(57)【要約】  本発明は、少なくとも一つの細胞を染色若しくはラベル付けし又は前記少なくとも一つの細胞に直接結合し若しくは鎖内の他の若しくは複数の抗体を介して前記少なくとも一つの細胞に間接的に結合した抗体に接合した分子又は構造を検出するためのデジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構の使用並びにデジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の方法及び使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの細胞を染色若しくはラベル付けし又は前記少なくとも一つの細胞に直接結合し若しくは鎖内の他の若しくは複数の抗体を介して前記少なくとも一つの細胞に間接的に結合した抗体に接合した分子又は構造を検出するためのデジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構の使用。
【請求項２】
分子、構造又は抗体は前記少なくとも一つの細胞の細胞表面に結合する請求項１に記載の使用。
【請求項３】
分子又は構造は、特定の波長範囲内に光吸収ピークを有し、及び／又は、デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構で用いられる光の偏光方向をシフトする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
１を超える数のタイプの分子又は構造は、前記細胞の同一の場所又は複数の場所で少なくとも一つの細胞を染色若しくはラベル付けし又は前記少なくとも一つの細胞に直接結合し又は鎖内の他の又は複数の抗体を介して前記少なくとも一つの細胞に間接的に結合した同一タイプの抗体に接合し、分子又は構造の少なくとも一つは、特定の波長範囲内に光吸収ピークを有し、分子又は構造の少なくとも一つは、デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構で用いられる光の偏光方向をシフトする請求項１から３のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
用いられる特定の分子又は構造は、特定の波長範囲内に光吸収ピークを有し、デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構で用いられる光の偏光方向をシフトする請求項１から３のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構を、互いに異なる少なくとも二つの波長の光に前記分子又は構造を露出するように配置した請求項１から５のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構を、デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構で用いられる少なくとも一つの物体光の偏光方向及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向をシフトするように配置した請求項１から６のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
少なくとも一つの物体光及び少なくとも一つの基準光が、互いに直交し又は互いにほぼ直交する偏光方向を得るようにするために、デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構を、デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構で用いられる少なくとも一つの物体光の偏光方向及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向をシフトするように配置した請求項１から７のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
少なくとも一つの細胞を染色若しくはラベル付けし又は前記少なくとも一つの細胞に直接結合し若しくは鎖内の他の若しくは複数の抗体を介して前記少なくとも一つの細胞に間接的に結合した抗体に接合した分子又は構造を検出する方法であって、
ａ）少なくとも一つの物体光(object beam of light)及び少なくとも一つの基準光(reference beam of light)を形成するステップであって、前記少なくとも一つの物体光及び前記少なくとも一つの基準光が互いにコヒーレントであるステップと、
ｂ）細胞試料を前記少なくとも一つの物体光に露出するステップと、
ｃ）前記細胞試料を通過する前記少なくとも一つの物体光を前記少なくとも一つの基準光に重ね合わせて干渉パターンを形成するステップと、
ｄ）ホログラムと呼ばれる前記干渉パターンを検出するステップと、
ｅ）物体波面の位相及び／又は振幅情報を前記干渉パターンから再構成するステップと、
