(57)【要約】癌に対する分子診断試験の特定のための方法および組成が提供される。本試験は、新規ＤＮＡ損傷修復を欠損している分子サブタイプを定義し、このサブタイプ内で患者の分類を可能にする。本発明は、癌に罹患している患者が、いずれの化学療法も投与する前に、治療レジメンに臨床的に応答するか、または応答しないかを判定するために使用することができる。この試験は、異なる癌型において、および現在使用中の多くの標準的な細胞傷害性化学療法薬物等の、ＤＮＡ損傷または修復に直接または間接的に影響を及ぼす異なる薬物とともに使用されてもよい。特に、本発明は、ある組み合わせの予測マーカーの使用を対象とし、予測マーカーの発現は、治療レジメンへの応答性または非応答性と相関する。
2013537045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ損傷治療剤に対する個体の応答性の予測方法であって、
ａ．前記個体から試験試料を得ることと、
ｂ．前記試験試料中の１つ以上のバイオマーカーであって、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、およびＡＰＯＬ３からなる群から選択される、１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定することと、
ｃ．前記発現レベルを捕捉する試験スコアを導出することと、
ｄ．前記試験スコアと応答性とを相互に関連付ける情報を含む閾値スコアを提供することと、
ｅ．前記試験スコアを前記閾値スコアと比較することを含み、ここで、前記試験スコアが前記閾値スコアを超える場合に応答性が予測される、方法。
【請求項２】
前記試験試料中の１つ以上の更なるバイオマーカーの発現レベルを測定することを含み、前記１つ以上の更なるバイオマーカーは、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、およびＡＬ１３７２１８．１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試験スコアが、前記バイオマーカーのすべての発現レベルを捕捉し、前記試験スコアが０．３６８１の値の閾値スコアを超える場合に、応答性が予測される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ損傷治療剤が、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ修復標的療法剤、ＤＮＡ損傷シグナリングの阻害剤、ＤＮＡ損傷誘導性の細胞周期停止の阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、および熱ショックタンパク質阻害剤からなる群から選択される１つ以上の物質を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ損傷治療剤が、アントラサイクリン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、オキサリプラチン、ブスルファン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、エピルビシン、および電離放射線のうちの１つ以上を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡ損傷治療剤が、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、Ｎｕ７４４１、Ｎｕ７０２６、相同組み換え阻害剤、ヌクレオチド除去修復阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ＡＧ０１４６９９、ＡＺＤ２２８１、ＡＢＴ−８８８、ＭＫ４８２７、ＢＳＩ−２０１、ＩＮＯ−１００１、ＴＲＣ−１０２、ＡＰＥＸ１阻害剤、ＡＰＥＸ２阻害剤、リガーゼＩＩＩ阻害剤、およびファンコニ貧血経路の阻害剤のうちの１つ以上を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記個体が癌に罹患している疑いがあるか、または癌に罹患していると診断されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が、乳癌および卵巣癌からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記癌が乳癌であり、前記ＤＮＡ損傷治療剤が、５−フルオロウラシル、アントラサイクリン、およびシクロホスファミドの組み合わせを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アントラサイクリンがエピルビシンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アントラサイクリンがドキソルビシンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
タキサンが前記ＤＮＡ損傷治療剤と併用投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌が卵巣癌であり、前記ＤＮＡ損傷治療剤が白金含有薬剤を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ損傷薬剤が、タキサンと併用投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌がファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路における１つ以上の突然変異と関連する、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ損傷応答欠損（ＤＤＲＤ）と関連する癌に罹患しているか、または前記癌を発症しやすい個体の診断方法であって、
ａ．前記個体から試験試料を得ることと、
ｂ．前記試験試料中の１つ以上のバイオマーカーであって、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、およびＡＰＯＬ３からなる群から選択される、１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定することと、
ｃ．前記発現レベルを捕捉する試験スコアを導出することと、
ｄ．前記試験スコアと前記癌の診断とを相互に関連付ける情報を含む閾値スコアを提供することと、
ｅ．前記試験スコアを前記閾値スコアと比較することを含み、ここで、前記試験スコアが前記閾値スコアを超える場合に、前記個体が前記癌に罹患しているか、または前記癌を発症しやすいと診断される、方法。
【請求項１７】
前記試験試料中の１つ以上の更なるバイオマーカーの発現レベルを測定することを含み、前記更なるバイオマーカーが、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、およびＡＬ１３７２１８．１からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記試験スコアが、前記バイオマーカーのすべての発現レベルを捕捉し、前記個体が、前記試験スコアが０．３６８１の値の閾値スコアを超える場合に、前記癌に罹患しているか、または前記癌を発症しやすいと診断される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が、乳癌および卵巣癌から選択される、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌が、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路における１つ以上の突然変異と関連する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、２０１０年９月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／３８３，２０１号および２０１１年５月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／４９０，０３９号の優先利益を主張し、これらの両方が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般的なＤＮＡ損傷修復欠損サブタイプの使用を含む、異なる解剖学的部位からの癌を診断するのに有用な分子診断試験に関する。本発明は、このＤＮＡ損傷修復欠損分子サブタイプを特定するために使用される４４の遺伝子の分類モデルの使用を含む。ある適用は、ＤＮＡ損傷を与える薬剤およびＤＮＡ修復標的療法剤を含む乳癌治療薬物クラスへの応答の層別化、およびそのための患者の選択である。別の適用は、ＤＮＡ損傷を与える薬剤に応答するものおよび応答しないものへの卵巣癌患者の層別化である。本発明は、新規治療の臨床試験評価中の濃縮ストラテジーに対する従来の療法選択および患者群の選択を誘導することができる試験を提供する。ＤＮＡ修復欠損サブタイプは、未使用／冷凍（ＦＦ）またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）した患者試料から特定することができる。
【背景技術】
【０００３】
製薬産業は、現在投与されている薬物よりもより効果的かつより特異的であるか、または副作用の少ない新規薬物治療の選択肢を継続的に追求する。人間集団内の遺伝的変異性が多くの薬物の有効性の実質的な差をもたらすため、薬物療法の代替は、常に開発されている。したがって、多種多様の薬物療法の選択肢が現在利用可能であるが、一人の患者が応答しないという場合には、更なる療法が常に必要とされる。
【０００４】
伝統的に、医師によって使用される治療パラダイムは、疾患を治療するための最も高い成功率をもたらす第１選択の薬物療法を処方している。次いで、第１選択の薬物療法は効果がない場合、代替の薬物療法が処方される。このパラダイムは、明らかに、ある疾患の最良の治療法ではない。例えば、癌等の疾患において、第１の治療は、多くの場合、最も重要であり、成功した治療に対して最良の機会を提供するため、その特定の患者の疾患に対して最も効果的である初回薬物を選択する必要性の高まりがある。
【０００５】
今年、米国において新たに乳癌と診断される女性は２０７，０９０人、そのうちの３９，８４０人の女性が乳癌に関連して死亡すると見られる（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２０１０）。標準的な化学療法は、一般に、アントラサイクリンおよびアルキル化剤等の直接ＤＮＡを損傷する薬剤、ならびに代謝拮抗物質および抗微小管剤を含む。
【０００６】
卵巣癌は、西洋諸国においてすべての婦人科癌の主な死因である。この高い死亡率は、ほとんどの患者において進行期での診断によるものである。上皮性卵巣癌（ＥＯＣ）は、卵巣悪性腫瘍の９０％を占め、漿液、粘液、類内膜、透明細胞、移行型、混合型、および未分化のサブタイプを含む異なる組織学的カテゴリーに分類される。これらの異なった組織は、異なる原因に起因する増加する証拠がある。卵巣癌の現行の標準的な治療は、減量手術および標準的な白金タキサンベースの細胞毒性化学療法である。しかしながら、すべての患者がこれに対して応答するわけではなく、応答する患者の約７０％が再発を経験する。組織学的または分子分類に基づく卵巣癌に対する特定の標的療法は、まだ市場に出回っていない。他の種類の癌と同様に、未だに適切な細胞毒性化学療法剤の正確な方法がない。
【０００７】
マイクロアレイおよび分子ゲノミクスの出現は、診断能力および疾患の予後分類に対する優位な影響の可能性があり、これは画定された治療レジメンへの個々の患者の応答の予測に役立ち得る。マイクロアレイは、大量の遺伝子情報の解析を提供し、それによって個体の遺伝子指紋を提供する。この技術は、特注の薬物治療レジメンのための必要なツールを最終的に提供することに対する更なる熱意がある。
【０００８】
現在、医療従事者は、化学療法剤から恩恵を受ける癌患者を特定するのに役立つ機構がほとんどない。薬物治療が特定の癌の生理学において最も効果的であることを正確に予測するのにこれらの方法が利用できないため、最適な第１選択の薬物の特定は困難である。この欠陥は、相対的に不良な単一薬剤の応答率ならびに癌の罹患率および死亡率の増加をもたらす。更に、患者は、しばしば必要以上に効果のない有毒な薬物療法を受けている。
【０００９】
分子マーカーは、例えば乳癌において、適切な治療を選択するために使用されている。「三重陰性」と称されるエストロゲンおよびプロゲステロンホルモン受容体、ならびにＨＥＲ２成長因子受容体を発現しない乳房腫瘍は、ＰＡＲＰ−１阻害剤の療法に応答するように思われる（Ｌｉｎｎ，Ｓ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ，Ｌ．，Ｊ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５  Ｓｕｐｐｌ  １，１１−２６（２００９）、Ｏ’Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ，Ｊ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６４，２０５−２１４（２０１１）。最近の研究は、乳房腫瘍の三重陰性状態がＰＡＲＰ−１阻害剤を含む併用療法に対する応答性を示し得るが、個々のＰＡＲＰ−１阻害剤に対する応答性を示すのに十分でない場合があることを示している（Ｏ’Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）。
【００１０】
更に、分子サブタイプと関連する遺伝子分類子を特定し、化学療法剤の応答性を示そうと努める他の研究がある（Ｆａｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １５，６８−７４（２００９）、Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８，３５５５−３５６１（２０１０））。しかしながら、今まで、ＤＮＡ損傷修復の欠損を示す分子サブタイプを正確に画定するために、癌疾患を問わず効き目があり、また、疾患を問わずＤＮＡ損傷修復を直接または間接的に標的とする任意の薬物に対する感受性も予測することができる診断試験が存在しない。
【００１１】
したがって、必要とされるのは、ＤＮＡを損傷する化学療法剤に対して応答する可能性がある患者と、代替療法を受けるべきである患者とに患者を層別化することを可能にするために、十分な正確度でＤＮＡ修復欠損腫瘍を特定する試験である。
【００１２】
また、必要とされるのは、異なる癌型にわたって十分な正確度で治療的応答性を予測する分子サブタイプ分類子である。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、転写物のいくつかまたはすべてが過剰発現または過少発現であるとき、ＤＮＡ損傷修復の欠損がある癌のサブタイプを特定するように癌に発現した遺伝子産物マーカーの収集を使用する方法を対象とする。このサブタイプの指定は、スクリーニングおよび適切な癌療法の選択における有用性を有する様式において、いかなる特定の薬物にも関連しないが、むしろ癌の生態を説明するときの診断試験と考えられ得る。本発明はまた、ＤＮＡ損傷治療剤に対して応答性または耐性を示すための方法も提供する。異なる態様において、この遺伝子または遺伝子産物の一覧表は、マイクロアレイ、Ｑ−ＰＣＲ、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、またはｍＲＮＡまたはタンパク質発現を定量化することができる他の技術等の当該技術分野において既知の方法を用いて送達され得る単一のパラメータまたは複数のパラメータ予測試験の基盤を形成し得る。
【００１４】
加えて、本明細書に記載される生物学的経路は、等級および段階と同様に、それ自体、癌の特徴であり、それ自体では、単一の癌疾患型に限定されない。したがって、遺伝子または遺伝子産物の収集を使用して、異なる組織中の異なる癌型にわたって癌療法の応答性を予測し得る。本発明の一実施形態において、これらの遺伝子または遺伝子産物は、乳房および卵巣癌腫瘍の両方を評価するのに有用である。
【００１５】
本明細書に記載される発明は、いかなる１つの薬物にも限定されず、ＤＮＡ損傷および／またはＤＮＡ損傷修復に直接または間接的に影響を及ぼす一連の薬物のいずれか、例えば、ＦＥＣ（５−フルオロウラシル／エピルビシン／シクロホスファミド）およびＦＡＣ（５−フルオロウラシル／アドリアマイシン／シクロホスファミド）等のネオアジュバント５−フルオロウラシル、アントラサイクリン、およびシクロホスファミドベースのレジメンに対する応答者および非応答者を特定するために使用することができる。本発明の特定の態様において、それは、乳癌においてパクリタキセル、フルオロウラシル、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、およびシクロホスファミド（Ｔ／ＦＡＣ）の新補助治療を評価するために有用である。この発明の他の態様において、それは、卵巣癌において白金または白金とタクソールによる治療を評価するために有用である。
【００１６】
本発明は、全生存、無増悪生存率、ＲＥＣＩＳＴによって定義されるような放射線応答、完全応答、部分的応答、安定疾患、ならびにＰＳＡ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、およびＣＡ１９−９等であるが、これらに限定されない血清学的マーカー等の異なる応答の分類を用いて薬物に対する応答の予測に関する。特定の実施形態において、本発明は、単独で、あるいは卵巣癌における標準治療またはＲＥＣＩＳＴおよび血清ＣＡ１２５レベルとの関連において、ＦＥＣまたはＦＡＣにより治療された乳癌における病理学的な完全応答を評価するために使用することができる。
【００１７】
別の態様において、本発明は、乳癌および卵巣癌におけるＤＮＡ損傷応答欠損（ＤＤＲＤ）分子サブタイプの特定に関する。この分子サブタイプは、２つの異なる遺伝子分類子、即ち、４０の遺伝子長であるものと４４の遺伝子長であるものの使用によって検出することができる。ＤＤＲＤの分類子は、まず、Ａｌｍａｃ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｒｒａｙ（ＤＳＡ（商標））上の５３個のプローブセットからなる分類子によって画定された。化学療法レジメンを含むＤＮＡ損傷に対する応答を予測する能力との関連において、この分類子の機能的関連性を検証するために、この分類子は遺伝子レベルで再度画定されることが必要であった。これは、Ａｌｍａｃ  Ｂｒｅａｓｔ  ＤＳＡ（商標）以外のマイクロアレイプラットフォーム上にプロファイル化された独立したデータセットからのマイクロアレイデータを使用してＤＤＲＤの分類子の評価を促進する。遺伝子レベルで分類子の画定を促進するために、Ａｌｍａｃ  Ｂｒｅａｓｔ  ＤＳＡ（商標）プローブセットをマッピングする遺伝子が画定することが必要であった。これには、Ｅｎｓｅｍｂｌ  ａｎｄ  ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ等の公的に入手可能なゲノムブラウザデータベースの利用が含んだ。これらの結果は、このモデルが４０の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルのものに優先するとき、４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルに対してのみ提供される。これらの結果は、分類子モデルがＤＮＡを損傷する治療法を含む化学療法レジメンに対する応答の効果的かつ有意な予測子であることを示す。
【００１８】
４０の遺伝子の分類子モデルおよび４４の遺伝子の分類子モデルの両方によるサブタイプの特定は、ＤＮＡ損傷を与える薬剤およびＤＮＡ修復標的療法剤を含む標準的な乳癌および卵巣癌治療薬物クラスへの応答を予測し、そのための患者を選択するために使用することができる。
【００１９】
別の態様において、本発明は、ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、ならびに免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法等の免疫学的検定等の上に列挙される従来の診断用途のためのキットに関する。そのようなキットは、遺伝子または遺伝子産物の発現をアッセイし、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を定量化するための適切な試薬および説明書を含む。
