(57)【要約】本明細書に開示される種々の実施形態は、微生物および他の生存物質を輸送するための改良された容器に関する。特定の実施形態は、空気透過性内壁と、穿孔を有するより強固な外壁とを備える空気透過性ブラダーを含む。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの壁の各々の外側端部で互いに一緒に結合された２つの壁を備える酸素透過性ブラダーであって、前記２つの壁の各々は、
（ａ）前記ブラダーの内壁を規定する第１のフィルムであって、前記第１のフィルムは薄い、障壁のないフレキシブルなフィルムを含む、第１のフィルムと、
（ｂ）前記第１のフィルムの外面に隣接して配置され、複数の穿孔を含む、第２のフィルムと、
を備える、酸素透過性ブラダー。
【請求項２】
前記第１のフィルムが、少なくとも５，５００ｃｃ／ｍ２／日の酸素透過性を有する、請求項１に記載の酸素透過性ブラダー。
【請求項３】
前記２つの壁のうちの１つが、前記２つの壁のうちの１つから延びる排出口を備え、前記排出口が、前記ブラダーの内部空洞と流体連通する開口部を規定する、請求項１に記載の酸素透過性ブラダー。
【請求項４】
前記排出口に結合可能なように構成されるカバーをさらに備える、請求項３に記載の酸素透過性ブラダー。
【請求項５】
前記第１のフィルムが、約１５μｍ〜約９０μｍの範囲の厚さを有する、請求項１に記載の酸素透過性ブラダー。
【請求項６】
前記第１のフィルムが、ポリエチレンまたはポリプロピレンを含む、請求項１に記載の酸素透過性ブラダー。
【請求項７】
前記第２のフィルムが、前記第１のフィルムより機械的に強く、より耐穿刺性である、請求項１に記載の酸素透過性ブラダー。
【請求項８】
前記第２のフィルムが、約４０μｍ〜約８０μｍの範囲の厚さを有する、請求項１に記載の酸素透過性ブラダー。
【請求項９】
前記第２のフィルムが、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、またはポリアミドを含む、請求項１に記載の酸素透過性ブラダー。
【請求項１０】
前記複数の穿孔の各々が、約０．１ｍｍ〜約３ｍｍの範囲の直径を有する、請求項１に記載の酸素透過性ブラダー。
【請求項１１】
前記第１および第２のフィルムが、前記２つの壁の各々の外側端部で互いに一緒に結合されているだけである、請求項１に記載の酸素透過性ブラダー。
【請求項１２】
前記ブラダーが、外部容器内に配置されるように構成される、請求項１に記載の酸素透過性ブラダー。
【請求項１３】
（ａ）障壁のないフレキシブルなフィルムを含む内側の酸素透過性フィルムと、
（ｂ）前記内側の酸素透過性フィルムと外側の穿孔フィルムの実質的な長さに沿って結合していないが、隣接して配置される外側の穿孔フィルムと、
（ｃ）前記外側の穿孔フィルムに前記内側の酸素透過性フィルムが結合するように構成される結合部であって、前記結合部は、少なくとも１つの壁の外側部周囲に位置する、結合部と、
を含む少なくとも１つの壁を備える酸素透過性ブラダー。
【請求項１４】
前記内側の酸素透過性フィルムが、少なくとも５，５００ｃｃ／ｍ２／日の酸素透過性を有する、請求項１３に記載の酸素透過性ブラダー。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの壁の１つが、
（ａ）前記少なくとも１つの壁の１つに結合している排出口であって、前記排出口は前記ブラダーの内部空洞と流体連通する開口部を規定する、排出口と、
（ｂ）前記排出口に結合するように構成されるカバーと、
を備える、請求項１３に記載の酸素透過性ブラダー。
【請求項１６】
前記外側の穿孔フィルムが、前記内側の酸素透過性フィルムより機械的に強い、請求項１３に記載の酸素透過性ブラダー。
【請求項１７】
生存微生物を輸送するための容器であって、前記容器は、
（ａ）実質的に剛性の外部容器と、
（ｂ）前記実質的に剛性の外部容器内に配置されるように構成される酸素透過性ブラダーであって、前記ブラダーは、
（ｉ）約１５μｍ〜約１００μｍの範囲の厚さを有する障壁のないフレキシブルなフィルムを含む内側フィルムと、
