(57)【要約】  本発明は、ラムノリピドを生産するための細胞および核酸ならびにそれらの使用、およびラムノリピドを生産するための方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2013537411.tif 000009
（式中、
ｍ＝２、１、または０、特定的には１または０、
ｎ＝１または０、特定的には１、
Ｒ１およびＲ２＝互いに独立して２〜２４を有する同一または異なる有機基、特定的には、任意選択により分枝状、任意選択により置換型、特定的にはヒドロキシ置換型、任意選択により不飽和、特定的には任意選択によりモノ、ジ、またはトリ不飽和のアルキル基）
で示される少なくとも１種のラムノリピドを生成可能な細胞であって、
野生型と比較して、酵素Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の少なくともの１つの増大された活性を有するように遺伝子改変されたものであり、前記酵素Ｅ１が、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸−ＡＣＰを経由するヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸への変換を触媒可能であり、前記酵素Ｅ２が、ラムノシルトランスフェラーゼＩであり、かつｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒可能であり、前記酵素Ｅ３が、ラムノシルトランスフェラーゼＩＩであり、かつｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒可能であることを特徴とする、細胞。
【請求項２】
前記酵素Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３が、
ポリペプチド配列の配列番号２を有する酵素Ｅ１ａ、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号２と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号２を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ１ａと、
ポリペプチド配列の配列番号１８を有する酵素Ｅ１ｂ、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号１８と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号１８を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ１ｂと、
ポリペプチド配列の配列番号７８を有する酵素Ｅ１ｃ、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号７８と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号７８を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ１ｃと、
ポリペプチド配列の配列番号８０を有する酵素Ｅ１ｄ、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号８０と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号８０を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ１ｄと、
ポリペプチド配列の配列番号８２を有する酵素Ｅ１ｅ、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号８２と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号８２を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ１ｅと、
から選択される少なくとも１種の酵素Ｅ１と、
ポリペプチド配列の配列番号４を有する酵素Ｅ２ａ、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号４と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号４を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ２ａと、
ポリペプチド配列の配列番号２０を有する酵素Ｅ２ｂ、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号２０と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号２０を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ２ｂと、
ポリペプチド配列の配列番号８４を有する酵素Ｅ２ｃ、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号８４と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号８４を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ２ｃと、
ポリペプチド配列の配列番号８６を有する酵素Ｅ２ｄ、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号８６と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号８６を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ２ｄと、
ポリペプチド配列の配列番号８８を有する酵素Ｅ２ｅ、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号８８と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号８８を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ２ｅと、
から選択される少なくとも１種の酵素Ｅ２と、
ポリペプチド配列の配列番号６を有する酵素Ｅ３ａ、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号６と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号６を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ３ａと、
ポリペプチド配列の配列番号２２を有する酵素Ｅ３ｂ、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号２２と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号２２を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ３ｂと、
ポリペプチド配列の配列番号９０を有する酵素Ｅ３ｃ、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号９０と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号９０を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ３ｃと、
ポリペプチド配列の配列番号９２を有する酵素Ｅ３ｄ、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号９２と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号９２を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ３ｄと、
から選択される少なくとも１種の酵素Ｅ３と、
からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
Ｅ２、Ｅ２Ｅ３、およびＥ１Ｅ２Ｅ３
から選択される酵素の組合せの増大された活性を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記酵素の組合せ
Ｅ１Ｅ２Ｅ３
の増大された活性を有し、かつ
ｎが＝１である
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
アスペルギルス属（Aspergillus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、バチルス属（Bacillus）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、パラコッカス属（Paracoccus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、エシェリキア属（Escherichia）、ザイモモナス属（Zymomonas）、ヤロウイア属（Yarrowia）、メチロバクテリウム属（Methylobacterium）、ラルストニア属（Ralstonia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ロドスピリラム属（Rhodospirillum）、ロドバクター属（Rhodobacter）、バークホルデリア属（Burkholderia）、クロストリジウム属（Clostridium）、およびカプリアビダス属（Cupriavidus）からなる群の属から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
野生型として、Ｃ６〜Ｃ１６の鎖長を有するポリヒドロキシアルカノエートを生成可能であること、特定的には、その野生型と比較して、より少量のポリヒドロキシアルカノエートを生成可能であるように遺伝子改変されたものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記細胞が、その野生型と比較して、少なくとも１種の酵素Ｅ９またはＥ１０の低減された活性を有することであって、
Ｅ９が、３−ヒドロキシアルカノイル−補酵素Ａからポリ−３−ヒドロキシアルカン酸への変換能力を有するポリヒドロキシアルカン酸シンターゼＥＣ：２．３．１．、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号３０もしくは配列番号３２を有するもの、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号３０もしくは配列番号３２と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号３０もしくは配列番号３２を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有するものであり、かつ
Ｅ１０が、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシアルカナノイル−補酵素Ａへの変換能力を有する３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰ：補酵素Ａ転移酵素、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号３４もしくは配列番号３６を有するもの、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号３４もしくは配列番号３６と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号３４もしくは配列番号３６を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有するものである
ことを特徴とする、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記細胞が、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１２１、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１２２、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１２３、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１２４、およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ４２Ｃ１、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴＯＹ０１またはＰ．プチダ（P. putida）ＫＴＯＹ０２からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の細胞。
【請求項９】
野生型と比較して、
少なくとも１種の酵素Ｅ４、ｄＴＴＰ：α−Ｄ−グルコース−１−リン酸チミジリルトランスフェラーゼ、ＥＣ２．７．７．２４、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号１０を有するもの、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号１０と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号１０を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有するもの、
少なくとも１種の酵素Ｅ５、ｄＴＴＰ−グルコース−４，６−ヒドロリアーゼ、ＥＣ４．２．１．４６、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号１２を有するもの、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号１２と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号１２を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有するもの、
少なくとも１種の酵素Ｅ６、ｄＴＤＰ−４−デヒドロラムノース−３，５−エピメラーゼ、ＥＣ５．１．３．１３、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号１４を有するもの、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号１４と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号１４を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有するもの、および
少なくとも１種の酵素Ｅ７、ｄＴＤＰ−４−デヒドロラムノースレダクターゼ、ＥＣ１．１．１．１３３、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号１６を有するもの、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号１６と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号１６を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有するもの、
からなる群から選択される酵素の少なくとも１つの増大された活性を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
野生型と比較して、細胞から周囲培地中への一般式（Ｉ）で示されるラムノリピドの輸送を触媒する少なくとも酵素Ｅ８、好ましくは、ポリペプチド配列の配列番号８、配列番号２４、配列番号２６、もしくは配列番号２８を有するもの、またはアミノ酸基の２５％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号８、配列番号２４、配列番号２６、もしくは配列番号２８と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号８、配列番号２４、配列番号２６、もしくは配列番号２８を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド配列を有するもの、の増大された活性を有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項１４に記載の少なくとも１種の核酸または請求項１５に記載の少なくとも１種のベクターを含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
本発明のさらなる対象が、以下のプロセス工程、
Ｉ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞を、炭素源を含有する培地と接触させる工程と、
ＩＩ）前記細胞による前記炭素源からのラムノリピドの生成を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程と、
ＩＩＩ）任意選択により、生成された前記ラムノリピドを単離する工程と、
を含む、
一般式（Ｉ）で示されるラムノリピドの生産方法である。
【請求項１３】
化粧製剤、皮膚製剤、または医薬製剤の生産、植物保護製剤の生産、ならびにケア剤および清浄剤および界面活性剤濃縮物の生産のための、請求項１２に記載の方法を用いて得られるラムノリピドの使用。
【請求項１４】
グループ［Ａ１〜Ｇ１］が、以下の配列：
Ａ１ａ）配列番号１で表される配列、ここで、この配列は、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ１ａ）Ａ１ａ）に属する配列に由来し、かつ配列番号１で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ１ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ１ａ）グループＡ１ａ）〜Ｃ１ａ）の１つに属する配列と少なくとも７０％まで同一である配列、
Ｅ１ａ）グループＡ１ａ）〜Ｄ１ａ）の１つに属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、
Ｆ１ａ）グループＡ１ａ）〜Ｅ１ａ）の１つに属する配列の少なくとも１個の塩基の置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、
Ｇ１ａ）グループＡ１ａ）〜Ｆ１ａ）の１つに属する配列に対する相補的配列、
Ａ１ｂ）配列番号１７で表される配列、ここで、この配列は、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ１ｂ）Ａ１ｂ）に属する配列に由来し、かつ配列番号１７で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ１ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ１ｂ）グループＡ１ｂ）〜Ｃ１ｂ）の１つに属する配列と少なくとも７０％まで同一である配列、
Ｅ１ｂ）グループＡ１ｂ）〜Ｄ１ｂ）の１つに属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、
Ｆ１ｂ）グループＡ１ｂ）〜Ｅ１ｂ）の１つに属する配列の少なくとも１個の塩基の置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、および
Ｇ１ｂ）グループＡ１ｂ）〜Ｆ１ｂ）の１つに属する配列に対する相補的配列、
で構成され、かつ
グループ［Ａ２〜Ｇ２］が、以下の配列：
Ａ２ａ）配列番号３で表される配列、ここで、この配列は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ２ａ）Ａ２ａ）に属する配列に由来し、かつ配列番号３で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ２ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ２ａ）グループＡ２ａ）〜Ｃ２ａ）の１つに属する配列と少なくとも８０％まで同一である配列、
Ｅ２ａ）グループＡ２ａ）〜Ｄ２ａ）の１つに属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、
Ｆ２ａ）グループＡ２ａ）〜Ｅ２ａ）の１つに属する配列の少なくとも１個の塩基の置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、
Ｇ２ａ）グループＡ２ａ）〜Ｆ２ａ）の１つに属する配列に対する相補的配列、
Ａ２ｂ）配列番号１９で表される配列、ここで、この配列は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ２ｂ）Ａ２ｂ）に属する配列に由来し、かつ配列番号１９で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ２ｂ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ２ｂ）グループＡ２ｂ）〜Ｃ２ｂ）の１つに属する配列と少なくとも７０％まで同一である配列、
Ｅ２ｂ）グループＡ２ｂ）〜Ｄ２ｂ）の１つに属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、
Ｆ２ｂ）グループＡ２ｂ）〜Ｅ２ｂ）の１つに属する配列の少なくとも１個の塩基の置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、および
Ｇ２ｂ）グループＡ２ｂ）〜Ｆ２ｂ）の１つに属する配列に対する相補的配列、
で構成され、かつ
グループ［Ａ３〜Ｇ３］が、以下の配列：
Ａ３ａ）配列番号５で表される配列、ここで、この配列は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ３ａ）Ａ３ａ）に属する配列に由来し、かつ配列番号５で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ３ａ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ３ａ）グループＡ３ａ）〜Ｃ３ａ）の１つに属する配列と少なくとも８０％まで同一である配列、
Ｅ３ａ）グループＡ３ａ）〜Ｄ３ａ）の１つに属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、
Ｆ３ａ）グループＡ３ａ）〜Ｅ３ａ）の１つに属する配列の少なくとも１個の塩基の置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、
Ｇ３ａ）グループＡ３ａ）〜Ｆ３ａ）の１つに属する配列に対する相補的配列、
Ａ３ｂ）配列番号２１で表される配列、ここで、この配列は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ３ｂ）Ａ３ｂ）に属する配列に由来し、かつ配列番号２１で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ３ｂ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ３ｂ）グループＡ３ｂ）〜Ｃ３ｂ）の１つに属する配列と少なくとも６０％まで同一である配列、
Ｅ３ｂ）グループＡ３ｂ）〜Ｄ３ｂ）の１つに属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、
Ｆ３ｂ）グループＡ３ｂ）〜Ｅ３ｂ）の１つに属する配列の少なくとも１個の塩基の置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、および
Ｇ３ｂ）グループＡ３ｂ）〜Ｆ３ｂ）の１つに属する配列に対する相補的配列、
で構成されることを条件として、少なくともそれぞれの場合に３つのグループ［Ａ１〜Ｇ１］、［Ａ２〜Ｇ２］、および［Ａ３〜Ｇ３］から選択される配列を含有する、単離された核酸。
【請求項１５】
配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４５、配列番号４７、および請求項１４に記載の核酸から選択される少なくとも１種の核酸配列を含む、ベクター、特定的には発現ベクターまたは遺伝子過剰発現カセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ラムノリピドを生産するための細胞および核酸ならびにそれらの使用、およびラムノリピドを生産するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術
界面活性剤は、現在、本質的には石油化学原料を主原料として生産される。再生可能原料系の界面活性剤の使用は、石油化学原料の不足が予見できるためおよび再生可能原料系または生分解性の製品の需要が増大しているため、好適な代替手段である。ラムノリピドは、１個（モノラムノシル脂質）または２個のラムノース基（ジラムノシル脂質）と、１個または２個の３−ヒドロキシ脂肪酸残基とで構成される（Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, pages 3037-51を参照されたい）。それは、界面活性剤として使用するためのあらゆる種類の用途で必要とされる界面活性を有する（Leitermann et al., 2009を参照されたい）。これらの脂質は、現在、さまざまなヒト病原性細菌および動物病原性細菌の野生型単離株、特定的にはシュードモナス属（Pseudomonas）およびバークホルデリア属（Burkholderia）の代表種を用いて、生産される（Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, pages 3037-51を参照されたい）。これらの生産生物が疾患を引き起こし得るという事実により、従来方式で生産されたラムノリピドの顧客満足度は、かなり著しく低減される。さらに、より高い安全性要件も、設備投資の増大および追加の後処理工程の可能性に起因して生産コストに影響を及ぼす。これらの生産生物を利用してある程度高い産物濃度さらには空時収率および／または炭素収率を達成することが可能であるが、これは、単独基質または共基質として植物油の使用を必要とする（Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, pages 3037-51を参照されたい）。しかしながら、植物油は、たとえば、グルコース、スクロース、もしくはポリサッカリド（たとえば、デンプン、セルロース、ヘミセルロースなど）、グリセロール、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＨ４などの他の炭素源と対比して、比較的高価な原料である。さらに、ラムノリピドは、発酵プロセスで激しい起泡を生じやすいという界面活性剤の特性が顕著である。このことは、とくに、親油性基質が利用される場合にあてはまる。この問
題は、たとえば、グルコース、スクロース、ポリサッカリド（デンプン、セルロース、ヘミセルロース）、またはグリセロールなどの水溶性基質の使用では、著しく軽減される。最後に、野生型単離株により生産されるラムノリピドの性質には、限られた範囲内で影響を及ぼし得るにすぎない。現在までのところ、これは、もっぱら、プロセス管理の最適化を介して行われる（ｐＨ、酸素供給量、培地組成、供給戦略、窒素供給量、温度、基質の選択など）。しかしながら、用途に適合する産物の性質に調整できるように、たとえば、種々のラムノリピド種の比（ラムノースおよび３−ヒドロキシ脂肪酸基の数）または３−ヒドロキシ脂肪酸基の鎖長および飽和度などの産物の特定の性質に非常に特定的な影響を及ぼすことが望ましいであろう。ラムノリピドは、家庭用途、清浄化用途、化粧用途、食品加工用途、医薬用途、植物保護用途、および他の用途で界面活性剤として広範に利用されることになれば、現在利用されている界面活性剤と競合した状態になるのは避けられない。これらは、非常に低コストで、顧客に対して明らかな健康リスクがなく、かつ明確に規定された調整可能な製品仕様で生産可能な大量化学品である。したがって、ラムノリピドもまた、できるかぎり低コストで、顧客に対して健康リスクがなく、かつできるかぎり詳細に規定された性質をもたせて、生産されなければならない。ラムノリピドは、たとえば、グルコースやグリセロールなどの便利な炭素源に基づいて、ＧＲＡＳ生物（generally regarded as save）ですでに生産されているが、これは、この場合、もっぱら、モノラムノシル脂質である（Ochsner et al. Appl. Environ. Microbiol. 1995. 61(9):3503-3506）。一方、Cha et al. in Bioresour Technol. 2008. 99(7):2192-9には、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）由来の遺伝子ｒｈｌＡおよびｒｈｌＢの導入によるＰ．プチダ（P. putida）におけるダイズ油からのモノラムノシル脂質の生産が記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、規定された調整可能な性質を有するモノおよびジラムノシル脂質の安価さおよび健康の観点から安全な生産についての必要性が増大している。この調整は、たとえば、個別の酵素活性の供給バランスをとってモノラムノシル脂質の富化を低減することにより、実施可能である。しかしながら、この調整はまた、たとえば、基質特異性に関して、つまり、たとえば、ラムノリピドに組み込まれるヒドロキシ脂肪酸の鎖長に関して、特定の性質を有する酵素を用いることにより、実施可能である。したがって、本発明は、安全な生産宿主を用いて容易に入手可能な炭素源からラムノリピドを生産する可能性を提供するという目的を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の説明
驚くべきことに、以下に説明される細胞およびこの細胞を利用した方法が、明示された本発明の目的の解決に寄与することを見いだした。したがって、本発明は、ラムノリピドを生成可能であり、かつ野生型と比較して遺伝子産物ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、およびｒｈｌＣの相同体の遺伝子産物の少なくとも１つの増大された活性を有する細胞に関する。本発明はさらに、生体触媒としての以上に挙げた細胞と単純な炭素源とを用いたラムノリピドの生産方法に関する。
【０００５】
非病原性でありかつ培養が単純である生物を利用可能なことは、本発明の利点である。単独基質または共基質としての油の使用が必要ないことは、さらなる利点である。他の利点は、本発明を利用して、規定された調整可能な性質を有するラムノリピドを生産可能なことである。ジラムノシル脂質を生産可能であることは、本発明の他の利点である。さらなる利点は、活性が増強されていない細胞を用いるよりも高い空時収率および炭素収率でラムノリピドを生産可能なことである。
【０００６】
冒頭に挙げた目的の達成への寄与は、一般式（Ｉ）
【化１】
2013537411.tif 000002
（式中、
ｍ＝２、１、または０、特定的には１または０、
ｎ＝１または０、特定的には１、
Ｒ１およびＲ２＝互いに独立して２〜２４個、好ましくは５〜１３個の炭素原子を有する同一または異なる有機基、特定的には、任意選択により分枝状、任意選択により置換型、特定的にはヒドロキシ置換型、任意選択により不飽和、特定的には任意選択によりモノ、ジ、またはトリ不飽和のアルキル基、好ましくは、ペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニル、およびトリデセニル、ならびにｏ＝１〜２３、好ましくは４〜１２の（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ３からなる群から選択されるもの）
で示される少なくとも１種のラムノリピドまたはその塩を生成可能な細胞、好ましくは単離細胞によりなされ、それは、野生型と比較して、酵素Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の少なくともの１つの増大された活性を有するように遺伝子改変されたものであり、ここで、酵素Ｅ１は、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸−ＡＣＰを経由するヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸への変換を触媒可能であり、酵素Ｅ２は、ラムノシルトランスフェラーゼＩであり、かつｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒可能であり、酵素Ｅ３は、ラムノシルトランスフェラーゼＩＩであり、かつｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの変換を触媒可能であり、ここで、これらの酵素Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３は、好ましくは、