【００２０】
本発明はまた、ＤＮＡ損傷応答欠損（ＤＤＲＤ）のヒト腫瘍を特定するための方法も提供する。本発明は、ＤＮＡを直接的に損傷する、ＤＮＡを間接的に損傷する、または正常なＤＮＡ損傷をシグナル伝達および／もしくは修復プロセスを阻害する薬物に対して感受性がある、応答する、または耐性があり応答しない、患者を特定するために使用することができる可能性がある。
【００２１】
本発明はまた、患者の従来の治療を誘導することに関する。本発明はまた、そのクラスの新規薬物がＤＮＡ損傷および／またはＤＮＡ損傷修復を直接または間接的に影響を及ぼす臨床試験のために患者を選択することに関する。
【００２２】
本発明および方法は、本発明におけるすべての転写物のアッセイについては達成したホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検材料、ならびに未使用／冷凍（ＦＦ）組織の使用を適応し、したがって、最も広く利用可能な種類の生検材料と適合する。発現レベルは、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）等の溶液中に保存されているＦＦＰＥ組織、未使用の冷凍組織、または未使用の組織から得られるＲＮＡを使用して判定され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＥＲ陰性（Ａ）およびＥＲ陽性（Ｂ）のＢＲＣＡ１／２突然変異および散発性野生型対照乳房試料の階層解析を示すダイアグラムを提供する。プローブセットのクラスター群は、右側に注釈を付けられ、それぞれのプローブセットのクラスター群の経路解析は、それぞれの画像の左側に注釈を付けられる。それぞれの画像についての説明文は、試料の突然変異状態およびシグネチャー群を示し、それぞれの試料は、分類子生成に対して割り当てられた。
【図２】（Ａ）組み合わせた試料セット、（Ｂ）ＥＲ陰性の試料セット、および（Ｃ）ＥＲ陽性の試料セットにおける、１０×５の相互検証下でのそれぞれの分類モデルのＡＵＣ性能を比較するｄｉａｇｒａｍｏｆｂｏｘプロットを提供する。（Ｄ）相互検証予測の感受性および特異性プロットを使用して、閾値を選択した。最大感受性および特異性は、約０．３７の対応するシグネチャースコアで１．６８２である。
【図３】相互検証によって推測される、４４の遺伝子の分類子モデルを用いたＢＲＣＡ状態を予測するための分類性能のＲＯＣ曲線のダイアグラムを提供する。ＡＵＣは、分類子モデルの適用後、約０．６８である。９５％信頼限界は、１０００回の反復があるブートストラップから推定されている。
【図４】アントラサイクリン系化学療法に対する応答を予測するために、３つの独立したデータセット：ＦＥＣ、ＦＡＣ１、およびＦＡＣ２  （Ｂｏｎｎｅｆｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １０３，２６４−２７２（２０１１）、Ｌｅｅ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６，７１１−７１８（２０１０）の組み合わせた解析において、４４の遺伝子の分類子モデルの分類性能のＲＯＣ曲線のダイアグラムを提供する。ＡＵＣは、分類子モデルの適用後、約０．７８である。９５％信頼限界は、１０００回の反復があるブートストラップから推測されている。
【図５】Ｔ／ＦＡＣで処理した試料中の応答において３つの独立したデータセットの組み合わせた解析において、４４の遺伝子の分類子モデルの分類性能のＲＯＣ曲線のダイアグラムを提供する（Ｈｅｓｓｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４，４２３６−４２４４（２００６）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｔａｂｃｈｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６，５３５１−５３６１（２０１０）。ＡＵＣはそれぞれ、分類子モデルの適用後、約０．６１である。９５％信頼限界は、１０００回のブートストラップ反復を用いて決定された。
【図６】社内のＡｌｍａｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ卵巣データセットからの白金およびタクソールにより処理した試料中の応答において２５９個の漿液性卵巣癌試料内の４４の遺伝子の分類子モデルの分類性能のＲＯＣ曲線のダイアグラムを提供する。ＡＵＣは、分類子モデルの適用後、約０．６８である。９５％信頼限界は、１０００回のブートストラップ反復を用いて決定された。
【図７】健常なドナーおよびファンコニ貧血の突然変異を有する患者から採取した骨髄試料中の４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子スコアのヒストグラム表現を提供する。ＡＵＣは、分類子モデルの適用後、０．９０である。９５％信頼限界は、１０００回のブートストラップ反復を用いて決定された。
【図８】ＢＲＣＡ１突然変異および野生型細胞株において、４４の遺伝子の分類子モデルを治療応答と相関させる図を提供する。（Ａ）ＨＣＣ１９３７−ＥＶ細胞と比較して、ＨＣＣ１９３７−ＢＲ細胞におけるＢＲＣＡ１の増加した発現を確認するウエスタンブロット解析。（Ｂ）ＢＲＣＡ１（ＨＣＣ１９３７−ＢＲ）細胞株の戻り外因性発現のある対照ベクターのみでトランスフェクトしたＨＣＣ１９３７（ＨＣＣ１９３７−ＥＶ）およびＨＣＣ１９３７内の平均４４の遺伝子のモデル（ＤＤＲＤ）分類子スコア（±標準誤差）。一連の濃度のＰＡＲＰ阻害剤ＫＵ００５８９４８（Ｃ）およびシスプラチン（Ｄ）への一定曝露下でＨＣＣ１９３７親細胞およびＨＣＣ１９３７−ＢＲ細胞の、細胞の生存のヒストグラム表示。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
特に定義されない限り、本明細書に使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解される同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または等価な任意の方法、デバイス、および材料が本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、デバイス、および材料は本明細書に記載されている。
【００２５】
本出願で言及されるすべての刊行物、公開された特許文献、および特許出願は、本出願が関連する当該技術分野において技術のレベルを示す。本明細書で言及されるすべての刊行物、公開された特許文献、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、公開された特許文献、または特許出願が、具体的かつ個別に示されるように、参照によって組み込まれるのと同じ程度まで参照によって組み込まれる。
【００２６】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の対象の１つまたは１つを超えて（即ち、少なくとも１つ）を指すように本明細書に使用される。例として、「ある要素」は、特にそれとは反対に明確に示されない限り、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【００２７】
本研究の主要な目的は、分子パラメータを臨床治療の決定に組み込むことによって、患者における周術期全身療法の有効性を増加させることである。薬理遺伝学／ゲノミクスは、異物または薬物に対する個体の応答に関与した遺伝子／ゲノム因子の研究である。本発明のマーカーの発現における促進または阻害効果を有する薬剤またはモジュレータは、患者において癌を（予防的または治療的に）治療するために個体に投与することができる。また、そのような治療と併せて個体の薬理ゲノミクスも考慮することが理想である。治療の代謝の差は、薬理学的に活性な薬物の用量と血液濃度との間の関係を変化させることにより、激しい毒性または治療の失敗を引き起こし得る。したがって、個体の薬理ゲノミクスの理解が予防または治療的処置に対する有効な薬剤（例えば薬物）の選択を可能にする。そのような薬理ゲノミクスが、適切な投薬量および治療レジメンを決定するために更に使用することができる。したがって、個体における本発明のマーカーの発現レベルは、それによって個体の治療的または予防的治療のために適切な薬剤を選択するために決定することができる。
【００２８】
本発明は、癌組織中に発現する遺伝子または遺伝子産物マーカー（以下、「バイオマーカー」とも称される）の独自の収集を対象とする。異なる態様において、このバイオマーカーの一覧表は、マイクロアレイ、Ｑ−ＰＣＲ、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、またはｍＲＮＡまたはタンパク質発現を定量化することができる他の技術等の当該技術分野において既知の方法を用いて送達され得る単一のパラメータまたは複数のパラメータ予測試験の基盤を形成し得る。
【００２９】
本発明はまた、細胞毒性化学療法後の予後または癌に対する特異的治療法の選択に有用であるキットおよび方法に関する。転写物のいくつかまたはすべてが過剰または過少発現であるとき、発現プロファイルがＤＮＡ損傷治療剤に対する応答性または耐性を示すような方法が提供される。これらのキットおよび方法は、癌に罹患している患者の腫瘍において差次的に発現される遺伝子または遺伝子産物を利用する。本発明の一実施形態において、これらのバイオマーカーの発現プロファイルは、発現プロファイルを１つ以上のＤＮＡ損傷治療剤に対する応答性と相関させるデータベースまたはモデルを生成するために、統計的方法または相関モデル下で、アーカイブ組織試料中の臨床転帰（応答または生存）と相関させる。次いで、予測モデルを使用して、ＤＮＡ損傷治療剤に対して応答性があることが知られていない患者における応答性を予測してもよい。多くの他の実施形態において、患者集団は、患者の臨床転帰、予後、またはＤＮＡ損傷治療剤に対する応答性に基づいて少なくとも２つのクラスに分類することができ、バイオマーカーは、実質的に患者のこれらのクラス間でクラス区別と相関させる。本明細書に記載される生物学的経路は、等級および段階と同様に、疾患として癌に共通しており、それ自体では、分類子および方法は、単一の癌疾患型に限定されない。
【００３０】
予測マーカーパネル／発現分類子
癌を治療するために使用されるＤＮＡ損傷治療剤等の治療剤に対する応答性または耐性を判定するのに有用である癌組織中に発現する遺伝子分類子としてバイオマーカーの独特の収集が提供される。そのような収集は、「マーカーパネル」、「発現分類子」、または「分類子」と称され得る。
【００３１】
本方法に有用なバイオマーカーが表１に特定される。これらのバイオマーカーは、治療剤、またはその欠乏に対する患者の応答を判定するための予測値を有すると特定される。それらの発現は、薬剤、より具体的には、ＤＮＡ損傷治療剤に対する応答と相関する。腫瘍における特定バイオマーカーの収集の発現を試験することによって、治療剤または薬剤の組み合わせが癌、およびいくつかの実施形態において、乳癌または卵巣癌細胞の成長率を低下させる可能性が最も高いことを判定することが可能である。特定された転写遺伝子または遺伝子産物マーカーの収集を試験することによって、治療剤または薬剤の組み合わせが癌の成長率を低下させる可能性が最も低いことを判定することも可能である。したがって、バイオマーカーの収集の発現を試験することによって、効果のないまたは不適切な治療剤を排除することが可能である。重要なことには、ある実施形態において、これらの判定は、患者間ベースまたは薬剤間ベースで行うことができる。したがって、特定の治療レジメンが特定の患者または患者のタイプに利益を与えるようであるかどうか、あるいは特定のレジメンを継続すべきかどうかを判定することができる。
【表１Ａ】
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【表１Ｂ】
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【００３２】
表１に列挙されるバイオマーカーのすべてまたはその一部は、予測バイオマーカーパネルにおいて使用してもよい。例えば、表１のバイオマーカーから選択されるバイオマーカーパネルは、本明細書に提供される方法を使用して生成することができ、表１に記載されるバイオマーカーのうちの１つ、およびそのすべて、ならびに中間のそれぞれおよびすべての組み合わせ（例えば、４個の選択されたバイオマーカー、１６個の選択されたバイオマーカー、７４個の選択されたバイオマーカー等）の間で含むことができる。いくつかの実施形態において、予測バイオマーカーセットは、少なくとも５、１０、２０、４０、６０、１００、１５０、２００、もしくは３００またはそれ以上のバイオマーカーを含む。他の実施形態において、予測バイオマーカーセットは、５、１０、２０、４０、６０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、または７００以下のバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、予測バイオマーカーセットは、表１に記載される複数のバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、予測バイオマーカーセットは、表１に記載される少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％のバイオマーカーを含む。選択される予測バイオマーカーセットは、本明細書に記載される方法および当該技術分野において既知の同様の方法を用いて提供される予測バイオマーカーから構築され得る。一実施形態において、バイオマーカーパネルは、表１の２０３個すべてのバイオマーカーを含む。別の実施形態において、バイオマーカーパネルは、表１または２の４０個または４４個のバイオマーカーを含む。
【００３３】
予測バイオマーカーセットは、様々な絶対値を持つ実規模に対応するスカラー重みを組み合わせて画定され得、これらは線形もしくは非線形の代数、三角法、または相関手段によって、スカラー値について数学的に導出された決定関数とともに、代数的、統計学習、ベイジアン、回帰、または同様のアルゴリズムを介して単一のスカラー値に更に組み合わされ、試料からの発現プロファイルが特定の薬物または薬物クラスに対して、応答者または非応答者、耐性のある者または耐性のない者の別個のクラスに分離され得る予測モデルを提供する。バイオマーカーメンバーシップを含むそのような予測モデルは、既知の薬物の応答性および／または耐性を有する歴史的患者試料からの一組の代表的な発現プロファイルから、重みおよび識別閾値の学習、感受性、特異性に対する最適化、負および正の予測値、危険率、またはそれらの任意の組み合わせ、相互検証下、ブートストラップ法または同様のサンプリング技法によって開発されている。
【００３４】
一実施形態において、バイオマーカーを使用して、それらの信号の加重和を形成し、これは個体の重みが正または負であり得る。結果として生じる加重和（「決定関数」）は、所定の参照点または値と比較される。参照点または値との比較を使用して、病態または転帰を診断または予測することができる。
【００３５】
上述のように、当業者は、表１に提供される分類子に含まれるバイオマーカーが治療剤に対する応答性または耐性における分類子において不均衡な重みをつけることを理解されよう。したがって、わずか１つの配列が使用され、治療剤に対する応答性等の転帰を診断または予測し得るとはいえ、その特異性および感受性または診断もしくは予測正確度は更なる配列を用いて増加し得る。
【００３６】
本明細書に使用される「重み」という用語は、統計的計算における項目の相対的重要度を指す。遺伝子発現分類子におけるそれぞれのバイオマーカーの重みは、当該技術分野において既知の解析方法を使用して患者試料のデータセットにおいて決定され得る。
【００３７】
一実施形態において、バイオマーカーパネルは、例えば疾患設定に依存して表中に詳細される対応する順位もしくは重みまたは代替の順位付けおよび重み付けを有する表２Ａに詳細される４０個のバイオマーカーを対象とする。別の実施形態において、バイオマーカーパネルは、例えば疾患設定に依存して表中に詳細される対応する順位もしくは重みまたは代替の順位付けおよび重み付けを有する表２Ｂに詳細される４４個のバイオマーカーを対象とする。表２Ａおよび２Ｂは、分類子における重みが減少する順序にバイオマーカーを順位付けし、相互検証下で測定された化合物の決定スコア関数における平均重みの順位付けとして定義される。表２Ｃは、それらの配列ＩＤ番号を参照して表２Ａおよび２Ｂの遺伝子を示すプローブセットを示す。表２Ｄは、シグネチャーにおける遺伝子のためのアレイ上に存在するアンチセンスプローブ配列を示す。
【表２Ａ】
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【表２Ｂ】
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【表２Ｃ】
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【表２Ｄ】
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【００３８】
異なる実施形態において、表２Ａおよび表２Ｂに記載されるバイオマーカーのサブセットは、本明細書に記載される方法において使用され得る。これらのサブセットとしては、表２Ａまたは表２Ｂの１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜４４、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、３６〜４４、１１〜２０、２１〜３０、３１〜４０、および３１〜４４位に入るバイオマーカーが挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、個体からの生体試料上でアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＧＢＰ５、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、およびＭＸ１のうちの少なくとも１つならびに表２Ｂのバイオマーカーの一覧表から選択される少なくともＮ個（Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６である）の更なるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出することによって個体において治療応答性が予測される。本明細書に使用される、「バイオマーカー」という用語は、遺伝子発現レベルあるいはタンパク質産生レベルのいずれかを示す、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンス転写物、ｍｉＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント、または任意の他の核酸配列もしくはポリペプチド配列を指すことができる。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２Ｉ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、またはＡＬ１３７２１８．１のバイオマーカーを指すとき、バイオマーカーはそれぞれ、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２Ｉ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、またはＡＬ１３７２１８．１のｍＲＮＡを含む。更なるまたは他の実施形態において、ＭＸ１、ＧＢＰ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＢＩＲＣ３、ＩＧＪ、ＩＱＧＡＰ３、ＬＯＣ１００２９４４５９、ＳＩＸ１、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ１、ＳＴＡＴ１、ＴＯＢ１、ＵＢＤ、Ｃ１ＱＣ、Ｃ２ｏｒｆ１４、ＥＰＳＴＩ、ＧＡＬＮＴ６、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ｂ、ＫＩＡＡ１２４４、ＬＯＣ１００２８７９２７、ＬＯＣ１００２９１６８２、またはＬＯＣ１００２９３６７９のバイオマーカーを指すとき、バイオマーカーはそれぞれ、ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＢＩＲＣ３、ＩＧＪ、ＩＱＧＡＰ３、ＬＯＣ１００２９４４５９、ＳＩＸ１、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ１、ＳＴＡＴ１、ＴＯＢ１、ＵＢＤ、Ｃ１ＱＣ、Ｃ２ｏｒｆ１４、ＥＰＳＴＩ、ＧＡＬＮＴ６、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ｂ、ＫＩＡＡ１２４４、ＬＯＣ１００２８７９２７、ＬＯＣ１００２９１６８２、またはＬＯＣ１００２９３６７９のアンチセンス転写物を含む。