ｆ）少なくとも一つの細胞を染色若しくはラベル付けし又は前記少なくとも一つの細胞に直接結合し若しくは鎖内の他の若しくは複数の抗体を介して前記少なくとも一つの細胞に間接的に結合した抗体に接合した分子又は構造を検出するための少なくとも一つの細胞分析像を構成するステップと、
によって、前記細胞試料のデジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成を実行する方法。
【請求項１０】
二つ以上の波長を使用し、用いられる特定の分子又は構造は、前記二つ以上の波長の少なくとも一つではあるが全てではない波長をカバーする波長範囲に光吸収ピークを有し、ステップａ）〜ｆ）を、用いられる波長の各々に対して実行して、ステップｆ）で取得されるとともに異なる波長の光から形成される像における少なくとも一つの同一の細胞の比較を可能にする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
二つの波長を使用し、一方の波長は、用いられる特定の分子又は構造が光吸収ピークを有する波長範囲によってカバーされ、もう一方の波長は、前記波長範囲外にあり、二つの細胞分析像を比較のために構成する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
用いられる特定の分子又は構造は、光の偏光方向をシフトし、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加することなく少なくとも１回実行し、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加してから少なくとも１回実行して、ステップｆ）で取得されるとともに異なる偏光方向から形成される像における少なくとも一つの同一の細胞の比較を可能にする請求項９から１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
用いられる特定の分子又は構造は、光の偏光方向をシフトし、少なくとも一つの物体光の偏光方向及び少なくとも一つの基準光の偏光方向が互いに直交し又は互いにほぼ直交するようになるために、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加することなく少なくとも１回実行し、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加してから少なくとも１回実行して、ステップｆ）で取得されるとともに異なる偏光方向から形成される像における少なくとも一つの同一の細胞の比較を可能にする請求項９から１２のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
１を超える数のタイプの分子又は構造を使用し、分子又は構造の少なくとも一つは、特定の波長範囲内に光吸収ピークを有し、分子又は構造の少なくとも一つは、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向をシフトする請求項９から１３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
用いられる特定の分子又は構造は、特定の波長範囲内に光吸収ピークを有し、用いられる特定の分子又は構造は、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向をシフトする請求項９から１３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
二つ以上の波長を使用し、少なくとも一つのタイプの用いられる特定の分子又は構造は、前記二つ以上の波長の少なくとも一つではあるが全てではない波長をカバーする波長範囲に光吸収ピークを有し、ステップａ）〜ｆ）を、用いられる波長の各々に対して実行し、少なくとも一つのタイプの用いられる特定の分子又は構造は、光の偏光方向をシフトし、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加することなく少なくとも１回実行し、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加してから少なくとも１回実行して、ステップｆ）で取得されるとともに異なる偏光方向から形成される像における少なくとも一つの同一の細胞の比較を可能にする請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