（ｉｉ）前記内側フィルムに隣接する外側フィルムであって、前記外側フィルムは複数の穿孔を含み、ここで、前記外側フィルムは、前記外側フィルムの４つの外側端部のみで前記内側フィルムに一緒に結合される、外側フィルムと、
を含む、ブラダーと、
を備える、生存微生物を輸送するための容器。
【請求項１８】
前記内側フィルムが、少なくとも５，５００ｃｃ／ｍ２／日の酸素透過性を有する、請求項１７に記載の容器。
【請求項１９】
前記外側フィルムが、前記内側フィルムより機械的に強い、請求項１７に記載の容器。
【請求項２０】
前記ブラダーが、前記ブラダーに結合される排出口をさらに含む、請求項１７に記載の容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その全体が本明細書に参照として援用される２０１０年２月８日に出願された米国仮特許出願第６１／３０２，２２８号の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書に開示される種々の実施形態は微生物を保存および輸送するための改良された酸素透過性容器に関する。より具体的には、特定の実施形態は穿孔を有する薄い内壁および外壁を有する容器に関する。
【背景技術】
【０００３】
液体根粒菌接種材料はここ数年広範囲に利用されている。その接種材料は主に、販売および出荷のために「バッグインボックス（ｂａｇ−ｉｎ−ｂｏｘ）」（「ＢＩＢ」）容器に充填されており、その容器は一般に、段ボール箱内に入れられるプラスチックバッグまたはブラダー（空気袋）からなる。例示の目的として、ＢＩＢ容器は、ワインおよびフルーツジュースなどの製品を保存するために使用されていることが理解される。
【０００４】
液体接種材料の輸送および保存の間、生存細胞の数が高いままであり、また、植え付け前に種子に付与する場合、根粒菌が生存していることが有益である。液体根粒菌接種材料は休眠状態ではない製品である。すなわち、微生物細胞は活発に呼吸しており、酸素の要求を必要とする。その結果として、接種材料のパッケージングは酸素透過性でなければならない。他の微生物もまた、保存および輸送のために酸素透過性を有するパッケージングを必要とする。
【０００５】
液体根粒菌接種材料を充填するための公知のＢＩＢ容器は、低密度ポリエチレン（「ＬＤＰＥ」）または超低密度ポリエチレン（「ＶＬＤＰＥ」）などの関連する変形物から作製されるバッグを使用している。これらのフィルムは障壁のない（ｎｏｎ−ｂａｒｒｉｅｒ）フィルムであるとみなされている。すなわち、それらは酸素および二酸化炭素に透過性である。これらのＢＩＢ容器に使用されるブラダーは一般に、単層フィルムまたは両方同じ材料である２つのフィルムからなる２層フィルムから作製され、それは典型的に液体に対して不浸透性である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
当該技術分野において、液体根粒菌接種材料および他の微生物のための改良されたパッケージングについての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に開示されるのは、微生物を含む、生存物質を保存および輸送するための種々の酸素透過性ブラダーの構成である。
【０００８】
例１において、酸素透過性ブラダーは、２つの壁の各々の外側端部で互いに一緒に結合された２つの壁を備える。２つの壁の各々は、第１のフィルムと第２のフィルムとを含む。第１のフィルムは、ブラダーの内壁を規定し、薄い、障壁のないフレキシブルなフィルムを含む。第２のフィルムは、第１のフィルムの外面に隣接して配置され、複数の穿孔を含む。
【０００９】
例２は例１に係るブラダーに関し、ここで、前記第１のフィルムは少なくとも５，５００ｃｃ／ｍ２／日の酸素透過性を有する。
【００１０】
例３は例１に係るブラダーに関し、ここで、前記２つの壁のうちの１つは、該２つの壁のうちの１つから延びる排出口であって、ブラダーの内部空洞と流体連通する開口部を規定する、排出口を備える。
【００１１】
例４は例３に係るブラダーに関し、排出口に結合可能なように構成されるカバーをさらに含む。
【００１２】
例５は例１に係るブラダーに関し、ここで、前記第１のフィルムは、約１５μｍ〜約９０μｍの範囲の厚さを有する。
【００１３】