【００３９】
更なる態様において、個体からの生体試料上でアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＧＢＰ５、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、およびＭＸ１、ならびに表２Ｂのバイオマーカーの一覧表から選択される少なくともＮ個の更なるバイオマーカーのうちの１つ（Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６である）に対応するバイオマーカー値を検出することによって個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料上でアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＧＢＰ５および表２Ｂのバイオマーカーの一覧表から選択される少なくともＮ個（Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、または３９である）の更なるバイオマーカーのうちの１つに対応するバイオマーカー値を検出することによって個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料上でアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＣＸＣＬ１０および表２Ｂのバイオマーカーの一覧表から選択される少なくともＮ個（Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、または３９である）の更なるバイオマーカーのうちの１つに対応するバイオマーカー値を検出することによって個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料上でアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＩＤＯ１および表２Ｂのバイオマーカーの一覧表から選択される少なくともＮ個（Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、または３９である）の更なるバイオマーカーのうちの１つに対応するバイオマーカー値を検出することによって個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料上でアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＭＸ−１および表２Ｂのバイオマーカーの一覧表から選択される少なくともＮ個（Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、または３９である）の更なるバイオマーカーのうちの１つに対応するバイオマーカー値を検出することによって個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。
【００４０】
更なる態様において、個体からの生体試料上でアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、およびＩＦＩ４４Ｌ、ならびに表２Ｂのバイオマーカーの一覧表から選択される少なくともＮ個（Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である）の更なるバイオマーカーのうちの２つに対応するバイオマーカー値を検出することによって個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料上でアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、およびＩＦＩ４４Ｌ、ならびに表２Ｂのバイオマーカーの一覧表から選択される少なくともＮ個（Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である）の更なるバイオマーカーのうちの１つに対応するバイオマーカー値を検出することによって個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料上でアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＣＸＣＬ１０および表２Ｂのバイオマーカーの一覧表から選択される少なくともＮ個（Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３である）の更なるバイオマーカーのうちの１つに対応するバイオマーカー値を検出することによって個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料上でアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＭＸ−１および表２Ｂのバイオマーカーの一覧表から選択される少なくともＮ個（Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３である）の更なるバイオマーカーのうちの１つに対応するバイオマーカー値を検出することによって個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料上でアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＩＤＯ１および表２Ｂのバイオマーカーの一覧表から選択される少なくともＮ個（Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３である）の更なるバイオマーカーのうちの１つに対応するバイオマーカー値を検出することによって個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料上でアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＩＦＩ４４Ｌおよび表２Ｂのバイオマーカーの一覧表から選択される少なくともＮ個（Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３である）の更なるバイオマーカーのうちの１つに対応するバイオマーカー値を検出することによって個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。
【００４１】
他の実施形態において、表２Ｃに記載されるプローブ（配列番号８３〜２０２）、またはそれらのサブセットは、本明細書に記載される方法において使用されてもよい。これらのサブセットとしては、ＧＢＰ５、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＭＸ１、ＩＦ１４４ｌ、ＣＤ２、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、およびＡＰＯＬ３のうちの１つ以上に対応する配列番号のサブセットが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、これらのプローブは、バイオマーカーＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、およびＡＬ１３７２１８．１のすべてに対応する。それぞれのサブセットは、同じバイオマーカーを対象とする複数のプローブを含むことができる。例えば、配列番号１３５、１４０、１４２、および１９５によって示されるプローブはすべて、ＧＢＰ５を対象とする。したがって、ＧＢＰ５を対象とするまたはそれに対応するプローブを含むサブセットは、配列番号１３５、１４０、１４２、および１９５のうちの１つ以上を含む。ＣＸＣＬ１０を対象とするまたはそれに対応するプローブを含むサブセットは、配列番号１３１および１６０のうちの１つ以上を含む。
【００４２】
分類子モデルを用いた遺伝子発現の測定
様々な方法が、バイオマーカーを特定し、疾患を診断するために利用されている。タンパク質系マーカーについては、これらには、二次元電気泳動法、質量解析法、および免疫測定法が含まれる。核酸マーカーについては、これらには、ｍＲＮＡ発現プロファイル、マイクロＲＮＡプロファイル、ＦＩＳＨ、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）、メチル化プロファイル、および大規模な遺伝子発現アレイが含まれる。
【００４３】
バイオマーカーが、個体において、異常なプロセス、疾患、または他の状態の兆候を示すか、またはその兆候であるとき、そのバイオマーカーは一般に、個体において、異常なプロセス、疾患または他の状態がないことの兆候を示すか、またはその兆候である発現レベルまたはバイオマーカー値と比較して、過剰発現か、あるいは過少発現であると説明される。「上方調節」、「上方調節された」、「過剰発現」、「過剰発現された」、およびそれらの任意の変形は、健常または正常な個体からの同様の生体試料中に一般的に検出されるバイオマーカーの値またはレベル（あるいは一連の値またはレベル）よりも大きい生体試料中のバイオマーカーの値またはレベルを指すために相互交換可能に使用される。これらの用語はまた、特定の疾患の異なる段階で検出され得るバイオマーカーの値またはレベル（あるいは一連の値またはレベル）よりも大きい生体試料中のバイオマーカーの値またはレベルを指してもよい。
【００４４】
「下方調節」、「下方調節された」、「過少発現」、「過少発現された」、およびそれらの任意の変形は、健常または正常な個体からの同様の生体試料中に一般的に検出されるバイオマーカーの値またはレベル（あるいは一連の値またはレベル）よりも小さい生体試料中のバイオマーカーの値またはレベルを指すために相互交換可能に使用される。これらの用語はまた、特定の疾患の異なる段階で検出され得るバイオマーカーの値またはレベル（あるいは一連の値またはレベル）よりも小さい生体試料中のバイオマーカーの値またはレベルを指してもよい。
【００４５】
更に、過剰発現されたあるいは過少発現されたバイオマーカーはまた、個体において、正常なプロセス、または疾患もしくは他の状態がないことの兆候を示す、またはその兆候であるバイオマーカーの「正常な」発現レベルまたは値と比較して、「差次的に発現される」、「差次的なレベル」または「差次的な値」を有すると称され得る。したがって、バイオマーカーの「差次的発現」はまた、バイオマーカーの「正常な」発現レベルからの変形として称され得る。
【００４６】
「差次的なバイオマーカー発現」および「差次的発現」という用語は、正常な対象におけるその発現と比較して、あるいは特定の療法に対して異なって応答するか、または異なる予後を有する患者におけるその発現と比較して、その発現が特定の疾患を患っている対象におけるより高いまたは低いレベルに対して活性化するバイオマーカーを指すために相互交換可能に使用される。用語はまた、その発現が同じ疾患の異なる段階でより高いまたは低いレベルに対して活性化されるバイオマーカーも含む。差次的に発現したバイオマーカーが、核酸レベルもしくはタンパク質レベルで活性化または阻害され得るか、あるいは異なるポリペプチド産物をもたらすために代替のスプライシングに供され得ることも理解されよう。そのような違いは、ポリペプチドのｍＲＮＡレベル、ｍｉＲＮＡレベル、アンチセンス転写物レベル、またはタンパク質表面発現、または分泌もしくは他の分配を含む、様々な変化によって証明され得る。差次的なバイオマーカー発現は、２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物間の発現の比較、２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物間の発現比率の比較、または正常な対象と疾患を患っている対象との間で異なるか、または同じ疾患の様々な段階との間で異なる同じ遺伝子の２つの異なる処理が行われた産物の比較さえ含み得る。差次的発現には、例えば、正常な細胞および罹患細胞の間での、あるいは異なる疾患事象もしくは疾患段階を受けている細胞の間でのバイオマーカーにおける時間的または細胞発現パターンでの量的な差および質的な差の両方が含まれる。
【００４７】
ある実施形態において、得られた発現プロファイルは、試料中の１つ以上の核酸の量またはレベルが決定される、ゲノムまたは核酸発現プロファイルであるものである。これらの実施形態において、診断または予後方法において利用される発現プロファイルを生成するためにアッセイされる試料は、核酸試料である。核酸試料には、解析される細胞または組織の表現型を決定するバイオマーカーの発現情報を含む核酸集団が含まれる。いくつかの実施形態において、核酸には、試料が、それが得られる宿主細胞または組織の発現情報を保有する限り、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ等のＲＮＡまたはＤＮＡ核酸を含み得る。試料は、当該技術分野において既知の多くの異なる方法において、例えば、細胞からのｍＲＮＡの単離によって調製され得、単離されたｍＲＮＡは、差次的遺伝子発現の分野において既知のｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等を調製するために単離、増幅、または利用されるとき使用される。したがって、試料中のｍＲＮＡのレベルの決定は、ｍＲＮＡからｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを調製し、続いて、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを測定することを含む。試料は、一般に、治療を必要とする対象から、例えば、標準プロトコルを用いた組織生検によって採取された細胞または組織から調製され、そのような核酸が生成され得る細胞型または組織としては、罹患細胞または組織、体液等が挙げられるが、これらに限定されない、表現型を決定するための発現パターンが存在している任意の組織が含まれる。
【００４８】
発現プロファイルは、任意の簡便なプロトコルを用いて初期の核酸試料から生成してもよい。差次的遺伝子発現／バイオマーカー解析の分野において用いられているもののような、発現プロファイルを作成する様々な異なる様式が知られているが、発現プロファイルを作成するための代表的かつ簡便な型の１つは、アレイに基づく遺伝子発現プロファイル作成プロトコルである。そのような適用は、作成されるべきプロファイルにおいてアッセイ／プロファイリングされるべき遺伝子のそれぞれについて「プローブ」核酸を表示する核酸アレイが用いられるハイブリダイゼーションアッセイである。これらのアッセイにおいて、標的核酸の試料は、最初に、アッセイされるべき初期の核酸試料から調製され、調製は、例えば、シグナル発生系のメンバー等の標識を用いた標的核酸の標識化を含み得る。標的核酸試料調製後、試料は、ハイブリダイゼーション条件下でアレイと接触させられ、それによって、複合体が、アレイ表面に付着したプローブ配列と相補的である標的核酸の間で形成される。次いで、ハイブリダイズした複合体の存在は、定性的かまたは定量的のいずれかで検出される。本方法に用いられる発現プロファイルを作成するために実施され得る特異的ハイブリダイゼーション技術は、米国特許第５，１４３，８５４号、第５，２８８，６４４号、第５，３２４，６３３号、第５，４３２，０４９号、第５，４７０，７１０号、第５，４９２，８０６号、第５，５０３，９８０号、第５，５１０，２７０号、第５，５２５，４６４号、第５，５４７，８３９号、第５，５８０，７３２号、第５，６６１，０２８号、第５，８００，９９２号（これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる）、ならびに国際公開第９５／２１２６５号、第９６／３１６２２号、第９７／１０３６５号、第９７／２７３１７号、欧州特許第３７３  ２０３号および第７８５  ２８０号に記載される技術を含む。これらの方法において、上述のように、発現がアッセイされるバイオマーカーのそれぞれについてのプローブを含む「プローブ」核酸のアレイが、標的核酸と接触させられる。接触は、上述のように、ハイブリダイゼーション条件（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）の下で行われ、次いで、結合していない核酸は除去される。ハイブリダイズした核酸の結果として生じたパターンは、探索された遺伝子のそれぞれについての発現に関する情報を提供し、発現情報は、遺伝子が発現しているかどうか、および典型的には、どれほどのレベルで発現しているかに関してであり、発現データ、即ち、発現プロファイルが定性的および定量的の両方であり得る。
【００４９】
バイオマーカー発現分類子の作成
一実施形態において、癌組織中のバイオマーカーの相対的発現レベルは、遺伝子発現プロファイルを作成するために測定される。患者組織試料からの一組のバイオマーカーの遺伝子発現プロファイルが、複合決定スコアの形態で要約され、トレーニングセットの患者データから数学的に導出されるスコア閾値と比較される。スコア閾値は、治療に対する応答性／非応答性等であるが、これらに限定されない、異なる特徴に基づいて患者群を分類する。患者のトレーニングセットデータは、予後、再発の可能性、長期生存、臨床転帰、治療応答、診断、癌分類、または個別のゲノミクスプロファイルによって特徴付けられる癌組織試料から導出されるのが好ましい。発現プロファイル、および患者試料からの対応する決定スコアは、数学的に導出されたスコア決定閾値の同じ側にあるトレーニングセットにおける患者試料の特徴と相関され得る。線形分類子スカラー出力の閾値は、トレーニングデータセット内で観察されるとき、相互検証下で、感受性および特異性の和を細大にするために最適化される。
【００５０】
与えられた試料に対する全発現データは、出発材料の異なる量を補正するために当業者に既知の方法を用いて正規化し、抽出および増幅反応等の効率を変動させる。診断または予後判定（例えば治療剤に対する応答性または耐性）を行うために正規化データ上での線形分類子の使用は、事実上、データ領域、即ち、分類子中のすべての遺伝子に対する発現値のすべての可能な組み合わせを、超平面を２つの互いに素な半分に分割することを意味する。この分割は、例えば治療剤に対して応答性または耐性を示す患者から大量のトレーニングセットの例から実験的に導出される。一般性の喪失なく、１つのバイオマーカーを除いてすべてに対してある一定の値を推測することができ、この決定が例えば治療剤に対する応答性または耐性から変化するとき、この残りのバイオマーカーに対して閾値を自動的に定義する。次いで、この動的閾値を超える発現値は、治療剤に対する耐性（負の重みを持つバイオマーカーに対して）または応答性（正の重みを持つバイオマーカーに対して）のいずれかを示す。この閾値の精密値は、分類子内のすべての他のバイオマーカーの実際に測定された発現プロファイルによって異なるが、あるバイオマーカーの一般的な表示が固定されたままである、即ち、高い値または「相対的過剰発現」は常に、応答性（正の重みを持つ遺伝子）または応答性（負の重みを持つ遺伝子）のいずれかの一因となる。したがって、全遺伝子発現分類子において、あるバイオマーカーの上方調節または下方調節が治療剤に対する応答性または耐性を示す場合、相対的発現は示すことができる。
【００５１】
一実施形態において、患者組織試料のバイオマーカー発現プロファイルは、線形分類子によって評価される。本明細書に使用される、線形分類子とは、複合決定スコアへの個別のバイオマーカー強度の加重和を指す（「決定関数」）。次いで、決定スコアは、所定のカットオフスコア閾値と比較され、試料がスコア閾値を超える（決定関数の正）または下回る（決定関数の負）場合に示す感受性および特異性においてあるセットポイントに対応する。
