５８％において発現される、肺癌および胃癌に関しては、これらの癌型では適切な標的がないためこれまでのところ認可されたｍＡｂ治療はない。ＰＬＡＣ１は、増殖だけでなく細胞の運動性、移動および浸潤にも関与する。
【００７０】
ＰＬＡＣ１発現は、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、膵癌、腎細胞癌、肝癌、肉腫、甲状腺癌および頭頸部癌において認められている。ＰＬＡＣ１は、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌腫、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤絨毛癌、子宮頸癌および甲状腺癌、ならびにそれらの転移形態の予防および／または治療のための特に有用な標的である。１つの実施形態では、ＰＬＡＣ１発現に関連する癌疾患は、乳癌または肺癌、好ましくは肺における転移性癌である。
【００７１】
「腫瘍関連抗原を担持する被験者」または「腫瘍関連抗原を発現する被験者」という用語は交換可能に使用され、腫瘍関連抗原が被験者において、例えば腫瘍関連抗原を発現する正常組織中におよび／または腫瘍関連抗原を発現もしくは異常発現する腫瘍形成性組織中に存在することを意味する。「腫瘍関連抗原を担持する細胞」という用語は、好ましくは、前記細胞がその表面に前記腫瘍関連抗原を担持すること、すなわち腫瘍関連抗原が前記細胞の表面と結合していることを意味する。
【００７２】
「エピトープ」という用語は、分子中の抗原決定基、すなわち免疫系によって認識される、例えば抗体によって認識される分子中のパートを指す。例えば、エピトープは、免疫系によって認識される、抗原上の別個の三次元部位である。本発明に関連して、エピトープは、好ましくはタンパク質、特に自己タンパク質に由来する。腫瘍関連抗原などのタンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続または不連続部分を含み、好ましくは５〜１００、好ましくは５〜５０、より好ましくは８〜３０、最も好ましくは１０〜２５アミノ酸長であり、例えば、エピトープは、好ましくは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸長であり得る。本発明に関連するエピトープは、腫瘍関連抗原、好ましくは前記腫瘍関連抗原の発現または異常発現に関連する疾患、例えば癌などの腫瘍形成性疾患に罹患している被験者における自己タンパク質である腫瘍関連抗原に由来する。本発明に関連するエピトープはＴ細胞エピトープでないことが特に好ましい。好ましくは、本発明に関連するエピトープはＢ細胞エピトープである。「本発明の核酸または本発明のベクターに含まれるエピトープ」という語句は、「エピトープをコードし、本発明の核酸または本発明のベクターに含まれる核酸」を意味する。
【００７３】
「エピトープを含むアミノ酸配列」という用語は、１またはそれ以上のエピトープのアミノ酸配列を含み、場合によりリンカー配列などの他の配列を含んでもよいアミノ酸配列を指す。エピトープを含むアミノ酸配列が２以上のエピトープを含む場合、前記エピトープは互いに同じであってもよくまたは異なってもよい。好ましくは、エピトープは上記で述べたような腫瘍関連抗原に由来する。エピトープを含むアミノ酸配列の長さは、好ましくは、ＨＢｃＡｇタンパク質に挿入または結合されたとき、キメラＨＢｃＡｇタンパク質がまだウイルス様粒子に組織化することができる長さである。例えば、エピトープを含むアミノ酸配列の長さは、１０アミノ酸まで、２０アミノ酸まで、３０アミノ酸まで、５０アミノ酸まで、１００アミノ酸まで、１５０アミノ酸まで、２００アミノ酸まで、２５０アミノ酸まで、または３００アミノ酸までであり得る。
【００７４】
「リンカー配列」は、好ましくは２つの他のアミノ酸配列を連結するアミノ酸配列である。例えば、ＨＢｃＡｇタンパク質の一部は、リンカー配列を介して腫瘍関連抗原配列の一部、例えばエピトープ配列と連結され得る。好ましいリンカー配列はＧ４ＳＧ４（配列番号：２４）である。
【００７５】
「免疫応答を誘発する」および「免疫応答を誘導する」という用語は、本発明に関連して交換可能に使用され、好ましくは体液性免疫応答の誘導を指す。体液性免疫応答は、好ましくは抗原特異的抗体、特にエピトープ特異的抗体の生成を含む。本発明に関連して、体液性免疫応答は、好ましくは腫瘍関連抗原に対する抗体の生成を含み、好ましくは、腫瘍関連抗原は、体液性免疫応答が誘発される被験者における自己タンパク質である。したがって、好ましい実施形態では、体液性免疫応答の間に生成される抗体は、好ましくは細胞の表面、例えば腫瘍細胞、好ましくは生腫瘍細胞の表面のその天然立体配座の腫瘍関連抗原に対する、自己抗体である。本発明に関連して、体液性免疫応答の間に生成される抗体は、好ましくは本明細書で述べる免疫エフェクター機能を誘発することができる。好ましくは、前記免疫エフェクター機能は、エピトープが由来する腫瘍関連抗原をその表面に担持する細胞を対象とする。例えば、生成される抗体は、そのような細胞に対するＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣを媒介することができ、ならびに／またはそれらは直接、その表面に腫瘍関連抗原を担持する細胞におけるアポトーシスを誘導するもしくは前記細胞の増殖を阻害する。「免疫応答を誘発する」および「免疫応答を誘導する」という用語はまた、細胞性免疫応答の誘導および細胞性ならびに体液性免疫応答の誘導も表し得る。免疫応答、好ましくは体液性免疫応答は、保護的／防止的／予防的および／または治療的であり得る。「誘導する」は、誘導前には特定の抗原に対する免疫応答が存在しなかったことを意味し得るが、同時に、誘導前に特定の抗原に対する一定のレベルの免疫応答が存在し、誘導後に前記免疫応答が増強されることも意味し得る。したがって、これに関連して「免疫応答を誘導する」はまた、「免疫応答を増強する」も包含する。好ましくは、個体における免疫応答の誘導後、前記個体は癌性疾患などの疾患を発症することから保護されるまたは免疫応答を誘導することによって疾患状態が改善される。例えば、腫瘍関連抗原に対する免疫応答は、癌を有する患者または癌を発症する危険性がある被験者において誘発され得る。この場合免疫応答を誘発することは、患者の疾患状態が改善されること、患者が転移を発症しないこと、または癌を発症する危険性がある被験者が癌を発症しないことを意味し得る。
【００７６】
「細胞性免疫応答」または「抗原に対する細胞性応答」は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩによる抗原の提示を特徴とする細胞に対する細胞応答を含むことが意図されている。細胞性応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして作用するＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称される）は、免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される）は、腫瘍細胞などの疾患細胞を死滅させ、さらなる疾患細胞の産生を防止する。
【００７７】
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分を指す。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域から成る。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域から成る。ＶＨおよびＶＬ領域は、より変異の少ない、フレームワーク領域（ＦＲ）中に点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各々のＶＨとＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲから成る：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００７８】
本発明に関連して「免疫エフェクター機能」という用語は、腫瘍の播種および転移の阻害を含む、腫瘍増殖の阻害および／または腫瘍発生の阻害をもたらす免疫系の成分によって媒介される任意の機能を包含する。好ましくは、免疫エフェクター機能は腫瘍細胞の死滅を生じさせる。好ましくは、本発明に関連する免疫エフェクター機能は、抗体媒介性エフェクター機能である。そのような機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、例えば表面抗原への抗体の結合による、腫瘍関連抗原を担持する細胞におけるアポトーシスの誘導、例えばＣＤ４０受容体もしくはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）への抗体の結合による、ＣＤ４０Ｌ媒介性シグナル伝達の阻害、および／または腫瘍関連抗原を担持する細胞の増殖の阻害、好ましくはＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを含む。したがって、１またはそれ以上の免疫エフェクター機能を媒介することができる抗体は、好ましくは、ＣＤＣ媒介性溶解、ＡＤＣＣ媒介性溶解、アポトーシス、同型接着および／または食作用を誘導することによって、好ましくはＣＤＣ媒介性溶解および／またはＡＤＣＣ媒介性溶解を誘導することによって細胞の死滅化を媒介することができる。抗体はまた、単に腫瘍細胞の表面の腫瘍関連抗原に結合することによって作用を及ぼし得る。例えば、抗体は、単に腫瘍細胞の表面の腫瘍関連抗原に結合することによって腫瘍関連抗原の機能をブロックし得るまたはアポトーシスを誘導し得る。例えば、細胞表面のＰＬＡＣ１に結合する抗体は細胞の増殖をブロックする。好ましい実施形態では、腫瘍関連抗原はＰＬＡＣ１であり、ＰＬＡＣ１に対して誘導される抗体によって及ぼされるエフェクター機能は増殖の阻害を含む。
【００７９】
ＡＤＣＣは、エフェクター細胞、特にリンパ球の細胞死滅能力を表し、これは、好ましくは標的細胞が抗体によって印づけられることを必要とする。ＡＤＣＣは、好ましくは、抗体が腫瘍細胞上の抗原に結合し、抗体Ｆｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と係合した場合に起こる。Ｆｃ受容体のいくつかのファミリーが同定されており、特定の細胞集団は、定められたＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、抗原提示を導く様々な程度の即時腫瘍破壊および腫瘍指向性Ｔ細胞応答の誘導を直接誘導する機構とみなすことができる。好ましくは、ＡＤＣＣのインビボでの誘導は、抗腫瘍T細胞応答およびさらなる宿主由来の抗体応答を導く。
【００８０】
ＣＤＣは、抗体によって指令され得るもう１つの細胞死滅化方法である。ＩｇＭは補体活性化のために最も有効なアイソタイプである。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３も、古典的補体活性化経路によってＣＤＣを指令するのにどちらも非常に有効である。好ましくは、このカスケードにおいて、抗原抗体複合体の形成は、ＩｇＧ分子などの関与する抗体分子のＣＨ２ドメイン上のごく近接した多数のＣ１ｑ結合部位の露出を生じさせる（Ｃ１ｑは補体Ｃ１の３つのサブ成分の１つである）。好ましくは、これらの露出されたＣ１ｑ結合部位は、それまでの低親和性Ｃ１ｑ−ＩｇＧ相互作用を高いアビディティの相互作用へと変換し、それが一連の他の補体タンパク質に関係する事象のカスケードを開始させ、エフェクター細胞化学走性／活性化物質Ｃ３ａおよびＣ５ａのタンパク質分解性放出を導く。好ましくは、補体カスケードは、細胞内および細胞外への水と溶質の自由な通過を促進する細胞膜の細孔を作り出し、アポトーシスを導き得る、膜侵襲複合体の形成に終わる。
【００８１】
本発明に関連して「免疫エフェクター細胞」という用語は、免疫反応の間にエフェクター機能を及ぼす細胞に関する。例えば、そのような細胞は、サイトカインおよび／またはケモカインを分泌し、微生物を死滅させ、抗体を分泌し、感染細胞または癌性細胞を認識し、そして場合によりそのような細胞を排除する。例えば、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージおよび樹状細胞を含む。
【００８２】
「被験者」および「個体」という用語は交換可能に使用され、哺乳動物に関する。例えば、本発明に関連する哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、家畜、例えばイヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ等、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット等、ならびに動物園の動物のような捕らわれている動物である。本明細書で使用される「動物」という用語はまた、ヒトを包含する。「被験者」という用語はまた、患者、すなわち動物、好ましくは疾患を有するヒト、好ましくはＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６またはＰＬＡＣ１などの腫瘍関連抗原の発現または異常発現に関連する疾患、好ましくは癌などの腫瘍形成性疾患を有するヒトを包含し得る。好ましい実施形態では、被験者の免疫系は機能不全ではないまたは基本的に機能不全ではない。これは、被験者の適切に機能する免疫系の基本的特性が被験者に存在することを意味する。これは、特に、被験者が、投与された抗原に対して、例えば体液性および／もしくは細胞性免疫応答の誘導などの免疫反応のタイプ、誘導される免疫反応の強さおよび／もしくは期間、または誘導される免疫反応の特異性に関して、正常に機能する免疫系を有する個体から期待される免疫反応に匹敵する免疫反応を生じることができることを含む。あるいはまたは付加的に、これは、前記被験者において自己寛容機構が維持され、存在することを含み得る。例えば、これらの自己寛容機構は、例えばそのまま投与された場合自己タンパク質である腫瘍関連抗原に対する免疫反応の抑制を生じさせ得る。
