(57)【要約】改変３次元構造体は、互いに凝集し合っている生体細胞を含む。生体細胞は、適切に、シュワン細胞および少なくとも１つの他種類の細胞を含む。シュワン細胞を伴う細胞は、適切に、骨髄幹細胞、または１つ以上の抗炎症特性を有する別の種類の細胞であることができる。本構造は、適切には、移植片が、生体において、切断された神経の近位片と遠位片との間に埋め込まれるとき、回復軸索成長を促進する移植片である。この移植片は、任意に、移植片の対向する軸端間に伸びる複数の無細胞導管を含むことができる。バイオプリンティング技術を使用して、複数の多細胞体を積み重ねることによって、成熟を通じて軸索を誘導する移植片になる３次元構築体を組み立てることができ、これらのそれぞれは、多細胞体を積み重ねて、その構造を形成するとき、崩壊を回避するのに十分互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多細胞構築体であって、
切断された神経末端間の神経連絡を回復するために、互いに凝集し合って、細長い移植片を形成する複数の生体細胞を含む、多細胞領域と、
前記移植片の内部を通じて軸方向に伸びる複数の無細胞チャネルと、
を含む、多細胞構築体。
【請求項２】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、あるいは１つ以上の無細胞材料で満たされている、請求項１に記載の多細胞構築体。
【請求項３】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、１つ以上の無細胞材料で部分的に満たされているか、あるいは１つ以上の無細胞材料で完全に満たされている、請求項１に記載の多細胞構築体。
【請求項４】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、１つ以上の無細胞材料で部分的に満たされているか、１つ以上の無細胞材料で完全に満たされているか、あるいはそれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載の多細胞構築体。
【請求項５】
前記生体細胞は、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、毛包幹細胞、嗅神経鞘細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多細胞構築体。
【請求項６】
前記生体細胞は、骨髄幹細胞を含む、請求項５に記載の多細胞構築体。
【請求項７】
前記生体細胞は、シュワン細胞を含む、請求項６に記載の多細胞構築体。
【請求項８】
前記多細胞領域中の総生体細胞数の約０．１〜約２０パーセントが、シュワン細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多細胞構築体。
【請求項９】
前記多細胞領域中の総生体細胞数の約１パーセント〜約１５パーセントが、シュワン細胞である、請求項８に記載の多細胞構築体。
【請求項１０】
前記多細胞領域中の総生体細胞数の１パーセント〜約１０パーセントが、シュワン細胞である、請求項９に記載の多細胞構築体。
【請求項１１】
前記多細胞領域中の総生体細胞数の約３パーセント〜約１０パーセントが、シュワン細胞である、請求項１０に記載の多細胞構築体。
【請求項１２】
前記多細胞領域中の総生体細胞数の約５パーセント〜約１０パーセントが、シュワン細胞である、請求項１１に記載の多細胞構築体。
【請求項１３】
前記シュワン細胞の少なくともいくつかは、前記無細胞チャネルと前記多細胞領域との間の接合面の少なくとも一部で集団化する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多細胞構築体。
【請求項１４】
前記移植片は、中央部分と、前記中央部分を取り囲む周囲部分とを有し、前記中央部分の細胞がシュワン細胞である割合は、前記周囲部分の細胞がシュワン細胞である割合よりも高い、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の多細胞構築体。
【請求項１５】
前記無細胞チャネル中の前記１つ以上の無細胞材料は、アガロースを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の多細胞構築体。
【請求項１６】
無細胞チャネル数は、２〜５個の範囲である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の多細胞構築体。
【請求項１７】
前記生体細胞は、抗炎症特性を有する細胞を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の多細胞構築体。
【請求項１８】
前記移植片は、管状である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の多細胞構築体。
【請求項１９】
前記移植片は、改変組織である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の多細胞構築体。
【請求項２０】
前記移植片は、神経支配されない、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の多細胞構築体。
【請求項２１】
前記移植片は、組織培養培地を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の多細胞構築体。
【請求項２２】
細長い３次元構造体であって、
それぞれの多細胞体が、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む、複数の改変多細胞体と、
それぞれの充填体が、前記多細胞体から前記充填体への細胞の移動および内方成長に抵抗する生体適合性材料を含む、複数の別個の充填体と、を含み、
前記多細胞体は、それぞれの多細胞体が、少なくとも１つの他の多細胞体と接触し、前記充填体が、前記構造体の対向端間に伸びる複数の無細胞チャネルを形成するように位置付けられ、配置されるパターンで配置される、細長い３次元構造体。
【請求項２３】
細長い３次元構造体であって、
それぞれの多細胞体が、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む、複数の神経支配されない多細胞体と、
それぞれの充填体が、前記多細胞体から前記充填体への細胞の移動および内方成長に抵抗する生体適合性材料を含む、複数の別個の充填体と、を含み、
前記多細胞体は、それぞれの多細胞体が、少なくとも１つの他の多細胞体と接触し、前記充填体が、前記構造体の対向端間に伸びる複数の無細胞チャネルを形成するように位置付けられ、配置されるパターンで配置される、細長い３次元構造体。
【請求項２４】
細長い３次元構造体であって、
それぞれの多細胞体が、組織培養培地と、互いに凝集し合っている複数の生体細胞と、を含む、複数の多細胞体と、
それぞれの充填体が、前記多細胞体から前記充填体への細胞の移動および内方成長に抵抗する生体適合性材料を含む、複数の別個の充填体と、を含み、
前記多細胞体は、それぞれの多細胞体が、少なくとも１つの他の多細胞体と接触し、前記充填体が、前記構造の対向端間に伸びる複数の無細胞チャネルを形成するように位置付けられ、配置されているパターンで配置される、細長い３次元構造体。
【請求項２５】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、あるいは１つ以上の無細胞材料で満たされている、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項２６】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、１つ以上の無細胞材料で部分的に満たされているか、あるいは１つ以上の無細胞材料で完全に満たされている、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項２７】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、１つ以上の無細胞材料で部分的に満たされているか、１つ以上の無細胞材料で完全に満たされているか、あるいはそれらの任意の組み合わせである、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項２８】
前記無細胞チャネルは、互いに並列な配向を有し、前記多細胞体によって互いに分離される、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項２９】
前記構造体の前記対向端間に伸びる少なくとも３つの無細胞チャネルがある、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項３０】
前記複数の生体細胞は、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、毛包幹細胞、嗅神経鞘細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞を含む、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項３１】
前記複数の生体細胞は、シュワン細胞を含む、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項３２】
前記複数の生体細胞は、骨髄幹細胞を含む、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項３３】
前記多細胞体は、比較的高い割合のシュワン細胞を有する第１の型の多細胞体と、比較的低い割合のシュワン細胞を有する第２の型の多細胞体と、を含む、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項３４】
前記第２の型の多細胞体は、前記第１の型の多細胞体および前記充填体を取り囲むように配置される、請求項３３に記載の細長い３次元構造体。
【請求項３５】
前記第１の型の多細胞体は、前記充填体に隣接して位置付けられる、請求項３３または３４のいずれかに記載の細長い３次元構造体。
【請求項３６】
前記第２の型の多細胞体は、骨髄幹細胞を含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項３７】
前記第１の型の多細胞体は、骨髄幹細胞を含み、前記第２の型の多細胞体中の骨髄幹細胞の割合は、前記第１の型の多細胞体中の骨髄幹細胞の割合よりも高い、請求項３６に記載の細長い３次元構造体。
【請求項３８】
前記多細胞体の少なくともいくつかは、実質的に桿状である、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項３９】
前記充填体の少なくともいくつかは、実質的に桿状である、請求項２２〜３８のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項４０】
前記多細胞体の少なくともいくつかは、実質的に球状である、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項４１】
前記充填体の少なくともいくつかは、実質的に球状である、請求項２２〜３７および４０のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項４２】
前記充填体の前記生体適合性材料は、前記多細胞体中の細胞の前記充填体への付着に抵抗する、請求項２２〜４１のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項４３】
前記充填体の少なくとも１つが、アガロースを含み、前記少なくとも１つの多細胞体中の前記生体細胞は、シュワン細胞を含み、前記少なくとも１つの多細胞体は、アガロースを含有する充填体に隣接してシュワン細胞があるように、前記少なくとも１つの充填体と接触する、請求項２２〜４２のいずれか１項に記載の細長い３次元構造体。
【請求項４４】
軸索を誘導する移植片であって、前記移植片が、神経系を有する生体に埋め込まれ、切断された神経末端間の間隙に位置付けられるときに、前記移植片を通じて再生軸索成長を促進することによって神経機能を回復するためのものであり、前記移植片は、
複数の生体細胞を含む細長い３次元構造体と、
前記細長い３次元構造体の対向端間に伸びる複数の別個の無細胞チャネルと、
を含む、軸索を誘導する移植片。
【請求項４５】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、あるいは１つ以上の無細胞材料で満たされている、請求項４４に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項４６】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、１つ以上の無細胞材料で部分的に満たされているか、あるいは１つ以上の無細胞材料で完全に満たされている、請求項４４に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項４７】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、１つ以上の無細胞材料で部分的に満たされているか、１つ以上の無細胞材料で完全に満たされているか、あるいはそれらの任意の組み合わせである、請求項４４に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項４８】
前記複数の生体細胞は、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、毛包幹細胞、嗅神経鞘細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞を含む、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項４９】
前記３次元構造は、神経支配されない、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項５０】
前記細長い３次元構造体は、改変組織である、請求項４４〜４９のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項５１】
前記細長い３次元構造体は、組織培養培地を含む、請求項４４〜５０のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項５２】
前記複数の生体細胞は、シュワン細胞を含む、請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項５３】
前記シュワン細胞の少なくともいくつかは、前記無細胞チャネルの表面に沿って位置する、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項５４】
前記複数の生体細胞は、抗炎症特性を有する細胞を含む、請求項４４〜５３のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項５５】
前記複数の生体細胞は、骨髄幹細胞を含む、請求項４４〜５４のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項５６】
前記無細胞チャネルは、互いに並列な配向を有し、前記細長い３次元構造体中の前記生体細胞のいくつかによって互いに分離される、請求項４４〜５５のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項５７】
前記細長い３次元構造体の対向端間に伸びる少なくとも３つの無細胞チャネルがある、請求項４４〜５６のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項５８】
前記無細胞チャネルのうちの少なくとも１つにアガロース充填体をさらに含む、請求項４４〜５７のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項５９】
前記生体細胞は、シュワン細胞を含み、前記シュワン細胞のうちの少なくともいくつかは、前記アガロース充填体と接触する、請求項４４〜５８のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項６０】
軸索を誘導する移植片であって、前記移植片が、神経系を有する生体に埋め込まれ、切断された神経末端間の間隙に位置付けられるときに、前記移植片を通じて再生軸索成長を促進することによって神経機能を回復するためのものであり、前記移植片は、
複数の生体細胞からなる細長い３次元構造体であって、前記生体細胞は、シュワン細胞を含み、前記細長い３次元構造体は、改変組織であるか、自己移植片ではないか、神経支配されないか、または組織培養培地を含む、細長い３次元構造体を含む、軸索を誘導する移植片。
【請求項６１】
前記細長い３次元構造体は、自己移植片ではない、請求項６０に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項６２】
前記複数の生体細胞は、少なくとも１つの抗炎症特性を有する細胞を含む、請求項６０または６１に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項６３】
前記少なくとも１つの抗炎症特性を有する細胞は、骨髄幹細胞を含む、請求項６２に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項６４】
前記複数の生体細胞は、間葉系幹細胞、毛包幹細胞、嗅神経鞘細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞をさらに含む、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項６５】
前記細長い３次元構造体は、神経支配されない、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項６６】
前記細長い３次元構造体は、改変組織である、請求項６１〜６５のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項６７】
前記細長い３次元構造体は、組織培養培地を含む、請求項６０〜６６のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項６８】
前記３次元構造は、外側部分と、前記外側部分の対向端間に軸方向に伸びる中央部分であって、前記外側部分が前記中央部分を取り囲むようになっている、中央部分と、を含み、前記中央部分の生体細胞集団は、前記外側部分の生体細胞集団中のシュワン細胞の割合よりも高いシュワン細胞の割合を含む、請求項６１〜６７のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項６９】
前記細長い３次元構造体の対向端間に伸びる少なくとも１つの無細胞チャネルをさらに含む、請求項６１〜６７のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項７０】
前記３次元構造体は、前記細長い３次元構造体の対向端間に伸びる複数の別個の無細胞チャネルを含む、請求項６１〜６９のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項７１】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、あるいは１つ以上の無細胞材料で満たされている、請求項６９または７０に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項７２】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、１つ以上の無細胞材料で部分的に満たされているか、あるいは１つ以上の無細胞材料で完全に満たされている、請求項６９または７０に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項７３】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、１つ以上の無細胞材料で部分的に満たされているか、１つ以上の無細胞材料で完全に満たされているか、あるいはそれらの任意の組み合わせである、請求項６９または７０に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項７４】