二つ以上の波長を使用し、少なくとも一つのタイプの用いられる特定の分子又は構造は、前記二つ以上の波長の少なくとも一つではあるが全てではない波長をカバーする波長範囲に光吸収ピークを有し、ステップａ）〜ｆ）を、用いられる波長の各々に対して実行し、少なくとも一つのタイプの用いられる特定の分子又は構造は、光の偏光方向をシフトし、少なくとも一つの物体光の偏光方向及び少なくとも一つの基準光の偏光方向が互いに直交し又は互いにほぼ直交するようにするために、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加することなく少なくとも１回実行し、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加してから少なくとも１回実行して、ステップｆ）で取得されるとともに異なる偏光方向から形成される像における少なくとも一つの同一の細胞の比較を可能にする請求項１４から１６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも一つの細胞を染色若しくはラベル付けし又は前記少なくとも一つの細胞に直接結合し若しくは鎖内の他の若しくは複数の抗体を介して前記少なくとも一つの細胞に間接的に結合した抗体に接合した分子又は構造を検出するためのデジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成(imaging)の方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間、動物、植物及び他の有機体中の細胞のような生体についての追加の及び更に正確な情報に対する果てしない要求が存在する。細胞は、非常に薄く、光学顕微鏡を用いて容易に識別することができる構造が非常に少ない。細胞及び細胞構造をより見やすくする様々な異なる方法が開発されている。これらの方法の多くは、細胞全体を染色する染色剤又は所定の細胞構造のみを染色する染色剤を入れる。これらの染色剤を蛍光性又は非蛍光性とすることができる。一例は、細胞全体を青色に染色する広く用いられている非蛍光性染色剤であるトリパンブルーである。トリパンブルーは、死細胞に対してのみ用いられる。細胞を染色するのに用いられる厳密な方法(exact method)は、異なる染色剤が異なる特性を有するので変化する。最近の(rather recent)ラベリング法は、細胞それ自体に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光物質を生成させる。このラベリングは、非常に選択的に特定の細胞構造を見せ又は非選択的に細胞全体を見せることができる。免疫標識(immunolabelling)と呼ばれる他の広く用いられている方法は、抗体を用いて細胞をラベル付けする。抗体は、脊椎動物の体液で見つかるタンパク質である。抗体は、異物と認識される物質及び粒子、例えば、バクテリア又はウイルスに結合し、抗体は、非常に特異的な構造(very specific structure)を標的にする。これは、抗体が細胞又は細胞の一部の非常に特異な小さい構造を識別するのに用いることができるので生物学的研究及び医学研究に有用である。抗体は、検出が非常に困難であるが、抗体をより明瞭に見やすくする多様な種々の分子又は構造に結合することができる。種々の抗体複合体は、光学顕微鏡検査、電子顕微鏡検査、分光分析又は放射能測定のような種々の検出法に適している。複合体抗体(conjugated antibodies)を、ターゲットに直接結合するのに用いることができる。更に強い信号が必要な場合、最初に、ラベル付けされていない抗体をターゲットに結合するのを許容し、その後、第１の組の非複合体抗体(non-conjugated antibodies)に第２の組の複合体抗体を結合するのを許容することによって信号を増幅することができる。第１の組の抗体は、一次抗体と呼ばれ、第２の組の抗体は、二次抗体と呼ばれる。信号を更に増幅したい場合には抗体の別の層を用いることができる。
【０００３】
異なるタイプの染色剤、ラベル及び抗体複合体は、複数又は少数の波長の光を吸収する能力、所定の波長の光を放出する能力、光を分散する能力又は光を偏光する能力のような種々の光に関連する特性を有する。これらの種々の特性により、染色剤は、光学顕微鏡、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡又はフローサイトメータ(flow cytometer)を用いたときに彩色又は蛍光として表示することができる。染色剤、ラベル又は複合体を、例えば、分光光度計又は蛍光プレートリーダを用いて計測することもできる。
【０００４】
吸収差を表す抗体複合体の例は、量子ドット、プラスチックボール、ガラスビーズ及び半導体である。光を散乱し又は光を偏光する抗体複合体の例は、ダイナビーズ(dynabeads)、金粒子、ナノ結晶又は電磁ビーズである。
【０００５】
デジタルホログラフィー顕微鏡検査によって、マーカを必要とすることなく生細胞を調べることができる。デジタルホログラフィー顕微鏡検査用の観察容器(observation vessel)及び前記容器の使用によるデジタルホログラフィー顕微鏡検査の方法を記載する国際公開第２００９／１５４５５８号において、デジタルホログラフィー顕微鏡検査によりマーカ又は染色剤を必要とすることなく生細胞を調べることができることが開示されている。実際には、デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成は単色像を示し、これは、これまでそのような技術がラベル付き又は染色細胞試料の分析に関心がなかったことを意味する。マーカの使用が増大し、その結果、そのようなマーカの関心及び種々の試料分析に対するマーカに関連したあり得るアプリケーションが増大している。