ポリペプチド配列の配列番号２を有する酵素Ｅ１ａ、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号２と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号２を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ１ａ、ただし、酵素Ｅ１ａの酵素活性は、好ましくは３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸−ＡＣＰを経由するヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号１８を有する酵素Ｅ１ｂ、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号１８と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号１８を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ１ｂ、ただし、酵素Ｅ１ｂの酵素活性は、好ましくは３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸−ＡＣＰを経由するヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号７８を有する酵素Ｅ１ｃ、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号７８と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号７８を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ１ｃ、ただし、酵素Ｅ１ｃの酵素活性は、好ましくは３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸−ＡＣＰを経由するヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号８０を有する酵素Ｅ１ｄ、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号８０と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号８０を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ１ｄ、ただし、酵素Ｅ１ｄの酵素活性は、好ましくは３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸−ＡＣＰを経由するヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号８２を有する酵素Ｅ１ｅ、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号８２と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号８２を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ１ｅ、ただし、酵素Ｅ１ｅの酵素活性は、好ましくは３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸−ＡＣＰを経由するヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
から選択される少なくとも１種の酵素Ｅ１と、
ポリペプチド配列の配列番号４を有する酵素Ｅ２ａ、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号４と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号４を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ２ａ、ただし、酵素Ｅ２ａの酵素活性は、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号２０を有する酵素Ｅ２ｂ、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号２０と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号２０を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ２ｂ、ただし、酵素Ｅ２ｂの酵素活性は、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号８４を有する酵素Ｅ２ｃ、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号８４と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号８４を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ２ｃ、ただし、酵素Ｅ２ｃの酵素活性は、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号８６を有する酵素Ｅ２ｄ、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号８６と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号８６を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ２ｄ、ただし、酵素Ｅ２ｄの酵素活性は、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号８８を有する酵素Ｅ２ｅ、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号８８と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号８８を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ２ｅ、ただし、酵素Ｅ２ｅの酵素活性は、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
から選択されるポリペプチド配列を有する少なくとも１種の酵素Ｅ２と、
ポリペプチド配列の配列番号６を有する酵素Ｅ３ａ、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号６と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号６を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ３ａ、ただし、酵素Ｅ３ａの酵素活性は、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号２２を有する酵素Ｅ３ｂ、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号２２と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号２２を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ３ｂ、ただし、酵素Ｅ３ｂの酵素活性は、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号９０を有する酵素Ｅ３ｃ、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号９０と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号９０を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ３ｃ、ただし、酵素Ｅ３ｃの酵素活性は、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
ポリペプチド配列の配列番号９２を有する酵素Ｅ３ｄ、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号９２と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号９２を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９２％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ３ｄ、ただし、酵素Ｅ３ｄの酵素活性は、好ましくはｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとする、
から選択される少なくとも１種の酵素Ｅ３と、
からなる群から選択される。
【０００７】
一般的に概観するには、図１を比較されたい。
【０００８】
細胞の「野生型」とは、本明細書では、ゲノムが進化により自然に形成された状態にある細胞を意味する。この用語は、細胞全体と個別遺伝子との両方に用いられる。したがって、「野生型」という用語は、特定的には、遺伝子配列が少なくとも部分的に組換え法により人為的に改変された細胞や遺伝子を包含しない。「ラムノリピド」という用語は、本発明との関連では、一般式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を意味するものとみなされる。酵素Ｅ１ａ〜Ｅ３ｂの実際に以上に示された活性が、以上に挙げられた酵素のより広範な活性範囲のうちの特別な例示的選択肢にすぎないことは、明らかであり、挙げられたそれぞれの活性は、信頼性のある測定法が所与の酵素の場合に利用可能なものである。したがって、非分枝状飽和Ｃ１０−アルキル基を有する基質の酵素が同様に、たとえ任意選択により活性低下を伴ったとしても、任意選択により分枝状または不飽和でもあり得るＣ６またはＣ１６−アルキル基を含有する基質を変換することは、明らかである。
【０００９】
「酵素の増大された活性」という用語は、好ましくは、増大された細胞内活性を意味するとみなされるものとする。細胞内の酵素活性を増大させるための次に続く実施形態は、酵素Ｅ１〜Ｅ３の活性の増大だけでなく、活性を任意選択により増大可能なすべての後述の酵素に対してもあてはまる。原理的には、酵素活性の増大は、酵素をコードする１種もしくは複数種の遺伝子配列のコピー数を増大させることにより、強力なプロモーターもしくは改良されたリボソーム結合部位を用いることにより、転写レギュレーターなどを用いて遺伝子発現の負の調節を低減するかもしくは遺伝子発現の正の調節を増幅することにより、遺伝子のコドン使用頻度を改変することにより、種々の方法でｍＲＮＡもしくは酵素の半減期を増大させることにより、遺伝子の発現の調節を改変することにより、または増大された活性を有する適切な酵素をコードする遺伝子もしくは対立遺伝子を利用することにより、さらには任意選択によりこれらの手段を組み合わせることにより、達成可能である。本発明によれば、遺伝子改変細胞は、たとえば、所望の遺伝子、この遺伝子の対立遺伝子、またはその一部を含有し、かつ任意選択によりその遺伝子の発現を可能になるプロモーターを含有するベクターを用いて、形質転換、形質導入、接合、またはこれら方法の組合せにより、生産される。異種発現は、特定的には、細胞の染色体内へのまたは染色体外で複製するベクター内への遺伝子または対立遺伝子の組込みにより、達成される。独国特許出願公開第１００３１９９９号には、ピルビン酸カルボキシラーゼにより例示される細胞内の酵素活性の増大可能性についての一般的概観が与えられており、これは、参考文献として本明細書に組み入れられ、細胞内の酵素活性の増大可能性に関するその開示内容は、本発明の開示の一部を形成するものとする。以上のおよびすべての後述の酵素または遺伝子の発現は、一次元および二次元タンパク質ゲル分離、それに続く適切な解析ソフトウェアを用いたゲル中タンパク質濃度の光学的同定により、検出可能である。酵素活性の増大が、排他的に、対応する遺伝子の発現の増大に基づく場合、酵素活性の増大の定量は、野生型細胞と遺伝子改変細胞との間で一次元または二次元タンパク質分離を比較することにより単純な方式で決定可能である。コリネ型細菌の場合のタンパク質ゲルの調製およびタンパク質の同定のための慣用的方法は、Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001))により記述された手順である。タンパク質濃度は、同様に、検出対象のタンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットハイブリダイゼーション（Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989）およびそれに続く濃度決定に適切なソフトウェアを用いた光学的分析（Lohaus and Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999) Angewandte Chemie 111: 2630-2647）により、分析可能である。ＤＮＡ結合タンパク質の活性は、ＤＮＡバンドシフトアッセイ（ゲル遅延とも呼ばれる）を利用して測定可能である（Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155）。他の遺伝子の発現に及ぼすＤＮＡ結合タンパク質の作用は、種々の詳細に記載されたレポーター遺伝子アッセイ法により検出可能である（Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989）。細胞内酵素活性は、種々の記載の方法に従って決定可能である（Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627、Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823）。以下の実施形態で特定の酵素の活性を決定する実用的方法が示されていない場合、酵素活性の増大の決定さらには酵素活性の減少の決定は、好ましくは、Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001)、Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998)、Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999)、およびWilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001)に記載の方法を利用して行われる。酵素活性の増大を内因性遺伝子の突然変異により達成する場合、そのような突然変異は、たとえば、ＵＶ照射もしくは突然変異原性化学物質などを用いた従来法によりランダムに行うか、または欠失、挿入、および／もしくはヌクレオチド交換などの遺伝子工学的方法を利用して選択的に行うか、のいずれかである。改変細胞は、これらの突然変異により得られる。酵素のとくに好ましい突然変異体はまた、特定的には、もはやフィードバック阻害性も産物阻害性も基質阻害性もない酵素であるか、またはそうした阻害性が少なくとも野生型酵素と比較して低減された範囲内にある酵素である。酵素活性の増大を酵素合成の増大により達成する場合、対応する遺伝子のコピー数を増大させるか、または構造遺伝子の上流に位置するプロモーターおよび調節領域またはリボソーム結合部位を突然変異させる。構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットも、同様に機能する。そのほかに、誘導性プロモーターを利用して、任意の所望の時点で発現を増大させることが可能である。しかしながら、それに加えて、「エンハンサー」もまた、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの間の改良された相互作用を利用して同様に増大された遺伝子発現を引き起こす調節配列として酵素遺伝子に帰属可能である。ｍＲＮＡの寿命の延長手段の結果として、同様に発現が改良される。さらに、酵素タンパク質の分解の予防により、同様に酵素活性が増大される。遺伝子または遺伝子構築物は、この場合、異なるコピー数を有するプラスミド中に存在するか、または染色体中に組み込まれて増幅される。他の選択肢として、さらに、培地組成および培養管理の改変により、関係する遺伝子の過剰発現を達成することが可能である。当業者であれば、このための方策が、とくに、Marti
n et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987))に、Guerrero et al. (Genes 138, 35-41 (1994))、Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))に、Eikmanns et al. (Genes 102, 93-98 (1991))に、欧州特許出願公開第０４７２８６９号に、米国特許第４，６０１，８９３号に、Schwarzer and Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991))に、Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))に、LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))に、国際出願公開第９６／１５２４６号に、Malumbres et al. (Genes 134, 15-24 (1993))に、特開平１０−２２９８９１号に、Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))に、ならびに遺伝学および分子生物学の公知の教科書に、見いだされる。以上に記載の手段は同様に、突然変異のように遺伝子改変細胞をもたらす。たとえば、エピソームプラスミドは、それぞれの遺伝子の発現を増大させるために利用される。好適なプラスミドまたはベクターは、原理的には、当業者がこの目的に利用可能なすべての実施形態である。そのようなプラスミドおよびベクターは、たとえば、Novagen、Promega、New England Biolabs、Clontech、またはGibco BRLの会社のパンフレットから入手可能である。さらなる好ましいプラスミドおよびベクターは、Glover, D. M. (1985) DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd. , Oxford、Rodriguez, R.L. and Denhardt, D. T (eds) (1988) Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham、Goeddel, D. V. (1990) Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7、Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに見いだしうる。次いで、増幅対象の遺伝子を含有するプラスミドベクターは、接合または形質転換により所望の株に変換される。接合方法は、たとえば、Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994)に記載されている。形質転換方法は、たとえば、Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988)、Dunican and Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989)、およびTauch et al., FEMS Microbiology Let-ters 123: 343-347 (1994)に記載されている。「交差」イベントを利用した相同的組換えの後、得られる株は、関係する遺伝子の少なくとも２つのコピーを含有する。
【００１０】
以上でおよび以下の実施形態で用いられる表現の「野生型と比較して増大された酵素Ｅｘの活性」とは、常に、好ましくは少なくとも２倍、とくに好ましくは少なくとも１０倍、さらに好ましくは少なくとも１００倍、それよりさらに好ましくは少なくとも１，０００倍、最も好ましくは少なくとも１０，０００倍に増大されたそれぞれの酵素Ｅｘの活性を意味するものとみなされる。さらに、「野生型と比較して増大された酵素Ｅｘの活性」を有する本発明に係る細胞はまた、特定的には、野生型がこの酵素Ｅｘの活性を含有していないかまたは少なくとも検出可能な活性を含有しておらず、かつたとえば過剰発現により酵素活性を増大させた後にのみ、この酵素Ｅｘの検出可能な活性を呈する、細胞を含む。これとの関連では、「過剰発現」という用語または以下の実施形態で用いられる「発現を増大させる」という表現はまた、出発細胞たとえば野生型細胞が発現を有していないかまたは少なくとも検出可能な発現を有しておらず、かつ酵素Ｅｘの検出可能な合成が組換え法によってのみ誘導される場合を包含する。
【００１１】
所与のポリペプチドの性質および機能に有意な変化をもたらさない所与のポリペプチド配列のアミノ酸基の変化は、当業者に公知である。したがって、たとえば、「保存アミノ酸」は、相互に交換可能であり、そのような好適なアミノ酸置換の例は、Ｓｅｒに対してＡｌａ、Ｌｙｓに対してＡｒｇ、ＧｌｎまたはＨｉｓに対してＡｓｎ、Ｇｌｕに対してＡｓｐ、Ｓｅｒに対してＣｙｓ、Ａｓｎに対してＧｌｎ、Ａｓｐに対してＧｌｕ、Ｐｒｏに対してＧｌｙ、ＡｓｎまたはＧｌｎに対してＨｉｓ、ＬｅｕまたはＶａｌに対してＩｌｅ、ＭｅｔまたはＶａｌに対してＬｅｕ、ＡｒｇまたはＧｌｎまたはＧｌｕに対してＬｙｓ、ＬｅｕまたはＩｌｅに対してＭｅｔ、ＭｅｔまたはＬｅｕまたはＴｙｒに対してＰｈｅ、Ｔｈｒに対してＳｅｒ、Ｓｅｒに対してＴｈｒ、Ｔｙｒに対してＴｒｐ、ＴｒｐまたはＰｈｅに対してＴｙｒ、ＩｌｅまたはＬｅｕに対してＶａｌである。たとえばアミノ酸の挿入または欠失の形での、とくにポリペプチドのＮ末端またはＣ末端での変化が、多くの場合、ポリペプチドの機能に有意な影響を及ぼさないことは、同様に公知である。
【００１２】
酵素の活性は、当業者に公知のように、たとえば、ボールミル、フレンチプレス、または超音波破砕機を利用して、この活性を含有する細胞を破壊し、続いて、１３，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離して、細胞、細胞片、および破壊助剤たとえばガラスビーズなどを分離除去することにより、決定可能である。次いで、得られる無細胞粗抽出物を用いて、産物の後続ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ検出による酵素アッセイを行うことが可能である。他の選択肢として、クロマトグラフィー法（たとえば、ニッケル−ニトリロ三酢酸アフィニティークロマトグラフィー、ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィー）により当業者に公知のように酵素を富化することが可能であるか、さもなければ、均一になるまで精製することが可能である。次いで、以上に記載したように得られたサンプルを用いて、酵素Ｅ１の活性を次のようにして決定する。標準的アッセイは、１２０μＬの最終体積中に、１００μＭの大腸菌（E. coli）ＡＣＰ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２００μＭのマロニル−補酵素Ａ、４０μＭのオクタノイル−補酵素Ａ（Ｅ１ａ用）、またはドデカノイル−補酵素Ａ（Ｅ１ｂ用）、１００μＭのＮＡＤＰＨ、２μｇの大腸菌（E. coli）ＦａｂＤ、２μｇのマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）ＦａｂＨ、１μｇの大腸菌（E. coli）ＦａｂＧ、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０、および５μｇの酵素Ｅ１を含有する。ＡＣＰ、β−メルカプトエタノール、およびリン酸ナトリウム緩衝液を３７℃で３０分間プレインキュベートしてＡＣＰを完全に還元する。酵素Ｅ１の添加により反応を開始する。ＨＣｌでｐＨ２．０に酸性化された２ｍｌの水を用いて反応を停止し、続いて、２ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１（ｖ：ｖ））で２回抽出する。遠心分離（１６，１００ｇ、５分、ＲＴ）により相分離を行う。下側有機相を除去し、真空遠心分離機で完全に蒸発させ、沈降物を５０μｌのメタノール中に取り込む。不溶分を遠心分離（１６，１００ｇ、５分、ＲＴ）により沈降させ、サンプルをＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより分析する。対応する質量トレースおよびＭＳ２スペクトルを解析することにより産物の同定を行う。
【００１３】
次いで、以上に記載したように得られたサンプルを用いて、酵素Ｅ２の活性を次のように決定する。標準的アッセイは、溶液中の、１８５μｌの１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０μｌの１２５ｍＭ  ｄＴＤＰ−ラムノース、および５０μｌのタンパク質粗抽出物（約１ｍｇの全タンパク質）または精製タンパク質（５μｇの精製タンパク質）で構成可能である。３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸（Ｅ２ａ用）または３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸（Ｅ２ｂ用）の１０ｍＭエタノール性溶液１０μｌの添加により反応を開始し、振盪（６００ｒｐｍ）しながら３０℃で１時間インキュベートする。続いて、１ｍｌのアセトンで反応を処理する。不溶分を遠心分離（１６，１００ｇ、５分、ＲＴ）により沈降させ、サンプルをＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより分析する。対応する質量トレースおよびＭＳ２スペクトルを解析することにより産物の同定を行う。
【００１４】
次いで、以上に記載したように得られたサンプルを用いて、酵素Ｅ３の活性を次のように決定する。標準的アッセイは、溶液中の、１８５μｌの１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０μｌの１２５ｍＭのｄＴＤＰ−ラムノース、および５０μｌのタンパク質粗抽出物（約１ｍｇの全タンパク質）または精製タンパク質（５μｇの精製タンパク質）で構成可能である。α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸（Ｅ３ａ用）またはα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸（Ｅ３ｂ用）の１０ｍＭエタノール性溶液１０μｌの添加により反応を開始し、振盪（６００ｒｐｍ）しながら３０℃で１時間インキュベートする。続いて、１ｍｌのアセトンで反応を処理する。不溶分を遠心分離（１６，１００ｇ、５分、ＲＴ）により沈降させ、サンプルをＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより分析する。対応する質量トレースおよびＭＳ２スペクトルを解析することにより産物の同定を行う。
【００１５】
以下の酵素の組合せ：
Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ１Ｅ２、Ｅ１Ｅ３、Ｅ２Ｅ３、およびＥ１Ｅ２Ｅ３
の増大された活性を有する本発明に係る細胞が好ましく、このうち、組合せ
Ｅ２、Ｅ２Ｅ３、およびＥ１Ｅ２Ｅ３、特定的にはＥ１Ｅ２Ｅ３
は、とくに好ましい。
【００１６】
酵素の組合せＥ１Ｅ２Ｅ３の増大された活性を有する本発明に係る細胞の好ましい実施形態では、ｎは、好ましくは＝１である。
【００１７】
本発明に係る細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。これらは、哺乳動物細胞（たとえば、ヒト由来細胞など）、植物細胞、または微生物、たとえば、酵母、菌類、もしくは細菌であり得る。中でも、微生物はとくに好ましく、細菌および酵母は最も好ましい。好適な細菌、酵母、または菌類は、特定的には、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) GmbH (DSMZ), Brunswick, Germanyに細菌、酵母、または菌類の株として寄託された細菌、酵母、または菌類である。本発明に好適な細菌は、
http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm、
に列挙された属に属し、本発明に好適な酵母は、
http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm
に列挙された属に属し、本発明に好適な菌類は、
http://www.dsmz.de/species/fungi.htm
に列挙されたものである。
【００１８】
本発明に係る好ましい細胞は、アスペルギルス属（Aspergillus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、バチルス属（Bacillus）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、パラコッカス属（Paracoccus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、エシェリキア属（Escherichia）、ザイモモナス属（Zymomonas）、ヤロウイア属（Yarrowia）、メチロバクテリウム属（Methylobacterium）、ラルストニア属（Ralstonia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ロドスピリラム属（Rhodospirillum）、ロドバクター属（Rhodobacter）、バークホルデリア属（Burkholderia）、クロストリジウム属（Clostridium）、およびカプリアビダス属（Cupriavidus）のものであり、中でも、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アルカリゲネス・ラタス（Alcaligenes latus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、バークホルデリア・アンドロポゴニス（Burkholderia andropogonis）、Ｂ．ブラシレンシス（B. brasilensis）、Ｂ．カレドニカ（B. caledonica）、Ｂ．カリベンシス（B. caribensis）、Ｂ．カリオフィリ（B. caryophylli）、Ｂ．フンゴラム（B. fungorum）、Ｂ．グラジオリ（B. gladioli）、Ｂ．グラセイ（B. glathei）、Ｂ．グルマエ（B. glumae）、Ｂ．グラミニス（B. graminis）、Ｂ．ホスピタ（B. hospita）、Ｂ．クルリエンシス（B. kururiensis）、Ｂ．フェナジニウム（B. phenazinium）、Ｂ．フィマタム（B. phymatum）、Ｂ．フィトファーマンス（B. phytofirmans）、Ｂ．プランタリイ（B. plantarii）、Ｂ．サッカリ（B. sacchari）、Ｂ．シンガポレンシス（B. singaporensis）、Ｂ．ソルディディコラ（B. sordidicola）、Ｂ．テリコラ（B. terricola）、Ｂ．トロピカ（B. tropica）、Ｂ．ツベラム（B. tuberum）、Ｂ．ウボネンシス（B. ubonensis）、Ｂ．ウナマエ（B. unamae）、Ｂ．ゼノボランス（B. xenovorans）、Ｂ．アンチナ（B. anthina）、Ｂ．ピロシニア（B. pyrrocinia）、Ｂ．タイランデンシス（B. thailandensis）、カンジダ・ブランキイ（Candida blankii）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）、メチロバクテリウム・エクストルクエンス（Methylobacterium extorquens）、パラコッカス・ベルスタス（Paracoccus versutus）、シュードモナス・アルゼンチネンシス（Pseudomonas argentinensis）、Ｐ．ボルボリ（P. borbori）、Ｐ．シトロネロリス（P. citronellolis）、Ｐ．フラベセンス（P. flavescens）、Ｐ．メンドシナ（P. mendocina）、Ｐ．ニトロレデュセンス（P. nitroreducens）、Ｐ．オレオボランス（P. oleovorans）、Ｐ．シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）、Ｐ．レジノボランス（P. resinovorans）、Ｐ．ストラミネア（P. straminea）、Ｐ．オーランティアカ（P. aurantiaca）、Ｐ．オーレオファシエンス（P. aureofaciens）、Ｐ．クロロラフィス（P. chlororaphis）、Ｐ．フラギ（P. fragi）、Ｐ．ルンデンシス（P. lundensis）、Ｐ．タエトロレンス（P. taetrolens）、Ｐ．アンタークティカ（P. antarctica）、Ｐ．アゾトフォルマンス（P. azotoformans）、「Ｐ．ブラッチフォルダエ（P. blatchfordae）」、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）、Ｐ．ブレンネリ（P. brenneri）、Ｐ．セドリナ（P. cedrina）、Ｐ．コルガタ（P. corrugata）、Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens）、Ｐ．ゲッサルディイ（P. gessardii）、Ｐ．リバネンシス（P. libanensis）、Ｐ．マンデリイ（P. mandelii）、Ｐ．マルギナリス（P. marginalis）、Ｐ．メディテラネア（P. mediterranea）、Ｐ．メリディアナ（P. meridiana）、Ｐ．ミグラエ（P. migulae）、Ｐ．ムシドレンス（P. mucidolens）、Ｐ．オリエンタリス（P. orientalis）、Ｐ．パナシス（P. panacis）、Ｐ．プロテオリティカ（P. proteolytica）、Ｐ．ローデシアエ（P. rhodesiae）、Ｐ．シンキサンタ（P. synxantha）、Ｐ．チベルバレンシス（P. thivervalensis）、Ｐ．トラシイ（P. tolaasii）、Ｐ．ベロニイ（P. veronii）、Ｐ．デニトリフィカンス（P. denitrificans）、Ｐ．ペルツシノゲナ（P. pertucinogena）、Ｐ．クレモリコロラタ（P. cremoricolorata）、Ｐ．フルバ（P. fulva）、Ｐ．モンテイリイ（P. monteilii）、Ｐ．モッセリイ（P. mosselii）、Ｐ．パラフルバ（P. parafulva）、Ｐ．プチダ（P. putida）、Ｐ．バレアリカ（P. balearica）、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）、Ｐ．アミグダリ（P. amygdali）、Ｐ．アベラナエ（P. avellanae）、Ｐ．カリカパパヤエ（P. caricapapayae）、Ｐ．チコリー（P. cichorii）、Ｐ．コロナファシエンス（P. coronafaciens）、Ｐ．フィクセレクタエ（P. ficuserectae）、「Ｐ．ヘリアンティ（P. helianthi）」、Ｐ．メリアエ（P. meliae）、Ｐ．サバスタノイ（P. savastanoi）、Ｐ．シリンガエ（P. syringae）、Ｐ．トマト（P. tomato）、Ｐ．ビリディフラバ（P. viridiflava）、Ｐ．アビエタニフィラ（P. abietaniphila）、Ｐ．アシドフィラ（P. acidophila）、Ｐ．アガリシ（P. agarici）、Ｐ．アルカリフィラ（P. alcaliphila）、Ｐ．アルカノリティカ（P. alkanolytica）、Ｐ．アミロデラモサ（P. amyloderamosa）、Ｐ．アスプレニイ（P. asplenii）、Ｐ．アゾティフィゲンス（P. azotifigens）、Ｐ．カナビナ（P. cannabina）、Ｐ．コエノビオス（P. coenobios）、Ｐ．コンゲランス（P. congelans）、Ｐ．コスタンチニイ（P. costantinii）、Ｐ．クルシビアエ（P. cruciviae）、Ｐ．デルヒエンシス（P. delhiensis）、Ｐ．エクスシビス（P. excibis）、Ｐ．エクストレモリエンタリス（P. extremorientalis）、Ｐ．フレデリクスベルゲンシス（P. frederiksbergensis）、Ｐ．フスコバギナエ（P. fuscovaginae）、Ｐ．ゲリディコラ（P. gelidicola）、Ｐ．グリモンティイ（P. grimontii）、Ｐ．インディカ（P. indica）、Ｐ．ジェッセニイ（P. jessenii）、Ｐ．ジンジュエンシス（P. jinjuensis）、Ｐ．キロネンシス（P. kilonensis）、Ｐ．クナックムッシイ（P. knackmussii）、Ｐ．コーリエンシス（P. koreensis）、Ｐ．リニ（P. lini）、Ｐ．ルテア（P. lutea）、Ｐ．モラビエンシス（P. moraviensis）、Ｐ．オティティディス（P. otitidis）、Ｐ．パチャストレラエ（P. pachastrellae）、Ｐ．パレロニアナ（P. palleroniana）、Ｐ．パパベリス（P. papaveris）、Ｐ．ペリ（P. peli）、Ｐ．ペロレンス（P. perolens）、Ｐ．ポアエ（P. poae）、Ｐ．ポハンエンシス（P. pohangensis）、Ｐ��サイクロフィラ（P. psychrophila）、Ｐ．サイクロトレランス（P. psychrotolerans）、Ｐ．ラトニス（P. rathonis）、Ｐ．レプティリボラ（P. reptilivora）、Ｐ．レシニフィラ（P. resiniphila）、Ｐ．リゾスファエラエ（P. rhizosphaerae）、Ｐ．ルベッセンス（P. rubescens）、Ｐ．サロモニイ（P. salomonii）、Ｐ．セギティス（P. segitis）、Ｐ．セプティカ（P. septica）、Ｐ．シミアエ（P. simiae）、Ｐ．スイス（P. suis）、Ｐ．サーモトレランス（P. thermotolerans）、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）、Ｐ．トレマエ（P. tremae）、Ｐ．トリビアリス（P. trivialis）、Ｐ．ツルビネラエ（P. turbinellae）、Ｐ．ツティコリネンシス（P. tuticorinensis）、Ｐ．ウムソンゲンシス（P. umsongensis）、Ｐ．バンコウベレンシス（P. vancouverensis）、Ｐ．ブラノベンシス（P. vranovensis）、Ｐ．キサントマリナ（P. xanthomarina）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）（特定的にはシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida））およびザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）およびバークホルデリア・タイランデンシス（Burkholderia thailandensis）は、とくに好ましい。