例６は例１に係るブラダーに関し、ここで、前記第１のフィルムは、ポリエチレンまたはポリプロピレンを含む。
【００１４】
例７は例１に係るブラダーに関し、ここで、前記第２のフィルムは、前記第１のフィルムより機械的に強く、より耐穿刺性がある。
【００１５】
例８は例１に係るブラダーに関し、ここで、前記第２のフィルムは、約４０μｍ〜約８０μｍの範囲の厚さを有する。
【００１６】
例９は例１に係るブラダーに関し、ここで、前記第２のフィルムは、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、またはポリアミドを含む。
【００１７】
例１０は例１に係るブラダーに関し、ここで、前記複数の穿孔の各々は、約０．１ｍｍ〜約３ｍｍの範囲の直径を有する。
【００１８】
例１１は例１に係るブラダーに関し、ここで、前記第１および第２のフィルムは、２つの壁の各々の外側端部で互いに一緒に結合されているだけである。
【００１９】
例１２は例１に係るブラダーに関し、ここで、前記ブラダーは、外部容器内に配置されるように構成される。
【００２０】
例１３において、酸素透過性ブラダーは少なくとも１つの壁を備える。少なくとも１つの壁は、内側の酸素透過性フィルムと、外側の穿孔フィルムと、結合部とを含む。内側の酸素透過性フィルムは、障壁のないフレキシブルなフィルムを含む。外側の穿孔フィルムは、内側の酸素透過性フィルムと外側の穿孔フィルムの実質的な長さに沿って結合していないが、隣接して配置される。結合部は、外側の穿孔フィルムに内側の酸素透過性フィルムが結合するように構成され、少なくとも１つの壁の外側部周囲に位置する。
【００２１】
例１４は例１３に係るブラダーに関し、ここで、内側の酸素透過性フィルムは、少なくとも５，５００ｃｃ／ｍ２／日の酸素透過性を有する。
【００２２】
例１５は例１３に係るブラダーに関し、ここで、前記少なくとも１つの壁のうちの１つは排出口とカバーとを備える。排出口は前記少なくとも１つの壁のうちの１つと結合し、ブラダーの内部空洞と流体連通する開口部を規定する。カバーは排出口と結合可能なように構成される。
【００２３】
例１６は例１３に係るブラダーに関し、ここで、外側の穿孔フィルムは内側の酸素透過性フィルムより機械的に強い。
【００２４】
例１７において、生存微生物を輸送するための容器は、実質的に剛性の外部容器と、実質的に剛性の外部容器内に配置されるように構成される酸素透過性ブラダーと、を備える。酸素透過性ブラダーは、内側フィルムと、外側フィルムとを備える。内側フィルムは、約１５μｍ〜約１００μｍの範囲の厚さを有する障壁のないフレキシブルなフィルムを含む。外側フィルムは内側フィルムに隣接して配置され、複数の穿孔を含む。加えて、外側フィルムは、外側フィルムの４つの外側端部のみで内側フィルムに一緒に結合される。
【００２５】
例１８は例１７に係るブラダーに関し、ここで、内側フィルムは少なくとも５，５００ｃｃ／ｍ２／日の酸素透過性を有する。
【００２６】
例１９は例１７に係るブラダーに関し、ここで、外側フィルムは内側フィルムより機械的に強い。
【００２７】
例２０は例１７に係るブラダーに関し、ここで、ブラダーはそのブラダーに結合する排出口をさらに含む。
【００２８】
複数の実施形態が開示されているが、本発明のさらに他の実施形態は、本発明の例示的な実施形態を示し、記載している以下の詳細な説明から当業者に明らかになるだろう。理解されるように、本発明は、本発明の趣旨および範囲から全て逸脱せずに種々の自明な態様において変更可能である。従って、図面および詳細な説明は例示とみなされ、決して限定されるわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】一実施形態に係る酸素透過性ブラダーの概略側面図である。
【図１Ｂ】図１Ａのブラダーの斜視図である。
【図２】一実施形態に係る２層ブラダーと比較した市販のブラダーにおける７℃の微生物での経時的生存率の比較折れ線グラフである。
【図３】一実施形態に係る２層ブラダーと比較した市販のブラダーにおける２２℃の微生物での経時的生存率の比較折れ線グラフである。
【図４】一実施形態に係る２層ブラダーと比較した市販のブラダーでの保存後に播種した２２℃の微生物での経時的生存率の比較折れ線グラフである。