前記シュワン細胞の少なくともいくつかは、前記無細胞チャネルの表面に沿って位置する、請求項７０〜７３のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項７５】
前記無細胞チャネルは、互いに並列な配向を有し、前記細長い３次元構造体中の前記生体細胞のいくつかによって互いに分離される、請求項６９〜７４のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項７６】
前記細長い３次元構造体の対向端間に伸びる少なくとも３つの無細胞チャネルがある、請求項７０〜７５のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項７７】
前記無細胞チャネルのうちの少なくとも１つにアガロース充填体をさらに含む、請求項７０〜７６のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項７８】
前記シュワン細胞の少なくともいくつかは、前記アガロース充填体と接触する、請求項７７に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項７９】
軸索を誘導する移植片であって、前記移植片が、神経系を有する生体に埋め込まれ、切断された神経末端間の間隙に位置付けられるときに、前記移植片を通じて再生軸索成長を促進することによって神経機能を回復するためのものであり、前記移植片は、
複数の生体細胞を含む細長い３次元構造体であって、前記３次元構造体は、外側部分と、前記外側部分の対向端間に軸方向に伸びる中央部分であって、前記外側部分が前記中央部分を取り囲むようになっている、中央部分と、を含み、前記中央部分の生体細胞集団は、前記外側部分の生体細胞集団中のシュワン細胞の割合よりも高いシュワン細胞の割合を含み、前記細長い３次元構造体は、改変組織であるか、自己移植片ではないか、神経支配されないか、または組織培養培地を含む、細長い３次元構造体を含む、軸索を誘導する移植片。
【請求項８０】
前記細長い３次元構造体は、自己移植片ではない、請求項７９に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項８１】
前記細長い３次元構造体は、前記細長い３次元構造体の対向端間に伸びる少なくとも１つの無細胞チャネルをさらに含む、請求項７９または８０に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項８２】
前記３次元構造体は、前記対向端間に伸びる複数の別個の無細胞チャネルを含む、請求項８１に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項８３】
前記無細胞チャネルは、前記中央部分を取り囲む、請求項８２に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項８４】
前記外側部分は、前記無細胞チャネルを取り囲む、請求項８１〜８３のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項８５】
前記無細胞チャネルは、互いに並列な配向を有し、前記細長い３次元構造体中の前記生体細胞のいくつかによって互いに分離される、請求項８１〜８４のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項８６】
前記細長い３次元構造体の対向端間に伸びる少なくとも３つの無細胞チャネルがある、請求項８１〜８５のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項８７】
前記無細胞チャネルのうちの少なくとも１つにアガロース充填体をさらに含む、請求項８１〜８６のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項８８】
前記シュワン細胞の少なくともいくつかは、前記アガロース充填体と接触する、請求項８１〜８７のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項８９】
前記シュワン細胞の少なくともいくつかは、前記無細胞チャネルの表面に沿って位置する、請求項８１〜８８のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項９０】
前記生体細胞は、骨髄幹細胞を含む、請求項７９〜８９のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項９１】
前記複数の生体細胞は、間葉系幹細胞、毛包幹細胞、嗅神経鞘細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞をさらに含む、請求項７９〜９０のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項９２】
前記細長い３次元構造体は、神経支配されない、請求項７９〜９１のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項９３】
前記細長い３次元構造体は、改変組織である、請求項７９〜９１のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項９４】
前記細長い３次元構造体は、組織培養培地を含む、請求項７９〜９３のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項９５】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、あるいは１つ以上の無細胞材料で満たされている、請求項８１〜９４のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項９６】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、１つ以上の無細胞材料で部分的に満たされているか、あるいは１つ以上の無細胞材料で完全に満たされている、請求項８１〜９４のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項９７】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、１つ以上の無細胞材料で部分的に満たされているか、１つ以上の無細胞材料で完全に満たされているか、あるいはそれらの任意の組み合わせである、請求項８１〜９４のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項９８】
軸索を誘導する移植片であって、前記移植片が、神経系を有する生体に埋め込まれ、切断された神経末端間の間隙に位置付けられるときに、前記移植片を通じて再生軸索成長を促進することによって神経機能を回復するためのものであり、前記移植片は、
複数の生体細胞を含む細長い３次元構造体であって、前記複数の生体細胞が、シュワン細胞を含む、細長い３次元構造体と、
前記細長い３次元構造体の対向端間に伸びる少なくとも１つの無細胞チャネルと、
前記無細胞チャネル中の少なくとも１つの充填体であって、アガロースを含む、充填体と、を含み、
前記シュワン細胞の少なくともいくつかは、前記充填体に隣接する無細胞チャネルに沿って位置する、軸索を誘導する移植片。
【請求項９９】
前記３次元構造体は、前記細長い３次元構造体の対向端間に伸びる複数の別個の無細胞チャネルを含む、請求項９８に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項１００】
前記複数の生体細胞は、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、毛包幹細胞、嗅神経鞘細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞を含む、請求項９８または９９に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項１０１】
前記複数の生体細胞は、抗炎症特性を有する細胞を含む、請求項９８〜１００のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項１０２】
前記複数の生体細胞は、骨髄幹細胞を含む、請求項９８〜１０１のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項１０３】
前記無細胞チャネルは、互いに並列な配向を有し、前記細長い３次元構造体中の前記生体細胞のいくつかによって互いに分離される、請求項９９〜１０２のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項１０４】
前記細長い３次元構造体の対向端間に伸びる少なくとも３つの無細胞チャネルがある、請求項９９〜１０３のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項１０５】
前記シュワン細胞の少なくともいくつかは、充填体と接触する、請求項９８〜１０４のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項１０６】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、あるいは１つ以上の無細胞材料で満たされている、請求項９８〜１０５のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項１０７】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、１つ以上の無細胞材料で部分的に満たされているか、あるいは１つ以上の無細胞材料で完全に満たされている、請求項９８〜１０５のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項１０８】
前記無細胞チャネルは、中空であるか、１つ以上の無細胞材料で部分的に満たされているか、１つ以上の無細胞材料で完全に満たされているか、あるいはそれらの任意の組み合わせである、請求項９８〜１０５のいずれか１項に記載の軸索を誘導する移植片。
【請求項１０９】
複数の生体細胞を含む多細胞体であって、前記細胞は、互いに凝集し合い、前記複数の生体細胞は、第１の型の生体細胞と、第２の型の生体細胞と、を含み、前記第１の型の生体細胞は、シュワン細胞であり、前記シュワン細胞は、前記複数の生体細胞の約０．１パーセントから約２０パーセントを構成する、多細胞体。
【請求項１１０】
シュワン細胞は、前記複数の生体細胞の約１パーセントから約１５パーセントを構成する、請求項１０９に記載の多細胞体。
【請求項１１１】
シュワン細胞は、前記複数の生体細胞の約１パーセントから約１０パーセントを構成する、請求項１１０に記載の多細胞体。
【請求項１１２】
シュワン細胞は、前記複数の生体細胞の約３パーセントから約１０パーセントを構成する、請求項１１１に記載の多細胞体。
【請求項１１３】
シュワン細胞は、前記複数の生体細胞の約５パーセントから約１０パーセントを構成する、請求項１１２に記載の多細胞体。
【請求項１１４】
前記第２の型の細胞は、骨髄幹細胞である、請求項１０９〜１１３のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１１５】
前記骨髄幹細胞は、前記複数の生体細胞の大部分を構成する、請求項１１４に記載の多細胞体。
【請求項１１６】
前記多細胞体は、少なくとも約１センチメートルの長さを有する、請求項１０９〜１１５のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１１７】
前記多細胞体は、少なくとも約２センチメートルの長さを有する、請求項１０９〜１１６のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１１８】
前記多細胞体は、少なくとも約３センチメートルの長さを有する、請求項１０９〜１１７のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１１９】
前記多細胞体は、約７センチメートル未満の長さを有する、請求項１０９〜１１８のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１２０】
前記多細胞体は、約５センチメートル未満の長さを有する、請求項１０９〜１１９のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１２１】
前記多細胞体は、約３センチメートル未満の長さを有する、請求項１０９〜１２０のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１２２】
前記多細胞体は、約１センチメートル〜約７センチメートルの範囲の長さを有する、請求項１０９〜１１５のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１２３】
前記多細胞体は、約２センチメートル〜約６センチメートルの範囲の長さを有する、請求項１０９〜１１５のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１２４】
前記多細胞体は、約３センチメートル〜約５センチメートルの範囲の長さを有する、請求項１０９〜１１５のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１２５】
前記多細胞体は、実質的に円筒状であり、実質的に円形の断面を有する、請求項１０９〜１２４のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１２６】
前記多細胞体は、組織培養培地をさらに含む、請求項１０９〜１２５のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１２７】
前記多細胞体は、神経支配されない、請求項１０９〜１２６のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１２８】
前記多細胞体は、改変組織である、請求項１０９〜１２７のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１２９】
前記多細胞体中の細胞の凝集力は、前記多細胞体が平面によって支持されるとき、３次元形状を維持することができるように十分強力であり、前記３次元形状は、幅と、前記幅の少なくとも約２分の１の高さである高さと、を含む、請求項１０９〜１２８のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１３０】
前記多細胞体中の細胞の凝集力は、前記多細胞体が平面によって支持されるとき、３次元形状を維持することができるように十分強力であり、前記３次元形状は、（ｉ）前記多細胞体の底面上の接触面であって、前記多細胞体が前記面と接触する、接触面を含み、かつ（ｉｉ）前記平面上への、前記多細胞体の前記３次元形状の２次元の突出部が、前記接触面の面積を超える面積である面積を有するように構成される、請求項１０９〜１２９のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１３１】
前記多細胞体中の細胞の凝集力は、前記多細胞体と実質的に同一である別の多細胞体が、前記多細胞体の上にあるとき、前記多細胞体が前記別の多細胞体の重量を支持することができるように十分に強力である、請求項１０９〜１３０のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１３２】
前記多細胞体中の細胞の凝集力は、前記多細胞体が、器具によって持ち上げられることができるように十分強力である、請求項１０９〜１１１のいずれか１項に記載の多細胞体。
【請求項１３３】
複数の生体細胞を含む多細胞体であって、前記細胞は、互いに凝集し合い、前記複数の生体細胞は、第１の型の生体細胞と、第２の型の生体細胞と、を含み、前記第１の型の生体細胞は、骨髄幹細胞であり、前記骨髄幹細胞は、前記複数の生体細胞の約８０パーセントを構成する、多細胞体。
【請求項１３４】
３次元構造体であって、
複数の細長い多細胞体であって、それぞれの多細胞体が、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含み、前記多細胞体は、対向する軸端を有する、複数の細長い多細胞体を含み、
前記多細胞体は、前記多細胞体が、互いに対して並列な配向を有し、前記多細胞体のうちの１つの両末端のうちの少なくとも１つが、前記多細胞体の隣接するものの対応する末端から軸方向にオフセットされる、３次元構造体。
【請求項１３５】
それぞれの充填体が、前記多細胞体から前記充填体への細胞の移動および内方成長に抵抗する生体適合性材料を含む、１つ以上の充填体をさらに含み、前記充填体が、前記多細胞体とともに３次元パターンで配置される、請求項１３４に記載の３次元構造体。
【請求項１３６】
前記充填体は、前記１つの多細胞体のオフセット末端と末端間当接関係に位置付けられる細長い充填体を含む、請求項１３５に記載の３次元構造。
【請求項１３７】
前記多細胞体は、多細胞体の第１および第２のセットを含み、前記多細胞体の第１のセットは、前記多細胞体の第２のセットの対応する末端に対して軸方向に陥凹した末端を有し、前記充填体は、前記多細胞体の第１のセットの陥凹した末端と末端間当接関係に位置付けられる１組の細長い充填体を含み、前記第２のセットの多細胞体は、前記セットの前記充填体の前記当接している末端と重なり合うのに十分な長さを有する、請求項１３５に記載の３次元構造。
【請求項１３８】
シュワン細胞が集団化した複数の軸方向のチャネルを備える多細胞構築体を生成する方法であって、
１）選択された生体細胞の間で異なる濃度のシュワン細胞を含む複数の種類の細胞ペーストを作製するステップと、
２）それぞれの細胞ペーストを細長い形状に成形するステップと、
３）制御環境において前記成形した細胞ペーストをインキュベートし、前記細胞が互いに凝集し合って細長い多細胞桿体を形成することを可能にするステップと、
４）前記多細胞桿体と同様の大きさの無細胞充填体または支持桿体を作製するステップと、
５）前記多細胞桿体のそれぞれが、少なくとも１つの他の多細胞桿体と接触し、低濃度のシュワン細胞を有する多細胞桿体が周辺層に置かれ、一方、高濃度のシュワン細胞を有する多細胞桿体が中央に置かれるようなパターンに従って、複数の多細胞桿体および無細胞桿体を配置するステップと、
６）前記多細胞桿体を少なくとも１つの他の多細胞桿体と融合させ、所望の構築体を形成するステップと、
を含む、方法。
【請求項１３９】
３次元神経移植片構築体であって、
（ａ）複数の第１の改変多細胞体であって、前記複数の第１の改変多細胞体のそれぞれの改変多細胞体が、複数の第１の生体細胞を含む、第１の改変多細胞体と、
（ｂ）複数の第２の改変多細胞体であって、前記複数の第２の改変多細胞体のそれぞれの改変多細胞体が、複数の第２の生体細胞を含む、第２の改変多細胞体と、
（ｃ）複数の別個の充填体であって、前記複数の別個の充填体のそれぞれの別個の充填体が、前記複数の第１の生体細胞または第２の生体細胞の移動および内方成長に抵抗する生体適合性材料を含む、別個の充填体と、を含み、
前記複数の別個の充填体は、前記３次元構造体の第１の末端と第２の末端の間で長手方向に伸びる複数の無細胞チャネルを形成する、３次元神経移植片構築体。
【請求項１４０】
前記複数の第１の生体細胞および前記複数の第２の生体細胞は、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、毛包幹細胞、嗅神経鞘細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、およびそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１３９に記載の３次元神経移植片構築体。