【００１９】
本発明に係る好ましい細胞は、野生型としてはラムノリピドを形成しないかまたは検出可能量のラムノリピドを形成せず、さらに野生型としては、好ましくは、酵素Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の活性を有していないかまたはそれらの検出可能な活性を有していない。
【００２０】
本発明によれば、本発明に係る細胞が、野生型としてＣ６〜Ｃ１６のモノアルカノエート鎖長を有するポリヒドロキシアルカノエートを形成可能な細胞であれば、有利である。そのような細胞は、たとえば、バークホルデリア属（Burkholderia）の種、バークホルデリア・タイランデンシス（Burkholderia thailandensis）、シュードモナス属（Pseudomonas）の種、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・シトロネロリス（Pseudomonas citronellolis）、シュードモナス・レジノボランス（Pseudomonas resinovorans）、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）、アルカリゲネス・ラタス（Alcaligenes latus）、およびラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）である。これとの関連では、本発明に係る好ましい細胞は、その野生型と比較して、より少量のポリヒドロキシアルカノエートを形成可能なように遺伝子改変される。そのような細胞は、たとえば、De Eugenio et al., Environ Microbiol. 2010. 12(1):207-21、およびRehm et al., Appl Environ Microbiol. 2001. 67(7):3102-9に記載されている。野生型と比較してより少量のポリヒドロキシアルカノエートを形成可能なそのような細胞は、特定的には、野生型と比較して少なくとも１種の酵素Ｅ９またはＥ１０の低減された活性を有することを特徴とし、
ここで、Ｅ９は、ポリヒドロキシアルカン酸シンターゼＥＣ：２．３．１．であり、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号３０もしくは配列番号３２を有するもの、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号３０もしくは配列番号３２と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号３０もしくは配列番号３２を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有するものを表し、ただし、酵素Ｅ９の酵素活性は、３−ヒドロキシアルカノイル−補酵素Ａからポリ−３−ヒドロキシアルカン酸への変換能力、特定的には、３−ヒドロキシテトラデカノイル−補酵素Ａからポリ−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換能力を意味するとみなされるものとし、
Ｅ１０は、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰ：補酵素Ａ転移酵素、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号３４もしくは配列番号３６を有するもの、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号３４もしくは配列番号３６と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号３４もしくは配列番号３６を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有するものを表し、ただし、酵素Ｅ１０の酵素活性は、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシアルカナノイル−補酵素Ａへの変換能力、特定的には、３−ヒドロキシアルカナノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−補酵素Ａへの変換能力を意味するとみなされるものとする。
【００２１】
一般的に概観するには、図１を比較されたい。
【００２２】
次いで、酵素Ｅ１〜Ｅ３に対して以上に記載したように得られたサンプルを用いて、最初に、５６０μｌの１００ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５と、ＤＭＳＯ中の２０μｌの３５ｍＭ  ＤＴＮＢと、２０μｌの４１ｍＭ  ３−ヒドロキシデカノイル−補酵素Ａと、を混合することにより、酵素Ｅ９の活性を決定する。続いて、１００μｌのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５中の５μｇの精製酵素Ｅ９を添加し、続いて、経時的な４１２ｎｍの吸光度の増大（５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンゾエート）（ＤＴＮＢ）を添加してＳＨ基を遊離させることにより引き起こされる）（ΔＥ／分）を分光光度計で連続的に１分間記録する。
【００２３】
次いで、酵素Ｅ１〜Ｅ３に対して以上に記載したように得られたサンプルを用いて、酵素Ｅ１０の活性を決定する。標準的アッセイは、２００μｌの全体積で５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５中に、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０μＭヒドロキシデカノイル−補酵素Ａ、および２０μＭ大腸菌（E. coli）ＡＣＰを含有する。５０μｌのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５中の５μｇの精製酵素Ｅ１０の添加により反応を開始し、３０℃で１時間インキュベートする。５０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸および１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（３０μｌ）の添加により反応を停止する。５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンゾエート）（ＤＴＮＢ）を添加してＳＨ基を遊離させることにより引き起こされる４１２ｎｍの吸光度の増大を経時的に記録することにより、放出された補酵素Ａを分光光度法で決定する。
【００２４】
したがって、用いられる「酵素Ｅｘの低減された活性」という表現は、好ましくは少なくとも０．５倍、とくに好ましくは少なくとも０．１倍、さらに好ましくは少なくとも０．０１倍、それよりさらに好ましくは少なくとも０．００１倍、最も好ましくは少なくとも０．０００１倍に低減された活性を意味するものとみなされる。「低減された活性」という表現はまた、検出可能な活性を含まない（「ゼロの活性」）。特定の酵素の活性の低減は、たとえば、選択的突然変異により、または特定の酵素の活性を低減させる当業者に公知の他の手段により、実施可能である。微生物中の酵素活性を低減させる方法は、当業者に公知である。とくに、ここでは分子生物学的技術を取り上げる。当業者であれば、とくにシュードモナス属（Pseudomonas）およびバークホルデリア属（Burkholderia）でのタンパク質発現の改変および低減ならびに酵素活性の付随的低下のための手引き、特定的には、特定遺伝子の中断のための手引きは、たとえば、Dubeau et al. 2009. BMC Microbiology 9:263、Singh & Rohm. Microbiology. 2008. 154:797-809、またはLee et al. FEMS Microbiol Lett. 2009. 297(1):38-48に見いだされる。本発明に係る好ましい細胞は、酵素活性の低減が、前記核酸配列の１つを含む遺伝子の改変により達成されることを特徴とし、この改変は、遺伝子中への外来ＤＮＡの挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列中の点突然変異、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、またはその遺伝子にフランキングする調節配列、たとえば、プロモーターやターミネーターなどもしくはリボソーム結合部位の改変（挿入、欠失、もしくは点突然変異）を含む群、好ましくはそれらで構成される群から選択される。外来ＤＮＡは、これとの関連では、遺伝子（生物ではない）に対して「外来」である任意のＤＮＡ配列を意味するものとみなされる。すなわち、内因性ＤＮＡ配列もまた、これとの関連では、「外来ＤＮＡ」として機能し得る。これとの関連では、遺伝子は、選択マーカー遺伝子の挿入により中断されることがとくに好ましく、したがって、外来ＤＮＡは、選択マーカー遺伝子であり、好ましくは、挿入は、その遺伝子座での相同的組換えにより行われたものである。
【００２５】
本発明に係る細胞の好ましい実施形態では、関係する細胞は、野生型と比較して低減されたポリヒドロキシアルカノエート合成を有するシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）細胞である。そのような細胞は、たとえば、Ren et al., Journal Applied Microbiology and Biotechnology 1998 Jun, 49(6):743-50にＧＰｐ１２１、ＧＰｐ１２２、ＧＰｐ１２３、およびＧＰｐ１２４として、Huisman et al., J Biol Chem. 1991 Feb 5; 266(4):2191-8にＧＰｐ１０４として、さらにはDe Eugenio et al., Environ Microbiol. 2010. 12(1):207-21にＫＴ４２Ｃ１として、およびOuyang et al. Macromol Biosci. 2007. 7(2):227-33にＫＴＯＹ０１およびＫＴＯＹ０２として、記載されており、本発明に係る好ましい細胞である。
【００２６】
本発明に係る細胞が、ｍ＝１を有するラムノリピドを形成可能である場合、Ｒ１およびＲ２により定義される基
【化２】
2013537411.tif 000003
は、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシドデセン酸３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデセン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデセン酸、３−ヒドロキシテトラデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシヘキサデカン酸、または３−ヒドロキシヘキサデカノイル−３−ヒドロキシヘキサデカン酸から誘導されることが好ましい。
【００２７】
当業者であれば、本発明に係る細胞がまた、一般式（Ｉ）で示される異なるラムノリピドの混合物を生成可能であることは、明らかである。
【００２８】
これとの関連では、本発明に係る細胞は、一般式（Ｉ）で示されるラムノリピドの混合物を生成可能であることが好ましく、特徴として、生成されるラムノリピドの８０重量％超、好ましくは９０重量％超、とくに好ましくは９５重量％超で、ｎは＝１であり、かつＲ１およびＲ２により定義される基は、生成されるラムノリピドの１０重量％未満、好ましくは５重量％未満、とくに好ましくは２重量％未満で、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸または３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデカン酸から誘導され、指定された重量％は、生成される一般式（Ｉ）で示されるすべてのラムノリピドの和を基準とする。
【００２９】
本発明に係る細胞が、野生型と比較して、以下のものからなる群から選択される酵素の少なくとも１つのそれぞれの場合に以下に明記される活性が増大されるように、Ｅ１〜Ｅ３に対して追加的に遺伝子改変されたものであれば有利である。
少なくとも１種の酵素Ｅ４、ｄＴＴＰ：α−Ｄ−グルコース−１−リン酸チミジリルトランスフェラーゼ、ＥＣ２．７．７．２４、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号１０を有するもの、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号１０と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号１０を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有するもの、ただし、酵素Ｅ４の酵素活性は、α−Ｄ−グルコース−１−リン酸およびｄＴＴＰからｄＴＤＰ−グルコースへの変換能力を意味するとみなされるものとする、
少なくとも１種の酵素Ｅ５、ｄＴＴＰ−グルコース−４，６−ヒドロリアーゼ、ＥＣ４．２．１．４６、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号１２を有するもの、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号１２と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号１２を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有するもの、ただし、酵素Ｅ５の酵素活性は、ｄＴＤＰ−グルコースからｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｄ−グルコースへの変換能力を意味するとみなされるものとする、
少なくとも１種の酵素Ｅ６、ｄＴＤＰ−４−デヒドロラムノース−３，５−エピメラーゼ、ＥＣ５．１．３．１３、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号１４を有するもの、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号１４と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号１４を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有するもの、ただし、酵素Ｅ６の酵素活性は、ｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｄ−グルコースからｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｌ−マンノースへの変換能力を意味するとみなされるものとする、ならびに
少なくとも１種の酵素Ｅ７、ｄＴＤＰ−４−デヒドロラムノースレダクターゼ、ＥＣ１．１．１．１３３、特定的には、ポリペプチド配列の配列番号１６を有するもの、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、参照配列の配列番号１６と比較して改変されているが、それでもなお、参照配列の配列番号１６を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは５０％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有するもの、ただし、酵素Ｅ７の酵素活性は、ｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｌ−マンノースからｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−マンノースへの変換能力を意味するとみなされるものとする。
【００３０】
酵素Ｅ４の活性は、酵素Ｅ１〜Ｅ３に対して以上のように得られたサンプルを用いて、５０μｌのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５中でｄＴＴＰ（５ｍＭ）および５μｇの精製酵素Ｅ４と共にα−Ｄ−グルコース−１−リン酸（１．３ｍＭ）をインキュベートし、３０℃で５、１０、および２０分間インキュベートした後、２０μｌのクロロホルムを添加して反応を停止することにより、決定される。次いで、混合物を撹拌し、１６，０００ｇおよび室温で５分間遠心分離する。水性相を新しい反応容器に移し、有機相を８０μｌの水で再度抽出する。両方の水性相を合わせ、ＨＰＬＣにより解析する。ここでは、Phenosphere ODS2カラム（２５０×４．６ｍｍ、Phenomenex, Torrance, USA）またはSpheresorb ODS2カラム（２５０×４．６ｍｍ、Waters, Milford, USA）を使用する。０．５Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（溶出液Ａ）を用いて１ｍｌ・分−１の流量で１５分間にわたりアナライトの溶出を行い、続いて、８０％溶出液Ａおよび２０％メタノールまでのリニアグラジエントを用いて０．７ｍｌ・分−１の流量で１４分間にわたり溶出を行う。次いで、ODS2カラムから溶出したアナライトをPhenosphere SAXイオン交換カラム（２５０×４．６ｍｍ、Phenomenex, Torrance, USA）に注入し、１ｍｌ・分−１の流量およびアンモニウムホルメートリニアグラジエント（２５分間にわたり２から６００ｍＭへ）を用いてアナライトを溶出させる。次いで、フォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を用いてｄＴＤＰグルコースの定量をそのＵＶ吸収により行う。チミジンの吸収極大は２６７ｎｍである。基準ヌクレオチド糖（Sigma-Aldrich, Munich, USA）により検量を行う。
【００３１】
次いで、酵素Ｅ１〜Ｅ３に対して以上のように得られたサンプルを用いて、５０μｌのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５中で５μｇの精製酵素Ｅ５と共にｄＴＤＰ−α−Ｄ−グルコース（１．３ｍＭ）をインキュベートし、３０℃で５、１０、および２０分間インキュベートした後、２０μｌのクロロホルムを添加して反応を停止することにより、酵素Ｅ５の活性を決定する。次いで、混合物を撹拌し、１６，０００ｇおよび室温で５分間遠心分離する。水性相を新しい反応容器に移し、有機相を８０μｌの水で再度抽出する。両方の水性相を合わせ、ＨＰＬＣにより解析する。ここでは、Phenosphere ODS2カラム（２５０×４．６ｍｍ、Phenomenex, Torrance, USA）またはSpheresorb ODS2カラム（２５０×４．６ｍｍ、Waters, Milford, USA）を使用する。０．５Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（溶出液Ａ）を用いて１ｍｌ・分−１の流量で１５分間にわたりアナライトの溶出を行い、続いて、８０％溶出液Ａおよび２０％メタノールまでのリニアグラジエントを用いて０．７ｍｌ・分−１の流量で１４分間にわたり溶出を行う。次いで、ODS2カラムから溶出したアナライトをPhenosphere SAXイオン交換カラム（２５０×４．６ｍｍ、Phenomenex, Torrance, USA）に注入し、１ｍｌ・分−１の流量およびアンモニウムホルメートリニアグラジエント（２５分間にわたり２から６００ｍＭへ）を用いてアナライトを溶出させる。次いで、フォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を用いてｄＴＤＰ−グルコースおよびｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｄ−グルコースの定量をそれらのＵＶ吸収により行う。チミジンの吸収極大は２６７ｎｍである。基準ヌクレオチド糖（Sigma-Aldrich, Munich, USA）により検量を行う。
【００３２】
次いで、酵素Ｅ１〜Ｅ３に対して以上に記載したように得られたサンプルを用いて、最初に５０μｌのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５中で５μｇの精製酵素Ｅ５と共にｄＴＤＰ−α−Ｄグルコース（１．３ｍＭ）を３０℃で１０分間インキュベートすることにより、酵素Ｅ６の活性を決定する。続いて、０．５μｇの精製酵素Ｅ６を添加し、３０℃で５、１０、および２０分間インキュベートした後、２０μｌのクロロホルムの添加により反応を停止する。次いで、混合物を撹拌し、１６，０００ｇおよび室温で５分間遠心分離する。水性相を新しい反応容器に移し、有機相を８０μｌの水で再度抽出する。両方の水性相を合わせ、ＨＰＬＣにより解析する。ここでは、Phenosphere ODS2カラム（２５０×４．６ｍｍ、Phenomenex, Torrance, USA）またはSpheresorb ODS2カラム（２５０×４．６ｍｍ、Waters, Milford, USA）を使用する。０．５Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（溶出液Ａ）を用いて１ｍｌ・分−１の流量で１５分間にわたりアナライトの溶出を行い、続いて、８０％溶出液Ａおよび２０％メタノールまでのリニアグラジエントを用いて０．７ｍｌ・分−１の流量で１４分間にわたり溶出を行う。次いで、ODS2カラムから溶出したアナライトをPhenosphere SAXイオン交換カラム（２５０×４．６ｍｍ、Phenomenex, Torrance, USA）に注入し、１ｍｌ・分−１の流量およびアンモニウムホルメートリニアグラジエント（２５分間にわたり２から６００ｍＭへ）を用いてアナライトを溶出させる。次いで、フォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を用いて、ｄＴＤＰ−グルコース、ｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｄ−グルコース、およびｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−マンノースの定量をそれらのＵＶ吸収により行う。チミジンの吸収極大は２６７ｎｍである。基準ヌクレオチド糖（Sigma-Aldrich, Munich, USA）により検量を行う。
【００３３】
次いで、酵素Ｅ１〜Ｅ３に対して以上に記載したように得られたサンプルを用いて、最初に５０μｌのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５中で５μｇの精製酵素Ｅ５と共にｄＴＤＰ−α−Ｄグルコース（１．３ｍＭ）を３０℃で１０分間インキュベートすることにより、酵素Ｅ７の活性を決定する。続いて、５μｇの精製酵素Ｅ６および０．５μｇの精製酵素Ｅ７さらにはＮＡＤＰＨ（１０ｍＭ）を添加し、３０℃で５、１０、および２０分間インキュベートした後、２０μｌのクロロホルムの添加により反応を停止する。次いで、混合物を撹拌し、１６，０００ｇおよび室温で５分間遠心分離する。水性相を新しい反応容器に移し、有機相を８０μｌの水で再度抽出する。両方の水性相を合わせ、ＨＰＬＣにより解析する。ここでは、Phenosphere ODS2カラム（２５０×４．６ｍｍ、Phenomenex, Torrance, USA）またはSpheresorb ODS2カラム（２５０×４．６ｍｍ、Waters, Milford, USA）を使用する。０．５Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（溶出液Ａ）を用いて１ｍｌ・分−１の流量で１５分間にわたりアナライトの溶出を行い、続いて、８０％溶出液Ａおよび２０％メタノールまでのリニアグラジエントを用いて０．７ｍｌ・分−１の流量で１４分間にわたり溶出を行う。次いで、ODS2カラムから溶出したアナライトをPhenosphere SAXイオン交換カラム（２５０×４．６ｍｍ、Phenomenex, Torrance, USA）に注入し、１ｍｌ・分−１の流量およびアンモニウムホルメートリニアグラジエント（２５分間にわたり２から６００ｍＭへ）を用いてアナライトを溶出させる。次いで、フォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を用いて、ｄＴＤＰ−グルコース、ｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｄ−グルコース、ｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−マンノース、およびｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｌ−マンノースの定量をそれらのＵＶ吸収により行う。チミジンの吸収極大は２６７ｎｍである。基準ヌクレオチド糖（Sigma-Aldrich, Munich, USA）により検量を行う。
【００３４】
以下の酵素の組合せ：Ｅ４Ｅ５、Ｅ４Ｅ６、Ｅ４Ｅ７、Ｅ５Ｅ６、Ｅ５Ｅ７、Ｅ６Ｅ７、Ｅ４Ｅ５Ｅ６、Ｅ４Ｅ５Ｅ７、Ｅ５Ｅ６Ｅ７、Ｅ４Ｅ６Ｅ７、Ｅ４Ｅ５Ｅ６Ｅ７の増大された活性を有する本発明に係る細胞が好ましく、このうち、組合せＥ４Ｅ５Ｅ６Ｅ７は、とくに好ましい。
【００３５】
本発明によれば、アシル−ＡＣＰおよびマロニル−補酵素Ａから３−ケトアシル−ＡＣＰへの変換および／または３−ケトアシル−ＡＣＰから（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰへの変換をもたらす酵素反応が増大されるように、本発明に係る細胞が脂肪酸生合成で遺伝子改変されたものであれば、有利であり得る。追加的または代替的に、本発明によれば、（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰからｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＡＣＰへの変換および／またはｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＡＣＰからアシル−ＡＣＰへの変換をもたらす酵素反応が低減されるように、本発明に係る細胞が脂肪酸生合成で遺伝子改変されたものであれば、有利であり得る。アシル−補酵素Ａからｔｒａｎｓ−２−エノイル−補酵素Ａへの変換および／またはｔｒａｎｓ−２−エノイル−補酵素Ａから（Ｓ）−３−ヒドロキシアルカノイル−補酵素Ａへの変換をもたらす酵素反応が増大されるように、本発明に係る細胞が脂肪酸のβ酸化で遺伝子改変されたものであれば、同様に有利であり得る。追加的または代替的に、本発明によれば、（Ｓ）−３−ヒドロキシアルカノイル−補酵素Ａから３−ケトアシル−補酵素Ａへの変換および／または３−ケトアシル−補酵素Ａからアシル−補酵素Ａおよびアセチル−補酵素Ａへの変換をもたらす酵素反応が低減されるように、本発明に係る細胞が脂肪酸のβ酸化で遺伝子改変されたものであれば、有利であり得る。一般的に概観するには、図１を比較されたい。
【００３６】
本発明に係る細胞は、ラムノリピドの生産に有利に使用可能であるので、それに続いて、この脂質は、任意選択により精製されるので、本発明に係る細胞が、野生型と比較して細胞から周囲培地中への一般式（Ｉ）で示されるラムノリピドの輸送を触媒する少なくとも酵素Ｅ８の増大された活性を有するものであれば、有利である。
【００３７】
好ましくは、これとの関連では、タンパク質Ｅ８は、ポリペプチド配列の配列番号８、配列番号２４、配列番号２６、もしくは配列番号２８を有する酵素Ｅ８、またはアミノ酸基の２５％まで、好ましくは２０％まで、とくに好ましくは１５％まで、特定的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが、欠失、挿入、置換、もしくはそれらの組合せにより、それぞれの参照配列の配列番号８、配列番号２４、配列番号２６、もしくは配列番号２８と比較して改変されているが、それでもなお、それぞれの参照配列の配列番号８、配列番号２４、配列番号２６、もしくは配列番号２８を有する酵素の酵素活性の少なくとも５０％で、好ましくは６５％、とくに好ましくは８０％、特定的には９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ８からなる群から選択される。ただし、酵素Ｅ８の酵素活性は、一般式（Ｉ）で示されるラムノリピドを細胞から周囲培地中に輸送する能力を意味するとみなされるものとする。本発明に係る細胞のさらなる好ましい実施形態は、以下に挙げる本発明に係るベクターまたは核酸の少なくとも１つを含有することを特徴とする。
【００３８】
本発明に係る細胞は、ラムノリピドの生産に有利に使用可能である。したがって、本発明のさらなる対象は、一般式（Ｉ）で示される化合物を生産するための本発明に係る細胞の使用である。
【００３９】
本発明のさらなる対象は、以下のプロセス工程、
Ｉ）本発明に係る細胞を、炭素源を含有する培地と接触させる工程と、
ＩＩ）細胞による炭素源からのラムノリピドの生成を可能にする条件下で細胞を培養する工程と、
ＩＩＩ）任意選択により、生成されたラムノリピドを単離する工程と、
を含む、一般式（Ｉ）
（式中、
ｍ＝２、１、または０、特定的には１または０、
ｎ＝１または０、特定的には１、
Ｒ１およびＲ２＝互いに独立して２〜２４個、好ましくは５〜１３個の炭素原子を有する同一または異なる有機基、特定的には、任意選択により分枝状、任意選択により置換型、特定的にはヒドロキシ置換型、任意選択により不飽和、特定的には任意選択によりモノ、ジ、またはトリ不飽和のアルキル基、好ましくは、ペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニル、およびトリデセニル、ならびにｏ＝１〜２３、好ましくは４〜１２を有する（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ３からなる群から選択されるもの）
で示されるラムノリピドの生産方法である。
【００４０】