【０００６】
デジタルホログラフィー顕微鏡検査により細胞を調べる一つの方法は、国際公開第２００７／０７３３４５号に開示されており、ここでは、細胞の成長(development)の段階を分析する方法及び分析を可能にする装置が開示されている。
【０００７】
上述したように、デジタルホログラフィー顕微鏡検査により細胞を調べる他の方法は、国際公開第２００９／１５４５５８号に開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の技術は、単色像を示す。これは、例えば、国際公開第２００７／０７３３４５号及び国際公開第２００９／１５４５５８号に開示された発明で規定されたこのような技術が細胞試料のラベリング及び染色の使用に関連した関心がなかったことを意味する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、少なくとも一つの細胞を染色若しくはラベル付けし又は前記少なくとも一つの細胞に直接結合し若しくは鎖内の他の若しくは複数の抗体を介して前記少なくとも一つの細胞に間接的に結合した抗体に接合した分子又は構造を検出するためのデジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構(setup)の使用を対象にする。
【００１０】
さらに、本発明は、少なくとも一つの細胞を染色若しくはラベル付けし又は前記少なくとも一つの細胞に直接結合し若しくは鎖内の他の若しくは複数の抗体を介して前記少なくとも一つの細胞に間接的に結合した抗体に接合した分子又は構造を検出する方法であって、
ａ）少なくとも一つの物体光(object beam of light)及び少なくとも一つの基準光(reference beam of light)を形成するステップであって、前記少なくとも一つの物体光及び前記少なくとも一つの基準光が互いにコヒーレントであるステップと、
ｂ）細胞試料を前記少なくとも一つの物体光に露出するステップと、
ｃ）前記細胞試料を通過する前記少なくとも一つの物体光を前記少なくとも一つの基準光に重ね合わせて干渉パターンを形成するステップと、
ｄ）ホログラムと呼ばれる前記干渉パターンを検出するステップと、
ｅ）物体波面の位相及び／又は振幅情報を前記干渉パターンから再構成するステップと、
ｆ）少なくとも一つの細胞を染色若しくはラベル付けし又は前記少なくとも一つの細胞に直接結合し若しくは鎖内の他の若しくは複数の抗体を介して前記少なくとも一つの細胞に間接的に結合した抗体に接合した分子又は構造を検出するための少なくとも一つの細胞分析像を構成するステップと、
によって、前記細胞試料のデジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成を実行する方法も言及する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
デジタルホログラフィー顕微鏡検査において、異なる焦点面に対して顕微鏡を機械的に設定する必要なく複数の焦点面を調べることができる。また、取得したデータを処理することによって異なる焦点面を調べることもできる。これにより、３次元像を取得することができる。特に、この方法は、不所望な干渉を小さくし、雑音のレベルを小さくし、かつ、細胞試料の高解像度ホログラフィー像(high-resolution holographic images)と同程度の細胞試料についての正確な位相及び振幅情報を取得することができる。
【００１２】
本発明による方法の一実施の形態において、互いにコヒーレントな少なくとも一つの物体光及び少なくとも一つの基準光を、コヒーレント光源から出射した光ビームを、例えば、ビームスプリッタによって二つのビームに分割することによって形成する。コヒーレント光源から出射した光ビームを、レーザビームとすることができる。レーザビームは、Ｈｅ−Ｎｅレーザ又はダイオードレーザのような任意の種類のレーザ光源から出射することができる。好適には、ダイオードレーザが用いられる。レーザ光源を、直線偏光にすることができる。
【００１３】
物体光及び基準光は互いにコヒーレントであり、これは、物体光及び基準光が同一波長を有するとともに時間経過中に一定の位相関係を有することを示すことを意味する。
【００１４】
物体光は細胞試料を通過する。基準光は、例えば、ビームスプリッタ、ミラー及び／又は光ファイバによって物体光の経路以外の経路に導かれるので、基準光は、細胞試料による影響が及ぼされないままである。
【００１５】
物体光は、細胞試料を通過する前に既知の波面を有する。物体光が少なくとも一つの細胞試料を通過するとき、細胞試料はあらゆる光をほとんど吸収しないが、細胞試料を伝播する光は、周辺媒体に対する光路差が生じる。したがって、細胞試料から出現する波面すなわち物体波面は、位相がシフトされる。当然、基準光も既知の波面を有する。光路長は、物理的／幾何学的な厚さに屈折率を乗算したものとして定義される。