【図５】一実施形態に係る２層ブラダーと比較した市販のブラダーにおける４℃〜５℃の微生物での経時的生存率の比較折れ線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書に開示される種々の実施形態は、液体根粒菌接種材料を含む微生物のための改良されたＢＩＢ容器に関し、また、そのような容器を作製する方法に関する。その実施形態は、微生物の酸素供給を改良できる高い酸素透過性を有するブラダーを有する容器を含み、それにより、より良い保存状態での生存率および適用される場合、その後の微生物の効果を生じる。概して、２層壁を有する本明細書に開示される種々のブラダーの実施形態は、各々の壁が２つの結合されていないフィルム：内側フィルムおよび外側穿孔フィルムを有する。
【００３１】
図１Ａおよび１ＢはＢＩＢ容器に使用するための透過性容器１０の一実施形態を示す。この容器１０の構造はＢＩＢ容器に使用されるブラダーについての最も一般的な構造である。すなわち、容器１０は、４つの端部１６、１８、２０、２２（図１Ｂに最適に示す）の各々に沿って互いに固定され、結合され、接着されるか、または取り付けられる２つの壁１２、１４を有し、それにより、容器１０の内部空洞２４を規定する。一実施形態によれば、２つの壁１２、１４は、熱加工を用いて端部１６、１８、２０、２２に一緒に結合される。あるいは、壁１２、１４は、接着剤を用いて端部１６、１８、２０、２２に一緒に結合されてもよい。あるいは、任意の公知のプロセスまたは組成が、２つの壁１２、１４を一緒に取り付けるために使用されてもよい。さらなる代替において、容器は、本明細書に開示される種々の実施形態のいずれかに係る内部空洞および２層酸素透過性壁を有する容器を形成する任意の公知の構成により形成されてもよい。図１Ｂに最適に示されるように、容器１０はまた、流体が内部空洞２４へ流入するようにその容器１０に配置される排出口２６を有してもよい。排出口２６はまた、その排出口２６につけられるキャップ２８を有してもよい。
【００３２】
一実施形態によれば、壁１２、１４の各々は「２層」または「双方（ｔｗｉｎ）層」の壁である。すなわち、各々は内側フィルム３０および外側フィルム３２を有する。２つのフィルム３０、３２は、空洞２４の長さに沿って互いに物理的に結合または取り付けられていない。代わりに、フィルム３０、３２は、結合していないまたは取り付けられていない形態で互いに隣接してまたは接触して単に配置され、上記の端部１６、１８、２０、２２においてのみ互いに結合されている。
【００３３】
一実施形態に係る内側フィルム３０は高い酸素透過性を有する薄いフィルムである。フィルム３０は軽量で高い通気性のあるフィルムである。一実施形態によれば、フィルム３０は薄いので、強度が低く、したがって、公知の２層容器に必要とされるものよりも通気性がある。一実施形態において、内側フィルム３０は、高密度ポリエチレン（「ＨＤＰＥ」）および超低密度ポリエチレン（「ＵＬＤＰＥ」）の混合物から作製される。あるいは、内側フィルム３０は、限定されないが、ＨＤＰＥ、中密度ポリエチレン（「ＭＤＰＥ」）、低密度ポリエチレン（「ＬＤＰＥ」）、超低密度ポリエチレン（「ＶＬＤＰＥ」）、ＵＬＤＰＥ、直鎖状低密度ポリエチレン（「ＬＬＤＰＥ」）、メタロセン直鎖状低密度ポリエチレン（「ｍＬＬＤＰＥ」）、および低圧力ポリエチレン（「ＬＰＰＥ」）のいずれか１つ以上を含む、種々のタイプのポリエチレンから作製されてもよい。別の代替によれば、内側フィルム３０はポリプロピレンから作製されてもよい。さらなる代替において、内側フィルムは、２層ブラダーに使用される単一のフィルムを含む、公知のＢＩＢブラダーに使用される任意の単一のフィルムを含む、任意の障壁のないフレキシブルなフィルムであってもよい。この適用の目的のために、「障壁のないフレキシブルなフィルム」とは、任意の薄い、酸素に透過性があるフレキシブルな高分子フィルムを意味する。
【００３４】
一実施形態において、内側フィルム３０は押出（または同時押出）フィルムである。この実施形態において、フィルム３０は、上記の例示的な成分の１つ以上のいずれかなどの種々の成分と一緒に押出機において最初に混ぜるまたは混合することによって標準的な押出加工を用いて作製されてもよい。次いで、押出機はこれらの成分を用いて均質のフィルムを成形する。あるいは、内側フィルム３０は任意の公知の押出加工により作製されてもよい。