本発明に係る遺伝子改変細胞は、以上に挙げた産物の生産の目的で、バッチプロセス（バッチ培養）またはフェドバッチプロセス（供給プロセス）または繰返しフェドバッチプロセス（繰返し供給プロセス）で栄養培地と連続的または非連続的に接触させることが可能であり、したがって、培養可能である。また、英国特許出願公開第１００９３７０号に記載されるように半連続プロセスも考えられる。公知の培養方法の概要は、Chmielの教科書（"Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik" [Bioprocess Technology 1. Introduction to the Bioprocess Technique] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)）またはStorhasの教科書（"Bioreaktoren und periphere Einrichtungen" [Bioreactors and Peripheral Devices], Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994）に記載されている。使用される培養培地は、それぞれの株の要求を好適に満たさなければならない。さまざまな酵母株の培養培地の説明は、たとえば、"Nonconventional yeast in biotechnology" (Ed. Klaus Wolf, Springer-Verlag Berlin, 1996)に含まれている。使用される炭素源は、炭水化物、たとえば、グルコース、スクロース、アラビノース、キシロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン、セルロース、およびヘミセルロースなど、植物および動物の油および脂肪、たとえば、ダイズ油、サフラワー油、ラッカセイ油、アサミ油、ジャトロファ油、ヤシ脂肪、カラバッシュ油、アマニ油、トウモロコシ油、ケシ種子油、マツヨイグサ油、オリーブ油、パーム核油、パーム油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ブドウ種子油、クルミ油、コムギ胚芽油、およびヤシ油など、脂肪酸、たとえば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、γ−リノレン酸、およびそのメチルエステルもしくはエチルエステル、さらには脂肪酸混合物など、直前に挙げた脂肪酸を含有するモノ、ジ、およびトリグリセリド、アルコール、たとえば、グリセロール、エタノール、およびメタノールなど、炭化水素、たとえば、メタンなど、炭素を含有するガスおよびガス混合物、たとえば、ＣＯ、ＣＯ２、合成ガス、もしくは煙道ガスなど、アミノ酸、たとえば、Ｌ−グルタメートもしくはＬ−バリンなど、または有機酸、たとえば、酢酸などであり得る。これらの物質は、単独でまたは混合物として使用可能である。炭素源としての炭水化物、特定的には、モノサッカリド、オリゴサッカリド、またはポリサッカリドの使用は、米国特許第６，０１，４９４号および米国特許第６，１３６，５７６号に記載されており、さらには炭化水素、特定的には、アルカン、アルケン、およびアルキン、さらにはそれらから誘導されるモノカルボン酸、ならびにこのモノカルボン酸から誘導されるモノ、ジ、およびトリグリセリド、さらにはグリセロールおよびアセテートの使用は、とくに好ましい。グリセロールと、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレイン酸、および／またはγ−リノレン酸と、のエステル化産物を含有するモノ、ジ、およびトリグリセリドは、なかでもとくに好ましい。本発明に係る細胞が���本発明に係る方法の実施時に長鎖状Ｃ源を培地中に提供する必要なく、最も単純な炭素源、たとえば、グルコース、スクロース、またはグリセロールなどからのラムノリピドを生成可能であることは、本発明の大きな利点である。したがって、本発明に係る方法の工程Ｉ）の培地が、６個超の炭素原子の鎖長を有するカルボン酸またはこれから誘導可能なエステルもしくはグリセリドを含有しないかあるいはその検出可能量を含有しないことは、入手不可能な場合、有利である。
【００４１】
使用される窒素源は、有機窒素含有化合物、たとえば、ペプトン、酵母エキス、肉抽出物、麦芽エキス、コーンスティープ水、ダイズミール、および尿素など、または無機化合物、たとえば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウム、アンモニア、水酸化アンモニウム、もしくはアンモニア水などであり得る。窒素源は、単独でまたは混合物として使用可能である。
【００４２】
使用されるリン源は、リン酸、リン酸二水素カリウム、もしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩であり得る。さらに、培養培地は、増殖に必要な金属塩、たとえば、硫酸マグネシウムや硫酸鉄などを含有しなければならない。最後に、アミノ酸やビタミンなどの必須の増殖促進剤を以上に挙げた物質に加えて利用することが可能である。さらに、好適な前駆体を培養培地に添加することが可能である。前記供給原料は、単一バッチの形態で培養物に添加可能であるか、または培養時に好適な形で供給可能である。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、もしくはアンモニア水などの塩基性化合物、またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物は、培養物のｐＨ調整のために好適に利用される。消泡剤、たとえば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどは、泡発生を抑制するために利用可能である。好適な選択的作用物質、たとえば、抗生物質などは、プラスミドの安定性を維持するために培地に添加可能である。好気的条件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、たとえば、空気などが培養物中に組み込まれる。培養物の温度は、通常は２０℃超、好ましくは２５℃超であり、４０℃超も可能であり、この場合、有利には９５℃、とくに好ましくは９０℃、最も好ましくは８０℃の培養温度を超えない。本発明に係る方法の工程ＩＩＩ）では、細胞により生成されたラムノリピドを、任意選択により、細胞および／または栄養培地から単離することが可能であり、単離のために、複合組成物から低分子量物質を単離するための当業者に公知のすべての方法、たとえば、濾過、抽出、吸着（クロマトグラフィー）、または結晶化などが可能である。
【００４３】
さらに、産物相は、バイオマスの残渣および種々の不純物、たとえば、油、脂肪酸、および他の栄養培地成分などを含有する。不純物の分離は、好ましくは、無溶媒プロセスで行われる。したがって、たとえば、ｐＨの調整を容易にするために、産物相を水で希釈することが可能である。次いで、酸またはアルカリによりｐＨを低下または上昇させてラムノリピドを水溶性の形態に変換することにより、産物相および水性相をホモジナイズすることが可能である。場合によっては、より高い温度でたとえば６０〜９０℃で絶えず攪拌しながらインキュベートすることにより、水性相中へのラムノリピドの可溶化を支援することが可能である。その後、続いてアルカリまたは酸によりｐＨを低下または上昇させることにより、水性相から容易に分離できるように、ラムノリピドを水不溶性の形態に再度変換することが可能である。次いで、産物相を水で１回または数回洗浄して、水溶性不純物を除去することが可能である。油残渣は、たとえば、好適な溶媒を利用して、有利には有機溶媒を利用して、抽出により分離することが可能である。アルカン化合物たとえばｎ−ヘキサンなどは、溶媒として好ましい。以上に記載の無溶媒プロセスの代わりに、好適な溶媒、たとえば、エチルアセテートやブチルアセテートなどのエステルを用いて、水性相からの産物の分離を行うことが可能である。前記抽出工程は、任意の所望の順序で行うことが可能である。これとの関連では、溶媒とくに有機溶媒が好ましく利用される。ｎ−ペンタノールは、溶媒として好ましい。溶媒を除去するために、たとえば、蒸留が行われる。続いて、凍結乾燥された産物を、たとえば、クロマトグラフィー法を利用してさらに精製することが可能である。例として、この時点では、好適な溶媒を利用した沈殿、好適な溶媒を利用した抽出、複合体化、たとえば、シクロデキストリンもしくはシクロデキストリン誘導体を利用した複合体化、結晶化、クロマトグラフィー法を利用した精製もしくは単離、または容易に分離可能な誘導体へのラムノリピドの変換が挙げられ得る。
【００４４】
本発明に係る方法を用いて生産可能なラムノリピド、特定的には、本発明に係る方法を用いて生産可能な以上に記載のラムノリピド混合物もまた、同様に本発明の対象である。本発明に係る方法を用いて生産可能なラムノリピドおよび混合物は、清浄剤、化粧製剤または医薬製剤、さらには植物保護製剤で有利に利用可能である。
【００４５】
したがって、本発明のさらなる対象は、化粧製剤、皮膚製剤、または医薬製剤の生産、植物保護製剤の生産、ならびにケア剤および清浄剤および界面活性剤濃縮物の生産のための、本発明に係る方法を用いて得られるラムノリピドの使用である。
【００４６】
「ケア剤」という用語は、ここでは、物品をその元の形態に維持する目的、外的影響（たとえば、時間、光、温度、圧力、汚染、物品に接触する他の反応性化合物との化学反応など）の作用、たとえば、老化、汚染、材料疲労などを低減または回避する目的、さらには物品の所望の好ましい特性を改良する目的を満たす製剤を意味するものとみなされる。たとえば、最後の点に関しては、改良された毛髪光沢または考慮対象の物品のより大きい弾性が挙げられ得る。「植物保護製剤」とは、その調製物の性質上明らかに植物保護に使用される製剤を意味するとみなされるものとする。このことは、除草剤、殺菌類剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、鳥害防御物質、植物栄養素、および土壌構造改良剤よりなるクラスに属する少なくとも１種の化合物が製剤中に含有される場合にとくにあてはまる。本発明によれば、本発明に係る方法を用いて生産されるラムノリピドは、家事用、工業用、特定的には、硬質表面用、皮革用、またはテキスタイル用として、ケア剤および清浄剤で好ましく使用される。
【００４７】
目的の達成への寄与は、少なくともそれぞれの場合に３つのグループ［Ａ１〜Ｇ１］、［Ａ２〜Ｇ２］、および［Ａ３〜Ｇ３］から選択される配列を含有する単離された核酸により提供される。
ここで、
グループ［Ａ１〜Ｇ１］は、以下の配列：
Ａ１ａ）配列番号１で表される配列、ただし、この配列は、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ１ａ）Ａ１ａ）に属する配列に由来し、かつ配列番号１で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ１ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ１ａ）グループＡ１ａ）〜Ｃ１ａ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ａ）に属する配列と少なくとも７０％まで、とくに好ましくは少なくとも９０％まで、さらに好ましくは少なくとも９５％まで、最も好ましくは少なくとも９９％まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｅ１ａ）グループＡ１ａ）〜Ｄ１ａ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ａ）に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｆ１ａ）少なくとも１個の塩基、好ましくは少なくとも２個の塩基、さらに好ましくは、少なくとも５個の塩基、最も好ましくは少なくとも１０個の塩基の、ただし、好ましくは１００個以下の塩基、とくに好ましくは５０個以下の塩基、最も好ましくは２５個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる、グループＡ１ａ）〜Ｅ１ａ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ａ）に属する配列の誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｇ１ａ）グループＡ１ａ）〜Ｆ１ａ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ａ）に属する配列に対する相補的配列、
Ａ１ｂ）配列番号１７で表される配列、ただし、この配列は、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ１ｂ）Ａ１ｂ）に属する配列に由来し、かつ配列番号１７で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ１ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ１ｂ）グループＡ１ｂ）〜Ｃ１ｂ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｂ）に属する配列と少なくとも７０％まで、とくに好ましくは少なくとも９０％まで、さらに好ましくは少なくとも９５％まで、最も好ましくは少なくとも９９％まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｅ１ｂ）グループＡ１ｂ）〜Ｄ１ｂ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｂ）に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｆ１ｂ）グループＡ１ｂ）〜Ｅ１ｂ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｂ）に属する配列の少なくとも１個の塩基、好ましくは少なくとも２個の塩基、さらに好ましくは少なくとも５個の塩基、最も好ましくは少なくとも１０個の塩基の、ただし、好ましくは１００個以下の塩基、とくに好ましくは５０個以下の塩基、最も好ましくは２５個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
Ｇ１ｂ）グループＡ１ｂ）〜Ｆ１ｂ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｂ）に属する配列に対する相補的配列、ならびに
Ａ１ｃ）配列番号７７で表される配列、ただし、この配列は、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ１ｃ）Ａ１ｃ）に属する配列に由来し、かつ配列番号７７で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ１ｃ）配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ１ｃ）グループＡ１ｃ）〜Ｃ１ｃ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｃ）に属する配列と少なくとも７０％まで、とくに好ましくは少なくとも９０％まで、さらに好ましくは少なくとも９５％まで、最も好ましくは少なくとも９９％まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｅ１ｃ）グループＡ１ｃ）〜Ｄ１ｃ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｃ）に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｆ１ｃ）グループＡ１ｃ）〜Ｅ１ｃ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｃ）に属する配列の少なくとも１個の塩基、好ましくは少なくとも２個の塩基、さらに好ましくは少なくとも５個の塩基、最も好ましくは少なくとも１０個の塩基の、ただし、好ましくは１００個以下の塩基、とくに好ましくは５０個以下の塩基、最も好ましくは２５個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
Ｇ１ｃ）グループＡ１ｃ）〜Ｆ１ｃ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｃ）に属する配列に対する相補的配列、ならびに
Ａ１ｄ）配列番号７９で表される配列、ただし、この配列は、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ１ｄ）Ａ１ｄ）に属する配列に由来し、かつ配列番号７９で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ１ｄ）配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ１ｄ）グループＡ１ｄ）〜Ｃ１ｄ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｄ）に属する配列と少なくとも７０％まで、とくに好ましくは少なくとも９０％まで、さらに好ましくは少なくとも９５％まで、最も好ましくは少なくとも９９％まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｅ１ｄ）グループＡ１ｄ）〜Ｄ１ｄ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｄ）に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｆ１ｄ）グループＡ１ｄ）〜Ｅ１ｄ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｄ）に属する配列の少なくとも１個の塩基、好ましくは少なくとも２個の塩基、さらに好ましくは少なくとも５個の塩基、最も好ましくは少なくとも１０個の塩基の、ただし、好ましくは１００個以下の塩基、とくに好ましくは５０個以下の塩基、最も好ましくは２５個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
Ｇ１ｄ）グループＡ１ｄ）〜Ｆ１ｄ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｄ）に属する配列に対する相補的配列、ならびに
Ａ１ｅ）配列番号８１で表される配列、ただし、この配列は、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ１ｅ）Ａ１ｅ）に属する配列に由来し、かつ配列番号８１で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ１ｅ）配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ１ｅ）グループＡ１ｅ）〜Ｃ１ｅ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｅ）に属する配列と少なくとも７０％まで、とくに好ましくは少なくとも９０％まで、さらに好ましくは少なくとも９５％まで、最も好ましくは少なくとも９９％まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｅ１ｅ）グループＡ１ｅ）〜Ｄ１ｅ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｅ）に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｆ１ｅ）グループＡ１ｅ）〜Ｅ１ｅ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｅ）に属する配列の少なくとも１個の塩基、好ましくは少なくとも２個の塩基、さらに好ましくは少なくとも５個の塩基、最も好ましくは少なくとも１０個の塩基の、ただし、好ましくは１００個以下の塩基、とくに好ましくは５０個以下の塩基、最も好ましくは２５個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを経由する３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
Ｇ１ｅ）グループＡ１ｅ）〜Ｆ１ｅ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ１ｅ）に属する配列に対する相補的配列、
で構成され、かつ
グループ［Ａ２〜Ｇ２］は、以下の配列：
Ａ２ａ）配列番号３で表される配列、ただし、この配列は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ２ａ）Ａ２ａ）に属する配列に由来し、かつ配列番号３で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ２ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ２ａ）グループＡ２ａ）〜Ｃ２ａ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ａ）に属する配列と少なくとも８０％まで、とくに好ましくは少なくとも９０％まで、さらに好ましくは少なくとも９５％まで、最も好ましくは少なくとも９９％まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｅ２ａ）グループＡ２ａ）〜Ｄ２ａ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ａ）に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｆ２ａ）グループＡ２ａ）〜Ｅ２ａ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ａ）に属する配列の少なくとも１個の塩基、好ましくは少なくとも２個の塩基、さらに好ましくは少なくとも５個の塩基、最も好ましくは少なくとも１０個の塩基の、ただし、好ましくは１００個以下の塩基、とくに好ましくは５０個以下の塩基、最も好ましくは２５個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｇ２ａ）グループＡ２ａ）〜Ｆ２ａ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ａ）に属する配列に対する相補的配列、
Ａ２ｂ）配列番号１９で表される配列、ただし、この配列は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ２ｂ）Ａ２ｂ）に属する配列に由来し、かつ配列番号１９で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ２ｂ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ２ｂ）グループＡ２ｂ）〜Ｃ２ｂ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｂ）に属する配列と少なくとも７０％まで、とくに好ましくは少なくとも９０％まで、さらに好ましくは少なくとも９５％まで、最も好ましくは少なくとも９９％まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｅ２ｂ）グループＡ２ｂ）〜Ｄ２ｂ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｂ）に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｆ２ｂ）グループＡ２ｂ）〜Ｅ２ｂ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｂ）に属する配列の少なくとも１個の塩基、好ましくは少なくとも２個の塩基、さらに好ましくは少なくとも５個の塩基、最も好ましくは少なくとも１０個の塩基の、ただし、好ましくは１００個以下の塩基、とくに好ましくは５０個以下の塩基、最も好ましくは２５個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
Ｇ２ｂ）グループＡ２ｂ）〜Ｆ２ｂ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｂ）に属する配列に対する相補的配列、
Ａ２ｃ）配列番号８３で表される配列、ただし、この配列は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ２ｃ）Ａ２ｃ）に属する配列に由来し、かつ配列番号８３で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ２ｃ）配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ２ｃ）グループＡ２ｃ）〜Ｃ２ｃ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｃ）に属する配列と少なくとも７０％まで、とくに好ましくは少なくとも９０％まで、さらに好ましくは少なくとも９５％まで、最も好ましくは少なくとも９９％まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｅ２ｃ）グループＡ２ｃ）〜Ｄ２ｃ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｃ）に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｆ２ｃ）グループＡ２ｃ）〜Ｅ２ｃ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｃ）に属する配列の少なくとも１個の塩基、好ましくは少なくとも２個の塩基、さらに好ましくは少なくとも５個の塩基、最も好ましくは少なくとも１０個の塩基の、ただし、好ましくは１００個以下の塩基、とくに好ましくは５０個以下の塩基、最も好ましくは２５個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
Ｇ２ｃ）グループＡ２ｃ）〜Ｆ２ｃ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｃ）に属する配列に対する相補的配列、
Ａ２ｄ）配列番号８５で表される配列、ただし、この配列は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ２ｄ）Ａ２ｄ）に属する配列に由来し、かつ配列番号８５で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ２ｄ）配列番号８６で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ２ｄ）グループＡ２ｄ）〜Ｃ２ｄ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｄ）に属する配列と少なくとも７０％まで、とくに好ましくは少なくとも９０％まで、さらに好ましくは少なくとも９５％まで、最も好ましくは少なくとも９９％まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｅ２ｄ）グループＡ２ｄ）〜Ｄ２ｄ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｄ）に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｆ２ｄ）グループＡ２ｄ）〜Ｅ２ｄ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｄ）に属する配列の少なくとも１個の塩基、好ましくは少なくとも２個の塩基、さらに好ましくは少なくとも５個の塩基、最も好ましくは少なくとも１０個の塩基の、ただし、好ましくは１００個以下の塩基、とくに好ましくは５０個以下の塩基、最も好ましくは２５個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
Ｇ２ｄ）グループＡ２ｄ）〜Ｆ２ｄ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｄ）に属する配列に対する相補的配列、ならびに
Ａ２ｅ）配列番号８７で表される配列、ただし、この配列は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ２ｅ）Ａ２ｅ）に属する配列に由来し、かつ配列番号８７で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ２ｅ）配列番号８８で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ２ｅ）グループＡ２ｅ）〜Ｃ２ｅ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｅ）に属する配列と少なくとも７０％まで、とくに好ましくは少なくとも９０％まで、さらに好ましくは少なくとも９５％まで、最も好ましくは少なくとも９９％まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換
を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｅ２ｅ）グループＡ２ｅ）〜Ｄ２ｅ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｅ）に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｆ２ｅ）グループＡ２ｅ）〜Ｅ２ｅ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｅ）に属する配列の少なくとも１個の塩基、好ましくは少なくとも２個の塩基、さらに好ましくは少なくとも５個の塩基、最も好ましくは少なくとも１０個の塩基の、ただし、好ましくは１００個以下の塩基、とくに好ましくは５０個以下の塩基、最も好ましくは２５個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
Ｇ２ｅ）グループＡ２ｅ）〜Ｆ２ｅ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ２ｅ）に属する配列に対する相補的配列、
で構成され、かつ
グループ［Ａ３〜Ｇ３］は、以下の配列：
Ａ３ａ）配列番号５で表される配列、ただし、この配列は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ３ａ）Ａ３ａ）に属する配列に由来し、かつ配列番号５で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ３ａ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ３ａ）グループＡ３ａ）〜Ｃ３ａ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ａ）に属する配列と少なくとも８０％まで、とくに好ましくは少なくとも９０％まで、さらに好ましくは少なくとも９５％まで、最も好ましくは少なくとも９９％まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｅ３ａ）グループＡ３ａ）〜Ｄ３ａ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ａ）に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｆ３ａ）グループＡ３ａ）〜Ｅ３ａ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ａ）に属する配列の少なくとも１個の塩基、好ましくは少なくとも２個の塩基、さらに好ましくは少なくとも５個の塩基、最も好ましくは少なくとも１０個の塩基の、ただし、好ましくは１００個以下の塩基、とくに好ましくは５０個以下の塩基、最も好ましくは２５個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｇ３ａ）グループＡ３ａ）〜Ｆ３ａ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ａ）に属する配列に対する相補的配列、
Ａ３ｂ）配列番号２１で表される配列、ただし、この配列は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ３ｂ）Ａ３ｂ）に属する配列に由来し、かつ配列番号２１で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ３ｂ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ３ｂ）グループＡ３ｂ）〜Ｃ３ｂ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ｂ）に属する配列と少なくとも６０％まで、とくに好ましくは少なくとも９０％まで、さらに好ましくは少なくとも９５％まで、最も好ましくは少なくとも９９％まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｅ３ｂ）グループＡ３ｂ）〜Ｄ３ｂ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ｂ）に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｆ３ｂ）グループＡ３ｂ）〜Ｅ３ｂ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ｂ）に属する配列の少なくとも１個の塩基、好ましくは少なくとも２個の塩基、さらに好ましくは少なくとも５個の塩基、最も好ましくは少なくとも１０個の塩基の、ただし、好ましくは１００個以下の塩基、とくに好ましくは５０個以下の塩基、最も好ましくは２５個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
Ｇ３ｂ）グループＡ３ｂ）〜Ｆ３ｂ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ｂ）に属する配列に対する相補的配列、
Ａ３ｃ）配列番号８９で表される配列、ただし、この配列は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ３ｃ）Ａ３ｃ）に属する配列に由来し、かつ配列番号８９で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ３ｃ）配列番号９０で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ３ｃ）グループＡ３ｃ）〜Ｃ３ｃ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ｃ）に属する配列と少なくとも６０％まで、とくに好ましくは少なくとも９０％まで、さらに好ましくは少なくとも９５％まで、最も好ましくは少なくとも９９％まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｅ３ｃ）グループＡ３ｃ）〜Ｄ３ｃ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ｃ）に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｆ３ｃ）グループＡ３ｃ）〜Ｅ３ｃ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ｃ）に属する配列の少なくとも１個の塩基、好ましくは少なくとも２個の塩基、さらに好ましくは少なくとも５個の塩基、最も好ましくは少なくとも１０個の塩基の、ただし、好ましくは１００個以下の塩基、とくに好ましくは５０個以下の塩基、最も好ましくは２５個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
Ｇ３ｃ）グループＡ３ｃ）〜Ｆ３ｃ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ｃ）に属する配列に対する相補的配列、ならびに
Ａ３ｄ）配列番号９１で表される配列、ただし、この配列は、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質をコードする、