【００８３】
本発明によれば、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、それらの組合せ、およびそれらの修飾形態を含む。この用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産されたおよび化学合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖としておよび直鎖状または共有結合閉環分子として存在し得る。
【００８４】
本発明に関連して、「免疫原性組成物」および「ワクチン組成物」という用語は交換可能に使用され、好ましくはウイルス様粒子の形態の、本発明によるタンパク質を含有する抗原性製剤に関する。免疫原性組成物は、１またはそれ以上の抗原に対する、好ましくは前記被験者における自己タンパク質である、好ましくは１またはそれ以上の腫瘍関連抗原に対する前記被験者の体液性および／または細胞性免疫系を刺激するために被験者に投与され得る。本発明に関連して免疫原性組成物は、好ましくはアジュバントの添加なしでその免疫原性能を及ぼし、好ましくは抗原、例えば本発明のタンパク質に含まれる、エピトープが由来する抗原、たとえば腫瘍関連抗原に対する防御的および／または治療的免疫反応を誘発するために任意の適切な経路で被験者に投与される。好ましい実施形態では、本発明による免疫原性組成物は、前記免疫原性組成物を投与された被験者内で腫瘍関連抗原に由来するエピトープに対する抗体産生を誘導することができ、前記腫瘍関連抗原は、好ましくは前記被験者内の自己タンパク質である。言い換え得ると、特に好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、その免疫原性組成物が投与された被験者における自己タンパク質である腫瘍関連抗原に対する自己抗体の生成を含む体液性免疫応答を誘発することができる。
【００８５】
「自己寛容を打破する」という用語は、被験者の免疫系が自己タンパク質に対する免疫応答を生じるようにする任意の手順を指す。通常、自己タンパク質は自己寛容によって被験者自身の免疫系から保護されている。免疫系は自己タンパク質を「自己」として認識し、そのような構造体を攻撃しない。これは、しばしば自己タンパク質である腫瘍関連抗原にとって、前記腫瘍関連抗原を担持する細胞が異種または疾患性と認識されず、したがって前記抗原に対する既存の自己寛容のために免疫系によって攻撃されないことを意味する。したがって、腫瘍療法に関連して、腫瘍関連抗原に対する自己寛容を打破することは望ましい。
【００８６】
「免疫療法」という用語は、特異的免疫反応の活性化を含む治療に関する。本発明に関連して、「防御する」、「予防する」、「予防的」、「防止的」または「防御的」などの用語は、個体における腫瘍の発生および／または増殖の予防または治療またはその両方に関する。本発明に関連して「免疫療法」という用語は、好ましくは能動的腫瘍免疫または腫瘍ワクチン接種を指す。免疫療法の予防的投与、例えば本発明の免疫原性組成物の予防的投与は、好ましくは腫瘍増殖の発生から受容者を保護する。免疫療法の治療的投与、例えば本発明の免疫原性組成物の治療的投与は、腫瘍の進行／増殖の阻害を導き得る。これは、好ましくは腫瘍の排除を導く、腫瘍の進行／増殖の減速、特に腫瘍の進行の阻止を含む。免疫療法の治療的投与は、個体を、例えば存在する腫瘍の播種または転移から保護し得る。
【００８７】
「免疫化（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」または「ワクチン接種」という用語は、治療的または予防的理由から免疫応答を誘導する目的で被験者に抗原を投与するプロセスを表す。
【００８８】
「アジュバント」という用語は、抗原または抗原ペプチドと組み合わせて個体に投与した場合、免疫応答を延長するまたは増強するまたは促進する化合物に関する。本発明の免疫原性組成物は、好ましくはアジュバントの添加なしでその免疫原性作用を及ぼす。それにもかかわらず、本発明の免疫原性組成物は任意の公知のアジュバントを含有し得る。アジュバントは、抗原の表面の増大、体内での抗原の保持の延長、抗原放出の遅延、マクロファージへの抗原の標的化、抗原の取込みの増大、抗原プロセシングの増強、サイトカイン放出の刺激、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞などの免疫細胞の刺激と活性化、および免疫細胞の非特異的活性化を含む、１またはそれ以上の機構によってその生物学的作用を及ぼすと推測される。アジュバントは、油性エマルション（例えばフロイントアジュバント）、無機化合物（ミョウバンなど）、細菌産物（百日咳菌毒素など）、リポソーム、および免疫刺激性複合体などの化合物の不均質な群を含む。アジュバントの例としては、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、ＤＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ；国際公開公報第９６／３３７３９号）、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８およびＱＳ−Ｌ１などのサポニン（Ｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ７：１７８−１８６）、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、ビタミンＥ、モンタニド、ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｋｒｉｅｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−５４９）、Ｆｌｔ３リガンド（ドイツ特許第１０２００８０６１５２２号）、ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールなどの生分解性油から調製される様々な油中水型エマルションがある。
【００８９】
「増大させる」または「増強する」などの用語は、好ましくは、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに一層好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも１００％の増大または増強に関する。これらの用語はまた、ゼロ時点で特定の化合物または状態について検出可能なシグナルが存在せず、ゼロ時点より後の特定の時点で特定の化合物または状態について検出可能なシグナルが存在する状況にも関し得る。
【００９０】
本発明による免疫原性組成物は、一般に「医薬的に許容される量」で、および「医薬的に許容される製剤」中で適用される。そのような組成物は、塩、緩衝剤、防腐剤、担体および場合により他の治療薬を含有し得る。「医薬的に許容される塩」は、例えば酸付加塩を含み、酸付加塩は、例えば、化合物の溶液を塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、カルボン酸またはリン酸などの医薬的に許容される酸の溶液と混合することによって形成され得る。さらに、化合物が酸性部分を担持する場合、適切な医薬的に許容されるその塩は、アルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムまたはマグネシウム塩）；ならびに適切な有機配位子（例えばアンモニウム、第四級アンモニウムならびにハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、アルキルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩などの対アニオンを用いて形成されるアミンカチオン）で形成される塩を含み得る。医薬的に許容される塩の説明的な例は、酢酸塩、アジピン酸、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストル酸塩、エシル酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプチン酸塩、グルコヘプトン酸、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレソルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６，ｐｐ．１−１９（１９７７）参照）。
【００９１】
本明細書で使用される場合「賦形剤」という用語は、例えば担体、結合剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤、着香剤または着色剤などの、有効成分ではない医薬製剤中のすべての物質を指すことが意図されている。
【００９２】
本発明による免疫原性組成物は、医薬的に許容される担体を含有し得る。本発明に関連して「医薬的に許容される担体」という用語は、ヒトへの投与に適する、１またはそれ以上の適合性固体または液体充填剤または希釈剤に関する。「担体」という用語は、有効成分の適用を容易にするために有効成分と組み合わされる天然または合成有機または無機成分に関する。好ましくは、担体成分は、水または鉱油、動物もしくは植物に由来するものを含む油、例えば落花生油、ダイズ油、ゴマ油、ヒマワリ油等のような滅菌液体である。塩溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセリン水溶液も水性担体化合物として使用し得る。
【００９３】
本発明によれば、免疫原性組成物は治療有効量で投与される。「治療有効量」は、単独でまたはさらなる薬剤と組み合わせて、所望反応または所望効果を生じさせる量に関する。特定の疾患または特定の状態の治療の場合、所望反応は疾患の進行の阻害に関する。これは、疾患の進行の減速、特に腫瘍の進行の阻止を含む。疾患または状態の治療についての所望反応はまた、疾患または状態の発生の遅延または発生の阻害であり得る。本発明による組成物の有効量は、状態または疾患、疾患の重症度、年齢、生理的状態、身長および体重を含む患者の個別のパラメータ、治療の期間、場合により併用される治療の種類、特定の投与経路、ならびに同様の因子に依存する。初期用量で患者の反応が不十分な場合は、複数回免疫またはより高い用量（より局所的な投与経路によって達成され得るより高い有効用量）を適用し得る。一般に、ヒトにおける治療のためまたは免疫反応の誘導もしくは増大のために、好ましくは、体重１ｋｇあたり０．０１〜２００μｇの範囲、好ましくは０．１〜１００μｇの範囲の、本発明のタンパク質、好ましくは本発明のウイルス様粒子の用量が製剤され、投与される。好ましい実施形態では、５０μｇ〜２ｍｇ、好ましくは６００μｇの本発明のウイルス様粒子が、約８０ｋｇの体重を有するヒト患者に投与される。好ましくは、この量は３回で、好ましくは標準的な免疫プロトコールにしたがって投与される。
【００９４】
１つの実施形態では、本発明による免疫原性組成物は、本発明による免疫原性組成物の初回投与から始まって４０日間、３０日間、２０日間、１５日間または１０日間にわたって５回以下、４回以下、３回以下または２回以下投与される。１つの実施形態では、本発明による免疫原性組成物は、本発明による免疫原性組成物の初回投与から始まって３０日間、２０日間、１５日間または１０日間にわたって３回または２回投与される。好ましくは、本発明による免疫原性組成物のこの投与に続いて、本発明による免疫原性組成物を使用した１回またはそれ以上、好ましくは単回のブースター投与が実施され、これは、好ましくは本発明による免疫原性組成物の最後の投与または最後のブースター投与から１５日以上、２０日以上、４０日以上、５０日以上または６０日以上後に実施される。
【００９５】
「発現」という用語は、本明細書ではその最も広い意味で使用され、ＲＮＡまたはＲＮＡとタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特にペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は一過性または安定であり得る。
【００９６】
本発明によれば、「ペプチド」という用語はオリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合によって共有結合連結された２またはそれ以上、好ましくは３またはそれ以上、好ましくは４またはそれ以上、好ましくは６またはそれ以上、好ましくは８またはそれ以上、好ましくは１０またはそれ以上、好ましくは１４またはそれ以上、好ましくは１６またはそれ以上、好ましくは２１またはそれ以上、および好ましくは８、１０、２０、３０、４０または５０まで、特に１００アミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大型ペプチド、好ましくは１００アミノ酸残基以上を有するペプチドを指すが、一般に「ペプチド」と「タンパク質」という用語は同義語であり、本明細書では交換可能に使用される。
【００９７】
発明の詳細な説明