【００５２】
事実上、これは、データ領域、即ち、バイオマーカー発現値のすべての可能な組み合わせのセットが異なる臨床的分類または予測に対応する２つの互いに排反する値、例えば治療剤に対する応答性に対応するものおよび耐性に対するものに分割されることを意味する。全分類子において、あるバイオマーカーの相対的な過剰発現は、決定スコアを増加する（正の重み）か、あるいはそれを減少させる（負の重み）ことができ、それ故に、例えば治療剤に対する応答性または耐性の全決定の一因となる。
【００５３】
「濃度曲線下面積」または「ＡＵＣ」という用語は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下の面積を指し、これらの両方は当該技術分野において公知である。ＡＵＣ測定は、完全データ範囲にわたる分類子の正確度を比較するのに有用である。より大きなＡＵＣを有する分類子は、対象となる２つの群（例えば卵巣癌試料および正常または対照試料）間で正確に未知を分類するより大きな能力を有する。ＲＯＣ曲線は、２つの集団（例えば治療剤に対して応答する個体および応答しない個体）を区別する際、特定の特徴（例えば本明細書に記載されるバイオマーカーのいずれかおよび／または更なる生物医学情報のいずれかの項目）の性能をプロットするために有用である。一般的には、全集団（例えば症例および対照）にわたる特徴データを、単一の特徴の値に基づいて、昇順で仕分ける。次いで、その特徴に対するそれぞれの値に対して、データに関して真の陽性または偽陽性率を計算する。真の陽性率は、その特徴に関する値を超える症例の数を計数して、次いで、症例の総数によって割ることによって決定する。偽陽性率は、その特徴に関する値を超える対照の数を計数して、次いで、対照の総数によって割ることによって決定する。この定義が、対照と比較して、症例にて特徴が上昇するシナリオを記述している一方で、この定義はまた、対照と比較して、症例にて特徴が抑制されるシナリオにも適応する（そのようなシナリオにおいて、その特徴に対する値を下回る試料が計数される）。ＲＯＣ曲線は、単一の特徴に対して、ならびに他の単一出力に対して産出可能であり、例えば、２つ以上の特徴の組み合わせが、数学的に一緒に統合されて（例えば加えられる、引かれる、かけられる等）、単一の合計値が提供され、この単一合計値はＲＯＣ曲線中でプロット可能である。更に、それによって組み合わせが単一出力値を誘導する、複数の特徴の任意の組み合わせが、ＲＯＣ曲線中でプロット可能である。特徴のこれらの組み合わせが試験を含んでよい。ＲＯＣ曲線は、試験の偽陽性率（１特異性）に対する試験の真の陽性率（感受性）のプロットである。
【００５４】
この量の解釈、即ち、治療剤に対するカットオフ閾値の応答性または耐性は、既知の転帰を有する一連の患者から成長相（「トレーニング」）で得られる。決定スコアに対して対応する重みおよび応答性／耐性のカットオフ閾値は、当業者に既知の方法によってトレーニングデータから先験的に固定される。本方法の好ましい実施形態において、部分最小二乗法判別解析（ＰＬＳ−ＤＡ）は、重みを判定するために使用される（Ｌ．Ｓｔａｈｌｅ，Ｓ．Ｗｏｌｄ，Ｊ．Ｃｈｅｍｏｍ．１（１９８７）１８５−１９６、Ｄ．Ｖ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｍ．Ｒｏｃｋｅ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８（２００２）３９−５０）。当業者に既知の分類を行うための他の方法はまた、癌分類子の転写物に適用するとき、本明細書に記載される方法を伴い得る。
【００５５】
異なる方法を使用して、これらのバイオマーカーにおいて測定された定量的データを予後または他の予測用途に変換することができる。これらの方法としては、パターン認識（Ｄｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００１）、機械の学習能力（Ｓｃｈｏｌｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｋｅｒｎｅｌｓ，ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ２００２，Ｂｉｓｈｏｐ，Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  １９９５）、統計学（Ｈａｓｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００１）、バイオインフォマティクス（Ｄｕｄｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ａｍ．Ｓｔａｔｉｓｔ．Ａｓｓｏｃ．９７：７７−８７、Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：６５６７−６５７２）、またはケモメトリックス（Ｖａｎｄｅｇｉｎｓｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｑｕａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  １９９８）の分野からの方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
トレーニングステップにおいて、両方の応答性／耐性の症例に対する一連の患者試料が測定され、本予測方法は、このトレーニングデータからの固有情報を用いて最適化し、トレーニングセットまたは未来の試料セットを最適に予測する。このトレーニングステップにおいて、使用された方法が、特定の強度パターンから特定の予測判定まで予測するためにトレーニングされるか、またはパラメータ化される。好適な変換または前処理ステップは、予後方法またはアルゴリズムに供される前に測定されたデータを用いて行われ得る。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態において、それぞれの転写物に対して前処理強度値の加重和が形成され、トレーニングセットにおいて最適化された閾値と比較される（Ｄｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００１）。重みは、部分最小二乗法（ＰＬＳ，（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８（２００２）３９−５０））またはサポートベクターマシン（ＳＶＭ，（Ｓｃｈｏｌｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｋｅｒｎｅｌｓ，ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ２００２））が挙げられるが、これらに限定されない、多数の線形分類子法によって導出され得る。
【００５８】
本発明の別の実施形態において、データは、上述のように加重和を適用する前に、非線形に変換される。この非線形変換は、データの次元を増加させることを含み得る。また、非線形変換および加重は、例えばカーネル関数の使用を通じて、暗黙的に行われ得る  （Ｓｃｈｏｌｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｋｅｒｎｅｌｓ，ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ２００２）。
【００５９】
本発明の別の実施形態において、新しいデータ試料は、実際に測定されたトレーニング試料または人工的に生成されたプロトタイプのいずれかである、２つ以上のクラスのプロトタイプと比較される。この比較は、例えば、ユークリッド距離（Ｄｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００１）、相関係数（Ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ，ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：５３０）等があるが、これらに限定されない、好適な同様の手段を用いて行われる。次いで、新しい試料は、最も近いプロトタイプまたは近くに最高の数のプロトタイプを有する予後群に割り当てられる。
【００６０】
本発明の別の実施形態において、決定木（Ｈａｓｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００１）またはランダムフォレスト（Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔｓ，Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ４５：５  ２００１）を使用して、転写物セットまたはそれらの産物に対して測定された強度データから予後判定を作成する。
【００６１】
本発明の別の実施形態において、ニューラルネットワーク（Ｂｉｓｈｏｐ，Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  １９９５）を使用して、転写物セットまたはそれらの産物に対して測定された強度データから予後判定を作成する。
【００６２】
本発明の別の実施形態において、線形、対角線の線形、二次およびロジスティック判別解析が含まれるが、これらに限定されない、判別解析（Ｄｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００１）を使用して、転写物セットまたはそれらの産物に対して測定された強度データから予後判定を作成する。
【００６３】
本発明の別の実施形態において、マイクロアレイについての予測解析（ＰＡＭ，（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：６５６７−６５７２））を使用して、転写物セットまたはそれらの産物に対して測定された強度データから予後判定を作成する。
【００６４】
本発明の別の実施形態において、階級類推のソフト非依存モデリング（Ｓｏｆｔ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｌａｓｓ  Ａｎａｌｏｇｙ（ＳＩＭＣＡ）、Ｗｏｌｄ，１９７６，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎ．８：１２７−１３９））を使用して、転写物セットまたはそれらの産物に対して測定された強度データから予後判定を作成する。
【００６５】
治療剤
上述のように、本明細書に記載される方法は、異常なＤＮＡ修復を有する腫瘍を標的とする治療剤（以下、「ＤＮＡ損傷治療剤」と称される）に対して応答するまたは応答しないとき、患者の分類を可能にする。本明細書に使用される「ＤＮＡ損傷治療剤」には、直接的にＤＮＡを損傷することが知られている薬剤、ＤＮＡ損傷修復を妨害する薬剤、ＤＮＡ損傷シグナリングを阻害する薬剤、ＤＮＡ損傷誘導性の細胞周期停止を阻害する薬剤、およびＤＮＡ損傷を間接的にもたらすプロセスを阻害する薬剤が含まれる。癌を治療するために使用されるいくつかの現行のそのような治療薬としては、以下のＤＮＡ損傷治療剤が挙げられるが、これらに限定されない。
１）ＤＮＡ損傷剤：
ａ．アルキル化剤（シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチン等の白金含有薬剤、シクロホスファミド、ブスルファン）
ｂ．トポイソメラーゼＩ阻害剤（イリノテカン、トポテカン）
ｃ．トピソメラーゼＩＩ阻害剤（エトポシド；ドキソルビシンおよびエピルビシン等のアントラサイクリン）
ｄ．電離放射線
２）ＤＮＡ修復標的療法剤
ａ．非相同末端結合阻害剤（ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、Ｎｕ７４４１、ＮＵ７０２６）
ｂ．相同組み換え阻害剤
ｃ．ヌクレオチド除去修復阻害剤
ｄ．塩基除去修復阻害剤（ＰＡＲＰ阻害剤、ＡＧ０１４６９９、ＡＺＤ２２８１、ＡＢＴ−８８８、ＭＫ４８２７、ＢＳＩ−２０１、ＩＮＯ−１００１、ＴＲＣ−１０２、ＡＰＥＸ１阻害剤、ＡＰＥＸ２阻害剤、リガーゼＩＩＩ阻害剤
ｅ．ファンコニ貧血経路阻害剤
３）ＤＮＡ損傷シグナル伝達阻害剤
ａ．ＡＴＭ阻害剤（ＣＰ４６６７２２、ＫＵ−５５９３３）
ｂ．ＣＨＫ１阻害剤（ＸＬ−８４４、ＵＣＮ−０１、ＡＺＤ７７６２、ＰＦ００４７７７３６）
ｃ．ＣＨＫ２阻害剤（ＸＬ−８４４、ＡＺＤ７７６２、ＰＦ００４７７７３６）
４）ＤＮＡ損傷誘導性の細胞周期停止阻害剤
ａ．Ｗｅｅ１キナーゼ阻害剤
ｂ．ＣＤＣ２５ａ、ｂ、またはｃ阻害剤
５）ＤＮＡ損傷を間接的にもたらすプロセスの阻害
ａ．ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤
ｂ．熱ショックタンパク質阻害剤（ゲルダナマイシン、ＡＵＹ９２２）
【００６６】
疾患および組織起源
本明細書に記載される予測分類子は、癌を治療するための治療剤に対する応答性または耐性を決定するのに有用である。本明細書に記載される生物学的経路は、等級および段階と同様に、それ自体、癌の特徴であり、それ自体では、単一の癌疾患型に限定されない。したがって、遺伝子または遺伝子産物の収集は、異なる組織中の異なる癌型にわたって癌療法の応答性を予測するために使用され得る。一実施形態において、遺伝子または遺伝子産物の収集は、乳房および卵巣癌腫瘍の両方を評価するのに有用である。
【００６７】
本明細書に使用される、癌としては、白血病、脳癌、前立腺癌、肝癌、卵巣癌、胃癌、結腸直腸癌、咽喉癌、乳癌、皮膚癌、メラノーマ、肺癌、肉腫、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、内分泌癌、子宮内膜癌、食道癌、神経膠腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、膵癌、下垂体癌、腎癌等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
一実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ修復標的療法剤、ＤＮＡ損傷シグナリングの阻害剤、ＤＮＡ損傷誘導性の細胞周期停止の阻害剤、およびＤＮＡ損傷を間接的にもたらすプロセスの阻害等のクラスであるが、これらのクラスに限定されない、化学療法剤により治療される癌を指す。これらの化学療法剤のそれぞれは、これらの用語が本明細書に使用されるように、「ＤＮＡ損傷治療剤」と見なされる。
【００６９】
「生体試料」、「試料」、および「試験試料」は、個体より入手さるか、またはそうでなければ個体に由来する任意の材料、生体液、組織、もしくは細胞を指すために本明細書で相互交換可能に使用される。これには、血液（全血、白血球、末梢血単核球、バフィーコート、血漿、および血清が含まれる）、喀痰、涙液、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、呼気、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、細胞、細胞抽出物、および脳脊髄液が含まれる。これには、先述のすべての実験的に分離した画分も含まれる。例えば、血液試料は、血清へ、または赤血球細胞または白血球細胞（白血球）のような特別な種類の血液細胞を含有する画分へ分画することができる。所望されるならば、試料は、組織と体液試料の組み合わせのように、個体からの試料の組み合わせであり得る。「生体試料」という用語は、例えば、大便試料、組織試料、または組織生検に由来するような、均質化した固体材料を含有する材料も含まれる。また、「生体試料」という用語には、組織培養物または細胞培養物に由来する材料も含まれる。生体試料を得るために任意の好適な方法を使用してもよく、例示的な方法には、例えば、瀉血、スワブ（例、頬内スワブ）、および微細針吸引生検法が含まれる。試料はまた、例えば、顕微解剖（例えばレーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）またはレーザー顕微解剖（ＬＭＤ））、膀胱洗浄、塗抹標本（例えばＰＡＰ塗抹標本）、または乳管洗浄によって採取することもできる。個体より入手されるか、またはそれに由来する「生体試料」には、個体から入手した後で任意の好適な様式で処理されたような、任意のそのような試料も含まれる。
【００７０】
そのような場合には、標的細胞は、腫瘍細胞、例えば、結腸癌細胞または胃癌細胞であり得る。標的細胞は、新たに入手した試料、冷凍試料、生検試料、体液試料、血液試料、パラフィン包埋した固定組織試料（即ち、組織ブロック）等の保存組織、または細胞培養物等であるが、これらに限定されない、ヒトおよび動物組織を含む任意の組織起源に由来する。
【００７１】
方法およびキット
遺伝子発現解析のためのキット
本明細書に記載される方法を行うための試薬、ツール、および／または指示書がキット中に提供され得る。例えば、キットは、癌患者に対する適切な療法を決定するための試薬、ツール、および指示書を含有することができる。そのようなキットは、患者から例えば生検等によって組織試料を収集するための試薬および組織を処理するための試薬を含むことができる。また、キットは、患者の試料中のバイオマーカーの発現レベルを決定するためにＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、プロテオーム解析、または免疫組織化学を行うための試薬等のバイオマーカー発現解析を行うための１つ以上の試薬も含むことができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを行うためのプライマー、ノーザンブロットを行うためのプローブ、ならびに／またはウエスタンブロット、免疫組織化学、およびＥＬＩＳＡ解析等のプロテオーム解析を行うための抗体がそのようなキットに含まれ得る。アッセイに適切な緩衝液も含めることができる。これらのアッセイのいずれかに必要とされる検出試薬も含めることができる。適切な試薬および方法は、以下に更に詳細に説明される。
【００７２】
本明細書に特徴付けられるキットはまた、バイオマーカー発現を測定するためのアッセイを行う方法を説明する指示シートを含むこともできる。指示シートはまた、参照コホートのバイオマーカーの発現レベルの決定方法、および試験患者と比較するための参照を確立するための発現データの収集方法を含む、参照コホートの決定方法のための指示書を含むこともできる。指示シートはまた、試験患者においてバイオマーカー発現をアッセイすることと、発現レベルを参照コホートの発現と比較し、試験患者に対して適切な化学療法を決定することに関する指示書を含むこともできる。適切な化学療法を決定するための方法が上述され、指示シート中に詳細に説明することができる。
【００７３】
キットに含まれる情報材料は、本明細書に記載される方法および／または本明細書に記載される方法のための試薬の使用に関する説明、指示、マーケティング、または他の材料であり得る。例えば、キットの情報材料は、例えば、キットのユーザが遺伝子発現解析の実施および結果の解釈、特に、特定の治療剤に対して陽性応答を有するヒトの可能性に応用するときに関する実質的な情報を得ることができる、住所、電子メールアドレス、ウェブサイト、または電話番号等の連絡先を含むことができる。
【００７４】
本明細書に特徴付けられるキットはまた、バイオマーカー発現から特定の治療剤に対して陽性応答を有する患者の可能性を推測するのに必要なソフトウェアを含むこともできる。
【００７５】
ａ）遺伝子発現プロファイリング法
生体試料中のｍＲＮＡの測定は、生体試料中の対応するタンパク質のレベルの検出のためのサロゲートとして使用され得る。したがって、本明細書に記載されるバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルのいずれかはまた、適切なＲＮＡを検出することによって検出することもできる。遺伝子発現プロファイリングの方法としては、マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＴ、ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、ＳＡＧＥ、質量解析法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