Ｂ３ｄ）Ａ３ｄ）に属する配列に由来し、かつ配列番号９１で表される配列と同一のタンパク質またはペプチドをコードする無イントロン配列、
Ｃ３ｄ）配列番号９２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする配列、
Ｄ３ｄ）グループＡ３ｄ）〜Ｃ３ｄ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ｄ）に属する配列と少なくとも６０％まで、とくに好ましくは少なくとも９０％まで、さらに好ましくは少なくとも９５％まで、最も好ましくは少なくとも９９％まで同一である配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｅ３ｄ）グループＡ３ｄ）〜Ｄ３ｄ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ｄ）に属する配列の相補鎖にハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列、ただし、この配列は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、
Ｆ３ｄ）グループＡ３ｄ）〜Ｅ３ｄ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ｄ）に属する配列の少なくとも１個の塩基、好ましくは少なくとも２個の塩基、さらに好ましくは少なくとも５個の塩基、最も好ましくは少なくとも１０個の塩基の、ただし、好ましくは１００個以下の塩基、とくに好ましくは５０個以下の塩基、最も好ましくは２５個以下の塩基の、置換、付加、逆位、および／または欠失により得られる誘導体、ただし、この誘導体は、好ましくは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸からα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸への変換を行い得るタンパク質またはペプチドをコードする、および
Ｇ３ｄ）グループＡ３ｄ）〜Ｆ３ｄ）の１つに属する、とくに好ましくはグループＡ３ｄ）に属する配列に対する相補的配列、
で構成される。
【００４８】
「ヌクレオチド同一性」または「アミノ酸同一性」は、ここでは、公知の方法を利用して決定される。一般的には、特別な要件を考慮したアルゴリズムを有する特定のコンピュータープログラムが使用される。同一性を決定するための好ましい方法によれば、さしあたり、比較される配列間の最大の一致が得られる。同一性を決定するためのコンピュータープログラムとしては、ＧＡＰが組み込まれたＧＣＧプログラムパッケージ（Deveroy, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), page 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi)）、ならびにＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴプログラムは、National Center for Biotechnology Information (NCBI)から、およびさらなる提供元（BLAST handbook, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al., above）から、入手可能である。公知のSmith-Watermanアルゴリズムもまた、ヌクレオチド同一性を決定するために同様に使用可能である。「ヌクレオチド同一性」を決定するための好ましいパラメーターは、ＢＬＡＳＴＮプログラム（Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410）を使用する場合、以下のとおりである。
期待値閾値：１０
ワードサイズ：２８
マッチスコア：１
ミスマッチスコア：−２
ギャップコスト：Ｌｉｎｅａｒ
以上のパラメーターは、ヌクレオチド配列比較でのデフォルトパラメーターである。ＧＡＰプログラムも同様に、以上のパラメーターで使用するのに好適である。
【００４９】
「アミノ酸同一性」を決定するための好ましいパラメーターは、ＢＬＡＳＴＰプログラム（Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410）を使用する場合、以下のとおりである。
期待値閾値：１０
ワードサイズ：３
マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２
ギャップコスト：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１；Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１
組成調整：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ
【００５０】
以上のパラメーターは、アミノ酸配列比較でのデフォルトパラメーターである。ＧＡＰプログラムも同様に、以上のパラメーターで使用するのに好適である。
【００５１】
以上のアルゴリズムに基づく６０％の同一性は、本発明との関連での６０％の同一性を意味する。より高い同一性の場合にも、同じことが言える。
【００５２】
配列の相補鎖に「ハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮して」ハイブリダイズする配列という特性は、好ましくはストリンジェント条件下で参照配列の相補鎖とハイブリダイズするかまたは遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイズする配列を意味する。たとえば、ハイブリダイゼーションは、２×ＳＳＣ中、６８℃で、またはBoehringer社（Mannheim）のジゴキシゲニン標識キットのプロトコルに従って、実施可能である。好ましいハイブリダイゼーション条件は、たとえば、７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中、６５℃での一晩のインキュベーション、およびそれに続く２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いた６５℃での洗浄である。グループＡ１）〜Ｅ１）、Ａ２）〜Ｅ２）、およびＡ３）〜Ｅ３の１つに属する配列の１個以上の塩基の置換、付加、逆位、および／または欠失により代替的Ｆ１、Ｆ２）、またはＦ３）に従って取得可能な、本発明に係る単離されたＤＮＡの誘導体としては、特定的には、それらがコードするタンパク質中で保存アミノ酸交換、たとえば、グリシンとアラニンとの交換またはアスパラギン酸とグルタミン酸との交換などをもたらす配列が含まれる。そのような機能的中立突然変異は、センス突然変異として記述され、ポリペプチドの活性の基本的改変をもたらさない。さらに、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の変化がその機能を有意に損なわないかまたはこれを安定化することさえも可能であることは、公知であるので、したがって、本発明に係る核酸を含有する配列の３’末端または５’末端に塩基が結合されたＤＮＡ配列もまた、本発明に包含される。当業者であれば、これに関する情報は、とくに、Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987))、O’Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), in Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994))、Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988))、ならびに遺伝学および分子生物学の公知の教科書に見いだされる。
【００５３】
本発明に係る核酸は、好ましくは、ベクター、特定的には、発現ベクターまたは遺伝子過剰発現カセットである。好適なベクターは、宿主細胞内へのＤＮＡの組込みに慣用される当業者に公知のすべてのベクターである。これらのベクターは、複製起点（たとえば、２μプラスミドやＡＲＳ（自己複製配列）のものなど）を有するので自律的複製も可能であるし、染色体（非複製プラスミド）中への組込みも可能である。ベクターはまた、複製起点をまったく有していない線状ＤＮＡ断片、たとえば、遺伝子挿入カセットまたは遺伝子過剰発現カセットなどをも意味するものとみなされる。遺伝子過剰発現カセットは、慣例的には、マーカー、過剰発現される遺伝子、さらには遺伝子の発現に適合する調節領域、たとえば、プロモーターやターミネーターなどで構成される。好ましいベクターは、プラスミドおよびカセット、たとえば、大腸菌（E. coli）酵母シャトルプラスミドを含む群から選択され、発現ベクター、遺伝子挿入カセットまたは遺伝子過剰発現カセット、特定的には、以下で説明されるベクターの配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４５、および配列番号４７は、とくに好ましい。
【００５４】
本発明に係るベクターの好ましい実施形態によれば、グループ［Ａ１〜Ｇ１］、［Ａ２〜Ｇ２］、および［Ａ３〜Ｇ３］の配列は、微生物の細胞内、たとえば、細菌、酵母、または菌類の細胞内でのこれらのＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの発現に好適な少なくとも１種の構成的または調節的プロモーターの制御下に存在し、この場合、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アルカリゲネス・ラタス（Alcaligenes latus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、バークホルデリア・アンドロポゴニス（Burkholderia andropogonis）、Ｂ．ブラシレンシス（B. brasilensis）、Ｂ．カレドニカ（B. caledonica）、Ｂ．カリベンシス（B. caribensis）、Ｂ．カリオフィリ（B. caryophylli）、Ｂ．フンゴラム（B. fungorum）、Ｂ．グラジオリ（B. gladioli）、Ｂ．グラセイ（B. glathei）、Ｂ．グルマエ（B. ｇｌｕｍａｅ）、Ｂ．グラミニス（B. graminis）、Ｂ．ホスピタ（B. hospita）、Ｂ．クルリエンシス（B. kururiensis）、Ｂ．フェナジニウム（B. phenazinium）、Ｂ．フィマタム（B. phymatum）、Ｂ．フィトファーマンス（B. phytofirmans）、Ｂ．プランタリイ（B. plantarii）、Ｂ．サッカリ（B. sacchari）、Ｂ．シンガポレンシス（B. singaporensis）、Ｂ．ソルディディコラ（B. sordidicola）、Ｂ．テリコラ（B. terricola）、Ｂ．トロピカ（B. tropica）、Ｂ．ツベラム（B. tuberum）、Ｂ．ウボネンシス（B. ubonensis）、Ｂ．ウナマエ（B. unamae）、Ｂ．ゼノボランス（B. xenovorans）、Ｂ．アンチナ（B. anthina）、Ｂ．ピロシニア（B. pyrrocinia）、Ｂ．タイランデンシス（B. thailandensis）、カンジダ・ブランキイ（Candida blankii）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa)、コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）、メチロバクテリウム・エクストルクエンス（Methylobacterium extorquens）、パラコッカス・ベルスタス（Paracoccus versutus）、シュードモナス・アルゼンチネンシス（Pseudomonas argentinensis）、Ｐ．ボルボリ（P. borbori）、Ｐ．シトロネロリス（P. citronellolis）、Ｐ．フラベセンス（P. flavescens）、Ｐ．メンドシナ（P. mendocina）、Ｐ．ニトロレデュセンス（P. nitroreducens）、Ｐ．オレオボランス（P. oleovorans）、Ｐ．シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）、Ｐ．レジノボランス（P. resinovorans）、Ｐ．ストラミネア（P. straminea）、Ｐ．オーランティアカ（P. aurantiaca）、Ｐ．オーレオファシエンス（P. aureofaciens）、Ｐ．クロロラフィス（P. chlororaphis）、Ｐ．フラギ（P. fragi）、Ｐ．ルンデンシス（P. lundensis）、Ｐ．タエトロレンス（P. taetrolens）、Ｐ．アンタークティカ（P. antarctica）、Ｐ．アゾトフォルマンス（P. azotoformans）、Ｐ．ブラッチフォルダエ（P. blatchfordae）、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）、Ｐ．ブレンネリ（P. brenneri）、Ｐ．セドリナ（P. cedrina）、Ｐ．コルガタ（P. corrugata）、Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens）、Ｐ．ゲッサルディイ（P. gessardii）、Ｐ．リバネンシス（P. libanensis）、Ｐ．マンデリイ（P. mandelii）、Ｐ．マルギナリス（P. marginalis）、Ｐ．メディテラネア（P. mediterranea）、Ｐ．メリディアナ（P. meridiana）、Ｐ．ミグラエ（P. migulae）、Ｐ．ムシドレンス（P. mucidolens）、Ｐ．オリエンタリス（P. orientalis）、Ｐ．パナシス（P. panacis）、Ｐ．プロテオリティカ（P. proteolytica）、Ｐ．ローデシアエ（P. rhodesiae）、Ｐ．シンキサンタ（P. synxantha）、Ｐ．チベルバレンシス（P. thivervalensis）、Ｐ．トラシイ（P. tolaasii）、Ｐ．ベロニイ（P. veronii）、Ｐ．デニトリフィカンス（P. denitrificans）、Ｐ．ペルツシノゲナ（P. pertucinogena）、Ｐ．クレモリコロラタ（P. cremoricolorata）、Ｐ．フルバ（P. fulva）、Ｐ．モンテイリイ（P. monteilii）、Ｐ．モッセリイ（P. mosselii）、Ｐ．パラフルバ（P. parafulva）、Ｐ．プチダ（P. putida）、Ｐ．バレアリカ（P. balearica）、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）、Ｐ．アミグダリ（P. amygdali）、Ｐ．アベラナエ（P. avellanae）、Ｐ．カリカパパヤエ（P. caricapapayae）、Ｐ．チコリー（P. cichorii）、Ｐ．コロナファシエンス（P. coronafaciens）、Ｐ．フィクセレクタエ（P. ficuserectae）、「Ｐ．ヘリアンティ（P. helianthi）」、Ｐ．メリアエ（P. meliae）、Ｐ．サバスタノイ（P. savastanoi）、Ｐ．シリンガエ（P. syringae）、Ｐ．トマト（P. tomato）、Ｐ．ビリディフラバ（P. viridiflava）、Ｐ．アビエタニフィラ（P. abietaniphila）、Ｐ．アシドフィラ（P. acidophila）、Ｐ．アガリシ（P. agarici）、Ｐ．アルカリフィラ（P. alcaliphila）、Ｐ．アルカノリティカ（P. alkanolytica）、Ｐ．アミロデラモサ（P. amyloderamosa）、Ｐ．アスプレニイ（P. asplenii）、Ｐ．アゾティフィゲンス（P. azotifigens）、Ｐ．カナビナ（P. cannabina）、Ｐ．コエノビオス（P. coenobios）、Ｐ．コンゲランス（P. congelans）、Ｐ．コスタンチニイ（P. costantinii）、Ｐ．クルシビアエ（P. cruciviae）、Ｐ．デルヒエンシス（P. delhiensis）、Ｐ．エクスシビス（P. excibis）、Ｐ．エクストレモリエンタリス（P. extremorientalis）、Ｐ．フレデリクスベルゲンシス（P. frederiksbergensis）、Ｐ．フスコバギナエ（P. fuscovaginae）、Ｐ．ゲリディコラ（P. gelidicola）、Ｐ．グリモンティイ（P. grimontii）、Ｐ．インディカ（P. indica）、Ｐ．ジェッセニイ（P. jessenii）、Ｐ．ジンジュエンシス（P. jinjuensis）、Ｐ．キロネンシス（P. kilonensis）、Ｐ．クナックムッシイ（P. knackmussii）、Ｐ．コーリエンシス（P. koreensis）、Ｐ．リニ（P. lini）、Ｐ．ルテア（P. lutea）、Ｐ．モラビエンシス（P. moraviensis）、Ｐ．オティティディス（P. otitidis）、Ｐ．パチャストレラエ（P. pachastrellae）、Ｐ．パレロニアナ（P. palleroniana）、Ｐ．パパベリス（P. papaveris）、Ｐ．ペリ（P. peli）、Ｐ．ペロレンス（P. perolens）、Ｐ．ポアエ（P. poae）、Ｐ．ポハンエンシス（P. pohangensis）、Ｐ．サイクロフィラ（P. psychrophila）、Ｐ．サイクロトレランス（P. psychrotolerans）、Ｐ．ラトニス（P. rathonis）、Ｐ．レプティリボラ（P. reptilivora）、Ｐ．レシニフィラ（P. resiniphila）、Ｐ．リゾスファエラエ（P. rhizosphaerae）、Ｐ．ルベッセンス（P. rubescens）、Ｐ．サロモニイ（P. salomonii）、Ｐ．セギティス（P. segitis）、Ｐ．セプティカ（P. septica）、Ｐ．シミアエ（P. simiae）、Ｐ．スイス（P. suis）、Ｐ．サーモトレランス（P. thermotolerans）、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）、Ｐ．トレマエ（P. tremae）、Ｐ．トリビアリス（P. trivialis）、Ｐ．ツルビネラエ（P. turbinellae）、Ｐ．ツティコリネンシス（P. tuticorinensis）、Ｐ．ウムソンゲンシス（P. umsongensis）、Ｐ．バンコウベレンシス（P. vancouverensis）、Ｐ．ブラノベンシス（P. vranovensis）、Ｐ．キサントマリナ（P. xanthomarina）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、特定的には、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、およびバークホルデリア・タイランデンシス（Burkholderia thailandensis）は、とくに好ましい。構成的プロモーターの例は、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ（いずれの場合も本発明に係る細胞内ではＬａｃＩリプレッサーの不在下）、Ｌｔｅｔ−Ｏ１（本発明に係る細胞内ではＴｅｔＲリプレッサーの不在下）、Ｔ５、およびｇａｐである。誘導性プロモーターの例は、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ（いずれの場合も本発明に係る細胞内ではＬａｃＩリプレッサーの存在下）、Ｌｔｅｔ−Ｏ１（本発明に係る細胞内ではＴｅｔＲリプレッサーの存在下）、Ｔ５（本発明に係る細胞内ではｌａｃオペレーターとの併用かつＬａｃＩリプレッサーの存在下）、ＳＰ６およびＴ７（それ自体発現が調節されるコグネイトＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の存在下）である。本発明に係るベクターは、プロモーターに加えて、好ましくは、リボソーム結合部位さらにはターミネーターを含むことが望ましい。ここでは、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターを含むベクターの発現カセット中に本発明に係る核酸を組み込むことがとくに好ましい。以上に挙げた構造エレメントに加えて、ベクターは、当業者に公知の選択遺伝子を追加的に含み得る。
【００５５】
指定のパーセント（％）はすべて、別に指定がなければ、質量パーセントである。以下に提示される実施例では、例を用いて本発明を説明するが、実施例に挙げた実施形態に本発明を限定しようとするものではなく、本発明の適用範囲は、説明の全体および特許請求の範囲から得られるものである。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】脂肪酸の生合成、脂肪酸のβ酸化、ならびにこれらの代謝経路とラムノリピド（酵素Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３）およびポリヒドロキシアルカノエート（酵素Ｅ９およびＥ１０）の生合成との関連性。脂肪酸の生合成、脂肪酸のβ酸化、ラムノリピドの生合成、およびポリヒドロキシアルカノエートの生合成における炭素の流れが示されている。補酵素、レドックス等価体、さらにはヌクレオチドの消費および生成は示されていない。
【図２】ＣＭＰ培地中で４８時間、７２時間、および９６時間培養した後の組換え株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣさらにはＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣのジラムノシル脂質生成（ｍｇ／ｌ／ＯＤ６００ｎｍ）。ラムノリピド濃度の分析は、ＨＰＬＣを利用して行った。
【図３】ＣＭＰ培地中で４８時間、７２時間、および９６時間培養した後の組換え株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、さらにはＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭのモノラムノシル脂質生成（ピーク面積／ＯＤ６００ｎｍ）。ラムノリピド濃度の分析は、ＨＰＬＣを利用して行った。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
実施例：
１．シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）１７０７遺伝子ｒｈｌＡおよびｒｈｌＢの異種発現用のベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢの構築
シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７遺伝子ｒｈｌＡおよびｒｈｌＢの異種発現のために、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ（配列番号３８）を構築した。このために、合成オペロンｒｈｌＡＢ（配列番号３７）をGeneArt AG社（Regensburg）により合成し、市販のベクターｐＭＡ（GeneArt AG）中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７の既知のゲノム配列であった。ベクターｐＭＡ：：ＡＢから出発して、合成オペロンをＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩによりベクターから切断し、続いて、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断された発現ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２（配列番号４９）中にライゲートした（Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad host range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176に記載されている）。得られるプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ（配列番号３８）は、７４２２塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）の形質転換は、当業者に公知の方法で行った。インサートの信頼性は、ＤＮＡ配列解析によりチェックした。ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２（配列番号４９）およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢを用いたシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０およびＧＰｐ１０４の形質転換は、既報どおり行った（Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854）。１０個のクローンのプラスミドＤＮＡを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢと命名した。
【００５８】
２．シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、およびｒｈｌＣの異種発現用のベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣの構築
シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、およびｒｈｌＣの異種発現のために、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ（配列番号４０）を構築した。このために、ｒｈｌＡＢＣ（配列番号３９）をGeneArt AG社（Regensburg）により合成し、市販のベクターｐＭＡ（GeneArt AG）中にインタークローン化した（intercloneｄ)。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７の既知のゲノム配列であった。ベクターｐＭＡ：：ＡＢＣから出発して、合成オペロンをＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩによりベクターから切断し、続いて、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断された発現ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２（配列番号４９）中にライゲートした（Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad host range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176）。得られるプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ（配列番号４０）は、８４０９塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）の形質転換は、当業者に公知の方法で行った。インサート（insert）の信頼性は、ＤＮＡ配列解析によりチェックした。ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣを用いたシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０およびＧＰｐ１０４の形質転換は、既報どおり行った（Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854）。１０個すべてのクローンのプラスミドＤＮＡを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣおよびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣと命名した。
【００５９】
３．シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢおよびｐａ１１３１の異種発現用のベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭの構築
シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、およびｐａ１１３１の異種発現のために、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ（配列番号４２）を構築した。このために、合成オペロンｒｈｌＡＢ−ｐａ１１３１（配列番号４１）をGeneArt AG社（Regensburg）により合成し、市販のベクターｐＭＡ（GeneArt AG）中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７の既知のゲノム配列であった。ベクターｐＭＡ：：ＡＢＭから出発して、合成オペロンをＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩによりベクターから切断し、続いて、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断された発現ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２（配列番号４９）中にライゲートした（Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad host range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176）。得られるプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ（配列番号４２）は、８７０２塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）の形質転換は、当業者に公知の方法で行った。インサートの信頼性は、ＤＮＡ配列解析によりチェックした。ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭを用いたシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０およびＧＰｐ１０４の形質転換は、既報どおり行った（Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854）。１０個すべてのクローンのプラスミドＤＮＡを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭおよびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭと命名した。
【００６０】
４．組換えＰ．プチダ（P. putida）株によるラムノリピド生産の定量
組換え株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣおよびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭを、ＬＢ寒天カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）プレート上で培養した。
【００６１】
ラムノリピドを生産するために、以下でＣＭＰ培地と記される培地を使用した。これは、２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．００７％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．１１％Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．２％（ｗ／ｖ）ＮａＮＯ３、０．０４％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０１％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、および０．２％（ｖ／ｖ）の微量元素溶液で構成される。これは、０．２％（ｗ／ｖ）ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５％（ｗ／ｖ）ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、および０．０６％（ｗ／ｖ）（ＮＨ４）ＭＯ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏで構成される。培地のｐＨをＮａＯＨで６．７に調整し、続いて、培地をオートクレーブにより滅菌した（１２１℃、２０分）。培養中のｐＨの調整は必要なかった。
【００６２】
シェーカーフラスコ中でのラムノリピド生産を調べるために、最初に前培養物を調製した。このために、ＬＢ寒天プレート上に新たに画線した株の接種ループを使用し、１０ｍｌのＬＢ培地を１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中に接種した。組換えＰ．プチダ（P. putida）株はすべて、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンが添加されたＬＢ培地中に存在した。株の培養を３０℃および２００ｒｐｍで一晩行った。前培養物を用いて２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍｌのＣＭＰ培地に接種した（開始時ＯＤ６００  ０．１）。培養物を２００ｒｐｍおよび３０℃で多くとも１２０時間培養した。２４時間間隔で、１ｍｌのブロスのサンプルを培養フラスコから取り出した。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプルの調製を次のように行った。
【００６３】
置換ピペット（Combitip）を用いて、１ｍｌのアセトンを２ｍｌ反応容器中に導入し、蒸発を最小限に抑えるために、反応容器をただちに閉めた。続いて１ｍｌのブロスを添加した。ブロス／アセトン混合物を撹拌した後、これを１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、８００μＬの上清をＨＰＬＣ容器に移した。
【００６４】