発明人は、驚くべきことに、被験者において体液性免疫応答を誘導する、すなわち被験者の免疫系に腫瘍関連抗原に対する抗体、特に自己抗体を生じさせることが可能であり、生成された抗体は、細胞の表面のその天然形態の腫瘍関連抗原を認識することができ、前記腫瘍関連抗原を担持する細胞に対して免疫エフェクター機能を及ぼすことができることを見出した。特に、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質から成るウイルス様粒子を腫瘍関連抗原に由来するエピトープのための担体として利用する。
【００９８】
免疫応答の誘導ならびに／または腫瘍形成性疾患の予防的および／もしくは治療的処置に関する本発明のすべての態様について、免疫応答は、ＨＢｃＡｇタンパク質の特定の位置に挿入されたまたは結合されたエピトープが由来する腫瘍関連抗原に対して誘導されること、ならびに腫瘍形成性疾患の予防的および／または治療的処置は、エピトープが由来する腫瘍関連抗原の表面発現に関連する腫瘍形成性疾患に関してであることが理解されるべきである。例えば、エピトープがＣＬＤＮ６に由来する場合、誘導される免疫応答ならびに予防的および／または治療的処置は、ＣＬＤＮ６を発現する細胞、好ましくはＣＬＤＮ６を発現する腫瘍細胞に対して、およびＣＬＤＮ６発現に関連する腫瘍形成性疾患に対してである。同じことがＣＬＤＮ１８．２およびＰＬＡＣ１および任意の他の腫瘍関連抗原についても当てはまる。特異的腫瘍関連抗原についての特定の好ましい腫瘍型は、本明細書で示され、本発明のすべての態様に適用される。
【００９９】
１つの態様では、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部とその中に挿入されたまたはそれに結合された、エピトープを含むアミノ酸配列とを含むタンパク質であって、エピトープが腫瘍細胞の表面と結合した腫瘍関連抗原の細胞外部分に由来するタンパク質を提供する。好ましくは、腫瘍関連抗原は、正常条件下では限られた数の特定組織および／または器官で、好ましくは３以下、より好ましくは２以下、最も好ましくは１つの特定組織または器官で発現され、腫瘍組織において発現または異常発現される。
【０１００】
好ましくは、エピトープを含むアミノ酸配列は、エピトープが少なくとも部分的にその天然立体配座を取るように、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質またはその部分のアミノ酸配列に挿入されるまたは結合される。天然立体配座は、これに関連して、エピトープが、その天然環境内で、すなわちそれが由来する腫瘍関連抗原内で、天然条件下で、すなわち腫瘍関連抗原が通常認められる条件下で取るのと同じ構造を示すことを意味する。これに関連して「部分的に」という用語は、キメラＨＢｃＡｇタンパク質内のエピトープの構造が腫瘍関連抗原内のエピトープの構造と必ずしも１００％同一ではないが、少なくとも有意の類似性が同定できることを意味し得る。したがって、好ましくは、本発明のタンパク質内のエピトープに対して生成される抗体は、好ましくは細胞の表面、好ましくは腫瘍細胞、好ましくは生腫瘍細胞、好ましくはその天然環境中の生腫瘍細胞の表面の、その天然立体配座の腫瘍関連抗原を認識し、それに結合することができる。好ましくは、エピトープは、本発明のタンパク質が、好ましくはウイルス様粒子の形態で、被験者に投与された場合、腫瘍関連抗原を担持する細胞に対する免疫応答が、腫瘍関連抗原を発現する前記被験者において誘発される立体配座を取る。好ましくは、前記免疫応答は、腫瘍関連抗原が前記被験者における自己タンパク質である場合でも誘発される。好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、被験者において存在する腫瘍関連抗原に抗原に対する自己寛容に逆らって、前記被験者においてエピトープが由来する腫瘍関連抗原に対する免疫応答、好ましくは体液性免疫応答を誘発することができる。好ましくは、本発明のタンパク質は、好ましくはウイルス様粒子の形態で、アジュバントなしで投与された場合でも、前記免疫応答を誘発することができる。
【０１０１】
本発明のタンパク質の特に好ましい実施形態では、前記タンパク質は、アジュバントなしにウイルス様粒子の形態で被験者に投与された場合、細胞の表面と結合した腫瘍関連抗原に対する体液性免疫応答を誘発することができ、前記腫瘍関連抗原は前記被験者における自己タンパク質である。好ましくは、体液性免疫応答は、好ましくはその天然立体配座の腫瘍関連抗原を担持する細胞に対して、１またはそれ以上の免疫エフェクター機能を示す抗体、好ましくは自己抗体の生成を含む。好ましくは、１またはそれ以上の免疫エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、アポトーシスの誘導、増殖の阻害、およびＣＤ４０Ｌ媒介性シグナル伝達の阻害から成る群より選択され、好ましくは、エフェクター機能はＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣである。
【０１０２】
当業者は、タンパク質が上記基準を満たすかどうかを容易に判定することができる。例えば、当業者は、例えばマウスまたはウサギ特異的アミノ酸配列を使用して、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２またはＰＬＡＣ１などの腫瘍関連抗原の細胞外部分に由来するエピトープを含む上述したようなタンパク質を生成し得る。当業者は、次に、ウサギ特異的エピトープを含むタンパク質でウサギを、またはマウス特異的エピトープを含むタンパク質でマウスを免疫化することができ、前記タンパク質は、好ましくはウイルス様粒子の形態であり、好ましくはアジュバントなしで投与される。当業者は免疫化スキームを十分に認識しており、これらのスキームのいずれも使用し得る。免疫化が完了した後、動物から血清を採取し、血清を、エピトープが由来し、免疫化が実施されたそれぞれの種のアミノ酸配列を有する腫瘍関連抗原を内因性または外因性に発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞への抗体媒介性エフェクター機能に関して試験し得る。例えば、その表面にそれぞれの腫瘍関連抗原を担持する細胞の死滅化またはそのような細胞の増殖の阻害を測定することができる。そのような方法を本発明の実施例の章で例示的に説明する。
【０１０３】
特に好ましい実施形態では、腫瘍関連抗原はクローディンファミリーのタンパク質またはＰＬＡＣ１である。好ましくは、クローディンファミリーのタンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２およびＣＬＤＮ６から成る群より選択される。
【０１０４】
エピトープは、好ましくは５アミノ酸から腫瘍関連抗原の細胞外部分の連続するパートの全長までの間であり、好ましくは前記腫瘍関連抗原に特異的である。例えば、エピトープは、５〜１００、好ましくは５〜５０、より好ましくは８〜３０、最も好ましくは１０〜２５アミノ酸長であり得、例えば、エピトープは、好ましくは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸長であり得る。
【０１０５】
本発明に関連して特に好ましいエピトープ配列は、ＣＬＤＮ６についてはＰＭＷＫＶＴＡＦＩＧＮＳＩ（配列番号：９）、ＭＷＫＶＴＡＦＩＧＮＳＩＶＶＡ（配列番号：１０）、ＦＩＧＮＳＩＶＶＡＱＶＶＷＥ（配列番号：１１）、ＶＶＡＱＶＶＷＥＧＬＷＭＳ（配列番号：１２）、ＶＡＱＶＶＷＥＧＬＷＭＳＣＶＶＱＳＴＧＱＭＱＣ（配列番号：１３）、ＫＶＴＡＦＩＧＮＳＩＶＶＡＱＶＶ（配列番号：１４）、ＫＶＴＡＦＩＧＮＳＩＶＶＡＱ（配列番号：１５）、ＲＤＦＹＮＰＬＶＡＥＡＱＫ（配列番号：１６）、ＤＦＹＮＰＬＶＡＥＡＱ（配列番号：１７）、ＴＡＨＡＩＩＲＤＦＹＮＰＬ（配列番号：１８）、ＤＦＹＮＰＬＶＡＥＡＱＫ（配列番号：１９）およびＩＲＤＦＹＮＰＬＶＡＥＡＱＫＲＥ（配列番号：２０）、ＣＬＤＮ１８．２についてはＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴ（配列番号：２１）、ＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬ（配列番号：４５）、ＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱ（配列番号：４６）、ＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬ（配列番号：４７）、ＳＣＶＲＥＳＳＧＦ（配列番号：４８）、ＶＲＥＳＳＧＦＴ（配列番号：４９）、ＶＲＥＳＳＧＦＴＥ（配列番号：５０）、ＲＧＹＦＴＬＬＧＬ（配列番号：５１）、ＥＣＲＧＹＦＴＬＬＧＬ（配列番号：５２）、ＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳ（配列番号：５３）、ＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱ（配列番号：５４）、ＭＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬ（配列番号：５５）、ＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲ（配列番号：５６）、ＲＩＧＳＭＥＤＳＡＫＡＮＭＴＬＴＳ（配列番号：５７）、ＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＴＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦ（配列番号：５８）、そしてＰＬＡＣ１についてはＶＦＳＥＥＥＨＴＱＶＰ（配列番号：２２）、ＶＦＳＥＥＥＨＴＱＶ（配列番号：２３）、ＡＰＱＫＳＰＷＬＴＫＰ（配列番号：５９）、ＱＫＳＰＷＬＴＫＰ（配列番号：６０）、ＡＰＱＫＳＰＷＬＴ（配列番号：６１）、ＭＲＶＡＳＫＳＲ（配列番号：６２）、ＡＰＱＫＳＰ（配列番号：６３）、ＴＡＱＫＤＥＫ（配列番号：６４）、ＳＫＧＴＰＳＫ（配列番号：６５）、ＡＰＱＫＳＰＷＬＴＫ（配列番号：６６）、ＱＫＳＰＷＬＴＫ（配列番号：６７）、ＳＭＲＶＡＳＫＳＲＡＴＡＱＫＤＥＫ（配列番号：６８）、ＰＰＮＨＶＱＰＨＡＹＱＦＴＹＲＶＴＥ（配列番号：６９）、ＳＭＲＶＡＳＫＳＫＲＡＴＡＱＫＤＥ（配列番号：７０）、ＳＭＲＶＡＳＫＳＫＲＡＴＡＱＫＤ（配列番号：７１）、ＳＭＲＶＡＳＫＳＫＲＡＴＡＱＫ（配列番号：７２）、ＲＶＡＳＫＳＫＲＡＴＡ（配列番号：７３）、ＹＥＶＦＳＬＳＱＳＳＱＲＰＮ（配列番号：７４）、ＥＶＦＳＬＳＱＳＳＱＲ（配列番号：７５）、ＩＤＷＦＭＶＴＶＨＰＦＭＬＮＮＤＶ（配列番号：７６）、ＩＤＷＦＭＶＴＶＨＰＦＭＬＮＮＤ（配列番号：７７）、ＩＤＷＦＭＶＴＶＨＰＦＭＬＮＮ（配列番号：７８）、ならびにそれらの変異体である。
【０１０６】
本発明のタンパク質の好ましい実施形態では、エピトープは、
（ｉ）配列表の配列番号：９〜２３および４５〜７８に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）好ましくはエピトープ配列の全長にわたって（ｉ）の下のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、好ましくは少なくとも８０％同一であり、（ｉ）の下のアミノ酸配列と免疫学的に等価であるアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）切断型であり、（ｉ）の下のアミノ酸配列と免疫学的に等価である、（ｉ）もしくは（ｉｉ）の下のアミノ酸配列
を含み、好ましくは基本的に前記アミノ酸配列から成り、好ましくは前記アミノ酸配列から成る。前記切断はアミノ末端またはカルボキシ末端においてであり得、また、エピトープ配列の全長の好ましくは４０％以下、好ましくは３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下である。
【０１０７】
これらのエピトープの変異体および／または誘導体も、前記変異体および／または誘導体が明確に開示されるエピトープと免疫学的に等価である限り、本発明において企図される。当業者は、エピトープ内の単一アミノ酸置換、付加、挿入および／または欠失は前記エピトープの免疫学的特性を有意に変化させない場合もあることを理解する。
【０１０８】
本発明のタンパク質の好ましい実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質は、
（ｉ）配列番号：１に示すアミノ酸配列もしくは少なくとも５０アミノ酸、好ましくは少なくとも６０アミノ酸、好ましくは少なくとも７０アミノ酸、好ましくは少なくとも８０アミノ酸、好ましくは少なくとも９０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、好ましくは少なくとも１１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１２０アミノ酸、好ましくは少なくとも１３０アミノ酸、好ましくは少なくとも１４０アミノ酸のその部分、または
（ｉｉ）好ましくは（ｉ）の下のアミノ酸配列もしくはその部分の全長にわたって、（ｉ）の下のアミノ酸配列もしくはその部分と少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、好ましくは少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは基本的に前記アミノ酸配列から成り、好ましくは前記アミノ酸配列から成る。好ましくは、本発明で使用されるＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質は、ウイルス様粒子への、好ましくはＢ型肝炎ウイルスコア抗原ウイルス様粒子の通常の形状、すなわち１８０または２４０サブユニットから成り、正二十面体構造を有する形状への組織化に関して、天然に生じるＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質と機能的に等価である。