ｍＲＮＡ発現レベルは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ、続いて、ｑＰＣＲ）によって測定される。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを創出する。ｃＤＮＡをｑＰＣＲアッセイに使用して、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれて蛍光を産生することができる。標準曲線への比較によって、ｑＰＣＲは、細胞当たりのｍＲＮＡのコピー数等の絶対測定値を測定することができる。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイ、およびキャピラリー電気泳動法と組み合わせたＲＴ−ＰＣＲはすべて、試料中のｍＲＮＡの発現レベルを測定するために使用されている。Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．Ｓｈｉｍｋｅｔｓ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００４を参照のこと。
【００７７】
ｍｉＲＮＡ分子は、非翻訳領域であるが、遺伝子発現を調節する可能性がある低分子ＲＮＡである。ｍＲＮＡ発現レベルの測定に適した方法のいずれも、対応するｍｉＲＮＡに使用することができる。最近、多くの研究室が、疾患のバイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡの使用を検討している。多くの疾患は広範囲の転写調節を伴うので、ｍｉＲＮＡがバイオマーカーとしての役割を見出すことは驚きではない。ｍｉＲＮＡ濃度と疾患の間の関連は、タンパク質レベルと疾患の間の関連よりずっと明らかでないことが多いが、それでもｍｉＲＮＡバイオマーカーの価値は、実質的であるかもしれない。当然ながら、疾患の間に差次的に発現されるいかなるＲＮＡとも同様に、インビトロ診断製品の開発が直面する課題には、ｍｉＲＮＡが疾患細胞においても存続して、解析のために容易に抽出される、またはｍｉＲＮＡが血液または他のマトリックス中へ放出されて、そこで測定されるのに十分長く存続しなければならないという必要条件が含まれるものである。タンパク質バイオマーカーにも同様の必要条件があるが、多くの潜在的なタンパク質バイオマーカーは、疾患の間に、病態および機能の部位で、傍分泌の形式で意図的に分泌される。多くの潜在的なタンパク質バイオマーカーは、その内部でそのタンパク質が合成される細胞の外側で機能するように設計されている。
【００７８】
遺伝子発現はまた、質量分析法を用いて評価され得る。多様な配置の質量分析計を使用して、バイオマーカー値を検出することができる。数種の質量分析計が利用可能であるか、または様々な配置で製作することができる。一般に、質量分析計は、以下の主要な構成要素を有する：試料注入口、イオン発生源、質量分析計、検出器、真空システム、および機器制御システム、およびデータシステム。一般に、試料注入口、イオン発生源、および質量分析計の違いにより、機器の種類とその能力を明確にする。例えば、注入口は、毛細管−カラム液体クロマトグラフィー源であり得るか、またはマトリックス支援レーザー脱離に使用されるような直接プローブまたはステージであり得る。一般的なイオン発生源は、例えば、ナノスプレーおよびマイクロスプレーが含まれるエレクトロスプレー、またはマトリックス支援レーザー脱離である。一般的な質量分析計には、四重極質量フィルタ、イオントラップ質量分析計、および飛行時間型質量分析計が含まれる。当該技術分野では、追加の質量分析法の方法が公知である（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：６４７Ｒ−７１６Ｒ（１９９８）、Ｋｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）を参照）。
【００７９】
タンパク質バイオマーカーとバイオマーカー値は、以下のいずれによって検出および測定することができる：エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、シリコン上の脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）、ウルトラフレックスＩＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦと呼ばれるタンデム飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）技術、大気圧光イオン化質量分析法（ＡＰＣＩ−ＭＳ）、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ−（ＭＳ）Ｎ、大気圧光イオン化質量分析法（ＡＰＰＩ−ＭＳ）、ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、およびＡＰＰＩ−（ＭＳ）Ｎ、四重極質量分析法、フーリエ変換質量分析法（ＦＴＭＳ）、定量的な質量分析法、およびイオントラップ質量分析法。
【００８０】
タンパク質バイオマーカーの特徴付けとバイオマーカー値の測定の前に、試料調製ストラテジーを使用して試料を標識して濃縮する。標識法としては、相対および絶対定量用等圧タグ（ｉＴＲＡＱ）と細胞培養中のアミノ酸の安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）が含まれるが、これらに限定されない。質量分光分析に先立って、候補バイオマーカータンパク質のために試料を選択的に濃縮するために使用される捕捉試薬としては、アプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、低分子、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖抗体断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、代替抗体スカフォールド（例えばダイアボディ等）、印字ポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、および合成受容体、ならびにこれらの修飾物および断片が含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
上述のアッセイは、癌治療剤の応答性を予測するための方法に有用であるバイオマーカー値の検出を可能にし、本方法には、個体からの生体試料において、表１または２に提供されるバイオマーカーからなる群から選択されるバイオマーカーにそれぞれ対応する少なくともＮ個のバイオマーカー値を検出することを含み、バイオマーカー値を使用して、以下に詳しく記載するような分類により、その個体が治療剤に対して応答性があるかどうかを示す。ある種の記載される予測バイオマーカーは、治療剤に対する応答性を予測するのに単独で有用であるが、２つ以上のバイオマーカーのパネルとしてそれぞれ有用であるバイオマーカーの複合サブセットの群分けのための方法も本明細書に記載される。したがって、本出願の様々な実施形態は、Ｎ個（Ｎが少なくとも３つのバイオマーカーである）のバイオマーカーを含む組み合わせを提供する。Ｎが上記の範囲のいずれかだけでなく、同様の、しかしより高い次数の範囲の任意数であるように選択され得ることが理解されよう。本明細書に記載される方法のいずれかに従って、バイオマーカー値を個別に検出して分類することができるか、またはそれらは、例えばマルチプレックスアッセイフォーマットにおけるように、集合的に検出して分類することができる。
【００８２】
ｂ）マイクロアレイ法
一実施形態において、本発明は、「オリゴヌクレオチドアレイ」（本明細書では「マイクロアレイ」とも称される）を使用する。マイクロアレイは、細胞中のバイオマーカーの発現を分析する、特に癌組織のバイオマーカーの発現を測定するために使用され得る。
【００８３】
一実施形態において、バイオマーカーアレイは、マイクロアレイに、細胞中に存在するｍＲＮＡ転写物（例えば、全細胞ｍＲＮＡまたは標識ｃＲＮＡから合成された蛍光標識ｃＤＮＡ）を示す検出可能に標識されるポリヌクレオチドをハイブリダイズすることによって製作される。マイクロアレイは、細胞または生物のゲノム中の多くの遺伝子、好ましくはほとんどまたはほぼすべての遺伝子の産物のための結合（例えば、ハイブリダイゼーション）部位の順序付けられたアレイを有する表面である。マイクロアレイは、当該技術分野において既知の多くの方法において作製され得る。しかしながら、製作されたマイクロアレイは、ある特定の特徴付けを共有する。本アレイは、再生可能であり、これにより、特定のアレイの多数のコピーを製作し、互いに容易に比較することを可能にする。好ましくは、マイクロアレイは、小さい、通常５ｃｍ２より小さく、それらは結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）条件下で安定している材料から作製される。マイクロアレイ中の特定の結合部位または結合部位の特有のセットが、細胞中の単一細胞の産物を特異的に結合する。特定の実施形態において、それぞれの位置で既知の配列の付加された核酸を含有する位置を指定可能なアレイが使用される。
【００８４】
細胞のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが作製され、好適なハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイにハイブリダイズされるとき、任意の特定の遺伝子に対応するアレイ中の部位に対するハイブリダイゼーションのレベルがその遺伝子／バイオマーカーから転写されたｍＲＮＡの細胞における出現率に反映することが理解されるだろう。例えば、全細胞ｍＲＮＡに相補的な検出可能に標識された（例えば、フルオロフォアを用いて）ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡがマイクロアレイにハイブリダイズされるとき、細胞において転写されない遺伝子に対応するアレイ上の部位（即ち、遺伝子の産物を特異的に結合可能である）は、シグナル（例えば蛍光シグナル）をほとんどまたは全くなく、コードされたｍＲＮＡがまん延している遺伝子は、比較的強いシグナルを有する。核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、プローブが特定のアレイ部位に対して「特異的に結合する」または「特異的にハイブリダイズする」ように、即ち、プローブが相補的核酸配列を有する配列アレイ部位に対してハイブリダイズする、二重鎖を形成するか、または結合するが、非相補的核酸配列を有する部位とはハイブリダイズしないように選択される。本明細書に使用される１つのポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドのうちの短い方が２５塩基と等しいかそれ未満であれば、標準的な塩基対合則を用いてミスマッチがない場合、またはポリヌクレオチドのうち短い方が２５塩基より長ければ、ミスマッチが５％を上回らない場合には、別のポリヌクレオチド配列に対して相補的であるとみなされる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、完全に相補的である（ミスマッチがない）。特異的なハイブリダイゼーション条件は、日常の実験を用いて、陰性対照を含むハイブリダイゼーションアッセイを行うことによって特異的なハイブリダイゼーションをもたらすことを示すことができる。
【００８５】
最適なハイブリダイゼーション条件は、標識プローブおよび固定化されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さ（例えば、オリゴマー対２００塩基を上回るポリヌクレオチド）および種類（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ）によって異なる。核酸に関する特異的（即ち、ストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件のための一般的なパラメータは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上記およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ（１９８７）（これはすべての目的においてその全体が組み込まれる）に記載されている。ｃＤＮＡマイクロアレイが使用されるとき、典型的なハイブリダイゼーション条件は、０．２％  ＳＤＳを加えた５×ＳＳＣ中、６５℃で４時間のハイブリダイゼーション、続いて、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．２％  ＳＤＳを加えた１×ＳＳＣ）中、２５℃で、続いて、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．２％  ＳＤＳを加えた０．１ＳＳＣ）中、２５℃で１０分間である（Ｓｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，ｐ．１０６１４（１９９６）を参照）。有用なハイブリダイゼーション条件はまた、例えば、Ｔｉｊｅｓｓｅｎ，“Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．（１９９３）およびＫｒｉｃｋａ，“Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９２）にも提供されている。
【００８６】
ｃ）免疫学的検定法
イムノアッセイ法は、その対応する標的または分析物に対する抗体の反応に基づいており、特定のアッセイフォーマットによって異なる試料中の分析物を検出することができる。免疫反応性に基づいたアッセイ法の特異性および感受性を改善するために、モノクローナル抗体が、しばしば、それらの特異的なエピトープ認識のため使用される。ポリクローナル抗体はまた、モノクローナル抗体と比較して、標的に対する親和性の増加のため様々なイムノアッセイにおいて首尾よく使用されている。イムノアッセイは、広範囲の生体試料マトリックスと一緒の使用のために設計されている。イムノアッセイフォーマットは、定性的、半定量的、および定量的な結果をもたらすように設計されている。
【００８７】
検出される特異的な分析物の既知濃度で創出される標準曲線の使用により、定量的な結果が得られ得る。未知の試料からの応答またはシグナルを標準曲線上にプロットして、未知の試料中の標的に対応する量または値が確定される。
【００８８】
多くのイムノアッセイフォーマットが設計されている。ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡは、分析物／バイオマーカーの検出について定量的であり得る。この方法は、分析物または抗体のいずれかへの標識の付着に依存して、標識成分は、間接的または直接的に酵素を含む。ＥＬＩＳＡ検定は、分析物の直接的、間接的、競合的、またはサンドイッチ検出用にフォーマット化され得る。他の方法は、例えば、放射性核種（Ｉ１２５）または蛍光等の標識に依存する。更なる技術には、例えば、凝集、ネフェロメトリー、比濁法、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ルミネックスアッセイ、その他が含まれる（ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂｒｉａｎ  Ｌａｗ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｔｄ．，２００５  ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【００８９】
例示のアッセイフォーマットには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、蛍光、化学発光、および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）イムノアッセイが含まれる。バイオマーカーを検出するための手順の例には、バイオマーカーの免疫沈降、続いて、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、平面電気クロマトグラフィー等のサイズおよびペプチドレベルの区別を可能にする定量的な方法が含まれる。
【００９０】
検出可能な標識またはシグナル発生材料を検出する、および／または定量する方法は、標識の性質に依存する。適切な酵素によって触媒される反応の産物（検出可能な標識は、酵素である、上記参照）は、蛍光性、発光性、または放射活性であるが、これらに限定され得ず、それらは、可視光線または紫外線を吸収してもよい。そのような検出可能な標識を検出するのに適している検出器の例としては、Ｘ線フィルム、放射活性カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、照度計、および濃度計が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
検出方法のいずれも、反応物の任意の好適な調製、処理、および分析を可能にする任意のフォーマットにおいて実施することができる。これは、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば９６ウェルまたは３８４ウェル）中であっても、または任意の好適なアレイもしくはマイクロアレイを使用してもよい。様々な薬剤のストック溶液を手動またはロボットで作製することができ、そしてすべてのピペット操作、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、試料の読出し、データ採取、および分析は、検出可能な標識を検出することが可能な市販の分析ソフトウェア、ロボット工学、および検出機器を使用して、ロボットで行うことができる。
【００９２】
臨床用途
いくつかの実施形態において、治療レジメンに対して応答する癌患者を特定および／または選択するための方法が提供される。特に、本方法は、治療レジメンに対して応答する癌患者を特定および／または選択することを対象とし、これにはＤＮＡを直接的または間接的に損傷する薬物を投与することを含む。また、治療レジメンに対して応答しない患者を特定するための方法も提供される。これらの方法には、一般に、患者の腫瘍（例えば患者の癌細胞）において予測マーカー（血液、または血液、尿、唾液、および他の体液中の成分等であるが、これらに限定されない腫瘍からの一次、転移性、または他の誘導体）の収集の発現レベルを決定することと、発現レベルを参照発現レベルと比較することと、試料中の発現が、治療剤に対する応答または非応答に対応する選択された予測バイオマーカーまたはバイオマーカーセットの発現パターンまたはプロファイルを含むかどうかを特定することと、が含まれる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷治療剤への個体の応答性の予測方法には、個体からの試験試料を得るステップと、試験試料中の１つ以上のバイオマーカーであって、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、およびＡＰＯＬ３からなる群から選択される、１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップと、発現レベルを捕捉する試験スコアを導出するステップと、試験スコアと応答性とを相互に関連付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、試験スコアを閾値スコアと比較するステップであって、試験スコアが閾値スコアを超えるとき、応答性が予測される、比較するステップと、を含む。当業者は、実施例１の教示を含む本明細書に提供される教示を用いて好適な閾値スコア、および好適なバイオマーカーの重み付けを決定することができる。
【００９４】
他の実施形態において、ＤＮＡ損傷治療剤に対する個体の応答性の予測方法は、試験試料中の１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定することを含み、１つ以上のバイオマーカーは、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、およびＡＬ１３７２１８．１からなる群から選択される。表２Ａおよび２Ｂは、例示的な遺伝子シグネチャー（または遺伝子分類子）を提供し、バイオマーカーはそれぞれ、その中に記載される４０または４４個の遺伝子産物からなり、閾値スコアは、その中に記載される個々の遺伝子産物重み付けに由来する。バイオマーカーが表２Ｂに記載される４４個の遺伝子産物からなるこれらの実施形態のうちの１つにおいて、バイオマーカーは、表２Ｂに提供される重み付けと関連し、０．３６８１の閾値スコアを超える試験スコアは、個体がＤＮＡ損傷治療剤に対して応答性である可能性を示す。