【００３５】
一実施形態によれば、内側フィルム３０は約１５μｍ〜約９０μｍの範囲の厚さを有してもよい。あるいは、内側フィルム３０は約５０μｍの厚さを有する。
【００３６】
１つの例示的な実施形態において、内側フィルム３０は市販のポリマーおよびＨＤＰＥの混合物である。より具体的には、市販のポリマーは、ミシガン州、ミッドランドにあるＤｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手可能なＤｏｗ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＦ  １１４０Ｇという商標名で販売されている。一実施形態において、得られる内側フィルム３０は、約８２％のＤｏｗポリマーと約１８％のＨＤＰＥから作製される。従来のＬＤＰＥフィルムの透過性とこの特定の内側フィルム３０の透過性との比較を与える表１に示すように、内側フィルム３０は約５９７７ｃｃ／ｍ２／日の酸素透過性を有する。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
一実施形態によれば、外側フィルム３２は複数の穿孔３０を有するフィルムである。外側フィルム３２は、厚さが２４％ポリエステルおよび７６％ポリエチレンの混合物から作製されるポリエステル／ポリエチレンフィルムから作製されてもよい。ポリエステルおよびポリエチレンに加えて、さらなる非限定的な材料の例としては、ポリプロピレンおよびポリアミドが挙げられる。あるいは、外側フィルム３２は任意のヒートシール可能なラミネートフィルムから作製されてもよい。ヒートシール可能なフィルムはＬＤＰＥまたはＵＬＤＰＥなどの材料から作製されてもよい。さらなる代替において、外側フィルム３２は、例えばポリエステルから作製されるフィルムを含む、任意のフレキシブルなフィルムから作製されてもよい。１つの特定の例示的な実施形態において、外側フィルム３２は、イタリアのブレナ（Ｂｒｅｎｎａ）にあるＣｏｒａｐａｃｋ社製のＣｏｒａｐａｎ  ＰＳ／ＬＬＥ１２＋４０として市販されているポリエステルとポリエチレンの混合物であり、ポリエステルが約２４％のフィルムを構成し、ポリエチレンが約７６％のフィルムを構成する。
【００３９】
一実施形態によれば、外側フィルム３２はラミネート加工を用いて成形され得るラミネートフィルムである。一例において、ポリエステルの層およびポリエチレンの層が最初に形成され、次いで一緒にラミネートされる。一実施形態において、２層はそれらの間に接着層を用いて一緒にラミネートされる。あるいは、２層は任意の公知のプロセスを用いて一緒にラミネートされてもよい。１つの特定の実施形態によれば、ポリエチレン層は公知のブローフィルム（ｂｌｏｗｎ  ｆｉｌｍ）加工を用いて成形される。あるいは、ポリエチレン層は任意の公知のプロセスを用いて成形されてもよい。ポリエステル層は公知のキャストフィルム加工を用いて成形されてもよい。あるいは、ポリエステル層は任意の公知のプロセスを用いて成形されてもよい。
【００４０】
一実施形態において、外側フィルム３２は約４０μｍ〜約８０μｍの範囲の厚さを有する。あるいは、外側フィルム３２は約５２μｍの厚さを有する。穿孔の各々は、約５ｍｍ〜約３０ｍｍの範囲のピッチにて約０．１ｍｍ〜約３ｍｍの範囲の直径を有してもよい。あるいは、穿孔は、約１０〜２０ｍｍのピッチにて約１ｍｍ孔の直径を有してもよい。
【００４１】
外側フィルム３２は内側フィルム３０より機械的に強い。一実施形態によれば、外側フィルム３２は公知のＢＩＢブラダーに使用されるフィルムより機械的に強くてもよいが、穿孔のためにより高い酸素透過性を有する。すなわち、穿孔から生じる外側フィルム３２の透過性はフィルム３２の機械的特性とは無関係であり、したがって、機械的に強く、さらに酸素に対してより高い透過性である孔の開いた外側フィルム３２が得られる。このように、特定の実施形態において、外側フィルム３２は容器１０に機械的強度および耐穿刺性を与える。この強度により、上記のように内側フィルム３０は軽量になり、強度の低い高い通気性のあるフィルムから作製できる。