【請求項１４１】
前記複数の第１の生体細胞は、シュワン細胞を含む、請求項１３９に記載の３次元神経移植片構築体。
【請求項１４２】
前記複数の第２の生体細胞は、骨髄幹細胞を含む、請求項１３９に記載の３次元神経移植片構築体。
【請求項１４３】
前記複数の第１の改変多細胞体は、前記複数の無細胞チャネルの周辺に集中する、請求項１４１に記載の３次元神経移植片構築体。
【請求項１４４】
前記複数の第２の改変多細胞体は、前記移植片の外周に集中する、請求項１４２に記載の３次元神経移植片構築体。
【請求項１４５】
前記充填体は、アガロースを含む、請求項１３９に記載の３次元神経移植片構築体。
【請求項１４６】
チャネル生物学的構造体であって、
（ａ）複数の第１の生体細胞と、
（ｂ）複数の第２の生体細胞と、
（ｃ）複数の無細胞チャネルと、を含み、
前記複数の無細胞チャネルは、前記３次元構造体の第１の末端と第２の末端との間で長手方向に伸びる、チャネル生物学的構造体。
【請求項１４７】
前記無細胞チャネルが、中空である、請求項１４６に記載のチャネル生物学的構造体。
【請求項１４８】
前記無細胞チャネルは、充填体で満たされている、あるいは部分的に満たされている、請求項１４６に記載のチャネル生物学的構造体。
【請求項１４９】
前記複数の第１の生体細胞および前記複数の第２の生体細胞は、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、毛包幹細胞、嗅神経鞘細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、およびそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１４６に記載のチャネル生物学的構造体。
【請求項１５０】
前記複数の第１の生体細胞は、シュワン細胞を含む、請求項１４６に記載のチャネル生物学的構造体。
【請求項１５１】
前記複数の第２の生体細胞は、骨髄幹細胞を含む、請求項１４６に記載のチャネル生物学的構造体。
【請求項１５２】
前記複数の第１の生体細胞は、前記複数の無細胞チャネルの周囲に集中する、請求項１５０に記載のチャネル生物学的構造体。
【請求項１５３】
前記複数の第２の生体細胞は、前記移植片の外周に集中する、請求項１５１に記載のチャネル生物学的構造体。
【請求項１５４】
損傷した軸索の近位断端と遠位断端とを再接合するための、請求項１４６〜１５３のいずれかに記載のチャネル生物学的構造体の使用。
【請求項１５５】
損傷した軸索の近位断端と遠位断端とを再接合するための神経移植片を製造するための、請求項１４６〜１５３のいずれかに記載のチャネル生物学的構造体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年２月２日出願の米国仮特許出願第６１／３３７，３０７号の利益を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。本出願はまた、２０１１年１月３１日出願の米国仮特許出願第６１／４３８，０９７号の利益も主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援の陳述
本発明は、国立科学財団により授与された助成金第０５２６８５４号の下で政府支援により行われた。政府は、本発明において一部権利を有する。
【０００３】
本発明は、再生医療および組織工学の分野に関し、より具体的には、軸索を誘導する移植片の生成、および損傷した神経の修復のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
神経は、軸索の封入されたケーブルのような束である。神経は、軸索のそれぞれに沿って伝わる電気化学的な神経刺激の共通経路を提供する。それぞれの神経は、多くの軸索を含む。それぞれの軸索は、神経内膜と呼ばれる一層の結合組織によって取り囲まれている。軸索は、束と呼ばれる群に一緒に束ねられ、それぞれの束は、神経周膜と呼ばれる一層の結合組織によって包まれている。最後に、全神経は、神経上膜と呼ばれる一層の結合組織によって包まれている。
【０００５】
神経軸索が切断されたとき、細胞体になおも付着している末端は、近位部に分類され、一方、他方の末端は、遠位部と呼ばれる。末梢神経系（ＰＮＳ）における神経再生は、軸索発芽によって生じ、近位断端で形成し、軸索発芽が遠位断端に到達するまで成長する。発芽の成長は、シュワン細胞（神経髄鞘細胞）から分泌される化学走化性因子によって支配される。近位軸索は、細胞体が無傷である限り再成長することができ、神経内膜チャネルにおいて、シュワン細胞との接触が行われる。ヒト軸索成長率は、小神経で２ｍｍ／日、大神経で５ｍｍ／日に達することができる。しかしながら、遠位部は、損傷から数時間以内に、ウォーラー変性が認められ、軸索およびミエリンが退化するが、神経内膜は残る。再生の後期において、残りの神経内膜管は、的確な標的に戻るように軸索成長を誘導する。ウォーラー変性中、シュワン細胞は、神経内膜管に沿って規則正しいカラムに成長し、神経内膜チャネルを保護し、保存するビュングナー帯（ｂｏＢ）を形成する。また、マクロファージおよびシュワン細胞は、再成長を増強させる神経栄養因子を放出する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様は、多細胞構築体である。この構築体は、切断された神経末端間の神経連結を回復するために、互いに凝集し合って、細長い移植片を形成する複数の生体細胞を有する多細胞領域を含む。複数の無細胞チャネルは、移植片の内部を通じて軸方向に伸びる。
【０００７】
本発明の別の態様は、細長い３次元構造体である。この構造体は、複数の改変多細胞体を含む。それぞれの多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。この構造体はまた、複数の別個の充填体も含む。それぞれの充填体は、多細胞体から充填体への細胞の移動および内方成長に抵抗する生体適合性材料を含む。多細胞体は、それぞれの多細胞体が、少なくとも１つの他の多細胞体と接触し、充填体が、構造体の対向端間に伸びる複数の無細胞チャネルを形成するように位置付けられ、配置されるパターンで配置される。
【０００８】
本発明のなお別の態様は、細長い３次元構造体である。この構造体は、複数の神経支配されない多細胞体を含む。それぞれの多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。この構造体は、複数の別個の充填体を含む。それぞれの充填体は、多細胞体から充填体への細胞の移動および内方成長に抵抗する生体適合性材料を含む。多細胞体は、それぞれの多細胞体が、少なくとも１つの他の多細胞体と接触し、充填体が、構造体の対向端間に伸びる複数の無細胞チャネルを形成するように位置付けられ、配置されるパターンで配置される。
【０００９】
本発明のさらに別の態様は、細長い３次元構造体である。この構造体は、複数の多細胞体を含む。それぞれの多細胞体は、組織培養培地と、互いに凝集し合っている複数の生体細胞と、を含む。この構造体は、複数の別個の充填体を含む。それぞれの充填体は、多細胞体から充填体への細胞の移動および内方成長に抵抗する生体適合性材料を含む。多細胞体は、それぞれの多細胞体が、少なくとも１つの他の多細胞体と接触し、充填体が、構造体の対向端間に伸びる複数の無細胞チャネルを形成するように位置付けられ、配置されるパターンで配置される。
【００１０】
本発明の別の態様は、移植片が、神経系を有する生体に埋め込まれ、切断された神経末端間の間隙に位置付けられるときに、移植片を通じて再生軸索成長を促進することによって神経機能を回復するための軸索を誘導する移植片である。この移植片は、複数の生体細胞、および細長い３次元構造体の対向端間に伸びる複数の別個の無細胞チャネルを含む、細長い３次元構造体を含む。
【００１１】
別の態様において、本発明は、移植片が、神経系を有する生体に埋め込まれ、切断された神経末端間の間隙に位置付けられるときに、移植片を通じて再生軸索成長を促進することによって神経機能を回復するための軸索を誘導する移植片を含む。軸索を誘導する移植片は、複数の生体細胞からなる細長い３次元構造体を含む。この生体細胞は、シュワン細胞を含む。細長い３次元構造体は、改変組織であり、自己移植片ではなく、神経支配されておらず、および／または組織培養培地を含む。
【００１２】
本発明のなお別の態様は、移植片が、神経系を有する生体に埋め込まれ、切断された神経末端間の間隙に位置付けられるときに、移植片を通じて再生軸索成長を促進することによって神経機能を回復するための軸索を誘導する移植片である。この移植片は、複数の生体細胞を含む細長い３次元構造体を含む。３次元構造体は、外側部分と、この外側部分の対向端間に軸方向に伸びる中央部分であって、外側部分が中央部分を取り囲むようになっている、中央部分と、を含む。中央部分の生体細胞集団は、外側部分の生体細胞集団中のシュワン細胞の割合よりも高いシュワン細胞の割合を含む。細長い３次元構造体は、改変組織であり、自己移植片ではなく、神経支配されておらず、および／または組織培養培地を含む。
【００１３】
本発明のなお別の態様は、移植片が、神経系を有する生体に埋め込まれ、切断された神経末端間の間隙に位置付けられるときに、移植片を通じて再生軸索成長を促進することによって神経機能を回復するための軸索を誘導する移植片である。この移植片は、複数の生体細胞を含む細長い３次元構造体を含む。この複数の生体細胞は、シュワン細胞を含む。少なくとも１つの無細胞チャネルは、細長い３次元構造体の対向端間に伸びる。少なくとも１つの充填体は、無細胞チャネル中にある。この少なくとも１つの充填体は、アガロースを含む。シュワン細胞の少なくともいくつかは、この充填体に隣接する無細胞チャネルに沿って位置する。
【００１４】
本発明の別の態様は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む多細胞体である。この複数の生体細胞は、第１の型の生体細胞と、第２の型の生体細胞と、を含む。第１の型の生体細胞は、シュワン細胞であり、シュワン細胞は、複数の生体細胞の約０．１パーセントから約２０パーセントを構成する。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む多細胞体である。この複数の生体細胞は、第１の型の生体細胞と、第２の型の生体細胞と、を含む。第１の型の生体細胞は、骨髄幹細胞であり、この骨髄幹細胞は、複数の生体細胞の約９０パーセントを構成する。
【００１６】
本発明の別の態様は、３次元構造体である。この３次元構造体は、複数の細長い多細胞体を含む。それぞれの多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。この多細胞体は、対向軸端を有する。この多細胞体は、多細胞体が、互いに対して並列な配向を有し、多細胞体のうちの１つの両末端のうちの少なくとも１つが、多細胞体の隣接するものの対応する末端から軸方向にオフセットされる。
【００１７】
本発明の別の態様は、シュワン細胞が集団化した複数の軸方向のチャネルを備える多細胞構築体を生成する方法である。本方法は、
１）選択された生体細胞の間で異なる濃度のシュワン細胞で複数の種類の細胞ペーストを作製するステップと、
２）それぞれの細胞ペーストを細長い形状に成形するステップと、
３）制御環境において、成形した細胞ペーストをインキュベートし、細胞が互いに凝集し合って細長い多細胞桿体を形成することを可能にするステップと、
４）多細胞桿体と同様の大きさの無細胞充填体または支持桿体を作製するステップと、
５）多細胞桿体のそれぞれが、少なくとも１つの他の多細胞桿体と接触し、低濃度のシュワン細胞を有する多細胞桿体は、周辺層に置かれ、一方、高濃度のシュワン細胞を有する多細胞桿体は、中央に置かれるようなパターンに従って複数の多細胞桿体および無細胞桿体を配置するステップと、
６）多細胞桿体を少なくとも１つの他の多細胞桿体と融合させ、所望の構築体を形成するステップと、を含む。
【００１８】
ある実施形態において、本明細書に開示されるのは、３次元神経移植片構築体であり、これには、（ａ）複数の第１の改変多細胞体のそれぞれの改変多細胞体が、複数の第１の生体細胞を含む、複数の第１の改変多細胞体と、（ｂ）複数の第２の改変多細胞体のそれぞれの改変多細胞体が、複数の第２の生体細胞を含む、複数の第２の改変多細胞体と、（ｃ）複数の別個の充填体のそれぞれの別個の充填体が、複数の第１の生体細胞または第２の生体細胞の移動および内方成長に抵抗する生体適合性材料を含む、複数の別個の充填体と、を含み、複数の別個の充填体は、３次元構造体の第１の末端と第２の末端の間に長手方向に伸びる複数の無細胞チャネルを形成する。いくつかの実施形態において、複数の第１の生体細胞および複数の第２の生体細胞は、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、毛包幹細胞、嗅神経鞘細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、およびそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、複数の第１の生体細胞は、シュワン細胞を含む。いくつかの実施形態において、複数の第２の生体細胞は、骨髄幹細胞を含む。いくつかの実施形態において、複数の第１の改変多細胞体は、複数の無細胞チャネルの周辺に集中する。いくつかの実施形態において、複数の第２の改変多細胞体は、移植片の外周に集中する。いくつかの実施形態において、充填体は、アガロースを含む。
【００１９】
ある実施形態において、本明細書に開示されるのは、チャネル生物学的構造体であり、これには、（ａ）複数の第１の生体細胞と、（ｂ）複数の第２の生体細胞と、（ｃ）複数の無細胞チャネルと、を含み、複数の無細胞チャネルは、３次元構造体の第１の末端と第２の末端の間に長手方向に伸びる。いくつかの実施形態において、無細胞チャネルは、中空である。いくつかの実施形態において、無細胞チャネルは、充填体で満たされている、あるいは部分的に満たされている。いくつかの実施形態において、複数の第１の生体細胞および複数の第２の生体細胞は、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、毛包幹細胞、嗅神経鞘細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、およびそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、複数の第１の生体細胞は、シュワン細胞を含む。いくつかの実施形態において、複数の第２の生体細胞は、骨髄幹細胞を含む。いくつかの実施形態において、複数の第１の生体細胞は、複数の無細胞チャネルの周辺に集中する。いくつかの実施形態において、複数の第２の生体細胞は、移植片の外周に集中する。
【００２０】
ある実施形態において、本明細書に開示されるのは、損傷した軸索の近位断端と遠位断端を再接合するための本明細書に開示のチャネル生物学的構造体の使用である。
【００２１】
ある実施形態において、本明細書に開示されるのは、損傷した軸索の近位断端と遠位断端を再接合するために、神経移植片を製造するための本明細書に開示のチャネル生物学的構造体の使用である。
【００２２】
他の目的および特徴は、以下で、一部分が明白となり、一部分が指摘されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】多細胞体および充填体から組み立てられた３次元構造体の一実施形態の透視図である。
【図１Ａ】多細胞体から組み立てられた３次元構造体の別の実施形態の透視図である。
【図２】複数の多細胞体および充填体が、図１に示される３次元構造体を形成するための所定のパターンに従って、互いの上に積み重なっている配列の一実施形態を示す。
【図２Ａ】複数の多細胞体および充填体が、３次元構造体を形成するための所定のパターンに従って、互いの上に積み重なっている配列の別の実施形態を示す。
【図２Ｂ】図２Ａに示される配列において生成された３次元構造体が、軸索を誘導する移植片に成熟する配列を示す。
【図２Ｃ】さらなる安定性のために構築体の末端で積み重ねられたさらなる充填体と組み合わせて、図２Ａに示される配列に従って生成された３次元構築体の平面図である。
【図３Ａ】多細胞体を作製する方法の一実施形態を示す。
【図３Ｂ】多細胞体を作製する方法の一実施形態を示す。
【図３Ｃ】多細胞体を作製する方法の一実施形態を示す。
【図３Ｄ】多細胞体を作製する方法の一実施形態を示す。
【図４Ａ】多細胞体の作製で用いるのに適している型を作製する方法の一実施形態を示す。
【図４Ｂ】多細胞体の作製で用いるのに適している型を作製する方法の一実施形態を示す。
【図４Ｃ】多細胞体の作製で用いるのに適している型を作製する方法の一実施形態を示す。
【図５】その内部特徴を示すために取り出された移植片の一部を用いて、軸索を誘導する移植片の一実施形態の略透視図である。
【図６】軸索を誘導する移植片の一実施形態の写真である。
【図７】シュワン細胞が蛍光標識されている、本明細書に記載の方法に従って改変された軸索を誘導する移植片の一実施形態の横断面の写真である。
【図８】本明細書に記載の方法に従って改変された軸索を誘導する移植片の移植後のラットにおける手術野を示す写真である。
【図９】本明細書に記載の方法に従って改変された軸索を誘導する移植片の移植後のラットにおける手術野を示す写真である。
【図１０】ラットに移植してから３週間後に採取された、本明細書に記載の方法に従って改変された軸索を誘導する移植片の一実施形態を含む神経片の写真である。
【図１１】図１０に示される神経片から採取した横断面の一連の組織学的写真を含み、これらの切片は、それぞれ、ラインＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、およびＥＥに沿って得られ、図１１の左欄の写真は、移植片の全切断面を示す大きさであり、左欄の写真の右側は、左欄の写真の様々な特徴の拡大である。
【図１２】本明細書に記載の方法に従って改変された軸索を誘導する移植片を用いてラットに移植してから３週間後の、近位天然神経（左）および遠位天然神経（右）から採取した横断面の２つの組織学的写真を含む。
【図１３】コラーゲン導管のみ（パネル（ａ））、または本明細書に記載の方法に従って改変された軸索を誘導する移植片で満たされたコラーゲン導管（パネル（ｂ））を用いて移植してから１２週間後のラットから切除した神経片の全体的形態を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
対応する参照文字は、図を通して対応する部分を示す。
【００２５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００２６】
毎年、米国だけで、２００，０００例を超える末梢神経手術が行われている。一般に、これらの手順は、１つ以上の切断された神経を架橋する移植片を必要とする。神経の自然再生は、一般に、２つの末端間が３ｃｍを超えない間隙に限定される。破裂した神経の修復は、神経が、それらの標的に向かって再成長または再生しなければならないため、深刻な臨床課題を示す。場合によっては、顕微鏡手術を通じて直接末端間の再連結が使用される場合があるが、この技術の使用は、神経が伸縮することができる程度（一般に、その元の長さのわずか約１０％超）によって制限される。約３ｃｍを超える間隙がある破裂を修復する際の現行の技術は、患者において、別の場所から採取された移植片（すなわち、自己移植片）を使用することである。しかしながら、自己移植片は、複数の外科手術を必要とする可能性があり、さらなる外傷を生じ、ドナー部位での病的状態を引き起こし、神経と移植片の間の不一致による異常な神経再生を招く可能性があり、最終的には、神経機能の十分な回復ができない恐れがある。さらに、修復を必要とする切断された神経が、運動神経である場合でさえ、感覚神経が、一般に、自己移植に使用される。ドナー部位からの感覚神経の摘出は、運動神経の摘出よりも少ない病的状態をもたらすためである（感覚神経のみの摘出は、感覚の喪失をもたらすが、運動機能の喪失はもたらさない）。しかしながら、運動神経の束は、感覚神経の束よりも著しく大きい。したがって、運動神経の間隙への感覚神経の移植は、天然運動神経部分と、移植されている感覚神経部分との間で構造の不一致をもたらす。構造におけるこの不一致は、自己移植片によって生じる場合がある、異常な神経再生について少なくとも部分的に関与すると考えられる。