【００９５】
癌は、その成長速度が治療剤との接触の結果として抑制され、治療剤との接触がない状態でその成長と比較されるとき、治療剤に対して「応答性」である。癌の成長は、様々な方法で測定することができ、例えば、腫瘍のサイズまたはその腫瘍型に適切な腫瘍マーカーの発現が測定され得る。
【００９６】
癌は、治療剤との接触がない状態でその成長と比較されるとき、その成長速度が治療剤との接触の結果として抑制されない、または超低度で抑制する場合、治療剤に対して「非応答性」である。上述のように、癌の成長は、様々な方法で測定することができ、例えば、腫瘍のサイズまたはその腫瘍型に適切な腫瘍マーカーの発現が測定され得る。治療剤に対して非応答性である性質は、異なる条件下で、特定の治療剤に対して「非応答性」の異なるレベルを示す異なる癌を有する、極めて変わりやすいものである。依然として更に、非応答性の測定は、患者の生活の質、転移の程度等を含む腫瘍の成長サイズを超えた更なる判定基準を用いて評価することができる。
【００９７】
この試験の適用は、全生存、無増悪生存率、ＲＥＣＩＳＴによって定義されるような放射線応答、完全応答、部分的応答、安定疾患、ならびにＰＳＡ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、およびＣＡ１９−９等であるが、これらに限定されない血清学的マーカー等の評価項目を予測する。
【００９８】
代替として、ＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくは１つ以上の核酸の試料内のタンパク質、またはコードされたタンパク質等のそれらの生物学的誘導体の検出、定量化、および適格性のための非アレイベースの方法が使用され得、これには定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、または免疫組織化学（ＩＨＣ）等が含まれる。
【００９９】
アッセイされる試料から発現プロファイルを得た後、発現プロファイルは、参照または対照プロファイルと比較され、細胞または組織、そしてひいては、試料が得られた宿主の療法に応答性である表現型に関する診断を行う。発現プロファイルに関して本明細書に使用される「参照」および「対照」という用語は、特定の患者の発現分類子を解釈し、予後または予測クラスを割り当てるために使用される遺伝子もしくは遺伝子産物発現の標準パターンまたはある種のバイオマーカーの発現レベルを意味する。参照または対照発現プロファイルは、所望の表現型、例えば応答表現型を有することが知られている試料から得られるプロファイルであり得、それ故に、陽性参照または対照プロファイルであり得る。加えて、参照プロファイルは、所望の表現型を有さないことが知られている試料からのものであり得、それ故に、陰性参照プロファイルであり得る。
【０１００】
定量的ＰＣＲが１つ以上の核酸のレベルを定量化する方法として使用される場合、この方法は、二重標識した蛍光性プローブ（即ち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）によって放出された蛍光の測定によってＰＣＲ産物の蓄積を定量化する。
【０１０１】
ある実施形態において、得られた発現プロファイルは、単一参照プロファイルと比較され、アッセイされる試料の表現型に関する情報を得る。なお他の実施形態において、得られた発現プロファイルは、２つ以上の異なる参照プロファイルと比較され、アッセイされた試料の表現型に関するより詳細な情報を得る。例えば、得られた発現プロファイルは、陽性および陰性参照プロファイルと比較され、試料が対象となる表現型を有するかどうかに関する確認された情報を得ることができる。
【０１０２】
得られた発現プロファイルと１つ以上の参照プロファイルの比較は、任意の便利な手法を用いて行われ得、例えば、発現プロファイルのデジタル画像を比較することによる、発現データのデータベースを比較すること等による様々な手法が当業者に知られている。発現プロファイルの比較方法を説明する特許としては、米国特許第６，３０８，１７０号および第６，２２８，５７５号が挙げられるが、これらに限定されず、これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。また、発現プロファイルの比較方法も上述される。
【０１０３】
比較ステップは、得られた発現プロファイルが１つ以上の参照プロファイルとどれほど類似または類似していないかに関する情報をもたらし、類似の情報を使用して、アッセイされる試料の表現型を決定する。例えば、陽性対照との類似は、アッセイした試料が応答性参照試料と類似している応答性表現型を有することを示す。同様に、陰性対照との類似は、アッセイした試料が非応答性参照試料に対して非応答性表現型を有することを示す。
【０１０４】
バイオマーカーの発現レベルは、異なる参照発現レベルと更に比較することができる。例えば、参照発現レベルは、バイオマーカーまたはバイオマーカーセットの発現が情報を提供するかどうかを評価し、患者が応答性であるか、それとも非応答性であるかを判定するための評価を行うために、既定の標準的な参照発現レベルであり得る。更に、バイオマーカーの発現レベルを判断するには、バイオマーカーと同時に測定される内部参照マーカーの発現レベルと比較し、患者が応答性であるか、それとも非応答性であるかの判定するための評価を行うことができる。例えば、本発明のバイオマーカーからならないが、一定の発現レベルを示すことが知られている異なるマーカーパネルの発現は、内部参照マーカーレベルとして評価することができ、バイオマーカー発現レベルは参照物と比較して判定される。代替の例において、非腫瘍試料である組織試料中の選択されたバイオマーカーの発現は、内部参照マーカーレベルとして評価することができる。バイオマーカーの発現レベルは、ある態様において、増加した発現を有するとき、判定され得る。バイオマーカーの発現レベルは、他の態様において、減少した発現を有するとき、判定され得る。発現レベルは、参照レベルと比較して、情報を与える変化がないとき、判定され得る。なお他の態様において、発現レベルは、本明細書に提供される方法によって判定されるとき、既定の標準的な発現レベルに対して判定される。
【０１０５】
本発明はまた、患者の従来の治療を誘導することに関するものである。診断試験がＤＮＡ損傷および／またはＤＮＡ損傷修復に直接的または間接的に影響を及ぼすクラスの薬物への応答者であることを示す患者は、その療法が施行され得、患者および腫瘍学者の両方が、患者が利益を得ることを確信し得る。診断試験によって非応答者であることを示される患者は、それらの利益を与える可能性が高い代替の療法に対して特定され得る。
【０１０６】
本発明は更に、そのクラスの新規薬物がＤＮＡ損傷および／またはＤＮＡ損傷修復に直接的または間接的に影響を及ぼす臨床試験のために患者を選択することに関する。潜在的な応答者による試験集団の濃縮は、関連判定基準下でその薬物の評価を通じて更に促進する。
【０１０７】
本発明は、なお更に、ＤＮＡ損傷応答欠損（ＤＤＲＤ）に関連する癌に罹患している、または癌を発症しやすい患者の診断方法に関する。ＤＤＲＤは、患者の１つまたは複数の細胞がＤＮＡ損傷を修復する能力の低下を有する任意の状態として本明細書に定義され、この能力の低下が腫瘍の発症または成長において原因因子である。ＤＤＲＤの診断は、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路における突然変異と関連があり得る。ＤＤＲＤの診断はまた、乳癌または卵巣癌とも関連し得る。これらの診断方法は、個体から試験試料を得るステップと、試験試料中の１つ以上のバイオマーカーであって、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、およびＡＰＯＬ３からなる群から選択される、１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップと、発現レベルを捕捉する試験スコアを導出するステップと、試験スコアと癌の診断とを相互に関連付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、試験スコアを閾値スコアと比較するステップと、を含み、試験スコアが閾値スコアを超えるとき、個体は、癌に罹患しているか、または癌を発症しやすいと判定される。当業者は、実施例１の教示を含む本明細書に提供される教示を用いて好適な閾値スコア、および好適なバイオマーカーの重み付けを決定することができる。
【０１０８】
他の実施形態において、ＤＤＲＤと関連する癌に罹患している、またはその癌を発症しやすい患者の診断方法は、試験試料中の１つ以上のバイオマーカーであって、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、およびＡＬ１３７２１８．１からなる群から選択される、１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定することを含む。表２Ａおよび２Ｂは、例示的な遺伝子シグネチャー（または遺伝子分類子）を提供し、バイオマーカーはそれぞれ、その中に記載される４０または４４個の遺伝子産物からなり、閾値スコアは、その中に記載される個々の遺伝子産物重み付けに由来する。バイオマーカーが表２Ｂに記載される４４個の遺伝子産物からなるこれらの実施形態のうちの１つにおいて、バイオマーカーは、表２Ｂに提供される重み付けと関連し、０．３６８１の閾値スコアを超える試験スコアは、癌の診断または癌を発症しやすいという診断を示す。
【実施例】
【０１０９】
以下の実施例は、限定のためではなく、例解のために提供される。
【０１１０】
［実施例１］
組織処理、階層クラスター分析、サブタイプの特定、および分類子の開発
腫瘍材料
本方法において有用であると判定される遺伝子（表２）は、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒから供給された１０７個のマクロ分析された乳房の腫瘍ＦＦＰＥ組織試料のコホートの遺伝子発現分析から特定された。本研究に対する倫理的承認は、施設内治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）およびＯｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｉｒｅｌａｎｄから得られた。
【０１１１】
この試料のコホートは、以下の通りに更に説明することができる：
○４７個の試料は、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２に対する野生型であった、即ち、生物学的な機能を持つＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２タンパク質を発現した。これらの試料は、これより、散発性対照と称されるものとする。
○３１個の試料は、ＢＲＣＡ１突然変異であった、即ち、生物学的な機能を持つＢＲＣＡ１タンパク質を発現しなかった。
○２９個の試料は、ＢＲＣＡ２突然変異であった、即ち、生物学的な機能を持つＢＲＣＡ２タンパク質を発現しなかった。
【０１１２】
遺伝子発現プロファイリング
全ＲＮＡを、Ｒｏｃｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてマクロ分析されたＦＦＰＥ腫瘍試料から抽出した。全ＲＮＡを、ＮｕＧＥＮ  ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ（商標）ＦＦＰＥ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて増幅した。次いで、増幅された単鎖ｃＤＮＡを、ＦＬ−Ｏｖａｔｉｏｎ（商標）ｃＤＮＡ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｖ２（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて断片化およびビオチン標識を行った。次いで、それをＡｌｍａｃ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）にハイブリダイズした。ＡｌｍａｃのＢｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）研究ツールは、ＦＦＰＥ組織試料の分析のために最適化され、有益なアーカイブした組織バンクの使用を可能にする。Ａｌｍａｃ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）研究ツールは、正常および癌性乳房組織の両方においてトランスクリプトームを示す革新的なマイクロアレイプラットフォームである。それ故に、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＳＡ（商標）は、一般的なマイクロアレイプラットフォームを用いて利用できない乳房疾患および組織設定内のトランスクリプトームの包括的な表示を提供する。アレイを、Ａｆｆｙｍｅｎｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ  ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて走査した。
【０１１３】
データの調製
プロファイルした試料の品質管理（ＱＣ）は、ＭＡＳ５前処理アルゴリズムを用いて実行された。異なる技術的態様は、平均ノイズおよびバックグラウンドの均質性、現在の判定の割合（アレイ品質）、シグナル品質、ＲＮＡ品質、およびハイブリダイゼーション品質に取り組まれた。対応するパラメータの分散および中央値絶対偏差を分析し、使用して、可能な異常値を特定した。
【０１１４】
Ａｌｍａｃの卵巣癌ＤＳＡ（商標）は、ポリヌクレオチドの３’末端から３００個のヌクレオチド内の領域を主に標的とするプローブを含む。したがって、標準的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＲＮＡの品質測定が適用された、つまり、３’末端のプローブセット強度と平均バックグラウンド強度との比率とともに３’末端のプローブセットのハウスキーピング遺伝子強度に対して、通常の３’／５’の比率に加えて使用された。ハイブリダイゼーション対照は、それらの強度および存在している細胞がＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって特定された必要条件に適合することを確立するために確認された。
【０１１５】
ＢＲＣＡ１／２突然変異および散発性対照トレーニングセットからの腫瘍試料は、ＥＳＲ１（エストロゲン受容体１）の転写レベルに基づいて２つのデータセットに分割された。それぞれの試料に対するｍＲＮＡ発現レベルＥ平均が、すべてのＥＳＲ１プローブセット（ＢＲＡＤ．１５４３６＿ｓ＿ａｔ、ＢＲＡＤ．１９０８０＿ｓ＿ａｔ、ＢＲＥＭ．１０４８＿ａｔ、ＢＲＩＨ．１０６４７Ｃ１ｎ２＿ａｔ、ＢＲＩＨ．５６５０Ｃ１ｎ２＿ａｔ、ＢＲＰＤ．１０６９０Ｃ１ｎ５＿ａｔ、ＢＲＲＳ．８１＿ａｔ、およびＢＲＲＳ．８１−２２＿ａｔ）の平均発現によって判定された。ｍＲＮＡ中央値の発現（Ｅすべての中央値）は、すべての試料に対して計算された。試料は、Ｅ平均−Ｅすべての中央値が０．５を超えるとき、ＥＲ陽性であり、Ｅ平均−Ｅすべての中央値が０．５を下回るとき、ＥＲ陰性であると見なされた。
【０１１６】
前処理が、Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＭＡ）（Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を用いて発現コンソールｖ１．１において行われ、それぞれ、５６個のおよび５１個の試料からなるＥＲ陽性およびＥＲ陰性試料の２つのデータマトリックスをもたらした。Ａｌｔｅｒによって説明されるアレイ品質と関連する分散を除去するために、更なる変換が行われた（Ａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０１１７】
特徴選択
複合型バックグラウンド＆分散フィルタをそれぞれのデータマトリックスに適用して、最も可変なプローブセットを特定した。バックグラウンドフィルタは、バックグラウンド標準偏差σＢｇ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェアより）によって定義された閾値を超える発現Ｅおよび発現分散ｖａｒＥを有するプローブセットの選択に基づき、特定の有意性ａでの標準正規分布の変位値ｚαを有するプローブセットが、以下である場合維持された。
Ｅ＞ｌｏｇ２（（ｚａσＢｇ））、ｌｏｇ２（（ｖａｒＥ）＞２［ｌｏｇ２（σＢｇ）−Ｅ−ｌｏｇ２（ｌｏｇ（２））］
式中、有意閾値はａ＝６．３．１０−５であり、選択されたプローブセットおよびそれらの遺伝子注釈の一覧については表１を参照されたい。
【０１１８】
階層クラスター分析
階層クラスター分析法を、卵巣癌ＤＳＡ（商標）（疾患特異的なアレイ）プラットフォームを用いて分析された１９９個の上皮性漿液卵巣腫瘍からのマイクロアレイデータに適用した（図１）。生の発現データは、標準的なＲｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＲＭＡ）手順を用いて前処理された。データセット中の非生物学的系統的分散が特定され、除外された。発現レベルが腫瘍から腫瘍まで有意に変化したそれらのプローブセットが特定された。これらのプローブセットは固有の一覧表を形成した。
【０１１９】
２次元クラスター分析（腫瘍、プローブセット）を行い、固有の一覧表に基づく腫瘍関係を構築した。階層凝集型クラスタリングを適用した（ピアソン相関距離およびＷａｒｄ連結）。最適な分割数は、ＧＡＰ指数（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ．，６３：４１１−４２３）を用いて選択された。サブクラスターにおいて利用可能なすべてのプローブセットが、遺伝子名に対してマッピングされた。
【０１２０】
遺伝子クラスターの機能分析
プローブセットのクラスターの機能的意義を構築するために、プローブセットは、遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ  ｇｅｎｅ  ＩＤ）に対してマッピングされ、超幾何関数（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ適用（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，１９９５，Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ．５７：２８９：３００））に基づいた濃縮分析を行った。生物学的プロセスおよび経路の過剰発現量は、ＧｅｎｅＧｏ（登録商標）からのＭｅｔａｃｏｒｅ（商標）単一の実験分析のワークフローを用いて、ＥＲ陽性およびＥＲ陰性の試料の両方の階層クラスタリングによって生成されたそれぞれの遺伝子群に対して分析された。アンチセンスプローブセットは、この分析から除外された。超幾何学的なｐ値がそれぞれの濃縮された機能エンティティクラスについて評価された。最大ｐ値を有する機能エンティティクラスが群の代表として選択され、これらの機能エンティティを示す一般的な機能分類が発現量（即ち、ｐ値）の有意性に基づく遺伝子クラスターに割り当てられた。
【０１２１】
ＩＦＮ／ＤＤの一般的な機能項目に対して濃縮されたクラスターの遺伝子は、ＤＮＡ損傷応答欠損（ＤＤＲＤ）試料群にグループ化され、分類子生成のために使用された。ＩＦＮ／ＤＤの一般的な機能項目によって示されるＥＲ陽性およびＥＲ陰性のデータセットからの試料クラスターは、分類のために選択され、ＤＤＲＤと呼ばれた。これらの機能項目によって示されないものは、非ＤＤＲＤと呼ばれた。
【０１２２】
プローブセットレベルでの分類子の開発
ＤＤＲＤのサブグループを形成する腫瘍類を特定した後、機能的なＤＤＲＤ遺伝子の一覧表（表１）を参照して、これらの腫瘍対腫瘍コホート中のその他すべて（非ＤＤＲＤ）の計算の分類を行い、ＤＤＲＤサブグループを分類する詳細な遺伝子分類モデルを特定した。これは、以下の選択肢（合計１８）のすべての組み合わせを用いて評価された：