【００４２】
２つのフィルム３０、３２の特性のために、本明細書に開示される実施形態の２層壁の種々の型は高い酸素透過性を有し、一方でまた、容器１０内に液体接種材料を保持するのに十分な強度を有する。種々の公知のブラダーは酸素透過性を有するが、ほとんどは、単層フィルムのみまたは単層を生成するために物理的に一緒に結合されている２層を有する。これらの単層フィルムは、通気性を有さず、または一部の形態で物理的に妥協せずに液体を含有するのに必要な強度を達成するのに必要とされる厚さのために透過性を犠牲にしている。本明細書に開示される種々の実施形態において、通気性のある、高い透過性の薄い内側フィルムは、高い透過性であるが、機械的に強い孔の開いた外側フィルムと合わされ、それらは、内側フィルムに隣接するが、結合または物理的に接着されずに配置され、微生物を含有する液体を含有するために使用され得る、高い透過性であるが、機械的に強い壁を生じる。
【００４３】
一実施形態によれば、本明細書に開示される実施形態の内側および外側フィルムを有する種々の２層壁は、当該技術分野において公知の従来のブラダーより高い酸素透過性を有する。一実施形態によれば、２つのフィルム３０、３２は、約４，０００ｃｃ／ｍ２／日〜約１２，０００ｃｍ／ｍ２／日の範囲の全体の酸素透過性を有する２層壁を生成する。あるいは、得られる２層壁は約６，０００ｃｃ／ｍ２／日の全体の酸素透過性を有する。特定の公知の従来の２層ブラダー（それは２ピースの同じＬＤＰＥフィルム（イリノイ州、ノースレークにあるＳｃｈｏｌｌｅ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｉｎｃ．製のＦｌｅｘｉＯｎｅ（商標）２７として市販されている）を用いて構築された）の透過性が約１，６５０ｃｃ／ｍ２／日（英国のサリー州、レザーヘッドにあるＰａｃｋａｇｉｎｇ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎにより実施されるＡＳＴＭ＃Ｆ１９２７−２８と説明されている透過性を測定するための標準的な方法を用いて計算した）であることを考慮すると、約６，０００ｃｃ／ｍ２／日の透過性を有するこの特定の２層の実施形態は公知のブラダーより３６３％高い透過性を示す。
【００４４】
特定の実施形態において、本明細書に記載される種々の透過性容器またはブラダーの実施形態は、外部容器の内側に配置されることが理解される（したがって、外部容器およびその外部容器内に配置されるブラダーまたは透過性容器が得られる。すなわち、典型的には、上記のバッグインバッグ容器と呼ばれる構成）。これらの実施形態において、外部容器はＢＩＢ容器に使用するための任意の公知の外部容器であってもよい。１つの例示的な実施形態において、外部容器は実質的に剛性の段ボール箱である。あるいは、任意の他の公知の外部容器が意図される。
【実施例】
【００４５】
実施例１−７℃の容器におけるＢ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍの安定性
発酵したブラディリゾビウム  ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）培養液の２つの１２．４リットルの試料を２つの異なるブラダー内に充填した。１つの試料は、上記のＦｌｅｘｉＯｎｅ（商標）２７から作製された同様の従来のポリエチレン２層ブラダー（図２において「従来」と示した）に充填し、第２の試料は、特定の実施形態において、２層ブラダー（図２において「Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｍ」と示した）に充填した。２層ブラダーの実施形態は、４６０×６００ｍｍの寸法、８２％Ａｆｆｉｎｉｔｙ１１４０Ｇおよび１８％ＨＤＰＥの混合物から作製された５０μｍ厚さの内側フィルム、ならびに２４％ポリエステルおよび７６％ポリエチレンを有する穿孔したポリエステル／ポリエチレンフィルムから作製された外側フィルムを有した。
【００４６】