【００２７】
別のアプローチは、自然または人工導管を用いて切断された末端部分をエンチューブレーションすることによって再生を誘導するのに依存する、広範囲に及ぶ神経損傷の修復のための代替法として導入されている。エンチューブレーション（ｅｎｔｕｂｕｌａｔｉｏｎ）技術は、自己神経移植片の採取と関連する病的状態がなく、短神経欠陥を架橋することができるが、修復の結果は、異なる導管材料とは異なる。エンチューブレーション（ｅｎｔｕｂｕｌａｔｉｏｎ）の材料は、合成もしくは自然（例えば、コラーゲン）、または同種（すなわち、同種移植片、例えば、脱細胞化されたヒト死体神経を用いて）であってもよい。
【００２８】
末梢神経の修復の際の組織工学技術の使用は、自己移植片、同種移植片、およびエンチューブレーション（ｅｎｔｕｂｕｌａｔｉｏｎ）技術と関連する問題を回避するための期待できる解決法を提供する。しかしながら、いくつかの科学的前進にもかかわらず、患者における損傷した神経を修復するためのバイオ工学構造の用途は、今もなお、非常に限定されている。いくつかの研究は、長手方向に配向した円筒形の構造が、神経内構造を模倣することによって軸索成長を支持することを示している。他の研究は、ある人工導管中のシュワン細胞の存在が、神経再生を改善するが、自己移植片で見られる回復のレベルに達するには十分でないことを示している。さらに、軸索成長は、既存の人工導管移植片に含まれる移植した足場によって引き起こされる炎症性および免疫応答によって低減される場合がある。
【００２９】
最近、新しい組織工学技術である「バイオプリンティング」は、所望の形状を有する３次元生物学的構築体を生成するために、発明者の研究室で開発されている。バイオプリンティング技術は、米国特許出願第１０／５９０，４４６号（米国特許出願公開第２００８／００７０３０４号として公開）に記載され、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４８５３０号（第ＷＯ２０１０／００８９０５号として公開）および対応する米国特許出願第１２／４９１，２２８号（米国特許出願公開第２０１０／００４１１３４号として公開）にさらに記載されている。米国特許出願公開第２００８／００７０３０４号および第２０１０／００４１１３４号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／００８９０５号は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。バイオプリンティング技術は、所定のパターンで多細胞体を配置することと、改変組織を形成するようにそれらを融合させることと、を含む方法において、複数の生体細胞を有する改変多細胞体の使用を含む。バイオプリンティングは、一般に、いかなる足場材料も用いずに、明確な建築上の特徴を作成することができる自動化ラピッドプロトタイピング法である。「バイオプリンティング」技術は、３次元組織を生成するのに有望である。
【００３０】
バイオ改変した軸索を誘導する移植片を生成するための新規の構造および方法が提供される。特に、神経再生プロセスにおいて誘導管としての役割を果たすことができる新規の改変した生物学的な軸索を誘導する移植片が提供される。移植片は、この誘導を通じて軸索成長を促進するように適合される。
【００３１】
この技術は、成熟を通じて所望の改変された軸索を誘導する移植片になることが可能な３次元構築体を組み立てるために使用することができる構成要素としての多細胞体の使用を含む。それぞれの多細胞体は、この多細胞体を単一の物体として取り扱う（例えば、持ち上げ、移動させる）ことができるほど十分に互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。多細胞体は、１つ以上の充填体（例えば、多細胞体から充填体への細胞の移動および内方成長に抵抗する生体適合性材料を含む充填体）と連結して使用して、成熟を通じて、構造の対向端間に伸びる複数の無細胞チャネルを有する細長い３次元構造体になり得る構築体を組み立てることができる。充填体は、改変した成熟組織の外部から、必要に応じて、内部から（例えば、無細胞チャネルから）も容易に除去することができる。場合によっては、１つ以上の充填体が、移植片中に残存しながら、移植片を移植することが望ましい場合がある。
【００３２】
本明細書に記載の軸索を誘導する移植片を作製するために、多細胞体および充填体を用いて、構造体の対向端間に伸びる複数の無細胞チャネルを有する３次元の細長い構造を形成する。軸索を誘導する移植片が、ヒトまたは他の動物において、神経損傷の部位（例えば、切断された神経の末端間の間隙において）で移植されるとき、近位天然神経からの軸索は、軸索を誘導する移植片を通じて、神経構造の遠位末端に成長する。神経発達および再生を支持するシュワン細胞は、軸索を誘導する移植片において、無細胞チャネルと多細胞領域の間の接合面の少なくとも一部で集団化し、これにより、移植片を通じて軸索の成長を促進すると考えられる。いかなる特定の理論にも拘束されないが、損傷した神経において、シュワン細胞および／または切断された軸索によって放出された神経栄養因子は、近位天然神経から、この移植片を通じて、神経の遠位末端への軸索の成長を促進することができる。
【００３３】
本発明の材料およびプロセスを用いて、３次元の生物学的に改変した組織を生成する方法の概説を提供し、そのようなプロセスおよび材料は、これより、さらに詳細に説明されよう。
【００３４】
多細胞体
この技術は、成熟を通じて所望の改変した軸索を誘導する移植片になることが可能な３次元構築体（図１および２）を組み立てるために使用することができる構成要素としての多細胞体の使用を含む。多細胞体、一般的な組織工学でのそれらの使用、およびバイオ改変した血管を作製する際のそれらの使用は、米国特許出願第１２／４９１，２２８号（米国特許公開第２０１０／００４１１３４号として公開）に詳細に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特に、多細胞体は、米国特許公開第２０１０／００４１１３４号、例えば、段落［００５４］、［００５５］、および［００５７］〜［００７２］を通じて記載され、米国特許公開第２０１０／００４１１３４号の図１Ａ〜１Ｃにおいて示される。
【００３５】
簡潔に言えば、それぞれの多細胞体は、この多細胞体を単一の物体として取り扱う（例えば、持ち上げ、移動させる）ことができるほど十分に互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含む。多細胞体の凝集力は、その生体細胞が、隣接している多細胞体の生体細胞と凝集可能になるほど十分な時間、その多細胞体が（例えば、作業表面上で、または複数の多細胞体を含む組立部において）、自立できるほど十分であるのが適切である。自立した多細胞体の形態で、複数の生体細胞を持ち上げ、移動する能力は、多くの異なる３次元構築体を組み立てるための柔軟性を提供する。例えば、多細胞体は、１つ以上の充填体（例えば、多細胞体から充填体への細胞の移動および内方成長に抵抗し、充填体への細胞の接着に抵抗することもできる生体適合性材料を含む充填体）と連結して用いて、成熟を通じて、構造体の対向端間に伸びる複数の無細胞チャネルを有する細長い３次元構造体になり得る構築体を組み立てることができる。また、多細胞体および充填体を用いて、成熟を通じて、他の形状を有する改変した組織になる構築体を組み立てることもできる。さらに、多細胞体が自立しているため、支持体のゲルまたは足場において、多細胞体を包理する必要がない。その代わりに、「空中でのプリント」、または低粘性組織培養培地でプリントする能力は、多細胞体が互いに直接接触することを確実にする様式で、多細胞体を配置することを促進する。多細胞体間でのより良好な接触は、成熟中、多細胞体の有効かつ信頼性の高い融合を促進することができる。加えて、充填体は、改変した成熟組織の外部から、必要に応じて、内部（例えば、管状構造体の管腔または無細胞チャネル）からも容易に除去することができる。
【００３６】
加えて、本明細書に記載の方法は、改変した軸索を誘導する移植片のために構成要素として細長い（例えば、実質的に桿状または桿状の）多細胞体を使用する。細長い多細胞体が、この多細胞体の長手方向軸に沿って有意な長さを超えて互いに既に凝集し合っているため、多細胞体の融合は、より信頼性があり、より少ない時間で達成することができる。さらに、細長い多細胞体は、十分な長さを有する接触域に沿って多細胞体間の接触を構築するために、並列に隣接している関係に配置することができる。これは、互いに隣接している多細胞体の迅速かつ信頼性がある融合を促進することができる。本出願の図面に示される多細胞体は、円筒状の桿であるが、多細胞体の形状が、本発明の広範囲内で変化させることができることを理解されよう。
【００３７】
それぞれの多細胞体は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含むため、細胞は、組織または器官改変等のバイオ改変プロセス中の容易な操作および処理のために粘弾性コンシステンシーおよび十分な一体性を有する所望の３次元（３Ｄ）形状を一緒に形成する。十分な一体性とは、剛性ではないが、粘弾性コンシステンシーを有し、細胞の活力を維持する多細胞体が、次の処理中、その物理的形状を保持することができることを意味する。
【００３８】
多細胞体は、１つ以上の事前に選択した細胞型からなり得る。軸索を誘導する移植片を構築するために使用することができる多細胞体を形成するのに使用される細胞は、神経系組織中に一般的に見出される細胞型（例えば、さらに存在する衛星膠細胞の有無にかかわらずシュワン細胞等の膠細胞）を有利に含むことができる。多細胞体を形成するのに使用される細胞はまた、１つ以上の抗炎症特性を示す細胞型（例えば、骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）または間葉系幹細胞）を有利に含むこともできる。多細胞体において抗炎症特性を示す細胞の含有により、他の型の神経移植片を有する移植部位で観察されている炎症を軽減することができる。炎症は、瘢痕組織の形成を促進する可能性があり、移植片への軸索の内方成長を妨げ得るため、神経機能の最適復元には望ましくない。多細胞体を形成するのに適切に使用することができる他の細胞型としては、毛包幹細胞、嗅神経鞘細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
多細胞体は、ホモ細胞型であっても、ヘテロ細胞型あってもよい。ホモ細胞型多細胞体では、複数の生体細胞は、単一細胞型の複数の生体細胞を含む。ホモ細胞型多細胞体の生体細胞のほとんど全ては、単一の細胞型の細胞であり、低レベルの不純物に対してある程度の耐性があり、そのホモ細胞型多細胞体を含む構築体の成熟にごくわずかな影響しか及ぼさない異なる細胞型の細胞を比較的少数含む。対照的に、ヘテロ細胞型多細胞体は、１つを超える細胞型の細胞を有意数含む。例えば、多細胞体は、第１の型の複数の生体細胞と、第２の型の複数の生体細胞（等）を含むことができ、この第２の細胞型は、第１の細胞型とは異なるものである。ヘテロ細胞型多細胞体はまた、第１の型の複数の細胞と、第２の型の複数の細胞と、第３の型の複数の細胞とを含むこともでき、この第１、第２、および第３の細胞型のそれぞれは、第１、第２、および第３の細胞型のうちの他の型とは異なるものである。
【００４０】
ヘテロ細胞型細胞体中の生体細胞は、ソーティング（選り分け）されない状態であり得るか、または改変組織に対して特定の内部構造を形成するための融合プロセス中に、「ソーティング（ｓｏｒｔ  ｏｕｔ）」（例えば、自己集合）することができる。細胞のソーティングは、差異的接着仮説（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）（ＤＡＨ）の予測と整合する。ＤＡＨは、構成細胞間の接着性と凝集性相互作用によって生じる組織表面張力および界面張力の観点で、細胞集団の液体様挙動を説明するものである。一般に、細胞は、細胞の接着力の差異に基づきソーティングすることができる。例えば、ヘテロ細胞型多細胞体の中心部にソーティングされる細胞型は、一般に、その多細胞体の外側にソーティングされる細胞よりも接着力が強い（すなわち、表面張力が大きい）。
【００４１】
軸索を誘導する移植片を作製するために、いくつかの実施形態において、ホモ細胞型とヘテロ細胞型多細胞体の組み合わせを使用することができる。例えば、第１の型の細胞がシュワン細胞であり、第２の型の細胞がＢＭＳＣ（または抗炎症特性を有する別の細胞型）であるヘテロ細胞型多細胞体は、軸索を誘導する移植片を作製するために、複数の生体細胞がＢＭＳＣ（または抗炎症特性を有する別の細胞型）である、ホモ細胞型多細胞体と一緒に使用することができる。ヘテロ細胞型多細胞体では、第１の型の細胞がシュワン細胞であり、第２の型の細胞がＢＭＳＣ（または抗炎症特性を有する別の細胞型）であり、シュワン細胞は、適切には、多細胞体の複数の生体細胞の約０．１パーセント〜約２０パーセント（ｖ／ｖ）、より適切には、多細胞体の複数の生体細胞の約１パーセント〜約１５パーセント（ｖ／ｖ）、さらに適切には、多細胞体の複数の生体細胞の約３パーセント〜約１０パーセント（ｖ／ｖ）、さらに適切には、多細胞体の複数の生体細胞の約５パーセント〜約１０パーセント（ｖ／ｖ）を構成する。例えば、シュワン細胞は、適切には多細胞体の複数の生体細胞の約１０％（ｖ／ｖ）を構成する。多細胞体の複数の生体細胞の残りは、ＢＭＳＣ、１つ以上の他の細胞型と組み合わせたＢＭＳＣ、または任意の他の適切な細胞型であり得る。
【００４２】
さらなる例として、軸索を誘導する移植片は、シュワン細胞の比較的高い割合を有する第１の型のヘテロ細胞型多細胞体、およびシュワン細胞の比較的低い割合を有する第２の型のヘテロ細胞型多細胞体を用いて構築することができる。このような場合には、シュワン細胞の比較的高い割合を有するヘテロ細胞型多細胞体では、シュワン細胞は、適切には、多細胞体の複数の生体細胞の約０．１パーセント〜約２０パーセント（ｖ／ｖ）、より適切には、多細胞体の複数の生体細胞の約１パーセント〜約１５パーセント（ｖ／ｖ）、さらに適切には、多細胞体の複数の生体細胞の約３パーセント〜約１０パーセント（ｖ／ｖ）、さらに適切には、多細胞体の複数の生体細胞の約５パーセント〜約１０パーセント（ｖ／ｖ）を構成する。例えば、シュワン細胞は、シュワン細胞の比較的高い割合を有する多細胞体の複数の生体細胞の約１０％（ｖ／ｖ）を構成する。シュワン細胞の比較的低い割合を有するヘテロ細胞型多細胞体は、実質的には、シュワン細胞を欠いている場合があり、またはシュワン細胞の比較的高い割合を有するヘテロ細胞型多細胞体のシュワン細胞の割合よりも低いシュワン細胞の割合を含む場合がある。
【００４３】
多細胞体を作製するのに使用される細胞は、非自己供給源からの細胞であっても、自己供給源からの細胞であってもよい。自己供給源からの細胞を使用するとき、これらの細胞は、修復されるべき神経損傷を有する個人から採取することができ、組織培養中で拡大され、多細胞体を作製するのに使用することができる。例えば、多細胞体がシュワン細胞および／または骨髄幹細胞を含む実施形態において、これらの細胞は、修復する必要がある神経損傷を有するヒトまたは他の動物から採取することができ、多細胞体を作製するために使用することができる、例えば、シュワン細胞は、損傷した神経の切除または別の外科手術中、生検によって採取することができる。あるいは、嗅神経鞘細胞または毛包幹細胞は、修復を必要とする神経損傷を有するヒトまたは動物から採取され、シュワン細胞に分化され得る。ＢＭＳＣは、当技術分野で知られている様々な手順を用いて、例えば、骨髄穿刺または骨髄生検によって（例えば、骨髄生検ピストルを用いて）患者の骨髄から採取することができる。採取されたシュワン細胞およびＢＭＳＣは、次いで、多細胞体を作製するために十分な数の細胞を生成するために、組織培養中で拡大することができる。
【００４４】
場合によっては、多細胞体は、複数の細胞に加えて、１つ以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、または１つ以上のＥＣＭ成分の１つ以上の誘導体を適切に含む。例えば、多細胞体は、様々なＥＣＭタンパク質（例えば、ゼラチン、フィブリノゲン、フィブリン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、および／またはプロテオグリカン）を含んでよい。下にさらに詳細に論じられているように、多細胞体を形成するのに用いる細胞ペーストに、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体を加えることができる。細胞ペーストに加えるＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、ヒトまたは動物の供給源から精製することも、当技術分野で知られている組み換え法によって作製することもできる。あるいは、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体を多細胞体中の細胞によって自然に分泌させることも、多細胞体を作製するのに用いる細胞を、当技術分野で知られているいずれかの適切な方法によって遺伝子操作して、１つ以上のＥＣＭ成分もしくはＥＣＭ成分の誘導体、および／または、１つ以上の細胞接着分子もしくは細胞−基材接着分子（例えば、セレクチン、インテグリン、免疫グロブリン、およびカドヘリン）の発現レベルを変えることもできる。ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、多細胞体中の細胞の凝集を促すことがある。例えば、ゼラチンおよび／またはフィブリノゲンを、多細胞体を形成するのに用いられる細胞ペーストに適切に加えることができる。次いで、トロンビンを加えることによって、フィブリノゲンをフィブリンに転換させることができる。
【００４５】
場合によっては、多細胞体は、組織培養培地を適切に含む。この組織培養培地は、いずれの生理学的な適合性のある培地であることができ、通常は、当技術分野で周知のように、含まれる細胞型（単数または複数）に従って選択することになる。この組織培地は、例えば、糖およびアミノ酸等の基本栄養素、増殖因子、抗生物質（汚染を最小限に抑えるためのもの）等を含んでもよい。
【００４６】
さらに、多細胞体は、適切には、神経支配されない（すなわち、実質的に神経がない）ものであることも、非軟骨性であることも、あるいは、神経支配されず、かつ非軟骨性であることもできる。多細胞体は、ヒトの手を加えなくても発生する生物学的構造体とは異なるため、「改変された」多細胞体として説明することができる。換言すると、この多細胞体は、合成のものであり、すなわち、自然発生しないものである。
【００４７】
多細胞体は、本発明の範囲内の様々な大きさおよび形状を有することができる。例えば、多細胞体は、適切には、細長い形状を有し、より適切には、実質的に円筒形状（例えば、実質的に桿状）であり得る。多細胞体は、一般に、米国特許公開第２０１０／００４１１３４号の段落［００６７］〜［００７２］に記載されるような同じ寸法および特徴を有する。軸索を誘導する移植片を作製するのに用いられる多細胞体の長さは、適切には、少なくとも約１センチメートル、より適切には、少なくとも約２センチメートル、さらに適切には、少なくとも約３センチメートルである。軸索を誘導する移植片を作製するのに用いられる多細胞体の長さは、適切には、約７センチメートル未満、より適切には、約６センチメートル未満、さらに適切には、約５センチメートル未満である。したがって、例えば、多細胞体は、適切には、約１センチメートル〜約７センチメートルの範囲、より適切には、約２センチメートル〜約６センチメートルの範囲、さらに適切には、約３センチメートル〜約５センチメートルの範囲を有する。
【００４８】