●３つの試料セット
○ＥＲ陰性とＥＲ陽性試料の組み合わせた試料セット（組み合わせた試料セット）
○ＥＲ陰性試料のみ
○ＥＲ陽性試料のみ
●２つの特徴セット
○７５％の分散／強度のフィルタリングおよびＤＤＲＤの一覧表の強制された含有物を有する全特徴の一覧表  ここで、両方の平均順位に基づいて、分散および強度の最低の組み合わせを有するプローブセットの７５％が除去された。使用される「ＶａｒＩｎｔ」という用語は、この選択肢を指す。
○ＤＤＲＤの一覧のみ使用される「一覧のみ」という用語は、この選択肢を指す。
●３つの分類アルゴリズム
○ＰＬＳ（部分最小二乗法）（ｄｅ  Ｊｏｎｇ，１９９３）
○ＳＤＡ（Ｓｈｒｉｎｋａｇｅ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ａｈｄｅｓｍａｋｉ  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｍｍｅｒ，２０１０）
○ＤＳＤＡ（対角線ＳＤＡ）（Ａｈｄｅｓｍａｋｉ  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｍｍｅｒ，２０１０）
【０１２３】
ＡＵＣを使用して、異なるモデルの性能を評価した。反復特徴除去（ＩＦＥ）がそれぞれのモデルの開発を通して実行され、最大ＡＵＣが相互検証にわたって最適な数の特徴を選択する際の主な判定基準であった。特徴を通して明白なＡＵＣの差異がない場合、最小特徴長が選択される。
【０１２４】
遺伝子レベルでの分類子の開発
複数のアレイプラットフォームにわたって分類子の検証を促進するために、選択されたプローブセットの分類子は、遺伝子レベルで再生成された。遺伝子レベルでのプローブセットの分類子の再開発は、２つの別個のステップを必要とした：
１．プローブセットの分類子における固有の遺伝子の発現強度は、アンチセンスのプローブセットを除く、それぞれの遺伝子に対するプローブセットのマッピングの中央値から推定された。
２．分類のために使用される分類子パラメータは、再推定された。
閾値は、すべての相互検証の予測にわたって最大の感受性および特異性に基づいて選択された。
【０１２５】
同様に、上位１０個の遺伝子（または現在の４４個の遺伝子シグネチャーに存在する任意の数の特徴）に対する遺伝子レベルを定義した発現強度を使用して、トレーニングデータセット中の相互検証において分類パラメータを再推定することによって、これらの１０個の遺伝子（または現在の４４個の遺伝子シグネチャーに存在する任意の数の特徴）のみに基づく分類子を再開発する、ならびにすべての相互検証の予測から得られた感受性および特異性を評価し、最大化することによって閾値を再構築し得た。この手法は、特徴は同じであるが、新しい重みを割り当てられることを含む特徴選択がないことを除いては、より大きな特徴セット（上述）からの作業時に使用される方法と同様である。
【０１２６】
検証データセットのための分類子スコアの計算
公的データセット
本分析のために使用されたデータセットは、即ち、ＦＡＣ１［ＧＥＯ受入番号ＧＳＥ２０２７１、（Ｔａｂｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）］、ＦＡＣ２［ＧＥＯ受入番号ＧＳＥ２２０９３、（Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）］、ＦＥＣ［ＧＥＯ受入番号ＧＳＥ６８６１、（Ｂｏｎｎｅｆｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）］、Ｔ／ＦＡＣ１［ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｍｄａｎｄｅｒｓｏｎ．ｏｒｇ／ｐｕｂｄａｔａ．ｈｔｍｌ、（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）］、Ｔ／ＦＡＣ２［ＧＥＯ受入番号ＧＳＥ１６７１６、（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）］、およびＴ／ＦＡＣ３［ＧＥＯ受入番号ＧＳＥ２０２７１、（Ｔａｂｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）］。３１個の試料において、ＦＡＣ１データセットとＦＡＣ２データセットとの間に重複があることに留意しなけれならない。これらの試料は、ＦＡＣ２データセットから除去され、したがって、ＦＡＣ１、ＦＡＣ２、およびＦＥＣデータセットの組み合わされた分析において、一度だけ含まれた。加えて、試料ＧＳＭ５０８０９２は、それが転移性リンパ節試料であるとき、ＦＡＣ１から除去された。
【０１２７】
すべてのデータセットは、ＲＭＡ（Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を用いて前処理された。それぞれの検証セットについては、アンチセンスのプローブセットを除く（該当する場合）、分類子遺伝子に対してマッピングするプローブセットが判定された。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｘ３ＰおよびＵ１３３Ａアレイのための注釈は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘウェブサイトから利用可能である。遺伝子強度マトリックスをもたらす、分類子におけるそれぞれに遺伝子に対してマッピングするすべてのプローブセットにわたる中央値の強度が計算された。次いで、分類子をこのデータマトリックスに適用し、それぞれの試料に対する分類子スコア／予測をもたらした。
【０１２８】
性能測定基準の計算
ＮＰＶおよびＰＰＶを計算するために、それぞれの評価項目（ＢＲＣＡ状態／応答）の出現率が、対応するデータセットにおいてそれぞれのクラスの割合を用いて推定された。
【０１２９】
単変量および多変量解析
単変量解析および多変量解析をそれぞれ行い、ＤＤＲＤの分類子と応答との間の関連性を評価し、関連性がもしあれば、既知の臨床的な予測に対して独立しているかどうか判定した。単変量解析のために表４に示されたｐ値は、ＭＡＴＬＡＢにおいてロジスティック回帰を使用して計算された。多変量解析については、ｐ値が変数の対数尤度を示す段階的ロジスティック回帰（Ｄｕｐｏｎｔ、２００９）を使用した。対数尤度は、変数のモデルに対するフィットの重要性の尺度であり、故に、他の予測子に対する予測子としての独立性を強調する。単変量解析および多変量解析の両方において、ｐ値＜０．０５は、有意性に対する判定基準として使用された。更に、未知の臨床因子を有する試料は、この評価において除外された。
【０１３０】
結果
分類子生成のための試料の選択
本研究の目的は、ＤＮＡ損傷治療剤に対して病原性細胞の応答性または耐性を判定することが可能な一組の遺伝子をトランスクリプトームレベルで特徴付けることであった。この点を考慮して、この生態を最も示したＡｌｍａｃ乳癌データセット内のこれらの試料が選択され、分類子生成のための残りの試料と比較された（次の項を参照のこと）。ＥＲ−ｖｅ試料セット内の試料クラスター２からの試料は、これらがＢＲＣＡ突然変異試料の最大の割合（６４％）を示し、最も優性の生態（ＩＦＮ／免疫応答）を示したとき、この選択に対して最も関連性のある試料であったことを決定した。これらの試料クラスターがそれぞれ、７３％および６７％のＢＲＣＡ突然変異腫瘍を有したため、ＥＲ＋ｖｅ試料セットの中から試料クラスター２および３からの試料が選択された。加えて、これらのクラスター内の最も優性な生態は、細胞周期、ＤＮＡ損傷応答、およびＩＦＮ／免疫応答に関連した。免疫シグナリングおよび細胞周期経路は、ＤＮＡ損傷に応答して変調されると報告されており（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｋ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６１，１０７１−１０７８（２００９）、Ｒｏｄｉｅｒ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１，９７３−９７９（２００９）、Ｘｕ，Ｙ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ６，２６１−２７０（２００６））、これらのサブグループを組み合わせて、推定上のＤＤＲＤサブグループを形成した。ＥＲ−ｖｅ試料セット（下述）のクラスター２ならびにＥＲ＋ｖｅ試料セット（下述）のクラスター２および３内の試料は、ＤＤＲＤ（ＤＮＡ損傷応答欠損）にクラス分類された（図１Ａを参照）が、一方、ＥＲ−ｖｅ試料セットの試料クラスター１および３ならびにＥＲ＋ｖｅ試料セットの試料クラスター１、４、５、および６内の試料は、非ＤＤＲＤにクラス分類された（図１Ｂを参照）。
【０１３１】
ＥＲ−ｖｅ試料セット：ＥＲ−ｖｅ試料セット内で、階層クラスター分析は、３つの試料クラスターおよび６つのプローブセットのクラスター群を定義した。プローブセットのクラスター３は、ＥＲ−ｖｅ試料セット内で最も有意な生態として特定され、インターフェロンおよび免疫応答シグナリングに対して濃縮された。
【０１３２】
ＥＲ＋ｖｅ試料セット：ＥＲ＋ｖｅ試料セット内で、階層分析は、６つの試料群および６つのプローブセットのクラスター群を定義した。プローブセットのクラスター５は、ＥＲ＋ｖｅ試料セット内で最も有意な生態として特定され、細胞外マトリックスリモデリングに対して濃縮された。ＥＲ＋ｖｅ試料セット内の次に最も有意なプローブセットのクラスターは、プローブセットのクラスター６であり、インターフェロンおよび免疫応答シグナリングに対して再度濃縮された。
【０１３３】
ＤＤＲＤの分類子モデルの開発および検証
ＤＤＲＤのサブグループを形成する腫瘍の類の特定後、機能的なＤＤＲＤ（ＩＦＮ／ＤＮＡ損傷）の遺伝子の一覧表を参照して、これらの腫瘍対腫瘍コホート中の他のすべての計算分類を行い、ＤＤＲＤのサブグループを分類する詳細な遺伝子分類モデルを特定した。
【０１３４】
分類パイプラインを使用して、複合型ＥＲ−ｖｅおよびＥＲ＋ｖｅ乳癌試料のセットを用いてモデルを導出した。この分類パイプラインは、一般に是認された良好な慣例に従って開発されている［ＭＡＱＣ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０］。このプロセスは、１）経験的データから遺伝子分類モデルの導出、および２）モデルの分類性能の評価を、両方とも相互検証下で、同時に行う。分類子生成の性能および成功は、例えば、分類法またはプローブセットのフィルタリングの選択のような、変化し得る多くのパラメータによって異なる。これを考慮すると、２つの特徴セットは、（ｉ）７５％の分散／強度のフィルタリングを有する全特徴の一覧表（ＤＤＲＤ（ＩＦＮ／ＤＮＡ損傷）の一覧表の強制された含有物を含む、表１）および（ｉｉ）ＤＤＲＤ（ＩＦＮ／ＤＮＡ損傷）の一覧のみを評価され、３つの分類アルゴリズム、即ち、ＰＬＳ（部分最小二乗法）、ＳＤＡ（Ｓｈｒｉｎｋａｇｅ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）、およびＤＳＤＡ（対角線ＳＤＡ）が評価された。反復特徴除去（ＩＦＥ）は、モデルの開発を通じて使用され、これは、それぞれの反復で最悪の順位付けされた特徴の画分を除外し、最小数の特性のみが残るとき、停止する反復手順である。この尺度はデータ中の群と出現率との間のカットオフから独立しているため、ＡＵＣで示される、受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ−ＲＯＣ）を使用して、分類性能を評価した。また、それは分類性能に対する選択の公認の尺度の１つでもある。したがって、それぞれのモデルに対する最高数の特徴が、相互検証下で、平均ＡＵＣに基づいて選択された。
【０１３５】
第１に、最高平均ＡＵＣに基づいてそれぞれのモデルに対する最高数の特徴を選択し、次いで、ボックスプロットを使用して、それぞれのモデルに対する性能を視覚化することによって、モデルの相互比較が行われた。これを図２に示す。左から右に、初めの３つのプロットはそれぞれ、分散および強度の最低平均を有する７５％を除外する（遺伝子の一覧表の含有物を強制する）ために、プローブセットの初期フィルタリングを用いて開発されたＰＬＳ、ＳＤＡ、およびＤＳＤＡ分類子を示す。次の３つのプロットはそれぞれ、ＤＤＲＤ（ＩＦＮ／ＤＮＡ損傷）の一覧のみを用いて開発されたＰＬＳ、ＳＤＡ、およびＤＳＤＡの分類子を示す。
【０１３６】
図２から、５３個のプローブセットを含む「ＰＬＳ  ＶａｒＩｎｔ」分類モデルが、他の５つのモデルの大部分よりも著しく高いＡＵＣを有する最高性能モデルであることは明白である。次いで、このモデルは、独立した外部データセットにおける検証のための次の相に進められ、ＤＤＲＤの分類スコアの能力を評価し、応答および予後について患者を層別化した。
【０１３７】
検証データセットが異なるアレイプラットフォームを有する公的または内部データのいずれかであるという事実により、分類モデルを検証するための非正統派アプローチが行われた。一般に使用されるアプローチは、代替のアレイプラットフォームに適用されるように設計されず、したがって、分類モデルの開発および独立した検証のための段階的アプローチは、以下の通りであった：
１．第Ｉ相−プローブセットレベルでのモデル生成、ＤＤＲＤのサブグループを分類するために相互検証下での最高モデルの選択（前述）
２．第ＩＩ相−プローブセットレベルの分類モデルの遺伝子レベルの分類モデルへの変換
３．第ＩＩＩ相−外部データセットを用いた再開発された遺伝子分類モデルの検証
【０１３８】
検証段階に達するために候補モデルを選択するため、このモデルは遺伝子レベルで再改造される必要があった（第ＩＩ相）。これには、分類モデルにおけるプローブセットを遺伝子レベルに対してマッピングすることと、それぞれの遺伝子に対する重みを再計算することを含んだ。選択されたモデルにおける５３個のプローブセットは、表２Ａに記載される４０個の遺伝子に対してマッピングし、続いて、注釈パイプラインの正確度が更なる解析を通じて改善されるとき、表２Ｂに記載される４４個の遺伝子に対してマッピングされた。
【０１３９】
遺伝子分類モデルの再開発において、遺伝子に関するすべての情報が使用されることを確立するために、それぞれの遺伝子（表２Ｃ）と関連するすべてのプローブセットの中央値の強度が遺伝子発現値として使用される。これは、すべての試料に対して計算され、モデルの開発および選択のために第Ｉ相において使用されたプローブセットの発現データマトリックスとは対照的に、遺伝子発現データマトリックスを得た。異なるバッチにわたる強度を安定させるために、それぞれの試料に対するすべてのプローブセットの中央値は、その試料に対するそれぞれの遺伝子の対応する強度から減算された。
【０１４０】
新しい重みが、ＰＬＳ回帰を用いてそれぞれの遺伝子に対して計算され、異なるアレイプラットフォームからの外部データセットにおける検証のために使用され得る最終遺伝子の分類子モデル（４０の遺伝子および４４の遺伝子の分類子モデル）をもたらした（第ＩＩＩ相）。
【０１４１】
第ＩＩＩ相において、他のアレイプラットフォームからのものであり得るデータセットを用いた分類子の検証のために、以下のステップが行われた：
１．アンチセンスのプローブセットを除く（該当する場合）、分類子における遺伝子に対してマッピングするプローブセットが判定される
２．分類子におけるそれぞれの遺伝子に関するすべてのプローブセットにわたる中央値の強度が計算され、低下した遺伝子強度マトリックスを得る。
ａ．プローブセットが特定のアレイプラットフォーム上の遺伝子に存在しない場合、トレーニングデータから観察された平均が代用として使用される。
３．それぞれの試料に対するすべてのプローブセットの中央値が計算され、低下した遺伝子強度マトリックスから減算される。
４．それぞれの遺伝子に対する値は、シグネチャーにおけるその遺伝子の「重み」を乗じる。
５．シグネチャーにおける遺伝子のそれぞれに対する４つの地点で得た値は、その試料に対してシグネチャースコアを生じるように一緒に加える。
６．この分類子は、それぞれの試料に対するスコアを得、応答する可能性が高い患者から応答する可能性が低い患者に層別化するために使用され得る。
【０１４２】
［実施例２］
４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルのインシリコ(in silico)での検証
４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルの性能は、元のＡｌｍａｃ乳房データセットおよび３つの独立したデータセット内でＲＯＣ（受信者動作特性）曲線下面積（ＡＵＣ）によって立証された。ＡＵＣは、観察された疾患スケールにおいて計算された統計値であり、分類子モデルを用いた表現型の予測の有効性の尺度である（Ｗｒａｙ  ｅｔ．  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌ  ６，１−９）。０．５のＡＵＣは、ランダム分類子に特有であり、１．０のＡＵＣは、クラスの完全分離を示す。したがって、４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルが、ＤＮＡ損傷を与える薬剤およびＤＮＡ修復標的療法剤を含む標準的な乳癌および卵巣癌の治療薬物クラスへの応答の予測、およびそのための患者の選択が可能であるかどうかを判定するために、その仮説は、これらのデータセット内の適用後のＡＵＣが０．５を超え、また、最低信頼間隔も０．５を超えなくてはならない。
【０１４３】
ＢＲＣＡ突然変異を散発性腫瘍から分離する４４の遺伝子の分類子モデルの能力の評価
ＤＤＲＤの状態を予測するために分類子スコアを使用して、ＢＲＣＡ突然変異の試料を散発性試料と分離するためのモデルの能力を評価した。本解析を行い、分類子モデルとＢＲＣＡ突然変異状態との間の関係を評価した。ＢＲＣＡ突然変異腫瘍は、機能的ＢＲＣＡ１／２の欠如によるＤＮＡ損傷応答の欠損のために起こる高度のゲノムの不安定性を示す。したがって、その仮説は、ＤＤＲＤの分類子モデルがＢＲＣＡ突然変異試料をＢＲＣＡ野生型散発性試料から分離することができなければならないことである。
【０１４４】
図３は、４４の遺伝子の分類子モデルがＢＲＣＡ突然変異を約０．６８のＡＵＣを有する散発性試料から分離することを示し、ここで、最低信頼間隔は両方のモデルにおいて約０．５６であり（表３Ａ）、その性能がランダム分類子よりも著しく良好であることを示す。したがって、本解析は、４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルがＤＮＡ損傷を修復することができないために高いゲノムの不安定性を有する試料を特定することが可能であることを確認する。
【０１４５】
独立したマイクロアレイの臨床的データセットに対する分類子モデルの適用
独立した乳房のマイクロアレイ臨床的データセット
（１）ＤＮＡ損傷化学療法に対する４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルの予測力の評価
ＤＮＡ損傷化学療法に対する応答を予測するために４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルの能力を評価するために、それを３つの公的に入手可能なデータセットから組み合わせたデータに適用した。それぞれの研究において、乳癌患者は、ＤＮＡを直接的に損傷する薬物であるネオアジュバント５−フルオロウラシル、アントラサイクリン、およびシクロホスファミドベースのレジメンにより治療した。第１のデータセット（Ｔａｂｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）および第２のデータセット（Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）はそれぞれ、フルオロウラシル、ドキソルビシン、およびシクロホスファミド（ＦＡＣ）によるネオアジュバント治療後、８７および５０個のＥＲ陽性およびＥＲ陰性の原発性乳癌試料に対する応答データを得た。第３のデータセット（Ｂｏｎｎｅｆｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ８，１０７１−１０７８（２００７））は、ネオアジュバント５−フルオロウラシル、エピルビシン、およびシクロホスファミド（ＦＥＣ）治療後、６６個のＥＲ陰性の原発性乳癌試料に対する応答データを得た。それぞれの研究は、終点として、病理学的完全応答（ｐＣＲ）または余病（ＲＤ）を使用した。それぞれのデータセットが比較的小さいとき、このデータを組み合わせて、解析の力を増大した。