ラムノリピドの検出および定量のために、蒸発光散乱検出器（Sedex LT-ELSD Model 85LT）を使用した。実際の測定は、Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, California)およびZorbax SB-C8迅速分離カラム（４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ、Agilent）により行った。注入量は５μｌであり、方法の実行時間は２０分であった。移動相として０．１％水性ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、溶液Ａ）およびメタノール（溶液Ｂ）を使用した。カラム温度は４０℃であった。ＥＬＳＤ（検出器温度６０℃）およびＤＡＤ（ダイオードアレイ、２１０ｎｍ）を検出器として機能させた。この方法で使用したグラジエントは、以下のとおりであった。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２およびＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２は、ラムノリピドを生産しなかったが、組換え株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭでは、異なるラムノリピド種の生成が検出可能であった（図２および３）。
【００６７】
Ｐ．プチダ（P. putida）中へのｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢおよびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭの組込みにより、モノラムノシル脂質の生成が可能であった（図３）。モノラムノシル脂質に対する基準物質が存在しなかったので、ＬＣ−ＭＳにおける対応する質量トレースおよびＭＳ２スペクトルを解析することにより、産物の同定を行った。ｒｈｌＣ（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ）を追加的に株に組み込んだ場合、モノおよびジラムノシル脂質が生産された（図２）。
【００６８】
Ｐ．プチダ（P. putida）ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢおよびＰ．プチダ（P. putida）ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭによるラムノリピド生成の直接比較により、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）ｐ３１１１とＰ．アエルギノサ（P. aeruginosa）ｒｈｌＡＢとの共発現がラムノリピド生合成の改良をもたらすことが示される（図３）。株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢおよび株Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢは、１２０時間後、約３９ピーク面積／ＯＤ６００ｎｍ（Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ）および２３ピーク面積／ＯＤ６００ｎｍのラムノリピド（Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ）を生産したが、株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭおよび株Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭは、１２０時間後、約５０ピーク面積／ＯＤ６００ｎｍ（Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ）および６２ピーク面積／ＯＤ６００ｎｍのラムノリピド（Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ）を生成した。
【００６９】
株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭおよび株Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭのモノラムノシル脂質合成を比較した場合、ＰＨＡ陰性突然変異型Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭでは６２ピーク面積／ＯＤ６００ｎｍ（１２０時間培養）およびＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭでは５０面積／ＯＤ６００ｎｍのモノラムノシル脂質を検出することが可能であった（図３）。
【００７０】
株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０およびＧＰｐ１０４中でのジラムノシル脂質生成（ｍｇ／ｌ／ＯＤ６００ｎｍ）の比較分析により、同様に、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４のＰＨＡ陰性株バックグラウンドではジラムノシル脂質のより多量の生成が示された。Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣは、平均で１１３ｍｇ／ｌ／ＯＤ６００ｎｍのジラムノシル脂質を生成したが（９６時間）、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣでは、９６時間後、５５ｍｇ／ｌ／ＯＤ６００ｎｍのジラムノシル脂質を検出可能であるにすぎなかった（図２）。したがって、ＰＨＡ合成に関して低減された株バックグラウンドの使用により、ラムノリピド生合成の改良がもたらされることを示すことが可能であった。
【００７１】
５．シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、ｐａ１１３１、およびｒｈｌＣの異種発現用のベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣの構築
シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、ｐａ１１３１、およびｒｈｌＣの異種発現のために、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣ（配列番号５１）を構築した。このために、合成オペロンｒｈｌＡＢ−ｐａ１１３１−ｒｈｌＣ（配列番号５０）をGeneArt AG社（Regensburg）により合成し、市販のベクターｐＭＡ（GeneArt AG）中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７の既知のゲノム配列であった。ベクターｐＭＡ：：ＡＢＭＣから出発して、合成オペロンをＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩによりベクターから切断し、続いて、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断された発現ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２（配列番号４９）中にライゲートした（Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176)。得られるプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣ（配列番号５１）は、９６６３塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）の形質転換は、当業者に公知の方法で行った。インサートの信頼性は、ＤＮＡ配列解析によりチェックした。ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣを用いたシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０およびＧＰｐ１０４の形質転換は、既報どおり行った（Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854）。１０個すべてのクローンのプラスミドＤＮＡを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣおよびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣと命名した。
【００７２】
６．組換えＰ．プチダ（P. putida）株およびＰ．アエルギノサ（P. aeruginosa）株によるラムノリピド生産の定性的比較
組換え株Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣおよびＰ．アエルギノサ（P. aeruginosa）ＤＳＭ１９８８０を、ＬＢ寒天カナマイシンプレート上（５０μｇ／ｍｌ、Ｐ．プチダ（P. putida））およびＬＢ寒天プレート上（Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa））で培養した。
【００７３】
ラムノリピドを生産するために、以下でＣＭＰ培地と記される培地を使用した。これは、２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．００７％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．１１％Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．２％（ｗ／ｖ）ＮａＮＯ３、０．０４％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０１％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、および０．２％（ｖ／ｖ）の微量元素溶液で構成される。これは、０．２％（ｗ／ｖ）ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５％（ｗ／ｖ）ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、および０．０６％（ｗ／ｖ）（ＮＨ４）ＭＯ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏで構成される。ＮａＯＨを用いて培地のｐＨを６．７に調整し、続いて、オートクレーブにより培地を滅菌した（１２１℃、２０分）。培養中のｐＨの調整は必要なかった。
【００７４】
このために、ＬＢ寒天プレート上に新たに画線した株の接種ループを使用し、１０ｍｌのＬＢ培地を１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中に接種した。組換えＰ．プチダ（P. putida）株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンが添加されたＬＢ培地中に存在した。Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）をＬＢ培地中で培養した。株の培養を３０℃および２００ｒｐｍで一晩行った。前培養物を用いて２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍｌのＣＭＰ培地に接種した（開始時ＯＤ６００  ０．１）。培養物を２００ｒｐｍおよび３０℃で多くとも１２０時間培養した。２４時間間隔で、１ｍｌのブロスのサンプルを培養フラスコから取り出した。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプルの調製を次のように行った。
【００７５】
置換ピペット（Combitip）を用いて、１ｍｌのアセトンを２ｍｌ反応容器中に導入し、蒸発を最小限に抑えるために、反応容器をただちに閉めた。続いて１ｍｌのブロスを添加した。ブロス／アセトン混合物を撹拌した後、これを１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、８００μＬの上清をＨＰＬＣ容器に移した。
【００７６】
生成された産物の同定のために、５μｌをＡｃｃｅｌａ  ＵＰＬＣユニット（Thermo Scientific, Dreieich）に注入した。準ＵＰＬＣカラム”Pursuit XRs ULTRA（Ｃ８、２．８μｍ、２．１×１００ｍｍ）（Varian, Darmstadt）を用いて、研究対象物質を分析した。４０℃で０．３ｍｌ／分の流量を用いて、移動相Ａ１（Ｈ２Ｏ、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）および移動相Ｂ１（メタノール、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）で構成されるグラジエントにより、２５分間以内で分離を行った。グラジエントの時間経過は、以下のとおりであった。
【００７７】
【表２】
2013537411.tif 000005
【００７８】
走査範囲ｍ／ｅ１００〜１０００で高分解能ＦＴ−ＩＣＲ  ＬＴＱ−ＦＴ質量分析計（Thermo Scientific, Dreieich）を用いて、波長領域２００〜６００ｎｍで質量選択的にＤＡＤ検出器により検出を行った。ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）によりイオン化を行った。Ｒ＝１０００００の分解能および≦２ｐｐｍの質量確度を用いて、ＦＴ−ＩＣＲ質量分析計により、精密質量および実験化学式を決定した。対応する質量トレースおよびＭＳ２スペクトルを解析することにより産物の同定を行う。株を比較できるように、対応する物質のピーク面積を対比した。図４に示されるように、株Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２は、ラムノリピドをまったく生成しなかった。Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣおよびＰ．アエルギノサ（P. aeruginosa）ＤＳＭ１９８８０は、ラムノリピドを生成したが、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣで生成されたジおよびモノラムノシル脂質の比は、たとえば４：１であり、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）ＤＳＭ１９８８０では、たとえば２：１であった。さらに、株Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣは、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）ＤＳＭ１９８８０とは対照的に、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデカン酸または３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸に由来するＲ１およびＲ２により決定される基を有するラムノリピドを生成しなかったか、またはごくわずか生成したにすぎなかった。
【００７９】
７．シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）中での異種発現用のベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ｒｆｂＢＤＡＣおよびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣの構築
Trenzyme GmbH社（Konstanz）において、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０の染色体ＤＮＡから出発してラムノース生合成オペロンｒｆｂＢＤＡＣを増幅した。このために、以下のプライマーを使用した。
ＲＬ１：５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＴＣＡＴＣＴＧＴＣＴＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣ−３’（配列番号４８）
ＲＬ２：５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＣＴＡＣＣＧＣＡＧＣＣＣＴＴＣ−３’（配列番号４３）
【００８０】
得られたＰＣＲ産物をTrenzyme社のalligatorクローニングシステムでインタークローン化し、大腸菌（E. coli）ＤＨ５α（New England Biolabs; Frankfurt）中に導入して形質転換させた。さまざまな候補ベクターを分析し、配列決定した。誤差のないＤＮＡ配列決定に成功した後、ＥｃｏＲＩによりベクターを切断し、標的断片ｒｆｂＢＤＡＣを単離した。さらなるインタークローニングのために、ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２（Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176）を同様に切断した。切断された標的断片（ｒｆｂＢＤＡＣ）および切断されたベクター（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２）を従来のライゲーションにより合体した。得られたベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ｒｆｂＢＤＡＣ（配列番号４５）を同様に大腸菌（E. coli）ＤＨ５α（New England Biolabs; Frankfurt）中に導入して形質転換させた。プラスミドの取込みの成功に関して、形質転換体のいくつかの候補を調べた。ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ｒｆｂＢＤＡＣをＰＣＲ用のマトリックスとして機能させた。以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
ＲＬ＿ＸｂａＩ−ｆｗ：５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号４４）
ＲＬ＿Ｘｂａ＿ｒｅｖ：５’−ＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’（配列番号４６）
【００８１】
New England Biolabs (Frankfurt)のPhusionTM High-Fidelity Master Mixポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを行った。当業者に公知の方法で行った。標的配列（ｌａｃプロモーターおよびｒｆｂＢＤＡＣ）をTrenzyme alligatorクローニングシステムでインタークローン化した。大腸菌（E. coli）ＤＨ５α（New England Biolabs; Frankfurt）形質転換体を選択し、さまざまな候補プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定した。配列をチェックし、妥当性を調べた後、ＸｂａＩを用いてベクターを切断した。従来のライゲーション法により、標的断片をＸｂａＩ（上記参照）で同様に切断されたｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ中にライゲートした。得られた標的ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ（配列番号４７）は、１２２４９塩基対のサイズを有する。ベクターのインサートを配列決定した。ＰＣＲの実施、アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ増幅の成功のチェック、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色、ＰＣＲ断片サイズの決定、ＰＣＲ産物の精製、およびＤＮＡ濃度の決定は、当業者に公知の方法で行った。ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣを用いたシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０およびＧＰｐ１０４の形質転換は、既報どおり行った（Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854）。１０個すべてのクローンのプラスミドＤＮＡを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣおよびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣと命名した。
【００８２】
８．ｒｆｂＢＤＡＣオペロンの過剰発現を用いたときと用いなかったときの組換えＰ．プチダ（P. putida）によるラムノリピド生産の定量
組換え株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣを、ＬＢ寒天カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するために、以下でＣＭＰ培地と記される培地を使用する。これは、２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．００７％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．１１％Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．２％（ｗ／ｖ）ＮａＮＯ３、０．０４％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０１％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、および０．２％（ｖ／ｖ）の微量元素溶液で構成される。これは、０．２％（ｗ／ｖ）ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５％（ｗ／ｖ）ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、および０．０６％（ｗ／ｖ）（ＮＨ４）ＭＯ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏで構成される。ＮａＯＨを用いて培地のｐＨを６．７に調整し、続いて、オートクレーブにより培地を滅菌する（１２１℃、２０分）。培養中のｐＨの調整は必要ない。
【００８３】
シェーカーフラスコ中でのラムノリピド生産を調べるために、最初に前培養物を調製する。このために、ＬＢ寒天プレート上に新たに画線した株の接種ループを使用し、１０ｍｌのＬＢ培地を１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中に接種する。組換えＰ．プチダ（P. putida）株はすべて、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンが添加されたＬＢ培地中で培養する。Ｐ．プチダ（P. putida）株の培養を３０℃および２００ｒｐｍで一晩行った。前培養物を用いて２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍｌのＣＭＰ培地に接種する（開始時ＯＤ６００  ０．１）。培養物を２００ｒｐｍおよび３０℃で多くとも１２０時間培養する。２４時間間隔で、１ｍｌのブロスのサンプルを培養フラスコから取り出す。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプルの調製を次のように行う。
【００８４】
置換ピペット（Combitip）を用いて、１ｍｌのアセトンを２ｍｌ反応容器中に導入し、蒸発を最小限に抑えるために、反応容器をただちに閉める。続いて１ｍｌのブロスを添加する。ブロス／アセトン混合物を撹拌した後、これを１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、８００μＬの上清をＨＰＬＣ容器に移す。ラムノリピドの検出および定量のために、蒸発光散乱検出器（Sedex LT-ELSD Model 85LT）を使用する。実際の測定は、Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, California)およびZorbax SB-C8迅速分離カラム（４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ、Agilent）により行う。注入量は５μｌであり、方法の実行時間は２０分である。移動相として０．１％水性ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、溶液Ａ）およびメタノール（溶液Ｂ）を使用する。カラム温度は４０℃である。ＥＬＳＤ（検出器温度６０℃）およびＤＡＤ（ダイオードアレイ、２１０ｎｍ）を検出器として機能させる。この方法で使用したグラジエントは、以下のとおりである。
【００８５】
【表３】
2013537411.tif 000006
【００８６】
Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２およびＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２は、ラムノリピドを生産しないが、組換え株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣでは、ラムノリピドの生成を検出可能である。
【００８７】
Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣは、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣと比較して、ジおよびモノラムノシル脂質の増大された生成を示し、また、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣは、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣと比較して、ジおよびモノラムノシル脂質の増大された生成を示す。このことから、モノおよびジラムノシル脂質の生成に及ぼすｒｆｂＢＤＡＣの発現の増幅のプラスの影響が明確に示される。
【００８８】
株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣおよびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣのモノ−およびジラムノシル脂質生合成を比較した場合、ＰＨＡ陰性突然変異型Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣでは、増大されたモノおよびジラムノシル脂質合成が検出される。以上にすでに説明したように、ラムノリピド生合成は、ＰＨＡ合成が不活性化された株バックグラウンドを用いると増大される。
【００８９】
９．組換え大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣおよび大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣの生成
大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０の形質転換は、電気穿孔により既報どおり行った（Miller JH. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Lab. Press; 1992）。１０個すべてのクローンのプラスミドＤＮＡを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣおよび大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣと命名した。
【００９０】
１０．ｒｆｂＢＤＡＣオペロンの過剰発現を用いたときと用いなかったときの組換え大腸菌（E. coli）株によるラムノリピド生産の定量
組換え株大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、および大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣは、ＬＢ寒天カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するために、以下でＣＭＰ培地と記される培地を使用する。これは、２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．００７％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．１１％Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．２％（ｗ／ｖ）ＮａＮＯ３、０．０４％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０１％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、および０．２％（ｖ／ｖ）の微量元素溶液で構成される。これは、０．２％（ｗ／ｖ）ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５％（ｗ／ｖ）ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、および０．０６％（ｗ／ｖ）（ＮＨ４）ＭＯ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏで構成される。ＮａＯＨを用いて培地のｐＨを６．７に調整し、続いて、オートクレーブにより培地を滅菌する（１２１℃、２０分）。培養中のｐＨの調整は必要ない。
【００９１】
シェーカーフラスコ中でのラムノリピド生産を調べるために、最初に前培養物を調製する。このために、ＬＢ寒天プレート上に新たに画線した株の接種ループを使用し、１０ｍｌのＬＢ培地を１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中に接種する。組換え大腸菌（E. coli）株はすべて、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンが添加されたＬＢ培地中で培養する。大腸菌（E. coli）株の培養を３７℃および２００ｒｐｍで一晩行った。前培養物を用いて２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍｌのＣＭＰ培地に接種する（開始時ＯＤ６００  ０．１）。培養物を２００ｒｐｍおよび３０℃で多くとも１２０時間培養する。２４時間間隔で、１ｍｌのブロスのサンプルを培養フラスコから取り出す。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプルの調製を次のように行う。
【００９２】
置換ピペット（Combitip）を用いて、１ｍｌのアセトンを２ｍｌ反応容器中に導入し、蒸発を最小限に抑えるために、反応容器をただちに閉める。続いて１ｍｌのブロスを添加する。ブロス／アセトン混合物を撹拌した後、これを１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、８００μＬの上清をＨＰＬＣ容器に移す。ラムノリピドの検出および定量のために、蒸発光散乱検出器（Sedex LT-ELSD Model 85LT)を使用する。実際の測定は、Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, California)およびZorbax SB-C8迅速分離カラム（４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ、Agilent）により行う。注入量は５μｌであり、方法の実行時間は２０分である。水性０．１％のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、溶液Ａ）およびメタノール（溶液Ｂ）を移動相として使用する。カラム温度は４０℃である。ＥＬＳＤ（検出器温度６０℃）およびＤＡＤ（ダイオードアレイ、２１０ｎｍ）を検出器として機能させる。この方法で使用したグラジエントは、以下のとおりである。
【００９３】
【表４】
2013537411.tif 000007
【００９４】
大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２は、ラムノリピドを生産しないが、組換え株大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣおよび大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣでは、モノおよびジラムノシル脂質の生成を検出可能であり、この場合、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣは、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣよりも有意に多量のモノおよびジラムノシル脂質を生成する。このことから、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７のｒｈｌＡＢＣの異種発現により大腸菌（E. coli）中でのモノおよびジラムノシル脂質の生成がもたらされることが示される。さらに、このことから、モノおよびジラムノシル脂質の生成に及ぼすｒｆｂＢＤＡＣの発現の増強のプラスの影響が示される。
【００９５】
１１．シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、およびｒｈｌＣならびにバークホルデリア・タイランデンシス（Burkholderia thailandensis）Ｅ２６４遺伝子ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７、ＢＴ＿ＩＩ１０８０、およびＢＴ＿ＩＩ１０８１の異種発現用のベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１の構築