図１および２に示される多細胞体１は、実質的には円筒形であり、実質的に円形の断面を有するが、異なる大きさおよび形状を有する多細胞体は、本発明の範囲内である。例えば、多細胞体は、本発明の範囲内で、断面が正方形、長方形、三角形、または他の非円形である細長い形状（例えば、円筒形状）であることができる。同様に、多細胞体は、概して、本発明の範囲内で、球状の形状、細長くない円筒形状、または立方体形状を有することができる。
【００４９】
多細胞体の作製方法
多細胞体を作製する方法は、米国特許出願公開第２０１０／００４１１３４号の段落［００７３］〜［００９６］、およびその刊行物の図３Ａ〜３Ｄ、４Ａ〜４Ｄ、５Ａ〜５Ｃ、および６Ａ〜６Ｃに示される。本明細書に記載の軸索を誘導する移植片を構築するのに使用される多細胞体は、一般に、同一の様式で調製される。
【００５０】
簡潔に言えば、本発明の範囲内で、上記の特徴を有する多細胞体を作製するための様々な方法がある。例えば、多細胞体は、複数の生体細胞を含有するか、または所望の細胞密度および粘度を有する細胞ペーストから製造することができる。細胞ペーストを、所望の形状に成形し、成熟（例えば、インキュベーション）を通じて多細胞体を形成させることができる。別例では、複数の生体細胞を含む細胞ペーストを細長い形状に成形することによって、細長い多細胞体を生成する。細胞ペーストを、制御環境においてインキュベートして、細胞を互いに凝集し合えるようにして、細長い多細胞体を形成させることができる。さらに別例では、細胞ペーストを３次元形状に保つデバイスの中で、複数の生体細胞を含む細胞ペーストを成形することによって多細胞体を生成する。上記のように、平面上で自立するほど十分な凝集力を有する細胞体を生成するのに十分な時間、細胞ペーストを３次元形状に保ちながら、制御環境中でインキュベートする。
【００５１】
細胞ペーストは、適切には、（Ａ）細胞または細胞集合体（細胞または細胞集合体は、単一の細胞型であっても、２つ以上の異なる細胞型であってもよい）と、細胞培養培地を（例えば、所定の比率で）混合して、細胞懸濁液を得て、（Ｂ）この細胞混合物を圧縮して、所望の細胞密度と粘度を有する細胞ペーストを作製することによって提供することができる。この圧縮作業は、この細胞ペーストに必要な所望の細胞濃度（密度）、粘度、および稠度を実現させるように、細胞培養から得た特定の細胞懸濁液を濃縮することによる等、多くの方法によって実現させることができる。例えば、型内で成形できるペレット中の細胞濃度を実現させるために、細胞培養から得た比較的希薄な細胞懸濁液を、所定の時間、遠心分離してもよい。タンジェンシャルフロー濾過（「ＴＦＦ」）は、細胞を濃縮または圧縮する別の適切な方法である。また、必要とされる押し出し特性を付与するために、化合物を細胞懸濁液と組み合わせてもよい。本発明で用いてよい適切な化合物のいくつかの例としては、コラーゲン、ヒドロゲル、マトリゲル、ナノ繊維、自己集合性ナノ繊維、ゼラチン、フィブリノゲン等が挙げられる。
【００５２】
したがって、これらの方法で用いる細胞ペーストは、適切には、複数の生体細胞を組織培養培地と混合し、これらの生体細胞を（例えば、遠心分離によって）圧縮することによって生成される。１つ以上のＥＣＭ成分、または１つ以上のＥＣＭ成分の誘導体を細胞ペースト中に含める場合（下にさらに詳細に論じられるように）、細胞ペレットは、適切には、ＥＣＭ成分（単数または複数）、またはＥＣＭの誘導体（単数または複数）を含有する１つ以上の生理学的に許容される緩衝液中に再懸濁させることができる。
【００５３】
さらなる処理のために望ましい細胞ペーストの細胞密度は、細胞型によって異なる場合がある。細胞間相互作用が細胞ペーストの特性を決定し、異なる細胞型により、細胞密度と細胞間相互作用との間で異なる関係を有する。細胞ペーストを成形する前に、細胞間相互作用を増大させるために、細胞を前処理してもよい。例えば、細胞ペーストを成形する前に、細胞間相互作用を高めるために、遠心後に遠心チューブ内で細胞をインキュベートしてもよい。
【００５４】
様々な方法を用いて、本発明による細胞ペーストを成形してよい。例えば、（例えば、濃縮／圧縮後に）細胞ペーストを操作するか、手作業で成型するか、またはプレス加工して、所望の形状を実現させてよい。例えば、マイクロピペット（例えば、キャピラリーピペット）のような予め形成済みの器具であって、その器具の内面と同じ形になるように細胞ペーストを成形する器具の中に細胞ペーストを取り込んで（例えば、吸引して）もよい。このマイクロピペット（例えば、キャピラリーピペット）の断面形状は、円形、正方形、長方形、三角形、または他の非円形の断面形状であることができる。細胞ペーストはまた、プラスチック型、金属型、またはゲル型のような予め形成済みの型に細胞ペーストを沈積させることによって、成形してもよい。さらに、遠心鋳造または連続鋳造を用いて、細胞ペーストを成形してもよい。
【００５５】
この方法の１つの例では、成形作業は、成形デバイス内に細胞ペーストを保持して、その成形デバイス内で細胞を部分的に互いに凝集し合えるようにすることを含む。例えば、図３Ａに示されているように、成形デバイス５１（例えば、キャピラリーピペット）の中に細胞ペースト５５を吸引して、成熟期間（本明細書ではインキュベーション期間とも称される）にわたって、その成形デバイス内に保持し（図３Ｂ）、細胞を少なくとも部分的に互いに凝集し合えるようにすることができる。第１の成形デバイス５１内で細胞を十分に凝縮させることができる場合には、１回の成熟ステップ（例えば１回のインキュベーションステップ）のみを有するプロセスで、多細胞体１を生成することができる。例えば、この方法は、適切には、単一の成形デバイス５１内で細胞ペースト５５を成形することと、成形した細胞ペーストを単一の制御環境中でインキュベートし、細胞を互いに凝集し合えるようにして、多細胞体を形成することができることを含む。この方法の場合、成形デバイス５１（例えば、キャピラリーピペット）は、適切には、下にさらに詳細に説明されているように、多細胞体を３次元構築体中に自動的に配置することができるバイオプリンターまたは類似の装置の印刷ヘッドの一部であることができる。細胞ペースト中の、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体、例えば、ゼラチンおよび／またはフィブリノゲンの含有により、多細胞体の総体的な凝集力を促進することができるため、単一の成熟ステップでの多細胞体の生成を促進する場合がある。しかしながら、細胞の生存能に影響が及ぶ前に、酸素および／または栄養素に触れる機会を細胞にせいぜい限定的にしか与えないキャピラリーピペットのような成形デバイス内に細胞を保持することができる時間には制限がある。
【００５６】
所望の凝集力を実現させるほど十分に長い成熟期間、成形デバイス５１内に細胞を保持できない場合には、部分的に凝集した細胞ペースト５５を、適切には、その成形デバイス（例えば、キャピラリーピペット）から、栄養素および／または酸素を細胞に供給させる第２の成形デバイス３０１（例えば、型）に移すと同時に、追加的な成熟期間、細胞をその第２の成形デバイス内に保持する。栄養素および酸素を細胞に供給させる適切な成形デバイス３０１およびこの型の作製方法の一例は、図４Ａ〜図４Ｃに示されている。この成形デバイスは、複数の多細胞体（例えば、実質的に同一の多細胞体）を生成するための型３０１である。型３０１は、生体適合性基材３０３を含み、この基材への細胞の移動および内方成長に抵抗し、基材への細胞の接着に抵抗する材料で作られている。型３０１は、細胞が型に増殖もしくは移動、または接着しないようにするいずれの材料で作られていてもよい。例えば、基材３０３は、適切には、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）（ＰＴＦＥ）、ステレンス鋼、ヒアルロン酸、アガロース、寒天、ポリエチレングリコール、ガラス、金属、プラスチック、またはゲル材料（例えば、アガロースゲルもしくは他のヒドロゲル）、および類似の材料で作ることができる。
【００５７】
基材３０３は、（例えば、第１の成形デバイス５１からの）比較的凝集力の小さい複数の細胞を含む組成物を受容するように、かつ、細胞の凝集力が向上して、上記の多細胞体の特徴のいずれも有する多細胞体のように、成熟期間前の組成物よりも凝集力が大きい多細胞体が形成される成熟期間の間、この組成物を所望の３次元形状に保つように成形されている。型３０１はまた、適切には、（例えば、この型の上に組織培地を分注することによって）組織培地を細胞ペースト５５に供給することができるように形作られている。例えば、図３Ｃおよび３Ｄに示されているように、複数の細長い溝３０５は、基材３０３に形成されている。型３０１の細長い溝３０５は、概して、米国特許出願公開第２０１０／００４１１３４号の段落［００８０］に記載されるものと同一の寸法および特徴を有する。
【００５８】
本発明の範囲内で、適切な型を作製するための様々な方法がある。例えば、図４Ａ〜４Ｃは、上記の多細胞体を作製するのに適している型を作製するために使用することができる、概して、２０１と指定されるツールの一実施形態を示す。一般に、ツール２０１の一部は、部分的に凝集した細胞ペーストを第２の成熟期間にわたって保持する型３０１の一部のネガ型となるように形作られている。例えば、ツール２０１は、適切には、本体２０３と、本体から伸びている複数の突起２０５とを含む。それぞれの突起２０５の大きさと形状は、適切には、細胞ペースト５５をある形状に保つことになる型基材中に凹部すなわち受容区域を形成して、この突起によって型内に形成されたその凹部／受容区域内の細胞のいずれも、成形した細胞ペーストの外側から約３００マイクロメートルを超えないようにする。このツールの本実施形態に関するさらなる詳細は、米国特許出願公開第２０１０／００４１１３４号の段落［００８２］および図５Ａ〜５Ｃに提供される。
【００５９】
型３０１を作製するためには、細胞培養皿２２１は、図４Ａに示されているように、凝固するか、またはゲルとして固まるように作製することができる液体２２３で適切に満たされる。例えば、この液体は、アガロース溶液２２３であることができる。ツール２０１を細胞培養皿２２１の上に配置して（図４Ｂ）、縁２１１が細胞培養皿の周縁２２５の上にくるとともに、突起２０５（例えば、フィン）が、ツール２０１の底部２０７から液体２２３まで伸びる。液体２２３を固化させて、突起２０５（例えば、フィン）の遠位末端を取り囲む固体またはゲル基材を形成することができる。ツール２０１を、細胞培養皿から持ち上げて、新たに生成された型３０１からツール２０１を引き離す（図４Ｃ）。
【００６０】
したがって、第２の成形デバイスを用いる場合には、部分的に凝集した細胞ペースト５５を、適切には、第１の成形デバイス５１（例えば、キャピラリーピペット）から第２の成形デバイス（例えば、図４Ｃに示されている型３０１）に移す。部分的に凝集した細胞ペースト５５は、第１の成形デバイス５１（例えば、キャピラリーピペット）によって、型３０１の溝３０５に移すことができる。したがって、この方法は、部分的に凝集した細胞ペースト５５を第２の成形デバイス３０１に移すことと、その部分的に凝集した細胞ペーストを第２の成形デバイス内に保持して、多細胞体を形成させることと、を含む。型３０１を、その中に保持されている細胞ペースト５５とともに制御環境中でインキュベートし、細胞ペースト中の細胞が互いにさらに凝集し合うようにして、多細胞体１を形成させる成熟期間の後には、得られる多細胞体１をキャピラリーピペットまたは他の器具で持ち上げるほど、細胞の凝集力は十分に強力になることになる。キャピラリーピペット５１（これより、型３０１の溝３０５から持ち上げた成熟した多細胞体１を含有する）は、適切には、下にさらに詳細に説明されているように、多細胞体を３次元構築体中に自動的に配置することができるバイオプリンターまたは類似の装置の印刷ヘッドの一部であることができる。
【００６１】
したがって、多細胞体１の作製方法の一例では、成形作業は、細胞ペースト５５を第１の成形デバイス５１内に保持して、第１の成形デバイス内で細胞を部分的に互いに凝集し合えるようにすることと、その部分的に凝集した細胞ペーストを第２の成形デバイス３０１に移すことと、その部分的に凝集した細胞ペーストを第２の成形デバイス内に保持して、多細胞体１を形成させることと、を含む。しかしながら、ゼラチンおよび／またはフィブリノゲンを細胞ペーストに加えるようないくつかの実施形態において、細胞が、第１の成形デバイス５１内で多細胞体を形成させるほど十分に凝集する場合もあり、細胞ペースト５５を第２の成形デバイス３０１に移して、その細胞ペーストを第２の成形デバイス内に保持するステップは、不要であることもある。
【００６２】
第１の成形デバイス５１には、適切には、キャピラリーピペットを含むことができ、第２の成形デバイスには、上記の型３０１等の、細胞を第２の成形デバイスに保ったまま、栄養素と酸素を細胞に供給できるデバイスを含むことができる。
【００６３】
多細胞体の断面形状とサイズは、実質的に、その多細胞体を作製するのに用いられる第１の成形デバイスと任意で第２の成形デバイスとの断面形状と大きさに対応することになり、当業者は、上述の断面形状、断面積、直径、および長さを有する多細胞体を作製するのに適している適切な断面形状、断面積、直径、および長さを有する適切な成形デバイスを選択できるであろう。
【００６４】
上述のように、多種多様な細胞型を用いて、本発明の多細胞体を作製してよい。したがって、例えば、上で列挙した全ての細胞型を含む、１つ以上の型の細胞または細胞集合体（ヒトおよび動物の体細胞）を出発材料として用いて、細胞ペーストを作製してよい。例えば、シュワン細胞、ＢＭＳＣ、間葉系幹細胞、毛包幹細胞、嗅神経鞘細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞を用いてよい。（例えば、上述のように、生検によって得られた）対象受容者の軸索を誘導する移植片に由来する自己細胞のサンプルを培養して、多細胞体を製造するのに十分な量の細胞を生成することができる。あるいは、非自己ドナーに由来する細胞または１つ以上の構築された細胞株からの細胞のサンプルを培養して、多細胞体を製造するのに十分な量の細胞を生成することができる。対象受容者に由来する細胞から作製した多細胞体は、宿主の炎症反応、または、受容者による、移植組織に対する他の急性もしくは慢性拒絶反応を回避するのに有益である。
【００６５】
上述のように、多細胞体は、ホモ細胞型であることも、ヘテロ細胞型であることもできる。ホモ細胞型多細胞体を作製するためには、細胞ペーストは、ホモ細胞型であることが適切である。ホモ細胞型多細胞体を作製するのに用いられる細胞ペースト中の生体細胞のほとんど全ては、単一の細胞型の細胞（例えば、骨髄幹細胞）であることになり、低レベルの不純物に対してある程度の耐性があり、そのような細胞ペーストから作製したホモ細胞型多細胞体を含む構築体の成熟にごくわずかな影響しか及ぼさない異なる細胞型の細胞を比較的少数含む。ホモ細胞型多細胞体を作製して、今度は、そのホモ細胞型多細胞体を用いて軸索を誘導する移植片を作製するためには、細胞ペースト中の複数の生体細胞は、ＢＭＳＣであることが適切であり得る。
【００６６】
一方、ヘテロ細胞型多細胞体を作製するためには、細胞ペーストは、１つを超える細胞型の細胞を有意数含むのが適切である（すなわち、細胞ペーストはヘテロ細胞型となる）。例えば、この細胞ペーストは、第１の型の複数の生体細胞と、第２の型の複数の生体細胞を含むことができ、この第２の細胞型は、第１の細胞型とは異なるものである。別例において、細胞ペーストは、第１の型の複数の生体細胞と、第２の型の複数の生体細胞と、第３の型の複数の生体細胞を含むことができる。したがって、この細胞ペーストを用いてヘテロ細胞型多細胞体を作製して、今度は、そのヘテロ細胞型多細胞体を用いて、軸索を誘導する移植片を作製する場合、細胞ペースト中の複数の生体細胞は、適切には、シュワン細胞、ＢＭＳＣ、間葉系幹細胞、毛包幹細胞、嗅神経細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞から選択される２つ以上の細胞型を含むことができる。例えば、複数の生体細胞は、ＢＭＳＣおよびシュワン細胞を含んでもよい。そのようなヘテロ細胞型多細胞体は、下でさらに詳細に記載されるように、適切に、ＢＭＳＣからなるホモ細胞型多細胞体と組み合わせて用いて、軸索を誘導する移植片を構築することができる。上でさらに詳細に記載されるように、ヘテロ細胞型細胞ペーストを用いて多細胞体を作製するとき、細胞の接着強度の相違に基づき、成熟および凝集プロセス中に、生体細胞を「ソーティング（ｓｏｒｔ  ｏｕｔ）」してよく、生体細胞は、それらの生理学的な立体配座を回復させる場合がある。
【００６７】
複数の生体細胞に加えて、１つ以上のＥＣＭ成分または１つ以上のＥＣＭ成分の１つ以上の誘導体（例えば、ゼラチン、フィブリノゲン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、および／またはプロテオグリカン）を、適切に、細胞ペーストに含めて、上記のように、これらの物質を多細胞体に組み込むことができる。細胞ペーストに加えるＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、ヒトまたは動物の供給源から精製することも、当技術分野で知られている組み換え法によって作製することもできる。細胞ペーストへのＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体の添加は、多細胞体中の細胞の凝集を促進する場合がある。例えば、ゼラチンおよび／またはフィブリノゲンを、細胞ペーストに添加することができる。より具体的には、１０〜３０％のゼラチン溶液と１０〜８０ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン溶液を複数の生体細胞と混合して、ゼラチンとフィブリノゲンを含む細胞懸濁液を形成させることができる。次いで、この細胞懸濁液を（例えば、遠心分離によって）圧縮して、細胞ペーストを形成させることができる。次いで、このプロセスによって形成された細胞ペーストを成形し、制御環境中でインキュベートし、細胞が互いに凝集し合えるようにして、多細胞体を形成させることができる。（例えば、プリントプロセス中に）トロンビンを添加することによって、このフィブリノゲンをフィブリンに転換させることができる。例えば、ゼラチンおよびフィブリノゲン等のＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体を細胞ペーストに含めるときには、成形ステップは、適切には、細胞ペーストを１つの成形デバイス内に保持して、多細胞体を形成させることを含み、インキュベートステップは、適切には、この成形した細胞ペーストを１つの制御環境中でインキュベートし、細胞が互いに凝集し合えるようにして、多細胞体を形成させることを含む。
【００６８】
本発明はまた、所望の３次元形状に形成された複数の細胞または細胞集合体を含む、多細胞体を製造するための方法も提供する。本発明の製造方法は、一般に、１）複数の事前に選択した細胞または細胞集合体を含む細胞ペースト（例えば、所望の細胞密度と粘度を有するもの）を提供するステップと、２）この細胞ペーストを（例えば、所望の形状に）成形するステップと、３）成熟を通じて該多細胞体を形成させるステップと、を含む。
【００６９】
上記の形成ステップは、多細胞体（例えば、細胞ユニット）の凝縮を確実にするために、１つまたは複数のステップを通じて実現させてもよい。あるプロセスでは、初期成熟時に、細胞ペーストを部分的に安定化させるか、または部分的に硬化させて、さらなる作業を可能にするほど十分な一体性を有する多細胞体を形成させてもよい。
【００７０】
一実施形態によれば、この形成ステップは、２つのサブステップ：Ａ）初期成熟のための第１の期間（例えば、所定の期間）にわたって、細胞ペーストをマイクロピペット（例えば、キャピラリーピペット）等の成形デバイス内に保持するサブステップと、Ｂ）さらなる成熟のための第２の期間（例えば、所定の期間）にわたって、この成形した細胞ペーストを型等の保持デバイスに沈積させるサブステップであって、この保持デバイスは、細胞がその型に増殖もしくは移動、または接着しないようにできる物質から作られている、サブステップと、を含んでもよい。この初期成熟は、さらなる成熟プロセスでの作業中に、無傷の状態を保つほど十分な安定性がある細胞ペーストを提供する。