【００１６】
本発明による方法の一実施の形態において、細胞試料を通過する少なくとも一つの物体光の少なくとも一つの基準光への重ね合わせが、例えば、他のビームスプリッタによって二つのビームをまとめることによって行われる。このような重ね合わせによって干渉パターンが生じ、干渉パターンは、例えば、少なくとも一つの細胞試料によって影響が及ぼされる物体波面についての情報を含む。
【００１７】
本発明による方法の一実施の形態において、干渉パターンを、ＣＣＤ又はＣＭＯＳのようなデジタルセンサによって検出する。検出される干渉パターンはホログラムと称される。
【００１８】
細胞試料を通過する少なくとも一つの物体光と少なくとも一つの基準光とを重ね合わせて干渉パターンを形成し、かつ、干渉パターンを検出するために、例えば、フーリエ機構(Fourier setup)又はフレネル機構(Fresnel setup)を用いることができる。好適には、フレネル機構を用いる。フーリエ機構とフレネル機構との差は、光学的配置の差として説明することができ、これは、近似、例えば、フレネル近似を再構成アルゴリズムに適用できる所定の条件を満足することを意味する。この近似は、像再構成処理を簡単にする。フレネル機構の場合、条件は、物体とセンサとの間の距離が物体の寸法及びセンサの寸法より大きいことである。これは、物体からの散乱光を収集するとともに光をほぼ平行な光ビームの形態でセンサに向かわせる顕微鏡対物レンズ(microscope objective)を用いることによって達成される。これは、センサから離間して配置される仮想オブジェクト(virtual object)を形成する。
【００１９】
検出した干渉パターンの位相及び／又は振幅情報から物体の波面が再構成される。再構成を、フーリエ変換再構成又は畳み込み再構成(convolution reconstruction)のような任意の公知の数値的な再構成(numerical reconstruction)処理によって行う。振幅情報を、関心のある焦点面を設定するために用いることができる。再構成された情報を、例えば、調べられた細胞試料の２次元又は３次元表示の像を取得するために用いることができる。
【００２０】
一つの物体光及び一つの基準光を形成する代案として、インラインデジタルホログラフィーを用いることができる。本明細書を検討する際に、インラインデジタルホログラフィーを用いるために本発明の方法の変更の仕方は当業者には明らかである。
【００２１】
取得した像を、形状、容量及び吸光度(optical density)のような調べられた物体についての有用な情報を決定するためにコンピュータによる像処理において更に用いることができる。
【００２２】
複数の取得した像を、形状の変化、容量の変化及び吸光度の変化のような調べられた物体についての追加の有用な情報を決定するために像処理において更に用いることもできる。
【００２３】
発明の特別な実施の形態
一部の実施の形態において、分子、構造又は抗体は前記少なくとも一つの細胞の細胞表面に結合する。これによって、細胞を損なうおそれが減少するので、本発明の寛大さ(lenience)が更に増大する。
【００２４】
デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構の使用の一部の実施の形態において、分子又は構造は、特定の波長範囲内に光吸収ピークを有し、及び／又は、デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構で用いられる光の偏光方向をシフトする。特定の波長範囲内に光吸収ピークを有する分子又は構造を用いることによって、分子又は構造を検出することができる。光の偏光方向をシフトする分子又は構造を用いることによって、分子又は構造を検出することができる。
【００２５】
デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構の使用の一つの特定の実施の形態によれば、１を超える数のタイプの分子又は構造は、前記細胞の同一の場所又は複数の場所で少なくとも一つの細胞を染色若しくはラベル付けし又は前記少なくとも一つの細胞に直接結合し又は鎖内の他の又は複数の抗体を介して前記少なくとも一つの細胞に間接的に結合した同一タイプの抗体に接合し、分子又は構造の少なくとも一つは、特定の波長範囲内に光吸収ピークを有し、分子又は構造の少なくとも一つは、デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構で用いられる光の偏光方向をシフトする。本実施の形態によれば、特定の波長範囲内にピークを有する光を吸収する能力を有する分子又は構造が、偏光方向をシフトする能力を有する分子又は構造とともに用いられ、すなわち、二つの異なるタイプの分子又は構造が用いられる。これらの特性を組み合わせることによって、異なる波長の光から形成される像と異なる偏光方向によって形成される像の両方を取得することができる。これら両方の種類の像を有するとき、分子又は構造が結合される細胞の検出の確実性が増大する。
【００２６】
デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構の使用の一部の実施の形態において、用いられる特定の分子又は構造は、特定の波長範囲内に光吸収ピークを有し、デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構で用いられる光の偏光方向をシフトする。これらの実施の形態において、特定の波長範囲内にピークを有する光を吸収する能力と偏光方向をシフトする能力の両方を有する分子又は構造が用いられ、すなわち、一つのタイプの分子又は構造が用いられる。上述したように、異なる波長の光から形成される像と異なる偏光方向によって形成される像の両方を取得することができる。これら両方の種類の像を有するとき、分子又は構造の検出の確実性が増大し、したがって、分子又は構造が結合される細胞の検出の確実性が増大する。
【００２７】
デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構の使用の一部の実施の形態において、デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構を、互いに異なる少なくとも二つの波長の光に前記分子又は構造を露出するように配置する。互いに異なる少なくとも二つの波長の光に分子又は構造を露出することによって、分子又は構造の検出の信頼性が増大する。
【００２８】
デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構の使用の一部の実施の形態において、デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構を、デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構で用いられる少なくとも一つの物体光の偏光方向及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向をシフトするように配置する。少なくとも一つの物体光の偏光方向及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向をシフトすることによって、分子又は構造の検出の信頼性が増大する。
【００２９】
好適には、得られる偏光方向が互いに直交し又は互いにほぼ直交するようにするために少なくとも一つの物体光の偏光方向及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向をシフトする。元々、少なくとも一つの基準光の偏光方向と少なくとも一つの物体光の偏光方向は通常は同一である。しかしながら、光の偏光方向をランダムに変える能力を有する分子又は構造を検出するために、少なくとも一つの基準光に対する少なくとも一つの物体光の偏光方向を、互いに垂直になる方向にシフトする必要がある。本発明の本実施の形態によれば、少なくとも一つの基準光に対する少なくとも一つの物体光の偏光方向の角度は、光の偏光方向をシフトし又は光の偏光方向をランダムに変える分子又は構造を検出することができるようにするために正確に９０°又は２７０°になる必要はない。しかしながら、角度は、少なくとも一つの物体光の偏光方向が少なくとも一つの基準光の偏光方向に対して垂直になる方向にシフトされるので、分子及び構造を検出するのが更に容易になる。９０°未満の角度又は９０°を超える角度は、例えば、７５〜８９°又は９１〜１０５°の角度、すなわち、２５５〜２６９°又は２７１〜２８５°の角度のように本発明に従って動く。しかしながら、９０°又は２７０°の角度において、偏光方向をランダムに変更する分子又は構成からの干渉パターンのみ検出可能である。
【００３０】
本発明による方法に関連して、一つの特定の態様によれば、二つ以上の波長を使用し、用いられる特定の分子又は構造は、前記二つ以上の波長の少なくとも一つではあるが全てではない波長をカバーする波長範囲に光吸収ピークを有し、ステップａ）〜ｆ）を、用いられる波長の各々に対して実行して、ステップｆ）で取得されるとともに異なる波長の光から形成される像における少なくとも一つの同一の細胞の比較を可能にする。
【００３１】
二つ以上の波長を用いることによって、本発明による方法の信頼性を増大させることができる。特定の波長範囲に光吸収ピークを有する分子又は構造を用いる場合、当該範囲内の少なくとも一つの波長及び当該範囲外の一つの波長を用いることができる。このようにして、分子又は構造の実際の検出を決定することができる。
【００３２】
さらに、少なくとも二つの波長を用いるとともに用いた波長の各々に対する像を生成することによって、取得した像を比較することができる。用いられる分子又は構造は、用いる波長の少なくとも一つをカバーするがそれ以外の用いる波長の一つをカバーしない波長範囲内に光吸収ピークを有するので、分子又は構造は、像の少なくとも一つに影響を及ぼし、少なくとも一つの他の像に影響を及ぼさない。影響が及ぼされた像と影響が及ぼされていない像とを比較することによって、分子又は構造が検出される。
【００３３】