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、およびｒｈｌＣならびにＢ．タイランデンシス（B. thailandensis）Ｅ２６４遺伝子ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７、ＢＴ＿ＩＩ１０８０、およびＢＴ＿ＩＩ１０８１の異種発現のために、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−  ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１（配列番号６９）を構築する。このために、合成オペロンＢＴＨ＿ＩＩ１０７７、ＢＴ＿ＩＩ１０８０、およびＢＴ＿ＩＩ１０８１（配列番号７０）を、DNA 2.0社（Menlo Park, CA, USA）により合成し、市販のベクターｐＪ２９４（DNA 2.0; Menlo Park, CA, USA）中にインタークローン化する。合成のベースは、株Ｂ．タイランデンシス（B. thailandensis）Ｅ２６４のゲノム配列である。ベクターｐＪ２９４−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１から出発して、合成オペロンをＸｂａＩによりこのベクターから切断し、続いて、ＸｂａＩを用いて同様に切断されたベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ（配列番号４０）中にライゲートする。得られた標的ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−  ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１（配列番号６９）は、１３７６８塩基対のサイズを有する。ベクターのインサートを配列決定する。ＰＣＲの実施、アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ増幅の成功のチェック、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色、ＰＣＲ断片サイズの決定、ＰＣＲ産物の精製、およびＤＮＡ濃度の決定は、当業者に公知の方法で行う。ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１（配列番号６９）を用いたシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０およびＧＰｐ１０４の形質転換は、既報どおり行う（Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854）。１０個すべてのクローンのプラスミドＤＮＡを単離して分析する。プラスミドを有する得られた株を、Ｐ．プチダ（P. putida）Ｋ
Ｔ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−  ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−  ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１と命名する。
【００９６】
１２．Ｂ．タイランデンシス（B. thailandensis）Ｅ２６４遺伝子ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７、ＢＴ＿ＩＩ１０８０およびＢＴ＿ＩＩ１０８１の過剰発現を用いたときと用いなかったときの組換えＰ．プチダ（P. putida）株によるラムノリピド生産の定量
実施例１、２、および１１で生成した組換え株Ｐ．プチダ（P. putida）の株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１  Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１を、ＬＢ寒天カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するために、以下でＭ９培地と記される培地を使用する。この培地は、２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．３％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．６７９％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．２％（ｗ／ｖ）ＮＨ４Ｃｌ、０．０４９％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および０．１％（ｖ／ｖ）の微量元素溶液で構成される。これは、１．７８％（ｗ／ｖ）ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１９１％（ｗ／ｖ）ＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、３．６５％（ｗ／ｖ）ＨＣｌ、０．１８７％（ｗ／ｖ）ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０８４％（ｖ／ｖ）ＮａＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、０．０３％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＢＯ３、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、および０．４７％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏで構成される。ＮＨ４ＯＨを用いて培地のｐＨを７．４に調整し、続いて、オートクレーブにより培地を滅菌する（１２１℃、２０分）。培養中のｐＨの調整は必要ない。シェーカーフラスコ中でのラムノリピド生産を調べるために、最初に前培養物を調製する。このために、ＬＢ寒天プレート上に新たに画線した株の接種ループを使用し、１０ｍｌのＬＢ培地を１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中に接種する。組換えＰ．プチダ（P. putida）株はすべて、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンが添加されたＬＢ培地中で培養した。Ｐ．プチダ（P. putida）株の培養を３７℃および２００ｒｐｍで一晩行う。前培養物を用いて２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍｌのＭ９培地（＋５０μｇ／ｍｌのカナマイシン）に接種する（開始時ＯＤ６００  ０．１）。培養物を２００ｒｐｍおよび３０℃で培養する。２４時間間隔で、１ｍｌのブロスのサンプルを培養フラスコから取り出す。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例４で説明したように行う。組換え株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１は、株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢおよびＰ．���チダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢよりも有意に多量のモノラムノシル脂質を生成することが示される。このことから、Ｂ．タイランデンシス（B. thailandensis）Ｅ２６４由来のＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１の増幅により、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７遺伝子ｒｈｌＡＢを含有するＰ．プチダ（P. putida）株中でのモノラムノシル脂質の生成が増大されることが実証される。さらに、組換え株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１は、株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣおよびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣよりも有意に多量のモノおよびジラムノシル脂質を生成することが示される。このことから、Ｂ．タイランデンシス（B. thailandensis）Ｅ２６４由来のＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−Ｉ１０８０−ＩＩ１０８１の増幅により、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７遺伝子ｒｈｌＡＢＣを含有するＰ．プチダ（P. putida）株中でのモノおよびジラムノシル脂質の生成が増大されることが証明される。最後に、株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１、およびＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１が、対応する対照株Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１、およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ−ＢＴＨ＿ＩＩ１０７７−ＩＩ１０８０−ＩＩ１０８１よりも有意に少量のモノ−およびモノおよびジラムノシル脂質を生成し得るので、株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０と比較して株バックグラウンドＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４中でのポリヒドロキシブチレート生成を低減することにより、増大されたラムノリピド生成がもたらされることが示される。
【００９７】
１３．シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、ｐａ１１３１、およびｒｈｌＣの異種発現用のベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭの構築
シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、ｐａ１１３１、およびｒｈｌＣの異種発現のために、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ（配列番号５８）を構築した。このために、オリゴヌクレオチド
ＭＦＳ２．０＿ｘｂａＩ＿ｆｗ：５’−ＡＧＧＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＧＡＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡＡＧＧＡＴＡＣ−３’（配列番号６０）
ＭＦＳ２．０＿ＸｂａＩ＿ｒｅｖ：５’−ＣＣＡＧＧＴＴＣＴＡＧＡＣＧＣＣＡＧＧＡＴＴＧＡＡＣＡＧＴＡＣＣ−３’（配列番号６１）
を含有する株シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＤＳＭ１７０７）のゲノムＤＮＡから出発して、遺伝子ｐａ１１３１（配列番号５９）を増幅した。
【００９８】
New England Biolabs (Frankfurt)製のPhusionTM High-Fidelity Master Mixポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ産物（１４８３塩基対）の増幅を行った。ＸｂａＩを用いてＰＣＲ産物を切断し、Fast Link Ligation Kit (Epicentre Technologies; Madison, WI, USA)により、ＸｂａＩを用いて同様に切断されたベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ（配列番号４０）中にライゲートした。得られた標的ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ（配列番号５８）は、９８９２塩基対のサイズを有する。ベクターのインサートを配列決定した。製造業者の説明書に従ってDNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen; Hilden)により、染色体ＤＮＡを単離した。ＰＣＲの実施、アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ増幅の成功のチェック、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色、ＰＣＲ断片サイズの決定、ＰＣＲ産物の精製、およびＤＮＡ濃度の決定は、当業者に公知の方法で行った。ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭを用いたシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０およびＧＰｐ１０４の形質転換は、既報どおり行った（Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854）。１０個すべてのクローンのプラスミドＤＮＡを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭおよびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭと命名した。
【００９９】
１４．シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７  ｐａ１１３１遺伝子の過剰発現を用いたときと用いなかったときの組換えＰ．プチダ（P. putida）株によるラムノリピド生産の定量
実施例２および１３で生成した組換え株Ｐ．プチダ（P. putida）の株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭを、ＬＢ寒天カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）プレート上で培養した。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例１２で説明したように行った。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例４で説明したように行った。結果を以下の表に示す。
【０１００】
【表５】
2013537411.tif 000008
【０１０１】
結果から、両方の株バックグラウンド（ＫＴ２４４０：野生型および不活性化されたポリヒドロキシブチレート生成を有するＧＰｐ１０４）でＰ．アエルギノサ（P. aeruginosa）遺伝子ｐａ１１３１の過剰発現によりジおよびモノラムノシル脂質の増大された生成がもたらされることが示される。さらに、結果から、ＧＰｐ１０４でのポリヒドロキシブチレート生成の低減により一般的にラムノシル脂質の増大された生成がもたらされることが示される。
【０１０２】
１５．コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７由来の遺伝子ｒｈｌＡおよびｒｈｌＢの異種発現用のベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢの構築
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７由来の遺伝子ｒｈｌＡおよびｒｈｌＢの異種発現のために、プラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢ（配列番号５２）を構築する。このために、合成オペロンｒｈｌＡＢ（配列番号３７）をGeneArt AG社（Regensburg）により合成し、市販のベクターｐＭＡ（GeneArt AG）中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７の既知のゲノム配列であった。ベクターｐＭＡ：：ＡＢから出発して、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて合成オペロンをベクターから切断し、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩを用いて切断された発現ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ（米国特許第７１１８９０４号）中にライゲートする。得られるプラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢ（配列番号５２）は、９７９３塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、ＤＮＡ配列解析によりチェックする。ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢを用いたＣ．グルタミカム（Ｃ. glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２の形質転換は、既報どおり行う（Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)）。形質転換体の選択は、ＬＢＨＩＳ寒天プレート（１８．５ｇ／ｌのブレインハートインフュージョンブロス、０．５Ｍソルビトール、５ｇ／ｌのＢａｃｔｏトリプトン、２．５ｇ／ｌのＢａｃｔｏ酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、および１８ｇ／ｌのＢａｃｔｏ寒天（５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンが追加されたもの））上で行う。プレートを３３℃で２日間培養した。プラスミドを有する得られた株をＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢと命名する。
【０１０３】
１６．コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７由来の遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、およびｒｈｌＣの異種発現用のベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣの構築
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７由来の遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢおよびｒｈｌＣの異種発現のために、プラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣ（配列番号５３）を構築する。このために、ｒｈｌＡＢＣ（配列番号３９）をGeneArt AG社（Regensburg）により合成し、市販のベクターｐＭＡ（GeneArt AG）中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７の既知のゲノム配列であった。ベクターｐＭＡ：：ＡＢＣから出発して、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて合成オペロンをベクターから切断し、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩを用いて切断された発現ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ（米国特許第７１１８９０４号）中にライゲートする。得られるプラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣ（配列番号５３）は、１０７８０塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、ＤＮＡ配列解析によりチェックする。ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣを用いたＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２の形質転換は、既報どおり行う（Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)）。形質転換体の選択は、ＬＢＨＩＳ寒天プレート（１８．５ｇ／ｌのブレインハートインフュージョンブロス、０．５Ｍソルビトール、５ｇ／ｌのＢａｃｔｏトリプトン、２．５ｇ／ｌのＢａｃｔｏ酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、および１８ｇ／ｌのＢａｃｔｏ寒天（５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを用いて追加が行われたもの））上で行う。プレートを３３℃で２日間培養した。プラスミドを有する得られた菌株をＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣと命名する。
【０１０４】
１７．コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７由来の遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、およびｐａ１１３１の異種発現用のベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭの構築
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７由来の遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢおよびｐａ１１３１の異種発現のために、プラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭ（配列番号５４）を構築する。このために、合成オペロンｒｈｌＡＢＭ（配列番号４１）をGeneArt AG社（Regensburg）により合成し、市販のベクターｐＭＡ（GeneArt AG）中にインタークローン化した。合成のベースは、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７の既知のゲノム配列であった。ベクターｐＭＡ：：ＡＢＭから出発して、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて合成オペロンをベクターから切断し、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩを用いて切断された発現ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ（米国特許第７１１８９０４号）中にライゲートする。得られるプラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭ（配列番号５４）は、１１０７３塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、ＤＮＡ配列解析によりチェックする。ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭを用いたＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２の形質転換は、既報どおり行う（Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)）。形質転換体の選択は、ＬＢＨＩＳ寒天プレート（１８．５ｇ／ｌのブレインハートインフュージョンブロス、０．５Ｍソルビトール、５ｇ／ｌのＢａｃｔｏトリプトン、２．５ｇ／ｌのＢａｃｔｏ酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、および１８ｇ／ｌのＢａｃｔｏ寒天（５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンが追加されたもの））上で行う。プレートを３３℃で２日間培養した。プラスミドを有する得られた菌株をＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭと命名する。
【０１０５】
１８．コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７由来の遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、ｐａ１１３１、およびｒｈｌＣの異種発現用のベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭの構築
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＤＳＭ１７０７由来の遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、ｐａ１１３１、およびｒｈｌＣの異種発現のために、プラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭ（配列番号５５）を構築する。このために、オリゴヌクレオチド
ＭＦＳ２．０＿ｘｂａＩ＿ｆｗ：５’−ＡＧＧＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＧＡＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡＡＧＧＡＴＡＣ−３’（配列番号６０）
ＭＦＳ２．０＿ＸｂａＩ＿ｒｅｖ：５’−ＣＣＡＧＧＴＴＣＴＡＧＡＣＧＣＣＡＧＧＡＴＴＧＡＡＣＡＧＴＡＣＣ−３’（配列番号６１）
を用いて株シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＤＳＭ１７０７）のゲノムＤＮＡから出発して、遺伝子ｐａ１１３１（配列番号５９）を増幅した。
【０１０６】
New England Biolabs (Frankfurt)製のPhusionTM High-Fidelity Master Mixポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ産物（１４８３塩基対）の増幅を行った。ＸｂａＩを用いてＰＣＲ産物を切断し、Fast Link Ligation Kit (Epicentre Technologies; Madison, WI, USA)により、ＸｂａＩを用いて同様に切断されたベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ（配列番号４０）中にライゲートした。得られた標的ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭ（配列番号５５）は、１２２６３塩基対のサイズを有する。ベクターのインサートを配列決定した。製造業者の説明書に従ってDNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen; Hilden)により、染色体ＤＮＡを単離した。ＰＣＲの実施、アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ増幅の成功のチェック、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色、ＰＣＲ断片サイズの決定、ＰＣＲ産物の精製、およびＤＮＡ濃度の決定は、当業者に公知の方法で行った。ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭを用いたＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２の形質転換は、既報どおり行う（Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)）。形質転換体の選択は、ＬＢＨＩＳ寒天プレート（１８．５ｇ／ｌのブレインハートインフュージョンブロス、０．５Ｍソルビトール、５ｇ／ｌのＢａｃｔｏトリプトン、２．５ｇ／ｌのＢａｃｔｏ酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、および１８ｇ／ｌのＢａｃｔｏ寒天（５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンが追加されたもの））上で行う。プレートを３３℃で２日間インキュベートした。プラスミドを有する得られた株をＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭと命名する。
【０１０７】
１９．Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）中での異種発現用のベクターｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣの構築
Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）中でのｌａｃプロモーターの制御下のＰ．プチダ（P. putida）由来の遺伝子ｒｆｂＢＤＡＣの異種発現のために、ベクターｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ（配列番号５７）を構築する。このために、ＸｂａＩを用いてベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ｒｆｂＢＤＡＣ（配列番号４５）を消化し、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０由来の遺伝子ｒｆｂＢＤＡＣとｌａｃプロモーターとを含有する断片（３８４０ｂｐ）を、ＸｂａＩで消化されたベクターｐＶＷＥＸ１（配列番号５６）中にライゲートする。得られるプラスミドｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ（配列番号５７）は、１２３１１塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、ＤＮＡ配列解析によりチェックする。ベクターｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣを用いたＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ、ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢ、ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭ、ＡＴＣＣ１３０３２  ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣ、およびＡＴＣＣ１３０３２  ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭの形質転換は、既報どおり行う（Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)）。形質転換体の選択は、ＬＢＨＩＳ寒天プレート（１８．５ｇ／ｌのブレインハートインフュージョンブロス、０．５Ｍソルビトール、５ｇ／ｌのＢａｃｔｏトリプトン、２．５ｇ／ｌのＢａｃｔｏ酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、および１８ｇ／ｌのＢａｃｔｏ寒天（５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンおよび２５ｍｇ／ｌのカナマイシンが追加されたもの））上で行う。プレートを３３℃で２日間培養した。プラスミドを有する得られた株を、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ、およびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣと命名する。
【０１０８】
２０．組換えＣ．グルタミカム（C. glutamicum）株によるラムノリピド生産の定量
実施例１５〜１９で生成したＣ．グルタミカム（C. glutamicum）株である組換え株Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ、およびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣを、５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンおよび５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンおよび２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを用いてＬＢＨＩＳ寒天プレート上で培養する。シェーカーフラスコ中でのラムノリピド生産を調べるために、最初に前培養物を調製する。このために、ＬＢＨＩＳ寒天プレート上に新たに画線された株の接種ループを使用し、１０ｍｌのＬＢＨＩＳ培地（１８．５ｇ／ｌのブレインハートインフュージョンブロス、０．５Ｍソルビトール、５ｇ／ｌのＢａｃｔｏトリプトン、２．５ｇ／ｌのＢａｃｔｏ酵母エキス、および５ｇ／ｌのＮａＣｌ、これに５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンまたは５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンおよび２５ｍｇ／ｌのカナマイシンが追加されている）を１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中に接種する。株の培養を３３℃および２００ｒｐｍで一晩行う。翌朝、５０ｍｌのＣＧＸＩＩ培地（５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンまたは５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンおよび２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有する）を１ｍｌの前培養物と共に、バッフルを含有する５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中に接種する（開始時ＯＤ６００  ０．１）。
【０１０９】
ＣＧＸＩＩ培地：
・２０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４（Merck）
・５ｇ／ｌの尿素（Merck）
・１ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４（Merck）
・１ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４（Merck）
・０．２５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（Merck）