【００７１】
様々な方法を用いて、さらなる成熟プロセスを促進することができる。一実施形態において、細胞ペーストは、凝集を助長するための期間（細胞型によって決まる場合がある）にわたって、約３７℃でインキュベートしてよい。代替として、または加えて、細胞ペーストは、接着を助長する因子および／またはイオンを含む細胞培地の存在下で、保持してもよい。
【００７２】
例えば、円筒形状の細胞ペーストが、破損することなくマイクロピペットからその円筒を押し出すことができるような細胞の接着になるまで、マイクロピペット（例えばキャピラリーピペット）中でインキュベートされた後（すなわち、初期成熟プロセス）、次いで、この細胞ペーストが、所望の形状を保つように促すさらなる成熟プロセスで、さらに培地とともにインキュベートおよび培養されてもよい。
【００７３】
充填体
本発明はまた、上記の多細胞体と組み合わせて用いて、所望の３次元生物学的改変組織を形成することができる充填体も提供する。充填体は、米国特許出願公開第２０１０／００４１１３４号の段落［００９７］〜［０１０４］の長さで説明されている。簡潔に言えば、本発明はまた、生物学的構築体を構築するためのビルディングユニットとして、多細胞体と組み合わせて用いられる充填体も提供し、この充填体を用いて、多細胞体が欠けている所望の３次元生物学的構築体の領域を画定する（例えば、多細胞構築体において無細胞チャネルを画定する）。この充填体は、少なくともいくつかの細胞型がその充填体に増殖もしくは移動、または接着しないようにできる無細胞材料から作られている所定の形状を有する充填体であるのが適切である。いくつかの実施形態において、充填体は、ほとんどの細胞型がその充填体に移動しないが、成熟軸索を誘導する移植片の無細胞チャネル中の所定の場所に放置することができ、近位神経構造から軸索を誘導する移植片に、軸索を誘導する移植片を通じて軸索の増殖を可能にする材料（例えば、アガロース）から作られている。この充填体材料は、栄養培地（本明細書では、組織培養培地または細胞培養培地とも称される）に対する透過性があるのが適切である。例えば、この充填体材料は、アガロース、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、および寒天、もしくは他のヒドロゲルからなる群から選択される生体適合性ゲル材料、または、ゲル以外の可撓性生体適合性物質であるのが適切である。特定の３次元生物学的改変組織を構築するのに用いる充填体の全ては、適切には、同じ材料から、同じ材料の同じ濃度から形成させることができる。例えば、本充填体は、適切には、約０．５％〜約４．５％の濃度のアガロースで作製することができ、より適切には、約１．５％〜約４％の濃度のアガロースで作製することができ、さらに適切には、約２％の濃度のアガロースで作製することができる。別例として、本充填体は、適切には、異なる材料から、または同じ材料の異なる濃度から形成させることができる。例えば、管腔を形成する充填体は、４％のアガロースで作製することができる一方で、所望の３次元生物学的改変組織を構築するために用いられる残りの充填体は、２％のアガロースで作製することができる。本充填体は、円筒形状を有するのが好ましい、対応する多細胞体の形状または大きさに従って、いずれの形状または大きさを呈してもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本充填体は、その充填体とともに所望の３次元生物学的改変組織を構築するのに用いられる多細胞体の形状および大きさと実質的には同一である形状および大きさを有する。したがって、例えば、本充填体は、適切には、多細胞体１との関連で上に記載の形状のうちのいずれかを有することができる。例えば、充填体と多細胞体の両方とも、実質的に円筒形（例えば、実質的に桿状）であり、（図１に示されるように）実質的に同一の直径を有する実質的に円形の断面を有してもよい。
【００７５】
図１および２に示される充填体１は、実質的に円筒形状であり、実質的に円形の断面を有するが、多細胞体が互いに融合したときに、所望の３次元生物学的改変組織が形成されるようなパターンに従って、充填体および多細胞体を、配置することができる限り、異なる大きさおよび形状を有する充填体はまた、本発明の範囲内である。例えば、充填体は、実質的に円筒形（例えば、実質的に桿状）であることができ、この多細胞体は、（米国特許出願公開第２０１０／００４１１３４号の図８および１２に示されるように）実質的に球状であることができる。さらに、充填体および多細胞体は両方とも、細長く、実質的に円筒形であるが、異なる長さを有してもよい。当業者は、様々な大きさおよび形状の充填体および多細胞体を組み合わせて、所望の３次元生物学的改変組織を形成することができる多くの方法があることを認識するであろう。
【００７６】
本充填体は、適切には、米国特許出願公開第２０１０／００４１１３４号の段落［０１００］〜［０１０４］に記載される方法を用いて生成される。
【００７７】
３次元構造体
上記の多細胞体および充填体は、軸索を誘導する神経移植片等の３次元の生物学的改変組織を生成するために、本発明の方法に従って使用することができる。簡潔に言えば、複数の多細胞体および複数の充填体は、各多細胞体が、（ｉ）別の多細胞体、または（ｉｉ）充填体の少なくとも１つと接触するようなパターンに従って配置される。次いで、多細胞体は、成熟プロセスを通じて少なくとも１つの他の多細胞体と融合され、神経回復手順で用いるのに適している３次元の生物学的改変組織移植片を形成する。次いで、充填体を融合した多細胞体から分離して、改変組織移植片を得ることができるが、いくつかの実施形態において、移植片は、移植を通じて所定の場所に放置する１つ以上の充填体を含むことができる。
【００７８】
概して、１０１と指定される、本発明の３次元構造体の一実施形態が、図１および２に示されている。構造体１０１は、複数の細長い多細胞体１を含み、これらのそれぞれは、上記の細長い多細胞体１と適切に同一である。例えば、細長い多細胞体１のそれぞれは、空中でプリントすることができる自立した多細胞組織体を生成するために上記の方法に従って、適切に生成されている。多細胞体１は、それぞれの多細胞体が、少なくとも１つの他の多細胞体と接触するパターンで配置される。多細胞体１の少なくとも１つは、十分な長さを有する接触域に沿って別の多細胞体と接触する。十分な長さを超える多細胞体間のこの接触は、米国特許出願公開第２０１０／００４１１３４号の段落［００１０６］で詳細に説明され、その刊行物の図１Ｃに例示される。例えば、図１および２の配置において、多細胞体１のそれぞれは、十分な長さを有する接触域を超える少なくとも１つ（例えば、２つ）の他の多細胞体と接触する。並列に隣接している関係において、接合している細長い多細胞体間の接触域は、少なくとも約１センチメートルの長さを有する。接触域の長さは、多細胞体１の長さに対応することができ、これは、所望の移植片の長さと適切にほぼ等しい。多細胞体１は、図１および２において、互いに接触しているが、成熟の初期段階では、多細胞体は、互いに凝集し合っていない。
【００７９】
構造体１０１はまた、１つ以上の充填体５も含み、これらのそれぞれは、上記の充填体と同一であるのが適切である。例えば、図１および２中の構造体は、複数の別個の充填体５を含む。充填体５は、多細胞体を有するパターンで配置されるため、それぞれの充填体は、少なくとも１つの多細胞体１または別の充填体と接触する。図１および２中の多細胞体１および充填体５が配置されて、多細胞体によって占有されず、充填体によっても占有されない構造１０１において、複数のスペース１７を形成する。スペース１７は、組織培養培地を適切に含有することができ、これは、多細胞体１および充填体５の上部上に組織培養培地を注ぐことによって、構造１０１に添加することができる。したがって、スペース１７は、多細胞体１中の細胞に栄養素および／または酸素の供給を促進することができる（例えば、成熟中）。
【００８０】
構造体中の多細胞体１の少なくともいくつかは、上記のような、シュワン細胞を含有するヘテロ細胞型細胞体である。例えば、ヘテロ細胞型細胞体は、骨髄幹細胞または間葉系幹細胞等の１つ以上の抗炎症性特性を有する異なる細胞型の細胞と組み合わせたシュワン細胞を適切に含む。シュワン細胞を含有するヘテロ細胞型細胞体は、１′′と指定される第１のセットの多細胞体を形成する。構造体中の多細胞体はまた、シュワン細胞である細胞の割合が、第１のセットの多細胞体中のシュワン細胞である細胞の割合よりも少ない、１′と指定される第２のセットの多細胞体も含む。例えば、第２のセット１′中の多細胞体は、同質細胞体（例えば、実質的にはＢＭＳＣのみを含有する）またはヘテロ細胞型細胞体（例えば、ＢＭＳＣおよび比較的低い数のシュワン細胞を含む）であり得る。
【００８１】
第２のセット１′の多細胞体１の少なくともいくつか（例えば、少数のシュワン細胞を有するまたはシュワン細胞がないもの）は、管様構造体３１の外層を形成するように配置される。充填体５の少なくとも１つおよび第１のセット１′′の多細胞体の少なくとも１つ（例えば、比較的高い割合のシュワン細胞を有するもの）は、管様構造体３１の外層内部であり、管様構造体の外層を形成する多細胞体によって実質的に取り囲まれる。例えば、図１および２中の多細胞体１′は、３つの充填体５および３つの多細胞体１′′（シュワン細胞を含有する）を取り囲む管様構造体３１を形成するように六角形構造で配置される。六角形構造の多細胞体１′のそれぞれは、少なくとも２つの近接する細長い多細胞体１と並列に隣接している関係にある。この配置において、管様構造体３１の内側の１つ以上の充填体５は、構造体１０１を通じて伸びる複数の無細胞チャネルを形成するように位置付けられる。充填体５は、多細胞体１から管様構造体３１を通じて伸びる細長い空間への細胞の移動および内方成長を適切に防ぎ、これは、以下に記載の方法に従って構造体の成熟後、無細胞チャネルになる。一般に、複数の生体細胞を含む管状改変組織を成熟により生成することができる多細胞体１の任意の配置は、管様構造体の内側に充填体があるかどうかにかかわらず、管様構造体であると見なされ得る。管様構造体は、隣接している多細胞体が、成熟のこの段階で互いに凝集し合っていないという事実によって、管状構造体とは異なり得るため、１つの物体が、管様構造体を形成する隣接する多細胞体の２つの間の空間に押し込まれる場合があることは前述から明らかである。
【００８２】
図１Ａは、通常、１０１′′と指定される３次元構造体の別の実施形態を示す。記載がない限り、この構造体１０１′′は、上記および図１に示される構造体１０１と同一である。この構造体１０１′′は、管様構造体３１内のいかなる充填体５も含まない。その代わりに、この管様構造体は、シュワン細胞を含有する多細胞体１′′で実質的に満たされている。
【００８３】
３次元構造体を作製する方法
上記の多細胞体を使用するための多くの異なる方法があり、これには、充填体５と連結して、本発明の範囲内の上記の３次元の生物学的構築体を生成する細長い多細胞体１を含む。例えば、１つの方法は、一般に、多細胞体のそれぞれが、少なくとも１つの他の多細胞体と接触して、多細胞体の少なくとも１つ（例えば、全て）を少なくとも１つの他の多細胞体に融合させて、所望の３次元生物学的改変組織を生成するようなパターンに従って複数の細長い多細胞体１を配置することを含む。
【００８４】
多くの方法を用いて、所望の３次元構造体を生成する所定のパターンで多細胞体を送達することができる。例えば、多細胞体は、互いに、もしくは充填体と接触するように、手作業で置くことも、ピペット、ノズル、もしくは針から押し出すことによって所定の場所に沈積させることも、自動機械によって接触させて位置付けることもできる。例えば、１つ以上の器具（上記の第１の成形デバイス５１、上記のような、型３０１から多細胞体を取り出すキャピラリーピペット、および／または異なる器具を適切に含むことができる）を用いて、多細胞体を持ち上げる（例えば、上記の型３０１からそれらを取り出す）。この器具によって、３次元構築体が（例えば、図２に示されるように）組み立てられる組み立て領域（例えば、ガラス表面）に多細胞体を移送し、組み立て領域に既に移送され、組み立てられる構築体中に設置されている任意の他の多細胞体および任意の充填体に対して適所に多細胞体を分注するか、あるいは、別の方法で設置する。
【００８５】
それぞれの多細胞体１を、その位置に配置した後、このプロセスを繰り返して、構築体に別の多細胞体または充填体を（例えば、既に構築体中に配置されている多細胞体と並べて配置することによって）追加するのが適切である。組み立てられる構築体が、１つ以上の充填体を含む場合、別の器具（図示されていないが、成形デバイス５１またはキャピラリーピペットと同様のものであってよい）を用いて、充填体５を持ち上げ（または上記のように充填体を作製し）、充填体を組み立て領域に移送し、充填体を必要とするいずれかの時点で、その充填体をその位置で、組み立てられる構築体中に分注するか、あるいは、別の方法で設置するのが適切である。多細胞体を組み立て領域に移送するために用いられる器具は、多細胞体および充填体を所望のパターンで配置することができるバイオプリンターの印刷ヘッドまたは他の自動化装置によって運ばれるのが適切である。例えば、１つの適切なバイオプリンターは、米国特許出願公開第２００４／０２５３３６５号に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。ＮｏｖｏｇｅｎのＭＭＸ  ＢＩＯＰＲＩＮＴＥＲは、適切なバイオプリンターの１つの市販の実施形態である。組織工学の技術分野の当業者は、適切な構築体に多細胞体（および充填体を用いる場合は、充填体）を配置するのに用いることができる他の適切なバイオプリンターおよび類似の装置を熟知しているであろう。組み立て領域に充填体を移送するのに用いる器具は、バイオプリンターの別のヘッドの一部であるのが適切である。バイオプリンターは、複数のヘッドを有することができ、および／または、多細胞体および充填体を移送するための様々な器具を１つ以上のバイオプリンターヘッドに順次に搭載することができる。バイオプリンターまたは類似の装置を用いて、構築体を自動的に組み立てるのが望ましいこともあるが、本明細書に記載の方法は、本発明の範囲内で、手作業で（例えば、１つ以上のキャピラリーピペットを用いて）実施することができる。
【００８６】
図２に示されるように、多細胞体１は、１つ以上の充填体５の上に配置する（例えば、積み重ねる）のが適切である。多細胞体１は、他の多細胞体および／または充填体５に隣接して配置するのが適切である。したがって、多細胞体１は、いずれの充填体５の中にも押し込んだり、または埋め込んだりしない。多細胞体をゲルまたは液体に分散させないので、これは「大気中でのプリント」と称することができる。
【００８７】
構築体の組み立てが完了すると、構築体の上部の上から組織培養培地を注入するのが適切である。この組織培養培地は、多細胞体と充填体との間の空間１７に入って、多細胞体中の細胞を支えることができる。さらなる充填体（図示せず）を図２に示される構造の周辺に積み重ねて、構造体がインキュベートされ、成熟することができる場合、互いと相対的な位置で充填体および多細胞体を保持するのを助長するためのさらなる支持を提供することができる。
【００８８】
図２Ａおよび２Ｂは、管状構築体の内側にある充填体および多細胞体１′′が、管様構造体を形成する多細胞体よりも長さが若干短いことを除いて、図２中の構造体１０１と実質的に同様である構造体の作製方法を示す。これにより、構造体の対向する両端に陥凹部４３が作製される。さらなる充填体５（図２Ｃ）が、構造体周辺に積み重ねられ、多細胞体の一部が、１つの充填体または多細胞体の末端が別の末端に当接するギャップまたは接合部と重なり合うように、構造体の末端で陥凹４３の中に伸びる。特に、図２Ｃに示されるように、多細胞体１′′および充填体５の陥凹末端４５は、管様構造体３１を形成する多細胞体１′の末端４９から軸方向にオフセットされる。充填体５のいくつかは、陥凹４３の中に延在し、陥凹を形成する充填体および多細胞体１′′の陥凹末端４５と当接する末端４７を有する。外側の管様構造体を形成する多細胞体１′は、当接する末端４５、４７を重ね合わせるのに十分な長さを有する。これにより、より安定性のある３次元構造体を作製する。構築体が構築される際に、陥凹末端での充填体は、支持を提供する。この構造体によって形成された移植片の末端は、外科医が、移植片それ自体に触れることなく、正確に移植片を配置することができ、天然神経構造の末端に移植片を付着させるための境界線を提供することもできる。あるいは、移植片の末端を、移植前に切除することができる。
【００８９】
３次元構築体中の多細胞体を互いに融合させて、生物学的改変組織を生成することができる。「融合させる」、「融合した」、または「融合」とは、接触している多細胞体の細胞が、細胞表面タンパク質間の相互作用を通じて直接的に、あるいは、それらの細胞とＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体との相互作用を通じて間接的に、互いに接着し合うようになることを意味する。融合後、構築体を取り囲むいかなる充填体は、改変組織から引き離すのが適切である。管様構造体を含む構築体の場合には、その管の外側にあるあらゆる充填体を（例えば、管様構築体から形成された管状構造体から剥がすことによって）取り除くことができる。
【００９０】
管状構造体の内側にある充填体５は、適切には、所定の場所に放置することができる。他の場合では、充填体５は、下にさらに論じられるように、成熟後および移植前に、３次元構築体から取り除くことができる。充填体５が取り除かれる場合では、これは、適切には、管状構造体の開口端から引き抜くことによって達成することができる。加えて、充填体５が、成熟後、構造体から取り除かれる場合、充填体５は、適切には、構造体から充填体を引き抜きやすくするために、所望に応じて、可撓性材料で作製することができる。別の選択肢は、融合後に（例えば、温度変化、光、または他の刺激によって）融解させることができる材料から充填体５を作製することである。
【００９１】
本発明はさらに、多細胞体を用いて、所定の３Ｄパターンに従って、事前に選択された受容環境中に複数の多細胞体をさらに送達して、細胞ユニットが融合して、所望のバイオ構築体になるようにすることによって、組織（例えば、軸索を誘導する移植片）等の３Ｄ形状を有する生物学的構築体を改変する別の方法を提供する。融合される２つ以上の多細胞体は、形状および大きさが同一のものであっても、異なるものであってもよく、同じ細胞型を含んでも、異なる細胞型を含んでもよい。数多くの方法で、この多細胞体をバイオ構築体エンジニアリングに適用してもよい。例えば、所望の構造体の上半分と下半分を含む２つの異なった形状の多細胞体を生成してもよく、これらの多細胞体を接触させ融合させてもよい。あるいは、複数の多細胞体を組み立て、充填体と組み合わせて、所望の形状に融合させてもよい。一実施形態によれば、多細胞体を充填体とともに用いる場合、このエンジニアリング法は、Ａ）複数の多細胞体を所定のパターンに従って、複数の充填体と所定の通りに組み合わせて送達して、層状構築体を形成させるステップ（これにより、多細胞体および充填体は接触している）と、Ｂ）成熟のため、事前に選択された制御環境中に層状構築体を沈積させるステップ（これにより、多細胞体が互いに融合し合って、融合した構築体が得られる）と、Ｃ）この融合した構築体から充填体を取り除いて、所望の生物学的構築体を生成するステップと、を含んでもよい。
【００９２】
損傷した神経を修復するための軸索を誘導する移植片
図５は、本発明の方法に従って改変された、概して、１００１と指定される多細胞構築体（例えば、軸索を誘導する移植片）の一例を示す。示されるように、構築体は、中央部１００５および末梢部１００３を含む細長い多細胞領域を含む。多細胞領域のそれぞれの部分１００３、１００５は、互いに凝集し合っている複数の生体細胞を含むため、多細胞領域は、損傷した神経への神経機能の回復で用いるのに適している細長い移植片１００１を形成する。下でさらに詳細に説明されるように、移植片が神経系を有する生体に埋め込まれ、切断された神経末端間の間隙に位置付けられるときに、移植片１００１を適合して、移植片を通じて再生させる軸索成長を促進する（例えば、この神経は、外傷によって切断され、および／または神経回復手順の調製時に、ヘルスケア従事者によって切除される）。移植片１００１は、広い意味で管状構造体である。しかしながら、移植片は、いかなる特定の断面形状を有する必要がなく、広範にわたる本発明の範囲内でいかなる中空部分を有する必要もない。