両方のブラダー中の材料は７℃に保存し、６ヶ月間にわたって１ヶ月毎に試料を無菌で得た。その結果を図２のグラフに示す。図に見られ得るように、１２週後、公知の従来のＢＩＢ容器における細菌数は生存率の劇的な減少を示した。対照的に、２層ブラダーの実施形態における細菌数は２６週まで高いままであった。
【００４７】
実施例２−２２℃の容器におけるＢ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍの安定性
発酵したＢ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍの培養液の２つの６．４リットルの試料を２つの異なるブラダーに充填した。１つの試料は、上記の実施例１に記載したものと同じブラダー（図３において「従来」と示した）に充填し、第２の試料は、同様に上記の実施例１に記載した２層ブラダーの実施形態（図３において「Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｍ」と示した）に充填した。
【００４８】
両方のブラダー中の材料は２２℃に保存し、６ヶ月間にわたって１ヶ月毎に試料を無菌で得た。その結果を図３のグラフに示す。これらの結果は、公知のブラダーと２層ブラダーの実施形態の両方において細菌数の減少が見られるが、従来のパッケージシステムの減少が２層の実施形態より非常に多いことを示す。
【００４９】
実施例３−保存後の種子におけるＢ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍの安定性
実施例２からの２つの試料をこの実験に使用した。上記のように２２℃での保存の５週後、各試料を別々に５００グラムの種子に与えた。
【００５０】
各バッチにおいて生存している根粒菌の数を図４に示すように定期的に試験した。その結果は、実施例２における２層ブラダーの実施形態に保存されている根粒菌細胞の種子における生存が、従来のブラダーに保存されている根粒菌細胞の生存より高いことを示す。加えて、２層ブラダーの実施形態に保存されている根粒菌細胞は、従来のブラダーに保存されている細胞（これは約３週で規定数以下に減少した）と対照的に、５週にわたって１つの種子当たり１００，０００個の細胞の規定数（カナダの規制に示されているように、植え付け前の１つの種子当たり最小の許容される数の生存細胞）以上で生存した。すなわち、種子を処理する時間と、処理した種子をフィールド（田畑）に植え付ける時間との間の期間は、この実施例に利用される２層ブラダーの実施形態を用いて長くすることができる。
【００５１】
実施例４−４〜５℃の容器におけるＢ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍの安定性
公知の菌株５３２Ｃの発酵したＢ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍの発酵液の２つの１２．８リットルの試料を２つの異なるブラダーに充填した。１つの試料は、上記の実施例１および２と同様のブラダー（図５において「従来」と示した）に充填し、第２の試料は、同様に実施例１および２に記載している２層ブラダーの実施形態（図５において「Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｍ」と示した）に充填した。
【００５２】
両方のブラダーの材料を４〜５℃に保存し、８ヶ月にわたって１ヶ月毎に試料を無菌で得た。その結果を図５にグラフで示す。図に見られ得るように、公知の従来のＢＩＢ容器における細菌数は、９週付近で開始して顕著な割合で減少し始めた。３５週までに、２層ブラダーの実施形態における細菌数は高いままであったが、従来の容器における細菌減少は２ｌｏｇより多かった。
【００５３】
本発明は好ましい実施形態を参照して記載しているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱しない形態および詳細で変更がなされてもよいことを当業者は理解するだろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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