【０１０９】
特に好ましい実施形態では、ＨＢｃＡｇタンパク質またはその部分は、配列番号：１の１４０位までの（１４０位を含む）アミノ酸位置または対応するアミノ酸位置にカルボキシ末端の切断を有する。例えば、カルボキシ末端切断は、配列番号：１の１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２または１８３位または対応するアミノ酸であり得、および前記位置を含む。配列番号：１の１４０位におけるおよび１４０位を含むカルボキシ末端切断とは、１４０位からカルボキシ末端までのアミノ酸がこの特定のＨＢｃＡｇ変異体または部分では失われていること、すなわちこのＨＢｃＡｇタンパク質変異体または部分は配列番号：１のアミノ酸１〜１３９で構成され得ることを意味する。これに関連して「対応するアミノ酸位置」は、本発明のタンパク質が配列番号：１に示すＨＢｃＡｇタンパク質以外のＨＢｃＡｇタンパク質、例えば挿入、付加および／または欠失を有する天然に生じる変異体を含む場合、配列番号：１の１４０位のアミノ酸は、前記天然に生じるＨＢｃＡｇ変異体の１４０位のアミノ酸に対応せず、より低いまたは高い数の位置に対応し得ることを意味する。対応するアミノ酸は、上述したように、例えば配列アラインメントによって決定され得る。
【０１１０】
本発明のタンパク質の特に好ましい実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質は、核酸に結合することはできないが、ウイルス様粒子に組織化する能力を保持するようにカルボキシ末端に切断を有する。主要なＲＮＡ認識活性は、配列番号：１のアミノ酸１５０〜１５７に対応するＨＢｃＡｇタンパク質内の領域に帰せられた。主要なＤＮＡ認識活性は、配列番号：１のアミノ酸１５７〜１７７に対応するＨＢｃＡｇタンパク質内の領域に帰せられた。したがって、ＨＢｃＡｇタンパク質の核酸結合能力を廃するために、核酸結合の役割を担うこれらの配列は、好ましくは欠失される。
【０１１１】
本発明で使用されるＨＢｃＡｇタンパク質の特に好ましい切断変異体は、配列番号：１のアミノ酸位置１５１または対応するアミノ酸位置におけるおよび前記アミノ酸位置を含む切断、すなわちカルボキシ末端アミノ酸が配列番号：１のアミノ酸位置１５０のアミノ酸に対応するＨＢｃＡｇタンパク質変異体である。好ましい実施形態では、ＨＢｃＡｇタンパク質の前記切断変異体は、好ましくはＧＧＳリンカーなどのグリシンリンカーによってＨＢｃＡｇ切断変異体に連結された、カルボキシ末端Ｈｉｓタグをさらに含む。好ましくは、ＨＢｃＡｇタンパク質の前記切断変異体は、配列番号：７９に示すアミノ酸配列を含む、基本的に前記アミノ酸配列から成る、または前記アミノ酸配列から成る。好ましくは、ＨＢｃＡｇタンパク質の前記切断変異体は、配列番号：８０に示す核酸によってコードされる。
【０１１２】
本発明のタンパク質の好ましい実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のＭＩＲに対応するアミノ酸配列の全部または一部が欠失している。例えば、配列番号：１のアミノ酸７４〜８９の全部または一部が欠失していてよい。
【０１１３】
本発明のタンパク質の好ましい実施形態では、エピトープを含むアミノ酸配列は、
（ｉ）Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のアミノ末端アミノ酸に結合している、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質の３０個のアミノ末端アミノ酸残基、好ましくは２０個のアミノ末端アミノ酸残基、好ましくは１０個のアミノ末端アミノ酸残基、好ましくは５個のアミノ末端アミノ酸残基内に挿入されている、またはＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質の３０個のアミノ末端アミノ酸残基、好ましくは２０個のアミノ末端アミノ酸残基、好ましくは１０個のアミノ末端アミノ酸残基のうちの１もしくはそれ以上、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸を置換している、および／または
（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸に結合している、またはＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質の３０個のカルボキシ末端アミノ酸残基、好ましくは２０個のカルボキシ末端アミノ酸残基、好ましくは１０個のカルボキシ末端アミノ酸残基内に挿入されている、またはＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質の３０個のカルボキシ末端アミノ酸残基、好ましくは２０個のカルボキシ末端アミノ酸残基、好ましくは１０個のカルボキシ末端アミノ酸残基のうちの１もしくはそれ以上、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸を置換している、および／または
（ｉｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のＭＩＲに対応するアミノ酸配列内に挿入されている、またはＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のＭＩＲに対応するアミノ酸配列内の１もしくはそれ以上のアミノ酸、例えば例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６アミノ酸を置換している、および／または
（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のＭＩＲに対応するアミノ酸配列内に位置する１もしくはそれ以上のアミノ酸、例えば配列番号：１のアミノ酸７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８または８９の１もしくはそれ以上もしくは対応するアミノ酸に結合している。
【０１１４】
エピトープを含むアミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のアミノ末端アミノ酸に結合しているまたはアミノ末端残基の間に挿入されている場合、エピトープを含むアミノ酸配列は、５０アミノ酸残基、好ましくは４０アミノ酸残基、好ましくは３０アミノ酸残基の最大長を有することが好ましい。また、９個以下、好ましくは５個以下、好ましくは４個以下、好ましくは３個以下のアミノ酸がＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のアミノ末端から欠失していることも好ましい。
【０１１５】
エピトープを含むアミノ酸配列は、ＭＩＲ内に挿入されているまたはＭＩＲの１またはそれ以上のアミノ酸を置換していることが特に好ましい。好ましくは、エピトープを含むアミノ酸配列は、
（ｉ）配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列の７７位と７８位のアミノ酸の間もしくは対応する位置でＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質に挿入されている、または
（ｉｉ）配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列の７４〜８１位、７６〜８１位、７６〜７９位もしくは７９〜８０位もしくは対応する位置のアミノ酸を置換している。
【０１１６】
エピトープを含むアミノ酸配列は、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質、すなわち上述したような腫瘍関連抗原に由来するエピトープを含むＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質が、ウイルス様粒子に、好ましくは通常のＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質ウイルス様粒子に組織化できるようにＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質に挿入されているまたは結合されていることが特に好ましい。前記タンパク質のこの特徴は、当業者によって、例えば本発明の実施例の章で述べるように、例えば透過型電子顕微鏡検査または動的光散乱と組み合わせた非対称フローフィールドフローフラクショネーションを用いることによって容易に判定され得る。
【０１１７】
また、エピトープを含むアミノ酸配列の構造、特に長さは、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質、すなわち上述したような腫瘍関連抗原に由来するエピトープを含むＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質がウイルス様粒子に組織化することができるように選択されることも好ましい。したがって、エピトープを含むアミノ酸配列は、好ましくは３００アミノ酸以下、好ましくは２５０アミノ酸以下、好ましくは２００アミノ酸以下、好ましくは１５０アミノ酸以下、より好ましくは１００アミノ酸以下の長さである。エピトープを含むアミノ酸配列は、１００アミノ酸残基までの長さ、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸であることが好ましい。エピトープを含むアミノ酸配列の長さは、２０〜６０アミノ酸、好ましくは２５〜５５アミノ酸、例えば２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４または５５アミノ酸であることが特に好ましい。
【０１１８】
本発明のタンパク質の一部の実施形態では、タンパク質は、エピトープを含む第一アミノ酸配列に加えて、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質に挿入されたまたは結合された、エピトープを含む１またはそれ以上のさらなるアミノ酸配列を含み得、エピトープを含む１またはそれ以上のさらなるアミノ酸配列のエピトープの１またはそれ以上は、互いに同じかまたは異なっており、エピトープを含む１またはそれ以上のさらなるアミノ酸配列のエピトープの１またはそれ以上は、エピトープを含む第一アミノ酸配列のエピトープと同じかまたは異なる。エピトープを含むこれらの１またはそれ以上のさらなるアミノ酸配列は、エピトープを含む第一アミノ酸配列に関して上記で述べたようにＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質に挿入され得るまたは結合され得る。エピトープを含む第一アミノ酸配列の長さならびにエピトープ等に関する開示は、エピトープを含む１またはそれ以上のさらなるアミノ酸配列にも適用される。エピトープを含む２以上のアミノ酸配列を含むキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質は、ウイルス様粒子に組織化できることが特に好ましい。
【０１１９】
本発明のタンパク質の一部の実施形態では、エピトープを含む第一アミノ酸配列および／またはエピトープを含むさらなるアミノ酸配列の１もしくはそれ以上は、同じかまたは異なる、２以上のエピトープを含む。例えば、２以上のエピトープを含むアミノ酸配列内の１つのエピトープは、１つの腫瘍関連抗原に由来し、その他のエピトープは別の腫瘍関連抗原に由来し得る。これは、特定の型の腫瘍が腫瘍関連抗原の組合せによって認識され得る場合に特に好都合である。２以上のエピトープを含む１つのアミノ酸配列内のエピトープはまた、同じ腫瘍関連抗原にも由来し得る。この場合、エピトープは、例えば、腫瘍関連抗原の異なる細胞外ループもしくは部分にまたは同じ細胞外ループもしくは部分に由来し得る。
【０１２０】
本発明のタンパク質は、タンパク質を構成する個々の要素、例えばＨＢｃＡｇタンパク質由来部分およびエピトープを含むアミノ酸配列の間に１またはそれ以上のリンカー配列を含み得る。好ましくは、エピトープを含むアミノ酸配列は、エピトープ配列の上流および／または下流にリンカー配列をさらに含む。例えば、エピトープを含むアミノ酸配列がＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質のＭＩＲに挿入されているまたはＭＩＲの全部もしくは一部を置換している場合、特にＭＩＲの全部もしくはその主要部分を置換している場合、エピトープは、エピトープの各々の側でリンカー配列に隣接されることが特に好ましい。
【０１２１】