・１０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ２（Merck）
・４２ｇ／ｌのＭＯＰＳ（Roth）
・０．２ｍｇ／ｌのビオチン（Merck）
・１ｍｌ／ｌの微量塩溶液
・ＮａＯＨを用いたｐＨ７に調整する
・オートクレーブ処理後、１ｍｌ／ｌのプロトカテク酸（３０ｇ／ｌ、希ＮａＯＨ中溶解、滅菌濾過）および４０ｇ／ｌのグルコース（Merck）を添加する
【０１１０】
微量塩溶液：
・１０ｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（Merck）
・１０ｇ／ｌのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（Merck）
・１ｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（Merck）
・０．２ｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（Merck）
・２０ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（Merck）
・溶解するために、ＨＣｌを用いてｐＨ１に酸性化する
【０１１１】
培養物を２００ｒｐｍおよび３３℃で０．４〜０．６の光学濃度（６００ｎｍ）まで培養する。この光学濃度で、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；最終濃度１ｍＭ）の添加により、培養物を誘導する。後続発現を同様に３３℃および２００ｒｐｍで７２時間行う。２４時間間隔で、１ｍｌのブロスのサンプルを培養フラスコから取り出す。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例４で説明したように行う。
【０１１２】
Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａは、ラムノリピドを生産しないが、組換え株Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭ、およびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭでは、ラムノリピドの生成を検出可能である。基準物質を利用して、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢおよびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭは、モノラムノシル脂質を生成するにすぎないが、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭ、およびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭは、ジラムノシル脂質およびモノラムノシル脂質を形成可能であることが示される。さらに、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭおよびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭは、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）由来のｐａ１１３１遺伝子の増幅を用いないそれぞれの基準株Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢおよびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣよりも多量のモノラムノシル脂質またはジラムノシル脂質およびモノラムノシル脂質を生成可能であることが示される。さらに、株Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ、およびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣは、Ｐ．プ
チダ（P. putida）由来のｒｆｂＢＤＡ遺伝子の増幅をを用いない株Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭ、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣ、およびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭよりも有意に多量の、モノラムノシル脂質（Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣおよびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＭ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ）またはよりモノおよびジラムノシル脂質（Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣおよびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ：：ＡＢＣＭ  ｐＶＷＥＸ１：：ｒｆｂＢＤＡＣ）を生成することが示される。
【０１１３】
２１．プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭを有するシュードモナス属（Pseudomonas）株の構築
プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭを、電気穿孔により、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６、およびシュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７中に組み込む。シュードモナス属（Pseudomonas）株の形質転換は、既報どおり行う（Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854）。形質転換体の選択は、栄養寒天プレート（５ｇ／ｌのペプトン、３ｇ／ｌの肉抽出物、１５ｇ／ｌの寒天、ｐＨ７、これに５０ｍｇ／ｌのカナマイシンが追加されている）上で行う。３０℃、より正確には２８℃で、プレートを２日間培養する。プラスミドを有する得られた株を、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、およびシュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭと命名する。
【０１１４】
２２．組換えシュードモナス属（Pseudomonas）株によるラムノリピド生産の定量
実施例２１で生成した組換え株シュードモナス属（Pseudomonas）株のシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ  ５００９０、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ���Ｍ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、およびシュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭを、ＬＢ寒天カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例１２で説明したように行う。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例４で説明したように行う。
【０１１５】
シュードモナス属（Pseudomonas）株シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、シュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２は、ラムノリピドを生産しないが、組換え株シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢおよびシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭおよびシュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭでは、モノラムノシル脂質の生成を検出可能であり、株シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭおよびシュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭでは、モノおよびジラムノシル脂質の生成を検出可能である。
【０１１６】
さらに、より少量のモノラムノシル脂質が、組換えシュードモナス属（Pseudomonas）株シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭシュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ、１７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭにより、ならびに組換えシュードモナス属（Pseudomonas）株シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、およびシュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭにより、生成され、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）遺伝子ｐａ１１３１を用いないそれぞれの基準株シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢおよびシュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、ならびにシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）由来のｐａ１１３１遺伝子の増幅を��いないシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ５００９０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＤＳＭ  ９９５８  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ６８９９  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＤＳＭ  ５０２０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）５０１９４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．ブラッシカセアラム（P. brassicacearum）ＤＳＭ  １３２２７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）ＤＳＭ  １０７０１  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＤＳＭ  ４１６６  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、およびシュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）ＤＳＭ  １７７１７  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣによるよりも少量のモノおよびジラムノシル脂質が生成される。
【０１１７】
２３．Ｐ．プチダ（P. putida）中でのシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡ７、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）１、およびバークホルデリア・タイランデンシス（Burkholderia thailandensis）Ｅ２６４由来の代替的ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、およびｒｈｌＣ遺伝子の異種発現用のベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡＯ１−Ｃ１およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡ７−ＣＥ２６４の構築
シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１およびシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡ７由来の遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、およびｒｈｌＣの異種発現のために、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡＯ１（配列番号６２）およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡ７（配列番号６３）を最初に構築する。このために、合成オペロンｒｈｌＡＢＰＡＯ１（配列番号６４）およびｒｈｌＡＢＰＡ７（配列番号６５）をDNA 2.0社（Menlo Park, CA, U.S.A）により合成し、市販のベクターｐＪ２９４（DNA 2.0）中でインタークローン化する。合成のベースは、株シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１およびシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡ７の既知のゲノム配列である。ベクターｐＪ２９４：：ＡＢＰＡＯ１およびｐＪ２９４：：ＡＢＰＡ７から出発して、合成オペロンをＫｐｎＩおよびＸｂａＩによりベクターから切断し、続いて、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩを用いて切断された発現ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２（配列番号４９）（Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176）中にライゲートする。得られるプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡＯ１（配列番号６２）およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡ７（配列番号６３）は、７３３２および７３５４塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、ＤＮＡ配列解析によりチェックする。第２の工程で、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡＯ１−Ｃ１（配列番号６６）およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡ７−ＣＥ２６４（配列番号６７）を生産する。このために、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）１（配列番号６８）およびバークホルデリア・タイランデンシス（Burkholderia thailandensis）Ｅ２６４（配列番号７６）由来のｒｈｌＣ遺伝子をDNA 2.0社（Menlo Park, CA, U.S.A）により合成し、市販のベクターｐＪ２９４（DNA 2.0）中にインタークローン化する。合成のベースは、株シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）１およびバークホルデリア・タイランデンシス（Burkholderia thailandensis）Ｅ２６４の既知のゲノム配列である。ベクターｐＪ２９４：：Ｃ１およびｐＪ２９４：：ＣＥ２６４から出発して、ｒｈｌＣ遺伝子をＸｂａおよびＳａｃＩによりベクターから切断し、続いて、ＸｂａおよびＳａｃＩを用いて同様に切断されたベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡＯ１（配列番号６２）およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡ７（配列番号６３）中にライゲートする。得られるプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡＯ１−Ｃ１（配列番号６６）およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡ７−ＣＥ２６４（配列番号６７）は、８３２５および８３３５塩基対のサイズである。ライゲーションおよび化学的コンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）の形質転換は、当業者に公知の方法で行う。インサートの信頼性は、ＤＮＡ配列解析によりチェックする。ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡＯ１−Ｃ１およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡ７−ＣＥ２６４を用いたシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０およびＧＰｐ１０４の形質転換は、既報どおり行う（Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854）。１０個すべてのクローンのプラスミドＤＮＡを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡＯ１−Ｃ１、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡ７−ＣＥ２６４、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡＯ１−Ｃ１、およびＰ．プチダ（P. putidａ）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡ７−ＣＥ２６４と命名する。
【０１１８】
２４．シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡ７、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）１、およびバークホルデリア・タイランデンシス（Burkholderia thailandensis）Ｅ２６４由来の代替的ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、およびｒｈｌＣ遺伝子を有する組換えＰ．プチダ（P. putida）株によるラムノリピド生産の定量
実施例２３で生成した組換え株Ｐ．プチダ（P. putida）株をＬＢ寒天カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例１２で説明したように行う。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例４で説明したように行う。
【０１１９】
株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２は、モノおよびジラムノシル脂質を生産できないが、株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡＯ１−Ｃ１、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡ７−ＣＥ２６４、Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡＯ１−Ｃ１、およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡ７−ＣＥ２６４は、モノさらにはジラムノシル脂質の両方を生成する。株は、ポリヒドロキシブチレート生成の低減により（Ｐ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡＯ１−Ｃ１およびＰ．プチダ（P. putida）ＧＰｐ１０４  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡ７−ＣＥ２６４）、ポリヒドロキシブチレート生成の低減がなされていない株（Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡＯ１−Ｃ１およびＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＰＡ７−ＣＥ２６４）よりも多量のモノおよびジラムノシル脂質を生産可能であることが示される。
【０１２０】
２５．Ｐ．プチダ（P. putida）および大腸菌（E. coli）中でのＰ．プチダ（P. putida）ｒｆｂＢＤＡＣオペロンの過剰発現用のベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣの構築
Ｐ．プチダ（P. putida）および大腸菌（E. coli）中でのＰ．プチダ（P. putida）ｒｆｂＢＤＡＣオペロンの過剰発現用のベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣを構築するために、、Ｐ．プチダ（P. putida）ｒｆｂＢＤＡＣオペロンをＰＣＲにより最初に増幅した。ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ｒｆｂＢＤＡＣ（配列番号４５）をＰＣＲ用のマトリックスとして機能させた。以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
ＲＬ＿ＡｇｅＩ−ｆｗ：５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＡＣＣＧＧＴＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号７１）
ＲＬ＿ＡｇｅＩ＿ｒｅｖ：５’−ＧＧＣＣＧＡＣＣＧＧＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡ−３’（配列番号７２）
【０１２１】
New England Biolabs (Frankfurt)のPhusionTM High-Fidelity Master Mixポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを行った。当業者に公知の方法で行った。標的配列（ｌａｃプロモーターおよびｒｆｂＢＤＡＣ）をTrenzyme alligatorクローニングシステムでインタークローン化した。大腸菌（E. coli）ＤＨ５α（New England Biolabs; Frankfurt）形質転換体を選択し、さまざまな候補プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定した。配列をチェックし、妥当性を調べた後、ＡｇｅＩを用いてベクターを切断した。標的断片を、従来のライゲーション方法により、ＡｇｅＩを用いて同様に切断されたベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ（配列番号３８）、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ（配列番号４２）、およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣ（配列番号５１）中にライゲートした。得られるベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ（配列番号７３）、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ（配列番号７４）、およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ（配列番号７５）は、１１９６０、１３２８９、および１４２５０塩基対のサイズを有する。ベクターのインサートを配列決定した。ＰＣＲの実施、アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ増幅の成功のチェック、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色、ＰＣＲ断片サイズの決定、ＰＣＲ産物の精製、およびＤＮＡ濃度の決定は、当業者に公知の方法で行った。ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣを用いたシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０の形質転換は、既報どおり行った（Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854）。１０個すべてのクローンのプラスミドＤＮＡを単離して分析した。プラスミドを有する得られた株を、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒ
ｆｂＢＤＡＣ、およびＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣと命名する。
【０１２２】
２６．組換えＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、およびＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣによるラムノリピド生産の定量
実施例２、７、および２５で生成した組換え株のＰ．プチダ（P. putida）株をＬＢ寒天カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例１２で説明したように行う。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例４で説明したように行う。
【０１２３】
Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、およびＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭは、モノラムノシル脂質を生成可能であるが、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、およびＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣは、モノおよびジラムノシル脂質を生成可能であることが示される。さらに、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、およびＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣは、、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）遺伝子ｐａ１１３１の増幅を用いない対応する対照株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、およびＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣよりも多量のモノおよびジラムノシル脂質を生成可能であることが示される。最後に、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣは、Ｐ．プチダ（P. putida）遺伝子ｒｆｂＢＤＡＣの増幅を用いないそれぞれの対照株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣよりも多量のモノラムノシル脂質（Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣおよびＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ）ならびにモノおよびジラムノシル脂質（Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣおよびＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ）を生成可能であることが示される。
【０１２４】
２７．組換え大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、および大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣの生成
大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０の形質転換は、電気穿孔により既報どおり行った（Miller JH. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Lab. Press; 1992）。１０個すべてのクローンのプラスミドＤＮＡを単離して解析した。プラスミドを有する得られた株を、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、および大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣと命名した。
【０１２５】
２８．組換え大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、および大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣによるラムノリピド生産の定量
実施例２７で生成した組換え大腸菌（E. coli）株をＬＢ寒天カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）プレート上で培養する。ラムノリピドを生産するための後続培養は、実施例１０で説明したように行う。以下のクロマトグラフィー分析用のサンプル調製およびクロマトグラフィー分析自体は、実施例４で説明したように行う。
【０１２６】
大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、および大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣは、モノラムノシル脂質を生成可能であるが、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、および大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣは、モノおよびジラムノシル脂質を生成可能であることが示される。さらに、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭおよび大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣは、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）遺伝子ｐａ１１３１の増幅を用いない大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、および大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣよりも多量のモノラムノシル脂質を生成することが示される。さらに、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭおよび大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣは、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）遺伝子ｐａ１１３１の増幅を用いない大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣおよび大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣよりも多量のモノおよびジラムノシル脂質を生成することが示される。さらに、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭおよび大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣは、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）遺伝子ｐａ１１３１の増幅を用いない大腸菌（E. col
i）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢおよび大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣよりも多量のモノラムノシル脂質を生成することが示される。最後に、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣおよび大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣは、Ｐ．プチダ（P. putida）遺伝子ｒｆｂＢＤＡＣの増幅を用いないそれぞれの対照株大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ、および大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭよりも多量のモノラムノシル脂質（大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢ＿ｒｆｂＢＤＡＣ、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ）ならびにモノおよびジラムノシル脂質（大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣ＿ｒｆｂＢＤＡＣおよび大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＢＣＭ＿ｒｆｂＢＤＡＣ）を生成することが示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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