二つ以上の波長を含む方法を実行する一つのやり方は、用いられる波長の一つに対してステップａ）〜ｆ）を実行し、その後、用いられる他の波長の一つに対してステップａ）〜ｆ）を実行し、２を超える数の波長を用いる場合には、残りの波長に対するステップａ）〜ｆ）を一つずつ実行することである。
【００３４】
他の一つのやり方は、用いられる波長の一つに対してステップａ）〜ｄ）を実行し、その後、用いられる他の波長の一つに対してステップａ）〜ｄ）を実行し、２を超える数の波長を用いる場合には、残りの波長に対するステップａ）〜ｄ）を一つずつ実行することである。その後、ステップｅ）及びｆ）を、用いられる波長の全てに対して同時に実行することができる。この他のやり方は、方法を実行する速度を増大し、すなわち、方法を実行する時間を減少させる。
【００３５】
デジタルホログラフィー顕微鏡検査及び像形成の機構の使用の一部の実施の形態において、二つの波長を使用し、一方の波長は、用いられる特定の分子又は構造が光吸収ピークを有する波長範囲によってカバーされ、もう一方の波長は、前記波長範囲外にあり、二つの細胞分析像を比較のために構成する。
【００３６】
一般的には、分子又は構造によって影響が及ぼされる一つの像を取得するとともに、分子又は構造によって影響が及ぼされない一つの像を取得するので、二つの異なる波長を用いて方法を実行すれば十分である。したがって、二つの像を比較するとともに分子又は構造を検出することができる。二つの波長のみを用いることによって、方法の効率は、２を超える数の波長を用いる場合に比べて増大する。しかしながら、２を超える数の波長を用いることによって、精度が増大する。
【００３７】
本発明による方法の他の特定の実施の形態によれば、用いられる特定の分子又は構造は、光の偏光方向をシフトし、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加することなく少なくとも１回実行し、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加してから少なくとも１回実行して、ステップｆ）で取得されるとともに異なる偏光方向から形成される像における少なくとも一つの同一の細胞の比較を可能にする。
【００３８】
本実施の形態において、用いられる分子又は構造によって偏光方向がシフトした少なくとも一つの像を生成する。物体光又は基準光の偏光方向をシフトするとき、偏光方向をランダムにシフトする分子又は構造が可視化される。少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向が互いに垂直又は互いにほぼ垂直となるように偏光方向をシフトするとともに偏光方向をそれ自体でシフトする任意の分子又は構造を有しないようにすることのみによって、何も示さない「ゼロ像」(zero image)が得られる。しかしながら、偏光方向をシフトする分子又は構造が用いられる場合、分子又は構造は、本発明のこの特定の実施の形態による像において示される。したがって、これは、少なくとも一つの細胞を染色若しくはラベル付けし又は前記少なくとも一つの細胞に直接結合し若しくは鎖内の他の若しくは複数の抗体を介して前記少なくとも一つの細胞に間接的に結合した抗体に接合した分子又は構造を見る場合に関連する不確実さのおそれを除去するやり方でもある。
【００３９】
「少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向をシフトする」という表現が少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向を互いにシフトすることなく像を形成すること、すなわち、変更方向をシフトする前に最初の位置又は対応する位置に戻ることに対応するように少なくとも一つの物体光と少なくとも一つの基準光の両方を同時にシフトすることを含まないことを理解するのは重要なことである。
【００４０】
本発明による方法の他の特定の実施の形態によれば、用いられる特定の分子又は構造は、光の偏光方向をシフトし、少なくとも一つの物体光の偏光方向及び少なくとも一つの基準光の偏光方向が互いに直交し又は互いにほぼ直交するようになるために、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加することなく少なくとも１回実行し、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加してから少なくとも１回実行して、ステップｆ）で取得されるとともに異なる偏光方向から形成される像における少なくとも一つの同一の細胞の比較を可能にする。少なくとも一つの基準光に直交する少なくとも一つの物体光の直交する偏光方向を有することについての関心は、上記で更に詳しく説明している。
【００４１】