リンカーは、好ましくは最大限５０アミノ酸、好ましくは最大限４０アミノ酸、より好ましくは最大限３０アミノ酸、さらに一層好ましくは最大限２０アミノ酸、最も好ましくは最大限１０アミノ酸から成る。リンカーは、２〜２５アミノ酸、好ましくは２〜２０アミノ酸、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸、最も好ましくは９アミノ酸から成ることが特に好ましい。リンカーは、好ましくはグリシン、アラニンまたはセリンなどの小さなアミノ酸を含み、好ましくは基本的に前記アミノ酸から成り、好ましくは前記アミノ酸から成る。好ましくは、リンカーは、連結されるアミノ酸配列、例えばエピトープ配列が、天然条件下で少なくとも部分的にその天然構造を取ることができるように選択される。好ましいリンカーは、基本的に、例えば５〜１５アミノ酸の長さを有する、グリシンおよびセリン残基から成り、例えば、好ましいリンカーはＧｌｙｍＳｅｒｎＧｌｙｐであり、ｍ、ｎおよびｐは１〜１０から独立して選択される整数であり、ｍ＋ｎ＋ｐは５〜１５である。特に好ましいリンカーはＧ４ＳＧ４（配列番号：２４）である。エピトープ配列がリンカー配列に隣接される実施形態では、リンカー配列は、本発明のタンパク質のＨＢｃＡｇ部分に、本発明のタンパク質のエピトープ部分を含むアミノ酸配列に含まれるとみなされ得るか、または２つのリンカー配列の一方は本発明のタンパク質のＨＢｃＡｇ部分に含まれるとみなされ、他方のリンカー配列は本発明のタンパク質のエピトープ部分を含むアミノ酸配列に含まれるとみなされ得る。
【０１２２】
一部の実施形態では、本発明のタンパク質は、例えば本発明のタンパク質の精製を容易にするために、１またはそれ以上のエピトープタグ、ペプチドタグまたはタンパク質タグを含み得る。そのようなエピトープタグ、ペプチドタグまたはタンパク質タグは、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ポリＨｉｓタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ＮｕｓＡタグおよびチオレドキシンタグ、または（増強）緑色蛍光タンパク質（（Ｅ）ＧＦＰ）、（増強）黄色蛍光タンパク質（（Ｅ）ＹＦＰ）、イソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）種由来（ＤｓＲｅｄ）もしくは単量体（ｍＲＦＰ）赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）等のような蛍光タンパク質タグを含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、エピトープタグ、ペプチドタグまたはタンパク質タグは、例えばトロンビン、第Ｘａ因子、プレシジョン（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ）、ＴＥＶプロテアーゼ等のようなプロテアーゼを使用して、本発明のタンパク質から切断され得る。そのようなプロテアーゼについての認識部位は当業者に周知である。好ましくは、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグまたはＦＬＡＧタグなどの小さなエピトープタグまたはペプチドタグが使用され、好ましくは、タグは除去され得る。好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、好ましくはカルボキシ末端に、Ｈｉｓタグ、好ましくはＨｉｓ６タグを含む。好ましくは、エピトープタグ、ペプチドタグまたはタンパク質タグはリンカーによって本発明のタンパク質のその他の要素の１またはそれ以上に連結され、リンカーは上記で述べたとおりであり得る。これに関連して好ましいリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳである。
【０１２３】
本発明のキメラＨＢｃＡｇタンパク質の好ましい実施形態では、ＨＢｃＡｇ骨格配列は配列番号：２５〜３０に示すアミノ酸配列、すなわちＨＢｃＡｇ骨格Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ（図７）から成る群より選択される。ＨＢｃＡｇ骨格をコードする好ましい核酸配列は、配列番号：３１〜３６に示す核酸配列であり、配列番号：３１は配列番号：２５をコードし、配列番号：３２は配列番号：２６をコードし、配列番号：３３は配列番号：  ２７をコードし、配列番号：３４は配列番号：２８をコードし、配列番号：３５は配列番号：２９をコードし、および配列番号：３６は配列番号：３０をコードする。「ＨＢｃＡｇ骨格」という用語は、エピトープを含むアミノ酸配列ではない本発明のタンパク質の部分に関する。これらの骨格は、配列表の配列番号：９〜２３および４５〜７８に示すエピトープ配列の１またはそれ以上を含むアミノ酸配列と組み合わされていることが特に好ましい。例えば、ＨＢｃＡｇ骨格Ａ（配列番号：２５）は、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７もしくは配列番号：７８を含むアミノ酸配列と組み合わせることができ、ＨＢｃＡｇ骨格Ｂ（配列番号：２６）は、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７もしくは配列番号：７８を含むアミノ酸配列と組み合わせることができ、ＨＢｃＡｇ骨格Ｃ（配列番号：２７）は、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、���列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７もしくは配列番号：７８を含むアミノ酸配列と組み合わせることができ、ＨＢｃＡｇ骨格Ｄ（配列番号：２８）は、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７もしくは配列番号：７８を含むアミノ酸配列と組み合わせることができ、ＨＢｃＡｇ骨格Ｅ（配列番号：２９）は、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７もしくは配列番号：７８を含むアミノ酸配列と組み合わせることができ、またはＨＢｃＡｇ骨格Ｆ（配列番号：３０）は、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４５、配列番号���４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７もしくは配列番号：７８を含むアミノ酸配列と組み合わせることができる。好ましくは、エピトープを含むアミノ酸配列は、リンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号：２４）とＨＢｃＡｇ部分の間のＨＢｃＡｇ骨格、すなわちこのリンカー配列のすぐ上流または下流に挿入される。好ましくは、エピトープを含むアミノ酸配列はまた、リンカー配列を含み、エピトープを含むアミノ酸配列がＨＢｃＡｇ骨格のリンカー配列の上流に挿入される場合、エピトープを含むアミノ酸配列のリンカー配列はエピトープ配列の上流に位置し、エピトープを含むアミノ酸配列がＨＢｃＡｇ骨格のリンカー配列の下流に挿入される場合、エピトープを含むアミノ酸配列のリンカー配列はエピトープ配列の下流に位置する。したがって、好ましい実施形態では、エピトープは、本発明のキメラＨＢｃＡｇタンパク質内のリンカー配列に隣接される。例えば、ＨＢｃＡｇ骨格のＣ末端に位置するＨｉｓタグは、上記で述べたような任意の他のエピトープタグ、ペプチドタグまたはタンパク質タグによって置換され得ること、およびリンカー配列も上記で述べたように異なり得ることが理解されるべきである。
【０１２４】
本発明のタンパク質の特に好ましい実施形態では、エピトープは、好ましくは配列ＧｌｙｍＳｅｒｎＧｌｙｐ（ｍ、ｎおよびｐは１〜１０から独立して選択される整数であり、ｍ＋ｎ＋ｐは５〜１５である）を有し、より好ましくは配列Ｇ４ＳＧ４（配列番号：２４）を有するリンカーが両側に隣接する配列ＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴ（配列番号：２１）を有するＣＬＤＮ１８．２３２〜４１ペプチドである。リンカーが両側に隣接するエピトープ（エピトープを含むアミノ酸配列）は、ＨＢｃＡｇ骨格配列に挿入され、エピトープを含むアミノ酸配列のＮ末端側に隣接するＨＢｃＡｇ骨格配列の部分は、好ましくは配列番号：１の２〜７３位、２〜７５位または２〜７８位のアミノ酸配列、好ましくは配列番号：１の１〜７３位、１〜７５位または１〜７８位のアミノ酸配列を含み、エピトープを含むアミノ酸配列のＣ末端側に隣接するＨＢｃＡｇ骨格配列の部分は、好ましくは配列番号：１の８０〜１５０位、８１〜１５０位または８２〜１５０位のアミノ酸配列を含む。好ましくは、エピトープを含むアミノ酸配列のＮ末端側に隣接するＨＢｃＡｇ骨格配列の部分は、配列番号：１の２〜７８位のアミノ酸配列、好ましくは配列番号：１の１〜７８位のアミノ酸配列を含み、エピトープを含むアミノ酸配列のＣ末端側に隣接するＨＢｃＡｇ骨格配列の部分は、配列番号：１の８１〜１５０位のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、エピトープを含むアミノ酸配列のＮ末端側に隣接するＨＢｃＡｇ骨格配列の部分は、そのＮ末端に付加的な配列を含み得、および／またはエピトープを含むアミノ酸配列のＣ末端側に隣接するＨＢｃＡｇ骨格配列の部分は、そのＣ末端に付加的な配列を含み得る。
【０１２５】
本発明のタンパク質の特に好ましい例は、
（ｉ）配列番号：３７〜４０に示すアミノ酸配列、または
（ｉｉ）（ｉ）の下のアミノ酸配列の全長の好ましくは６０％にわたって、より好ましくは少なくとも７０％にわたって、より好ましくは少なくとも８０％にわたって、より好ましくは少なくとも９０％にわたって、最も好ましくは少なくとも９５％にわたって、（ｉ）の下のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、好ましくは少なくとも８０％同一であり、および（ｉ）の下のアミノ酸配列と機能的に、好ましくは免疫学的に等価であるアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくは基本的に前記アミノ酸から成る、好ましくは前記アミノ酸から成るタンパク質である。例えば、（ｉｉ）の下のアミノ酸配列は、好ましくはウイルス様粒子に組織化することができ、好ましくはウイルス様粒子の形態でおよびアジュバントなしで被験者に投与された場合、好ましくは、前記被験者においてエピトープが由来する腫瘍関連抗原に対する免疫応答、好ましくは体液性免疫応答を誘発することができる。上記で特定したように、生成される抗体は、好ましくは細胞の表面上の、好ましくは腫瘍細胞の表面上のその天然立体配座の腫瘍関連抗原を、好ましくは認識し、それに結合することができる。好ましくは、前記免疫反応はまた、腫瘍関連抗原が被験者における自己タンパク質である場合にも誘発される。
【０１２６】
本発明のタンパク質の好ましい例をコードする好ましい核酸配列は、配列番号：４１〜４４に示す核酸であり、配列番号：４１は配列番号：３７をコードし、配列番号：４２は配列番号：３８をコードし、配列番号：４３は配列番号：３９をコードし、および配列番号：４４は配列番号：４０をコードする。
【０１２７】
別の態様では、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸を含む、好ましくは基本的に前記核酸から成る、好ましくは前記核酸から成るポリヌクレオチドを提供する。本発明のタンパク質をコードする核酸の特に好ましい例は、配列番号：４１〜４４に示される。また、本発明のタンパク質をコードする核酸配列の変異体も、核酸変異体によってコードされる特定のタンパク質変異体がそれぞれのタンパク質と機能的に、好ましくは免疫学的に等価である限り、上記で述べたように本発明によって企図される。好ましい実施形態では、本発明によるポリヌクレオチドはコドン使用頻度に関して最適化される。例えば、本発明のタンパク質が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物宿主において発現される場合、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは原核生物コドン使用頻度に関して最適化される。
【０１２８】
さらなる態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクター、好ましくは組換えベクターを提供する。「組換え」は、前記ベクターが天然では生じないこと、例えば、前記ベクターが遺伝子操作によって作製されたことを意味する。本発明に関連するベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、λファージなどのファージベクター、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体ベクターを含む、当業者に公知の任意のベクターであり得る。前記ベクターは、発現ベクターならびにクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミドならびにウイルスベクターを含み、一般に所望コード配列および特定の宿主生物（例えば細菌、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物）またはインビトロ発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要な適切なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは、一般に特定の所望ＤＮＡフラグメントを操作し、増幅するために使用され、所望ＤＮＡフラグメントの発現のために必要な機能的配列を欠如し得る。当業者は、対象とするポリヌクレオチド配列のベクターへの組込みのために使用される技術を十分に認識する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、前出も参照のこと）。ベクター、例えばプラスミドは、複製起点（ｏｒｉ）、マルチクローニングサイト、およびプロモーター（構成的または誘導的）、転写開始部位、リボソーム結合部位、転写終結部位、ポリアデニル化シグナルなどの調節配列、および抗生物質耐性または突然変異もしくは欠失の相補性に基づく栄養要求性マーカーなどの選択マーカーを含み得る。１つの実施形態では、対象とするポリヌクレオチド配列は、調節配列に作動可能に連結されている。