【０１４６】
解析は、４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルがアントラサイクリンベースの化学療法に対する応答と著しく関連したことを示した（相対リスク（ＲＲ）＝４．１３、ＣＩ＝１．９４−９．８７、ＡＵＣ＝０．７８、ＣＩ＝０．７０−０．８５、Ｐ＝０．００１、表３Ｂ、図４）。分類子の陰性予測値（ＮＰＶ）は、陽性予測値（ＰＰＶ）よりも相当高く（０．９０対０．４４、表３Ｂ）、ＤＤＲＤ陰性腫瘍がＤＮＡ損傷化学療法に対して応答する可能性が低いことを示す。
【０１４７】
段階的ロジスティック回帰を使用して、４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルの能力を判定し、臨床的変数に対して調節するとき、組み合わせたデータセットにおける応答を予測した（表４）。４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルは、単変量解析において最も著しい臨床的変数があることが判定された。多変量解析は、４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルの予測値が、段階、等級、およびとりわけＥＲ状態から独立していることを確認した。
【０１４８】
エストロゲン、プロゲステロン、およびＨＥＲ２受容体に対する否定性は、異常なＤＤＲのバイオマーカーとして、ひいては、ＤＮＡ損傷およびＤＮＡ修復標的療法剤に対する応答として示唆されている（Ｆｏｕｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。しかしながら、このアプローチは、ＥＲ陽性であることが報告されている２０％のＢＲＣＡ１および４０％のＢＲＣＡ２突然変異腫瘍を除外する（Ｆｏｕｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。対照的に、採用した解析アプローチによって、ＦＥＣおよびＦＡＣのデータセットを組み合わせた解析内で４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子の予測値の多変量解析によって立証されるように、４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子がＥＲ陽性およびＥＲ陰性の両方の腫瘍において、ＤＤＲＤのサブグループを検出し、ＥＲ状態からのその非依存性を示す。臨床的に、これは、ＥＲ状態に関係なく、ＤＮＡ損傷治療に対する患者の予測された応答性を判定するために、すべての乳癌患者に適用され得ることを示唆するため、ＤＤＲＤの分類子の翻訳適用の重要な態様である。
【０１４９】
（２）タキサン含有化学療法レジメンに対する４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルの予測力の評価
タキサン等の非ＤＮＡ損傷剤を含有する化学療法レジメンに対する応答を予測するために、４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルの力が評価された。３２１人の原発性乳癌患者に対して、パクリタキセルおよびＦＡＣ（Ｔ／ＦＡＣ）によるネオアジュバント治療後の応答データを有する３つのデータセットからのデータが組み合わせられ、この応答をｐＣＲとして定義した（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｔａｂｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルは両方とも応答と関連した（ＡＵＣ＝０．６１、ＣＩ＝約０．５２〜０．６９、表３Ｂ、図５）が、この性能は、ＦＡＣ／ＦＥＣのみで治療した試料内のものと比較して著しく減少した。加えて、多変量解析は、Ｔ／ＦＡＣに対して応答を予測する能力において、ＤＤＲＤの分類子が他の臨床的パラメータ（Ｐ＝０．２１）から独立しなかったことを示した（表４）。これは、ＤＤＲＤの分類子によって検出されたサブグループが抗微小管剤も含有するレジメンよりもむしろＤＮＡ損傷のみのレジメンに対してより感受性があることを示唆している。
【０１５０】
独立した卵巣のマイクロアレイ臨床的データセット
別の疾患領域における４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルの性能を研究することが決定された。したがって、分類子モデルの性能が、漿液性組織を有する一組の２５９個のＦＦＰＥ原発性卵巣癌試料内で評価された。これらの試料は、白金の補助治療あるいは白金およびタキサンの補助治療のいずれかを受けた患者からのものであり、卵巣癌ＤＳＡ（商標）においてプロファイルされた。応答データは、ＲＥＳＩＳＴおよび／または血清マーカーＣＡ１２５レベルによって判定された。これらの試料への４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルの適用により、非応答者と応答者を有意に区別することが証明され、約０．６８のＡＵＣおよび約０．５９のより低い信頼限界を得た（図６）。４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルは、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の機能障害を検出する。
【０１５１】
ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２を含む、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ（ＦＡ／ＢＲＣＡ）経路は、ＤＮＡ修復において不可欠な役割を果たし、突然変異または後成的サイレンシングのいずれかにより、乳癌において消失され得る（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，２００６）。したがって、４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルがＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２に加えてこの経路のメンバーの廃止を検出し得るかどうかが判定された。ＦＡ／ＢＲＣＡ経路において一連の突然変異を担持する２１人のＦＡ患者および機能的なＦＡ／ＢＲＣＡ経路を有する１１人の健常な対照の骨髄から生成されるマイクロアレイデータを用いて公的データセットが特定された（Ｖａｎｄｅｒｗｅｒｆ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１４，５２９０−５２９８（２００９）。４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルは、ＦＡ／ＢＲＣＡ突然変異試料と０．９０のＡＵＣを有する正常な試料とを有意に区別し（ＣＩ＝０．７６〜１．００、Ｐ＜０．００１、図７）、これにより多重機構を通じてＤＤＲＤの分類子とＦＡ／ＢＲＣＡ経路の機能障害との間の強い相関関係を示した。
【０１５２】
４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルのインシリコでの検証の要約
４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルのインシリコでの検証を以下に示す：
（ａ）４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルは、野生型ＢＲＣＡ（散発性）乳房の腫瘍試料とＢＲＣＡ突然変異の乳房の腫瘍試料とを有意に区別することが可能である。これは、ＤＤＲＤの分類子モデルがＢＲＣＡ突然変異腫瘍等の高レベルのゲノムの不安定性を有する腫瘍と関連する生態を検出することが可能であることを意味する。これらの腫瘍は、一般に、ＤＮＡ損傷化学療法レジメンに対してより良好に応答する。
（ｂ）４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルは、ＦＡＣおよびＦＥＣ（Ｂｏｎｎｅｆｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｔａｂｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）ならびにＴ／ＦＡＣ（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｔａｂｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）によるネオアジュバント治療後の３つの独立した乳房のデータセットの組み合わせにおいて、非応答者（ｐＣＲを示さなかったもの）を定義された応答者（ｐＣＲを示したもの）と有意に区別することが可能である。４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルは、他の臨床学的因子から独立しており、ＦＡＣ／ＦＥＣを組み合わせた解析において最も有意に独立した応答の予測子であることが見いだされた。これらの研究は、未使用の冷凍（ＦＦ）試料を用い、２つの異なるマイクロアレイプラットフォーム、即ち、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｘ３ＰマイクロアレイおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイを用いて実行された。これらの結果は、異なる試料材料（ＦＦＰＥの代わりにＦＦ）、および２つの異なるマイクロアレイのプラットフォームからマイクロアレイデータを利用する独立した乳房のデータセット内の４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルの性能を検証する。
（ｃ）４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルは、白金または白金／タキサンベースの療法による補助治療後の独立したＡｌｍａｃ卵巣のデータセット内の非応答者と応答者とを有意に区別することが可能である。このデータは、Ａｌｍａｃ  Ｏｖａｒｉａｎ  ＤＳＡ（商標）においてプロファイルされたＦＦＰＥ試料を用いて生成された。
（ｄ）４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルは、骨髄組織試料を用いて、ＦＡ／ＢＲＣＡ突然変異試料と正常な試料とを有意に区別すること可能であり、これにより多重機構を通じてＤＤＲＤの分類子とＦＡ／ＢＲＣＡ経路の機能障害との強い相関関係を示す。
【０１５３】
要約すると、ＤＤＲＤの分類子モデルは、独立して検証され、３つの異なる疾患領域（乳房、卵巣、およびＦＡ）にわたる性能におけるロバスト性を示し、これは、４つの異なるマイクロアレイプラットフォーム（Ａｌｍａｃ  Ｂｒｅａｓｔ  ＤＳＡ（商標）およびＡｌｍａｃ  Ｏｖａｒｉａｎ  ＤＳＡ（商標）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｘ３ＰマイクロアレイおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイ）からのデータを利用する２つの異なる試料型（ＦＦＰＥおよびＦＦ）において、４つの異なる化学療法レジメン（ＦＡＣ、ＦＥＣ、Ｔ／ＦＡＣ、および白金／タキサン）に対して応答者と非応答者を区別する能力を示した。ＤＤＲＤが、ＤＮＡ損傷治療剤に対して応答性がある独立した予測子であり、ＦＡ／ＢＲＣＡ経路における突然変異を予測することができることを示している。この性能の塑性および再現性は、４４の遺伝子の分類子モデルによって特定されるＤＤＲＤのサブグループ内で特定される生態がＤＮＡ損傷を与える薬剤に対して応答を予測することに有意かつ堅牢に関連し、したがって、ＤＮＡを直接的に損傷する薬物、ＤＮＡを間接的に損傷する薬物、または正常なＤＮＡ損傷シグナリングおよび／または修復プロセスを阻害する薬物を含む、標準的な乳癌および卵巣癌の治療薬物クラスに対する応答を予測し、そのために患者を選択するために使用することができるサブタイプを特定する本発明の特許請求を支持することを意味する。
【０１５４】
【表３】
2013537045.tif 000016
【０１５５】
【表４】
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【０１５６】
［実施例３］
４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子モデルのインビトロ検証
４４の遺伝子の分類子モデル内で得られた遺伝子を内在する生態を評価するために、多くの研究は乳房の細胞株のパネルを用いてインビトロで行われた。
【０１５７】
方法
細胞株の維持
ＨＣＣ１９３７親、ＨＣＣ１９３７−ＥＶ、およびＨＣＣ１９３７−ＢＲ細胞株は、Ｐａｕｌ  Ｈａｒｋｉｎ教授によりＱｕｅｅｎ’ｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｂｅｌｆａｓｔ（ＱＵＢ）から快く寄付された。細胞株は、通常、５０Ｕのペニシリン／ｍＬ、５０μｇのストレプトマイシン／ｍＬ、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持された。ＨＣＣ１９３７−ＥＶおよびＨＣＣ９３７−ＢＲ細胞株はまた、０．２ｍＬ／ｍｇのジェネティシンも必要とされた。細胞株は、５％  ＣＯ２の加湿環境で、３７℃で培養された。
【０１５８】
クローン形成アッセイ−ＰＡＲＰ−１阻害剤の感受性の判定
ＰＡＲＰ−１阻害剤（ＫＵ００５８９４８）に対する感受性の測定については、指数関数的に成長している細胞を、６ウェルプレートに播種した。播種してから２４時間後、細胞は漸増用量の薬物を含む培地に供した。細胞培地を４〜５日おきに補充した。１２〜１４日後、細胞をメタノール中に固定し、クリスタルバイオレット溶液で染色し、計数した。特定の用量に対する対照の生存率は、ビヒクル処理した細胞の平板効率で割ったその用量に対する平板効率として計算された。生存曲線および半数阻害濃度（ＩＣ５０）値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて計算された。
【０１５９】
細胞生存アッセイ−シスプラチン感受性の判定
シスプラチンに対する感受性の測定については、指数関数的に成長している細胞を、９６ウェルプレートに播種した。播種してから２４時間後、細胞は漸増用量のシスプラチンを含む培地に供した。細胞は、薬物の存在下で、９６時間インキュベートし、その後、細胞の生存率をＰｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ−Ｇｌｏ発光細胞生死判別アッセイを用いて評価した。細胞の感受性は、ビヒクル（ＤＭＳＯ）対照の割合として計算された。生存曲線および半数阻害濃度（ＩＣ５０）値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて計算された。
【０１６０】
結果
ＤＤＲＤのサブグループは、乳癌細胞株モデル内で特定され得る。
前臨床モデルシステムを使用して、４４の遺伝子のＤＤＲＤの分類子が異常なＤＤＲの評価基準であったことを確認した。ＨＣＣ１９３７乳癌細胞株は、ＢＲＣＡ１突然変異によるＤＤＲＤである（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。４４の遺伝子の分類子をＨＣＣ１９３７空ベクター対照細胞（ＨＣＣ１９３７−ＥＶ）およびＢＲＣＡ１機能性が修正されたＨＣＣ１９３７細胞（ＨＣＣ１９３７−ＢＲ）に適用された（図７Ａ）。ＤＤＲＤの４４の遺伝子の分類子スコアは、それぞれ、０．５１１１および０．１５１６の平均スコアを有する、ＨＣＣ１９３７−ＢＲ細胞と比較してＨＣＣ１９３７−ＥＶ内で高くなることが見出される（図７Ｂ）。ＤＤＲＤの４４の遺伝子の分類子スコアと一致して、ＨＣＣ１９３７  ＢＲＣＡ１突然変異細胞株は、ＢＲＣＡ１を修正した細胞株と比較してＰＡＲＰ−１阻害剤ＫＵ００５８９４８（図７Ｃ）およびシスプラチン（図７Ｄ）に対してより感受性があった。これらの前臨床データは、ＤＤＲＤの４４の遺伝子の分類子が、ＤＤＲＤ陽性腫瘍細胞において免疫シグナリングを測定し、ＤＮＡ損傷剤（シスプラチン）およびＤＮＡ修復標的薬剤（ＰＡＲＰ−１阻害剤）の両方に対する応答と相関させることを示唆している。
【０１６１】
ＤＤＲＤの４４の遺伝子の分類子は、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の機能障害を検出する。
ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２を含む、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ（ＦＡ／ＢＲＣＡ）経路は、ＤＮＡ修復において不可欠な役割を果たし、突然変異または後成的サイレンシングのいずれかにより、乳癌において消失され得る（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ａ．Ｄ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４，３７９９−３８０８（２００６））。ＤＤＲＤの４４の遺伝子の分類子がＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２に加えてこの経路のメンバーの廃止を検出し得るかどうかが判定された。ＦＡ／ＢＲＣＡ経路において一連の突然変異を担持する２１人のＦＡ患者および機能的なＦＡ／ＢＲＣＡ経路を有する１１人の健常な対照の骨髄から生成されるマイクロアレイデータを用いて公的データセットが特定された（Ｖａｎｄｅｒｗｅｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＤＤＲＤの４４の遺伝子の分類子は、ＦＡ／ＢＲＣＡ突然変異試料と０．９０のＡＵＣを有する正常な試料とを有意に区別し（ＣＩ＝０．７６〜１．００、Ｐ＜０．００１）、これにより多重機構を通じてＤＤＲＤの分類子とＦＡ／ＢＲＣＡ経路の機能障害との間の強い相関関係を示した。
【０１６２】
結論
ＤＤＲＤの４４の遺伝子の分類子スコアは、ＢＲＣＡ１突然変異において有意に高く、ひいては、同系のＢＲＣＡ１を修正した細胞株と比較して、ＤＤＲＤのＨＣＣ１９３７乳癌細胞株において有意に高かった。４４の遺伝子の分類子スコアが、これらの細胞内のＤＤＲの機能障害と相関させるとき、ＤＤＲＤの分類子によって検出された免疫シグナリングがその細胞に内在し、リンパ球浸潤の作用ではないことを示す。ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２は、ＦＡ／ＢＲＣＡ  ＤＤＲネットワークの一部を示し、これは突然変異または約３３％の乳癌において過少発現であることが報告されている多くの他のタンパク質を含む（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ａ．Ｄ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４，３７９９−３８０８（２００６）。前述のように、ＤＤＲＤの４４の遺伝子の分類子は、ＦＡ突然変異を有する患者からの骨髄試料と正常な対照を有意に区別した。これは、ＤＤＲＤの分類子が、具体的にＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２の機能障害というよりもむしろ経路内の任意の異常性を検出することが可能であることを示唆している。ＤＤＲＤの４４の遺伝子の分類子が、ＰＴＥＮ欠損等の他の機構によるＤＤＲ欠損、細胞周期のチェックポイントの機能障害、または代謝障害による増加した活性酸素種等を有する腫瘍を特定し得ることが可能である。構造性のＤＮＡ損傷により、これらの腫瘍は、ＰＡＲＰ−１またはＣＨＫ１／２阻害剤等のＤＮＡ修復標的療法剤に対して応答性がある可能性が高い。
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013537045.tif 000029
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