【００９３】
多細胞領域は、多細胞体の説明との関連で上記の同じ細胞型を含む。例えば、多細胞領域は、適切には、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、毛包幹細胞、嗅神経鞘細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞を含む。別例では、多細胞領域中の細胞は、骨髄幹細胞等の１つ以上の抗炎症特性を有する細胞を含む。さらに別例では、多細胞領域中の細胞は、シュワン細胞を含む。さらなる別例では、多細胞領域中の細胞は、骨髄幹細胞およびシュワン細胞を組み合わせて含む。多細胞領域が、シュワン細胞を含む場合、シュワン細胞の数は、多細胞領域中の細胞の総数の、適切には、約０．１パーセント（ｖ／ｖ）〜約２０パーセント（ｖ／ｖ）の範囲であり、より適切には、約１パーセント（ｖ／ｖ）〜約１５パーセント（ｖ／ｖ）の範囲であり、さらに適切には、約３パーセント（ｖ／ｖ）〜約１０（ｖ／ｖ）パーセントの範囲であり、さらに適切には、約５パーセント（ｖ／ｖ）〜約１０（ｖ／ｖ）パーセントの範囲である。また、多細胞領域が、シュワン細胞を含む場合、多細胞領域中の他の生体細胞は、適切には、骨髄幹細胞から本質的になることができる。しかしながら、上で記載される特定の例に記述されているもの以外の細胞型の様々な組み合わせは、広範にわたる本発明の範囲内で、移植片の多細胞領域内に存在する場合があることを理解されよう。
【００９４】
図５に示される実施形態において、少なくとも１つの無細胞チャネル１００７は、多細胞領域によって形成される構造体の対向端間を移植片１００１の内部を通じて軸方向に伸びる。より具体的には、図５において、複数の別個の無細胞チャネル１００７は、多細胞領域によって形成される構造体の対向端間を移植片１００１を通じて伸びる。無細胞チャネル１００７の数は、広範にわたる本発明の範囲内で、変えることができる。例えば、適切には、２〜７個の無細胞チャネルがあり、より適切には、３〜５個の無細胞チャネルがある。別例では、少なくとも３個の無細胞チャネルがある。例えば、図５に示される移植片１００１は、ちょうど３個の無細胞チャネル１００７を有する。無細胞チャネル１００７は、適切には、移植片１００１を通じて全ての方向に伸びるため、チャネルのそれぞれは、移植片が埋め込まれる場合、実質的には、反対方向の近位神経片と遠位神経片との間の全ての方向に継続的に伸びることができる。しかしながら、無細胞チャネルは、本発明の範囲内で、移植片の全長よりも若干短い長さであり得る。例えば、移植片の外周部１００３は、例えば、図２Ａおよび２Ｂで概説される方法を用いることによって、中央部１００５（中央部において無細胞チャネルを含む）よりも若干長く作製することができる。必要に応じて、より長い外側部分を有する移植片の末端は、移植のための移植片を用意するために切除することができる。上述のように、移植片を埋め込む一方で、これらの末端が、本発明の範囲内で、でこぼこであることも可能である。
【００９５】
無細胞チャネル１００７は、図５に示されるように、適切には、並列な配向に配置され、多細胞領域中の細胞によって互いに分離される。例えば、無細胞チャネル１００７は、適切には、実質的に互いに平行である。さらに、無細胞チャネル１００７は、多細胞領域の部分によって互いに間隔をあけるのが適切である。無細胞チャネル１００７はまた、互いに均等に間隔をあけるのが適切である。チャネル間の多細胞領域の部分の厚さは、チャネルの数、および無細胞チャネルのシュワン細胞が集中するライニングを支持するのに十分な厚さを有するチャネルの直径によって異なる。
【００９６】
無細胞チャネル１００７は、充填体５によって形成されるのが適切である。無細胞チャネル１００７の寸法は、実質的には、上記の充填体の寸法に同一であるのが適切であり得る。あるいは、無細胞チャネル１００７は、充填体５とは異なる長さのものであり得る。例えば、２つ（またはそれ以上の）充填体は、個々の充填体よりも長い１つの無細胞チャネルを作製するように、端から端まで配置され得る。場合によっては、充填体５を、損傷した神経の部位に移植する前に、移植片１００１から取り除くことができる。充填体５を取り除く場合、無細胞チャネル１００７は、移植片１００１が移植されるとき、空であり、移植片を通じて近位神経断端から遠位神経断端に軸索成長を誘導する中空軸索誘導を形成する。他の場合には、１つ以上の充填体５は、３次元構築体／移植片１００１中に残り、損傷した神経部位に移植片の残りとともに移植してもよい。例えば、充填体５が、アガロースで作られ、移植のために、成熟した軸索を誘導する移植片の無細胞チャネル中の所定の場所に放置するとき、近位神経構造からの軸索は、軸索を誘導する移植片に、軸索を誘導する移植片を通じて成長することが見出されている。この場合、充填体５はまた、移植片が、移植前あるいは移植後のいずれかで圧縮される場合、移植片１００１へのさらなる機械的一体性を提供し、無細胞チャネル１００７の崩壊を防ぐのにも役立つ。
【００９７】
シュワン細胞は、適切には、無細胞チャネル１００７と移植片１００１の多細胞領域の間の接合面の少なくとも一部で集団化する。特に、シュワン細胞の少なくともいくつかは、適切には、軸索の内方成長を支持するために、無細胞チャネル１００７に対してシュワン細胞が集中するライニングを形成する。５に示されるように、移植片は、高い割合のシュワン細胞を有する中央部１００５と、中央部を取り囲み、低い割合のシュワン細胞を有する周辺部１００３を有する。周辺部１００３と中央部１００５の間の境界線は、異なる境界線であるものとして、図５の概略図に示されるが、移植片の多細胞部分は、実際には、このように違わないが、その代わり、シュワン細胞が集中する中央部から、シュワン細胞が比較的少ないまたはシュワン細胞がない周辺部に段階的移行があることを認識されよう。移植片１００１のシュワン細胞が集中する中央部１００５は、概して、高い割合のシュワン細胞を含む多細胞充填体１′′によって形成される領域に対応する。移植片１００１の中央部１００５において、シュワン細胞の全割合は、上記のシュワン細胞を含有する多細胞体１′′におけるシュワン細胞の割合とほぼ同等である。多細胞体１′、１′′、および充填体５によって形成される３次元構築体１０１の成熟中、シュワン細胞のいくつかは、細胞型をセルフソーティングする差異的接着仮説の説明と一致する様式で、無細胞チャネル１００７のライニングにそれら自体をソーティングする。多細胞体１′、１′′からの他の細胞型はまた、本発明の範囲内で、ライニングにも存在し得るが、シュワン細胞は、無細胞チャネル１００７のライニングに優先的に近づく。無細胞チャネル１００７のシュワン細胞が集中するライニングは、移植片１００１の無細胞チャネルへの軸索の内方成長を促進すると考えられる。シュワン細胞は、神経発達および再生の役割を持っていることが知られている。いかなる特定の理論にも拘束されないが、損傷した神経において、シュワン細胞および／または切断された軸索によって放出された神経栄養因子は、軸索を誘導する移植片を通じて、近位天然神経から神経の遠位末端への軸索の成長を促進することができると考えられる。シュワン細胞が、無細胞チャネル１００７の表面に沿って位置するため、軸索が移植片中に成長する場合、シュワン細胞は、軸索および／またはアガロース充填体に接触するように位置付けられる。したがって、シュワン細胞によって放出されたシグナリング分子は、この移植片を通じて軸索成長を促進することができる。
【００９８】
移植片１００１が、インキュベーター内で成熟させるために、上記のような、所定のパターンで多細胞体および充填体を配置することによって組織構築体１０１を作製させることによって作製した改変組織であることが適切であることを前述から認識されよう。上記の方法を用いた結果として、多細胞領域によって形成された３次元構造体は、神経支配されないことが適切である。さらに、３次元構造体は、多細胞体からのいくつかの残留する組織培養培地を含むのが適切である。対照的に、神経修復のために用いられる多くの先行技術の移植片（自己移植片および同種移植片を含む）は、神経支配される。さらに、先行技術の自己移植片および同種移植片は、いかなる組織培養培地も含まない。
【００９９】
いくつかの実施形態において、軸索を誘導する移植片は、充填体によって形成されるいかなる無細胞チャネルも含まない。近位天然神経からの軸索は、本明細書に記載の無細胞チャネルなしで、軸索を誘導する移植片に、軸索を誘導する移植片を通じて成長すると考えられる。下でさらに詳細に説明される、図１１は、移植時に、充填体によって占められる無細胞チャネルを含んだ軸索を誘導する移植片を用いて、移植してから３週間後、軸索（参照番号１０１７によって特定される小さい黒色点）が、３週間の移植の終了時に、移植片中に残留した無細胞チャネル１００７の部分の外側の移植片中の多くの場所に存在したことを示す。これは、軸索が、上記の、シュワン細胞が集中する中央部１００５を通じて、近位末端から、充填体を通じて成長せずに、あるいは無細胞チャネルを通じて成長せずに、遠位末端に成長することができたことを示唆している。したがって、本明細書に記載の無細胞チャネルを欠いている軸索を誘導する移植片はまた、近位天然神経から、移植片に、移植片を通じて、ならびに天然神経構造体の遠位末端への軸索の成長も支持する可能性がある。
【０１００】
軸索を誘導する移植片を用いた損傷した神経の修復
成熟後、軸索を誘導する移植片は、神経への負傷を有する生体（例えば、ヒトまたは他の動物）に埋め込むことができる。軸索を誘導する移植片は、切断された神経末端間の間隙に位置付けることができる。この様式で軸索を誘導する移植片の位置付けは、軸索を誘導する移植片の無細胞チャネルを通じて再生軸索成長を促進し、神経機能の回復をもたらす。より具体的には、切断された天然神経の近位末端からの軸索は、軸索を誘導する移植片の無細胞チャネルを通じて成長し、神経構造体の遠位末端まで成長する。
【０１０１】
移植前に、軸索を誘導する移植片１００１を取り囲む生体適合性材料（例えば、アガロース）が取り除かれ、図５に示されるもののような構造体をあとに残す。無細胞チャネル１００７中の生体適合性材料が、近位神経構造から軸索を誘導する移植片に、軸索を誘導する移植片を通じて軸索の成長を可能にする材料である場合、移植のために所定の場所に放置されてもよい。例えば、アガロース充填体５を用いて、無細胞チャネル１００７を作製する場合、アガロース充填体が、移植のために無細胞チャネル中に放置されているときでさえ、軸索が、移植片に、移植片を通じて成長することが知られているため、アガロース充填体は、移植前に無細胞チャネルから取り除かれる必要はない。無細胞チャネル１００７中の充填体５の放置により、移植片へのさらなる構造的一体性を有利に与えることができる。例えば、充填体は、移植片が、移植前または移植後に圧縮される場合でさえ、無細胞チャネルを開口したままにすることができる。
【０１０２】
別例として、無細胞チャネル１００７中の充填体５は、軸索を誘導する移植片１００１の移植前に取り除かれてもよい。無細胞チャネル１００７中の充填体５の除去は、例えば、充填体が、軸索の成長を支持しない材料からなる場合には、適切である。無細胞チャネル１００７中の充填体５が、移植前に取り除かれる場合、無細胞チャネルは、移植時に、中空であり、軸索が移植片に成長するにつれて、やがて軸索が集団化する。
【０１０３】
本発明の軸索を誘導する移植片は、負傷の直接的な結果として、あるいは神経切除手術の結果として、切断されている末梢神経系におけるあらゆる神経の修復に使用することができる。軸索を誘導する移植片は、少なくとも約１ｃｍ〜約７ｃｍの長さの範囲の切断された神経の間隙の修復に適している長さに、上で説明される方法を用いて構築することができる。軸索を誘導する移植片は、修復されるべき切断された神経の末端間の間隙の長さと少なくとも同じである長さを有するように構築されるのが適切である。したがって、例えば、切断された神経の間隙が、約３ｃｍの長さである場合、軸索を誘導する移植片もまた、少なくとも約３ｃｍの長さであるように調製されるのが適切である。長すぎる移植片は、外科医が神経を露出させたとき、容易に切断することができるため、移植片が短すぎるよりも移植片が長すぎる方がはるかに良い。したがって、移植片は、移植が完了する前に、いつでもより短い切片に切断することができるように、構築されるのが適切である。軸索を誘導する移植片は、特に、神経の自然再生が生じる可能性が低い、ある長さの切断された神経の間隙の修復に適している。大抵、切断された神経の間隙が、約３ｃｍ未満の長さであるときにのみ自然再生され、切断された神経の間隙が、２ｃｍの長さであるときにでさえ、確実に自然再生されるとは限らない。したがって、軸索を誘導する移植片は、特に、少なくとも約２ｃｍの切断された神経の間隙の修復に適している。
【０１０４】
したがって、軸索を誘導する移植片は、約１ｃｍ〜約７ｃｍの範囲の長さを有する切断された神経の間隙の修復に適しており、約２ｃｍ〜約６ｃｍの範囲の長さを有する切断された神経の間隙の修復により適しており、約３ｃｍ〜約５ｃｍの範囲の長さを有する切断された神経の間隙の修復にさらに適している。
【０１０５】
さらに、軸索を誘導する移植片を作製するために現行の技術を用いることによって、移植片の断面の構造は、修復される神経の断面の構造と一致するように構築することができることを理解されよう。特に、軸索を誘導する移植片の直径は、例えば、多細胞体および／もしくは充填体の直径を変化させることによって、または軸索を誘導する移植片を構築するために用いられる多細胞体およびもしくは充填体の数を変化させることによって、変えることができる。加えて、１つを超える軸索を誘導する移植片を用いて、大きな直径の神経への損傷を修復することができる。さらに、軸索を誘導する移植片中の無細胞チャネルの数は、修復を必要とする損傷した神経の束に適している構造を有する軸索を誘導する移植片を作製するために、本明細書の上に記載される技術を用いて変えることができる。
【０１０６】
軸索を誘導する移植片は、単独で、あるいはサポートスリーブ（例えば、コラーゲン導管または死体の脱細胞化された神経）の内側のいずれかで、切断された神経の部位に埋め込まれてもよい。当業者は、適切なサポートスリーブを選択することが可能であろう。一般に、他の技術によって（例えば、自己移植片を用いて）損傷した神経を修復するために当技術分野で用いられるコラーゲン導管はまた、本明細書に記載の本発明の軸索を誘導する移植片と関連してサポートスリーブとして用いることにも適している。例えば、Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって販売されているＮＥＵＲＯＧＥＮのコラーゲン導管を使用してもよい。
【０１０７】
軸索を誘導する移植片が挿入される切断された神経の部位は、当技術分野で知られている標準的な外科技術を用いて曝露させることができる。軸索を誘導する移植片が、単独で（例えば、コラーゲン導管なしで）埋め込まれるとき、軸索を誘導する移植片は、外科手術野に浮かせ、外科用接着剤（例えば、フィブリン接着剤）または縫合によりそれぞれの末端で介在移植片として固定するのが適切である。軸索を誘導する移植片が、サポートスリーブ、例えば、コラーゲン導管とともに埋め込まれるとき、コラーゲン導管または他のスリーブは、埋め込まれるべき軸索を誘導する移植片の長さとほぼ一致するように、適切に切断する。コラーゲン導管はまた、その長手方向軸に沿って切断される。次いで、軸索を誘導する移植片は、この外科手術野に、および長手方向に切断した導管に浮かせるのが適切であり、導管中の長手方向の切断部は、再封鎖される。あるいは、軸索を誘導する移植片は、長手方向に切断した導管の内側に置かれ、次いで、この外科手術野に移すことができる。次いで、天然神経構造の遊離端を、適切には、この導管中に取り付け、外科用接着剤または外科用縫合材料（例えば、９−０ナイロン）で固定することができる。軸索を誘導する移植片が、切断された神経構造の両端に固定されると、外科手術野は、当業者に知られている標準的な外科手術技術を用いて閉鎖することができる。
【実施例】
【０１０８】
実施例１：多細胞体の調製
マウス骨髄幹細胞。マウス骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｔｏ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  Ｗｈｅｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｈｅａｒｔ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４：１２３６−４５（２００６）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって使用されるものと同一の条件下で単離された。簡潔に言えば、全骨髄が、８〜１２週齢の野生型ＩＣＲマウスの大腿骨から単離された。イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で骨を洗い流した後、骨髄を、２０ゲージ針を介して反復通過させ、４０μｍ  ナイロン製のスリーブを通して濾過した。得られた細胞懸濁液を洗浄し、ＩＭＤＭ／２０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）とともに、細菌等級のペトリ皿中に４週間置かれ、毎週新たに培地が供給された。単離後、マウスＢＭＳＣは、１２％  ドナーウマ血清、１２％  ウシ胎仔血清、１ｍＭ  ヒドロコルチゾン、ならびに１．０×１０５単位／Ｌのペニシリンおよびストレプトマイシン（ＢＭＳＣ培地）で補充したＩＭＤＭ中に培養された。細胞を１０ｃｍのペトリ皿上で増殖させ、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。１２個のコンフルエントなペトリ皿が、約２．５ｍｍの外径および３．５ｃｍの長さを有する１つの軸索を誘導する移植片を調製するために必要であった。
【０１０９】
シュワン細胞。シュワン細胞（ＣＲＬ−２７６５）は、ＡＴＣＣから購入された。培地組成物は、１０％  ＦＢＳ、および１．０×１０５単位／Ｌのペニシリンおよびストレプトマイシン（シュワン細胞培地）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコースであった。
【０１１０】
アガロース型の調製
２％  アガロース溶液の調製。２ｇの超高純度の低融点（ＬＭＰ）アガロースを、１００ｍＬの超高純度の水／緩衝溶液（１：１、ｖ／ｖ）中に溶解した。緩衝溶液は、ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水  １×）またはＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液  １×）であり得る。アガロース溶液は、温水（８０℃を超える）を含有するビーカー中に入れ、アガロースが完全に溶解するまで、熱板上に放置した。アガロース溶液は、温度が３６℃を上回る限り、液体の状態である。この温度を下回ると、相転移が生じ、粘度が増加し、最終的に、アガロースは、ゲルを形成する。
【０１１１】
アガロース型の調製。アガロース型は、細胞培養皿２２１（直径１０ｃｍ）に適合するＴｅｆｌｏｎプリント（即ち、Ｔｅｆｌｏｎツール２０１）（図４Ａ〜Ｃ）を用いて形成された。組立部（Ｔｅｆｌｏｎツール＋ペトリ皿）を垂直に保ち、約４０ｍＬの予熱しておいたアガロースをＴｅｆｌｏｎツール中の孔を通してペトリ皿に注ぎ入れた。全ての気泡を除去した後、組立部を４℃で少なくとも１時間置いた。アガロースが完全にゲル化した後、Ｔｅｆｌｏｎツール２０１を取り除くと、アガロース中に溝が現れた（図４Ｃ中の溝３０５を参照）。次いで、１０ｍＬの培地をこの型に添加した。
【０１１２】
多細胞体の調製