【０１２９】
さらなる態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、古細菌もしくは細菌細胞などの原核生物細胞または酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞などの真核生物細胞であり得る。好ましい実施形態では、宿主細胞は、大腸菌細胞などの細菌細胞である。当業者は、前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターを前記宿主細胞に導入するための方法を十分に認識する。例えば、細菌細胞は、例えば化学的形質転換、例えば塩化カルシウム法または電気穿孔を用いて容易に形質転換することができる。酵母細胞は、例えば酢酸リチウム形質転換法または電気穿孔を用いて形質転換し得る。他の真核生物細胞は、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの市販のリポソームに基づくトランスフェクションキット、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）などの市販の脂質に基づくトランスフェクションキット、ポリエチレングリコールに基づくトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃（バイオリスティック）、電気穿孔、またはウイルス感染を用いてトランスフェクトすることができる。本発明の好ましい実施形態では、宿主細胞は本発明のポリヌクレオチドを発現する。発現されたタンパク質は、可溶性であり得るおよび／または封入体中で発現され得る。本発明のタンパク質は、場合により上記のエピトープタグ、ペプチドタグまたはタンパク質タグを利用して、当業者に周知のタンパク質精製法を用いて精製し得る。１つの実施形態では、本発明のタンパク質は変性条件下で精製される。本発明のタンパク質は、次に、インビトロでウイルス様粒子に組織化され得る。
【０１３０】
別の態様では、本発明は、本発明のタンパク質の複数のコピー、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上のコピーを含むウイルス様粒子を提供する。好ましい実施形態では、本発明のウイルス様粒子は、アジュバントなしで被験者に投与された場合、細胞の表面と結合した腫瘍関連抗原に対する免疫応答、好ましくは体液性免疫応答を誘発することができ、腫瘍関連抗原は前記被験者における自己タンパク質である。体液性免疫応答が対象とする腫瘍関連抗原は、本発明のウイルス様粒子中に含まれる本発明のタンパク質に含まれるエピトープが由来する腫瘍関連抗原であることは当業者に明らかである。
【０１３１】
本発明のウイルス様粒子は、例えば、好ましくは正二十面体構造を有する１８０または２４０のＨＢｃＡｇタンパク質サブユニットから成る、通常のＨＢｃＡｇウイルス様粒子であり得るか、または任意の他のウイルス様粒子構造、例えば球状または杆状構造を取り得る。好ましくは、ウイルス様粒子は１８０または２４０サブユニットから成り、好ましくは正二十面体構造を有する。
【０１３２】
１つの実施形態では、本発明のウイルス様粒子は、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質および本発明のタンパク質の複数のコピーから成り、タンパク質サブユニットの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに一層好ましくは少なくとも９５％が本発明のタンパク質である。例えば、ウイルス様粒子は１８０のタンパク質サブユニットで構成され得、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０または１８０サブユニットが本発明のタンパク質であり得る。例えば、ウイルス様粒子は２４０のタンパク質サブユニットで構成され得、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０または２４０サブユニットが本発明のタンパク質であり得る。これに関連してＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質は、好ましくは天然に生じるＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質またはその部分、好ましくは本発明のタンパク質について上記で特定したようなそのカルボキシ末端切断部分である。Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原はまた、好ましくは遺伝子操作が機能的特性を変化させない、特にウイルス様粒子に組織化するＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質の能力を妨げない限り、天然に生じるＢ型肝炎ウイルスコア抗原タンパク質またはその部分の遺伝子操作された変異体であり得る。
【０１３３】
特に好ましい実施形態では、本発明のウイルス様粒子を構成するタンパク質サブユニットの１００％が本発明のタンパク質である。したがって、特に好ましい実施形態では、本発明のウイルス様粒子は本発明のタンパク質の多数のコピーで構成される。ウイルス様粒子を構成する単一タンパク質は、単一または異なる腫瘍関連抗原に由来する同じかまたは異なるエピトープを含み得る。それらはまた、同じかもしくは異なるＨＢｃＡｇ部分、または同じかもしくは異なるＨＢｃＡｇ骨格を含み得る。
【０１３４】
別の態様では、本発明は、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞または本発明のウイルス様粒子ならびに医薬的に許容される希釈剤、担体および／または賦形剤を含有する免疫原性組成物を提供する。好ましくは、免疫原性組成物は、被験者において細胞の表面と結合した腫瘍関連抗原に対する免疫応答、好ましくは体液性免疫応答を誘発するためであり、腫瘍関連抗原は、好ましくは前記被験者における自己タンパク質である。本発明の免疫原性組成物はアジュバントを含まないことが特に好ましい。好ましくは、本発明の免疫原性組成物の免疫学的作用、例えばエピトープが由来する腫瘍関連抗原に対する自己抗体の生成はまた、アジュバントの添加なしで被験者に投与された場合にも認めることができる。しかし、上記で述べたようにアジュバントの添加は免疫原性作用を増大および／または延長させ得る。
【０１３５】
他の態様では、本発明は、腫瘍の予防的および／または治療的処置のための本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物を提供する。一般に、本発明に関連する腫瘍は、好ましくは、上記で定義された腫瘍関連抗原の発現または異常発現に関連する腫瘍である。例えば、腫瘍関連抗原は、分化抗原、癌／精巣抗原、栄養膜組織に特異的な抗原、または生殖系列特異的抗原である。好ましくは、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物は、腫瘍関連抗原の発現または異常発現に関連する疾患の予防的および／または治療的処置のためであり、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物に含まれるエピトープは前記腫瘍関連抗原に由来する。
【０１３６】
例えば、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物がＣＬＤＮ６に由来するエピトープを含む場合、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物は、ＣＬＤＮ６の発現または異常発現に関連する疾患、例えば上記で述べたような腫瘍形成性疾患の予防的および／または治療的処置のためである。好ましくは、腫瘍形成性疾患は、好ましくは卵巣癌、特に卵巣腺癌および卵巣奇形癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む肺癌、特に扁平上皮肺癌および腺癌、胃癌、乳癌、肝癌、膵癌、皮膚癌、特に基底細胞癌および扁平上皮癌、悪性黒色腫、頭頸部癌、特に悪性多形腺腫、肉腫、特に滑膜肉腫および癌肉腫、胆管癌、膀胱の癌、特に移行上皮癌、腎癌、特に明細胞腎細胞癌および乳頭状腎細胞癌を含む腎細胞癌、結腸癌、精巣胎児性癌および胎盤絨毛癌、ならびにそれらの転移形態から成る群より選択される、癌疾患である。癌疾患は、卵巣癌、肺癌、転移性卵巣癌および転移性肺癌から成る群より選択されることが特に好ましい。好ましくは、卵巣癌は癌腫または腺癌である。好ましくは、肺癌は癌腫または腺癌であり、好ましくは細気管支癌腫または細気管支腺癌などの細気管支癌である。
【０１３７】
さらに、例えば、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物がＣＬＤＮ１８．２に由来するエピトープを含む場合、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物は、ＣＬＤＮ１８．２の発現または異常発現に関連する疾患、例えば上記で述べたような腫瘍形成性疾患の予防的および／または治療的処置のためである。好ましくは、腫瘍形成性疾患は、癌、好ましくは胃癌、食道癌、膵癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝癌、頭頸部癌および膀胱の癌、ならびにそれらの転移、特にクルーケンベルク腫瘍などの胃癌転移、腹膜転移およびリンパ節転移から成る群より選択される癌である。
【０１３８】
さらに、例えば、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物がＰＬＡＣ１に由来するエピトープを含む場合、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物は、ＰＬＡＣ１発現または異常発現に関連する疾患、例えば腫瘍形成性疾患の予防的および／または治療的処置のためである。好ましくは、腫瘍形成性疾患は、癌、好ましくは乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、特に腎細胞癌腫、前立腺癌、肝癌、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤絨毛癌、子宮頸癌および甲状腺癌、ならびにそれらの転移形態から成る群より選択される癌である。
【０１３９】
別の態様では、本発明は、被験者において腫瘍関連抗原に対する免疫応答、好ましくは体液性免疫応答を誘発するための方法を提供し、腫瘍関連抗原は、好ましくは前記被験者における自己タンパク質であり、前記方法は、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物を前記被験者に投与することを含む。好ましくは、前記被験者は、腫瘍に罹患しているかまたは腫瘍を発症する危険性があり、前記腫瘍は、好ましくは腫瘍細胞の表面と腫瘍関連抗原の結合を特徴とする。好ましくは、前記腫瘍は、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物に含まれるエピトープが由来する腫瘍関連抗原に関連する。好ましい実施形態では、前記方法は、本発明のウイルス様粒子または免疫原性組成物を投与することを含む。好ましくは、体液性免疫応答を誘発することは、細胞の表面、好ましくは生細胞の表面、例えば腫瘍関連抗原を担持する／発現する腫瘍細胞の表面と結合している、エピトープが由来する腫瘍関連抗原を特異的に認識する／腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体、好ましくは自己抗体の生成を含む。好ましくは、生成される抗体は、細胞の表面のその天然立体配座の腫瘍関連抗原を認識する。生成される抗体は、エピトープが由来する腫瘍関連抗原をその表面に担持する細胞に対するエフェクター機能を誘発できることが特に好ましい。例えば、生成される抗体は、そのような細胞に対するＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣを媒介することが可能であり得、ならびに／またはそれらは直接、その表面に腫瘍関連抗原を担持する細胞におけるアポトーシスを誘導し得るもしくは前記細胞の増殖を阻害し得る。好ましくは、本発明のこの態様では、免疫応答、好ましくは体液性免疫応答は、被験者における腫瘍増殖の低減、好ましくは阻害、最も好ましくは腫瘍の後退をもたらす。
【０１４０】
さらなる態様では、本発明は、被験者において腫瘍関連抗原に対する自己寛容を打破するための方法であって、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物を前記被験者に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、自己寛容を打破することは、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物に含まれるエピトープが由来する腫瘍関連抗原に関してである。
【０１４１】