少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加することなくステップａ）〜ｆ）を実行すること及び少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加してからステップａ）〜ｆ）を実行することを伴う方法を実施する一つのやり方は、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加することなくステップａ）〜ｆ）を最初に実行した後に少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトを伴うステップａ）〜ｆ）を実行することである。
【００４２】
他の代案は、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加することなくステップａ）〜ｄ）を最初に実行した後に少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトを伴うステップａ）〜ｄ）を実行することである。その後、ステップｅ）及びｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加することなく実行されるステップａ）〜ｄ）のシーケンスに対して同時に実行する。この代案の方法は、方法を実行する速度を増大し、すなわち、方法を実施する時間を減少させる。
【００４３】
本発明による方法の一部の実施の形態において、１を超える数のタイプの分子又は構造を使用し、分子又は構造の少なくとも一つは、特定の波長範囲内に光吸収ピークを有し、分子又は構造の少なくとも一つは、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向をシフトする。これらの実施の形態において、特定の波長範囲内にピークを有する光を吸収する能力を有する分子又は構造が、偏光方向をシフトする能力を有する分子又は構造とともに用いられ、すなわち、二つの異なるタイプの分子又は構造が用いられる。これらの特性を組み合わせることによって、異なる波長の光から形成される像と異なる偏光方向によって形成される像の両方を取得することができる。これら両方の種類の像を有するとき、分子又は構造が結合される細胞の検出の確実性が増大する。
【００４４】
本発明による方法の一部の実施の形態において、用いられる特定の分子又は構造は、特定の波長範囲内に光吸収ピークを有し、用いられる特定の分子又は構造は、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向をシフトする。これらの実施の形態において、特定の波長範囲内にピークを有する光を吸収する能力と偏光方向をシフトする能力の両方を有する分子又は構造が用いられ、すなわち、一つのタイプの分子又は構造が用いられる。上述したように、異なる波長の光から形成される像と異なる偏光方向によって形成される像の両方を取得することができる。これら両方の種類の像を有するとき、分子又は構造の検出の確実性が増大し、したがって、分子又は構造が結合される細胞の検出の確実性が増大する。
【００４５】
本発明による方法の一部の実施の形態において、二つ以上の波長を使用し、少なくとも一つのタイプの用いられる特定の分子又は構造は、前記二つ以上の波長の少なくとも一つではあるが全てではない波長をカバーする波長範囲に光吸収ピークを有し、ステップａ）〜ｆ）を、用いられる波長の各々に対して実行し、少なくとも一つのタイプの用いられる特定の分子又は構造は、光の偏光方向をシフトし、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加することなく少なくとも１回実行し、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向のシフトをステップａ）に追加してから少なくとも１回実行して、ステップｆ）で取得されるとともに異なる偏光方向から形成される像における少なくとも一つの同一の細胞の比較を可能にする。これらの実施の形態において、異なる波長の光から形成される像及び異なる偏光方向から形成される像を取得する。これによって、これらの要因の両方を分析することができ、分子又は構造の検出の確実性を増大させることができ、分子又は構造が結合される細胞の検出の確実性が増大する。方法のこれらの実施の形態で形成される像の最も少ない数は３である。これらの像の一つを、第１の波長を用いるとともにステップａ）に対する追加を行うことなく得られる基準像とすることができる。これらの像の一つを、第２の波長を用いるとともにステップａ）に対する追加を行うことなく得られる像とすることができる。これらの像の一つを、第１の波長を用いるがステップａ）に対する追加を行うことによって得られる像とすることができる。しかしながら、方法の精度を増大させるために、異なる波長の光から形成される像の数及び異なる偏光方向から形成される像の数の両方を増大させることができる。さらに、この場合にも、少なくとも一つの物体光の偏光方向及び少なくとも一つの基準光の偏光方向が互いに直交し又は互いにほぼ直交するようにするために、少なくとも一つの物体光及び／又は少なくとも一つの基準光の偏光方向をシフトすることができる。
【国際調査報告】
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