ＢＭＳＣ多細胞体。ＢＭＳＣのコンフルエントなペトリ皿から培地を取り除き、細胞を１０ｍＬのＰＢＳで洗浄した。１．５ｍＬのトリプシン０．１％を細胞上に均一に播き、表面から細胞を剥がした。細胞が皿から剥がれ始めたとき、ＢＭＳＣ培地中の５ｍＬの２ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液を、この皿に加えた。得られた細胞懸濁液を９００ｇで５分間遠心分離した。培地を取り除いた（すなわち、上清を取り除いた）後、細胞ペレットを、２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する２００μＬのＢＭＳＣ培地に再懸濁させ、数回、ピペットで吸い上げたり押し出したりして（すなわち、激しくピペッティングして）、細胞クラスターに分解して、実質的に単一の細胞懸濁液を得た。
【０１１３】
実質的に桿状のＢＭＳＣ多細胞体の調製のために、１５ｍＬの遠心チューブ内に置いた２ｍＬのエッペンドルフチューブに、細胞懸濁液を移した。１３００ｇで２分間遠心分離することによって、高密度ペレットを形成させた。培地（すなわち、上清）を取り除いて、１ｍＬのエッペンドルフピペッターに取り付けられている１ｍＬのチップの中に挿入したキャピラリーチューブ（外径（ＯＤ）＝１ｍｍ；内径（ＩＤ）＝０．５または０．３ｍｍ）に吸引することによって、ペレット（すなわち、細胞ペースト）を移した。細胞ペーストが入っているキャピラリーチューブを、２ｍＭ  ＣａＣｌ２が入っている培地中で１５分間、３７℃、５％  ＣＯ２にてインキュベートした。図３Ｃに示されるように、得られた成形した細胞ペースト５５を、プランジャーを用いて、培地で満たしたアガロース型３０１の溝３０５の中にキャピラリーチューブ５１から実質的に桿状の細胞体として押し出した。型３０１を、インキュベーター内に一晩置いた。翌日、成熟した実質的に桿状のＢＭＳＣ多細胞体１を、図３Ｄに示されるように、手作業でキャピラリーチューブ５１′に吸引し（すなわち、吸い込み）、さらに使用するまで培地中に置いた。
【０１１４】
（Ｂ）混合したＢＭＳＣおよびシュワン細胞多細胞体。シュワン細胞のコンフルエントなペトリ皿から培地を取り除き、細胞を１０ｍＬのＰＢＳで洗浄した。１．５ｍＬのトリプシン０．１％を細胞上に均一に播き、表面から細胞を剥がした。細胞が皿から剥がれ始めたとき、５ｍＬのシュワン細胞培地を、この皿に加えた。得られた細胞懸濁液を９００ｇで５分間遠心分離した。上記のように、ＢＭＳＣを、コンフルエントなペトリ皿から剥がし、ＢＭＳＣ培地中の５ｍＬの２ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液に再懸濁し、９００ｇで５分間遠心分離した。ＢＭＳＣおよびシュワン細胞の両方を含む実質的に桿状の多細胞体を作製するために、細胞ペレットの容量を推定した。約９０％のＢＭＳＣおよび約１０％のシュワン細胞（ｖ／ｖ）が入っている細胞懸濁液を、２００μＬのＢＭＳＣ培地中に調製し、１３００ｇで２分間遠心分離して、高密度の細胞ペレットを作製した。ＢＭＳＣおよびシュワン細胞の両方を含有する多細胞体を、上記の手順に従って、この高密度ペレットから調製した。
【０１１５】
実施例２：３個の無細胞チャネルを有するバイオ改変した軸索を誘導する移植片の調製
１０ｍＬの２％  アガロースの予熱した溶液を、１０ｃｍのペトリ皿に沈積させ、均一に広げて、均一な層を形成させた。このペトリ皿を４℃で置いて、アガロースをゲル化した。キャピラリーチューブに、２％  アガロース溶液を充填し、（冷たい吹き込む空気、または冷却ＰＢＳ溶液を用いて）冷却して、実質的に桿状の充填体を形成させた。
【０１１６】
双眼顕微鏡下で、ピストンまたはワイヤを用いて充填体５をキャピラリーチューブ５１、５１′から押し出し、５ｃｍのアガロース棒（すなわち、充填体）をペトリ皿内部のアガロース層の上に真っ直ぐ置いた。図１および２を参照すると、第２の充填体５を、第１の充填体に並列させ（例えば、隣接して置く）、１０個の充填体を沈積して、構造体の１段目の層を形成させた。図１および２に示されるように、構造体の２段目の層に存在する６個の充填体５を沈積させた。３個のＢＭＳＣ多細胞体１′を、構造体の第２の層の第４、第５、および第６の位置に沈積させて、軸索を誘導する移植片の下層を形成させた。図１および２に示されるように、構造体の３段目の層を、第１、第２、第４、第７、および第８の位置で５個の充填体５、第３および第６の位置で２個のＢＭＳＣ多細胞体１′、ならびに第５の位置で混合したＢＭＳＣ／シュワン細胞多細胞体１′′を沈積させることによって形成させた。構造体の４段目の層では、３個の充填体５を、第１、第５、および第７の位置で沈積させ、２個のＢＭＳＣ多細胞体１′を、第２および第６の位置で沈積させ、２個の混合したＢＭＳＣ／シュワン細胞多細胞体を、第３および第４の位置１′′で沈積させた。構造体の５段目の層は、３個の充填体５（第１、第３、および第６の位置で）、２個のＢＭＳＣ多細胞体１′（第２および第５の位置で）、ならびに１個の混合したＢＭＳＣ／シュワン細胞多細胞体１′′（第４の位置で）から構成させた。構造体の６段目の層を形成させるために、２個のアガロース充填体５を、第１および第５の位置で沈積させ、３個のＢＭＳＣ多細胞体１′を、第２、第３、および第４の位置で沈積させて、軸索を誘導する移植片の上層を形成させた。７段目の層は、４個のアガロース充填体５から構成させた。沈積プロセス全体を通じて、少量の組織培養培地（一度に約１０μＬ）を構築体の側部に加えて、材料（すなわち、アガロースおよび多細胞体）の脱水を回避した。上記および図１に示される構造体を構築するために用いられる充填体および多細胞体に垂直な配向において、アガロース充填体を構築体の上に置いた。０．５〜１ｍＬの液体アガロースを構造体周辺に注ぎ、構築体の一体性を保った。ゲル化後、全構築体が、完全に沈むまで組織培養培地を加えた。１０〜１４日間の成熟期間中、構築体を、インキュベーター内に置き、組織培養培地を一日おきに取り替えた。
【０１１７】
１４日後、軸索を誘導する移植片を取り囲むアガロースを取り除き、この移植片は、縫合および移植に耐えるのに十分頑丈であった。図６は、１４日間の成熟期間後の１０ｃｍの細胞培養皿２２１における、上記の手順を用いて調製された軸索を誘導する移植片の写真である。
【０１１８】
実施例３：バイオ改変した軸索を誘導する移植片におけるシュワン細胞の局在化
成熟した軸索を誘導する移植片内の細胞配置を視覚化するために、シュワン細胞は、蛍光性膜色素ＤｉＩＣ１８（５）−ＤＳ脂質親和性カルボシアニントレーサーで、染色した。これらの蛍光標識されたシュワン細胞を用いて、上で概説した手順を用いて、混合したＢＭＳＣ／シュワン細胞多細胞体を作製し、得られた混合したＢＭＳＣ／蛍光標識されたシュワン細胞多細胞体を用いて、上で概説した手順に従って、軸索を誘導する移植片を調製した。１０日間の成熟期間後、軸索を誘導する移植片を、アガロースから取り除いた。横断面を、成熟した軸索を誘導する移植片から切除し、蛍光立体顕微鏡を用いて、蛍光染色およびシュワン細胞の局在化を視覚化した。
【０１１９】
図７で見られるように、シュワン細胞（構造体においてより明るい領域によって示される）は、バイオ改変した軸索を誘導する移植片の中央部１００５により集中し、その周辺ではあまり集中していない。したがって、中央部を形成する細胞は、移植片の周辺部を形成する細胞よりも高い割合のシュワン細胞を含むことが認識される。構造体における３個の無細胞チャネル１００７は、画像中のより濃い斑として現れる。この写真のカラーバージョンは、シュワン細胞を緑色で示し、米国仮出願第６１／３３７，３０７号（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本出願は、これに対する優先権を主張する）の図２（ａ）として現れる。本仮出願およびＨｕｂｂａｒｄらの参考文献に表わされるカラー写真を、本明細書の図７として示される白黒写真に置き換える際には、まず、全画像の彩度を増加させ、次いで、全画像の輝度を増加させ、画像をグレースケールに変換し、全画像のコントラストを増加させた。このプロセスは、移植片の緑色蛍光部分を明るくし、移植片のシュワン細胞が集中する部分がより明るく表示され、一方、移植片の他の部分は、改善されたグレースケール写真でより濃いグレーである。
【０１２０】
シュワン細胞が、軸索を誘導する移植片の中央部により集中し、その周辺にあまり集中していないこの配置は、図５中に略図で示される。図５では、外周部１００３は、高濃度のシュワン細胞を有し、無細胞チャネル１００７を含む中央部１００５と比較して、低濃度のシュワン細胞を有する。
【０１２１】
実施例４：ラットにおける軸索を誘導する移植片の移植−手順１
軸索を誘導する移植片を通じて軸索の再生は、齧歯類の坐骨神経損傷モデルにおいて研究されている。約４００グラムの体重の雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、腹腔内（ＩＰ）経路を介して、ケタミン（８７ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１３ｍｇ／ｋｇ）の混合溶液で麻酔をかけた。無菌調製およびドレーピング条件下でこれらの手順を行い、手順中および回復時、加温パッドを用いた。ラットは、術前および術後、完全に腹臥位になるまで、１つのケージに入れた。鎮静状態後、ラットの左側面大腿部の毛をそり、ラットの後肢を準備し、無菌状態で覆布した。皮膚切開は、中央の側面大腿部に沿って外科用メスで行われ、皮膚弁を、筋膜を曝露しながら持ち上げた。これは、切開され、腿部の筋肉組織間の間隔は、長手方向に分割され、その分岐点でのおよびその分岐点より遠位の坐骨神経の直接的方向を鋭く曝露した。その分岐点への神経近位の１ｃｍのストレッチが、摘出され、１ｃｍの神経片を切除した。バイオ改変した軸索を誘導する移植片を、この手術野に浮かせ、フィブリン接着剤を用いてそれぞれの末端で介在神経移植片として固定し、封鎖を形成する時間を与えた。創傷を軽く洗浄し、止血は、軽度の圧迫により全手順を通じて達成した。４−０吸収性縫合糸で筋肉および皮膚を閉合した。ラットを隔離されたケージ中の加温パッド上で、腹臥状態まで回復させた。図８は、この手順を用いた軸索を誘導する移植片の移植後のラットにおける外科手術野の写真である。軸索を誘導する移植片１００１を、外科手術野１００９で見ることができる。
【０１２２】
実施例５：ラットにおける軸索を誘導する移植片の移植−手順２
約４００グラムの体重の雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、腹腔内経路を介して、ケタミン（８７ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１３ｍｇ／ｋｇ）の混合溶液で麻酔をかけた。無菌調製およびドレーピング条件下でこれらの手順を行い、手順中および回復中、加温パッドを用いた。ラットは、術前および術後、完全に腹臥位になるまで、１つのケージに入れた。鎮静状態後、ラットの左側面大腿部の毛をそり、ラットの後肢を準備し、無菌状態で覆布した。皮膚切開は、中央の側面大腿部に沿って外科用メスで行われ、皮膚弁を、筋膜を曝露しながら持ち上げた。これは、切開され、腿部の筋肉組織間の間隔は、長手方向に分割され、その分岐点でのおよびその分岐点より遠位の坐骨神経の直接的方向を鋭く曝露した。その分岐点への神経近位の１ｃｍのストレッチが、摘出され、１ｃｍの神経片を切除した。バイオ改変した軸索を誘導する移植片を、１セントメートルの創傷（すなわち、約１２〜１４ミリメートルの長さ）に適合するように切断された、長手方向に切断された市販のコラーゲン神経誘導管（すなわち、「コラーゲン管」または「コラーゲン導管」）に浮かせ、これをこの改変移植片用のサポートスリーブとして用いた。天然坐骨神経の遊離端を、このコラーゲンサポートスリーブ中に取り付け、９−０ナイロンで固定した。次いで、創傷を洗浄し、止血は、軽度の圧迫により達成した。４−０吸収性縫合糸で筋肉および皮膚を閉合した。ラットを隔離されたケージ中の加温パッド上で、腹臥状態まで回復させた。
【０１２３】
図９は、この手順を用いて、コラーゲン導管１０１１の内部に軸索を誘導する移植片の移植後のラットにおける外科手術野１００９の写真である。天然神経構造の近位部１０１３および遠位部１０１５も可視される。
【０１２４】
実施例６：移植から３週間後の軸索を誘導する移植片の全体的な形態学的および組織学的評価
移植から３週間後のラットに上記と同じ様式で麻酔をかけ、移植部位を曝露した。バイオ改変した軸索を誘導する移植片、ならびに軸索を誘導する移植片への天然神経近位部分および遠位部分を含む神経片を、ラットから採取し、形態学的観察のために写真撮影した。図１０は、上記の手順２を用いた移植から３週間後に採取された軸索を誘導する移植片を含む神経片の写真である。図１０中の矢印は、横断面が、組織学的評価のために取られた場所を示す。切片ＡＡは、近位天然神経で切断し、切片ＢＢは、軸索を誘導する移植片との近位天然神経の接合部で切断し、切片ＣＣは、軸索を誘導する移植片の中央部で切断し、切片ＤＤは、遠位天然神経との遠位軸索を誘導する移植片の接合部で切断し、切片ＥＥは、遠位天然神経で切断する。遠位天然神経（すなわち、切片ＥＥ）に存在するあらゆる軸索は、軸索を誘導する移植片を通じて再生されている。
【０１２５】
図１１は、４倍および１０倍の倍率で、図１０中の矢印によって示される切片にほぼ対応する場所から得られた横断面の組織画像である。組織化学のために、採取した神経片は、一晩４％  パラホルムアルデヒドで固定した。エタノール系で脱水した後、組織を、パラフィン浸透および包埋の処理を行った。４μｍの横断面を、図１０中に示される場所で切除し、軸索を検出するために、Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ染色に供した。
【０１２６】
図１１では、軸索１０１７は、高倍率（すなわち、１０倍）の切片で小さい黒色点として現れる。加えて、コラーゲンサポートスリーブ１０１１の一部が、低倍率（すなわち、４倍）画像の一部に見ることができる。切片内の白色領域は、無細胞チャネル１００７の残留部分である。連続切片のこれらの組織画像は、軸索を誘導する移植片を通じて、近位天然神経から遠位天然神経への軸索の再生を示す。
【０１２７】
図１２は、サポートスリーブとして用いられるコラーゲン導管内部でバイオ改変した軸索を誘導する移植片を用いて移植してから３週間後の、近位天然神経および遠位天然神経から得られた横断面の４０倍の倍率で得られた組織画像を示す。図１２中のスケールバー１０１９は、１００μｍの長さである。軸索１０１７は、小さな黒色点として現れ、この画像は、高倍率画像において手作業で計数される場合、移植から３週間後の近位断端に存在する軸索の約４０％が、バイオ改変した軸索を誘導する移植片を交差し、天然神経の遠位断端に達したことを示す。
【０１２８】
実施例７：移植から１２週間後の軸索を誘導する移植片の全体的形態学
上記の手順に従って、雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの坐骨神経において、１０ｍｍの切除が行われた。上記の方法を用いて調製されたバイオ改変した軸索を誘導する移植片がない、あるいはこの移植片で満たされた、コラーゲン導管／スリーブを用いて間隙を修復することによる、比較研究が実行された。１２週間後、コラーゲン導管（移植時に空であるコラーゲン導管、およびバイオ改変した移植片のためのスリーブとして用いられたコラーゲン導管を意味する）を、近位および遠位神経断端とともに採取し、形態学的観察のために写真撮影した。
【０１２９】
図１３は、コラーゲン導管のみ（パネル（ａ））による、またはバイオ改変した軸索を誘導する移植片で満たされたコラーゲン導管（パネル（ｂ））による移植から１２週間後採取された、導管ならびに近位および遠位神経断端の比較を示す。近位天然神経構造１０１３は、採取した切片の極左末端において可視される。遠位神経構造１０１５は、組織によってほとんど取り囲まれているが、採取した神経片の極右末端において可視される。パネル（ｂ）では、コラーゲン導管の一部は、平滑かつ明確な修復部１０２１を曝露するために取り除かれている。コラーゲン導管中の切断部の境界線は、点線１０２３によって示される。コラーゲン導管１０２５の残りは、点線の右側にある。写真は、移植から１２週間後、神経の近位断端と遠位断端の間の連続は、いずれかの修復方法を用いて再構築された。しかしながら、軸索を誘導する移植片を含むコラーゲン導管は、より平滑かつより明確な（すなわち、一定直径）連結をもたらした。加えて、軸索を誘導する移植片とともに埋め込まれるコラーゲン導管は、ほぼ完全に無傷であり、一方、コラーゲン導管のみが埋め込まれるとき、ほぼ完全に吸収された。図１３のパネル（ａ）では、コラーゲン導管の唯一の残りの部分が、実線１０２７で囲まれている。いかなる特定の理論にも拘束されないが、これは、ＢＭＳＣが、抗炎症特性を有するため、コラーゲン導管が、軸索を誘導する移植片とともに埋め込まれる動物における炎症反応の低下によるものであると考えられる。
【０１３０】
実施例８：切断されたヒト神経を修復する方法
修復を必要とする神経があるヒト患者が特定される。神経切除手術が、この患者において任意に行われる。神経の近位断端と遠位断端の間の距離とほぼ等しい長さを有する軸索を誘導する移植片が、上で概説される手順に従って調製される。
【０１３１】
ヒト患者に麻酔をかける。当技術分野で知られている標準的な外科技術を用いて、切断された神経を曝露し、可視化する。軸索を誘導する移植片を、神経の近位断端と遠位断端の間に置き、神経の近位断端と遠位断端を、縫合または外科用接着剤で移植片に固定する。次いで、創傷を洗浄し、止血は、軽度の圧迫により達成する。当技術分野で知られている標準的な外科技術を用いて、筋肉および皮膚を閉合する。
【０１３２】
実施例９：切断されたヒト神経を修復する方法
修復を必要とする神経があるヒト患者が特定される。神経切除手術が、この患者において任意に行われる。神経の近位断端と遠位断端の間の距離とほぼ等しい長さを有する軸索を誘導する移植片が、上で概説される手順に従って調製される。
【０１３３】
ヒト患者に麻酔をかける。当技術分野で知られている標準的な外科技術を用いて、修復されるべき神経を曝露し、可視化する。軸索を誘導する移植片を、神経の近位断端と神経の遠位断端の間の空間に適合するように切断された長手方向に切断されたコラーゲンサポートスリーブに浮かせる。コラーゲンサポートスリーブおよび／または移植片の過剰な末端は、存在する場合、取り除くことができる。神経の近位末端および遠位末端は、コラーゲンサポートスリーブ中に取り付け、縫合または外科用接着剤で固定する。次いで、創傷を洗浄し、止血は、軽度の圧迫により達成する。当技術分野で知られている標準的な外科技術を用いて、筋肉および皮膚を閉合する。
【０１３４】
本発明は、その特定の実施形態と関連させて説明されているが、本発明の方法論は、さらなる修正が可能であることが理解されよう。本特許出願は、一般に、本発明の原理に従っているとともに、本発明と関連する技術分野内の既知または慣例的な実施態様内に入るような本開示からの逸脱形態、および本明細書でこれまで示してきた本質的な特長に適用できるような本開示からの逸脱形態、および添付の特許請求の範囲に従うような本開示からの逸脱形態を含む本発明のあらゆる変形形態、用途、または適合形態を網羅するように意図されている。
【０１３５】
本明細書の多細胞構築体、３次元構造体、軸索を誘導する移植片、および多細胞体の要素を導入するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、要素のうちの１つまたは複数があることを意味することを意図する。「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語ならびにそれらの変形は、包括的であり、列挙された要素の他に追加の要素が存在する可能性があることを意味することを意図する。
【０１３６】
様々な変更が、本発明の範囲から逸脱することなく、上記のものに行われ得る場合、上記の説明に含まれ、添付図に示される全ての事項は、例示として解釈されるべきであり、限定の意味に解釈されるべきでないことを意図する。
【図１】
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【図１Ａ】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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