別の態様では、本発明は、被験者において腫瘍を治療するおよび／または予防するための方法であって、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物を前記被験者に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、前記腫瘍は、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物に含まれるエピトープが由来する腫瘍関連抗原の発現または異常発現に関連する。治療されるおよび／または予防される特定の好ましい腫瘍型は、本明細書で述べたとおり、特に例示的な腫瘍関連抗原ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２およびＰＬＡＣ１に関して述べたとおりである。
【０１４２】
本発明の方法および使用の好ましい実施形態では、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物は、アジュバントなしで投与される。
【０１４３】
本発明はまた、腫瘍の予防的および／もしくは治療的処置のための薬剤を製造するため、被験者において腫瘍関連抗原に対する体液性免疫応答を誘発するため、ただし腫瘍関連抗原は前記被験者における自己タンパク質である、または被験者において腫瘍関連抗原に対する自己寛容を打破するための、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物の使用を提供する。これに関連して、上記で述べた実施形態はまた、本発明のこの態様にも適用される。
【０１４４】
上記の方法および使用のすべてに関して、本発明のタンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のウイルス様粒子または本発明の免疫原性組成物は、好ましくはそれを必要とする被験者に治療有効量で投与される。本明細書で述べる化合物および組成物は、経口的に、口腔、舌下、鼻内経路で、吸入などによる肺経路によって、直腸経路によって、または非経口的に、例えば海綿体内、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、心室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、皮内、節内または皮下的に投与されることが好ましい。投与は、注入または無針注射技術によってであり得る。好ましくは、本明細書で述べる化合物または組成物は非経口的に投与される。非経口投与に適する組成物は、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含み得る滅菌水溶液の形態で最適に使用される。水溶液は、必要に応じて、適切に緩衝されるべきである（好ましくは３〜９のｐＨに）。
【０１４５】
本発明のすべての方法および使用は、好ましくは本明細書中上記で述べたような腫瘍形成性疾患の予防的および／または治療的処置を目的とする。一部の実施形態では、本発明の前記方法および使用は、従来の腫瘍療法、例えば手術、放射線療法、化学療法および／またはモノクローナル抗体での受動免疫と組み合わせ得る。例えば、本発明の化合物、組成物、方法または使用は、原発腫瘍の外科的除去後に、切除されなかった腫瘍細胞を標的するためおよび／または転移の形成を予防するために適用され得る。本明細書で述べる化合物および組成物はまた、化学療法のために使用される組成物の一部であり得、例えば、それらは従来の化学療法組成物に含有され得る。
【０１４６】
発明者は、被験者における自己タンパク質である腫瘍関連抗原の発現または異常発現に関連する腫瘍形成性疾患に対する前記被験者の能動免疫化のための手段を提供する。したがって、そのような腫瘍形成性疾患を予防するおよび／または治療するため手段および方法を提供することを達成した。
【０１４７】
本発明を以下の図面と実施例によって詳細に説明するが、これらは説明目的のためだけに使用され、限定を意図されない。説明および実施例により、同様に本発明に包含されるさらなる実施形態が当業者にアクセス可能である。
【実施例】
【０１４８】
ＨＢｃＡｇ−ＶＬＰに基づくワクチンの生成
キメラＨＢｃＡｇ融合タンパク質の組換え生成のために、ＨＢｃＡｇ配列内のエピトープ挿入部位が異なる様々な細菌発現ベクター（ＨＢｃＡｇ骨格）を生成した。生成したＨＢｃＡｇ骨格のいずれにおいても、エピトープをＨＢｃＡｇ  ＭＩＲの特定の領域に挿入し得る。ＨＢｃＡｇ骨格を除き、ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーおよびＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０エピトープを付加的にＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ末端に結合し得るかまたはアミノ末端部分、例えばＳａｌＩ制限部位とＳｐｅＩ制限部位の間に挿入し得る（図１）。ＨＢｃ遺伝子サブタイプａｗｙのＮ末端部分の野生型配列はＭＤＩＤＰＹＫである。制限部位ＳａｌＩおよびＳｐｅＩの挿入により、配列Ｍ  ＶＤＡＡＴＳ  ＤＩＤＰＹＫが導かれるが、制限部位の分離のためにアラニンが必要である。制限部位ＳａｌＩとＳｐｅＩの間のエピトープ（ｘｘｘ）の挿入の結果、配列Ｍ  ＶＥ  ｘｘｘ  ＳＳ  ＤＩＤＰＹＫとなる。融合タンパク質のＤＮＡ配列を、大腸菌における発現のために配列最適化した。制限酵素のための適切な認識配列を融合タンパク質の発現カセットに組み込んでおり、これは、大きな労力を必要とせずに挿入するカセットまたはエピトープの様々な領域を置換するまたは組み込むことを可能にする（図１および７参照）。
【０１４９】
ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２およびＰＬＡＣ１エピトープを、それぞれ、ＨＢｃＡｇ  ＭＩＲ（ＨＢｃＡｇ骨格ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０）に直接挿入するか、またはタンパク質の折りたたみの間のエピトープの柔軟性を高めるためにアミノ末端およびカルボキシン末端でグリシン／セリン（Ｇ４ＳＧ４）リンカーに隣接させた。さらに、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）をコードする配列を発現カセットの３'末端に組み込み、アフィニティクロマトグラフィを使用するＧＭＰ条件下での融合タンパク質のその後の精製を可能にした（図１参照）。利用したＨＢｃＡｇ配列は、Ｃ末端切断型ＨＢｃＡｇタンパク質（アミノ酸１〜１５０）をコードする３'切断変異体である。この変異体はＶＬＰに組織化することができ、野生型ＨＢｃＡｇ（アミノ酸１〜１８３）とは異なり核酸に結合することができず、細菌核酸によるワクチンの潜在的汚染を防止する。
【０１５０】
大腸菌におけるキメラＨＢｃＡｇ融合構築物の発現後、融合タンパク質を、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィを用いて変性条件下にそれらの二量体形態で精製した。その後、融合タンパク質のＶＬＰへのインビトロ組織化を、高塩濃度緩衝液に対する透析を用いて実施し、組織化されたＶＬＰのさらなる精製と濃縮のために最終的なショ糖密度勾配超遠心工程を実施した。ＶＬＰの再組織化の成功および品質を、未変性タンパク質アガロースゲル電気泳動およびネガティブコントラスト透過型電子顕微鏡検査を用いて確認した（図２参照）。腫瘍抗原ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２およびＰＬＡＣ１の特異的エピトープが、ＨＢｃＡｇのＶＬＰへの組織化能力を妨げることなくＨＢｃＡｇに挿入され得ることが確認された。変性方法を用いて精製した融合タンパク質は、インビトロで、電子顕微鏡像が野生型ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰと異ならない高度に純粋なＶＬＰへと組織化していた。さらなる免疫実験の結果を、続いて、以下のキメラＨＢｃＡｇ  ＶＬＰに関して例示的に示す（図８参照）：
【０１５１】
ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型（配列番号：３７および４１）：アミノ末端およびカルボキシ末端ＨＢｃＡｇドメイン（発現ベクターＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０）、挿入されグリシンリンカーに隣接された細胞外ドメイン１（ＥＣ１）のＣＬＤＮ１８．２エピトープ（ＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴ；配列番号：２１）ならびにＣ末端Ｈｉｓタグから成る融合タンパク質。
【０１５２】
ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０  ＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型（配列番号：３８および４２）：アミノ末端およびカルボキシ末端ＨＢｃＡｇドメイン（発現ベクターＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０）、挿入された細胞外ドメイン１（ＥＣ１）のＣＬＤＮ１８．２エピトープ（ＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴ；配列番号：２１）ならびにＣ末端Ｈｉｓタグから成る融合タンパク質。
【０１５３】
ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＰＬＡＣ１の３番目のループＡ（配列番号：３９および４３）：アミノ末端およびカルボキシ末端ＨＢｃＡｇドメイン（発現ベクターＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０）、挿入されグリシンリンカーに隣接された予測上の３番目のＰＬＡＣ１タンパク質ループのＰＬＡＣ１エピトープ（ＶＦＳＥＥＥＨＴＱＶＰ；配列番号：２２）ならびにＣ末端Ｈｉｓタグから成る融合タンパク質。
【０１５４】
ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０  ＰＬＡＣ１の３番目のループＢ（配列番号：４０および４４）：アミノ末端およびカルボキシ末端ＨＢｃＡｇドメイン（発現ベクターＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０）、挿入された予測上の３番目のＰＬＡＣ１タンパク質ループのＰＬＡＣ１エピトープ（ＶＦＳＥＥＥＨＴＱＶ；配列番号：２３）ならびにＣ末端Ｈｉｓタグから成る融合タンパク質。
【０１５５】
キメラＨＢｃＡｇ−ＶＬＰに基づくワクチンの検査
精製キメラＨＢｃＡｇ  ＶＬＰの免疫原性および抗原性にわたる全般的な様々な種の検査のために、それらをＮＺＷウサギおよびＢａｌｂ／ｃマウス（ＶＬＰを担持するＣＬＤＮ１８．２エピトープのみ）にそれぞれ適用した。アジュバントを添加した免疫試験とアジュバントなしでの免疫試験を実施した。
【０１５６】
ＣＬＤＮ１８．２エピトープの配列（配列番号：２１）は、ウサギおよびマウスにおいて内因性に発現されるタンパク質のそれぞれの領域と同一である。ＣＬＤＮ１８．２に対する抗体応答の誘導は、したがって、それぞれの生物における自己寛容の打破を示す。間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦ）ならびにフローサイトメトリ分析（ＦＡＣＳ）を、誘導された体液性免疫応答の特徴づけと有効性確認のための読み出しとして使用した。
【０１５７】
ＣＬＤＮ１８．２およびＰＬＡＣ１でそれぞれ一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を間接ＩＦのために使用した。細胞をスライドガラス上に固定し、一部の場合は透過処理して（ＣＬＤＮ１８．２に関してのみ）、その後それぞれのポリクローナル抗血清と共にインキュベートした。蛍光標識二次抗体を使用して結合抗体の免疫学的検出を実施した。トランスフェクトしていないＣＨＯ細胞または二次抗体と共にインキュベートしただけのトランスフェクトＣＨＯ細胞を陰性対照として使用した。さらに、ＣＬＤＮ１８．２に対するポリクローナル抗血清を、アミノ末端アミノ酸１〜６９がＣＬＤＮ１８．２と異なる、ＣＬＤＮ１８のスプライス変異体、ＣＬＤＮ１８．１でトランスフェクトしたＣＨＯを使用してそれらの特異性に関して試験した（図３参照）。
【０１５８】
生成したポリクローナル抗血清は、その天然立体配座のそれぞれの標的表面抗原を認識できたことおよびこれらの抗体は前記表面抗原に結合できることが示されている（ＣＬＤＮ１８．２およびＰＬＡＣ１に関して図３に例示的に示す）。免疫原をアジュバントと共に適用したかまたはアジュバントなしで適用したかは無関係であった。さらに、ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰを担持するＣＬＤＮ１８．２エピトープに関して、それらが２つの異なる種において自己寛容を打破できることが明らかにされている。さらに、ＣＬＤＮ１８．２エピトープでの免疫によって生成された抗血清は、ＣＬＤＮ１８．２トランスフェクト細胞に対してアイソフォーム特異的免疫反応性を示した。
【０１５９】
生成したポリクローナル抗血清の免疫反応性を検証するためのさらなるアプローチとしてＦＡＣＳ分析を実施した（ＣＬＤＮ１８．２に関して例示的に示す；図４参照）。しかし、間接ＩＦと異なり、これらの実験では細胞を固定せず、透過処理も行わなかった。したがって、抗原の検出は、生細胞上にて天然立体配座で実施される。さらに、標的腫瘍関連抗原を内因性に発現する細胞を使用し、それにより、生成した抗血清が生理的密度の腫瘍関連抗原エピトープを検出できるかどうかを確認した（図４参照）。
【０１６０】
生成したＣＬＤＮ１８．２に対するポリクローナル抗血清は、内因性に発現された抗原を検出することができ、生細胞上のその天然立体配座のタンパク質に特異的に結合できたことが示されている。自己タンパク質に対する既存のＢ細胞寛容を能動ワクチン接種によって打破することができ、その場合免疫原へのアジュバントの添加は無関係であることが確認された。
【０１６１】
標的細胞表面抗原の天然立体配座の認識に加えて、治療上有効なエフェクター機能を有する抗体の誘導は、能動免疫方法の成功のために極めて重要である。抗体エフェクター機能は、一方では細胞傷害作用、例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）ならびに抗体媒介性抗増殖作用である。ルシフェラーゼに基づくＣＤＣおよびＡＤＣＣアッセイを、それぞれ、ＣＬＤＮ１８．２に対するポリクローナル抗血清の細胞傷害性エフェクター機能の分析のために使用した。２つの異なる種で生成された抗血清は、ＣＬＤＮ１８．２アイソフォームを特異的に対象とするＣＤＣならびにＡＤＣＣエフェクター機能を発揮したことが示されている。ＨＢｃＡｇ野生型ＶＬＰ（抗原エピトープの挿入なし）またはアジュバントと組み合わせたキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）結合ＣＬＤＮ１８．２ペプチド（キメラＨＢｃＡｇ  ＶＬＰに挿入されたエピトープと同一であった）での免疫によって誘導されたポリクローナル抗血清は、いかなる細胞傷害性エフェクター機能も示さなかった（図５参照）。
【０１６２】
これまでの試験は、ＰＬＡＣ１の発現が増殖を支持することを示している。そこで、能動免疫化によって生成されたＰＬＡＣ１に対するポリクローナル抗血清を増殖阻害エフェクター機能に関して分析した。このために、内因性にＰＬＡＣ１を発現する細胞（ＭＣＦ−７）ならびにＰＬＡＣ１陰性細胞（ＭｅｌＨＯ）を、ＰＬＡＣ１に対するポリクローナル抗血清と共に７２時間インキュベートし、その後５−ブロモ−２'−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）に基づく増殖アッセイを実施した。癌遺伝子ｍｙｃに対するモノクローナル抗体およびキメラＨＢｃＡｇ  ＶＬＰでの能動ワクチン接種によって生成したＣＬＤＮ１８．２に対するポリクローナル抗血清を対照として使用した。ＰＬＡＣ１に対するポリクローナル抗血清だけが用量依存的なＰＬＡＣ１特異的抗増殖作用を媒介したことが示されている。したがって、細胞傷害性エフェクター機能に加えて、抗増殖性抗体エフェクター機能も、キメラＨＢｃＡｇ  ＶＬＰを用いた能動免疫化によって生成され得る（図６参照）。
【０１６３】
ＨＢｃＡｇ  ＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰでの免疫
挿入したＣＬＤＮ１８．２エピトープに対する抗体応答を誘導するキメラＶＬＰの潜在能をマウスおよびウサギの免疫によって分析した。重要な点として、選択したエピトープおよび短命胃細胞に厳密に限定されるオルソログタンパク質の組織分布は、３つの種すべてにおいて保存されている。
【０１６４】
フローサイトメトリによって測定されたほぼ最大の抗標的体液性免疫応答は、免疫経路または適用したアジュバントに関わりなく、２回の免疫後にのみ認められた。標的特異的抗体応答の分析は、抗標的抗体反応性が経時的に低下し、３回目のワクチン接種（０日目、１０日目および２８日目のワクチン接種）の約２か月後にバックグラウンドレベルに戻ることを明らかにした。しかし、１０２日目に追加免疫を実施した場合は、標的に対する自己抗体反応性が急速に増大し、自己抗体産生についての免疫記憶の存在を示唆した。さらに、このデータは、追加免疫による標的特異的自己抗体の誘導が実現可能であることおよび抗ＨＢｃＡｇ免疫が引き継がれていなかったことを示す。
【０１６５】
さらなる実験では、抗体応答のドリフトの問題に部分的に関連する、ＨＢｃＡｇ−担体分子に対する既存の免疫応答が、標的特異的自己抗体応答を誘導するＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０  ＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰの能力を廃さないことを明らかにすることができた。したがって、潜在的に存在する担体誘導性エピトープ抑制（ＣＩＥＳ）を克服することができ、ＨＢｃＡｇ担体の表面に高密度で提示されるＣＬＤＮ１８．２エピトープ（ＶＬＰ分子当たり２４０のＣＬＤＮ１８．２エピトープ）の免疫原性が、これに関してその骨格と同等であることを指示した。
【０１６６】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０  ＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰ、ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰで免疫するか、または対照としてＫＬＨ結合直鎖状ＣＬＤＮ１８．２３２〜４１ペプチドで免疫し、直鎖状ＣＬＤＮ１８．２３２〜４１ペプチドまたはＨＢｃＡｇ骨格に対する抗体反応性を、ＥＬＩＳＡエンドポイント力価を測定することによって判定した。アジュバント、投与経路および免疫原の量を変化させて、種々の免疫プロトコールを各々３〜５匹のマウスの群に適用した。
【０１６７】
ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰで免疫したマウスからの血清は、他の群のマウスと比較して、直鎖状ＢＳＡ結合ＣＬＤＮ１８．２３２〜４１ペプチドに対してより高い特異的反応性を示すことが認められた。興味深いことに、アジュバントを添加せずにＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰで皮下的に免疫したマウスは、前記ペプチドに対して最も高い平均エンドポイント力価を明らかした。すべてのＶＬＰが、類似のエンドポイント力価で、ＨＢｃＡｇ骨格に対する抗体を誘導した。キメラＶＬＰの熱変性は、骨格に対する抗体の発現を損なうことなくペプチド結合抗体を誘導するそれらの能力を無効にした。
【０１６８】
ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰでワクチン接種したマウスのうちで、約９０％がＥＬＩＳＡにおいて直鎖状ＣＬＤＮ１８．２エピトープを認識することが示された。これらの３分の１は、ＦＡＣＳによって分析した場合、トランスフェクタント上の天然ＣＬＤＮ１８．２分子に結合することができた。ウサギでは、ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰでワクチン接種した動物のすべての血清が、直鎖状エピトープならびに天然タンパク質を認識することができた。ＣＬＤＮ１８．１トランスフェクタントを対照として使用した場合、この変異体との交差反応性は認められなかった。
【０１６９】
ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０  ＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰと比較して、ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰは、内因性に発現する腫瘍細胞の表面の生理的密度の天然タンパク質を認識する、自己抗体を誘発するうえで明らかに優れていた。
【０１７０】
ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰにおいて部分的防御を与える予防的ワクチン接種は免疫応答性同系マウス腫瘍モデル
ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰの予防的インビボ効果を評価するため、マウスＣＬＤＮ１８．２で安定に形質導入したＣＴ２６結腸癌細胞の静脈内適用によって肺転移形成を誘導した免疫応答性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける同系腫瘍モデルを使用した。
【０１７１】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、すべてＡｂＩＳＣＯ−１００（Ｉｓｃｏｎｏｖａ）中で製剤された、５０μｇのＣ末端切断型（アミノ酸１〜１５０）ＨＢｃＡｇ（ＨＢｃＡｇΔ）−ＶＬＰ、ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰ、または対照としてＰＢＳで３回（１日目、１４日目、２８日目）ワクチン接種した。最後の免疫の２週間後、１×１０５の、マウスＣＬＤＮ１８．２を安定に発現する同系ＣＴ２６結腸癌細胞を尾静脈に投与した。１３日後、マウスを犠死させ、肺を計量して、肺転移の負荷を評価するために顕微鏡分析に供した。肺重量の統計分析を、ＡＮＯＶＡ、次いでテューキー検定によって実施した。組織病理学的評価のために、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した肺の３μｍ厚切片を脱パラフィン化し、再水和して、次にｐＨ６のクエン酸緩衝液中で熱誘導エピトープ回収を行った。Ｈ２Ｏ２によって内因性ペルオキシダーゼをクエンチングした後、非特異的抗体結合部位を１０％ヤギ血清でブロックし、その後ポリクローナルウサギ抗ＣＬＤＮ１８（Ｍｉｄ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に４℃で一晩インキュベートした。結合の検出のために、ＨＲＰ結合二次抗体（ＢｒｉｇｈｔＶｉｓｉｏｎ  ポリＨＲＰ抗ウサギ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ）およびＶｅｃｔｏｒ  ＮｏｖａＲＥＤＴＭキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。ヘマトキシリンで対比染色し、脱水して、封入した後、ＭＩＲＡＸ  ＳＣＡＮ（Ｚｅｉｓｓ）を使用して切片を記録した。腫瘍と正常組織の面積の比率を、ＩｍａｇｅＪ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．４４を用いて測定した。群間の統計的な差異をＡＮＯＶＡ、次いでダン検定によって評価した。
【０１７２】
ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰでワクチン接種したマウスに由来する肺の肉眼的分析は、ＨＢｃＡｇΔ−ＶＬＰまたはＰＢＳ対照群と比較してより少ない数の転移結節（図９Ａ）および腫瘍細胞で攻撃誘発しなかったマウスに近い有意に低い肺重量（図９Ｂ）を明らかにした。さらに、ＣＬＤＮ１８．２のＩＨＣ染色によってＣＴ２６−ＣＬＤＮ１８．２肺転移を視覚化した後計算した全肺切片当たりの癌性組織面積のパーセンテージは、ＨＢｃＡｇΔ−ＶＬＰでワクチン接種したマウスまたはＰＢＳ対照群と比較して有意に（ｐ＜０．０５）低かった（図９Ｃ、９Ｄ）。
【０１７３】
結論として、これらのデータは、ＨＢｃＡｇ  Ｄｅｌ  ７９〜８０リンカーＣＬＤＮ１８．２−ＥＣ１短縮型ＶＬＰでの予防的ワクチン接種が高度悪性／腫瘍形成性ＣＴ２６−ＣＬＤＮ１８．２細胞に対する防御を媒介することを示す。
【０１７４】
要約すると、開発されたキメラＨＢｃＡｇ  ＶＬＰは、能動免疫療法上有効な腫瘍ワクチン接種における使用のためのすべての必要条件を満たす。キメラＨＢｃＡｇ  ＶＬＰの投与により、被験者において、前記被験者における自己タンパク質である腫瘍関連抗原に対する抗体が生成され得ること、および誘導される抗血清は治療上有効なエフェクター機能を媒介することが示された。
【図１】
2013521785.tif 000002
【図４】
2013521785.tif 000003
【図５Ａ】
2013521785.tif 000004
【図５Ｂ】
2013521785.tif 000005
【図６Ａ】
2013521785.tif 000006
【図６Ｂ】
2013521785.tif 000007
【図７Ａ】
2013521785.tif 000008
【図７Ｂ】
2013521785.tif 000009
【図７Ｃ】
2013521785.tif 000010
【図７Ｄ】
2013521785.tif 000011
【図７Ｅ】
2013521785.tif 000012
【図７Ｆ】
2013521785.tif 000013
【図８Ａ】
2013521785.tif 000014
【図８Ｂ】
2013521785.tif 000015
【図８Ｃ】
2013521785.tif 000016
【図８Ｄ】
2013521785.tif 000017
【図９Ｂ】
2013521785.tif 000018
【図９Ｄ】
2013521785.tif 000019
【図２】
2013521785.tif 000020
【図３Ａ】
2013521785.tif 000021
【図３Ｂ】
2013521785.tif 000022
【図３Ｃ】
2013521785.tif 000023
【図９Ａ】
2013521785.tif 000024
【図９Ｃ】
2013521785.tif 000025
【配列表】
2013521785000001.app
【国際調査報告】
2013521785.tif 000026
2013521785.tif 000027
2013521785.tif 000028
2013521785.tif 000029
2013521785.tif 000030
2013521785.tif 000031
2013521785.tif 000032